(57)【要約】  本発明は、単独で又は他の化学療法剤、具体的にはTRAILに基づく化学療法剤と組み合わせて癌の処置に有用である、9個の選択的c-FLIP阻害剤を提供する。また、本発明は、9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの少なくとも1つを含む医薬組成物及びキット、並びに、癌の処置方法、具体的には化学耐性を克服する又はTRAILに基づく治療に対する腫瘍の感度を改善させるための方法におけるその使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的c-FLIP阻害剤が以下の式のうちの1つを有する小分子である:
【化１】
2019535721.tif 000003
癌の処置において使用するための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項２】
選択的c-FLIP阻害剤が式(1)、(2)、(3)、(4)、及び(9)のうちの1つを有する、具体的には式(1)、(4)、及び(9)のうちの1つを有する小分子である、請求項1に記載の使用のための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項３】
癌がc-FLIPを過剰発現する、請求項1又は請求項2に記載の使用のための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項４】
c-FLIPを過剰発現する癌が、肺癌、結腸直腸癌、膵癌、卵巣癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膠芽細胞腫、膀胱尿路上皮癌、子宮頸癌、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平細胞癌(HNSCC)、肝細胞癌、B細胞慢性リンパ球性白血病、胆嚢癌、ユーイング肉腫、上咽頭癌、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、神経芽細胞腫、骨髄腫、急性骨髄性白血病、骨肉腫、腎肉腫、子宮内膜癌、悪性胸膜中皮腫、カポジ肉腫、末梢T細胞リンパ腫、及び赤白血病からなる群から選択される、請求項3に記載の使用のための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項５】
癌が化学耐性である、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項６】
癌がTRAILに基づく抗癌剤に耐性又は非感受性である、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項７】
TRAILに基づく抗癌剤が、TRAIL受容体作用剤又はリガンド、具体的にはTRAIL-R1作用剤若しくはリガンド又はTRAIL-R2作用剤若しくはリガンドである、請求項6に記載の使用のための選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項８】
癌の処置においてプロアポトーシス剤として使用する、式(1)〜(9)のうちの1つを有する選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項９】
癌の化学耐性を克服するために使用する、式(1)〜(9)のうちの1つを有する選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項１０】
TRAIL受容体作用剤治療に対する癌の耐性を克服する又はTRAIL受容体作用剤治療に対する癌の感度を改善させるために使用する、式(1)〜(9)のうちの1つを有する選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容されるその塩。
【請求項１１】
有効量の式(1)〜(9)のうちの1つを有する少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤と、薬学的に許容されるその担体又は賦形剤とを含む、癌の処置において使用する、又は癌の化学耐性を克服するために使用する、又はTRAIL受容体作用剤治療に対する癌の耐性を克服するため若しくはTRAIL受容体作用剤治療に対する癌の感度を改善させるために使用する、医薬組成物。
【請求項１２】
少なくとも1つの追加の治療剤を更に含む、請求項11に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
追加の治療剤が、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、消毒剤、及びその組合せからなる群から選択される、請求項12に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
追加の治療剤が、TRAILに基づく抗癌剤、好ましくはTRAIL受容体作用剤又はリガンド、より好ましくはTRAIL-R1作用剤若しくはリガンド又はTRAIL-R2作用剤若しくはリガンドである、請求項12に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
式(1)〜(9)のうちの1つを有する少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物と、少なくとも1つの追加の治療剤とを含み、少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤及び少なくとも1つの追加の治療剤が別々の容器に含まれている、癌の処置において使用する、又は癌の化学耐性を克服するために使用する、又はTRAIL受容体作用剤治療に対する癌の耐性を克服するため若しくはTRAIL受容体作用剤治療に対する癌の感受性を改善させるために使用するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が本明細書中に参照として組み込まれている、2016年11月17日に出願の欧州特許出願EP 16 306 500号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の化学療法は、新規抗腫瘍薬の開発と共に徐々に改善されてきている。しかし、特定の悪性腫瘍の化学療法での処置は成功しており、有望である一方で、その有効性がしばしば腫瘍の薬物耐性によって制限されている。実際、化学療法に対する耐性は、依然としてヒト悪性腫瘍の処置における大きな障害である。事実、多くの腫瘍(たとえば、結腸癌、膵癌、膠芽細胞腫、及び前立腺癌)は、癌治療で使用されるより強力な細胞毒性剤の多くに内因的に耐性がある。初期には感受性である他の腫瘍(たとえば乳癌)は、再発し、初期の治療剤に対して耐性となり、頻繁に、初期の処置で使用しなかった他の癌薬にも耐性を有する。臨床的有効性を低下させることに加えて、化学耐性は処置の早期終了や、再発のない間隔や生存の低下をもたらす。
【０００３】
様々な機構が化学耐性に寄与しており、その1つがアポトーシスの欠損である。アポトーシス(又はプログラム細胞死)は、通常は発達及び加齢中に、組織中の細胞集団を維持するための恒常性機構として起こる。また、アポトーシスは、免疫反応において、又は細胞が疾患若しくは侵害性剤によって損傷した場合等に、防御機構としての基本的役割も果たす。細胞が生理的にプログラミングされたアポトーシス細胞死を受けることができないことは、その悪性形質転換に固有の特徴であるため、アポトーシスプロセスの失敗は多くのヒト癌の重要な構成要素である。また、悪性細胞におけるアポトーシスシグナル伝達の欠損及び余剰の生存機構は、様々な癌種における薬物耐性にも寄与する。複雑かついくつかのレベルで調節されるアポトーシスの機構は大規模に調査されている。細胞アポトーシス機構の理解の増加は、癌治療行為の関連標的としてアポトーシスシグナル伝達経路の一部の分子成分を同定することを助けている。これらの分子成分のうちの1つは、細胞性FADD様インターロイキン-1ベータ-変換酵素阻害タンパク質であるc-FLIPである(Safa及びPollock、Cancers、2011、3:1639〜1671頁、Safa、Exp. Oncol、2012、34:176〜184頁、Safa, J.、Carcinog. Mutagen.、2013、補遺6、doi:10.4172/2157〜2518頁.S6-003、Fulda、Expert. Opin. Ther. Targets、2016、17:195〜201頁、Shirley及びMicheau、Cancer Lett.、2013、332:141〜150頁)。
【０００４】
c-FLIPタンパク質は、触媒として不活性なカスパーゼ-8/-10相同体である。これは、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、Fasリガンド(Fas-L)、及びTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(TRAIL)に誘導されるアポトーシス、並びに悪性細胞において化学療法剤によって始動されるアポトーシスを抑制する、主要な抗アポトーシス調節因子及び耐性因子である。タンパク質c-FLIPは、リガンド依存性及び非依存性の様式でFADD(デスドメインを有するFas関連タンパク質、Fas-Associated protein with Death Domain)及び/又はカスパーゼ-8若しくは10並びにTRAIL受容体4(DR4)及び受容体5(DR5)と結合し、アポトーシス阻害性複合体(AIC)を形成する。立ち代って、この相互作用は、死誘導性シグナル伝達複合体(DISC)の形成、及び続くカスパーゼカスケードの活性化を防ぐ。
【０００５】
c-FLIPを標的とするためにこれまで使用されてきた戦略には、その分解及び/又はその発現の減少を引き起こす分子の使用が含まれる。たとえば、多様なヒト癌細胞系においてc-FLIPL(c-FLIPの長いアイソフォーム)の発現を特異的にノックダウンする低分子干渉RNA(siRNA)は、TRAIL誘導性のDISCの動員を増加させ、化学療法剤の有効性を引き上げて、したがってエフェクターカスパーゼ刺激及びアポトーシスを増強させることが見いだされている(Longleyら、Oncogene、2006、25:838〜848頁)。c-FLIPの分解並びにc-FLIPL及びc-FLIPS(それぞれc-FLIPの長い及び短いアイソフォーム)のmRNA及びタンパク質レベルの減少を引き起こす小分子が開発されている(Hernandezら、J. Gastrointest. Surg.、2001、5:56〜65頁、Mawjiら、Cancer Res.、2007、67:8307〜8315頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開特許WO98/32856号
【特許文献２】米国特許第6,342,363号
【特許文献３】国際公開特許WO99/37684号
【特許文献４】米国特許第6,072,047号
【特許文献５】米国特許第6,342,369号
【特許文献６】国際公開特許WO98/51793号
【特許文献７】国際公開特許WO98/41629号
【特許文献８】国際公開特許WO98/35986号
【特許文献９】国際公開特許WO98/46643号
【特許文献１０】国際公開特許WO99/02653号
【特許文献１１】国際公開特許WO99/09165号
【特許文献１２】国際公開特許WO99/11791号
【特許文献１３】国際公開特許WO 2009/140469号
【特許文献１４】米国特許第6,455,040号
【特許文献１５】米国特許第6,743,625号
【特許文献１６】米国特許第6,433,147号
【特許文献１７】米国特許第6,902,910号
【特許文献１８】米国特許第7,115,717号
【特許文献１９】米国特許公開第2002097033号
【特許文献２０】米国特許公開第20060062786号
【特許文献２１】米国特許公開第2014161845号
【特許文献２２】米国特許公開第2014159562号
【特許文献２３】米国特許公開第2013148877号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Safa及びPollock、Cancers、2011、3:1639〜1671頁
【非特許文献２】Safa、Exp. Oncol、2012、34:176〜184頁
【非特許文献３】Safa, J.、Carcinog. Mutagen.、2013、補遺6、doi:10.4172/2157〜2518頁.S6-003
