(57)【要約】本明細書において、合成皮革、人工表皮層、人工真皮層、層状構造、それらから生産された製品およびその生産方法が開示される。一局面において、合成皮革を製造する方法が提供され、この方法は、ａ．線維芽細胞を含む人工真皮層を形成するステップ；ｂ．上記真皮層の少なくとも一部をなめし、それにより、上記合成皮革を形成するステップを含み、上記線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである。別の局面において、上記方法は、人工表皮層を形成するステップをさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成皮革を製造する方法であって、
ａ．線維芽細胞を含む人工真皮層を形成するステップ；
ｂ．前記真皮層の少なくとも一部をなめし、それにより、前記合成皮革を形成するステップ
を含み、
前記線維芽細胞が、人工多能性幹細胞から分化したものである、方法。
【請求項２】
人工表皮層を形成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表皮層が、ケラチノサイトを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記真皮層上に前記表皮層を配置し、それにより、層状構造を形成するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
合成皮革を製造する方法であって、
ａ．人工真皮層上に人工表皮層を配置し、それにより、層状構造を形成するステップであって、前記表皮層がケラチノサイトを含み、前記真皮層が線維芽細胞を含む、ステップ；および
ｂ．前記層状構造の少なくとも一部をなめし、それにより、前記合成皮革を形成するステップ
を含み、前記線維芽細胞または前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、方法。
【請求項６】
合成皮革を製造する方法であって、
ａ．人工真皮層上に人工表皮層を配置し、それにより、層状構造を形成するステップであって、前記表皮層がケラチノサイトを含み、前記真皮層が線維芽細胞を含む、ステップ；
ｂ．前記表皮層の少なくとも一部を除去して、除去生成物を形成するステップ；および
ｃ．前記除去生成物の少なくとも一部をなめし、それにより、前記合成皮革を形成するステップ
を含み、前記線維芽細胞または前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、方法。
【請求項７】
前記ケラチノサイトが、哺乳動物ケラチノサイトである、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ケラチノサイトが、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記層状構造が、メラノサイトをさらに含む、請求項４から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記メラノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記メラノサイトが、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記合成皮革が、色素をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記メラノサイトが、哺乳動物メラノサイトである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記線維芽細胞が、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項５から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記線維芽細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現する、請求項１または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記線維芽細胞が、哺乳動物線維芽細胞である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ヒト哺乳動物が、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つである、請求項８または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記表皮層が、コラーゲンをさらに含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記表皮層が、さらなる処理に供される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記層状構造が、コラーゲンをさらに含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記層状構造が、さらなる処理に供される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記除去生成物が、コラーゲンをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２７】
前記除去生成物が、さらなる処理に供される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記真皮層が、コラーゲンをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記真皮層が、さらなる処理に供される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記処理が、保存加工、水漬け、ベーチング、ピックリング、脱酸、シンニング、再なめし、潤滑化、クラスティング、湿潤化、水絞り、シェービング、再クロム処理、中和、染色、加脂、充填、ストリッピング、スタッフィング、白化、固着、セッティング、乾燥、コンディショニング、空打ち、ステーキング、バフィング、仕上げ、油入れ、ブラッシング、パディング、含浸、スプレー、ローラーコーティング、カーテンコーティング、艶出し、プレーティング、型押し、アイロン掛け、グレージング、タンブリングおよびその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２３、２５、２７または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コラーゲンが、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生される、別に添加される、またはその任意の組み合わせである、請求項２２、２４、２６または２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記コラーゲン産生細胞が、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記コラーゲン産生細胞が、前記上皮細胞を含み、前記上皮細胞が、扁平上皮細胞、立方細胞、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記コラーゲン産生細胞が、前記ケラチノサイトを含み、前記ケラチノサイトが、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記コラーゲン産生細胞が、平滑筋細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記合成皮革が、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記真皮層の厚さが、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及ぶ、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記真皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及ぶ、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記合成皮革が、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の真皮層が、前記第２の真皮層上に配置される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記表皮層の厚さが、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及ぶ、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記表皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及ぶ、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記合成皮革が、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記合成皮革が、基底膜代用物をさらに含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記基底膜代用物が、前記表皮層と前記真皮層との間にある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記基底膜代用物が、乾燥無細胞羊膜を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記真皮層が、足場上に形成される、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記足場が、天然または合成である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記足場が、絹を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記足場が、天然組織接着剤を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記天然組織接着剤が、フィブリン糊を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記足場が、前記合成皮革中に部分的に含まれる、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記真皮層または前記表皮層が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記真皮層が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記真皮層が、補充物と共に培養される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記補充物が、コラーゲン、フィブリン、増殖因子、アスコルビン酸、硫酸デキストラン、またはカラゲナンのうちの１種または複数種を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記補充物が、天然補充物である、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記補充物が、合成補充物である、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記人工多能性幹細胞が、成体体細胞におけるＯｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃまたはその組み合わせの誘導遺伝子発現を通じて産生される、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
皮革製品の少なくとも一部を製造する方法であって、
請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法によって生産された合成皮革から前記皮革製品の前記少なくとも一部を形成するステップを含む、方法。
【請求項６１】
前記皮革製品が、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネスまたは鞭のうちの１つまたは複数を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記皮革製品が、腕時計のバンドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記皮革製品が、ベルトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記皮革製品が、袋物である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法によって生産された、合成なめし皮革。
【請求項６６】
なめす前に、
線維芽細胞を含む人工真皮層
を含む合成なめし皮革であって、前記線維芽細胞が、人工多能性幹細胞から分化したものである、合成なめし皮革。
【請求項６７】
なめす前に、人工表皮層をさらに含む、請求項６６に記載の合成なめし皮革。
【請求項６８】
前記表皮層が、ケラチノサイトをさらに含む、請求項６７に記載の合成なめし皮革。
【請求項６９】
前記表皮層が、前記真皮層上にあり、それにより、層状構造を形成している、請求項６７または６８に記載の合成なめし皮革。
【請求項７０】
なめす前に、
線維芽細胞を含む人工真皮層、および
ケラチノサイトを含む人工表皮層
を含む層状構造を含む合成なめし皮革であって、
前記線維芽細胞または前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、合成なめし皮革。
【請求項７１】
なめす前に、
層状構造を含む除去生成物
を含む合成なめし皮革であって、前記層状構造が、
線維芽細胞を含む人工真皮層、および
ケラチノサイトを含む人工表皮層
を含み、前記表皮層の一部が除去され、前記線維芽細胞または前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、合成なめし皮革。
【請求項７２】
前記ケラチノサイトが、哺乳動物ケラチノサイトである、請求項６８から７１のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項７３】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項７２に記載の合成なめし皮革。
【請求項７４】
前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項６８から７３のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項７５】
前記ケラチノサイトが、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する、請求項７４に記載の合成なめし皮革。
【請求項７６】
前記層状構造が、メラノサイトをさらに含む、請求項６９から７５のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項７７】
前記メラノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項７６に記載の合成なめし皮革。
【請求項７８】
前記メラノサイトが、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現する、請求項７７に記載の合成なめし皮革。
【請求項７９】
色素をさらに含む、請求項７７または７８に記載の合成なめし皮革。
【請求項８０】
前記メラノサイトが、哺乳動物メラノサイトである、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項８１】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項８０に記載の合成なめし皮革。
【請求項８２】
前記線維芽細胞が、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項７０または７１に記載の合成なめし皮革。
【請求項８３】
前記線維芽細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現する、請求項６６または８２に記載の合成なめし皮革。
【請求項８４】
前記線維芽細胞が、哺乳動物線維芽細胞である、請求項６６から８２のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項８５】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項８４に記載の合成なめし皮革。
【請求項８６】
前記非ヒト哺乳動物が、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つである、請求項７３、８１または８５に記載の合成なめし皮革。
【請求項８７】
前記表皮層が、コラーゲンをさらに含む、請求項６７から７１のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項８８】
前記層状構造が、コラーゲンをさらに含む、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項８９】
前記除去生成物が、コラーゲンをさらに含む、請求項７１に記載の合成なめし皮革。
【請求項９０】
前記真皮層が、コラーゲンをさらに含む、請求項６６から８９のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項９１】
前記コラーゲンが、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生される、別に添加される、またはその任意の組み合わせである、請求項８７から９０のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項９２】
前記コラーゲン産生細胞が、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含む、請求項９１に記載の合成なめし皮革。
【請求項９３】
前記コラーゲン産生細胞が、前記上皮細胞を含み、前記上皮細胞が、扁平上皮細胞、立方細胞、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含む、請求項９２に記載の合成なめし皮革。
【請求項９４】
前記コラーゲン産生細胞が、前記ケラチノサイトを含み、前記ケラチノサイトが、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含む、請求項９２に記載の合成なめし皮革。
【請求項９５】
前記コラーゲン産生細胞が、平滑筋細胞を含む、請求項９２に記載の合成なめし皮革。
【請求項９６】
ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含む、請求項６６から９５のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項９７】
前記真皮層の厚さが、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及ぶ、請求項６６から９６のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項９８】
前記真皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及ぶ、請求項９７に記載の合成なめし皮革。
【請求項９９】
前記合成皮革が、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含む、請求項６６から９８のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１００】
前記第１の真皮層が、前記第２の真皮層上にある、請求項９９に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０１】
前記表皮層の厚さが、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及ぶ、請求項６７から７１のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０２】
前記表皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及ぶ、請求項１０１に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０３】
前記合成皮革が、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含む、請求項１０１または１０２に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０４】
基底膜代用物を含む、請求項１０１から１０３のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０５】
前記基底膜代用物が、前記表皮層と前記真皮層との間にある、請求項１０４に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０６】
前記基底膜代用物が、乾燥無細胞羊膜を含む、請求項１０５に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０７】
前記真皮層が、足場上に形成される、請求項６６から１０６のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０８】
前記足場が、天然または合成である、請求項１０７に記載の合成なめし皮革。
【請求項１０９】
前記足場が、絹を含む、請求項１０７に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１０】
前記足場が、天然組織接着剤を含む、請求項１０９に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１１】
前記天然組織接着剤が、フィブリン糊を含む、請求項１１０に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１２】
前記足場が、前記合成なめし皮革中に部分的に含まれる、請求項１０７から１１１のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１３】
前記真皮層または前記表皮層が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、請求項６６から１１２のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１４】
前記真皮層が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、請求項１１３に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１５】
腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネスまたは鞭のうちの１つまたは複数に含まれる、請求項６６から１１４のいずれか一項に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１６】
腕時計のバンドに含まれる、請求項１１５に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１７】
ベルトに含まれる、請求項１１５に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１８】
袋物に含まれる、請求項１１５に記載の合成なめし皮革。
【請求項１１９】
毛包細胞およびメラノサイト
を含む人工表皮層であって、前記メラノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、表皮層。
【請求項１２０】
前記毛包細胞が、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞またはその組み合わせを含む、請求項１１９に記載の表皮層。
【請求項１２１】
前記メラノサイトが、哺乳動物メラノサイトである、請求項１１９または１２０に記載の表皮層。
【請求項１２２】
ケラチノサイトをさらに含む、請求項１１９から１２１に記載の表皮層。
【請求項１２３】
前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１２２に記載の表皮層。
【請求項１２４】
前記ケラチノサイトが、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する、請求項１２３に記載の表皮層。
【請求項１２５】
前記ケラチノサイトが、哺乳動物ケラチノサイトである、請求項１２２、１２３、または１２４に記載の表皮層。
【請求項１２６】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項１２１または１２５に記載の表皮層。
【請求項１２７】
前記非ヒト哺乳動物が、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つである、請求項１２６に記載の表皮層。
【請求項１２８】
前記メラノサイトが、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現する、請求項１１９から１２７のいずれか一項に記載の表皮層。
【請求項１２９】
毛包をさらに含む、請求項１１９から１２７のいずれか一項に記載の表皮層。
【請求項１３０】
ａ．毛包細胞を含む人工表皮層；および
ｂ．線維芽細胞を含む人工真皮層
を含む層状構造であって、前記線維芽細胞が、人工多能性幹細胞から分化したものである、層状構造。
【請求項１３１】
前記線維芽細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現する、請求項１３０に記載の層状構造。
【請求項１３２】
前記表皮層が、ケラチノサイトをさらに含む、請求項１３０に記載の層状構造。
【請求項１３３】
前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１３２に記載の層状構造。
【請求項１３４】
前記ケラチノサイトが、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する、請求項１３３に記載の層状構造。
【請求項１３５】
前記毛包細胞が、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞またはその組み合わせである、請求項１３２に記載の層状構造。
【請求項１３６】
前記表皮層が、メラノサイトをさらに含む、請求項１３０に記載の層状構造。
【請求項１３７】
前記メラノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１３６に記載の層状構造。
【請求項１３８】
前記メラノサイトが、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現する、請求項１３７に記載の層状構造。
【請求項１３９】
色素沈着している、請求項１３６、１３７または１３８に記載の層状構造。
【請求項１４０】
前記表皮層が、階層化されている、請求項１３７に記載の層状構造。
【請求項１４１】
基底膜代用物をさらに含む、請求項１３０から１４０のいずれか一項に記載の層状構造。
【請求項１４２】
前記基底膜代用物が、前記表皮層と前記真皮層との間にある、請求項１４１に記載の層状構造。
【請求項１４３】
前記基底膜代用物が、乾燥無細胞羊膜を含む、請求項１４２に記載の層状構造。
【請求項１４４】
足場をさらに含む、請求項１３０に記載の層状構造。
【請求項１４５】
前記足場が、天然または合成である、請求項１４４に記載の層状構造。
【請求項１４６】
前記足場が、絹を含む、請求項１４４に記載の層状構造。
【請求項１４７】
前記真皮層が、前記足場上にある、請求項１４４に記載の層状構造。
【請求項１４８】
ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の構成要素をさらに含む、請求項１３０から１４７のいずれか一項に記載の層状構造。
【請求項１４９】
２つまたはそれよりも多い真皮層をさらに含む、請求項１３０から１４８のいずれか一項に記載の層状構造。
【請求項１５０】
毛包をさらに含む、請求項１３０から１４９のいずれか一項に記載の層状構造。
【請求項１５１】
柔皮をさらに含む、請求項１３０から１４９のいずれか一項に記載の層状構造。
【請求項１５２】
層状構造を製造する方法であって、
人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む人工真皮層上に、毛包細胞を含む人工表皮層を配置し、それにより、前記層状構造を形成するステップ
を含む、方法。
【請求項１５３】
人工多能性幹細胞から分化した前記細胞が、線維芽細胞、メラノサイト、ケラチノサイトまたはその組み合わせである、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
人工多能性幹細胞から分化した前記細胞が、線維芽細胞である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記線維芽細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記表皮層が、ケラチノサイトをさらに含む、請求項１５２から１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ケラチノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ケラチノサイトが、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記毛包細胞が、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞またはその組み合わせを含む、請求項１５２から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記表皮層が、メラノサイトをさらに含む、請求項１５２から１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記メラノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記メラノサイトが、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現する、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記真皮層が、補充物と共に培養される、請求項１５２から１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記補充物が、コラーゲン、フィブリン、増殖因子、アスコルビン酸、硫酸デキストラン、カラゲナンまたはその組み合わせを含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記補充物が、天然補充物である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
１つまたは複数の前記補充物が、合成補充物である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６７】
前記真皮層が、足場上で培養される、請求項１５２から１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記足場が、天然または合成である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記足場が、絹を含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
前記真皮層が、足場上に配置される、請求項１５２から１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
前記足場が、天然または合成である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記足場が、絹を含む、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記表皮層が、階層化されている、請求項１５２から１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
