(57)【要約】  本開示は、ミトコンドリアへの輸送のための、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つのセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインを含み、各サブドメインが、ミトコンドリア内に局在化することができる、核酸送達構築物を説明する。また、ミトコンドリア遺伝子機能を向上させるか、もしくは欠陥があるミトコンドリア遺伝子機能を抑制するか、または両方の方法およびミトコンドリア病を治療する方法が、本明細書で開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つのセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインを含み、各サブドメインが、ミトコンドリア内に局在化することができる、核酸送達構築物。
【請求項２】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、β２．７  ＲＮＡ（配列番号１または配列番号２）、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（Ｄ２；配列番号４または配列番号８）、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）、β２．７  ＲＮＡのドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）およびそれらの組合せからなる群から選択されるＲＮＡ配列のうちの１つまたは複数の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸送達構築物。
【請求項３】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、β２．７  ＲＮＡ（配列番号１または配列番号２）、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（Ｄ２；配列番号４または配列番号８）、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）、β２．７  ＲＮＡのドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の核酸送達構築物。
【請求項４】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからの１つもしくは２つもしくは３つもしくは４つまたはそれよりも多いＲＮＡ配列が、β２．７  ＲＮＡの全長配列（配列番号１（センス））、β２．７  ＲＮＡの全長配列（配列番号２（アンチセンス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（配列番号３（センス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（配列番号７（アンチセンス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（配列番号４（センス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（配列番号８（アンチセンス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（配列番号５（センス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（配列番号９（アンチセンス））、β２．７  ＲＮＡのドメイン４（配列番号６（センス））およびβ２．７  ＲＮＡのドメイン４（配列番号１０（アンチセンス））からなる群から選択される配列を含む、請求項３に記載の核酸送達構築物。
【請求項５】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、β２．７  ＲＮＡのドメイン２、ドメイン３およびドメイン４（配列番号１１（センス）または配列番号３９（アンチセンス））；またはβ２．７  ＲＮＡのドメイン１、ドメイン３およびドメイン４（配列番号１２（センス）または配列番号４０（アンチセンス））；またはβ２．７  ＲＮＡのドメイン１、ドメイン２およびドメイン４（配列番号１３（センス）または配列番号４１（アンチセンス））；またはβ２．７  ＲＮＡのドメイン１、ドメイン２およびドメイン３（配列番号１４（センス）または配列番号４２（アンチセンス））を含む、請求項３に記載の核酸送達構築物。
【請求項６】
少なくとも１つのスペーサー配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸送達構築物。
【請求項７】
核酸送達構築物が、少なくとも２つのスペーサー配列を含む場合、少なくとも１つのスペーサー配列が、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列の５’末端にあり、かつ少なくとも１つの別のスペーサー配列が、３’末端にある、請求項６に記載の核酸送達構築物。
【請求項８】
少なくとも１つのスペーサー配列が、Ｓ１ａ（配列番号２６）、Ｓ１ｂ（配列番号２７）、Ｓ２ａ（配列番号２８）、Ｓ２ｂ（配列番号２９）、Ｓ３ａ（配列番号３０）、Ｓ３ｂ（配列番号３１）、Ｓ４ａ（配列番号３２）、Ｓ４ｂ（配列番号３３）、Ｓ６ａ（配列番号３４）、Ｓ６ｂ（配列番号３５）、Ｓ８ａ（配列番号３６）、Ｓ８ｂ（配列番号３７）およびスペーサーＦ３Ａ（配列番号３８）からなる群から選択され、かつ／または任意選択で、スペーサー配列が、停止コドンを含む、請求項６または７に記載の核酸送達構築物。
【請求項９】
各ＲＮＡ配列が、式Ｉ：
【化１】
2019514972.tif 000062
に従い、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、ドメイン２（Ｄ２  配列番号４または配列番号８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）からなる群から選択され、
式中、各Ｘが独立して、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せからなる群から選択され；各Ｘに任意選択で、請求項６〜８で定義する少なくとも１つまたは複数のスペーサー配列が先行するか、もしくは続くか、または隣接する、請求項３に記載の核酸送達構築物。
【請求項１０】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、ＲＮＡ配列の四量体であり、各ＲＮＡ配列が、式ＩＩ：
【化２】
2019514972.tif 000063
に従い、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、ドメイン２（Ｄ２  配列番号４または配列番号８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）からなる群から選択され、
式中、各Ｘが独立して、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せからなる群から選択され；スペーサー配列Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ａ、Ｓ３ｂ、Ｓ４ａおよびＳ４ｂが、請求項８で定義する通りである、請求項３に記載の核酸送達構築物。
【請求項１１】
各Ｘが、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）であるか；もしくは各Ｘが、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）であるか；または核酸送達構築物が、配列番号１５もしくは配列番号５１に記載の核酸配列を含むか、もしくは核酸送達構築物が、配列番号１６もしくは配列番号５２に記載の核酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸送達構築物。
【請求項１２】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、式ＩＩＩ：
【化３】
2019514972.tif 000064
に従い、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、ドメイン２（Ｄ２；配列番号４または配列番号８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）からなる群から選択されるＲＮＡ配列の八量体であり、
式中、ＸおよびＹが、互いに異なり、各Ｘおよび各Ｙが独立して、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せからなる群から選択され；スペーサー配列Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ａ、Ｓ３ｂ、Ｓ４ａおよびＳ４ｂが、請求項８で定義する通りである、請求項３に記載の核酸送達構築物。
【請求項１３】
Ｘが、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）であり、かつＹが、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）であるか；もしくはＸが、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）であり、かつＹが、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）であるか；または核酸送達構築物が、配列番号１７もしくは配列番号５３に記載の核酸配列を含むか；もしくは核酸送達構築物が、配列番号１８に記載の核酸配列を含む、請求項１２に記載の核酸送達構築物。
【請求項１４】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、式ＩＶ：
【化４】
2019514972.tif 000065
に従い、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、ドメイン２（Ｄ２；配列番号４または配列番号８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）からなる群から選択されるＲＮＡ配列の八量体であり、
式中、ＸおよびＹが、互いに異なり、各Ｘおよび各Ｙが独立して、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せからなる群から選択され；スペーサー配列Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ａ、Ｓ３ｂ、Ｓ４ａおよびＳ４ｂが、請求項８で定義する通りである、請求項３に記載の核酸送達構築物。
【請求項１５】
Ｘが、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）であり、かつＹが、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）であるか；または核酸送達構築物が、配列番号１９に記載の核酸配列を含む、請求項１４に記載の核酸送達構築物。
【請求項１６】
ペイロードをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸送達構築物。
【請求項１７】
配列番号２０〜配列番号８２のいずれか一項に記載の配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸送達構築物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター、組換え細胞または組換え生物。
【請求項１９】
核酸配列が、構成的に発現されるか、または構成的でなく発現される、請求項１９に記載の組換え細胞または組換え生物。
【請求項２０】
ドメイン１（Ｄ１；配列番号３または７）、ドメイン２（Ｄ２；配列番号４または８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または１０）からなる群から選択されるヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つまたは複数のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ配列を含む核酸配列。
【請求項２１】
ミトコンドリア遺伝子機能を向上させるか、もしくは欠陥があるミトコンドリア遺伝子機能を抑制するか、または両方の（ただし、この場合、ミトコンドリア遺伝子は互いに異なる）方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸送達構築物を対象に投与することを含み、ミトコンドリア遺伝子機能が、互いに異なる、方法。
【請求項２２】
ミトコンドリア病を治療する方法であって、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸送達構築物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
核酸送達構築物が、アンチセンスＲＮＡを送達するために使用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ミトコンドリア病が、母性遺伝真性糖尿病、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、神経障害、運動失調症、網膜色素変性症、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、ミトコンドリア筋症脳症乳酸アシドーシスおよび脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ）、パーキンソン病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、ピアソン症候群および進行性眼筋麻痺（ＰＥＯ）からなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ミトコンドリア病が、ＭＴ−ＴＬ１（ｔＲＮＡロイシン）、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＴＫ（ｔＲＮＡリジン）、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＴＨ（ヒスチジン）、ＭＴ−ＴＬ１（ロイシン）、ＭＴ−ＴＶ（バリン）およびそれらの組合せからなる群から選択される、少なくとも１つの冒された（ミトコンドリア）遺伝子を標的化することにより治療される、請求項２２または２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月６日出願のＳＧ仮出願第１０２０１６０３６２８Ｑ号の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的についてその全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本開示は、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、核酸配列の輸送のためのミトコンドリア標的化配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ミトコンドリアは、ほとんど全ての生物において、呼吸サイクルの最終的な部分に関わる細胞小器官である。ミトコンドリアのゲノム構成は独特であり、３７個の遺伝子をコードし、そのうちの２２個はｔＲＮＡ遺伝子であり、２個はミトコンドリアリボソームＲＮＡ（１２ｓおよび１６ｓ）遺伝子であり、１３個の遺伝子は呼吸酵素のサブユニットをコードしている。これらの呼吸遺伝子の欠陥は、いくつかの神経変性障害、例えば運動失調症、視神経症、パーキンソン病と関連付けられており、また老化とも関連付けられている。しかしながら、ミトコンドリア保護および調節のためのミトコンドリアによる核酸の取り込みは十分に調査されておらず、効率的なミトコンドリア送達ベクターはまだ特定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、ペイロード（例えば送達システムにより運搬される核酸配列）を細胞のミトコンドリアへ送達することができる送達システムが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本発明は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つのセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインを含み、各サブドメインが、ミトコンドリア内に局在化することができる、核酸送達構築物に関する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示する核酸配列を含むベクター、組換え細胞または組換え生物に関する。
【０００７】
また別の態様では、本発明は、ドメイン１（Ｄ１；配列番号３または７）、ドメイン２（Ｄ２；配列番号４または８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または１０）からなる群から選択されるヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つまたは複数のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ配列を含む核酸配列に関する。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、ミトコンドリア遺伝子機能を向上させるか、もしくは欠陥があるミトコンドリア遺伝子機能を抑制するか、または両方の（ただし、この場合、ミトコンドリア遺伝子は互いに異なる）方法であって、本明細書で開示する核酸送達構築物を対象に投与することを含み、ミトコンドリア遺伝子機能が、互いに異なる、方法に関する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ミトコンドリア病を治療する方法であって、本明細書で開示する核酸送達構築物を対象に投与することを含む方法に関する。
【００１０】
本発明は、非限定的な例および付属の図面と関連して考慮すると、詳細な説明についてより良く理解される。
【００１１】
図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【００１２】
図２は、β２．７  ＲＮＡとそのアンチセンスＲＮＡとの間の顕著なホモロジーを示す構造および機能分析を示す。ａ）ｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）を使用したＴｏｗｎｅ  β２．７アンチセンスＲＮＡの熱力学的プロファイリングにより、相補鎖のドメインＤ１〜Ｄ４に対応する、熱力学的に保存された構造サブドメインＤ１ＡＳ〜Ｄ４ＡＳを特定した。ｂ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写センス（Ｔ７）またはアンチセンス（ＳＰ６）全長β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトし、ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよび左から右へ（Ｄ１〜Ｄ４についての）ドメイン特異的プライマーを使用して定量した。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。ｃ）ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して検出される、全長β２．７アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＳＤＤＣのミトコンドリア局在化。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｄ）ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した、全長β２．７  ＲＮＡ、全長β２．７アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＳＤＣのミトコンドリア局在化。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【００１３】
図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【００１４】
図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【００１５】
図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【００１６】
図６は、組換え核酸のミトコンドリア送達のためのＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ由来配列／構造（ｍβ２．７）を使用する模式図の例を示す。ｍβ２．７は、全長β２．７  ＲＮＡ、その構造サブドメイン、β２．７  ＲＮＡの反復のいずれかであり得る。ａ）は、組換え非コードまたはコードＲＮＡの５’末端へのｍβ２．７の融合を示す。ｂ）は、組換え非コードまたはコードＲＮＡの３’末端へのｍβ２．７の融合を示す。ｃ）は、二本鎖ＤＮＡ（遺伝子）に対する相補的塩基対形成、すなわち、結合ドメインを介したｍβ２．７の結合を示す。ｄ）は、環状一本鎖ＤＮＡまたは組換えミトコンドリアゲノムへの相補的結合ドメイン（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を介したｍβ２．７の連結を示す。ｅ）は、ｄ）で示される相補的結合ドメインを介したｍβ２．７の連結を示すが、ｓｓＤＮＡを酵素的に、ｄｓＤＮＡに変換し、ライゲーションした。ｆ）は、ｄ）で示される相補的結合ドメインを介したｍβ２．７の連結を示すが、２つまたはそれよりも多いｍβ２．７  ＲＮＡを環状ｓｓＤＮＡに連結している。
【００１７】
図７は、本発明で使用するｐＶＡＸ１ベクターの模式的マップを示す。ｐＶＡＸ１ベクターに構築物をクローニングするために、ＮｄｅＩおよびＢｃｌＩ部位を使用した。
【００１８】
図８は、２ステップで行った、単一ドメイン欠失構築物を生成するために使用した重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ  ＰＣＲ：ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の模式図を示す。第１のステップでは、欠失ドメイン（ΔＤ）の上流の領域を、ＮｈｅＩ部位を有する通常のフォワードプライマーと、ΔＤの下流の領域にプライミング部位を導入するＯＥリバースプライマーとを使用してＰＣＲ増幅する。続いて、ΔＤの下流のドメインを、ΔＤの上流の領域にプライミング部位を導入するＯＥフォワードプライマーと、ＢａｍＨＩ部位を有する通常のリバースプライマーとを使用してＰＣＲ増幅する。両方のＰＣＲ産物をその後、ゲル精製し、等モル量で共に混合し、その後ＰＣＲで再増幅すると、ＯＥが導入したプライミング部位は、それらの各々の対応物のプライマーとして作用し、これにより所望の欠失を有する全長構築物を得た。
