(57)【要約】本開示は、疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現する単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにかかる疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶα及びＶβポリペプチド対をコードする核酸に関連する方法及び組成物を提供する。かかる疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１０剤による治療を受け入れ可能な疾患を有する被験体の末梢（例えば、血液）から得ることができる。本開示はまた、単離された疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の被験体への投与に関する治療方法及び組成物、ならびに疾患抗原特異的ＴＣＲ及び／またはキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変したＣＤ８＋Ｔ細胞に関する治療方法及び組成物を企図する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドの同定方法であって、
ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患を有する被験体にＩＬ−１０剤を投与すること；
前記被験体から採取した１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する試料由来の核酸配列を配列決定すること；及び
前記ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする前記核酸及び／または前記ＶβＴＣＲポリペプチドをコードする前記核酸の存在量を、ＩＬ−１０剤療法に先立って、またはＩＬ１０剤療法中のより早い時点で、ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な前記疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料中の前記ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする前記核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量と比較すること
を含み；
前記配列決定が、核酸可変α（Ｖα）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定することを含み
前記参照試料中よりも多量に前記試料中に存在する前記Ｖα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドが、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的なＶα／ＶβＴＣＲポリペプチド対を表す、同定方法。
【請求項２】
前記被験体が、ＩＬ−１０剤治療に対して、少なくとも安定または少なくとも部分奏効を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が、ＩＬ−１０剤療法に対する少なくとも部分奏効を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料を、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくともＰＤ１＋ｍｉｄのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくともＰＤ１＋ｈｉｇｈのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記試料を、ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料を、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ３アゴニストと接触させてＩＦＮγ発現を刺激することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ３アゴニストが抗ＣＤ３抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を、ＰＤ１＋、ＩＦＮγ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、及び／またはパーフォリン＋であるＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１人以上の患者に前記被験体が含まれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が腫瘍を有し、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍抗原に特異的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体が腫瘍を有し、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍浸潤性リンパ球である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の癌、または造血系、脾臓、もしくは胸腺の癌から選択されるがんの腫瘍である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が、食道、咽頭、胃、小腸、大腸、結腸、または直腸の癌の腫瘍である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が、メラノーマ、結腸直腸癌、または腎臓癌である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、ウイルス感染を有し、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が感染ウイルスの抗原に特異的である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−１０剤がヒトＩＬ−１０である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−１０剤がペグ化ＩＬ−１０（ＰＥＧ−ＩＬ−１０）である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、ＩＬ−１０の少なくとも１つのモノマーのＮ末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、モノペグ化ＩＬ−１０及びジペグ化ＩＬ−１０の混合物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０の前記ＰＥＧ成分が、５ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を有する、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−１０剤を、被験体に皮下投与する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体がヒト被験体である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／または前記ＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定すること；及び
前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び／または前記ＶβＴＣＲポリペプチドの少なくとも前記相補性決定領域（ＣＤＲ）の前記アミノ酸配列を決定すること；
前記ＶαＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列及び／または前記ＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の存在量を、ＩＬ−１０剤療法に先立って、またはＩＬ１０剤療法中のより早い時点で、ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な前記疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料中の前記ＶαＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列及び／または前記ＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列と比較すること
を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法に従って単離したＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲの抗原特異性を、前記Ｖα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を前記参照試料中のＶα及び  ／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列と比較することによって評価することを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードするベクターの生成方法であって、
ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患に対してＩＬ−１０剤療法を投与した被験体から採取した１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む試料由来の核酸を配列決定すること；及び
疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチド対をコードする核酸を１つ以上の構築物にクローニングして、疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチドの一方または両方をコードするベクターを作製すること
を含み、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、可変α（Ｖα）ＴＣＲポリペプチド及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を有する疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、
ＩＬ−１０剤に先立って、またはＩＬ１０剤治療中のより早い時点で、前記ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料よりも豊富に存在するＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドが、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記Ｖα／ＶβＴＣＲポリペプチド対を表す、方法。
【請求項３２】
前記ベクターが、前記Ｖα及びＶβＴＣＲポリペプチド対の促進された発現の、ＣＤ８＋Ｔ細胞への安定な形質移入に適している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体が、ＩＬ−１０剤治療に対して、少なくとも安定または少なくとも部分奏効を示す、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体が、ＩＬ−１０薬剤療法に対して少なくとも部分奏効を示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料を、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくともＰＤ１＋ｍｉｄのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくともＰＤ１＋ｈｉｇｈのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料を、ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料を、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ３アゴニストと接触させてＩＦＮγ発現を刺激することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＤ３アゴニストが抗ＣＤ３抗体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料を、ＰＤ１＋、ＩＦＮγ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、及び／またはパーフォリン＋であるＣＤ８＋Ｔ細胞について富化する、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記一人以上の患者に、前記被験体が含まれる、請求項３１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記被験体が腫瘍を有し、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍抗原に特異的である、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記被験体が腫瘍を有し、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍浸潤性リンパ球である、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍が、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）、または造血系、脾臓、もしくは胸腺の癌から選択されるがんの腫瘍である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記腫瘍が、食道、咽頭、胃、小腸、大腸、結腸、または直腸の癌の腫瘍である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記腫瘍が、メラノーマ、結腸直腸癌、または腎臓癌である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体がウイルス感染を有し、
前記ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞が、前記感染性ウイルスの抗原に特異的である、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルスが、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＩＬ−１０剤がヒトＩＬ−１０である、請求項３１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＩＬ−１０剤がペグ化ＩＬ−１０である、請求項３１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、ＩＬ−１０の少なくとも１つのモノマーのＮ末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０が、モノペグ化ＩＬ−１０及びジペグ化ＩＬ−１０の混合物を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＰＥＧ−ＩＬ−１０の前記ＰＥＧ成分が、５ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を有する、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩＬ−１０剤を、前記被験体に皮下投与する、請求項３１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記被験体がヒト被験体である、請求項３１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲの複数のＶα／ＶβＴＣＲペアの前記Ｖα及びＶβＴＣＲポリペプチドをコードする複数の核酸を複数のベクターにクローニングし、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチド対をコードする構築物のライブラリーを作製する、請求項３１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドを、同一ベクター中にクローニングする、請求項３１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドをベクターにクローニングし、それによって全長αＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び全長βＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を提供する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドをベクターにクローニングし、それによって一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴｖ）をコードする核酸を提供する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ｓｃＴｖが、Ｎ末端からＣ末端方向に、前記ＶβＴＣＲポリペプチド、リンカー、及び前記ＶαＴＣＲポリペプチドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項３１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項６０に記載の方法によって作製する核酸ベクターのライブラリー。
【請求項６７】
遺伝子改変Ｔ細胞の生成方法であって、
請求項３１〜５９のいずれか一項に記載の方法によって得られた構築物をＣＤ８＋Ｔ細胞内に導入して、疾患抗原特異的ＴＣＲの前記Ｖα及びＶβＴＣＲポリペプチド対を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を産生することを含む、生成方法。
【請求項６８】
前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドが、同一または異なる発現構築物上の別個の発現カセットにコードされる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記構築物によりコードされる前記ＶαＴＣＲポリペプチドが、そのＣ末端で、定常αＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記構築物によりコードされる前記ＶβＴＣＲポリペプチドが、そのＣ末端で、β定常ＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記構築物が、ＶβＴＣＲポリペプチド及びＶαＴＣＲポリペプチドを含む一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）をコードする核酸を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記ｓｃＴｖが、Ｎ末端からＣ末端方向に、前記ＶβＴＣＲポリペプチド、リンカー、及び前記ＶαＴＣＲポリペプチドを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法によって産生する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団。
【請求項７４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患を有する被験体の治療方法であって、
遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を前記被験体に投与すること
を含み、
前記Ｔ細胞が、前記被験体の前記疾患の抗原に特異的である疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα／ＶβペアのＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドを含む組換えＴＣＲを発現するように遺伝子改変されており；
前記投与が、前記被験体の前記疾患を治療するのに有効である、治療方法。
【請求項７５】
前記ＶαＴＣＲポリペプチドの前記ＣＤＲ及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドの前記ＣＤＲの前記アミノ酸配列を、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って同定する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドの前記アミノ酸配列を、請求項２５の方法に従って同定する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記遺伝子改変Ｔ細胞の前記ＶαＴＣＲポリペプチド及び前記ＶβＴＣＲポリペプチドが、同一または異なる発現構築物の別々の発現カセットにコードされる、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記遺伝子改変Ｔ細胞の前記ＶαＴＣＲポリペプチドが、前記構築物にコードされ、そのＣ末端で定常αＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する、請求項７４〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記遺伝子改変Ｔ細胞の前記ＶβＴＣＲポリペプチドが、前記構築物にコードされ、そのＣ末端でβ定常ＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する、請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記遺伝子改変Ｔ細胞の前記ＶβＴＣＲポリペプチド及び前記ＶαＴＣＲポリペプチドが、前記ＶβＴＣＲポリペプチド及び前記ＶαＴＣＲポリペプチドを含む一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）をコードする核酸を含む構築物にコードされる、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ｓｃＴｖが、Ｎ−末端からＣ−末端方向に、前記ＶβＴＣＲポリペプチド、リンカー、及び前記ＶαＴＣＲポリペプチドを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患ががんであり、
前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記疾患抗原特異的ＴＣＲががんの抗原に特異的である、請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記がんが固形腫瘍である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記腫瘍が、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）、または造血系、脾臓、もしくは胸腺の癌から選択されるがんの腫瘍である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記がんが、食道、咽頭、胃、小腸、大腸、結腸、または直腸の癌である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記がんが、メラノーマ、結腸直腸癌、または腎臓癌である、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患がウイルス感染であり、
前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の前記疾患抗原特異的ＴＣＲが前記ウイルスの抗原に特異的である、請求項７４〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ウイルスが、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
さらなる治療剤を投与することを含む、請求項７４〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記治療剤がＩＬ−１０剤である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患ががんであり、
前記治療剤が化学療法剤である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患がウイルス感染であり、
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記投与が、複数の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含み、
前記複数の前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が、異なる疾患抗原特異的ＴＣＲを有する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項７４〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が、前記被験体に対して自己由来である、請求項７４〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１６年１月１１日に出願された米国仮出願第６２／２７７，４４２号の優先権を主張し、前記出願はその全体を参照によって本明細書に援用する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発するためのＩＬ−１０剤の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
［序論］
サイトカインのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する作用を介して複数の免疫応答を調節する多面発現性サイトカインである。ＩＬ−１０は、活性化単球及び活性化マクロファージにおけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦの発現を阻害することによって免疫応答を抑制することができ、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生も抑制する。ＩＬ−１０は主にマクロファージで発現するが、発現は活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞及び単球においても検出されている。ＩＬ−１０は、免疫応答を抑制することに加えて、ＩＬ−２及びＩＬ−４処理した胸腺細胞の増殖を刺激し、Ｂ細胞の生存率を高め、ＭＨＣクラスＩＩの発現を刺激することを含む免疫刺激特性を示す。
【０００４】
ヒトＩＬ−１０はホモダイマーであり、２つのモノマーサブユニット間の非共有結合相互作用の破壊によって生物学的に不活性になる。公開されたＩＬ−１０の結晶構造から得られたデータは、この機能性二量体がＩＦＮ−γに一定の類似性を示すことを示している（Ｚｄａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３：５９１−６０１）。
【０００５】
ＩＬ−１０は、古典的に、免疫抑制性サイトカインとして定義されている（ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９１．１７４（５）：ｐ．１２０９−２０；ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９１．１７４（４）：ｐ．９１５−２４）。最近の証拠は、このサイトカインのペグ化形態が免疫腫瘍学に関して免疫刺激効果を発揮することを明らかに示している（Ｅｍｍｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１２．７２（１４）：ｐ．３５７０−８１；Ｍｕｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１１．２０（６）：ｐ．７８１−９６）。この抗腫瘍効果の特異的機序には、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び内在性ＩＦＮγの両方が必要であることが示されている（Ｍｕｍｍら、上記）。具体的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＩＬ−１０／ＰＥＧ−ＩＬ−１０に曝露することにより、ＩＦＮγ、グランザイムＢ及びパーフォリン分泌の増強がもたらされる。ＩＦＮγ及びグランザイムＢの両方の分泌は、Ｔ細胞受容体と、同族のＭＨＣ  Ｉ／抗原複合体との会合に依存する（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ，２０１５，３５（１２）：９４８−９５５）。
【０００６】
その多面発現活性の結果として、ＩＬ−１０は、炎症症状、免疫関連障害、線維性障害、代謝障害及びがんを含む広範囲の疾患、障害及び病態に関連している。多くのそのような疾患、障害及び病態に対するＩＬ−１０による臨床及び前臨床評価は、その治療可能性を確固たるものにしている。
【０００７】
ＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０（ＡＭ００１０）単独療法によるヒトがん患者の治療は、グランザイムＢ＋腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の実質的な増加を特徴とする実質的な抗腫瘍応答をもたらす。この活性化ＣＤ８＋腫瘍内Ｔ細胞浸潤に付随して、血清サイトカインであるＩＦＮγ、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ及び活性化Ｔ細胞マーカーＦａｓＬにおいても増加が再現される（Ｉｎｆａｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＣＯ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２０１５．３３（１５＿ｓｕｐｐｌ）：ｐ．３０１７）。これらのサイトカインは、広域免疫活性化の特徴である。
【０００８】
［概要］
本開示は、疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現する単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにそのような疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＶα及びＶβポリペプチド対をコードする核酸に関連する方法及び組成物を提供する。そのような疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１０剤による治療を受け入れ可能な疾患を有する被験体の末梢（例えば、血液）から得ることができる。本開示はまた、単離された疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の被験体への投与に関連する治療方法及び組成物、ならびに疾患抗原特異的ＴＣＲ及び／またはキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変したＣＤ８＋Ｔ細胞に関連する治療方法及び組成物を企図する。
【０００９】
本明細書では、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドの同定方法を提供し、当該方法は：ＩＬ−１０剤治療を受け入れ可能な疾患を有する被験体にＩＬ−１０剤を投与すること；前記被験体から採取した１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する試料由来の核酸を配列決定すること；ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量を、ＩＬ−１０剤療法に先立ってまたはＩＬ１０剤療法中のより早い時点においてＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料中のＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量と比較することを含み；ここで、前記配列決定は、可変α（Ｖα）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定することを含み、試料中に参照試料よりも多量に存在するＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドは、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的なＶα／ＶβＴＣＲポリペプチド対であることを表す。
【００１０】
本明細書では、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードするベクターの生成方法も提供し、当該方法は：ＩＬ−１０剤治療を受け入れ可能な疾患に対してＩＬ−１０剤治療を施した被験体から採取した１つ以上のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する試料由来の核酸を配列決定することを含み、ここで、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞は、可変α（Ｖα）ＴＣＲポリペプチド及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を含む疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し；方法はまた、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチド対をコードする核酸を１つ以上の構築物にクローニングして、疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチドの一方または両方をコードするベクターを作製することを含み、ここで、ＩＬ−１０剤療法に先立ってまたはＩＬ１０剤療法中のより早い時点においてＩＬ−１０剤治療を受け入れ可能な疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料よりも多量に試料中に存在するＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドは、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に特異的なＶα／ＶβＴＣＲポリペプチド対であることを表す。
【００１１】
任意の実施形態において、被験体は、ＩＬ−１０剤治療に対し、少なくとも安定（stable disease）または少なくとも部分奏効を示し得る。いくつかの実施形態では、被験体は、ＩＬ−１０剤療法に対する少なくとも部分奏効を示す。
【００１２】
任意の実施形態において、試料を、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、少なくともＰＤ１＋ｍｉｄのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する。いくつかの実施形態では、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、少なくともＰＤ１＋ｈｉｇｈのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する。
【００１３】
任意の実施形態において、試料を、ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化してもよい。任意の実施形態において、試料を、ＩＦＮγ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化してもよい。いくつかの実施形態では、試料を、ＩＦＮγ＋，ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化する。いくつかの実施形態では、試料を、ＩＦＮγ＋ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化する。いくつかの実施形態では、試料を、ＰＤ１＋，ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化する。いくつかの実施形態では、試料を、ＩＦＮγ＋ＣＤ４５ＲＯ＋，ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞で富化する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ３アゴニストと接触させてＩＦＮ□□発現を刺激することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。
【００１４】
任意の実施形態において、試料は、末梢血、リンパ、または被験体の腫瘍由来であってもよい。
【００１５】
任意の実施形態において、試料を、ＰＤ１＋、ＩＦＮγ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、及び／またはパーフォリン＋であるＣＤ８＋Ｔ細胞で富化してもよい。
【００１６】
任意の実施形態において、１人以上の患者は被験体を含み得る。いくつかの実施形態では、１人以上の患者が被験体である。
【００１７】
任意の実施形態において、方法は、ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定すること；ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドの少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を決定すること；及び、ＶαＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の存在量及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の存在量を、ＩＬ−１０剤療法に先立って、またはＩＬ１０剤療法中のより早い時点において、ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料中のＶαＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の存在量及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の存在量と比較することを含み得る。
【００１８】
任意の実施形態において、本方法は、上記のように、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドのいずれか一つの同定方法の実施形態に従って単離するＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲの抗原特異性を、Ｖα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列と、参照試料のＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列とを比較することによって評価することを含み得る。
【００１９】
本明細書では、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアミノ酸配列の取得方法も提供し、本方法は、インターロイキン（ＩＬ）−１０剤を、ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患を有する被験体に投与することを含んでもよく、ここで、前記投与は、被験体において少なくとも部分奏効を提供するのに有効であり；本方法はまた、ＩＬ−１０剤療法に対して少なくとも部分奏効を有する被験体から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を取得し；ＰＢＬからＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し；可変α（Ｖα）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定することを含んでもよく、ここで、ＶαＴＣＲポリペプチド及びβＴＣＲポリペプチドは、単離されたＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面に発現するＴＣＲのＶα／ＶβＴＣＲペアであり；ならびに本方法はまた、配列決定した核酸によってコードされるＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を決定することを含んでもよく、ここでＶα及びＶβＴＣＲポリペプチドは、疾患の抗原に特異的なＶα／ＶβＴＣＲポリペプチド対を表す。
