(57)【要約】  試料の超解像撮像のための装置であって、前方視野（３０）内の試料（２）から発出する光を集光する対物レンズ（４）と、集光した光によって試料の超解像撮像を実行する処理構成（２０）と、（ｉ）視野の外側からの入力光を受光し、（ｉｉ）励起光を試料に向けるために導波路部品内の内部全反射を用いるように構成された導波路部品（１）と、入力光に、第１の時間に、導波路部品内の第１の光学モードに対応する第１の光経路を辿らせ、第１の時間とは異なる第２の時間に、導波路部品内の第１の光学モードとは異なる第２の光学モードに対応する第２の光経路を辿らせる電子光経路制御システム（４０）とを備える。
2019516140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の超解像撮像のための装置であって、
前方視野を有し、前記前方視野内の前記試料から発出する光を集光するように構成された対物レンズと、
前記集光した光によって前記試料の超解像撮像を実行するように構成された処理構成と、
前記対物レンズの前方に位置する導波路部品であって、（ｉ）前記視野の外側からの入力光を受光し、（ｉｉ）前記試料に励起光を向けるために前記導波路部品内の内部全反射を用いるように構成された導波路部品と、
前記入力光に、
第１の時間に、前記導波路部品内の第１の光学モードに対応する第１の光経路を辿らせ、
前記第１の時間とは異なる第２の時間に、前記導波路部品内の前記第１の光学モードとは異なる第２の光学モードに対応する第２の光経路を辿らせるように構成された電子光経路制御システムと
を備える装置。
【請求項２】
前記第１の時間および前記第２の時間は、前記超解像画像の第１のフレームに関する露光期間内である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光経路制御システムは、前記入力光に、前記第１のフレーム内で複数回、前記第１と第２の光経路間を循環させるように構成される、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の時間は、前記超解像画像の第１のフレームに関する露光期間内であり、前記第２の時間は、前記第１の時間とは異なる前記超解像画像の第２のフレームに関する露光期間内である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記電子光経路制御システムは、前記入力光に、異なるそれぞれの時間に２つ以上の光経路を辿らせるように構成され、各光経路は、前記導波路部品内の異なるそれぞれの光学モードに対応する、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記導波路部品に入力光を注入するように構成された光注入デバイスを更に備え、前記光経路制御システムは、前記第１の時間と前記第２の時間との間で前記入力光が前記導波路部品に入る位置または角度を変更するために、前記導波路部品に対して前記光注入デバイスを動かすように構成されたアクチュエータを備える、請求項１〜５のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
前記アクチュエータは振動圧電ステージを備える、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記光経路制御システムは、前記第１の時間に第１の値を有し、前記第２の時間に前記第１の値とは異なる第２の値を有するように、前記入力光の偏光、位相、または波長の１または複数を変更するための構成を備える、請求項１〜７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記光経路制御システムは、前記第１の時間に第１の値を有し、前記第２の時間に前記第１の値とは異なる第２の値を有するように前記導波路部品内の温度を変更することによって、前記導波路部品内の屈折率を変更するように構成された温度変更素子を備える、請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記処理構成は、０．５ミリ秒〜３０秒の持続期間を有する露光期間にわたって集光された光を用いて１フレームを生成するように構成される、請求項１〜９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
前記集光された光における少なくとも１つの波長に関して、前記超解像撮像は、前記波長における前記対物レンズの解像度よりも細かい撮像解像度を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記集光された光は、前記試料によって放出された蛍光を備え、前記超解像撮像は蛍光顕微鏡法である、請求項１〜１１のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
前記超解像撮像は、単一分子局在化法を備える、請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記超解像撮像は、変動光場ベースの超解像法を備える、請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１５】
前記超解像撮像は、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、直接確率的光学再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）、光活性化局在顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、超解像光変動撮像（ＳＯＦＩ）、およびエントロピーベース超解像撮像（ＥＳＩ）から成るグループから選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
前記導波路部品は、少なくとも部分的に前記対物レンズの前記視野内にある出力面から前記励起光を出力するように構成される、請求項１〜１５のいずれかに記載の装置。
【請求項１７】
前記導波路部品は、光経路に沿って前記入力光を前記試料の方へ導くように構成され、前記光経路は、前記試料に向かう方向に拡大する幅を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の装置。
【請求項１８】
前記幅は断熱的に拡大する、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記導波路部品は、エバネッセント場から成る励起光のみを前記試料に向けるように構成される、請求項１〜１８のいずれかに記載の装置。
【請求項２０】
前記導波路部品は、第１のコア領域および前記第１のコア領域と接する第１のクラッド領域を備え、前記第１のコア領域は前記第１のクラッド領域よりも高い屈折率を有し、１または複数の光経路に沿って前記導波路部品を通るように光を導くように構成され、前記第１のクラッド領域は、前記試料を保持するための試料ウェルを画定するように形作られる、請求項１〜１９のいずれかに記載の装置。
【請求項２１】
前記導波路部品は、前記導波路部品の端面から前記励起光を出力するように構成される、請求項１〜１８のいずれかに記載の装置。
【請求項２２】
前記励起光を集中させるように構成された回析格子を備える、請求項１〜１８および請求項２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
前記導波路部品は、前記励起光を集中させるためのレンズを形成するように少なくとも１次元において先細りである光経路に沿って前記入力光を前記試料に向かって導くように構成される、請求項１〜１８および請求項２１、２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
前記レンズはアキシコンレンズである、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記導波路部品は、
第１のコア領域および前記第１のコア領域と接する第１のクラッド領域であって、前記第１のコア領域は前記第１のクラッド領域よりも高い屈折率を有し、前記導波路部品を通る第１のコア光経路を画定するように構成された、第１のコア領域および第１のクラッド領域と、
第２のコア領域および前記第２のコア領域と接する第２のクラッド領域であって、前記第２のコア領域は前記第２のクラッド領域よりも高い屈折率を有し、前記導波路部品を通る第２のコア光経路を画定するように構成された、第２のコア領域および第２のクラッド領域と
を備え、前記第１のコア領域は、前記試料の第１の領域に励起光を向けるように構成され、前記第２のコア領域は、前記第１の領域とは異なる前記試料の第２の領域に励起光を向けるように構成される、請求項２１〜２４のいずれかに記載の装置。
【請求項２６】
前記導波路部品は、基板上にモノリシックに一体化された導波路構造を備える、請求項１〜２５のいずれかに記載の装置。