【００１９】
図９は、単一ドメイン構築物の合成およびクローニング策を概略する模式図を示す。ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するために、それぞれ、フォワードおよびリバースプライマーを設計した。ＰＣＲ産物を続いて、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製し、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＶＡＸ１ベクターにクローニングした。
【００２０】
図１０は、ミトコンドリアＧＦＰ送達を試験するために使用した様々な構築物の略図を示す。ミトコンドリア特異的ＧＦＰ発現を促進するために、ゲノム開始および停止コドンを、ミトコンドリア特異的開始（ＡＴＡ）および停止コドンに（それぞれ）ＰＣＲ改変した。
【００２１】
図１１は、核局在化配列（ＮＬＳ）のＰＣＲ導入の略図を示す。ＮＬＳ配列を、フォワードおよびリバースプライマーを使用してＰＣＲによりｐＥＢＦＰ−ＮＵＣプラスミドからＰＣＲ増幅し、停止コドン（ＡＧＡ）の上流に挿入した。
【００２２】
図１２は、ドメイン２およびドメイン３タンデム反復配列を合成するために使用したクローニング策の略図を示す。ＰＣＲプライマーを使用して、個々のコピーを最初に４組合成した。特定のタンデム反復についての全てのプライマーは、同じ結合領域を共有するので、特定のタンデム反復についての全ての組について、Ｔｍは同じである。各組は、図においてＳ１〜Ｓ４で示す、それ自体のスペーサーの組を有する。ある組の３’末端の部位が、タンデム反復内の次の組の５’末端の部位に一致するように、制限酵素部位を選択した。使用した制限酵素部位は、ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＡｇｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩであった。ＰＣＲ後、産物をＰＣＲ精製し、それらの各々の制限酵素部位で消化した。消化したＰＣＲ産物をその後、等モル量の消化したベクター骨格中で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。
【００２３】
図１３は、Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４およびＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４の合成策の略図を示す。ドメイン２タンデム反復（Ｄ２Ｘ４）を、Ｄ２Ｘ４を有するｐＶＡＸ１ベクターからＰＣＲ増幅した。より短い断片の増幅を防ぐために、プライマーの結合領域の大部分がベクター骨格それ自体上にあるように、プライマーを設計した。プライマーの各々は、いずれかの末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を消化し、Ｄ３Ｘ４配列を有するｐＶＡＸ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内に再ライゲーションした。ベクターの再ライゲーションを防ぐために、消化したベクターをアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。図１３の第２の部分は、Ｄ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４に使用した策の略図を示す。同様に、ドメイン３タンデム反復（Ｄ３Ｘ４）を、Ｄ３Ｘ４を有するｐＶＡＸ１ベクターからＰＣＲ増幅した。用いたプライマー設計策は、上記に概略するドメイン２タンデム反復（Ｄ２Ｘ４）に使用したものと同じであった。ＰＣＲ産物を消化し、Ｄ２Ｘ４配列を有する脱リン酸化したｐＶＡＸ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内に再ライゲーションした。
【００２４】
図１４は、（Ｄ３＿Ｄ２）ｘ４を合成するために使用した策の略図を示す。第１のステップでは、Ｄ３ｘ４の第１のＤ３を、同じ制限酵素部位を使用してＤ２Ｘ４の第１の反復位置にクローニングした。第２のステップでは、Ｄ３ｘ４の第３のＤ３を、同じ制限酵素部位を使用してＤ２Ｘ４の第３の位置にクローニングした。このようにして得たステップ２の生成物をその後、いずれかの末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をその後、ステップ２の生成物の下流にライゲーションした。
【００２５】
図１５は、アンチセンスＲＮＡが標的化する配列を単離するために使用した策の略図を示す。ミトコンドリアＲＮＡを、遺伝子特異的リバースプライマー配列（ＡＴＰ６ＲｖおよびＡＴＰ８Ｒｖ）で逆転写して、ファーストストランド（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ＡＴＰ６およびＡＴＰ８  ｃＤＮＡプールを得た。続いて、これらのプールを、ＰＣＲの鋳型として使用して、標的エレメントを表す二本鎖ＤＮＡ配列を得た。
【００２６】
図１６は、ＡＴＰ６＿β２．７を合成するために使用した策の略図を示す。ＡＴＰ６標的配列を、ＰＣＲにより再増幅して、β２．７＿ｐＶＡＸ１配列中の向きとは反対向きの制限酵素部位を導入した。得られた産物を、ＮｈｅＩおよびＢｓｐｅＩで消化し、その後β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクター骨格にライゲーションして、ＡＴＰ６＿Ｎｏスペーサー＿β２．７を得た。生成物を、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩでの消化によりスクリーニングした。続いて、スペーサー配列を、２ステップｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりこの構築物の下流に導入した。第１のステップでは、β２．７の断片（β２．７Ｆ）を、通常のフォワードプライマーと、スペーサー配列の一部（ＳＦ１）を導入するリバースプライマーとでＰＣＲ増幅した。次のステップでは、ステップ１の産物を、ステップ１と同じフォワードプライマーと、ＳＦ１に結合し、残りのスペーサー配列（ＳＦ２）およびクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位を同時に導入するリバースプライマーとでＰＣＲ増幅した。これは、スペーサー配列を再構成した。ステップ２のＰＣＲ産物を、ＡＴＰ６＿Ｎｏスペーサー＿β２．７にクローニングして、ＡＴＰ６＿β２．７を得た。
【００２７】
図１７は、β２．７＿ＡＴＰ８構築物を生成するために使用した策の略図を示す。精製したＡＴＰ８標的配列を、リバースプライマーでＰＣＲ増幅し、これによりＳｐｅＩ部位を導入した。同時に、ＰＣＲによりβ２．７から断片を増幅し、得られた産物は、５’末端および３’末端に、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有した。β２．７  ＰＣＲ産物およびＡＴＰ８  ＰＣＲ産物を、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで単独消化し、等モル量で混合し、２２℃で４時間ライゲーションした。ＳｐｅＩ部位は、２塩基充填によりＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションすることができ、これにより有効に両方の部位が破壊される。ライゲーション後、アンチセンスＡＴＰ８配列に融合したβ２．７断片を有する、正確なサイズの生成物をゲルから精製した。その後、このライゲーション生成物をＰＣＲ増幅して、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し、β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクター骨格にクローニングし戻して、インタクトな配列を生成した。
【００２８】
図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【００２９】
図１９は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ａ）またはＨｅｐＧ２（ｂ）細胞に、フルオレセイン−１２ウラシル標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし（緑色）、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色し（青色）、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで染色した（赤色）ことを示す。トランスフェクトしたＲＮＡとミトコンドリアとの共局在化を、重ね合わせた像で黄色シグナルにより示す。
【００３０】
図２０は、タンデム反復ＲＮＡの最小自由エネルギー（ｍｆｅ）構造、すなわち、（Ｄ２）４、（Ｄ３）４、（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４、（Ｄ２）４＿（Ｄ３）４および（Ｄ３＿Ｄ２）４を示す。これらの構造は、ｍｆｏｌｄにより予測される通りである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１ａ】図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【図１ｂ】図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【図１ｃ】図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【図１ｄ】図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【図１ｅ】図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【図１ｆ】図１は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性を決定する単一の構造サブドメインを特定する構造および機能分析を示す。ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトした。細胞質画分およびミトコンドリア画分を精製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して各画分中のβ２．７  ＲＮＡの相対的分布を決定した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。ｂ）アルゴリズムｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）ならびに２００ｎｔのウィンドウサイズおよび１ｎｔのシフト増加を使用した、ＣＭＶ  Ｔｏｗｎｅ株のβ２．７  ＲＮＡ配列の熱力学的プロファイリング。各ウィンドウについての二次構造形成のギブス自由エネルギー（ΔＧ）値を、配列ウィンドウの位置に対してプロットした。ΔＧ最小値は、４つの熱力学的に保存され、かつ機能的に関連する可能性がある構造サブドメインＤ１〜Ｄ４を示す。ｃ）明確な二次構造サブドメインＤ１〜Ｄ４は、ｍｆｏｌｄにより予測される、Ｔｏｗｎｅ  β２．７  ＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ転写産物の最小自由エネルギー構造（ｍｆｅ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）内のエネルギー的最小値の各々に割り当てることができる。ｄ）は、β２．７  ＲＮＡドメイン構造の略図を、単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）および単一ドメイン構築物（ＳＤＣ：ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）と共に示す。ｅ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示す。ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写全長β２．７  ＲＮＡまたはＳＤＣをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞の結果を示し、ミトコンドリア取り込みは、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した。データは、３回の独立した実験の±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
【図２】図２は、β２．７  ＲＮＡとそのアンチセンスＲＮＡとの間の顕著なホモロジーを示す構造および機能分析を示す。ａ）ｆｏｌｄｓｐｌｉｔ（ＨＵＳＡＲ）を使用したＴｏｗｎｅ  β２．７アンチセンスＲＮＡの熱力学的プロファイリングにより、相補鎖のドメインＤ１〜Ｄ４に対応する、熱力学的に保存された構造サブドメインＤ１ＡＳ〜Ｄ４ＡＳを特定した。ｂ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写センス（Ｔ７）またはアンチセンス（ＳＰ６）全長β２．７  ＲＮＡをトランスフェクトし、ミトコンドリア取り込みを、ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよび左から右へ（Ｄ１〜Ｄ４についての）ドメイン特異的プライマーを使用して定量した。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。ｃ）ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して検出される、全長β２．７アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＳＤＤＣのミトコンドリア局在化。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｄ）ｒｔＲＴ−ＰＣＲおよびドメイン特異的プライマーを使用して測定した、全長β２．７  ＲＮＡ、全長β２．７アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＳＤＣのミトコンドリア局在化。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ａ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｂ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｃ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｄ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｅ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｆ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｇ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｈ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｉ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｊ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図３ｋ】図３は、ミトコンドリアＧＦＰ発現を誘発する、ＧＦＰ  ｍＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介ミトコンドリア標的化の結果を示す。ａ）β２．７−ＧＦＰ融合構築物および対照の設計。β２．７  ＲＮＡ配列を、ゲノム開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｇＧＦＰ）またはミトコンドリア開始および停止コドンを伴うＧＦＰ配列遺伝子（ｍｔＧＦＰ）のいずれかと融合した。ＧＦＰ配列への融合に際してβ２．７  ＲＮＡのサブドメインＤ１〜Ｄ４の構造を保存するために、スペーサー配列を設計し、挿入した。任意の細胞質ｍｔＧＦＰを核に標的化するために、ｍｔＧＦＰタンパク質を核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合させた構築物を設計した。ＧＦＰタンパク質またはＧＦＰ−ＮＬＳ融合体のみが翻訳されるように、各々の核またはミトコンドリア翻訳停止コドン（三角形により示される）を、各々のＧＦＰまたはＮＬＳ配列の下流に入れた。ｂ）ｍｆｏｌｄにより予測されるＲＮＡ二次構造を使用したスペーサー配列の機能性を示す例。ＧＦＰ  ｍＲＮＡとβ２．７  ＲＮＡとの間にスペーサーを挿入すると、β２．７  ＲＮＡサブドメインＤ２およびＤ３が復元される。ｃ）β２．７陰性対照または親β２．７  ＲＮＡと比較した、β２．７融合ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性。ｄ）ＨｅｐＧ２細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア局在化をモニターした。データは、３回の独立した実験の平均値を示す（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）〜ｆ）散布図およびヒストグラムシフトを含む、フローサイトメトリー分析。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ＿β２．７融合ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡベクターをトランスフェクトし、ＧＦＰ発現を３日目にモニターした。ｈ）フローサイトメトリーデータの要約。幾何平均、ＧＦＰ陽性細胞の割合およびメジアンを示す。データは、３回の独立した実験を表す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定およびスチューデントｔ検定）。ｉ〜ｋ、ＨｅｐＧ２細胞に、ＮＬＳ（＋）またはＮＬＳ（−）ＧＦＰ−β２．７  ＲＮＡ融合構築物をトランスフェクトし、共焦点顕微鏡像におけるＧＦＰ発現およびミトコンドリア染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）の共局在化を分析し、ＩｍａｇｅＪアルゴリズム  ＪＡＣＯＰ：ｉ、ピアソン係数；ｊ、マンダース係数（Ｍａｎｄｅｒ’ｓ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）；およびｋ、オーバーラップ係数を使用した３つの異なる方法で示した。各５つの代表的な画像を分析した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図４ａ】図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【図４ｂ】図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【図４ｃ】図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【図４ｄ】図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【図４ｅ】図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【図４ｆ】図４は、アンチセンスＲＮＡのβ２．７  ＲＮＡ媒介送達が、ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８のノックダウンを誘発し得ることを示す。ａ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ミトコンドリア遺伝子ｍｔＡＴＰ６およびｍｔＡＴＰ８を標的化する、コンピュータ選択非構造化アンチセンスＲＮＡの最小自由エネルギー（ＭＦＥ）二次構造。ｂ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡおよび対照の設計。スペーサーＳ６およびＳ８は、β２．７  ＲＮＡへの融合に際して、アンチセンスＲＮＡドメインが開放したままであることを確実にする。ｃ）ｍｆｏｌｄにより予測される、ａｓＡＴＰ６＿β２．７およびβ２．７＿ａｓＡＴＰ８融合ＲＮＡのＭＦＥ構造。ｄ）β２．７＿アンチセンス融合ＲＮＡ（ａｓＡＴＰ６またはａｓＡＴＰ８）または対照ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ｍｔＡＴＰ６またはｍｔＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウン。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｅ）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用して検出した、ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルの低減。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。ｆ、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ細胞生存アッセイにより決定した、ＲＮＡトランスフェクション２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞生存。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、ダネットの多重比較検定）。