【００２０】
本明細書において、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードするベクターの作製方法も提供し、本方法は：ＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患に対するＩＬ−１０剤療法に対して少なくとも部分奏効を示す被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを含み、ここで、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドを有する疾患抗原特異的ＴＣＲを発現し；ならびに、本方法は、単離されたＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチド対をコードする核酸を１つ以上の構築物にクローニングして、疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチドの一方または両方をコードするベクターを生成することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｖα及びＶβＴＣＲポリペプチド対の促進された発現をＣＤ８＋Ｔ細胞に安定導入するのに適している。いくつかの実施形態では、ＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドを、同じベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、全長αＴＣＲポリペプチドをコードし、全長βＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を提供するように、ＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドをベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴｖ）をコードする核酸を提供するように、ＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドをベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、ｓｃＴｖは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶβＴＣＲポリペプチド、リンカー、及びＶαＴＣＲポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単離されたＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲの複数のＶα／ＶβＴＣＲペアのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチドをコードする複数の核酸を複数のベクターにクローニングして、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチド対をコードする構築物のライブラリーを作製する。本明細書に記載するように作製した核酸ベクターのライブラリーもまた、提供する。
【００２１】
任意の実施形態において、単離とは、ＩＦＮγ＋，ＣＤ４５ＲＯ＋，ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＢＬまたは単離されたＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ３アゴニストと接触させてＩＦＮγ発現を刺激することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。
【００２２】
任意の実施形態において、単離とは、ＣＤ４５ＲＯ＋，ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することを含み得る。
【００２３】
任意の実施形態において、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、少なくともＰＤ１＋ｍｉｄのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、少なくともＰＤ１＋ｈｉｇｈのレベルで細胞表面ＰＤ１を発現する。
【００２４】
任意の実施形態において、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＣＤ４５ＲＯ、グランザイムＢ、及びパーフォリンのうちの１つ以上を発現し得る。
【００２５】
任意の実施形態において、被験体は腫瘍を有する場合があり、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍浸潤性リンパ球であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管、腎臓、腎臓細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の癌、または造血系、脾臓、もしくは胸腺の癌から選択されるがんの腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、食道、咽頭、胃、小腸、大腸、結腸、または直腸の癌の腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、メラノーマ、結腸直腸癌、または腎臓癌である。
【００２６】
任意の実施形態において、被験体はウイルス感染を有する場合があり、ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞は感染ウイルスの抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【００２７】
任意の実施形態において、ＩＬ−１０剤は、ヒトＩＬ−１０であってもよい。
【００２８】
任意の実施形態において、ＩＬ−１０剤は、ペグ化ＩＬ−１０（ＰＥＧ−ＩＬ−１０）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０の少なくとも１つの単量体のＮ末端アミノ酸残基に共有結合した少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、モノＰＥＧ化ＩＬ−１０及びジＰＥＧ化ＩＬ−１０の混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０のＰＥＧ成分は、５ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量を有する。
【００２９】
任意の実施形態において、ＩＬ−１０剤を被験体に皮下投与してもよい。
【００３０】
任意の実施形態において、被験体はヒト被験体であってもよい。
【００３１】
任意の実施形態において、本方法は：ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定し；ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を分析して、ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドの相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定することを含み得る。
【００３２】
任意の実施形態において、本方法は：Ｖα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を、ＩＬ−１０剤を投与する前に疾患組織に存在するＴ細胞上に発現するＴＣＲのＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列と比較することによって、単離されたＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲの抗原特異性を評価することを含み得る。
【００３３】
本明細書ではまた、遺伝子改変Ｔ細胞の作製方法を提供し、本方法は、上記のように、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲの可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードするベクターの生成方法の任意の実施形態によって得られる構築物をＣＤ８＋Ｔ細胞に導入して、疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及びＶβＴＣＲポリペプチド対を発現する遺伝子改変Ｔ細胞を産生することを含む。いくつかの実施形態では、ＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドは、同じまたは異なる発現構築物上の別々の発現カセットにコードされる。いくつかの実施形態では、構築物によってコードされるＶαＴＣＲポリペプチドは、そのＣ末端で、α定常ＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、構築物によってコードされるＶβＴＣＲポリペプチドは、そのＣ末端でβ定常ＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、構築物は、ＶβＴＣＲポリペプチド及びＶαＴＣＲポリペプチドを含む一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＴｖは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶβＴＣＲポリペプチド、リンカー、及びＶαＴＣＲポリペプチドを含む。本明細書に記載の方法によって産生する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団もまた提供する。
【００３４】
本明細書ではまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患を有する被験体の治療方法も提供し、本方法は：遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を被験体に投与することを含み、前記Ｔ細胞は、被験体の疾患の抗原に特異的な疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα／Ｖβ対のＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドを有する組換えＴＣＲを発現するように遺伝子改変されており；前記投与は被験体の疾患の治療に有効である。いくつかの実施形態では、ＶαＴＣＲポリペプチドのＣＤＲ及びＶβＴＣＲポリペプチドのＣＤＲのアミノ酸配列は、上記のように、疾患抗原特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアミノ酸配列の取得方法の任意の実施形態に従って同定した。いくつかの実施形態では、ＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列は、ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定し；ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；ならびに、ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を分析して、ＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドの相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定することを含む方法に従って同定した。
【００３５】
任意の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞のＶαＴＣＲポリペプチド及びＶβＴＣＲポリペプチドは、同じかまたは異なる発現構築物の別々の発現カセットにコードされ得る。いくつかの実施形態では、構築物にコードされる遺伝子改変Ｔ細胞のＶαＴＣＲポリペプチドは、そのＣ末端でα定常ＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、構築物にコードされる遺伝子改変Ｔ細胞のＶβＴＣＲポリペプチドは、そのＣ末端でβ定常ＴＣＲポリペプチドに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞のＶβＴＣＲポリペプチド及びＶαＴＣＲポリペプチドは、ＶβＴＣＲポリペプチド及びＶαＴＣＲポリペプチドを含む一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）をコードする核酸を含む構築物によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｓｃＴｖは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶβＴＣＲポリペプチド、リンカー、及びＶαＴＣＲポリペプチドを含む。
【００３６】
任意の実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患はがんであってもよく、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲは、がんの抗原に特異的であってもよい。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管、腎臓、腎臓細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の癌、または造血系、脾臓もしくは胸腺の癌である。いくつかの実施形態では、がんは、食道、咽頭、胃、小腸、大腸、結腸、または直腸の癌である。いくつかの実施形態では、がんは、メラノーマ、結腸直腸癌、または腎臓癌である。
【００３７】
任意の実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患はウイルス感染であってもよく、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲはウイルスの抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【００３８】
任意の実施形態において、本方法は、さらなる治療剤を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、治療剤はＩＬ−１０剤である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患はがんであり、治療剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患はウイルス感染であり、治療剤は抗ウイルス剤である。
【００３９】
任意の実施形態において、投与は、複数の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを含み、ここで、複数の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞には、異なる疾患抗原特異的ＴＣＲを保有する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、被験体に対して自己由来である。
【００４０】
他の実施形態は、本開示の教示に基づいて当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】パネルＡ〜Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した場合のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞機能（パネルＡ〜Ｂ）及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞機能（パネルＣ〜Ｄ）に対するＩＬ−１０の効果を示す。
【図２】腫瘍抗原特異的腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞（腫瘍浸潤性リンパ球、または「ＴＩＬ」とも呼ばれる）に対する、６日間（パネルＡ）、１０日間（パネル  Ｂ）、または１５日間（パネルＣ）の、腫瘍保有マウスの治療効果を示す。
【図３】ＰＤ１陽性であるＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の割合に対する腫瘍保有マウスの長期ＩＬ−１０治療（２１〜２８日）の効果を示す。
【図４】ＩＬ−１０単独療法に部分奏功を示したメラノーマ患者の末梢から採取したＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上（パネルＡ）、及びＩＬ−１０単独療法に部分奏効を示したＲＣＣ患者の末梢から採取したＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上（パネルＢ）のＣＤ４５ＲＯの発現を図示する。
【図５】指示されたＡＭ００１０の一日量を投与した後の患者の腫瘍縮小効果、及びがん患者の末梢血における増大及び収縮したＴ細胞クローンの相対的数を示す。治療後の括弧内に示す日に、患者の腫瘍縮小効果を分析した。治療後の、示した日に存在するＴ細胞クローンを、ＡＭ００１０を投与する前の１日目の前と比較することによって分析した。Ｍｅｌ＝メラノーマ；ＣＲＣ＝結腸直腸癌；ＲＣＣ＝腎細胞癌；ＰＤ＝進行；ＳＤ＝安定；ＰＲ＝部分奏効。「抗ＰＤ１  ｍＡｂ」＝抗ＰＤ１モノクローナル抗体。
【図６】ＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０単剤療法の後に進行性疾患を示した（パネルＡ）か、または少なくとも部分奏効を示した（パネルＢ）腎細胞癌患者における末梢Ｔ細胞の評価結果を示す。
【図７】ＩＬ−１０剤で治療した被験体から採取したＰＤ１＋，ＣＤ８＋疾患抗原特異的Ｔ細胞の製造の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
［詳細な説明］
本開示をさらに説明する前に、本開示は本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものでないことは理解されたく、また、本明細書中で使用する用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、これに限定することを意図するものでないことも理解されたい。
【００４３】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間で、明示的に別段の定めがない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値と、その記載する範囲内の任意の他の指定値、または介在値は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含むことができ、記載する範囲内の特定の除外される境界を条件として、本発明に包含される。記載する範囲が境界の一方または両方を含む場合、その含まれる境界の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。請求項は任意の要素を排除するように作成し得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の詳述に関連して、そのような排他的な用語、例えば「専ら」、「単なる」などを使用するための、または「否定的な」制限を使用するための前提として用いられることを意図している。
【００４５】
本明細書中に記載する刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。さらに、提示する公開日は、実際に公開された日付とは異なる場合があり、個別に確認する必要がある場合がある。
【００４６】
［概要］
ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法などの遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞による治療は、例えばがん関連（例えばＢ細胞及びＴ細胞リンパ腫）ならびに免疫関連悪性腫瘍の治療のための治療的アプローチである。ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞には、一般的に、例えば関心対象の腫瘍上に存在する既知の抗原に特異的な組換えＴ細胞受容体を発現するように遺伝子改変した患者由来記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。本開示は、がんの治療のためにＣＡＲ−Ｔ細胞療法を用いることに関連して一般的に記載しているが、そのような療法はまた、他の適応症、例えばウイルス感染（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ）の治療にも利用できることを理解されたい。
【００４７】
ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法の開発における１つの課題は、遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲの所望の抗原特異性を提供するための、ＣＡＲ−Ｔポリペプチドに用いるＶα／ＶβＴＣＲペアの適切な可変α（Ｖα）及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドの同定である。
【００４８】
本明細書中に記載するように、ＰＥＧ−ＩＬ−１０によるがん患者の治療により、腫瘍抗原特異的ＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の末梢血における蓄積が生じる。この現象は、グランザイムＢ＋，ＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の増加に付随して起こる。ＰＥＧ−ＩＬ−１０によるがん患者の治療により、細胞傷害性腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積が生じる。この集団のうち、ＰＤ１＋ｍｉｄ〜ＰＤ１＋ｈｉｇｈ  末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原及び特異的抗原を認識するユニークなαβＴＣＲ配列を表す。ＰＥＧ−ＩＬ−１０による治療に応答してがん患者から単離されたこれらの細胞は、腫瘍（例えば固形腫瘍）に対して、マウス腫瘍モデルからのモデル化では達成し得ない高親和性成熟選択ＴＣＲ配列を提供する。同じ腫瘍徴候及び同じＭＨＣハプロタイプにおけるＰＥＧ−ＩＬ−１０による治療（単剤療法として、または免疫チェックポイント療法及び／または化学療法との併用で）によって生成する配列を調べることにより、現時点では未知の腫瘍抗原に特異的で、生産的な抗腫瘍免疫応答を誘発可能なＶα／ＶβＴＣＲペアが得られるであろう。
【００４９】
本開示は、ＩＬ−１０剤による治療後の患者由来の疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成及び単離方法、ならびにそのような疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲのＶα／ＶβＴＣＲペアの、可変α（Ｖα）及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチド、及び／または可変α（Ｖα）及び可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドのＣＤＲのアミノ酸配列の同定方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ１＋でもある末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞である。コード核酸及び／またはそこから得られる情報は、そのようなＶα／ＶβＴＣＲペアをコードする個々の構築物及び／または構築物のライブラリーを作製するために用いることができる。そのような核酸及び／またはそれらから得られる情報を用いて、そのようなＶα／ＶβＴＣＲポリペプチド対（またはそのようなＶα／ＶβＴＣＲポリペプチドの少なくともＣＤＲ）を含む組換えＴＣＲを発現する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を産生することができ、ここで、組換えＴＣＲは、例えばリンカーを介してＶαポリペプチドに作動可能に連結したＶβポリペプチドを含む単鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴｖ）を含むＣＡＲ−Ｔであり得る。本開示はさらに、がん患者及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な疾患を有する患者、例えば慢性的なウイルス感染患者（例えば、ＨＢＶ感染患者）の治療方法を企図する。
【００５０】
［定義］
他に特段の指示がない限り、以下の用語は以下に示す意味を有することを意図するものとする。他の用語は、本明細書中の別の箇所において定義される。
【００５１】
用語「患者」または「被験体」は、同じ意味で用いられ、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳類）を指す。
【００５２】
用語「投与」、「投与する」などは、それらを、例えば、被験体、細胞、組織、器官、または生物学的液体に対して用いる場合、例えばＩＬ−１０もしくはＰＥＧ−ＩＬ−１０）、核酸（例えば、天然ヒトＩＬ−１０をコードする核酸）；上記のものを含む医薬組成物、または、被験体、細胞、組織、器官、もしくは生物学的液体に対する診断薬の接触を指す。細胞との関連で、投与は、細胞に対する試薬の接触（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの）、ならびに細胞と接触している流体への試薬の接触を含む。
【００５３】
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、診断、観察などがなされている疾患、障害もしくは病態、またはその徴候の後に開始する一連の行為（ＩＬ−１０またはＩＬ−１０を含む医薬組成物の投与など）を指し、被験体が患っている疾患、障害もしくは病態の根本原因の少なくとも１つ、または被験体が患っている疾患、障害、病態に関連する症状の少なくとも１つを、一時的にもしくは永久に、排除、低減、抑制、緩和もしくは改善する。したがって、治療には、活動性疾患を阻害すること（例えば、疾患、障害または病態の発症もしくはさらなる進展、またはその臨床症状との連関を阻止すること）が含まれる。これらの用語は、ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０が、他の状況、例えば、液相またはコロイド相においてＩＬ−１０受容体と接触する状況下でも使用され得る。
【００５４】
本明細書中で使用する用語「治療を必要とする」とは、医師または他の介護者によってなされる、被験体が治療を必要とするか、または治療から恩恵を受けるであろうとの判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づいてなされる。
【００５５】
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」などは、一般的に、特定の疾患、障害または病態にかかりやすい被験体に関して、被験体の疾患、障害、病態などの発症リスクを、一時的にまたは永続的に、予防、抑制、阻害または軽減する（例えば、臨床症状がないことによって判定する）か、またはその発症を遅らせるために、ある様式で（例えば、疾患、障害、病態またはその症状の発症前に）開始する一連の行為（例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−１０を含む医薬組成物の投与）を指す。場合により、本用語はまた、疾患、障害または病態の、有害な病態または望ましくない病態への進行を遅らせるか、またはその進行を抑制することを指す。
【００５６】
本明細書中で使用する用語「予防を必要とする」とは、医師または他の介護者によってなされる、被験体が予防的ケアを必要とするか、または予防的ケアから恩恵を受けるであろうとの判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づいてなされる。
【００５７】
語句「治療有効量」とは、単独または医薬組成物の一部として、単回用量または連続用量のいずれかで、被験体に投与する場合に、疾患、障害または病態の任意の症状、態様、または特徴に対して任意の検出可能な、プラスの効果を有し得る量で、被験体に薬剤を投与することを指す。治療有効量は、関連する生理学的効果を測定することによって確認することができ、投与レジメン及び被験体の病態の診断分析などに関連して調整することができる。例えば、投与後に産生される炎症性サイトカインの量の測定値を、治療有効量が使用されたかどうかの指標とすることができる。
【００５８】
語句「変化を起こすのに十分な量で」とは、特定の治療の投与前（例えば、ベースラインレベル）及び投与後に測定する指標のレベルの間に検出可能な差があることを意味する。指標は、任意の客観的パラメータ（例えば、ＩＬ−１０の血清濃度）または主観的パラメータ（例えば、被験体の幸福感）を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態における本開示は、フローサイトメトリーを用いたマーカー、例えば、細胞表面マーカーの発現の分析を含む。マーカー特異的試薬（例えば、蛍光標識抗体）による染色後の、フローサイトメトリーによって評価する検出可能な標識（例えば、蛍光）の相対強度に基づいて、細胞を「陽性」または「陰性」として分類することができる。一般的に、二峰性に分布するマーカー、例えばＣＤ８、ＰＤ１、ＩＦＮγ、ＣＤ４５ＲＯ、グランザイムＢ、パーフォリンなどの染色において容易に識別できる差異に基づくそれらの発現レベルに従って細胞を区別する。いくつかの実施形態では、すべての細胞について、マーカー染色の頻度分布が得られ、集団曲線を、より高い染色及びより低い染色集団にフィッティングし、それぞれの集団分布の統計分析の観点から最も統計的に属する可能性の高い集団に細胞を割り当てる。いくつかの実施形態では、マーカー染色の頻度分布はすべての細胞について得られ、集団曲線を、より高い染色、中間レベルの染色、及びより低い染色集団にフィッティングし、それぞれの集団分布の統計分析の観点から最も統計的に属する可能性の高い「高」、「中」、及び／または「低」集団に細胞を割り当てる。Ｔ細胞を＋及び−カテゴリー、ならびに「高」、「中」及び／または「低」カテゴリーにに分離する方法は、当業者に公知である。
【００６０】
したがって、例えば、本開示は、Ｔ細胞上のＰＤ１発現の分析を企図する。Ｔ細胞は、ＰＤ１（ＣＤ２７９としても知られる）細胞表面発現の実質的に二峰性の分布を示し、ここで、ＰＤ１細胞表面発現のより高いピーク周辺の細胞を、「ＰＤ１ｈｉｇｈ」（または「ＰＤ１＋」）として分類してもよく、ＰＤ１細胞表面発現のより低いピーク周辺の細胞を、「ＰＤ１ｌｏｗ」（または「ＰＤ１−」）として分類してもよい。活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣＤ８＋Ｔ細胞の集団はまた、ＰＤ１ｈｉｇｈ細胞とＰＤ１ｌｏｗ細胞との間に細胞の中間集団（「ＰＤ１ｍｉｄ」）を含む場合があり、ここで、ＰＤ１ｍｉｄ細胞は、ＰＤ１ｌｏｗ細胞より高いがＰＤ１ｈｉｇｈ細胞より低いレベルのＰＤ１細胞表面発現を有する。したがって、関心対象の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ１の中間（「ｍｉｄ」）〜高レベルの細胞表面発現（「ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ」）を有し得る。言い換えれば、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面上に低いＰＤ１発現を有さない（すなわち、「ＰＤ１ｌｏｗ」ではない）ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団であり得る。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、「ＰＤ１ｍｉｄ」は、細胞集団中のＰＤ１発現の最低レベル（「ＰＤ１ｌｏｗ」）の少なくとも約１００〜１５０倍であり、細胞集団中のＰＤ１発現の最高レベル（「ＰＤ１ｈｉｇｈ」）の約１／３未満であるようなＰＤ１の細胞表面発現レベルを指し、ここで、細胞表面ＰＤ１発現はフローサイトメトリーによって検出する。例えば、「ＰＤ１  ｍｉｄ」細胞は、およそ３０００のフローサイトメトリーによる平均チャネル蛍光検出をもたらす細胞表面ＰＤ１のレベルを発現する場合があり、一方、低いＰＤ１発現（「ＰＤ１ｌｏｗ」）は、およそ２００の平均チャネル蛍光検出で表され、高いＰＤ１発現（「ＰＤ１ｈｉｇｈ」）は、およそ９０００の平均チャネル蛍光検出で表される。「ＰＤ１ｌｏｗ」細胞は、ＰＤ１＋またはＰＤ１のいずれかとして細胞を特徴付ける場合、「ＰＤ１ｌｏｗ」はＰＤ１陰性（「ＰＤ１−」）であるとみなされることに留意すべきである。
【００６２】
用語「小分子」とは、約１０ｋＤａ未満、約２ｋＤａ未満、または約１ｋＤａ未満の分子量を有する化合物を指す。小分子は、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、及び合成分子を含むが、これらに限定されない。治療的には、小分子は細胞に対してより透過性であり、分解の影響を受けにくく、大分子よりも免疫応答を誘発しにくい。
【００６３】
用語「リガンド」とは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる分子またはその複合体を指す。用語「リガンド」は、天然及び合成リガンド、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、ムテイン、ならびに抗体由来の結合組成物を包含する。用語「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣物及び抗体のペプチド模倣物も包含する。本用語はまた、アゴニストでもアンタゴニストでもないが、その生物学的特性、例えばシグナル伝達または接着に有意に影響を及ぼすことなく受容体に結合することができる薬剤を包含する。用語「リガンド」はまた、例えば、化学的方法または組換え方法によって、膜結合リガンドの可溶性バージョンに変更された膜結合リガンドも含む。受容体は細胞内に存在することができ、すなわち細胞質、核、またはその他の細胞内区画に存在するか、または会合し、細胞膜を潜在的に横断し、さらに細胞膜の細胞内表面にリガンド結合部位を有することができる。リガンドと受容体との複合体は、「リガンド−受容体複合体」と呼ばれる。
【００６４】
用語「阻害剤」及び「アンタゴニスト」、または「アクチベーター」及び「アゴニスト」とは、それぞれ阻害分子または活性化分子、例えばリガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織、または器官を指す。阻害剤は、生体分子、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞の活性を、低減、遮断、抑止、遅延活性化、不活性化、脱感作、または下方制御する分子である。アクチベーターは、生体分子、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞の活性を増加、活性化、促進、活性化の増強、感作、または上方制御する分子である。阻害剤はまた、構成的活性を、低減、抑止、または不活性化する分子として定義され得る。「アゴニスト」は、標的と相互作用して標的の活性の増加を引き起こすか、または促進する分子である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用（複数可）に対抗する分子である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を抑止、低減、阻害、または中和し、アンタゴニストはまた、同定したアゴニストが存在しない場合でさえ、標的（例えば、標的受容体）の構成的活性を、抑止、阻害、または低減することができる。
【００６５】
用語「調節する」、「調節」などは、単独で、または他の因子と組み合わせて、他の生体分子の機能または活性を、直接的または間接的に、調節、増加または減少させる分子の能力を指す。用語「モジュレーター」は、上記の活性を調節可能な分子を広く指すことを意味する。例えば、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞のモジュレーターは、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞の活性を変化させる分子であり、活性を、活性化、阻害するか、またはその調節特性を変化させることができる。モジュレーターは単独で作用可能であるか、または補因子、例えばタンパク質、金属イオン、または小分子を使用することができる。
【００６６】
分子の「活性」とは、例えば：（ａ）リガンドまたは受容体への分子の結合；（ｂ）その受容体に結合した場合の触媒活性へのリガンドの応答レベル；（ｃ）遺伝子発現または細胞シグナル伝達、分化または成熟を刺激する能力；（ｄ）抗原活性；及び／または（ｅ）他の分子の活性の調節を説明するものであるか、またはそれらを指し得る。本用語はまた、細胞間相互作用（例えば、接着）を調節または維持する活性、または細胞の構造（例えば、細胞膜）を維持する活性を指し得る。「活性」はまた、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などの比活性を意味し得る。用語「増殖活性」は、例えば細胞分裂を、促進するか、それに必要であるか、またはそれに特異的に関連する活性を包含する。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、「同等」、「同等の活性」、「〜と同等の活性」、「同等の効果」、「〜と同等の効果」、「同様の」及び「実質的に同様の」は、定量的及び／または定性的に観ることが可能な比較用語である。本用語の意味は、多くの場合、それらを使用する文脈に依存する。一例として、受容体を活性化する２つの薬剤は、定性的観点からは同等の効果を有すると見なすことができるが、一方の薬剤が、当技術分野で一般に受け入れられているアッセイ（例えば、用量反応アッセイ）または当技術分野で一般に受け入れられている動物モデルにおいて測定する他の薬剤の活性の２０％を達成可能であるに過ぎない場合に、２つの薬剤は、定量的な観点からは同等の効果がないと見なすことができる。１つの結果を別の結果と比較する（例えば、１つの結果を参照標準と比較する）場合、「同等の」とは、多くの場合、１つの結果が参照標準から、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満ずれていることを意味する。特定の実施形態では、１つの結果が参照標準から、１５％未満、１０％未満、または５％未満ずれている場合に、参照標準と同等である。一例として、限定するものではないが、活性または効果は、有効性、安定性、溶解性、または免疫原性を意味し得る。
【００６８】
例えば、細胞、組織、器官、または生物の用語「応答」は、例えば、生物学的区画内の濃度、密度、接着、または移動などの生化学的挙動または生理学的挙動の変化、遺伝子の発現速度、または分化の状態を包含し、ここで、その変化は、活性化、刺激、もしくは治療、または遺伝的プログラミングのような内部機構と相関する。特定の状況において、用語「活性化」、「刺激」などは、内部機構、ならびに外部または環境因子によって調節される細胞活性化を指し；一方、用語「阻害」、「下方制御」などは、反対の効果を指す。
【００６９】
本明細書中において同じ意味で用いられる用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。ポリペプチドは、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸、及び修飾されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。ポリペプチドの例として、限定するものではないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含む融合タンパク質；異種及び同種のリーダー配列を有する融合タンパク質；Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有さない融合タンパク質；免疫学的に標識されたタンパク質との融合タンパク質；などが挙げられる。
【００７０】