【請求項２７】
対物レンズの前方視野内に少なくとも部分的に位置する試料の超解像撮像を実行するための方法であって、
前記視野の外側から前記対物レンズの前方に位置する導波路部品内への入力光を受光することと、
第１の時間に、前記導波路部品内の第１の光学モードに対応する第１の光経路を辿るように入力光を向けることと、
前記第１の時間とは異なる第２の時間に、前記導波路部品内の前記第１の光学モードとは異なる第２の光学モードに対応する第２の光経路を辿るように前記入力光を向けることと、
前記試料に励起光を向けるために前記導波路部品内の内部全反射を用いることと、
前記対物レンズによって前記試料からの光を集光することと、
前記集光した光によって超解像画像を生成することと
を備える方法。
【請求項２８】
前記第１の時間および前記第２の時間は、前記超解像画像の第１のフレームに関する露光期間内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のフレーム内で前記第１と第２の光経路間を循環することを更に備える、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の時間は、前記超解像画像の第１のフレームに関する露光期間内であり、前記第２の時間は、前記第１のフレームとは異なる前記超解像画像の第２のフレームに関する露光期間内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
異なるそれぞれの時間に２つ以上の光経路を辿るように入力光を向けることを更に備え、各光経路は、前記導波路部品内の異なるそれぞれの光学モードに対応する、請求項２７〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の時間に第１の位置または第１の角度で前記導波路部品に光を注入することと、前記第２の時間に、前記第１の位置または第１の角度とは異なる第２の位置または第２の角度で前記導波路部品に光を注入することとを更に備える、請求項２７〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の時間に第１の波長、位相、または偏光で前記導波路部品に光を注入することと、前記第２の時間に、前記第１の波長、位相、または偏光とは異なる第２の波長、位相、または偏光で前記導波路部品に光を注入することを更に備える、請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の時間と前記第２の時間とで前記導波路部品の温度を変更することによって前記導波路部品内の屈折率を変更することを更に備える、請求項２７〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
０．５ミリ秒〜３０秒の持続期間を有する露光期間にわたって集光された光を用いて前記超解像画像を生成するための１フレームを生成することを備える、請求項２７〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記集光された光における少なくとも１つの波長に関して、前記超解像画像は、前記波長における前記対物レンズの解像度よりも細かい解像度を有する、請求項２７〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
蛍光顕微鏡法を用いて前記超解像画像を生成することを備える、請求項２７〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
単一分子局在化法を用いて前記超解像画像を生成することを備える、請求項２７〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
変動光場ベースの超解像法を用いて前記超解像画像を生成することを備える、請求項２７〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）を用いて、直接確率的光学再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）を用いて、光活性化局在顕微鏡法（ＰＡＬＭ）を用いて、超解像光変動撮像（ＳＯＦＩ）を用いて、またはエントロピーベース超解像撮像（ＥＳＩ）を用いて前記超解像画像を生成することを備える、請求項２７〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記導波路部品からの励起光を前記試料に向けることは、前記導波路部品の出力面から前記試料に励起光を向けることを備え、前記出力面は、少なくとも部分的に前記対物レンズの前記視野内にある、請求項２７〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記試料に向かう方向に拡大する幅を有する光経路に沿って前記入力光を前記試料の方へ導くことを更に備える、請求項２７〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記幅は断熱的に拡大する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記導波路部品からの励起光を前記試料に向けることは、エバネッセント場から成る励起光のみを前記試料に向けることを備える、請求項２７〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記導波路部品内に画定された試料ウェル内に試料を保持することを更に備える、請求項２７〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記導波路部品からの励起光を前記試料に向けることは、前記導波路部品の端面から前記試料に励起光を向けることを備える、請求項２７〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記導波路部品からの励起光を前記試料に集中させることを更に備える、請求項２７〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記試料の第１の領域に励起光を向けることと、前記試料の第２の領域に励起光を向けることとを更に備え、前記第２の領域は、励起光が向けられない分離領域によって前記第１の領域から分離される、請求項２７〜４７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の超解像撮像を実行するための装置および方法に関する。限定ではないが具体的には、本発明は、試料の直接確率的光学再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）撮像を実行するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡は、組織学、細胞生物学、およびその関連分野において、たとえば細胞などの生体試料を観察するために用いられる。しかし、光学顕微鏡の解像力は、光の回析限界によって制限される。この制限により、可視光顕微鏡の解像度は約２００〜３００ｎｍに限られる。この制限を克服するために、当該技術において、「ナノスコピー」、「超解像撮像」、または「超解像顕微鏡法」と称されるいくつかの技術が開発されてきた。
【０００３】
これらの超解像撮像技術は、約２０〜５０ｎｍに至る解像度による生体試料の撮像を可能にする。これらは、生体試料に添付され、または埋め込まれた、光切替え蛍光体または量子ドットマーカから放出された光を処理することに基づく。そのような超解像技術の既知の例は、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、直接確率的光学再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）、光活性化局在顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、超解像光変動撮像（ＳＯＦＩ）、およびエントロピーベース超解像撮像（ＥＳＩ）を含む。
【０００４】
図１は、たとえばｄＳＴＯＲＭ撮像などの超解像撮像のための典型的な従来技術構成を示す。この構成は、第１のレーザ光源１４０、第２の光源１４５、第１のビームスプリッタ１６０、第２のビームスプリッタ１５０、関連波長において約２５０ｎｍの解像度を有する対物レンズ１１０（たとえばｈｉｇｈ−ＮＡ  ６０ｘ対物レンズ）、試料１７０、およびＣＣＤまたはｓＣＭＯＳ検出器１９０を備える。この構成は、第１のレーザ光源１４０からの光を第１のビームスプリッタ１６０へ向け、第２のレーザ光源１４５からの光を第１のビームスプリッタ１６０へ向けるための手段も含む。第１のビームスプリッタ１６０は、第１および第２のレーザ光源１４０、１４５から受光したレーザ光を結合して励起光１３０を形成し、励起光１３０を第２のビームスプリッタ１５０へ向ける。第２のビームスプリッタ１５０は、励起光１３０を対物レンズ１１０に向ける。
