(57)【要約】  本発明は、抗細菌活性を有し、D-アミノ酸を示す新種のペプチド及びそれらの使用に関する。インビトロ及びインビボにおいてペプチドエピメラーゼ活性を示し、それによってアミノ酸配置をLからDに変化させるためにペプチドを修飾するために有用な新規酵素にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する17残基の配列を含む、少なくとも2個のD型アミノ酸を有するペプチドであって、前記配列が配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号69と配列番号71の間に4〜8個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸であり、配列番号69及び71の残基[V/I/A]がD配置を有する、ペプチド。
【請求項２】
W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H(配列番号72)の配列を含み、Xa、Xb及びXcが極性アミノ酸であり、Xdが脂肪族アミノ酸であり、Xeが任意のアミノ酸である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[L/V/A]-G-S-[A/G]-H(配列番号73)の配列を含む、請求項2に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号61〜68からなる群から選択される配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する24残基の配列を含み、前記配列が配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号21と配列番号69の間に4〜7個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸である、請求項1に記載のペプチド。
【請求項６】
配列L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(配列番号23)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X1、X2、X3及びX4が任意のアミノ酸である、請求項5に記載のペプチド。
【請求項７】
X1がアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、X2がリジン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、X3がバリン、イソロイシン又はグルタミンである、請求項6に記載のペプチド。
【請求項８】
配列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(配列番号24)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X4が疎水性アミノ酸、好ましくは、ロイシン、バリン、アラニン又はメチオニンである、請求項5に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号20の配列を含むか、本質的に配列番号20の配列からなるか、又は配列番号20の配列からなり、19位のバリンがD配置であり、27位のイソロイシンがD配置である、請求項5から8のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１１】
薬物、好ましくは抗菌剤、より好ましくは抗細菌剤として使用するための、請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する17残基の配列を含むペプチドであって、前記配列が配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号69と配列番号71の間に4〜8個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸であるペプチドを、配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220〜225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位の70%が保存されているエピメラーゼと接触させる工程を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドを調製するためのインビトロにおける方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する24残基を含み、前記配列が配列N/D-D-L-W-Y-F-V/I(配列番号21)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)及び配列番号21と配列番号22の間に4〜7個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸である、請求項12に記載のインビトロ法。
【請求項１４】
配列番号25と少なくとも30%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220〜225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位の70%が保存されているラジカルSAMペプチドエピメラーゼの、請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドの調製のための使用。
【請求項１５】
配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有し、配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及びアミノ酸の配列番号69と配列番号71の間に4〜8個のアミノ酸の連結配列を含む17残基の配列を含むペプチドであって、X4が任意のアミノ酸であるペプチドをコードする異種核酸、並びに配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220〜225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位の70%が保存されているラジカルSAMペプチドエピメラーゼをコードする異種核酸を含み、前記ペプチド及び前記エピメラーゼを同時発現することができる組換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記ペプチドが、配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有し、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X4が任意のアミノ酸である24残基の配列を含む、請求項15に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
請求項15又は16に記載の組換え宿主細胞を前記ペプチド及び前記エピメラーゼの同時発現に適した条件で培養する工程、並びに少なくとも2個のD型アミノ酸を有する前記ペプチドを回収する工程を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドの調製方法。
【請求項１８】
請求項1から9のいずれか一項に記載のペプチドを調製するための、請求項15又は16に記載の組換え宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品、特にペプチドの抗菌活性及び酵素学に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌耐性は、細菌、寄生虫、ウイルス及び真菌によって広がり続ける感染範囲の効果的な予防及び治療の脅威となる。抗菌耐性は、政府の全部門及び社会全体の行動を必要とする、世界的な公衆衛生にとってますます重大な脅威である。抗菌耐性は、世界のあらゆる地域に存在する。新たな耐性機構は世界中に出現し、拡散する。
【０００３】
抗菌耐性による日常的な問題を考慮すると、新たな種類の抗菌剤が強く必要とされる。特に、抗菌ペプチドは非常に興味深い。これらのペプチドは、一般的に強力である。更に、これらのペプチドは、治療薬として一般的に使用される低分子よりも選択性及び特異性が良好であることが多い。
【０００４】
とはいうものの、これらのペプチド使用及び治療のための開発の主な限界は、それらの半減期と関係している。実際に、これらのペプチドは、生体内に存在するプロテアーゼ及びペプチダーゼの作用によって通常減少してしまう。
【０００５】
したがって、ペプチド分解を抑制するために、エキソペプチダーゼに対するC-アミド化及びN-アセチル化、非天然アミノ酸又はD型アミノ酸の導入等の数多くの戦略が開発されてきた。しかし、これらの戦略は、合成ペプチドの場合にだけ使用することができ、ペプチドの組換え生成には適していない。特に、ペプチド中にD型アミノ酸を導入する簡単な方法はないが、このような修飾には興味が持たれる。実際に、D型アミノ酸は天然のアミノ酸と同じ特性を示すが、通常プロテアーゼに対してより耐性があり、免疫原性も少ない可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第2007/0184015号、SooNKap HahN等
【特許文献２】国際公開第2005/006938号パンフレット
【特許文献３】国際公開第99/43835号パンフレット
【特許文献４】国際公開第96/00787号パンフレット
【特許文献５】国際公開第00/56900号パンフレット
【特許文献６】国際公開第94/25612号パンフレット
【特許文献７】国際公開第00/24883号パンフレット
【特許文献８】欧州特許第238023号
【特許文献９】国際公開第96/00787号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第4,889,803号
【特許文献１１】米国特許第5,047,335号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Butcher等(2007、J Bacteriol, 189、8616)
【非特許文献２】Lippincott Williams & Wilkins, 2000
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【非特許文献３４】Mazodier等、1989、J. Bacteriol. 171: 3583〜3585頁
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【非特許文献４２】Hawksworth等、「Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi」、8版、1995、CAB International, University Press, Cambridge, UK
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【非特許文献４４】Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980
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【非特許文献５０】Hinnen等、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920
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【非特許文献５２】Soding, J. (2005)「Protein homology detection by HMM-HMM comparison」. Bioinformatics 21、951〜960頁
【非特許文献５３】Butcher等、2007、J Bacteriol, 189、8616
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
結論として、いかなる新たな種類の抗菌剤、特に抗菌ペプチドにも大いに興味が持たれる。更に、それに関連して、ペプチド中のL型アミノ酸をD型アミノ酸に修飾するために適したいかなる方法も非常に有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、細菌、すなわち、D-アミノ酸残基を保有するバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)から得られた抗菌ペプチドを同定した。したがって、本発明者等は、新たな種類のバクテリオシンを発見した。このペプチドは、そのアミノ酸の一部がD配置であるときのみ抗菌効果を示す特異性を有する。このペプチドは、ペプチド中におけるアミノ酸の配置をL配置からD配置に変化させる特性を示す同細菌から得られた酵素によって調製することができる。したがって、この酵素は、ペプチド、特に、組換え生成によって調製したペプチド中におけるL型アミノ酸をD型アミノ酸に変換するために有用であり得る。
【００１０】
したがって、本発明は、配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する17残基の配列を含む、少なくとも2個のD型アミノ酸を有する抗菌ペプチドであって、前記配列が配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号69と配列番号71の間に4〜8個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸であり、配列番号69及び71の残基[V/I/A]がD配置を有する、抗菌ペプチドに関する。
【００１１】
好ましくは、このペプチドは、W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-XC-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H(配列番号72)の配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなり、Xa、Xb及びXcは極性アミノ酸であり、Xdは脂肪族アミノ酸であり、Xeは任意のアミノ酸である。より好ましくは、このペプチドは、W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[L/V/A]-G-S-[A/G]-H(配列番号73)の配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなる。
【００１２】
好ましい実施形態では、このペプチドは、配列番号61〜68からなる群から選択される配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなる。
【００１３】
一実施形態では、このペプチドは、配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する24残基の配列を含み、前記配列は配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号21と配列番号69の間に4〜7個のアミノ酸の連結配列を含み、X4は任意のアミノ酸である。
【００１４】
好ましくは、このペプチドは配列L-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(配列番号23)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X1、X2、X3及びX4は任意のアミノ酸である。より好ましくは、X1はアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、X2はリジン、アスパラギン又はアスパラギン酸であり、X3はバリン、イソロイシン又はグルタミンである。
【００１５】
好ましくは、このペプチドは配列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(配列番号24)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X4は疎水性アミノ酸であり、好ましくは、ロイシン、バリン、アラニン又はメチオニンである。
【００１６】
好ましくは、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)中のバリン又はイソロイシンはD配置であり、配列W-I/V-X4-G-S(配列番号22)中のイソロイシン又はバリンはD配置である。
【００１７】
好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号20の配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなり、19位のバリンはD配置であり、27位のイソロイシンはD配置である。
【００１８】
本発明はまた、本発明によるペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明は更に、薬物、好ましくは抗菌剤、より好ましくは抗細菌剤として使用するための本発明によるペプチドに関する。本発明は、医薬、好ましくは、抗菌剤、より好ましくは抗細菌剤の製造のための本発明によるペプチドの使用に関する。本発明は、治療量の本発明によるペプチドを投与する工程を含む、それらを必要とする対象を治療するための方法に関する。
【００２０】
本発明は、本発明によるペプチドを調製するためのインビトロにおける方法に関し、この方法は、配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する17残基の配列を含むペプチドであって、前記17残基の配列が配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号69と配列番号71の間に4〜8個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸であるペプチドと、配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220〜225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位の70%が保存されているラジカルSAMペプチドエピメラーゼとを接触させる工程を含む。
【００２１】
一実施形態では、このペプチドは、配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する24残基の配列を含み、前記配列は配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)及び配列番号21と配列番号22の間に4〜7個のアミノ酸である連結配列を含み、X4は任意のアミノ酸である。
【００２２】
更に、配列番号25と少なくとも30%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220〜225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位の70%が保存されているラジカルSAMペプチドエピメラーゼの、本発明によるペプチドの調製のための使用に関する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する17残基の配列を含むペプチドであって、前記配列が配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号69と配列番号71の間に4〜8個のアミノ酸の連結配列を含み、X4が任意のアミノ酸であるペプチドをコードする異種核酸、並びに配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸を有し、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220〜225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位の70%が保存されているエピメラーゼをコードする異種核酸を含み、ペプチド及びエピメラーゼを同時発現することができる組換え宿主細胞に関する。一実施形態では、このペプチドは、配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有する24残基の配列を含み、前記配列は配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)及び配列番号21と配列番号22の間に4〜7個のアミノ酸である連結配列を含み、X4は任意のアミノ酸である。
