(57)【要約】  本発明は、癌の成長を抑制するための手段及び方法を提供する。一部の実施形態における手段は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分と、に結合する、タンパク質及び抗体を含む。タンパク質、抗体及び細胞の作製に有用な様々な細胞及びアッセイが、更に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー又はｃＭＥＴの膜結合型メンバーの細胞外部分、及び、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合型メンバーの細胞外部分に結合するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が抗体、好ましくは二重特異性抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ＷＮＴ経路が古典的（canonical）ＷＮＴ経路である、請求項１又は２に記載のタンパク質又は抗体。
【請求項４】
前記ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーが上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ若しくはＥｒｂｂ−１）又はＥｒｂｂ−３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
【請求項５】
前記ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合型メンバーが、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＦＲＺ１、ＦＲＺ２、ＦＲＺ３、ＦＲＺ４、ＦＲＺ５、ＦＲＺ６、ＦＲＺ７、ＦＲＺ８、ＦＲＺ９、ＦＲＺ１０、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３、Ｎ−カドヘリン、Ｋｒｅｍｅｎ１及びＫｒｅｍｅｎ２、ＲＯＲ２、又はＲＹＫを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
【請求項６】
前記ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合型メンバーが、ＷＮＴシグナル伝達に関与するＬＧＲファミリーのメンバー、好ましくはＬＧＲ４、若しくはＬＧＲ５、又はＺＮＲＦ３、若しくはＲＮＦ４３を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
【請求項７】
前記タンパク質が、二重特異性抗体、又はその機能性部分、誘導体及び／若しくは類似体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質又は抗体。
【請求項８】
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー又はｃＭＥＴの膜結合型メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインと、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合型メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインとを含む、二重特異性抗体、又はその機能性部分、誘導体及び／若しくは類似体。
【請求項９】
ＥＧＦＲ及びＬＧＲ４、ＥＧＦＲ及びＬＧＲ５、ＥＧＦＲ及びＺＮＲＦ３、ＥＧＦＲ及びＲＮＦ４３、ＨＥＲ３及びＬＧＲ４、ＨＥＲ３及びＬＧＲ５、ＨＥＲ３及びＺＮＲＦ３、又はＨＥＲ３及びＲＮＦ４３に結合する可変ドメインを含む、請求項８に記載の二重特異性抗体、又はその機能性部分、誘導体及び／若しくは類似体。
【請求項１０】
ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインと、を含み、
ＥＧＦＲに結合する前記可変ドメインのＶＨ鎖が、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、前記ＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下、好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下若しくは１個以下のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する前記可変ドメインのＶＨ鎖が、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列、又は、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列において、前記ＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下、好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下若しくは１個以下のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、請求項８又は９に記載の二重特異性抗体、又はこの機能性部分、誘導体及び／若しくは類似体。
【請求項１１】
癌を有する個体の治療で用いるための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
前記癌が腺癌である、請求項１１に規定の使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
前記癌が、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、黒色腫、精巣癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、又はカルチノイド癌である、請求項１１又は１２に規定の使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
前記癌が結腸直腸癌である、請求項１１〜１３のいずれか一項に規定の使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
癌を有する個体の治療のための方法であって、前記方法が、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、又は前記抗体の機能性部分、誘導体及び／若しくは類似体を、これらを必要とする前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合型メンバーを発現し、かつ前記ＷＮＴ経路の膜結合型メンバーを発現する細胞と、を含む、細胞系。
【請求項１７】
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合型メンバーを発現し、かつ前記ＷＮＴ経路の膜結合型メンバーを発現する細胞の増殖を、前記細胞の増殖を許容する系において抑制するための方法であって、前記方法が、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは抗体、又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を前記系に提供することを含む、方法。
【請求項１８】
ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、前記エピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に位置し、前記アミノ酸残基のうち、Ｄ４３、Ｇ４４、Ｍ４６、Ｆ６７、Ｇ９０、及びＦ９１が、前記抗体の前記エピトープへの結合に関与する、抗体。
【請求項１９】
Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのアミノ酸残基置換のうちの１つ以上が、前記抗体のＬＧＲ５への前記結合を低下させる、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、前記エピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に位置し、前記抗体のＬＧＲ５への前記結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体。
【請求項２１】
ＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との前記抗体の相互作用が、Ｒスポンジン（ＲＳＰＯ）のＬＧＲ５への結合を２０％を超えて抑制しない、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体のＬＧＲ５への結合の抑制が、前記抗体及び前記ＲＳＰＯが、モル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在する場合に測定される、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に位置するＬＧＲ５上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、ＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との前記抗体の相互作用が、ＲＳＰＯのＬＧＲ５への結合を、前記抗体及び前記ＲＳＰＯがモル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在する場合、２０％を超えて抑制しない、抗体。
【請求項２４】
前記エピトープが立体構造エピトープである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
二重特異性抗体であり、更に、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー又はｃＭＥＴの膜結合型メンバーに結合することができる可変ドメインを含む、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
ヒトＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、アミノ酸残基のうち、Ｉ４６２、Ｇ４６５、Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｎ４９３、及びＣ４９９が前記抗体の前記エピトープへの結合に関与する、抗体。
【請求項２７】
Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａから選択されるアミノ酸残基置換のうちの１つ以上が、前記抗体のヒトＥＧＦＲへの前記結合を低下させる、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
ヒトＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、前記エピトープが、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に位置し、前記抗体のＥＧＦＲへの前記結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合分子の領域に関する。詳細には、本発明は、異常細胞を伴う疾患の治療のための治療用結合分子の領域に関する。より詳細には、本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とに結合する結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
この疾患の治療において達成された多くの進歩、及び癌の原因となる分子現象についての知識の増加にも関わらず、癌は依然として、世界における死亡の主要原因である。例えば、結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、全世界で３番目に多い癌である。２００８年に、１２３万人がこの疾患と診断された。結腸直腸癌は欧州において２番目に多い癌であり、２０１２年には、約４４７，０００の症例が新たに診断された（全体の１３％）。結腸直腸癌は癌死亡の４番目に多い原因となっており、年間６０８，０００の死亡原因（ＥＵでは１４８，０００）となっていると推定される。ＣＲＣにおいてはいくつかの新たな治療が進歩してはいるものの、多くが臨床試験で不成功に終わり、転移性ＣＲＣは依然として、ほとんど治療不可能である。
【０００３】
従来、ほとんどの抗癌剤の発見は、必須の細胞機能を阻害し、分裂細胞を死滅させる薬剤に焦点が向けられてきた。しかしながら、進行癌の症例では、治療によって患者が生命を脅かすほどの副作用に苦しむ程度まで積極的に適用しても、化学療法によって完治に至るのはまれである。ほとんどの症例において、患者の体内の腫瘍は成長を停止し、又は一時的に収縮する（寛解と呼ばれる）が、時にはより急激に再び増殖を開始し（再発と呼ばれる）、治療がますますより困難となる。更に最近になって、抗癌剤開発の焦点は、広範囲の細胞毒性化学療法から、より毒性が低い細胞増殖抑制性の標的療法へと移行した。シグナル伝達経路成分を特異的に抑制する標的療法による進行癌の治療は、白血病において、臨床的に実証された。しかしながら、大部分の癌腫において、標的療法は依然として無効であることが判明している。結腸直腸癌においては、８０％を超える患者が、受容体型チロシンキナーゼＥＧＦＲを過剰発現しているが、ＥＧＦＲ阻害療法による治療の結果は反応率が１０％程度であり、化学療法の場合と同様に、これらの反応は持続的ではない。一部の患者においては、この低い反応率は、阻害剤の下流の変異の活性化に関連する場合があるが、特別な種類の自己再生癌細胞が、多くの状況において、抗癌剤の作用が限定的である原因の説明になり得るとの科学的エビデンスが蓄積されつつある。
【０００４】
癌幹細胞は、正常幹細胞と特徴を共有し、最も重要なものとしては、長期間に渡って自己再生する能力を持つ腫瘍細胞であり、特定の癌において多くの細胞種を生じさせる。最近のエビデンスによれば、従来の化学療法及び現在の標的療法によって、腫瘍の大部分を形成する分化した細胞及び分化しつつある細胞は死滅するが、一方で、自己再生癌幹細胞は、これらの治療手法には感応性がより低いことが示唆されている。そのため、典型的には、腫瘍中に細胞の小さな亜集団を形成する癌幹細胞は、治療後の疾患の再発及び転移の形成の原因である可能性がある。癌幹細胞は、癌の発達を開始する１つ以上の変異を蓄積した、成体幹細胞から発生すると考えられている。正常幹細胞では、正常幹細胞の周囲環境において伝達されるシグナルを介し、空間的にも時間的にも両面において、増殖は厳重に制御されている。対照的に、癌幹細胞は、正常幹細胞が癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子における変異に依存している正常幹細胞の区画外で、より少ない制御の下で、増殖し、かつ分化する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
理論に束縛されるわけではないが、癌幹細胞を標的とし、これらの細胞における重要な成長経路及び分化経路を遮断する手段及び方法が開発されたものと考えられる。標的化は、幹細胞の標的に特異的な結合アームと、成長因子受容体経路を特異的に阻害する別の結合アームとを有するタンパク質を用いることにより、実現される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とに結合するタンパク質を提供する。本タンパク質は、好ましくは抗体であり、好ましくは二重特異性抗体、又はこれらの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体である。
【０００７】
本発明はまた、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とに結合する二重特異性抗体、又はこの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体を提供する。
【０００８】
癌を有する個体の治療方法であって、本方法が、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を、これらを必要とする個体に投与することを含む、方法もまた提供される。
【０００９】
本発明は、癌を有する個体の治療で用いるための本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を更に提供する。
【００１０】
一実施形態において、癌は、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＥＧＦ受容体リガンド反応癌である。
【００１１】
本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体と、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞と、を含む細胞系が更に提供される。この細胞は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＥＧＦ受容体リガンド反応細胞である。
【００１２】
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞の成長を、この細胞の成長を許容する系において抑制するための方法であって、本方法が、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を系に提供することを含む、方法もまた提供される。この細胞は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＥＧＦ受容体リガンド反応細胞である。
【００１３】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、これらのアミノ酸残基のうち、Ｄ４３、Ｇ４４、Ｍ４６、Ｆ６７、Ｇ９０、及びＦ９１が、抗体のエピトープへの結合に関与する、抗体を提供する。
【００１４】
抗体は、好ましくは、アミノ酸残基Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上の置換が、ＬＧＲ５の抗体の結合を低下させる抗体である。
【００１５】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、抗体のＬＧＲ５への結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体を更に提供する。
【００１６】
抗体は、好ましくは、ＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との抗体の相互作用が、Ｒスポンジン１（ＲＳＰＯ  １）のＬＧＲ５への結合を２０％を超えて抑制しない、抗体である。抗体のＬＧＲ５への結合の抑制は、好ましくは、抗体及びＲＳＰＯが、モル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在する場合に測定される。
【００１７】
本発明は、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置されるＬＧＲ５上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、ＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との抗体の相互作用が、ＲＳＰＯのＬＧＲ５への結合を、抗体及びＲＳＰＯがモル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在する場合、２０％を超えて抑制しない、抗体を更に提供する。
【００１８】
エピトープは、好ましくは立体構造エピトープである。エピトープは、好ましくは、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基４０〜９５内に配置される。抗体のＬＧＲ５への結合は、好ましくは、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される。抗体は、好ましくは、更なるタンパク質に結合可能な更なる可変ドメインを更に含む。更なるタンパク質は、好ましくは、細胞外部分を含む膜タンパク質である。更なるタンパク質は、好ましくは、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。
【００１９】
特に好ましい実施形態においては、抗体は二重特異性抗体である。
【００２０】
二重特異性抗体は、好ましくは、ＬＧＲ５の細胞外部分上の上記のエピトープに結合可能な可変ドメインと、更なるタンパク質に結合可能な可変ドメインと、を含む。本明細書に記載したように、更なるタンパク質は、好ましくは、ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。この更なるタンパク質に結合する可変ドメインは、好ましくは、上記の更なるタンパク質の細胞外部分に結合する。
【００２１】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインと、更なるタンパク質に結合可能な可変ドメインと、を含む二重特異性抗体であって、ＬＧＲ５エピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、これらのアミノ酸残基のうち、Ｄ４３、Ｇ４４、Ｍ４６、Ｆ６７、Ｇ９０、及びＦ９１が抗体の結合に関与する、二重特異性抗体を更に提供する。可変ドメインのＬＧＲ５への結合は、好ましくは、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される。更なるタンパク質は、好ましくは、細胞外部分を含む膜タンパク質である。更なるタンパク質は、好ましくは、ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。
【００２２】
ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴへの（二重）特異性抗体の結合は、好ましくは、上記のＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴを含む細胞において、リガンド誘導シグナル伝達を低下させる。
【００２３】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、タンパク質のＬＧＲ５への結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体を更に提供する。
【００２４】
理論に束縛されるわけではないが、図３９に示したＬＧＲ５のＭ４６、Ｆ６７、Ｇ９０、及びＦ９１は、可変ドメインに対する接触残基、すなわち、ＬＧＲエピトープに結合可能な可変ドメインの抗原結合部位であると考えられる。アミノ酸残基Ｄ４３Ａ及びＧ４４Ａの置換によって抗体の結合が低下することは、これらのアミノ酸残基が接触残基であるという事実による可能性があるが、これらのアミノ酸残基の置換が、１つ以上の他の接触残基（すなわち、４６、６７、９０又は９１位の）を有するＬＧＲの部分の立体構造の（わずかな）変化を誘導し、その立体構造が抗体結合を低下する程度のものである可能性もある。エピトープは、上記のアミノ酸置換を特徴とする。抗体が同一のエピトープに結合するか否かは、様々な方法で判定可能である。実施例において、好ましい方法を記載する。本方法は、ＣＨＯ細胞を利用する。ＣＨＯ細胞はＬＧＲ５を細胞膜上に、又は、アラニン置換変異体上に発現し、好ましくは、変異体は、置換Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、又はＦ９１Ａのうちの１つ以上を含む。試験抗体はＣＨＯ細胞に接触され、抗体の細胞への結合が比較される。試験抗体は、抗体がＬＧＲ５に結合し、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、又はＦ９１Ａの置換を有するＬＧＲ５にはより弱い程度で結合する場合、エピトープに結合する。それぞれが１つのアラニン残基置換を含む変異体のパネルとの結合を比較することが、好ましい。このような結合試験は、当該技術分野において周知である。多くの場合、パネルは、本質的に全てのアミノ酸残基を網羅する、単一のアラニン置換変異体を含む。ＬＧＲ５については、パネルは、タンパク質の細胞外部分を網羅する必要のみがある。特定の変異体の発現は弱められ得るが、これは、異なる領域（複数可）に結合する１つ以上のＬＧＲ５抗体によって容易に検出される。発現がまた、これらの対照抗体に対して低下される場合、膜上のタンパク質のレベル又はフォールディングは、この特定の変異体に対して弱められる。パネルに対する試験抗体の結合特性により、試験抗体が、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、又はＦ９１Ａの置換を有する変異体に対して低下した結合を呈するか否か、要するに、試験抗体が本発明の抗体であるか否かが、容易に特定される。Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、又はＦ９１Ａの置換を有する変異体への低下した結合により、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置されるエピトープもまた特定され、同じことが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基４０〜９５内の配置にも当てはまる。好ましい実施形態においては、パネルは、Ｄ４３Ａ置換変異体、Ｇ４４Ａ置換変異体、又は両方を含む。ＭＦ５８１６のＶＨのＶＨ配列を有する抗体は、これらの置換変異体に対し、低下した結合を呈する。
【００２５】
好ましい実施形態においては、ＲＳＰＯ  １のＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との相互作用は、抗体のＬＧＲ５への結合を、２０％を超えて抑制しない。抗体のＬＧＲ５への結合の抑制は、好ましくは、抗体及びＲＳＰＯ  １が、モル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在する条件下で測定される。
【００２６】
結合の抑制は、好ましくは、抗体及びＲＳＰＯ  １が、モル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在するときに測定される。抗体のＲＳＰＯに対するモル比が０．００１未満であると、抗体のＬＧＲ５への結合が低下される場合が時としてあることが分かった。
【００２７】
本明細書において抗体のＲＳＰＯに対するモル比に言及する場合、抗体は、飽和量の抗体が存在する際に得られる結合の４０％〜８０％をもたらす量で存在することが好ましい。
【００２８】
本発明は、ヒトＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、アミノ酸残基のうち、Ｉ４６２、Ｇ４６５、Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｎ４９３、及びＣ４９９が抗体のエピトープへの結合に関与する抗体を更に提供する。抗体は、好ましくは、抗体のＥＧＦＲへの結合がＥＧＦＲによって低下されることを特徴とする抗体であり、Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａから選択されるアミノ酸残基置換のうちの１つ以上が導入されている。
【００２９】
本発明は、ヒトＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に配置され、抗体のＥＧＦＲへの結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体を更に提供する。抗体のヒトＥＧＦＲへの結合は、ＥＧＦの受容体への結合を阻害する。ＥＧＦＲ上のエピトープは立体構造エピトープである。
【００３０】
このエピトープは、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に、好ましくは、図４０に示した配列番号２の４３０〜４８０内に、好ましくは、図４０に示した配列番号２の４３８〜４６９内に配置される。
【００３１】
抗体は、好ましくは、更なる可変ドメインを含み、この更なる可変ドメインは、更なるタンパク質に結合可能である。更なるタンパク質は、好ましくは、細胞外部分を含む膜タンパク質である。更なるタンパク質は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーである。
【００３２】
抗体は、典型的には二重特異性抗体である。
【００３３】
ヒトＥＧＦＲに結合する可変ドメインは、好ましくは、少なくとも、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ３配列と異なるＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を有する可変ドメインである。
【００３４】
ヒトＥＧＦＲに結合する可変ドメインは、好ましくは、少なくとも、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸置換を有する、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を有する可変ドメインである。
【００３５】
ヒトＥＧＦＲに結合する可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨ鎖の配列、又は、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨ鎖のアミノ酸配列において、ＭＦ３７５５のＶＨ鎖に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を有する可変ドメインである。
【００３６】
更なるタンパク質は、好ましくは、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３、好ましくはＬＧＲ５である。
【００３７】
本発明は、ＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインと、更なるタンパク質に結合可能な可変ドメインと、を含む二重特異性抗体であって、ＥＧＦＲエピトープが、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に配置され、これらのアミノ酸残基のうち、Ｉ４６２、Ｇ４６５、Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｎ４９３、及びＣ４９９が抗体のエピトープへの結合に関与する、二重特異性抗体を更に提供する。可変ドメインのＥＧＦＲへの結合は、好ましくは、以下のアミノ酸残基置換Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａのうちの１つ以上によって低下される。更なるタンパク質は、好ましくは細胞外部分、好ましくはＷＮＴ経路の膜結合メンバー、好ましくはＬＧＲ５を含む、膜タンパク質である。
【００３８】
理論に束縛されるわけではないが、エピトープの接触残基、すなわち、可変ドメインがヒトＥＧＦＲに接触するのは、恐らくＩ４６２、Ｋ４８９、Ｉ４９１、及びＮ４９３であると考えられる。アラニンへの置換による変異は、エピトープの（わずかな）立体構造の変化を誘導し、その結果、エピトープへの結合が低下するため、アミノ酸残基Ｇ４６５及びＣ４９９は、恐らく、抗体のＥＧＦＲへの結合に間接的に関与している。
【００３９】
上記のエピトープを有するＥＧＦＲに結合する１つ以上の可変ドメインを含む抗体は、ＥＧＦＲリガンド反応癌又は細胞の成長を抑制するために用いられた際、より良好な有効性を有することが示されている。二重特異性抗体において、上記のエピトープとのＥＧＦＲ結合可変ドメインを含む抗体のアームは、他の細胞表面タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む様々な他のアームと、より良好に組み合わされる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１−１】図１。  本出願に記載のＶＨフラグメントのアミノ酸配列である。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域、並びにＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４領域を示している。
【図１−２】図１の続き。
【図２−１】図２。本出願に記載の、選択された、ＶＨをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【図２−２】図２の続き。
【図２−３】図２の続き。
【図２−４】図２の続き。
【図２−５】図２の続き。
【図３】共通軽鎖（ｃＬＣ）の注釈付きの配列である。
【図４−１】図４。  本出願において試験した抗体の注釈付きのＦｃ（ＣＨ１〜ＣＨ３）領域のアミノ酸配列である。
【図４−２】図４の続き。
【図５】チューモロイド（tumoroid）Ｐ１４Ｔ及びＰ１８Ｔにおけるチューモロイド形態に対する成長因子ＥＧＦ及びＨＲＧの効果を示す画像である。  チューモロイドＰ１４Ｔ及びＰ１８Ｔにおけるチューモロイド形態に対する成長因子ＥＧＦ及びＨＲＧの効果の例。成長因子は、チューモロイドの大きさ、管腔の大きさ及び管腔の分布の変化を同時に誘導する。これらの３つの形態パラメータの組み合わせにより、確認されたオルガノイドについて、固有の特徴空間における配置が特定される。ユークリッド距離は、これらの３つの特徴の組み合わせに基づき、成長因子を含まない（ＧＦなしの）場合を基準点として算出することができる。次いで、ユークリッド距離は、処理によって誘導されたＸ、Ｙ及びＺ方向の変化となる。
【図６】３５日目に取得した、抗原を安定的に過剰発現したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に結合する、ＺＮＲＦ３免疫した動物の血清のＦＡＣＳ解析図である。  安定的にＺＮＲＦ３のＥＣＤを発現する２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞株への結合について血清を試験し、０日目（免疫前）の血清と比較した。全てのパネルが、対照（非染色）細胞（灰色塗りつぶし）と、それぞれの血清で染色した細胞（塗りつぶしなし）との重複を示している。マウスをＬ１９〜Ｌ２４でナンバリングし、対照染色を、図の右側のｎ．ｃ．：陰性対照に示す。
【図７】選定したモノクローナルファージクローンの調製物を用いた、ＤｉＤ標識ＺＮＲＦ３過剰発現細胞と非標識（親）２９３Ｆ  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞との混合物のＦＡＣＳ染色の例である。  全てのドットプロットは、非染色細胞と、ファージ上で発現した選定したＦａｂで染色した細胞との重複である。全てのパネルの上半分は、ＤｉＤ標識抗原陽性細胞を示し、パネルの下半分は、非標識抗原陰性２９３Ｆ  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を示している。図に示した６つのクローン（１〜６と表示）のうち、４つは抗原特異的（１、３、４及び６）であり、２つ（２及び５）は非反応性である。タンパク質の発現の対照は、ｃＭｙｃ由来エピトープタグを標的とする抗体で染色し、陰性対照は、二次抗体（抗Ｍ１３及びＳｔｒｅｐ−ＰＥ）のみで染色した。
【図８】ｈＬＧＲ５を過剰発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞の細胞表面のｈＬＧＲ５を標的とする一価のＩｇＧ（全て破傷風トキソイドＦａｂフラグメントと組み合わせた）の親和性順位付けのグラフ図である。  全パネルのうちの代表例を示す。ＩｇＧの２倍希釈系列（５μｇ／ｍＬ〜０．０８μｇ／ｍＬ）を、ｈＬＧＲ５を安定的に発現する一定数の細胞（５×１０５細胞／ウェル）において試験した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各データポイントについて測定し、染色に用いたＩｇＧの増加量に対してプロットした。個々の曲線に基づき、各ＩｇＧから曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、順位付けに用いた。表（右パネル）は、グラフ（左パネル）に示した二重特異性ＩｇＧのＡＵＣ値を示している。ＡＵＣ値に基づき、ＩｇＧを、これらのそれぞれの標的に対する結合親和性について順位付けした。
【図９】Ｒ−スポンジン阻害ＥＬＩＳＡにおいて試験したｈＬＧＲ５一価結合ＩｇＧ（全てＴＴ  Ｆａｂフラグメントと組み合わせた）のｒｈＲ−スポンジン３阻害能力を示すグラフ図である。  ＬＧＲ５パネルの代表例を示している。０．０３１μｇ／ｍＬのｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ及び抗Ｆｃ抗体による検出を用い、２μｇ／ｍＬのコーティングしたｒｈＲ−スポンジン３への非抑制結合により、最大結合（０％に対して規準化した）を設定した。最大結合についてのＯＤ４５０ｎｍ値を、１００％と設定した。Ｒ−スポンジン３が過剰であることは、過剰のＲ−スポンジン３（１５μｇ／ｍＬ）の添加が競合の陽性対照としての役割をすることを示している。１５μｇ／ｍＬで試験した二重特異性ＩｇＧに対するＯＤ４５０ｎｍ値を最大シグナルに基づいて規準化し、青色の棒で示した。クローンは、百分率が８０％未満である場合、部分的に阻害しているものとみなし、百分率が５０％未満である場合、阻害しているものとみなした。この例は、ＬＧＲ５標的ＬＧＲ５／ＴＴ  ＩｇＧフラグメントの代表的なパネルを示している。
【図１０】培地中、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦの存在下における、参照抗体ＰＧ３７５５（ＥＧＦＲ二価単一特異性）及びＰＢ１０６５１（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５二重特異性）の、チューモロイド株Ｐ１８Ｔに対する成長抑制効果を示す画像である。  抗体は、ＥＧＦ誘導チューモロイド表現型を、成長因子刺激がない表現型（第１列）へと回復させる。ＰＢ１０６５１は、ＥＧＦＲ二重特異性参照抗体ＰＧ３７５５よりも低い用量で、成長阻害剤として有効である。
【図１１】ＥＧＦＲ／ＷＮＴ標的二重特異性抗体及び対照処理に暴露した１つの結腸チューモロイドについての、検証選別結果の例を示す図である。  ユークリッド距離が低いほど処理効果がより強力であり、１が正常な成長に等しい。ＰＢ１０６５１（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８１６を有するＥＧＦＲ／ＬＧＲ５抗体）は、試験した用量（２μｇ／ｍＬ）で完全な成長抑制を示し、セツキシマブよりも効果が優れている。
【図１２Ａ】図１２は、放射性標識タンパク質の免疫反応性を示すグラフ図である。図１２Ａは、ＰＢ１０６５１中の抗ＥＧＦＲ  ＦａｂアームのＬｉｎｄｍｏアッセイのグラフ図である。
【図１２Ｂ】図１２は、放射性標識タンパク質の免疫反応性を示すグラフ図である。図１２Ｂは、ＰＢ１０６５１の抗ＬＧＲ５  ＦａｂアームのＬｉｎｄｍｏアッセイのグラフ図である。  １２５Ｉによるタンパク質の標識後、免疫反応性の低下はほとんどなかった。ＰＢ１０６５１は、１２５Ｉによる標識後に免疫反応性を保持している。
【図１３Ａ】図１３は、ＬＧＲ５及びＥＧＦＲに結合するＰＢ１０６５１の親和性解析のグラフ図である。図１３Ａは、ＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞に結合するＰＢ１０６５１の親和性解析のグラフ図である。
【図１３Ｂ】図１３は、ＬＧＲ５及びＥＧＦＲに結合するＰＢ１０６５１の親和性解析のグラフ図である。図１３Ｂは、ＣＨＯ−ＥＧＦＲ細胞に結合するＰＢ１０６５１の親和性解析のグラフ図である。
【図１３Ｃ】図１３は、ＬＧＲ５及びＥＧＦＲに結合するＰＢ１０６５１の親和性解析のグラフ図である。図１３Ｃは、ＤＬＤ−１細胞に結合するＰＢ１０６５１の親和性解析のグラフ図である。  ＰＢ１０６５１は、ＥＧＦＲ及びＬＧＲ５の両方にナノモル以下の親和性で結合する。
【図１４】ＰＢ１０６５１中に存在する抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームによって認識されるＥＧＦＲ上のエピトープを、ＥＧＦＲの構造（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；ｐｄｂ参照１ＹＹ９）上にモデル化した図である。ＰＢ１０６５１中の抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームは、ショットガン突然変異誘発分析による測定で、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩ中の残基に結合する。  ＰＢ１０６５１の結合に関連することが判明した残基を、構造中でハイライトしている。
【図１５】ＰＢ１０６５１によって認識されるＬＧＲ５上のエピトープを、ＲＳＰＯ  １との複合体中のＬＧＲ５の構造（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３：ｐｄｂ参照４ＢＳＲ）上にモデル化した図である。ＰＢ１０６５１中の抗ＬＧＲ５  Ｆａｂアームは、ショットガン突然変異誘発分析による測定で、ＬＧＲ５のＮ−ＣＡＰドメイン及び第１のロイシンリッチリピート中に存在する残基に結合する。  認識される残基は、二量体の左側（ライトグレー）のＬＧＲ５分子中に黒で示す。ＲＳＰＯ  １は球棒モデルで示す。
【図１６】ＯＭＰ８８Ｒ２０抗ＬＧＲ５抗体の複製品のＬＧＲ５への結合は、リガンドＲ−スポンジン１によって用量依存的に抑制されることを示すグラフ図である。  ＯＭＰ８８Ｒ２０の複製品（ＰＧ７７１１）を、ＬＧＲ５過剰発現細胞への結合のＥＣ５０（５０ｎｇ／ｍＬ）における結合について、その都度量を増加させたＲ−スポンジン１の存在下で試験した。得られたＭＦＩ値は、対照（Ｒ−スポンジン１なし）値に対して規準化した。
【図１７】ＰＢ１０６５１中に存在する抗ＬＧＲ５  Ｆａｂ  ＭＦ５８１６のＬＧＲ５への結合は、リガンドＲ−スポンジン１の大モル過剰において抑制されないことを示すグラフ図である。  ＬＧＲ５過剰発現細胞への結合について、その都度濃度を増加させたＲ−スポンジン１又はラット抗体１Ｄ９の存在下で、ＯＭＰ８８Ｒ２０の複製品（ＰＧ７７１１）を５０ｎｇ／ｍＬで試験し、二重特異性抗体を１００ｎｇ／ｍＬで試験した。表示した抗体の結合は、ＰＥ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体によって検出した。曲線の全てのポイントについて、得られたＭＦＩ値を、対照（Ｒ−スポンジン１なし）条件において判明した値に対して規準化した（この値で除算した）。
【図１８】二価の単一特異性ＰＧ３７５５が、ＥＧＦＲを介したシグナル伝達を強力に抑制することを示すグラフ図である。  Ａ４３１細胞の増殖（アラマーブルーを細胞に加えた後の蛍光カウントとして測定した：Ｙ軸）を、６２．５ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦと、その都度量を増加させた、表示した抗ＥＧＦＲ抗体との存在下で測定した。ＰＧ１３３７は、非結合（陰性）対照としての役割をした。カウントの増加は、細胞数の増加を示しており、これにより、ＥＧＦＲを介したシグナル伝達の阻害を示している。
【図１９】アフコシル化ＰＢ１０６５１が、ＥＧＦＲ及びＬＧＲ５の両方のカニクイザルオルソログに同等の親和性で結合することを示すグラフ図である。  ＦＡＣＳにおいて、表示した濃度における表示した抗体により染色後に得られたＭＦＩ値を、用いた抗体の濃度の関数として示す。ＥＧＦＲについては、セツキシマブを、カニクイザルＥＧＦＲ結合についての陽性対照として用いた。ＬＧＲ５については、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈのｈｕ８Ｅ１１ｖ２の複製品（ＰＧ７５４３）を、カニクイザルＬＧＲ５結合についての陽性対照として用いた。
【図２０】リード抗ＬＧＲ５／ＥＧＦＲ二重特異性抗体を用い、ＦＡＣＳにおける患者由来オルガノイドの染色によって可視化した、ＬＧＲ５発現の図である。  結腸直腸癌患者由来のオルガノイド試料（Ｐ１８）を、２つの異なる抗ＬＧＲ５抗体（ＭＦ５８１６及びＭＦ５８１４）と、破傷風毒素（ＴＴ）を認識する陰性対照とを用いて染色した。ＴＴ抗体の染色は、２つの抗ＬＧＲ５抗体の染色の閾値の設定に用いた。０．８％に設定したＴＴの染色により、ＭＦ５８１６抗体及びＭＦ５８１４抗体は、細胞の５３．６％及び５２．７％がＬＧＲ５発現に対して陽性であるとスコア化され、同等の染色レベルを示した。
【図２１】リード二重特異性抗ＬＧＲ５／ＥＧＦＲ二重特異性抗体を用いた患者由来オルガノイドの染色及び選別が、ＬＧＲ５発現（癌幹）細胞を強化することを示すグラフ図である。  結腸直腸癌オルガノイド株（Ｐ１８Ｔ）を、ＦＡＣＳ染色と、抗ＬＧＲ５抗体ＭＦ５８１４及びＭＦ５８１６によって同定された染色細胞の上位（陽性）及び下位（陰性）１５％の選別とに用いた。２０００の単一細胞を各集団について選別し、定量的ＰＣＲ用のｃＤＮＡの作製に用いた。Ｂ２Ｍの発現を内因性対照として用い、２−ΔΔＣＴ法及びＳｔｅｐＯｎｅ  ２．２  ｐｌｕｓソフトウェアを用い、陽性分画中のＬＧＲ５  ｍＲＮＡの発現を、陰性分画に対して表した。実験を、各抗体及び実験の繰り返しについて２回別々に実施し（実験１及び実験２）、陰性分画に対し、陽性分画中でＬＧＲ５  ｍＲＮＡの増加を呈した。エラーバーは、ＳｔｅｐＯｎｅ  ２．２  ｐｌｕｓソフトウェアを用いた解析の一部として生成される、相対定量最大（relative quantification max）を表す。
【図２２】リード抗ＬＧＲ５／ＥＧＦＲ二重特異性抗体を用いたＬＧＲ５発現細胞の患者由来オルガノイドの選別が、腫瘍開始細胞を強化することを示す図である。  左：Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＭＶＸ１０  ＭａｃｒｏＶｉｅｗ顕微鏡を用いて取得した、ＢＭＥ滴の１つを示すオルガノイドの写真である。ＭＦ５８１６の写真における挿入は、滴中のオルガノイドの１つの、より詳細な表示を示している。右：ＬＧＲ５陽性及び陰性細胞集団中に見出された、２週間の培養後にカウントされたオルガノイドの数を表す棒グラフである。
【図２３】リード抗ＬＧＲ５／ＥＧＦＲ二重特異性抗体による患者由来オルガノイドの処理が、オルガノイドの成長を強力に抑制することを示す図である。  左：表示した抗体（グラフの下に示した）による異なる処理後に見出された、平均オルガノイド数（上）及びオルガノイドの大きさ（下）を示す棒グラフである。右：異なる処理後にオルガノイドから得られた代表的な画像の例である。単一細胞を接種し、３日間放置し、オルガノイドを構築した。３日目に培地を取り出し、抗体を濃度２μｇ／ｍＬで含む培地と交換した。オルガノイドを更に７日間、更に培養した。７日目に、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳｃａｎＲを用い、４倍の光学対物レンズを用いてオルガノイドをスキャンし、ＩｍａｇｅＪを用い、自社設計のマクロを実行してオルガノイドの数を定量化した。データはＴＴ対照との比較で示す。また、対応のあるサンプルの両側ｔ検定を実施し、処理間の有意差を評価した。エラーバーは、標準偏差を表す。＊＝ｐ≦０．０５（ＴＴとの比較）、＊＊＝ｐ≦０．００１（ＴＴとの比較）。＃＝ｐ≦０．０５（ＥＧＦＲ−ＴＴとの比較）、＃＃＝ｐ≦０．００１（ＥＧＦＲ−ＴＴとの比較）。
【図２４】ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ二重特異性抗体が、未分化細胞集団の低下を増強したことを示す図である。  単一細胞を接種し、３日間培養した後、抗体で処理した。７日後に、全ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＰＣＲ解析に用い、ＬＧＲ５及びＣＫ２０（分化のマーカー）のｍＲＮＡレベルを検出した。発現の違いを、２−ΔΔＣＴ法を用いて検出した。データは、陰性対照（ＴＴ−ＴＴ）との比較で示す。実験を２回別々に実施し、２回の実験の平均を示した。エラーバーは、２回の実験の標準偏差を示す。
【図２５Ａ】図２５。  本発明のＶＨ及び／又はＣＤＲ中のアミノ酸配列において、結合特異性を喪失せずに許容されるアミノ酸配列の変化を示すスーパークラスターの例を示す図である。
【図２５Ｂ】図２５の続き。  本発明のＶＨ及び／又はＣＤＲ中のアミノ酸配列において、結合特異性を喪失せずに許容されるアミノ酸配列の変化を示すスーパークラスターの例を示す図である。
【図２５Ｃ】図２５の続き。  本発明のＶＨ及び／又はＣＤＲ中のアミノ酸配列において、結合特異性を喪失せずに許容されるアミノ酸配列の変化を示すスーパークラスターの例を示す図である。
【図２６Ａ】図２６は、患者由来チューモロイド及び正常組織由来オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長抑制におけるＰＢ１０６５１及びセツキシマブの力価の比較を示すグラフ図である。図２６Ａは、正常組織由来のオルガノイド培養物に対するＰＢ１０６５１及びセツキシマブの濃度範囲による処理の効果の例を示すグラフ図である。
【図２６Ｂ】図２６は、患者由来チューモロイド及び正常組織由来オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長抑制におけるＰＢ１０６５１及びセツキシマブの力価の比較を示すグラフ図である。図２６Ｂは、癌組織由来のオルガノイド培養物に対するＰＢ１０６５１及びセツキシマブの濃度範囲による処理の効果の例を示すグラフ図である。
【図２６Ｃ】図２６は、患者由来チューモロイド及び正常組織由来オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長抑制におけるＰＢ１０６５１及びセツキシマブの力価の比較を示すグラフ図である。図２６Ｃは、患者由来チューモロイド及び正常組織由来オルガノイドを用いて得られた成長抑制に対するＩＣ５０値を示す表である。３列目の比は、ＩＣ５０（セツキシマブ）／ＩＣ５０（ＰＢ１０６５１）の比を示している。
【図２７Ａ】図２７。表示した抗体によるｐ１８Ｔオルガノイド培養物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理の３Ｄ画像解析において、オルガノイドの大きさを、用いた抗体の濃度の関数としてプロットしたグラフ図である。
【図２７Ｂ】図２７の続き。表示した抗体によるＣ１Ｍオルガノイド培養物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理の３Ｄ画像解析において、オルガノイドの大きさを、用いた抗体の濃度の関数としてプロットしたグラフ図である。  オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長抑制において、ＰＢ１０６５１は、単一特異性の抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＬＧＲ５抗体よりも、有意に強力である。抗ＬＧＲ５抗体は、オルガノイドの成長に対して効果を示さない。
【図２８Ａ】図２８は、参照抗体ＰＧ３７５５（ＥＧＦＲ二価、単一特異性）、ＰＧ５８１６（ＬＧＲ５二価、単一特異性）、又はこれらの当モルの組み合わせ、及びＰＢ１０６５１（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５二重特異性）の、ＥＧＦの存在下におけるチューモロイド株Ｐ１８Ｔに対する成長抑制効果を示すグラフ図である。オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長抑制において、ＰＢ１０６５１は、親の二価の単一特異性抗体の混合物よりも強力である。図２８Ａは、処理に用いた抗体濃度の関数として示したＰ１８Ｔオルガノイドの大きさのグラフ図である。ＰＧ５８１６で処理したオルガノイドは成長抑制を示さなかった。ＰＧ３７５５は成長を有意に低下させたが、ＰＢ１０６５１と同程度ではなかった。ＰＧ３７５５とＰＧ５８１６との組み合わせもまた、Ｐ１８Ｔチューモロイドの成長抑制がＰＢ１０６５１よりも有意に低かった。
【図２８Ｂ】図２８は、参照抗体ＰＧ３７５５（ＥＧＦＲ二価、単一特異性）、ＰＧ５８１６（ＬＧＲ５二価、単一特異性）、又はこれらの当モルの組み合わせ、及びＰＢ１０６５１（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５二重特異性）の、ＥＧＦの存在下におけるチューモロイド株Ｐ１８Ｔに対する成長抑制効果を示すグラフ図である。オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長抑制において、ＰＢ１０６５１は、親の二価の単一特異性抗体の混合物よりも強力である。図２８Ｂは、表示した抗体（左パネル）による表示したオルガノイド（上）の処理について判明した成長抑制に対するＩＣ５０値の比較表である。ＰＢ１０６５１について判明したＩＣ５０値は、親抗体の混合物について判明した値よりも常に低い。
【図２９】ＰＢ１０６５１によるｉｎ  ｖｉｔｒｏのオルガノイドの処理が、ＬＧＲ５又はＥＧＦＲを標的とする単一特異性の二価の抗体では確認されなかった、抗体の細胞内局在をもたらすことを示す写真である。  抗体処理の２４時間後に、オルガノイドを固定し、透過処理し、ヒトＩｇＧに対して染色し、抗体の細胞（内）局在を示した。ＰＢ１０６５１の場合のみ、二価の単一特異性抗体によって処理したオルガノイドにはなかった、点状の細胞内染色が確認された。二価の単一特異性抗体による処理の場合、抗体は濃縮され、細胞膜上に局在した。
【図３０】ＰＢ１０６５１による処理に反応性のオルガノイドが、処理に反応性ではないオルガノイドの処理後には確認されない、抗体の細胞内局在を示すことを示す写真である。  抗体処理の２４時間後に、オルガノイドを固定し、透過処理し、ヒトＩｇＧに対して染色し、抗体の細胞（内）局在を示した。ＰＢ１０６５１（Ｃ０Ｍ、Ｃ５５Ｔ、Ｐ１８Ｔ、Ｃ３１Ｍ）による処理に反応性の異なるオルガノイドは、抗体の細胞内染色を示したが、一方、非反応性のオルガノイドは、ＰＢ１０６５１（Ｃ２８Ｔ、Ｐ１９Ｔｂ、Ｐ８Ｔ、Ｃ５１Ｎ）の細胞表面局在を示した。
【図３１】ＭＶ１４５３及びＭＶ１６２６プラスミドのベクターマップである。
【図３２】ＭＶ１６２２（ＲＭＤ発現ベクター）のベクターマップである。
【図３３】アフコシル化ＰＢ１０６５１のＣＥＸ−ＨＰＬＣプロファイルを示すクロマトグラムである。
【図３４】ＰＢ１０６５１（非増強）及びＰＧ１３３７（対照）と比較したＰＢ１０６５１（ＡＤＣＣ増強）のＡＤＣＣリポーターアッセイの結果を示すグラフ図である。
【図３５】患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルにおけるＥＧＦＲ及びＬＧＲ５の発現を示すグラフ図である。  生きた試験腫瘍及び凍結ストック腫瘍におけるＥＧＦＲ遺伝子及びＬＧＲ５遺伝子の発現を、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲによって測定した。発現は、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、２−ΔΔＣＴ法によって得られたｌｏｇ変換値として表している。生きた動物から抽出した腫瘍は、参照ストック腫瘍と同様の遺伝子発現値を呈した。
【図３６】ＰＢ１０６５１がＰＤＸのｉｎ  ｖｉｖｏ成長を抑制することを示すグラフ図である。  結腸直腸ＰＤＸモデルを、ＰＢ１０６５１又はセツキシマブ又はＰＢＳで１週間ごとに処置した（矢印）。腫瘍の成長（ｍｍ３で示した）を、処置中及び処置停止後に追跡した。セツキシマブ（１つのＷＴと１つのＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄの変異体）に反応性のモデルもまた、ＰＢ１０６５１に反応した。３つのうち１つのＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ／Ｄ変異体モデルは、セツキシマブが呈したＰＢ１０６５１の有意な腫瘍成長抑制に反応しなかった。
【図３７】ＰＢ１０６５１による処置が、腫瘍中の増殖細胞の数の有意な低下をもたらすことを示す、処置（２μｇ／ｍＬ）４８時間後のＰ１８チューモロイドの免疫組織化学染色の写真である。  上のパネルは、増殖のマーカー（ｋｉ６７）を示し、下のパネルはアポトーシスのマーカー（切断カスパーゼ３）を示す。画像は、２０倍の対物レンズを用いて撮像した。茶色の染色は、ヘマトキシリンを用いて対比染色された細胞核と共に発現を示す。
