(57)【要約】ＤＮＡポリメラーゼ、核酸、及びプライミングした鋳型核酸の鋳型塩基に相補的なヌクレオチドを含む、ヌクレオチド特異的三元複合体の形成を検出するための方法及びシステムを提供する。本方法及びシステムにより、ヌクレオチドのプライマーへの化学的組み込みを必要とせずに、後続の正しいヌクレオチドを決定することが容易になる。これは、利点として、シグナル対ノイズ比を向上させ、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇプロトコールで得られる結果の質を高め、読取り長の延長を可能にする。これらの結果は、非標識天然ヌクレオチドを使用する手順においてさえ達成することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験ヌクレオチドが、プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む後続の正しいヌクレオチドであるかどうかの判定方法であって：
（ａ）前記プライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；
（ｂ）工程（ａ）の前記プライミングした鋳型核酸を、前記ＤＮＡポリメラーゼ及び前記被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；
（ｃ）各工程（ａ）及び（ｂ）間の１つ以上の時点において、それぞれ、前記プライマー内への前記被験ヌクレオチドの化学的組み込みを伴わずに、前記第１及び第２の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼへの前記プライミングした鋳型核酸の結合を測定し；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）での前記結合の測定結果を用いて、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを判定する工程を含む、前記判定方法。
【請求項２】
前記被験ヌクレオチドが、付加された蛍光標識を含まない天然ヌクレオチドであり、工程（ｃ）が、前記被験ヌクレオチドへの前記ＤＮＡポリメラーゼの結合の結果として光学特性を変化させる立体構造感受性色素からの蛍光または吸光シグナル間の差異を測定することを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の反応混合物が前記被験ヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｅ）ホスホジエステル結合の形成によって、前記プライミングした鋳型核酸の前記プライマーに前記被験ヌクレオチドを化学的に組み込む工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）〜（ｅ）を少なくとも５０回繰り返す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｆ）前記被験ヌクレオチドの代わりに第２の被験ヌクレオチドを用いて前記工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程をさらに含み、前記被験ヌクレオチド及び前記第２の被験ヌクレオチドが互いに異なっている、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ｅ）前記第２の反応混合物を、可逆的ターミネーター部分を有する可逆的ターミネーターヌクレオチドと、前記第２の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼとを含む第３の反応混合物で置換する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
（ｆ）ホスホジエステル結合の形成によって、前記可逆的ターミネーターヌクレオチドを前記プライマーに組み込む工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｇ）前記プライマーに組み込まれた前記可逆的ターミネーターヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター部分を除去する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）〜（ｇ）を少なくとも５０回繰り返すことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライミングした鋳型核酸を固体支持体に固定化し、工程（ｂ）が、前記第１の反応混合物を含む容器から前記第２の反応混合物を含む異なる容器に前記固体支持体を移動させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライミングした鋳型核酸を固体支持体に固定化し、各工程（ａ）及び（ｂ）が、前記プライミングした鋳型核酸上に反応混合物を流すことを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）が、各工程（ａ）及び（ｂ）間に、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を連続的に測定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）が、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次に、前記測定した光シグナル間の差異を計算して、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が、工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）が、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次に、前記測定した光シグナル間の比を計算して、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が、工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）が、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次に、前記測定した光シグナルの時間依存変化率を計算して、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が、工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験ヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される天然ヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験ヌクレオチドが、外因性蛍光標識を含まない、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験ヌクレオチドが、外因性標識を含まない非標識被験ヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験ヌクレオチドがヌクレオチド類似体である、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド類似体が、可逆的ターミネーター部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記可逆的ターミネーター部分を有する前記ヌクレオチド類似体が、蛍光標識をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライミングした鋳型核酸を表面に固定化し、工程（ｃ）が、屈折率の変化を測定して、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）が、インターフェロメトリーまたは表面プラズモン共鳴検出による屈折率の変化を測定することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼが、添加した蛍光標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドに結合した後に特性を変化させる添加した蛍光標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドに結合した後に特性を変化させる添加した蛍光標識を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記プライミングした鋳型核酸を表面に固定化し、工程（ｃ）が、屈折率の変化を測定し、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の反応混合物が、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドである場合に最大限の三元複合体形成を達成するために必要とされる濃度よりも低い濃度で前記被験ヌクレオチドをさらに含み、前記第２の反応混合物が、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドである場合に最大限の三元複合体形成を達成するのに十分な濃度で前記被験ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）が、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回る場合に、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドであると判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む、後続の正しいヌクレオチドの同定方法であって：
（ａ）前記プライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；
（ｂ）工程（ａ）の前記プライミングした鋳型核酸を、前記ＤＮＡポリメラーゼ、及び第１の被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；
（ｃ）工程（ｂ）の前記プライミングした鋳型核酸を、前記ＤＮＡポリメラーゼ、前記第１の被験ヌクレオチド、及び第２の被験ヌクレオチドを含有する第３の反応混合物と接触させ；
（ｄ）工程（ｃ）の前記プライミングした鋳型核酸を、前記ＤＮＡポリメラーゼ、前記第１の被験ヌクレオチド、前記第２の被験ヌクレオチド、及び第３の被験ヌクレオチドを含有する第４の反応混合物と接触させ；
（ｅ）工程（ｄ）の前記プライミングした鋳型核酸を、前記ＤＮＡポリメラーゼ、前記第１の被験ヌクレオチド、前記第２の被験ヌクレオチド、前記第３の被験ヌクレオチド、及び第４の被験ヌクレオチドを含有する第５の反応混合物と接触させ；
（ｆ）前記第１の被験ヌクレオチドの前記プライマーへの化学的組み込みを伴わずに、各工程（ａ）〜（ｅ）間の１つ以上の時点において、前記ＤＮＡポリメラーゼへの前記プライミングした鋳型核酸の結合を測定し；
（ｇ）前記後続の正しいヌクレオチドを：
（ｉ）工程（ｂ）での前記結合の測定結果が工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回る場合、前記第１の被験ヌクレオチドとして、または
（ｉｉ）工程（ｃ）での前記結合の測定結果が工程（ｂ）での前記結合の測定結果を上回る場合、前記第２の被験ヌクレオチドとして、または
（ｉｉｉ）工程（ｄ）での前記結合の測定結果が工程（ｃ）での前記結合の測定結果を上回る場合、前記第３の被験ヌクレオチドとして、または
（ｉｖ）工程（ｅ）での前記結合の測定結果が工程（ｄ）での前記結合の測定結果を上回る場合、前記第４の被験ヌクレオチドとして同定する工程を含む、前記同定方法。
【請求項３３】
工程（ｆ）の後に、（ｈ）ホスホジエステル結合形成により、前記後続の正しいヌクレオチドを前記プライマーに化学的に組み込む工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記各被験ヌクレオチドが他の被験ヌクレオチドと異なっており、前記各被験ヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記各被験ヌクレオチドが他の被験ヌクレオチドと異なっており、前記各被験ヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる群から選択される天然ヌクレオチドである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記各被験ヌクレオチドが他の被験ヌクレオチドと異なっており、前記被験ヌクレオチドがいずれも外因性蛍光標識を含まない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記各被験ヌクレオチドが他の被験ヌクレオチドと異なっており、前記各被験ヌクレオチドが可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記プライマーに組み込まれた前記後続の正しいヌクレオチドが、可逆的ターミネーター部分を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記プライマーに組み込まれた前記後続の正しいヌクレオチドが、可逆的ターミネーター部分を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験ヌクレオチドのいずれも可逆的ターミネーター部分を有さず、工程（ｆ）と工程（ｈ）との間に、（ｉ）前記プライミングした鋳型核酸に結合した任意の被験ヌクレオチドを除去し、次いで可逆的ターミネーター部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを添加する工程が存在する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ａ）〜（ｅ）で使用する前記ポリメラーゼが、工程（ｈ）で使用する前記ポリメラーゼと異なる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
被験ヌクレオチドが、プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む後続の正しいヌクレオチドであるかどうかの判定方法であって：
（ａ）前記プライミングした鋳型核酸を、第１のＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；
（ｂ）工程（ａ）の前記プライミングした鋳型核酸を、第２のＤＮＡポリメラーゼ及び前記被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ、ここで、前記第２のＤＮＡポリメラーゼは、前記第１のＤＮＡポリメラーゼにはない標識を有し、
（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）間の１つ以上の時点において、それぞれ、前記プライマーへの前記被験ヌクレオチドの化学的組み込みを伴わずに、前記プライミングした鋳型核酸を含む複合体中に存在する前記標識を検出することによって、前記プライミングした鋳型核酸の前記第２のＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定し；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）での前記結合の測定結果を用いて、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを判定する工程を含む、前記判定方法。
【請求項４３】
前記第１及び第２のＤＮＡポリメラーゼの前記アミノ酸配列が同一である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
各工程（ａ）及び（ｂ）を、三元複合体の形成を安定化させ、二元複合体の形成を不安定化する緩衝条件下で行う、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
各工程（ａ）及び（ｂ）を、高塩濃度緩衝条件下で行う、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のＤＮＡポリメラーゼが、外因性の検出可能な標識を含まない、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
各回において異なる被験ヌクレオチドを用いて、各工程（ａ）〜（ｃ）を３回繰り返すことをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記第２のＤＮＡポリメラーゼの前記標識が蛍光標識である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記工程（ｃ）が、同族ヌクレオチドへの前記第２のＤＮＡポリメラーゼの結合の結果として光学特性を変化させる立体構造感受性色素からの蛍光シグナルの測定を含まない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験ヌクレオチド及び前記プライミングした鋳型核酸に結合した任意のポリメラーゼを除去することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記プライミングした鋳型核酸を、第３のＤＮＡポリメラーゼ及び可逆的ターミネーターヌクレオチドを含有する第３の反応混合物と接触させ、次いで前記第３のＤＮＡポリメラーゼを用いて前記可逆的ターミネーターヌクレオチドを前記プライマーに組み込み、可逆末端プライマーを生成することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
各工程（ａ）〜（ｃ）において前記可逆末端プライマーを含む前記プライミングした鋳型核酸を用いて、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
プライミングした鋳型核酸分子中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を有するヌクレオチドの組み込み方法であって：
（ａ）前記プライミングした鋳型核酸分子を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；
（ｂ）第１の被験ヌクレオチドを前記プライマーに組み込ませずに、工程（ａ）の前記プライミングした鋳型核酸分子を、前記ＤＮＡポリメラーゼ及び第１の被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；
（ｃ）各工程（ａ）及び（ｂ）間の１つ以上の時点において、第１の被験ヌクレオチドを前記プライマーに化学的に組み込ませずに、前記プライミングした鋳型核酸分子の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定し、工程（ｂ）において三元複合体が形成されたかどうかを確立し；
（ｄ）以下の２つのオプション、
（ｉ）工程（ｂ）において前記三元複合体が形成されなかったことが工程（ｃ）において確立された場合、次に、工程（ｂ）の前記プライミングした鋳型核酸分子を、前記第１の被験ヌクレオチド及び第２の被験ヌクレオチドと組み合わせて前記ＤＮＡポリメラーゼを含有する第３の反応混合物と接触させ、ここで、前記第２の被験ヌクレオチドは前記第１の被験ヌクレオチドとは異なっており；
（ｉｉ）工程（ｂ）において前記三元複合体が形成されたことが工程（ｃ）において確立された場合、次に、工程（ｂ）の前記プライミングした鋳型核酸分子を前記第３の反応混合物と最初に接触させずに、工程（ｂ）の前記プライミングした鋳型核酸分子を第４の反応混合物と接触させ、組み込み反応を実行して前記プライマーに前記ヌクレオチドを組み込む、
のうちの１つを選択する工程を含む、前記組み込み方法。
【請求項５４】
前記プライミングした鋳型核酸分子を固体支持体に固定化する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第４の反応混合物が、前記第１及び第２の反応混合物の前記ポリメラーゼとは異なるポリメラーゼを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第４の反応混合物が、前記第１及び第２の反応混合物の前記ポリメラーゼとは異なるポリメラーゼを含み、工程（ｄ）（ｉｉ）において前記プライマーに組み込まれる前記ヌクレオチドが可逆的ターミネーター部分を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記プライミングした鋳型核酸分子を固体支持体に固定化し、接触工程（ａ）及び（ｂ）が、それぞれ、前記固体支持体に固定化した前記プライミングした鋳型核酸分子上に前記反応混合物を流すことを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記プライミングした鋳型核酸分子を固体支持体に固定化し、接触工程（ａ）及び（ｂ）が、それぞれ、前記第１の反応混合物を含む容器から前記第２の反応混合物を含む容器へ前記固体支持体を移動させることを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１及び第２の反応混合物のそれぞれが、同じ濃度の前記ポリメラーゼを含有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記第４の反応混合物が、前記第１及び第２の反応混合物の前記ポリメラーゼとは異なるポリメラーゼを含有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
工程（ｃ）が、インターフェロメトリーまたは表面プラズモン共鳴検出のいずれかによって測定することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の被験ヌクレオチドが天然ヌクレオチドである、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の被験ヌクレオチドが、可逆的ターミネーター部分を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
工程（ｄ）（ｉｉ）において組み込まれる前記ヌクレオチドが、天然ヌクレオチド及び可逆的ターミネーターを含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術
本願は、２０１６年４月２２日に出願された米国仮出願第６２／３２６，３５６号の利益を主張する。この先願の開示全体は、その全体を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、一般的に、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は核酸配列決定技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
鋳型核酸鎖の正確な配列決定は、ゲノム解析、分子診断などにおいて多くの重要な用途を見出す。公知の位置での選択肢の中から単一のヌクレオチド塩基を同定することさえ、一塩基多型（すなわち、「ＳＮＰ」）分析の基礎として役立ち得る。公知の核酸配列の短いストレッチの検出は、臨床的または環境的供給源由来の細菌、真菌、及びウイルスの病原体を同定するために使用されてきた。公知の核酸配列における遺伝的または後天的遺伝子変異体（例えば、変化または変異）を検出することは、例えば特定の薬物療法への感受性の変化に関する重要な情報を提供する。最終的に、ゲノム規模での配列決定は、１つ以上の連続した配列に組み立てることができる数百万のヌクレオチドの正確な同定に依存する。これらの事例の各々は、鋳型核酸鎖に沿った異なる位置での、一度に１個ずつの個々のヌクレオチドの正確な同定に決定的に依存する。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトは、従来の蛍光サンガー法でのジデオキシリボヌクレオチド配列決定技術を用いて完全に達成された。その時以来、後続技術は、ゲノム解析を日常的な臨床及び産業上の実験応用に統合することを意図して、ポリヌクレオチド配列情報の取得手順を単純化してきた。
【０００５】
別の核酸配列決定プラットフォームとして、ハイブリダイゼーションによる配列決定、及びｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法が挙げられる。第１の例では、検出可能に標識したＤＮＡ鎖を、固体支持体に固定化した最大で数千の規定のプローブ配列のアレイに、ハイブリダイズする条件下で接触させる。この手順で形成した短鎖二本鎖を、連続した配列へ組み立てるためにコンピュータで検出及び解析することができる。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法の手順は様々な形態をとってきたが、同時に効果的でもあった。標識ヌクレオチドの付加、検出、及びその後の化学的処理の化学における自動化及び改良は、生の配列情報の取得手順に革命をもたらした。いくつかの場合には、核酸配列の比較的短いストレッチのみを決定するが、大規模に並列処理することにより、ゲノム規模の核酸配列を推定するために必要な情報がもたらされる。
【０００６】
一般的に述べると、異なるシーケンシングプラットフォーム間で、配列決定読取り長を延長するとともに、塩基読み上げ精度を向上させる必要がある。本発明は、この必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本開示は、被験ヌクレオチドが、プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを決定する方法に関する。本方法は：（ａ）プライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；（ｂ）工程（ａ）のプライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ及び被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；（ｃ）各工程（ａ）及び（ｂ）間の１つ以上の時点において、被験ヌクレオチドのプライマー内への化学的組み込みを伴わずに、それぞれ、第１及び第２の反応混合物のＤＮＡポリメラーゼへの、プライミングした鋳型核酸の結合を測定し；（ｄ）工程（ｃ）での結合の測定結果を用いて、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを決定する工程を含む。一般的に好ましい一実施形態によれば、被験ヌクレオチドは、添加した蛍光標識を含まない天然ヌクレオチドであり得、工程（ｃ）は、被験ヌクレオチドへのＤＮＡポリメラーゼの結合の結果として光学特性を変化させる立体構造感受性色素からの蛍光シグナルまたは吸光シグナルの差異を測定することを含まない。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１の反応混合物は被験ヌクレオチドを含まない。好ましくは、本方法は、（ｅ）ホスホジエステル結合の形成によりプライミングした鋳型核酸のプライマー内に被験ヌクレオチドを化学的に組み込む工程をさらに含む。より好ましくは、本方法は、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返すことをさらに含む。例えば、工程（ａ）〜（ｅ）を少なくとも５０回繰り返すことができる。あるいは、本方法は、（ｆ）被験ヌクレオチドの代わりに第２の被験ヌクレオチドを用いて工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程を含むことができ、ここで、被験ヌクレオチドと第２の被験ヌクレオチドは互いに異なっている。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、本方法は、（ｅ）第２の反応混合物を、可逆的ターミネーター部分を有する可逆的ターミネーターヌクレオチド、及び第２の反応混合物のＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼを含有する第３の反応混合物で置換する工程を含む。より好ましくは、本方法は、（ｆ）ホスホジエステル結合の形成によって可逆的ターミネーターヌクレオチドをプライマーに組み込む工程をさらに含む。さらにより好ましくは、本方法は、（ｇ）プライマーに組み込まれた可逆的ターミネーターヌクレオチドから可逆的ターミネーター部分を除去する工程をさらに含む。さらにより好ましくは、本方法は、工程（ａ）〜（ｇ）を少なくとも５０回繰り返すことを含む。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、プライミングした鋳型核酸を固体支持体に固定化することができ、工程（ｂ）は、第１の反応混合物を含む容器から第２の反応混合物を含む別の容器へ固体支持体を移動させることを含み得る。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、プライミングした鋳型核酸を固体支持体に固定化することができ、工程（ａ）及び（ｂ）のそれぞれは、工程（ａ）及び（ｂ）の各々は、プライミングした鋳型核酸の上に反応混合物を流す工程を含み得る。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、工程（ｃ）は、各工程（ａ）及び（ｂ）の間に、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を連続的に測定することを含み得る。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、工程（ｃ）は、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次いで、測定した光シグナル間の差異を計算し、工程（ｂ）での結合の測定結果が、工程（ａ）での結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含み得る。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、工程（ｃ）は、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次いで、測定した光シグナルの比を計算し、工程（ｂ）での結合の測定結果が、工程（ａ）での結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、工程（ｃ）は、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次いで、測定した光シグナルの時間依存変化率を計算し、工程（ｂ）での結合の測定結果が工程（ａ）での結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、被験ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される天然ヌクレオチドであり得る。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、被験ヌクレオチドは外因性蛍光標識を含まない。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、被験ヌクレオチドは、外因性標識を含まない非標識被験ヌクレオチドであり得る。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、被験ヌクレオチドはヌクレオチド類似体である。より好ましくは、ヌクレオチド類似体は、可逆的ターミネーター部分を有する。さらにより好ましくは、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体は、蛍光標識をさらに含む。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まない他の実施形態では、プライミングした鋳型核酸を表面に固定化し、工程（ｃ）は、屈折率の変化を測定し、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定することを含む。より好ましくは、工程（ｃ）は、インターフェロメトリーまたは表面プラズモン共鳴検出による屈折率の変化を測定することを含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１の反応混合物のＤＮＡポリメラーゼは、添加した蛍光標識を含まない。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１の反応混合物のＤＮＡポリメラーゼには、ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドに結合した後に特性を変える蛍光標識を添加しない。第１の反応混合物が被験ヌクレオチドを含まず、被験ヌクレオチドが、外因性標識を含まない非標識被験ヌクレオチドであり得る他の実施形態では、第１の反応混合物のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドに結合した後に特性を変化させる添加した蛍光標識を含まないことが可能である。より好ましくは、プライミングした鋳型核酸を表面に固定化し、工程（ｃ）は、屈折率の変化を測定し、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定することを含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１の反応混合物は、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである場合に最大限の三元複合体形成を達成するのに必要な濃度より低い濃度で被験ヌクレオチドをさらに含み、第２の反応混合物は、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである場合に最大限の三元複合体形成を達成するのに十分な濃度で被験ヌクレオチドを含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、工程（ｄ）は、工程（ｂ）での結合の測定結果が工程（ａ）での結合の測定結果を上回る場合、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドであると判定することを含む。
【０００８】
