(57)【要約】  本発明は、癌患者に対する治療の効果を評価する際に使用するための方法、剤およびキットを提供する。加えて、本発明は、治療される癌患者における抗癌剤の治療用量の投与される基準を低下させるための併用療法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）前記患者の少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの小胞体（ＥＲ）ストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、前記生体試料の少なくとも１つが前記治療の開始後に得られるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの前記発現値が前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準における前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られた前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が、前記患者が前記治療に対する応答者であることを示す、方法。
【請求項２】
前記所定の標準における前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い前記少なくとも１つの生体試料中の前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が、前記治療が継続されるべきであることを示唆する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカが、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、真核生物開始因子２のリン酸化サブユニットα（ｐ−ｅＩＦ２ａ）、リン酸化イノシトール要求性１（ｐ−ＩＲＥ）、リン酸化ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ｐ−ＰＥＲＫ）、またはＣ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＲストレスマーカが、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）における前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの前記発現レベルが、前記患者の少なくとも２つの時間的に離された生体試料において決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも２つの生体試料の１つが、前記治療の開始前に得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも２つの時間的に離された生体試料が、１週間、２週間、３週間または４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月または４ヶ月間離される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、前記患者に配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む前記単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を投与することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む前記単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩が、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む前記単離されたペプチド、または前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩が、１週間に１回、２回または３回の頻度で投与される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療が、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌および女性生殖系悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、神経起源の紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、直腸癌、膵癌および脊髄新生物からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者における前記癌細胞が、ＳＴ２陽性細胞である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカに特異的な少なくとも１つの検出剤を前記少なくとも１つの生物学的試料またはそれから得られる任意の核酸またはタンパク質産物と接触させることを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカに特異的な前記少なくとも１つの検出剤が、抗体または検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体であり、前記抗体が、前記ＥＲストレスマーカを特異的に認識しかつ結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測する方法での使用のためのＥＲストレスマーカに特異的な検出剤であって、前記方法が、
（ａ）前記患者の少なくとも１つの生体試料中において前記検出剤を用いて前記ＥＲストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、前記生体試料の少なくとも１つが治療の開始後に得られるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記ＥＲストレスマーカの前記発現値が前記ＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準における前記ＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られた前記ＥＲストレスマーカの発現値が、前記患者が前記治療の応答者であることを示す、検出剤。
【請求項１８】
前記所定の標準における前記ＥＲストレスマーカの発現値より高い前記少なくとも１つの生体試料中の前記ＥＲストレスマーカの発現値が、前記治療が継続されるべきであることを示唆する、請求項１７に記載の使用のための検出剤。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカが、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、真核生物開始因子２のリン酸化サブユニットα（ｐ−ｅＩＦ２ａ）、リン酸化イノシトール要求性１（ｐ−ＩＲＥ）、リン酸化ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ｐ−ＰＥＲＫ）またはＣ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１７または１８に記載の使用のための検出剤。
【請求項２０】
前記ＥＲストレスマーカが、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２１】
ステップ（ａ）における前記ＥＲストレスマーカの前記発現レベルが、前記患者の少なくとも２つの時間的に離された生体試料において決定される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２２】
前記少なくとも２つの生体試料の１つが、前記治療の開始前に得られる、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２３】
前記少なくとも２つの時間的に離された生体試料が、１週間、２週間、３週間または４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月または４ヶ月間離される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２４】
前記治療が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩を用いる、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２５】
前記癌が、膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌および女性生殖系悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２６】
前記癌が、神経起源の紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、直腸癌、膵癌および脊髄新生物からなる群から選択される、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２７】
前記患者における前記癌細胞が、ＳＴ２陽性細胞である、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２８】
ＥＲストレスマーカに特異的な前記検出剤が、抗体または検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体であり、前記抗体が、前記ＥＲストレスマーカを特異的に認識しかつ結合する、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の使用のための検出剤。
【請求項２９】
（ａ）生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を決定することに特異的な少なくとも１つの検出剤、および任意で
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩の治療の開始前およびこれらの投与時に癌患者について決定される前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値、
（ｃ）少なくとも１つの対照試料、
の少なくとも１つを含むキット。
【請求項３０】
生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現のレベルを決定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチド、または前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩
をさらに含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
使用のための説明書をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのＥＲストレスマーカが、ＢｉＰである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の前記応答を予測することにおける使用のための、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
癌を治療する方法での使用のための抗癌剤と配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩とを含む併用療法であって、前記抗癌剤が、前記抗癌剤の治療用量の基準より低い用量で投与される、併用療法。
【請求項３６】
前記抗癌剤の投与される量が、抗癌剤の治療用量の基準より少なくとも約１％〜５０％、約５％〜４５％、約１０％〜４０％、約１５％〜３５％または約２０％〜３０％低い、請求項３８に記載の使用のための併用療法。
【請求項３７】
前記抗癌剤が、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫療法剤、ホルモン剤、生物学的剤、分化因子、抗血管新生因子、抗オートファジ剤または免疫刺激剤である、請求項３８または３９に記載の使用のための併用療法。
【請求項３８】
前記抗癌剤が、タキソールである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項３９】
前記単離されたペプチドおよび前記抗癌剤が、同時にまたは連続して投与される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４０】
前記癌が、膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌または女性生殖系悪性腫瘍である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４１】
前記癌が、卵巣癌または膵癌である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４２】
前記癌が、ＳＴ２陽性癌細胞を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４３】
前記単離されたペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩からなる、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４４】
単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩が、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４５】
前記単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩が、１週間に１回、２回または３回の頻度で投与される、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の使用のための併用療法。
【請求項４６】
（ａ）抗癌剤、および
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩
を含む、治療用キット。
【請求項４７】
使用のための説明書をさらに含む、請求項４６に記載の治療用キット。
【請求項４８】
前記抗癌剤が、前記抗癌剤の治療用量の基準よりも低い用量で投与される、癌を治療する方法での使用のための請求項４６または４７に記載の治療用キット。
【請求項４９】
それを必要とする患者における癌の治療の方法であって、前記抗癌剤と組み合わせて治療有効量の配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは前記単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を前記患者に投与することを含み、前記単離されたペプチドが、前記抗癌剤の投与される治療用量の基準を下げる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示は、個人化された医薬品に関する。より具体的には、本開示は、癌治療の効果を予測するのに使用するための方法、キットおよび組成物を提供する。加えて、本開示は、治療される癌患者における抗癌剤の治療用量の基準を低下させるための併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在開示される主題の背景として関連すると考えられる参考文献を以下に列挙する：
［１］Ｍｅｈｔａら、２０１０年、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２（２）１２５−１４８
［２］Ｌｅｅ，Ａ．Ｓ．２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７（８）：３４９６−３４９９
［３］Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｚ．ら、２０１４年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １４５：３４９−３５８
［４］Ｓａｔｏ，Ｍ．ら、２０１０年、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６９：９７−１１４
［５］Ｈａｎ，Ｋ．Ｓ．ら、２０１５年、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ６：３４８１８−３０
［６］国際公開出願第２００８／０４２５０８号
［７］米国特許第２００９／０１８１４７２号
［８］国際公開出願第０２／０８２０７６号
［９］国際公開出願第０２／０７７１７６号
［１０］国際公開出願第２００６／０４６２３９号
［１１］国際公開出願第２００７／１２２６２２号
［１２］国際公開出願第２００７／０９１２４０号
［１３］国際公開出願第２００８／０７５３４９号
［１４］Ｓａｎｄｌｅｒ，Ｕ．ら、２０１０年，Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＩＳＳＮ：１７９０−５１２５
［１５］Ｓａｎｄｌｅｒ，  Ｕ．ら、２０１０年，Ｊ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ８：３２７−３３９．
［１６］国際公開出願第２０１５／０８３１６７号
［１７］Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ，Ｅ．Ａら、２００９年，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５：２２８−２４７
【０００３】
本明細書中の上記の参考文献の認知は、これらがいずれかの点で、本明細書に開示された主題の特許性にいかなる意味でも関係していることを意味することを暗示するものではない。
【０００４】
背景
技術的進歩により、腫瘍進行の分子基盤の理解が大幅に深まり、多数の腫瘍および治療応答バイオマーカが現在までに確認されている（１）。
【０００５】
これらのマーカは一般に、標準治療後の癌再発の可能性などの、患者の全体的な結果を客観的に評価することを目的とする予後マーカ、および特定の臨床的介入による恩恵の可能性を評価することを目的とする予測マーカの２つのタイプに分けることができる（１）。
【０００６】
癌の発生および予後に関与する細胞マーカの中には、小胞体（ＥＲ）に主に存在する、ＢｉＰ（結合免疫グロブリンタンパク質）とも呼ばれるグルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８がある。ＨＳＰ７０タンパク質ファミリーに属するＧＲＰ７８は、適切なタンパク質の折り畳みを促進し、中間体が凝集するのを防ぎ、誤った折り畳みタンパク質をプロテアソーム分解の標的とする。さらに、ＧＲＰ７８はＥＲストレスシグナル伝達調節因子として働く。ＧＲＰ７８は、腫瘍増殖、生存、転移および広範な治療に対する耐容性を促進し、したがってＧＲＰ７８の発現は、腫瘍の挙動および治療応答のバイオマーカとして役立ち得る（２）。
【０００７】
上記と一致して、癌細胞は、ＧＲＰ７８の発現を誘導することによって、腫瘍環境における慢性ストレスに適応し（２）、それは強力な抗アポトーシス因子として機能し薬剤耐性を付与する（３）。実際に、癌患者の血清中のＧＲＰ７８自己抗体の存在が、一般に予後不良と関連することが示されている（４）。抗血管新生療法後のＧＲＰ７８／ＢｉＰアップレギュレーションは、複数の研究において実証されている。例えば、Ｈａｎらは、スニチニブ治療が、Ｃａｋｉ−１異種移植において低酸素症を誘発し、それに続いて対照群と比較して治療群においてＧＲＰ７８／ＢｉＰの発現が増えたことを示した（５）。
【０００８】
したがって、ＧＲＰ７８は、とりわけ、癌を有する対象がホルモン療法に対する耐性を発現させる危険があるかどうかを決定するための、種々の条件のマーカとして（６）、頭頸部癌の場合に腫瘍等級を評価するための予後マーカとして（７）または様々な癌の腫瘍マーカとして（８、９）提唱された。しかし、ＧＲＰ７８が癌進行または癌治療の間に作用する機構は、依然として明確ではない。
【０００９】