本開示を通して、一文字または三文字コードに従って遺伝的にコード化されたＬ−アミノ酸が参照されることが理解されよう。読者の便宜のために、以下の１文字及び３文字のアミノ酸コードを提供する：
Ｇ   グリシン     Ｇｌｙ     Ｐ             プロリン       Ｐｒｏ
Ａ   アラニン     Ａｌａ     Ｖ             バリン Ｖａｌ
Ｌ   ロイシン     Ｌｅｕ     Ｉ             イソロイシン   Ｉｌｅ
Ｍ   メチオニン   Ｍｅｔ     Ｃ             システイン     Ｃｙｓ
Ｆ   フェニルアラニ       Ｐｈｅ            Ｙ     チロシン       Ｔｙｒ
ン                           
Ｗ   トリプトファン       Ｔｒｐ            Ｈ     ヒスチジン     Ｈｉｓ
Ｋ   リジン       Ｌｙｓ     Ｒ             アルギニン     Ａｒｇ
Ｑ   グルタミン   Ｇｌｎ     Ｎ             アスパラギン   Ａｓｎ
Ｅ   グルタミン酸 Ｇｌｕ     Ｄ             アスパラギン酸 Ａｓｐ
Ｓ   セリン       Ｓｅｒ     Ｔ             スレオニン     Ｔｈｒ
【００７１】
本明細書中で使用する場合、用語「変異体」は、天然型の変異体及び非天然型の変異体を包含する。天然型の変異体には、相同体（ある種と別の種とで、アミノ酸またはヌクレオチド配列がそれぞれ異なるポリペプチド及び核酸）、及び対立遺伝子変異体（種内のある個体と別の個体とで、アミノ酸またはヌクレオチド配列がそれぞれ異なるポリペプチド及び核酸）が含まれる。非天然型の変異体には、それぞれ、アミノ酸またはヌクレオチド配列を変化させたポリペプチド及び核酸が含まれ、ここで、配列の変化は人為的に導入される（例えば、ムテイン）。例えば、変化は、実験室で人間の介入によって生成される（「人工的に」）。用語「ムテイン」とは、単一または複数のアミノ酸置換によって改変されたタンパク質を指す。ムテインは、多くの場合、部位特異的またはランダム突然変異誘発に供してクローニングした遺伝子、または完全に合成した遺伝子に由来する。
【００７２】
用語「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などは、本明細書中では同じ意味で用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体の任意の長さのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、直鎖及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが含まれる。
【００７３】
本明細書中でポリペプチドの構造に関して用いる場合、用語「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」（または「アミノ末端（ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」）及び「Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」（または「カルボキシル末端（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」）とは、それぞれ、ポリペプチドのアミノ及びカルボキシ最末端を指し、一方、用語「Ｎ末端の（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）」及び「Ｃ末端の（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）」とは、それぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に向かってのポリペプチドのアミノ酸配列における相対的な位置を指し、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端の残基を含み得る。「すぐＮ末端側の」または「すぐＣ末端側の」とは、第一及び第二のアミノ酸残基が共有結合して連続アミノ酸配列を提供する場合の、第二のアミノ酸残基に対する第一のアミノ酸残基の位置を指す。
【００７４】
ポリペプチド及び核酸に関して使用する場合、用語「由来する」とは、参照ポリペプチドまたは核酸に由来するアミノ酸またはヌクレオチド配列を含むポリペプチドまたは核酸（例えば、天然型ポリペプチドまたは核酸）を指し、参照分子の供給源にも、参照分子を改変した方法にも限定されない。一例として、用語「由来する」は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列の相同体または変異体を含む。
【００７５】
ポリペプチドまたは核酸に関して、用語「単離された」とは、天然型の場合、天然に存在し得る環境とは異なる環境にある、関心対象のポリペプチドまたは核酸を指す。「単離された」とは、関心対象のポリペプチドが実質的に富化されている、及び／または関心対象のポリペプチドが部分的または実質的に精製されている試料内のポリペプチドまたは核酸を含むことを意味する。ポリペプチドが非天然型の場合、「単離された」とは、ポリペプチドが、合成または組換えのいずれかの手段によって作製した環境から分離されていることを示す。
【００７６】
「富化された」とは、関心対象の分子が、ａ）開始時の試料中の関心対象の分子の濃度より高い濃度（例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも６４倍、またはそれ以上）で存在するように、試料を非天然に操作する（例えば、科学者によって）ことを意味する。開始時の試料は、生体試料（例えば、試料中に関心対象の分子が天然に存在するか、または投与後に関心対象の分子が存在する試料）であるか、または関心対象の分子の濃度が環境より高い由来元に由来するもの（例えば、ポリペプチドを発現する組換え細菌細胞由来のもの）であってもよい。
【００７７】
用語「実質的に純粋な」とは、関心対象の成分を含む組成物であって、関心対象の成分（例えば、ポリペプチド）が組成物の全量の約５０％超、一般的には、組成物の全量の約６０％超を構成する組成物を指す。より一般的には、「実質的に純粋な」とは、全組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上が関心対象の成分である組成物を指す。いくつかの場合には、関心対象の成分は、組成物の全量の約９０％超、または約９５％超を構成するであろう。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、用語「特異的に結合する」または「選択的に結合する」とは、リガンドとその受容体、抗体とその抗原、または他の結合対との相互作用を指す。選択的結合を使用して、異種混合物中のリガンドの存在を示し得る。したがって、指定の条件下で、リガンドはその受容体に選択的に結合すると考えられ、リガンドはその受容体に結合し、異種混合物中の他の成分には実質的に結合しない。免疫グロブリンに関して、抗原に選択的に結合する免疫グロブリンは、その抗原、またはその変異体もしくはムテインに対して、任意の他の抗原よりも少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも１００倍高い親和性で結合する。特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析による測定において、約１０９Ｌ／ｍｏｌ超の親和性を有する（Ｍｕｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．１９８０  Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０−２３９）。
【００７９】
本開示のポリペプチド及び核酸分子に関連する「ヒト」への任意の言及は、ポリペプチドまたは核酸の取得方法またはその由来元に関して限定することを意味するものではなく、むしろ、天然型のアイソフォームを含む天然型ヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応し得ることから、その配列に関してのみの言及であることに留意すべきである。
【００８０】
本明細書中で使用する「〜上に発現する」とは、通常、細胞内での、細胞部分、もしくはその前駆体の産生の結果として、細胞の表面上に存在する細胞部分（例えば、タンパク質またはその複合体）、及び細胞部分、もしくはその前駆体の、細胞膜の外表面への移行を記載するために使用され得る。
【００８１】
「プログラム細胞死タンパク質１」または「ＰＤ１」とは、リンパ球のサブセットで発現する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体を指し、ＣＤ２７９としても知られている。ヒトＰＤ１（遺伝子ＩＤ：５１３３）は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされる。
【００８２】
「ＣＤ４５ＲＯ」とは、リンパ球のサブセットで発現する受容体型タンパク質チロシンホスファターゼファミリーメンバーであるＣＤ４５のアイソフォームを指す。ＣＤ４５の他のアイソフォームには、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、及びＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）が含まれる。ＣＤ４５ＲＯは、他のアイソフォームよりも短く、ＲＡ、ＲＢ及びＲＣとして知られるＣＤ４５エクソンを欠くＣＤ４５のアイソフォームである。ヒトＣＤ４５（遺伝子ＩＤ：５７８８）は、ＰＲＰＲＣ遺伝子によってコードされる。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、「抗原特異的Ｔ細胞」及び「抗原に特異的なＴ細胞」とは、可変領域を含有するα及びβポリペプチド鎖などのＴＣＲポリペプチドの構造により、抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、その細胞表面上に発現するＴ細胞を指す。ＴＣＲが抗原に特異的であるＴ細胞は、成熟中にＴＣＲゲノム遺伝子座の組換えを受けてもよく、及び／または遺伝子改変して１つ以上のＴＣＲポリペプチドまたは改変ＴＣＲ様受容体（キメラ抗原受容体など）を発現してもよい。
【００８４】
「疾患抗原」または「疾患関連抗原」とは、免疫応答、例えば、Ｔ細胞を介した免疫応答を誘発するエピトープ（例えば、抗原性ペプチド、脂質、多糖類、核酸など）を指す。疾患が腫瘍である場合、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞上に発現するエピトープであり得る。腫瘍抗原は腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞、特に同じ系統の細胞には通常発現しない。いくつかの場合には、腫瘍抗原は、体の他の細胞で通常発現するエピトープであり得るが、非腫瘍の状況では免疫応答を誘導しない。腫瘍抗原は、免疫系が未成熟で応答できない胎児発育中に正常細胞上に一般的に発現する１つ以上のエピトープを有し得る。腫瘍抗体は、通常、正常細胞上では非常に低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上では有意に高いレベルで発現する１つ以上のエピトープを有し得る。
【００８５】
［疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の作製方法の概要］
本開示は、一実施形態では、ＩＬ−１０剤療法で治療可能な疾患を有する患者の末梢における疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導方法を提供し、本方法は、そのような疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を誘発するのに有効な量のＩＬ−１０剤を患者に投与し、患者から疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を採取する（例えば、末梢血試料などの患者の組織試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞）。したがって、本開示は、ＩＬ−１０剤、ＩＬ−１０剤の製造方法、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生及びＩＬ−１０剤療法のための投薬レジメン、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生方法、そのようなＴ細胞のＴＣＲの分析、ＴＣＲα及びβ配列及び核酸のライブラリーの作製、そのようなＴ細胞のＴＣＲの抗原特異性の分析、そのようなＴ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲのＴＣＲα及びβ配列を有する組換えＴＣＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）の産生、遺伝子改変Ｔ細胞組成物、ならびにそれらの製造方法及び治療における使用法、ならびに医薬組成物及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ１＋でもある末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞である。これらの本開示の特徴を以下に説明する。
【００８６】
［ＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）］
ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られる抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４（Ｍｄａ−７）、及びＩＬ−２６、インターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−γ、−δ、−ε、−κ、−Ω、及び−τ）ならびにインターフェロン様分子（リミチン、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９）を含むサイトカインのセットであるタイプ（クラス）−２サイトカインに分類される。
【００８７】
ＩＬ−１０は、免疫調節及び炎症において多面的効果を有するサイトカインである。ＩＬ−１０は、肥満細胞によって産生され、これらの細胞がアレルギー反応の部位で有する炎症作用を打ち消す。ＩＬ−１０は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦなどの前炎症性サイトカインの合成を阻害することができるが、ＩＬ−１０は、Ｔ細胞及び肥満細胞に対しても刺激性であり、Ｂ細胞の成熟、増殖及び抗体産生を刺激する。ＩＬ−１０は、ＮＦ−κＢ活性を抑止することができ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の調節に関与する。ＩＬ−１０はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性及びＢ細胞の抗体産生を誘導し、マクロファージ活性及び腫瘍促進性炎症を抑制する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節は用量依存性であり、より高い用量は、より強い細胞傷害性応答を誘導する。
【００８８】
ヒトＩＬ−１０は３７ｋＤａの分子量を有するホモダイマーであり、各１８．５ｋＤａモノマーは１７８個のアミノ酸を含み、その最初の１８個はシグナルペプチドを含み、２個のシステイン残基は２個の分子内ジスルフィド結合を形成する。ＩＬ−１０二量体は、２つの単量体サブユニット間の非共有相互作用の破壊により生物学的に不活性になる。
【００８９】
本開示は、８０％の相同性を示すヒトＩＬ−１０（ＮＰ＿０００５６３）及びマウスＩＬ−１０（ＮＰ＿０３４６７８）及びその使用を意図する。さらに、本開示の範囲は、ラット（受託番号ＮＰ＿０３６９８６．２；ＧＩ１４８７４７３８２）；ウシ（受託番号ＮＰ＿７７６５１３．１；ＧＩ４１３８６７７２）；ヒツジ（受託番号ＮＰ＿００１００９３２７．１；ＧＩ５７１６４３４７）；イヌ（受託番号ＡＢＹ８６６１９．１；ＧＩ１６６２４４５９８）；及びウサギ（受託番号ＡＡＣ２３８３９．１；ＧＩ３２４２８９６）を含む他の哺乳動物種由来のＩＬ−１０オーソログ及びその修飾形態を含む。
【００９０】
用語「ＩＬ−１０」、「ＩＬ−１０ポリペプチド（複数可）」、「ＩＬ−１０分子（複数可）」、「ＩＬ−１０剤（複数可）」などは、広義に解釈することが意図され、例えば、ホモログ、変異体（ムテインを含む）、及びその断片を含むヒト及び非ヒトＩＬ−１０関連ポリペプチド、ならびに例えばリーダー配列（例えば、シグナルペプチド）、及び前記の改変バージョンを有するＩＬ−１０ポリペプチドを含む。さらなる特定の実施形態では、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０ポリペプチド（複数可）、及びＩＬ−１０剤（複数可）はアゴニストである。
【００９１】
ＩＬ−１０受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体は、α及びβサブユニットからなり、これらはそれぞれＲ１及びＲ２とも呼ばれる。受容体の活性化には、αとβの両方に結合する必要がある。ＩＬ−１０ポリペプチドの１つのホモダイマーはαに結合し、同じＩＬ−１０ポリペプチドの他のホモダイマーはβに結合する。
【００９２】
組換えヒトＩＬ−１０の有用性は、腎クリアランス、タンパク質分解及び血流中での単量体化などに起因し得るその比較的短い血清半減期によってしばしば制限される。結果として、その二量体構造を破壊せず、その活性に悪影響を及ぼすことなく、ＩＬ−１０の薬物動態特性を改善するための様々なアプローチが検討されている。ＩＬ−１０のペグ化は、特定の薬物動態パラメータ（例えば、血清半減期）の改善及び／または活性の増強をもたらす。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、用語「ペグ化ＩＬ−１０」及び「ＰＥＧ−ＩＬ−１０」とは、ＩＬ−１０タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基に、一般的にリンカーを介して共有結合し、それにより結合が安定するようにした１つ以上のポリエチレングリコール分子を有するＩＬ−１０分子を指す。用語「モノペグ化ＩＬ−１０」及び「モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、１つのポリエチレングリコール分子がＩＬ−１０二量体の１つのサブユニット上の単一アミノ酸残基に、一般的にリンカーを介して共有結合していることを示す。本明細書中で使用する場合、用語「ジペグ化ＩＬ−１０」及び「ジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子がＩＬ−１０二量体の各サブユニット上の単一残基に、一般的にリンカーを介して結合していることを示す。
【００９４】
特定の実施形態では、本開示で使用するＰＥＧ−ＩＬ−１０は、ＩＬ−１０二量体の１つのサブユニットのＮ末端のアミノ酸残基のαアミノ基に、１〜９個のＰＥＧ分子がリンカーを介して共有結合しているモノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０である。１つのＩＬ−１０サブユニット上のモノペグ化は、通常、サブユニットシャッフリングに起因する非ペグ化、モノペグ化及びジペグ化ＩＬ−１０の異種混合物を生じる。さらに、ペグ化反応を完了まで進行させることは、一般的に、非特異的かつ多ペグ化されたＩＬ−１０をもたらし、その生物活性を低下させる。したがって、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法によって生成したモノペグ化ＩＬ−１０及びジペグ化ＩＬ−１０の混合物の投与を含む。
【００９５】
特定の実施形態では、ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａである。ＩＬ−１０へのＰＥＧ結合の方法または部位は重要ではないが、特定の実施形態において、ペグ化は、ＩＬ−１０剤の活性を変化させないか、または最小限しか変化させない。特定の実施形態では、半減期の増加は、生物学的活性の任意の減少より大きい。ＰＥＧ−ＩＬ−１０の生物学的活性は、米国特許第７，０５２，６８６号に記載のように、通常、細菌抗原（リポ多糖類（ＬＰＳ））でチャレンジした被験体の血清中の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ）のレベルを評価し、ＰＥＧ−ＩＬ−１０で処置することによって測定する。
【００９６】
ＩＬ−１０変異体は、血清半減期の増加、ＩＬ−１０に対する免疫応答の低下、精製または調製の促進、ＩＬ−１０からその単量体サブユニットへの変換の低減、治療有効性の向上、及び治療使用中の副作用の重篤度または発生の軽減を含む、様々な目的を考慮して調製することができる。アミノ酸配列変異体は、天然には見出されない所定の変異体であるが、翻訳後変異体、例えばグリコシル化変異体であることもあり得る。ＩＬ−１０の任意の変異体は、それが適切なレベルのＩＬ−１０活性を保持するならば使用可能である。
【００９７】
語句「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質のアミノ酸（複数可）を、類似の酸性、塩基性、電荷、極性、または側鎖サイズを有する側鎖を含むアミノ酸で置換することによってタンパク質の活性を保存する置換を指す。保存的アミノ酸置換は、一般的に、以下の群のアミノ酸残基の置換を伴う：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；及び６）Ｄ、Ｅ。置換、挿入または欠失の指針は、異なる変異型タンパク質または異なる種由来のタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づき得る。したがって、任意の天然型ＩＬ−１０ポリペプチドに加えて、本開示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の、通常２０、１０、または５個以下のアミノ酸置換を有することを意図しており、ここで、置換は、多くの場合、保存的アミノ酸置換である。
【００９８】
本開示はまた、成熟ＩＬ−１０に由来する連続アミノ酸残基を含む成熟ＩＬ−１０の活性断片（例えば、部分配列）を企図する。ペプチドまたはポリペプチド部分配列の連続アミノ酸残基の長さは、部分配列が由来する特定の天然型アミノ酸配列に応じて様々に異なる。一般的に、ペプチド及びポリペプチドは、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６０アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸〜約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸〜全長ペプチドまたはポリペプチドであり得る。
【００９９】
さらに、ＩＬ−１０ポリペプチドは、規定の長さの連続アミノ酸（例えば、「比較ウィンドウ」）にわたって参照配列と比較して規定の配列同一性を有し得る。比較用の配列のアラインメント方法は、当該技術分野で公知である。比較用の配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメント及び目視検査によって実行可能である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  補足資料）参照）。
【０１００】
一例として、適切なＩＬ−１０ポリペプチドは、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６０アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸〜約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸〜最大で全長ペプチドまたはポリペプチドの連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１０１】
以下でさらに考察するように、ＩＬ−１０ポリペプチドは、天然源から単離することができ（例えば、天然の環境以外の環境）、また、組換えにより作製することもでき（例えば、細菌、酵母、Ｐｉｃｈｉａ、昆虫細胞などの遺伝子改変宿主細胞内で）、ここで、遺伝子改変宿主細胞は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で改変されている。ＩＬ−１０ポリペプチドはまた、合成によっても産生可能である（例えば、無細胞化学合成法によって）。
【０１０２】
ＩＬ−１０剤をコードする核酸分子は、それらの天然型及び非天然型アイソフォーム、対立遺伝子変異体及びスプライシング変異体を含む本開示によって企図される。本開示はまた、天然型ＤＮＡ配列に比べて１残基以上の塩基が様々に変化しているが、遺伝コードの縮重により、ＩＬ−１０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列になお翻訳される核酸配列も包含する。
【０１０３】
［ＩＬ−１０の産生方法］
本開示のポリペプチドは、非組換え法（例えば、化学合成法）及び組換え法を含む任意の適切な方法によって産生することができる。
【０１０４】
化学合成法
ポリペプチドを化学的に合成する場合、液相または固相を介して合成を進行させることができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、非天然アミノ酸の取り込み及び／またはペプチド／タンパク質主鎖修飾が可能になる。本開示のポリペプチドを合成するために、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの様々な形態のＳＰＰＳが利用可能である。化学合成の詳細は当技術分野で公知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．（２００６）Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０；及びＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【０１０５】
固相ペプチド合成は、以下に記載するように実施することができる。α官能基（Ｎα）及び任意の反応性側鎖を、酸不安定性基または塩基不安定性基で保護する。保護基は、アミド結合を連結する条件下では安定であるが、形成されたペプチド鎖を損なうことなく容易に開裂させることができる。αアミノ官能基のための適切な保護基として、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｂｏｃ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル、Ｆｍｏｃ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）など。
【０１０６】
適切な側鎖保護基として：アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４−メトキシ−２，３−６−トリメチルベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリル及びトリチル（Ｔｒｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
固相合成において、Ｃ末端アミノ酸を、適切な支持材料にカップリングする。適切な支持材料は、合成プロセスの段階的な縮合及び開裂反応のための試薬及び反応条件に対して不活性であり、使用する反応媒体には溶解しないものである。市販の支持材料の例として、反応性基及び／またはポリエチレングリコールで修飾したスチレン／ジビニルベンゼン共重合体；クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体；ヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体；などが挙げられる。ペプチド酸の調製が所望される場合、４−ベンジルオキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ−アンカー）または塩化２−クロロトリチルで誘導体化したポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼンまたはＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）を使用することができる。ペプチドアミドの場合には、５−（４′−アミノメチル）−３′，５′−ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ−アンカー）またはｐ−（２，４−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）を用いることができる。
【０１０８】
ポリマー支持体への結合は、Ｃ末端Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、室温または高温（例えば、４０℃〜６０℃）下、例えば２〜７２時間の反応時間で、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドンまたは類似の溶媒中への活性化試薬の添加により、支持材料と反応させることによって達成することができる。
【０１０９】
ＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーへのＮα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）のカップリングは、例えばＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または他のカルボジイミド、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）または他のウロニウム塩、Ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）または他のホスホニウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミドまたはオキシムなどのカップリング試薬の補助の下、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在下または非存在下、例えばＨＯＢｔを添加したＴＢＴＵの補助の下、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミンまたはＮ−メチルモルホリンなどの塩基の添加の存在下または非存在下、例えば、ジイソプロピルエチルアミンの存在下、２〜７２時間の反応時間で（例えば、１．５〜３倍過剰のアミノ酸及び２倍過剰のカップリング試薬で３時間、例えば、約１０℃〜５０℃の温度、例えば２５℃で、例えばジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジクロロメタンなどの溶媒中で）行うことができる。
【０１１０】
カップリング試薬の代わりに、上記の条件下で、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルなど）、Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物または酸フッ化物を使用することも可能である。
【０１１１】
Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）は、ＤＩＥＡを添加して１０〜１２０分、例えば２０分の反応時間で、ジクロロメタン中の２−クロロトリチル樹脂にカップリングさせることができるが、この溶媒及びこの塩基の使用に限定されない。
【０１１２】
保護されたアミノ酸の連続的なカップリングは、ペプチド合成における通常の方法、一般的には自動化ペプチド合成機で実施することができる。例えばジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％〜５０％）を５〜２０分間、例えばＤＭＦ中の５０％ピペリジンで２×２分間及びＤＭＦ中２０％ピペリジンで１×１５分間処理することにより、固相上の結合したアミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ保護基を切断した後、３〜１０倍過剰、例えば１０倍過剰の後続の保護されたアミノ酸を、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはこれらの２つの混合物などの不活性非極性溶媒中、約１０℃〜５０℃、例えば２５℃の温度で前方のアミノ酸にカップリングする。第一のＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸をＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーにカップリングさせるための前述の試薬は、カップリング試薬として適している。保護されたアミノ酸の活性エステル、またはその塩化物もしくはフッ化物または対称無水物も代替物として使用することができる。
【０１１３】
固相合成の終了時に、ペプチドを支持材料から切断すると同時に、側鎖保護基を切断する。切断は、５％〜２０％Ｖ／Ｖのスカベンジャー、例えば、ジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオール、フェノールまたは水、例えば１５％ｖ／ｖのジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール１：１：１を添加したトリフルオロ酢酸または他の強酸性媒体で、０．５〜３時間、例えば２時間以内に行うことができる。完全に保護された側鎖を有するペプチドは、２−クロロトリチルアンカーを氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で切断することによって得られる。保護されたペプチドは、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製することができる。ペプチドがＷａｎｇアンカーを介して固相に結合しており、Ｃ末端アルキルアミド化を有するペプチドを得ることを意図している場合、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンによるアミノ分解によって切断を行うことができる。アミノ分解は、約−１０℃〜５０℃（例えば、約２５℃）の温度、及び約１２〜２４時間（例えば、約１８時間）の反応時間で実施する。さらに、ペプチドは、例えばメタノールを用いた再エステル化により、支持体から切断することができる。
【０１１４】
得られる酸性溶液は、ペプチドを沈殿させ、エーテル中に残るスカベンジャーと切断した保護基とを分離するために、３〜２０倍量の冷エーテルまたはｎ−ヘキサン、例えば１０倍過剰のジエチルエーテルと混合することができる。氷酢酸から数回ペプチドを再沈殿させることにより、さらなる精製を行うことができる。得られる沈殿物を、水もしくはｔｅｒｔ−ブタノールまたは２つの溶媒の混合物、例えばｔｅｒｔ−ブタノール／水の１：１混合物中に溶解し、凍結乾燥することができる。
【０１１５】
得られるペプチドは、酢酸塩形態の弱塩基性樹脂上でのイオン交換；非誘導体化ポリスチレン／ジビニルベンゼン共重合体（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）上の疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲルでの吸着クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー、例えばカルボキシメチルセルロース；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５上の分配クロマトグラフィー；向流分配クロマトグラフィー；または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、オクチルまたはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相上の逆相ＨＰＬＣを含む様々なクロマトグラフィー法によって精製することができる。
【０１１６】
Ｂ．組換え生成
ヒト及びマウスＩＬ−１０の調製を記載する方法は、例えば、組換え技術及び他の合成技術を含む、ＩＬ−１０活性を有するタンパク質の製造方法を示す米国特許第５，２３１，０１２号に見出すことができる。ＩＬ−１０はウイルス起源であり得、エプスタイン−バーウイルス（ＢＣＲＦ１タンパク質）からのウイルスＩＬ−１０のクローニング及び発現は、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１２３０に開示されている。ＩＬ−１０は、本明細書に記載するような当該技術分野で公知の標準技術を使用して、多くの方法で得ることができる。組換えヒトＩＬ−１０はまた、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｊから市販されている。
【０１１７】
組換え技術を使用してポリペプチドを産生する場合、任意の適切な構築物、及び原核細胞または真核細胞、例えば、それぞれ、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母宿主細胞などの任意の適切な宿主細胞を使用して、ポリペプチドを細胞内タンパク質または分泌タンパク質として産生することができる。宿主細胞として使用可能な真核細胞の他の例として、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び／または植物細胞が挙げられる。哺乳類宿主細胞を使用する場合、それらには、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、及びＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１）；ならびにハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が含まれる。
【０１１８】
ポリペプチドの発現に適した様々な宿主−ベクター系を、当該分野で公知の標準的な手順に従って使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ参照。宿主細胞への遺伝物質の導入方法として、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが挙げられる。導入した、ポリペプチドをコードする核酸が安定に発現するように、これらの導入方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、継代可能なエピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供可能であるか、またはゲノムに組み込むことができる。関心対象のポリペプチドの産生に使用するための様々な適切なベクターが市販されている。
【０１１９】
ベクターは、宿主細胞中の染色体外で維持することができるか、または宿主細胞ゲノムへ組み込むことができる。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を提供し、コード領域が転写開始領域の転写制御下で作動可能に連結する誘導性または構成的発現、ならびに転写及び翻訳終止領域を提供することができる。一般的に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的または誘導性のいずれかであり得、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であり得る。
【０１２０】
発現構築物は、一般的に、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有し、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主中で作用する選択マーカーを存在させて、ベクターを含む細胞の選択を容易にすることができる。さらに、発現構築物は、さらなる要素を含み得る。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有することができ、それにより生物において、例えば発現のために哺乳類または昆虫細胞、ならびにクローニング及び増幅のために原核生物宿主において維持可能になる。さらに、発現構築物は、選択可能なマーカー遺伝子を有することができ、形質転換した宿主細胞の選択を可能にする。選択可能な遺伝子は当該技術分野において公知であり、使用する宿主細胞によって様々に異なる。
【０１２１】
