(57)【要約】  本発明は、微細藻類からのフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドの生産のためのプロセスならびにその精製されたフコキサンチンの医薬組成物、美容組成物、栄養補給用組成物および食品組成物における使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類からフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを生産するための改善されたプロセスであって、
（ａ）フコキサンチンおよび／またはポリサッカライドの生産の向上のための急速な細胞増殖を可能にするインデューサーを用いて微細藻類培地を培養する工程と；
（ｂ）藻類培養物を回収および乾燥して乾燥培養物を生産する工程と；
（ｃ）空気圧粉砕を実施して藻類の細胞壁を割る工程と；
（ｄ）乾燥培養物を抽出してフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物を生産する工程と；
（ｅ）抽出混合物をバイオマス画分およびフコキサンチンに富んだオレオレジンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物に分離し、必要に応じて前記フコキサンチンに富んだオレオレジンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物をさらに精製する工程と、
を含むプロセス。
【請求項２】
藻類培養物が、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｋｕｍ  ｓｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．、Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．、Ｎａｖｉｃｕｌｌａ  ｌｅｎｓｉ、Ｎａｖｉｃｕｌｌａ  ｉｎｃｅｒｔａおよびＣｈａｅｏｔｏｃｅｒｏｕｓ  ｓｐ．から選択される、請求項１のプロセス。
【請求項３】
微細藻類の培養が、窒素飢餓または硝酸塩飢餓、リン飢餓、光の欠乏、特定の光波長の選択、培養中の光波長の変更（青−緑から緑−赤への変更）、Ｈ２Ｏ２の添加、加熱、より高いｐＨの使用、塩素イオンの添加、植物ホルモンの添加、オゾンへの培地の曝露およびそれらのストレス条件の組み合わせから選択されるストレス条件を用いて実施される、請求項１のプロセス。
【請求項４】
微細藻類の培養が、開放系、閉鎖系または半閉鎖系で実施される、請求項１のプロセス。
【請求項５】
微細藻類の回収が、遠心分離、および必要に応じて再遠心分離、により微細藻類を水性混合物から分離した後に乾燥させることによって実施される、請求項１のプロセス。
【請求項６】
その規模が微細藻類の種類および培養培地の塩分に依存する、遠心分離により微細藻類から水を分離することによって微細藻類の回収が実施される、請求項５のプロセス。
【請求項７】
藻類培養物が、凍結乾燥、噴霧乾燥、蒸発、風乾または真空乾燥、熱い空気への曝露、耐熱窓ベルト乾燥（refractory window belt drying）、オーブン中での乾燥およびそれらの方法の組み合わせから選択される少なくとも１つの方法によって乾燥される、請求項５のプロセス。
【請求項８】
乾燥プロセスが、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、レシチン、タルク、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、シリコーン水酸化物（silicone hydroxide）、キトサンおよびそれらの粉末化剤または固結防止剤の組み合わせから選択される粉末化剤または固結防止剤を添加して実施される、請求項５のプロセス。
【請求項９】
回収されたバイオマスが、固形物に濃縮され、塩分を減らすために水で洗浄され、必要に応じて再遠心分離されて、１０〜４５％の固形物を含む生産物をもたらす、請求項５のプロセス。
【請求項１０】
回収されたバイオマスの遠心分離、および必要に応じて再遠心分離、によって得られる上清が、分泌されたポリサッカライドの精製のために使用される、請求項５のプロセス。
【請求項１１】
フコキサンチンが、少なくとも１種の有機溶媒および／または超臨界流体（ＳＣＦ）液体ＣＯ２を用いた抽出によってタンパク質から分離される、請求項１のプロセス。
【請求項１２】
抽出に使用される少なくとも１種の有機溶媒が、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピルおよびそれらの溶媒の混合物から選択される、請求項１１のプロセス。
【請求項１３】
抽出に使用される溶媒にリン酸が添加される、請求項１１のプロセス。
【請求項１４】
大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ゴマ油およびそれらの組み合わせから選択される食用油が、抽出のための溶媒として使用されるか、または共溶媒として使用される、請求項１１のプロセス。
【請求項１５】
乾燥バイオマスにおいて少なくとも１．５％のフコキサンチンおよび抽出物において少なくとも１０％のフコキサンチンを含む生産物をもたらす、請求項１のプロセス。
【請求項１６】
ポリサッカライドの精製を可能にするために抽出後の残存パルプが熱水に溶解される、請求項１１のプロセス。
【請求項１７】
ＳＣＦ抽出より前に、またはＳＣＦ抽出の後に、乾燥バイオマスが、プロテアーゼなどの酵素を用いて酵素的に処理される、ならびに／または熱水および／もしくは熱蒸気で抽出される、ならびに／または緩衝液での洗浄によって処理される、ならびに／またはフコキサンチンに結合しているタンパク質を変性させるために処理される、請求項１１のプロセス。
【請求項１８】
濾過、濾過用媒体として天然シリカビーズを用いたカラム上でのゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー法（分取ＴＬＣまたは分取ＨＰＬＣを含む）およびそれらの方法の組み合わせから選択される方法によってポリサッカライドが分離および精製される、請求項１のプロセス。
【請求項１９】
必要に応じて液体クロマトグラフィーと組み合わせた追加的なＳＣＦシーケンスによって、フコキサンチンに富んだオレオレジンがさらに精製され、脂肪酸から分離されて、精製されたフコキサンチンをもたらす、請求項１のプロセス。
【請求項２０】
