(57)【要約】本開示は、概して、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に対するヒト抗体、ならびにＩＬ−２活性の調節のためのかかる抗体の使用方法、およびがん、自己免疫疾患、または感染症などの状態の治療における使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１×１０−１０Ｍ以下の親和性ＫＤでヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合し、ＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２  Ｒα）サブユニットとのＩＬ−２の結合を阻害する、ヒト抗体またはヒト化抗体であって、
ＩＬ−２  Ｒαβγを介したＩＬ−２シグナル伝達およびＩＬ−２  Ｒβγを介したＩＬ−２シグナル伝達を阻害し、
ＩＬ−２  Ｒαβγを介したＩＬ−２シグナル伝達を、ＩＬ−２  Ｒβγを介するよりも大きい程度で阻害する、ヒト抗体またはヒト化抗体。
【請求項２】
ヒトまたはマウスのＩＬ−２  ＲβまたはＩＬ−２  Ｒβγ複合体を発現する細胞へのヒトＩＬ−２の結合を完全には遮断しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβγ、またはＩＬ−２  ＲαβγへのＩＬ−２の結合に対してアロステリックな部位で結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ネガティブモジュレーター抗体であり、任意選択で、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２  Ｒα）との間の結合親和性を少なくとも約２倍、任意選択で最大１０００倍弱めることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体と複合体化したＩＬ−２が、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するＣＨＯ細胞に５ｎＭ以下のＥＣ５０で結合するか、または前記抗体と複合体化したＩＬ−２が、ＩＬ−２  Ｒβを発現する（しかしγｃを発現しない）ＣＨＯ細胞に１００ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトＩＬ−２と、マウスＩＬ−２、ラットＩＬ−２、またはウサギＩＬ−２のうちの１つまたは複数とに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現する細胞におけるＳＴＡＴ５活性化のＩＬ−２刺激を、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しない細胞よりも大きい程度で阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現する細胞におけるＳＴＡＴ５活性化のＩＬ−２刺激を２００倍以上阻害する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しない細胞におけるＳＴＡＴ５活性化のＩＬ−２刺激を１０倍以下阻害する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現する細胞における増殖のＩＬ−２刺激を、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しない細胞よりも大きい程度で阻害する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現するＮＫ細胞の増殖のＩＬ−２刺激を１５倍超阻害する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しないＢａＦ３細胞の増殖のＩＬ−２刺激を１０倍未満阻害する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、またはＸＰＡ．９２．０９９からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
（ａ）配列番号１７、２０、２３、もしくは２６に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１９、２２、２５、もしくは２８に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと
を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１７、２０、２３、もしくは２６に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、
（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、
（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１９、２２、２５、もしくは２８に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと
を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１７、２０、２３、もしくは２６に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、
（ｂ）配列番号１８、２１、２４、もしくは２７に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、
（ｃ）配列番号１９、２２、２５、もしくは２８に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと
を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体。
【請求項１７】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの３つが、配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号１、３、５、または７に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号１、３、５、または７に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
１つまたは複数の重鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列からの対応する１つまたは複数のアミノ酸で置き換えられている、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれか１つをさらに含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも２つを含む、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも３つを含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
（ａ）配列番号２９、３２、３５、もしくは３８に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、
（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域からの、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９に記載される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、
（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域からの、配列番号３１、３４、３７、もしくは４０に記載される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと
を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
（ａ）配列番号２９、３２、３５、もしくは３８に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、
（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域からの、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９に記載される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、
（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域からの、配列番号３１、３４、３７、もしくは４０に記載される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと
を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体。
【請求項２８】
（ａ）配列番号２９、３２、３５、もしくは３８に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、
（ｂ）配列番号３０、３３、３６、もしくは３９に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、
（ｃ）配列番号３１、３４、３７、もしくは４０に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと
を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つが、配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載されている、請求項２６〜２８に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３３】
配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
軽鎖可変領域中の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド配列を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２９〜４０に記載されている、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
（ｉ）軽鎖可変領域の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列であって、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２９〜４０に記載されている、アミノ酸配列と、（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている、アミノ酸配列とを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体であって、
（ａ）軽鎖可変領域が、配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、またはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、またはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号３１、３４、３７、もしくは４０、またはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み、かつ／または
（ｂ）重鎖可変領域が、配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、またはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、またはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１９、２２、２５、もしくは２８、またはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、
ＩＬ−２に結合する抗体。
【請求項３７】
（ａ）軽鎖可変領域が、配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号３１、３４、３７、もしくは４０、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含み、かつ／または
（ｂ）重鎖可変領域が、配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１９、２２、２５、もしくは２８、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を少なくとも含む、
請求項３１に記載の抗体。
【請求項３８】
ＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２  Ｒ−α）サブユニットへのＩＬ−２の結合を阻害する、請求項１４〜３７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
ＩＬ−２  Ｒβγ複合体へのＩＬ−２の結合を部分的に阻害する、請求項１４〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβγ、またはＩＬ−２  ＲαβγへのＩＬ−２の結合に対してアロステリックな部位で結合する、請求項１４〜３９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４１】
