(57)【要約】  本発明は、急性疼痛から慢性疼痛への変質のバイオマーカーとしての、及び治療ターゲットとしてのＭｙｏ１ａの同定に関する。特に、本発明は、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するための製品及び方法に関し、哺乳動物、好ましくはヒト被験体に特に適切である。より具体的には、本発明は、好ましくはバイオマーカーとしてＭＹＯ１Ａ遺伝子を使用して、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価することに関する。本明細書では、本発明者らは、ＭＹＯ１Ａに特異的な結合試薬、それを含有する組成物、デバイス、キット及び動物モデルを提供し、慢性疼痛を患う被験体の素因を評価するためのそれらの使用をさらに記載する。本発明はまた、慢性疼痛を診断、予防、管理又は治療するための製品及び方法に関する。
2019512213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのバイオマーカーとしての、Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡ（Ｍｙｏ１ａ）をコードするＤＮＡ、Ｍｙｏ１ａをコードするｍＲＮＡ又はＭｙｏ１ａタンパク質の使用。
【請求項２】
機能的Ｍｙｏ１ａを発現するＭｙｏ１ａホモ接合（Ｍｙｏ１ａ＋／＋）参照被験体において観察された発現と比較した、被験体におけるＭｙｏｓｉｎ  ＩＡ（Ｍｙｏ１ａ）の欠如、発現減少又は非機能的発現が、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
傷害誘発性慢性機械的疼痛が炎症性慢性機械的疼痛、神経因性慢性機械的疼痛又は術後慢性機械的疼痛である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するin vitro方法であって、該被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸配列を分析する（典型的には、配列決定する）工程を含み、配列番号：１で特定されているＭｙｏ１ａ野生型核酸配列と比較した、該被験体におけるＭｙｏ１ａ核酸配列の変化の検出が、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有することを示すのに対して、変化の欠如が、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有しないことを示す、方法。
【請求項５】
生物学的サンプルが血液、血漿又は血清サンプルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の予防又は治療に使用するための、Ｍｙｏ１ａをコードするＤＮＡ、Ｍｙｏ１ａをコードするｍＲＮＡ又はＭｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質のアゴニスト。
【請求項７】
Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質のアゴニストと、薬学的に許容し得る担体とを含む、組成物。
【請求項８】
被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の予防又は治療に使用するための、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
被験体が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用、請求項４若しくは５に記載の方法、請求項６に記載の使用のためのＭｙｏ１ａをコードするＤＮＡ、Ｍｙｏ１ａをコードするｍＲＮＡ若しくはＭｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質のアゴニスト、又は請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
支持体上に固定化されたＭｙｏ１ａ遺伝子の全部又は一部に結合する少なくとも１つの相補的核酸を含む、デバイス。
【請求項１１】
傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのキットであって、該被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸を配列決定するためのオリゴヌクレオチドを含む、キット。
【請求項１２】
疼痛を予防、軽減又は治療するための薬物候補のin vitro又はex vivoスクリーニング方法であって、Ｍｙｏ１ａ機能的発現を活性化若しくは刺激し又は逆に低減若しくは抑制する薬物候補の能力を決定することを含み、該能力が確認された場合には、該薬物候補を、Ｍｙｏ１ａアゴニストとして、及び疼痛を予防、軽減若しくは治療するための薬物候補として、又は逆にＭｙｏ１ａアンタゴニストとして同定する、方法。
【請求項１３】
Ｍｙｏ１ａモデュレーター及び／又は疼痛を予防、軽減若しくは阻害するための薬物をスクリーニングするための、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ（Ｍｙｏ１ａ−／−）動物モデルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性疼痛から慢性疼痛への変質のバイオマーカーとしての、及び治療ターゲットとしてのＭｙｏ１ａの同定に関する。特に、本発明は、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するための製品及び方法に関し、哺乳動物、好ましくはヒト被験体に特に適切である。より具体的には、本発明は、好ましくはバイオマーカーとしてＭＹＯ１Ａ遺伝子を使用して、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価することに関する。本明細書では、本発明者らは、ＭＹＯ１Ａに特異的な結合試薬、それを含有する組成物、デバイス、キット及び動物モデルを提供し、慢性疼痛を患う被験体の素因を評価するためのそれらの使用をさらに記載する。本発明はまた、慢性疼痛を診断、予防、管理又は治療するための製品及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
疼痛は、一般に、急性及び慢性に分類される。急性疼痛は短期間型であり、身体の完全性の維持に必須であるのに対して、慢性疼痛は、通常の治癒時間を超えて持続し、健康に悪影響を及ぼす。慢性炎症性疼痛又は神経因性疼痛は、高消耗性長期間型感覚異常、例えば痛覚過敏症、異痛症及び自発性疼痛を生じさせる(Munro et al., 2009)。これらの症候は、末梢神経系及び中枢神経系の両方における疼痛経路の異常に長い感作の結果として起こり、疼痛伝達回路における促進の増加又は抑制の喪失のいずれかを引き起こす(Sandkuhler, 2009; Zeilhofer et al., 2012)。炎症及び神経傷害の状況では、様々な機構を介して、脊髄抑制の低下が起こる。これらとしては、抑制性グリシンレセプターのプロスタグランジンＥ２媒介性抑制(Ahmadi et al., 2002; Harvey et al., 2004; Muller et al., 2003; Zeilhofer et al., 2012)及び塩化カリウム排出輸送体ＫＣＣ２の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）媒介性ダウンレギュレーション（これは、塩化物の恒常性を不安定化してＧＡＢＡ作動性及びグリシン作動性抑制機能を変化させる）(Coull et al., 2005; Coull et al., 2003; Zeilhofer et al., 2012)が挙げられる。より最近の研究では、急性及び傷害誘発性持続性疼痛のコントロールに関与する脊髄（ＳＣ）興奮性及び抑制性介在ニューロンの異なるサブセットを伴ういくつかの微小回路が解明された(Bourane et al., 2015a; Bourane et al., 2015b; Duan et al., 2014; Foster et al., 2015; Peirs et al., 2015; Petitjean et al., 2015)。まとめると、これらのデータは、傷害誘発性急性疼痛の発症をコントロールする末梢性感作及び中枢性感作の両方の基礎となる分子機構及び細胞機構が公知であることを実証している。しかしながら、急性疼痛から慢性疼痛への移行をトリガーする分子事象及び細胞事象に関する知識は依然として限られている。例えば、一般的な外科手術、例えば乳腺手術及び胸部手術、脚切断並びに冠状動脈バイパス後の個体の約１０〜５０％では、急性術後疼痛後、続いて持続性疼痛が起こることが十分に立証されている(Gilron et al., 2013; Kehlet et al., 2006)。これらの患者の一部のみが慢性術後疼痛（ＣＰＳＰ）を発症する経緯及び理由は不明である。臨床では、ＣＰＳＰの発症を予測するいくつかのリスク因子が示唆されている。これらとしては、年齢、性別、手術の種類、誘発疼痛性刺激に対する患者の応答の術前評価及び術後評価、並びにＣＰＳＰを発症する遺伝的感受性が挙げられる(Kehlet et al., 2006)。
【０００３】
慢性疼痛の発症、予防及び治療に関する情報の欠如を考慮すると、その適切な管理を可能にする新たなバイオマーカーの同定に対する、及びその予防、減弱又は治療を可能にする新たな治療化合物に対する明確な必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
発明の簡単な説明
驚くべきことに、本明細書では、本発明者らは、Ｍｙｏ１ａの喪失又はその発現の変化が、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因に関連することを初めて実証する。
【０００５】
したがって、本発明の第１の目的は、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのバイオマーカーとしての、Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡ（Ｍｙｏ１ａ）、好ましくはＭｙｏ１ａ遺伝子をコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はＭｙｏ１ａタンパク質の使用に関する。
【０００６】
本発明はまた、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するin vitro方法であって、該被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸配列を分析する（典型的には、配列決定する）工程を含み、配列番号：１で特定されているＭｙｏ１ａ野生型核酸配列と比較した、該被験体におけるＭｙｏ１ａ核酸配列の変化の検出が、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有することを示すのに対して、変化の欠如が、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有しないことを示す方法に関する。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の予防又は治療に使用するための、Ｍｙｏ１ａをコードするＤＮＡ、Ｍｙｏ１ａをコードするｍＲＮＡ又はＭｙｏ１ａ  タンパク質（「Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡ」）のアゴニストと、薬学的に許容し得る担体又は支持体と一緒にＭｙｏ１ａ  タンパク質のアゴニストを含む組成物と、被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を予防又は治療するためのその使用とに関する。
【０００８】
Ｍｙｏ１ａモデュレーターのin vitro又はex vivoスクリーニング方法であって、Ｍｙｏ１ａ機能的発現及び／又は生物学的機能を活性化若しくは刺激し又は逆に低減若しくは抑制する薬物候補の能力を決定することを含み、該能力が確認された場合には、該薬物候補を、Ｍｙｏ１ａアゴニスト（活性化剤）として、及び潜在的には疼痛を予防、軽減若しくは治療するための薬物候補として、又は逆にＭｙｏ１ａアンタゴニスト（阻害剤）として同定する方法も本明細書に記載される。
【０００９】
本明細書では、本発明者らは、Ｍｙｏ１ａモデュレーター及び／又は疼痛を予防、軽減若しくは阻害するための薬物をスクリーニングするための、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ（Ｍｙｏ１ａ−／−）動物モデルの使用可能性を明らかにする。
【００１０】
本発明はまた、上記方法を実行するために適切なキット及びデバイス、例えば、支持体上に固定化されたＭｙｏ１ａ遺伝子若しくはＭｙｏ１ａ遺伝子座の全部若しくは一部に結合する少なくとも１つの相補的核酸、典型的にはＭｙｏ１ａ核酸を配列決定するためのオリゴヌクレオチドを含むデバイス、又は傷害誘発性慢性機械的疼痛若しくは炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのキットであって、該被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸を配列決定するためのオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。
【００１１】
特定の態様では、本発明は、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するための、支持体上に固定化されたＭｙｏ１ａ遺伝子又はＭｙｏ１ａ遺伝子座の全部又は一部に結合する少なくとも１つの相補的核酸を含むデバイスの使用に関する。
【００１２】
別の特定の態様では、本発明は、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのキットの使用であって、該キットが、該被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸を配列決定するためのオリゴヌクレオチドを含む使用に関する。
【００１３】
本発明との関連では、被験体は、任意の哺乳動物被験体、特にヒト被験体である。
【００１４】
発明の詳細な説明
疼痛は、実際の又は潜在的な組織損傷に関連する不快な知覚経験である。したがって、疼痛は、様々な傷害及び疾患の最も一般的な症候である。疼痛の異なる類が存在し、例えば、侵害受容性疼痛は、一般に、炎症性疼痛及び病理学的疼痛（これは、神経系に対する損傷によって（すなわち、神経因性疼痛）、又はその異常機能によって（線維筋痛症、過敏性大腸症候群、緊張型頭痛などのような機能障害性疼痛）引き起こされる疾患状態である）と区別される。
【００１５】