別の態様では、本開示は、プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む後続の正しいヌクレオチドの同定方法に関する。本方法は：（ａ）プライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；（ｂ）工程（ａ）のプライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ及び第１の被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；（ｃ）工程（ｂ）のプライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の被験ヌクレオチド、及び第２の被験ヌクレオチドを含有する第３の反応混合物と接触させ；（ｄ）工程（ｃ）のプライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の被験ヌクレオチド、第２の被験ヌクレオチド、及び第３の被験ヌクレオチドを含有する第４の反応混合物と接触させ；（ｅ）工程（ｄ）のプライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、第１の被験ヌクレオチド、第２の被験ヌクレオチド、第３の被験ヌクレオチド、及び第４の被験ヌクレオチドを含有する第５の反応混合物と接触させ；（ｆ）第１の被験ヌクレオチドのプライマーへの化学的組み込みを伴わずに、各工程（ａ）〜（ｅ）間の１つ以上の時点において、プライミングした鋳型核酸のＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定し；（ｇ）後続ヌクレオチドを：（ｉ）工程（ｂ）での結合の測定結果が、工程（ａ）での結合の測定結果を上回る場合には、第１の被験ヌクレオチドとして、または（ｉｉ）工程（ｃ）での結合の測定結果が、工程（ｂ）での結合の測定結果を上回る場合には、第２の被験ヌクレオチドとして、または（ｉｉｉ）工程（ｄ）での結合の測定結果が、工程（ｃ）での結合の測定結果を上回る場合には、第３の被験ヌクレオチドとして、または（ｉｖ）工程（ｅ）での結合の測定結果が、工程（ｄ）での結合の測定結果を上回る場合には、第４の被験ヌクレオチドとして同定する工程を含む。一般的に好ましい一実施形態によれば、本方法は、工程（ｆ）の後に、（ｈ）ホスホジエステル結合形成によってプライマーに後続の正しいヌクレオチドを化学的に組み込む工程をさらに含む。より好ましくは、各被験ヌクレオチドは他の被験ヌクレオチドと異なっており、各被験ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される。あるいは、各被験ヌクレオチドは他の被験ヌクレオチドと異なっており、各被験ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる群から選択される天然ヌクレオチドである。あるいは、各被験ヌクレオチドは他の被験ヌクレオチドと異なっており、いずれの被験ヌクレオチドも外因性蛍光標識を含まない。あるいは、各被験ヌクレオチドは他の被験ヌクレオチドと異なっており、各被験ヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体である。あるいは、プライマーに組み込まれる後続の正しいヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分を有する。好ましくは、プライマーに組み込まれる後続の正しいヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分を有する。別の一般的に好ましい実施形態によれば、本方法が、工程（ｆ）の後に、（ｈ）ホスホジエステル結合形成によってプライマーに後続の正しいヌクレオチドを化学的に組み込む工程をさらに含む場合、いずれの被験ヌクレオチドも可逆的ターミネーター部分を有さず、工程（ｆ）と工程（ｈ）との間に、（ｉ）プライミングした鋳型核酸に結合した任意の被験ヌクレオチドを除去し、次いで可逆的ターミネーター部分を有する少なくとも１つのヌクレオチドを添加する工程が存在する。別の一般的に好ましい実施形態によれば、本方法が、工程（ｆ）の後に、（ｈ）ホスホジエステル結合形成によってプライマーに後続の正しいヌクレオチドを化学的に組み込む工程をさらに含む場合、工程（ａ）〜（ｅ）で使用するポリメラーゼは、工程（ｈ）で使用するポリメラーゼと異なり得る。
【０００９】
別の態様では、本開示は、被験ヌクレオチドが、プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを判定する方法に関する。本方法は：（ａ）プライミングした鋳型核酸を、第１のＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；（ｂ）工程（ａ）のプライミングした鋳型核酸を、第２のＤＮＡポリメラーゼ及び被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させることであって、第２のＤＮＡポリメラーゼは、第１のＤＮＡポリメラーゼには存在しない標識を有し；（ｃ）工程（ａ）及び工程（ｂ）間の１つ以上の時点において、それぞれ被験ヌクレオチドのプライマーへの化学的組み込みを伴わずに、プライミングした鋳型核酸を含む複合体中に存在する標識を検出することによって、プライミングした鋳型核酸の第２のＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定し；（ｄ）工程（ｃ）での結合の測定結果を用いて、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを判定する工程を含む。一般的に好ましい一実施形態によれば、第１及び第２のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は同一であり得る。別の一般的に好ましい実施形態によれば、各工程（ａ）及び（ｂ）は、三元複合体の形成を安定化させ、二元複合体の形成を不安定化する緩衝条件下で生じる。好ましくは、各工程（ａ）及び（ｂ）は、高塩濃度緩衝条件下で生じる。さらにより好ましくは、第１のＤＮＡポリメラーゼは、外因性の検出可能な標識を含まない。別の一般的に好ましい実施形態によれば、本方法は、各工程（ａ）〜（ｃ）を、各回において異なる被験ヌクレオチドを用いて３回繰り返すことをさらに含む。好ましくは、第２のＤＮＡポリメラーゼの標識は蛍光標識である。より好ましくは、工程（ｃ）は、同族ヌクレオチドへの第２のＤＮＡポリメラーゼの結合の結果として光学特性を変化させる立体構造感受性色素からの蛍光シグナルの測定を含まない。別の一般的に好ましい実施形態によれば、本方法は、被験ヌクレオチド及びプライミングした鋳型核酸に結合した任意のポリメラーゼを除去することをさらに含む。好ましくは、プライミングした鋳型核酸を、第３のＤＮＡポリメラーゼ及び可逆的ターミネーターヌクレオチドを含有する第３の反応混合物と接触させ、次いで第３のＤＮＡポリメラーゼを用いて可逆的ターミネーターヌクレオチドをプライマーに組み込むことにより、可逆的末端プライマーを生成するさらなる工程が存在する。より好ましくは、本方法は、可逆的末端プライマーを含むプライミングした鋳型核酸を各工程（ａ）〜（ｃ）で用いて、工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本開示は、プライミングした鋳型核酸分子中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を有するヌクレオチドを組み込む方法に関する。本方法は：（ａ）プライミングした鋳型核酸分子を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ；（ｂ）第１の被験ヌクレオチドのプライマーへの組み込みを伴わずに、工程（ａ）のプライミングした鋳型核酸分子を、ＤＮＡポリメラーゼ及び第１の被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；（ｃ）各工程（ａ）及び（ｂ）間の１つ以上の時点において、第１の被験ヌクレオチドのプライマーへの化学的組み込みを伴わずに、プライミングした鋳型核酸分子のＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定して工程（ｂ）において三元複合体が形成されたかどうかを確立し；（ｄ）以下の２つのオプションのうちのいずれか１つを選択する工程を含む：（ｉ）工程（ｂ）において三元複合体が形成されなかったことが工程（ｃ）において確立された場合、次に、工程（ｂ）のプライミングした鋳型核酸分子を、第１の被験ヌクレオチド及び第２の被験ヌクレオチドと組み合わせてＤＮＡポリメラーゼを含有する第３の反応混合物と接触させ、ここで、第２の被験ヌクレオチドは第１の被験ヌクレオチドとは異なっており；（ｉｉ）工程（ｂ）において三元複合体が形成されたことが工程（ｃ）において確立された場合、次に、工程（ｂ）のプライミングした鋳型核酸分子を第３の反応混合物と最初に接触させずに、工程（ｂ）のプライミングした鋳型核酸分子を第４の反応混合物と接触させ、組み込み反応を実行してプライマーにヌクレオチドを組み込む。一般的に好ましい一実施形態によれば、プライミングした鋳型核酸分子を固体支持体に固定化する。好ましくは、第４の反応混合物は、第１及び第２の反応混合物のポリメラーゼとは異なるポリメラーゼを含有する。あるいは、第４の反応混合物は、第１及び第２の反応混合物のポリメラーゼとは異なるポリメラーゼを含有し、工程（ｄ）（ｉｉ）においてプライマーに組み込まれるヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分を有する。別の一般的に好ましい実施形態によれば、プライミングした鋳型核酸分子を固体支持体に固定し、接触工程（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、固体支持体に固定化したプライミングした鋳型核酸分子上に反応混合物を流すことを含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、プライミングした鋳型核酸分子を固体支持体に固定化し、接触工程（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ、第１の反応混合物を含む容器から第２の反応混合物を含む容器へ固体支持体を移動させることを含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１及び第２の反応混合物はそれぞれ、同じ濃度のポリメラーゼを含有する。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第４の反応混合物は、第１及び第２の反応混合物のポリメラーゼとは異なるポリメラーゼを含有する。別の一般的に好ましい実施形態によれば、工程（ｃ）は、インターフェロメトリーまたは表面プラズモン共鳴検出のいずれかによる測定を含む。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１の被験ヌクレオチドは天然ヌクレオチドである。別の一般的に好ましい実施形態によれば、第１の被験ヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分を有する。別の一般的に好ましい実施形態によれば、工程（ｄ）（ｉｉ）において組み込まれるヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、及び可逆的ターミネーターを有するヌクレオチドのいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】照合したｄＮＴＰ同一性（水平軸）の関数として測定した結合シグナル（垂直軸）を示す一連の棒グラフを示す。この図は、二元複合体形成に対する測定シグナル（すなわち、非同族ヌクレオチドの存在を示す）が安定したままである一方で、三元複合体形成に対する測定シグナル（すなわち、同族ヌクレオチドの存在を示す）が減少傾向にあることを示す。白抜きのバーは正しい陽性判定に関連するシグナルを示し、一方、点描のバーは正しい陰性判定に関連するシグナルを示す。暗い対角線の塗りつぶしは、偽陽性の塩基読み上げ（Ｔ）を示し、明るい対角線の塗りつぶしは、偽陰性の塩基読み上げ（Ｃが欠落）を示す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、時間（水平軸）の関数としての結合活性（垂直軸）を示すグラフ図である。図２Ａに示す区分は、各々の全サイクルに対する４つのパート：結合、組み込み、クエンチ、及び再生を示す。図２Ｂは、時間（水平軸）の関数としての結合活性（垂直軸）を示すグラフ図である。ポリメラーゼ及び第１の（低）濃度のヌクレオチドと接触させることを含む二相性結合手順に起因する追加の第１（すなわち、初期）パートを含む、各々の全サイクルに対する５つのパートを示す。サイクル番号２、４、８、１０、１２、１６、及び２０に示す白抜きの矢印は、正しい塩基判定を示す。サイクル６、１４、及び１８に示す黒塗りの矢印は不正確な塩基判定を示す。両方のグラフ図において、「サイクル番号」は、プライミングした鋳型核酸と示したヌクレオチドとを接触させる独立した工程を識別させる。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法における照合したｄＮＴＰ同一性（横軸）の関数として測定した結合シグナル（垂直軸）をグラフで示した棒グラフを示す。図３Ａは、単相検査工程のみを用いた標準的なｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順を用いて得られた結果を示す。より強いシグナルは三元複合体形成を示し、一方、より弱いシグナルは二元複合体形成と関連していた。図３Ｂは、プライミングした鋳型核酸をポリメラーゼ及びヌクレオチドと２つのフェイズで結合させるための二相性プロトコールを用いて得られた結果を示す。白抜きのバーは正しい陽性判定に関連するシグナルを示し、一方、点描のバーは正しい陰性判定に関連するシグナルを示す。図３Ａでは、１つの偽陽性判定（暗い対角線の塗りつぶし）と１つの偽陰性判定（明るい対角線の塗りつぶし）を矢印で示す。
【図４】図４は、測定した結合シグナル（縦軸）を進行パラメータ（横軸）の関数として示すグラフ図である。プロット上部に、１２種類の進行間隔の継続時間（秒単位で測定）を示す。第１及び第２の進行間隔は、それぞれプライマー／鋳型の充填及び洗浄工程を表す。第３の進行間隔は、二相性プロトコールの第１段階に対応する（すなわち、プライミングした鋳型核酸は、添加したヌクレオチドの非存在下でポリメラーゼと相互作用する）。各々２０秒間持続する進行間隔４〜７は、二相プロトコールの第２段階に対応する（すなわち、プライミングした鋳型核酸は、添加したヌクレオチドの存在下でポリメラーゼと相互作用する）。進行間隔４〜７の間に存在するヌクレオチド（複数可）は、それぞれ：ｄＴＴＰ；ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰ；ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＣＴＰ；ならびにｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰであった。この組み合わせで使用する第３のヌクレオチドは、三元複合体形成を促進し、同族ヌクレオチド（ｄＣＴＰ）に対応していた。進行間隔８はＥＤＴＡ洗浄工程であった。進行間隔９〜１０は、それぞれ、組み込み前の再生洗浄工程、及び組み込み工程であった。進行間隔１１〜１２は、ＥＤＴＡ洗浄、及び後続の試験前の再生洗浄であった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
プライミングした鋳型核酸分子、ポリメラーゼ、及びプライマーのすぐ下流にあり、プライミングした鋳型核酸の鋳型鎖に相補的な後続の正しいヌクレオチドを含む三元複合体を検出するための技術を開示する。ポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸との間の相互作用により、ヌクレオチド非依存的な二元複合体の形成が促進されるにもかかわらず、明確かつ明白な検出が達成されている。本アプローチは、ヌクレオチドの非存在下でさえも、プライミングした鋳型核酸上で非特異的な二元複合体を飽和させることができるという本明細書に開示する観察に従うものである。対照的に、ヌクレオチド特異的な三元複合体形成は用量依存的な結合を示し、二元複合体形成に関与する分子に加えてポリメラーゼ分子を動員する。特定の動作理論に拘泥することを望まないが、ヌクレオチド特異的三元複合体及び非特異的二元複合体の形成は、ポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸分子との間の異なる相互作用が関与している可能性がある。三元複合体形成を導く特異的相互作用のみが、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法における後続の正しいヌクレオチドに関して、有益である。
【００１３】
三元複合体形成の検出を増強するための技術は、試験する候補ヌクレオチドの存在または量によって異なる結合条件下で、プライミングした鋳型核酸とのポリメラーゼの相互作用を比較することを含む。例えば、ポリメラーゼ濃度を実質的に一定に維持する一方で、被験ヌクレオチド（例えば、天然のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰもしくはｄＴＴＰ；またはヌクレオチド類似体）を、２つの異なる濃度で存在させることができる。２つの被験ヌクレオチド濃度は、互いに対して相対的に低く、及び高くする（すなわち、被験ヌクレオチドを両方の条件下に含める）ことができる。あるいは、すべての場合においてポリメラーゼ濃度を実質的に一定に維持する一方で、２つの異なる結合条件に、被験ヌクレオチドの存在及び非存在（すなわち、ゼロ濃度）を含めてもよい。
【００１４】
利点として、本技術は、天然（例えば、非標識）ヌクレオチド、検出可能な標識（例えば、蛍光または他の光学的に検出可能な標識）を有するヌクレオチド、または標識もしくは非標識ヌクレオチド類似体（例えば、可逆的ターミネーター部分を有する修飾ヌクレオチド）を含む、様々なタイプのヌクレオチドを用いて実行することができる。さらに、本技術は、調節された反応条件、明確な配列決定、長い読取り長、試薬の全体的なコスト低減、及び機器コストの低減を提供する。
【００１５】
開示する技術は、任意の手段及び任意の理由で、プライミングした鋳型核酸の後続塩基の同一性を決定するために使用する結合反応に適用することができる。本技術を用いて、ＤＮＡポリメラーゼと、プライミングした鋳型核酸に相補的な後続の正しいヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）との特異的結合をモニタリングし、特異的結合を非特異的結合と区別することができる。本技術は、単一ヌクレオチドの決定（例えば、ＳＮＰ決定）、あるいは、一度に１つのヌクレオチドを同定するサイクルを反復的に用いる、より広範な核酸配列決定手順に適用し得る。例えば、本明細書において提供する方法は、シリアル番号１４／８０５，３８１（米国特許出願公開第２０１７／００２２５５３Ａ１号として公開されている）で識別される同一出願人の米国特許出願に記載されているように、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順に関連して使用することができ、その開示は、その全体を参照として本明細書に援用する。
【００１６】
定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。明確にするために、以下の特定の用語は特定の意味を有するものとする。他の用語は、本明細書中の他の節で定義する。
【００１７】
単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。明細書及び請求項において使用する同様の単語を用いて量的な表現を修飾してもよく、それは関連する基本的な機能に変化を生じさせることなく許容可能に変化させ得るものである。したがって、「約」などの用語によって修飾された値は、指定する正確な値に限定されない。他に指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分の量、分子量、反応条件などの特性を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解すべきである。したがって、これに反する示唆がなされない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、本開示の組成物、装置、または方法によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告する有効数字の数を考慮し、通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、「ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法」とは、プライミングした鋳型核酸分子（例えば、ブロックしたプライミングした鋳型核酸分子）に対するポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドの特異的結合を、プライミングした鋳型核酸分子のプライマー鎖に組み込まれる後続の正しいヌクレオチドを同定するために用いる配列決定技術を指す。特異的結合相互作用は、プライマーへのヌクレオチドの化学的組み込みをもたらす必要はない。いくつかの実施形態では、特異的結合相互作用は、プライマー鎖へのヌクレオチドの化学的組み込みに先行することができるか、またはプライマーへの類似した後続の正しいヌクレオチドの化学的組み込みに先行することができる。したがって、後続の正しいヌクレオチドの検出は、後続の正しいヌクレオチドの組み込みを伴わずに起こり得る。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または文法上の均等物は、共有結合によって互いに連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。したがって、「核酸」は、核酸合成中に重合酵素が作用し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせなどのポリヌクレオチドである。用語「核酸」には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの類似体（誘導体）が含まれる。二本鎖核酸は、核酸合成を妨害し得る二次構造を最小限にすることができるという利点がある。二本鎖核酸は、ニックまたは一本鎖ギャップを有する場合がある。
【００２０】
本明細書中で使用する場合、「鋳型核酸」は、本明細書中に開示する方法または装置を用いて、検出、配列決定、評価または分析する核酸である。
【００２１】
本明細書中で使用する場合、「プライミングした鋳型核酸」（または「プライミングした鋳型核酸分子」）は、プライマーでプライミングした（すなわち、ハイブリダイズさせた）鋳型核酸であり、プライマーは、鋳型核酸の一部に相補的な配列を有する３′末端を有するオリゴヌクレオチドである。プライマーは、場合により遊離の５′末端を有する（例えば、プライマーは非共有結合的に鋳型と会合する）ことができるか、またはプライマーは鋳型と連続的であり得る（例えば、ヘアピン構造を介して）。プライミングした鋳型核酸は、相補的プライマー及びそれが結合している鋳型核酸を含む。プライミングした鋳型核酸分子は、重合反応において伸長可能であるか、あるいは伸長を妨げるブロッキング部分を有することができる。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオチド」は、窒素含有塩基、五炭糖（リボースまたはデオキシリボース）、及び少なくとも１つのリン酸基を含む分子である。本用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、外因性標識または可逆的ターミネーターを含むように修飾されたヌクレオチド、及びヌクレオチド類似体を包含する。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「天然」ヌクレオチドとは、外因性標識（例えば、蛍光色素、または他の標識）またはヌクレオチド類似体を特徴とし得る化学修飾を含まない天然に存在するヌクレオチドを指す。本明細書に記載のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順を実施するうえで有用な天然ヌクレオチドの例として：ｄＡＴＰ（２′−デオキシアデノシン−５′−三リン酸）；ｄＧＴＰ（２′−デオキシグアノシン−５′−三リン酸）；ｄＣＴＰ（２′−デオキシシチジン−５′−三リン酸）；ｄＴＴＰ（２′−デオキシチミジン−５′−三リン酸）；及びｄＵＴＰ（２′−デオキシウリジン−５′−三リン酸）が挙げられる。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオチド類似体」は、天然ヌクレオチドの任意の成分（例えば、窒素含有塩基、五炭糖、またはリン酸基（複数可））を置換、除去及び／または修飾する化学的部分などの１つ以上の修飾を有する。ヌクレオチド類似体は、核酸重合反応においてポリメラーゼによって組み込み可能であっても組み込み不可能であってもよい。場合により、ヌクレオチド類似体の３′−ＯＨ基を、部分によって修飾する。この部分は、ポリメラーゼ伸長の３′可逆的または不可逆的ターミネーターであってもよい。ヌクレオチドの塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、もしくはウラシル、またはその類似体のいずれかであってもよい。場合により、ヌクレオチドは、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、ニトロピロール（３−ニトロピロールを含む）またはニトロインドール（５−ニトロインドールを含む）塩基を有する。ヌクレオチドは、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＧＭＰを含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチドはまた、ＤＮＡポリメラーゼの終結阻害剤であるジデオキシヌクレオチドまたは２′，３′ジデオキシヌクレオチドも含む場合があり、これらはｄｄＮＴＰ（ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＵＴＰ及びｄｄＣＴＰ）と略記される。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「後続の正しいヌクレオチド」（「同族」ヌクレオチドと呼ばれる場合もある）は、後続の鋳型ヌクレオチドの塩基に相補的な塩基を有するヌクレオチドである。後続の正しいヌクレオチドは、後続の鋳型ヌクレオチドを補完するためにプライマーの３′末端でハイブリダイズする。後続の正しいヌクレオチドは、必ずしもそうである必要はないが、プライマーの３′末端に組み込むことができる。例えば、後続の正しいヌクレオチドは、組み込み反応を完了させる三元複合体のメンバーであり得るか、あるいは後続の正しいヌクレオチドは、組み込み反応を触媒しない安定化された三元複合体のメンバーであり得る。後続の鋳型塩基に相補的ではない塩基を有するヌクレオチドは、「不正確な」（または「非同族」）ヌクレオチドと呼ばれる。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、ヌクレオチド類似体に関して使用する場合の「ブロッキング部分」は、核酸重合反応の組み込み工程中にヌクレオチドが第２のヌクレオチドへの共有結合を形成する（例えば、プライマーのヌクレオチドの３′−ＯＨを介して）ことを阻害または防止するヌクレオチドの一部である。「可逆的ターミネーター」ヌクレオチドのブロッキング部分をヌクレオチド類似体から除去して、ヌクレオチドを組み込み可能にすることができる。そのようなブロッキング部分を、本明細書中では「可逆的ターミネーター部分」と呼ぶ。例示的な可逆的ターミネーター部分は、米国特許第７，４２７，６７３号；第７，４１４，１１６号；及び７，０５７，０２６号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６７８及びＷＯ０７／１２３７４４に記載されており；これらの各々は参照として援用する。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「被験ヌクレオチド」は、プライミングした鋳型核酸（またはブロックしたプライミングした鋳型核酸）及びポリメラーゼをさらに含む三元複合体の形成に関与するその能力についての調査の対象となるヌクレオチドである。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「ポリメラーゼ」は、同族ヌクレオチド及びプライミングした鋳型核酸（またはブロックしたプライミングした鋳型核酸）との三元複合体を形成するタンパク質または他の分子の総称であり、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ及びトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一般的には、ポリメラーゼは、ヌクレオチド結合が起こり得る１つ以上の活性部位を有する。場合により、ポリメラーゼは、ヌクレオチド重合の触媒作用が起こり得る１つ以上の活性部位を有する。場合により、ポリメラーゼは、例えば突然変異または化学修飾などの修飾により、ヌクレオチド重合触媒機能が欠如している。あるいは、ポリメラーゼは、その相補的核酸鎖に結合したプライマーの３′末端へのヌクレオチドの重合を触媒し得る。例えば、ポリメラーゼは、ホスホジエステル結合を介してプライマーの３′−ＯＨ基への後続の正しいヌクレオチドの付加を触媒し、それによりヌクレオチドをプライマーに化学的に組み込む。場合により、提供する方法で使用するポリメラーゼは、プロセッシブポリメラーゼである。場合により、提供する方法で使用するポリメラーゼは、ディストリビューティブポリメラーゼである。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「二相性」とは、プライミングした鋳型核酸がポリメラーゼ及び被験ヌクレオチドと接触する２段階プロセスを指す。このプロセスの第１段階は、準飽和レベルのヌクレオチド（複数可）の存在下で、またはヌクレオチドの非存在下で、プライミングした鋳型核酸をポリメラーゼと接触させることを含む。受容体に結合するリガンド（例えば、ポリメラーゼに結合するヌクレオチド）に関して用いる場合、用語「準飽和」とは、平衡状態において少なくとも９０％の受容体がリガンドと結合するようにするために必要な濃度よりも低いリガンド濃度を指す。例えば、準飽和量のヌクレオチドは、少なくとも９０％、９５％、９９％またはそれ以上のポリメラーゼをヌクレオチドに結合させることができる。このプロセスの第２段階は、第１段階で使用した濃度よりも高濃度のヌクレオチド（複数可）の存在下で、第１段階のプライミングした鋳型核酸とポリメラーゼとを接触させることを含み、その高濃度は、反応におけるヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである場合に、最大限の三元複合体の形成を得るのに十分である。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、鋳型、プライマー、またはプライミングした鋳型核酸を「提供する」とは、例えば、反応混合物または反応チャンバーに対して、１つ以上の核酸ポリマーを調製及び送達することを指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、分子結合事象に関して使用する場合の「モニタリング」（または場合により「測定」）とは、２つの分子種間の測定可能な相互作用または結合を検出するプロセスを指す。例えば、モニタリングは、一般的には、手順中の様々な時点で、ポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸（またはブロックしたプライミングした鋳型核酸）との間の測定可能な相互作用を検出することを含み得る。モニタリングは断続的（例えば、周期的）または連続的（例えば、中断することなく）であり得、定量的結果の取得を含み得る。モニタリングは、結合事象中のある期間にわたって複数のシグナルを検出することによって、あるいは結合事象中または結合事象後の単一の時点でシグナル（複数可）を検出することによって実行することができる。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「接触させる」とは、試薬をともに混合する（例えば、固定化した鋳型核酸と、ポリメラーゼを含有する緩衝液、またはポリメラーゼと被験ヌクレオチドの組み合わせのいずれかとを混合する）ことを指し、それによって物理的結合反応または化学反応が起こり得る。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「組み込む」または「化学的に組み込む」とは、核酸及びヌクレオチドに関して用いる場合、ホスホジエステル結合の形成によって同族ヌクレオチドを核酸プライマーに結合させるプロセスを指す。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「二元複合体」とは、ポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸（またはブロックしたプライミングした鋳型核酸）との複合体であり、この複合体は、ヌクレオチド分子、例えば後続の正しいヌクレオチドを含まない。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「三元複合体」とは、ポリメラーゼと、プライミングした鋳型核酸（またはブロックしたプライミングした鋳型核酸）と、プライマーのすぐ下流に位置し、プライミングした鋳型核酸またはブロックしたプライミングした鋳型核酸の鋳型鎖に相補的な後続の正しいヌクレオチドとの間の複合体である。プライミングした鋳型核酸には、例えば、遊離の３′−ＯＨを有するプライマーまたはブロックしたプライマー（例えば、３′末端ヌクレオチドの塩基または糖部分において、酵素的ホスホジエステル結合形成を妨げる化学修飾を有するプライマー）が含まれ得る。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「触媒金属イオン」とは、ポリメラーゼによる、核酸（例えば、プライマー）の３′−ＯＨと、入ってくるヌクレオチドのリン酸との間のホスホジエステル結合形成を促進する金属イオンを指す。「二価触媒金属陽イオン」は、２の原子価を有する触媒金属イオンである。触媒金属イオンは、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、及びプライミングした鋳型核酸間の複合体の形成を安定化させるのに必要な、金属イオンの非触媒濃度と呼ばれる濃度で存在させることができる。金属イオンの触媒濃度とは、核酸（例えば、プライマー）の３′−ＯＨ基と、入ってくるヌクレオチドのリン酸基との間の反応をポリメラーゼが触媒するのに十分な金属イオンの量を指す。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「非触媒金属イオン」とは、ポリメラーゼ酵素が存在する場合にプライマーへのヌクレオチドの化学的組み込みに必要なホスホジエステル結合の形成を促進しない金属イオンを指す。一般的には、非触媒金属イオンは陽イオンである。非触媒金属イオンは、ポリメラーゼによるホスホジエステル結合の形成を阻害することがあり、したがって、ヌクレオチド組み込みを防止することによって三元複合体を安定化し得る。非触媒金属イオンは、例えば触媒金属イオンと比較して、競合結合を介してポリメラーゼと相互作用し得る。「二価非触媒金属イオン」は、２の原子価を有する非触媒金属イオンである。二価非触媒金属イオンの例として、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、及びＳｒ２＋が挙げられるが、これらに限定されない。３価のＥｕ３＋及びＴｂ３＋イオンは、３の原子価を有する非触媒金属イオンである。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、「外因性標識」とは、配列決定試薬の天然類似体には存在しない配列決定試薬の検出可能な化学的部分、例えば、合成ヌクレオチド類似体または合成ポリメラーゼ類似体（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）上に存在する非天然の標識を指す。天然のｄＮＴＰは特有の限定された蛍光特性を有し得るが、その一方で天然のｄＮＴＰは付加的な比色または蛍光部分を含まない。逆に、γリン酸に結合した化学リンカー及び蛍光部分を含むように修飾したｄＡＴＰ（２′−デオキシアデノシン−５′−三リン酸）分子は、結合した化学成分が、通常、ヌクレオチドの一部ではないことから、外因性の標識を含むと言われるであろう。当然、検出可能な標識をヌクレオチド塩基に付加するための化学修飾も、外因性標識と考えられる。同様に、蛍光色素を含むように修飾されたＤＮＡポリメラーゼ（例えば、酵素の一次配列の一部であるシステイン残基への結合によって）もまた、その標識が、通常、ポリメラーゼの一部ではないことから外因性標識を含むと言われるであろう。
【００３９】
本明細書中で使用する場合、「非標識」とは、付加された、または外因性の標識（複数可）またはタグ（複数可）を含まない分子種を指す。当然、非標識ヌクレオチドは、外因性蛍光標識、または外因性ラマン散乱タグのいずれも含まないであろう。天然ヌクレオチドは、非標識分子種の別の例である。非標識分子種は、核酸配列決定または分析生化学に関連して、本明細書に記載するか、または当該技術分野で公知の１つ以上の標識を除外することができる。
【００４０】
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−Ｂｉｎｄｉｎｇ法