ヒト胸腺に特有のｃＤＮＡによってコードされる「Ｔ１０１」と称されるペプチドが、これまでに同定されている。このペプチドおよびその誘導体は、とりわけ、免疫系の刺激物質としてのＴ１０１の役割を介して癌治療に関与していた（国際公開出願第２００６／０４６２３９号、１０）。国際公開出願第２００６／０４６２３９号は、Ｔ１０１が免疫系を刺激し腫瘍サイズを減少させることができ、このペプチドが癌細胞の増殖に影響を及ぼすことを示唆している。国際公開出願第２００６／０４６２３９号はまた、例えば標準化学療法の過程で患者を保護することにおける、Ｔ１０１の免疫に基づく役割を示唆する。
【００１０】
国際公開出願第２００７／１２２６２２号（１１）では、Ｔ１０１を用いる癌の治療も示唆された。これは、とりわけ、種々のタイプの腫瘍の発症に対するＴ１０１の効果を実証している。ペプチドＴ１０１はまた、免疫学的疾患の治療に関連して、国際公開出願第２００７／０９１２４０（１２）に、およびＴ１／ＳＴ２受容体を有する細胞を伴う疾患の治療または予防に関連して、国際公開出願第２００８／０７５３４９号（１３）ならびにＳａｎｄｌｅｒらによる刊行物（１４および１５）に記載されている。
【００１１】
さらに、「Ｎｅｒｏｆｅ」と称されるＴ１０１のペプチド誘導体は、癌細胞による癌転移に関連することが公知であるタンパク質の分泌を減少させ、かつインビトロでの癌細胞の移動を直接阻害することが報告されている。加えて、このペプチドは、癌患者における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の血清レベルに影響を及ぼすことが示されており（国際公開出願第２０１５／０８３１６７号、１６）、癌転移を予防または治療する方法での使用が示唆された。
【発明の概要】
【００１２】
その態様の１つにより、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）患者の少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの小胞体（ＥＲ）ストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【００１３】
いくつかの実施形態では、所定の標準における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値は、治療を継続すべきであることを示唆する。
【００１４】
他の実施形態では、少なくとも１つのＥＲストレスマーカは、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、真核生物開始因子２のリン酸化サブユニットα（ｐ−ｅＩＦ２ａ）、リン酸化イノシトール要求性１（ｐ−ＩＲＥ）、リン酸化ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ｐ−ＰＥＲＫ）またはＣ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）またはこれらの任意の組み合わせである。本開示の様々な実施形態は、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）であるＥＲストレスマーカに関する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルは、患者の少なくとも２つの時間的に離された生体試料において決定される。他の特定の実施形態では、少なくとも２つの生体試料の１つは、治療の開始前に得られる。さらなる実施形態では、少なくとも２つの時間的に離された生体試料は、１週間、２週間、３週間、または４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月または４ヶ月間離される。
【００１６】
種々の実施形態では、本明細書で定義される方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩は、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。いくつかの実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩は、１週間に１回、２回または３回の頻度で投与される。
【００１７】
さらなる実施形態では、本明細書で定義される治療は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる。
【００１８】
本開示の様々な実施形態では、本開示の癌は、膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌および女性生殖系悪性腫瘍からなる群から選択される。他の特定の実施形態では、癌は、神経起源の紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、直腸癌、膵癌および脊髄新生物からなる群から選択される。さらなる実施形態では、患者中の癌細胞はＳＴ２陽性細胞である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、少なくとも１つのＥＲストレスマーカに特異的な少なくとも１つの検出剤を、少なくとも１つの生体試料またはそれから得られる任意の核酸またはタンパク質産物と接触させるステップを含む。様々な実施形態では、少なくとも１つのＥＲストレスマーカに特異的な少なくとも１つの検出剤は、抗体または検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体であり、抗体はＥＲストレスマーカを特異的に認識し結合する。
【００２０】
本開示は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測する方法における使用のための、ＥＲストレスマーカに特異的な検出剤をさらに提供する。この方法は、
（ａ）患者の少なくとも１つの生体試料中において検出剤を用いてＥＲストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＥＲストレスマーカの発現値がＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準におけるＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られたＥＲストレスマーカの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【００２１】
本開示は、
（ａ）生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を決定することに特異的な少なくとも１つの検出剤、および任意で
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩の治療の開始前およびこれらの投与時に癌患者について決定される少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値、
（ｃ）少なくとも１つの対照試料、
の少なくとも１つを含むキットをさらに提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を決定するためのキットは、生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルを決定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む。
【００２３】
他の実施形態では、少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を決定するためのキットは、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチド、または単離されたペプチドの薬学的に許容される塩
をさらに含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を決定するためのキットは、使用説明書をさらに含む。
【００２５】
種々の実施形態では、本明細書に定義されるキットは、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測することにおける使用のためのキットである。
【００２６】
本開示は、癌を治療する方法における使用のための、抗癌剤と、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩とを含む併用療法をさらに提供し、抗癌剤は、抗癌剤の治療用量の基準より少ない用量で投与される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、使用のための併用療法は、抗癌剤の投与量が抗癌剤の治療用量の基準より少なくとも約１％〜５０％、約５％〜４５％、約１０％〜４０％、約１５％〜３５％または約２０％〜３０％少ない。
【００２８】
他の実施形態では、使用のための併用療法は、抗癌剤が化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫療法剤、ホルモン剤、生物学的剤、分化因子、抗血管新生因子、抗オートファジ剤または免疫刺激剤である。さらなる実施形態では、使用のための併用療法は、抗癌剤がタキソールである。
【００２９】
さらなる実施形態では、使用のための併用療法は、単離されたペプチドおよび抗癌剤が同時に、または連続して投与される。
【００３０】
使用のための併用療法の態様の様々な実施形態では、癌は、膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌または女性生殖系悪性腫瘍である。使用のための併用療法の態様の特定の実施形態では、癌は、卵巣癌または膵癌である。使用のための併用療法の態様のさらなる実施形態では、癌はＳＴ２陽性癌細胞を含む。
【００３１】
使用のための併用療法の態様のいくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩からなる。
【００３２】
使用のための併用療法の態様の他の実施形態では、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。使用のための併用療法の態様のさらなる実施形態では、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、１週間に１回、２回または３回の頻度で投与される。
【００３３】
その態様の別の１つでは、本開示は、
（ａ）抗癌剤、および
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩、
を含む治療用キットを提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、治療用キットは、使用説明書をさらに含むキットである。
【００３５】
他の実施形態では、治療用キットは、癌を治療する方法における使用のためのものであり、抗癌剤は、抗癌剤の治療用量の基準より少ない用量で投与される。
【００３６】
さらに別の態様により、本開示は、それを必要とする患者における癌の治療の方法であって、治療的有効量の配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を抗癌剤と組み合わせて患者に投与することを含み、単離されたペプチドが抗癌剤の投与治療量の基準を下げる、方法を提供する。
【００３７】
本明細書に開示された主題をより良く理解し、実際にどのように実施できるかを例示するために、以下の実施形態を添付の図面を参照して非制限的な例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】患者の無作為化および割り当ての要約であり、患者数および特定のコホートへの割り当て、ならびに研究で使用される投薬量を示す。
【図２Ａ−Ｂ】脊髄新生物に罹患している患者００２〜００６から採取した生検の顕微鏡写真である。図２Ａは、ｄＴＣＡｐＦが投与される前に患者から得られた生検の結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）染色を示し、図２ＢはｄＴＣＡｐＦでの１１ヶ月の治療後に得られた生検のＢｉＰ染色を示す。染色に用いた抗体は抗ＢｉＰ抗体（Ａｂｃａｍ）であった。
【図３】ＥＲストレスマーカＢｉＰの血清レベルの変化とｄＴＣＡｐＦの用量との間の相関を示すグラフである。
【図４】ＥＲストレスマーカＢｉＰの血清レベルの変化と腫瘍サイズの変化との間の相関を示すグラフである。
【図５】患者のＴ１／ＳＴ２発現による臨床試験への参加日数を示すグラフである。
【図６】ＳＴ２陰性およびＳＴ２陽性集団について、ＥＲストレスマーカＢｉＰの血清レベルの変化と腫瘍サイズの変化との間の相関を示すグラフである。
【図７】用量群による経時的なｄＴＣＡｐＦの血清濃度を示すグラフである。エラーバーはＳＤを表す。
【図８】腫瘍サイズの変化とｄＴＣＡｐＦの投与量との間の相関を示すグラフである。
【図９Ａ−Ｄ】対照ＯＶ９０細胞（図９Ａ）、示したようにｄＴＣＡｐＦペプチドで処理したＯＶ９０細胞（図９Ｂ）、対照ＯＶ９０ＳＴ２ノックアウト（ＫＯ）細胞（図９Ｃ）および示したようにｄＴＣＡｐＦペプチドで処理したＯＶ９０ＳＴ２ノックアウト（ＫＯ）細胞（図９Ｄ）の、β−ｃｏｐを対象とした抗体を用いた免疫細胞化学的画像である。
【図１０Ａ−Ｄ】対照ＯＶ９０細胞（図１０Ａ）、示したようにｄＴＣＡｐＦペプチドで処理したＯＶ９０細胞（図１０Ｂ）、対照ＯＶ９０ＳＴ２ノックアウト（ＫＯ）細胞（図１０Ｃ）および示したようにｄＴＣＡｐＦペプチドで治療したＯＶ９０ＳＴ２ノックアウト（ＫＯ）細胞（図１０Ｄ）の、ＧＲＰ７８  ＢｉＰを対象とした抗体を用いた免疫細胞化学的画像である。
【図１１Ａ−Ｂ】治療終了時のｄＴＣＡｐＦ治療患者における血清ＣＲＴレベル（図１１Ａ）およびｄＴＣＡｐＦ治療患者におけるＣＲＴレベルの変化（図１１Ｂ）を示す棒グラフである。
【図１２】ｄＴＣＡｐＦの存在下でのナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化を示すグラフである。
【図１３Ａ−Ｂ】タキソール（２ｎＭまたは４ｎＭ）、ｄＴＣＡｐＦ（２５μｇ／ｍｌ）またはそれらの組み合わせ（ｄＴＣＡｐＦ２５μｇ／ｍｌ、タキソール２または４ｎＭ）の存在下における、ヒト卵巣癌細胞（図１３Ａ）およびヒト膵癌細胞（図１３Ｂ）におけるＢｒｄＵ取り込みのレベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本開示は、全Ｄアミノ酸配列Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓを有する本明細書のｄＴＣＡｐＦ（またはＮｅｒｏｆｅ）（配列番号１と示す）と呼ばれるペプチドによる治療が、ＥＲストレスマーカ結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）の発現レベルの上昇から明らかなように、様々な癌において小胞体（ＥＲ）ストレスを増加させたという驚くべき発見に基づく。注目すべきことに、ＥＲストレスマーカＢｉＰの観察された増加は、治療期間の終わりでの腫瘍サイズの減少によって示されるように、ｄＴＣＡｐＦ治療患者における腫瘍増殖の阻害と相関することが見出された。
【００４０】
したがって、とりわけ、本開示は、癌患者におけるペプチドｄＴＣＡｐＦを用いる治療の効果を評価するためのバイオマーカとして、ＥＲストレスマーカ、例えばＢｉＰを使用できることを示す。
【００４１】
従って、その態様の１つにおいて、本開示は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）患者の少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの小胞体（ＥＲ）ストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【００４２】
換言すれば、本開示は、初期段階で（例えば、以下に例示されるような治療開始から約１ヶ月後、またはさらなる時点で）、癌患者が治療に応答するか否か（すなわち、治療が好適であるか）を決定するため、および（例えば、治療の開始または終了の後に、これらの結論に基づいてさらなる治療選択肢、例えば、このタイプの治療を進めることが推奨されるか否か、を決定するための方法を提供する。
【００４３】
多数の治療プロトコールが多くの場合望ましくない副作用と関連し、さらには奏効しない可能性があるという事実を考慮すると、好適な治療プロトコールを調整することは、非常に価値があり、臨床的に望ましい。したがって、治療開始後の初期の段階で、および／または全治療期間もしくは治療期間後に治療プロトコールを最適化することは、不適切な治療を避け、不要な副作用および薬物負荷を低減し奏効する機会を向上し得る。
【００４４】
癌患者の治療に対する応答に関して本明細書で使用される用語「予測」または「予測する」は、本明細書に定義した治療に対して、患者が好ましく応答する、すなわち有益な応答を有する、または好ましくない（すなわち、有益な応答を経験しない）応答をする可能性の決定または評価を指す。本明細書で定義される治療に対して全体的に好ましい応答を有する患者は、「応答者」と称され、治療に対して好ましくない応答をする患者は、「非応答者」と称される。
【００４５】
本開示の文脈における用語「応答」は、治療の結果としての患者の全体的な結果を指し、それは本発明の当業者に公知の任意の臨床パラメータを用いて評価できる。したがって、本明細書で定義される治療の文脈における用語「応答者」は、同じ状態（例えば、本明細書で定義される癌疾患の、同じタイプ、病期、程度および／もしくは分類）と診断された未治療の対象と比較して、または治療開始前（もしくはその最初の日、最初の投与の前）の同じ対象の臨床パラメータと比較して、または少なくとも１つの臨床パラメータの改善が達成されなかった患者集団（本明細書では「非応答者」と定義される）の臨床パラメータと比較して、少なくとも１つの臨床パラメータにおいて全体的な改善を経験する患者を指す。
【００４６】
治療に対する「非応答者」という用語は、臨床的パラメータの少なくとも１つにおいて改善を経験せずに同じ状態（例えば、病理の同じタイプ、病期、程度、および／または分類）と診断されるか、または本明細書に定義される治療前の同じ対象の臨床パラメータを経験する患者を指す。
【００４７】
癌の文脈における「臨床パラメータの改善」の意味は、当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、腫瘍サイズの縮小、少なくとも部分的な腫瘍増殖の阻害、腫瘍の数の減少、受容可能な疾患マーカ（すなわち、疾患の診断またはモニターに使用される当該分野で公知の任意のマーカ）の減少、腫瘍細胞転移の（少なくとも部分的な）阻害、抗腫瘍免疫応答の増強、腫瘍に関連する１つ以上の複数の症状の少なくとも部分的な軽減、治療後の生存期間の延長、治療後の所与の時点での死亡率の減少などを含む。したがって、いくつかの実施形態では、有益な応答は、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（１７）に従って評価され得る腫瘍負荷の減少である。
【００４８】
上に詳述したように、本開示は、患者の少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの小胞体（ＥＲ）ストレスマーカの発現レベルを最初に決定して発現値を得ることによって、本明細書で定義される治療に対する癌患者の応答を予測するための方法を提供し、ここで生体試料の少なくとも１つは、治療の開始後に得られる。次いでステップ（ｂ）では、ステップ（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が、少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかが決定される。本発明の方法によれば、（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が、所定の標準における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い場合は、患者は治療に対する「応答者」として診断される。
【００４９】
対照試料の対応する所定の標準発現値（またはカットオフ値）と比較して高いまたは低い、以下に定義される発現値は、患者が「応答者」または「非応答者」であるかどうかを予測することを理解されたい。
【００５０】