通常、疼痛は一時的であり、侵害刺激が除去されるか又は根本的な損傷若しくは病状が治癒するまで継続するだけであるが、関節リウマチ、末梢神経障害、ガン及び特発性疼痛（外傷若しくは病状の治癒後も持続する疼痛、又はいかなる明確な原因もなく生じる疼痛）などのいくつかの疼痛性症状は、数年間持続し得る。長期間継続する疼痛は慢性と称され、迅速に消する疼痛は急性と称される。伝統的には、急性疼痛と慢性疼痛との区別は、発症からの任意の時間間隔に依拠し；２つの最も一般的に使用されるマーカーは、疼痛の発症から３カ月及び６カ月であるが(Turk, Okifuji, Pain terms and taxonomies of pain; In: Bonica, Loeser, Chapman, Turk, Butler, Bonica’s management of pain. Hagerstwon: Lippincott Williams & Wilkins, 2001)、急性疼痛から慢性疼痛への移行を１２カ月とする理論家及び研究者もいる(Spanswick, Main, Pain management: an interdisciplinary approach. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2000)。他では、３０日未満継続する疼痛に急性が適用され、６カ月間を超える疼痛に慢性が適用され、１〜６カ月継続する疼痛に亜急性が適用されている(Thienhaus, Cole, Classification of pain. In: Weiner, Pain management: a practical guide for clinicians. Boca Raton: CRC Press, 2002)。任意の固定期間を伴わない慢性疼痛の代表的な別の定義は、「予想される治癒期間を超えて延長する疼痛」である(Turk, Okifuji, 2001, Pain terms and taxonomies. In Loeser, Butler, Chapman, et al. Bonica’s management of pain, Lippincott Williams&Wilkins. ISBN 0-683-30462-3)。慢性疼痛は、ガン性疼痛又は良性に分類され得る(Thienhaus, Cole, 2002, Classification of pain. In Weiner, Pain management: A practical guide for clinicians, American Academy of Pain Management, ISBN 0-8493-0926-3)。
【００１６】
痛覚は、侵害受容器とも称される感覚神経によって脳に伝達される。侵害受容器は、熱的（加熱／冷却）、機械的及び化学的刺激などの複数の形態の侵害刺激又は強い刺激に応答し得るので、ポリモーダルであると考えられている。侵害受容器の感覚求心性線維は、多くの点で異種性である。例えば、感覚神経は、それらの直径及びミエリン形成の程度にしたがって、Ａα、−β、−δ及びＣ−線維に分類される。次いで、末梢からの感覚入力は処理され、脊髄内の興奮性及び抑制性介在ニューロンを伴う複雑な回路によって、高次の脳領域に伝達される(Basbaum et al., 2009; Todd, 2010)。興奮と抑制との間のバランスは、正常な感覚機能の維持に重要あり、これらの回路の機能障害は、炎症性疼痛及び神経因性疼痛などの疼痛の発症につながる。
【００１７】
疼痛の処置としては、局所麻酔剤（これは、神経伝達を遮断し、感覚及び疼痛に影響を与える）及び鎮痛剤（これは、疼痛を緩和し、さらに炎症の化学メディエーターの活性を妨げ得る）の使用が挙げられる。急性疼痛は、通常、鎮痛剤及び麻酔剤などの薬物療法によって管理される。しかしながら、慢性疼痛の管理は、はるかに困難である。加えて、外科病棟、集中治療室及び救急外来全体で、一般診療で、ガン性疼痛を含む全ての形態の慢性疼痛の管理で、並びに終末期ケアで、疼痛の不適切な処置が蔓延している。この怠慢は、新生児から虚弱高齢者に至る全年齢に及ぶ。選択される公知の鎮痛性分子にかかわらず、特に、神経因性疼痛、炎症性疼痛及び／又は慢性疼痛の処置が依然として不完全であることを考慮すると、改善された疼痛処置は現在まで依然として、患者によって強く必要とされている。
【００１８】
本発明の目的は、施術者が疼痛処置を最適化するのを支援するために、慢性疼痛を発症しやすい被験体者間を区別することである。
【００１９】
本発明との関連では、患者又は被験体は、動物、好ましくは脊椎動物、典型的には哺乳動物である。好ましい実施態様では、哺乳動物は、その年齢又は性別にかかわらず、ヒトである。さらに、哺乳動物は、動物、特に家畜又は繁殖動物、特にウマ、イヌ、ネコなどであり得る。
【００２０】
本明細書では、本発明者らは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスにおいて、短期間型の可逆的な炎症性疼痛、神経因性疼痛及び術後疼痛が不可逆的な慢性疼痛に変質することを実証するが、これは、発生病変の病因にかかわらず、Ｍｙｏ１ａの喪失が、マウスが慢性疼痛を発症する素因となることを示している。行動学的薬理学を使用して、本発明者らは、炎症及び神経傷害の状況において、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスが、ＧＡＢＡＡ−Ｒアゴニストであるムシモールの鎮痛効果に対して選択的に非感受性であったことを見出したが、これは、Ｍｙｏ１ａの喪失がイオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性シグナリングを損なったことを実証している。したがって、ＳＣ切片における電気生理学的記録により、炎症条件下において、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、第ＩＩ層介在ニューロンの興奮性グルタミン酸作動性活性のムシモール誘発性増加が完全に消失したことが実証された。不偏ＲＮＡディープシーケンシングスクリーニングを使用して、本発明者らは、ＤＲＧ及びＳＣニューロンの両方においてＧＡＢＡＡ−Ｒ（ＧＡＢＲＡ２）のα２サブユニットの選択的アップレギュレーションを明らかにした。まとめると、これらのデータは、イオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性シグナリングの選択的変化を介した傷害誘発性慢性疼痛及び炎症誘発性慢性熱的疼痛の発症の予測遺伝的因子としてＭｙｏ１ａ遺伝子を同定している。
【００２１】
本明細書では、本発明者らは、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのバイオマーカー（又は予測遺伝的因子）としての、Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡ（Ｍｙｏ１ａ）をコードする核酸配列、典型的にはＭｙｏ１ａ、好ましくはＭｙｏ１ａ遺伝子をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡの使用を記載する。機械的疼痛又は熱的疼痛は、機械的若しくは熱的な異痛症（刺激によって引き起こされる疼痛であり、通常は痛みを伴わない）又は痛覚過敏症（刺激に対する過度の反応であり、通常は疼痛を伴う）であり得る。
【００２２】
傷害誘発性慢性機械的疼痛は、典型的には、炎症性慢性機械的疼痛、神経因性慢性機械的疼痛及び／又は術後慢性機械的疼痛である。これら３つの古典的に区別される種類の疼痛はそれぞれ、傷害によってトリガーされる（すなわち、組織損傷に関連する）。より具体的には、本発明との関連では：
−炎症性慢性機械的疼痛は、組織損傷及び免疫細胞の浸潤に関連する；
【００２３】
−神経因性慢性機械的疼痛は、神経系に影響を及ぼす傷害によってトリガーされ、神経系に対する実際の損傷を伴うものでもよいし、又は伴わないものでもよい（すなわち、神経は、腫瘍によって浸潤若しくは圧迫され得、瘢痕組織によって絞扼され得、又は感染によって炎症が起こり得る）。疼痛は、多くの場合、燃焼性、灼熱性又は電気ショック性を有する。持続性異痛症はまた、神経因性疼痛の共通の特徴である。疼痛は、任意の損傷組織の明らかな治癒後も数カ月又は数年間持続し得る。
【００２４】
神経因性疼痛の例としては、ヘルペス後（又は帯状疱疹後）神経痛、反射性交感神経性ジストロフィー／灼熱痛（神経外傷）、ガン性疼痛の成分、幻肢痛、絞扼神経障害（例えば、手根管症候群）及び末梢神経障害（広範囲の神経損傷）が挙げられる。末梢神経障害の多くの原因のうち、糖尿病が最も一般的であるが、この症状はまた、慢性的なアルコール使用、他の毒素への曝露（多くの化学療法を含む）、ビタミン欠乏及び多種多様な他の病状によって引き起こされ得る。この症状の原因が診断されないままであることは珍しいことではない；並びに
【００２５】
−術後慢性機械的疼痛は、手術中に生じた組織損傷から直接生じる。
【００２６】
Ｍｙｏ１ａ遺伝子は、ミオシンスーパーファミリーのメンバーであるＭｙｏｓｉｎ−１ａ（本明細書では「Ｍｙｏ１ａ」とも特定される）をコードする。このタンパク質は、非従来型のミオシンである。それは、従来型の骨格筋ｍｙｏｓｉｎ−１（ＭＹＨ１）と混同されるべきではない。非従来型のミオシンは、従来型のミオシンに特徴的な基本ドメインを含有し、それらのテイルドメインによってクラスメンバーとさらに区別される。それらは、アクチンベースの分子モーターとして機能する。Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡは、脊髄のニューロンにおいて［より具体的には、本明細書では「腰部ＬＴＭＲ」とも特定される成体腰部後根神経節（ＤＲＧ）由来のＬＴＭＲニューロンにおいて］、及び腸の特定領域のニューロンにおいて発現されることが公知である。Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡはまた、三叉神経において発現される(Tyska, M.J. et al.)。
【００２７】
Ｍｙｏ１ａ遺伝子は、高度に多型であると同定されている。予想よりも多くの変異体が実際に観察された（同義：予想１５３．１、観察１５８、ｚ＝−０．２５．ミスセンス：予想３６３．９、観察４０５、ｚ＝−１．０５）。
【００２８】
本発明の典型的な実施態様では、機能的Ｍｙｏｓｉｎ  Ｉａ（Ｍｙｏ１ａ）を発現するＭｙｏ１ａホモ接合（Ｍｙｏ１ａ＋／＋）参照被験体において観察された発現と比較した、被験体におけるＭｙｏｓｉｎ  ＩＡ（Ｍｙｏ１ａ）の欠如、発現減少若しくは欠如又は非機能的発現は、被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因である。
【００２９】
機能的Ｍｙｏｓｉｎ  Ｉａを発現する参照被験体は、Ｍｙｏ１ａホモ接合（Ｍｙｏ１ａ＋／＋）被験体である。参照被験体のＭｙｏ１ａ遺伝子は、配列番号：１又はその機能的変異体からなる。配列番号：１の機能的Ｍｙｏ１ａ変異体は、機能的Ｍｙｏｓｉｎ  Ｉａ（配列番号：２）をコードする。機能的Ｍｙｏ１ａ変異体は、例えば限定されないが、配列番号：３（イヌ）及び配列番号：５（ネコ）などの配列番号：１のオルソログから選択され得る。
【００３０】
Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡの非機能的発現は、典型的には、後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄におけるＧＡＢＡレセプター（ＧＡＢＡ−Ｒ）のα２サブユニットの選択的アップレギュレーションに関連し、当業者によって間接的に検出され得る。同様に、被験体におけるＧＡＢＡ作動性シグナリングの変化の検出は、Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡの発現を検証する理由、又は前記被験体におけるＭｙｏ１ａを配列決定する理由となる。
【００３１】
タンパク質、典型的にはＭｙｏｓｉｎ  Ｉａを検出又は定量するために当業者が使用可能な方法は当業者に周知であり、本明細書において以下でさらに特定されている。
【００３２】
傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する好ましい方法は、該被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸配列を分析する（好ましくは、配列決定する）工程を含むin vitro方法であり、配列番号：１で特定されているＭｙｏ１ａ野生型核酸配列と比較した、該被験体におけるＭｙｏ１ａ核酸配列の変化の検出は、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有することを示すのに対して、変化の欠如は、該被験体が傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有しないことを示す。
【００３３】
核酸配列の変化は、機能的Ｍｙｏ１ａを発現するＭｙｏ１ａホモ接合（Ｍｙｏ１ａ＋／＋）参照被験体において観察された発現と比較したＭｙｏ１ａ核酸の異常発現（典型的には、発現減少、低減又は欠如）、又は核酸によってコードされるタンパク質（Ｍｙｏ１ａ）の異常（典型的には、非機能的）発現若しくは活性の原因となる。
【００３４】
典型的には、核酸配列の変化は、Ｍｙｏ１ａ遺伝子、典型的にはＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡのレベルで決定され得る。好ましくは、検出は、遺伝子座の全部若しくは一部を配列決定することによって、又は遺伝子座の全部若しくは一部の選択的ハイブリダイゼーション若しくは増幅によって実施される。より好ましくは、遺伝子座特異的増幅は、変化同定工程前に行われる。
【００３５】
変化した核酸又は遺伝子座は、典型的には、遺伝子座のコード領域及び／又は非コード領域において突然変異又は突然変異の組み合わせを含む核酸又は遺伝子座配列である。
【００３６】
突然変異は、典型的には、点突然変異、又は２つ以上の残基（塩基）の欠失若しくは挿入である。
【００３７】
点突然変異は、ある塩基を別の塩基と交換する置換（すなわち、余分な塩基が核酸配列の新たな場所に挿入される挿入）であり得る。点突然変異は、ミスセンス突然変異（これは、単一のヌクレオチドが異なるアミノ酸の置換を引き起こすように変化する点突然変異である）又はナンセンス突然変異、例えばフレームシフト突然変異（これは、転写ｍＲＮＡにおける未成熟終止コドン又はナンセンスコドン、及び切断型又は不完全型タンパク質産物をもたらす）である。
【００３８】
欠失は、遺伝子座のコード部分又は非コード部分における２つ以上の残基の任意の領域、例えば２つの残基から遺伝子又は遺伝子座全体を包含し得る。典型的な欠失は、より小さな領域、例えば約５０個未満の連続する塩基対のドメイン（イントロン）又は反復配列又はフラグメントに影響を及ぼすが、より大きな欠失も起こり得る。挿入は、遺伝子座のコード部分又は非コード部分における１つ又は複数の残基の付加を包含し得る。挿入は、典型的には、遺伝子座における１〜５０個の塩基対の付加を含み得る。再構成は、配列の逆位を含む。遺伝子座の変化は、終止コドン、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシング又はプロセシング、産物の不安定性、切断型ポリペプチドの産生などをもたらし得る。
【００３９】
本発明との関連で遭遇する全ての場合において、突然変異は、機能的タンパク質産物の産生を停止若しくは減少させるか、又は非機能的タンパク質産物をもたらす。突然変異は、典型的には、機能喪失型突然変異である。
【００４０】
Ｍｙｏｓｉｎ  Ｉａの機能的発現に影響を及ぼさない変異又は多型は、当業者によって、核酸配列の変化として同定されないであろう。
【００４１】
