(57)【要約】  開示されるのは、表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための装置が提供され、前記装置は、ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを通って移動するよう強制するための排気ファンとに動作可能に接続された密封可能チャンバを備える。開示されるのはまた、表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための方法が提供され、前記方法は、ａ）ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを垂直に通って移動するよう強制するための排気ファンとに動作可能に接続された密封可能チャンバ内で、複数の食品または容器を提供することと、ｂ）所定の湿度に到達するように密封可能チャンバ内の湿度を調整することによって、食品または容器の表面上で凝縮を起こすことと、ｃ）オゾン発生器によって発生させられたオゾンガスを、所定の滞留時間期間にわたって密封可能チャンバを通過させるために、所定の排気速度を発生させるようにオゾン発生器および排気ファンを動作させることと、ｄ）密封可能チャンバからオゾンガスを放出することとを含む。本発明は、容器内またはその上の細菌、酵母、カビ、および白カビのレベルを減少させるための方法をさらに提供する。
2019522998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための方法であって、
ａ）ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを垂直に通って移動するよう強制するための排気ファンとに動作可能に接続された前記密封可能チャンバ内で、複数の前記食品または前記容器を提供するステップと、
ｂ）所定の湿度に到達するように前記密封可能チャンバ内の湿度を調整することによって、前記食品または前記容器の表面上で凝縮を起こすステップと、
ｃ）前記オゾン発生器によって発生させられたオゾンガスを、所定の滞留時間期間にわたって前記密封可能チャンバを通過させるために、所定の排気速度を発生させるように前記オゾン発生器および前記排気ファンを動作させるステップと、
ｄ）前記密封可能チャンバからオゾンガスを放出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記細菌がリステリア属である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌がサルモネラ属または糞便系大腸菌群である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記食品が果物または野菜である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記食品が、リンゴ、メロン、レタス、キノコ、ズッキーニ、キュウリ、またはハチの巣である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記食品が、種子、香辛料、紅茶、穀物、ドライフルーツ、または木の実である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記所定の湿度が、約７０〜１００％または約６５〜８５％、好ましくは約８０〜９０％または約８５％である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記滞留時間が１０分よりも長い、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記滞留時間が約２０分から約４０分の間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記所定の排気速度が約１０〜１５００ｃｆｍである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記所定の排気速度が約２５０〜７００ｃｆｍ、好ましくは約３００〜６００ｃｆｍまたは約５００ｃｆｍである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記密封可能チャンバ内のオゾン濃度が、ステップｃ）において、前記細菌の９９〜９９．９９９％を殺すのに十分な時間期間にわたって約４〜２０ｐｐｍで維持される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記密封可能チャンバ内のオゾン濃度が、ステップｃ）において、前記細菌の９９〜９９．９９９％を殺すのに十分な時間期間にわたって約１４〜２０ｐｐｍまたは４〜６ｐｐｍで維持される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記密封可能チャンバが、１〜３０００ｌｂｓ、好ましくは１０〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記密封可能チャンバが、約１６００〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記密封可能チャンバが、少なくとも１ｌｂｓ、少なくとも１０ｌｂｓ、少なくとも１００ｌｂｓ、または少なくとも２００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、オゾン含有液を前記食品または前記容器と接触させるステップを除外する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
オゾンが、約１〜６０ｇ／ｈ、好ましくは約６〜６０ｇ／ｈのレートで、前記密封可能チャンバへと導入される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）前記所定の湿度が約７０〜１００％であり、
（ｉｉ）前記滞留時間が１０分よりも長く、
（ｉｉｉ）前記所定の排気速度が約１０〜１５００ｃｆｍであり、
（ｉｖ）前記密封可能チャンバ内のオゾン濃度が、ステップｃ）において約４〜２０ｐｐｍで維持される、
請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための装置であって、ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを垂直に通って移動するよう強制するための排気ファンとに動作可能に接続された前記密封可能チャンバを備える、装置。
【請求項２１】
オゾンセンサをさらに備える、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
乾燥機アセンブリをさらに備え、前記乾燥機アセンブリが、フードと、乾燥機排気ファンとを備える、請求項２０または２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記密封可能チャンバが、１〜３０００ｌｂｓ、好ましくは１０〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
前記密封可能チャンバが、約１６００〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記密封可能チャンバが、少なくとも１ｌｂｓ、少なくとも１０ｌｂｓ、少なくとも１００ｌｂｓ、または少なくとも２００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
容器内の酵母、カビ、および／または白カビのレベルを減少させるための方法であって、
ａ）ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを垂直に通って移動するよう強制するための排気ファンとに動作可能に接続された前記密封可能チャンバ内で、１つまたは複数の前記容器を提供するステップと、
ｂ）所定の湿度に到達するように前記密封可能チャンバ内の湿度を調整することによって、前記１つまたは複数の容器の表面上で凝縮を起こすステップと、
ｃ）前記オゾン発生器によって発生させられたオゾンガスを、所定の滞留時間期間にわたって前記密封可能チャンバを通過させるために、所定の排気速度を発生させるように前記オゾン発生器および前記排気ファンを動作させるステップと、
ｄ）前記密封可能チャンバからオゾンガスを放出するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記容器が再利用可能なプラスチック容器（ＲＰＣ）である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、食物およびそのための容器内の微生物数を減少させるための方法および装置に関する。本発明の方法および装置は、本明細書において、本発明の理解を容易にするために、リンゴに関して説明される。しかしながら、前記方法および前記装置の適用可能性はリンゴに限定されないことは、当業者には明らかであるはずである。むしろ、前記方法および前記装置は、他の果物および野菜、ハチの巣などの、望ましくない表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい他の産物、ならびにそのための容器において微生物数を減少させるように適合可能である。
【背景技術】
【０００２】
関連する従来技術との議論および比較