癌、メタボリックシンドローム（体重過多、肥満、高血中コレステロールＬＤＬ、高血中トリグリセリド、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、高血中スクロース（high-blood sucrose）を含む）、アテローム動脈硬化症、認知症、アルツハイマー病、記憶喪失、多発性硬化症、うつ病（環境ストレス、熱ストレスおよび一般的な神経保護を含む）から選択される状態または疾患を防止、改善または処置するための製剤における単独の、または他の有効成分と組み合わせた、活性医薬成分としての請求項１９のフコキサンチンの使用。
【請求項２１】
抗老化、皮膚の美白および皮膚の保護として使用される局所投与または他の投与形態のための美容用調製物（軟膏、ゲル、クリーム、溶液、エマルジョンおよびローション）における請求項１９のフコキサンチンの単独での、または他の有効成分と組み合わせた、使用。
【請求項２２】
請求項１９のフコキサンチンを含む医薬組成物を調製する方法であって、前記フコキサンチンを、吸収促進剤、結合剤、増量剤（bulking agent）、担体、コーティング剤、希釈剤、崩壊剤、増量剤（extender）、充填剤、香味料、潤滑剤、界面活性剤および湿潤剤から選択される少なくとも１種の追加的な有効成分と混合することによる方法。
【請求項２３】
請求項１９のフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを含む栄養補給食品、栄養補助食品または食品用調製物を調製する方法であって、前記フコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを、糖およびデンプン、食物繊維、脂質、アミノ酸、タンパク質（タンパク質単離物またはタンパク質加水分解物など）、乳酸、ビタミンならびにミネラルから選択される食品成分と混合することによる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、微細藻類からのフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドの生産のための改善されたプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類は、光合成によって自律的に増殖する能力を有する独立栄養性光合成微生物である。微細藻類は、海水培地および淡水または汽水ならびに様々な陸上の生息環境において成長する。淡水または海洋において見出される微細藻類の大部分の種は、一般的に独立栄養性であり、すなわち、それらは光合成によってのみ増殖できる。これらの種については、それらの環境中の有機性炭素含有基質または有機物の存在は好ましくなく、増殖を改善しない。しかし、一定数の種の微細藻類は、厳密に独立栄養性であるとは見出されない。従って、従属栄養性であるこれらの種の一部は、光の完全な不在下で、発酵によって（すなわち、有機物を使用することによって）成長することができる。
【０００３】
光合成が成長に必須なままである微細藻類の他の種は、光合成および微細藻類の環境中に存在する有機物の両方から恩恵を受けることができる。これらの中間の種は、混合栄養性であると言われており、光および有機物の両方の存在下で培養できる。
【０００４】
フコキサンチンは、褐色または緑色を有する褐藻類のクロロプラストにおいて色素として見出されるキサントフィルである。フコキサンチンは、カロテノイドのファミリーに属し、βカロテンの分子と構造的に類似した分子を有する。フコキサンチンは、ヒトの体内でビタミンのような活性を有さず、抗酸化物質として作用すると考えられている。ヒトによるフコキサンチンの摂取は、いくつかの健康上の利点と関連している。
【０００５】
フコキサンチンは、可視スペクトルの主に青−緑から黄−緑の部分の光を吸収し、５１０〜５２５ｎｍ付近にピークを有し、４５０〜５４０ｎｍの範囲で吸収する。フコキサンチンは、褐色海藻（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ科の大型海藻）および珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ科の微細藻類）に豊富に存在する。フコキサンチンはまた、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．などの黄金色微細藻類（golden-brown microalgae）にも存在する。
【０００６】
フコキサンチンの構造式は以下の通りである。
【化１】
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【０００７】
フコキサンチンの化学式はＣ４２Ｈ５８Ｏ６であり、その化学名は［（１Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−［（３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ，９Ｅ，１１Ｅ，１３Ｅ，１５Ｅ）−１８−［（１Ｒ，３Ｓ，６Ｓ）−３−ヒドロキシ−１，５，５−トリメチル−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタン−６−イル］−３，７，１２，１６−テトラメチル−１７−オキソオクタデカ−１，３，５，７，９，１１，１３，１５−オクタエニリデン］−３，５，５−トリメチルシクロヘキシル］アセテートである。
【０００８】
フコキサンチンは、その独特の構造に寄与する７つの共役二重結合、エポキシ、ヒドロキシル、ケトンカルボニルおよびカルボキシルエステル部分に加えて、その分子中にアレン部分を有する。
【０００９】
一般にカロテノイドおよび特にフコキサンチンは、活性医薬成分として、栄養補助食品として、栄養補給食品として、（例えば、日本料理において）食品添加物として、化粧品において、および動物用飼料における添加物として、商業的に幅広く使用されている。
【００１０】
国際公開ＷＯ２０１４／００３７４０および国際公開ＷＯ２０１４／０７８４５９に記載されるように、フコキサンチンなどのカロテノイドは、体重減少の促進に有効である可能性がある。典型的な製剤には、脂肪ブロッカー（fat blocker）、フィラー成分（filler component）、インスリン増感剤（insulin sensitizer）および脂肪増殖抑制薬（fat growth suppressant）が包含され、ここで、脂肪ブロッカーは、フコキサンチンまたはプニカ酸などのカロテノイドを含んでよい。この使用は、脂肪細胞の分化および増殖を阻害しながら脂肪の減少を誘発し得る、長期間にわたって脂肪細胞にフコキサンチンの代謝産物を貯蔵する人体の能力に起因する可能性がある。
【００１１】
