(57)【要約】  本発明は、ナノケージ、具体的にはタンパク質ナノケージ、特にフェリチンナノケージを提供する。本発明は、変異フェリチンポリペプチドおよびそれらをコードする核酸、突然変異フェリチンナノケージ、ならびに診断および薬物送達における、また同様に薬物開発中の表現型スクリーニングにおける、それらの使用に及ぶ。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型フェリチンポリペプチドの修飾されたアミノ酸配列を含む変異フェリチンポリペプチドであって、前記修飾された配列が、二量体サブユニット境界面または前記ポリペプチドのＮ末端にあり、前記変異体が、核形成剤と接触しない限り、フェリチンナノケージに集合することができない、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、修飾されたバクテリオフェリチンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記変異バクテリオフェリチンが、Ｈｉｓ標識を含み、任意選択で、前記Ｈｉｓ標識が、核酸配列（配列番号３）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号４）もしくはその変異体の断片を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記変異バクテリオフェリチンが、Ｎ末端Ｈｉｓ標識を含み、任意選択で、前記変異バクテリオフェリチンが、核酸配列（配列番号５）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号６）もしくはその変異体の断片を含む、請求項２または請求項３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記変異バクテリオフェリチンが、ガドリニウム結合ペプチド、シリカ結合ペプチド、または金、銅、鉄などの金属結合ペプチドから選択される核形成剤に結合するように構成されたアミノ酸配列を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記変異バクテリオフェリチンが、金結合ペプチドを含み、任意選択で、前記金結合ペプチドが、核酸配列（配列番号７）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号８）もしくはその変異体の断片を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記核形成剤結合ペプチドが、Ｃ末端核形成剤結合ペプチドであり、任意選択で、前記変異バクテリオフェリチンが、核酸配列（配列番号９）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号１０）もしくはその変異体の断片を含む、請求項５または請求項６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記変異バクテリオフェリチンが、Ｎ末端Ｈｉｓ標識と、Ｃ末端核形成剤結合ペプチドと、を含み、任意選択で、前記変異バクテリオフェリチンが、核酸配列（配列番号１１）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号１２）もしくはその変異体の断片を含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記変異フェリチンポリペプチドが、修飾された哺乳動物フェリチン、好ましくは修飾されたヒトフェリチンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記変異ヒトフェリチンが、前記野生型ヒトポリペプチドの前記二量体サブユニット境界面を妨害する１つ以上の修飾を含み、それによって核形成剤と接触しない限り、前記変異体が重鎖二量体を形成できないようにする、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記変異フェリチンポリペプチドが、変異ヒト重鎖フェリチンを含む、請求項９または請求項１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記変異ヒト重鎖フェリチンが、前記野生型ポリペプチド中に１つ以上の修飾を含み、前記ポリペプチドの前記重鎖二量体サブユニット境界面中の１つ以上の疎水性残基が、小さいアミノ酸残基で置換され、それによって、核形成剤と接触しない限り、前記変異体が、重鎖二量体を形成できないようにし、その結果、高次のナノケージとなる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記重鎖二量体サブユニット境界面が、配列番号１９、２０、２１、２２、または２９に示されるアミノ酸残基を含む、またはそれらからなる、請求項１１または請求項１２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異重鎖フェリチンポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸２９、３６、８１、または８３中に、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの修飾を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異重鎖フェリチンポリペプチドが、配列番号１６のアミノ酸残基Ｌ２９、Ｌ３６、Ｉ８１、および／またはＬ８３の修飾によって形成され、前記アミノ酸Ｌ２９における修飾が、アラニンによる置換を含み、前記アミノ酸Ｌ３６における修飾が、アラニンによる置換を含み、前記アミノ酸Ｉ８１における修飾が、アラニンによる置換を含み、および／または前記アミノ酸Ｌ８３における修飾が、アラニンによる置換を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記変異ヒト重鎖フェリチンポリペプチドが、核酸配列（配列番号３０）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号３１）もしくはその変異体の断片を含む、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記変異フェリチンポリペプチドが変異ヒト軽鎖フェリチンを含む、請求項９または請求項１０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記変異ヒト軽鎖フェリチンが、前記野生型ポリペプチド中に１つ以上の修飾を含み、前記ポリペプチドの前記軽鎖二量体サブユニット境界面中の１つ以上の疎水性残基が、小さいアミノ酸残基で置換され、それによって、核形成剤と接触しない限り、前記変異体が軽鎖二量体を形成できないようにし、その結果、高次のナノケージとなる、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記軽鎖二量体サブユニット境界面が、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９に示されるアミノ酸残基を含む、またはそれらからなる、請求項１７または請求項１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記変異軽鎖フェリチンポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸３２、３６、６７、または７９中に、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの修飾を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記変異軽鎖フェリチンポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸残基Ｌ３２、Ｆ３６、Ｌ６７、および／またはＦ７９の修飾によって形成され、前記アミノ酸Ｌ３２における修飾が、アラニンによる置換を含み、前記アミノ酸Ｆ３６における修飾が、アラニンによる置換を含み、前記アミノ酸Ｌ６７における修飾が、アラニンによる置換を含み、前記アミノ酸Ｆ７９における修飾が、アラニンによる置換を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記変異ヒト軽鎖フェリチンが、核酸配列（配列番号３２）によってコードされる、あるいはアミノ酸配列（配列番号３３）またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記変異フェリチンが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）から選択されるフルオロフォアを含み、任意選択で、前記フルオロフォアが、前記変異フェリチンのＮ末端に、または前記変異フェリチンのＮ末端に向かって、配置される、請求項１〜２２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記フルオロフォアが、ＧＦＰを含み、任意選択で、前記核酸配列（配列番号３４）によってコードされる、またはアミノ酸配列（配列番号３５）もしくはその変異体の断片を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記変異ヒト重鎖フェリチンが、核酸（配列番号３６）によってコードされる、またはアミノ酸（配列番号３７）配列もしくはその変異体の断片を含む、請求項２３または請求項２４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記変異ヒト軽鎖フェリチンが、核酸（配列番号３８）によってコードされる、またはアミノ酸（配列番号３９）配列もしくはその変異体の断片を含む、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記変異ヒト重鎖または軽鎖フェリチンが、核酸配列（配列番号３）によってコードされるＨｉｓ標識を含む、またはアミノ酸配列（配列番号４）もしくはその変異体の断片を含み、任意選択で、前記Ｈｉｓ標識がＮ末端Ｈｉｓ標識である、請求項９〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記変異ヒト重鎖フェリチンが、核酸（配列番号４０）によってコードされる、またはアミノ酸（配列番号４１）配列もしくはその変異体の断片を含む、請求項９〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記変異ヒト軽鎖フェリチンが、核酸（配列番号４２）によってコードされる、またはアミノ酸（配列番号４３）配列もしくはその変異体の断片を含む、請求項９〜２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記変異ヒトフェリチンが、ガドリニウム結合ペプチド、シリカ結合ペプチド、または金、銅、鉄などの金属結合ペプチドから選択される核形成剤結合ペプチドを含み、任意選択で、前記金属結合ペプチドが、配列番号８に実質的に示されるアミノ酸配列もしくはその変異体の断片を含む、またはそれらからなる、あるいは配列番号７に実質的に示される核酸配列によってコードされる、請求項９〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記変異ヒト重鎖フェリチンが、核酸（配列番号４４）によってコードされる、あるいはアミノ酸（配列番号４５）配列またはその断片もしくは変異体を含む、請求項９〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記変異ヒト軽鎖フェリチンが、核酸（配列番号４６）によってコードされる、あるいはアミノ酸（配列番号４７）配列またはその断片もしくは変異体を含む、請求項９〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記変異フェリチンが、抗体またはその抗原結合断片に結合するように構成されたアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記抗体またはその抗原結合断片結合ペプチドが、前記変異フェリチンポリペプチドのＮ末端に、または前記変異フェリチンポリペプチドのＮ末端に向けて、配置される、請求項１〜３２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記抗体またはその抗原結合断片結合アミノ酸配列が、Ｚドメインを含み、任意選択で、前記Ｚドメイン配列が、２つのタンデムドメインが互いに隣接して配置（即ち、ＺＺ）されるように、反復配列としてコードされる、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Ｚドメインが、前記核酸配列（配列番号４８）によってコードされる、あるいは前記アミノ酸配列（配列番号４９）またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記変異ヒト重鎖フェリチンが、核酸（配列番号５０）によってコードされる、またはアミノ酸（配列番号５１）配列またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記変異バクテリオフェリチンが、核酸（配列番号５２）によってコードされる、あるいはアミノ酸（配列番号５３）配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
野生型フェリチンと、抗体またはその抗原結合断片結合ペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、および核形成剤結合ペプチドからなる群から選択される１つ以上のペプチドと、を含む、融合タンパク質。
【請求項３９】
前記融合タンパク質が、（ｉ）任意選択で、配列番号２として実質的に示されるアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなる、あるいは配列番号１として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる、バクテリオフェリチン、または（ｉｉ）任意選択で、配列番号１６または１８として実質的に示されるアミノ酸配列を含む、もしくはそれからなる、あるいは配列番号１５もしくは１７として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる、ヒトフェリチン、を含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記抗体またはその抗原結合断片結合ペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、および核形成剤結合ペプチドが、請求項１〜３７のいずれか１項に定義されるとおりである、請求項３８または請求項３９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、またはその断片もしくは変異体、を含むまたはそれからなる、単離された核酸。
【請求項４２】
前記核酸が、配列番号５、９、１１、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに実質的に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる、請求項４１に記載の単離された核酸。
【請求項４３】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチド、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質および核形成剤を含む、フェリチンナノケージ。
【請求項４４】
フェリチンナノケージを調製する方法であって、前記方法が、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチド、または請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、核形成剤と接触させることを含む、方法。
【請求項４５】
前記核形成剤が、約１〜５００ｎｍ、１〜１００ｎｍ、２〜５０ｎｍ、または３〜１０ｎｍの平均粒径を有するナノ粒子を含む、請求項４３に記載のナノケージまたは請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記核形成剤が金属性であり、任意選択で、前記核形成剤が、金、鉄、または銅である、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項４７】
前記フェリチンナノケージが、金ナノ粒子を封入する、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項４８】
前記フェリチンナノケージが、蛍光タンパク質またはフルオロフォアなどの造影剤を用いて機能化される、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項４９】
前記フェリチンナノケージが、抗体もしくはその抗原結合断片を含む、またはそれによって機能化され、任意選択で、前記抗体またはその抗原結合断片が、エンドサイトーシス受容体またはＩｇＧ抗体に対して免疫特異性である、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項５０】
前記核形成剤が、薬物分子などの活性剤であるペイロード分子に結合する、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項５１】
前記ナノケージが、フェリチンポリペプチドまたは融合タンパク質の複数の同一のモノマーを含み、各モノマーが、フェリチン、任意選択で前記ヒトフェリチンの軽鎖または重鎖、ならびに抗体またはその抗原結合断片結合ペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、および核形成剤結合ペプチドからなる群から選択される１つ以上のドメイン、を含む、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項５２】
前記ナノケージが、フェリチンポリペプチドまたは融合タンパク質の複数の異なるモノマーを含み、第１および第２のモノマーが、フェリチンと、任意選択で前記ヒトフェリチンの軽鎖または重鎖と、抗体またはその抗原結合断片結合ペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、および核形成剤結合ペプチドからなる群から選択される１つ以上のドメインと、を含み、前記第１および第２のモノマーが、異なる組み合わせのドメインを有する、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のナノケージまたは方法。
【請求項５３】
ペイロード分子、好ましくは薬物分子を標的細胞に送達するためのベクターとして使用するための、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージ。
【請求項５４】
ペイロード分子、好ましくは薬物分子をフェリチンナノケージ中に封入する方法であって、前記方法が、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチドまたは請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、ペイロード分子に共役した核形成剤と接触させることと、前記ペイロード分子を封入するために、前記ポリペプチドまたはタンパク質をナノケージに自己集合させることを可能にすることと、を含む、方法。
【請求項５５】
前記ペイロード分子の分子量が５０Ｄａ〜１０ｋＤａである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
フェリチンナノケージを標的の生物環境に標的化する方法であって、前記方法が、請求項４３〜５０に記載のフェリチンナノケージを、標的細胞に対して免疫特異性である抗体またはその抗原結合断片によって機能化することと、前記機能化されたナノケージを前記標的の生物環境に標的化することを可能にすることと、を含む、方法。
【請求項５７】
療法または診断に使用するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチド、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージ。
【請求項５８】
疾患、好ましくは癌の治療、予防、または改善に使用するための、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチド、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージ。
【請求項５９】
前記ナノケージを熱に露出させて分解することにより、前記ペイロード分子を解放することを含む、請求項５８に記載の使用のための変異フェリチンポリペプチド、融合タンパク質、またはフェリチンナノケージ。
【請求項６０】
前記ナノケージを分解することによって、前記ペイロード分子を解放するように、封入されたペイロード分子を含み、任意選択で熱源がレーザーを含む、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージを加熱するための熱源の使用。
【請求項６１】
細胞への薬物送達をその治療効果と相関させるための、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージの使用。
【請求項６２】
請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージを含む、表現型アッセイ。
【請求項６３】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の変異フェリチンポリペプチド、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージ、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項６４】
請求項６３に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスであって、前記プロセスが、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の治療有効量の変異フェリチンポリペプチド、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のフェリチンナノケージ、および薬学的に許容されるビヒクルを接触させることを含む、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノケージ、具体的にはタンパク質ナノケージ、特にフェリチンナノケージに関する。本発明は、変異フェリチンポリペプチドおよびそれらをコードする核酸、突然変異フェリチンナノケージ、ならびに診断および薬物送達における、また同様に薬物開発中の表現型スクリーニングにおける、それらの使用に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ナノケージは、自己集合して、中央キャビティを有する三次元構造を形成するタンパク質の一分類である。そのようなタンパク質の幅広い多様性は、様々な程度のサイズ、内部キャビティの大きさ、および多孔性を伴って天然に存在する。フェリチンはそのようなタンパク質の１つである。それは全ての生物界で見られ、鉄を貯蔵するよう天然に作用し、それによってフェントン反応で引き起こされる酸化的損傷から宿主を保護する。フェリチンはその潜在的なバイオナノテクノロジー応用に関してかなりの注目を集めている１。