本発明との関連では、「Ｍｙｏ１ａ遺伝子座」は、Ｍｙｏ１ａコード配列、Ｍｙｏ１ａ非コード配列（例えば、イントロン）、転写及び／又は翻訳をコントロールするＭｙｏ１ａ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー／サイレンサー領域、ターミネーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）、全ての対応する発現産物、例えばＭｙｏ１ａ  ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）；並びにＭｙｏ１ａ遺伝子の（５’ＵＴＲ領域に隣接する）開始コドンの上流の２０kb領域、好ましくは１５．３kb領域及び（３’ＵＴＲ領域に隣接する）非翻訳領域の下流の２０kb領域、好ましくは１４．１kb領域の周辺配列を含む、細胞又は生物における全ての配列又は産物を表す。特定の実施態様では、ほとんどの変化は、プロモーター配列中にない。
【００４２】
特定の実施態様では、変化したＭｙｏ１ａ核酸は、少なくとも１つの点突然変異、好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）、例えば機能喪失型ＳＮＰ、すなわち核酸によってコードされるタンパク質の欠如又は異常（非機能的）発現の原因となるＳＮＰを含むＭｙｏ１ａ野生型核酸である。Ｍｙｏ１ａ野生型核酸はまた、いくつかの一塩基多型（ＳＮＰ）を含み得る。
【００４３】
Ｍｙｏ１ａを含む目的のゲノム領域において第１のＳＮＰが同定されたら、この第１のＳＮＰと連鎖不平衡にある他のさらなるＳＮＰが同定され得る。実際、慢性疼痛素因表現型に関連する第１のＳＮＰと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰは、この形質に関連するであろう。したがって、所定のＳＮＰと慢性疼痛素因表現型との間の関連が実証されたら、この特定領域におけるＳＮＰの密度を増加させるために、この形質に関連するさらなるＳＮＰの発見は非常に重要であり得る。所定のＳＮＰと連鎖不平衡にあるさらなるＳＮＰの同定は、（ａ）複数の個体由来の第１のＳＮＰを含むか又はその周辺のゲノム領域由来のフラグメントを増幅すること；（ｂ）前記第１のＳＮＰを有するか又はその周辺のゲノム領域において第２のＳＮＰを同定すること；（ｃ）前記第１のＳＮＰと第２のＳＮＰとの間で連鎖不平衡分析を行うこと；及び（ｄ）前記第１のマーカーと連鎖不平衡にあるものとして前記第２のＳＮＰを選択することを伴う。工程（ｂ）及び（ｃ）を含む部分組み合わせも企図される。連鎖不平衡にあるこれらのＳＮＰもまた、本発明の方法において、より具体的には、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する方法において使用され得る。
【００４４】
慢性疼痛素因表現型の原因となる遺伝子座における突然変異は、慢性疼痛素因表現型を示す患者由来の遺伝子座の配列と、（配列番号：１又はその機能的変異体を含有すると上記で定義される）参照患者由来の遺伝子座の配列とを比較することによって同定され得る。同定されたＳＮＰ又はＭｙｏ１ａ遺伝子のＳＮＰの関連に基づいて、同定された遺伝子座は、突然変異についてスキャンされ得る。好ましい実施態様では、遺伝子座の機能的領域、例えばエクソン及びスプライス部位、プロモーター及び他の調節領域は、突然変異についてスキャンされる。好ましくは、慢性疼痛素因表現型を示す患者は、慢性疼痛素因表現型に関連することが示された突然変異又は突然変異アレルを有し、参照患者は、慢性疼痛素因表現型に関連する突然変異又は突然変異アレルを有しない。このような突然変異を検出するために使用される方法は、一般に、以下：慢性疼痛素因を示す患者及び参照患者由来の遺伝子座のＤＮＡサンプルから、慢性疼痛素因表現型に関連するＳＮＰ又はＳＮＰ群を含む目的の遺伝子座の領域を増幅する工程；慢性疼痛素因表現型を示す患者及び参照表現型を示す患者由来のＭｙｏ１ａ遺伝子のＤＮＡ配列を比較する工程；慢性疼痛素因表現型を示す患者に特異的な突然変異を決定する工程を含む。
【００４５】
特定の実施態様では、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する方法は、以下：（ａ）該被験体からＭｙｏ１ａ  ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡの試験サンプルを得る工程、（ｂ）該試験サンプルと、好ましくは少なくとも１つの突然変異、典型的には点突然変異、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を含む変化したターゲットＭｙｏ１ａ核酸配列に相補的であり、それに特異的にハイブリダイゼーションする少なくとも１つの核酸プローブとを接触させて、ハイブリダイゼーションサンプルを形成する工程、（ｃ）該ターゲット核酸配列と該核酸プローブとの特異的ハイブリダイゼーションが起こるために十分な条件下で、該ハイブリダイゼーションサンプルを維持する工程、及び（ｄ）該変化したターゲット核酸配列と該核酸プローブとの特異的ハイブリダイゼーションが存在するかを検出する工程を含むin vitro方法であり、このような特異的ハイブリダイゼーションは、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を示す。
【００４６】
傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する本明細書に記載される好ましい方法のほとんどは、生物学的サンプル（これは、典型的には、被験体の血液サンプル、血漿サンプル又は血清サンプルである）の細胞から得られた核酸に対して実施される。
【００４７】
あまり好ましくないが、変化はまた、Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡポリペプチド（例えば、前駆タンパク質及び成熟タンパク質）のレベルで決定され得る。
【００４８】
特定の核酸の異常（特に、低い又は欠如）発現、又は対応するＭｙｏｓｉｎ  ＩＡポリペプチド若しくはタンパク質の異常発現を決定することを目的とする特定の技術の例は、本明細書に詳述される。
【００４９】
核酸における変化の存在は、以下でさらに説明されるように、当技術分野の方法、例えば制限消化、配列決定、（例えば、ヌクレオチドアレイ上に存在する核酸プローブとの）選択的ハイブリダイゼーション及び／又は選択的増幅を使用して、当業者によって容易に検出され得る。
【００５０】
遺伝子における変化はまた、変化したＲＮＡ発現の存在を決定することによって検出され得る。変化したＲＮＡ発現は、変化したＲＮＡ配列の存在、変化したＲＮＡスプライシング又はプロセシングの存在、変化したＲＮＡ量の存在などを含む。これらは、当技術分野で公知の様々な技術によって、例えば、ＲＮＡの全部若しくは一部を配列決定することによって、又は前記ＲＮＡの全部若しくは一部の選択的ハイブリダイゼーション若しくは選択的増幅によって検出され得る。
【００５１】
Ｍｙｏ１ａなどのターゲット核酸の異常発現の存在は、特に、ターゲット核酸配列内にハイブリダイゼーションするように設計されたプローブを使用して、リアルタイム定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって検出され得る(O’Driscoll L. et al., 1993及びYajima T. et al, 1998を参照のこと)。
【００５２】
さらなる変法では、前記方法は、目的の遺伝子によってコードされるポリペプチド又はタンパク質の変化した発現の存在を検出することを含む。変化したポリペプチド発現は、変化したポリペプチド配列の存在、変化したポリペプチド量の存在、変化した組織分布の存在などを含む。これらは、当技術分野で公知の様々な技術によって、例えば、配列決定及び／又は特定のリガンド（例えば、抗体）に対する結合によって検出され得る。
【００５３】
特定の実施態様では、異常タンパク質発現の検出は、正常タンパク質をコードするｍＲＮＡの細胞レベルを測定することによって、当業者によって容易に実施され得、コントロール又は基準レベルと比較して減少したレベルは、異常タンパク質発現と相関する。
【００５４】
配列決定は、当技術分野で周知の技術を使用して、自動シーケンサーを使用して行われ得る。配列決定は、完全な遺伝子座に対して、又はより好ましくはその特定のドメイン、典型的には、有害な突然変異又は他の変化を有することが公知であるか又は疑われるものに対して実施され得る。
【００５５】
増幅は、核酸複製を開始させるように機能する相補的核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。増幅は、当技術分野で公知の様々な技術にしたがって、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）によって実施され得る。これらの技術は、市販の試薬及びプロトコールを使用して実施され得る。好ましい技術は、アレル特異的ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、通常、反応を開始するために、特定の核酸プライマーの使用を必要とする。目的の遺伝子座由来の配列を増幅するために有用な核酸プライマーは、前記遺伝子座のターゲット領域に隣接する遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有する被験体では、前記ターゲット領域が変化している。
【００５６】
本発明の別の特定の目的は、Ｍｙｏ１ａ遺伝子又は目的の遺伝子座（周辺領域を含む）由来の配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくは、遺伝子座における核酸配列に相補的であり、それに特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、前記遺伝子座のターゲット領域に隣接する遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有する被験体では、前記ターゲット領域が変化している。ＳＮＰを含むターゲット領域を増幅するために使用され得るプライマーは、それらの配列に基づいて、又はＭｙｏ１ａ遺伝子のゲノム配列に基づいて設計され得る。
【００５７】
本発明はまた、核酸プライマーであって、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有する特定の被験体において変化しているＭｙｏ１ａ遺伝子座コード配列（例えば、遺伝子又はＲＮＡ）の一部に相補的であり、それに特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーに関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、Ｍｙｏ１ａ遺伝子座又はＲＮＡの変化した配列に特異的である。このようなプライマーを使用することによって、増幅産物の検出は、遺伝子座における変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の欠如は、特定の変化が検討サンプル中に存在しないことを示す。
【００５８】
本発明はまた、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する方法における、上記で言及される及び本明細書で特定される核酸プライマー又は核酸プライマーペアの使用に関する。
【００５９】
ハイブリダイゼーション検出方法は、核酸配列変化を検出するように機能する相補的核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成に基づく。特定の検出技術は、野生型（又はその機能的変異体）若しくは変化した遺伝子又は対応するＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用と、それに続くハイブリッドの存在の検出とを伴う。プローブは懸濁液中にあり得るか、又は（核酸アレイ又はチップ技術のように）基材若しくは支持体上に固定化され得る。プローブは、典型的には、ハイブリッドの検出を容易にするために標識される。
【００６０】
これに関して、本発明の特定の実施態様は、被験体由来のサンプルと、変化したＭｙｏ１ａ遺伝子座に特異的な核酸プローブとを接触させること、及びハイブリッドの形成を評価することを含む。
【００６１】
特に好ましい実施態様では、前記方法は、サンプルと、それぞれ野生型Ｍｙｏ１ａ遺伝子座及びその様々な変化形態に特異的なプローブのセットとを同時に接触させることを含む。この実施態様では、サンプル中の遺伝子座における様々な形態の変化の存在を直接検出することが可能である。また、単一の被験体又は様々な被験体由来の様々なサンプルは、並行して処置され得る。
【００６２】
本発明との関連では、プローブは、Ｍｙｏ１ａ遺伝子又はＲＮＡ（のターゲット部分）に相補的であり、それに特異的にハイブリダイゼーションすることができるポリヌクレオチド配列であって、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因となる遺伝子アレル（「突然変異アレル」）に関連する突然変異を検出するために適切なポリヌクレオチド配列を指す。
【００６３】
プローブは、好ましくは、特定のＭｙｏ１ａ遺伝子、ＲＮＡ又はそのターゲット部分に完全に相補的である。プローブは、典型的には、８〜１０００、例えば１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。より長いプローブも使用され得ると理解すべきである。本発明の好ましいプローブは、変化を有するＭｙｏ１ａ遺伝子座又はＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイゼーションし得る８〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。
【００６４】
本発明の方法は、変化した（例えば、突然変異した）Ｍｙｏ１ａ遺伝子又はＲＮＡに特異的な核酸プローブ（すなわち、前記変化したＭｙｏ１ａ遺伝子又はＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションする核酸プローブであって、前記変化を欠くＭｙｏ１ａ遺伝子又はＲＮＡに本質的にハイブリダイゼーションしない核酸プローブ）を用いる。
【００６５】
特異性は、ターゲット配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって生成されたシグナルと区別され得る特異的シグナルを生成することを示す。完全に相補的な配列は、本発明のプローブを設計するために好ましい。しかしながら、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションと区別され得る限り、特定のミスマッチが許容され得ると理解すべきである。
【００６６】
本発明はまた、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する方法における、上記に記載される及び本明細書で特定される核酸プローブの使用に関する。
【００６７】