２０１４年１２月、米国での多州にわたるリステリア症大流行が、カラメルでコーティングされたリンゴの消費に結び付けられた。次の数ヶ月にわたって、調査から、リステリア属は、被害を受けたリンゴの表面で発生し、それはその後、持ち手として使用されることになる棒が生産中にリンゴに刺されたときにリンゴの内部へと導入されたことが明らかにされた。キャンディーアップルからのリステリア症のリスクは、依然として低いとみなすことができるが、カラメルリンゴ生産中に予防措置を適用することが必要とされている。
【０００３】
水溶性消毒剤中でリンゴを洗うことは、そのような予防措置の一例である。しかしながら、水洗システムは、コストおよび空間上の制約ならびに水を製造施設に持ち込むことについての懸念ゆえに、常に実際的であるとは限らない。さらに、この消毒オプションは、限られた汚染除去能力を有すること（＜１ｌｏｇ  ｃｆｕの減少）がわかっており、潜在的に交差汚染を招き得る（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、２０１４年、「Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎ  ｆｒｅｓｈ  ａｐｐｌｅｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１８４、９２〜９７。その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、リンゴ上に残留する水分は、リンゴ上でのカラメルのコーティングを妨げ、それによって、生産中に困難が生じる。したがって、水を含まない手法（たとえば、過酸化水素蒸気）は、キャンディーアップル生産により適合し、さらに、従来の収穫後洗浄と比較したとき、農産物を除染するうえで効果的であることが判明している（Ｂａｃｋら、２０１４年、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｖａｐｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７  ａｎｄ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｒｅｓｈ  ｌｅｔｔｕｃｅ．」、Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、４４、７８〜８５。その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００４】
オゾンは、抗菌作用と関連付けられ、米国食品医薬品局によって、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）に指定されている（たとえば、ＳｈａｒｍａおよびＨｕｄｓｏｎ、「Ｏｚｏｎｅ  ｇａｓ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ」、Ａｍ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．、２００８年１０月、３６（８）：５５９〜６３を参照されたい。その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。食物を除染するためにオゾンを含む溶液を使用する工程は、たとえば、米国特許第６，４８５，７６９号および第６，１６２，４７７号明細書に記載されている。しかしながら水は、食物製造施設内の汚染源であることが多い。さらに、上述されたように、水を含まない手法は、キャンディーアップルを含むある特定のタイプの食品により適合する。
【０００５】
さらに最近、オゾンガスの使用が提案された（たとえば、Ｋｈａｄｒｅら、２００１年、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｚｏｎｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ：  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１２６２〜１２５２を参照されたい。その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。以前の研究は、貯蔵室の空気へと導入されたオゾンが、果物上の微生物負荷を減少させることができることを示した（Ｙａｓｅｅｎら、２０１５年、「Ｏｚｏｎｅ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔ−ｈａｒｖｅｓｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｐｌｅ  ｆｒｕｉｔｓ」、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、５４、９４〜１０３。その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、貯蔵室内のオゾンは、備品の過度の腐食を防止し、労働者に対する危険を減少させるために、低レベル（０．５〜２ｐｐｍ）で適用される。したがって、曝露時間の延長が微生物減少を達成するために必要とされるが、各個々のリンゴを接触させることは難題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，４８５，７６９号
【特許文献２】米国特許第６，１６２，４７７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｅｒｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、２０１４年、「Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎ  ｆｒｅｓｈ  ａｐｐｌｅｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１８４、９２〜９７
【非特許文献２】Ｂａｃｋら、２０１４年、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｖａｐｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１５７：Ｈ７  ａｎｄ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｏｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｒｅｓｈ  ｌｅｔｔｕｃｅ．」、Ｆｏｏｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、４４、７８〜８５
【非特許文献３】ＳｈａｒｍａおよびＨｕｄｓｏｎ、「Ｏｚｏｎｅ  ｇａｓ  ｉｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ」、Ａｍ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．、２００８年１０月、３６（８）：５５９〜６３
【非特許文献４】Ｋｈａｄｒｅら、２００１年、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｚｏｎｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ：  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、１２６２〜１２５２
【非特許文献５】Ｙａｓｅｅｎら、２０１５年、「Ｏｚｏｎｅ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔ−ｈａｒｖｅｓｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｐｌｅ  ｆｒｕｉｔｓ」、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、５４、９４〜１０３
【非特許文献６】Ｍｉｌｌｅｒら、２０１３年、「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｏｚｏｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｆｒｕｉｔ  ａｎｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」、Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５、７７〜１０６
【非特許文献７】ｄｅ  Ｃａｎｄｉａら、２０１５年、「Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｖｉａｂｌｅ  ｌｏａｄｓ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｆｏｏｄ−ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６、１２
