(57)【要約】Cas9阻害ポリペプチドの組成物および方法が提供される。2019535324.tif 000031
2019535324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する方法であって、以下の段階を含む、方法：
該細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に（例えば、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%）同一であるCas9阻害ポリペプチドを、細胞内に導入し、それによって細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する段階。
【請求項２】
細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCas9ポリペプチドと接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Cas9阻害ポリペプチドがSEQ ID NO: 1〜170のうちの1つを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
細胞が、前記導入の前にCas9ポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞が、Cas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
プロモーターが誘導性であり、かつ前記方法が、前記導入の前に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞が、前記導入の後にCas9ポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
プロモーターが誘導性であり、かつ前記方法が、前記導入の後に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記導入が、細胞内に存在しかつ該細胞に対して異種である発現カセットから、該細胞においてCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含み、
該発現カセットが、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む、
請求項1記載の方法。
【請求項１０】
プロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドの発現を誘導する剤に細胞を接触させることを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドをコードするRNAを細胞内に導入すること、および該細胞において該RNAからCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記導入が、Cas9阻害ポリペプチドを細胞内に挿入すること、またはCas9阻害ポリペプチドに細胞を接触させることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
細胞が真核細胞である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
細胞がヒト細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
細胞が血液細胞または人工多能性幹細胞である、請求項14〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
エクスビボで行われる、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、前記導入および接触後に哺乳動物内に導入される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
細胞が哺乳動物にとって自己のものである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
細胞が原核細胞である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一であるCas9阻害ポリペプチド
を含む、細胞。
【請求項２２】
真核細胞である、請求項21記載の細胞。
【請求項２３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
細胞がヒト細胞である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
細胞が原核細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
SEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一であるCas9阻害ポリペプチドをコードする核酸
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項26記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
プロモーターが、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である、請求項27記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
プロモーターが誘導性である、請求項27または28記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
DNAまたはRNAである、請求項26記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項27〜29のいずれか一項記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項３２】
ウイルスベクターである、請求項31記載のベクター。
【請求項３３】
SEQ ID NO:1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一である、単離されたCas9阻害ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項26〜29のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは請求項33記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項26〜30のいずれか一項記載のポリヌクレオチドまたは請求項33記載のポリペプチドを含む、送達媒体。
【請求項３６】
リポソームまたはナノ粒子である、請求項35記載の送達媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、2016年11月16日に出願された米国仮特許出願第62/422,850号に対する優先権の恩典を主張し、これはあらゆる目的のために参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルスからの攻撃を防ぐ能力は、細胞生命の顕著な特徴である。細菌は、細菌ウイルス（ファージ）による感染に抵抗するために、制限酵素およびCRISPR-Casシステムを含む複数の機構を用いている (Labrie, S.J., Samson, I.E., and Moineau, S. (2010). Nat Rev Micro, 8, 317-327)。CRISPRアレイは、そのクラスター化された規則的間隔の短いパリンドロームリピートの間に位置する小さなスペーサー配列として、可動遺伝因子との以前の遭遇の配列特異的残遺物を有する (Mojica, F.J.M et al. (2005). J. Mol. Evol., 60, 174-182)。これらのスペーサーは、プログラムされた標的への結合およびその切断を促進するガイドRNAを作製するために利用される（Brouns, S.J.J et al. (2008). Science, 321, 960-964；Garneau, J.E. et al. (2010). Nature, 468, 67-71）。免疫機能に必要なCRISPR関連 (cas) 遺伝子は、CRISPRアレイに隣接して見出される場合が多い（Marraffini, L.A. (2015). CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature, 526, 55-61；Wright, A.V., Nunez, J.K., and Doudna, J.A. (2016). Cell, 164, 29-44）。Casタンパク質は、外来ゲノムの破壊を行うのみならず (Garneau, J.E. et al. (2010). Nature, 468, 67-71)、成熟CRISPR RNA (crRNA) の生成（Deltcheva；Haurwitz, R.E et al (2010). Science, 329, 1355-1358）および外来配列のCRISPRアレイ中への獲得（Nunez, J.K. et al. (2014). Nat. Struct. Mol. Biol , 21, 528-534；Yosef, I., Goren, M.G., and Qimron, U. (2012). Nucleic Acids Research, 40, 5569-5576）も促進する。
【０００３】
CRISPR-Cas適応免疫系は、細菌界において一般的であり、かつ多様である。細菌ゲノムにわたって6つの異なる型（I〜VI）が同定されており（Abudayyeh, O.O et al. (2016). Science aaf5573；Makarova, K.S. et al. (2015). Nat Rev Micro, 13, 722-736). Nat Rev Micro, 13, 722-736）、それらはRNAガイドによって規定される標的DNAまたはRNA配列を切断する能力を有する。CRISPR-Casシステムの持つ容易にプログラムできる性質は広く活用されており、多くの新規遺伝子技術への扉を開いている (Barrangou, R., and Doudna, J.A. (2016), Nature Biotechnology, 34, 933-941)。これらの技術の大部分は、動物細胞における遺伝子編集を含むそのような適用の基礎として、化膿性連鎖球菌 (Streptococcus pyogenes) (Spy) 由来のCas9を、操作されたシングルガイドRNAと共に使用する（Cong, L. et al. (2013). Science 339, 819-823；Jinek, M. et al. (2012). Science, 337, 816-821；Mali, P. et al. (2013). Science, 339, 823-826；Qi, L.S. et al. (2013). Cell, 152, 1173-1183）。加えて、II-Aサブタイプ内のCas9オルソログが遺伝子編集適用について検討されており (Ran, F.A. et al. (2015). Nature 520, 186-191)、Cpf1（V型 (Zetsche, B. et al. (2015). Cell, 163, 759-771)）およびC2c2（VI型（Abudayyeh, O.O et al. (2016). Science aaf5573；East-Seletsky, A. et al. (2016). Nature 538, 270-273））などの新たなクラス2 CRISPR単一タンパク質エフェクターが特徴付けられている。クラス1 CRISPR-Casシステム（I型、III型、およびIV型）はRNAガイド多タンパク質複合体であり、したがって複雑であるため大部分のゲノム適用において看過されてきた。しかしながら、これらのシステムは、全細菌のほぼ半数および古細菌のおよそ85%において見出され、自然界では最も一般的である (Makarova, K.S. et al. (2015), Nat Rev Micro, 13, 722-736). Nat Rev Micro, 13, 722-736)。
【０００４】