本明細書において、ポリメラーゼに基づく核酸のｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ（ＳＢＢ）反応を記載し、反応においては、反応の個別の工程の間に、ポリメラーゼは開構造と閉構造の間で立体構造遷移を受ける。一工程では、ポリメラーゼはプライミングした鋳型核酸に結合し、本明細書においてプレ挿入構造とも呼ばれる二元複合体を形成する。続く工程では、入ってくるヌクレオチドが結合し、ポリメラーゼフィンガーが閉じ、ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸及びヌクレオチドを含むプレケミストリー構造を形成し；ここでは、結合したヌクレオチドは組み込まれてはいない。本明細書において「検査」工程とも呼ばれるこの工程の後に、ホスホジエステル結合の形成と、それに付随するヌクレオチドからのピロリン酸切断（すなわち、ヌクレオチド組み込み）の化学工程が続いてもよい。ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸及び新たに組み込まれたヌクレオチドは、ポストケミストリー、プレトランスレーション構造を生じる。プレケミストリー構造及びプレトランスロケーション構造の両方は、ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸及びヌクレオチドを含み、ポリメラーゼは閉鎖状態にあり、いずれの立体構造も本明細書中では閉鎖複合体または閉鎖三元複合体と呼ばれる。閉鎖プレ挿入状態では、Ｍｇ２＋などの二価触媒金属イオンは、プライマーの３′ヒドロキシルによるピロリン酸（ＰＰｉ）の求核置換を含む迅速な化学反応を媒介する。ポリメラーゼは、ＰＰｉの遊離、ポストトランスロケーション工程、及び転位が次のラウンドの反応を開始すると開状態に戻る。閉鎖複合体が、二価触媒金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋）の非存在下で形成可能な一方で、閉鎖複合体のポリメラーゼは、二価金属イオンの存在下で、ヌクレオチドの化学的付加能力を有する。Ｍｇ２＋などの触媒金属イオンのレベルが低いかまたは不十分であると、閉鎖複合体における後続の正しいヌクレオチドの非共有結合的な（例えば、物理的な）隔離が生じる。この閉鎖複合体は、安定化された、または捕捉された閉鎖複合体と呼ばれる場合がある。上記の任意の反応工程において、ポリメラーゼ配置及び／または核酸との相互作用を検査工程の間にモニタリングして、鋳型核酸配列における後続の正しい塩基を同定してもよい。組み込み前または組み込み後に、反応条件を変更してプライミングした鋳型核酸からポリメラーゼを解離させ、再びポリメラーゼ結合を阻害する試薬を局所環境から除去するように変更することができる。
【００４１】
一般的に述べると、ＳＢＢ手順は、後続の鋳型塩基を同定する「検査」工程、及び場合により、プライミングした鋳型核酸のプライマー成分の３′末端に１つ以上の相補的ヌクレオチドを付加する「組み込み」工程を含む。付加される後続の正しいヌクレオチドの同一性は、共有結合を介したプライマーの３′末端へのそのヌクレオチドの化学的結合を伴わずに、またはその前に判定する。検査工程は、手順において使用するプライミングした鋳型核酸を提供し、プライミングした鋳型核酸を、ポリメラーゼ酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）及び後続の正しいヌクレオチドとしての可能性を調査する１つ以上の被験ヌクレオチドと接触させることを含む。さらに、被験ヌクレオチドの存在下で、ポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸との間の相互作用をモニタリングまたは測定する工程が存在する。場合により、相互作用を安定化剤の存在下で生じさせることができ、それによってポリメラーゼ−核酸相互作用は後続の正しいヌクレオチドの存在下で安定化される。さらに、検査工程は、そのヌクレオチドの組み込みを必要とせずに、後続の正しいヌクレオチドの同一性を同定または判定する。異なる記述をするならば、標識または非標識ヌクレオチドを用いて１回以上の検査サイクルを実施する場合、プライマーへのヌクレオチドの化学的組み込みを伴わずに、後続の正しいヌクレオチドの同一性を確立することができる。
【００４２】
便宜上、単一の鋳型核酸分子に関する方法を記載する場合があるが、これらの方法は単なる例示に過ぎない。本明細書中に提供する配列決定方法は、複数の鋳型核酸を容易に包含し、複数の核酸は、単一の核酸をクローン的に増幅したコピー、または組み合わせを含む異種核酸、例えば、クローン的に増幅した異種核酸の集団であってもよい。したがって、そのような配列決定方法は、本明細書に完全に開示される。
【００４３】
検査工程
本明細書に記載の技術による検査工程は、典型的に、（１）プライミングされた鋳型核酸（すなわち、プライマーとハイブリッド形成された鋳型核酸分子）を提供する副工程と；（２）プライミングされた鋳型核酸を、ポリメラーゼ、及び少なくとも１つの被験ヌクレオチドの濃度に関する２通りの条件（「第１」及び「第２」の条件）を提供する反応混合物に接触させる副工程と；（３）ヌクレオチド（複数可）の存在下におけるポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸分子との相互作用を、プライミングされた鋳型核酸に如何なるヌクレオチドも化学的に組み込むことなしにモニタリングする副工程と；（４）モニタリングされた相互作用を用いて、鋳型核酸中の後続の塩基（すなわち、後続の正しいヌクレオチド）を同定する副工程と；を含む。プライミングされた鋳型核酸のプライマーは、伸長性プライマーであり得る。被験ヌクレオチドの塩基がプライミングされた鋳型核酸分子の後続の塩基に相補的である場合、プライミングされた鋳型核酸、ポリメラーゼ及び被験ヌクレオチドは、三元複合体を形成できる。先に述べた接触工程の第２条件の下では、ポリメラーゼと被験ヌクレオチドとが共存するので、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである場合、被験ヌクレオチドの濃度は三元複合体を形成するのに十分な濃度である。先に述べた接触工程の第１条件の下では、ポリメラーゼは典型的に第２の条件の場合と実質的に同じ濃度で存在するが、被験ヌクレオチドは存在しないか、あるいは第２の条件で使用される濃度の３０％、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは１０％以下で存在するかのいずれかである。被験ヌクレオチドの塩基がプライミングされた鋳型核酸分子の後続の塩基に対して相補的でない場合、プライミングされた鋳型核酸及びポリメラーゼは、二元複合体を形成できる。接触は、任意で、二元複合体の形成に対してよりも寧ろ三元複合体の形成に有利な条件下にて行われる。同定工程に、プライミングされた鋳型核酸の後続の塩基に対して相補的なヌクレオチドの塩基を同定することを含めてもよい。
【００４４】
これらすべての工程を１回以上繰り返すことによって、詳細にわたる配列情報を得ることができる。例えば、接触工程及びモニタリング工程を、１回以上繰り返すことができる。任意で、ポリメラーゼと第１の被験ヌクレオチドとを含む反応混合物を使用して、接触工程及びモニタリング工程を繰り返す。任意で、接触工程及びモニタリング工程を、ポリメラーゼと第２のヌクレオチドとを含む反応混合物を使用して、繰り返す。任意で、接触工程及びモニタリング工程を、ポリメラーゼと第３のヌクレオチドとを含む反応混合物を使用して、繰り返す。任意で、接触工程及びモニタリング工程を、ポリメラーゼと第４のヌクレオチドとを含む反応混合物を使用して、繰り返す。ここで理解すべき点は、ポリメラーゼと被験ヌクレオチドとを含む各接触工程に先立って、より低い濃度にて（例えば、１０倍以上低い濃度にて）、あるいはヌクレオチドの不在下にて、ポリメラーゼと同じ被験ヌクレオチドとを含む接触工程を行うことである。したがって、先行する接触工程は、被験ヌクレオチドの不在下でポリメラーゼと接触することを含み得る。
【００４５】
本明細書中に記載されている配列決定方法において、ＤＮＡポリメラーゼと少なくとも１つの被験ヌクレオチドとを含む反応混合物は、１、２、３または４種類のヌクレオチド分子（例えば、標識もしくは非標識ヌクレオチドのいずれか）を含み得る。任意で、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰから選択される天然ヌクレオチドである。任意で、反応混合物は、１つ以上の三リン酸ヌクレオチドと、１つ以上の二リン酸ヌクレオチドとを含む。任意で、プライミングされた鋳型核酸と、ポリメラーゼと、反応混合物中に含まれる４つのヌクレオチド分子のうちの１つとの間に閉鎖複合体が形成される。
【００４６】
提供されている方法の具体例では、プライミングされた鋳型核酸を、最初に、被験ヌクレオチドを添加しないポリメラーゼを含む反応混合物と接触させる。その後、プライミングされた鋳型核酸を、ポリメラーゼと第１の被験ヌクレオチドとを含む反応混合物と接触させ；ポリメラーゼ、及び第１の被験ヌクレオチドと第２の被験ヌクレオチドとの組み合わせを含む反応混合物と接触させて；ポリメラーゼ、及び第１の被験ヌクレオチドと第２の被験ヌクレオチドと第３の被験ヌクレオチドとの組み合わせを含む反応混合物と接触させてから；ポリメラーゼ、及び第１の被験ヌクレオチドと第２の被験ヌクレオチドと第３の被験ヌクレオチドと第４の被験ヌクレオチドとの組み合わせを含む反応混合物と接触させる。モニタリングは、連続的に、または各反応混合物が変化した後に遂行できる。
【００４７】
検査工程は、ヌクレオチドの組み込みが減衰または達成されるように、制御できる。検査工程中にヌクレオチドの組み込みが減衰される場合は、後続の正しいヌクレオチドの同一性を判別した後に、別途の組み込み工程を行ってもよい。別途の組み込み工程は、検査工程中に塩基が既に同定されているため、モニタリングの必要なしに遂行できる。検査中にヌクレオチドの組み込みが進行する場合、組み込み後に核酸上のポリメラーゼを捕捉する安定化剤を使用して、以後のヌクレオチドの組み込みを減衰させてもよい。可逆的に終結するヌクレオチド（すなわち、可逆的ターミネーター部分を含むヌクレオチド）もまた、後続のヌクレオチドの付加を防止するために使用できる。ＳＢＢ法では、ポリメラーゼと鋳型核酸との間の相互作用をヌクレオチド上の標識なしでモニタリングできるので、標識されたヌクレオチドを使用する必要なしに鋳型核酸塩基を制御下で判別できる。ただし、明確さを期して言うと、結合したヌクレオチドの蛍光検出を可能にすることを目的に本開示の手順を実施する場合、標識されたヌクレオチド（例えば、蛍光ヌクレオチド）の使用は任意である。
【００４８】
本明細書中に記載されている配列決定方法において、被験ヌクレオチド（例えば、少なくとも１つの被験ヌクレオチド）は、例えば、遊離３’ヒドロキシル基であり得る３’ヒドロキシル基を含む。任意で、被験ヌクレオチド分子の３’ヒドロキシル基は、３’ブロッキング部分を含むように修飾される。３’ターミネーター部分は、可逆的ターミネーターである場合もあれば、または不可逆的ターミネーターである場合もある。任意で、可逆的ターミネーターを含む被験ヌクレオチドを用いた検査工程の後の、或る時点において、少なくとも１つのヌクレオチド分子の可逆的ターミネーターは置換または除去される。
【００４９】
接触工程
【００５０】
開示されている方法では、プライミングされた鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ及び１つ以上の被験ヌクレオチドと接触させるための、２つの工程を用いる。第１の工程（本明細書中で「第１のフェーズ」または「フェーズ１」と呼ばれることもある）は、プライミングされた鋳型核酸を、添加されたヌクレオチドの不在下でポリメラーゼと接触させるか、あるいはポリメラーゼと接触させるかのいずれかを含み、且つヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドであるときに、三元閉鎖複合体の最大形成を達成するのに必要な量もしくは濃度を下回る量または濃度のヌクレオチドを含む。例えば、被験ヌクレオチドは、第２相で使用される濃度の３０％、より好ましくは２０％、またはさらにより好ましくは１０％以下の濃度で使用できる。第２の工程（本明細書中で「第２のフェーズ」または「フェーズ２」と呼ばれることもある）は、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼとを、被験ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドであるときに最大限の三元複合体の形成を生じるのに十分な量または濃度のヌクレオチドと組み合わせて接触させることを含む。この「飽和」レベルのヌクレオチドは、合理的な試験だけを用いて、容易に判別できる。指針として、第１フェーズで使用されるポリメラーゼの濃度を、第１フェーズでは≧４００ｎＭとし、第２フェーズでは≦４００ｎＭとしてもよい。さらなる指針として、ｄＮＴＰの濃度を、第１フェーズでは０〜１０μＭとし、第２フェーズでは２０〜４００μＭとしてもよい。この方法の第１フェーズ及び第２フェーズにおいて単一濃度のポリメラーゼを使用することができるが、第１フェーズで使用した濃度の方が高くなるように異なるポリメラーゼ濃度を用いた場合も、同様に良好な結果が得られた。被験ヌクレオチドの濃度が手順の変数として特定されるように、２つの異なる接触工程においてポリメラーゼを実質的に同じ濃度とすることが、好ましい。したがって、一般的に言えば、第２の接触工程中の被験ヌクレオチドの濃度の方が、最初の（すなわち、第１の）接触工程において使用され得る被験ヌクレオチドの濃度よりも高い。任意で、最初に、プライミングされた鋳型核酸と接触するために使用された溶液から、被験ヌクレオチドを完全に省略することも可能である。この場合、被験ヌクレオチドの第１の濃度は０μＭとなる。任意で、最初の（すなわち、第１の）接触工程における被験ヌクレオチドの濃度は、従来の手段では検出できない程度に低い濃度とされる。
【００５１】
プライミングされた鋳型核酸分子と、ポリメラーゼと１つ以上の被験ヌクレオチド分子とを含む反応混合物との接触は、三元複合体の形成を安定化させ、且つ／あるいは二元複合体の形成を不安定化させる条件下で行われる場合がある。任意で、反応混合物にグルタミン酸カリウムを含める。任意で、三元複合体の形成を安定化させる条件に、プライミングされた鋳型核酸を安定化剤と接触させることを含める。任意で、反応混合物に安定化剤を含める。安定化剤を、１つ以上の非触媒金属イオンとしてもよい。例示的な非触媒金属イオンとしては、ストロンチウムイオン、スズイオン、ニッケルイオン、及びユーロピウムイオンが挙げられる。例えば、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼと被験ヌクレオチドとを含む、検査工程の反応混合物はまた、安定化剤として０．０１ｍＭ〜３０ｍＭの塩化ストロンチウムを含む場合がある。
【００５２】
或る実施形態において、プライミングされた鋳型核酸は、固体支持体の表面上に固定化される。この固定化には、プライミングされた鋳型核酸及び固体支持体の一方もしくは他方またはさらには両方の鎖の間の、共有結合もしくは非共有結合のいずれかを用いることができる。例えば、プライミングされた鋳型核酸の鋳型とプライマー鎖とが異なる分子である場合、鋳型鎖が、例えばその５’末端を介して固定化される場合があるが、ただし、ポリメラーゼと相互作用するためには、プライマーの３’末端が利用可能なことが必要とされる。
【００５３】
プライミングされた鋳型核酸が固体支持体に固定化されている場合、接触工程の実施方法に関して、代替の選択肢が存在する。例えば、固体支持体を、異なる試薬溶液が入った別々の容器どうし（例えば、マルチウェルプレートの個々のウェル）の間で物理的に移送することもできる。これは、自動化機器またはロボット機器を用いて、達成するのが、好都合である。別の実施例において、プライミングされた鋳型核酸は、フローセル内またはチャンバー内の固体支持体に固定化される。この場合、チャンバーを通過するかあるいは固定化されたプライミング済み鋳型核酸を横切る、異なる液体試薬の制御された流れを介して、異なる接触工程が実行される場合がある。
【００５４】
モニタリング工程
ヌクレオチド分子の存在下での、プライミングされた鋳型核酸分子とのポリメラーゼの相互作用のモニタリングまたは測定は、様々な方法で行うことができる。例えば、モニタリングには、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼとヌクレオチドとの間の相互作用の会合キネティクスの測定を含めることもできる。ヌクレオチド分子の存在下でポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸分子との相互作用をモニタリングする際には、ポリメラーゼとプライミングされた鋳型核酸分子との間の平衡結合定数（すなわち、ヌクレオチドの存在下における、鋳型核酸に対するポリメラーゼの平衡結合定数）を測定することを、含めてもよい。このようにして、例えば、ヌクレオチドの存在下でプライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの平衡結合定数を測定することを、モニタリングに含める。ヌクレオチド分子の存在下での、プライミングされた鋳型核酸分子とポリメラーゼとの相互作用のモニタリングは、４つのヌクレオチドのいずれか１つの存在下でプライミングされた鋳型核酸を基にポリメラーゼの解離キネティクスを測定することを含む。任意で、ヌクレオチド分子の存在下での、プライミングされた鋳型核酸分子とのポリメラーゼの相互作用のモニタリングは、閉鎖複合体の解離のキネティクス（すなわち、プライミングされた鋳型核酸、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの解離）の測定を含む。任意で、測定された会合キネティクスは、ヌクレオチド分子の同一性に応じて異なる。任意で、ポリメラーゼは、使用されたヌクレオチドのタイプごとに、異なる親和性を有する。任意で、ポリメラーゼは、各タイプの閉鎖複合体におけるヌクレオチドのタイプごとに、異なる解離定数を有する。会合、平衡及び解離のキネティクスは公知であり、当業者であれば容易に判別できる。例えば、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（１６）：７９７５−８４（２０１２）；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３５（１）：１９３−２０２（２０１３）；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ８７１９３９，１１  ｐａｇｅｓ（２０１０）；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４（２）：９３６−４３（２００４）；Ｗａｌｓｈ  ａｎｄ  Ｂｅｕｎｉｎｇ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ５３０９６３，１７  ｐａｇｅｓ（２０１２）；及び  Ｒｏｅｔｔｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７（３７）：９７１８−９７２７（２００８）を参照のこと。これらの全容は本明細書において参照により援用されている。
【００５５】
プライミングされた鋳型核酸のプライマーに第１のヌクレオチドを化学的に組み込むことなしに、第１のヌクレオチドの存在下で、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼとの定常状態の相互作用をモニタリングすることを、モニタリング工程に含めてもよい。任意で、第１のヌクレオチドをプライミングされた鋳型核酸のプライマーに化学的に組み込むことなしに、第１のヌクレオチドの存在下で、プライミングされた鋳型核酸からポリメラーゼが解離するのをモニタリングすることを、モニタリングに含める。任意で、プライミングされた鋳型核酸のプライマーに第１のヌクレオチドを化学的に組み込むことなしに、第１のヌクレオチドの存在下で、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼとの会合をモニタリングすることを、モニタリングに含める。再三繰り返すが、これらの手順における被験ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド（すなわち、無標識）、標識ヌクレオチド（例えば、蛍光標識ヌクレオチド）、またはヌクレオチド類似体（例えば、可逆的もしくは不可逆的ターミネーター部分を含むように修飾されたヌクレオチド）であり得る。
【００５６】
本明細書中に記載されている配列決定方法では、反応混合物中に触媒金属イオンが存在しないか、またはポリメラーゼの活性部位に触媒金属イオンが存在しないので、プライミングされた鋳型核酸のプライマーにヌクレオチドが化学的に組み込まれるのが防止される。任意で、接触工程において反応混合物中の触媒金属イオンをキレート化することによって、プライミングされた鋳型核酸のプライマーにヌクレオチドが化学的に組み込まれるのが防止される。任意で、非触媒金属イオンは、後続の正しいヌクレオチドの存在下で三元閉鎖複合体の安定化剤として作用する。任意で、接触工程において反応混合物中の触媒金属イオンを非触媒金属イオンで置換することによって、プライミングされた鋳型核酸にヌクレオチド分子が化学的に組み込まれるのが防止される。任意で、触媒金属イオンをマグネシウムとする。ポリメラーゼの金属イオン機構は、ポリメラーゼ−ヌクレオチド−ＤＮＡの結合相互作用を安定化させるためには低濃度の金属イオンを必要とすることを仮定する。例えば、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２７．２．２，Ｂｅｒｇ  ＪＭ，Ｔｙｍｏｃｚｋｏ  ＪＬ，Ｓｔｒｙｅｒ  Ｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，２００２を参照のこと。
【００５７】
任意で、検査工程において反応混合物中の触媒イオンを低濃度とする（すなわち、低濃度の触媒イオンを被験ヌクレオチドの存在下または不在下で、ポリメラーゼを結合させるために使用する）ことにより、プライミングされた鋳型核酸のプライマーに被験ヌクレオチドが化学的に組み込まれるのが防止される。任意で、触媒イオン（例えば、マグネシウムイオン）は、約１μＭ〜約１００μＭの低濃度とされる。任意で、約０．５μＭ〜約５μＭの低濃度とされる。任意で、検査工程の反応混合物にはコバルトが含まれ、組み込み工程には、検査工程における反応混合物中のコバルトの濃度と比較して高濃度のコバルトを含有する組み込み反応混合物との接触することが含まれる。
【００５８】
ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸との間の相互作用のモニタリングを可能にしながら、ヌクレオチドが化学的に組み込まれるのを防止するための反応条件を提供することによって、或る程度、検査工程を制御できる。それによって、核酸鋳型鎖の後続の塩基の同一性の判別が可能になる。そのような反応条件を「検査反応条件」と呼ぶ場合がある。任意で、検査条件の下で三元複合体または閉鎖複合体が形成される。任意で、安定化された三元複合体または閉鎖複合体が、検査条件下にて、またはプレケミストリー構造にて形成される。任意で、安定化された閉鎖複合体は、封入ヌクレオチドが組み込まれているが、閉鎖複合体のせいで以後のヌクレオチドの組み込みが可能とはならない、プレトランスロケーション構造とされる。任意で、この検査条件では、異なるヌクレオチドの存在下にて、ポリメラーゼに対する親和性が、プライミングされた鋳型核酸とは異なることが強調される。任意で、この検査条件では、異なるヌクレオチドの存在下にて、プライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの示差的親和性が生ずる。例として、異なるヌクレオチドの存在下にて、プライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの示差的親和性を生ずる検査条件としては、限定されないが、塩濃度が高いこと、及びグルタミン酸カリウムを組み込むことが挙げられる。プライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性を変化させるために使用され得るグルタミン酸カリウム濃度は、１０ｍＭ〜１．６Ｍのグルタミン酸カリウム、または１０ｍＭ〜１．６Ｍの間の任意の量が包含される。任意で、塩の濃度が５０ｍＭから１，５００ｍＭの場合、塩濃度が高いことを指す。
【００５９】
モニタリング工程における鋳型核酸とのポリメラーゼ相互作用、または鋳型核酸及びヌクレオチドの組み合わせとのポリメラーゼ相互作用の検出を、検査に含めるのが一般的である。検出には、光学的、電気的、熱的、音響的、化学的及び機械的手段が含まれる場合がある。任意で、モニタリングは、バッファー交換または洗浄工程の後に実行され、洗浄工程では、観察領域から任意の非結合試薬（例えば、非結合ポリメラーゼ及び／またはヌクレオチド）を除去する。任意で、バッファー交換または洗浄工程の間、ポリメラーゼ−核酸またはポリメラーゼ−核酸−ヌクレオチド複合体の解離キネティクスを用い、後続の塩基の同一性を判別できるようにモニタリングを行う。任意で、検査反応混合物または第１の反応混合物の付加過程の間、核酸に対するポリメラーゼの会合キネティクスを用い、核酸上の後続の塩基の同一性を判別できるようにモニタリングを行う。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸とからなる二元複合体を、閉鎖複合体と識別することを、モニタリングに含める。任意で、測定された親和性が平衡親和性となる平衡条件下にて、モニタリングが行われる。異なるまたは類似の検査試薬を含む複数の検査工程を逐次実行することによって、後続の鋳型塩基の同一性を判別する場合もある。異なる検査試薬に対して異なる核酸が異なる反応を呈する１つの配列決定反応において、複数の鋳型核酸を同時に配列決定する場合には、複数の検査工程を利用してもよい。任意で、複数の検査工程を用いることで、後続の塩基を定量する精度を向上させることができる。
【００６０】
例示的な配列決定反応では、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、後続の正しいヌクレオチドとを含む閉鎖複合体の形成、及び／または安定化を、検査工程に含める。閉鎖複合体の形成特性及び／または放出特性をモニタリングすることによって、封入ヌクレオチド、ひいては鋳型核酸中の後続の塩基を同定する。閉鎖複合体特性は、配列決定反応成分（例えば、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド）及び／または反応混合物成分、ならびに／あるいは条件に応じて異なる場合がある。任意で、閉鎖複合体は、プレケミストリー構造とされる。任意で、閉鎖複合体は、プレトランスロケーション構造とされる。任意で、閉鎖複合体は、ポストトランスロケーション構造とされる。
【００６１】
検査工程は、被験ヌクレオチドの存在下にて、プライミングされた鋳型核酸とポリメラーゼとの相互作用をモニタリングすることを含む。閉鎖複合体の形成がモニタリングされる場合もある。任意で、閉鎖複合体の形成の不在がモニタリングの対象とされる。任意で、閉鎖複合体の解離がモニタリングの対象とされる。任意で、ヌクレオチドの組み込みをモニタリングすることを、組み込み工程に含める。任意で、ヌクレオチドの組み込みの不在をモニタリングすることを、組み込み工程に含める。
【００６２】
検査工程及び／または組み込み工程の任意の工程を、モニタリングの対象とすることができる。任意で、ポリメラーゼに外来性標識、すなわち「タグ」を付す。任意で、ポリメラーゼ上の検出可能タグまたは標識は、除去可能である。任意で、ヌクレオチドまたはポリメラーゼに検出可能標識を付したとしても、配列決定中には標識が検出されない。任意で、配列決定反応の成分に対し、外来性標識で検出可能標識を付さないこともある。
【００６３】
ヌクレオチドの組み込みを許可し得る条件下または許可し得ない条件下、適正及び不適正なヌクレオチドの存在下にて鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性における変化のモニタリングを用いることによって、核酸配列を判別できる。種々のヌクレオチド（修飾または標識ヌクレオチドを含む）の存在下にて、鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性を、様々なヌクレオチドの存在下におけるポリメラーゼ−核酸相互作用のオフレートとしてモニタリングできる。種々の適合／適正、不適合／不適正及び修飾ヌクレオチドに対する多くの標準ポリメラーゼの親和性ならびにオフレートは、当該技術分野において公知である。クレノウポリメラーゼの単分子を撮像することによって、ヌクレオチド型の組み込みが防止される様々なヌクレオチド型に対する鋳型核酸のオフレートが、明確に且つ測定可能に異なることが、明らかにされる。
【００６４】
任意で、プライミングされた鋳型核酸の存在下で、特定のタイプのヌクレオチドがポリメラーゼに利用可能にされる。ヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである場合に、ポリメラーゼが安定化して閉鎖複合体を形成し得るような、反応をモニタリングする。ヌクレオチドが不適正なヌクレオチドである場合でも、依然として閉鎖複合体が形成可能ではあるが、安定化剤または反応条件のさらなる補助なしに（例えば、触媒イオン、ポリメラーゼ阻害剤、塩の不在下で）閉鎖複合体が解離する可能性がある。解離速度は、ポリメラーゼ、鋳型核酸及びヌクレオチドの特定の組み合わせの親和性、ならびに反応条件に依存する。任意で、親和性はオフレートとして測定される。任意で、親和性は、閉鎖複合体の種々のヌクレオチドどうしの間で異なる。例えば、プライマーの３’末端の下流の鋳型核酸中の後続の塩基がＧである場合、オフレートとして測定されたポリメラーゼ−核酸親和性は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのいずれを添加するかに応じて異なることが予期される。この場合、オフレートが最も遅いのはｄＣＴＰである。他のヌクレオチドはそれぞれ異なるオフレートで相互作用をもたらす。任意で、反応条件、例えば、安定化剤の存在（例えば、マグネシウムまたは阻害性化合物の不在）または反応条件（例えば、ヌクレオチド修飾または修飾ポリメラーゼ）に応じて、オフレートが異なる場合がある。いったん後続の正しいヌクレオチドの同一性が判別されると、閉鎖複合体の形成を特異的に標的とする条件下にて、１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチドタイプを、同時に反応混合物中に導入することが可能になる。過剰のヌクレオチドを反応混合物から除去し、閉鎖複合体の後続の正しいヌクレオチドを組み込めるように、反応条件を調節してもよい。この配列決定反応では、配列決定サイクルごとに１つのヌクレオチドのみが組み込まれることが保証される。
【００６５】
ヌクレオチドの存在下における鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性は、当業者に公知の複数の方法で測定できる。任意で、親和性はオフレートとして測定される。このオフレートは、反応物を洗浄緩衝液で洗浄した際の、鋳型核酸からのポリメラーゼの放出をモニタリングすることにより、測定される。任意で、親和性はオフレートとして測定される。このオフレートは、平衡結合条件の下で、特にポリメラーゼ結合率が低いかまたは拡散が制限されている平衡結合条件の下で、鋳型核酸からのポリメラーゼの放出をモニタリングすることにより、測定される。ポリメラーゼがＤＮＡ−ポリメラーゼ複合体から脱落して、すぐには負荷が戻らず、複合体からポリメラーゼが放出されたことが検出されるまでに十分な時間がかかることが見込まれる場合には、ポリメラーゼ結合速度が拡散律速される程度にポリメラーゼを十分低濃度にすることがある。親和性の高い相互作用を期して、核酸からポリメラーゼがゆっくりと放出されるが、逆に親和性の低い相互作用ではポリメラーゼの放出速度が迅速化される結果となる。この場合、動的洗浄条件下でまたは平衡状態にて測定されたオフレートを用い、親和性のスペクトルを、異なるオフレートに変換する。最小のオフレートは、添加されたヌクレオチドに相補的な塩基に対応している。一方、他方のオフレートは、選択されたポリメラーゼとヌクレオチドとの組み合わせに応じて、公知の様式にて変動する。
【００６６】
任意で、ポリメラーゼ及びヌクレオチドが反応混合物中に提供された後に、オフレートが平衡シグナル強度として測定される。この場合、最も低いオフレートの（最も親和性の高い）ヌクレオチドとの相互作用によって、最も強いシグナルが発生する一方、他の異なるオフレートのヌクレオチドとの相互作用によって、測定可能な異なる強度のシグナルが発生する。非限定的な例として、全内部反射（ＴＩＲＦ）条件下で測定された蛍光標識ポリメラーゼでは、好適に選択された時間枠内で表面固定化核酸分子に結合されたポリメラーゼ分子の数に応じて異なる測定蛍光強度を生ずることが好ましい。ポリメラーゼの内在性蛍光、例えばトリプトファン蛍光もまた利用できる。選択された時間枠内では結合ポリメラーゼ分子の数が極めて少ないため、高オフレートの相互作用では低い測定強度が得られる。この場合、高オフレートとは、ポリメラーゼの大部分は核酸に結合されていないことを示唆する。限定されるものではないが、標識または蛍光スキームをはじめとする、任意の表面局在測定スキームを使用できる。平衡条件下にて親和性を測定するための好適な測定スキームとしては、限定されないが、結合質量、屈折率、表面電荷、誘電率、及び当該技術分野において公知の他のスキームが挙げられる。任意で、オンレート・エンジニアリングとオフレート・エンジニアリングとを組み合わせることによって、提案されたスキームにて検出の忠実度を向上させることができる。非限定的な例として、一様に低いオンレート、塩基依存性、変動オフレートによって、非結合ポリメラーゼが長期にわたって非結合のままに維持されるので、オフレート及び測定強度における変動の識別を向上させることが可能となる。添加されたポリメラーゼ、ヌクレオチド、またはポリメラーゼとヌクレオチドの両方について濃度を低下させ、オンレートを操作できる。
【００６７】
任意で、ポリメラーゼと核酸との間の相互作用は、ポリメラーゼに付着された検出可能タグを介してモニタリングされる。タグは、光学的、電気的、熱的、質量、サイズ、電荷、振動、及び圧力を含むがそれらに限定されない検出方法によってモニタリングできる。標識は、磁性、蛍光性または帯電性であり得る。外部及び内部標識スキームでは、蛍光異方性を用い、閉鎖複合体中の核酸に対しポリメラーゼが安定に結合しているのを判別できる。
【００６８】
一例として、ポリメラーゼをフルオロフォアで標識することで、閉鎖複合体の形成が、安定な蛍光シグナルとしてモニタリングされるようになる。不適正なヌクレオチドの存在下にてポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用が不安定な場合は、後続の正しいヌクレオチドの存在下にて形成される閉鎖複合体と比較してシグナルが多少弱くなる。しかしながら、或る好ましい実施形態において、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ手順は、ポリメラーゼに連結された任意の外来性標識（例えば、蛍光標識）の検出に依存しない。例えば、ポリメラーゼは天然のポリメラーゼであり得る。
【００６９】
同定工程
三元複合体または閉鎖複合体の存在、形成及び／または解離をモニタリングすることによって、後続の正しい塩基またはヌクレオチドの同一性を判別できる。後続の塩基の同一性は、プライマーの３’末端に後続の正しいヌクレオチドを化学的に組み込むことなしに、判別できる。任意で、添加されたヌクレオチドの存在下にてプライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性をモニタリングすることによって、後続の塩基の同一性が判別される。任意で、後続の正しいヌクレオチドの存在下にてプライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性を用い、鋳型核酸上の後続の正しい塩基を判別できる。任意で、不適正なヌクレオチドの存在下にてプライミングされた鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性を用い、鋳型核酸上の後続の正しい塩基を判別できる。
【００７０】
組み込み工程
任意で、本明細書中に記載されている方法に、組み込み工程をさらに含める。一例として、鋳型核酸の後続の塩基に相補的な単一ヌクレオチド（例えば、非標識ヌクレオチド、可逆的ターミネーターヌクレオチド、または検出可能に標識されたヌクレオチド類似体）を、プライミングされた鋳型核酸分子のプライマー中に組み込むことを、組み込み工程に含める。任意で、プライミングされた鋳型核酸分子、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを、組み込み反応混合物と接触させることを、組み込み工程に含める。組み込み反応混合物は、典型的に、触媒金属イオンを含む。