【０００３】
最近の研究によって、インビボ診断および薬物送達のための潜在的薬剤としてのフェリチンナノケージの適合性および適用性が実証されている。それらは１２ｎｍの外径および８ｎｍの内部キャビティを有する。フェリチンナノケージはｐＨのシフトによって可逆的に分解することができ２、これを利用してケージ当たり約５個のＤｏｘ分子の比で、抗がん剤ドキソルビシン（Ｄｏｘ）を封入する３ことが実証されている。このアプローチは有用であったが、完全に集合したケージのうち典型的には５０％以下しか回収されない、低効率の問題がある３，４。また、ナノケージが薬物の存在下で再形成される場合、受動的封入技術を使用してフェリチン内に封入することができる活性剤である、Ｄｏｘの割合はわずか約０．１〜０．４％で、非常に低いため、薬物の搭載が無駄になる。
【発明の概要】
【０００４】
Ｄｏｘ搭載フェリチンナノケージは、マウスモデルにおいて癌の標的化を実証するために首尾よく使用されてきた。内田および同僚ら５は、フェリチンのＮ末端にペプチド（Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ、ＲＧＤ４Ｃ）、αｖβインテグリンを標的とすることが知られているＲＧＤペプチドの誘導体３、多くの種類の腫瘍細胞に上方制御される腫瘍バイオマーカーをコードするアプローチを取った６〜９。本発明者らは、これらのペプチド修飾ナノケージはＣ３２メラノーマ細胞に結合することができることを実証した５。その後、Ｘｉｅおよび同僚らは、Ｄｏｘ搭載ＲＧＤ４Ｃ修飾フェリチンを使用してマウスにおいて腫瘍モデルＵ８７ＭＧをうまく標的して治療した。１０さらに、Ｙａｎおよび同僚らは、マウスモデルにおいてＨＴ２９腫瘍を治療するためにＤｏｘ搭載フェリチンを使用できることを首尾よく実証した４。この後者の研究において、本発明者らは能動的な標的化が必要ではないことを見出し、取り込みは、天然ＴｆＲ１受容体媒介エンドサイトーシスを介することを本発明者らは提案した。
【０００５】
キメラフェリチン分子は、異なるペプチドをタンパク質のＮ末端に連結することによって作製され得ることもまた実証されている。２種類のフェリチンをインビトロで混合し、ｐＨスイッチを使用して分解および再集合させることにより、異なるペプチドを同じナノケージ構造に組み込むことができる。これは、多価エピトープがナノケージに付着できるが分布に制限がある方法を提供する１１。
【０００６】
インビボでの薬物の標的化送達のためのナノ粒子は、重要な研究の主題となっている魅力的なアイデアである。それにもかかわらず、過去１０年間で、設計されたナノ粒子の標的化率を大幅に向上させることはできなかった１２。研究されたナノ粒子の大部分は、１０〜２００ｎｍのサイズ範囲に化学的に基づいており、多くの腫瘍と関連する増強された透過性および保持効果（ＥＰＲ）に依存している。これらの方法の送達効率が低いことによって、生体適合性およびサイズの問題は重要であり、より大きなナノ粒子が単核食作用系（ＭＰＳ）によって容易に隔離されることが示される。加えて、ＥＰＲの有効性は、普遍的な標的化メカニズムとして疑問視されている。薬物標的化の改善は明らかに生体適合性、生物学的利用能、および標的化効率の変化を必要とする。
【０００７】
フェリチンは、多くの化学薬品に代わる魅力的な代替物である。血中に留まるのに十分な大きさ（＞８ｎｍ）があるが、生体適合性であり非免疫原性でもある４、１１。サイズ（＜５０ｎｍ）は標的化効率における重要な因子であるので、それはまた、十分に小さくより良好な腫瘍貫通特性を有する。１２。さらに、フェリチンの腫瘍への浸潤は細胞内輸送機構を介して起こり得ることが提示されており、したがって腫瘍浸潤に対するＥＰＲ効果に完全には依存しないであろう１３、１４。
【０００８】
それゆえに、フェリチンナノケージおよびその成分の改善が必要であり、それによりインビトロおよびインビボおよび／または診断において、ならびに薬剤開発における表現型スクリーニングにおいて、細胞への薬物の標的送達のために使用することができる。
【０００９】
インビボまたはインビトロのいずれかで、細胞内に薬物を送達できる技術の潜在的な多数の応用を容易にするために、本発明者らは、モジュールおよび一般的なアプローチを促進する生体適合性プラットフォームを設計することを目指した。本発明者らは、自己集合してナノケージ構造を形成することができないように二量体サブユニット界面が変異している、変異フェリチンポリペプチドを開発した。しかしながら、変異フェリチンを核形成性金属コア（例えば金ナノ粒子）と接触させると、突然変異体はコアの周りに自己集合し、それによってコアを封入するナノケージを形成する。さらに、活性剤を変異フェリチンポリペプチドと接触させる前に、活性剤を金属コアに付着させることによって、小分子剤などの活性剤を自己集合ナノケージ構造に封入することが可能である。したがって、本発明は、既知のシステムで使用されている厳しい変性条件なしにフェリチンナノケージに薬物を封入するための新規なメカニズムを提供する。本発明者らはまた、診断および画像化実験で使用するために、変異ナノケージを突然変異フェリチンへのＮ末端蛍光タンパク質の融合によって蛍光性になるように修飾できることを示した。さらに、彼らはまた、ナノケージが抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合することができ、変異フェリチンのＮ末端への抗体結合ドメインのさらなる融合よって細胞を標的とすることができ、それによって、抗体結合タンパク質は標的細胞に特異的に結合することができることを実証した。本発明者らはまた、この抗体に基づいた標的化プラットフォームが細胞、例えば腫瘍細胞への薬物の標的化送達のために使用できることを実証している。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様において、野生型フェリチンポリペプチドの修飾されたアミノ酸配列を含む変異フェリチンポリペプチドが提供され、修飾された配列は二量体サブユニット境界面またはポリペプチドのＮ末端にあり、核形成剤と接触しない限り、変異体はフェリチンナノケージに集合することができない。
【００１１】
有利なことに、本発明の変異フェリチンは、生体適合性であり、免疫原性ではない。本発明者らは、フェリチンポリペプチドモノマーのいくつかの実施形態を操作し、それによって、核生成剤の存在下ではナノケージにのみ自己集合する。これらの修飾されたナノケージモノマーは、インビボまたはインビトロのいずれかで、細胞内への薬物の送達を容易にするように、診断または治療に使用することができる。
【００１２】
１つの好ましい実施形態では、本変異フェリチンポリペプチドは、バクテリオフェリチン（Ｂｆｒ）としても知られる修飾された細菌フェリチンを含む。バクテリオフェリチンはＥ．ｃｏｌｉから単離され得る。このバクテリオフェリチンは、二量体タンパク質境界面の間で結合する２４個のサブユニットおよび１２個のヘム基を含む。野生型Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオフェリチンの核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）は既知であり、以下のとおり、本明細書では配列番号１および配列番号２またはその断片もしくは変異体として表されてもよい。
【００１３】
【化１】
2019535246.tif 000003
【００１４】
１つの好ましい実施形態では、本変異バクテリオフェリチンはＨｉｓ標識を含む。好ましくは、Ｈｉｓ標識は、以下のとおり、配列番号３および配列番号４に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号３）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号４）もしくはその変異体の断片を含む。
【００１５】
【化２】
2019535246.tif 000004
【００１６】
好ましくは、本変異バクテリオフェリチンはＮ末端Ｈｉｓ標識を含む。したがって、本変異バクテリオフェリチンは、以下のとおり、配列番号５および配列番号６に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号５）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号６）もしくはその変異体の断片を含むことが好ましい。
【００１７】
【化３】
2019535246.tif 000005
【００１８】
別の好ましい実施形態では、本変異バクテリオフェリチンは、核形成剤に結合するように構成されたアミノ酸配列を含み、例えば、シリカ結合ペプチド、または金、銅、鉄などの金属結合ペプチドであってもよい。代替的な実施形態では、本変異体はガドリニウム結合ペプチドを含んでもよい。しかしながら、最も好ましくは、本変異バクテリオフェリチンは金結合ペプチドを含む。例えば、好適な金属結合ペプチドは、以下のとおり、配列番号７および配列番号８に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号７）によってコードされ得るか、またはアミノ酸配列（配列番号８）もしくはその変異体の断片を含む。
【００１９】
【化４】
2019535246.tif 000006
【００２０】
好ましくは、核形成剤結合ペプチドは、Ｃ末端核形成剤結合ペプチドである。したがって、本変異バクテリオフェリチンは、好ましくは、以下のとおり、配列番号９および配列番号１０に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号９）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号１０）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００２１】
【化５】
2019535246.tif 000007
【００２２】
別の好ましい実施形態では、本変異バクテリオフェリチンは、Ｎ末端Ｈｉｓ標識およびＣ末端核形成剤結合ペプチドを含んでもよい。したがって、好ましくは、本変異バクテリオフェリチンは、以下のとおり、配列番号１１および配列番号１２に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号１１）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号１２）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００２３】
【化６】
2019535246.tif 000008
【００２４】
実施例に記載されるように、発明者らは、Ｎ末端Ｈｉｓ標識の付加により、バクテリオフェリチンが、そのナノケージ組成においては二量体化も純化もしなかったが、代わりに個々のモノマーとして二量体化および純化したことを観察し、驚いた。しかしながら、バクテリオフェリチンがＣ末端金結合ペプチドを有した場合、かつ金ナノ粒子核形成剤の添加後に、本変異バクテリオフェリチンは、驚くべきことに、金ナノ粒子の周囲に形成されたナノケージと一致するより高次の構造を形成した。驚くべきことに、Ｎ末端Ｈｉｓタグを用いたバクテリオフェリチン配列の軽微な修飾により、通常の生理学的条件下でバクテリオフェリチンのナノケージ構造が不安定化され、Ｃ末端金属結合ペプチドの使用は、厳しい変性条件を使用することなく、ナノケージの金属結合ペプチドをテンプレートとした集合を確立するのに足りる。
【００２５】
１つの好ましい態様において、バクテリオフェリチンは、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびＨｉｓ標識をコードする核酸を含む構築物を使用して細菌宿主中で発現される。構築物中で使用されるプロモーターは、構成的Ｊ２３１００プロモーターを誘導性Ｔ７プロモーターと組み合わせて有する合成プロモーターであってもよい。例えば、好ましい細菌発現構築物の核酸配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）は、以下のとおり、本明細書ではそれぞれ配列番号１３および配列番号１４またはその断片もしくは変異体として表されてもよい。
【００２６】
【化７】
2019535246.tif 000009
【００２７】
しかしながら、最も好ましい実施形態では、本変異フェリチンポリペプチドは、修飾された哺乳動物フェリチン、最も好ましくは修飾されたヒトフェリチンを含む。好ましくは、本変異ヒトフェリチンは、野生型ヒトポリペプチドの二量体サブユニット境界面を妨害することにより、本変異体が、核形成剤と接触しない限り重鎖二量体を形成できないようにする、１つ以上の修飾を含む。ヒトフェリチンは、軽鎖フェリチンサブユニット（ｌＦＴＮ）もしくは重鎖フェリチンサブユニット（ｈＦＴＮ）、またはこれら両方の組み合わせで構成され得る。宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｌＦＴＮまたはｈＦＴＮのいずれかを発現させることによって、単一のタンパク質モノマーのみからなるフェリチン変異体ナノケージを創出することが可能である。
【００２８】
野生型ヒト重鎖フェリチンの核酸配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）は既知であり、以下のとおり、本明細書では配列番号１５および配列番号１６またはその断片もしくは変異体として表されてもよい。
【００２９】
【化８】
2019535246.tif 000010
【００３０】
野生型ヒト軽鎖フェリチンの核酸配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）は既知であり、実質的に以下のとおり、本明細書では配列番号１７および配列番号１８またはその断片もしくは変異体として表されてもよい。
【００３１】
【化９】
2019535246.tif 000011
【００３２】
実施例に記載されるように、発明者らは、１４７個を超える保存されたフェリチンタンパク質を分析し、驚くべきことに、少なくとも１個の疎水性残基を含有するヒトフェリチンタンパク質（重鎖および軽鎖）の二量体境界面にいくつかの進化的に保存されたドメインを特定することができた（実施例２の表１を参照されたい）。次いで、これらの保存されたモチーフ内の疎水性残基を部位特異的突然変異誘発のために慎重に選択した（図４Ｃおよび４Ｄを参照されたい）。特定した保存されたモチーフに従って、４つの突然変異をフェリチンの重鎖変異体［ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）］に創出し、同様に４つの突然変異をポリペプチドの軽鎖変異体［ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）］に創出した。
【００３３】
したがって、１つの好ましい一実施形態では、本変異フェリチンポリペプチドは、変異ヒト重鎖フェリチンを含む。好ましくは、本変異ヒト重鎖フェリチンは、野生型ポリペプチドの二量体サブユニット境界面を妨害することにより、本変異体が、核形成剤と接触しない限り重鎖二量体を形成できないようにする、１つ以上の修飾を含む。
【００３４】
好ましくは、本変異ヒト重鎖フェリチンは、野生型ポリペプチド中に１つ以上の修飾を含み、この修飾において、本ポリペプチドの重鎖二量体サブユニット境界面中の１つ以上の疎水性残基が小さいアミノ酸残基で置換されることにより、本変異体が、核形成剤と接触しない限り、重鎖二量体、ひいてはより高次のナノケージを形成できないようになる。好ましくは、重鎖二量体サブユニット境界面は、表１に示されるアミノ酸残基、即ち、配列番号１９、２０、２１、２２、および２９を含むかまたはそれからなる。
【００３５】
好ましくは、変異重鎖フェリチンポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸２９、３６、８１、または８３に少なくとも１つの修飾を含む。好ましくは、変異重鎖フェリチンポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸２９、３６、８１、または８３に、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは４つの修飾を含む。好ましくは、変異重鎖フェリチンポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸残基Ｌ２９、Ｌ３６、Ｉ８１、および／またはＬ８３の修飾によって形成される。好ましくは、アミノ酸Ｌ２９における修飾は、アラニンによる置換、即ちＬ２９Ａを含む。好ましくは、アミノ酸Ｌ３６における修飾は、アラニンによる置換、即ちＬ３６Ａを含む。好ましくは、アミノ酸Ｉ８１における修飾は、アラニンによる置換、即ちＩ８１Ａを含む。好ましくは、アミノ酸Ｌ８３における修飾は、アラニンによる置換、即ちＬ８３Ａを含む。
【００３６】
好ましくは、変異ヒト重鎖フェリチンポリペプチド（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）は、以下のとおり、配列番号３０および配列番号３１に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号３０）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号３１）もしくはその変異体の断片を含む。
【００３７】
【化１０】
2019535246.tif 000012
【００３８】
代替的な好ましい実施形態では、本変異フェリチンポリペプチドは、変異ヒト軽鎖フェリチンを含む。好ましくは、本変異ヒト軽鎖フェリチンは、野生型ポリペプチドの二量体サブユニット境界面を妨害することにより、本変異体が、核形成剤と接触しない限り軽鎖二量体を形成できないようにする、１つ以上の修飾を含む。好ましくは、この修飾または各修飾は、ポリペプチドの軽鎖二量体サブユニット境界面中の１つ以上の疎水性残基が小さいアミノ酸残基で置換されることにより、変異体が、核形成剤と接触しない限り、軽鎖二量体、ひいてはより高次のナノケージを形成できないようにすることを含む。好ましくは、軽鎖二量体サブユニット境界面は、表１に示されるアミノ酸残基、即ち、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、および２９を含むかまたはそれらからなる。
【００３９】
好ましくは、変異軽鎖フェリチンポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸３２、３６、６７、または７９に少なくとも１つの修飾を含む。好ましくは、変異軽鎖フェリチンポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸３２、３６、６７、または７９に、少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは４つの修飾を含む。好ましくは、変異軽鎖フェリチンポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸残基Ｌ３２、Ｆ３６、Ｌ６７、および／またはＦ７９の修飾によって形成される。好ましくは、アミノ酸Ｌ３２における修飾は、アラニンによる置換、即ちＬ３２Ａを含む。好ましくは、アミノ酸Ｆ３６における修飾は、アラニンによる置換、即ちＦ３６Ａを含む。好ましくは、アミノ酸Ｌ６７における修飾は、アラニンによる置換、即ちＬ６７Ａを含む。好ましくは、アミノ酸Ｆ７９における修飾は、アラニンによる置換、即ちＦ７９Ａを含む。
【００４０】
好ましくは、変異ヒト軽鎖フェリチン（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）は、以下のとおり、配列番号３２および配列番号３３に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号３２）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号３３）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００４１】
【化１１】
2019535246.tif 000013
【００４２】
実施例に記載されるように、４つの変異を、ヒトフェリチンの重鎖［ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）］および軽鎖［ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）］鎖に創出した。これらの各々は、Ｃ末端金結合ペプチドを用いてまたは用いずに、ナノケージの可視化を可能にするためにＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）とのＮ末端融合物として構築した。
【００４３】
よって、１つの好ましい実施形態では、バクテリアフェリチンまたはヒトフェリチン（重鎖または軽鎖）であってもよい変異フェリチンは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などのフルオロフォアを含む。好ましいフルオロフォアはＧＦＰを含み、その核酸配列（配列番号３４）およびアミノ酸配列（配列番号３５）は既知であり、以下のとおり、配列番号３４および配列番号３５に実質的に示される。
【００４４】
【化１２】
2019535246.tif 000014
【００４５】
フルオロフォアは、好ましくは、変異フェリチンのＮ末端にまたは変異フェリチンのＮ末端の方に配置される。したがって、好ましくは、変異ヒト重鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号３６および配列番号３７に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号３６）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号３７）もしくはその変異体の断片を含む。
【００４６】
【化１３】
2019535246.tif 000015
【００４７】
【化１４】
2019535246.tif 000016
【００４８】
好ましくは、変異ヒト軽鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号３８および配列番号３９に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号３８）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号３９）もしくはその変異体の断片を含む。
【００４９】
【化１５】
2019535246.tif 000017
【００５０】
【化１６】
2019535246.tif 000018
