(57)【要約】  本開示は一般に、脊髄性筋萎縮症を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法であって、補体経路の阻害剤を対象者に投与することを含む、方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊髄性筋萎縮症(SMA)を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法であって、補体経路の阻害剤を対象者に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記阻害剤が、抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、抗C1q抗体である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記抗C1q抗体が、C1qと自己抗体の間、又はC1qとC1rの間、又はC1qとC1sの間の相互作用を阻害する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記抗C1q抗体が、循環又は組織からのC1qの排除を促進する、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、100nM〜0.005nMの範囲、又は0.005nM未満の解離定数(KD)を有する抗C1q抗体である、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、20:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1qと結合する抗C1q抗体である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、6:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1qと結合する抗C1q抗体である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、2.5:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1qと結合する抗C1q抗体である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、抗C1r抗体である、請求項2に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗C1r抗体が、C1rとC1qの間、又はC1rとC1sの間の相互作用を阻害するか、又は前記抗C1r抗体がC1rの触媒活性を阻害するか若しくはプロC1rから活性型プロテアーゼへのプロセシングを阻害する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、100nM〜0.005nMの範囲、又は0.005nM未満の解離定数(KD)を有する抗C1r抗体である、請求項10又は11に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、20:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1rと結合する抗C1r抗体である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、6:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1rと結合する抗C1r抗体である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、2.5:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1rと結合する抗C1r抗体である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗C1r抗体が、循環又は組織からのC1rの排除を促進する、請求項10〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が、抗C1s抗体である、請求項2に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗C1s抗体が、C1sとC1qの間、又はC1sとC1rの間、又はC1sとC2又はC4の間の相互作用を阻害するか、又は前記抗C1s抗体がC1sの触媒活性を阻害するか若しくはプロC1sから活性型プロテアーゼへのプロセシングを阻害する、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、100nM〜0.005nMの範囲、又は0.005nM未満の解離定数(KD)を有する抗C1s抗体である、請求項17又は19に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、20:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1sと結合する抗C1s抗体である、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、6:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1sと結合する抗C1s抗体である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、2.5:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1sと結合する抗C1s抗体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗C1s抗体が、循環又は組織からのC1sの排除を促進する、請求項17〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
C1qに特異的に結合し、及びその生物学的活性を中和する、請求項2〜22のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
前記生物学的活性が、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球状C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)ベータ-アミロイドへのC1q結合、(10)カルレティキュリンへのC1q結合、(11)アポトーシス細胞へのC1q結合、又は(12)神経細胞膜の構成成分へのC1q結合である、請求項24に記載の抗体。
【請求項２６】
前記生物学的活性が、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス若しくは神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である、請求項24又は25に記載の抗体。
【請求項２７】
CH50溶血が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、アカゲザル、及び/又はカニクイザルのCH50溶血を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、CH50溶血の少なくとも約50%〜少なくとも約90%を中和することができる、請求項26又は27に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、150ng未満、100ng未満、50ng未満、又は20ng未満の用量で、CH50溶血の少なくとも50%を中和することができる、請求項26〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又はその抗体断片である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、抗体断片であり、及び前記抗体断片が、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、ダイアボディ、又は単鎖抗体分子である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、標識基に結合している、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識基が、光学標識、放射性同位元素、放射性核種、酵素基、ビオチニル基、核酸、オリゴヌクレオチド、酵素、又は蛍光標識である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、抗C1複合体抗体であり、任意選択的に、前記抗C1複合体抗体が、C1r又はC1sの活性化を阻害するか、又はC2又はC4に作用するその能力を阻止する、請求項2に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗C1複合体抗体が、C1複合体内のコンビナトリアルエピトープと結合し、前記コンビナトリアルエピトープが、C1q及びC1sの両方、C1q及びC1rの両方、C1r及びC1sの両方、又はC1q、C1r、及びC1sのそれぞれのアミノ酸を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体が、C4の切断を阻害し、C2の切断を阻害しない、請求項2〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、C2の切断を阻害し、C4の切断を阻害しない、請求項2〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、哺乳類のC1q、C1r、又はC1sと結合する、請求項2〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、ヒトC1q、C1r、又はC1sと結合する、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、哺乳類のC1複合体と結合する、請求項2〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、血液脳関門を通過する、請求項2〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体が、治療剤に共有結合している、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記治療剤が、抗炎症タンパク質、神経治療剤、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、抗菌薬、内分泌薬、代謝薬、マイトトキシン、化学療法薬、又はsiRNAを含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記神経治療剤が、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-4/5、線維芽細胞増殖因子(FGF)-2及びその他のFGF、ニューロトロフィン(NT)-3、エリスロポエチン(EPO)、肝細胞増殖因子(HGF)、上皮増殖因子(EGF)、形質転換増殖因子(TGF)-α、TGF-β、血管内皮増殖因子(VEGF)、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、血小板由来増殖因子(PDGF)、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球マクロファージCSF、ネトリン、カルジオトロフィン-1、ヘッジホッグ、白血病抑制因子(LIF)、ミドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質(BMP)、サポシン、セマフォリン、又は幹細胞因子(SCF)から選択されるニューロトロフィンである、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体が、第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である、請求項2〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
第2の抗原が、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、アンジオペップペプチド、又はANG1005である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
脊髄性筋萎縮症に罹患した患者におけるシナプス喪失を阻害する方法であって、請求項2〜43のいずれか一項で定義される抗体を投与することを含む、方法。
【請求項４８】
前記脊髄性筋萎縮症が、シナプスの喪失又は神経接合部喪失に関連する、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記脊髄性筋萎縮症が、補体受容体3(CR3)/C3又は補体受容体CR1に依存性であるシナプス喪失に関連する、請求項47又は48に記載の方法。
【請求項５０】
前記脊髄性筋萎縮症が、病理学的活性依存性のシナプス刈り込みに関連する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記脊髄性筋萎縮症が、ミクログリアによるシナプス食作用と関連する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
アンチセンス薬を連携して投与することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記アンチセンス薬が、ヒトSMN1又はSMN2プレmRNAをコードする核酸に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトSMN2プレmRNAをコードする核酸のイントロン7に対して相補的である、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記アンチセンス薬が、ヌシネルセンである、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が、古典的補体活性化経路を、少なくとも30%〜少なくとも99.9%の範囲の量で阻害する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が、C1q結合により開始される代替的補体活性化経路を阻害する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が、代替的補体活性化経路を、少なくとも30%〜少なくとも99.9%の範囲の量で阻害する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が、補体依存性細胞媒介性細胞傷害(CDCC)を阻害する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体が、補体依存性細胞媒介性細胞傷害(CDCC)活性化経路を、少なくとも30%〜少なくとも99.9%の範囲の量で阻害する、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が、自己抗体及び補体依存性細胞媒介性細胞傷害(CDCC)を阻害する、請求項59又は60に記載の方法。
【請求項６２】
抗C1q抗体、抗C1r抗体、及び抗C1s抗体から選択される第2の抗体を投与することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
治療有効量の抗体依存性細胞傷害(ADCC)の阻害剤を前記対象者に投与することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
治療有効量の古典的補体活性化経路の阻害剤を前記対象者に投与することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
治療有効量の代替的補体活性化経路の阻害剤を前記対象者に投与することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
治療有効量の自己抗体及びその対応する自己抗原間の相互作用の阻害剤を前記対象者に投与することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
対象者の脊髄性筋萎縮症を発症するリスクを決定する方法であって、
(a)抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体を前記対象者に投与するステップであって、前記抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体が、検出可能な標識と結合している、ステップ
(b)検出可能な標識を検出して、前記対象者内のC1q、C1r、又はC1sの量又は位置を測定するステップ、及び
(c)C1q、C1r、又はC1sのうちの1つ以上の量又は位置を参照と比較するステップであって、前記脊髄性筋萎縮症を発症するリスクが、C1q、C1r、又はC1sのうちの1つ以上の量又は位置を参照と比較することに基づき特徴付けられる、ステップ
を含む前記方法。
【請求項６８】
検出可能な標識が、核酸、オリゴヌクレオチド、酵素、放射性同位元素、ビオチン、又は蛍光標識を含む、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
検出可能な標識が、X線、CT、MRI、超音波、PET及びSPECTのための造影剤を使用して検出される、請求項77に記載の方法。
【請求項７０】
蛍光標識が、フルオレセイン、ローダミン、シアニン染料又はBODIPYから選択される、請求項67に記載の方法。
【請求項７１】
請求項3、10、又は17のいずれか一項に記載の抗体、及び前記抗体を使用して脊髄性筋萎縮症を治療又は予防するための説明書を含む添付文書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2016年5月9日に出願の米国仮特許出願第62/333,348号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、脊髄性筋萎縮症を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性疾患は、全世界において約3千万人に影響を及ぼす神経系の消耗性疾患である。神経変性疾患は、その治療が困難であり、また死亡率及び罹患者のケアにかかるコストの両面において健康上の懸念も高まっている。神経系は脆弱な身体要素であり、また急性の傷害、例えば脳卒中や脊髄損傷など、又は変性疾患の両方において、そこから再生する能力は限定されている。神経変性疾患は、脳及び脊髄におけるニューロンサブタイプの進行的喪失により特徴付けることができ、また散発性又は家族性であり得る。神経変性疾患の症状発現は、時期を問わず出現する可能性があり、中年又は老年においてより一般的に出現する。該集団の平均余命の増加を前提とすれば、このような疾患の罹病率が増加するものとされ、神経変性疾患を治療する新しい療法が必要とされる。
【０００４】
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、脊髄におけるα運動ニューロンの変質により特徴付けられる、臨床的に不均一な常染色体劣性神経筋疾患であり、その結果進行性の近位筋力低下及び麻痺が引き起こされる。SMAは、幼児において主に診断され、成人ではより頻度が低い。推定罹病率は、生児出生6,000件につき1例〜10,000件につき1例であり、また保因頻度は1/40〜1/60である。SMAは、最も致命的な小児病理学を代表する。SMA患者は、四肢近位筋において支配的な筋力低下及び萎縮を一般的に有する。SMA表現型は、2つの遺伝子、サバイバルオブモーターニューロン1(survival of motor neuron 1:SMN1)、及びSMN1におけるホモ接合性の突然変異に起因する表現型を有するSMN2の発現レベルと一般的に関連する。表現型は、発現年齢及び実現した運動機能に基づき、4つの重症度グレードに分類される。
【０００５】
現在のところ、SMAに対する承認済みの唯一の治療法は、生物学的製剤のスピンラザ(Spinraza)(ヌシネルセン)である。スピンラザは、イントロンスプライシングサイレンサーN1(intronic splicing silencer N1:ISS-N1)ターゲットに基づくアンチセンス薬である。スピンラザは、注射により、脊髄を取り巻く体液中に投与される。しかし、スピンラザの臨床トライアルは、そのほとんどにおいて、すでにSMAと診断された症候性の幼児及び小児の治療に重点が置かれ、そのときには多くの変化が運動ニューロンにすでに生じてしまっている。また、神経系における毒性(神経毒性)が動物試験で認められた。したがって、SMAを予防する、その発症リスクを低下させる、及びそれを治療する新しい療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は一般に、脊髄性筋萎縮症(SMA)を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法であって、補体経路の阻害剤を対象者に投与することを含む、方法に関する。
【０００７】
神経変性疾患には異なる病因が存在するものの、すべてのニューロンに存在する細胞の共通点の1つは、シナプスである。機能的シナプスの変性は、神経変性全体の主要な機構を理解する上で重要である。証拠より、神経筋シナプス内の欠陥は、SMA疾患の最初期の病理学的指標の1つであることが示唆される。別の例として、シナプス喪失がニューロン喪失に先行すること明らかにされているアルツハイマー病(AD)が挙げられる。シナプス喪失は、ニューロンを、補体経路の阻害剤又はアンタゴニストと接触させることにより阻害される。例えば、阻害剤は、補体カスケードの活性化を遮断すると考えられ、ニューロンにおける特異的補体タンパク質の発現を遮断し、補体活性化を誘発するシグナリング分子を妨害し、ニューロンにおいて補体阻害剤の発現を上方制御し、さもなければシナプス喪失における補体の役割を妨害することができる。例えば、成体脳内でシナプス喪失を防止する能力は、様々な神経変性状態において正常なニューロン機能を維持する上で、重要な意味合いを有する。
【０００８】
したがって、補体活性化経路の阻害、例えば、抗体を使用して補体活性化経路を含む初期の補体活性化を阻害することなどは、脊髄性筋萎縮症を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療するための有望な治療戦略となり得る。特に、抗C1q抗体、抗C1r抗体、及び抗C1s抗体は、自己抗体が補体活性化の古典的経路の契機となるのを阻止し、また補体因子のニューロン発現に起因するシナプス喪失を阻止する可能性がある。
【０００９】
本開示は一般に、例えば、このような補体因子のうちの1つ以上と結合する抗体、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片などの投与を通じて補体活性化を阻害することにより、例えば、補体因子C1q、C1r、又はC1sを阻害することにより、脊髄性筋萎縮症を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法と関する。
【００１０】
ヒト補体は、液性系を「補完」し、また抗体依存性の殺菌を支援する血漿の熱不安定成分として当初定義された。補体は、今日では、特に、炎症及び侵入微生物に対する身体防御に関係することから、血液中を循環する、又は哺乳類の先天性免疫において重要な役割を司る膜表面に結合した30を超えるタンパク質からなる、厳密に制御されたタンパク質分解ネットワークであることが公知である。補体タンパク質は、多くの細胞型により産生され、また多様な協働的機能を有する。例えば、補体は、自己抗原及びアポトーシス細胞の排除に関わり、獲得免疫への架け橋となり、また組織再生及び腫瘍成長において重要な役割も担う。これらの機能を実行するために、補体系は、貪食細胞による破壊のために病原体の細胞表面と相互作用してこれらを標識する可溶性及び細胞表面結合性のタンパク質の相互作用に依存する。補体系は多数の異なる血漿タンパク質から構成され、主に肝臓で産生される。これらのタンパク質のいくらかは、チモーゲンとして公知のプロテアーゼのクラスであり、タンパク質分解での切断によって活性化される。これらのチモーゲンは、侵入病原体が検出されるまでは不活性な形態で広く分布し得る。補体系はこのように誘発される酵素カスケードにより活性化される。
【００１１】
補体活性化は3つの経路、すなわち、古典的経路、副経路及びレクチン経路により開始される。3つの経路はすべて、パターン認識タンパク質による表面構造の検出により開始される。さらに、3つの経路はすべて共通の交差点である補体C3で合流する。C3は急性期反応因子である。活性化した単球とマクロファージによって少量が生成されるが、肝臓が合成の主要部位である。約200kDの単鎖前駆体(pro-C3)は細胞内に見出され、cDNAはそれが1,663アミノ酸を含むことを示す。これはタンパク質分解での切断によって加工され、成熟タンパク質ではジスルフィド結合によって連結されるアルファ及びベータサブユニットになる。pro-C3は22アミノ酸残基のシグナルペプチド、ベータ鎖(645残基)及びアルファ鎖(992残基)を含有する。2つの鎖は、成熟タンパク質には存在しない4アルギニン残基によって連結されている。
【００１２】
古典的経路は、補体タンパク質C1qが表面結合型抗体(IgM及びIgG)のパッチに直接結合すること、また、C反応性タンパク質、血清アミロイドP、ペントラキシン3、並びに細胞、シナプス、及び微生物の表面上にあるその他の公知及び未知の結合部位に結合することによっても活性化される。
【００１３】
レクチン経路は、MASP-1及びMASP-2と命名された2つの血清セリンプロテアーゼと会合した状態にあるマンノース結合レクチン(MBL)が結合することにより活性化される。MBLは、急性期タンパク質であり、またその補体経路における機能は、構造的に類似するC1qと類似している。MBLが細胞又は病原体の炭化水素表面に結合した後、MASP-1及びMASP-2がMBLに結合し、そしてこの会合によりC4及びC2の切断及び活性化が引き起こされる。MASP-1及びMASP-2タンパク質は、C1r及びC1sと構造的に類似しており、またそれらの活性を模倣する。古典的補体経路と類似して、レクチン補体経路も、C3及び該カスケード内のさらに下流に位置するその他の末端成分の活性化にC4及びC2を必要とする。
【００１４】
補体経路の活性化は、補体タンパク質の生物学的に活性な断片、例えば、C3a、C4a、及びC5aアナフィラトキシン、並びに白白血球走化性を伴う炎症活性、マクロファージ、好中球、血小板、マスト細胞、及び内皮細胞の活性化、血管透過性の増加、細胞溶解、及び組織傷害を媒介するsC5b-9膜侵襲複合体(MAC)を生成する。また、細胞表面抗原に結合した抗体は、補体系を活性化させ、外来細胞の膜に細孔を形成することも可能である、又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)による細胞破壊も媒介し得る。このプロセスでは、Fc受容体を有する細胞毒細胞が、標的細胞上で、抗体のFc領域に結合し、そして細胞の殺傷を促進する。また、外来細胞に結合した抗体は、オプソニンとして機能することも可能であり、Fc又はC3b受容体を有する貪食細胞が抗体被覆細胞と結合し、それを貪食することを可能にする。
【００１５】
C1qは18本のポリペプチド鎖(6本のC1q A鎖、6本のC1q B鎖、及び6本のC1q C鎖)からなる460kDaの巨大多量体タンパク質である。C1r及びCrs補体タンパク質はC1q末端領域に結合してC1複合体(C1qr2s2)を形成する。C1q複合体の細胞表面又は抗体Fc領域の補体結合ドメインへの結合は、C1qの立体構造変化を誘導し、C1rの自己触媒酵素活性の活性化をもたらし、これにより次にC1sが切断されて活性型セリンプロテアーゼが生成される。一度活性化されると、C1sはC4を切断してC4bが生成し、C4bは次にC2と結合する。C2は、C1sにより切断され、活性化した形態のC2aが生じ、C4bに結合し、そして古典的経路のC3コンバターゼ(C4b2a)を形成する。最終的に、この経路は、膜侵襲複合体の形成を引き起こし、同複合体は影響を受けた細胞を溶解及び殺傷する。
【００１６】
C3は、各補体経路の中心的な構成要素であり、また先天性免疫応答及び獲得免疫応答のいずれにおいても補体系にとって重要である。C3bは、補体系における主要なエフェクター分子の1つであり、またアミノ酸Cys(988)とGlu(991)の間でC3bが切断されると、極めて反応性のチオエステルの放出を引き起こし、アセチル基転移によりC3bが細胞表面に結合するのを可能にする(シグナルペプチドを含まない成熟したタンパク質配列に基づくナンバリング)。さらに、追加の結合部位が切断されると、C3bが、CR1(CD35)又はH因子(いずれもプロテアーゼI因子による切断における補助因子)に対する結合部位を備えるいくつかの制御及び/又は補体タンパク質と相互作用するのが可能になる。I因子は、C3bをArg(1281)とSer(1282)、及びArg(1298)とSer(1299)の間で切断し、それによって断片C3f及びC3biが生成する。C3biは、病原体の表面に結合した状態で留まることができ、そこで、マクロファージ及びキラー細胞上で発現しているCR3(CD11b/CD18)により認識される。その後、CR3は、食作用及び病原体の破壊を媒介する。CR1と連携して、I因子は、アミノ酸Arg(932)とGlu(933)の間でさらに切断することができ、これによりC3dg及びC3cを形成する。C3dgは、Bリンパ球及び樹状細胞(DC)上で発現しているCR2(CD21)により認識されるように、表面に留まる能力も有する。