【０００５】
試料における特定の関心領域を撮像するために、励起光は、その領域内の蛍光体を励起するように試料１７０の関心領域に向けられる。ｄＳＴＯＲＭを実行する場合、当業者には既知であるように、２つの異なる波長が用いられ得る。試料領域内の蛍光体が発光すると、その光は、関心領域の画像を生成するために集光され処理される。これは、励起光１３０が関心領域に向けられ、関心領域から発出する光が集光され得るように、試料１７０における関心領域に対物レンズ１１０の焦点を合わせることによって実現される。第２のビームスプリッタ１５０は、励起光１７０から集光した光１２０を濾過し、集光した光１２０をＣＣＤ検出器１９０に向けるように機能する。当然、更なる濾過が実行されてもよい。コンピュータ（不図示）は、ＣＣＤ検出器１９０からデータを受信し、ガウシアンフィット（または他の既知の方法）によって蛍光体の位置を決定するために、対物レンズの２５０ｎｍの解像度を超える精度までデータを処理する。
【０００６】
現在超解像撮像のために一般的に用いられる装置に関する問題は、装置が高価かつ大きく、設置および操作が不便であり得ることである。
【０００７】
超解像撮像構成は一般に、エバネッセント場（全内部反射蛍光発光）または高傾斜光学積層シート（ＨＩＬＯ）のいずれかによって試料を照明するために高開口率（ＮＡ）の対物レンズを用いる。
【０００８】
しかし、高開口率（ＮＡ）のレンズは高価である。またこれらは、蛍光が試料から集光され得る場を制限する限られた視野（ＦＯＶ）を有する。この限られた視野は、一般的な生体試料、たとえば大きな細胞培養物および群体または組織のサイズよりも小さい、約５０〜２５０ｎｍのサイズである。これは、生体試料全体の全体副解像画像を取得するために、撮像中、試料に対して顕微鏡を再配置および再調整する必要があることを意味する。これは特に、生細胞培養物を撮像する際、細胞培養物の第２の部分が視野外にある場合、細胞培養物の第１の部分および細胞培養物の第２の部分に関する動きを同時に撮像することが不可能であるため、問題である。また、取得した副解像画像をつなぎ合わせ、生体試料全体の全体副解像画像を形成するためには、複雑な画像処理が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、これらの欠点に様々に対処する超解像撮像を実行するための装置および方法を提供することである。
【００１０】
第１の態様によると、本発明は、試料の超解像撮像のための装置を提供し、装置は、
前方視野を有し、前方視野内の試料から発出する光を集光するように構成された対物レンズと、
集光した光によって試料の超解像撮像を実行するように構成された処理構成と、
対物レンズの前方に位置し、（ｉ）視野の外側からの入力光を受光し、（ｉｉ）励起光を試料に向けるために導波路内の内部全反射を用いるように構成された導波路部品と
を備える。
【００１１】
第２の態様によると、本発明は、対物レンズの前方視野内に少なくとも部分的に位置する試料の超解像撮像を実行するための方法を提供し、方法は、
視野の外側から対物レンズの前方に位置する導波路部品内への入力光を受光することと、
励起光を試料に向けるために導波路部品内の内部全反射を用いることと、
対物レンズによって試料からの光を集光することと、
集光した光によって超解像撮像を実行することと
を備える。
【００１２】
このように、当業者には分かるように、本発明によると、光は対物レンズによって供給されるのではなく、（内部全反射によって光を導く）導波路部品によって試料へ供給される。したがって対物レンズは、励起光を試料に供給し、かつ試料から放出された光を集光するために同じ対物レンズを必要とするのではなく、試料からの光を集光するために最適化され得る。
【００１３】
超解像撮像用の試料を励起するために導波路を用いることは、超解像撮像において一般的に用いられるものよりも低い開口率の撮像対物レンズの使用が可能であり、試料のより広い視野および低い設備費をもたらすことを含む、数々の驚くべき利点を提供する。また、導波路部品は、たとえばビームスプリッタなど追加の部品を必要とせず試料に励起光を直接供給することができるので、従来の超解像機構に伴うアライメントの複雑性の大部分が回避される。
【００１４】
導波路部品は好適には、好適には対物レンズの視野の外側に位置する、たとえばレーザなどの光源から入力光を受光する。導波路部品は、空気、またはたとえば導波路部品に結合された光ファイバケーブルなど他の何らかの媒体を介して入力光を受光してよい。入力光の波長は、たとえば複数の様々な波長間での時間的多重化によって、経時的に変化してよい。入力光は好適には対物レンズを通過しない。また励起光も好適には対物レンズを通過しない。対物レンズは好適には、０．４よりも大きく、かつ好適には１．４９未満の開口率を有する。
【００１５】
対物レンズは好適には、導波路を介した光経路の方向と非平行な光軸を有する。いくつかの実施形態において、対物レンズの光軸は、導波路を介した光経路の方向または導波路の平面層に対してほぼ垂直である。
【００１６】
任意の適切な超解像撮像技術が実行され得る。超解像撮像は好適には、集光された光における少なくとも１つの波長に関して、その波長における対物レンズの解像度よりも撮像解像度が細かくなるものである。対物レンズの解像度は当然、レンズの回析限界によって制限される。集光された光は好適には、試料によって放出された蛍光を備え、超解像撮像は好適には蛍光顕微鏡法である。超解像撮像は、単一分子局在化法、または変動光場ベース超解像技術を備えてよい。超解像撮像は、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、直接確率的光学再構築顕微鏡法（ｄＳＴＯＲＭ）、光活性化局在顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、超解像光変動撮像（ＳＯＦＩ）、およびエントロピーベース超解像撮像（ＥＳＩ）から成るグループから選択され得る。好適な実施形態のセットは、ｄＳＴＯＲＭを用いる。
【００１７】
導波路部品は、任意の適切な形式であってよい。いくつかの実施形態において、導波路部品は、１または複数の平面層を備える。導波路部品は、スラブ導波路構造、リブ導波路構造、ストリップ導波路構造、またはマルチコア励起導波路構造を備えてよい。好適な実施形態のセットにおいて、導波路は、平面基板であってよい基板上にモノリシックに一体化された導波路構造を備える。基板はシリコンであってよい。基板は好適には、たとえば１６０〜１７０マイクロメートルなど、２００マイクロメートル未満の最大厚さを有する。いくつかの実施形態において、基板は、基板を通して試料からの光を集光することが可能であるために透明であってよい。
【００１８】
導波路部品は好適には、少なくとも部分的に対物レンズの視野内にある出力面から励起光を出力するように構成される。出力面は好適には平面である。出力面は、（たとえばエバネッセント場として励起光を試料に向ける場合）導波路部品内で光が辿る経路の方向に平行であってよく、あるいは、（たとえばビームまたはシートとして出力面から試料に励起光を向ける場合）導波路部品内で光が辿る経路の方向に対し傾斜して（好適には垂直であって）よい。
【００１９】
導波路部品は、少なくとも１次元において試料に向かう方向に拡大する幅を有する光経路に沿って入力光を試料の方へ導くように構成され得る。これは、エバネッセント場によって間接的にまたは直接的に、試料のより大きな面積を励起光で照明するために役立ち得る。この幅は好適には、（特定の超解像撮像技術のために有用であり得る）導波路の単一モード条件が維持され得るように、断熱的に拡大する。
【００２０】
実施形態の１セットにおいて、導波路部品は、エバネッセント場から成る励起光のみを試料に向けるように構成される。試料は好適には、導波路部品と接する。導波路部品は、第１のコア領域および第１のコア領域と接する第１のクラッド領域を備えてよく、第１のコア領域は、第１のクラッド領域よりも高い屈折率を有し、導波路を通る第１のコア光経路を画定するように構成され、第１のクラッド領域は、試料を保持するための試料ウェルを画定するように形作られる。
【００２１】
試料ウェルは、１または複数の壁、具体的には４つの平面側壁を備えてよい。試料ウェルは、たとえばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、またはＰＬＬ（ポリエルリジン）分子を備える生体適合層でコーティングされ得る。
【００２２】