【００２４】
最後に、本発明は、本発明による組換え宿主細胞をペプチド及びエピメラーゼの同時発現に適した条件で培養する工程並びに少なくとも1個のD型アミノ酸を有するペプチドを回収する工程を含む、本発明によるペプチドを調製するための方法、又はL型及びD型アミノ酸の組み立てを可能にするペプチド合成のために使用する合成方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
バチルス・スブチリスのyydFGHIJオペロンを研究することによって、本発明者等は第1に新種の抗菌ペプチド、第2にインビトロにおいてペプチド中のL型アミノ酸をD型残基に変換することができるエピメラーゼを同定した。したがって、このエピメラーゼはペプチド操作に有用である。
【００２６】
抗菌ペプチド
おそらく細菌の細胞壁強度の感知に関与する2成分系LiaRSの調節に関与する遺伝子の検索において、Butcher等(2007、J Bacteriol, 189、8616)はLiaRS発現を誘導すると考えられるオペロンYydFGHIJを同定した。しかし、このオペロンのどの成分もインビトロにおいて単離することも調査することもできなかった。
【００２７】
本発明者等は、このオペロンがペプチドYydFを生成し、このペプチドが非常に驚くべきことに、新種のラジカルSAMエピメラーゼをコードするYydG酵素によって翻訳後修飾されることを示した。更に、本発明者等は、YydFペプチドは抗菌活性を有するが、これは、D型アミノ酸を含む場合だけであることを発見した。D型アミノ酸がないと、このペプチドは、生理活性ペプチドにおいて今まで知られていない特性であるこの抗菌活性が欠如する。より詳細には、この抗菌活性には2個のD型アミノ酸が必要である。
【００２８】
したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号1の33位から49位における配列と少なくとも40%の同一性を有する17残基の配列を含む、少なくとも1個のD型アミノ酸、好ましくは2個のD型アミノ酸を有するペプチドに関する。特に、このペプチドは、配列番号1の33位から49位における配列と少なくとも45、50、55、60、70、80、85、90、95、98又は99%の同一性を有する17残基の配列を含むことができる。或いは、このペプチドは、配列番号1の33位から49位における17残基の配列及び1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の置換、付加又は欠失を含むことができる。
【００２９】
好ましい一実施形態では、このペプチドは、配列番号1の33〜35、40〜43、46及び47位の残基が保存されている配列を含む。更なる一態様では、配列番号1の36及び44位の残基は、V、I及びA、好ましくはV及びIからなる群から選択される。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有し、配列W-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)を含む、少なくとも2個のD型アミノ酸を有するペプチドであって、X4が疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン、バリン又はアラニンである17残基の配列を含む、ペプチドに関する。特に、このペプチドは、配列番号1の33位から49位における配列と少なくとも40、45、50、55、60、70、80、85、90又は95%の同一性を有する17残基の配列を含むことができる。所望により、このペプチドは更に、配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)を含む。好ましくは、配列番号69及び71のアミノ酸[V/I/A]はD型アミノ酸である。ペプチド配列において、N末端からC末端までの方向を考慮すると、配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)は配列W-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)、好ましくはW-[I/V]-X4-G-S(配列番号22)の前にある。好ましい実施形態では、モチーフW-Y-F-[V/I/A](配列番号71)は、4個から8個のアミノ酸を含む結合配列、好ましくは5個若しくは7個のアミノ酸、好ましくは6個のアミノ酸の結合配列によって、モチーフW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)、好ましくはW-[I/V]-X4-G-S(配列番号22)から隔てられている。最も好ましい実施形態では、このペプチドは、W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-Xa-Xb-Xc-N-R-W-[V/I/A]-Xd-G-S-Xe-H(配列番号72)の配列を含み、Xa、Xb及びXcは極性アミノ酸であり、Xdは脂肪族アミノ酸であり、Xeは任意のアミノ酸である。好ましくは、XaはS、N、C及びTの群から選択され、より好ましくはS又はNである。好ましくは、XbはS、N、T、Q、D、E、K、R及びHからなる群から選択され、より好ましくはS、N、Q及びK、更により好ましくはS、Q及びKからなる群から選択される。好ましくは、XcはS、N、T、Q、D、E、K、R及びHからなる群から選択され、より好ましくはS、N、Q、E、R及びK、更により好ましくはE、K、S及びQからなる群から選択される。好ましくは、XdはL、I、V、A、より好ましくはL、V及びAからなる群から選択される。好ましくは、XeはA、G又はS、より好ましくはA又はGからなる群から選択される。
【００３１】
非常に特異的な実施形態では、このペプチドは、W-Y-F-[V/I/A]-[K/R]-[S/N]-[S/Q/K]-[E/K/S/Q]-N-R-W-[V/I/A]-[L/V/A]-G-S-[A/G]-H(配列番号73)の配列から本質的になるか、又はこの配列からなる。
【００３２】
本発明の一態様では、このペプチドは、配列番号61〜68からなる群から選択される配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなる。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、配列番号1の26位から49位における配列と少なくとも40%の同一性を有する24残基の配列を含む、少なくとも1個のD型アミノ酸、好ましくは2個のD型アミノ酸を有するペプチドに関する。特に、このペプチドは、配列番号1の26位から49位における配列と少なくとも45、50、60、70、80、85、90、95、98又は99%の同一性を有する24残基の配列を含むことができる。或いは、このペプチドは、配列番号1の26位から49位における24残基の配列及び1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の置換、付加又は欠失を含むことができる。
【００３４】
好ましい一実施形態では、このペプチドは、配列番号1の26、31〜35、43、46及び47位の残基が保存されている配列を含む。更なる態様では、配列番号1の23、25、27〜30、36、37、38、41、42、44、48及び49位の1つ又は数個の残基はまた保存されている。例えば、配列番号1の23、25、27〜30、36、37、38、41、42、44、48及び49位の1〜11個の残基、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個の残基は保存されていてもよい。より好ましくは、配列番号1の23、25、27〜30、36、37、38、41、42、44、48及び49位の残基は保存されている。更により好ましくは、配列番号1の25、29及び38位の残基は保存されている。
【００３５】
次に、本発明によるペプチドは、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)、特にL-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(配列番号23)又は/及びW-I/V/A-X4-G-S(配列番号22)を含み、X1、X2、X3及びX4は任意のアミノ酸である。所望により、このペプチドは両配列を含む。所望により、配列W-I/V/A-X4-G-S(配列番号69)は配列W-I/V-X4-G-S(配列番号22)である。好ましくは、X1はアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、好ましくはアラニン及びアスパラギン酸、より好ましくはアラニンである。好ましくは、X2はリジン、アスパラギン又はアスパラギン酸、好ましくはリジン又はアスパラギン、より好ましくはリジンである。好ましくは、X3はバリン、イソロイシン又はグルタミン、好ましくはバリン又はイソロイシン、より好ましくはバリンである。好ましくは、X4は疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン、バリン、アラニン又はメチオニンである。特定の実施形態では、X1はアラニン及びアスパラギン酸、好ましくはアラニンであり、X2はリジン又はアスパラギン、好ましくはリジンであり、X3はバリン又はイソロイシン、好ましくはバリンであり、X4は疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン、バリン又はアラニンである。好ましい実施形態では、このペプチドは、配列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(配列番号24)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X4は疎水性アミノ酸であり、好ましくは、ロイシン、バリン又はアラニンである。「I/V」又は「V/I」は本明細書ではイソロイシン又はバリンを意味する。「N/D」は本明細書ではアスパラギン又はアスパラギン酸を意味する。「I/V/A」は本明細書ではイソロイシン、バリン又はアラニンを意味する。
【００３６】
好ましい態様では、配列W-I/V-X4-G-S(配列番号22)において、I/Vはイソロイシンである(配列番号57)。或いは、配列W-I/V-X4-G-S(配列番号22)において、I/Vはバリンである(配列番号58)。別の態様では、W-I/V/A-X4-G-S(配列番号69)はW-A-X4-G-S(配列番号70)である。好ましくは、X4は疎水性アミノ酸、より好ましくはロイシン、バリン、アラニン又はメチオニンであり、更により好ましくはロイシン、バリン又はアラニンである。
【００３７】
好ましい態様では、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)では、N/Dはアスパラギンであり、I/Vはバリンである。或いは、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)では、N/Dはアスパラギン酸であり、I/Vはイソロイシンである。
【００３８】
ペプチド配列において、N末端からC末端までの方向を考慮すると、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)、特にL-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(配列番号23)は配列W-I/V-X4-G-S(配列番号22)の前にある。
【００３９】
好ましい実施形態では、モチーフN/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)は、4個から7個のアミノ酸を含む結合配列、好ましくは5個又は6個のアミノ酸の、好ましくは5個のアミノ酸の結合配列によって、モチーフW-I/V-X4-G-S(配列番号22)から隔てられている。最も好ましい実施形態では、このペプチドはN/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-I/V-X4-G-S(配列番号59)又はN/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)6-W-I/V-X4-G-S(配列番号60)の配列を含み、X4は上記と同じ意味を有する。
【００４０】
次に、好ましい実施形態では、本発明は、配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有し、配列L-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(配列番号24)及び/又はW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含む、少なくとも2個のD型アミノ酸を有するペプチドであって、X4が疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン、バリン又はアラニンである24残基の配列を含む、ペプチドに関する。特に、このペプチドは、配列番号1の26位から49位における配列と少なくとも45、50、60、70、80、85、90又は95%の同一性を有する24残基の配列を含むことができる。好ましい実施形態では、配列番号1の23、25、27〜30、36、37、38、41、42、44、48及び49位の1個又は数個の残基、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個の残基はまた保存されている。
【００４１】
このペプチドは少なくとも1個のD型アミノ酸、好ましくは2個のD型アミノ酸を含む。例えば、1、2、3、4又は5個のD型アミノ酸を含んでいてもよい。所望により、D型アミノ酸は任意のアミノ酸、好ましくはI、V、A、N、S及びTからなる群から選択される、より好ましくは、I、V及びAからなる群から選択される、更により好ましくはI及びVからなる群から選択されるアミノ酸であってもよい。
【００４２】
特定の実施形態では、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)中のバリン、イソロイシン又はアラニンはD配置であり、及び/又は配列W-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)、好ましくは配列W-I/V-X4-G-S(配列番号22)中のイソロイシン、バリン又はアラニンはD配置である。好ましい実施形態では、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)中のバリン、イソロイシン又はアラニン及び配列W-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)、好ましくはW-I/V-X4-G-S(配列番号22)中のイソロイシン、バリン又はアラニンはD配置である。好ましい態様では、N/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)5-W-I/V-X4-G-S(配列番号59)又はN/D-D-L-W-Y-F-V/I-(X)6-W-I/V-X4-G-S(配列番号60)の配列中のバリン又はイソロイシンはD配置である。所望により、ペプチドは更にD型アミノ酸を含んでいてもよい。
【００４３】
好ましくは、ペプチドの長さは、アミノ酸約65個以下、より好ましくはアミノ酸50個以下であり、特にアミノ酸約15個から約50個であり、例えば、アミノ酸約17個から約50個、アミノ酸約18個から約50個、アミノ酸約17個から約40個、アミノ酸約20個から約40個又は約25個から約35個であってもよい。
【００４４】
ペプチドは、配列番号1〜19で示したアミノ酸配列又は配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)、特にL-X1-X2-X3-N-D-L-W-Y-F-V/I(配列番号23)及び/又はW-I/V-X4-G-S(配列番号22)、より好ましくはL-A-K-V-N-D-L-W-Y-F-V(配列番号24)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含むそれらの機能的断片からなる群から選択される配列を含むか、それらの配列から本質的になるか又はそれらの配列からなっていてもよい。機能的とは、抗菌活性、特に抗細菌活性を有することである。
【００４５】
非常に特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号20の配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなり、19位のバリンはD配置であり、及び/又は27位のイソロイシンはD配置である。好ましくは、19位のバリン及び27位のイソロイシンはいずれもD配置である。
【００４６】
別の非常に特定の実施形態では、ペプチドは、配列番号1の配列を有し、36位のバリンはD配置であり、及び/又は44位のイソロイシンはD配置である。好ましくは、36位のバリン及び44位のイソロイシンはいずれもD配置である。
【００４７】
特定の実施形態では、このペプチドは天然には見いだされない。このペプチドは非天然のペプチドである。
【００４８】
本明細書で記載したペプチドのN末端及びC末端は所望によりタンパク質分解に対して保護されていてもよい。好ましい実施形態では、N末端はアセチル基の形態であってもよく、及び/又はC末端はアミド基の形態であってもよい。好ましい実施形態では、ペプチドのC末端は遊離である。
【００４９】
或いは、又は更に、タンパク質分解に耐性のあるペプチドの内部修飾も想定され、例えば、少なくとも-CONH-ペプチド結合は修飾されて(CH2NH)還元結合、(NHCO)レトロインベルソ結合、(CH2-O)メチレン-オキシ結合、(CH2-S)チオメチレン結合、(CH2CH2)カルバ結合、(CO-CH2)セトメチレン結合、(CHOH-CH2)ヒドロキシエチレン結合、(N-N)結合、E-アルケン結合又は-CH=CH-結合によっても置換される。
【００５０】
例えば、ペプチドはアセチル化、アシル化、アミド化、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、リン酸化等によって修飾されていてもよい。
【００５１】
本発明によるペプチドは、希少アミノ酸、特に、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、6-N-メチルリジン、N-エチルグリシン、N-メチルグリシン、N-エチルアスパラギン、アロ-イソロイシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、又は合成アミノ酸、特に、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン及びシクロヘキシル-アラニンである1個又は複数のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００５２】
所望により、ペプチドは、所望によりリンカー又はスペーサー(例えば、ジグリシン)によって付加部分に結合することができる。所望により、ペプチドはタンパク質融合物の一部であってもよい。付加部分は、その細胞摂取又は進入を容易にする部分、特に、PTD(タンパク質形質導入ドメイン)又は細胞貫通ペプチド;ホーミングペプチド;PEG(ポリエチレングリコール)、オリゴ-N-メトキシ-エチルグリシン(NMEG)、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はイムノグロブリンFCドメイン等の安定化剤;免疫-タグ、ビオチン、レクチン又はキレート剤等の親和性タグ;His-タグ等の精製タグ;光学的タグ、キレート化ランタニド、蛍光色素又はFRETアクセプター/ドナー等の検出可能なラベル;標的化部分;分泌シグナルペプチド;又はそれらの組み合わせであってもよい。付加部分は、ペプチドのN末端又はC末端のいずれかに付加することができる。好ましくは、付加部分は、ペプチドのN末端に付加する。
【００５３】
本発明の別の態様では、使用した治療用量での尿中への排泄を低減し、血漿中での半減期を延長するために、ペプチドはそれらのC末端又はリジン残基をポリエチレングリコール(PEG)分子、特に1500MW若しくは4000MWのPEGに共有結合させる。更に別の実施形態では、薬物送達系を形成する小球体用の生分解性で生体適合性のポリマー材料中にペプチドを含めることによって、ペプチド半減期を延長する。ポリマー及びコポリマーは、例えば、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)である(米国特許第2007/0184015号、SooNKap Hahn等において例示された通り)。
【００５４】