【図３８Ａ】図３８は、  ｉｎ  ｖｉｖｏのオルガノイド成長抑制において、ＰＢ１０６５１がセツキシマブよりも有意に強力であることを示すグラフ図である。図３８Ａは、Ｐ１８異種移植成長に対する抗体の１週間ごとの投与の効果を示すグラフ図である。  腫瘍の平均の大きさが５０ｍｍ３に達した時点で抗体処置を開始し（０日目）、体積の相対変化をプロットする。マウスを１週間に１回処置した（矢印で示した）。処置群の全ての腫瘍体積を平均し、プロットした。各時点での異種移植の数を表に示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。＊＝Ｐ＜０．０１（ＰＢＳとの比較）、＃＝Ｐ＜０．０１（セツキシマブとの比較）、対応のあるｔ検定分析により求めた。
【図３８Ｂ】図３８は、  ｉｎ  ｖｉｖｏのオルガノイド成長抑制において、ＰＢ１０６５１がセツキシマブよりも有意に強力であることを示すグラフ図である。図３８Ｂは、Ｃ３１Ｍ異種移植成長に対する抗体の１週間ごとの投与の効果を示すグラフ図である。  腫瘍の平均の大きさが３０ｍｍ３に達した時点で抗体処置を開始し（０日目）、体積の相対変化をプロットする。マウスを１週間に１回処置した（矢印で示した）。処置群の全ての腫瘍体積を平均し、プロットした。各時点での異種移植の数を表に示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。＊＝Ｐ＜０．０１（ＰＢＳとの比較）、＃＝Ｐ＜０．０５（セツキシマブとの比較）、対応のあるｔ検定分析により求めた。
【図３９−１】図３９。ヒトＬＧＲ５の注釈付きのアミノ酸配列である。  リーダーは、成熟タンパク質から切断されたアミノ酸配列を示し、Ｎ領域はアミノ酸２１〜７０（両端の番号を含む）に及び、ＬＲＲはロイシンリッチリピートを表し、ＬＬＲ１はロイシンリッチリピート領域１であり、ＬＲＲ２はロイシンリッチリピート領域２であるといった具合である。ＬＬＲ１はアミノ酸７１で始まり、アミノ酸９４で終わり（両端の番号を含む）、ＬＬＲ２は９５で始まり、１１８で終わる（両端の番号を含む）。ＣＲＬはシステインリッチリンカー領域である。ＴＭは様々な膜貫通領域を示し、Ｃ−ＴＥＲＭは、タンパク質のｃ末端を示す。注釈付きの部分が共に、配列番号１で示された１つの連続した配列を形成する。この完全な配列が配列番号１であり、何らかの理由により、別の配列もまた配列番号１として示される場合であっても、このナンバリングが優先する。
【図３９−２】図３９の続き。
【図４０−１】図４０。野生型ヒトＥＧＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００５２２８）の注釈付きのアミノ酸配列である。  シグナルペプチド、細胞外部分、予測される膜貫通ヘリックス、及びＣ末端尾部を含む細胞内チロシンキナーゼを全て示している。注釈付きの部分が共に、配列番号２で示された１つの連続した配列を形成する。この完全な配列が配列番号２であり、何らかの理由により、別の配列もまた配列番号２として示される場合であっても、このナンバリングが優先する。
【図４０−２】図４０の続き。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とに結合するタンパク質を開示する。このようなタンパク質は、更に「本発明のタンパク質」とも呼ばれる。
【００４２】
好ましい実施形態においては、本発明のタンパク質は、抗体（又は本出願の他の箇所に記載のような、抗体部分、誘導体、若しくは類似体）、抗体様物質、ポリペプチド、アプタマー又はこれらの組み合わせである。これらのタンパク質又はアプタマーは、典型的には１つの標的に結合する。本発明のタンパク質は、２つの標的に結合する。これらの抗体、抗体様物質、ポリペプチド及びアプタマーの任意の組み合わせが、当該技術分野において既知の方法によって結合可能であることを理解されたい。例えば、一部の実施形態において、本発明のタンパク質は、複合タンパク質又は融合タンパク質である。抗体に関しては、多特異性抗体を製造する技術が進歩し、通常の単一特異性抗体と同一の全体構造を有するが、抗体の２つのアームがそれぞれ異なる標的と結合する二重特異性抗体も含む。
【００４３】
抗体様物質は、抗体と同様に抗原に特異的に結合可能であるが、構造上、抗体には無関係なポリペプチドである。抗体様物質は通常人工のペプチド又はタンパク質であり、モル質量は約３〜２０ｋＤａである。抗体に対する通常の利点は、より良好な溶解度、組織透過性、熱及び酵素に対する安定性、及び比較的低い製造費用である。抗体様物質の非限定的な例は、アフィボディ分子（典型的には、プロテインＡのＺドメインに基づく）、アフィリン（典型的には、γ−Ｂクリスタリン又はユビキチンに基づく）、アフィマー（典型的には、シスタチンに基づく）、アフィチン（典型的には、スルホロブス・アシドカルダリウス由来のＳａｃ７ｄに基づく）、アルファボディ（典型的には、三重らせんコイルドコイルに基づく）、アンチカリン（典型的には、リポカリンに基づく）、アビマー（典型的には、様々な膜受容体のＡドメインに基づく）、ＤＡＲＰｉｎ（典型的には、アンキリンリピートモチーフに基づく）、フィノマー（典型的には、Ｆｙｎ  ７のＳＨ３ドメインに基づく）、クニッツドメインペプチド（典型的には、様々なプロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインに基づく）、及びモノボディ（典型的には、フィブロネクチンのＩＩＩ型ドメインに基づく）である。
【００４４】
モノボディは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）を分子足場として用いて構築される合成結合タンパク質である。モノボディは、標的結合タンパク質を形成するための抗体の、単純かつ頑健な代替物である。用語「モノボディ」は、ヒトフィブロネクチンの第１０ＦＮ３ドメインを用いてモノボディの概念を示した最初の論文を発表した、Ｋｏｉｄｅのグループにより、１９９８年に作られた。
【００４５】
モノボディ及び他の抗体様物質は、典型的には、コンビナトリアルライブラリーから作製され、ここでは、ファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ及び酵母表面ディスプレイ等の分子ディスプレイ技術及び定向進化技術を用い、足場の一部が多様化される。大多数の抗体様物質は、それぞれの標的に対して高い親和性及び高い特異性を有する。
【００４６】
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド分子又はペプチド分子である。アプタマーは通常、大きなランダム配列プールからこれらを選択することによって作製されるが、天然のアプタマーもまた、リボスイッチ中に存在する。アプタマーは、巨大分子と同様に、基礎研究及び臨床目的の両方に用いることができる。
【００４７】
本明細書で用いる場合、用語「複合体」は、共有結合により結合した、任意選択的には結合領域により結合した、２つ以上の分子を指す。例えば、一部の実施形態において、複合体は、結合領域によって第２のタンパク質又は非タンパク質部分に結合した、第１のタンパク質又は非タンパク質部分である。例えば、本発明のタンパク質の一部の実施形態において、タンパク質は共有結合した２つ以上の抗体を含む、又は、共有結合した２つ以上の抗体からなる。複合体は第１及び第２の部分に限定されず、一部の実施形態においては、更なる結合領域によって結合した第３、第４又は更なる部分も有し得る。本出願の他の箇所に記載するように、タンパク質部分の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリペプチド、ペプチド模倣体又は抗体（又は本出願の他の箇所に記載のような、抗体部分、誘導体、若しくは類縁体）が挙げられる。非タンパク質部分の例としては、これに限定されるものではないが、アプタマーが挙げられる。多種類のリンカーを用いることができ、リンカーは、複合体中の分子の種類に従って適切であるように、また、リンカーの所望の特性（長さ、可動性、プロテアーゼ活性に対する抵抗性及び他の同様の特性）に応じて選択される。このようなリンカーは、ヌクレオチド、ポリペプチド、又は好適な合成材料を含み得る。例えば、リンカーは可動性ペプチドリンカーであり得る。特定の実施形態において、リンカーは開裂可能なリンカーであり得、複合体の部分を互いに分離することができる。他の実施形態において、ペプチドリンカーはらせん状リンカーであり得る。リンクタンパク質及び他の分子について、様々な例及びキットが、当該技術分野において周知である。本明細書で用いる場合、用語「融合タンパク質」は、組み換えによってＤＮＡレベルで結合され、単一のポリペプチドとして共に発現された２つ以上のポリペプチド又はタンパク質を含むタンパク質を指す。融合タンパク質はまた、同じくＤＮＡによってコードされ、融合タンパク質と共に発現されたペプチド結合領域も含む。融合タンパク質の一部であるペプチドリンカーは、可動性、親水性、プロテアーゼ抵抗性、開裂性等の特定の特性を有するように設計され得る。全てのこれらの特性は、ＤＮＡ配列内で設計可能であり、リンカーを設計する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、抗体は、当該技術分野において周知の、本明細書に記載のような方法によって結合することができ、二重特異性抗体又は多標的抗体を形成する。更に、二重特異性抗体は、当該技術分野において既知の様々な方法、例えば、ＢｉＣｌｏｎｉｃｓ（登録商標）等の技術を用いることにより構築可能である。二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、典型的には、２つの異なるモノクローナル抗体の結合ドメインを含み、したがって、２つの異なるエピトープに結合する。Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）分子、更に他の完全長ＩｇＧ二重特異性抗体は、ｓｃＦｖのＦａｂの完全長ＩｇＧ分子の２つの異なる可変領域によってコードされた、２つの異なる抗原結合特異性を有する。Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）は、本明細書の他の箇所で詳述される２つの異なる共通軽鎖（ｃＬＣ）抗体をコードする遺伝子構造体による、個々の細胞のコトランスフェクションによって作製可能である。ＣＨ３エンジニアリングにより、効率的なヘテロ二量体形成及び本質的に純粋な二重特異性抗体の形成が確保される。一部の実施形態において、本発明のタンパク質は、細胞、細胞の群、組織又は腫瘍におけるシグナル伝達を、本発明のタンパク質の意図された目的に有用である程度で抑制し、例えば、当該技術分野において既知のアッセイにおける測定で、中性物質又は陰性対照によって誘導されるシグナル伝達に比べ、これらの反応の任意の１つ以上の誘導を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、最も好ましくは９０％、９５％、９９％、又は１００％低下させ得る。
【００４８】
本発明のタンパク質は、好ましくは抗体、又はその部分、誘導体、若しくは類似体を含む。本発明のタンパク質は、好ましくは二重特異性抗体である。
【００４９】
抗体は、典型的には、いわゆる抗原結合部位を介し、抗体の標的に結合する。非修飾抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、抗体の可変ドメインに存在する。可変ドメインは、上記の抗原結合部位を含む。抗原に結合する可変ドメインは、抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。
【００５０】
一実施形態において、抗体可変ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合部位は、組み合わされたＶＨ／ＶＬ可変ドメインに、又は、ＶＨ領域のみ若しくはＶＬ領域のみに存在する場合がある。抗原結合部位が可変ドメインの２つの領域のうちの１つのみに存在する場合、もう一方の可変領域は、結合可変領域のフォールディング及び／又は安定性に寄与し得るが、抗原自体の結合に有意に寄与することはない。
【００５１】
本明細書で用いる場合、抗原結合は、抗体のその抗原への典型的な結合能を指す。抗体の抗原への結合は、様々な方法で評価可能である。１つの方法は、抗体を抗原（好ましくは抗原を発現する細胞）とインキュベートし、非結合の抗体を除去し（好ましくは洗浄工程により）、結合した抗体に結合する標識抗体を用いて結合した抗体を検出することである。
【００５２】
抗体による抗原結合は、典型的には、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、抗原及び可変ドメインの両方の特異的な三次元構造を介し、タンパク質の不規則で非特異的な付着とは対照的に、これらの２つの構造を正確に結合させる（鍵と鍵穴に類似の相互作用）。抗体は、典型的には、抗原のエピトープと呼ばれる抗原の一部を認識し、このようなエピトープが他の化合物にも存在し得ることから、本発明による抗体は、このような他の化合物が同一のエピトープを含んでいれば、他のタンパク質を認識することもできる。したがって、用語「結合」は、抗体の、別のタンパク質への結合、又は同一のエピトープを含むタンパク質（複数可）への結合を排除するものではない。このような他のタンパク質（複数可）は、好ましくはヒトタンパク質ではない。
【００５３】
抗体等の本発明のタンパク質は、典型的には、生後、好ましくは成人の細胞の膜上の特定の標的タンパク質以外の他のタンパク質には結合しない。
【００５４】
上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの１つの膜結合メンバーの細胞外部分に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は特定のメンバーに結合し、同一種のＥＧＦ受容体ファミリーの別のメンバーの細胞外部分への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。例えば、ＥｒｂＢ−１に結合する抗原結合部位を含む抗体はＥｒｂＢ−１に結合し、同一種の相同受容体ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ−４（ＨＥＲ４）への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＥｒｂＢ−２に結合する抗原結合部位を含む抗体はＥｒｂＢ−２に結合し、同一種の相同受容体ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体はＥｒｂＢ−３に結合し、同一種の相同受容体ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２及びＥｒｂＢ−４への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＥｒｂＢ−４に結合する抗原結合部位を含む抗体はＥｒｂＢ−４に結合し、同一種の相同受容体ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２及びＥｒｂＢ−３への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。当然のことながら、抗体がファミリーの２つ以上のメンバーに結合するよう設計されている場合には、２つ以上のメンバーへの結合は本質的に同一であり得る。本発明においては、各抗体それぞれがファミリーの１つのメンバーにのみ結合することが望ましい。ＥｒｂＢファミリーが細胞表面受容体のファミリーであることを考慮し、結合は、典型的には、これらの細胞表面に受容体（複数可）を発現する細胞について評価される。
【００５５】
本発明の抗体は、好ましくは、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーに対するリガンドの結合を阻害する。本明細書で用いる用語「結合を阻害する」は、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーへの抗体の結合が、リガンドがＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーに結合するのとリガンドと競合することを意味する。抗体はリガンドの結合を減少させることができ、リガンドが既にＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーに結合している場合、リガンドを置換することができ、又は、抗体は、例えば立体障害により、リガンドがＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーに結合し得るのを、少なくとも部分的に抑制することができる。
【００５６】
本発明のＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）結合タンパク質又はＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）結合タンパク質、好ましくは本発明の抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）若しくはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２５０５８）のリガンド誘導成長、又はＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）のリガンド誘導細胞死として測定される、ＥＧＦＲリガンド又はＨＥＲ３リガンド誘導シグナル伝達をそれぞれ、好ましくは抑制する。上記のＥＧＦＲ又はＨＥＲ３結合タンパク質は、当該技術分野において既知のアッセイにおける測定で、中性物質又は陰性対照の存在下のリガンド誘導作用に比べ、リガンド誘導シグナル伝達を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、最も好ましくは９０％、９５％、９９％、又は１００％低下させることができる。ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ−３はそれぞれ多数のリガンドと結合することができ、上記のＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞の成長を刺激することができる。１つ又は両方の受容体に対するリガンドの存在下で、ＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞の成長が刺激される。ＢｘＰＣ３細胞のＥＧＦＲ及び／又はＥｒｂＢ−３リガンド誘導成長は、リガンドの非存在下及び存在下における細胞の成長を比較することにより測定可能である。ＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥＧＦＲリガンド誘導成長を測定するための好ましいＥＧＦＲリガンドは、ＥＧＦである。ＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥｒｂＢ−３リガンド誘導成長を測定するための好ましいＥｒｂＢ−３リガンドは、ＮＲＧ１である。リガンド誘導成長は、好ましくは、飽和量のリガンドを用いて測定される。好ましい実施形態においては、ＥＧＦは、培地の１００ｎｇ／ｍＬの量で用いられる。ＮＲＧ１は、好ましくは培地の１０ｎｇ／ｍＬで用いられる。ＥＧＦ及びＮＲＧ１は、好ましくは、実施例に記載のようなＥＧＦ及びＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９６−ＨＢ及び２３６−ＥＧ）である。本発明のタンパク質又は抗体が二価形態のシグナル伝達を抑制するか否かの判定については、本明細書において上で記載したような方法が、タンパク質又は抗体の単一特異性の一価又は二価体を用いて実施されることが好ましい。換言すると、タンパク質又は抗体は、シグナル伝達が判定される受容体に対する結合部位のみを有する。抗体の場合、これは、抗原結合の可変ドメインがＥＧＦ受容体ファミリーメンバーに結合する可変ドメインからなる、二価の単一特異性抗体となる。
【００５７】
本発明のＥＧＦＲ結合タンパク質又はＨＥＲ３結合タンパク質、好ましくは本発明の抗体は、ＢｘＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８７）若しくはＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  １２５０５８）のＥＧＦＲリガンド又はＨＥＲ３リガンド誘導成長をそれぞれ、好ましくは抑制する。上記のＥＧＦＲ又はＨＥＲ３結合タンパク質は、当該技術分野において既知のアッセイにおける測定で、中性物質又は陰性対照によって誘導されるリガンド誘導成長に比べ、リガンド誘導成長シグナル伝達を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、最も好ましくは９０％、９５％、９９％、又は１００％低下させることができる。ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ−３はそれぞれ多数のリガンドと結合することができ、上記のＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞の成長を刺激することができる。１つ又は両方の受容体に対するリガンドの存在下で、ＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞の成長が刺激される。ＢｘＰＣ３細胞のＥＧＦＲ及び／又はＥｒｂＢ−３リガンド誘導成長は、リガンドの非存在下及び存在下における細胞の成長を比較することにより測定可能である。ＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥＧＦＲリガンド誘導成長を測定するための好ましいＥＧＦＲリガンドは、ＥＧＦである。ＢｘＰＣ３細胞又はＢｘＰＣ３−ｌｕｃ２細胞のＥｒｂＢ−３リガンド誘導成長を測定するための好ましいＥｒｂＢ−３リガンドは、ＮＲＧ１である。リガンド誘導成長は、好ましくは、飽和量のリガンドを用いて測定される。好ましい実施形態においては、ＥＧＦは、培地の１００ｎｇ／ｍＬの量で用いられる。ＮＲＧ１は、好ましくは培地の１０ｎｇ／ｍＬで用いられる。ＥＧＦ及びＮＲＧ１は、好ましくは、実施例に記載のようなＥＧＦ及びＮＲＧ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９６−ＨＢ及び２３６−ＥＧ）である。
【００５８】
ＥＧＦ受容体ファミリーリガンドは、好ましくはＥＧＦＲ受容体リガンド又はＨＥＲ３受容体リガンドである。本明細書で用いる「ＨＥＲ３リガンド又はＥｒｂＢ−３リガンド」は、ＥｒｂＢ−３に結合しかつＥｒｂＢ−３を活性化するポリペプチドを指す。ＥｒｂＢ−３リガンドの例としては、これらに限定されるものではないが、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）及びニューレグリン２（ＮＲＧ２）が挙げられる（Ｏｌａｙｉｏｙｅ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．；ＥＭＢＯ  Ｊ（２０００）Ｖｏｌ  １９：ｐｐ  ３１５９−３１６７を参照）。この用語は、好ましくは、生物学的に活性なフラグメント及び／又は天然に存在するポリペプチドの変異体を含む。本明細書で用いる「ＥＧＦＲリガンド又はＥｒｂＢ−１リガンド」は、ＥＧＦＲに結合しかつＥＧＦＲを活性化するポリペプチドを指す。ＥＧＦＲリガンドの例としては、これらに限定されるものではないが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリン及びエピレグリンが挙げられる（Ｏｌａｙｉｏｙｅ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．；ＥＭＢＯ  Ｊ（２０００）Ｖｏｌ  １９：ｐｐ  ３１５９〜３１６７を参照）。この用語は、好ましくは、生物学的に活性なフラグメント及び／又は天然に存在するポリペプチドの変異体を含む。
【００５９】
ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は特定のメンバーに結合し、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体等の、同一種のＷＮＴシグナル伝達経路のメンバーではない別の膜結合タンパク質の細胞外部分への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＬＧＲ５に結合する抗原結合部位を含む抗体はＬＧＲ５に結合し、同一種のＩＧＦ−１受容体の細胞外部分への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＬＧＲ４に結合する抗原結合部位を含む抗体はＬＧＲ４に結合し、同一種のＩＧＦ−１受容体への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＲＮＦ４３に結合する抗原結合部位を含む抗体はＲＮＦ４３に結合し、同一種のＩＧＦ−１受容体、ＬＧＲ４又はＬＧＲ５への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＺＮＲＦ３に結合する抗原結合部位を含む抗体はＺＮＲＦ３に結合し、同一種のＩＧＦ−１受容体又はＲＮＦ４３への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。当然のことながら、抗体がファミリーの２つ以上のメンバーに結合するよう設計されている場合には、２つ以上のメンバーへの結合は本質的に同一であり得る。例えば、ＬＧＲ５に結合する抗体は、同一種のＬＧＲ４に結合することができ、逆もまた同様である。好ましい実施形態においては、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分に結合する抗原結合部位を含む本発明の抗体は特定のメンバーに結合し、同一種のファミリーの別の膜結合の細胞外部分への結合は、その他が同一の条件下で１００分の１以下である。ＬＧＲ５に結合する抗原結合部位を含む抗体はＬＧＲ５に結合し、同一種のＬＧＲ４への結合は、その他が同一の条件下で１０分の１以下、好ましくは１００分の１以下である。ＬＧＲ４に結合する抗原結合部位を含む抗体はＬＧＲ４に結合し、同一種のＬＧＲ５への結合は、その他が同一の条件下で１０分の１以下、好ましくは１００分の１以下である。本発明においては、各抗体それぞれがファミリーの１つのメンバーにのみ結合することが望ましい。本発明におけるＷＮＴシグナル伝達経路の好ましいメンバーは、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＦＲＺ１、ＦＲＺ２、ＦＲＺ３、ＦＲＺ４、ＦＲＺ５、ＦＲＺ６、ＦＲＺ７、ＦＲＺ８、ＦＲＺ９、ＦＲＺ１０、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３、Ｎ−カドヘリン、Ｋｒｅｍｅｎ１及びＫｒｅｍｅｎ２、ＲＯＲ２／ＲＹＫ）である。ここに列挙したメンバーが細胞表面受容体であることを考慮し、結合は、典型的には、これらの細胞表面に受容体（複数可）を発現する細胞について評価される。
【００６０】
本明細書で用いる用語「抗体」は、タンパク質性の分子を意味し、好ましくはタンパク質の免疫グロブリンクラスに属し、抗原上のエピトープに結合する可変ドメインを１つ以上含み、このようなドメインは、抗体の可変ドメインとの配列相同性に由来する、又は、抗体の可変ドメインと配列相同性を共有する。治療用抗体は、治療される対象の天然の抗体（例えばヒトの対象の場合はヒト抗体）にできるだけ近いものが好ましい。抗体結合は、特異性及び親和性に関して発現され得る。特異性は、どの抗原又は抗原のエピトープが、結合ドメインにより特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強さの尺度である。特異的結合は、親和性（ＫＤ）が少なくとも１×１０ｅ−６Ｍ、より好ましくは１×１０ｅ−７Ｍ、より好ましくは１×１０ｅ−９Ｍ超の親和性による結合と定義する。典型的には、治療用抗体は、親和性が最大１×１０ｅ−１０Ｍ以上である。本発明の二重特異性抗体等の抗体は、典型的には、自然抗体の定常ドメイン（Ｆｃ部分）を含む。本発明の抗体は、典型的には二重特異性完全長抗体、好ましくはヒトＩｇＧサブクラスのものである。本発明の抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。本発明のこのような抗体は、所望により当該技術分野において既知の技術により増強することができる良好なＡＤＣＣ特性を有し、ヒトへのｉｎ  ｖｉｖｏ投与に際し好ましい半減期を有し、クローン細胞における同時発現に際しホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成する修飾重鎖をもたらすことができる、ＣＨ３エンジニアリング技術が存在する。
【００６１】
本発明の抗体は、好ましくは「完全長」抗体である。本発明による用語「完全長」は、本質的に完全な抗体を含むことと定義されるが、必ずしも、完全なままの抗体の全ての機能を有するわけではない。疑義回避のため説明すると、完全長抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。それぞれの鎖は定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含み、重鎖についてはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、軽鎖についてはＣＬ、ＶＬで示したドメインに細分することができる。抗体は、Ｆａｂフラグメント部分に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合する。抗体は、定常ドメインを介して、主としてＦｃ部分を介して免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。
【００６２】
用語「可変ドメイン」、「ＶＨ／ＶＬ対」、「ＶＨ／ＶＬ」は、本明細書において互換的に用いられる。本発明による完全長抗体は、所望の特徴をもたらすことができる、又は、元の鎖におけるものの代替に過ぎない、変異が存在し得る、抗体を包含する。このような変異は、領域のいずれかの実質的な部分の欠失であってはならない。しかしながら、１つ又はいくつかのアミノ酸残基が欠失している抗体は、その結果得られた抗体の結合特性を本質的に変えることなく、用語「完全長抗体」の範囲内に包含される。例えば、ＩｇＧ抗体は、定常領域に１〜２０個のアミノ酸残基の挿入、欠失又はこれらの組み合わせを有する場合がある。例えば、抗体のＡＤＣＣ活性は、抗体自体が低いＡＤＣＣ活性を有する場合、抗体の定常領域をわずかに修飾することによって改善することができる（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０：４４８１〜４４８９）。変更はまた、時には、保存若しくは製造を改善するため、又はＣ末端リジンを除去するためになされる（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｋｕｂｏｔａ  Ｔ，Ｎｉｗａ  Ｒ，Ｓａｔｏｈ  Ｍ，Ａｋｉｎａｇａ  Ｓ，Ｓｈｉｔａｒａ  Ｋ，Ｈａｎａｉ  Ｎ）。抗体のＡＤＣＣ活性を改善するための別の方法は、酵素によってグリコシル化経路を阻害することにより、フコースの低下をもたらすことである（ｖｏｎ  Ｈｏｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）；Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１６０７〜１６１８）。誘発ＡＤＣＣ中の抗体又はエフェクター細胞の効果を測定するための、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が存在する。これらの中には、クロム−５１［Ｃｒ５１］放出アッセイ、ユーロピウム［Ｅｕ］放出アッセイ、及び硫黄−３５［Ｓ３５］放出アッセイがある。通常、特定の表面露出抗原を発現する標識標的細胞株を、その抗原に特異的な抗体とインキュベートする。洗浄後、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現するエフェクター細胞を、抗体標識標的細胞と共にインキュベートする。標的細胞の溶解を、シンチレーションカウンター又は分光光度法により、細胞内の標識の放出によって実質的に測定する。
【００６３】
本発明の二重特異性抗体は、一実施形態において、アフコシル化されている場合がある。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、通常のＣＨＯ細胞中で産生される同一の抗体に比べた場合、Ｆｃ領域に、フコシル化の量が低いＮ−結合炭水化物構造を含む。
【００６４】
完全長ＩｇＧ抗体が好ましく、これは、これらの抗体の好ましい半減期と、免疫原性の理由から、完全に自己由来の（ヒト）分子に近いままである必要性による。本発明の抗体は、好ましくは二重特異性ＩｇＧ抗体、好ましくは二重特異性完全長ＩｇＧ１抗体である。ＩｇＧ１は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて好まれる。ヒトにおけるいかなる免疫原性も防止するため、本発明による二重特異性ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１であることが好ましい。
【００６５】
用語「二重特異性」（ｂｓ）は、抗体（上記定義の通り）の１つの部分が抗原上の１つのエピトープに結合する一方で、第２の部分が、同一の抗原又は異なる抗原上の異なるエピトープに結合することを意味する。異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。しかしながら、異なるエピトープは、同一の抗原上に存在する場合もある。本発明によると、上記の第１及び第２の抗原は、実際には２つの異なるタンパク質である。好ましい二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体の部分を含み、その結果、２つの異なる種類の抗原に結合可能な抗体である。二重特異性抗体によって認識される２つの抗原の、発現レベル、細胞（内）局在、及び化学量論に応じ、抗体の両方のＦａｂアームが、これらのエピトープに同時に結合し得る、又は、結合し得ない。二重特異性抗体の１つのアームは、典型的には、１つの抗体の可変ドメインを含み、もう一方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含む（すなわち、二重特異性抗体の１つのアームが１つの軽鎖と対になった１つの重鎖によって形成される一方で、もう一方のアームが軽鎖と対になった異なる重鎖によって形成される）。本発明の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるが、一方、軽鎖可変領域は、本発明の二重特異性抗体において、好ましくは同一である。異なる重鎖可変領域が同一又は共通の軽鎖に関連する二重特異性抗体は、共通軽鎖（ｃＬＣ）を有する二重特異性抗体とも呼ばれる。そのため、両方のアームが共通軽鎖を含む、本発明による二重特異性抗体が更に提供される。
【００６６】
好ましい二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖及び共通軽鎖を単一細胞で同時発現することにより得ることができる。野生型ＣＨ３ドメインが用いられる場合、２つの異なる重鎖（Ａ及びＢ）及び共通軽鎖の同時発現により、３つの異なる抗体種ＡＡ、ＡＢ及びＢＢがもたらされる。ＡＡ及びＢＢは、２つの単一特異性、二価抗体を表し、ＡＢは二重特異性抗体を表す。所望の二重特異性生成物（ＡＢ）の割合を増加させるため、ＣＨ３エンジニアリングを用いることができ、換言すると、以下に定義する適合ヘテロ二量体形成ドメインを有する重鎖を用いることができる。
【００６７】
本明細書で用いる用語「適合ヘテロ二量体形成ドメイン」は、エンジニアリングされたドメインＡ’が、エンジニアリングされたＢ’と共に優先的にヘテロ二量体を形成し、逆もまた同様である一方で、Ａ’−Ａ’間及びＢ’−Ｂ’間のホモ二量体形成は低下するようにエンジニアリングされたタンパク質ドメインを指す。
【００６８】
本明細書に記載のような二重特異性抗体は、好ましくは、共通軽鎖を含む。本発明による用語「共通軽鎖」は、同一であり得る、又は、いくつかのアミノ酸配列の違いを有し得るが、完全長抗体の結合特異性は影響を受けない、軽鎖を指す。例えば、本明細書で用いる共通軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的なアミノ酸の変更、重鎖等と対になった際に結合特異性に寄与しない、又は、部分的にしか寄与しない領域のアミノ酸の変更を導入し試験することにより、同一ではないが、それでもなお機能的には同等である軽鎖を調製又は見出すことが可能である。用語「共通軽鎖」、「共通ＶＬ」、「単一軽鎖」、「単一ＶＬ」は、用語「再配列」を付加又は付加せずに、本明細書において全て互換的に用いられる。共通軽鎖として、異なる重鎖と組み合わせ可能なヒトの軽鎖を用い、機能性抗原結合ドメインを有する抗体を形成すること（国際公開第２００４／００９６１８号、同第２００９／１５７７７１号、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８及びＮｉｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）が、本発明の態様である。好ましくは、共通軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒトレパートリーで頻繁に用いられ、良好な熱力学的安定性、収率及び溶解度を有する、軽鎖可変領域である。好ましい生殖系列軽鎖はＯ１２、好ましくは再配列生殖系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１（図３）又はこれらのフラグメント若しくは機能的同等物（すなわち、同一のＩｇＶκ１−３９遺伝子断片ではあるが、異なるＩＧＪκ遺伝子断片）（ｉｍｇｔ．ｏｒｇのＩＭＧＴデータベースワールドワイドウェブによる命名法）。しかしながら、同一の原理はλ軽鎖についても有効であり、そのため、λ軽鎖は本発明においてももたらされる。そのため、上記の共通軽鎖が生殖系列軽鎖、好ましくはＩｇＶκ１−３９遺伝子断片を含む再配列生殖系列ヒトκ軽鎖、最も好ましくは再配列生殖系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１（図３）である、本発明による二重特異性抗体が更に提供される。用語、再配列生殖系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧκＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖又は略してｈｕＶκ１−３９、又は簡潔に１−３９は、本出願全体にわたり、互換的に用いられる。当業者であれば、「共通」は、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的同等物も指すことを認識するであろうことは明らかである。上記の軽鎖の多くの変異体が存在し、変異体には、機能的結合領域の形成に実質的には影響を及ぼさない変異（欠失、置換、付加）が存在する。本発明の軽鎖はまた、１〜２０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換又はこれらの組み合わせを有する、本明細書において上で特定した軽鎖であり得る。
【００６９】
ＶＨが第１の抗原を特異的に認識することができ、免疫グロブリン可変ドメインにおいてＶＨと対になったＶＬが第２の抗原を特異的に認識することができる抗体もまた想定される。その結果得られるＶＨ／ＶＬ対は、抗原１又は抗原２のいずれかに結合する。例えば国際公開第２００８／０２７２３６号、同第２０１０／１０８１２７号及びＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０，４７２〜４８６）に記載のいわゆる「ツーインワン抗体（two-in-one antibodies）」は、本発明の二重特異性抗体とは異なり、更に「ツーインワン」抗体と呼ばれる。
【００７０】
抗体の一部は抗原結合部分であり、典型的には、抗体の可変ドメインを含む。一部はまた、いわゆる単一ドメイン抗体フラグメントであり得る。単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ、開発者Ａｂｌｙｎｘによりナノボディ（Nanobody）と呼ばれる）は、単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体フラグメントである。全抗体と同様に、単一ドメイン抗体フラグメントもまた、特定の抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体フラグメントは分子量が１２〜１５ｋＤａしかなく、２つの重鎖タンパク質鎖及び２つの軽鎖からなる通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりも非常に小さく、更に、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖と半分の重鎖）及び単一鎖可変フラグメント（約２５ｋＤａ、１つが軽鎖由来、１つが重鎖由来の２つの可変ドメイン）よりも小さい。単一ドメイン抗体それ自体は、通常の抗体よりも非常に小さいわけではない（典型的には９０〜１００ｋＤａ）。単一ドメイン抗体フラグメントは、主として、ラクダ科の動物に見出された重鎖抗体からエンジニアリングされ、これらはＶＨＨフラグメント（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））と呼ばれる。一部の魚類も重鎖のみの抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体」）を有し、この抗体から、ＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体フラグメントを得ることができる。別の手法は、ヒト又はマウス由来の通常の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）から二量体可変ドメインを分割して単量体とすることである。単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は、現在重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディ（nanobodies）もまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。抗体部分の非限定的な例は、抗体又はその同等物の重鎖及び／若しくは軽鎖の可変ドメインを含む。このような部分の非限定的な例は、ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体（ｄＡｂｓ）及びユニボディ（Unibodies）である。好適な抗体部分又は誘導体は、少なくとも、抗体又はその同等物の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する。このような結合分子の非限定的な例は、Ｆ（ａｂ）フラグメント及び単一鎖Ｆｖフラグメントである。二重特異性抗体の機能部分は、二重特異性抗体の抗原結合部分、又は結合部分の誘導体及び／若しくは類似体を含む。本明細書において上述したように、抗体の結合部分は、可変ドメインに含まれる。
【００７１】
抗体の誘導体は、ＣＤＲ領域を除き、最大２０個のアミノ酸において自然抗体のアミノ酸配列とは異なるタンパク質である。本明細書に開示の抗体の誘導体は、最大２０個のアミノ酸において上記のアミノ酸配列とは異なる抗体である。
【００７２】
本発明のタンパク質が結合するＷＮＴ経路の好ましい膜結合メンバーは、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＦＲＺ１、ＦＲＺ２、ＦＲＺ３、ＦＲＺ４、ＦＲＺ５、ＦＲＺ６、ＦＲＺ７、ＦＲＺ８、ＦＲＺ９、ＦＲＺ１０、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３、Ｎ−カドヘリン、Ｋｒｅｍｅｎ１及びＫｒｅｍｅｎ２、ＲＯＲ２、ＲＹＫである。この列挙からは、ＷＮＴ経路において活性のあるＬＧＲファミリーの膜結合メンバー、特にＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６が好ましい。好ましい実施形態においては、ＬＧＲファミリーの膜結合メンバーは、ＬＧＲ４又はＬＧＲ５、特にＬＧＲ５である。他の好ましい標準的なＷＮＴ経路の膜結合メンバーは、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３である。
【００７３】
マウスＬｇｒ４、Ｌｇｒ５、及びＬｇｒ６は、Ｒ−スポンジン（Ｒ−スポンジン１〜４）に対する高親和性受容体であり、Ｇタンパク質シグナル伝達の関与なしに、Ｗｎｔ受容体Ｌｒｐ５／６のリン酸化を増加させ、ｂ−カテニンを安定化することが実証されている（Ｃａｒｍｏｎ，Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，１１４５２〜１１４５７；ｄｅ  Ｌａｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７６，２９３〜２９７．）。Ｒ−スポンジンは、トロンボスポンジンリピート（ＴＳＲｓ）の存在を特徴とするタンパク質の非常に大きいファミリーのメンバーである。Ｒ−スポンジンはまた、ｂ−カテニンの安定化及びＷｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ共受容体Ｌｒｐ６のリン酸化によって測定されるＷｎｔ増強活性の発現に必要な、Ｎ−末端システインリッチなフューリンリピートを含む（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））。機能性Ｒ−スポンジンの発現レベルを上昇させる遺伝子融合が、ヒト結腸癌のサブセットにおいて報告されている（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，６６０〜６６４．）。Ｌｇｒ−Ｒ−スポンジン複合体について認識されている役割は、Ｌｒｐ−Ｆｒｉｚｚｅｄ−ｗｎｔ受容体複合体を介してシグナル伝達を調節することであるが、現在のモデルは、Ｌｇｒ−Ｒ−スポンジン複合体自体が、高度に相同のＥ３リガーゼＲｎｆ４３及びＺｎｒｆ３を介して調節を受けることを示唆している。具体的には、Ｌｇｒ４、Ｌｇｒ５、及びＬｇｒ６受容体は、Ｒ−スポンジンリガンドを効率的に補充し、これらを、同じくＲ−スポンジン結合部位を含むＲｎｆ４３／Ｚｎｒｆ３と相互作用する位置に配置する役割をする（ｄｅ  Ｌａｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ（２０１４）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２８，３０５〜３１６）。この相互作用はＲｎｆ４３又はＺｎｒｆ３の膜クリアランスをもたらし、表面のＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体を持続させ、ｗｎｔシグナル強度を高め（ｄｅ  Ｌａｕ，ｅｔ  ａｌ（２０１４）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２８，３０５〜３１６）、結腸癌中で強化する（Ｈａｏ，Ｈ．−Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８５，１９５〜２００）。
【００７４】
標準的な経路において活性であるＷＮＴ経路の膜結合メンバーは、特定のメンバーに応じ、非標準的な経路においても活性であり得、逆もまた同様である。
【００７５】
ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー（ＨＥＲ）は、４つのメンバー、すなわち、ＥｒｂＢ（赤芽球腫）−１、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４を有する。上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、又はＨＥＲ１）は、Ｈｅｒ−１、−２、−３及び−４又はｃＥｒｂＢ−１、−２、−３及び−４と呼ばれる、４つの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）のファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢ−１は様々な異名でも知られ、これらのうち最も一般的なものはＥＧＦＲである。ＥＧＦＲは、４つのサブドメインから構成される細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有し、これらのうちの２つはリガンド結合に関与し、残りの２つはホモ二量体形成及びヘテロ二量体形成に関与する。ＥＧＦＲは様々なリガンドからの細胞外シグナルを統合し、多様な細胞内反応をもたらす。ＥＧＦＲによって活性化される主要なシグナル伝達経路は、Ｒａｓ−マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）マイトジェンシグナル伝達カスケードから構成される。この経路の活性化は、Ｇｒｂ２をチロシンリン酸化ＥＧＦＲに補充することによって開始される。これにより、Ｇｒｂ２結合Ｒａｓ−グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ（ＳＯＳ）を介し、Ｒａｓが活性化される。更に、ＰＩ３キナーゼＡｋｔシグナル伝達経路もまたＥＧＦＲによって活性化されるが、この活性化は、ＥｒｂＢ−３（ＨＥＲ３）の同時発現がある場合により一層強い。ＥＧＦＲはいくつかのヒト上皮性悪性腫瘍、特に乳癌、膀胱癌、非小細胞性肺癌肺癌、結腸癌、卵巣癌、頭頸部癌及び脳癌に関係があるとされる。遺伝子における変異の活性化、並びに受容体及びそのリガンドの過剰発現が見出され、オートクリン活性化ループがもたらされる。そのため、ＲＴＫは、癌治療の標的として広範に用いられている。ＲＴＫを標的とする低分子阻害剤と、細胞外リガンド結合ドメインを標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の両方が開発され、ほとんどが選定された患者の集団に対してではあるが、これまでのところ、いくつかの臨床的成果が示されている。ヒトＥＧＦＲタンパク質及びこれをコードする遺伝子のデータベースアクセッション番号は（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００５２２８．３）である。このアクセッション番号は主として、標的としてのＥＧＦＲタンパク質を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、抗体によって結合されるＥＧＦＲタンパク質の実際の配列は様々であり得る。癌及び腫瘍という語を本明細書で用い、典型的には、別途明記しない限り、両者とも癌を指す。
【００７６】
本明細書においてＥＧＦＲに言及する場合、別途記載しない限り、その言及はヒトＥＧＦＲを指す。ＥＧＦＲに結合する抗原結合部位は、ＥＧＦＲ及び様々なその変異体、例えば一部のＥＧＦＲ陽性腫瘍上に発現された変異体等に結合する。
【００７７】
本明細書で用いる用語「ＥｒｂＢ−３」は、ヒトにおいてＥＲＢＢ３遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。この遺伝子又はタンパク質の別名は、ＨＥＲ３、ＬＣＣＳ２、ＭＤＡ−ＢＦ−１、ｃ−ＥｒｂＢ−３、ｃ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３−Ｓ、ｐ１８０−ＥｒｂＢ３、ｐ４５−ｓＥｒｂＢ３、及びｐ８５−ｓＥｒｂＢ３である。本明細書においてＥｒｂＢ−３に言及する場合、その言及はヒトＥｒｂＢ−３を指す。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトＥｒｂＢ−３に結合する。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ヒトと他の哺乳動物とのオルソログ間の配列及び三次構造の類似性のため、このようなオルソログにも結合する場合があるが、必ずしもそうでない場合もある。ヒトＥｒｂＢ−３タンパク質及びこれをコードする遺伝子のデータベースアクセッション番号は、（ＮＰ＿００１００５９１５．１、ＮＰ＿００１９７３．２、ＮＣ＿００００１２．１１、ＮＣ＿０１８９２３．２、ＮＴ＿０２９４１９．１２）である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＥｒｂＢ−３を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、抗体によって結合されるＥｒｂＢ−３タンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＥｒｂＢ−３抗原結合部位は、ＥｒｂＢ−３及び様々なその変異体、例えば一部のＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。ＥｒｂＢ−３に結合する抗原結合部位は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３のドメインＩＩＩに結合する。本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体の標的としての、本明細書に記載のＥＧＦ受容体ファミリーは、好ましくは、上皮成長因子受容体Ｅｒｂｂ−１（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−３又はＥｒｂＢ−４である。好ましい実施形態においては、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーはＥｒｂＢ−１又はＥｒｂＢ−３である。
【００７８】
用語「ＬＧＲ」は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体として知られるタンパク質のファミリーを指す。このファミリーのいくつかのメンバーがＷＮＴシグナル伝達経路に関与していることが知られており、注目すべきは、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５及びＬＧＲ６である。
【００７９】
ＬＧＲ４はロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体４である。この遺伝子又はタンパク質の別名は、ＧＰＲ４８、Ｇタンパク質共役型受容体４８（G Protein−Coupled Receptor 48）、ＢＮＭＤ１７、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体４（Leucine-Rich Repeat-Containing G Protein-Coupled Receptor 4）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体４（Leucine-Rich Repeat-Containing G-Protein Coupled Receptor 4）、Ｇタンパク質共役型受容体４８（G-Protein Coupled Receptor 48）である。
【００８０】
ＬＧＲ４に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＬＧＲ４に結合する。本発明のＬＧＲ４結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳動物とのオルソログ間の配列及び三次構造の類似性のため、このようなオルソログにも結合する場合があるが、必ずしもそうでない場合もある。ヒトＬＧＲ４タンパク質及びこれをコードする遺伝子のデータベースアクセッション番号は、（ＮＣ＿００００１１．１０、ＮＣ＿０１８９２２．２、ＮＴ＿００９２３７．１９、ＮＰ＿０６０９６０．２）である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＬＧＲ４を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、結合されるＬＧＲ４タンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＬＧＲ４抗原結合部位は、ＬＧＲ４及び様々なその変異体、例えば一部のＬＧＲ４陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【００８１】