【００１７】
C4は、約350μg/mlの濃度で血漿中に存在する約200kDaの3鎖型糖タンパク質である。C4は、古典的補体経路活性化シーケンス内の第2の補体タンパク質として機能する。しかるべき抗体が基質と結合すると、C1複合体との結合及びその活性化を引き起こす。活性化したC1は、次にC4α鎖のN末端からC4aを切断する。そのような切断は、内部のチオエステルを露出させ、該チオエステルは、C4αサブユニットのC4d領域内の991位及び994位に位置するアミノ酸と連結する。露出すると、この極めて反応性の基は、求核攻撃を受けて標的基質との共有結合を形成する。C4の主要な断片であるC4bは、切断後に標的基質と共有結合し、そしてC4aを放出し、そして古典的経路のC2に対する受容体として作用する。C2はC4bと結合し、次に活性なC1により切断されて補体カスケードが継続する。
【００１８】
補体は、それが外来の侵入者と宿主細胞の両方を攻撃し得るという点で非特異的である。正常な条件下では、ニューロンを含む宿主細胞は、C1阻害剤(C1-Inh)などの様々な液相及び膜結合型の補体制御タンパク質によって、潜在的な補体媒介性損傷から保護される。C1-INHはC1rとC1sを活性型C1複合体から解離し、これによって宿主細胞は、膜侵襲複合体に由来する溶解又は損傷から保護される。潜在的な補体媒介性損傷から保護する他のタンパク質としては、C4b結合タンパク質(C4BP)、H因子、(FH)、補体受容体1(CR1;CD35)、補体受容体Ig(CRIg)、崩壊促進因子(DAF;CD55)、膜コファクタータンパク質(MCP;CD46)及びCD59が挙げられる。しかし、これらの構成要素の欠損、又は特定の病的状態に対する反応における補体の過剰活性化は、この保護機構を圧倒し得る。そのようなバランスを失した活性化は、ますます多くの数の疾患と病変に関連付けられてきた。
【００１９】
例えば、様々な補体構成要素は、インビトロ及びインビボでニューロン及びグリア細胞により発現される。脳におけるそれらの機能は知られていないが、これらの補体タンパク質の多くの発現は、脳損傷後又は神経変性疾患の病態の過程において血清又は炎症性サイトカインによって上方調節される。培養中のアストロサイトは、C1q、C1r、C1s、C4、C2及びC3、並びにより末端の補体タンパク質を発現することが報告されている。ニューロンはC4及びC3を発現することが報告されている。C1qは、ニューロンシナプスにおいて発現され、排除のためにこれらのシナプスにマークを付すことが示された。例えば、米国特許公開第2012/0195880号及び第2012/328601号を参照されたい。選択的シナプス喪失は、正常な脳の発達の本質的な側面(「シナプス刈り込み」)であるが、過剰なシナプス喪失は、特に成熟又は加齢脳において、神経変性及び認知低下をもたらす。シナプス補体の蓄積増加は、通常の老化及び神経変性疾患進行におけるシナプスの喪失に寄与する。反対に、補体発現の低下は神経保護性であった。シナプス喪失に罹患したニューロンは、中枢神経系ニューロン、又は末梢神経系ニューロンであり得る。
【００２０】
補体因子、例えばC1q、C1r、又はC1sなどの活性を中和すれば、脊髄性筋萎縮症(SMA)などの障害において、補体活性化を遮断し、シナプス喪失を阻止し、及び神経変性疾患進行を遅延させることができる。SMAにおける補体因子、例えばC1q、C1r、又はC1sなどの中和と関する方法が、本明細書に開示される。
【００２１】
本開示に記載されるすべての配列は、本明細書が開示する抗体及び関連する組成物について、本明細書により参照として組み込まれている国際公開第2015/006504号、米国仮特許出願第62/075793号、米国仮特許出願第62/261376号、国際公開第2014/186599号、米国特許第8,877,197号から参照として組み込まれる。
【００２２】
特定の態様では、SMAを予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法であって、補体経路の阻害剤を対象者に投与することを含む、方法が、本明細書に開示される。
【００２３】
有害なシナプス喪失に罹患した患者に、抗体、例えば抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体などを投与することを含む、SMAにおけるシナプス喪失を阻害する方法が、本明細書に開示される。該方法は、神経前駆細胞、又はニューロン形成エンハンサーの投与をさらに含み得る。特定の好ましい実施形態では、抗体は、C1q、C1r、又はC1sと結合し、そして補体活性化を阻害する。
【００２４】
完全長抗体は、組換えDNAエンジニアリング技術の使用により調製され得る。そのような操作されたバージョンは、例えば、天然抗体の可変領域から、天然抗体のアミノ酸配列における又はそれへの挿入、欠失又は変化によって生成されるものを含む。この種類の特定の例には、1種類の抗体に由来する少なくとも1つのCDR及び場合により1つ以上のフレームワークアミノ酸、及び第2の抗体に由来する可変領域の残りの部分を含有する、操作された可変領域が含まれる。抗体をコードするDNAは、完全長抗体をコードするDNAの所望の部分以外、すべてを欠失させることにより調製され得る。キメラ化抗体をコードするDNAは、ヒト定常領域を実質的に又はもっぱらコードするDNAと、ヒト以外の哺乳類の可変領域の配列に実質的に又はもっぱら由来する可変領域をコードするDNAを再結合させることにより調製され得る。ヒト化抗体をコードするDNAは、対応するヒト抗体領域に実質的に又はもっぱら由来する相補性決定領域(CDR)以外の定常領域及び可変領域をコードするDNAと、ヒト以外の哺乳類に実質的に又はもっぱら由来するCDRをコードするDNAを再結合させることにより調製され得る。
【００２５】
抗体をコードする適切なDNA分子の供給源として、細胞、例えば完全長抗体を発現するハイブリドーマなどが挙げられる。例えば、抗体は、抗体の重鎖及び/又は軽鎖をコードする発現ベクターを発現する宿主細胞から単離され得る。
【００２６】
抗体断片は、抗体可変及び定常領域をコードするDNAの操作と再発現を含む組換えDNAエンジニアリング技術の使用によっても調製され得る。さらなるアミノ酸又はドメインを必要に応じて改変し、付加し、又は欠失させるために、標準的な分子生物学的技術を使用してもよい。可変又は定常領域に対する任意の変更も、本明細書において使用される「可変」及び「定常」領域という用語になおも包含される。いくつかの事例では、CH1ドメインの翻訳が鎖間システインで停止するように、CH1の鎖間システインをコードするコドンの直後に停止コドンを導入して抗体断片を生成させるのに、PCRが使用される。適切なPCRプライマーを設計するための方法は、当技術分野で周知であり、抗体CH1ドメインの配列は容易に入手できる。いくつかの実施形態では、部位特異的突然変異誘発技術を使用して停止コドンを導入してもよい。
【００２７】
本開示の抗体は、例えばIgG、IgM、IgA、IgD及びIgEと、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含むそのサブクラスを含む、任意の抗体アイソタイプ(「クラス」)に由来してもよい。特定の好ましい実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖はマウスIgG1に由来する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、阻害剤は、抗体、例えば抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体などである。抗C1q抗体は、C1qと自己抗体の間、又はC1qとC1rの間、又はC1qとC1sの間の相互作用を阻害し得る。抗C1r抗体は、C1rとC1qの間、又はC1rとC1sの間の相互作用を阻害し得る。抗C1r抗体は、C1rの触媒活性を阻害し得る、又は抗C1r抗体は、プロC1rから活性型プロテアーゼへのプロセシングを阻害し得る。抗C1s抗体は、C1sとC1qの間、又はC1sとC1rの間、又はC1sとC2又はC4の間の相互作用を阻害し得る、或いは抗C1s抗体は、C1sの触媒活性を阻害し得る、又はプロC1sから活性型プロテアーゼへのプロセシングを阻害し得る。いくつかの事例では、抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体は、循環又は組織からのC1q、C1r、又はC1sの排除を引き起こす。
【００２９】
本明細書に開示の抗体は、例えば、哺乳類のC1q、C1r、又はC1s、好ましくはヒトC1q、C1r、又はC1sと結合するモノクローナル抗体であり得る。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は抗体断片であり得る。本明細書に開示の抗体は、血液脳関門(BBB)も通過し得る。抗体は、BBB受容体媒介型の輸送システム、例えばインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、LDL受容体、又はIGF受容体を利用するシステムなどを活性化し得る。抗体は、ヒトへの投与に適する十分なヒト配列を有するキメラ抗体であり得る。抗体は、グリコシル化されてもよく、また非グリコシル化されてもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、CHO細胞内での翻訳後修飾により生成されるグリコシル化パターンでグリコシル化される。
【００３０】
本開示の抗体は、BBB又は胎盤を通過する輸送が望ましい場合、治療剤、例えば抗炎症タンパク質、神経治療剤、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、抗菌薬、内分泌薬、代謝薬、マイトトキシン、化学療法薬など、又はsiRNAと共有結合することも可能である。抗体と例えば神経治療剤の間の共有結合は、血液脳関門を通過するための抗体-薬剤間の融合を可能にし、また治療剤が中枢神経系内でその活性の治療上有用な部分を保持するのを可能にする限り、抗体の任意の適する部分と治療剤の間の結合であり得る。例えば、共有結合は、抗体の1つ以上の軽鎖と治療剤との間にあり得る。ペプチド神経治療剤(例えば、脳由来の栄養因子BDNFなどのニューロトロフィン)の場合、ペプチドは、そのカルボキシ末端又はアミノ末端と抗体の軽鎖(LC)又は重鎖(HC)のカルボキシ末端又はアミノ末端とにより共有結合し得る。
【００３１】
本開示の抗体と連結し得るその他の神経治療剤として、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-4/5、線維芽細胞増殖因子(FGF)-2及びその他のFGF、ニューロトロフィン(NT)-3、エリスロポエチン(EPO)、肝細胞増殖因子(HGF)、上皮増殖因子(EGF)、形質転換増殖因子(TGF)-α、TGF-β、血管内皮増殖因子(VEGF)、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、血小板由来増殖因子(PDGF)、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球マクロファージCSF、ネトリン、カルジオトロフィン-1、ヘッジホッグ、白血病抑制因子(LIF)、ミドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質(BMP)、ネトリン、サポシン、セマフォリン、又は幹細胞因子(SCF)から選択されるニューロトロフィンが挙げられる。
【００３２】
抗体は、第1及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体であり得、例えば、第1の抗原は、C1q、C1r、及びC1sから選択され、並びに/又は第2の抗原は、抗体が血液脳関門を通過するのを可能にする抗原、例えばトランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマ単一ドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、アンジオペップ(angiopep)ペプチド、若しくはANG1005から選択される抗原などである。
【００３３】
本開示の抗体は、C1q、C1r、又はC1に結合し、そしてその生物学的活性を阻害し得る。例えば、(1)自己抗体へのC1q結合、(2)C1rへのC1q結合、(3)C1sへのC1q結合、(4)ホスファチジルセリンへのC1q結合、(5)ペントラキシン-3へのC1q結合、(6)C反応性タンパク質(CRP)へのC1q結合、(7)球状C1q受容体(gC1qR)へのC1q結合、(8)補体受容体1(CR1)へのC1q結合、(9)β-アミロイドへのC1q結合、又は(10)カルレティキュリンへのC1q結合。他の実施形態では、C1qの生物学的活性は、(1)古典的補体活性化経路の活性化、(2)抗体及び補体依存性細胞傷害の活性化、(3)CH50溶血、(4)シナプス喪失、(5)B細胞抗体産生、(6)樹状細胞成熟、(7)T細胞増殖、(8)サイトカイン産生、(9)ミクログリア活性化、(10)アルサス反応、(11)シナプス又は神経終末の食作用、又は(12)補体受容体3(CR3/C3)を発現する細胞の活性化である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、CH50溶血は、ヒト、マウス、及び/又はラットのCH50溶血を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、CH50溶血の少なくとも約50%〜少なくとも約95%を中和することができる。抗体は、150ng未満、100ng未満、50ng未満、又は20ng未満の用量で、CH50溶血の少なくとも50%を中和することができることもある。
【００３５】
補体活性を測定するためのその他のインビトロアッセイ法として、補体活性化期間中に形成する補体成分又は複合体の分裂産物を測定するためのELISAアッセイが挙げられる。古典的経路による補体活性化は、血清中のC4d及びC4のレベルを監視することにより、ELISA法で測定可能である。代替的経路の活性化は、循環中のBb又はC3bBbP複合体のレベルを評価することによるELISA法で測定可能である。インビトロでの抗体媒介型の補体活性化アッセイ法は、C1q、C1r、又はC1s産生の阻害を評価するのにも利用可能である。
【００３６】
本開示の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、又はその抗体断片であり得る。
【００３７】
本開示の抗体は、抗体断片、例えばFab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、ダイアボディ、又は単鎖抗体分子などであってもよい。
【００３８】
対象者に、第2の薬剤、例えば第2の抗体又は第2の阻害剤などを投与する方法が、本明細書に開示される。抗体は、抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体であり得る。阻害剤は、抗体依存性細胞傷害活性、代替的補体活性化経路の阻害剤;及び/又は自己抗体と自己抗原の間の相互作用の阻害剤であり得る。代替的実施形態では、第2の薬剤は、アンチセンス薬、例えばヌシネルセンなどであり得る。第2の薬剤は、好ましくは抗体と連携して投与される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、(a)抗体(すなわち、抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体)を対象者に投与するステップであって、前記抗体が、検出可能な標識と結合している、ステップ、(b)検出可能な標識を検出して、対象者内のC1q、C1r、又はC1sの量又は位置を測定するステップ、及び(c)C1q、C1r、又はC1sのうちの1つ以上の量又は位置を参照と比較するステップであって、脊髄性筋萎縮症を発症するリスクが、C1q、C1r、又はC1sのうちの1つ以上の量又は位置を参照と比較することに基づき特徴付けられる、ステップを含む、対象者の脊髄性筋萎縮症発症リスクを決定する方法が提供される。検出可能な標識は、核酸、オリゴヌクレオチド、酵素、放射性同位元素、ビオチン、又は蛍光標識を含み得る。いくつかの事例では、抗体は、ビオチン化のプロセスを使用して、ビオチンなどのコエンザイムで標識され得る。ビオチンが標識として使用される場合、抗体の検出は、アビジン又はその細菌対応物のストレプトアビジンなどのタンパク質の付加により達成され、これらのいずれかは前述の染料、フルオレセインなどの蛍光マーカー、放射性同位元素又はペルオキシダーゼなどの酵素といった検出可能なマーカーに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片(例えば、Fab、Fab'-SH、Fv、scFv、又はF(ab')2断片)である。
【００４０】
本明細書に開示の抗体は、標識基、例えば、放射性同位元素、放射性核種、酵素基、ビオチニル基、核酸、オリゴヌクレオチド、酵素、又は蛍光標識に結合され得る。標識基は、立体障害の可能性を低下させる任意の適切な長さのスペーサーアームを介して抗体に結合され得る。タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野において公知であり、またそのような標識化抗体を調製するのに利用可能である。
【００４１】
様々な投与経路が考えられる。そのような投与方法として、局所的、非経口、皮下、腹腔内、肺内、髄腔内、鼻腔内、及び病変内投与が挙げられるが、但しこれらに限定されない。非経口輸液として、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。中枢神経系の状態を治療する場合、抗体は、非侵襲的末梢投与経路、例えば静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内投与など、又は経口投与であっても、その後に血液脳関門を通過するように構成され得る。
【００４２】
本開示は、(a)対象者に、本実施形態のいずれかに由来する抗体を投与するステップ(抗体は検出可能な標識に結合している)、(b)検出可能な標識を検出して、対象者における抗体の量又は位置を測定するステップ、及び(c)補体活性化に関連する疾患を発症するリスクが、抗体の量の参照との比較に基づいて特徴付けられる場合、抗体の量又は位置を参照と比較することにより、個体内のシナプスを検出する方法も提供する。例えば、検出可能な標識は、核酸、オリゴヌクレオチド、酵素、放射性同位元素、ビオチン、又は蛍光標識(例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン染料、又はBODIPY)を含み得る。検出可能な標識は、X線、CT、MRI、超音波、PET及びSPECTのための造影剤を使用して検出され得る。
【００４３】
本明細書に記載する様々な実施形態の特性の1つ、一部、又は全部は、本明細書に提示する組成物及び方法の他の実施形態を形成するために組合せ可能であると理解される。本発明に関連する実施形態の組合せは、いずれも本発明に特に包含され、また組合せのいずれもみな、個別且つ明確に開示されるかのように本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素の下位の組合せのいずれも、本発明に特に包含され、またそのような下位の組合せのいずれもみな、個別且つ明確に本明細書に開示されるかのように本明細書に開示される。本明細書に提示する組成物及び方法のこれらの及びその他の態様は、当業者にとって明らかとなる。
【００４４】
本明細書で議論される公開資料は、本出願の出願日前にそれらを開示する目的でもっぱら提供される。本明細書内のいずれも、先行する発明だからといって先行する日付のそのような公開資料に対して、本発明が権利を主張できないとする承認とは解釈されない。さらに、提示する公開資料の日付は、実際の公開資料の日付とは異なる可能性もあり、それらは独立に確認される必要があり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】抗C1qがシナプス喪失に対して保護的であることを示す図である。抗体は、末梢投与により投与した。
【図２】抗C1qを投与したときの筋活動・運動の改善、及び生存延長を示す図である。
【図３】出生後0日目から12日目まで、2日毎に、M1抗体を用いて100mg/Kg i.p.で治療したSMNdelta7マウスを示す図であり、寿命の改善及び体重増加を示した。
【図４】SMNが欠損したSMNdelta7マウスを示す図であり、C1qがどのように運動ニューロン上のシナプスに付着するか、及び正常な(WT)シナプスの発達の程度はより低いことを表す。出生後4日目にC1qで標識した(赤)腰部L4レベルの運動ニューロンを示し、またシナプスはシナプトフィジンで標識した(緑)。
【図５】抗体M1で治療したSMNdelta7マウスを示す図であり、運動ニューロンにおいて固有受容性シナプスを救済することを示す。脊髄内の運動ニューロン(赤)、及びvGlut1で標識したシナプス(白)。M1は、SMAマウスにおいて固有受容性シナプスの救済を引き起こした。
【図６−１】2つのパネル、(A)及び(B)から構成される。図6は、脊髄性筋萎縮症(SMA)の概要を示す図である。患者は、サバイバルモーターニューロン1 gen(SMN1)内に常染色体劣性突然変異を有し、不十分なレベルの完全長SMNタンパク質をもたらす(図6A)。SMN-Δ7マウスモデルは、最も重症のSMA患者の臨床画像を厳密に再現する(図6B)。突然変異体マウスは、ヒトSMN2について2種類の遺伝子導入コピーを発現する(SMN-Δ7)。SMAマウスは、出生後約2週間生存し、重度の運動機能障害、及び姿勢・脊髄反射の不具合を示す(図6B)。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７−１】2つのパネル、(A)及び(B)から構成される。図7は、SMAにおける運動回路機能障害を示す図である。図7Aは、SMA運動ニューロン上の感覚性固有受容性シナプスの有意な喪失が、運動ニューロンの選択的喪失前にどのように生ずるかを示す。いずれのイベントも、脊髄反射の機能障害をもたらす。図7Bは、運動ニューロンシナプス(青色)、及び感覚ニューロンシナプス(緑)を示す。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】SMAにおいて、C1qは興奮性シナプスに優先的に付着することを示す図である。SMAでは、C1qは、神経細胞体及び近接するデンドライトのいずれにおいても、SMN欠損運動神経上のVgluT1シナプスに高頻度で付着する。しかし、阻害性のシナプスにはほとんど付着しない。免疫反応実験では、WT及びSMAの脊髄(L1)の両方にC1qが存在することが判明した。WTでは、C1qは、感覚シナプスにほとんど付着しない。
【図９】C3は、SMAにおいて興奮性シナプスにも付着することを示す図である。C3は、SMA運動ニューロン上のVgluT1シナプスに高頻度で付着する。そのような結果から、C1q及びC3のいずれも、SMNが欠損した興奮性シナプスに付着することが実証され、補体カスケードの活性化が示唆される。
【図１０】ミクログリアがSMAにおけるシナプス除去に関係することを示す図である。ミクログリア免疫反応性と対比した形態的実験より、VGluT1シナプスがミクログリア内部に存在することが明らかである。そのような結果から、ミクログリアは、SMA運動ニューロン内シナプス除去を媒介することが示唆される。
【図１１】ミクログリアが、C1qの主要な供給源であることを示す図である。この図では、すべてのIBA1+細胞は、C1q陽性及びTMEM119陽性である。そのような結果から、ミクログリアが脊髄におけるC1qの主要な供給源料であることが示唆される。さらに、IBA1+TMEM119-細胞の欠損から、SMAのマウスモデルにおいて、浸潤性マクロファージが存在しないことが示唆される。
【図１２−１】5つのパネル、(A)、(B)、(C)、(D)、及び(E)から構成される。図12は、C1qをインビボで遮断すれば、SMA表現型が改善し、VGluT1シナプスが救済されることを示す図である。抗C1q抗体により治療すると、中程度ではあるが、SMA未治療の幼獣と比較して有意な寿命の改善及び体重増加を引き起こした。SMA治療された幼獣では、その正向反射が有意に改善した。重要なこととして、このような行動上の改善は、シナプスの救済に関連する。VGluT1シナプスは、SMA運動ニューロンの近接するデンドライト及び神経細胞体の両方において救済される。
【図１２−２】図１２−１の続きである。
【図１２−３】図１２−２の続きである。
【図１２−４】図１２−３の続きである。
【図１３−１】3つのパネル、(A)、(B)、及び(C)から構成される。図13は、救済されたVGluT1シナプスは、機能的シナプスであることを示す図である。救済された固有受容性シナプスの機能を試験するために、エクスビボでの脊髄調製を実施して、脊髄後根を刺激し、そして脊髄反射を記録した。グレーで強調するように、WTマウスは明確な単シナプス応答を示す(図13B)。神経反射は、SMAマウスにおいて顕著に低下している。C1q中和Abを用いて治療すると、単一刺激後の神経反射の大きさが有意に改善した。運動ニューロン生存数とは無関係のシナプスの機能について調査するために、脊髄後根ニューロンを高周波数で刺激した。20Hzで刺激すると、WTマウスでは約60%の低下を引き起こしたが、SMAマウスではほぼ完全であった(図13B)。抗C1q抗体により治療すると、WTマウスに認められた低下とほぼ同一の低下を引き起こし、救済されたシナプスは機能的であるというさらなる証拠を提供する。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１３−３】図１３−２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本開示は一般に、脊髄性筋萎縮症を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法であって、補体経路の阻害剤を対象者に投与することを含む、方法に関する。
【００４７】
適切な抗体として、補体成分C1q、C1r、又はC1sに結合する抗体が挙げられる。そのような抗体として、Fab、F(ab')2、Fv、及び単鎖抗体を含む、モノクローナル抗体、並びにその相同体、類似体、及び改変若しくは派生形態が挙げられる。
【００４８】
好ましい抗体は、(1)ヒト血漿又は血清から得られた精製済みの補体成分の酵素消化に由来する天然型の補体成分(例えば、C1q、C1r、若しくはC1s)、又は(2)真核生物系若しくは原核生物系により発現される組換え補体成分若しくはその派生断片を用いて、齧歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット)を免疫化することにより生成し得るモノクローナル抗体である。その他の動物、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒト免疫グロブリンを発現する遺伝子導入マウス、及びヒトBリンパ球を移植した重度複合型免疫不全(SCID)マウスも、免疫化に利用可能である。
【００４９】
病原体に対して免疫系が応答すると、ポリクローナル及びモノクローナル抗体が、免疫グロブリン(Ig)分子として自然に生成される。ヒト血清中における8mg/ml濃度の支配的様式では、〜150-kDa IgG1分子は、2つの同一の〜50-kDaの重鎖と2つの同一の〜25-kDの軽鎖から構成される。
【００５０】
ハイブリドーマは、免疫動物から得たBリンパ球をミエローマ細胞と融合させる従来手順により生成可能である。さらに、抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体が、ファージディスプレイシステムにおいて、ヒトBリンパ球由来の組換え単鎖Fv又はFabライブラリーをスクリーニングすることにより生成可能である。MAbsのヒトC1q、C1r、又はC1sに対する特異性は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ウェスタン免疫ブロット法、又はその他の免疫化学技術により試験可能である。
【００５１】
スクリーニングプロセスにおいて識別された抗体の、補体活性化に対する阻害活性は、代替的補体経路の場合、未感作のウサギ若しくはモルモットRBC、又は古典的補体経路の場合には、感作ニワトリ又はヒツジRBCを使用する溶血アッセイにより評価可能である。古典的補体経路に対して特異的な阻害活性を示すそのようなハイブリドーマは、限界希釈法によりクローン化される。抗体は、上記のアッセイにより、ヒトC1q、C1r、又はC1sに対する特異性について特徴付けを行うために精製される。
【００５２】
抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体の可変領域の分子構造に基づき、抗体の結合領域の分子構造を模倣し、またC1q、C1r、又はC1sの活性を阻害する小分子を生成、及びスクリーニングするのに、分子モデリング及び合理的分子設計が利用可能である。このような小分子は、ペプチド、ペプチド模倣物、オリゴヌクレオチド、又は有機化合物であり得る。模倣分子が、神経学的疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患における補体活性化の阻害剤として利用可能である。或いは、コンビナトリアル化合物のライブラリーから適する小分子を単離するために、当該分野で使用される大規模なスクリーニング手順を一般的に使用することができる。
【００５３】
本明細書に開示するような抗体の適切な曝露量は、血清1ml当たり10〜500μgの間であり得る。最適な用量を決定する従来の方法、すなわち、様々な用量を投与し、そしてどの用量が望ましくない副作用を伴わずに適する有効性を提供するか判断した後に、実際の血清曝露量が臨床トライアルで決定可能である。
【００５４】
組換えDNA技術の到来前は、抗体分子の構造を分析し、分子のどの部分がその様々な機能を担っているのかを決定するために、ポリペプチド配列を切断するタンパク質分解酵素(プロテアーゼ)が使用された。プロテアーゼパパインを用いる限定消化により、抗体分子は3つの断片に切断される。Fab断片として公知の2つの断片は、同一であり抗原結合活性を含有する。Fab断片は抗体分子の2つの同一なアームに対応し、そのそれぞれは、重鎖のVH及びCH1ドメインと対になった完全な軽鎖からなる。その他の断片は抗原結合活性を含まないが、容易に結晶化することが元来観察され、この理由のためにFc断片(Fragment crystallizable)と名付けられた。
【００５５】
Fab分子は、定常ドメインCH2及びCH3を欠いた重鎖を有するIg分子の人工的な〜50kDa断片である。2つのヘテロ親和性(VL-VH及びCL-CH1)ドメイン相互作用が、Fab分子の2本鎖構造を支えており、これはさらにCLとCH1の間のジスルフィド架橋によって安定化される。Fab及びIgGは、VL及びVHから3個ずつ(LCDR1、LCDR2、LCDR3及びHCDR1、HCDR2、HCDR3)の6個の相補性決定領域(CDR)により形成される同一の抗原結合部位を有する。CDRは抗体の超可変抗原結合部位を規定する。最も高い配列のバリエーションはLCDR3及びHCDR3に見出され、これは天然の免疫系ではそれぞれVL及びJL遺伝子又はVH,DH及びJH遺伝子の再構成によって生成される。LCDR3及びHCDR3は通常は抗原結合部位のコアを形成する。6個のCDRをつなぎ且つ提示する保存領域はフレームワーク領域と呼ばれる。可変領域の3次元構造では、フレームワーク領域は、外側では超可変CDRループにより、及び内側では保存されたジスルフィド架橋により連結された2つの相対する逆平行βシートのサンドイッチを形成する。
【００５６】
脊髄性筋萎縮症などにおいて、シナプス喪失の有害な影響に悩まされる個体を保護又は治療する方法が本明細書に開示される。正常に発達した未成熟アストロサイトは、特異的な補体タンパク質を発現するようにニューロンを誘導するシグナルを生成し、それによってシナプス除去が生じる間に発達ウィンドウを設けることが可能になる。発生中のそのようなタンパク質の発現は、発生中のシナプス形成の時期を反映し、これは胎生期脳及び成体脳ではオフであるが、シナプス刈り込み及び除去が生ずる出生後の脳においては高レベルでオンである。
【００５７】
これらの知見は、様々な臨床的状態、特にシナプス喪失が関与する神経変性状態、例えば脊髄性筋萎縮症などについて幅広い示唆を有する。シナプス喪失は、補体経路の阻害剤又はアンタゴニストをニューロンに接触させることによって阻害される。例えば、阻害剤は補体カスケードの活性化を遮断することができ、ニューロンにおける特定の補体タンパク質の発現を遮断することができ、補体活性化を誘導するシグナリング分子に干渉することができ、ニューロンにおける補体阻害剤の発現を上方調節することができ、この他ではシナプス喪失における補体の役割を妨げる。例えば成体脳では、シナプス喪失を防止する能力は、様々な神経変性状態における正常な神経細胞機能を維持するために重要な示唆を有する。
【００５８】
抗補体C1q抗体
適切な阻害剤として、脊髄性筋萎縮症を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法で用いられる、補体C1qタンパク質と結合する抗体(すなわち、抗補体C1q抗体、本明細書では抗C1q抗体及び抗C1q抗体とも呼ぶ)、及びそのような抗体をコードする核酸分子が挙げられる。
【００５９】
下記の14のパラグラフに記載されるすべての配列は、本明細書が開示する抗体及び関連する組成物について、本明細書により参考として組み込まれている国際公開第2015/006504号から参照として組み込まれる。
【００６０】
軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む抗C1q抗体を投与する方法が本明細書に開示される。抗体は、少なくともヒトC1q、マウスC1q、又はラットC1qに結合し得る。抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト抗体であり得る。軽鎖可変ドメインは、受託番号PTA-120399として預託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体M1のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。重鎖可変ドメインは、ATCC受託番号PTA-120399として預託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体M1のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、HVR-L1の配列番号5、HVR-L2の配列番号6、HVR-L3の配列番号7、HVR-H1の配列番号9、HVR-H2の配列番号10、及びHVR-H3の配列番号11のうちの1つ以上を含む。
【００６２】
抗体は、配列番号4と少なくとも85%同一である軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び配列番号8と少なくとも85%同一である重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み得る。
【００６３】
C1qと自己抗体の間の相互作用を阻害する抗C1q抗体を投与する方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qとシナプスの間の相互作用を阻害する。好ましい実施形態では、抗C1q抗体は、循環又は組織からのC1qの排除を引き起こす。
【００６４】
抗C1q抗体は、C1qタンパク質に結合することができ、また(a)配列番号1のアミノ酸残基196〜226(配列番号16)、又は配列番号1のアミノ酸残基196〜226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(配列番号16)に対応するC1qタンパク質A鎖(C1qA)のアミノ酸残基;(b)配列番号1のアミノ酸残基196〜221(配列番号17)、又は配列番号1のアミノ酸残基196〜221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号17)に対応するC1qAのアミノ酸残基;(c)配列番号1のアミノ酸残基202〜221(配列番号18)、又は配列番号1のアミノ酸残基202〜221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号18)に対応するC1qAのアミノ酸残基;(d)配列番号1のアミノ酸残基202〜219(配列番号19)、又は配列番号1のアミノ酸残基202〜219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(配列番号19)に対応するC1qAのアミノ酸残基;並びに(e)配列番号1のアミノ酸残基Lys 219及び/若しくはSer 202、又は配列番号1のLys 219及び/若しくはSer 202に対応するC1qAのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸と結合する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗体は、(a)配列番号3のアミノ酸残基218〜240(配列番号20)、又は配列番号3のアミノ酸残基218〜240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qタンパク質C鎖(C1qC)のアミノ酸残基;(b)配列番号3のアミノ酸残基225〜240(配列番号21)、又は配列番号3のアミノ酸残基225〜240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(c)配列番号3のアミノ酸残基225〜232(配列番号22)、又は配列番号3のアミノ酸残基225〜232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr 225、又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr 225に対応するC1qCのアミノ酸残基;(e)配列番号3のアミノ酸残基174〜196(配列番号23)、又は配列番号3のアミノ酸残基174〜196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(f)配列番号3のアミノ酸残基184〜192(配列番号24)、又は配列番号3のアミノ酸残基184〜192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基; (g)  配列番号3のアミノ酸残基185〜187、又は配列番号3のアミノ酸残基185〜187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser 185、又は配列番号3のアミノ酸残基Ser 185に対応するC1qCのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸とさらに結合する。
【００６６】
特定の実施形態では、抗C1q抗体は、配列番号1に示すようなヒトC1qAのアミノ酸残基Lys 219及びSer 202、又は配列番号1に示すようなLys 219及びSer 202に対応するヒトC1qAのアミノ酸、並びに配列番号3に示すようなヒトC1qCのアミノ酸残基Tyr 225、又は配列番号3に示すようなTyr 225に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基と結合する。特定の実施形態では、抗C1q抗体は、配列番号1に示すようなヒトC1qAのアミノ酸残基Lys 219、又は配列番号1に示すようなLys 219に対応するヒトC1qAのアミノ酸残基、及び配列番号3に示すようなヒトC1qCのアミノ酸残基Ser 185、又は配列番号3に示すようなSer 185に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基と結合する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qタンパク質と結合し、また(a)配列番号3のアミノ酸残基218〜240(配列番号20)、又は配列番号3のアミノ酸残基218〜240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号20)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(b)配列番号3のアミノ酸残基225〜240(配列番号21)、又は配列番号3のアミノ酸残基225〜240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号21)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(c)配列番号3のアミノ酸残基225〜232(配列番号22)、又は列番号3のアミノ酸残基225〜232(YDMVGIQG)(配列番号22)に対応するC1qCのアミノ酸残基配;(d)配列番号3のアミノ酸残基Tyr 225、又は配列番号3のアミノ酸残基Tyr 225に対応するC1qCのアミノ酸残基;(e)配列番号3のアミノ酸残基174〜196(配列番号23)、又は配列番号3のアミノ酸残基174〜196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号23)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(f)配列番号3のアミノ酸残基184〜192(配列番号24)、又は配列番号3のアミノ酸残基184〜192(RSGVKVVTF)(配列番号24)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(g)配列番号3のアミノ酸残基185〜187、又は配列番号3のアミノ酸残基185〜187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基;(h)配列番号3のアミノ酸残基Ser 185、又は配列番号3のアミノ酸残基Ser 185に対応するC1qCのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸と結合する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示の抗C1q抗体は、C1qとC1sの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qとC1rの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qとC1sの間、及びC1qとC1rの間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qと別の抗体、例えば自己抗体などの間の相互作用を阻害する。好ましい実施形態では、抗C1q抗体は、循環又は組織からのC1qの排除を引き起こす。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、2.5:1; 2.0:1、1.5:1、又は1.0:1未満の化学量論で各相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、C1q抗体は、相互作用、例えばC1q-C1s相互作用などを、C1q及び抗C1q抗体につき、ほぼ等モル濃度で阻害する。他の実施形態では、抗C1q抗体は、20:1未満、19.5:1未満、19:1未満、18.5:1未満、18:1未満、17.5:1未満、17:1未満、16.5:1未満、16:1未満、15.5:1未満、15:1未満、14.5:1未満、14:1未満、13.5:1未満、13:1未満、12.5:1未満、12:1未満、11.5:1未満、11:1未満、10.5:1未満、10:1未満、9.5:1未満、9:1未満、8.5:1未満、8:1未満、7.5:1未満、7:1未満、6.5:1未満、6:1未満、5.5:1未満、5:1未満、4.5:1未満、4:1未満、3.5:1未満、3:1未満、2.5:1未満、2.0:1未満、1.5:1未満、又は1.0:1未満の化学量論でC1qと結合する。特定の実施形態では、抗C1q抗体は、20:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1qと結合する。特定の実施形態では、抗C1q抗体は、6:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1qと結合する。特定の実施形態では、抗C1q抗体は、2.5:1〜1.0:1の範囲、又は1.0:1未満の結合化学量論でC1qと結合する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qとC1rの間、又はC1qとC1sの間、又はC1qとC1r及びC1sの両者間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qとC1rの間、C1qとC1sの間、及び/又はC1qとC1r及びC1sの両者間の相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qA鎖に結合する。他の実施形態では、抗C1q抗体は、C1qB鎖に結合する。他の実施形態では、抗C1q抗体は、C1qC鎖に結合する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1qA鎖、C1qB鎖、及び/又はC1qC鎖に結合する。いくつかの実施形態では、抗C1q抗体は、C1q A鎖、B鎖、及び/又はC鎖の球状ドメインに結合する。他の実施形態では、抗C1q抗体は、C1qA鎖、C1qB鎖、及び/又はC1qC鎖のコラーゲン様ドメインに結合する。
【００６９】
本開示の抗体が、2つ以上の補体因子の間の相互作用、例えばC1qとC1sの相互作用、又はC1qとC1rの間の相互作用などを阻害する場合、抗体の存在下で生ずる相互作用は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%低下し得る。特定の実施形態では、抗体の存在下で生ずる相互作用は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、少なくとも30%〜少なくとも99%の範囲の量で低下する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、C2又はC4の切断を、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%、又は少なくとも30%〜少なくとも99%の範囲の量で阻害する。C2又はC4の切断を測定する方法は、当技術分野において周知されている。C2又はC4の切断に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、C1q及び各抗C1q抗体についてほぼ等モル濃度でC2又はC4の切断を阻害する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、自己抗体依存性及び補体依存性細胞傷害(CDC)を、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%、又は少なくとも30%〜少なくとも99%の範囲の量で阻害する。自己抗体依存性及び補体依存性細胞傷害の阻害に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であり得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、本開示の抗体が存在しない対照と比較して、補体依存性細胞媒介性細胞傷害(CDCC)を、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも99%、又は少なくとも30%〜少なくとも99%の範囲の量で阻害する。CDCCを測定する方法は、当技術分野において周知されている。CDCC阻害に関する本開示の抗体のEC50値は、3μg/ml、2.5μg/ml、2.0μg/ml、1.5μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml未満であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)ではなく、CDCCを阻害する。
【００７３】
ヒト化抗補体C1q抗体
本開示のヒト化抗体は、古典的補体経路のC1複合体内の補体因子C1q及び/又はC1qタンパク質に特異的に結合する。ヒト化抗C1q抗体は、ヒトC1q、ヒト及びマウスC1qに、ラットC1q、又はヒトC1q、マウスC1q、及びラットC1qに特異的に結合し得る。
【００７４】
下記の16のパラグラフに記載されるすべての配列は、本明細書が開示する抗体及び関連する組成物について、本明細書により参考として組み込まれている米国仮特許出願第62/075793号から参照として組み込まれる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、配列番号47のアミノ酸配列を含む、又は配列番号37と少なくとも70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の相同性を有するヒトIgG4重鎖定常領域である。ヒトIgG4重鎖定常領域は、1つ以上の改変及び/又はKabat番号付与に基づくアミノ酸置換を有するFc領域を含み得る。そのような場合、Fc領域は、248位においてロイシンからグルタミン酸へのアミノ酸置換を含み、そのような置換は、Fc領域がFc受容体と相互作用するのを阻害する。いくつかの実施形態では、Fc領域は、241位においてセリンからプロリンへのアミノ酸置換を含み、そのような置換は、抗体内でのアームスイッチングを阻止する。
【００７６】
ヒトIgG4(S241P L248E)重鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号47)である。
【００７７】
抗体は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含むことができ、前記重鎖可変ドメインは、配列番号31〜34のうちの任意の1つのから選択されるアミノ酸配列、又は配列番号31〜34のうちの任意の1つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む。特定のそのような実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号35〜38のうちの任意の1つから選択されるアミノ酸配列、又は配列番号35〜38のうちの任意の1つから選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７８】
重鎖可変ドメインバリアント1(VH1)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000002
(配列番号31)である。VH1の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００７９】
重鎖可変ドメインバリアント2(VH2)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000003
2019514994.tif 000004
(配列番号32)である。VH2の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８０】
重鎖可変ドメインバリアント3(VH3)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000005
(配列番号33)である。VH3の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８１】
重鎖可変ドメインバリアント4(VH4)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000006
(配列番号34)である。VH4の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８２】
κ軽鎖可変ドメインバリアント1(Vκ1)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000007
(配列番号35)である。Vκ1の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８３】
κ軽鎖可変ドメインバリアント2(Vκ2)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000008
(配列番号36)である。Vκ2の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８４】
κ軽鎖可変ドメインバリアント3(Vκ3)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000009
(配列番号37)である。Vκ3の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８５】
κ軽鎖可変ドメインバリアント4(Vκ4)のアミノ酸配列は、
2019514994.tif 000010
(配列番号38)である。Vκ4の超可変領域(HVR)は、太字及び下線付きの文字で表す。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗C1q抗体は、Fab領域を含有する重鎖可変領域、及びFc領域を含有する重鎖定常領域を含み、前記Fab領域は本開示のC1qタンパク質に特異的に結合するが、Fc領域はC1qタンパク質と結合することができない。いくつかの実施形態では、Fc領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4アイソタイプに由来する。いくつかの実施形態では、Fc領域は、補体活性を誘発することができず、及び/又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)を誘発することができない。いくつかの実施形態では、Fc領域は、限定されないが、アミノ酸置換を含む、1つ以上の改変を含む。特定の実施形態では、本開示のヒト化抗C1q抗体のFc領域は、Kabat番号付与規定に基づく248位、若しくはKabat番号付与規定に基づく248位に対応する位置において、及び/又はKabat番号付与規定に基づく241位、若しくはKabat番号付与規定に基づく241位に対応する位置においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、248位又は248位に対応する位置におけるアミノ酸置換は、Fc領域がFc受容体と相互作用するのを阻害する。いくつかの実施形態では、248位又は248位に対応する位置におけるアミノ酸置換は、ロイシンからグルタミン酸へのアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、241位又は241位に対応する位置におけるアミノ酸置換は、抗体内でのアームスイッチングを阻止する。いくつかの実施形態では、241位又は241位に対応する位置におけるアミノ酸置換は、セリンからプロリンへのアミノ酸置換である。特定の実施形態では、本開示のヒト化抗C1q抗体のFc領域は、配列番号37のアミノ酸配列、又は配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、若しくは少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗C1q抗体は、C1qタンパク質に結合し得るが、また(a)配列番号39のアミノ酸残基196〜226(配列番号42)、又は配列番号39のアミノ酸残基196〜226(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(配列番号42)に対応するC1qタンパク質A鎖(C1qA)のアミノ酸残基、(b)配列番号39のアミノ酸残基196〜221(配列番号43)、又は配列番号39のアミノ酸残基196〜221(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号43)に対応するC1qAのアミノ酸残基、(c)配列番号39のアミノ酸残基202〜221(配列番号44)、又は配列番号39のアミノ酸残基202〜221(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(配列番号44)に対応するC1qAのアミノ酸残基、(d)配列番号39のアミノ酸残基202〜219(配列番号45)、又は配列番号39のアミノ酸残基202〜219(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(配列番号45)に対応するC1qAのアミノ酸残基、並びに(e)配列番号39のアミノ酸残基Lys 219及び/若しくはSer 202、又は配列番号39のLys 219及び/若しくはSer 202に対応するC1qAのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸と結合する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗C1q抗体は、(a)配列番号41のアミノ酸残基218〜240(配列番号46)、又は配列番号41のアミノ酸残基218〜240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号46)に対応するC1qタンパク質C鎖(C1qC)のアミノ酸残基、(b)配列番号41のアミノ酸残基225〜240(配列番号48)、又は配列番号41のアミノ酸残基225〜240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号48)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(c)配列番号41のアミノ酸残基225〜232(配列番号49)、又は配列番号41のアミノ酸残基225〜232(YDMVGIQG)(配列番号49)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(d)配列番号41のアミノ酸残基Tyr 225、又は配列番号41のアミノ酸残基Tyr 225に対応するC1qCのアミノ酸残基、(e)配列番号41のアミノ酸残基174〜196 (配列番号50)、又は配列番号41のアミノ酸残基174〜196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号50)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(f)配列番号41のアミノ酸残基184〜192(配列番号30)、又は配列番号41のアミノ酸残基184〜192 (RSGVKVVTF)(配列番号30)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(g)配列番号41のアミノ酸残基185〜187、又は配列番号41のアミノ酸残基185〜187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(h)配列番号41のアミノ酸残基Ser 185又は配列番号41のアミノ酸残基Ser 185に対応するC1qCのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸とさらに結合し得る。