【００５１】
好ましくは、変異ヒト重鎖または軽鎖フェリチンは、Ｈｉｓ標識、より好ましくはＮ末端Ｈｉｓ標識を含む。好ましくは、Ｈｉｓ標識は、本明細書に開示されるように、核酸配列（配列番号３）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号４）もしくはその変異体の断片を含む。
【００５２】
よって、好ましくは、変異ヒト重鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号４０および配列番号４１に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号４０）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号４１）もしくはその変異体の断片を含む。
【００５３】
【化１７】
2019535246.tif 000019
【００５４】
【化１８】
2019535246.tif 000020
【００５５】
よって、好ましくは、変異ヒト軽鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号４２および配列番号４３に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号４２）によってコードされるか、またはアミノ酸配列（配列番号４３）もしくはその変異体の断片を含む。
【００５６】
【化１９】
2019535246.tif 000021
【００５７】
【化２０】
2019535246.tif 000022
【００５８】
当業者であれば、修飾されたフェリチンのＮ末端（配列番号５、６、９、１０、１１、または１２）に、フルオロフォア、好ましくはＧＦＰ（配列番号３４および３５）を含む、変異バクテリオフェリチンポリペプチドを構築する方法を理解する。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、変異ヒト重鎖または軽鎖フェリチンは、核形成剤結合ペプチド、例えば、シリカ結合ペプチド、もしくは金、銅、鉄などの金属結合ペプチドを含むか、またはガドリニウム結合ペプチドであってもよい。最も好ましくは、変異ヒト重鎖または軽鎖フェリチンは、金結合ペプチドを含む。例えば、好適な金属結合ペプチドは、配列番号８に実質的に示されるアミノ酸配列もしくはその変異体の断片を含むかもしくはそれからなってもよく、または配列番号７に実質的に示される核酸配列によってコードされてもよい。好ましくは、核形成剤結合ペプチドは、Ｃ末端核形成剤結合ペプチドである。
【００６０】
ヒトフェリチンでは、ケージの形成を防ぐために二量体化境界面の修飾が必要であり、驚くべきことに、ナノケージは、Ｃ末端金結合ペプチドの非存在下であっても、金ナノ粒子によって形成された。別の好ましい実施形態では、変異ヒト重鎖または軽鎖フェリチンは、Ｎ末端Ｈｉｓ標識およびＣ末端核形成剤結合ペプチドを含む。
【００６１】
したがって、好ましくは、変異ヒト重鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号４４および配列番号４５に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号４４）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号４５）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００６２】
【化２１】
2019535246.tif 000023
【００６３】
【化２２】
2019535246.tif 000024
【００６４】
好ましくは、変異ヒト軽鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号４６および配列番号４７に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号４６）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号４７）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００６５】
【化２３】
2019535246.tif 000025
【００６６】
【化２４】
2019535246.tif 000026
【００６７】
実施例に記載されるように、発明者らは、抗体結合ドメインを含む変異ヒトフェリチンを構築した。よって、１つの好ましい実施形態では、細菌フェリチンであってもヒトフェリチンであってもよい（重鎖であっても軽鎖であってもよい）変異フェリチンは、ＩｇＧアイソタイプ抗体などの抗体またはその抗原結合断片に結合するように構成されたアミノ酸配列を含む。好ましい抗体またはその抗原結合断片に結合するアミノ酸配列は、Ｚドメインを含み、このＺドメインは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡの誘導体であり、かつ安定性がより優れ、Ｆｃ抗体ドメインに対する結合親和性がより高い、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの操作されたバージョンである。いくつかの実施形態では、Ｚドメイン配列は、単一ドメインとしてコードされてもよいが、好ましくは、反復としてコードされて、その結果、２つのタンデムドメインが、配列が直接反復とならないように好ましくは十分なＤＮＡ重複をもって、互いに隣接して配置される（即ち、ＺＺ）。ＺＺの核酸（配列番号４８）およびアミノ配列（配列番号４９）は既知であり、以下のとおり、配列番号４８および配列番号４９に示されるとおりである。
【００６８】
【化２５】
2019535246.tif 000027
【００６９】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片に結合するペプチドは、変異フェリチンポリペプチドのＮ末端にまたは変異フェリチンポリペプチドのＮ末端の方に提供される。
【００７０】
好ましくは、変異ヒト重鎖フェリチンは、以下のとおり、配列番号５０および配列番号５１に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号５０）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号５１）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００７１】
【化２６】
2019535246.tif 000028
【００７２】
【化２７】
2019535246.tif 000029
【００７３】
【化２８】
2019535246.tif 000030
【００７４】
好ましくは、変異バクテリオフェリチンは、以下のとおり、配列番号５２および配列番号５３に実質的に示されるように、核酸配列（配列番号５２）によってコードされるか、あるいはアミノ酸配列（配列番号５３）またはその断片もしくは変異体を含む。
【００７５】
【化２９】
2019535246.tif 000031
【００７６】
【化３０】
2019535246.tif 000032
【００７７】
上記の変異フェリチンポリペプチドおよび関連する融合タンパク質に加えて、発明者らは、Ｈｉｓ標識、核形成剤結合ペプチド、ＧＦＰ（即ち、フルオロフォア）、および／または抗体結合ペプチドの１つ以上のアミノ酸配列に融合した野生型フェリチンポリペプチド（即ち、細菌、またはヒト軽鎖、またはヒト重鎖）を含む融合タンパク質の広範なシリーズも構築した。
【００７８】
したがって、本発明の第２の態様では、野生型フェリチンと、抗体またはその抗原結合断片に結合するペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、および核形成剤結合ペプチドからなる群から選択される１つ以上のペプチドと、を含む、融合タンパク質が提供される。
【００７９】
融合タンパク質は、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、核形成剤結合ペプチド、および抗体結合ペプチドの様々な組み合わせ、即ち、これらの特徴のいくつかまたはすべてを含み得る。
【００８０】
好ましくは、融合タンパク質は、バクテリオフェリチンを含み、より好ましくは、配列番号２として実質的に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるか、あるいは配列番号１として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる。
【００８１】
しかしながら、より好ましくは、融合タンパク質はヒトフェリチンを含み、このヒトフェリチンは、軽鎖フェリチンまたは重鎖フェリチンであり得る。したがって、好ましくは、融合タンパク質は、配列番号１６または１８として実質的に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるか、あるいは配列番号１５もしくは１７として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる。
【００８２】
好ましくは、フルオロフォアはＧＦＰを含む。ＧＦＰは、配列番号３５として実質的に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなってもよく、あるいは配列番号３４として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる。好ましくは、フルオロフォアは、変異フェリチンのＮ末端にまたは変異フェリチンのＮ末端の方に配置される。
【００８３】
好ましくは、Ｈｉｓ標識は、配列番号４として実質的に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるか、あるいは配列番号３として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる。好ましくは、Ｈｉｓ標識は、変異フェリチンのＮ末端にまたは変異フェリチンのＮ末端の方に配置される。
【００８４】
好ましくは、核形成剤結合ペプチドは、シリカ結合ペプチド、または金、銅、もしくは鉄などの金属結合ペプチドを含む。しかしながら、好ましくは、核形成剤結合ペプチドは、金結合ペプチドを含む。好ましくは、金結合ペプチドは、配列番号８に実質的に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるか、あるいは配列番号７に実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる。
【００８５】
好ましくは、抗体またはその抗原結合断片に結合するペプチドは、反復Ｚドメインを含む。好ましくは、反復Ｚドメインは、配列番号４９として実質的に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるか、あるいは配列番号４８として実質的に示される核酸配列またはその断片もしくは変異体によってコードされる。
【００８６】
最も好ましくは、融合タンパク質は、野生型重鎖ヒトフェリチン、ＧＦＰ、およびＨｉｓ標識を含む。したがって、好ましい実施形態では、第２の態様の融合タンパク質は、配列番号５４に実質的に示される核酸によってコードされるか、あるいは配列番号５５に実質的に示されるアミノ酸またはその断片もしくは変異体を含む。
【００８７】
【化３１】
2019535246.tif 000033
【００８８】
【化３２】
2019535246.tif 000034
【００８９】
最も好ましくは、融合タンパク質は、野生型軽鎖ヒトフェリチン、ＧＦＰ、およびＨｉｓ標識を含む。別の好ましい実施形態では、第２の態様の融合タンパク質は、実質的に配列番号５６に記載の核酸によってコードされるか、あるいは実質的に配列番号５７に記載のアミノ酸またはその断片もしくは変異体を含む。
【００９０】
【化３３】
2019535246.tif 000035
【００９１】
【化３４】
2019535246.tif 000036
【００９２】
さらに別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、野生型重鎖ヒトフェリチン、ＧＦＰ、Ｈｉｓ標識、および好ましくは金属（例えば、金）結合ペプチドである核形成剤結合ペプチドを含む。よって、第２の態様の融合タンパク質は、配列番号５８に実質的に示される核酸によってコードされるか、あるいは配列番号５９に実質的に示されるアミノ酸またはその断片もしくは変異体を含む。
【００９３】
【化３５】
2019535246.tif 000037
【００９４】
【化３６】
2019535246.tif 000038
【００９５】
またさらに別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、野生型軽鎖ヒトフェリチン、ＧＦＰ、Ｈｉｓ標識、および好ましくは金属（例えば、金）結合ペプチドである核形成剤結合ペプチドを含む。よって、第２の態様の融合タンパク質は、配列番号６０に実質的に示される核酸によってコードされるか、あるいは配列番号６１に実質的に示されるアミノ酸またはその断片もしくは変異体を含む。
【００９６】
【化３７】
2019535246.tif 000039
【００９７】
【化３８】
2019535246.tif 000040
【００９８】
またさらに別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、野生型重鎖ヒトフェリチン、ＧＦＰ、Ｈｉｓ標識、および抗体またはその抗原結合断片に結合するペプチドを含む。よって、第２の態様の融合タンパク質は、配列番号６２に実質的に示される核酸によってコードされるか、あるいは配列番号６３に実質的に示されるアミノ酸またはその断片もしくは変異体を含む。
【００９９】
【化３９】
2019535246.tif 000041
【０１００】
【化４０】
2019535246.tif 000042
【０１０１】
上記変異体および野生型フェリチンポリペプチドならびに融合タンパク質中のオープンリーディングフレーム間で使用される好ましいペプチドリンカー配列には、以下が含まれる。
【０１０２】
【化４１】
2019535246.tif 000043
【０１０３】
ＧＦＰから生じる蛍光シグナルに干渉することなくＶｙｂｒａｎｔ細胞染色キットを使用する表現型細胞アッセイによって細胞送達を実施することができるように、ＧＦＰを欠く融合タンパク質のさらなる実施形態を創出した。変異フェリチン融合体を、異なるリンカーアミノ酸配列を用いて創出した。よって、これらの融合タンパク質は、好ましくは、配列番号７２、７４、および７６に実質的に示される核酸によってコードされるか、あるいは配列番号７３、７５、および７７に実質的に示されるアミノ酸、またはその断片もしくは変異体を含んでもよい。
【０１０４】
【化４２】
2019535246.tif 000044
【０１０５】
【化４３】
2019535246.tif 000045
【０１０６】
【化４４】
2019535246.tif 000046
【０１０７】
実施例に示すように、本発明者らによって開発された変異フェリチンポリペプチドは、金属（例えば金）ナノ粒子などの核形成剤と接触しない限り、自己組織化してナノケージを形成することができないような方法で変異した。その場合、突然変異体は金属コアの周りに自己集合し、それによってナノケージを形成し、コアを封入する。
【０１０８】
さらなる態様において、第１の態様の変異フェリチンポリペプチドもしくは第２の態様の融合タンパク質、またはその断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなる、単離された核酸を提供する。
【０１０９】
核酸は、好ましくは、または本明細書に記載の１つ以上のヌクレオチド配列を含むかまたはそれらからなる。好ましい核酸は、実質的に配列番号５、９、１１、３０、３２、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２、５４、５６、５８、６０、または６２のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
【０１１０】
したがって、第３の態様では、第１の態様の変異フェリチンポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質を含むフェリチンナノケージ、および核形成剤が提供される。
【０１１１】
一実施形態において、ナノケージは、フェリチンポリペプチドまたは融合タンパク質の複数の同一モノマーを含むことができる。例えば、一実施形態において、各モノマーは、フェリチン、および抗体またはその抗原結合断片結合ペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓタグ、および核形成剤結合ペプチドからなる群から選択される１つ以上のドメインを含むことができる。好ましくは、モノマーは、ヒトフェリチンを含み、任意選択で、軽鎖または重鎖フェリチンを含む。例えば、実施例１３に記載したように、モノマーはＨｉｓ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を含んでもよい。したがって、得られたナノケージは、各サブユニット上にＺＺドメインおよびＧＦＰドメインを含むだろう。同一のドメインがナノケージの各サブユニットに提示されるように、ドメインの他の組み合わせをナノケージ全体に使用されるモノマーに含めることができることが理解されよう。
【０１１２】
しかしながら、別の実施形態において、ナノケージは、フェリチンポリペプチドまたは融合タンパク質の複数の異なるモノマーを含み得る。例えば、ナノケージは、フェリチンを含む第１のおよび第２のモノマー、ならびに抗体またはその抗原結合断片結合ペプチド、フルオロフォア、Ｈｉｓ標識、および核形成剤結合ペプチドからなる群より選択される１つ以上のドメインを含むことができ、第１のおよび第２のモノマーはドメインの異なる組み合わせを有する。好ましくは、モノマーは、ヒトフェリチンを含み、任意選択で、軽鎖または重鎖フェリチンを含む。
【０１１３】
実施例１３に記載されるように、化合物または異なる種類のフェリチンサブユニットからなる混合ナノケージも作製した。例えば、一実施形態において、第１のモノマーはＨｉｓ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を含み、第２のモノマーはＨｉｓ−ＧＦＰ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を含み得る。得られた融合タンパク質のｈＦｔｎ部分は同一であるので、いくつかのサブユニット上にＺＺドメインを含み、他のサブユニット上にＧＦＰドメインを含むナノケージが形成する。異なるドメインが各ナノケージのサブユニットに提示されるように、ドメインの他の組み合わせをナノケージに存在する様々な異なるモノマーに含めることができることが理解されよう。
【０１１４】
第４の態様において、フェリチンナノケージの製造方法であって、核形成剤と、第１の態様の変異フェリチンポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質とを接触させることを含む方法を提供する。
【０１１５】
核形成剤は、好ましくは約１〜５００ｎｍ、より好ましくは１〜１００ｎｍ、さらにより好ましくは２〜５０ｎｍ、最も好ましくは３〜１０ｎｍ、の平均直径を有するナノ粒子を含む。好ましくは、核形成剤は金属性である。例えば、核形成剤は金、鉄、または銅であり得る。別の実施形態において、薬剤はガドリニウム結合ペプチドを含み得る。
【０１１６】
好ましくは、フェリチンポリペプチドは、核形成剤を封入する。最も好ましくは、フェリチンナノケージは金ナノ粒子を封入する。
【０１１７】
有利なことに、本発明による方法をフェリチンナノケージを使用して、容易に作製するができる。さらに、本発明による方法は、ナノケージを作製するために苛酷な変性条件を使用する必要がなく、再形成ナノケージの完全性を破壊する可能性を減らすので有利である。
【０１１８】
本発明者らはまた、診断および画像化実験における使用のために、ナノケージをＮ末端蛍光タンパク質のフェリチンモノマーへの融合によって蛍光性であるように修飾できることを示した。したがって、好ましくは、フェリチンナノケージは、蛍光タンパク質またはフルオロフォアなどの造影剤で機能化される。本発明のナノケージは、例えばＧＦＰ等、蛍光タンパク質の融合または結合によって蛍光になるように修飾することができる。好ましくは、蛍光タンパク質は、フェリチンポリペプチドのＮ末端でまたはその近くで融合している。
【０１１９】
さらに、本発明者らはまた、ナノケージを抗体で「装飾」し、それによって抗体結合ドメインのさらなる融合によって細胞を標的とすることができ、それによって抗体結合ナノケージが標的細胞に特異的に結合することができる。好ましくは、抗体結合ドメインはフェリチンモノマーのＮ末端に融合している。有利なことに、ナノケージの特異的標的化およびエンドサイトーシスは、ＩｇＧ結合ドメインでフェリチンを修飾することによって達成することができる。これにより、ナノケージを単純な結合反応でＩｇＧ型抗体に結合させることが可能になる。したがって、フェリチンナノケージの抗体への結合は細胞の特異的標的化をもたらす。さらに、ＥＧＦＲ受容体などのエンドサイトーシス受容体を標的とする抗体を使用することによって、ナノケージをエンドサイトーシスすることができ（Ｇｏｈ＆Ｓｏｒｋｉｎ，ＣＳＨ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．５（５），２０１３）、これは、ナノケージおよびその内容物を細胞内に直接送達することにつながる。実施例１１および１２に記載されるように、本発明のナノケージは抗ＥＧＦＲ抗体でうまく機能化された。
【０１２０】
したがって、好ましくは、フェリチンナノケージを含むか、または抗体もしくはその抗原結合断片で機能化される。好ましくは、抗体またはその抗原結合断片はエンドサイトーシス受容体に対して免疫特異的である。このように、ナノケージはエンドサイトーシスされて、ナノケージおよびその内容物を直接標的細胞に送達する。
【０１２１】
好ましい抗体またはその抗原結合断片結合アミノ酸配列は、Ｚドメインを含み、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡの誘導体である。これは、安定性がより優れ、Ｆｃ抗体ドメインに対する結合親和性がより高い、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの操作されたバージョンである。したがって、好ましくは、フェリチンナノケージは、ＩｇＧ抗体で機能化される。好ましくは、抗原認識がＦｖドメインとの直接的な相互作用を介して損なわれないように、フェリチンナノケージは、抗体のＦｃドメインに結合することによって機能化される。抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは標的細胞または組織に対して免疫特異性を示す。したがって、ナノケージは、フェリチンポリペプチドのＮ末端でまたはその近くで抗体結合ドメインの融合によって特定の細胞（例えば腫瘍細胞）を標的とすることができる。したがって、有利なことに、本発明による機能化されたナノケージは特定の細胞を標的とし、同時に可視化することができる。