ＬＧＲ５はロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５である。この遺伝子又はタンパク質の別名は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体（Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役型受容体５（Leucine-Rich Repeat-Containing G Protein-Coupled Receptor 5）、Ｇタンパク質共役型受容体ＨＧ３８、Ｇタンパク質共役型受容体４９（G-Protein Coupled Receptor 49）、Ｇタンパク質共役型受容体６７、ＧＰＲ６７、ＧＰＲ４９、オーファンＧタンパク質共役型受容体ＨＧ３８、Ｇタンパク質共役型受容体４９（G Protein-Coupled Receptor 49）、ＧＰＲ４９、ＨＧ３８及びＦＥＸである。
【００８２】
ＬＧＲ５に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＬＧＲ５に結合する。本発明のＬＧＲ５結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳動物とのオルソログ間の配列及び三次構造の類似性のため、このようなオルソログにも結合する場合があるが、必ずしもそうでない場合もある。ヒトＬＧＲ５タンパク質及びこれをコードする遺伝子のデータベースアクセッション番号は、（ＮＣ＿００００１２．１２、ＮＴ＿０２９４１９．１３、ＮＣ＿０１８９２３．２、ＮＰ＿００１２６４１５５．１、ＮＰ＿００１２６４１５６．１、ＮＰ＿００３６５８．１）である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＬＧＲ５を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、結合されるＬＧＲ５タンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＬＧＲ５抗原結合部位は、ＬＧＲ５及び様々なその変異体、例えば一部のＬＧＲ５陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【００８３】
ＺＮＲＦ３は亜鉛及びリングフィンガー３（Zinc And Ring Finger 3）である。この遺伝子又はタンパク質の別名は、亜鉛及びリングフィンガー３（Zinc And Ring Finger 3）、亜鉛／リングフィンガータンパク質３（Zinc/RING Finger Protein 3）、リングフィンガータンパク質２０３（RING Finger Protein 203）、ＫＩＡＡ１１３３、ＲＮＦ２０３、新規Ｃ３ＨＣ４型亜鉛フィンガー（リングフィンガー）（Novel C3HC4 Type Zinc Finger （Ring Finger））、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＺＮＲＦ３、ＣＴＡ−２９２Ｅ１０．６、ＥＣ  ６．３．２．、及びＢＫ７４７Ｅ２．３  ３。
【００８４】
ＺＮＲＦ３に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＺＮＲＦ３に結合する。本発明のＺＮＲＦ３結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳動物とのオルソログ間の配列及び三次構造の類似性のため、このようなオルソログにも結合する場合があるが、必ずしもそうでない場合もある。ヒトＺＮＲＦ３タンパク質及びこれをコードする遺伝子のデータベースアクセッション番号は、（ＮＣ＿００００２２．１１、ＮＴ＿０１１５２０．１３、ＮＣ＿０１８９３３．２、ＮＰ＿００１１９３９２７．１、ＮＰ＿１１５５４９．２）である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＺＮＲＦ３を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、結合されるＺＮＲＦ３タンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＺＮＲＦ３抗原結合部位は、ＺＮＲＦ３及び様々なその変異体、例えば一部のＺＮＲＦ３陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【００８５】
ＲＮＦ４３はリングフィンガータンパク質４３（Ring Finger Protein 43）である。この遺伝子又はタンパク質の別名は、リングフィンガータンパク質４３（Ring Finger Protein 43）、ＲＮＦ１２４、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ４３、リングフィンガータンパク質４３（RING Finger Protein 43）、ＥＣ  ６．３．２．、ＵＲＣＣである。
【００８６】
ＲＮＦ４３に結合する本発明のタンパク質又は抗体は、ヒトＲＮＦ４３に結合する。本発明のＲＮＦ４３結合タンパク質又は抗体は、ヒトと他の哺乳動物とのオルソログ間の配列及び三次構造の類似性のため、このようなオルソログにも結合する場合があるが、必ずしもそうでない場合もある。ヒトＲＮＦ４３タンパク質及びこれをコードする遺伝子のデータベースアクセッション番号は、（ＮＣ＿００００１７．１１、ＮＴ＿０１０７８３．１６、ＮＣ＿０１８９２８．２、ＮＰ＿００１２９２４７３．１、ＮＰ＿００１２９２４７４．１、ＮＰ＿０６０２３３．３）である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＲＮＦ４３を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、結合されるＲＮＦ４３タンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＲＮＦ４３抗原結合部位は、ＲＮＦ４３及び様々なその変異体、例えば一部のＲＮＦ４３陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【００８７】
インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体は、インスリン様成長因子に高い親和性で結合する。この受容体はチロシンキナーゼ活性を有する。インスリン様成長因子Ｉ受容体は、形質転換現象において重要な役割を担っている。前駆体の開裂により、αサブユニット及びβサブユニットを生成する。インスリン様成長因子Ｉ受容体は、ほとんどの悪性腫瘍組織において過剰発現されており、細胞の生存を促進することにより、抗アポトーシス剤として作用する。このタンパク質は、多数の異なる名前、例えば、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＥＣ  ２．７．１０．１、インスリン様成長因子Ｉ受容体、可溶性ＩＧＦ１Ｒ、変異体１、可溶性ＩＧＦ１Ｒ変異体２、ＣＤ２２１抗原、ＥＣ  ２．７．１０、ＣＤ２２１、ＩＧＦＩＲ、ＪＴＫ１３、及びＩＧＦＲ等で知られている。ＩＧＦ１Ｒの外部Ｉｄは、ＨＧＮＣ：５４６５、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３４８０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１４０４４３、ＯＭＩＭ：１４７３７０及びＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ０８０６９である。
【００８８】
本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞の成長を、この細胞の成長を許容する系において抑制するための方法であって、本方法が、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を系に提供することを含む、方法を更に提供する。この細胞は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＥＧＦ受容体リガンド反応細胞である。この系は、好ましくは培養系である。本方法は、好ましくは、上記の細胞を上記の系において培養することを含む。
【００８９】
本発明において、細胞が、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーをコードする、感知可能なＲＮＡを含んでいる場合、細胞は、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現すると言われている。発現は、多くの場合、細胞を、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーに結合する抗体とインキュベートすることによっても検出可能である。しかしながら、一部のメンバーは、このような抗体試験に対し、又は、一部のメンバーに対し、十分に高くは発現されず、特異抗体がない。このような場合には、ｍＲＮＡの検出が好ましい。
【００９０】
本明細書においてタンパク質／遺伝子のアクセッション番号又は別名を示している場合、これらは主として、標的としての上記のタンパク質を同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異及び／又は選択的スプライシングのため、本発明の抗体によって結合される標的タンパク質の実際の配列は様々であり得る。
【００９１】
本発明はまた、癌を有する個体の治療方法であって、本方法が、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を、これらを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供する。個体は、好ましくは、癌を有する個体である。癌は、好ましくは腺癌である。好ましい癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、黒色腫、精巣癌、尿路上皮癌、腎癌、胃癌、又はカルチノイド癌(Carcinoid cancer)である。好ましい実施形態においては、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、又は黒色腫である。特に好ましい実施形態においては、癌は、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、又は肝臓癌である。特に好ましい実施形態においては、癌は消化管癌である。好ましい実施形態においては、癌は結腸直腸癌である。
【００９２】
癌は、好ましくは、これらに限定されるものではないが、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーリガンドがもたらされた際に成長反応を呈する癌である。本発明のタンパク質は、好ましくは、これに対して癌が成長反応を呈するＥＧＦ受容体ファミリーメンバーに結合する、タンパク質である。好ましい実施形態においては、癌は、培地中のＥＧＦファミリーメンバーに反応し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長反応を呈する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏは、好ましくは、実験の項でオルガノイドについて詳述するような培養である。癌は、好ましくは、本発明のタンパク質が結合するＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する癌である。
【００９３】
本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体と、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞と、を含む細胞系が、更に提供される。この細胞は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＥＧＦ受容体リガンド反応細胞である。
【００９４】
本明細書に記載のような系又は細胞系は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系である。系を用い、細胞の成長反応を検出することができる。好ましい実施形態においては、ＥＧＦ受容体リガンドは、本明細書の他の箇所で定義した好ましいＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーに対するリガンドである。好ましい実施形態においては、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーは、本明細書の他の箇所で定義したＷＮＴ経路の好ましい膜結合メンバーである。
【００９５】
ＥＧＦ受容体リガンド反応性である癌又は細胞は、ＥＧＦ受容体リガンドに対して成長（増殖）反応を呈する。細胞又は癌がＥＧＦ受容体リガンド反応性であるか否かを判定するための好ましい方法は、細胞の成長因子反応性を、実施例に記載のようなオルガノイド培養アッセイにおいて測定することである。１つの方法は、細胞又は癌の細胞を、成長因子（ＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）又はＮＲＧ（５ｎｇ／ｍＬ）等）の存在下又は不在下でオルガノイド細胞系に接種した後、５日間培養することである。続いて、生細胞数を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）を用い、測定することができる。次いで成長因子刺激細胞を用いた発光の読み取りを用い、非刺激細胞（成長因子（複数可）が不在）を用いて得られた読み取りと比較することができる。
【００９６】
本発明は、ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞の成長を、この細胞の成長を許容する系において抑制するための方法であって、本方法が、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を系に提供することを含む、方法を更に提供する。この細胞は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＥＧＦ受容体リガンド反応細胞である。抑制は、細胞数又は腫瘍の大きさ等の細胞数の派生的な測定値が、本発明のタンパク質又は二重特異性抗体の存在以外は同様である条件下で得られる細胞数に比べた場合、好ましくは少なくとも１０％減少していることである。抑制は、好ましくは、少なくとも、細胞数の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の減少である。抑制はまた、オルガノイド１つ当たりの管腔数等の、腫瘍悪性度又は異形成に関連した他のパラメータが、本発明のタンパク質又は二重特異性抗体の存在以外は同様である条件下で得られる管腔数に比べた場合に、少なくとも１０％減少していることであってもよい。抑制は、好ましくは、少なくとも、オルガノイド１つ当たりの管腔数の２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の減少である。
【００９７】
疑義回避のため説明すると、本明細書で用いる細胞の成長についての言及は、細胞数の変化を指す。成長の抑制は、本来であれば得られていた細胞数の低下を指す。成長の増加は、本来であれば得られていた細胞数の増加を指す。細胞の成長は、典型的には、細胞の増殖を指す。
【００９８】
上記の上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバー若しくはｃＭＥＴ、及び／又は膜上の上記のＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーを含む細胞への、本発明のタンパク質又は二重特異性抗体の結合は、上記の上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリー若しくはｃＭＥＴ、及び／又はＲスポンジンに対する成長因子の存在下で、上記の細胞の成長／増殖を低下させる。この低下は、本発明のタンパク質又は二重特異性抗体の不在下における、その他が同一の条件下での同じ細胞の成長／増殖と比較される。
【００９９】
本発明のタンパク質若しくは二重特異性抗体、又はこれらの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体は、好ましくは、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ６、ＥｒｂＢ−１及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−１及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−２及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−２及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−２及びＬＧＲ６、ＥｒｂＢ−２及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−２及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ６、ＥｒｂＢ−３及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−３及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−４及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−４及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−４及びＬＧＲ６、ＥｒｂＢ−４及びＺＮＲＦ３、並びにＥｒｂＢ−４及びＲＮＦ４３に結合する、本発明のタンパク質若しくは二重特異性抗体、又はこれらの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体から選択される。
【０１００】
好ましい実施形態においては、これは、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−１及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−１及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−３及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−３及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−４及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−４及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−４及びＺＮＲＦ３、並びにＥｒｂＢ−４及びＲＮＦ４３から選択される。好ましい実施形態においては、これは、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−１及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−１及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ４、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−３及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−３及びＲＮＦ４３から選択される。好ましい実施形態においては、これは、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−１及びＺＮＲＦ３、ＥｒｂＢ−１及びＲＮＦ４３、ＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ５、ＥｒｂＢ−３及びＺＮＲＦ３、並びにＥｒｂＢ−３及びＲＮＦ４３から選択される。特に好ましい実施形態においては、本発明のタンパク質若しくは二重特異性抗体、又はこれらの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体は、ＥｒｂＢ−１及びＬＧＲ５、並びにＥｒｂＢ−３及びＬＧＲ５に結合する、本発明のタンパク質若しくは二重特異性抗体、又はこれらの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体から選択される。
【０１０１】
抗体又は二重特異性抗体は、好ましくは、２つの可変ドメインを含み、１つの可変ドメインは１つのタンパク質の細胞外部分に結合し、もう一方の可変ドメインは、もう一方のタンパク質の細胞外部分に結合する。
【０１０２】
一実施形態において、本発明は、ＥｒｂＢ−１に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、少なくとも、図１に示したＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０若しくはＭＦ４２８９からなる群から選択されるＥｒｂＢ−１特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０若しくはＭＦ４２８９からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、二重特異性抗体を提供する。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０又はＭＦ４２８９のＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１０３】
上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０若しくはＭＦ４２８９からなる群から選択されるＥｒｂＢ−１特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域、又は最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が、図１に示したＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０若しくはＭＦ４２８９からなる群から選択されるＥｒｂＢ−１特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０又はＭＦ４２８９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。好ましい重鎖可変領域はＭＦ３７５５である。別の好ましい重鎖可変領域はＭＦ４２８０である。
【０１０４】
重鎖可変領域ＭＦ３７５５を有する１つ以上の可変ドメインを含む抗体は、ＥＧＦＲリガンド反応癌又は細胞の成長を抑制するために用いられた際、より良好な有効性を有することが示されている。二重特異性抗体において、重鎖可変領域ＭＦ３７５５を有する可変ドメインを含む抗体のアームは、他の細胞表面タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む様々な他のアームと、より良好に組み合わされる。重鎖可変領域ＭＦ４２８０を有する可変ドメインを含む抗体はまた、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３に結合する可変ドメインとも良好に機能する。
【０１０５】
一実施形態において、本発明は、ＥｒｂＢ−３に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、少なくとも、図１に示したＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、若しくはＭＦ４８６３からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、若しくはＭＦ４８６３からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、二重特異性抗体を提供する。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、又はＭＦ４８６３のＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１０６】
上記の可変ドメインは、好ましくは、少なくとも図１に示したＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、若しくはＭＦ４８６３からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が、図１に示したＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、若しくはＭＦ４８６３からなる群から選択されるＥｒｂＢ−３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む。可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、又はＭＦ４８６３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。好ましい重鎖可変領域はＭＦ３１７８である。
【０１０７】
一実施形態において、本発明は、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、図１に示したＭＦ５７７７若しくはＭＦ５７８１からなる群から選択されるＬＧＲ４特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５７７７若しくはＭＦ５７８１からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、二重特異性抗体を提供する。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５７７７又はＭＦ５７８１のＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１０８】
上記の可変ドメインは、好ましくは、少なくとも図１に示したＭＦ５７７７若しくはＭＦ５７８１からなる群から選択されるＬＧＲ４特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５７７７若しくはＭＦ５７８１からなる群から選択されるＬＧＲ４特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５７７７又はＭＦ５７８１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。好ましい重鎖可変領域はＭＦ５７８１である。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、上記の二重特異性抗体の重鎖可変領域が、図１に示したＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、若しくはＭＦ５８１８からなる群から選択されるＬＧＲ５特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含む、又は、可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、若しくはＭＦ５８１８からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、二重特異性抗体を提供する。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ  ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、又はＭＦ５８１８のＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１１０】
上記の可変ドメインは、好ましくは、少なくとも図１に示したＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、若しくはＭＦ５８１８からなる群から選択されるＬＧＲ５特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、若しくはＭＦ５８１８からなる群から選択されるＬＧＲ５特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、又はＭＦ５８１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。好ましい重鎖可変領域はＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、又はＭＦ５８１８である。特に好ましい重鎖可変領域はＭＦ５７９０、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、及びＭＦ５８１８、好ましくはＭＦ５８１４、ＭＦ５８１８及びＭＦ５８１６であり、重鎖可変領域ＭＦ５８１６は特に好ましい。別の好ましい重鎖可変領域はＭＦ５８１８である。
【０１１１】
一実施形態において、本発明は、ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、図１に示したＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９からなる群から選択されるＲＮＦ４３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、二重特異性抗体を提供する。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９のＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１１２】
上記の可変ドメインは、好ましくは、少なくとも図１に示したＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９からなる群から選択されるＲＮＦ４３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９からなる群から選択されるＲＮＦ４３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。好ましい重鎖はＭＦ５８３２又はＭＦ５８３６である。好ましい重鎖可変領域はＭＦ５８３６である。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、図１に示したＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、若しくはＭＦ５８８８からなる群から選択されるＺＮＲＦ３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ３配列を少なくとも含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、若しくはＭＦ５８８８からなる群から選択されるＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、二重特異性抗体を提供する。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、又はＭＦ５８８８のＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。
【０１１４】
上記の可変ドメインは、好ましくは、少なくとも図１に示したＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、若しくはＭＦ５８８８からなる群から選択されるＺＮＲＦ３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸が、図１に示したＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、若しくはＭＦ５８８８からなる群から選択されるＺＮＲＦ３特異的重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域を含む。上記の可変ドメインは、好ましくは、図１に示したＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、又はＭＦ５８８８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を少なくとも含む重鎖可変領域を含む。好ましい重鎖可変領域はＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８８４、又はＭＦ５８８８である。好ましい重鎖可変領域はＭＦ５８８８及びＭＦ５８５０、好ましくはＭＦ５８５０である。
【０１１５】
ＣＤＲ配列は、例えば、最適化を目的として、好ましくは抗体の結合力又は安定性を改善するために変更される。最適化は、例えば、突然変異誘発法によって実施され、その結果得られた抗体の安定性及び／又は結合親和性を好ましくは試験した後、改善されたＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ３特異的ＣＤＲ配列が、好ましくは選択される。当業者は、本発明による、少なくとも１つの改変されたＣＤＲ配列を含む抗体変異体を作製することが十分可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用され得る。保存的アミノ酸置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン等の１つの疎水性残基を別の疎水性残基に置換すること、及び１つの極性残基を別の極性残基に置換すること、例えば、アルギニンをリジンに、グルタミン酸をアスパルギン酸に、又はグルタミンをアスパラギンに置換すること等が挙げられる。
【０１１６】
ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくは、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０若しくはＭＦ４２８９のアミノ酸配列、又は、図１のＶＨ鎖配列に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３３７０、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０若しくはＭＦ４２８９のアミノ酸配列を含む。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくはＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、本二重特異性抗体は、本明細書の他の箇所で定義したＷＮＴ経路の膜結合メンバーに結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態においては、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーは、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３である。
【０１１７】
ＨＥＲ３に結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくは、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、若しくはＭＦ４８６３のアミノ酸配列、又は、図１のＶＨ鎖配列に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１２５、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１７８、若しくはＭＦ４８６３のアミノ酸配列を含む。好ましい重鎖はＭＦ３１７８である。好ましい実施形態においては、本二重特異性抗体は、本明細書の他の箇所で定義したＷＮＴ経路の膜結合メンバーに結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態においては、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーは、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３である。
【０１１８】
ＬＧＲ４に結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくは、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７若しくはＭＦ５７８１のアミノ酸配列、又は、図１のＶＨ鎖配列に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７若しくはＭＦ５７８１のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、本二重特異性抗体は、本明細書の他の箇所で定義したＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態においては、ＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーはＥＧＦＲ又はＨＥＲ３、好ましくはＥＧＦＲである。好ましい重鎖はＭＦ３７５５である。
【０１１９】
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくは、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、若しくはＭＦ５８１８のアミノ酸配列、又は、図１のＶＨ鎖配列に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８０５、ＭＦ５８０８、ＭＦ５８０９、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７、若しくはＭＦ５８１８のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、本二重特異性抗体は、本明細書の他の箇所で定義したＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態においては、ＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーはＥＧＦＲ又はＨＥＲ３、好ましくはＥＧＦＲである。好ましい重鎖はＭＦ３７５５である。
【０１２０】
ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくは、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９のアミノ酸配列、又は、図１のＶＨ鎖配列に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３２、ＭＦ５８３６、若しくはＭＦ５８３９のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、二重特異性抗体は、本明細書の他の箇所で定義したＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態においては、ＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーはＥＧＦＲ又はＨＥＲ３、好ましくはＥＧＦＲである。好ましい重鎖はＭＦ３７５５である。
【０１２１】
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、好ましくは上記の可変ドメインのＶＨ鎖を含み、好ましくは、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、若しくはＭＦ５８８８のアミノ酸配列、又は、図１のＶＨ鎖配列に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８６２、ＭＦ５８８２、ＭＦ５８８４、ＭＦ５８８７、若しくはＭＦ５８８８のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態においては、二重特異性抗体は、本明細書の他の箇所で定義したＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態においては、ＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーはＥＧＦＲ又はＨＥＲ３、好ましくはＥＧＦＲである。好ましい重鎖はＭＦ３７５５である。
【０１２２】
好ましくは、本明細書において特定したＶＨ又はＶＬにおける、上記のアミノ酸の挿入、欠失及び置換は、ＣＤＲ３領域には存在しない。記述したアミノ酸の挿入、欠失及び置換はまた、好ましくは、ＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域には存在しない。記述したアミノ酸の挿入、欠失及び置換はまた、好ましくは、ＦＲ４領域には存在しない。
【０１２３】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ４に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１２４】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ４に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７８１のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７８１のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１２５】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１２６】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８０３のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８０３のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１２７】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１４のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１４のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１２８】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１２９】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１７のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１７のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３０】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３１】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３２のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３２のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３２】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３６のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３６のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３３】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３４】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５３のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５３のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３５】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３６】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８４のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８４のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３７】
本発明はまた、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３８】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ４に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１３９】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ４に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７８１のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７８１のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４０】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４１】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８０３のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８０３のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４２】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１４のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１４のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４３】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４４】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１７のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１７のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４５】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＬＧＲ５に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４６】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３６のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３６のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４７】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４８】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５３のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５３のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１４９】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１５０】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８４のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８４のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１５１】
本発明はまた、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインと、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインとを含む抗体であって、ＨＥＲ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３１７８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含み、かつ
ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【０１５２】
本発明のタンパク質又は二重特異性抗体は、好ましくはヒトにおいて用いられる。この目的のため、本発明の抗体は、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。ポリペプチドに対するヒトの耐性は、多くの異なる態様によって影響を受ける。免疫は、それがＴ細胞を介するか、Ｂ細胞を介するか、又はその他のものであるかに関わらず、ポリペプチドに対するヒトの耐性に包含される変数の１つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくはヒトの定常領域（図４）である。定常領域は、ヒト自然抗体の定常領域に対し、１個以上、好ましくは１０個以下、好ましくは５個以下のアミノ酸の違いを含み得る。定常部分は、完全にヒト自然抗体由来であることが好ましい。本明細書で作製された様々な抗体は、国際公開第２００９／１５７７７１号に記載のようなそれぞれの標的で免疫した共通軽鎖マウス由来のものである。本明細書で作製された様々な抗体は、ヒト抗体可変ドメインライブラリー由来のものである。このように、これらの可変ドメインはヒトのものである。固有のＣＤＲ領域は、ヒト由来であってもよい、合成であってもよい、又は、別の生物由来であってもよい。可変領域が、ＣＤＲ領域以外は、ヒト自然抗体の可変領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する場合、その可変領域はヒト可変領域であるとみなされる。ＥＧＦＲファミリーメンバー若しくはＷＮＴ経路の膜結合メンバーに結合する抗体のＶＨの可変領域、又は本発明の抗体中の軽鎖は、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列において可能性のある違いは数に入れず、ヒト自然抗体の可変領域に対し、１個以上、好ましくは１０個以下、好ましくは５個以下のアミノ酸の違いを含み得る。このような変異は、体細胞高頻度突然変異において、自然界でも生じる。
【０１５３】
抗体は、少なくとも重鎖可変領域については、様々な動物種由来であってもよい。このような、例えばマウスの重鎖可変領域をヒト化するのは一般的な方法である。これを実現可能な様々な方法があり、その中には、マウス重鎖可変領域の三次元構造に一致する三次元構造を有するヒト重鎖可変領域中へのＣＤＲの移植、好ましくは、マウス重鎖可変領域由来の既知又は疑いのあるＴ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープを除去することによる、マウス重鎖可変領域の非免疫化がある。この除去は、典型的には、エピトープの配列がもはやＴ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープではないように修飾されるように、エピトープ中のアミノ酸の１個以上を別の（典型的には保存的な）アミノ酸に置換することによる。
【０１５４】
非免疫化されたマウスの重鎖可変領域は、ヒトにおいて、元のマウス重鎖可変領域よりも免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域又は可変ドメインは、例えば張り合わせるように、更にヒト化される。張り合わせ法（veneering techniques）を用いることにより、免疫系によって容易に遭遇される外側の残基がヒトの残基によって選択的に置換され、弱免疫原性又は実質的に非免疫原性の上張りされた表面を含むハイブリッド分子がもたらされる。本発明で用いられる動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類の動物、最も好ましくはヒトである。
【０１５５】
本発明によるタンパク質又は二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト抗体の定常領域を含む。重鎖定常ドメインの違いにより、抗体は５つのクラス、すなわちアイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥに分類される。これらのクラス又はアイソタイプは、対応するギリシャ文字が付けられた、少なくとも１つの上記の重鎖を含む。好ましい実施形態においては、本発明は、本発明による抗体であって、上記の定常領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの定常領域の群から選択され、より好ましくは、上記の定常領域がＩｇＧ定常領域、より好ましくはＩｇＧ１定常領域（図４）、好ましくは変異ＩｇＧ１定常領域を含む、抗体を提供する。ＩｇＧ１の定常領域におけるいくつかの変異は自然界で生じ、かつ／又はその結果得られる抗体の免疫学的特性を変化させることなく、許容される。典型的には約１〜１０個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせが、定常領域において許容される。
【０１５６】
ヒトでの使用において非ヒト残基の含量を最小化するための合理的な方法が、発展した。抗体の抗原結合特性を別の抗体に良好に移植するために、様々な方法が利用できる。抗体の結合特性は、主としてＣＤＲ３領域の正確な配列に基づいており、多くの場合、全体として可変ドメインの適切な構造と組み合わされた可変ドメイン中のＣＤＲ１領域及びＣＤＲ２領域の配列によって補助される。ＣＤＲ領域を別の抗体の適切な可変ドメインに移植するための様々な方法が、現在利用可能である。これらの方法のいくつかはＪ．Ｃ．Ａｌｍａｇｒｏ１  ａｎｄ  Ｊ．Ｆｒａｎｓｓｏｎ（２００８）「Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ」１３，１６１９〜１６３３にレビューされており、この内容は参照により本明細書に含まれる。
【０１５７】
上記の最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせは、好ましくはＶＨ鎖のＣＤＲ３領域、好ましくはＶＨ鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域又はＣＤＲ３領域、好ましくはＦＲ４領域にはない。
【０１５８】
