(57)【要約】  本発明は、ＶＨＳＶワクチン及びモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントを含有する魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物及びこれを利用した魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法に関し、本発明に係る浸漬用ウイルス性出血性敗血症ワクチンを使用すると、注射接種が難しい魚類に対して、効果的にウイルス性出血性敗血症を予防することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨＳＶワクチン及びモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントを含有する魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物。
【請求項２】
前記モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントの含有量は、０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントの含有量は、２ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物を含有する水槽で魚類を浸漬することを特徴とする魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法。
【請求項５】
前記浸漬は、２〜８週間行うことを特徴とする請求項４に記載の魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浸漬用ウイルス性出血性敗血症予防ワクチン組成物に関し、さらに詳しくはＶＨＳＶワクチン及びモンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含有する魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物及びこれを利用した魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳ）は、韓国と日本でヒラメ魚の養殖産業とヨーロッパの魚の養殖でサケ科の魚類に非常に致命的なウイルス性病気の一つである（Ｋｉｍ，ＷＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ２９６：１６５，２００９；Ｓｋａｌｌ，ＨＦ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｉｓｈ．Ｄｉｓ．２８：５０９，２００５；Ｔａｋａｎｏ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｆｉｓｈ．Ｐａｔｈｏｌ．２０：１８６，２０００）。ＶＨＳウイルス（ＶＨＳＶ）は、３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−ＮＶ−Ｌ−５’の順で６個の遺伝子を暗号化する〜１１Ｋｄを有するＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ系統のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＶＨＳＶは、ＧとＮ遺伝子の遺伝子配列に基づいて、４種類の主要な遺伝子型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）に分けられ、各遺伝子型の毒性は感染する魚種により異なる（Ｅｍｍｅｎｅｇｇｅｒ，ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇａｎ，１０７：９９，２０１３）。ＶＨＳＶ遺伝子型ＩＶは、太平洋沿岸北西部地域で発見される海魚の種類や韓国と日本でヒラメから分離されて、冬／春期間の間水温が９〜１５℃の間である時に主に現れ、感染魚の体重が増加するにつれＶＨＳＶ病原性が減少する（Ｉｓｓｈｉｋ，Ｔ．，Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇａｎ  ４７，８７：２００１；Ｋｉｍ，ＳＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｃｅａｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１：９５，２００４）。
【０００３】
ＶＨＳＶに対する魚類ワクチンの開発のためには、ウイルス性糖タンパク質を注入するＤＮＡまたは組み換えワクチンを利用する伝統的な方法が試みられている（Ｂｙｏｎ，ＪＹ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｓｈ．Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８，１３５，２００５）。しかし、該当ワクチンはまだ商業的使用に許可を受けられていない。
【０００４】
魚の予防接種で、腹腔内注射は、先天性と後天性免疫反応を引き起こすのに高い効率のためにワクチン伝達の最も一般的な方法であるが、浸漬ワクチン（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｖａｃｔｔｉｎｅ）は、腹腔内にワクチンを注射することができない小魚に適する。しかし、浸漬ワクチンは多量のワクチンが求められ、注射ワクチンより免疫率及び免疫期間が低い短所がある。
【０００５】