【非特許文献４】Fulda、Expert. Opin. Ther. Targets、2016、17:195〜201頁
【非特許文献５】Shirley及びMicheau、Cancer Lett.、2013、332:141〜150頁
【非特許文献６】Longleyら、Oncogene、2006、25:838〜848頁
【非特許文献７】Hernandezら、J. Gastrointest. Surg.、2001、5:56〜65頁
【非特許文献８】Mawjiら、Cancer Res.、2007、67:8307〜8315頁
【非特許文献９】Safa、Exp. Oncol.、2012、34:176〜184頁
【非特許文献１０】「Remington's Pharmaceutical Sciences」、E.W. Martin、第18版、1990、Mack Publishing Co.:ペンシルバニア州Easton
【非特許文献１１】Sambrookら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989
【非特許文献１２】Harlow及びLane編、Using Antibodies、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999
【非特許文献１３】Wilsonら、Cancer Res.、2007、6:5754〜5762頁
【非特許文献１４】Haagら、Gut、2011、60:225〜237頁
【非特許文献１５】Kauhら、PLoS One、2010、5:e10376頁
【非特許文献１６】El-Gazzarら、Gynecol. Oncol.、2010、117:451〜459頁
【非特許文献１７】Parkら、Biochem. Pharmacol.、2009、77:1328〜1336頁
【非特許文献１８】Namら、Cancer Sci.、2003、94:1066〜1073頁
【非特許文献１９】Dayら、Biochem. Pharmacol.、2008、76:1694〜1704頁
【非特許文献２０】Tiwaryら、PLoS One、2010、5:e11865頁
【非特許文献２１】Zhangら、Cancer Res.、2007、67:9425〜9434頁
【非特許文献２２】Yangら、Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.、2007、34、1245〜1251頁
【非特許文献２３】McLornanら、Clin. Cancer Res.、2010、16:3442〜3451頁
【非特許文献２４】Ullenhagら、Clin. Cancer Res.、2007、13:5070〜5075頁
【非特許文献２５】Korkolopoulouら、Urology、2004、63:1198〜1204頁
【非特許文献２６】Wangら、Gynecol. Oncol.、2007、105:571〜577頁
【非特許文献２７】Valnet-Rabierら、Br. J. Haematol.、2005、128:767〜773頁
【非特許文献２８】Valenteら、Br. J. Haematol.、2006、132:560〜570頁
【非特許文献２９】Liら、J. Cancer Res. Clin. Oncol.、2008、134:609〜615頁
【非特許文献３０】Salonら、Cell Death Differ.、2006、13:260〜272頁
【非特許文献３１】Duら、Exp. Clin. Cancer Res.、2009、28:24頁
【非特許文献３２】Zhouら、Clin. Sci. (Lond.)、2004、106:397〜405頁
【非特許文献３３】Panら、Science、1997、276:111〜113頁
【非特許文献３４】Sheridanら、Science、1997、277:818〜821頁
【非特許文献３５】Panら、Science、1997、277:815〜818頁
【非特許文献３６】Screatonら、Curr. Biol.、1997、7:693〜696頁
【非特許文献３７】Walczakら、EMBO J.、1997、16:5386〜5387頁
【非特許文献３８】Wuら、Nature Genetics、1997、17:141〜143頁
【非特許文献３９】Kimら、Bioconjugate Chem.、2011、22:1631〜1637頁
【非特許文献４０】Chaeら、Molecular Cancer Therapeutics、2010、9:1719〜1729頁
【非特許文献４１】Turら、J. Biol. Chem.、2008、283:20560〜20568頁
【非特許文献４２】van der Slootら、PNAS USA、2006、103:8634〜8639頁
【非特許文献４３】Pavetら、Cancer Research、2010、70:1101〜1110頁
【非特許文献４４】Gieffersら、Molecular Cancer Therapeutics、2013、12:27357頁
【非特許文献４５】Wahlら、Hepatology、2013、57:625〜636頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多大な努力が他のc-FLIP標的癌治療剤の開発に集中されている。しかし、c-FLIPはカスパーゼ-8と顕著な構造的類似性を有しているため、c-FLIPを直接標的とすることは非常に困難であり、その理由は、DISCへのc-FLIPの動員を遮断することができる小分子は、カスパーゼ-8の動員も同時に阻害することができ、したがってアポトーシスを阻害するからである。したがって、当分野(たとえばSafa、Exp. Oncol.、2012、34:176〜184頁を参照)において、カスパーゼ-8を阻害せずにc-FLIPを標的とする小分子を開発する必要性が存在することが理解されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、抗アポトーシスタンパク質c-FLIPの選択的阻害剤であるいくつかの小分子を提供する。本発明者らの知る限り、これらの小分子は、c-FLIPタンパク質自体と直接相互作用する、より詳細には直接結合することによってc-FLIPを選択的に阻害する、最初の非ペプチド性小分子である。以下の実施例セクションに記載のように、本発明者は、in silico方法及び国立癌研究所(NCI)データベースから入手可能な1,880個の化合物を含有するライブラリを使用することによって、これらの分子を同定した。c-FLIPの相同性3Dモデルにより、高い親和性でc-FLIPを結合する能力、及びプロカスパーゼ-8に対してc-FLIPにおける最も高い選択性をどちらも示す9個の小分子の同定が可能となった。c-FLIPを過剰発現するヒト肺癌細胞系を使用したin vitroアッセイにより、これらの9個の小分子の阻害効果及びカスパーゼ-8アポトーシスカスケードを回復させるその能力が確認された。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、以下の式のうちの1つを有する小分子:
【化１】
2019535721.tif 000002
又は生理的に許容できるその塩である、癌の処置において使用するための選択的c-FLIP阻害剤に関する。
【００１１】
具体的には、本発明は、癌の処置におけるプロアポトーシス剤としてのその使用のための、選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容できるその塩を提供する。
【００１２】
特定の好ましい実施形態では、選択的c-FLIP阻害剤は式(1)、(2)、(3)、(4)、及び(9)のうちの1つを有する。
【００１３】
特定の好ましい実施形態では、選択的c-FLIP阻害剤は式(1)、(4)、及び(9)のうちの1つを有する。
【００１４】
好ましい実施形態では、対象は癌患者である。
【００１５】
本発明の選択的c-FLIP阻害剤は、任意の癌の処置において使用し得る。しかし、特定の好ましい実施形態では、本発明の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの1つを使用して処置する癌は、c-FLIPを過剰発現する癌である。たとえば、c-FLIPを過剰発現する癌は、肺癌、結腸直腸癌、膵癌、卵巣癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、膠芽細胞腫、膀胱尿路上皮癌、子宮頸癌、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平細胞癌(HNSCC)、肝細胞癌、B細胞慢性リンパ球性白血病、胆嚢癌、ユーイング肉腫、上咽頭癌、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、神経芽細胞腫、骨髄腫、急性骨髄性白血病、骨肉腫、腎肉腫、子宮内膜癌、悪性胸膜中皮腫、カポジ肉腫(FLIPのウイルス型を発現するカポジ肉腫ヘルペスウイルスに関連)、末梢T細胞リンパ腫、及び赤白血病であり得る。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの1つを使用して処置する癌は化学耐性である。したがって、本発明は、化学耐性癌の処置において使用するための、選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容できるその塩に関する。また、本発明は、癌の化学耐性を克服するために使用する、選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容できるその塩にも関する。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの1つを使用して処置する癌は、TRAIL受容体作用剤治療に対して(又はTRAILに基づく抗癌剤に対して)耐性又は非感受性である。したがって、また、本発明は、TRAIL受容体作用剤治療に対して(又はTRAILに基づく抗癌剤に対して)耐性又は非感受性である癌の処置において使用するための、選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容できるその塩にも関する。本発明は更に、TRAIL受容体作用剤治療に対する(若しくはTRAILに基づく抗癌剤に対する)癌の耐性若しくは非感受性を克服するため、又はTRAIL受容体作用剤治療に対する(若しくはTRAILに基づく抗癌剤に対する)癌の感度を改善させるために使用する、選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容できるその塩に関する。
【００１８】
特定の実施形態では、TRAILに基づく抗癌剤はTRAIL受容体作用剤又はリガンドである。具体的には、TRAIL受容体作用剤又はリガンドはTRAIL-R1作用剤若しくはリガンド又はTRAIL-R2作用剤若しくはリガンドであり得る。
【００１９】
関連する態様では、本発明は、それを必要としている対象に、治療上有効な量の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの1つ、又は生理的に許容されるその塩、又はその医薬組成物を投与するステップを含む、対象において癌を処置する方法を提供する。上に示すように、特定の実施形態では、癌はc-FLIPを過剰発現する。特定の実施形態では、癌は化学耐性癌である。特定の実施形態では、癌はTRAIL受容体作用剤治療に対して(又はTRAILに基づく抗癌剤に対して)耐性又は非感受性である。
【００２０】
別の態様では、本発明は、癌の処置において使用する、又は癌の化学耐性を克服するために使用する、又はTRAIL受容体作用剤治療に対する(若しくはTRAILに基づく抗癌剤に対する)癌の耐性を克服するために使用する、又はTRAIL受容体作用剤治療に対する(又はTRAILに基づく抗癌剤に対する)癌の感度を改善させるための医薬組成物であって、有効量の式(1)〜(9)のうちの1つを有する少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤と、薬学的に許容されるその担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
特定の実施形態では、医薬組成物は少なくとも1つの追加の治療剤を含む。たとえば、追加の治療剤は、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、消毒剤、及びその組合せからなる群から選択され得る。