図３に示した可変重鎖配列を含む可変ドメインの軽鎖は、好ましくは、Ｏ１２の、又は、Ｏ１２に基づく生殖系列軽鎖、好ましくは、再配列生殖系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１又はこれらのフラグメント若しくは機能性誘導体（ｉｍｇｔ．ｏｒｇのＩＭＧＴデータベースワールドワイドウェブによる命名法）である。用語、再配列生殖系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１−３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１、ＩＧＫＶ１−３９／ＩＧＫＪ１、ｈｕＶκ１−３９軽鎖又は略してｈｕＶκ１−３９が用いられる。軽鎖は、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する場合がある。上記の１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせは、好ましくはＶＬ鎖のＣＤＲ３領域、好ましくはＶＬ鎖のＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域若しくはＣＤＲ３領域、又はＦＲ４領域にはない。
【０１５９】
二重特異性抗体を作製するため、様々な方法が利用可能である。１つの方法は、細胞中での２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖の発現と、細胞によって産生された抗体を採取することを含む。こうして作製された抗体は、典型的には、異なる組み合わせの重鎖及び軽鎖を有する抗体の集合を含み、これらのうちの一部が所望の二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、続いてこの集合から精製することができる。細胞によって産生される二重特異性抗体の他の抗体に対する比は、様々な方法で増加させることができる。本発明の好ましい実施形態においては、この比は、２つの異なる軽鎖ではなく、２つの本質的に同一の軽鎖を細胞中で発現させることにより増加される。この構想は、当該技術分野において「共通軽鎖」法とも呼ばれている。本質的に同一の軽鎖が、異なる抗原結合部位及び付随する異なる結合特性を有する可変ドメインを形成させる２つの異なる重鎖と共に作用する場合、細胞によって産生される二重特異性抗体の他の抗体に対する比は、２つの異なる軽鎖の発現に比べ、有意に改善される。細胞によって産生される二重特異性抗体の比は、２つの異なる重鎖の互いの対形成を、２つの同一の重鎖の対形成よりも刺激することにより、更に改善することができる。当該技術においては、このような重鎖のヘテロ二量体形成が実現可能である様々な方法が記載されている。１つの方法は、「穴に入るノブ（knob into hole）」型の二重特異性抗体を作製することである。米国特許出願公開第２００３／００７８３８５号（Ａｒａｔｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を参照されたい。別の方法は、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ（ＪＢＣ  ２０１０，ｖｏｌ  ２８５，ｐｐ  １９６３７〜１９６４６）に記載のようなチャージエンジニアリング（charge engineering）を用いることによるものである。別の好ましい方法は、米国仮出願第６１／６３５，９３５号、これに続く正規の米国出願第１３／８６６，７４７号及び国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４号（国際公開第２０１３／１５７９５４（Ａ１）号）に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。二重特異性抗体を（単一細胞から）作製する方法及び手段が開示されており、これによって、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成に好都合である手段が提供される。これらの方法はまた、本発明においても好適に用いることができる。したがって、本発明は、本発明による二重特異性抗体を（単一細胞から）作製するための方法であって、上記の二重特異性抗体が、境界面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを有し、上記の方法が、上記の細胞において、ａ）重鎖を含む第１のＣＨ３ドメインをコードする第１の核酸分子と、ｂ）重鎖を含む第２のＣＨ３ドメインをコードする第２の核酸分子と、をもたらすことを含み、上記の核酸分子には、重鎖を含む上記の第１及び第２のＣＨ３ドメインの優先的な対形成のための手段が提供されており、上記の方法が、上記の宿主細胞を培養し、上記の２つの核酸分子を発現させ、かつ上記の二重特異性抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法を提供する。上記の第１及び第２の核酸分子は、同一の核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれていてもよい。あるいは、上記の第１及び第２の核酸分子は、上記の細胞に別々にもたらされる。
【０１６０】
好ましい実施形態は、本発明による二重特異性抗体を単一細胞から作製するための方法であって、上記の二重特異性抗体が、境界面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを含み、上記の方法が、
ａ）ＥＧＦＲファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分に結合し、かつ第１のＣＨ３ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第１の核酸分子と、ｂ）ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分に結合し、かつ第２のＣＨ３ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第２の核酸分子と、を有する細胞を提供することを含み、上記の核酸分子には、上記の第１及び第２のＣＨ３ドメインの優先的な対形成のための手段が提供されており、
上記の方法が、上記の細胞を培養し、上記の２つの核酸分子によってコードされるタンパク質を発現させ、かつ上記の二重特異性ＩｇＧ抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法を提供する。特に好ましい実施形態においては、上記の細胞はまた、共通軽鎖をコードする第３の核酸分子を有する。上記の第１、第２及び第３の核酸分子は、同一の核酸分子、ベクター又は遺伝子送達ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同一部位に組み込まれていてもよい。あるいは、上記の第１、第２及び第３の核酸分子は、上記の細胞に別々にもたらされる。好ましい共通軽鎖はＯ１２に基づき、好ましくは、好ましい共通軽鎖は、上記の再配列生殖系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１  ３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である。上記の第１及び第２のＣＨ３ドメインの優先的な対形成のための手段は、好ましくは重鎖コード領域のＣＨ３ドメインにおける対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生する好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵナンバリングによるナンバリング）、並びに第２のＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ、又はこの逆の場合である。そのため、二重特異性抗体を作製する、本発明による方法であって、上記の第１のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵナンバリングによるナンバリング）を含み、上記の第２のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅを含み、上記の方法が、上記の細胞を培養し、上記の核酸分子によってコードされるタンパク質を発現させ、かつ上記の二重特異性抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法が更に提供される。二重特異性抗体を作製する、本発明による方法であって、上記の第１のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（ＥＵナンバリングによるナンバリング）を含み、上記の第２のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋを含み、上記の方法が、上記の細胞を培養し、上記の核酸分子を発現させ、かつ上記の二重特異性抗体を培養物から採取する工程を更に含む、方法もまた提供される。これらの方法によって作製可能な抗体もまた、本発明の一部である。ＣＨ３ヘテロ二量体形成ドメインは、好ましくはＩｇＧ１ヘテロ二量体形成ドメインである。ＣＨ３ヘテロ二量体形成ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくはＩｇＧ１定常領域である。
【０１６１】
一実施形態において、本発明は、本発明による抗体重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。核酸分子（典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏの、単離又は組み換え核酸分子）は、好ましくは、図１に示した重鎖可変領域、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有する、図１に示した重鎖可変領域をコードする。好ましい実施形態においては、核酸分子は、図２に示した配列を含む。別の好ましい実施形態においては、核酸分子は図２に示した核酸と同一のアミノ酸配列をコードするが、核酸分子は１つ以上の異なるコドンをコードするため、異なる配列を有する。本発明は、図１の重鎖をコードする核酸配列を更に提供する。
【０１６２】
本発明で用いられる核酸分子は、典型的には、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、これらに限定されない。別の核酸は、当業者には利用可能である。本発明による核酸は、例えば細胞に含まれている。上記の核酸が上記の細胞で発現される際、上記の細胞は、本発明による抗体を産生することができる。そのため、本発明は、一実施形態において、本発明による抗体を含む細胞及び／又は本発明による核酸を提供する。上記の細胞は、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。本発明の適用上、好適な細胞は、本発明による抗体及び／又は本発明による核酸を含むことができ、好ましくはこれらを産生することができる任意の細胞である。
【０１６３】
本発明は、本発明による抗体を含む細胞を更に提供する。好ましくは、上記の細胞（典型的にはｉｎ  ｖｉｔｒｏの、単離又は組み換え細胞）は上記の抗体を産生する。好ましい実施形態においては、上記の細胞はハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞又はＰＥＲ−Ｃ６ＴＭ細胞である。特に好ましい実施形態においては、上記の細胞はＣＨＯ細胞である。本発明による細胞を含む細胞培養物が、更に提供される。様々な機関及び企業が、抗体の大量生産用、例えば臨床用途に細胞株を開発している。このような細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。これらの細胞はまた、タンパク質の生産等の他の目的にも用いられる。タンパク質及び抗体の工業規模生産向けに開発された細胞株は、本明細書では、更に工業細胞株と呼ぶ。したがって、好ましい実施形態においては、本発明は、本発明の抗体の生産のための、抗体の大量生産用に開発された細胞株の使用を提供する。本発明は、図１に示したＶＨ、ＶＬ、及び／又は重鎖をコードする核酸分子を含む抗体を産生する細胞を更に提供する。好ましくは、上記の核酸分子は、図２に示した配列を含む。
【０１６４】
本発明は、本発明の細胞を培養し、かつ上記の培養物から上記の抗体を採取することを含む、抗体の作製方法を更に提供する。好ましくは、上記の細胞は無血清培地で培養される。好ましくは、上記の細胞は懸濁成長に適応されている。本発明による抗体の作製方法により入手可能な抗体が、更に提供される。抗体は、好ましくは培養物の培地から精製される。好ましくは、上記の抗体はアフィニティー精製される。
【０１６５】
本発明の細胞は、例えば、臨床目的用の抗体作製へのその適合性により既知の、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞、２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞、又は別の細胞種である。特に好ましい実施形態においては、上記の細胞はヒト細胞である。好ましくは、細胞は、アデノウイルスＥ１領域又はこの機能的同等物によって形質転換される。このような細胞株の好ましい例は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株又はこの同等物である。特に好ましい実施形態においては、上記の細胞はＣＨＯ細胞又はこの変異体である。好ましくは、変異体は、抗体の発現のためにグルタミン合成酵素（ＧＳ）ベクター系を利用する。
【０１６６】
本発明は、本発明による抗体を含む医薬組成物を更に提供する。医薬組成物は、好ましくは、好ましくは薬学的に許容可能な添加物又は担体を含む。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、ヒスチジン５〜５０ｍＭ、トレハロース１００〜３００ｍＭ、ポリソルベート２０  ０．１〜０３ｇ／Ｌ、又はこれらの組み合わせを含む。ｐＨは、好ましくはｐＨ＝５．５〜６．５に設定される。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、ヒスチジン２５ｍＭ、トレハロース２２０ｍＭ、ポリソルベート２０  ０．２ｇ／Ｌ、又はこれらの組み合わせを含む。ｐＨは、好ましくはｐＨ＝５．５〜６．５、最も好ましくはｐＨ＝６に設定される。
【０１６７】
本発明の抗体は、好ましくは、標識、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏ撮像用の標識を更に含む。このような標識は、典型的には、治療用には不要である。標識は、例えば診断用の設定において、例えば体内の標的細胞の可視化において役立つ場合がある。様々な標識が好適であり、多くが当該技術分野で周知である。好ましい実施形態においては、標識は検出用の放射性標識である。別の好ましい実施形態においては、標識は赤外線標識である。好ましくは、赤外線標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像に好適なものである。様々な赤外線標識が、当業者には利用可能である。好ましい赤外線標識は、例えば、ＩＲＤｙｅ  ８００、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤ、ＩＲＤｙｅ  ６８０ＬＴ、ＩＲＤｙｅ  ７５０、ＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ  ＩＲＤｙｅ  ６５０、ＩＲＤｙｅ  ７００ホスホルアミダイト、ＩＲＤｙｅ  ８００ホスホルアミダイト（ＬＩ−ＣＯＲ  ＵＳＡ；４６４７  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｓｔｒｅｅｔ；Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）である。
【０１６８】
ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーリガンドがもたらされた際に、癌が成長反応を呈するか否かを確認するため、当業者は、例えば、ＥＧＦＲの増幅及び／又は（ＥＧＦ反応に対する）免疫組織化学的検査における染色を測定することができる。腫瘍試料中、腫瘍細胞の少なくとも１０％が陽性でなくてはならない。腫瘍試料はまた、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上の陽性細胞を含む場合がある。癌がＨＥＲ３リガンドに対して成長反応を呈するか否かを確認するため、当業者は、例えば、ＨＥＲ３の増幅及び／又は免疫組織化学的検査における染色を測定することができる。腫瘍試料中、腫瘍細胞の少なくとも１０％が陽性でなくてはならない。腫瘍試料はまた、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上の陽性細胞を含む場合がある。癌がＷｎｔ（ＬＧＲ５、ＬＧＲ４、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３）受容体標的に対して感応性であるか否かを確認するため、当業者は、例えば、Ｗｎｔ標的の増幅及び／又は免疫組織化学的検査における染色を測定することができる。腫瘍試料中、腫瘍細胞の少なくとも１％が陽性でなくてはならない。腫瘍試料はまた、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上の陽性細胞を含む場合がある。
【０１６９】
患者に投与される本発明による抗体の量は、典型的には治療濃度域内であり、すなわち、治療効果を得るために十分な量が用いられ、その一方で、この量は、容認できない程度の副作用を来す閾値を超えない。所望の治療効果を得るために必要な抗体の量が低い程、治療濃度域は、典型的には大きくなる。そのため、十分な治療効果を低用量で発揮する、本発明による抗体が好ましい。用量は、セツキシマブの投与方式の範囲内であり得る。用量は、より低い場合もある。
【０１７０】
本発明による二重特異性抗体は、好ましくは、セツキシマブに比べ、当然のことながら他は同様の条件下で、皮膚毒性を誘発することがより少ない。本発明による二重特異性抗体は、好ましくは、セツキシマブに比べ、当然のことながら他は同様の条件下で、炎症性ケモカイン、好ましくはＣＸＣＬ１４の産生がより少ない。本発明による二重特異性抗体は、好ましくは、セツキシマブに比べ、当然のことながら他は同様の条件下で、抗菌ＲＮＡ分解酵素、好ましくはＲｎａｓｅ  ７の機能障害を誘発することがより少ない。
【０１７１】
本発明は、とりわけ、ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とを標的とし、その結果、強力な、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌細胞株の増殖抑制と、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長抑制をもたらす抗体を記載している。抗体は、これらを、重鎖のヘテロ二量体形成を推進するＣＨ３領域に変異を含む相補的発現ベクター中にクローニングすることにより、二重特異性抗体として作製される。多くの二重特異性抗体を小規模で作製し、癌細胞株に対する結合アッセイ及び機能アッセイにおいて試験した。本発明の抗体、特に本発明の二重特異性抗体は、低毒性プロファイルと高い効果とを兼ね備えることができる。本発明の抗体は、様々な種類及び系統のＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とした治療において有用であり得る。本発明の抗体は、同一の抗原（複数可）に両方のアームで結合する抗体に比べた場合、増大した治療濃度域を有することができる。本発明の二重特異性抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、又はこれらの組み合わせで、ＭＥＨＤ７９４５Ａ抗体に比べた場合、より良好な成長抑制効果を呈することができる。
【０１７２】
ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する癌を有する対象において、転移の形成を抑制するための方法もまた提供される。癌は、好ましくはＥＧＦ受容体リガンド反応性癌である。高いＨｅｒリガンド（例えばＥＧＦ、ヘレグリン）レベルが、典型的には、転移の形成中（すなわち、腫瘍細胞又は腫瘍開始細胞の遊走、浸潤、成長及び／若しくは分化）に存在する。典型的には、腫瘍開始細胞は、ＣＤ４４等の幹細胞マーカーに基づいて同定される。そのため、これらのプロセスは、トラスツズマブ及びペルツズマブ等の、現在知られている治療では、ほとんど抑制できない。本発明による抗体は、腫瘍細胞又は癌幹細胞等の腫瘍開始細胞の成長及び／若しくは分化を抑制することができるため、本発明によるこのような抗体はまた、転移の形成の抑制にも特に好適である。そのため、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３又はＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍を有する対象において転移の形成を抑制するための方法であって、上記のＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−３若しくはＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍細胞及び／又は周囲の間質組織細胞（例えば、線維芽細胞、マクロファージ及び単球等の白血球、内皮等）が、ＢＸＰＣ３又はＭＣＦ７細胞のｈｅｒリガンド発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％若しくは９５％であるＨｅｒリガンド発現レベルを有し、ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ３の細胞外部分、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分に結合する二重特異性抗体、又はこの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体の、対象への投与を含む、方法が更に提供される。ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ３の細胞外部分、及びＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分に結合する二重特異性抗体、又はこの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体もまた、転移の形成の治療又は予防で用いるために提供される。上記の転移が由来する腫瘍は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３又はＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍である。腫瘍細胞及び／又は周囲の間質組織細胞は、好ましくは、ＢＸＰＣ３細胞又はＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％若しくは９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。
【０１７３】
本発明による二重特異性抗体、又はこの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体の使用が、転移の形成の治療又は予防のための薬物の製造のために、更に提供される。上記の転移が由来する腫瘍は、好ましくは、ＥｒｂＢ−３又はＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−３陽性腫瘍である。腫瘍細胞及び／又は周囲の間質組織細胞は、好ましくは、ＢＸＰＣ３細胞又はＭＣＦ７細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％若しくは９５％であるヘレグリン発現レベルを有する。
【０１７４】
本発明の抗体は、懸濁２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクション後、５０ｍｇ／Ｌ超のレベルで作製することができる。二重特異性抗体は、収率７０％超で、９８％超に精製することができる。解析特徴分析試験は、二価の単一特異性ｌｇＧ１と同等の二重特異性ｌｇＧ１抗体プロファイルを示す。
【０１７５】
明確さ及び簡潔な記載のため、特徴は、本明細書においては、同一又は別の実施形態の一部として記載しているが、本発明の範囲は、記載した特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解されよう。
【０１７６】
数学においては、ユークリッド距離又はユークリッド計量が、ユークリッド空間における２点間の「通常の」（すなわち直線）距離である。この距離により、ユークリッド空間は距離空間となる。関連する基準は、ユークリッドノルムと呼ばれる。
【０１７７】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多くのポリペプチド成長因子、サイトカイン、及びホルモンに対して高親和性の細胞表面受容体である。ヒトゲノム中で同定された、現在知られている９０個の固有のチロシンキナーゼ遺伝子のうち、５８個が、受容体型チロシンキナーゼタンパク質をコードする。受容体型チロシンキナーゼは、正常な細胞プロセスに関連するが、癌の発症及び進行においても役割を有する。受容体型チロシンキナーゼは、少なくとも１つの細胞外ドメインを含む。
【０１７８】
一態様において、本発明は、ＲＴＫ受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とに結合するタンパク質を提供する。本タンパク質は、好ましくは抗体であり、好ましくは二重特異性抗体、又はこれらの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体である。
【０１７９】
本発明はまた、ＲＴＫ受容体ファミリーの膜結合メンバーの細胞外部分と、ＷＮＴシグナル伝達経路の膜結合メンバーの細胞外部分とに結合する二重特異性抗体、又はこの機能部分、誘導体及び／若しくは類似体を提供する。
【０１８０】
癌を有する個体の治療方法であって、本方法が、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を、これらを必要とする個体に投与することを含む、方法もまた提供される。
【０１８１】
本発明は、癌を有する個体の治療で用いるための本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を更に提供する。
【０１８２】
一実施形態において、癌は、ＲＴＫ受容体ファミリーのそれぞれのメンバーのリガンドに対して反応性の癌、及びＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する癌である。
【０１８３】
本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体と、ＲＴＫ受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞と、を含む細胞系が、更に提供される。細胞系は、好ましくは、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体と、ＲＴＫ受容体ファミリーの膜結合メンバーを発現し、かつＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する細胞と、を含む細胞系である。
【０１８４】
細胞の成長／増殖の抑制を許容する系もまた提供され、本方法は、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を系に提供することを含む。細胞は、好ましくは、この細胞の成長／増殖を許容する系においてＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現するＲＴＫ受容体リガンド反応細胞であり、本方法は、本発明のタンパク質又は本発明の二重特異性抗体を系に提供することを含む。細胞は、好ましくは、ＷＮＴ経路の膜結合メンバーを発現する、ＲＴＫ受容体リガンド反応細胞である。
【０１８５】
好ましいＲＴＫ受容体ファミリーのメンバーは、上記のＥＧＦ−受容体ファミリー及びｃ−ＭＥＴ、Ａｘｌ及びＭＳＴ１Ｒである。
【０１８６】
ＭＥＴ又はＣ−ＭＥＴは、胚発生、器官形成及び創傷治癒に関連した単一通過チロシンキナーゼ受容体である。肝細胞成長因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）及びそのスプライシングアイソフォーム（ＮＫ１、ＮＫ２）が、現在知られているＭＥＴ受容体のリガンドである。ＭＥＴは、通常、上皮由来の細胞によって発現され、一方、ＨＧＦ／ＳＦの発現は、間葉由来の細胞において確認される。ＨＧＦ／ＳＦがその同起源の受容体ＭＥＴに結合すると、活性化を誘導する。Ｍｅｔはまた、ＭＥＴ癌原遺伝子、受容体型チロシンキナーゼ、肝細胞成長因子受容体、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ、分散因子受容体、癌原遺伝子Ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ／ＳＦ受容体、ＨＧＦ受容体、ＳＦ受容体、ＥＣ  ２．７．１０．１、Ｍｅｔ癌原遺伝子チロシンキナーゼ、Ｍｅｔ癌原遺伝子、ＥＣ  ２．７．１０、ＡＵＴＳ９、ＲＣＣＰ２、Ｃ−Ｍｅｔ、及びＨＧＦＲ  ３としても知られている。遺伝子及びタンパク質のアクセッション番号は、ＮＣ＿０００００７．１４、ＮＴ＿００７９３３．１６、ＮＣ＿０１８９１８．２、ＮＰ＿０００２３６．２、ＮＰ＿００１１２０９７２．１である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＣ−ＭＥＴを同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、抗体によって結合されるＣ−ＭＥＴタンパク質の実際の配列は様々であり得る。Ｃ−ＭＥＴ抗原結合部位は、Ｃ−ＭＥＴ及び様々なその変異体、例えば一部のＣ−ＭＥＴ陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【０１８７】
ＡＸＬ又はＡＸＬ受容体型チロシンキナーゼは、ヒトにおいてＡＸＬ遺伝子によってコードされる酵素であるチロシンタンパク質キナーゼ受容体ＵＦＯをコードする。ＡＸＬの別名は、ＡＸＬ受容体型チロシンキナーゼ、ＡＸＬ癌遺伝子、ＥＣ  ２．７．１０．１、ＵＦＯ、チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＵＦＯ、ＡＸＬ形質転換配列／遺伝子、ＥＣ  ２．７．１０、ＪＴＫ１１、Ｔｙｒｏ７、及びＡＲＫ  ３である。遺伝子及びタンパク質のアクセッション番号は、ＮＣ＿００００１９．１０、ＮＣ＿０１８９３０．２、ＮＴ＿０１１１０９．１７、ＮＰ＿００１２６５５２８．１、ＮＰ＿００１６９０．２、ＮＰ＿０６８７１３．２である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＡＸＬを同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、抗体によって結合されるＡＸＬタンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＡＸＬ抗原結合部位は、ＡＸＬ及び様々なその変異体、例えば一部のＡＸＬ陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【０１８８】
ＭＳＴ１Ｒ又はマクロファージ刺激１受容体又はＲＯＮ。ＭＳＴ１Ｒの別名は、マクロファージ刺激１受容体、ＲＯＮ、ＰＴＫ８タンパク質チロシンキナーゼ８、Ｃ−Ｍｅｔ関連チロシンキナーゼ、ＭＳＰ受容体、ＥＣ  ２．７．１０．１、Ｐ１８５−Ｒｏｎ、ＣＤｗ１３６、ＰＴＫ８、マクロファージ刺激１受容体（Ｃ−Ｍｅｔ関連チロシンキナーゼ）３、マクロファージ刺激タンパク質受容体、タンパク質チロシンキナーゼ８、ＭＳＴ１Ｒ変異体ＲＯＮ３０、ＭＳＴ１Ｒ変異体ＲＯＮ６２、ＲＯＮ変異体Ｅ２Ｅ３、ＲＯＮ変異体２１、ＣＤ１３６抗原、ＥＣ  ２．７．１０、ＣＤ１３６であり、全て膜結合型である。遺伝子及びタンパク質のアクセッション番号は、ＮＣ＿０００００３．１２、ＮＴ＿０２２５１７．１９、ＮＣ＿０１８９１４．２、ＮＰ＿００１２３１８６６．１、ＮＰ＿００２４３８．２である。これらのアクセッション番号は主として、標的としてのＭＳＴ１Ｒを同定する更なる方法を提供するために示しているが、例えば、一部の癌等に発生する変異等のコーディング遺伝子における変異のため、抗体によって結合されるＭＳＴ１Ｒタンパク質の実際の配列は様々であり得る。ＭＳＴ１Ｒ抗原結合部位は、ＭＳＴ１Ｒ及び様々なその変異体、例えば一部のＭＳＴ１Ｒ陽性腫瘍細胞により発現された変異体等に結合する。
【０１８９】
本発明はまた、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７７７のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９０】
本発明はまた、ＬＧＲ４に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７８１のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７８１のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９１】
本発明はまた、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５７９０のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９２】
本発明はまた、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８０３のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８０３のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９３】
本発明はまた、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１４のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１４のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９４】
本発明はまた、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１６のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９５】
本発明はまた、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１７のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１７のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９６】
本発明はまた、ＬＧＲ５に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８１８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９７】
本発明はまた、ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３２のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３２のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９８】
本発明はまた、ＲＮＦ４３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３６のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８３６のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０１９９】
本発明はまた、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５０のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０２００】
本発明はまた、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５３のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５３のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０２０１】
本発明はまた、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０２０２】
本発明はまた、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８４のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８４のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０２０３】
本発明はまた、ＺＮＲＦ３に結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８８のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ５８８８のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０２０４】
一実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む単一特異性抗体であって、可変ドメインのＶＨ鎖が、
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又は
図１に示したＶＨ鎖ＭＦ３７５５のアミノ酸配列において、上記のＶＨに関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、単一特異性抗体を提供する。
【０２０５】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置される、抗体に関する。アミノ酸残基Ｄ４３、Ｇ４４、Ｍ４６、Ｆ６７、Ｇ９０、及びＦ９１が抗体の結合に関与することが示された。関与することは、全ての残基が抗体によって実際に接触されていることを必ずしも意味しない。理論に束縛されるわけではないが、Ｄ４３Ａ又はＧ４４Ａを置換することにより、エピトープに（わずかな）立体構造変化が生じ、この立体構造変化により、抗体のエピトープへの結合が低下するものと考えられる。
【０２０６】
抗体のＬＧＲ５との相互作用は、ＬＧＲ５発現細胞の膜上に発現されたＬＧＲ５へのＲＳＰＯ  １の結合を抑制しない。抗体のＲＳＰＯ  １との相互作用は、ＬＧＲ５発現細胞の膜上に発現されたＬＧＲ５への抗体の結合を抑制しない。これは、抗体及びＲＳＰＯ  １が、ＬＧＲ５への結合に対し、少なくとも本明細書に示したモル比の範囲外では、互いに競合しないことを意味している。抗体のＲＳＰＯ  １に対するモル比は、典型的には０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）のモル比である。この範囲において、抗体のＬＧＲ５への結合は、ＲＳＰＯ  １のＬＧＲ５への結合を抑制（阻害）しない。
【０２０７】
本明細書において抗体のＲＳＰＯに対するモル比に言及する場合、抗体は、飽和量の抗体が存在する際に得られる結合の４０％〜８０％をもたらす量で存在することが好ましい。
【０２０８】
ＬＧＲ５に結合する様々な抗体が記載されている。抗体のＬＧＲ５への結合は、ＲスポンジンのＬＧＲ５への結合を阻害する場合、又は阻害しない場合がある。Ｒスポンジン１リガンドのＬＧＲ５への結合を阻害する抗体は、タンパク質のＮ末端領域、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）領域１及びＬＲＲ２を含む領域に結合することが分かっている（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１；Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ  ４７６；ｐｐ  ２９３〜２９７及び同論文中に記載の追加情報）。エレメントは、図３９に示した配列番号１に示したＬＧＲ５タンパク質配列のアミノ酸２１〜１１８（両端の番号を含む）に含まれ、アミノ酸２１〜７０はＮ末端領域を構成し、アミノ酸７１〜９４（両端の番号を含む）はＬＲＲ１を構成し、９５〜１１８はＬＲＲ２を構成する。ＬＧＲ５のＲｓｐｏｎｄｉｎ  １との相互作用を阻害しない抗体は、当該技術分野においてほんのわずかしか報告されておらず、発明者が知る限り、これらはいずれもＬＧＲ５のＮ末端領域には結合しない。
【０２０９】
次に、本発明は、図３９に示した配列番号１のＬＧＲ５配列のアミノ酸残基２１〜１１８内のエピトープに結合するタンパク質であって、このタンパク質が、Ｒスポンジン１のＬＧＲ５への結合を阻害しない、タンパク質を提供する。
【０２１０】
抗体がＲスポンジンのＬＧＲ５への結合を阻害するか否かを判定するための試験は、好ましくは、細胞膜上にＬＧＲ５を発現するＣＨＯ細胞を含む。分析される抗体及びＲスポンジンを混合して細胞に加え、抗体の細胞への結合を測定する。過剰のＲスポンジンの存在下における、抗体のＬＧＲ５発現細胞への結合の量は、抗体がＲスポンジンのＬＧＲ５への結合を阻害しないことを示す。この試験は、好ましくは、ＬＧＲ５に結合し、ＲスポンジンのＬＧＲ５への結合を阻害する対照抗体を更に含む。対照抗体は、好ましくは、実施例に記載のような抗体ＰＢ１０２６１又はＯＭＰ８８Ｒ２０である。その他は同一の条件下で、対照抗体に比べた場合、より多くのタンパク質がＬＧＲ５発現細胞に結合可能であれば、タンパク質はＲスポンジン１のＬＧＲ５への結合を阻害しない。これは、好ましくはタンパク質又は対照抗体のＲスポンジンに対するモル比が１：１０以下、すなわち０．１以下、好ましくはモル比が０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）である条件下で評価される。タンパク質は、好ましくは、別の膜結合タンパク質の細胞外部分にも結合する。好ましい実施形態においては、他の膜結合タンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。
【０２１１】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能なタンパク質であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、タンパク質のＬＧＲ５への結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される、タンパク質を更に提供する。好ましい実施形態においては、Ｒスポンジン（ＲＳＰＯ）１のＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との相互作用は、タンパク質のＬＧＲ５への結合を、２０％を超えて抑制しない。タンパク質のＬＧＲ５への結合の抑制は、好ましくは、タンパク質及びＲＳＰＯ  １、２、３又は４がモル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）（タンパク質：ＲＳＰＯ）で存在するときに測定される。
【０２１２】
本発明は、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置されるＬＧＲ５上のエピトープに結合可能なタンパク質であって、ＲＳＰＯ  １のＬＧＲ５発現細胞上のＬＧＲ５との相互作用が、タンパク質のＬＧＲ５への結合を、タンパク質とＲＳＰＯ  １がモル比０．１以下、好ましくはモル比０．１〜０．００１（両端の値を含む）、好ましくは０．１〜０．０１（両端の値を含む）で存在するとき、２０％を超えて抑制しない、タンパク質を更に提供する。このエピトープは、好ましくは、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基４０〜９５内に配置される。タンパク質のＬＧＲ５への結合は、好ましくは、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される。これは、典型的には、タンパク質は、これらの上記のアミノ酸と相互作用することを示している。これらのアミノ酸を変更することにより、タンパク質のＬＧＲ５への結合が変化する。そのため、これらのアミノ酸は、ＬＧＲ５において、結合タンパク質に対する接触残基である可能性が高い。本発明の場合、発明者らは、残基Ｍ４６、Ｆ６７、Ｇ９０Ａ及びＦ９１が接触残基であると考えている。Ｄ４３及びＧ４４も接触残基である可能性はあるが、他の残基の特異的な立体構造を変化させ、その結果、他の残基がもはやタンパク質によって結合されないようにする残基である可能性もある。タンパク質は、好ましくは、更なるタンパク質に結合可能である。更なるタンパク質は、好ましくは、細胞外部分を含む膜タンパク質である。更なるタンパク質は、好ましくは、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。本明細書で説明したＬＧＲ５結合タンパク質は、好ましくは抗体、好ましくは二重特異性抗体である。
【０２１３】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む二重特異性抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、可変ドメインのＬＧＲ５への結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下され、二重特異性抗体が、更なるタンパク質に結合可能な可変ドメインを更に含む、二重特異性抗体を更に提供する。更なるタンパク質は、好ましくは、細胞外部分を含む膜タンパク質である。更なるタンパク質は、ＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。
【０２１４】
本明細書に記載のタンパク質又は二重特異性抗体のＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴへの結合は、好ましくは、上記のＥＧＦ受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴを含む細胞において、リガンド誘導シグナル伝達を低下させる。
【０２１５】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置される、抗体を提供する。
【０２１６】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｄ４３、Ｇ４４、Ｍ４６、Ｆ６７、Ｇ９０、及びＦ９１が抗体のエピトープへの結合に関与する、抗体を更に提供する。
【０２１７】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上の置換が、抗体のエピトープへの結合を低下させる、抗体を更に提供する。
【０２１８】
本発明は、ＬＧＲ５の細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、このエピトープが、図３９に示した配列番号１のアミノ酸残基２１〜１１８内に配置され、抗体のエピトープへの結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｄ４３Ａ、Ｇ４４Ａ、Ｍ４６Ａ、Ｆ６７Ａ、Ｇ９０Ａ、及びＦ９１Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体を更に提供する。
【０２１９】
本明細書で用いられる膜タンパク質は、細胞膜タンパク質、すなわち、細胞を外界から分離する膜である細胞の外膜にあるタンパク質である。膜タンパク質は、細胞外部分を有する。膜タンパク質が細胞の細胞膜にある膜貫通領域を含んでいる場合、膜タンパク質は、少なくとも細胞上にある。
【０２２０】
抗体は、好ましくは、更なるタンパク質に結合可能な更なる可変ドメインを更に含む。更なるタンパク質は、好ましくは、細胞外部分を含む膜タンパク質である。更なるタンパク質は、好ましくは、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの膜結合メンバー又はｃＭＥＴである。抗体は二重特異性抗体である。
【０２２１】
明確さ及び簡潔な記載のため、特徴は、本明細書においては、同一又は別の実施形態の一部として記載しているが、本発明の範囲は、記載した特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることが理解されよう。
【実施例】
【０２２２】
本明細書で用いる「ＭＦＸＸＸＸ」（配列中、Ｘは独立して０〜９の数字である）は、ＶＨが４桁によって同定されるアミノ酸配列を有する、可変ドメインを含むＦａｂを示す。別途記載がない限り、可変ドメインの軽鎖可変領域は、典型的には、図３の配列を有する。軽鎖は、図３に示した配列を有する。「ＭＦＸＸＸＸ  ＶＨ」は、４桁によって同定されるＶＨのアミノ酸配列を示す。ＭＦは、軽鎖の定常領域と、通常軽鎖の定常領域と相互作用する重鎖の定常領域とを更に含む。ＰＧは、同一の重鎖及び軽鎖を含む単一特異性抗体を示す。ＰＢは、２つの異なる重鎖を有する二重特異性抗体を示す。重鎖のＶＨ／可変領域は異なり、かつ典型的にはＣＨ３領域でもあり、重鎖のうちの一方がそのＣＨ３ドメインのＫＫ変異を有し、もう一方がＣＨ３ドメインの相補的ＤＥ変異を有する（国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４号（国際公開第２０１３／１５７９５４号として公開）を参照）。ＰＢ、ＰＧ及び他のコードにおいて、数値表示に製造バッチの表示が続く場合がある。例えば、ＰＢ１０６５１ｐ０６は、ＰＢ１０６５１のバッチ６である。
【０２２３】
実施例１：
方法、材料及び抗体のスクリーニング
細胞株：
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（カタログ番号ｐ／ｎ５１−００２９）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手し、２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地で定常的に維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１１２６８）及びＣＨＯ−Ｋ１（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ１１０）細胞株はＡＴＣＣより購入し、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及びＦＢＳ（Ｌｏｎｚａ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）で定常的に維持した。
【０２２４】
組み換えヒト及びマウスＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３発現ベクターの作製
ヒトＬＧＲ４完全長ヒト（ｈ）ＬＧＲ４は、２つのＦＬＡＧタグ及び２つのＨＡタグを含むベクターｐＥＦ１＿Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐＥＦ１＿ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡ）中に存在し、ｐＶａｘ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡを得た。挿入配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１８４９０との比較によって確認した。配列は、アミノ酸レベルの以下の逸脱、すなわちシグナルペプチドにおけるＰ２Ａを含んでいた。構造体ｐＥＦ１＿ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡからの挿入を、ｐＶａｘ１に再クローニングした。別途、ｐＶａｘ１中の完全長ｈＬＧＲ４を、ｈＬＧＲ４の短縮型、ｈＬＧＲ４（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３（ＴＭ）−ＦＬＡＧで置換し、ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ４（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３（ＴＭ）−ＦＬＡＧを得た。
【０２２５】
細胞表面発現の完全長ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡ挿入（ｐＥＦ１＿Ｍｙｃ／Ｈｉｓ及びｐＶａｘ１の両方における）のアミノ酸配列
ＭＡＧＰＬＧＬＬＣＦＬＡＬＧＬＬＧＳＡＧＰＳＧＡＡＰＰＬＣＡＡＰＣＳＣＤＧＤＲＲＶＤＣＳＧＫＧＬＴＡＶＰＥＧＬＳＡＦＴＱＡＬＤＩＳＭＮＮＩＴＱＬＰＥＤＡＦＫＮＦＰＦＬＥＥＬＱＬＡＧＮＤＬＳＦＩＨＰＫＡＬＳＧＬＫＥＬＫＶＬＴＬＱＮＮＱＬＫＴＶＰＳＥＡＩＲＧＬＳＡＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＴＳＶＰＥＤＳＦＥＧＬＶＱＬＲＨＬＷＬＤＤＮＳＬＴＥＶＰＶＨＰＬＳＮＬＰＴＬＱＡＬＴＬＡＬＮＫＩＳＳＩＰＤＦＡＦＴＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＫＩＲＳＬＳＱＨＣＦＤＧＬＤＮＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＧＥＦＰＱＡＩＫＡＬＰＳＬＫＥＬＧＦＨＳＮＳＩＳＶＩＰＤＧＡＦＤＧＮＰＬＬＲＴＩＨＬＹＤＮＰＬＳＦＶＧＮＳＡＦＨＮＬＳＤＬＨＳＬＶＩＲＧＡＳＭＶＱＱＦＰＮＬＴＧＴＶＨＬＥＳＬＴＬＴＧＴＫＩＳＳＩＰＮＮＬＣＱＥＱＫＭＬＲＴＬＤＬＳＹＮＮＩＲＤＬＰＳＦＮＧＣＨＡＬＥＥＩＳＬＱＲＮＱＩＹＱＩＫＥＧＴＦＱＧＬＩＳＬＲＩＬＤＬＳＲＮＬＩＨＥＩＨＳＲＡＦＡＴＬＧＰＩＴＮＬＤＶＳＦＮＥＬＴＳＦＰＴＥＧＬＮＧＬＮＱＬＫＬＶＧＮＦＫＬＫＥＡＬＡＡＫＤＦＶＮＬＲＳＬＳＶＰＹＡＹＱＣＣＡＦＷＧＣＤＳＹＡＮＬＮＴＥＤＮＳＬＱＤＨＳＶＡＱＥＫＧＴＡＤＡＡＮＶＴＳＴＬＥＮＥＥＨＳＱＩＩＩＨＣＴＰＳＴＧＡＦＫＰＣＥＹＬＬＧＳＷＭＩＲＬＴＶＷＦＩＦＬＶＡＬＦＦＮＬＬＶＩＬＴＴＦＡＳＣＴＳＬＰＳＳＫＬＦＩＧＬＩＳＶＳＮＬＦＭＧＩＹＴＧＩＬＴＦＬＤＡＶＳＷＧＲＦＡＥＦＧＩＷＷＥＴＧＳＧＣＫＶＡＧＦＬＡＶＦＳＳＥＳＡＩＦＬＬＭＬＡＴＶＥＲＳＬＳＡＫＤＩＭＫＮＧＫＳＮＨＬＫＱＦＲＶＡＡＬＬＡＦＬＧＡＴＶＡＧＣＦＰＬＦＨＲＧＥＹＳＡＳＰＬＣＬＰＦＰＴＧＥＴＰＳＬＧＦＴＶＴＬＶＬＬＮＳＬＡＦＬＬＭＡＶＩＹＴＫＬＹＣＮＬＥＫＥＤＬＳＥＮＳＱＳＳＭＩＫＨＶＡＷＬＩＦＴＮＣＩＦＦＣＰＶＡＦＦＳＦＡＰＬＩＴＡＩＳＩＳＰＥＩＭＫＳＶＴＬＩＦＦＰＬＰＡＣＬＮＰＶＬＹＶＦＦＮＰＫＦＫＥＤＷＫＬＬＫＲＲＶＴＫＫＳＧＳＶＳＶＳＩＳＳＱＧＧＣＬＥＱＤＦＹＹＤＣＧＭＹＳＨＬＱＧＮＬＴＶＣＤＣＣＥＳＦＬＬＴＫＰＶＳＣＫＨＬＩＫＳＨＳＣＰＡＬＡＶＡＳＣＱＲＰＥＧＹＷＳＤＣＧＴＱＳＡＨＳＤＹＡＤＥＥＤＳＦＶＳＤＳＳＤＱＶＱＡＣＧＲＡＣＦＹＱＳＲＧＦＰＬＶＲＹＡＹＮＬＰＲＶＫＤＳＲＤＹＫＤＤＤＤＫＡＧＡＤＹＫＤＤＤＤＫＬＤＧＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＧＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
配列中、
ＭＡＧＰＬＧＬＬＣＦＬＡＬＧＬＬＧＳＡＧＰＳＧＡ：シグナルペプチド