ネガティブモジュレーター抗体であり、任意選択で、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２  Ｒα）との間の結合親和性を少なくとも約２倍、任意選択で最大１０００倍弱めることができる、請求項１４〜４０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４２】
ＩＬ−２  Ｒβγ複合体へのＩＬ−２の結合のＥＣ５０を３倍超シフトさせない、請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４３】
ヒトＩＬ−２と、マウスＩＬ−２、ラットＩＬ−２、またはウサギＩＬ−２のうちの１つまたは複数とに結合する、請求項１４〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４４】
ＩＬ−２によるＩＬ−２  Ｒの刺激に応答した細胞におけるＳＴＡＴ５活性化を阻害する、請求項１４〜４３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４５】
ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１４〜４４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４６】
修飾されたもしくは未修飾のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである重鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４７】
１つまたは複数の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列からの対応する１つまたは複数のアミノ酸で置き換えられている、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４８】
ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、またはＸＰＡ．９２．０９９からなる群から選択される、請求項１４〜１６、２６〜２８、または３５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４９】
前記軽鎖可変領域に付着したヒト軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５０】
前記軽鎖定常領域が、修飾されたもしくは未修飾のラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５１】
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に１０−１０Ｍ以下の親和性ＫＤで結合する、請求項１４〜４１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５３】
発現制御配列に作動可能に連結された、請求項５２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５３に記載のベクターまたは請求項４９に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項５５】
重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含み、重鎖および軽鎖の核酸が、異なる核酸によって、または同じ核酸で発現される、請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
好適な条件下で請求項５４または５５に記載の宿主細胞を培養する工程と、抗体を回収する工程とを含む、請求項５４または５５に記載の宿主細胞を使用して抗体を産生する方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法によって産生された、抗体。
【請求項５８】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、滅菌医薬組成物。
【請求項５９】
ＩＬ−２活性の抑制を必要とする患者においてＩＬ−２活性を抑制するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜５２のいずれか一項に記載の抗体または請求項５８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項６０】
インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターロイキン２受容体（ＩＬ−２  Ｒ）のレベルまたは活性の増加に関連付けられる疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜５１のいずれか一項に記載の抗体または請求項５８に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項６１】
前記疾患、状態、または障害が、がん、微生物感染、喘息、および自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが、黒色腫、腎細胞癌、リンパ腫、肉腫、乳癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頚部癌、皮膚癌、および扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記投与が、前記対象における腫瘍体積を低減させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記投与が、前記対象におけるＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を増加させる、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体が、静脈内、腫瘍内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下に投与される、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体が、第２の薬剤と併用して投与される、請求項６０〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
第２の薬剤が、ＩＬ−２、ＩＬ−２バリアント、チェックポイント阻害剤、ＣＡＲＴ／ＴＩＬ薬剤、腫瘍抗原に対する抗体、またはワクチンである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
第２の薬剤がＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントである場合、前記抗体を、投与前にＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントと複合体化することができるか、または別個に投与することができる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントと前記ＩＬ−２抗体とが、１：１のモル比で投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＩＬ−２抗体をＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントと併用して投与することが、ＩＬ−２の治療指数（ＴＩ）を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０倍、またはそれよりも大きく増加させる、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
チェックポイント阻害剤、ＣＡＲＴ／ＴＩＬ薬剤、腫瘍抗原に対する抗体、またはワクチンの投与をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体が、１週間に１回、２週間ごとに１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回、または３カ月ごとに１回投与される、請求項６０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターロイキン２受容体（ＩＬ−２  Ｒ）の増加に関連付けられる状態または障害の治療における使用のための、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物または請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
ＩＬ−２またはＩＬ−２  Ｒの発現または活性の増加に関連付けられる状態または障害の治療における使用のための、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物または請求項５８に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
細胞を、細胞におけるＩＬ−２活性を調節するのに有効な量の請求項１〜５１のいずれか一項に記載の抗体または請求項５８に記載の医薬組成物と接触させる工程を含む、細胞におけるＩＬ−２活性を調節するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４０１，１５８号および２０１６年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／４２１，０３８号の優先権を主張するものであり、それらの全体は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、ファイル名：５１１３４＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：２０，３９９バイト；作成日：２０１７年９月２８日として識別されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本開示は、概して、インターロイキン２（ＩＬ−２）抗体、およびＩＬ−２シグナル伝達と関連付けられる状態を治療するための療法であって、それを必要とする対象に治療有効量のＩＬ−２抗体を投与することを含む、療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、サイトカインの４つのαヘリックス束ファミリーのメンバーである、１５ｋＤａのペプチドである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７，２９−６０（２００９）（非特許文献１））。これはＴ細胞増殖因子として１９７６年に最初に同定され、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、リンパ球馴化培地（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＬＣＭ）因子、Ｔ細胞分裂促進因子（ＴＭＦ）、キラーヘルパー因子（ＫＨＦ）、およびＴ細胞置換因子（ＴＲＦ）を含む多様な名称で称されてきた（Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｐ  ８１−９６（１９９２）（非特許文献２）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ  １１３−１２５（２００１）（非特許文献３））。ＩＬ−２は、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む多くの細胞によって産生される。ＩＬ−２は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与を含む幅広いシグナルの後に産生され、ナイーブＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ２８などの共刺激分子が結合すると急速かつ一時的に産生される。ＩＬ−２分泌の一過性の性質は、ＴＣＲシグナルによる転写誘導および共刺激シグナルによるＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化、続いてＩＬ−２遺伝子の転写サイレンシングおよびＩＬ−２  ｍＲＮＡの急速な分解に依拠する。ＩＬ−２がその自己産生を阻害する、典型的な自己調節的フィードバックループが近年記載されている（Ｍａｌｅｋ  ＴＲ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６，４５３−４７９（２００８）（非特許文献４））。
【０００５】
ＩＬ−２の受容体（ＩＬ−２  Ｒ）は、３つの鎖、ＩＬ−２  Ｒα（別名、ＣＤ２５）、ＩＬ−２  Ｒβ（別名、ＣＤ１２２）、および共通ガンマ鎖γｃ（別名、ＣＤ１３２）からなる。３つの受容体鎖は、様々な細胞型上に別個に、かつ異なって発現される。ＩＬ−２は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ、およびＭＡＰＫ経路などの細胞経路を活性化させるＩＬ−２  Ｒβとγｃとの間の相互作用を介してシグナル伝達する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７，２９−６０（２００９）
【非特許文献２】Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｐ  ８１−９６（１９９２）
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ  １１３−１２５（２００１）
【非特許文献４】Ｍａｌｅｋ  ＴＲ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６，４５３−４７９（２００８）