したがって、本方法は、試験されるＥＲストレスマーカのいずれか１つの発現値が標準集団の発現値もしくはこうした集団のカットオフ値の範囲内であるか、または、標準集団発現値もしくはこうした集団のカットオフ値よりも高いかどうかを調べることを含む。発現値は、治療のある時点での特定のＥＲストレスマーカについて得られる発現値が、標準集団（すなわち、所定の標準発現値）について対応する治療時点で得られる発現値より約１％〜９９．９％のいずれか１つだけ高い、具体的には、約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％、約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、または約９９％〜９９．９％、またはそれを超えて高い場合、対応する所定の標準発現値よりも「高い」と言われる。
【００５１】
したがって、用語「低い」は、例えば、約１％〜９９．９％、具体的には約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、または約９９％〜９９．９％のうちのいずれか１つ、所定の標準発現値より低い任意の発現値を指す。
【００５２】
換言すれば、試験試料の特定の発現値は、所定のカットオフ値または標準値と比較される。本明細書中で使用される場合、用語「比較する」は、少なくとも２つの異なる試料間の類似性または相違を発見するために、本発明に従って試験される試料について得られる発現レベルおよび／または発現値の任意の調査を示す。本発明による比較は、コンピュータベースのアプローチを使用する可能性を包含することに留意されたい。
【００５３】
本明細書で定義される用語「所定の標準発現値（複数可）」は、好ましくは本発明の方法により発現値が得られる時点（複数可）に対応する時点で、本明細書で定義される治療に対する応答者の集団におけるＥＲストレスマーカの、以下に定義される発現値を得るために任意により標準化される、発現レベルを指す。これらに限定されないが、例えば、以下に記載される臨床試験に登録された患者について得られた発現レベルである。これらの患者は、例示的な所定の標準応答者集団、または治療前に得られた試料中の、および治療２９日目に得られた試料中のＥＲストレスマーカＢｉＰの所定の標準発現値としての役割を果たす。
【００５４】
ここで単に「カットオフ」と称されることもある所定の標準発現値は、高い診断感受性（真陽性率）および高い診断特異性（真陰性率）の両方の要件を満たす値であることに留意すべきである。用語「感受性」および「特異性」は、本明細書で定義された治療に対する応答性に関連する予め確立された集団に属するものとして試料を正しく分類するために、１つ以上のＥＲストレスマーカの能力に関して本明細書で使用されることに留意すべきである。
【００５５】
ある代替的実施形態では、対照試料（または対照生体試料）を使用できる（所定の標準発現値の代わりに、またはそれに加えて）。したがって、ＥＲストレスマーカの発現値は対照試料中の発現値と比較される。対照試料は、健康な対象、同じ病理学的障害を患っており本明細書に定義される単離されたペプチドによって治療されない対象、治療前の治療される患者、治療に応答する対象および非応答の対象の少なくとも一人から得ることができる。
【００５６】
上に示したように、本開示は、ペプチドｄＴＣＡｐＦ（配列番号１によって示される）を用いる治療が、治療に対し陽性の患者の応答に相関して、種々の癌患者から得られた腫瘍において小胞体（ＥＲ）でのストレスを増加させたという驚くべき発見に基づく。ＥＲは、新たに合成されるタンパク質の折り畳みおよび成熟において重要な役割を有する。ＥＲストレスは、当技術分野で公知のように、ＥＲにおける誤った折り畳みのおよび折り畳まれなかったタンパク質の蓄積によって現れるＥＲホメオスタシスの崩壊を指す。ＥＲストレスは、複雑なシグナル伝達ネットワーク、例えば、ＥＲストレスを減少させホメオスタシスを回復させるように作用する、折り畳み不全タンパク質応答（Ｕｎｆｏｌｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＵＰＲ）と呼ばれるネットワークを活性化する。
【００５７】
ＵＰＲは、３つのＥＲ膜貫通タンパク質：イノシトール要求性１（ＩＲＥ１）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、および活性化転写因子６（ＡＴＦ６）によって開始される。ストレスのない状態では、ＥＲシャペロンである免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）がこれらのマスター調節因子の内腔ドメインに結合してそれらを不活性に保つ。ＥＲストレス時に、ＢｉＰはこれらのセンサーから解離し、それらの活性化をもたらす。
【００５８】
活性化されたＵＰＲは、下流のエフェクタを、適応応答、フィードバック制御、および細胞運命制御という３つの異なる機能で調節する。ＵＰＲ適応応答は、とりわけ、折り畳みを増加させるための分子シャペロンおよびタンパク質プロセシング酵素のアップレギュレーションを含む。フィードバック制御は、ＥＲホメオスタシスが再度確立されるようなＵＰＲ活性化の負の調節を含む。ＵＰＲによる細胞運命の調節は、ＥＲストレス関連障害の病因において重要な役割を果たす。当技術分野で公知のように、細胞が、ＵＰＲにより緩和できるＥＲストレスに遭遇する場合には、細胞は生き残る。しかし、解明できないＥＲストレス状態の間、ＵＰＲはＥＲストレスを減少させホメオスタシスを回復することができず、細胞死を促進する。
【００５９】
ＥＲストレスに関連する他の経路は小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）であり、これは、ユビキチン化ならびにその後のタンパク質分解複合体（すなわちプロテアソーム）による分解およびＥＲストレス媒介アポトーシスのために小胞体の誤った折り畳みタンパク質を標的とする、細胞経路である。
【００６０】
したがって、用語「小胞体ストレスマーカ」または「ＥＲストレスマーカ」は、小胞体ストレス応答に関連する任意の分子、例えば、これらに限定されないが、ＥＲストレスを低減しホメオスタシスを回復するように作用する、ＵＰＲと呼ばれるシグナル伝達ネットワークに関連する任意の分子、小胞体関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）に関連する任意の分子、またはＥＲストレス媒介性アポトーシスに関連する任意の分子を指す。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書で定義されるＥＲストレスマーカは、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）とも称されるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ−７８）、イノシトール要求性１（ＩＲＥ１）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、真核生物開始因子２のサブユニットα（ｅＩＦ２α）、ＩＩ型ＥＲ膜貫通型転写因子（ＡＴＦ６）またはＣ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）である。
【００６２】
上に詳述したように、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）ＥＲマーカの発現レベルの上昇が、ペプチドｄＴＣＡｐＦを投与された患者において、これらの患者における腫瘍増殖の阻害と相関して検出された。
【００６３】
したがって様々な実施形態では、方法、本開示による使用およびキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な検出剤は、ＥＲストレスマーカが結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）であるものである。用語結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）およびグルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８は、同義的に使用され、同じＥＲストレスマーカを指す。
【００６４】
７８ｋＤａグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ−７８）または熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）としても知られている、用語「結合免疫グロブリンタンパク質」（ＢｉＰ）は、ヒトにおいてＨＳＰＡ５遺伝子によってコードされ、かつ小胞体（ＥＲ）の内腔に位置する分子シャペロンとして作用するタンパク質を指す。ＢｉＰは、新たに合成されたタンパク質を、それらがＥＲ中に転座されるときに結合し、それらをその後の折り畳みおよびオリゴマー化に適した状態に維持する。ＢｉＰは、転座機構の必須成分でもあり、プロテアソームによる分解に向けられる異常タンパク質のＥＲ膜を通過する輸送において役割を果たす。ＢｉＰは、全ての増殖条件下で豊富なタンパク質であるが、その合成は、ＥＲ中で折り畳まれていないポリペプチドの蓄積をもたらす条件下で顕著に誘導される。本開示の特定の実施形態では、ＢｉＰは、受託ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ１１０２１を有するヒトＢｉＰである。
【００６５】
具体的には、その態様の別の１つでは、本開示は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）患者の少なくとも１つの生体試料中のＢｉＰの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＢｉＰの発現値がＢｉＰの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準におけるＢｉＰの発現値より高い（ａ）で得られたＢｉＰの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【００６６】
他の特定の実施形態では、本開示によるＥＲストレスマーカは、イノシトール要求性１（ＩＲＥ１）である。ＩＲＥ１、タイプＩ  ＥＲ膜貫通キナーゼは、そのＮ末端管腔ドメインによりＥＲストレスを感知する。折り畳まれていないまたは誤って折り畳まれたタンパク質の存在を感知すると、ＩＲＥ１は二量体化し自己リン酸化して活性化する。
【００６７】
他の特定の実施形態では、本開示によるＥＲストレスマーカは、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）である。ＰＥＲＫはＩ型ＥＲ膜貫通キナーゼでもあり、ＥＲストレスによって活性化されると、オリゴマー化し、自己リン酸化し次いで真核生物開始因子２のサブユニットα（ｅＩＦ２α）上のＳｅｒ５１を直接リン酸化する。
【００６８】
したがって、さらなる特定の実施形態では、本開示によるＥＲストレスマーカは、真核生物開始因子２のサブユニットα（ｅＩＦ２α）である。
【００６９】
さらに特定の実施形態では、本開示によるＥＲストレスマーカは、ＩＩ型ＥＲ膜貫通転写因子（ＡＴＦ６）である。ＡＴＦ６は２つのアイソフォーム、ＡＴＦ６αおよびＡＴＦ６βを有する。
【００７０】
他の特定の実施形態では、本開示によるＥＲストレスマーカは、Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）などのＥＲストレス媒介アポトーシスである。
【００７１】
さらなる具体的な実施形態では、本明細書で定義されるＥＲストレスマーカは、リン酸化タンパク質、例えばｐ−ｅＩＦ２α、ｐ−ＩＲＥ１またはｐ−ＰＥＲＫである。
【００７２】
したがって、上記および他の実施形態では、本開示によるＥＲストレスマーカは、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）、真核生物開始因子２のリン酸化サブユニットα（ｐ−ｅＩＦ２ａ）、リン酸化イノシトール要求性１（ｐ−ＩＲＥ）、リン酸化ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ｐ−ＰＥＲＫ）またはＣ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）またはこれらの任意の組み合わせである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本開示による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、その治療が継続されるべきであることを示す。言い換えると、本開示による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤のいくつかの実施形態では、所定の標準における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値は、その治療が継続されるべきであることを示唆する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、患者が癌退行、無増悪生存、無病生存、完全応答、または部分応答のうちの少なくとも１つを経験する場合、その患者は本開示による治療に対する応答者である。
【００７５】
あるいは、患者の少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が、所定の標準における同じＥＲストレスマーカの発現値よりも低い場合、治療は停止されるべきである。
【００７６】
上記のように、本開示の方法は、生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルを決定することに基づく。用語「発現レベル（ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または「発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）」は、同義的に使用され、生体試料中のアミノ酸産物またはタンパク質をコードするポリペプチド（タンパク質）またはポリヌクレオチドの量（数量）の数値表現を一般に指す。「発現」は一般に、細胞中で存在し作用する構造へと遺伝子コード化情報が変換されるプロセスを指し、それをコードするポリペプチド（タンパク質）またはポリヌクレオチドの量の測定を介して評価され得る。
【００７７】
少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルの決定はまた、ポリペプチド（タンパク質）またはそのコードするポリヌクレオチドの断片の発現レベル、または任意の翻訳後修飾タンパク質（例えば、リン酸化タンパク質）またはその断片の発現レベルに基づいて行われ得る。
【００７８】
小胞体ストレスマーカ（例えば、ＢｉＰ）またはポリペプチド断片もしくはその誘導体またはそれらをコードする任意の核酸の発現レベルを決定することは、調査される小胞体ストレスマーカに特異的な検出剤を用いて、当該分野で公知の任意の方法によって行うことができる。例えば、ＥＲストレスマーカの発現レベルを決定することは、ＥＬＩＳＡ、イムノアッセイ、免疫蛍光、免疫組織化学、免疫沈降、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＰＣＲ、免疫ＰＣＲ、または表面プラズモン共鳴を用いて行うことができる。
【００７９】
特に、ＥＲストレスマーカＢｉＰの発現レベルを決定することは、ＥＬＩＳＡベースの方法を用いて、または標識抗体（例えば、ＢｉＰに対する標識抗体）を使用して、以下に記載するように実施できる。ＥＲストレスマーカ（例えば、ＢｉＰ）の発現レベルを決定することは、ＢｉＰタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現レベルを決定することに基づいてもよく、または生体試料中のＢｉＰの任意のポリペプチド断片もしくは誘導体の発現レベルを決定することによってもよい。
【００８０】
ある特定の具体的な実施形態では、本発明の方法による発現レベルを決定して発現値を得るステップは、追加および任意の正規化のステップをさらに含む。この実施形態によれば、本明細書に定義される少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルの決定に加えて、少なくとも１つの好適な対照参照遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルが同試料中で決定される。このような実施形態によれば、ステップ（ａ）で得られる本発明の少なくとも１つのストレスマーカの発現レベルが、試験試料中の追加の任意のステップで得られる少なくとも１つの参照対照遺伝子の発現レベルに従って正規化され、これにより正規化された発現値を得る。任意により、同様の正規化は、適用可能な場合に少なくとも１つの対照試料または代表的な標準（すなわち、本明細書で定義される所定の標準）においても実施される。
【００８１】
したがって、用語「発現値」は、実験的に得られる、または本明細書で詳述される少なくとも１つの正規化ステップによって、「発現のレベル（ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」または「発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）」を正規化することによって得られる「発現のレベル」または「発現レベル」を入力値として使用する計算の結果を指し、本明細書で「発現値」と呼ばれる計算値が得られる。
【００８２】
より具体的には、本明細書中で使用される場合、「正規化値」または「発現値」は、ＥＲストレスマーカの未加工の発現値を、同じ試料からの対照参照遺伝子、例えば安定発現ハウスキーピング対照遺伝子の発現値で割った商である。ＥＲストレスマーカの未加工の発現レベルを対照参照遺伝子の未加工の発現レベルでの除算は、技術的な失敗または不正確さが本質的になくマーカ遺伝子の正規化された発現値を構成する、商または尺度を与える。この正規化された発現値は次いで、正規化されたカットオフ値、すなわち正規化された発現値から計算されるカットオフ値と比較され得る。ある実施形態では、対照参照遺伝子は、マイクロアレイ分析において分析されるすべての試料において安定性を維持する遺伝子であり得る。
【００８３】
特定の実施形態では、本明細書に定義される方法およびキットは、少なくとも１つのＥＲストレスマーカに特異的な少なくとも１つの検出剤を少なくとも１つの生体試料とまたはそれから得られる任意の核酸またはタンパク質産物と接触させることを含む。
【００８４】
以下に示すように、ＥＲストレスマーカＢｉＰの決定は、ＢｉＰに対する抗体の使用に基づいた。従って本開示による使用およびキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤のいくつかの実施形態では、（少なくとも１つの）ＥＲストレスマーカに特異的な検出剤は抗体または検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体であり、この抗体はＥＲストレスマーカを特異的に認識し結合する。
【００８５】
本明細書において定義される「ＥＲストレスマーカに特異的な検出剤」という用語は、試料中の関連ＥＲストレスマーカの発現レベルを定量するために使用され得るＥＲストレスマーカに特異的な任意の剤（例えば、これらに限定されないが、関連するＥＲストレスマーカをコードするｍＲＮＡを検出するために特異的な核酸剤または関連するＥＲストレスマーカもしくはその断片を結合し認識する特異的抗体）を意味する。
【００８６】
さらに、本キットによりまたは本発明の方法のいずれかのステップにおいて使用されるＥＲストレスマーカに特異的な検出剤または試薬のいずれかは天然に存在しない生成物または化合物であることが理解されなければならない。そのようなものとして、本発明の検出分子はいずれも、天然に存在する化合物または生成物を対象としない。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＥＲストレスマーカはＢｉＰであり、用語「ＢｉＰに特異的な検出剤」は、試料中のＢｉＰ発現のレベルを定量するために使用され得るＢｉＰに特異的な任意の剤（例えば、ＢｉＰをコードするｍＲＮＡの検出に特異的な核酸剤またはＢｉＰもしくはその断片を結合し認識する特異的抗体）を意味する。
【００８８】
用語「抗体」は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、これらに限定されないが、一本鎖抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはその活性断片もしくはこれらの相同体を含む。上記および他の実施形態では、本明細書に定義される抗体は、天然に存在しない抗体である。検出可能な部分にコンジュゲートされた抗体は、蛍光、化学発光などによって検出可能なタグ（本明細書では「標識抗体」とも呼ばれる）を有するように、検出可能な部分にコンジュゲートされる任意の抗体を指す。