【図５ａ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｂ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｃ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｄ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｅ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｆ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｇ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図５ｈ】図５は、β２．７  ＲＮＡサブドメイン２および３の明確なタンデム反復が、ミトコンドリア取り込みの向上を示し、ミトコンドリア複合体Ｉを保護し得ることを示す結果を示す。ａ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示し、ｂ）は、ｍｆｏｌｄにより予測される、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）タンデム反復のＭＦＥ構造の模式図を示す。スペーサーｓ１〜ｓ４は、タンデム反復構築物Ｄ２Ｘ４およびＤ３Ｘ４のサブドメインＤ２およびＤ３の構造を安定化するために使用した。ｄ）は、ドメイン２（Ｄ２Ｘ４）もしくは３（Ｄ３Ｘ４）の四量体反復、それらの組合せ（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）またはドメイン３／２反復（（Ｄ３＿Ｄ２）Ｘ４）を含む構築物の例示的な略図を示す。ｃ）は、メジアンＣＴ比を示す線グラフを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを連続希釈し、逆転写し、ｒｔＰＣＲに供して、各希釈についてのＣＴ比を決定した。各標準曲線は、１０４個の分子まで有効に検出した。Ｅ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、ドメイン２または３単量体または四量体のミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。Ｆ）は、ｒｔＲＴ−ＰＣＲにより決定される、トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における、親β２．７  ＲＮＡに対する、様々なタンデム反復ＲＮＡのミトコンドリア取り込みの相対的取り込みレベルを示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイを使用した細胞生存染色の結果を示し、これによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたはプラスミド発現ベクターをトランスフェクトした後の２００μＭロテノン処理２４時間（ｇ））または４８時間（ｈ））に対する、ミトコンドリア複合体Ｉの保護をモニターする。データは、非処理対照に対して正規化した。Ｅ）〜Ｈ）で示すデータは、３回の独立した実験の平均＋標準偏差として示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。
【図６】図６は、組換え核酸のミトコンドリア送達のためのＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ由来配列／構造（ｍβ２．７）を使用する模式図の例を示す。ｍβ２．７は、全長β２．７  ＲＮＡ、その構造サブドメイン、β２．７  ＲＮＡの反復のいずれかであり得る。ａ）は、組換え非コードまたはコードＲＮＡの５’末端へのｍβ２．７の融合を示す。ｂ）は、組換え非コードまたはコードＲＮＡの３’末端へのｍβ２．７の融合を示す。ｃ）は、二本鎖ＤＮＡ（遺伝子）に対する相補的塩基対形成、すなわち、結合ドメインを介したｍβ２．７の結合を示す。ｄ）は、環状一本鎖ＤＮＡまたは組換えミトコンドリアゲノムへの相補的結合ドメイン（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を介したｍβ２．７の連結を示す。ｅ）は、ｄ）で示される相補的結合ドメインを介したｍβ２．７の連結を示すが、ｓｓＤＮＡを酵素的に、ｄｓＤＮＡに変換し、ライゲーションした。ｆ）は、ｄ）で示される相補的結合ドメインを介したｍβ２．７の連結を示すが、２つまたはそれよりも多いｍβ２．７  ＲＮＡを環状ｓｓＤＮＡに連結している。
【図７】図７は、本発明で使用するｐＶＡＸ１ベクターの模式的マップを示す。ｐＶＡＸ１ベクターに構築物をクローニングするために、ＮｄｅＩおよびＢｃｌＩ部位を使用した。
【図８】図８は、２ステップで行った、単一ドメイン欠失構築物を生成するために使用した重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ  ＰＣＲ：ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の模式図を示す。第１のステップでは、欠失ドメイン（ΔＤ）の上流の領域を、ＮｈｅＩ部位を有する通常のフォワードプライマーと、ΔＤの下流の領域にプライミング部位を導入するＯＥリバースプライマーとを使用してＰＣＲ増幅する。続いて、ΔＤの下流のドメインを、ΔＤの上流の領域にプライミング部位を導入するＯＥフォワードプライマーと、ＢａｍＨＩ部位を有する通常のリバースプライマーとを使用してＰＣＲ増幅する。両方のＰＣＲ産物をその後、ゲル精製し、等モル量で共に混合し、その後ＰＣＲで再増幅すると、ＯＥが導入したプライミング部位は、それらの各々の対応物のプライマーとして作用し、これにより所望の欠失を有する全長構築物を得た。
【図９】図９は、単一ドメイン構築物の合成およびクローニング策を概略する模式図を示す。ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するために、それぞれ、フォワードおよびリバースプライマーを設計した。ＰＣＲ産物を続いて、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、精製し、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＶＡＸ１ベクターにクローニングした。
【図１０】図１０は、ミトコンドリアＧＦＰ送達を試験するために使用した様々な構築物の略図を示す。ミトコンドリア特異的ＧＦＰ発現を促進するために、ゲノム開始および停止コドンを、ミトコンドリア特異的開始（ＡＴＡ）および停止コドンに（それぞれ）ＰＣＲ改変した。
【図１１】図１１は、核局在化配列（ＮＬＳ）のＰＣＲ導入の略図を示す。ＮＬＳ配列を、フォワードおよびリバースプライマーを使用してＰＣＲによりｐＥＢＦＰ−ＮＵＣプラスミドからＰＣＲ増幅し、停止コドン（ＡＧＡ）の上流に挿入した。
【図１２】図１２は、ドメイン２およびドメイン３タンデム反復配列を合成するために使用したクローニング策の略図を示す。ＰＣＲプライマーを使用して、個々のコピーを最初に４組合成した。特定のタンデム反復についての全てのプライマーは、同じ結合領域を共有するので、特定のタンデム反復についての全ての組について、Ｔｍは同じである。各組は、図においてＳ１〜Ｓ４で示す、それ自体のスペーサーの組を有する。ある組の３’末端の部位が、タンデム反復内の次の組の５’末端の部位に一致するように、制限酵素部位を選択した。使用した制限酵素部位は、ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＡｇｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩであった。ＰＣＲ後、産物をＰＣＲ精製し、それらの各々の制限酵素部位で消化した。消化したＰＣＲ産物をその後、等モル量の消化したベクター骨格中で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。
【図１３】図１３は、Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４およびＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４の合成策の略図を示す。ドメイン２タンデム反復（Ｄ２Ｘ４）を、Ｄ２Ｘ４を有するｐＶＡＸ１ベクターからＰＣＲ増幅した。より短い断片の増幅を防ぐために、プライマーの結合領域の大部分がベクター骨格それ自体上にあるように、プライマーを設計した。プライマーの各々は、いずれかの末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を消化し、Ｄ３Ｘ４配列を有するｐＶＡＸ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内に再ライゲーションした。ベクターの再ライゲーションを防ぐために、消化したベクターをアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。図１３の第２の部分は、Ｄ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４に使用した策の略図を示す。同様に、ドメイン３タンデム反復（Ｄ３Ｘ４）を、Ｄ３Ｘ４を有するｐＶＡＸ１ベクターからＰＣＲ増幅した。用いたプライマー設計策は、上記に概略するドメイン２タンデム反復（Ｄ２Ｘ４）に使用したものと同じであった。ＰＣＲ産物を消化し、Ｄ２Ｘ４配列を有する脱リン酸化したｐＶＡＸ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内に再ライゲーションした。
【図１４】図１４は、（Ｄ３＿Ｄ２）ｘ４を合成するために使用した策の略図を示す。第１のステップでは、Ｄ３ｘ４の第１のＤ３を、同じ制限酵素部位を使用してＤ２Ｘ４の第１の反復位置にクローニングした。第２のステップでは、Ｄ３ｘ４の第３のＤ３を、同じ制限酵素部位を使用してＤ２Ｘ４の第３の位置にクローニングした。このようにして得たステップ２の生成物をその後、いずれかの末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をその後、ステップ２の生成物の下流にライゲーションした。
【図１５】図１５は、アンチセンスＲＮＡが標的化する配列を単離するために使用した策の略図を示す。ミトコンドリアＲＮＡを、遺伝子特異的リバースプライマー配列（ＡＴＰ６ＲｖおよびＡＴＰ８Ｒｖ）で逆転写して、ファーストストランド（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ＡＴＰ６およびＡＴＰ８  ｃＤＮＡプールを得た。続いて、これらのプールを、ＰＣＲの鋳型として使用して、標的エレメントを表す二本鎖ＤＮＡ配列を得た。
【図１６】図１６は、ＡＴＰ６＿β２．７を合成するために使用した策の略図を示す。ＡＴＰ６標的配列を、ＰＣＲにより再増幅して、β２．７＿ｐＶＡＸ１配列中の向きとは反対向きの制限酵素部位を導入した。得られた産物を、ＮｈｅＩおよびＢｓｐｅＩで消化し、その後β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクター骨格にライゲーションして、ＡＴＰ６＿Ｎｏスペーサー＿β２．７を得た。生成物を、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩでの消化によりスクリーニングした。続いて、スペーサー配列を、２ステップｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりこの構築物の下流に導入した。第１のステップでは、β２．７の断片（β２．７Ｆ）を、通常のフォワードプライマーと、スペーサー配列の一部（ＳＦ１）を導入するリバースプライマーとでＰＣＲ増幅した。次のステップでは、ステップ１の産物を、ステップ１と同じフォワードプライマーと、ＳＦ１に結合し、残りのスペーサー配列（ＳＦ２）およびクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位を同時に導入するリバースプライマーとでＰＣＲ増幅した。これは、スペーサー配列を再構成した。ステップ２のＰＣＲ産物を、ＡＴＰ６＿Ｎｏスペーサー＿β２．７にクローニングして、ＡＴＰ６＿β２．７を得た。
【図１７】図１７は、β２．７＿ＡＴＰ８構築物を生成するために使用した策の略図を示す。精製したＡＴＰ８標的配列を、リバースプライマーでＰＣＲ増幅し、これによりＳｐｅＩ部位を導入した。同時に、ＰＣＲによりβ２．７から断片を増幅し、得られた産物は、５’末端および３’末端に、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有した。β２．７  ＰＣＲ産物およびＡＴＰ８  ＰＣＲ産物を、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで単独消化し、等モル量で混合し、２２℃で４時間ライゲーションした。ＳｐｅＩ部位は、２塩基充填によりＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションすることができ、これにより有効に両方の部位が破壊される。ライゲーション後、アンチセンスＡＴＰ８配列に融合したβ２．７断片を有する、正確なサイズの生成物をゲルから精製した。その後、このライゲーション生成物をＰＣＲ増幅して、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し、β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクター骨格にクローニングし戻して、インタクトな配列を生成した。
【図１８ａ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｂ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｃ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｄ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｅ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｆ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｇ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｈ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｉ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１８ｊ】図１８は、ミトコンドリアに局在し、高効率の機能的ＭＴ−ＡＴＰ６ノックダウンを誘発するＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスタンデム反復融合ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のデータおよび模式図を示す。ａ）は、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４融合ＲＮＡ（上部パネル）およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ｍｆｅ構造（下部パネル）の略図を示す。ｂ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＡＴＰ６＿ｐＶＡＸ、ＡＴＰ６＿β２．７およびＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。ｃ）は、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウェスタンブロットの結果を示す。トランスフェクション２４時間後に、ＡＴＰ６タンパク質レベルをウェスタンブロット分析によりモニターした。Ｍｔ−ＣＯＸＩＩ（チトクロームｃオキシダーゼポリペプチドＩＩ）をミトコンドリアローディング対照として使用した。ｄ）は、対照ＲＮＡと共に、アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルの低減を示す棒グラフを示す。ＡＴＰレベルの低減は、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ−Ｇｌｏアッセイを使用してトランスフェクション２４時間後に決定した。データ組の正規化のために、細胞のみの対照を使用した（ダネットの多重比較検定）。ｅ）は、等モル量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡの臭化エチジウム非含有アガロースゲル電気泳動の像を示す。ｆ）は、フルオレセイン標識ＲＮＡのウラシル比に対する蛍光強度を示す棒グラフを示す。ｇ）およびｈ）は、フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２（ｈ））細胞いずれかのマンダースオーバーラップ係数を示す。フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ−Ｏｒａｎｇｅ染色ミトコンドリアとの共局在化を、共焦点顕微鏡像からＩｍａｇｅＪアルゴリズムＪＡＣＯＰを使用して定量した。マンダースオーバーラップ係数により表される共局在化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ（ｉ））およびＨｅｐＧ２（ｊ））においてマンダースオーバーラップ係数に対して強度を調節したＲＮＡ標識を示す。５つの像を分析に使用した（テューキーの多重比較検定）。データは、５つの代表的な像の各平均±ＳＤを示す。ｇ）およびｈ）中のデータの有意性を、一元配置分散分析を使用してダネットの多重比較検定で検定した。ｉ）およびｊ）中のデータの有意性を、テューキーの多重比較検定を使用して検定した。
【図１９ａ】図１９は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ａ）またはＨｅｐＧ２（ｂ）細胞に、フルオレセイン−１２ウラシル標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし（緑色）、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色し（青色）、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで染色した（赤色）ことを示す。トランスフェクトしたＲＮＡとミトコンドリアとの共局在化を、重ね合わせた像で黄色シグナルにより示す。
【図１９ｂ】図１９は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ａ）またはＨｅｐＧ２（ｂ）細胞に、フルオレセイン−１２ウラシル標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし（緑色）、核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色し（青色）、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒで染色した（赤色）ことを示す。トランスフェクトしたＲＮＡとミトコンドリアとの共局在化を、重ね合わせた像で黄色シグナルにより示す。
【図２０】図２０は、タンデム反復ＲＮＡの最小自由エネルギー（ｍｆｅ）構造、すなわち、（Ｄ２）４、（Ｄ３）４、（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４、（Ｄ２）４＿（Ｄ３）４および（Ｄ３＿Ｄ２）４を示す。これらの構造は、ｍｆｏｌｄにより予測される通りである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
用語の定義
「ネイキッド核酸」という用語は、非ウイルスまたはウイルスベクターとは対照的に、例えば細胞から細胞への移行または核酸配列での細胞の形質転換中に起こる、任意の他の化合物とも、ヒストン、タンパク質、脂質、糖、ナノ粒子構造、ウイルスキャプシドまたはエンベロープ核酸とも複合体形成していない核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を指す。
【００３３】
「コード／非コード核酸配列」という用語は、コードおよび非コード核酸配列の両方を指す。非コード核酸（すなわち、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）は、タンパク質に翻訳されない核酸分子である。逆に、コード核酸分子は、タンパク質に翻訳される核酸分子である。例えば、ＲＮＡについて使用する場合、これらの非コードＲＮＡは、非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｐｃＲＮＡ：ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、非メッセンジャーＲＮＡ（ｎｍＲＮＡ：ｎｏｎ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）および機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ）とも呼ばれる。例えば、機能的非コードＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列は多くの場合、ＲＮＡ遺伝子として公知である。非コードＲＮＡ遺伝子の例として、非常に豊富で、かつ機能的に重要なＲＮＡ、例えばトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ：ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ：ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）ならびに核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡまたはＵ−ＲＮＡ）、エクソソーム／細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ：ｅｘｏｓｏｍａｌ／ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ：Ｐｉｗｉ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ＲＮＡ）、カハール小体ＲＮＡ遺伝子（ｓｃａＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  Ｃａｊａｌ  ｂｏｄｙ  ＲＮＡ）および長鎖非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ：ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡまたはｌｎｃＲＮＡ：ｌｏｎｇ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）などのＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されず、非限定的にＸ不活性特異的転写産物（Ｘｉｓｔ：Ｘ−ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）およびＨＯＸ転写産物アンチセンスＲＮＡ（ＨＯＴＡＩＲ：ＨＯＸ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）などの例を含む。ヒトゲノムにコードされている非コードＲＮＡの数は未知であるが、しかしながら、トランスクリプトームおよびバイオインフォマティクス研究から、数千の非コードＲＮＡの存在が示唆されている。新たに特定された非コードＲＮＡの多くは、それらの機能について立証されていないので、多くは非機能性である可能性がある。また、多くの非コードＲＮＡは非機能性であり（多くの場合「ジャンクＲＮＡ」と呼ばれる）、偽性転写の結果であるようである。