【００７１】
組み込み工程後に、次の検査工程に備えて、プライミングされた鋳型核酸分子を調製することを、提供されている方法にさらに含めてもよい。任意で、プライミングされた鋳型核酸もしくは核酸／ポリメラーゼ複合体を１回以上の洗浄工程；温度の変化；機械的振動；ｐＨの変化；塩または緩衝液組成の変化、光学的刺激、またはこれらの組み合わせに供することを、調製に含める。任意で、プライミングされた鋳型核酸またはプライミングされた鋳型核酸／ポリメラーゼ複合体を、１種以上の緩衝液、界面活性剤、タンパク質変性剤、プロテアーゼ、酸化剤、還元剤、あるいは他の薬剤であってポリメラーゼ内の内部架橋、またはポリメラーゼと核酸との間の架橋を解除できる薬剤に接触させることを、洗浄工程に含める。
【００７２】
任意で、この方法に、検査工程及び組み込み工程を繰り返すことをさらに含めることによって、鋳型核酸分子の配列決定が行われるようにする。組み込み工程の実行に先立って、検査工程を１回以上繰り返してもよい。任意で、連続２回の検査工程は、種々のヌクレオチド分子（例えば、種々の標識付きまたは無標識ヌクレオチド）を有する反応混合物を含む。任意で、プライミングされた鋳型核酸分子に単一のヌクレオチドを組み込む前に、第１の反応混合物を、ポリメラーゼと、１、２、３または４種類のヌクレオチド分子（例えば、種々の非標識ヌクレオチド）とを含む第２の反応混合物で置き換える。任意で、ヌクレオチド分子は、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰから選択される天然ヌクレオチドである。
【００７３】
組み込み反応を、組み込み反応混合物を介して、可能にすることができる。任意で、組み込み反応混合物に、検査反応とは異なるヌクレオチドの組成物を含める。例えば、検査反応には或る種類のヌクレオチドを含め、組み込み反応には別の種類のヌクレオチドを含める。もう１つの例として、検査反応には或る種類のヌクレオチドを含め、組み込み反応には４種類のヌクレオチドを含める。その逆も同様で、検査反応に４種類のヌクレオチドを含め、組み込み反応に或る種類のヌクレオチドを含める。任意で、検査反応混合物を変更するか、または組み込み反応混合物で置換する。任意で、組み込み反応混合物に、触媒金属イオン、塩化カリウム、またはこれらの組み合わせを含める。
【００７４】
反応混合物中に存在するヌクレオチドが、閉鎖複合体中に封鎖されない場合、複数のヌクレオチドの挿入が引き起こされる可能性がある。したがって、化学的組み込み工程に先立って洗浄工程を用いることによって、捕捉された閉鎖複合体中に封鎖されたヌクレオチドのみを、組み込み工程中に確実に組み込めるように利用することができる。任意で、遊離ヌクレオチドを、ホスファターゼ等の酵素で除去してもよい。捕捉されたポリメラーゼ複合体は、ポリメラーゼ、プライミングされた鋳型核酸と後続の正しいヌクレオチドとを含む閉鎖複合体、安定化閉鎖複合体または三元複合体である場合がある。
【００７５】
任意で、組み込み工程中には、検査工程の閉鎖複合体中に封入されたヌクレオチドが、鋳型核酸プライマーの３’末端に組み込まれる。任意で、検査工程中に、検査工程の閉鎖複合体内に封入されたヌクレオチドが組み込まれるが、この閉鎖複合体では後続のヌクレオチドの組み込みが許可されない。この場合、組み込み工程中に閉鎖複合体が放出されれば、後続のヌクレオチドの組み込みが可能になる。
【００７６】
任意で、検査工程からのヌクレオチドを置換して、別のヌクレオチドを鋳型核酸プライマーの３’末端に組み込むことを、組み込み工程に含める。閉鎖複合体（例えば、ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である）内からヌクレオチドを放出し、鋳型核酸プライマーの３’末端に異なる種類のヌクレオチドを組み込むことを、組み込み工程にさらに含めてもよい。任意で、放出されたヌクレオチドを除去して、後続の正しいヌクレオチドを含む組み込み反応混合物で置き換える。
【００７７】
組み込みに適した反応条件は、試験反応混合物を組み込み反応混合物で置換することを含む場合がある。任意で、検査反応混合物中に存在するヌクレオチドを、組み込み反応混合物中の１つ以上のヌクレオチドで置換する。任意で、検査工程中に存在するポリメラーゼを、組み込み工程中に置換する。任意で、検査工程中に存在するポリメラーゼを、組み込み工程中に修飾する。任意で、検査工程中に存在する１つ以上のヌクレオチドを、組み込み工程中に修飾する。検査工程中に存在する反応混合物及び／または反応条件を、組み込み工程中に任意の手段を介して変更してもよい。これらの手段としては、限定されないが、試薬の除去、試薬のキレート化、試薬の希釈、試薬の添加のほか、導電率またはｐＨ等の反応条件の変更、ならびにこれらの任意の組み合わせが挙げられる。検査工程及び／または組み込み工程中に、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、ヌクレオチドとの任意の組み合わせを含む反応混合物中の試薬を修飾してもよい。
【００７８】
任意で、組み込み工程の反応混合物には競合阻害剤が含まれ、この競合阻害剤によって、複数の組み込みの発生が低減される。或る実施形態において、この競合阻害剤は、組み込み不能ヌクレオチドである。或る実施形態において、この競合阻害剤は、アミノグリコシドである。競合阻害剤は、活性部位中のヌクレオチドまたは触媒金属イオンのいずれかを置換する機能を有する。このため、例えば、第１の組み込み後に、活性部位が競合阻害剤で占有されたために、第２の組み込みが阻止される。一部の実施形態では、組み込み可能ヌクレオチドと競合阻害剤の両方が組み込み工程に導入され、このため、プライマーの３’末端に単一ヌクレオチドが確実に組み込まれるように、組み込み可能ヌクレオチドと阻害剤との比率を調整できる。
【００７９】
任意で、提供された反応混合物（組み込み反応混合物を含む）中に、組み込み不能ヌクレオチドである少なくとも１つの非標識ヌクレオチド分子を含める。換言すれば、プライミングされた鋳型核酸分子のプライマーに組み込み不能な１つ以上の非標識ヌクレオチド分子が、提供された反応混合物中に含まれる場合がある。組み込み不能ヌクレオチドとしては、例えば、二リン酸ヌクレオチドが挙げられる。例えば、ヌクレオチドを組み込み不能にするための、三リン酸基に対する修飾を、ヌクレオチドに含める場合がある。組み込み不能ヌクレオチドの例は、米国特許第７，４８２，１２０号に見られ、この開示の全容は本明細書中に参照により援用されている。任意で、プライマーの３’末端に遊離ヒドロキシル基を含めないようにしてもよい。それにより、如何なるヌクレオチドもプライマーに組み込めないようにし、こうして、任意のヌクレオチドを組み込み不能にすることができる。
【００８０】
検査工程中に、任意で、被験ヌクレオチドを含有する反応混合物とともに、ポリメラーゼ阻害剤を含めてもよい。そうすることで、後続の正しいヌクレオチドに結合した際に、核酸上のポリメラーゼが捕捉されるようになる。任意で、ポリメラーゼ阻害剤をピロリン酸類似体とする。任意で、ポリメラーゼ阻害剤をアロステリック阻害剤とする。任意で、ポリメラーゼ阻害剤をＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーとする。任意で、ポリメラーゼ阻害剤はポリメラーゼ中の触媒イオン結合部位と競合する。任意で、ポリメラーゼ阻害剤を逆転写酵素阻害剤とする。ポリメラーゼ阻害剤を、ＨＩＶ−１逆転写酵素阻害剤またはＨＩＶ−２逆転写酵素阻害剤としてもよい。ＨＩＶ−１逆転写酵素阻害剤を、（４／６−ハロゲン／ＭｅＯ／ＥｔＯ置換ベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）チアゾリジン−４−オンとしてもよい。
【００８１】
提供されている配列決定法では、組み込み工程の前に、後続の正しいヌクレオチドが同定され、組み込み工程において標識付き試薬及び／またはモニタリングを不要とすることができる。ゆえに、提供されている方法では、任意で、付着した検出可能タグまたは標識をヌクレオチドに含めない。任意で、ヌクレオチドに検出可能標識を含めたとしても、この方法では標識が検出されない。任意で、適正なヌクレオチドは検出可能標識を含有しないのに対し、不適正なヌクレオチドまたは後続の塩基に相補的でないヌクレオチドは、検出可能標識を含む。
【００８２】
組み込み工程に先立って、配列決定反応の検査工程を１回、２回、３回、４回またはそれ以上繰り返してもよい。検査工程及び組み込み工程を、鋳型核酸の所望の配列が得られるまで繰り返してもよい。
【００８３】
閉鎖複合体または安定化された閉鎖複合体の形成を用いることによって、配列決定サイクルにつき１つのヌクレオチドのみを鋳型核酸プライマーに確実に付加でき、この付加されたヌクレオチドが閉鎖複合体内に封鎖されるようになる。配列決定サイクルごとの、制御下での単一ヌクレオチドの組み込みによって、ホモポリマーリピートを含む核酸領域の配列決定精度が向上する。
【００８４】
反応混合物
核酸配列決定の反応混合物、または単に「反応混合物」は、典型的に、ポリメラーゼベースの核酸合成反応において一般的に存在する試薬を含む。反応混合物試薬としては、限定されないが、酵素（例えば、ポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、鋳型核酸、プライマー核酸、塩類、緩衝液、小分子、補因子、金属、及びイオンが挙げられる。イオンを、触媒イオン、二価触媒イオン、非触媒イオン、非共有金属イオン、またはこれらの組み合わせとしてもよい。反応混合物に、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、グルタミン酸カリウム、ＮＨ４Ｃｌ、またはＮＨ４ＨＳＯ４等の塩類を含めてもよい。反応混合物に、Ｍｇ２＋もしくはＭｎ２＋Ｍｇ酢酸塩、Ｃｏ２＋またはＢａ２＋等のイオン源を含めてもよい。反応混合物に、スズイオン、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、またはＥｕ＋３を含めてもよい。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＡＣＥＳ、ＭＥＳ、リン酸塩ベースの緩衝液、及び酢酸塩ベースの緩衝液を挙げることができる。反応混合物に、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のようなキレート剤を含めてもよい。任意で、反応混合物に架橋試薬を含めてもよい。本明細書中に提供されている反応混合物は、任意で、検査工程中に使用される反応混合物、及びヌクレオチドの組み込み中に使用される組み込み反応混合物であり。上記の薬剤のうちの１つ以上を含み得る。本明細書中では、反応混合物が検査中に使用された場合、検査反応混合物と呼ぶ場合がある。任意で、高濃度の塩類；高ｐＨ；１、２、３、４もしくはそれ以上の種類の非標識ヌクレオチド；グルタミン酸カリウム；キレート剤；ポリメラーゼ阻害剤；触媒金属イオン；非触媒金属イオン；またはこれらの任意の組み合わせを、検査反応混合物に含める。検査反応混合物に、１０ｍＭ〜１．６Ｍ、または１０ｍＭ〜１．６Ｍの間の任意の量のグルタミン酸カリウムを含めてもよい。任意で、触媒金属イオン；１、２、３、４もしくはそれ以上の種類のヌクレオチド（例えば、非標識ヌクレオチド）；塩化カリウム；非触媒金属イオン；またはこれらの任意の組み合わせを、組み込み反応混合物に含める。
【００８５】
任意で、本開示の技術による反応混合物は、検査工程中に閉鎖複合体の形成及び安定化を調節する。例えば、検査工程の反応条件は、任意で、ヌクレオチドがカプセル化されている閉鎖複合体の形成及び／または安定化に有利とし、二元複合体の形成及び／または安定化を阻止するものとすることができる。イオン強度、ｐＨ、温度等の配列決定反応パラメーター、またはこれらの任意の組み合わせを調節することによって、あるいは二元複合体不安定化剤を反応に添加することによって、ポリメラーゼと鋳型核酸との間の二元相互作用を操作できる。任意で、高塩（例えば、５０ｍＭ〜１５００ｍＭ）及び／またはｐＨ変化を利用して、二元複合体を不安定化させる。任意で、ヌクレオチドが存在するかどうかに関係なく、配列決定反応の検査工程中または組み込み工程中には、ポリメラーゼと鋳型核酸との間の二元複合体が形成される場合がある。任意で、反応条件は、閉鎖三元複合体の安定化及び二元複合体の不安定化に有利とされる。一例として、検査反応混合物のｐＨをｐＨ４．０〜ｐＨ１０．０に調整することによって、閉鎖三元複合体の安定化及び二元複合体の不安定化に有利とすることができる。任意で、検査反応混合物のｐＨをｐＨ４．０〜ｐＨ６．０とする。任意で、検査反応混合物のｐＨをｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０とする。
【００８６】
提供されている反応混合物、及び本明細書中に開示されている配列決定法によって、ヌクレオチドの化学的付加を制御しながら、後続の塩基の同一性を明らかにする方法で、ヌクレオチド及び鋳型核酸とポリメラーゼとの相互作用が促進される。任意で、この方法を、検出可能に標識されたヌクレオチドの不在下で、または標識が検出されない標識付きヌクレオチドの存在下で行う。
【００８７】
試験反応混合物条件下でポリメラーゼ鋳型核酸複合体内に封入されたプライミング済み鋳型核酸及びヌクレオチドに結合したポリメラーゼを含む閉鎖複合体の形成及び／または安定化を促進するための、反応混合物及び方法が、本明細書に記載されている。検査反応条件がヌクレオチドの組み込みを阻害または減衰させる可能性がある。任意で、プレケミストリー構造または三元複合体において、封入ヌクレオチドの組み込みが阻害され、複合体は安定化または捕捉される。任意で、封入ヌクレオチドが組み込まれ、後続のヌクレオチドの組み込みが阻害される。この場合、複合体は、プレトランスロケーション構造にて安定化または捕捉される。本明細書中に記載されている配列決定反応では、検査工程中に閉鎖複合体が安定化され、制御下でヌクレオチドの組み込みが可能となる。任意で、安定化された閉鎖複合体は、封入ヌクレオチドの組み込みを、検査工程中に過渡的に（例えば、複合体を検査してからヌクレオチドを組み込むため）、あるいは恒常的に（例えば、専ら検査のため）減衰させる複合体とされる。任意で、安定化された閉鎖複合体によって、封入ヌクレオチドの組み込みを許可する一方、後続のヌクレオチドの組み込みを許可しないようにする。任意で、閉鎖複合体を安定化させ、鋳型核酸中の後続の塩基が同定されるように、ヌクレオチドの存在下で鋳型核酸との任意のポリメラーゼ相互作用をモニタリングする。
【００８８】
任意で、封入ヌクレオチドによって、閉鎖複合体中の鋳型核酸への結合が著しく減少したかあるいは無効化された。任意で、封入ヌクレオチドを、後続の塩基において鋳型核酸に対して塩基対形成する。任意で、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、鋳型核酸またはこれらの任意の組み合わせの同一性は、封入ヌクレオチドと閉鎖複合体中の鋳型核酸との間の相互作用に影響を及ぼす。
【００８９】
任意で、封入ヌクレオチドを閉鎖複合体のポリメラーゼに結合させる。任意で、封入ヌクレオチドを閉鎖複合体のポリメラーゼに弱く会合させる。任意で、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、鋳型核酸またはこれらの任意の組み合わせの同一性は、封入ヌクレオチドと閉鎖複合体中のポリメラーゼとの間の相互作用に影響を及ぼす。所与のポリメラーゼについて、各ヌクレオチドは、ポリメラーゼに対する親和性が別のヌクレオチドとは異なる。任意で、この親和性は、鋳型核酸及び／またはプライマーに多少依存する。
【００９０】
閉鎖複合体は過渡的に形成される場合がある。任意で、封入ヌクレオチドは後続の正しいヌクレオチドである。一部の方法では、後続の正しいヌクレオチドの存在は、閉鎖複合体の安定化に多少寄与する。任意で、封入ヌクレオチドは後続の正しいヌクレオチドではない。
【００９１】
任意で、複数のプライミングされた鋳型核酸、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせを、検査反応条件に含める。任意で、１、２、３、４もしくはそれ以上の種類の異なるヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを、複数のヌクレオチドに含める。任意で、複数の鋳型核酸が、鋳型核酸のクローン母集団とされる。
【００９２】
閉鎖複合体の安定性を調節できる反応条件としては、限定されないが、触媒金属イオンの利用可能性、準最適または阻害性金属イオン、イオン強度、ｐＨ、温度、ポリメラーゼ阻害剤、架橋試薬、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。閉鎖複合体の安定性を調節できる反応試薬としては、限定されないが、組み込み不能ヌクレオチド、不適正なヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ポリメラーゼ、非伸張性重合開始部位を有する鋳型核酸、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００９３】
検査反応混合物としては、限定されないが、酵素を含む他の分子を挙げることができる。任意で、検査反応混合物には、核酸重合反応において一般的に存在する生体分子である任意の試薬が包含される。反応成分としては、限定されないが、塩類、緩衝液、小分子、金属、及びイオンが挙げられる。任意で、反応混合物の特性を、例えば、電気的に、磁気的に、及び／または振動を伴って操作できる。
【００９４】
ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体
本明細書中に記載されているヌクレオチドで、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ手順を実施するために有用なものとしては、天然ヌクレオチド、標識ヌクレオチド（例えば、外来性蛍光色素、または天然ヌクレオチド中には見出されない他の標識を含むヌクレオチド）、及びヌクレオチド類似体（例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド）が包含される。
【００９５】
本明細書中に記載されている技術に関連して使用可能なヌクレオチドの性質には柔軟性がある。ヌクレオチドには、その窒素含有塩基として、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルのいずれかが含まれる場合がある。任意で、ヌクレオチドは、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、ニトロピロール（３−ニトロピロール等）またはニトロインドール（５−ニトロインドール等）の塩基を含む。有用なヌクレオチドとしては、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＵＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ及びｄＵＭＰが包含されるが、これらに限定されるものではない。任意で、リン酸塩基は部分で修飾される。この部分は検出可能標識を含む場合がある。任意で、ヌクレオチドの３’ＯＨ基は部分で修飾される。この部分３’可逆的または不可逆的ターミネーターであり得る。ヌクレオチドはまた、ＤＮＡポリメラーゼの終結阻害剤、ジデオキシヌクレオチド、すなわちｄｄＮＴＰ（ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＵＴＰ）と略記される２’，３’ジデオキシヌクレオチドを含む場合がある。
【００９６】
任意で、検査工程の閉鎖複合体は、閉鎖複合体の安定化を促進するためヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドを含む。任意で、ヌクレオチド類似体は、窒素含有塩基と５炭素糖とリン酸基とを含み、ヌクレオチドの任意の成分が修飾及び／または置換される場合がある。ヌクレオチド類似体は、組み込み不能ヌクレオチドであり得る。組み込み不能ヌクレオチドは、配列決定方法が行われている間の任意の時点で組み込み可能になるように修飾することが可能である。
【００９７】
ヌクレオチド類似体としては、限定されないが、α−リン酸修飾ヌクレオチド、α−βヌクレオチド類似体、β−リン酸修飾ヌクレオチド、β−γヌクレオチド類似体、γ−リン酸修飾ヌクレオチド、ケージドヌクレオチド、またはｄｄＮＴＰが挙げられる。ヌクレオチド類似体の例は、その全容が本明細書中に参照により援用されている米国特許第８，０７１，７５５号に記載されている。
【００９８】
ヌクレオチド類似体は、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの組み込みを可逆的に防止するターミネーターを含む場合がある。或る種の可逆的ターミネーターは、３’−Ｏ−ブロックされた可逆的ターミネーターである。ここで、ターミネーター部分は、ヌクレオチドの５−炭素糖の３’−ＯＨ末端の酸素原子に連結されている。例えば、米国特許第７，５４４，７９４号及び米国特許第８，０３４，９２３号（これらの特許の開示内容は、本明細書において参照により援用されている）には、３’−ＯＨ基が３’−ＯＮＨ２基で置換された可逆的ターミネーターｄＮＴＰが記載されている。この種の可逆的ターミネーター部分は、便宜的に、ＮａＮＯ２を含有する酢酸緩衝液を用いて、除去できる（例えば、「脱ブロック」工程）。別のタイプの可逆的ターミネーターヌクレオチドは、欧州特許出願公開第１９７４０５７号に記載されている２’−修飾可逆的ターミネーターである。さらに別のタイプの可逆的ターミネーターは、３’非ブロック化可逆的ターミネーターであり、このターミネーター部分はヌクレオチドの窒素含有塩基に連結されている。例えば、米国特許第８，８０８，９８９号（その開示内容は本明細書において参照により援用されている）には、本明細書に記載されている方法に関連して使用可能な塩基修飾可逆的ターミネーターヌクレオチドの具体例が開示されている。本明細書中に記載されている方法と関連して同様に使用可能な他の可逆的ターミネーターとしては、米国特許第７，９５６，１７１号、米国特許第８，０７１，７５５号及び米国特許第９，３９９，７９８号（これらの米国特許の開示は参照により援用される）に記載されているものが挙げられる。ターミネーターを有するヌクレオチド類似体の総説については、例えば、Ｍｕ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  Ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＆  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１（１）：３４−４０（２０１３）を参照のこと。任意で、検査工程中に使用される１つ以上の天然ヌクレオチドは、組み込み工程中に組み込まれる第２のタイプのヌクレオチドで置換される。例えば、検査工程中に使用される反応混合物中に存在するヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分を含むヌクレオチド類似体（例えば、ヌクレオチド分子の塩基または糖に位置する）で置換される場合がある。
【００９９】
任意で、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの組み込みを不可逆的に防止するための、ターミネーターを有する修飾ヌクレオチド類似体が、ヌクレオチドの代わりに使用される。不可逆的ヌクレオチド類似体としては、ジデオキシヌクレオチド、ｄｄＮＴＰ（ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ）が挙げられる。ジデオキシヌクレオチドには、ポリメラーゼ媒介型の合成に必須とされるｄＮＴＰの３’−ＯＨ基が欠けている。
【０１００】
任意で、核酸重合反応の組み込み工程中にヌクレオチドが第２のヌクレオチド（プライマーの３’ＯＨ）と共有結合を形成するのを阻害または防止するための、ブロッキング部分を、組み込み不能ヌクレオチドに含める。このブロッキング部分を、ヌクレオチドから除去すれば、ヌクレオチドの組み込みが可能となる。
【０１０１】
任意で、閉鎖複合体中に存在するヌクレオチド類似体によって、閉鎖複合体が安定化される。任意で、ヌクレオチド類似体は組み込み不能とされる。任意で、ヌクレオチド類似体を放出して、天然のヌクレオチドを組み込む。任意で、閉鎖複合体を放出し、ヌクレオチド類似体を修飾して、修飾ヌクレオチド類似体を組み込む。任意で、閉鎖複合体中のヌクレオチド類似体を修飾及び／または不安定化する反応条件下で、閉鎖複合体を放出する。
【０１０２】
任意で、閉鎖複合体中に存在するヌクレオチド類似体を組み込んで閉鎖複合体が安定化させる。閉鎖複合体は、ヌクレオチド類似体によって、または、例えば本明細書中に開示されているいずれかの安定化方法によって、安定化される場合がある。任意で、ヌクレオチド類似体に、後続のヌクレオチドの組み込みを許可させないようにする。例えば、本明細書中に記載されている任意の方法で閉鎖複合体を放出させ、ヌクレオチド類似体に修飾を施すことが可能である。ヌクレオチド類似体に修飾を施したことによって、このヌクレオチド類似体の３’末端への後続ヌクレオチドの組み込みが可能となる。
【０１０３】
任意で、検査工程中には、反応混合物中にヌクレオチド類似体が存在する。検査工程中には、例えば、１、２、３、４またはそれより多くのヌクレオチド類似体が反応混合物中に存在する。任意で、組み込み工程中に、ヌクレオチド類似体を置換、希釈、または封鎖する。任意で、ヌクレオチド類似体を天然ヌクレオチドで置換する。天然ヌクレオチドは、後続の正しいヌクレオチドを含み得る。任意で、組み込み工程中に、ヌクレオチド類似体に修飾を施す。修飾されたヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチドと類似するかまたは同じであり得る。
【０１０４】
任意で、ヌクレオチド類似体のポリメラーゼに対する結合親和性は、天然ヌクレオチドとは異なる。任意で、ヌクレオチド類似体の後続の塩基との相互作用は、天然ヌクレオチドとは異なる。ヌクレオチド類似体及び／または組み込み不能ヌクレオチドは、鋳型核酸の相補的塩基と塩基対合する場合がある。
【０１０５】
任意で、ヌクレオチド類似体は、ポリメラーゼに融合された、修飾ヌクレオチドまたは天然ヌクレオチドとされる。任意で、複数のヌクレオチド類似体は、複数のポリメラーゼに対する融合を含み、各ヌクレオレオチド類似体は異なるポリメラーゼを含む。
【０１０６】
ヌクレオチドは、二元複合体の形成に対してよりも寧ろ閉鎖複合体の形成に有利となるように修飾される場合がある。ポリメラーゼに対して高親和性を有するように対象のヌクレオチドを選択または修飾することによって、そのポリメラーゼが、先にヌクレオチドに結合されてから、鋳型核酸に結合されるようになる。
【０１０７】
閉鎖複合体中のポリメラーゼを捕捉するヌクレオチド修飾はいずれも、本明細書中に開示されている方法で使用できる。ヌクレオチドの捕捉は永続的または過渡的であり得る。任意で、ヌクレオチド類似体は、閉鎖複合体を安定化させる手段とはされない。ヌクレオチド類似体を利用した反応では、任意の閉鎖複合体の安定化法を組み合わせて使用できる。
【０１０８】
任意で、閉鎖複合体の安定化を可能にするヌクレオチド類似体は、通常閉鎖複合体を放出する反応条件と組み合わせて用いる。この条件としては、限定されないが、放出試薬（例えば、マグネシウムまたはマンガンのような、触媒金属イオン）の存在が挙げられる。任意で、閉鎖複合体は、触媒金属イオンの存在下でさえも、安定化される。任意で、閉鎖複合体は、ヌクレオチド類似体の存在下でさえも、放出される。任意で、閉鎖複合体の安定化は、安定化試薬及び／または放出試薬の濃度及び／または同一性、ならびにこれらの任意の組み合わせに、多少依存する。任意で、ヌクレオチド類似体を用いた閉鎖複合体の安定化は、閉鎖複合体を安定化するように機能する追加の反応条件と組み合わせて用いられる。これらの反応条件としては、限定されないが、触媒金属イオンの封鎖、除去、還元、省略、及び／キレート化；ポリメラーゼ阻害剤、架橋剤の存在；ならびにこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１０９】
任意で、１つ以上のヌクレオチドが識別タグ及び／または検出可能タグまたは標識で標識される場合があるが、そのようなタグまたは標識は、検査中、塩基の同定中、または塩基の組み込み中に検出されないので、本明細書に開示されている配列決定方法が行われている間にも検出されない。これらのタグどうしは、蛍光、ラマンスペクトル、電荷、質量、屈折率、発光、長さ、または他の任意の測定可能な特性における差異によって区別できる。鋳型核酸上の相補的塩基を正しく同定できる程度に、ポリメラーゼ−核酸複合体への結合の忠実度が十分に維持されている限り、タグをヌクレオチド上の１つ以上の異なる位置に付着させることができる。任意で、タグをヌクレオチドの核酸塩基位置に付着させる。好適な反応条件下では、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸との閉鎖複合体の中にタグ化ヌクレオチドを封入できる。あるいは、タグを、ヌクレオチドのγリン酸塩位置に付着させる。
【０１１０】
ポリメラーゼ
開示されているｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ技法を遂行するのに有用なポリメラーゼとしては、突然変異体、組み換え体、融合体、遺伝子改変体、化学的改変体、合成体、及び類似体を含むが、これらに限定されない、天然起源のポリメラーゼならびにその修飾された変種が挙げられる。天然起源のポリメラーゼ及びその修飾された変種は、重合反応を触媒する能力を保持するポリメラーゼに限定されない。任意で、天然起源の及び／またはそれらの修飾されたバリエーションは、重合反応を触媒する能力を保持する。任意で、天然起源の及び／または修飾されたバリエーションは、核酸への結合親和性の増大、核酸への結合親和性の減少、触媒速度の向上、触媒速度の低下等、ＤＮＡを配列決定する能力を増強する特殊な特性を有する。突然変異ポリメラーゼには、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸（天然起源または非天然起源のもの）で置換されたポリメラーゼ、１つ以上のアミノ酸が挿入されたかまたは欠失したポリメラーゼが包含される。修飾されたポリメラーゼには、ポリメラーゼの存在及び相互作用をモニタリングするために使用できる外部タグが含まれているポリメラーゼが包含される。任意で、ポリメラーゼからの内在性シグナルを用いて、これらポリメラーゼの存在及び相互作用をモニタリングできる。したがって、ポリメラーゼからの内在性シグナルの検出によるポリメラーゼ、ヌクレオチド及び鋳型核酸の相互作用のモニタリングを、提供されている方法に含めてもよい。任意で、内在性シグナルは光散乱信号とされる。例えば、内在性シグナルには、トリプトファンのような特定のアミノ酸の天然の蛍光が包含され、ポリメラーゼからの内在性シグナルの変化は、閉鎖複合体の形成を示唆するものであり得る。したがって、提供されている方法において、ポリメラーゼは非標識ポリメラーゼであり、そのポリメラーゼに関連する検出可能標識の不在下でモニタリングが行われる。特定の反応条件下で修飾されたポリメラーゼまたは天然起源のポリメラーゼによっては、単一ヌクレオチドのみを組み込むものもあれば、単一ヌクレオチドが組み込まれた後にプライマー−鋳型に結合されたままに維持されるものもある。任意で、ポリメラーゼのサムドメインとフィンガードメインは、ポリメラーゼの閉鎖形態において物理的に近接していることから、過渡性または共有結合性架橋を形成し得る。例えば、サムドメインとフィンガードメイン上の好適な位置で、天然システインまたは操作されたシステインによって、架橋が形成される場合がある。
【０１１１】
本明細書中で使用されているポリメラーゼ及びその変種という用語はまた、互いに連結された少なくとも２つの部分を含む融合タンパク質を指す。この場合、核酸鎖へのヌクレオチドの重合を触媒できるペプチドを含む１つの部分が、第２の部分（例えばレポーター酵素またはプロセシビティー修飾ドメイン）を含む別の部分に連結されている。例えば、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼは核酸重合ドメインとチオレドキシン結合ドメインとを含み、ここでチオレドキシン結合はポリメラーゼのプロセシビティーを増強する。チオレドキシン結合が存在しない場合、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼは、プロセシビティーがわずか１ないし少数の塩基に抑えられたディストリビューティブポリメラーゼとなる。ＤＮＡポリメラーゼは詳細が異なる一方、フィンガー、パーム及びサムと呼ばれる特定領域を有する手の全体的な形状が類似しているとともに、サムドメイン及び／またはフィンガードメインの移動をはじめとする、核酸合成中の全体的な構造変化も類似している。
【０１１２】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、細菌性ＤＮＡポリメラーゼ、真核性ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ファージＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。細菌性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ（Ｃｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｃｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼならびにＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓｏ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片が挙げられる。真核性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、ζ、λ、σ、μ、及びκ、ならびにＲｅｖｌポリメラーゼ（末端デオキシシチジルトランスフェラーゼ）及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が挙げられる。ウイルスＤＮＡポリメラーゼには、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＧＡ−ｌ、ｐｈｉ−２９様ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＺＡ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ−１５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｐ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼが包含される。他のＤＮＡポリメラーゼには、熱安定性及び／または好熱性のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、以下から単離されたＤＮＡポリメラーゼが挙げられる：Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｉｌｌｉｇｉ（Ｔｚｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓｕ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｕｒｂｏ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属ＧＢ−Ｄポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属ＪＤＦ−３（ＪＤＦ−３）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ（Ｔｇｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属  ｇｏ  Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａ���ｃｈｉｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＯＫ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ．Ｔｏｋ  Ｐｏｌ）；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡポリメラーゼ；ならびにヘテロ二量体ＤＮＡポリメラーゼＤＰ１／ＤＰ２。また、エンジニアリング及び修飾を施されたポリメラーゼも、本開示の技術に関連して有用とされる。例えば、超好熱性海洋古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎの修飾版（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ）を使用することができる。