【００２２】
特定の実施形態では、追加の治療剤は、TRAILに基づく抗癌剤、好ましくはTRAIL受容体作用剤又はリガンド、より好ましくはTRAIL-R1作用剤若しくはリガンド又はTRAIL-R2作用剤若しくはリガンドである。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は、癌の処置において使用する、又は癌の化学耐性を克服するために使用するキットであって、式(1)〜(9)のうちの1つを有する少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物と、少なくとも1つの追加の治療剤とを含んでおり、前記少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤及び前記少なくとも1つの追加の治療剤が別々の容器に含まれているキットを提供する。
【００２４】
具体的には、キットは、TRAIL受容体作用剤治療に対する(若しくはTRAILに基づく抗癌剤に対する)癌の耐性を克服するために使用する、又はTRAIL受容体作用剤治療に対する(若しくはTRAILに基づく抗癌剤に対する)癌の感度を改善させるために提供してよく、前記キットは、式(1)〜(9)のうちの1つを有する少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物と、少なくとも1つのTRAILに基づく抗癌剤とを含んでおり、前記少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤及び前記少なくとも1つのTRAILに基づく抗癌剤は別々の容器に含まれている。TRAILに基づく抗癌剤は、好ましくはTRAIL受容体作用剤又はリガンド、より好ましくはTRAIL-R1作用剤若しくはリガンド又はTRAIL-R2作用剤若しくはリガンドである。
【００２５】
関連する態様では、本発明は、医薬、具体的には本明細書中に記載の抗癌治療において使用することを意図する医薬を製造するための、本明細書中に記載の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの少なくとも1つの使用に関する。
【００２６】
本発明の上述及び他の目的、利点、及び特長は、以下の好適な実施形態の詳細な説明を読むことによって当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ａ．H1703細胞系の細胞の、本明細書中に記載のTRAIL及びc-FLIP阻害剤に対する感度を示す図である。偽細胞には空のベクターで形質移入した一方で、H1703-FLIP(L)はc-FLIPタンパク質の長い形態を発現した。H1703細胞を、デスリガンドTRAILを100ng/mLで18時間使用して試験した。アポトーシスのレベルは、H1703-偽において60%を上回るレベルに達した。対照的に、c-FLIP(L)の過剰発現はTRAIL媒介性アポトーシスを阻害することが見いだされた。Ｂ．H1703細胞系の細胞の、本明細書中に記載のTRAIL及びc-FLIP阻害剤に対する感度を示す図である。偽細胞には空のベクターで形質移入した一方で、H1703-FLIP(L)はc-FLIPタンパク質の長い形態を発現した。9個の新しく同定したc-FLIP阻害剤((1)〜(9))をまず25μΜの標準濃度で試験した。対照はDMSOを単独で使用して行った。その濃度で毒性が高いと見いだされた分子は、後により低い濃度で使用した一方で、その濃度で毒性を示さないことが見いだされた分子は、後に25μΜ以上の濃度で使用した。
【図２Ａ】c-FLIP阻害剤が、デスリガンドTRAILと組み合わせた場合にH1703細胞をアポトーシス細胞死に対して感作させることを示す図である。それぞれの分子の適切な濃度を決定するために、無毒性化合物では25μΜ以上、毒性化合物では25μΜ以下の範囲の濃度を使用した。最も適切な濃度を決定した後、それぞれの化合物を単独で、又はTRAILと組み合わせて試験して、この同時投与が癌細胞においてアポトーシスを回復させることができるかどうかを決定した。分子(1)、(2)、及び(3)で得られた結果を示す。最も活性のある化合物は分子(1)、(3)、(4)、(8)、及び(9)であることが見いだされた。
【図２Ｂ】c-FLIP阻害剤が、デスリガンドTRAILと組み合わせた場合にH1703細胞をアポトーシス細胞死に対して感作させることを示す図である。それぞれの分子の適切な濃度を決定するために、無毒性化合物では25μΜ以上、毒性化合物では25μΜ以下の範囲の濃度を使用した。最も適切な濃度を決定した後、それぞれの化合物を単独で、又はTRAILと組み合わせて試験して、この同時投与が癌細胞においてアポトーシスを回復させることができるかどうかを決定した。分子(4)、(5)、及び(6)で得られた結果を示す。最も活性のある化合物は分子(1)、(3)、(4)、(8)、及び(9)であることが見いだされた。
【図２Ｃ】c-FLIP阻害剤が、デスリガンドTRAILと組み合わせた場合にH1703細胞をアポトーシス細胞死に対して感作させることを示す図である。それぞれの分子の適切な濃度を決定するために、無毒性化合物では25μΜ以上、毒性化合物では25μΜ以下の範囲の濃度を使用した。最も適切な濃度を決定した後、それぞれの化合物を単独で、又はTRAILと組み合わせて試験して、この同時投与が癌細胞においてアポトーシスを回復させることができるかどうかを決定した。分子(7)、(8)、及び(9)で得られた結果を示す。最も活性のある化合物は分子(1)、(3)、(4)、(8)、及び(9)であることが見いだされた。
【図３Ａ】c-FLIP阻害剤によるcFLIP/FADD相互作用の阻害を示す図である。プルダウンアッセイを行って、FLIP/FADD相互作用を防ぐことに対する9個のc-FLIP阻害剤の阻害活性を評価した。FLIP及びFADD分子を生成してクロマトグラフィーカラムで精製し、その後、様々な濃度のそれぞれの分子の存在下でインキュベートした。試料を後に、FADDに対するMBPカラムに通した。様々な分子の阻害活性を評価した。分子(1)、(2)、及び(3)で得られた結果を示す。
【図３Ｂ】c-FLIP阻害剤によるcFLIP/FADD相互作用の阻害を示す図である。プルダウンアッセイを行って、FLIP/FADD相互作用を防ぐことに対する9個のc-FLIP阻害剤の阻害活性を評価した。FLIP及びFADD分子を生成してクロマトグラフィーカラムで精製し、その後、様々な濃度のそれぞれの分子の存在下でインキュベートした。試料を後に、FADDに対するMBPカラムに通した。様々な分子の阻害活性を評価した。分子(4)、(5)、及び(6)で得られた結果を示す。
【図３Ｃ】c-FLIP阻害剤によるcFLIP/FADD相互作用の阻害を示す図である。プルダウンアッセイを行って、FLIP/FADD相互作用を防ぐことに対する9個のc-FLIP阻害剤の阻害活性を評価した。FLIP及びFADD分子を生成してクロマトグラフィーカラムで精製し、その後、様々な濃度のそれぞれの分子の存在下でインキュベートした。試料を後に、FADDに対するMBPカラムに通した。様々な分子の阻害活性を評価した。分子(7)、(8)、及び(9)で得られた結果を示す。
【図４Ａ】c-FLIP阻害剤(1)、(3)、(4)、及び(9)が、デスリガンドTRAILと組み合わせた場合にH1703-FLIP(L)細胞のアポトーシス経路を再活性化させることを示す図である。偽細胞(H1703)には空のベクターで形質移入した一方で、H1703-FLIP(L)細胞はc-FLIPタンパク質の長い形態を発現した。カスパーゼ-8、カスパーゼ-3、及びPARP(カスパーゼ-3基質、アポトーシス中に切断される)の切断を、H1703偽細胞において、TRAIL単独の存在下、c-FLIP阻害剤のうちの1つ単独の存在下、又はc-FLIP阻害剤のうちの1つとTRAILとの組合せの存在下で評価した。
【図４Ｂ】c-FLIP阻害剤(1)、(3)、(4)、及び(9)が、デスリガンドTRAILと組み合わせた場合にH1703-FLIP(L)細胞のアポトーシス経路を再活性化させることを示す図である。偽細胞(H1703)には空のベクターで形質移入した一方で、H1703-FLIP(L)細胞はc-FLIPタンパク質の長い形態を発現した。カスパーゼ-8、カスパーゼ-3、及びPARP(カスパーゼ-3基質、アポトーシス中に切断される)の切断を、H1703-FLIP(L)細胞において、TRAIL単独の存在下、c-FLIP阻害剤のうちの1つ単独の存在下、又はc-FLIP阻害剤のうちの1つとTRAILとの組合せの存在下で評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
明細書全体にわたって、以下の段落で定義するいくつかの用語を用いる。
【００２９】
本明細書中で使用する用語「対象」とは、癌を発生する可能性があるが、疾患を患っていても患っていなくてもよい、ヒト又は別の哺乳動物(たとえば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、等)をいう。非ヒト対象はトランスジェニック又は他の様式で改変した動物であってもよい。本発明の多くの実施形態では、対象は人間である。そのような実施形態では、対象は多くの場合「個体」又は「患者」と呼ぶ。これらの用語は特定の年齢を示さず、したがって新生児、小児、ティーンエイジャー、及び成人が包含される。より詳細には、用語「患者」とは、疾患を患っている個体をいう。したがって、用語「癌患者」とは、癌を患っている個体をいう。癌患者は、癌を診断されていても診断されていなくてもよい。また、この用語には、以前に癌の治療を受けた個体も含まれる。
【００３０】
本明細書中で使用する用語「癌」とは、調節されない細胞成長、分化の欠如、及び局所組織に浸潤して転移する能力によって典型的に特徴づけられる、哺乳動物における生理的状態をいう又は説明する。癌は任意の臓器の任意の組織で発生することができる。癌の例には、それだけには限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。より詳細には、そのような癌の例には、骨癌、肺癌、肝臓癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼球内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、生殖器又は繁殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、骨盤癌、中枢神経系(CNS)新生物、神経外胚葉性癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が含まれる。
【００３１】
用語「攻撃的」及び「侵襲性」は、本明細書中で互換性があるように使用される。癌を特徴づけるために本明細書中で使用する場合、これらは、その境界を越えて隣接組織内へと拡大する腫瘍の傾向をいう。侵襲性癌は、腫瘍が特定の臓器に限局される臓器限局癌と対比することができる。腫瘍の侵襲性特性は、多くの場合、基質物質及び基底膜物質を分解して、カプセルの限局を越えてかつ腫瘍が位置する特定の組織の限局を越えて腫瘍が拡大することを可能にする、コラゲナーゼ等のタンパク質分解酵素の生成を伴う。
【００３２】
本明細書中で使用する用語「転移」とは、腫瘍細胞が1つの臓器又は組織から別の位置へと広がることをいう。また、この用語は、転移の結果新しい位置で形成される腫瘍組織のこともいう。「転移癌」とは、その元の、すなわち原発の位置から広がる癌であり、「続発性癌」又は「続発性腫瘍」とも呼び得る。一般に、転移性腫瘍は、それが派生する原発性腫瘍の組織に由来して命名される。腫瘍転移のプロセスは、細胞間基質の局所的な侵襲及び破壊、血管、リンパ管又は他の輸送チャネル内への異物侵入、循環中での生存、続発部位での血管からの遊走、及び新しい位置での成長を含む、多段階の事象である。
【００３３】
用語「化学耐性癌」とは、化学療法耐性又は化学耐性を示す癌をいう。用語「化学療法耐性」及び「化学耐性」は、本明細書中で互換性があるように使用される。これらは、化学療法に対する癌細胞の非感受性、すなわち、化学療法剤の意図する治療的細胞毒性効果を回避する癌細胞の能力をいう。化学耐性は、内因的であることができるか、又は時間とともに、たとえば抗癌治療への反復曝露の後に発生することができる。対照的に、「化学感受性」とは、化学療法剤の細胞毒性効果に対する癌細胞の感受性をいう。化学感受性及び化学耐性の変化は、単回処置の後の化学療法の毒性効果(たとえば異なる患者におけるもの)を比較することによって、又は反復処置にわたる毒性の変化(たとえば同じ患者又は異なる患者におけるもの)を評価することによって、測定することができる。癌細胞の化学感受性の増加又は化学耐性の減少は、化学療法剤の治療上の有効性の改善を意味する。