タンパク質の単離及び精製は、当該分野で公知の方法に従って達成することができる。例えば、タンパク質は、構成的及び／または誘導時にタンパク質を発現するように遺伝子改変した細胞の溶解物から、または免疫親和性精製によって合成反応混合物から単離することができ、これは通常、試料を抗タンパク質抗体に接触させ、非特異的に結合した物質を除去し、特異的に結合したタンパク質を溶出することを含む。単離したタンパク質は、透析及びタンパク質精製に通常使用される他の方法によってさらに精製することができる。一実施形態では、金属キレートクロマトグラフィー法を用いてタンパク質を単離することができる。タンパク質は、単離を容易にするための改変を含み得る。
【０１２２】
ポリペプチドは、実質的に純粋な形態または単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製することができる。ポリペプチドは、存在し得る他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に比べてポリペプチドが富化された組成物中に存在し得る。例えば、他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に、ポリペプチドが、例えば、約９０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満で存在するように、精製ポリペプチドを提供することができる。
【０１２３】
組換え技術を用いてＩＬ−１０ポリペプチドを作製し、当該分野で公知の異なるＩＬ−１０関連核酸を操作し、ＩＬ−１０ポリペプチドをコード可能な構築物を提供することができる。特定のアミノ酸配列を提供する場合、当業者であれば、例えば分子生物学における当業者の背景及び経験の観点から、そのようなアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸分子を認識するであろうことは理解されるであろう。
【０１２４】
アミド結合の置換
いくつかの場合には、ＩＬ−１０は、ペプチド結合以外の１つ以上の結合を含み、例えば、少なくとも２つの隣接するアミノ酸が、アミド結合以外の結合を介して結合する。例えば、望ましくないタンパク質分解または他の分解手段を低減または排除するため、及び／または血清安定性を増加させるため、及び／または立体構造の自由度を制限または高めるために、ＩＬ−１０の骨格内の１つ以上のアミド結合を置換することができる。
【０１２５】
別の例では、ＩＬ−１０中の１つ以上のアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−などのアミド結合のアイソスターである結合で置換することができる。ＩＬ−１０における１つ以上のアミド結合は、例えば、還元アイソスター擬似ペプチド結合によって置換することもできる。Ｃｏｕｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１−１８４参照。そのような置換及びそれらの実施方法は、当業者に公知である。
【０１２６】
アミノ酸置換
ＩＬ−１０ポリペプチド中に１つ以上のアミノ酸置換を作製することができる。以下は非限定的な例である：
【０１２７】
ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニン、または分枝状、環状及び直鎖状のアルキル、アルケニルもしくはアルキニル置換基を含むＣ１−Ｃ１０炭素由来の脂肪族側鎖で置換された他のシンプルα−アミノ酸を含むアルキル置換疎水性アミノ酸の置換；
【０１２８】
ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含む疎水性アミノ酸、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、または上記に列挙した芳香族アミノ酸のアルコキシ（Ｃ１−Ｃ４）置換型、その例は：２−、３−または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−または５−メトキシトリプトファン、２′−、３′−または４′−アミノ−、２′−、３′−または４′−クロロ−、２、３または４−ビフェニルアラニン、２′−、３′−または４′−メチル−、２−、３−または４−ビフェニルアラニン、及び２−または３−ピリジルアラニンであり；
【０１２９】
ｃ）例えば、プロＲ位において置換基がヘテロ原子上（例えば、α窒素、または遠位窒素もしくは窒素）またはα炭素上のどちらにあるかに関わらず、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む塩基性側鎖を含むアミノ酸、ならびに前記アミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換型（Ｃ１−Ｃ１０分枝、直鎖、または環状）誘導体の置換。一例となり得る化合物として：Ｎ−ε−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−γ，γ′−ジエチル−ホモアルギニンが挙げられる。アルキル基がα炭素のプロＲ位を占める化合物であるα−メチル−アルギニン、α−メチル−２，３−ジアミノプロピオン酸、α−メチル−ヒスチジン、α−メチル−オルニチンも含まれる。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基は、１つ以上の窒素、酸素、または硫黄原子を単一でまたは組合せで有する）、カルボン酸、または酸塩化物、活性エステル、活性アゾリド及び関連誘導体、ならびにリジン、オルニチンまたは２，３−ジアミノプロピオン酸などの多くの公知の活性化誘導体のいずれかから形成されるアミドも含まれる。
【０１３０】
ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、２，４−ジアミノプリオピオン酸のアルキル、アリール、アリールアルキル及びヘテロアリールスルホンアミド、オルニチンまたはリジン、ならびにテトラゾール置換アルキルアミノ酸を含む酸性アミノ酸の置換；
【０１３１】
ｅ）アスパラギン、グルタミン、及びアスパラギンまたはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む側鎖アミド残基の置換；ならびに
【０１３２】
ｆ）セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、及びセリンまたはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含むヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
【０１３３】
いくつかの場合では、ＩＬ−１０は、天然型の非遺伝子コード型Ｌ−アミノ酸、合成Ｌ−アミノ酸、またはアミノ酸のＤ−エナンチオマーの１つ以上を含む。例えば、ＩＬ−１０は、Ｄ−アミノ酸のみを含むことができる。例えば、ＩＬ−１０ポリペプチドは、以下の残基の１つ以上を含むことができる：ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリジン、２，４−ジアミノ酪酸、ｒｈｏ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、δ−アミノ吉草酸、及び２，３−ジアミノ酪酸。
【０１３４】
さらなる修飾
システイン残基またはシステインアナログをＩＬ−１０ポリペプチドに導入して、ジスルフィド結合を介して別のペプチドへの結合を提供するか、またはＩＬ−１０ポリペプチドの環化を提供することができる。システインまたはシステイン類似体の導入方法は、当該分野で公知であり；例えば、米国特許第８，０６７，５３２号を参照されたい。
【０１３５】
ＩＬ−１０ポリペプチドは環化することができる。ＩＬ−１０ポリペプチドに、１つ以上のシステインまたはシステイン類似体を導入することができ、導入されたシステインまたはシステイン類似体は、第二の導入されたシステインまたはシステイン類似体とジスルフィド結合を形成することができる。環化の他の手段として、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入が挙げられ；例えば、米国特許第８，０４４，１７５号を参照されたい。環化結合を形成可能なアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組合せを使用及び／または導入することができる。環化結合は、架橋の導入を可能にする官能基を用いて、アミノ酸の任意の組合せ（またはアミノ酸と−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−または−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−）で生成することができる。いくつかの例は、ジスルフィド、ジスルフィド模倣物、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−カルバ架橋、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）ならびにエステル及びエーテルを含有する架橋などである。これらの例では、ｎは任意の整数であってもよいが、多くの場合、１０未満である。
【０１３６】
他の修飾として、例えば、Ｎ−アルキル（もしくはアリール）置換（ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタム及び他の環状構造を構築するための骨格架橋が挙げられる。他の誘導体として、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ−修飾誘導体（例えば、Ｃ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、アルキルアミド及びヒドラジドなどの置換アミドを含むＮ末端修飾誘導体が挙げられる。
【０１３７】
いくつかの場合には、ＩＬ−１０ポリペプチド中の１つ以上のＬ−アミノ酸を１つ以上のＤ−アミノ酸で置換する。
【０１３８】
いくつかの場合には、ＩＬ−１０ポリペプチドは、レトロインベルソ類似体である（例えば、Ｓｅｌａ  ａｎｄ  Ｚｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４４９参照）。レトロ−インベルソペプチド類似体は、直鎖状ポリペプチドの異性体であり、アミノ酸配列の方向が逆転（レトロ）し、例えば、Ｌ−アミノ酸よりむしろＤ−アミノ酸を用いて、その中の１つ以上のアミノ酸のキラリティーＤ−またはＬ−が反転（インベルソ）している。［例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：７４４；及びＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：６９２参照］。
【０１３９】
ＩＬ−１０ポリペプチドは、「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含むことができ、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、または小胞膜を横断することを容易にするポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機分子を指す。別の分子に結合したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、または細胞質ゾルからオルガネラ内への移動など、分子が膜を横断することを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤはＩＬ−１０ポリペプチドのアミノ末端に共有結合し、他の実施形態ではＰＴＤはＩＬ−１０ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合する。例示的なタンパク質形質導入ドメインとして、最小限のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応）；細胞に進入するのに十分な数のアルギニン残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）；トランケート型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号４）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとして、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７）；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列には、以下のいずれかが含まれるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号８）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号９）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１０）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）。
【０１４０】
ＩＬ−１０ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離型（Ｒ３＝ＯＨ）または、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩もしくはカルシウム塩などの生理学的に許容可能なアルカリもしくはアルカリ土類塩の形態で存在することができる。カルボキシル基はまた、例えば、メタノール、分枝状または非分枝状Ｃ１−Ｃ６−アルキルアルコール、例えばエチルアルコールまたはｔｅｒｔ−ブタノールなどの第一級、第二級または第三級アルコールでエステル化することもできる。カルボキシル基はまた、アンモニア、分枝または非分枝Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミンまたはＣ１−Ｃ６ジ−アルキルアミン、例えばメチルアミンまたはジメチルアミンなどの第一級または第二級アミンでアミド化することもできる。
【０１４１】
ＩＬ−１０ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離型（Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝Ｈ）または生理学的に許容可能な塩の形態、例えば、塩化物または酢酸塩の形態で存在し得る。アミノ基は、Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルなどの酸でアセチル化することもできる。アミノ基は、上記で提供されるもの（例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、及びＡｌｌｏｃ）などの、ペプチド化学において慣用的に使用されるアミノ保護基によって保護された形態で存在し得る。アミノ基は、Ｎ−アルキル化可能であり、ここで、Ｒ１及び／またはＲ２＝Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ２−Ｃ８アルケニルまたはＣ７−Ｃ９アラルキルである。アルキル残基は、直鎖、分枝または環状（例えば、それぞれ、エチル、イソプロピル及びシクロヘキシル）であり得る。
【０１４２】
ＩＬ−１０機能を増強及び／または模倣するための特定の修飾
本明細書中に開示する治療様式（例えば、ＩＬ−１０）の１つ以上の物理的特性及び／またはそれらを投与する様式を改善することは、多くの場合に有益であり、時には不可欠である。物理的特性の改善には、例えば、免疫原性の調節；水溶性、バイオアベイラビリティー、血清半減期、及び／または治療半減期を高める方法；及び／または生物活性の調節が含まれる。特定の修飾はまた、例えば、検出アッセイ（例えば、エピトープタグ）に用いるための抗体の産生及びタンパク質精製を容易にするために有用であり得る。そのような改善は、通常、治療様式の生物活性に悪影響を及ぼさず、及び／またはその免疫原性を増加させることなく加えなければならない。
【０１４３】
ＩＬ−１０のペグ化は、本開示によって企図される１つの特定の修飾であるが、他の修飾として、グリコシル化（Ｎ−及びＯ−結合）；ポリシアル化；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含むアルブミン融合分子；例えば共役脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）；及びＦｃ融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
ペグ化：タンパク質治療薬の臨床的有効性は、短い血漿半減期及びプロテアーゼ分解に対する感受性によってしばしば制限される。様々な治療用タンパク質（例えば、フィルグラスチム）の研究は、ポリペプチド配列を様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのいずれかに複合体化または連結することを含む様々な修飾によって、そのような困難を克服することができることを示した。これは、タンパク質、及び例えばＰＥＧなどの非タンパク質性ポリマーの両方に共有結合した連結部分によって頻繁に行われる。そのようなＰＥＧ結合型生体分子は、より良好な物理的及び熱安定性、酵素分解に対する感受性の保護、溶解性の増加、より長いｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期及びクリアランスの減少、免疫原性及び抗原性の低下、ならびに毒性の低減を含む、臨床上有用な特性を有することが示された。
【０１４５】
ＰＥＧ化が薬物動態パラメータに及ぼす有益な効果に加えて、ペグ化それ自体が活性を増強できる。例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、非ＰＥＧ化ＩＬ−１０よりも特定のがんに対してより有効であることが示されている（例えば、ＥＰ２０６６３６Ａ２参照）。
【０１４６】
ポリペプチド配列への複合体化に適したＰＥＧは、一般的に、室温で水に可溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、式中、Ｒは、水素または保護基、例えばアルキルまたはアルカノール基であり、ｎは１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは一般的に１〜８個の炭素を有する。ポリペプチド配列に複合体化したＰＥＧは、直鎖または分枝鎖であり得る。分枝ＰＥＧ誘導体、「スター−ＰＥＧ」及びマルチアームＰＥＧは、本開示によって企図される。本開示において使用するＰＥＧの分子量は、任意の特定の範囲に限定されるものではなく、本明細書中の他の箇所に例を記載する。一例として、特定の実施形態は５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有し、他の実施形態は４ｋＤａ〜１０ｋＤａの分子量を有する。
【０１４７】
本開示はまた、ＰＥＧが異なるｎ値を有し、したがって様々な異なるＰＥＧが特定の比で存在する複合体の組成物を企図する。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１，２，３及び４である複合体の混合物を含む。いくつかの組成物は、ｎ＝１である複合体の割合は１８〜２５％であり、ｎ＝２である複合体の割合は５０〜６６％であり、ｎ＝３である複合体の割合は１２〜１６％であり、ｎ＝４である複合体の割合は最大５％である。そのような組成物は、当該分野で公知の反応条件及び精製方法によって生成することができる。例示的な反応条件を、本明細書を通して記載する。カチオン交換クロマトグラフィーを用いて複合体を分離することができ、その後、例えば、未修飾タンパク質配列と、他の数のＰＥＧを有する複合体とを含むことなく精製された、所望の数のＰＥＧが結合した複合体を含む画分を同定する。
【０１４８】
ペグ化は、ポリペプチドのＮ末端のαアミノ基、リジン残基の側鎖のεアミノ基、及びヒスチジン残基の側鎖のイミダゾール基で最も頻繁に生じる。大部分の組換えポリペプチドは単一のα及び多数のεアミノ及びイミダゾール基を有するため、リンカーの化学的性質に応じて多数の位置異性体を生成することができる。当該分野で公知の一般的なペグ化戦略を本明細書に適用することができる。
【０１４９】
２つの広く使用されている第１世代活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ；例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：１００−１１４；及びＭｉｒｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｈｅｃｋ（１９９３）Ｂｉｏ−ｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：５６８−５６９）ならびにリジン残基と優先的に反応してカルバミン酸結合を形成するが、ヒスチジン及びチロシン残基と反応することも知られているベンゾトリアゾールカーボネートＰＥＧ（ＢＴＣ−ＰＥＧ；例えば、Ｄｏｌｅｎｃｅ，ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，６５０，２３４号参照）である。特定の分子（例えば、ＩＦＮα）上のヒスチジン残基への結合は、加水分解に対して不安定なイミダゾールカルバミン酸結合であることが示されている（例えば、Ｌｅｅ  ａｎｄ  ＭｃＮｅｍａｒ、米国特許第５，９８５，２６３号参照）。第二世代ペグ化技術は、これらの不安定な結合ならびに残基反応性における選択性の欠如を回避するように設計されている。ＰＥＧ−アルデヒドリンカーの使用は、還元的アミノ化を介してポリペプチドのＮ末端上の単一部位を標的とする。
【０１５０】
１つ以上のポリペプチド配列の遊離アミノまたはカルボキシル基とポリエチレングリコールとの間の結合を媒介する末端反応基（「スペーサー」）を介して、ＰＥＧを本開示のポリペプチドに結合させることができる。遊離アミノ基に結合可能なスペーサーを有するＰＥＧとして、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化することにより調製することができるＮ−ヒドロキシスクシンイミドポリエチレングリコールが挙げられる。遊離アミノ基に結合可能な別の活性化ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルと塩化シアヌルとを反応させて調製することができる２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合する活性化ポリエチレングリコールとして、ポリオキシエチレンジアミンが挙げられる。
【０１５１】
スペーサーを有するＰＥＧへの本開示の１つ以上のポリペプチド配列の複合体化は、様々な従来の方法によって行うことができる。例えば、複合体化反応は、試薬対タンパク質のモル比４：１〜３０：１を使用して、ｐＨ５〜１０、温度４℃〜室温で、３０分間〜２０時間、溶液中で行うことができる。反応条件は、反応が所望する置換の程度を支配的に生じるように選択することができる。一般的に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、及び短い反応時間は、結合したＰＥＧの数を減少させる傾向がある一方で、高温、中性〜高ｐＨ（例えば、ｐＨ≧７）、及び長い反応時間は、結合したＰＥＧの数を増加させる傾向にある。当該技術分野で公知の様々な手段を用いて反応を終了させることができる。いくつかの実施形態では、反応混合物を酸性化し、例えば−２０℃で凍結させることによって反応を終了させる。様々な分子のペグ化は、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号；第５，６４３，５７５号；第５，９１９，４５５号；第５，９３２，４６２号；及び第５，９８５，２６３号に記載されている。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、例えば、米国特許第７，０５２，６８６号に記載されている。本明細書中での使用が意図される具体的な反応条件は、実施例の項に記載されている。
【０１５２】
本開示はまた、ＰＥＧ模倣体の使用を企図する。ＰＥＧの特性（例えば、血清半減期の向上）を保持しながら、いくつかのさらなる有利な特性を付与する組換えＰＥＧ模倣物が開発されている。一例として、ＰＥＧと同様の拡張された立体構造を形成可能な単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む）を、関心対象のペプチドまたはタンパク質性薬剤に、あらかじめ組換えによって融合させて生成することができる（例えば、ＡｍｕｎｉｘのＸＴＥＮ技術；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。これにより、製造プロセス中のさらなる複合体化工程の必要性が排除される。さらに、確立された分子生物学技術により、ポリペプチド鎖の側鎖組成を制御することができ、免疫原性及び製造特性を最適化することができる。
【０１５３】
［グリコシル化］：本開示の目的では、「グリコシル化」は、タンパク質、脂質または他の有機分子にグリカンを結合させる酵素的プロセスを広く指すことを意図する。本開示と関連して、用語「グリコシル化」の使用は、一般的に、１つ以上の炭水化物部分を付加または除去する（基礎的なグリコシル化部位を除去することによって、または化学的及び／または酵素的手段によってグリコシル化を除去することによって）こと、及び／または天然配列に存在し得る、または存在し得ない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することを意図する。さらに、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び割合の変化を含む天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【０１５４】
グリコシル化は、ＩＬ−１０などのポリペプチドの物理的性質（例えば、可溶性）に劇的に影響し得るうえに、タンパク質安定性、分泌及び細胞内局在化においても重要であり得る。グリコシル化されたポリペプチドはまた、向上した安定性を示し得るか、または半減期などの１つ以上の薬物動態特性を向上させることができる。さらに、溶解度の改善は、例えば、非グリコシル化ポリペプチドを含む製剤よりも医薬投与に適した製剤の生成を可能にする。
【０１５５】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変することによって達成することができる。ポリペプチドに対する改変は、例えば、１つ以上のセリンまたはスレオニン残基（Ｏ−結合グリコシル化部位の場合）またはアスパラギン残基（Ｎ−結合グリコシル化部位の場合）の付加または置換によって行うことができる。Ｎ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖の構造及び各型で見出される糖残基は、異なり得る。両方に一般的に見られる１つのタイプの糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と称する）である。シアル酸は、多くの場合、Ｎ−結合オリゴ糖及びＯ−結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のために、糖タンパク質に酸性特性を付与することができる。本開示の特定の実施形態は、Ｎ−グリコシル化変異体の生成及び使用を含む。
【０１５６】
本開示のポリペプチド配列は、核酸レベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成するように予め選択した塩基でポリペプチドをコードする核酸を変異させることによって任意に改変することができる。
【０１５７】
ポリシアリル化：本開示はまた、ポリペプチドの安定性及びｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態学を改善するために、ポリシアリル化の使用、すなわち、天然型の生分解性α−（２→８）結合ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）へのポリペプチドの複合体化を企図する。ＰＳＡは、生分解性の非毒性の天然ポリマーであり、親水性が高く、血中における高い見かけの分子量を与え、血清半減期を延長させる。さらに、ある範囲のペプチド及びタンパク質治療剤のポリシアリル化は、顕著に低下したタンパク質分解、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の保持、及び免疫原性及び抗原性の低下をもたらした（例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３００（１−２）：１２５−３０参照）。部位特異的ポリシアリル化のための様々な技術が利用可能である（例えば、Ｔ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０８（１８）７３９７−７４０２（２０１１）参照）。
【０１５８】
［アルブミン融合］：複合体化のためのさらなる適切な成分及び分子として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンが挙げられる。
【０１５９】
本開示によれば、アルブミンは、カルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端及びアミノ末端の両方において、及び内部で薬物分子（例えば、本明細書に記載のポリペプチド）と複合体化させることができる（例えば、ＵＳＰ５，８７６，９６９及びＵＳＰ７，０５６，７０１参照）。
【０１６０】
本開示によって企図されるＨＳＡ−薬物分子複合体において、アルブミン分泌性プレ配列及びその変異体、その断片及び変異体、及びＨＳＡ変異体などの、様々な形態のアルブミンを使用することができる。そのような形態は、一般的に、１つ以上の所望のアルブミン活性を有する。さらなる実施形態では、本開示は、アルブミン、アルブミン断片、及びアルブミン変異体などに直接または間接的に融合したポリペプチド薬物分子を含む融合タンパク質を含み、ここで融合タンパク質は、非融合型の薬物分子よりも高い血漿安定性を有し、及び／または、融合タンパク質は、非融合型の薬物分子の治療活性を保持している。いくつかの実施形態では、間接的な融合は、リンカー、例えばペプチドリンカーまたはその修飾されたバージョンによって行う。
【０１６１】
上記に示唆したように、本開示の１つ以上のポリペプチドへのアルブミンの融合は、例えば、遺伝子操作によって達成することができ、それによって、ＨＳＡをコードする核酸またはその断片を、１つ以上のポリペプチド配列をコードする核酸に結合させる。
【０１６２】
代替アルブミン結合戦略：直接融合の代替として、いくつかのアルブミン結合戦略が開発され、本明細書に記載のＩＬ−１０剤とともに使用することができる。一例として、本開示は、共役脂肪酸鎖（アシル化）ならびにアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列及び本明細書に記載の１つ以上のポリペプチドの配列を含む融合タンパク質を介したアルブミン結合を企図する。
【０１６３】
他の分子との複合体化：複合体化のためのさらなる適切な成分及び分子として、例えば、サイログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）などのポリアミノ酸；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；ならびにＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質及び表面抗原；またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１６４】
したがって、本開示は、ポリペプチド配列のＮ末端及び／またはＣ末端における、１つ以上の追加の成分または分子、例えば、別のポリペプチド（例えば、目的のポリペプチドに対して異種のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、または担体分子の複合体化を企図する。したがって、例示的なポリペプチド配列は、別の成分または分子との複合体として提供することができる。
【０１６５】
ＩＬ−１０ポリペプチドはまた、大きくて緩やかに代謝される高分子、例えば、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、またはセルロースビーズなどの多糖類；ポリグルタミン酸またはポリリジンなどのポリマー性アミノ酸；アミノ酸共重合体；不活性化ウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、またはロイコトキシン分子由来のトキソイドなどの不活性化細菌毒素；不活性化細菌；及び樹状細胞などに複合体化することもできる。そのような複合体化形態は、所望であれば、本開示のポリペプチドに対する抗体を産生するために使用することができる。
【０１６６】
複合体化のためのさらなる候補成分及び分子として、単離または精製に適したものが挙げられる。特定の非限定的な例として、結合分子、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または、例えば、プラスチックもしくはポリスチレンビーズ、プレートもしくはビーズ、磁気ビーズ、試験ストリップ、及び膜を含む固体支持体を含む分子が挙げられる。
【０１６７】
Ｆｃ融合分子：特定の実施形態では、本開示のポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシル末端を免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合させて、融合型複合体（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合型複合体は、バイオ医薬品の全身性半減期を増加させることが示されており、したがって、バイオ医薬品は、より少ない頻度の投与で済む可能性がある。
【０１６８】
Ｆｃは、血管をライニングする内皮細胞の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合すると、Ｆｃ融合分子は分解から保護され、循環器中に再放出され、循環器中で分子をより長く維持する。このＦｃ結合は、内在性ＩｇＧがその長い血漿半減期を保持する機構であると考えられている。より最近のＦｃ融合技術は、バイオ医薬品の単一コピーを抗体のＦｃ領域に連結し、従来のＦｃ融合型複合体に比べてバイオ医薬品の薬物動態学的及び薬力学的特性を最適化する。
【０１６９】
他の改変：本開示は、１つ以上の特性を改善するための、現在公知であるか、または将来開発されるＩＬ−１０の他の修飾の使用を意図する。例として、その様々な態様が、例えば、米国特許出願第２００７／０１３４１９７号及び第２００６／０２５８６０７号に記載されるヘキシル化、ならびに融合タグとしてのＳＵＭＯを含む融合分子（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）が挙げられる。
【０１７０】
リンカー：リンカー及びその使用は上記に記載されている。本開示のポリペプチド配列を修飾するために使用する任意の前述の成分及び分子は、リンカーを介して場合により複合体化していてもよい。適切なリンカーとして、改変したポリペプチド配列と連結した成分及び分子との間のいくらかの動きを可能にするのに一般的に十分な長さの「可撓性リンカー」が挙げられる。リンカー分子は、通常、約６〜５０原子の長さである。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２〜１０個のモノマーユニットを含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組合せであってもよい。適切なリンカーは、容易に選択することができ、任意の適切な長さ、例えば、１残基のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０残基または５０残基を上回るアミノ酸であり得る。
【０１７１】
可撓性リンカーの例として、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１３）、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号１４）、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号１５）、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ（配列番号１６）、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎ（配列番号１７）及び（ＧＧＧＳｍ）ｎ（配列番号１８）、ならびにそれらの組合せが挙げられ、式中、ｍ、ｎ、及びｏは、それぞれ独立して、少なくとも１〜２０の整数、例えば１〜１８、２〜１６、３〜１４、４〜１２、５〜１０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される）、及び他の可撓性リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、構成要素間の中立的テザーとして機能し得る。可撓性リンカーの例として、ＧＧＳＧ（配列番号１９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２３）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号２４）が挙げられる。
【０１７２】
可撓性リンカーのさらなる例として、グリシンポリマー（Ｇ）ｎまたはグリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２６）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７）であり、式中、ｎ＝１〜５０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０である）が挙げられる。例示的な可撓性リンカーとして、ＧＧＧＳ（配列番号／／）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２８）、ＧＧＳＧ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３０）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３１）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３３）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号３４）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのリンカー配列の多量体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、または３０〜５０）を一緒に連結して可撓性リンカーを提供してもよく、これを用いて、本明細書中に開示するＩＬ−１０剤に異種アミノ酸配列を複合体化してもよい。本明細書中に記載するように、異種アミノ酸配列は、シグナル配列及び／またはアルブミン、Ｆｃ配列などのような融合パートナーであってもよい。
【０１７３】
ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生及び治療のためのＩＬ−１０剤投与
末梢ＰＤ１＋，ＣＤ８＋，疾患抗原特異的Ｔ細胞を誘発するために、ＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を治療有効量で被験体に投与する。治療有効量は、治療する疾患、治療によって達成する目標、被験体に投与する他の治療剤、ならびに被験体の年齢、体重、性別、健康状態及び身体状態、投与するＩＬ−１０製剤ならびに投与経路などの一般的に評価される被験体の様々な特性などの要因を考慮して、熟練した医師によって容易に決定され得る。ＩＬ−１０剤の治療有効量は、例えば、安全性及び用量漸増試験、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験（例えば、動物モデル）、及び当業者に公知の他の方法から容易に決定することができる。
【０１７４】
他の箇所で詳細に考察するように、本開示は、特定の血清トラフ濃度を達成するための、及び／または特定の平均血清トラフ濃度を維持するためのＩＬ−１０投与の実施形態を企図する。
【０１７５】
一般的に、投薬パラメータは、治療有効量が、被験体に対して不可逆的に有毒であり得る量（すなわち、最大耐量、「ＭＴＤ」）未満であり、被験体に測定可能な効果を生成するために必要な量以上であることを必要とする。そのような量は、例えば、投与経路及び他の要因を考慮して、ＡＤＭＥに関連する薬物動態学的及び薬力学的パラメータによって決定される。
【０１７６】
治療有効量（ＥＤ）とは、それを摂取する被験体のある割合に対して、治療応答または所望の効果を生じさせる薬剤の用量または量である。薬剤の「有効量中央値」またはＥＤ５０は、投与を受ける集団の５０％において治療応答または所望の効果を生じさせる薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は、薬剤の効果の合理的な期待尺度として一般的に使用されるが、必ずしも医師が関連するすべての要因を考慮して適切と考えるであろう用量ではない。したがって、いくつかの状況では、有効量は、計算されたＥＤ５０を上回ることが可能であり、他の状況では、有効量は、計算されたＥＤ５０を下回ることが可能であり、さらに他の状況では、有効量は、計算されたＥＤ５０と同等であり得る。