上記で示されているように、Ｍｙｏ１ａ遺伝子座における変化はまた、目的のタンパク質（Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡ）を発現する組織のサンプルにおけるＭｙｏ１ａポリペプチド配列又は発現レベルの変化についてスクリーニングすることによって検出され得る。タンパク質を検出するために、免疫組織化学（例えば、生検）、イムノブロッティング（特に、ウエスタンブロット）、プロテオミクス、又は目的のタンパク質（Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡ）に対する抗体ベースのバイオセンサー、及び当業者に公知の任意の他の方法が、目的の被験体由来のＭｙｏｓｉｎ  ＩＡを含有する生物学的サンプルに適用され得る。
【００６８】
サンプルと、特定の核酸配列によってコードされるＭｙｏｓｉｎ  ＩＡに特異的なリガンドとを接触させ、複合体の形成を決定することも記載されている。
【００６９】
異なる種類のリガンド、例えば特定の抗体が使用され得る。特定の実施態様では、サンプルと、特定の核酸によってコードされるＭｙｏｓｉｎ  ＩＡに特異的な抗体とを接触させ、複合体の形成を決定する。このような複合体を検出するための様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が使用され得る。
【００７０】
本発明との関連では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び実質的に同じ抗原特異性を有するそのフラグメント又は誘導体を表す。フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域などが挙げられる。誘導体としては、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体などが挙げられる。特定の遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体は、前記ポリペプチドに選択的に結合する抗体（すなわち、前記ポリペプチド又はそのエピトープ含有フラグメントに対して生じる抗体）を表す。他の抗原に対する非特異的結合が起こり得るが、ターゲットポリペプチドに対する結合はより高い親和性で起こり、非特異的結合と確実に区別され得る。
【００７１】
傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価する本発明の方法は、好ましくは、任意の外科手術の前に被験体に対して実施される。
【００７２】
傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのキットであって、被験体由来のサンプルにおける、Ｍｙｏ１ａ遺伝子座若しくは対応するポリペプチド若しくはタンパク質；Ｍｙｏ１ａ遺伝子若しくは対応するポリペプチド若しくはタンパク質発現及び／又はＭｙｏ１ａ遺伝子活性の変化の存在を検出するための製品及び試薬を含むキットも開示される。
【００７３】
このようなキットは、任意の核酸、典型的には任意のプライマー、任意のプライマーペア及び／若しくは任意の核酸プローブ（野生型及び突然変異体）；本発明に記載される任意のリガンド、好ましくは抗体；並びに／又は支持体上に固定化されたこのような核酸及び／若しくはリガンドを含む任意のデバイスを含む。本明細書に記載されるキットは、ハイブリダイゼーション、増幅又は抗原−抗体免疫応答を実施するための試薬及び／又はプロトコールをさらに含み得る。これらのキットは、本明細書に記載される方法に使用すべきマイクロアレイであって、定量ＰＣＲ又は多重化技術によって読み取られるマイクロアレイをさらに含み得る。特定のデバイスは、支持体上に固定化されたＭｙｏ１ａ遺伝子又はＭｙｏ１ａ遺伝子座の全部又は一部に結合する少なくとも１つの相補的核酸、好ましくはいくつかの相補的核酸を含む。
【００７４】
特定のキット、典型的には、傷害誘発性慢性機械的疼痛又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する被験体の素因を評価するためのキットは、以下のキットである：
−被験体の生物学的サンプルから得られたＭｙｏ１ａ核酸を配列決定するためのキットであって、核酸配列、典型的にはオリゴヌクレオチド、例えばプライマー又はプライマーペアを含むキット；
−被験体の生物学的サンプル、典型的には血液サンプルにおける被験体のＭｙｏ１ａ遺伝子の異常な／変化した発現を検出するためのキットであって、（ｉ）少なくとも１つのプライマーペアと、（ｉｉ）Ｍｙｏ１ａの発現の定量的検出を可能にする少なくとも１つの標識／検出可能（例えば、蛍光）プローブ、例えば２つの異なるプローブと、（ｉｉｉ）コントロール集団におけるＭｙｏ１ａに対応するコントロール定量的発現値を提供するリーフレットとを含むキット；並びに
−被験体の生物学的サンプル、典型的には血液サンプルにおける被験体のＭｙｏ１ａ遺伝子の異常な／変化した発現を検出するためのキットであって、（ｉ）少なくとも１つのプライマーペアと、（ｉｉ）少なくとも２つの異なる標識プローブ（野生型アレルを認識する第１のプローブ、及びＭｙｏ１ａの突然変異アレルを認識する第２のプローブ）とを含むキット。
【００７５】
被験体がＭｙｏｓｉｎ  Ｉａを発現しないか又は異常に発現する（すなわち、Ｍｙｏｓｉｎ  Ｉａを不十分に発現するか又は非機能的ミソシンＩａを発現する）場合、本発明者らは、疼痛を予防又は治療するために、「疼痛の適合処置」を被験体に適用しなければならないことを本明細書で示す。実際、本発明者らは、前記被験体において傷害誘発慢性疼痛が確立されたら、前記疼痛は、アルカロイド、特にＧＡＢＡＡ−Ｒアゴニスト、例えばムシモールによって回復させることができず、不可逆的になることを発見した。
【００７６】
本発明との関連では、被験体における疼痛を「処置」又は「処置する」という用語は、本発明による適切な化合物又は組成物の適用又は投与後に、本明細書に記載される被験体における任意の形態の疼痛、又は疼痛に関連する任意の疾患若しくは症状（特に、疼痛に関連する任意の炎症症状又は神経障害症状）、又はこのような疾患若しくは症状の任意の症候を遅延させ、安定化し、根治し、治癒し、緩和し、軽減し、変化させ、改善し、向上させ、修正し、又は影響を与えることを表す。「処置」又は「処置する」という用語はまた、（任意の傷害、病状又は症状に関連し得る）疼痛の処置における成功、例えば、疼痛を改善し、寛解させ、その進行若しくは重症度を遅延させ、安定化し、その症候を低減し、又は被験体に対してそれをより許容性にすることの任意の指標（任意の客観的又は主観的なパラメータを含む）を指す。疼痛を「処置する」という用語はまた、疼痛耐性を増加させ、及び／又は感知される疼痛を減少させることを含む。特定の実施態様では、本発明の方法、化合物及び組成物は、疼痛耐性を増加させるための、及び／又は感知される疼痛を減少させるためのものである。本明細書で使用される場合、「疼痛耐性」という用語は、感情的に及び／又は身体的な破綻前に、被験体が感知及び我慢し得る疼痛の量を指す。疼痛耐性は、疼痛閾値（疼痛をもたらすために必要な最少刺激）と区別される。本明細書で使用される場合、「疼痛耐性の増加」は、一般に、例えば被験体への適切な化合物又は組成物の投与後に、被験体が、以前の状態と比較して優れた疼痛耐性を発達させ得る（すなわち、感知される疼痛がより少ない）状況を指す。
【００７７】
本発明との関連では、被験体における疼痛に関する「予防する」又は「予防」は、本発明による適切な化合物又は組成物の適用又は投与後に、被験体が任意の種類の疼痛を獲得するリスクの可能性（又は、それに対する感受性）を少なくとも減少させることを指す。例えば、「予防する」は、被験体において、典型的には、慢性疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の素因を有すると同定されたが、疼痛の症候をまだ経験していない又は示していない被験体において、疼痛、典型的には慢性疼痛の臨床症候の少なくとも１つを発症させないことを含む。
【００７８】
本発明の疼痛の適合処置は、典型的には、Ｍｙｏ１ａをコードする核酸配列（典型的には、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）及び／又はＭｙｏｓｉｎ  １ａタンパク質のアゴニストを被験体に外生的供給、例えば投与することを伴う。投与は、例えば、髄腔内（ｉ．ｔ．）投与であり得る。
【００７９】
したがって、本発明の目的は、本明細書で定義される被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の予防又は治療に使用するための、Ｍｙｏ１ａをコードする核酸配列（典型的には、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）及び／又はＭｙｏｓｉｎ  １ａタンパク質のアゴニスト（Ｍｙｏ１ａは機能的Ｍｙｏ１ａである）に関する。
【００８０】
本発明では、「Ｍｙｏｓｉｎ  １ａタンパク質のアゴニスト」という用語は、野生型Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質の生物学的機能を活性化若しくは刺激することができるか、又は機能的に変化したＭｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質の機能を回復させることができる任意のタンパク質を表すために使用される。このようなアゴニストは、対応する野生型タンパク質の特性を示す（特に、野生型Ｍｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質の生物学的機能を活性化若しくは刺激することができるか、又は機能的に変化したＭｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質の機能を回復させることができる）天然若しくはリコンビナントタンパク質又はタンパク質フラグメントであり得る。
【００８１】
本発明はまた、被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を予防又は治療するための組成物、典型的には医薬組成物を調製するための、Ｍｙｏ１ａをコードするＤＮＡ、Ｍｙｏ１ａをコードするｍＲＮＡ又はＭｙｏｓｉｎ  １ａタンパク質のアゴニスト（Ｍｙｏ１ａは機能的Ｍｙｏ１ａである）に関する。
【００８２】
本発明はさらに、Ｍｙｏ１ａをコードするＤＮＡ、Ｍｙｏ１ａをコードするｍＲＮＡ又はＭｙｏｓｉｎ  １ａタンパク質のアゴニストと、薬学的に許容し得る担体又は支持体とを含む組成物、典型的には、被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の予防又は治療に使用するための組成物に関する。
【００８３】
全ての本発明において使用可能な適切な賦形剤、希釈剤又は担体は、例えば、生理食塩水、等張液、滅菌溶液又は緩衝液などから選択され得る。それらは、安定化剤、甘味剤及び／又は界面活性剤などをさらに含み得る。それらは、それ自体が公知のガレヌス技術を使用することによって、アンプル、フラスコ、錠剤又はカプセルの形態で製剤化され得る。
【００８４】
本発明はまた、疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を予防又は治療するための方法であって、前記製品から選択される少なくとも１つの化合物を、それを必要とする被験体、典型的には哺乳動物、特にヒトに投与することを含む方法に関する。
【００８５】
治療又は予防を必要とする被験体は、処置された被験体であって、上記方法にしたがって、傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を発症する素因を有すると同定された被験体である。
【００８６】
本発明はまた、
−疼痛の素因を有すると同定された被験体における急性疼痛から慢性疼痛への変質、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の発生を予防することができる化合物をスクリーニング又は選択するためのin vitro、in vivo又はex vivo方法であって、試験化合物の存在下で、特定の細胞、組織又は動物モデルによるＭｙｏ１ａの発現を評価する工程を含み、該試験化合物に曝露又は接触されていないコントロール細胞、組織又は動物モデルと比較した、該特定の細胞、組織又は動物モデルによる機能的Ｍｙｏ１ａの発現の増加が、疼痛の素因を有すると同定された被験体における急性疼痛から慢性への変質、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛の発生を予防する前記化合物の能力を示す方法、
−変化したＭｙｏ１ａ核酸、変化したＭｙｏ１ａ核酸発現、又は対応するＭｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質の変化した／異常な発現若しくは活性を有する被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を予防又は治療するために使用可能な化合物をスクリーニングするためのin vitro、in vivo又はex vivo方法であって、（ｉ）前記変化した若しくは異常なＭｙｏｓｉｎ  ＩＡタンパク質の機能的発現を回復させ、（ｉｉ）前記タンパク質の発現若しくは活性を誘導若しくは増加させ、又は（ｉｉｉ）前記タンパク質のアゴニストリガンドの発現若しくは活性を誘導若しくは増加させる試験化合物の能力をin vitro、in vivo又はex vivoで決定することを含む方法。
−Ｍｙｏ１ａモデュレーターのin vitro、in vivo又はex vivoスクリーニング方法であって、Ｍｙｏ１ａ機能的発現及び／又は生物学的機能を活性化若しくは刺激し又は逆に低減若しくは抑制する薬物候補の能力を決定することを含み、該能力が確認された場合には、該薬物候補を、Ｍｙｏ１ａアゴニスト（活性化剤）として、及び潜在的には疼痛を予防、軽減若しくは治療するための薬物候補として、又は逆にＭｙｏ１ａアンタゴニスト（阻害剤）として同定する方法、並びに
−疼痛を予防、軽減又は治療するための薬物候補のin vitro又はex vivoスクリーニング方法であって、Ｍｙｏ１ａ機能的発現を活性化若しくは刺激し又は逆に低減若しくは抑制する薬物候補の能力を決定することを含み、該能力が確認された場合には、該薬物候補を、Ｍｙｏ１ａアゴニストとして、及び疼痛を予防、軽減若しくは治療するための薬物候補として、又は逆にＭｙｏ１ａアンタゴニストとして同定する方法
を提供する。
【００８７】
本明細書に記載されるスクリーニング方法の１つを用いて同定された化合物は、本発明との関連では、被験体における疼痛、特に傷害誘発性慢性機械的疼痛及び／又は炎症誘発性慢性熱的疼痛を予防又は治療するために使用され得る。
【００８８】
本明細書では、本発明者らはさらに、機能喪失型突然変異が傷害後に不可逆的疼痛状態をもたらす最初の動物モデルＭｙｏ１ａ  ＫＯ（Ｍｙｏ１ａ−／−）マウスを記載する。このマウスモデルは、Tyska et al. (2005)に記載されている。
【００８９】
したがって、本発明の目的は、Ｍｙｏ１ａモデュレーター及び／又は疼痛を予防、軽減若しくは阻害するための薬物をスクリーニングのためのこのようなＭｙｏ１ａ  ＫＯ（Ｍｙｏ１ａ−／−）動物モデルの使用に関する。
【００９０】
このモデルは、慢性疼痛の発症及び確立を予防するための適切な薬理学的療法を設計するために使用され得る。
【００９１】
このモデルはさらに、急性疼痛から慢性疼痛への移行をトリガーする細胞機構及び分子機構の理解を深めるための研究において使用するための実験ツールとして使用され得る。