【０１２２】
したがって、本発明者らは、本発明のナノケージが薬物分子を標的細胞または組織に送達するためのベクターとして使用できることを認識した。
【０１２３】
したがって、さらなる態様では、標的とする生物学的環境にペイロード分子、好ましくは薬物分子を送達するためのベクターとして使用するための、本発明によるフェリチンナノケージが提供される。
【０１２４】
好ましくは金属ナノ粒子である核形成剤は、薬物分子などの活性剤であり得るペイロードに結合され得る。したがって、好ましくは、フェリチンナノケージは、使用時に、ペイロード分子を封入して標的とする生物学的環境に運ぶように構成される。ナノケージは、その中にペイロード分子が含まれる内部キャビティを含み、ペイロード分子は、ナノケージが少なくとも標的とする生物学的環境に隣接している場合に活性であり得る。
【０１２５】
したがって、第５の態様では、ペイロード分子、好ましくは薬物分子をフェリチンナノケージに封入する方法であって、第１の態様の変異フェリチンポリペプチドまたは第２の態様の融合タンパク質を、ペイロード分子にコンジュゲートする核形成剤と接触させることと、ポリペプチドまたはタンパク質をナノケージに自己集合させ、それによってペイロード分子を封入することを可能にすることと、を含む方法を提供する。
【０１２６】
本明細書に記載のペイロード分子は、変異フェリチンポリペプチドまたは融合タンパク質の封入およびその後の混合の前に核形成剤に結合することができる小分子剤などの活性剤であってもよい。ペイロード分子の分子量は、５０Ｄａ〜１０ｋＤａ、好ましくは１００Ｄａ〜１ｋＤａ、より好ましくは２５０Ｄａ〜１０００Ｄａであり得る。
【０１２７】
実施例では抗癌剤ドキソルビシンを例示的な活性剤として使用したので、最も好ましい。別の好ましいペイロード分子は、実施例１１に記載されているように、パクリタキセルである。ペイロード分子は、実施例１２に記載されるように、アクチノマイシンなどの抗生物質であり得る。したがって、ペイロード分子はペプチドまたは環状ペプチドであり得る。さらに別の好ましいペイロード分子はアクチノマイシン−Ｄである。実施例１４に記載されるように、質量分析法を用いて、１３．３アクチノマイシンＤ分子をナノケージによって封入した。
【０１２８】
ペイロード分子は、ファンデルワールス力またはイオン力によって核形成剤に結合または共役していてもよい。核形成剤−薬物複合体は、核形成剤および活性剤複合体をナノケージ内に封入するフェリチンナノケージの形成をもたらす。したがって、有利なことに、本発明による方法を使用して、薬物をフェリチンナノケージに容易に搭載することができる。本発明のさらなる利点は、それ以外の場合には、補助なしで細胞を透過することができない、薬物の治療範囲を広げるために使用できることである。好ましくは、核形成剤は金属ナノ粒子、より好ましくは金ナノ粒子である。
【０１２９】
本発明者らは、標的化可能な薬物送達剤としてフェリチンを製造および使用する革新的なアプローチを生み出した。本発明者らはフェリチンモノマーにおける突然変異を操作し、それによって、それは単独でナノケージを形成せず、その単量体状態で精製することができる。金属ナノ粒子と混合すると、ナノ粒子は核形成部位として作用し、ナノケージは金属ナノ粒子の周囲に特異的に再形成する。ナノケージを適切な抗体で機能化させることは、ナノケージが標的部位を標的とすることを確実にする。実施例５は、ナノケージがＭＮＫ１．１（マウスナチュラルキラー細胞）およびＨＴ２９（結腸直腸癌）細胞株を標的とする方法を説明し、それは、ＭＮＫ１．１の場合はＮＫ１．１受容体、またはＨＴ２９の場合はＥＧＦＲ受容体のいずれかを標的とすることができる既知の抗体を有する。
【０１３０】
第６の態様では、標的とする生物学的環境にフェリチンナノケージを標的化する方法を提供し、該方法は、標的細胞に対して免疫特異的な抗体またはその抗原結合断片で第３の態様のフェリチンナノケージを機能化することと、機能化されたナノケージを標的とする生物学的環境に標的させることと、を含む。
【０１３１】
抗体の結合を介してフェリチンナノケージを特定の細胞型に標的化する能力は、疾患の診断および治療に大きな可能性を創出する。フェリチンナノケージが所望の標的とする生物学的環境に到達すると、それはリソソームに関連するｐＨの低下にさらされ、それにより、別の方法で封入されたペイロード分子剤がナノケージから放出され、そこで、それはその生物学的効果を発揮する。
【０１３２】
ナノケージを蛍光性にすることができるので、既知のエピトープ疾患マーカーを提示する特定の細胞型を同定するために、それらは画像化方法で使用することができる。これにより、画像診断しやすい部位における癌の種類の診断にそれらを使用する可能性が創出される。したがって、標的とする生物学的環境は、癌または腫瘍細胞などの細胞または組織であり得る。例としては、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌などの消化管を介してアクセス可能な癌である。さらに、皮膚癌ならびに頸部癌および咽頭癌を含む体表面近くの癌は診断に利用しやすいと思われる。
【０１３３】
さらに、薬物封入複合体は金属（例えば金）ナノ粒子を含有するので、薬物の活性放出のためのメカニズムも可能である。金ナノ粒子は、それらのプラズモン効果のために光を吸収し、レーザー照射を使用して、入射レーザー照射の強度に比例してナノ粒子の局所的加熱を引き起こし得る。ナノケージをその標的とする生物学的環境に標的化した後、エンドソームに関連するｐＨ低下がもたらすのと同じ方法で、局所的加熱がナノケージ複合体の熱分解をもたらすので、レーザー誘起加熱を用いて封入薬物の放出を活性化することができる。この種のアプローチは、化合物を局所的に送達し、レーザー光源を使用して撮影および治療することの両方ができる最新の内視鏡技術を利用することができる。したがって、本発明者らは、この種のナノケージデバイスが現在の治療行為およびアプローチに適合するだろうと考えている。
【０１３４】
薬物をナノケージ内に封入する能力はまた、診断および治療（セラノスティック）を組み合わせたアプローチの可能性を提供する。
【０１３５】
したがって、第７の態様では、治療または診断における使用のための、第１の態様の変異フェリチンポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質、または第３の態様のフェリチンナノケージが提供される。
【０１３６】
第８の態様では、疾患、好ましくは癌の治療、予防、または改善に使用するための、第１の態様の変異フェリチンポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質、または第３の態様のフェリチンナノケージが提供される。
【０１３７】
第９の態様において、疾患、好ましくは癌を治療、改善または予防する方法が提供され、該方法は、治療有効量の第１の態様の変異フェリチンポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質、または第３の態様のフェリチンナノケージをそのような治療を必要とする対象に投与することを含む。
【０１３８】
好ましくは、この方法は、第３の態様のフェリチンナノケージを対象に投与し、次いでナノケージを分解するように熱にさらし、それによってペイロード分子を放出させることを含む。
【０１３９】
熱は、レーザーなどの適切な熱源によって提供されてよい。レーザー誘起薬物放出の原理は、Ｄｏｘなどのナノケージ内の蛍光結合分子の蛍光偏光を調べることによって実証されている。異方性は、試料内の偏光度の尺度に依存しない強度を提供する。蛍光分子が平面偏光を吸収すると、それは励起源と同じ平面で放射される。しかしながら、蛍光寿命の間、吸収と発光の間に、分子は回転できる。これは、放出された光が分子の新しい方向に関連することを意味する。垂直面と水平面の両方で放射光を測定することによって、偏光度（異方性）を決定することが可能である。大分子は小分子よりもゆっくり回転するので、異方性の度合いは分子のサイズに依存する。したがって、ナノケージ内に封入された蛍光分子は非常に高い異方性値を有するであろう。金属ナノ粒子のレーザー照射は、ナノケージの破壊および蛍光化合物の放出をもたらし、そしてこれは、測定された異方性の有意な減少によって画像化することができる。
【０１４０】
したがって、第１０の態様において、ナノケージを分解し、それによってペイロード分子を放出するために、封入ペイロード分子を含む第３の態様によるフェリチンナノケージを加熱する熱源の使用が提供される。
熱源はレーザーであり得る。
【０１４１】
発明者らはまた、ナノケージは、薬物開発で使用するための表現型スクリーンで使用することができると考えている。
【０１４２】
したがって、第１１の態様では、その治療効果と共に細胞への薬物送達を相関させる第３の態様によるフェリチンナノケージの使用が提供される。
【０１４３】
第１２の態様では、第３の態様によるフェリチンナノケージを含む表現型アッセイが提供される。
【０１４４】
例えば、本発明者らは、細胞内への小分子剤の送達のためのプラットフォーム技術としてフェリチンナノケージを使用する能力を実証している。この技術はナノケージ複合体の封入および集合のための規定された方法を提供するので、化合物を細胞内に送達するための一般的方法として想像することができる。小分子化合物の金属ナノ粒子コアへの結合は、多種多様なイオン性相互作用、静電相互作用、および疎水性相互作用に役立つと思われる。薬物結合ナノ粒子の周りの突然変異ナノケージの集合もまた強固に見える。さらに、ＺＺドメインとＩｇＧアイソタイプ抗体との相互作用によるナノケージ複合体の抗体への結合は、迅速かつ効果的である。したがって、これは非常に広範囲の市販の抗体に適用することができ、これを使用して、広範囲の異なる細胞型を効果的に標的とすることができる。
【０１４５】
秩序あるプロセスおよびナノケージ送達の多様性のために、インビボ効果について小分子をスクリーニングするためのプラットフォームとしてこれを使用することが可能である。多くの場合、小分子剤は細胞透過性が低いため機能しない。さらに、薬物開発中に、細胞透過性についての知識なく、表現型細胞アッセイにおける化合物クラスの有効性に関して結論が下されることが多い。細胞膜を通過するように作製できるならば、薬物は非常に効果的であり得る。失敗のモード、非細胞透過、または生物学的有効性の低さをさらに詳細に説明できれば、スクリーニングをする上で有用であると思われる。
【０１４６】
本発明のフェリチンナノケージは、表現型アッセイにおいて細胞内に化合物を効果的に送達するための方法を提供し、規則正しい集合プロセスはハイスループットスクリーニングシナリオに適応可能である。さらに、化学的標識化または蛍光タンパク質の融合のいずれかによって蛍光性にされたナノケージを使用して、個々の細胞の取り込みをモニターすることができる。細胞選別法と組み合わせると、表現型アッセイはナノケージ蛍光に基づく用量反応と相関する可能性がある。
【０１４７】
例えば、本発明者らは表現型アッセイを使用して活性剤Ｄｏｘの細胞内への効果的な送達を実証した。ＭＴＴアッセイは、還元時に紫色を呈するテトラゾリウム色素基質（ＭＴＴ）を用いて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼ酵素を介して細胞の代謝活性を測定する。生存細胞数の減少は活性の喪失、ひいては色反応の減少をもたらす。例えば、本明細書に記載の変異フェリチンポリペプチドは、試験薬を封入するナノケージを作製するために使用され得る。Ｄｏｘ搭載ナノケージの場合、複合体を形成するときに２つの濃度のＤｏｘ（０．１μＭおよび０．２μＭ）を使用することができる。それらを抗ＥＧＦＲと混合してもよく、ＭＴＴアッセイを用いて生存率を測定する前に、ＨＴ２９細胞とのそれらの相互作用を経時的にモニターしてもよい。高搭載量のＤｏｘで形成されたナノケージは、アッセイの時間経過の間に表現型応答を示すべきでる。データはまた、Ｄｏｘ（０．１または２．０μＭ）を使用した異なるナノケージ搭載条件に対する用量反応を実証すべきである。
【０１４８】
さらなる表現型アッセイは、フローサイトメトリーおよびＴｏｐｒｏ３色素などの適切な色素を使用して実施され得る。Ｔｏｐｒｏ３はＤＮＡに結合し、優先的に非生存細胞に入る。前述同様に、ＨＴ２９細胞を抗ＥＧＦＲ抗体に予め結合させたＡｕ−ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）およびＤｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）複合体で処理することができる。Ｄｏｘのみの制御も細胞のみと一緒に実施することができる。
【０１４９】
第１の態様の変異フェリチンポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質、または第３の態様によるフェリチンナノケージ（以下、「剤」または「活性剤」として称される）が、単剤療法で、または癌などの疾患を治療、改善、または予防するための既知の療法の補助として、またはそれと組み合わせて使用され得る薬剤で使用され得ることが理解されよう。
【０１５０】
本発明による薬剤は、特に組成物の使用方法に応じて、いくつかの異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液剤などの形態で、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与できる他の適切な任意の形態であり得る。本発明による薬剤のビヒクルは、それが与えられる対象によって良好な忍容性が示されるものでなければならないことが理解されるであろう。
【０１５１】
本発明による薬剤（即ち、フェリチンナノケージ）を含む薬剤は、いくつかの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされる場合があり、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、または液剤の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。本発明の薬剤を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）によって投与されてもよい。組成物はまた、局所使用のためにも製剤化され得る。例えば、クリームまたは軟膏は、皮膚に塗布されてもよい。
【０１５２】
本発明による薬剤はまた、徐放型または遅延型放出デバイスに組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入されてもよく、薬剤は数週間または数ヶ月にわたって放出されてもよい。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。そのようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤による長期治療が必要とされ、通常頻繁な投与を必要とするであろう（例えば、少なくとも毎日の注射）場合に、特に有益であり得る。
【０１５３】
好ましい実施形態では、本発明による薬剤および組成物は、血流にまたは直接治療が必要な部位に注射することによって対象に投与されてもよい。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）、または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）であり得る。
【０１５４】
必要とされるフェリチンナノケージの量は、その生物学的活性および生物学的利用能によって決定され、次に投与方法、それが封入する活性剤の生理化学的特性、および存在する場合、それが単独療法として、または併用療法に使用されるかどうかによって決定されることが理解されるであろう。投与頻度はまた、治療される対象内の薬剤の半減期によっても影響される。投与される最適投与量は、当業者によって判定されてよく、使用中の特定の薬剤、医薬組成物の強度、投与方法、および癌の進行によって変わる。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む、治療される特定の対象によるさらなる要因は、投与量を調整する必要性をもたらすであろう。
【０１５５】
一般に、本発明によるナノケージおよび／または活性剤の０．０１μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の一日量を使用してもよい。より好ましくは、１日量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１５６】
実施例で論じるように、フェリチンナノケージは、疾患の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。例えば、ナノケージは、対象が疾患を発症した直後に投与することができる。１日量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として全身に与えられてもよい。あるいは、ナノケージは１日に２回以上の投与を必要としてもよい。一例として、ナノケージは、２５ｍｇ〜７０００ｍｇの一日量（すなわち、体重７０ｋｇと仮定して）を２回（または治療される疾患の重症度に応じて２回以上）投与することができる。治療を受けている患者は、起床時に第１の用量を服用し、次に夕方に（２回投与計画の場合）またはその後３〜４時間間隔に第２の用量を服用することができる。あるいは、徐放型放出デバイスを使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明によるナノケージの最適用量を患者に提供することができる。
【０１５７】
製薬業界によって慣用されるもの（例えば、インビボ実験、臨床試験など）などの既知の手順を使用して、本発明によるナノケージを含む特定の製剤および厳密な治療計画（ナノケージの１日用量ならびに／または活性剤および投与頻度など）を形成することができる。
【０１５８】
したがって、本発明の第１３の態様において、第１の態様の変異フェリチンポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質、または第３の態様のフェリチンナノケージ、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物が提供される。
【０１５９】
組成物は、癌などの、治療可能な対象において任意の疾患の治療的改善、予防または治療に使用することができる。
【０１６０】
本発明はまた、第１４の態様において、第１３の態様による医薬組成物の製造方法を提供し、該方法は、治療有効量の第１の態様の変異フェリチンポリペプチド、第２の態様の融合タンパク質、または第１の態様のフェリチンナノケージ、および薬学的に許容されるビヒクルと接触させることを含む。
【０１６１】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による薬剤、組成物および薬物は、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペット等の任意の哺乳動物を治療するために使用されてもよいし、他の獣医学的用途に使用されてもよい。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。
【０１６２】
薬剤の「治療有効量」は、対象に投与される際の任意の量であり、目的の疾患を治療するために、または所望の効果を生むために必要とされる薬物の量である。
【０１６３】
例えば、使用される治療有効量のナノケージおよび／または活性剤は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。
【０１６４】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物を製剤するのに有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【０１６５】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含んでもよい。ビヒクルは、封入材料でもあり得る。粉末剤では、ビヒクルは、本発明による微粉化活性剤と混合されている微粉化固体である。錠剤では、ナノケージは、適切な割合で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合され、所望の形およびサイズに固められてもよい。粉末剤および錠剤は、好ましくは最大９９％の活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであってよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【０１６６】
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、および加圧組成物を調製するのに使用される。ナノケージは、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁させてもよい。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤などの他の適切な薬学的添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例には、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）、およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば分別ヤシ油および落花生油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルでもあり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【０１６７】
滅菌溶液または懸濁剤である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射によって利用することができる。ナノケージは、滅菌水、食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して投与時に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物として調製することができる。
【０１６８】
本発明の化合物および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノレート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびそのエチレンオキシドと共重合した無水物）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明による化合物は、液体か固体いずれかの組成物の形態で経口投与もされ得る。経口投与に適した組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および散剤などの固体形態、ならびに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、乳剤、および懸濁剤が挙げられる。
【０１６９】