他の実施形態のセットにおいて、導波路部品は、導波路部品の端面から励起光を出力するように構成される。試料は端面と接してよく、または端面と試料との間に、たとえばエアギャップおよび／またはセルバッファ溶液（たとえばリン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）などの媒体があってよい。ここでも導波路部品は、試料を保持するための試料ウェルを画定してよい。この試料ウェルは、１または複数の側壁を備えてよい。これらの側壁の少なくとも１つは、少なくとも１つの導波層を備えてよい。端面は、試料ウェルの１つの側壁の少なくとも一部を形成してよい。したがって、受容された試料は、好適には対物レンズの光軸に垂直である横方向に照明され得る。端面は、たとえばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、またはＰＬＬ（ポリエルリジン）分子を備える生体適合層でコーティングされ得る。
【００２３】
そのような構成は、たとえば試料内の１マイクロメートルよりも深くで、試料の表面領域を越えて蛍光体が励起されることを有利に可能にする。
【００２４】
またそのような構成は、所与のレーザ光に関して、励起パワーが比較的低い、一般的には総入力光パワーの約１０％未満である既知のエバネッセント場ベースの照明技術と比べて、蛍光体が比較的高パワーで効率的に励起されることも可能にする。
【００２５】
端面からの励起光は、好適には光シートの形状である。光シートは好適には、対物レンズの前方視野の主方向に対し好適には垂直である横平面において試料と交差する。光シートを好適に生成することによって、試料の断面全体が照明され得る。また光は、対物レンズの光軸に対し平行を超えた横平面において発散するビームとして、あるいは均一な発散を有するビームとして形成されてもよい。
【００２６】
端面から発出する光ビームまたは光シートの厚さは、好適には５００、１０００、または２０００ナノメートル未満である。これを可能にするために、導波層は、透明材料の光透過薄膜として設けられ得る。この薄膜は、１マイクロメートル未満の厚さを有してよい。
【００２７】
端面は、試料を載置可能な表面エリアの側方に位置してよい。
【００２８】
端面からの励起光の発散は、少なくとも対物レンズの光軸に平行な平面において制御され得る。好適には、少なくともこの平面において、発散は、好適には平面である端面の形状および断面による自然発散よりも小さくなるように制御される。そのような制御は、端面自体によって、または端面に近接した導波層エリアによってもたらされ得る。
【００２９】
またビームは、好適には光軸上にある試料内の焦点または線焦点に向かって収束してよい。光軸の方向に平行な平面における収束および光軸を横断する発散は、同時に確立され得る。
【００３０】
導波路部品は、励起光を集中させるように構成されたレンチキュラレンズ、静的回析格子、または音響回析格子を備えてよい。これによって、試料のどの部分が励起されるかをより詳細に制御することができる。同じ理由により、導波路部品は、励起光を集中させるためのレンズを形成するように少なくとも１次元において先細りである光経路に沿って入力光を試料の方へ導くように構成され得る。レンズはアキシコンレンズであってよい。アキシコンレンズは、中央コアが薄く特定の距離に関して非回析性であるプセウドベッセルビームを生成するために用いられ得る。先細りは回転対称、たとえば円錐状であってよいが、好適にはウエッジ形またはピラミッド形であり、そのような形状はたとえばリソグラフィを用いて製造することが容易であり得るためである。レンズは好適には、出力面に位置する。
【００３１】
既知の超解像技術に伴う欠点は、試料の１つの小領域しか励起され、撮像されることができない点である。本発明の実施形態における導波路部品は、
第１のコア領域および第１のコア領域と接する第１のクラッド領域であって、第１のコア領域が第１のクラッド領域よりも高い屈折率を有し、導波路部品を通る第１のコア光経路を画定するように構成された、第１のコア領域および第１のクラッド領域と、
第２のコア領域および第２のコア領域と接する第２のクラッド領域であって、第１のコア領域が第２のクラッド領域よりも高い屈折率を有し、導波路部品を通る第２のコア光経路を画定するように構成された、第２のコア領域および第２のクラッド領域と
を備えてよく、第１のコア領域は、試料の第１の領域に励起光を向けるように構成され、第２のコア領域は、試料の第１の領域とは異なる第２の領域に励起光を向けるように構成される。
【００３２】
このように、それぞれの領域における蛍光体を選択的に励起することによって、試料は、複数の領域（たとえば試料を通る平行スライス）において撮像され得る。導波路部品は当然、３つ、４つ、またはそれより多くの異なる試料領域に光を向けることができるように更に多くのコアおよびクラッド領域を備えてよい。したがって、処理構成が、試料の３次元（３Ｄ）モデルを生成することが可能になり得る。
【００３３】
導波路部品は、試料を保持するためのウェルまたは他の保持構成を備えてよい。
【００３４】
装置は、第１の時間に、入力光に導波路部品内の第１の光経路を辿らせ、第１の時間とは異なる第２の時間に、第１の光経路とは異なる導波路部品内の第２の光経路を辿らせるように構成された電子光経路制御システムを備えてよい。好適には、入力光は、第２の時間に第１の光経路を辿ることはない。好適には、入力光は、第１の時間に第２の光経路を辿ることはない。マルチコア実施形態において、これらの第１および第２の光経路は、それぞれ第１のコア光経路および第２のコア光経路に対応してよく、あるいは、これらは単一コア内の異なる経路であってもよい。第１の時間および第２の時間は、（たとえばＳＴＯＲＭまたはｄＳＴＯＲＭなどの単一分子局在化技術を用いる場合）いずれも単一フレーム露光期間内、すなわち、単一フレームに関する露光時間内であってよい。あるいは、（たとえばＥＳＩまたはＳＯＦＩなどの変動光場ベースの技術を用いる場合）第１の時間は第１のフレームに関する露光期間内であってよく、第２の時間は、第１のフレームとは異なる第２のフレームに関する露光期間内であってよい。これは、第１および第２の光経路が導波路部品内の異なるそれぞれの光学モードに対応し得るため、エバネッセント場によって試料を励起するように構成された実施形態において特に有利であることが分かっている。したがってエバネッセント場のパターンは、光学モード間で異なる。１つの単一フレーム露光期間内で複数のそのようなパターンを生成することによって、全体を通して１つのモードのみを用いることに比べ、単一分子局在化技術を用いる場合に露光期間にわたって試料のより均一な平均励起が実現され得る。単一フレーム露光期間にわたって試料が均一に励起されなかった場合、その結果生じる超解像画像は、重要な細部が欠損し、またはストライプパターンなどのアーチファクトを含むことがある。あるいは、異なるそれぞれのフレームの露光期間において様々なパターンを生成することによって、変動光場ベース超解像技術に用いるために適した照明の変動が実現され得る。この場合、各パターン（モード）は好適には、所与の単一フレーム露光期間中、一定である。
【００３５】
処理構成は好適には、約１、５、１０、１００、１０００、または１０，０００ミリ秒の持続期間を有する露光期間にわたって集光された光を用いて１フレームを生成するように構成される。フレームは、当業者には周知であるように、処理構成のメモリに（たとえばアレイとして）格納され得る。
【００３６】
処理構成は好適には、たとえば１００、１０００、１０，０００、またはそれ以上など複数のフレームを生成し、これらを用いて、１または複数の超解像出力画像またはアニメーションを（たとえば上述したような従来の超解像技術を用いて）生成するように構成される。そのような出力画像またはアニメーションは、メモリに格納され、および／またはたとえばコンピュータモニタなどのディスプレイに表示され得る。好適には、フレームは全て同じ持続期間の露光期間を有する。
【００３７】
処理構成は、たとえばマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、ＡＳＩＣ、ＦＰＧＡ、ＤＳＰ、メモリ、およびソフトウェア命令を含むメモリのいずれか１つまたは複数など、任意の適切な処理手段を備えてよい。処理構成は、たとえばデスクトップＰＣなどのローカルデバイス、またはたとえばサーバなどの遠隔デバイスを備えてよく、あるいはたとえばサーバのクラウドを備えるなど分散されてもよい。更なる態様によると、本発明は、たとえば光源を制御すること、および／または光注入デバイスを制御すること、および／または試料から集光された光を用いて超解像画像を生成することを含む、本明明細書で説明されたステップのいずれかを実行するように処理構成に命令するための命令を備えるソフトウェアおよびソフトウェア担持有形媒体を備える。
【００３８】
光経路制御システムは、入力光に、単一フレームに関する露光期間内で複数回、たとえば２回、１０回、１００回、またはそれ以上、第１および第２の光経路（および任意選択的に追加の光経路）間を循環させるように構成され得る。これは特定の超解像技術を用いる際に有益であり、たとえばｄＳＴＯＲＭオンチップ実験において、単一画像フレーム内で複数のモードが励起されることを可能にする。変動光場ベース超解像技術の場合は、画像フレームごとに１つのモードを有することが好適であり得る。