【００９２】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実験セクションに示されているが（図１〜８及び表１〜４を参照のこと）、これは、本出願の範囲を限定するものではなく例示であるとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＬＴＭＲリッチなＭｙｏ１ａの喪失は、傷害誘発性急性機械的疼痛を慢性疼痛に変質させる。（Ａ〜Ｃ）成体腰部後根神経節（ＤＲＧ）におけるＭｙｏ１ａ発現ニューロンの特性評価。Ｍｙｏ１ａアンチセンスプローブ（赤色）を使用したＩＳＨ、並びにそれに続く抗ＧＩＮＩＰ（青色）抗体及びＩＢ４（緑色）（Ａ）又は抗Ｒｅｔ抗体（青色）（Ｃ）を用いた二重免疫標識。（Ｂ）Ｍｙｏ１ａ（赤色）及びＴｒｋＢアンチセンスプローブ（緑色）を使用した二重ＩＳＨ。スケールバー：１００μm。（Ｄ〜Ｅ）Ｅ１５及び新生（Ｐ０）ＤＲＧ及びＳＣ組織におけるＩＳＨ（赤色）によるＭｙｏ１ａ発現の分析。スケールバー：５０μm（Ｄ）及び１００μm（Ｅ）。（Ｆ）成体ＳＣ組織に対する、Ｍｙｏ１ａプローブを使用した（白色、左パネル）又はプローブなしの（右パネル）ＩＳＨ。破線領域は、ＳＣの第Ｉ〜ＩＩｏ層を画定する。（Ｇ）（β−アクチンと比べた）成体ＤＲＧ及びＳＣにおけるＭｙｏ１ａ転写産物の定量。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。（Ｈ〜Ｊ）カラギーナン誘発性炎症（ＷＴではｎ＝１１及びＫＯではｎ＝１３）（Ｈ）、ＣＣＩ手術（ＷＴではｎ＝９及びＫＯではｎ＝１０）（Ｉ）及び足切開手術（ＷＴではｎ＝１０及びＫＯではｎ＝１０）（Ｊ）後のＷＴ及びＫＯマウスの機械的応答。データは、各群について平均±ＳＥＭとして示されている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）（図５〜７も参照のこと）。
【図２】Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ムシモール及びジアゼパム媒介性鎮痛作用が損なわれる。（Ａ〜Ｄ）ＳＮＩ手術、並びに示されている時点におけるＳＮＣ８０ １０nmol、ＤＡＭＧＯ ０．２nmol（Ａ）、バクロフェン ０．１μg、ＴＡＦＡ４ ２μg（ｎ＝マウス ６匹／遺伝子型）（Ｂ）、タウリン ４０μgの髄腔内投与後、プレガバリン ３mg/kg（ｎ＝マウス ８匹／遺伝子型）の腹腔内投与後（Ｃ）及びムシモール ０．１５μg（ｎ＝マウス ８匹／遺伝子型）（Ｄ）の髄腔内投与後のＷＴ及びＫＯマウスの機械的応答。（Ｅ〜Ｇ）ザイモサン誘発性炎症（ｎ＝マウス ９匹／遺伝子型）（Ｅ）、並びに示されている時点におけるムシモール ０．１５μg、ＳＮＣ８０ １０nmol（ｎ＝マウス ９匹／遺伝子型）（Ｆ）及びＤＺＰ ０．０９mg/kg（Ｇ）（ｎ＝マウス ７匹／遺伝子型）後のＷＴ及びＫＯマウスの機械的応答。データは、各群について平均±ＳＥＭとして示されている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎｓ：非有意）
【図３】ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス由来のＤＲＧ及びＳＣ組織の転写分析は、Ｇａｂｒａ２発現の増加を明らかにする。（Ａ）ＷＴと比べたＫＯマウスのＤＲＧ（ＤＥ遺伝子 ９７個）及びＳＣ（ＤＥ遺伝子 ３１個）ニューロンにおいてディファレンシャルに発現される（ＤＥ）遺伝子の数（偽発見率 ５％）を表すベン図。ＤＲＧにおいてのみディファレンシャルに発現される遺伝子は赤色で表されており（遺伝子 ８４個）、ＳＣのみについては青色で表されており（遺伝子 １８個）、又はＤＲＧ及びＳＣニューロンの両方については黄色で表されている（遺伝子 １３個）。（Ｂ）ＤＲＧ及びＳＣニューロンの両方におけるＤＥ遺伝子のヒートマップ図であり、発現増加を示す遺伝子は赤色で示されており、発現減少を示すものは緑色で示されている。スケールは、ＷＴと比べた、ＫＯマウスにおいて観察された発現のＬｏｇ２変化倍率を表す。（Ｃ）ＷＴ及びＫＯマウス由来のＤＲＧ及びＳＣ組織におけるＷｄｆｙ１、Ｇａｂｒａ２及びＮｎｔ転写産物の定量。データは、ＫＯ対ＷＴの平均変化倍率±ＳＥＭを表す（ｎ＝独立した実験 ３回）。（Ｄ）ＷＴ（左）及びＫＯ（右）マウス由来のＬ５  ＤＲＧ（上パネル）及び腰部ＳＣ（下パネル）における、ＩＳＨ（赤色）によって評価したＧａｂｒａ２転写産物発現。スケールバー：１００μm。（Ｅ）ＷＴ（左）及びＫＯ（右）マウス由来の腰部ＳＣの後角におけるＧＡＢＲＡ２タンパク質発現（緑色）を示す免疫染色。スケールバー：５０μm。（Ｆ）ＷＴ及びＫＯマウス由来のＳＣの第Ｉ〜ＩＩＩ層におけるＧＡＢＲＡ２免疫蛍光強度の定量。データは、ＫＯ対ＷＴの平均変化倍率±ＳＥＭを表す（ｎ＝独立した実験 ３回）。（Ｇ）ＷＴ（左）及びＫＯ（右）マウスの腰部ＳＣの後角におけるＧＡＢＲＡ１タンパク質発現（赤色）を示す免疫染色。スケールバー：５０μm。（表１〜４も参照のこと）。
【図４】ザイモサン炎症後のＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ＥＰＳＣ頻度のムシモール誘発性増加が喪失する。（Ａ）解離Ｃ−ＬＴＭＲにおけるムシモール誘発性電流（Ｍｕｓｃ）の全細胞記録の代表的なトレース。（Ｂ）ＷＴ：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓ及びＫＯ：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓマウス由来のＣ−ＬＴＭＲにおいて記録された、示されている用量のＭｕｓｃのバス適用後の電流振幅（平均±ＳＥＭ）。記録された細胞の数は、ヒストグラムに示されている。（Ｃ〜Ｆ）ナイーブ（Ｃ〜Ｄ）及びザイモサン炎症ＷＴ及びＫＯマウス（Ｅ〜Ｆ）におけるＭｕｓｃ適用後の第ＩＩ層介在ニューロンにおける自発性ＥＰＳＣの全細胞記録。左パネル：ＡＣＳＦ下（黒色のトレース）、５μM Ｍｕｓｃの灌流後（青色のトレース）及び洗浄中（褐色のトレース）に得られたＥＰＳＣの代表的なトレース。中央パネル：左パネルに示されている実験のＥＰＳＣ間隔（秒単位）の累積分布。左へのＭｕｓｃ／青色曲線のシフト（Ｃ、Ｄ、Ｅ中央パネル）は、ＥＰＳＣ頻度の可逆的増加を示すことに留意する。右パネル：ＡＣＳＦ下、５μM Ｍｕｓｃの灌流後及び洗浄中における正規化ＥＰＳＣ頻度（平均±ＳＥＭ）。ザイモサン炎症マウス由来の切片では、Ｍｕｓｃの効果がないことに留意する。記録された細胞の数は、右パネルに示されている（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意）。（図８も参照のこと）。
【図５】ＭＹＯ１Ａの非存在下では、成体ＤＲＧニューロンの生存、特異化、中枢神経支配及び末梢神経支配は損なわれない。（Ａ〜Ｂ）ＷＴ及びＫＯマウス由来の成体腰部Ｌ４  ＤＲＧ切片上に現れた総ＰＧＰ９．５＋（Ａ）及び示されているサブセット（Ｂ）の細胞数。データは、３回の独立した実験の平均絶対値（Ａ）又はＰＧＰ９．５ニューロンの平均％（Ｂ）±ＳＥＭを表す。遺伝子型間で、統計学的有意差は観察されなかった。（Ｃ〜Ｅ）Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ＳＣの感覚ニューロン神経支配が保存されている。抗ＣＧＲＰ（赤色、Ｃ）、ＧＩＮＩＰ（青色、Ｃ〜Ｅ）、ＩＢ４（緑色、Ｄ）及び抗ＰＫＣγ（赤色、Ｅ）を用いたＷＴ（上パネル）及びＫＯ（下パネル）マウス由来のＳＣ横断切片の免疫染色。スケールバー：１００μm。（Ｆ〜Ｇ）Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、有毛皮膚の感覚ニューロン神経支配が保存されている。抗ＰＧＰ９．５（赤色、Ｆ）及び抗Ｓ１００（赤色、Ｇ）を用いたＷＴ（上パネル）及びＫＯ（下パネル）マウス由来の有毛皮膚切片の免疫染色。スケールバー：有毛皮膚神経支配を示すＰＧＰ９．５及びＳ１００：５０μm。表皮神経支配を示すＰＧＰ９．５：１５μm。（図１に関連）。
【図６】ＭＹＯ１Ａの非存在下では、Ｃ−ＬＴＭＲ及びＡδ−ＬＴＭＲの電気生理学的特性が保存されている。（Ａ〜Ｄ）Ｃ−ＬＴＭＲの電気生理学的特性。（Ａ〜Ｂ）グラフは、ＷＴ及びＫＯ  Ｃ−ＬＴＭＲの電気容量及び静止膜電位を示す。（Ｃ）脱分極電流パルス（５０pA、１０００ms）に対するＷＴ及びＫＯ  Ｃ−ＬＴＭＲの応答を示す代表的なトレース。（Ｄ）グラフは、ＷＴ（黒色）及びＫＯ  Ｃ−ＬＴＭＲ（灰色）の振幅（Δ１０pA、１０００ms）を増加させる電流工程を脱分極させることによって誘発される活動電位（ＡＰ）の数を表す。（Ｅ〜Ｉ）Ａδ−ＬＴＭＲの電気生理学的特性。ＷＴ及びＫＯ  Ａδ−ＬＴＭＲの細胞電気容量（上パネル）及び静止膜電位（下パネル）は、Ｅに示されている。脱分極（Ｆ〜Ｇ上パネル）又は過分極（Ｆ〜Ｇ下パネル）電流注入（それぞれ１０００ms、Δ０．１nA又はΔ−０．１nA）によって、ＡＰを誘発した。（Ｆ）図は、ＷＴ（黒色）及びＫＯ（赤色）Ａδ−ＬＴＭＲについて得られた代表的なトレースを示す。（Ｇ）曲線は、それぞれ脱分極電流注入中（上パネル）又は過分極電流注入後（下パネル）の注入電流の関数としてＡＰ発火の確率を表す。過分極パルスの終了時に観察されたＡＰリバウンドは、Ａδ−ＬＴＭＲの特徴である。（Ｈ）−６０mVの保持電位による体細胞の段階的な機械的刺激によって誘発した、ＷＴ（黒色）及びＫＯ（赤色）Ａδ−ＬＴＭＲにおける代表的な機械的活性化（ＭＡ）電流。（Ｉ）ピーク振幅（Ｉピーク）を正規化して、電流／プローブ変位曲線を得た。曲線は、プローブ変位の関数として正規化ピーク電流（Ｉ−ピーク）を示す。ＷＴとＫＯ  Ａδ−ＬＴＭＲとの間では、平均正規化振幅に差異はない。Ｃ−ＬＴＭＲ及びＡδ−ＬＴＭＲの遺伝子型間で、統計学的有意差は観察されなかった。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。（図１に関連）。
【図７】ナイーブＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス及びＭｙｏ１ａ＋／−マウスの行動特性評価並びに傷害後熱及び機械的過敏症。オープンフィールド（Ａ）及びロータロッド（Ｂ：時間及びＣ：速度）試験におけるＷＴ及びＫＯの行動。足の冷却（Ｄ：アセトン試験）及び有害な熱（Ｅ：ホットプレート試験）に対する熱感受性は、遺伝子型間で差異を示さない。（Ｆ）グラフは、ホルマリン試験におけるＷＴ及びＫＯマウス疼痛行動を示す。ヒストグラムは、第１段階及び第２段階における応答持続時間を表す。この試験では、ＫＯマウスが応答持続時間の増加を示すことに留意する（＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｇ〜Ｈ）ハーグリーブス試験において、カラギーナン誘発性炎症（Ｇ）及び足切開手術（Ｈ）後のＷＴ及びＫＯマウスの熱過敏症を決定した（＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：非有意）。（Ｉ）カラギーナン誘発炎症後のＷＴ、Ｍｙｏ１ａ＋／−及びＫＯマウスの機械的応答（＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｍｙｏ１ａ＋／−対ＷＴ）。（Ｊ）ビククリン（１０μL中０．０１μg）の髄腔内注射後のＷＴ及びＫＯマウスの機械的応答（ｎｓ：非有意）。データは、各群について平均±ＳＥＭとして示されている。（図１に関連）。
【図８】Ｍｙｏ１ａ  ＫＯナイーブ又は炎症マウスにおけるＳＣ第ＩＩ層ニューロンの受動特性、能動特性及びシナプス特性の電気生理学的特性評価。（Ａ〜Ｆ）グラフは、ナイーブ下における、並びにカラギーナン（Ｃａｒｒａ．）及びザイモサン（Ｚｙｍｏ．）誘発性炎症におけるＷＴ及びＫＯマウス由来のＳＣ第ＩＩ層介在ニューロンの平均膜電位（Ａ）、膜抵抗（Ｂ）、電気容量（Ｃ）、−２５pAの過分極パルスに対するサグ比（Ｄ）、−２５の電流パルスに対するリバウンドＡＰの数（Ｅ）及び＋２５pAの電流パルスに対するＡＰの数（Ｆ）を表す。記録された細胞の数は、ナイーブ：ＷＴ １６個及びＫＯ ２６個、Ｃａｒｒａ．：ＷＴ ２９個及びＫＯ ２３個並びにＺｙｍｏ．：ＷＴ １０個及びＫＯ １２個である。（Ｇ）グラフは、ナイーブ下における、並びにＣａｒｒａ及びＺｙｍｏ誘発性炎症におけるＷＴ及びＫＯマウスのＳＣ第ＩＩ層介在ニューロンにおいて記録されたペアドパルス比を示す。記録された細胞の数は、ナイーブ：ＷＴ １９個及びＫＯ ３３個、Ｃａｒｒａ．：ＷＴ ９個及びＫＯ １３個並びにＺｙｍｏ．：ＷＴ ９個及びＫＯ ９個である。データは、各群について平均±ＳＥＭとして示されている。遺伝子型間で、有意差は観察されなかった。（図４に関連）。図１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、図３Ｄ、Ｅ、Ｇ及び図５Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇは、それぞれ２回示されている（コントラストが異なる色を示す同一図）。
【実施例】
【００９４】
実験パート
材料及び方法
マウス
標準的な飼育条件（２３℃、湿度 ４０％、明周期 １２時間、並びに飼料及び水へのフリーアクセス）下で、マウスを維持した。この研究において使用したマウスの数並びにストレス及び苦痛を最小化するように、特に努力した。全てのプロトコールは、動物実験に関する欧州連合の推奨にしたがっている。
【００９５】
Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスは、Tyska et al., 2005 (Tyska et al., 2005)によって作製されたものである。コントロール野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを自家繁殖した。それぞれＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスをＴａｆａ４Ｖｅｎｕｓ／Ｖｅｎｕｓ (Delfini et al., 2013)及びＭｙｏ１ａ＋／−：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓマウスと交配することによって、ＷＴ：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯ：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓマウスを作製した。
【００９６】
組織学
in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及び免疫染色のための成体後根神経節（ＤＲＧ）及び脊髄（ＳＣ）標本を得るために、ケタミン／キシラジンの混合物でマウスを深麻酔し、次いで、パラホルムアルデヒド４％の氷冷０．１Ｍリン酸緩衝溶液（４％ＰＦＡ）で経心灌流した。氷冷４％ＰＦＡで組織をさらに２４時間固定した。新生Ｐ０マウスを屠殺し、氷冷ＰＢＳで迅速に洗浄し、摘出し、氷冷４％ＰＦＡで２４時間固定した。Ｅ１５胚を氷冷ＰＢＳ中に収集し、氷冷４％ＰＦＡで２４時間固定した。成体背部有毛皮膚を切除し、氷冷４％ＰＦＡで２時間固定した。ＧＡＢＲＡ１及びＧＡＢＲＡ２免疫染色では、腰部ＳＣ（Ｌ１−Ｌ３）を迅速に切開し、氷冷４％ＰＦＡで３０分間固定した。凍結保護のために、標本を３０％（w/v）スクロース溶液に移してから、ＯＣＴ封入剤で凍結させた。標準的なクリオスタット(Leica)を使用して、１２μm凍結切片（ＤＲＧ）及び１８〜２０μm凍結切片（ＳＣ、Ｅ１５及びＰ０）を得た。
【００９７】
in situハイブリダイゼーション