ファージ感染との細菌の戦いに応答して、ファージは今度は、その宿主細菌を溶解するか、または宿主細菌のゲノムに組み込まれる能力を増強する、細菌の免疫系の阻害因子をコードする場合が多い (Samson, I.E. et al (2013). Nat Rev Micro, 11, 675-687)。ファージにコードされる「抗CRISPR」タンパク質の最初の例は、緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) における（クラス1）I-E型およびI-F型システムについて生じた（Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432；Pawluk, A. et al. (2014), mBio 5, e00896）。際立ったことに、I-F型抗CRISPR遺伝子10個およびI-E型抗CRISPR遺伝子4個が今日までに発見されており (Pawluk, A. et al (2016). Nature Microbiology, 1, 1-6)、そのすべてが、これまで機能が未知であった異なる小タンパク質（50〜150アミノ酸）をコードする。4つのI-F抗CRISPRタンパク質の本発明者らの生化学的研究により、それらが多タンパク質CRISPR-Cas複合体中の異なるCasタンパク質と直接相互作用して、標的DNAの認識または切断のいずれかを妨げることが明らかになった (Bondy-Denomy, J et al. (2015). Nature, 526, 136-139)。各タンパク質は、異なる配列、構造、および作用様式を有する（Maxwell, K.L. et al. (2016). Nature Communications, 7, 13134；Wang, X. (2016). Nat. Struct. Mol. Biol 23, 868-870）。これらの知見により、CRISPR-Cas阻害因子の独立した進化が支持され、さらに多くのものがまだ発見されていないことが示唆される。この観点から、最近の論文では、緑膿菌以外の抗CRISPR遺伝子を同定するために、予測されるヘリックス・ターン・ヘリックス (HTH) モチーフを有するシグネチャー抗CRISPR関連 (aca) 遺伝子の保存が利用された。これは、I-F型CRISPR-Cas系統発生に広く及ぶ、プロテオバクテリアにわたる抗CRISPRの発見につながった (Pawluk, A. et al. (2016). Nature Microbiology, 1, 1-6)。これにより、抗CRISPRがすべてのCRISPRシステムに対して存在し得ることが示唆され、それらの発見を可能にする方法が必要とされる。
【０００５】
緑膿菌におけるI型抗CRISPRは、組み込まれたファージゲノム（プロファージ）から発現され、宿主CRISPR-Casシステムの恒常的不活性化をもたらす (Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432)。これは、多くの場合、プロファージが、同一細胞内に同時に存在するCRISPRスペーサーと完全な同一性を有するDNA標的を有する状況をもたらし得、この状況は「自己標的指向」と称される（図1A）。プロファージ抗CRISPR遺伝子の非存在下では、宿主ゲノムはプロファージの標的指向中に切断されるため、この状況ではCRISPR-Cas不活性化が生存の必須条件となる（Bondy-Denomy et al. (2013). Nature , 493, 429-432；Edgar, R., and Qimron, U. (2010). J. Bacteriol 192, 6291-6294）。しかしながら、抗CRISPRの発現はこのリスクを無効にし、溶原菌の生存を可能にする。本発明者らは、自己標的指向が明白であるCRISPRシステムを有するゲノムが、新たなCRISPR-Cas阻害因子を同定するための候補であると推測する。本明細書において、本発明者らは、自己標的指向の事象を同定するためにバイオインフォマティクスアプローチを用いる、リステリア・モノサイトゲネス (Listeria monocytogenes) における、ファージにコードされるこれまで未知であったCRISPR-Cas9阻害因子の同定を記載する。本発明者らは、これらの阻害因子のうちの2つが、細菌細胞およびヒト細胞において化膿性連鎖球菌Cas9の活性もまた阻止し得ることを示す。
【発明の概要】
【０００６】
定義
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸 (DNA) またはリボ核酸 (RNA)、および一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかであるそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。他に指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列ばかりでなく、その保存的に改変された変種（例えば、縮重コドン置換物）、対立遺伝子、オルソログ、SNP、および相補的配列もまた暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換物は、1つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【０００７】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味する。これは、コード領域に先行する領域および後続する領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
【０００８】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する、一連の核酸制御配列と定義される。本明細書で用いられる場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合のTATAエレメントのような、転写開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた任意に、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらは転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置してよい。プロモーターは異種プロモーターであってよい。
【０００９】
「発現カセット」は、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の既定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成によって作製された核酸構築物である。発現カセットは、プラスミド、ウイルスゲノム、または核酸断片の一部であってよい。典型的に、発現カセットは、プロモーターに機能的に連結された、転写されるべきポリヌクレオチドを含む。プロモーターは異種プロモーターであってよい。ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターとの関連において、「異種プロモーター」とは、天然の産物において（例えば、野生型生物において）見出されるポリヌクレオチドと同じポリヌクレオチドに機能的に連結されているわけではないプロモーターを指す。
【００１０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。3つの用語はすべて、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーばかりでなく、1個または複数個のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で用いられる場合、本用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００１１】
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変種」とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重により、数多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、コドンを、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変化は、保存的に改変された変化の一種である「サイレント変化」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、その核酸のあらゆる考えられ得るサイレント変化を表す。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一の分子をもたらすことができることを認識するであろう。したがって、記載される各配列には、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化が暗に意味されている。
【００１２】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変更によって化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる場合に「保存的に改変された変種」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提示する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に付加され、それらを排除しない。場合によっては、Cas9またはsgRNAの保存的に改変された変種は、本明細書に記載されるように、増加した安定性、会合、および活性を有し得る。
【００１３】
以下の8つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
1) アラニン (A)、グリシン (G)；
2) アスパラギン酸 (D)、グルタミン酸 (E)；
3) アスパラギン (N)、グルタミン (Q)；
4) アルギニン (R)、リジン (K)；
5) イソロイシン (I)、ロイシン (L)、メチオニン (M)、バリン (V)；
6) フェニルアラニン (F)、チロシン (Y)、トリプトファン (W)；
7) セリン (S)、スレオニン (T)；および
8) システイン (C)、メチオニン (M)
（例えば、Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y. (1984) を参照されたい）。
【００１４】
アミノ酸は、本明細書において、一般に公知の3文字記号、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会 (Biochemical Nomenclature Commission) により推奨される1文字記号のいずれかによって言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられているその1文字暗号によって言及され得る。
【００１５】
本出願において、アミノ酸残基は、非修飾野生型ポリペプチド配列において1と番号付けされる最も左側の残基からのその相対位置に従って番号付けされる。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列との関連における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、同一である2つまたはそれ以上の配列または既定のサブ配列を指す。「実質的に同一である」2つの配列は、配列比較アルゴリズムを用いて、または特定の領域が指定されない場合には手動アライメントおよび目視検査により測定して、比較域 (comparison window) または指定領域にわたって最大限一致するように比較およびアライメントした場合に、少なくとも60%の同一性、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義はまた試験配列の相補体にも言及する。アミノ酸配列に関して、場合により、同一性は、少なくとも約50アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたり、またはより好ましくは75〜100アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたり存在する。
【００１７】
配列比較をする場合、典型的には一方の配列が参照配列の役割を果たし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用することもできるし、または代替のパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが算出される。核酸およびタンパク質の配列比較には、BLAST 2.0アルゴリズムおよび以下に考察される初期設定パラメータが用いられる。