第２の真皮層上で前記真皮層を培養するステップをさらに含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１７５】
前記真皮層が、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養される、請求項１５２から１７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７６】
前記真皮層が、コラーゲンマトリクス上で培養されない、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記真皮層の厚さが、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及ぶ、請求項１５２から１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記真皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及ぶ、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記表皮層の厚さが、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及ぶ、請求項１５２から１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記表皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及ぶ、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
毛包細胞およびケラチノサイトまたはメラノサイトを含む人工表皮層；
線維芽細胞を含む人工真皮層
を含む層状構造であって、前記線維芽細胞、前記ケラチノサイトまたは前記メラノサイトが、人工多能性幹細胞から分化したものであり、前記メラノサイトが、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現し、前記線維芽細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現し、前記ケラチノサイトが、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する、層状構造。
【請求項１８２】
前記真皮層の厚さが、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及ぶ、請求項１８１に記載の層状構造。
【請求項１８３】
前記真皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及ぶ、請求項１８２に記載の層状構造。
【請求項１８４】
前記表皮層の厚さが、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及ぶ、請求項１８１から１８３のいずれか一項に記載の層状構造。
【請求項１８５】
前記表皮層の前記厚さが、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及ぶ、請求項１８４に記載の層状構造。
【請求項１８６】
ａ．角質層；
ｂ．顆粒層；
ｃ．有棘層；および
ｄ．基底層
を含む人工表皮層であって、前記角質層、前記顆粒層、前記有棘層、および前記基底層が、図６Ａ、図８Ａに示されるように組織化されている、人工表皮層。
【請求項１８７】
前記角質層の厚さが、約０．０１ｍｍから約０．０５ｍｍに及ぶ、請求項１８６に記載の人工表皮層。
【請求項１８８】
前記顆粒層の厚さが、約０．０１ｍｍから約０．１５ｍｍに及ぶ、請求項１８６から１８７のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１８９】
前記有棘層の厚さが、約０．０１ｍｍから約０．１５ｍｍに及ぶ、請求項１８６から１８８のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９０】
前記基底層の厚さが、約０．０１ｍｍから約０．１５ｍｍに及ぶ、請求項１８６から１８９のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９１】
ａ．角質層；
ｂ．顆粒層；
ｃ．有棘層；および
ｄ．基底層
を含む人工表皮層。
【請求項１９２】
前記角質層の厚さが、前記人工表皮層の約４％から約２０％に及ぶ、請求項１９１に記載の人工表皮層。
【請求項１９３】
前記顆粒層の厚さが、前記人工表皮層の約４％から約６０％に及ぶ、請求項１９１から１９２のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９４】
前記有棘層の厚さが、前記人工表皮層の約４％から約４０％に及ぶ、請求項１９１から１９３のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９５】
前記基底層の厚さが、前記人工表皮層の約４％から約４０％に及ぶ、請求項１９１から１９４のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９６】
前記人工表皮層中に含まれる細胞の少なくとも約２％が、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１８６から１９５のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９７】
前記人工表皮層中に含まれる細胞の少なくとも約１０％が、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１８６から１９６のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【請求項１９８】
前記人工表皮層中に含まれる細胞の少なくとも約５０％が、人工多能性幹細胞から分化したものである、請求項１８６から１９６のいずれか一項に記載の人工表皮層。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１６年４月２１日に出願された米国仮出願第６２／３２５，８１９号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
政府の支援
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）助成金番号Ｒ２１  ＡＲＯ６１５８３およびＲ０１  ＡＲ０５１９３０、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＵＫ）助成金番号Ｇ０８０１０６１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  ａｎｄ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  Ｂｕｌｌｏｓａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの支援を受けてなされた。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書において、合成皮革を製造する方法が開示される。一部の実施形態では、方法は、線維芽細胞を含む人工真皮層（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｄｅｒｍａｌ  ｌａｙｅｒ）を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、真皮層の少なくとも一部をなめし、それにより、合成皮革を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、方法は、人工表皮層を形成するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトを含み得る。一部の実施形態では、方法は、真皮層上に表皮層を配置し、それにより、層状構造を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、哺乳動物ケラチノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、合成皮革は、色素を含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ（ｅｑｕｉｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、非哺乳動物は、魚類、鳥類または爬虫類であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、層状構造は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、真皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、処理は、保存加工（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）、水漬け（ｓｏａｋｉｎｇ）、ベーチング（ｂａｔｉｎｇ）、ピックリング（ｐｉｃｋｌｉｎｇ）、脱酸（ｄｅｐｉｃｋｌｉｎｇ）、シンニング（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、再なめし（ｒｅｔａｎｎｉｎｇ）、潤滑化（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）、クラスティ��グ（ｃｒｕｓｔｉｎｇ）、湿潤化、水絞り（ｓａｍｍｙｉｎｇ）、シェービング、再クロム処理（ｒｅｃｈｒｏｍｉｎｇ）、中和、染色、加脂、充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）、ストリッピング、スタッフィング（ｓｔｕｆｆｉｎｇ）、白化、固着（ｆｉｘａｔｉｎｇ）、セッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）、乾燥、コンディショニング（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、空打ち（ｍｉｌｌｉｎｇ）、ステーキング（ｓｔａｋｉｎｇ）、バフィング、仕上げ、油入れ（ｏｉｌｉｎｇ）、ブラッシング、パディング（ｐａｄｄｉｎｇ）、含浸、スプレー、ローラーコーティング、カーテンコーティング、艶出し（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）、型押し、アイロン掛け、グレージング（ｇｌａｚｉｎｇ）、タンブリングおよびその任意の組み合わせからなる群より選択することができる。一部の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生することができる、別に添加することができる、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞（ｃｏｍｅｏｃｙｔｅ）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞を含み得、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方細胞（ｃｕｂｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ）、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、ケラチノサイトを含み得、ケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、平滑筋細胞を含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ）、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、第１の真皮層は、第２の真皮層上に配置することができる。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、基底膜代用物をさらに含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に形成することができる。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然組織接着剤を含み得る。一部の実施形態では、天然組織接着剤は、フィブリン糊を含み得る。一部の実施形態では、足場は、部分的に合成皮革中に含まれ得る。一部の実施形態では、真皮層または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、補充物と共に培養することができる。一部の実施形態では、補充物は、コラーゲン、フィブリン、増殖因子、アスコルビン酸、硫酸デキストラン、またはカラゲナンのうちの１種または複数種を含み得る。一部の実施形態では、補充物は、天然補充物であり得る。一部の実施形態では、補充物は、合成補充物であり得る。一部の実施形態では、人工多能性幹細胞は、成体体細胞におけるＯｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃまたはその組み合わせの誘導遺伝子発現を通じて産生され得る。一部の実施形態では、革製品の少なくとも一部は、本明細書で開示される方法から形成され得る。一部の実施形態では、革製品は、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ（ｃｌｕｔｃｈ）、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、インテリア、エクステリア、椅子張り材料（ｕｐｈｏｌｓｔｅｒｙ）、製本材料（ｂｏｏｋ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙（ｗａｌｌ  ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、床材（ｆｌｏｏｒ  ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、天井張り材料（ｃｅｉｌｉｎｇ  ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー（ｄｕｖｅｔ  ｃｏｖｅｒ）、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品のうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、革製品は、腕時計のバンドであり得る。一部の実施形態では、革製品は、ベルトであり得る。一部の実施形態では、革製品は、袋物であり得る。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【０００４】
本明細書において、合成皮革を製造する方法が開示される。一部の実施形態では、方法は、人工真皮層上に人工表皮層を配置し、それにより、層状構造を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトを含み得、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。一部の実施形態では、方法は、層状構造の少なくとも一部をなめし、それにより、合成皮革を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞またはケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、合成皮革は、色素を含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ（ｅｑｕｉｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、非哺乳動物は、魚類、鳥類または爬虫類であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、層状構造は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、真皮層は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、処理は、保存加工（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）、水漬け（ｓｏａｋｉｎｇ）、ベーチング（ｂａｔｉｎｇ）、ピックリング（ｐｉｃｋｌｉｎｇ）、脱酸（ｄｅｐｉｃｋｌｉｎｇ）、シンニング（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、再なめし（ｒｅｔａｎｎｉｎｇ）、潤滑化（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）、クラスティング（ｃｒｕｓｔｉｎｇ）、湿潤化、水絞り（ｓａｍｍｙｉｎｇ）、シェービング、再クロム処理（ｒｅｃｈｒｏｍｉｎｇ）、中和、染色、加脂、充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）、ストリッピング、スタッフィング（ｓｔｕｆｆｉｎｇ）、白化、固着（ｆｉｘａｔｉｎｇ）、セッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）、乾燥、コンディショニング（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、空打ち（ｍｉｌｌｉｎｇ）、ステーキング（ｓｔａｋｉｎｇ）、バフィング、仕上げ、油入れ（ｏｉｌｉｎｇ）、ブラッシング、パディング（ｐａｄｄｉｎｇ）、含浸、スプレー、ローラーコーティング、カーテンコーティング、艶出し（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）、型押し、アイロン掛け、グレージング（ｇｌａｚｉｎｇ）、タンブリングおよびその任意の組み合わせからなる群より選択することができる。一部の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生することができる、別に添加することができる、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞（ｃｏｍｅｏｃｙｔｅ）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞を含み得、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方細胞（ｃｕｂｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ）、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、ケラチノサイトを含み得、ケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、平滑筋細胞を含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ）、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、第１の真皮層は、第２の真皮層上に配置することができる。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、基底膜代用物をさらに含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に形成することができる。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然組織接着剤を含み得る。一部の実施形態では、天然組織接着剤は、フィブリン糊を含み得る。一部の実施形態では、足場は、部分的に合成皮革中に含まれ得���。一部の実施形態では、真皮層または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、補充物と共に培養することができる。一部の実施形態では、補充物は、コラーゲン、フィブリン、増殖因子、アスコルビン酸、硫酸デキストラン、またはカラゲナンのうちの１種または複数種を含み得る。一部の実施形態では、補充物は、天然補充物であり得る。一部の実施形態では、補充物は、合成補充物であり得る。一部の実施形態では、人工多能性幹細胞は、成体体細胞におけるＯｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃまたはその組み合わせの誘導遺伝子発現を通じて産生され得る。一部の実施形態では、革製品の少なくとも一部は、本明細書で開示される方法から形成され得る。一部の実施形態では、革製品は、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ（ｃｌｕｔｃｈ）、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、インテリア、エクステリア、椅子張り材料（ｕｐｈｏｌｓｔｅｒｙ）、製本材料（ｂｏｏｋ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙（ｗａｌｌ  ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、床材（ｆｌｏｏｒ  ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、天井張り材料（ｃｅｉｌｉｎｇ  ｃｏｖｅｒｉｎｇ）、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー（ｄｕｖｅｔ  ｃｏｖｅｒ）、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品のうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、革製品は、腕時計のバンドであり得る。一部の実施形態では、革製品は、ベルトであり得る。一部の実施形態では、革製品は、袋物であり得る。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【０００５】
本明細書において、合成皮革を製造する方法が開示される。一部の実施形態では、方法は、人工真皮層上に人工表皮層を配置し、それにより、層状構造を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトを含み得、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。一部の実施形態では、方法は、層状構造から表皮層の少なくとも一部を除去して、除去生成物を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、方法は、除去生成物の少なくとも一部をなめし、それにより、合成皮革を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞またはケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、合成皮革は、色素を含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、除去生成物は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、除去生成物は、さらなる処理に供され得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ（ｅｑｕｉｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、非哺乳動物は、魚類、鳥類または爬虫類であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、層状構造は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、真皮層は、さらなる処理に供することができる。一部の実施形態では、処理は、保存加工（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）、水漬け（ｓｏａｋｉｎｇ）、ベーチング（ｂａｔｉｎｇ）、ピックリング（ｐｉｃｋｌｉｎｇ）、脱酸（ｄｅｐｉｃｋｌｉｎｇ）、シンニング（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、再なめし（ｒｅｔａｎｎｉｎｇ）、潤滑化（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）、クラスティング（ｃｒｕｓｔｉｎｇ）、湿潤化、水絞り（ｓａｍｍｙｉｎｇ）、シェービング、再クロム処理（ｒｅｃｈｒｏｍｉｎｇ）、中和、染色、加脂、充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）、ストリッピング、スタッフィング（ｓｔｕｆｆｉｎｇ）、白化、固着（ｆｉｘａｔｉｎｇ）、セッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）、乾燥、コンディショニング（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、空打ち（ｍｉｌｌｉｎｇ）、ステーキング（ｓｔａｋｉｎｇ）、バフィング、仕上げ、油入れ（ｏｉｌｉｎｇ）、ブラッシング、パディング（ｐａｄｄｉｎｇ）、含浸、スプレー、ローラーコーティング、カーテンコーティング、艶出し（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）、プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）、型押し、アイロン掛け、グレージング（ｇｌａｚｉｎｇ）、タンブリングおよびその任意の組み合わせからなる群より選択することができる。一部の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生することができる、別に添加することができる、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞（ｃｏｍｅｏｃｙｔｅ）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞を含み得、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方細胞（ｃｕｂｏｉｄａｌ  ｃｅｌｌ）、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、ケラチノサイトを含み得、ケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、平滑筋細胞を含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ）、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、第１の真皮層は、第２の真皮層上に配置することができる。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、基底膜代用物をさらに含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に形成することができる。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場���、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然組織接着剤を含み得る。一部の実施形態では、天然組織接着剤は、フィブリン糊を含み得る。一部の実施形態では、足場は、部分的に合成皮革中に含まれ得る。一部の実施形態では、真皮層または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、補充物と共に培養することができる。一部の実施形態では、補充物は、コラーゲン、フィブリン、増殖因子、アスコルビン酸、硫酸デキストラン、またはカラゲナンのうちの１種または複数種を含み得る。一部の実施形態では、補充物は、天然補充物であり得る。一部の実施形態では、補充物は、合成補充物であり得る。一部の実施形態では、人工多能性幹細胞は、成体体細胞におけるＯｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃまたはその組み合わせの誘導遺伝子発現を通じて産生され得る。一部の実施形態では、革製品の少なくとも一部は、本明細書で開示される方法から形成され得る。一部の実施形態では、革製品は、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、インテリア、エクステリア、椅子張り材料、製本材料、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙、床材、天井張り材料、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品のうちの１つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、革製品は、腕時計のバンドであり得る。一部の実施形態では、革製品は、ベルトであり得る。一部の実施形態では、革製品は、袋物であり得る。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成皮革に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【０００６】
本明細書において、合成なめし皮革が開示される。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、なめす前に、線維芽細胞を含む人工真皮層を含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、なめす前に、人工表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、真皮層上にあり、それにより、層状構造を形成している場合がある。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、合成皮革は、色素をさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ（ｅｑｕｉｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、非哺乳動物は、魚類、鳥類または爬虫類であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生することができる、別に添加することができる、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞（ｃｏｍｅｏｃｙｔｅ）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞を含み得、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方細胞、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、ケラチノサイトを含み得、ケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、平滑筋細胞を含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ）、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、第１の真皮層は、第２の真皮層上にあり得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、基底膜代用物を含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に形成することができる。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然組織接着剤を含み得る。一部の実施形態では、天然組織接着剤は、フィブリン糊を含み得る。一部の実施形態では、足場は、合成なめし皮革中に部分的に含まれ得る。一部の実施形態では、真皮層または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、インテリア、エクステリア、椅子張り材料、製本材料、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙、床材、天井張り材料、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品のうちの１つまたは複数に含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、腕時計のバンドに含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、ベルトに含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、袋物に含まれ得る。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【０００７】