【００８９】
用語「接触させること」は、一緒にする、置く、インキュベートするまたは混合することを意味する。このように、２つの物が例えば、それらを互いに触れ合わせるまたはそれらを組み合わせることによって、一緒にされるまたは一緒に置かれるとき、第１の物は第２の物と接触される。本発明の文脈において、用語「接触させること」は、ＥＲストレスマーカの検出分子の少なくとも１つ（および任意により１つの好適な対照参照遺伝子）と試験される試料（複数可）の核酸またはアミノ酸分子との間の相互作用を可能にするすべての手段またはステップを含む。
【００９０】
このようにその態様の別の１つにより、本開示は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測する方法において使用するためのＥＲストレスマーカに特異的な検出剤を提供する。この方法は、
（ａ）患者の少なくとも１つの生体試料中で検出剤によりＥＲストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＥＲストレスマーカの発現値がＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準におけるＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られたＥＲストレスマーカの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【００９１】
本発明の方法は、治療中の様々な時点で、すなわち患者の「時間的に離された」生体試料において、本明細書で定義される治療に対する患者の応答を反復測定すること、それにより患者の継続的な応答をモニターすることにさらに関する。時間的に離された生体試料の各々の１つについて本明細書で定義される方法のステップ（ａ）で得られる少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が、治療に沿った対応する時点（複数可）における対応する集団（応答者）について得られる所定の標準における同じ少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値よりも高い場合、治療は継続されてよい。
【００９２】
例えば、ＥＲストレスマーカレベル、例えばＢｉＰレベルの差は、同一の患者から得られた２つの生体試料間のＥＲストレスマーカの発現レベルを比較することによって計算できる。第１の生体試料は、治療前または治療の第１日目（初回投与前）に患者から得られた対照生体試料であるか、または第１の生体試料は、治療前と同じ状態および臨床状況を有する患者から得られた、関連ＥＲストレスマーカの所定の標準発現レベルである。第２の生体試料は、治療の開始後に得られた患者の生体試料である。上記の手順を繰り返してもよい。
【００９３】
例えば、以下に例示するように、第２の生体試料は、治療開始後約４週間（例えば２９日目）に得られてよく、第１の生体試料（対照生体試料）は、治療前または治療第１日目の初回投与前に得られる。具体的には、ＥＲストレスマーカがＢｉＰである場合、ＢｉＰ発現レベルの差は、以下のとおり測定される：［（２９日目でのＢｉＰレベル）−（１日目でのＢｉＰレベル）］＊１００／（１日目でのＢｉＰレベル）
【００９４】
したがって特定の実施形態では、本明細書に定義される方法のステップ（ａ）における少なくとも１つの生体試料は、治療の開始後約４週間で得られる。
【００９５】
種々の実施形態では、本開示による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、ステップ（ａ）における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルが、少なくとも２つの時間的に離された患者の生体試料において決定されるものである。
【００９６】
本明細書において定義される生体試料の文脈における「時間的に離された」という用語は、異なる時点で、例えばこれらに限定されないが、治療前および治療２９日目に得られる生体試料を指す。
【００９７】
他の実施形態では、本開示による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、少なくとも２つの生体試料の１つが治療の開始前に得られるものであり、ここで「治療の開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療開始（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）」は、本明細書に定義される単離されたペプチドの最初の用量の投与を意味すると解釈されるべきである。用語「治療の開始前」は、単離されたペプチドの最初の投与前を意味する。いくつかの実施形態では、用語「治療の開始前」は、最初の投与が行われる前の治療の第１日目を指す。
【００９８】
他の具体的な実施形態では、本開示による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、少なくとも２つの時間的に離された生体試料が、１週間、２週間、３週間または４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月または４ヶ月離れている。さらなる実施形態では、本開示による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、少なくとも２つの時間的に離された生体試料が４ヶ月を超えて離れているものである。
【００９９】
用語「生体試料」は、本明細書においてその最も広い意味で使用され、哺乳動物対象から得られる試料を指す。生体試料は、哺乳類（ヒトを含む）から得られてよく、流体、固体および組織を包含する。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、組織試料、生検試料または細胞溶解物である。
【０１００】
上に詳述したように、生体試料は、本明細書中で定義される治療の開始後、または治療の開始前に（開始に先立って）得られる。生体試料は、当業者に公知の任意の方法によって得られてよい。
【０１０１】
以下の実施例に記載するように、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対するｄＴＣＡｐＦの効果も調べた。図１２に示すように、受容体ＣＤ３３５およびＣＤ３３７の発現の増加は、ｄＴＣＡｐＦによって誘導された。ナチュラルキラー細胞は、ウイルス感染細胞に対する迅速な応答をもたらし、腫瘍形成に応答する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ｄＴＣＡｐＦによる受容体ＣＤ３３５およびＣＤ３３７の活性化は、これらの細胞におけるＥＲストレスの増加に関連する。したがって、いくつかの実施形態では、ＥＲストレスの測定が患者の細胞、例えばＮＫ細胞において行われる。
【０１０２】
さらに、生体試料に関して用語「少なくとも１つの」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれを超える生体試料を指す。変更すべきところは変更して、ＥＲストレスマーカの文脈における「少なくとも１つの」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれを超えるＥＲストレスマーカを指す。
【０１０３】
以下の実施例１に示す結果によれば、ＢｉＰのレベルの明らかな差は、１１ヶ月の治療後に同じ患者から得られた生検材料（図２Ｂ）において観察されたＢｉＰのレベルと比較して、治療開始前の脊髄新生物患者から得られた生検材料（図２Ａ）で観察された。上記の結果は、ｄＴＣＡｐＦペプチドが、脊髄新生物癌患者から得られた腫瘍においてＥＲストレスを増加させたことを実証する。
【０１０４】
さらに、以下の実施例２に示される結果は、ＢｉＰのレベルの増加が、本明細書に特定された条件下でペプチドｄＴＣＡｐＦにより治療された異なる癌型を有する患者における腫瘍増殖の完全な阻害と相関したことを実証する。
【０１０５】
本開示を記載するために本明細書中で使用される場合、「癌」または「腫瘍」は、同等に、組織または器官の過形成に関連する。組織がリンパ系または免疫系の一部である場合、悪性細胞は、循環細胞の非固形腫瘍を含み得る。他の組織または器官の悪性腫瘍は、固形腫瘍を生じ得る。一般に、本開示の方法および組成物は、非固形および固形腫瘍の治療で使用され得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本開示の癌は、膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌および女性生殖系悪性腫瘍からなる群から選択される。
【０１０７】
本開示のさらなる実施形態では、癌は、神経起源の紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、直腸癌、膵癌および脊髄新生物からなる群から選択される。
【０１０８】
下記の臨床研究では、患者の腫瘍細胞においてｄＴＣＡｐＦの抗腫瘍活性とＴ１／ＳＴ２の発現状況との間に相関が見られた。直接的な相関がＴ１／ＳＴ２陽性、腫瘍サイズの変化およびＥＲストレスの誘導の間で認められた。これらの所見は、ＳＴ２遺伝子ノックアウトＯＶ−９０細胞とｄＴＣＡｐＦのインキュベーションがＥＲストレスをもたらさないことを示す、以下の実施例４に記載される前臨床試験と一致する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの観察は、Ｔ１／ＳＴ２受容体が、ｄＴＣＡｐＦに陽性に応答する可能性が高いＴ１／ＳＴ２陽性患者を選択するためのバイオマーカであり得ることを示唆する。
【０１０９】
従って、さらなる実施形態では、本開示の方法は、ｄＴＣＡｐＦ治療下で患者から得られた生体試料（複数可）中の細胞のＳＴ２受容体の状態を決定することをさらに含む。以下に詳述するように、可溶性Ｔ１／ＳＴ２受容体および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）Ｔ１／ＳＴ２受容体発現のレベルでのベースラインからの変化もまた、ｄＴＣＡｐＦを用いる治療を受けている患者から得られる前治療および／または治療中の腫瘍組織試料においてモニターされる。
【０１１０】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、癌細胞でのＳＴ２受容体の発現はｄＴＣＡｐＦの細胞への進入を促進する。したがって、本明細書中で定義される使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤のいくつかの実施形態では、患者の癌細胞は、ＳＴ２陽性細胞である。
【０１１１】
本明細書において定義される用語「ＳＴ２受容体」またはＴ１／ＳＴ２受容体（「Ｔ１／ＳＴ２」および「ＳＴ２／Ｔ１」とも呼ばれる）は、３つの細胞外免疫グロブリンドメインおよび細胞内ＴＩＲドメインを有するＩＬ−１Ｒスーパーファミリーのメンバーを指す。Ｔ１／ＳＴ２は、心臓血管疾患に関与すると示されている。本明細書中で定義される用語「ＳＴ２陽性細胞」は、細胞上のＳＴ２受容体の存在が、例えば以下に記載の方法に限定されるものではないが当該分野で公知の任意の方法によって同定される、細胞を指す。
【０１１２】
さらなる実施形態では、本開示による使用のためのＥＲストレスマーカに特異的な方法または検出剤は、本方法が、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を患者に投与することをさらに含む。
【０１１３】
さらなる態様により、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を患者に投与するステップと、
（ｂ）患者の少なくとも１つの生体試料中の少なくとも１つの小胞体（ＥＲ）ストレスマーカの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値が少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準における少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値より高い（ａ）で得られた少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【０１１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩は、当業者に公知の任意の投与経路、例えば静脈内（ｉｖ）で投与され得る。
【０１１５】
本明細書で定義される単離されたペプチドは、所望の治療結果を達成するのに必要な「有効量」で投与され得る。「有効量」は、治療目的、投与経路および患者の一般的状態（年齢、性別、体重および主治医が知っている他の考慮事項）に関連する疾患の重篤度によって決定される。
【０１１６】
以下に詳述するように、進行中の臨床試験が、決定された癌型、用量、投与回数、治療期間、投与および他のパラメータに従って本発明者らにより行われる。以下に詳述するように、投薬レジメンは、６、１２、２４、４８または９６ｍｇ／ｍ２であった（例えば、図１に示すとおり）。
【０１１７】
さまざまな実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩は、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２または約１０ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１１８】
特定の実施形態では、本明細書で定義される使用のためのＥＲストレスマーカに特異的な方法または検出剤は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩が約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１１９】
さらに特定の実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチド、または単離されたペプチドの薬学的に許容される塩は約６、１２、２４、４８または９６ｍｇ／ｍ２ｄＴＣＡｐＦの用量で投与される。
【０１２０】
さらに特定の実施形態では、本明細書で定義される使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩が１週間に１回、２回または３回の頻度で投与される。
【０１２１】
なおさらなる特定の実施形態では、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩は、３回／週の頻度で投与される。
【０１２２】
以下に例示するように、局所進行性または転移性固形腫瘍におけるｄＴＣＡｐＦを用いる治療（６、１２、２４、４８および９６ｍｇ／ｍ２にて、３回／週、連続２８日間のサイクル）は、安全で十分に耐性があり、用量依存直線ＰＫを有した。ｄＴＣＡｐＦは抗原因子を抑制し、抗癌サイトカインの産生を誘導し、かつＥＲストレスを引き起こし、これがおそらく患者の一部で観察された臨床転帰をもたらした。陽性Ｔ１／ＳＴ２染色は、ｄＴＣＡｐＦに対する応答の予測マーカとして働く可能性がある。
【０１２３】
したがって、本発明は、それを必要とする患者における癌の治療方法であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、単離されたペプチドの治療有効量は、約６、１２、２４、４８、または９６ｍｇ／ｍ２である。さらなる実施形態では、単離されたペプチドは、少なくとも約４週間の連続する期間の間、週に３回投与される。さらに特定の実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる本明細書でｄＴＣＡｐＦと呼ばれるペプチドである。
【０１２４】
他の特定の実施形態では、単離されたペプチドの治療有効量は、約２４、４８、または９６ｍｇ／ｍ２またはそれを超える。さらに特定の実施形態では、治療有効量は、少なくとも約４週間の期間、約２４ｍｇ／ｍ２（またはそれより多い）であり、患者は、約４８、９６ｍｇ／ｍ２以上の治療有効量で単離されたペプチドをさらに投与される。
【０１２５】
本明細書で使用される「治療（処理）する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（処理）している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（処理）（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、癌を有する患者における疾患活性の１つ以上の臨床的パラメータ、症状または徴候を改善する、緩和するまたは排除することを意味する。当技術分野で公知であり、上で詳述したような癌に関連する臨床パラメータは、例えば腫瘍サイズ、腫瘍増殖、腫瘍の数、疾患マーカ、腫瘍細胞転移などである。「患者」は、本明細書で定義される単離されたペプチド、または本発明のいずれかの医薬組成物の投与が望ましい任意の哺乳類を意味し、すなわち本明細書に定義される癌に罹患した患者、特にヒト患者を意味する。
【０１２６】
本明細書で定義される治療のモニターは、例えばＲＥＣＩＳＴガイドライン（１７）に従って、治療に対する癌患者の応答をモニターするための当技術分野で公知の任意の手段によって実施できる。
【０１２７】
以下に詳述するように、本開示は、とりわけ、Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（配列番号１）の全Ｄアミノ酸配列を有するペプチドｄＴＣＡｐＦで行われる進行中の臨床試験と関連する結果に関する。
【０１２８】
本明細書中で定義される用語「単離されたペプチド」は、本明細書において「ｄＴＣＡｐＦ」または「Ｎｅｒｏｆｅ」と称される配列番号１で示されるアミノ酸配列（すなわち、すべてＤコンフォメーションでのアミノ酸配列Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ）および配列番号１で示されるアミノ酸配列の機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を包含する。
【０１２９】
本明細書に定義される単離されたペプチドのいずれかの薬学的に許容される塩は、本開示に包含され、特にペプチドの酢酸塩である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、単離されたペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなり、Ｔｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓの全Ｄアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本開示による単離されたペプチドは、配列番号１によって示されるアミノ酸配列の薬学的に許容される塩、例えばその酢酸塩である。
【０１３１】
言い換えれば、種々の実施形態では、本発明による使用またはキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤は、治療が配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる単離ペプチドによるまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩によるものである。
【０１３２】
他の特定の実施形態では、本開示は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドを用いるまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための方法を提供する。この方法は、
（ａ）患者の少なくとも１つの生体試料中のＢｉＰの発現レベルを決定して発現値を得るステップであって、生体試料の少なくとも１つが治療開始後に得られる、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られたＢｉＰの発現値がＢｉＰの所定の標準発現値よりも高いか低いかを決定するステップと
を含み、
所定の標準におけるＢｉＰの発現値より高い（ａ）で得られたＢｉＰの発現値は患者が治療に対して応答者であることを示す。
【０１３３】