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、強制空気流によって導入されるガス状オゾンを使用して、果物および野菜、ハチの巣などの食物、ならびにそのための容器内の、微生物、特にリステリア属の数を減少させる方法および装置に関する。本発明はまた、プラスチック容器の表面上の合計好気性菌数ならびに酵母レベルおよびカビレベルを減少させるように適合可能である。本発明によれば、オゾンは、より高いオゾン濃度を使用することを可能にし、リンゴなどの複数の物体の容器を通る制御された均一な（受動とは対照的な）空気流を容易にする、強制空気を使用して導入される。さらなる利点が、リンゴ加工システムの乾燥部分の初期段階でオゾンを導入する場合に得られる。果物の周囲の相対湿度がこの段階では高いので、理論上は、オゾンの致死効果に対する微生物細胞の感受性が増加する（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１３年、「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｏｚｏｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｆｒｕｉｔ  ａｎｄ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」、Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５、７７〜１０６、およびｄｅ  Ｃａｎｄｉａら、２０１５年、「Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｖｉａｂｌｅ  ｌｏａｄｓ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ  ｆｏｏｄ−ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｕｒｆａｃｅｓ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６、１２。開示全体が各々、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００９】
本発明は、表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品上で、またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための方法を提供し、前記方法は、ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを通って垂直に移動するよう強制するための排出ファンとに動作可能に接続された密封可能チャンバ内で、複数の前記食品または前記容器を提供することと、所定の湿度に到達するように密封可能チャンバ内の湿度を調整することによって、食品または容器の表面上で凝縮を起こすことと、オゾン発生器によって発生させられたオゾンガスを、細菌の９９〜９９．９９９％を殺すのに十分な所定の滞留時間期間にわたって密封可能チャンバを通過させるために、所定の排気速度を発生させるようにオゾン発生器および排出ファンを動作させることと、密封可能チャンバからオゾンガスを放出することとを含む。
【００１０】
本発明は、容器内またはその上の細菌、酵母、カビ、および白カビのレベルを減少させるための方法をさらに提供し、前記方法は、ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを通って垂直に移動するよう強制するための排出ファンとに動作可能に接続された密封可能チャンバ内で、１つまたは複数の前記容器を提供することと、所定の湿度に到達するように密封可能チャンバ内の湿度を調整することによって、１つまたは複数の容器の表面上で凝縮を起こすことと、オゾン発生器によって発生させられたオゾンガスを、所定の滞留時間期間にわたって密封可能チャンバを通過させるために、所定の排気速度を発生させるようにオゾン発生器および排出ファンを動作させることと、密封可能チャンバからオゾンガスを放出することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本明細書において説明される本発明の一実施形態による装置の図である。
【図２】本発明の一実施形態による、リンゴにおいて微生物数を減少させるための方法のステップ１（凝縮）を示す図である。オゾンスライドゲートは閉じられている。リンゴの箱（ｂｉｎ）は包まれ、フードが下ろされている。ドアは開いている。リンゴを通して暖かい空気を引き上げ、表面の凝縮を起こすために、乾燥機排気ファンを稼働させる。
【図３】本発明の一実施形態による、リンゴにおいて微生物数を減少させるための方法のステップ２（オゾン処理）を示す図である。オゾンスライドゲートは開いている。リンゴの箱は包まれ、フードが下ろされている。ドアは閉じられている。オゾン発生器が稼働し、オゾンガスが下方向に沈み始める。排出ファンは、リンゴを通してオゾンガスを分散させるために低スピードで稼働する。
【図４】本発明の一実施形態による、リンゴにおいて微生物数を減少させるための方法のステップ３（排出）を示す図である。オゾンスライドゲートは開いたままである。リンゴの箱は包まれ、フードが下ろされている。ドアは閉じられている。オゾン発生器はオフになる。排出ファンは、乾燥機排気オープンダクトを通して、およびオゾン発生器オープンダクトを通して新鮮な空気を引き込みながら、オゾンガスをチャンバから放出するために、高いスピードで稼働する。
【図５】本発明の一実施形態による、リンゴにおいて微生物数を減少させるための方法のステップ４（空気乾燥）を示す図である。
【図６】本明細書において説明される本発明の一実施形態による装置の強制空気オゾン反応器の図である。
【図７】本明細書において説明される実験１の実験セットアップによるオゾン処理チャンバおよび接種されたリンゴの位置の概略図である。
【図８】リンゴへと接種され、次いで、異なる時間期間にわたって６ｇ／ｈのレートで導入されたオゾンを用いて処理された、リステリアモノサイトゲネスおよびラクトバチルス属の対数減少を示すグラフである。オゾン濃度は、５分の曝露で３０ｐｐｍ±２、１０分で５５ｐｐｍ±２、１５分で７７ｐｐｍ±２と測定された。
【図９】処理チャンバ内で測定されたオゾン濃度に対する排気ファン速度の影響を示すグラフである。
【図１０】リンゴへと接種され、異なるファン排気速度で動作するオゾンチャンバ内で処理されたラクトバチルス属の対数減少を示すグラフである。接種されたリンゴは、リンゴパイル（ｐｉｌｅ）内の異なる場所に置かれ、次いで、２０分間処理された。
【図１１】リンゴへと接種され、次いで、２５０ｃｆｍまたは５００ｃｆｍのファン排気速度で動作する反応器内でオゾンを用いて処理されたラクトバチルス属の対数減少を示すグラフである。各点は、リンゴパイル内の異なるポイントに位置する５つのリンゴの平均を表す。
【図１２】５００ｃｆｍで動作する反応器内で測定されたオゾン濃度を示すグラフである。さまざまな停止ポイントを有する５回の異なる稼働が示されている。
【図１３】実験１において使用された乾燥機システムの概略図である。リンゴ乾燥手順：乾燥されることになる箱の側面をストレッチラップで包む。フードの下に置き、良好な密封を確保する。ファンをオンにし、リンゴを乾燥させる。
【図１４Ａ】実験室規模の反応器内のリンゴカラムの上部または下部におけるリンゴの表面下の温度プロファイルのグラフである。オゾンは、上部で導入され、リンゴパイルを通して引かれた。反応器内の周囲温度は２３℃であった。
【図１４Ｂ】実験室規模の反応器内のリンゴカラムの上部または下部におけるリンゴの表面下の温度プロファイルのグラフである。オゾンは、上部で導入され、リンゴパイルを通して引かれた。反応器内の周囲温度は２３℃であった。
【図１５】実験２における、処理されていない対照群と比較した、強制空気オゾン反応器内で処理された接種されていない再利用可能なプラスチック容器（ＲＰＣ）の合計好気性菌数および酵母数およびカビ数のグラフである。
【図１６】リンゴへと接種され、次いで強制空気オゾン反応器内で処理されたラクトバチルス属の対数減少に対する処理時間の影響のグラフである。リンゴは、実験１において、リンゴパイル（２つの箱）の上部、中央部、および下部に配置され、次いで、５００ｃｆｍの空気排気ファンスピードを使用してオゾンを用いて処理された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において説明される本発明の態様は、果物、特にリンゴにおいて、細菌を不活性化することおよび／または微生物数を減少させることに関して説明されているが、説明される方法、装置、および関連アセンブリは、他のタイプの食物または産物において微生物数を減少させるために使用可能であることが認識されるべきである。
【００１３】
さらに、本明細書において説明される方法および装置の特定の実施形態および例は例示であり、本開示の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、多くの変形が、これらの実施形態および例に導入可能である。異なる例示的な実施形態および／または例の要素および／または特徴は、本開示および添付の特許請求の範囲内で、互いと組み合わされてもよいし、および／または、互いの代わりに用いられてもよい。
定義
本明細書で使用されるとき、および別段に記載されていない限り、以下の用語の各々は、以下に記載される定義を有するものとする。
【００１４】