遺伝子特異的ＰＣＲプライマー及び成体マウスＤＲＧ由来のｃＤＮＡテンプレートを使用して、ジゴキシゲニン標識Ｍｙｏ１ａ及びＧａｂｒａ２アンチセンスプローブ並びにフルオレセイン標識ＴｒｋＢプローブを合成し、(Reynders et al., 2015)に記載されているように、in situハイブリダイゼーション又はダブルin situハイブリダイゼーションを行った。プローブ合成に使用したプライマーは、以下に列挙されている：
【化１】
2019512213.tif 000003
【００９８】
免疫染色
ラット抗ＧＩＮＩＰ（１：５００、Moqrich laboratory）、ヤギ抗Ｒｅｔ（１：５００、R&D Systems）、ウサギ抗ＴｒｋＡ（１：１０００、Dr. L. Reichardt, University of Californiaからの寄贈）、ヤギ抗ＴｒｋＣ（１：５００、R&D Systems）、ウサギ抗ＣＧＲＰ（１：１０００、ImmunoStar）、ウサギ抗ＰＫＣγ（１：５００、Santa Cruz）、ウサギ抗ＰＧＰ９．５（１：２００、Thermo Scientific）、ウサギ抗Ｓ１００（１：１０００、Darko）、ウサギ抗ＧＡＢＲＡ２（１：２０００、Synaptic Systems）及びモルモット抗ＧＡＢＲＡ１（１：１０００、Synaptic Systems）を用いて、免疫組織染色を行った。InvitrogenのAlexa Fluor 488コンジュゲートＩＢ４を使用して、ＩＢ４標識を行った。AxioImager Z1 (Zeiss)蛍光顕微鏡下で観察する前に、スライドをImmuMount (Thermo Scientific)でマウントした。Photoshopソフトウェアを使用して、コントラストを調整した。
【００９９】
ＷＴとＭｙｏ１ａ  ＫＯとの間のＧａｂｒａ２発現の比較では、同じ露出パラメータを使用して画像を取得し、コントラストを等しく調整した。
【０１００】
ＳＣ及び皮膚神経支配並びにＧＡＢＲＡ染色では、LSM-780共焦点顕微鏡(Zeiss)を使用して画像取得を実施し、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯ標本間で、同じピンホール口径、レーザー強度及びゲインパラメータに配慮した。
【０１０１】
細胞数及び統計分析
Gaillard et al., 2014に記載されているように、成体ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス由来の腰部Ｌ４  ＤＲＧにおいて、ＤＲＧニューロンの合計及び一部をカウントした。簡潔に言えば、Ｌ４  ＤＲＧの１２μm連続切片を６つのスライド上に分配し、これらを異なるマーカー（パンニューラルマーカーＰＧＰ９．５を含む）に供した。このアプローチにより、本発明者らは、全てのカウントをニューロンの総数（ＰＧＰ９．５）に換算することができた。各遺伝子型について、３回の独立した実験を実施した。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。
【０１０２】
ＧＡＢＲＡ２蛍光強度
ImageJソフトウェアを使用して、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯ  ＳＣ切片の第Ｉ〜ＩＩＩ層において、ＧＡＢＲＡ２発現に関連する１mm2当たりの蛍光強度（関心領域におけるピクセルの平均蛍光）を決定した。各遺伝子型について、３回の独立した実験を実施し、ＳＣ切片 ５〜１０個を分析し、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ対ＷＴ標本の蛍光強度の変化倍率を計算した。
【０１０３】
薬物
ＳＮＣ８０(Tocris Bioscience)を１００mM ＨＣｌ溶液に溶解し、ＤＡＭＧＯ(Sigma Aldrich)を生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解し、バクロフェン(Sigma Aldrich)をＨ２Ｏ（ｐＨ７．６）に溶解し、リコンビナントヒトＴＡＦＡ４(R&D Systems)を生理食塩水に溶解し、ジアゼパム(DZP, Roche)を１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／９０％生理食塩水に溶解し、ムシモール(Tocris Bioscience)、タウリン(Sigma Aldrich)、ビククリン(Sigma Aldrich)及びプレガバリン(Sigma Aldrich)をリン酸緩衝液（ＰＢ、５０mM、ｐＨ７．４）に溶解した。
【０１０４】
プレガバリンを除いて、髄腔内（intratechal）（ｉ．ｔ）注射によって、全ての薬物を投与した。投与量は、図の凡例に示されている。プレガバリンを腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。図の凡例に示されているように、機械的刺激に対する応答を薬物投与後３０分から６時間まで記録した。
【０１０５】
行動試験及び統計分析
８〜１２週齢のＭｙｏ１ａ  ＫＯ及びＷＴ雄において、全ての行動分析を行った。全ての実験を室温（約２２℃）で行った。全ての実験の前に、動物を試験環境に１時間順化させた。試験中、実験者は、マウスの遺伝子型について把握していなかった。試験動物の数は、図の凡例のセクションに示されている。全てのエラーバーは、ＳＥＭを表す。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ事後検定を使用して、全ての統計分析を行った。Gaillard et al., 2014 (Gaillard et al., 2014)に記載されているように、オープンフィールド、ロータロッド、ホットプレート及びホルマリン試験を行った。
【０１０６】
アセトン試験
アセトン液滴蒸発アッセイ(Hulse et al., 2012)を使用して、無害な皮膚冷却に対するナイーブマウスの感受性を評価した。１mlシリンジを使用して、１滴のアセトンを左後足に適用した。アセトン適用直後に、尻込み／疼痛のような行動の持続時間（秒）を合計２分間記録した。この試験を２回繰り返し、尻込み／疼痛行動の平均持続時間を計算した。
【０１０７】
熱過敏症
カラギーナン炎症の前後及び足切開手術後に、Gaillard et al., 2014に記載されているようにハーグリーブス試験を使用して、後足熱過敏症を決定した。カラギーナン炎症性疼痛モデルでは、炎症後１日から６０日までのいくつかの時点（凡例を参照のこと）において、試験を実施した。足切開疼痛モデルでは、炎症後１日から３０日までのいくつかの時点（凡例を参照のこと）において、試験を実施した。
【０１０８】
機械的閾値
炎症、神経障害及び足切開手術の前並びにそれらの後のいくつかの時点において、以前に記載されているように(Gaillard et al., 2014)、アップダウン法によるフォンフライフィラメントを使用して、足底面の機械的閾値を決定した。
【０１０９】
傷害誘発性疼痛モデル
カラギーナン及びザイモサンＡ誘発性炎症
３０Ｇニードルシリンジを使用して、Ｈ２Ｏ中１％カラギーナンを含有する溶液（重量／体積、Sigma）２０μl又は０．９％ＮａＣｌ中ザイモサン−Ａ ０．０６mgを含有する溶液（重量／体積、Sigma）２０μlを左後足の足底側に皮下注射した。
【０１１０】
カラギーナン誘発性炎症では、炎症前、並びに炎症後１時間から６０日までのいくつかの時点（凡例を参照のこと）において、機械的閾値を決定した。ザイモサン炎症では、注射前、１日目及び６０日目までのいくつかの時点（凡例を参照のこと）において、機械的閾値を決定した。加えて、炎症前、１日目及び２日目、薬物投与の前後において、ザイモサンモデルにおける機械的閾値を測定した。
【０１１１】
慢性絞扼傷（ＣＣＩ）
ケラチン／キシラシン麻酔マウスにおいて、モノクリル再吸収性縫合糸繊維(6-0, Ethicon, Piscataway, NJ, USA)を使用して、総坐骨神経周辺で緩く結んだ３箇所の結紮（約１mm間隔）を実施することによって(Bennett and Xie, 1988)、片側末梢単神経障害を誘発した。神経はほとんど識別不可能な程度に狭窄したので、神経上膜血管系を通る循環は阻害されなかった。手術後、加温チャンバーにおいて動物を回復させ、次いで、それらを飼育ケージに戻した。ＣＣＩ前、及び手術後３日から６０日までのいくつかの時点（凡例を参照のこと）において、機械的閾値を測定した。
【０１１２】
足切開
Brennan (1999)に記載されているように、足切開疼痛モデルを実施した。簡潔に言えば、ケタミン／キシラシンでマウスを麻酔し、踵の近位端から２〜５mmの右後足の足底面に５mm縦切開を実施した。次いで、鉗子を用いて足底筋肉を慎重に持ち上げ、筋起始をインタクトに保ちながら、刃物を用いて縦方向に切開した。６．０シルクモノフィラメント(Ethicon, Piscataway, NJ, USA)を使用して、１回の水平マットレス縫合で創傷を閉鎖し、ベタジン軟膏で創傷部位を覆った。手術後、加温チャンバーにおいて動物を回復させ、それらを飼育ケージに戻した。傷害後６時間から手術前及び手術後６０日まで（凡例を参照のこと）、機械的閾値を決定した。
【０１１３】
神経部分傷害（ＳＮＩ）
(Shields et al., 2003)に記載されているように、神経部分傷害手術を実施した。簡潔に言えば、ケタミン／キシラジンの混合物でマウスを麻酔し、坐骨神経の三尖弁の位置で皮膚及び大腿筋を介して切開を行った。6.0シルクフィラメント(Ethicon, Piscataway, NJ, USA)を使用して、総腓腹神経及び総腓骨神経を結紮し、脛骨神経をインタクトに保ちながら切断した。手術後、加温チャンバーにおいて動物を回復させ、次いで、それらを飼育ケージに戻した。手術後７日目、９日目及び１４日目、薬物投与の前後において、機械的閾値を測定した。
【０１１４】
ＲＮＡ抽出
ケタミン／キシラジンの混合物でマウスを深麻酔し、RNA Later (Qiagen) ５〜１０mLで経心灌流した。Ｌ３〜Ｌ５  ＤＲＧ及びＳＣを迅速に解剖し、製造業者の説明書にしたがってRNeasy Micro Kit (Qiagen)を使用して、ＲＮＡを抽出した。品質コントロールのために、ＲＮＡをRNA NanoChip (Agilent)にロードし、2100 Bioanalyzer system (Agilent technology)を用いて処理した。
【０１１５】
ハイスループットシーケンシング及び分析
それぞれマウス ２〜３匹から、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯ  ＤＲＧ及びＳＣ  ＲＮＡを２回反復の実験で抽出した。TruSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina)を使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを調製した。Agilent DNA1000 chipsを使用して、濃度及びフラグメントサイズについて、全てのライブラリーを検証した。HiSeq 2000 (Illumina)によって配列決定を実施し、RTA (Illumina)を使用してベースコールを実施し、FastQC (FASTQC, 2010)及びRSeQC (Wang et al., 2012)を使用して品質コントロールを実施した。デフォルト値を使用したSubread (Liao et al., 2013) (C version 1.4.6-p2)を使用して、配列をｍｍ１０ゲノムに固有にマッピングした。featureCounts (Liao et al., 2014) (C version 1.4.6-p2)を使用して、遺伝子エクソン（ＧＲＣｍ３８．ｐ４遺伝子アセンブリ）にマッピングしたリードをカウントした。偽発見率（ＦＤＲ）カットオフ ５％を使用したDESeq2 BioConductor R package (Love et al., 2014)を使用し、生物学的複製物からのエクソンカウントを使用して、ディファレンシャルな遺伝子発現を実施した。
【０１１６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)を使用して、各サンプルから得られたＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。qPCR Sybr-Green master mix (ThermoFisher)を使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、遺伝子発現を評価した。StepOne qPCR装置(Applied Biosystems)において、サンプルを４０サイクルにわたってランした。標準的なΔＣｔ又はΔΔＣｔ法を使用してβ−アクチンに対する正規化によって、各遺伝子をコードする転写産物の相対量を決定した。
【０１１７】
全ての実験を３回反復で実施し、データは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ対ＷＴの転写産物発現レベルの変化倍率（平均±ＳＥＭ）を表す。ｑＰＣＲに使用したプライマー配列は、
【化２】
2019512213.tif 000004
である。
【０１１８】
ＤＲＧニューロンの解離及び培養
成体ＷＴ、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ、ＷＴ：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯ：Ｔａｆａ４＋／Ｖｅｎｕｓマウスを深麻酔し（ケタミン／キシラジン）、ＤＲＧを迅速に解剖し、氷冷ＨＢＳＳ−ｇｌｕ（ＨＢＳＳ  １×（Gibco）、０，１M Ｄ−グルコース（Sigma）、５０mM ＨＥＰＥＳ（Gibco）、ｐｈ７，４）に収集し、２mg/ml １型コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ）及び５mg/mlディスパーゼ（両方ともGibco製）を使用した３７℃における２０分間の酵素消化に２回供した。ＨＢＳＳ−ｇｌｕでＤＲＧを２回洗浄し、ＮＢｃ培地（ＮＢｃ：Neurobasal (Gibco)、１％（v/v）Ｂ２７（Gibco）、１０００U/mlペニシリン（Invitrogen）、１０００μg/mlストレプトマイシン（Invitrogen））に再懸濁した。直径が漸減する３つの針先（ゲージ１８、２１、２６）を通すことによって、単細胞懸濁液を得た。細胞をポリオルニチン−ラミニンコーティングディッシュにプレーティングし、３７℃で１〜２時間維持してから、１０ng/mlニューロトロフィン４（ＮＴ４、Peprotech）及び２ng/mlグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、Invitrogen）を追加した。live Venus fluorescenceによってＣ−ＬＴＭＲを同定し、「ロゼット」様形態によってＡｄ−ＬＴＭＲを同定した(Dubreuil et al, 2004)。プレーティング後、パッチクランプ記録を１８〜３０時間実施した。
【０１１９】
培養ＤＲＧにおける電気生理学
Axopatch 200B amplifierを使用して、電気生理学的記録を実施した。pCLAMP 10.5 (Molecular Devices)によって、データを分析した。
【０１２０】
Ｃ−ＬＴＭＲ及びＡδ−ＬＴＭＲの全細胞記録