２つのＤＮＡ／ポリヌクレオチド／核酸配列間の同一性パーセントを計算するためには、最初に、２つの配列のアライメントを調製し、続いて配列同一性値を計算しなければならないことを当業者は理解するであろう。２つの配列についての同一性パーセントは、（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較による構造的アライメント、ならびに（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアライメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ（例えば、関数形式および定数）に応じて異なる値を取り得る。
【０１７０】
アライメントをしたので、２つの配列間の同一性百分率を計算するための多くの異なる方法がある。例えば、同一性の数を次のもの：（ｉ）最短配列の長さ；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除いた同値位置の数で割ることができる。さらに、同一性百分率もまた、長さに強く依存することが理解されるであろう。したがって、一対の配列が短いほど、偶然に起こると予想され得る配列同一性が高くなる。
【０１７１】
したがって、ＤＮＡ配列の正確なアライメントは、複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、４６７３〜４６８０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４８７６〜４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡのマルチプルアライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下の通りであり得る。ＤＮＡアライメントについて：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップエクステンションペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝同一性。タンパク質アライメントについて：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップエクステンションペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質アライメントについて：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アライメントのために、これらおよび他のパラメータを変えることが必要であり得ることを認識しているだろう。
【０１７２】
好ましくは、２つのＤＮＡ／ポリヌクレオチド／核酸配列間の同一性パーセントの計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアライメントから計算することができ、ここでＮは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除く、比較された位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性パーセントを計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上述のような好適なパラメータのセットを使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した配列アライメントを準備することと、（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することと、を含む。
【０１７３】
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド／核酸配列は、配列番号１〜１０のいずれか１つに示される配列、またはそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、３倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中に約４５℃でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし、続いて、０．２倍のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中に約２０〜６５℃で少なくとも１回洗浄することを意味する。
【０１７４】
遺伝暗号の縮重のために、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、任意の核酸配列を、変えるか、または変化させて、その機能性変異体を提供することができるであろうことは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変された配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生成する。他の好適な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、それが置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変されて保存的な変化を生成する、配列の全部または一部を含むものである。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、リシン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。負帯電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置換され得るかが理解され、当業者であれば、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【０１７５】
本明細書に記載される特徴のうちの全て（任意の添付の特許請求の範囲、要約、および図面を含む）、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップのうちの全ては、そのような特徴および／もしくはステップのうちの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記態様のうちのいずれかと組み合わせされ得る。
【０１７６】
本発明をよりよく理解するために、また本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、添付の図面を例として参照する。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】Ｂｆｒのサイズ排除の結果を示す。（Ａ）７．１３ｍｌに溶出ピークを有するＢｆｒのＳＥＣトレース。（Ｂ）６．９７ｍｌに溶出ピークを有するＢｆｒ−ＡｕＢＰのＳＥＣトレース。５．７９ｍｌでＸ軸と交差する黒い矢印は、市販の２４量体ウマ脾臓フェリチンの溶出点を示す。濃青線と赤線は、それぞれ２８０ｎｍおよび４２０ｎｍでの吸光度の値に対応する。水色と赤の色は、それぞれ２８０ｎｍ（タンパク質）および４２０ｎｍ（ヘム）での平均吸光度の値の±１標準偏差に相当する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図２】Ａｕナノ粒子を用いたＢｆｒのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。（Ａ）ＧＮＰがある場合とない場合のＢｆｒのＳＥＣトレースを、それぞれ赤と青で示す。（Ｂ）ＧＮＰがある場合とない場合のＢｆｒ−ＡｕＢＰのＳＥＣトレースを、それぞれ赤と青で示す。ピーク１はフェリチンモノマーまたはダイマーであり、ピーク２は２４量体のナノケージである。これは、ナノケージからのモノマー／ダイマーの分離を示す。
【図３】ＡｕＮＰを含むＢｆｒのＴＥＭの結果を示す。（Ａ）８個のハイブリッドナノ粒子を示すピーク２の顕微鏡写真（図２Ｂ）。そのうちの１つを青い矢印で強調する。ＧＮＰを黒丸で表示する。Ｂｆｒ−ＡｕＢＰタンパク質成分は、各封入ＡｕＮＰの周囲に薄いハローとして見える（黒丸）。可能性のあるタンパク質凝集物は赤い矢印で強調表示される。（Ｂ）対照としてネイキッドＧＮＰを示す顕微鏡写真。（Ｃ）ＡｕＮＰの不在下でのＢｆｒ−ＡｕＢＰを示すピーク１の顕微鏡写真（図２Ｂ）。
【図４】軽鎖フェリチン（ｌＦＴＮ）および重鎖フェリチン（ｈＦＴＮ）の二量体境界面を示す。Ａ．ｌＦＴＮ二量体（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＦＧ８（非対称単位）［１５６］）。Ｂ．ｈＦＴＮ二量体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＡＪＯ（生物学的集合１）［１５８］）。各二量体について、一方のサブユニットはオレンジ色で示され、他方のサブユニットは青で示される。Ｃ．二量体界面における保存された疎水性残基および突然変異のリストを強調するＩＦＴＮ二量体。Ｄ．二量体界面における保存された疎水性残基を強調するｈＦＴＮ二量体。Ｅ．疎水性残基を含む軽鎖および重鎖フェリチン（ｌＦＴＮおよびｈＦＴＮ）の二量体界面における保存モチーフ、およびこれらの保存ドメインに関連する突然変異
【図５−１】突然変異誘発によるｌＦＴＮ変異体の不安定化の結果。（Ａ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ、（Ｂ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）、（Ｃ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ−ＡｕＢＰおよび（Ｄ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約７．１ｍｌで溶出する。ｈＦＴＮサブユニットの変異したバージョン（ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ））を含む構築物は、より低い割合のナノケージで溶出するように見えるが（パネルＢおよびＤ）、かなりの程度の２４量体ケージが残り、モノマーと直接一致せず、集合中間体（＞１および＜２４サブユニット）であり得る他の多くのバンドが見られる。濃緑色の線は、４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応する。薄緑色の色は、４９７ｎｍでの平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図５−２】突然変異誘発によるｌＦＴＮ変異体の不安定化の結果。（Ａ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ、（Ｂ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）、（Ｃ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ−ＡｕＢＰおよび（Ｄ）ＧＦＰ−ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約７．１ｍｌで溶出する。ｈＦＴＮサブユニットの変異したバージョン（ｌＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ））を含む構築物は、より低い割合のナノケージで溶出するように見えるが（パネルＢおよびＤ）、かなりの程度の２４量体ケージが残り、モノマーと直接一致せず、集合中間体（＞１および＜２４サブユニット）であり得る他の多くのバンドが見られる。濃緑色の線は、４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応する。薄緑色の色は、４９７ｎｍでの平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図６−１】突然変異誘発によるｈＦＴＮ変異体の結果を示す。（Ａ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ、（Ｂ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、（Ｃ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ−ＡｕＢＰ、および（Ｄ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム。全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約７．１ｍｌで溶出する。ｈＦＴＮサブユニットの変異したバージョン（ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ））を含有する構築物は、主にモノマーとして溶出すると見られるが（パネルＢ＆Ｄ）、濃緑色の線は４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応する。薄緑色の色は、４９７ｎｍでの平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図６−２】突然変異誘発によるｈＦＴＮ変異体の結果を示す。（Ａ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ、（Ｂ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、（Ｃ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ−ＡｕＢＰ、および（Ｄ）ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム。全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約７．１ｍｌで溶出する。ｈＦＴＮサブユニットの変異したバージョン（ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ））を含有する構築物は、主にモノマーとして溶出すると見られるが（パネルＢ＆Ｄ）、濃緑色の線は４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応する。薄緑色の色は、４９７ｎｍでの平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図７】ｈＦＴＮのＺＺ−ＧＦＰ融合を示す。（Ａ）ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ、（Ｂ）ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム。全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約６．９ｍｌで溶出する。野生型ｈＦＴＮを有するＺＺ−ＧＦＰ融合は、主に２４量体として溶出することが見られるが（パネルＡ）、変異したｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）は、主にモノマーとして溶出することが見られる（パネルＢ）。濃緑線は４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応する。薄緑色の色は、４９７ｎｍでの平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図８】ｈＦＴＮの挙動を示す。（Ａ）ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ、（Ｂ）ＡｕＮＰを含むＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮのＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム。全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約６．８ｍｌで溶出する。野生型ｈＦＴＮは主に２４量体として溶出することが見られる（パネルＡ）。ＡｕＮＰの存在下では、ＡｕＮＰはＦＴＮ２４量体と共溶出する。濃緑色の線は４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応し、濃青色の線は５３０ｎｍでの吸光度（ＡｕＮＰ吸光度）に対応する。両方の例における色は、平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図９】突然変異ｈＦＴＮの再集合を示す。（Ａ）ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、（Ｂ）ＡｕＮＰを含むＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）のＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラム。全てのクロマトグラムにおいて、２４量体は約５．３ｍｌで溶出し、モノマーは約６．８ｍｌで溶出する。野生型ｈＦＴＮは主に２４量体として溶出することが見られる（パネルＡ）。ＡｕＮＰの存在下では、ＡｕＮＰはＦＴＮ２４量体と共溶出する。濃緑色の線は４９７ｎｍでの吸光度の値（ＧＦＰ吸光度）に対応し、濃青色の線は５３０ｎｍでの吸光度（ＡｕＮＰ吸光度）に対応する。両方の例における色は、平均吸光度の値の±１標準偏差に対応する。各データセットは３回の生物学的反復からなる。
【図１０】ＡｕＮＰを含むｈＦＴＮのＴＥＭ分析結果を示す。ＡｕＮＰを含むｈＦＴＮのＴＥＭ分析（Ａ）ＡｕＮＰを含む野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ、青い矢印はＡｕＮＰを含むクラスターを示し、赤い矢印は単離されたナノケージを示す。（Ｂ）ＡｕＮＰを含む突然変異ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、青い矢印は封入されたＡｕＮＰを含むナノケージを示し、赤い矢印は単離されたナノケージ断片を示し、黄色い矢印は空のナノケージを示す。（Ｃ）ＡｕＮＰを含まない突然変異ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）。（Ｄ）ＡｕＮＰを含まない野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ、赤い矢印はナノケージを示す。
【図１１】ドキソルビシンの金ナノ粒子への結合を示す。５ｎｍの金ナノ粒子へのドキソルビシン（Ｄｏｘ）の結合を、Ｄｏｘの蛍光シグナルからモニターした。５ｎｍのＡｕナノ粒子の存在下または非存在下のいずれかで、ＰＢＳ中でＤｏｘ濃度の滴定を測定した。蛍光をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー（ｅｘ：４８２〜１６、ｅｍｍ：５８０〜３０）で測定し、バックグラウンドを差し引いた後に強度をプロットした。ＡｕへのＤｏｘの結合は、Ｄｏｘ蛍光の著しい消光を引き起こす。
【図１２】ヨウ化プロピジウムとＡｕナノ粒子との相互作用を示す。５ｎｍの金ナノ粒子へのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の結合を、ＰＩの蛍光シグナルからモニターした。ＰＩ濃度の滴定は、５ｎｍのＡｕナノ粒子の存在下または非存在下のいずれかでＰＢＳ中で測定した。蛍光をＦｌｕｏｒｏｍａｘ−４（ｅｘ：４９３ｎｍ、ｅｍｍ：５５０〜７５０）で測定し、バックグラウンドを差し引いた後に発光スキャンをプロットする。ＰＩのＡｕへの結合はＰＩ蛍光の完全な消失を引き起こす。
【図１３】精製したナノケージ−Ａｕ−Ｄｏｘ複合体のＤｏｘ蛍光を示す。ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、Ａｕナノ粒子およびＤｏｘを含有する複合体は、突然変異フェリチンタンパク質（０．１μＭ）を異なる濃度のＤｏｘ（０．１μＭ〜１０．０μＭ）に添加することによって形成された。１６時間後、形成されたナノケージをＨＰＬＣで精製し、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４中でＤｏｘ蛍光についてスキャンした（ｅｘ：４８２ｎｍ、ｅｍｍ：５００〜６００）。
【図１４−１】薬物封入の質量分析である。ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、Ａｕナノ粒子、およびＤｏｘを含む複合体は、突然変異フェリチンタンパク質（０．１μＭ）を異なる濃度のＤｏｘ（０．１μＭ〜１０．０μＭ）に添加することによって形成され、これが薬物の金への結合に影響するかどうかを評価するために、クエン酸塩またはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）によって安定化させたＡｕナノ粒子調製物を使用した。１６時間後、形成されたナノケージをＨＰＬＣで精製し、ＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５５０）で分析し、較正標準に基づいてＤｏｘおよびＰＩについて２０ｐｐｍのウィンドウを使用してデータを定量化した。
【図１４−２】薬物封入の質量分析である。ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）、Ａｕナノ粒子、およびＤｏｘを含む複合体は、突然変異フェリチンタンパク質（０．１μＭ）を異なる濃度のＤｏｘ（０．１μＭ〜１０．０μＭ）に添加することによって形成され、これが薬物の金への結合に影響するかどうかを評価するために、クエン酸塩またはＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）によって安定化させたＡｕナノ粒子調製物を使用した。１６時間後、形成されたナノケージをＨＰＬＣで精製し、ＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５５０）で分析し、較正標準に基づいてＤｏｘおよびＰＩについて２０ｐｐｍのウィンドウを使用してデータを定量化した。
【図１５】ＧＦＰナノケージの抗体特異的細胞結合を示す。精製した野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（２０μｇ）を、２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＮＫ１．１抗体（１μｇ）または抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）のいずれかと混合した。各アッセイについて、５０μｌのナノケージ抗体を１００μｌ中のＨＴ２９またはＭＮＫ１．１いずれかの１×１０６個の細胞と混合した。ＦＩＴＣチャネル（ｅｘ：４８８ｎｍ、ｅｍｍ：５３０〜３０ｎｍ）を用いて細胞をＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析し、ＧＦＰ蛍光を観察した。データは、ＭＮＫ１．１細胞（Ａ）およびＨＴ２９細胞（Ｃ）について、細胞のみ（赤いヒストグラム、すべてのトレース）およびナノケージのみを含む細胞および抗体を含まない細胞を示す。ナノケージ抗体をＭＮＫ１．１細胞（Ｂ）およびＨＴ２９細胞（Ｄ）で示す。