本明細書で使用されるとき、数値または範囲の文脈における「約」は、列挙または特許請求される数値または範囲の±１０％を意味する。本明細書で開示される任意の範囲によって、その範囲内の１００分の１、１０分の１、および整数の一の位の量がすべて、本発明の一部として具体的に開示されることが意味される。したがって、「約」記載された値は、具体的には、その記載された値を含む。たとえば、約２０分の範囲は、２０分を含む、２０分±１０％の範囲内のすべての測定値を指す。
【００１５】
一連の実験を通して、本明細書において説明される方法および装置の発明者らは、リステリア属をオゾンガスで燻蒸することによって、農産物、特にリンゴ上のリステリア属を殺すことが可能であることを示した。この一連の実験では、結果は、２−ｌｏｇから５−ｌｏｇの殺菌にわたった。各「対数」減少は、１０倍の殺菌の程度を示す。すなわち、９９％（２−ｌｏｇ）から９９．９９９％（５−ｌｏｇ）のリステリア属の殺菌があった。これらの最初の肯定的な実験室の結果は、より大きな、商業的規模の適用試験が正当化されることを示唆した。したがって、１６００〜３０００ｌｂｓのリンゴを収容するのに十分に大きいオゾンチャンバが構築され、これは、本発明者らによって開発されたリンゴ乾燥機システムを組み込み、オゾン発生器、電気的制御機構、および安全性システムに接続された。前記乾燥機システムの概略図が、図１３に示されている。前記大規模オゾンチャンバ内で行われた実験からの結果は、「実験１」において説明される。
【００１６】
したがって、本発明の一実施形態では、表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品上、またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための装置が提供され、前記装置は、ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを垂直に通って移動するよう強制するための排出ファンとに動作可能に接続された密封可能チャンバを備える。
【００１７】
本明細書において説明される装置の一実施形態では、装置は、オゾンセンサをさらに備える。別の実施形態では、装置は乾燥機アセンブリをさらに備え、前記乾燥機アセンブリは、フードと、乾燥機排気ファンとを備える。
【００１８】
一実施形態では、密封可能チャンバは、１〜３０００ｌｂｓ、好ましくは１０〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する。別の実施形態では、密封可能チャンバは、約１６００〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する。さらに別の実施形態では、密封可能チャンバは、少なくとも１ｌｂｓ、少なくとも１０ｌｂｓ、少なくとも１００ｌｂｓ、または少なくとも２００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品上、またはそのための容器上で、細菌を不活性化するおよび／または微生物数を減少させるための方法が提供され、前記方法は、ａ）ｉ）オゾンガスを発生させるためのオゾン発生器とｉｉ）オゾンガスが密封可能チャンバを垂直に通って移動するよう強制するための排出ファンとに動作可能に接続された密封可能チャンバ内で、複数の前記食品または前記容器を提供するステップと、ｂ）所定の湿度に到達するように密封可能チャンバ内の湿度を調整することによって、食品または容器の表面上で凝縮を起こすステップと、ｃ）オゾン発生器によって発生させられたオゾンガスを、所定の滞留時間期間にわたって密封可能チャンバを通過させるために、所定の排気速度を発生させるようにオゾン発生器および排出ファンを動作させるステップと、ｄ）密封可能チャンバからオゾンガスを放出するステップとを含む。
【００２０】
本明細書において説明される方法の一実施形態では、細菌はリステリア属である。別の実施形態では、細菌はサルモネラ属または糞便系大腸菌群である。
【００２１】
一実施形態では、食品は果物または野菜である。別の実施形態では、食品は、リンゴ、メロン、レタスたとえば細かく切られたレタス、キノコ、ズッキーニ、キュウリ、またはハチの巣である。さらに別の実施形態では、食品は、種子、香辛料、紅茶、穀物、ドライフルーツ、または木の実である。さらなる実施形態では、食品は、加工食品である。
【００２２】
一実施形態では、所定の湿度は、約７０〜１００％または約６５〜８５％、好ましくは約８０〜９０％または約８５％である。別の実施形態では、滞留時間は１０分よりも長い。さらに別の実施形態では、滞留時間は、約２０分から約４０分の間、特に、約２０分または約４０分である。
【００２３】
一実施形態では、所定の排気速度は約１０〜１５００ｃｆｍである。別の実施形態では、所定の排気速度は、約２５０〜７００ｃｆｍ、好ましくは約３００〜６００ｃｆｍまたは約５００ｃｆｍである。
【００２４】
一実施形態では、密封可能チャンバ内のオゾン濃度は、ステップｃ）において、細菌の９９〜９９．９９９％を殺すのに十分な時間期間にわたって約４〜２０ｐｐｍで維持される。別の実施形態では、密封可能チャンバ内のオゾン濃度は、ステップｃ）において、細菌の９９〜９９．９９９％を殺すのに十分な時間期間にわたって約１４〜２０ｐｐｍまたは４〜６ｐｐｍで維持される。
【００２５】
一実施形態では、密封可能チャンバは、１〜３０００ｌｂｓ、好ましくは１０〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する。別の実施形態では、密封可能チャンバは、約１６００〜３０００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する。別の実施形態では、密封可能チャンバは、少なくとも１ｌｂｓ、少なくとも１０ｌｂｓ、少なくとも１００ｌｂｓ、または少なくとも２００ｌｂｓの食品を保持する容積を有する。
【００２６】
本明細書において説明される方法の一実施形態では、前記方法は、オゾン含有液を食品または容器と接触させるステップを除外する。別の実施形態では、オゾンは、約１〜６０ｇ／ｈ、好ましくは約６〜６０ｇ／ｈのレートで、密封可能チャンバへと導入される。
【００２７】
一実施形態では、密封可能チャンバとオゾン発生器と（好ましくは）２速排出ファンとを備える装置が提供される。また、密封可能チャンバは、室内排気ファンに接続された内部オゾンセンサを備えることができる。装置は、消毒されることになる食物の、上部の箱上に取り付けられたフードと、乾燥機排気ファンとからなる乾燥機機器アセンブリをさらに備えることができる。前記装置の図が、図１に示されている。図１では、以下の凡例が使用されている。１０１：酸素ガス、１０２：オゾン発生器、１０３：オゾンガス、１０４：リンゴ箱（底部が開いている）、１０５：換気装置、１０６：接種されたリンゴ。
【００２８】
別の実施形態では、本明細書において説明される方法および装置は、バイオフィルム内および再利用可能なプラスチック容器（ＲＰＣ）などの容器の表面上のシュードモナス属を、増菌（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によってのみ検出可能な低いレベルまで減少させるように適合可能である。さらなる実施形態では、本明細書において説明される方法および装置は、容器、特に、プラスチック容器ならびに食物およびハチの巣のための容器内の、合計好気性菌数および酵母数およびカビ数を減少させるように適合可能である。容器およびその中に含まれる食品内の微生物数を同時に（１回の稼働で）減少させることも、本発明の範囲内で想定される。
【００２９】
別の実施形態では、本明細書において説明される方法および装置は、食品上の殺虫剤を減少させるように適合可能である。
【００３０】
本発明の一実施形態による、前記装置を使用して食品および容器内の微生物数を減少させるための方法のステップは、以下で説明される。
【００３１】
以下の凡例は、図２〜図５および図１３に使用される。
１：オゾンスライドゲート
２：オゾン発生器
３：乾燥機排気ファン
４：調整可能なフード
５：室内排気ファン
６：リンゴの箱
７：密封された／密封可能チャンバ
８：内部オゾンセンサ
９：排出ファン
１０：炭素フィルタ
１１：室内オゾンセンサ
１２：プラスチックシート
１３：プラスチックパレット
ステップ１：凝縮（図２に示されている）
リンゴの箱（６）が、冷却器（温度３６〜４０°Ｆ）から取り出され、箱が気密であることを確実にするように透明なプラスチックのラップで上から下まで包まれる。箱のスタックの上部は、下部の箱の下面と同様に、開いたままにされる。この特定の構成は、同様の効果を達成するために変えられてよいことに留意されたい。言い換えれば農産物は、その外周上では周囲に対して閉じられており、上部および下部では開いている、好ましくは垂直の容器内で、保管される。実験の目的のために、容器は、本明細書では、端の開いた箱を積み重ね、それらの箱をそれらの接続ポイントでそれぞれの外周をぐるりと密封することによって、形成された。包まれた箱のスタックは、密封可能チャンバ（７）内に置かれ、フード（４）が、空気圧シリンダのシステムを使用して、密封するように上部の箱上に下ろされる。リンゴ（６）をバイパスできないように密な嵌合が重要である。オゾン発生器スライドゲート（１）が閉じられる。チャンバドアは開いたままにされる。フード（４）を介して箱のスタックと流体接続する乾燥機排気ファン（３）が、リンゴ（６）上で表面凝縮を起こすために、箱のスタックの開いた下部を通して、そしてリンゴ（６）を通して暖かい空気を引き上げるように（この場合、２４００ｃｆｍで）稼働させられる。ファンは、チャンバ内が７０〜１００％、好ましくは約８０〜９０％または約８５％の所望の湿度に到達するように（この場合、１０〜１５分間）稼働させられる。次いで、乾燥機ファン（３）がオフにされる。