【００３４】
用語「処置」とは、本明細書中において、(1)疾患若しくは状態の発症を遅延させる若しくは防ぐ、(2)疾患若しくは状態の少なくとも1つの症状の進行、増悪、若しくは悪化を減速させる若しくは止める、(3)疾患若しくは状態の少なくとも1つの症状の寛解をもたらす、又は(4)疾患若しくは状態を治癒させることを目的とする方法又はプロセスを特徴づけるために使用する。処置は、疾患又は状態の開始後に、治療効果のために投与し得る。或いは、処置は、疾患又は状態の発症の前に、予防的又は防止的作用のために投与し得る。この場合は用語「防止」を使用する。
【００３５】
用語「組合せ療法」とは、疾患又はその症状の処置、或いは、疾患又はその症状を処置するために有効量の2つ以上の化学薬品又は成分を投与することが含まれる、所望の生理的変化を達成する方法、或いは、化学薬品又は成分を同じ組成物の一部として一緒に投与する、又は同時に若しくは異なる時点で別々かつ独立して投与する(すなわち、それぞれの薬剤若しくは成分の投与が有限期間によって互いに隔てられている)、生理的変化を生じることをいう。また、用語「組合せ療法」とは、疾患若しくはその症状の処置、又は、化学薬品若しくは化合物と治療手段とを一緒に若しくは別々かつ独立して投与する、有効量の少なくとも1つの化学薬品若しくは化合物と少なくとも1つの治療手段(たとえば、手術、放射線療法等)とを投与することが含まれる、所望の生理的変化を達成する方法もいう。
【００３６】
本明細書中で使用する用語「投薬レジメン」とは、配合物、投与経路、薬物用量、投薬間隔、及び処置期間を含めた薬物投与のスケジュールをいう。
【００３７】
用語「アポトーシス促進性」とは、本明細書中において、分子、化合物、薬剤、又は組成物を定義又は特徴づけるために使用し、その作用機構にかかわらずアポトーシス又はプログラム細胞死を誘導する、引き起こす、促進する、又は増加させる分子、化合物、薬剤、又は組成物をいう。
【００３８】
「医薬組成物」とは、本明細書中において、有効量の本発明の少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤又は生理的に許容できるその塩と少なくとも1つの薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含むと定義される。
【００３９】
用語「生理的に許容できる塩」とは、それぞれ遊離塩基又は遊離酸の生物活性及び特性を保持しており、生物学的に又は他の様式で望ましくないわけではない、任意の酸付加塩又は塩基付加塩をいう。酸付加塩は、無機酸(たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等)、又は有機酸(たとえば、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等)を用いて形成する。塩基付加塩は、無機塩基(たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウムの塩等)、又は有機塩基(たとえば、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂を含めた置換アミン、たとえば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチル-アミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、トリメタアミン(trimethamine)、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩)を用いて形成することができる。
【００４０】
本明細書中で使用する用語「治療上有効な量」とは、その意図する目的、たとえば、細胞、組織、系、又は対象における所望の生物学的又は薬用の応答を果たすために十分である、任意の量の分子、化合物、薬剤、又は組成物をいう。
【００４１】
用語「薬学的に許容される担体又は賦形剤」とは、活性成分の生物学的活性及び/又は治療活性の有効性を妨害せず、それを投与する濃度で宿主に対して過剰な毒性がない担体媒体をいう。この用語には、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、並びに吸着遅延剤等が含まれる。薬学活性のある物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は当分野で周知である(たとえば、その全体が本明細書中に参照として組み込まれている「Remington's Pharmaceutical Sciences」、E.W. Martin、第18版、1990、Mack Publishing Co.:ペンシルバニア州Eastonを参照)。
【００４２】
数値に関して本明細書中で使用する用語「約(approximately)」及び「約(about)」には、一般に、別段に記述しない限り、又は内容から他の様式で明らかでない限り(そのような数値が可能な値の100%を超える場合以外)は、その数値の両方向に10%の範囲内にある数値(その数値よりも大きい又は小さいもの)が含まれる。
【００４３】
特定の好ましい実施形態の詳細な説明
上述のように、本発明は、抗癌剤として有用である、具体的にはc-FLIPを過剰発現する癌の処置において有用である、9個の選択的c-FLIP阻害剤を提供する。
【００４４】
I-選択的c-FLIP阻害剤
本明細書中で使用する用語「c-FLIP」とは、細胞性FLICE様阻害タンパク質又は細胞性FADD様インターロイキン-1ベータ-変換酵素阻害タンパク質と呼ばれるヒトタンパク質をいう(UniProtKB/Swiss-Prot番号:015519)。このタンパク質は、FLIP、CASH、Casper、i-FLICE、MRIT、FLAME-1、Usurpin、及びCLARPとしても知られている。これは、ヒト第2染色体の位置33.1の長い(q)アームに位置するCLFAR遺伝子によってコードされている(遺伝子ID:8837)。c-FLIPは13個の明確なスプライシングされた変異体を有しており、そのうちの3つはタンパク質として発現される:26kDaの短い形態(c-FLIPs)、c-FLIPの24kDaの形態(c-FLIPR)、及び55kDaの長い形態(c-FLIPL)(Safa、Exp. Oncol.、2012、34:176〜184頁)。
【００４５】
用語「c-FLIP阻害剤」とは、c-FLIPの抗アポトーシス活性を防ぐ、阻害する、低下させる、緩和させる、又は減少させる化合物又は薬剤をいう。用語「防ぐ」、「阻害する」、「低下させる」、「緩和させる」、及び「減少させる」は、対照と比較して使用する。当業者にはそれぞれの実験において使用する適切な対照が容易に同定されるであろう。たとえば、c-FLIP阻害剤で処置した対象又は細胞における阻害されたc-FLIP-抗アポトーシス活性を、c-FLIP阻害剤で処置していない対象又は細胞における応答と比較する。本発明の状況において、9個の選択的c-FLIP阻害剤は、c-FLIPと直接相互作用することによって、より具体的にはc-FLIPと直接結合することによって、c-FLIPの抗アポトーシス活性を阻害する。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「選択的c-FLIP阻害剤」とは、優先的な様式でc-FLIPと結合することによって(すなわち、他のタンパク質に対するよりも高い親和性でc-FLIPと結合することによって、具体的には、カスパーゼ-8に対するよりも高い親和性でc-FLIPと結合することによって)、タンパク質c-FLIPの抗アポトーシス活性を防ぐ、阻害する、低下させる、緩和させる、又は減少させるc-FLIP阻害剤をいう。結合は、酵素免疫アッセイ(たとえば酵素結合免疫アッセイ(ELISA))、免疫ブロットアッセイ等を含めた当分野で標準的な様々な方法を使用して測定することができる(Sambrookら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989又はHarlow及びLane編、Using Antibodies、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999を参照)。
【００４７】
本発明者によって同定された9個の選択的c-FLIP阻害剤は、式(1)〜(9)のうちの1つを有する小分子である。また、本発明は、これら9個の選択的c-FLIP阻害剤の任意の生理的に許容できる塩も包含する。
【００４８】
本発明による選択的c-FLIP阻害剤は、調製方法は本発明の限定要因ではないため、当分野で知られている様々な適切な方法のうちの任意のものを使用して調製し得る。或いは、本発明による選択的c-FLIP阻害剤は購入してもよい(分子(1):NCI Diversity 3、分子(2):NCI Diversity 3、分子(3):NCI diversity 3、NCI plated 2007、分子(4):NCI diversity 3、NCI plated 2007、分子(5):NCI diversity 3、NCI plated 2007、Vitas M社、eMolecules社、Molport BB社、分子(6):NCI diversity 3、NCI plated 2007、vitas M社、eMolecules社、pharmeks社、Asinex社、Molport社、分子(7):NCI diversity 3、分子(8):NCI diversity 3、eMolecules社、Molport社、life chemicals社、Mcule社Make-on-demand、分子(9):NCI diversity 3、NCI plated 2007)。
【００４９】
II-選択的c-FLIP阻害剤の治療的使用
A.適応症
本発明による選択的c-FLIP阻害剤は癌の処置において使用し得る。具体的には、本発明による選択的c-FLIP阻害剤は、癌の処置においてプロアポトーシス剤として使用し得る。本発明の処置方法は、選択的c-FLIP阻害剤(本明細書中に定義)又はその医薬組成物を使用して達成し得る。この方法は、一般に、それを必要としている対象に、有効量の本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物を投与するステップを含む。一般に、対象は癌患者である。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤及び処置方法は一次治療(主要治療とも呼ばれる)として使用する。他の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤及び方法は二次治療又は三次治療として使用する。更に他の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤及び方法は救済療法として使用する。本明細書中で使用する用語「救済療法」とは、任対象の最初の治療レジメンが失敗した後、又は対象の状態が最初の処置に応答しなかった後に、意のレジメンと共に摂取する治療剤を意味する。更に他の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤及び方法は救出治療として使用する。本明細書中で使用する用語「救出治療」とは、最初の処置の作用を相殺する、又は標準若しくは最初の処置に対する耐性を克服するために使用する治療剤をいう。他の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤及び方法はネオアジュバント治療として使用する(すなわち、たとえば主処置又は一次処置を投与する前に処置する癌の大きさ又は程度を低下させるために、主処置又は一次処置の前に対象に投与する)。更に他の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤及び方法はアジュバント治療として使用する(すなわち、対象に既に投与した、又は対象に同時投与している、又は対象に続いて投与する、1つ又は複数の他の治療剤の効果を改変するために、対象に投与する)。
【００５１】