ＡＰＰＬＣＡＡＰＣＳＣＤＧＤＲＲＶＤＣＳＧＫＧＬＴＡＶＰＥＧＬＳＡＦＴＱＡＬＤＩＳＭＮＮＩＴＱＬＰＥＤＡＦＫＮＦＰＦＬＥＥＬＱＬＡＧＮＤＬＳＦＩＨＰＫＡＬＳＧＬＫＥＬＫＶＬＴＬＱＮＮＱＬＫＴＶＰＳＥＡＩＲＧＬＳＡＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＴＳＶＰＥＤＳＦＥＧＬＶＱＬＲＨＬＷＬＤＤＮＳＬＴＥＶＰＶＨＰＬＳＮＬＰＴＬＱＡＬＴＬＡＬＮＫＩＳＳＩＰＤＦＡＦＴＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＫＩＲＳＬＳＱＨＣＦＤＧＬＤＮＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＧＥＦＰＱＡＩＫＡＬＰＳＬＫＥＬＧＦＨＳＮＳＩＳＶＩＰＤＧＡＦＤＧＮＰＬＬＲＴＩＨＬＹＤＮＰＬＳＦＶＧＮＳＡＦＨＮＬＳＤＬＨＳＬＶＩＲＧＡＳＭＶＱＱＦＰＮＬＴＧＴＶＨＬＥＳＬＴＬＴＧＴＫＩＳＳＩＰＮＮＬＣＱＥＱＫＭＬＲＴＬＤＬＳＹＮＮＩＲＤＬＰＳＦＮＧＣＨＡＬＥＥＩＳＬＱＲＮＱＩＹＱＩＫＥＧＴＦＱＧＬＩＳＬＲＩＬＤＬＳＲＮＬＩＨＥＩＨＳＲＡＦＡＴＬＧＰＩＴＮＬＤＶＳＦＮＥＬＴＳＦＰＴＥＧＬＮＧＬＮＱＬＫＬＶＧＮＦＫＬＫＥＡＬＡＡＫＤＦＶＮＬＲＳＬＳＶＰＹＡＹＱＣＣＡＦＷＧＣＤＳＹＡＮＬＮＴＥＤＮＳＬＱＤＨＳＶＡＱＥＫＧＴＡＤＡＡＮＶＴＳＴＬＥＮＥＥＨＳＱＩＩＩＨＣＴＰＳＴＧＡＦＫＰＣＥＹＬＬＧＳＷＭＩＲＬＴＶＷＦＩＦＬＶＡＬＦＦＮＬＬＶＩＬＴＴＦＡＳＣＴＳＬＰＳＳＫＬＦＩＧＬＩＳＶＳＮＬＦＭＧＩＹＴＧＩＬＴＦＬＤＡＶＳＷＧＲＦＡＥＦＧＩＷＷＥＴＧＳＧＣＫＶＡＧＦＬＡＶＦＳＳＥＳＡＩＦＬＬＭＬＡＴＶＥＲＳＬＳＡＫＤＩＭＫＮＧＫＳＮＨＬＫＱＦＲＶＡＡＬＬＡＦＬＧＡＴＶＡＧＣＦＰＬＦＨＲＧＥＹＳＡＳＰＬＣＬＰＦＰＴＧＥＴＰＳＬＧＦＴＶＴＬＶＬＬＮＳＬＡＦＬＬＭＡＶＩＹＴＫＬＹＣＮＬＥＫＥＤＬＳＥＮＳＱＳＳＭＩＫＨＶＡＷＬＩＦＴＮＣＩＦＦＣＰＶＡＦＦＳＦＡＰＬＩＴＡＩＳＩＳＰＥＩＭＫＳＶＴＬＩＦＦＰＬＰＡＣＬＮＰＶＬＹＶＦＦＮＰＫＦＫＥＤＷＫＬＬＫＲＲＶＴＫＫＳＧＳＶＳＶＳＩＳＳＱＧＧＣＬＥＱＤＦＹＹＤＣＧＭＹＳＨＬＱＧＮＬＴＶＣＤＣＣＥＳＦＬＬＴＫＰＶＳＣＫＨＬＩＫＳＨＳＣＰＡＬＡＶＡＳＣＱＲＰＥＧＹＷＳＤＣＧＴＱＳＡＨＳＤＹＡＤＥＥＤＳＦＶＳＤＳＳＤＱＶＱＡＣＧＲＡＣＦＹＱＳＲＧＦＰＬＶＲＹＡＹＮＬＰＲＶＫＤ：ｈＬＧＲ４（ＦＬ）
ＳＲ：リンカー領域
ＤＹＫＤＤＤＤＫ：ＦＬＡＧタグ
ＡＧＡ：リンカー領域
ＤＹＫＤＤＤＤＫ：ＦＬＡＧタグ
ＬＤＧＧ：リンカー領域
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ：ＨＡタグ
ＡＧＡ：リンカー領域
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ：ＨＡタグ
【０２２６】
細胞表面発現のｐＶａｘ１中ｈＬＧＲ４（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３−ＦＬＡＧ挿入のアミノ酸配列：
ＭＰＧＰＬＧＬＬＣＦＬＡＬＧＬＬＧＳＡＧＰＳＧＡＡＰＰＬＣＡＡＰＣＳＣＤＧＤＲＲＶＤＣＳＧＫＧＬＴＡＶＰＥＧＬＳＡＦＴＱＡＬＤＩＳＭＮＮＩＴＱＬＰＥＤＡＦＫＮＦＰＦＬＥＥＬＱＬＡＧＮＤＬＳＦＩＨＰＫＡＬＳＧＬＫＥＬＫＶＬＴＬＱＮＮＱＬＫＴＶＰＳＥＡＩＲＧＬＳＡＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＴＳＶＰＥＤＳＦＥＧＬＶＱＬＲＨＬＷＬＤＤＮＳＬＴＥＶＰＶＨＰＬＳＮＬＰＴＬＱＡＬＴＬＡＬＮＫＩＳＳＩＰＤＦＡＦＴＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＫＩＲＳＬＳＱＨＣＦＤＧＬＤＮＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＧＥＦＰＱＡＩＫＡＬＰＳＬＫＥＬＧＦＨＳＮＳＩＳＶＩＰＤＧＡＦＤＧＮＰＬＬＲＴＩＨＬＹＤＮＰＬＳＦＶＧＮＳＡＦＨＮＬＳＤＬＨＳＬＶＩＲＧＡＳＭＶＱＱＦＰＮＬＴＧＴＶＨＬＥＳＬＴＬＴＧＴＫＩＳＳＩＰＮＮＬＣＱＥＱＫＭＬＲＴＬＤＬＳＹＮＮＩＲＤＬＰＳＦＮＧＣＨＡＬＥＥＩＳＬＱＲＮＱＩＹＱＩＫＥＧＴＦＱＧＬＩＳＬＲＩＬＤＬＳＲＮＬＩＨＥＩＨＳＲＡＦＡＴＬＧＰＩＴＮＬＤＶＳＦＮＥＬＴＳＦＰＴＥＧＬＮＧＬＮＱＬＫＬＶＧＮＦＫＬＫＥＡＬＡＡＫＤＦＶＮＬＲＳＬＳＶＰＹＡＹＱＣＣＡＦＷＧＣＤＳＹＡＮＬＮＴＥＤＮＳＬＱＤＨＳＶＡＱＥＫＧＴＡＤＡＡＮＶＴＳＴＬＥＮＥＥＨＳＱＩＩＩＨＣＴＰＳＴＧＡＦＫＰＣＥＹＬＬＧＳＷＭＩＲＶＡＬＹＶＧＩＡＶＧＶＶＡＡＬＩＩＩＧＩＩＩＹＣＣＣＣＲＧＫＤＤＮＴＥＤＫＥＤＡＲＰＮＲＥＡＹＥＥＰＰＥＱＬＲＥＬＳＲＥＲＥＥＥＤＤＹＲＱＥＥＱＲＳＴＧＲＥＳＰＤＨＬＤＱＤＹＫＤＤＤＤＫ
配列中、
ＭＰＧＰＬＧＬＬＣＦＬＡＬＧＬＬＧＳＡＧＰＳＧＡ：シグナルペプチド
ＡＰＰＬＣＡＡＰＣＳＣＤＧＤＲＲＶＤＣＳＧＫＧＬＴＡＶＰＥＧＬＳＡＦＴＱＡＬＤＩＳＭＮＮＩＴＱＬＰＥＤＡＦＫＮＦＰＦＬＥＥＬＱＬＡＧＮＤＬＳＦＩＨＰＫＡＬＳＧＬＫＥＬＫＶＬＴＬＱＮＮＱＬＫＴＶＰＳＥＡＩＲＧＬＳＡＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＴＳＶＰＥＤＳＦＥＧＬＶＱＬＲＨＬＷＬＤＤＮＳＬＴＥＶＰＶＨＰＬＳＮＬＰＴＬＱＡＬＴＬＡＬＮＫＩＳＳＩＰＤＦＡＦＴＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＫＩＲＳＬＳＱＨＣＦＤＧＬＤＮＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＧＥＦＰＱＡＩＫＡＬＰＳＬＫＥＬＧＦＨＳＮＳＩＳＶＩＰＤＧＡＦＤＧＮＰＬＬＲＴＩＨＬＹＤＮＰＬＳＦＶＧＮＳＡＦＨＮＬＳＤＬＨＳＬＶＩＲＧＡＳＭＶＱＱＦＰＮＬＴＧＴＶＨＬＥＳＬＴＬＴＧＴＫＩＳＳＩＰＮＮＬＣＱＥＱＫＭＬＲＴＬＤＬＳＹＮＮＩＲＤＬＰＳＦＮＧＣＨＡＬＥＥＩＳＬＱＲＮＱＩＹＱＩＫＥＧＴＦＱＧＬＩＳＬＲＩＬＤＬＳＲＮＬＩＨＥＩＨＳＲＡＦＡＴＬＧＰＩＴＮＬＤＶＳＦＮＥＬＴＳＦＰＴＥＧＬＮＧＬＮＱＬＫＬＶＧＮＦＫＬＫＥＡＬＡＡＫＤＦＶＮＬＲＳＬＳＶＰＹＡＹＱＣＣＡＦＷＧＣＤＳＹＡＮＬＮＴＥＤＮＳＬＱＤＨＳＶＡＱＥＫＧＴＡＤＡＡＮＶＴＳＴＬＥＮＥＥＨＳＱＩＩＩＨＣＴＰＳＴＧＡＦＫＰＣＥＹＬＬＧＳＷＭＩＲ：ｈＬＧＲ４（ＥＣＤ）
ＶＡＬＹＶＧＩＡＶＧＶＶＡＡＬＩＩＩＧＩＩＩＹＣＣＣＣＲＧＫＤＤＮＴＥＤＫＥＤＡＲＰＮＲＥＡＹＥＥＰＰＥＱＬＲＥＬＳＲＥＲＥＥＥＤＤＹＲＱＥＥＱＲＳＴＧＲＥＳＰＤＨＬＤＱ：ＴＭ領域を含むＧＰＡ３３配列
ＤＹＫＤＤＤＤＫ：ＦＬＡＧ
【０２２７】
ヒトＨｕｍａｎ  ＬＧＲ５
完全長ヒト（ｈ）ＬＧＲ５は、２つのＦＬＡＧタグ及び２つのＨＡタグを含むベクターｐＥＦ１＿Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（ｐＥＦ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡ）中に存在し、ｐＶａｘ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡを得た。配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００３６６７．３との比較によって確認した。構造体ｐＥＦ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡからの挿入を、ｐＶａｘ１に再クローニングし、ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡを得た。別途、ｐＶａｘ１中の完全長ｈＬＧＲ５を、ｈＬＧＲ５の短縮型、ｈＬＧＲ５（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３（ＴＭ）−ＦＬＡＧで置換し、ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３（ＴＭ）−ＦＬＡＧを得た。
【０２２８】
細胞表面発現の完全長ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡ挿入（ｐＥＦ１＿Ｍｙｃ／Ｈｉｓ及びｐＶａｘ１の両方における）のアミノ酸配列
ＭＤＴＳＲＬＧＶＬＬＳＬＰＶＬＬＱＬＡＴＧＧＳＳＰＲＳＧＶＬＬＲＧＣＰＴＨＣＨＣＥＰＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＬＰＮＰＬＰＳＬＲＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＹＩＰＫＧＡＦＴＧＬＹＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＨＶＰＴＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＥＩＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＰＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＲＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＫＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＲＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＱＩＴＥＦＰＤＬＴＧＴＡＮＬＥＳＬＴＬＴＧＡＱＩＳＳＬＰＱＴＶＣＮＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＦＳＶＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＶＤＴＦＱＱＬＬＳＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＩＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＨＡＬＱＳＬＩＳＳＥＮＦＰＥＬＫＶＩＥＭＰＹＡＹＱＣＣＡＦＧＶＣＥＮＡＹＫＩＳＮＱＷＮＫＧＤＮＳＳＭＤＤＬＨＫＫＤＡＧＭＦＱＡＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＬＤＧＷＬＩＲＩＧＶＷＴＩＡＶＬＡＬＴＣＮＡＬＶＴＳＴＶＦＲＳＰＬＹＩＳＰＩＫＬＬＩＧＶＩＡＡＶＮＭＬＴＧＶＳＳＡＶＬＡＧＶＤＡＦＴＦＧＳＦＡＲＨＧＡＷＷＥＮＧＶＧＣＨＶＩＧＦＬＳＩＦＡＳＥＳＳＶＦＬＬＴＬＡＡＬＥＲＧＦＳＡＫＹＳＡＫＦＥＴＫＡＰＦＳＳＬＫＶＩＩＬＬＣＡＬＬＡＬＴＭＡＡＶＰＬＬＧＧＳＫＹＧＡＳＰＬＣＬＰＬＰＦＧＥＰＳＴＭＧＹＭＶＡＬＩＬＬＮＳＬＣＦＬＭＭＴＩＡＹＴＫＬＹＣＮＬＤＫＧＤＬＥＮＩＷＤＣＳＭＶＫＨＩＡＬＬＬＦＴＮＣＩＬＮＣＰＶＡＦＬＳＦＳＳＬＩＮＬＴＦＩＳＰＥＶＩＫＦＩＬＬＶＶＶＰＬＰＡＣＬＮＰＬＬＹＩＬＦＮＰＨＦＫＥＤＬＶＳＬＲＫＱＴＹＶＷＴＲＳＫＨＰＳＬＭＳＩＮＳＤＤＶＥＫＱＳＣＤＳＴＱＡＬＶＴＦＴＳＳＳＩＴＹＤＬＰＰＳＳＶＰＳＰＡＹＰＶＴＥＳＣＨＬＳＳＶＡＦＶＰＣＬＡＲＤＹＫＤＤＤＤＫＡＧＡＤＹＫＤＤＤＤＫＬＤＧＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＧＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡ
配列中、
ＭＤＴＳＲＬＧＶＬＬＳＬＰＶＬＬＱＬＡＴＧ：シグナルペプチド
ＧＳＳＰＲＳＧＶＬＬＲＧＣＰＴＨＣＨＣＥＰＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＬＰＮＰＬＰＳＬＲＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＹＩＰＫＧＡＦＴＧＬＹＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＨＶＰＴＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＥＩＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＰＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＲＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＫＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＲＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＱＩＴＥＦＰＤＬＴＧＴＡＮＬＥＳＬＴＬＴＧＡＱＩＳＳＬＰＱＴＶＣＮＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＦＳＶＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＶＤＴＦＱＱＬＬＳＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＩＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＨＡＬＱＳＬＩＳＳＥＮＦＰＥＬＫＶＩＥＭＰＹＡＹＱＣＣＡＦＧＶＣＥＮＡＹＫＩＳＮＱＷＮＫＧＤＮＳＳＭＤＤＬＨＫＫＤＡＧＭＦＱＡＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＬＤＧＷＬＩＲＩＧＶＷＴＩＡＶＬＡＬＴＣＮＡＬＶＴＳＴＶＦＲＳＰＬＹＩＳＰＩＫＬＬＩＧＶＩＡＡＶＮＭＬＴＧＶＳＳＡＶＬＡＧＶＤＡＦＴＦＧＳＦＡＲＨＧＡＷＷＥＮＧＶＧＣＨＶＩＧＦＬＳＩＦＡＳＥＳＳＶＦＬＬＴＬＡＡＬＥＲＧＦＳＡＫＹＳＡＫＦＥＴＫＡＰＦＳＳＬＫＶＩＩＬＬＣＡＬＬＡＬＴＭＡＡＶＰＬＬＧＧＳＫＹＧＡＳＰＬＣＬＰＬＰＦＧＥＰＳＴＭＧＹＭＶＡＬＩＬＬＮＳＬＣＦＬＭＭＴＩＡＹＴＫＬＹＣＮＬＤＫＧＤＬＥＮＩＷＤＣＳＭＶＫＨＩＡＬＬＬＦＴＮＣＩＬＮＣＰＶＡＦＬＳＦＳＳＬＩＮＬＴＦＩＳＰＥＶＩＫＦＩＬＬＶＶＶＰＬＰＡＣＬＮＰＬＬＹＩＬＦＮＰＨＦＫＥＤＬＶＳＬＲＫＱＴＹＶＷＴＲＳＫＨＰＳＬＭＳＩＮＳＤＤＶＥＫＱＳＣＤＳＴＱＡＬＶＴＦＴＳＳＳＩＴＹＤＬＰＰＳＳＶＰＳＰＡＹＰＶＴＥＳＣＨＬＳＳＶＡＦＶＰＣＬ：ｈＬＧＲ５
ＡＲ：リンカー領域
ＤＹＫＤＤＤＤＫ：ＦＬＡＧタグ
ＡＧＡ：リンカー領域
ＤＹＫＤＤＤＤＫ：ＦＬＡＧタグ
ＬＤＧＧ：リンカー領域
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ：ＨＡタグ
ＡＧＡ：リンカー領域
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ：ＨＡタグ
【０２２９】
細胞表面発現のｐＶａｘ１中ｈＬＧＲ５（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３（ＴＭ）−ＦＬＡＧ挿入のアミノ酸配列：
ＭＤＴＳＲＬＧＶＬＬＳＬＰＶＬＬＱＬＡＴＧＧＳＳＰＲＳＧＶＬＬＲＧＣＰＴＨＣＨＣＥＰＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＬＰＮＰＬＰＳＬＲＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＹＩＰＫＧＡＦＴＧＬＹＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＨＶＰＴＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＥＩＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＰＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＲＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＫＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＲＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＱＩＴＥＦＰＤＬＴＧＴＡＮＬＥＳＬＴＬＴＧＡＱＩＳＳＬＰＱＴＶＣＮＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＦＳＶＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＶＤＴＦＱＱＬＬＳＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＩＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＨＡＬＱＳＬＩＳＳＥＮＦＰＥＬＫＶＩＥＭＰＹＡＹＱＣＣＡＦＧＶＣＥＮＡＹＫＩＳＮＱＷＮＫＧＤＮＳＳＭＤＤＬＨＫＫＤＡＧＭＦＱＡＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＬＤＧＷＬＩＲＶＡＬＹＶＧＩＡＶＧＶＶＡＡＬＩＩＩＧＩＩＩＹＣＣＣＣＲＧＫＤＤＮＴＥＤＫＥＤＡＲＰＮＲＥＡＹＥＥＰＰＥＱＬＲＥＬＳＲＥＲＥＥＥＤＤＹＲＱＥＥＱＲＳＴＧＲＥＳＰＤＨＬＤＱＤＹＫＤＤＤＤＫ
配列中、
ＭＤＴＳＲＬＧＶＬＬＳＬＰＶＬＬＱＬＡＴＧ：シグナルペプチド
ＧＳＳＰＲＳＧＶＬＬＲＧＣＰＴＨＣＨＣＥＰＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＬＰＮＰＬＰＳＬＲＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＹＩＰＫＧＡＦＴＧＬＹＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＨＶＰＴＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＥＩＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＰＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＲＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＫＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＲＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＱＩＴＥＦＰＤＬＴＧＴＡＮＬＥＳＬＴＬＴＧＡＱＩＳＳＬＰＱＴＶＣＮＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＦＳＶＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＶＤＴＦＱＱＬＬＳＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＩＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＨＡＬＱＳＬＩＳＳＥＮＦＰＥＬＫＶＩＥＭＰＹＡＹＱＣＣＡＦＧＶＣＥＮＡＹＫＩＳＮＱＷＮＫＧＤＮＳＳＭＤＤＬＨＫＫＤＡＧＭＦＱＡＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＬＤＧＷＬＩＲ：ｈＬＧＲ５（ＥＣＤ）
ＶＡＬＹＶＧＩＡＶＧＶＶＡＡＬＩＩＩＧＩＩＩＹＣＣＣＣＲＧＫＤＤＮＴＥＤＫＥＤＡＲＰＮＲＥＡＹＥＥＰＰＥＱＬＲＥＬＳＲＥＲＥＥＥＤＤＹＲＱＥＥＱＲＳＴＧＲＥＳＰＤＨＬＤＱ：ＴＭ領域を含むＧＰＡ３３配列
ＤＹＫＤＤＤＤＫ：ＦＬＡＧ
【０２３０】
マウスＬＧＲ５
完全長（ＦＬ）マウス（ｍ）ＬＧＲ５をコードするｃＤＮＡは、ｃＭｙｃ及びＨＩＳタグを含むｐＥＦ１＿Ｍｙｃ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐＥＦ１＿ｍＬｇｒ５−Ｍｙｃ−ＨＩＳ）中に存在していた。ｍＬｇｒ５  ｃＤＮＡ配列は、配列決定及び参照配列ＮＭ＿０１０１９５．２との比較によって確認した。
【０２３１】
細胞表面発現のｐＥＦ１＿Ｍｙｃ／Ｈｉｓ中完全長マウス（ｍ）Ｌｇｒ５−Ｍｙｃ−ＨＩＳ挿入のアミノ酸配列
ＭＤＴＳＣＶＨＭＬＬＳＬＬＡＬＬＱＬＶＡＡＧＳＳＰＧＰＤＡＩＰＲＧＣＰＳＨＣＨＣＥＬＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＰＡＳＬＬＨＲＬＣＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＨＩＰＫＧＡＦＴＧＬＨＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＱＶＰＥＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＤＶＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＡＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＫＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＲＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＶＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＨＩＴＥＦＰＨＬＴＧＴＡＴＬＥＳＬＴＬＴＧＡＫＩＳＳＬＰＱＡＶＣＤＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＬＳＧＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＧＳＴＦＱＱＬＦＮＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＶＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＲＡＬＱＳＬＩＰＳＡＮＦＰＥＬＫＩＩＥＭＰＳＡＹＱＣＣＡＦＧＧＣＥＮＶＹＫＩＳＮＱＷＮＫＤＤＧＮＳＶＤＤＬＨＫＫＤＡＧＬＦＱＶＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＦＧＳＷＬＩＲＩＧＶＷＴＴＡＶＬＡＬＳＣＮＡＬＶＡＬＴＶＦＲＴＰＬＹＩＳＳＩＫＬＬＩＧＶＩＡＶＶＤＩＬＭＧＶＳＳＡＶＬＡＡＶＤＡＦＴＦＧＲＦＡＱＨＧＡＷＷＥＤＧＩＧＣＱＩＶＧＦＬＳＩＦＡＳＥＳＳＩＦＬＬＴＬＡＡＬＥＲＧＦＳＶＫＣＳＳＫＦＥＶＫＡＰＬＦＳＬＲＡＩＶＬＬＣＶＬＬＡＬＴＩＡＴＩＰＬＬＧＧＳＫＹＮＡＳＰＬＣＬＰＬＰＦＧＥＰＳＴＴＧＹＭＶＡＬＶＬＬＮＳＬＣＦＬＩＭＴＩＡＹＴＫＬＹＣＳＬＥＫＧＥＬＥＮＬＷＤＣＳＭＶＫＨＩＡＬＬＬＦＡＮＣＩＬＹＣＰＶＡＦＬＳＦＳＳＬＬＮＬＴＦＩＳＰＤＶＩＫＦＩＬＬＶＩＶＰＬＰＳＣＬＮＰＬＬＹＩＶＦＮＰＨＦＫＥＤＭＧＳＬＧＫＨＴＲＦＷＭＲＳＫＨＡＳＬＬＳＩＮＳＤＤＶＥＫＲＳＣＥＳＴＱＡＬＶＳＦＴＨＡＳＩＡＹＤＬＰＳＴＳＧＡＳＰＡＹＰＭＴＥＳＣＨＬＳＳＶＡＦＶＰＣＬＡＡＡＲＧＨＰＦＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＭＨＴＧＨＨＨＨＨＨ
配列中、
ＭＤＴＳＣＶＨＭＬＬＳＬＬＡＬＬＱＬＶＡＡ：シグナルペプチド
ＧＳＳＰＧＰＤＡＩＰＲＧＣＰＳＨＣＨＣＥＬＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＰＡＳＬＬＨＲＬＣＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＨＩＰＫＧＡＦＴＧＬＨＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＱＶＰＥＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＤＶＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＡＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＫＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＲＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＶＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＨＩＴＥＦＰＨＬＴＧＴＡＴＬＥＳＬＴＬＴＧＡＫＩＳＳＬＰＱＡＶＣＤＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＬＳＧＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＧＳＴＦＱＱＬＦＮＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＶＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＲＡＬＱＳＬＩＰＳＡＮＦＰＥＬＫＩＩＥＭＰＳＡＹＱＣＣＡＦＧＧＣＥＮＶＹＫＩＳＮＱＷＮＫＤＤＧＮＳＶＤＤＬＨＫＫＤＡＧＬＦＱＶＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＦＧＳＷＬＩＲＩＧＶＷＴＴＡＶＬＡＬＳＣＮＡＬＶＡＬＴＶＦＲＴＰＬＹＩＳＳＩＫＬＬＩＧＶＩＡＶＶＤＩＬＭＧＶＳＳＡＶＬＡＡＶＤＡＦＴＦＧＲＦＡＱＨＧＡＷＷＥＤＧＩＧＣＱＩＶＧＦＬＳＩＦＡＳＥＳＳＩＦＬＬＴＬＡＡＬＥＲＧＦＳＶＫＣＳＳＫＦＥＶＫＡＰＬＦＳＬＲＡＩＶＬＬＣＶＬＬＡＬＴＩＡＴＩＰＬＬＧＧＳＫＹＮＡＳＰＬＣＬＰＬＰＦＧＥＰＳＴＴＧＹＭＶＡＬＶＬＬＮＳＬＣＦＬＩＭＴＩＡＹＴＫＬＹＣＳＬＥＫＧＥＬＥＮＬＷＤＣＳＭＶＫＨＩＡＬＬＬＦＡＮＣＩＬＹＣＰＶＡＦＬＳＦＳＳＬＬＮＬＴＦＩＳＰＤＶＩＫＦＩＬＬＶＩＶＰＬＰＳＣＬＮＰＬＬＹＩＶＦＮＰＨＦＫＥＤＭＧＳＬＧＫＨＴＲＦＷＭＲＳＫＨＡＳＬＬＳＩＮＳＤＤＶＥＫＲＳＣＥＳＴＱＡＬＶＳＦＴＨＡＳＩＡＹＤＬＰＳＴＳＧＡＳＰＡＹＰＭＴＥＳＣＨＬＳＳＶＡＦＶＰＣＬ：ｍＬＧＲ５（ＦＬ）
ＡＡＡＲＧＨＰＦ：リンカー
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ：ｃＭｙｃ由来エピトープタグ
ＮＭＨＴＧ：リンカー
ＨＨＨＨＨＨ：ヘキサＨｉｓタグ
【０２３２】
ヒトＺＮＲＦ３をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト（ｈ）ＺＮＲＦ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１２０６９９８．１）をコードするｃＤＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡの特定部分（細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：アミノ酸１〜２１９、又はＥＣＤ−ＴＭ部分（短縮変異体）：アミノ酸１〜２５６）を増幅した。標的タンパク質を抗原陰性細胞の表面に発現可能とするため、かつ安定な細胞クローンを作製可能とするため、ｈＺＮＲＦ３のＥＣＤをコードするｃＤＮＡをｐＤｉｓｐｌａｙ（ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ）−ｃＭｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））にクローニングし、短縮変異体（自己ＴＭ領域を有するＥＣＤ）をｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ−ＴＭ））にクローニングした。ｐＤｉｓｐｌａｙ構造体により、細胞外ｃＭｙｃ由来エピトープタグを介したタンパク質表面発現の確認が可能となる。特異的プライマーを設計して合成し、ｈＺＮＲＦ３の特定部分の増幅に用いた。次いでこれらをｐＤｉｓｐｌａｙ（ＥＣＤのみ）にクローニングし、ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ）−ｃＭｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ）及びｐｃＤＮＡ３．１（ＴＭ領域を有するＥＣＤ）を得、（抗原陰性）細胞中で発現するｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ−ＴＭ）を得た。
【０２３３】
マウスＺＮＲＦ３  ＥＣＤ及びヒトＲＮＦ４３  ＥＣＤをコードするｃＤＮＡのクローニング、並びに組み換えタンパク質の作製
マウス（ｍ）ＺＮＲＦ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１０８０９２４．２、アミノ酸５３〜２０５、用いたシグナルペプチドはシスタチン由来であった）のＥＣＤ及びヒトＲＮＦ４３（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０１７７６３、アミノ酸２４〜１０９、シスタチンリーダー配列を含む）のＥＣＤをコードするｃＤＮＡを用い、ベクターｐＵＰＥ（Ｕ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＢＶ）において、標的のＥＣＤからなる、組み換えの、精製した、ｈｉｓタグを付加したタンパク質を作製した。要約すると、構造体（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｐｌｏｓ  ＯＮＥ  ８：２−１０）をＨｅｋ２９３Ｅ細胞（２９３  ｃ１８  ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクションし、産生の１週間後に、タンパク質を含む上清を採取した。ヘキサＨＩＳタグを付加したタンパク質を、ＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）及びゲル濾過の手段によって精製した。マウスＺＮＲＦ３の（コドン最適化）ＥＣＤをコードする別のｃＤＮＡを合成的に作製し、ｃＭｙｃ由来エピトープタグ及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の膜貫通領域とフレームを揃え、細胞表面に発現するｐＤｉｓｐｌａｙにクローニングした（ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｍＺｎｒｆ３−ｃＭｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））。
【０２３４】
ヒトＲＮＦ４３をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト（ｈ）ＲＮＦ４３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿ＮＭ＿０１７７６３）をコードするｃＤＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡの特定部分（細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：アミノ酸１〜１９９、又はＥＣＤ−ＴＭ部分（短縮変異体）：アミノ酸１〜２２２）を増幅した。標的タンパク質を抗原陰性細胞の表面に発現可能とするため、かつ安定な細胞クローンを作製可能とするため、ｈＲＮＦ４３のＥＣＤをコードするｃＤＮＡをｐＤｉｓｐｌａｙにクローニングし（ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｈＲＮＦ４３（ＥＣＤ）−ｃＭｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））、ｈＲＮＦ４３の短縮変異体（自己ＴＭ領域を有するＥＣＤ）をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＲＮＦ４３（ＥＣＤ−ＴＭ））。ｐＤｉｓｐｌａｙ構造体により、細胞外ｃＭｙｃ由来エピトープタグを介したタンパク質表面発現の確認が可能となる。特異的プライマーを設計して合成し、ｈＺＮＲＦ３の特定部分の増幅に用いた。次いで、（抗原陰性）細胞での発現及び標的を安定的に発現する細胞クローンの作製のため、これらをｐＤｉｓｐｌａｙ（免疫化のためＥＣＤのみ）及びｐＣＤＮＡ３．１（ＴＭ領域を有するＥＣＤ）にクローニングした。
【０２３５】
マウスＲＮＦ４３をコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス（ｍ）ＲＮＦ４３（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿１７２４４８．３、アミノ酸１〜１９９）のＥＣＤをコードするｃＤＮＡを合成遺伝子として発注し、ｃＭｙｃ由来エピトープタグ及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の膜貫通領域とフレームを揃え、細胞表面にｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｍＲｎｆ４３−ｃＭｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ）を発現するｐＤｉｓｐｌａｙにクローニングした。
【０２３６】
細胞表面発現のｐＤｉｓｐｌａｙ中ヒトＺＮＲＦ３（ＥＣＤ）のアミノ酸配列：
ＭＲＰＲＳＧＧＲＰＧＡＴＧＲＲＲＲＲＬＲＲＲＰＲＧＬＲＣＳＲＬＰＰＰＰＰＬＰＬＬＬＧＬＬＬＡＡＡＧＰＧＡＡＲＡＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＹＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＴＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＲＰＰＲＱＰＴＥＹＦＤＭＶＤＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ
配列中、
ＭＲＰＲＳＧＧＲＰＧＡＴＧＲＲＲＲＲＬＲＲＲＰＲＧＬＲＣＳＲＬＰＰＰＰＰＬＰＬＬＬＧＬＬＬＡＡＡＧＰＧＡＡＲＡ：シグナルペプチドＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＹＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＴＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＲＰＰＲＱＰＴＥＹＦＤＭ：
ヒトＺＮＲＦ３  ＶＤのＥＣＤ：クローニング部位によってコードされるアミノ酸
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ：ｃＭｙｃ由来エピトープタグ
ＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ：ＴＭ領域を含むＰＤＧＦＲ配列
【０２３７】
細胞表面発現のヒトＺＮＲＦ３短縮変異体のアミノ酸配列：
ＭＲＰＲＳＧＧＲＰＧＡＴＧＲＲＲＲＲＬＲＲＲＰＲＧＬＲＣＳＲＬＰＰＰＰＰＬＰＬＬＬＧＬＬＬＡＡＡＧＰＧＡＡＲＡＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＹＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＴＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＲＰＰＲＱＰＴＥＹＦＤＭＧＩＦＬＡＦＦＶＶＶＳＬＶＣＬＩＬＬＶＫＩＫＬＫＱＲＲＳＱＮＳＭＮＲＰＡＶ
配列中、
ＭＲＰＲＳＧＧＲＰＧＡＴＧＲＲＲＲＲＬＲＲＲＰＲＧＬＲＣＳＲＬＰＰＰＰＰＬＰＬＬＬＧＬＬＬＡＡＡＧＰＧＡＡＲＡ：シグナルペプチド
ＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＹＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＴＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＲＰＰＲＱＰＴＥＹＦＤ：ヒトＺＮＲＦ３のＥＣＤ
ＭＧＩＦＬＡＦＦＶＶＶＳＬＶ：予測されるＴＭ領域
ＣＬＩＬＬＶＫＩＫＬＫＱＲＲＳＱＮＳＭＮＲＰＡＶ：細胞内テール
【０２３８】
可溶性タンパク質発現のｐＵＰＥ可溶性マウスＺＮＲＦ３  ＥＣＤ−Ｈｉｓのアミノ酸配列：
ＧＳＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＨＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＭＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＬＡＡＡＨＨＨＨＨＨ
配列中、
ＧＳ：クローニング部位によってコードされたアミノ酸
ＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＨＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＭＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＬ：マウスＺＮＲＦ３のＥＣＤ
ＡＡＡ：クローニング部位によってコードされたアミノ酸
ＨＨＨＨＨＨ：ヘキサＨｉｓタグ
【０２３９】
細胞表面に発現されたｐＤｉｓｐｌａｙアミノ酸配列中のマウス（ｍ）ＺＮＲＦ３配列：
ＭＲＰＲＳＧＧＲＰＧＡＰＧＲＲＲＲＲＬＲＲＧＰＲＧＲＲＬＰＰＰＰＰＬＰＬＬＬＧＬＬＬＡＡＡＧＰＧＡＡＲＡＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＨＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＭＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＬＰＰＲＱＰＴＥＹＦＤＭＶＤＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ
配列中、
ＭＲＰＲＳＧＧＲＰＧＡＰＧＲＲＲＲＲＬＲＲＧＰＲＧＲＲＬＰＰＰＰＰＬＰＬＬＬＧＬＬＬＡＡＡＧＰＧＡＡＲＡ：シグナルペプチド
ＫＥＴＡＦＶＥＶＶＬＦＥＳＳＰＳＧＤＹＴＴＨＴＴＧＬＴＧＲＦＳＲＡＧＡＭＬＳＡＥＧＥＩＶＱＭＨＰＬＧＬＣＮＮＮＤＥＥＤＬＹＥＹＧＷＶＧＶＶＫＬＥＱＰＥＬＤＰＫＰＣＬＴＶＬＧＫＡＫＲＡＶＱＲＧＡＴＡＶＩＦＤＶＳＥＮＰＥＡＩＤＱＬＮＱＧＳＥＤＰＬＫＲＰＶＶＹＶＫＧＡＤＡＩＫＬＭＮＩＶＮＫＱＫＶＡＲＡＲＩＱＨＬＰＰＲＱＰＴＥＹＦＤＭ：ＥＣＤ  ｍＺＮＲＦ３
ＶＤ：クローニング部位によってコードされるアミノ酸
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ：ｃＭｙｃ由来エピトープタグ
ＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ：ＴＭ領域を含むＰＤＧＦＲ配列
【０２４０】
細胞表面発現のｐＤｉｓｐｌａｙ中ヒトＲＮＦ４３のアミノ酸配列：
ＭＳＧＧＨＱＬＱＬＡＡＬＷＰＷＬＬＭＡＴＬＱＡＧＦＧＲＴＧＬＶＬＡＡＡＶＥＳＥＲＳＡＥＱＫＡＩＩＲＶＩＰＬＫＭＤＰＴＧＫＬＮＬＴＬＥＧＶＦＡＧＶＡＥＩＴＰＡＥＧＫＬＭＱＳＨＰＬＹＬＣＮＡＳＤＤＤＮＬＥＰＧＦＩＳＩＶＫＬＥＳＰＲＲＡＰＲＰＣＬＳＬＡＳＫＡＲＭＡＧＥＲＧＡＳＡＶＬＦＤＩＴＥＤＲＡＡＡＥＱＬＱＱＰＬＧＬＴＷＰＶＶＬＩＷＧＮＤＡＥＫＬＭＥＦＶＹＫＮＱＫＡＨＶＲＩＥＬＫＥＰＰＡＷＰＤＹＤＶＶＤＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ
配列中、
ＭＳＧＧＨＱＬＱＬＡＡＬＷＰＷＬＬＭＡＴＬＱＡＧＦＧＲＴＧＬＶＬＡＡＡＶＥＳＥＲＳＡ：シグナルペプチド
ＥＱＫＡＩＩＲＶＩＰＬＫＭＤＰＴＧＫＬＮＬＴＬＥＧＶＦＡＧＶＡＥＩＴＰＡＥＧＫＬＭＱＳＨＰＬＹＬＣＮＡＳＤＤＤＮＬＥＰＧＦＩＳＩＶＫＬＥＳＰＲＲＡＰＲＰＣＬＳＬＡＳＫＡＲＭＡＧＥＲＧＡＳＡＶＬＦＤＩＴＥＤＲＡＡＡＥＱＬＱＱＰＬＧＬＴＷＰＶＶＬＩＷＧＮＤＡＥＫＬＭＥＦＶＹＫＮＱＫＡＨＶＲＩＥＬＫＥＰＰＡＷＰＤＹＤＶ：ヒトＲＮＦ４３のＥＣＤ
ＶＤ：クローニング部位によってコードされたアミノ酸
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ：Ｍｙｃ由来エピトープタグ
ＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ：ＴＭ領域を含むＰＤＧＦＲ配列
【０２４１】
細胞表面発現のｐＤｉｓｐｌａｙ中マウスＲＮＦ４３のアミノ酸配列：
ＭＳＧＧＨＱＬＱＬＡＶＬＷＰＷＬＬＭＡＴＬＨＡＧＦＧＨＴＧＲＶＬＡＡＡＶＥＳＥＲＳＡＥＱＫＡＶＩＲＶＩＰＬＫＭＤＰＴＧＫＬＮＬＴＬＥＧＶＦＡＧＶＡＥＶＴＰＡＥＧＫＬＭＱＳＨＰＬＹＬＣＮＡＳＤＤＤＮＬＥＰＧＦＩＳＩＶＫＬＥＳＰＲＲＡＰＲＰＣＬＳＬＡＳＫＡＲＭＡＧＥＲＧＡＮＡＶＬＦＤＩＴＥＤＲＳＡＡＥＱＬＱＱＰＬＧＬＴＫＰＶＶＬＩＷＧＳＤＡＡＫＬＭＥＦＶＹＫＮＲＫＡＹＶＷＩＥＬＫＥＰＰＡＧＡＮＹＤＶＶＤＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ
配列中、
ＭＳＧＧＨＱＬＱＬＡＶＬＷＰＷＬＬＭＡＴＬＨＡＧＦＧＨＴＧＲＶＬＡＡＡＶＥＳＥＲＳＡ：シグナルペプチド
ＥＱＫＡＶＩＲＶＩＰＬＫＭＤＰＴＧＫＬＮＬＴＬＥＧＶＦＡＧＶＡＥＶＴＰＡＥＧＫＬＭＱＳＨＰＬＹＬＣＮＡＳＤＤＤＮＬＥＰＧＦＩＳＩＶＫＬＥＳＰＲＲＡＰＲＰＣＬＳＬＡＳＫＡＲＭＡＧＥＲＧＡＮＡＶＬＦＤＩＴＥＤＲＳＡＡＥＱＬＱＱＰＬＧＬＴＫＰＶＶＬＩＷＧＳＤＡＡＫＬＭＥＦＶＹＫＮＲＫＡＹＶＷＩＥＬＫＥＰＰＡＧＡＮＹＤＶ：マウスＲＮＦ４３のＥＣＤ
ＶＤ：クローニング部位によってコードされたアミノ酸
ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ：Ｍｙｃ由来エピトープタグ
ＮＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ：ＴＭ領域を含むＰＤＧＦＲ配列
【０２４２】
ＬＧＲ５及びＥＧＦＲのカニクイザル及びラットオルソログのクローニング
カニクイザルＬＧＲ５をコードするｃＤＮＡを、ヒト特異的プライマーを用い、カニクイザル結腸及び肝臓ｃＤＮＡから増幅した（Ｃｙｎｏ−ＬＧＲ５−ＦＯＲ：５’−ＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＣＴＣＧＧＴＧ−３’及びＣｙｎｏ−ＬＧＲ５−ＲＥＶ：５’−ＣＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＡＧＡＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＣ−３’）。ＰＣＲ反応の収率及び特異性を場合によっては向上させるため、ＤＭＳＯを反応に加えた。肝臓及び結腸ｃＤＮＡの両方により、予想された２．７ｋｂのバンドが増幅され、次いで、結腸ｃＤＮＡから得られたＰＣＲ生成物をクローニングに用いた。得られたｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（ＢａｍＨ１−Ｎｏｔ１）にクローニングし、配列決定した。カニクイザルの細胞外ドメインから構成されるキメラＥＧＦ受容体をコードする配列（国際公開第２０１０／０２２７３６（Ａ２）号にも記載されている）を、米国特許出願公開第２０１０／０１８３６１５（Ａ１）号（７９ページ）から得られたヒト膜貫通部分及び細胞内部分に結合させた。コードするｃＤＮＡは、ヒト細胞での発現にコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔに発注し、ＧｅｎｅＡｒｔによりクローニングした。次いで、このｃＤＮＡを、Ｎｈｅ１及びＮｏｔ１を用い、ｐｃＤＮＡ３．１に再クローニングした。ラットＥＧＦＲ及びラットＬＧＲ５をコードするｃＤＮＡはＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（ラットＥＧＦＲコードｃＤＮＡ：カタログ番号ＲＧ８０１００−ＵＴ；ＧｅｎＢａｎｋ参照ＨＭ８０１０４１．１）及びＯｒｉｇｅｎｅ（ラットＬＧＲ５コードｃＤＮＡ：カタログ番号ＲＮ２０２７３８；ＧｅｎＢａｎｋ参照ＮＭ＿００１１０６７８４）より入手可能である。両方のｃＤＮＡを、Ｋｐｎ１及びＮｏｔ１を用い、ｐｃＤＮＡ３．１に再クローニングした。全てのｃＤＮＡを配列決定し、正しいことが示された。
【０２４３】
完全長ｗｔカニクイザルＬＧＲ５のアミノ酸配列
ＭＤＴＳＲＬＧＶＬＬＳＬＰＶＬＬＱＬＡＡＧＳＳＳＰＲＳＧＡＬＬＲＧＣＰＴＨＣＨＣＥＰＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＬＰＮＰＬＰＳＬＲＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＹＩＰＫＧＡＦＴＧＬＹＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＱＶＰＴＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＥＩＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＰＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＲＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＫＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＲＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＱＩＴＥＦＰＤＬＴＧＴＡＮＬＥＳＬＴＬＴＧＡＱＩＳＳＬＰＱＴＶＣＮＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＦＳＶＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＶＤＴＦＱＱＬＬＳＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＶＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＨＡＬＱＳＬＩＳＳＥＮＦＰＥＬＫＩＩＥＭＰＹＡＹＱＣＣＡＦＧＶＣＥＮＡＹＫＩＳＮＱＷＮＫＧＤＮＳＳＭＤＤＬＨＫＫＤＡＧＭＦＱＶＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＬＤＧＷＬＩＲＩＧＶＷＴＩＡＶＬＡＬＴＣＮＡＬＶＴＳＴＶＦＲＳＰＬＹＩＳＰＩＫＬＬＩＧＶＩＡＶＶＮＭＬＴＧＶＳＳＡＶＬＡＧＶＤＡＦＴＦＧＳＦＡＲＨＧＡＷＷＥＮＧＶＧＣＱＶＩＧＦＬＳＩＦＡＳＥＳＳＶＦＬＬＴＬＡＡＬＥＲＧＦＳＶＫＣＳＡＫＦＥＴＫＡＰＦＳＳＬＫＶＩＩＬＬＣＡＬＬＡＬＴＭＡＡＶＰＬＬＧＧＳＥＹＧＡＳＰＬＣＬＰＬＰＦＧＥＰＳＴＴＧＹＭＶＡＬＩＬＬＮＳＬＣＦＬＭＭＴＩＡＹＴＫＬＹＣＮＬＤＫＧＤＬＥＮＩＷＤＣＳＭＶＫＨＩＡＬＬＬＦＴＮＣＩＬＹＣＰＶＡＦＬＳＦＳＳＬＬＮＬＴＦＩＳＰＥＶＩＫＦＩＬＬＶＩＶＰＬＰＡＣＬＮＰＬＬＹＩＬＦＮＰＨＦＫＥＤＬＶＳＬＧＫＱＴＹＦＷＴＲＳＫＨＰＳＬＭＳＩＮＳＤＤＶＥＫＱＳＣＤＳＴＱＡＬＶＴＦＴＳＳＳＩＡＹＤＬＰＰＳＳＶＰＳＰＡＹＰＶＴＥＳＣＨＬＳＳＶＡＦＶＰＣＬ
配列中、
ＭＤＴＳＲＬＧＶＬＬＳＬＰＶＬＬＱＬＡＡＧ：シグナルペプチド
ＳＳＳＰＲＳＧＡＬＬＲＧＣＰＴＨＣＨＣＥＰＤＧＲＭＬＬＲＶＤＣＳＤＬＧＬＳＥＬＰＳＮＬＳＶＦＴＳＹＬＤＬＳＭＮＮＩＳＱＬＬＰＮＰＬＰＳＬＲＦＬＥＥＬＲＬＡＧＮＡＬＴＹＩＰＫＧＡＦＴＧＬＹＳＬＫＶＬＭＬＱＮＮＱＬＲＱＶＰＴＥＡＬＱＮＬＲＳＬＱＳＬＲＬＤＡＮＨＩＳＹＶＰＰＳＣＦＳＧＬＨＳＬＲＨＬＷＬＤＤＮＡＬＴＥＩＰＶＱＡＦＲＳＬＳＡＬＱＡＭＴＬＡＬＮＫＩＨＨＩＰＤＹＡＦＧＮＬＳＳＬＶＶＬＨＬＨＮＮＲＩＨＳＬＧＫＫＣＦＤＧＬＨＳＬＥＴＬＤＬＮＹＮＮＬＤＥＦＰＴＡＩＲＴＬＳＮＬＫＥＬＧＦＨＳＮＮＩＲＳＩＰＥＫＡＦＶＧＮＰＳＬＩＴＩＨＦＹＤＮＰＩＱＦＶＧＲＳＡＦＱＨＬＰＥＬＲＴＬＴＬＮＧＡＳＱＩＴＥＦＰＤＬＴＧＴＡＮＬＥＳＬＴＬＴＧＡＱＩＳＳＬＰＱＴＶＣＮＱＬＰＮＬＱＶＬＤＬＳＹＮＬＬＥＤＬＰＳＦＳＶＣＱＫＬＱＫＩＤＬＲＨＮＥＩＹＥＩＫＶＤＴＦＱＱＬＬＳＬＲＳＬＮＬＡＷＮＫＩＡＩＩＨＰＮＡＦＳＴＬＰＳＬＩＫＬＤＬＳＳＮＬＬＳＳＦＰＶＴＧＬＨＧＬＴＨＬＫＬＴＧＮＨＡＬＱＳＬＩＳＳＥＮＦＰＥＬＫＩＩＥＭＰＹＡＹＱＣＣＡＦＧＶＣＥＮＡＹＫＩＳＮＱＷＮＫＧＤＮＳＳＭＤＤＬＨＫＫＤＡＧＭＦＱＶＱＤＥＲＤＬＥＤＦＬＬＤＦＥＥＤＬＫＡＬＨＳＶＱＣＳＰＳＰＧＰＦＫＰＣＥＨＬＬＤＧＷＬＩＲＩＧＶＷＴＩＡＶＬＡＬＴＣＮＡＬＶＴＳＴＶＦＲＳＰＬＹＩＳＰＩＫＬＬＩＧＶＩＡＶＶＮＭＬＴＧＶＳＳＡＶＬＡＧＶＤＡＦＴＦＧＳＦＡＲＨＧＡＷＷＥＮＧＶＧＣＱＶＩＧＦＬＳＩＦＡＳＥＳＳＶＦＬＬＴＬＡＡＬＥＲＧＦＳＶＫＣＳＡＫＦＥＴＫＡＰＦＳＳＬＫＶＩＩＬＬＣＡＬＬＡＬＴＭＡＡＶＰＬＬＧＧＳＥＹＧＡＳＰＬＣＬＰＬＰＦＧＥＰＳＴＴＧＹＭＶＡＬＩＬＬＮＳＬＣＦＬＭＭＴＩＡＹＴＫＬＹＣＮＬＤＫＧＤＬＥＮＩＷＤＣＳＭＶＫＨＩＡＬＬＬＦＴＮＣＩＬＹＣＰＶＡＦＬＳＦＳＳＬＬＮＬＴＦＩＳＰＥＶＩＫＦＩＬＬＶＩＶＰＬＰＡＣＬＮＰＬＬＹＩＬＦＮＰＨＦＫＥＤＬＶＳＬＧＫＱＴＹＦＷＴＲＳＫＨＰＳＬＭＳＩＮＳＤＤＶＥＫＱＳＣＤＳＴＱＡＬＶＴＦＴＳＳＳＩＡＹＤＬＰＰＳＳＶＰＳＰＡＹＰＶＴＥＳＣＨＬＳＳＶＡＦＶＰＣＬ：カニクイザルＬＧＲ５
【０２４４】
ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３過剰発現細胞株の作製
ｈＬＧＲ４（ｐＥＦ１＿ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡ）、ｈＬＧＲ５（ｐＥＦ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡ）、ｈＺＲＮＦ３（ＥＣＤ）（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ）及びｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ）−Ｍｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））及びｈＲＮＦ４３（ＥＣＤ）（ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｈＲＮＦ４３−（ＥＣＤ）−Ｍｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））を発現する構造体を用い、それぞれのタンパク質を安定的に発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆクローン及びＣＨＯ−Ｋ１クローンを作製した。構造体を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞中でＰＥＩ（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞）又はリポフェクタミン（ＣＨＯ細胞）トランスフェクションを用い、一過性トランスフェクションし、それぞれの標的と反応する抗体を用い、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。良好にトランスフェクションした後、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞の両方を、限界希釈法により、０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８の選択圧下で接種し、安定な細胞クローンを得た。選定の２〜３週間後、クローンをＦＡＣＳによってスクリーニングした。選定したクローンを連続継代により拡大培養し、ＦＡＣＳで再試験し、−１５０℃で凍結した。
【０２４５】
免疫化に用いたマウス
ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３に結合するヒト抗体を作製するため、ヒトＶＫ１−３９軽鎖（共通軽鎖マウス、国際公開第２００９／１５７７７１号を参照）及びヒト重鎖（ＨＣ）小遺伝子座（minilocus）（ヒトＶ遺伝子断片、全てのヒトＤｓ及びヒトＪｓの選定を含む）の遺伝子導入マウスを、タンパク質をコードするＤＮＡ又は下記に簡単に説明する組み換えＤＮＡのいずれかで免疫した。これらのマウスは、「ＭｅＭｏ（登録商標）」マウスと呼ばれる。
【０２４６】
免疫化
ｈＬＧＲ４／ｈＬＧＲ５  ＤＮＡ免疫化
１８匹のマウスを、それぞれ完全長ｈＬＧＲ４及びｈＬＧＲ５を発現するプラスミドＤＮＡ（ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡ及びｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡ）２０μｇで免疫した。更に、１２匹のマウスを、ＧＰＡ３３の膜貫通ドメイン及びＦｌａｇタグに融合したｈＬＧＲ４及びｈＬＧＲ５の細胞外ドメインのプラスミドＤＮＡ（ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ４（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３−ＦＬＡＧ及びｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３−ＦＬＡＧ）２０μｇで免疫した。マウスに、０、３、６、１４、１７、２８、３１、４９、６３、７０、８４及び９１日目にワクチン接種した。
【０２４７】
ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３、ＲＮＦ４３タンパク質免疫化
６匹のマウスを、ＰＢＳに溶解した組み換えヒト（ｒｈ）ＬＧＲ４−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号７７５０−ＧＰ）、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号８０７８−ＧＰ）、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号７９９４−ＲＦ）又はｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号７９６４−ＲＮ）タンパク質４０μｇで免疫し、ＧｅｒｂｕアジュバントＭＭ（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）４０μＬを添加した。続いて、マウスを組み換えタンパク質２０μｇ（＋ＧｅｒｂｕアジュバントＭＭ  ２０μＬ）で１４及び２８日目に追加免疫し、その後、血清力価が確認されるまで、又は免疫期間が３箇月を超えるまで、組み換えタンパク質２０μｇで更に追加免疫した。
【０２４８】
抗体価の測定
免疫したマウスの血清中の抗ｈＬＧＲ４、抗ｈＬＧＲ５、抗ｈＺＮＲＦ３又は抗ｈＲＮＦ４３力価を、ＦＡＣＳによって、それぞれの標的を過剰発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞について測定した。
【０２４９】
リンパ組織の回収
脾臓及び流入領域リンパ節を、良好に免疫された全てのマウス（表１を参照）から取り出した。単一細胞懸濁液を脾臓及び鼠径リンパ節の両方から調製した後、これらの組織をトリゾール試薬中に溶解し、使用まで−８０℃で保存した。
【０２５０】
ＶＨ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲクローニングによる「免疫」ファージ抗体レパートリーの作製
良好に免疫されたマウスの鼠径リンパ節を、「免疫」ファージ抗体レパートリーの構築に用いた。トリゾールを用いてＲＮＡをリンパ組織から抽出し、全ＲＮＡ  １μｇを、ＩｇＧ−ＣＨ１特異的プライマーを用いたＲＴ反応に用いた。次いで、得られたｃＤＮＡを用い、自社開発のＶＨ特異的プライマーを用い、本質的にＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１〜９７）に記載のように、ＶＨをコードするｃＤＮＡのポリクローナルプールを増幅した。次いで、Ｆａｂフラグメントをファージ上に呈するため、得られたＰＣＲ生成物を、Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８〜３０）に記載のように、ファージミドベクターにクローニングした。ただし、軽鎖は各抗体に同一のものであり、ベクターによってコードされた。ライゲーション後、ファージミドを用いて大腸菌ＴＧ１を形質転換し、形質転換した細菌を、アンピシリン及びグルコースを含むＬＢ寒天平板培地に接種した。全てのファージライブラリーは１０６超の形質転換体を含んでおり、挿入頻度は８０％超であった。終夜培養した後細菌を採取し、確立した手順（ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８〜３０）に従い、ファージを調製するのに用いた。
【０２５１】
合成又は免疫ファージ抗体レパートリーからの、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３に特異的に結合するＦａｂフラグメントを保有するファージの選定