ステップ２：オゾン処理（図３に示されている）
ひとたび所望の湿度に到達し、乾燥機ファン（３）がオフにされると、チャンバドアはしっかりと閉じられ、ラッチされる。オゾンスライドゲート（１）が開かれる。オゾン発生器（２）が稼働し、オゾンガスが、フード（４）を通って入り、リンゴ容器を通って下降する。オゾン発生器の出力（オゾンレート）は、オゾノネーション（ｏｚｏｎｏｎａｔｉｏｎ）チャンバのサイズに依存して選択可能である。
【００３２】
排出ファン（９）は、リンゴを通してオゾンガスを分散させ、チャンバ内で陰圧を生み出すために、チャンバの下部において、低いスピード、たとえば、３００〜６００ｃｆｍで稼働する。空気流は、圧力差および乱流を生み出すよう、産物の層（ｂｅｄ）を通るように向けられる。排出ファンのスピードは、オゾン処理されている産物に依存して選択されるべきである。
【００３３】
オゾンは、上部から下部へとリンゴを通して下へと引かれ、次いで、チャンバの外部に排気される前に排出ファン（９）および炭素フィルタ（１０）を通って出される。オゾンのための滞留時間は、リンゴのサイズ、箱の体積、およびどれほど多くのオゾンがリンゴ上の任意の有機化合物によって分離されるかに依存して変化するであろう。排出ファン（９）の近くのチャンバ内部のオゾンセンサ（８）は、ひとたびオゾンガスがリンゴを通過すると、オゾンガスの濃度をモニタする。オゾン処理プロセス中、排気ファンのスピードは、１４から２０ｐｐｍの間で変化する濃度を達成するように選択される。ひとたび濃度が上昇するのをやめ、所望の曝露時間が達成されると、オゾン処理プロセスが完了し、オゾン発生器（２）が停止する。
【００３４】
任意選択で、もしもオゾンが室内で室内センサ（１１）によって検出された場合、アラームが出され、室内排気ファン（５）が稼働するであろう。
ステップ３：排出（図４に示されている）
オゾン発生器（２）がオフになる。排出ファン（９）は、乾燥機排気オープンダクトを通して、およびオゾン発生器のオープンダクトを通して新鮮な空気を引き込みながら、チャンバからオゾンガスを放出するように、約１０００ｃｆｍの高いスピードで稼働する。これは、チャンバ内部のオゾンセンサ（８）が０を示すまで、約４０秒かかる。
ステップ４：空気を乾燥させる（図５に示されている）
ひとたびオゾンがチャンバから排出されると、ドアが開かれ、オゾンスライドゲート（１）が閉じられる。リンゴの箱（６）は包まれたままであり、フード（４）は下ろされたままである。室温になるまで、リンゴを通して暖かい空気を引き上げるために、乾燥機排気ファン（３）を稼働させる（９０分）。
【００３５】
上述された実施形態で言及された特定のプロセスパラメータは、例として提供される。当業者は、プロセスパラメータの多くが相互に関係することを認識するであろう。たとえば、オゾン処理ステップ中の目標オゾン濃度は、食品のタイプ、バッチサイズ、およびオゾンチャンバのサイズに依存して変化することができる。空気流は、オゾン発生器によって発生させられたオゾンを産物の層を通して均一に分散させるのに十分でなければならない。あまりに低い空気のスピードは、オゾンを均一に分散させず、産物の層内のある特定のポイントにおいてのみ殺菌を達成する。本発明者らは、４’×４’×３’の３つの箱内に積み重ねられた、２４００ｌｂｓの７２カウントサイズ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｚｅ）のリンゴを通る５００ｃｆｍの空気流は、毎時６０ｇ（毎分１グラム）のオゾン送出を使用したオゾンの均質な分布および最適な殺菌を達成するであろう、と決定している。このプロセスは、規模の拡大または縮小が可能である。
【００３６】
一実施形態では、表面および表面下の微生物の存在の影響を受けやすい食品上の細菌を不活性化するための特許請求される方法のプロセスパラメータは、以下のとおりである。
オゾン：
１）１６０立方フィートの容器内で毎分０．１から３グラム。これは、１立方フィート当たり０．０００６２５ｇおよび１立方フィート当たり０．０１８７５ｇの比に対応する。
【００３７】
２）２４００ｌｂｓのリンゴへと毎分０．１から３グラム。これは、食物１ポンド当たり毎分０．００００４１６７グラムおよび食物１ポンド当たり毎分０．００１２５グラムの比に対応する。
【００３８】
３）４０分間にわたって毎分０．１グラムから３グラム。これは、リンゴ２４００ｌｂｓ当たり４グラムから１２０ｇのオゾンの比に対応する。
【００３９】
４）オゾン濃度は、選択された特定のプロセスパラメータに依存して変化するであろう。たとえば、本発明者らは、５００ｃｆｍの空気流が４〜６ｐｐｍのピークオゾン濃度という結果をもたらすことを見出した。
【００４０】
空気流：１６０立方フィートの容器内の食品の層を通して１０ｃｆｍから１５００ｃｆｍの間。これは、１立方フィートの容器当たり０．０６２５ｃｆｍおよび１立方フィートの容器当たり９．３７５ｃｆｍの空気流の比に対応する。目標空気速度は、密封可能チャンバのサイズに依存し得る。
【００４１】
温度：３６°Ｆから９０°Ｆの間。
【００４２】
湿度：７０％および１００％。
【００４３】
容器のサイズ／食物の表面積：各々の４’×４’×３’の箱は、７２カウントサイズ（１ブッシェル内に７２個のリンゴ）の、８００ｌｂｓのリンゴまたは１３５０個の個々のリンゴを保持する。各リンゴは、平均０．６ｌｂｓ（２６０グラム）の重さがある。各リンゴの表面積は、平均で３７ｉｎ２（２３０ｃｍ２）である。したがって、各箱内では、４９，９５０ｉｎ２（３１０，５００ｃｍ２）の産物表面が処理される。
【００４４】
上記の比は、他のタイプおよびサイズの食品、たとえば、サクランボ、レタス、およびスイカに関するパラメータを計算するために使用可能である。具体的には、サクランボは、リンゴよりも大きい、単位重量当たりの表面積を有する。スイカは、リンゴよりも小さい、単位重量当たりの表面積を有する。したがって、所望の殺菌レベルを達成するために必要とされるオゾン曝露は、サクランボの場合はより高く、スイカの場合はより低くなるであろう。オゾン曝露のレベルは、たとえば、空気流および／もしくは滞留時間を調整すること、ならびに／または異なるサイズの密封可能チャンバを使用することによって、調整可能である。
【００４５】
小さいファンとともに使用される標準的なマイクロ波のサイズに対応するサイズを有する密封可能チャンバと、大量の農産物のハンドラ用のはるかに大きいユニットとを含む、さまざまなサイズを有する密封可能チャンバの使用は、本明細書において説明される方法および装置の範囲内である。
【００４６】
オゾン滞留時間：滞留時間は、産物の体積およびオゾンの濃度に依存する。本発明者らは、１箱当たり８００ｌｂｓの３つのリンゴ箱について４０分の滞留時間で最良の結果を見出した。
【００４７】
オゾンモニタ（５）は、任意選択で室内に設置可能であり、０．１ｐｐｍのオゾンが検出された場合、チャンバを自動的に遮断し、室内排気ファン（５）を起動するようにプログラムされる。
【００４８】
本発明の装置および方法は、環境に配慮しているという点で、以前から知られている消毒方法よりも有利である。具体的には、本発明の方法は、水を使用せず、それによって、新鮮な水を節約し、塩素またはアンモニアのような刺激の強い（ｈａｒｓｈ）消毒用化学物質を有する化学廃液の作成を回避する。さらに、オゾンガスは酸素に分解され、危険なまたは有害な副産物を残さない。
【００４９】
最後に、本明細書において言及される任意の実施形態または特徴と、別個に言及される他の実施形態または特徴のいずれかのうちの１つまたは複数との組み合わせは、本発明の範囲内であると企図される。
実験
実験１：キャンディーアップル生産用途のリンゴ上のリステリアモノサイトゲネスを不活性化するための強制空気オゾン反応器の開発
要約
強制空気オゾン反応器のリンゴ除染能力が、実験室研究と商業的規模研究の組み合わせを使用して評価された。実験室研究では、リステリアモノサイトゲネスを接種されたリンゴを通るオゾンガスの流れのダイナミクスが研究された。ある特定の条件下では、リンゴ上のリステリア属レベルを２．１２〜３．０７ｌｏｇ  ｃｆｕ減少させることが可能であった。単一の稼働で２つのリンゴ袋（２０００ｌｂｓ）を処理する容積をもつ商業的規模のユニットが構築された。商業的試験を容易にするために、リステリア属と比較してオゾンに対する等しい抵抗をもつラクトバチルス属株が選択された。バリデーション研究を通して、リンゴ上に接種された代用物を不活性化する処理の均質性および致死性は、空気のダイナミクスおよび処理時間に依存する、ということが見出された。ある特定の条件下では、リステリア属の代用物の４．４２ｌｏｇ  ｃｆｕの減少を達成することが可能であった。結論として、強制空気オゾン処理は、困難な手法において、リンゴ加工の過程におけるリステリア属に関連付けられたリスクを管理するために適用可能である、ということが実証された。
【００５０】
材料および方法
使用された細菌およびリンゴの接種
この研究において使用された病原体は、志賀毒素産生性大腸菌、すなわちＳＴＥＣ、血清型Ｏ１５７：Ｈ７（２菌株）およびＯ１１１、Ｏ４５、Ｏ２６の１菌株、ならびにリステリアモノサイトゲネス（血清型４ａ、４ｂ、１／２ｂ、１／２ａ、および３ａ）を含んだ。これらの分離株は、それらが過去の大流行に関連付けられているので特に関連性があり、ゲルフ大学食品科学部の微生物株保存機関から得られた。特に、リステリアモノサイトゲネスの血清型４ｂ（新鮮な農産物から分離された）およびラクトバチルスフルクチボランス（ワインから分離された）が、研究全体を通じて使用された。ラクトバチルスフルクチボランスＡＴＣＣ８２８８はまた、研究において、リステリアモノサイトゲネスの代用物として適用され、アメリカンタイプカルチャーコレクション（米国、アトランタ）から得られた。