現在、多くの魚ワクチンはアジュバント、すなわち言い換えると免疫反応を引き起こす物質を必要とする。サケとニジマスのためのワクチンの場合、多くのアジュバントが商業的に利用可能である。しかし、ヒラメの場合、ホルマリン処理で非活性化させたＶＨＳＶで作られたり実験的予防接種に使用されるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）アジュバント、スクアレン、水酸化アルミニウムなど少数の種類だけが報告されている（Ｖｉｎａｙ，ＴＮ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１：４６０３，２０１３；Ｋｉｍ，ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｓｈ．Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：２０６，２０１６）。
【０００６】
そこで、本発明者等は、ＶＨＳＶを浸漬型ワクチンで魚類に使用する場合、ワクチンの効率を上げることができる効率的なアジュバントを開発しようと鋭意努力した結果、モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ，Ｆｒａｎｃｅ）をアジュバントで使用して、ＶＨＳＶワクチンと共にヒラメ水槽に浸漬する場合、ＶＨＳＶウイルスに対する感染抑制効果が向上されることを確認して本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記ワクチン組成物を含有する水槽で魚類を浸漬することを特徴とする魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明は、ＶＨＳＶワクチン及びモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントを含有する魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記ワクチン組成物を含有する水槽で魚類を浸漬することを特徴とする魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る浸漬用ウイルス性出血性敗血症ワクチンを使用すると、注射接種が難しい魚類に対して、効果的にウイルス性出血性敗血症を予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ワクチン処理後ヒラメに対する写真で、各々対照区（Ａ）、ＶＨＳワクチン注射区（１０６ＴＣＩＤ５０／匹）（Ｂ）、ＶＨＳＶワクチン浸漬区（Ｃ）、アジュバント濃度別添加ＶＨＳＶワクチン浸漬区（Ｄ、Ｅ、Ｆ区）を示したものである。
【図２】本発明に係る浸漬ワクチン処理後の免疫関連遺伝子の発現パターン変化をｑＰＣＲで確認した結果を示したものである。
【図３】本発明に係る浸漬ワクチン処理後、ＶＨＳＶを感染させたヒラメ群の累積斃死率を示したもので、Ａはワクチン処理後４週目感染させた群で、Ｂはワクチン処理後８週目感染させた群を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
魚類の感染病予防のための方法中、ワクチンを含有する水槽で魚を浸漬する浸漬ワクチン法は、魚の集団予防接種に適するが、予防効率が低いためさほど開発されていない。本発明では、ヒラメにモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントとＶＨＳＶワクチンを含むウイルス性出血敗血症に対する浸漬ワクチンの効果と安定性を確認した。感染履歴がないヒラメを熱−非活性化ＶＨＳＳウイルスとモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントと結合して、浸漬方法によって予防接種を行った。その結果、モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントが含まれた浸漬ワクチンは、血液学的及び組織病理学的分析で毒性が現れず、浸漬ワクチン適用後、人為的にＶＨＳＶを感染させたヒラメの相対的生存率（ＲＰＳ）は、アジュバントを含む予防接種を行った魚でアジュバントを含まず予防接種をした魚よりはるかに高いことを確認した。このような結果から、モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを含むＶＨＳＶ浸漬ワクチンが、ＶＨＳに対してヒラメに防御免疫を誘発することが分かる。
【００１３】
従って、一観点において、本発明は、ＶＨＳＶワクチン及びモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントを含有する魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物に関する。
【００１４】
本発明のワクチン組成物で、前記モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントは、０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌで含有されることを使用することができ、好ましくは、２ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌで含有されることを使用することができ、さらに好ましくは５ｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌを使用することができする。
【００１５】
本発明で使用されるＶＨＳＶワクチンの濃度は、１０５〜１０９ＴＣＩＤ５０／５Ｌを使用することができ、好ましくは、１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０／５Ｌを使用することができる。
【００１６】
本発明に係るアジュバントを含む浸漬ワクチンは、免疫関連遺伝子、すなわち、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびトール様受容体（ＴＬＲ）３を符号化する遺伝子の発現を増加させて、ＶＨＳＶ感染による魚類の生存率を増加させる。