【００１８】
「比較域」は、本明細書で用いられる場合、2つの配列を最適にアライメントした後に、同じ連続位置数の参照配列に対して1つの配列を比較することができる、20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群より選択される連続位置数のいずれか1つのセグメントに対する言及を含む。
【００１９】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するためのアルゴリズムはBLAST 2.0アルゴリズムであり、これはAltschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されている。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センター (National Center for Biotechnology Information) のウェブサイト、ncbi.nlm.nih.govにおいて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合に一致するか、またはいくらかの正値の閾値スコアTを満たす、問い合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することにより、高スコア配列対 (HSP) を最初に同定することを伴う。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、前記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始する際の出発点として働く。ワードヒットは次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM（一致残基の対に対する報酬スコア；常に>0）およびN（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に<0）を用いて算出される。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するためにスコアリング行列が用いられる。ワードヒットの各方向への延長は、以下の場合に停止される：累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ減少した場合；1つもしくは複数の負のスコアを有する残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定としてワードサイズ (W) 28、期待値 (E) 10、M=1、N=-2、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、初期設定としてワードサイズ (W) 3、期待値 (E) 10、およびBLOSUM62スコアリング行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989) を参照されたい）を使用する。
【００２０】
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) を参照されたい）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小和確率 (P(N)) であり、これは2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提示する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、および最も好ましくは約0.001未満である場合、該核酸は該参照配列と類似していると見なされる。
【００２１】
「CRISPR/Cas」システムとは、外来核酸に対する防御のための細菌システムのクラスを指す。CRISPR/Casシステムは、広範囲の真正細菌生物および古細菌生物において見出される。CRISPR/Casシステムには、I型、II型、III型、V型、およびVI型サブタイプが含まれる。野生型II型CRISPR/Casシステムは、ガイドかつ活性化RNAと複合体を形成したRNA媒介性ヌクレアーゼ、Cas9を利用して、外来核酸を認識および切断する。
【００２２】
Cas9相同体は、以下の分類群：放線菌門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門-クロロビウム門、クラジミア門-ウェルコミクロビウム門、クロロフレクサス門、藍色細菌、ファーミキューテス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ網、およびテルモトガ門の細菌を含むがこれらに限定されない、多種多様な真正細菌において見出される。例示的なCas9ポリペプチドは、化膿性連鎖球菌のCas9ポリペプチドである。さらなるCas9タンパク質およびその相同体は、例えば、Chylinksi, et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737；Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477；Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24;110(39):15644-9；Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7；およびJinek, et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21に記載されている。Cas9タンパク質は、ヌクレアーゼ欠損であってよい。例えば、Cas9タンパク質は、標的DNAにニックを入れるが、二本鎖切断を引き起こさないニッキングエンドヌクレアーゼであってよい。Cas9はまた、ヌクレアーゼ活性をもたないプログラム可能なDNA結合タンパク質である「不活性型 (dead) Cas9」(dCas9) を生じるように、両方のヌクレアーゼドメインが不活性化されてもよい。いくつかの態様において、dCas9 DNA結合は、本明細書に記載されるポリペプチドによって阻害される。
【００２３】
発明の概要
1つの局面において、細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する方法が提供される。いくつかの態様において、本方法は、細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に（例えば、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%）同一であるCas9阻害ポリペプチドを、細胞内に導入し、それによって細胞においてCas9ポリペプチドを阻害する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCas9ポリペプチドと接触させる段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、細胞においてCas9阻害ポリペプチドをCRISPR-Cas9システムの他の成分と接触させ、それによってCas9ポリペプチド活性を間接的に阻害する段階を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドはSEQ ID NO: 1〜170のうちの1つを含む。
【００２５】
いくつかの態様において、細胞は導入前にCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、細胞は、Cas9ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。いくつかの態様において、プロモーターは誘導性であり、かつ本方法は、導入の前に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、細胞は導入後にCas9ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、プロモーターは誘導性であり、かつ本方法は、導入の後に、細胞においてCas9ポリペプチドの発現を誘導する剤または条件に、細胞を接触させる段階を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、導入は、細胞内に存在しかつ該細胞に対して異種である発現カセットから、細胞においてCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含み、ここで、発現カセットは、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは誘導性プロモーターであり、かつ導入は、Cas9阻害ポリペプチドの発現を誘導する剤に細胞を接触させることを含む。
【００２８】
いくつかの態様において、導入は、Cas9阻害ポリペプチドをコードするRNAを細胞内に導入すること、および細胞において該RNAからCas9阻害ポリペプチドを発現させることを含む。
【００２９】
いくつかの態様において、導入は、Cas9阻害ポリペプチドを細胞内に挿入すること、またはCas9阻害ポリペプチドに細胞を接触させることを含む。
【００３０】
いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は血液細胞または人工多能性幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。
【００３１】
いくつかの態様において、本方法はエクスビボで行われる。いくつかの態様において、細胞は、前記導入および接触後に哺乳動物に導入される。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物にとって自己のものである。
【００３２】
細胞に対して異種であり、かつSEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一であるCas9阻害ポリペプチドを含む細胞（任意に単離されている）もまた提供される。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。
【００３３】
Cas9阻害ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドもまた提供される。いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一である。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、前記核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの態様において、プロモーターは誘導性である。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドはDNAまたはRNAである。
【００３４】
上記のまたは本明細書の他所に記載される発現カセットを含むベクターもまた提供される。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。
【００３５】
（任意に単離された）Cas9阻害ポリペプチドもまた提供される。いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドは、SEQ ID NO: 1〜170のうちのいずれか1つまたは複数と実質的に同一である。
【００３６】
上記のまたは本明細書の他所に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む薬学的組成物もまた提供される。
【００３７】
上記のまたは本明細書の他所に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む送達媒体もまた提供される。いくつかの態様において、送達媒体はリポソームまたはナノ粒子である。
【００３８】
他の局面は、本文書の残りの部分において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1A〜C：リステリア・モノサイトゲネスにおけるCRISPR-Cas9ゲノム自己標的指向 (ST) に関する概観。図1A：ゲノム自己標的指向の原理を示す概略図であり、この場合、可動遺伝因子 (MGE) は同一ゲノムにおけるCRISPRアレイ中のスペーサーの標的配列を有する。この「自己標的指向ゲノム」におけるCRISPR-Cas9機能は、細胞生存の継続のためにおそらく不活性である。図1B：リステリア菌ゲノムにおける、cas9関連自己標的指向を有するゲノム（赤色）およびSTを有さないゲノム（灰色）の存在量。図1C：ST事象の例であり、この場合、株J0161のCRISPRアレイ中のスペーサー16は、常在プロファージ (φJ0161a) との完全なPAMおよびプロトスペーサー一致を有する（スペーサー配列：crRNA (SEQ ID NO:171)、プロトスペーサーおよびプロトスペーサー相補体 (SEQ ID NO:172〜173)）。