さらに、フコキサンチンは、筋肉組織におけるグルコース代謝の異常の補正など、他の健康上の利点を有し、これは、現在のところは確認されていないメカニズムによって、糖尿病患者を助け、ヒトのコレステロールおよびトリグリセリドの血中濃度を低下させることができる。ヒトにフコキサンチンを補給すると血圧、肝臓脂肪貯蔵および肝臓酵素の値の低下が認められている。
【００１２】
いくつかの研究グループが、フコキサンチンの抗炎症作用、抗侵害受容作用および抗癌作用を研究している。１つの研究は、フコキサンチンが、場合によっては様々な癌細胞のアポトーシスを誘導することによる、またはゼラチン分解酵素ＭＭＰ−９の発現を抑制するとともにメラノーマ細胞の移動性を抑制することによって癌細胞の侵襲性に対する阻害効果を発揮することによる、その抗癌作用に加えて、酸化ストレス関連疾患に対する効果を有する可能性があるということを示している。
【００１３】
例えば、Ｌ．Ｊ  Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｒ  Ｄｒｕｇｓ，  ２０１５  Ｊｕｌ  ３１；１３（８）；４７８４−９８）は、「Ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎｏｌ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」なるタイトルの論文において、フコキサンチンは消化管の消化酵素によって主にフコキサンチノールに代謝されると記載している。これらの化合物は、抗変異原作用、抗糖尿病作用、抗肥満作用、抗炎症作用および抗腫瘍作用を含め、多くの有益な健康上の効果を有することが示されている。この総説において、著者は、癌の種々のタイプに応じてフコキサンチンおよびフコキサンチノールの作用機序を解説している。現在の知見は、これらの化合物が、癌の発症および悪性度の処置および／または防止に有効であるということを示唆している。
【００１４】
フコキサンチンを生産するための海藻の使用は、いくつかの欠点を有する。海藻の様々な部分におけるフコキサンチンの含有量は低く、すなわち、その乾燥重量の約０．０１〜０．３％である。従って、海藻からのフコキサンチンの抽出は、５％のフコキサンチンのオレオレジンを１Ｋｇ生産するために約２トンの乾燥海藻が使用されるため（収率０．００２５％）、商業規模では扱いにくい。さらに、海藻の収穫は、秋と冬の季節に限定され、他の季節には実施できず、従って、製造工場は、年間を通じて常に最大生産能力で稼働するわけではない可能性がある。別の問題は、ますます汚染されている海洋において海藻の生育条件を制御できないことにある。さらに、海洋において生育する海藻は、重金属（例えば、水銀およびカドミウム）、ヨウ素、多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）および放射能汚染物などの汚染物質を隔離する傾向がある。
【００１５】
従って、微細藻類は、フコキサンチンの生産に好ましい。しかし、微細藻類からフコキサンチンを生産するための当技術分野で公知の現在の方法は、比較的低い収率および純度で生産物をもたらす。例えば、Ｃ．Ｍ．Ｒｅｄｄｙらは、米国出願公開ＵＳ２０１５／０１４０６１９において、微細藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．からのバイオ燃料の生産を説明している。フコキサンチンは、このプロセスの副産物であるが、このプロセスは、単離されたフコキサンチンの濃度が非常に低い（すなわち、０．３〜２ｍｇ／ｇである）ため、効率的ではない。
【００１６】
従って、高純度のフコキサンチンを比較的高い収率でもたらすであろうフコキサンチンの生産のための効率的なプロセスが当技術分野で必要とされている。本発明は、そのようなプロセスを提供する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、高い収率および純度でフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを生産するための改善されたプロセスを提供する。
【００１８】
本発明の一部の実施形態によれば、本明細書で開示されるプロセスによって、フコキサンチンおよび／もしくはポリサッカライドに富んだ乾燥微細藻類粉末ならびに／またはフコキサンチンおよび他の化合物（多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）など）に富んだオレオレジンならびに／またはポリサッカライドおよび／もしくは硫酸化ポリサッカライドに富んだ溶液が提供される。
【００１９】
出願人は、以下の工程を含む、微細藻類からフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを生産するための改善されたプロセスを開発した。
（ａ）フコキサンチンおよび／またはポリサッカライドの生産の向上のための急速な細胞増殖を可能にするインデューサーを用いて微細藻類培地を培養する工程；
（ｂ）藻類培養物を回収および乾燥して乾燥培養物を生産する工程；
（ｃ）空気圧粉砕を実施して藻類の細胞壁を割る工程；
（ｄ）乾燥培養物を抽出してフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物を生産する工程；および
（ｅ）抽出混合物をバイオマス画分およびフコキサンチンに富んだオレオレジンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物に分離し、必要に応じて前記フコキサンチンに富んだオレオレジンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物をさらに精製する工程。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書で提供されるプロセスは、乾燥バイオマスにおいて少なくとも約１．５％のフコキサンチンおよび抽出物において少なくとも約１０％のフコキサンチンを含む粗生産物をもたらす。
【００２１】
本発明の一部の実施形態によれば、濾過、（例えば、濾過用媒体として天然シリカビーズを用いた）カラム上でのゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー法（分取ＴＬＣまたは分取ＨＰＬＣを含む）およびそれらの方法の組み合わせから選択される方法により、フコキサンチンがポリサッカライドから分離され、精製されて、高純度のフコキサンチンをもたらす。
【００２２】