【００８９】
特定の実施形態では、本開示のヒト化抗C1q抗体は、配列番号39に示すようなヒトC1qAのアミノ酸残基Lys 219及びSer 202、又は配列番号39に示すようなLys 219及びSer 202に対応するヒトC1qAのアミノ酸、並びに配列番号41に示すようなヒトC1qCのアミノ酸残基Tyr 225、又は配列番号41に示すようなTyr 225に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基に結合し得る。特定の実施形態では、抗C1q抗体は、配列番号39に示すようなヒトC1qAのアミノ酸残基Lys 219、又は列番号39に示すようなLys 219に対応するヒトC1qAのアミノ酸残基配、及び配列番号41に示すようなヒトC1qCのアミノ酸残基Ser 185、又は配列番号41に示すようなSer 185に対応するヒトC1qCのアミノ酸残基と結合する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本開示のヒト化抗C1q抗体は、C1q  タンパク質に結合し得るが、また(a)配列番号41のアミノ酸残基218〜240(配列番号46)、又は配列番号41のアミノ酸残基218〜240(WLAVNDYYDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号46)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(b)配列番号41のアミノ酸残基225〜240(配列番号48)、又は配列番号41のアミノ酸残基225〜240(YDMVGIQGSDSVFSGF)(配列番号48)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(c)配列番号41のアミノ酸残基225〜232(配列番号49)、又は配列番号41のアミノ酸残基225〜232(YDMVGIQG)(配列番号49)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(d)配列番号41のアミノ酸残基Tyr 225、又は配列番号41のアミノ酸残基Tyr 225に対応するC1qCのアミノ酸残基、(e)配列番号41のアミノ酸残基174〜196 (配列番号50)、又は配列番号41のアミノ酸残基174〜196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(配列番号50)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(f)配列番号41のアミノ酸残基184〜192(配列番号50)、又は配列番号41のアミノ酸残基184〜192(RSGVKVVTF)(配列番号50)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(g)配列番号41のアミノ酸残基185〜187、又は配列番号41のアミノ酸残基185〜187(SGV)に対応するC1qCのアミノ酸残基、(h)配列番号41のアミノ酸残基Ser 185、又は配列番号41のアミノ酸残基Ser 185に対応するC1qCのアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基内のC1qタンパク質の1つ以上のアミノ酸と結合する。
【００９１】
抗補体C1s抗体
適切な阻害剤として、補体C1sタンパク質と結合する抗体(すなわち、抗補体C1s抗体、本明細書では抗C1s抗体及びC1s抗体とも呼ぶ)、及びそのような抗体をコードする核酸分子が挙げられる。補体C1sは、補体カスケードの上流に位置し、またその基質特異性の範囲が狭いので、魅力的な標的である。さらに、活性化形態のC1sに特異的に結合する抗体(例えば、モノクローナル抗体、但しこれに限定されない)を取得することが可能である。
【００９２】
下記の2つのパラグラフに記載されるすべての配列は、本明細書が開示する抗体及び関連する組成物について、本明細書により参考として組み込まれている国際公開第2014/186599号から参照として組み込まれる。
【００９３】
特定の態様では、抗C1s抗体を投与する方法が本明細書に開示される。抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、軽鎖可変ドメインは、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含み、また重鎖は、2013年5月15日付けでATCCに預託されたハイブリドーマ細胞系又はその複製産物(ATCC受託番号PTA-120351)により産生されたマウス抗ヒトC1sモノクローナル抗体5A1のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む。他の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含み、また重鎖可変ドメインは、2013年5月15日付けでATCCに預託されたハイブリドーマ細胞系又はその複製産物(ATCC受託番号PTA-120352)により産生されたマウス抗ヒトC1sモノクローナル抗体5C12のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗体はC1s又はC1sプロ酵素に特異的に結合し、そしてその生物学的活性、例えばC1sのC1qへの結合、C1sのC1rへの結合、又はC1sのC2若しくはC4への結合などを阻害する。生物学的活性は、C1sのタンパク質分解酵素活性、C1sプロ酵素から活性型プロテアーゼへの変換、又はC2若しくはC4のタンパク質分解での切断であり得る。特定の実施形態では、生物学的活性は、古典的補体活性化経路の活性化、抗体の活性化、及び補体依存性細胞傷害、又はC1F溶血である。
【００９５】
以下の62のパラグラフ内のすべての配列は、本明細書が開示する抗体及び関連する組成物について、本明細書により参考として組み込まれているVan Vlasselaerの米国特許第8,877,197号から参照として組み込まれる。
【００９６】
補体成分C1sのドメインIV及びVを包含する領域内のエピトープに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体を投与する方法が本明細書に開示される。いくつかの場合では、抗体は、C1sが補体成分4(C4)に結合するのを阻害し、及び/又はC1sのプロテアーゼ活性を阻害しない。いくつかの実施形態では、方法は、C1複合体内の補体成分C1sと高い結合性(avidity)を有して結合するヒト化モノクローナル抗体を投与することを含む。
【００９７】
配列番号57のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)のうちの1つ以上、及び/又は配列番号58のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域のCDRのうちの1つ以上を有する抗C1s抗体を投与する方法が、本明細書に開示される。抗C1s抗体は、ヒト又はラット補体C1sタンパク質と結合し得る。いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、補体C1sタンパク質により切断される少なくとも1つの基質の切断を阻害する。
【００９８】
特定の実施形態では、抗体は、a)配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、及び配列番号56から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)、並びに/又はb)配列番号62、配列番号63、配列番号53、配列番号64、配列番号65、及び配列番号66から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む。
【００９９】
抗体は、配列番号51のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号54のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号55のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び番号56のアミノ酸配列を有するCDR-H3配列を含み得る。
【０１００】
他の実施形態では、抗体は、配列番号67のアミノ酸配列を有する可変領域の軽鎖CDR、及び/又は配列番号68のアミノ酸配列を有する可変領域の重鎖CDRを含み得る。
【０１０１】
抗体は、補体成分C1sに特異的に結合するヒト化抗体であり得るが、前記抗体は、エピトープとの結合において、配列番号57若しくは配列番号67のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域のCDRのうちの1つ以上、及び/又は配列番号58若しくは配列番号68のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域のCDRのうちの1つ以上を含む抗体と競合する。
【０１０２】
その他の事例では、抗体は、補体C1sに特異的に結合するヒト化抗体であり得るが、前記抗体は、a)補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合するヒト化抗体であって、エピトープとの結合において、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、及び配列番号56から選択されるアミノ酸配列を有するCDRを含む抗体と競合する前記ヒト化抗体、並びにb)補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合するヒト化抗体であって、エピトープとの結合において、配列番号62、配列番号63、配列番号53、配列番号64、配列番号65、及び配列番号66から選択されるアミノ酸配列を有するCDRを含む抗体と競合する前記ヒト化抗体から選択される。いくつかの場合では、抗体は、エピトープとの結合において、a)配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号69、配列番号55、及び配列番号56、又はb)配列番号62、配列番号63、配列番号53、配列番号64、配列番号65、及び配列番号66を含む重鎖及び軽鎖CDRを含む抗体と競合する。
【０１０３】
抗体は、異なるポリペプチド中に存在する軽鎖領域及び重鎖領域を含み得る。抗体は、Fc領域を含み得る。
【０１０４】
配列番号57のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列の軽鎖可変領域、及び配列番号58のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗C1s抗体が、本明細書に開示される。
【０１０５】
抗C1s抗体は、抗原結合断片、Igモノマー、Fab断片、F(ab')2断片、Fd断片、scFv、scAb、dAb、Fv、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、単特異性抗体、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体から選択され得る。
【０１０６】
抗体IPN003(本明細書では「IPN-M34」又は「M34」又は「TNT003」とも呼ぶ)が結合するエピトープとの結合において競合する、例えば、抗体IPN003の可変ドメインを含む抗体、例えば抗体IPN003などを投与する方法が、本明細書に開示される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、方法は、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合する抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、単離された抗C1s抗体は、活性化したC1sタンパク質と結合する。いくつかの実施形態では、単離された抗C1s抗体は、C1sの不活性化形態と結合する。その他の事例では、単離された抗C1s抗体は、活性化したC1sタンパク質とC1sの不活性化形態の両方と結合する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、方法は、C4の切断を阻害するモノクローナル抗体を投与することを含み、その場合、単離されたモノクローナル抗体はC2の切断を阻害しない。いくつかの実施形態では、方法は、C2の切断を阻害するモノクローナル抗体を投与することを含み、その場合、単離されたモノクローナル抗体は、C4の切断を阻害しない。いくつかの場合では、単離されたモノクローナル抗体はヒト化されている。いくつかの場合では、抗体は、古典的補体経路の成分を阻害する。いくつかの場合では、抗体により阻害される古典的補体経路の成分はC1sである。本開示は、C4の切断を阻害するが、但しC2の切断は阻害しない単離されたモノクローナル抗体、又は該単離されたモノクローナル抗体を含む医薬組成物を、それを必要としている個体に投与することにより、補体媒介型の疾患又は障害を治療する方法も提供する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、方法は、C1sによるC2又はC4の切断を阻害する、すなわち、C1s媒介型のC2又はC4のタンパク質分解での切断を阻害するモノクローナル抗体を投与することを含む。いくつかの場合では、モノクローナル抗体はヒト化されている。いくつかの場合では、抗体は、C2又はC4がC1sに結合するのを阻害することにより、C1sによるC2又はC4の切断を阻害するが、例えば、いくつかの場合では、C2又はC4がC1sのC2又はC4の結合部位に結合するのを阻害することにより、抗体はC1s媒介型のC2又はC4の切断を阻害する。したがって、いくつかの場合では、抗体は、競合的阻害剤として機能する。本開示は、C1sによるC2又はC4の切断を阻害する、すなわちC1s媒介型のC2又はC4のタンパク質分解での切断を阻害する単離されたモノクローナル抗体を、それを必要としている個体に投与することにより、脊髄性筋萎縮症を治療する方法も提供する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、方法は、C1sによるC4の切断を阻害するモノクローナル抗体を投与することを含み、その場合、該抗体は、C1sによる補体成分C2の切断を阻害しない、すなわち、該抗体は、C1s媒介型のC4の切断を阻害するが、C1s媒介型のC2の切断を阻害しない。いくつかの場合では、モノクローナル抗体はヒト化されている。いくつかの場合では、モノクローナル抗体は、C4がC1sと結合するのを阻害するが、C2がC1sと結合するのを阻害しない。いくつかの実施形態では、方法は、C1sによるC4の切断を阻害する単離されたモノクローナル抗体を、それを必要としている個体に投与することにより補体媒介性の疾患又は障害を治療することを含み、その場合、該抗体は、C1sによる補体成分C2の切断を阻害しない、すなわち、該抗体はC1s媒介型のC4の切断を阻害するが、C1s媒介型のC2の切断を阻害しない。本方法のいくつかの実施形態では、抗体はヒト化されている。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、方法は、C1sのドメインIV及びVを包含する領域内のエピトープに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体を投与することを含む。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、図1に示し、及び配列番号70に記載するアミノ酸配列のアミノ酸272〜422内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの場合では、ヒト化モノクローナル抗体は、図1に示し、及び配列番号70に記載するアミノ酸配列のアミノ酸272〜422内のエピトープに特異的に結合し、そしてC4がC1sと結合するのを阻害する。いくつかの実施形態では、方法は、図1に示し、及び配列番号70に記載するアミノ酸配列のアミノ酸272〜422内のエピトープに特異的に結合し、またC4がC1sと結合するのを阻害するヒト化モノクローナル抗体を、それを必要としている個体に投与することにより、補体媒介性の疾患又は障害を治療することを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、方法は、C1sのドメインIV及びVを包含する領域内の高次構造エピトープに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体を投与することを含む。例えば、図1に示し、配列番号70に記載するアミノ酸配列のアミノ酸272〜422内の高次構造エピトープに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体。いくつかの場合では、ヒト化モノクローナル抗体は、図1に示し、及び配列番号70に記載するアミノ酸配列のアミノ酸272〜422内の高次構造エピトープに特異的に結合し、そしてC4がC1sと結合するのを阻害する。いくつかの実施形態では、方法は、脊髄性筋萎縮症を含み、方法は、図1に示し、及び配列番号70に記載するアミノ酸配列のアミノ酸272〜422内の高次構造エピトープに特異的に結合し、そしてC4がC1sと結合するのを阻害するヒト化モノクローナル抗体を、それを必要としている個体に投与することを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、方法は、C1複合体内の補体成分C1sと結合するモノクローナル抗体を投与することを含む。C1複合体は、C1qにつき6分子、C1rにつき2分子、及びC1sにつき2分子から構成される。いくつかの場合では、モノクローナル抗体はヒト化されている。したがって、いくつかの場合では、C1複合体内の補体成分C1sと結合するヒト化モノクローナル抗体。いくつかの場合では、抗体は、C1複合体内に存在するC1sと高い結合性を有して結合する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体(例えば、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合する対象抗体)は、a)IPN003抗体の1、2、又は3つのVL CDRを含む軽鎖領域、及びb) IPN003抗体の1、2、又は3つのVH CDRを含む重鎖領域を含み、その場合、VH及びVL CDRは、Kabatの定義に従う(例えば、表1、及びKabat 1991を参照)。
【０１１５】
他の実施形態では、抗C1s抗体(例えば、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合する対象抗体)は、a)IPN003抗体の1、2、又は3つのVL CDRを含む軽鎖領域、及びb)IPN003抗体の1、2、又は3つのVH CDRを含む重鎖領域を含み、その場合、VH及びVL CDRはChothiaの定義に従う(例えば、表1、及びChothia 1987を参照)。
【０１１６】
IPN003抗体のCDRのアミノ酸配列、並びにVL及びVHのアミノ酸配列を表2に提示する。表2は、アミノ酸配列のそれぞれに割り振られた配列番号も提示する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体(例えば、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合する対象抗体)は、a)配列番号51、配列番号52、及び配列番号53から選択される1、2、又は3つのCDRを含む軽鎖領域、及びb)配列番号54、配列番号55、及び配列番号56から選択される1、2、又は3つのCDRを含む重鎖領域を含む。いくつかのこのような実施形態では、抗C1s抗体は、ヒト化VH及び/又はVLフレームワーク領域を含む。
配列番号51:SSVSSSYLHWYQ;
配列番号52:STSNLASGVP;
配列番号53:HQYYRLPPIT;
配列番号54:GFTFSNYAMSWV;
配列番号55:ISSGGSHTYY;
配列番号56:ARLFTGYAMDY。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、及び配列番号56から選択されるアミノ酸配列を有するCDRを含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号51、配列番号52、及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号54、配列番号55、及び配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号51のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号52のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号54のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号55のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び配列番号56のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号57に記載するアミノ酸配列と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号57:
DIVMTQTTAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTFYSLTISSMEAEDDATYYCHQYYRLPPITFGAGTKLELK。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号58に記載するアミノ酸配列と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
配列番号58:
QVKLEESGGALVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQIPEKRLEWVATISSGGSHTYYLDSVKGRFTISRDNARDTLYLQMSSLRSEDTALYYCARLFTGYAMDYWGQGTSVT。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号57のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号58のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号58のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号57のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号58のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号58のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合し、前記抗体は、エピトープとの結合において、配列番号57のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域の軽鎖CDR、及び配列番号58のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域の重鎖CDRを含む抗体と競合する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号57のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域の軽鎖CDR、及び配列番号58のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域の重鎖CDRを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体(例えば、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合する対象抗体)は、a)配列番号62、配列番号63、及び配列番号53から選択される1、2、又は3つのCDRを含む軽鎖領域、並びにb)配列番号64、配列番号65、及び配列番号66から選択される1、2、又は3つのCDRを含む重鎖領域を含む。
配列番号62:TASSSVSSSYLH;
配列番号63:STSNLAS;
配列番号53:HQYYRLPPIT;
配列番号64:NYAMS;
配列番号65:TISSGGSHTYYLDSVKG;
配列番号66:LFTGYAMDY
【０１３３】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号62、配列番号63、配列番号53、配列番号64、配列番号65、及び配列番号66から選択されるアミノ酸配列を有するCDRを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号62、配列番号63、及び配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号64、配列番号65、及び配列番号66のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号62のアミノ酸配列を有するCDR-L1、配列番号63のアミノ酸配列を有するCDR-L2、配列番号53のアミノ酸配列を有するCDR-L3、配列番号64のアミノ酸配列を有するCDR-H1、配列番号65のアミノ酸配列を有するCDR-H2、及び配列番号66のアミノ酸配列を有するCDR-H3を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67に記載するアミノ酸配列と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
配列番号67:
QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTFYSLTISSMEAEDDATYYCHQYYRLPPITFGAGTKLELK。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号68に記載するアミノ酸配列と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
配列番号68:
EVMLVESGGALVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQIPEKRLEWVATISSGGSHTYYLDSVKGRFTISRDNARDTLYLQMSSLRSEDTALYYCARLFTGYAMDYWGQGTSVTVSS。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号68のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号68のアミノ酸配列と90%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67のアミノ酸配列と95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号68のアミノ酸配列と95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合し、前記抗体は、エピトープとの結合において、配列番号67のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域の軽鎖CDR、及び配列番号68のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域の重鎖CDRを含む抗体と競合する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域の軽鎖CDR、及び配列番号68のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域の重鎖CDRを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号67に記載するアミノ酸配列と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、抗C1s抗体は、配列番号68に記載するアミノ酸配列と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１５０】