【００３９】
装置は、たとえば光ファイバケーブル、レンズ、またはミラーなど、導波路部品へ光を注入するように構成された光注入デバイスを備えてよい。光注入デバイスは、処理構成によって制御され得る。光経路制御システムは、単一フレーム露光期間中に、または１つの単一フレーム露光期間と次の単一フレーム露光期間とで、注入光が（たとえば導波路部品の端面において）導波路部品へ入る位置または角度を変更するために、光注入デバイスを導波路部品に対して動かすように構成されたアクチュエータを備えてよい。レンズ部分または対物レンズ全体を動かすことにより、時間によって様々な平行オフセット、様々な入射角、または様々な焦点位置がもたらされ得る。アクチュエータは、光注入デバイスに結合され得る、たとえば振動圧電ステージなどの圧電アクチュエータまたは振動モータを備えてよい。アクチュエータは、導波路部品内への光を結合するために機能する、たとえば導波路の上面、底面、または側面において入力光の伝搬方向に平行な平面に伸長し得る音響光学回析格子を備えてよく、変調信号の周波数を変更することによって、様々な回析格子および様々な偏向が生成され、導波路部品の入口面に対して入力光ビームが動かされ得る。
【００４０】
光経路制御システムは、単一フレーム露光期間中に、または１つの単一フレーム露光期間と次の単一フレーム露光期間とで、入力光の偏光、位相、または波長の１または複数を変更するための構成を備えてよい。これはたとえば、様々な光経路の長さを提供するために異なる位置で異なる厚さを有する、たとえば回転ディスクまたは可動スラブなどの回転偏光子または位相変更デバイスを備えてよい。光経路制御システムは、単一フレーム露光期間中に、または１つの単一フレーム露光期間と次の単一フレーム露光期間とで、導波路部品内の温度を変更することによって導波路部品内の屈折率を変更するように構成された温度変更素子を備えてよい。
【００４１】
出願人は、単一フレーム露光期間内でまたは単一フレーム露光期間ごとに入力光に変化を加える必要がない、エバネッセント場から様々な励起場を実現する他の方法も考案した。これは、導波路部品の第１の光学モードに対応する導波路部品を通る第１の光経路および導波路部品の第２の光学モードに対応する導波路部品を通る第２の光経路を同時に辿るように光を向け、第１および第２の光学モードを干渉させることによって実現される。この干渉は、撮像が行われる間にエバネッセント励起光の強度を変調させる。そのような照明は、たとえばＳＯＦＩおよびＥＳＩなどの変動照明ベース超解像分析に適することが分かっている。
【００４２】
本明細書で説明された任意の態様または実施形態の特徴は、適当な場合、本明細書で説明された他の任意の態様または実施形態に適用されてよい。様々な実施形態または実施形態のセットが参照されたが、これらは必ずしも個別的ではなく重複し得ることを理解すべきである。
【００４３】
以下、本発明の特定の好適な実施形態が、単に一例として添付図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】蛍光顕微鏡法を実行するための従来技術機構の略図である。
【図２】本発明に係る蛍光顕微鏡法を実行するための機構の略図である。
【図３】本発明に係る導波路部品の断面図である。
【図４】図３の導波路部品の平面図である。
【図５ａ】本発明に係る導波路部品の平面図である。
【図５ｂ】本発明に係る導波路部品の平面図である。
【図５ｃ】本発明に係る導波路部品の平面図である。
【図６ａ】全て本発明に係る３つの代替導波路構造の断面プロファイルである。
【図６ｂ】全て本発明に係る３つの代替導波路構造の断面プロファイルである。
【図６ｃ】全て本発明に係る３つの代替導波路構造の断面プロファイルである。
【図７】本発明に係るマルチコア導波路部品の導波路端部における側面プロファイルである。
【図８ａ】本発明に係る２つの導波路部品における異なる端面構成の平面図である。
【図８ｂ】本発明に係る２つの導波路部品における異なる端面構成の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
図２は、蛍光顕微鏡法を実行するための装置を示し、装置は、導波路部品１を向いた前方視野３０を有する、たとえばＰｌａｎ  Ｎ  ２０ｘ/０．４オリンパス（登録商標）製対物レンズなどの対物レンズ４を含む。装置は、導波路部品１の入力面に光結合された光注入デバイス４０、および導波路部品１に載置され対物レンズ４の前方視野３０内にある試料２も含む。装置は、前方視野３０内で対物レンズ４によって集光された光を受光し処理するように構成された処理構成２０も含む。
【００４６】
この例における試料は、蛍光体が埋め込まれた動物細胞であるが、当然、他の試料が用いられてもよい。
【００４７】
光注入デバイス４０は、導波路部品１に光を注入するための対物レンズ１０、アクチュエータ１２、および３つの光源８を備える。３つの光源からの３つの光ビームは、それぞれ４０５ナノメートル、４８８ナノメートル、および６４７ナノメートルの波長を有する。対物レンズ１０は、３つの光ビームを受光し、導波路部品１に注入するために光ビームを集中させる。注入された光は、導波路のための入力光を形成する。１または複数の異なる波長を有する入力光は、たとえばｄＳＴＯＲＭを用いて、試料２の単一分子局在化超解像撮像を可能にする。
【００４８】
アクチュエータ１２は、様々な位置および／または様々な角度で導波路部品１へ光を注入するために、対物レンズ１０を導波路部品１に対して動かすことができる。導波路部品１へ光が注入される位置および／または角度を変更することによって、光注入デバイス４０と導波路部品１との間の光結合を細かく調整することが可能である。またそれによって、画像処理中、光が様々な位置および／または角度で導波路部品へ注入され、注入光が導波路部品に沿って伝搬する光経路を変化させることができる。導波路部品内で注入光が伝搬する光経路は、導波路部品１の光学モードによって画定された光経路に対応する。
【００４９】
図３および図４に示すように、導波路部品１は、基板２０１に形成された導波路構造を備える。導波路構造の層は、上側クラッド層２０４と下側クラッド層２０２との間に挟まれた導光層２０３（本明細書において場合によってはコア層２０３と称される）を含む。下側クラッド層２０２は、コア層２０３の第１面２０８と基板２０１との間に構成される。上側クラッド層２０４は、コア層２０３の第１面２０８と反対側にあるコア層２０３の第２面２０９に構成される。コア層２０３は、クラッド層よりも高い屈折率を有し、導波路部品１へ注入される光を誘導する。
【００５０】
この例において、導波路構造は、（図３および図６ａに示すような）スラブ導波路であるが、後述するように、導波路部品は代わりに、（たとえば図６ｂに示すような）リブ導波路構造、（たとえば図６ｃに示すような）ストリップ導波路構造、または（たとえば図７に示すような）マルチコア励起導波路構造を備えてもよい。
【００５１】
図３、図４、および図６ａのスラブ導波路構造は、好適にはシリコンまたは透明基板上に形成され、五酸化タンタルＴａ２Ｏ５または窒化シリコンＳｉ３Ｎ４の薄いコア層（好適には５００ｎｍ未満）２０３、二酸化シリコンＳｉＯ２の下側クラッド層２０２、および二酸化シリコンＳｉＯ２の上側クラッド層２０４を備える。上側および下側クラッド層は、バイオイメージングに用いられる試料媒体の屈折率と厳密に一致する屈折率（すなわちｎ＝１．３８）を有する材料で作られてもよい。
【００５２】
導波路部品１に注入された光は導波路構造１に沿って伝搬し、注入光の一部は導波路コア領域の外側を伝搬する。この光の一部は、エバネッセント場として知られている。エバネッセント場における強度は、薄い導波路を作ることによって、およびコアとクラッドとの高い屈折率コントラストを用いることによって高められ得る。したがって、コアには高屈折率材料を用い、クラッドには（理想的には試料媒体と一致する）低屈折率材料を用いることが好適である。また、コアおよびクラッド材料は、低い吸収損失および低い自家蛍光を有するべきである。
【００５３】
導波路部品１は、導波路構造において伝搬するエバネッセント場に重なるように試料２０６を保持するために作られたドックも含む。エバネッセント場との重なりは、注入光の少なくとも一部が、ドック内に収容された試料２０６に向けられることを確実にする。試料２０６に向けられた光は、本明細書において励起光と称される。励起光が試料２０６へ向けられる導波路構造の面は、本明細書において出力面と称される。
【００５４】
スラブ導波路構造において、ドックは、エバネッセント場と重なる試料ウェル２０７を画定する間隙を上側クラッド層２０４に備える。試料ウェル２０７は、少なくとも部分的に導波路部品１の長さおよび幅に沿って伸長する。
【００５５】