【００５１】
各細菌の濃度は、光学密度（ＯＤ）と段階希釈の両方によって決定された。各細菌が同じ濃度（８−ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌ）に希釈された後、糞便系大腸菌株は、最終接種物を作成するために一緒に混合され、ならびにリステリアモノサイトゲネス株も同様であった。
【００５２】
接種物は、使用前に最長１２時間４℃で保存され、ひとたび除去されると１分間ボルテックスされた。各細菌株（ｓｔａｉｎ）は、単一コロニーの分離を可能にするために、選択寒天培地上に画線平板法で塗り広げられ（ｓｔｒｅａｋ  ｐｌａｔｅｄ）、それが次いで除去され、５０ｍｌのトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）中で３７℃にて２４時間、またはラクトバチルス属の場合はＭＲＳブロス中で３０℃にて４８時間、発育させられた。ストレス適応を可能にするために、細胞は遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＳＴ８）によって採取され（１０分間で５０００ｇ）、ペレットは、８ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌの最終的な細胞密度まで生理食塩水中で再懸濁させられ、１分間ボルテックスされ（ＩＫＡ（登録商標）Ｖｏｒｔｅｘ３  Ｓｈａｋｅｒ）、４℃で４８時間貯蔵された。上澄みは廃棄された。
【００５３】
ワックスがかけられていないリンゴおよびアイスバーグレタス１玉が提供され、必要とされるまで４℃で貯蔵された。使用された農産物が、打ち傷および摩耗などの機械的損傷の明らかな兆候を伴わず、損なわれていないことが重要であった。したがって、目に見える任意の損傷の兆候（打ち傷、切断、茎の欠落）または任意の腐敗をもつリンゴは使用されなかった。レタスの玉は、加工中に機械的損傷を有していた葉の最も外側の層を除去することによって、処理の準備がされた。
【００５４】
リンゴは、果実の上部まわりの皮に８−ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの濃度の試験用細菌１００μｌをスポット接種され、次いで、２０分〜４時間にわたってバイオセーフティキャビネット内で乾燥させられ、次いで、最長で２４時間にわたって４℃に移行させられた。細菌をインターナライズするために、１ｍｌの懸濁液が、茎の割れ目に追加され、１分間真空下に置かれ、真空から除去され、１分間放置されてから、さらに１分間もう一度真空化される。細菌は、１００ｍｌの生理食塩水とともに果実全体をプラスチックパウチ内に置くことによって、リンゴから回収された。果物は、６０秒間手で揉まれ、希釈系列が生理食塩水中で調製された。リステリアモノサイトゲネスは、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｆｏｒｍｕｌａ寒天培地（ＭＯｘ）上で計数され、ラクトバチルス属は、ＭＲＳ寒天培地上に塗り広げられた。両方の場合において、プレートは、４８〜７２時間３０℃でインキュベートされ、次いで、典型的なコロニーがカウントされた。両方の場合において、検出下限は、リンゴ１つあたり３ｌｏｇ  ｃｆｕであった。
【００５５】
リンゴ上に接種され、オゾンを用いて処理されたリステリアモノサイトゲネスおよびラクトバチルス属の不活性化
リンゴは、上述されたように、リステリアモノサイトゲネスまたはラクトバチルス属のどちらかを接種された。次いで、接種されたリンゴ（５つはリステリア属を接種され、５つはラクトバチルス属を接種された）は、ＰＶＣバイオバブル内に置かれ、６ｇ／ｈのレートでオゾンに曝露された。処理の完了時に、オゾン処理の残存物が上述されたように回収され、対照群に対するｌｏｇ数の減少が決定された。
【００５６】
実験室規模の強制空気オゾン反応器
反応器は、その外周をぐるりと密封されおよび／または閉じられ、その上部および下部が開いていて、その中でリンゴが穴の開いたボックスにおいて置かれる（３０ｃｍの深さ）、容器（０．１５７”の波形プラスチックで裏張りされた３．５’×３．５’×３．５’−１／２”合板ボックス）の底部または上部に配置されたオゾン発生器（Ｎｅｔｅｃｈ（登録商標）、オゾン出力６ｇ／ｈ、流量１０ｌ／分、電力−１２０Ｗ、５０／６０Ｈｚ）からなった（図６）。図６では、以下の凡例が使用されている。６０１：シリーズ９４０送信機Ａｅｒｏｑｕａｌ、６０２：プローブ−温度、オゾン濃度、および湿度、６０３：オゾンガス、６０４：酸素ガス、６０５：４つのＵＶランプ（２５４ｎｍ）および排気ファン、６０６：加熱ランプ、６０７：排気、６０８：リンゴ（３０ｃｍの深さ）、６０９：オゾン発生器、６１０：加湿機、および６１１：ファン。
【００５７】
オゾンは、９．５ｍ／ｓの速度でファンを介してリンゴパイルを通して上または下へと引っ張られた（ＣＦＭ／ＣＭＭ  Ｔｈｅｒｍｏ−Ａｎｅｍｏｍｅｔｅｒ−Ｅｘｔｅｃｈ（登録商標）−モデル番号ＡＮ１００を用いて測定され、２０個のポイントでの空気流の平均、および３％の速度精度）。反応器は、湿度が加湿機（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  番号３０４３−５９７４−０、１ガロンの容積、３６時間の稼働時間、ロー−ハイ設定）によって６５〜８５％の相対湿度に保たれた、密閉されたシステムである。温度、湿度、およびオゾン濃度は、Ａｅｒｏｑｕａｌによって＜±０．００８ｐｐｍ０〜０．１ｐｐｍ、＜±１０％０．１〜０．５ｐｐｍの認定精度に較正されたＡｅｒｏｑｕａｌシリーズ９４０モニタリングユニット（Ａｕｃｋｌａｎｄ、ＮＺ）を使用して測定された。
【００５８】
空気は、ファンを介してチャンバから排気され、処理後の残留オゾンを分解するために４つのＵＶ−Ｃランプ（２５４ｎｍ）の上を通過した。リンゴの温度は、パイルの中央部に配置されたリンゴの果実中０．５または１．０ｃｍのところに入れられた温度計プローブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｔｒａｃｅａｂｌｅ（登録商標）、精度±０．０５℃、範囲−５０°〜＋１５０℃）を使用して記録された。処理時間は２０分間に設定され、その後、リンゴは除去され、次いで、パイルの上部、中央部、または下部のリンゴへと再分割された。残存するリステリアモノサイトゲネスは、上述されたように回収され、処理されていない果物を使用して初期負荷が決定されたＭＯｘ上で計数された。
【００５９】
農産物が接種され、病原体が付着する時間を与えられた後、上述されたように、それらは次いで、チャンバ内に置かれ、６ｇ／ｈのレートでオゾンに曝露された。パラメータは、言及されたようにチャンバ内で制御され、オゾン濃度は、発生の５分後の３０ｐｐｍから始まり、２０分後に８０ｐｐｍまで上がった。湿度は、加湿機によって一定に保たれたので８５〜９０％で安定し、温度は２４．４℃〜２６．８℃であった。処理の完了時、残留オゾンは、４つのＵＶライト（２５４ｎｍ波長−ピークオゾン破壊）によって分解され、ファンを用いてチャンバから除去された。オゾン処理の残存物は回収され（以下で説明される）、対照群に対するｌｏｇ数の減少が決定された。
【００６０】
オゾンのリンゴ除染能力に対する空気流の影響
オゾン導入ポイントがプロセスに影響を及ぼすかどうかを決定するために、ガスが異なる場所でチャンバへと導入される能力試験が行われた。１つの構成では、オゾン発生器は、３０ｃｍの深さのリンゴを有する、穴を開けられた容器の下部に置かれた。３つの接種されたリンゴが、底部、中央部、または上部に置かれた。オゾンは、送風機を介してリンゴの層を通して引かれ、次いで排気を、残留オゾンを分解するためにＵＶランプ上を通過させた。別の構成では、オゾンは、リンゴの上方（チャンバの外部）に置かれ、空気流は下方向に強制された。上述されたように、湿度、温度、およびオゾン濃度は、一定のレートで保たれた。
【００６１】
複数のレイヤにおけるリンゴ上のリステリアモノサイトゲネスを不活性化するオゾンの能力
リンゴは、リステリアモノサイトゲネスを接種され、付着のために室温（２１℃）で２時間放置された。次いで、接種されたリンゴ（ｎ＝３）が、トレイにおける中央の列（Ｂ）に置かれ（下部）、レイヤは、接種されていないリンゴで終了した。接種されたリンゴ（ｎ＝３）のさらなるレイヤが、リンゴの層上に置かれ（中央部）、同じく、レイヤは、接種されていない果物で終了した。最後に、３つの接種されたリンゴが、２つのレイヤの上に置かれ、接種されていないリンゴによって囲まれた（上部）。したがって、トレイは、全部でリンゴの３つのレイヤを有した。リンゴは、チャンバ内に置かれ、次いで、２０分間にわたって高い相対湿度下で２０分間オゾンを用いて処理された。
【００６２】
条件付きリンゴのオゾン処理
試験が、凝縮を伴うおよび伴わないリンゴでのオゾンの能力を決定するために実行された。リンゴは、リステリア属を接種され、一方のセットは１２時間４℃で置かれ、他方は２０℃で保持された。リンゴは、４℃から除去され、次いで、処理チャンバ内に直接的に置かれ、オゾン（６ｐｐｍ）が２０分間適用された。
【００６３】
商業的規模の強制空気オゾン発生器反応器