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、ＩＬ−２シグナル伝達に関連付けられるか、またはＩＬ−２シグナル伝達の調節が臨床的（もしくは免疫）応答の改善をもたらし得る、疾患または障害の治療のための方法および組成物を提供する。本開示は、ヒトＩＬ−２に結合する抗体を提供する。本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２  Ｒ鎖（ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃ）のいずれかまたは全てへのＩＬ−２結合に対して示差的効果を有し得る。特に、本開示は、がんの治療におけるかかる抗体の使用方法を提供する。
【０００８】
様々な実施形態では、本開示は、２×１０−９Ｍ以下の親和性ＫＤを有するＩＬ−２に特異的な抗体を提供する。様々な実施形態では、本開示は、１×１０−１０Ｍ以下の親和性ＫＤを有するＩＬ−２に特異的な抗体を提供する。例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗ＩＬ−２抗体は、少なくとも１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ、またはそれ以下の親和性で結合する。ある特定の実施形態では、親和性は、表面プラズモン共鳴またはＫｉｎＥｘＡアッセイによって測定される。
【０００９】
様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  ＲαβγおよびＩＬ−２  Ｒβγを介したＩＬ−２シグナル伝達を阻害し、抗体は、ＩＬ−２  Ｒαβγを介したＩＬ−２シグナル伝達を、ＩＬ−２  Ｒβγを介するよりも大きい程度で阻害する。
【００１０】
関連する実施形態では、抗体は、ＩＬ−２に結合し、ＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２  Ｒα）サブユニットとのＩＬ−２の結合を阻害する。様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒαβγを介したＩＬ−２シグナル伝達を、ＩＬ−２  Ｒβγを介するよりも大きい程度で阻害する。
【００１１】
関連する実施形態では、抗体は、ヒトまたはマウスのＩＬ−２  ＲβまたはＩＬ−２  Ｒβγ複合体を発現する細胞へのヒトＩＬ−２の結合を完全には遮断しない。関連する態様では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒα、またはＩＬ−２  Ｒβおよびγｃ鎖へのＩＬ−２の結合に対してアロステリックな部位で結合する。
【００１２】
様々な実施形態では、抗体は、ネガティブモジュレーター抗体であり、任意選択で、抗体は、ＩＬ−２とＩＬ−２受容体α（ＩＬ−２  Ｒα）との間の結合親和性を少なくとも約２倍、任意選択で最大で１０００倍弱めることができる。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２とＩＬ−２  Ｒαとの間の結合親和性を少なくとも２〜１０００倍、１０〜１００倍、２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、または１０００倍弱めることができる。様々な実施形態では、ＩＬ−２と複合体化された抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞に約５ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する。様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒβを発現する（が、γｃを発現しない）細胞に約２００ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２と複合体化された抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞に０．１〜１００ｎＭ、０．１〜１０ｎＭ、１〜５ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合する。様々な実施形態では、ＩＬ−２と複合体化された抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞に１、２、３、４、または５ｎＭのＥＣ５０で結合する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２と複合体化された抗体は、ＩＬ−２  Ｒβを発現する（が、γｃを発現しない）細胞に１０〜５００ｎＭ、１０〜３００ｎＭ、１０〜２００ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合する。様々な実施形態では、ＩＬ−２と複合体化された抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞に１０、５０、１００、１５０、または２００ｎＭのＥＣ５０で結合する。関連する実施形態では、ＩＬ−２と複合体化された抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞に、ＩＬ−２  Ｒβを発現する（が、γｃを発現しない）細胞よりも９〜４０倍結合する。
【００１３】
様々な実施形態では、抗体は、ヒトＩＬ−２と、マウスＩＬ−２、ラットＩＬ−２、またはウサギＩＬ−２のうちの１つまたは複数とに結合する。
【００１４】
様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しない細胞よりも大きい程度で、ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現する細胞におけるＳＴＡＴ５活性化のＩＬ−２刺激を阻害する。例えば、マウスＩＬ−２  Ｒα、Ｒβ、およびγｃを発現する細胞（例えば、ＣＴＬＬ−２）において、ＥＣ５０シフトは、マウスＩＬ−２  Ｒβおよびγｃ（例えば、マウス初代ＮＫ細胞）の場合の１３〜１６倍と比較して、２９３〜７９３倍の範囲であり得る。ヒトＩＬ−２  Ｒα、Ｒβ、およびγｃを発現する細胞（例えば、ＮＫ９２細胞株）では、ＥＣ５０シフトは、ヒトＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞（ヒトＣＤ２５＋枯渇初代ＮＫ細胞）の場合の４５〜１０４倍、またはヒトＲβおよびγｃを発現するように操作されたＣＨＯ−Ｋ１細胞の場合の５〜９倍と比較して、４９５〜１８５５倍の範囲であり得る。ＥＣ５０シフトの比は、マウスＲβおよびγｃと比較してマウスＲα、Ｒβ、およびγｃでは１８〜６０倍大きく（対照抗体ＭＡＢ６０２、別名クローン５３５５では７６倍）、ヒトＲβおよびγｃと比較してヒトＲα、Ｒβ、およびγｃでは９〜１９倍大きかった（ＭＡＢ６０２では５０倍）。関連する実施形態では、抗体は、ヒトＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを４００倍以上発現する細胞の場合、マウスＩＬ−２、Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現する細胞におけるＳＴＡＴ５活性化のＩＬ−２刺激を２００倍以上阻害する。関連する実施形態では、抗体は、ＳＴＡＴ５活性化のＩＬ−２刺激を、ヒトＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しない細胞において１０倍未満（ＣＨＯ−Ｒβγ）もしくは１５０倍（例えば、ヒトＣＤ２５＋枯渇初代ＮＫ細胞において）、またはマウスＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現する細胞（例えば、マウスＮＫ細胞）において２０倍未満阻害する。
【００１５】
様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しない細胞よりも大きい程度で、ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現する細胞における増殖のＩＬ−２刺激を阻害する。様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、およびγｃを発現するＮＫ細胞の増殖のＩＬ−２刺激を２０倍超阻害する。様々な実施形態では、抗体は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃを発現するがＩＬ−２  Ｒαを発現しないＢａＦ３細胞の増殖のＩＬ−２刺激を１２倍未満阻害する。
【００１６】
一実施形態では、ＩＬ−２抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１７】
様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００１８】
様々な実施形態では、抗体は、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、またはＸＰＡ．９２．０９９からなる群から選択される。
【００１９】
一態様では、本開示は、（ａ）配列番号１７、２０、２３、もしくは２６に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１９、２２、２５、もしくは２８に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体を提供する。
【００２０】
関連する態様では、本開示は、（ａ）配列番号１７、２０、２３、もしくは２６に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、（ｂ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７に記載される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、（ｃ）（ａ）と同じ重鎖可変領域からの、配列番号１９、２２、２５、もしくは２８に記載される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体を提供する。
【００２１】
さらなる態様では、本開示は、（ａ）配列番号１７、２０、２３、もしくは２６に記載される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、（ｂ）配列番号１８、２１、２４、もしくは２７に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、（ｃ）配列番号１９、２２、２５、もしくは２８に記載される、独立して選択された重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するそれらのバリアントと、を含む、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体を提供する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つは、配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている。関連する実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの３つは、配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本明細書において企図される抗体は、配列番号１、３、５、または７に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１、３、５、または７に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む抗体が本明細書に提供される。
【００２４】
本明細書に記載される抗体は、重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことがさらに企図され、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている。
【００２５】
ある特定の実施形態では、本明細書において企図される抗体は、別のヒト抗体アミノ酸配列からの対応するアミノ酸（複数可）で置き換えられた１つ以上の重鎖フレームワークアミノ酸を含む。
【００２６】
一実施形態では、本明細書において企図される抗体は、配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれか１つをさらに含む。他の実施形態では、本明細書において企図される抗体は、配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも２つを含む。他の実施形態では、本明細書において企図される抗体は、配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも３つを含む。
【００２７】
別の態様では、本明細書に記載される抗体は、（ａ）配列番号２９、３２、３５、もしくは３８に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、（ｂ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域からの、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９に記載される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、（ｃ）（ａ）と同じ軽鎖可変領域からの、配列番号３１、３４、３７、もしくは４０に記載される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、を含む。
【００２８】