【０１１３】
ＲＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、及びＫｌｌポリメラーゼ）；真核性ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、及びＲＮＡポリメラーゼＶ）；ならびに古細菌ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０１１４】
逆転写酵素としては、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＰＤＢ  １ＨＭＶ）由来のＨＩＶ−１逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス２型由来のＨＩＶ−２逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、鳥骨髄芽球症ウイルス由来のＡＭＶ逆転写酵素、及び真核生物染色体のテロメアを維持するテロメラーゼ逆転写酵素が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
任意で、適切な発光トリガーの存在下にて、閉鎖複合体の形成が、安定な発光シグナルとしてモニタリングされるように、ポリメラーゼを化学発光タグで標識する。不適正なヌクレオチドの存在下にてポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用が不安定な場合は、後続の正しいヌクレオチドの存在下にて形成される閉鎖複合体と比較してシグナルが多少弱くなる。加えて、発光をトリガーする前の洗浄工程では、安定な閉鎖複合体に結合されていないすべてのポリメラーゼ分子を除去できる。
【０１１６】
任意で、ポリメラーゼを光散乱タグで標識することで、閉鎖複合体の形成が、安定な光散乱シグナルとしてモニタリングされるようになる。不適正なヌクレオチドの存在下にてポリメラーゼと核酸との相互作用が不安定な場合は、後続の正しいヌクレオチドの存在下にて形成される閉鎖複合体と比較してシグナルが多少弱くなる。
【０１１７】
任意で、ポリメラーゼをプラズモニックナノ粒子タグで標識して、閉鎖複合体の不在下にてまたは不適正なヌクレオチドを含む閉鎖複合体の存在下にて、閉鎖複合体の形成を、プラズモニック共鳴とは異なるプラズモニック共鳴のシフトとしてモニタリングする。プラズモン共鳴の変化は、閉鎖複合体の局部的な誘電環境の変化に起因する場合もあれば、あるいはクローン的に増幅された核酸分子のクラスター上でのプラズモニックナノ粒子の同期的凝集に起因する場合もあれば、あるいは閉鎖複合体の構成においてプラズモンにそれぞれ異なる影響を及ぼす別の手段である場合もある。
【０１１８】
任意で、ポリメラーゼをラマン散乱タグで標識することで、閉鎖複合体の形成が、安定なラマン散乱シグナルとしてモニタリングされるようになる。不適正なヌクレオチドの存在下にてポリメラーゼと核酸との相互作用が不安定な場合は、後続の正しいヌクレオチドの存在下にて形成される閉鎖複合体と比較してシグナルが多少弱くなる。
【０１１９】
任意で、後続の正しいヌクレオチドを、ヌクレオチドに対して高親和性を有するように選択または修飾されたポリメラーゼ上のタグで同定する。それによって、そのポリメラーゼが、先にヌクレオチドに結合されてから、鋳型核酸に結合されるようになる。例えば、アフリカブタ熱ウイルス由来のＤＮＡポリメラーゼＸは、ポリメラーゼが最初にヌクレオチドに結合し、次に鋳型核酸に結合するように、基質結合の順序が改変される。任意で、別々の区画内の各タイプのヌクレオチドとともにポリメラーゼをインキュベートし、各区画に異なるタイプのヌクレオチドを収容してから、インキュベートされるヌクレオチドに応じてそれぞれ異なるタグでポリメラーゼを標識する。これらの条件では、無標識ヌクレオチドが、別の標識が付されたポリメラーゼに結合する。ポリメラーゼを、各ヌクレオチド型に結合された同じ種類のポリメラーゼとしてもよいし、あるいは各ヌクレオチド型に結合された異なるポリメラーゼとしてもよい。示差的に標識されたポリメラーゼ−ヌクレオチド複合体は、配列決定反応の任意の工程に同時的に追加される場合がある。各ポリメラーゼ−ヌクレオチド複合体は、後続の塩基がポリメラーゼ−ヌクレオチド複合体中のヌクレオチドに相補的な、鋳型核酸に結合する。後続の正しいヌクレオチドは、そのヌクレオチドを担持するポリメラーゼ上のタグで同定される。組み込み不能条件及び／または検査条件下では、標識付きポリメラーゼ−ヌクレオチド複合体が、後続の鋳型塩基に対して照合を実行する場合があり、いったん後続の鋳型塩基の同一性が判別され、複合体が不安定化、除去、封鎖、及び／または希釈してから、確実に１つのヌクレオチドのみが組み込まれるように別個の組み込み工程を実行する。
【０１２０】
ポリメラーゼ上に検出可能タグを導入する一般的な方法では、任意で、ポリメラーゼの非活性領域内に存在するアミンまたはシステインへの化学的抱合を含む。そのような抱合法は当該技術分野において周知である。非限定的な例として、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）は、酵素上に見つかるアミン基を標識する用途に汎用されている。システインは、チオールまたはマレイミド基と容易に反応するのに対し、カルボキシル基はＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）で活性化することによってアミンと反応し得る。任意で、Ｎ末端アミンのみが反応性であるｐＨ範囲（例えばｐＨ７）では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応を用い、それによりポリメラーゼ１つにつき１つのタグが付加する。
【０１２１】
任意で、ポリメラーゼに付着させるタグを電荷タグとし、鋳型核酸周辺の局所電荷密度の変化を測定することにより、電気的手段を介して、安定な閉鎖複合体の形成を検出できる。電荷を検出するための方法は、当該技術分野において周知であり、とりわけ電界効果トランジスタ、誘電分光法、インピーダンス測定、及びｐＨ測定等の方法が挙げられる。電界効果トランジスタとしては、イオン感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）、電荷変調電界効果トランジスタ、絶縁ゲート電界効果トランジスタ、金属酸化物半導体電界効果トランジスタのほか、半導体単層カーボンナノチューブを用いて製造された電界効果トランジスタが挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
任意で、電荷タグは、約４未満、または約１０を超える等電点を有するペプチドタグとされる。任意で、ペプチドタグを含むポリメラーゼの等電点総数は、約５未満または約９を超えるものとされる。電荷タグは、正または負に荷電された任意の部分であり得る。電荷タグは、質量、及び／または染料のような標識を含む追加の部分を含む場合がある。任意で、電荷タグは、ｐＨの変化等の特定の反応条件の下でのみ、正または負の電荷を有するものとされる。
【０１２３】
ポリメラーゼを、フルオロフォア及び／または消光剤で標識してもよい。任意で、核酸を、フルオロフォア及び／または消光剤で標識してもよい。任意で、１つ以上のヌクレオチドを、フルオロフォア及び／または消光剤で標識してもよい。例示的なフルオロフォアとしては、限定されるものではないが、蛍光性ナノ結晶；量子ドット；ジクロロ［Ｒ１１０］、ジクロロ［Ｒ６Ｇ］、ジクロロ［ＴＡＭＲＡ］、ジクロロ［ＲＯＸ］等をはじめとするＤ−ローダミン受容体色素；フルオレセイン、６−ＦＡＭ等をはじめとするフルオレセイン供与体色素；Ｃｙ３Ｂ等のシアニン色素；Ａｌｅｘａ色素、ＳＥＴＡ色素、Ｃｙ３Ｂ等とＦＲＥＴ対を形成するａｔｔｏ  ６４７Ｎ等のＡｔｔｏ色素等が挙げられる。フルオロフォアとしては、限定されるものではないが、ＭＤＣＣ（７−ジエチルアミノ−３−［（［（２−マレイミジル）エチル］アミノ）カルボニル］クマリン）、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、ＴＭＲ、ＲＯＸ、テキサスレッド、Ｃｙ５、ＬＣレッド７０５及びＬＣレッド６４０が挙げられる。フルオロフォア、ならびにその使用方法（ポリメラーゼ及び他の分子への付着を含む）は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ  Ｃａｌｉｆ．）及びＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  Ｇｕｉｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に記載されており、この文献の全容は本明細書において参照により援用されている。例示的な消光剤としては、限定されるものではないが、ＺＥＮ、ＩＢＦＱ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＤＤＱ−Ｉ、ＤＤＱ−１１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｑｘｌクエンチャー、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、及びＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１が挙げられる。
【０１２４】
任意で、ポリメラーゼの重合能力または忠実度に影響を及ぼすことなしに、立体構造感受性色素をポリメラーゼの活性部位の近くに付着させることで、立体構造の変化、あるいは閉鎖複合体の形成による極性環境の変化を、色素の蛍光特性もしくは吸光特性の変化として反映させることができる。一般的なフルオロフォア、例えばＣｙ３及びフルオレセインは、閉鎖複合体の形成を二量体のポリマー−核酸複合体とは明確に区別できる程度に、ポリメラーゼ結合及び閉鎖複合体の形成に対して強いソルバトクロマティック（ｓｏｌｖａｔｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ）応答を有することが公知である。任意で、閉鎖複合体を、立体構造的に感受性の色素から発せられる蛍光シグナルまたは吸収シグナルにおける差異に基づいて、二成分系とは区別できる。任意で、ソルバトクロマティック色素を使用して、立体構造遷移をモニタリングすることができる。その際、立体構造の変化によって誘発された局部極性環境の変化をレポーターシグナルとして使用できる。ソルバトクロマティック色素としては、限定されるものではないが、ライヒャルト（Ｒｅｉｃｈａｒｔ）色素、ＩＲ４４、メロシアニン色素（例えば、メロシアニン５４０）、４−［２−（Ｎ−置換−１，４−ヒドロピリジン−４−イリジン）エチリデン］シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−オン、赤色ピラゾロン色素、アゾメチン染料、インドアニリン染料、ジアザメロシアニン染料、インジゴによって例示されるインジゴイド染料等、ならびにこれらの混合物が挙げられる。色素またはフルオロフォアをポリメラーゼの特定の部位に導入する方法は、当該技術分野において周知である。非限定的な例として、色素を用いたＴ７  ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的標識の手順は、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，著“Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｔ７  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８４：１３６−１４４（２００９）に記載されており、その全容は本明細書において参照により援用されている。
【０１２５】
任意で、反応を妨げることなしに、閉鎖複合体の形成を感知できる位置で、ポリメラーゼをフルオロフォアで標識する。ポリメラーゼは、天然ポリメラーゼまたは修飾ポリメラーゼである場合がある。修飾ポリメラーゼには、１つ以上のアミノ酸の突然変異、付加及び／または欠失を有するものが包含される。任意で、全部とは限らないが１つ以上のシステインアミノ酸が、アラニン等の別のアミノ酸に変異する。この場合、残りの１つ以上のシステインを、フルオロフォアへの部位特異的抱合用に使用する。あるいは、１つ以上のアミノ酸は、フルオロフォア抱合に適した反応性アミノ酸（例えば、システイン）、または第一級アミンを含むアミノ酸に変異される。
【０１２６】
任意で、適正なヌクレオチドの存在下にてポリメラーゼと鋳型核酸とが結合すると、蛍光の低減を誘発し得るのに対し、不適正なヌクレオチドとの結合は、蛍光の増加を引き起こす。適正なヌクレオチドの存在下にてポリメラーゼと鋳型核酸とが結合すると、蛍光の増加を誘発し得るのに対し、不適正なヌクレオチドとの結合は、蛍光の低減を引き起こす。蛍光シグナルを用い、ヌクレオチド誘導性立体構造変化のキネティクスをモニタリングし、鋳型核酸配列中の後続の塩基を同定できる。
【０１２７】
任意で、ポリメラーゼに由来する散乱シグナル、またはポリメラーゼに付着されたタグ、例えばナノ粒子タグを介して、ポリメラーゼ／核酸の相互作用をモニタリングできる。
【０１２８】
閉鎖複合体の形成及び操作のための条件
本明細書中に用いられている閉鎖複合体は、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、ヌクレオチドとを含む三元複合体であり得る。閉鎖複合体は、ヌクレオチドが封鎖されてはいるが組み込まれていない、プレケミストリー構造となる場合もある。代替的に、閉鎖複合体は、プライミングされた鋳型核酸中のプライマーの３’末端とのホスホジエステル結合の形成によってヌクレオチドが組み込まれる、プレトランスロケーション構造となる場合もある。触媒金属イオンの不在下にて、または触媒金属イオンのレベル欠如下にて閉鎖複合体が形成され、それによって、化学的組み込みなしに、後続の正しいヌクレオチドをポリメラーゼ活性部位内に物理的に封鎖できる。任意で、封鎖ヌクレオチドを、組み込み不能ヌクレオチドとしてもよい。触媒金属イオンの存在下で、閉鎖複合体が形成される場合があり、この場合、閉鎖複合体は組み込まれたヌクレオチド類似体を含むが、ＰＰｉは放出機能を有さない。この場合、閉鎖複合体は、プレトランスロケーション構造にて安定化される。任意で、ポリメラーゼを化学的に架橋することによってプレトランスロケーション構造を安定化する。任意で、閉鎖複合体を、外部手段によって安定化させてもよい。場合によっては、小分子、または抗体もしくはアプタマーのような巨大分子のアロステリック結合を介して閉鎖複合体を安定化させる場合もある。任意で、高親和性を持つ活性部位の近くに結合するピロリン酸類似体を介して、ポリメラーゼのトランスロケーションを防いで、閉鎖複合体を安定化させてもよい。
【０１２９】
本明細書において、安定化された閉鎖複合体または安定化された三元複合体とは、プライミングされた鋳型核酸の重合開始部位（プライマーの３’末端）にて、閉構造におけるサムドメインとフィンガードメインとの架橋、開構造へのポリメラーゼの戻りを防ぐアロステリック阻害剤の結合、プレトランスロケーション工程にてポリメラーゼを捕捉するピロリン酸類似体の結合、ポリメラーゼの活性部位における触媒金属イオンの不在、ならびに触媒金属イオンの代用としてのニッケル、スズ及びＳｒ２＋等の金属イオンの添加をはじめとする１つの手段または手段を併用して捕捉されたポリメラーゼを指す。このため、ヌクレオチドが組み込まれた後でさえも、ポリメラーゼを重合開始部位に捕捉させることが可能である。したがって、ポリメラーゼは、プレケミストリー構造、プレトランスロケーション工程、ポストトランスロケーション工程にて捕捉される場合もあれば、あるいはこれらの任意の中間工程にて捕捉される場合もある。このようにして、後続の正しいヌクレオチドまたは塩基の十分な検査及び同定が可能となる。
【０１３０】
本明細書に記載されているように、ポリメラーゼベースの、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ反応は、一般に、ポリメラーゼ、及びプライミングされた鋳型核酸の後続の塩基に相補的である場合もあればあるいは相補的でない場合もある１種以上のヌクレオチドを、プライミングされた鋳型核酸に対し提供することと；プレケミストリー構造においてプライミングされた鋳型核酸へのヌクレオチドの化学的組み込みが無効にされるかまたは厳格に阻止されるか、あるいは１つ以上の相補的なヌクレオチドの組み込みがプライマーのプライムの３’末端で起こる条件下で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸との相互作用を検査することと；を含む。任意で、ヌクレオチドの組み込みの前に、安定化剤を使用してプレケミストリー構造を安定化し、別個の組み込み工程で、検査工程に従って、プライマーの３’末端に単一ヌクレオチドを組み込むことが好ましい。任意で、単一ヌクレオチドの組み込みが行われた場合、プレトランスロケーション構造を安定化することによって、検査を促進し、且つ／あるいは後続のヌクレオチドの組み込みを防止することが可能である。
【０１３１】
上記したように、本明細書に記載されている核酸配列決定方法には、検査工程が含まれる。検査工程は、１つ以上のヌクレオチドを含む反応混合物中のプライミングされた鋳型核酸の重合開始部位にポリメラーゼを結合させることと；相互作用をモニタリングすることと；を含む。任意で、ポリメラーゼによる封入ヌクレオチドの組み込みを減衰または阻害する条件下にて、ポリメラーゼ−プライミングされた鋳型核酸の複合体中にヌクレオチドが封鎖され、閉鎖複合体が形成される。任意で、安定化剤を添加して、後続の正しいヌクレオチドの存在下で三元複合体を安定化させる。この閉鎖複合体は、安定化された立体構造、またはポリメラーゼが捕捉されたプレケミストリー構造にある。閉鎖複合体によって、封入ヌクレオチドの組み込みを許可する一方、後続のヌクレオチドの組み込みを許可しないようにする。この閉鎖複合体は、安定化された立体構造、または捕捉されたプレトランスロケーション構造にある。任意で、ポリメラーゼドメインの架橋、ポリメラーゼの核酸への架橋、小分子、不競合阻害剤、競合阻害剤、非競合阻害剤、及び変性によるアロステリック阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を含むがこれらに限定されない１つの手段または手段の組み合わせを用い、ポリメラーゼを閉鎖複合体内の重合部位に捕捉し、捕捉された閉鎖複合体の形成によって、核酸鋳型上の後続の塩基の同一性に関する情報を提供する。
【０１３２】
任意で、捕捉されたまたは安定化された立体構造から閉鎖複合体を解放し、鋳型核酸プライマーの３’末端へのヌクレオチドの組み込みを可能にする。反応条件の組成を調節することによって、閉鎖複合体を不安定化及び／または放出させる場合もある。加えて、電気的手段、磁気的手段及び／または機械的手段によって閉鎖複合体を不安定化することもできる。機械的手段には、例えば、超音波攪拌を用いた機械的攪拌が含まれる。機械的振動によって、閉鎖複合体を不安定化し、ＤＮＡへのポリメラーゼの結合を抑制する。このようにして、検査反応混合物を組み込み混合物で置換する洗浄工程ではなく、機械的な攪拌を用い、鋳型核酸からポリメラーゼを除去し、工程ごとに単一ヌクレオチドの添加を伴う連続組み込み工程を周期的に繰り返すことができる。
【０１３３】
閉鎖複合体の安定化もしくは閉鎖複合体の放出反応条件、及び／または方法の任意の組み合わせを併用できる。例えば、閉鎖複合体を放出するように機能する触媒イオンとの検査反応では、閉鎖複合体を安定化させるポリメラーゼ阻害剤が存在する場合がある。先に述べた例において、閉鎖複合体の安定化または放出は、ポリメラーゼ阻害剤の特性及び濃度、触媒金属イオンの濃度、反応混合物の他の試薬及び／または条件、ならびにこれらの任意の組み合わせに依存する場合がある。
【０１３４】
プライミングされた鋳型核酸中のプライマーの３’末端へのヌクレオチドの共有結合が減衰される反応条件下にて、閉鎖複合体が安定化される場合がある。任意で、閉鎖複合体は、プレケミストリー構造または三元複合体にあるものとされる。任意で、閉鎖複合体は、プレトランスロケーション構造とされる。閉鎖複合体の放出、及び／または反応混合物中のプライマーへのヌクレオチドの化学的組み込みを可能にする触媒金属イオンの利用可能性を調節することによって、この閉鎖複合体の形成を開始し且つ／あるいは安定化させることができる。例示的な金属イオンとしては、限定されるものではないが、マグネシウム、マンガン、コバルト、及びバリウムが挙げられる。触媒イオンを、任意の調合物、例えば、ＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯ２）２、及びＭｎＣｌ２等の塩類としてもよい。
【０１３５】
配列決定反応では、ポリメラーゼ及び／またはヌクレオチドに基づいて、触媒金属イオンの選択及び／または濃縮を行うことができる。例えば、ＨＩＶ逆転写酵素は、ヌクレオチドの組み込みにマグネシウムを利用する（Ｎ  Ｋａｕｓｈｉｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１１５３６−１１５４６（１９９６）、及びＨ  Ｐ  Ｐａｔｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：５３５１−５３６３（１９９５）、これらの全容は本明細書において参照により援用されている）。マグネシウム対マンガンを用いた閉鎖複合体の形成の速度は、ポリメラーゼ及びヌクレオチドの同一性に応じて異なる場合がある。そのため、閉鎖複合体の安定性は、触媒金属イオン、ポリメラーゼ、及び／またはヌクレオチドの同一性に応じて異なってくる場合がある。さらに、閉鎖複合体の安定化に必要な触媒イオンの濃度は、触媒金属イオン、ポリメラーゼ、及び／またはヌクレオチドの同一性に応じて変動する可能性があるが、本明細書中に提供される指針を用いて容易に定量できる。例えば、或る金属イオンの触媒イオン濃度が高い場合にヌクレオチドの組み込みが起こる場合があるが、同じ金属イオンの濃度が低い場合にはヌクレオチドの組み込みが起こらない。あるいはその逆も同様である。したがって、金属イオンの同一性、金属イオンの濃度、ポリメラーゼの同一性、及び／またはヌクレオチドの同一性を修飾することにより、制御下での検査反応条件が可能となる。
【０１３６】
配列決定反応の検査工程中に、触媒金属イオンを封鎖、除去、還元、省略、及び／またはキレート化し、閉鎖複合体を形成し且つ／あるいは安定化させることによって、閉鎖複合体の放出及び／または化学的組み込みが起こらないようにするができる。ヌクレオチドの組み込みに触媒金属イオンを利用できないようにする任意の手順（例えば、ＥＤＴＡ及び／またはＥＧＴＡの使用）を、キレート化に含める。還元は、反応混合物中の触媒金属イオン濃度を希釈することを含む。反応混合物を、希釈するかまたは非触媒イオンを含む溶液で置換できる。これにより、閉鎖複合体の形成は可能になるが、ヌクレオチドの組み込みは阻害される。非触媒イオンとしては、限定されるものではないが、カルシウム、ストロンチウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ロジウム及びストロンチウムが挙げられる。任意で、検査反応において、閉鎖複合体の形成を促進することを目的に、Ｎｉ２＋が提供される。任意で、検査反応において、閉鎖複合体の形成を促進することを目的に、Ｓｒ２＋が提供される。任意で、非触媒金属イオン及び触媒金属イオンは両方とも、一方のイオンが他方のイオンよりも高い有効濃度にて存在する、反応混合物中に存在する。提供されている方法において、コバルトのような非触媒イオンは、高濃度で触媒作用的になる（すなわち、ヌクレオチドの組み込みを促進する）可能性がある。このようにして、任意で、低濃度の非触媒金属イオンを使用して三元複合体の形成を促進し、高濃度の非触媒金属イオンを使用して組み込みを促進する。
【０１３７】
検査条件の下で、非触媒イオンを反応混合物に添加してもよい。反応に既にヌクレオチドが含まれている場合もある。任意で、非触媒イオンを１つ以上のヌクレオチドと複合体化し、複合体化されたヌクレオチドを反応混合物に添加する。高温（約８０℃）にてヌクレオチドと非触媒イオンとを混合することによって、非触媒イオンをヌクレオチドと複合体化できる。例えば、クロムヌクレオチド複合体を混合物に添加することによって、閉鎖複合体の形成及び安定化が促進される場合もある。任意で、クロムヌクレオチド複合体は、クロム単座、二座または三座複合体である。任意で、クロムヌクレオチド複合体は、α単座、またはβ−γ−二座ヌクレオチドとされる。
【０１３８】
任意で、Ｓｒ２＋を含む反応条件では、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、ヌクレオチドとの間に閉鎖複合体を形成し、Ｓｒ２＋によって閉鎖複合体の形成を促進する。Ｓｒ２＋を存在させることで、不適正なヌクレオチドを含む複合体の形成に対してよりも寧ろ、後続の正しいヌクレオチドを含む閉鎖複合体の形成に有利とすることができる。Ｓｒ２＋イオンは、約０．０１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度にて存在し得る。任意で、Ｓｒ２＋は、１０ｍＭのＳｒＣｌ２として存在する。検査条件下で閉鎖複合体の形成をモニタリングすることによって、閉鎖複合体の鋳型核酸中の後続の塩基を同定する。Ｓｒ２＋の存在下でｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）の各々に対するポリメラーゼの親和性（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂｓｔのクレノウ断片）が異なる可能性がある。したがって、ポリメラーゼ鋳型核酸のｄＮＴＰに対する結合親和性を測定することを検査に含める場合があり、結合親和性は鋳型核酸中の後続の塩基を示す。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸との間の二元相互作用を不安定化させる条件下で、結合相互作用を行ってもよい。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、後続の正しいヌクレオチドとの間の三元相互作用を安定化させる条件下で、結合相互作用を行ってもよい。検査後、洗浄工程で、非結合ヌクレオチドを除去し、Ｍｇ２＋を反応物に添加することによって、ピロリン酸（ＰＰｉ）開裂及びヌクレオチドの組み込みを誘導する。任意で、洗浄工程では、Ｓｒ２＋を含めることによって、三元複合体の安定性を維持し、三元複合体の解離を防止する。所望の配列の読取り長が得られるまで、反応を繰り返すことができる。
【０１３９】
任意で、Ｎｉ２＋を含む反応条件では、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、ヌクレオチドとの間に閉鎖複合体を形成し、Ｎｉ２＋によって閉鎖複合体の形成を促進する。Ｎｉ２＋を存在させることで、不適正なヌクレオチドを含む複合体の形成に対してよりも寧ろ、後続の正しいヌクレオチドを含む閉鎖複合体の形成に有利とすることができる。Ｎｉ２＋イオンは、約０．０１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度にて存在し得る。任意で、Ｎｉ２＋は、１０ｍＭのＮｉＣｌ２として存在する。検査条件下で閉鎖複合体の形成をモニタリングすることによって、閉鎖複合体の鋳型核酸中の後続の塩基を同定する。Ｓｒ２＋の存在下でｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）の各々に対するポリメラーゼの親和性（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂｓｔのクレノウ断片）が異なる可能性がある。したがって、ポリメラーゼ鋳型核酸のｄＮＴＰに対する結合親和性を測定することを検査に含める場合があり、結合親和性は鋳型核酸中の後続の塩基を示す。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸との間の二元相互作用を不安定化させる条件下で、結合相互作用を行ってもよい。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、後続の正しいヌクレオチドとの間の三元相互作用を安定化させる条件下で、結合相互作用を行ってもよい。検査後は、洗浄によって、非結合ヌクレオチド及びポリメラーゼを除去し、Ｍｇ２＋を反応物に添加することによって、ピロリン酸（ＰＰｉ）開裂及びヌクレオチドの組み込みを誘導する。任意で、洗浄バッファー中にＮｉ２＋を含めることによって、三元複合体の安定性を維持し、三元複合体の解離を防止する。所望の配列の読取り長が得られるまで、反応を繰り返すことができる。
【０１４０】
任意で、非触媒濃度のＣｏ２＋を含む反応条件では、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、ヌクレオチドとの間に閉鎖複合体を形成し、Ｃｏ２＋によって閉鎖複合体の形成を促進する。非触媒濃度のＣｏ２＋を存在させることで、不適正なヌクレオチドを含む複合体の形成に対してよりも寧ろ、後続の正しいヌクレオチドを含む閉鎖複合体の形成に有利とすることができる。Ｃｏ２＋イオンは、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭの濃度にて存在し得る。任意で、Ｃｏ２＋は、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２として存在する。検査条件下で閉鎖複合体の形成をモニタリングすることによって、閉鎖複合体の鋳型核酸中の後続の塩基を同定する。Ｃｏ２＋の存在下でｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）の各々に対するポリメラーゼの親和性（例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｂｓｔのクレノウ断片）が異なる可能性がある。したがって、ポリメラーゼ鋳型核酸のｄＮＴＰに対する結合親和性を測定することを検査に含める場合があり、結合親和性は鋳型核酸中の後続の塩基を示す。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸との間の二元相互作用を不安定化させる条件下で、結合相互作用を行ってもよい。任意で、ポリメラーゼと、プライミングされた鋳型核酸と、後続の正しいヌクレオチドとの間の三元相互作用を安定化させる条件下で、結合相互作用を行ってもよい。検査後は、洗浄によって、非結合ヌクレオチド及びポリメラーゼを除去し、触媒濃度のＣｏ２＋を反応物に添加することによって、ピロリン酸（ＰＰｉ）開裂及びヌクレオチドの組み込みを誘導する。任意で、洗浄バッファー中に非触媒濃度のＣｏ２＋を含めることによって、三元複合体の安定性を維持し、三元複合体の解離を防止する。所望の配列の読取り長が得られるまで、反応を繰り返すことができる。
【０１４１】
任意で、触媒金属イオンによって、後続のヌクレオチドの組み込み及び閉鎖複合体の放出なしに、閉鎖複合体の形成が促される場合がある。任意で、反応混合物中のＭｇ２＋の濃度が０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μＭの場合、ポリメラーゼの立体構造における変化を誘発し、後続のヌクレオチドの組み込み、ＰＰｉ及び閉鎖複合体の放出なしに、閉鎖複合体が形成される場合がある。任意で、Ｍｇ２＋の濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．５μＭ〜約４μＭ、約０．５μＭ〜約３μＭ、約μＭ〜約５μＭ、約１μＭ〜約４μＭ、及び約１μＭ〜約３μＭとされる。
【０１４２】
任意で、ヌクレオチドの組み込みを可能にするのに必要な配列決定反応において利用可能な触媒金属イオンの濃度は、約０．００１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約２ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．０５〜約２ｍＭ、または約０．０５ｍＭ〜約１ｍＭとされる。任意で、触媒金属イオンの濃度は、５ｍＭ〜５０ｍＭとされる。任意で、触媒金属イオンの濃度は、５ｍＭ〜１５ｍＭ、または約１０ｍＭとされる。
【０１４３】
以下の反応工程：プライミングされた鋳型核酸の提供、ポリメラーゼの提供、二元複合体の形成、ヌクレオチドの提供、プレケミストリー閉鎖複合体の形成、ヌクレオチドの組み込み、プレトランスロケーション閉鎖複合体の形成、及びポストトランスロケーション構造の形成のいずれかの前、途中、後のいずれかの段階で、非触媒性イオンを反応混合物に添加してもよい。洗浄工程中に、非触媒イオンを反応混合物に添加してもよい。反応混合物中の反応を通して、非触媒イオンが存在する場合がある。例えば、非触媒金属イオンを希釈する濃度で触媒イオンを反応混合物に添加することによって、ヌクレオチドの組み込みが可能となる。
【０１４４】
触媒イオン及び非触媒イオンがヌクレオチドの組み込みを調節する能力は、ｐＨ、イオン強度、キレート剤、化学的架橋、修飾ポリメラーゼ、組み込み不能ヌクレオチド、機械的または振動エネルギー、及び電場を含むがこれらに限定されない、反応混合物における条件に依存する可能性がある。
【０１４５】
任意で、配列決定反応において、ヌクレオチドを組み込まずに閉鎖複合体の形成を可能にするのに必要な非触媒金属イオンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約３０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．１〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１〜約４０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約２ｍＭ〜約３０ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、またはこれらの範囲内の任意の濃度である。
【０１４６】
検査反応混合物にポリメラーゼ阻害剤を添加することによって、閉鎖複合体を形成し且つ／あるいは安定化させることができる。阻害剤分子ホスホノアセテート（ホスホノ酢酸）及びホスホノホルメート（ホスホノギ酸、一般名：ホスカルネット）、スラミン、アミノグリコシド、ＩＮＤＯＰＹ−１及びタゲチトキシンは、ポリメラーゼ活性の不競合または非競合阻害剤の、非限定的な例である。酵素の活性部位の近くに阻害剤分子を結合することによって、ヌクレオチドの組み込みサイクルのプレトランスロケーションまたはポストトランスロケーションのいずれかの工程でポリメラーゼを捕捉し、ヌクレオチドの組み込み前または後に閉鎖複合体の立体構造にてポリメラーゼを安定化させ、反応混合物中の阻害剤分子を除去、希釈またはキレート化で利用できなくなるまで、ポリメラーゼを鋳型核酸に強制的に結合させる。
【０１４７】
したがって、プライマーでプライミングされた鋳型核酸分子を提供することと；プライミングされた鋳型核酸分子を、ポリメラーゼとポリメラーゼ阻害剤及び少なくとも１つの非標識ヌクレオチド分子とを含む第１の反応混合物に接触させることと；プライミングされた鋳型核酸分子のプライマー内にヌクレオチドを組み込むことなしに、非標識ヌクレオチド分子の存在下でプライミングされた鋳型核酸分子とポリメラーゼとの相互作用をモニタリングすることと；モニタリングされた相互作用によってプライミングされた鋳型核酸分子の後続の塩基に相補的なヌクレオチドを同定することと；を含む検査工程を具備する鋳型核酸分子を配列決定する方法が提供されている。ポリメラーゼ阻害剤は、非標識ヌクレオチド分子がプライマー鋳型核酸のプライマー内に組み込まれるのを防ぐ。任意で、阻害剤は、非競合阻害剤、アロステリック阻害剤、または不競合アロステリック阻害剤とされる。任意で、ポリメラーゼ阻害剤はポリメラーゼ中の触媒イオン結合部位と競合する。