本発明による処置方法の実施において、本明細書中に記載の選択的c-FLIP阻害剤で処置する癌は、任意の臓器の任意の組織において発生した任意の癌であり得る。したがって、癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病であり得る。癌の例には、それだけには限定されないが、骨癌、肺癌、肝臓癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼球内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、生殖器又は繁殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、骨盤癌、中枢神経系(CNS)新生物、神経外胚葉性癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が含まれる。
【００５２】
特定の好ましい実施形態では、本発明の方法を使用して処置する癌は、c-FLIPを過剰発現することが知られている。c-FLIPアイソフォームの発現の増加は、それだけには限定されないが、結腸直腸癌(Longleyら、Oncogene、2006、25:838〜848頁、Wilsonら、Cancer Res.、2007、6:5754〜5762頁)、膵癌(Haagら、Gut、2011、60:225〜237頁、Kauhら、PLoS One、2010、5:e10376頁)、卵巣癌(El-Gazzarら、Gynecol. Oncol.、2010、117:451〜459頁、Parkら、Biochem. Pharmacol.、2009、77:1328〜1336頁)、胃癌(Namら、Cancer Sci.、2003、94:1066〜1073頁)、乳癌(Dayら、Biochem. Pharmacol.、2008、76:1694〜1704頁、Tiwaryら、PLoS One、2010、5:e11865頁)、前立腺癌(Zhangら、Cancer Res.、2007、67:9425〜9434頁)、黒色腫(Yangら、Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.、2007、34、1245〜1251頁)、及び神経膠芽腫(McLornanら、Clin. Cancer Res.、2010、16:3442〜3451頁)を含めた様々な種類の癌からの細胞系において示されている。結腸直腸癌(McLornanら、Clin. Cancer Res.、2010、16:3442〜3451頁、Ullenhagら、Clin. Cancer Res.、2007、13:5070〜5075頁)、膀胱尿路上皮癌(Korkolopoulouら、Urology、2004、63:1198〜1204頁)、子宮頸癌(Wangら、Gynecol. Oncol.、2007、105:571〜577頁)、バーキットリンパ腫(Valnet-Rabierら、Br. J. Haematol.、2005、128:767〜773頁)、非ホジキンリンパ腫(Valenteら、Br. J. Haematol.、2006、132:560〜570頁)、頭頸部扁平細胞癌(HNSCC)(Liら、J. Cancer Res. Clin. Oncol.、200
8、134:609〜615頁)、肺腺癌(Salonら、Cell Death Differ.、2006、13:260〜272頁)、及び肝細胞癌(Duら、Exp. Clin. Cancer Res.、2009、28:24頁)に罹患している患者からの腫瘍組織におけるc-FLIPのレベルの上昇は、臨床成績の不良に関連づけられている。また、c-FLIPの過剰発現は胃癌においても見られており、これはリンパ節転移において重要な役割を果たしており、最終的には腫瘍の進行に寄与する(Zhouら、Clin. Sci. (Lond.)、2004、106:397〜405頁)。c-FLIPの過剰発現に関連する他の癌には、B細胞慢性リンパ球性白血病、胆嚢癌、ユーイング肉腫、上咽頭癌、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、神経芽細胞腫、骨髄腫、急性骨髄性白血病、骨肉腫、腎肉腫、子宮内膜癌、悪性胸膜中皮腫、カポジ肉腫、末梢T細胞リンパ腫、及び赤白血病が含まれる。したがって、本発明による処置方法は、c-FLIPの過剰発現に関連する任意の癌を処置するために使用し得る。
【００５３】
c-FLIP阻害剤は、特定の抗ウイルス手法において、具体的には、FLIPのウイルス型を発現するカポジ肉腫ヘルペスウイルスに関連するカポジ肉腫の処置等、FLIPのウイルス型を発現するウイルスの場合において有用であり得ることは、注目に値する。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明による処置方法は、癌患者における化学耐性を克服するため、又は、言い換えれば化学耐性癌を患っている患者を処置するために使用する。本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物を有益に投与できる病理学的状況の例には、それだけには限定されないが、非小細胞肺癌及びEGFRを標的とした治療に耐性を生じた疾患形態(ゲフィチニブ、エルロチニブ)、ソラフェニブによって処置する肝細胞癌及びそのような薬剤に耐性を生じた形態、HER2を標的とした治療に関連するHER2増幅乳癌(トラスツズマブ)及びこの薬剤に耐性を生じた形態、ホルモン療法に関連するエストロゲン受容体陽性(ER+)乳癌及び注目に値するにホルモン療法に応答しない低レベルのERを有するエストロゲン受容体陽性(ER+)乳癌の部分集団(ルミナルB)、一部のトリプルネガティブ乳癌、エストロゲン受容体を標的とした治療に耐性を生じた乳癌(フルベストラント)、PDGFRを標的とした治療に対して悲観受精又は耐性である胃腸間質腫瘍(イマチニブ)、前立腺癌におけるアンドロゲン受容体を標的とした治療に対する耐性、黒色腫及び結腸癌におけるBRAFV600Eを標的とした治療に対する耐性等が含まれる。他の例には、ER+乳癌におけるタモキシフェン耐性、頭頸部癌におけるセツキシマブ耐性、腎臓及び卵巣癌におけるトレバナニブ耐性、膠芽細胞腫におけるテモゾマイド耐性、膵癌におけるゲムシタビン耐性、卵巣癌におけるカルボプラチン耐性、神経芽細胞腫におけるビンクリスチン耐性、及び急性リンパ芽球性白血病におけるメトトレキサート耐性が含まれる。
【００５５】
本発明による処置の効果は、当分野で知られている診断的アッセイ、試験、及び手段の
うちの任意のものを使用して評価又はモニタリングし得る。
【００５６】
B.組合せ療法
特定の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、本明細書中に記載の処置方法に従って単独で投与する。他の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、少なくとも1つの追加の治療剤若しくは治療手段と組み合わせて投与する。選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、治療剤若しくは治療手段を投与する前に、治療剤若しくは手段と同時に、及び/又は治療剤若しくは手段を投与した後に投与し得る。
【００５７】
本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその組成物の投与と組み合わせて行い得る治療手段には、それだけには限定されないが、手術、放射線療法等が含まれる。
【００５８】
本発明の選択的c-FLIP阻害剤のうちの1つ又はその医薬組成物と組み合わせて投与し得る治療剤は、癌の処置において有益な効果を有することが知られている、又は一般的に患者に対して有益であることが知られている、様々な生物活性化合物から選択し得る(たとえば、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、消毒剤、及びその組合せ)。
【００５９】
本明細書中に記載の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物と組み合わせて投与し得る抗癌剤には、以下の群のうちの1つに習慣的に分類される薬物が含まれる:アルキル化剤、プリン拮抗剤、ピリミジン拮抗剤、植物アルカロイド、挿入抗生物質、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節物質、抗ホルモン、及び抗アンドロゲン。そのような抗癌剤の例には、それだけには限定されないが、BCNU、シスプラチン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、パクリタキセル、テモゾマイド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、アルトレタミン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、シタラビン、アザシチジン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタン、及びアミフォスチンが含まれる。
【００６０】
そのような抗癌剤の他の例には、それだけには限定されないが、慢性リンパ球性白血病の処置に使用されるアレムツズマブ(CAMPATH(登録商標))等の抗CD52抗体、結腸直腸癌及び乳癌の処置に使用されるベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))を含めた抗VEGF抗体、急性骨髄性白血病の処置に使用されるゲムツズマブ、オゾガマイシン(MYLOTARG(登録商標))を含めた抗CD33抗体、リンパ腫の処置に使用されるイブリツモマブ(ZEVALIN(登録商標))、ホジキンリンパ腫の処置に使用されるリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))、ホジキンリンパ腫の処置に使用されるトシツモマブ(BEXXAR(登録商標))、及び慢性リンパ球性白血病の処置に使用されるオファツムマブ(ARZERRA(登録商標))を含めた抗CD20抗体、結腸直腸癌、頭頸部癌、及び扁平細胞癌の処置に使用されるセツキシマブ(ERBITUX(登録商標))並びに結腸直腸癌の処置に使用されるパニツムマブ(VECTIBEX(登録商標))等の抗EGFR抗体、乳癌及び胃癌の処置に使用されるトラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))を含めた抗Her2抗体、黒色腫の処置に使用されるイピリムマブ(YERVOY(登録商標))を含めた抗CTLA4抗体を含めた、癌の処置に使用される治療的抗体が含まれる。
【００６１】
特定の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、癌、具体的にはTRAIL受容体リガンド又は作用剤に対して耐性又は非感受性である癌を処置するために、TRAILに基づく抗癌剤と組み合わせて投与する。実際に、本発明者は、c-FLIPタンパク質を過剰発現するヒト肺癌細胞系からの細胞をTRAIL単独で処置したことが、c-FLIPの抗アポトーシスの役割が原因で細胞死に効果がなかったことを実験で示している。しかし、TRAILと本発明の選択的c-FLIP阻害剤との組合せはTRAIL媒介性アポトーシスを増強させることが見いだされ、これは、本発明の選択的c-FLIP阻害剤が、c-FLIPが細胞死受容体と結合することを効率的に防ぎ、したがってカスパーゼ-8アポトーシスカスケードを回復させていることを裏付けている(以下の実施例セクションを参照)。
【００６２】
本明細書中で使用する用語「TRAIL」とは、サイトカインスーパーファミリーのメンバーである、Apo-2リガンド(Apo2L)としても知られる腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導性リガンドをいう。細胞死受容体4及び5(それぞれDR4及びDR5)としても知られるTRAIL-受容体1(TRAIL-R1)又はTRAIL受容体2(TRAIL-R2)を架橋結合させることによって、TRAILは、幅広い腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する一方で生きた正常細胞を残す能力を有する。この独特な特性の発見がTRAILに基づく抗癌剤の開発をもたらした。
【００６３】