【００１７】
他の観点において、本発明は、前記魚類のウイルス性出血性敗血症予防のための浸漬用ワクチン組成物を含有する水槽で魚類を浸漬することを特徴とする魚類のウイルス性出血性敗血症予防方法に関する。
【００１８】
本発明の浸漬ワクチンは、特に注射時に扱うのに非実用的な小魚類、稚魚などに使用するのに適する。
【００１９】
本発明の一態様では、ヒラメのＶＨＳに対するモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧアジュバントのＶＨＳＶ浸漬ワクチンの安全性と効果を確認した。ＶＨＳＶ浸漬ワクチンがＶＨＳＶ感染から魚類を保護して、１０ｇ／５ＬのモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧが５０ｇ／５ＬのモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧ服用量よりさらに優れた感染防禦能を有することを確認した。
【００２０】
本発明の他の様態では、浸漬ワクチン接種を行ってから２週後に、魚類の免疫反応に潜在的に関連がある１１個の遺伝子発現を評価した。ここで、ＩＬ−１βがＶＨＳＶ浸漬ワクチン（３．６倍）と１０ｇのモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを入れたＶＨＳＶ浸漬ワクチン（＞３８倍）処理後にワクチン接種されなかった対照標準と比較して最も強く増加した。ＩＬ−１β炎症反応に直接的に関与するサイトカインで、免疫反応を調節するのに中心的な役割、例えば、免疫能、リンパ球活性化、白血球移動及び食菌作用に関連した遺伝子の調節を行う。
【００２１】
ＩＬ−８の発現は、対照標準と比較した時、１０ｇのモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを含むＶＨＳＶ浸漬ワクチン接種処理後１５倍以上発現が増加したが、ＶＨＳＶ浸漬ワクチン群では０．４８倍減少した。ＩＬ−８は、ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｆａｍｉｌｙの構成員であり、これの分泌は、内在免疫反応に関連したＴＬＲｓによって促進され得る。ＩＬ−８は、ＶＨＳＶに感染したヒラメに対する炎症反応因子になり得る。本発明で、ＩＬ−８発現は、モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを入れたＶＨＳＶ浸漬ワクチン接種で誘導されたが、これはこのアジュバントが炎症反応を誘導することを示す。ＴＬＲ３は、対照標準と比較した時、アジュバントなしにＶＨＳＶ浸漬ワクチン接種処理後最も強く陽性フィードバックされる遺伝子である（９．６７倍増加）。ＶＨＳＶ感染は、ＴＬＲ３発現を相当増加させると知られている。従って、我々の結果は、浸漬ワクチンがＴＬＲ３を誘導したことを示すが、これはｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡウイルスの両方に対する魚類の免疫反応に重要である。
【００２２】
モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを含まない浸漬ワクチンが、魚類でＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＴＬＲ３及びＧＣＳＦといった免疫関連遺伝子の発現数値を増加させても、これはＶＨＳＶ感染から魚類を保護することができない。モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを含まない浸漬ワクチンは、ワクチン接種を行ってから８週後にＶＨＳＶで免疫性検査を受ける時に死亡を促進させたりもした。このような遺伝子産物は、これらの発現数値が魚類をＶＨＳＶ免疫性検査から保護するモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを入れた浸漬ワクチン接種から誘導されるので、魚類ＶＨＳＶの生長を持続させない。また、ＴＬＲ３シグナリングは、抗ウイルス遺伝子プログラム（Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７：２５１，２００２）とＧＣＳＦ、ＩＬ−１（Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ７：２２９，１９８９）、そしてＴＮＦ（Ｓｅｏ  ａｎｄ  Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１０７１，２００２）のようなｃｙｔｏｋｉｎｅが抗ウイルス活動をさせる。
【００２３】
モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを含む浸漬ワクチン接種で誘導されたこのような遺伝子の数値が、ＶＨＳＶ感染から魚類を保護するのに充分であるが、モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧを含まない浸漬ワクチン接種で誘導された遺伝子はそうでないこともある。