【０１７７】
ＰＥＧ−ＩＬ−１０の治療有効量の例は、約０．０１〜約１００μｇのＰＥＧ−ＩＬ−１０／ｋｇ体重／日、約０．１〜２０μｇのＰＥＧ−ＩＬ−１０／ｋｇ体重／日、約０．５〜１０μｇのＰＥＧ−ＩＬ−１０／ｋｇ体重／日、または約１〜４μｇのＰＥＧ−ＩＬ−１０／ｋｇ体重／日であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−１０を連続注入により投与し、約５０〜８００μｇタンパク質／ｋｇ体重／日（例えば、約１〜１６μｇタンパク質／ｋｇ体重／日のＰＥＧ−ＩＬ−１０）を送達する。注入速度は、例えば、副作用及び血球数の評価に基づいて様々に変化させることができる。ＩＬ−１０剤についての他の特定の投薬パラメータは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【０１７８】
特定の実施形態では、ＩＬ−１０剤の用量は、「単位剤形」で表される。語句「単位剤形」とは、物理的に別個の単位を指し、各単位は、所定の量のＩＬ−１０剤を、単独で、または１つ以上の追加の薬剤と組み合わせて、所望の効果を生じるのに十分な量で含む。単位剤形のパラメータは、特定の薬剤及び達成するべき効果に依存することが理解されるであろう。
【０１７９】
ＩＬ−１０剤の全身性レベルは：（１）特定のレベルを上回るレベルもしくはあるレベルの範囲内の平均ＩＬ−１０血清トラフ濃度；（２）ある程度の時間の間、特定のレベルを上回る平均ＩＬ−１０血清トラフ濃度；（３）特定のレベルを上回るかもしくは下回る定常状態のＩＬ−１０血清濃度レベル、またはあるレベルの範囲内の定常状態のＩＬ−１０血清濃度レベル；または（４）特定のレベルを上回るかもしくは下回る、またはあるレベルの範囲内の濃度特性のＣｍａｘを含む、いくつかの方法で特徴づけることができる。本明細書に記載されるように、ＩＬ−１０剤の投与期間にわたるＩＬ−１０濃度の平均血清の維持は、特定の疾患状態の治療において特に有益であることが見出されている。
【０１８０】
本開示のいくつかの実施形態では、ＩＬ−１０剤療法の経過中のＩＬ−１０剤の有用な血漿及び／または血清レベルの濃度特性には：約１．０ｐｇ／ｍＬ超、約１０．０ｐｇ／ｍＬ超、約２０．０ｐｇ／ｍＬ超、約３０ｐｇ／ｍＬ超、約４０ｐｇ／ｍＬ超、約５０．０ｐｇ／ｍＬ超、約６０．０ｐｇ／ｍＬ超、約７０．０ｐｇ／ｍＬ超、約８０．０ｐｇ／ｍＬ超、約９０ｐｇ／ｍＬ超、約０．１ｎｇ／ｍＬ超、約０．２ｎｇ／ｍＬ超、約０．３  ｎｇ／ｍＬ超、約０．４ｎｇ／ｍＬ超、約０．５ｎｇ／ｍＬ超、約０．６ｎｇ／ｍＬ超、約０．７ｎｇ／ｍＬ超、約０．８ｎｇ／ｍＬ超、約０．９ｎｇ／ｍＬ超、約１．０ｎｇ／ｍＬ超、約１．５ｎｇ／ｍＬ超、約２．０ｎｇ／ｍＬ超、約２．５ｎｇ／ｍＬ超、約３．０ｎｇ／ｍＬ超、約３．５ｎｇ／ｍＬ超、約４．０ｎｇ／ｍＬ超、約４．５ｎｇ／ｍＬ超、約５．０ｎｇ／ｍＬ超、約５．５ｎｇ／ｍＬ超、約６．０ｎｇ／ｍＬ超、約６．５ｎｇ／ｍＬ超、約７．０ｎｇ／ｍＬ超、約７．５ｎｇ／ｍＬ超、約８．０ｎｇ／ｍＬ超、約８．５ｎｇ／ｍＬ超、約９．０ｎｇ／ｍＬ超、約９．５ｎｇ／ｍＬ超、または約１０．０  ｎｇ／ｍＬ超の平均ＩＬ−１０血漿及び／または血清トラフ濃度が含まれる。
【０１８１】
本開示の特定の実施形態において、ＩＬ−１０剤を被験体に投与し、ＩＬ−１０治療の経過中の平均ＩＬ−１０血清トラフ濃度を１．０ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲で、あるいは１．０ｐｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬの範囲、あるいは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１．０ｎｇ／ｍＬの範囲、あるいは１．０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲で達成する。本開示は、そのような範囲が明示的に列挙されていなくても、本明細書に記載する濃度に包含される任意の濃度を含む範囲を意図することが理解されるべきである。一例として、一実施形態における平均血清ＩＬ−１０濃度は、０．５ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。さらなる例として、本開示の特定の実施形態は、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１０．５ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約９．０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約８．０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ〜約７．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ〜約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ〜約９．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ〜約８．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ〜約７．０ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ〜約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ〜約９．０ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ〜約８．０ｎｇ／ｍＬ、及び約２．０ｎｇ／ｍＬ〜約７．０ｎｇ／ｍＬの範囲の平均ＩＬ−１０血清トラフ濃度を含む。特定の実施形態では、１〜２ｎｇ／ｍＬの平均ＩＬ−１０血清トラフ濃度を、治療期間にわたって維持する。
【０１８２】
本開示はまた、平均ＩＬ−１０血清ピーク濃度が、ＩＬ−１０剤治療の期間にわたって約１０．０ｎｇ／ｍＬ以下である実施形態を企図する。さらなる実施形態は、平均ＩＬ−１０血清トラフ濃度が約１．０ｐｇ／ｍＬ以上であることを意図する。最適な平均血清濃度は、通常、望ましくない副作用を導入することなく所望の治療効果を達成する平均血清濃度である。
【０１８３】
本開示の特定の実施形態は、ＩＬ−１０治療を受ける被験体をモニタリングし、予測し、したがって副作用を潜在的に回避する方法を提供し、方法は：（１）被験体のＩＬ−１０のピーク濃度を測定し；（２）被験体のＩＬ−１０トラフ濃度を測定し；（３）ピークトラフ変動を算出し；及び（４）算出したピークトラフ変動を用いて被験体における潜在的な副作用を予測することを含む。特定の被験体集団では、ピークトラフの変動が小さいことは、被験体がＩＬ−１０関連副作用を経験する確率が低いことを示す。さらに、いくつかの実施形態、特にピークトラフ変動は、特定の投与パラメータを用いて特定の疾患、障害及び病態を治療するために決定され、その変動は参照標準として使用される。
【０１８４】
大多数の薬物について、血漿薬物濃度は多指数関数的に低下する。静脈内投与の直後に、薬物は最初の空間（血漿体積として最小限に画定される）全体に急速に分布し、血管外空間（例えば、特定の組織）へのより緩慢な平衡分布が生じる。静脈内ＩＬ−１０投与は、そのような２区画動態モデルに関連する（Ｒａｃｈｍａｗａｔｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（１１）：２０７２−７８参照）。皮下組換えｈＩＬ−１０の薬物動態も研究されている（Ｒａｄｗａｎｓｋｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５（１２）：１８９５−１９０１）。したがって、適切なＩＬ−１０投薬関連パラメータを評価する場合、分布容積の考慮が適切である。さらに、ＩＬ−１０剤を特定の細胞型に標的化する努力が探求されている（例えば、Ｒａｃｈｍａｗａｔｉ，Ｈ．（Ｍａｙ  ２００７）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｔ．３５（５）：８１４−２１参照）。
【０１８５】
本開示は、上記のように治療されている被験体における任意のＩＬ−１０血清トラフ濃度の維持をもたらすＩＬ−１０剤の任意の用量の投与及び投薬レジメンを企図する。非限定的な例として、被験体がヒトである場合、非ペグ化ｈＩＬ−１０は、０．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、７．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１０．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１２．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１７．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２２．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、３０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、または３５μｇ／ｋｇ／日を超える用量で投与することができる。さらに、非限定的な例として、被験体がヒトである場合、比較的小さなＰＥＧ（例えば、５ｋＤａモノ−ジ−ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０）を含むペグ化ｈＩＬ−１０は、０．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、０．７５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１．２５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、１．７５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２．２５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、２．７５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、３．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、３．２５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、３．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、３．７５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、４．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量、４．２５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、４．５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、４．７５μｇ／ｋｇ／日を超える用量、または５．０μｇ／ｋｇ／日を超える用量で投与することができる。
【０１８６】
特定のＩＬ−１０血清濃度などを達成するのに必要なＩＬ−１０血清濃度、用量及び治療プロトコールに関する先の考察は、ＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）による単剤療法に属するが、１つ以上のさらなる療法と組み合わせてＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を投与する場合、当業者（例えば、薬理学者）は、最適な投薬レジメン（複数可）を決定することができる。
【０１８７】
投与経路
本開示は、任意の適切な様式でのＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）、及びその組成物の投与を企図する。投与の最適な経路として、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射またはインプラント）、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）及び脳室内）、経口、経鼻、経膣、舌下、眼内、経直腸、局所（例えば、経皮）、舌下及び吸入が挙げられる。一般的に、皮下または筋肉内に投与するデポー注射もまた、本明細書に開示するＩＬ−１０剤を規定の期間にわたって放出するために利用することができる。
【０１８８】
疾患抗原特異的ＰＤ１＋ＣＤ８＋末梢Ｔ細胞の作製方法
上記のように、本開示は、一実施形態において、治療有効量のＩＬ−１０剤を患者に投与することによる、ＩＬ−１０剤療法で治療可能な疾患を有する被験体の末梢における疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導方法を提供する。さらに、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、治療有効量のＩＬ−１０剤を被験体に投与した後に被験体から組織試料を得ることによって単離され得る。一実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）であり、被験体から末梢血試料を採取することによって、治療有効量のＩＬ−１０剤で治療した被験体からＣＤ８＋Ｔ細胞を得ることができる。
【０１８９】
図７を参照すると、本開示の方法の一般的な実施例は、ＩＬ−１０剤療法、例えばＰＥＧ−ＩＬ−１０療法を、ＩＬ−１０剤による治療を受け入れ可能な疾患を有する患者に投与することを含み得る７１０。患者が所定時間ＩＬ−１０剤療法を受けた後、リンパ球（例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む末梢血試料）を含む組織試料を患者から採取する７２０。場合により、ＩＬ−１０剤療法に対する奏効について患者をモニタリングしてもよい。いくつかの場合には、患者がＩＬ−１０剤治療に対して少なくとも安定状態または少なくとも部分奏効を示す場合、組織試料を患者から採取する。いくつかの場合には、患者が少なくとも安定または少なくとも部分奏効を示さない場合、組織試料を採取せずにＩＬ−１０剤療法を継続する。
【０１９０】
患者から組織試料を採取した後７２０、組織試料中の核酸を核酸配列決定によって分析し７４０、ＴＣＲ配列を得る（例えば、可変α（Ｖα）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／または可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸）。この配列を分析して、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲに対するＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の［相対的］存在量の推定値を取得し得る。試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲのＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸と、ＩＬ−１０剤療法の前、またはＩＬ−１０剤療法の初期の時点でＩＬ−１０剤療法を受け入れ可能な疾患を有する１人以上の患者から採取した参照試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲのＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸とを比較することによって、抗原特異的ＴＣＲ（α鎖及びβ鎖のＴＣＲペア配列によって定義される）を発現する特定のＴ細胞集団が、クローン的に増大し、クローン的に収縮しているか、またはＩＬ−１０剤療法に応答して新たに生成したかどうかを判定することが可能である。
【０１９１】
試料中のＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量は、任意の適切な手段を用いて測定してもよい。いくつかの場合には、存在量とは、ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の、参照核酸に比べた出現頻度である。いくつかの場合には、存在量とは、ＶαＴＣＲポリペプチドをコードする核酸及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の、参照核酸に比べた数、またはその生物情報学的に取得した推定値である。
【０１９２】
増大は、３倍以上、例えば５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、または３０倍以上の参照試料と比較した、被験体由来の試料中のＶαＴＣＲポリペプチド及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量の変化を含み得る。
【０１９３】
いくつかの場合では、試料は、関心対象の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために、細胞表面マーカー発現に基づいて分画され得るＰＢＬを含有する。関心対象のＣＤ８＋Ｔ細胞には、ＰＤ１（ＣＤ２７９）及び／またはＬＡＧ３などの細胞表面マーカーの上昇した発現に基づいて同定された活性化疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれ得る。いくつかの実施形態では、方法は、場合により、末梢血試料からＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＰＤ−１＋Ｌａｇ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定及び単離することを含み得る。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ、ＣＤ８＋として同定及び単離され、ならびにＩＦＮγ、ＣＤ４５ＲＯ、グランザイムＢ、及びパーフォリンのうちの１つ以上の発現について陽性である。単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞、例えばＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、疾患関連抗原に特異的な活性化Ｔ細胞中で富化してもよく、それに伴い、その疾患抗原特異性はα及びβ鎖ＴＣＲペア配列に応じたものとなる。
【０１９４】
これらのＴＣＲペアのアミノ酸配列は、疾患抗原特異性をＴ細胞に付与する配列を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、全長α及びβ鎖ＴＣＲペアのアミノ配列をコードする核酸構築物、またはα及びβ鎖ＴＣＲペアのアミノ配列の可変領域を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸構築物を形質導入することによって、組換え疾患抗原特異的Ｔ細胞を生成する７５０ことを含み、ここで、α及びβ鎖ＴＣＲペアのアミノ配列は、ＩＬ−１０剤で治療した患者から採取した疾患抗原特異的Ｔ細胞含有組織試料由来であった。次いで、これらの改変型疾患抗原特異的Ｔ細胞を、改変型疾患抗原特異的Ｔ細胞上に発現するＴＣＲが特異的に結合する抗原を発現していることを特徴とする疾患の治療を必要とする適切な患者に投与してもよい。
【０１９５】
本開示の方法は、病状を治療するためにＩＬ−１０剤を投与した患者から疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得ることを含み得る。患者は、ＩＬ−１０剤療法に応答する疾患、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原反応性細胞傷害活性が病状の改善に寄与するような病状を有する任意の個体であり得る。
【０１９６】
患者は、限定するものではないが、がん；コレステロール関連疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、原生動物及び細胞内生活環を有する寄生虫などの感染性因子によって引き起こされる疾患を含むＩＬ−１０剤療法に応答する任意の病状を有していてもよい。
【０１９７】
本明細書に記載の方法によれば、病態または疾患は、がんまたはがん関連障害などの増殖性障害であり得る。特定のがんに限定されないが、がんは、結腸癌、メラノーマ及び扁平上皮癌に関連する腫瘍を含む固形腫瘍であり得るか、または血液学的障害であり得る。患者は、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管（例えば、食道、口腔咽頭、胃、小腸もしくは大腸、結腸、または直腸の癌を含むが、これらに限定されない）、腎臓、腎臓細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳（例えば、神経膠腫）、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の癌；ならびに造血系及び免疫系の癌（例えば、脾臓または胸腺）が挙げられる。特定の実施形態では、腫瘍またはがんは、結腸癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、肺癌、膠芽細胞腫、または白血病である。がん関連疾患、障害及び病態という用語（複数可）の使用は、がんに直接的または間接的に関連する状態を広く指すこと意味し、例えば、血管形成及び異形成などの前がん状態を含む。いくつかの実施形態では、がんは転移性である。
【０１９８】
ウイルス感染因子には、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及びＲＮＡウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、またはヘルペスウイルスである。いくつかの場合では、患者は、限定されないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、インフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パポバウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴリンパ球性ウイルス（ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２）、コロナウイルス、ポリオウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）などによって引き起こされるウイルス感染を有する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、患者は、以下にさらに記載するようにＩＬ−１０剤を投与した被験体であり、その病状は、ＩＬ−１０剤治療に対して少なくとも臨床部分応答を示す。治療に対する臨床応答は、任意の適切な方法を用いて測定してもよく、治療する病状によって様々に異なるであろう。
【０２００】
例えば、病態が腫瘍である場合、ＩＬ−１０剤治療に対する被験体の応答は、例えば、腫瘍負荷（例えば、腫瘍質量、腫瘍体積、腫瘍バイオマーカーの量など）及び／または治療前後の腫瘍分布を測定することによって得られる。ＩＬ−１０剤治療に対するがんを有する被験体の「臨床部分応答」は、一般的に、腫瘍のサイズの減少、または患者の体内におけるがんの程度の低下を指し、治療前に比べた、治療後の測定臨床変数（例えば、腫瘍体積及び／または腫瘍質量）の、５０％以上を含む１０％以上の、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上の、及び６０％以下を含む９９％以下の、例えば９０％以下、８０％以下、７０％以下の減少を含み得、ここで、１００％の減少は、測定した臨床変数が検出不可能なレベル及び／またはバックグラウンドレベルまで低下することを表し得る。病態のバックグラウンドレベルは、その病態を有していないことが既知の個体で得られた病態の臨床変数の平均測定値であってもよい。対照的に、がんの被験体は、ＩＬ−１０剤療法後に「安定」を呈していると称され、そこでは、選択した臨床変数（例えば、腫瘍体積及び／または腫瘍質量など）によって測定されるがんの程度または重症度は減少も増加もしない。がんの被験体は、ＩＬ−１０剤療法後の治療に対する「非応答者」として分類され、そこでは、選択した臨床変数（例えば、腫瘍体積及び／または腫瘍質量など）によって測定されるがんの程度または重症度は増加する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０剤治療に対するウイルス感染性疾患の応答は、関連する臨床測定値、例えば、ＩＬ−１０剤治療の前及び後の、ウイルス力価（例えば、血中の）、抗ウイルス抗体（例えば、血中の）、ウイルス由来核酸のレベル（例えば、ＰＣＲによって検出する血中または組織中の）を比較することによって得られる。ＩＬ−１０剤治療に対するウイルス感染の「臨床部分応答」は、測定される臨床変数（例えば、ウイルス力価、ウイルス特異的抗体力価及び／またはウイルスタンパク質力価）において、治療前に比べて治療後に、５０％以上を含む１０％以上の、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上の、及び６０％以下を含む９９％以下の、例えば９０％以下、８０％以下、７０％以下の減少を含み得、ここで、１００％の減少は、測定される臨床変数が検出不可能なレベル及び／またはバックグラウンドレベルまで低下することを表し得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０剤療法に対する少なくとも臨床部分応答は、血中または血液画分（血清／血漿）中のｑＰＣＲによって検出可能なウイルス核酸の少なくとも９０％の減少；既知のウイルス抗原（複数可）に対する抗体力価の少なくとも９０％の減少；血清中のウイルスタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡによって検出する）の少なくとも９０％の減少の１つ以上であり得る。病態のバックグラウンドレベルは、病態を有していないことが既知の個体で得られる病態の臨床変数の平均測定値であってもよい。
【０２０２】
ＩＬ−１０剤療法は、病態を治療するための上記の任意の適切なＩＬ−１０剤療法であってもよく、治療有効量のＩＬ−１０剤を患者に投与することを含む。適切なＩＬ−１０剤として、組換えヒトＩＬ−１０及びペグ化ＩＬ−１０が挙げられ、例えば、ＵＳ６，２１７，８５７；ＵＳ２００８／０３１７７０７；及びＵＳ８，６９１，２０５に記載されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０剤は、例えばＵＳ８，６９１，２０５に記載されているようなペグ化ＩＬ−１０、例えば、モノペグ化ＩＬ−１０及びジペグ化ＩＬ１０などの混合物である。投与レジメンは、病態、例えばがんまたは感染性疾患に対する治療効果を達成するための任意の適切な投薬量、投薬間隔、及び投薬期間を含み得る。いくつかの場合には、投与レジメンは、１０μｇ／Ｋｇ以上を含む０．１μｇ／Ｋｇ以上の、例えば０．５μｇ／Ｋｇ以上、１．０μｇ／Ｋｇ以上、２．０μμｇ／Ｋｇ以上、５．０μｇ／Ｋｇ以上のＩＬ−１０剤の投与量、及び２０μｇ／Ｋｇ以下を含む５０μｇ／Ｋｇ以下、例えば４０μｇ／Ｋｇ以下、３０μｇ／Ｋｇ以下の投与量を含む。いくつかの場合には、投与レジメンは、１０〜４０μｇ／Ｋｇを含む０．１〜５０μｇ／Ｋｇ、０．５〜４０μｇ／Ｋｇ、１．０〜４０μｇ／Ｋｇの範囲のＩＬ−１０剤の投与量を含む。
【０２０３】
いくつかの場合には、ＩＬ−１０剤の投与レジメンは、１日に１回またはそれより短い間隔を含む、１週間に１回またはそれより短い間隔で、例えば３日に１回またはそれより短い間隔で、２日に１回またはそれより短い間隔で、及び、１日１回またはそれより長い間隔を含む、１日３回またはそれより長い間隔で、例えば１日２回またはそれより長い間隔で投与することを含む。いくつかの場合には、投与レジメンは、１日２回〜２日に１回を含む、１日３回〜週１回、例えば１日２回〜３日に１回の範囲の間隔で投与することを含む。いくつかの場合には、ＩＬ−１０療法を、少なくとも１〜１５０日間、少なくとも５〜１００日間、少なくとも１０〜５０日間、少なくとも１５〜４５日間、少なくとも２０〜４０日間、少なくとも３０日以上、患者に投与し、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、または２９日以上の間、投与してもよい。いくつかの場合には、ＩＬ−１０剤を、３か月以上を含む数週間、例えば、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、２か月以上の間、及び３か月以下を含む５年以下、例えば１年以下、９か月以下、６か月以下の間、投与する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０療法を、４週間〜６か月間を含む２週間〜５年、例えば３週間〜１年間、４週間〜９か月間、患者に投与した。
【０２０４】
上記のように、ＩＬ−１０剤療法で治療した患者から得られる組織試料は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む任意の適切な組織試料であり得る。いくつかの場合には、組織試料は、原発腫瘍またはその転移由来の試料のような腫瘍試料である。いくつかの実施形態では、試料は末梢血試料である。いくつかの実施形態では、末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞は、患者から採取した試料、例えば末梢血試料から単離する。本明細書中で使用する場合、「末梢血」とは、個体の循環器系内を循環する血液を指す。末梢血試料は、血液の循環プールから直接採取してもよい。本開示の態様によれば、任意の適切な方法を用いて、上記のようにＩＬ−１０剤で治療した患者から、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を採取してもよい（例えば、Ｆｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ７．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．ＮＹ）。いくつかの実施形態では、試料はリンパ節試料、またはリンパ試料である。
【０２０５】
患者試験試料、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞を含む任意の適切な患者参照試料は、任意の適切な時間に患者から採取し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０剤療法の開始前に参照試料を採取し、治療開始後に試験試料を採取することが重要であり得る。患者の病態が、少なくとも安定している（安定）か、またはＩＬ−１０剤療法に対する少なくとも臨床部分応答（ＰＲ）を示した後の時点で試験試料を採取した。試験試料（及び／またはＴ細胞増殖に対する継続的なＩＬ−１０剤療法の効果の分析に関心がある場合、参照試料）を採取する時点として以下が挙げられるが、これらに限定されない：治療開始から１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、または２９日以内もしくは以後、またはそれ以降、及び、例えば、治療開始から１〜２００日、１０〜１９０日、２０〜１８０日後であってもよい。いくつかの場合では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する試料は、３か月以上を含む数週間、例えば３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、２か月以上、及び３か月以下を含む５年以下、例えば、１年以下、９か月以下、６か月以下の間のＩＬ−１０剤投与後の患者から採取してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む試料を採取する前に、ＩＬ−１０療法を、４週間〜６か月を含む２週間〜５年、例えば３週間〜１年間、４週間〜９か月、患者に投与した。
【０２０６】
いくつかの場合には、患者から採取する試料を任意の好都合な様式で処理して、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離してもよい。いくつかの場合には、試料中のリンパ球、例えば末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、リンパ球、例えばＰＢＬ上の細胞表面マーカーの発現に基づいて選別または分画して、特定のＣＤ８＋Ｔ細胞サブタイプ（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）で富化したＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を含む１つ以上の試料を提供する。選別または分画は、任意の適切な方法、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズに基づく分離などを用いて行ってもよい。
【０２０７】
試料中に含まれる及び／または患者から採取した試料から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を、活性化され、抗原特異的である任意の適切なＣＤ８＋Ｔ細胞で富化してもよい。上記のように、Ｔ細胞は、細胞表面マーカー発現、例えばＰＤ１（ＣＤ２７９としても知られる）細胞表面発現の実質的に二峰性の分布を示し得る。したがって、ＰＤ１の表面発現に基づいて活性化Ｔ細胞を同定する場合、ＰＤ１細胞表面発現のより高いピーク周辺の細胞を「ＰＤ１ｈｉｇｈ」として分類し、ＰＤ１細胞表面発現のより低いピーク周辺の細胞を「ＰＤ１ｌｏｗ」として分類する。活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣＤ８＋Ｔ細胞の集団は、ＰＤ１ｈｉｇｈ細胞とＰＤ１ｌｏｗ細胞との間に、中間の細胞集団（ＰＤ１ｍｉｄ）を含む場合があり、そこでは、ＰＤ１ｍｉｄ細胞は、ＰＤ１ｌｏｗ細胞よりも高いが、ＰＤ１ｈｉｇｈ細胞より低いレベルのＰＤ１細胞表面発現を有する。したがって、関心対象の活性化抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ１の中〜高レベルの細胞表面発現（「ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ」）を有し得る。換言すれば、活性化抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面上のＰＤ１発現が低くない（すなわち、「ＰＤ１ｌｏｗ」ではない）ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団であり得る。
【０２０８】
細胞表面マーカー、例えばＰＤ１の発現レベルを測定してもよく、所望の範囲内にある細胞表面マーカーの発現レベルを有する細胞を、任意の適切な方法、例えば、限定するものではないが、細胞表面マーカーに対する蛍光検出可能な抗体で細胞を標識し、続いてＦＡＣＳで；または磁気ビーズに基づく分離法などを用いて単離してもよい。
【０２０９】
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞用の任意の他の適切なマーカーによって定義され得る。いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯの細胞表面発現の上昇（「ＣＤ４５ＲＯ＋」）を示す。いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インターフェロン（ＩＦＮ）γを高レベルに発現する（「ＩＦＮγ＋」）。いくつかの実施形態では、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化のマーカーであるグランザイムＢ及び／またはパーフォリンの発現の上昇を示す。したがって、本開示は、ＰＤ１及びＣＤ８細胞表面発現、ならびに例えば以下のような他のマーカーの任意の組合せを企図する：
【０２１０】
１）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋；
【０２１１】
２）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋；
【０２１２】
３）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋；
【０２１３】
４）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、パーフォリン＋；
【０２１４】
５）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２１５】
６）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、グランザイムＢ＋；
【０２１６】
７）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、パーフォリン＋；
【０２１７】
８）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２１８】
９）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋；
【０２１９】
１０）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２２０】
１１）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、パーフォリン＋；または
【０２２１】
１２）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋。
【０２２２】
１３）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋；
【０２２３】
１４）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋；
【０２２４】
１５）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋；
【０２２５】
１６）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、パーフォリン＋；
【０２２６】
１７）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２２７】
１８）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、グランザイムＢ＋；
【０２２８】
１９）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、パーフォリン＋；
【０２２９】
２０）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２３０】
２１）ＬＡＧ３＋（例えば、ＬＡＧ３ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋；
【０２３１】
２２）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２３２】
２３）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、パーフォリン＋；または
【０２３３】
２４）ＰＤ１＋（例えば、ＰＤ１ｍｉｄ−ｈｉｇｈ）、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、
【０２３４】
２５）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋；
【０２３５】
２６）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋；
【０２３６】
２７）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋；
【０２３７】
２８）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、パーフォリン＋；
【０２３８】
２９）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２３９】
３０）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、グランザイムＢ＋；
【０２４０】