用語「TRAIL-R1」、「DR4」、及び「DR4受容体」は、本明細書中で互換性があるように使用される。これらは、完全長TRAIL受容体配列、並びにPanら、Science、1997、276:111〜113頁、国際公開特許WO98/32856号、米国特許第6,342,363号、及び国際公開特許WO99/37684号に記載されている受容体の可溶性の細胞外ドメイン形態をいう。
【００６４】
用語「TRAIL-R2」、「DR5」、及び「DR5受容体」は、本明細書中で互換性があるように使用される。これらは、完全長TRAIL受容体配列、並びにSheridanら、Science、1997、277:818〜821頁、Panら、Science、1997、277:815〜818頁、米国特許第6,072,047号、米国特許第6,342,369号、国際公開特許WO98/51793号、国際公開特許WO98/41629号、Screatonら、Curr. Biol.、1997、7:693〜696頁、Walczakら、EMBO J.、1997、16:5386〜5387頁、Wuら、Nature Genetics、1997、17:141〜143頁、国際公開特許WO98/35986号、国際公開特許WO98/46643号、国際公開特許WO99/02653号、国際公開特許WO99/09165号、及び国際公開特許WO99/11791号に記載されている、受容体の可溶性の細胞外ドメイン形態をいう。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「TRAILに基づく抗癌剤」とは、TRAILの正常な活性と相互作用又はそれを妨げて治療効果を生じる任意の分子又は化合物をいう。治療効果は、様々な作用機構のうちの任意のものの結果生じ得る。TRAILに基づく抗癌剤の例には、具体的には、TRAIL受容体リガンド及びTRAIL受容体作用剤が含まれる。
【００６６】
本明細書中で使用する用語「TRAIL受容体リガンド」とは、TRAIL受容体のうちの1つに対するリガンドとして作用する(すなわち、TRAIL受容体のうちの1つと選択的に結合して複合体を形成する)、TRAIL、組換えTRAIL、TRAIL断片、及びTRAIL類似体、具体的にはTRAIL-R1(DR4)及び/又はTRAIL-R2(DR5)をいう。
【００６７】
用語「TRAIL受容体作用剤」とは、TRAIL-R1又はTRAIL-R2の1つ又は複数の生物活性を部分的又は完全に増強させる、刺激する、又は活性化する、任意の分子又は化合物、及び生物活性のあるその変異体をいう。これは、in vitro、in situ、in vivo、又はex vivoにかかわらず、これらの受容体のうちの一方又は両方とのその直接結合の結果として起こり、受容体活性化又はシグナル伝達を引き起こす。本発明の実施において、部分的又は完全に増強、刺激、又は活性化されるTRAIL-R1又はTRAIL-R2の生物活性はアポトーシスである。
【００６８】
本発明の処置方法の実施において有用なTRAIL受容体のリガンド及び作用剤は、典型的には、TRAIL断片、その変異体又は融合体等の、TRAILペプチド又は模倣体であり、コンジュゲート分子の非存在下におけるTRAIL断片、変異体、又は融合体と比較してTRAILコンジュゲートのin vivo半減期を延ばす、コンジュゲート分子と任意選択で連結していてもよい。ヒトTRAILの核酸及びアミノ酸配列は当分野で知られている。好ましくは、TRAIL断片は可溶性TRAILである。内在性の完全長TRAILには、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインが含まれる。典型的には、可溶性TRAILは、TRAIL-R1又はTRAIL-R2を介してシグナル伝達を刺激することができる、TRAILの細胞外ドメイン又はその機能的断片若しくはその変異体である。たとえば、デュラネルミン(Apo1L/TRAIL)は、TRAIL-R1及びTRAIL-R2をどちらも標的とする組換えヒトTRAILである(国際公開特許WO 2009/140469号を参照)。TRAILコンジュゲートの例は当分野で知られている(Kimら、Bioconjugate Chem.、2011、22:1631〜1637頁、Chaeら、Molecular Cancer Therapeutics、2010、9:1719〜1729頁)。たとえば野生型TRAILのDR4選択的突然変異体(Turら、J. Biol. Chem.、2008、283:20560〜20568頁)、野生型TRAILのDR5選択的突然変異体(van der Slootら、PNAS USA、2006、103:8634〜8639頁)、並びに一価、二価、及び三価TRAIL模倣ペプチド(Pavetら、Cancer Research、2010、70:1101〜1110頁)等、TRAIL類似体の例は当分野で知られている。TRAIL融合タンパク質の例は当分野で知られている(Gieffersら、Molecular Cancer Therapeutics、2013、12:27357頁、Wahlら、Hepatology、2013、57:625〜636頁)。TRAIL作用剤は、TRAIL-R1(DR4)受容体又はTRAIL-R2(DR5)受容体と結合する作用性抗体であり得る。受容体と結合してそれを活性化させ、天然のリガンドであるTRAILを模倣する作用性抗体は、「抗TRAIL受容体抗体」とも呼ばれる。TRAIL-R1(DR4)と結合する作用性抗体には、完全ヒト化モノクローナル抗体であるマパツムマブ(HGS-ETR1)が含まれる。TRAIL-R2(DR5)と結合する作用性抗体には、レキサツムマブ(HGS-RTR2)、ドロジツマブ(Apomab/PRO95780)、コナツムマブ(AMG 655)、ティガツズマブ(CS-1008/TRA-8)、HGSTR2J/KMTRS、及びLBY-135が含まれる。レキサツムマブ、ドロジツマブ、及びコナツムマブは完全ヒトIgG1抗体である一方で、ティガツズマブはヒト化IgG1抗体であり、LBY135はキメラマウス/ヒト抗体である。TRAIL受容体と結合するTRAIL受容体及び抗体は、米国特許第6,455,040号(DRS)、第6,743,625号(DR5)、第6,433,147号(DR4)、及び第6,902,910号(DR4)に記載されている。他の例には、抗TRAIL-R受容体抗体(米国特許第7,115,717号)、抗TRAIL-R4(米国特許公開第2002097033号)、抗TRAIL-R抗体(米国特許公開第20060062786号)、抗DR5マパツムマブ及びドロジツマブ(米国特許公開第2014161845号)、抗DR5レキサツムマブ及びティガツズマブ(米国特許公開第2014159562号)、並びにLBY 135コナツムマブ(米国特許公開第2013148877号)が含まれる。
【００６９】
したがって、本発明は、TRAIL受容体作用剤治療に対する癌患者の感度を改善させるための、本明細書中に記載の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの少なくとも1つの使用を提供する。本明細書中で使用する用語「TRAIL受容体作用剤治療」とは、TRAILに基づく抗癌剤(又はTRAIL受容体リガンド若しくは作用剤)を処置する対象に投与する治療(又は処置方法)をいう。また、本発明は、(1)癌患者をTRAIL受容体作用剤治療の候補として同定する、又は受容体作用剤治療を使用して処置する癌患者として同定するステップと、(2)患者に、有効量の本発明の9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの少なくとも1つと有効量の少なくとも1つのTRAIL受容体リガンド又は作用剤を投与するステップであって、9個の選択的c-FLIP阻害剤のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのTRAIL受容体リガンド又は作用剤を投与する前、その間、又はその後に投与するステップとを含む、TRAIL受容体作用剤治療に対する癌患者の感度を改善させる方法も提供する。
【００７０】
したがって、特定の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、TRAILに基づく抗癌剤と組み合わせて投与する。
【００７１】
少なくとも1つの選択的c-FLIP阻害剤を少なくとも1つの追加の治療剤と組み合わせて投与する方法では、c-FLIP阻害剤及び追加の治療剤は、同時(すなわち、一緒若しくは別々であるがほぼ同じ時点で、たとえば、互いに5分以内、15分以内、若しくは30分以内)に投与し得るか、又は、これらは順次(すなわち、別々かつ異なる時点で、たとえば、同じ日の異なる時点若しくは同じ週の異なる時点若しくは同じ月の異なる時点等)投与し得る。
【００７２】
C.投与
本発明による選択的c-FLIP阻害剤(任意選択で、1つ又は複数の適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤と配合した後)を、所望の用量で、それを必要としている対象に、任意の適切な経路によって投与することができる。錠剤、カプセル、注射用液剤、リポソーム中へのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル等を含めた様々な送達系が知られており、本発明の選択的c-FLIP阻害剤を投与するために使用することができる。投与方法には、それだけには限定されないが、真皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病巣内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺、硬膜外、眼球、及び経口の経路が含まれる。本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、任意の好都合又は他の適切な経路によって、たとえば、輸液又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚の内層(たとえば、口内、粘膜、直腸、及び腸管粘膜等)を介した吸着によって投与し得る。投与は全身性又は局所的であることができる。非経口投与は、カテーテル挿入等によって、患者の所定の組織に向けられていてもよい。当業者には理解されるように、選択的c-FLIP阻害剤と追加の治療剤と共に投与する実施形態では、c-FLIP阻害剤及び治療剤は、同じ経路(たとえば経口)によって、又は異なる経路(たとえば経口と静脈内)によって投与し得る。
【００７３】
D.用量
本発明による選択的c-FLIP阻害剤(又はその医薬組成物)の投与は、送達される量が意図する目的に有効であるような用量で行う。投与経路、投与する配合物用量は、所望する治療効果、処置する障害の重篤度、任意の感染症の存在、患者の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態、使用する選択的c-FLIP阻害剤の効力、生体利用度、及びin vivo半減期、併用治療の使用(又は不使用)、並びに他の臨床学的因子に依存する。これらの要因は、担当医によって治療の過程で容易に決定可能である。その代わりに又はそれに加えて、投与する用量は、動物モデルを使用した研究から決定することができる。これら及び他の方法に基づいて、最大の有効性を達成するために用量を調節することは当分野で周知であり、熟練の医師の能力範囲内にある。
【００７４】
本発明による処置は、単一の用量又は複数の用量から成り得る。したがって、選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物の投与は、一定期間の間一定である、又は周期的かつ特定の間隔である、たとえば、1時間に1回、日に1回、週に1回(若しくはなんらかの他の複数日数間隔)、月に1回、年に1回(たとえば徐放性形態)であり得る。或いは、送達は、所定の期間中に複数回、たとえば、週に2回以上、月に2回以上等で起こり得る。送達は、一定期間にわたる連続的な送達、たとえば静脈内送達であり得る。
【００７５】
一般に、投与する選択的c-FLIP阻害剤(又はその医薬組成物)の量は、好ましくは対象の体重1kgあたり約1ng〜約1000mg、たとえば、対象の体重1kgあたり約100ng〜約500mg、又は対象の体重1kgあたり約1μg〜約100mg、又は対象の体重1kgあたり約100μg〜約10mg、又は対象の体重1kgあたり約500μg〜約1mgの範囲となる。
【００７６】
III-医薬組成物
上述のように、本発明の選択的c-FLIP阻害剤は、それ自体で又は医薬組成物として投与し得る。したがって、本発明は、癌の処置において使用するための、有効量の選択的c-FLIP阻害剤と少なくとも1つの薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は1つ又は複数の追加の生物活性剤を更に含む。