処理構成２０は、たとえばＣＣＤまたはｓＣＭＯＳカメラなど試料から光を検出するための蛍光検出デバイス５、および蛍光検出デバイス５を制御し、既知の超解像撮像技術を用いて試料２０６の超解像画像を生成するために検出された光を処理するための電子制御ユニット６を含む。
【００５６】
たとえば１０ミリ秒続く超解像単一フレーム露光期間の開始時、アクチュエータ１２は、光注入デバイス４０を第１の光注入位置に配置する。第１の光注入位置において、光注入デバイスは、スラブ導波路構造内の第１の光経路（または光経路の第１のセット）を辿るように第１の入力光を導波路部品１へ注入する。第１の光経路（複数も可）を辿る注入光の少なくとも一部は、コア領域２０３の外側で第１のエバネッセント場として伝搬し、試料ウェル２０７内へ向けられる。試料ウェル２０７内へ向けられた第１のエバネッセント光は、第１の励起パターンを形成する。第１の励起パターンは、約１ミリ秒の期間、試料ウェル２０７内の試料２０６を照明する。
【００５７】
超解像単一フレーム露光期間の開始から１ミリ秒後、アクチュエータ１２は、光注入デバイス４０を第２の光注入位置に配置する。第２の光注入位置において、光注入デバイスは、スラブ導波路構造内の第２の光経路（または光経路の第２のセット）を辿るように第２の入力光を導波路部品１へ注入する。第２の光経路（複数も可）を辿る注入光の少なくとも一部は、コア領域２０３の外側で第２のエバネッセント場として伝搬し、試料ウェル２０７内へ向けられる。試料ウェル２０７内へ向けられた第２のエバネッセント場は、第２の励起パターンを形成する。第２の励起パターンは、約１ミリ秒の期間、試料ウェル２０７内の試料２０６を照明する。
【００５８】
超解像単一フレーム露光期間の開始から２ミリ秒後、アクチュエータ１２は、光注入デバイス４０を第３の光注入位置に配置する。第３の光注入位置において、光注入デバイスは、スラブ導波路構造内の第３の光経路（または光経路の第３のセット）を辿るように第３の入力光を導波路部品１へ注入する。第３の光経路（複数も可）を辿る注入光の少なくとも一部は、コア領域２０３の外側で第３のエバネッセント場として伝搬し、試料ウェル２０７内へ向けられる。試料ウェル２０７内へ向けられた第３のエバネッセント場は、第３の励起パターンを形成する。第３の励起パターンは、約１ミリ秒の期間、試料ウェル２０７内の試料２０６を照明する。
【００５９】
アクチュエータ１２はその後、光注入デバイス４０を再び第１の光注入位置に配置し、このプロセスは、１０ミリ秒間の露光期間が終了するまで循環する。
【００６０】
試料２０６を照明する第１、第２、および第３の励起パターンは、試料内の蛍光体を刺激し、蛍光発光および発光させる。対物レンズ４は、単一フレーム露光期間全体を通して、蛍光体から放出された光を集光する。単一フレーム露光期間中に対物レンズ４によって集光された光は、蛍光検出デバイス５へ向けられる。蛍光検出デバイス５は、受光した光を電気信号として検出し、電気信号を電子制御ユニット６へ送信する。電子制御ユニット６は、試料の第１の画像を生成するために、ｄＳＴＯＲＭ単一分子局在化法を用いて電気信号を処理する。
【００６１】
電子制御ユニット６は、たとえばマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、ＡＳＩＣ、ＦＰＧＡ、ＤＳＰ、メモリおよびソフトウェア命令を含むメモリの１または複数など、任意の適切な処理手段を備えてよく、たとえばデスクトップＰＣなどの単一デバイスを備えてよく、あるいはたとえば遠隔サーバまたはサーバのクラウドなどに分散されてもよい。
【００６２】
ｄＳＴＯＲＭ超解像撮像技術において、試料の第１の画像は、第１のフレームに対応する。第１のフレームが生成された後、装置は、試料の１０，０００ほどのフレームを更に生成する。後続フレームの各々において、次の単一フレーム露光期間ごとに試料は再び３つの励起パターンのサイクルによって照明され、以下同様である。
【００６３】
電子制御ユニット６は、第１のフレームおよび後続フレームの各々をメモリに記録する。フレームの全てが捕捉された後、電子制御ユニット６は、既知のｄＳＴＯＲＭ超解像撮像技術を用いて、フレームの全てに基づいて試料の最終超解像画像を生成する。
【００６４】
発明者は、単一フレーム露光期間中、試料２０６に対する励起光の重なりおよび方向を変更することにより、単一フレーム露光期間における励起光の優れた均一性がもたらされることを発見した。特に、発明者は、静的光経路と比べて、変化する光経路は、試料と重なる励起光の強度を平均化することを発見した。励起光の良好な均一性は、優れた解像度、少ないアーチファクト、鋭いコントラスト、および優れた強度色域を有する高品質の超解像画像をもたらす。場合によっては、導波路ベースの超解像撮像は、照明パターンが極めて不均一である（たとえば、視覚化される構造と同規模のストライプを有する）ことにより、この特徴なしでは完全に不可能なこともある。
【００６５】
この例において、試料ウェル２０７と重なるコア層２０３の第２面２０９は出力面を形成し、そこから光が試料に向けられることが理解される。
【００６６】
第１、第２、および第３の光経路（または経路のセット）は、導波路構造の様々な光学モードによって画定された様々な経路に対応してよい。たとえば、第１の光経路は、スラブ導波路構造の基本モードに対応してよく、第２の光経路は、スラブ導波路構造の１次モードに対応してよい。他の例として、光経路の第１のセットは、スラブ導波路構造のモードの第１のセット（たとえば基本モードおよび１次モード）に対応してよく、光経路の第２のセットは、スラブ導波路構造のモードの第２のセット（たとえば１次モードおよび２次モード）に対応してよい。
【００６７】
図２は、たとえばｄＳＴＯＲＭなどの蛍光顕微鏡法を実行するための機構を示す。導波路部品１は、対物レンズ４の視野内に位置する試料２を支持する。導波路部品１は導波路構造を形成し、そこへ光が注入される。注入光は、導波路構造に沿って全反射によって導かれ、注入光の少なくとも一部は、エバネッセント光場として伝搬する。導波路は、注入光の少なくとも一部を試料２に向ける。
【００６８】
任意選択的に、導波路部品１に対する対物レンズ１０の動きを制御するアクチュエータ１２は、電子コントローラによって制御される。たとえばアクチュエータは、ソーラボ（登録商標）製のピエゾコントローラＢＰＣ３０３によって制御されるピエゾステージであってよい。
【００６９】
あるいは、導波路部品１へ光を注入するために対物レンズ１０を用いるのではなく、光注入デバイス４０が、光ファイバ１１によって導波路部品１へ光を注入してよい。たとえば光注入デバイス４０は、各光源から光ビームを受光するように構成された光ファイバカプラ１０、および光ファイバカプラ１０と導波路部品１との間で光結合された光ファイバ１１を備えてよい。光ファイバカプラは、光ファイバ１１に沿って様々な光ビームを多重化し、導波路部品１内に光を集中させる。任意選択的に、この例において、光注入デバイス４０は、光ファイバ１１と接続されたアクチュエータ１２を備えてよく、対物レンズ１０と接続されたアクチュエータの構成と同様に、アクチュエータ１２は、導波路部品１に対する光ファイバ１１の位置および／または角度を動かしてよい。
【００７０】
追加または代替として、導波路部品１は、導波路部品１に対する光注入デバイス４０の位置を調整するためにアクチュエータ１３に接続され得る。したがってこのアクチュエータは、本開示の例に従って単一フレーム露光期間中に導波路構造内の第１および／または第２の光経路を辿るように導波路部品１へ入力光を注入するために用いられ得る。アクチュエータ１３はたとえば、振動圧電ステージであってよい。
【００７１】
任意選択的に、光注入デバイス４０は、たとえば単波長または調整可能波長光源など、任意の数の光源８または単一の光源８を備えてよい。各光源は、蛍光体の励起に適した光、たとえば可視スペクトル（４００〜８００ナノメートル）または近赤外線（８００〜１５００ナノメートル）を放出してよい。また、各光源は、たとえばソリッドステートレーザ、ファイバレーザ、またはダイオードレーザなどのレーザ光源であってよい。追加または代替として、各光源８は、ＬＥＤ光源または超解像顕微鏡法に適した他の任意の光源であってよい。
【００７２】
追加または代替として、入力光は、単波長または多波長を有してよい。たとえば入力光は、６４７ナノメートルの光または４８８ナノメートルの光（蛍光撮像に関して最も一般的に用いられる２つの波長）を備えてよい。
【００７３】
あるいは、光注入デバイスは、第１、第２、および第３の光経路（または光経路のセット）をそれぞれ辿るように第１、第２、および第３の入力光を導波路部品１へ同時に注入してよい。この例において、第１、第２、および第３の光経路は、導波路部品１における導波路構造の第１、第２、および第３の光学モードによって画定された光経路に対応する。第１、第２、および第３の光学モードの各々は互いに異なる。第１、第２、および第３の光学モードを導波路部品１に同時に伝搬することにより、第１、第２、および第３の光学モードは互いに干渉する。当該技術において、異なる伝搬モードの干渉は、モードビーティングとして知られている。第１、第２、および第３のモードのビーティングは、導波路部品１から試料に向けられる励起光を変調する。発明者は、このように励起光を変調することにより、時間変化する励起光に適合された超解像撮像技術に基づいて試料を撮像することが可能であることを発見した。