【００３４】
「センス」および「アンチセンス」という用語は、他の核酸分子に対して、核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの極性を比較するために使用される概念を指す。文脈によって、これらのセンスおよびアンチセンス分子は、核酸配列の通常の５’〜３’命名規則と比較して異なる分子を指し得る。例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）において、ＤＮＡの一本鎖は、同じ配列のＲＮＡ変形がタンパク質に翻訳されるか、または翻訳可能である場合、センス鎖（または正（＋）鎖）と呼ばれ得る。この正ＤＮＡ鎖に相補的な鎖は、アンチセンス（または負（−）鎖）と呼ばれる。これは、上記に定義する、コードおよび非コード核酸配列の概念と混同するべきではない。例として、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の２つの相補鎖は通常、「センス」鎖および「アンチセンス」鎖として区別される。ＤＮＡセンス鎖は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）のようであり、予期されるタンパク質コードを読むために使用することができる。例えば、センスＤＮＡのＡＴＧは、ｍＲＮＡのＡＵＧコドンに対応し、アミノ酸メチオニンをコードし得る。しかしながら、ＤＮＡセンス鎖それ自体は、細胞がタンパク質を製造するために使用されない。ＤＮＡアンチセンス鎖は、ＤＮＡセンス鎖に相補的な塩基を有し、ｍＲＮＡの鋳型として使用されるので、タンパク質コード源として働くのはＤＮＡアンチセンス鎖である。転写は、ＤＮＡ鋳型鎖に相補的なＲＮＡ産物をもたらすので、ｍＲＮＡは、ＤＮＡアンチセンス鎖に相補的である。ｍＲＮＡは、翻訳（タンパク質合成）に使用されるものである。ＲＮＡの例では、アンチセンスＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ配列（または転写産物）である。言い換えると、それは、ＲＮＡのコード配列に相補的な非コード鎖である。例えば、アンチセンスＲＮＡをコードする導入遺伝子を導入することは、目的の遺伝子の発現をブロックするために使用される技術である。
【００３５】
発明の詳細な説明
全ての真核生物で見られる二重膜結合細胞小器官であるミトコンドリアは典型的に、全ての生存真核細胞においてＡＴＰ産生と関連付けられる。しかしながら、呼吸サイクルの部分を形成する酵素の欠陥は、例えば、ミトコンドリアゲノムへのアクセスが困難であるために治療が困難であり得るミトコンドリア関連疾患をもたらす。それゆえ、例えばミトコンドリアゲノムにおける欠陥と関連付けられるかかる疾患を治療するために、本開示は、例えば、ミトコンドリアへの標的化および共局在化についてのヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの性質を使用する、ミトコンドリアへのＲＮＡの標的化送達のための、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）β２．７  ＲＮＡ内のＲＮＡ配列のサブドメインおよび組合せを特定する。したがって、例えば、組換えミトコンドリア遺伝子発現をもたらす、ミトコンドリアへの組換えコードＲＮＡのミトコンドリア送達を、本明細書で開示する。また、例えば、ミトコンドリア遺伝子発現の機能的ノックダウンを誘発する、ミトコンドリアへの非コードアンチセンスＲＮＡのミトコンドリア送達を、本明細書で開示する。特定した配列は、例えば、神経変性疾患もしくは他のミトコンドリア関連疾患においてミトコンドリア機能不全を抑制するための、もしくはミトコンドリア遺伝子機能を復元するための遺伝子療法における使用のため、または抗老化目的のためである。
【００３６】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの５’末端部分、いわゆるｐ１３７  ＲＮＡは、ミトコンドリア複合体Ｉ保護複合体Ｉ活性と共局在化することが示されているが、しかしながら、機能的コードまたは非コードＲＮＡが、β２．７  ＲＮＡ配列を使用して送達されたことはまだない。ミトコンドリアへの組換え核酸の送達を可能にするベクターシステムの作製は、例えばミトコンドリア関連の、まだ不治のヒト疾患の遺伝子療法を可能にする。ヒトサイトメガロウイルスに由来する明確な非コードＲＮＡ、いわゆるβ２．７  ＲＮＡは、哺乳動物細胞のミトコンドリアに局在化し、ミトコンドリア複合体Ｉに結合することが分かった。したがって、一例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはそれらの組合せを含む。別の例では、核酸送達システムは、ＲＮＡを含む。別の例では、核酸送達システムは、ＤＮＡを含む。
【００３７】
したがって、一例では、本発明は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つのセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインを含み、各サブドメインが、ミトコンドリア内に局在化することができる、核酸送達構築物に関する。別の例では、核酸送達構築物は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つのセンスＲＮＡサブドメインを含む。別の例では、核酸送達構築物は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡサブドメインを含む。また別の例では、核酸送達構築物は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの１つまたは複数のセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインを含む。
【００３８】
本明細書で開示する核酸送達構築物は、いくつかのセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインを含み得る。一例では、核酸送達構築物のサブドメインの数は、１〜１０個の間のサブドメイン、５〜１５個の間のサブドメイン、１２〜２２個の間のサブドメインまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６個のサブドメインであるが、これらに限定されない。言い換えると、本開示に記載の核酸送達構築物は、１〜１０個の間のＲＮＡ配列、５〜１５個の間のＲＮＡ配列、１２〜２２個の間のＲＮＡ配列または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６個のＲＮＡ配列を含む。
【００３９】
本開示は、ミトコンドリアへの標的化送達のためのＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ内のＲＮＡ配列の特定に関する。すなわち、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡは、細胞に導入されると、ミトコンドリアを探し出し、ミトコンドリアに入り、その結果、上記細胞の細胞質では見られない。同じことは、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡのＲＮＡサブドメインの各々についても言える。特定したＲＮＡ配列は、４つの熱力学的に保存された構造サブドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）からなる。これらのサブドメインから、ＲＮＡ配列のタンデム反復および組合せを構築する。タンデム反復は、機能的に関連するドメイン、例えばドメイン２（Ｄ２Ｘ４）およびドメイン３（Ｄ３Ｘ４）から構築し、そのうち例えばドメイン３（Ｄ３Ｘ４）は、高いミトコンドリア局在化可能性を示す。タンデム反復の組合せは、例えば（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４）として構築し、（Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４）は、最も高いミトコンドリア標的化可能性を示す。ドメイン１および４は、アンチセンス転写産物について同様の構造を示し、アンチセンスドメインＡＳ１およびＡＳ４は、実質的なミトコンドリア局在化可能性を示す。ミトコンドリアへの、コードＲＮＡを伴うＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ由来配列の送達は、組換えミトコンドリア遺伝子発現をもたらす。例えば、ドメインＤ３およびＤ２の二重四量体（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４）は、野生型β２．７  ＲＮＡより高い効率でミトコンドリア複合体Ｉを保護する。
【００４０】
したがって、一例では、各サブドメインがミトコンドリア内に局在化することができるが、細胞質に局在化しない核酸配列は、本明細書で開示する通りである。
【００４１】
ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの５’末端であるヒトサイトメガロウイルスｐ１３７  ＲＮＡの単離したＲＮＡ配列を、本明細書で開示する。このヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡ配列の５’末端は、それぞれＤ１〜Ｄ４と命名された４つの熱力学的に保存された構造サブドメインからなり、それらの各々は、細胞のミトコンドリアを標的化することができる。したがって、一例では、本明細書で開示する核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡ（配列番号１または配列番号２）、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（Ｄ２；配列番号４または配列番号８）、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）、β２．７  ＲＮＡのドメイン４（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）およびそれらの組合せであるが、これらに限定されない、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列を含む。一例では、核酸送達構築物は、本明細書で開示する１種類のＲＮＡ配列を含む。ＲＮＡ配列の種類の例は、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ｔＲＮＡ由来ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ：ｔＲＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ）、小ｒＤＮＡ由来ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｒＤＮＡ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）およびトランスファー−メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ：ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）であるが、これらに限定されない。一例では、核酸送達構築物は、センスＲＮＡを含む。別の例では、核酸送達構築物は、アンチセンスＲＮＡを含む。さらなる例では、核酸送達構築物は、センスおよびアンチセンスＲＮＡの組合せを含む。別の例では、核酸送達構築物は、本明細書で開示するＲＮＡ配列の組合せを含む。また別の例では、核酸送達構築物は、本明細書で開示するＲＮＡ配列の組合せを含み、核酸送達構築物は、単一のＲＮＡ配列の多数の反復を含み得る。別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡの全長配列（配列番号１（センス））を含む。別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡの全長配列（配列番号２（アンチセンス））を含む。また別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（配列番号３（センス））を含む。また別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（配列番号７（アンチセンス））を含む。さらなる例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（配列番号４（センス））を含む。一例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（配列番号８（アンチセンス））を含む。別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（配列番号５（センス））を含む。また別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（配列番号９（アンチセンス））を含む。さらなる例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン４（配列番号６（センス））を含む。一例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン４（配列番号１０（アンチセンス））を含む。別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン２、ドメイン３およびドメイン４（配列番号１１（センス）または配列番号３９（アンチセンス））を含む。さらなる例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン１、ドメイン３およびドメイン４（配列番号１２（センス）または配列番号４０（アンチセンス））を含む。さらなる例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン１、ドメイン２およびドメイン４（配列番号１３（センス）または配列番号４１（アンチセンス））を含む。別の例では、核酸送達構築物は、β２．７  ＲＮＡのドメイン１、ドメイン２およびドメイン３（配列番号１４（センス）または配列番号４２（アンチセンス））を含む。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウィンドウにわたり同一であるか、またはいくつかの同一の残基（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたは残基対残基に基づいて）を有する状況を指す。「配列同一性の割合」という用語は、２つの最適に整列させた配列を比較ウィンドウにわたり比較し、同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果を１００倍して、配列同一性の割合を算出することにより計算される。「配列同一性」という用語は、本明細書で使用するとき、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸が、少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも２４〜４８個のヌクレオチド（８〜１６個のアミノ酸）位置のウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む場合があり、配列同一性の割合が、比較ウィンドウにわたり参照配列の全部で２０パーセントまたはそれ未満である欠失または付加を含み得る配列に対して参照配列を比較することにより計算される、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示す。参照配列は、１サブセットのより大きな配列であり得る。したがって、別の例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、ＲＮＡ配列が、本明細書で開示するＲＮＡ配列のうちの１つまたは複数の７０％〜９９％の間の、７５％〜８５％の間の、７８％〜８８％の間の、８０％〜８９％の間の、約９０％の、約９１％の、約９２％の、約９３％の、約９４％の、約９５％の、約９６％の、約９７％の、約９８％の、または約９９％の配列同一性を有する、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列を含む。一例では、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡからのＲＮＡ配列が、β２．７  ＲＮＡ（配列番号１または配列番号２）、β２．７  ＲＮＡのドメイン１（Ｄ１；配列番号３または配列番号７）、β２．７  ＲＮＡのドメイン２（Ｄ２；配列番号４または配列番号８）、β２．７  ＲＮＡのドメイン３（Ｄ３；配列番号５または配列番号９）、β２．７  ＲＮＡのドメイン（Ｄ４；配列番号６または配列番号１０）およびそれらの組合せであるが、これらに限定されない、ＲＮＡ配列のうちの１つまたは複数の約９０％の、約９１％の、約９２％の、約９３％の、約９４％の、約９５％の、約９６％の、約９７％の、約９８％の、または約９９％の配列同一性を有する核酸送達構築物は、本明細書で開示する通りである。
【００４３】
また、本明細書で開示する核酸送達構築物は、核酸配列中に１つまたは複数の変化をさらに含み得る。一例では、かかる変化は、ＲＮＡ配列中の突然変異である。別の例では、核酸送達構築物は、１つまたは複数の非構造的突然変異を含む。また別の例では、核酸送達構築物は、１つまたは複数の構造中立突然変異を含む。本明細書で使用するとき、「非構造的突然変異」または「構造中立突然変異」という用語は、核酸配列の配列を変化させるが、突然変異していない配列と比較して突然変異した配列の機能的構造を保存している核酸配列中の突然変異を指す。
【００４４】
これらのサブドメインから、ＲＮＡ配列のタンデム反復および組合せを構築する。本明細書で使用するとき、「タンデム反復」という用語は、１つまたは複数のヌクレオチドのパターンが反復しており、反復が互いに直接隣接している、核酸配列内の区分を指す。例えば、一列に３回反復しているＡＴＧＧＣの配列は、したがってＡＴＧＧＣ  ＡＴＧＧＣ  ＡＴＧＧＣを含む配列をもたらし、タンデム反復であると理解される。本明細書で開示する発明に基づいて、配列を、機能的ＲＮＡドメインから、すなわち、サブドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３またはＤ４のいずれかから構築する。かかる構築したドメインの例は、ドメイン２（ドメイン２の４回反復、言い換えると、Ｄ２Ｘ４）およびドメイン３（ドメイン３の４回反復、言い換えると、Ｄ３Ｘ４）であるが、これらに限定されない。したがって、一例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、単一ドメインの二つ組（２）、三つ組（３）、四つ組（４）、五つ組（５）、六つ組（６）、七つ組（７）、八つ組（８）またはより長い反復が挙げられるが、これらに限定されない、本明細書で開示するＲＮＡ配列の組合せおよび／または多数を含む。言い換えると、本明細書で開示するＲＮＡ配列の組合せおよび／または多数として、単一ドメインの二量体、三量体、四量体または多量体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「スペーサー」という用語は、構築物内で、核酸配列の５’もしくは３’末端のいずれかに、または核酸配列の両方の末端に挿入される、核酸配列を指す。スペーサーは、例えばＲＮＡ配列中の核酸配列の構造的完全性が残ることを確実にするために、核酸配列内の規定の位置に挿入される。これは、ＲＮＡ配列の機能または特徴、例えば核酸構築物のミトコンドリア標的化能力の保持を確実にする。また、スペーサーは、任意の立体効果が起こるのを防ぐように、かつ核酸配列がその天然の三次構造を達成することができるように機能し、また、これによりその機能の保持を促進する。したがって、一例では、本明細書で開示する核酸送達構築物は、１〜１０個の間の、５〜１５個の間の、８〜２４個の間の、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、約６個の、約７個の、約８個の、または約９個のスペーサー配列を含む。一例では、核酸送達構築物は、約６個のスペーサー配列を含む。別の例では、核酸送達構築物は、約７個のスペーサー配列を含む。また別の例では、核酸送達構築物は、約８個のスペーサー配列を含む。さらなる例では、核酸送達構築物は、約９個のスペーサー配列を含む。
【００４６】
上記に示すように、スペーサー配列は、核酸配列内のいずれの箇所にも入れることができる。例えば、スペーサーは、ＲＮＡ配列の開始（すなわち、５’末端）に見られ得る。また、スペーサーは、ＲＮＡ配列の末端（すなわち、３’末端）に見られ得る。また、１個を超えるスペーサーを使用する場合、これらのスペーサーは、ＲＮＡ配列の５’および３’末端の両方に見られ得る。したがって、一例では、核酸送達構築物が、少なくとも２個またはそれよりも多いスペーサーを含む場合、少なくとも１個のスペーサー配列は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡのＲＮＡ配列の５’末端にあり、少なくとも１個の他のスペーサー配列は、３’末端にある。
【００４７】
スペーサーの長さは、例えば、スペーサーが果たすことが意図される特定の機能により規定される。例えば、スペーサーの機能が、２つまたはそれよりも多いＲＮＡ配列間の立体障害を防ぐことである場合、このスペーサーは、得られるＲＮＡ構造のサイズによって、数十〜数百ヌクレオチドの長さであり得る。言い換えると、本発明で開示するスペーサー配列は、隣接するＲＮＡサブドメイン間で任意の立体障害が生じることを防ぐのに十分長く、かつ／またはスペーサー配列の長さは、隣接するＲＮＡサブドメインが、それらの熱力学的に好ましい構造に折り畳まれることを可能にするのに十分長い。そうは言っても、当業者は、スペーサー長が、本明細書で開示する核酸送達システムで開示する少なくとも１つのセンスまたはアンチセンスＲＮＡサブドメインの長さ、構造および組合せ（複数可）に依存することを理解し得る。一例では、スペーサー配列は、長さが５〜４０ヌクレオチドの間、５〜３０ヌクレオチドの間、６〜１０ヌクレオチド、８〜１４ヌクレオチドの間、１５〜２０ヌクレオチドの間、２２〜２８ヌクレオチドの間、２５〜３７の間、２８〜３９ヌクレオチドの間、約７ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２７ヌクレオチド、約２９ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約３４ヌクレオチド、約３６ヌクレオチドである。一例では、スペーサー配列は、５ヌクレオチド長である。別の例では、スペーサー配列は、６ヌクレオチド長である。また別の例では、スペーサー配列は、１３ヌクレオチド長である。さらなる例では、スペーサー配列は、１７ヌクレオチド長である。一例では、スペーサー配列は、２４ヌクレオチド長である。また別の例では、スペーサー配列は、３２ヌクレオチド長である。