リンゴは、７ｌｏｇ  ｃｆｕのラクトバチルス属懸濁液を接種され、冷却器内で施設に輸送された。反応器は、６０ｇ／ｈのレート（３７ｐｐｍ）でオゾンをステンレス鋼チャンバへと導入する４．０’×３．５’×１０．０’のステンレス鋼ユニットの上部に置かれた、発生器（Ｍｅｄａｌｌｉｏｎ  Ｉｎｄｏｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ、モデル０３−２０−２４  ＵＶ  Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｏｕｔｐｕｔ、２４個の２４”  ＡＴ９８７オゾンランプ、２２４／２４０ボルトＡＣ５０／６０ＨＺ８アンプ、最大オゾン出力１６１．２ｇ／ｈ、最大空気容積１２００ＣＦＭ）からなった。
【００６４】
箱内のリンゴは、使用前に冷却器内に保持され、果実の表面上に形成された凝縮を保証するために処理チャンバに直接的に移された。互いの上に積み重ねられ、リンゴスタック内にオゾンを含むためにプラスチックフィルムで包まれた、２つのリンゴ箱（３．９’×３．３’×２．５’）が、各試験に使用された。密封は、オゾン送出ノズルの蓋によって箱の上部に形成され、空気速度は、反応器の下部に配置された排気ファンによって制御された（図７）。オゾン濃度は、オゾンモニタ（２Ｂ  Ｔｅｃｈ（登録商標）、モデル１０６−Ｌ、範囲０〜１００ｐｐｍのオゾン、精度１．５ｐｐｂ）を使用して、オゾン排気ポートの極めて近くで測定された。チャンバ内のオゾンの濃度は、５０ｐｐｍ〜１００ｐｐｍの範囲にわたった。処理時間およびファンスピードは、プロセスの完了時に排出ステップとともに電子的に設定され、ファンは、４つの２５Ｗランプ（１００時間および８０°Ｆで２５４ｎｍにて測定され、２４”の長さ、および１５ｍｍの直径−標準的なＵＶランプ（シリアル番号０５−１３４８））を通してオゾンを引いた。
【００６５】
接種されたリンゴは、チャンバの上部、中央部、または下部に並べられた。プロセスの完了時、リンゴは除去され、残存するラクトバチルス属が計数された。
細菌の回収および計数
レタス
処理後、レタスの玉は刻まれ、５００ｍｌの生理食塩水中に懸濁させられ、１分間ストマッキング処理（ｓｔｏｍａｃｈ）され、希釈系列が生理食塩水中で調製された。ＳＴＥＣを計数するために、次いで、試料が、２４時間３７℃でインキュベートされたソルビトールマッコンキー寒天培地（ＣＴ−ＳＭＡＣ）および発色培地（ＣＨＲＯＭａｇａｒ）上に平板塗抹法で塗り広げられた（ｓｐｒｅａｄ  ｐｌａｔｅｄ）。リステリアモノサイトゲネスは、２４〜４８時間３５℃でインキュベートされたＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｇａｒ（ＭＯＸ）上に塗り広げられた。
リンゴ
レタスと同じ手法でリンゴから病原体を回収する難題を抱えた後、リンゴの表面からリステリア属を回収するのに適した方法を決定するために、基礎研究が行われた。リンゴは、１００μｌのリステリア属［８−ｌｏｇ  ＣＦＵ］をスポット接種され、次いで、４時間にわたって付着させられた。次いで、リステリア属が、各方法の効率を評価するために、３つの方法のうちの１つによって回収された。方法は、以下のとおりであった。方法（１）リンゴ全体が、滅菌プラスチックパウチ内に置かれ、１００ｍｌの生理食塩水中に懸濁させられ、手で１分間こすられた。方法（２）の場合、皮むき器が、リンゴの果皮を除去するために使用され、次いで、リンゴが、５０ｍｌの生理食塩水中に置かれ、１分間激しく振り混ぜられた。最後に、方法（３）は、ラボトップブレンダ（ｌａｂ  ｔｏｐ  ｂｌｅｎｄｅｒ）を使用して果皮がホモジナイズされたことを除いて、（２）に関して説明されたのと同じであった。回収の方法に関係なく、希釈系列は、生理食塩水中で調製され、次いで、２４〜４８時間３５℃でインキュベートされたＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ａｇａｒ（ＭＯＸ）上に塗抹平板法で塗り広げられた。推定陽性コロニーがカウントされ、ｌｏｇ  ＣＦＵが報告された。
付着に対するリステリア属のインキュベーション温度の影響
リステリア属のインキュベーション温度がリンゴへのリステリア属の付着に重要であるかどうかを決定するために、細菌は、２５℃（リステリア属が鞭毛を発現した）と３７℃（すなわち、鞭毛は発現しなかった）の両方で培養された。細菌は、上述されたように、除去される前にリンゴに固着する時間を与えられた（方法１）。
統計分析
各実験は、少なくとも３回繰り返され、３つ組の試料が分析された。細菌数が、チューキー検定と組み合わせてＡＮＯＶＡを使用して実行された平均間の差によってｌｏｇ１０値へと変換された。
結果
リステリアモノサイトゲネスの代用物としてのラクトバチルスフルクチボランスの適性
リステリアモノサイトゲネスと比較された、オゾンに対するラクトバチルス属の相対的抵抗が、抗菌ガスが導入されたバイオバブルの内部に置かれた接種されたリンゴを使用して評価された。オゾン処理によるラクトバチルス属およびリステリアモノサイトゲネスの不活性化の程度は、適用時間（オゾン濃度）に依存することがわかった。相対的な観点では、同じオゾン曝露を受けたラクトバチルス属と比較されたリステリアモノサイトゲネスの対数減少に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）（図８）。したがって、ラクトバチルス属菌株は、オゾン処理能力を評価するための商業的試験に適用可能な、リステリアモノサイトゲネスの適切な代用物である。
【００６６】
リンゴへと接種されたリステリアモノサイトゲネスを不活性化するオゾンの能力に対する空気流の方向の影響
接種されたリンゴが、実験室規模の反応器内に置かれ、次いで、ガスが容器の上部または下部のどちらかで導入されることによって、オゾンを用いて処理された。相対湿度は６５〜８５％の相対湿度に保持され、処理時間は２０分間に設定された（表１）。
【００６７】
リステリア属のｌｏｇ数減少は、パイル内のリンゴの位置に依存せず、オゾンが層の上部に導入されたか底部に導入されたかにも依存しないことがわかった（表１）。結果は、オゾンがリンゴの層を通して成功裏に注入され得ることにより、空気流の方向に関係なく果実との均質な接触を可能にすることを示す。
【００６８】
表１：リンゴに接種され、次いで、図６に示された上部または下部の反応器内で処理されたリステリア属のＬｏｇ数減少。処理は２０分間実行され、リンゴの果実は最初、反応器へと載せられる前に４℃で貯蔵された。ここで、試料の平均が報告されたことに続いて、標準誤差（標準偏差を試料サイズｎの平方根で除算したもの、ここで、ｎは≧３である）が報告される。  
【００６９】
【表１】
2019522998.tif 000003
【００７０】
リンゴとのオゾンの接触はパイル内の果実の場所に依存しなかったが、層内の果実の温度プロファイルに関する差が存在した。具体的には、入ってくるオゾンストリームを受けたリンゴは、底部のリンゴよりも早く暖まった（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。リンゴの深さ０．５ｃｍにおける温度は、果実の内側１ｃｍと比較して早く上昇した。結果の意義は、温度差が存在すればリンゴの表面は水分を保持（凝縮）するであろう、ということである。パイルの上部におけるリンゴの急速な温度上昇は、底部におけるリンゴと比較してより高いレートの水分除去を引き起こすであろうし、これが今度はオゾンの能力を減少させるであろう。しかしながら、層内のリンゴの位置と無関係に得られたリステリア属の比較可能なｌｏｇ数減少によれば、そのようなことはなかった。表面のリンゴは、表面水分の減少を補償するであろうより高い濃度のオゾンに曝露されることが可能である。
【００７１】
商業的規模の強制空気オゾン反応器
商業的規模の反応器が、実験室試験の知見に基づいて、前に説明されたように構築された。工学的予想から、ユニットの上部においてオゾンを導入し、次いでそれを、リンゴパイルを通して下へと引き、チャンバの下部において排気することはより容易であった。バリデーション試験では、接種されたリンゴは、オゾン処理がリンゴ上へと均一に適用されているかどうかを決定するために、リンゴパイル内の異なる位置に置かれた。オゾン濃度は、上述されたようにオゾンモニタによって決定され、空気流は、ｃｆｍ単位で、設定された時間期間にわたって空気速度と堆積測定値の組み合わせを測定する、（上述されたような）風速計を用いてモニタされ、１立方フィートは約２８リットルに等しい。
【００７２】
図９は、強制空気オゾン反応器内のオゾン濃度に対する排気速度（毎分立方フィート）の影響を示す。２つのリンゴ箱が反応器内に置かれ、排気ファンのスピードは、異なる空気速度を与えるように設定された。オゾンは、反応器の上部で導入され、リンゴの層を通過した後に測定された。処理は２０分の期間にわたって実行され、オゾン濃度は３０秒ごとにログ記録された。
【００７３】
反応器の異なる部分における空気速度が、異なる位置に置かれた流量計を使用して測定された。５００ｃｆｍの設定された空気流設定を使用することによって、オゾン入口における吸入は０．０８ｍ３／ｓであり、それは、リンゴパイルの下部では６．６×１０−３ｍ３／ｓ、空気出口では０．２７ｍ３／ｓに減少した。反応器の異なる部分における空気速度の変化は、入口、層、および出口の直径／面積を反映する。
【００７４】