ファージライブラリーは、標準化された手順（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１〜９７；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８〜３０）に従って回収し、自社で作製した合成レパートリーの場合は２回の選定、免疫ファージ抗体レパートリーの場合は１回で、ファージを選定した。１回目は、組み換えタンパク質をＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートの壁又はＮＵＮＣ免疫チューブにコーティングし、一方、２回目は、標的を過剰発現する組み換えタンパク質又は細胞のいずれかを用いた。ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレート又は免疫チューブは、４％ＥＬＫで阻害した。ファージ抗体ライブラリーも４％ＥＬＫ及び過剰のヒトＩｇＧで阻害し、ファージライブラリーをコーティングした抗原に付加する前に、Ｆｃ領域の結合体を枯渇させた。
【０２５２】
ファージライブラリーとコーティングしたタンパク質とのインキュベーションは、振とう条件下において室温で２時間実施した。次いで、プレート又はチューブを、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むＰＢＳで５〜１０回洗浄した後、ＰＢＳで５〜１０回洗浄した。結合したファージを５０ｍＭグリシン（ｐＨ２．２）を用いて溶出させ、大腸菌ＴＧ−１に加え、３７℃でインキュベートしてファージ感染させた。続いて、感染した細菌を、アンピシリン及びグルコースを含む寒天平板培地に接種し、３７℃で終夜インキュベートした。１回目の選定後、コロニーを平板培地からこそげ取ってまとめた後回収し、かつ増幅し、合成レパートリーについて、強化した初回ファージプールを調製した。「免疫」レパートリーについては、１回目のファージ選定後に、単一クローンを標的への結合についてスクリーニングした。
【０２５３】
次いで、合成レパートリーについては、強化したライブラリーを、上記の手順を用いた組み換えヒト（ｒｈ）タンパク質（ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｍＬｇｒ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ又はｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、可溶性ｒｈＲＮＦ−４３−ＨＩＳ、ｒｍＺｎｒｆ３−ＨＩＳ（自社で作製））、又はｈＬＧＲ４（ＦＬ）、ｈＬＧＲ５（ＦＬ）、ｈＺＮＲＦ３（ＥＣＤ）若しくはｈＲＮＦ４３（ＥＣＤ）を安定的に発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞のいずれかについて選定した。全ての細胞の選定について、回収したファージ及び細胞を４％ＥＬＫで阻害した。回収したファージを阻害した後、５＾１０６の親Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞とインキュベートし、１時間低下させた。低下後、細胞を遠心沈殿させ、ファージの上清を、ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３を発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に移した。細胞及びファージを、２〜８℃で２時間インキュベートした。細胞の洗浄（５〜１０回）は、ＢＳＡを０．５％含むＰＢＳ  ５ｍＬを用いて実施した。結合したファージを２００ｍＭ  ＴＥＡを用いて溶出させ、溶出液をトリス（ｐＨ８）で中和し、大腸菌ＴＧ−１に加え、３７℃でインキュベートしてファージ感染させた。続いて、ファージに感染した細菌を、アンピシリン及びグルコースを含む寒天平板培地に接種し、３０℃又は３７℃で終夜インキュベートした。
【０２５４】
２回目の選定後、個々のクローンを採取し、標的反応性について試験した。次いで、ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３、又はｈＲＮＦ４３に結合する陽性のファージクローンを、ＦＡＣＳで、それぞれの標的を安定的に過剰発現する２９３Ｆへの結合について同定した（下記を参照）。
【０２５５】
細胞のＤｉＤ標識並びにＤｉＤ陽性細胞及びＤｉＤ陰性細胞の混合物によるＦＡＣＳ染色
それぞれの標識を安定的に過剰発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞クローンを、自家作製した。これらの細胞を、標準化された手順を用い、培養し、採取した。次いで、細胞培地１ｍＬ中約２０００万の抗原発現細胞を、ＤｉＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ２２８８９）１μＬにより、３７℃で２０分間標識した。ＤｉＤ標識を細胞の少量のアリコートについてＦＡＣＳで確認し、一貫して９０％超であることが分かった。次いで、細胞を細胞培地２０ｍＬで２回洗浄した後、ＦＡＣＳ染色に用いた。この目的のために、抗原陰性（親）Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞とＤｉＤ標識抗原陽性細胞との１：１混合物を調製し、丸底の９６ウェルＦＡＣＳマイクロタイタープレートに、１ウェル当たり２００，０００細胞のアリコートに分割した。モノクローナルファージを用いた染色を、下記のように実施した。
【０２５６】
モノクローナルファージを用いた標識陽性細胞と標識陰性細胞との混合物のＦＡＣＳ染色
それぞれの標的への結合について選定された単一クローンのモノクローナルファージを、記載（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１〜９７；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８〜３０）のように調製した。これらを、４％の乳を含む全量１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のＢＳＡ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中でファージ（３０μＬ）とインキュベートすることにより、ＦＡＣＳで、（ＤｉＤ標識）抗原陽性細胞株と（非標識）抗原陰性細胞株との混合物への結合について試験した。３回洗浄した後、ビオチン化抗Ｍ１３抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、カタログ番号６１Ｒ−Ｍ１０１ＡＢＴＢ６２−ＦＥＺ、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：１２５、氷上で３０分間）及びＰＥ標識ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＳＡ１００４−４；ＦＡＣＳ緩衝液中に１：４００、氷上で１５分間）で染色することにより、結合したファージを検出した。染色した細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【０２５７】
ＲＴＫ標的抗体
ＥＧＦＲ標的及びＨＥＲ３標的ｃＬＣ抗体を、前述の方法（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１〜９７；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ  ２５；２７４（２６）：１８２１８〜３０）を用い、自社で作製した大型の合成ファージ抗体レパートリー（ＨＥＲ３）から、又は良好に標的免疫されたＭｅＭｏマウス（ＥＧＦＲ）から作製したファージ抗体レパートリーから得た。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対する抗体、並びにＥＧＦＲ抗体及びＨＥＲ３抗体それぞれに対する抗体可変ドメインＶＨ鎖を作製する方法は、参照により本明細書に組み込まれる、係属中の出願、すなわち、国際公開第２０１５／１３０１７３（Ａ１）号及び同第２０１５／１３０１７２（Ａ１）号に記載されている。
【０２５８】
ファージミドベクターからＩｇＧ発現ベクターへのＶＨをコードするｃＤＮＡの再クローニング
全ての標的特異的クローンの、ＶＨをコードするｃＤＮＡを配列決定した。次いで、配列同一性及びクラスター分析（図２５）に基づく固有のクローンの選定を、標準化された分子生物学的手法に従い、Ｓｆｉ１−ＢｓｔＥＩＩ消化又はＳｆｉＩ／ＸｈｏＩ消化と、消化したｃＤＮＡのプールのＩｇＧ発現プラスミドへのライゲーションとを用い、異なるＩｇＧ発現ベクターに再クローニングした。
【０２５９】
二重特異性抗体の作製
独占権下にあるＣＨ３エンジニアリング技術を用い、異なるＶＨドメインを有するＩｇＧをコードする２つのプラスミドの一過性コトランスフェクションにより、二重特異性抗体を作製し、効率的なヘテロ二量体形成及び二重特異性抗体の形成を確保した。共通軽鎖もまた、同一の細胞中で、同一のプラスミド上又は別のプラスミド上のいずれかで、コトランスフェクションした。本発明者らの同時係属中の出願（例えば、国際公開第２０１３／１５７９５４号及び同第２０１３／１５７９５３号；参照により本明細書に組み込まれる）において、本発明者らは、単一細胞から二重特異性抗体を作製する方法及び手段を開示しており、単一特異性抗体の形成よりも二重特異性抗体の形成に好都合である手段が提供される。これらの方法はまた、本発明においても好適に用いることができる。具体的には、本質的に二重特異性完全長ＩｇＧ分子のみを産生する好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメインにおける３５１位及び３６６位、例えばＬ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵナンバリングによるナンバリング）のアミノ酸置換（「ＫＫ変異」重鎖）、並びに第２のＣＨ３ドメインにおける３５１位及び３６８位、例えばＬ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ変異」重鎖）、又はこの逆の場合である。本発明者らの同時係属中の出願において、負に帯電したＤＥ変異重鎖及び正に帯電したＫＫ変異重鎖が優先的に対になり、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成することが、以前に実証されている。ＤＥ変異重鎖（ＤＥ−ＤＥホモ二量体）又はＫＫ変異重鎖（ＫＫ−ＫＫホモ二量体）のホモ二量体形成は、同一の重鎖間のＣＨ３−ＣＨ３境界面における帯電した残基間の強い反発力のため、ほとんど発生しない。
【０２６０】
上記のＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３に結合する抗体をコードするＶＨ遺伝子を、以前に得られ、国際公開第２０１５／１３０１７２号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、正に帯電したＣＨ３ドメイン及びＲＴＫ（ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３）標的抗体をコードするベクターにクローニングし、負に帯電したＣＨ３ドメインをコードするベクターにクローニングした。懸濁成長に適応させた２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、振とう機上のＴ１２５フラスコ中で、密度３．０×１０６細胞／ｍＬで定常状態となるまで培養した。細胞を、密度０．３〜０．５×１０６生細胞／ｍＬで、２４ディープウェルプレートの各ウェル中に接種した。細胞を、異なる抗体をコードする２つのプラスミドの混合物で一過性トランスフェクションし、独占権下にあるベクター系にクローニングした。トランスフェクションの７日後に細胞上清を採取し、０．２２μＭフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過した。滅菌した上清を、抗体の精製まで４℃で保存した。
【０２６１】
モノクローナル抗体の作製
ＶＨ配列の選定もまた、単一特異性の二価のＩｇＧをコードする、ＩｇＧ１発現ベクターに再クローニングした。懸濁に適応させた２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞を、振とう機上のＴ１２５フラスコ中で、密度３．０×１０６細胞／ｍＬで定常状態となるまで培養した。細胞を、密度０．３〜０．５×１０６生細胞／ｍＬで、２４ディープウェルプレートの各ウェル中に接種した。細胞を、個々の滅菌したＤＮＡ、すなわち、標準化された手順によるＰＥｌ混合物で一過性トランスフェクションし、更に培養した。トランスフェクションの７日後に上清を採取し、０．２２μＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）フィルタで濾過した。滅菌した上清を、抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製するまで、４℃で保存した。
【０２６２】
ＬＧＲ５、ＦＺＤ７及びＲ−スポンジン３を標的とする比較抗体のクローニング及び発現。
ＥＧＦＲ、ＦＺＤ、ＲＳＰＯ３又はＬＧＲ５を特異的に認識する抗体は、当該技術分野において既知である。比較抗体を、公開情報に従って構築した。すなわち、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡ配列は公開特許由来であり、完全長ヒトＩｇＧ１分子をコードする発現ベクターにクローニングした。続いて、標準的な手順に従い、抗体を一過性トランスフェクションにより２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞中で発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用い、培養上清から精製した。ｈｕ８Ｅ１１ｖ２（抗ＬＧＲ５）抗体を、米国特許出願公開第２０１３／０３３６８８５（Ａ１）号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）から複製した。ＢＮＣ１０１抗体（抗ＬＧＲ５）の配列情報は、米国特許出願公開第２０１６／００３１９８４（Ａ１）号（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）から入手した。ＯＭＰ１８Ｒ５抗体（抗ＦＺＤ）をコードする配列は、豪州特許出願公開第２０１４／２１２０８１（Ａ１）号（Ｏｎｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）から複製した。ＯＭＰ１８Ｒ２０及びＯＭＰ１８Ｒ２１抗体配列（抗ＬＧＲ５）は米国特許第８，６２８，７７４（Ｂ２）号（Ｏｎｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）に見出され、この特許から複製した。ＯＭＰ１３１Ｒ１０（抗ＲＳＰＯ３）をコードする配列は、国際公開第２０１６／０９００２４（Ａ２）号（Ｏｎｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）から複製した。セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））の臨床バッチを用いた。複製した抗体及びこれらの複製抗体に付与した内部番号の一覧を表７に示す。
【０２６３】
機能的スクリーニング用のＩｇＧの精製
ＩｇＧの精製は、小規模（５００μｇ未満）、中規模（１０ｍｇ未満）及び大規模（１０ｍｇ超）で、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施した。小規模精製は、無菌条件下で、２４ウェルフィルタプレート中で濾過を用いて実施した。まず、培地のｐＨをｐＨ８．０に調整した後、ＩｇＧを含む上清をプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（５０％ｖ／ｖ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と、振とうプラットフォーム上６００ｒｐｍで、２５℃において２時間インキュベーションした。次に、ビーズを濾過によって採取した。ビーズをＰＢＳ  ｐＨ７．４で２回洗浄した。次いで結合したＩｇＧをｐＨ３．０で０．１Ｍクエン酸緩衝液によって溶出させ、Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用い、溶出液を直ちに中和した。マルチスクリーンＵｌｔｒａｃｅｌ  １０マルチプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた遠心分離により、緩衝液交換を実施した。試料は、最終的にＰＢＳ  ｐＨ７．４中に採取した。ＩｇＧ濃度を、Ｏｃｔｅｔを用いて測定した。タンパク質試料は、４℃で保存した。
【０２６４】
Ｏｃｔｅｔを用いたＩｇＧの定量
精製したＩｇＧの量を測定するため、抗体の濃度を、Ｏｃｔｅｔ分析によって、プロテインＡバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅ−Ｂｉｏ、供給業者の推奨に従った）を用い、全ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ４５０６）を標準物質として用い、測定した。
【０２６５】
ＬＧＲ４／ＬＧＲ５／ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３特異的ＩｇＧの結合の特徴分析
ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３を標的とする抗体を、まず、非関連（対照）抗原：破傷風トキソイドを認識する第２のＦａｂアームを有する二重特異性共通軽鎖抗体として発現させた。抗体を、ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲ３又はｈＲＮＦ４３を過剰発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞への結合について、ＦＡＣＳで試験した。そのため、細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、１０６細胞／ｍＬに希釈した。１〜２×１０５の細胞を、Ｕ字型底の９６ウェルプレート中の各ウェルに加えた。細胞を、３００ｇ、４℃で２分間遠心分離した。プレート（複数可）を反転させることにより、上清を廃棄した。各ＩｇＧ試料の５０μｌを加え（スクリーニング用に、ＦＡＣＳ緩衝液中、濃度５μｇ／ｍＬに希釈した）、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬで２回洗浄した。１：４００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬを加え、暗所において氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を加えた後、細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、ＨＴＳ設定で解析した。抗体の細胞への結合は、染色した細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって評価した。抗体は、ＭＦＩが、（陰性対照）非結合抗体（破傷風トキソイドを標的とする）で染色した同一の細胞集団のＭＦＩの少なくとも５倍である場合、これらの標的に結合しているものとみなした。
【０２６６】
結合反応性を試験するため、ＥＬＩＳＡアッセイも用いた。ＬＧＲ４及びＬＧＲ５を標的とする二重特異性ＩｇＧを、抗原ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ及び破傷風トキソイドに対する反応性について試験した。ＺＮＲＦ３抗体及びＲＮＦ４３抗体を、抗原ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ、ｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ及び破傷風トキソイドに対する反応性について試験した。抗原を、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートに終夜コーティングした。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１時間阻害した。選定した抗体を、ＰＢＳ−５％ＢＳＡで希釈した濃度５μｇ／ｍＬで試験し、２５℃で１時間結合させた。あるいは、二重特異性ＩｇＧをタイトレーションする際、５μｇ／ｍＬ又は８μｇ／ｍＬで開始する７段階の２倍希釈系列を調製した。対照として、コーティングした抗原に特異的な市販の抗体及び抗破傷風トキソイド対照抗体について、この手順を同時に実施した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。結合したＩｇＧを１：２０００に希釈したＨＲＰ複合体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって検出し、２５℃で１時間結合させた。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、結合したＩｇＧをＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２染色によって可視化し、染色をＯＤ４５０ｎｍの測定によって定量化した。
【０２６７】
ＦＡＣＳにおけるＬＧＲ４／ＬＧＲ５／ＺＮＲＦ３／ＲＮＦ４３特異的ＩｇＧの親和性順位付け
細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、１０６細胞／ｍＬに希釈した。１〜２×１０５の細胞を、Ｕ字型底の９６ウェルＦＡＣＳプレート中の各ウェルに加えた。細胞を、３００ｇ、４℃で２分間遠心分離した。プレート（複数可）を反転させることにより、上清を廃棄した。各ＩｇＧ試料の５０μＬを、５μｇ／ｍＬで開始する７段階の２倍希釈系列に加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液１５０μＬで２回洗浄した。１：４００に希釈したマウス抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬを加え、暗所において氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を加えた後、細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターにおいて、ＨＴＳ設定で解析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、ＭＦＩを染色に用いた抗体濃度の関数として得られたプロットから得られた曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することにより、抗体の細胞への結合を定量化した。
【０２６８】
機能性試験用のＩｇＧの精製
ＡＥＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００システムにおいて、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム及びＨｉＴｒａｐ脱塩カラムを用い、中規模精製を実施した。試料は５ｍＬ／分でロードした。カラムを、カラム２つ分の体積のＰＢＳで洗浄した。ＩｇＧをｐＨ３．０で０．１Ｍクエン酸緩衝液によって溶出させた。次に、試料を脱塩し、最終的な緩衝液をＰＢＳ  ｐＨ７．４とした。ＩｇＧを、０．４５μＭフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過した。ＩｇＧ濃度を、ＯＤ２８０を用いて測定した。タンパク質試料は、−８０℃で保存した。
【０２６９】
標的のマウスオルソログとの反応性についての抗体の試験
ｍＬｇｒ４結合反応を試験するため、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ＬＧＲ４標的抗体及びＬＧＲ５標的抗体を、組み換えｍＬｇｒ４−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８０７７−ＧＰ）タンパク質に対する反応について試験した。ｍＬｇｒ４−Ｆｃを、ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートに終夜コーティングした。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１時間阻害した。選定した抗体を、ＰＢＳ−５％ＢＳＡで希釈した単一濃度５μｇ／ｍＬで試験し、２５℃で１時間結合させた。対照として、コーティングした抗原に特異的な市販の抗体及び対照（抗ＴＴ  ｃＬＣ）抗体について、この手順を同時に実施した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。結合したＩｇＧを１：２０００に希釈したＨＲＰ複合体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって検出し、２５℃で１時間結合させた。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、結合したＩｇＧをＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２染色によって可視化し、染色をＯＤ４５０ｎｍの測定によって定量化した。
【０２７０】
二重特異性ＩｇＧを、ｍＬｇｒ５、ｍＺｎｒ３又はｍＲｎｆ４３を一過性発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞への結合について、ＦＡＣＳで試験した。そのため、リポフェクタミンを用い、ｍＬｇｒ５、ｍＺｎｒｆ３又はｍＲｎｆ４３をコードする構造体（ｐＥＦ１＿ｍＬｇｒ５−Ｍｙｃ−ＨＩＳ、ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｍＺｎｒｆ３−Ｍｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ）、ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｍＲｎｆ４３−Ｍｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））によって細胞を一過性トランスフェクションし、採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、１０６細胞／ｍＬに希釈した。１〜２×１０５の細胞を、Ｕ字型底の９６ウェルプレート中の各ウェルに加えた。細胞を、３００ｇ、４℃で２分間遠心分離した。プレート（複数可）を反転させることにより、上清を廃棄した。各ＩｇＧ試料の５０μＬを濃度５μｇ／ｍＬで加え、氷上で１時間インキュベートした。細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。１：４００に希釈したマウス抗ヒトＩｇＧ  ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬを加え、暗所において氷上で３０〜６０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を加えた後、細胞を１回遠心分離し、上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターにおいて、ＨＴＳ設定で解析した。抗体の細胞への結合は、トランスフェクションした細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって定量化した。
【０２７１】
Ｒ−スポンジン３阻害ＥＬＩＳＡアッセイ
全ての４つのＷＮＴ標的は、Ｒ−スポンジンをこれらのリガンドとして有する（Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１１８（３）：１１２〜８；Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ａｕｇ；１９１（２）：１４９〜５５）。各標的について、リガンド阻害アッセイを開発し、標的（ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３）特異的抗体が、Ｒ−スポンジン３の標的への結合を阻害する能力を試験した。それぞれの標的のＥＣＤのＦｃ融合タンパク質の、コーティングされたＲ−スポンジン３への結合を、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３を標的とする過剰のｃＬＣ  ＩｇＧの存在下で試験した。ｃＬＣ  ＩｇＧがＲ−スポンジン３結合部位に結合する場合、Ｆｃ融合タンパク質はもはやコーティングに結合できず、ＥＬＩＳＡシグナルが喪失する。組み換えＲ−スポンジン３（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標）ＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングした。ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１時間阻害した。選定した抗体を、ＰＢＳ−５％ＢＳＡで希釈した濃度１５μｇ／ｍＬで、組み換えヒト標的タンパク質（ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ又はｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ）の存在下、阻害について試験した。ＩｇＧ／組み換えヒト標的タンパク質複合体を１０分間プレインキュベートした後、Ｒ−スポンジン３でコーティングしたプレートに１０分間〜２時間加えた。阻害の対照として、ＩｇＧの代わりに過剰（１５μｇ／ｍＬ）のｒｈＲ−スポンジン３を加え、この手順を同時に実施した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。結合したＦｃタンパク質を１：２０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ複合体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｓ）によって検出し、２５℃で１時間結合させた。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄し、結合した複合体をＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２染色によって検出し、染色をＯＤ４５０ｎｍの測定によって定量化した。
【０２７２】
細胞表面に発現された抗原に結合する二重特異性抗体の親和性の測定。
ｖａｎ  Ｕｈｍらによって記載された手順に従い、ＩＯＤＯ−ＧＥＮを用い、アフコシル化ＰＢ１０６５１を１２５Ｉで放射標識した。放射線標識後の抗体の免疫反応性を、Ｌｉｎｄｍｏらによって記載された方法によって検査した。１２５Ｉ−ＰＢ１０６５１の定常状態の細胞親和性測定を、ＥＧＦＲ又はＬＲＧ５のいずれかを発現するＣＨＯ細胞を用いて実施し、ＥＧＦＲ及びＬＧＲ５それぞれへの親和性を検査した。更に、ＥＧＦＲを内因性に発現するが、検出可能なＬＧＲ５は発現しないＤＬＤ−１細胞株への親和性もまた測定した。アッセイでは、一定濃度の標的（細胞）を用い、定常状態条件における親和性測定の背景にある前提を妨害することなく、放射性リガンドの量をタイトレーションした。非特異的結合（ＮＳＢ）を、１００倍モル過剰の非標識ＰＢ１０６５１の存在により、並行して評価した。アッセイを２回繰り返し、推定ＫＤ値を、３回の独立した実験の平均として報告する。ＫＤ値の推定は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．６．０ｈ非線形回帰、１部位−全て（One−Site−−Total）を用い、非特異的結合ではＫＤ値は０より大きくなくてはならないという制約で実施した。
【０２７３】
参考文献：
Ｌｉｎｄｍｏ  Ｔ，Ｂｏｖｅｎ  Ｅ，Ｃｕｔｔｉｔｔａ  Ｆ，Ｆｅｄｏｒｋｏ  Ｊ，Ｂｕｎｎ  ＰＡ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｒ  ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｔ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｃｅｓｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８４；７２：７７〜８９．
ｖａｎ  Ｕｈｍ  ＪＩ，Ｖｉｓｓｅｒ  ＧＷ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈａｎｓ  ＭＪ，Ｇｅｌｄｏｆ  ＡＡ，Ｍｅｕｌｅｍａｎ  ＥＪ，Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｚｅｎ  ＪＡ．Ｔｈｅ  ｕｌｔｉｍａｔｅ  ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｎｉｇｈｔｍａｒｅ：ｕｐｏｎ  ｒａｄｉｏ−ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  Ａ，ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｏｄｉｎｅ  ａｔｏｍ  ｉｔｓｅｌｆ  ｓｅｅｍｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｆａｔａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ．ＥＪＮＭＭＩ  Ｒｅｓ．２０１５；５：５．
【０２７４】
ショットガン突然変異誘発分析によるエピトープマッピング
ＰＢ１０６５１によって認識されたＥＧＦＲ及びＬＧＲ５上のエピトープを、Ｄａｖｉｄｓｏｎらにより記載された方法（２０１４）に従い、ショットガン突然変異誘発分析によって測定した。２つの変異ライブラリーを２つの抗原から作製した。一方のライブラリーはヒトＥＧＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列ＮＰ＿００５２１９．２）のアミノ酸３００〜５２０（リガンド結合ドメインＬ２又はドメインＩＩＩ）を含み、もう一方はヒトＬＧＲ５（ＧｅｎＢａｎｋ参照配列ＡＡＨ９６３２４．１）のアミノ酸２２〜５６０（第１の膜貫通ヘリックスまではＮ末端ドメインである）を含んでいた。ＬＧＲ５発現構造体を、アミノ酸８３４で短縮し、受容体の細胞表面発現を増加させた。異なるエピトープを標的とする自社開発の抗体を、変異体の発現の対照抗体として用いた。
【０２７５】
参考文献
Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄｏｒａｎｚ，Ｂ．Ｊ．（２０１４）Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｐｐｉｎｇ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３，１３〜２０．
【０２７６】
細胞アッセイを用いたＬＧＲ５結合に対するＰＢ１０６５１中のＬＧＲ５  Ｆａｂアーム及びリガンドＲ−スポンジン１間の競合。
米国特許第８，６２８，７７４（Ｂ２）に記載の抗体ＯＭＰ８８Ｒ２０の文献に基づく複製品（ＰＧ７７１１と呼ぶ）をリガンド阻害対照として用い、抗ＬＧＲ５  Ｆａｂアームのリガンド阻害能力を実証するアッセイを設定した。ＬＧＲ５をコードする発現構造体を有するＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションによってヒトＬＧＲ５を過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１由来の細胞クローンを作製した後、限界希釈法により、抗生物質（Ｇ４１８）耐性クローンを選定した。次いで、ＯＭＰ８８Ｒ２０の複製品のこの細胞株への結合を、抗体の希釈系列において試験し、結合のＥＣ５０を測定した。次に、抗体の、ＬＧＲ５発現ＣＨＯ細胞クローンへのＥＣ５０濃度での結合を、ＦＡＣＳにおいて、その都度量を増加させたリガンドＲ−スポンジン１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４６４５−ＲＦ／ＣＦ）の存在下で測定した。ＰＢ１０６５１の抗ＬＧＲ５  Ｆａｂ（ＭＦ５８１６）のＬＧＲ５への結合がリガンドの結合によって抑制されるか否かを試験するため、抗体を、ＬＧＲ５結合について１００ｎｇ／ｍＬで、その都度量を増加させたＲ−スポンジン１の存在下で試験した。ＬＧＲ５の膜近傍領域に結合することが報告されているラット抗ＬＧＲ５抗体１Ｄ９（ｄｅ  Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いて同様のアッセイを実施し、相互作用の特異性を示した。
【０２７７】
ＰＢ１０６５１中の抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームのリガンド阻害能力。
抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧを、ＥＧＦ誘導シグナル伝達に対する抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧの効果について試験するため、ＥＧＦ誘導によるＡ４３１細胞のアポトーシス細胞死を抑制する能力について抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧを試験した。要約すると、高濃度（１０ｎＭ）のＥＧＦは、Ａ４３１細胞において（アポトーシス）細胞死を誘導する（Ｇｕｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。この効果は、セツキシマブ（マウス２２５抗体は、セツキシマブのマウス同等物である）等のリガンド阻害抗ＥＧＦＲ抗体の添加により、用量依存的に回復可能である。Ａ４３１細胞を１５００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに接種し、終夜培養した。翌日、抗体を表示濃度で、６２．５ｎｇ／ｍＬ（１０ｎＭ）の組み換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３６−ＥＧ）と共に加え、細胞を３日間培養した。３日後、アラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＤＡＬ１１００）の添加、及び５９０ｎｍ発光、５６０ｎｍ励起の蛍光の測定により、代謝的に活性な細胞の数を測定した。全ての抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧを、抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧのＥＧＦ阻害効果について、このアッセイでセツキシマブと比較して試験した。
【０２７８】
参考文献：
Ｇｕｌｌｉ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａ４３１  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，１９９６．７（２）：ｐ．１７３〜１７８．
【０２７９】
熱安定性アッセイ
二重特異性ＩｇＧの安定性についての指標を得るため、全てのＩｇＧを、血清を含む培地（ＤＭＥＭ、高グルコース（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号４１９６６−０２９）、９％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＳＶ３０１８０）を添加）中、４０℃で１週間インキュベートした後、結合ＥＬＩＳＡで（本質的に上記のように）、結合について試験した。このＥＬＩＳＡは、２μｇ／ｍＬの抗原（ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ又はｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ）をコーティングすること、５μｇ／ｍＬのＩｇＧにおいて１００μＬを用いること、及びＰＢＳ中５％のＢＳＡで阻害することからなる。このアッセイにおいて、２〜８℃（冷蔵庫）で保存した同一のＩｇＧ（血清を含む培地中）の抗原への結合を、４０℃で保存したＩｇＧの結合と比較した。４０℃で１週間インキュベートした後の結合の低下（％）を算出した。
【０２８０】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）オルガノイド培養物
ＣＲＣオルガノイドを、ワーキング細胞バンクとして、上記（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｃｅｌｌ  １６１：９３３〜４５）のように作製し、スクリーニングアッセイ用に、ドライアイス上で凍結バイアルとして、凍結培地（凍結保護物質として１０％のＤＭＳＯを含むウシ胎児血清）１ｍＬ当たり１，５００，０００細胞の密度で発送した。凍結チューブは、３箇月以内の使用には−８０℃で、長期間の保存には−１５０℃で保存した。
【０２８１】
培地
アドバンストＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １２４９１−０２３）５００ｍＬを、１００×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １５１４０−１２２）５ｍＬ、１００×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ３５０５０−０３８）５ｍＬ及び１Ｍヘペス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １５６３０−０５６）５ｍＬで強化することにより、チューモロイド拡大培地を作製した。強化したアドバンストＤＭＥＭ  ７０ｍＬに、Ｒ−スポンジン１でコンディショニングした培地２０ｍＬ及びノギンでコンディショニングした培地（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｃｅｌｌ  １６１：９３３〜４５）１０ｍＬを加え、チューモロイド拡大培地１００ｍＬを調製し、これに、５０×Ｂ２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  １７５０４−０４４）２ｍＬ、１Ｍニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎ０６３６）１ｍＬ、５００ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ９１６５）２５０μＬ、５ｍＭ  Ａ８３−０１（ＴＧＦβ阻害剤、Ｔｏｃｒｉｓ  ２９３９）１０μＬ及び３０ｍＭ  ＳＢ２０２１９０（ｐ３８阻害剤、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ７０６７）３３μＬを更に添加した。チューモロイド拡大培地には、ヒトＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＡＦ−１００−１５）又はヒトＮＲＧ−１／ＨＲＧ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ  １１３４３０４７）の存在下で結腸チューモロイドを新たに接種した後、１０ｍＭ  Ｙ２７６３２（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、Ａｂｍｏｌｅ  Ｙ−２７６３２二塩酸塩）１００μＬを更に添加した。ＥＧＦ及びＨＲＧはオルガノイドの拡大を刺激する成長因子であり、これらの用量が、スクリーニングアッセイの感度を決定する。ＥＧＦは、スクリーニング中は用量２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ若しくは１０ｎｇ／ｍＬで、又は、拡大中は１０ｎｇ／ｍＬ若しくは５０ｎｇ／ｍＬで加えた。ＨＲＧは、５ｎｇ／ｍＬで単独で用いた。
【０２８２】
野生型オルガノイド拡大培地はチューモロイド拡大培地と同等で、ただし、１つの置き換えを有し、強化したアドバンストＤＭＥＭ  ７０ｍＬを、強化したアドバンストＤＭＥＭ  ２０ｍＬとＷＮＴ３Ａでコンディショニングした培地５０ｍＬとの組み合わせで置き換えた（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｃｅｌｌ  １６１：９３３〜４５）。正常な組織由来の結腸オルガノイドと、野生型ＡＰＣを有する結腸チューモロイドはＷＮＴ依存性であるため、拡大にはＷＮＴの存在が必要である。
【０２８３】
ゲル組成
凍結した結腸チューモロイドを水浴中３７℃で速やかに解凍し、強化したアドバンストＤＭＥＭ  ５ｍＬ中に採取した。オルガノイドは、４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、ペレット化した。上清を除去し、オルガノイドを、成長因子を含まないチューモロイド拡大培地中に取り出した。このオルガノイド懸濁液を、Ｃｕｌｔｒｅｘ成長因子低減基底膜抽出物、タイプ２、ＰａｔｈＣｌｅａｒ（Ａｍｓｂｉｏ  ３５３３−０１０−０２）と混合した。最終的なＣｕｌｔｒｅｘゲルの割合は６０％であり、１ｍＬ当たりの細胞数は１００，０００であった。
【０２８４】
患者由来オルガノイドの成長因子反応性の測定
患者由来オルガノイドが成長因子の処理に反応するか否かを測定するため、患者由来オルガノイドを、成長因子（ＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ）、又はＮＲＧ（５ｎｇ／ｍＬ））の存在下又は非存在下で上記のように接種した後、５日間培養した。次いで、生細胞数を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７１）を用い、測定した。次いで、成長因子刺激細胞を用いた発光の読み取りを用い、非刺激細胞を用いて得られた読み取りと比較した。
【０２８５】
培養プレートの調製
ゲル化は、あらかじめ温めた培養プレートでは、より速やかであった。そのため、細胞接種前日に、全ての培養プレートを、加湿したＣＯ２インキュベーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で３７℃に置いた。
【０２８６】
結腸チューモロイドを拡大するため、２４ウェル又は６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を用い、１ウェル当たり、ゲル／オルガノイド懸濁液１５μＬを３適又は１０適のいずれかを、規則的な距離で点在させた。３７℃における３０分間のゲル化期間後、１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含むチューモロイド拡大培地（０．５ｍＬ又は２ｍＬ）を加えた。接種１日目に、チューモロイド拡大培地は、１０μＭのＹ２７６３２を含んでいた。拡大中の培地交換は、Ｙ２７６３２を含まない、ＥＧＦ含有チューモロイド拡大培地よるものであった。
【０２８７】
スクリーニングを実施するため、３８４ウェルのμｃｌｅａｒプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ７８１０９１）を用いた。１ウェル当たり、ゲル／オルガノイド混合物１５μＬを、自動化液体処理を用いて分注した。３７℃でのゲル化３０分後に、チューモロイド拡大培地（又は該当する場合はオルガノイド拡大培地）４５μＬを、各ウェル中のゲルの上部に加えた。培地に成長因子を添加し、又は、添加せず、（参照）抗体及び化合物を、Ｖ字型底の９６ウェルプレート中で培地と混合した後、固化したゲルを有する３８４ウェルプレートに加えた。
【０２８８】
抗体マスタープレートの調製
参照抗体（セツキシマブ（４℃）、陰性対照抗体、単一ＨＥＲ３又はＥＧＦＲ標的抗体、かつＨＥＲ３／ＥＧＦＲ抗体（ドライアイス上））を発送し、スクリーニング用に４℃で保存した。二重特異性抗体及び単一特異性抗体は、ディープウェル９６ウェルプレート（deep-well 96-wells plates）中に密封され、４℃で発送して提供された。概して、単一特異性ｃＬＣ抗体についての表記は、実施例を通じて接頭辞「ＰＧ」によって識別され、一方、二重特異性ｃＬＣ抗体についての表記は、接頭辞「ＰＢ」によって認識される。疑義回避のため説明すると、ｃＬＣ抗体のＦａｂフラグメントについての表記は、接頭辞「ＭＦ」によって認識される。抗体を、４つのＶ字型底の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ７３６−０１１８）のウェルＢ０２〜ウェルＧ１１（内側の６０ウェル）の範囲の無作為に割り付けた位置に、手作業で移した。参照抗体も、無作為に割り付けた位置のプレートに、等しい濃度で加えた。これらの抗体マスタープレートを用い、１：１０のＰＢＳ希釈プレートを調製した。マスタープレート及び希釈プレートは、密封して４℃で保存した。
【０２８９】
スクリーニング結果の検証のため、二重特異性ＩｇＧのリードパネル（濃度０．５ｍｇ／ｍＬの４６の抗体）を、スクリーニングプレートにおける抗体の無作為割り付けを容易にし、交差汚染及び蒸発を防止するため、ねじ蓋をしたマイクロバイアルに入れて発送した。各実験の実施前に、二重特異性ＩｇＧを、これらをＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した参照抗体と共に、１つのＶ字型底の９６ウェルプレート（内側の６０ウェル）に入れた。このプレートを更にもう一度、ＰＢＳで１：５に希釈し、抗体を２０μｇ／ｍＬで含む第２のマスタープレートを得た。希釈及びプレートの暴露は、Ｆｅｌｉｘリキッドハンドラーを用いて実施した。
【０２９０】
暴露方式
高用量及び低用量Ｖ字型底の９６ウェル抗体マスタープレートを、暴露前に培地で１：１０に希釈した。一次スクリーニングに適用した抗体濃度は１０μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬ又は４０μｇ／ｍＬ及び４μｇ／ｍＬであり、検証選別において、抗体用量は１０μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬであった。抗体を、接種の３０分後にオルガノイドに加えた。プレート固定前の抗体暴露は最低７日間、最高９日間であった。
【０２９１】
固定及び撮像
暴露されたチューモロイドプレートを撮像用に調製するため、オルガノイドを固定し、染色して細胞核及びアクチン細胞骨格をそれぞれ、前述のように可視化した（Ｄｉ  ｅｔ  ａｌ  ＰｌｏｓＯｎｅ  ２０１４，ＰＭＩＤ  ２５２８９８８６）。プレートの撮像は、Ｔｗｉｓｔｅｒ  ＩＩロボットアームに連結したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  ＸＬＳを用い、前述のように実施した（Ｓａｎｄｅｒｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１５，ＰＭＩＤ  ２６２２７９５１）。簡潔に説明すると、３８４ウェルプレート中の各ウェルのｚスタックを、４倍のレンズを用い、ｚステップサイズ５０μｍで取得した。１ウェル当たりの断面の数は２０断面〜２４断面の範囲であり、各ウェル中のゲルの深さの範囲全体を網羅した。
【０２９２】
画像解析
取得した画像を、ＯｃｅｌｌＯ  Ｏｍｉｎｅｒ（登録商標）３Ｄ画像解析プラットフォームによってアクセス可能な中央データサーバに保存した。これにより、分散計算設計による、３Ｄ画像スタックの直接の並行解析が可能となる。ソフトウェアが、各ウェル中で検出された対象物（細胞核及び細胞骨格）の構造と、これらの相対的な位置を解析する。解析に際し、出力を確認し、原画像の品質と解析方法を検出する。ソフトウェアが生成した対象物ごとの測定（細胞核、オルガノイド、オルガノイド内の細胞核、管腔、オルガノイド及び構造体全体（オルガノイド、細胞核及び管腔）の中の管腔の相対的な位置）を、続いてウェルごと、かつプレートのレイアウト情報（細胞株、成長因子の状態、処理等）に連結したデータに集計した。データ集計に際し、データを、対照処理内の整合性、エッジ効果がないこと、反復実験間及びｚ’因子間、陽性対照及び陰性対照間の整合性について確認した。次に、データをｚスコアについて規準化し、データをＴＩＢＣＯ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）にロードして検査し、更なる異常値を排除した。５００の異なる形態的特徴を収集した。次いで、データを一連の統計処理にかけ、ｚスタック画像から収集した約５００の特徴から、特徴のこの集合が、参照処理効果を陰性対照の形態から判別させる能力に基づき、３〜２０の分割選定を行った。参照と陰性対照との距離をユークリッド距離の測定値として算出し（図５）、０と１との間にスケーリングした。形態変化のこの統合スコアを用い、化合物スクリーニング中の該当物を識別した。個々の選定した特徴の測定値を、画像による裏付けと共に用い、オルガノイドに対する該当物の効果を実証し、確認した。
【０２９３】
Ｚ’因子：Ｚ’因子は、高処理スクリーニングアッセイの品質についての統計的尺度であり、陽性対照と陰性対照との間の分離ウィンドウを示す。Ｚ’因子は、陽性対照及び陰性対照の標準偏差の合計の３倍を１から差し引き、陽性対照の平均と陰性対照の平均との差の絶対値で除算したものと定義する。０より小さいＺ’値は、陰性対照と陽性対照との間の重複が多過ぎることを示し、０〜０．５の値は、有用ではあるが、スクリーニングウィンドウが限定的あることを示し、０．５〜１．０の値は、陽性対照と陰性対照との間の分離が強力な、優れたアッセイであることを示す。
【０２９４】
選定した抗ＬＧＲ５  ｃＬＣ抗体を用いたオルガノイドＰ１８Ｔから得られた細胞のＦＡＣＳ染色
結腸直腸癌試料由来のオルガノイドを、１００％基底膜抽出物（ＢＭＥ，Ａｍｓｂｉｏ）中で、３７℃及び５％ＣＯ２において、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭヘペス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×Ｂ２７レチノイン酸フリー体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．１μｇ／ｍＬノギン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ロック阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭ  ＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３μｍ  ＳＢ２０２１９０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｎＭガストリン（Ｔｏｃｒｉｓ）、１μｇ／ｍＬ  Ｒ−ＳＰＯ１（自社製）、１０ｍＭニコチノミド（Nicotinomide）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．２５ｍＭ  Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５μＭ  Ａ８３−０１（Ｔｏｃｒｉｓ）を添加したアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から構成される培地によって培養した。解析の前日、オルガノイドを単一細胞に脱凝集させた。この目的のために、培地を取り除き、ＢＭＥを細胞回収溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートすることにより、オルガノイドをまずＢＭＥから遊離させた。続いて、オルガノイドを遠心分離した（全ての遠心分離工程は、４℃において、２００ｇで５分間であった）。ペレットを１ｍＬの５０％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ）、５０％ＰＢＳ中に再懸濁し、ピペットによる吸い上げ及び流出を繰り返し、単一細胞の懸濁液が得られたかを定期的に視覚的に評価した。ＴＥをＰＢＳ  １０ｍＬで希釈し、遠心分離した。細胞をＰＢＳ  １０ｍＬ中で２回洗浄した後、ＢＭＥ中に再懸濁し、あらかじめ温めたプレート（３７℃）上に、５０μＬのアリコートに分割して滴下した。ＢＭＥの滴下を１５分間放置した後、１滴当たり５００μＬの培地を加えた。１２時間後、細胞回収溶液を用い、細胞をＢＭＥから分離した。氷上に１時間放置した後、細胞を遠心分離し、０．５％のＢＳＡ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（染色緩衝液）１０ｍＬで１回洗浄した。次いでペレットを染色緩衝液中に懸濁し、カウントした。最大で抗体１００μＬ当たり１００，０００の細胞を用いた。細胞の概数をカウントした後、細胞を遠心分離し、１０μｇ／ｍＬに希釈した一次抗体（モノクローナルかつ二重特異性ＩｇＧ）を含む染色緩衝液１００μＬ中に再懸濁した。チューブを規則的に反転して均質な染色を確保しながら、細胞を氷上で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１ｍＬの染色緩衝液で洗浄し、遠心分離した。細胞を１ｍＬの染色緩衝液中で再度洗浄した後、１：４００に希釈したＲ−ＰＥに結合された抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈ１０１０４）を含む染色緩衝液１００μＬでインキュベートした。細胞を、遮光し、氷上で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１ｍＬの染色緩衝液中で２回洗浄した後、０．１μＭ  ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む染色緩衝液中に、細胞を再懸濁した。細胞を遮光して氷上に維持し、直ちに解析した。ＳＳＣ−Ｗ対ＳＳＣ−Ａを用いて二重線を排除し、ＤＡＰＩを��いて死細胞を排除した。ＬＧＲ５抗体のゲーティングは、破傷風毒素（ＭＦ１３３７）に対して上昇する、陰性対照抗体の染色に基づいて設定した。蛍光は、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎを用い、ＤＡＰＩ用に設定したＵＶレーザー及び４５０／５０フィルター、並びにＲ−ＰＥ蛍光を検出するための緑色レーザーを５８２／１５フィルターと共に用いて検出した。