【００４８】
一例では、スペーサー配列は、Ｓ１ａ（配列番号２６）、Ｓ１ｂ（配列番号２７）、Ｓ２ａ（配列番号２８）、Ｓ２ｂ（配列番号２９）、Ｓ３ａ（配列番号３０）、Ｓ３ｂ（配列番号３１）、Ｓ４ａ（配列番号３２）、Ｓ４ｂ（配列番号３３）、Ｓ６ａ（配列番号３４）、Ｓ６ｂ（配列番号３５）、Ｓ８ａ（配列番号３６）、Ｓ８ｂ（配列番号３７）およびスペーサーＦ３Ａ（配列番号３８）ならびにそれらの組合せであるが、これらに限定されない。
【００４９】
また、スペーサー配列は、機能的核酸配列または他の構造モチーフもしくは機能モチーフを含有し得る。例えば、スペーサー配列は任意選択で、停止コドンをさらに含んでもよい。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「核局在化シグナル」または「ＮＬＳ」という用語は、１つまたは複数の追加の分泌シグナルまたはシグナルペプチドをコードする核酸配列を指す。これらの核局在化配列を、核酸配列の５’または３’末端に付加し、これによりペプチドのＣ末端もしくはＮ末端またはＣおよびＮ末端の両方でのかかる核局在化配列の発現をもたらしてもよい。本分野で公知の一例は、新生タンパク質を細胞質から細胞核へ移入するよう方向付ける核局在化配列（ＮＬＳ）の付加である。多くの様々な核局在化配列の変形があり、それらの長さおよび構成は、それらを単離した細胞型に依存する。例えば、ヌクレオプラスミンの核局在化配列は、「ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ」であるが、ｃ−ｍｙｃの核局在化配列は、「ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ」である。したがって、一例では、核酸送達構築物は任意選択で、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。
【００５１】
一例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、式Ｉ：
【００５２】
【化１】
2019514972.tif 000002
に記載のＲＮＡ配列であり、式中、各Ｘは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せであり；各Ｘに任意選択で、本明細書で定義する少なくとも１つまたは複数のスペーサー配列が先行するか、もしくは続くか、または隣接する。言い換えると、一例では、核酸送達システムは、二量体であり、各Ｘは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）またはそれらの組合せであり；各Ｘに任意選択で、本明細書で定義する少なくとも１つまたは複数のスペーサー配列が先行するか、もしくは続くか、または隣接する。
【００５３】
一例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、式ＩＩ：
【００５４】
【化２】
2019514972.tif 000003
に記載のＲＮＡ配列であり、式中、各Ｘは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せであり；スペーサー配列Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ａ、Ｓ３ｂ、Ｓ４ａおよびＳ４ｂは、本明細書で開示する通りである。一例では、Ｘは、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）である。別の例では、Ｘは、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）である。また別の例では、式ＩＩに記載の核酸送達構築物は、配列番号１５または配列番号５１に記載の核酸配列を含む。さらなる例では、式ＩＩに記載の核酸送達構築物は、配列番号１６または配列番号５２に記載の核酸配列を含む。言い換えると、一例では、核酸送達システムは四量体であり、各Ｘは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）またはそれらの組合せであり；各Ｘに任意選択で、本明細書で定義する少なくとも１つまたは複数のスペーサー配列が先行するか、もしくは続くか、または隣接する。
【００５５】
一例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、式ＩＩＩ：
【００５６】
【化３】
2019514972.tif 000004
に記載のＲＮＡ配列であり、式中、ＸおよびＹは、互いに異なり、各Ｘおよび各Ｙは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せであり；スペーサー配列Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ａ、Ｓ３ｂ、Ｓ４ａおよびＳ４ｂは、本明細書で定義する通りである。一例では、Ｘは、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）であり、Ｙは、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）である。別の例では、Ｘは、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）であり、Ｙは、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）である。さらなる例では、式ＩＩＩに記載の核酸送達構築物は、配列番号１７または配列番号５３に記載の核酸配列を含む。別の例では、式ＩＩＩに記載の核酸送達構築物は、配列番号１８に記載の核酸配列を含む。言い換えると、一例では、核酸送達システムは、四量体であり、各ＸおよびＹは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）またはそれらの組合せであり；各ＸおよびＹに任意選択で、本明細書で定義する少なくとも１つまたは複数のスペーサー配列が先行するか、もしくは続くか、または隣接する。
【００５７】
一例では、本明細書で開示する核酸送達システムは、式ＩＶ：
【００５８】
【化４】
2019514972.tif 000005
に記載のＲＮＡ配列の八量体であり、式中、ＸおよびＹは、互いに異なり、各Ｘおよび各Ｙは独立して、非限定的に、Ｄ１（配列番号３または配列番号７）、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）、Ｄ４（配列番号６または配列番号１０）あるいは単一ドメインの二つ組、三つ組、四つ組、五つ組、六つ組、七つ組、八つ組またはより長い反復を含むそれらの組合せであり；スペーサー配列Ｓ１ａ、Ｓ１ｂ、Ｓ２ａ、Ｓ２ｂ、Ｓ３ａ、Ｓ３ｂ、Ｓ４ａおよびＳ４ｂは、本明細書で定義する通りである。一例では、Ｘは、Ｄ３（配列番号５または配列番号９）であり、Ｙは、Ｄ２（配列番号４または配列番号８）である。別の例では、式ＩＩＩに記載の核酸送達構築物は、配列番号１９に記載の核酸配列を含む。
【００５９】
特許請求の範囲の核酸送達システムを送達システムとして機能させるために、核酸配列は、ペイロードをさらに含む必要がある。本明細書で使用するとき、「ペイロード」という用語は、核酸送達システムの配列に挿入される場合があり、その挿入の結果として細胞のミトコンドリアに対して、またはミトコンドリア内で作用する１つまたは複数の核酸配列を指す。ペイロードは、ピラノシル核酸（ｐ−ＲＮＡ：ｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、トレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アラニル核酸（ＡＮＡ：ａｌａｎｙｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、モルホリノホスホルアミデート（ＭＦ：ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）を含む組換え核酸配列、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸、核酸アナログおよび核酸模倣物；ペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、合成ポリマー、低分子量化合物などを含む非核酸ベースの分子であり得るが、これらに限定されない。一例では、組換え核酸配列は、非コード核酸配列、コード核酸配列、一本鎖核酸配列、直鎖状二本鎖核酸配列、アンチセンス核酸配列、センス核酸配列、環状一本鎖核酸配列および環状二本鎖核酸配列であるが、これらに限定されない。別の例では、組換え核酸配列は、完全、天然または組換えミトコンドリアゲノムである。また別の例では、核酸送達構築物は、配列番号２０または配列番号８２のいずれか１つに記載の配列を含む。
【００６０】
さらに、上記ペイロードは、輸送することができるように核酸送達システムに付着させる必要がある。一例では、ペイロードを、核酸送達システムに共有結合により連結させる。別の例では、ペイロードを、核酸送達システムに非共有結合により連結させる。非共有結合性連結は、イオン性相互作用、水素結合もしくはハロゲン結合を含む静電相互作用により、双極子−双極子相互作用、誘起双極子相互作用を含むファンデルワールス力もしくはロンドン分散力により、π−π相互作用、カチオン−もしくはアニオン−π相互作用もしくは極性−π相互作用を含むπ効果により、または疎水性効果により実現することができる。共有結合性連結は、これに反して、原子間の電子対の共有を含む連結である。共有結合または連結の例として、σ結合、π結合、金属−金属結合、アゴスチック相互作用、曲がった結合および三中心二電子結合が挙げられるが、これらに限定されない、多くの種類の相互作用が挙げられる。
【００６１】
例えば、ペイロード輸送の飛行的概念を支配する物理的概念に類似して、当業者は、ペイロードのサイズは、かかるペイロードをその意図される目的地へ運搬するために必要とされる担体（すなわち、核酸送達システム）のサイズを規定することを理解し得る。したがって、一例では、核酸送達構築物の全体のサイズは、ペイロードのサイズに比例する。これは、例えば長さが２００個の核酸のペイロードのための核酸送達システムは、わずか５０個の核酸長であるペイロードの核酸送達システムより４倍大きいことを意味する。逆に、わずか１０個の核酸長のペイロードは、２０個の核酸長のペイロードのための核酸送達システムの半分のサイズの核酸送達システムを利用することができる。したがって、一例では、核酸送達システムは、スケールを変更することができる。別の例では、核酸送達システムは、ペイロードのサイズに従って、またはペイロードのサイズに比例してスケールを変更することができる。
【００６２】
最も活性なＲＮＡ、（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４が、ＭＴ−ＡＴＰ６に方向付けたアンチセンスＲＮＡをミトコンドリアに共送達する可能性を調査した。この目標のために、ＭＴ−ＡＴＰ６アンチセンスＲＮＡを、スペーサーを介して（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４の５’末端に融合し、これにより構築物ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４を生成した。ｍｆｏｌｄでの予測に従って、アンチセンスＲＮＡの開放構造と、（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４内のドメイン構造との両方を保存するように、スペーサーを選択した（図１８ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後のウェスタンブロットを使用して標的遺伝子ノックダウンをタンパク質レベルについてモニターした（図１８ｂ、ｃ）。ＡＴＰ６＿β２．７  ＲＮＡと比較して、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４  ＲＮＡは、ＭＴ−ＡＴＰ６タンパク質の実質的により強いノックダウンを誘発し、細胞ＡＴＰレベルの２．１倍高い低減を引き起こした（図１８ｄ）。このデータは、ミトコンドリア標的化はスケールを変更することができ、標的化ベクターの長さの増大により制限されたり、または損なわれたりしないことを示す。ミトコンドリアＲＮＡ標的化の直接的な証拠を得るために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写中にＲＮＡをフルオレセイン−１２ウラシルで標識し、アガロースゲル電気泳動を使用してＲＮＡの完全性および標識効率を査定した（図１８ｅ）。ソフトウェアＩｍａｇｅＪ  ｖ１．４８を使用してバンド強度を定量し（図１９）、ウラシルカウントまたは長さに対する強度の比を計算した（図１８ｆ）。これらの比は全てのＲＮＡについて同等であり、同様の標識効率を示した。続いて、ＨＥＫ２９３ＴまたはＨｅｐＧ２細胞に、標識したＲＮＡをトランスフェクトし、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅでミトコンドリアを染色した（図１９）。マンダースオーバーラップ係数（ＭＯＣ：Ｍａｎｄｅｒｓ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を、標識したＲＮＡとミトコンドリアとの共局在化の計量として決定した（図１８ｇ、ｈ）。全てのβ２．７−ＲＮＡ／−ドメインキメラは、β２．７−陰性ＲＮＡと比較して顕著なレベルの共局在化を示した。ＨＥＫ２９３Ｔ（図１８ｉ）またはＨｅｐＧ２細胞（図１８ｊ）においてＲＮＡ標識強度調節マンダースオーバーラップ係数を比較すると、（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４タンデム反復構造を有するＲＮＡは、ＲＮＡを含有するβ２．７−ＲＮＡと比較して顕著により強い共局在化効果を示した。
【００６３】
また、本明細書で開示する核酸送達システムを含むか、または発現する、ベクター、組換え細胞、組換え生物および核酸配列が、本開示に包含される。一例では、ベクターは、本明細書で開示する核酸送達システムを含む。別の例では、ベクターは、ネイキッド核酸もしくは非ウイルスベクターもしくはウイルスベクターまたはそれらの組合せを含む。
【００６４】
一例では、組換え細胞は、本明細書で開示する核酸配列を含む。別の例では、組換え細胞は、連続様式で（すなわち、連続的に）核酸配列を発現する。また別の例では、組換え細胞は、非連続様式で（すなわち、非連続的に）核酸配列を発現する。一例では、組換え生物は、本明細書で開示する核酸配列を含む。別の例では、組換え生物は、連続様式で（すなわち、連続的に）核酸配列を発現する。また別の例では、組換え生物は、非連続様式で（すなわち、非連続的に）核酸配列を発現する。
【００６５】
一例では、核酸配列は、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡの少なくとも１つまたは複数のセンスまたはアンチセンスＲＮＡ配列を含む。別の例では、ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡのＲＮＡ配列は、ドメイン１（Ｄ１；配列番号３または７）、ドメイン２（Ｄ２；配列番号４または８）、ドメイン３（Ｄ３；配列番号５または９）およびドメイン４（Ｄ４；配列番号６または１０）であるが、これらに限定されない。
【００６６】
また、疾患を治療する方法が、本発明の範囲内で開示される。ミトコンドリア病は通常、欠陥があるミトコンドリアＤＮＡ（ｍＤＮＡ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ）の不均等な分離から生じる不均一性により引き起こされる。したがって、１つの治療方法は、欠陥がある多量のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を低減させ、これにより野生型メッセンジャーＲＮＡがミトコンドリアに再配置されることを可能にすることである。特定した配列は、したがって、神経変性疾患もしくは他のミトコンドリア関連疾患においてミトコンドリア機能不全を抑制するため、もしくはミトコンドリア遺伝子機能を復元するための遺伝子療法で、または抗老化目的のために使用することができる。
【００６７】
親ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡは、ミトコンドリア複合体Ｉをある特定の阻害剤から保護することができ、したがってミトコンドリアを酸化的ストレスおよびＤＮＡ損傷から保護し、これにより細胞生存を増大させる。また、親ヒトサイトメガロウイルスβ２．７  ＲＮＡは、脳内のドーパミン作動性ニューロンの死を防ぐことが分かった。脳内のドーパミン作動性ニューロンの死は、パーキンソン病の特質であると考えられている。例えば、短い１００ヌクレオチド長のサブドメイン（β２．７  ＲＮＡのドメイン２）は、親β２．７  ＲＮＡ配列と同程度までミトコンドリア複合体Ｉを保護することに成功したことが示されている。それゆえ、本明細書で開示する他のドメインのうち、ドメイン２は、パーキンソン病の治療において実行することができる。親配列という用語は、ヒトサイトメガロウイルス株ｔｏｗｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ６１６２８５．１）由来の元のβ２．７  ＲＮＡ配列を指す。
【００６８】
細胞透過性ペプチドは、例えばヒトおよび動物モデルの肺組織にβ２．７由来配列をうまく送達するために使用することができる。この送達は、例えば酸化的リン酸化不全（ＯＸＰＨＯＳ：ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）を治療し、別の例では、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）と関連付けられる活性酸素種（ＲＯＳ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）レベルを増大させるように働く。加えて、アンチセンスＲＮＡは、肺内の遺伝的ミトコンドリア欠陥を標的化するために使用することができる。
【００６９】
また、β２．７  ＲＮＡまたはそのサブドメインは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍＤＮＡ）欠失を有する障害、例えばカーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ：Ｋｅａｒｎｓ−Ｓａｙｒｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ピアソン症候群および進行性眼筋麻痺（ＰＥＯ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｏｐｔｈａｌｍｏｐｌｅｇｉａ）（それらの全ては、重複表現型を共有し、ミトコンドリアＤＮＡ内の共通の４９７７塩基対欠失と関連付けられる）の治療のためにインタクトなミトコンドリアゲノムを送達するために使用することができる。
【００７０】
したがって、一例では、ミトコンドリア病を治療する方法が、開示される。別の例では、ミトコンドリア病を治療する方法は、本明細書で開示する核酸送達構築物を対象に投与することを含む。また別の例では、本方法は、アンチセンスＲＮＡを送達するための核酸送達構築物を使用することを含む。ミトコンドリア病は、母性遺伝真性糖尿病、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ：Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｏｐｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、神経障害、運動失調症、網膜色素変性症、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ：ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｗｉｔｈ  ｒａｇｇｅｄ  ｒｅｄ  ｆｉｂｅｒｓ）、ミトコンドリア筋症脳症乳酸アシドーシスおよび脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｙｏｐａｔｈｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｋｅ  ｌｉｋｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ）、パーキンソン病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）、ピアソン症候群および進行性眼筋麻痺（ＰＥＯ）であり得るが、これらに限定されない。
【００７１】
上記ミトコンドリア病は、様々な方法で、例えば、非限定的に、ＭＴ−ＴＬ１（ｔＲＮＡロイシン）、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＴＫ（ｔＲＮＡリジン）、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＴＨ（ヒスチジン）、ＭＴ−ＴＬ１（ロイシン）、ＭＴ−ＴＶ（バリン）およびそれらの組合せである１つまたは複数のミトコンドリア遺伝子を標的化することにより、治療することができる。
【００７２】
ミトコンドリア病の治療の一例は、欠陥があるミトコンドリア遺伝子／遺伝子機能のアンチセンス媒介抑制である。これは、例えばアンチセンスＲＮＡをミトコンドリアへ送達するための本明細書で開示する核酸送達システムの使用を含む。例えば、アンチセンスＲＮＡのヒトサイトメガロウイルスβ２．７媒介送達が、ミトコンドリア内でｍｔ−ＡＴＰ６  ｍＲＮＡをうまくノックダウンする能力は、本出願で実証されている。ｍｔ−ＡＴＰ６の欠陥は、例えば非限定的に、神経障害、運動失調症および網膜色素変性症（ＮＡＲＰ：ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，ａｔａｘｉａ，ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）と関連付けられている。ＮＡＲＰの例では、β２．７媒介アンチセンスＲＮＡ送達システムは、ＮＡＲＰと関連付けられる欠陥があるｍＲＮＡをうまくノックダウンし、これにより野生型ＡＴＰ６  ｍＲＮＡがミトコンドリアに再配置されることを可能にするために使用されている。それゆえ、本明細書で開示する核酸システムは、ＮＡＲＰの治療に使用することができる。
【００７３】
特許請求の範囲の発明をミトコンドリア病の治療でどのように使用することができるかを示す別の例は、ミトコンドリア遺伝子の送達である。アンチセンスＲＮＡを使用して欠陥があるｍＲＮＡを抑制することの代替として、本明細書で開示する核酸送達システムは、インタクトな（ミトコンドリア）遺伝子をミトコンドリアに送達して、欠陥があるＲＮＡに対するインタクトなｍＲＮＡの比を増大させるために使用することができる。標的遺伝子およびそれらの関連疾患の非網羅的リストを以下に示す。
【００７４】
【表１】
2019514972.tif 000006
【００７５】