【０１４８】
検出プラットフォーム：閉鎖複合体の検出用計測手段
ヌクレオチド存在下でのポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用は、外因性標識を用いずにモニタリングすることができる。例えば、屈折率変化の検出、電荷検出、ラマン散乱検出、エリプソメトリー検出、ｐＨ検出、サイズ検出、質量検出、表面プラズモン共鳴、導波モード共鳴、ナノポア干渉分光法、ウィスパリングギャラリーモード共振、ナノ粒子散乱、フォトニック結晶、水晶振動子マイクロバランス、バイオレイヤーインターフェロメトリー、振動検出、圧力検出、及び閉鎖複合体内でのポリメラーゼと鋳型核酸との結合による付加質量または屈折率を検出する他のラベルフリー検出スキームによって、配列決定反応をモニタリングしてもよい。
【０１４９】
場合により、屈折率変化の検出は、表面プラズモン共鳴検出、局在プラズモン共鳴検出、プラズモン−光子結合検出、サブ波長ナノホールによる透過検出（強化光透過）、フォトニック結晶検出、インターフェロメトリー検出、屈折検出、導波モード共鳴検出、リング共振器検出、またはエリプソメトリー検出を含むがこれらに限定されない手段の１つまたは組み合わせによって達成される。場合により、核酸分子を表面に局在させてもよく、様々なヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼと核酸との相互作用を、局所屈折率の変化として測定してもよい。
【０１５０】
場合により、鋳型核酸を表面上または表面近傍に適切に係留するか、または局在させ、その結果、ヌクレオチド存在下でのポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用により、表面を透過し、または表面から反射した光を変化させる。表面はナノ構造を含み得る。場合により、表面はプラズモンまたはプラズモン共鳴を維持することができる。場合により、表面は、共振空洞、共振リングまたはフォトニック結晶スラブに限定されないフォトニック基板である。場合により、表面は、導波モード共鳴センサーである。場合により、ナノホールアレイ、ナノ粒子または微小粒子上またはその近傍に、核酸を適切に係留または局在させ、その結果、核酸の存在下でのポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用により、微小粒子またはナノ粒子と相互作用する光の吸光度、散乱、反射または共鳴を変化させる。
【０１５１】
場合により、金表面上のナノホールアレイを屈折率センサーとして使用する。ＤＮＡ増幅のためのＰＣＲ反応において使用するプライマーの１つにチオール基を組み込む標準的なチオール化学によって鋳型核酸を金属表面に結合させてもよい。ナノホールアレイの寸法を入射光に適切に調整する場合、ヌクレオチド存在下での鋳型核酸へのポリメラーゼの結合を、ナノホールを透過する光の変化としてモニタリングすることができる。標識スキーム及びラベルフリーのスキームの両方について、平衡シグナル強度の単純で直接的な測定により、安定した閉鎖複合体の形成が明らかにされ得る。
【０１５２】
場合により、表面プラズモンを維持することができる表面に核酸分子を局在化し、局在化した核酸とのポリメラーゼの相互作用によって引き起こされる屈折率の変化を、表面プラズモンの特性の変化を介してモニタリングしてもよく、表面プラズモンの前記特性は、表面プラズモン共鳴を含み得る。表面プラズモン、局在表面プラズモン（ＬＳＰ）、または表面プラズモンポラリトン（ＳＰＰ）は、電磁波と表面電荷のプラズマ振動との結合から生じる。ＬＳＰはナノ粒子表面に閉じ込められ、一方、ＳＰＰは高電子移動度表面と誘電体媒体との間の界面で高電子密度表面に閉じ込められる。表面プラズモンは、界面の方向に沿って伝搬し得るが、それらはエバネッセント様式でのみ誘電体媒体に浸透する。表面プラズモン共鳴条件は、入射電磁放射線の周波数が表面電子の固有振動周波数に一致する場合に確立される。例えば結合または分子クラウディングによる、界面における誘電特性の変化は、表面電子の振動に影響を与え、それによって表面プラズモン共鳴波長を変化させる。表面プラズモン共鳴が可能な表面には、限定されないが、ナノ粒子、ナノ粒子のクラスター及び凝集体、連続平面、ナノ構造化表面、及び微細構造化表面が含まれる。金、銀、アルミニウム、高導電性金属酸化物（例えば、酸化インジウムスズ、酸化亜鉛、酸化タングステン）などの物質は、その表面で表面プラズモン共鳴をサポートすることができる。
【０１５３】
場合により、単一の核酸分子または核酸の複数のクローンコピーをナノ粒子に結合させ、その結果、核酸へのポリメラーゼの結合により、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）のシフトを引き起こす。ナノ粒子に入射する光は、内部の伝導電子を、ナノ粒子の大きさ、形状及び組成に依存する共鳴周波数で集合的に振動させる。関心対象のナノ粒子は、球形のナノ粒子、ナノロッド、ナノピラミッド、ナノダイヤモンド、及びナノディスクを含む様々な形状を取り得る。これらのＬＳＰＲモードの結果、ナノ粒子は光を強力に吸収して散乱させるため、暗視野（光学散乱）顕微鏡法を用いて単一のナノ粒子が目で容易に観察される。例えば、単一の８０ｎｍ銀ナノスフェアは、３×１０−２ｍ２の散乱断面を有する４４５ｎｍの青色光を散乱させ、この断面はフルオレセイン分子の蛍光断面より百万倍大きく、自己クエンチ限界までフルオレセインで満たした同様のサイズのナノスフェアの断面よりも１０００倍大きい。場合により、ナノ粒子は、可視スペクトルの随所に散乱ピークを有する、超高輝度、ナノサイズの光散乱体として構成されたプラズモン共鳴粒子である。プラズモン共鳴粒子は、ブリーチングしないという点で利点を有する。場合により、プラズモン共鳴粒子を調製し、鋳型核酸でコーティングし、ポリメラーゼと１つ以上のヌクレオチドを含む反応混合物中に用いて、ポリメラーゼ鋳型核酸−粒子相互作用を検出する。前述の工程の１つ以上は、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＰＮＡＳ  ９７：９９６−１００１（２０００）に開示されている１つ以上の方法に基づくか、または由来するものであってもよい。前記文献は、その全体を参照として本明細書に援用する。
【０１５４】
共鳴波長における非常に大きな吸光係数により、貴金属ナノ粒子は、表面近傍相互作用に対して極めて強い標識として機能することができる。場合により、ポリメラーゼと、ナノ粒子に局在するＤＮＡとの相互作用は、共鳴波長をシフトさせる。結合または結合相互作用に起因する共鳴波長の変化は、多くの方法の１つによって測定することができる。場合により、ある範囲の波長にわたって照度をスキャンし、撮像装置において最大散乱が観察される波長を同定する。場合により、撮像装置の近傍の分散要素とともに広帯域照明を利用し、それによって共鳴ピークを分光学的に同定する。場合により、ナノ粒子システムに、その共鳴波長またはその共鳴波長付近で照射してもよく、任意の結合相互作用が、照射波長から新しい共鳴波長へシフトするにつれて、散乱する光の強度の低下として観察され得る。照射波長の位置に依存して、共鳴ピークが照射波長に向かってシフトすると、相互作用はナノ粒子の散乱の増加として現れることさえある。場合により、ＤＮＡ結合ナノ粒子を表面に局在させてもよく、あるいは、ＤＮＡ結合ナノ粒子を溶液中に懸濁してもよい。ナノ粒子を使用するバイオセンシングの包括的な概説は、Ａｎｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ７：４４２−４５３（２００８）に記載されており、前記文献はその全体を参照として本明細書に援用する。
【０１５５】
場合により、ＬＳＰＲが可能なナノフィーチャを、平面基板上にリソグラフィによってパターン化する。ナノフィーチャの２次元パターニングは、多数の異なる核酸分子の多重及び高スループット分析において利点を有する。場合により、金ナノポストは、核酸がナノポストに結合しているポリメラーゼ鋳型核酸相互作用の表面プラズモン共鳴イメージング検出のための基質である。ナノ構造のサイズ及び期間は、表面プラズモン共鳴シグナルの増強に影響を及ぼし得るものであり、場合により、対照フィルムと比較して、２、３、４、５、６、７、８倍またはそれ以上のシグナル増幅をもたらす。
【０１５６】
場合により、表面プラズモン共鳴を、平面に維持してもよい。クレッチマン配置（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）及び表面プラズモン共鳴イメージング（例えば、ＧＷＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；マディソン、ＷＩ；またはＨｏｒｉｂａ；京都、日本）に基づく多くの市販の機器が利用可能であり、ＤＮＡをその表面に単一のスポットとして多重化アレイパターンで結合させるための良好に確立されたプロトコールを有する。クレッチマン配置では、金属膜、一般的には金をプリズムの側面に蒸着させ、入射放射線をある角度で発射して表面プラズモンを励起する。エバネッセント波が、反対側のプラズモンを励起する金属膜を貫通し、これを利用して金膜に近い表面近傍及び表面相互作用をモニタリングする。共鳴角において、プリズム−金界面から反射した光は、激しく減衰する。固定波長の照明を仮定すると、共鳴角に近い一定角度での反射光の強度をモニタリングすることによって、ならびに表面プラズモン共鳴条件（最小反射率）を確立するために必要な入射角の変化をモニタリングすることの両方によって、結合相互作用を試験してもよい。ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラなどの２Ｄ撮像装置を利用して反射光をモニタリングする場合、照明領域全体を高解像度で撮像し得る。この方法は、表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＲｉ）と呼ばれている。この方法により、表面上の独立領域の高スループット解析を同時に行うことができる。角度を固定した構成で広帯域照明を使用してもよく、表面プラズモン共鳴に結合する波長を、反射スペクトルにおけるディップを探すことによって分光学的に同定する。表面の相互作用は、共鳴波長のシフトによってモニタリングする。
【０１５７】
表面プラズモン共鳴は、タンパク質−核酸相互作用をモニタリングするための十分に確立された方法であり、核酸の結合及びデータ分析の両方に対して多くの標準的なプロトコールが存在する。文献からの例示的な参照として、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，”Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｍａｙ  ２２，２０１３；及びＢｒｏｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｔｏ  Ｃｒｅａｔｅ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  Ｇｏｌｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２１：８０４４−５１（１９９９）が挙げられ、両文献は、その全体を参照として本明細書に援用する。
【０１５８】
ポリメラーゼ／核酸相互作用は、局在化表面プラズモンを維持可能なナノ構造化表面上でモニタリングしてもよい。場合により、ポリメラーゼ／核酸相互作用は、表面プラズモンポラリトンを維持可能なナノ構造化表面上でモニタリングしてもよい。
【０１５９】
場合により、ポリメラーゼ／核酸相互作用は、局在化表面プラズモンを維持可能なナノ構造化表面上でモニタリングしてもよい。場合により、ポリメラーゼ／核酸相互作用は、表面プラズモンポラリトンを維持可能なナノ構造化表面上でモニタリングしてもよい。
【０１６０】
場合により、ナノホールアレイを介した異常光透過（ＥＯＴ）を使用して核酸／ポリメラーゼ相互作用をモニタリングしてもよい。プラズモン金属膜のサブ波長ナノホールを透過する光は、古典的な電磁気理論の予想よりも高い。この光透過の増強は、入射放射線と結合するプラズモン共鳴を考慮して説明してもよく、それにより、共振波長で、予測よりも大きい割合の光が金属ナノホールを横切って透過する。この光透過の増強は、ナノホールの寸法及びピッチ、金属の特性、ならびにナノホールを有する金属フィルムの両側の媒体の誘電特性に依存する。バイオセンサーとの関連において、金属ナノホールアレイの透過率は、金属膜と接触する媒体の屈折率に依存し、それにより、例えば、ポリメラーゼと、金属表面に結合した核酸との相互作用を、ナノホールアレイを横切って透過する光の強度の変化としてモニタリングしてもよい。非常にコンパクトな光学素子及び撮像素子を用いる、表面プラズモン共鳴のＥＯＴ／プラズモニックナノホールアレイアプローチを使用する場合の計測手段及びアラインメント要件を採用してもよい。低出力のＬＥＤ照明とＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラがあれば、ロバストなＥＯＴプラズモニックセンサーを実装するのに十分である。例示的なナノホールアレイベースの表面プラズモン共鳴検出装置は、Ｅｓｃｏｂｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ“Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎａｎｏｈｏｌｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｄｕａｌ−Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｓｏｕｒｃｅ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ    ２１：１１５００１（２０１１）に記載されており、前記文献はその全体を参照として本明細書に援用する。
【０１６１】
プラズモンナノホールアレイは、ガラス表面上に堆積させた光学的に不透明な金の層（５０ｎｍより大きい厚さ）上にパターニングしてもよい。場合により、プラズモンナノホールアレイは、ガラス上に堆積させた光学的に厚いアルミニウムまたは銀のフィルム上にパターニングしてもよい。場合により、ナノホールアレイを、低屈折率のプラスチック上に堆積させた光学的に厚い金属層上にパターニングする。低屈折率のプラスチック上にプラズモニックナノホールアレイをパターニングすることは、金属層の２つの側面上の屈折率をより良く一致させることによって屈折率変化に対するデバイスの感度を高める。場合により、ナノホールアレイの屈折率感度は、ホール間の距離を増加させることによって高まる。場合により、例えば、エンボス加工、キャスティング、インプリント−リソグラフィ、またはテンプレートストリッピングによって複製することによって、ナノホールアレイを製造する。場合により、コロイドを使用する自己組織化によってナノホールアレイを製造する。場合により、レーザー干渉リソグラフィなどの直接投射パターニングによってナノホールアレイを製造する。
【０１６２】
ナノバケット構成は、ナノホール構成よりも好ましい可能性がある。ナノホール構成では、ナノフィーチャの底部はガラスまたはプラスチックまたは他の適切な誘電体であるが、ナノバケット構成では、ナノフィーチャの底部はプラズモン金属を含む。ナノバケットアレイは、局所的屈折率に対する透過感度を維持しながら製造するのが比較的簡単であるという利点がある。
【０１６３】
場合により、ナノホールアレイプラズモン検出を、安価な方法で大面積を撮像するためのレンズフリーホログラフィックイメージング法と組み合わせる。場合により、プラズモンバイオセンシングプラットフォームは、ナノホールアレイを有するプラズモンチップ、チップに照射するように構成された発光ダイオードソース、及び表面上の分子結合事象によって変調されるナノホールの回折パターンを記録するＣＭＯＳイメージャチップを含む。結合事象は、ヌクレオチド存在下でのポリメラーゼと鋳型核酸との間の閉鎖複合体の形成であってもよい。
【０１６４】
表面プラズモン共鳴検出のために表面を官能化する（核酸を結合するために）方法は、両方の検出スキームが、核酸を結合させる必要がある同様の金属表面を使用するため、ＥＯＴナノホールアレイに直接適用してもよい。
【０１６５】
場合により、ポリメラーゼ／核酸相互作用に関連する屈折率変化を、プラズモンをサポートしないナノ構造化表面上でモニタリングしてもよい。場合により、導波モード共鳴を使用してポリメラーゼ／核酸相互作用をモニタリングしてもよい。導波モード共鳴または導波路モード共鳴は、回折格子またはプリズムなどの位相整合素子の導入によって、光導波路の導波モードが励起され、同時に抽出される現象である。そのような導波モードは、導波されたままにはならず、１次元及び２次元のフォトニック結晶スラブにおいて観察されるため、「リーキーモード」とも呼ばれる。導波モード共鳴は、隣接してまたは互いの上部に配置された２つの光学構造の導波路モードに回折モードを結合することとみなしてもよい。例えば、光導波路の上部に配置された回折格子の場合、回折モードの１つを、光導波路の導波モードに正確に入射結合し、導波路に沿ってそのモードを伝搬させることができる。非共鳴条件下の場合、光は導波路に入射結合しないため、構造は完全に透明に見える場合がある（誘電体導波路を使用する場合）。共鳴時に、共鳴波長は導波路に強く入射結合し、格子−導波路界面からの下流要素に応じて構造から出射結合し得る。グレーティングカプラが導波路の全面にわたって延在する場合、入射結合した光が次のグレーティング素子で出射結合するため、光を導くことができない。したがって、格子導波路構造では、共鳴は強い反射ピークとして観察されるが、構造は、非共鳴条件に対して透明である。共鳴条件は、入射光の角度、格子特性、偏光及び波長に依存する。例えば導波路の表面全体に格子が結合しているために導波モードの伝播が存在しない場合、共鳴モードは、強い光閉じ込め、及び導波路層から横方向への放射のエバネッセント伝播の観点から、リーキーモード共鳴とも呼ばれ得る。例えば、生体分子の結合に起因する格子付近の誘電特性の変化は、導波路への入射結合に影響を及ぼし、それによって共鳴条件を変化させる。場合により、核酸分子を格子導波路構造の表面に結合させる場合、ポリメラーゼ／核酸相互作用を、リーキーモード共鳴の波長の変化としてモニタリングし得る。
【０１６６】
回折素子は、導波路素子を明白に必要とすることなく、透明な基板上に直接使用してもよい。格子ナノ構造の近傍の相互作用による共鳴条件の変化を、反射した放射または透過した放射の共鳴波長のシフトとしてモニタリングしてもよい。
【０１６７】
核酸を結合させた導波モード共鳴センサーからの反射光を用いて、ポリメラーゼ／核酸相互作用をモニタリングしてもよい。照明用に広帯域照明源を使用してもよく、反射光の分光学的試験は、ポリメラーゼ結合に起因する局所屈折率の変化を明らかにすることができる。
【０１６８】
場合により、広帯域照明を使用し、透過光を試験して、ポリメラーゼ相互作用に起因する共鳴シフトを同定してもよい。直線偏光した狭帯域照明を使用してもよく、直交偏光子を介して透過光をフィルタリングしてもよく；透過光は、偏光を変えるリーキーモード応答を除いて、直交偏光子により完全に減衰する。この実施態様は、屈折率モニタリングを、安価な撮像システムでモニタリングし得る単純な透過アッセイに変換する。公表された資料には、光学部品の組立体が記載されている。Ｎａｚｉｒｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｏｗ−Ｃｏｓｔ  Ｌａｂｅｌ−Ｆｒｅｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ  Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓｅｄ  Ｐｏｌａｒｉｚｅｒｓ，”Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １８：１９１２０−１９１２８（２０１０）を参照されたい。前記文献はその全体を参照として本明細書に援用する。
【０１６９】
ナノ構造化表面に加えて、屈折率変調をモニタリングするために、平滑な非構造化表面も有効に使用してもよい。場合により、インターフェロメトリーを用いて、ポリメラーゼと、構造化されていない光学的に透明な基材に結合した核酸との相互作用をモニタリングしてもよい。核酸分子は、当該技術分野で公知の任意の手段によってガラススライドの上面に結合させてもよく、システムはガラススライドの底面から照明される。この構成には２つの反射面があり、ガラススライドの底面からの１つの反射と、結合した核酸分子を有する上面からのもう１つの反射がある。２つの反射波は、互いに干渉して、経路長差に基づいて強め合うまたは弱め合う干渉を引き起こし、上面から反射した波は、結合した核酸分子に起因する誘電率の変化によって（及びその後のポリメラーゼと、結合した核酸分子との相互作用によって）変調される。底面からの反射が変化しないため、核酸分子への任意の結合が、上面及び底面から反射されたビーム間の位相差に反映され得、これは観察される干渉パターンに影響を及ぼす。場合により、バイオレイヤーインターフェロメトリー法を用いて核酸／ポリメラーゼ相互作用をモニタリングする。バイオレイヤーインターフェロメトリー法は、Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メンローパーク、ＣＡ）によって販売されている装置のような市販の装置で行ってもよい。
【０１７０】
場合により、上面からの反射光を、集束光学要素を用いて選択的に選択する。底面からの反射光は、焦点面にはないため無視する。核酸が結合した上面のみに着目すると、集束レンズによって集められた光は、部分的に反射する入射放射線に対応する平面波と、焦点面内の分子によって収集方向に散乱する放射線に対応する散乱波を含む。入射放射線がコヒーレントである場合、これらの２つの成分を干渉させてもよい。この散乱ベースの干渉検出は非常に感度が高く、これを用いて、単一のタンパク質分子までも検出することができる。
【０１７１】
場合により、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、閉鎖複合体を検出するためのバイオセンサーとして構成される。ＦＥＴのゲート端子は、鋳型核酸の添加によって修飾される。荷電タグを含むポリメラーゼの結合は、電気化学的シグナルの変化をもたらす。後続の正しいヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼの鋳型核酸への結合は、他の不正確なヌクレオチドの存在下で鋳型核酸に結合するポリメラーゼとは異なるシグナルを提供し、各々の不正確なヌクレオチドもまた、異なるシグナルを提供し得る。場合により、ポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用を、ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸、またはヌクレオチド上の外因性標識を使用することなく、ＦＥＴを用いてモニタリングする。場合により、組み込み反応中のＨ＋イオンの遊離により生じるｐＨ変化を、ＦＥＴを用いて検出する。場合により、ポリメラーゼは、ＦＥＴによって検出する連続的なＨ＋イオンを生成するタグを含む。場合により、連続Ｈ＋イオン生成タグはＡＴＰシンターゼである。場合により、連続Ｈ＋イオン生成タグは、パラジウム、銅または他の触媒である。場合により、ヌクレオチド組み込み後のＰＰｉの遊離を、ＦＥＴを用いて検出する。例えば、一度に１種類のヌクレオチドを反応に供してもよい。後続の正しいヌクレオチドを加え、組み込み可能な条件下になると、ＰＰｉが切断され、遊離し、これがＦＥＴを用いて検出され、したがって後続の正しいヌクレオチド及び後続塩基が同定される。場合により、鋳型核酸をナノチューブの壁に結合させる。場合により、ポリメラーゼをナノチューブの壁に結合させる。ＦＥＴは、小型で軽量であることから配列決定用センサーとしての使用に効果的であり、ポータブル配列決定用モニタリング成分としての使用に適している。分子相互作用のＦＥＴ検出の詳細は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ“Ａｎ  ＦＥＴ−Ｔｙｐｅ  Ｃｈａｒｇｅ  Ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，”Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２０：６９−７４（２００４），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｓ．２００４．０１．０２５；及びＳｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｔｕｂｅ  ＦＥＴ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，”Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３：４５９−６３（２００３），ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｌ０３４０１７２に記載されており、これらの文献はその全体を参照として本明細書に援用する。
【０１７２】
一例として、ポリメラーゼは蛍光タグを有する。高いシグナル対ノイズ比を有するポリメラーゼ−核酸相互作用をモニタリングするために、エバネッセント照射または共焦点イメージングを用いてもよい。局在化鋳型核酸上の閉鎖複合体の形成は、例えば、バックグラウンドに対する蛍光の増加として観察され得るが、いくつかの場合には、消光または局所的極性環境の変化による蛍光の減少としても観察され得る。場合により、同一の反応混合物中で、ポリメラーゼ分子の一画分をフルオロフォアでタグ標識し、一方、別の画分をクエンチャーでタグ標識してもよく；その場合、核酸の局在化クローン集団上の閉鎖複合体の形成が、バックグラウンドに対する蛍光の減少として明らかになる。核酸のクローン集団は、支持体表面、例えば平面基質、微小粒子、またはナノ粒子に結合させてもよい。場合により、ポリメラーゼを、フルオロフォア、ルミノフォア、ケミルミノフォア、クロモフォア、またはバイオルミノフォアでタグ標識する。
【０１７３】
場合により、複数の鋳型核酸を表面に係留させ、１つ（またはそれ以上）のｄＮＴＰを連続的に流す。親和性のスペクトルは、後続の正しいヌクレオチドの同一性、したがって鋳型核酸中の後続塩基の同一性を明らかにする。場合により、反応混合物を除去及び置換（すなわち、洗浄工程）する必要のない条件下で、親和性を測定する。例えば、測定した結合相互作用の強度の自己相関は、核酸配列の動態を容易に明らかにすることができる。場合により、試験は、ヌクレオチド存在下でのプライミングした鋳型核酸に対するポリメラーゼの親和性をモニタリングすることを含む。場合により、ポリメラーゼは核酸と一過的に結合し、結合動力学及び親和性は、鋳型核酸上の後続塩基の同一性に関する情報を提供する。場合により、閉鎖複合体が形成され、閉鎖複合体の形成に関与する反応条件は、核酸上の後続塩基に関する情報を提供する。場合により、ポリメラーゼを、その相互作用において重合部位に捕捉し、したがって解離速度を測定するための洗浄工程を必要とせずに親和性が明らかになる。
【０１７４】
ポリメラーゼと核酸との間の動的相互作用を測定することができる任意の技術を用いて、親和性を測定し、本明細書に開示する配列決定反応法を可能にしてもよい。
【０１７５】
ヌクレオチド特異的三元複合体形成を検出するためのシステム
提供する方法は、核酸重合反応の任意の成分が表面に局在するプラットフォームを使用して実施することができる。場合により、鋳型核酸を、平面基板、ナノホールアレイ、微小粒子、またはナノ粒子に結合させる。場合により、すべての反応成分を、反応混合物中に自由に懸濁し、固体支持基材に固定化しない。
【０１７６】
場合により、鋳型核酸を表面に固定化する。表面は、平面基板、ヒドロゲル、ナノホールアレイ、微小粒子、またはナノ粒子であってもよい。場合により、反応混合物は、複数のクローン的に増幅した鋳型核酸分子を含有する。場合により、反応混合物は、複数の識別可能な鋳型核酸を含有する。
【０１７７】
本明細書では、とりわけ、ヌクレオチド存在下でのポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸との相互作用を試験し、ポリメラーゼドメインの架橋、ポリメラーゼの核酸への架橋、小分子によるアロステリック阻害、不拮抗阻害剤、競合的阻害剤、非競合的阻害剤、及び変性を含むがこれらに限定されない手段の１つまたは組み合わせによって、鋳型閉鎖複合体の後続塩基を同定することを含む配列決定反応を行うためのシステムを提供し；その場合、捕捉したポリメラーゼ複合体の形成は、核酸鋳型上の後続塩基の同一性に関する情報を提供する。
【０１７８】
本明細書に開示する任意の配列決定方法の１つ以上の工程を実行するためのシステムもまた提供する。場合により、システムは、ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ及び鋳型核酸結合アッセイを実施するために必要な成分及び試薬を含み、鋳型核酸はナノ構造上に提供される。場合により、システムは、鋳型ＤＮＡ分子をナノ構造に結合させるために必要な１つ以上の試薬及び指示書を含む。例えば、システムは、結合動態を決定するために表面プラズモン共鳴とともに使用するように構成された、チップなどのナノ構造を提供する。そのようなチップの一例は、ＣＭ５センサーＳチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ピスカタウェイ、ＮＪ）である。システムは、表面プラズモン共鳴装置のような計測手段を提供してもよい。システムは、ストレプトアビジン及び／またはビオチンを提供してもよい。場合により、システムは、ビオチン化鋳型ＤＮＡを調製するための、ビオチン−ＤＮＡ、ＤＮＡリガーゼ、緩衝液、及び／またはＤＮＡポリメラーゼを提供する。場合により、システムは、ビオチン化ＤＮＡを精製するためのゲルまたは試薬（例えば、フェノール：クロロホルム）を提供する。あるいは、システムは、ビオチン化鋳型ＤＮＡの特性決定のための試薬、例えば、質量分析またはＨＰＬＣを提供する。場合により、システムは、ストレプトアビジンをチップ上に固定化するための、ストレプトアビジン、チップ、試薬、計測手段、及び／または指示書を含む。場合により、鋳型ＤＮＡコーティング用にあらかじめ構成されたシステムにチップを提供し、鋳型核酸または修飾鋳型核酸（例えば、ビオチン化鋳型ＤＮＡ）を結合させることができる試薬を用いてチップを固定化する。場合により、システムはチップ再生のための試薬を提供する。
【０１７９】
本明細書に開示する任意の配列決定方法の１つ以上の工程を実行するためのシステムもまた提供する。場合により、システムは、ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ及び鋳型核酸結合アッセイを実施するために必要な成分及び試薬を含み、鋳型核酸はナノ粒子上に提供される。場合により、システムは、鋳型ＤＮＡ分子をナノ粒子上に結合させるために必要な１つ以上の試薬及び指示書を含む。ナノ粒子は、例えば、金ナノ粒子を用いることによって、核酸−ポリメラーゼ相互作用の電気化学的検出用に構成してもよい。場合により、ＤＮＡ−ナノ粒子複合体は、水性金コロイド溶液と、例えば、その末端に遊離チオールまたはジスルフィド基を有する鋳型ＤＮＡ分子との間で形成される。複合体は、同じ核酸配列を有し得る。場合により、ナノ粒子複合体は、高温（例えば、６０℃超）及び高イオン強度（例えば１Ｍ  Ｎａ＋）において凝集及び沈殿に対して安定化する。場合により、システムは、ジスルフィドまたはチオールで鋳型ＤＮＡ分子を生成することを含む、ナノ粒子結合用鋳型ＤＮＡ分子を調製するための試薬を提供する。ジスルフィドを含有する鋳型核酸は、例えば、３′−チオール修飾剤であるコントロールドポアグラス（ＣＰＧ）を使用するか、またはユニバーサルサポートＣＰＧで開始し、ジスルフィド修飾剤ホスホラミダイトを配列中の第１のモノマーとして添加することによって合成することができる。システムは、ジスルフィド修飾鋳型核酸を得るための核酸合成試薬及び／または指示書を提供してもよい。チオールを含有する鋳型核酸はまた、５′−トリチルチオール修飾剤であるホスホラミダイトによる核酸合成中に生成され得る。システムは、例えば、電気泳動または遠心分離を使用するナノ粒子複合体精製用の試薬及び／または指示書を提供してもよい。場合により、ナノ粒子複合体を使用して、比色分析によりポリメラーゼ鋳型核酸相互作用をモニタリングする。この場合、強力なポリメラーゼ結合の存在下で、ナノ粒子複合体の融解温度は増加する。したがって、ＤＮＡ結合の強さを、この融解遷移の変化によって測定することができ、それは色の変化によって観察することができる。システムは、場合により、融解遷移を検出するための試薬及び装置を含む。
【０１８０】
本明細書に開示する任意の配列決定方法の１つ以上の工程を実行するためのシステムもまた提供する。場合により、システムは、検出可能なポリメラーゼを用いて、ヌクレオチド存在下でポリメラーゼ及び鋳型核酸結合アッセイを行うために必要な成分及び試薬を含む。場合により、ポリメラーゼを検出可能に標識する。場合により、ポリメラーゼを、ポリメラーゼの固有の性質、例えば芳香族アミノ酸を用いて検出する。場合により、システム内に存在するポリメラーゼ及び鋳型核酸は、溶液への使用のために、支持体へ複合体化せずに構成される。ポリメラーゼ上の検出可能な標識はフルオロフォアであってもよく、蛍光を用いてポリメラーゼ−鋳型核酸の結合事象をモニタリングする。場合により、検出可能なポリメラーゼは、溶液中の鋳型核酸、または支持構造に結合させた鋳型核酸と組み合わせて使用してもよい。場合により、ポリメラーゼの１つ以上のシステイン残基をＣｙ３−マレイミドで標識する。場合により、システムは、蛍光標識したポリメラーゼ分子を調製するのに必要な試薬及び／または指示書を含む。システムは、蛍光標識ポリメラーゼを精製するための試薬及び／または指示書を含んでもよい。
【０１８１】
方法の手順上の特徴
閉鎖複合体の形成を介して後続塩基の同一性を同定した試験工程の後、任意の組み込み工程または追加の試験工程のための準備として、反応条件を、適切にリセット、再充填、または改変してもよい。場合により、ヌクレオチドを化学的に組み込むことなく、後続塩基の同一性を同定する。場合により、ヌクレオチドの化学的組み込みによって後続塩基の同一性を同定し、その後のヌクレオチド組み込みを阻害する。場合により、配列決定中の鋳型核酸以外の試験工程のすべての成分を除去または洗い流し、システムを試験前の条件に戻す。場合により、試験工程の部分的な成分を除去する。場合により、試験工程に追加の成分を追加する。
【０１８２】
場合により、組み込み工程において可逆的ターミネーターヌクレオチドを使用して１サイクル当たり確実に１つのヌクレオチドのみが組み込まれるようにする。試験工程で塩基同一性が分かるため、可逆的ターミネーターヌクレオチドには標識は必要ない。非蛍光標識可逆的ターミネーターは、市販品の製造業者から容易に入手可能である。非標識可逆的ターミネーターヌクレオチドは、それらのより小さい立体的フットプリント、及び天然ヌクレオチドと同様のサイズであることから、標識可逆的ターミネーターに比べて、はるかに速い組み込み速度を有すると予想される。
【０１８３】
本明細書において、試験及び／または組み込みのサイクルごとに配列決定用試薬を次々と導入する試薬サイクルシーケンシング法を部分的に開示する。場合により、配列決定用反応混合物は、ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸、及び少なくとも１種類のヌクレオチドを含む。場合により、ヌクレオチド及び／またはポリメラーゼを、配列決定用反応混合物に周期的に導入する。場合により、配列決定用反応混合物は、複数のポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸、及びヌクレオチドを含む。場合により、複数のヌクレオチド及び／または複数のポリメラーゼを、配列決定用反応混合物に周期的に導入する。場合により、配列決定反応の試験工程は、配列決定反応の組み込み工程とは異なる組成を有する。
【０１８４】
場合により、１つ以上のヌクレオチドを連続的に配列決定反応に添加し、及びそこから除去する。場合により、１、２、３、４、またはそれ以上の種類のヌクレオチドを反応混合物に添加し、及びそこから除去する。例えば、１種類のヌクレオチドを配列決定反応に添加し、そこから除去し、別のタイプのヌクレオチドで置き換える。場合により、試験工程中に存在するヌクレオチドのタイプは、組み込み工程中に存在するヌクレオチドのタイプとは異なる。場合により、１つの試験工程中に存在するヌクレオチドのタイプは、連続的な試験工程中に存在するヌクレオチドのタイプとは異なる（すなわち、連続的な試験工程を組み込み工程の前に行う）。場合により、１、２、３、４またはそれ以上の種類のヌクレオチドが試験反応混合物中に存在し、１、２、３、４、またはそれ以上の種類のヌクレオチドが組み込み反応混合物中に存在する。