抗C1s抗体は、配列番号79に記載し、図2に示すアミノ酸配列(VHバリアント1)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５１】
抗C1s抗体は、配列番号80に記載し、図3に示すアミノ酸配列(VHバリアント2)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５２】
抗C1s抗体は、配列番号81に記載し、図4に示すアミノ酸配列(VHバリアント3)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５３】
抗C1s抗体は、配列番号82に記載し、図5に示すアミノ酸配列(VHバリアント4)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０１５４】
抗C1s抗体は、配列番号83に記載し、図6に示すアミノ酸配列(VKバリアント1)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５５】
抗C1s抗体は、配列番号84に記載し、図7に示すアミノ酸配列(VKバリアント2)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５６】
抗C1s抗体は、配列番号85に記載し、図8に示すアミノ酸配列(VKバリアント3)と85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【０１５７】
抗C1s抗体は、表3に示すIPN003親抗体FRのアミノ酸配列と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個のフレームワーク(FR)アミノ酸置換を含む重鎖可変領域を含み得る(図9)。
【０１５８】
定義
本明細書で使用されるとき、「a」又は「an」は1以上を意味し得る。本明細書において請求項で使用される場合、「含む」という単語と一緒に使用される際には、「a」又は「an」という単語は、1又は1より大きいことを意味し得る。例えば、(an)「抗体」への言及は、1つから多数の抗体への言及である。本明細書で使用されるとき、「別の」は、少なくとも第2の、又はその後のものを意味し得る。
【０１５９】
本明細書で使用するとき、別の化合物又は組成物と「併用した」投与は、同時投与及び/又は異なる時点での投与を含む。併用投与にはまた、同時処方としての投与又は別々の組成物としての投与が包含され、異なる投与頻度又は間隔で、並びに同じ投与経路又は異なる投与経路を用いることを含む。したがって、共同治療を受ける対象者は、異なる治療剤の複合した効果を享受することができる。
【０１６０】
用語「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)及び抗体断片を含む。
【０１６１】
基本的な4本鎖抗体ユニットは、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。VH及びVLの対は一緒になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性について、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6を参照されたい。
【０１６２】
任意の脊椎動物種由来のL鎖を、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(「κ」)及びラムダ(「λ」)と呼ばれる2つの明確に異なるタイプのうちの1つに割り当てることができる。それらの重鎖(CH)の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには5クラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それぞれ、アルファ(「α」)、デルタ(「δ」)、イプシロン(「ε」)、ガンマ(「γ」)及びミュー(「μ」)と称する重鎖を有する。γ及びαクラスは、CH配列及び機能の相対的にわずかな差異に基づいて、サブクラス(アイソタイプ)にさらに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス、すなわちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2を発現する。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知であり、例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders Co., 2000)に一般的に記載されている。
【０１６３】
「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔をおいた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)、続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)、その他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。
【０１６４】
「単離された」分子又は細胞は、それが生成された環境において元来関連付けられる少なくとも1つの夾雑分子又は細胞から同定及び分離される分子又は細胞である。好ましくは、単離された分子又は細胞は、生成環境に関連するすべての成分が付随していない。単離された分子又は細胞は、それが天然に見出される形態又は設定以外の形態にある。したがって、単離された分子は、細胞中に天然に存在する分子とは区別され、単離された細胞は、組織、器官又は個体において天然に存在する細胞と区別される。いくつかの実施形態において、単離された分子は、本開示の抗C1s、抗C1q、又は抗C1r抗体である。他の実施形態では、単離された細胞は本開示の抗C1s、抗C1q、又は抗C1r抗体を生成する宿主細胞又はハイブリドーマ細胞である。
【０１６５】
「単離された」抗体は、その生成環境(例えば、天然又は組換え)の成分から同定、分離及び/又は回収された抗体である。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その生成環境に由来する他のすべての夾雑成分が付随していない。その生成環境に由来する夾雑成分、例えば、トランスフェクトされた組換え細胞から生じるものは、典型的には、抗体の研究、診断的又は治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質が含まれ得る。特定の好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、(1)例えばLowry法によって決定したとき抗体の95重量%を超えるまで、いくつかの実施形態において99重量%を超えるまで、(2)スピンニングカップシークェネーター(Spinning cup sequenator)の使用によってN末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度に、又は(3)非還元又は還元条件下でクーマシーブルー、又は好ましくは銀染色を用いたSDS-PAGEで均質になるまで精製される。単離された抗体には、組換えT細胞内のインサイチュ抗体が含まれる。これは、該抗体の天然の環境の少なくとも1つの成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたポリペプチド又は抗体は、少なくとも1つの精製ステップを含む過程によって調製される。
【０１６６】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「VH」及び「VL」と称することができる。これらのドメインは、一般的に、抗体の最可変部分(同じクラスの他の抗体と比較して)であり、抗原結合部位を含む。
【０１６７】
用語「可変」とは、可変ドメインの一定のセグメントが、抗体間で配列に関して広範囲に相違するという事実を指す。Vドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全長にわたって均質に分布していない。代わりに、可変性は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの両方の超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々4つのFR領域を含み、大部分はベータシート立体配置を採り、3つのHVRによって連結され、それらはベータシート構造を連結するループを形成し、いくつかの場合ではベータシート構造の部分を形成する。各鎖のHVRは、FR領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖のHVRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)を参照されたい)。定常ドメインは、抗原への抗体の結合には直接的には関与しないが、抗体依存性細胞傷害への抗体の参加などの多様なエフェクター機能を示す。
【０１６８】
本明細書で使用されるとき、用語「CDR」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの可変領域の中に見出される不連続抗原結合部位を意味することが意図される。CDRは、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977);Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)(本明細書ではKabat 1991も参照される);by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)(本明細書ではChothia 1987も参照される);及びMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)に記載されており、そこではその定義は、互いに比較した場合に重複する又は一部のアミノ酸残基を含む。それでもなお、抗体若しくは移植抗体又はそのバリアントを指すためにどちらの定義を適用する場合も、本明細書で規定され使用される用語の範囲内であることが意図される。上記の引用文献の各々により規定されるCDRを包含するアミノ酸残基は、比較として下記の表1中に示される。表2中に記載されるCDRはKabat 1991に従って規定された。
【０１６９】
【表１】
2019514994.tif 000011
【０１７０】
【表２】
2019514994.tif 000012
【０１７１】
本明細書で使用されるとき、用語「CDR-L1」、「CDR-L2」及び「CDR-L3」は、それぞれ軽鎖可変領域の第1、第2及び第3のCDRを指す。本明細書で使用されるとき、用語「CDR-H1」、「CDR-H2」及び「CDR-H3」は、それぞれ重鎖可変領域の第1、第2及び第3のCDRを指す。本明細書で使用されるとき、用語「CDR-1」、「CDR-2」及び「CDR-3」はそれぞれいずれかの鎖の可変領域の第1、第2及び第3のCDRを指す。
【０１７２】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用するとき、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指す。すなわち、該集団の個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性がある突然変異及び/又は翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、ただ1つの抗原部位に指向される。典型的には種々の決定基(エピトープ)に指向される種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上のただ1つの決定基に指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、典型的にはハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる夾雑がないため有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団として得られるという抗体の特徴を示し、いずれかの具体的な方法による抗体の生成を要求すると解されるべきではない。例えば、本開示に従って用いられるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えばKohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975)、Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)、Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988)、Hammerling et al, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991)、Marks et al, J. Mol Biol. 222: 581-597 (1992)、Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)、Lee et al, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)、Fellouse, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 101(34): 12467-472 (2004)、及びLee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132, (2004)を参照されたい)、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の部分又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を製造する技術(例えば、WO1998/24893、WO1996/34096、WO1996/33735、WO1991/10741、Jakobovits et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 90: 2551 (1993)、Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993)、Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993)、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号及び第5,661,016号、Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)、Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994)、Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)、Fishwild et al, Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996)、Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)、並びにLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, (1995)を参照されたい)を含む多様な技術によって作製できる。
【０１７３】
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」は、抗体断片とは対照的に、実質的に無傷な形態で、抗体を指すために互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Fc領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列バリアントであってもよい。いくつかの場合において、インタクト抗体は、1つ以上のエフェクター機能を有することができる。
【０１７４】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域及び/又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片、ダイアボディ、線状抗体(米国特許第5,641,870号、実施例2、Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)を参照されたい)、単鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【０１７５】
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片、及び残りの「Fc」断片(容易に結晶化する能力を反映した呼称)を生じる。Fab断片は、完全なL鎖と併せてH鎖の可変領域ドメイン(VH)及び1つの重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)からなる。各Fab断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、それはただ1つの抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、ただ1つの大きなF(ab')2断片を生じ、それは大ざっぱに、異なる抗原結合活性を有する2つのジスルフィド連結されたFab断片に対応し、なお抗原を架橋することができる。Fab'断片は、抗体のヒンジ領域に由来する1つ以上のシステインを含むCH1ドメインのカルボキシ末端にいくつかの追加の残基を有するという点でFab断片と異なる。Fab'-SHは、Fab'についての本明細書における呼称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保持する。F(ab')2抗体断片は、もともとFab'断片の間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合物もまた公知である。
【０１７６】
Fc断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された両H鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域の配列によって決定され、その領域はまたある種の細胞上で見出されるFc受容体(FcR)によって認識される。
【０１７７】
本明細書において、用語「Fc領域」は、天然配列Fc領域と変異Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために用いられる。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変動する可能性があるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基又はPro230からそのカルボキシル末端までの一続きの長さと規定される。Fc領域のC末端リジン(EU番号付与システムによる残基447)は、例えば、抗体の製造若しくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換えにより操作することによって除去することができる。したがって、インタクト抗体の組成は、すべてのK447残基が除去された抗体集団、K447残基が除去されていない抗体集団、及びK447残基をもつ抗体及びもたない抗体の混合物を有する抗体集団を含むことができる。本開示の抗体で使用するために適切な天然配列のFc領域としては、ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4が含まれる。
【０１７８】
「天然配列のFc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトFc領域には、天然配列のヒトIgG1 Fc領域(非A及びAアロタイプ)、天然配列のヒトIgG2 Fc領域、天然配列のヒトIgG3 Fc領域、及び天然配列のヒトIgG4 Fc領域並びに天然に存在するそれらのバリアントが含まれる。
【０１７９】
「バリアント(変種)Fc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾、好ましくは1個以上のアミノ酸置換によって、天然配列のFc領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントFc領域は、天然配列のFc領域又は親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のFc領域又は親ポリペプチドのFc領域において、約1個〜約10個のアミノ酸置換、及び好ましくは約1個〜約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書において、バリアントFc領域は、好ましくは天然配列のFc領域及び/又は親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80%相同性を有し、最も好ましくは、それと少なくとも約90%相同性、より好ましくは、それと少なくとも約95%相同性を有する。
【０１８０】
「Fc受容体」又は「FcR」は、抗体のFc領域と結合する受容体を表す。好ましいFcRは、天然配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体と結合するもの(ガンマ受容体)であり、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含み、これには対立遺伝子バリアント及びこれらの受容体の別のスプライス型を含む。FcγRII受容体はFcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「阻害性受容体」)を含み、それらは同様のアミノ酸配列を有し、主としてその細胞質ドメインにおいて相違する。活性化受容体FcγRIIAは、イムノレセプターチロシン系活性化モチーフ(「ITAM」)をその細胞質ドメインに含む。阻害性受容体FcγRIIBは、イムノレセプターチロシン系阻害モチーフ(「ITIM」)をその細胞質ドメインに含む。(例えば、M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)を参照されたい)。FcRは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)、Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994)及びde Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)に概説されている。他のFcRは、将来同定されるものを含み、本明細書において用語「FcR」に包含される。また、FcRは、抗体の血清半減期を増加させ得る。
【０１８１】
FcRnとのインビボでの結合及びヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス若しくは遺伝子導入されたヒト細胞株で、又はバリアントFc領域を有するポリペプチドを投与した霊長類でアッセイすることができる。WO2004/42072(Presta)は、FcRとの結合が改善された又は低下した抗体バリアントを記載している。例えば、Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照されたい。
【０１８２】
「Fv」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、しっかり固定された非共有結合の1つの重鎖及び1つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの2つのドメインの折畳みからは、6つの超可変ループ(H鎖及びL鎖からそれぞれ3ループ)が発し、それは、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、ただ1つの可変ドメイン(又は1つの抗原に特異的な3つのHVRのみを含む半分のFV)でも、抗原を認識し、結合する能力を有するが、親和性は完全な結合部位よりも低い。
【０１８３】
「単鎖Fv」は、「sFv」又は「scFv」とも略され、1本のポリペプチド鎖に連結されたVH及びVL抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、sFvポリペプチドはさらに、抗原結合のためにsFvに所望の構造を形成させることができるポリペプチドリンカーをVHとVLドメインの間に含む。sFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【０１８４】
抗体の「機能的断片」は、インタクト抗体の一部分を含み、一般的には、インタクト抗体の抗原結合領域若しくは可変領域、又は修飾されたFcR結合能力を保持若しくは有する抗体のF領域が含まれる。抗体断片の例には、線状抗体、単鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【０１８５】
用語「ダイアボディ」は、Vドメインの鎖内ではなく鎖間の対形成が達成されるように、それによって二価断片、すなわち、2つの抗原結合部位を有する断片を生じるように、VHとVLドメインの間に短いリンカー(約5〜10残基)を有するsFv断片(先行する段落を参照されたい)を構築することによって調製された小さな抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、2つの「クロスオーバー」sFv断片のヘテロダイマーであり、2つの抗体のVH及びVLドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO1993/011161、WO/2009/121948、WO/2014/191493、Hollinger et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 6444-48 (1993)に非常に詳細に記載されている。
【０１８６】
本明細書で使用するとき、「キメラ抗体」は、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖の残余部分は、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体(免疫グロブリン)、並びに所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片を指す(米国特許第4,816,567号、Morrison et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81: 6851-55 (1984))。本明細書において対象とするキメラ抗体は、PRIMATIZED(登録商標)抗体を含み、該抗体の抗原結合領域は、例えば、対象とする抗原を用いてマカクザルを免疫することによって産生される抗体由来である。本明細書で使用するとき、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットである。
【０１８７】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、レシピエントのHVR由来の残基が、所望の特異性、親和性及び/又は能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のHVR由来の残基によって置き換えられる。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体及びドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、結合親和性などの抗体の性能をさらに洗練するために実施され得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部又は実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリン配列のものと対応し、FR領域の全部又は実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のものであるが、FR領域は、抗体の性能、例えば、結合親和性、異性化、免疫原性などを改善する個々のFR残基の1つ以上の置換を含むことができる。FRにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、H鎖では6個以下であり、L鎖では3個以下である。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、例えば、Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986)、Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照されたい。また、例えば、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998)、Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995)、Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994)、並びに米国特許第6,982,321号及び第7,087,409号を参照されたい。