ミトコンドリア病の治療のまた別の例は、欠陥があるミトコンドリア遺伝子機能を抑制することおよびインタクトな遺伝子と欠陥がある遺伝子との間の比を増大させるためにミトコンドリアへインタクトな遺伝子を送達することの両方の組合せである。
【００７６】
本明細書で開示するように、本発明の治療適用は、欠陥がある遺伝子発現を抑制するためにアンチセンス配列を送達すること、もしくは代わりに、正しい遺伝子機能を補完するためにインタクトな遺伝子を送達することのいずれか、または両方の組合せであり得る。
【００７７】
したがって、一例では、ミトコンドリア遺伝子機能を向上させるか、もしくは欠陥があるミトコンドリア遺伝子機能を抑制するか、または両方の（ただし、この場合、ミトコンドリア遺伝子は、互いに異なる）方法が、開示される。ミトコンドリア遺伝子機能を向上させることおよび欠陥があるミトコンドリア遺伝子機能を抑制することの両方の場合、遺伝子機能の向上および抑制は、同時に、または連続して起こってもよい。一例では、遺伝子機能の向上および抑制は、同時に起こる。別の例では、ミトコンドリア遺伝子機能は、互いに異なる。また別の例では、本方法は、本明細書で開示する核酸送達配列を対象に投与することを含む。
【００７８】
例えば、ドメイン３（Ｄ３Ｘ４）は、高いミトコンドリア局在化可能性を示すことが示されている。タンデム反復の組合せを、例えばＤ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４またはＤ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４として構築し、これによりＤ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４は、最も高いミトコンドリア標的化可能性を示すことが示されている。ドメイン１および４はアンチセンス転写産物について同様の構造を示すこと、およびアンチセンスドメインＡＳ１およびＡＳ４は実質的なミトコンドリア局在化可能性を示すことがさらに示されている。
【００７９】
コードＲＮＡを伴うＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ由来配列のミトコンドリアへの送達は、組換えミトコンドリア遺伝子発現をもたらす。例えば、ドメインＤ３およびＤ２の二重四量体（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４と表す）は、例えば野生型β２．７  ＲＮＡより高い効率でミトコンドリア複合体Ｉを保護する。
【００８０】
コンピュータ法を使用して、β２．７  ＲＮＡ内の４つの熱力学的に保存された構造サブドメインを特定した。全ての４つのドメインは、実質的なミトコンドリア局在化を示し、また、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア局在化活性は、例えばドメイン３と呼ばれる単一のサブドメインの使用により実現され得ることが示された。さらに、４つのドメインのうちの２つ（例えば、ドメイン１および４）は、アンチセンス転写産物について非常に類似する構造を示し、アンチセンスドメインＡＳ１およびＡＳ４は、実質的なミトコンドリア局在化可能性を示した。例えばβ２．７  ＲＮＡまたはドメイン３と比較して、例えばセンスドメイン３の四量体は、２倍高いミトコンドリア局在化活性を有することが分かり、別の例では、ドメイン２の四量体を伴うドメイン３の四量体は、３倍高い活性を示した。ミトコンドリア特異的表現型を誘発するために、β２．７  ＲＮＡ由来配列を、組換え核酸をミトコンドリアへ送達するために使用した。第１に、一例では、コードＲＮＡに、ミトコンドリア特異的開始および停止コドンを提供し、ミトコンドリア特異的組換え遺伝子発現をもたらした。第２に、ミトコンドリア特異的遺伝子を標的化するアンチセンスＲＮＡを、ミトコンドリア特異的遺伝子発現の機能的ノックダウンを誘発するために使用した。それゆえ、この技術については、ミトコンドリア遺伝子療法における使用、または例えば非核酸化合物のミトコンドリア送達のための使用が見出される。
【００８１】
特許請求の範囲の発明の使用の例として、例示的な方法は、組換えミトコンドリア遺伝子発現をもたらす、コードＲＮＡを伴うＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ由来配列のミトコンドリアへの送達を含む。例えばアンチセンスＲＮＡを伴うＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡ由来配列のミトコンドリアへの送達は、ミトコンドリア遺伝子発現の機能的ノックダウンを誘発する。かかる送達構築物の一例は、高いミトコンドリア局在化可能性を示すことが示されているβ２．７  ＲＮＡサブドメイン３の四量体反復である。例えばβ２．７  ＲＮＡサブドメイン３および２の２つの四量体反復（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４）の例示的な配置は、高いミトコンドリア標的化可能性を示す。ドメインＤ３およびＤ２の例示的な二重四量体（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４）は、野生型β２．７  ＲＮＡより高い効率でミトコンドリア複合体Ｉを保護することが示されている。概略する方法の例示的な適用は、遺伝子療法において、例えばミトコンドリア機能不全を抑制すること、または別の例では、ミトコンドリア遺伝子機能を復元することである。また、適用例は、神経変性疾患もしくは他のミトコンドリア関連疾患における使用または抗老化のための使用を含む。
【００８２】
特許請求の範囲の発明の使用の別の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術と共に特許請求の範囲の核酸送達システムを使用すること、すなわち、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび一本鎖ガイド（ｓｇ：ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡの送達のために、またはこれらの構成成分をコードする各々の遺伝子の送達のために、特許請求の範囲の核酸送達システムを使用することを含む。Ｃａｓ９酵素はその後、ｓｇＲＮＡと共に、欠陥があるミトコンドリア遺伝子またはゲノムを特異的に切断し、機能的に不活性化し得るリボ核タンパク質複合体を形成し得る。
【００８３】
さらなる適用は、プラスミドベースのミトコンドリア標的化ベクターを提供することである。コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡの転写のための目的の配列を、ミトコンドリア標的化配列の上流または下流のいずれかに挿入してもよい。キメラＲＮＡはその後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ鋳型から転写され、その後標的細胞へ送達されるか、または標的細胞にＤＮＡベクターをトランスフェクトした後に内因的にＤＮＡ鋳型から転写され得る。ウイルス送達粒子、例えば非限定的にレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスの生成のためのこれらのベクターの変形もまた想起される。
【００８４】
本明細書で例示的に示す本発明は、本明細書で特に開示されていない、任意の要素（単数）または要素（複数）、限定（単数）または限定（複数）の非存在下で好適に実施することができる。したがって、例えば「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広く、限定せず解釈されるべきである。加えて、本明細書で用いる用語および表現は、限定の用語としてではなく、説明の用語として使用されており、かかる用語および表現の使用において、示され、説明されている特徴またはそれらの部分の任意の均等物を除外する意図はないが、特許請求の範囲の発明の範囲内で様々な改変が可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意選択の特徴により特に開示されているが、当業者は、本明細書で開示するその中で具体化されている発明の改変および変形に頼ってもよく、かかる改変および変形は本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【００８５】
本発明は、本明細書で広く、かつ一般的に説明されている。また、一般的な開示内に入るより狭い種類および亜属の分類の各々は、本発明の部分を形成する。これは、切除される材料が特に本明細書で列挙されているかどうかにかかわらず、属から任意の主題を除去するという条件付きまたは消極的な限定を伴う、本発明の一般的な説明を含む。
【００８６】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内であり、非限定的な例である。加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群に関して説明されている場合、当業者は、また、本発明がこれによりマーカッシュ群の任意の個々の構成員または構成員の部分群に関して説明されていることを認識する。
【００８７】
本開示全体を通して、ある特定の実施形態は、範囲形式で開示され得る。範囲形式の説明は、単に便利および簡潔さのためであり、開示範囲の範囲についての確固たる限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の説明は、全ての可能性がある部分範囲およびその範囲内の個々の数値を特に開示したものと考えられるべきである。例えば、１〜６などの範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲およびその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５および６を特に開示したものと考えられるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用する。
【００８８】
実験の節
ＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡでの熱力学的に保存された構造サブドメインの特定
ソフトウェアｆｏｌｄｓｐｌｉｔを使用して、ＣＭＶの非コードβ２．７  ＲＮＡ内の４つの熱力学的に保存された構造サブドメイン（それぞれ、Ｄ１〜Ｄ４と命名されている）を特定した（図１ｂ）。熱力学的保存は多くの場合、ＲＮＡ機能と相関する。これらの４つのドメインの各々は、完全なβ２．７  ＲＮＡについて予測されるＲＮＡ二次構造内の明確な構造サブドメインに割り当てることができる（図１ｃ）。
【００８９】
ＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡおよびその明確な機能的サブドメインは、ヒト細胞のミトコンドリアに局在化する
例えば（ｉ）全長β２．７  ＲＮＡの、（ｉｉ）４つの単一ドメインＤ１〜Ｄ４の各々の、および（ｉｉｉ）単一ドメイン欠失構築物のミトコンドリア局在化を調査した（図１ｄ〜ｆ）。全ての欠失突然変異体および４つの単一ドメインのうちの３つは、ミトコンドリア標的化の低減を示したが、ドメイン３は、全長β２．７  ＲＮＡの完全なミトコンドリア標的化可能性を示した。
【００９０】
明確なＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡアンチセンスドメインは、ヒト細胞のミトコンドリアに局在化する
本明細書で開示する構築物のアンチセンス配列を、陰性対照としての使用を考慮し、それゆえ、また、それらの構造および熱力学的保存について調査した。予想外に、アンチセンスβ２．７  ＲＮＡの構造は、センスβ２．７  ＲＮＡの構造と比較して非常に対称性であった。非常に類似する熱力学的保存が観察され、β２．７  ＲＮＡアンチセンス配列内の対応する位置内に、４つの保存された構造サブドメイン（Ｄ１＿ＡＳ〜Ｄ４＿ＡＳ）を特定することが可能であった（図２ａ）。詳細な構造分析により、特にアンチセンスドメインＤ１＿ＡＳおよびＤ４＿ＡＳは、対応するセンスドメインＤ１およびＤ４と比較して構造的にほとんど同一であることが明らかになった。（ｉ）全長アンチセンスβ２．７  ＲＮＡの、（ｉｉ）４つの単一アンチセンスドメインＤ１＿ＡＳ〜Ｄ４＿ＡＳの各々の、および（ｉｉｉ）アンチセンス単一ドメイン欠失構築物のミトコンドリア局在化を調査した（図２ｂ〜ｄ）。全長アンチセンスβ２．７  ＲＮＡは、センスＲＮＡと比較して、顕著に弱いミトコンドリア取り込みを示し（図２ｂ）、４つのアンチセンスドメインＤ１＿ＡＳ〜Ｄ４＿ＡＳの各々の欠失は、ミトコンドリア標的化をさらに低減した（図２ｃ）。個々のアンチセンスドメインを試験すると、アンチセンスドメインＤ１＿ＡＳおよびＤ４＿ＡＳは、全長アンチセンスＲＮＡと比較して約５倍高い活性を示し、センス全長β２．７  ＲＮＡのミトコンドリア標的化活性の約７０％に達することが示された（図２ｄ）。
【００９１】
ＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡは、組換えコードＲＮＡをミトコンドリアに共送達し、組換えタンパク質のミトコンドリア発現をもたらす
β２．７  ＲＮＡ全長ＲＮＡを、β２．７  ＲＮＡの活性構造が、それをＥＧＦＰ配列に融合するのに際して変更されないことを確実にするスペーサー配列を介して、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの３’末端に融合した（図３ａ、ｂ）。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの２つの異なる変形：１．細胞質発現のための正規の開始および停止コドンを伴う従来型ｍＲＮＡ；および２．ミトコンドリアでのみ翻訳され得るが、細胞の細胞質では翻訳されないミトコンドリア開始および停止コドンを伴う改変変形を検討した。加えて、細胞質に達した任意のＥＧＦＰタンパク質が、細胞質およびミトコンドリアに由来する任意の重複するＥＧＦＰシグナルを抑制するために核に標的化され得るように、ＥＧＦＰタンパク質を核局在化ペプチドに融合させたミトコンドリアＥＧＦＰ配列の変形を生成した。全ての配列および対照をその後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア標的化（図３ｃ）、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）および共焦点顕微鏡を使用してＥＧＦＰ発現（図３ｄ〜ｊ）について試験した。β２．７  ＲＮＡのミトコンドリア標的化は、それをＥＧＦＰ  ｍＲＮＡに融合することによって妨げられない（図３ｃ）。ＦＡＣＳ分析により、ミトコンドリアｅｇｆｐ配列（ｍｔＧＦＰ＿ｓ）単独は、任意のＥＧＦＰ発現を誘発しないことが示された。ミトコンドリアに由来するはずの顕著なＥＧＦＰ発現は、それをβ２．７  ＲＮＡに融合した後に（ｍｔＧＦＰ＿ｓ＿β２．７）、検出することができた（図３ｇ）。共焦点画像化は、ＥＧＦＰとミトコンドリア特異的染色（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）との共局在化を可視化するのに十分鋭敏ではなかった。しかしながら、３つの異なる共局在化係数は、ｍｔＧＦＰ＿ｓ＿β２．７の場合、ＥＧＦＰとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄとの顕著な共局在化を示したが、ｍｔＧＦＰ＿ｓ対照については示さなかった（図３ｈ〜ｊ）。
【００９２】
ＣＭＶ  β２．７  ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡをミトコンドリアへ共送達し、組換えタンパク質のミトコンドリア発現の抑制をもたらす
次に、β２．７  ＲＮＡを、ミトコンドリア遺伝子、例えば両方ともミトコンドリアＡＴＰ合成に関与するＭＴ−ＡＴＰ６およびＭＴ−ＡＴＰ８を標的化する、コンピュータで選択した非構造化アンチセンスＲＮＡに融合した（図４）。アンチセンスＲＮＡを、両方の配列（アンチセンスおよびβ２．７  ＲＮＡ）の活性構造が融合プロセス中に維持されることを確実にするためにスペーサーを介してβ２．７  ＲＮＡに融合した。その後、ミトコンドリアＲＮＡ標的化を、ｒｔＲＴ−ＰＣＲ（図４ｅ）、ミトコンドリアＡＴＰ合成のノックダウン（図４ｆ）およびＡＴＰレベルの低減の結果としての細胞生存の低減（図４ｇ）を使用して測定した。β２．７  ＲＮＡの融合は、アンチセンスＲＮＡをミトコンドリアへ標的化し、ミトコンドリアＭＴ−ＡＴＰ６またはＭＴ−ＡＴＰ８  ｍＲＮＡレベルのノックダウンを誘発し、細胞生存を顕著に低減させた。
【００９３】
β２．７  ＲＮＡサブドメイン３の四量体反復は、高いミトコンドリア局在化可能性を示す
例えば最も活性なβ２．７  ＲＮＡサブドメイン、一例ではＤ３およびＤ２の多数の反復を使用することにより、β２．７  ＲＮＡのミトコンドリア標的化可能性を改善することを目的とした。ドメインＤ３またはＤ２の四量体反復を構築し、ｒｔＲＴ−ＰＣＲを使用してミトコンドリア標的化について調査した（図５ａ〜ｆ）。Ｄ２四量体ミトコンドリア標的化は、全長β２．７  ＲＮＡのミトコンドリア標的化と同等であったが、Ｄ３四量体は、２倍高いミトコンドリア標的化活性を示した。
【００９４】
β２．７  ＲＮＡサブドメイン３および２の２つの四量体反復の配置（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４）は、最も高いミトコンドリア標的化可能性を示す
（ｉ）Ｄ３の４つの反復およびこれに続くＤ２の４つの反復（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４）もしくは（ｉｉ）Ｄ２の４つの反復およびこれに続くＤ３の４つの反復（Ｄ２ｘ４＿Ｄ３ｘ４）または（ｉｉｉ）交互のドメインＤ３およびＤ２［（Ｄ３＿Ｄ２）ｘ４］を含む次の構築物を試験した。Ｄ２ｘ４＿Ｄ３ｘ４および（Ｄ３＿Ｄ２）ｘ４は、全長β２．７  ＲＮＡと同等の低いミトコンドリア標的化活性を示したが、構築物Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４は、約３倍活性であることが分かった（図５ｇ）。
【００９５】
ドメインＤ３およびＤ２の二重四量体（Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４）は、野生型β２．７  ＲＮＡより高い効率でミトコンドリア複合体Ｉを保護する
β２．７  ＲＮＡの５’末端部分は、ロテノンなどの阻害剤からミトコンドリア複合体Ｉを保護することが以前に報告されていた。ドメインＤ３もしくはＤ２単独またはそれらの多量体配置が、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＲＮＡまたは代わりにＲＮＡを内因的に発現するプラスミドのいずれかを送達する場合、ロテノンに対して複合体Ｉを保護することができるかどうかについて調査した（図５ｈ、ｉ）。Ｄ２、Ｄ３、Ｄ３ｘ４およびＤ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４  ＲＮＡは、ＲＮＡを直接的に送達する場合、全長β２．７  ＲＮＡと同等に保護的であったが、Ｄ３ｘ４＿Ｄ２ｘ４は、ＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡを送達する場合、より活性であることが分かった。
【００９６】
ミトコンドリア標的化配列を使用して組換え核酸をミトコンドリアへ送達する策
組換えＲＮＡまたはＤＮＡは、ミトコンドリア標的化配列に共有結合により連結するか、または代わりに相補的塩基対形成を介して非共有結合により連結することができる。組換え核酸は、一本鎖、直鎖状二本鎖、環状一本鎖または環状二本鎖のいずれかであり得る。１つまたは多数のミトコンドリア標的化配列を、１つのミトコンドリア標的化複合体を形成するために使用することができる（図６）。
【００９７】
材料および方法
親構築物の設計
構築物を設計する目的は、それをｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）ベクターにクローニングして、それぞれ、ドメイン特性および導入遺伝子送達を研究することである。オンラインアルゴリズムＮＥＢｃｕｔｔｅｒ  ｖ２．０を使用して、制限酵素部位を選択した。Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、構築物を合成した。構築物を、続いてｐＶＡＸ１ベクターにクローニングした。ＣＭＶプロモーター配列を、ｐＶＡＸ１プラスミドベクターから得た。ＣＭＶプロモーターは、動物細胞においてＲＮＡの発現を促進するためであった。Ｔ７プロモーターは、親構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を促進するためであり、ＳＰ６プロモーターは、アンチセンスＲＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を促進するために反転させた。ＨｉｎｄＩＩＩを、Ｔ７転写のためにプラスミドを直鎖状にするために使用し、ＢｓｐＥＩを、ＳＰ６転写のためにプラスミドを直鎖状にするために使用した。ＮｈｅＩ、ＸｂａＩおよびＢｃｌＩ部位を、クローニングに使用した。ＳＶ４０ポリＡシグナルを、ｍＲＮＡのポリアデニル化および核輸送を促進するために付加した。スペーサーは、カナマイシンプロモーターとポリＡシグナルとの間のベクター配列であり、ＫａｎａＰは、ＢｃｌＩを使用するクローニング中にベクターから最初に除去されるプロモーターの部分である。ＤｒａＩＩＩを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターへのクローニングを促進するために含めた（図７を参照のこと）。
【００９８】
単一ドメイン欠失構築物（ＳＤＤＣ）の合成
β２．７  ＲＮＡ機能に対する個々のドメインの効果を研究するために、個々のドメインが欠失している構築物を生成した。ドメインを欠失させるために使用した策は、図８で示す重複伸長ＰＣＲであった。
【００９９】
ＳＤＤＣの合成のための重複伸長（ＯＥ）ＰＣＲ策
重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ  ＰＣＲ）を、２つのステップで行った。第１のステップでは、欠失ドメイン（ＤＤ）の上流の領域を、ＮｈｅＩ部位を有する通常のフォワードプライマーと、ＤＤの下流の領域にプライミング部位を導入するＯＥリバースプライマーとを使用してＰＣＲ増幅した。続いて、ＤＤの下流のドメインを、ＤＤの上流の領域にプライミング部位を導入するＯＥフォワードプライマーと、ＢａｍＨＩ部位を有する通常のリバースプライマーとを使用してＰＣＲ増幅した。両方のＰＣＲ産物をその後、ゲル精製し、等モル量で共に混合し、その後ＰＣＲを使用して再増幅し、ここではＯＥが導入したプライミング部位が、それらの各々の対応物についてのプライマーとして働き、これにより所望の欠失を有する全長構築物を得た。
【０１００】
単一ドメイン構築物（ＳＤＣ）の合成