代替的な実施形態では、本明細書において企図される抗体は、（ａ）配列番号２９、３２、３５、もしくは３８に記載される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、（ｂ）配列番号３０、３３、３６、もしくは３９に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、（ｃ）配列番号３１、３４、３７、もしくは４０に記載される、独立して選択された軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、または１つもしくは２つのアミノ酸が改変されたそれらのバリアントと、を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列のうちの少なくとも２つは、配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載されている。
【００３０】
本明細書に記載される抗体は、配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むことがさらに企図される。関連する実施形態では、抗体は、配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。なお別の実施形態では、抗体は、配列番号９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００３１】
さらなる実施形態では、本明細書に記載される抗体は、軽鎖可変領域中の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載されている。
【００３２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、（ｉ）軽鎖可変領域中の３つ全てのＬＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列であって、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号２９〜４０のいずれか１つに記載されている、アミノ酸配列と、（ｉｉ）重鎖可変領域の３つ全てのＨＣＤＲにわたって少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１７〜２８のいずれか１つに記載されている、アミノ酸配列と、を含む。
【００３３】
様々な実施形態では、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、インターロイキン２（ＩＬ−２）に結合する抗体を提供し、（ａ）軽鎖可変領域は、少なくとも配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号３１、３４、３７、もしくは４０、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含み、かつ／あるいは（ｂ）重鎖可変領域は、少なくとも配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１９、２２、２５、もしくは２８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む。
【００３４】
様々な実施形態では、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、ＩＬ−２に結合する抗体を提供し、（ａ）軽鎖可変領域は、少なくとも配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、もしくはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、もしくはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号３１、３４、３７、もしくは４０、もしくはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含み、かつ／あるいは（ｂ）重鎖可変領域は、少なくとも配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、もしくはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、もしくはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１９、２２、２５、もしくは２８、もしくはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２受容体アルファ（ＩＬ−２  Ｒ−α）サブユニットとのＩＬ−２の結合を阻害する。関連する実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２  Ｒβγ複合体へのＩＬ−２の結合を完全には遮断しない。
【００３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、ＩＬ−２Ｒγ、および／またはＩＬ−２  ＲβγへのＩＬ−２の結合に対してアロステリックな部位で結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２に結合し、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、および／またはγｃへの結合優先度に影響を及ぼす立体構造変化を誘導する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２  Ｒβγ複合体へのＩＬ−２の結合のＥＣ５０を３倍超シフトさせない。
【００３８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩＬ−２とのＩＬ−２  Ｒの刺激に応じて細胞におけるＳＴＡＴ５活性化を阻害する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、重鎖定常領域をさらに含み、当該重鎖定常領域は、修飾もしくは非修飾のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００４０】
ある特定の実施形態では、１つ以上の軽鎖フレームワークアミノ酸が、別のヒト抗体アミノ酸配列からの対応するアミノ酸（複数可）で置き換えられている抗体が提供され、当該フレームワークは、任意選択で、図１２に示される変化のうちの１つ以上を含む。
【００４１】
一態様では、本開示の抗体は、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、またはＸＰＡ．９２．０９９からなる群から選択される。
【００４２】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、軽鎖可変領域に結合したヒト軽鎖定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖定常領域は、修飾もしくは非修飾ラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらの断片、またはそれらの組み合わせである。
【００４３】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。様々な実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６に記載されている。
【００４４】
さらなる態様では、本開示は、発現制御配列に作動可能に連結された、本明細書において企図される核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示の発現ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞もまた企図される。ある特定の実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含み、重鎖および軽鎖核酸は、異なる核酸によって、または同じ核酸上で発現される。
【００４５】
関連する態様では、本開示は、本明細書に記載される宿主細胞を使用して抗体を産生する方法を提供し、当該方法は、好適な条件下で宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む。本明細書に開示される方法によって産生された抗体もまた提供される。
【００４６】
本開示はさらに、本明細書に開示される抗体と薬学的に許容される担体とを含む滅菌医薬組成物を企図する。
【００４７】
別の態様では、本開示は、ＩＬ−２活性の抑制を必要とする患者においてＩＬ−２活性を抑制するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。様々な実施形態では、当該方法が、制御性Ｔ細胞／ＣＤ２５  ｈｉ、Ｔエフェクター／ＣＤ  ２５  ｌｏ、および／または高親和性三量体ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２  Ｒαβγ）もしくはＩＬ−２Ｒαなどの細胞集団におけるＩＬ−２活性を抑制することが企図されている。
【００４８】
別の態様では、本開示は、インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターロイキン２受容体（ＩＬ−２  Ｒ）の発現または活性の増加に関連付けられる疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００４９】
様々な実施形態では、本開示は、インターロイキン２（ＩＬ−２）シグナル伝達の調節が対象における免疫応答を改善させるのに有益である疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００５０】
別の態様では、本開示は、がん、微生物感染、喘息、および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患、状態、または障害を治療するための方法を提供する。
【００５１】
様々な実施形態では、がんは、黒色腫、腎細胞癌、リンパ腫、肉腫、乳癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、頭頚部癌、皮膚癌、および扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される。
【００５２】
様々な実施形態では、微生物感染は、ウイルス、細菌、または真菌感染である。
【００５３】
様々な実施形態では、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することは、対象における腫瘍体積を低減させる。
【００５４】
様々な実施形態では、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することは、対象におけるＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を増加させる。様々な実施形態では、抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を、少なくとも約１倍、任意選択で最大で１００倍増加させる。他の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞対ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を、少なくとも１〜１００倍、１０〜１００倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、または１００倍増加させることができる。
【００５５】
様々な実施形態では、本明細書に開示される抗体は、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、筋肉内、皮内、または皮下に投与される。
【００５６】
様々な実施形態では、本明細書に開示される抗体は、第２の薬剤と併用して投与される。関連する実施形態では、第２の薬剤は、ＩＬ−２、ＩＬ−２バリアント、もしくはＩＬ−２レベルを増加させることができる薬剤、チェックポイント阻害剤、ＣＡＲＴ／ＴＩＬ薬剤、腫瘍抗原に対する抗体、またはワクチンである。関連する実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤からなる群から選択される。
【００５７】
様々な実施形態では、抗体がＩＬ−２と併用して投与される場合、ＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントおよびＩＬ−２抗体は、１：１モル比で投与される。様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体をＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントと併用して投与することは、ＩＬ−２の治療指数（ＴＩ）を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍以上増加させる。
【００５８】
様々な実施形態では、抗体が、ＩＬ−２、およびチェックポイント阻害剤、ＣＡＲＴ／ＴＩＬ薬剤、腫瘍抗原に対する抗体、またはワクチンなどの第２の薬剤と併用して投与され得ることが企図される。
【００５９】
様々な実施形態では、ＩＬ−２と併用して、また任意選択でチェックポイント阻害剤または他の補助的腫瘍学的治療薬と併用して、ＩＬ−２抗体を投与することであって、それにより非ＩＬ−２応答性腫瘍型に対する効果が、増殖および／または転移の阻害に対して感受性となる、投与することを含む、疾患、例えば、がんを治療する方法が本明細書に提供される。
【００６０】
様々な実施形態では、ＩＬ−２は、本明細書に記載される別の第２の薬剤の投与を伴うかまたは伴わずに、投与前に抗体と複合体化されてもよい。