本発明の一部の実施形態によれば、例えば液体クロマトグラフィーによって取得された高純度のフコキサンチンは、癌、メタボリックシンドローム（体重過多、肥満、高血中コレステロールＬＤＬ、高血中トリグリセリド、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、高血中スクロース（high-blood sucrose）を含む）、アテローム動脈硬化症、認知症、アルツハイマー病、記憶喪失、多発性硬化症、うつ病（環境ストレス、熱ストレスおよび一般的な神経保護を含む）から選択される状態または疾患を防止、改善または処置するための製剤において単独で、または他の有効成分と組み合わせて、使用される。
【００２３】
本発明は、医薬的に許容される賦形剤、および必要に応じて他の治療薬、と混合された本明細書で説明されるように生産された高純度のフコキサンチンを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
一部の実施形態によれば、剤形に製剤化できる本発明の医薬組成物は、例えば錠剤、丸剤、粉末、顆粒剤、糖衣錠、液体、懸濁液、エマルジョン、顆粒剤、カプセル、坐剤、注射用調製物（溶液および懸濁液）、パッチ等として投与される。
【００２５】
一部の実施形態によれば、本発明のフコキサンチンは、抗老化、皮膚の美白、皮膚の保護および他の美容用途として使用される局所投与または他の投与形態のための美容用調製物（軟膏、ゲル、クリーム、溶液、エマルジョン、ローション等など）において単独で、または他の有効成分と組み合わせて、使用される。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明のフコキサンチンを含む医薬組成物は、前記フコキサンチンを、吸収促進剤、結合剤、増量剤（bulking agent）、担体、コーティング剤、希釈剤、崩壊剤、増量剤（extender）、充填剤、香味料、潤滑剤、界面活性剤、湿潤剤等から選択される少なくとも１種の追加的な有効成分と混合することによって調製される。
【００２７】
一部の実施形態によれば、本発明のフコキサンチンを含む栄養補給食品、栄養補助食品または食品用調製物は、前記フコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを、糖およびデンプン、食物繊維、脂質、アミノ酸、タンパク質（タンパク質単離物またはタンパク質加水分解物（protein hydtrolyzates）など）、乳酸、ビタミン、ミネラルならびにそのような調製物において一般的に使用される他の成分などの食品成分と混合することによって調製される。
【００２８】
一部の実施形態によれば、本発明の栄養補助食品には、例えば、飲料、スープ、スナック、乳製品等が包含され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、溶媒としてアセトン／メタノール／ヘキサンを用いたフコキサンチンのＨＰＬＣの検量線を示す。
【図２】図２は、溶媒としてアセトニトリルを用いたフコキサンチンのＨＰＬＣの検量線を示す。
【図３−１】図３は、３．６８６ｍｇ／ｍＬという濃度を有するフコキサンチン溶液のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図３−２】図３は、３．６８６ｍｇ／ｍＬという濃度を有するフコキサンチン溶液のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、クロロフィルＡの検量線を示す。
【図５】図５は、４５０ｎｍにおけるクロロフィルＡのＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。
【図６−１】図６は、クロロフィルＡを含む凍結乾燥抽出されたフコキサンチンのオレオレジンのクロマトグラムを示す。
【図６−２】図６は、クロロフィルＡを含む凍結乾燥抽出されたフコキサンチンのオレオレジンのクロマトグラムを示す。
【図７】図７は、齢（日）に対する蓄積フコキサンチンの％として表される、硝酸塩飢餓下での１００Ｌの屋外平面パネルにおけるＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．の増殖曲線を示す。
【図８】図８は、齢（日）に対する乾燥重量（ＤＷ）として表される、硝酸塩飢餓下での１００Ｌの屋外平面パネルにおけるＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．の増殖曲線を示す。
【図９】図９は、齢（日）に対する乾燥重量（ＤＷ）として表されるＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．（オーキシンの添加により誘導）の増殖曲線を示す。
【図１０】図１０は、齢（日）に対するフコキサンチンの％として表されるＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．（青−緑の光の欠乏および高ｐＨにより誘導）の増殖曲線を示す。
【図１１】図１１は、齢（日）に対する乾燥重量（ＤＷ）として表されるＡｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．（オーキシンの添加により誘導）の増殖曲線を示す。
【図１２】図１２は、齢（日）に対する乾燥重量（ＤＷ）として表されるＡｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．（青色光の欠乏および高ｐＨにより誘導）の増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、高い収率および純度でフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを生産するための改善されたプロセスを提供する。
【００３１】
本発明の一部の実施形態によれば、本明細書で開示されるプロセスによって、フコキサンチンおよび／もしくはポリサッカライドに富んだ乾燥微細藻類粉末ならびに／またはフコキサンチンおよび他の化合物（多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）など）に富んだ固形オレオレジンならびに／またはポリサッカライドおよび／もしくは硫酸化ポリサッカライドに富んだ溶液が提供される。
【００３２】
出願人は、以下の工程を含む、微細藻類からフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを生産するための改善されたプロセスを開発した。
（ａ）フコキサンチンおよび／またはポリサッカライドの生産の向上のための急速な細胞増殖を可能にするインデューサーを用いて微細藻類培地を培養する工程；