本明細書において、合成なめし皮革が開示される。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、なめす前に、層状構造を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、人工真皮層を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、人工表皮層を含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトを含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞またはケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、合成皮革は、色素をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、色素をさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ（ｅｑｕｉｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生することができる、別に添加することができる、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞（ｃｏｍｅｏｃｙｔｅ）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞を含み得、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方細胞、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、ケラチノサイトを含み得、ケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、平滑筋細胞を含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ）、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、第１の真皮層は、第２の真皮層上にあり得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、基底膜代用物を含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に形成することができる。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然組織接着剤を含み得る。一部の実施形態では、天然組織接着剤は、フィブリン糊を含み得る。一部の実施形態では、足場は、合成なめし皮革中に部分的に含まれ得る。一部の実施形態では、真皮層または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、インテリア、エクステリア、椅子張り材料、製本材料、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙、床材、天井張り材料、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品のうちの１つまたは複数に含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、腕時計のバンドに含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、ベルトに含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、袋物に含まれ得る。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【０００８】
本明細書において、合成なめし皮革が開示される。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、なめす前に、層状構造を含む除去生成物を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、人工真皮層を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、人工表皮層を含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトを含み得る。一部の実施形態では、表皮層の一部は、除去され得る。一部の実施形態では、線維芽細胞またはケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、除去生成物は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、合成皮革は、色素をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、色素をさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ（ｅｑｕｉｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、コラーゲンをさらに含み得る。一部の実施形態では、コラーゲンは、コラーゲン産生細胞によって少なくとも部分的に産生することができる、別に添加することができる、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、角質細胞（ｃｏｍｅｏｃｙｔｅ）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、上皮細胞を含み得、上皮細胞は、扁平上皮細胞、立方細胞、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、ケラチノサイトを含み得、ケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせを含む。一部の実施形態では、コラーゲン産生細胞は、平滑筋細胞を含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｎｔｉｎ）、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせのうちの１種または複数種をさらに含み得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の真皮層および第２の真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、第１の真皮層は、第２の真皮層上にあり得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、合成皮革は、第１の表皮層および第２の表皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、合成皮革は、基底膜代用物を含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に形成することができる。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然組織接着剤を含み得る。一部の実施形態では、天然組織接着剤は、フィブリン糊を含み得る。一部の実施形態では、足場は、合成なめし皮革中に部分的に含まれ得る。一部の実施形態では、真皮層または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、腕時計のバンド、ベルト、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類、かばん、袋物、クラッチ、財布、バックパック、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、インテリア、エクステリア、椅子張り材料、製本材料、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙、床材、天井張り材料、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品のうちの１つまたは複数に含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、腕時計のバンドに含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、ベルトに含まれ得る。一部の実施形態では、合成なめし皮革は、袋物に含まれ得る。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したもの��ある場合がある。合成なめし皮革に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【０００９】
本明細書において、人工表皮層が開示される。一部の実施形態では、人工表皮層は、毛包細胞およびメラノサイトを含み得る。一部の実施形態では、人工表皮層は、毛包細胞を含み得る。一部の実施形態では、人工表皮層は、メラノサイトを含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、毛包細胞は、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、哺乳動物メラノサイトであり得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、哺乳動物ケラチノサイトであり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト哺乳動物であり得る。一部の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギのうちの１つであり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、非哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、非哺乳動物は、魚類、鳥類または爬虫類であり得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、表皮層は、毛包を含み得る。人工表皮層に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。人工表皮層に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。人工表皮層に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００１０】
本明細書において、層状構造が開示される。一部の実施形態では、層状構造は、人工表皮層を含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、毛包細胞を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、人工真皮層を含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、毛包細胞は、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞またはその組み合わせであり得る。一部の実施形態では、表皮層は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、層状構造は、色素沈着している場合がある。一部の実施形態では、表皮層は、階層化されている場合がある。一部の実施形態では、層状構造は、基底膜代用物を含み得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、表皮層と真皮層との間にあり得る。一部の実施形態では、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、足場をさらに含み得る。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上にあり得る。一部の実施形態では、層状構造は、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン、脂質、脂肪酸、糖質、またはその組み合わせからなる群より選択される１種または複数種の構成要素を含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、２つまたはそれよりも多い真皮層をさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、毛包をさらに含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、柔皮をさらに含み得る。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００１１】
本明細書において、層状構造を製造する方法が開示される。一部の実施形態では、方法は、毛包細胞を含む人工表皮層を、人工多能性幹細胞から分化した細胞を含む人工真皮層上に配置し、それにより、層状構造を形成するステップを含み得る。一部の実施形態では、人工多能性幹細胞から分化した細胞は、線維芽細胞、メラノサイト、ケラチノサイトまたはその組み合わせであり得る。一部の実施形態では、人工多能性幹細胞から分化した細胞は、線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、毛包細胞は、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、メラノサイトをさらに含み得る。一部の実施形態では、メラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、真皮層は、補充物と共に培養することができる。一部の実施形態では、補充物は、コラーゲン、フィブリン、増殖因子、アスコルビン酸、硫酸デキストラン、カラゲナンまたはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、補充物は、天然補充物であり得る。一部の実施形態では、補充物は、合成補充物であり得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上で培養される場合がある。一部の実施形態では、足場は、天然または合成であり得る。一部の実施形態では、足場は、絹を含み得る。一部の実施形態では、足場は、キトサンを含み得る。一部の実施形態では、真皮層は、足場上に配置され得る。一部の実施形態では、表皮層は、階層化されている場合がある。一部の実施形態では、真皮層は、第２の真皮層上で培養される場合がある。一部の実施形態では、真皮層は、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養される場合がある。一部の実施形態では、真皮層は、コラーゲンマトリクス上で培養されない場合がある。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。層状構造���含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００１２】
本明細書において、層状構造が開示される。一部の実施形態では、層状構造は、毛包細胞およびケラチノサイトまたはメラノサイトを含む人工表皮層；線維芽細胞を含む人工真皮層を含み得、線維芽細胞、ケラチノサイトまたはメラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合があり、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現し、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現し、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現する。一部の実施形態では、層状構造は、人工表皮層を含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、毛包細胞を含み得る。一部の実施形態では、表皮層は、ケラチノサイトまたはメラノサイトを含み得る。一部の実施形態では、層状構造は、人工真皮層を含み得る。ある実施形態では、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。一部の実施形態では、線維芽細胞、ケラチノサイトまたはメラノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイトは、Ｓｏｘ−１０、ＭＩＴＦ−Ｍ、ｇｐ−１００、ＤＣＴ、ＴＹＲ、ＭＬＡＮＡまたはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ、またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物線維芽細胞であり得る。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、ＫＲＴ１４、ｐ６３、ＤＳＧ３、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５、ＴＡｐ６３、Ｌａｍｂ３、ＫＲＴ１８またはその組み合わせを発現することができる。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．０２ｍｍから約５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、真皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍに及び得る。一部の実施形態では、表皮層の厚さは、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍに及び得る。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。層状構造に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００１３】
本明細書において、人工表皮層が開示される。人工表皮層は、角質層を含み得る。人工表皮層は、顆粒層を含み得る。人工表皮層は、有棘層を含み得る。人工表皮層は、基底層を含み得る。一部の実施形態では、角質層、顆粒層、有棘層、または基底層は、図６Ａまたは図８Ａに示すように組織化されている場合がある。角質層の厚さは、約０．０１ｍｍから約０．０５ｍｍに及び得る。顆粒層の厚さは、約０．０１ｍｍから約０．１５ｍｍに及び得る。有棘層の厚さは、約０．０１ｍｍから約０．１５ｍｍに及び得る。前記基底層の厚さは、約０．０１ｍｍから約０．１５ｍｍに及び得る。角質層の厚さは、人工表皮層の約４％から約２０％に及び得る。顆粒層の厚さは、人工表皮層の約４％から約６０％に及び得る。有棘層の厚さは、人工表皮層の約４％から約４０％に及び得る。基底層の厚さは、人工表皮層の約４％から約４０％に及び得る。人工表皮層に含まれる細胞の少なくとも約２％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。人工表皮層に含まれる細胞の少なくとも約１０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。人工表皮層に含まれる細胞の少なくとも約５０％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００１４】
参照による組込み
本明細書において言及された全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれていると具体的および個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【００１５】
本明細書に記載の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示されている。本明細書に記載されている特徴の原理が使用されている説明的な例が示されている以下の詳細な記載および以下の添付の図面を参照すると、本明細書に記載されている特徴および特徴の利点に関するより良好な理解が得られるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、合成皮革生産の概略図を示す。
【００１７】
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、層状構造を示す。図２Ａは、足場上に表皮層および真皮層を含む層状構造を示す。図２Ｂは、足場上に表皮層、基底膜代用物、および真皮層を含む層状構造を示す。図２Ｃは、足場上に表皮層および複数の真皮層を含む層状構造を示す。図２Ｄは、足場上に表皮層、基底膜代用物、および複数の真皮層を含む層状構造を示す。図２Ｅは、表皮層、基底膜代用物、および複数の真皮層を含む層状構造を示す。図２Ｆは、表皮層および複数の真皮層を含む層状構造を示す。
【００１８】
【図３】図３は、層状構造の発達を示す。
【００１９】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、皮革（図４Ａ）、天然の皮膚（図４Ｂ）、および表皮等価物（図４Ｃ）の比較分析を示す。
【００２０】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、天然の皮膚および表皮等価物の角質層の比較分析を示す。図５Ａは、表皮表面画像を示す。図５Ｂは、コルネオデスモソーム（ｃｏｒｎｅｏ−ｄｅｓｍｏｓｏｍｅ）画像を示す。図５Ｃは、ＣＤＳＮ／ヘキスト画像を示す。
【００２１】
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、天然の皮膚および表皮等価物の顆粒層の比較分析を示す。図６Ａは、ロリクリン（ＬＯＲ）染色を示す。図６Ｂは、電子密度の高い沈殿物として透過型電子顕微鏡で撮影された表皮Ｃａ＋＋勾配を示す。図６Ｃは、ランタン灌流による透過性障壁完全性の評価を示す。図６Ｄは、タイトジャンクションタンパク質１／閉鎖帯−１（ＴＪＰ１／ＺＯ−１）が、脂質二重層内の原線維様構造であり得るタイトジャンクション鎖タンパク質を、アクチン細胞骨格に係留することを示す。図６Ｅは、縦列にクラスター化して、プロフィラグリンとして知られている大型３５０ｋＤａタンパク質前駆体となるフィラグリン（ＦＬＧ）モノマーが、ＳＧの細胞内のケラトヒアリン顆粒に存在することを示す。
【００２２】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＴＥＭで評価した天然の皮膚および表皮等価物の脂質二重層形成を示す。図７Ａは、ＳＣおよびＳＧの境界での正常な脂質分泌を示す。図７Ｂは、ＳＧの層状体（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｏｄｙ）を示す。図７Ｃは、天然の皮膚の正常な脂質二重層（ＬＢ）形態を示す。
【００２３】
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、基底上層のマーカーである、ケラチン１０（ＫＲＴ１０；図８Ａ）、ケラチン１（ＫＲＴ１；図８Ｂ）、デスモコリン１（ＤＣＬ１；図８Ｃ）を含む、天然の皮膚および表皮等価物の基底上層のマーカーの比較分析を示す。図８Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された表皮等価物の両方のデスモソームを示す。
【００２４】
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、天然の皮膚および表皮等価物の基底層の比較分析を示す。増殖のマーカーであるＭＫＩ６７（図９Ａ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４；図９Ｂ）、および転写因子ＴＰ６３（図９Ｃ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された表皮等価物の両方の典型的な基底の層の分布を示す。図９Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された表皮等価物の両方のヘミデスモソームを示す。
【００２５】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｆは、基底膜の細胞外マトリクス成分の比較分析を示す。図１０Ａは、インテグリンβ１発現を示す。図１０Ｂは、フィブロネクチン発現を示す。図１０Ｃは、コラーゲンＩＶ発現を示す。図１０Ｄは、コラーゲンＶＩ発現を示す。図１０Ｅは、コラーゲンＶＩＩ発現を示す。図１０Ｆは、ラミニン５発現を示す。
【００２６】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｉは、全層皮膚等価物（ＦＳＥ）の構造分析を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＦＳＥの断面が倍率２６００×（図１１Ａ）および倍率５２００×（図１１Ｂ）で表皮の別個の細胞層を表すことを示す。図１１Ｃは、倍率９００×のＦＳＥの表面を示す。図１１Ｄ〜１Ｆは、存在する真皮線維芽細胞および豊富な細胞外マトリクスを有する真皮足場の縦断面を倍率９１×（図１１Ｄ）、倍率１６２×（図１１Ｅ）および倍率４０５×（図１１Ｆ）で示す。図１１Ｇ〜１１Ｉは、存在する真皮線維芽細胞および豊富な細胞外マトリクスを有する真皮足場を倍率８０×（図１１Ｇ）、倍率６９５×（図１１Ｈ）および倍率２７００×（図１１Ｉ）で示す。
【００２７】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｒは、真皮等価物の操作の時間経過を示す。図１２Ａ〜１２Ｉは、足場上に真皮線維芽細胞を播種した２日後を倍率３６×（図１２Ａ）、倍率６９５×（図１２Ｂ）、倍率１４７０×（図１２Ｃ）、倍率７７５０×（図１２Ｄ）、倍率２３２０×（図１２Ｅ）、倍率２４２０×（図１２Ｆ）、倍率６５６０×（図１２Ｇ）、倍率１７０００×（図１２Ｈ）および倍率２２０００×（図１２Ｉ）で示す。図１２Ｊ〜１２Ｒは、足場上に真皮線維芽細胞を播種した７日後を倍率６４×（図１２Ｊ）、倍率１００×（図１２Ｋ）、倍率３６４×（図１２Ｌ）、倍率８２×（図１２Ｍ）、倍率２５３×（図１２Ｎ）、倍率３９４０×（図１２Ｏ）、倍率５５５０×（図１２Ｐ）、倍率９４４０×（図１２Ｑ）および倍率２１６８０（図１２Ｒ）で示す。
【図１２−２】図１２Ａ〜１２Ｒは、真皮等価物の操作の時間経過を示す。図１２Ａ〜１２Ｉは、足場上に真皮線維芽細胞を播種した２日後を倍率３６×（図１２Ａ）、倍率６９５×（図１２Ｂ）、倍率１４７０×（図１２Ｃ）、倍率７７５０×（図１２Ｄ）、倍率２３２０×（図１２Ｅ）、倍率２４２０×（図１２Ｆ）、倍率６５６０×（図１２Ｇ）、倍率１７０００×（図１２Ｈ）および倍率２２０００×（図１２Ｉ）で示す。図１２Ｊ〜１２Ｒは、足場上に真皮線維芽細胞を播種した７日後を倍率６４×（図１２Ｊ）、倍率１００×（図１２Ｋ）、倍率３６４×（図１２Ｌ）、倍率８２×（図１２Ｍ）、倍率２５３×（図１２Ｎ）、倍率３９４０×（図１２Ｏ）、倍率５５５０×（図１２Ｐ）、倍率９４４０×（図１２Ｑ）および倍率２１６８０（図１２Ｒ）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
例証のために応用例を参照して、いくつかの態様を下に説明する。本明細書に記載されている特徴の十分な理解をもたらすために数多くの具体的な詳細、関係、および方法が示されていることを理解すべきである。しかし、当業者であれば、１つもしくは複数の具体的な詳細事項なしに、または他の方法を用いて、本明細書記載の特徴を実施できることを容易に認識するであろう。具体的に示さない限り、一部の行為は、他の行為または事象と異なる順序でおよび／または同時に起こり得るので、本明細書に記載されている特徴は、行為または事象の例証された順序づけに限定されない。さらに、例証された行為または事象の全てが本明細書に記載されている特徴に従って方法を実行するために要求されるわけではない。
【００２９】
本明細書で使用される用語は、特定の場合について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明らかに示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有すること」、「有する」、「伴う」という用語、またはその変形が詳細な説明および／または特許請求の範囲で使用される限り、そのような用語は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包含的であることを意図する。
【００３０】
本開示において、「約」または「およそ」という用語は、所与の値の最大１０％の範囲を意味し得る。本開示において、「実質的に」という用語は、多大な範囲または程度までなされ得るものを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、任意の成体細胞を形成する能力を有する任意の前駆細胞を指す場合がある。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」または「ＥＳＣ」という用語は、任意の成体細胞を形成する能力を有する前駆細胞を指す場合がある。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、非多能性細胞（例えば成体体細胞）から人工的に派生した多能性幹細胞の一種を指す場合がある。人工多能性幹細胞は、任意の成体細胞を形成する能力において胚性幹細胞と同一であり得るが、胚に由来しない。場合により、本明細書で開示されるＩＰＳＣ細胞は、ＩＰＳＣ細胞であり得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「合成皮革」という用語は、本明細書に記載されている皮膚等価物が、任意の哺乳動物または非哺乳動物にとって皮膚等価物として役立ち得ることを意味することができる。実施形態は、ヒト、ならびに非ヒト霊長類ならびにウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、およびネコ種のメンバーのみならず、マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類、ウサギを含むウサギ科のメンバーなどの非ヒト哺乳動物；ならびにサメおよびアカエイを含む魚類、ダチョウを含む鳥類、ならびにトカゲ、ヘビおよびクロコダイルを含む爬虫類などの非哺乳動物を用いて実施することができる。形成される特定の哺乳動物合成皮革は、本明細書に記載されている実施形態に使用される細胞の供給源、例えばケラチノサイトおよび線維芽細胞に依存する場合があり、例えば、皮膚等価物を形成するためにウシのケラチノサイトおよび線維芽細胞が使用される場合、ウシの合成皮革を形成することができる。
【００３５】
概要
本明細書において、合成皮革、人工表皮層、人工真皮層、層状構造、それらから製造された製品およびその生産方法が開示される。ある特定の場合に、本明細書において合成皮革が開示される。場合により、合成皮革は、１つまたは複数の層を含む。場合により、１つまたは複数の層は細胞を含み、前記細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。場合により、本明細書に記載されている方法は、合成皮革の生産を、確実に、正確に、および再現性よく商業レベルに拡大するハイスループット方法を提供する。合成皮革、操作された表皮等価物、操作された全層皮膚等価物および本明細書で開示されるそれを製造する方法の利点は、これに限定されないが、魅力的な外観、テクスチャー、厚さ、および耐久性のカスタマイズされた組織を、再現性よく、ハイスループットで、規模の拡大縮小が容易な形で生産することを含む。本明細書で使用される場合、全層皮膚等価物は、少なくとも１つの真皮層および少なくとも１つの表皮層を含み得る。本明細書で使用される場合、全層皮膚等価物および全皮膚等価物は、互換的に使用することができる。
【００３６】
本明細書で開示される合成皮革は、線維芽細胞を含む人工真皮層という層およびケラチノサイトを含む人工表皮層を含み得る。真皮層および表皮層は、層状構造を形成し得る。合成皮革は、１つまたは複数の層状構造を含み得る。合成皮革は、なめされ、さらに処理され得る。合成層を形成している細胞は、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化したものである場合がある。天然皮革の厚さおよびテクスチャーを達成するために、真皮層は、絹などの足場上に配置される場合がある。