【０１８８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するヒト抗体、及び/又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを用いて作製されたヒト抗体である。このヒト抗体の定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野において公知の多様な技術を用いて製造することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)、Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。さらにヒトモノクローナル抗体の調製には、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)、Boerner et al, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)に記載された方法が利用できる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座は不能にされているトランスジェニック動物、例えば、免疫ゼノマウスに抗原を投与することによって調製できる(例えば、XENOMOUSE(商標)技術に関しては米国特許第6,075,181号及び第6,150,584号を参照されたい)。さらに、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Li et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)を参照されたい。
【０１８９】
用語「超可変領域」、「HVR」又は「HV」は、本明細書で使用するとき、配列が超可変である及び/又は構造的に規定されたループを形成する抗体の可変ドメイン領域を指す。一般的に、抗体は、6つのHVRを含み、3つはVHにあり(H1、H2、H3)、3つはVLにある(L1、L2、L3)。天然の抗体では、H3及びL3は6つのHVRで最大の多様性を示し、特に、H3は抗体に精密な特異性を付与する上で固有の役割を果たすと考えられる。例えば、Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000)、Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ (2003))を参照されたい。実際に、天然に存在するラクダ科の重鎖のみからなる抗体は、軽鎖の非存在下で機能し、安定である。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)及びSheriff et al, Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996)を参照されたい。
【０１９０】
いくつかのHVRの範囲決定が用いられ、本明細書に包含される。Kabatの相補性決定領域(CDR)であるHVRは配列可変性に基づき、最も一般的に用いられている(Kabat et al.、上述)。Chothiaは、むしろ構造性ループの配置に言及する(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))。AbM HVRは、Kabat CDRとChothia構造性ループの折衷案を提示し、オックスフォードモレキュラー(Oxford Molecular)のAbM抗体モデリングソフトウェアで用いられている。「接触」HVRは、利用可能な複合結晶構造の分析に基づいている。これらHVRの各々の残基を下記に記す。
【０１９１】
【表３】
2019514994.tif 000013
【０１９２】
HVRは以下の通りの「伸長HVR(extended HVR)」を含むことができる:VLにおいて24-36又は24-34(L1)、46-56又は50-56(L2)及び89-97又は89-96(L3)、並びにVHにおいて26-35(H1)、50-65又は49-65(好ましい実施形態)(H2)及び93-102、94-102又は95-102(H3)。可変ドメイン残基は、これらの伸長HVRの定義の各々についてKabat et al.(上述)に従って番号付与される。
【０１９３】
「フレームワーク」又は「FR」残基は、本明細書で定義されるHVR残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１９４】
語句「Kabatの可変ドメイン残基の番号付与」又は「Kabatのアミノ酸の位置の番号付与」及びそれらの変型は、抗体の編集に関して重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについて用いられるKabat et al.(上述)の番号付与システムを指す。この番号付与システムを用いると、実際の直線的なアミノ酸配列は、可変ドメインのFR又はHVRにおける短縮又は挿入に対応してアミノ酸の減少又は付加を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後ろに1アミノ酸の挿入(Kabatによる残基52a)及び重鎖FR残基82の後ろに挿入残基(例えば、Kabatによる残基82a、82b及び82cなど)を含むことができる。残基のKabat番号付与は、Kabat番号付与が実施された「標準」配列と所与の抗体の配列の相同性領域におけるアラインメントによって該抗体について決定することができる。
【０１９５】
Kabat番号付与システムは、一般的に、可変ドメインにおける残基(軽鎖の残基1-107程度及び重鎖の残基1-113程度)に言及する場合に使用される(例えば、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「EU番号付与システム」又は「EUインデックス」は、一般的に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基に言及するときに使用される(例えば、Kabat et al.(上述)において報告されているEUインデックス)。「KabatにおけるようなEUインデックス」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基番号付与を指す。本明細書において他に記述がなければ、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Kabat番号付与システムによる残基番号付与を意味する。本明細書において他に記述がなければ、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、EU番号付与システムによる残基番号付与を意味する(例えば、米国特許公開第2010-280227号を参照されたい)。
【０１９６】
「アクセプターヒトフレームワーク」は、本明細書で使用するとき、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来のVL又はVHフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又は既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態において、既存のアミノ酸変化の数は、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下又は2個以下である。既存のアミノ酸変化がVHに存在する場合、好ましくはそれらの変化は、位置71H、73H及び78Hのほんの3つ、2つ又は1つで起こり、例えば、それらの位置でのアミノ酸残基は71A、73T及び/又は78Aであってもよい。いくつかの実施形態において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【０１９７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンのVL又はVHフレームワーク配列の選択における最も一般的に存在するアミノ酸残基を示すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンのVL又はVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)におけるようなサブグループである。VLについての例には、Kabat et al.(上述)におけるようなサブグループであり得るカッパI、カッパII、カッパIII又はカッパIVが含まれ得る。さらに、VHについては、サブグループは、Kabat et al.(上述)におけるようなサブグループI、サブグループII又はサブグループIIIであり得る。
【０１９８】
特定の位置の「アミノ酸修飾」は、特定の残基の置換若しくは欠失、又は特定の残基に隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基に「隣接する」挿入は、その1つ又は2つの残基内の挿入を意味する。挿入は、特定の残基のN末端側又はC末端側であり得る。本明細書では好ましいアミノ酸修飾は置換である。
【０１９９】
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のHVRにおいて1つ以上の変更を有する抗体であり、該変更は、そのような変更をもたない親抗体と比較して、抗原に対する該抗体の親和性の改善をもたらす。いくつかの実施形態において、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル親和性又はピコモル親和性さえ有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野において公知の手法によって製造される。例えば、Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、VH及びVLドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。HVR及び/又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)、Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)、Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)、Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)及びHawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に記載されている。
【０２００】
本明細書で使用するとき、用語「特異的に認識する」又は「特異的に結合する」とは、測定可能であり、再現性を有する相互作用、例えば、標的と、抗体との間の引力又は結合を指し、生物学的分子を含む不均質な分子集団の存在下で該標的の存在を決定できる。例えば、標的又はエピトープと特異的に又は優先的に結合する抗体は、それが他の標的又は標的の他のエピトープと結合するよりも高い親和性、結合性(avidity)で、より迅速に、及び/又はより長い時間、この標的又はエピトープと結合する抗体である。また、例えば、第1の標的に特異的又は優先的に結合する抗体(又は部分)は、第2の標的に特異的に又は優先的に結合してもよく又は結合しなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない(但し、排他的な結合を含んでもよい)。標的に特異的に結合する抗体は、少なくとも約103M-1若しくは104M-1、時々約105M-1若しくは106M-1、他の例においては約106M-1若しくは107M-1、約108M-1〜109M-1、又は約1010M-1〜1011M-1或いはそれを超える結合定数を有してもよい。様々なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイを慣用的に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択する。特異的な免疫反応性を決定するために用いることができるイムノアッセイフォーマット及び条件の説明については、例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
【０２０１】
「同一性」とは、本明細書で使用するとき、アライメントされた配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が、配列間で同一であることを表す。「類似性」とは、本明細書で使用するとき、アライメントされた配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基が、配列間で類似したタイプであることを指す。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンに置換され得る。高頻度で相互に置換可能なその他のアミノ酸として、
-  フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸)、
-  リジン、アルギニン、及びヒスチジン(塩基性側鎖を有するアミノ酸)、
-  アスパラギン酸及びグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸)、
-  アスパラギン及びグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸)、並びに
-  システイン及びメチオニン(イオウ含有側鎖を有するアミノ酸)
が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【０２０２】
同一性及び類似性の程度は、直ちに計算可能である(例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988、Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993、Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987、及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991を参照)。
【０２０３】
本明細書で使用するとき、補体タンパク質と第2のタンパク質の間の「相互作用」は、限定されないが、タンパク質-タンパク質相互作用、物理的相互作用、化学的相互作用、結合、共有結合及びイオン結合を包含する。本明細書で使用するとき、抗体は、抗体が2つのタンパク質間の相互作用を破壊し、減少し、又は完全に排除するとき、2つのタンパク質間の「相互作用を阻害する」。本開示の抗体又はその断片は、該抗体又はその断片が2つのタンパク質のうちの1つに結合するとき、2つのタンパク質間の「相互作用を阻害する」。
【０２０４】
「ブロッキング」抗体、「アンタゴニスト」抗体、「阻害」抗体又は「中和」抗体は、該抗体が結合する抗原の1つ以上の生物学的活性、例えば、1つ以上のタンパク質との相互作用を阻害又は低減する抗体である。いくつかの実施形態において、ブロッキング抗体、アンタゴニスト抗体、阻害抗体又は「中和」抗体は、1つ以上の生物学的活性又は抗原の相互作用を実質的に又は完全に阻害する。
【０２０５】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列バリアントFc領域)に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプとともに変動する。
【０２０６】
本明細書で使用するとき、用語「親和性」は、2つの物質(例えば抗体と抗原)の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数(KD)として表される。親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の親和性よりも、少なくとも1倍大きく、少なくとも2倍大きく、少なくとも3倍大きく、少なくとも4倍大きく、少なくとも5倍大きく、少なくとも6倍大きく、少なくとも7倍大きく、少なくとも8倍大きく、少なくとも9倍大きく、少なくとも10倍大きく、少なくとも20倍大きく、少なくとも30倍大きく、少なくとも40倍大きく、少なくとも50倍大きく、少なくとも60倍大きく、少なくとも70倍大きく、少なくとも80倍大きく、少なくとも90倍大きく、少なくとも100倍大きく、又は少なくとも1,000倍大きく、又はさらに大きくてもよい。標的タンパク質への抗体の親和性は、例えば、約100ナノモル濃度(nM)から約0.1nMまで、約100nMから約1ピコモル濃度(pM)まで、又は約100nMから約1フェムトモル濃度(fM)まで、又はさらに大きくてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「結合性(avidity)」は、2つ以上の物質の複合体の、希釈した後の解離に対する抵抗性を指す。用語「免疫反応性」及び「優先的に結合する」は、本明細書では抗体及び/又は抗原結合性断片に関して互換的に使用される。
【０２０７】
用語「結合する」は、例えば、塩橋及び水架橋などの相互作用を含む、共有結合、静電気的、疎水性、及びイオン性並びに/又は水素結合性の相互作用による、2つの分子の間の直接的結合を指す。例えば、対象の抗C1s抗体は、補体C1sタンパク質中のエピトープに特異的に結合する。「特異的結合」は、少なくとも約10-7M以上、例えば、5×10-7M、10-8M、約5×10-8M及びそれよりも大きい親和性を有する結合を指す。「非特異的結合」は約10-7M未満の親和性での結合、例えば、10-6M、10-5M、10-4Mなどの親和性での結合を指す。
【０２０８】
用語「kon」は、本明細書で使用するとき、抗原への抗体の結合に関する速度定数を指すことが意図される。
【０２０９】
用語「koff」は、本明細書で使用するとき、抗体/抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指すことが意図される。
【０２１０】
用語「KD」は、本明細書で使用するとき、抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
【０２１１】
本明細書で使用するとき、ペプチド、ポリペプチド又は抗体の配列に関して「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列をアラインさせ、必要な場合にギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮しないで、該特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当該技術分野の技術範囲内である多様な方法、例えば、公開されているコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMEGALIGN(商標)(DNASTAR)ソフトウェアを用いて達成できる。当業者は、アラインメントを測定するために適切なパラメータを決定することができ、それには、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な、当該技術分野で公知の任意のアルゴリズムが含まれる。
【０２１２】
「生物学的試料」は個体から取得された多様な試料の種類を含み、診断又は監視のアッセイにおいて使用することができる。この定義には、血液及び他の生物学的起源の液体試料、生検標本又は組織培養又はそれに由来する細胞及びその子孫などの固形組織試料が含まれる。この定義には、試薬による処理、可溶化、又はポリヌクレオチドなどの特定の構成要素の濃縮などにより、その調達後に任意の方法で操作されている試料も含まれる。用語「生物学的試料」には、臨床試料が含まれ、また培養、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、及び組織試料における細胞も含む。用語「生物学的試料」には尿、唾液、脳脊髄液、間質液、眼液、滑液、血漿及び血清などの血液分画などが含まれる。用語「生物学的試料」にはまた固形組織試料、組織培養試料、及び細胞試料も含まれる。
【０２１３】
「単離された」核酸分子は、同定されている核酸分子であって、該核酸分子が生成された環境で通常付随する少なくとも1つの夾雑核酸分子から分離されている核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、生成環境に関連するすべての成分が付随していない。本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、それが天然で見出される形態又は設定以外の形態にある。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書の任意のポリペプチド及び抗体をコードする核酸と区別される。
【０２１４】
用語「ベクター」は、本明細書で使用するとき、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。1つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、その中に付加的なDNAセグメントを連結させ得る環状の二本鎖DNAを指す。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、この場合、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結させることができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞内に導入されたときに宿主細胞のゲノム中に組み込まれることができ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用することができる。
【０２１５】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書で互換的に使用するとき、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド若しくは塩基、及び/又はそれらの類似体、或いはDNA若しくはRNAポリメラーゼによって又は合成反応によってポリマーに取り込ませることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識とのコンジュゲーションなどの、合成後になされる修飾(複数可)を含むことができる。他の修飾の種類には、例えば、「キャッピング」、天然に存在するヌクレオチドのうちの1つ以上を類似体に置換すること、例えば、非荷電結合(例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)を有するもの及び荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有するものなどのヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ(ply)-L-リジンなど)などのペンダント部分を含有するもの、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有するもの、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結を有するもの(例えば、アルファアノマー核酸など)、並びにポリヌクレオチドの非修飾形態が含まれる。さらに、糖の中に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換える、標準的な保護基によって保護する、若しくはさらなるヌクレオチドとのさらなる連結を調製するために活性化することができる、又は固体若しくは半固体の支持体にコンジュゲートさせることができる。5'及び3'末端のOHは、リン酸化するか、又はアミン若しくは1〜20個の炭素原子の有機キャップ基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを標準的な保護基へと誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-、又は2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、アラビノース、キシロース、又はリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、及びメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当該技術分野において一般に知られているリボース又はデオキシリボース糖の類似形態を含有することもできる。1つ以上のリン酸ジエステル結合を代替の連結基によって置き換えることができる。これらの代替の連結基には、限定されないが、リン酸が、P(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR'、CO、又はCH2(「ホルムアセタール」)によって置き換えられている実施形態が含まれ、ここで、各々のR又はR'は、独立して、H、又はエーテル(-O-)結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、若しくは���ラルキルを場合によって含有する置換若しくは非置換アルキル(1〜20個のC)である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の説明は、RNA及びDNAを含む、本明細書で言及されたすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【０２１６】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートの組込み用のベクターのレシピエントとすることができる又はそれであった個々の細胞若しくは細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な又は意図的な突然変異のために、もとの親細胞と必ずしも完全に同一(形態構造において又はゲノムDNA相補体において)でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
【０２１７】
「担体」は、本明細書で使用するとき、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含み、採用される用量及び濃度でそれに曝露される細胞又は哺乳動物に対して毒性を示さない。多くの場合、生理学的に許容される担体はpH緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例には、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン、単糖類、二糖類及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン、キレート剤、例えば、EDTA、糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、ツイーン(TWEEN(商標))、ポリエチレングリコール(PEG)及びプルロニック(PLURONICS(商標))が含まれる。
【０２１８】
「ニューロトロフィン」という用語は、脳内で神経保護性の栄養因子を指す。この因子は、本開示の組成物及び方法での使用に適し、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-4/5、線維芽細胞増殖因子(FGF)-2及びその他のFGF、ニューロトロフィン(NT)-3、エリスロポエチン(EPO)、肝細胞増殖因子(HGF)、上皮増殖因子(EGF)、形質転換増殖因子(TGF)-α、TGF-β、血管内皮増殖因子(VEGF)、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン、血小板由来増殖因子(PDGF)、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球マクロファージCSF、ネトリン、カルジオトロフィン-1、ヘッジホッグ、白血病抑制因子(LIF)、ミドカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質(BMP)、サポシン、セマフォリン、及び幹細胞因子(SCF)が挙げられる。
【０２１９】