【００７７】
本発明の選択的c-FLIP阻害剤又はその医薬組成物は、任意の量で、所望の予防的又は治療効果を達成するために有効な任意の投与経路を使用して投与し得る。最適な医薬配合は、投与経路及び所望の用量に応じて変動させることができる。そのような配合は、物理的状態、安定性、in vivo放出速度、及び投与した活性成分のin vivoクリアランス速度に影響を与え得る。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、投与の容易性及び用量の均一性のために単位剤形で配合し得る。本明細書中で使用する表現「単位剤形」とは、処置する患者のための、物理的に分離された単位をいう。しかし、組成物の合計一日用量は担当医によって正しい医学的判断の範囲内で決定されることを理解されたい。
【００７９】
A.配合物
注射用調製物、たとえば、無菌的注射用水性又は油性懸濁液は、既知の技術に従って、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して配合し得る。また、無菌的注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌的注射用液剤、懸濁液、又は乳濁液、たとえば2,3-ブタンジオール中の溶液であってもよい。用い得る許容されるビヒクル及び溶媒には、とりわけ、水、リンゲル液、米国薬局方及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。更に、無菌的な不揮発性油が溶液又は懸濁の媒体として慣習的に用いられている。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含めた、任意の無刺激の不揮発性油を用いることができる。また、オレイン酸等の脂肪酸も注射用配合物の調製に使用し得る。無菌的な液体担体は、非経口投与のための無菌的な液体形態の組成物において有用である。
【００８０】
注射用配合物は、たとえば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、使用前に滅菌水若しくは他の無菌的注射用媒体に溶かす若しくは分散させることができる、無菌的な固体組成物の形態の滅菌剤を取り込ませることによって、滅菌することができる。無菌的な溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、たとえば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下の注射によって投与することができる。注射は、1回押すことによるもの、又は徐々の輸液であり得る。必要又は所望の場合は、注射部位での痛みを和らげるために、組成物に局所麻酔剤を含め得る。
【００８１】
活性成分の効果を延長するために、多くの場合は、皮下又は筋肉内注射からの成分の吸収を遅くすることが望ましい。非経口投与した活性成分の吸収の遅延は、活性成分を油状ビヒクルに溶かす又は懸濁させることによって達成し得る。注射用デポー形態は、ポリ乳酸-ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中でマイクロカプセル封入した活性成分のマトリックスを形成することによって作製される。活性成分のポリマーに対する比及び用いる特定のポリマーの性質に応じて、成分放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(酸無水物)が含まれる。また、デポー注射用配合物は、活性成分を体組織に適合性のあるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に封入することによっても調製することができる。
【００８２】
経口投与のための液体剤形には、それだけには限定されないが、薬学的に許容される乳濁液、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁液、シロップ、エリキシル、及び加圧組成物が含まれる。選択的c-FLIP阻害剤に加えて、液体剤形は、たとえば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにその混合物等の、当分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有し得る。不活性希釈剤以外に、経口組成物には、湿潤剤、懸濁剤、保存料、甘味料、香味料、香料、増粘剤、着色料、粘度調節剤、安定化剤、又は浸透圧調節剤等のアジュバントも含めることができる。経口投与のための適切な液体担体の例には、水(潜在的に上記の添加剤、たとえばセルロース誘導体を含有するもの、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液)、アルコール(一価アルコールやグリコール等の多価アルコールが含まれる)及びその誘導体、並びに油(たとえば、精製ヤシ油及びラッカセイ油)が含まれる。加圧組成物には、液体担体はハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容される噴霧剤であることができる。
【００８３】
経口投与のための固体剤形には、たとえば、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、及び顆粒が含まれる。そのような固体剤形では、選択的c-FLIP阻害剤は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム等の少なくとも1つの不活性の薬学的に許容される賦形剤又は担体、及び以下のうちの1つ又は複数と混合してもよい:(a)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸等の充填剤又は増量剤、(b)カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシア等の結合剤、(c)グリセロール等の湿潤剤、(d)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、(e)パラフィン等の溶液緩染剤、第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、(g)セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等の湿潤剤、(h)カオリン及びベントナイトクレイ等の吸収剤、並びに(i)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びその混合物等の潤滑剤。固体配合物に適した他の賦形剤には、非イオン性及び陰イオン性表面修飾剤等の表面修飾剤が含まれる。表面修飾剤の代表的な例には、それだけには限定されないが、ポロキサマー188、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、ホスフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びトリエタノールアミンが含まれる。カプセル、錠剤、及び丸薬の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。
【００８４】
また、同様の種類の固体組成物を、ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を使用して、軟充填及び硬充填ゼラチンカプセルにおいて充填剤としても用い得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、及び医薬配合物の分野で周知の他のコーティング等のコーティング及びシェルを用いて調製することができる。これらは任意選択で乳白剤を含有していてよく、また、活性成分のみを、又は優先的には腸管の特定の部分で、任意選択で遅延された様式で放出するような組成のものであることもできる。使用することができる包埋組成物の例には、ポリマー物質及びワックスが含まれる。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明の組成物を局所的に特定の領域に投与することが望ましい場合がある。これは、たとえば、限定することを目的としないが、手術中の局所輸液、外用施用、注射、カテーテル、坐薬、或いは皮膚パッチ若しくはステント又は他の移植片によって達成し得る。
【００８６】
外用投与には、組成物は、好ましくはゲル、軟膏、ローション、又はクリームとして配合し、これには水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル、又は鉱物油等の担体を含めることができる。他の外用担体には、液体石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール(95%)、水中のポリオキシエチレンモノラウレート(5%)、又は水中のラウリル硫酸ナトリウム(5%)が含まれる。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定化剤、及び同様の薬剤等の他の物質を必要に応じて加え得る。
【００８７】
更に、特定の事例では、本発明の組成物を、皮膚上、皮膚中又は皮膚下に置いた経皮装置内に配置し得ることが予想される。そのような装置には、受動的又は能動的な放出機構のどちらかによって活性成分を放出するパッチ、移植片、及び注射が含まれる。経皮投与には、上皮及び粘膜組織を含めた、身体の表面及び身体の導管の内層を横切るすべての投与が含まれる。そのような投与は、ローション、クリーム、泡沫、パッチ、懸濁液、液剤、並びに坐薬(直腸及び経膣)中の本発明の組成物を使用して実施し得る。
【００８８】
経皮投与は、活性成分(すなわち本発明による選択的c-FLIP阻害剤)と、皮膚に無毒性であり、皮膚を介した血流内への全身性吸収のための成分の送達を可能にする担体とを含有する経皮パッチの使用によって達成し得る。担体は、クリーム及び軟膏、ペースト、ゲル、並びに密封装置等の任意数の形態をとり得る。クリーム及び軟膏は、水中油又は油中水のどちらかの種類の、粘稠の液体又は半固体の乳濁液であり得る。活性成分を含有する石油又は親水性石油中に分散させた吸収性粉末から構成されるペーストが適切であり得る。担体を用いて若しくは用いずに活性成分を含有するリザーバーを覆った半透膜、又は活性成分を含有するマトリックス等の様々な密封装置を使用して、活性成分を血流内に放出させ得る。
【００８９】
坐薬配合物は、坐薬の融点を変更するためにワックスを添加しない又は添加しないカカオ脂、及びグリセリンを含めた、従来の材料から作製し得る。また、様々な分子量のポリエチレングリコール等の水溶性坐薬基剤も使用し得る。
【００９０】
様々な配合物を生成するための材料及び方法は当分野で知られており、対象発明の実施に適応させ得る。抗体を送達するための適切な配合物は、たとえば「Remington's Pharmaceutical Sciences」、E.W. Martin、第18版、1990、Mack Publishing Co.:ペンシルバニア州Eastonに見つけることができる。
【００９１】
B.追加の生物活性剤
特定の実施形態では、本発明の選択的c-FLIP阻害剤は、本発明の医薬組成物中の唯一の活性成分である。他の実施形態では、医薬組成物は1つ又は複数の追加の生物活性剤を更に含む。適切な生物活性剤の例には、それだけには限定されないが、抗癌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、消毒剤、及びその組合せが含まれる。TRAILに基づく治療剤を含めた選択的抗癌剤の例は、上に列挙されている。
【００９２】
そのような医薬組成物では、選択的c-FLIP阻害剤及び少なくとも1つの追加の治療剤は、選択的c-FLIP阻害剤及び治療剤の同時、別々、又は順次投与のために1つ又は複数の調製物で合わせ得る。より具体的には、本発明の組成物は、選択的c-FLIP阻害剤及び治療剤を一緒に又は互いに独立して投与できるような様式で配合し得る。たとえば、選択的c-FLIP阻害剤及び治療剤を単一の組成物中で一緒に配合することができる。或いは、これらを(たとえば別々の組成物及び/又は容器中、たとえば医薬パック又はキットの形態で)維持し、別々に投与し得る。
【００９３】
C.医薬パック又はキット