（ｂ）藻類培養物を回収および乾燥して乾燥培養物を生産する工程；
（ｃ）空気圧粉砕を実施して藻類の細胞壁を割る工程；
（ｄ）乾燥培養物を抽出してフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物を生産する工程；および
（ｅ）抽出混合物をバイオマス画分およびフコキサンチンに富んだオレオレジンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物に分離し、必要に応じて前記フコキサンチンに富んだオレオレジンおよび／またはポリサッカライドに富んだ抽出物をさらに精製する工程。
【００３３】
本発明によれば、本明細書で使用される場合、光学密度（Ｏ．Ｄ）なる用語は、様々な濃度の溶液を用いた例えばフコキサンチンのサンプル（図１および図２）または例えばクロロフィルＡのサンプル（図４）の例えば４５０ｎｍの波長において分光光度計で測定された吸光度に関する。
【００３４】
本発明によれば、本明細書で使用される場合、上清なる用語は、遠心分離または沈殿によって得られる、残りの溶液または液体を指す。
【００３５】
本発明によれば、本明細書で使用される場合、検量線は、未知のサンプルを既知濃度のサンプルのセットと比較することによって未知のサンプルにおける物質の濃度を決定する方法である。
【００３６】
本発明によれば、本明細書で使用される場合、超臨界流体抽出法（ＳＦＥ）は、抽出溶媒として超臨界流体を用いて１つの成分（抽出剤）を別の成分（マトリックス）から分離するプロセスである。抽出は、固体マトリックスからであるが、液体からであってもよい。生産物から望ましくない物質を除去するために（例えば、カフェイン除去）、あるいは所望の生産物（例えば、エッセンシャルオイル）を回収するために、ＳＦＥを用いることができる。通常、液体の二酸化炭素（ＣＯ２）は、最もよく使用される超臨界流体の１つである。
【００３７】
本発明によれば、本明細書で使用される場合、オーキシンは、より高いバイオマス取得率を誘発するために添加される植物のブラシノステロイドホルモン（brassinosterodial hormone）である。
【００３８】
本発明によれば、本明細書で使用される場合、増殖培地なる用語は、例えば微細藻類および微生物を増殖させるために使用される、植物に由来する特定の細胞型および微生物学的培養を用いることによって微生物または細胞または小さな植物の増殖を支える液体またはゲルの混合物である増殖培地または培養培地のいずれかを指す。
【００３９】
本発明の一態様によれば、微細藻類は、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｋｕｍ  ｓｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．、Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．、Ｎａｖｉｃｕｌｌａ  ｌｅｎｓｉ、Ｎａｖｉｃｕｌｌａ  ｉｎｃｅｒｔａおよびＣｈａｅｏｔｏｃｅｒｏｕｓ  ｓｐ．から選択される。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、微細藻類の培養は、増殖を誘導する培地であって、従って急速な細胞の成長および大量取得を可能にする培地において実施される。
【００４１】
本発明の一部の実施形態によれば、微細藻類の培養は、窒素飢餓または硝酸塩飢餓、リン飢餓、光の欠乏、特定の光波長の選択、培養中の光波長の変更（例えば、青−緑から緑−赤への変更）、Ｈ２Ｏ２の添加、加熱、より高いｐＨ値（最大９．０）の使用、塩素イオンの添加、植物ホルモン（オーキシンおよびサイトカイニンなど）の添加、オゾンへの培地の曝露およびそれらのストレス条件の組み合わせから選択される（フコキサンチンの合成および蓄積を誘導する）ストレス条件を用いて実施される。
【００４２】
本発明の一部の実施形態によれば、微細藻類の培養は、開放系、閉鎖系または半閉鎖系で実施される。
【００４３】
本発明の特定の実施形態によれば、微細藻類の培養は、開放系で実施される。
【００４４】
本発明の特定の実施形態によれば、微細藻類の培養は、閉鎖系で実施される。
【００４５】
本発明の特定の実施形態によれば、微細藻類の培養は、半閉鎖系で実施される。
【００４６】
図７〜図１２は、硝酸塩飢餓、より高い温度の使用（加熱）、より高いｐＨ値（最大９．０）の使用および光の波長（色）の変更（青−緑または緑−赤への変更）などのストレス要因の組み合わせが、フコキサンチンの蓄積の誘導と共に藻類の増殖の阻害を引き起こすということを示す。例えば図８、図１１および図１２における乾燥物（ＤＷ）の蓄積は、６日目まで急速であり、その後、一定になる。
【００４７】
実施例３は、表１で詳述されるように、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．に対する硝酸塩飢餓の誘発の影響ならびにオーキシンを添加して増殖させるＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．に対する光波長の変化の誘発の影響を実証する。
【００４８】
【表１】
2019506133.tif 000003
【００４９】
さらに、実施例３は、以下の表２で詳述されるように、Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．に対する硝酸塩飢餓の誘発の影響ならびにオーキシンを添加して増殖させるＡｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．に対する光波長の変化の誘発および高ｐＨの使用の影響を実証する。
【００５０】
【表２】
2019506133.tif 000004
【００５１】
本発明の特定の実施形態によれば、最初の培養段階の間に植物のブラシノステロイドホルモン（サイトカイニンおよびオーキシンなど）を添加すると、バイオマス取得率が高くなる。
【００５２】
本発明の特定の実施形態によれば、微細藻類の回収は、例えば工業用遠心分離機における遠心分離により微細藻類を水性混合物から分離した後に乾燥させることによって実施される。
【００５３】