【００７４】
任意選択的に、モードビーティングは、励起光を変調するために導波路構造内を伝搬する任意の数の光学モードによって実行され得る。たとえばモードビーティングは、導波路構造内を同時に伝搬する第１および第２の光学モードのみによって実行され得る。
【００７５】
任意選択的に、超解像撮像は、蛍光体ではなく量子ドットを備える試料に実行され得る。この例において、試料に向けられる励起光は、量子ドットを刺激し、超解像撮像のための光を放出させる。
【００７６】
任意選択的に、処理構成２０は、たとえば対物レンズ４によって集光された光を濾過するためのバンドフィルタなど、１または複数のフィルタも含んでよい。たとえばフィルタは、励起光に対応する光を遮断し、蛍光体によって放出された光に対応する光を透過させるように構成され得る。
【００７７】
図６ａ、図６ｂ、および図６ｃは、考えられる３つの異なる導波路構造における層の断面図を示す。
【００７８】
図６ａは、図３および図４に関して上述したスラブ導波路構造２００における層の断面図を、試料ウェル２０６から離れた領域において示す。
【００７９】
図６ｂは、リブ導波路構造３００を画定するように導波路構造の上側クラッド層２０４内にエッチングされたリッジを有することによって横方向の導光がもたらされる任意選択的変形例を示す。リブ導波路構造３００において、リッジは、上側クラッド層２０４を通るがコア層２０３を通らないエッチング部分である。リブ導波路３００構造における横方向の導光は、コア層２０３の外側へ向けられるエバネッセント場の強度を高める。その結果、スラブ導波路構造２００と比べて、リブ導波路構造３００内に画定された試料ウェル２０７と重なるエバネッセント場の強度が高くなることにより、試料２０６と相互作用する励起光の強度が高くなる。励起光の強度の増加は、より強い蛍光発光をもたらす。
【００８０】
図６ｃは、ストリップ導波路構造４００を画定するように導波路構造のコア層２０３を通って更にエッチングされたリッジを有することによって、試料２０６に向けられるエバネッセント場の強度の更なる増加がもたらされる追加の変形例を示す。ストリップ導波路構造４００における横方向の導光は、コア層２０３の外側へ向けられるエバネッセント場の強度を高める。その結果、スラブ導波路構造２００およびリブ導波路構造３００と比べて、ストリップ導波路構造３００内に画定された試料ウェル２０７に重なるエバネッセント場の強度が高くなることにより、試料２０６と相互作用する励起光の強度が高くなる。励起光の強度の増加は、より強い蛍光発光をもたらす。
【００８１】
一般に、リブ導波路は、側壁の粗さの低減によって伝搬損失を低減する。またリブ導波路は、単一モード条件に対し（たとえば厚さおよび幅などの）導波路パラメータを拡大する。ただし、光はストリップ導波路内により強く閉じ込められ、より鋭い曲がり、折り返しを可能にし、導波路構造の設置面積を低減する。また、両方の導波路内で同様の誘導パワーの場合、ストリップ導波路はリブ導波路よりもエバネッセント場における高い強度を有する。更に、両方の導波路が単一モードにされていない限り、所与の導波路パラメータに関して通常、ストリップ導波路はリブ導波路よりも多い数のモードを支持する。撮像条件に依存して、スラブ、リブ、またはストリップ導波路ジオメトリのいずれかが用いられてよい。（バイオイメージングに用いられる可視波長に関して伝搬損失が著しく高まる場合に）エバネッセント場における高パワーが必要である場合、リブ導波路を用いることが好適であるが、変動光場ベースの撮像技術の場合は、より多い数のモードを支持することができるためにストリップ導波路が好適である。ただし、スラブ、リブ、またはストリップ導波路構造は全て、任意の超解像撮像技術に用いることができる。
【００８２】
スラブ導波路構造２００、リブ導波路構造３００、およびストリップ導波路構造４００の幅は、好適には１ミクロン〜１００ミクロンの範囲である。
【００８３】
任意選択的に、リブまたはストリップ導波路構造は、上側クラッド層２０４に画定された試料ウェル２０７の幅を拡大するために長さ方向に広くなってよい。導波路構造の幅を拡大することは、導波路構造に沿って伝搬する光場の幅を広げ、試料２０６を保持するためのより大きな試料ウェル２０７を可能にする。より広い励起光場と結合したより大きな試料ウェル２０７は、より大きな試料面積が超解像撮像のために撮像されることを可能にする。
【００８４】
図５ａ、図５ｂ、および図５ｃは、リブ導波路構造３００の上側クラッド層２０４に試料ウェル２０７が形成された３つの代替構成のそれぞれの平面図を示す。図５ａおよび図５ｂにおいて、リブ導波路構造３００の幅は、より大きな試料面積２０７を画定するために断熱的に拡大され、導波路構造に沿って伝搬する光場の幅を広げる。発明者は、導波路構造の幅を断熱的に拡大することにより、断熱領域４５０より前の領域に伝搬する光の光学モードプロファイルが維持され得ることを発見した。たとえば、断熱構造４５０は、断熱構造に至るまでの導波路構造に伝搬する光の基本モードプロファイルを維持する。
【００８５】
任意選択的に、リブまたはストリップ導波路構造の幅は、図５ｂの領域４６０に示すように、試料ウェル２０７領域の後、細くなってよい。
【００８６】
スラブ導波路構造を備える導波路部品１は、標準的な半導体製造技術を用いて製造され得る。たとえばスラブ導波路構造は、第１に、シリコン基板にＳｉＯ２の下層２０２をスパッタリングすること、第２に、ＳｉＯ２の下層２０２にＴａ２Ｏ５のコア層２０３をスパッタリングすること、その後第３に、コア層２０３にＳｉＯ２の上層２０４をスパッタリングすることによって製造され得る。試料ウェル２０７は、フォトリソグラフィおよびウェットエッチングを用いて上層２０４に間隙を画定することによって形成され得る。
【００８７】
リブ導波路構造を備える導波路部品１は、リッジを画定するために上側クラッド層２０４をイオンビームミリングすることによって製造され得る。上側クラッド層２０４は、好適には、コア層２０３から２００ｎｍ上の深さにエッチングされる。イオンビームミリングは、導波路の側壁の粗さを有利に低減することにより、導波路構造内での光伝搬損失を低減させる。
【００８８】
任意選択的に、導波路構造および試料ウェル２０７は、導波路部品１の基板２０１上にモノリシックに一体化され得る。
【００８９】
任意選択的に、導波路部品１は、複数の導波路構造を備えてよい。各導波路構造は、入力光を受光し、励起光を試料ウェル２０７内へ向けてよい。追加または代替として、導波路構造は複数の導波路構造を備えてよく、各導波路構造が入力光を受光し、複数の導波路構造の１または複数へ励起光を向けてよい。
【００９０】
試料２０６を試料ウェル２０７内へ載置する前に、導波路部品１は、５％（ｖ／ｖ）のＨｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）製）に７０℃で１０分間導波路部品を浸すことによって洗浄され得る。その後、Ｈｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）は、導波路部品を第１に脱イオン水に、第２にイソプロパノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）製）に、第３に脱イオン水に浸すことによって除去され得る。
【００９１】
試料ウェル２０７は、図３に示すように導波路コア層２０３上に構成されたバイオ層２０５を含んでよい。バイオ層は、試料内の蛍光体と導波路コア層２０３との非特異的結合を防ぎ、ＢＳＡまたはＰＥＧを備えてよい。またバイオ層２０５は、試料ウェル２０７内で直接試料を培養することを容易にする。バイオ層２０５は、好適であるが必須ではない。また、バイオ層の厚さは、エバネッセント場が試料ウェル２０７内の試料と重なることを確実にするように選択され、一般的には２０ｎｍ未満である。
【００９２】
任意選択的に、試料は、たとえばカバーガラスへの細胞付着のために用いられる既知のプロトコルなどの標準的プロトコルの後、導波路部品１の試料ウェル２０７内で直接作製され得る。
【００９３】
ストリップ導波路構造４００におけるリッジ４１０の側壁は、試料２０６を保持するためのドック２０７を画定してよい。すなわち、リッジの側壁は、試料ウェル２０７を画定してよい。この例において、試料２０６に向けられ試料ウェル２０７と重なるのは、リッジの側部においてコア層２０３の外側で伝搬するエバネッセント場である。試料ウェルをリッジの側壁に隣接して構成することは、本開示に係る、試料と相互作用するエバネッセント場の強度の増加による利益も得る。すなわち、導波路構造の側壁は、試料を支持することによって、試料を受け入れるための試料ウェル２０７を形成してよい。導波路部品は、試料を保持するための他の構造を含んでもよい。