【００３７】
本明細書において、合成皮革を製造する方法も開示される。方法は、人工真皮層および人工表皮層を含む層状構造を形成するステップ、ならびに層状構造をなめすステップを含み得る。方法は、例えば、天然皮革の厚さおよびテクスチャーを達成するために、人工真皮層および表皮層をさらに処理するステップも含み得る。
【００３８】
合成皮革
合成皮革は、１つまたは複数の細胞層を含み得る。例えば、合成皮革は、真皮層、表皮層、および基底膜または基底膜代用物のうちの１つまたは複数を含み得る。合成皮革は、皮下組織、鱗屑、薄板、皮骨（ｏｓｔｅｏｄｅｒｍ）、またはその組み合わせをさらに含み得る。場合により、合成層は、全層皮膚等価物を含む。そのような全層皮膚等価物は、本明細書で開示される層のうちの任意の１つまたは組み合わせを含み得る。合成皮革中の１つまたは複数の細胞層の一部は、例えばシェービングにより除去される場合がある。場合により、合成皮革は、なめすことができる。なめしは、細胞層または層状構造のうちの１つまたは複数の形成後に行うことができる。なめしは、細胞層の少なくとも一部が合成皮革から除去できた後に行うことができる。場合により、合成皮革は、さらに処理される場合がある。場合により、合成皮革は、毛包細胞およびメラノサイトを含み得る。毛包細胞および／またはメラノサイトは、幹細胞（例えばｉＰＳＣ）から分化したものである場合がある。
【００３９】
一部の実施形態では、合成なめし皮革は、層状構造を含み得る。層状構造は、線維芽細胞を含む人工真皮層を含み得る。層状構造は、ケラチノサイトを含む人工表皮層も含み得る。場合により、層状構造は、線維芽細胞を含む人工真皮層およびケラチノサイトを含む人工表皮層を含み得る。場合により、線維芽細胞またはケラチノサイトは、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００４０】
場合により、合成なめし皮革は、真皮層の少なくとも部分を含み得る。場合により、合成なめし皮革は、真皮層を含まない。場合により、真皮層は、除去される場合がある。
【００４１】
真皮層
合成皮革は、真皮層（例えば人工真皮層）を含み得る。真皮層は、操作された真皮等価物、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した人工真皮層であり得る。
【００４２】
真皮層は、結合組織の細胞を含み得る。例えば、真皮層は、線維芽細胞を含み得る。真皮層中の線維芽細胞は、これらに限定されないが、表面抗原分類１０（ＣＤ１０）、表面抗原分類７３（ＣＤ７３）、表面抗原分類４４（ＣＤ４４）、表面抗原分類９０（ＣＤ９０）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、およびプロリル−４−ヒドロキシラーゼベータ線維芽細胞を含む１つまたは複数のマーカーを発現することができる。場合により、真皮層は、免疫細胞、マクロファージ、脂肪細胞、またはその組み合わせなどの他の種類の細胞も含む。
【００４３】
真皮層は、細胞に加えてマトリクス構成要素をさらに含み得る。マトリクス構成要素の例には、これらに限定されないが、コラーゲン、エラスチン、ならびにグリコサミノグリカン（例えばヒアルロナン）、プロテオグリカン、および糖タンパク質から主として構成される細胞外ゲル様物質である原線維外マトリクスのうちの任意の１つまたは複数が含まれる。
【００４４】
真皮層は、マトリクス支持体を含み得る。マトリクス支持体は、足場であり得る。マトリクス支持体は、収縮コラーゲンゲルを含み得る。純粋なコラーゲンマトリクスの代替物は、例えば、Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈら、Ｊ．  Ｂｕｒｎ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｈａｂｉｌ．、１５巻：３４６〜５３頁（１９９４年）に記載されているポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｇｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）メッシュ、または例えばＢｕｒｋｅら、Ａｎｎ．  Ｓｕｒｇ．、１９４巻：４１３〜４２０頁（１９８１年）に記載されているシラスティック膜で覆われたコラーゲンおよびグリコサミノグリカンマトリクス（Ｃ−ＧＡＧ）、または様々な生体高分子、例えばＫｅｌｌｏｕｃｈｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、３６３巻：４７２〜４７８頁（２００７年）に記載されているキトサンであり得る。場合により、マトリクスに線維芽細胞を播種して、例えば器官型モデルを生じさせることができる。同種死体皮膚からの天然由来の真皮をケラチノサイトシートと共に使用することもできる。この技法の変形は、ケラチノサイトシートを支持するために死体皮膚からの凍結乾燥失活真皮を使用することができる。
【００４５】
皮革の厚さは、単位がミリメートル、オンス、またはアイロン（ｉｒｏｎ）で報告される場合がある。（１オンスは、１／６４インチまたは０．０１５６インチまたは０．３９６ｍｍに等しい。１アイロンは、１／４８インチまたは０．０２０８インチまたは０．５３ｍｍに等しい。）
【００４６】
真皮層の厚さは、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。真皮層は、厚さ約０．０１ｍｍから約５０ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、厚さ約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、厚さ約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、厚さ約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、厚さ約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、真皮層の厚さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、真皮層の厚さは、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０ｍｍの厚さを有し得る。
【００４７】
真皮層の長さは、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。真皮層は、長さ約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、真皮層は、長さ約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、長さ約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、長さ約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、長さ約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、真皮層の長さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、真皮層の長さは、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの長さを有し得る。
【００４８】
真皮層の幅は、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。真皮層は、幅約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、真皮層は、幅約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、幅約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、幅約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、真皮層は、幅約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、真皮層の幅は、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、真皮層の幅は、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、真皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの幅を有し得る。
【００４９】
合成皮革は、１つまたは複数の真皮層を含み得る。例えば、合成皮革は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、４０、６０、８０、または１００個の真皮層を有し得る。合成皮革が１つよりも多い真皮層を含む場合、真皮層は、別の真皮層上に配置される場合がある。例えば、合成皮革は、２つの真皮層、例えば第１の真皮層および第２の真皮層を含み得る。第１の真皮層は、第２の真皮層上に配置される場合がある。
【００５０】
真皮層は、例えば複数の亜層（ｓｕｂｌａｙｅｒ）を有して、階層化されている場合がある。亜層は、異なる組成、例えば、異なる濃度の線維を有し得る。真皮層の亜層は、異なる厚さおよび密度を有し得る。例えば、真皮層は、真皮乳頭層（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｌａｙｅｒ）、真皮網状層（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｄｅｒｍａｌ  ｌａｙｅｒ）、またはその任意の組み合わせを有し得る。真皮乳頭層は、ゆるい輪紋状結合組織（ｌｏｏｓｅ  ａｒｅｏｌａｒ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）および／またはゆるく配列した線維、例えばコラーゲン線維を含み得る。真皮網状層は、コラーゲン線維および真皮弾性線維を含む密な不規則性結合組織を含み得る。
【００５１】
真皮層は、全方向に収縮性で均質であり得る遊離のコラーゲンマトリクスまたは格子を含み得る。線維芽細胞、および適切な場合には真皮の他の種類の細胞は、連続コラーゲンゲル中に分布している場合がある。真皮等価物は、線維芽細胞が分布している少なくとも１つのコラーゲンＩ型マトリクスを含み得る。これは、他の細胞外マトリクス成分も含有し得る。細胞外マトリクス成分には、コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンまたはヒアルロン酸が含まれ得る。真皮層は、コラーゲンＩＶ型およびラミニン、エンタクチン、またはその組み合わせを含有する場合がある。これらの様々な成分の濃度は、調整することができる。例えば、ラミニンの濃度は、最終容積の約１％から約１５％であり得る。例えば、コラーゲンＩＶの濃度は、最終容積の約０．３％から約４．５％であり得る。例えば、エンタクチンの濃度は、最終容積の約０．０５％から約１％であり得る。使用されるコラーゲンは、ウシ起源、ラット尾もしくは魚由来のコラーゲン、または任意の他の供給源の天然コラーゲンもしくは線維芽細胞の存在下で収縮を可能にする遺伝子工学により産生されたコラーゲンであり得る。一部の実施形態では、コラーゲンは、非天然供給源に由来し得る。マトリクスは、ピンと張っていない場合があるコラーゲンゲルであって、線維芽細胞の優先的組織化を課さない水平および垂直の両方の収縮によって得られるコラーゲンゲルであり得る。「遊離」とも呼ばれるそのようなマトリクスは、支持体に接着しない場合があり、それに様々な厚さおよび直径を付与してその容積を無制限に改変することができる。真皮等価物の厚さは、少なくとも０．０５ｃｍ、場合によりおよそ０．０５から２ｃｍであり得る。厚さは、皮膚等価物または合成皮革の有利な性質を損なわずに増加することもできる。場合により、厚さは、約３ｍｍから約２０ｃｍまたはそれよりも多い場合がある。
【００５２】
表皮層
合成皮革は、表皮層（例えば人工表皮層）を含み得る。表皮層は、操作された表皮等価物、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成した人工表皮層であり得る。
【００５３】
表皮層は、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、および炎症細胞を含む１つまたは複数の種類の細胞を含み得る。例えば、表皮層は、ケラチノサイトを含み得る。表皮層中のケラチノサイトは、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその任意の組み合わせを含み得る。
【００５４】
場合により、表皮層は、少なくとも基底ケラチノサイト、例えば、分化していないケラチノサイトを含む。表皮層は、部分的に分化したケラチノサイトおよび完全に分化したケラチノサイトをさらに含み得る。合成皮革中の１つまたは複数の表皮層において、基底ケラチノサイトが局在する真皮表皮接合部からケラチノサイトが前進するときに、未分化の基底ケラチノサイトから完全に分化したケラチノサイトへの移行があり得る。
【００５５】
基底ケラチノサイトは、表皮層および真皮層を一緒に守ることを助けるために役立つヘミデスモソームを発現することができる。基底ケラチノサイトは、皮膚を再生するために役立つこともできる。本明細書における合成皮革中の表皮層は、これらの機能に役立つ基底ケラチノサイトを有し得る。したがって、そのような基底ケラチノサイトを含む合成皮革は、再生能があり得る。合成皮革中の１つまたは複数の表皮層における基底ケラチノサイトと分化したケラチノサイトとの間の他の差異は、基底膜部（ｂａｓａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｚｏｎｅ）（ＢＭＺ）に沿って表皮ケラチノサイト中にＥ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンの両方が存在するが、分化して、ＢＭＺから離れて局在するケラチノサイトは、Ｅ−カドヘリンだけを発現することであり得る。
【００５６】
表皮層の基底ケラチノサイトは、真皮層と直接接触する層において整列している場合があり、分化したケラチノサイトと線維芽細胞との間の境界として役立つ。別の場合には、基底ケラチノサイトと真皮層との間にギャップがある。なおさらに、分化したケラチノサイトと真皮層との間のギャップを残しながら、基底ケラチノサイトと他の基底ケラチノサイトとの間にギャップがある場合がある。基底ケラチノサイトまたは分化したケラチノサイトと真皮層との間にギャップがあるこれらの後者の場合、真皮層および表皮層は、互いに一様に接触しているわけでなく、相互に隣接している。真皮層と表皮層との間に、概して流体があり得るが、細胞、コラーゲン、マトリクスまたは他の支持体の層などの他の介在物質が実質的にあり得ない点で、それらは隣接している。
【００５７】
表皮層中のケラチノサイトは、１つまたは複数のマーカーを発現することができる。そのようなマーカーには、これらに限定されないが、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、腫瘍タンパク質ｐ６３（ｐ６３）、デスモグレイン３（ＤＳＧ３）、インテグリンベータ４（ＩＴＧＢ４）、ラミニンアルファ５（ＬＡＭＡ５）、ケラチン５（ＫＲＴ５）、腫瘍タンパク質ｐ６３のアイソフォーム（例えばＴＡｐ６３）、ラミニンベータ３（ＬＡＭＢ３）、およびケラチン１８（ＫＲＴ１８）が含まれる。
【００５８】
表皮層の厚さは、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。表皮層は、厚さ約０．００１ｍｍから約１０ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、厚さ約０．００５ｍｍから約１０ｍｍ、約０．００５ｍｍから約５ｍｍ、約０．００５ｍｍから約２ｍｍ、約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約５ｍｍ、約０．０１ｍｍから約２ｍｍ、約０．０１ｍｍから約１、約０．０１ｍｍから約０．８ｍｍ、約０．０１ｍｍから約０．４ｍｍ、約０．０１ｍｍから約０．２ｍｍ、約０．０１ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．４ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．２ｍｍ、約０．０５ｍｍから約０．１ｍｍ、約０．１ｍｍから約０．４ｍｍ、約０．１ｍｍから約０．２ｍｍ、約０．０８ｍｍから約１ｍｍ、または約０．０５ｍｍから約１．５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、厚さ約０．０１ｍｍから約２ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、厚さ約０．１ｍｍから約０．２２ｍｍを有し得る。場合により、表皮層の厚さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、真皮層の厚さは、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。場合により、本明細書に記載されている厚さの値は、表皮層および基底膜代用物の厚さであり得る。
【００５９】
表皮層の長さは、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。表皮層は、長さ約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、表皮層は、長さ約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、長さ約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、長さ約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、長さ約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、表皮層の長さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、表皮層の長さは、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、表皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、表皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、表皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの長さを有し得る。
【００６０】
表皮層の幅は、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。表皮層は、幅約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、表皮層は、幅約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、幅約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、幅約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、表皮層は、幅約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、表皮層の幅は、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、表皮層の幅は、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、表皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、表皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、表皮層は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの幅を有し得る。
【００６１】
合成皮革は、１つまたは複数の表皮層を含み得る。例えば、合成皮革は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、４０、６０、８０、または１００個の表皮層を有し得る。合成皮革が１つよりも多い表皮層を含む場合、１つの表皮層は、別の表皮層上に配置される場合がある。例えば、合成皮革は、２つの表皮層、例えば第１の表皮層および第２の表皮層を含み得る。第１の表皮層は、第２の表皮層上に配置される場合がある。
【００６２】
表皮層は、例えば複数の亜層を有して、階層化されている場合がある。亜層は、異なる細胞組成、例えば、異なる種類のケラチノサイトを有し得る。表皮層の亜層は、異なる厚さおよび／または密度を有し得る。例えば、表皮層は、角化層（角質層）、透明（ｃｌｅａｒ）／半透明（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）層（淡明層）、顆粒状層（顆粒層）、有棘状層（有棘層）、基底の層／胚芽層（基底層／芽層（ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｕｍ））、またはその任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を有し得る。場合により、表皮層は、機能的表皮透過性バリア（例えば、角質層における組織化脂質二重層）を含む。場合により、角質層、淡明層、顆粒層、有棘層、または基底層／芽層は、約０．０００１ｍｍから約５ｍｍの厚さを有し得る。場合により、角質層、淡明層、顆粒層、有棘層、または基底層／芽層は、少なくとも約０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍの厚さを有し得る。場合により、角質層、淡明層、顆粒層、有棘層、または基底層／芽層は、最大で約５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍの厚さを有し得る。
【００６３】
表皮層は、色素、例えばメラニンを産生する細胞をさらに含み得る。そのような色素産生細胞は、メラノサイトであり得る。表皮層中のメラノサイトは、１つまたは複数のマーカーを発現することができる。そのようなマーカーには、これらに限定されないが、ＳＲＹボックス含有遺伝子１０（Ｓｏｘ−１０）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ−Ｍ）、プレメラノソームタンパク質（ｇｐ−１００）、ドパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、およびメランＡ（ＭＬＡＮＡ）が含まれ得る。
【００６４】
合成皮革中の細胞
合成皮革は、本明細書で開示される真皮層および表皮層中の細胞を含み得る。場合により、合成皮革は、毛包細胞、内皮細胞、真皮乳頭細胞、免疫系細胞（リンパ球、樹状細胞、マクロファージまたはランゲルハンス細胞など）、脂肪細胞、神経細胞、およびそれらの混合物も含む。
【００６５】
合成皮革中の１つまたは複数の細胞は、遺伝子操作された細胞であり得る。「遺伝子操作された」という用語は、細胞の核酸含有量への人工的な変更を指す場合がある。したがって、遺伝子操作された細胞には、細胞のゲノム中の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含有する細胞、ならびに細胞に挿入された自己複製染色体外核酸の導入を含む変更を含有する細胞が含まれ得る。遺伝子操作された細胞には、１つまたは複数の遺伝子の転写が変更されている、例えば増加または減少されている細胞も含まれる。
【００６６】
場合により、合成皮革は、メラノサイト、毛包、汗腺および神経終末部などの天然の皮膚の構成要素のうちの少なくとも１つを有する。ある特定の場合に、合成皮革は、それがこれらの構成要素のうちの少なくとも１つの欠如していることにより、正常で天然の皮膚と識別することができる。異常な表現型を表す、または変更された遺伝子型を有する少なくとも１つの細胞を有する一部の場合では、合成皮革は、これらの構成要素のうちの全てを含むことができる。
【００６７】
ある場合に、追加的な構成要素が合成皮革に添加される場合がある。そのような追加的な構成要素には、筋上皮細胞、導管細胞、分泌細胞、肺胞細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、接着、乳腺、またはその任意の混合物が含まれ得る。場合により、合成皮革は、神経細胞、結合組織（骨、軟骨、骨形成細胞および軟骨細胞に分化している細胞、ならびにリンパ組織を含む）、上皮細胞（腔および管の内層またはチャネルを形成する内皮細胞、外分泌上皮細胞、上皮吸収細胞、角化する上皮細胞、ならびに細胞外マトリクス分泌細胞を含む）、および未分化細胞（胚細胞、幹細胞、および他の前駆細胞など）のうちの１つまたは複数を含む。
【００６８】
合成皮革は、毛包を含み得る。毛包は、乳頭、マトリクス、毛根鞘、隆起、漏斗、立毛筋、皮脂腺、およびアポクリン汗腺を含む１つまたは複数の構造を含み得る。毛包は、真皮乳頭細胞、外毛根鞘細胞、またはその任意の組み合わせを含む１つまたは複数の毛包細胞を含み得る。場合により、毛包は、表皮層中にある場合がある。場合により、毛包は、真皮層中にある場合がある。毛包細胞は、前駆体、例えばｉＰＳＣなどの幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、毛包細胞の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００６９】
一部の実施形態では、合成皮革は、毛、血管、皮脂腺、毛包、脂腺、神経、またはその組み合わせを欠如する場合がある。
【００７０】
場合により、合成皮革は、例えば１つまたは複数の層状構造中に毛を含み得る。例えば、合成皮革は、柔皮を含み得る。毛（例えば、柔皮）は、天然、合成、またはその組み合わせであり得る。毛（例えば、柔皮）は、合成皮革中の細胞から成長させる、または外因性供給源から合成皮革に添加することができる。他の場合に、合成皮革は、毛を全く有しない場合がある。
【００７１】
幹細胞
合成皮革中の１つまたは複数の細胞は、幹細胞などの前駆細胞から分化したものである場合がある。例えば、合成皮革中の線維芽細胞は、幹細胞から分化したものである場合がある。例えば、合成皮革中のケラチノサイトは、幹細胞から分化したものである場合がある。例えば、合成皮革中のメラノサイトは、幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％は、幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、線維芽細胞の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、ケラチノサイトの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。一部の実施形態では、メラノサイト細胞の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％は、人工多能性幹細胞から分化したものである場合がある。
【００７２】
幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞（すなわち体性幹細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。一部の実施形態では、幹細胞は、全能性、多能性または多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）の例えば成体幹細胞および臍帯血幹細胞であり得る）。胚性幹細胞は、１週齢未満の受精胚から派生させることができる。人工多能性幹細胞は、線維芽細胞などの任意の体細胞（例えば成体体細胞）におけるＯｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子のうちの１つまたは複数の誘導発現を通じて得ることができる。場合により、１つまたは複数の他の遺伝子が、体細胞を人工多能性幹細胞にリプログラミングするために誘導される場合もある。そのような遺伝子の例には、ＮＡＮＯＧ、ＵＴＦ１、ＬＩＮ２８、ＳＡＬＬ４、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＥＳＳＲＢ、ＤＰＰＡ４、ＳＶ４０ＬＴ、ＲＥＭ２、ＭＤＭ２、およびサイクリンＤ１が含まれる。
【００７３】
遺伝子発現をモジュレートして体細胞をｉＰＳＣにリプログラミングするために様々な送達方法が使用される場合がある。例示的な送達方法には、裸のＤＮＡの送達、アデノウイルス、電気的送達、化学的送達、機械的送達、ポリマーベースのシステム、マイクロインジェクション、レトロウイルス（例えば、ＭＭＬＶ由来レトロウイルス）、およびレンチウイルス（例えば、切除可能なレンチウイルス）が含まれる。場合により、人工多能性幹細胞は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ．  ２００７年１１月３０日；１３１巻（５号）：８６１〜７２頁（２００７年）、またはＹｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８巻、１９１７〜１９２０頁（２００７年）（２００７年）によって記載されているプロトコールに従って得ることができる。場合により、体細胞（例えば成体体細胞）に、Ｏｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含むレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターがトランスフェクトされる。場合により、センダイウイルス、例えば、株式会社ＩＤファーマ（日本）製のセンダイウイルスが送達システムとして使用される。
【００７４】
細胞の供給源
合成皮革は、１つまたは複数の種の動物に由来する細胞を含み得る。例えば、合成皮革中の細胞は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物、またはその任意の組み合わせに由来し得る。
【００７５】
合成皮革は、哺乳動物、例えば、哺乳動物細胞、または非哺乳動物に由来する細胞を含み得る。哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であり得る。非ヒト哺乳動物は、アンテロープ、クマ、ビーバー、バイソン、イノシシ、ラクダ、カリブー、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ゾウ、エルク、キツネ、キリン、ヤギ、ノウサギ、ウマ、アイベックス、カンガルー、ライオン、ラマ、オオヤマネコ、ミンク、ムース、雄ウシ、ペッカリー、ブタ、ウサギ、サイ、アザラシ、ヒツジ、リス、トラ、クジラ、オオカミ、ヤク、またはシマウマであり得る。場合により、哺乳動物は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはウサギであり得る。非哺乳動物は、魚類、鳥類または爬虫類であり得る。場合により、哺乳動物は、ヒトであり得る。一部の実施形態では、ヒトは、著名人であり得る。本明細書で使用される場合、「著名人」という用語は、以前の活動の評判または一般的な名声により社会の注目を浴びた人物として定義することができる。「著名人」は、これらに限定されないが、プロおよびアマチュアスポーツ、エンターテインメント、音楽、映画、ビジネス、活字および電子媒体、政治などを含む業界に関連し得る。
【００７６】
合成皮革は、他の種に由来する細胞を含み得る。場合により、細胞は、ニワトリ、アヒル、エミュー、ガチョウ、ライチョウ、ダチョウ、キジ、ハト、ウズラ、またはシチメンチョウなどの鳥類に由来する。場合により、細胞は、カメ、ヘビ、クロコダイル、またはアリゲーターなどの爬虫類に由来する。場合により、細胞は、カエル、ヒキガエル、サンショウウオ、またはイモリなどの両生類に由来する。場合により、細胞は、カタクチイワシ、バス、ナマズ、コイ、タラ、ウナギ、ヒラメ、フグ、ハタ、コダラ、オヒョウ、ニシン、サバ、マヒマヒ、オニイトマキエイ、カジキ、オレンジラフィー、パーチ、カワカマス、ポラック、サケ、イワシ、サメ、フエダイ、シタビラメ、アカエイ、メカジキ、ティラピア、マス、マグロ、またはウォールアイなどの魚類に由来する。
【００７７】