３１）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、パーフォリン＋；
【０２４１】
３２）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２４２】
３３）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋；
【０２４３】
３４）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、グランザイムＢ＋、パーフォリン＋；
【０２４４】
３５）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、パーフォリン＋；または
【０２４５】
３６）ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋、ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、グランザイムＢ＋、
【０２４６】
その発現を用いて、活性化及び／または抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分類及び富化し得る他の適切な細胞表面マーカーとして、限定するものではないが、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４及びＩＣＯＳの１つ以上が挙げられる（例えば、Ｇｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４  Ｍａｙ；１２４（５）：２２４６−５９参照）。
【０２４７】
疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲ分析とライブラリー作製
配列決定さらなる態様において、本開示の方法は、抗原特異的（例えば、ＰＤ１＋及び／またはＬＡＧ３＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む試料由来のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のα及びβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の配列決定を含む。配列決定は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する試料中に発現する機能的な抗原特異的ＴＣＲを構成するα及びβ鎖の可変領域中の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を決定可能な任意の適切な方法を用いて行ってもよい。適切な方法は、例えば、ＵＳ２０１４０３２２７１６、ＵＳ２０１３０２７３６４７、ＵＳ２０１５００３１０４３に記載されている（例えば、Ｈｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α  ａｎｄ  β  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７．３０１（２０１５）：３０１ｒａ１３１−３０１ｒａ１３１も参照）。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、配列決定は、ハイスループット配列決定プラットフォーム（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（登録商標）システム（例えば、ＳＯＬｉＤ（登録商標）ｖ４）；ＩｌｌｕｍｉｎａのＧＡＩＩｘ、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００及びＭｉＳｅｑ（登録商標）シーケンサー；Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）半導体配列決定プラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰａｃＢｉｏ  ＲＳ及びＳａｎｇｅｒの３７３０ｘｌ）；多様なＴＣＲ配列を増幅するように設計された適切なプライマー対；及び個々のＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するα及びβ鎖のペアを決定するために、適切なコンピュータアルゴリズムを使用することを含み得る。適切な方法は、例えば、ＵＳ２０１４０３２２７１６、ＵＳ２０１５００３１０４３に記載されており、これらの各々は、参照として本明細書に援用する。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、配列決定は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の個々の細胞を選別し、個々に選別したＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞に発現するＴＣＲのα及びβ鎖をコードするヌクレオチド配列の配列を決定することを含み得る（例えば、ＵＳ２０１３０２７３６４７；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｎｏｖ；１９（１１）：１５４２−６参照）。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、Ｔ細胞由来の核酸を配列決定する前に、患者から採取した単離ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増大させ、及び／または選択してもよい。任意の適切な方法を使用して、培養中の単離された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を増大させ、及び／または選択してもよい。
【０２５１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲのα及びβ鎖ペアをコードする核酸を配列決定した後、各鎖のＣＤＲ領域を含むα及びβ鎖のアミノ酸配列を決定してもよい。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、上記の方法によって決定するＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲのα及びβ鎖ペアのアミノ酸配列を分析することを含む。いくつかの実施形態では、分析は、ＩＬ−１０剤で治療した患者の末梢血に由来するＴＣＲ配列のα及びβ鎖ペアを、ＩＬ−１０剤治療前の患者の病理部位に由来するＴＣＲ配列の同様のα及びβ鎖ペアと比較することを含み得る。そのような分析は、ＩＬ−１０剤治療によって優先的に増大するＴ細胞上に発現する１つ以上の抗原特異的ＴＣＲを明らかにする可能性がある。病理部位は、例えば腫瘍または感染部位であってもよく、病理部位に浸潤するＴ細胞は、ＩＬ−１０剤治療前に生検によって患者から採取してもよい。
【０２５３】
いくつかの場合には、分析は、１人以上の患者由来の複数のクローンのα及び／またはβ鎖アミノ酸配列を比較し、公知または公知ではない疾患関連抗原に特異的なＴＣＲのα及び／またはβ鎖のコンセンサス一次構造を生成することを含み得る。コンセンサス一次構造は、一次構造中のアミノ酸位置に応じて様々に異なるアミノ酸配列の任意の特徴を含み得、特徴は抗原特異性に関連し得る。関心対象のコンセンサス一次構造には、α及び／またはβ鎖の長さに沿ったコンセンサス電荷分布、ならびにα及び／またはβ鎖のコンセンサスアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５４】
いくつかの場合には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲのα及びβ鎖ペアのアミノ酸配列を分析することは、多数の患者由来の複数のクローンのα及び／またはβ鎖アミノ酸配列を比較し、試料の１つ以上のパラメータに基づいて、ＴＣＲのα及び／またはβ鎖のコンセンサス一次構造を生成することを含み得る。パラメータは、患者のハプロタイプ、患者の有する疾患のタイプ（例えば、がんのタイプ、感染のタイプ）などを含むが、これらに限定されない試料の任意の適切なパラメータであり得る。例えば、いくつかの場合には、アミノ酸配列を分析することにより、患者が患者に特有の疾患または疾患抗原に対するクローンのα及び／またはβ鎖アミノ酸配列を有すること（すなわち、「プライベート」Ｔ細胞応答）を明らかにしてもよい。いくつかの場合には、アミノ酸配列を分析することにより、２人以上の患者がそれぞれ、疾患または疾患抗原（すなわち、「パブリック」Ｔ細胞応答）と類似のクローンのα及び／またはβ鎖アミノ酸配列を有することを明らかにしてもよい。
【０２５５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲのα及びβ鎖ペアのアミノ酸配列間のコンセンサス配列の分析は、任意の簡便な方法を用いて行ってもよい。適切な方法は、例えば、Ｋｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８５．８（２００２）：１０２５−１０３４；Ｔｒａｕｔｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３２．１１（２００２）：３１８１−３１９０に記載されている。通常、アミノ酸配列の分析は、ＴＣＲの抗原特異性に寄与するＴＣＲのα及びβ鎖の領域にわたって実施する。いくつかの場合では、分析は、ＴＣＲのα及びβ鎖の一方または両方の可変領域（Ｖα及びＶβ）の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３）に関して実施する。いくつかの場合には、分析は、ＴＣＲのα及びβ鎖の可変領域に関して実施する。いくつかの場合には、分析は、可変領域及び定常領域（すなわち全長α及びβ鎖ＴＣＲポリペプチド）を含むＴＣＲのα及びβ鎖の領域に関して実施する。いくつかの場合には、分析は、ＴＣＲの全長α及びβ鎖に関して実施する。
【０２５６】
抗原特異性の分析いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに選別して、公知の抗原、例えば公知の疾患抗原に特異的な、またはＴ細胞を採取した患者の疾患組織に存在する新たな抗原に特異的な細胞を同定し、単離してもよい。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して、新規疾患抗原特異的ＴＣＲα／βペア及び／または新規疾患特異的抗原を同定することができる。そのような実施形態では、疾患抗原特異性は、ＩＬ−１０剤治療の前に、患者ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む病変組織の試料を患者から採取する（例えば、固形腫瘍生検）ことによって評価することができる。この前処理試料は、アーカイブ試料として使用することができる。この前処理試料を、本明細書に記載の後処理試料と同じ処理及び分析に供し、前処理試料中のＴＣＲα及びβ配列を得ることができる。次いで、前処置試料中に存在するＴＣＲ配列を、治療後の試料（複数可）（例えば、ＩＬ−１０剤療法の開始後の異なる時点で採取した）のＴＣＲ配列と比較して、ＩＬ−１０剤治療前及びＩＬ−１０剤治療後（例えば、異なる時点で、例えば、１日目と、１日目、５日目、１０日目、１５日目、２０日目、３０日目などの１つ以上とを比較して）に疾患組織Ｔ細胞内に存在するＴＣＲα及びβ配列を同定することができる。ＩＬ−１０剤療法後に出現頻度が高まったＴＣＲα及び／またはβ配列は、ＩＬ−１０剤療法に応答して増大した、疾患組織の抗原に特異的な（例えば、腫瘍抗原特異的な）ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲとして同定される。
【０２５８】
疾患抗原結合特異性は、例えば、ＩＬ−１０剤療法後に増大した患者のＴ細胞上に存在するＴＣＲを同定することによって分析することができる。例えば、ＩＬ−１０剤治療の前に、患者ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する疾患組織または疾患関連組織の試料（例えば、固形腫瘍生検、ウイルス感染組織など）中に存在するＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのアミノ酸配列、またはコードする核酸配列を患者から採取する。この前処理試料は、アーカイブ試料として使用できる。前処理試料はＴＣＲ関連配列の供給源として使用されるため、この試料をＴ細胞の選択に供する必要はないことに留意すべきである。
【０２５９】
前処理及び後処理試料中に存在するＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドのコード核酸配列、またはアミノ酸配列を決定してもよい。ＶβＴＣＲポリペプチド配列は、通常、ＶαＴＣＲポリペプチドよりもＴＣＲ間でより多様性を示すため、この段階での配列分析は、前処理及び後処理試料中のＶβＴＣＲポリペプチド（その断片、例えば、ＶβＴＣＲのＣＤＲ３などを含む）のアミノ酸配列またはそのコードする核酸に対してのみ実施することができる。次いで、ＴＣＲα及び／またはβ配列を比較して、ＩＬ−１０剤療法の前に疾患組織に存在するＴ細胞中に存在するもの、及びＩＬ−１０剤療法後に出現頻度が高まったこれらの配列を決定することができる。ＩＬ−１０剤療法後の出現頻度が、選択したバックグラウンドレベルを超えて増加するＴＣＲ配列は、疾患組織の抗原に特異的なＴＣＲ（例えば、腫瘍抗原特異的、ウイルス抗原特異的）に関連するものとして同定され、ＩＬ−１０剤療法によって増大するＴ細胞クローン中に存在するＴＣＲを表す。
【０２６０】
同定した疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドの（例えば、ＴＣＲのＶα／Ｖβポリペプチド対を含む、Ｖα及び／またはＶβＴＣＲポリペプチドの）アミノ酸配列、コードする核酸配列、ならびにそのようなコードする核酸配列を含む構築物は、核酸及び／またはクローンのライブラリー、ならびに核酸配列及び／またはアミノ酸配列情報のデータベースに含めるうえで特に重要である。同様に、本開示は、少なくともＶβポリペプチドについての核酸及び／またはアミノ酸配列情報のデータベースの構築を提供し、場合により、Ｖαポリペプチド配列情報、ならびに前処理試料中に存在するＴ細胞のＶα／Ｖβポリペプチド対の配列情報を含むことができる。
【０２６１】
疾患抗原結合特異性は、患者の前治療疾患組織への特異的結合を評価することによって、例えば、ＩＬ−１０剤療法に応答して上方制御または誘導することによって同定されるＴＣＲα／βペアを含む組換えＴＣＲ（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）を発現するように遺伝子改変したＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的結合を試験することによって分析することができる。そのような組換えＴＣＲ、及び／またはそのような抗原のＴ細胞エピトープが結合する疾患抗原は、当該分野で公知の方法によって同定することができる。
【０２６２】
抗原が既知の抗原である場合、本方法を用いて、例えば、既知の抗原のエピトープに結合する新規Ｔ細胞エピトープ及び／または新規α／βＴＣＲポリペプチド対を同定することができる。いくつかの場合には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば既知の抗原に特異的な単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、支持体、例えば磁気ビーズ、カラムなどに複合体化した既知の抗原と接触させ、それにより既知の抗原に特異的な細胞と、特異的でない細胞とを分離してもよい。いくつかの場合には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、既知の抗原に特異的な単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、蛍光部分に複合体化した既知の抗原、及び例えばＦＡＣＳにより蛍光レベルに基づいて選別した細胞と接触させ、抗原特異的Ｔ細胞を単離してもよい。好適な方法は、例えば、ＵＳ２００６０１３４７０号に記載されており、これは参照として本明細書に援用する。任意の適切な公知の抗原を使用してもよい。いくつかの場合には、ＩＬ−１０剤療法を投与した患者ががんを有する場合、誘導したＣＤ８＋Ｔ細胞が指向する抗原は、既知の腫瘍関連抗原である。限定するものではないが、ＣＢＸ２、ＰＬＡＣ１、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＭＡＧＥＡ３、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ５、ＳＵＮＣ１、ＭＡＧＥＡ１０、ＬＲＲＮ１、ＭＡＧＥＡ９、ＷＴ１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＡ７２−４、ＳＣＣ、ＭＫ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、ＨＥＲ２、Ｇ２５０、ｇｐ−１００、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）−１、−２、及び−３、ＢＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＭＡＲＴ、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＲＰ、ＬＡＧＥ、ＧＡＧＥ、チロシナーゼ、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ、血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及びＮＹ−ＥＳＯ１を含む多種多様な腫瘍関連抗原が当該分野で公知である。いくつかの実施形態では、上記のように、ＩＬ−１０剤療法を投与した患者が感染性疾患を有する場合、公知の抗原は、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＨＩＶ  ｇｐ１２０などのウイルス抗原、または細胞内病原体由来の任意の他の公知の抗原性ペプチドである。
【０２６３】
ライブラリー。また、本明細書では、核酸構築物、例えばベクターのライブラリーを提供し、ここでライブラリーは、本明細書に記載の方法を用いて取得する複数の抗原特異的ＴＣＲα及びβ鎖ペア配列、またはその可変領域の少なくとも１つ以上を表す。いくつかの場合には、ライブラリーの各構築物は、例えばマルチシストロン構築物として、またはＣＡＲとして、抗原特異的ＴＣＲα及びβ鎖ペア配列、またはその可変領域の少なくとも１つ以上を含み得る。
【０２６４】
遺伝子改変Ｔ細胞の産生。ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲのα及びβ鎖ペアの患者特異的配列及び／またはコンセンサス配列は、以下にさらに記載するように、疾患特異的抗原を標的とし、必要とする個体（誘導したＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した患者を含むが、これに限定されない）に投与する場合に治療効果を提供するトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞集団の生成に利用できる。
【０２６５】
本方法の態様は、Ｔ細胞内でＴＣＲまたはＴＣＲ様受容体（例えば、以下にさらに記載するような、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を発現するように構成される１つ以上のベクターに、疾患抗原特異的Ｖα及びＶβＴＣＲペアのそれぞれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をクローニングすることを含み得る。核酸のクローニングは、任意の適切な方法を用いて行ってもよい。ベクターは、Ｔ細胞内で、ＴＣＲサブユニット、またはＴＣＲ様受容体、例えばＣＡＲをクローニング及び／または発現するための任意の適切なベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、多数の公知の遺伝子導入系（例えば、天然の形質転換受容性、化学的な方法による形質転換、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法、遺伝子銃による形質転換、形質移入、または接合）のいずれかによって宿主細胞に導入してもよい。選択する遺伝子導入系は、使用する宿主細胞及びベクター系に依存する。いくつかの場合には、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００９  Ｊｕｎ；２０（６）：６３０−４０参照）。
【０２６６】
いくつかの場合には、以下にさらに記載するように、単一のベクターは、例えば全長ＴＣＲとして、または一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴｖ）を含むキメラ抗原受容体として、ＴＣＲのα及びβ鎖の両方、または少なくともその可変領域を含む遺伝子産物を発現するように構成される。
【０２６７】
遺伝子改変Ｔ細胞、同細胞の産生、及び治療における使用方法
本開示は、組換え疾患抗原特異的ＴＣＲを発現する遺伝子改変Ｔ細胞の新規生成、同定、増大、産生及び使用、ならびに治療における使用方法を意図する。
【０２６８】
遺伝子組換えＴ細胞の作製
本開示は、遺伝子改変Ｔ細胞を提供し、前記Ｔ細胞は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変され、前記ＴＣＲは、可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドの１つ、２つ、及び／または３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びＶα／ＶβＴＣＲペアの可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドの１つ、２つ、及び／または３つのＣＤＲを含み、前記Ｖα／ＶβＴＣＲペアは、ＩＬ−１０剤の投与に応答して哺乳類において誘導されるＰＤ１＋，ＣＤ８＋末梢Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲ由来である。一実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞上に発現するＴＣＲは、ＩＬ−１０剤の投与に応答して哺乳類に誘導されるＣＤ８＋末梢Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲに由来するＶα／ＶβＴＣＲペアの完全長Ｖα及びＶβポリペプチドを含み得る。
【０２６９】
一実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞である。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ；人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、及びキメラ免疫受容体としても知られる）は、がん（例えば、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫の治療）及び他の悪性腫瘍の新たな治療法を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、既知の疾患抗原（例えば、関心対象の腫瘍上に存在する抗原）に特異的な組換えＴ細胞受容体を発現するように改変した自己（患者由来）または同系ドナー記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含み得る。同系ドナーＴ細胞を使用する場合、Ｔ細胞をさらに遺伝子改変し、内在性ＴＣＲの発現を破壊（例えば、ノックアウト）してもよいことに留意すべきである。本明細書で企図する他のタイプのＴ細胞として、ナイーブＴ細胞、セントラル記憶型Ｔ細胞、エフェクター記憶型Ｔ細胞、またはそれらの組合せが挙げられる。本開示は、がんの治療について、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を用いるという文脈で一般的に記載するが、そのような治療がこれに限定されないことを理解されたい。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞療法を受け入れ可能な任意の疾患、例えばウイルス感染の治療に利用できる。
【０２７０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、養子細胞移入（ＡＣＴ）の使用を含み得る。患者自身の培養Ｔ細胞を利用するＡＣＴは、患者特異的ながん療法として、有望性を示した（Ｓｎｏｏｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎ（２０１３）Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ  １５（８１）：１２０−２５）。規定された特異性の抗原標的化受容体をＴ細胞に挿入するための遺伝子工学的アプローチの使用は、ＡＣＴの潜在的能力を大きく拡大させた。ほとんどの場合、これらの改変キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用される。
【０２７１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の開始には、患者または患者との十分なＭＨＣ適合性を有するドナーからのＴ細胞の除去が含まれる。次いで、Ｔ細胞を遺伝子改変し、既知のがん（例えば、腫瘍）に特異的な抗原に対するＣＡＲを発現させる。ｅｘ  ｖｉｖｏで十分な数まで増大した後、自己細胞を患者の体内に注入して戻し、がんの抗原特異的破壊をもたらす。
【０２７２】
ＣＡＲは、通常、細胞外抗原結合部分に融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、最も一般的にはモノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなるタイプの抗原標的化受容体である。ＣＡＲは、ＭＨＣを介した提示とは無関係に細胞表面抗原を直接認識し、複数の患者において、任意の所定の抗原に特異的な単一受容体構築物の使用を可能にする。
【０２７３】
キメラ抗原受容体は、通常、いくつかの主要成分を含み、そのいくつかを以下に記載する。その抗原結合特異性が、可変アルファ（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びＶα／ＶβＴＣＲペアの可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドのＣＤＲによって提供されるキメラ抗原受容体を、本明細書中ではＣＡＲ−Ｔと称し、そのようなＣＡＲ−Ｔ構築物を含む遺伝子改変Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞と称する。そのようなＣＡＲ−Ｔ構築物の抗原結合部分を、本明細書中では一本鎖Ｔ細胞受容体、すなわち「ｓｃＴｖ」と称する場合がある。
【０２７４】
本明細書中で使用する場合、語句「抗原特異的標的化領域」（ＡＳＴＲ）とは、ＣＡＲを特異的抗原に指向させる領域を指す。ＣＡＲの標的化領域は細胞外である。本開示の特定の実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原を標的とする少なくとも２つの標的化領域を含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つ以上の異なる抗原を標的とする３つ以上の標的化領域を含む。
【０２７５】
本開示に関して、ＣＡＲ−ＴのＡＳＴＲは、１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲは、可変α（Ｖα）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチドのＣＤＲに対応する配列を有し、及び前記ＡＳＴＲは、１つ、２つまたは３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲは、ＩＬ−１０剤の投与に応答して哺乳類に誘導されるＣＤ８＋末梢Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲのＶα／ＶβＴＣＲペアの可変β（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドのＣＤＲに対応する配列を有する。一実施形態では、ＣＡＲ−ＴのＡＳＴＲは、ＩＬ−１０剤の投与に応答して哺乳類に誘導されるＣＤ８＋末梢Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲに由来するＶα／ＶβＴＣＲペアの全長Ｖα及びＶβポリペプチドを含む。別の実施形態では、ＣＡＲ−ＴのＡＳＴＲは、ＩＬ−１０剤の投与に応答して哺乳類に誘導されるＣＤ８＋末梢Ｔ細胞の疾患抗原特異的ＴＣＲに由来するＶα／ＶβＴＣＲペアと９０％以上の配列相同性を有するＶα及びＶβポリペプチドを含む。
【０２７６】
通常、ＡＳＴＲは、Ｖαポリペプチドに作動可能に連結した（例えば、ペプチドリンカーを介して）Ｖβポリペプチドを含む一本鎖ポリペプチドを含み、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）のＡＳＴＲを提供する。例えば、ｓｃＴｖのＡＳＴＲは、Ｎ末端からＣ末端方向に、Ｖβポリペプチド−リンカー−Ｖαポリペプチドの一般構造を有していてもよい。ｓｃＴｖのＡＳＴＲのＶαポリペプチドのＣ末端をｓｃＴＶの追加成分に作動可能に融合させてもよく、例えばＮ末端からＣ末端方向に、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインであり、その各々の例を以下に示す。ｓｃＴＶの産生方法は、当該分野において記載されており、例えば、ＵＳ２０１２／０２５２７４２を参照されたい。本開示はまた、ｓｃＴｖのＡＳＴＲを含む可溶性ポリペプチド（「可溶性ｓｃＴｖ」）を企図する。そのような場合、これらのポリペプチドは、例えば、ｓｃＴｖのＡＳＴＲのＶβポリペプチドのＮ末端に融合したヒト血清アルブミンなどの溶解性を促進するポリペプチドを含む。
【０２７７】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞外スペーサードメイン」（ＥＳＤ）とは、抗原特異的標的化領域と膜貫通ドメインとの間のＣＡＲの親水性領域を指す。本開示は、ＣＡＲ−ＴがＥＳＤを含む実施形態を企図し、その例として、例えば、ＵＳ２０１２／０２５２７４２に記載されるようなＣＤ８及び他のドメインのヒンジ領域；ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４など）のＧｌｙ３またはＣＨ１及びＣＨ３ドメインを含む人工的スペーサー配列；またはこれらの組合せが挙げられる。当業者であれば、本明細書中で企図する他のＥＳＤを認識している。
【０２７８】
本明細書中で使用する場合、用語「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ）とは、原形質膜を横断するＣＡＲの領域を指す。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列、またはこれらの組合せである。当業者であれば、本開示の記載とともに使用し得る他の膜貫通ドメインを認識している。
【０２７９】
本明細書中で使用する場合、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」（ＩＳＤ）及び「細胞質ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、その特化した機能を細胞に行わせるＣＡＲの部分を指す。ＩＳＤの例として、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはその任意の相同体（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（δ、Δ及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）及びＴ細胞形質導入に関与する他の分子、例えばＣＤ２、ＣＤ５及びＣＤ２８が挙げられる。当業者であれば、本開示の記載とともに使用し得る他のＩＳＤを認識している。
【０２８０】
用語「同時刺激ドメイン」（ＣＳＤ）とは、記憶細胞の増殖、生存または発達を促進するＣＡＲの部分を指す。本明細書中の他の箇所に示すように、本開示のＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインを含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、ＣＳＤには、ＴＮＦＲスーパーファミリーの１つ以上のメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−１、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０またはこれらの組合せが含まれる。当業者であれば、本開示の記載とともに使用し得る他の同時刺激ドメインを認識している。
【０２８１】
本明細書中に記載するＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞技術とともに使用する場合、用語「リンカー」、「リンカードメイン」及び「リンカー領域」とは、本開示のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを共に連結する約１〜１００アミノ酸長のオリゴまたはポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に動くように、グリシン及びセリンなどの自由度の高い残基から構成され得る。特定の実施形態は、２つの隣接するドメインが相互に立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合に、より長いリンカーを使用することを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは切断不能であるが、他の実施形態では切断可能である（例えば、２Ａリンカー（例えばＴ２Ａ））、２Ａ様リンカーまたはその機能的均等物、及び上記の組合せ。本開示の実施形態は、リンカーに、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルス（Ｐ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ配列、またはそれらの組合せ、変異体及び機能的均等物が含まれることを企図する。さらなる実施形態では、リンカー配列は、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間の切断をもたらすＡｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（２Ａ）−ｐｒｏ（２Ｂ）モチーフを含む。他のリンカーは、当業者には容易に明らかであり、本開示の教示とともに使用することが意図される。
【０２８２】
治療における遺伝子改変Ｔ細胞の使用方法
記載する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）は、単独で、または他の治療剤との組合せで、ＣＤ８＋細胞療法を受け入れ可能な疾患の治療に有用である。一般的に、遺伝子改変Ｔ細胞（複数可）（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）は、治療対象の疾患に従って選択する。
【０２８３】
本開示の方法は、ＣＤ８＋細胞療法による治療を受け入れ可能な疾患に罹患している哺乳類被験体に、１つ以上の選択した遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を投与することを企図する。
【０２８４】
一実施形態では、ＣＤ８＋細胞治療による治療を受け入れ可能な疾患に罹患している哺乳類被験体に投与する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、同一の組換えＴＣＲを発現する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団である。別の実施形態では、ＣＤ８＋細胞治療による治療を受け入れ可能な疾患に罹患している哺乳類被験体に投与する遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面上に発現する疾患抗原特異的ＴＣＲに対して異種である。この後者のアプローチでは、集団中の遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるＶα／ＶβＴＣＲペアを、同一の疾患抗原（例えば、同じ抗原の異なるエピトープ）または異なる疾患抗原に結合するように選択してもよい。
【０２８５】
本開示によって企図される、場合により併用療法での遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）の投与を含む治療には、がん、例えば、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、胃腸管（食道、中咽頭、胃、小腸または大腸、結腸、または直腸）、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳（例えば神経膠腫）、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）、ならびに造血系及び免疫系（例えば、脾臓または胸腺）の癌を含む増殖性疾患、障害または病態の治療または予防が含まれる。本開示はまた、例えば、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、潜伏腫瘍、ウイルス誘発性癌（例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌、及びパピローマウイルス）、腺癌、リンパ腫、癌腫、メラノーマ、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、化学的に誘導される癌、転移、及び血管新生を含む、他のがん関連疾患、障害または病態の治療または予防方法も提供する。本開示は、例えば、調節性Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を調節することによって、腫瘍細胞またはがん細胞抗原に対する忍容性を低下させることを意図する（例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３１８０−８７；及びＳａｗａｙａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：１５０１−０９参照）。特定の実施形態では、腫瘍またはがんは、結腸癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、肺癌、神経膠芽腫、または白血病である。がん関連疾患、障害及び病態という用語（複数可）の使用は、がんに直接的または間接的に関連する状態を広く指すことを意味するものであり、例えば、血管新生及び前癌状態、例えば異形成などを包含する。
【０２８６】
本開示はまた、ウイルス感染によって引き起こされる疾患を治療または予防するために、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法）を、場合により併用療法で使用することを企図する。ウイルス剤の例には、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）及びＲＮＡウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、レトロウイルス、またはヘルペスウイルスである。いくつかの場合には、疾患は、限定するものではないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、インフルエンザ、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、アデノウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−Ｉ）、単純ヘルペスウイルスＩＩ型（ＨＳＶ−ＩＩ）、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パポバウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、及びヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、ヒトＴリンパ球性ウイルス（ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２）、コロナウイルス、ポリオウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）などによって引き起こされ得る。