１３４ ＫＣｌ、１ ＭｇＣｌ２、４．８ ＣａＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、０．４ Ｎａ−ＧＴＰ及び１０ ＥＧＴＡ（ｐＨ７．３）（mM単位）を含有するＫＣｌベースの溶液を充填した１〜２ＭΩピペットを用いて、培養Ｃ−ＬＴＭＲのパッチクランプ記録を実施した。１０５ Ｋアスパラギン酸塩、１０ ＮａＣｌ、２７ ＫＣｌ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、０．４ Ｎａ−ＧＴＰ、５ クレアチン−リン酸塩（ナトリウム塩）、１ ＣａＣｌ２、１０ ＥＧＴＡ、１ ＭｇＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨでｐＨ７．２、約３２９mOsm）（mM単位）を含有するＫＣｌベースの溶液を充填した１〜３ＭΩピペットを用いて、培養Ａδ−ＬＴＭＲのパッチクランプ記録を実施した。
【０１２１】
１４０ ＮａＣｌ、４ ＫＣｌ、２ ＭｇＣｌ２、２ ＣａＣｌ２、１０ ＨＥＰＥＳ及び１０ グルコース（ｐＨ７．４）（mM単位）を含有する標準外液で、ニューロンを流速 ２〜３ml／分で灌流した。
【０１２２】
ＧＡＢＡＡレセプターアゴニストであるムシモール(Tocris Bioscience)のストック溶液を水で調製し、所望の濃度で外液に溶解した。ムスシモールを１０秒間バス適用した。
【０１２３】
機械的活性化電流
水平から４５度の角度で配置し、機械的プローブとして使用した圧電−電動アクチュエータ(Step Driver PZ-150 M; Burleigh)に取り付けられた密封先端熱加工ガラスマイクロピペットを用いて、機械的刺激を実現した。pClamp software (Molecular Devices)によって、細胞へのプローブの下降運動を駆動した。Ａδ−ＬＴＭＲの全パッチクランプ記録と同じ溶液を用いて、−６０mVの保持電位で電圧固定機械的活性化電流を記録した。機械的刺激のベースラインは、機械的活性化電流を誘導するプローブ変位−０．５μmの距離としてμm単位で定義した。
【０１２４】
後根が付着した脊髄切片からの全細胞パッチクランプ記録
全細胞記録のために、幼若（Ｐ２４〜Ｐ４５）Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ及びＷＴマウス由来の後根が付着した横断脊髄切片を調製した。簡潔に言えば、ペントバルビタール（２００mg/kg）を使用して動物を麻酔し、氷冷含酸素低カルシウム人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ；mM単位：ＮａＣｌ １０１；ＫＣｌ ３．８；ＭｇＣｌ２１８．７、ＭｇＳＯ４１．３；ＫＨ２ＰＯ４１．２；ＨＥＰＥＳ １０；ＣａＣｌ２１；グルコース １）で灌流し、次いで、断首した。脊柱及び周辺筋肉を迅速に摘出し、氷冷含酸素ＡＣＳＦに浸漬した。椎弓切除後、脊髄を徐々に摘出し、その腰部を小３％アガロースブロックに入れた。Leica VTS1000 vibratomeを使用して脊髄切片（厚さ３００μm）を切断し、９５％Ｏ２−５％ＣＯ２で少なくとも１時間平衡化した加温（３１℃）ＡＣＳＦ（mM単位：ＮａＣｌ １３０．５；ＫＣｌ ２．４；ＣａＣｌ２ ２．４；ＮａＨＣＯ３１９．５；ＭｇＳＯ４１．３；ＫＨ２ＰＯ４１．２；ＨＥＰＥＳ １．２５；グルコース １０；ｐＨ７．４）に移してから、パッチクランプ記録を開始した。加温（３１℃）ＡＣＳＦに浸した記録チャンバーに脊髄切片を入れた。multiclamp 2B (Molecular devices)を使用して、Olympus BX51顕微鏡のコントロール下で、電気生理学的測定を実施した。Ｃベースのピペット溶液（mM単位：メタンスルホン酸Ｃｓ １２０；ＣｓＣｌ ２０；ＣａＣｌ２ ０．１；ＭｇＣｌ２ １．３；ＥＧＴＡ １；ＨＥＰＥＳ １０；ＧＴＰ ０．１；ｃＡＭＰ ０．２；ロイペプチン ０．１；Ｎａ２ＡＴＰ ３；Ｄ−マンニトール ７７；ｐＨ７．３）をパッチピペット（７〜１１Ω）に充填した。Master 8 (A.M.P.Instrument Ltd) stimulatorに接続されたガラス吸引電極を使用して、後根を刺激した。典型的には、１組の高持続時間（５００μs）高強度刺激（３５０μA）を使用して、記録切片においてほとんどの一次求心性繊維をリクルートした。全ての薬物は、Sigmaから購入した。コルモゴルフ・スミルノフ検定を使用して、各細胞について、ＥＰＳＣ頻度の統計比較を評価した。
【０１２５】
結果
Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、傷害誘発性急性機械的疼痛は慢性疼痛に変質する。
最近の研究において、本発明者らは、成体Ｃ−ＬＴＭＲでは、Ｍｙｏ１ａが高濃縮されていることを確認した(Reynders et al., 2015)。共発現分析により、ＧＩＮＩＰ＋／ＩＢ４−Ｃ−ＬＴＭＲでは、Ｍｙｏ１ａが実際に発現されていたが（図１Ａ）、ＴｒｋＢによってマーキングしたＡδ  ＬＴＭＲ、及びＡβ  Ｒｅｔ＋ＬＴＭＲの一部においても、その発現が起こっており（図１Ｂ及び１Ｃ）、ペプチド作動性ＴｒｋＡ＋及び固有受容性ＴｒｋＣ＋ニューロンから完全に除外されていた（データは示さず）ことが示された。発生レベルでは、Ｍｙｏ１ａは、Ｅ１５の大型ＤＲＧニューロンの一部において発現され（図１Ｄ）、その発現は、出生時のＤＲＧニューロンの大部分に及ぶ（図１Ｅ）。in situハイブリダイゼーション及びｑ−ＲＴ−ＰＣＲによって確認されるように、発生中のＳＣ及び成体におけるＭｙｏ１ａ発現レベルは、ほとんど検出不可能である（図１Ｄ〜Ｇ）。
【０１２６】
感覚生理学におけるＭＹＯ１Ａの役割についての知見を得るために、本発明者らは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスを分析しようとした(Tyska et al., 2005)。これらのマウスは生存能力があり、繁殖力があり、記載されている摂動の大部分は、この非定型ミオシンタンパク質が高発現される腸内生物学に関連していた(Kravtsov et al., 2012; Mazzolini et al., 2012)。しかしながら、体性感覚系におけるＭＹＯ１Ａの役割については、全く不明であった。
【０１２７】
ＭＹＯ１Ａの喪失がＤＲＧニューロン発達を変化させたかを試験するために、本発明者らは、一連の定量的及び定性的分析を実施した。本発明者らは、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスの間で、腰部ＤＲＧニューロンの総数又はＴｒｋＡ＋、ＴｒｋＢ＋、ＴｒｋＣ＋、Ｒｅｔ＋及びＴＨ＋ニューロンの数に差異がないことを見出した（図５Ａ及び５Ｂ）。解剖学的レベルでは、ＳＣ切片に対する二重及び三重染色実験により、ペプチド作動性ＣＧＲＰ＋及び一部の非ペプチド作動性ＧＩＮＩＰ＋求心性神経は、ＳＣの後角におけるそれらの各層への正常な中心投影を示したことが示された（図５Ｃ〜Ｅ）。末梢では、ＰＧＰ９．５及びＳ１００染色により、全てのＤＲＧニューロン及び毛包神経支配ＬＴＭＲの正常な末梢ターゲット神経支配が明らかになった（図５Ｆ及び１Ｇ）。最後に、ＭＹＯ１Ａの喪失がＤＲＧニューロンのニューロン興奮性に影響を及ぼすかを試験するために、本発明者らは、培養Ｃ−ＬＴＭＲ及びＤ−ヘアＡδ機械的受容器においてパッチクランプ記録を実施した。Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスをＴａｆａ４Ｖｅｎｕｓマウスと交配させることによってＣ−ＬＴＭＲを可視化し、それらのロゼット様形状によってＤ−ヘアニューロンを同定した。両タイプのニューロンでは、２つの遺伝子型間で、受動的及び内因的電気特性に差異はなかった（図６Ａ〜Ｇ）。さらに、本発明者らは、圧電駆動機械的刺激に対する、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス由来の培養Ｄ−ヘアニューロンの感受性に差異はなかったことを見出した（図６Ｈ及び６Ｉ）。まとめると、これらのデータは、ＤＲＧニューロンの生存、分子成熟、解剖学的構成及び電気生理学的特性のために、ＭＹＯ１Ａが不要であることを実証している。
【０１２８】
体性感覚におけるＭＹＯ１Ａの役割についての知見を得るために、本発明者らは、急性及び傷害条件下で、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスを一連の体性感覚試験に供した。オープンフィールド試験及びロータロッド試験では、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスは正常な行動を示したが（図７Ａ〜Ｃ）、ホットプレート試験では、有害な熱刺激の感知能力に差異はなく、アセトン試験に対して正常な応答を示した（図７Ｄ及び７Ｅ）。次いで、本発明者らは、急性条件及び３つの異なる病理学的条件（カラギーナン誘発性炎症、慢性絞扼傷モデル（ＣＣＩ）(Bennett and Xie, 1988)及びブレナン試験(Brennan, 1999)）下で、それらのマウスの機械的感受性を試験した。基本条件において、及び傷害後のいくつかの時点において、アップダウン法を使用して、機械的感受性を試験した（図１Ｆ〜Ｈ）。３つのパラダイムの全てにおいて、２つの遺伝子型間で、ベースラインレベルにおける機械的閾値は類似していた（図１Ｆ〜Ｈ）。カラギーナンの足底内注射は、両遺伝子型において、炎症１時間後から機械的閾値の大幅な低下を誘導した（図１Ｆ）。印象的なことに、炎症３日後、ＷＴマウスはベースラインレベルに戻ったのに対して、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、機械的過敏症が炎症６０日後まで延長したが、これは、可逆的な急性炎症誘発性機械的疼痛が長期間型の不可逆的な慢性疼痛に変質することを実証している。神経傷害及び術後モデルでは、同じ行動反応が観察された。ＷＴマウスでは、ＣＣＩ誘発性機械的過敏症の有意な回復が３０日目に始まり、約４０日目にベースラインレベルに戻ったのに対して、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、カラギーナン誘発性炎症と同様に、機械的過敏症がＣＣＩ６０日後まで持続した（図１Ｇ）。最後に、ブレナン試験において、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、切開誘発性機械的過敏症は不可逆的であったのに対して、ＷＴマウスでは、それは１０日間未満持続した（図１Ｈ）。ハーグリーブス試験を使用してカラギーナン及びブレナンパラダイムにおいて、熱過敏症を評価した。カラギーナンモデルにおいて、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、熱過敏症が延長したが、炎症後６０日目にベースラインレベルに戻った（図７Ｇ）。しかしながら、ブレナンモデルでは、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス間で術後誘発性熱過敏症に差異はなかった（図７Ｈ）。最後に、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスは、両段階中に、ホルマリン誘発性防衛行動の有意な増強を示した（図７Ｆ）。まとめると、これらのデータは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスが傷害誘発性慢性機械的疼痛を発症する素因を有することを実証しており、急性疼痛から慢性疼痛への移行をトリガーする機構を解明するための優れたモデル系としてこれらのマウスを使用することができることを示唆している。
【０１２９】
ＭＹＯ１Ａの喪失は、イオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性シグナリングを特異的に変化させる
傷害誘発性慢性疼痛は、ＳＣにおける興奮性神経伝達と抑制性神経伝達との間の不均衡によって引き起こされ、同時に起こる過度の疼痛は、オピオイド、ＧＡＢＡ及びグリシンレセプターアゴニスト、カルシウムチャンネルアンタゴニスト並びに本発明者らが最近同定したＴＡＦＡ４などの様々な化合物によって一時的に回復され得ることが十分に確立されている。Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、これらのシグナル伝達経路のどれが機能不全であるか解明するために、本発明者らは、神経部分傷害（ＳＮＩ）神経因性疼痛モデル(Decosterd and Woolf, 2000)を使用して、これらの化合物の鎮痛効果を試験した。ＳＮＩモデルは非常に再現性があり、長期間型の不可逆的な機械的疼痛を誘発するので、それを選択した。このパラダイムを使用して、本発明者らは、δ及びμオピオイドレセプターアゴニストであるＳＮＣ８０及びＤＡＭＧＯ（図２Ａ）、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニストであるバクロフェン及びＴＡＦＡ４（図２Ｂ）、α２δ電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤であるプレガバリン並びにグリシンレセプターアゴニストであるタウリン（図３Ｃ）の髄腔内（ＩＴ）投与が、両遺伝子型におけるＳＮＩ誘発性機械的過敏症を有意に回復させたことを示した。しかしながら、ＷＴマウスとは対照的に、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ＧＡＢＡＡアゴニストのムシモールの髄腔内投与は、ＳＮＩ誘発性機械的疼痛を完全に回復させることができなかった（図２Ｄ）。ザイモサンＡ誘発性炎症性疼痛モデルにおいても、ムシモールの鎮痛効果に対するＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスの耐性が確認された(Witschi et al., 2011)。本発明者らは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ザイモサン誘発性炎症が長期の不可逆的な機械的過敏症ももたらしたことを初めて示した（図２Ｅ）。ムシモール又はＧＡＢＡＡ−Ｒ陽性アロステリックモデュレーターであるジアゼパム（ＤＺＰ）の髄腔内投与は、ＷＴマウスにおけるザイモザン誘発性機械的過敏症を大きく回復させたが、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスに対しては効果がなかった（図２Ｆ及び２Ｇ）。重要なことに、ＳＮＣ８０の注射は、両遺伝子型における機械的疼痛を大きく回復させた（図２Ｈ）。まとめると、これらのデータは、傷害誘発性慢性機械的疼痛を発症するＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスの素因が、イオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性抑制性神経伝達の選択的障害に起因することを実証している。
【０１３０】
ＭＯＹ１Ａの喪失は、ＤＲＧ及びＳＣニューロンの両方におけるＧＡＢＲＡ２の選択的アップレギュレーションをもたらした