【図２】図2A〜D：リステリア菌J0161由来のプロファージは、2つのCRISPR-Cas9阻害因子遺伝子を含む。図2A：リステリア菌10403sにおけるII-A型CRISPR-Cas遺伝子座。tracrRNA、および30のスペーサーを含むCRISPRアレイと共に、4つのcas遺伝子が示される。予測される転写の方向は、黒矢印で示される。以降の実験では、非標的指向プラスミド (pNT)、およびこの株におけるスペーサー1と一致するプロトスペーサーを有する標的指向プラスミド (pT) を利用する。図2B： CRISPR-Cas標的指向 (pT) または非標的指向 (pNT) プラスミドがリステリア菌10403sのファージ救済（φ救済）株にエレクトロポレーションされた後の形質転換コロニーの代表的な写真であり、野生型 (wt) J0161（φJ0161aプロファージを含有する）は自己標的指向を表すために赤色で示される。解析されたφ救済10403s変種には、cas9欠失株 (Δcas9)、φJ0161aの溶原菌 (::φJ0161a)、φJ0161a由来の個々のCRISPR-Cas9阻害因子遺伝子を構成的に発現する株（+acrIIA1、+acrIIA2）、およびCRISPR-Cas9阻害因子遺伝子を欠失させたφJ0161aの溶原菌 (::φJ0161aΔacrIIA1-2)) が含まれる。wtとφ救済10403sの比較については図7を参照されたい。図2C：10403sφ救済株およびwt J0161株を、形質転換効率について評価した。10403sφ救済cas9欠失株 (Δcas9)、cas9の構成的発現 (Δcas9+cas9)、およびこれらの株のφJ0161a溶原菌 (::φJ0161a) を解析した。エラーバーは、3つの生物学的複写物の標準偏差を示す。L.D. 検出限界。図2D：リステリア・モノサイトゲネス10403sおよびJ0161に由来する2つの類似プロファージからのオープンリーディングフレームの比較。φJ0161の10個の断片を含む特有の遺伝子（赤色）を、10403sにおいてCRISPR-Cas9阻害について試験した。n.e.、CRISPR-Cas9活性に対する影響なし、tox.、発現させた場合に断片は毒性、t.、自己標的指向プロトスペーサーの位置。丸で囲んだ断片は抗CRISPR活性を示し、2つの遺伝子（acrAII1、acrAII2）が個々にCRISPR-Cas活性を阻害し得る。保存された（灰色）遺伝子は試験しなかった。参考までに、細胞溶解、キャプシド構築、および宿主組込み (int.) に関与するファージ遺伝子を表示してある。
【図３】図3A〜C：ゲノム構築およびacrIIA遺伝子の普及。図3A：リステリア・モノサイトゲネス由来のacrIIA1 (1) およびその相同体 (orfD) のゲノム状況が、acrIIA1相同体を垂直にアライメントした模式図として縮尺通りに示される。典型的に、acrIIA遺伝子は、プロファージ内でファージ溶解素 (ply) 遺伝子に隣接してまたはその近傍にコードされる。acrIIA1およびorfDのゲノム隣接部（acrIIA1〜4、orfA〜E）が示される。個々の遺伝子 (***) を、リステリア・モノサイトゲネス10403sにおいてCRISPR-Cas9阻害についてアッセイした（図9を参照されたい）。隠れマルコフモデル (HMM) 予測ソフトウェアを用いて、ヘリックス・ターン・ヘリックス (HTH) モチーフおよびAP2 DNA結合モチーフがいくつかのタンパク質において検出された (Soding, J., Biegert, A., and Lupas, A.N. (2005). Nucleic Acids Research, 33, W244-W248)。図3B：各acrIIA遺伝子が共存する頻度の円グラフ表示。図3C：リステリア・モノサイトゲネスのパンゲノムにおけるacrIIA遺伝子およびcas9遺伝子の普及の円グラフ表示。関連のアクセッション番号については、補足表1を参照されたい。
【図４】AcrIIA1〜4相同体の系統発生解析。（図4A）AcrIIA1についてGenBank内の全非重複タンパク質配列を検索するための反復psi-BLASTp検索後に同定された全長タンパク質配列の系統発生再構築。BLASTpを用いて、（図4B）AcrIIA2、（図4C）AcrIIA3、および図4D AcrIIA4に関して同様のツリーを構築した（方法を参照されたい）。選択されたブートストラップ支持値は、黒丸 (≧90%)、白四角 (≧70%)、または破線 (<70%) で示される。ボックス内の配列ファミリーは、抗CRISPR機能について試験されたファミリーを表す。その他の相同体は、ツリー下に記載される、ゲノム中に存在する異なる配列ファミリーを示す。
【図５】図5A〜D：化膿性連鎖球菌dCas9およびCas9の阻害。図5A：実験設定の概要を示す概略図であり、この場合、化膿性連鎖球菌 (Spy) dCas9、および染色体赤色蛍光タンパク質 (RFP) 遺伝子を標的指向するガイドRNAを有する大腸菌 (E. coli) BW25113の単一細胞蛍光が測定された。図5B：候補の (orf) および確証された (acr) acrIIA遺伝子を、dCas9ベースの抑制を阻害する能力について試験した。得られた測定値は、ガイドRNAのない対照に対して各候補遺伝子について正規化された、単峰性集団における単一細胞のRFP蛍光中央値を示す。エラーバーは、少なくとも3つの生物学的複写物の標準偏差を示す。遺伝子同定情報については、図2および図9を参照されたい。図5C：実験設定の概要を示す概略図であり、この場合、ドキシサイクリン誘導性eGFPカセットを有するHEK293T細胞に、単一転写物tracrRNA／eGFP標的指向ガイドRNAおよびNLS-SpyCas9をコードするプラスミドを、5つのコドン最適化ファージ遺伝子のうちの1つをコードする発現構築物と共に、異なる比率でトランスフェクトした。誘導の12時間後に、eGFP陽性細胞のパーセントをフローサイトメトリーによって測定した。図5D：eGFP陽性細胞の平均パーセントが、+/-生物学的複写物間の標準偏差で示される。左側から右側へ、1:1および3:1というCas9/sgRNAプラスミドに対する比率で、漸増量の阻害因子プラスミド（ngで）を添加した。データは、ベースラインとしてのファージORFなしのトランスフェクションに対して正規化した。
【図６】Cas9のAcrIIAによる阻害の模式図描写である。
【図７Ａ】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7A：化膿性連鎖球菌SF370 (Spy_SF370)、リステリア・モノサイトゲネス10403s (Lmo_10403s)、リステリア・モノサイトゲネスJ0161 (Lmo_ J0161)、およびリステリア・イノキュア (Listeria innocua) (Lin_Clip11262) からのII-A型CRISPR-cas遺伝子座の比較。Cas9タンパク質配列間の同一性パーセントが示される。
【図７Ｂ】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7B：自己標的指向株Lmo J0161のCRISPRアレイ。CRISPRDetectウェブユーティリティによって予測されたII-A型CRISPRアレイが示される（スペーサー配列：それぞれSEQ ID NO:174〜192；リピート配列：SEQ ID NO:193）。自己標的指向スペーサー（16番 (SEQ ID NO:189)）は四角で囲まれている。太字は、標的認識に関与するRNAコードヌクレオチドである。
【図７Ｃ】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7C：リステリア・モノサイトゲネスJ0161による自己標的指向を示す、修飾されたCRISPR標的アウトプット。予測されるcrRNAプロセシング部位は、くさび型記号によって識別される。（配列：crRNA (SEQ ID NO:194)、標的DNAおよび標的DNA相補体 (SEQ ID NO:195〜196)）。
【図７Ｄ】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7D：tracrRNA遺伝子座のアライメント。（Spy_SF370 (SEQ ID NO:197)；Lmo_10403s (SEQ ID NO:198)；Lmo_ J0161 (SEQ ID NO:199)：Lin_Clip11262 (SEQ ID NO:200)）。
【図７Ｅ】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7E：CRISPR遺伝子座のアライメント。（Spy_SF370 (SEQ ID NO:201)；Lmo_10403s (SEQ ID NO:202)；Lmo_ J0161 (SEQ ID NO:203)：Lin_Clip11262 (SEQ ID NO:204)）。
【図７Ｆ−１】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7F：Cas9タンパク質配列のアライメント。必須の化学的機能性を有する残基が四角で囲まれている。（Spy_SF370 (SEQ ID NO:205)；Lmo_10403s (SEQ ID NO:206)；Lmo_ J0161 (SEQ ID NO:207)：Lin_Clip11262 (SEQ ID NO:208)）。
【図７Ｆ−２】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7F：Cas9タンパク質配列のアライメント。必須の化学的機能性を有する残基が四角で囲まれている。（Spy_SF370 (SEQ ID NO:205)；Lmo_10403s (SEQ ID NO:206)；Lmo_ J0161 (SEQ ID NO:207)：Lin_Clip11262 (SEQ ID NO:208)）。
【図７Ｆ−３】図7A〜F：図1に関連して、リステリア・モノサイトゲネスJ0161におけるCRISPR-Cas9による自己標的指向は、機能喪失変異と関連していない。図7F：Cas9タンパク質配列のアライメント。必須の化学的機能性を有する残基が四角で囲まれている。（Spy_SF370 (SEQ ID NO:205)；Lmo_10403s (SEQ ID NO:206)；Lmo_ J0161 (SEQ ID NO:207)：Lin_Clip11262 (SEQ ID NO:208)）。
【図８】図2A〜Dに関連して、φ10403sプロファージは、リステリア・モノサイトゲネス10403sにおけるプラスミド標的指向に影響を及ぼさない。標的指向（pT；pRAU31）または非標的指向（pNT；pRAU29）プラスミドの形質転換および選択後のコロニーを示す代表的なプレート。10403sの野生型 (wt) および非溶原（φ救済）株を解析した。プラスミドおよび株の設計および命名に関するさらなる情報については、表S1を参照されたい。
【図９】図2に関連した、リステリア・モノサイトゲネス10403sにおいてCRISPR-Cas9阻害活性についてスクリーニングされたφJ0161aプロファージの断片。標的指向（pT；pRAU31）または非標的指向（pNT；pRAU29）プラスミドの形質転換および選択後のコロニーを示す代表的なプレート。図2dにおいて命名されるすべてのファージ断片について、DNA配列情報が提供される。プラスミドおよび株の設計および命名に関するさらなる情報については、表S1を参照されたい。
【図１０Ａ】図2Bおよび図3Aに関連した、リステリア・モノサイトゲネス10403sにおいてCRISPR-Cas9阻害活性についてスクリーニングされた個々の遺伝子。標的指向（pT；pRAU31）または非標的指向（pNT；pRAU29）プラスミドの形質転換および選択後のコロニーを示す代表的なプレート。すべての候補II-A型CRISPR-Cas阻害因子について、所定の名称、遺伝子座タグ、アクセッション番号、およびDNA配列情報が提供される。プラスミドおよび株の設計および命名に関するさらなる情報については、表S1を参照されたい。