言い換えれば、本開示は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドを用いるまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測するための、使用、組成物およびキットのためのＥＲストレスマーカに特異的な方法、検出剤を提供する。
【０１３４】
本明細書において定義される用語「ペプチド」は、アミノ酸残基の分子鎖を指し、これらは、必要に応じて、そのアミノ酸残基の各々の１つにおいて、例えばマンノシル化、グリコシル化、アミド化（例えば、Ｃ末端アミド）、カルボキシル化またはリン酸化により修飾され得る。ペプチドは、遺伝子工学的方法、宿主細胞での発現を介して、または任意の他の適切な手段を介して、合成的に得ることができる。ペプチドを産生するための方法は、当技術分野において周知である。
【０１３５】
用語「単離された」は、天然環境から取り出され、単離または分離されたアミノ酸配列またはペプチドなどの分子を指す。
【０１３６】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸」は、天然のアミノ酸残基および合成アミノ酸残基、ならびに天然のアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に発生するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ−ホスホセリン）である。
【０１３７】
アミノ酸という用語は、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を含み、Ｄ−アミノ酸はＬ−アミノ酸の鏡像であり、炭素アルファにおけるキラリティが反転されている。Ｄ−アミノ酸は、プロテアーゼ媒介分解に対して高度に耐性であり、低い免疫原性応答を有する。
【０１３８】
用語「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」は、ペプチド結合によって連結されるアミノ酸残基がペプチドおよびタンパク質の鎖中に並ぶ順序にも関係する。この配列は一般に、遊離アミノ基を含むＮ末端から遊離カルボキシル基を含むＣ末端へと報告される。
【０１３９】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本開示による単離されたペプチドは配列番号１によって示されるペプチドを含むが、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または両方の末端に追加のアミノ酸残基も含み得ることを意味する。
【０１４０】
上に示したように、本開示はまた、配列番号１によって示されるアミノ酸配列を有するペプチドの誘導体を含む単離されたペプチドも包含する。
【０１４１】
「誘導体」または「誘導体（複数可）」という用語は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むが、それらの全体的な配列において１つ以上のアミノ酸が異なる、すなわち配列番号１の全配列内の欠失、置換（例えば、少なくとも１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換）、逆位または付加を有するペプチドを含むことを意味する。この用語はまた、その全体的な配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基の、そのそれぞれのＬアミノ酸残基による置換を包含する。
【０１４２】
特定の実施形態では、本開示は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列の機能的誘導体に関する。この機能的誘導体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは９５％、特に９９％の同一性を有する。
【０１４３】
アミノ酸の「置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換すること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。アミノ酸置換は、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、以下の８つのグループの各々は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【０１４４】
これらのペプチド誘導体は元のペプチドの生物学的活性を変えてはならないことが理解される。用語「機能的」は、修飾されたペプチド（すなわち誘導体）が修飾されていないペプチドのものと質的に類似している生物学的活性を保持することを示すことを意味する。誘導体の生物学的活性は、本明細書に記載されるように、すなわち当技術分野で公知のように、動物モデルへの投与時の誘導体の効果をモニターすることによって測定できる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書で定義される単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、医薬組成物中に含まれる。
【０１４６】
本明細書において定義される用語「医薬組成物」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチド、または単離されたペプチドの薬学的に許容される塩および任意により当技術分野で公知の少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体を含むペプチドを指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤などを含む。医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。
【０１４７】
本開示によるそれを必要とする対象を治療するために使用される医薬組成物は任意によりまた、緩衝剤、その浸透圧を調整する剤、および任意により、当技術分野で公知の１つ以上の薬学的に許容される添加剤も含む。
【０１４８】
本発明によるそれを必要とする対象を治療するために使用される医薬組成物は、単位剤形で簡便に提示でき、例えば以下の実施例に詳述されるような、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製できる。
【０１４９】
本開示による組成物はまた、本明細書中で特に言及される成分に加えて、問題の製剤のタイプに関して当該分野で慣用である他の薬剤も含み得ることが理解されるべきである。
【０１５０】
さらにまた、本開示は、
（ａ）生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を決定することに特異的な少なくとも１つの検出剤、および任意で
（ｂ）治療の開始前および配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩の投与時に癌患者について決定される少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値、
（ｃ）少なくとも１つの対照試料、
の少なくとも１つを含むキットを提供する。
【０１５１】
少なくとも１つのＥＲストレスマーカの「発現値を決定するための特異的な検出剤」という用語は、本明細書で定義されるＥＲストレスマーカに特異的な任意の検出剤、および任意により、上記で定義した少なくとも１つの好適な対照参照遺伝子の発現レベルを決定するために特異的な追加の検出剤を意味する。
【０１５２】
対照試料は、生体試料またはそれらに由来する任意のポリペプチド／核酸を含み得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、本開示によるキットは、生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現レベルを決定するための少なくとも１つの試薬をさらに含む。そのような目的のために当該分野で公知の任意の試薬、これらに限定されないが、例えば二次抗体色素および蛍光剤が包含される。
【０１５４】
さらなる実施形態では、本開示によるキットは、
（ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチド、または単離されたペプチドの薬学的に許容される塩
をさらに含む。
【０１５５】
他の実施形態では、本開示によるキットは、使用説明書をさらに含む。このような指示書は、生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値の決定を行うための指示；および生体試料中の少なくとも１つのＥＲストレスマーカの発現値を少なくとも１つのＥＲストレスマーカの所定の標準発現値と比較するための指示：の少なくとも１つを含んでよい。
【０１５６】
さらなる実施形態では、本開示によるキットは、少なくとも１つのＥＲストレスマーカがＢｉＰであるものである。
【０１５７】
他の実施形態では、本開示のキットは、配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を用いる治療に対する癌患者の応答を予測することにおける使用のためである。
【０１５８】
以下に例示されるように、細胞上のより豊富なＳＴ２受容体は、ｄＴＣＡｐＦペプチドの細胞への進入を促進した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これは、治療される患者の癌細胞におけるＥＲストレスの増加を可能にし、かつ単離されたペプチドまたはそれと共に投与される任意の追加の剤の投与量を低下させることができる。
【０１５９】
ほとんどの抗癌剤は、安全性および有効性の理由から、かなり狭い用量範囲を有する強力な医薬品である。剤の少なすぎる摂取は癌をうまく治療できず、過剰に摂取すると生命を脅かす副作用を引き起こす可能性がある。化学療法はそれに伴う副作用が知られている。一般的な副作用は、とりわけ、疲労、痛み、口および喉の痛み、下痢、悪心ならびに嘔吐である。投与される化学療法剤の用量を制限するまたは減少させる方法がしたがって望ましい。
【０１６０】
以下に示すように、癌細胞に対するｄＴＣＡｐＦペプチドの有益な治療効果およびＥＲストレスとのその独特な関連性を理解することは、本発明のさらなる態様の基礎としての役割を果たし、それによりｄＴＣＡｐＦが別の抗癌治療剤と組み合わされる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＥＲストレスに及ぼすｄＴＣＡｐＦの効果の結果として、ｄＴＣＡｐＦは、追加の抗癌剤の投与量を有意に減少させることができ、それにより関連する副作用を間接的に減少させ、一方で薬物の抗腫瘍効果を維持する。
【０１６１】
ｄＴＣＡｐＦを追加の抗癌治療剤、例えばタキソールと組み合わせて投与した研究を以下に記載する。驚くべきことに、剤、すなわちｄＴＣＡｐＦおよびタキソール、の各々の１つは、細胞生存率に対しわずかな効果のみ有したが、ｄＴＣＡｐＦをタキソールと組み合わせることで、相乗効果がもたらされ、細胞生存率が大幅に低下した。従って、ｄＴＣＡｐＦと抗癌剤との組合せは、癌治療中の抗癌剤の治療投与用量の基準を低減できる。
【０１６２】
したがって、その態様のさらに別の１つでは、本開示は、癌を治療する方法での使用のための抗癌剤および配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩を含む併用療法を提供し、抗癌剤は、抗癌剤の治療用量の基準より少ない用量で投与される。
【０１６３】
本明細書で使用される用語「併用療法」は、２種以上の剤、すなわち配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドと抗癌剤との附随（同時）または連続投与を指す。例えば、同時投与は、２つ以上の剤を含有する１つの剤形または２つ以上の剤の混合物の投与を意味してよく、連続投与は、異なる時点で、さらには異なる投与経路により得る、患者に投与される別個の剤形を意味する。
【０１６４】
したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本発明の単離されたペプチドおよび抗癌剤は、同時に、または連続して投与される。
【０１６５】
したがって、本明細書で使用される用語「抗癌剤の標準的治療量」は、投与される抗癌剤（複数可）、患者の年齢、性別、体重および患者の疾患ならびに全身健康状態に関連する臨床パラメータなどの考慮事項に基づき、癌患者における特定の癌の型の治療について熟練した医師により推奨される用量を指す。いくつかの抗癌剤は患者の体重（キログラム）によって決定されるが、いくつかの抗癌剤用量は、医師が身長および体重を用いて計算する体表面積（ＢＳＡ）に基づいて決定される。ＢＳＡは、平方メートル（ｍ２）で表される。ＢＳＡを考慮した後であっても、小児および成人の投与量は異なる。
【０１６６】
以下に示すように、ペプチドｄＴＣＡｐＦをタキソールと組み合わせることは、相乗効果および細胞生存率の実質的な低下をもたらした。したがって、ｄＴＣＡｐＦペプチドと抗癌剤との併用療法は、癌治療中の抗癌剤の治療投与用量の基準を低下させることができる。
【０１６７】
本開示のいくつかの実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、抗癌剤の投与量が抗癌剤の治療用量の基準より少なくとも約１％〜５０％、約５％〜４５％、約１０％〜４０％、約１５％〜３５％または約２０％〜３０％少ない。
【０１６８】
「抗癌薬」または「抗腫瘍薬」としても公知の用語「抗癌剤」は、その広い意味で使用され、悪性または癌性疾患の治療において有効な任意の薬物または剤を包含する。抗癌薬のいくつかのクラス、とりわけ、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、５ＦＵ）、天然産物、免疫療法剤、ホルモンおよび阻害剤がある。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本開示による抗癌剤は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫療法剤（例えば、阻害性免疫受容体をダウンレギュレートする抗体、抗体断片またはモノクローナル抗体）、ホルモン剤、生物学的剤、分化因子、抗血管形成因子、抗オートファジ剤または免疫刺激剤である。
【０１７０】
当技術分野で公知の「化学療法剤」は、新しい細胞を形成するプロセスの異なる段階で細胞を標的とする薬物である。化学療法剤の例としては、これらに限定されないが、いくつかの例を挙げれば、アルキル化剤、代謝拮抗物質（例えば５−ＦＵ）、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤（例えばパクリタキセルまたはタキソール）またはコルチコステロイドである。
【０１７１】
当技術分野で公知の用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、チロシンキナーゼを阻害する薬物を指す。チロシンキナーゼは、シグナル伝達カスケードによる多くのタンパク質の活性化を担う酵素である。タンパク質は、タンパク質にリン酸基を付加することによって活性化され（リン酸化）、リン酸化はチロシンキナーゼ阻害剤が阻害するステップである。
【０１７２】
本開示の文脈における用語「免疫療法剤」または「免疫刺激剤」は癌免疫療法を指し、これは免疫系を刺激して腫瘍を破壊しようと試みる。
【０１７３】
当技術分野で公知の癌治療の文脈における用語「生物学的剤」（「免疫療法」と呼ばれることもある）は、生物、生物由来の物質、またはそのような物質の実験室で製造されたものを使用して疾患を治療することを伴う。癌のためのいくつかの生物学的療法は、身体の免疫系を刺激して癌細胞に対して作用するワクチンまたは細菌を使用する。腫瘍の増殖および進行に関与する特定の分子を妨害する生物学的療法は、標的療法とも呼ばれる。
【０１７４】
当該技術分野で公知の用語「抗血管新生因子」は、血管新生、すなわち新しい血管の生成プロセス、を妨害する物質を指す。抗血管新生剤は、薬物または他の物質を用いて、腫瘍が、それらが増殖し続けるために必要とする新しい血管を作るのを止める標的療法のタイプである。
【０１７５】
当技術分野で公知の用語「抗オートファジ剤」は、プロセスオートファジ、すなわち不要なまたは機能不全の成分を分解する細胞の調節された破壊的メカニズム、を妨害する薬物を指す（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン）。
【０１７６】
さらなる実施形態では、本開示による抗癌剤は、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫療法剤、ホルモン剤、生物学的剤、分化因子、抗血管新生因子、抗オートファジ剤または免疫刺激剤である。
【０１７７】
特定の実施形態では、抗癌剤はタキソールである。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、癌を治療する方法における使用のための、抗癌剤と配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体からなる単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩とを含む併用療法を提供し、この方法では、抗癌剤は、抗癌剤の治療用量の基準より少ない用量で投与される。
【０１７９】
さらに特定の実施形態では、本開示は、癌を治療する方法における使用のための、タキソールと配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体からなる単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩とを含む併用療法を提供し、この方法では、タキソールはこの抗癌剤の治療用量の標準より少ない用量で投与される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１８１】
さらなる実施形態では、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、１週間に１回、２回または３回の頻度で投与される。特定の実施形態では、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、週に３回の頻度で投与される。
【０１８２】
さらなる実施形態では、単離されたペプチド、抗癌剤、またはその薬学的に許容される塩は、一緒にまたは別々に、医薬組成物中に含まれる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、癌が膵癌、卵巣癌、神経起源の紡錘形細胞新生物、紡錘形細胞新生物、転移性結腸直腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、結腸腺癌、直腸癌、直腸腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、脊髄新生物、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸癌、胃癌、小腸癌、肝癌、肝臓癌または女性生殖系悪性腫瘍である。
【０１８４】
他の実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、癌が卵巣癌または膵癌であるものである。さらなる実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、癌が乳癌であり、好ましくは乳癌がトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。
【０１８５】
さらなる実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、癌がＳＴ２陽性癌細胞を含む。
【０１８６】
さらに別の実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、単離されたペプチドが配列番号１で示されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩からなるものである。
【０１８７】
さらなる実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩が約５ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１８８】
さらなる実施形態では、本開示による使用のための併用療法は、単離されたペプチドまたはその薬学的に許容される塩が１週間に１回、２回または３回の頻度で投与されるものである。