【０２８７】
併用療法
本開示はまた、遺伝子改変Ｔ細胞単独療法ならびに併用療法の両方を企図する。例えば、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞を、単独で、または遺伝子改変Ｔ細胞を用いた併用療法に使用してもよい１つ以上の活性剤（例えば、化学療法剤）または他の予防的もしくは治療的非薬理学的様式（例えば、局在化放射線療法または放射線全身照射療法）と併用して哺乳類被験体に投与してもよい。一例として、本開示は、本明細書に記載するように、放射フェイズが１つ以上のさらなる療法（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法、及び場合により、ＩＬ−１０剤の投与）または治療剤による治療に先行するか、または後に続く、治療レジメンを企図する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法及びＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、または他の種類の移植療法と併用して使用することをさらに意図する。
【０２８８】
本明細書中で使用する場合、「併用療法」とは、別々に投与するかまたは導入可能な、例えば、別々に投与するために別々に製剤化（例えば、キットで提供してもよい）可能な療法、及び一緒に投与または導入可能な療法を含むことを意味する。特定の実施形態では、例えば１つ以上の他の薬剤に先行して１つの薬剤を投与する場合、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）及び／または他の薬剤（複数可）を連続的に投与または塗布する。他の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）及び他の薬剤（複数可）を同時に投与し、そこでは、例えば、２つ以上の薬剤を同時に、またはほぼ同時に投与し；２つ以上の薬剤は、２つ以上の別個の製剤中に存在してもよく、または単一の製剤に組み合わせてもよい（すなわち、合剤）。薬剤を連続的に投与するかまたは同時に投与するかにかかわらず、それらは本開示の目的のために併用投与されるとみなされる。
【０２８９】
本開示の遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）は、状況に応じて適切な方法で、少なくとも１つの他の活性薬剤と併用してもよい。一実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）による、場合によりＩＬ−１０剤及び／または他の薬剤（複数可）による治療を、ある期間にわたって維持する。別の実施形態では、少なくとも１つの他の薬剤（複数可）による治療を低減させるか、または中止し（例えば、被験体が安定している場合）、一方、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）による、場合によりＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）による治療を、一定の投薬レジメンで維持する。さらなる実施形態では、他の薬剤（複数可）による治療を低減させるか、または中止し（例えば、被験体が安定している場合）、一方、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）、及び場合によりＩＬ−１０剤による治療を低減させる（例えば、より低い用量、より少ない投薬頻度、またはより短い治療レジメン）。さらに別の実施形態では、他の薬剤（複数可）による治療を、低減するか、または中止し（例えば、被験体が安定している場合）、及び遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）による、場合によりＩＬ−１０剤による治療を増加させる（例えば、より高い用量、より多くの投薬頻度、またはより長い治療レジメン）。さらに別の実施形態では、他の薬剤（複数可）による治療を維持し、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）、及び場合によりＩＬ−１０剤による治療を、低減させるか、または中止する（例えば、より少ない用量、より少ない投薬頻度、またはより短い治療レジメン）。さらに別の実施形態では、他の薬剤（複数可）による治療及び本開示のＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）による治療を、低減させるか、または中止し（例えば、より少ない用量、より少ない投薬頻度、またはより短い治療レジメン）、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）による治療を維持する。
【０２９０】
本明細書に記載する遺伝子改変Ｔ細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法など）と併せて、本開示は、増殖状態、がん、腫瘍、または前癌性疾患、障害もしくは病態の抗原に特異的なＴＣＲを有する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）、及び場合によりＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）、及び場合により所望の活性を示す少なくとも１つの追加の治療剤または予防剤（複数可）または診断剤による、増殖状態、がん、腫瘍、または前癌性疾患、障害もしくは病態の治療及び／または予防方法を提供する。本開示のいくつかの実施形態は、従来の化学療法剤（例えば、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、抗生物質、代謝拮抗物質、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、抗ホルモン剤及びタキソイド）の使用を企図する。本開示の他の実施形態は、シグナル伝達阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣもしくはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）または免疫調節剤と併用して本明細書に記載するＩＬ−１０剤を投与し、腫瘍増殖の相加的または相乗的抑制を達成することを含む、腫瘍抑制または腫瘍増殖の方法を企図する。
【０２９１】
本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法としての遺伝子改変Ｔ細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法など）と併せて、本開示はまた、感染性ウイルスの抗原に特異的なＴＣＲを有する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）を投与することによるウイルス感染の治療方法を提供する。そのような療法は、ＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）、及び／または抗ウイルス剤の投与を含み得る。
【０２９２】
医薬組成物
遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）またはＩＬ−１０剤などの治療剤を被験体に投与する場合、本開示は、被験体への投与に適した任意の形態の組成物の使用を意図する。通常、そのような組成物は、治療剤（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）またはＩＬ−１０）及び１つ以上の薬学的に許容可能な、または生理学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む「医薬組成物」である。医薬組成物は、本開示の方法において使用することができ；したがって、例えば、本明細書に記載する治療方法及び予防方法及び使用を実施するために、医薬組成物をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで被験体に投与することができる。
【０２９３】
本開示の医薬組成物は、意図する投与方法または投与経路に適合するように製剤化することができ；例示的な投与経路を本明細書に記載する。さらに、医薬組成物は、本開示によって企図される疾患、障害及び病態を治療または予防するために、本明細書に記載する他の治療活性物質または化合物と併用することができる。
【０２９４】
医薬組成物は、通常、本開示によって企図される治療有効量の治療剤（例えば、遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）またはＩＬ−１０剤）及び１つ以上の薬学的及び生理学的に許容可能な製剤を含む。適切な薬学的に許容可能な、または生理学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤として、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸及び硫酸水素ナトリウム）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸）、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、洗浄剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤、及び／またはアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、適切なビヒクルは、場合により非経口投与用の医薬組成物に一般的な他の物質を補充した生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水であり得る。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。当業者であれば、本明細書で企図される医薬組成物及び剤形において使用可能な様々な緩衝剤を容易に認識するであろう。一般的な緩衝剤として、薬学的に許容可能な弱酸、弱塩基、またはその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、緩衝成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びその塩などの水溶性物質であり得る。許容可能な緩衝剤として、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及びＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９５】
医薬組成物を製剤化した後、それをバイアルまたはシリンジなどの滅菌容器に保存することができる。いくつかの実施形態では、適切な場合には、医薬組成物は、使い捨て容器（例えば、単回使用のバイアル、アンプル、シリンジ、または自動注入装置（ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似））で提供されるが、他の実施形態では、再使用式容器（例えば、再使用式バイアル）で提供される。ＩＬ−１０剤について、インプラント（例えば、移植可能なポンプ）及びカテーテルシステム、低速注入ポンプ及びデバイスを含む任意の薬物送達装置を使用してＩＬ−１０を送達することができ、これらのすべては当業者に公知である。通常、皮下または筋肉内に投与するデポー注射もまた、規定する期間にわたって本明細書に開示するポリペプチドを放出するために利用することができる。デポー注射は、通常、固形または油性のものであり、一般的に、本明細書に記載の製剤成分の少なくとも１つを含む。当業者であれば、可能な製剤及びデポー注射の使用に精通している。
【０２９６】
医薬組成物は、滅菌注射用の水性または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、本明細書に記載するそれらの適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いて、公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として存在し得る。利用できる許容可能な希釈剤、溶媒及び分散媒体として、水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの適切な混合物が挙げられる。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の低刺激性の不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射剤の調製に用いられる。吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含めることによって、特定の注射可能な製剤の持続的な吸収を達成することができる。
【０２９７】
製剤はまた、インプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ及びマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放製剤などの迅速な分解または身体からの除去から組成物を保護するための担体を含むこともできる。
【０２９８】
キット
本開示はまた、標的疾患の抗原に特異的なＴＣＲを有する遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）、所望によりＩＬ−１０剤（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）を含み、及びその医薬組成物を含むキットも企図する。キットは、一般的に、以下に記載するように、様々な構成要素を収容する物理的構造の形態であり、例えば上記方法の実施において利用することができる。
【０２９９】
キットは、本明細書中に開示するような遺伝子改変Ｔ細胞の産生に使用するための所望の疾患抗原特異的ＴＣＲをコードする遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞）及び／または構築物（複数可）を含むことができ（例えば、滅菌容器中に提供される）、これは被験体への投与に適した医薬組成物の形態であり得る。提供する場合、ＩＬ−１０剤は、即時使用可能な形態で、または例えば投与前に再構成または希釈が必要な形態で提供され得る。ＩＬ−１０剤が、使用者によって再構成される必要がある形態である場合、キットは、ＩＬ−１０剤に同梱または別添された緩衝剤、薬学的に許容可能な賦形剤なども含むことができる。キットは、ＩＬ−１０剤及び／または使用する特定のＣＡＲ−Ｔ  Ｔ細胞療法の成分の両方を含むこともでき；キットはいくつかの薬剤を別々に含み得るか、またはそれらをキット内であらかじめ組み合わせることができる。本開示のキットは、そこに収容される構成要素を適切に維持するために必要な条件（例えば、冷凍または凍結）のために設計することができる。
【０３００】
キットは、キット内の構成要素の識別情報及びそれらの使用説明書（例えば、投薬パラメータ、作用機序（複数可）、薬物動態学及び薬力学、副作用、禁忌などを含む有効成分（複数可）の臨床薬理学）を含むラベルまたはパッケージングインサートを含むことができる。キットの各構成要素は、個々の容器内に封入することができ、様々な容器はすべて単一のパッケージ内に入れることができる。ラベルまたはインサートには、ロット番号や有効期限などの製造元情報を含めることができる。ラベルまたはパッケージングインサートは、例えば、構成要素を収容する物理的構造に組み込むか、物理的構造内に別々に収容するか、またはキットの構成要素（例えば、アンプル、シリンジまたはバイアル）に固定することができる。
【０３０１】
ラベルまたはインサートは、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）、ＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなどの光ディスク、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、またはＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気的記憶媒体、またはこれらのハイブリッド、例えば磁気／光記憶媒体、フラッシュ媒体もしくはメモリ型カードをさらに含むか、またはそれらに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、実際の説明書はキット内に存在しないが、例えばインターネットサイトを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。
【実施例】
【０３０２】
以下の実施例は、本発明を製造及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者が自らの発明と見なすものの範囲を限定するものではなく、以下の実験が実施され、それらが実施可能な実験のすべてであることを表明することを意図するものでもない。なお、現時点で記載されている例示的な記述は必ずしも実施する必要はなく、そこに記載されているデータ等を生成するための記述が可能であることは理解されたい。使用する数（例えば、量、温度など）に関して正確さを保つための努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。
【０３０３】
他に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い圧である。以下のような標準的な略語を使用する：ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数可）；ｍｉｎ＝分（複数可）；ｈまたはｈｒ＝時間（複数可）；ａａ＝アミノ酸（複数可）；ｂｐ＝塩基対（複数可）；ｋｂ＝キロベース（複数可）；ｎｔ＝ヌクレオチド（複数可）；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル；μｌまたはμＬ＝マイクロリットル；ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル；ｌまたはＬ＝リットル；ｎＭ＝ナノモル；μＭ＝マイクロモル；ｍＭ＝ミリモル；Ｍ＝モル；ｋＤａ＝キロダルトン；ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）；ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）；ＳＣまたはＳＱ＝皮下（に）；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝ユニット；ｎｓ＝統計的に有意ではない；ＰＭＡ＝ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート；ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地；ＰＢＭＣ＝初代末梢血単核球；ＦＢＳ＝ウシ胎仔血清；ＦＣＳ＝ウシ胎仔血清；ＨＥＰＥＳ＝４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＬＰＳ＝リポ多糖類；ＲＰＭＩ＝ロズウェルパーク記念研究所培地；ＡＰＣ＝抗原提示細胞；ＦＡＣＳ＝蛍光標識細胞分取。
【０３０４】
材料及び方法以下の実施例において、以下の一般的な材料及び方法を、表記されている場合には使用し、または使用し得る：
【０３０５】
分子生物学的方法  分子生物学における標準的な方法は、科学文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．参照。前記文献は、細菌細胞におけるクローニング及びＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞及び酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質及びタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）について記載している）。
【０３０６】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生、精製、及び断片化が記載されている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ参照）；蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ参照）；及び、例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマー及びプローブ、ポリペプチド、及び抗体を含む核酸の改変に適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）。抗体のさらなる考察を、本明細書の他の箇所に示す。
【０３０７】
ソフトウェア  例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージ及びデータベースが利用可能である（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；及びＤｅＣｙｐｈｅｒ（商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，ＮＶ）参照。
【０３０８】
ペグ化  本明細書に記載するペグ化ＩＬ−１０は、当業者に公知の任意の手段によって合成してもよい。モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０及びモノ／ジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物を製造するための例示的な合成スキームが記載されている（例えば、米国特許第７，０５２，６８６号；米国特許出願公開第２０１１／０２５０１６３号；ＷＯ２０１０／０７７８５３参照）。本開示の特定の実施形態は、選択的にＰＥＧ化されたモノ−及びジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物を含む。本開示の実施に適したＰＥＧの製造及び使用（及び他の薬物送達技術）における当業者自身の技能を活用することに加えて、当業者は、ＰＥＧ関連技術の多くの商品製造業者（例えば、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）及びＰａｒｃｈｅｍ（Ｎｅｗ  Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，ＮＹ））に精通している。
【０３０９】
動物  本開示の記載と併せて、当業者に公知の様々なマウス及び他の動物株を使用することができる。例えば、免疫適格性のＢａｌｂ／ＣまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから入手し、標準的な手順に従って使用することができる（例えば、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９（１１）：７０６７−７３及びＣｏｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４（６）：６８１−８９参照）。
【０３１０】
ＩＬ−１０濃度  血清ＩＬ−１０濃度レベル及び曝露レベルは、当該技術分野で使用される標準的な方法によって決定することができる。例えば、実験の被験体がマウスである場合、マウス尾小片から全血（約５０μＬ／マウス）を平滑キャピラリーチューブに収集し、遠心分離によって血清と血液細胞を分離し、標準的なＥＬＩＳＡキット及び技術によってＩＬ−１０曝露レベルを決定することによって、血清曝露レベルアッセイを実施することができる。
【０３１１】
ＦＡＣＳ分析  ＦＡＣＳ分析のための多数のプロトコール、材料及び試薬が市販されており、本明細書に記載するものと併せて使用してもよい（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｆｏｒｄ，ＭＡ；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。直接的フローサイトメトリー（すなわち、複合体化一次抗体を用いる）及び間接的フローサイトメトリー（すなわち、一次抗体及び複合体化二次抗体を用いる）の両方を使用してもよい。例示的な直接フロープロトコールは、以下の通りである：採取した細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウム中で１〜５×１０６細胞／ｍＬの濃度に細胞懸濁液を調整する。細胞を、ポリスチレン丸底１２×７５ｍｍ２ファルコンチューブ中で染色してもよい。細胞を十分に遠心分離し、細胞の喪失を最小限に留めるが細胞の再懸濁が困難になるほどではない程度に上清液を除去してもよい。一次標識抗体を添加してもよく（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）、必要に応じて３％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈してもよい。４℃で少なくとも３０分間インキュベートした後、細胞を４００ｇで５分間遠心分離して３回洗浄し、次いで０．５〜１ｍＬの氷冷ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウム中に再懸濁してもよい。細胞は分析する時まで（好ましくは同日以内に）氷上で暗所に維持してもよい。細胞を標準的な方法論を用いて固定し、数日間保存してもよく；異なる抗原に対する固定は、抗原特異的最適化を必要とし得る。
【０３１２】
以下に記載するアッセイは代表的なものであり、排他的なものではない。
【０３１３】
組換えマウスＩＬ−１０（ｒＭｕＩＬ−１０）、ペグ化ｒＭｕＩＬ−１０（ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０）、ペグ化ｒＨｕＩＬ−１０（ＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０）  以下の実施例で使用するＰＥＧ化ＩＬ−１０は、特許文献（例えば、ＵＳ８，６９１，２０５）に記載されているようなモノ／ジＰＥＧ−ＩＬ−１０ミックスの混合物であった。モノ／ジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０混合物の製造のための合成スキームの２つの例を以下に示す：
【０３１４】
ペグ化ＩＬ−１０合成スキーム１  ＩＬ−１０（例えばマウスまたはヒト）を５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５〜７．４に対して透析する。モル比１：１〜１：７の５ｋＤａ  ＰＥＧ−プロピルアルデヒドを、０．７５〜３０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で１〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度でＩＬ−１０と反応させる。あるいは、ピコリンボランを用いて同様の方法で反応を活性化することができる。反応物を５〜３０℃で３〜２４時間インキュベートする。ペグ化反応のｐＨを６．３に調整し、７．５ｍｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０をＰＥＧと反応させて、ＩＬ−１０対ＰＥＧリンカーの比を１：３．５にする。シアノ水素化ホウ素の最終濃度は約２５ｍＭであり、反応を１５℃で１２〜１５時間行う。モノ−及びジ−ＰＥＧ  ＩＬ−１０は反応の最大産物であり、それぞれの濃度は終結時に約５０％である。反応は、グリシンまたはリジンなどのアミノ酸、あるいはトリス緩衝液を用いてクエンチしてもよい。ゲル濾過、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、ならびにサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）などの複数の精製方法を用いて所望のペグ化ＩＬ−１０分子を単離することができる。
【０３１５】
ペグ化ＩＬ−１０合成スキーム２  ＩＬ−１０（例えば、マウスまたはヒト）を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析する。透析したＩＬ−１０を、透析緩衝液を用いて３．２倍に希釈し、約０．５〜１２ｍｇ／ｍＬの濃度にする。リンカーを添加する前に、ＳＣ−ＰＥＧ−１２ｋＤａ（Ｄｅｌｍａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｙｗｏｏｄ、ＩＬ）及び１容量の１００ｍＭ  Ｎａ−四ホウ酸塩をｐＨ９．１で９倍量の希釈したＩＬ−１０に添加して、ＩＬ−１０溶液のｐＨを８．６に調整した。ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを透析緩衝液に溶解し、適切な容量のリンカー溶液（ＩＬ−１０のモル量あたり１．８〜３．６モルのリンカー）を希釈したＩＬ−１０溶液に加えてペグ化反応を開始させる。速度を制御するために反応を５℃で実施し、反応溶液を穏やかに撹拌する。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によって測定するモノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０の収率が４０％に近づいた段階で、１Ｍグリシン溶液を終濃度３０ｍＭとなるまで加え、反応を停止させる。ＨＣｌ溶液を用いて反応溶液のｐＨを７．０に緩やかに調整し、反応物を０．２μｍのフィルターで濾過し、−８０℃で保存する。０．０５％ＭＳＡを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中にＰＥＧ−ＩＬ−１０を０．７５〜１．０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。
【０３１６】
本明細書中で使用するモノ−及びジ−ＰＥＧ化ｒＨｕＩＬ−１０の混合物を、ＡＭ００１０と称する場合があり、５ｋＤａ  ＰＥＧ及びＰＰＡリンカーを用いてこれを合成し、また、上記スキーム１に示すように合成することができる。
【０３１７】
マウスＣＤ８＋Ｔ細胞の単離及びＩＬ−１０治療：マウスＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ１マウス（Ｃ５６Ｂ１／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＭＥ）から磁気的に単離し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）、１００〜１０００ＩＵ／ｍＬ  ｒＭｕＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）中で７〜１０日間培養した。ＯＴ１  Ｔ細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で３日間活性化し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３５）ペプチド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の存在下で外因的にパルスした自己骨髄細胞で再刺激した。再刺激の３日後、細胞を記載の濃度のｒＭｕＩＬ−１０に５日間曝露した。次いで、細胞を洗浄し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）の存在下でパルスしたＰＤＶ６細胞に曝露した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）について、製造元の説明書に従って細胞溶解率を測定した。
【０３１８】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の単離及びＩＬ−１０治療：正常な「健康な」ヒトメラノーマ腫瘍生検からヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気的に単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）。腫瘍細胞を６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で培養し、Ｔ細胞を２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ）で別々に培養した。１００〜１０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を補充した完全ＲＰＭＩ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）で培養し、５〜７日ごとに再度栄養補給した。加熱溶解させた腫瘍細胞抗原でＴ細胞を再刺激し、これを１０〜１２日ごとに外因的にＴＴ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８０３、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に添加して抗原提示細胞として機能させた。再刺激の３日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を洗浄し、記載濃度のｒＨｕＩＬ−１０に５日間曝露した。細胞を洗浄し、標識した同種腫瘍細胞Ｃｒ５１（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ａ３７５腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１９、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）またはＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）に、記載したエフェクター対標的比で加え、標準的な４時間クロム放出アッセイを行った。
【０３１９】
ＥＬＩＳＰＯＴ：記載したＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０（Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）投与後、ＣＴ２６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８）腫瘍保有マウスから磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によりマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。細胞を洗浄し、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）あたり１０００〜５０００個の細胞を三連で播種した。何も含まないか、１μｇ／  ｍＬの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１００〜５００のＣＴ２６、または１００〜５００の４Ｔ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３９）を含むウェルを、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に１時間、予め曝露した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、製造元の説明書に従って発色させた。ＣＴＬ（Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザーを用いてプレート画像を捕捉し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてスポットを定量した。
【０３２０】
［ｑＰＣＲ］：Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ及びＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔをそれぞれ用いて、製造元の説明書に従って、ＲＮＡを抽出し、単離したＣＤ８＋Ｔ細胞からｃＤＮＡを合成する。製造元のプロトコールに従って、ＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ及びＱｉａｇｅｎのプライマーを用いて、ｃＤＮＡ鋳型上で定量的ＰＣＲを実施する。Ｃｔ値は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＵＳＢ及びＧＡＰＤＨの平均Ｃｔ値に対して正規化する。
【０３２１】
［ＣＴ２６腫瘍モデル］：４〜６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、１×１０５個のＣＴ２６細胞（ＣＲＬ−２６３８；ＡＴＣＣ）を１００μＬの容量で、この動物の右下側の側腹部の皮下に移植した。触知可能になった後は、腫瘍の成長を週２回測定した。腫瘍体積は、式（幅２×長さ／２）を用いて計算し、式中、長さは長手方向の寸法である。腫瘍の体積が平均７５ｍｍ３に達した場合、その動物を層別化した。５匹のマウス／コホートに、ビヒクルまたはペグ化組換えＩＬ−１０（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を毎日、２８日間にわたって皮下投与した。２８日間の投与後、組織及び腫瘍分析のために各群のマウスを安楽死させた。
【０３２２】
［４Ｔ１腫瘍モデル］：４〜６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスに、１×１０４個の４Ｔ１細胞（ＣＲＬ−２５３９；ＡＴＣＣ）を１００μＬの容量で、この動物の右下側の側腹部の皮下に移植した。触知可能になった後は、腫瘍の成長を週２回測定した。腫瘍体積は、式（幅２×長さ／２）を用いて計算し、式中、長さは長手方向の寸法である。腫瘍の体積が平均７５ｍｍ３に達した場合、その動物を層別化した。５匹のマウス／コホートに、ビヒクルまたはペグ化組換えＩＬ−１０（ＡＲＭＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を毎日、２８日間にわたって皮下投与した。２８日間の投与後、組織及び腫瘍分析のために各群のマウスを安楽死させた。
【０３２３】
［腫瘍浸潤性リンパ球の単離］：腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を単離するために、５ｍＬの消化緩衝液（ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）、３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）でミンチ状にし、消化緩衝液で３５ｍＬの最終容量にした。腫瘍のスラリーを３７℃で４５分間、回転させた。次いで、物質を７０μｍの細胞ストレーナに通すことにより、腫瘍スラリーを機械的に破壊した。細胞をＲＰＭＩで２回洗浄し、次いで２５ｍＬのＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再懸濁した。細胞懸濁液を１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の下層に配し、ブレーキを停止させたうえで、室温で３０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、ＴＩＬを含有する細胞界面を回収し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄した。次いで、ＭＡＣＳ細胞分離技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて製造元のプロトコールに従ってＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離したＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗体染色及びフローサイトメトリー分析の前に、１ｍＬの細胞あたり１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び１μＬのＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で１０時間処理した。
【０３２４】