【図１０Ｂ】図2Bおよび図3Aに関連した、リステリア・モノサイトゲネス10403sにおいてCRISPR-Cas9阻害活性についてスクリーニングされた個々の遺伝子。標的指向（pT；pRAU31）または非標的指向（pNT；pRAU29）プラスミドの形質転換および選択後のコロニーを示す代表的なプレート。すべての候補II-A型CRISPR-Cas阻害因子について、所定の名称、遺伝子座タグ、アクセッション番号、およびDNA配列情報が提供される。プラスミドおよび株の設計および命名に関するさらなる情報については、表S1を参照されたい。
【図１１】図11A〜B：図5に関連した、大腸菌における化膿性連鎖球菌由来のAcrIIA3相同体の毒性。図11A：AcrIIAタンパク質の発現を伴うおよび伴わない大腸菌CRISPRiレポーター株の単一細胞RFP蛍光値の分布。AcrIIAタンパク質の発現により、sgRNA（CRISPRiノックダウンのない）状態に向かう集団蛍光の単峰性シフトが起こり、CRISPRi活性の均一な破壊が示される。AcrIIA阻害因子の発現を伴ってまたは伴わずに、株をIPTGの存在下で2.5時間培養してCRISPRiを誘導した。図11B：Spy AcrIIA3の発現は、大腸菌において毒性である。IPTG（CRISPRi誘導）およびアラビノース（AcrIIA3誘導）の存在下において、Spy AcrIIA3はsgRNAの存在下または非存在下において毒性であり、その毒性がCRISPRi活性に依存しないことが示される。
【図１２】図2および図3に関連した、pPL2oexLのベクターマップファイル。リステリア・モノサイトゲネス10403sにおいてCRISPR-Cas9阻害について試験しようとする遺伝子およびファージ断片を、pPL2oexLのpHyperとFLAGタグの間にクローニングした。pPL2oexL派生物には、天然の終止コドンが含まれた。
【図１３】acrIIA1はファーミキューテス門に非常に広く及んでおり、相同体は、それらが見出される生物においてCas9機能を阻害する可能性が高い。抗CRISPR機能を有するacrIIA遺伝子の新たな相同体を同定するために、本明細書に示される系統樹からの異なるメンバーを、細胞ベースのアッセイにおいて抗CRISPR活性について試験した。公知の抗CRISPR遺伝子のこれらの相同体は、SpyCas9に対して直接作用するものを同定するために、外来の細菌システム（緑膿菌）において試験される。
【図１４】異種宿主（緑膿菌）における、対照ファージ (D3)、またはJBD30特異的sgRNAを伴うSpyCas9によって標的指向されるファージ (JBD30) の10倍希釈物を示すファージプラークアッセイ。表示された抗CRISPR acrIIA4（陽性対照）またはacrIIA1の発現は、SpyCas9を不活性化する。
【図１５】図15A〜B：15A）異なるリステリア属可動因子において見出されたacrIIA2相同体の複数配列アライメント。（AcrIIA2a.1 (SEQ ID NO:69)；AcrIIA2a.2 (SEQ IDD NO:84)；AcrIIA2b.1 (SEQ ID NO:108)；AcrIIA2b.3 (SEQ ID NO:209)；AcrIIA2c.1 (SEQ ID NO:97)；およびAcrIIA2c.2 (SEQ ID NO:98)）。試験した相同体を色付き矢印で示し、結果の要約をアライメントの下に示す。15B）異なる相同体間の同一性（アミノ酸レベルで）およびそれらのアクセッション番号を要約する表。
【図１６】SpyCas9、およびファージJBD30を標的指向するsgRNAを発現する緑膿菌の菌叢の上部にファージJBD30の10倍系列希釈物がスポットされた、バクテリオファージプラークアッセイ。ファージは、CRISPR活性の非存在下でプラークを形成する。Cas9およびsgRNAは、左側から右側へ、漸増量のアラビノース（0.001%、0.01%、0.1%）によって誘導される。Cas9の非存在下において (Δcas9)、ファージは十分にプラークを形成するが、Cas9が存在して抗CRISPRがない場合には（ベクター）、Cas9が誘導されるにつれてプラーク形成は減少する。acrIIA4（陽性対照）が供給されると、すべてのレベルにおいてCas9は阻止される。acrIIA2b.3のみが、その活性についてacrIIA4に匹敵する。元のacrIIA2a.1は部分的にのみ活性があり、acrIIA2b.1ではわずかな改善が認められる。
【図１７】ストレプトコッカス種において見出されたacrIIA3bの相同体を、SpyCas9およびsgRNAを発現する異種システム（緑膿菌）において抗CRISPR活性について試験した。結果（図6におけるデータ）の要約が表中に示され、抗CRISPRの起源の種、その種におけるCas9の化膿性連鎖球菌との配列同一性、および抗CRISPRに関する同様の情報が示される。acrIIA3aおよびacrIIA3b毒性が以前に観察されたことを考慮して、これらの新たなタンパク質を毒性（毒性の有無）および抗CRISPR機能（acrの有無）について評価した。
【図１８】LB寒天プレート上での細菌細胞のスポット力価測定。SpyCas9は、緑膿菌ゲノムを標的指向するsgRNAと共にプログラムされ、したがって細胞を死滅させる。細胞は、抗CRISPRが機能的である場合のみ生存する。プレートは、非誘導プレート（左側の欄）、ACR誘導のみのプレート(中央の欄、ACR毒性を試験するため)、またはCas9/sgRNA/ACR誘導プレート（右側の欄、ACR機能を試験するため）上にプレーティングされた、細胞の10倍系列希釈物を示している。抗CRISPRがCas9機能を阻止しない限り、ゲノムがCas9によって切断されて、死滅を引き起こす。最も右側のパネルにおけるコロニーがACR活性を示す。
【図１９】実施例2からのデータの一部の要約。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
Cas9ヌクレアーゼのいくつかのポリペプチド阻害因子（「Cas9阻害ポリペプチド」）がファージから同定された。ファージから最初に発見されたCas9阻害ポリペプチドは、AcrIIA1、AcrIIA2、AcrIIA3、およびAcrIIA4と命名された。
【００４１】
本明細書に記載されるCas9阻害ポリペプチドは、望ましくないCas9活性を阻害するために多くの局面において使用され得る。例えば、1つまたは複数のCas9阻害ポリペプチドを用いて、ゲノム編集においてCas9を調節し、それによってCas9阻害ポリペプチドの導入前にいくらかのCas9活性を可能にすることができる。これは、例えば、Cas9のオフターゲット効果を制限するのに役立ち得る。この使用および他の使用は、以下により詳細に記載される。
【００４２】
実施例および配列リストに記載されるように、数多くのCas9阻害ポリペプチドが発見された。例示的なCas9阻害ポリペプチドの例には、SEQ ID NO: 1〜169、または実質的に（例えば、少なくとも50、60、70、75、80、85、90、95、または98%）同一のアミノ酸配列のうちのいずれかを含むタンパク質が含まれる。いくつかの態様において、前記ポリペプチドは、上記に掲載された配列のうちの1つを有することに加えて、アミノ末端、カルボキシル末端、またはその両方において、他のアミノ酸配列または他の化学的部分（例えば、検出可能な標識）を含む。付加的なアミノ酸配列には、タグ、検出可能なマーカー、または核局在化シグナル配列が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４３】
実施例において記述されるように、いくつかのCas9阻害ポリペプチドは、リステリア・モノサイトゲネスCas9および化膿性連鎖球菌 (Spy) Cas9を阻害することが示された。本明細書に記載されるCas9阻害ポリペプチドは、他のブロックII-A Cas9タンパク質もまた同様に阻害することが考えられ、かつ予測される。本明細書で用いられる場合、「Cas9阻害ポリペプチド」とは、形質転換効率アッセイ中にリステリア・モノサイトゲネスにおいてCas9酵素の機能を阻害するタンパク質である。標的指向DNA配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) を有するプラスミドが、インタクトなCas9機能を備えた株を形質転換するために用いられた場合、形質転換事象はCas9によって妨げられ、選択下で非常に小さなコロニーを生じる。これは、リステリア・モノサイトゲネスを形質転換するために用いられた場合に正常なサイズのコロニーを生成する、非標的指向DNA配列を備えたプラスミドと比較される。Cas9阻害因子の発現はCas9活性を無効にし、標的指向プラスミドおよび非標的指向プラスミドの両方で、形質転換された正常サイズのコロニーをもたらす。Cas9阻害ポリペプチドの阻害活性は、他の方法でも測定することができると考えられるものの、実施例においてより詳細に示される上記のアッセイは、Cas9阻害ポリペプチドが活性を有するかどうかを判定するためのアッセイである。
【００４４】
Cas9阻害ポリペプチドを任意の細胞内に導入して、その細胞においてCas9を阻害することができる。いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドが細胞内に導入された時に、細胞はCas9タンパク質を含有している。他の態様では、Cas9阻害ポリペプチドが細胞内に導入され、次いでCas9ポリペプチドが該細胞内に導入される。
【００４５】
Cas9阻害ポリペプチドの細胞内への導入は、様々な形態をとり得る。例えば、いくつかの態様では、Cas9阻害ポリペプチド自体が細胞内に導入される。ポリペプチドを細胞内に導入するための任意の方法を使用することができる。例えば、いくつかの態様では、エレクトロポレーション、または細胞へのリポソームもしくはナノ粒子送達を用いることができる。他の態様では、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入され、その後にCas9阻害ポリペプチドが該細胞において発現される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドはRNAである。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドはDNAである。
【００４６】
いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドは、細胞において、発現カセットによってコードされるRNAから発現され、この場合、発現カセットは、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である。プロモーターの選択は、それを発現させようとする細胞および所望の発現パターンに依存する。いくつかの態様では、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現が、選択された条件下で発現され得るように、プロモーターは誘導性または抑制性である。いくつかの例では、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現が活性化されるかまたは増加するように、プロモーターは誘導性プロモーターである。
【００４７】
誘導性プロモーターは、特定の分子、例えば、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、金属イオン、アルコール、またはステロイド化合物の存在または非存在によって活性化され得る。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、環境条件、例えば光または温度によって活性化されるプロモーターである。さらなる例では、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現が、低レベルもしくは検出不可能なレベルまで低下し得るか、または除去され得るように、プロモーターは抑制性プロモーターである。抑制性プロモーターは、リプレッサー分子が直接結合することによって抑制され得る（トリプトファンの存在下におけるtrpオペレーターに対するtrpリプレッサーの結合など）。特定の例において、抑制性プロモーターはテトラサイクリン抑制性プロモーターである。他の例において、抑制性プロモーターは、低酸素または金属イオンへの曝露などの環境条件によって抑制可能なプロモーターである。
【００４８】
いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、発現カセットの一部として）は、ベクターによって細胞に送達される。例えば、いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクター、およびレンチウイルスベクターが含まれ得るが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドまたはCas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞送達系の一部として、または細胞送達系の中で送達される。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、または受容体媒介性送達といった様々な送達系が公知であり、本開示の組成物を投与するために使用することができる。