【０１８９】
本開示は、
（ａ）抗癌剤、および
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩
を含む治療用キットをさらに提供する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に定義される治療用キットは、使用指示書をさらに含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の治療用キットは、癌を治療する方法での使用のためであり、ここで抗癌剤は、その抗癌剤の治療用量の基準より少ない用量で投与される。
【０１９２】
本開示は、それを必要とする患者における癌の治療の方法であって、抗癌剤と組み合わせて配列番号１で示されるアミノ酸配列もしくはその機能的誘導体を含む単離されたペプチドまたは単離されたペプチドの薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む方法をさらに提供し、ここで単離されたペプチドは抗癌剤の治療投与量の基準を下げる。
【０１９３】
本明細書で使用される用語「約」は、言及される値よりも最大で、１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、および場合によっては最大２０％高いまたは低い偏差し得る値を示し、偏差範囲は整数値を含み、該当する場合は非整数値も含み、連続範囲を構成する。
【０１９４】
本発明は、開示され記載されているが、このような方法ステップおよび組成物などが幾分変化し得るので、本明細書に開示された特定の例、方法ステップ、および組成物に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ使用され、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその同等物によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【０１９５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびこれらの活用形は、「含むがこれらに限定されない」を意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語を包含する。「から本質的になる」という句は、追加の成分および／またはステップが、特許請求された組成物または方法の基本的なかつ新規な特徴を実質的に変更しない場合にのみ、組成物または方法が追加の成分および／またはステップを含み得ることを意味する。本明細書および以下の実施例および特許請求の範囲全体を通じて、文脈上他の意味を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外するものではないことを示すと理解される。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、用語「方法」は、これらに限定されないが、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的および医学的技術の実践者により知られる、または既知の様式、手段、技法および手順から容易に開発される様式、手段、技法および手順を含む、所定のタスクを達成するための様式、手段、技法および手順を指す。
【０１９７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【０１９８】
本明細書および以下の実施例および特許請求の範囲全体を通じて、文脈上他の意味を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外するものではないことを示すと理解される。
【０１９９】
以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らが使用した技術の代表例である。これらの技術は、本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であることが認識されるが、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の趣旨および意図する範囲から逸脱することなく多くの変更を行うことができることを認識するであろう。
【０２００】
実施例
さらなる詳述なく、当業者は、上記の説明を用いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の好ましい具体的な実施形態は、単なる例示として解釈されるものであり、決して特許請求された発明を限定するものではない。
【０２０１】
当該分野で公知であり、本明細書に具体的に記載されない標準的な分子生物学プロトコールは、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１年のように行われる。
【０２０２】
実験手順
生検
生検材料は、当業者に周知の手順により、熟練した医師によって患者から得られた。
【０２０３】
生検材料により得られた組織のＢｉＰ染色
溶液および試薬
−キシレン（Ｓｉｇｍａ＃５３４０５６）、
−エタノール、無水変性、組織学的等級（１００％Ｓｏｌｕｆｉｘ＃Ｅ００３および９５％Ｓｉｇｍａ＃３２２９４）、
−脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）
−ヘマトキシリンＧｉｌｌ２（Ｓｉｇｍａ＃ＧＨＳ２１６）、
−洗浄緩衝液：１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（１×ＴＢＳＴ）、１Ｌを調製する場合は、５０ｍｌの２０Ｘ  ＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ＃Ｊ６４０）を９５０ｍｌのｄＨ２Ｏに加え、１ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ＃Ｊ６４０）を添加し、緩衝液を混合した。
−抗体希釈剤：ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）抗体希釈液＃８１１２、
−抗原アンマスキング：
クエン酸塩：１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液：１Ｌを調製する場合は２．９４ｇのクエン酸ナトリウム三ナトリウム塩二水和物（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７・２Ｈ２Ｏ）を１ＬのｄＨ２Ｏに添加した。ｐＨを６．０に調整した。
−ＴＥ：１０ｍＭトリス／１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０：１Ｌを調製する場合は、１．２１ｇのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（Ｃ４Ｈ１１ＮＯ３）および０．３７２ｇのＥＤＴＡを１ＬのｄＨ２Ｏに添加した。
−３％過酸化水素：１００ｍＬの溶液を調製する場合は、１０ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ＃２１６７６３）を９０ｍｌのｄＨ２Ｏに添加した。
−ブロッキング溶液：バックグラウンドバスター（Ｉｎｎｏｖｅｘ＃ＮＢ３０６）；
−一次抗体：免疫組織化学のための抗ＢｉＰ抗体（抗ＢＩＰ  ａｂ２１６８５、ａｂｃａｍ）；
−ビオチン化二次抗体：ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）ブースト免疫組織化学（ＩＨＣ）検出試薬（ＨＲＰ、ウサギ）＃８１１４；
−ＤＡＢ試薬（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ６１９０）；
−Ｅｕｋｉｔｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ（Ｓｉｇｍａ＃０３９８９）；
【０２０４】
脱パラフィン／再水和
この手順の間、いずれのときにもスライドは乾燥させなかった。生検組織の切片を当該分野で公知のように調製し、以下のように脱パラフィン／水和した：切片を各５分間のキシレンの３回洗浄でインキュベートし、各１０分間の１００％エタノールの２回洗浄でさらにインキュベートし、次に各１０分間の９５％エタノールの２回洗浄でインキュベートし、最後に切片を各５分間ｄＨ２Ｏ中で２回洗浄した。
【０２０５】
抗原アンマスキング
クエン酸塩については、スライドを１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で煮沸し、次いで１０分間、沸点未満の温度で維持した。スライドをベンチトップ上で３０分間冷却した。トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）については、スライドを１０ｍＭ  ＴＥ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）中で煮沸し、次いで１８分間、沸点未満の温度で維持した。スライドをベンチ上で３０分間冷却した。
【０２０６】
染色
切片をｄＨ２Ｏで各５分間３回洗浄し、３％過酸化水素中で１０分間インキュベートし、ｄＨ２Ｏで各５分間２回洗浄し、洗浄緩衝液で５分間洗浄した。次に、切片の各々の１つを室温にて３０分間、１００〜４００μｌのブロッキング溶液でブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、抗体希釈液中で１：５００に希釈した１００〜４００μｌの一次抗体（すなわち抗ＢｉＰ）を切片の各々の１つに加えた。処理した切片を４℃で一晩インキュベートした。次に、抗体溶液を除去し、切片を洗浄緩衝液で各５分間３回洗浄した。ビオチン化二次抗体（１００〜４００μｌ）を切片の各々の１つに加え、処理した切片を二次抗体の存在下で室温にて３０分間インキュベートした。次いで、二次抗体溶液を除去し、切片を各５分間、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、試薬３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、１００〜４００μｌ）を切片の各々の１つに加え、染色を注意深くモニターした。切片ができるとすぐに、スライドをｄＨ２Ｏ中に浸漬した。切片を、製造業者の使用説明書に従ってヘマトキシリンで任意に対比染色し、次いで各５分間ｄＨ２Ｏで２回洗浄した。
【０２０７】
切片の脱水
切片を各１０秒間９５％エタノール中で２回インキュベートし、インキュベーションを１００％エタノール中で繰り返し、切片を各１０秒間２回インキュベートした。インキュベーションを次いでキシレン中で繰り返し、切片を各１０秒間２回インキュベートし、次にカバースリップを分析のためにマウントした。
【０２０８】
ｄＴＣＡｐＦペプチドおよびそれを含む組成物の調製
ペプチドｄＴＣＡｐＦまたはＮＥＲＯＦＥ（商標）（両方の用語は、本明細書で同義的に使用され、上記の同じペプチドを指す）は１４アミノ酸残基の長さのペプチドであり、ここでアミノ酸残基のすべてはＴｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（または配列番号１で示される、一文字表記でＷＷＴＦＦＬＰＳＴＬＷＥＲＫ）のアミノ酸配列を有する、Ｄ−立体配置である。
【０２０９】
このペプチドを以下のようにして合成した。臨床試験で使用するための最終医薬品であるｄＴＣＡｐＦアセテートを、Ｎｅｘｔａｒ  Ｌｔｄ．（Ｉｓｒａｅｌ）によるＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＭＰ）の下で製造し、包装し、試験し、ラベル付けおよびリリースした。
【０２１０】
注射用溶液用のｄＴＣＡｐＦ粉末を、バイアル当たり注射用水（ＷＦＩ）で２ｍＬの最終容量に再構成するために、４．８％マンニトールとともに、凍結乾燥した、活性物質の１５ｍｇを含む５ｍＬバイアル（７．５ｍｇ／ｍＬの濃度で）または８０ｍｇを含む１０ｍＬバイアル（４０ｍｇ／ｍＬの濃度で）として供給した。
【０２１１】
注射用溶液として再構成した２ｍＬのｄＴＣＡｐＦ粉末のバイアルをその後、注入のために水性デキストロース５％中で１００または２５０ｍＬの最終容量に希釈しなければならない。ｄＴＣＡｐＦを、第Ｉ相臨床試験での使用のために指定された臨床現場用にＮｅｘｔａｒ  Ｌｔｄから供給した。
【０２１２】
薬物生成物は、注射用水中での単回の再構成用の白色で無菌の、非発熱性の凍結乾燥ケーキである。再構成後、この薬物生成物は透明で無色の溶液の外観を有する。バイアルは、タイプＩ透明注入ガラス５ｍＬまたは１０ｍＬバイアルであり、２０ｍｍのアルミニウムフリップオフキャップを備えた２０ｍｍの凍結乾燥タイプのゴム栓で栓をされる。各１０本のバイアルは、白色のラベル付き外箱中に二次包装される。バイアルおよび二次包装箱の臨床研究ＧＣＰ標準ラベル付けは、Ｎｅｘｔａｒ  Ｌｔｄ．による制御条件下で行われる。
【０２１３】
進行中の臨床試験概要
患者
この試験は、病理学的に確認された局所進行性および／または転移性固形悪性腫瘍を有する、以前の標準療法が奏効しなかったまたは許容できなかった成人患者（１８歳以上）を含んだ。主要試験対象患者基準は、評価可能／測定可能な疾患およびＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）のパフォーマンスステータス（ＰＳ）１以下を含んだ。肝癌／肝転移を有する患者は、肝機能が一定の基準を満たしていれば適格であり、脳転移を有する患者は、放射線療法が登録の４週間以上前に完了しかつ患者が４ｍｇ／日以下のデキサメタゾンを受けた場合、適格であった。主要除外基準は、治験薬の開始１４日前に抗癌治療を受けていること、および１６週未満の平均余命を含んだ。患者の特徴を以下の表１に要約する。
【表１】
2019512669.tif 000002
【０２１４】
研究デザイン
現在の臨床研究は、公式のオープンラベル第Ｉ相用量漸増研究である。第一の目的は、ｄＴＣＡｐＦの最大耐量（ＭＴＤ）および安全性プロファイルを決定することであった。評価は、薬物暴露、有害事象（ＡＥ：有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）に準拠した等級付け、および用量制限毒性（ＤＬＴ）の特徴付けを含んだ。他の目的は、ｄＴＣＡｐＦ投与後の血管新生因子の血清レベル、薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）分析、ならびに受容体染色および腫瘍応答の評価を含んだ。
【０２１５】
用量漸増試験は、伝統的な「３＋３」スキームに従い、連続２８日間のサイクルで３回／週、６、１２、２４、４８、および９６ｍｇ／ｍ２の静脈内（ｉｖ）ｄＴＣＡｐＦの用量を含んだ。患者の割り当ては図１に示される。すべての３名の患者コホートにおいて、第１および第２の患者について第１回投与の間隔は２〜４週間であり、第３の患者では１週間以上であった。新たな用量レベルを、前のレベルでの３名の患者について２８日以上の追跡調査後に開始した。ＭＴＤを、３名の対象のうちの１名以上が最初の治療サイクル中にＤＬＴを経験する最高用量レベルとして定義した。ＡＥとは関係のない理由で最初の治療サイクルを完了しなかった患者を、交代させた。さらに、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、および血漿半減期（ｔ１／２）を含む、ＰＫパラメータを決定した。ＰＫパラメータを、非コンパートメントモデルを用いて推定した。
【０２１６】
言い換えれば、患者に、疾患が進行していない限り、週３回、６ｍｇ／ｍ２でｄＴＣＡｐＦを静脈内投与した。１２ｍｇ／ｍ２の用量が安全であることが証明され、かつ疾患が進行していた場合、患者に１２ｍｇ／ｍ２を投与した。例えば、図１での患者番号１は、２サイクルの治療（６および１２ｍｇ／ｍ２のｄＴＣＡｐＦにて）を投与された。図１での患者番号４は、３サイクルの治療を受けた（１２、２４および４８ｍｇ／ｍ２のｄＴＣＡｐＦにて）。
【０２１７】
ｄＴＣＡｐＦの臨床活性を、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１を用いて、身体検査、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）技術（評価可能な疾患のみ）により８週間ごとに評価し、かつ適切な場合には、各サイクルで有益な腫瘍マーカを評価した。この研究は、Ｒａｂｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの制度審査委員会およびイスラエル保健省によって承認され、ヘルシンキ宣言に従ってＲａｂｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＤａｖｉｄｏｆｆ  Ｃｅｎｔｅｒで実施された。すべての患者は登録前にインフォームドコンセントに署名した。試験はＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０１６９０７４１）に登録された。
【０２１８】
投与
注射用溶液用のｄＴＣＡｐＦ粉末を、上記のとおりバイアル当たり注射用水で２ｍＬの最終容量に再構成するために、４．８％マンニトールとともに、凍結乾燥した、活性物質の１５ｍｇを含む５ｍＬバイアル（７．５ｍｇ／ｍＬ）または８０ｍｇを含む１０ｍＬバイアル（４０ｍｇ／ｍＬ）として供給する。注射用溶液として再構成した２ｍＬのｄＴＣＡｐＦ粉末のバイアルをその後、４８ｍｇ／ｍ２以下の用量レベルの注入のために水性デキストロース５％中で最終容量１００ｍＬに希釈する必要がある。４８ｍｇ／ｍ２を超える用量レベルの場合、最終希釈容量は２５０ｍＬであった。注射用のｄＴＣＡｐＦを６０分間静脈内（ｉｖ）投与した。
【０２１９】
薬物動態分析
ＡＵＣ（０−２４）、Ｃｍａｘ、Ｃｍｉｎ、Ｔｍａｘおよびｔ１／２を含むＰＫパラメータを、非コンパートメントモデルを使用して推定する。用量レベルにわたり比較を行って、比例性を評価する。ＰＫパラメータの要約を以下の表２に示す。
【表２】
2019512669.tif 000003
【０２２０】
薬力学的分析
循環サイトカインおよび可溶性Ｔ１／ＳＴ２受容体および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）Ｔ１／ＳＴ２受容体発現のレベルにおけるベースラインからの変化を解釈のために提示し、ＰＫおよび抗腫瘍活性分析と相関させた。前治療および／または治療中の腫瘍組織試料が得られる場合、Ｔ１／ＳＴ２受容体アッセイの結果を臨床的解釈のために提示する。
【０２２１】
バイオマーカ分析
血液試料を患者から採取し、以下に記載するように定期的に氷上に１０分間置いた。血清を４℃で１０分間３０００ｒｐｍにて遠心することによって集め、−２０℃以下で別個のバイアル中に保持し、−２０℃でＩｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｅｙ  Ｌｔｄに輸送し、そこで解凍し、等分し、−２０℃以下で保存する。反復凍結融解サイクルを回避した。
【０２２２】
全長抗ＳＴ２抗体（ＧｅｎＭｅｄ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ）を用いて、Ｔ１／ＳＴ２受容体について免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を行った。種々の因子の血清レベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。測定した追加の因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アンジオポエチン−１、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β１）（いずれもＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）のＥＬＩＳＡキットを用いて）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１２ｐ７０（ＩＬ−１／２ｐ７０）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；およびグルコース調節タンパク質７８（ＧＲＰ７８）／ＢｉＰ（Ｅｎｚｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含んだ。ペプチドを用いる治療を受けている患者において測定された様々な血管新生因子およびサイトカインの血清レベルの要約を以下の表３に示す。
【表３】