末梢神経系及び中枢神経系の両方において、ＧＡＢＡ作動性抑制の喪失は、いくつかの手段によって変化され得ることが十分に確立されている。これらとしては、ＧＡＢＡＡ−Ｒのサブユニット組成の変化、ＧＡＢＡレベルの変化、ＧＡＢＡ放出確率及びシナプス間隙からのその除去速度、並びにＧＡＢＡ媒介性抑制を興奮に切り替える塩化物勾配の変化が挙げられる(Sandkuhler, 2009)。Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、これらの機構のどれが影響を受けるか解明するために、本発明者らは、不偏ＲＮＡディープシーケンシングスクリーニングを使用した。ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスのＤＲＧ及びＳＣニューロンから調製したポリＡ  ｍＲＮＡの生物学的複製物を、全エクソームカバレッジの平均２５０倍に相当する非常に高い配列決定深度（複製物当たり平均１１２×１０６のエクソームマッピングリード）へのハイスループットシーケンシングに供した（表１）。
【表１】
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【０１３１】
Ｍｙｏ１ａ発現の喪失により非常に有意にディファレンシャルに発現された（ＤＥ）遺伝子をコールし（＜５％ＦＤＲ；＜ｐ  ０．０００２５）、ＤＲＧニューロンではＤＥ遺伝子 ９８個（図３Ａ及び表２）及びＳＣニューロンではＤＥ遺伝子 ３２個（図３Ａ及び表３）を同定した。
【表２】
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【表３】
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【０１３２】
ＤＥ遺伝子の大部分が、Ｍｙｏ１ａが正常に発現されるＤＲＧニューロンに固有であったことは驚くべきことではないが（図１Ａ〜Ｇ）、少数（１４個）のＤＥ遺伝子は、ＤＲＧ及びＳＣニューロンの両方においてデレギュレーションされており、ＤＥ遺伝子 １８個がＳＣニューロンに固有であった（図３Ａ及び３Ｂ）。ＲＮＡ  ｓｅｑデータを確認するために、本発明者らは、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、両組織においてディファレンシャルに発現された少数の遺伝子に注目した。Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、両組織において、Ｎｎｔ、Ｇａｂｒａ２及びＷｄｆｙ１は非常に有意な増加を示した（図３Ｃ）。しかしながら、本発明者らは、ダウンレギュレーションされた遺伝子のディファレンシャルな発現を確認することができなかった（データは示さず）。
【０１３３】
本発明者らの行動実験によって明らかになったイオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性神経伝達のＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス選択的変化により、本発明者らはＧａｂｒａ２遺伝子に注目した。Ｇａｂｒａ２は、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスにおいて発現の変化を示した唯一のＧＡＢＡレセプターサブユニットであった（表４）。
【表４】
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【０１３４】
ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を補足するために、本発明者らは、in situハイブリダイゼーション及び免疫組織化学を使用した。in situハイブリダイゼーションを使用して、本発明者らは、ＤＲＧでは、Ｇａｂｒａ２のアップレギュレーションがかなり明確であり、大きなサイズのニューロンにおけるアップレギュレーションは、ＳＣよりも非常に強いことを見出した（図３Ｄ）。免疫組織化学を使用して、本発明者らは、一次求心性終末及び局所介在ニューロンが混在するＳＣの後角では、Ｇａｂｒａ２のアップレギュレーションがＧＡＢＲＡ２タンパク質の有意な増加を伴っていたことを確認した（図３Ｅ及び３Ｆ）。重要なことに、ＧＡＢＲＡ２の選択的アップレギュレーションと一致して（表４）、本発明者らは、２つの遺伝子型間で、ＧＡＢＲＡ１（α１サブユニット）の免疫応答性に差異はないことを見出した（図３Ｇ）。最後に、ＧＡＢＲＡ２のアップレギュレーションがＧＡＢＡＡ−Ｒ機能に影響を与えるかを試験するために、本発明者らは、培養ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯ  Ｖｅｎｕｓ発現Ｃ−ＬＴＭＲにおいて全細胞パッチクランプ記録を実施した。本発明者らは、両遺伝子型において、漸増濃度のムシモールのバス適用が同様の電流振幅をトリガーしたことを見出したが（図４Ａ及び４Ｂ）、これは、ＧＡＢＲＡ２のアップレギュレーションが、その選択的アゴニストであるムシモールに応じてＧＡＢＡＡ−Ｒ応答を変化させなかったことを実証している。
【０１３５】
炎症Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、第ＩＩ層介在ニューロンの興奮性グルタミン酸作動性活性のムシモール誘発性増加が大幅に損なわれる。
ムシモールの鎮痛効果に対するＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスの非感受性を合理的に説明するために、本発明者らは、ＳＣ切片に対する全細胞パッチクランプ記録を使用した。最初に、急性条件下及び炎症後（カラギーナン及びザイモサン）の内部第ＩＩ層ニューロンの一連の電気生理学的特性の徹底的な特性評価により、ＷＴマウス及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウス間で差異はないことが明らかになった（図８）。次いで、本発明者らは、急性条件下及びザイモサン炎症後において、ＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスの第ＩＩ層ニューロンにおける自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）に対するムシモールのバス適用の発生率を調査した。これらの条件下では、２つの遺伝子型間で、ｓＥＰＳＣの全平均振幅は類似していた（データは示さず）。ナイーブＷＴマウスでは、左方向へのｓＥＰＳＣ間隔累積分布曲線のシフトによって示されているように、５μMムシモールのバス適用は、ｓＥＰＳＣ頻度の有意な増加を誘導した（図４Ｃ）。ザイモサンで炎症を起こしたＷＴマウス由来の切片では、この効果はほぼ倍増した（図４Ｅ）。興味深いことに、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウス由来のナイーブ切片では、ムシモールは、ｓＥＰＳＣ頻度の劇的な５４４％の増加を誘導した（図４Ｄ）。しかしながら、ムシモールのバス適用はｓＥＰＳＣ頻度に対して効果がなかったように、ザイモサン炎症ＫＯマウスから得られた切片では、この効果は完全に喪失したが（図４Ｆ）、これは、本発明者らが、傷害後におけるムシモールの鎮痛効果に対するＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスの非感受性を観察したことをさらに裏付けている（図２Ｄ及び２Ｆ）。
【０１３６】
結論
これらの実験では、本発明者らは、ＭＹＯ１Ａの喪失が、可逆的な傷害誘発性急性疼痛を長期間型の不可逆的な疼痛に変質させたことを示した。２つの炎症性疼痛モデル、１つの神経因性疼痛モデル及び１つの術後疼痛モデルにおいて、この疼痛の慢性化は機械的感受性に対して選択的であったが、これは、ＭＹＯ１Ａの喪失が、個体が傷害誘発性慢性疼痛を発症する素因となることを示唆しており、これらのマウスが、急性疼痛から慢性疼痛への移行をトリガーする細胞機構及び分子機構を解明するための理想的な動物モデルであることを示している。実際、本発明者らは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスにおける傷害誘発性機械的過敏症は、オピオイド、バクロフェン、プレガバリン、ＴＡＦＡ４及びタウリンによって一時的に回復され得るが、ムシモール及びジアゼパムによって回復され得ないので、ＭＹＯ１Ａの喪失は、イオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性シグナリングを選択的に損なったことを見出した。本発明者らはまた、ＭＹＯ１Ａの喪失が、ＧＡＢＡＡ−Ｒのα２サブユニットの構成的アップレギュレーションをもたらしたことを見出したが、これは、このサブユニットの発現の変化が傷害誘発性疼痛の慢性化の過程に関与する可能性を示唆している。
【０１３７】
慢性疼痛は深刻かつ高度に不均質な医療問題であり、罹患率は世界人口の２０〜３０％で変動する(Bouhassira et al., 2008; Breivik et al., 2006)。慢性疼痛を発症する個体がごく一部であることを考慮すると、遺伝的因子の寄与が想定されている(Belfer et al., 2015; Devor, 2004; Macrae, 2008; Tegeder et al., 2006; Voscopoulos and Lema, 2010)。本明細書では、本発明者らは、４つの異なる疼痛パラダイムを使用して、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスが傷害後に不可逆的な慢性疼痛を発症したことを示したが、これは、ＭＹＯ１Ａの喪失と慢性疼痛の発症との因果関係を実証している。非常に重要なことに、本発明者らは、炎症の状況下において、Ｍｙｏ１ａ＋／−マウスにおけるＭｙｏ１ａ遺伝子の１コピーの喪失が、長期間型の不可逆的な機械的疼痛を誘発したことを見出したが、これは、傷害誘発性慢性疼痛を発症する素因遺伝子としてのＭｙｏ１ａの寄与をさらに裏付けている（図７Ｉ）。
【０１３８】
行動薬理学を使用して、本発明者らは、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ムシモールによって傷害誘発性機械的過敏症を回復させることができないことを示した。このイオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性シグナリング障害は、電気生理学的記録によってさらに実証され、本発明者らは、急性条件下では、ムシモールが、第ＩＩ層介在ニューロンの興奮性グルタミン酸作動性活性の劇的な増加を誘発したのに対して、炎症後、この効果が完全に消失したことを示した。本発明者らはまた、ナイーブＷＴ及びＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ＧＡＢＡＡ−Ｒビククリン（biccuculine）の選択的アンタゴニストが同様の機械的過敏症を誘発したことを示したが（図７Ｊ）、これは、急性条件下のＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、ＧＡＢＡＡ−Ｒが機能的であることを実証している。まとめると、これらのデータは、傷害が脊髄ＧＡＢＡＡ−Ｒの活性状態から不活性状態へのシフトを引き起こし、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスにおけるイオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性神経伝達をさらにサイレンシングして慢性疼痛の発症をもたらすことを示している。この現象に対する説得力のある１つの説明は、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスでは、傷害がＧＡＢＡＡ−Ｒの大規模なインターナリゼーションを誘導するというものである。実際、致命的な難治性痙攣性てんかん重積状態（ＳＥ）が実験的に誘発された動物では、エンドサイトーシスの増強に起因するシナプスＧＡＢＡＡ−Ｒの減少が観察されている(Naylor et al., 2005; Terunuma et al., 2008)。興味深いことに、表面レセプターのこの減少は、ベンゾジアゼピン感受性サブユニットを含有するＧＡＢＡＡ−Ｒを主にターゲティングし、これにより、ベンゾジアゼピンに対するＳＥ患者の薬理耐性及び発作の非終結性の両方が説明される。注目すべきことに、本発明者らは、傷害条件下では、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯマウスはムシモール及びＤＺＰに対して完全に非感受性であり、これらの同じ条件下において、傷害誘発性機械的過敏症が確立されると、これらのマウスでは、それが不可逆的になることを実証した。
【０１３９】
観察された表現型に対する別の可能な説明は、本発明者らのＲＮＡディープシーケンシングデータによるものであった。本発明者らは、ＭＹＯ１Ａの喪失が、安定状態のＤＲＧ及びＳＣニューロンの両方においてＧａｂｒａ２の大規模かつ選択的なアップレギュレーションを伴っていたことを見出したが、これは、この発現の変化が、観察された傷害誘発性疼痛の慢性化に関与する可能性が高いことを示している。本発明者らは、ｇａｂｒａ２のアップレギュレーションがＧＡＢＲＡ２タンパク質の有意な増加をもたらしたことを確認したが、Ｍｙｏ１ａ  ＫＯ  ＣＬＴＭＲでは、この増加は、ムシモール誘発性電流の振幅に対して効果がない。ＧＡＢＲＡ２が、ＤＲＧ及びＳＣニューロンにおいてディファレンシャルに発現される唯一のＧＡＢＡＡ−Ｒサブユニットであったことを考慮すると、本発明者らのデータは、ＧＡＢＲＡ２のアップレギュレーションが、より多くのＧＡＢＡＡ−Ｒがα２サブユニットを含有する方向にバランスをシフトさせることに寄与する可能性が高いことを示唆している。この場合、α２及びα１は、ＤＲＧにおいて発現される主なサブユニットであるので、大きなサイズの一次求心性ニューロンでは、α２／α１比が主に影響を受けるであろう（図３Ｄを参照のこと）。
【０１４０】
この仮説と一致して、最近の研究では、難治性痙攣性てんかん重積状態及び難治性てんかんを有する患者は、α１含有レセプターを犠牲にして、有意に多くのα２含有ＧＡＢＡＡ−Ｒを有することが実証された(Loddenkemper et al., 2014)。α２含有ＧＡＢＡＡ−Ｒが、他のαサブユニットを含有するＧＡＢＡＡ−Ｒよりも、過剰なインターナリゼーションをする傾向があるかを調べる将来の研究が必要である。
【０１４１】
結論として、傷害条件下のＭｙｏ１ａ  ＫＯマウスにおけるＧＡＢＡＡ−Ｒ機能を損なう正確な機構は解明されなかったが、本発明者らは、機能喪失型突然変異が傷害後に不可逆的な疼痛状態をもたらす最初のマウスモデルを記載する。本発明者らはまた、傷害誘発性慢性疼痛の発症の予測遺伝的因子としてＭｙｏ１ａ遺伝子を真剣に検討すべきであることを強く主張し、イオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性系が、急性疼痛から慢性疼痛への移行に寄与する主な機構であると指摘する。本発明者らの研究はまた、（ｉ）急性疼痛から慢性疼痛への移行をトリガーする分子機構及び細胞機構の理解を深めるために、並びに（ｉｉ）慢性疼痛の確立を予防するための「アラカルト」薬理学的療法を設計するために使用することができる強力な前臨床動物モデルを提供する。
【０１４２】
参考文献
【表５】
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2019512213.tif 000012
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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