【０２９５】
選別後のＬＧＲ５  ｍＲＮＡの強化
ＬＧＲ５  ＦＡＣＳ染色がＬＧＲ５を発現する細胞を強化したか否かを評価するため、染色された細胞の上位及び下位の１５％が分離されるように設定した選別ゲートによって、細胞を選別した。合計２０００の細胞をピクロプロファイリング緩衝液（ＩＲＢ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙより提供された）中に選別した後、選別した細胞をＩＲＢ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙにより、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成用に処理した。ＬＧＲ５の発現を、定量的ＰＣＲを用い、ＴａｑＭａｎプローブ及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（両者ともＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより）を用いて評価した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、光学カバーを備えたクリアオプティカル９６ウェル反応プレート（clear optical 96-well reaction plates）中で、製造業者の使用説明書に従って反応を実施した。陰性及び陽性のＬＧＲ５分画間の発現を、ＬＧＲ５プローブ（Ｈｓ００１７３６６４＿ｍ１）を用いて評価し、内因性対照遺伝子Ｂ２Ｍ（Ｈｓ９９９９９９０７＿ｍ１）の発現を用いて規準化した。標的遺伝子の発現の差を、ＳｔｅｐＯｎｅ  ２．２  ｐｌｕｓソフトウェアを用いて求めた。
【０２９６】
ＬＧＲ５に対するＰ１８染色、並びにＬＧＲ５陽性及び陰性集団の選別、並びにこれら２つの集団間の成長の差
細胞を前述のように染色し、染色された細胞の上位及び下位１５％が、Ｐｒｉｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２００μＬの培地中に選別されるように、選別ゲートを設定した。選別した細胞の数を、ＦＡＣＳ選別の実施数に基づいて測定した。選別後、細胞を遠心分離し、ＢＭＥ  ２５μＬ当たり２０００の細胞密度で接種した。２週間後、形成されたオルガノイドの数を、倒立光学顕微鏡を用い、手作業でカウントした。
【０２９７】
ＥＧＦＲ×ＬＧＲ５二重特異性抗体によるＰ１８Ｔオルガノイドの処理
抗体処理実験のため、培地を変更し、ガストリン又はＰＧＥ２を含まず、ＥＧＦの濃度を低下させた（２．５ｎｇ／ｍＬ）。オルガノイドを脱凝集させた後、トリファンブルー（Tryphan Blue）染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて生細胞の数を測定し、５０００の細胞を、４８ウェル組織培養プレート中の２５μＬのＢＭＥに接種した。各処理において技術的反復実験を８回行い、１ウェル当たり２５０μＬの培地で培養した。単一細胞接種の３日後、培地を取り出し、抗体処理（２μｇ／ｍＬ）を含む培地と交換した。抗体を加えてから７日後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳｃａｎＲを用い、４倍の光学対物レンズを用いてプレートをスキャンし、ＩｍａｇｅＪを用い、ＩＲＢ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆａｃｉｌｉｔｙによって設計されたマクロを実行してオルガノイドの数を定量化した。実験を３回別々に繰り返し、対応のあるサンプルの両側ｔ検定を実施し、処理間の有意差を評価した。
【０２９８】
ＲＮＡの単離、並びにＬＧＲ５及びＣＫ２０のｍＲＮＡレベルのＱ−ＰＣＲ解析
処理したチューモロイドの組織培養プレートを計数のためにスキャンした後、チューモロイドを細胞回収溶液を用いて分離し、氷上で１時間インキュベートした。次いで、チューモロイドを遠心分離し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁し、全ＲＮＡを抽出した。クロロホルムで相分離した後、上部の水相を７０％エタノールと混合し、製造業者より提供された手順書に従い、ＲＮＡカラム（ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通して洗浄した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用い、ＲＮＡを定量した。次いで、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＴａｑＭａｎプローブ及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（両者ともＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲを用い、ｍＲＮＡのＬＧＲ５（Ｈｓ００１７３６６４＿ｍ１）レベル及びＣＫ２０  （Ｈｓ００３００６４３＿ｍ１）レベルを定量した。発現の違いは、２−ΔΔＣＴ法及びＳｔｅｐＯｎｅ  ２．２  ｐｌｕｓソフトウェアを用いて検出した。
【０２９９】
異なる適応症のＰＤＸモデルにおけるＬＧＲ５及びＥＧＦＲのＲＮＡ及びタンパク質レベルのＥｘ  ｖｉｖｏ測定
ｉｎ  ｖｉｖｏで培養したＰＤＸ腫瘍から抽出したｍＲＮＡを用い、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって、ＬＧＲ５遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子の発現レベルを分析した。Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｕｂａｓｅ２．ｃｒｏｗｎｂｉｏ．ｃｏｍ）のデータを、キロベース１００万当たりのフラグメント（ＦＫＰＭ）のｌｏｇ２換算で表示した（表９）。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養した異なるＰＤＸ腫瘍から抽出した腫瘍細胞を、１５μｇ／ｍＬのＰＧ５８１６（抗ＬＧＲ５）、ＰＧ３７５５（抗ＥＧＦＲ）及び（対照）ＰＧ１３３７で染色した後、結合した抗体をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧで検出した。表１０は、いくつかの癌の適応症における全ての抗体染色の平均蛍光強度を示している。
【０３００】
実施例２：ファージ抗体選定を用いたＷＮＴ経路標的を標的とする抗体パネルの作製
４つの異なるＷＮＴ標的によるＭｅＭｏ（登録商標）マウスの免疫化。
ＭｅＭｏ（登録商標）マウスを、完全長ヒトＬＧＲ４及びＬＧＲ５（ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ４−ＦＬＡＧ−ＨＡ及びｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５−ＦＬＡＧ−ＨＡ）をコードする発現構造体、ＬＧＲ４若しくはＬＧＲ５（ｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ４（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３−ＦＬＡＧ及びｐＶａｘ１＿ｈＬＧＲ５（ＥＣＤ）−ＧＰＡ３３−ＦＬＡＧ）の細胞外ドメイン、又は組み換えタンパク質ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ若しくはｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかで免疫した。それぞれの抗原を安定的に過剰発現する、自社で作製したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞株を用いたＦＡＣＳアッセイによって、標的に対する体液性免疫反応のエビデンスについて、マウス血清をスクリーニングした。図６は、データの例を示している。４つのＷＮＴ標的で良好に免疫されたマウスの血清ＩｇＧ力価（免疫化の前に採取された血清のＭＦＩの少なくとも３倍の標的を安定的に発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞株の染色をもたらす最高の血清希釈と定義した）を、表１に示す。次いで、それぞれの抗原に対して有意かつ特異的な免疫反応を備えたことが示されたマウスを試験から取り出し、これらのマウスのリンパ組織（鼠径リンパ節）を採取した。得られたリンパ節から、ＲＴ−ＰＣＲによって、非溶解性ファージの表面でＦａｂフラグメントを発現するファージミドにおいて、ＩｇＧ及びＶＨ特異的プライマー対、並びにＶＨをコードするｃＤＮＡのポリクローナルプールのクローニングを用い、「免疫」ファージ抗体レパートリーを作製した。作製した全てのライブラリは、サイズが１０＾６クローン超（個々の形質転換体）であり、挿入頻度は８０％超であった。
【０３０１】
標的特異的ｃＬＣ抗体を作製するためのファージの選定
本質的にＭａｒｋｓらによって記載されたように（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１−９７）、標的ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３及びｈＲＮＦ４３を標的とするｃＬＣ抗体パネルを作製するため、ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ、ｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）又はｈＲＮＦ４３若しくはｍＺＮＲＦ３の可溶性ＥＣＤ（自社で調製した）を固体の支持体にコーティングし、自社で作製した合成ｃＬＣファージ抗体レパートリーを、過剰なヒトＩｇＧの存在下（Ｆｃ結合ファージの選定を防止するため）でコーティングした抗原に結合するために選別した。並行して、標的で良好に免疫された動物から作製した「免疫」ファージ抗体レパートリーも、選定に用いた。コーティングしたタンパク質に基づく選定はマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、ｍａｘｉｓｏｒｐ）において実施し、それぞれの標的を過剰発現したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に基づく選定は溶液中で実施し、結合したファージの溶出は、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２）又は１００ｍＭ  ＴＥＡ（ｐＨ１２）を用いたｐＨショックによって実施した。合成ファージ抗体ライブラリーを用いた１回目の選定後、選定したクローンのポリクローナルプールを用い、再度ファージを調製し、ファージを、同一の抗原への結合のために選別した、又は、それぞれの抗原を安定的に過剰発現する、自社で作製したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に基づいて選定した。１回（免疫ライブラリー）又は２回（合成ライブラリー）の選定後、単一クローンを採取し、モノクローナルファージの調製に用いた。これらのモノクローナルファージは、これらの標的への結合について、２つの細胞株、すなわち、親（抗原陰性）Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞株と、ＷＮＴ標的を安定的に過剰発現したＤｉＤ標識２９３Ｆ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞との混合物を用いて、ＦＡＣＳで試験した。（ＤｉＤ標識）抗原陽性細胞集団を認識し、抗原陰性細胞を認識しなかったファージクローンを抗原特異的とみなし、そのため、更に特徴分析を行った。図７は、選定したクローンを、標的発現細胞への抗原特異的結合について、ＦＡＣＳによって試験した実験を示している。
【０３０２】
標的特異的であることが示されたクローンは、次いで配列決定し、これらの配列同一性に基づいて分類した。抗体クローンの「クラスター」は、同一のＶＨ  Ｖ遺伝子使用を共通に有し、同一のＨＣＤＲ３配列及びＨＣＤＲ３長を有する抗体の群と定義した（図１７）。これらのクローンは全て、ＭｅＭｏマウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫反応中に多様化した単一の先祖のクローンに由来する。「スーパークラスター」は、同一のＶＨ  Ｖ遺伝子使用を共通に有し、ＨＣＤＲ３において少なくとも７０％の配列同一性を有し、同一のＨＣＤＲ３長を有するクローンの群と定義した。この定義は恣意的なものではあるが、恐らく、これらのクローンはまた、選定され、活性化され、ｉｎ  ｖｉｖｏ体液性免疫反応中に多様化した単一のＢ細胞前駆体から生じたものと考えられる（しかし証明されてはいない）。実際には、スーパークラスターのクローンは、同一のエピトープに結合するが、異なる親和性及び／又はエピトープの異なる位置で結合することが予想される。次いで、（上記のように定義した）スーパークラスターに従い、少なくとも２つのクローンを選定し、クローン検証プロセスに移行し、標的への特異的結合を確認し、クローンの配列を確認した。これらの数は、ＶＨが異なる生殖系列遺伝子使用及び／又はＨＣＤＲ３配列を有するＦａｂクローンに基づく。次いで、クローン検証プロセスに適合した（すなわち、これらの標的への結合及び特異性が確認され、配列が検証された）クローンを用い、ＶＨ遺伝子を発現ベクターに再クローニングし、対応するＩｇＧを作製し、特徴分析を行った。４つの標的、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３のうちの１つを特異的に認識する合計６６７の異なる抗体が同定され、このうちの２８８について更に特徴分析を行った（表２）。続いて、これらのクローンを全て、ＷＮＴ標的を標的とするＦａｂアームの一価の相互作用の特徴分析をその標的によって可能とするため、「ダミー」（すなわち、非関連の抗ＴＴ）Ｆａｂを有する二重特異性ｃＬＣ  ＩｇＧ形態に再クローニングした。
【０３０３】
実施例３：抗体パネルの特徴分析。
ファージディスプレイから分離した選定Ｆａｂフラグメント（コードＭＦｎｎｎｎで示した）を、ＤＥＫＫ変異を含むＩｇＧ１発現ベクターに再クローニングした。この目的のために、ＶＨをコードするｃＤＮＡを、抗体フラグメントの選定に用いたファージミドベクターから切除し、（ＫＫ）ＤＥＫＫ変異を含むＩｇＧ発現ベクターに再クローニングした。相補的（ＤＥ）ＤＥＫＫ変異を含む発現構造体とコトランスフェクションし、非結合性対照抗原破傷風トキソイド（ＴＴ：ＭＦ１３３７）を標的とするＦａｂフラグメントをコードすることにより、二重特異性抗ＷＮＴ×ＴＴ  ＩｇＧを得た（ＷＮＴは、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３を指す）。次いで、ＷＮＴ標的に対して一価の結合活性を有する二重特異性ＩｇＧ１パネルを作製し、精製し、これらの産生能及び特異性について特徴分析を行った。
【０３０４】
２９３Ｆ細胞中で両方のＦａｂフラグメントをコードするプラスミドの一過性コトランスフェクションにより、正に帯電したＫＫベクター中のＷＮＴ標的アーム（ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３）に結合する異なるＦａｂフラグメントを、負に帯電したＤＥ二重特異性ベクター中の破傷風トキソイドを標的とする対照Ｆａｂフラグメントと組み合わせることによって、二重特異性ＩｇＧを小規模で作製した。作製後、二重特異性ＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、緩衝液をＰＢＳに交換した。良好な作製の結果、ＩｇＧ１完全長抗体を最小濃度０．１ｍｇ／ｍＬで得て、固有コード（ＰＢｎｎｎｎｎ、ここで、ｎｎｎｎｎは、無作為に生成した番号を表す）を付与し、２つの異なる標的に結合するＦａｂフラグメントの特定の組み合わせを同定した。
【０３０５】
良好に作製された二重特異性ＩｇＧを、これらのそれぞれの標的への結合について、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの両方で試験した。ＥＬＩＳＡは、ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ又はｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃを２μｇ／ｍＬ、又は、破傷風トキソイドを２．５μｇ／ｍＬでコーティングとして用いて実施した。ＩｇＧは、単一濃度５μｇ／ｍＬで試験した。ＩｇＧは、確認されたＯＤ４５０ｎｍシグナルが、上記のバックグラウンド（陰性対照抗体のＯＤ４５０ｎｍシグナル）より５倍超高い場合、ｒｈＬＧＲ４−Ｆｃ、ｒｈＬＧＦＲ５−Ｆｃ、ｒｈＺＮＲＦ３−Ｆｃ又はｒｈＲＮＦ４３−Ｆｃに結合するものとみなした。更に、ＴＴ及び４つのＷＮＴ標的（ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３）のうちの１つを標的とする二重特異性ＩｇＧのＦＡＣＳ解析を実施し、これらのそれぞれのＷＮＴ標的への特異的結合性を測定した。ＦＡＣＳ解析は、ＤｉＤ染色を用い、非標識Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２３９Ｆ細胞（ＤｉＤ−）を、標識した抗原陽性（ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＲＮＦ３又はｈＲＮＦ４３を発現する）Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（ＤｉＤ＋）と混合することにより、実施した。二重特異性ＩｇＧは、細胞の２つの混合物において、特異性について常に並行して試験した。ＬＧＲ４又はＬＧＲ５を標的とするＦａｂフラグメントを含む二重特異性ＩｇＧを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（抗原陰性Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞と混合した）を過剰発現するｈＬＧＲ４及びｈＬＧＲ５の両方において試験し、ＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３結合抗体を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（抗原陰性Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞と混合した）を過剰発現するｈＺＮＲＦ３及びｈＲＮＦ４３の両方において試験した。二重特異性ＩｇＧは、抗原陽性集団（ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＲＮＦ３又はｈＲＮＦ４３を安定的に発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞）のＭＦＩが、抗原陰性集団（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞）のＭＦＩよりも５倍超高い場合、ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＦＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３に特異的に結合するものとみなした。
【０３０６】
ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡの両方において、又はいくつかの場合ＦＡＣＳのみにおいて（ｈＬＧＲ４結合Ｆａｂフラグメント）、６６のうち４１のＬＧＲ４  Ｆａｂフラグメント、８４のうち６９のＬＧＲ５  Ｆａｂフラグメント、１０５のうち９２のＺＮＲＦ３  Ｆａｂフラグメント、３３のうち２９のＲＮＦ４３  Ｆａｂフラグメントが、これらのそれぞれの標的（ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３）に、二重特異性（Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標））形態で、特異的に結合することが分かった。
【０３０７】
二重特異性抗体パネルの特徴分析
ヒトＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３に特異的に結合することが確認された二重特異性一価のＩｇＧを、親和性、安定性、Ｒ−スポンジン３阻害能力、及びマウスオルソログ交差反応性について更に特徴分析し、その後、更に分割選定を行った。
【０３０８】
親和性タイトレーションのＦＡＣＳ解析
結合抗体を、制限的抗体ＦＡＣＳ（limited antibody FACS）でタイトレーションし、これらの親和性について、これらを順位付けした。ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３を過剰発現するＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞の細胞表面のｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３を標的とする一価のＩｇＧ（全て破傷風トキソイドＦａｂフラグメントと組み合わせた）。各ＩｇＧを、それぞれの該当する過剰発現Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞株において試験した。ＩｇＧの２倍希釈系列（５μｇ／ｍＬ〜０．０８μｇ／ｍＬ）を、ＷＮＴ標的を安定的に発現する一定数の細胞（５×１０５細胞／ウェル）において試験した。各個々の測定値からの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏ（ＦＡＣＳ解析ソフトウェアＢＤ）によって測定した。各ＩｇＧについてＭＦＩ値を抗体の濃度に対してプロットし、これらの曲線から、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。ＡＵＣ値に基づき、二重特異性ＩｇＧの順位付けを、標的ごとに行った。親和性順位付けに用いたデータの例を図８に示す。
【０３０９】
選定した抗体のマウスオルソログ交差反応性
二重特異性ＩｇＧの結合特性を更に明らかにするため、マウスオルソログ交差反応性を測定した。ｍＬｇｒ５、ｍＺＮＲＦ３及びｍＲＮＦ４３（ｐＥＦ１＿ｍＬｇｒ５−Ｍｙｃ−ＨＩＳ、ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｍＺｎｒｆ３−Ｍｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ）、ｐＤｉｓｐｌａｙ＿ｍＲｎｆ４３−Ｍｙｃ−ＰＤＧＦＲ（ＴＭ））のマウスオルソログを発現する構造体を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で一過性トランスフェクションした。濃度５μｇ／ｍＬの一価のＩｇＧを染色に用い、ＩｇＧの結合をＦＡＣＳによって解析した。非トランスフェクションのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞と比べ、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が２倍増加した場合、二重特異性ＩｇＧは、マウス交差反応性であるものとみなした。９２のうち９２の抗ＺＮＲＦ３  ＩｇＧが、ｍＺｎｒｆ３と交差反応性であり、２９のうち９の抗ＲＮＦ４３  ＩｇＧが、ｍＲｎｆ４３と交差反応性であり、６９のうち１８の抗ＬＧＲ５  ＩｇＧが、マウスＬｇｒ５オルソログと交差反応性であった。ｍＬｇｒ４交差反応性は、ＥＬＩＳＡで、ｒｍＬｇｒ４−Ｆｃ（ＲＮＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質について試験した。二重特異性ＩｇＧは、ＯＤ４５０ｎｍがバックグラウンド（陰性対照抗体のＯＤ４５０ｎｍシグナル）より５倍超高い場合に、ｍＬｇｒ４交差反応性であるものとみなした。ＩｇＧを、単一濃度５μｇ／ｍＬにおけるｒｍＬｇｒ４−Ｆｃへの結合について試験し、交差反応性を確認した。４１のうち３６の抗ＬＧＲ４  ＩｇＧが、試験の結果、ｍＬｇｒ４交差反応性であった。
【０３１０】
Ｒ−スポンジン阻害
ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３標的抗体がＲ−スポンジン３結合を阻害し得るか否かを試験可能とするため、全ての二重特異性ＩｇＧをリガンド阻害ＥＬＩＳＡで試験した。４つのＷＮＴ標的の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質の、コーティングされたＲ−スポンジン３への結合を、ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３を標的とする過剰の二重特異性ＩｇＧの存在下で試験した。異なる標的を標的とする二重特異性ＩｇＧを、それぞれのＦｃ融合タンパク質とｒｈＲ−スポンジン３との相互作用を阻害するこれらの能力について試験するため、これらの二重特異性ＩｇＧを、阻害ＥＬＩＳＡで試験した。ＩｇＧは、単一ＩｇＧ濃度１５μｇ／ｍＬを用いて試験した。
【０３１１】
クローンは、２つの独立したアッセイにおいて、ＯＤ４５０ｎｍシグナルが少なくとも５０％低下した場合、阻害しているものとみなした。ＯＤ４５０ｎｍシグナルの低下が２０〜５０％のみの場合、これらのクローンは、部分的に阻害しているものとみなした。ＩｇＧのサブセット、ＺＮＲＦ３を標的とするＩｇＧ（４８）、ＲＮＦ４３を標的とするＩｇＧ（１０）、完全ＬＧＲ４を標的とするＩｇＧ（４１）及びＬｇｒ５パネルを標的とするＩｇＧ（６９）を、Ｒ−スポンジン阻害能力について試験した。ＬＧＲ４については、３つが阻害し、５つが部分阻害した。ＺＮＲＦ３については、１つの阻害剤及び１つの部分阻害剤が確認された。ＲＮＦ４３については、３つの阻害剤及び２つの部分阻害剤が確認され、全てが２つの異なるスーパークラスターに属していた。ＬＧＲ５パネルについては、Ｒ−スポンジン３の結合を部分的に阻害した１０のＩｇＧが確認された。Ｒ−スポンジン３阻害アッセイで生成したデータの例を、図９に示す。
【０３１２】
抗体の４０℃における安定性の測定
二重特異性ＩｇＧの安定性の指標を得るため、全てのＩｇＧを、血清を含む培地において４０℃で１週間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡでの結合を、同一の培地において４℃でインキュベートした二重特異性抗体の結合と比較した。１週間後、ＩｇＧをＥＬＩＳＡスクリーニングに用い、ＩｇＧがこれらの標的への結合を維持しているか否かを測定した。結合は、４℃での１週間のインキュベーションに比べ、４０℃での１週間のインキュベーション後に残存したＯＤ４５０ｎｍシグナルの百分率で求めた。ほとんどのＩｇＧを２回試験し、ＩｇＧが２つの独立したアッセイにおいて、その結合を少なくとも５０％保持した場合、安定であるとみなした。２つの試験において安定性がばらついた場合、これらのＩｇＧは部分的に安定であるとみなし、ＩｇＧの結合の保持が２回とも５０％未満であった場合、これらは不安定であるとみなした。ＬＧＲ４については、４１のうち１２のＩｇＧが結合を保持し（７つが部分的に安定、２つが未確定で、ＥＬＩＳＡにおいて結合しなかった）、ＬＧＲ５については、６９のうち３８のＩｇＧが結合を保持し（７つが部分的に安定）、ＺＮＲＦ３については、９２のうち２８のＩｇＧが結合を保持し（１０が部分的に安定）、ＲＮＦ４３については、２９のうち１０のＩｇＧが結合を保持した（９が部分的に安定）。
【０３１３】
二重特異性ＩｇＧの順位付け及び選定
特徴分析終了後、データを収集し、得られた全てのデータに基づいて順位付けを行った。フォローアップの機能的スクリーニング用のＷｎｔ標的Ｆａｂフラグメントの選定は、下記のように実施した。
４０℃で少なくとも５０％の結合を保持した二重特異性ＩｇＧを選定した。次いで、最も高い親和性結合体を選定した。この選定は、異なる特徴、例えば、マウスオルソログ交差反応性又はＲ−スポンジン阻害能力を有する結合体を含んだ。機能的スクリーニング用に、４つの異なるＷＮＴ標的を標的とする二重特異性Ｆａｂフラグメントを、合計５４選定した。ＬＧＲ４については、４１のうち１０のＦａｂフラグメント、ＬＧＲ５については、６９のうち１７のＦａｂフラグメント、ＺＮＲＦ３については、９２のうち１８のＦａｂフラグメント、ＲＮＦ４３については、２９のうち９のＦａｂフラグメントを選定した（表３）。
【０３１４】
機能的スクリーニング用のパネルの作製
選定したｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３に対するＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントを、二重特異性抗体の大型パネル（５００超の二重特異性抗体）の作製に用いた。選定したＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントを、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）結合Ｆａｂフラグメントと組み合わせ、二重特異性ＩｇＧのパネルとして作製し、精製した。細胞アッセイにおいて受容体活性化を阻害するために選定された、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的なＦａｂフラグメントは、二重特異性形態で組み合わせた場合、他のＦａｂフラグメントの機能は阻害しない。４つのＥＧＦＲ  Ｆａｂフラグメント、ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０、ＭＦ３３７０及びＭＦ４２８９、並びに４つのＨＥＲ３  Ｆａｂフラグメント、ＭＦ３１７８、ＭＦ３１７６、ＭＦ３１２５及びＭＦ４８６３を、選定したＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントとの組み合わせで用いた（作製したパネルの分割選定については、表５を参照）。
【０３１５】
二重特異性抗体は、ＷＮＴアームを正に帯電したＫＫ変異を含む重鎖上に発現させ、かつＲＴＫアームを負に帯電したＤＥ変異を含む重鎖上に発現させる、ＩｇＧベクターの同時発現によって作製し、精製し、これらの標的結合、特異性及び安定性について検証した。結合及び安定性品質管理（ＱＣ）に適合した二重特異性抗体のパネルを、機能的スクリーニングに用いた（５４のうち５３のＷＮＴ標的ＦａｂフラグメントがＱＣに適合した）。４つのＷＮＴ標的（ｈＬＧＲ４、ｈＬＧＲ５、ｈＺＮＲＦ３又はｈＲＮＦ４３）のうちの１つと、ＥＧＦＲ若しくはＨＥＲ３  Ｆａｂフラグメント、又はモック陰性対照Ｆａｂフラグメントとしての破傷風トキソイドとを標的とする、５００超の精製されかつ検証された二重特異性抗体のパネルを、下記の機能的スクリーニングアッセイにおいて、患者由来オルガノイドに対するこれらの活性についてスクリーニングした。
【０３１６】
実施例４：結腸オルガノイドにおける二重特異性抗体の機能的スクリーニング
結腸オルガノイドは、機能的管腔を形成する上皮結腸構造の形成を可能とする、成長因子を含む拡大培地中で培養した、ＬＧＲ５陽性（癌）幹細胞由来である（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４１：１７６２〜１７７２）。オルガノイドの成長、発達及び管腔形成は、結腸直腸癌細胞の遺伝的背景と、成長を刺激する成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）又はニューレグリン−１（ＮＲＧ）／ヘレグリン（ＨＲＧ）への反応とによって異なる。異なる患者由来のＣＲＣチューモロイドの形態は大きく異なり、形態的プロファイルは、同一起源のチューモロイド間では一致し、チューモロイドは、これらが由来した元の腫瘍と、遺伝的にはほとんど同一である。そのため、培養したＣＲＣオルガノイドの画像のハイコンテンツ定量解析は、異なる患者由来のＣＲＣオルガノイドを区別することができ、また、シグナル伝達経路の活性化（例えば、ＨＥＲ受容体、例えばＥＧＦ及びＨＲＧのリガンドによって誘導される）に伴う形態的変化の測定に用いることもできる。同様に、機能阻害抗体又は他の治療用分子によるこれらの反応の抑制を、測定することができる。画像に基づく解析により、細胞増殖とは無関係であり得る形態の変化を測定することができ、化合物の活性について、従来の増殖アッセイから得られる情報に対し、更なる情報をもたらす。そのため、化合物誘導性の表現型の変化は、ＣＲＣオルガノイドにおける抗体の機能的スクリーニングに対する基礎となる。
【０３１７】
開発された二重特異性抗体は、ＷＮＴシグナル伝達関連細胞表面発現タンパク質ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３を標的とすることと組み合わせ、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３のいずれかを標的とする。スクリーニング系は、二重特異性抗体の活性による、チューモロイドの成長の抑制をモニターするよう設計されている。これは、特定の経路の標的化された抑制に感応性のオルガノイド（及び関連する分子プロファイル）の選定、また、オルガノイドにおいて活性な新規分子の選定の両方に用いることができる。
【０３１８】
結腸チューモロイドモデルの選定
選別に用いる結腸チューモロイドモデルは、ＥＧＦ、ＨＲＧ又はＷＮＴ３Ａに反応した形態的変化の実証に基づいて選定した。これらの因子への形態的な反応を、異なる患者起源の、２０のチューモロイドのパネルにおいて検査した（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｃｅｌｌ  １６１：９３３〜４５）。まず、チューモロイドを拡大させ、分割し、３８４ウェルプレートに再接種し、成長１週間後の基本的な形態を解析し、記録した。次に、拡大培地中にＥＧＦ若しくはＨＲＧが存在する、又は、成長因子が存在しない条件で、同一の２０のチューモロイドを、成長因子に対するこれらの反応性について試験した。これを行うため、全５００の形態的特徴を解析し、可溶性因子によって誘導された変化を測定した。成長因子反応性の測定、並びに成長因子依存性のチューモロイド培養物と成長因子非依存性のチューモロイド培養物との区別を可能とする、一連の頑健な特徴を、各オルガノイドについて選定した（表４を参照）。これによって、単一の特徴だけでは、異なるＣＲＣオルガノイドにおいて反応を至適に定量化するのに不十分であることが実証された。これらのデータに基づき、以下のチューモロイド株を選定した。すなわち、成長、及びチューモロイド内の分枝化した管腔構造の形成について重度にＥＧＦＲシグナル伝達依存性であるＰ１８Ｔ（ＡＰＣｍｕｔ）；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３シグナル伝達及び抑制に対し、明確な形態的変化効果を示すＰ１４Ｔ（ＡＰＣｍｕｔ、ＳＭＡＤ４ｍｕｔ）；ＡＰＣ変異が欠如し、そのため、拡大についてＷＮＴ３Ａに依存するチューモロイドモデルとしてのＰ１９Ｔｂ（ＡＰＣｗｔ、ただし、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＰ５３、ＢＲＡＦ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ２、ＥＲＢＢ３、ＰＯＬＥ及びＲＮＦ４３変異体以外）；最後に、拡大について成長因子の存在に依存性を呈さないモデルとしてのＰ２６Ｔ（ＡＰＣｍｕｔ、ＫＲＡＳｍｕｔ、ＴＰ５３ｍｕｔ及びＣＴＮＮＢ１ｍｕｔ）。二重特異性抗体の最初のスクリーニングにおいて、Ｐ２６Ｔは、いずれの成長因子依存性も、成長因子受容体標的抗体への感応性も示さず、更なる抗体スクリーニングからは除外した。
【０３１９】
二重特異性抗体中の機能性Ｆａｂフラグメントの同定
結腸チューモロイドの形態的特徴を変化させることが可能な機能性二重特異性抗体を同定するため、二重特異性抗体を、ＥＧＦ刺激のない成長条件と比較し、また、ＥＧＦ成長条件において、ＥＧＦＲ／ＭＡＰＫシグナル伝達抑制化合物（例えばセツキシマブ及びトラメチニブ）の効果と比較した。機能性二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ／ＭＡＰＫシグナル伝達阻害剤及び／又はＥＧＦを培地から除外することによって得られた形態的プロファイルの方向への、ＥＧＦ条件におけるチューモロイドの拡大を制限する二重特異性抗体の能力によって特定した。ＥＧＦＲ標的アームの作用を増強したＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントは、同等の一価の（二重特異性ＥＧＦＲ×ＴＴ）標的Ｆａｂフラグメントに比べ、有意に増強した成長抑制能力を示したものであった。
【０３２０】
ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＺＮＲＦ３又はＲＮＦ４３のみを（非標的破傷風トキソイド（ＴＴ）−Ｆａｂフラグメントとの組み合わせで）標的とした二重特異性抗体を、成長因子を含まない培地（Ｐ１９Ｔｂ）、又はＥＧＦ若しくはＨＲＧを含む培地（Ｐ１８Ｔ及びＰ１４Ｔ）のいずれかにおける陰性対照の形態と比較し、ＷＮＴシグナル伝達受容体のみを標的とする潜在的効果を検討した。
【０３２１】
ＨＥＲ３標的Ｆａｂフラグメントを有する二重特異性抗体を、ＨＲＧ刺激のない成長条件と、又は、ＨＲＧ条件におけるＨＥＲ３標的抗体及びＰＩ３Ｋ阻害剤の効果と、機能的に比較した。機能性ＨＥＲ３抑制二重特異性抗体は、ユークリッド空間における、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、トラメチニブ、非ＨＲＧ培養条件及び／又はＨＥＲ３標的参照抗体と同一方向へのＨＲＧ刺激成長反応を抑制したものであると、定義した。成長抑制効果に関して、同等の一価のＨＥＲ３二重特異性抗体に比べ、ＨＥＲ３標的アームの作用を増強したＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントを、候補の標的Ｆａｂフラグメントとみなした。
【０３２２】
一次選別における二重特異性抗体候補の選定
ＥＧＦの存在下で、Ｐ１４Ｔ及びＰ１８Ｔ結腸チューモロイドの形態に、成長因子の不在下、若しくは参照ＥＧＦＲ／ＭＡＰＫ阻害剤の存在下における表現型に近い、一致する、又は表現型を超える変化を誘導した二重特異性抗体を、潜在的な候補として特定した。ＥＧＦ条件と同様に、効果が、成長因子がない条件の陰性対照、及び／若しくは参照ＨＥＲ３／ＰＩ３Ｋ阻害剤の距離に近づく、一致する、又は、陰性対照の距離を超えた場合、ＨＲＧ培養条件で試験した抗体を、フォローアップに指定した。成長因子処理に比較的非感応性であったＰ１９Ｔｂについては、機能的抗体選定は、トラメチニブ及びＰＩ３Ｋ阻害剤ＣＨ５１３２７９９によって誘導された形態プロファイルを特徴とする陰性対照からの距離の算出に基づいた。
【０３２３】
二重特異性パネルを、３つの異なる結腸チューモロイド（Ｐ１８Ｔ、Ｐ１４Ｔ及びＰ１９Ｔｂ）においてスクリーニングした。スクリーニングした抗体パネルにより、５３の異なるＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメント及び１つのＴＴ標的Ｆａｂフラグメントとの、４つの異なるＥＧＦＲ標的Ｆａｂフラグメントとの組み合わせ、４つの異なるＨＥＲ３標的Ｆａｂフラグメントとの組み合わせ、及び１つの抗破傷風トキソイド（陰性対照）Ｆａｂフラグメントとの組み合わせを試験した。各二重特異性抗体を、チューモロイドの成長を抑制するそれぞれの能力についてスコア化した。ＴＴ／ＷＮＴフラグメントの組み合わせは、いずれもチューモロイドの成長を抑制しなかった（０／５３）。ＥＧＦＲ標的Ｆａｂフラグメントの群内では、ＭＦ３７５５Ｆａｂフラグメントが最も強力であり、５３のうち２２の二重特異性ＭＦ３７５５／ＷＮＴＦａｂフラグメントの組み合わせがチューモロイドの発達を抑制した。これに次ぐＥＧＦＲ標的フラグメントはＭＦ４２８０で、５３のうち４つが、活性な抑制ＥＧＦＲ／ＷＮＴＦａｂフラグメントの組み合わせであった。１つ（１／５３）のＥＧＦＲ標的二重特異性ＭＦ３３７０／ＷＮＴＦａｂフラグメントの組み合わせが抑制活性を示し、チューモロイドの成長を有意に制限するＥＧＦＲ標的二重特異性ＭＦ４２８９／ＷＮＴＦａｂフラグメントの組み合わせはなかった（０／５３）。二重特異性抗体を含むＨＥＲ３標的Ｆａｂフラグメントの群内では、ＭＦ３１７８  ＦａｂフラグメントのＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントとの組み合わせが最も強力であり、５２のうち１９のＭＦ３１７８／ＷＮＴの組み合わせが、チューモロイドの成長を抑制した。これに次ぐＨＥＲ３標的ＦａｂフラグメントはＭＦ４８６３で、５３のうち６つが、活性なＭＦ４８６３／ＷＮＴ二重特異性抗体であった。ＨＥＲ３標的ＦａｂフラグメントＭＦ３１２５及びＭＦ３１７６を含む二重特異性抗体は、有意なチューモロイドの成長抑制を示さなかった（ＭＦ３１２５（０／５３）及びＭＦ３１７６（０／５２））。
【０３２４】
順位を付けると、ＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントとの二重特異性ＩｇＧ形態での最も強力な組み合わせのＲＴＫ標的Ｆａｂフラグメントは、ＥＧＦＲ標的ＦａｂフラグメントとしてはＭＦ３７５５、また、ＨＥＲ３標的ＦａｂフラグメントとしてはＭＦ３１７８であった。ＬＧＲ４標的ＦａｂフラグメントＭＦ５７７７及びＭＦ５７８１、ＬＧＲ５標的ＦａｂフラグメントＭＦ５７９０、ＭＦ５８０３、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１６、ＭＦ５８１７及びＭＦ５８１８、ＲＮＦ４３ＦａｂフラグメントＭＦ５８３２及びＭＦ５８３６、並びにＺＮＲＦ３標的ＦａｂフラグメントＭＦ５８５０、ＭＦ５８５３、ＭＦ５８５５、ＭＦ５８８４及びＭＦ５８８８を、ＲＴＫ標的Ｆａｂフラグメントと二重特異性ＩｇＧ形態で組み合わせた際のＰ１８Ｔ、Ｐ１４Ｔ及びＰ１９Ｔｂチューモロイド形態に対する機能的効果に基づく検証選別に進む、潜在的な候補として特定した。ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＲＮＦ４３及びＺＮＲＦ３標的Ｆａｂフラグメントを、ＥＧＦＲ標的ＦａｂフラグメントＭＦ３７５５、ＨＥＲ３標的ＦａｂフラグメントＭＦ３１７８、又は非標的ＴＴ  ＦａｂフラグメントＭＦ１３３７のいずれかと組み合わせ、新たなバッチで作製し、フォローアップの検証選別において、これらの活性を確認した。
【０３２５】
二重特異性ＲＴＫ／ＷＮＴ抗体の検証選別
ＲＴＫ／ＷＮＴ二重特異性抗体の候補は、ＥＧＦ及びＨＲＧの両方の培養条件において、潜在的、理論的に関連のある活性を示しているため、二重特異性候補抗体の検証選別もまた、２つの成長因子条件、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ又は５ｎｇ／ｍＬのＨＲＧにおいて実施した。対照は、ＥＧＦ又はＨＲＧのいずれも含まない培地を入れたウェルを含んだ。成長因子条件で用いた他の対照は、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、ＰＧ３７５５（ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）、トラメチニブ（ＭＥＫ）、ＣＨ５１３２７９９（ＰＩ３Ｋ）、ＰＧ３１７８（ＨＥＲ３／ＨＥＲ３）、ＰＧ２８６３（ＨＥＲ３／ＨＥＲ３）、ＰＧ３７９４（ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ）及びＰＢ４５２２（ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ）である。ＰＧ１３３７（ＴＴ／ＴＴ）は陰性対照抗体の役割をし、それぞれ化合物で処理したウェル、又は抗体で処理したウェルとして、同じ体積のＤＭＳＯ又はＰＢＳを加えたウェルと共に、陰性対照と呼んだ。
【０３２６】
４６の二重特異性抗体の抗体検証選別を、異なる患者を起源とする２４の結腸チューモロイドにおいて、２回又は４回の反復実験で実施した。一連の、試験した結腸チューモロイド株は、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇらの記載（２０１５  Ｃｅｌｌ  １６１：９３３〜４５）の３つの成長因子依存性の患者試料Ｐ１８Ｔ、Ｐ１４Ｔ及びＰ８Ｔ、並びに２つの成長因子非依存性の患者試料Ｐ１９Ｔｂ及びＰ２８Ｎからなっていた。新たな一連の１９の結腸チューモロイド、すなわち、１０の成長因子依存性の原発性結腸チューモロイド株、５つの成長因子非依存性の原発性結腸チューモロイド株、及び４つの（成長因子依存性の）転移性結腸チューモロイド株をスクリーニングした。２４の異なる患者由来結腸チューモロイド株における二重特異性抗体候補のスクリーニングの結果、チューモロイドの成長についての成長因子依存性により、ＲＴＫ標的Ｆａｂフラグメントを介した腫瘍の抑制が特定可能であることが示された。
【０３２７】
形態プロファイルを、スケール０（成長が完全に抑制されたプロファイルに等しい表現型）及び１（陰性対照と同様の表現型）で規準化することにより、二重特異性抗体検証選別において機能性結腸腫瘍抑制抗体を特定するためのカットオフを算出した。単一の抗体が、特定の用量で、特定のチューモロイド株におけるスコアが毎回０．５未満である場合、この抗体処理を、腫瘍の発達の抑制を示しているものとみなした。抗体が特定の用量で、ＥＧＦ又はＨＲＧのいずれかの培養条件において抑制を示した回数をスコア化し、その条件についての、処理したウェルの数の百分率として表した。この百分率を、２４のスクリーニングした結腸チューモロイド株全てにおいて算出した。
【０３２８】
２４の結腸チューモロイドにおける検証選別により、ＲＴＫ−Ｆａｂフラグメントを介した腫瘍の発達抑制を増強した４つのＬＧＲ５標的Ｆａｂフラグメント及び２つのＲＮＦ４３標的Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＬＧＲ５標的抗体ＦａｂフラグメントとしてＭＦ５８１６、ＭＦ５８１４、ＭＦ５８１８及びＭＦ５７９０を、また、ＲＮＦ４３標的ＦａｂフラグメントとしてＭＦ５８３２及びＭＦ５８３６を特定した。最高順位の抗体は、標的ＦａｂフラグメントＭＦ３７５５及びＭＦ５８１６から構成されるＥＧＦＲ／ＬＧＲ５二重特異性抗体ＰＢ１０６５１であった（図１０）。ＨＲＧ条件では、最高順位の抗体は、標的ＦａｂフラグメントＭＦ３１７８及びＭＦ５８１６から構成されるＨＥＲ３／ＬＧＲ５二重特異性抗体ＰＢ１０７４８であった。これは、２つの独立した成長因子条件において、かつ２つの異なるＲＴＫ標的Ｆａｂフラグメントとの組み合わせにおいて、ＬＧＲ５標的ＦａｂフラグメントＭＦ５８１６が、ＲＴＫ標的を増強する最も強力なＷＮＴ標的Ｆａｂフラグメントであることを示した。ＰＢ１０６５１中のＭＦ３７５５と組み合わせたＭＦ５８１６は、チューモロイドの成長及び発達を強力に低下させることによって、別のレベルの腫瘍抑制をもたらし、これは、管腔形成の更なる低下、細胞の収縮、及び細胞核の円形化（rounding up of the nuclei）によって確認できる。これらの形態的所見は、ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５抗体ＰＢ１０６５１が、上皮成長因子シグナル伝達を有効に阻害し、成長に障害のあるチューモロイド細胞において細胞死反応を誘導することを示している（図１１）。この形態表現型は、ＥＧＦＲ標的抗体セツキシマブでも、また、ＭＦ３７５５を従来型ＩｇＧの形態とした場合も観察されなかった。
【０３２９】
リード候補抗体の選定
ＰＢ１０６５１（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５二重特異性抗体（ＦａｂフラグメントＭＦ３７５５及びＭＦ５８１６から構成される））を、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ条件において、以下の特徴から、第１のリード候補抗体として選定した。すなわち、ＰＢ１０６５１は、１０μｇ／ｍＬの試験用量で、２４の異なる結腸チューモロイドモデルの７５％において、強力な抑制効果を示した。２）ＰＢ１０６５１の１０μｇ／ｍＬで処理したウェルの６７％（４０／６０）が、５０％超の成長低下を示した。３）５２％（５９のうち３１のウェル）が、ＰＢ１０６５１の２μｇ／ｍＬでの処理に対し、５０％超の成長低下を示した。４）ＰＢ１０６５１は、セツキシマブ（１０μｇ／ｍＬで４７％（５６／１１９）、２μｇ／ｍＬで２９％（３５／１１９））及びＥＧＦＲ／ＴＴ参照抗体ＰＢ９９１９（１０μｇ／ｍＬで２７％（１６／６０）、２μｇ／ｍＬで５％（３／６０））よりも効果が優れていた。
【０３３０】
ＰＢ１０６４７（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５  ＭＦ３７５５×ＭＦ５８１４）は第２の候補抗体であり、２４の異なるチューモロイドモデルの５４％（１３／２４）を１０μｇ／ｍＬで抑制し、５０％超の成長低下が、１０μｇ／ｍＬでは、暴露したウェルの５２％（３１／６０）で、２μｇ／ｍＬでは３７％（２２／６０）で認められた。
【０３３１】
他のＥＧＦＲ／ＬＧＲ５抗体は、ＰＢ１０６５９（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８１８）が、２４のチューモロイドモデルの５０％（１２／２４）で有効であり、ＰＢ１０６５９に１０μｇ／ｍＬで暴露したウェルの５０％（３０／６０）、２μｇ／ｍＬでは３２％（１９／６０）が抑制を示した。ＰＢ１０６２７（ＭＦ３７５５×ＭＦ５７９０）は、４２％のチューモロイド（１０／２４）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは３９％のウェル（２３／５９）、２μｇ／ｍＬでは３３％のウェル（２０／６０）で低下を示した。ＰＢ１０６３１（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８０３）は、３３％のチューモロイド（８／２４）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは３４％のウェル（２０／５９）、２μｇ／ｍＬでは１２％（７／５９）で抑制を示した。ＰＢ１０６５５（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８１７）は、２４のチューモロイドモデルの２０％（５）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは２５％のウェル（１５／６０）、２μｇ／ｍＬでは６／６０（１０％）で抑制を示した。
【０３３２】
ＥＧＦＲ／ＬＧＲ４抗体ＰＢ１０６１９（ＭＦ３７５５×ＭＦ５７７７）は、２９％（７／２４）のチューモロイドモデルで有効であり、チューモロイドの抑制を、１０μｇ／ｍＬでは２８％（１７／６０）のウェルで、２μｇ／ｍＬでは１５％（９／６０）でもたらした。ＥＧＦＲ／ＬＧＲ４抗体ＰＢ１０６２３（ＭＦ３７５５×ＭＦ５７８１）は、２４のうち８つのチューモロイドモデル（３３％）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは３０％のウェル（１８／６０）、２μｇ／ｍＬでは１０％のウェル（６／６０）で抑制を示した。
【０３３３】
ＥＧＦＲ／ＲＮＦ４３抗体ＰＢ１０６６１（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８３２）は、２４のうち１３のチューモロイドモデル（５４％）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは４２％のウェル（２５／６０）、２μｇ／ｍＬの試験用量では２２％（１３／６０）で抑制を示した。ＥＧＦＲ／ＲＮＦ４３抗体ＰＢ１０６６７（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８３６）は、２４のうち１３のチューモロイドモデル（５４％）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは３５％のウェル（２１／６０）、２μｇ／ｍＬでは２０％のウェル（１２／６０）で抑制を示した。
【０３３４】
ＥＧＦＲ／ＺＮＲＦ３抗体は、ＰＢ１０６７５（ＭＦ３７５５×Ｆ５８５０）が、２４のうち８つのチューモロイドモデル（３３％）で有効であり、５０％超の抑制を、１０μｇ／ｍＬでは試験したウェルの３５％（２１／６０）が、２μｇ／ｍＬでは１５％（９／６０）が示し、ＰＢ１０６９５（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８８４）は、３７％のチューモロイド（９／２４）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは３４％（２０／５９）、２μｇ／ｍＬでは１２％（７／５９）で抑制を示し、ＰＢ１０６７９（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８５３）は、チューモロイドモデルの２１％（５／２４）でチューモロイドの発達を抑制し、１０μｇ／ｍＬではウェルの２０％（１２／６０）で抑制し、ＰＢ１０７０３（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８８８）は、２４のうち５つのチューモロイドモデル（２１％）で有効であり、１０μｇ／ｍＬでは２２％のウェル（１３／６０）、２μｇ／ｍＬでは１２％のウェル（７／５９）で抑制を示した。
【０３３５】
ＦａｂフラグメントＭＦ３１７８及びＭＦ５８１６から構成されるＨＥＲ３／ＬＧＲ５抗体であるＰＢ１０７４８は、ＨＲＧ刺激チューモロイド抑制抗体として、試験した結腸チューモロイドモデルの６２％（１５／２４）で有効であり、暴露したウェルの５６％（６７／１２０）で抑制を示した。ＰＢ１０７４８は、ＨＥＲ３／ＴＴ参照抗体ＰＢ９２１５（ＭＦ３１７８×ＭＦ１３３７；ＨＲＧ刺激チューモロイドの発達の５０％超を、３４％（４１／１２０）の暴露したウェルで抑制した）よりも効果が優れていた。
【０３３６】
他のＨＥＲ３／ＬＧＲ５抗体は、ＰＢ１０７３５（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８１４）が、２４のうち１１のチューモロイドモデル（４６％）で有効であり、４３％の暴露したウェル（５１／１１８）で抑制を示し、ＰＢ１０７５６（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８１８）は、２４のうち８つ（３３％）のチューモロイドモデルで有効であり、暴露したウェルの３７％（４４／１１９）で抑制を示し、ＰＢ１０７１５（ＭＦ３１７８×ＭＦ５７９０）は、２４のうち１２（５０％）のチューモロイドモデルで有効であり、ウェルの４２％（４９／１１７）で抑制を示し、ＰＢ１０７１９（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８０３）は、２４のうち７つ（２９％）のチューモロイドモデルで有効であり、暴露したウェルの３４％（４０／１１９）で抑制を示し、ＰＢ１０７５２（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８１７）は、２４のうち１２（５０％）のチューモロイドモデルで有効であり、ウェルの２８％（３３／１２０）で抑制を示した。