【００６１】
様々な実施形態では、本明細書に開示される抗体は、１週間に１回、２週間ごとに１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回、または３カ月ごとに１回もしくはそれよりも少ない頻度で投与される。
【００６２】
様々な実施形態では、ＩＬ−２およびＩＬ−２抗体が予め混合されている場合、当該薬剤は、１週間に２回一緒に投与されてもよい。様々な実施形態では、ＩＬ−２は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、静脈内に投与される。
【００６３】
Ｉｌ−２抗体と関連するＩＬ−２を添加する場合、ＩＬ−２が、順次に、例えば同じ日に投与されることが企図され、ある特定の実施形態では、ＩＬ−２抗体は、ＩＬ−２の投与の前に投与される。様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、１週間に１回投与され、１週間に１回または１週間に複数回のＩＬ−２の投与が抗体の投与に続く。
【００６４】
様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、１週間に１回投与され、ＩＬ−２治療薬（例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）は、既知の処方スケジュールで、かつより低いＩＬ−２用量で投与される。
【００６５】
様々な実施形態では、本開示は、ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒの発現または活性の増加または減少に関連付けられる状態または障害の治療において、本明細書に開示される抗体を含む組成物または医薬組成物を投与するための方法を提供する。
【００６６】
一態様では、本開示は、細胞におけるＩＬ−２活性を調節するための方法であって、当該細胞を、当該細胞におけるＩＬ−２活性を調節するのに有効な量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物と接触させる工程を含む、方法を提供する。
【００６７】
ＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒの発現または活性に関連付けられる本明細書に記載される障害のいずれかの治療のための、ＩＬ−２に結合する本開示の前述の抗体もしくは組成物のいずれかを含む組成物、または医薬品の調製におけるその使用もまた企図されている。任意選択で使用のための好適な指示書と共に、前述の抗体または組成物のいずれかを含むシリンジ、例えば単回使用もしくはプレフィルドシリンジ、滅菌密封容器、例えばバイアル、ボトル、容器、および／またはキットもしくはパッケージもまた企図される。
【００６８】
本明細書に記載される各特徴もしくは実施形態、または組み合わせは、本発明の態様のいずれかの非限定的で例示的な例であり、そのため、本明細書に記載される任意の他の特徴もしくは実施形態、または組み合わせと組み合わせ可能であることが意図される。例えば、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「ある特定の実施形態」、「さらなる実施形態」、「特定の例示的な実施形態」、および／または「別の実施形態」などの表現で特徴が記載される場合、これらの実施形態の種類は、考えられるあらゆる組み合わせを列挙することを必要とすることなく、本明細書に記載される任意の他の特徴または特徴の組み合わせと組み合わされることが意図されている特徴の非限定的な例である。かかる特徴または特徴の組み合わせは、本発明の態様のいずれにも提供される。範囲内にある値の例が開示される場合、これらの例はいずれも、範囲の考えられる終点として企図され、かかる終点の間のあらゆる数値が企図され、上限および下限の終点のあらゆる組み合わせが想定される。
【００６９】
本明細書中の見出しは、読者の便宜のためであり、限定的であることを意図しない。本発明のさらなる態様、実施形態、および変形は、詳細な説明および／または図面および／または特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＸＰＡ．９２．０９９の配列に対する、選択されたクローンの重鎖および軽鎖の複数の配列アラインメントを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、可変ＩＬ−２濃度の存在下での、ＩＬ−２  ＲβまたはＩＬ−２  Ｒβγを発現する細胞へのＸＰＡ．９２．０１９（図２Ａ）、ＸＰＡ．９２．０４１（図２Ｂ）、ＸＰＡ．９２．０４２（図２Ｃ）、ＸＰＡ．９２．０９９（図２Ｄ）の結合の測定値を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、固定濃度のＩＬ−２（１００ｎＭ）の不在下および存在下での、ＸＰＡ．９２．０１９（図３Ａ）、ＸＰＡ．９２．０４１（図３Ｂ）、およびＸＰＡ．９２．０４２（図３Ｃ）抗体の力価測定、ならびにＩＬ−２  ＲβまたはＩＬ−２  Ｒβγを発現する細胞への結合の測定値を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、０．００１〜１００ｎｇ／ｍＬの抗ＩＬ−２抗体または対照の存在下での、ＩＬ−２に対するＢａＦ３−ＩＬ−２  Ｒβγ（図４Ａ）、ＮＫ−９２（図４Ｂ）、およびＣＴＬＬ−２（図４Ｃ）細胞のＩＬ−２に対する増殖応答を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＮＫ９２（図５Ａ）、ＢａＦ３−ＩＬ−２  Ｒβγ（図５Ｂ）、およびＣＴＬＬ−２細胞（図５Ｃ）のＩＬ−２誘導性増殖について、ＥＣ５０シフトとしてのＩＬ−２抗体の効果を示す。
【図６】図６は、異なる種のＩＬ−２配列のアラインメントおよびＩＬ−２タンパク質上のＩＬ−２  Ｒアルファ鎖結合部位を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、抗ＩＬ−２抗体複合体または対照の存在下での、ヒトＮＫ−９２（図７Ａ）、ヒト初代ＮＫ細胞（Ｒα枯渇）（図７Ｂ）、またはマウス初代ＮＫ細胞（図７Ｃ）におけるＳＴＡＴ５のＩＬ−２誘導性リン酸化を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｇは、脾臓中のＴ細胞およびＮＫ細胞サブセットの出現頻度のグラフ表示を示す：ＩＬ−２／抗体複合体のインビボ投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスの、ＣＤ８＋の割合（図８Ａ）；ＣＤ４＋の割合（図８Ｂ）；ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉの割合（図８Ｃ）；ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＣＤ２５ｈｉの割合（図８Ｄ）；ＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の比（図８Ｅ）；ＮＫ細胞の割合（図８Ｆ）、およびＮＫ細胞による平均グランザイムＢ（ＧＲＺＢ）産生（図８Ｇ）。
【図９】図９Ａ〜９Ｆは、ビヒクル対照（図９Ａ）、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（図９Ｂ）、抗ＰＤ−１抗体単独（図９Ｃ）、ＩＬ−２／ｍＡｂ、ＸＰＡ．９２．０９９＋抗ＰＤ−１抗体（図９Ｄ）、抗ＣＴＬＡ−４抗体単独（図９Ｅ）、およびＩＬ−２／ｍＡｂ、ＸＰＡ．９２．０９９＋抗ＣＴＬＡ−４抗体（図９Ｆ）で治療した、皮下ＬＬＣ異種移植マウスモデルにおける個々の腫瘍の応答を示す。各グラフ中、２９日目の線は治療の最終日を表す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（ＩＬ−２ｃｘ）ならびに抗ＰＤ−１抗体単独療法および併用療法で治療した皮下ＬＬＣ異種移植マウスの、平均腫瘍サイズ（図１０Ａ）および後の生存率（図１０Ｂ）を示す。エラーバーは、平均値の＋／−標準誤差（ＳＥＭ）を表し、アーム当たりｎ＝１５マウスである。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（ＸＰＡ．９２．０１９もしくはＸＰＡ．９２．０９９  ＩＬ−２抗体を使用）単独で、または抗ＰＤ−１抗体と併用して治療した皮下ＬＬＣ異種移植マウスモデルからのＴ細胞サブセットの百分率のグラフ表示を示す（ＣＤ８＋の割合、図１１Ａ；ＣＤ８＋のＣＤ４４＋、図１１Ｂ；ＣＤ４＋、図１１Ｃ；ＣＤ４＋のＣＤ２５＋、図１１Ｄ；ＣＤ８＋のＩＦＮγ＋、図１１Ｅ；ＣＤ８＋／ＣＤ４＋比、図１１Ｆ）。
【図１２】図１２は、ＩＭＧＴシステムによって指定された、ＩＬ−２抗体、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９の重鎖および軽鎖の可変領域および相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列および対応する配列（ＩＤ）番号（ＮＯ）を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、２００ｎＭの固定濃度の示された抗体と予め複合体化された様々な用量のＩＬ−２で２４時間治療したヒトＰＢＭＣの分析を示す。ＮＫ細胞マーカーおよびＣＤ６９発現のために試料を染色し、フローサイトメトリーによって分析し、リンパ球／ＣＤ３−／ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔにゲートをかけた。ドナー６０３（図１３Ａ）およびドナー６２５（図１３Ｂ）について、ＩＬ−２濃度に対してＣＤ６９の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をプロットした。ＩＬ−２単独に対する抗体治療曲線からのＥＣ５０値の倍数シフトを判定した（図１３Ｃ）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、２００ｎＭの固定濃度の示された抗体と予め複合体化された様々な用量のＩＬ−２で２４時間治療したヒトＰＢＭＣを示す。ＴｒｅｇマーカーおよびＣＤ６９発現のために試料を染色し、フローサイトメトリーによって分析し、リンパ球／ＣＤ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−にゲートをかけた。ドナー６０３（図１４Ａ）およびドナー６２５（図１４Ｂ）について、ＩＬ−２濃度に対してＣＤ６９のＭＦＩをプロットした。ＩＬ−２単独に対する抗体治療曲線からのＥＣ５０値の倍数シフトを判定した（図１４Ｃ）。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、２００ｎＭの固定濃度の示された抗体と予め複合体化された様々な用量のＩＬ−２で２４時間治療したヒトＰＢＭＣのＴｒｅｇホメオスタシスを示す。Ｔｒｅｇマーカーのために試料を染色し、フローサイトメトリーによって分析し、リンパ球／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−にゲートをかけた。ドナー６０３（図１５Ａ）およびドナー６２５（図１５Ｂ）について、全ＣＤ４＋集団のＴｒｅｇの出現頻度が示される。
【図１６】図１６は、ＣＴ２６結腸癌細胞を受け、ＩＬ−２単独で治療した動物における、腫瘍増殖帰結の分析結果を示す。
【図１７】図１７は、ＣＴ２６結腸癌細胞、および異なるモル比のＩＬ２：ｍＡｂ  ＩＬ２を受ける動物における腫瘍増殖帰結を示し、１：１比の抗体対ＩＬ−２を受ける動物が、他の比のＩＬ−２／抗体併用治療を受ける動物と比較して改善された効力を有したことを実証する。
【図１８】図１８は、１：１または２：１モル比のｍＡｂ：ＩＬ２複合体で治療した動物における結腸細胞株のより遅い腫瘍増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明は、インターロイキン２（ＩＬ−２）に対するヒト抗体に関する材料、方法、および使用を提供する。特に、本開示は、がんの治療におけるかかる抗体の使用方法を提供する。
【００７２】
本開示は、ＩＬ−２と相互作用し、ＩＬ−２活性、例えば、結合パートナーＩＬ−２  Ｒα、ＩＬ−２  Ｒαβγ、およびＩＬ−２  Ｒβγを介したシグナル伝達などを調節する分子または薬剤を提供する。本開示は、がん、微生物感染、喘息、および自己免疫疾患を治療するための治療薬を提供する。本明細書に開示される組成物は、有利に、腫瘍における免疫細胞活性を調節する能力を有し、それにより、一態様では、腫瘍の増殖に直接的または間接的に影響を及ぼす細胞集団に影響を及ぼすことによってがんを治療する方法を提供する。
【００７３】
定義
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定的であることは意図しない。
【００７４】
本明細書で使用される「ＣＨＯ」は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を指す。
【００７５】
本明細書で使用される「ＣＨＯ−Ｋ１」は、親ＣＨＯ細胞株のサブクローンを指し、これは、成体チャイニーズの卵巣に由来した。
【００７６】
本明細書で使用される「ＩＬ−２」は、インターロイキン２を指す。
【００７７】
本明細書で使用される「ＩＬ−２  Ｒ」は、インターロイキン２受容体を指す。ＩＬ−２  Ｒは、３つの鎖またはサブユニット、ＩＬ−２  Ｒα（別名、ＣＤ２５）、ＩＬ−２  Ｒβ（別名、ＣＤ１２２）、および共通ガンマ鎖γｃ（別名、ＣＤ１３２）からなる。「ＩＬ−２Ｒβおよびγｃ」という用語は、αサブユニットを欠き、かつβおよびγサブユニットを含むＩＬ−２Ｒを指すように、「ＩＬ−２Ｒβγ」という用語と互換的に使用される。
【００７８】
本明細書で使用される「Ｔｒｅｇ」または「Ｔｒｅｇｓ」は、制御性Ｔ細胞を指す。
【００７９】