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【０２２３】
免疫原性
循環抗ｄＴＣＡｐＦ抗体のレベルにおけるベースラインからの変化を、解釈のために提示する。
【０２２４】
抗腫瘍活性分析
評価可能または測定可能な疾患を有する対象を、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴ）バージョン１．１の応答評価基準に従って２サイクル毎に評価する。サイクルを週３回の投与での４週間の治療と定義する。腫瘍病変の測定およびベースラインからの変化を、サイクルおよび用量コホート毎に要約する。ｄＴＣＡｐＦ用量群毎の有害事象の要約を以下の表４に示す。
【表４】
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【０２２５】
客観的腫瘍応答率（完全応答および部分応答）、客観的腫瘍応答の持続時間、客観的腫瘍応答時間、および無増悪生存を提示する。時間−事象推定値および生存曲線を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法およびＣｏｘモデルを使用して、計算された粗ハザード比および計算された調整ハザード比（交絡変数のために調整された）を用いて生成する。有益な腫瘍マーカ評価（例えば、ＣＡ１２５またはＰＳＡ）を有する対象は、サイクル毎に適切な評価を受ける。腫瘍マーカパラメータを、評価可能な場合、サイクルおよび用量コホートによって要約する。ｄＴＣＡｐＦのＰＫ、ＰＤおよび臨床効果の間の関係の探索的評価を行う。試験に登録された患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）の要約を以下の表５に示す。
【表５】
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【０２２６】
統計分析
記述統計学をすべての分析に使用し、ＳＡＳ（登録商標）バージョン９．１（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）で実施した。回帰分析を、月ごとの腫瘍変化、ｄＴＣＡｐＦの投与量、およびＥＲストレスバイオマーカ（ＢｉＰ）のレベル間の双方向相関を研究するために使用した。相関の統計的有意性を、Ｆ統計を用いて検証した
【０２２７】
ＥＬＩＳＡによるＧＲＰ７８／Ｂｉｐマーカ血中濃度の測定
ｄＴＣＡｐＦペプチドによる治療を受けている患者におけるＢｉＰの血漿レベルの測定を以下のように行った。
【０２２８】
試料の採取
血液を、ラベンダー上部バキュテイナーチューブ中でｄＴＣＡｐＦにより治療される患者から採集し、その後氷上に１０分間置いた。次に、バキュテイナーを４℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。血漿画分を別のバイアルに集め、−２０℃でＷｏｒｌｄ  ＣｏｕｒｉｅｒによりＲ＆Ｄ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔに出荷するまで−２０℃以下で保った。受領時に、血清試料を解凍し、５６μｌのアリコートを０．５ｍｌのバイアル中に入れ、−２０℃以下で保存した。反復凍結融解サイクルを回避した。血液を、最初のサイクルの１日目、１５日目および２９日目に、およびその後のサイクルの２９日目に採取した。
【０２２９】
ＧＲＰ７８／ＢＩＰの血中濃度の測定
ＧＲＰ７８／ＢＩＰの血中濃度の測定を、キットＧＲＰ／ＢＩＰ  ＥＬＩＳＡキット（ｃａｔ＃ＡＤＩ−９００−２１４  Ｅｎｚｏを用いて実施した。血漿試料のアリコートを４℃で解凍し、４℃にて６分間１０，０００Ｇで遠心した。試料を次いで、ＢＳＡおよび界面活性剤（キットアッセイ）緩衝液を含有するトリス緩衝食塩水で１：５に希釈した。試料を次いでロバ抗ヒツジＩｇＧでプレコートした提供された９６ウェルプレート上に二重で載せた。較正試料およびブランク試料もまたプレート上に装填し、次いでＢｉＰ（黄色）に向けられた抗体を、ブランクのウェルを除いてウェルのすべてに添加した。ＥＬＩＳＡプレートを密閉し、１時間７５０ＲＰＭで振とうしながら室温（ＲＴ）でインキュベートした。
【０２３０】
上記のインキュベーション期間後、プレートを洗浄せず、ＢｉＰコンジュゲート（青色）をブランク以外のウェルのすべてに添加した。プレートを、さらに１時間（ＲＴ）振とうしながらインキュベートした。
【０２３１】
追加のインキュベーション期間後、ウェルの内容物を吸引し、各ウェルに界面活性剤を含有する３００μｌのトリス緩衝食塩水（キットの洗浄緩衝液）を添加することにより、ウェルを自動洗浄（Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ  ｐｒｏ  ＩＩ  Ｗａｓｈステーション）を用いて洗浄した。洗浄手順をさらに３回繰り返し、合計４回洗浄した。最後洗浄の後、ウェルを吸引し、プレートをリントフリーのペーパータオル上でしっかりと上下逆さまに軽くたたいて、残留する洗浄緩衝液を取り除いた。
【０２３２】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を各ウェルに添加し、プレートを密閉し、振とうしながら暗所で室温にて１９分間インキュベートした。停止溶液をその後、各ウェルに添加し、デルタＯＤを４５０ｎｍ／５７０ｎｍで読み取った。ブランクウェル値をすべての結果から差し引いた。較正曲線を作成し、ＢｉＰ  ｎｇ／ｍＬ値をそれに応じて計算し希釈係数（ｘ５）を掛けた。
【０２３３】
血漿ＢｉＰ発現量の差の算出
ＢｉＰの血漿発現レベルの差を、治療の２９日目にｄＴＣＡｐＦで治療される患者の血漿中で測定したＢｉＰ発現レベルと、治療の１日目（ｄＴＣＡｐＦペプチドの最初の投与前）にｄＴＣＡｐＦで治療される患者の血漿中で測定したＢｉＰ発現レベルとの間の差を計算すること、およびその結果を治療の１日目に測定した上記のＢｉＰ発現レベルで割る（正規化）ことにより求めた。つまり、（２９日目のＢｉＰレベル）−（１日目のＢｉＰレベル）*１００／（１日目のＢｉＰレベル）である。
【０２３４】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）血中濃度の測定
血清ＣＲＴレベルを、キットＥｌｉｓａ  ＣＲＴキット（ヒト）（ＯＫＥＨ０１０５４、Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を用いて測定した。サイクル１の１日目および１５日目または２９日目（Ｃ１Ｄ１、Ｃ１Ｄ１５およびＣ１Ｄ２９）の患者の試料を解凍し、１０，０００Ｇで１０分間遠心し、製造業者のプロトコールに従ってプレートに装填した。
【０２３５】
腫瘍サイズの決定
腫瘍サイズを、固体腫瘍ガイドラインの応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）に従って、医療現場で評価した（例えば、コンピュータ断層撮影スキャン（ＣＴ）の実施により）。試験の最終日（すなわち、ペプチドの最後の投与後）の腫瘍サイズを、試験の最初の日（ペプチドの最初の投与前）の腫瘍サイズと比較した（百分率で）。
【０２３６】
癌細胞におけるＳＴ２の状態の評価
癌細胞におけるＳＴ２の状態を、特定の抗ヒトｓｔ２受容体抗体を用いて、免疫組織化学によって患者から得られた生検試料について評価した。染色ステップ後、生検を病理学者によって評価した。
【０２３７】
ｄＴＣＡｐＦで処理したＯＶ９０細胞の免疫組織化学（ＩＣＣ）
細胞培養の増殖および処理のための材料
成長培地：
−ＤＭＥＭ高グルコース、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ４１９６５−０３９）；
−ピルビン酸ナトリウム１１．０ｍｇ／ｍｌ（１００ｍＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ  Ｎｏ．０３−０４２−１Ｂ）；
−５０ｍｌのＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ  ｎｏ．０４−１２１−１Ａ）；
−０．５ｍｌアンフォテリシンＢ２５００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ  ｎｏ．０３−０２９−１）；
−５ｍｌの硫酸ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ  ｎｏ．０３−０３５−１）；
処理培地：
処理培地は、５％マンニトール（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ  ｎｏ．Ｍ４１２５−５００Ｇ）を補充した増殖培地に基づいた。培地を、マンニトール添加後０．２μｍフィルターでろ過した。
追加材料：
−トリプシンＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ｃａｔ  ｎｏ．０３−０５２−１Ｂ）；
−７５ｃｍ２培養フラスコ（Ｎｕｎｃ  ｃａｔ  ｎｏ．１７８９０５）；
−２５ｃｍ２培養フラスコ（Ｎｕｎｃ  ｃａｔ  ｎｏ．１３６１９６）；
−マンニトール中２０ｍｇ／ｍｌのｄＴＣＡｐＦ（アリコートを使用し、凍結融解サイクルの繰り返しを回避する）；
−ヒト卵巣癌細胞株ＯＶ９０を使用した：レギュラーＯＶ９０（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ）およびＴ１／ＳＴ２  ＫＯ  ＯＶ９０（発明者により製造）；
ＩＣＣ用の材料：
−スライド：Ｎｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩＣｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（１５４５３４  Ｎｕｎｃ）；
−洗浄緩衝液：ＰＢＳ（０２−０２３−５Ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）；
−固定溶液：ＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒド（２５２５４９Ｓｉｇｍａ）；
−浸透溶液：ＰＢＳ中の０．２５％トリトンＸ−１００（０６９４  Ａｍｒｅｓｃｏ）；
−ブロッキング緩衝液：０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（０７７７  Ａｍｒｅｓｃｏ）を含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（Ａ７９０６  Ｓｉｇｍａ）、２２．５２ｍｇ／ｍＬグリシン（Ｇ８８９８−５００Ｇ  Ｓｉｇｍａ）；
−抗体緩衝液：０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（０７７７  Ａｍｒｅｓｃｏ（登録商標））を含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（Ａ７９０６）；
−一次抗体：１：５００に希釈した抗５８ｋゴルジマーカ（ａｂ２７０４３）、１：２５０に希釈した抗−β−ＣＯＰ（ａｂ６３２３）、１：１，０００に希釈した抗ＧＲＰ７８  ＢｉＰ（ａｂ２１６８５）（抗体はＡｂｃａｍから購入）；
−二次抗体：５８ｋゴルジマーカおよびβ−ＣＯＰ：ＺｙｔｏＣｈｅｍ  Ｐｌｕｓ（ＨＲＰ）ポリマー抗ウサギ（ＺＵＣ０３２−００６）。ＢＩＰ：ＺｙｔｏＣｈｅｍ  Ｐｌｕｓ（ＨＲＰ）ポリマー抗マウス（ＺＵＣ０５０−００６）；
−ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド、Ｄ３９３９  Ｓｉｇｍａ）；
−水性マウント培地（Ａｂ１２８９８２  Ａｂｃａｍ）。
【０２３８】
細胞培養の増殖
ＯＶ９０およびＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ細胞を、最大７０〜８０％の密度に達するまで３７℃、５％ＣＯ２および１００％湿度でインキュベーター中のフラスコ中で増殖させた。培地を、ピペットを用いてフラスコから除いた。次に、４ｍｌのトリプシンＥＤＴＡを各フラスコに添加し、フラスコを、細胞の大部分がフラスコから分離するまで数分間インキュベーター中に置いた。細胞の分離を増やすためにフラスコを軽く叩くことを避けた。培地（１０ｍｌ）を次いでフラスコに加え、培地およびトリプシン中の培養物を２つのフラスコに分け、その各々に１５ｍｌの新しい培地を添加した。細胞を、７０〜８０％に達するまで増殖のために２〜３日間インキュベートし、継代手順を必要に応じて繰り返した。
【０２３９】
細胞の処理
培地およびトリプシン中で上に詳述したように増殖させた細胞培養物を５０ｍｌコニカルチューブに移し、チューブを４℃で１０分間３００ｇで遠心した。次に上清を捨て、ペレットを流動化するために、１５ｍｌの新鮮な培地を細胞ペレットに添加した。細胞を計数し、１ｍｌの増殖培地中のチャンバースライド上に１０，０００細胞／ウェルで播種した。チャンバースライドを１時間フード中に静置した後、インキュベーターに一晩移した。翌日、細胞処理培地を、５０μｇ／ｍＬのｄＴＣＡｐＦを含んで調製した。細胞を、チャンバースライドから培地を吸引し廃棄することにより、および各ウェルにｄＴＣＡｐＦ（または対照）を含む０．５ｍｌの細胞処理培地を添加することにより処理し、次いでインキュベーター中で４８時間インキュベートした。その期間の後、ｄＴＣＡｐＦを含む処理培地の追加用量を処理細胞ウェルに加え、細胞を、さらなる２４時間のインキュベートの後に回収した。
【０２４０】
免疫化学
上で詳述したように処理した細胞を、以下のＩＣＣプロトコールに供した。インキュベーション期間の完了後、培地を吸引し、細胞を、各ウェルを洗浄緩衝液で満たすことによって洗浄した。次に、緩衝液を捨て、３００μｌの固定溶液を各ウェルに加えた。細胞を１５分間室温でインキュベートした。固定溶液を次いで捨て、ウェルを簡単に２回すすいだ。次に、３００μｌの浸透溶液を各ウェルに加え、細胞を１０分間室温でインキュベートした。浸透化溶液を捨て、ウェルを３回、それぞれ洗浄について５分間、洗浄した。ブロッキング緩衝液（１ｍｌ）を各ウェルに加え、細胞を１時間室温でインキュベートした。インキュベーション時間の終了前に、上で詳述した一次抗体を抗体希釈緩衝液で希釈した。次に、ブロッキング緩衝液をウェルから捨て、１２０μｌの一次抗体を各ウェルに添加した。細胞を次いでパラフィルム（またはダクトテープ）で覆い、４℃で一晩インキュベートした。
【０２４１】
翌日、一次抗体を捨て、ウェルを洗浄緩衝液で３回、それぞれの洗浄について５分間、洗浄した。二次抗体を次いで各ウェル（１〜２滴）に加え、細胞ウェルを３０分間室温にてインキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液で３回、それぞれの洗浄について５分間、洗浄した。ＤＡＢ基質（新たに調製し、０．２μｍフィルターでろ過した）を各ウェル（１〜２滴）に添加し、発育を確認しながら細胞ウェルを５〜１５分間インキュベートした。細胞ウェルを５分間ＰＢＳで洗浄した。ウェルを次いでスライドから取り出し、スライドを風乾した。マウント媒体を加え、スライドをカバースリップ上に置いた。視覚化を、光学顕微鏡を用いて行った。
【０２４２】
タキソールまたはｄＴＣＡｐＦの存在下でのＢｒｄＵ取り込みアッセイ
ヒト膵癌細胞（ＢｘＰＣ３）およびヒト卵巣癌細胞（ＯＶ９０）を、以下に詳述するように、ＢｒｄＵの存在下で２４時間、ｄＴＣＡｐＦまたはタキソールで処理した。
【０２４３】
細胞を、５％ＣＯ２で３７℃にてインキュベーター中で２４時間、１００μｌのＤＭＥＭ（ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４１９６５−０３９）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  １４−１２７−１Ａ）の入った９６ウェルプレートの真ん中に２，０００細胞／ウェルで置いた。培地を次に、２．５％ＦＢＳおよびＤＭＳＯ中の最終濃度２ｎＭまたは４ｎＭのタキソール（ｓｉｇｍａ  Ｔ７４０２）またはＤＭＳＯ中の最終濃度２５μｇ／ｍｌのｄＴＣＡｐＦ（ｎｅｘｔａｒ  ＩＳＫ３５３−０１バッチ３５１−０１／１．６８）を含む２００μｌのＤＭＥＭに置き換えた。対照細胞での培地を、上記のようにＤＭＥＭおよびＦＢＳで置き換えた。細胞ウェル中のＤＭＳＯの最大濃度は０．５％未満であった。４つのウェルを各濃度について使用した。
【０２４４】
タキソールおよびｄＴＣＡｐＦ処理細胞ならびに対照細胞を、以下のようにＢｒｄＵの存在下で２４時間さらにインキュベートした：２０μｌのＢｒｄＵ試薬（２．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で１：１００希釈）を細胞に添加し、プレートを５％ＣＯ２で３７℃のインキュベーター中で２４時間インキュベートした。ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡをキットプロトコール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃２７５２）に従って実施した。
【０２４５】
タキソールおよびｄＴＣＡｐＦの存在下でのＢｒｄＵ取り込みアッセイ
癌細胞（ＢｘＰＣ３）およびヒト卵巣癌細胞（ＯＶ９０）を、以下に詳述するように、ＢｒｄＵの存在下で２４時間、ｄＴＣＡｐＦおよびタキソールで処理した。
【０２４６】
細胞を、５％ＣＯ２で３７℃にてインキュベーター中で２４時間、１００μｌのＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳを含む９６ウェルプレートの真ん中に２，０００細胞／ウェルで置いた。培地を次に、２．５％ＦＢＳおよびＤＭＳＯ中の最終濃度２５μｇ／ｍｌのｄＴＣＡｐＦ（ｎｅｘｔａｒ  ＩＳＫ３５３−０１バッチ３５１−０１／１．６８）を含む２００μｌのＤＭＥＭに置き換えた。細胞ウェル中のＤＭＳＯの最大濃度は０．５％未満であった。４つのウェルを各濃度について使用した。最終濃度２ｎＭまたは４ｎＭでタキソール（２．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ５μｌ中で）を次に、ｄＴＣＡｐＦを含有する細胞に添加し、処理した細胞をＢｒｄＵの存在下で以下のようにさらに２４時間インキュベートした：２．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で１：１００に希釈したＢｒｄＵ試薬２０μｌを、実験終了２４時間前に細胞に添加した。最後に、ＢｒｄＵ  ＥＬＩＳＡをキットプロトコール（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃２７５２）に従って実施した。
【０２４７】
実施例１
ペプチドｄＴＣＡｐＦは、癌細胞における小胞体（ＥＲ）ストレスを増加させる
上に示したように、ヒト胸腺に特有のｃＤＮＡによってコードされる「Ｔ１０１」と呼ばれるペプチドが同定され、とりわけ癌腫瘍サイズを減少させることが報告された。さらに、本明細書でｄＴＣＡｐＦ（または「Ｎｅｒｏｆｅ」）と称される、Ｔ１０１のペプチド誘導体は、癌細胞による癌転移に関連することが公知であるタンパク質の分泌を減少させ、かつインビトロでの癌細胞の移動を直接阻害することが報告されている（１６）。
【０２４８】
上記のとおり、進行中の臨床試験は現在、ペプチドｄＴＣＡｐＦを用いて行われている。このペプチドは、配列番号１によって示されるＴｒｐ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｌｙｓの全Ｄアミノ酸配列を有し、上記のとおり調製された。
【０２４９】
ペプチドｄＴＣＡｐＦを、上で説明した癌患者（表１）に、示された投薬レジメンで、週３回、静脈内（ｉｖ）投与した。
【０２５０】
癌細胞に対するｄＴＣＡｐＦペプチドの効果を調べるために、上記のレジメンの下でｄＴＣＡｐＦにより１１ヶ月間治療した脊髄腫瘍患者から生検を採取した。組織生検を、治療前および治療１１ヶ月後に患者から得て、小胞体（ＥＲ）ストレスのマーカであるＢｉＰのレベルを検出するために抗ＢｉＰ抗体で染色した。
【０２５１】
上で詳述したように、ＧＲＰ７８としても知られている結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）は、ＥＲ中で分子シャペロンとして作用し、その合成は、ＥＲ中の折り畳まれていないポリペプチドの蓄積をもたらす条件下で顕著に誘導される。
【０２５２】
図２に示すように、ＢｉＰのレベルの明らかな差が、治療開始前（図２Ａ）および１１ヶ月治療後（図２Ｂ）の患者から得られた生検で観察され、これは、ｄＴＣＡｐＦペプチドが脊髄新生物癌患者から得られた腫瘍においてＥＲストレスを増加させたことを示す。
【０２５３】
実施例２