場合により、合成皮革中の全ての細胞は、同じ種に由来する。例えば、合成皮革中の全ての細胞は、ウシ細胞であり得る。他の場合に、合成皮革は、複数の種に由来する細胞を含む。例えば、合成皮革は、ウシ細胞およびアリゲーター細胞を含み得る。場合により、合成皮革は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、または１０個の種に由来する細胞を含む。
【００７８】
合成皮革中の細胞の前駆体も、本明細書に記載されている供給源に由来し得る。例えば、幹細胞（例えばｉＰＳＣ）、体細胞（例えば、ｉＰＳＣにリプログラミングするため）、合成細胞に使用される初代細胞、真皮層細胞、表皮層細胞、または合成細胞およびその前駆体における任意の細胞は、本明細書に記載されている供給源に由来し得る。
【００７９】
任意の細胞は、生細胞または死細胞であり得る。複数の細胞が存在する場合、細胞は、生細胞であっても、死細胞であっても、その任意の組み合わせであってもよい。
【００８０】
層状構造
合成皮革は、１つまたは複数の層状構造を含み得る。層状構造は、第２の種類の層上に第１の種類の層を配置することによって形成することができる。第１の種類の層および第２の種類の層は、同じまたは異なる場合がある。場合により、層状構造は、真皮層上に表皮層を配置することによって形成することができる。例えば、層状構造は、基底膜代用物を間に含んで真皮層上に表皮層を配置することによって形成することができる。
【００８１】
層状構造は、２つまたはそれよりも多い層を含み得る。場合により、層状構造は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、または１０００個の層を含む。場合により、層状構造は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、または１０００個の第１の種類の層、および少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、または５０個の第２の種類の層を含む。例えば、層状構造は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、または１０００個の真皮層、および少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、または１０００層の表皮層を含み得る。
【００８２】
層状構造は、本明細書に記載されている１つまたは複数の種類の細胞を含み得る。例えば、層状構造は、線維芽細胞などの真皮層中の細胞、ケラチノサイトなどの表皮層中の細胞、またはその任意の組み合わせを含み得る。場合により、層状構造は、線維芽細胞およびケラチノサイト以外の細胞をさらに含む。例えば、層状構造は、メラノサイトを含み得る。
【００８３】
層状構造は、厚さ約０．００１ｍｍから約１００ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、厚さ約０．００５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．００５から約１０、約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。場合により、層状構造の厚さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、４０ｍｍ、６０ｍｍ、８０ｍｍ、または１００ｍｍであり得る。場合により、層状構造の厚さは、最大で１００ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００ｍｍの厚さを有し得る。
【００８４】
層状構造の長さは、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。層状構造は、長さ約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、層状構造は、長さ約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、長さ約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、長さ約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、長さ約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、層状構造の長さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、層状構造の長さは、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの長さを有し得る。
【００８５】
層状構造の幅は、合成皮革の機能または使用に適合するように操作される場合がある。層状構造は、幅約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、層状構造は、幅約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、幅約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、幅約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、幅約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、層状構造の幅は、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、層状構造の幅は、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、層状構造は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの幅を有し得る。
【００８６】
層状構造は、線維芽細胞およびケラチノサイトを少なくとも約５０：１、４０：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：１０、または１：１００の任意の比で含み得る。場合により、線維芽細胞対ケラチノサイトの比は、約２０：１から約３：１、約２０：１から約４：１、約２０：１から約５：１、約２０：１から約１０：１、または約２０：１から約１５：１であり得る。
【００８７】
層状構造は、線維芽細胞およびメラノサイトを少なくとも約５０：１、４０：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：１０、または１：１００の任意の比で含み得る。場合により、線維芽細胞対メラノサイトの比は、約２０：１から約３：１、約２０：１から約４：１、約２０：１から約５：１、約２０：１から約１０：１、または約２０：１から約１５：１であり得る。
【００８８】
層状構造は、ケラチノサイトおよびメラノサイトを少なくとも約５０：１、４０：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：１０、または１：１００の任意の比で含み得る。場合により、ケラチノサイト対メラノサイトの比は、約２０：１から約３：１、約２０：１から約４：１、約２０：１から約５：１、約２０：１から約１０：１、または約２０：１から約１５：１であり得る。
【００８９】
層状構造中の１種類の細胞は、層状構造中の全細胞集団の最大で９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１０％、５％、または１％を構成し得る。層状構造中の１種類の細胞は、層状構造中の全細胞集団の少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を構成し得る。例えば、層状構造中の線維芽細胞は、層状構造中の全細胞集団の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を構成し得る。
【００９０】
合成皮革
合成皮革は、１つまたは複数の層状構造によって形成される場合がある。例えば、合成皮革は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個の層状構造によって形成される場合がある。
【００９１】
合成皮革は、様々な厚さであり得る。例えば、合成皮革は、天然皮革に類似した厚さを有し得る。場合により、合成皮革は、厚さ約０．００１ｍｍから約１００ｍｍを有し得る。例えば、層状構造は、厚さ約０．００５ｍｍから約５０ｍｍ、約０．００５から約１０、約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．５ｍｍから約５ｍｍ、約０．５ｍｍから約３ｍｍ、約０．８ｍｍから約３ｍｍ、約０．８ｍｍから約２ｍｍ、約０．８ｍｍから約１．８ｍｍ、約０．８ｍｍから約１．６ｍｍ、約０．９ｍｍから約１．４ｍｍ、約１ｍｍから約１．５ｍｍ、約１ｍｍから約１．４ｍｍ、または約１ｍｍから約１．３ｍｍを有し得る。場合により、合成皮革の厚さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、４０ｍｍ、６０ｍｍ、８０ｍｍ、または１００ｍｍであり得る。場合により、合成皮革の厚さは、最大で１００ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。場合により、合成皮革の厚さは、約１．２ｍｍであり得る。
【００９２】
合成皮革は、長さ約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、合成皮革は、長さ約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、合成皮革は、長さ約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、合成皮革は、長さ約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、合成皮革は、長さ約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、合成皮革の長さは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、合成皮革の長さは、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、合成皮革は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、合成皮革は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの長さを有し得る。一部の実施形態では、合成皮革は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの長さを有し得る。
【００９３】
合成皮革は、幅約０．０１ｍｍから約５０ｍを有し得る。例えば、合成皮革は、幅約０．０１ｍｍから約１０ｍｍ、約０．０１ｍｍから約８ｍｍ、約０．０１から約５ｍｍ、約０．０２から約５ｍｍ、約０．０５から約５ｍｍ、約０．１から約５ｍｍ、約０．１から約２ｍｍ、約０．１から約１ｍｍ、約０．１から約０．８ｍｍ、または約０．１から約０．５ｍｍを有し得る。例えば、合成皮革は、幅約０．０２ｍｍから５ｍｍを有し得る。例えば、合成皮革は、幅約０．１ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。例えば、合成皮革は、幅約０．２ｍｍから０．５ｍｍを有し得る。場合により、合成皮革の幅は、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。場合により、合成皮革の幅は、最大で５０ｍｍ、４０ｍｍ、２０ｍｍ、１０ｍｍ、８ｍｍ、４ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０１ｍｍであり得る。一部の実施形態では、合成皮革は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ｍｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、合成皮革は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００ｃｍの幅を有し得る。一部の実施形態では、合成皮革は、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００ｍの幅を有し得る。
【００９４】
基底膜代用物
合成皮革は、基底膜代用物をさらに含み得る。基底膜代用物は、２つの細胞層、例えば、真皮層と表皮層との間にあり得る。基底膜代用物は、構造的観点および／または生化学的観点からｉｎ  ｖｉｖｏで存在するものと類似した真皮表皮接合部であり得る。生化学的観点から、基底膜代用物は、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩ、ラミニン５、エンタクチン、フィブロネクチン、またはその任意の組み合わせなどの、基底膜、基底膜緻密層、透明板および基底下部（ｓｕｂ−ｂａｓａｌ  ｚｏｎｅ）の構成要素を含み得る。
【００９５】
合成皮革中の基底膜代用物は、尿路基底膜（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＵＢＭ）、肝臓基底膜（ＬＢＭ）、羊膜（ａｍｎｉｏｎ）、絨毛膜、同種移植片心膜、同種移植片無細胞真皮、羊膜（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ワルトン膠様質、またはその任意の組み合わせであり得る。例えば、基底膜代用物は、乾燥無細胞羊膜であり得る。ある特定の場合に、基底膜代用物は、ポリマー、例えばナノポリマーであり得る。例えば、基底膜代用物は、Ｂｙｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４巻、１〜７頁、２０１４年によって記載されているナノ繊維性ポリヒドロキシブチレート−ｃｏヒドロキシバレレート（ＰＨＢＶ）であり得る。
【００９６】
足場
細胞層（例えば真皮層）、層状構造、または合成皮革は、足場上に配置される場合がある。足場は、ある特定の堅固さ（例えば耐引裂性）、弾性、またはその両方を提供することができる。場合により、足場の一部または全体は、合成皮革中に含まれる場合がある。他の場合に、足場は、合成皮革中に含まれない場合がある。合成皮革における層の形成を援助した後、足場は、最終合成皮革製品から除去することができる。ある特定の場合に、合成皮革中に含まれる足場は、ある期間の後に分解する場合がある。本明細書に記載されている足場は、小柱状パターンを含み得る。
【００９７】
足場は、天然材料、合成材料、またはその組み合わせから製造される場合がある。足場の例には、生体吸収性合成ポリマーから製造されたネットを使用して形成された足場、シリコン薄膜にナイロンネットを付着させることにより形成された足場、コラーゲンスポンジおよびシリコンシートの二層構造を有する足場、シートに作ったアテロコラーゲンスポンジを使用して形成された足場、異なる孔径を有するコラーゲンスポンジをマッチさせることにより形成された足場、およびフィブリン糊を使用して形成された無細胞真皮マトリクス（ＡＤＭ）または細胞を含まずに製造された同種皮膚が含まれる。
【００９８】
足場は、コラーゲン（例えばコラーゲンマトリクス）、天然接着剤（例えば、フィブリン糊、コールドグルー（ｃｏｌｄ  ｇｌｕｅ）、動物性膠、血液アルブミン（ａｌｂｕｍｅｎ）糊、カゼイン糊、またはデンプンおよびデキストリン糊などの植物性糊）などの天然物質を含み得る。場合により、足場は、絹を含む。例えば、足場は、絹から作られている場合がある。一部の実施形態では、足場は、絹フィブロイン、セルロース、綿、アセテート、アクリル、ラテックス繊維、リネン、ナイロン、レーヨン、ビロード、モダクリリック、オレフィンポリエステル、サラン、ビニヨン、羊毛、ジュート、麻、竹、亜麻またはその組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、足場は繊維を含み得る。一部の実施形態では、繊維は、絹、綿、羊毛、リネン、特に木材、植物または藻類から抽出されたセルロース、ポリアミド、変性セルロース（レーヨン、ビスコース、アセテート、特にアセテートレーヨン）、ポリ−ｐ−フェニレンテレフタルアミド、アクリル繊維、例えばポリメチルメタクリレートまたはポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレートの繊維、ポリオレフィンの繊維、例えばポリエチレンまたはポリプロピレンの繊維、ガラス、シリカ、アラミド、例えばグラファイトの形態の炭素、ポリ（テトラフルオロエチレン）、不溶性コラーゲン、ポリエステル、ポリ塩化ビニルまたはポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリル、キトサン、ポリウレタン、ポリ（ウレタン−尿素）またはポリエチレンフタレート、および上記の繊維などのポリマーのブレンドから形成された繊維、例えばポリアミド／ポリエステル繊維またはその任意の組み合わせであり得る。
【００９９】
足場は、ポリマーを含み得る。ポリマーは、生体高分子であり得る。生体高分子には、これらに限定されないが、キチン、キトサン、エラスチン、コラーゲン、ケラチンまたはポリヒドロキシアルカノエートが含まれ得る。ポリマーは、生分解性、生物安定性、またはその組み合わせであり得る。足場中のポリマーは、天然ポリマーであり得る。例示的な天然ポリマーには、多糖、例えばアルギネート、セルロース、デキストラン、プルラン（ｐｕｌｌａｎｅ）、ポリヒアルロン酸、キチン、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）またはポリ（３−ヒドロキシ脂肪酸）が含まれる。場合により、足場は、天然ポリマーの化学誘導体も含む。そのような化学誘導体は、アルキル、アルキレンなどの化学基の置換および／または付加、ヒドロキシル化、酸化、ならびに当業者が精通する他の修飾を含み得る。天然ポリマーは、コラーゲン、ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、および血清アルブミンなどのタンパク質から選択することもできる。足場中のポリマーは、ポリアルファ−ヒドロキシ酸、例えばポリＬ−乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）またはそのコポリマー（例えば、ポリＤ，Ｌ−乳酸ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ））、およびヒアルロン酸を含む生分解性合成ポリマーであり得る。
【０１００】
足場は、生体吸収性であり得る。生体吸収性足場は、生細胞を含有または支持して、それらをある期間、所望の構成に保持する能力があり得る非細胞傷害性構造または物質であり得る。「生体吸収性」という用語は、身体が無毒の副産物に分解することができ、その副産物が身体から排泄または体内で代謝される任意の材料を指す場合がある。足場用の例示的な生体吸収性材料には、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ジメチルトリメチレンカーボネート）、ポリ（アミノ酸）、チロシン由来ポリ（カーボネート）、ポリ（カーボネート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（パラ−ジオキサノン）、ポリ（エステル）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、コラーゲン、ゼラチン、血清アルブミン、タンパク質、多糖、ムコ多糖、糖質、グリコサミノグリカン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸、バーシカン、コポリマー、ポリマーのブレンドおよび混合物、ならびに生体吸収性結合を含有するオリゴマーが含まれる。
【０１０１】
足場は、様々な厚さであり得る。例えば、足場は、細胞層を形成するために適切であり得る厚さを有し得る。例えば、足場は、厚さ約０．１ｍｍから約１０ｍｍ、例えば約０．１ｍｍから約５ｍｍ、約０．１ｍｍから約４ｍｍ、約０．１ｍｍから約３ｍｍ、約０．１ｍｍから約２ｍｍ、約０．１ｍｍから約１ｍｍ、約０．２ｍｍから約１ｍｍ、約０．３ｍｍから約１ｍｍ、約０．４ｍｍから約１ｍｍ、約０．５ｍｍから約１ｍｍ、０．３ｍｍから約１．５ｍｍ、約０．４ｍｍから約１．２ｍｍ、約０．６ｍｍから約１．２ｍｍ、または約０．７ｍｍから約１．５ｍｍを有し得る。例えば、足場は、厚さ約０．５ｍｍから１ｍｍを有し得る。場合により、足場は、少なくとも０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、または５ｍｍの厚さであり得る。場合により、足場は、最大で０．５ｍｍ、０．８ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍの厚さであり得る。一部の実施形態では、足場は、足場上に配置および／または増殖されるべき細胞層の長さおよび／または幅を有し得る。一部の実施形態では、足場は、本明細書に記載されている細胞層の長さおよび／または幅を有し得る。
【０１０２】
足場は、合成皮革の面に表面積を有し得る。例えば、足場は、約０．１ｍｍ２から約１００ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約９５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約９０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約８５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約８０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約７５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約７０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約６５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約６０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約５５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約５０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約４５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約４０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約３５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約３０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約２５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約２０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約１５ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約１０ｍｍ２、約０．１ｍｍ２から約５ｍｍ２、または約０．１ｍｍ２から約１ｍｍ２の表面積を有し得る。場合により、足場は、約０．１ｃｍ２から約１００ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約９５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約９０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約８５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約８０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約７５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約７０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約６５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約６０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約５５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約５０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約４５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約４０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約３５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約３０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約２５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約２０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約１５ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約１０ｃｍ２、約０．１ｃｍ２から約５ｃｍ２、または約０．１ｃｍ２から約１ｃｍ２の表面積を有し得る。場合により、足場は、約０．１ｍ２から約１００ｍ２、約０．１ｍ２から約９５ｍ２、約０．１ｍ２から約９０ｍ２、約０．１ｍ２から約８５ｍ２、約０．１ｍ２から約８０ｍ２、約０．１ｍ２から約７５ｍ２、約０．１ｍ２から約７０ｍ２、約０．１ｍ２から約６５ｍ２、約０．１ｍ２から約６０ｍ２、約０．１ｍ２から約５５ｍ２、約０．１ｍ２から約５０ｍ２、約０．１ｍ２から約４５ｍ２、約０．１ｍ２から約４０ｍ２、約０．１ｍ２から約３５ｍ２、約０．１ｍ２から約３０ｍ２、約０．１ｍ２から約２５ｍ２、約０．１ｍ２から約２０ｍ２、約０．１ｍ２から約１５ｍ２、約０．１ｍ２から約１０ｍ２、約０．１ｍ２から約５ｍ２、または約０．１ｍ２から約１ｍ２の表面積を有し得る。
【０１０３】
場合により、足場は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、または１００ｍｍ２の表面積を有し得る。場合により、足場は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、または１００ｃｍ２の表面積を有し得る。場合により、足場は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、７５、または１００ｍ２の表面積を有し得る。
【０１０４】
あるいは、細胞層は、足場上に形成しない場合がある。例えば、真皮層は、足場（例えばコラーゲンマトリクス）上に形成しない場合がある。ある特定の場合に、合成皮革は、足場を含まない。
【０１０５】
色素
合成皮革は、１つまたは複数の色素を含み得る。合成皮革の１つまたは複数の層構造は、色素沈着している場合がある。合成皮革中の色素は、合成皮革を形成している細胞において産生された天然色素であり得る。例えば、色素は、ユーメラニン（例えば褐色ユーメラニンおよび黒色ユーメラニン）、フェオメラニン、神経メラニン、またはその任意の組み合わせを含むメラニンであり得る。合成皮革中の色素は、皮革色素染料などの外因性色素であり得る。
【０１０６】
コラーゲン
合成皮革は、コラーゲンを含み得る。コラーゲンは、少なくとも２８種の異なるコラーゲン型のファミリーの任意のメンバーを指す場合がある。コラーゲンは、アミノ酸−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−の反復する三つ組みによって特徴付けることができ、その結果、コラーゲン中のアミノ酸残基のおよそ３分の１はグリシンである。Ｘは、プロリンであり得、Ｙは、ヒドロキシプロリンであり得る。したがって、コラーゲンの構造は、異なる長さのペプチド鎖の対になった三重ユニットを有し得る。合成皮革は、１つまたは複数の種からのコラーゲンを含み得る。場合により、合成皮革は、異なる動物からのコラーゲンを含む。異なる動物は、異なるアミノ酸組成のコラーゲンを産生することができ、それらは、異なる性質（および結果として生じる皮革における違い）をもたらすことができる。コラーゲン線維モノマーは、約１０５０アミノ酸長のアルファ鎖から産生される場合があり、その結果、三重らせんは、直径約１．５ｎｍを有する、長さ約３００ｎｍの桿状形態をとる。
【０１０７】
合成皮革は、１つまたは複数の種類のコラーゲンを含み得る。合成皮革中に含まれるコラーゲンには、原線維状コラーゲン、非原線維状コラーゲン、またはその組み合わせが含まれ得る。原線維状コラーゲンには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、およびＸＩ型コラーゲンが含まれる。非原線維状コラーゲンには、断続性三重らせんを有する原線維付随性コラーゲン（例えば、ＩＸ型、ＸＩＩ型、ＸＩＶ型、ＸＶＩ型、およびＸＩＸ型）、短鎖コラーゲン（例えば、ＶＩＩＩ型およびＸ型）、基底膜コラーゲン（ＩＶ型）、マルチプレキシン（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎ）（断続を有する複数の三重らせんドメイン）（例えば、ＸＶ型およびＸＶＩＩＩ型）、ＭＡＣＩＴコラーゲン（断続性三重らせんを有する膜付随性コラーゲン）（例えば、ＸＩＩＩ型およびＸＶＩＩ型）が含まれる。
【０１０８】
コラーゲンは、合成皮革の１つまたは複数の部分に含まれ得る。例えば、コラーゲンは、合成皮革中の１つもしくは複数の真皮層、１つもしくは複数の表皮層、またはその組み合わせに含まれ得る。例えば、コラーゲンは、合成皮革中の１つまたは複数の層状構造に含まれ得る。場合により、合成皮革の部分を工程途中に除去できる場合、コラーゲンは除去生成物中にも含まれ得る。
【０１０９】
合成皮革中のコラーゲンは、１つまたは複数の供給源由来であり得る。例えば、コラーゲンは、合成皮革中のコラーゲン産生細胞によって産生される場合がある。例えば、コラーゲンは、皮革に別に添加することができる。場合により、合成皮革は、コラーゲン産生細胞によって産生されるコラーゲンを含み、コラーゲンは、別に添加される。
【０１１０】
合成皮革中のコラーゲンの少なくとも部分は、コラーゲン産生細胞によって産生される場合がある。そのようなコラーゲン産生細胞は、合成皮革に含まれ得る。例示的なコラーゲン産生細胞には、上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、角質細胞、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、基底細胞、平滑筋細胞、またはその組み合わせが含まれる。上皮細胞には、扁平上皮細胞、立方細胞、円柱細胞、基底細胞、またはその組み合わせが含まれ得る。線維芽細胞には、真皮線維芽細胞が含まれ得る。ケラチノサイトには、上皮ケラチノサイト、基底ケラチノサイト、増殖中の基底ケラチノサイト、分化した基底上ケラチノサイト、またはその組み合わせが含まれ得る。合成皮革中のコラーゲンは、１つまたは複数の種類のコラーゲン産生細胞によって産生される場合がある。
【０１１１】
添加剤
合成皮革は、１つまたは複数の添加剤をさらに含み得る。そのような添加剤は、商業的魅力（例えば、外観、色、または匂い）を高めることができる。例示的な添加剤には、無機質、繊維、脂肪酸、およびアミノ酸、タンパク質が含まれる。添加剤は、臭気剤であり得る。
【０１１２】
添加剤には、マトリクスタンパク質、プロテオグリカン、抗酸化剤、パーフルオロカーボン、および増殖因子のうちの１種または複数種が含まれ得る。増殖因子は、サイトカイン（例えば、細胞によって産生され、かつそれ自体および／または多様な他の隣接もしくは遠隔細胞に影響する可能性があるもの）を含む、タンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチドの複合体であり得る。増殖因子は、発生的にまたは多数の生理刺激もしくは環境刺激に応答して、特定の種類の細胞の増殖および／または分化に影響することができる。全てでないが一部の増殖因子は、ホルモンである。例示的な増殖因子には、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えば塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、例えばＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスホーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−ａ）、トランスホーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、例えばＴＧＦｐｉおよびＴＧＦＰ３、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などが含まれる。他のポリペプチドまたは分子（例えば、治癒剤；マトリクス分解酵素などの酵素およびマトリクス分解酵素阻害剤（例えばＴＩＭＰ）、抗生物質、および抗真菌剤）も合成皮革に添加することができる。