本発明はまた、本発明によるペプチドの薬学的に許容される塩を包含する。薬学的に許容される塩は、薬学的技術で通常使用される、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸等の薬学的に許容される無機酸の塩;酢酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、アスコルビン酸及び酒石酸等の薬学的に許容される有機酸の塩;ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム又はアンモニウムの塩等の薬学的に許容される無機塩基の塩;或いは塩形成可能な(salifiable)窒素を含有する有機塩基の塩であってもよい。前記塩の調製方法は、当業者には周知である。
【００５５】
好ましい実施形態では、ペプチドは単離する。
【００５６】
抗菌ペプチドの使用
本発明は、前記で定義したペプチドを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は更に、薬学的に許容される担体及び/又は賦形剤を含むことができる。薬学的使用は、獣医学的使用も検討される。所望により、医薬組成物は更に、別の活性成分、好ましくは別の抗菌剤、より好ましくは別の抗細菌剤又は抗炎症剤を含むことができる。
【００５７】
この分子を含む医薬組成物は、当業者には公知の標準的な医薬実務(Lippincott Williams & Wilkins, 2000並びにEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. Swarbrick及びJ. C. Boylan著, 1988〜1999、Marcel Dekker, New York)に従って製剤化する。
【００５８】
本発明はまた、薬物、特に抗菌剤、より好ましくは抗細菌剤として使用するための前記で定義したペプチドに関する。更に、抗菌剤、より好ましくは抗細菌剤として使用するための医薬を製造するための前記で定義したペプチドの使用にも関する。更に、治療有効量の前記で定義したペプチドを投与する工程、それによって感染を治療又は予防する工程を含む、感染、特に細菌感染を治療又は予防するための方法に関する。
【００５９】
好ましい実施形態では、前記で定義したペプチドは、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)中のバリン、イソロイシン又はアラニン及び配列W-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)、好ましくはW-I/V-X4-G-S(配列番号22)中のイソロイシン、バリン又はアラニンがD配置である。非常に特異的な実施形態では、ペプチドは、配列番号20の配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなり、19位のバリン及び27位のイソロイシンはD配置である。別の非常に特定の実施形態では、このペプチドは、配列番号1の配列を有し、36位のバリン及び44位のイソロイシンはD配置である。別の非常に特定の実施形態では、このペプチドは、配列番号61〜68からなる群から選択される配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなり、4位及び12位の残基はD配置である。
【００６０】
所望により、前記で定義したペプチドは、別の薬物、好ましくは別の抗菌剤、より好ましくは別の抗細菌剤又は抗炎症剤と組み合わせて使用することができる。
【００６１】
「治療する」又は「治療」とは、疾患を治癒、軽減又は遅延させることを意味する。これには予防的又は治療的処置が含まれる。
【００６２】
本出願で使用した「治療有効量」という用語は、感染の治療を引き起こすのに十分な、患者に投与する治療薬の量を意味する。
【００６３】
医薬組成物の形態、投与経路、投薬量及び投与計画はもちろん、治療する症状、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別等に左右される。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与等のために製剤化することができる。
【００６５】
経口投与のために、組成物は錠剤、カプセル、散剤、顆粒並びにシロップ剤、エリキシル剤及び濃縮ドロップ等の液体調製物等の従来の経口剤形に製剤化することができる。例えば、薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩等を含む非毒性固形担体又は希釈剤を使用してもよい。圧縮錠剤のために、粉末材料に粘着性を付与する薬剤である結合剤も必要である。例えば、デンプン、ゼラチン、ラクトース又はデキストロース等の糖類、及び天然又は合成ゴムを結合剤として使用することができる。崩壊剤も錠剤の分解を容易にするために錠剤には必要である。崩壊剤には、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、ゴム及び架橋ポリマーが含まれる。更に、製造工程における錠剤材料の表面への付着を防御し、製造中の粉末材料の流動特性を改善するために、滑沢剤及び流動促進剤も錠剤に含める。コロイド状二酸化シリコンは流動促進剤として最も一般的に使用され、タルク又はステアリン酸等の化合物は滑沢剤として最も一般的に使用される。
【００６６】
経皮投与のために、組成物は、軟膏、クリーム又はジェル形態に製剤化することができ、浸透を容易にするためにジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド及びジメチルホルムアミド等の適切な浸透剤又は界面活性剤を使用することができる。
【００６７】
経粘膜投与のために、経鼻スプレー、直腸又は膣坐剤を使用することができる。活性化合物は、当業界で公知の方法によって公知の坐剤基剤のいずれかに組み込むことができる。このような基剤の例には、カカオ脂、ポリエチレングリコール(カーボワックス)、モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン及びこれらの混合物と共に融点又は溶解率を改変するために適合したその他の材料が含まれる。
【００６８】
本発明による医薬組成物は、実質的に投与直後又は投与後の所定の時点若しくは期間に活性薬物を放出するために製剤化することができる。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、本発明の分子0.001mgから10gを含む。好ましくは、本発明による医薬組成物は、本発明の分子0.01mgから1gを含む。
【００７０】
更に別の態様では、本発明は、消毒薬、保存剤又は殺虫剤としての本発明によるペプチドの使用に関する。「消毒薬」という用語は、表面(例えば、壁、ドア、医療器具)、液体(例えば、水)又はガス(例えば、麻酔ガス)でのペプチドの抗菌活性に関する。一実施形態では、本発明によるペプチドは、細菌バイオフィルムの排除のために使用する。好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは特に、手術又は人工器官の消毒のために使用する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、本発明によるペプチドでコーティングされた、又は本発明によるペプチドを含む少なくとも1つの表面を有する本体を含む医療装置又は移植物に関する。本発明はまた、装置又は移植物の少なくとも1つの表面に、本発明によるペプチドのコーティングを適用するか、又は接触して設置する工程を含む、医療装置又は移植物の調製方法に関する。
【００７２】
この種類の医療装置又は移植物並びにそれらの使用及び調製方法は、例えば、国際公開第2005/006938号パンフレットの特許出願に記載されている。
【００７３】
本発明によるペプチドでコーティングされた、又は本発明によるペプチドを含む表面は、ポリエチレン、ダクロン、ナイロン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ラテックス、シリコーンエラストマー等の熱可塑性材料若しくはポリマー材料又は金等の金属材料から構成されていてもよい。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、そのN末端若しくはC末端を介して、機能化した表面、好ましくは金属表面に共有的に結合する。所望により、ペプチドはスペーサー腕によって表面に結合していてもよい。
【００７４】
好ましくは、表面は、ペプチドで0.4から300mg/cm2の密度でコーティングしてもよい。
【００７５】
或いは、装置又は移植物、特に骨及び関節の人工器官は、本発明によるペプチドを含むセメント混合物でコーティングしてもよい。
【００７６】
ペプチドは、別の活性分子、好ましくは抗生物質と組み合わせてもよい。
【００７７】
装置又は移植物は、例えば、血管内、腹腔内、胸膜及び泌尿器カテーテル、心臓弁、心臓ペースメーカー、血管シャント、冠状動脈シャント、歯科補綴物又は整形外科用人工器官若しくは眼内人工器官であってもよい。
【００７８】
ペプチドの調製
本明細書で記載したペプチドは、当業者に公知の標準的な合成方法、例えば、化学合成又は遺伝子組換えを使用して合成することができる。特に、ペプチドは、最初にMerrifieldによって記載された方法によって合成することができる。
【００７９】
化学合成技術の例は、固相合成及び液相合成である。固相合成では、例えば、合成するペプチドのC末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒中で不溶性の支持体に結合させ、1つは適切な保護基で保護されたアミノ基及び側鎖官能基を有するアミノ酸をC末端からN末端の順に1つずつ縮合する反応、1つは樹脂に結合したアミノ酸又はペプチドのアミノ基の保護基を開放する反応を交互に反復することによって、ペプチド鎖をこの方法で伸長する。固相合成法は、使用する保護基の種類に応じて、主にtBoc法及びFmoc法に分類される。典型的に使用される保護基には、アミノ基用にtBoc(t-ブトキシカルボニル)、Cl-Z(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、Br-Z(2-ブロモベンジルオキシカルボニル)、Bzl(ベンジル)、Fmoc(9-フルオレニルメトキシボニル)、Mbh(4,4'-ジメトキシジベンズヒドリル)、Mtr(4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル)、Trt(トリチル)、Tos(トシル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)及びClz-Bzl(2,6-ジクロロベンジル)、グアニジノ基用にNO2(ニトロ)及びPmc(2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル)、並びにヒドロキシル基用にtBu(t-ブチル)が含まれる。所望するペプチドを合成した後、脱保護反応を行い、固相支持体から切断する。このようなペプチド切断反応は、Boc法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸で、Fmoc法ではTFAで実施することができる。
【００８０】
或いは、ペプチドは組換え技術を使用して合成することができる。この場合、本発明によるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸及び/又は遺伝子構築物を使用する。したがって、本発明は、本発明によるペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸及び/又は遺伝子構築物に関する。遺伝子構築物は、本明細書で定義した本発明によるペプチドをコードするポリヌクレオチド及び宿主細胞における本発明によるペプチドの発現(例えば、転写及び翻訳)を可能にする調節配列(適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等)を含む。したがって、別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを発現する(又は適切な環境下で発現することができる)、及び/又は本発明のポリヌクレオチド又は本発明の遺伝子構築物を含有する宿主又は宿主細胞に関する。
【００８１】
D-アミノ酸を含有するペプチドを得るために、ペプチドは本発明で記載したペプチドエピメラーゼと共に同時発現することができる。
【００８２】
ペプチド生成方法は、所望により、前記ペプチドを精製する工程、前記ペプチド化学的に修飾する工程、及び/又は前記ペプチドを医薬組成物に製剤化する工程を含むことができる。例えば、本明細書で記載したペプチドは、組換え技術によって、分泌シグナルペプチド又は精製タグとのタンパク質融合物として調製することができる。この分泌シグナルペプチド又は精製タグは、更なる生成段階で切断又は除去することができる。
【００８３】
本発明の特定の対象では、ペプチドの調製方法は、L型アミノ酸を有する前述のペプチドを提供又は合成する工程、及びこのペプチドを酵素(すなわち、エピメラーゼ)と接触させ、それによって前記ペプチドの少なくとも1個のL型アミノ酸をD型アミノ酸に変換する工程を含み、エピメラーゼとは以下に定義する通りである。
【００８４】
ラジカルSAMエピメラーゼ
本発明者等は、ペプチドに含有されるアミノ酸の配置をL配置からD配置に修飾することができるバチルス・スブチリスにおけるYydGと呼ばれるラジカルSAMエピメラーゼを同定した。この酵素は、インビトロ条件においても変換を実行することができる。その配列は配列番号18で示される。更に、この酵素は、ラジカルSAM酵素スーパーファミリー内であっても、その他の公知のエピメラーゼとは関係がない。
【００８５】
したがって、本発明は、ペプチドに含有されるアミノ酸の配置をL配置からD配置に修飾することができ、配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ配列を含むエピメラーゼに関する。好ましくは、このエピメラーゼは、配列番号25と少なくとも35、40、50、60、70、80、85、90、95、97.5又は99%の同一性を有するアミノ配列を含む。
【００８６】
バチルス・スブチリスのYydGは、以下の識別番号で公開データベースに示されている:UniProt Q45595;GeneID 937720;GenBank NP_391897.1及びNC_000964.3。
【００８７】
本開示の教示に基づいて、当業者は、ラジカルSAMエピメラーゼを有する微生物からその他の酵素を同定することができる。ポリペプチドは、天然から単離された微生物を含むその他の原料(例えば、土壌、コンポスト、水等)、又は天然の材料(例えば、土壌、コンポス、水等)からプローブを使用して直接得られたDNA試料から同定して入手することができる。天然の生育地から微生物及び直接DNAを単離するための技術は、当業界ではよく知られている。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは次に、別の微生物のゲノムDNA若しくはcDNAライブラリー又は混合DNA試料を同様にスクリーニングすることによって入手することができる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを一旦検出したら、ポリヌクレオチドは当業者に公知の技術を利用することによって単離又はクローニングすることができる(例えば、Sambrook等、1989を参照のこと)。当業者はまた、データベース中の既に利用可能な配列データを使用することができる。更に、当業者は、現在使用している方法によって配列番号25のアミノ酸配列を有するエピメラーゼの変種を調製することができる。特に、安定性増加(例えば、熱安定性)、D型アミノ酸の生成増加、エピメラーゼの特異性及び/又は選択性の改変等の有利な特性を備えた変種。
【００８８】
配列番号25と比較して100%同一な配列をUniprot AOAOC2UHS5、AOAOA1MJP5及びL8AWU7で開示する。その他のバチルス・スブチリス株は高い同一性(最高90%の同一性)を備えた配列を示し、配列番号26〜29及び32で開示されている。その他のバチルス株は高い同一性を備えた配列を示し、配列番号30及び33〜35で開示されている。著しい同一性を備えた配列は、サリニバチルス・アイディンゲンシス(Salinibacillus aidiingensis)、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス(Staphylococcus pseudintermedius)、スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermidis)、パエニバチルス(Paenibacillus)種、エンテロコッカス・カカエ(Enterococcus caccae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、コリネバクテリウム・ジブテリア(Corynebacterium diphtheria)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)及びビフィドバクテリウム・ボヘミカム(Bifidobacterium bohemicum)で同定されたことがあり、配列番号31及び36〜52で開示されている。図6は、酵素配列のアラインメントを示す。
【００８９】
【化１】
2019500338.tif 000002
【００９０】
太字及び下線を引いた位置は、上記で開示した配列のリストにおいて完全に保存されている。太字及びイタリック体の位置は、上記で開示した配列のリストにおいて非常に類似した特性の群の間で保存されている。したがって、同一性百分率が約30%であっても、完全に保存されている、及び十分に保存されているアミノ酸の数が多いことが認められ得る。
【００９１】
したがって、好ましい実施形態では、エピメラーゼは、配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列を配列番号25と整列させたとき、太字及び下線を引いた位置の70、80又は90%が保存されている(配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、150、152、169、176、180、181、183、204、206〜208、214、217、220-225、228、230、252、254、262、289、292、296及び309位)。好ましくは、太字及び下線を引いた位置の95%は保存されている。特定の実施形態では、太字及び下線を引いた位置は全て保存されている。より好ましくは、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、204、206〜208、214、217、220〜225、228及び230位の90又は95%がエピメラーゼ配列では保存されている。特定の実施形態では、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、204、206〜208、214、217、220〜225、228及び230位は全てエピメラーゼ配列では保存されている。
【００９２】
好ましい実施形態では、エピメラーゼは配列番号25と少なくとも30%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、13〜27、56〜63、83〜90、112〜120及び204〜230区域から選択される1つ又は数個の区域は配列番号25の配列と少なくとも50%の同一性を有する。この実施形態では、更に、エピメラーゼ配列では、配列番号25の14〜15、18、20〜24、27、58〜60、63、83、84、87〜90、112、115、117、120、204、206〜208、214、217、220〜225、228及び230位の90又は95%が保存されている。
【００９３】
特定の実施形態では、配列番号25の14、18、21、222及び223位のシステイン残基はエピメラーゼ配列では保存されている。
【００９４】
一実施形態では、エピメラーゼは配列番号25〜52、好ましくは配列番号25〜30、32及び34から選択される配列、より好ましくは配列番号25と少なくとも80、85、90又は95%の同一性を有する配列を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなるアミノ酸配列を有する。エピメラーゼは、配列番号25〜52、好ましくは配列番号25〜30、32及び34から選択される配列、より好ましくは配列番号25を含むか、この配列から本質的になるか、又はこの配列からなり、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の置換、付加又は欠失を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００９５】