【図１６】抗体標的ナノケージの運命を示す。Ｚスライスを示す共焦点顕微鏡。精製Ａｕ−ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合した。ＨＴ−２９細胞を、細胞接着のために、一晩、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のチャンバースライド（ｉｂｉｄｉ）上に播種した。次いで、細胞を精製ナノケージ−Ａｕ複合体（２０μｌ）を用いて３７℃で異なる時間処理した（パネルａ〜ｃ、２時間、ｄ〜ｆ、２４時間）。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４％の冷パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。リソソームを可視化するために、１％のＢＳＡでブロックした後、細胞をさらに１時間、抗Ｌａｍｐ１（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に１時間インキュベートした。核を、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で室温で２分間染色し、次いで再びＰＢＳで洗浄した。細胞を封入剤およびカバーガラスで覆い、顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０倒立共焦点顕微鏡下で観察した（Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、ＤＡＰＩ  ｅｘ４０５ｎｍ、ｅｍｍ４２０〜４８０ｎｍ、Ｃｙ３  ｅｘ５５０ｎｍ、ｅｍｍ５６０ｎｍ、Ｄｏｘ  ｅｘ４８８ｎｍ、ｅｍｍ５５０〜５９０ｎｍ）。画像は、ＧＦＰシグナルを緑色、Ｌｍｐ１シグナルを赤色、およびＤＡＰＩを青色で示す。
【図１７】封入ナノケージによる細胞へのＤｏｘの送達を示す。Ｚスライスを示す共焦点顕微鏡。精製Ｄｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうちの１００μｌ）を２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合した。ＨＴ−２９細胞を、細胞接着のために、一晩、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のチャンバースライド（ｉｂｉｄｉ）上に播種した。次いで、細胞をナノケージ−抗体複合体（１００μｌ）で３７℃で異なる時間処理した（パネルａ〜ｃ、２時間、ｄ〜ｆ、２４時間）。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４％の冷パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。核を、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で室温で２分間染色し、次いで再びＰＢＳで洗浄した。細胞を封入剤およびカバーガラスで覆い、顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０倒立共焦点顕微鏡下で観察した（Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、ＤＡＰＩ  ｅｘ４０５ｎｍ、ｅｍｍ４２０〜４８０ｎｍ、Ｄｏｘ  ｅｘ４８０ｎｍ、ｅｍｍ５５０〜５９０ｎｍ）。画像はＤｏｘシグナルが赤、ＤＡＰＩが青で表示する。
【図１８】封入ナノケージによる細胞へのＰＩの送達を示す。Ｚスライスを示す共焦点顕微鏡。精製Ｄｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうちの１００μｌ）を２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合した。ＨＴ−２９細胞を、細胞接着のために、一晩、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のチャンバースライド（ｉｂｉｄｉ）上に播種した。次いで、細胞をナノケージ−抗体複合体（１００μｌ）で３７℃で異なる時間処理した（パネルａ〜ｃ、２時間、ｄ〜ｆ、２４時間）。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４％の冷パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。核を、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で室温で２分間染色し、次いで再びＰＢＳで洗浄した。細胞を封入剤およびカバーガラスで覆い、顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０倒立共焦点顕微鏡下で観察した（Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、ＤＡＰＩ  ｅｘ４０５ｎｍ、ｅｍｍ４２０〜４８０ｎｍ、ＰＩ  ｅｘ５３５ｎｍ、ｅｍｍ６１７ｎｍ）。画像はＤｏｘシグナルが赤、ＤＡＰＩが青で表示する。
【図１９】精製したＤｏｘ／ＰＩ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、１８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（１００μｌ〜３０ｎＭ）を２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合したことを示す。ＨＴ−２９細胞を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で一晩増殖させた。次いで、細胞をナノケージ−抗体複合体（１００μｌ）で３７℃で４８時間および７２時間処理した。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。再懸濁細胞をＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５５０）によって分析し、較正標準に基づいてＤｏｘおよびＰＩについて２０ｐｐｍウィンドウを用いてデータを定量化した。
【図２０】ドラッグデリバリーの表現型アッセイを示す。ａ）ＭＴＴアッセイ０．１μＭまたは２．０μＭのＤｏｘのいずれかで搭載することにより調整した、精製Ｄｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうちの１００μｌ）を２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合した。細胞を３枚の９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）上で培養し、次いで、細胞を調製したナノケージ−抗体複合体と共にインキュベートした。示した時点（２４、４８、７２時間）で、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ（培養容量の１／１０、典型的には２０μＬ）で希釈した、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）ストック（５ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴ可溶化溶液（１：１のＤＭＳＯおよびイソプロピルアルコール）を各ウェルに加えてＭＴＴホルマザン結晶を可溶化した。５９０ｎｍのＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒで３７℃で１０分間振盪した後、吸光度を読み取った。およびｂ）Ｔｏｐｒｏ３アッセイ：細胞およびナノケージを上述の通り（２．０μＭのＤＯＸを使用して）調製した。アッセイの前に、細胞をＴｏＰｒｏ−３染色液（１μＭ）と混合し、３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ｅｘ６４０ｎｍ、ｅｍｍ６７０／１４）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。
【図２１−１】ナノケージで送達されたパクリタキセル（Ｐａｃ）に対するＶｙｂｒａｎｔ染色およびフローサイトメトリーを用いた表現型細胞死滅アッセイを示す。精製Ｐａｃ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうち１００μｌ）を５．０μＭのＰａｃを搭載することにより調製し、取り込まれていない薬物をＺｏｒｂａｘスピンカラムにより除去し、これをＰＢＳ中の抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合し、５×１０５個の生細胞に曝露した。Ａは、抗体の非存在下、抗体の存在下、および５μＭの遊離薬物について、薬物搭載ナノケージについて２４時間および４８時間後に観察された死細胞の程度を示す。Ｂは、細胞のみ、ｈＦｔｎのみを有する細胞、遊離薬物のみを有する細胞、および抗体を含むＰａｃ搭載ナノケージについてのフローサイトメトリードットプロットを示し、左上象限は死細胞を示し、左下は生細胞を示す。
【図２１−２】ナノケージで送達されたパクリタキセル（Ｐａｃ）に対するＶｙｂｒａｎｔ染色およびフローサイトメトリーを用いた表現型細胞死滅アッセイを示す。精製Ｐａｃ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうち１００μｌ）を５．０μＭのＰａｃを搭載することにより調製し、取り込まれていない薬物をＺｏｒｂａｘスピンカラムにより除去し、これをＰＢＳ中の抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合し、５×１０５個の生細胞に曝露した。Ａは、抗体の非存在下、抗体の存在下、および５μＭの遊離薬物について、薬物搭載ナノケージについて２４時間および４８時間後に観察された死細胞の程度を示す。Ｂは、細胞のみ、ｈＦｔｎのみを有する細胞、遊離薬物のみを有する細胞、および抗体を含むＰａｃ搭載ナノケージについてのフローサイトメトリードットプロットを示し、左上象限は死細胞を示し、左下は生細胞を示す。
【図２２−１】は、ナノケージ送達アクチノマイシン−Ｄ（Ａｃｔ−Ｄ）に対するＶｙｂｒａｎｔ染色およびフローサイトメトリーを用いた表現型細胞死滅アッセイを示す。精製Ａｃｔ−Ｄ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうち１００μｌ）を５．０μＭのＡｃｔ−Ｄを搭載することにより調製し、取り込まれていない薬物をＺｏｒｂａｘスピンカラムにより除去し、これをＰＢＳ中の抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合し、５×１０５個の生細胞に曝露した。Ａは、抗体の非存在下、抗体の存在下、および５μＭの遊離薬物について、薬物搭載ナノケージについて２４時間および４８時間後に観察された死細胞の程度を示す。Ｂは、細胞のみ、ｈＦｔｎのみを有する細胞、遊離薬物のみを有する細胞、および抗体を含むＡｃｔ−Ｄ搭載ナノケージについてのフローサイトメトリードットプロットを示す。左上象限は死細胞を示し、左下は生細胞を示す。
【図２２−２】は、ナノケージ送達アクチノマイシン−Ｄ（Ａｃｔ−Ｄ）に対するＶｙｂｒａｎｔ染色およびフローサイトメトリーを用いた表現型細胞死滅アッセイを示す。精製Ａｃｔ−Ｄ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３０ｎＭのうち１００μｌ）を５．０μＭのＡｃｔ−Ｄを搭載することにより調製し、取り込まれていない薬物をＺｏｒｂａｘスピンカラムにより除去し、これをＰＢＳ中の抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合し、５×１０５個の生細胞に曝露した。Ａは、抗体の非存在下、抗体の存在下、および５μＭの遊離薬物について、薬物搭載ナノケージについて２４時間および４８時間後に観察された死細胞の程度を示す。Ｂは、細胞のみ、ｈＦｔｎのみを有する細胞、遊離薬物のみを有する細胞、および抗体を含むＡｃｔ−Ｄ搭載ナノケージについてのフローサイトメトリードットプロットを示す。左上象限は死細胞を示し、左下は生細胞を示す。および
【図２３】ｈＦｔｎナノケージ内に封入されたＡｃｔ−Ｄの定量化を決定するために行われた質量分析結果を示す。（Ａ）ＱＮＹＨＱＤＳＥＡＡＩＮＲペプチドに基づいて、モノマーＨｉｓ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）について検量線法を実施した。（Ｂ）Ａｕナノ粒子に結合したアクチノマイシン−Ｄについて検量線法を実施した。（Ｃ）次いで、ＨＰＬＣ精製したＡｃｔ−Ｄ封入ナノケージＡｃｔ−Ｄ−Ｈｉｓ−ＺＺ−Ａｕ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を同じ日に同じ方法で分析した。ペプチドおよびＡｃｔ−Ｄの面積を決定し、ＡおよびＢにおける検量線に基づいて、１ケージ当たり１３．３のＡｃｔ−Ｄ分子であると計算された。
【実施例】
【０１７８】
Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａ．ｆｕ）由来の耐熱性フェリチンは、低塩で二量体形態で安定であり、かつ高塩への遷移でナノケージ構造を可逆的に形成することが以前に実証されている１５、１６。しかしながら、不安定化した二量体状態にある間、それは金ナノ粒子と相互作用してフェリチン封入金ナノ粒子を形成する可能性がある。フェリチン内に薬物または金属コアのいずれかを封入するための他の努力は、低ｐＨでその構成二量体に解離し、中性ｐＨに戻る遷移でナノケージを再形成することができるという事実に依存する３、１７、１８。しかし、このｐＨの変化はまた、部分的に破壊的であり、それは再形成されたナノケージの完全性に影響を及ぼす１８。フェリチンを損傷しない、穏やかな条件下での規則正しい分解および再集合の概念は、したがって、フェリチンに基づくナノケージを作製するための魅力的な選択肢である。これまでのところ、Ａ．ｆｕフェリチン以外のものでこれは達成されていない。したがって、本発明者らは、過酷な変性条件を使用せずに、規則正しい分解および再集合を示すナノケージを作製することにした。
【０１７９】
材料および方法
タンパク質の発現および精製
目的の組換えタンパク質をコードするプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１−ＤＥ３に形質転換した。単一コロニーをクロラムフェニコールを含む８×５ｍＬのＬＢ培地（３４μｇｍｌ−１）に懸濁し、振盪インキュベーター内で２２０ｒｐｍで３７℃で一晩増殖させた。２リットルの三角フラスコ２個を使用して、１：１００希釈、３７℃、２２０ｒｐｍで２時間接種したスターター培養物、クロラムフェニコール（３４μｇｍｌ−１）を含有する５００ｍＬのＬＢ培地中の約１０ｍＬのスターター培養物、ＯＤ６００が０．４〜０．５に達した培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、ＯＤ６００が１．７〜２．２に達するまで約６時間タンパク質を発現させた。最初に、培養物を２×５００ｍＬの遠心分離管（５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）に回収し、ペレットを−８０℃で保存した。
【０１８０】
ペレット細胞を、１つのプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、５０ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で氷上で解凍した。再懸濁した細胞を２×１０分間超音波処理（振幅４０％、パルス２秒間オン、２秒間オフ）し、次いで遠心分離した（１５０００ｒｐｍ、４℃、４０分間）。固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓタグ）を用いて行った初期精製、ＮｉＣｌ２で荷電したＨｉｓタグビーズ（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア）を氷上の上清に添加し、１０分毎に１時間混合した。この混合物を溶解緩衝液を用いて５０ｍＬにし、遠心分離した（３０００ｒｐｍ、４℃、２分）。廃棄した上清が透明になるまで、これを溶解緩衝液で２〜３回繰り返した。ビーズをカラムに載せ、１０ｍＬの溶解緩衝液で２回洗浄し、１０ｍＬの溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、３００ｍＭイミダゾール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出する。溶出したタンパク質を一晩透析した（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２）。Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット（３０００ｒｐｍ、４℃、〜３０分）を用いてタンパク質を１〜２ｍＬに濃縮した。サイズ排除クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラムを用いたＧＥ  Ａｋｔａ  ＦＰＬＣシステムが、０．５ｍＬ／分の流速（緩衝液５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で混合した。タンパク質を含む画分を合わせて１〜２ｍＬに濃縮した（３０００ｒｐｍ、４°Ｃ、約１時間）。貯蔵のために使用される場合は、８０％のグリセロールと（容量で）均等に混合した。
【０１８１】
ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
精製後、本発明者らのタンパク質試料の四次構造を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プラットフォーム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ダイオードアレイ検出器付きＴｈｅｒｍｏ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）を用いて分析した。濾過した（０．２２μｍフィルター）緩衝液Ａ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で平衡化した冷蔵（１０℃）ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）でＳＥＣを行った。試料注入の前に、タンパク質試料を緩衝液Ａに対して一晩透析した。緩衝液Ａは、ＳＥＣ実験において移動相としても使用された。各実験について、０．２ｍｇのタンパク質をカラムに載せた。ＳＥＣ実験は、０．３ｍｌ／分の流速で４５分間行った。ダイオードアレイを使用して、タンパク質試料がカラムから溶出したときのタンパク質試料の吸光度特性を測定した。具体的には、３つの波長（λ＝２８０ｎｍ、４９７ｎｍ、５３０ｎｍ）での高周波（１０Ｈｚ）モニタリングと周期的波長走査（２３０〜７００ｎｍ）とを組み合わせた。カラムを一連の標準的な市販のタンパク質を使用して較正し、これにより、その後に試料の分子量を推定することが可能になる。タンパク質試料の濃度を、ヒト軽鎖フェリチンには２８０ｎｍで１５，９３０ｃｍ−１Ｍ−１、およびヒト重鎖フェリチンには２８０ｎｍで１８，９１０ｃｍ−１Ｍ−１の吸光係数を用いて、吸光度分光法を用いて計算した。他の融合タンパク質の吸光係数、吸光係数はＥｘＰＡＳｙ  ＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いて計算した。ヘム分子に対するＢｆｒサブユニットの比は、４１７ｎｍで１３７，０００ｃｍ−１Ｍ−１のヘムに対する吸光係数を用いて計算した。
【０１８２】
ナノケージ製造および薬物封入
精製フェリチンタンパク質を５ｎｍの金ナノ粒子（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した。化学量論は、タンパク質濃度および単位体積あたりの金粒子の表示数から推定され、金ナノ粒子あたり２４個のタンパク質モノマーを得るために計算された。薬物を封入した場合は、室温で、示された濃度で、これらをＡｕナノ粒子に添加され、フェリチンは１分〜３０分後の間に添加された。金ナノ粒子とタンパク質を４℃で１２時間、共インキュベートした。必要であれば、１〜２ｍＬ（３０００ｒｐｍ、４℃）に濃縮し、次いで上記のようにＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ナノケージを含む画分を合わせて１〜２ｍＬに濃縮した（３０００ｒｐｍ、４℃、約１時間）。貯蔵のために使用される場合は、８０％のグリセロールと（容量で）均等に混合した。
【０１８３】
金ナノ粒子封入フェリチンナノケージの濃度は、５ｎｍの金ナノ粒子の２８０ｎｍでの吸光係数（１．６６×１０７Ｍ−１ｃｍ−１）と、同様に存在する関連タンパク質成分についての２８０ｎｍでの吸光係数との合計に基づいて、計算した。
【０１８４】
透過型電子顕微鏡分析
タンパク質試料を炭素被膜の銅グリッド上に載せた。グリッドはグロー放電を用いて前もって準備された。この技術はグリッドの親水性を高め、タンパク質試料をカーボンコーティングに接着させる。タンパク質試料をグリッド上に載せた後、コントラストを与えるためにネガティブ染色（酢酸ウラニル）を適用した。
【０１８５】
蛍光分析
記載した励起波長および発光波長、ならびに５ｎｍのスリット幅のいずれかを用いた４００μｌのキュベット付きのＪｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ４で、蛍光測定を行った。あるいは、ＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダーを、透明底の黒壁プレートを使用して、記載のフィルターまたはモノクロメーター設定で使用した（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）。
【０１８６】
ＬＣＭＳ
精製タンパク質および細胞抽出物サンプルをＡｇｉｌｅｎｔ  ６５５０でＬＣＭＳにより分析した。ＬＣ分離は、１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＶｙｄａｃ  ２１４ＭＳ  Ｃ４カラム、２．１×１５０ｍｍおよび５μｍ粒径（Ｇｒａｃｅ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を用いて、３５℃の温度で緩衝液流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで、変性移動相（緩衝液Ａは０．１％ギ酸水溶液、および緩衝液Ｂは０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）を用いて、達成された。成分の溶出は、１８．５分かけて３％から４０％の緩衝液Ｂの直線勾配を用いて達成した。オンライン質量スペクトルは、デュアルエレクトロスプレーＪｅｔ  Ｓｔｒｅａｍ源（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えた６５５０四重極型飛行時間型装置で蓄積した。質量スペクトルは、毎秒０．６スペクトルの速度で１００〜１７００ｍ／ｚ範囲で得られた。標的化ＭＳ／ＭＳは、１．３Ｄａの前駆体単離ウィンドウおよび１５ｅＶの衝突エネルギーで１００〜１７００Ｄａの範囲にわたって取得した。