親β２．７＿ｐＶＡＸ１から、単一ドメインをＰＣＲ増幅した。単一ドメインの各々についてのＰＣＲ条件は、以下の通りであった：単一ドメイン１（ＳＤ１＿ｐＶＡＸ１）：β２．７＿ｐＶＡＸ１を鋳型として使用して、Ｄ１ＦおよびＤ１Ｒを使用してＰＣＲを行い、続いてＰＣＲ産物をＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してクローニングした。ＰＣＲ条件反応混合物は、１０ｎｇの鋳型、５μｌの１０×Ｔａｑ緩衝液、４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、３００ｎＭの各プライマーおよび０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅヌクレアーゼ非含有水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、最終体積を５０μｌに調整した。使用した反応条件は、９４℃で５分間；９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を２５サイクル；７２℃で５分間であった。単一ドメイン２（ＳＤ２＿ｐＶＡＸ１）、単一ドメイン３（ＳＤ３＿ｐＶＡＸ１）および単一ドメイン４（ＳＤ４＿ｐＶＡＸ１）構築物を同様に、ただし代わりに特異的ＰＣＲプライマーＤ２ＦおよびＤ２Ｒ、Ｄ３ＦおよびＤ３ＲまたはＤ４ＦおよびＤ４Ｒを使用して生成した（図９を参照のこと）。
【０１０１】
単一ドメイン増幅のための策
ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するために、それぞれ、フォワードおよびリバースプライマーを設計した。ＰＣＲ産物を続いて、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、精製し、ＢｓｐＥＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＶＡＸ１ベクターにクローニングした。
【０１０２】
ＧＦＰ融合構築物の合成
ＧＦＰ融合構築物の設計：ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）プラスミドベクターを使用して、全てのＧＦＰ融合構築物を設計した。制限酵素部位ＢｓｐＥＩおよびＤｒａＩＩＩを使用して、β２．７  ＲＮＡ配列を、プラスミドのｅＧＦＰ配列の下流にクローニングした。次に、ｅＧＦＰ配列をプラスミドからＰＣＲ増幅して、スペーサー配列と共にいずれかの末端に制限酵素部位を導入した。ミトコンドリア特異的遺伝子発現を可能にするために、ｅＧＦＰメッセージの開始および停止コドンを、ミトコンドリア特異的開始および停止コドンで改変した。ＧＦＰ発現の分析は主にプラスミドベクターを使用して行い得るので、ＣＭＶ転写産物の構造を、ｍｆｏｌｄを使用して構造的保存について分析した。ＰＣＲ条件を以下に説明する。１０ｎｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１鋳型、５ｍＭの１０×ｔａｑ緩衝液、４ｍＭ  Ｍｇｃｌ２、３００ｎｍの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む５０μｌのＰＣＲ反応を設定した。サイクラーを、９４℃で５分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を２５サイクル；７２℃で１０分間に設定した。β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクターからＳＶ４０ポリＡを伴う親β２．７配列を切り取り、ゲル精製し、図１０で示すようにＢｓｐＥＩおよびＤｒａＩＩＩ部位を使用してｅＧＦＰ配列の下流にライゲーションした。
【０１０３】
上記に説明するクローニングプロセスは、ゲノムＧＦＰ＋β２．７を創出する。第２の対照、つまりゲノムＧＦＰ＋スペーサー＋β２．７を、スペーサー配列およびＮｈｅＩ部位を導入するリバースプライマーを有するＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲにより、元のｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターからｅＧＦＰ配列を増幅し、その後、それをゲノムＧＦＰ＋β２．７ベクターにクローニングし戻すことにより創出した。ミトコンドリア特異的発現を可能にするために、ｅＧＦＰ配列の開始および停止コドンを、ｍｔ開始コドンを導入するフォワードプライマーと、スペーサー配列およびミトコンドリア特異的停止コドンを導入するリバースプライマーとを有するＰＣＲプライマーを使用して改変し、その後、それを、ＮｈｅＩ部位を使用してβ２．７を有するｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにクローニングし戻して、ｍｔＧＦＰ＋スペーサー＋β２．７を生成した。これらの両方の場合に、単一のＮｈｅＩ制限酵素部位を使用してＧＦＰ配列をベクターにクローニングし、それゆえ、ベクター骨格再ライゲーションを防ぐために、ベクターを、ＮｈｅＩでの消化中に同時にアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。陰性対照として、ｍｔＧＦＰ＋スペーサー＋β２．７プラスミドから、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位をそれぞれ有するプライマーを使用して、ＣＭＶプロモーターの一部を有するｍｔＧＦＰ＋スペーサー配列をＰＣＲ増幅した。同時に、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドベクターを、ＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間で消化して、元のＧＦＰ配列およびＣＭＶプロモーターの一部を除去した。ＰＣＲ産物をその後、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、精製し、ゲル精製したベクター骨格にライゲーションし戻し、これによりＣＭＶプロモーターを再構成し、ｅＧＦＰ配列をｍｔＧＦＰ＋スペーサー配列で置き換える。
【０１０４】
ＧＦＰ融合構築物にＳＶ４０核局在化シグナルを付加する
共焦点顕微鏡による画像化を促進するために、ｐＥＢＦＰ＿ＮＵＣ（Ａｄｄｇｅｎｅ）からＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）をＰＣＲ増幅し、ミトコンドリア構築物を含む全てのＧＦＰ発現構築物中のＧＦＰ配列の下流にクローニングした。ＮＬＳは、インフレームのミトコンドリア特異的停止コドンを有し、その結果、細胞質ＧＦＰのみが核に標的化され、一方でミトコンドリア内ＧＦＰは、ミトコンドリアに局在化したままである。これは、ミトコンドリア内での翻訳が、不完全なＮＬＳを生成するためである。ｐＥＢＦＰ＿ＮＵＣプラスミドは、ＮＬＳ配列の３つのタンデム反復を有し、それゆえ、タンデム反復に隣接するようにＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅および設計策を、図で説明する。クローニング後、構築物を、単一のＸｈｏＩ消化を使用してスクリーニングした。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。ｐＥＢＦＰ＿ＮＵＣを鋳型として使用して、ＮＬＳ＿クローニングＦｗおよびＮＬＳ＿クローニングＲｖを使用してＰＣＲを行い、その後、試料をＰＣＲ精製し、Ｂｓｐ１４０７ＩとＢｓｐＥＩ部位との間のＧＦＰ配列の下流にクローニングした。使用したＰＣＲ条件は、以下の通り：１０ｎｇのｐＥＢＦＰ＿ＮＵＣ鋳型、５ｍＭのＴａｑ緩衝液、４ｍＭのＭｇｃｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、それぞれ３００ｎＭのＮＬＳ＿クローニングＦｗおよびＮＬＳ＿クローニングＲｖ、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、体積をｕｌｔｒａｐｕｒｅヌクレアーゼ非含有水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で５０μｌに調整した。使用したサイクル条件は、９４℃で５分間；９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間を２５サイクル；７２℃で５分間であった。
【０１０５】
ｐＥＢＦＰ＿ＮＵＣプラスミドから、ＢｓｒＧＩおよびＢｓｐＥＩ部位をそれぞれ導入するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用するＰＣＲにより、ＮＬＳ配列をＰＣＲ増幅した（図１１を参照のこと）。加えて、また、フォワードプライマーは、単一のＴ−Ｇ置換によりＮＬＳの上流の余分なＢｓｐＥＩ部位を破壊した。その後、ＰＣＲ産物を続いて、ＢｓＲＧＩおよびＢｓｐＥＩでそれぞれ消化し、全ての構築物においてＧＦＰ配列の下流にライゲーションした。ＰＣＲ産物は、ＸｈｏＩ部位を有し、これを使用して、消化によりクローンをスクリーニングした。
【０１０６】
タンデム反復構築物の合成
ドメインの相互作用を研究するために、２つの機能的ドメイン、この例では、つまりドメイン２および３のタンデム反復を創出した。４つの異なる配置を以下のように創出した。
【０１０７】
ドメイン３およびドメイン２のそれぞれ４つのコピー（Ｄ３Ｘ４）（Ｄ２Ｘ４）を有する構築物
構築物を生成するための策を、図１２で示すように創出した。制限酵素部位は、ＮＥＢｃｕｔｔｅｒ  Ｖ２．０を使用して選択した。これらのタンデム反復のＴ７およびＣＭＶ転写産物の構造を、スペーサー配列を使用して安定化し、ＲＮＡｆｏｌｄおよびｍｆｏｌｄを使用して立証した。各反復およびその関連スペーサーを、スペーサーおよび各々の制限酵素部位を挿入するＰＣＲプライマー（４組）を使用して合成し、その後、ｐＶＡＸ１ベクターにクローニングした。同じタンデム反復内の各組のプライマーは同じ結合領域を有したので、アニーリング温度は、特定のタンデム反復についての全てのＰＣＲの組について同じままであった。ＰＣＲで使用したサイクル条件を以下に示す。
【０１０８】
ドメイン２タンデム反復
多数のライゲーションプロセスを使用するタンデム反復の構築。
ＰＣＲプライマーを使用して、個々のコピーを最初に４組合成した（図１２を参照のこと）。特定のタンデム反復についての全てのプライマーは、同じ結合領域を共有するので、それゆえ、Ｔｍは、特定のタンデム反復についての全ての組について同じである。各組は、図中でＳ１〜Ｓ４により示されるそれ自体のスペーサーの組を有する。１組の３’末端の部位がタンデム反復内の次の組の５’末端の部位と一致するように、制限酵素部位を選択した。ＰＣＲ後、産物をＰＣＲ精製し、それらの各々の制限酵素部位で消化した。同時に、ｐＶＡＸ１ベクターをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクター骨格をゲル精製した。消化したＰＣＲ産物をその後、等モル量の消化したベクター骨格と混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。
【０１０９】
Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４の構築策
同様に、ドメイン２タンデム反復（Ｄ２Ｘ４）を、Ｄ２Ｘ４を有するｐＶＡＸ１ベクターからＰＣＲ増幅した（図１３を参照のこと）。より短い断片の増幅を防ぐために、プライマーの結合領域の大部分がベクター骨格それ自体上にあるように、プライマーを設計した。プライマーの各々は、いずれかの末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を消化し、Ｄ３Ｘ４配列を有するｐＶＡＸ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内に再ライゲーションした。ベクターの再ライゲーションを防ぐために、ベクターをアルカリホスファターゼで脱リン酸化した。
【０１１０】
Ｄ２Ｘ４＿Ｄ３Ｘ４の構築策
同様に、ドメイン３タンデム反復（Ｄ３Ｘ４）を、Ｄ３Ｘ４を有するｐＶＡＸ１ベクターからＰＣＲ増幅した。用いたプライマー設計策は、Ｄ３Ｘ４＿Ｄ２Ｘ４について使用した策と同じであった。ＰＣＲ産物を消化し、Ｄ２Ｘ４配列を有する脱リン酸化したｐＶＡＸ１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内に再ライゲーションした。
【０１１１】
ドメイン３およびドメイン２各々の交互反復（Ｄ３＿Ｄ２）４を有する構築物
交互反復構築物を、４ステップで生成した。Ｄ３Ｘ４およびＤ２ｘ４の両方は、同じ組の制限酵素部位を共有する。クローニング前に、ｍｆｏｌｄおよびＲＮＡｆｏｌｄを使用してＣＭＶおよびＴ７転写産物を立証した。詳細なクローニングスキームを、図１４で説明する。
【０１１２】
第１のステップにおいて、ドメイン３の単一のコピーを、ＮｈｅＩおよびＥｃｏｒＩ部位を使用してクローニングした。第２のステップにおいて、ドメイン３の別のコピーを、ＫｐｎＩとＡｇｅＩ部位との間でクローニングした。このようにして得た生成物をここで、両方ともＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するドメイン３タンデムＦｗおよびドメイン２タンデムＲｖを使用してＰＣＲ鋳型として使用する。正しいサイズのＰＣＲ産物をゲル精製し、ステップ２の生成物を有する脱リン酸化したｐＶＡＸ１プラスミドにライゲーションし戻す。クローンをその後、消化によりスクリーニングし、配列決定（ＡＩＴＢｉｏｔｅｃｈ）により確証した。
【０１１３】
ミトコンドリア標的化のためのアンチセンスＲＮＡの設計
標的の選択および候補の選択
使用したミトコンドリア標的化のための候補は、本質的に複合体Ｖのサブユニット（ＡＴＰアーゼ）であるＭｔ−ＡＴＰ６およびＭｔ−ＡＴＰ８であった。ＨＵＳＡＲ  ｆｏｌｄａｎａｌｙｚｅを使用して１００、２００および３００のウィンドウサイズならびに１ヌクレオチドのシフトで、２つの遺伝子を標的化するアンチセンスＲＮＡを設計し、その後、５’または３’末端のいずれかに最大数の不対塩基を有する候補を選択した。これらの配列を続いて、開放末端の位置に基づいて５’末端または３’末端のいずれかでβ２．７  ＲＮＡに融合し、ｍｆｏｌｄを使用して構造的保存を分析した。
【０１１４】
標的配列の精製
以下の図で説明する手順を使用して、単離したミトコンドリアＲＮＡから標的配列を得た。逆転写の反応条件は以下の通りであった：５００ｎｇのｍｔＲＮＡを、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μｌの２μＭ遺伝子特異的リバースプライマーと混合し、ＲＮアーゼ非含有水で１４μｌの最終体積になるように調整した。混合物を６５℃で５分間加熱し、続いて氷上で２分間急冷した。この反応混合物をその後、４μｌの５×ファーストストランド緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、２０ＵのＲＮアーゼＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＶと混合し、反応の最終体積は２０μｌであり、５５℃で１時間インキュベートし、その後７０℃で１５分間熱不活性化した。
【０１１５】
アンチセンス生成のための標的配列の単離
ミトコンドリアＲＮＡを、遺伝子特異的リバースプライマー配列（ＡＴＰ６ＲｖおよびＡＴＰ８Ｒｖ）で逆転写して、ファーストストランドＡＴＰ６およびＡＴＰ８  ｃＤＮＡプールを得た。続いて、これらのプールを、ＰＣＲの鋳型として使用して、標的エレメントを表す二本鎖ＤＮＡ配列を得た（図１５を参照のこと）。
【０１１６】
アンチセンスを生成するための標的配列のクローニング
ＡＴＰ６アンチセンス配列のクローニング
ＡＴＰ６アンチセンス配列は、５’末端に最大数の不対塩基を有していたので、β２．７配列の５’末端に融合しなければならなかった。アンチセンス配列を得るために、ミトコンドリアＲＮＡプールから得た標的配列を逆転写し、β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクターに、Ｔ７プロモーターの下流、かつβ２．７配列の上流へクローニングした。精製したＡＴＰ６標的を、ＡＴＰ６＿Ｃｌｏｎｉｎｇ＿ＦｗおよびＡＴＰ６＿Ｃｌｏｎｉｎｇ＿Ｒｖを使用してＰＣＲ増幅した。クローニング策を、図１６で説明する。
【０１１７】
ＡＴＰ６アンチセンス配列の合成およびクローニング
ＡＴＰ６標的配列をＰＣＲにより再増幅して、β２．７＿ｐＶＡＸ１配列中の制限酵素部位とは反対方向の制限酵素部位を導入した。得られた産物を、ＮｈｅＩおよびＢｓｐｅＩで消化し、その後β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクター骨格にライゲーションした。生成物を、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩでの消化によりスクリーニングした。続いて、スペーサー配列を、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりこの構築物の下流に導入し、その後、配列決定（ＡＩＴＢｉｏｔｅｃｈ）により確証した。
【０１１８】
ＡＴＰ８アンチセンス配列のクローニング
不対塩基が主に、３’末端に存在していたので、ＡＴＰ８標的配列を、β２．７配列の下流にクローニングした。ＡＴＰ８標的を、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより増幅して、所望の制限酵素部位および安定化スペーサー配列を導入し、β２．７配列の下流にクローニングした（図１７を参照のこと）。
【０１１９】
β２．７＿ＡＴＰ８融合構築物を生成するためのクローニング策
精製したＡＴＰ８標的配列を、ＳｐｅＩ部位を導入するリバースプライマーでＰＣＲ増幅した。同時に、得られる産物が５’末端および３’末端にそれぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するように、ＰＣＲによりβ２．７から断片を増幅した。β２．７  ＰＣＲ産物およびＡＴＰ８  ＰＣＲ産物を、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩおよびＳｐｅＩで単独消化し、等モル量で混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２２℃で３時間ライゲーションした。ＳｐｅＩ部位は、２塩基フィル・インによりＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションすることができ、これは、両方の制限酵素部位を有効に破壊する。ライゲーション後、正しいサイズの生成物を、ゲルから精製し、この生成物は、アンチセンスＡＴＰ８配列に融合したβ２．７断片を有する。このライゲーション生成物をＰＣＲ増幅して、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し、β２．７＿ｐＶＡＸ１ベクター骨格にクローニングし戻して、インタクトな配列を生成した。クローンを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重消化により確証し、その後、配列決定（ＡＩＴＢｉｏｔｅｃｈ）により確証した。
【０１２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるＲＮＡ合成
Ｔ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行った。アンチセンスＲＮＡおよびβ２．７＿ＧＦＰ  ＲＮＡを合成するために、ＳＰ６ポリメラーゼを使用した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡの残りを合成した。Ｔ７およびＳＰ６プロモーターの最後の６塩基を、以前に示されているように、それぞれ選択し、最終的にそれぞれ、Ｔ７およびＳＰ６転写産物の一部にする。
【０１２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型の調製
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用する全てのプラスミドベクターを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一晩抽出し、翌日、エタノールを使用して沈殿させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型を、ＰＣＲにより、またはプラスミドを直鎖状にすることにより調製した。プラスミドを直鎖状にすることに使用した全ての制限酵素は、ランナウェイ転写産物の形成を防ぐために５’オーバーハングを生成した。ＰＣＲ合成した鋳型の場合、フォワードプライマーが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７／ＳＰ６プロモーターの配列を導入した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により、ＰＣＲ鋳型および直鎖状プラスミドの両方を精製した。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
Ｔ７／ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＩＶＴを行った。１μｇの直鎖状プラスミド／精製ＰＣＲ鋳型を、５０μｌの最終体積中で１×転写緩衝液、１０ｍＭ  ＮＴＰ混合物、２０ＵのＲＮアーゼＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および３０ＵのＳＰ６／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと共に、３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、３ＵのＤＮアーゼＩを反応混合物に添加し、３７℃で少なくとも３０分間インキュベートした。ＲＮＡをその後、フェノールクロロホルム抽出により精製した。
【０１２３】
トランスフェクション
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中のリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全てのトランスフェクションを行った。
【０１２４】
ＲＮＡ取り込みの分析のためのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション
ＨｅｐＧ２細胞を、Ｔ７５フラスコ中で抗生物質を含むＤＭＥＭ中にて成長させ、９０％コンフルエントでトランスフェクトした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中でトランスフェクションを行った。製造業者のプロトコールにより、１μｇ当量のβ２．７  ＲＮＡおよびその誘導体をトランスフェクトした。トランスフェクション６時間後に培地を交換した。トランスフェクション２４時間後、リアルタイムＰＣＲによる分析のためにミトコンドリアＲＮＡを単離した。
【０１２５】
ミトコンドリアＲＮＡノックダウンの分析のためのＨｅｋ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