本発明の一部の実施形態によれば、乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、蒸発、風乾または真空乾燥、熱い空気への曝露、耐熱窓ベルト乾燥（refractory window belt drying）、オーブン中での乾燥およびそれらの方法の組み合わせから選択される少なくとも１つの方法によって実施される。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、微細藻類の回収は、その規模が微細藻類の種類および培養培地の塩分に依存する、例えば遠心分離により微細藻類から水を分離することによって実施される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、回収されたバイオマスは、固形物に濃縮された後、塩分を減らすために水で洗浄され、必要に応じて再遠心分離されて、少なくとも１０％の固形物（好ましくは少なくとも３０％の固形物、最も好ましくは少なくとも４５％の固形物）を含む生産物をもたらす。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、回収されたバイオマスの遠心分離、および必要に応じて再遠心分離、によって得られる上清は、分泌されたポリサッカライドの精製のために使用される。
【００５７】
本発明の一部の実施形態によれば、有機溶媒および／または超臨界流体（ＳＣＦ）（液体のＣＯ２など）を用いて、フコキサンチンがタンパク質から分離され、抽出される。
【００５８】
本発明の一部の実施形態によれば、抽出に使用される溶媒は、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロピルおよびそれらの溶媒の混合物から選択される。
【００５９】
本発明の一態様によれば、抽出に使用される溶媒にリン酸が添加される。
【００６０】
本発明の一部の実施形態によれば、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ゴマ油およびそれらの組み合わせから選択される食用油が、抽出のための溶媒として使用されるか、または共溶媒として使用される。
【００６１】
本発明の一部の実施形態によれば、微細藻類乾燥バイオマスからのフコキサンチンに富んだオレオレジンの抽出に使用されるＳＣＦ溶媒は、液体のＳＣＦ−ＣＯ２、ブタン、プロパン、Ｎ２Ｏ等から選択され、好ましくは液体のＳＣＦ−ＣＯ２である。
【００６２】
本発明の別の態様によれば、超臨界ＣＯ２のための超臨界流体抽出法（ＳＦＥ）の条件は、３１℃の臨界温度および７４バールの臨界圧力を上回る。
【００６３】
本発明の別の態様によれば、約５００〜１０００バールの範囲の抽出圧力および約５０〜１００℃の範囲の温度を用いて、乾燥された藻類のマトリックスに溶媒が通される。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、Ｏ２対バイオマスの比は、３０：１〜５００：１である。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、ＣＯ２の流速は、１時間あたり１００〜７００Ｋｇである。
【００６６】
本発明の一部の実施形態によれば、乾燥プロセスは、必要に応じて、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、レシチン、タルク、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、シリコーン水酸化物（silicone hydroxide）、キトサン等およびそれらの粉末化剤または固結防止剤の組み合わせから選択される粉末化剤または固結防止剤を添加して実施される。
【００６７】
本発明の一部の実施形態によれば、フコキサンチンに富んだオレオレジンは、必要に応じて液体クロマトグラフィーと組み合わせた追加的なＳＣＦ抽出シーケンス（例えば、最大で５回の抽出）によってさらに精製される。
【００６８】
本発明の別の態様によれば、ポリサッカライドの精製を可能にするために、例えば５回目の抽出シーケンスの後の残存パルプが熱水に溶解される。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書で提供されるプロセスは、乾燥バイオマスにおいて少なくとも約１．５％のフコキサンチンおよび抽出物において少なくとも約１０％のフコキサンチンを含む粗生産物をもたらす。
【００７０】
本発明の一部の実施形態によれば、ＳＣＦ抽出より前に、またはＳＣＦ抽出の後に、乾燥バイオマスは、プロテアーゼなどの酵素を用いて酵素的に処理される、ならびに／または熱水および／もしくは熱蒸気で抽出される、ならびに／または緩衝液での洗浄によって処理される、ならびに／またはフコキサンチンに結合しているタンパク質を変性させるために処理される。
【００７１】
本発明の別の態様によれば、残存パルプ（例えば、５回目の抽出の後のもの）は、熱水および／または酸性水溶液に溶解される。
【００７２】
本発明の一部の実施形態によれば、濾過、（例えば、濾過用媒体として天然シリカビーズを用いた）カラム上でのゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー法（分取ＴＬＣまたは分取ＨＰＬＣを含む）およびそれらの方法の組み合わせから選択される方法により、フコキサンチンがポリサッカライドから分離され、精製されて、高純度のフコキサンチンをもたらす。
【００７３】
本発明の一部の実施形態によれば、例えば液体クロマトグラフィーによって取得された高純度のフコキサンチンは、栄養補助食品として、あるいは、癌、メタボリックシンドローム（体重過多、肥満、高血中コレステロールＬＤＬ、高血中トリグリセリド、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性糖尿病、高血中スクロースを含む）、アテローム動脈硬化症、認知症、アルツハイマー病、記憶喪失、多発性硬化症、うつ病（環境ストレス、熱ストレスおよび一般的な神経保護を含む）から選択される状態または疾患を防止、改善または処置するための製剤における活性医薬成分として、単独で、または他の有効成分と組み合わせて、使用される。
【００７４】
本発明は、医薬的に許容される賦形剤、および必要に応じて他の治療薬、と混合された本明細書で説明されるように取得された高純度のフコキサンチンを含む医薬組成物を提供する。
【００７５】
一部の実施形態によれば、例えば製剤化された剤形である本発明の医薬組成物は、例えば錠剤、丸剤、粉末、顆粒剤、糖衣錠、液体、懸濁液、エマルジョン、顆粒剤、カプセル、坐剤、注射用調製物（溶液および懸濁液）、パッチ等として投与される。
【００７６】