モンタナイドを含まないワクチンは、いくつかの免疫関連遺伝子は増加させる一方、ＮＫＥＦ、ＩＦＮ  ｔｙｐｅ  Ｉ、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９のような抗ウイルスポテンシャルを有するいくつかの他の免疫関連遺伝子の数値は減少させる：Ｍｅｇａｌｏｃｙｔｉｖｉｒｕｓ感染は、ＮＫＥＦの数値を増加させて、ＮＫＥＦの過発現はターボット（カレイの一種）でｍｅｇａｌｏｃｙｔｉｖｉｒｕｓの生長を防ぐ（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９１：４３０，２０１３）；ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮｓとＩＦＮ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓの結合は、ウイルスの自己複製を防ぐことができる３００個以上のＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ（ＩＳＧｓ）を誘導する（Ｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）；ＴＬＲ７とＴＬＲ９は、ウイルス感染を認知して、信号伝達体系を活性化して、抗ウイルス性ｃｙｔｏｋｉｎｅｓとｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓの産生を誘導することができる（Ｘａｇｏｒａｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｌｉｃｈｌｉａ，Ｏｐｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｊ．２：４９，２００８）。
【００２４】
モンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧは、ワクチン前月を促進する伝達体であり水に分散した液体ナノ粒子で構成されていて、浸漬経路を介した集団ワクチン接種に適する。アジュバントは、早期免疫、作動因子反応の長い持続時間、例えば、抗体形成または細胞毒性Ｔ細胞活動を可能にして、免疫促進剤を不要とさせる。アジュバント水溶液は、魚類表面を介した抗原吸収を向上させることによって魚類の細胞性免疫反応、体液性免疫反応を共に強化させる。側線器官、エラ、胃、そして後小腸を含む皮膚は、不活性バクテリアと活性バクテリア共に主な吸収場所としての役割をする。本発明では、アジュバントが抗原粒子の吸収を向上させて予防接種の効果を向上させることを確認した。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００２６】
下記実施例では、ヒラメに対する浸漬ワクチンの効果を確認したが、ウイルス性出血性敗血症が現れるヒラメ、ニジマス、大西洋サケ、ブラウントラウト、ギンザケ、マスノスケ、タラ、ターボット、イワシ、カタクチイワシなどの魚類にも制限なしに使用できることは当業者に自明である。
【００２７】
実施例１：ＶＨＳワクチン製作及び実験群選択
１−１：ＶＨＳワクチン製作
ＶＨＳＶウイルス菌株としては、発明者が以前分離したＦＰ−ＶＨＳ２０１０−１（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＫＰ３３４１０６．１）を不活性化させて使用した。
【００２８】
製造方法は、ＶＨＳＶに感染したヒラメの組織をＭＥＭを添加して磨砕した後、培地で５０倍、１００倍希釈してウイルスを準備した。前記準備されたウイルス接種液の２００ｕｌを単層培養されたＥＰＣ細胞株に接種して室温で３０分間吸着させた後、２％ＦＢＳと１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＭＥＭ培地を入れて２０℃で培養して細胞変性効果（ＥＰＣ）を逆像顕微鏡を利用して観察した。ＣＰＥが確認されたウイルス培養液を集めて遠心分離で細胞を除去した後、上澄み液でＴＣＩＤ５０を決めた。正常細胞は同量のＰＢＳを接種して前記のような条件で観察した。
【００２９】
このように準備されたウイルスで６０℃で３日間置いて不活性化させてｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅを準備した。準備されたワクチンは、細胞に再接種して一週間観察して不活性化を確認した。濃度別にモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ社）と混合して５分間浸漬してワクチン処理に使用した。
【００３０】
１−２：試験魚選択及び実験群選択
ＶＨＳＶに感染した履歴がないヒラメ養殖場（浦項（ポハン）、韓国）を選択して、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法を使用して、ＶＨＳＶに感染していないことを確認した。
試験魚は、ＶＨＳＶに対する抗体価が現れない健康なヒラメ（１４．１±０．１ｃｍ、２５．５±１．５ｇ）を選定して試験区当たり７０匹ずつ収容して実験に使用した。試験用水槽は、３００Ｌ  ＦＲＰ水槽を使用し、実験終了時まで流水式で管理した。
【００３１】
実施例１で製造したＶＨＳワクチンとアジュバントモンタナイドＩＭＳ１３１２ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ社）と混合して５分間浸漬した後、表１に提示された群別にワクチン処理に使用した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
実施例２：ＶＨＳ浸漬ワクチンの安定性確認
ＶＨＳ浸漬ワクチンの安定性を確認するために、浸漬処理したヒラメに対して、病理組織学的検査と血液生化学的性状を分析した（図１）。
【００３４】
病理組織学的検査は、ワクチン処理第２週目及び４週目に各臓器に対する目視検査を実施して病理組織学的検査に必要な臓器を摘出した。
【００３５】
その結果、ワクチン処理群と対照群で、副作用が見られずヒラメに安全であると判断されて、生検結果、アジュバントによる副作用はないことが確認された。
【００３６】
ワクチン接種が試験の血液性状に及ぼす影響を調べるために、ワクチン処理されたヒラメの血液を採取して、Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＯＴ，総タンパク質及び総コレステロール濃度を自動血液分析器を利用して測定した。
【００３７】