１０５個の２９３Ｔ  Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレート中で抗生物質を含むＤＭＥＭ中にて成長させ、翌日トランスフェクトした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中でトランスフェクションを行った。製造業者のプロトコールにより、８００ｎｇ当量のアンチセンス＿β２．７融合ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション６時間後に培地を交換した。トランスフェクション２４時間後、トータルＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲにより分析した。
【０１２６】
ＦＡＣＳ分析および共焦点顕微鏡のためのＨｅｐＧ２細胞のトランスフェクション
ＦＡＣＳ分析のために、３０，０００個のＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェルプレート中で成長させ、３０％コンフルエントでトランスフェクトした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中でトランスフェクションを行った。製造業者のプロトコールにより、８００ｎｇの対照ｐＥＧＦＰ−ｃ１およびβ２．７＿ＧＦＰ融合プラスミド（＋ＮＬＳ）をトランスフェクトした。トランスフェクション６時間後に培地を交換した。トランスフェクション２４時間後、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現について分析した。共焦点顕微鏡分析のために、２０，０００個のＨｅｐＧ２細胞を、１．５μＭ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（ｉＢＩＯ）中に播種した。スライド中のチャンバー面積は、４８ウェルプレート中のウェルの面積と同じ面積を有し、したがって、トランスフェクションをそれに応じて行った。製造業者のプロトコールにより、４００ｎｇの対照ｐＥＧＦＰ−Ｃ１およびβ２．７＿ＧＦＰ融合プラスミド（＋ＮＬＳ）をトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を各々の色素で染色し、共焦点顕微鏡を使用して分析した。
【０１２７】
細胞生存分析のためのＨＥＫ２９３Ｔのトランスフェクション
５００００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレート中に播種した。８００ｎｇ当量のβ２．７  ＲＮＡを各ウェルに添加し、トータルＲＮＡ／ウェルを、非処理のＨＥＫ２９３Ｔ細胞から以前に単離したＲＮＡを使用して８００ｎｇに調節した。６時間後に培地を交換した。１０５個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレート中に播種し、１．５μｇのβ２．７  ＲＮＡ＿アンチセンス融合ＲＮＡをトランスフェクトした。以前に単離したＲＮＡは、標的配列を含有し得るので、それゆえ、単離したＲＮＡの代わりにフィーダーＲＮＡ（酵母ｔＲＮＡ）を使用してトータルＲＮＡ／ウェルを１．５μｇに調節した。続いて、トランスフェクション６時間後に培地を交換した。
【０１２８】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏアッセイのためのＨｅｋ２９３Ｔのトランスフェクション
２５０００個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに播種し、３００ｎｇ当量のβ２．７  ＲＮＡ＿アンチセンスＲＮＡをトランスフェクトした。１ウェル当たりのＲＮＡの量を、フィーダーＲＮＡを使用して調節した。トランスフェクション６時間後に培地を交換した。
【０１２９】
ＲＮＡの単離およびリアルタイムＰＣＲ
ミトコンドリアＲＮＡの単離
ミトコンドリア単離キット（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）を使用して製造業者のガイドラインにより、ＨｅｐＧ２細胞からミトコンドリアを単離した。単離したミトコンドリアを、１×ミトコンドリア単離緩衝液中に再懸濁した。汚染細胞質ＲＮＡを除去するために、ミトコンドリア懸濁液を、以前に説明するようにＲＮアーゼＡ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。インキュベーション後、ＲＮアーゼＡを、２×体積のＴｒｉｚｏｌ試薬の添加により不活性化し、その後ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造業者のガイドラインにより抽出した。
【０１３０】
トータルＲＮＡの単離
２４ウェルプレート中に播種したＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、１×ＰＢＳで洗浄した。続いて、２００μｌのＴｒｉｚｏｌ試薬を添加した。２４ウェル中の混合物を、溶液が粘性を失うまで再懸濁した。構成成分をその後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、ＲＮＡを製造業者のガイドラインにより単離した。
【０１３１】
ＤＮアーゼ処理およびｃＤＮＡ合成
５００ｎｇの単離したＲＮＡ（ミトコンドリア／トータル）を、１ｕのＤＮアーゼＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および２０ＵのＲｎアーゼＯＵＴと共に３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を、３．７５ｍＭの最終濃度になるように添加し、７５℃で１２分間インキュベートして、ＤＮアーゼＩを不活性化した。この反応混合物をその後、１×ＲＴ緩衝液、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ＵのＲＮアーゼＯＵＴ、５００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎｇのランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２５Ｕのｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＡＢＩ）で、２０μｌの最終体積にて３７℃で２時間、逆転写し、続いて８５℃で１５分間熱不活性化した。
【０１３２】
リアルタイムＰＣＲ
１μｌのｃＤＮＡを、５μｌの２×ＳＹＢＲ  ＣＦＸマスターミックスおよび４００ｎｍの各（フォワードおよびリバース）プライマーと混合した。ＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機内で、以下の熱サイクル条件：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間を４０サイクルを使用してリアルタイムＰＣＲを行った。各試料を、二重で行った。
【０１３３】
相対的定量
１２ｓ  ｒＲＮＡを、正規化のための内部対照として使用した。ΔΔＣＴ法を使用して、相対的ＲＮＡレベルを決定した。非処理のミトコンドリア試料との比較により、細胞質汚染β−アクチンのレベルを決定した。
【０１３４】
絶対的定量
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（トランスフェクトするＲＮＡ）を、１０１０〜１００１分子に連続希釈し、逆転写し、上記に説明するようにリアルタイムＰＣＲに供した。反応当たりの分子数に対してメジアンＣＴ値をプロットすることにより、ＲＮＡ標準曲線を準備した。ＳＤＳ２．４ソフトウェアを使用して各々の標準曲線と比較することにより、各ＲＮＡのコピー数（単離したＲＮＡのマイクログラム（μｇ）当たりの分子数）を決定した。
【０１３５】
フローサイトメトリーによるＧＦＰ発現の分析
試料調製
２４ウェルに播種したＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、その後トリプシンを完全ＤＭＥＭの添加により不活性化した。ＤＭＥＭ中の細胞を、遊離細胞塊に対して８〜１０倍に再懸濁し、続いて６０００ｇで５分間の遠心分離にてペレット化した。細胞をその後、１×ＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析のために完全ＤＭＥＭ中に再懸濁した。
【０１３６】
フローサイトメトリー分析
Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙＡｎＡＤＰフロサイトメーターを使用して、フローサイトメトリー分析を行った。細胞に４８８ｎｍレーザーを照射し、前方（ＦＳＣ−Ａ）および側方散乱（ＳＳＣ−Ａ）を使用してＦＳＣパルス幅分析を使用する二重項排除によってゲート開閉した。５１０ｎｍ〜５４０ｎｍバンドパスフィルターを使用して、ＧＦＰ発現を測定した。トランスフェクション後１、３および５日目に、最大２０，０００個の細胞を測定した。ＦｌｏｗＪＯ  ７．６．１を使用して、データを分析した。
【０１３７】
共焦点顕微鏡
細胞をチャンバースライド内でトランスフェクトし、トランスフェクション後３日目に分析した。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）および／またはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＨ２ＴＭＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で製造業者のガイドラインにより染色した。細胞をその後、ＨＣＳ  ＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で対比染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）レーザースキャニング共焦点顕微鏡で、６０×／１．００水浸対物レンズを使用して、４０５ｎｍ固体レーザーダイオード（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー（ＧＦＰ）、５４３ｎｍ  ＨｅＮｅ緑色レーザー（Ｍｉｔｏｃｔｒａｃｋｅｒ）および６３３ｎｍ  ＨｅＮｅ赤色（ｃｅｌｌ  ｍａｓｋ）にて、画像を取り込んだ。画像を続いて、ＩｍａｇｅＪ  Ｖ１．４８を使用して分析した。
【０１３８】
ロテノン誘導細胞死
２００ｍＭのロテノンストック溶液を、無水ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中に調製した。ロテノンストック溶液を、完全ＤＭＥＭ中に２００μＭの最終濃度になるように希釈し、０．２２μＭフィルターを使用して濾過した。トランスフェクション２４時間後、ロテノン＿ＤＭＥＭを、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞に投与し、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイを使用してトランスフェクション２４、４８および７２時間後に細胞死を決定した。細胞死査定後、細胞をＰＢＳで洗浄し、続く時点での分析のために新しい薬物を投与した。
【０１３９】
Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ細胞生存アッセイ
２４ウェルプレート中に播種したＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞生存アッセイに、製造業者のガイドラインにより供した。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１リーダーを使用して発光／励起（５３０／５９０）で、感度を６０に設定して、蛍光を測定した。細胞生存における低減の割合（％）を、細胞のみの対照との比較により決定した。
【０１４０】
ＡＴＰレベルの測定
Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレート中でトランスフェクトし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、トランスフェクション２４時間後にＡＴＰレベルを決定した。ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００ＰＲＯプレートリーダーを使用して、発光を測定した。絶対ＡＴＰレベルを、製造業者のガイドラインにより準備したＡＴＰ標準曲線から決定した。ＡＴＰレベルの相対的変化を、細胞のみの対照との比較により決定した。
【０１４１】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０を使用して、統計分析を行った。全ての数値は、３回の独立した実験の平均＋ＳＤ（平均＋標準偏差）として表した。スチューデントｔ検定および分散分析を使用して、統計的有意性を決定した。
【０１４２】
構築物ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４の生成
最終Ｄ２反復の下流の（Ｄ２）４中に安定化スペーサー配列を挿入して、（Ｄ２）４＿Ｓ構築物を得た。（Ｄ２）４＿Ｓを、いずれかの末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するプライマーでＰＣＲ増幅した。続いて、ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローニングして、ＡＴＰ６＿（Ｄ３）４＿（Ｄ２）４構築物を得た。
【０１４３】
フルオレセイン−１２ウラシル標識ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
蛍光ＲＮＡを、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））で合成した。１μｇの直鎖状プラスミド／精製ＰＣＲ鋳型を、５μｌの５×転写緩衝液、５μＬの１０ｍＭ  ＮＴＰ混合物（１０ｍＭ  ＧＴＰ、１０ｍＭ  ＣＴＰ、１０ｍＭ  ＡＴＰ、７．５ｍＭ  ＵＴＰ、２．５ｍＭ  フルオレセイン−１２  ＵＴＰ）、１０ＵのＲＮアーゼＯＵＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２０ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼと２５μＬの最終体積で３７℃にて３時間インキュベートした。３ＵのＤＮアーゼＩを反応混合物に添加し、３７℃で少なくとも３０分間インキュベートして、ＤＮＡ鋳型を除去した。ＲＮＡをその後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。臭化エチジウム非含有１．５％アガロースゲルで、ＲＮＡの質を分析した。ＵＶトランスイルミネーター上でゲルに照射し、Ｓａｍｓｕｎｇ  ｇａｌａｘｙ  Ｓ７スマートフォンを使用して取り込んだ。ＩｍａｇｅＪ  ｖ１．４８を使用して、バンド強度を決定した。
【０１４４】
共焦点顕微鏡
細胞をチャンバースライド内でトランスフェクトし、トランスフェクション２４時間後に分析した。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＨ２ＴＭＲｏｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で製造業者のガイドラインにより染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）レーザースキャニング共焦点顕微鏡で、６０×／１．００水浸対物レンズを使用して、４０５ｎｍ固体レーザーダイオード（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー（ＧＦＰ）、５４３ｎｍ  ＨｅＮｅ緑色レーザー（Ｍｉｔｏｃｔｒａｃｋｅｒ）にて、画像を取り込んだ。画像を続いて、ＩｍａｇｅＪ  Ｖ１．４８を使用して分析した。ｐｌｕｇｉｎ  ＪＡＣＯＰを使用して、ミトコンドリア（赤色）画分内のＧＦＰ（緑色）の共局在化の程度を決定し、マンダースオーバーラップ係数（ＭＯＣ）を報告した。
表
【０１４５】
【表２】
2019514972.tif 000007
2019514972.tif 000008
2019514972.tif 000009
【０１４６】
【表３】
2019514972.tif 000010
2019514972.tif 000011
2019514972.tif 000012
2019514972.tif 000013
2019514972.tif 000014
2019514972.tif 000015
2019514972.tif 000016
2019514972.tif 000017
2019514972.tif 000018
2019514972.tif 000019
2019514972.tif 000020
2019514972.tif 000021
2019514972.tif 000022
2019514972.tif 000023
2019514972.tif 000024
2019514972.tif 000025
2019514972.tif 000026
2019514972.tif 000027
2019514972.tif 000028
2019514972.tif 000029
2019514972.tif 000030
【０１４７】
【表４】
2019514972.tif 000031
2019514972.tif 000032
2019514972.tif 000033
2019514972.tif 000034
2019514972.tif 000035
2019514972.tif 000036
2019514972.tif 000037
2019514972.tif 000038
2019514972.tif 000039
2019514972.tif 000040
2019514972.tif 000041
2019514972.tif 000042
2019514972.tif 000043
2019514972.tif 000044
2019514972.tif 000045
2019514972.tif 000046
2019514972.tif 000047
2019514972.tif 000048
2019514972.tif 000049
2019514972.tif 000050
2019514972.tif 000051
2019514972.tif 000052
2019514972.tif 000053
2019514972.tif 000054
2019514972.tif 000055
2019514972.tif 000056
2019514972.tif 000057
2019514972.tif 000058
2019514972.tif 000059
2019514972.tif 000060
2019514972.tif 000061
【図１ａ】
2019514972.tif 000066
【図１ｂ】
2019514972.tif 000067
【図１ｃ】
2019514972.tif 000068
【図１ｄ】
2019514972.tif 000069
【図１ｅ】
2019514972.tif 000070
【図１ｆ】
2019514972.tif 000071
【図２ａ】
2019514972.tif 000072
【図２ｂ】
2019514972.tif 000073
【図２ｃ】
2019514972.tif 000074
【図２ｄ】
2019514972.tif 000075
【図３ａ】
2019514972.tif 000076
【図３ｂ】
2019514972.tif 000077
【図３ｃ】
2019514972.tif 000078
【図３ｄ】
2019514972.tif 000079
【図３ｅ】
2019514972.tif 000080
【図３ｆ】
2019514972.tif 000081
【図３ｇ】
2019514972.tif 000082
【図３ｈ】
2019514972.tif 000083
【図３ｉ】
2019514972.tif 000084
【図３ｊ】
2019514972.tif 000085
【図３ｋ】
2019514972.tif 000086
【図４ａ】
2019514972.tif 000087
【図４ｂ】
2019514972.tif 000088
【図４ｃ】
2019514972.tif 000089
【図４ｄ】
2019514972.tif 000090
【図４ｅ】
2019514972.tif 000091
【図４ｆ】
2019514972.tif 000092
【図５ａ】
2019514972.tif 000093
【図５ｂ】
2019514972.tif 000094
【図５ｃ】
2019514972.tif 000095
【図５ｄ】
2019514972.tif 000096
【図５ｅ】
2019514972.tif 000097
【図５ｆ】
2019514972.tif 000098
【図５ｇ】
2019514972.tif 000099
【図５ｈ】
2019514972.tif 000100
【図６ａ】
2019514972.tif 000101
【図６ｂ】
2019514972.tif 000102
【図６ｃ】
2019514972.tif 000103
【図６ｄ】
2019514972.tif 000104
【図６ｅ】
2019514972.tif 000105
【図６ｆ】
2019514972.tif 000106
【図７】
2019514972.tif 000107
【図８】
2019514972.tif 000108
【図９】
2019514972.tif 000109
【図１０】
2019514972.tif 000110
【図１１】
2019514972.tif 000111
【図１２】
2019514972.tif 000112
【図１３】
2019514972.tif 000113
【図１４】
2019514972.tif 000114
【図１５】
2019514972.tif 000115
【図１６】
2019514972.tif 000116
【図１７】
2019514972.tif 000117
【図１８ａ】
2019514972.tif 000118
【図１８ｂ】
2019514972.tif 000119
【図１８ｃ】
2019514972.tif 000120
【図１８ｄ】
2019514972.tif 000121
【図１８ｅ】
2019514972.tif 000122
【図１８ｆ】
2019514972.tif 000123
【図１８ｇ】
2019514972.tif 000124
【図１８ｈ】
2019514972.tif 000125
【図１８ｉ】
2019514972.tif 000126
【図１８ｊ】
2019514972.tif 000127
【図１９ａ】
2019514972.tif 000128
【図１９ｂ】
2019514972.tif 000129
【図２０−１】
2019514972.tif 000130
【図２０−２】
2019514972.tif 000131
【国際調査報告】
2019514972.tif 000132
2019514972.tif 000133
2019514972.tif 000134
2019514972.tif 000135