【０１１３】
添加剤は、当該分野に公知の保存料も含み得る。例示的な保存料には、抗菌保存料、例えばプロピオン酸カルシウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、亜硫酸塩（例えば、二酸化硫黄、重硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウムなど）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｍｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＤＴＡ）、抗酸化剤、例えばブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）が含まれる。
【０１１４】
ある特定の場合に、合成皮革は、細胞外マトリクスまたは結合組織を含み得る。例えば、合成皮革は、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、ゼラチン、プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、フィブロネクチン、ラミニン、デルマトポンチン、脂質、脂肪酸、糖質、およびその組み合わせをさらに含み得る。
【０１１５】
合成皮革の模様
合成皮革に模様を付けることができる。例えば、合成皮革に、アンテロープ、クマ、ビーバー、バイソン、イノシシ、ラクダ、カリブー、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ゾウ、エルク、キツネ、キリン、ヤギ、ノウサギ、ウマ、アイベックス、カンガルー、ライオン、ラマ、オオヤマネコ、ミンク、ムース、雄ウシ、ペッカリー、ブタ、ウサギ、アザラシ、ヒツジ、リス、トラ、クジラ、オオカミ、ヤク、シマウマ、カメ、ヘビ、クロコダイル、アリゲーター、恐竜、カエル、ヒキガエル、サンショウウオ、イモリ、ニワトリ、アヒル、エミュー、ガチョウ、ライチョウ、ダチョウ、キジ、ハト、ウズラ、シチメンチョウ、カタクチイワシ、バス、ナマズ、コイ、タラ、ウナギ、ヒラメ、フグ、ハタ、コダラ、オヒョウ、ニシン、サバ、マヒマヒ、オニイトマキエイ、カジキ、オレンジラフィー、パーチ、カワカマス、ポラック、サケ、イワシ、サメ、フエダイ、シタビラメ、アカエイ、メカジキ、ティラピア、マス、マグロ、ウォールアイ、およびその組み合わせから選択される動物の皮膚模様にならった模様が付けられる場合がある。模様は、ドラゴン、ユニコーン、グリフィン、サイレン、フェニックス、スフィンクス、サイクロプス、サテュロス、メドゥーサ、ペガサス、ケルベロス、テュポエウス（Ｔｙｐｈｏｅｕｓ）、ゴルゴン、カリュブディス、エムプーサ、キメラ、ミノタウロス、ケートス（ｃｅｔｕｓ）、ヒュドラ、ケンタウロス、妖精、人魚、ネッシー、サスクワッチ、サンダーバード、イエティ、チュパカブラ、およびその組み合わせから選択される空想動物の皮膚模様であり得る。
【０１１６】
合成皮革は、伝統的な動物の皮（ｓｋｉｎ）、革（ｈｉｄｅ）、または皮革製品およびデザインパラメーター（例えば、細胞型、添加剤、サイズ、形状）に類似するように製造することができる。場合により、合成皮革は、伝統的な動物の皮、革、または皮革製品に実質的に類似し得る組成によって特徴付けられる細胞層を含む。例えば、そのような層は、実質的に水性流体約６０％から８０％、タンパク質約１４％〜３５％、脂肪約１％〜２５％であり得る組成によって特徴付けることができる。場合により、細胞層のケラチノサイトは、整列している。例えば、ケラチノサイトは、電場の適用により整列している場合がある。例えば、ケラチノサイトは、基層を周期的に伸展および弛緩させることなどの機械的刺激の適用によって整列している場合がある。場合により、整列した（例えば、電気的に配向したおよび機械的に配向した）ケラチノサイトは、相互に関して多くの動物皮膚組織に見ることができるのと実質的に同じ配向を有する。
【０１１７】
革製品
本明細書における合成皮革は、革製品の少なくとも一部であり得る。例えば、合成皮革は、革製品における天然皮革の代用物として使用することができる。例示的な革製品には、腕時計のバンド、ベルト、サスペンダー、パッケージング、靴、ブーツ、履物、手袋、衣類（例えば、トップス（ｔｏｐｓ）、ボトム（ｂｏｔｔｏｍｓ）、および上着）、かばん、袋物（例えば、ショルダーストラップが付属したもしくは付属しないハンドバッグ）、クラッチ、財布、小銭入れ、札入れ（ｂｉｌｌｆｏｌｄ）、キーポーチ（ｋｅｙ  ｐｏｕｃｈｅ）、クレジットカード入れ、筆箱、バックパック、ケース、札入れ、サドル、ハーネス、鞭、旅行用品（例えば、トランク、スーツケース、旅行用バッグ、化粧品ケース、もしくは洗面道具）、リュックサック、書類入れ、書類かばん（ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ｂａｇ）、ブリーフケース、アタッシュケース、ペット用品（例えば、引きひももしくは首輪）、狩猟および釣り用品（例えば、銃ケース、刃物ケース、もしくは堅い武器（ｆｉｒｍ  ａｒｍ）用のホルスター）、文房具（例えば、便箋、ブックカバー、カメラケース、眼鏡ケース、タバコ入れ、葉巻入れ、宝石箱、もしくは携帯電話ケース）、スポーツ用具（例えば、バスケットボール、サッカーボール、もしくはフットボールなどのボール）、建物インテリア、建物エクステリア、椅子張り材料、製本材料、家具、ランプ、ランプシェード、テーブル掛け、壁紙、床材、天井張り材料、自動車インテリア、自動車エクステリア、ボートインテリア、ボートエクステリア、飛行機インテリア、ヨットインテリア、ヨットエクステリア、枕カバー、シーツ、羽毛掛け布団カバー、ジュエリー、アクセサリー、眼鏡、サングラス、または消費者向け電化製品が含まれる。例えば、革製品は、時計の包みであり得る。例えば、革製品は、ベルトであり得る。例えば、革製品は、袋物であり得る。
【０１１８】
皮膚移植片
合成皮革またはその部分は、皮膚移植片、例えば、被験体に移植するための同種移植片または異種移植片としても使用することができる。例えば、合成皮革、真皮層、表皮層および／または層状構造は、同種移植または異種移植用の皮膚移植片の供給源であり得る。場合により、合成皮革、真皮層、表皮層および／または層状構造は、移植片のレシピエントにおける免疫拒絶を減少させるように遺伝的に改変された細胞を用いて生産される場合がある。
【０１１９】
方法
本明細書において、合成皮革を製造する方法も開示される。方法は、人工真皮層を形成するステップ、人工表皮層を形成するステップ、またはその組み合わせを含み得る。方法は、人工真皮層および／または人工表皮層の少なくとも一部をなめすステップをさらに含み得る。合成皮革中の細胞、例えば、真皮層および／または表皮層中の細胞は、幹細胞（例えばｉＰＳＣ）から分化したものである場合がある。本明細書における方法は、幹細胞（例えばｉＰＳＣ）を合成皮革中の細胞、例えば、真皮層および／または表皮層中の細胞に分化させるステップをさらに含み得る。ある特定の場合に、方法は、第２の細胞層（例えば真皮層）上に第１の細胞層（例えば表皮層）を配置し、それにより、層状構造を形成するステップ、および層状構造の少なくとも一部をなめすステップを含む。場合により、方法は、第１の細胞層（例えば表皮層）の少なくとも一部を除去するステップをさらに含み得る。
【０１２０】
細胞層の形成
細胞層は、１つまたは複数の種類の細胞を含む複数の多細胞体（ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｏｄｙ）を調製すること、およびそのような多細胞体を配列させて細胞層を形成することによって形成することができる。例えば、細胞層は、複数の多細胞体を隣り合って配列させることによって形成する場合があり、その際、多細胞体は、融合して平面層を形成する。
【０１２１】
細胞層を形成するステップは、足場を必要とし得る。細胞層は、足場上に複数の多細胞体を配列させることによって形成することができる。例えば、形成するステップは、多細胞体を融合させて層（例えば、実質的に平面の層）を形成する支持担体上に多細胞体を配列または配置させることを含み得る。場合により、多細胞体または層は、相互に水平および／または垂直に隣り合って配列される。あるいは、細胞層を形成するステップは、足場を必要としない場合がある。
【０１２２】
細胞層は、細胞を培地またはゲル中に包埋することによって形成することができる。場合により、真皮層は、コラーゲンＩまたはフィブリンゲル中に包埋された線維芽細胞を使用して形成することができる。他の種類の培地も使用することができる。例えば、培地は、コラーゲンゲルの必要なしに表皮の長期維持を可能にするのに十分な量の細胞外マトリクスを分泌するように線維芽細胞を促すことができる。
【０１２３】
多細胞体の形成
本明細書に記載されている特徴を有する多細胞体を製造する様々な方法がある。場合により、多細胞体は、例えば、所望の細胞密度および粘度を有する、複数の細胞を含有する細胞ペーストから製作することができる。さらなる場合では、細胞ペーストは、所望の形状に成形することができ、成熟（例えばインキュベーション）を通じて多細胞体が形成し得る。場合により、複数の細胞を含む細胞ペーストを伸長した形状（例えば円筒形）に成形することによって、伸長した多細胞体を生産することができる。さらなる場合に、細胞ペーストを制御された環境でインキュベートして、細胞を相互に接着および／または密着させて、伸長した多細胞体を形成することができる。例えば、多細胞体は、複数の生細胞を含む細胞ペーストを、細胞ペーストを三次元形状に保持するデバイス中で成形することによって産生される場合がある。場合により、細胞ペーストを制御された環境でインキュベートすることができ、一方で、本明細書に記載されている平面上で支持体自体に十分に密着する多細胞体を産生するのに十分な時間、細胞ペーストを三次元形状に保持することができる。
【０１２４】
細胞ペーストは、（Ａ）（１つまたは複数の細胞型の）細胞または細胞凝集物と、細胞培養培地とを（例えば予め決定された比で）混合して、細胞懸濁物をもたらすこと、ならびに（Ｂ）細胞懸濁物を圧縮して、所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストを生産することによって提供することができる。圧縮は、細胞培養から生じた特定の細胞懸濁物を濃縮して、細胞ペーストのために要求される所望の細胞濃度（密度）、粘度、およびコンシステンシーを達成することなどによる、いくつかの方法によって達成することができる。場合により、細胞培養からの比較的希薄な細胞懸濁物を決められた時間遠心分離して、型の中で成形することが可能なペレット中の細胞濃度を達成することができる。接線流濾過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮または圧縮する別の適切な方法である。場合により、化合物を細胞懸濁物と組み合わせて、要求される押出性質を与える。適切な化合物には、コラーゲン、ヒドロゲル、マトリゲル、ナノ繊維、自己集合性ナノ繊維、ゼラチン、およびフィブリノーゲンが含まれる。ＥＣＭ構成要素（またはＥＣＭ構成要素の誘導体）を含有する１種または複数種の生理学的に許容される緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁すること、および結果として生じた細胞懸濁物を再度遠心分離して細胞ペーストを形成することによって、１種または複数種のＥＣＭ構成要素（またはＥＣＭ構成要素の誘導体）も含まれ得る。
【０１２５】
細胞ペーストを成形するために様々な方法を使用することができる。例えば、特定の実施形態では、細胞ペーストを（例えば濃縮／圧縮後に）手作業で成形または圧縮して、所望の形状を達成することができる。さらなる例として、予め形成された器具の内面に適合するように細胞ペーストを成形するマイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）などの器具内に細胞ペーストを取り入れる（例えば吸引する）ことができる。マイクロピペット（例えばキャピラリーピペット）の断面形状は、代替的に、円形、正方形、長方形、三角形、または他の非円形の断面形状であり得る。一部の実施形態では、細胞ペーストは、プラスチック型、金属型、またはゲル型などの予め形成された型の中にそれを沈着させることによって成形することができる。一部の実施形態では、遠心注型または連続注型を使用して細胞ペーストを成形することができる。
【０１２６】
細胞ペーストをさらに成熟させることができる。場合により、接着および／または密着を促進するために細胞ペーストを約３７℃である期間（細胞の種類に依存し得る）インキュベートすることができる。代替的または追加的に、細胞ペーストは、接着および／または密着を促進するために因子および／またはイオンを含有する細胞培養培地の存在下で保持することができる。
【０１２７】
層を形成するための支持担体上の多細胞体の配列
多細胞体を支持担体上に配列させて、所望の三次元構造（例えば、実質的に平面の層）を生産することができる。例えば、多細胞体は、手作業で互いに接触して配置する、ピペット、ノズル、もしくはニードルからの押出により所定の位置に沈着させる、またはバイオファブリケーター（ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｏｒ）などの自動機械により接触して配置することができる。
【０１２８】
支持担体は、流体、気体、および栄養分が透過性であり得、配列およびその後の融合の間に細胞培養培地を多細胞体および／または層の全ての表面と接触させる。場合により、支持担体は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、および他の細胞外マトリクスなどの天然生体材料製であり得る。場合により、支持担体は、ヒドロキシアパタイト、アルギネート、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびそれらのコポリマーなどの合成生体材料製であり得る。場合により、支持担体は、固形、半固形、または固形と半固形支持体要素との組み合わせであり得る。場合により、支持担体は、平面層の生産を容易にするために平面であり得る。場合により、支持担体は、細胞培養環境（例えば、ペトリ皿、細胞培養フラスコなど）またはバイオリアクターの一部などの非透過性表面から高いまたは上昇している場合がある。透過性の上昇した支持担体は、早期細胞死の予防に寄与し、細胞増殖の増大に寄与することができ、層を形成するための多細胞体の融合を容易にする。
【０１２９】
層の組立てが完了した後、構築物の上部に組織培養培地を注ぐことができる。場合により、組織培養培地は、多細胞体の間の空間に入って、多細胞体中の細胞を支持する。三次元構築物中の多細胞体を互いに融合させて、合成皮革の形成に使用するための層（例えば、実質的に平面の層）を生産することができる。「融合する」、「融合した」または「融合」という用語は、連続した多細胞体の細胞が細胞表面タンパク質間の相互作用を介して直接的に、または細胞とＥＣＭ構成要素もしくはＥＣＭ構成要素の誘導体との相互作用を介して間接的にのいずれかで互いに接着および／または密着するようになることを意味し得る。融合層は、完全に融合することができ、その多細胞体は、実質的に連続的になる。あるいは、融合層は、実質的に融合または部分的に融合することができ、多細胞体の細胞は、層を無傷で移動および操作することを可能にするために必要な程度に接着および／または密着するようになる。
【０１３０】
多細胞体は、融合して細胞培養環境（例えば、ペトリ皿、細胞培養フラスコ、またはバイオリアクター）中で層を形成することができる。場合により、多細胞体は、多細胞体に含まれる細胞型の増殖を容易にするのに適切な条件で融合して環境中で層を形成することができる。場合により、融合は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分、ならびにその中の増分にわたって起こる。他の場合に、融合は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８時間、ならびにその中の増分にわたって起こる。なお他の場合には、融合は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、および１４日、ならびにその中の増分にわたって起こる。さらなる場合では、融合は、約２時間から約２４時間にわたって起こる。融合時間に関連する要因には、細胞型、細胞型の比、培養条件、および増殖因子などの添加剤の存在が含まれ得る。
【０１３１】
層の融合が完了した後、層と支持担体とは分離することができる。他の場合に、層の融合が実質的に完了または部分的に完了した場合に、層と支持担体とが分離されるが、層の細胞は、層をばらばらにせずに層を移動、操作、および積み重ね可能にするために必要な程度に、互いに接着および／または密着している。層と支持担体とは、支持担体を融解、溶解、または分解するための標準的な手順を介して分離することができる。場合により、支持担体は、例えば層に有害に影響しない温度変化、光、または他の刺激により溶解させることができる。ある特定の場合に、支持担体は、可撓性材料から作り、層から剥離することができる。分離された層は、さらなる成熟のためにバイオリアクターに移すことができる。場合により、分離された層は成熟し、操作された動物の皮、革、または皮革製品に組み込まれた後にさらに融合する。
【０１３２】
あるいは、層および支持担体は、分離されない場合がある。支持担体は、組み立てられ操作された動物の皮、革、または皮革製品のパッケージング、凍結、販売または消費前に分解または生分解する。
【０１３３】
細胞層は、ある期間にかけて形成することができる。場合により、細胞層、例えば表皮層または真皮層は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１２０、３００日以内に形成することができる。場合により、真皮層は、約１から１５日、例えば、５から１０日、または１０から１２日で形成することができる。場合により、真皮層は、約５から２５日、例えば、１４から１５日で形成することができる。
【０１３４】
本開示は、改善されたバリア機能を有する合成皮革を製造する方法を提供する。場合により、方法は、ケラチノサイトと、アスコルビン酸およびリノール酸とを含む培養培地を提供するステップ；ならびに改善されたバリア機能を有する合成皮革が形成できるような条件下でケラチノサイトを培養するステップを含む。場合により、培養条件は、湿度約５０から９５％、例えば湿度約７５％での培養を含む。場合により、アスコルビン酸は、約１０から１００マイクログラム／ｍｌの濃度で提供することができる。なおさらなる場合には、リノール酸は、約５から８０マイクロモル濃度の濃度で提供することができる。本開示は、特定の供給源のケラチノサイトから形成した合成皮革に限定されない。実際に合成皮革は、近二倍体不死化ケラチノサイト（ＮＩＫＳ）細胞を含むがこれに限定されない多様な初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトから形成することができる。なおさらなる場合には、ケラチノサイトは、外因性野生型または改変体クルッペル様因子（ＧＫＬＦ）を発現する。なおさらなる場合には、ケラチノサイトは、２つの異なる供給源に由来する。他の場合に、合成皮革は、約４０から約２４０ｐＦの表面静電容量を有する。一部の好ましい場合に、皮膚等価物は、約８０から約１２０ｐＦの表面静電容量を有する。他の好ましい場合に、皮膚等価物中のセラミド５、６、および７の含有量は、総セラミド含有量の約２０から約５０％であり得る。なお他の好ましい場合には、皮膚等価物中のセラミド２の含有量は、総セラミド含有量の約１０から約４０％であり得る。なおさらなる場合に、本開示は、先ほど記載した方法によって製造された皮膚等価物を提供する。
【０１３５】
層状構造を形成するための層の配列
複数の細胞層を配列させて層構造を形成することで、本明細書に記載されている合成皮革を生産することができる。場合により、真皮層および表皮層は別々に形成され、真皮層上に表皮層を配置することによって組み立てられる（例えば、表皮層および真皮層の両方が完全に形成したとき）。場合により、表皮層は、真皮層の上に成長することができる。ある特定の場合に、基底膜または基底膜代用物は、真皮層と表皮層との間に配置することができる。例えば、細胞層は、互いに接触して手作業で配置する、またはバイオファブリケーターなどの自動化されコンピューター支援された機械によってコンピュータースクリプトに従って所定の位置に沈着させることができる。
【０１３６】
複数の細胞層を組み立てる前に、１つまたは複数の品質管理ステップを行うことができる。例えば、真皮上に配置する前に経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を表皮に対して行うことができ（例えば０日目）、続いて組織分析を行うことができる（例えば、最低で３〜５日）。本明細書提供の方法を使用すると、不適切に形成した層状構造または全層皮膚等価物のリスクは、低い可能性がある。
【０１３７】
複数の細胞層は、様々な方法で組み立てることができる。場合により、表皮層および真皮層（基底膜代用物を有するまたは有しない）は、例えば天然皮革の厚さおよび引張強さを達成するために、足場（例えば絹）上に配置される。場合により、表皮層および複数の真皮層（基底膜代用物を有するまたは有しない）は、足場を使用せずに組み立てられる。そのような組立ては、天然皮革に類似した厚さおよび引張強さを達成することができる。場合により、表皮層および複数の真皮層（基底膜代用物を有するまたは有しない）は、天然皮革に類似した厚さおよび引張強さを達成するために、足場（例えば絹）上に配置される。
【０１３８】
一部の実施形態では、化学試験、機械的試験、性能試験、強度試験、耐久性試験、水分試験、寸法試験またはその組み合わせを、１つまたは複数の多重細胞層、合成皮革、人工表皮層、人工真皮層、層状構造、それらから生産された製品に行うことができる。一部の実施形態では、化学試験、機械的試験、性能試験、強度試験、耐久性試験、水分試験、寸法試験またはその組み合わせは、非標準試験を使用して行うことができる。一部の実施形態では、化学試験、機械的試験、性能試験、強度試験、耐久性試験、水分試験、寸法試験またはその組み合わせは、標準試験を使用して行うことができる。一部の実施形態では、試験は、国際標準化機構（ＩＳＯ）、ヨーロッパ標準化委員会（ＣＥＮ）、ＡＳＴＭインターナショナルまたは国際皮革技術者化学者協会連合会（ＩＵＬＴＣＳ）により指示および／または採用および／または承認および／または開発されたように行うことができる。一部の実施形態では、表１〜表１１のうちの任意の１つにおける試験またはその任意の変形は、任意の１つもしくは複数の対応する方法またはその任意の変形を使用して行うことができる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０１３９】
一部の実施形態では、皮革製品は、本物の皮革に類似した物理的性質を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００ｌｂ／ｉｎ２のＡＳＴＭ  Ｄ−２２０９−９５によって測定された引張強さを有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、約５０００、４０００、３０００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９５０、９００、８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０ｌｂ／ｉｎ２未満のＡＳＴＭ  Ｄ−２２０９−９５によって測定された引張強さを有し得る。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、ＡＳＴＭ−Ｄ２２１２−９４によって測定した少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｌｂのスリットを有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、ＡＳＴＭ−Ｄ２２１２−９４によって測定した約２００、１５０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｌｂ未満のスリットを有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、ＡＳＴＭ−Ｄ４７０５−９３に従って測定したとき少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個のステッチを有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、約２００、１５０、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個未満のステッチを有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、スリットおよびステッチのそれぞれの試験に従って測定したときに、少なくとも約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｌｂであるスリットおよびステッチの値を有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される合成皮革またはそれから製造された皮革製品は、ＡＳＴＭ  Ｄ６１８２によって測定した少なくとも約５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００、５０，０００、５５０００、６００００、６５０００、７００００、８００００のバリーフレックス（Ｂａｌｌｙ  ｆｌｅｘ）を有し得る。
【０１４１】
複数の細胞層を組み立てて合成皮革（例えば、全層皮膚等価物）を形成することができる。合成皮革は、上部、中央部および下部を含み得る。上部は表皮層を含み得る。例えば、上部は、単層表皮層であり得る。中央部は、基底膜代用物を含み得る。場合により、中央部は、基底膜代用物を有さない。例えば、中央部は、無視できるほどの厚さの層を有し得る。下部は、１つまたは複数の真皮層を有し得る。場合により、下部は、足場（例えば絹）上に配置された単一の真皮層を有する。場合により、下部は、足場を有しない複数の真皮層（例えば、最大５層）を有する。場合により、下部は、相互に上に積み重ねられ、足場（例えば絹）上に配置された複数の真皮層を有する。
【０１４２】
表皮層と真皮層との間の接着性は、層の分割に耐えるのに十分強い場合がある。場合により、細胞層は、足場上に接着することによって組み立てることができる。天然または合成接着剤を組立てのために使用することができる。天然接着剤は、フィブリン糊、コールドグルー、動物性膠（例えば、骨膠、魚膠、皮膠、蹄膠（ｈｏｏｆ  ｇｌｕｅ）、ウサギ皮膚膠（ｒａｂｂｉｔ  ｓｋｉｎ  ｇｌｕｅ）、肉膠（ｍｅａｔ  ｇｌｕｅ））、血液アルブミン糊、カゼイン糊、植物性糊（例えば、デンプン、デキストリン糊、カナダバルサム、松脂系糊、コッコニア（ｃｏｃｃｏｎｉａ）、アラビアゴム、切手用のり、ラテックス、図書館用のり（ｌｉｂｒａｒｙ  ｐａｓｔｅ）、メチルセルロース、粘液、レゾルシノール樹脂、もしくは尿素−ホルムアルデヒド樹脂）、またはその任意の組み合わせであり得る。合成接着剤は、アクリロニトリル、シアノアクリレート（例えば、ｎ−ブチル−２−シアノアクリレート糊）、アクリル、レゾルシノール糊、エポキシ樹脂、エポキシパテ、エチレン酢酸ビニル、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリエステル樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルフィド、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル（ホワイトグルー（ｗｈｉｔｅ  ｇｌｕｅ）（例えばエルマーズグルー（Ｅｌｍｅｒ’ｓ  Ｇｌｕｅ）およびイエローカーペンターズグルー（ｙｅｌｌｏｗ  ｃａｒｐｅｎｔｅｒ’ｓ  ｇｌｕｅ）（脂肪族樹脂を含む）、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリ塩化ビニルエマルジョン（ＰＶＣＥ）、ポリビニルピロリドン、ゴムのり、シリコーン、およびスチレンアクリルコポリマーであり得る。例えば、組立ては、フィブリン糊を使用して行うことができる。例えば、組立ては、ｎ−ブチル−２−シアノアクリレート糊を使用して行うことができる。
【０１４３】
場合により、細胞層（例えば、実質的に平面の層）は、積み重ねられて合成皮革を形成する。細胞層は、多細胞体の配置、パターン、または配向によって定義される配向を有し得る。場合により、各層は、支持担体および／または１つもしくは複数の他の層に対して特定の配向で積み重ねることができる。例えば、１つまたは複数の層は、支持担体および／または下の層に対する回転を含む配向で積み重ねることができ、その際、回転は、０．１から１８０度の間、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、および１８０度、またはその中の増分であり得る。他の場合に、全ての層は、実質的に同じように配向される。
【０１４４】
層の積み重ねが完了した後、三次元構築物中の層を互いに融合させて、合成皮革を生産することができる。場合により、層は、細胞培養環境（例えば、ペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクターなど）で融合する。場合により、融合は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分、ならびにその中の増分の間にわたって起こる。他の場合に、融合は、１から４８時間の間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、および４８時間、ならびにその中の増分の間にわたって起こる。例えば、融合は、約２時間から約２４時間にわたって起こり得る。
【０１４５】
培養条件
細胞および細胞層は、様々な細胞培養条件で培養することができる。細胞または細胞層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。例えば、真皮層および／または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。あるいは、細胞または細胞層は、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。例えば、真皮層および／または表皮層は、ｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。
【０１４６】
細胞および細胞層は、１種または複数種の補充物と共に培養することができる。１種または複数種の補充物は、天然補充物、合成補充物、またはその組み合わせであり得る。場合により、補充物は、添加剤であり得る。場合により、補充物のうちの１種または複数種は、ｉＰＳＣ由来線維芽細胞からの細胞外マトリクスの生産および組立てを誘導することで、合成皮革の自然な外見を高める。例示的な補充物は、コラーゲンおよびフィブリンなどのＥＣＭ構成要素、増殖因子、アスコルビン酸などの小分子、硫酸デキストラン、カラゲナンなどの巨大分子が含まれ得る。
【０１４７】
細胞層は、ある特定の空気湿度で培養することができる。例えば、細胞層（例えば、真皮層または表皮層）は、湿度約２０％から約１００％で培養することができる。例えば、湿度は、約４０％から約１００％、約５０％から約９５％、約４５％から約９０％、約５５％から約９５％、約６０％から約９０％、約７０％から約８０％、約７１％から約７９％、約７２％から約７８％、約７３％から約７７％、約７４％から約７６％、約６０％から約７０％、約６５％から約７５％、約７０％から約８０％、約７５％から約８５％、約８０％から約９０％、約８５％から約９５％、または約９０％から約１００％、約４０％から約６０％、約４５％から約５５％、約４６％から約５４％、約４７％から約５３％、約４８％から約５２％、約４８％から約５３％、約４９％から約５４％、または約４７％から約５１％であり得る。
【０１４８】
皮革の処理
なめし