エピメラーゼがペプチドに含有されるアミノ酸の配置をL配置からD配置に修飾する能力を試験するための方法は、例えば、実施例の項目で詳細に開示する。例えば、エピメラーゼは、補因子S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)の存在下で、配列番号1〜20からなる群から選択される配列を有するペプチドと接触させ、D型アミノ酸を含むペプチドの生成を検出する。より詳細には、エピメラーゼは、補因子S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)の存在下で、配列番号20のペプチドYydF18-49と接触させ、19位及び/又は27位にD型アミノ酸を含むペプチドの生成を検出する。
【００９６】
前記で定義した酵素のアミノ酸配列が別のポリペプチドの領域のN末端又はC末端に融合したハイブリッドポリペプチド又は融合ポリペプチドも提供する。融合ポリペプチドを生成するための技術は当業界では公知で、融合ポリペプチドがインフレームであり、融合ポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるように、酵素をコードするコーディング配列と別のポリペプチドの付加領域を連結する工程を含む。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に作製されるインテイン技術を使用して構築することができる(Cooper等、1993、EMBO J. 12: 2575〜2583頁; Dawson等、1994、Science 266: 776〜779頁)。
【００９７】
本開示による酵素の安定性を増強するため、細胞(細菌細胞又は酵母細胞等)からの融合タンパク質の分泌を促進するため(N末端疎水性シグナルペプチド等)、又は融合タンパク質の精製を支援するため、融合ポリペプチドの付加領域を選択することができる。より詳細には、付加領域は、酵素の精製又は固定のために有用なタグであってもよい。このようなタグは当業者には周知で、例えば、Hisタグ(His6)、FLAGタグ、HAタグ(インフルエンザタンパク質ヘマグルチニンから得られたエピトープ)、マルトース結合タンパク質(MPB)、MYCタグ(ヒトがん原タンパク質MYCから得られたエピトープ)、STREPタグ又はGSTタグ(低分子グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)である。
【００９８】
融合ポリペプチドは更に、酵素と付加領域の間に切断部位を含むことができる。融合タンパク質の分泌時に、この部位は切断されて2つのポリペプチドを放出する。切断部位の例には、限定はしないが、Martin等、2003、J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568〜576頁; Svetina等、2000、J. Biotechnol. 76: 245〜251頁; Rasmussen-Wilson等、1997、Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488〜3493頁; Ward等、1995、Biotechnology 13: 498〜503頁;及びContreras等、1991、Biotechnology 9: 378〜381頁; Eaton等、1986、Biochemistry 25: 505〜512頁; Collins-Racie等、1995、Biotechnology 13: 982〜987頁; Carter等、1989、Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240〜248頁;及びStevens, 2003、Drug Discovery World 4: 35〜48頁で開示された部位が含まれる。
【００９９】
前記で定義したエピメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸構築物又はベクターを更に提供する。より詳細には、核酸構築物又はベクターは前記エピメラーゼの発現のために適している。更に、前記で定義したエピメラーゼをコードする核酸配列を含む核酸、組換え核酸構築物又は組換えベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【０１００】
核酸構築物
実際に、本発明は、本発明のエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。核酸はDNA(cDNA若しくはgDNA)、RNA又はこの2つの混合物であってもよい。1本鎖形態又は2本鎖形態又はこの2つの混合物であってもよい。例えば、修飾された結合、修飾されたプリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾された糖を含む修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。化学合成、組換え及び変異誘発を含む当業者に公知の任意の方法によって調製することができる。
【０１０１】
本発明はまた、制御配列に適合した条件下で適切な宿主細胞においてコーディング配列の発現を導く1つ又は複数の制御配列に動作可能に結合した本開示によるエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。ポリヌクレオチドは、エピメラーゼを発現するために様々な方法で操作することができる。発現ベクターに応じて、ベクターに挿入する前にポリヌクレオチドを操作することが望ましいか又は必要なことがある。組換えDNA法を利用するポリヌクレオチドの修飾技術は当業界では周知である。
【０１０２】
制御配列は、宿主細胞によって認識されるプロモーター又は本発明のエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを発現するためのインビトロ発現系を含んでいてもよい。プロモーターは、エピメラーゼの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、切断型及びハイブリッドプロモーターを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよく、宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。所望により、プロモーターは誘導性であってもよい。
【０１０３】
細菌宿主細胞において適切なプロモーターの例は、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)のアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・リケニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)のマルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・スブチリスのレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・スブチリスのxylA及びxylB遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)のcrylllA遺伝子(Agaisse及びLereclus, 1994、Molecular Microbiology 13: 97〜107頁)、大腸菌(E. coli)のlacオペロン、大腸菌のtrcプロモーター(Egon等、1988、Gene 69: 301〜315頁)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)のアガラーゼ遺伝子(dagA)並びに原核生物ベータ-ラクタマーゼ遺伝子(Villa-Kamaroff等、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727〜3731頁)並びにtacプロモーター(DeBoer等、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21〜25頁)から得られたプロモーターである。更なるプロモーターは、「Useful proteins from recombinant bacteria」  Gilbert等、1980、Scientific American 242: 74〜94頁;及びSambrook等、1989に記載されている。タンデムプロモーターの例は国際公開第99/43835号パンフレットに開示されている。
【０１０４】
糸状菌宿主細胞において適切なプロモーターの例には、アスペルギルス・ニデゥランスのアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)の中性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー若しくはアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)のグルコアミラーゼ(glaA)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)のTAKAアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)のトリプシン様プロテアーゼ(国際公開第96/00787号パンフレット)、フザリウム・ベネナツム(Fusarium venenatum)のアミログルコシダーゼ(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウム・ベネナツムのDaria(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウム・ベネナツムのQuinn(国際公開第00/56900号パンレット)、リゾムコール・ミーハイ(Rhizomucor miehei)のリパーゼ、リゾムコール・ミーハイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)のベータ-グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイのセロビオヒドロラーゼI、トリコデルマ・リーゼイのセロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーゼイのキシラナーゼI、トリコデルマ・リーゼイのキシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイのベータ-キシロシダーゼの遺伝子から得られたプロモーター並びにNA2-tpiプロモーター(非翻訳リーダーがアスペルギルスのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子の非翻訳リーダーによって置換されているアスペルギルスの中性アルファ-アミラーゼ遺伝子の改変プロモーターであり、非限定的な例には、非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデゥランス又はアスペルギルス・オリザエのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子の非翻訳リーダーによって置換されているアスペルギルス・ニガーの中性アルファ-アミラーゼ遺伝子の改変プロモーター)、それらの変異体、切断型及びハイブリッドプロモーターが含まれる。
【０１０５】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のエノラーゼ(ENO-1)、サッカロマイセス・セレビシエのガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロマイセス・セレビシエのアルコール脱水素酵素/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH1、ADH2/GAP)、サッカロマイセス・セレビシエのトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、サッカロマイセス・セレビシエのメタロチオネイン(CUP1)及びサッカロマイセス・セレビシエの3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のためにその他の有用なプロモーターは、Romanos等、1992、Yeast 8: 423〜488頁に記載されている。
【０１０６】
制御配列はまた、転写を終了するために宿主細胞によって認識される転写ターミネーターであってもよい。ターミネーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの3'末端に動作可能に結合する。宿主細胞中で機能を果たす任意のターミネーターを本発明で使用することができる。
【０１０７】
細菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、バチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)のアルカリプロテアーゼ(aprH)、バチルス・リケニフォルミスのアルファ-アミラーゼ(amyL)及び大腸菌のリボソームRNA(rrnB)の遺伝子から得られる。
【０１０８】
糸状菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデゥランス(Aspergillus nidulan)のアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのアルファ-グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ及びフザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１０９】
酵母宿主細胞に好ましいターミネーターは、サッカロマイセス・セレビシエのエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエのチトクロームC(CYC1)及びサッカロマイセス・セレビシエのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に有用なその他のターミネーターは、Romanos等、1992、上記に記載されている。
【０１１０】
制御配列はまた、遺伝子の発現を増加させる、プロモーターの下流及び遺伝子のコーディング配列の上流にあるmRNA安定化領域であってもよい。
【０１１１】
適切なmRNA安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシスのcrylllA遺伝子(国際公開第94/25612号パンフレット)及びバチルス・スブチリスのSP82遺伝子(Hue等、1995、Journal of Bacteriology 177: 3465〜3471頁)から得られる。
【０１１２】
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要なmRNAの非翻訳領域であるリーダーであってもよい。リーダーは、エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドの5'末端に動作可能に結合する。宿主細胞中で機能を果たす任意のリーダーを使用することができる。
【０１１３】
糸状菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデゥランスのトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１１４】
酵母宿主細胞に適切なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエのエノラーゼ(ENO-1)、サッカロマイセス・セレビシエの3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエのアルファ因子及びサッカロマイセス・セレビシエのアルコール脱水素酵素/グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。
【０１１５】
制御配列はまた、転写したとき、転写したmRNAにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識されるポリアデニル化配列、すなわち、エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドの3'-末端に動作可能に結合した配列であってもよい。宿主細胞中で機能を果たす任意のポリアデニル化配列を使用することができる。
【０１１６】
糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデゥランス(Aspergillus nidulan)のアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのアルファ-グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ及びフザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１１７】
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、Guo及びSherman, 1995、Mol. Cellular Biol. 15: 5983〜5990頁に記載されている。
【０１１８】
制御配列はまた、エピメラーゼのN末端に結合したシグナルペプチドをコードし、細胞の分泌経路にエピメラーゼを導くシグナルペプチドコーディング領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコーディング配列の5'末端は、エピメラーゼをコードするコーディング配列の区域を有する翻訳リーディングフレームに天然に結合したシグナルペプチドコーディング配列を元々含有していてもよい。或いは、コーディング配列の5'末端は、コーディング配列にとって外来であるシグナルペプチドコーディング配列を含有していてもよい。外来シグナルペプチドコーディング配列は、コーディング配列が天然にシグナルペプチドコーディング配列を含有しない場合に必要なことがある。或いは、外来シグナルペプチドコーディング配列は、ポリペプチドの分泌を増強するために天然のシグナルペプチドコーディング配列と簡単に置換することができる。しかし、発現したポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコーディング配列を使用することができる。
【０１１９】
細菌宿主細胞に効果的なシグナルペプチドコーディング配列は、バチルス  NCIB 1 1837のマルトース生成アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスのスブチリシン、バチルス・リケニフォルミスのベータ-ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスのアルファ-アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスの中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)及びバチルス・スブチリスのprsAの遺伝子から得られたシグナルペプチドコーディング配列である。更なるシグナルペプチドは、Simonen及びPalva, 1993、Microbiological Reviews 57: 109〜137頁に記載されている。
【０１２０】
糸状菌宿主細胞に効果的なシグナルペプチドコーディング配列は、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエのTAKAアミラーゼ、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)のセルラーゼ、フミコーラ・インソレンスのエンドグルカナーゼV、フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)のリパーゼ及びリゾムコール・ミーハイのアスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング配列である。
【０１２１】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエのアルファ因子及びサッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼの遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコーディング配列は、Romanos  等、1992、上記に記載されている。