【０１８５】
場合により、ポリメラーゼを、配列決定反応に周期的に添加し、及びそこから除去する。１つ以上の異なる種類のポリメラーゼを、配列決定反応に周期的に添加し、及びそこから除去してもよい。場合により、試験工程の間に存在するポリメラーゼの種類は、組み込み工程中に存在するポリメラーゼの種類とは異なる。１つの試験工程中に存在するポリメラーゼの種類は、連続試験工程中に存在するポリメラーゼの種類とは異なっていてもよい（すなわち、連続試験工程を組み込み工程の前に実施する）。
【０１８６】
場合により、試薬の存在、ｐＨ、温度、及びイオン強度などの条件を、配列決定反応を通して変化させる。場合により、金属を配列決定反応に周期的に添加し、及びそこから除去する。例えば、触媒金属イオンを、試験工程中に存在させず、組み込み工程中に存在させてもよい。あるいは、ポリメラーゼ阻害剤を、試験工程中に存在させ、組み込み工程中に存在させなくてもよい。場合により、配列決定反応中に消費される反応成分に、配列決定反応中の任意の時点で新規成分を添加して補充する。
【０１８７】
閉鎖複合体形成に有利な反応条件に対し、一度に１種類のヌクレオチドをポリメラーゼとともに添加することができる。後続の正しいヌクレオチドが存在する場合、ポリメラーゼは鋳型核酸にのみ結合する。各ヌクレオチド添加後の洗浄工程により、閉鎖複合体に関与しないすべての余剰のポリメラーゼ及びヌクレオチドが反応混合物から除去されることが保証される。ヌクレオチドを既知の順序で一度に１つずつ添加する場合、添加したヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである場合に、閉鎖複合体の形成によって鋳型核酸上の後続塩基が決定される。閉鎖複合体は、立体構造変化及びポリメラーゼ−鋳型核酸−ヌクレオチド相互作用の安定性の増加の両方によって同定され得る。場合により、後続の正しいヌクレオチドの存在下で形成される閉鎖複合体の安定性は、不正確なヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼと鋳型核酸との不安定な相互作用に比べて少なくとも１桁大きい。洗浄工程を用いることにより、未結合のヌクレオチド及びポリメラーゼが存在しないこと、及び反応中に存在する唯一のヌクレオチドが、ポリメラーゼ及び鋳型核酸との閉鎖複合体中に隔離されたものであることが保証される。鋳型核酸上の後続塩基が決定した後、閉鎖複合体中に隔離された後続の正しいヌクレオチドを、閉鎖複合体の解離または不安定化に有利な反応条件下で流し込み、鋳型核酸プライマー鎖を１塩基伸長すること（組み込み）により、組み込んでもよい。したがって、洗浄工程により、組み込まれた唯一のヌクレオチドが閉鎖複合体由来の後続の正しいヌクレオチドであることが保証される。この試薬サイクリング法を繰り返し、核酸配列を決定してもよい。この試薬サイクリング法は、単一鋳型核酸分子、またはＰＣＲ産物またはローリングサークル増幅ＤＮＡなどのクローン集団のコレクションに適用してもよい。多くの異なる鋳型を、例えば固体支持体上に配列している場合、並行して配列することができる。場合により、洗浄工程は、二元複合体形成を不安定化させる。場合により、洗浄を、二元複合体が確実に除去される期間にわたって行い、反応混合物中に安定化した閉鎖複合体を残す。場合により、洗浄工程は、反応を高イオン強度または高ｐＨ溶液で洗浄することを含む。
【０１８８】
場合により、組み込み工程は３段階のプロセスである。第１段階では、閉鎖複合体の形成に有利な反応条件において、プライミングした鋳型核酸を高忠実度ポリメラーゼとともに含む反応に、４つのヌクレオチド型すべてを導入し、後続の正しいヌクレオチドは、鋳型核酸との安定な複合体を形成することができる。第２段階では、余剰のヌクレオチド及び未結合ポリメラーゼを洗い流す。第３段階では、閉鎖複合体を不安定化し、閉鎖複合体内の隔離されたヌクレオチドが鋳型核酸プライマーの３′末端に組み込まれるように反応条件を改変する。別のアプローチでは、第２段階を改変し、閉鎖複合体中に存在し得る高忠実度ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドのいずれかを完全に除去し、次いで、除去した成分を、第２のポリメラーゼ及び１つ以上のヌクレオチド（例えば、可逆的ターミネーターヌクレオチド）で置き換える。組み込み工程における緊密なポリメラーゼ−核酸複合体の形成は、標準的な技術、例えば、非特異的ＤＮＡ結合ドメインをポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから入手可能なＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）に融合させること、及び高濃度のヌクレオチドを利用して正しいヌクレオチドが閉鎖複合体中に常に存在することを保証することによって可能になる。
【０１８９】
ポリメラーゼ分子は、ポリメラーゼ合成反応に通常必要とされる二価金属イオンの非存在下でさえも、後続の正しいヌクレオチドの存在下で、フィンガークローズコンフォメーションでプライミングした鋳型核酸分子に結合する。立体構造変化により、ポリメラーゼの活性部位内の後続の鋳型塩基に相補的なヌクレオチドが捕捉される。場合により、閉鎖複合体の形成を用いて、鋳型核酸上の後続塩基の同一性を判定してもよい。場合により、プライミングした鋳型核酸を、触媒二価金属イオンの非存在下、ポリメラーゼの存在下で異なるヌクレオチドに連続的に接触させてもよく；その場合の閉鎖複合体の形成は、鋳型核酸と現在接触しているヌクレオチドが核酸上の後続塩基に対する相補的ヌクレオチドであることを示す。既知の順序でヌクレオチドを鋳型核酸に接触させる（ポリメラーゼの存在下及び触媒金属イオンの非存在下）ことにより、閉鎖複合体形成を誘導する順序での特定の位置に基づいて相補的ヌクレオチドを容易に同定することが保証される。場合により、各ヌクレオチド添加後に適切な洗浄工程を実施し、すべての余剰の酵素及びヌクレオチドを確実に除去し、活性部位において後続の正しいヌクレオチドとともに閉鎖複合体中の核酸に結合するポリメラーゼのみを残してもよい。閉鎖複合体は、閉構造におけるポリメラーゼの立体構造変化を明らかにする手段によって、またはポリメラーゼ／核酸／後続の正しいヌクレオチド複合体の安定性の増加を、二元ポリメラーゼ−核酸複合体と比較して、またはポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸と不正確なヌクレオチドとの間の不安定な相互作用と比較して明らかにする手段によって同定してもよい。
【０１９０】
場合により、後続の相補的ヌクレオチドを同定するプロセス（試験工程）は、ヌクレオチドの化学的組み込みを阻害する条件下で、固定したプライミングした鋳型核酸を、１種類のポリメラーゼ及びヌクレオチドを含有する試験混合物と接触させ、洗浄工程によって未結合の試薬を除去し、固定化した核酸上のポリメラーゼ閉鎖複合体の存在または非存在を検出し、閉鎖複合体形成が検出されるまで異なる種類のヌクレオチドを用いてこれらの工程を連続的に繰り返す工程を含む。閉鎖複合体は、立体構造変化及びポリメラーゼ／核酸／後続の正しいヌクレオチド複合体の安定性の増加の両方によって同定してもよい。連続したヌクレオチド添加の間の洗浄工程は、高い忠実度で閉鎖複合体の形成を検出可能な検出機構、例えば、エバネッセント波検出法または閉鎖複合体からのシグナルを選択的にモニタリングする方法を用いることによって排除してもよい。上記の試験工程の後に、閉鎖複合体を触媒金属イオンと接触させて、閉鎖複合体中に隔離されたヌクレオチドをプライマーの３′末端に共有結合により付加することを含む組み込み工程を行ってもよい。場合により、組み込み工程は、ヌクレオチドの化学的組み込みを阻害する条件下で、固定化した核酸を、複数の種類のヌクレオチド及びポリメラーゼの組み合わせを含む組み込み前の混合物と接触させることを含んでもよく；組み込み前の混合物は、高効率の閉鎖複合体形成を確実にするための添加剤及び溶液条件（例えば、低塩条件）を含み得る。本方法はまた、洗浄工程を実施して未結合試薬を除去し、固定化した複合体に触媒金属イオンを含む組み込み混合物を供給して、ポリメラーゼの活性部位内に隔離されたヌクレオチドを化学的に組み込むことを含み得る。組み込み前の混合物は非常に効率的な閉鎖複合体形成を保証し、一方、洗浄工程及び組み込み混合物はプライマーの３′末端への単一ヌクレオチドの付加を保証する。場合により、組み込み工程は、試験後に１種類のヌクレオチドの添加を直接行ってもよい。例えば、配列決定に使用する繰り返しパターンは、以下のフローパターンを含み得る：（ｉ）ｄＡＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｉｉ）洗浄、（ｉｉｉ）Ｍｇ＋２、（ｉｖ）洗浄、（ｖ）ｄＴＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｖｉ）洗浄、（ｖｉｉ）Ｍｇ＋２、（ｖｉｉｉ）洗浄、（ｉｘ）ｄＣＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｘ）洗浄、（ｘｉ）Ｍｇ＋２、（ｘｉｉ）洗浄、（ｘｉｉｉ）ｄＧＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｘｉｖ）洗浄、（ｘｖ）Ｍｇ＋２、（ｘｖｉ）洗浄。場合により、配列決定に使用する繰り返しパターンは、（ｉ）ｄＡＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｉｉ）洗浄、（ｉｉｉ）ｄＴＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｉｖ）洗浄、（ｖ）ｄＧＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｖｉ）洗浄、（ｖｉｉ）ｄＣＴＰ＋／ポリメラーゼ、（ｖｉｉｉ）洗浄、（ｉｘ）組み込み前の混合物、（ｘ）洗浄、（ｘｉ）Ｍｇ、（ｘｉｉ）洗浄を含み得る。洗浄工程は、一般的には、金属イオンキレート化剤及び他の小分子を含有し、試験工程中の偶発的な組み込みを防止する。組み込み工程後、プライマー鎖は、通常、１塩基伸長される。このプロセスを繰り返すことにより、核酸の連続核酸塩基を同定し、核酸配列を効果的に決定してもよい。場合により、試験工程は、高塩濃度条件、例えば５０ｍＭ〜１，５００ｍＭ塩の条件下で実施する。
【０１９１】
配列決定の適用では、流体及び試薬の交換を最小限に留めるか、または排除することが効果的であり得る。ポンプ、バルブ、試薬容器を取り外すことにより、より小型の装置の製造を簡素化することができる。本明細書において、「オールイン」配列決定法を部分的に開示し、本方法では、試験及び／または組み込みの各サイクルにおいて次々と試薬を導入する必要がなくなる。反応に対して試薬を一度だけ添加し、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法は、配列決定反応内に既に封入されている試薬を操作することによって行う。そのようなスキームは、異なるヌクレオチドを区別する方法、核酸のクローン集団及び／または異なる核酸分子にわたってヌクレオチドの組み込みを同期する方法、及びサイクル当たり確実に１つのヌクレオチドのみを付加する方法を必要とする。
【０１９２】
場合により、配列決定反応混合物は、ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸、及び少なくとも１種類のヌクレオチドを含む。場合により、配列決定反応混合物は、複数のポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸、及びヌクレオチドを含む。本明細書中で提供する場合、ポリメラーゼは、単一のポリメラーゼまたは複数のポリメラーゼを指す。本明細書中で提供する場合、プライミングした鋳型核酸または鋳型核酸は、単一のプライミングした鋳型核酸もしくは単一の鋳型核酸、または複数のプライミングした鋳型核酸もしくは複数の鋳型核酸を指す。本明細書中で提供する場合、ヌクレオチドは、１つのヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを指す。本明細書中で提供する場合、単一のヌクレオチドは１つのヌクレオチドである。場合により、配列決定反応のヌクレオチドには、以下のヌクレオチド：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰのうちの１、２、３、または４種類が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９３】
場合により、試験工程及び組み込み工程は、単一の配列決定反応混合物中で行う。
【０１９４】
場合により、１、２、３、４種類またはそれ以上のヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が反応混合物中に同時に存在し、１種類のヌクレオチドが後続の正しいヌクレオチドである。反応混合物は、少なくとも１つのポリメラーゼ及び少なくとも１つのプライミングした鋳型核酸をさらに含む。場合により、鋳型核酸は、鋳型核酸のクローン集団である。場合により、ポリメラーゼ、プライミングした鋳型核酸、及びヌクレオチドは、試験反応条件下で閉鎖複合体を形成する。
【０１９５】
提供する方法では、４種類のヌクレオチドを別個の異なる濃度で存在させることができ、鋳型核酸に対するポリメラーゼの拡散及び結合時間は、４種類のヌクレオチドの異なる濃度に起因して、それらが後続の正しいヌクレオチドである場合、４種類のヌクレオチドのそれぞれについて異なる。例えば、最も高い濃度のヌクレオチドは、鋳型核酸上のその相補的塩基に速い時間で結合し、最も低い濃度のヌクレオチドは、より遅い時間で鋳型核酸上のその相補的塩基に結合し；鋳型核酸上の相補的塩基への結合は、閉状態の閉鎖複合体における後続の正しいヌクレオチド存在下での鋳型核酸へのポリメラーゼの結合を指す。したがって、後続の正しいヌクレオチドの同一性は、閉鎖複合体中の鋳型核酸へのポリメラーゼの結合の速度または時間をモニタリングすることによって判定される。場合により、４種類のヌクレオチドをそれらの濃度によって区別してもよく、異なる濃度のヌクレオチドは、核酸へのポリメラーゼの結合について、測定可能な異なるオンレートをもたらす。場合により、４種類のヌクレオチドを、それらの濃度によって区別してもよく、異なる濃度のヌクレオチドは、安定化した閉鎖複合体の形成について、測定可能な異なるオンレートをもたらす。
【０１９６】
場合により、ポリメラーゼを標識する。場合により、ポリメラーゼを標識せず（すなわち、蛍光標識などの外因性標識を有さない）、本明細書に開示するか、または当該技術分野で公知の任意のラベルフリーの検出方法を用いる。場合により、核酸へのポリメラーゼの結合を、ポリメラーゼの検出可能な特徴を介してモニタリングする。場合により、安定化した閉鎖複合体の形成を、ポリメラーゼの検出可能な特徴を介してモニタリングする。ポリメラーゼの検出可能な特徴として、光学的、電気的、熱的、比色的特徴、質量、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１９７】
場合により、１、２、３、４種類、またはそれ以上のヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を１、２、３、４種類、またはそれ以上の異なるポリメラーゼに係留し；各種のヌクレオチドを異なるポリメラーゼに係留し、各ポリメラーゼは、同定可能なように、異なる外因性標識または他のポリメラーゼからの検出可能な特徴を有する。すべての係留したヌクレオチド型を、係留したヌクレオチド−ポリメラーゼを含む閉鎖複合体を形成する配列決定反応混合物に一緒に添加することができ；閉鎖複合体をモニタリングしてポリメラーゼを同定し、それによってポリメラーゼが係留する後続の正しいヌクレオチドを同定する。係留は、多リン酸基及びリンカー分子を介して、ヌクレオチドのγリン酸で起こり得る。そのようなγ−リン酸の結合方法は当該分野において標準的であり、フルオロフォアをγリン酸リンカーに結合させる。場合により、異なるヌクレオチド型を、区別可能な外因性標識によって同定する。場合により、識別可能な外因性標識を、各ヌクレオチドのγリン酸の位置に結合させる。
【０１９８】
場合により、配列決定反応混合物は、触媒金属イオンを含む。場合により、触媒金属イオンは、配列決定反応の任意の時点で一過性の様式でポリメラーゼと反応するために利用可能である。ロバストな配列決定を保証するために、触媒金属イオンは、組み込み工程中に、鋳型核酸中の後続塩基に相補的な単一のヌクレオチドをプライマーの３′末端に組み込むことが可能な、短時間の間、利用可能である。この場合、他のヌクレオチド、例えば、鋳型核酸中の後続塩基の下流の塩基に相補的なヌクレオチドが組み込まれることはない。場合により、触媒金属イオンマグネシウムを、配列決定反応混合物中に光ケージ化錯体（例えばＤＭ−ニトロフェン）として存在させ、その結果、局在化ＵＶ照射によってマグネシウムを遊離させ、これをポリメラーゼが核酸導入のために利用できるようにする。さらに、配列決定反応混合物はＥＤＴＡを含有してもよく、マグネシウムは、触媒作用によるヌクレオチド組み込み後にポリメラーゼ活性部位から遊離し、配列決定反応混合物中のＥＤＴＡによって捕捉され、その結果、マグネシウムがその後のヌクレオチド組み込みを触媒することができなくなる。
【０１９９】
したがって、提供する方法では、触媒金属イオンは、配列決定反応において、それがトリガーによって遊離し得るキレート化またはケージ化形態で存在し得る。例えば、触媒金属イオンは、閉鎖複合体の後続の正しいヌクレオチドの組み込みを触媒し、触媒金属イオンが活性部位から遊離するにつれて、第２のキレート剤またはケージング剤によって隔離され、金属イオンはその後の組み込みを触媒できなくなる。そのキレート化またはケージ化錯体からの触媒金属イオンの局所的な遊離は、エバネッセント波照射または構造化照明などの局所的アンケージングまたは非キレート化スキームを用いることによって保証される。触媒金属イオンの徐放は、例えば、熱手段によって生じ得る。それらの光ケージ化錯体からの触媒金属イオンの徐放は、光電界閉じ込めによって、例えば導波路または全反射照明顕微鏡法などのエバネッセント照射によって鋳型核酸の近傍に局所的に遊離し得る。触媒金属イオンの徐放は、例えば、鋳型核酸の近傍の溶液のｐＨを変化させることによって生じ得る。ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡのようなキレート剤はｐＨ依存性である。５未満のｐＨでは、二価陽イオンＭｇ２＋及びＭｎ２＋はＥＤＴＡによって効果的にキレート化されない。鋳型核酸の近傍でｐＨを制御可能に操作する方法により、触媒金属イオンをキレート剤から徐放させることができる。場合により、局所的ｐＨ変化は、核酸が結合している表面に電圧を印加することによって誘導される。ｐＨ法は、ｐＨがキレート化範囲に戻った場合に金属がそのキレート化形態に戻るという利点を提供する。
【０２００】
場合により、触媒金属イオンはポリメラーゼの活性部位に強く結合しており、単一のヌクレオチド組み込み後に鋳型核酸からポリメラーゼを除去する必要がある。ポリメラーゼの除去は、高度にディストリビューティブなポリメラーゼを使用することによって達成してもよく、このポリメラーゼは、各ヌクレオチドの添加後に、合成される鎖の３′末端（例えば、プライマー）から脱落する。未結合のポリメラーゼを、さらに、電場または磁場に供し、核酸分子の近傍からそれを除去してもよい。ポリメラーゼに結合した任意の金属イオンを、配列決定反応混合物中に存在するキレート剤、または閉鎖複合体の形成を妨げることなくポリメラーゼの活性部位への結合について金属イオンと競合する分子によって隔離してもよい。鋳型核酸（例えば、電場、磁場、及び／またはキレート剤）からポリメラーゼを除去または移動させる力を停止させることにより、もう１ラウンドの配列決定のためにポリメラーゼが鋳型核酸に近接できるようにしてもよい（試験及び組み込み）。次のラウンドの配列決定は、非限定的な例として、閉鎖複合体を形成し、鋳型核酸及び／または閉鎖複合体の近傍から未結合ポリメラーゼを除去し、触媒金属イオンの遊離を制御して閉鎖複合体内に隔離された単一のヌクレオチドを組み込み、単一の組み込みの後に鋳型核酸から解離したポリメラーゼを鋳型核酸の近傍から除去し、キレート剤または競合結合剤を使用して任意の遊離の触媒金属イオンを隔離し、ポリメラーゼが鋳型核酸に近接して、次のサイクルの配列決定を行えるようにすることを含む。
【０２０１】
上記は、核酸配列の同定のためのポリメラーゼ−核酸結合反応である。しかしながら、核酸配列の同定は、メチル化及びヒドロキシメチル化を含む核酸修飾に関する情報を含み得る。メチル化は、鋳型核酸のシトシン塩基上で起こり得る。ＤＮＡメチル化は、遺伝子の発現を安定に変化させる可能性がある。ＤＮＡメチル化はまた、様々なタイプのがん、アテローム性動脈硬化症、及び老化の進行においても示される。したがって、ＤＮＡメチル化は、ヒト疾患のエピジェネティックバイオマーカーとして働くことができる。
【０２０２】
場合により、本明細書中で提供するｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の間に、鋳型核酸上の１つ以上のシトシンメチル化を同定する。鋳型核酸は、配列決定の前にクローン的に増幅してもよく、アンプリコンはそれらの鋳型核酸と同じメチル化を含む。鋳型核酸の増幅は、アンプリコンのメチル化を達成するためのＤＮＡメチルトランスフェラーゼの使用を含む場合がある。鋳型核酸または増幅した鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び１つ以上のヌクレオチド型を含有する反応混合物に提供し、ポリメラーゼと核酸との相互作用をモニタリングする。場合により、メチル化シトシン存在下でのポリメラーゼと鋳型核酸との相互作用は、未修飾シトシン存在下での相互作用とは異なる。したがって、ポリメラーゼ−核酸相互作用の試験に基づいて、修飾ヌクレオチドの同一性を判定する。
【０２０３】
場合により、１つ以上の試験及び／または組み込み工程に続いて、ヌクレオチドのサブセットを添加し、フェージングを低減またはリセットする。したがって、方法は、配列決定する鋳型核酸分子を、ヌクレオチドのサブセット及び核酸分子の鋳型鎖の反対鎖にヌクレオチドを組み込むための酵素を含有する組成物と接触させる一つ以上の工程を含み得る。接触は、核酸分子中のフェージングを減少させる条件下で行うことができる。場合により、鋳型核酸分子を接触させる工程は、組み込み工程後及び／または試験工程後に行う。場合により、接触は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ラウンド以上の配列決定の後、すなわち試験及び組み込みのラウンドの後に行う。場合により、３０〜６０ラウンドの配列決定の後に接触を行う。場合により、各ラウンドの配列決定の後（すなわち、１セットの試験及び組み込み工程の後）に接触を行う。場合により、各ラウンドの配列決定の後に複数回の接触工程を行い、各接触工程はヌクレオチドの異なるサブセットを含み得る。場合により、本方法は、接触後に１つ以上の洗浄工程をさらに含む。場合により、サブセットは２つまたは３つのヌクレオチドを含む。場合により、サブセットは３つのヌクレオチドを含む。場合により、ヌクレオチドのサブセットは、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰまたはその誘導体のうちの３種から選択される。場合により、３つのヌクレオチドは、アデノシン、シトシン、及びグアニンを含む。場合により、３つのヌクレオチドは、アデノシン、シトシン、及びチミンを含む。場合により、３つのヌクレオチドは、シトシン、グアニン及びチミンを含む。場合により、３つのヌクレオチドは、アデノシン、グアニン及びチミンを含む。場合により、接触の各ラウンドは、ヌクレオチドの同じサブセットまたは異なるサブセットを含む。場合により、核酸鋳型の配列決定をモニタリングし、ヌクレオチドのサブセットとの接触をフェージングの検出の際に行う。例えば、米国特許第８，２３６，５３２号も参照されたい。前記文献はその全体を参照として本明細書に援用する。
【０２０４】
場合により、配列決定反応は、複数の鋳型核酸、ポリメラーゼ及び／またはヌクレオチドを含み、複数の閉鎖複合体をモニタリングする。クローン的に増幅した鋳型核酸を一緒に配列決定してもよく、その場合、クローンは近接して局在化し、配列決定時のモニタリングを向上させることができる。場合により、閉鎖複合体の形成により、複数のクローン的に増幅した鋳型核酸における塩基伸長の同調性が保証される。塩基伸長の同調性により、配列決定のサイクル当たり１塩基のみの付加が可能になる。
【実施例】
【０２０５】
予備試験は、プライミングした鋳型核酸、ポリメラーゼ、及び後続の正しいヌクレオチド（すなわち、同族ヌクレオチド）の特異的相互作用が、有用な配列情報を示す三元複合体をどのように形成するかを実証した。後続の正しいヌクレオチドの同一性は、プライマー伸長産物への化学的組み込みの前、及び天然ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる非標識ヌクレオチド）の使用によって有利に判定された。この手順では、修飾ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体、または蛍光もしくは他の標識を組み込んだヌクレオチド）を使用することができるが、一方で、天然ヌクレオチドは、配列決定プロトコール中に標識または他の化学的部分を除去する必要性を排除することにより、迅速なサイクリングを促進した。マッチ／ミスマッチ塩基識別を増強するためのアプローチに関連して上記で論じたように、塩濃度を、試験工程中の三元複合体形成が選好されるように操作することができる。これにより、三元複合体形成に起因するシグナル対ノイズ比が高まり、正しい塩基読み上げが向上した。正しい塩基読み上げを向上させ、読取り長を延長するための他のアプローチを以下に説明する。
【０２０６】
図１は、プライミングした鋳型核酸をポリメラーゼ及びヌクレオチドと結合させるための二相性プロトコールを用いなかったホモポリマー圧縮による標準的なＳＢＢ手順を用いて得られた結果を示す。およそ２８サイクルの４つすべてのｄＮＴＰの試験及び組み込み（単一塩基の照合を用いた）を使用して、１００残基余りのヌクレオチドの配列データを得た。三元複合体形成を示す測定シグナル（縦軸）（同族ヌクレオチドの同定に関連する）は、サイクル数（横軸）が増加するにつれて減少傾向を示した。逆に、二元複合体の検出を示す測定シグナル（非同族ヌクレオチドの同定に関連する）は同様には減少しなかった。より詳細には、二元複合体のバックグラウンド検出に関連するシグナルは、配列決定手順の期間にわたって実質的に一定のままであった。その結果、正しい塩基読み上げのためのシグナル：ノイズ比は、図に示すよりも長い配列読取り結果からの正しい塩基読み上げでは好ましくないという傾向を示した。したがって、ＳＢＢ手順における塩基読み上げに有用なシグナル：ノイズ比を向上させることを目的として、二元複合体形成に関連するバックグラウンドシグナルを減少させるために用い得る方法を研究することは興味深いことであった。
【０２０７】
以下の実施例は、２つの異なるポリメラーゼ結合条件下でモニタリングした相互作用を比較する技術を示し、本技術では、ポリメラーゼ濃度を一定に保持し、被験ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；ヌクレオチド類似体；または標識ヌクレオチド）を２つの異なる濃度で存在させる。２つのヌクレオチド濃度は、互いに対して相対的に低く、及び相対的に高くし得る。例えば、２つのヌクレオチド濃度は１０倍以上異なり得る。実際には、２つの異なる結合条件は、被験ヌクレオチド（複数可）の存在及び非存在（すなわち、ゼロ濃度）の違いであることができる。２つの条件のうちの第２の条件で使用するヌクレオチド濃度が常に高く、その結果、プライミングした鋳型核酸を、最初にポリメラーゼ、及び２つのヌクレオチド濃度のうちの低い方に曝露する。プライミングした鋳型核酸とポリメラーゼ及びヌクレオチドとの結合について言及する場合、用語「二相性」は、ヌクレオチドが最初に低濃度（またはゼロ濃度）で存在し、次いで高濃度で存在する場合に用いられる。手順による結果は、予想外にも、二元及び三元複合体において、ＤＮＡポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸との相互作用が非常に異なることを示した。同様に、本技術は、予想外にも、配列決定中の鋳型中のホモポリマーストレッチの検出に有用であることが判明した。
【０２０８】
実施例１は、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順を行う場合に、二相性プロトコールに従ってプライミングした鋳型核酸をポリメラーゼと接触させることの利点を示す。アプローチは、正しい塩基読み上げを混乱させ得る二元複合体の形成を抑制するよりもむしろ、ポリメラーゼの濃度が一定でヌクレオチド濃度が増加した場合の結合シグナルの比較に基づいていた。塩基読み上げに使用するシグナルの品質は、二相性プロトコールの使用によって劇的に高められた。より詳細には、プロトコールは基本的に非特異的ポリメラーゼ結合のベースラインを確立した。
【０２０９】
実施例１
バックグラウンドの低減によるＤＮＡポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸とのヌクレオチド特異的相互作用の検出の向上
光ファイバーチップの表面で結合反応を測定するためのバイオレイヤーインターフェロメトリーを用いるＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）（メンローパーク、ＣＡ）Ｏｃｔｅｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔをマルチウェルプレートフォーマットで使用し、バックグラウンド低減技術を示した。標準的な手順に従って、５′末端をビオチン化した鋳型鎖を用いて、ストレプトアビジン（ＳＡ）で官能化した光ファイバーチップ上に、プライミングした鋳型核酸を固定化した。ビオチン化したＡＬＫ１００鋳型ＤＮＡから読み取った予想される配列は、配列番号１の配列（潜在的な読取り長８６ヌクレオチド）を有し、ハイブリダイズしたＤＮＡプライマーは配列番号２の配列を有していた。サイクリングプロトコールを開始する前に、２００ｍＭのＫＣｌ、１６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝溶液中でチップを洗浄した。トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１６０ｍＭのＫＣｌ、１６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、３％のＤＭＳＯ、３００ｍＭのベタイン、１ｍＭのβメルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１ｍＭのＮｉＳＯ４、２８０Ｕ／ｍｌのＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメント及び１００μＭ（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＧＴＰ）または４００μＭ（ｄＴＴＰ）の濃度のヌクレオチドの１つを含有する試験緩衝液を用いて、４つの被験ヌクレオチドのそれぞれについての独立した結合反応を連続的に行った。この手順の試験緩衝液にＤＭＳＯ及びベタインを補充してＤＮＡ二次構造を制御した。試薬交換の間に洗浄工程は必要なかった。プライミングした鋳型核酸へのポリメラーゼ及びヌクレオチドの結合を達成するために単一の接触工程を用いる場合、結合工程は２００秒の長さであり、結合相互作用のモニタリングは連続的であった。これは、プライミングした鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び被験ヌクレオチドを含有する単一の溶液と接触させることによって達成した。二相性結合プロトコールの１つの試験では、最初に、プライミングした鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び濃度１０μＭで１つのヌクレオチドを含有する溶液に４５秒間接触させ、次いで、プライミングした鋳型核酸を、ポリメラーゼ及び同じヌクレオチドをより高い濃度（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰについては１００μＭ；ｄＴＴＰについては４００μＭ）で含有する溶液に３０秒間接触させることが、手順に含まれていた。二相性結合プロトコールの別の試験では、第１の接触工程で使用した溶液は、ポリメラーゼを含有するが、結合相互作用の可能性について調べようとするいずれのヌクレオチドも含有せず；第２の接触工程で使用した溶液は、ポリメラーゼ及び１つのヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰについては１００μＭ、ｄＴＴＰについては４００μＭ）を含有していた。二相性結合プロトコールのこの後者の試験では、第１及び第２の接触工程をそれぞれ１５秒間行った。二相性結合プロトコールの両方の試験において、第１及び第２の接触工程で使用したポリメラーゼ含有溶液は、一定濃度（すなわち２８０Ｕ／ｍｌ）のポリメラーゼを含有していた。次に、組み込み工程があり、三元複合体に含まれる後続の正し��ヌクレオチドをプライマー鎖に化学的に組み込んだ。これは、化学的組み込みを促進するための、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、３％のＤＭＳＯ、３００ｍＭのベタイン、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１Ｕ／ｍｌ  のＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメント、及び終濃度２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するトリス緩衝溶液にチップを移すことによって行った。次に、二価陽イオンをキレート化することにより組み込み反応をクエンチする工程があった。クエンチは、組み込み緩衝液からチップを、５００ｍＭのＫＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有するトリス緩衝洗浄溶液に移すことによって行った。最後に、２００ｍＭのＫＣｌ、１６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝再生溶液中にチップを浸すことによって各サイクルを完了した。インターフェロメトリーのモニタリングによる結果を解析して、正しいヌクレオチド及び不正確なヌクレオチドを同定した。二相性結合手順を使用して得られた結果の場合、これは、ポリメラーゼを含む第１及び第２の接触工程後に測定したシグナルを比較することを含み、被験ヌクレオチドを後続の正しいヌクレオチドとして同定するためには、第２の接触工程後に測定したシグナルが第１の接触工程後に測定したシグナルを上回ることが必要であった。例えば、第２の接触工程の後に測定したシグナルは、第１の接触工程の後に測定したシグナルを、後続の正しいヌクレオチドとしてスコアリングする最小閾値で上回っていなければならない。工程を繰り返し、鋳型核酸についての広範な配列情報を取得した。
【０２１０】