ＥＲマーカＢｉＰレベルの上昇は腫瘍サイズの減少と相関する
上の実施例１で詳述したように、観察されたＢｉＰレベルの上昇に基づいて、ｄＴＣＡｐＦペプチドはこのペプチドでの治療を受けている患者から得られた腫瘍細胞においてＥＲストレスを増加させることが示された。驚くべきことに、ＥＲストレスマーカＢｉＰの増加は、以下に詳述するように、治療される患者における腫瘍増殖の阻害と高い相関関係にあることが見出された。
【０２５４】
ＢｉＰのレベルを、１日目（ｄＴＣＡｐＦの最初の投与前）およびｄＴＣＡｐＦでの治療の２９日目に上で詳述したように実施したｄＴＣＡｐＦペプチドを用いる臨床試験に参加した癌患者の血漿中で測定した。治療の１日目に癌患者について得られたＢｉＰの血漿レベル（「ベースライン」レベル）を次いで、治療の２９日目の同じ癌患者について得られたＢｉＰの血漿レベルから差し引いた。
【０２５５】
並行して、参加癌患者を、上記のとおり、治療の１日目（または治療開始直前）および最終日に、コンピュータ断層撮影スキャン（ＣＴ）を用いて腫瘍サイズについて評価した。腫瘍サイズの差異（本明細書では「腫瘍変化」とも呼ばれる）をその後、上記のようにして計算した。簡潔には、「腫瘍変化」は、治療の初日（第１日）〜治療の最終日（治療期間は上記の基準に基づいて決定された）の間にｄＴＣＡｐＦによる治療時に得られた腫瘍サイズの差の尺度である。
【０２５６】
全体として、３９名の患者をスクリーニングし、そのうち１７名が登録され試験を完了した。患者の大半（６４％）は男性で、年齢中央値（範囲）は６５歳（５１〜９４）歳であった。患者のほぼ半分（４７％）が結腸直腸癌（ＣＲＣ）を有し、約１／４（２９％）が膵癌を有した。１名を除く全患者は、登録前に複数の抗癌療法（例えば、化学療法、放射線療法、生物学的療法）を受けた（表１）。患者は、図１に詳述されるように、漸増用量（６ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、２４ｍｇ／ｍ２、４８ｍｇ／ｍ２、および９６ｍｇ／ｍ２）のｄＴＣＡｐＦを１〜３サイクル受けた。
【０２５７】
上記のように、ＧＲＰ７８／ＢｉＰタンパク質（ＥＲストレスバイオマーカとして）の血清レベルを、上に示されるようにｄＴＣＡｐＦ治療の開始前および治療の２９日後に測定した。統計的に有意な相関が、図３に示されるように、投与されたｄＴＣＡｐＦ用量と血清ＧＲＰ７８／ＢｉＰレベルの変化との間に（Ｐ≦０．０５）、ならびに腫瘍サイズの変化とＧＲＰ７８／ＢｉＰの血清レベルの変化との間に（Ｐ≦０．００２）（図４）見られ、ｄＴＣＡｐＦがＥＲストレスを誘導したことを示唆する。
【０２５８】
図４に示すように、ＢｉＰのレベルの変化と腫瘍サイズの変化との間に（負の）直線的相関があり、すなわち、ＢｉＰのレベルの増加は腫瘍増殖の完全な阻害と相関した。これらの結果は、ｄＴＣＡｐＦが、とりわけ、癌細胞中でＥＲストレスを増加させることによって、かついかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ゴルジ複合体を破壊することを介して作用し、それによって癌細胞死をもたらすことを実証する。
【０２５９】
上記のとおり治療の１日目および２９日目に決定された臨床試験に参加する患者におけるＢｉＰの血清レベルを以下の表６に示す。
【表６】
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【０２６０】
興味深いことに、上の表３に示すように、６ｍｇ／ｍ２の用量でのｄＴＣＡｐＦを用いる治療は、アンギオポイエチン−１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＴＧＦ−β、およびＶＥＧＦの血清レベルの上昇を導いた。しかし、１２〜４８ｍｇ／ｍ２の用量では、これらの因子の血清レベルの低下が観察され、９６ｍｇ／ｍ２では、ＶＥＧＦ−Ｄを除くすべての因子の増加が認められた。また、Ｇ／Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１、およびＴＮＦ−αなどのすべての抗癌サイトカインの血清レベルは、すべての用量レベルにおいて、ｄＴＣＡｐＦの投与により上昇した。
【０２６１】
ｄＴＣＡｐＦの活性の様式（ＭＯＡ）を探索するために、患者をＴ１／ＳＴ２の状態ごとに検査した。図５に示すように、腫瘍がＴ１／ＳＴ２陽性である（ＩＨＣによって決定される）患者は、腫瘍がＴ１／ＳＴ２陰性である患者よりも長く治験に留まり、かつｄＴＣＡｐＦ治療中に安定な疾患（ＳＤ）を経験したことが見出された。
【０２６２】
Ｔ１／ＳＴ２受容体（本明細書では「ＳＴ２」および「ＳＴ２／Ｔ１」とも称される）は、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）スーパーファミリーのメンバーである。当技術分野で公知のように、インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）スーパーファミリーのメンバーは、細胞外免疫グロブリン様ドメインおよび細胞内Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１Ｒ（ＴＩＲ）ドメインを特徴とする。このファミリーのメンバーは宿主の防衛、傷害およびストレスにおいて重要な役割を果たす。ペプチドｄＴＣＡｐＦが由来する胸腺ペプチドＴ１０１は、Ｔ１／ＳＴ２受容体のリガンドとして機能し得ることがこれまでに報告されている（１３〜１５）。
【０２６３】
したがって、集団の各々（Ｔ１／ＳＴ２陰性陽性患者およびＴ１／ＳＴ２陽性患者）について、ＢｉＰレベルを再分析した（すなわち、腫瘍サイズの変化対ｄＴＣＡｐＦ投与用量）。結果を図６にグラフで示す。
【０２６４】
ＳＴ２陽性およびＳＴ２陰性癌が分離された図６に示すように、ＳＴ２陽性であった癌細胞中のＢｉＰマーカレベルを腫瘍変化に相関させると、Ｒ値は−０．９８であり、ＳＴ２陰性であった癌細胞では、Ｒ値は−０．８３であった。ＳＴ２陽性のグラフのｐ値は、小さなデータセットであるために最適ではない。
【０２６５】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、この差は、ＳＴ２陽性細胞上のＳＴ２受容体のより高い存在量がこれらの細胞中へのｄＴＣＡｐＦペプチドの進入を容易にし、このためより少ない用量のペプチドをおそらく必要とすることを示している。
【０２６６】
「ＳＴ２陰性」と定義された細胞においてでさえ、ＳＴ２陽性細胞の場合よりも低い存在量であるが、細胞中にｄＴＣＡｐＦペプチドを組み込むための十分なＳＴ２受容体が存在することは注目に値する。
【０２６７】
上に提示した結果は、ＥＲストレスマーカＢｉＰが、このペプチドで治療される癌患者における腫瘍増殖を阻害する際のｄＴＣＡｐＦペプチドの効率のマーカとして使用できることを示している。効果は既に治療の最初の１ヶ月で明らかであるので、治療の初期段階でＢｉＰのレベルを決定することは、治療効率の評価のための評価テストまたはツールとして役立ち得、かつこれらの患者のさらなる治療ステップの決定、例えば、ｄＴＣＡｐＦを使用する治療を続けるべきか否かの決定の助けとなる。
【０２６８】
実施例３
ペプチドｄＴＣＡｐＦの安全性および耐容性
様々なパラメータを、以下に詳述するように、安全性、ＰＫおよび有効性を含み、上記実施例２で言及した臨床試験に参加する患者について分析した。
安全性および耐容性
【０２６９】
患者１名あたりの治療サイクルの平均数は３．２±１．４であった。用量制限毒性（ＤＬＴ）はコホート５までのいずれの患者においても観察されなかった。有害事象（ＡＥ）を上の表４に要約する。研究薬物に関連するものはなかった。高血圧、貧血、嘔吐、下痢、および腹痛が最も多く報告されたグレード２ＡＥであり、高血圧が最も多く報告されたグレード３ＡＥであった。嘔吐は１名の患者で報告された唯一のグレード４ＡＥであった。ほとんどのＡＥは自己解決型であった。全体的に、ｄＴＣＡｐＦでの治療は、累積毒性がなく、耐容性が良好であった。ＭＴＤには達しなかった。
【０２７０】
薬物動態
サイクル１および２の初日のＰＫ結果を表２に要約する。ｔ１／２、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０は用量に線形に関係した。ｄＴＣＡｐＦの用量依存性血漿濃度が観察された（図７）。
【０２７１】
効能
３ヶ月間以上（１２、２４、４８ｍｇ／ｍ２）治療された１７名の患者のうち５名が、治療期間全体を通じて安定な疾患（ＳＤ）を経験した。特に、１名の患者は、明らかに脊髄を圧迫する脊髄新形成のため、腰痛および衰弱を患い、様々な鎮痛薬（例えば、トラマドール、オキシコドン／ナロキソン、モルヒネ、およびプレガバリン）を投与され、歩行器を使用した。６ヵ月間の治療（１２、２４、４８ｍｇ／ｍ２）後に、患者はいかなる鎮痛薬も必要とせずに歩行を改善した。
【０２７２】
無増悪生存（ＰＦＳ）分析は、６名の患者が以前のレジメンと比較してｄＴＣＡｐＦに対してより長いＰＦＳを経験し、かつ１名は以前のレジメンでのＰＦＳと同等であったＰＦＳを有したことを明らかにした（これらのＰＦＳ値は、上の表５に太字で示される）。さらに、先立って治療を受けなかった１名の患者は、治験薬に３３０日間留まることができた（染色陽性）（表５）。回帰分析は、腫瘍サイズの変化とｄＴＣＡｐＦ投与用量との間に統計的に有意な相関を明らかにした（図８）。
【０２７３】
実施例４
ＳＴ２ノックアウト細胞に対するｄＴＣＡｐＦペプチドの効果
上記のように、ＳＴ２陽性細胞上のＳＴ２受容体のより高い存在量は、これらの細胞中へのｄＴＣＡｐＦペプチドの侵入を促進し得る。癌細胞でのＳＴ２受容体の存在が、細胞へのｄＴＣＡｐＦの侵入に及ぼす効果をさらに調べるために、下に詳述するとおり、ＳＴ２ノックアウト（ＫＯ）細胞を調製し、ｄＴＣＡｐＦ投与に応答したこれらの細胞における種々のタンパク質のレベルを調べた。
【０２７４】
ＳＴ２受容体のノックアウトに使用した細胞は、哺乳動物卵巣細胞ＯＶ９０（腺癌）であった。上に詳述したように、ＯＶ９０細胞およびＫＯ  ＯＶ９０細胞にｄＴＣＡｐＦを投与し、次いでこれらを免疫細胞化学アッセイに供した。
【０２７５】
図９Ａ（ｄＴＣＡｐＦを投与されなかった対照ＯＶ９０細胞）と図９Ｂ（ｄＴＣＡｐＦを投与されたＯＶ９０細胞）との比較により明らかなように、ｄＴＣＡｐＦはゴルジ装置の完全破壊を誘発し、その結果ＥＲストレスを生じた。図９Ｂは、消失したゴルジ、およびＥＲ上に蓄積した破壊タンパク質を示し、これが次いでＥＲストレスをもたらすことを示している。これらの結果は、ゴルジ装置タンパク質の１つである、β−ｃｏｐタンパク質の分析に基づいている。
【０２７６】
上記の結果とは対照的に、図９Ｃ（処理されていない対照ＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ）および図９Ｄ（ペプチドを投与されたＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ細胞）に示されるようにＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ細胞において、ｄＴＣＡｐＦのゴルジ体への効果は観察されなかった（矢印は無傷のゴルジ体を指す）。
【０２７７】
図１０は、ｄＴＣＡｐＦ投与の結果としてＯＶ９０およびＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ細胞におけるＢｉＰ発現の評価を示す。ＯＶ９０細胞では、図１０Ａ（ｄＴＣＡｐＦの非存在下）と図１０Ｂ（ｄＴＣＡｐＦの存在下）との比較により示されるように、ｄＴＣＡｐＦ処理によりＢｉＰ染色の明らかな増強が観察されるが、ＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ細胞では図１０Ｃと図１０Ｄとの比較により推測されるように、ｄＴＣＡｐＦ処理の結果としてのＢｉＰの染色の差がない。これは、ＯＶ９０  ＳＴ２  ＫＯ細胞がｄＴＣＡｐＦに応答せず、ＥＲストレスがこれにより誘導されなかったことを意味する。
【０２７８】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、上記の結果は、ＳＴ２受容体が患者でのＥＲストレスとどのように関連するかを実証する。ｄＴＣＡｐＦに対するＳＴ２陽性細胞の感受性の増大、および上記の結果はまた、図６に示されるＳＴ２陽性細胞において観察されたＢｉＰの発現レベルの大きな差異を説明する。
【０２７９】
実施例５
正常細胞に対するｄＴＣＡｐＦペプチドの効果
ペプチドｄＴＣＡｐＦを健常なヒト末梢免疫細胞に適用し、正常な健常細胞とは対照的に癌細胞はＥＲストレスに対して明らかに非常に感受性が高いことから、わずかな細胞死のみが生じた（データ示さず）。従って、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ｄＴＣＡｐＦは癌細胞に選択的に影響を及ぼすようである。
【０２８０】
実施例６
ＥＲマーカＣＲＴのレベルはｄＴＣＡｐＦペプチドの投与量と相関しない
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、細胞のＥＲにおいて正常な条件下で発現されるシャペロンであり、新たに合成されるタンパク質の折り畳みを助ける。さらに、ｄＴＣＡｐＦによる処理の結果としてのＢｉＰ  ＥＲストレスマーカの増加を示す上に提示された結果に加えて、ｄＴＣＡｐＦにより治療されるヒト患者におけるＣＲＴ血清レベルの変化も調べた。異なる投与用量のｄＴＣＡｐＦ（６ｍｇ／ｍｍ２〜９６ｍｇ／ｍｍ２）を受けた患者は、ＣＲＴ血清レベルの変化を誘導したが、上に詳述したとおり、ｄＴＣＡｐＦの投与および腫瘍サイズと線形相関を示したＢｉＰレベルとは対照的に、ｄＴＣＡｐＦを投与した用量との相関はなかった。
【０２８１】
上記臨床試験に参加した癌患者でのｄＴＣＡｐＦによる治療の終了時のＣＲＴの血清レベルを示す棒グラフを図１１Ａに示し、ｄＴＣＡｐＦ治療を受けている患者での血清ＣＲＴレベルの変化を示す棒グラフを図１１Ｂに示す。
【０２８２】
要約すると、ｄＴＣＡｐＦの用量とＣＲＴ血清レベルとの間に相関は観察されなかった。マウスで行われたインビトロ実験は、ｄＴＣＡｐＦによる処置の結果としてレベルが上昇したＢｉＰとは対照的に、細胞中のＣＲＴレベルはｄＴＣＡｐＦ処理による影響を受けなかったことを示した（データは示さず）。
【０２８３】
ＣＲＴは、ｄＴＣＡｐＦで処理した場合にそのレベルが細胞中で上昇しないシャペロンであり、ＢｉＰのレベルはｄＴＣＡｐＦで処理した後にインビトロおよびインビボにおいて増加する。両方ともＥＲストレス修復機構の一部であるが、ｄＴＣＡｐＦはインビトロおよびインビボのＢｉＰを選択的に増加し、ＣＲＴレベルにいかなる影響も及ぼさない。ＣＲＴレベルの変化が起こらなかったという観察は、ＢｉＰの血清レベルの変化およびＣＲＴレベルの「変化なし」と相関する。これは、患者におけるＢｉＰレベルの変化がｄＴＣＡｐＦのインビトロ／インビボ活性と完全に相関することを意味する。
【０２８４】
実施例７
ペプチドｄＴＣＡｐＦはＮＫ細胞を活性化する
ナチュラルキラー細胞または「ＮＫ細胞」は、先天性免疫系にとって重要な細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞の役割は、適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割と類似する。他の機能の中で特に、ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞への迅速な応答を提供し、腫瘍形成に応答する。
【０２８５】
ｄＴＣＡｐＦの効果を、ヒトＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋、Ｌｏｎｚａ（２Ｗ−５０１）から購入）についても調べた。ＮＫ細胞をＬＧＭ−３培地（ＩＬ−２およびＩＬ−１５を補充）に播種した。細胞をｄＴＣＡｐＦで２４時間、およびさらに７２時間処理した後、ＣＤ３３５およびＣＤ３３７抗原（それぞれ、天然細胞傷害性誘発受容体１（Ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）および天然細胞毒性誘発受容体３（Ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３））に焦点を当てたＦＡＣＳ分析を行った。図１２に示すように、両方の受容体の発現の増加がｄＴＣＡｐＦによって誘導された。
【０２８６】
ＣＤ３３５およびＣＤ３３７受容体は、癌細胞およびウイルス感染細胞に対するＮＫ細胞活性にとって重要である。ＮＫ細胞活性の誘導は、患者００６（脊髄新生物を有する）について上記した臨床試験中にも観察された。臨床試験中、患者の生検材料を、臨床試験への参加前および治療投与後に、特異的抗ヒトＮＫ細胞抗体で染色した。ｄＴＣＡｐＦを投与された後の患者の生検材料におけるＮＫ細胞の強い染色が観察された（データは示さず）。
【０２８７】
実施例８
ｄＴＣＡｐＦをタキソールと組み合わせると相乗効果が生じる
癌細胞に対するｄＴＣＡｐＦペプチドの有益な治療効果はさらなる研究を促し、この研究ではｄＴＣＡｐＦを上記の条件下で、追加の抗癌治療剤、すなわちタキソールと組み合わせて癌細胞に投与した。
【０２８８】
パクリタキセルとしても公知であるタキソールは、抗癌（「抗腫瘍性」または「細胞傷害性」）化学療法薬である。パクリタキセルは、乳癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、黒色腫、食道癌、および他のタイプの固形腫瘍癌の治療に使用される「植物アルカロイド」、「タキサン」および「抗微小管剤」に分類される。
【０２８９】
投与された剤の効果を、活性なＤＮＡ合成およびそれによる細胞の増殖および生存を検出するために使用される、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイによってモニターした。
【０２９０】
ｄＴＣＡｐＦペプチドとタキソールの併用効果を評価するために、２種類の癌細胞、ヒト卵巣癌細胞（ＯＶ９０、図１３Ａ）およびヒト膵癌細胞（ＢｘＰＣ３、図１３Ｂ）を用いた。
【０２９１】
ＢｒｄＵ取り込みアッセイの結果に基づき、タキソールをヒト卵巣癌細胞（図１３Ａ）またはヒト膵癌細胞（図１３Ｂ）に単独で投与した場合、対照の未処理細胞と比較して細胞生存率に対するいかなる効果も観察されなかった。
【０２９２】
さらに、図１３Ａに示すように、ｄＴＣＡｐＦペプチド（２５μｇ／ｍｌ）をヒト卵巣癌細胞に単独で投与した場合、対照の未処理細胞と比較して細胞生存率に対するいかなる効果も観察されなかった。
【０２９３】
しかし、ｄＴＣＡｐＦペプチド（２５μｇ／ｍｌ）をタキソール（２ｎＭ）と組み合わせてヒト卵巣癌細胞に投与すると、ＢｒｄＵ取り込みの約５０％の減少が観察された（図１３Ａ）。この効果は、ＢｒｄＵ取り込みが観察されなかった４ｎＭの濃度のタキソールとｄＴＣＡｐＦ（２５μｇ／ｍｌ）との組み合わせで増強された。
【０２９４】
さらに、図１３Ｂに示すように、ｄＴＣＡｐＦペプチド（２５μｇ／ｍｌ）を単独でヒト膵癌細胞に投与した場合、対照の未処理細胞と比較して細胞生存率に対しわずかな効果のみが観察された。しかし、ｄＴＣＡｐＦ（２５μｇ／ｍｌ）をタキソール（２ｎＭ）と組み合わせてヒト卵巣癌細胞に投与すると、ＢｒｄＵ取り込みの約２０％の減少が観察された（図１３Ｂ）。この効果は、２５μｇ／ｍｌでのｄＴＣＡｐＦと４ｎＭの濃度でのタキソールの組み合わせを使用した場合より顕著であり、ＢｒｄＵ取り込みの４０％を超える減少に達した。
【０２９５】
これらの結果は、タキソールの活性に対するｄＴＣＡｐＦペプチドの相乗効果を示唆しており、それ自体は増殖にいかなる効果も有さず、それによって化学療法で使用されるタキソールの用量を減少させることができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、この相乗効果は、上で実証されるような、細胞死の促進に寄与するｄＴＣＡｐＦによるＥＲストレスの誘導により説明できる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019512669.tif 000017
【図９Ａ−Ｄ】
2019512669.tif 000018
【図１０Ａ−Ｄ】
2019512669.tif 000019
【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月23日(2018.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2019512669.tif 000023
2019512669.tif 000024
2019512669.tif 000025
2019512669.tif 000026
2019512669.tif 000027