【０１２２】
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することも望ましいこともある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的又は物理的刺激に応答してオン又はオフする遺伝子の発現を引き起こす系である。原核生物系の調節系には、lac、tac及びtrpオペレーター系が含まれる。酵母では、ADH2系又はGAL1系を使用することができる。糸状菌では、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリザエのTAKAアルファ-アミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・オリザエのグルコアミラーゼプロモーターを使用することができる。調節配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にする配列である。真核生物系では、これらの調節配列には、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が含まれる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に動作可能に結合しているだろう。
【０１２３】
発現ベクター
本発明はまた、上記で開示した核酸構築物又は本発明のエピメラーゼをコードするポリヌクレオチド、プロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能にする1つ又は複数の便利な制限部位をこのような部位に含むことできる組換え発現ベクターを生成するために、様々なヌクレオチド及び制御配列を一緒に結合してもよい。或いは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現のために適切なベクターに挿入することによって発現することができる。
【０１２４】
特定の実施形態では、発現ベクターは更に、その発現のために必要な制御配列に動作可能に結合した、上記で開示したような本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。より詳細には、本発明のエピメラーゼ及びペプチドの発現のために使用した制御配列は、宿主細胞における同時発現に適している。所望により、ペプチドをコードするポリヌクレオチド及びエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、単一のプロモーター(すなわち、オペロン)又は同じか若しくは異なっていてもよい2つのプロモーターの制御下であってもよい。
【０１２５】
或いは、本発明は、本発明のエピメラーゼをコードする核酸を含む第1の発現ベクター及び本発明のペプチドをコードする核酸を含む第2の発現ベクターを含むキットに関する。別の選択肢では、キットは、本発明のエピメラーゼをコードする核酸及び本発明のペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを含むことができる。
【０１２６】
発現ベクターの作製において、コーディング配列が発現に適切な制御配列と動作可能に結合するように、コーディング配列をベクター内に配置する。
【０１２７】
組換え発現ベクターは、組換えDNA手法を便利に行うことができ、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター(例えば、プラスミド又はウイルス)であってもよい。ベクターの選択は典型的に、ベクターを導入する宿主細胞とベクターとの適合性に左右される。ベクターは、直鎖状又は閉環プラスミドであってもよい。
【０１２８】
ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製と独立しているベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を確実にするために任意の手段を含有していてもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであってもよい。更に、宿主細胞のゲノムに導入する全DNAを一緒に含有する単一のベクター若しくはプラスミド又は2つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを使用することができる。
【０１２９】
好ましくは、ベクターは、形質転換した、トランスフェクトした、形質導入した等の細胞の容易な選択を可能にする1つ又は複数の選択可能なマーカーを含有する。選択可能なマーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属耐性、原栄養性対栄養要求性等を提供する遺伝子である。
【０１３０】
細菌選択マーカーの例は、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を付与するバチルス・リケニフォルミス若しくはバチルス・スブチリスの遺伝子又はマーカーである。酵母宿主細胞に適切なマーカーには、限定はしないが、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3が含まれる。糸状菌宿主細胞で使用するための選択マーカーには、限定はしないが、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)及びtrpC(アントラニル酸合成酵素)並びにそれらの同等物が含まれる。アスペルギルス細胞で使用するための好ましいのは、アスペルギルス・ニデゥランス又はアスペルギルス・オリザエamdS及びpyrG遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)遺伝子である。
【０１３１】
好ましくは、ベクターは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込み又は細胞内におけるゲノムとは独立したベクターの自己複製を可能にする要素を含有する。
【０１３２】
宿主細胞ゲノムへの組み込みが生じる場合、配列のゲノムへの組み込みは、相同又は非相同組換えに基づいてもよい。或いは、ベクターは、染色体の正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組み込みを導くために、付加ポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置での組み込みの可能性を増大するために、組み込み要素は、相同組換えの可能性を増強するために対応する標的配列に対して高程度の配列同一性を有する、十分な数、例えば、100から10,000塩基対、400から10,000塩基対及び800から10,000塩基対の核酸を含有するべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であってもよい。更に、組み込み要素は、ポリヌクレオチドをコーディングしていなくてもコーディングしていてもよい。他方、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込んでもよい。
【０１３３】
自己複製のために、ベクターは更に、問題の宿主細胞においてベクターが自己複製するのを可能にする複製開始点を含むことができる。複製開始点は、細胞内で機能を果たす、自己複製を媒介する任意のプラスミドレプリケーターであってもよい。「複製開始点」又は「プラスミドレプリケーター」という用語は、プラスミド又はベクターのインビボにおける複製を可能にするポリヌクレオチドを意味する。細菌の複製開始点の例は、大腸菌における複製を可能にするプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177及びpACYC184の複製開始点並びにバチルスにおける複製を可能にするpUB110、pE194、pTA1060及びpAMβ1の複製開始点である。酵母宿主細胞で使用するための複製開始点の例は、2つの微少な複製開始点、ARS1、ARS4、ARS1及びCEN3の組み合わせ、並びにARS4及びCEN6の組み合わせである。糸状菌細胞に有用な複製開始点の例は、AMA1及びANSIである(Gems等、1991、Gene 98: 61〜67頁; Cullen等、1987、Nucleic Acids Res. 15: 9163〜9175頁;国際公開第00/24883号パンフレット)。AMA1遺伝子の単離及びこの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築物は、国際公開第00/24883号パンフレットで開示された方法によって実現することができる。
【０１３４】
ポリペプチドの生成を増加させるために、本発明のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーを宿主細胞に挿入してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも1個の追加コピーを宿主細胞ゲノムに組み込むか、又はポリヌクレオチドに増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることによって得ることができ、選択可能なマーカー遺伝子の増幅したコピーを含有し、それによってポリヌクレオチドの追加コピーを含有する細胞を、適切な選択可能な薬剤の存在下で細胞を培養することによって選択することができる。
【０１３５】
本発明の組換え発現ベクターを構築するために、前述の要素を連結するために使用した手法は当業者には周知である(例えば、Sambrook等、1989、上記を参照のこと)。
【０１３６】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のエピメラーゼの生成を導く1つ又は複数の制御配列に動作可能に結合した本開示によるエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。本開示によるエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターは、構築物又はベクターが染色体組み込み体又は以前に記載された自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入する。
【０１３７】
本発明は更に、ペプチドの生成を導く1つ又は複数の制御配列に動作可能に結合した本開示によるペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に含む組換え宿主細胞に関する。特に、宿主細胞は本開示によるエピメラーゼ及びペプチドを同時発現することができる。この実施形態では、宿主細胞はいずれも、本発明のペプチド及びペプチドのアミノ酸の配置のL配置からD配置への変化によって抗菌ペプチドを修飾することができるエピメラーゼを生成する。
【０１３８】
好ましい実施形態では、宿主細胞は宿主細胞に対して異種の本発明のエピメラーゼをコードする核酸を含む。他の好ましい実施形態では、宿主細胞は宿主細胞に対して異種のペプチドをコードする核酸を含む。別の好ましい実施形態では、宿主細胞は宿主細胞に対していずれも異種のペプチド及びエピメラーゼをコードする核酸を含む。
【０１３９】
「宿主細胞」という用語は、複製中に生じる変異によって親細胞と同一ではない、親細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその原料によって大きく左右される。
【０１４０】
宿主細胞は、本発明のエピメラーゼの組換え生成において有用な任意の細胞、例えば、原核生物又は真核生物であってもよい。
【０１４１】
原核生物の宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性菌であってもよい。グラム陽性菌には、限定はしないが、バチルス、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロコッカス、ゲオバチルス(Geobacillus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、オーシャンバチルス(Oceanobacillus)、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びストレプトマイセスが含まれる。グラム陰性細菌には、限定はしないが、カンピロバクター(Campylobacter)、大腸菌、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、フソバクテリウム(Fusobacterium)、ヘリコバクター(Helicobacter)、イリオバクター(Ilyobacter)、ナイセリア(Neisseria)、シュードモナス(Pseudomonas)、サルモネラ(Salmonella)及びウレアプラズマ(Ureaplasma)が含まれる。細菌宿主細胞は、限定はしないが、バチルス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウジイ、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウタス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・チューリンゲンシス細胞を含むバチルス細胞であってもよい。細菌宿主細胞はまた、限定はしないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)及びストレプトコッカス・ズーエピデミカス(Streptococcus zooepidemicus)細胞を含む任意のストレプトコッカス細胞であってもよい。細菌宿主細胞は更に、限定はしないが、ストレプトマイセス・アクロモゲネス(Streptomyces achromogenes)、ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)及びストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)細胞を含む任意のストレプトマイセス細胞であってもよい。
【０１４２】
DNAのバチルス細胞への導入は、プロトプラスト形質転換(例えば、Chang及びCohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111〜115頁を参照のこと)、コンピテント細胞形質転換(例えば、Young及びSpizizen, 1961、J. Bacteriol. 81: 823〜829頁又はDubnau及びDavidoff-Abelson, 1971、J. Mol. Biol. 56: 209〜221頁を参照のこと)、エレクトロポレーション(例えば、Shigekawa及びDower, 1988、Biotechniques 6: 742〜751頁を参照のこと)又は接合(例えば、Koehler及びThorne, 1987、J. Bacteriol. 169: 5271〜5278頁を参照のこと)によって達成することができる。DNAの大腸菌への導入は、プロトプラスト形質転換(例えば、Hanahan, 1983、J. Mol. Biol. 166: 557〜580頁を参照のこと)又はエレクトロポレーション(例えば、Dower等、1988、Nucleic Acids Res. 16: 6127〜6145頁)によって達成することができる。DNAのストレプトマイセス細胞への導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション(例えば、Gong等、2004、Folia Microbiol. (Praha) 49: 399〜405頁を参照のこと)、接合(例えば、Mazodier等、1989、J. Bacteriol. 171: 3583〜3585頁を参照のこと)又は形質導入(例えば、Burke等、2001、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289〜6294頁を参照のこと)によって達成することができる。DNAのシュードモナス細胞への導入は、エレクトロポレーション(例えば、Choi等、2006、J. Microbiol. Methods 64: 391〜397頁を参照のこと)又は接合(例えば、Pinedo及びSmets, 2005、Appl. Environ. Microbiol. 71: 51〜57頁を参照のこと)によって達成することができる。DNAのストレプトコッカス細胞への導入は、天然のコンピテンス(例えば、Perry及びKuramitsu, 1981、Infect. Immun. 32: 1295〜1297頁を参照のこと)、プロトプラスト形質転換(例えば、Catt及びJollick、1991、Microbios 68: 189〜207頁を参照のこと)、エレクトロポレーション(例えば、Buckley等、1999、Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800〜3804頁を参照のこと)又は接合(例えば、Clewell, 1981、Microbiol. Rev. 45: 409〜436頁を参照のこと)によって達成することができる。しかし、DNAの宿主細胞への導入のために当業界で公知の任意の方法を使用してもよい。
【０１４３】
宿主細胞はまた、ほ乳類、昆虫、植物又は真菌細胞等の真核生物であってもよい。宿主細胞は真菌細胞であってもよい。本明細書では、「真菌」には、子嚢菌(Ascomycota)門、担子菌(Basidiomycota)門、ツボカビ(Chytridiomycota)門及び接合菌(Zygomycota)門及び卵菌(Oomycota)門並びに栄養胞子形成菌全て(Hawksworth等、「Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi」、8版、1995、CAB International, University Press, Cambridge, UKによって定義される通り)が含まれる。真菌宿主細胞は酵母細胞であってもよい。本明細書では、「酵母」には、胞子無形成酵母(エンドミセス目)、担子胞子形成酵母及び不完全菌類(ブラストミセス(Blastomycetes))に属する酵母が含まれる。酵母の分類は、本発明の目的のために将来変化することがあるので、酵母はBiology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore及びDavenport著、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980)に記載された通りに定義する。酵母宿主細胞は、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)又はヤロウイア(Yarrowia)細胞、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、サッカロマイセス・カールベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ジアスタチカス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロマイセス・ドウグラシイ(Saccharomyces douglasii)、サッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、サッカロマイセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)又はヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)細胞であってもよい。真菌宿主細胞は糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」には、真菌門(Eumycota)及び卵菌門(Oomycota)に更に分類される糸状形態全てが含まれる(Hawksworth等、1995、上記によって定義される通り)。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖類から構成される菌糸体壁が特徴である。糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium)、ビジェルカンデラ(Bjerkandera)、セリポリオプシス(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、コプリナスI(Coprinus)、コリオラス(Coriolus)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィロバシディウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフソラ(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロマイセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ファネロカエテ(Phanerochaete)、フィレビア(Phlebia)、ピロミセス(Piromyces)、プレウロタス(Pleurotus)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、トラメテス(Trametes)又はトリコデルマ(Trichoderma)細胞であってもよい。例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フェチドゥス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデゥランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、ビジェルカンデラ・アダスタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブローサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・サブバーミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、クリソスポリウム・イノプス(Chrysosporium inops)、クリソスポリウム・ケラチノフィルム(Chrysosporium keratinophilum)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クリソスポリウム・メルダリウム(Chrysosporium merdarium)、クリソスポリウム・パンニコラ(Chrysosporium pannicola)、クリソスポリウム・クイーンスランジクム(Chrysosporium queenslandicum)、クリソスポリウム・トロピクム(Chrysosporium tropicum)、クリソスポリウム・ゾナツム(Chrysosporium zonatum)、コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオラス・ヒルストゥス(Coriolus hirsutus)、フザリウム・バクトリジオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レティクラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシナム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイド(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・サルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロサム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイド(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベネナツム、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、マイセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲナム(Penicillium purpurogenum)、ファネロカエテ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラジアータ(Phlebia radiata)、プレウロタス・エリンギ(Pleurotus eryngii)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ビローサ(Trametes villosa)、トラメテス・ベルシコロル(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞であってもよい。
【０１４４】
真菌細胞は、それ自体公知の方法によるプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生が関与する方法によって形質転換することができる。アスペルギルス及びトリコデルマ宿主細胞の形質転換に適切な手法は、欧州特許第238023号、Yelton等、1984、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470〜1474頁及びChristensen等、1988、Bio/Technology 6: 1419〜1422頁に記載されている。フザリウム種を形質転換するために適切な方法は、Malardier等、1989、Gene 78: 147〜156頁及び国際公開第96/00787号パンフレットに記載されている。酵母は、Becker及びGuarente, In Abelson, J.N.及びSimon, M.I.著、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194、182〜187頁、Academic Press, Inc., New York; Ito等、1983、J. Bacteriol. 153: 163;及びHinnen等、1978、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920によって記載された手法を使用して形質転換することができる。
【０１４５】
細胞はまた、ほ乳類細胞、例えば、COS、CHOであってもよい(米国特許第4,889,803号;米国特許第5,047,335号)。特定の実施形態では、細胞は非ヒト及び非胚性である。更に、本発明のエピメラーゼは、非ヒトトランスジェニック動物によって、例えば、動物によって生成されたミルク中で生成することができた。
【０１４６】
細胞は植物細胞であってもよい。次に、本発明のエピメラーゼは、トランスジェニック植物によって生成することができた。
【０１４７】
或いは、前記で定義した宿主細胞をエピメラーゼの生成を誘導する条件下で培養する工程、エピメラーゼを回収し、及び/又は精製する工程を含む、本発明によるエピメラーゼの生成方法も提供する。或いは、前記で定義したエピメラーゼをコードする核酸によるエピメラーゼのインビトロ発現を含む、本発明によるエピメラーゼの生成方法も提供する。所望により、この方法は更に、エピメラーゼを固相支持体上に固定する工程を含む。
【０１４８】
酵素は、当業界で公知の方法を使用して回収することができる。例えば、酵素は、限定はしないが、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション又は沈殿を含む従来の手法によって栄養培地から回収することができる。
【０１４９】
酵素は、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、限定はしないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除)、電気泳動手法(例えば、調製用等電点電気泳動)、溶解度差(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、SDS-PAGE又は抽出(例えば、Protein Purification, Janson及びRyden著、VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと)を含む当業界で公知の様々な手法によって精製することができる。他の態様では、酵素は回収しないが、酵素を発現する本発明の宿主細胞を酵素源として使用する。
【０１５０】
前記で定義した単離又は組換えエピメラーゼを含む組成物又はキットも提供する。特に、組成物又はキットには、酵素添加物として鉄(例えば、(NH4)2Fe(SO4)2)及び硫黄(例えば、Na2S)並びにジチオスレイトール又はベータ-メルカプトエタノール等の還元剤を含めることができる。更に、組成物は、S-アデノシルL-メチオニン(SAM)合成酵素が存在するとき、SAM、酵素補因子又はメチオニン及びATPを含むことができる。所望により、エピメラーゼは固相支持体に固定することができる。
【０１５１】
本発明はまた、D型アミノ酸を有するペプチドを生成するために、前記で定義したエピメラーゼ、このエピメラーゼを含む組成物、キット又は固相支持体、或いは、前記で定義したエピメラーゼをコードする核酸配列を含む核酸、組換え核酸構築物又は組換えベクターを含む組換え宿主細胞の使用に関する。
【０１５２】
ペプチド中のL-アミノ酸をD-アミノ酸に変換するためのエピメラーゼの使用
したがって、本発明は、ペプチド中のL-アミノ酸をD-アミノ酸に変換するための本発明のエピメラーゼの使用に関する。本発明のエピメラーゼとペプチドを接触させる工程、所望により、L配置からD配置に変換した少なくとも1個のアミノ酸を含むペプチドを回収する工程を含む、ペプチド中のL-アミノ酸をD-アミノ酸に変換するための方法にも関する。
【０１５３】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明によるペプチドと前記で定義したエピメラーゼを接触させる工程を含む、本発明によるペプチドの調製方法に関する。本発明によるペプチドを調製するための前記で定義したエピメラーゼの使用にも関する。特に、ペプチドは前記で定義した任意の特定の配列を有することができる。好ましくは、この方法はインビトロで実施する。第1の実施形態では、このペプチドは、配列番号1の33位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有し、配列W-Y-F-[V/I/A](配列番号71)及びW-[I/V/A]-X4-G-S(配列番号69)及び配列番号69と配列番号71の間の4〜8個のアミノ酸である連結配列を含み、X4は任意のアミノ酸である17残基の配列を含む。第2の実施形態では、このペプチドは、配列番号1の26位から49位の配列と少なくとも40%の同一性を有し、配列N/D-D-L-W-Y-F-[V/I/A](配列番号21)及びW-I/V-X4-G-S(配列番号22)を含み、X4は任意のアミノ酸である24残基の配列を含む。
【０１５４】
最後に、本発明は、本発明による組換え宿主細胞をペプチド及びエピメラーゼの同時発現に適した条件で培養する工程及び少なくとも1個のD型アミノ酸を有するペプチドを回収する工程を含む、本発明によるペプチドの調製方法に関する。好ましくは、この方法はエキソビボにおいて実施する。前記で定義したペプチドを調製するための、本発明による組換え宿主細胞の使用にも関する。
【０１５５】
特定の態様では、エピメラーゼ及びペプチドの原料は一致し得る。例えば、好ましくはバチルス・スブチリスのエピメラーゼは、バチルス・スブチリスから得られたペプチドを調製するために使用することができた。この特定の態様では、前記で定義したペプチドが配列番号1〜5から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する配列又は少なくとも24個の連続した残基のそれらの断片を含むならば、選択したエピメラーゼは配列番号25〜35から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する。前記で定義したペプチドが配列番号6〜9から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する配列又は少なくとも24個の連続した残基のそれらの断片を含むならば、選択したエピメラーゼは配列番号36〜38から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する。前記で定義したペプチドが配列番号10の配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する配列又は少なくとも24個の連続した残基のそれらの断片を含むならば、選択したエピメラーゼは配列番号39〜40から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する。前記で定義したペプチドが配列番号11〜13及び17〜18から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する配列又は少なくとも24個の連続した残基のそれらの断片を含むならば、選択したエピメラーゼは配列番号41〜50から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する。前記で定義したペプチドが配列番号14〜16から選択される配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する配列又は少なくとも24個の連続した残基のそれらの断片を含むならば、選択したエピメラーゼは配列番号51の配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する。前記で定義したペプチドが配列番号19の配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する配列又は少なくとも24個の連続した残基のそれらの断片を含むならば、選択したエピメラーゼは配列番号52の配列と少なくとも80、85、90若しくは95%の同一性を有する。
【０１５６】
定義
約:本明細書で使用するとき、「約」は大体10%、好ましくは大体5%を意味する。例えば、約100は90と110の間、好ましくは95と105の間を意味する。
【０１５７】
「からなる(consists of)」、「本質的に〜からなる(consists essentially of)」又は「実質的に含む(substantially comprises)」:要素又は要素類に対して等、これらの用語を使用した本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書での記載は、特に記載したり、明確に文脈によって否定したりしない限り、「その特定の要素又は要素類からなる」、「本質的にその特定の要素又は要素類からなる」又は「その特定の要素又は要素類を実質的に含む」、本発明の類似の態様又は実施形態を支持するものである。例えば、本明細書で特定の配列を含むと記載したペプチド又はタンパク質は、特に記載したり、明確に文脈によって否定したりしない限り、その配列からなるペプチド又はタンパク質も記載するものと理解されたい。「本質的に〜からなる(consists essentially of)」とは、その配列からなるペプチド又はタンパク質を意味するが、1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個の置換、付加又は欠失も含んでいてもよい。特に、「本質的に〜からなる(essentially consist in)」とは、ペプチドがN又はC末端に1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個の付加アミノ酸及び1、2若しくは3個の置換、欠失又は付加を含んでいてもよいことを意味することができる。
【０１５８】
コーディング配列:「コーディング配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接指定するポリヌクレオチドを意味する。コーディング配列の境界は一般的に、ATG、GTG又はTTG等の開始コドンで開始し、TAA、TAG、又はTGA等の終止コドンで終止するオープンリーディングフレームによって決定される。コーディング配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１５９】
制御配列:「制御配列」という用語は、本発明のエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドに対して天然(すなわち、同じ遺伝子由来)又は異種(すなわち、異なる遺伝子及び/又は異なる種)であってもよい。好ましくは、制御配列は異種である。よく知られていて、当業者に現在使用されている制御配列が好ましい。このような制御配列には、限定はしないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが含まれる。最低でも、制御配列にはプロモーター並びに転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。制御配列とエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドのコーディング領域との連結を容易にする特異的な制限部位を導入するために、制御配列にリンカーを設けてもよい。制御配列及びコーディング配列の機能的組み合わせは、発現カセットと呼ぶことができる。
【０１６０】
発現:「発現」という用語には、限定はしないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含むポリペプチドの生成に関与する任意の工程が含まれる。
【０１６１】
発現ベクター:「発現ベクター」という用語は、本発明のエピメラーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、発現をもたらす制御配列に動作可能に結合した直鎖状又は環状DNA分子を意味する。次に、発現ベクターには、本発明のエピメラーゼの発現に適した発現カセットが含まれる。
【０１６２】
単離した:「単離した」という用語は、天然で生じない形態又は環境における物質を意味する。単離した物質の非限定的な例には、(1)任意の非天然に生じる物質、(2)限定はしないが、天然では関係のある天然に生じる成分の1つ若しくは複数又は全てから少なくとも部分的に取り出された任意の酵素、変種、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子を含む任意の物質、(3)天然に見いだされる物質に対して人工的に修飾した任意の物質、或いは(4)天然では関係のあるその他の成分に対して物質の量を増加させることによって修飾した任意の物質(例えば、物質をコードする遺伝子の多数コピー、;物質をコードする遺伝子に天然では関係のあるプロモーター以外の強力なプロモーターの使用)が含まれる。
【０１６３】
組換え体:組換え体とは、遺伝子操作によって生成した核酸構築物、ベクター及びタンパク質を意味する。
【０１６４】
異種:宿主細胞、ベクター又は核酸構築物の場合、遺伝子操作によって、宿主細胞、ベクター又は核酸構築物に導入されたエピメラーゼ/ペプチドのコーディング配列を示す。宿主細胞の場合、エピメラーゼ/ペプチドのコーディング配列が導入する細胞とは異なる原料から生じることを意味し得る。例えば、バチルス・スブチリスのエピメラーゼを大腸菌で発現させる。或いは、エピメラーゼ/ペプチドのコーディング配列は、例えば、その天然のプロモーターではない、又は天然の位置とは異なる位置に導入されたプロモーターの制御下にあるので、エピメラーゼ/ペプチドのコーディング配列は、それらのコーディング配列が導入されているが、天然ではない環境のために異種とみなされる細胞と同じ種から得られることも意味し得る。
【０１６５】
核酸構築物:「核酸構築物」という用語は、普通ならば天然に存在しない方法で核酸の区域を含有するように修飾された、又は合成された、1つ又は複数の制御配列を含む、単鎖又は2本鎖の核酸分子を意味する。
【０１６６】
動作可能に結合した:「動作可能に結合した」という用語は、制御配列がコーディング配列の発現を導くように、制御配列がコーディング配列に対して適切な位置にある配置を意味する。
【０１６７】
配列同一性:2つのアミノ酸配列の間の配列同一性は、「配列同一性」というパラメータによって示される。本発明のために、2つのアミノ酸配列(A)と(B)の間の「パーセント同一性」は、比較ウインドウによって、最適な方法で整列した2つの配列を比較することによって決定される。配列の前記アラインメントは周知の方法によって、例えば、Needleman-Wunschの汎用アラインメントのアルゴリズムを使用して実施することができる。タンパク質分析ソフトウェアは、様々な置換、欠失及び保存的アミノ酸置換を含むその他の修飾に割り当てた類似性の測定値を使用して類似の配列を合致させる。一旦、全体のアラインメントが得られたら、同一性の百分率は、整列した同一のアミノ酸残基の全数を配列(A)と配列(B)の間の最長の配列に含有される残基の全数によって除することによって得ることができる。
【０１６８】
配列同一性は典型的に、配列分析ソフトウェアを使用して決定する。2つのアミノ酸配列を比較するために、例えば、EMBL-EBIによって提供され、