用語「防止すること(予防すること、妨げること)」は、当技術分野で認識されており、状態、例えばSMAなどと関連して使用される場合には、当技術分野においてよく理解されており、その組成物を受けない対象者に比べて、対象者において医学的な状態の1つ以上の徴候の頻度若しくは重篤度を軽減するか、又はその開始を遅らせる組成物の投与を含む。したがって、SMA進行の防止は、例えば、治療を受けなかった対照集団に比べて治療を受けた患者集団において、神経変性の平均量を、例えば、統計学上及び/又は臨床上有意な量で低下させることを含む。同様に、神経変性疾患進行の防止には、治療を受けない患者と比べて、治療を受ける患者が、障害、例えば認知低下及び/若しくは記憶喪失などを生じる可能性を減少させること、又は障害の発症を遅らせることが含まれる。
【０２２０】
「対象者」という用語は、本明細書で使用されるとき、生体の哺乳類を指し、用語「患者」と互換的に使用され得る。哺乳類の例は、以下に限定されないが、哺乳類の分類の任意のメンバー:胎児を含むヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジーなど、並びに他の類人猿及びサルの種;家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど;飼育動物、例えばウサギ、イヌ、及びネコなど;齧歯類、例えばラット、マウス、モルモットなどを含む実験動物を含む。この用語は特定の年齢や性別を意味しない。
【０２２１】
用語「治療」又は「治療すること」は、本明細書で使用されるとき、対象者の状態を安定化若しくは改善するか、又は対象者が治療を受けなかった場合と同程度に対象者の状態が悪化する見込みを減少させるために、症状、臨床上の徴候、又は状態の基礎病理を減少、停止又は無効にすることを含む。
【０２２２】
治療の対象となる方法に関する化合物の「治療上有効量」という用語は、(哺乳類、好ましくはヒトに対して)望ましい投薬レジメンの一部として投与される場合に、治療されるべき障害若しくは状態のための、又は美容上の目的のための臨床上許容される基準に従って、例えば任意の医学治療に適用可能な妥当なベネフィット/リスク比で、症状を緩和し、状態を改善し、又は疾患状態の開始を遅らせる、調製物中の化合物の量を指す。本明細書中の治療上有効量は、いくつかの因子、例えば患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において望ましい反応を誘発する抗体の能力などに従って変化し得る。
【０２２３】
本明細書で使用するとき、特定の疾患、障害、若しくは状態を発症する「危険性(リスク)がある」個体は、検出可能な疾患若しくは疾患の症状を有しても又は有していなくてもよく、本明細書に記載されている治療方法の前に検出可能な疾患若しくは疾患の症状を示していても又は示していなくてもよい。「危険性がある」とは、個体が1つ以上の危険因子を有することを示し、該危険因子は、当該技術分野において公知の特定の疾患、障害、又は状態の発症と相関する測定可能なパラメータである。これらの危険因子の1つ以上を有する個体は、これらの危険因子のうち1つ以上を有しない個体よりも、特定の疾患、障害、又は状態を発症する確率が高い。
【０２２４】
「慢性的」投与とは、長期間にわたり、初期の治療効果(活性)を維持するように、急性様式ではなく連続的様式での医薬の投与を指す。「間欠」投与とは、中断することなく連続的に行われないが、むしろ本質的には周期的である治療を指す。
【０２２５】
他に定義されない限りは、本明細書中で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解される同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似した又は等価な任意の方法及び材料は本発明の実施又は試験で使用され得るが、好ましい方法と材料が次に説明される。本明細書中で言及された出版物のすべては、出版物が引用される関連の方法及び/又は材料を開示及び説明するために参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))、the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))、Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons、Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)、Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)、Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)、及びCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)に記載されている幅広く利用される方法論など。
【０２２６】
核酸、ベクター及び宿主細胞
本開示の方法で使用するのに適する抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているように、組換え法及び組成物を用いて生成することができる。いくつかの実施形態において、本開示の抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体のVL/CLを含むアミノ酸配列、及び/又はVH/CH1を含むアミノ酸配列をコードすることができる。いくつかの実施形態において、このような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。そのような核酸を含む宿主細胞も提供され得る。宿主細胞は、(1)抗体のVL/CLを含むアミノ酸配列、及び抗体のVH/CH1を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVL/CLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、及び抗体のVH/CH1を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含み得る(例えば、それで形質導入されている)。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核生物であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。
【０２２７】
抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体を作製する方法が本明細書に開示される。方法は、抗体の発現に適した条件下で、抗C1q、抗C1r又は抗C1s抗体をコードする核酸を含有する本開示の宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、その後、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から回収される。
【０２２８】
本開示のヒト化抗C1q、抗C1r又は抗C1s抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び/又は発現のための1つ以上のベクターに挿入する。このような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離され、配列決定され得る。
【０２２９】
本明細書に記載されている、本開示の抗体又はそれらの断片ポリペプチド(抗体を含む)のいずれかをコードする核酸配列を含む適切なベクターは、限定されないが、クローニングベクター及び発現ベクターを含む。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築することができ、又は当該技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。使用を意図された宿主細胞に応じて、選択されたクローニングベクターが変化し得る一方で、有用なクローニングベクターは、一般的に自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼの単一の標的を有し得、及び/又はベクターを含むクローンの選択に使用することができるマーカー遺伝子を担持することができる。適切な例としては、プラスミド及び細菌ウイルス、例えば、pUC18、pUC19、Bluescript(例えば、pBS SK+)及びその誘導体、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、並びにpSA3及びpAT28などのシャトルベクターが挙げられる。これら及び多くの他のクローニングベクターは、BioRad、Strategene及びInvitrogenなどの市販業者から入手可能である。
【０２３０】
対象とする核酸を含むベクターは、いくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入され得、手段としては、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン又は他の物質を採用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、及び感染(例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性病原体である場合)が含まれる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存する。いくつかの実施形態において、ベクターは、本開示の抗C1q、抗C1r又は抗C1s抗体をコードする1つ以上のアミノ酸配列を含む核酸を含む。
【０２３１】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞には、原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、本開示の抗C1q、抗C1r又は抗C1s抗体は、特に、グリコシル化及びFcエフェクター機能が必要ない場合、細菌中で産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関して、(例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号及び第5,840,523号、並びに大腸菌における抗体断片の発現を記載するCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。
【０２３２】
抗体スクリーニング
シナプス喪失の調節能力について、候補抗体をスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングは、インビトロモデル、遺伝子的に改変された細胞若しくは動物、又は精製されたタンパク質を使用して実施され得る。多様なアッセイ法が、この目的、例えばインビトロ培養システムなどで利用可能である。例えば、インビトロ培養システムは、ミクログリア細胞の皮質ニューロンの培養への添加、その後にニューロンから除去され、及び/又はミクログリア細胞により取り込まれたシナプスの数の計測を含み得る。
【０２３３】
候補抗体の機能的活性も、例えば、アミロイドベータオリゴマーの脳内注射による誘発試験動物、又はSMAと関連したヒト家族性突然変異で遺伝的に改変された動物、又は誘発形態のSMAを有する動物を対象として、正常な発達又は老化期間中に、シナプス喪失を調節する抗体の能力を評価することにより、インビボでも試験され得る。
【０２３４】
候補抗体は、結合アッセイなどにより、コンピューターに基づくモデリング使用しても同定され得る。様々なインビトロモデルが、抗体が補体と結合するか、さもなければその活性に影響を及ぼすか判断するのに利用可能である。そのような候補抗体は、シナプス喪失が起こりやすい環境でニューロンと接触させることにより試験され得る。そのような抗体は、シナプス喪失に対する効果についてインビボモデルにおいてさらに試験され得る。
【０２３５】
シナプス喪失は、培養中のニューロンに候補抗体を投与すること、及び抗体の非存在又は存在下でシナプスの存否を決定することによって定量可能である。本開示のいくつかの実施形態では、ニューロンは、例えば網膜神経節細胞(RGC)の初代培養である。RGCの精製された集団は、従来法、例えば連続免疫パンニングなどにより取得される。細胞は適切な培地中で培養され、該培地は適切な成長因子、例えばCNTF、BDNFなどを通常含む。神経細胞、例えばRCGは、十分な期間培養され、十分に突起を伸長させ、約1日〜1週の期間で候補抗体とともに培養される。ニューロンは、シナプス喪失のためのシグナリングを誘導するために、生きたアストロサイト細胞フィーダー上で培養され得る。アストロサイトフィーダー層を培養する方法は当技術分野で公知である。例えば、ニューロンが生存できない培地中で、非接着細胞を除去して、皮質グリアが蒔かれてもよい。
【０２３６】
シナプスの定量では、培養物は、固定され、ブロッキングされ、さらに洗浄され、次にシナプスタンパク質、例えばシナプトタグミンなどに特異的な抗体で染色し、適切な試薬で可視化される。染色の分析は顕微鏡で行うことができる。いくつかの実施形態では、蛍光発光のデジタル画像は、カメラと画像取得ソフトウェアを用いて、使用しない部分の画素値範囲を除去するように調節されており、使用する画素値は画素値範囲全体を利用するように調節されている。対応するチャンネルの画像を重ね合わせ、2つの1チャンネル画像をそれぞれのカラーチャンネルとして含むカラー(RGB)画像を生成してもよい。共局在した点は、各画像チャンネルから低周波数バックグラウンドを除くローリングボールバックグラウンドサブトラクションアルゴリズムを使用して同定することができる。画像中のすべてのシナプトタグミン、PSD-95、及び共局在した点について、数、平均面積、平均最小及び最大画素強度、並びに平均画素強度が、解析用に記録される。
【０２３７】
一般的に、複数のアッセイ混合物が、様々な濃度に対する異なる反応を取得するために、異なる抗体濃度で並行して試験される。一般的に、これらの濃度のうちの1つが、陰性対照、すなわち濃度ゼロ又は検出レベル未満のものとして使用される。
【０２３８】
医薬組成物及び投与
本開示の抗体は、医薬組成物の形態で投与され得る。
【０２３９】
本開示の抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、場合によって薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])とともに混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵用に調製され得る。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、採用される用量と濃度でレシピエントに無毒性であり、また緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、及びその他の有機酸など;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベンなど;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなど;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなど;グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物;キレート化剤、例えばEDTAなど;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなど;塩形成対イオン、例えばナトリウムなど;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);並びに/又は非イオン性界面活性剤、例えばツイーン(TWEEN(商標))、プルロニック(PLURONICS(商標))、若しくはポリエチレングリコール(PEG)などを含有する。
【０２４０】
リポフェクション又はリポソームもまた、抗体又は抗体断片を細胞内に送達するために使用することができ、ここで、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合するエピトープ、又は最小断片が好ましい。
【０２４１】
抗体はまた、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中にそれぞれ取り込むことができ、コロイド薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)中、又はマクロエマルジョン中に取り込むことができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２４２】
非経口投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通る濾過によって容易に達成される。
【０２４３】
徐放調製物が調製できる。徐放調製物の適切な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含み、これらのマトリックスは造形品の形態、例えば、フィルム又はマイクロカプセルである。徐放マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア)など、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。ポリマー、例えばエチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などは、100日以上の間分子を放出できる一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間でタンパク質を放出する。
【０２４４】
本開示の抗体及び組成物は、局所的、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、及び病変内投与を含む、但しこれらに限定されない様々な経路により一般的に投与される。非経口投与経路として、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、又は皮下投与が挙げられる。本開示の抗体及び組成物は、発育中の胎児への投与を含み得る(例えば、血管内など)。
【０２４５】
医薬組成物は、所望の製剤に応じて、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして規定される、希釈剤の薬学的に許容される無毒性担体も含むことができる。希釈剤は、組合せ物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、PBS、リンガー溶液、デキストロース、及びハンクス溶液である。さらに、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、又は無毒性で非治療的な非免疫原性の安定剤、賦形剤などを含むことができる。また組成物は、生理学的条件に近づけるための追加の物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤、及び界面活性剤なども含むことができる。
【０２４６】
組成物は、様々な安定化剤のいずれか、例えば抗酸化剤などを含むことができる。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、該ポリペプチドは、ポリペプチドのインビボでの安定性を増強する、そうでなければその薬理学的特性を高める(例えば、ポリペプチドの半減期を増加させる、その毒性を低減させる、その他の薬物動態学的及び/又は薬力学的な特徴を強化する、溶解性又は取り込みを高める)、様々な周知の化合物と複合体化することができる。そのような修飾剤又は複合体化剤の例には、硫酸、グルコン酸、クエン酸、及びリン酸が含まれる。組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボでの属性を高める分子と複合体化することができる。このような分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン(例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン)、及び脂質が挙げられる。様々な種類の投与に適した製剤に関するさらなる指導は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)に見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単な概説については、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照されたい。
【０２４７】
活性成分の毒性及び治療有効性は、例えばLD50(集団の50%に致死的な用量)及びED50(集団の50%に治療上有効な用量)を決定することを含む、細胞培養及び/又は実験動物における標準的な薬学的手順に従って決定することができる。毒性及び治療効果の間の用量比は治療指数であり、これはLD50/ED50の比として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。
【０２４８】
細胞培養及び/又は動物試験から得られるデータは、ヒトのための用量の範囲を定式化する際に使用することができる。活性成分の用量は、一般的に、毒性の低いED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、採用される投薬形態及び利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。
【０２４９】
本明細書に記載される医薬組成物は、様々な異なる方法で投与することができる。例としては、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、髄腔内、及び頭蓋内の方法により、薬学的に許容される担体を含有する組成物を投与することが挙げられる。
【０２５０】
経口投与について、有効成分は、固体製剤、例えばカプセル、錠剤、及び粉末など、又は液体製剤、例えばエリキシル、シロップ、及び懸濁液などで投与することができる。有効成分は、不活性成分及び粉末担体、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどとともにゼラチンカプセルに封入することができる。望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散、又は他の公知の望ましい特徴を提供するために添加することができる追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、及び食用白色インクである。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作製することができる。錠剤とカプセルの両方は、数時間にわたって薬剤の連続放出を提供する徐放製品として製造することができる。圧縮錠剤は、いかなる不快な味もマスクし、錠剤を大気から保護するために糖衣で被覆され若しくはフィルムで被覆され、又は胃腸管における選択的崩壊に関して腸溶被覆され得る。経口投与用の液体製剤は、患者の許容性を高めるために着色料及び香味料を含有することができる。
【０２５１】
非経口投与に適切な製剤には、水性及び非水性、等張滅菌注射溶液が挙げられ、それらには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液が含まれ得る。
【０２５２】
医薬組成物を製剤化するために使用される成分は、好ましくは、高純度のものであり、潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない(例えば、少なくともナショナルフード(NF)グレード、一般には、少なくとも分析グレード、より典型的には少なくとも医薬品グレード)。さらに、非経口用として意図された組成物は、通常無菌である。所与の化合物が使用前に合成されなければならない程度に、得られた生成物は、典型的には、合成又は精製プロセス中に存在し得る、いかなる潜在的に有毒な作用物質、特にいかなる内毒素も実質的に含まない。非経口投与用の組成物はまた、実質的に等張性であり、GMP条件下で作製される。
【０２５３】
本開示の組成物は、任意の医学的に適切な手順、例えば、血管内(静脈内、動脈内、毛細血管内)投与、脳脊髄液への注入、硝子体内、局所、体腔内、又は脳内直接注入を使用して投与されてもよい。髄腔内投与は、公知の技術に従って、オンマヤリザーバの使用により実施してもよい(F. Balis et al., Am J. Pediatr. Hematol. Oncol. 11, 74, 76(1989))。
【０２５４】
治療剤が脳において局所的に投与される場合には、本開示の治療用組成物を投与するための1つの方法は、任意の適切な手法により、例えば、投与のために腔又はシストの中に、直接注入(必要な場合には、注入シリンジの定位固定の位置決定に助けられて)するか、又はオンマヤリザーバの先端を配置することなどによって、その場所の中又は付近に配置することによる。或いは、対流強化送達カテーテルを、その場所の中へ、天然の又は外科的に生成されたシストの中へ、又は正常な脳塊の中へ直接埋め込んでもよい。そのような対流強化医薬組成物送達装置は、組成物の脳塊全体への拡散を大きく改善する。この送達装置の埋め込まれたカテーテルは、治療用組成物を脳及び/又は腫瘍塊へ送達するために、拡散流ではなく高流動微量注入を利用する(約0.5〜15.0μl/分の範囲の流速を用いる)。そのような装置は米国特許第5,720,720号に記載され、参照により本明細書に全体が組み入れられる。
【０２５５】
特定の患者に与えられる治療用組成物の有効量は様々な因子に依存し得るが、そのいくつかは患者間で異なり得る。能力のある臨床医は、患者に投与する治療剤の有効量を決定することができる。薬剤の用量は、治療、投与経路、治療の性質、患者のその治療に対する反応性などに依存する。LD50動物データ及び他の情報を利用して、臨床医は、投与経路に依存して、個体にとっての最大安全用量を決定することができる。通常の技術を利用して、能力のある臨床医は、通常の臨床試験の過程で特定の治療用組成物の用量を最適化することができる。組成物は、一連の1つより多い投与において対象者に投与することが可能である。治療用組成物の場合、一定の周期的な投与が時に必要である、又は望ましい場合がある。治療レジメンは薬剤によって変わり、例えば、いくつかの薬剤は、1日又は半日毎に長期間服用してもよいが、より選択的な薬剤は、より特定された時間経過、例えば、1日、2日、3日以上、1週以上、1月以上などで、1日毎、半日毎、半週毎、毎週毎で投与されてもよい。
【０２５６】
製剤は、脳における保持及び安定化のために最適化してもよい。薬剤が頭蓋区画に投与される場合、薬剤は、区画内に保持され、拡散されず、さもなければ血液脳関門を通過しないことが望ましい。安定化技術は、分子量の増加を達成するために、架橋、多量体化、又は基、例えばポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体などへの連結などを含む。
【０２５７】
保持を増加させるための他の方策には、生分解性又は生侵食性移植物への薬剤の取り込みが含まれる。治療的活性剤の放出速度は、ポリマーマトリックスを通過する輸送速度及び移植物の生分解によって調節される。また、ポリマー障壁を通過する薬物の輸送は、化合物の溶解度、ポリマーの親水性、ポリマーの架橋度、ポリマー障壁を薬物に対してより透過性にする吸水時のポリマーの膨張、移植物の形状などによっても影響を受ける。移植物は、移植部位として選択される領域のサイズ及び形状に見合った大きさのものである。移植物は、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、マイクロカプセルなどであってもよく、また選択された挿入部位に適合する任意のサイズ又は形状であってもよい。
【０２５８】
移植物は、モノリシックであってもよく、すなわち活性剤を、ポリマーマトリックスにわたり均一に分布させるか又はカプセル化し、この場合、活性剤のリザーバはポリマーマトリックスによってカプセル化される。採用されるポリマー組成物の選択は、投与部位、所望の治療期間、患者の耐性、治療されるべき疾患の性質などにより変化する。ポリマーの特徴としては、移植部位での生分解性、目的の薬剤との適合性、カプセル化の容易性、生理学的環境における半減期が含まれる。
【０２５９】