「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の生物活性を呈する限り、完全集合抗体（ｆｕｌｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、四量体抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗原断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディ、Ｆｃａｂ）、および前述のものを含む組換えペプチドが含まれる。「免疫グロブリン」または「四量体抗体」は、各々が可変領域および定常領域を含む２つの重鎖および２つの軽鎖からなる四量体糖タンパク質である。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術、または無傷抗体の酵素切断もしくは化学的切断によって産生され得る。抗体断片または抗原結合部分には、抗体が所望の生物活性を保持する限り、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体；キレート化組換え抗体（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、トリボディもしくはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそれらのバリアントもしくは誘導体、およびポリペプチドの特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチド、例えば、１、２、３、４、５、または６個のＣＤＲ配列が含まれる。
【００８０】
「免疫グロブリン」または「天然抗体」は、四量体糖タンパク質である。天然型免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびエプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合しており、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全目的のためにその全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗原結合部位を形成する。
【００８１】
本明細書で使用される「重鎖可変領域」は、当該抗体重鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。重鎖可変領域は、当該抗体重鎖の１、２、または３つのＣＤＲを含有し得る。
【００８２】
本明細書で使用される「軽鎖可変領域」は、当該抗体軽鎖可変ドメインの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体分子の領域を指す。軽鎖可変領域は、抗体によってカッパまたはラムダ軽鎖であり得る当該抗体軽鎖の１、２、または３つのＣＤＲを含有し得る。
【００８３】
「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然型変異の可能性を除いて同一である）から得た抗体を指す。
【００８４】
本明細書で使用される「抗体バリアント」は、参照抗体可変領域ドメインの可変領域において少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有する抗体ポリペプチド配列を指す。バリアントは、非修飾抗体と実質的に同種または実質的に同一であり得る。
【００８５】
本明細書で使用される「キメラ抗体」は、典型的には異なる種に由来する２つの異なる抗体に由来する配列を含有する抗体を指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびげっ歯類抗体断片、一般的にはヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００８６】
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原の生物学的機能を排除するかまたは大幅に低減させることができる抗体分子である。したがって、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合、または細胞内シグナル伝達などの生物学的機能を排除するかまたは大幅に低減させることができる。
【００８７】
「単離された」抗体は、同定され、その天然環境の成分から分離および回収されたものである。その天然環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用に干渉する物質であり、これには酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。様々な実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって判定した場合、９５重量％超の抗体、および最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用して還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる同種性が得られるまで、精製される。単離された抗体には、組換え細胞内の原位置の抗体が含まれ、これは抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しなくなるためである。しかしながら、通常、抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、標的に「特異的に結合する」、「それに対して特異的である」、または標的抗原に対して「免疫応答性」である抗体は、同様の抗原よりも大きい親和性で標的抗原に結合する抗体または抗体物質を指す。本開示の一態様では、標的結合ポリペプチド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、他の種、すなわち非ヒト種の標的へのその結合親和性と比較して、ヒト標的により大きい親和性で結合するが、標的のオルソログを認識し、かつそれに結合するポリペプチドへの結合は、提供される範囲内である。
【００８９】
例えば、その同族の抗原「に対して特異的である」抗体またはその断片であるポリペプチドは、抗体の可変領域が、検出可能な優先度で目的のポリペプチドを認識し、かつそれに結合することを示す（すなわち、ファミリーメンバー間の局在化した配列同一性、相同性、または類似性の存在の可能性にもかかわらず、結合親和性における測定可能な差によって同じファミリーの他の既知のポリペプチドから目的のポリペプチドを識別することができる）。特異的抗体は、抗体の可変領域の外側、および特に分子の定常領域内の配列との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術におけるＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡまたは他の抗体）とも相互作用し得ることが理解されよう。本開示の方法における使用のための抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは周知であり、当該技術分野でルーチン的に実践されている。かかるアッセイの包括的な考察については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。本方法における使用のための抗体は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して産生することができる。
【００９０】
「エピトープ」という用語は、抗原結合領域のうちの１つ以上において抗体などの選択的結合剤によって認識され、かつ結合されることができる任意の分子の部分を指す。エピトープは通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの化学活性表面基からなり、特異的な三次元構造特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有する。本明細書で使用されるエピトープは、連続していても連続していなくてもよい。さらに、エピトープは、それらが、抗体を生成するために使用されるエピトープと同一の三次元構造を有するが、抗体免疫応答を刺激するために使用された標的に見出されるアミノ酸残基を含まないかまたはいくつかのみを含むという点で、模倣性（ミモトープ）であり得る。本明細書で使用される場合、ミモトープは、選択的結合剤によって結合されたエピトープと異なる抗原とは見なされず、選択的結合剤は、エピトープおよびミモトープの同じ三次元構造を認識する。
【００９１】
本開示の抗体物質およびポリペプチドに関連して使用される場合の「誘導体」という用語は、ユビキチン化、治療剤または診断剤へのコンジュゲーション、標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの共有ポリマー結合、およびオルニチンなどのアミノ酸の化学的合成による挿入または置換などの技術によって化学的に修飾されたポリペプチドを指し、これらは通常、ヒトタンパク質において生じない。誘導体は、本開示の誘導体化されていない分子の結合特性を保持する。
【００９２】
「治療有効量」という用語は、本明細書において、治療される疾患の症状または徴候を改善させるかまたは減らすのに有効な本開示の標的特異的組成物の量を示す。
【００９３】
本明細書の方法に関して使用される「治療する」、「治療された」、「治療すること」、および「治療」という用語は、事象、疾患、または状態の臨床症状、発症、または進行を一時的または永続的に、部分的または完全に排除、低減、抑制、または改善することを指す。かかる治療は、有用であるために絶対的である必要はない。
【００９４】
本方法は、本明細書に記載される例示的な配列を含み得る標的特異的抗体、その断片、バリアント、および誘導体、本明細書に引用される標的特異的抗体を含む医薬製剤の使用を提供する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り当てられ得、これらはさらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は周知である。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有し、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、ＡＤＣＣ活性を有する。本明細書に開示される抗体は、それが定常ドメインを含む場合、これらのサブクラスまたはアイソタイプのいずれかであり得る。
【００９５】
本開示は、図１２に記載される例示的な配列を含み得る標的特異的抗体、その断片、バリアント、および誘導体、上記に引用される標的特異的抗体を含む医薬製剤、医薬製剤を調製する方法、ならびに医薬製剤および化合物を用いて患者を治療する方法を提供する。本明細書に記載され、かつ本方法において使用される抗体は、約２×１０−９Ｍ以下、または約１×１０−１０Ｍ、または約１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、または１０−１３  Ｍ以下、または１０−１０〜１０−１３ＭのＫＤの、１つ以上のＩＬ−２抗原に対する結合親和性を呈し得る。かかる親和性は、従来の技術を使用して、例えば、平衡透析によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、製造業者によって概説された一般的な手順を使用してＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００器具）を使用することによって、１２５Ｉ標識化標的抗原を使用した放射免疫測定によって、または以下の実施例に記載されるかもしくは当業者に既知である別の方法によって、容易に判定され得る。親和性データは、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｎ  ＮＹ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１：６６０，１９４９）の方法によって分析され得る。
【００９６】
ＫｉｎＥｘＡ動的排除アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）も抗体のその抗原に対する親和性を測定するのに有用である。ＫｉｎＥｘＡ技術は、溶液相と固体層との間の結合事象ではなく、溶液相中の結合事象を測定する。さらに、結合事象を測定するための多くの方法は少なくとも１つの反応物質が固定化または標識化によって修飾されることを必要とする一方、ＫｉｎＥｘＡ法は、研究中の分子の修飾を必要としない。ＫｉｎＥｘＡ法は、現在利用可能である他の方法よりも幅広い結合定数が測定されることを可能とすると考えられている。ＫｉｎＥｘＡデバイスおよび抗体特性評価のための操作は、製造業者（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）から入手可能であり、公開文献、例えば、米国特許第６，６６４，１１４号およびＤａｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２：６４７−６５７（２００４）に見出すことができる。
【００９７】
インターロイキン２（ＩＬ−２）