【００５０】
例示的なリポソーム送達方法論は、Metselaar et al., Mini Rev. Med. Chem. 2(4):319-29 (2002)；Q'Hagen et al., Expert Rev. Vaccines 2(2):269-83 (2003)；O'Hagan, Curr. Drug Targets Infjct. Disord. 1(3):273-86 (2001)；Zho et al., Biosci Rep. 22(2):355-69 (2002)；Chikh et al., Biosci Rep. 22(2):339-53 (2002)；Bungener et al., Biosci. Rep. 22(2):323-38 (2002)；Park, Biosci Rep. 22(2):267-81 (2002)；Ulrich, Biosci. Rep. 22(2):129-50；Lofthouse, Adv. Drug Deliv. Rev. 54(6):863-70 (2002)；Zhou et al., J. Inmunmunother. 25(4):289-303 (2002)；Singh et al., Pharm Res. 19(6):715-28 (2002)；Wong et al., Curr. Med, Chem. 8(9):1123-36 (2001)；およびZhou et al., Immunonmethods (3):229-35 (1994) に記載されている。
【００５１】
金、酸化鉄、チタン、ハイドロゲル、およびリン酸カルシウムナノ粒子送達方法論を含む例示的なナノ粒子送達方法論は、Wagner and Bhaduri, Tissue Engineering 18(1): 1-14 (2012)（無機ナノ粒子を記載）；Ding et al., Mol Ther e-pub (2014)（金ナノ粒子を記載）；Zhang et al., Langmuir 30(3):839-45 (2014)（二酸化チタンナノ粒子を記載）；Xie et al., Curr Pharm Biotechnol 14(10):918-25 (2014)（生分解性リン酸カルシウムナノ粒子を記載）；および;Sizovs et al., J Am Chem Soc 136(1):234-40 (2014) に記載されている。
【００５２】
本明細書に記載されるCas9阻害ポリペプチドの原核細胞内への導入は、原核生物にタンパク質または核酸を導入するために用いられる任意の方法によって達成され得る。いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドは、Cas9阻害ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを送達する送達ベクター（例えば、バクテリオファージ）によって原核細胞に送達される。いくつかの態様において、原核生物におけるCas9の阻害は、そのファージが細菌を死滅させるのを助け得るか、または他のファージがそれを死滅させるのを助け得る。
【００５３】
本明細書に記載されるCas9阻害ポリペプチドは、Cas9を含有する、発現する、または発現すると予測される、任意の細胞内に導入され得る。例示的な細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。例示的な原核細胞には、生物工学的目的、すなわち、所望の代謝産物の生産のために使用されるもの、大腸菌、およびヒト病原体が含まれ得るが、これらに限定されない。そのような原核細胞の例には、例えば、大腸菌 (Escherichia coli)、シュードモナス種、コリネバクテリウム種、枯草菌 (Bacillus subtitis)、肺炎連鎖球菌 (Streptococcus pneumonia)、緑膿菌、黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus)、カンピロバクター・ジェジュニ (Campylobacter jejuni)、フランシセラ・ノビシダ (Francisella novicida)、ジフテリア菌 (Corynebacterium diphtheria)、エンテロコッカス種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコプラズマ・ガリセプチカム (Mycoplasma gallisepticum)、ストレプトコッカス種、またはトレポネーマ・デンティコラ (Treponema denticola) が含まれ得る。例示的な真核細胞には、例えば動物（例えば、哺乳動物）または植物細胞が含まれ得る。例示的な哺乳動物細胞には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、およびラット細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞は培養細胞または初代細胞であってよい。例示的な細胞型には、これらに限定されないが、人工多能性細胞、幹細胞、または前駆細胞、およびT細胞もしくはB細胞を含むがこれらに限定されない血液細胞が含まれ得る。
【００５４】
いくつかの態様において、細胞は動物（例えば、任意に遺伝子修復が必要なヒト）から採取され、次いで遺伝子編集のためのCas9および任意にガイドRNAがエクスビボで該細胞内に導入され、そしてCas9阻害ポリペプチドが該細胞内に導入される。いくつかの態様において、細胞はその後、同じ動物（自己）または異なる動物（同種）に導入される。
【００５５】
本明細書に記載される態様のいずれにおいても、Cas9ポリペプチドを細胞内に導入して、Cas9のDNA結合および／または切断（ならびに任意に編集）を可能にし、続いて本明細書に記載されるCas9阻害ポリペプチドを導入することができる。細胞内に活性Cas9が存在するこのタイミングは、したがって、その後Cas9阻害ポリペプチドを細胞に供給し、それによってCas9を不活性化することにより、制御することができる。これは、例えば、非標的指向染色体配列が結合または変更されるようなCas9「オフターゲット」効果を減少させるのに有用であり得る。Cas9活性を、Cas9阻害ポリペプチドの導入に際して終了する、限定された「バースト」に制限することにより、オフターゲット効果を制限することができる。いくつかの態様において、Cas9ポリペプチドとCas9阻害ポリペプチドは、異なる誘導因子によって調節される、異なる誘導性プロモーターから発現される。これらの態様により、Cas9ポリペプチドの発現を最初に開始させ、その後続いて、任意にCas9発現の誘導因子を除去しながら、Cas9阻害ポリペプチドを導入することが可能になる。
【００５６】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるCas9阻害ポリペプチドは、動物（例えば、ヒト）または植物に導入（例えば、投与）され得る。これを用いて、例えば、CRISPR/Cas9遺伝子編集がインビボで行われる状況において、または個体が望ましくないCas9に曝露される環境において、例としてCas9を含む生物兵器が放出される場合に、インビボCas9活性を調節することができる。
【００５７】
いくつかの態様において、Cas9阻害ポリペプチドまたはCas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、薬学的組成物として投与される。いくつかの態様において、組成物は、Cas9阻害ポリペプチドまたはCas9阻害ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載されるかまたはその他で公知であるリポソーム、ナノ粒子、または他の送達媒体などの送達系を含む。例えば、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、もしくは皮内）、吸入、経皮適用、直腸投与、または経口投与を含む、当技術分野で公知の任意の経路を用いて、組成物を哺乳動物（例えば、ヒト）に直接投与して、Cas9を阻害することができる。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物により、および組成物を投与するために用いられる特定の方法により、部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の多種多様の適切な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照されたい）。
【実施例】
【００５９】
実施例1
結果
リステリア・モノサイトゲネスにおけるCRISPR-Cas9は外来DNAを標的とする
リステリア・モノサイトゲネスは、十分に特徴づけられたファージ集団を有する通性細胞内食品媒介性病原体である。多くのリステリア・モノサイトゲネス分離株はII-A型CRISPR-Casシステムを有し (Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065)、それらのCRISPRスペーサーは、多くの毒性、溶原性、および組込みファージとの同一性を有する（Di, H. et al. (2014) Biochem Biophys Res Commun, 454, 399-403；Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065)。しかしながら、規範的なCRISPR-Cas機能の実験的証拠は存在しない。本発明者らはリステリア・モノサイトゲネスの275のゲノムを解析し、ゲノムの15% (n = 41) においてII-A型CRISPR-Cas9システム (Lmo Cas9) を同定した（図1B）。興味深いことに、自己標的指向の例を有する8つのゲノム（全体の3%）を見出したが（図1Bおよび1C）、CRISPRリピート、PAM、tracrRNA、Cas9、および関連プロモーターは明白な不活性化変異を欠いているため、CRISPR-cas9は機能的であると予測される（図6A〜E）。これらの株は、スペーサー-プロトスペーサー対の安定した共存を可能にするCRISPR-Cas9の阻害因子を有すると予測した。
【００６０】
阻害因子がリステリア・モノサイトゲネスのプロファージによってコードされるかどうかを試験するために、自己標的指向を示さないリステリア・モノサイトゲネス株 (10403s) における阻害されないCRISPR-Cas9の機能性を最初に確証した。このシステムの活性を試験するために、Cas9結合に必要な3塩基モチーフである同族プロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) と共に標的指向プロトスペーサー（すなわち、CRISPRアレイ中の天然スペーサーと相補的である配列）を有するプラスミド (pT) を設計した（図2A）。pT、または同一のプラスミド骨格で非標的指向配列を有する対照プラスミド (pNT) のいずれかによる10403sの形質転換効率を測定した。10403sのプロファージ救済型（φ救済）はこのアッセイにおいてwt10403sと区別不能であったため、以降の解析を単純化する目的で、以降の実験のすべてにそれを使用した（図7）。pTによる形質転換はpNTと比較して非常に小さなコロニーをもたらしたが（図2B、最も左側のパネル）、長時間インキュベートして出現したコロニーの数は同じであった（図2C、さらなる解析については考察を参照されたい）。この表現型がCRISPR-Cas9干渉の結果であることを確認するために、cas9欠失株を構築した。pTおよびpNTでこの株を形質転換すると、区別不能なサイズのコロニーが生じた（図2B、左から2番目のパネル)。しかしながら、cas9をリステリア・モノサイトゲネス染色体の構成的活性プロモーター下に戻すと、pTによる形質転換は完全に阻害された（図2C）。まとめると、これらの実験から、Cas9は、リステリア・モノサイトゲネス株10403sにおいて内因性レベルおよび過剰発現レベルの両方で機能的であり、プロトスペーサーを有するプラスミドによる形質転換を制限することが実証される。
【００６１】
常在プロファージはリステリア・モノサイトゲネスにおけるCRISPR-Cas9を不活性化する