その結果、グルコースの濃度は１２．３±３．５〜３１．０±１９．３ｍｇ／ｄＬ、ＧＯＴは２０．０±３．５〜３９．７±６．４Ｕ／Ｌ、ＧＰＴは１．０±０．０〜８．４±４２．３Ｕ／Ｌ、総タンパク質濃度は３．７±０．４〜４．６±０．２ｇ／ｄＬで示された（表２）。血清中のグルコース濃度、ＧＯＴ（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＰＴ（Ｇｌｕｔａｍｉｎ  ｐｙｒｕｖｉｃ  ｔｒａｎａｍｉｎａｓｅ）及び総タンパク質濃度は、すべてのワクチン接種区と対照区との間に有意な差が見られずアジュバントまたはワクチンによる副作用はないと判断された。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
実施例３：ＶＨＳ浸漬ワクチン処理後、免疫関連遺伝子発現変化分析
ＶＨＳワクチン処理後、Ａ〜Ｆ実験群の免疫関連遺伝子の発現パターン変化を確認するために、ｑＰＣＲを実施した。
【００４０】
実験区別ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ７４１３６）を利用してＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出してＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ−ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ７９２５４）を処理した後、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｑｕａｌｉｔｙを確認してｑＰＣＲを実施した。Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃＤＮＡ  ５ｕｌ（１／５  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）にＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ２Ｘ  ＧｒｅｅｎＳｔａｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｃａｔ．Ｋ−６２５３）、ＰＣＲ  Ｒｘｎ．５０ｕｌ／ｒｘｎで実施した。
【００４１】
ＰＣＲ条件は、下記の通りである。
Ｓｔｅｐ  １：９５℃  分
Ｓｔｅｐ  ２：（９５℃  １５秒、６０℃  １分）ｘ４５サイクル／ｓｃａｎ
Ｓｔｅｐ  ３：６５℃  ５分
Ｓｔｅｐ  ４：融解曲線分析  ６５℃〜９５℃（１℃／秒）
ＰＣＲ機械は、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ  ＴＭ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｔ．Ｋ−２０６０）を使用して、データ分析は、２−ｄｄＣｔＭｅｔｈｏｄを利用して相対定量分析を実施した。
ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ及びＩＦＮ  ｔｙｐｅ  １に対するプライマーは、Ｂｉｏｎｅｅｒ社から購入して、残りのプライマーは表３に示された配列で製作した。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
ワクチン処理後免疫遺伝子発現率を確認した。
その結果、図２及び表４に示された通り、アジュバント処理によって、ＩＬ−１βの発現が最も多く誘導されてＴＬＲ−７の発現率は変化がなかった。ワクチン処理後２週目、ＶＨＳ  ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ（アジュバント１０ｇ添加浸漬ワクチン群）の発現が誘導されて、８週目には注射ワクチンの発現誘導が最も活発であった（表４）。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
実施例４：ＶＨＳ浸漬ワクチン処理によるヒラメのＶＨＳ感染予防効果確認
ＶＨＳ浸漬ワクチンを処理したヒラメで、ＶＨＳ感染に対して予防効果を有するか否かを確認するために、浸漬ワクチン処理後４週目及び８週目ＶＨＳＶで感染させた後、生存率を調べた。腹腔注射法でヒラメを人為感染後、２週間累積斃死率を調べた。相対生存率は下記のように計算した。
相対生存率（％）＝１−（試験区の累積斃死率／対照区の累積斃死率）×１００
【００４６】
その結果、図３のＡに示された通り、ワクチン処理４週目にＶＨＳＶを感染させたヒラメの累積斃死率は、対照区は８５％ですべての実験区中最も高く、ワクチン浸漬区は６５％、ワクチン注射区は３５％、１００ｇアジュバント添加浸漬ワクチン区は４５％、５０ｇアジュバント添加浸漬ワクチン区は１５％、１０ｇアジュバント添加浸漬ワクチン区は１０％を示して、アジュバント濃度により感染防御能に差を示した。
【００４７】
相対生存率は、ワクチン浸漬群が２４％、ワクチン注射群５９％、１０ｇアジュバント添加浸漬群８８％、５０ｇアジュバント添加浸漬群８２％、１００ｇアジュバント添加浸漬群が２７％であった。
【００４８】
ワクチン接種８週目ＶＨＳＶで感染させた後、防御能では図３のＢに示されたた通り、対照区の斃死率は６５％である一方、注射ワクチンの斃死率は５０％、１００ｇアジュバント添加浸漬ワクチン区は４０％、５０ｇアジュバント添加浸漬ワクチン区は３０％、１０ｇアジュバント添加浸漬ワクチン区は２０％、アジュバント非添加浸漬ワクチン区は８０％で、アジュバントを添加しなかったワクチンの場合はワクチンの効果がないことを確認した。また、アジュバント濃度により感染防御能に差を示した。
【００４９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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