空気排気ポートの近くで測定されたオゾン濃度は、空気速度に依存した（図９）。低い排気速度では、オゾン濃度は、１０分安定して稼働し、最高ガス濃度を達成した。空気速度がチャンバ内のオゾンのレベルを増加させればさせるほど、安定した抗菌ガス濃度を達成する時間が減少した。最高排気速度（７００ｃｆｍ）では、記録されたオゾン濃度は、より遅いファンスピードが適用されたときと比較すると著しくより低い、４ｐｐｍであった。
【００７５】
低いファン排気速度では、リンゴ上に接種されたラクトバチルス属のｌｏｇ数減少は、パイル内でのリンゴの位置に依存した。具体的には、著しくより高いｌｏｇ数減少が、底部のリンゴと比較して、パイルの上部のリンゴの場合に得られた。しかしながら、空気速度が５００ｃｆｍを超えて増加すると、リンゴパイルの下部と比較された上部におけるラクトバチルス属のｌｏｇ数減少に関する有意差はなかった。試験された最高ファンスピード（７００ｃｆｍ）では、ラクトバチルス属の対数減少は、リンゴパイルの上部では、パイルの中央部または下部に配置されたリンゴパイルと比較して、著しくより低かった。したがって、好ましい排気速度は５００〜６００ｃｆｍの範囲内である。空気排気速度の影響は、オゾン濃度とリンゴパイルのまわりの流れのダイナミクスとの組み合わせによるものであるらしい。低い排気ファンスピードでは、オゾンは、主に層の上部に蓄積し、次いで、ゆっくりと引っ張られるであろう。ファンスピードが増加すると、発生器を通して引っ張られる空気がオゾンの濃度を希釈するが、層を通る流れは、より均質である。最高ファンスピード（７００ｃｆｍ）では、オゾンユニットを通して引っ張られる空気は、殺菌作用において濃度が減少するポイントまでの高い希釈を引き起こすが、リンゴパイルの本体内に蓄積することができる。この事実に関係なく、好ましい空気排気スピードは、５００〜６００ｃｆｍである（図１０）。
【００７６】
図１０は、異なる空気排気速度下で動作する強制空気オゾン反応器内の上部、中央部、または下部に置かれたリンゴ上のラクトバチルス属のＬｏｇ数減少を示す。
【００７７】
リンゴは、茎端のまわりにラクトバチルス属をスポット接種され、５個の果実がリンゴパイルの上段に置かれ、５個が中央部に置かれ、５個は下部の箱の下に置かれた。オゾンは、上部で導入され、排気ファンによって設定された異なるレートでリンゴパイル（２箱）を通して引かれた。２０分の処理後、リンゴは除去され、ラクトバチルス属が回収された。
【００７８】
試験は、リンゴ上に接種されたラクトバチルス属のオゾン媒介性不活性化の能力に対する処理時間の影響を評価するために、５００ｃｆｍの排気速度を使用して実行された（図１６）。６分または１０分の処理時間は、空気がオゾンなしでリンゴパイルを通して引っ張られた対照群と比較して有意差はない、ということがわかった（０．１９±０．２９  ｌｏｇ  ＣＦＵの減少）。しかしながら、＞２０分の処理時間は、より短い時間と比較して有意により大きい対数減少を支持した。処理時間を４０分に延長することは、記録されたｌｏｇ数減少を有意に増加しなかった。
【００７９】
試験は、リンゴ上に接種されたラクトバチルス属のオゾン媒介性不活性化の能力に対する処理時間の影響を評価するために、２５０ｃｆｍおよび５００ｃｆｍの排気速度を使用して実行された。２５０ｃｆｍで実行された試験では、６分または１０分の処理時間は、空気がオゾンなしでリンゴパイルを通して引っ張られた対照群と比較して有意差はない、ということがわかった（０．１９±０．２９  ｌｏｇ  ｃｆｕの減少）。しかしながら、＞２０分の処理時間は、より短い時間と比較して有意により大きい対数減少を支持した。処理時間を４０分に延長することは、記録されたｌｏｇ数減少を有意に増加しなかった。
【００８０】
同様に、より高いファン排気速度（５００ｃｆｍ）を使用して実行された試験は、５分でも１０分でもラクトバチルス属の数の有意な変化という結果を生じなかった。しかしながら、ラクトバチルス属の対数減少は続いて、時間とともに増加することがわかった。適用された最長処理（４０分）は、ラクトバチルス属の数の４．４２  ｌｏｇ  ｃｆｕの減少という結果を生じた。
【００８１】
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、処理の効果は、所定の排気速度に関連するだけでなく、産物の層／容器を通じた圧力差、ならびに表面の乱流にも関連するものと考える。
議論／結論：
オゾン導入レートは、チャンバ内の約１４〜２０ｐｐｍのオゾンの比較的安定した濃度が達成されるように確立される。データを集団とみなすと、そのようなオゾン濃度においてリンゴを除染するのに適した処理条件は、１０〜４０分、好ましくは１５〜２５分、最も好ましくは約２０分の処理時間であり、ファン排気速度は５００〜６００ｃｆｍであろう。この条件は、リンゴパイル全体を通してリステリア属の代用物の平均４．４２±０．３０ｌｏｇ  ｃｆｕの減少を支持しながら、層内でのオゾンの均質な分布をもたらすであろう。
実験２：強制空気オゾン反応器を使用した再利用可能なプラスチッククレート（ＲＰＣ）の除染
材料および方法
シュードモナス・フルオレッセンスが、ＴＳＢ中で２４時間３０℃にて培養され、細胞が、遠心分離によって採取され、次いで、生理食塩水中でＯＤ６００＝０．２まで再懸濁させられた。０．１ｍｌのシュードモナス属懸濁液が堆積させられた、未使用のＲＰＣ上の内側底面上および側面上のエリア（２〜３ｃｍ２）がマークされた。ＲＰＣは２３℃に保たれ、バイオフィルム形成を支援するために、接種されたエリアに、（マークされたエリア１つ当たり）１０ｍｌの体積のＴＳＢが合計５日間噴霧された。さらに、新しく堆積させられた細胞の不活性化を比較するために、シュードモナス属が、オゾン処理の４時間前に接種された。
強制空気オゾン処理
２つの試験が実行され、第１の試験は、１つの開いたクレートおよび１つの折りたたまれたクレートをリンゴの箱の上に置いた。箱は、オゾン反応器内に置かれ、４０分間処理された。第２の試験では、ＲＰＣは、果物および野菜の包装機に送出されるように並べられたスタック内の異なる場所に置かれた。折りたたまれたＲＰＣのスタックは、オゾン反応器内に置かれ、３０分間処理された。
【００８２】
接種されたＲＰＣに加えて、接種されていないクレートは、内側からスポンジ試料を取ることによる試料であった。１０個のランダムに選択されたＲＰＣが、オゾン処理の前に試料採取され、異なる１０個のセットが、処理後に試料採取された。
微生物分析
スポンジは、クレートの底面および側壁上の接種されたエリアからシュードモナス属を回収するために使用された。オゾン処理を受けていない別個のクレートのセットが、初期レベルを決定するために使用された。スポンジは、３０ｍｌの生理食塩水中に懸濁させられ、６０秒間のストマッキング処理（ｓｔｏｍａｃｈｉｎｇ）によってホモジナイズされた。ホモジネートは、希釈系列を調製するために使用され、その後、希釈系列は、４８時間３０℃でインキュベートされたシュードモナス属寒天培地上に塗り広げられた。コロニーが回収されなかった場合、ホモジネートが、等しい体積のＴＢＳに追加され、２４時間３０℃でインキュベートされた。増菌培養物が、シュードモナス属寒天培地上に画線され、２４時間３０℃でインキュベートされ、その後、典型的なコロニーがあるかどうか検査された。
【００８３】
接種されていないＲＰＣからのスポンジ試料は、３０ｍｌの生理食塩水中に懸濁させられ、ストマッキング処理によってホモジナイズされた。希釈系列が調製され、合計好気性菌数を決定するために３４℃でインキュベートされたＴＳＡ上と、酵母およびカビの数を決定するために５日間２５℃でインキュベートされたポテト・デキストロース寒天培地上に塗り広げられた。
結果
接種されたＲＰＣ
【００８４】
【表２】
2019522998.tif 000004
【００８５】
【表３】
2019522998.tif 000005
【００８６】
接種されていないＲＰＣ
図１５を参照されたい。
結論
強制空気オゾン反応器処理は、バイオフィルム内およびＲＰＣの表面上のシュードモナス属を、増菌によってのみ検出可能であるほど十分に低いレベルまで減少させることができた。一般にオゾン処理の除染能力はスタック内のＲＰＣの位置に依存しなかったが、より高い頻度の陽性試料がスタックの中央部および下部に配置されたクレート内で検出された。オゾン処理は、内在性微生物レベルのレベルを、合計好気性菌数および酵母およびカビに関する許容可能レベルより下まで減少させた。
【図１】
2019522998.tif 000006
【図２】
2019522998.tif 000007
【図３】
2019522998.tif 000008
【図４】
2019522998.tif 000009
【図５】
2019522998.tif 000010
【図６】
2019522998.tif 000011
【図７】
2019522998.tif 000012
【図８】
2019522998.tif 000013
【図９】
2019522998.tif 000014
【図１０】
2019522998.tif 000015
【図１１】
2019522998.tif 000016
【図１２】
2019522998.tif 000017
【図１３】
2019522998.tif 000018
【図１４Ａ】
2019522998.tif 000019
【図１４Ｂ】
2019522998.tif 000020
【図１５】
2019522998.tif 000021
【図１６】
2019522998.tif 000022
【国際調査報告】
2019522998.tif 000023
2019522998.tif 000024
2019522998.tif 000025