自己標的指向スペーサーを有する株においてCRISPR-Cas9が無効にされ得るかどうかを試験するために、そのスペーサー16が同じゲノム中のプロファージ (φJ0161a) と完全に一致するリステリア・モノサイトゲネス株J0161において免疫機能を調べた（図1C）。J0161において明らかに有害なCRISPR-Cas変異を検出することはできず、この自己標的指向シナリオが阻害の結果であり、機能喪失の結果ではないことが示唆された（図6B〜F）。J0161のII-A型CRISPRアレイは10403sのものと異なるため、J0161特異的標的指向プラスミド (pTJ0161) を用いてJ0161におけるCRISPR-Cas9の機能を試験した。自己標的指向によって暗に示される不活性化と一致して、形質転換効率にもコロニーサイズにも、pTJ0161とpNTを区別する有意な違いはなかった（図2Bおよび2C、最も右側のパネル）。したがって、本発明者らは、J0161ゲノムがCas9阻害因子をコードすると判断した。
【００６２】
J0161におけるCRISPR-Cas9不活性化に関する遺伝学的基礎の探索において、本発明者らは、プロファージφJ0161がこの株における自己標的指向配列を含有するという理由で、阻害因子遺伝子の推定供給源としてこれに着目した。φJ0161が阻害因子を含有するかどうかを判定するために、10403sのプロファージ救済株をφJ0161で溶原化し、プラスミド形質転換によりCRISPR-Cas9機能性についてアッセイした。φ救済10403s株がpTを標的指向した一方で、φJ0161aの獲得はCRISPR-Cas9機能を不活性化するのに十分であり（図2B、左から3番目のパネル、および図2C、左から4番目のパネル）、このプロファージがCRISPR-Cas9の阻害因子をコードすることが示唆された。φJ0161aプロファージはまた、cas9を構成的に発現する株においてもプラスミド標的指向を不活性化し、阻害機構が、cas9プロモーターの自然調節を破壊することによって作動するのではないことが示唆された（図2C、左から5番目）。
【００６３】
φJ0161aがCRISPR-Cas9機能を阻害し、内因性プロファージφ10403sが阻害しないことを考慮して、これら2つの近縁ファージのゲノムを比較して、異なる領域を同定した（図2D）。>40%のタンパク質配列同一性を有する共有の39個のコアなファージ遺伝子に加えて、遺伝子の10個の非重複特有クラスターが同定された（クラスターの境界は、予測されるオペロン構造に基づいて選択され、クラスター当たり1〜12個の遺伝子が存在する）。各クラスターをクローニングし、プロファージ救済10403sのゲノム中に組み込み、CRISPR-Cas9機能についてアッセイした。10個の断片のうち、7個はリステリア・モノサイトゲネスへの導入に成功したが、3個の断片はリステリア・モノサイトゲネスゲノムに挿入することができず、おそらくは単独で毒性であった。プラスミド形質転換アッセイにより、φJ0161a断片1がCRISPR-Cas9を阻害し得る唯一の断片であることが明らかにされ、この断片が少なくとも1つのCRISPR-Cas9阻害因子をコードすることが示された（図2D、図8）。この4遺伝子断片から個々の遺伝子を発現させることにより、2つの抗CRISPR遺伝子、LMOG_03146およびLMOG_03147（本明細書において、それぞれacrIIA1およびacrIIA2と称される）の決定的な同定に至った（図2Bおよび2D）。10403s::φJ0161a溶原菌からacrIIA1およびacrIIA2の両方を欠失させると、CRISPR-Cas9機能は回復し、これらがφJ0161aにおける唯一の抗CRISPR遺伝子であることが確認された（図2B）。
【００６４】
抗CRISPR遺伝子座はリステリア・モノサイトゲネスに広く及んでいる
さらなるII-A型抗CRISPRを同定するために、関連リステリア・モノサイトゲネスプロファージにおける、acrIIA1およびacrIIA2のゲノム位置と類似の位置を調べた。左の組込み部位と細胞溶解に関与する遺伝子との間に、遺伝子順序が高度に保存された小さなオペロン（2〜5遺伝子）内の、acrIIA1を含有する反復性の抗CRISPR (acr) 遺伝子座が同定された（図3A）。本発明者らは、acr遺伝子座内に保存された5つの新規タンパク質ファミリーを同定した。これらを試験するために、代表的なものをクローニングして10403sゲノム中に組み込み、pTおよびpNTの形質転換効率をアッセイした。CRISPR不活性化の能力がある、2つの新たな遺伝子が同定されたが（acrIIA3およびacrIIA4）、残りの3つ（orfC、D、E）にはこの能力はなかった（図3A、図9）。
【００６５】
リステリア・モノサイトゲネスにおけるCRISPR-Cas9不活性化が広範囲にわたるかどうかを判定するために、次に各抗CRISPRの保存パターンを解析した。各acrIIA遺伝子は単独でCRISPR-Cas9を不活性化するのに十分であるが、本発明者らは、大部分のacr遺伝子座におけるacrIIA1の共通の存在を認めた。acrIIA2〜4のほぼすべての例 (91%) が、ヘリックス・ターン・ヘリックス (HTH) モチーフ含有acrIIA1の上流に見出され、この遺伝子がacr遺伝子座のマーカーとなり得ることが示唆された（図3B）。119のacr遺伝子座において本発明者らが認めた最も一般的なシナリオは、acrIIA1-2またはacrIIA1-2-3のいずれかであり、acr遺伝子座の66%を示した。全体として、acrIIA遺伝子はリステリア・モノサイトゲネスゲノムの25%において同定され、リステリア・モノサイトゲネスcas9含有株のおよそ50%が、同じゲノム中に少なくとも1つの抗CRISPRを有する（図3C）。複数のacrIIAコードプロファージを有するリステリア・モノサイトゲネスの多くの例もまた同定された（補足表1）。さらに、最初に同定された自己標的指向の全8例のゲノム中に、少なくとも1つのacrIIA遺伝子が見出され（図1B、補足表1）、これらのシナリオがいかに安定しているかが示された。まとめると、これらのデータにより、リステリア・モノサイトゲネスにおけるCRISPR-Cas9の広範なプロファージ媒介性不活性化が示唆される。
【００６６】
（表Ｓ１）図1B、4B、および4Cに関連した、acrIIA遺伝子保存
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【００６７】
以前のHTH含有抗CRISPR関連 (aca) 遺伝子は、新規なI型抗CRISPR遺伝子を同定するためのマーカーとして使用されたが (Pawluk, A. et al. (2016). Nature Microbiology, 1, 1-6)、aca遺伝子はそれ自体が抗CRISPR活性を有さなかった。本発明者らは、acrIIA1がそのようなマーカーの役割を果たし得ると仮定した。acrIIA1の包括的系統発生解析を行い、相同体が、可動因子およびコアゲノムの両方において、ファーミキューテス門にわたって広く検出されることが明らかになった（図4A）。acr遺伝子座メンバーとして独立して同定されていたHTH含有遺伝子であるorfDによって例証される、遠縁のacrIIA1相同体のファミリーが、リステリアゲノムにおいて同定された（図3A）。この遺伝子は機能アッセイにおいて抗CRISPR活性を欠いていたが、プラスミドpLMIVにおいてこれがacrIIA4と同時に存在することにより、広範なacrIIA1/orfDスーパーファミリーを、新たなacr遺伝子を同定するためのマーカーとして使用できることが示唆された（図3A）。これらのシステムにおけるHTH含有遺伝子が、新規な抗CRISPRを発見するための有効なマーカーとして役立つかどうかを判断するには、今後の研究が必要であろう。
【００６８】
acrIIA2〜4の相同性状況を判定するために、同様の系統発生解析を実施した。ファーミキューテス門のコアゲノムに広く及ぶacrIIA1とは異なり、これら他の3つのacr遺伝子は主に、リステリア属におけるプロファージに限定された。acrIIA2の3つの異なる配列ファミリーが同定され、リステリア属シホファージ (siphophage)（尾部の長い非収縮性ファージのファミリー）内にのみ見出されたのに対して（図4B）、2つのacrIIA3ファミリーは、リステリア属およびストレプトコッカス属のシホファージのゲノム内に認められた（図4C）。最後に、acrIIA4は2つの異なる配列ファミリーにおいて認められ、その一方はリステリア属のシホファージおよびプラスミドであり、他方は偏性毒性ミオファージ (myophage)（長い収縮性尾部を有するファージ）の群であった（図4D）。acrIIA2およびacrIIA3がほぼ常にacrIIA1と共に見出されるのに対して、acrIIA4は、リステリア属のファージおよび可動因子においてacrIIA1相同体の非存在下で存在する場合が多かった。例えば、毒性ファージにおけるacrIIA4のファミリーは、予測されるタンパク質中におよそ70アミノ酸のC末端伸長を有し、HTH含有遺伝子acrIIA1またはorfDと共に存在しないという点で異なり、これらのacrIIA4ファミリー間の潜在的な機構的相違および進化の相違が示唆される。まとめると、これらの解析により、相同acr遺伝子を特異性決定因子に関して調べるための十分な配列空間が明らかになり、リステリア・モノサイトゲネスにおけるcas9と可動因子との間の活発な激しい競争が示唆される。
【００６９】
AcrIIA2、AcrIIA3、およびAcrIIA4は化膿性連鎖球菌Cas9を阻害する
Lmo Cas9 AcrIIAタンパク質の多用途性を判定するために、これらの阻害因子が、化膿性連鎖球菌 (Spy) 由来の関連Cas9タンパク質（Lmo Cas9と53%同一）に対して機能的であるかどうかを問うた。このオルソログは、RNAガイドヌクレアーゼとして生物工学的応用のために (Barrangou, R., and Doudna, J. A. (2016), Nature Biotechnology, 34, 933-941)、およびプログラム可能な遺伝子抑制のための触媒不活性化変異体 (dCas9) によるプログラム可能な遺伝子抑制のために（Gilbert, L.A. et al. (2013). Cell 154, 442-451；Qi, L.S. et al. (2013). Cell, 152, 1173-1183）、広く用いられている。Spy dCas9を保有する大腸菌株を用いて、dCas9が染色体RFPレポーター遺伝子の転写を妨げるのをAcrIIAタンパク質が阻止するかどうかを試験した（図5A）。阻害因子を欠く遺伝子背景では、sgRNAおよびdCas9の存在によって、ガイドRNAのない株と比較してRFP蛍光が2.6%まで減少した。acrIIA2はdCas9機能を部分的に阻止し、蛍光発生は25%までである一方、acrIIA4はほぼ完全にdCas9を阻止し、蛍光はガイドなし対照の85%であった（図5B）。acrIIA3は大腸菌に対して毒性であるため、このタンパク質から意味のあるデータを得ることができなかった。これはフローサイトメトリー中に記録された細胞数を減少させ（図10aを参照されたい）、蛍光測定値の大きなばらつきをもたらした。Lmo_acrIIA3と45%の配列同一性を有する化膿性連鎖球菌由来のAcrIIA3の相同体（アクセッション番号：AND04610.1）もまた試験したが、大腸菌の増殖が損なわれた（図10b）。acrIIA3毒性の機構はまだ解明されていない。本発明者らは、acrIIA2およびacrIIA4は大腸菌におけるSpy dCas9を異なる程度まで阻害すると結論づける。
【００７０】
真核細胞におけるSpy Cas9の一般的適用を考慮して、次にAcrIIAタンパク質をヒト細胞における遺伝子編集を阻止する能力について試験した。ヒトコドン最適化AcrIIAタンパク質を発現するベクターの存在下または非存在下で、誘導性eGFPレポーター遺伝子を有するHEK293T細胞に、Spy Cas9、およびeGFPを標的指向するsgRNAの両方を発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。遺伝子編集を36時間進行させた後、eGFPを12時間誘導し、次いで細胞蛍光をフローサイトメトリーによって測定した（図5C)。Cas9およびeGFP sgRNAの存在下では、遺伝子編集によりGFP陽性細胞の数は25%減少したのに対して、acrIIA2またはacrIIA4の同時発現によりCas9ベースの遺伝子編集は妨げられた（図5D）。このアッセイにおいてacrIIA3の化膿性連鎖球菌相同体 (Spy acrIIA3) をさらに試験したところ、これはヒト細胞において毒性がなかったが、Cas9機能に影響を及ぼさなかった。リステリア・モノサイトゲネスにおいて抗CRISPR活性を有さない陰性対照であるorfAと同様に、acrIIA1はヒト細胞において非機能的であった。大腸菌におけるdCas9実験と総合すると、これらのデータから、異種宿主におけるオルソロガスCas9の機能を阻害するためのAcrIIA2およびAcrIIA4タンパク質の有用性が実証される。したがって、これらの試薬は、CRISPR-Cas9ゲノム編集ツールキットにおける新たなツールとなる。