本明細書における方法は、合成皮革の少なくとも一部、例えば、合成皮革中の真皮層および／または表皮層の少なくとも一部をなめすステップを含み得る。なめしは、合成皮革を天然皮革に類似させ、天然皮革は、動物の原皮、多くの場合に成牛皮のなめしによって創出される、耐久性のある可撓性材料でありうる。本明細書におけるなめしは、動物の皮を処理して皮革を生産するプロセスを指す場合がある。なめしは、渋なめし（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｔａｎｎｉｎｇ）（例えば、タンニンを使用する）、クロムなめし（硫酸クロムを含むクロム塩）、アルデヒドなめし（グルタルアルデヒドまたはオキサゾリジン化合物を使用する）、シンタン（合成タンニン、芳香族ポリマーを使用する）、細菌染色などを含む様々な方法で行うことができる。
【０１４９】
なめしは、革／皮中のタンパク質を腐敗しない安定な材料に変換する一方で、その材料を可撓性のまま保たせるために行うことができる。クロムは、なめし材料として使用することができる。細胞層または層状構造のｐＨを調整（例えば、低下；例えばｐＨ約２．８〜３．２に）して、なめしを増強することができ；なめしの後に、ｐＨを上昇させることができる（ややより高いレベル、例えばｐＨ約３．８〜４．２に「塩基性化」）。
【０１５０】
なめしは、細胞層、例えば、真皮層および表皮層に行うことができる。なめしは、層状構造、例えば、少なくとも真皮層および少なくとも表皮層を含む層状構造に行うこともできる。ある特定の場合に、なめしは、合成皮革に行うこともできる。例えば、なめしは、細胞層、例えば、真皮層または表皮層を形成した後に行うことができる。例えば、なめしは、層状構造を形成した後に行うことができる。
【０１５１】
なめしは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）材料を修飾することによって行うことができる。なめしは、ＥＣＭ中のコラーゲンを修飾することによって行うことができる。なめしは、なめし剤、例えば、硫酸クロム（ＩＩＩ）（［Ｃｒ（Ｈ２Ｏ）６］２（ＳＯ４）３）を使用して行うことができる。硫酸クロム（ＩＩＩ）は、より高いｐＨでオール化（ｏｌａｔｉｏｎ）と呼ばれるプロセスを経てポリクロム（ＩＩＩ）化合物を与えるヘキサアクアクロム（ｈｅｘａａｑｕａｃｈｒｏｍｉｕｍ）（ＩＩＩ）陽イオン［Ｃｒ（Ｈ２Ｏ）６］３＋を与えるように溶解させることができ、ポリクロム（ＩＩＩ）化合物は、なめしにおいて活性であり、コラーゲンサブユニットの架橋である。一部のリガンドには、硫酸陰イオン、コラーゲンのカルボキシル基、アミノ酸側鎖からのアミン基、およびマスキング剤が含まれる。マスキング剤は、ポリクロム（ＩＩＩ）鎖の形成を抑制するために使用される酢酸などのカルボン酸であり得る。マスキング剤は、クロム（ＩＩＩ）錯体の透過を阻害せずにコラーゲンの反応性を増加させるために、タンナーがｐＨをさらに増加させることを可能にすることができる。なめしは、オール化およびオキソール化（ｏｘｏｌａｔｉｏｎ）から生じる種類のポリクロム種による架橋に一致して、コラーゲン中のタンパク質鎖間の間隔（例えば、１０から１７Å）を増加させることができる。クロムは、コラーゲンと架橋され得る。クロムなめし皮革は、約４％から５％の間のクロムを含有し得る。この効率は、皮革のその増加した熱水安定性および熱水中でのその耐収縮性によって特徴付けることができる。層状の本体をなめし、コラーゲンを修飾するために他のなめし剤を使用することができる。
【０１５２】
なめしは、他の無機質を使用して行うこともできる。場合により、なめしは、ミョウバン、ジルコニウム、チタン、鉄塩、またはその組み合わせに基づく薬剤を使用して行うことができる。
【０１５３】
さらなる処理
本明細書において製造された細胞層、層状構造、および合成皮革は、なめしの後にさらに処理することができる。場合により、本明細書提供の方法は、１つまたは複数の皮革処理ステップ（例えば、伝統的な皮革の形成に使用されるステップ）をさらに含む。処理ステップの例には、保存加工、水漬け、石灰漬け、脱毛、フレッシング、分割、脱灰、再石灰漬け、ベーチング、脱脂、フライジング（ｆｒｉｚｉｎｇ）、漂白、着色、ピックリング、脱酸、なめし、再なめし（例えば、処理の間に色落ちした場合）、シンニング、再なめし、潤滑化、クラスティング、湿潤化、水絞り、シェービング、再クロム処理、中和、染色、加脂、充填、ストリッピング、スタッフィング、白化、固着、セッティング、乾燥、コンディショニング、空打ち（例えば、ドライ空打ち）、ステーキング、バフィング、仕上げ、油入れ、ブラッシング、パディング、含浸、スプレー、ローラーコーティング、カーテンコーティング、艶出し、プレーティング、型押し、アイロン掛け、グレージング、およびタンブリングが含まれる。
【０１５４】
合成皮革は、例えば、動物の皮、革、または皮革を構築するために使用された多細胞体および／または層の数、サイズ、および配列を制御することによって成形することができる。他の場合に、動物の皮、革、または皮革は、例えば、裁断、プレス（ｐｒｅｓｓｉｎｇ）、成形、またはスタンピングによって成形することができる。合成皮革の形状は、伝統的な動物の皮、革、または皮革製品に類似するように作ることができる。
【０１５５】
本明細書における方法は、本明細書において生産された合成皮革の一部を除去するステップを含み得る。場合により、方法は、表皮層の少なくとも一部を除去して除去生成物を形成するステップを含む。例えば、除去はシェービングであり得る。
【０１５６】
色素沈着
本明細書における方法は、合成皮革を色素沈着させるステップを含み得る。場合により、色素沈着は、合成皮革に色素産生細胞（例えばメラノサイト）を導入することによって行うことができる。場合により、合成皮革は、機能的生メラノサイトを含む。メラノサイトは、ヒトの皮膚と類似の位置を有し得る。場合により、メラニンは、メラノサイトによって構成的に産生される場合がある。場合により、メラニンは、ケラチノサイトに輸送される場合がある。場合により、メラノサイトは、刺激、例えばＵＶ照射の際に、またはアルファメラノサイト刺激ホルモン（ａＭＳＨ）、エンドセリン１（ＥＴ１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、プロスタグランジンＥ２およびＦ２α（ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）または神経増殖因子（ＮＧＦ）などの色素沈着促進活性剤によって産生される。
【０１５７】
合成皮革における前駆細胞から細胞への分化
ケラチノサイトおよびメラノサイトなどの表皮層中の細胞、ならびに線維芽細胞などの真皮層中の細胞は、ｉＰＳＣなどの前駆細胞から派生、例えば分化させることができる。他の場合には、細胞層を形成するために初代細胞または初代細胞に由来する培養細胞を使用して、合成皮革を製造することができる。
【０１５８】
ｉＰＳＣを合成皮革における細胞、例えば、ケラチノサイト、メラノサイト、または線維芽細胞に分化させる様々な方法を使用することができる。場合により、ｉＰＳＣからケラチノサイトへの分化、およびｉＰＳＣ由来ケラチノサイトからの３Ｄ表皮の構築は、Ｐｅｔｒｏｖａら、３Ｄ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１４年４月２４日；２巻（５号）：６７５〜８９頁によって記載された方法を使用して行うことができる。他の場合に、細胞層は、初代細胞を使用して形成することができる。例えば、初代ケラチノサイトからの３Ｄ表皮の構築は、Ｓｕｎ  Ｒら、Ｌｏｗｅｒｅｄ  ｈｕｍｉｄｉｔｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１５年１月；２１巻（１号）：１５〜２２頁に記載された方法を使用して行うことができる。
【０１５９】
場合により、本明細書に記載されている方法は、合成皮革の生産を、商業レベルに確実に、正確に、および再現性よく拡大するハイスループット方法を提供する。合成皮革、操作された表皮等価物、操作された全層皮膚等価物および本明細書で開示されるそれを製造する方法の利点は、これに限定されないが、魅力的な外観、テクスチャー、厚さ、および耐久性のカスタマイズされた組織を、再現性よく、ハイスループットで、規模の拡大縮小が容易な形で生産することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法は、増加した収量の表皮層、真皮層、層状構造または合成皮革のうちの１つまたは複数を生産することができる。一部の実施形態では、増加した収量は、同等の方法と比べて少なくとも約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または約１５倍の収量であり得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、合成皮革、人工表皮層、人工真皮層、層状構造、およびそれらから生産された製品の製造コストを減らすことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、均一な厚さの合成皮革、人工表皮層、人工真皮層、層状構造、およびそれらから生産された製品を生産することができる。一部の実施形態では、合成皮革、人工表皮層、人工真皮層、層状構造、およびそれらから生産された製品は、実質的に均一な厚さ、長さおよび／または幅を有し得る。一部の実施形態では、表皮層、真皮層、層状構造のうちの任意の１つまたは複数における細胞は、均質に分布している場合がある。一部の実施形態では、表皮層、真皮層、層状構造のうちの任意の１つまたは複数における細胞は、不均質に分布している場合がある。
【０１６０】
表皮等価物の比較分析
図４Ａ〜４Ｃは、良質の皮革、天然の皮膚および表皮等価物の比較分析を示す。図４Ａは、天然の皮膚および良質の皮革の縦断面のＦＥＳＥＭを示す。図４Ａは、表皮（ｅ）および真皮（ｄ）の別個の形態的構造を示す。なめしは、皮の構造を永続的に変更した。表皮における個別の細胞間の境界は、識別不能になった。水分の除去は、真皮中のコラーゲン束をより圧縮させ、耐久性にした。倍率：１０００×。
【０１６１】
図４Ｂは、ＦＥＳＥＭ像を示す。一例として図４Ｂは、良質の皮革の表面および表皮等価物の表面の両方が、同等の触覚（タッチ）経験を誘導する可能性が高いことを示す、類似の滑らかな外観を有することを示す。倍率：２０００×。
【０１６２】
図４Ｃは、良質の皮革および表皮等価物の縦断面のＦＥＳＥＭを示す。なめしを行う前に、天然の皮膚の表皮、図４Ａに類似して、個別の細胞層が表皮等価物において識別可能である。真皮中のコラーゲンが、主として皮膚の引張強さの原因であり得るので、コラーゲン束は、皮革に厚さおよび耐久性を与えることができる（挿入図）が、表皮の外層に完全に依存し得る知覚経験を与えない場合がある。
【０１６３】
図５Ａ〜５Ｃは、天然の皮膚および表皮等価物の角質層（ＳＣ；角化層）の比較分析を示す。図５Ａは、表皮等価物の表面が天然の皮膚の表面よりも滑らかに見えることを示すＦＥＳＥＭ像を示し、これは、細胞培養の制御された環境が原因であり得る。図５Ｂは、ＴＥＭを使用して、ＳＣの主要な「機械的」接合部であるコルネオデスモソーム（矢印）が表皮等価物においてより高電子密度の領域として検出できたことを示す。図５Ｃは、コルネオデスモシン（ＣＤＳＮ）が合成され、角化の開始直前にＳＧにおける細胞によって細胞外空間に排出され得ることを示す。ＣＤＳＮは、カドヘリンによって占有されているＳＧデスモソームの細胞間部分内に包埋する可能性があり、そのようにして、コルネオデスモソームを形成することができる。矢印は、天然の皮膚および表皮等価物のＳＣにおける類似に整列したＣＤＳＮの点状蓄積を指し、これはコルネオデスモソームを表す可能性が高い。ＳＣ、角質層；ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層。
【０１６４】
図６Ａ〜６Ｅは、天然の皮膚および表皮等価物の顆粒層（ＳＧ；顆粒状層）の比較分析を示す。図６Ａは、そのロリクリン（ＬＯＲ）染色を示す。ＬＯＲは、角化細胞エンベロープの主要なタンパク質構成要素であり、角化する上皮の顆粒状層に発現される場合がある。ＳＧにおける類似のＬＯＲ発現パターン（矢印で指し示したＨ＆Ｅ染色組織切片の濃褐色の色素）が、天然の皮膚の表皮（パネルの左側）および表皮等価物（パネルの右側）の両方において検出された。ｄ、真皮；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン＆エオシン；ＳＢ、基底層；ＳＣ、角質層；ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層；＊、トランスウェルフィルター膜。図６Ｂにおいて、表皮Ｃａ＋＋勾配は、透過電子顕微鏡観察で高電子密度沈殿物として捕捉することができる。Ｃａ＋＋の沈着物は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）の両方においてＳＧに存在し、ＳＣに不在であった。ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層。図６Ｃにおいて、透過性バリアの完全性をランタン灌流によって評価した。ランタンは、生存可能なＳＧの細胞外空間における高電子密度の沈着物として視覚化され、これは、ランタン、ならびに伸展により水および他の小イオンが、この層内のケラチノサイトの間を通過することができることを実証している。対照的に、機能している脂質バリアがランタンの上方運動を遮断しているので、ランタンは、ＳＣ中にさらに透過することができない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物は、天然の皮膚と等しく機能的な透過性バリアを実証した。ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層。図６Ｄは、タイトジャンクションタンパク質１／閉鎖帯−１（ＴＪＰ１／ＺＯ−１）が、脂質二重層内の原線維様構造であるタイトジャンクション鎖タンパク質をアクチン細胞骨格に繋留していることを示す。矢印は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）のＳＧにおける類似に整列したＴＪＰ１／ＺＯ−１の鮮緑色細胞膜関連蓄積を指し示す。ＳＣ、角質層；ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層。図６Ｅは、プロフィラグリンとして公知の大型の３５０ｋＤａタンパク質前駆体に縦にクラスター形成したフィラグリン（ＦＬＧ）モノマーが、ＳＧの細胞中のケラトヒアリン顆粒中に存在することを示す。矢印は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）のＳＧにおける類似に整列した鮮赤色顆粒およびＦＬＧの細胞膜関連蓄積を指し示す。ＳＣ、角質層；ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層。
【０１６５】
図７Ａ〜７Ｃは、ＴＥＭで評価した天然の皮膚および表皮等価物における脂質二重層の形成を示す。図７Ａにおいて、白色矢印は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）の両方におけるＳＣとＳＧとの境界での正常な脂質分泌を指し示す。図７Ｂにおいて、層状体（白い矢尻印）が、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）の両方のＳＧにおいて見られる。図７Ｃはｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）の正常な脂質二重層（ＬＢ）形態を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）における脂質二重層は、類似の外観を有した。ＳＣ、角質層。
【０１６６】
図８Ａ〜８Ｄは、天然の皮膚および表皮等価物の基底上層のマーカーの比較分析を示す。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃ、免疫組織化学（ＫＲＴ１０；矢印で指し示したＨ＆Ｅ染色組織切片の濃褐色の色素）および免疫蛍光（矢印で示した赤色の細胞質／ＫＲＴ１／および赤色の細胞膜／ＤＣＬ１／染色）によって実証されているように、基底上層、有棘層（ＳＳ）および顆粒層（ＳＧ）のマーカーであるケラチン１０（ＫＲＴ１０）、ケラチン１（ＫＲＴ１）、デスモコリン１（ＤＣＬ１）は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）において類似の発現パターンを有する。ｄ、真皮；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン＆エオシン；ＳＢ、基底層；ＳＣ、角質層；ＳＧ、顆粒層；ＳＳ、有棘層；＊、トランスウェルフィルター膜。図８Ｄにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物の両方において、デスモソーム（矢印）が明確に画定されている。ＳＳ、有棘層。
【０１６７】
図９Ａ〜９Ｄは、天然の皮膚および表皮等価物の基底層（ＳＢ；基底の層）の比較分析を示す。図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、および図９Ｄに関して、増殖マーカーＭＫＩ６７、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、および転写因子ＴＰ６３は、免疫組織化学（ＭＫＩ６７；矢印で指し示したＨ＆Ｅ染色組織切片の濃褐色の色素）および免疫蛍光（矢印によって示される緑色細胞質／ＫＲＴ１４／および白色核／ＴＰ６３／染色）によって実証されているように、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）の両方において典型的な基底の層の分布を示す。ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物の両方において、ヘミデスモソーム（矢印）が明確に画定されている。ＢＭ、基底膜；Ｃｙ、細胞質；ｄ、真皮；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン＆エオシン；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＴＭ、トランスウェルフィルター膜。
【０１６８】
図１０Ａ〜１０Ｆは、基底膜の細胞外マトリクス構成要素の比較分析を示す。基底膜（ＢＭ）は、真皮表皮接合部上に不可欠な構造的足場を提供することができる細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質の凝縮したネットワークから形成することができる。インテグリンβ１は、細胞をＥＣＭと結合することによって複数の上皮細胞機能を調節し、それは、真皮表皮接合部のＢＭの維持に重要であり得る。図１０Ａにおいて、インテグリンβ１は、矢印（細胞膜関連染色）および矢尻印（トランスウェル膜の穴を通して突出している細胞の先端上）によって示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）の両方において典型的な基底の層の分布を示す。ＢＭ、基底膜；ｄ、真皮；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＳＧ、顆粒層；ＴＭ、トランスウェル膜。
【０１６９】
フィブロネクチンは、細胞接着において役割を果たすことができる。図１０Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）においてフィブロネクチンが大部分は真皮に発現され得、比較的わずかがＢＭ領域において検出され得ることを示す。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）において、フィブロネクチンは、トランスウェル膜の穴を通して突出している細胞の先端で検出することができる（赤色矢尻印）。ｄ、真皮；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＳＧ、顆粒層；ＴＭ、トランスウェル膜。
【０１７０】
ＢＭによって提供される機械的支持は、コラーゲンＩＶ、または表皮等価物の場合は足場によって決定することができる。図１０Ｃにおいて、矢尻印で示すように、コラーゲンＩＶの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）と類似の斑状パターンを有する。ＢＭ、基底膜；ｄ、真皮；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＳＧ、顆粒層；ＴＭ、トランスウェル膜。
【０１７１】
コラーゲンＶＩは、細胞接着において役割を果たすことができ、フィブロネクチンと関連することができる。図１０Ｄにおけるように、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）において、コラーゲンＶＩは、大部分は真皮に発現され得、比較的わずかしかＢＭ領域において検出されない可能性がある。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）において、コラーゲンＶＩは、トランスウェル膜の穴を通して突出している細胞の先端で検出することができる（矢尻印）、図１０Ｄ。ＢＭ、基底膜；ｄ、真皮；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＳＧ、顆粒層；ＴＭ、トランスウェル膜。
【０１７２】
コラーゲンＶＩＩは、基底膜を真皮中のコラーゲンＩおよびＩＩＩ原線維に向けて繋留することができる。図１０Ｅにおいて矢尻印で指し示されるように、コラーゲンＶＩＩの発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）と類似の斑状パターンを有する。ＢＭ、基底膜；ｄ、真皮；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＳＧ、顆粒層；ＴＭ、トランスウェル膜。
【０１７３】
ラミニン５（鎖組成α３β３γ２）は、繋留フィラメントの主な構成要素であり得、ｉｎ  ｖｉｖｏのＢＭの最初の組立てに不可欠であり得る。図１０Ｆにおいて矢尻印で示すように、ラミニン５の発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏの天然の皮膚（パネルの左側）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した表皮等価物（パネルの右側）と類似のパターンを有する。ラミニン５が表皮等価物に特に豊富なことに加えて、痕跡量のラミニン５を基底層細胞の細胞膜（矢印）に見ることができる。ＢＭ、基底膜；ｄ、真皮；ＳＢ、基底層；ＳＳ、有棘層；ＳＧ、顆粒層；ＴＭ、トランスウェル膜。
【０１７４】
図１１Ａ〜１１Ｉは、全層皮膚等価物（ＦＳＥ）の構造分析を示す。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＦＳＥの断面が倍率２６００×（図１１Ａ）および倍率５２００×（図１１Ｂ）で表皮の別個の細胞層を表すことを示す。図１１Ｃは、良質の皮革と類似の滑らかな外観を有する、倍率９００×のＦＳＥの表面を示し、これは、ＦＳＥが同等の触覚（タッチ）経験を誘導することができることを示す。図１１Ｄ〜１Ｆは、存在する真皮線維芽細胞および豊富な細胞外マトリクスを有する真皮足場の縦断面を倍率９１×（図１１Ｄ）、倍率１６２×（図１１Ｅ）および倍率４０５×（図１１Ｆ）で示す。図１１Ｇ〜１１Ｉは、存在する真皮線維芽細胞および豊富な細胞外マトリクスを有する真皮足場を倍率８０×（図１１Ｇ）、倍率６９５×（図１１Ｈ）および倍率２７００×（図１１Ｉ）で示す。
【０１７５】
図１２Ａ〜１２Ｒは、真皮等価物の操作の時間経過を示す。図１２Ａ〜１２Ｉは、足場上に真皮線維芽細胞を播種した後２日目に倍率３６×（図１２Ａ）、倍率６９５×（図１２Ｂ）、倍率１４７０×（図１２Ｃ）、倍率７７５０×（図１２Ｄ）、倍率２３２０×（図１２Ｅ）、倍率２４２０×（図１２Ｆ）、倍率６５６０×（図１２Ｇ）、倍率１７０００×（図１２Ｈ）および倍率２２０００×（図１２Ｉ）で示す。細胞は、足場の中空構造中に遊走し、細胞外マトリクスを分泌し始めることができる。図１２Ｊ〜１２Ｒは、足場上に真皮線維芽細胞を播種した後７日目に倍率６４×（図１２Ｊ）、倍率１００×（図１２Ｋ）、倍率３６４×（図１２Ｌ）、倍率８２×（図１２Ｍ）、倍率２５３×（図１２Ｎ）、倍率３９４０×（図１２Ｏ）、倍率５５５０×（図１２Ｐ）、倍率９４４０×（図１２Ｑ）および倍率２１６８０（図１２Ｒ）で示す。縦（図１２Ｊ〜１２Ｌ）および横断面（図１２Ｍ〜１２Ｒ）は、より密な細胞およびより豊富な細胞外マトリクスを示すことができ、一部の領域は、足場の中空構造がほぼ完全に閉塞している（図１２Ｍ〜１２Ｐ）。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１  ｉＰＳＣのケラチノサイトへの分化）
分化を誘導するために、未分化ｉＰＳＣを、２０％Ｏ２雰囲気環境に移し、１ｍＭ  ＡＴＲＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を補充されたｍＴＥＳＲ１または他の多能性幹細胞基本培地で７日間処理する（誘導）。
【０１７７】
外胚葉運命の早期獲得を示す細胞を選択するために、細胞を回収し、新たに調製した３Ｄ  ＨＤＦ  ＥＣＭまたは他のタイプのＥＣＭに、１ｃｍ２当たり５〜１０×１０３細胞の密度で再プレーティングし、ヒト血小板ライセート（ｌｙｓｔｅ）などの血清代用物ならびに１ｍＭ  ＡＴＲＡおよび２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４を補充されたダルベッコ変法イーグル培地／Ｈａｍ  Ｆ１２（３：１；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはケラチノサイト培地でさらに７日間成長させる（選択）。
【０１７８】
推定上の表皮前駆細胞を富化するために、コラーゲンＩＶ型コーティング皿への迅速付着を使用することができ、迅速に付着した細胞を、１ｍＭ  ＡＴＲＡを補充された規定ケラチノサイト−ＳＦＭまたは他のケラチノサイト培地で７日間培養する（富化）。その後、細胞を、ＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または他のケラチノサイト培地でさらに７日間培養してから（拡大増殖）、最終的に回収して分析する。
【０１７９】
（実施例２  人工多能性幹細胞のケラチノサイト系統への分化）
ＧｅｌｔｒｅｘおよびＣｏｌによる組織培養皿のコーティング
この手順は、生物学的安全キャビネット内で無菌技術を使用して実施してもよい。Ｇｅｌｔｒｅｘマトリクスは、マトリゲルと同様に、室温（ＲＴ）で迅速に凝固する。各々の新しいバッチのマトリクスを到着時にアリコートにし、この試薬を取り扱う際は、事前に冷却したピペットチップ、ラック、およびチューブを使用する。５０、１００、および２００μＬのアリコートを作製し、−８０℃で保管する。Ｇｅｌｔｒｅｘは１：１００希釈で使用する。
【０１８０】
下記のコーティング手順は、６０ｍｍ組織培養皿用に記載されている場合がある。より大型の皿を使用する場合、それに応じてコーティング溶液の容積を調整する。１．  −８０℃の冷凍庫からＧｅｌｔｒｅｘの５０μＬアリコートを取り出し、生物学的安全キャビネット内で氷上に配置する。２．  ５ｍＬの冷却無菌ＤＭＥＭ／Ｆ１２を、１５ｍＬのコニカルチューブに添加する。３．  １ｍＬのガラスピペットを使用して、ステップ２で調製した１５ｍＬのコニカルチューブから１ｍＬの冷却ＤＭＥＭ／Ｆ１２を取り、凍結Ｇｅｌｔｒｅｘに添加する。ピペットで穏やかに吸引排出して、Ｇｅｌｔｒｅｘを解凍および溶解させる。溶解したＧｅｌｔｒｅｘを、ステップ２で調製した１５ｍＬのコニカルチューブ中のＤＭＥＭ／Ｆ１２の残りに移す。ピペットして、希釈Ｇｅｌｔｒｅｘを混合する。４．  ５０μＬの３ｍｇ／ｍＬ  ＣｏｌＩストック溶液を、ステップ３の希釈Ｇｅｌｔｒｅｘに添加する。ピペットで取り、希釈ＧｅｌｅｔｒｅｘをＣｏｌＩと混合する。４ｍＬのコーティング溶液を６０ｍｍ皿に添加する。プレートをタッピングまたは旋回して、表面全体を確実にコーティングする。５．  Ｇｅｌｔｒｅｘ／ＣｏｌＩコーティング溶液を有する皿を、３７℃の組織培養インキュベーターで少なくとも１時間インキュベートする。６．  コーティングが完了したら、コーティング溶液を皿に残し、次のサブセクションに記載されているｉＰＳＣのプレーティングに進む。あるいは、コーティング溶液を吸引し、２ｍＬの新たなＤＭＥＭ／Ｆ１２をコーティング皿に添加して、細胞をプレーティングする前に皿が乾燥するのを防止する。
【０１８１】
分化させるためのｉＰＳＣのプレーティング
約７０％コンフルエントに成長させた無フィーダーｉＰＳＣの６０ｍｍ組織培養皿を１つ調製する。顕微鏡で細胞を検査して、混入が存在しないこと、および未分化表現型が維持されていることを確認する。細胞は、ストレスに供されているかまたは死滅しつつある場合に、分化を開始して、より大型の多形細胞を有する「敷石状（ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ）」領域を示す。こうした細胞は、ケラチノサイトへの分化に使用するべきではない。
【０１８２】
ｉＰＳＣをケラチノサイトへと分化させるため、１：８分割比のｉＰＳＣ。１．  Ｎ２Ｂ２７培地およびディスパーゼを３７℃の水浴で事前に温めておく。２．  顕微鏡を使用して、コロニーが継代のために準備ができていることを確認する。培地を皿から穏やかに吸引する。２ｍＬの１×ＰＢＳを添加し、プレートを旋回させて細胞を洗浄し、ＰＢＳを穏やかに吸引する。３．  １ｍＬのディスパーゼを添加し、プレートを３７℃の組織培養インキュベーターに３〜５分間にわたって戻した。４．  細胞をディスパーゼと共にインキュベートしている間、Ｇｅｌｔｒｅｘ／ＣｏｌＩコーティング手順のステップ６のＧｅｌｔｒｅｘ／ＣｏｌＩコーティング溶液（またはＤＭＥＭ／Ｆ１２）を穏やかに吸引し、４ｍＬの完全Ｎ２Ｂ２７培地を、コーティング皿に添加する。５．  ディスパーゼと共に３〜５分間インキュベートした後、細胞が、コロニー周囲の縁端が巻き上がっていることまたは折り返されていることを調べることにより、採集する準備ができていることを確認する。６．  プレートを生物学的安全キャビネットに移し、ディスパーゼを注意深く吸引する。ディスパーゼで処理した後、コロニーは、皿の表面に非常にゆるく付着しており、それほど強い力を使用しなくとも剥離させることができる。７．  ２ｍＬの単純ＤＭＥＭ／Ｆ１２を穏やかに添加する。培地を吸引し、洗浄を３回繰り返す。８．  ２ｍＬの完全Ｎ２Ｂ２７を皿に添加し、コロニーをプレートから穏やかにこそぎ落とす。皿の細胞を１５ｍＬコニカルチューブに移し、６ｍＬの完全Ｎ２Ｂ２７を添加して、細胞懸濁物の総容積を８ｍＬにする。９．  細胞懸濁物を穏やかに混合して、大きな細胞塊をほぐす。１ｍＬの細胞懸濁物を、本サブセクションのステップ３で調製したコーティング皿に移す。残りの細胞は、所与の実験室で規定されている条件を使用して破棄するか、または再プレーティングする。１０．  新たにプレーティングした細胞をインキュベーターに移し、プレートを穏やかに前後左右に振とうし、細胞を均等に分布させる。３７℃の組織培養インキュベーターで細胞を一晩インキュベートする。
【０１８３】
ＲＡおよびＢＭＰ４によるｉＰＳＣの分化
ｉＰＳＣ由来ケラチノサイトの分化および継代培養は、生物学的安全キャビネット内で無菌技術を使用して実施する。継代した翌日に新しいプレートを検査して、ｉＰＳＣの付着が成功したことを確認する。ｉＰＳＣがコロニーを形成し始めた場合、下記の分化プロトコールに進む。
【０１８４】
１．  完全ＤＫＳＦＭ（抗生物質およびＤＫＳＦＭ補充物を有する）を３７℃の水浴で事前に温めておく。２．  前ステップで事前に温めておいた５ｍＬのＤＫＳＦＭを１５ｍＬコニカルチューブに添加し、１μＭの最終作業濃度を達成するように５μＬの１ｍＭ  ＲＡを、および２５ｎｇ／ｍＬの最終作業濃度を達成するように５μＬの２５μｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４を添加し、よく混合する。３．  プレーティングしたｉＰＳＣを有する皿からＮ２Ｂ２７培地を吸引し、４ｍＬの１×ＰＢＳで１回洗浄し、上記ステップの１μＭ  ＲＡおよび２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４を含有する４ｍＬのＤＫＳＦＭを添加する。これは、分化手順の１日目である。４．  細胞をインキュベーターに移し、４８時間インキュベートする。５．  ４８時間のインキュベーション後、培地を、１μＭ  ＲＡおよび２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４を含有する新たなＤＫＳＦＭと取り換える。細胞をさらに４８時間にわたってインキュベーターに移す。６．  第２ラウンドの４８時間誘導後（分化の４日目）、培地を、ＲＡおよびＢＭＰ４を含まない完全ＤＫＳＦＭと取り換える。１日おきに培地を換えて、細胞を完全ＤＫＳＦＭで１０日間インキュベーター内にてインキュベートする。７．  分化の１４日目に、抗生物質および提供されている補充物を添加することにより完全ＣｎＴ−０７培地を調製し、培地を事前に温めておく。この日までに、成長したｉＰＳＣコロニーの大多数の細胞は、上皮様表現型を示し始める。８．  分化細胞からＤＫＳＦＭを吸引し、４ｍＬの完全ＣｎＴ−０７と取り換える。１日おきに完全ＣｎＴ−０７を換えて、細胞を、組織培養インキュベーター内でさらに１０日間インキュベートする。