www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=protein,で利用可能なタンパク質のペアワイズ配列アラインメント用のツール「Emboss needle」を使用することができ、初期設定は(I)マトリクス:BLOSUM62、(ii)ギャップオープン:10、(iii)ギャップ延長:0.5、(iv)アウトプット形式:ペア、(v)エンドギャップペナルティ:フォールス、(vi)エンドギャップオープン:10、(vii)エンドギャップ延長:0.5を使用する。
【０１６９】
或いは、配列同一性はまた典型的に、配列分析ソフトウェアClustal Omegaを使用し、HHalignアルゴリズム及びコアアラインメントエンジンとしてその初期設定を使用して、決定することができる。このアルゴリズムは、初期設定と共にSoding, J. (2005)「Protein homology detection by HMM-HMM comparison」. Bioinformatics 21、951〜960頁において記載されている。
【０１７０】
アミノ酸:本明細書で定義したアミノ酸配列は、以下に示したように1文字によって表す:A、Ala(アラニン);R、Arg、(アルギニン);N、Asn、(アスパラギン); D、Asp、(アスパラギン酸);C、Cys、(システイン);Q、Gln、(グルタミン);E、Glu、(グルタミン酸);G、Gly、(グリシン);H、His、(ヒスチジン);I、Ile、(イソロイシン);L、Leu、(ロイシン);K、Lys、(リジン);M、Met、(メチオニン);F、Phe、(フェニルアラニン);P、Pro、(プロリン);S、Ser、(セリン);T、Thr、(トレオニン);W、Trp、(トリプトファン);Y、Tyr、(チロシン);及びV、Val、(バリン)。
【０１７１】
保存された:保存されたアミノ酸とは、定義した配列を参照配列と整列させ、参照配列中で示した位置に対応する定義した配列の残基が参照配列中に存在する残基と同一であることを意味する。アラインメントは、任意の利用可能な方法によって、特に、直前の同一性決定のために開示した方法によって、より好ましくはClustal Omegaによって実施することができる。残基の位置は、参照配列中に示す。
【０１７２】
本明細書で使用した「抗菌」という用語は、抗細菌、抗ウイルス、抗真菌及び/又は抗寄生虫活性を意味する。前記活性は、IC50又はMIC等の異なるパラメータを測定することによって評価することができる。
【０１７３】
「IC50」又は「半数阻害濃度」とは、インビトロにおける微生物集団の増殖を半分に抑制するために必要な物質の濃度である。
【０１７４】
「MIC」又は「最小阻害濃度」とは、前記物質の存在下で、一般的に37℃で18時間インキュベーションした後の微生物増殖を完全に阻害する物質の最低濃度である。
【０１７５】
本明細書で使用した「致死濃度、50%」又は「LC50」という用語は、集団の半分を殺滅するために必要な物質の濃度を意味する。LC50は、物質の毒性の定量的な指標である。特に、LC50は本明細書ではAMPの細胞溶解活性を評価するために使用され、この場合、細胞集団の半分の溶解を誘導するペプチドの濃度に対応する。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。yydFGHIJオペロンの構造。yydF:推定ペプチド、yydG:ラジカルSAM酵素、yydH:プロテアーゼ、yydIJ:ABC型輸送体。
【図１Ｂ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。大腸菌において発現した精製YydGのゲル電気泳動分析。
【図１Ｃ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。嫌気的に再構成されたYydGのUV-可視スペクトル。
【図１Ｄ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。特に、B.スブチリス種及びスタフィロコッカス種において見いだされた密接なYydF相同体のマルチプルアラインメント。
【図１Ｅ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。嫌気性条件下で、亜ジチオン酸ナトリウムの存在下(2mM)又は非存在下で4時間インキュベーションした後の、SAM切断(257nm)のHPLC分析。
【図１Ｆ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。嫌気性条件下で、亜ジチオン酸ナトリウムの存在下(2mM)又は非存在下で4時間インキュベーションした後の、反応によって生成したペプチド(280nm)のHPLC分析。
【図１Ｇ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。逆相HPLCによって定量し、UV-可視検出(280nm)によってモニターした5'-dA(■)及び修飾ペプチド(◆)の生成の時間経過。YydG(100μM)は、嫌気性条件下で、亜ジチオン酸ナトリウム(2mM)を含めて、基質YydF18-491mMの存在下でインキュベートした。
【図１Ｈ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。YydFでインキュベートしたYydGのHPLC分析。嫌気的再構成後、YydGを嫌気性条件下でDTT(6mM)及びSAM(1mM)の存在下で、亜ジチオン酸ナトリウム(2mM)を含めて、又は含めずにインキュベートした。
【図１Ｉ】YydGの精製、分光学的分析及び活性。YydF18-49の切断型でインキュベートしたYydGのHPLC分析。嫌気的再構成後、YydGを嫌気性条件下でDTT(6mM)及びSAM(1mM)の存在下で、亜ジチオン酸ナトリウム(2mM)を含めて、又は含めずにインキュベートした。
【図２Ａ】YydGはペプチド骨格へのH原子輸送を触媒する。YydF18-49のトリプシンによるペプチドマッピング及びLC-MS分析。数字は各ペプチドのm/z値を示す。太字の配列は、LC-MSによって同定された関連ペプチドを示す(すなわち、ペプチド1:NH2-GLLDESQK、[M+H]+=931.48;ペプチド2:VNDLWYF、[M+2H]2+=592.31;ペプチド3:WILGSGH-Ac、[M+H]+=768.41)。
【図２Ｂ】YydGはペプチド骨格へのH原子輸送を触媒する。YydGでインキュベーションした後のYydF18-49のトリプシンによるペプチドマッピング及びLC-MS分析。数字は各ペプチドのm/z値を示す。太字の配列は、LC-MSによって同定された関連ペプチドを示す(すなわち、ペプチド1:NH2-GLLDESQK、[M+H]+=931.48;ペプチド2:VNDLWYF、[M+2H]2+=592.31;ペプチド3:WILGSGH-Ac、[M+H]+=768.41)。
【図２Ｃ】YydGはペプチド骨格へのH原子輸送を触媒する。重水素化緩衝液中においてYydGでインキュベーションした後のペプチドYydF18-49のLC-MS分析。
【図２Ｄ】YydGはペプチド骨格へのH原子輸送を触媒する。重水素化緩衝液中においてYydGでインキュベーションした後のYydF18-49のトリプシンによるペプチドマッピング及びLC-MS分析。
【図３Ａ】YydGはアミノ酸エピメリ化を触媒する。重水素緩衝液中でYydF18-49をrSAM酵素YydGでインキュベーションした後に得られたアミノ酸(下の軌跡)と比較したL-Ile/D-アロ-Ile(上の軌跡)のLC-MS/MS分析。アミノ酸はN-α-(2,4-ジニトロ-5-フルロフェニル)-L-バリンアミド(L-FDVA)で誘導体化し、FDVA-誘導体としてLC-MSによって検出した。
【図３Ｂ】YydGはアミノ酸エピメリ化を触媒する。重水素緩衝液中でYydF18-49をrSAM酵素YydGでインキュベーションした後に得られたアミノ酸(下の軌跡)と比較したL-/D-Val(上の軌跡)のLC-MS/MS分析。アミノ酸はN-α-(2,4-ジニトロ-5-フルロフェニル)-L-バリンアミド(L-FDVA)で誘導体化し、FDVA-誘導体としてLC-MSによって検出した。
【図４Ａ】YydG変異体の活性。強調したシステイン残基を有するYydGの配列。
【図４Ｂ】YydG変異体の活性。精製した変異体酵素のゲル電気泳動分析。
【図４Ｃ】YydG変異体の活性。嫌気的再構成後のA3(すなわち、AxxxAxxA)(青い軌跡)、C22A(緑の軌跡)、C222A(赤い軌跡)及びC223A(紫の軌跡)変異体のUV-可視スペクトル。
【図４Ｄ】YydG変異体の活性。SAM(1mM)及び亜ジチオン酸ナトリウムの存在下でのYydF18-49及び4つの変異体のインキュベーション後の反応のHPLC分析。
【図４Ｅ】YydG変異体の活性。C223A変異体によって生成したペプチドのLC-MS分析並びに対応する質量及び配列。
【図５Ａ】YydGのYydF18-49の活性。YydF18-49又はエピメリ化生成物YydFbの存在下でのB.スブチリスのプレート増殖阻害アッセイ。
【図５Ｂ】YydGのYydF18-49の活性。ペプチドの非存在下(□)或いは修飾を含有していない遊離C末端を有するYydF18-49ペプチドAc-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWILGSGH(配列番号20)(■)、D-アロ-Ile(◆)、D-Val(◇)又は2個のエピメリ化した残基を含有する遊離C末端を有するYydF18-49ペプチド:Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYF{d-V}KSKENRW{d-I}LGSGH(配列番号20)(▲)の存在下でのLB培地中におけるバチルス・スブチリスの増殖。OD値は、3つの独立した培養の平均である。
【図６】特に、B.スブチリス種及びスタフィロコッカス種において見いだされた密接したYydG相同体のマルチプルアラインメント。
【図７】B.スブチリスから単離されYydF33-49と命名されたYydFペプチドの質量スペクトル分析。(a)B.スブチリスによって分泌されたペプチド、(b)D-アミノ酸残基を含有する合成YydF33-49DDペプチド、及び(c)合成YydF33-49ペプチドのLC-MS/MS分析。関連するイオンを示す。表1は完全アラインメント用である。ペプチド配列において、D配置のアミノ酸は灰色で示している。
【図８】(A)YydF33-49又はYydF33-49DDの存在下での液体LB培地中でのB.スブチリスの増殖。B.スブチリスはLB培地単独(◆)、YydF33-49(□)又はYydF33-49DD(■)の存在下で増殖させた。各測定値は、3回の増殖実験の平均及びSDを示す。黒色はエピメリ化した残基である。(b)YydF18-49(100μM)又はYydF18-49DD(100、10若しくは1μM)の存在下でのB.スブチリスの増殖比。比は、ペプチドの非存在下での増殖と比較することによって決定した。(c)YydF33-49又はYydF33-49DD(100、10、1、0.1若しくは0.01μM)の存在下でのB.スブチリスの増殖比。比は、ペプチドの非存在下での細菌増殖と比較することによって決定した。
【図９】YydF18-49の存在下(□)又は増殖3時間後にYydF18-49DDを添加(矢印)した後(■)の液体LB培地中でのB.スブチリスの増殖。各測定値は、3回の増殖実験の平均及びSDを示す。
【図１０】YydF33-49(a)、YydF33_49AA(b)、YydF33_49VV(c)、YydF33_49II(d)、ペプチド-SA1(e)、ペプチド-SA2(f)、ペプチド-SE(g)又はペプチド-SP(h)100μMの存在下での液体LB培地中におけるB.スブチリスの増殖。太字はエピメリ化した残基である。
【図１１】YydF33-49(a)、YydF33_49AA(b)、YydF33_49VV(c)、YydF33_49II(d)、ペプチド-SA1(e)、ペプチド-SA2(f)、ペプチド-SE(g)又はペプチド-SP(h)100μMの存在下での液体BHI培地中におけるエンテロコッカス・フェカリスの増殖。太字はエピメリ化した残基である。
【図１２】YydF33-49(a)、YydF33_49AA(b)、YydF33_49VV(c)、YydF33_49II(d)、ペプチド-SA1(e)、ペプチド-SA2(f)、ペプチド-SE(g)又はペプチド-SP(h)100μMの存在下での液体BHI培地中におけるストレプトコッカス・アガラクチアの増殖。太字はエピメリ化した残基である。
【実施例】
【０１７７】
(実施例1)
ここで、本発明者等は、一般的な研究種バチルス・スブチリスが、リボソーム由来ではあるが、D-アミノ酸を含有する新種の生理活性ペプチドを生成することができることを示した。このペプチドは、ラジカルSAM酵素のスーパーファミリーに属する新規酵素によって翻訳後修飾される。本発明者等は、この新規酵素が、L-イソロイシン及びL-バリン残基をD-アロ-イソロイシン及びD-バリンに変換するために、ラジカルをベースにした前例のない機構を使用することを示した。本発明者等は、CαH-原子除去を触媒し、炭素中心ラジカルの形成を導くために、この酵素が5'-デオキシアデノシルラジカルを作り出すことを立証した。変異誘発実験によって、この酵素が2つの重要な[4Fe-4S]中心を保有し、触媒サイクルの終結に必要不可欠なH原子ドナーの同定を可能にすることが裏付けられる。最後に、特有の方法で、本発明者等は、細菌の完全な細胞壁の主要な成分であるLiaRSを誘導すると考えられるこの生理活性ペプチドの活性にD-アミノ酸の存在が必要であることを発見した。
【０１７８】
バチルス・スブチリスのLia系は、2成分系(LiaRS)及び阻害タンパク質(LiaF)から構成される細胞表層ストレスモジュールである。この遺伝子系は、ファーミキューテスにおいて、及び細胞壁ストレス応答を編成する複合調節ネットワークの一部において高く保存されている。その調節は極めて詳細に記載されたことがあるが、B.スブチリスにおけるその正確な生理学的役割は完全には理解されていない。LiaRSは、ナイシン、バンコマイシン又はバシトラシン等の細胞壁を標的とする抗生物質によって特異的に強く誘導され、したがって細胞壁抗生物質のバイオセンサー及びハイスループットスクリーニングとして開発されたことがある。抗生物質を感知すると、LiaRSは、抗生物質耐性は付与しないが、おそらく完全な細胞壁を維持するために、遺伝子発現を活性化する細胞表層ストレスシグナルを伝達する。
【０１７９】
LiaRS調節に関与する遺伝子を同定しようとして、変異誘発研究がB.スブチリスにおいて行われ、yydFGHIJオペロンの発見につながった(Butcher等、2007、J Bacteriol, 189、8616)。このオペロンは、LiaRSに対して正の調節を示し、ラジカルSAM酵素及びプロテアーゼ(それぞれ、YydG及びYydH)によって修飾され、最終的にABC型輸送体(YydIJ)によって細胞外媒体に排出される推定ペプチド(YydF)をコードする遺伝子系の特徴全てを保有するが、これらの成分はいずれもまだ単離も調査もされていなかった(図1A)。
【０１８０】
ラジカルSAM酵素は、酸化、稀なメチル移動反応又はチオエーテル結合形成等の非常に多様なタンパク質及びペプチド修飾を触媒することが明らかになってきた酵素ファミリーである。これらの酵素は、その他の酵素では実行することができない化学的に困難な反応に関与する、いわゆるRiPP(リボソームで合成され、翻訳後修飾されたペプチド)の生合成の主要なプレーヤーとして浮上してきた。推定ラジカルSAM酵素YydGの生物学的役割及び触媒機能を調査するために、本発明者等はこのタンパク質を大腸菌において過剰発現させ、YydFペプチドに対するその活性をアッセイした。精製したタンパク質(図1B)は、ラジカルSAM酵素の独特な光学特性を有しており、320nm及び420nmに電荷移動吸収バンドを有した(図1C)。[4Fe-4S]2+クラスターモル吸光係数ε410約15,000M-1cm-1に基づくと、この酵素は嫌気的再構成後に1個から2個の[4Fe-4S]中心を保有するものと考えられる(図1C)。
【０１８１】
ゲノム検索によって、yydF及びyydGは、エンテロコッカス・フェカリス並びにS.アガラクチア及びS.エピデルミスを含む数種のストレプトコッカス及びスタフィロコッカス等の数種のグラム陽性病原体にも存在することが明らかになった。YydF相同体の配列アラインメントは、N末端部分に位置する推定リーダー配列及びペプチドの末端に17残基の高く保存されたモチーフを示した(図1D)。本発明者等は、YydF18-49と呼んだ18位から49位の保存されたアミノ酸残基を包含する完全長YydFペプチド又は切断型のいずれかを含む再構成酵素をアッセイした。(図1E)に示したように、嫌気性及び還元条件下で、YydGは、S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)ホモリシス開裂から生じると予測される5'-デオキシアデノシン(5'-dA; 12.3分に溶出)並びに46、47.6及び48分に溶出する3個のペプチド誘導体:YydFa、YydFb及びYydFcも生成した(図1E、F、G及びH)。3個のペプチドの形成は厳密に、1電子ドナーとしての亜ジチオン酸ナトリウムの存在に左右され、類似の生成物はYydF又はYydF18-49を使用して得られた(図1F、G及びH)。反応の動態解析によって、YydGは修飾した生成物1モル当たり5'-dA 1モルを生成し、共役していないSAM開裂が反応の進行と共に引き起こされるが、インビトロ条件下で数回の代謝回転を触媒することが示された(図1G)。これらの結果によって、インビトロにおいて、YydGはラジカルをベースにした機構によってYydFを修飾するためにSAMを使用することが示された。YydF18-49は良好な基質であることが明らかになり、特徴付けが容易なので、YydGによって触媒される修飾を同定するためにYydF18-49を使用することに決定した。
【０１８２】
形成した3つのペプチドの質量スペクトル検査によって、基質と比較して質量差がないことが明らかになった(YydF18-49[M+3H]3+=1258.92)。これは、架橋結合、酸化又はメチル化等のペプチド又はタンパク質翻訳後修飾を触媒する公知の全rSAM酵素とは対照的であった(7、9、14〜16)。基質のトリプシンによるペプチドマッピングによって3つのペプチド(ペプチド1[M+H]+=931.48、ペプチド2[M+H]2+=592.31及びペプチド3:[M+H]+=768.41)が得られ、図2Aに示したように22、27及び19.2分に溶出した。酵素的に修飾したペプチドの比較によって、ペプチド2及び3と同じ分子量を有するが、それぞれ26.5及び23.5分に溶出する2つの新規ペプチド(すなわち、ペプチド2*及びペプチド3*)の出現が示された(図2B)。この結果は、YydGが、1つは内部(ペプチド2における)、1つはペプチドのC末端(ペプチド3における)に位置する2つの修飾を導入することを裏付けた。実施した実験全てにおいて、YydFcは主要な生成物であった。トリプシンによるペプチドマッピングによって、ペプチド3*/ペプチド3比がペプチド2*/ペプチド2比よりも5倍大きいので(図2B)、ペプチドの重要なC末端が修飾されることが明らかになり、YydGが、いくつかの優先される部位を有することが示された。
【０１８３】
rSAM酵素が触媒中にH原子を除去し、時々交換することが知られているので、発明者等は、YydGによって触媒される修飾の性質及び位置を同定するために、>90%重水素化緩衝液中で反応を反復した。重水素化緩衝液中において、YydGは常に最も豊富な生成物であるYydFcと類似の生成物パターンを生成した(図2C)。興味深いことに、反応のLC-MS分析によって、これらの条件下で、YydFa及びYydFcの分子量は[M+3H]3+=1259.24で、YydFbの分子量は[M+3H]3+=1259.6であることが示された。これは、基質YydF18-49([M+3H]3+=1258.92)よりも1及び2ダルトン単位大きく、重水素原子1個がYydFa、YydFcに、重水素原子2個がYydFbにそれぞれ組み込まれたことを明白に示している。この反応のトリプシンによるペプチドマッピングは、分子量が1ダルトン単位移動した(すなわち、[M+2H]2+=593.04及び[M+2H]+=769.52)ペプチド2*及びペプチド3*に限定した重水素組み込みの位置の特定を可能にした(図2D)。これら2つのペプチドのLC-MS/MSフラグメンテーションは、ペプチド2*のVal36(特徴のあるイオンy1、y2+1及びb7、b8+1によって示された通り)及びペプチド3*のIle44(イオンy5及びy6+1の同定によって示された通り)への重水素組み込みを示した。これらの結果は、YydGが2個のペプチドH原子の、溶媒の交換可能な2個のH原子による置換を触媒することを示した。
【０１８４】