別の態様では、本発明は、本発明の選択的c-FLIP阻害剤の投与を可能にする、1つ又は複数の成分を含有する1つ又は複数の容器(たとえば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ、又はボトル)を含む医薬パック又はキットを提供する。
【００９４】
医薬パック又はキットの様々な成分は、固体(たとえば凍結乾燥)又は液体の形態で供給し得る。それぞれの成分は、一般に、そのそれぞれの容器中に一定分割するか、又は濃縮形態で提供することが適切である。本発明によるパック又はキットには、凍結乾燥した成分を再構成するための媒体が含まれ得る。キットの個々の容器は、販売するために厳重管理下で維持することが好ましい。
【００９５】
特定の実施形態では、パック又はキットには、上に列挙されているもの等の、1つ又は複数の追加の治療剤が含まれる。任意選択で、医薬又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する行政機関によって規定された形態の注意書き又は添付文書を容器に付随させることができ、その注意書きは、ヒト投与のための製造、使用、又は販売における機関の承認を反映している。添付文書の注意書きは、本明細書中に開示する処置方法による医薬組成物の使用の説明を含有し得る。
【００９６】
識別子、たとえば、バーコード、高周波、IDタグ等が、キット中又は上に存在し得る。識別子は、たとえば、品質管理、在庫管理、ワークステーション間の移動の追跡等の目的のために、キットをユニークに同定するために使用することができる。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例は、本発明を作製及び実施する好ましい様式の一部を記載している。しかし、実施例は例示目的のみであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されよう。更に、実施例中の説明を過去形で提示しない限り、文章は、明細書の他の部分と同様、実験を実際に行った、又はデータを実際に得たことを示唆することを意図しない。
【００９８】
材料及び方法
細胞培養。H1703(ヒト非小細胞肺癌細胞系)細胞を、10%ウシ胎児血清及びピューロマイシン抗生物質(2μg/ml)(Sigma-Aldrich社)を添加したRPMI1640(LONZA社)培養培地中で成長させた。細胞は、37℃及び5%のCO2のインキュベーター内で加湿雰囲気下に保った。H1703細胞はO.Micheau氏(INSERM社、フランスDijon)からの贈り物であった。
【００９９】
フローサイトメトリー分析。アポトーシス細胞死をフローサイトメトリー(cytoFLEX、Backman Coulter社)によって確認した。TRAIL単独、c-FLIP阻害剤単独、又はTRAIL/c-FLIP阻害剤の同時投与で細胞を処理した後、細胞を収集し、洗浄し、IXアネキシン結合緩衝液中に再懸濁させた。アネキシン-V-PEを細胞に加え、20分間、室温、暗所で静置した。フローサイトメトリー分析を最終ステップで実施した。
【０１００】
コンピテント細菌の形質転換。FLIP及びFADD遺伝子は前もってクローニングされ、そのそれぞれのプラスミドpET24b及びpMALC2中に挿入されており、Richard Daniellou教授(ICOA、フランスOrleans)からの贈り物として提供された。Pet24b及びPmalc2プラスミドをその対応するコンピテント細菌細胞、すなわちそれぞれRosetta及びDH5α細胞と混合し、氷上に20分間静置した。熱ショックステップを行った後、LB培地を加え、37℃で1時間静置して成長させ、その後、細胞を適切な抗生物質を含むLBプレート上に拡げ、37℃で終夜インキュベートした。
【０１０１】
c-FLIP及びFADDタンパク質の生成。形質転換させたコンピテント細胞を大量のLB成長培地中、37℃で培養し、1MのIPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)を使用してそれぞれのタンパク質の発現を刺激し、細胞を静置して18時間、30℃で成長させた。細胞を収集し、遠心分離し、トリス/NaCl緩衝液(トリス  50mM、NaCl 100mM、pH8.0)に再懸濁させ、その後、これらを6000gで10分間、4℃で遠心分離した。上清を取り除き、細菌ペレットは、細胞溶解並びにそれぞれcFLIP及びFADD精製のためのNi-NTAカラム及びMBP補足カラム上でのタンパク質精製に使用した。FLIPはHisタグ付きタンパク質であり、FADDはMBPタグ付きタンパク質である。精製したタンパク質をそれぞれの分子と共に18時間、+4℃でインキュベートし、その後、試料をMBP補足カラムに再度通した。
【０１０２】
ウエスタンブロット分析。精製し、FADD/FLIP/化合物インキュベート後に得られた試料を、4〜12%のビス-トリスポリアクリルアミドゲルに流して、FLIP及びFADDのバンドの存在を評価した。
【０１０３】
試薬及び抗体。キラーTRAIL(ヒト組換えBULK)はAlexis Biochemicals社から購入した。9個の分子はNCI-DS&CB(国立癌研究所-Drug synthesis and chemistry branch、米国)から得た。ウエスタンブロッティング実験には、抗FLIP抗体(クローンDAVE 2)をADIPOGEN社から購入した。抗His抗(3D5)はInvitrogen社から購入した。抗MBP抗体はNew England Biolabs社から購入した。抗ウサギ及びマウスHRPが連結した二次抗体は、Santa Cruz Biotechnology社から購入した。アネキシンV-PEアポトーシス検出キットはBD Biosciences社から購入し、製造者の指示に従って使用した。
【０１０４】
結果
選択的c-FLIP阻害剤の同定。カスパーゼ-8及びc-FLIPの結晶学的構造は未知であるため、本発明者は、c-FLIP及びカスパーゼ-8の構築に、in silico方法を使用した「3D相同性モデル」(MOE2012、SiteFinder、GeneDoc)を用いた。これにより、c-FLIPのデスエフェクタードメイン2(DED2)がウイルスv-FLIPのDED2に相同的であり、カスパーゼ-8のDED2がFADDのDEDと相同的であることが見いだされた。
【０１０５】
その後、ドッキング方法を使用して、NIHから入手可能な1880個の分子のライブラリのうちから、カスパーゼ-8に対してc-FLIPと選択的に結合することができる分子を同定した。化学式(1)〜(9)を有する9個の分子がこのプロセスによって同定された。
【０１０６】
同定された9個の分子のin vitro特性の評価。同定された9個の分子の特性を評価するために、本発明者らは、c-FLIPを過剰発現するヒト肺癌細胞系H1703からの細胞を使用した。
【０１０７】
TRAILに対するH1703細胞の感度:最初の目標は、H1703細胞がTRAILに感受性であることを検証することであった。これを行うために、細胞を100ng/mLの濃度のTRAILで18時間処理し、その後、細胞を洗浄し、アネキシンV-PEと共にインキュベートして、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスレベルを評価した。予想どおり、H1703-偽細胞(c-FLIP(L)を欠く)はTRAILに感受性であり、アポトーシスは60%を超えるレベルに達した。対照的に、H1703-FLIP(L)細胞は、抗アポトーシスFLIPタンパク質の発現が原因でTRAILに耐性があることが見いだされた。図1(A)に示す得られた結果は、H1703細胞系の細胞がTRAIL感受性であることを明白に示している。その後、H1703細胞を25μΜの標準濃度のそれぞれの分子単独で処理して、分子細胞毒性を評価した(図1(B)を参照)。一部の分子は25μΜで細胞毒性があることが見いだされた一方で、他のものは細胞毒性を示さなかった。したがって、本発明者らは、それぞれの分子について一定範囲の濃度を適用して、単独で投与した場合に細胞に対して毒性効果を有さない適切な用量を決定した。
【０１０８】
TRAILと9個の同定した分子のうちのそれぞれとの組合せ処置:それぞれの化合物の最良濃度を同定した後、H1703細胞を、TRAIL(100ng/mL)単独又は9個の同定した分子のうちの1つ単独又はTRAILと9個の同定した分子のうちの1つとの組合せで、18時間処理した。アポトーシスの百分率は、上述のアネキシンV試験を使用したフローサイトメトリーによって測定した。得られた結果を図2(A、B、及びC)に示す。これらは、デスリガンドTRAILは、抗アポトーシスタンパク質c-FLIPを過剰発現する細胞に効果を与えなかった一方で、任意の9個の同定した分子のうちの1つでc-FLIP機能を遮断することによりTRAIL誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の感度が増加したことを示している。
【０１０９】
プルダウンアッセイ:その後、FADDとc-FLIPとの間の相互作用を阻害する9個の同定した分子の能力を、プルダウンアッセイを使用して調査した。in vitro試験を使用して9個のc-FLIP阻害剤の阻害性の役割を評価した後、本発明者らは、生化学的試験及び分子試験を使用して、これらの分子が実際にFADDとc-FLIPとの間の相互作用を阻害できることを実証することで、結果を確認することとした。この目的を達成するために、本発明者らはc-FLIP(c-FLIPはその精製が非常に効率的であるので精製が必要ないため)及びFADDを細菌中で産生させ、その後、適切なカラム(上述)を使用してこれらのタンパク質を精製した。精製した後、c-FLIP及びFADDを、様々な濃度の9個のc-FLIP阻害剤のうちのそれぞれと共に18時間インキュベートした。その後、FADD(MBPタグ付きタンパク質)を結合するMBP補足カラムに試料を通した。cFLIPがFADDと結合したままであった場合は、MBPカラム上のFADDで捕捉した。その後、ウエスタンブロット分析を使用して、c-FLIP阻害剤の濃度の増加に伴ったc-FLIPバンドの消失をモニタリングすることによって試料を評価した。得られた結果を図3(A、B、及びC)に示す。ウエスタンブロットにおけるc-FLIPバンドの消失はFADD-c-FLIP相互作用の阻害に対応している。得られた結果は、式(1)、(2)、(3)、(4)、(7)、及び(9)を有するc-FLIP阻害剤はFADDとc-FLIPとの間の相互作用を阻害することを示す一方で、式(6)及び(8)を有する分子では、高濃度においてさえもc-FLIPに対応するバンドが常に存在していたため効果を有さないことが見いだされた。これらのin vitro及び分子実験の結果は、本発明の9個の分子の大多数が実際にc-FLIP阻害剤であることを裏付けている。
【０１１０】
TRAILと組み合わせたc-FLIP阻害剤によるアポトーシス経路の再活性化:カスパーゼの切断はアポトーシス経路の開始のマーカーである。したがって、本発明者らは、H1703-偽細胞及びH1703-FLIP(L)細胞において、TRAIL単独の存在下、c-FLIP阻害剤(分子(1)、(3)、(4)、及び(9))の存在下、並びにTRAILとc-FLIP阻害剤のうちの1つとの組合せの存在下で、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3、及びPARP(アポトーシス中に切断を受けるカスパーゼ-3基質)の切断を調査した。得られた結果を図4(A)〜図4(B)に示す。これらは、H1703-偽細胞は、TRAIL単独又はc-FLIP阻害剤のうちの1つと組み合わせたTRAILで処理した場合に、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3、及びPARPの切断を示すことを明白に示している。しかし、H1703-偽細胞をc-FLIP阻害剤単独で処理した場合には切断は観察されなかった。H1703細胞(FLIPを過剰発現する)は、切断が観察されずTRAILに耐性があることが観察され、c-FLIP阻害剤のうちの1つで処理した場合も同様であった。対照的に、TRAILとc-FLIP阻害剤のうちの1つとの組合せを用いたH1703細胞の処理は、カスパーゼ-8、カスパーゼ-3、及びPARPの切断を誘導することが観察された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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