【０１８７】
ヒトフェリチン突然変異モノマーおよびナノケージのタンパク質消化
プロトコールは製造業者の説明書から作った。ナノケージを、４ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中の８Ｍ尿素中でインキュベートし、９５°Ｃで２０分間加熱した。変性後、反応混合物を冷却し、尿素濃度が１Ｍ未満になるように５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を加えた。次いで、修飾されたトリプシンを最終プロテアーゼ：タンパク質比１：１００まで添加し、完全消化のために３７℃で一晩インキュベートした。ヒトフェリチン突然変異モノマー試料は尿素変性を必要とせず、トリプシンで消化されただけであった。
【０１８８】
緩衝液中の薬物、金ナノ粒子上の薬物、およびヒトフェリチン突然変異モノマーについて、種々の濃度（０、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２μＭ）の標準溶液を調製した。
【０１８９】
標的化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定
エレクトロスプレーイオン化を備えたＡｇｉｌｅｎｔ６５５０四重極型−飛行時間型（Ｑ−ＴｏＦ）質量分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に結合されたＡｇｉｌｅｎｔ１２９０ＬＣシステムを使用して、標的化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を適用した。使用したＬＣカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｘｔｅｎｄ  Ｃ−１８、２．１×５０ｍｍおよび１．８μｍ粒径であった。ＬＣ緩衝液は、０．１％ギ酸水溶液および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）であった。標的分子に加えて、測定されるタンパク質についての２つの診断用トリプシンペプチドが標的化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法のために選択された。これは、消化された試料の自動ＭＳ／ＭＳ分析によってタンパク質から同定されたペプチドと、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｌｅｃｔｏｒソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定に適していると予測されるものとの比較によって達成された。記録されたＬＣ保持時間と標的前駆体の質量を組み合わせることによって、標的分子とタンパク質の両方の濃度を決定する方法が開発された。
【０１９０】
定量化は、標準のＬＣ保持時間および正確に測定された診断用前駆体または断片イオンの面積に基づいた。各ペプチドのプロトン化分子、［Ｍ＋２Ｈ］２＋を標的とし、標的化期間を通して生成物イオンを蓄積させて衝突誘起解離させた。標準の保持時間における目的の分子またはペプチドの溶出に対応するピークの積分面積を用いて濃度を計算した。これは、各実体の生成物イオンスペクトルからの前駆体イオンまたは断片イオンのいずれかに対する応答から測定された。標準から作成した検量線を用いて濃度を計算した。
【０１９１】
フローサイトメトリー
ＦＩＴＣチャネルを用いてＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリーを行い、ＧＦＰを観察した（ｅｘ４８８ｎｍ、ｅｍｍ５３０〜３０ｎｍ、ＴｏＰｒｏ−３を赤チャネルで撮像した（ｅｘ６４０ｎｍ、ｅｍｍ６７０／１４））。Ｆｌｏｗ−Ｊｏソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１９２】
ＬＣＭＳ分析のための細胞調製
ビーズビーズ法を用いて細胞を溶解した。細胞を７ｋｒｃｆで１０分間ペレット化して１００μｌのメタノールに溶解し、均質になるまでボルテックスした。５０μｌの酸洗浄済みガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。次いで、細胞を３０秒間ボルテックスし、１４Ｋｒｐｍで１５分間遠心分離する前に、４回３０秒間氷上で３０秒間保った。次いで、上清を上記のようにＬＣＭＳ分析のために採取した。
【０１９３】
免疫蛍光
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を０．１％のＴＸ−１００／ＰＢＳで１５〜２０分間透過処理し、３回洗浄した。次いで、細胞を５％正常ヤギ血清／ＰＢＳまたは１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４５分間ブロックした（洗浄は不要）。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、２時間（または４℃で一晩）適用した。未結合の一次抗体を除去するために４回徹底的に洗浄する。次いで、細胞を二次抗体と共に１時間インキュベートし、ブロッキング溶液または洗浄緩衝液で希釈した。次いで、二次抗体を吸引し、必要ならば、ＰＢＳ中のＤＡＰＩ［１μｇ／ｍＬ］と共に１０分間インキュベートし、４回洗浄した。次いで、カバーガラスは、洗浄緩衝液の残留塩を除去するために、Ｈ２Ｏ中に浸漬した。一滴の封入剤を添加し、スライドを密封した。使用した抗体は図の説明文に述べた通りである。
【０１９４】
ＭＴＴアッセイ
精製Ｄｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３１ｎＭのうちの１００μｌ）を０．１μＭまたは２．０μＭのＤｏｘのいずれかを搭載することにより調整し、２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合した。細胞を３枚の９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）上で培養し、次いで、細胞を試験対象のナノケージ構築物と共にインキュベートした。示した時点（２４、４８、７２時間）で、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ（培養容量の１／１０、典型的には２０μＬ）で希釈した、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）ストック（５ｍｇ／ｍＬ）と共に３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、ＭＴＴ可溶化溶液（１：１のＤＭＳＯおよびイソプロピルアルコール）を各ウェルに加えてＭＴＴホルマザン結晶を可溶化した。５９０ｎｍの試験波長でプレートシェーカーで、３７℃で１０分間振盪した後、吸光度を読み取った。
【０１９５】
ＴｏＰｒｏ−３アッセイ
精製Ｄｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（３１ｎＭのうちの１００μｌ）を２．０μＭのＤＯＸを搭載することにより調製し、２１０μｌのＰＢＳ中で抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ）と混合した。細胞を３枚の９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）上で培養し、次いで、細胞を試験対象のナノケージ構築物と共にインキュベートした。アッセイの前に、細胞をＴｏＰｒｏ−３染色液（１μＭ）と混合し、３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ｅｘ６４０ｎｍ、ｅｍｍ６７０／１４）で分析し、データをＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。
【０１９６】
Ｖｙｂｒａｎｔ細胞染色アッセイを用いた表現型細胞死アッセイ
ＨＴ−２９細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー排除アッセイ（血球計を用いてトリパンブルー染料で処理した細胞を計数する）を用いて、細胞生存率を評価して、５×１０５個の生細胞を含む細胞懸濁液の量を決定した。生細胞（５×１０５）を１２ウェルプレートに最終容量５００μＬで播種した。この最終５００μＬ容量は、５×１０５細胞＋培地＋薬物−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ＋抗ＥＧＦＲ抗体（０．５〜１μｇ）からなるであろう。実験を停止する前に、プレートを３７℃、５％のＣＯ２、９５％の湿度に設定した組織培養インキュベーター内で２４時間または４８時間インキュベートした。細胞による薬物Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮの取り込みを、細胞傷害性アッセイ、例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ細胞アポトーシスアッセイのために試験化合物または対照化合物、トリプシン処理細胞およびペレット化細胞を含有する５００μＬの溶液を除去することによって止めた。染色する前に、細胞を遠心分離し（３０００ｒｐｍで２分間）、次いで冷ＰＢＳ中で洗浄した後、第２の遠心分離ステップを微量遠心機で３０００ｒｐｍで２分間行った。細胞ペレットを、ＹＯＰＲＯおよびＰＩ染色剤を含む１ｍＬの氷冷滅菌１×ＰＢＳに再懸濁する前に、上清を除去して廃棄した。染色溶液は、１ｍＬのＰＢＳに０．２５μＬのＹＯＰＲＯ（成分Ａ）および０．２５μＬのＰＩ（成分Ｂ）ストック溶液を添加することによって調製した。染色を必要とする試料の数に対して容量を拡大した（例えば、１０個の試料＝１０ｍＬのＰＢＳ中の各２．５μＬの染色）。細胞を染色溶液中で氷上で２０分間インキュベートした。インキュベーション期間後の３０分以内に、染色された細胞を、ＹＯＰＲＯ  Ｒ−１については緑色蛍光発光（すなわち５３０／３０バンドパス）およびヨウ化プロピジウムについては赤色蛍光発光（すなわち６１０／２０バンドパス）の４８８ｎｍ励起を用いて、フローサイトメトリーにより分析し、細胞をゲートしてデブリを排除した。単色染色細胞を用いて標準補正を行った。染色された細胞集団は３つのグループに分けられる。生細胞は低レベルの緑色蛍光を示し、アポトーシス細胞は徐々に高いレベルの緑色蛍光を示し、死細胞は赤色および緑色蛍光の両方を示す。
【０１９７】
顕微鏡検査
細胞取り込みおよびＨＦｎナノケージの分布を共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０）によって調べた。簡潔に説明すると、ＨＴ−２９細胞を、細胞接着のために一晩、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のチャンバースライド（ｉｂｉｄｉ）上に播種した。次いで、細胞をＨＦｎと共に３７℃で異なる時間で処理した。インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、４％の冷パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。リソソームを可視化するために、１％のＢＳＡでブロックした後、細胞をさらに１時間、抗Ｌａｍｐ１（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共に１時間インキュベートした。核を、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で室温で２分間染色し、次いで再びＰＢＳで洗浄した。細胞を封入剤およびカバーガラスで覆い、顕微鏡で観察した（Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ、ＤＡＰＩ  ｅｘ４０５ｎｍ、ｅｍｍ４２０〜４８０ｎｍ、Ｃｙ３  ｅｘ５５０、ｅｍｍ５６０ｎｍ、ＰＩ  ｅｘ４３５ｎｍ、ｅｍｍ６１７ｎｍ）。
【０１９８】
フェリチン
本発明者らは、異なる生物源由来のフェリチンを使用した。バクテリオフェリチン（Ｂｆｒ）はＥ．ｃｏｌｉから単離され、二量体タンパク質界面間に結合する２４個のサブユニットおよび１２個のヘム基を含む。ヒトフェリチン（ＦＴＮ）は、軽鎖フェリチンサブユニット（ｌＦＴＮ）もしくは重鎖フェリチンサブユニット（ｈＦＴＮ）、または両方の組み合わせから構成され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｌＦＴＮまたはｈＦＴＮのいずれかを発現させることによって、単一のタンパク質モノマーのみからなるフェリチンナノケージを作製することが可能である。
【０１９９】
ＴＥＭ法
タンパク質試料を炭素被膜の銅グリッド上に載せた。グリッドはグロー放電を用いて前もって準備された。この技術は、グリッドの親水性を高め、タンパク質試料を炭素被膜に接着させることを可能にする。タンパク質試料をグリッド上に載せた後、コントラストを与えるためにネガティブ染色（酢酸ウラニル）を適用した。染色後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて試料を撮像した。
【０２００】
実施例１−バクテリオフェリチン
Ｅ．ｃｏｌｉバクテリオフェリチン（Ｂｆｒ）を用いたタンパク質ナノケージの形成を評価するために、ｂｆｒ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉゲノムから増幅し、発現構築物にクローニングした。遺伝子の２つの変異体が生成され、一つ（配列番号５）は精製のためのＮ末端Ｈｉｓタグを含み、２番目（配列番号９）はＣ末端金結合ペプチド（ＡｕＢＰ）を含んでいた。金属結合ペプチドは、金属表面へのタンパク質の結合を調整するための機構を提供することが示されており１９、Ａｕ結合ペプチドの添加は、フェリチン空洞内の金ナノ粒子の封入を容易にできることが示された１５。
【０２０１】
驚くべきことに、Ｎ末端Ｈｉｓタグの付加は、Ｂｆｒがそのナノケージ組成物中ではなく、個々のモノマーとして精製したことを意味した（図１参照）。５ｎｍ金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を添加し、一晩インキュベートした後、ＡｕＢＰを含有するタンパク質は、Ａｕナノ粒子の周囲に形成されているナノケージと一致する高次構造を形成していた（図２参照）。精製されたナノケージ複合体の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、ナノケージが実際にＡｕＮＰの周りに形成されたことを実証した（図３参照）。
【０２０２】
Ｎ末端精製タグによるＢｆｒ配列の非常にわずかな修飾は、通常の条件下でＢｆｒのナノケージ構造を不安定化するのに十分であると思われる。Ｃ末端ＡｕＢＰの使用は、厳しい変性条件を使用せずにナノケージのＡｕＢＰ鋳型集合体を確立するのに十分である。
【０２０３】
実施例２−ヒトフェリチンサブユニット操作
Ｅ．ｃｏｌｉからのヒト重鎖および軽鎖フェリチン（ｈＦＴＮ、ｌＦＴＮ）の発現および精製は安定したナノケージ構造を生成した。Ｎ末端Ｈｉｓ精製タグをｈＦＴＮまたはＩＦＴＮのいずれかに付加しても高次ケージ構造は不安定化しなかった。したがって、本発明者らは、タンパク質アミノ酸配列の操作に基づいてケージ構造を不安定化しようとした。高次の２４量体ナノケージ構造を形成する際に、フェリチンサブユニットは、まず対称二量体界面を介して二量体に集合する（図４参照）。かなりの発明努力を用いて、本発明者らは二量体の詳細な構造分析を行い、これがナノケージ中で最も安定した界面であり、三元構造を不安定化するための良い基礎を提供することを実証した。
【０２０４】
１４７個の保存されたフェリチンタンパク質の構造を分析して、少なくとも１つの疎水性残基を含有するヒトフェリチンタンパク質の二量体界面における進化的に保存された疎水性残基を同定した（表１参照）。
【０２０５】
【表１】
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【０２０６】
次いで、これらの保存されたモチーフ内の疎水性残基を部位特異的突然変異誘発のために慎重に選択した（図４Ｃおよび４Ｄを参照されたい）。同定された保存モチーフに従って、ＦＴＮの重鎖変異体［ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）］および軽鎖変異体［ＩＦＴＮ（Ｌ３２Ａ、Ｆ３６Ａ、Ｌ６７Ａ、Ｆ７９Ａ）］に４つの突然変異を生じた。これらは、ナノケージの可視化を可能にするために、およびＣ末端ＡｕＢＰ（配列番号７）の有無にかかわらず、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）とのＮ末端融合として構築された。
【０２０７】
ＦＴＮの各重鎖および軽鎖変異体について、４つのタンパク質変異体が発現され精製された。
【０２０８】
（ｉ）Ｎ末端ＧＦＰを有する野生型ＦＴＮ、
（ｉｉ）Ｎ末端ＧＦＰおよびＣ末端ＡｕＢＰを有する野生型ＦＴＮ、
（ｉｉｉ）Ｎ末端ＧＦＰを有する突然変異ＦＴＮ、ならびに
（ｉｖ）Ｎ末端ＧＦＰおよびＣ末端ＡｕＢＰを有する突然変異ＦＴＮ。
【０２０９】
これらの変異体（ＤＮＡおよびタンパク質）の配列は本明細書に提供される。これら４つのタンパク質を精製し、それらの四次構造をＨＰＬＣによって分析した（図５および６参照）。これらのデータの分析から、ｈＦＴＮの二量体界面に導入された４つの突然変異が四次構造を首尾よく不安定化し、変異したタンパク質がＳＥＣによってモノマーとして溶出することは明らかである。ｌＦＴＮに導入された４つの突然変異がある程度の四次構造を不安定化するが、依然として存在する大部分の２４量体ナノケージが存在する。
【０２１０】
抗体結合ドメイン
ｈＦＴＮの不安定化がうまくいったので、その後の抗体への結合を容易にするためにドメインをそのＮ末端に付加した。この目的のためにＺドメインが選択された。これはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡの誘導体であり、より高い安定性およびＦｃ抗体ドメインに対するより高い結合親和性を有するプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの操作されたバージョンである（Ｎｉｌｓｓｏｎ  １９８７，ｒｅｆ  ２１）。Ｚドメインは、２つのタンデムドメインが存在するように反復としてコードされた（ＺＺ）。Ｎ末端ＺＺおよびＧＦＰを用いたｈＦＴＮのＳＥＣ分析は、全長タンパク質が依然としてナノケージとして精製されている一方で、変異したｈＦＴＮがモノマーとして精製することを実証している（図７参照）。
【０２１１】
実施例３ーヒトフェリチンナノケージの再集合
実施例２に記載された様々な突然変異を有するＦＴＮナノケージを不安定化したので、本発明者らは、以前Ｂｆｒを用いて行ったように、ナノケージを金属ナノ粒子（例えば金）の周りに規則正しい様式で再集合できるかどうかを実証したかった（図３−実施例１を参照のこと）。野生型ｈＦＴＮおよび突然変異ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）の両方に対するＺＺ−ＧＦＰ−ＦＴＮ融合物を、ほぼ化学量論量の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）と共にインキュベートし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって調べた。ＳＥＣはタンパク質と複合体をそのサイズに基づいて分離し、小さい分子ほど多孔質カラムマトリックスを通る経路が長くなり溶出が遅くなるが、大きい分子ほど空隙容量で時間がかかるため溶出が速くなる。これを使用して、フェリチンモノマーをケージ複合体から非常に効果的に分離することができる（図２を参照）。野生型（図８参照）および突然変異ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（図９参照）の両方が、タンパク質およびＡｕＮＰの両方を含む高次複合体を示し、これはＡｕＮＰが野生型および変異したタンパク質の両方と規則正しい複合体を形成できることを示す。
【０２１２】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣによって精製されたＡｕＮＰ複合体のさらなる分析は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって行われた。これらのデータは、野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮタンパク質がＡｕＮＰとクラスターを形成するが、ＡｕＮＰがフェリチンの中空空間内に封入されているという証拠はないことを示している（図１０Ａ参照）。野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ単独で、単離されたナノケージ構造を容易に形成する（図１０Ｄ参照）。ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）突然変異体は、ＡｕＮＰの非存在下ではナノケージを形成しない（図１０Ｃ参照）が、ＡｕＮＰの存在下では、ＡｕＮＰが、フェリチンナノケージの中央空間内に明らかに封入されるナノケージ構造の割合が高い（図１０Ｂ参照）。
【０２１３】
これらのデータは、ｈＦＴＮの二量体界面に導入されたＬ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ突然変異がタンパク質界面を不安定化して四次ナノケージ構造を形成しないようにするのに十分であることを明らかに実証している。意外で予測のつかない結果は、この不安定化したタンパク質がＡｕＮＰの周囲を鋳型にして、ＡｕＮＰを高い効率で封入するナノケージ構造を形成することである。これは特に驚くべきことである。なぜなら、以前はｂｆｒに要求されていたように、鋳型がＦＴＮの内部Ｃ末端に金結合ペプチドを含む必要なく生じたからである（図２および３参照）。
【０２１４】
実施例４−ナノケージへの薬物の封入
実施例３において、本発明者らは、金ナノ粒子の周りのフェリチンナノケージの規則正しい集合を実証した。本発明者らはまた、ナノケージ内に薬物を直接封入することを可能にするために、このプログラムされた規則正しい集合を使用した。金ナノ粒子は、共有結合性薬物−Ａｕ複合体の形成による薬物送達のための独立型ベクターと考えられてきた２０。ここで本発明者らは、高度に分極化可能なＡｕ表面への薬物分子の受動的結合、およびその後のフェリチンナノケージへのそれらの封入による安定化を使用して、異なるアプローチを利用しようとした。本発明者らは、その固有の蛍光によって５ｎｍのＡｕナノ粒子への抗癌剤ドキソルビシン（Ｄｏｘ）の結合を評価した。Ａｕナノ粒子の存在下での蛍光の消光は、ＤｏｘとＡｕとの間の相互作用を実証する（図１１参照）。さらに、本発明者らは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とＡｕナノ粒子との間の相互作用を実証し、この場合は、蛍光の完全な除去が観察された（図１２参照）。