採用することができる生分解性ポリマー組成物は、分解したとき、単量体を含む生理学的に許容される分解生成物をもたらす有機エステル又はエーテルであり得る。無水物、アミド、オルトエステルなどは、単独で又は他の単量体と組み合わせて用途を見出すことができる。ポリマーは、縮合ポリマーであり得る。ポリマーは、架橋であっても、また非架橋であってもよい。特に興味深いのは、ヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、ホモポリマー又はコポリマーのいずれか、及び多糖類である。対象とするポリエステルには、D-乳酸、L-乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、ポリカプロラクトン、及びそれらの組合せのポリマーが含まれる。L-ラクテート又はD-ラクテートを採用することによって、ゆっくりと生分解するポリマーが達成され、一方、分解は、ラセミ化合物で実質的に高められる。グリコール酸と乳酸のコポリマーは、特に関心が高く、この場合、生分解速度は、乳酸に対するグリコール酸の比率によって調節される。最も急速に分解されるコポリマーは、ほぼ同量のグリコール酸と乳酸を有し、この場合、ホモポリマーのいずれかは分解に対してより抵抗性がある。乳酸に対するグリコール酸の比率はまた、移植物における脆性にも影響し、この場合、より柔軟な移植物はより大きい形状に望ましい。対象とする多糖類には、アルギン酸カルシウム、及び官能化セルロース、特に約5kD〜500kDの分子量、水不溶性であることによって特徴付けられるカルボキシメチルセルロースエステルなどがある。生分解性ハイドロゲルはまた、本開示の移植物に採用することもできる。ハイドロゲルは、典型的には、液体を吸収する能力によって特徴付けられるコポリマー材料である。採用され得る例示的な生分解性ハイドロゲルは、Heller: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. III, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, pp 137-149に記載されている。
【０２６０】
キット
本開示はまた、医薬組成物の配合物のうちの1つ以上が充填された1つ以上の容器を備える医薬パック又はキットも提供する。そのような容器と関連するものとして、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関が規定する書式の注意書きを挙げることができ、該注意書きは、ヒトへの投与を目的とする製造、使用、又は販売を所管する機関による承認を反映する。
【０２６１】
本開示のキットは、精製された抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体を含む1つ以上の容器、及び当技術分野で公知の方法に基づく使用説明書を含み得る。一般的に、これらの説明書は、当技術分野で公知の任意の方法に従って、疾患を治療又は診断するための阻害剤の投与の説明を含む。キットは、その個体がSMA及びSMAの段階を有するかどうかを同定することに基づいて、治療に適した個体を選択する説明をさらに含んでもよい。
【０２６２】
説明書は、一般的に、意図された治療のための用量、投薬スケジュール及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば、複数用量パッケージ)又はサブユニット用量であってもよい。本開示のキットに付属される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書(例えば、キットに含まれる紙シート)の指示書であるが、機械によって読むことができる説明書(例えば、磁気又は光学記憶ディスク上に担持された説明書)も許容される。
【０２６３】
ラベル又は添付文書は、組成物が、SMAを治療するために使用されることを示す。説明書は、本明細書に記載されている方法のいずれかを実施するために提供されてもよい。
【０２６４】
本開示のキットは、好ましくは適する包装内に配置される。適する包装として、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟包装(例えば、密閉されたマイラ又はプラスチック袋)などが挙げられるが、但しこれらに限定されない。また、吸入器、経鼻投与デバイス(例えば、アトマイザー)又は注入デバイス、例えばミニポンプなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージが企図される。キットは無菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。容器はまた無菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は古典的補体経路の阻害剤である。容器は、第2の薬学的活性剤をさらに含んでもよい。
【０２６５】
キットは、場合により、緩衝液及び解釈的情報などの追加の要素を提供することができる。通常、キットは、容器と、容器上又は容器に関連するラベル若しくは添付文書を含む。
【０２６６】
補体の阻害
補体の活性を阻害するいくつかの分子が公知である。公知の化合物に加えて、適切な阻害剤が本明細書に記載される方法によりスクリーニングされ得る。上述の通り、正常な細胞は補体活性を遮断するタンパク質、例えばCD59、C1阻害剤などを産生し得る。本開示のいくつかの実施形態では、補体はそのようなポリペプチドをコードする遺伝子の発現を上方制御することにより阻害される。
【０２６７】
補体活性化を遮断する分子の改変もまた当技術分野で公知である。例えば、そのような分子は、限定されないが、改変補体受容体、例えば可溶性CR1などを含む。CR1の最も一般的なアロタイプの成熟タンパク質は、1998個のアミノ酸残基(1930残基の細胞外ドメイン、25残基の膜貫通領域、及び43残基の細胞質ドメイン)を含む。細胞外ドメイン全体は、それぞれ60個〜70個のアミノ酸残基からなる短いコンセンサスリピート(SCR)又は補体制御タンパク質リピート(CCPR)と呼ばれる30回繰り返しユニットで構成される。近年のデータは、C1qがヒトCR1に特異的に結合することを示す。したがって、CR1は、3つの補体オプソニンのすべて、すなわちC3b、C4b及びC1qを認識する。膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有さない、可溶性バージョンの組換えヒトCR1(sCR1)が生成されており、天然CR1の公知の機能のすべてを保持することが示されている。虚血/再灌流損傷の動物モデルにおけるsCR1の心保護的役割が確認されている。数種類のヒトC1q受容体(C1qR)が記述されてきた。これらには、C1qのコラーゲン様ドメインに結合することからcC1qRと呼ばれる、遍在的に分布する60kDa〜67kDaの受容体が含まれる。このC1qRバリアントは、カルレティキュリン(単球の食作用を調節する126kDa受容体)であることが示された。gC1qRは膜結合型分子ではなく、C1qの球状領域に親和性を有する分泌型可溶性タンパク質であり、補体活性化の液相制御因子として機能し得る。
【０２６８】
崩壊促進因子(DAF)(CD55)は、4つのSCR、及び広範なO-結合型グリコシル化が可能であるセリン/スレオニン富化ドメインから構成される。DAFは、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーにより細胞膜に結合しており、そのC4bとC3bに結合する能力を通じて、C3及びC5コンバーターゼを解離することにより働く。DAFの可溶性バージョン(sDAF)は補体活性化を阻害することが示されている。
【０２６９】
「セルピン」ファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤のメンバーであるC1阻害剤は、液相C1活性化を妨げる高度にグリコシル化された血漿タンパク質である。C1阻害剤は、C1r及びC1sの活性部位を遮断し、それらをC1qから解離させることによって、古典的経路の補体活性化を制御する。
【０２７０】
補体活性化のペプチド阻害剤としてC5aが挙げられ、またその他の阻害性分子として、フカン(Fucan)が挙げられる。
【０２７１】
シナプス喪失
シナプスは2つのニューロンの間、又はニューロンと筋肉細胞の間の神経筋接合部(NMJ)に形成される非対称連絡接合部である。化学シナプスは、神経伝達物質の分泌により細胞から細胞への連絡を可能にし、一方電気シナプスでは、シグナルがイオン性電流を許容する特化した細胞間チャンネルであるギャップ結合を通じて伝達される。イオンに加えて、シナプス機能を調節する他の分子(ATP及びセカンドメッセンジャー分子など)が、ギャップ結合ポアを通って拡散し得る。成熟したNMJでは、シナプス前膜及びシナプス後膜は、基底膜を形成する細胞外タンパク質を含有するシナプス間隙によって隔てられている。シナプス小胞は、シナプス前部の放出部位にクラスター化しており、伝達物質受容体は、シナプス後膜の接合部ひだにクラスター化しており、グリアの突起が神経終末を囲んでいる。
【０２７２】
シナプス形成は動的過程である。発生中では、最終的に維持されるよりも多くのシナプスが生じる。したがって、過剰なシナプス入力の除去は、シナプス回路成熟において重要なステップである。シナプス除去は、シナプス前部と後部のパートナー間の相互作用が関与する競合的過程である。CNSでは、NMJと同様に、シナプス回路の発生過程の活動依存的再構築が、同期活動入力を選択的に安定化し、非同期活動性の入力を除去することを含み得る過程によって起きる。シナプス回路の解剖学的精密化が、シナプスの急速な除去を伴う動的過程によって、個別の軸索と樹状突起のレベルにおいて生ずる。軸索が分枝し再構築する際には、シナプスは、形成し、急速に起きるシナプス除去により解体する。
【０２７３】
正常な発生中の喪失に加えて、シナプス喪失は、SMAを含む多くの神経変性障害に共通する早期の病理学的現象であり、認知低下と最もよく相関する。例えば、臨床前のアルツハイマー病(AD)の患者の脳、並びに遺伝子改変動物モデルにおける研究では、シナプス損傷が疾患進行初期に起きることを示している。脳におけるこのシナプス結合の早期破壊は、ニューロンの機能不全をもたらし、これは次に、いくつかの神経変性障害で観察される認知症及び/又は運動障害の特徴的な症状につながる。
【０２７４】
AD及び他の神経変性障害に関わるいくつかの分子は、シナプス機能において重要な役割を果たす。例えば、AβPPは中枢及び末梢のシナプス部位に優先的な局在を有する。遺伝子改変マウスでは、変異型のAβPPの異常発現が、アミロイド沈着をもたらすだけでなく、広範なシナプス損傷ももたらす。このシナプス病態は早期に起こり、プラーク形成よりも可溶性Aβ1-42のレベルに関連している。遺伝子産物が、シナプス複合体と密接に関連することが示されている他の神経変性疾患として、ハンチントン病(HD)及び筋緊張性ジストロフィー(DM)が挙げられる。ハンチンチン(HTT)は、シナプス小胞タンパク質シナプトフィジンのものと非常によく似た分布を有する膜結合型タンパク質である。ヒト脳における研究では、一部のニューロンの核周囲部、ニューロピル、バリコシティにおいて、神経終末と思われる点状の染色として、HTTが検出された。DM遺伝子の遺伝子産物であるセリン/スレオニンキナーゼ(DMK)が、骨格筋の神経筋接合部と、心臓組織の介在板において、シナプス後部に局在することが見出されている。DMKは、小脳、海馬、中脳、及び髄質におけるシナプス部位でも見出された。
【０２７５】
本明細書に開示の抗体は、シナプス喪失SMAを阻害するのに利用可能である。シナプス喪失を阻害すればシナプスの維持又はシナプス喪失の低減を引き起こすが、さもなければ減少が生ずる。
【０２７６】
血液脳関門
本明細書で使用するとき、「血液脳関門」(BBB)とは、末梢循環と脳及び脊髄の間の関門を指す。BBBは、脳毛細血管内皮細胞膜内での緊密な接合により形成される。そのような緊密な接合が形成されると、極めて緊密なバリアが構築され、分子量60Daの尿素ほどに小型の分子であっても、脳内への分子の輸送が制限される。脳内の血液-脳関門、脊髄内の血液-脊髄関門、及び網膜内の血液-網膜関門は、中枢神経系(CNS)内の連続した毛細血管関門であり、まとめて血液脳関門又はBBBと呼ばれる。本開示は、BBB受容体媒介型輸送システムと結合する抗体であって、BBBを通過する輸送が望ましい薬剤、例えば神経治療剤と結びついたそのような抗体を含む組成物及び方法を提供する。本開示の組成物及び方法は、選択された内因性のBBB受容体媒介型輸送システムにより輸送することができ、また所望の薬剤にも結合することができる任意の適する構造を利用することができる。
【０２７７】
BBBは、いくつかの高分子を血液から脳に輸送できるようにする特異的受容体を有することが明らかにされており、このようなトランスポーターは、本開示の組成物のためのトランスポーターとして適する。本開示において有用な内因性のBBB受容体媒介型輸送システムは、インスリン、トランスフェリン、インスリン様増殖因子1及び2 (IGF1及びIGF2)、レプチン、並びにリポタンパク質を輸送するトランスポーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、内因性インスリンBBB受容体媒介型輸送システム、例えば、ヒト内因性インスリンBBB受容体媒介型輸送システムを介して、BBB通過能力を有する構造を利用する。
【０２７８】
血液脳関門(BBB)を通過する薬物送達のための1つの方策は、浸透圧的手段、例えばマンニトール若しくはロイコトリエンなどによるBBBの破壊、又は血管作動性物質、例えばブラジキニンなどの使用による生化学的なBBBの破壊を必要とする。特定の薬剤に的を絞ったBBB開門を使用する可能性も選択肢の1つである。BBB破壊剤は、組成物を血管内注入により投与する際に、本発明の治療用組成物とともに共投与することができる。BBBを通過する他の方策は、担体媒介性トランスポーター、例えばグルコース及びアミノ酸担体など、インスリン又はトランスフェリンに対する受容体媒介性トランスサイトーシス、並びに活性排出トランスポーター、例えばp-糖タンパク質などを含む、内在性輸送システムの使用を必要とし得る。活性輸送成分も、血管の上皮壁を通過する輸送を促進するために、本開示の抗体にコンジュゲートされてもよい。或いは、例えば、オンマヤリザーバを経由するような、脳脊髄液への薬剤の髄腔内直接送達により、BBBの背後に薬物を送達することも検討され得る。
【０２７９】
脊髄性筋萎縮症
本開示の抗体は、補体経路の阻害剤(例えば、阻害剤、例えば抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体など)を投与することを含む、SMAを予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する本方法において有用であり得る。また、本開示の抗体は、SMAにおけるシナプス喪失の阻害でも有用であり得る。
【０２８０】
シナプス喪失は、神経変性疾患の重要な指標として機能する認知機能低下の重要な相関事象である。例えば、ミクログリアは、シナプスの発達を阻害し、そしてシナプスの可塑性及び機能を制御する。ミクログリア-シナプス相互作用の破壊は、シナプス喪失、及び神経変性疾患における認知障害を含む機能障害に寄与する。さらに、ミクログリア上で発現する免疫関連の分子又は受容体、例えば補体タンパク質、又は補体、及びフラクタルキン受容体などを破壊すると、出生前及び出生後の両方における脳の発達においてシナプスの異常及び配線異常を引き起こし、ミクログリアとシナプス接合のスカルプティングとを関連付ける。
【０２８１】
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、幼児において主に診断され、また成人ではより頻度が低い、臨床的に不均一な常染色体劣性神経変性疾患である。
【０２８２】
補体経路の異常な活性化及びミクログリアの食細胞活性は、SMAにおけるシナプス喪失を媒介し得る。例えば、本明細書に開示するように、C1qの遮断は、脊髄性筋萎縮症(SMA)を予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療する方法において、補体阻害剤として役に立つ可能性がある。SMAのマウスモデルを対象とした免疫組織化学アッセイから、C1qが運動ニューロン上の抑制性シナプスではなく、興奮性シナプスと異常会合していることが判明した。またC1q及びC3は、影響を受けやすい運動ニューロン上の固有受容性(VGluT1+)シナプスにも付着する。シナプス除去では、SMN欠損脊髄におけるC1qの主要な供給源である反応性ミクログリアの食細胞活性が媒介する。モノクローナル抗C1q抗体を用いたC1qのインビボ遮断による免疫療法は、除去されるように運命づけられたシナプスを救済し、また初期のシナプス喪失を阻止する。行動上及び形態学上の分析から、固有受容性シナプスの有意な救済、正向時間、姿勢、及び寿命の改善が明らかになった。脊髄のエクスビボ調製を利用する機能的アッセイでは、除去から救済されたシナプスは機能的であることが実証され、SMAが運動回路の疾患であるというさらなる証拠を提供する。
【０２８３】
SMAは、サバイバル運動ニューロン遺伝子(SMN)の欠損/突然変異により引き起こされる。ヒトでは、2つのSMN遺伝子、すなわちユビキタスタンパク質(完全長SMN又はFL-SMN)をコードするテロメリックSMN1、及びエクソン7を欠いた、非機能的なタンパク質を主に生成するそのセントロメア相同体SMN2 (Δ7-SMN)が存在するが、実際、SMAの重症度を調節可能な機能的タンパク質について、SMN2遺伝子が生成するその量は限定されている。これから、異なる発現年齢及び疾患の重症度により特徴付けられる5つの主要な臨床的SMAの型(0、I、II、III、IV)の存在が説明される。SMAの指標として、運動ニューロンの喪失、及び異常な姿勢反射が挙げられる。
【０２８４】
0型又は出生前SMAは、SMAの最も重度の形態として提案された呼称である。罹患した幼児は、出生時に顕著な衰弱及び先天性多発性関節拘縮症を一般的に呈する。0型SMAの幼児は、一般的に6カ月以前に死亡する。
【０２８５】
I型はこれまでにウェルドニッヒ・ホフマン病(Werdnig-Hoffmann)と呼ばれ、症例の約60%を占める。症状は、出生時又は出生後の最初の数か月以内に現れる。I型の幼児は、重度の衰弱を呈し、低緊張性であり、介助なくして座ることができず、嚥下困難であり、腱反射を認めず、また吸引反射の障害及び呼吸器系合併症を有する。舌線維束性収縮を有するのがほとんどである。呼吸不全が原因の死亡が、幼児の2回目の誕生日までに一般的に生ずる。
【０２８６】
SMA II型は、SMAの中間形態である。症状は、生後6〜12カ月において通常明白であり、そして衰弱、筋緊張低下、体位性の手指振戦、及び低速移動又は歩行の不具合により特徴付けられる。II型の個体では、腱反射を認めない。II型罹患患者は、配置されさえすれば、一般的に自立した座位を維持することができ、介助付きで歩行する能力を有し得るが、また青年期及び若年成人期まで生存し得る。I型と同様に、呼吸不全が、通常II型小児の死因である。
【０２８７】
III型は、SMAのより軽度の形態であり、症状は2歳以降に現れる。下肢が、脊柱側弯症、筋腱短縮を含む合併症及び呼吸器系合併症により、最も一般的に影響を受ける。SMA III罹患患者は、一般的に補助なしで歩行することができる。III型の個体は、成人期まで生存することができる。
【０２８８】
SMA IV型は、III型と類似した表現型を有する成人期発症型の状態である。この型のSMAは稀である。
【０２８９】
胃腸合併症は、SMAの個体において一般的であり、またこの合併症は、非移動性及び栄養失調に起因するものか、又は胃腸の移動性に一次的欠陥が存在するのかはっきりしていない。I型SMAの幼児は、多くの場合食事時間が長く、またすぐに疲労する。この摂食能力の低下は、進行性衰弱の第1の兆候であり得、そして生育の不具合及び誤嚥を引き起こすおそれがある。胃腸機能障害として、延髄機能障害に起因する摂食及び嚥下困難が挙げられ、また舌の衰弱、開口困難、及び頭部制御不良として顕在化する。その他の関連する問題として、胃食道逆流、胃排出遅延、及び便秘が挙げられる。このような合併症は、その他の理由により、座る又は立つことができない個体にも認められるが、またSMAを有するが歩行できる個体ではあまり一般的ではない。
【０２９０】
衰弱及び移動障害は、SMA患者における非常に多くの筋骨格問題の病因となり得る。早期に把握し、そして適切な管理を行えば、機能の維持、生存能力の劣化防止、及び生活の質の改善に役立つ。SMAを有する歩行不能の個体では、拘縮が一般的であり、また柔軟性を維持し、拘縮を予防する定期的なストレッチング及びブレーシングプログラムが、治療の主たる目的である。手動式及び電動車椅子が、生後18〜24カ月の早期から開始され得る。若干の荷重を支えることができ、また若干の体幹制御を有する小児は、短下肢装具を備えたスタンディングフレーム又はモバイルスタンダーを使用することもできる。
【０２９１】
脊柱側弯症が、SMAを有するほとんどすべての歩行不能の個体において生ずる。治療しなければ、脊柱側弯症は胸郭変形と後続する呼吸器系制限を引き起こす。脊柱の融合及びブレーシングは、脊柱側弯症に対する選りすぐりの治療法であるが、但しその有効性について明確なコンセンサスは形成されていない。
【０２９２】
治療方法
補体活性化を阻害する薬剤を投与することにより、そうしなければ失われてしまうシナプスを維持することができる。そのような薬剤として、抗C1q抗体、抗C1r抗体、又は抗C1s抗体阻害剤が挙げられる。その他の薬剤として、天然補体発現を上方制御する阻害剤、又はニューロン、アストロサイト、ミクログリア、内皮細胞、又は乏突起膠細胞におけるC1q、C1r、又はC1s合成を下方制御する薬剤、補体活性化を遮断する薬剤、補体活性化に対するシグナルを遮断する薬剤などを挙げることができる。そのような薬剤は、脊髄性筋萎縮症治療を目的として、単独で又は1つ以上のその他の療法、例えばアンチセンス薬療法などと組み合わせて利用可能である(下記の「併用療法」セクションを参照)。例えば、本明細書に記載するような抗体は、アンチセンス薬スピンラザ(商標)(ヌシネルセン)と同時に投与され得る。
【０２９３】
本明細書に開示する薬剤の投与は、単独使用又は本明細書に開示するその他の薬剤との併用によらず、例えば、脊髄性筋萎縮症(SMA)に罹患した患者において、SMAを予防する、その発症リスクを低下させる、又はそれを治療するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に開示する方法は、死亡率を低下させ、及び/又はSMAに罹患した患者の寿命を延ばす。
【０２９４】
本方法は、シナプス喪失と関連した状態、例えばSMAなどにおけるニューロン機能維持の改善を促進する。神経接合を維持すれば、未治療患者と比較して神経変性疾患において機能的改善をもたらす。シナプス喪失の防止は、そのような治療を欠いた対照と比較して、1、2、3、4、5、6日間、又は少なくとも1週間にわたり、少なくとも測定可能な改善、例えば、少なくとも10%のシナプス数の改善、少なくとも20%の改善、少なくとも50%の改善、又はそれ超を含み得る。
【０２９５】
本開示の薬剤は、あらゆる副作用を最低限に抑えつつ、シナプス喪失を減少させる投薬量で投与され得る。組成物は、インビボ使用に関する医師のガイダンスに従い、取得及び使用され得るものと考えられる。治療用製剤の投薬量は、疾患の性質、投与頻度、投与方法、宿主からの薬剤排除などに依存して幅広く変化し得る。
【０２９６】
特定の患者に投与される治療組成物の有効量は、様々な因子に依存し得るが、そのうちのいくつかは、患者間で異なり得る。通常の技術を利用して、能力のある臨床医は、通常の臨床試験の過程において特定の治療用組成物又は造影組成物の投薬量を調製することができる。
【０２９７】
治療剤、例えば補体の阻害剤、遺伝子発現のアクチベーターなどは、適切な薬学的に許容される担体又は希釈剤との併用によって、治療用投与のための多様な製剤に取り込むことができ、また固形、半固形、液体、又はガス状の形態の調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、軟膏、液剤、坐薬、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェア剤、及びエアロゾル剤などに製剤化してもよい。したがって、化合物の投与は、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、髄腔内、経鼻、気管内などの投与を含む多様な方法で達成し得る。活性剤は、投与後に全身性であってもよいし、また局所投与、壁内投与の使用によって、又は活性用量をインプラントの部位に保持するように働くインプラントの使用によって局在化させてもよい。
【０２９８】
併用治療
本開示の補体阻害剤は、脊髄性筋萎縮症の治療を目的として、限定されないが、任意の追加の治療、例えば免疫抑制療法又はアンチセンス薬物療法などと連携して利用可能である。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、補体活性化の代替的経路の阻害剤と組み合わせて投与され得る。そのような阻害剤として、限定されないが、B因子遮断抗体、D因子遮断抗体、CD59の可溶性、膜結合型、タグ化、又は融合タンパク質形態、DAF、CR1、CR2、Crry、又はC3の切断を遮断するコンプスタチン様ペプチド、非ペプチドC3aRアンタゴニスト、例えばSB 290157など、コブラ毒因子又は非特異的補体阻害剤、例えばメシル酸ナファモスタット(FUTHAN; FUT-175)、アプロチニン、K-76モノカルボン酸(MX-1)、及びヘパリンなどを挙げることができる(例えば、T.E. Mollnes & M. Kirschfink, Molecular Immunology 43 (2006) 107-121を参照)。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、自己抗体とその自己抗原の間の相互作用の阻害剤と組み合わせて投与される。そのような阻害剤は、精製された可溶性形態の自己抗原、又は抗原模倣物、例えばペプチド、若しくはAQP4抗原のミモトープを含むRNA由来のミモトープを含むことができる。或いは、そのような阻害剤は、古典的補体経路を誘発することなく、自己抗原を認識し、自己抗体の結合を防ぐ遮断剤を含むことができる。そのような遮断剤として、例えば、自己抗原結合RNAアプタマー、又はそれらのFcドメイン内で機能性C1q、C1r、若しくはC1s結合部位を欠損している抗体(例えば、Fab断片、又はC1q、C1r、若しくはC1sに結合しないように別途工学的に作出された抗体)が含まれ得る。
【０３００】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の抗体は、アンチセンス薬と連携して投与され得る。アンチセンス薬は、スプライシングの修正により、完全に機能的なタンパク質の発現を復元し得る。そのようなアンチセンス薬は、ヒトSMN1又はSMN2プレmRNAをコードする核酸に対して相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る(例えば、アンチセンス薬は、ヒトSMN2プレmRNAをコードする核酸のイントロン7に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る)。例えば、本開示の抗体は、アンチセンス薬スピンラザ(商標)(ヌシネルセン)と連携して投与され得る。
【０３０１】
本開示の方法では、中枢神経系への細胞又は組織移植と組み合わせた使用を見出すことができるが、そのようなグラフトとして、神経前駆体、例えば胎児組織中に見出される前駆体など、神経幹細胞、胚性幹細胞、又は神経の修復又は強化について検討されるその他の細胞及び組織などが挙げられる。神経幹細胞及び前駆細胞は、散在するCNS領域への十分に立証された移動経路に沿った移動、微環境的契機に応答した発達的及び領域的にも適切な複数の細胞型への分化、並びに宿主前駆細胞及びその子孫を伴う非破壊的非腫瘍形成的な点在(interspersion)を含む、正常な発達の側面に関与することができる。ヒトNSCは、このような散在する場所において、インビボで外来導入遺伝子を発現する能力を有する。したがって、このような細胞では、SMA治療での使用が見出される。
【０３０２】
参照による組込み
本明細書において引用される各々の特許、公開特許出願及び非特許文献はここに参照によってその全体が組み込まれる。
【０３０３】
等価物
当業者は、本明細書に記載される発明の特定の実施形態の多くの等価物を、通常の実験に過ぎないものを使用して認識するか、又は確認することができる。そのような等価物は以下の特許請求の範囲によって含まれることが意図される。
【図１】
2019514994.tif 000014
【図２】
2019514994.tif 000015
【図３】
2019514994.tif 000016
【図４】
2019514994.tif 000017
【図５】
2019514994.tif 000018
【図６−１】
2019514994.tif 000019
【図６−２】
2019514994.tif 000020
【図７−１】
2019514994.tif 000021
【図７−２】
2019514994.tif 000022
【図８】
2019514994.tif 000023
【図９】
2019514994.tif 000024
【図１０】
2019514994.tif 000025
【図１１】
2019514994.tif 000026
【図１２−１】
2019514994.tif 000027
【図１２−２】
2019514994.tif 000028
【図１２−３】
2019514994.tif 000029
【図１２−４】
2019514994.tif 000030
【図１３−１】
2019514994.tif 000031
【図１３−２】
2019514994.tif 000032
【図１３−３】
2019514994.tif 000033
【配列表】
2019514994000001.app
【国際調査報告】
2019514994.tif 000034
2019514994.tif 000035
2019514994.tif 000036
2019514994.tif 000037
2019514994.tif 000038
2019514994.tif 000039
2019514994.tif 000040
2019514994.tif 000041