本発明の一部の実施形態によれば、高純度のフコキサンチンは、抗老化、皮膚の美白、皮膚の保護および他の美容用途として使用される局所投与または他の投与形態のための美容用調製物（軟膏、ゲル、クリーム、溶液、エマルジョン、ローション等など）において単独で、または他の有効成分と組み合わせて、使用される。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明のフコキサンチンを含む医薬組成物は、前記フコキサンチンを、吸収促進剤、結合剤、増量剤（bulking agent）、担体、コーティング剤、希釈剤、崩壊剤、増量剤（extender）、充填剤、香味料、潤滑剤、界面活性剤、湿潤剤等から選択される少なくとも１種の追加的な有効成分と混合することによって調製される。
【００７８】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明のフコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを含む栄養補給食品、栄養補助食品または食品用調製物は、前記フコキサンチンおよび／またはポリサッカライドを、糖およびデンプン、食物繊維、脂質、アミノ酸、タンパク質（タンパク質単離物またはタンパク質加水分解物など）、乳酸、ビタミン、ミネラルならびにそのような調製物において一般的に使用される他の成分などの食品成分と混合することによって調製される。
【００７９】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の栄養補給食品、栄養補助食品または食品用調製物には、例えば、飲料、スープ、スナック、乳製品等が包含され得る。
【００８０】
これより、以下の実施例を参照する。これらの実施例は上記の説明とともに本発明を説明する役割を果たすが、本発明の範囲を限定するものではない。本発明のさらなる目的、利点および新規の特徴が当業者に明らかになるであろう。
【実施例】
【００８１】
実施例１
この実施例は、微細藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍの野生型株６４６の培養を詳述する。
【００８２】
微細藻類Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍの野生型株６４６を寒天プレートおよび試験管において人工光の下で培養し、エルレンマイヤーフラスコおよび５リットルの丸底ガラスフラスコに移した。次いで、培養物を３リットルのカラムに移し、培養した。照明条件（遮光対完全な日光）と乾燥重量の蓄積とフコキサンチンの蓄積の間の相関関係を調査した。以下の表３は、初期濃度が３０ｇ／Ｌであり最終濃度が３０ｍｇ／Ｌであった液体ストックに添加された増殖培地の化合物を詳述する。
【００８３】
３４ｇの塩の混合物を硝酸カリウム、リン酸二水素カリウムおよび微量元素の混合物とともに９８０ｍＬの脱イオン水に添加した。体積を１Ｌに調整し、この混合物をオートクレーブした。冷却後、クエン酸第二鉄および２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）をそれぞれ１ｍＬ添加した。以下の表３は、添加された化合物の初期濃度を詳述する。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
以下の表４は、１Ｌの溶液に添加された微量元素の量と初期濃度を詳述する。
【００８６】
【表４】
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【００８７】
以下の表５は、添加されたビタミンの量と初期濃度を詳述する。
【００８８】
【表５】
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【００８９】
実施例２
この実施例は、カラムにおけるフコキサンチンの生産を詳述する。
【００９０】
初期濃度０．４ｇ／Ｌのストック溶液で４つのカラムをそれぞれ充填した。カラムＮｏ．１は、毎日１７：００まで５０〜６０％遮光した。カラムＮｏ．２では、緑−赤フィルターを通すことによって「緑」波長群に光を散乱させた。カラムＮｏ．３では、青色フィルターを通すことによって「青」波長群に光を散乱させた。カラムＮｏ．４は遮光されず、その代わり、完全な日光に晒された。培養は、１％のＣＯ２を流しながら２４〜２５℃の温度で実施した。以下の表６は、２週間の培養の後に測定された結果のデータを包含する。
【００９１】
【表６】
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【００９２】
実施例３
この実施例は、微細藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．の野生型の培養を説明する。
【００９３】
微細藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．の野生型を寒天プレートおよび試験管において人工光の下で培養し、エルレンマイヤーフラスコおよび５リットルの丸底ガラスフラスコに移した。次いで、培養物を７Ｌのプラスチック製スリーブに移して最大濃度が６ｇ／Ｌの溶液を形成させ、完全な日光の下で培養した。培養物を回収して２ｇ／Ｌの濃度に希釈し、プラスチック製のバッグに播種した。照明条件（波長）と乾燥重量の蓄積とフコキサンチン生産の間の相関関係を調査した。
【００９４】
以下の表７は、増殖培地の内容を詳述し、ここで、初期ストック濃度は３０ｇ／Ｌであり、最終ストック培地濃度は３０ｍｇ／Ｌであった。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
３４ｇの塩の混合物を硝酸カリウム（ＫＮＯ３）およびリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）および微量元素の混合物とともに９８０ｍＬの脱イオン水に添加した。体積を１Ｌに調整し、この混合物をオートクレーブした。冷却後、クエン酸第二鉄および２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．６）をそれぞれ１ｍＬ添加した。
【００９７】
実施例４
この実施例は、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．の培養とＡｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．の培養を実証する。
【００９８】
Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｓｐ．のコロニーとＡｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．のコロニーをペトリ皿において寒天上で増殖させた。この材料を、人工海水培地を含む試験管に移した。培養物を試験管からフラスコへと希釈し、さらにポリエチレン製スリーブへと希釈して、人工光および１％のＣＯ２で強化された濾過空気の注入の下で増殖させた。