【０３３７】
２つのＨＥＲ３／ＲＮＦ４３抗体は、ＰＢ１０７６４（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８３６）が、２４のうち１７のチューモロイドモデル（７１％）で有効であり、暴露したウェルの３８％（４６／１２０）で抑制を示し、ＰＢ１２３３６（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８３２）は、２４のうち１１のチューモロイドモデル（４６％）で有効であり、暴露したウェルの４１％（４９／１２０）で抑制を示した。
【０３３８】
２つのＨＥＲ３／ＬＧＲ４抗体は、ＰＢ１０７１１（ＭＦ３１７８×ＭＦ５７８１）が、６２％のチューモロイドモデル（１５／２４）で有効であり、暴露したウェルの５０％（５９／１１９）で抑制を示し、ＰＢ１０７０７（ＭＦ３１７８×ＭＦ５７７７）は、試験したチューモロイドモデル２４のうち１３（５４％）で有効であり、暴露したウェル１２０のうち４１（３４％）で抑制を示した。
【０３３９】
ＨＥＲ３及びＺＮＲＦ３の両方を標的とする二重特異性抗体は、ＰＢ１０７７６（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８５３）が、ＨＲＧに暴露したチューモロイドモデル２４のうち１１（４６％）で有効であり、暴露したウェルの４０％（４８／１２０）で抑制を示し、ＰＢ１０７７２（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８５０）は、２４のうち１２のモデル（５０％）で有効であり、暴露したウェルの３９％（４６／１１９）で抑制を示し、ＰＢ１０７８０（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８５５）は、２４のうち８つ（３３％）の結腸チューモロイドモデルで有効であり、暴露したウェルの３１％（３７／１１９）で抑制を示し、ＰＢ１０８００（ＭＦ３１７８×ＭＦ５８８８）は、２４のうち１２のチューモロイドモデル（５０％）で有効であり、暴露したウェルの２９％（３４／１１９）で抑制を示した。
【０３４０】
実施例５：リード候補抗体の特徴分析
細胞アッセイを用いた二重特異性抗体結合の親和性測定。
ヨウ素化手順を最適化した後、特定の放射能４０ＧＢｑ／μｍｏｌで標識されたＰＢ１０６５１タンパク質を入手した。放射化学的純度は、タンパク質沈殿による分析で９９％超であった。Ｌｉｎｄｍｏアッセイにおいて、免疫反応性のわずかな低下のみが観察された。ＥＧＦＲ及びＬＧＲ５に対する１２５Ｉ−ＰＢ１０６５１の免疫反応性は、ＥＧＦＲ又はＬＲＧ５のいずれかを発現するＣＨＯ細胞を用い、８９％超であると推定された。Ｌｉｎｄｍｏアッセイの結果は、図１２に示す。定常状態の親和性測定を用い、１２５Ｉ−ＰＢ１０６５１のＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞に対するＫＤは、測定の結果０．８６±０．１３ｎＭであり、ＣＨＯ−ＥＧＦＲ細胞に対する１２５Ｉ−ＰＢ１０６５１のＫＤは、０．２２±０．０８６ｎＭであることが分かった。１２５Ｉ−ＰＢ１０６５１のＤＬＤ−１細胞に対するＫＤは、０．１８±０．０２４ｎＭと推定された。データの例を図１３に示す。
【０３４１】
ショットガン突然変異誘発分析によるＰＢ１０６５１のエピトープマッピング
ＰＢ１０６５１に存在する両方のＦａｂアームによってそれぞれ認識される、ＥＧＦＲ及びＬＧＲ５上のエピトープをマッピングするため、ショットガン突然変異誘発法を用いた。両方のＦａｂアームの、それぞれの抗原への結合に関連した残基を、明確に特定することが可能であった。ＥＧＦＲ又はＬＧＲ５のいずれかへのＰＢ１０６５１の結合を阻害し、かつ対照抗体（関連の残基を識別する）の結合を抑制しなかった突然変異を、表８に示す。これらのデータは、通常はリガンドＥＧＦに接触している部位と部分的に重複しているドメインＩＩＩ（Ｏｇｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を、抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームが認識することを示している。これは、ＰＢ１０６５１が、リガンドとＥＧＦＲとの相互作用を直接阻害し得ることを示している。このエピトープを、図１４のＥＧＦＲの構造（ｐｄｂ参照１ＹＹ９）中に示す。ＬＧＲ５を認識するＦａｂアームは、Ｎ−ＣＡＰドメインと第１のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）とに配置される残基を認識することが示された。残基を、ＲＳＰＯ  １との複合体中のＬＧＲ５の構造（ｐｄｂ参照４ＢＳＲ、Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）で、図１５に示す。
【０３４２】
参考文献：
Ｌｉ  Ｓ，Ｓｃｈｍｉｔｚ  ＫＲ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．Ａｐｒ；７（４）：３０１〜１１．
Ｏｇｉｓｏ，Ｈ．Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１０，７７５〜７８７．
Ｐｅｎｇ，Ｗ．Ｃ．ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＧＲ５．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ２７；３（６）：１８８５〜１８９２．
【０３４３】
細胞アッセイを用いたＰＢ１０６５１中の抗ＬＧＲ  Ｆａｂアームの結合に対するリガンドＲ−スポンジン１による競合
ＰＢ１０６５１中に存在する抗ＬＧＲ５  Ｆａｂアームが、リガンドＲ−スポンジン１の存在下でＬＧＲ５に結合する能力の測定を可能とするため、細胞アッセイを設定した。リガンド阻害抗ＬＧＲ５抗体ＯＭＰ８８Ｒ２０（ＰＧ７７１１）のＬＧＲ５発現細胞クローンへの結合についてのＥＣ５０は、測定の結果５０ｎｇ／ｍＬ（３３３ｐＭ）であり、次いで、この濃度を用い、リガンドＲ−スポンジン１によるＬＧＲ５への結合を測定した。図１６は、ＦＡＣＳにおいて、加えたＲ−スポンジン１の濃度の関数として測定した、ＬＧＲ５発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に結合するＯＭＰ８８Ｒ２０のＭＦＩシグナル（Ｒ−スポンジン１不在下で得たＭＦＩシグナルに対して規準化した）を示す。次いで、二重特異性抗（ＴＴ×ＬＧＲ５）抗体を、ＬＧＲ５発現ＣＨＯ細胞クローンに結合する抗体の能力について、その都度濃度を増加させたＲ−スポンジン１の存在下で試験した。ＰＧ７７１１を、陽性対照として５０ｎｇ／ｍＬで含ませた。二重特異性抗体を、まず、ＬＧＲ５を発現するＣＨＯ細胞クローンへの結合について濃度範囲で試験し、ＦＡＣＳにおいて結合のＥＣ５０を測定した。ＥＣ５０は、リードＦａｂ  ＭＦ５８１６を含むＰＢ１０２８６については１５６ｎｇ／ｍＬ、ＭＦ５７９０を含むＰＢ１０２６１については２００ｎｇ／ｍＬであることが、分かった。しかしながら、用いたアッセイにおける同一濃度の抗原特異的Ｆａｂ又はＰＧ７７１１を比較するため、また、場合によっては、アッセイの感度を上げるため、二重特異性抗体は、１００ｎｇ／ｍＬで試験した。図１７は、リード抗ＬＧＲ５  Ｆａｂ  ＭＦ５８１６は、大過剰モル（１２０倍）のリガンドの存在下であっても、結合ＬＧＲ５によって抑制されず、一方、同一のアッセイにおいて、ＯＭＰ８８Ｒ２０の複製品は完全に抑制されたことを示している。更に、ＰＢ１０２６１（ＬＧＲ５標的アームＭＦ５７９０を含む）の結合の低下が確認され、このアッセイは、リガンド阻害抗ＬＧＲ５  Ｆａｂとリガンド非阻害抗ＬＧＲ５  Ｆａｂとを区別可能であることが実証された。１Ｄ９ラット抗ＬＧＲ５抗体を阻害アッセイに用いた場合は、差及び競合が確認されず（図１７）、相互作用の特異性が実証された。
【０３４４】
参考文献：
ｄｅ  Ｌａｕ  Ｗ，Ｂａｒｋｅｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｇｒ５  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｗｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊｕｌ  ４；４７６（７３６０）：２９３〜７．
【０３４５】
細胞アッセイを用いたＰＢ１０６５１の抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームのリガンド阻害能力。
ＰＢ１０６５１の抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームが、ＥＧＦを介したシグナル伝達を阻害する能力を試験するため、細胞アッセイを用いた。図１８は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦを介した細胞死を阻害するＰＧ３７５５の力価（Ｇｕｌｌｉらによって記載された方法に従って試験した）を、セツキシマブの力価と比較して示している。抗体は、ＥＧＦを介したシグナル伝達を、少なくともセツキシマブの力価と同等の力価で阻害する。
【０３４６】
参考文献：
Ｇｕｌｌｉ，Ｌ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａ４３１  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ，１９９６．７（２）：ｐ．１７３〜１７８．
【０３４７】
ＰＢ１０６５１の種交差反応性。
ＰＢ１０６５１を、その両方の標的であるＥＧＦＲ及びＬＧＲ５のラット及びカニクイザルのオルソログとの交差反応性について試験した。カニクイザルｃＤＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲによって得られたカニクイザルＬＧＲ５のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（参照ＸＭ＿００５５７１５４２）からの予測配列に一致した。ラット及びカニクイザルに加え、ヒトのコーディング構造体を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションに用いた。次いで、ヒト、ラット、又はカニクイザルのオルソログのいずれかを一過性発現する細胞への抗体結合を、ＦＡＣＳで試験した。図１９は、染色に用いた抗体濃度の関数として、染色後にＦＡＣＳで得られた、平均蛍光強度（ＭＦＩ）のグラフを示している。ＥＧＦＲを認識するＦａｂアーム、及びＬＧＲ５を認識するＦａｂアームの両方が、標的のカニクイザルオルソログに対し、完全に交差反応性であることが分かり、結合のＥＣ５０値は、ヒト又はカニクイザルのオルソログへの結合について、有意な差はなかった。同様の実験において、両方のアームのラットオルソログとの交差反応性を評価した。ＰＢ１０６５１は、ＬＧＲ５のラットオルソログに良好に結合することが分かったが、ＥＣ５０は、結合性ヒトＬＧＲ５について判明した値に比べ、約１ｌｏｇ変化した。しかしながら、抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂアームは、ＥＧＦＲのラットオルソログに対してはほとんど交差反応性はなく（ＥＣ５０において２ｌｏｇの差）、この抗体は、ラットｉｎ  ｖｉｖｏモデル又はラットにおける毒性試験には不適当となった。カニクイザルＬＧＲ５交差反応性の陽性対照として、ｈｕ８Ｅ１１ｖ２の複製品（ＰＧ７５４３）を用いた。セツキシマブを、カニクイザルＥＧＦＲ交差反応性の対照として用いた。
【０３４８】
患者由来オルガノイド上の特異的ＬＧＲ５標的
ＦａｂフラグメントＭＦ５８１６及びＭＦ５８１４が、患者由来オルガノイドの表面に発現されたＬＧＲ５に結合することを実証するため、ＦａｂフラグメントＭＦ５８１６又はＭＦ５８１４を含むＰＧ５８１６及びＰＧ５８１４（二価のモノクローナルＩｇＧ）を用い、オルガノイドＰ１８Ｔ由来の個々の細胞の染色に用いた。ＴＴを標的とする陰性対照抗体を用いた染色に比べ、ＰＧ５８１６を用いた結果、Ｐ１８Ｔチューモロイド由来細胞の５３．６％が染色され、ＰＧ５８１４を用いた結果、Ｐ１８Ｔチューモロイド由来細胞の５２．５％が染色された。（図２０）。
【０３４９】
ＬＧＲ５選別は、ＬＧＲ５発現細胞及び腫瘍開始細胞を強化する
更に、二重特異性形態のＬＧＲ５標的Ｆａｂフラグメントが、Ｐ１８Ｔチューモロイド細胞上のＬＧＲ５に実際に結合することを実証するため、抗ＴＴ  Ｆａｂフラグメントと組み合わせたＦａｂフラグメントＭＦ５８１４又はＭＦ５８１６を含む二重特異性抗体ＰＢ１０２８４及びＰＢ１０２８６で細胞を染色した。染色後、ＦＡＣＳを用いて細胞を選別し、染色された細胞集団及び非染色の細胞集団を、ＬＧＲ５  ｍＲＮＡレベルについて、Ｑ−ＰＣＲによって分析した。ＬＧＲ５  ＦａｂアームＭＦ５８１６又はＭＦ５８１４を含む二重特異性抗体を用いてＰ１８Ｔ由来チューモロイド細胞を染色した結果、選別したＬＧＲ５陽性細胞分画において、ＬＧＲ５陰性細胞分画に比べ、６〜１４倍強化されたＬＧＲ５  ｍＲＮＡ発現レベルが得られた（図２１）。
【０３５０】
更に、これらの強化されたＬＧＲ５発現Ｐ１８Ｔチューモロイド細胞集団は、コロニー形成能力を４倍増加させた。すなわち、Ｐ１８Ｔを、ＦＡＣＳ染色と、抗ＬＧＲ５抗体、すなわち、ＭＦ５８１４−ＴＴ、ＭＦ５８１６−ＴＴ及びＭＦ５７９０−ＴＴによって同定された染色細胞の上位（陽性）及び下位（陰性）１５％の選別とに用いた。２０００の細胞を、２５μＬのＢＭＥ中に、２回の反復実験（技術的反復実験）で接種した。培養の２週間後、倒立光学顕微鏡を用い、オルガノイドを手作業でカウントした。結果は、ＭＦ５８１４−ＴＴ、ＭＦ５７９０−ＴＴ及びＭＦ５８１６−ＴＴ抗体は、平均して、オルガノイドの成長を強化し、陽性分画はそれぞれ、４．５倍、３．７倍及び７．１倍陰性分画よりも多いオルガノイドを形成した（図２２）。これらのデータは、患者由来オルガノイドからのＬＧＲ５陽性細胞についての選別後、腫瘍開始細胞が明らかに強化されることを実証している。
【０３５１】
ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ二重特異性抗体は、患者由来オルガノイドの成長を抑制する
３Ｄスクリーニングで特定されたリード二重特異性抗ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ抗体の治療効果を測定する独立した方法として、オルガノイドを異なる二重特異性抗体で処理し、オルガノイドの成長を、７日後に、標準的なコロニー形成アッセイにおいて評価した（図２３）。図の右側に示した画像は、マクロの解析によって生成された画像の例であり、オルガノイド（黒丸）を含む１滴を示している。実験を３回別々に繰り返し、オルガノイドの数及び大きさを、実験間で平均した。これらのデータは、抗体検証選別を用いて得られたデータを裏付け、リード二重特異性ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ抗体が、患者由来オルガノイドの成長の強力な阻害剤であることを示している。
【０３５２】
ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ二重特異性抗体による患者由来オルガノイドの処理は、未分化細胞集団を強力に低下させる。
チューモロイドを、リード二重特異性ＬＧＲ５／ＥＧＦＲで７日間処理した後、定量的リアルタイムＰＣＲ解析を用い、ＬＧＲ５及びＣＫ２０（分化のマーカー）の発現に対する抗体の効果を評価した（図２４）。結果は、ＥＧＦＲ×ＴＴ（ＭＦ３７５５×ＭＦ１３３７；ＰＢ９９１９）抗体が、ＴＴ×ＴＴに比べ、ＬＧＲ５  ｍＲＮＡレベルにおいて０．５倍の増加をもたらし、一方、ＣＫ２０のレベルは４倍低下させることを示している。ＬＧＲ５抗体ＭＦ５８１４×ＴＴ（ＭＦ５８１４×ＭＦ１３３７；ＰＢ１０２８４）及びＭＦ５８１６−ＴＴ（ＭＦ５８１６×ＭＦ１３３７；ＰＢ１０２８６）は効果をほとんど示さない。しかしながら、ＴＴアームをＥＧＦＲアームで置換する場合、ＭＦ５８１４×ＥＧＦＲ（ＭＦ５８１４×ＭＦ３７５５；ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ；ＰＢ１０６４７）抗体及びＭＦ５８１６−ＥＧＦＲ（ＭＦ５８１６×ＭＦ３７５５；ＬＧＲ５×ＥＧＦＲ；ＰＢ１０６５１）抗体による処理後、ＬＧＲ５レベルは、それぞれ５．９倍及び７．２倍低下する。ＣＫ２０発現もまた、ＰＢ１０６４７（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５、ＭＦ５８１４×ＭＦ３７５５）抗体及びＰＢ１０６５１（ＥＧＦＲ／ＬＧＲ５、ＭＦ５８１６×ＭＦ３７５５）抗体の両方により、１０．４倍及び１３．７倍低下した。これらのデータは、このチューモロイド株において、ＬＧＲ５標的アームの追加によって、ＥＧＦＲの抑制によってもたらされるＬＧＲ５  ｍＲＮＡレベルの相対的な増加を抑制することができ、一方、ＥＧＦＲ抑制の元の効果も増強する（ＣＫ２０  ｍＲＮＡの低下）ことを示唆している。
【０３５３】
腫瘍（チューモロイド）由来オルガノイド及び正常組織由来オルガノイドのＰＢ１０６５１による処理。
ＰＢ１０６５１が選択的に結腸癌由来チューモロイドを標的とし、正常な結腸組織由来オルガノイドは標的としないことを実証するため、オルガノイド培養物を、アフコシル化ＰＢ１０６５１又はセツキシマブと共にインキュベートした。図２６は、表示した抗体のそれぞれの用量における、オルガノイド（チューモロイド）の大きさを示している。Ｃ５１Ｎは、正常な結腸組織由来のオルガノイドである。Ｃ１Ｍは、癌組織由来のオルガノイド（チューモロイド）である（図２６Ｂ）。図２６Ａは、正常組織（Ｃ５５Ｎ）由来のオルガノイド及び同一の患者由来の癌組織（Ｃ５５Ｔ）に対する結果を示している。図２６Ｃは、５つの正常組織オルガノイド、３つの原発性結腸癌チューモロイド、及び３つの転移性結腸癌チューモロイドにおける、セツキシマブ及びＰＢ１０６５１についてのＩＣ５０の表である。セツキシマブのＩＣ５０：ＰＢ１０６５１のＩＣ５０の比を、図２６Ｃの最後の列に示す。これは、ＰＢ１０６５１が、チューモロイドにおいて、セツキシマブよりも２０〜２００倍強力であり、一方、ＰＢ１０６５１の正常オルガノイドにおける効果は、セツキシマブよりも弱いことを示している。更なる試験により、培地中のＷＮＴ又はＲ−スポンジンの存在は、セツキシマブ又はＰＢ１０６５１がチューモロイドの成長を抑制する効果に対して影響を及ぼさないことが実証された（図示せず）。
【０３５４】
ＬＧＲ５標的抗体は、結腸チューモロイドの成長を抑制しない
ＰＢ１０６５１の二重特異性の態様が、腫瘍抑制能力をもたらすために必要であることを確認するため、ＰＢ１０６５１を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ又はＯｎｃｏＭｅｄによって生産されている他のＷＮＴ標的抗体（表７）と比較した。図２７において、チューモロイドモデルＰ１８Ｔ及びＣ１Ｍにおける、ＬＧＲ５標的抗体（ＰＧ７７０９、ＰＧ７７１１、ＰＧ７７１２及びＰＧ７５４３）のオルガノイドの成長に対する作用を、ＰＢ１０６５１及びセツキシマブを介してもたらされる作用と比較する。これらの結果は、比較抗体のいずれも、結腸チューモロイドの成長を抑制しないことを示している。
【０３５５】
二重特異性ＰＢ１０６５１は、チューモロイドの成長抑制において、二価の単一特異性抗体の混合物よりも強力である
二重特異性抗体ＰＢ１０６５１は、ＥＧＦＲ標的アーム（ＭＦ３７５５）及びＬＧＲ５標的アーム（ＭＦ５８１６）から構成されている。両方のＦａｂアーム間の実際の物理的相互作用が、結腸チューモロイドに対して強力な抑制効果をもたらすために必要であることを示すため、これらを、ＰＢ１０６５１（ＭＦ３７５５×ＭＦ５８１６；ＥＧＦＲ×ＬＧＲ５）、セツキシマブ、ＰＧ３７５５（ＭＦ３７５５×ＭＦ３７５５；ＥＧＦＲ×ＥＧＦＲ）、ＰＧ５８１６（ＭＦ５８１６×ＭＦ５８１６；ＬＧＲ５×ＬＧＲ５）、ＰＧ１３３７（ＭＦ１３３７×ＭＦ１３３７；ＴＴ×ＴＴ）及びＰＧ３７５５とＰＧ５８１６との１：１混合物の用量を増加させながらインキュベートした。図２８Ａは、抗ＬＧＲ５抗体と抗ＥＧＦＲ抗体との混合物による処理の結果、チューモロイドの成長抑制が、二重特異性抗体ＰＢ１０６５１による処理に比べ、より低いことを示している。興味深いことに、正常オルガノイドの成長は、抗ＥＧＦＲ抗体と抗ＬＧＲ５抗体との混合物により、二重特異性抗体によるよりも、より強力に抑制された。これらの効果を、図２８Ｂの他のチューモロイド及び正常オルガノイドについて、ＩＣ５０の表にまとめる。
【０３５６】
結腸チューモロイドにおけるＰＢ１０６５１の局在試験は、特異的な細胞内染色パターンを示す
ＢＭＥ２  ＲＧＦハイドロゲルに接種されていた間に、抗体がチューモロイドに達することをしめすため、７日齢のＰ１８Ｔチューモロイドを、表示した抗体（２μｇ／ｍＬ）で２４時間処理した後、固定し（４％パラホルムアルデヒド、１５分間）、透過処理した（０．１％トリトン−×１００及び０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ）。続いて、オルガノイドを、ヤギ抗ヒトＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：３０００）で対比染色した。細胞核及びアクチンは、記載（Ｄｉ  ｅｔ  ａｌ  ＰｌｏｓＯｎｅ  ２０１４，ＰＭＩＤ  ２５２８９８８６）のように染色した。図２９は、全ての抗体が、ゲルに浸透し、チューモロイド中の全ての細胞に結合できることを示している。ＥＧＦＲ標的抗体セツキシマブ及びＰＧ３７５５は細胞膜に局在し、一方、ＰＢ１０６５１は、細胞内に小斑点が点在した染色パターンを示す。このパターンは、比較ＬＧＲ５抗体（ＰＧ７７０９、ＰＧ７７１１又はＰＧ７７１２）のいずれにも確認されない。
【０３５７】
結腸チューモロイドにおけるＰＢ１０６５１の局在試験は、チューモロイド感応性に相関する、核近傍の細胞内点状染色パターンを示す
更なる結腸チューモロイドモデル及びオルガノイドモデルを、ＰＢ１０６５１の対比染色及び撮像アッセイに含めた（上記参照）。図３０は、ＰＢ１０６５１の細胞内の染色パターンが、Ｐ１８Ｔ、Ｃ０Ｍ、Ｃ５５Ｔ（ＰＢ１０６５１に高感応性、ＩＣ５０＜１μｇ／ｍＬ）において、Ｃ３１Ｍの一部のチューモロイド（ＰＢ１０６５１に中程度に感応性）において確認されるが、ＰＢ１０６５１非感応性（ＩＣ５０＞１０μｇ／ｍＬ）のＣ２８Ｔ、Ｐ８Ｔ若しくはＰ１９Ｔｂチューモロイド、又はＣ５１Ｎ正常結腸オルガノイドでは確認されないことを示している。ＰＢ１０６５１における核近傍の細胞内小斑点は、抗体のインキュベーション時間（２４時間又は７日間）とは無関係に、低抗体濃度（ＰＢ１０６５１  ５０ｎｇ／ｍＬ）及びＡｌｅｘａ−４８８結合形態において、一貫して認められる。
【０３５８】
実施例６：ＰＢ１０６５１の作製及び生化学的特徴分析
プラスミドの作製
トランスフェクション用のプラスミドを、プラスミドＭＶ１４５３及びＭＶ１６２６から作製した（図３１を参照）。これらのプラスミドを、ＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限酵素（ＭＶ１４５３）並びにＳｆｉＩ及びＸｈｏＩ制限酵素（ＭＶ１６２６）で消化した後、ＶＨｓ  ＭＦ３７５５（消化したＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩ）及びＭＦ５８１６（消化したＳｆｉＩ及びＸｈｏＩ）を結合し、構造体ＭＧ３７５５Ｃ４５３及びＭＧ５８１６Ｃ６２６を形成した。ＭＶ１６２２はＦｌａｇタグされたＲＭＤ酵素をコードする（図３２）。
【０３５９】
抗体の作製
タンパク質の作製は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５０３０−０２４）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２３３８−０１８）で培養した、抗体のテール部分へのフコース残基の結合が抑制されたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ懸濁細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ７９００７）の一過性トランスフェクションによって実施した［Ｈｅｎｎｉｎｇ  ｖｏｎ  Ｈｏｒｓｔｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．１２，ｐｐ．１６０７〜１６１８，２０１０］。トランスフェクションの１日前に、細胞を密度５．０×１０５細胞／ｍＬで接種し、３７℃、８％  ＣＯ２において、軌道振とう速度１５５ｒｐｍで、終夜インキュベートした。トランスフェクション用に、プラスミドＤＮＡ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ、分子量２５，０００ダルトン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号２３９６６）の混合物を含む培地を調製した。２５ｍＬのトランスフェクション体積に対し、内毒素を含まないプラスミドＤＮＡ  ２５μｇを、ＰＥＩ  ６２．５μｇ及び培地２．５ｍＬと混合した。次いで、混合物をボルテックスで撹拌し、室温で２０分間インキュベートし、細胞に加えた。細胞を３７℃、８％  ＣＯ２において、軌道振とう速度１５５ｒｐｍで、６日間インキュベートした。細胞懸濁液を採取し、１０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を採取し、４０００ｇで１０分間遠心分離した。
【０３６０】
抗体の精製
抗体の精製は、抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ  ＬＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、室温で数時間、バッチ式で結合させることによって実施した。次いで、結合した抗体を含むＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ  ＬＸセファロースを、重力流動カラムに移した。カラムをＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ３．０を用いて抗体を溶出させ、１ＭトリスｐＨ８．０を用い、ｐＨを７．０に中和した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）１０ｋＤａスピンフィルタを用いて試料を濃縮し、ＰＢＳ緩衝液であらかじめ平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、ゲル濾過により更に精製した。
【０３６１】
陽イオン交換ＨＰＬＣ
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）を用い、抗体試料の電荷不均一性を検討し、また、生成物関連の不純物（ホモ二量体及び半量体）の存在及び量を測定した。実験は、周囲温度において、ＳＰ  ＳＴＡＴ  ７μｍカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＵＶ−ｖｉｓ検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣシステムで実施した。試料１０μｇを測定ごとに注入した。２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０のＮａＣｌ濃度を０から１Ｍに増加させるグラジエントを適用し、抗体を分離した。データは、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて解析した。
【０３６２】
ＡＤＣＣリポーターアッセイ
アフコシル化抗体ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）の活性を、Ｖ１５８（高親和性）ＦｃγＲＩＩＩａ受容体変異体又はＦ１５８（低親和性）ＦｃγＲＩＩＩａ受容体変異体（Ｐｒｏｍｅｇａ）のいずれかを含むＡＤＣＣリポーター細胞において試験した。抗体の一連のタイトレーション、すなわち、アフコシル化ＰＢ１０６５１（ＰＢ１０６５１−ＭＶ１６２２）、非アフコシル化ＰＢ１０６５１及び非標的ＩｇＧ１（ＰＧ１３３７）を、高親和性及び低親和性ＦｃγＲＩＩＩ変異体を保有するＡＤＣＣリポーター細胞［Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．９９，ｎｏ．３，ｐｐ．７５４〜７５８，２００２；Ｍｕｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６，ｎｏ．１１，ｐｐ．１７８９〜１７９６］と組み合わせ、Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞及びＢｘＰＣ３細胞に加えた。ＡＤＣＣ活性は、ルシフェラーゼ活性の測定によって検出した。
【０３６３】
実験
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞を、ＭＧ３７５５Ｃ４５３、ＭＧ５８１６Ｃ６２６及びＭＶ１６２２でトランスフェクションし、ＩｇＧ  ＰＢ１０６５１ｐ１０を得た。精製後、ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）の収量は、ＯＤ２８０の測定によって測定した結果、１Ｌの作製体積当たり２９ｍｇであった。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析を、精製したタンパク質について実施した（図３３）。二重特異性ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）分子に相当する主ピークが、保持時間１５分に、いくつかの酸性帯電変異体と共に認められた。ＭＦ３７５５×ＭＦ３７５５  ＤＥＤＥホモ二量体に相当する小さいピーク（５％未満）が、約１１分に見える。
【０３６４】
更に、ＡＤＣＣリポーターアッセイを実施した。データは、アフコシル化ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）ディスプレイは、高（Ｖ１５８）及び低（Ｆ１５８）ＦｃγＲＩＩＩａ受容体変異体と組み合わせた全ての細胞株に対してＡＤＣＣ活性を有意に増加させたことを示している。対照の非アフコシル化ＰＢ１０６５１は、若干のＡＤＣＣ活性を、高親和性ＦｃγＲＩＩＩａ受容体変異体エフェクター細胞と組み合わせたＡ４３１細胞において示したが、シグナルは、ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）シグナルよりも有意に低かった。他の細胞株／エフェクター細胞の組み合わせについては、ＰＢ１０６５１は陰性であり、一方、ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）は強力なＡＤＣＣ活性を示した。ＰＧ１３３７（抗破傷風トキソイド）は非結合対照ＩｇＧであり、全ての実験で陰性であった（図３４）。
【０３６５】
実施例７：リード抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
動物モデルの選定
アフコシル化ＰＢ１０６５１（ＭＶ１６２２）の治療効果を、結腸直腸患者由来の腫瘍を有する免疫不全マウス（患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルとして知られる）において評価した。ＰＤＸモデルＣＲ２５１９、ＣＲ２１６１、ＣＲ２５０１、ＣＲ０１５０及びＣＲ０１９３（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｈｕｂａｓｅ２．ｃｒｏｗｎｂｉｏ．ｃｏｍ）を、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって解析したＬＧＲ５遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子の両方の発現に基づいて選定した。モデルは、異なる状態のＫＲＡＳ遺伝子を呈した。すなわち、ＣＲ２５１９及びＣＲ２１６１はＫＲＡＳの野生型であり、一方、ＣＲ２５０１、ＣＲ０１５０はＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異体、ＣＲ０１９３はＫＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ変異体であった。ＣＲ０２３１及びＣＲ２５０１はセツキシマブ感応性であり、一方、ＣＲ０１５０はセツキシマブに低反応性であった。
【０３６６】
遺伝子発現解析
ＰＤＸモデルが、表示したＬＧＲ５及びＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現レベルを、効力試験で用いた動物において保持していたことを確認するため、生きた腫瘍における発現を、ＰＤＸストック腫瘍の発現と比較した。ストック腫瘍（凍結物）及び生きた腫瘍（試験動物）からＲＮＡを抽出し、ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｍ  １５５９６−０１８）及びＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ  ８５３００）と共に均質化した。次いで、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ７４１０６）及びＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ７６２５４）によって精製した。ＲＮＡの品質を、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ分光光度計によって確認した。ｃＤＮＡを逆転写（ＡＢＩ  ４３７４９６６）によって調製した。ＬＧＲ５及びＥＧＦＲの発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ反応によって、それぞれＴａｑＭａｎプローブＨｓ００９６９４２２＿ｍ１及びＨｓ０１０７６０９０＿ｍ１を用いて測定し、ＴａｑＭａｎプローブＨｓ０２７５８９９１＿ｇ１を用いたグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対して規準化した。目的の遺伝子とＧＡＰＤＨとのＣｔ値の差を算出し、この差を２乗に変換することにより、データを解析した。図３５は、効力試験に用いた全ての６つのＰＤＸモデルが、元の凍結ＰＤＸ腫瘍ストックと同等のＥＧＦＲ及びＬＧＲ５両方の発現を呈したことを示している。これらの６モデルにおけるＬＧＲ５発現は、１３７の結腸直腸癌ＰＤＸモデルの利用可能な集合からの、最も低いＬＧＲ５発現を呈したＰＤＸモデル（ＣＲ０１５６０）におけるよりも、１０００倍超高かった。選定した６モデルにおけるＥＧＦＲのｍＲＮＡの発現は、ＣＲＣ  ＰＤＸの集合全体において最も高いＥＧＦＲ発現を呈したＣＲ１１９７よりも低かった。
【０３６７】
ＰＤＸにおける効力試験
５つの結腸直腸癌ＰＤＸ腫瘍モデル（ＣＲ２５１９、ＣＲ２１６１、ＣＲ２５０１、ＣＲ０１５０及びＣＲ０１９３）のうちの１つに由来するＰＤＸ腫瘍フラグメント（直径２〜３ｍｍ）を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍を、１００〜２００ｍｍ３の体積まで成長させた。次いで、マウスを、１週間に４回のＰＢＳ（２００μＬ）又はアフコシル化ＰＢ１０６５１（１匹当たりＰＢＳ中０．５ｍｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与で処置した。腫瘍を２週間に１回キャリパーで測定し、腫瘍体積（ＴＶ）を、式ＴＶ＝０．５×ａ×ｂ２［式中、ａ及びｂはそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である］を用いて算出した。アフコシル化ＰＢ１０６５１は、強力な腫瘍抑制活性をＣＲ２５１９及びＣＲ０１９３  ＰＤＸモデルにおいて呈し、この活性は、セツキシマブの活性と同様であった（図３６）。アフコシル化ＰＢ１０６５１は、限定的ではあるが、有意な抗腫瘍活性をＣＲ２５０１  ＰＤＸモデルにおいて呈し、一方、セツキシマブは腫瘍成長を有意には低下させなかった。ＰＤＸモデルＣＲ２１６１及びＣＲ０１５０は、セツキシマブ又はアフコシル化ＰＢ１０６５１には強く反応せず、アフコシル化ＰＢ１０６５１に対して抗腫瘍活性の傾向を示すのみであった（図３６）。
【０３６８】
実施例８：Ｐ１８Ｔ及びＣ３１Ｍ  異種移植試験
材料及び方法
Ｐ１８チューモロイドの免疫組織化学的検査
抗体の添加から４８時間後に培地を取り出し、ＢＭＥ滴を４８ウェルプレートにおいてホルマリン３００μＬ中、室温で２時間固定した。次いで、ピペットを用い、ＢＭＥ滴を手作業で砕き、ペレット化し、ペレットを崩壊させずに、新鮮なホルマリンに入れた。ペレットを室温で終夜放置した後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、ペレットをＰＢＳ中に穏やかに再懸濁し、ＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）組織学的検査施設による、パラフィン包埋切片作製のための処理用に、マイクロカセットに入れた。
【０３６９】
Ｋｉ６７及び切断カスパーゼ３染色を、ＩＲＢ組織学的検査施設によって、Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓ（Ｄａｋｏ−Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて実施した。染色前に、抗原回収プロセスの一部として、低ｐＨ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＦＬＥＸ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｄａｋｏ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）を用い、９７℃で２０分間、ＰＴ  Ｌｉｎｋ（Ｄａｋｏ−Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、切片を脱ろうした。ペルオキシダーゼ阻害溶液（Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ  Ｓ２０２３）を用い、内因性ペルオキシダーゼを、１０分間消失処理した。ウサギポリクローナル抗Ｋｉ６７（ａｂ１５５８０，Ａｂｃａｍ）及びウサギポリクローナル抗カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９６６１Ｓ）を、１：１０００及び１：５００に希釈し、室温でそれぞれ６０分間及び１２０分間インキュベートした。ビオチンを含まないＢｒｉｇｈｔＶｉｓｉｏｎポリＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ（BrightVision Poly-HRP-Anti Rabbit IgG Biotin-free）を二次抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ，ＤＰＶＲ−１１０ＨＲＰ）に用い、室温で３０分間インキュベートした。３−３’−ジアミノベンジジン（Ｋ３４６８，Ｄａｋｏ）を５分間用い、染色を現した。切片をヘマトキシリン（Ｄａｋｏ，Ｓ２０２０８４）で対比染色し、Ｄａｋｏ  ＣｏｖｅｒＳｔａｉｎｅｒを用い、トルエンを含まない封入剤（ＣＳ７０５，Ｄａｋｏ）で標本にした。染色の特異性は、一次抗体の除外によって確認した。画像は、ＤＳ−Ｒｉ１カメラに取り付けたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００を用いて取得した。
【０３７０】
Ｐ１８Ｔ及びＣ３１Ｍオルガノイド異種移植の処理
全てのマウスの実験は、バルセロナサイエンスパーク動物管理及び使用委員会（Animal Care and Use Committee of Barcelona Science Park）（ＣＥＥＡ−ＰＣＢ）及びカタロニア政府により、プロトコル第ＤＡＡＭ７３２９号の下で承認された。チューモロイドを７日間成長させた後、注射用の単一細胞懸濁液に脱凝集した。培養条件及び単一細胞を作製する方法は、「選定した５つの抗ＬＧＲ５  ｃＬＣ抗体を用いてオルガノイドＰ１８Ｔから得られた細胞のＦＡＣＳ染色」の項に記載されている。全てのマウス試験に、６〜８週齢の雌ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）を用いた。異種移植は、２００，０００のＰ１８Ｔ細胞又は１，０００，０００のＣ３１Ｍ細胞を含むＢＭＥ：ＰＢＳ（５０：５０）溶液１００μＬを皮下注射することにより開始した。腫瘍体積が３００ｍｍ３に達した時点でマウスを屠殺し、腫瘍を採取した。１つの腫瘍を、約０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×０．５ｍｍ（幅×長さ×高さ）の小断片に手作業で切り刻んだ。次いで、１側腹部当たり１断片を用い、レシピエントＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの４つの側腹部に断片を定置させた。トロッカー（trocker）を用い、断片をマウスに埋め込んだ。トロッカーは、腫瘍断片を皮膚の下に押し込む装置である。合計３０匹のマウスを移植に用いた。マウスの腫瘍体積が平均５０ｍｍ３に達した時点で、マウスを無作為に処置群に割り付けた。１週間に１回、４週間、マウスにＰＢＳ（ｐＨ７．４  Ｇｉｂｃｏ  Ｒｅｆ  １００１０−０１５）２００μＬ、セツキシマブ（臨床バッチ、５ｍｇ／ｍＬ）、又はアフコシル化ＰＢ１０６５１（２．５ｍｇ／ｍＬ）を注射した。セツキシマブ及びアフコシル化ＰＢ１０６５１は、マウスの体重に関わらず、マウス１匹当たり０．５ｍｇの用量で注射した。腫瘍体積は、手作業のキャリパーを用い、１週間に３回取得した測定値により、式：（長さ×幅×高さ）／２を用いて算出した。腫瘍体積が３００ｍｍ３を超えた、腫瘍が潰瘍化した、又は試験のエンドポイントである最初の抗体の注射から２８日間に達したいずれかの時点で、マウスを屠殺した。大きさの制限／潰瘍形成のために、マウスにおいて単一の腫瘍のみを採取する必要があった場合には、腫瘍の一部を切除し、更なる試験のために、残りをその箇所に留置した。追加の切除又は複数の腫瘍を採取する必要があった場合、マウスを選別し、全ての試料を同時に採取した。データは、０日（処置の第１日目）に対して表し、対応のあるサンプルのｔ検定の解析は、各処置群間で、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて実施した。
【０３７１】
結果
Ｋｉ６７染色は、細胞増殖の指標であり、抗体処理によってもたらされる成長に対する作用が増殖の低下によるものであるか否かの判定に用いた。チューモロイドを、固定前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで４８時間（２μｇ／ｍＬ）処理した。チューモロイドのアフコシル化ＰＢ１０６５１による処理は、他の処置群に比べ、陽性細胞の数及び染色の強度について低下をもたらした（図３７）。セツキシマブ抗体及びＥＧＦＲ−ＴＴ抗体は、ＴＴ−ＴＴ対照処理に比べ、わずかな、中程度の陽性細胞の数の低下をもたらした。切断カスパーゼ３染色もまた実施し、抗体がアポトーシスを促進したか否かを評価した。低レベルのアポトーシスが、ＴＴ対照、ＥＧＦＲ−ＴＴ及びセツキシマブ処置群で確認され、同等の染色が３群間で見られた。陽性細胞の数が、アフコシル化ＰＢ１０６５１処置群で増加した。これらの結果は、アフコシル化ＰＢ１０６５１二重特異性抗体は、セツキシマブ及び他の単一抗ＥＧＦＲアームよりも、増殖の低下及びアポトーシスの誘導に優れていることを示唆している。
【０３７２】
異種移植をＮＯＤ−ＳＩＣＤマウスにおいて構築し、１週間に１回、４週間、アフコシル化ＰＢ１０６５１（０．５ｍｇ／マウス／週）、セツキシマブ（０．５ｍｇ／マウス／週）又はＰＢＳで処置した。抗体の反応を評価するため、腫瘍体積を追跡し、群間で比較した。アフコシル化ＰＢ１０６５１による処置は、ＰＢＳ及びセツキシマブの両方に比べ、Ｐ１８Ｔ及びＣ３１Ｍの両異種移植モデルに対し、２日目以降、平均腫瘍体積増加において有意な低下をもたらした（全ての時点についてＰ＝＜０．０１、図３８）。Ｐ１８Ｔ異種移植モデルにおいて、セツキシマブ処置マウスは、ＰＢＳ処置マウスと同様の成長動態を示し、大きな腫瘍体積のため、ＰＢＳ群及びセツキシマブ群の大多数のマウスを、１６日目に試験から除外する必要があった。２０日目までに、腫瘍体積の平均倍数変化は、ＰＢＳ及びセツキシマブについてはそれぞれ１５．２（±５．３）及び１４．２（±９．９）であり、一方、アフコシル化ＰＢ１０６５１群については、この値は４．５（±０．５９）であった。指数関数的成長式の非線形カーブフィッティングにより求めた腫瘍倍増時間は、ＰＢＳ群及びセツキシマブ群については９日間、アフコシル化ＰＢ１０６５１処置群については６日間と算出され、腫瘍倍増時間において３０％低下した。同様に、Ｃ３１Ｍ異種移植モデルにおいて、ＰＢＳ及びセツキシマブ処置群に比べ、ＰＢ１０６５は、腫瘍成長を有意に低下させた（図３８）。
【０３７３】
実施例８：ＰＢ１０６５１の反復投与を用いた非ＧＬＰカニクイザル毒性試験。
ＰＢ１０６５１の可能性のある毒性を評価するため、カニクイザルにおける非ＧＬＰ反復投与毒性試験を実施した。ＰＢ１０６５１に存在するＥＧＦＲ  Ｆａｂアームを考慮すると、皮膚及び胃腸（ＧＩ）管毒性が予想され得る。抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブ（アービタックス（Erbitux））の場合、サルにおいて、１週間用量７５ｍｇ／ｋｇで重篤な皮膚毒性による死亡が確認され、２４ｍｇ／ｋｇ／週が、サルの慢性毒性試験における最大耐用量であった。パニツムマブ（ベクティビックス（Vectibix））の場合、サルにおいて、４週間試験中のわずか３週間後に、用量３０ｍｇ／ｋｇ／週で死亡が認められ、１３週ＩＶ毒性試験における、より低い用量（７．５及び１５ｍｇ／ｋｇ／週）で、時折死亡が認められた。この情報に基づき、用量レベル２５ｍｇ／ｋｇを、本試験におけるＰＢ１０６５１の最高用量として選定した。１群当たり１匹の雄及び１匹の雌のカニクイザルを用い、４群を、対照（媒体のみ）、２．５ｍｇ／ｋｇ／週、７．５ｍｇ／ｋｇ／週及び２５ｍｇ／ｋｇ／週とし、週１回の投与を４回、各群に与えた。抗体は、静脈内注入により、１時間にわたってカニクイザルに投与した。
【０３７４】
結果
カニクイザルにおけるセツキシマブ及びパニツムマブによる毒性試験は、皮膚毒性（紅斑、乾燥／剥離皮膚／脱毛）及び胃腸（ＧＩ）管作用（軟便／下痢、脱水）を、用量制限毒性として示し（ＥＭＡ−ＥＰＡＲ  ２００４  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ＥＭＡ−ＥＰＡＲ  ２００７  ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、試験品目の抗ＥＧＦＲ活性と一致した。しかしながら、ＰＢ１０６５１については、本試験で投与した最高用量においても、反復試験後、皮膚毒性もＧＩ管毒性も共に確認されなかった。毛が細くなる、紫斑、軟便の発生等の臨床徴候が有効成分群及び対照群で同様に確認されたため、これらの臨床徴候は、薬物関連ではないと考えられた。ＰＢ１０６５１の投与に関連すると考えられる臓器重量の変化及び／又は臓器重量比の変化はなかった。更に、ＰＢ１０６５１の投与に関連すると考えられる肉眼的所見又は顕微鏡的所見はなかった。結論として、ＰＢ１０６５１のカニクイザルへの１週間に１回、４週間の静脈内（注入）投与は、ＰＢ１０６５１の投与に関連すると考えられる、臓器重量の変化又は臓器重量比の変化、肉眼的所見又は顕微鏡的所見をもたらさなかった。
【０３７５】
本発明に至る研究は、助成金合意第［６０１８７６］．１４号の下、［欧州連合］［欧州原子力共同体］第７回フレームワークプログラム（［ＦＰ７／２００７−２０１３］［ＦＰ７／２００７−２０１１］）より資金援助を受けた。
【０３７６】
【表１】
2019500405.tif 000002
【０３７７】
【表２】
2019500405.tif 000003
【０３７８】
【表３】
2019500405.tif 000004
【０３７９】
ＦＡＣＳ親和性タイトレーション、Ｒ−スポンジン３阻害ＥＬＩＳＡ及び４０℃安定性ＥＬＩＳＡを示す。ＦＡＣＳ親和性タイトレーションについては、曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。Ｒ−スポンジン阻害ＥＬＩＳＡについては、最大結合値（１００％の結合に設定した）と比較した、ＩｇＧ当たりの残存する結合の百分率、及び２つの独立した実験からの最終結論を示した。４０℃安定性ＥＬＩＳＡを示す。４℃及び４０℃で１週間後のＯＤ４５０ｎｍ値を表に示す。４℃に対する４０℃のＯＤ４５０ｎｍの比（百分率）を表に示す。最終結論、すなわち、ＩｇＧが安定、部分的に安定であると考えられるか、又は、ＯＤシグナルが０．１未満であった場合はＮＡを、右側の列に記載している。
【０３８０】
【表４】
2019500405.tif 000005
【０３８１】
【表５】
2019500405.tif 000006
【表６】
2019500405.tif 000007
【０３８２】
【表７】
2019500405.tif 000008
【０３８３】
【表８】
2019500405.tif 000009
【０３８４】
【表９】
2019500405.tif 000010
【０３８５】
【表１０】
2019500405.tif 000011
【０３８６】
【表１１】
2019500405.tif 000012
【０３８７】
本発明は、（中でもとりわけ）以下の態様を提供する。
態様１．ヒトＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、アミノ酸残基のうち、Ｉ４６２、Ｇ４６５、Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｎ４９３、及びＣ４９９が抗体のエピトープへの結合に関与する、抗体。
態様２．Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａから選択されるアミノ酸残基置換のうちの１つ以上が、抗体のヒトＥＧＦＲへの結合を低下させる、態様１に記載の抗体。
態様３．ヒトＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインを含む抗体であって、エピトープが、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に配置され、抗体のＥＧＦＲへの結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａのうちの１つ以上によって低下される、抗体。
態様４．抗体のヒトＥＧＦＲへの結合が、ＥＧＦの受容体への結合を阻害する、態様１〜３のいずれか１つに記載の抗体。
態様５．エピトープが立体構造エピトープである、態様１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
態様６．エピトープが、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に、好ましくは、図４０に示した配列番号２の４３０〜４８０内に、好ましくは、図４０に示した配列番号２の４３８〜４６９内に配置される、態様１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
態様７．抗体が更なる可変ドメインを含み、この更なる可変ドメインが更なるタンパク質に結合可能である、態様１〜６のいずれか１つに記載の抗体。
態様８．更なるタンパク質が、細胞外部分を含む膜タンパク質である、態様７に記載の抗体。
態様９．更なるタンパク質がＷＮＴ経路の膜結合メンバーである、態様７又は態様８に記載の抗体。
態様１０．抗体が、ヒトＥＧＦＲに結合する可変ドメインと、更なるタンパク質に結合する可変ドメインと、を含む二重特異性抗体である、態様１〜９のいずれか１つに記載の抗体。
態様１１．上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、少なくとも、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ３配列を含む、又は、上記の可変ドメインの重鎖可変領域が、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは１個以下のアミノ酸が、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ３配列と異なる重鎖ＣＤＲ３配列を含む、態様１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
態様１２．上記の可変ドメインが、少なくとも、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又は、最大３個、好ましくは最大２個、好ましくは最大１個のアミノ酸置換を有する、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む、態様１０又は態様１１に記載の抗体。
態様１３．ＥＧＦＲに結合する可変ドメインが、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨ鎖の配列、又は、図１に示したＭＦ３７５５のＶＨ鎖のアミノ酸配列において、ＭＦ３７５５のＶＨ鎖に関し、最大１５個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、好ましくは１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、若しくはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列を含む、態様１１又は態様１２に記載の抗体。
態様１４．更なるタンパク質がＬＧＲ４、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＲＮＦ４３又はＺＮＲＦ３である、態様７〜１３のいずれか１つに記載の抗体。
態様１５．更なるタンパク質がＬＧＲ５である、態様１４に記載の抗体。
態様１６．ＥＧＦＲの細胞外部分上のエピトープに結合可能な可変ドメインと、更なるタンパク質に結合可能な可変ドメインと、を含む二重特異性抗体であって、ＥＧＦＲエピトープが、図４０に示した配列番号２のアミノ酸残基４２０〜４８０内に配置され、これらのアミノ酸残基のうち、Ｉ４６２、Ｇ４６５、Ｋ４８９、Ｉ４９１、Ｎ４９３、及びＣ４９９が抗体のエピトープへの結合に関与する、二重特異性抗体。
態様１７．可変ドメインのＥＧＦＲへの結合が、以下のアミノ酸残基置換Ｉ４６２Ａ、Ｇ４６５Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９３Ａ、及びＣ４９９Ａのうちの１つ以上によって低下される、態様１６に記載の二重特異性抗体。
態様１８．更なるタンパク質が、細胞外部分を含む膜タンパク質である、態様１６又は態様１７に記載の二重特異性抗体。
態様１９．更なるタンパク質がＷＮＴ経路の膜結合メンバー、好ましくはＬＧＲ５である、態様１６〜１８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
【０３８８】
上記のエピトープを有するＥＧＦＲに結合する１つ以上の可変ドメインを含む抗体は、ＥＧＦＲリガンド反応癌又は細胞の成長を抑制するために用いられた際、より良好な有効性を有することが示されている。二重特異性抗体において、上記のエピトープとのＥＧＦＲ結合可変ドメインを含む抗体のアームは、他の細胞表面タンパク質の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む様々な他のアームと、より良好に組み合わされる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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