【００７１】
考察
ファージにコードされる細菌免疫系の阻害因子は、これら2つの実体間の進化上の激しい競争における強い選択圧に起因して出現する (Samson, IE. et al. (2013). Nat Rev Micro, 11, 675-687)。I型CRISPR-Casシステムにおいてファージにコードされる抗CRISPRが最初に同定されたことによって、さらなるCRISPR阻害因子が存在することが示唆されたが、それらを発見するための方法は欠如していた。本明細書において、本発明者らは、CRISPR-Cas阻害因子遺伝子のゲノムマーカーとして「自己標的指向」を使用するバイオインフォマティクス戦略を提示する（図1A）。このアプローチにより、4つの異なるII-A型CRISPR-Cas9阻害因子が同定され（図3A）、これらは合わせると、自己標的指向を有する全ゲノムを含む、Cas9をコードする全リステリア・モノサイトゲネスゲノムの半数に存在する（図3C）。本発明者らは、このアプローチが他のCRISPR-Casシステムにおけるacr遺伝子を同定するのに役立つと推定するが、III型システムについては、自己標的指向に対する寛容性のための異なる機構が記載されている（Goldberg, G.W. et al. (2014). Nature 514, 633-637；Samai, P. et al. (2015), Cell, 161, 1164-1174）。
【００７２】
AcrIIAタンパク質の同定を容易にするために、最初に、リステリア・モノサイトゲネスにおける機能的CRISPR-Cas9システムを実証する（図2B）。この生物におけるCRISPR-Casの以前の研究は、I-B型システム、およびcas遺伝子を欠く関連のI-B由来CRISPRオーファンアレイに焦点を合わせた（Mandin, P. et al. (2007). Nucleic Acids Research, 35, 962-974；Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065）。規範的なCRISPR-Cas機能はそれまでいずれのシステムについても確証されていなかったが、オーファンアレイは、宿主リボヌクレアーゼによりプロセシングされて、非コードRNAを生成することが示された（Mandin, P. et al. (2007). Nucleic Acids Research, 35, 962-974；Sesto, N. et al. (2014). PLoS Genet, 10, e1004065）。II-A CRISPR-Casシステムの機能を観察するために、本発明者らは、標準的な形質転換効率アッセイを使用して、株10403sにおけるCas9機能が配列特異的様式でプラスミドの形質転換を制限するのに十分であることを示した（図2A〜C）。pTによる10403sの形質転換中に観察された小コロニー表現型を考慮して、本発明者らは、cas9発現の内因性レベルが、プラスミドを完全に排除するには十分ではなく、プラスミドが非常に小さいコロニー内で維持されると考えた。このことを確認したところ、cas9の発現増加により、このアッセイにおいて形質転換が完全に消失した（図2C）。φJ0161aがこの過剰発現されたCRISPR-Cas9システムを阻害し得ることを考慮して（図2C）、同定された阻害因子が、内因性Cas9機能および過剰発現されたCas9機能の両方を阻止することができると結論づける。
【００７３】
候補抗CRISPR遺伝子を同定するために、CRISPR活性株10403s由来の関連プロファージと株J0161由来のCRISPRを阻害するプロファージを比較し、消去法 (process of elimination) クローニングアプローチを採用した（図2D）。単離された2つのacr遺伝子の同定が、φJ0161中に存在するacrIIA1およびacrIIA2遺伝子について確認された。さらなる抗CRISPRを探索する上で、本発明者らは、関連ファージにおける保存されたゲノム位置決めが、タンパク質自体の間の配列保存の欠如にかかわらず、異なるII-A型Cas9阻害因子タンパク質を同定するための優れた代用物であることを見出す（図3A）。このことは、I-F型およびI-E型抗CRISPRの研究において以前に認められている（Bondy-Denorny et al. (2013), Nature , 493, 429-432；Pawluk, A. et al. (2014), mBio 5, e00896）。リステリア・モノサイトゲネスにおいて、プロファージ中にCas9阻害因子が高度に行き渡っていることにより、CRIPR-Cas9機能の広範な不活性化が示唆される（図3C）。現在のところ、acrIIA1と他の抗CRISPRとの一般的共存を説明するための機構的関連性があるかどうかを、本発明者らは理解していない（図3Aおよび3B）。この遺伝子は、プラスミド負荷アッセイにおいてCRISPR-Cas9機能を不活性化するのに十分であるが、本発明者らは、感染または溶原化中にそれが他のacrIIA遺伝子の補助因子または調節因子として働き得、したがって観察されたゲノム関連性を説明すると推測する。AcrIIA1がこの関連で実際に二機能性タンパク質であるのかどうか、およびさらに広範に、そのスーパーファミリーがacr遺伝子のマーカーであるのかどうかを理解するには、今後の研究が必要であろう。
【００７４】
系統発生解析により、リステリア属可動因子において、可動因子にacrIIA2〜4が一般的に存在することが実証される（図4）。これは、Cas9ベースの標的指向および適応を阻止することによって、この生物において水平遺伝子移動を促進する可能性が高い (Heler, R. et al. (2015) Nature 519, 199-202)。これらのacrIIA遺伝子が最初に同定されたプロファージのファミリーに加えて、遠位のシホファージ、ミオファージ、およびプラスミドにおいても相同体が見出された。最も注目すべきことには、毒性ミオファージによってコードされるacrIIA4相同体は、それらの近傍にacrIIA1スーパーファミリー相同体を有さなかった。さらに、リステリア属以外の属におけるacrIIA1およびacrIIA3相同体の存在により、CRISPR-Cas9不活性化がファーミキューテス門においてありふれている可能性があることが実証される。
【００７５】
CRISPR-Cas9機能を不活性化するために、理論的には多くの機構が可能である。操作されたエレメント（すなわち、cas9プロモーター、sgRNA設計およびプロモーター）による異種宿主におけるacrIIA2およびacrIIA4の有効性を実証することにより、本発明者らは転写抑制の可能性は低いと結論づける。I型抗CRISPRは、干渉に必要とされるCasタンパク質に直接結合し、DNA結合またはDNA切断を妨げることによって機能する (Bondy-Denomy, J et al. (2015). Nature, 526, 136-139)。拡張することにより、本発明者らは、ヒト細胞において機能する能力を考慮して、acrIIA2およびacrIIA4に関して同様の機構を予測する。dCas9ベースのアッセイと比較して、ヒト細胞における切断ベースのCas9アッセイにおいて、acrIIA2の有効性が増強されていたことより、切断阻害がCas9機能の完全な不活性化として現れて、それが結合および切断の両方をある程度阻害し得ることが示唆される。AcrIIA4の場合には、DNA結合は明らかに阻害されるが、これがCas9との直接的な相互作用を介するかどうかはまだわかっていない。
【００７６】
II-A型阻害因子の同定および今後の機構的精査は、天然の設定および操作された設定において規範的なCRISPR-Cas9機能を研究するための有益な新たな試薬を提供する。大腸菌およびヒト細胞においてSpy Cas9を阻止するAcrIIAタンパク質の能力により、これらのタンパク質がCas9のための翻訳後「オフスイッチ」を提供し得ることが示唆される。これは、真核生物システムにおいて適用され得るこの強力なシステムに対して調節を積み重ねて、ゲノム編集を制御することができる。CRISPR-Cas9ツールボックスにこのように新たなものが加えられたことで、ゲノム遺伝子座へのdCas9結合の効果を特異的に逆転させる、または核内でCas9が活性を有する時間を制限して、オフターゲット遺伝子編集を減少させるなど、新たな適用が可能になる。阻害因子タンパク質の探索を拡大して、ファージ-細菌の激しい競争から我々に提供される豊富なツールを開拓し続けることが重要であろう。
【００７７】
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【００７８】
（表Ｓ２）株およびプラスミド
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【００７９】
実験モデルおよび対象の詳細
微生物
リステリア・モノサイトゲネス株はブレインハートインフュージョン (BHI) 培地で培養した。大腸菌株はLB培地で培養した。
【００８０】
細胞株
ヒト胎児腎293＋T細胞抗原（HEK293T、CRL-3216、ATCC）細胞は、10%ウシ胎仔血清（FBS、Atlanta Biologicals）および50μg/mL ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S、UCSF CCF）を補充したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で培養した。
【００８１】
実施例2
本発明者らは、遺伝子編集に広く用いられるCas9の化膿性連鎖球菌オルソログに対して抗CRISPR機能を有するacrIIA1〜4の相同体を同定しようとした（図13）。
【００８２】
図14：AcrIIA1は、異種システム（すなわち、天然生物以外）において抗Cas9活性を有する。以前、このタンパク質は、大腸菌またはヒト細胞において抗Cas9機能を有さなかった。この矛盾の理由はいまだ不明であるが、陽性対照AcrIIA4と比較して、AcrIIA1は、Cas9を標的指向しながらこの異種システム（緑膿菌）において非常に良好に機能する。
【００８３】
図15：天然配列空間を広くサンプリングして、配列アライメントにより、AcrIIA2相同体が同定された。元のタンパク質に加えて、3つの相同体を試験した。ファージプラークアッセイを用いて図16に示されるように、AcrIIA2b.1およびAcrIIA2b.3は、元のタンパク質、AcrIIA2aと比較して強力な抗SpyCas9活性を有する。
【００８４】
図17：同様の相同性検索を実施して、AcrIIA3相同体、AcrIIA3b.2、3b.3、3b.4が同定された。細菌がプレート上にスポットされたアッセイを用いて図18に示されるように、これら3つの新たな抗CRISPRタンパク質は、細菌において毒性がなく、かつ強力に働いた。本文書において同定されたAcrIIA4は、Cas9に堅固に結合する、強力でかつ広域性のCas9阻害因子である（Dong et al Nature、および Shin et al Science Advancesを参照されたい）。1つの相同体 (AcrIIA4b) が、穏やかな抗Cas9活性を有すると特定された。
【００８５】
図19は、実施例2に記載された結果を要約する。
【００８６】
参考文献
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【００８７】
本明細書に記載される実施例および態様は説明の目的のためにのみ提供されること、ならびにこの点を考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用された出版物、特許、および特許出願はすべて、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８８】
配列
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ−１】
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【図７Ｆ−２】
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【図７Ｆ−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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