【０１８５】
ｉＰＳＣ由来ケラチノサイトの迅速付着および培養
分化の２４日目に、成長したｉＰＳＣコロニーから遊走して離れた多数の細胞は、ケラチノサイト様表現型を示し、ケラチノサイト運命への外胚葉の拘束に必要な主要制御因子であるｐ６３、およびＫｒｔ１４を発現し始める。この日までに、ｉＰＳＣ分化に使用した６０ｍｍ皿は、完全にコンフルエントであり、継代する必要がある。継代中にｉＰＳＣ由来ケラチノサイトを富化するために、分化ｉＰＳＣ培養物を、ＣｏｌＩ／ＣｏｌＩＶコーティングプレートに迅速に付着させる。最大４枚の１００ｍｍ  ＣｏｌＩ／ＣｏｌＩＶコーティング組織培養皿を使用して、分化ｉＰＳＣを含有する１枚の６０ｍｍ皿の迅速付着手順を実施する。１枚の１００ｍｍ皿のみを使用する場合、迅速付着手順のために、分化ｉＰＳＣ培養物の１／４をプレーティングする。
【０１８６】
ＣｏｌＩおよびＣｏｌＩＶによるプレートのコーティング
この手順は、生物学的安全キャビネット内で無菌技術を使用して実施してもよい。１．ＣｏｌＩＶ粉末を、０．２５％無菌氷酢酸で２ｍｇ／ｍＬの濃度に再構成する。時々旋回させて、数時間２〜８℃で溶解させる。アリコートを作製し、それらを−２０℃で保管する。２．  バイアルを氷バケツに置き、４℃で数時間保つことにより、ＣｏｌＩＶストック溶液（２ｍｇ／ｍＬ）のアリコートを非常にゆっくりと解凍する。３．  ＣｏｌＩＶストック溶液を、７μｇ／ｍＬの最終作業濃度になるように、適切な容積（各１００ｍｍ皿当たり５ｍＬ）の０．２５％無菌氷酢酸に再懸濁する。適切な容積のＣｏｌＩストック溶液を添加して、３０μｇ／ｍＬの最終作業ＣｏｌＩ濃度を達成する。５ｍＬの作業溶液を使用することにより、１００ｍｍ皿を覆うようにプレートをコーティングする。プレートを、生物学的安全キャビネット内で室温にて１時間インキュベートする。４．  コーティングしたプレートから液体を吸引し、皿を、５ｍＬの無菌１×ＰＢＳで１回、および５ｍＬのｄｄＨ２Ｏで１回すすぐ。５．  洗浄した皿を、生物学的安全キャビネット内で空気乾燥する。プレートをそのまま使用するか、またはプレートをパラフィルムで密封し、最大６か月間４℃で保管する。以前に保管したＣｏｌＩＶコーティングプレートを使用するためには、プレートを生物学的安全キャビネット内で少なくとも１時間室温に温めてから、細胞をプレーティングする。
【０１８７】
ｉＰＳＣ由来ケラチノサイトの迅速付着
１．  分化の２４日目に、完全ＣｎＴ−０７、Ａｃｃｕｔａｓｅ、およびＣｏｌＩ／ＣｏｌＩＶコーティング皿を事前に温める。２．  細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを添加し、組織培養インキュベーターで５分間インキュベートする。細胞が剥離し始めたことを顕微鏡で確認する。３．  ３ｍＬの完全Ｃｎｔ−０７を添加し、ピペットで吸引排出して細胞を取り外し、細胞懸濁物を１５ｍＬコニカルチューブに収集する。細胞を２６０×ｇで５分間遠心し、上清を吸引する。ペレットを１０ｍＬの完全Ｃｎｔ−０７培地に再懸濁し、２６０×ｇで５分間の遠心を繰り返し、上清を吸引する。４．  ペレットを４ｍＬの完全ＣｎＴ−０７に再懸濁し、ピペットで吸引排出して細胞塊をほぐして単細胞にする。５．  ９ｍＬの完全ＣｎＴ−０７培地を、各ＣｏｌＩ／ＣｏｌＩＶコーティング皿に添加し、上記ステップ４の１ｍＬの細胞懸濁物を、各ＣｏｌＩ／ＣｏｌＩＶコーティング皿に移す。細胞を、コーティング皿に１５〜３０分間室温で付着させる。６．  浮遊細胞（これらは、未分化ｉＰＳＣまたは部分的に分化したｉＰＳＣである）を有する培地を注意深く吸引する。付着細胞（これらは、ｉＰＳＣ由来Ｋｒｔ１４陽性細胞である）は、静置しておく。１０ｍＬの新たな完全ＣｎＴ−０７を、付着細胞を有するプレートに添加する。１日おきに培地を換えて、３７℃の組織培養インキュベーター内で細胞を拡大増殖させる。細胞は、必要に応じてＡｃｃｕｔａｓｅと共に、ＣｏｌＩコーティング皿のＣｎＴ−０７またはＥｐｉＬｉｆｅ（ＥＤＧＳ補充物を有する）で継代する。継代２または継代３の後、および迅速付着ステップの後、培養物は、約９０％が、ケラチノサイト様表現型を示すＫｒｔ１４陽性細胞で構成されているはずである。得られた培養物のケラチノサイト様表現型は、Ｋｒｔ１４発現の標準的免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）分析により、および器官型培養で正常な階層化表皮を再構成する能力により、検証することができる。
【０１８８】
（実施例３  初代ケラチノサイトからの表皮層の調製）
初代ケラチノサイトを、単一の新生児包皮から単離し、ヒトケラチノサイト成長補充物で補充された０．０７ｍＭのＣａ２＋１５４ＣＦ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で成長させる。最初の継代ケラチノサイトの懸濁物（２．２１×１０５／ｃｍ２インサート）を、製造業者のプロトコールに従って、ＣｎＴ−０７培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）またはＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）中のＣｅｌｌｓｔａｒｔ  ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（または他のＥＣＭ基質）をコーティングしたＰＥＴ、０．４ｍｍインサート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に播種する。
【０１８９】
播種後の３日目（Ｄ３）に、培地を、ＣｎＴ−０２−３Ｄ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）またはＣｎＴ−３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）に切り替える。４日目に、ＨＥＥを、インサートの底部にＣｎＴ−０２−３ＤまたはＣｎＴ−３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒを供給することにより空気に曝露させる。４日目以降、回収するまで、ＨＥＥに、ＣｎＴ−０２−３ＤまたはＣｎＴ−３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒを毎日供給する。ＨＥＥを、３７℃および５％ＣＯ２の高湿度（１００％ＲＨ）または乾燥（５０％ＲＨの）インキュベーターで成長させる。ダイヤル比重計（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、インキュベーター湿度を測定する。低インキュベーター湿度は、水皿を取り外すことにより維持する。
【０１９０】
容量オスモル濃度が変化する可能性を制御するため、培地を毎日新しくする。このプロトコールを使用すると、マイクロオスモメーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で測定したところ、容量オスモル濃度の著しい変化は検出されない。経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定、光学顕微鏡、電子顕微鏡には、１２ウェルインサートを使用し、経表皮水分喪失（ＴＥＷＬ）測定および免疫ブロットには、６ウェルインサートを使用する。
【０１９１】
（実施例４  表皮層の培養）
ケラチノサイトを、ＣｎＴ−０７培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）またはＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）中の０．４μｍ細孔インサートを有するポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号：ＭＣＨＴ１２Ｈ４８）に、２．０〜２．５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種する。
【０１９２】
播種後の３日目（Ｄ３）に、培地を、ＣｎＴ−０２−３Ｄ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）またはＣｎＴ−３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）に切り替える。４日目に、細胞を、インサートの底部にＣｎＴ−０２−３ＤまたはＣｎＴ−３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒを供給することにより空気に曝露させる。４日目以降、１４日目に回収するまで、表皮層に、ＣｎＴ−０２−３ＤまたはＣｎＴ−３Ｄ  Ｂａｒｒｉｅｒを毎日供給する。
【０１９３】
（実施例５  支持担体の調製）
２％アガロース溶液を調製するために、２ｇの超高純度低融点（ＬＭＰ）アガロースを、１００ｍＬの超純水／緩衝溶液（１：１、ｖ／ｖ）に溶解する。緩衝溶液は、任意選択で、ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水１×）またはＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液１×）であってもよい。アガロース溶液を、温水（８０℃よりも高温）を含有するビーカーに入れ、アガロースが完全に溶解するまでホットプレート上に保持してもよい。アガロース溶液は、温度が３６℃よりも高温である限り、液体のままである。３６℃未満では、相転移が生じ、粘性が増加し、アガロースは最終的にゲルを形成する。
【０１９４】
アガロース支持担体を調製するため、１０ｍＬの２％液体アガロース（温度＞４０℃）を、直径１０ｃｍのペトリ皿に入れ、均等に分散させて、均一層を形成してもよい。アガロースは、冷蔵庫で４℃にてゲルを形成させる。
【０１９５】
（実施例６  線維芽細胞、ケラチノサイト、およびメラノサイトを含む合成皮革の生産）
プロトコールの概要は以下の通りであってもよい：ａ）線維芽細胞をコラーゲンの溶液に接触させ、その後、十分な期間にわたってインキュベートし、線維芽細胞が分布し、真皮等価物を構成する収縮コラーゲンマトリクスを得る；ｂ）ケラチノサイトおよびメラノサイトの混合物を、ａ）で得た真皮等価物に播種し、液体培地中で浸漬培養する；ｃ）ｂ）で得た培養物全体（真皮等価物に播種したケラチノサイトおよびメラノサイト）を浸漬し、皮膚等価物を構成する、コラーゲンマトリクスに線維芽細胞を含有する真皮等価物上にメラノサイトを含有する多階層化表皮等価物が得られるまで、気液界面で培養を継続する。
【０１９６】
ステップａ）は、均質な懸濁物中に、特にウシ由来のコラーゲンＩ型ならびにコラーゲンＩおよびＩＩＩの混合物（格子の最終容積に対しておよそ３０％）を用いて実施することができる。ラミニン（特に最終容積に対して１％から１５％まで）、コラーゲンＩＶ（特に最終容積に対して０．３％から４．５％まで）、および／またはエンタクチン（特に最終容積に対して０．０５％から１％まで）などの他の構成成分をそれに添加して、均質な懸濁物を得ることが有利である。線維芽細胞を皮膚から得る。線維芽細胞を好適な培地で培養し、その後、懸濁してから、コラーゲンおよび成長因子の懸濁物と混合する。混合物を、一般的には３６℃から３７．５℃までの、およそ３７℃の温度で、１〜６日間、好ましくは４日間または５日間インキュベートする。有利には、混合物を、その付着を可能にしない、特に支持体の縁端への混合物の付着を防止する支持体上でインキュベートする。そのような支持体は、特に、その表面を事前に処理することにより、例えば、その表面をウシアルブミンまたは血清でコーティングすることにより得ることができる。このようにして、栄養培地を放出しつつ、幾つかの方向に自由に収縮し、その中に線維芽細胞が包埋されているコラーゲンゲルを得る。
【０１９７】
ステップｂ）の実施には、皮膚、好ましくは成体皮膚に由来するケラチノサイトを使用することができる。ＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎ（Ｃｅｌｌ、６巻、３３１〜３４４頁、１９７５年）の技法に従って播種する前に、ケラチノサイトを、成長因子が存在する、特に、アミノ酸、血清、コレラ毒素、インスリン、トリヨードサイロニン、およびｐＨ緩衝溶液が存在する当業者に公知の好適な培地中の、３Ｔ３線維芽細胞で構成されるフィーダー支持体上で培養することにより増幅させる。特に、そのような培養培地は、特に、ケラチノサイトのための少なくとも１つの細胞分裂促進性成長因子（例えば、表皮成長因子（ＥＧＦ）および／またはケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、特にＫＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、および任意選択で抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ）を含有していてもよい。
【０１９８】
メラノサイトは、幼若動物皮膚または成体動物皮膚に由来するメラノサイトであってもよい。メラノサイトは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＭＣＤＢ１５３などの基本培地からなり、メラノサイト特異的成長因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＥＴ−１、ＥＴ３、またはαＭＳＨなど）を補充されている、ホルボールエステルが存在しない好適な培地中で、特に、Ｍ２培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）またはＭ２５４（Ｃａｓｃａｄｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（商標））などの他の培地中で培養することにより増幅させる。
【０１９９】
これら培養物から、メラノサイトの細胞懸濁物およびケラチノサイトの細胞懸濁物を調製し、混合して、混合ケラチノサイト／メラノサイト懸濁物を得る。メラノサイト／ケラチノサイト比は、１：１０から２：１までであってもよく、一般的に、およそ１：１である。この混合懸濁物を真皮等価物に堆積させる。真皮等価物は、コラーゲンなどの生物学的材料を介して支持体に付着させることが有利である。メラノサイト／ケラチノサイト懸濁物を、リング内、または境界が定められた表面部分上に懸濁物を維持するための任意の等価な手段内に堆積させる。液体栄養培地を、細胞の混合物を覆うような様式で添加する。この培地は、当業者に公知の成長因子、特にＥＧＦおよび／またはＫＧＦを含有する。培地を定期的に取り換えることになり、一般的には２〜１０日間の期間にわたって、特に５〜８日間の期間にわたって、およびおよそ７日間の期間にわたって、浸漬物として培養を継続する。培地は、浸漬の２日目から、理想的には浸漬の４日目から、ＫＧＦを含有する。
【０２００】
その後、皮膚を、それ自体は公知の様式で浸漬して、ケラチノサイトの分化および階層化表皮等価物の形成を得る。気液界面で浸漬物として培養することに対応するこのステップｃ）を、分化構造が得られるまで、一般的にはおよそ７日間継続する。しかしながら、ステップｃ）は、上記の記載で指定されている有利な特徴を有する皮膚等価物を保存しつつ同時に、より長期間にわたって、例えばおよそ２８日間にわたって継続してもよい。栄養培養培地を、定期的に新しくすることになる。その後、皮膚等価物を取り出して、必要な試験を行なう。
【０２０１】
（実施例７  培養皮膚検体での濾胞形成の誘導）
拡大増殖させたＤＰ細胞を、培養したＯＲＳ細胞と混合し、洗浄し、２０ｍｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）に、好適な細胞密度で注意深く再懸濁する。各実験で使用される培養したＤＰおよびＯＲＳ細胞は、異なるドナーから得られたものである。なぜなら、ＤＰ細胞およびＯＲＳ細胞の培養期間が異なり、同じドナーに由来する２つの細胞型を調製することができないためである。細胞懸濁物を、培養確立の１日後に、培養皮膚片の真皮にゆっくりと注入する。
【０２０２】
（実施例８）
毛包細胞集団の培養
毛包を、後頭部から得る。真皮乳頭（ＤＰ）細胞を、Ｒａｎｄａｌｌら、Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｂａｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂａｌｄｉｎｇ  （ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｏｐｅｃｉａ）  ｓｃａｌｐ．、Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１９９６年：１３４巻：４３７〜４４４頁）に記載されているように、調製および培養する。
【０２０３】
手短に言えば、毛包のＤＰを、解剖顕微鏡下で単離し、個々に２４ウェル組織培養プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）へと移す。１５％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ）を補充されたＤＭＥＭ中で細胞培養を実施する。細胞増殖を開始したら、コンフルエントになるまで細胞を培養し、２回の継代で拡大増殖させた。外毛根鞘（ＯＲＳ）細胞を単離する場合、隆起領域を含む毛包の中央部分を切除し、穏やかなトリプシン処理にかける。少なくとも１０個の毛包細胞を各培養に使用する。得られた細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で２回洗浄し、標準的ケラチノサイト培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ、Ｓｉｇｍａ）での細胞培養に供する。培養の１週間後に、細胞を回収する。
【０２０４】
（実施例９  全層皮膚等価物のなめし）
全層皮膚等価物を、クロムなめしによりなめす。第１のステップは、氷および硫酸処理である。これにより、組織は、クロムを受け入れることができるように開放される。その後、クロムを酸化マグネシウムと共に添加する。
【０２０５】
このプロセスにより、全層皮膚等価物のｐＨレベルは約３に低下する。クロムが全層皮膚等価物全体に作用したら、なめし液を導入する。これにより、ｐＨは、約４にまで上昇する。その後、温水浴にかけてから、ロールプレスして過剰な液体を除去する。その後、最終段階では、必要に応じて表面処理を施し、その後全層皮膚等価物を引き延ばしながら乾燥させ、それがなされたら再度プレスする。
【０２０６】
（実施例１０  Ｘ−ｔａｎなめしプロトコール）
全層皮膚等価物は、Ｘ−ｔａｎ手順を使用してなめしてもよい。なめす前に、全層皮膚等価物を石灰漬けにする。石灰漬けは、皮膚等価物を浸すステップ、基質を添加するステップ、ｐＨを調整するステップ、および洗浄するステップを含む。その後、皮膚等価物を洗浄し、前脱灰緩衝液を添加し、皮膚等価物を脱灰し、洗浄することにより、皮膚等価物を脱灰する。その後、水戻しを行い、なめし基質を添加し、ｐＨをなめし実施ｐＨへと調整し、固定のサイクルおよび固定を実施し、乳化加脂して、なめし皮膚等価物を得ることにより、皮膚等価物をなめす。
【０２０７】
（実施例１１  全層皮膚等価物）
Ｉ型コラーゲンマトリクス（０．５×１０６個のｉＰＳＣ由来線維芽細胞を含有する）を、ポリエチレンテレフタレート膜（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に堆積させ、重合させてもよい。重合させたマトリクスを約７日間インキュベーションした後、１×１０６個のｉＰＳＣ由来ケラチノサイトおよび０．１×１０６個のｉＰＳＣ由来メラノサイトをマトリクスに播種し、さらに７日間インキュベートしてもよい。複合培養物を、気液界面に上昇させ、下から栄養供給して、表皮分化を誘導してもよい。約１４日後に、全層皮膚等価物を回収し、ＬＮ２で瞬間凍結してもよく、またはメラニン定量化のためにろうに包埋してもよく、そのいずれでもよい。
【０２０８】
（実施例１２  凍結切片の免疫染色）
固定：組織を、３．８％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２〜７．６で３０分間固定してもよい。試料を、ＰＢＳで３回、５分間洗浄してもよい。組織試料を、４℃で回転させながら、一連の無菌スクロース勾配（１０％スクロースで一晩、１５％スクロースで６〜８時間、３０％スクロースで一晩、および最終的に、最適切断温度（ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ））化合物と１：１で混合した３０％スクロースで一晩）に浸透させてもよい。試料を、ＯＣＴで包埋し、液体窒素蒸気中で凍結してもよい。凍結ブロックは、−８０℃で保管することができる。
【０２０９】
切片の切断：切断する前日に、凍結ブロックを、−２０℃に一晩移しておいてもよい。標準的クライオスタットを使用して、切片（１０μｍ）を調製してもよい。切片は、処理するまで−２０℃で保ってもよい。
【０２１０】
処理：対照インキュベーションを含むことができる。一次抗体の代わりに、免疫前血清またはアイソタイプ一致非免疫抗体を使用してもよい。切片を、９０％冷却アセトンで１０分間、または０．２％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで５分間のいずれかに浸して、抗原を曝露させる。試料を、ＰＢＳで３回、５分間洗浄してもよい。０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する５％ＢＳＡに切片を１時間浸すことにより、非特異的抗体反応性を阻止した。その後、切片を、２つの抗体：ｉ）２．５μｇ／ｍｌのＣｈｒｏｍＰｕｒｅロバ全ＩｇＧ（ブロッキング用；二次抗体はすべてロバで産生されていてもよい）；ｉｉ）１μｇ／ｍｌの適切な一次抗体の混合物と共に４℃で一晩インキュベートしてもよい。切片を、ＰＢＳで３回、５分間すすいでもよい。切片を、ロバで産生され、赤色または緑色フルオロフォアのいずれかにコンジュゲートされている適切な種特異的二次抗体と共に、室温で３０〜６０分間インキュベートしてもよい。切片を、ＰＢＳで３回、５分間洗浄してもよい。その後、切片を、１０μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２と共に室温で１０分間インキュベートしてもよい。切片を、ＰＢＳで３回、５分間洗浄してもよい。
【０２１１】
視覚化：試料を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ媒体（Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントしてもよい。適切なフィルターを装備する落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で試料を視覚化してもよい。
【０２１２】
（実施例１３  パラフィン包埋切片の免疫染色）
固定：組織を、３．８％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２〜７．６で３０分間固定してもよい。試料を、ＰＢＳで３回、５分間洗浄してもよい。組織試料を、昇順のエタノール系列（５０％、７０％、２×１００％；各２０分間）および透徹剤（キシレン、２×２０分間）で脱水してもよい。試料を、６５℃にて１時間パラフィンろうで２回灌流し、パラフィンブロックに包埋してもよい。パラフィンブロックは、さらなる使用まで室温で保管することができる。
【０２１３】
切片の切断：組織を、標準的ミクロトームを使用して、５μｍ厚に切片化した。切片は、処理するまで室温に保つことができる。
【０２１４】
処理：対照インキュベーションを含むことができる。一次抗体の代わりに、免疫前血清またはアイソタイプ一致非免疫抗体を使用してもよい。切片を、昇順系列のキシレン／エタノール系列、２×キシレン、２×１００％エタノール、および１×７０％および５０％；各１０分間で再湿潤化してもよい。その後、切片を、水道水で短時間すすいでもよい。その後、切片を、ヘマトキシリンで５分間染色してもよい。その後、切片を、溶液が清浄になるまでｄＨ２Ｏで洗浄してもよい。切片を、０．５％エオシンで１０分間染色してもよい。その後、切片を、水道水で短時間すすいでもよい。切片を５％ＢＳＡに１時間浸すことにより、非特異的抗体反応性を阻止した。その後、切片を、２つの抗体：ｉ）２．５μｇ／ｍｌのＣｈｒｏｍＰｕｒｅロバ全ＩｇＧ（ブロッキング用；二次抗体はすべてロバで産生されていてもよい）；ｉｉ）１μｇ／ｍｌの適切な一次抗体の混合物と共に４℃で一晩インキュベートしてもよい。切片を、ＰＢＳで３回、５分間すすいでもよい。切片を、ロバで産生され、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされている適切な種特異的二次抗体と共に、室温で３０分間インキュベートしてもよい。切片を、ＰＢＳで３回、５分間洗浄してもよい。
【０２１５】
視覚化：試料を、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質キット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってインキュベートしてもよい。ＤＡＢは、褐色の染色をもたらす。塩化ニッケルが基質溶液に添加されている場合、灰〜黒色染色が生じる場合がある。試料を、昇順のエタノール系列（５０％、７０％、２×１００％；各１０分間）および透徹剤（キシレン、２×１０分間）で脱水してもよい。試料を封入剤でマウントし、デジタルカメラを装備した位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で視覚化してもよい。
【０２１６】
（実施例１４  電界放射型走査電子顕微鏡法（ＦＥＳＥＭ））
固定：試料を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドおよび２％グルタルアルデヒドで２４時間４℃にて固定し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液に入れ、さらなる処理の前に４℃で維持してもよい。
【０２１７】
処理：試料を、１％ＯｓＯ４水溶液で１時間、後固定してもよい。昇順のエタノール系列（５０％、７０％、２×１００％；各１０分間）で脱水した後、試料を、Ｔｏｕｓｉｍｉｓ  Ａｕｔｏｓａｍｄｒｉ−８１５Ｂ装置を用いて液体ＣＯ２で臨界点乾燥し、両面銅テープで１５ｍｍアルミニウムマウントにマウントし、Ｄｅｎｔｏｎ  ＤｅｓｋＩＩ  Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒを使用して、４０Åの金−パラジウムをスパッタリングでコーティングしてもよい。
【０２１８】
視覚化：二重重複試料の断面を、内部形態分析用に薄型４５／９０度ＳＥＭマウントにマウントしてもよい。視覚化は、ｉｎＬｅｎｓ二次電子（ＳＥ）検出ならびに混合シグナルＩｎＬｅｎｓ／ＳＥ２（７５／２５％）検出を３〜５ｍｍの作動距離で使用して、２〜３ｋＶで作動させたＺｅｉｓｓ  Ｓｉｇｍａ  ＦＥＳＥＭ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で実施してもよい。画像は、保存解像度２０４８×１５３６およびライン平均ノイズ低減アルゴリズム（ｌｉｎｅ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ  ｎｏｉｓｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、ＴＩＦＦで撮影してもよい。
【０２１９】
処理：以前に乾燥した試料（つまり、皮革）をサイズに合わせて切断し、Ｄｅｎｔｏｎ  ＤｅｓｋＩＩ  Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒを使用して、４０Åの金−パラジウムをスパッタリングでコーティングしてもよい。
【０２２０】
視覚化：二重重複試料の断面を、内部形態分析用に薄型４５／９０度ＳＥＭマウントにマウントしてもよい。視覚化は、ｉｎＬｅｎｓ二次電子（ＳＥ）検出ならびに混合シグナルＩｎＬｅｎｓ／ＳＥ２（７５／２５％）検出を３〜５ｍｍの作動距離で使用して、２〜３ｋＶで作動させたＺｅｉｓｓ  Ｓｉｇｍａ  ＦＥＳＥＭ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）で実施してもよい。画像は、保存解像度２０４８×１５３６およびライン平均ノイズ低減アルゴリズムを使用して、ＴＩＦＦで撮影してもよい。
【０２２１】
（実施例１５  透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ））
固定：試料を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の０．０６％塩化カルシウムを有する２％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドで、３０分間４℃にて固定してもよい。その後、試料を、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液に入れ、さらなる処理の前に４℃で維持してもよい。
【０２２２】
処理：その後、試料を洗浄し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１．５％フェロシアン化カリウムを有する０．２％四酸化ルテニウム（脂質二重層の視覚化用）または１．５％四酸化オスミウムのいずれかに入れて、室温にて４５分間暗所に置いてもよい。緩衝液ですすいだ後、試料を、勾配エタノール系列（５０％、７０％、２×１００％；各１０分間）で脱水し、その後低粘度エポキシ樹脂に包埋してもよい。
【０２２３】
視覚化：半薄切片を、１％ホウ砂溶液中の１％アズールＩＩを有する１％トルイジンブルーで染色し、位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で観察してもよい。超薄切片を収集し、水飽和３％酢酸ウラニルで染色してもよく、および／または２．５％クエン酸鉛で、コーティングされていないニッケルグリッドに造影してもよい。超薄切片を、６０ｋＶで作動させたＺｅｉｓｓ  １０Ａ電子顕微鏡で観察してもよい。画像は、ＴＩＦＦで撮影してもよい。
【０２２４】
イオン捕獲細胞化学（Ｃａ＋＋勾配）：
【０２２５】
固定：超微細なＣａ＋＋局在化の場合、試料を、０．０４Ｍスクロースを含有する、２％パラホルムアルデヒド、２％グルタルアルデヒド、０．０９Ｍシュウ酸カリウムで固定してもよい。その後、試料を４℃で一晩固定してもよい
【０２２６】
処理：試料を、２％ピロアンチモン酸カリウムを含有する１％四酸化オスミウム、ｐＨ７．４で、４℃にて２時間暗所で後固定してもよい。その後、組織試料を、アルカリ化された水（ｐＨ１０）で洗浄し、脱水のためにエタノール溶液（５０％、７０％、２×１００％；各１０分間）に移し、低粘度エポキシ樹脂に包埋してもよい。
【０２２７】
視覚化：超薄切片を収集し、水飽和３％酢酸ウラニルで染色してもよく、および／または２．５％クエン酸鉛で、コーティングされていないニッケルグリッドに造影してもよい。超薄切片を、６０ｋＶで作動させたＺｅｉｓｓ  １０Ａ電子顕微鏡で観察してもよい。画像は、ＴＩＦＦで撮影してもよい。
【０２２８】
ランタン灌流：
【０２２９】
固定：灌流経路は、すべての被験体で、２％グルタルアルデヒド、１％パラホルムアルデヒドを含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４中の４％硝酸ランタンに試料を室温で１時間浸漬することより評価した。
【０２３０】
処理：試料を洗浄し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の１．５％フェロシアン化カリウムを有する１．５％四酸化オスミウムに入れて、室温にて４５分間暗所に置いてもよい。カコジル酸緩衝液ですすいだ後、試料を、勾配エタノール系列（５０％、７０％、２×１００％；各１０分間）で脱水し、その後低粘度エポキシ樹脂に包埋してもよい。
【０２３１】
視覚化：超薄切片を収集し、水飽和３％酢酸ウラニルで染色してもよく、および／または２．５％クエン酸鉛で、コーティングされていないニッケルグリッドに造影してもよい。超薄切片を、６０ｋＶで作動させたＺｅｉｓｓ  １０Ａ電子顕微鏡で観察してもよい。画像は、ＴＩＦＦで撮影してもよい。
【０２３２】
一部の実施形態が本明細書に図示および記載されているが、そのような実施形態は、例示のために提供されているに過ぎない。今や、当業者であれば、本明細書で提供されている開示から逸脱せずに、多数の変異、変更、および置換をなすことができることを理解するだろう。本明細書に記載されている実施形態の種々の代替を使用することができることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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