【００９９】
スリーブにおいて増殖させた培養物を屋外の１００リットルの平面パネルまたは１０〜１５リットルを含むスリーブに移した。培養物を１００リットルの平面パネルに移した日を培養齢０日目とした。
【０１００】
培養物を毎日サンプリングし、それらの乾燥重量およびフコキサンチン濃度を決定した。増殖は一般に２つの段階に分けられた。まず、増殖条件を、最適かつ迅速な増殖とバイオマスの獲得を支えるように設定した。５〜７日間の迅速な増殖の後、フコキサンチン誘導段階である第２の生産段階に藻類を移した。
【０１０１】
実施例５
この実施例は、スリーブにおけるフコキサンチンの生産を詳述する。
【０１０２】
初期濃度２ｇ／Ｌで４つのスリーブに播種した。第１のスリーブは、毎日１７：００まで５０〜７０％遮光した。第２のスリーブでは、緑−赤フィルターを通すことによって「緑」波長群に光を散乱させた。第３のスリーブでは、青色フィルターを通すことによって「青」波長群に光を散乱させた。４つ目は遮光されず、その代わり、完全な日光に晒された。以下の表８は、１０日間の増殖の後の培養データを詳述する。
【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
実施例６
この実施例は、回収、後処理および抽出を詳述する。
【０１０５】
藻類培養物を回収し、遠心分離機を用いて遠沈させる。約３０％の固形物を含むペレット化した藻類のペーストを真水で洗浄し、混合しながら水に再懸濁し、凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥の後、１％の二酸化ケイ素をバイオマス粉末に添加し、これをさらに精製し、空気圧粉砕によってホモジナイズした。２％のフコキサンチン（８４ｇ）を含む乾燥バイオマス粉末（４．２Ｋｇ）を超臨界流体ＣＯ２抽出によって抽出した。
【０１０６】
以下の表９は、ＳＣＦ−ＣＯ２抽出の結果をまとめたものである。
【０１０７】
【表９】
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【０１０８】
８４ｇ（２％）のフコキサンチンを含む４．２Ｋｇのバイオマス粉末のＳＣＦ抽出は、６０６ｇのフコキサンチンのオレオレジン（セパレーター１）＋９５．７ｇのフコキサンチンのオレオレジン（セパレーター２）＝１１．２％のフコキサンチンを含む７０１．７グラムのフコキサンチンのオレオレジンをもたらした。従って、フコキサンチンの回収は、７４．８ｇ（セパレーター１）＋４．０ｇ（セパレーター２）＝７８．８ｇのフコキサンチン（９３．８％）であった。
【０１０９】
実施例７
この実施例は、有機溶媒を用いたフコキサンチンの抽出を詳述する。
【０１１０】
バイオマス粉末を、周囲温度で４時間にわたって無水エタノール中で２回インキュベートし、抽出した。抽出物をヘキサンでの液液抽出によって分配した。減圧蒸留によって溶媒を除去した。
【０１１１】
実施例８
この実施例は、フコキサンチンの分析のためのＨＰＬＣ法を詳述する。
【０１１２】
アセトン／メタノール／ヘキサンの１：１：１の溶媒混合物またはアセトニトリルにサンプルを溶解させ、それぞれ同じ溶媒混合物または溶媒で希釈した。Ｏ．Ｄ値の測定は、フコキサンチンのピーク吸光度（４５０ｎｍ）で実施した。
【０１１３】
ＨＰＬＣによるフコキサンチンの分離に関するデータ：
カラム：Ｃ１８  ２５０Ｘ４．６
波長：４５０ｎｍ
流速：０．８ｍＬ／分
サンプラー温度：１５℃；カラム温度：２８℃
移動相：（Ａ）メタノール８５％＋０．５Ｍ酢酸アンモニウム；（Ｂ）アセトニトリル：水（９０：１０）；（Ｃ）酢酸エチル
実行時間：３５分
【０１１４】
以下の表１０は、使用されるＨＰＬＣの勾配を詳述する。
【０１１５】
【表１０】
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【０１１６】
本明細書で引用される参考文献（刊行物、特許出願および特許を含む）は全て、各参考文献が参照により組み込まれることが個々に且つ具体的に示されており各参考文献の全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」なる用語ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」なる用語は、別段の記載がない限り、制約のない用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の別個の値の各々を個別に指す簡略な方法としての役割を果たすことが意図されているに過ぎず、別個の値の各々は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明される方法は全て、本明細書中に別段の指示がない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施されてよい。本明細書で提供される任意および全ての例または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明の理解をより容易にすることが意図されているに過ぎず、別段の主張がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。
【０１１８】
本発明者らに知られている最良の形態を含め、本発明の好ましい実施形態が、本発明の実施のために本明細書で説明されている。それらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を閲覧すれば当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変形を使用することを予想しており、本発明者らは、本明細書で具体的に説明されるものとは別の方法で本発明が実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許容されるように本明細書に添付された特許請求の範囲に記載される主題の改変および均等物を全て包含する。さらに、それらの可能な変形の全てにおける上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書中に別段の指示がない限り、あるいは文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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