【０２１５】
小分子はＡｕナノ粒子に結合することができるので、本発明者らは、ナノ粒子がＡｕナノ粒子の周囲に秩序構造を形成し得ることを実証して以来、これが薬物のタンパク質ナノケージへの規則正しい封入のメカニズムを提供すると仮定した。したがって、本発明者らは、Ａｕ−薬物ナノ粒子複合体によって指示されるナノケージ形成で、小分子のＡｕナノ粒子への事前の結合がタンパク質ナノケージ内へのそれらの封入をもたらすことを実証しようとした。これを評価するために、突然変異ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）タンパク質を、異なる濃度のＤｏｘまたはＰＩの存在下でＡｕナノ粒子に添加した。次いで、Ａｕナノ粒子の周囲に形成されたナノケージをＨＰＬＣによって精製した（図９のように）。次に、精製したＤｏｘ−Ａｕ−ナノケージ複合体を、Ｄｏｘ蛍光の測定によりＤｏｘについて評価した。Ｄｏｘ蛍光の明らかな存在は、Ｄｏｘが精製されたナノケージ複合体中に存在したことを示した（図１３参照）。蛍光によるＰＩの封入は、結合時のその完全な消光のためにモニターすることができなかった。
【０２１６】
薬物封入のさらなる分析は、質量分析法（ＭＳ）によって評価した。薬物−Ａｕ−ナノケージの複合体をＭＳによる分析の前にＨＰＬＣによって精製し、薬物が複合体中に存在するかどうかを決定した。データは、ＰＩとＤｏｘの両方がナノケージ複合体中に存在し、薬物の封入がクエン酸塩とＰＢＳの両方で安定化されたＡｕナノ粒子で生じたことを明確に示している（図１４参照）。まとめると、これらのデータは、Ａｕナノ粒子への小分子の受動的結合が、フェリチンナノケージへのそれらの封入に十分であることを実証している。
【０２１７】
実施例５−標的細胞へのフェリチンナノケージの標的化
ＺドメインがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ由来のＩｇＧ結合ドメインの合成誘導体であるので、Ｎ末端ＺＺドメインを含むフェリチン融合体は、原則として、ＩｇＧアイソタイプ抗体に結合することができるはずである。本発明者らは、直接抗体相互作用によりフェリチンナノケージの標的化を特定の細胞型に誘導することができる特異性を評価した。細胞結合を決定するための蛍光基礎を確立するために、本発明者らは、ＧＦＰ標識の野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮを使用した。細胞特異的標的化の原理を実証するために２つの異なる細胞型および抗体を使用し、ここで、発明者らは、ＭＮＫ１．１（マウスナチュラルキラー細胞）およびＨＴ２９（結腸直腸癌）細胞株を選択し、それは、ＭＮＫ１．１の場合はＮＫ１．１受容体、またはＨＴ２９の場合はＥＧＦＲ受容体のいずれかを標的とすることができる既知の抗体を有する。適切な標的化抗体の存在下または非存在下での野生型ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮを用いたフローサイトメトリー試験は、抗体の非存在下ではナノケージの識別可能なバックグラウンド結合を示さないが、抗体の存在下では集団の蛍光における完全な転換が観察された（図１５を参照）。
【０２１８】
実施例６−標的細胞への薬物の送達
特定の細胞に対して免疫特異性を示す抗体に予め結合することによって、ナノケージがそのような細胞に効果的に標的化され得ることを実証したので、本発明者らは薬物搭載ナノケージ複合体が薬物のペイロードを細胞に送達できることを決定しようとした。ＧＦＰを含むナノケージは、細胞内でのナノケージの送達および運命をモニターするために作製されたが、ＧＦＰを含まないフェリチンは、薬物の運命を蛍光でモニターできるように封入されたＡｕ−薬物を含むナノケージを作製するために使用された。Ａｕ−ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）および薬物−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）複合体を前述同様に形成し、ＨＰＬＣによって精製した。次いで、それらを前述同様に抗ＥＧＦＲと混合し、ＨＴ２９細胞とのそれらの相互作用を経時的にモニターした。
【０２１９】
ＧＦＰ標識ナノケージは細胞に結合することが明らかに見られ、２時間後にナノケージの点状分布が細胞表面と細胞内部の両方に観察された（図１６）。細胞はまた、後期リソソームマーカーであるランプ１で染色された。２時間後の内在化ＧＦＰシグナルは、明らかに点状であるがリソソームとは関連していないことがわかり、これはエンドソーム内へのエンドサイトーシスの初期段階と一致している（図１６ａおよび１６ｂ参照）。２４時間後、画像は、ＧＦＰが細胞質全体に分散し、リソソームシグナルと部分的に関連した状態で、明らかに変化し、リソソームと関連するｐＨ低下によって分解され分散されるＧＦＰと一致する（図１６ｄおよび１６ｅ参照）。
【０２２０】
Ｄｏｘの蛍光シグナルを追跡することによって、薬物を搭載したナノケージが薬物を細胞に送達する能力をモニターした。精製したＤｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を細胞と共にインキュベートし、２時間後および２４時間後に核のＤＡＰＩ染色を組み合わせたＤｏｘ蛍光について画像化した。２時間後、細胞質中にはＤｏｘの弱いシグナルがあるが、Ａｕナノ粒子によって結合されたＤｏｘは本発明者らの以前の特徴付けに基づいて有意に減少した蛍光を有するだろう。２４時間後、細胞核へのＤｏｘシグナルの明らかな移行がある（図１７参照）。これは、ナノケージの分散がＤｏｘの分散およびその核への移行をもたらす、図１６で観察されたナノケージの運命と一致する。
【０２２１】
共焦点顕微鏡によりＰＩの送達を観察しようとしたが、ＰＩをうまく観察できなかった（図１８参照）。ＰＩチャネルからの唯一のシグナルはまた細胞のみの対照で観察され、自己蛍光と一致する（ＰＩはＤｏｘとは異なる波長で画像化されることに注意）。
【０２２２】
薬物送達のさらなる評価を質量分析法によって行った。上記で用いた投与手順に従って、細胞を溶解前に洗浄し、薬物の存在をＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５５０）で測定した。ナノケージによって送達されたＰＩおよびＤｏｘの両方が溶解細胞中に存在した（図１９参照）。対照試料において薬物単独の送達を見ることも可能であり、ナノケージ−薬物複合体を作製するときに使用された濃度と同じ遊離薬物濃度が使用された（ＰＩは５０μＭおよびＤｏｘは２μＭ）。ナノケージのみで処理した細胞は、質量分析によるシグナルを全く示さなかった（図示せず）。
【０２２３】
実施例７−細胞への薬物送達の表現型アッセイ
本発明者らは、細胞へのＤｏｘの効果的な送達を実証するために表現型アッセイを用いた。ＭＴＴアッセイは、還元時に紫色を呈するテトラゾリウム色素基質（ＭＴＴ）を用いて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼ酵素を介して細胞の代謝活性を測定する。生存細胞数の減少は活性の喪失、ひいては色反応の減少をもたらす。Ａｕ−ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）およびＤｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）複合体を前述同様に形成し、ＨＰＬＣによって精製した。Ｄｏｘ搭載ナノケージの場合、複合体を形成するときに２つの濃度のＤｏｘ（０．１μＭおよび０．２μＭ）を使用した。次いで、それらを前述同様に抗ＥＧＦＲと混合し、ＭＴＴアッセイを用いて生存率を測定する前に、ＨＴ２９細胞とのそれらの相互作用を経時的にモニターした。高搭載量のＤｏｘで形成されたナノケージは、アッセイの時間経過の間に表現型応答を明らかに示した（図２０ａ）。またデータによって、Ｄｏｘ（０．１または２．０μＭ）を使用した異なるナノケージ搭載条件に対する用量反応が実証される。フローサイトメトリーおよびＴｏｐｒｏ３色素を用いてさらなる表現型アッセイを行った。Ｔｏｐｒｏ３はＤＮＡに結合し、優先的に非生存細胞に入る。前述同様に、ＨＴ２９細胞を抗ＥＧＦＲ抗体に予め結合させたＡｕ−ＺＺ−ＧＦＰ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）およびＤｏｘ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）複合体で処理し、細胞のみと一緒にＤｏｘのみの対照も行った（図２０ｂ）。このアッセイでは、薬物搭載ナノケージは２４時間で生存率に明らかな差を示す。対照細胞との違いは、より長い時点ではそれほど顕著ではなくなり、これは取り込みが抗ＥＧＦＲ抗体の存在によって引き起こされるためであり得る。細胞のみの対照は７２時間後でさえも低い応答を有するが、より長い時点でこの色素は生存シグナルとしてそれほど特異的でなくなることもまた知られている。
【０２２４】
実施例８−表現型スクリーニングプラットフォームにおけるナノケージの使用
本発明者らは、フェリチンナノケージを小分子剤を細胞内に送達するためのプラットフォーム技術として使用する能力を実証した。この技術はナノケージ複合体の封入および集合のための規定された方法を提供するので、化合物を細胞内に送達するための一般的方法として想像することができる。小分子化合物のＡｕナノ粒子への結合は、多種多様なイオン性相互作用、静電相互作用、および疎水性相互作用に役立つ。薬物結合ナノ粒子の周りの突然変異ナノケージの集合もまた強固に見える。さらに、ＺＺドメインとＩｇＧアイソタイプ抗体との相互作用によるナノケージ複合体の抗体への結合は、迅速かつ効果的である。したがって、これは非常に広範囲の市販の抗体に適用することができ、これを使用して、広範囲の異なる細胞型を効果的に標的とすることができる。
【０２２５】
秩序あるプロセスおよびナノケージ送達の多様性のために、インビボ効果について小分子をスクリーニングするためのプラットフォームとしてこれを使用することが可能である。多くの場合、小分子剤は細胞透過性が低いため機能しない。さらに、薬物開発中に、細胞透過性についての知識なく、表現型細胞アッセイにおける化合物クラスの有効性に関して結論が下されることが多い。細胞膜を通過するように作製できるならば、薬物は非常に効果的であり得る。失敗のモード、非細胞透過、または生物学的有効性の低さをさらに詳細に説明できれば、スクリーニングをする上で有用であると思われる。
【０２２６】
本明細書に記載のフェリチンナノケージは、表現型アッセイにおいて細胞内に化合物を効果的に送達するための方法を提供し、規則正しい集合プロセスはハイスループットスクリーニングシナリオに適応可能である。さらに、化学的標識化または蛍光タンパク質の融合のいずれかによって蛍光性にされたナノケージを使用して、個々の細胞の取り込みをモニターすることができる。細胞選別法と組み合わせると、表現型アッセイはナノケージ蛍光に基づく用量反応と相関する可能性がある。
【０２２７】
実施例９−疾患の診断および治療におけるナノケージ
抗体の結合を介してフェリチンナノケージを特定の細胞型に標的化する能力は、疾患の診断および治療に可能性を創出する。ナノケージを蛍光性にすることができるので、既知のエピトープ疾患マーカーを提示する特定の細胞型を同定するために、それらは画像化方法で使用することができる。これにより、画像診断しやすい部位における癌の種類の診断にそれらを使用する可能性が創出される。この例としては、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌など、消化管を介してアクセス可能な癌である。さらに、皮膚癌ならびに頸部癌および咽頭癌を含む体表面近くの癌は診断に利用しやすいと思われる。
【０２２８】
薬物をナノケージ内に封入する能力はまた、診断および治療（セラノスティック）を組み合わせたアプローチの可能性を提供する。さらに、薬物封入複合体はＡｕナノ粒子を含有するので、薬物の活性放出のためのメカニズムもまた可能である。Ａｕナノ粒子はそれらのプラズモン効果のために光を吸収し、レーザー照射は入射レーザー照射の強度に比例してナノ粒子の局所加熱を引き起こすことが判明している（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ）。ナノケージの標的化に続いて、局所加熱がナノケージ複合体の熱分解をもたらすので、レーザー誘起加熱を用いて封入薬物の放出を活性化することができる。この種のアプローチは、化合物を局所的に送達し、レーザー光源を使用して撮影および治療することの両方ができる最新の内視鏡技術を利用することができる。したがって、本発明者らは、この種のナノケージデバイスが現在の治療行為およびアプローチに適合するだろうと考えている。
【０２２９】
実施例１０−蛍光偏光による薬物放出の測定
レーザー誘起薬物放出の原理は、Ｄｏｘなどのナノケージ内の蛍光結合分子の蛍光偏光を調べることによって実証することができる。異方性は、試料内の偏光度の尺度に依存しない強度を提供する。簡単に言うと、蛍光分子が平面偏光を吸収すると、それは励起源と同じ平面で放射される。しかしながら、蛍光寿命の間、吸収と発光の間に、分子は回転できる。これは、放出された光が分子の新しい方向に関連することを意味する。垂直面と水平面の両方で放射光を測定することによって、偏光度（異方性）を決定することが可能である。大分子は小分子よりもゆっくり回転するので、異方性の度合いは分子のサイズに依存する。したがって、ナノケージ内に封入された蛍光分子は非常に高い異方性値を有するであろう。Ａｕナノ粒子のレーザー照射がナノケージの破壊および蛍光化合物の放出をもたらす場合、これは測定された異方性の有意な減少によって画像化されるであろう。
【０２３０】
実施例１１−フェリチンナノケージによる細胞へのパクリタキセルの送達
パクリタキセル（Ｐａｃ）は、太平洋イチイから最初に単離された天然産物である。それは多くの種類の癌を治療するために一般的に使用され、多くの副作用を有することが知られている。それは有糸分裂紡錘体集合を標的とすることにより細胞分裂を防ぐ。アルブミン結合製剤（アブラキサン）は、ある程度、癌治療における薬物の有効性を高め、投与に以前使用された溶媒に関連したいくつかの毒性問題を軽減した。アブラキサンは、原則として、適切な薬物送達のために得ることができる利点を示すが、それでもなお重大な毒性問題を抱えている。
【０２３１】
本発明者らは、本発明のフェリチンナノケージによる結腸腫瘍癌細胞株（ＨＴ−２９）へのＰａｃの封入および送達を実証するために実験を行った。Ｐａｃ（５μＭ）を封入して、上記のように薬物−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）ナノケージを作製した。細胞に添加する前に、Ｚｏｒｂａｘスピンカラムを用いて過剰の遊離薬物を除去した。抗ＥＧＦＲ抗体（０．５μｇ）をＰａｃ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）に添加し、抗体結合ケージを細胞に添加した（３０ｎＭ）。
【０２３２】
金ナノ粒子のみを含有するｈＦｔｎの細胞毒性効果を決定するための対照として、搭載されていないＡｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）送達ビヒクルをＨＴ２９細胞に添加した。遊離Ｐａｃを薬物のみの対照として高濃度（５μＭ）で細胞に添加した。細胞内への薬物送達の表現型効果を、フローサイトメトリーを用いてＶｙｂｒａｎｔ蛍光染色によって評価し、死細胞、アポトーシス細胞および生細胞の割合を測定した。
【０２３３】
４８時間後、ｈＦｔｎ−Ｐａｃ（＞７０％細胞死）を細胞内に送達して、遊離薬物単独よりも驚くほど多くの細胞死を引き起こすパクリタキセルのペイロードを放出することができる（約９％細胞死）（図２１参照）。これらのデータは、ｈＦｔｎナノケージが、適切な標的化抗体の存在下で、細胞内へのＰａｃの封入および送達において非常に効率的であることを実証している。Ｐａｃは、送達されると強い表現型応答をもたらす著しい細胞毒性を引き起こすが、膜透過性が低い遊離Ｐａｃは細胞にほとんど影響を及ぼさない。
【０２３４】
実施例１２−フェリチンナノケージによるアクチノマイシン−Ｄの細胞への送達
アクチノマイシン−Ｄ（Ａｃｔ−Ｄ）は、フェノキサゾン環を介して結合した２つの環状ペプチドからなる。それは多くの種類の癌を治療するための化学療法薬としても使用されている抗生物質であり、ＷＨＯの必須医薬品のリストに載っている。それには重大な副作用がある。
【０２３５】
本発明者らは、Ａｃｔ−Ｄのサイズおよび複雑さの環状ペプチドを封入し、本発明のフェリチンナノケージによって結腸腫瘍癌細胞株（ＨＴ−２９）に細胞に送達できるかどうかを発見するために実験を行った。Ａｃｔ−Ｄ（５μＭ）を封入して、前述同様に薬物−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）ナノケージを作製した。細胞に添加する前に、Ｚｏｒｂａｘスピンカラムを用いて過剰の遊離薬物を除去した。抗ＥＧＦＲ抗体（０．５μｇ）をＡｃｔ−Ｄ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）に添加し、抗体結合ケージを細胞に添加した（３０ｎＭ）。
【０２３６】
金ナノ粒子のみを含有するｈＦｔｎの細胞毒性効果を決定するための対照として、搭載されていないＡｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）送達ビヒクルをＨＴ２９細胞に添加した。遊離Ａｃｔ−Ｄを薬物のみの対照として高濃度（５μＭ）で細胞に添加した。細胞内への薬物送達の表現型効果を、フローサイトメトリーを用いてＶｙｂｒａｎｔ蛍光染色によって評価し、死細胞、アポトーシス細胞および生細胞の割合を測定した。４８時間後、Ａｃｔ−Ｄ−Ａｕ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）（１０％細胞死）を細胞内に送達してＡｃｔ−Ｄのペイロードを放出することができる。高濃度の遊離薬物単独では、ナノケージ送達薬物で観察されたものと同程度の細胞死が引き起こされる（図２２参照）。このように、遊離薬物は、それを細胞内に進入させ、死に至らせるいくつかの細胞透過特性を有することは明らかであるが、記載のアッセイでは、細胞殺傷の程度は、類似濃度に関して文献に報告されたほど高くはなかった２２。３０ｎＭのＡｃｔ−Ｄ搭載ナノケージによる処理は、高濃度の遊離薬物に対して類似の応答を示し、これは、大幅な低濃度で同様のレベルの細胞送達が達成されたことを実証している。Ａｃｔ−Ｄは、Ｐａｃほど細胞死を誘導するのに強力ではないようである（図２２および２１を比較されたい）。
【０２３７】
実施例１３−化合物ナノケージ
Ａｕナノ粒子をＨｉｓ−ＺＺ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）およびＨｉｓ−ＧＦＰ−ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｌ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）とインキュベートすることによって、異なるタイプのサブユニットからなる化合物ナノケージも作製した。Ａｕナノ粒子は核形成剤として作用し、融合タンパク質のｈＦｔｎ部分は同一であるので、いくつかのサブユニット上にＺＺドメインおよび他のサブユニット上にＧＦＰドメインを含むナノケージが形成された。これらの化合物ナノケージは、蛍光および薬物の細胞送達に関して予想通りに挙動した。
【０２３８】
実施例１４−質量分析法による薬物定量化
ナノケージへの薬物の搭載が実施され得ることを実証するために、精製したＡｃｔ−Ｄ−Ｈｉｓ−ＺＺ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）ナノケージの質量分析を実施した。検量線は、試料の直接定量化に必要である。タンパク質成分に関して、ｈＦｔｎ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）モノマー濃度の良好な値を提供するペプチド断片が同定され、次いで、標準希釈液を使用して、このペプチドのｍ／ｚシグナルの５０ｐｐｍの面積に基づいて標準曲線を作成した。同様に、Ａｃｔ−Ｄの標準曲線は、これがＡｃｔ−Ｄシグナルを分解するＡｕ−ナノ粒子の能力に影響する場合には、Ａｕナノ粒子に結合したＡｃｔ−Ｄの標準希釈に基づいて確立された。
【０２３９】
両方の標準曲線は濃度に対して良好な線形応答を示した（図２３ＡおよびＢ参照）。これらの検量線に基づいて、精製したＺＺ−Ａｕ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）を分析した。次いで、ＺＺ−Ａｕ−ｈＦＴＮ（Ｌ２９Ａ、Ｌ３６Ａ、Ｉ８１Ａ、Ｌ８３Ａ）およびＡｃｔ−Ｄから生じるシグナルの定量化を標準曲線に基づいて計算した。モノマーからナノケージへの形成を補正した後、Ａｃｔ−Ｄの量はナノケージ当たり１３．３分子と計算された（図２３Ｃ参照）。
【０２４０】
参考文献
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ＯＮ  ＦＩＯＮＬＡＮＦＩ  ＦＩ  ＦＩ  ＦＩＦＩＯＮＦＩ  ＦＩ。
【図１】
2019535246.tif 000048
【図２】
2019535246.tif 000049
【図３】
2019535246.tif 000050
【図４】
2019535246.tif 000051
【図５−１】
2019535246.tif 000052
【図５−２】
2019535246.tif 000053
【図６−１】
2019535246.tif 000054
【図６−２】
2019535246.tif 000055
【図７】
2019535246.tif 000056
【図８】
2019535246.tif 000057
【図９】
2019535246.tif 000058
【図１０】
2019535246.tif 000059
【図１１】
2019535246.tif 000060
【図１２】
2019535246.tif 000061
【図１３】
2019535246.tif 000062
【図１４−１】
2019535246.tif 000063
【図１４−２】
2019535246.tif 000064
【図１５】
2019535246.tif 000065
【図１６】
2019535246.tif 000066
【図１７】
2019535246.tif 000067
【図１８】
2019535246.tif 000068
【図１９】
2019535246.tif 000069
【図２０】
2019535246.tif 000070
【図２１−１】
2019535246.tif 000071
【図２１−２】
2019535246.tif 000072
【図２２−１】
2019535246.tif 000073
【図２２−２】
2019535246.tif 000074
【図２３】
2019535246.tif 000075
【配列表】
2019535246000001.app
【国際調査報告】
2019535246.tif 000076
2019535246.tif 000077
2019535246.tif 000078
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