【００９４】
代替構成において、導波路構造の端面は、試料２０６を保持するためのドック２０７を画定する。すなわち、導波路構造の端面は、試料ウェル２０７を画定してよい。この例において、導波路部品１の端面から出て導波路部品１に沿って導かれる入力光は、試料２０６へ向けられる。試料ウェル２０７は、導波路構造を基板層まで、または基板層を貫通して終端とすることによって画定され得る。典型的に、導波路構造は、導波路構造をエッチングまたは割断することによって終端とされ得る。
【００９５】
図７は、端面照明構成の例を示す。導波路部品１は、基板２０１上に形成されたマルチコア導波路構造、および導波路構造の端面２５０によって画定された試料ウェル２０７を備える。導波路構造の端面２５０は、試料ウェル２０７の壁部を画定し、試料２０６が支持され得る支持台を提供する。
【００９６】
マルチコア導波路構造の層は、第１の導光層２０３ａおよび第２の導光層２０３ｂ（または第１のコア層２０３ａおよび第２のコア層２０３ｂ）を含む。第１のコア層２０３ａは、上側クラッド層２０４と下側クラッド層２０２との間に挟まれる。下側クラッド層２０４は、基板２０１と第１のコア層２０３ａとの間に構成される。第２のコア層２０３ｂは、上側クラッド層２０４と上面クラッド層２１４との間に挟まれる。第１のコア層２０３ａは、上側クラッド層２０４および下側クラッド層２０２よりも高い屈折率を有する。第２のコア層２０３ｂは、上側クラッド層２０４および上面クラッド層２１４よりも高い屈折率を有する。
【００９７】
試料ウェルおよび端面は、マルチコア導波路構造において基板層２０１までエッチングされた間隙によって形成され、それによって入力光は、コアの各々から、導波路構造の外かつ自由空間内へ、または試料内へ導かれ得る。
【００９８】
超解像撮像中の第１の時間に、アクチュエータ１２は、光注入デバイス４０を第１の光注入位置に配置する。第１の光注入位置において、光注入デバイスは、マルチコア導波路構造の第１のコア２０３ａを通るように入力光を導くために導波路部品１へ入力光を注入する。第１のコア層２０３ａは、試料ウェル２０７の第１の領域を通るように第１の高さにおいて注入光を導波路構造から外に向ける。
【００９９】
超解像撮像中の第１の時間の後の第２の時間に、アクチュエータ１２は、光注入デバイス４０を第２の光注入位置に配置する。第１の光注入位置において、光注入デバイスは、マルチコア導波路構造の第２のコア２０３ｂを通るように入力光を導くために導波路部品１へ入力光を注入する。第２のコア層２０３ｂは、試料ウェル２０７の第２の領域を通るように第２の高さにおいて注入光を導波路構造から外に向ける。第２の高さは、第１のコア領域２０３ａに対する第２のコア層２０３ｂの位置によって定められる。試料ウェル２０７を通る第１の領域５１０は、励起光が向けられない分離領域によって第２の領域５２０から分離される。
【０１００】
導波路構造から外に向けられた光は、試料内の蛍光体を刺激し、蛍光発光および発光させる。実質的に試料の第１の領域５１０における蛍光体のみが、２０３ａの第１のコア層から発出する励起光によって刺激される。同様に、実質的に試料の第２の領域５２０における蛍光体のみが、２０３ｂの第２のコア層から発出する励起光によって刺激される。試料２０６において励起される体積は基本的に、導波路構造の端面２５０から発出する励起光の体積に限定される。
【０１０１】
放出光は集光され、図２に関して説明したように超解像撮像を提供するために処理される。試料ウェルの様々な領域を通るように励起光を向けることにより、マルチコア構造は、試料ウェル２０７内の試料２０６の様々な領域が励起光によって刺激されることを有利に可能にする。特に、マルチコア導波路は、試料内の様々な高さに位置する蛍光体が刺激され、それによって試料の様々な深さから発光することを可能にする。試料の様々な深さからの放出光を集光することにより、様々な試料深さにおける超解像撮像が可能である。（理解されるように、本明細書における高さ、深さ、幅などへの言及は、文脈が指示しない限り、装置が特定の方向で動作するように限定するものとして理解すべきではない。）
【０１０２】
要するに、この例において、端面２５０自体が試料ウェル２０７の側壁の一部であり、試料２０６と接触している。たとえば、光は、適切な結合技術を用いて、たとえば端面２５０と反対側の入射面において結合される光を集中させる対物レンズによって、図６の左側からそれぞれの導波層内へ結合される。
【０１０３】
試料２０６に向けられた励起光が導波路構造の端面２５０から発出する構成において、導波路構造の上側クラッド層２０４は空気であってよい。すなわち、導波路構造の層は、基板２０１上に構成された下側クラッド層２０２および下側クラッド層２０２上に構成されたコア領域２０３を備えてよい。
【０１０４】
図７には示されないが、試料ウェル内の試料２０６は、導波路構造の端面２５０と接するのではなく端面２５０と接しないように載置されてもよい。この構成において、励起光は、端面２５０から試料２０６へ自由空間において伝搬する。
【０１０５】
任意選択的に、この構成における試料ウェル２０７は、基板２０１の上面におけるウェルの底部に堆積されたバイオ層２０５を備えてよい。バイオ層２０５は、試料内の蛍光体と基板層２０１との非特異的結合を防ぎ、ＢＳＡ、ＰＥＧ、またはＰＬＬを備えてよい。また、バイオ層は、試料ウェル２０７内で直接試料を培養することを容易にする。バイオ層２０５は、好適であるが必須ではない。
【０１０６】
任意選択的に、導波路構造の端面２５０は平面である。
【０１０７】
導波路構造の端面２５０から発出する励起光は、わずかに発散し得る。励起光の発散は、端面２５０における導波路構造の幅に依存する。導波路構造の端面から外に向けられる励起光の発散を軽減するために、導波路構造の幅は、励起光を集中させるレンズを形成するために長さ方向に先細りであってよい。
【０１０８】
図８ａは、先細り端面６５０を形成するように長さ方向に幅が先細りである、ストリップ導波路構造４００を示す。任意選択的に、導波路構造の高さもまた長さ方向に先細りであり、２次元に先細りの端面を画定してよい。発明者は、少なくとも１次元においてアキシコンレンズを画定するように導波路領域の端面６５０を先細りにすることは、導波路構造から外へ向けられ試料２０６に向けられる光（すなわち励起光）の発散を軽減するために特に有利であることを発見した。導波路構造の端部領域を先細り先端部６５０のように形成することにより、ビーム成形のためのアキシコンレンズが生じる。アキシコンレンズは、導波路構造を通る入力光の伝搬方向に沿った線焦点をもたらす。
【０１０９】
導波路構造の幅は、適切なマスクに従ってレンズを形成するように導波路の端面を形作るために、イオンビームミリングまたは他の任意の適切なエッチング技術を用いて先細りにされ得る。あるいは導波路構造の幅は、レンズを形成するように導波路の端面を形作るために、再成長および選択的成長または他の任意の適切なエピタキシャル技術を用いて先細りにされ得る。導波路構造の高さもまた、適切なエッチングプロセスを用いて（たとえばある程度）先細りにされ得る。
【０１１０】
追加または代替として、導波路構造の端面から外に向けられる励起光の発散を軽減するために、導波路構造の端面に光を集中させるための回析格子６６０が設けられ得る。
【０１１１】
図８ｂは、ストリップ導波路構造の端面に構成された回析格子６６０を示す。この例において、回析格子６６０は励起光に重なり、励起光の発散を軽減して励起光を試料２０６に集中させるように励起光を反射する。回析格子６６０は、標準的なエッチング技術を用いて導波路構造および／または基板の１または複数の層にエッチングされ得る。
【０１１２】
導波路構造の端部領域は、基板層２０１に垂直かつ対物レンズ４の光軸３と平行な面において導波路構造から発出する励起光を偏向させるために、スタティックまたはプログラマブル音響回析格子６６０を画定してよい。その結果、導波路構造から発出する励起光ビームの高さは、プログラマブル音響回析格子６６０を調整することによって制御され得る。
【０１１３】
当業者には理解されるように、本発明は、本発明のいくつかの特定の実施形態を説明することによって示されたが、これらの実施形態に限定されるものではない。様々な変形例および改良例が、添付の特許請求の範囲の範囲内で可能である。
【０１１４】
本明細書に含まれる従来技術への任意の参照は、そのような技術が世界中のあらゆる国で共通の一般的知識の一部を成すことを認めるものとしてみなされるものではない。「備える」という語および「備えている」などの変化形は、文脈が明確な言葉または必然的な暗示によって他の場合を必要とする場合を除き、包括的または開放的な意味で用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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