図２Ａ及び２Ｂは、それぞれ、プライミングした鋳型核酸をポリメラーゼ及びヌクレオチドと同時に接触させることを含む標準的な単一の結合工程；ならびにプライミングした鋳型核酸を最初にポリメラーゼ及び１０μＭのヌクレオチドと接触させ、次いでより高いヌクレオチド濃度でポリメラーゼ及びヌクレオチドと接触させることを含む二相性結合工程を用いて得られたインターフェロメトリートレースを示している。サイクル３（ｄＴＴＰを使用して実施）が陰性結果である一方で、サイクル４は陽性結果（ｄＧＴＰを使用して実施）であるにもかかわらず、図２Ａのサイクル番号３及び４のトレースは非常に類似している。これは、サイクル３での読み上げが困難であり、サイクル３でモニタリングした位置でのＴを示す偽陽性の結果が生成された可能性を示している。また、興味深い点として、サイクル９が実際にはホモポリマートリプレット（すなわち、ＧＧＧ）を検出したことを表しているにもかかわらず、サイクル９は他の真の陽性結果に非常に類似していた。対照的に、図２Ｂに示すトレースは、陽性判定と陰性判定をはっきりと区別していた。すべての場合において、第２の（すなわち、より高い）ヌクレオチド濃度を用いた場合に、より高いシグナルによって陽性判定が示された。逆に、陰性判定は、第１の接触工程中に測定した最大シグナルと、より高いヌクレオチド濃度を用いた第２の接触工程中に測定したシグナルとの間に実質的な変化を示さなかった。簡単に述べると、モニタリングしたシグナルが、第１の接触工程の間にモニタリングした最大シグナルと比較して、第２の接触工程においてより高い場合、陽性結果が示された。これは、第２及び第１の接触工程において測定したシグナルの最小比を必要とすることによっても処理することができる。あるいは、特定のヌクレオチド曝露期間の最初と最後の時点を結ぶ線またはベクトルの傾きを分析して、陽性の塩基読み上げを行うための最小値を上回ったかどうかを判定することができる。データ分析を続けると、塩基位置８で開始するダブレットＧ（サイクル番号１５〜１６で検出される）は、第２の接触工程の間に異常に高いシグナルを生じ、これにより、二相性結合手順が、ユニークな単一の塩基と、ホモポリマーストレッチの存在とを区別できることを示した。最後に、図２Ａ及び２Ｂのトレースは、組み込み工程（すなわち、図２Ａの単一塩基の各サイクルの第２工程；図２Ｂの単一塩基の各サイクルの第３工程）中に観察された応答に関して定性的に異なっていた。より詳細には、シグナルは、図２Ａの組み込み工程の期間中、均一に増加したが、図２Ｂの組み込み工程中には減少した。この差異は、異なる結合工程のアプローチによって形成された複合体は同じではないことを示した。別の言い方をすれば、二相性結合アプローチは、同じ結果をもたらす単一工程の結合アプローチの変形ではなかった。その代わり、異なるトレースパターンの特性は、ポリメラーゼとプライミングした鋳型核酸との相互作用における機械的差異を反映していた。
【０２１１】
実施例２は、二相性ポリメラーゼ結合プロトコールを組み込んだｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順で得られた配列情報の質を評価するために使用する技術を記載する。
【０２１２】
実施例２
三元複合体形成の検出増強、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−Ｂｉｎｄｉｎｇプロトコールで得られるデータの精度向上
プライミングした鋳型核酸を光ファイバーチップに固定化し、本質的に実施例１に記載したように、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）（メンローパーク、ＣＡ）Ｏｃｔｅｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔとともに使用するための準備としてチップを洗浄した。手順に用いた試験緩衝液、組み込み緩衝液、クエンチング緩衝液、及び再生緩衝液の組成も実施例１と同じであった。プライミングした鋳型核酸をポリメラーゼと接触させる単一工程を用いて行った対照試験を、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントと、１００μＭ（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＧＴＰ）または４００μＭ（ｄＴＴＰ）の濃度の被験ヌクレオチドのうちの１つとを組み合わせて用いて実施した。この対照試験において、ポリメラーゼ及びヌクレオチドをプライミングした鋳型核酸に接触させる工程を、結合相互作用のモニタリングを継続しながら２００秒間進行させた。プライミングした鋳型核酸に結合する二相性ポリメラーゼを組み込む試験では、ポリメラーゼ及び濃度２μＭの１つのヌクレオチドを含有する溶液を使用する４５秒間の第１の接触工程を採用した。これに、ポリメラーゼ及び同じヌクレオチドをより高い濃度（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰについては１００μＭ；ｄＴＴＰについては４００μＭ）で含有する溶液を使用する３０秒間の第２の接触工程が続いた。第１及び第２の接触工程で使用した溶液は、一定濃度（すなわち２８０Ｕ／ｍｌ）のポリメラーゼを含有していた。次に、組み込み工程があり、三元複合体に含まれる後続の正しいヌクレオチドをプライマー鎖に化学的に組み込んだ。これは、化学的組み込みを促進するための、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、３％のＤＭＳＯ、ベタイン、β−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメント、及び終濃度２ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するトリス緩衝溶液にチップを移すことによって行った。特に、試験及び組み込み工程で使用する緩衝液にＤＭＳＯ及びベタインを補充し、ＤＮＡ二次構造を制御した。次に、二価陽イオンをキレート化して組み込み反応をクエンチする工程があった。クエンチングは、チップを、組み込み緩衝液から５００ｍＭのＫＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有するトリス緩衝洗浄溶液に移すことによって行った。最後に、ＫＣｌ、グルタミン酸カリウム、及びＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝再生溶液にチップを浸すことによって各サイクルを完了した。モニタリングしたインターフェロメトリーの測定結果に基づいて後続の正しいヌクレオチドを同定するための手順は、実施例１に記載した通りであった。プライミングした鋳型核酸を異なる溶液と接触させる工程を繰り返して、鋳型核酸の配列情報を取得した。
【０２１３】
図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ、ホモポリマー圧縮を用いたｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順に供した同じプライミングした鋳型核酸についての約６０ヌクレオチド長にわたる塩基読み上げ結果を示し、ポリメラーゼは、単一工程で、または二相性結合プロトコールを用いた。図３Ａのプロットは、１つの偽陰性判定、及び５０ヌクレオチドを超える配列における１つの偽陽性判定を含む。正しい陰性判定は、一般的に、陽性の結果を読み上げるために必要な任意の閾値を下回る検出可能なシグナルに関連していた。興味深いことに、正しい陰性判定に関連するバックグラウンドシグナルは実質的に安定したままであった一方で、正しい陽性判定については、読取り長が長くなるにつれて、シグナル強度が減少する傾向を示している。その結果、シグナル対ノイズ比は読取り長が長くなるにつれて減少した。何らかの手段によって低減または調節しない場合、読取り長には上限が存在するであろう。対照的に、図３Ｂは、正しい陰性判定に関連する検出可能なシグナルが、二相性ポリメラーゼ結合手順によって実質的に排除されたことを示す。正しい読み上げのためのシグナル対ノイズ比は、二相性結合手順を用いた場合に劇的に良好であった。さらに、二相性結合手順を用いて得られた結果において、配列決定エラーは検出されなかった。
【０２１４】
直前において記載した手順とはわずかに異なる二相性結合技術を使用して、正しい塩基読み上げ結果が２００塩基の読取り長にわたって達成され、エラーは含まれていなかった。より具体的には、プライミングした鋳型核酸を、最初に被験ヌクレオチドの非存在下でＤＮＡポリメラーゼと接触させ、次いでＤＮＡポリメラーゼと被験ヌクレオチドとの組み合わせと接触させた。上記のように、結合（すなわち、ポリメラーゼ含有溶液を使用する第１及び第２接触工程）、組み込み（すなわち、二価陽イオン触媒の添加）、クエンチング（すなわち、二価陽イオン及びポリメラーゼ反応産物の除去）、及び緩衝液の再生を、サイクルで実施した。結果は、２３０ヌクレオチドの読取り長にわたってわずか２つのエラーしか観察されなかったことを示した。この劇的な改善は、二相性結合技術の利点を示している。
【０２１５】
実施例３は、組み込み反応を実施する前に複数の被験ヌクレオチドを試験するために二相性手順をどのように使用したかを示す。本技術は、二元複合体の検出に関連するバックグラウンドシグナルを効果的に低減し、それによって後続の正しいヌクレオチドを含む三元複合体の特異的検出を増強する。同様に、非生産的な組み込み反応を避けることによってアッセイ時間を短縮した。組み込み反応に使用するヌクレオチドは、非標識の天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり得る。あるいは、組み込み反応におけるヌクレオチドは、標識または非標識の、及び／または可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体であり得る。
【０２１６】
実施例３
複数の被験ヌクレオチドのプログレッシブな結合及び試験、その後の組み込み反応
プライミングした鋳型核酸を光ファイバーチップに固定化し、本質的に実施例１に記載したように、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）（メンローパーク、ＣＡ）Ｏｃｔｅｔ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔとともに使用するための準備としてチップを洗浄し、その際、プライミングした鋳型核酸の固定化は２００秒以上かけて進行させた。次に、１００μｇ／ｍｌの超高純度ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した結合緩衝液中でセンサーチップを４５秒間洗浄した。次に、チップを試験緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１６０ｍＭのＫＣｌ、１６０ｍＭのグルタミン酸、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、１００μｇ／ｍＬの超高純度ＢＳＡ、１ｍＭのＮｉＳＯ４及び４００ｎＭのＢｓｕポリメラーゼのラージフラグメントを含有する溶液）に３０秒間曝露し、ｄＮＴＰの非存在下で二元複合体を形成できるようにした。次いで、チップを、単一のｄＮＴＰ（１００μＭのｄＴＴＰ）を補充した試験緩衝液に２０秒間曝露し；続いて２つのｄＮＴＰ（１００μＭのｄＴＴＰ及び１００μＭのｄＡＴＰ）を補充した試験緩衝液に２０秒間曝露し；続いて３つのｄＮＴＰ（１００μＭのｄＴＴＰ、１００μＭのｄＡＴＰ、及び１００μＭのｄＣＴＰ）を補充した試験緩衝液に２０秒間曝露し；最後に４つのｄＮＴＰ（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰのそれぞれについて１００μＭ）を補充した試験緩衝液に２０秒間曝露した。最終溶液からチップを取り出し、ＥＤＴＡ洗浄緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５００ｍＭのＫＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、２ｍＭのＥＤＴＡ）に２０秒間直接注入して、プライミングした鋳型核酸とともに形成していた任意の複合体からポリメラーゼ及びヌクレオチドを取り除いた。ＥＤＴＡ洗浄中における、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、Ｎｉ２＋、及びグルタミン酸カリウムの除去に続いて、ポリメラーゼまたはヌクレオチドのいずれも含まない酵素組み込み緩衝液中でチップを２０秒間平衡化した。この平衡化工程は任意であり、前の工程から持ち越された可能性のある試薬をチップから除去するのに役立った。次いで、ポリメラーゼ及び１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、後続の正しいヌクレオチドが既知である場合には単一のｄＮＴＰ、または４つすべての可逆的ターミネーターｄＮＴＰ）、ならびに鋳型鎖の後続の正しいヌクレオチドに応答してプライマーのｄＮＴＰ組み込み及び伸長を促進するのに十分な量の触媒金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋）を補充した組み込み緩衝液にチップを５秒間曝露した。チップを、ＥＤＴＡ洗浄緩衝液に再度２０秒間曝露してポリメラーゼ及び可逆的ターミネーターを除去し、試験再生溶液に２０秒間曝露した後、ｄＮＴＰ試験工程（すなわち、二相性ポリメラーゼ結合プロトコールの第１フェイズ）を行わずにサイクルを開始し、これを繰り返した。試験再生溶液は、２００ｍＭのＫＣｌ、１６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝溶液であった。このデモンストレーションではモニタリングは継続的であったが、定期的なモニタリングによっても良好な結果が得られたであろう。全工程を、５００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で行った。
【０２１７】
図４は、開示するアプローチが三元複合体検出のためのシグナル：ノイズ比を高めることを明確に確認したインターフェロメトリートレースを示す。添加したヌクレオチドの非存在下でプライミングした鋳型核酸をポリメラーゼと接触させたポリメラーゼ結合の初期フェイズは、３０秒間の処理の間に結合シグナルの実質的な増加をもたらした。これは、プライミングした鋳型核酸とポリメラーゼとの間の二元複合体の形成を示したものである。ポリメラーゼ及びｄＴＴＰの存在下で行った試験は、前の工程で測定したシグナルと比較して実質的に変化しないままであった。これは、ｄＴＴＰの存在下では二元複合体のみが形成され、ｄＴＴＰが後続の正しいヌクレオチドではないことを示したものである。その後の、ポリメラーゼ、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰの存在下で行った試験は、前の工程と比較して同様の結果を示した。これは、二元複合体のみが形成されたことから、ｄＴＴＰもｄＡＴＰも後続の正しいヌクレオチドではないことを示したものである。対照的に、ポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＣＴＰの存在下で行った試験工程は、前の工程と比較して結合シグナルの実質的な増加を示し、それにより、ｄＣＴＰを含む三元複合体が形成されたことを示した。ｄＣＴＰを含む試薬と接触させた後に三元複合体が形成されたことから、ｄＣＴＰが後続の正しい塩基として同定された。最後に、ポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰの存在下で行った試験工程は、予想通り、前の工程と比較して結合シグナルのそれ以上の増加を示さなかった。したがって、一度、三元複合体が形成された場合、非同族ｄＧＴＰを含有させても、結合シグナルは変化しなかった。特に、図４に示す結果を得るために使用した手順は、後続の正しいヌクレオチドを組み込むために通常使用する５秒間の工程において、ヌクレオチドを含まなかった。したがって、その工程中の結合シグナルの増加はなかった。反応間隔を図４中に表示し、組み込み反応を含むワークフローを示す。
【０２１８】
ラベルフリー系を用いてなされた上記の発見を、次に、外因性の検出可能な標識に基づく配列決定システムに適用した。特定の具体例では、１つ以上の蛍光ポリメラーゼを用いるシステムを使用して、組み込みを行わずに同族ヌクレオチドを同定した。例示的な実施例において使用したポリメラーゼは、添加したヌクレオチドの存在下及び非存在下で均一に蛍光性であった。立体構造感受性の蛍光ポリメラーゼは本手順で使用可能であるが、必ずしもそれである必要はない。特定の実施形態では、検出可能に標識したポリメラーゼは、同族ヌクレオチドの存在下または非存在下で、プライミングした鋳型核酸に結合する場合、実質的に異なるシグナルを生成しない。
【０２１９】
好ましくは、被験ヌクレオチドの非存在下及び存在下でプライミングした鋳型核酸（すなわち、同族ヌクレオチド候補）と接触させるための別個の工程で使用するポリメラーゼは、同一のアミノ酸配列を有する。例えば、２つのポリメラーゼは、ヌクレオチド存在下で使用するポリメラーゼ上の、外因性の検出可能な標識の存在のみが異なり得る。より具体的には、被験ヌクレオチドを含む第２の接触工程で使用するポリメラーゼは、４つの異なるヌクレオチドを試験する全サイクル中において被験ヌクレオチドをいずれも含まない初期の接触工程で使用する化学修飾されたバージョンのポリメラーゼであり得る。
【０２２０】
一般的に述べれば、ポリメラーゼに基づく配列決定手順においてポリメラーゼ結合に二相性アプローチを使用することには利点がある。ラベルフリー系に関連して適用した二相性アプローチの上記の議論が、第１及び第２の接触工程において同じポリメラーゼを使用してバックグラウンドシグナルを低減することに焦点を当てたのに対し、検出可能に標識したポリメラーゼを用いる配列決定手順は、同一ではないポリメラーゼを用いることが好ましい。より詳細には、第１の反応混合物は、好ましくは、同族ヌクレオチドの存在をそのヌクレオチドを組み込まずに示すために使用する外因性標識を有していないポリメラーゼを含有する。第２の接触工程で使用する第２の反応混合物は、ここでも組み込まずに同族のヌクレオチドの結合を示す外因性標識を有するポリメラーゼを含有する。二相性結合技術を用いて、プライミングした鋳型核酸を、ポリメラーゼの蛍光標識を有していないポリメラーゼを含有する第１の反応混合物に最初に接触させるが、ポリメラーゼの蛍光標識は第２の反応混合物中には存在し、第２の接触工程においてこれをプライミングした鋳型核酸に接触させる。
【０２２１】
特定の好ましい実施形態では、第２の接触工程で使用するポリメラーゼは、第１の接触工程で使用するポリメラーゼと、外因性化学標識、例えば外因性蛍光標識を有する点で異なる。例えば、プライミングした鋳型核酸を接触させるための初期工程（すなわち、同族ヌクレオチド候補を含まない第１の反応混合物を使用して）で使用するポリメラーゼは、外因性蛍光部分を有していないポリメラーゼであり得る。したがって、プライミングした鋳型核酸に接触する第１のポリメラーゼは、好ましくは、蛍光シグナルに実質的に寄与しない。第２の接触工程で使用する第２の反応混合物が提供するポリメラーゼは、好ましくは、第１の反応混合物のポリメラーゼに存在しない外因性蛍光標識を有する。ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順において、組み込まずに同族ヌクレオチドを同定することは、三元複合体形成による検出可能なシグナルと関連することは理解されたい。
【０２２２】
異なるヌクレオチドの連続添加（すなわち、先に添加したヌクレオチドを含む任意の複合体を除去する前に、プライミングした鋳型を第２のヌクレオチドと接触させること）に基づく手順において、後続の工程のポリメラーゼは、場合により、同じ標識または異なる標識（例えば、同じまたは異なる蛍光標識）を含む。重要なことは、初期の接触工程（本明細書中では第１の接触工程と呼ぶ）のポリメラーゼが、同族ヌクレオチドの結合を示すために用いる任意の後続の工程（複数可）の蛍光標識を欠いていることである。別の言い方をすれば、同族ヌクレオチドを同定するために１つ以上の標識ポリメラーゼを使用するｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ法の手順では、ヌクレオチド照合の全サイクルの各々に対し、プライミングした鋳型核酸を、同族ヌクレオチド候補の非存在下でポリメラーゼに最初に接触させるべきである。４工程のヌクレオチド結合を調べる場合、試験工程に先行する初期の工程は、４つの被験ヌクレオチドのいずれかの非存在下で、プライミングした鋳型核酸をポリメラーゼと接触させることを含むべきである。
【０２２３】
二相性アプローチは、単一標識のポリメラーゼ、または複数の示差的に標識したポリメラーゼを用いる手順において得られる結果を効果的に向上させる。向上した結果は、ヌクレオチドと接触させる前のポリメラーゼの存在による結合シグナルの減少から生じる。
【０２２４】
一般的に同族ヌクレオチドの結合を示すために特定の検出可能な標識を使用する（すなわち、三元複合体形成を示すために単一の標識を使用する）場合、その特定の検出可能な標識は、任意の同族ヌクレオチド候補の非存在下で、プライミングした鋳型核酸と接触させるポリメラーゼには存在させないべきである。この場合、異なるヌクレオチドを一度に１つずつ添加するそれぞれの異なるヌクレオチドの添加中に、検出可能に標識した同じポリメラーゼが存在するであろう。明確にするために、プライミングした鋳型核酸は、最初に、ヌクレオチドの非存在下でポリメラーゼと接触させるべきであり、ポリメラーゼは、三元複合体形成を示すために使用する検出可能な標識を含まない。第１のヌクレオチド結合工程では、初期の接触工程に由来するポリメラーゼ（例えば、「非標識」ポリメラーゼ）の非存在下で、初期の工程に由来するプライミングした鋳型核酸を、標識ポリメラーゼ及び第１のヌクレオチドを含有する反応混合物と接触させる。第２のヌクレオチド結合工程では、ここでも、初期の接触工程に由来するポリメラーゼの非存在下で、前の工程に由来するプライミングした鋳型核酸を、標識ポリメラーゼ及び第２のヌクレオチドを含有する反応混合物と接触させる。場合により、第１のヌクレオチドは、第２のヌクレオチドとともに、標識ポリメラーゼを含有するが初期の接触工程由来のポリメラーゼは含有しない反応混合物中に含有される。一度に１つのヌクレオチドをプログレッシブに取り替えるか、または添加する反応混合物を各時点で用いて、このプロセスを第３及び第４のヌクレオチドについて繰り返し、その場合、標識ポリメラーゼは含めるが、初期の接触工程に由来するポリメラーゼは取り除く。
【０２２５】
複数の示差的に標識したポリメラーゼを使用して、組み込まずに同族ヌクレオチドを同定する場合、並列的な効果が実現される。上記のように、プライミングした鋳型核酸を接触させるための初期の工程は、潜在的な同族ヌクレオチドとして試験すべき任意の添加するヌクレオチドの非存在下でポリメラーゼを含む反応混合物を使用して実施すべきである。ここでも、上記のように、初期の接触工程のポリメラーゼは、同族ヌクレオチドの結合を示すために続いて使用する任意のポリメラーゼと同じ検出可能な標識を有するべきではない。次に、ヌクレオチドの照合を、前の工程に由来するプライミングした鋳型核酸を、第１の標識ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドとして試験する第１のヌクレオチドを含有する反応混合物と接触させることによって開始する。次に、前の工程に由来するプライミングした鋳型核酸を、第２の標識ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドとして試験する第２のヌクレオチドを含有する反応混合物と接触させることができる。この反応は、第２の標識ポリメラーゼのみを含み、初期の接触工程のポリメラーゼまたは第１の標識ポリメラーゼのいずれも含まない。このようにして、ヌクレオチドの結合を、ポリメラーゼ上の標識との関連によってコード化することができる。次に、前の工程に由来するプライミングした鋳型核酸を、第３の標識ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドとして試験する第３のヌクレオチドを含有する反応混合物と接触させることができる。この反応は、第３の標識ポリメラーゼのみを含み、初期の接触工程のポリメラーゼ、第１の標識ポリメラーゼ、または第２の標識ポリメラーゼを含まない。ここでも、ヌクレオチドの結合を、ポリメラーゼ上の標識との関連によってコード化することができる。最後に、前の工程に由来するプライミングした鋳型核酸を、第４の標識ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドとして試験する第４のヌクレオチドを含有する反応混合物と接触させることができる。この反応は、第４の標識ポリメラーゼのみを含み、初期の接触工程のポリメラーゼ、第１の標識ポリメラーゼ、第２の標識ポリメラーゼ、または第３の標識ポリメラーゼを含まない。ここでも、ヌクレオチドの結合を、ポリメラーゼ上の標識との関連によってコード化することができる。第１、第２、第３、及び第４のポリメラーゼはすべて、識別可能な標識を有することができる。このアプローチにより、試験工程の一部として単一のスキャンを行ってもよい。例えば、単一の蛍光スキャンを行って、示差的に標識したポリメラーゼの各々を含有する三元複合体を検出することができる。
【０２２６】
開示する方法及び組成物のために使用することができ、それらに関連して使用することができ、それらのための準備として使用することができ、またはそれらの産物である、物質、組成物、及び成分を上記に開示した。これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどを開示する場合、これらの化合物の様々な個々の、及び集合的な組み合わせ、及び並び換えの各々についての具体的な言及が明示的に開示されない場合があるとしても、各々は、本明細書において具体的に企図され、記載されるものと理解されたい。例えば、方法が開示され、議論され、その方法を含む多くの分子に対してなし得る多数の改変が議論される場合、方法のそれぞれの、またはすべての組み合わせ及び並び換え、ならびに可能な改変は、これに反する示唆が特になされない限り、具体的に企図されるものとする。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に企図され、開示される。この概念は、開示する組成物を使用する方法の工程を含む本開示のすべての態様に適用される。したがって、実行可能な追加の工程が多岐に渡る場合、これらの追加の工程の各々は、開示する方法の任意の特定の方法の工程または方法の工程の組み合わせで実行可能であること、及びそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットの各々が特に企図され、開示されるものとみなすべきであることを理解されたい。
【０２２７】
本明細書に引用する刊行物、及びそれらが引用する資料は、その全体を参照として本明細書に具体的に援用する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも、個々の刊行物、特許、または特許出願を、具体的かつ個別に参照として援用することを示しているかのように、本明細書において参照として援用される。
【０２２８】
本明細書中で使用する見出しは、単に構成上の目的のためのものに過ぎず、その記載または特許請求の範囲を限定することを意味しないことは理解されたい。
【０２２９】
多くの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な変更がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月20日(2018.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験ヌクレオチドが、プライミングした鋳型核酸中のプライマーのすぐ下流の、鋳型鎖中の後続塩基に相補的な塩基を含む後続の正しいヌクレオチドであるかどうかの判定方法であって：
（ａ）前記プライミングした鋳型核酸を、ＤＮＡポリメラーゼを含有する第１の反応混合物と接触させ、それにより、前記プライミングした鋳型核酸と前記ポリメラーゼとを含む二元複合体を形成し；
（ｂ）工程（ａ）の前記二元複合体を、前記ＤＮＡポリメラーゼ及び前記被験ヌクレオチドを含有する第２の反応混合物と接触させ；
（ｃ）各工程（ａ）及び（ｂ）間の１つ以上の時点において、それぞれ、前記プライマー内への前記被験ヌクレオチドの化学的組込みを伴わずに、前記第１及び第２の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼへの前記プライミングした鋳型核酸の結合を測定し；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）での前記結合の測定結果を用いて、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドであるかどうかを判定する工程を含み、
（ｉ）前記第１の反応混合物が前記被験ヌクレオチドを含まないか、または
（ｉｉ）前記第１及び第２の反応混合物のそれぞれが前記被験ヌクレオチドを含み、前記第１の反応混合物の前記被験ヌクレオチドが前記第２の反応混合物の前記被験ヌクレオチドの濃度より低い濃度で存在するかのいずれかである、前記判定方法。
【請求項２】
前記被験ヌクレオチドが、付加された蛍光標識を含まない天然ヌクレオチドであり、工程（ｃ）が、前記被験ヌクレオチドへの前記ＤＮＡポリメラーゼの結合の結果として光学特性を変化させる立体構造感受性色素からの蛍光または吸光シグナル間の差異を測定することを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の反応混合物が前記被験ヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｅ）ホスホジエステル結合の形成によって、前記プライミングした鋳型核酸の前記プライマーに前記被験ヌクレオチドを化学的に組み込む工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）〜（ｅ）を少なくとも５０回繰り返す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｆ）前記被験ヌクレオチドの代わりに第２の被験ヌクレオチドを用いて前記工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返す工程をさらに含み、前記被験ヌクレオチド及び前記第２の被験ヌクレオチドが互いに異なっている、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ｅ）前記第２の反応混合物を、可逆的ターミネーター部分を有する可逆的ターミネーターヌクレオチドと、前記第２の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼとは異なるＤＮＡポリメラーゼとを含む第３の反応混合物で置換する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
（ｆ）ホスホジエステル結合の形成によって、前記可逆的ターミネーターヌクレオチドを前記プライマーに組み込む工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｇ）前記プライマーに組み込まれた前記可逆的ターミネーターヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター部分を除去する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）〜（ｇ）を少なくとも５０回繰り返すことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライミングした鋳型核酸を固体支持体に固定化し、工程（ｂ）が、前記第１の反応混合物を含む容器から前記第２の反応混合物を含む異なる容器に前記固体支持体を移動させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記プライミングした鋳型核酸を固体支持体に固定化し、各工程（ａ）及び（ｂ）が、前記プライミングした鋳型核酸上に反応混合物を流すことを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）が、各工程（ａ）及び（ｂ）間に、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を連続的に測定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）が、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次に、前記測定した光シグナル間の差異を計算して、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が、工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）が、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次に、前記測定した光シグナル間の比を計算して、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が、工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）が、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を示す光シグナルを測定し、次に、前記測定した光シグナルの時間依存変化率を計算して、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が、工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回るかどうかを判定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験ヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰからなる群から選択される天然ヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験ヌクレオチドが、外因性蛍光標識を含まない、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験ヌクレオチドが、外因性標識を含まない非標識被験ヌクレオチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験ヌクレオチドがヌクレオチド類似体である、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド類似体が、可逆的ターミネーター部分を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記可逆的ターミネーター部分を有する前記ヌクレオチド類似体が、蛍光標識をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライミングした鋳型核酸を表面に固定化し、工程（ｃ）が、屈折率の変化を測定して、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）が、インターフェロメトリーまたは表面プラズモン共鳴検出による屈折率の変化を測定することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼが、添加した蛍光標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドに結合した後に特性を変化させる添加した蛍光標識を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の反応混合物の前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドに結合した後に特性を変化させる添加した蛍光標識を含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記プライミングした鋳型核酸を表面に固定化し、工程（ｃ）が、屈折率の変化を測定し、前記プライミングした鋳型核酸の前記ＤＮＡポリメラーゼへの結合を測定することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の反応混合物が、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドである場合に最大限の三元複合体形成を達成するために必要とされる濃度よりも低い濃度で前記被験ヌクレオチドをさらに含み、前記第２の反応混合物が、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドである場合に最大限の三元複合体形成を達成するのに十分な濃度で前記被験ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）が、工程（ｂ）での前記結合の測定結果が工程（ａ）での前記結合の測定結果を上回る場合に、前記被験ヌクレオチドが前記後続の正しいヌクレオチドであると判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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