修飾の性質を決定するために、本発明者等はN-α-(2,4-ジニトロ-5-フルオロフェニル)-L-バリンアミド(L-FDVA)で誘導体化した後のペプチドの酸加水分解及びそのアミノ酸含量のLC-MSによる分析を実施した。YydF18-49ペプチドは、2個のVal及び1個のIle残基は含有するが、Ileと同じ分子量を有するだけでなく類似の滞留時間で溶出する5個のLeu残基を含有する。図3Aに示した様に、最適化したLC-MS/MS条件では、L-Ile及びL-Leuだけでなく、対応するD型(D-アロ-Ile及びD-Leu)の分離及び特徴付けも可能であった。酵素的に修飾したペプチドの分析によって、L-Ile及びL-Leuの同定に加えて、27.7分に溶出する別の生成物がD-アロ-Ileに対応して形成されることが明らかに示された。同様に、Val残基の分析(図3B)によって、L-Valだけでなく26分に溶出するD-Valの存在が示された。
【０１８５】
したがって、本発明者等は、YydGがインビトロにおいてペプチド骨格に活性のあることが示された最初のラジカルSAMエピメラーゼであることを立証した。この酵素は、Ile残基の最高約35%及びVal残基の最高約10%のエピメリ化を触媒した。この結論と矛盾せず、重水素化緩衝液中でYydGをインキュベートすることによってエピメリ化したアミノ酸を誘導体化したとき、それらの質量分析によって+1Da増加していることが明らかになり(図3C&D)、完全なペプチド及びトリプシンによる誘導体で実施した分析と矛盾しなかった(図2C&D)。
【０１８６】
D型アミノ酸であることを明確に断言するために、本発明者等は36位に1個のD-Val及び44位に1個のD-アロ-Ileを含有するYydF18-49変種ペプチドを合成した。この合成ペプチドのトリプシンによるペプチドマッピング及びアミノ酸プロファイルは、酵素的に修飾したペプチドの1つを完全に再現した(データは示さず)。
【０１８７】
これらの分析に基づいて、本発明者等は、36位にD-Valを含有するペプチドとしてYydFa、44位にD-アロ-Ileを含有するペプチドとしてYydFc並びに36位にD-Val及び44位にD-アロ-Ileを含有するペプチドとしてYydFbを割り当てることができた。したがって、YydGは1つ又は2つの修飾されたアミノ酸を含有するペプチドの混合物を生成し、Ile44は好まれる基質であった(図2C)。
【０１８８】
重水素緩衝液中実施したエピメリ化中に、本発明者等が、溶媒の交換可能なH原子がペプチド骨格に組み込まれることを立証したとき、LC-M分析によって示されるように、顕著な標識を含有しない5'-dAが生成した。これらの結果及び図1Gの動態分析は、YydGがVal36又はIle44のCαH原子を除去するために1個の5'-dAラジカル(5'-dA・)を生成し、付随して1モルの5'-dAを形成することと矛盾しない。
【０１８９】
解決すべき最後に残された問題は、触媒中に導入される交換可能なH原子の起源であった。実際に、炭素が中心のラジカルは、このような反応性の高い種は酵素活性部位に密封されて維持されなければならないので、緩衝液成分と相互作用しそうにない。本発明者等は、反応の終結に必要なH原子ドナー及びラジカル消去剤としてタンパク質アミノ酸残基を支持した。YydG配列を詳しく調べることによって、ラジカルSAMモチーフの3つのシステイン残基に加えて、配列にはたった6個のシステインしか存在しないことが指摘された(図4A)。興味深いことに、2つのシステイン残基(すなわち、Cys22及びCys223)は別のシステイン残基に隣接しており、そのうちの1つはrSAM[4Fe-4S]中心を含有する予測ループの内部にあった。タンパク質のC末端の5つのその他のシステイン残基の構成は、rSAM酵素の追加的[4Fe-4S]中心の配位に関与するモチーフを連想させる。それらの機能を探索するために、本発明者等はCxxxCxxCラジカルSAMモチーフの3つのシステイン残基、Cys22、Cys222又はys223をアラニン残基によって置換した。設計した4つの変異体(すなわち、A3、C22A、C222A及びC223A)の精製に成功したが、C222A変異体は精製が困難であることがわかり、切断型として部分的に生成した(図4B)。分光学的分析によって、そのUV-可視スペクトルに基づいて、AxxxAxxA変異体は約1個の[4Fe-4S]中心を含有し、[4Fe-4S]中心の量は、C22A及びC223A変異体における量よりも2倍多いことが示された(図4C)。重要なことに、嫌気的に精製したAxxxAxxA変異体は、多量の鉄-硫黄中心を既に含有しており、この変異体における[4Fe-4S]中心の存在は嫌気的再構成とは独立していることが示された。C22A及びC223A変異体のUV-可視スペクトルは、野生型酵素に完全に重なり(図1B)、YydGが2個の[4Fe-4S]中心を含有するらしい事実が裏付けられた。C222A変異体は、嫌気的再構成の後でも鉄-硫黄中心を含有しないようであった(図4C)。C222Aの最大吸収は250nmに移動し、これから、[4Fe-4S]配位に関与するシステイン残基がrSAM酵素を含む鉄-硫黄酵素において変異するとき繰り返し報告されているように、タンパク質が間違って折り畳まれた可能性が示された。したがってCys222はYydG中に存在する第2の[4Fe-4S]の配位に関与するものと考えられる。
【０１９０】
変異体全ての活性は、YydF18-49基質を用いてアッセイした(図4D)。予測通り、A3変異体は、ペプチド基質を変換することもSAMを切断することもできなかった。C222A変異体はまた、酵素活性を完全に失った。対照的に、C22A変異体は酵素の活性に影響を及ぼさず、3つのエピメリ化したペプチド(すなわち、YydFa、YydFb及びYydFc)を生成した。C223A変異体はエピメリ化活性も妨害しなかった。しかし、この酵素変種は、10分、19.8分及び26分で溶出するその他のペプチド誘導体を生成した(図4E)。高分解能質量分析によって、これらのペプチドが推定された加水分解生成物と比較して-30.005Da又は-1.032Da移動した質量を有することが示された。これらは全て、C末端又はN末端に、YydG酵素の標的である切断されたVal36又はIle44を含有した(図4E)。それらの構造は以下の通りに決定された:Ac-GLLDESQKLAKVNDLWYFVKSKENRWI*(配列番号53)(ペプチドG18-I44*、[M+2H]2+=1646.3834);及びI*LGSGH-NH2(配列番号55)(ペプチドG18-I44*、[M+Na]+=603.2851)。切断は、アミノ酸のカルボキシ基又はアミノ基の欠如として同定され、Cα-N又はCα-CO結合の破壊及びアミノ酸Cα原子への酸素原子の付加から生じた。これらの結果は、反応が酸素分子に曝露されたときに、rSAM酵素ファミリーの別のメンバー、ピルビン酸ギ酸リアーゼアクチバーゼによって得られた基質断片化とよく似ている。本発明者等はまた、YydGがVal36及びIle44のCα原子に炭素中心のラジカルを作り出し、Cys223が反応の終結に不可欠な役割を果たすことを最終的に立証した。
【０１９１】
別のrSAM酵素、胞子の光生成物リアーゼ(SPリアーゼ)に関する本発明者等の以前の研究を考慮して、本発明者等は不可欠なH原子ドナーとしてのCys223の役割を解釈した。実際に、SPリアーゼの変異体を調査していて、適切なタンパク質H原子ドナーが存在しないと、基質ラジカル中間体は偶発的なラジカル捕捉剤と反応して、様々な付加物の形成を導くことがあることを示した。ここで、安定化したCαラジカルは、Cys223のチオール基が存在しないと、分子酸素と自由に反応し、これら特有のペプチジル骨格の破壊を導く。
【０１９２】
最後に、YydFGHIJオペロン(図1A)はB.スブチリスにおいてLia系を活性化することが示されたので、本発明者等は様々な細菌種おける酵素反応前後のYydF18-49ペプチドの活性をアッセイした。本発明者等は酵素的にエピメリ化したペプチド又はD-Val36及びD-アロ-Ile44を含有する合成ペプチドのいずれかによってB.スブチリスの増殖の強力な阻害を立証した。対照的に、修飾していないYydF18-49ペプチドは活性を欠いていた(図5A)。同様に、液体培地中では、強力で持続的な阻害として活性があることがわかったエピメリ化ペプチドのみを測定することができた(図5B)。この阻害をベースにして、分子を解読するためには更なる研究が必要であるが、本発明者等の知識によれば、天然にエピメリ化したペプチドが調節性又は抗菌性の細菌ペプチドの活性形態であることがわかったのは初めてである。
【０１９３】
本研究は、本明細書でエピペプチドと呼ぶD-アミノ酸を含有するペプチドは、一般的な研究室細菌バチルス・スブチリスだけでなくストレプトコッカス・アガラクチア、エンテロコッカス・フェカリス又はスタフィロコッカス・エピデルミス等の多くの病原種も含む生きた生物において、以前に予測されたものよりもずっと一般的であることを示した。予期せぬことに、本発明者等は、ここでD-アミノ酸がプロテアーゼに対する耐性をもたらすだけでなく、細菌応答にも直接関与するものと考えられることを示した。
【０１９４】
(実施例2)
遺伝子yydFは、バチルス・スブチリスによって生成されるペプチド(配列番号1)をコードするために文献において提案された。しかし、その実際の合成又はいかなる翻訳後修飾の証拠も報告されたことがなかった。
【０１９５】
合成培地(5倍緩衝溶液(500mL中Na2HPO4:17g、KH2PO4:7.5g、NaCl:1.25g、NH4Cl:2.5g);微量元素溶液: 200mL中MnCl2:20mg、ZnCl2:34mg、CuCl2:8.6mg、CoCl2:12mg、Na2MoO4:12mg)でB.スブチリスを増殖させた後、本発明者等は、質量スペクトル分析によって立証したように(表1)、YydFから生じ、残基33から49を包含する(図7)ペプチドの精製に成功した。単離したペプチド配列は(配列番号61)であることが決定された:
【０１９６】
【化２】
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【０１９７】
更に、本発明者等は、B.スブチリスによって生成されたペプチドYydF33-49が36位(Val)及び44位(Ile)に位置する2個のエピメリ化した残基(すなわち、D-アミノ酸)を含有することを決定した。したがって、このペプチドはYydF_33-49DDと呼ばれた。本発明者等による以前の研究(実施例1)によって、エピメリ化した残基は、アミノ酸Cα原子を標的とする特有のラジカルSAM酵素、YydGによるL-アミノ酸残基の変換の結果であることが立証された。現在、はっきりとしたエピメリ化を含有するこのような短いペプチドが細菌によって生成されることは知られていない。
【０１９８】
オペロンYydFGHIJは、その他の刺激の中でも細菌の完全な細胞壁を感知する2成分系LiaRSを誘導することが示されたので、本発明者等は様々なYydFペプチド誘導体によって誘発される推定細菌増殖の阻害を検索した。最初の試験は、残基18-49を包含するペプチド(YydF18-49、配列番号20)で実施した。
【０１９９】
示したように(図5B)、2個エピメリ化した残基:Val36及びIle44(配列番号61に従って番号付けしている)を含有するペプチドYydF18-49DDが存在する場合のみ、本発明者等は細菌増殖阻害をモニターした。1個のエピメリ化した残基の存在又はエピメリ化した残基の非存在は細菌増殖にあまり影響を及ぼさなかった。このことは、エピメリ化した残基を含む短いペプチドが細菌増殖を阻害できることを初めて示唆した。
【０２００】
2つの重要なエピメリ化した残基の存在が阻害特性に不可欠であることが立証されたので、本発明者等はB.スブチリスによって生成されるペプチドの配列(配列番号61)に対応する2つのペプチドを合成した。これらの2個のペプチドはL-アミノ酸残基のみ(YydF33-49)又は2個の不可欠なエピメリ化した残基:D-Val36及びD-Ile44(YydF33-49DD)を含有した。YydF33-49DDペプチドのみが細菌増殖を阻害することがわかった(図8a)。この新規ペプチドは、以前にアッセイしたYydF18-49DDペプチドよりも100倍強力で(図8b&c)、MIC<1μMであることがわかった。更に、本発明者等はこれらのペプチドが細菌増殖を阻害するだけでなく、細菌細胞死を誘導することも示した。実際に、最初に3時間増殖させた後、YydF18-49ペプチドを中期対数増殖期に添加すると(図9)、細胞密度の減少を伴う明らかな減速が測定された。
【０２０１】
興味深いことに、YydFペプチドの相同体は、サリニバチルス・アイディンゲンシス(Salinibacillus aidingensis)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、パニエバチルス種等の数種のグラム陽性菌及びエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・カカエ(Enterococcus caccae)、ストレプトコッカス・アガラクチア、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス、スタフィロコッカス・エクオラム、スタフィロコッカス・コンジメンティ(Staphylococcus condimenti)及びスタフィロコッカス・エピデルミス等の数種の病原種のゲノムにおいて予測される(図1D、図6)。
【０２０２】
これらのペプチドに生理活性があるかどうかを決定するために、本発明者等はストレプトコッカス種及びスタフィロコッカス種のゲノムで同定された配列に基づいてペプチドのライブラリーを合成した。本発明者等は、これらのペプチドがB.スブチリスで同定されたペプチドと同じ翻訳後修飾を含有するとの仮説を立て、これは4位及び12位に2個のD-アミノ酸を含む17個のアミノ酸の処理されたペプチド(配列番号62〜65)を意味する。エピメリ化した残基は太字である。
ストレプトコッカス・アガラクチアペプチド-SA1 WYFVRSSKNRWVAGSAH(配列番号62)
ストレプトコッカス・アガラクチアペプチド-SA2 WYFVRNSKNRWVAGSAH(配列番号63)
スタフィロコッカス・エクオラムペプチド-SE WYFVKSKQNRWVVGSGH(配列番号64)
スタフィロコッカス・シュードインターメディウスペプチド-SP WYFVKSQSNRWIVGSGH(配列番号65)
【０２０３】
更に、本発明者等はまた、B.スブチリスから得られた3個の非天然ペプチドYydF33_49配列(配列番号61)を合成したが、これらは2個のエピメリ化した残基(すなわち、Val36及びIle44)がいずれもVal、Ile又はAla残基によって置換されており、それぞれYydF33_49VV、YydF33_49II及びYydF33_49AAであった(配列番号66-68)。エピメリ化した残基は太字である。
YydF33_49AA WYFAKSKENRWALGSGH(配列番号66)
YydF33_49VV WYFVKSKENRWVLGSGH(配列番号67)
YydF33_49II WYFIKSKENRWILGSGH(配列番号68)
【０２０４】
これらの7個のペプチド(配列番号62-68)は、B.スブチリス及び2つの代表的なグラム陽性病原菌:S.アガラクチア及びE.フェカリスに対してアッセイした。示したように、非天然の配列を有するペプチドを含むペプチドは全て、B.スブチリスに対して効果的であった(図10)。E.フェカリスの増殖はペプチド-SA1及びペプチド-SA2で顕著に遅延し、増殖はペプチド-SE及び非天然ペプチドYydF33_49AAで完全に阻害された(図11)。S.アガラクチアは、YydF33-49DD並びに誘導体YydF33-49AA及びYydF33-49vvによって阻害されたが、YydF33-49IIによっては阻害されなかった(図12)。ペプチド:ペプチド-SA1、ペプチド-SA2、ペプチド-SE及びペプチド-SPはいずれも阻害剤であった。
【０２０５】
したがって、本発明者等は、2個のD-アミノ酸残基を含有する短いペプチドは、関係のある病原体を含む数種のグラム陽性菌の増殖を阻害することができる新種の阻害性ペプチドであることを示した。これらは、中期対数増殖期の開始時又は細菌増殖後に添加すると効果的である。最後に、配列中のいくつかの明確な修飾は属及び種レベルでのこれらのペプチドの阻害特性及び特異性を調整することができ、標的抗生物質の開発を可能にする。更に、17個のアミノ酸のフレームワーク及び芳香族残基(W又はY)の下流の2個のD-アミノ酸の保存された位置(4位及び12位)に基づいて、本発明者等はまた、アッセイしたグラム陽性菌全てに対して効果的であることがわかった非天然配列を含むペプチドを設計することができることを示した。
【０２０６】
この生理活性ペプチドは、元のYydF33-49配列に対して100%から58.8%で変化する配列同一性を有することがわかり、それらの全体的な阻害特性を変更することなく少なくとも7個のアミノ酸残基を変化させることができることを意味する。したがって、特定の細菌属を標的とし、生物学的特性を調整するために、前例のない方法でこれらのペプチドを操作することができる。
【０２０７】
【化３】
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【０２０８】
材料及び方法
YydG発現
yydG遺伝子を合成し(Life Technologies社)、pASKプラスミドにクローニングした。プラスミドを大腸菌BL21(DE3)star(Life Technologies社)で発現させ、タンパク質発現はアンピシリン(100μg.mL-1)を含有するLB培地中で実施した。21℃で一晩増殖後、細胞を収集し、緩衝液A(トリス50mM、KCl300mM、グリセロール10% pH 7.5)中で超音波処理することによって破砕した。細菌懸濁液を45,000×gで1.5時間遠心分離し、タンパク質上清を予め緩衝液Aで平衡化したStreptactin大容量(IBA GmbH)カラムに添加した。YydGタンパク質はデスチオビオチン(0.6mg/mL)を含有する緩衝液A6mLで溶出し、分画分子量10kDaのAmicon濃縮器(Millipore社)で更に濃縮した。
【０２０９】
酵素再構成
YydGは、Bactron IV嫌気性チャンバー中において嫌気性条件下で再構成した。タンパク質は、DTT3mMで12℃で15分間混合し、次にNa2S及び(NH4)2Fe(SO4)2を添加し、この溶液を12℃で4時間インキュベートした。
【０２１０】
酵素アッセイ
YydGは、特に指示しなければ、DTT3mM、SAM1mM及びペプチド基質1mMでインキュベートした。インキュベーションは、10μLずつの試料で25℃で厳密な嫌気性条件下で一晩実施した。
【０２１１】
HPLC分析
HPLC分析は、逆相カラム(LiChroSphere 100 RP-18e 5μm)を装備したAgilent 1200 series infinity(Merck Millipore社)で実施した。溶媒A(H2O、0.1% TFA)からB(80% CH3CN、19.9% H2O、0.1% TFA)の勾配を以下の通りに適用した:0〜1分:100% A/0% B;1〜45分:流速1ml.分-1で1分当たり溶媒B 1%の線形勾配。検出は、ダイオードアレイ検出器及びフルオレセンス(278nmで励起し、350nmで放射)を用いて257nm及び278nmで実施した。
【０２１２】
液体クロマトグラフィー-質量スペクトル/質量スペクトル分析
高分解液体クロマトグラフィー質量スペクトル/質量スペクトル分析は、LTQ-Orbitrap Discovery質量分析器(ThermoFisher社)を使用して、ナノエレクトロスプレーイオン源及びUltimate 3000 LC system(Dionex社)を用いて実施した。LTQ質量分析器(ThermoFisher社)及びナノエレクトロスプレーイオン源は所定の分析のために使用した。ペプチド分析は、ナノカラムPepmap 100 C18(0.075及び15cm、100Å、3μm)で実施した。
【０２１３】
固体培地での阻害アッセイ
アッセイする細菌種の一晩培養物を滅菌したBHI液体培地に新たに播種した。37℃で4時間細菌を増殖させた後、培地を1/1000に希釈し、42℃で予め加熱した軟寒天培地に播種した。細菌を含有するアガロース培地を前もってゼリー状にした滅菌BHIアガロース層に重層した。ペプチド200μgをプレートに点在させ、細菌増殖を37℃で進行させた。
【０２１４】
液体培地での阻害アッセイ
アッセイする細菌種の一晩培養物を滅菌したLB液体培地に新たに播種した。37℃で4時間細菌増殖後、培地を1/10000に希釈し、滅菌した液体LB又はBHI培地に播種した。ペプチド溶液を0.01から100μMの範囲の最終濃度で添加し(1/100)、600nmでのODをTecanマイクロプレートリーダー(Infinite(登録商標)200 PRO series)を使用して連続的に記録した。
【０２１５】
【表１】
2019500338.tif 000005
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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