［活性化誘導細胞死アッセイ］：例示的な活性化誘導細胞死アッセイは、以下のプロトコールを用いて行うことができる。ヒト初代末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、標準的なプロトコールに従って単離した（例えば、Ｆｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ７．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ参照）。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの抗ＣＤ４５ＲＯ  ＭＡＣＳビーズ及びＭＡＣＳ細胞分離技術を製造元のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４５ＲＯは記憶Ｔ細胞のマーカーである。細胞を活性化するために、１ｍＬの単離した細胞（３×１０６細胞／ｍＬの密度で）を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でプレコーティングした標準的な２４ウェルプレート（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中のＡＩＭ  Ｖ培地中で３日間（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培養した。２４ウェルプレートを抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でプレコーティングするために、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を含有する３００μＬの炭酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ  ８．３）を、各ウェル中で３７℃、２時間インキュベートし、次いで各ウェルをＡＩＭ  Ｖ培地で洗浄した。３日間の活性化の後、細胞を回収し、計数し、標準２４ウェルプレート中の１ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地（２×１０６細胞／ｍＬの密度で）に再プレーティングし、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＰＥＧ化ＩＬ−１０で３日間処理した。次に、上記のヒトＰＥＧ化ＩＬ−１０による活性化及び処理を繰り返し、その後、製造元の手順書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ除外によって生存細胞を計数するか、またはフローサイトメトリー分析のために染色した。
【０３２５】
［フローサイトメトリー］：抗マウスＩＦＮγ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＰＤ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）抗体を用いて、製造元のプロトコールに従って、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｐｌｕｓ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、単離したマウス腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞を染色した。以下の実験における分析のために、「ＰＤ１＋ｍｉｄ」細胞は、通常、およそ３０００のフローサイトメトリーによる平均チャネル蛍光検出をもたらすレベルの細胞表面ＰＤ１を発現し、一方、低いＰＤ１発現（「ＰＤ１＋ｌｏｗ」）は  およそ２００の平均チャネル蛍光検出で表され、「ＰＤ１＋ｈｉｇｈ」発現は、およそ９０００の平均チャネル蛍光検出で表される。
【０３２６】
［ＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０療法及び腫瘍縮小効果の評価］ヒトメラノーマ患者を、腹部へのＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０（ＡＭ００１０）の毎日の皮下自己注射により治療した。治療上活性な用量は、５〜２０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。進行性疾患（ＰＤ）、安定疾患（ＳＤ）及び部分奏効（ＰＲ）をコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンによって評価した。ＡＭ００１０の投与前及び投与開始後６〜７週の間隔で患者を１日目にスキャンした。全身ＣＴスキャンを用いて、腫瘍の位置及び腫瘍の大きさの変化を評価した。標的病変を決定し、各スキャン時点で腫瘍塊の最大断面積を測定した。標的病変は、放射線科医及び腫瘍専門医の両者によって評価する。最大の横断面総体積（２次元で測定）が１つのスキャンから次のスキャンにかけて２５％を超えて増加した標的病変を有する患者には、進行性疾患の指定を与えた。最大の横断面総体積（２次元で測定）が１つのスキャンから次のスキャンにかけて２５％を超えて増加するかまたは５０％を超えて減少するかのいずれにも該当しない標的病変を有する患者には、安定疾患の指定を与えた。最大の横断面総体積（２次元で測定）が１つのスキャンから次のスキャンにかけて５０％を超えて減少した標的病変を有する患者には、部分奏効疾患の指定を与えた。
【０３２７】
［実施例１：マウスＣＤ８＋細胞のＩＬ−１０処置は機能増強を誘導する］
単離されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞機能に対するＩＬ−１０の効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、上記のように組換えマウスＩＬ−１０（ｒＭｕＩＬ−１）の存在下で、または対照としてｒＭｕＩＬ−１０の非存在下で処置した。細胞毒性マーカーであるグランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン及びサイトカインＩＦＮγの遺伝子発現のｑＰＣＲ分析によって、Ｔ細胞活性化を評価した。上記のように、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号３５）の存在下でパルスしたＰＤＶ６細胞を溶解するためのＩＬ−１０処置したＳＩＩＮＦＥＫＬ初回刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞の能力によって、Ｔ細胞の細胞傷害性を評価した。
【０３２８】
図１、パネルＡに示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウスＩＬ−１０により刺激したマウスＣＤ８＋細胞は、細胞傷害マーカーであるグランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン及びサイトカインＩＦＮγの発現の増強を示した。図１、パネルＢに示すように、マウスＯＴ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞の処置は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ存在下でパルスした腫瘍細胞標的の細胞傷害性の増強をもたらす。
【０３２９】
［実施例２：腫瘍生検から単離したヒトＣＤ８＋細胞のＩＬ−１０処置は機能増強をもたらす］
培養で増殖させたメラノーマ腫瘍の患者生検から、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を採取し、加熱溶解した腫瘍細胞抗原で再刺激し、次いで上記のように、ＩＬ−１０の非存在下で、または記載の濃度の組換えヒトＩＬ−１０（ｒＨｕＩＬ−１０）の存在下で培養した。細胞毒性マーカーであるグランザイムＡ、グランザイムＢ、パーフォリン及びサイトカインＩＦＮγの遺伝子発現のｑＰＣＲ分析によって、Ｔ細胞活性化を評価した。同種のメラノーマ腫瘍細胞、Ａ３７５細胞（ヒト無色素性メラノーマ細胞株）、またはＫ５６２細胞（ヒト骨髄性白血病細胞株）を溶解する能力によってＴ細胞の細胞傷害性を評価した。
【０３３０】
図１のパネルＣに示すように、刺激した腫瘍内由来ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒＨｕＩＬ−１０処置は、グランザイムＡ、Ｂ、パーフォリン及びＩＦＮγの発現を増強した。さらに、示すように、ｒＨｕＩＬ−１０処置は、同種腫瘍細胞標的の細胞傷害性の増強ももたらす。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のｒＨｕＩＬ−１０処置は、Ａ３７５細胞またはＫ５６２細胞のいずれに対しても細胞毒性の顕著な増加をもたらさず、このことは、増加した細胞毒性が抗原特異的であることを示した。
【０３３１】
［実施例３：腫瘍を有するマウスの継続的治療は腫瘍抗原特異的な腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらす］
ＣＴ２６腫瘍を有するマウスを、１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０、または対照としてビヒクルで、毎日、６、１０または１５日間処置し、ＣＤ８＋腫瘍内Ｔ細胞を単離した。ＰＢＭＣまたは機械的に破壊し、酵素消化したＣＴ２６（ＡＴＣＣ）腫瘍から１，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）ビーズで単離することによりＥＬＩＳＰＯＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を作製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、二次刺激なし（ｗ／ｏ）、１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ、マウス扁平上皮腫瘍）または４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ、マウス乳房腫瘍）（陰性対照として）に２４時間曝露した。スポットをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで定量した。
【０３３２】
ＩＦＮγを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３に曝露する場合、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０処置群において増加する（図２、パネルＡ）。このことは、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０処置が、ＴＣＲ連結に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強することを示している。同様に、ＩＦＮγを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞は、同種のＣＴ２６腫瘍細胞に曝露する場合にも、時間とともに増加し（図２、パネルＢ）、その結果、処置の１５日目までに、ＴＣＲと抗ＣＤ３とのライゲーション時にＩＦＮγを分泌するすべての細胞もまた、同種の腫瘍細胞への曝露時にＩＦＮγを分泌した（図２、パネルＣ）。
【０３３３】
これらの結果は、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０処置によって活性化され、ＩＦＮγを分泌可能なＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍抗原に特異的であることを示している。腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が時間とともに増加するという観察は、ＰＥＧ−ｒＩＬ−１０による継続的治療が、そのαβＴＣＲ配列が固形組織腫瘍に特異的な新規ＣＡＲＴ  ＴＣＲ構築物を表している腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の漸次的蓄積を引き起こすことを示している。
【０３３４】
［実施例４：継続的なＩＬ−１０治療はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ１発現を調節する］
ＰＤ１及びＩＦＮγ発現レベルに対する、実施例３に記載のＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０による１５日間の処置の効果を評価した。ＰＤ１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のマーカーである（Ａｇａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６．８（５）：ｐ．７６５−７２）。ＰＤ１の発現はまた、活性化誘導細胞死（Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ，２０１５．２１：ｐ．９０１−１０）及びＴ細胞の疲弊（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ，２０１５．６：ｐ．ｅ１７９２）に関連する。
【０３３５】
実施例３に記載するＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０による継続的な治療は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞ＴＩＬ上のＰＤ１の発現レベルを変化させた。マウスでは、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０による継続的な治療は、ＰＤ１発現を下方制御し、それによってビヒクル処置マウスに比べてＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＤ１＋ｍｉｄレベルの発現状態に維持した。ビヒクル処置マウスにおけるＰＤ１＋−ｈｉｇｈ  ＣＤ８＋Ｔ細胞ＴＩＬの割合は５１．６％であり；ＰＤ−１＋−ｈｉｇｈ  ＣＤ８＋Ｔ細胞ＴＩＬは、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０で１５日間処置したマウスにおいてわずか９．７８％であった。対照的に、ＰＤ１＋−ｍｉｄ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合はビヒクル処置マウスでは１７．９％であったが、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０で１５日間処置したマウスでは３１．２％に増加した。
【０３３６】
さらに、長期間の治療も、ＰＤ１陽性であるＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋ＴＩＬの比率を変化させた。上記の図２に示すように、ＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋ＴＩＬは、腫瘍内の腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を表す。したがって、これらのＩＦＮγ陽性ＰＤ１陽性細胞は、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを表す。図３のパネルＡは、ビヒクルで処置したマウス由来のＴＩＬのプール及びＩＦＮγ陽性であるＰＤ１＋／−，ＣＤ８＋の量を示す。ビヒクル処置マウスにおけるＰＤ１−，ＣＤ８＋，ＩＦＮγ＋の割合は約２．４１％であり、一方、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０で１５日間処置したマウスにおけるＰＤ１＋，ＣＤ８＋，ＩＦＮγ＋の割合は約３．７％である。図３、パネルＢは、ＰＥＧ−ｒＭｕＩＬ−１０による長期間の処置が、これらの割合を、それぞれ１５．１％及び１２．８％に変化させることを示す。
【０３３７】
したがって、これらのデータは、これらのＩＦＮγ陽性ＰＤ１陽性細胞が、そこから抗原特異的ＴＣＲ配列（例えば、α及びβＴＣＲ配列）を取得することが可能な、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを表すことを示している。
【０３３８】
［実施例５：ＩＬ−１０療法によって誘導されるＰＤ１＋ＣＤ８＋末梢Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞（記憶Ｔ細胞）である］
健常ドナー由来のＰＤ１＋ＣＤ８＋末梢Ｔ細胞をさらに分析して、それらの表現型を評価した。活性化誘導細胞死のモデルを使用してこれらのＴ細胞の評価を行い、そこにおいては、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞を複数回の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８再刺激に曝露し、活性化した細胞を休止期にＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０（ＡＭ００１０）またはビヒクル（対照）に曝露した。次いで、細胞を、記憶Ｔ細胞のマーカーであるＰＤ１及びＣＤ４５ＲＯの両方の表面発現について分析した。図４に示すように、このようにしてＩＬ−１０でＣＤ８＋Ｔ細胞を処置すると、ＰＤ１＋記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞が蓄積する。
【０３３９】
図４のパネルＡ及びＢは、２人の異なるドナーから採取した末梢Ｔ細胞を用いた結果を表す。パネルＡは健常なドナー由来の末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析結果を提供する。ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、３日間活性化し、ＡＭ００１０に３日間曝露した。３日の休止期間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、それらのＰＤ１及びＣＤ４５ＲＯ細胞表面発現を測定した（Ｂの終り）。次いで、これらの細胞を３日間再刺激し、次いでＡＭ００１０に３日間曝露した。３日間の休止期間の後、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、それらのＰＤ１及びＣＤ４５ＲＯ細胞表面発現を測定した（Ｄの終り）。複数回の再刺激の後、これらの細胞をＡＭ００１０に曝露すると、より生存能の高いＰＤ１＋細胞が得られ、このことは、ＡＭ００１０が活性化誘導細胞死を予防することを示唆している。これらの細胞は、その記憶表現型（ＣＤ４５ＲＯ＋）により抗原特異的であり、これらの細胞は、そのＰＤ１発現レベルのおかげで活性化される。刺激条件が類似しているため、同細胞は、Ｃｈａｎら（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ（２０１５）３５（１２）：９４８−９５５）によって記載されたＩＦＮγ陽性細胞である可能性が高い。
【０３４０】
これらのデータは、ＩＬ−１０療法によって誘導されるＰＤ１＋，ＣＤ８＋末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞が、これらの患者において活性化された腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞であることを示している。
【０３４１】
［実施例６：ＩＬ−１０処置患者における末梢Ｔ細胞増大の評価］
患者の末梢ＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−１０処置の効果を評価した（図５）。メラノーマ（Ｍｅｌ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、または結腸直腸癌（ＣＲＣ）を有し、上記のＰＥＧ−ＩＬ−１０（ＡＭ００１０）単剤療法、または抗ＰＤ１モノクローナル抗体と併用したＰＥＧ−ＩＬ−１０（ＡＭ００１０）治療を受けたがん患者からＰＢＭＣを採取した。ＰＥＧ−ＩＬ−１０療法の開始前に採取した末梢血試料を対照試料として用いた。図５の括弧内に示す日に試料を患者から採取し；投与したＰＥＧ−ＩＬ−１０（ＡＭ００１０）の用量を図５のＸ軸上に示す。患者を、進行性疾患（ＰＤ）、安定疾患（ＳＤ）、または少なくとも部分奏効（ＰＲ）として分類した。試験試料及び参照試料中の少なくともＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸を配列決定し、試験試料中の少なくともＶβＴＣＲポリペプチド配列をコードする核酸の出現頻度を、参照試料中の同じＶβＴＣＲをコードする核酸の出現頻度と比較した。参照試料に対して試験試料中で出現頻度が増加した場合、その配列を「増大した」Ｔ細胞クローンによって発現されたものと分類した。参照試料に対して試験試料中で出現頻度が減少した場合、その配列を「収縮した」Ｔ細胞クローンによって発現されたものと分類した。「増大した」クローンは、疾患抗原特異的Ｔ細胞を表す。結果を図５に示す。
【０３４２】
ＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０（ＡＭ００１０）で処置した患者において、末梢Ｔ細胞の増大を評価した。図６は、１０μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０（ＡＭ００１０）を皮下に毎日（パネルＡ）または２０μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｒＨｕＩＬ−１０（ＡＭ００１０）を皮下に毎日（パネルＢ）処置した２人の腎細胞癌患者における末梢Ｔ細胞クローンの増大対収縮の代表的な分析を示す。「パネルＡ」の患者は進行性疾患（ＲＣＣ  ＰＤ）を示し、一方、「パネルＢ」は腫瘍質量の９３％の減少を示し、したがって少なくとも部分奏効（ＲＣＣ  ＰＲ）を示した。ＰＥＧ−ｒＨｕＩ：−１０の最初の投与前の１日目及び処置の２９日目の両方で末梢Ｔ細胞を採取した。図６の黒丸は、１日目から処置日までの増大クローンを示し、白丸は収縮クローンを示す。図６の灰色の円は、増大も収縮もしない末梢内のクローンを表す。
【０３４３】
パネルＡで評価したＲＣＣ  ＰＤ患者は、１日目に比べて、治療後２９日目に２つの増大末梢クローン及び４つの収縮クローンを示した。パネルＢのＲＣＣ  ＰＲ患者は、１日目に比べて、１１３日の治療後に８９９個の増大クローン及び４７個の収縮クローンを示す。
【０３４４】
これらの実験データは、ＩＬ−１０剤による処置に少なくとも部分奏効を有する罹患患者の末梢が、疾患抗原特異的ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞の豊富な供給源であることを示しており、これを用いて抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン集団の産生を促進することができる。そのようなクローン集団は、単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、細胞ベースの療法として使用する（例えば、同じ型の疾患（例えば、同じ型の腫瘍）を有するがん患者に投与する）ことができる。ＰＤ１＋，ＣＤ８＋末梢Ｔ細胞は、ＩＬ−１０剤による処置に少なくとも部分奏効を有する罹患患者の末梢、得られるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の配列、ならびに遺伝子改変Ｔ細胞、例えば、キメラ抗原受容体を有するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）の産生における使用に適したαＴＣＲ及びβＴＣＲ配列のライブラリーを産生するために使用される配列から得ることができる。
【０３４５】
［実施例７：ＩＬ−１０剤療法に応答する患者の末梢から採取したＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＴＣＲα及び／またはβ配列のライブラリーの作製］
上記に示したように、ＩＬ−１０剤による治療を受け入れ可能な疾患を有し、ＩＬ−１０剤療法を受けた患者の組織試料（例えば、末梢血由来）は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の供給源を提供する。図７は、そのような抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲの配列を得るためのこの供給源の使用可能な方法の例示的な概略を提供する。
【０３４６】
第一に、患者試験試料として機能するＣＤ８＋Ｔ細胞の供給源を同定するか、または取得する。この供給源は、例えば、患者から採取した血液試料（または血液試料の一部）であり得る。そのような患者は、通常、ＩＬ−１０療法を受け入れ可能な任意の疾患を有し、その疾患には、がん（例えば、メラノーマ、ＲＣＣ、またはリンパ腫などの固形腫瘍）及びウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ）による感染によって引き起こされる疾患が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。ＩＬ−１０剤治療レジメンは、治療する疾患、投与するＩＬ−１０剤（例えば、ｒＨｕＩＬ−１０、ペグ化ｒＨｕＩＬ−１０）などの多くの要因によって様々に異なるであろう。治療レジメンは、ＩＬ−１０剤単剤療法であり得るか、またはその病態についての他の治療（例えば、併用療法におけるような）を伴ってもよい。ＩＬ−１０剤単独療法による治療後に少なくとも部分的に応答性である患者は特に重要であり得る。
【０３４７】
所望し得る患者試験試料の任意の適切な処理に続いて、試料中に存在する少なくともＶβＴＣＲポリペプチド配列をコードする核酸を得て、配列決定する。場合により、そのような核酸処理及び配列決定の前に、試料を処理してＴ細胞を富化することができる。例えば、試料中の細胞をＦＡＣＳで選別して、ＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得ることができる。そのような細胞を、場合によりＰＤ１−ｍｉｄ発現レベルについて選択してもよく、及び／または場合により、ＣＤ４５ＲＯ＋及び／または細胞内ＩＦＮγ＋及び／またはグランザイムＢ＋及び／またはパーフォリン＋であるように選択してもよい。細胞内ＩＦＮγ＋及び／またはグランザイムＢ＋及び／またはパーフォリン＋を選択することにより、活性化抗原特異的細胞の選択が容易になる。関心がある場合、そのような選択の前に、１〜１０μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３の存在下での２〜４時間のインキュベーションを介してＩＦＮγを誘導することができる。ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞（または、例えば、ＰＤ１−ｍｉｄ，ＣＤ８＋Ｔ細胞；ＣＤ４５ＲＯ＋ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞；ＣＤ４５ＲＯ＋，ＰＤ１−ｍｉｄ＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞）を任意に選別し、単一の細胞集団を提供することができる。ＰＤ１＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞を、任意の適切な方法（例えば、ＵＳ２００６０１３４７０４；ＵＳ２０１５０２７５２９６参照）を用いて、それらの抗原特異性に基づいて任意に選別し、規定の抗原特異性を有するＴ細胞の集団を提供することができる。関心のあるところでは、ＰＤ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の単一または集団を、当技術分野で公知の方法に従って、培養物中で任意に増大させることができる。
【０３４８】
α及び／またはβＴＣＲ遺伝子は、例えば、適応的バイオテクノロジーまたは類似の方法などの商業的サービスによって提供される方法論を用いて単離または配列決定することができる。（例えば、ＵＳ２０１４０３２２７１６；ＵＳ２０１５０２７５２９６；ＵＳ９０４３１６０参照）。
【０３４９】
次いで、患者試験試料から取得したＴＣＲ配列を分析して、患者試験試料中に存在するＶβ及び／またはＶα配列の出現頻度を、参照試料中のこれらの同じＶβ及び／またはＶα配列の出現頻度と比較して決定する。参照試料は、ＩＬ−１０剤治療前の患者由来の同一組織型の試料であり得る。これに代えて、または加えて、参照試料は、治療開始後の、試料分析時点よりも前の時点における同じ患者由来の同一組織型の試料であり得る。そのような参照試料の配列データをコンピュータデータベースに提供することができ、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで配列比較を行うことができることは理解されたい。参照試料に比べて患者試験試料中で出現頻度が増加したＶβ及び／またはＶαＴＣＲ配列は、ＩＬ−１０剤療法及び／または継続的ＩＬ−１０剤療法に応答して増大したクローンのＴＣＲを表す。
【０３５０】
Ｖβ及び／またはＶα配列を任意に分析して、任意のアミノ酸コンセンサス配列を同定し、患者のハプロタイプ及び疾患のタイプ（例えば、がんのタイプ）の両方に関してアミノ酸コンセンサス配列を同定することができる。これらのαβＴＣＲ遺伝子は、内在的に生成された新規疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体配列を表し、これは、ＩＬ−１０剤による長期投与によって特異的に誘発され、強力な抗疾患細胞機能をもたらす。
【０３５１】
得られたＴＣＲ核酸を使用して、完全なα及び／またはβＴＣＲ配列をコードする複数の構築物（例えば、レトロウイルス構築物）を含むライブラリーを作製することができる。そのような構築物を使用して１つ以上のＴＣＲをコードする構築物を自己患者末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールに形質導入し、それによってモノクローナルまたはポリクローナルＣＤ８＋Ｔ細胞集団を誘発する。そのようなモノクローナルまたはポリクローナルＣＤ８＋Ｔ細胞集団を単離し、治療のために患者に再注入することができる。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０剤処置の前に、患者ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む疾患組織の試料（例えば、固形腫瘍生検）を患者から採取する。この前処置試料は、アーカイブ試料として用いることができる。この前処置試料は、上記の後処置試料と同じ処置に供する。核酸（例えば、ＤＮＡ）を抽出し、前処置及び後処置試料中のＴＣＲα及び／またはβ配列を決定する。ＶβＴＣＲポリペプチド配列は、一般的に、ＶαＴＣＲポリペプチドよりもＴＣＲ間でより多様性を示すため、この段階での配列分析は、ＶβＴＣＲポリペプチドをコードする核酸に対してのみ行うことができる。次いで、ＴＣＲα及び／またはβ配列を比較して、ＩＬ−１０剤療法の前に疾患組織内に存在するＴ細胞中に存在し、ＩＬ−１０剤療法後に出現頻度が増加したこれらの配列を決定することができる。ＩＬ−１０剤療法後に増加するＴＣＲ配列は、疾患組織の抗原に特異的（例えば、腫瘍抗原特異的）である可能性が高いと同定され、ＩＬ−１０剤療法によって増大したＴ細胞クローン中に存在するＴＣＲを表す。そのようなＴＣＲ配列は、核酸及び／またはクローンのライブラリーに含めるうえで特に重要である。
【０３５３】
［実施例８．ＰＥＧ−ＲＨＩＬ−１０によるヒトがん被験体の治療は、抗腫瘍効果に関連するＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの増殖を誘導する：］
ＰＥＧ−ｒｈＩＬ１０（ＡＭ００１０）処置患者における免疫応答を評価し、客観的腫瘍縮小効果との免疫相関を同定するために、２０μｇ／ｋｇのＡＭ００１０を毎日、２８日間処置した３０人のヒト被験体において、８３の免疫関連サイトカイン、ケモカイン及び血清タンパク質を繰り返し測定した。
【０３５４】
ＡＭ００１０は、Ｔｈ１及びＴｈ２調節及びＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に偏重した免疫活性化を誘導した。Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ−１８、ＴＮＦα）ならびに活性化Ｔｈ２  ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の産物であるＩＬ−３及びＩＬ−４は、一貫して増加した。ＩＬ−７もまた有意に誘導された。ＡＭ００１０はまた、細胞傷害性エフェクター分子（ＦａｓＬ、リンホトキシンＢ）を増加させ、免疫抑制性サイトカインＴＧＦβならびに慢性炎症及び腫瘍関連炎症を媒介するＴｈ１７関連サイトカインを減少させた。ＩＬ−２３、ＩＬ−１７及びホモダイマーＩＬ−１２ｐ４０は約４０％減少し、一方、ＩＬ−６は一貫して変化しなかった。血清中の免疫刺激性サイトカインの増加は、治療期間を通して、少なくとも最大４００日持続した。ＡＭ００１０は、腫瘍のタイプまたはＸ線写真の腫瘍縮小効果に関係なく、ＩＬ−１８において同じ一貫した変化を誘導した。
【０３５５】
観察されたサイトカイン特性は、ＡＭ００１０処置患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の指標であったため、血中のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞を分析した。ＰＤ−１、Ｌａｇ−３またはＴｉｍ−３などの免疫チェックポイントは、誘導可能であり、それらの活性化時にＴ細胞上で発現する。さらに、増加した免疫チェックポイント発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍抗原を認識するＴ細胞レパートリーを表す。末梢血由来Ｔ細胞におけるチェックポイント発現に関して、ＡＭ００１０処置に応答する表現型変化を評価した。ＡＭ００１０処置は、持続性の腫瘍縮小効果を有する腎細胞患者の血中のＬａｇ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させた。有意な割合のＬａｇ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＤ−１も発現していた。評価したすべての患者において、ＰＤ−１＋Ｔ細胞及び増殖中の（ＫＩ−６７＋）ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、処置期間を通して増加し、血清サイトカインによって示唆される持続的な免疫活性化を確認した。
【０３５６】
Ｔ細胞の活性化の増加は、複数のチェックポイントの上方制御をもたらす。Ｌａｇ−３を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞及び増殖するＬａｇ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は有意かつ持続的に増加した。しかしながら、Ｌａｇ−３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は増加せず、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に焦点を当てた免疫活性化を示した。別の免疫チェックポイント、Ｔｉｍ−３は、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導し、がん患者の疲弊したＴ細胞と関連している。Ｔｉｍ−３（またはＣＴＬＡ−４）は、わずかな割合のＣＤ８＋Ｔ細胞にのみ発現し、有意に上方制御されなかった。ＰＤ−１＋Ｌａｇ−３＋二重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びそれらの増殖は、ＡＭ００１０処置の間に連続的に増加し、これらの細胞の疲弊よりむしろ持続的な活性化を示した。
【０３５７】
この活性化特性は、臨床応答と相関していた。遅延応答を有するＲＣＣ患者では、ＰＤ−１＋Ｌａｇ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が客観的な腫瘍縮小効果と同時に起こり、縮小効果に関与していることが示唆された。実際、２か月の治療後の患者におけるＬａｇ−３＋ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有病率及びそれらの増殖は、客観的な腫瘍縮小効果と相関していた。血中の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の罹患率の増加に加えて、ＡＭ００１０は、患者の腫瘍における活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の数及びグランザイムＢ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数も増加させた。
【０３５８】
［実施例９：増大Ｔ細胞クローンの配列同定及び特徴付け］
患者におけるＬａｇ−３＋ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増加及び増大は、別個の抗原チャレンジしたクローンＴ細胞集団の増大及び／または末梢Ｔ細胞の既存のサブセットの機能的成熟を示す。各集団の寄与を評価するために、末梢血由来のＴＣＲディープシークエンシングにより、ＡＭ００１０処置患者のＴ細胞レパートリーの組成を分析した。ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＥＤＴＡ血液試料からＤＮＡを単離し、ＴＣＲディープシークエンシングを行った。増大及び収縮クローンを、前処置及び処置中の試料の間に１０倍超の変化を有するＴ細胞クローンとして定義した。
【０３５９】
処置前及び処置中のクローンＴ細胞レパートリーの比較により、ＡＭ００１０処置した患者においてＴ細胞クローンの強い増大があることが明らかになった。配列決定は２，９５２個のユニークなＴＣＲ  ＣＤＲ３Ｖβ拡張配列の存在を示した。Ｔ細胞の増大には、治療前または既存のレパートリーにおいて検出可能なクローン及び治療前の患者において検出不可能であったクローン（新規クローン）が含まれていた。この新規増大は、多種多様ながんのタイプの患者において観察された。
【０３６０】
ベースラインから１０倍を超えて変化したクローンを分析した。ＡＭ００１０は、１患者あたり中央値２４０個（１７〜７８６の範囲）のＴ細胞クローンに対し、１０倍超の増大をもたらしたが、一方、１患者あたり中央値１８個（０〜１５０）のＴ細胞クローンのみが、１０倍を超えて収縮した。平均すると、治療前の患者のＴ細胞レパートリーの０．０６％に相当するＴ細胞クローンは、末梢Ｔ細胞レパートリー全体の６％に増大した。血中のＴ細胞の増大率は、縮小効果と相関していた。客観的な腫瘍縮小効果を有する患者は、中央値１５％のＴ細胞クローンの増大を有し（範囲４．３〜４３％；＞１０倍の増大／クローン）、それに対し、安定疾患を有する患者ではわずか２．９％（０．９９〜４．３）であり、進行性疾患を有する患者では１．８％（０．７８〜３．１）であった。さらに、客観的な腫瘍縮小効果を有する患者は、個々のクローンの中央値７６１（５２４〜７８６）の増大を有していたのに対し、安定疾患を有する患者では１９４クローン（８１〜５１９）及び進行性疾患を有する患者では１６４クローン（１７〜３２８）であった。
【０３６１】
抗ＰＤ−１に対する腫瘍縮小効果は、腫瘍における高い遺伝子変異量と相関し、結果として生じる新抗原に対する既存のＴ細胞応答が腫瘍縮小効果を促進し得ることを示唆する。希少または新規Ｔ細胞のクローン増大が、予測される遺伝子変異量が高いかまたは低い、及び腫瘍組織内に既存のＣＤ８＋Ｔ細胞が多いかまたは少ないすべての腫瘍タイプで観察された。新規Ｔ細胞増大の大きさがＡＭ００１０単独療法の患者における腫瘍縮小効果と相関していたが、一方、自己免疫関連ＡＥは観察されなかった。抗ＣＴＬＡ−４療法を受けている前立腺癌患者では、患者１人あたり５５を上回るＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの増大が、重篤な免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）に先行しており、このことは、これらの増大するＴ細胞クローンの自己反応性を示唆している（Ｓｕｂｕｄｈｉ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１１３（４２）：１１９１９−１１９２４）。
【０３６２】
本発明を実施するために本発明者らが知る最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。上記を読むことにより、開示する実施形態の記載、変形が、当業者に明らかになる可能性があり、当業者は、そのような変形を適切に用い得ると予想される。したがって、本発明は、本明細書に具体的に記載されているものとは別の方法で実施されること、及び本発明が、適用法によって許容される通り、添付の特許請求の範囲に記載される主題のすべての改変及び均等物を含むことを意図している。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、あるいは文脈によって明らかに否定されない限り、それらのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【０３６３】
本明細書中に引用するすべての刊行物、特許出願、受託番号、及び他の参考文献は、あたかも個々の刊行物または特許出願を具体的かつ個別に参照として援用することを示すように、参照として本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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