インターロイキン２（ＩＬ−２）は、サイトカインの４つのαヘリックス束ファミリーのメンバーである、１５ｋＤａのペプチドである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７，２９−６０（２００９））。これはＴ細胞増殖因子として１９７６年に最初に同定され、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）、リンパ球馴化培地（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＬＣＭ）因子、Ｔ細胞分裂促進因子（ＴＭＦ）、キラーヘルパー因子（ＫＨＦ）、およびＴ細胞置換因子（ＴＲＦ）を含む多様な名称で称されてきた（Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｐ  ８１−９６（１９９２）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ  １１３−１２５（２００１））。ＩＬ−２は、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって、次に活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞によって、ならびにより小さい程度で活性化樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む多くの細胞によって産生される。ＩＬ−２は、ナイーブＴ細胞上のＴＣＲおよびＣＤ２８などの共刺激分子が結合すると急速かつ一時的に産生される。ＩＬ−２分泌の一過性の性質は、ＴＣＲシグナルによる転写誘導および共刺激シグナルによるＩＬ−２  ｍＲＮＡの安定化、続いてＩＬ−２遺伝子の転写サイレンシングおよびＩＬ−２  ｍＲＮＡの急速な分解に依拠する。ＩＬ−２がその自己産生を阻害する、典型的な自己調節的フィードバックループが近年記載されている（Ｍａｌｅｋ  ＴＲ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６，４５３−４７９（２００８））。
【００９８】
初めは免疫刺激因子と考えられていたが、後の研究において免疫寛容における役割も明かされた（Ｍａｌｅｋ  ＴＲ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６，４５３−４７９（２００８））。現在では、ＩＬ−２が複雑な役割を有し、免疫活性化、特異的記憶、および免疫寛容の維持に寄与することが広く認められている（Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｔ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（３）Ｓ１６１−１６７（２００２）、Ｂａｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｏｘｅｎｉｕｓ，ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ８，１１４２−１１４８（２００７））。ＩＬ−２刺激の特定の効果は、例えば、ヘルパーＴ細胞の存在、ＣＤ２８シグナル伝達を介した共刺激、および制御性Ｔ細胞による抑制など要因を含む、生物学的文脈に依拠する。この生物学的文脈の一部は、異なる細胞型上の３つのＩＬ−２受容体鎖の示差的発現を介して、かつ急性抗原刺激または慢性感染症などの異なる条件下で媒介される。さらに、ＩＬ−２およびその受容体は、ポジティブおよびネガティブフィードバック機構の両方によって制御されている（Ｂｏｙｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅｎｔ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，１８０−１９０（２０１２））。
【００９９】
ＩＬ−２ムテイン
ＩＬ−２バリアント（ムテイン）は、野生型ＩＬ−２と比較して改善された治療効果を有し得る。ＩＬ−２  Ｒβに対する結合親和性が減少したＩＬ−２ムテイン、例えばＢＡＹ  ５０−４７９８（ＩＬ−２のＮ８８Ｒ変異を含有する）およびＳｅｌｅｃｔｉｋｉｎｅ（ＩＬ−２のＤ２０Ｔ変異を持つ）が生成されている（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１９７−１２０２（２０００）、Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．”Ｍｅｄ．”１１，５（２０１３）。しかしながら、臨床試験で試験されたとき、これらのＩＬ−２ムテインは、患者における毒性の減少を示さなかった。ＩＬ−２  Ｒαに対する結合親和性が減少したＩＬ−２ムテイン（例えば、「ｎｏ−αムテイン」ＧＡ５０１およびＧＡ５０４が生成されている（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：６２３０−３８（２０１３）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３，４８６（２０１３））。アゴニスティックＩＬ−２ムテインＨ９およびＤ１０（別名、ＩＬ−２スーパーカイン）は、２００倍増加した親和性でＩＬ−２  Ｒβと会合し、ＩＬ−２  Ｒαを必要とせずに二量体ＩＬ−２Ｒに効率的に結合した。かかる結合は、インビトロおよびインビボでのＳＴＡＴ５リン酸化および細胞増殖の増加をもたらした（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９−３３（２０１２））。Ｈ９変異体Ｈ９−ＲＥＴＲは、Ｈ９内に４つの変異（Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、およびＳ１３０Ｒ）を導入することによって操作され、ＩＬ−２  Ｒβ結合を保持したが、大幅に減少したγｃに対する親和性を実証した（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２：８１５−２５）。ＩＬ−２ムテインはまた、ＷＯ２０１４／１０００１４、ＷＯ２０１５１６４８１５、ＷＯ２０５／１１８０１６、ＷＯ２０１６／０３０３５０、ＵＳ８，７５９，４８６、およびＵＳ９，２６６，９３８に記載されている。
【０１００】
インターロイキン２受容体（ＩＬ−２  Ｒ）
ＩＬ−２の受容体は、３つの鎖、ＩＬ−２  Ｒα（別名、ＣＤ２５）、ＩＬ−２  Ｒβ（別名、ＣＤ１２２）、および共通ガンマ鎖γｃ（別名、ＣＤ１３２）からなる。３つの受容体鎖は、様々な細胞型上に別個に、かつ異なって発現される。ＩＬ−２は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ、およびＭＡＰＫ経路などの細胞経路を活性化させるＩＬ−２  Ｒβとγｃとの間の相互作用を介してシグナル伝達する。ＩＬ−２  Ｒαとの相互作用を介してＩＬ−２に対するより高い感受性が付与され、これによりＩＬ−２に独立して結合し、他の２つの鎖との会合を促進して、高親和性三量体受容体複合体を形成することができる（Ｍａｌｅｋ  ＴＲ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６，４５３−４７９（２００８））。Ｔａｃ抗原とも称されるＩＬ−２  ＲαはＩＬ−２に対して特異的である一方、ＩＬ−２  Ｒβは、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の両方によって利用され、共通β鎖と称されることもある。共通γ鎖とも称されるＩＬ−２  Ｒγは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１を含むいくつかのサイトカインによって共有される（Ｍａｌｅｋ  ＴＲ，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６，４５３−４７９（２００８）、Ｓｍｉｔｈ  ＫＡ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｐ  １４５９−１４６９（２００１）、Ｂｏｙｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅｎｔ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，１８０−１９０（２０１２））。
【０１０１】
治療薬としてのＩＬ−２
ＩＬ−２の組換え修飾版（アルデスロイキン）は、１９９２年に転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）、および１９９８年に転移性黒色腫（ＭＭ）の治療のために米国ＦＤＡによって承認された。これは患者のサブセットにおける生存率の改善に有効であり、わずかな割合の患者において恒久的、完全、および明白に治癒的な退縮をもたらすことが示されている（Ｄｕｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２６）（２０１４）、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９２，５４５１−５４５８（２０１４））。同時に、大多数の患者は重度の副作用を経験し、これには多くの場合、血管漏出症候群（ＶＬＳ）、肺水腫、低血圧、腎損傷、ＣＮＳ障害、および心臓作用が含まれる。ほとんどの副作用は可逆的であるものの、治療の管理の必要性のため、専門免疫療法センターでの入院が必要となり、これは、治療への受け入れのための厳しい適格性要件と共に、アルデスロイキンの利用を制限している（Ｄｕｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２（２６）（２０１４））。アルデスロイキン治療の別の短所は、急速な腎クリアランスにより投与されるＩＬ−２の半減期が短くなるため、数週間にわたって５日間にかかる複数の静脈投与が必要となることである。
【０１０２】
ＩＬ−２の複数の役割ならびにそれらの根底の機構および相互作用の理解における近年の進歩は、ＩＬ−２活性の一見逆説的な効果の説明に役立っている。例えば、制御性Ｔ細胞は、高レベルのＩＬ−２  Ｒα（ＣＤ２５）を発現し、低レベルのＩＬ−２に対して感受性となる。したがって、低濃度のＩＬ−２での治療は、活性化前にＩＬ−２  Ｒαをほとんど発現しないエフェクターＴ細胞よりも抑制経路を刺激する可能性が高い。免疫抑制を提供することに加え、制御性Ｔ細胞はＩＬ−２のためのシンクも提供し、それによりエフェクターＴ細胞が活性化される可能性をさらに低減させ得る。合わせて、これらの効果は、応答率の低減に寄与し得、抗腫瘍応答を達成するための高用量のＩＬ−２治療の必要性を説明し得る（Ｂｏｙｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２，１８０−１９０（２０１２））。最後に、研究者らは、肺内皮細胞上のＩＬ−２受容体の発現を報告しており、これは、これらの細胞型に対するＩＬ−２の直接効果をもたらし得る。治療効果のために必要とされる高用量のＩＬ−２は、内皮細胞上の低レベルのＩＬ−２受容体を活性することができ、これが、ＶＬＳ、肺水腫、および低血圧をもたらす損傷に寄与し得ることが提唱されている（Ｂｏｙｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｐｒｅｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２，１８０−１９０（２０１２）、Ｒａｆｉ−Ｊａｎａｊｒｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３，１６１９−１６２７（１９９９）、Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７，１１９０６−１１９１１（２０１０）、Ｄｏｗｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，５８−６５（１９９２））。
【０１０３】
複数の手法が提案され、腫瘍学のためのＩＬ−２に基づく免疫療法における潜在的な改善として試験されており、これには、１）ＩＬ−２  Ｒβγとのその相互作用を低減させる（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，１１９７−１２０２（２０００））かもしくは増加させる（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８４，５２９−５３３（２０１２））か、またはＩＬ−２  Ｒαとのその相互作用を低減させる（Ｃｈａｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２２，６８０−６９０（２０１６）、米国特許第９，２６６，９３８号）ためのＩＬ−２の操作；２）ＩＬ−２融合またはコンジュゲーションによる半減期の増加（ＷＯ２０１２／０６５０８６、ＷＯ２０１３／１７７１８７、ＷＯ２０１５／１１８０１６）；３）抗受容体抗体を使用したＩＬ−２治療の増強（ＷＯ２００８／００３４７３）；４）がん抗原を標的とする抗体へのＩＬ−２のコンジュゲート（ＷＯ２０１６／０３０３５０、Ｓｕｊｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３４（１），８９−９７（２０１４））；５）ＩＬ−２  ＲαへのＩＬ−２の融合（ＷＯ２０１６／０２２６７１）；および６）ＩＬ−２活性を調節する抗ＩＬ−２抗体の使用（Ｂｏｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１，１９２４−１９２７（２００６）、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７，２１７１−２１７６（２０１０）、Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２，８１５−８２５（２０１５）、Ｔｏｍａｌａ  ａｎｄ  Ｋｏｖａｒ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（２０１６））（米国特許公開第２０１０／０３１０５０１号および同第２０１３／０１４２７５５号、ＷＯ２００７／０９５６４３、ＷＯ２０１４／１０８７４８、ＷＯ２０１５／１０９２１２、ＷＯ２０１６／００５９５０）が含まれる。ＩＬ−２受容体とのＩＬ−２相互作用を調節する抗ＩＬ−２抗体の複数の報告が公開されているが、これらは、この有望な手法の概念の証拠を示すためにマウス抗ヒトＩＬ−２または抗マウスＩＬ−２について記載している（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７，１１９０６−１１９１１（２０１０）、Ｂｏｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１，１９２４−１９２７（２００６）、Ｌｅｔｏｕｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７，２１７１−２１７６（２０１０））（米国特許公開第２０１３／０１４２７５５号）。理想的には治療用抗体はヒト起源のものであるが、マウスまたは他の種からヒト化された抗体も許容され得る。代理抗体の使用は、最終的な治療候補の活性を完全には再現しない場合がある結合特性の微細な差異の危険性をもたらす。複数の研究により、これらの抗体のエピトープにおける差異の機能的な結果が強調されている（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７，３１１（２０１５）、Ｒｏｊａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１８，１０５−１１３（２０１３）、Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２４，４２７−４４６（２０１２））���
【０１０４】
抗体
上記のように、「免疫グロブリン」または「天然抗体」は、四量体糖タンパク質である。天然型免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各重鎖は、一端において可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端において可変ドメイン（ＶＬ）、および他方の端部において定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列されている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）。
【０１０５】
免疫グロブリン可変ドメインは、３つの超可変領域またはＣＤＲによって結合した相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と同じ一般構造を呈する。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３，１９８９の定義に従う。
【０１０６】
抗体の超可変領域は、抗原結合を担う抗体のＣＤＲアミノ酸残基を指す。超可変領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基［例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によって記載されるように軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）］、ならびに／または超可変ループからの残基（例えば、［Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）］によって記載されるように軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）を含む。ＣＤＲはまた、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３）に従って同定および付番され、これは、軽鎖および重鎖可変ドメインにおけるＣＤＲ位置を以下のように記載する：ＣＤＲ１、およそ残基２７〜３８；ＣＤＲ２、およそ残基５６〜６５；およびＣＤＲ３、およそ残基１０５〜１１６（生殖系列）または残基１０５〜１１７（再配列）。一実施形態では、ＣＤＲは、本明細書に開示されるものとおよそ同様の長さの抗体重鎖または軽鎖の軽鎖可変ドメインにおいておよそ残基２６〜３１（Ｌ１）、４９〜５１（Ｌ２）、および８８〜９８（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいておよそ残基２６〜３３（Ｈ１）、５１〜５８（Ｈ２）、および９７〜１１０（Ｈ３）に位置することが企図される。しかしながら、当業者は、特定の抗体の配列が同定されるときにＣＤＲ残基の実際の位置が上記の予想される残基とは異なり得ることを理解する。
【０１０７】
フレームワークまたはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１０８】
モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得た抗体を指し、その集団の中で、混合における全ての抗体が、単一のクローンに由来する単一のアミノ酸配列を有する。モノクローナル抗体は、一般的に高度に特異的であり、単一の抗原部位またはエピトープを対象とする。対照的に、ポリクローナル抗体調製物は、典型的には、同じまたは異なる決定基（エピトープ）を対象とする多様なアミノ酸配列を有する抗体の混合を含む。それらの特異性に加え、モノクローナル抗体は、それらが、異なる特異性および特徴を有する他の免疫グロブリンが混入していない均質な培養物中で合成される点で有利である。
【０１０９】
下記のように、本明細書において企図されるモノクローナル、ヒト、ヒト化、および本明細書に記載される他の抗体を含む抗体は、典型的には、組換え生成されるか、またはインビトロもしくはインビボで遺伝子コードを操作する他の方法を介して生成され、したがって、天然に見出される特定の抗体を必ずしも反映しない。
【０１１０】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−７，１９７５）（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）に記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。モノクローナル抗体を産生するためのさらなる方法は当業者には周知である。
【０１１１】
上記の方法によって産生されたものなどのモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および／または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【０１１２】
ＩＬ−２抗体
本開示は、標的特異的抗体をコードするアミノ酸分子の使用を包含する。完全ヒト抗ヒトＩＬ−２抗体は、ファージディスプレイライブラリから生成された。本明細書に記載されるＩＬ−２抗体は、異なるＩＬ−２受容体鎖とのヒトＩＬ−２の相互作用を示差的に調節する。具体的には、その目的は、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃ結合およびシグナル伝達を許容しながら、ＩＬ−２  ＲαとのＩＬ−２の相互作用を防止または低減させることができる抗体を同定することであった。これを達成するために、抗リガンド抗体を同定するために、示差的ＩＬ−２調節特性を保有することが予想される異なる組み合わせのヒトＩＬ−２受容体鎖を発現するように操作された細胞を使用した新規のスクリーニング手法が生み出された。フローサイトメトリーに基づくスクリーニングを使用して、抗体を、ＩＬ−２制限に対するそれらの効果または操作された細胞株への結合の許容度に基づいて階層化した。目的の抗体もＩＬ−２と複合体化させ、３つ全ての受容体鎖またはＩＬ−２  Ｒβおよびγｃのみのいずれかを発現するＩＬ−２依存性細胞株を使用した機能アッセイにおいて試験した。インビボ試験により、これらの細胞株上で異なるパターンの活性を有する抗体が、マウスにおいてＴ細胞サブセットに対する示差的効果を媒介することが実証された。驚くべきことに、インビボでのＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の優先的の刺激において最も強い差異をもたらした抗体は、受容体結合許容度のハイブリッドパターンを保有した。例えば、ＩＬ−２  Ｒα結合を完全には遮断しない抗体は、インビボ治療後に、ＩＬ−２  Ｒα結合を完全に遮断した抗体より大きいＣＤ８＋／ＣＤ４＋比のＴ細胞をもたらした。ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞における最も大きいシフトをもたらした抗体が、ＩＬ−２  Ｒβγ細胞においてシグナル伝達の小程度の阻害を有したという発見も想定外であった。単独で、および他の免疫調節抗体と併用した、ｈＩＬ−２とこれらの抗体との複合体の腫瘍学モデルにおける試験は、免疫療法剤としてのそれらの潜在性をさらに実証した。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ヒト抗標的抗体のアミノ酸配列は、図１２、もしくは配列番号９、１１、１３、もしくは１５に記載される抗体ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、ＸＰＡ．９２．０９９の、またはそれらのバリアント（本明細書に記載されるヒト化抗体または任意の他のバリアントを含む）の成熟（すなわち、シグナル配列を欠く）軽鎖可変領域（ＶＬ）の１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬは、前述の抗体のいずれか１つの軽鎖のＣＤＲ１の始まりからＣＤＲ３の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
一実施形態では、標的特異的抗体は、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含み、これらの各々は独立して、配列番号９、１１、１３、または１５に記載されるＶＬ領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、配列番号９、１１、１３、もしくは１５に記載されるＶＬ領域をコードする核酸から選択されるか、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６に記載されるＶＬ領域をコードする核酸分子によってコードされる。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ヒト抗標的抗体のアミノ酸配列は、図１２、もしくは配列番号１、３、５、もしくは７に記載される抗体ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、ＸＰＡ．９２．０９９の、またはそれらのバリアント（本明細書に記載されるヒト化抗体または任意の他のバリアントを含む）の成熟（すなわち、シグナル配列を欠く）重鎖可変領域（ＶＨ）の１つ以上のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、前述の抗体のいずれか１つの重鎖のＣＤＲ１の始まりからＣＤＲ３の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
一実施形態では、標的特異的抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）を含み、これらの各々は独立して、配列番号１、３、５、もしくは７に記載されるＶＨ領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、配列番号１、３、５、もしくは７に記載されるＶＨ領域をコードする核酸から選択されるか、または配列番号２、４、６、もしくは８に記載されるＶＨ領域をコードする核酸分子によってコードされる。
【０１１７】
標的特異的抗体のポリペプチドは、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、またはＸＰＡ．９２．０９９からなる群から選択されるＶＨ領域のアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含み得る。
【０１１８】
別の実施形態では、抗体は、上記に開示される成熟軽鎖可変領域および上記に開示される成熟重鎖可変領域を含み、これらは任意選択で、図１２に記載されるように対形成している。
【０１１９】
例示的な実施形態では、本開示は、配列番号１７〜４０のうちのいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３のうちのいずれか１つ２、３、４、５、または６つをそれぞれ保持し、任意選択でかかるＣＤＲ（複数可）のいずれかにおける１つまたは２つの変異、例えば保存的または非保存的置換を含み、任意選択で図１２に記載されるように対形成している、モノクローナル抗体；配列番号１７〜２８のいずれか１つのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、または重鎖可変領域の全てを保持し、任意選択でかかるＣＤＲ（複数可）のいずれかにおける１つまたは２つの変異を含み、任意選択で任意の好適な重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＥをさらに含む、モノクローナル抗体、そのヒト配列、またはそのハイブリッド；配列番号２９〜４０のいずれか１つのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、または軽鎖可変領域の全てを保持し、任意選択でかかるＣＤＲ（複数可）のいずれかにおける１つまたは２つの変異を含み、任意の好適な軽鎖定常領域、例えばカッパまたはラムダ軽鎖定常領域をさらに含む、モノクローナル抗体、そのヒト配列、またはそのハイブリッドを企図する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、抗体は、３つ全ての軽鎖ＣＤＲ、３つ全ての重鎖ＣＤＲ、または図１２に記載されるように対形成している軽鎖および重鎖の６つ全てのＣＤＲを含む。いくつかの例示的な実施形態では、抗体由来の２つの軽鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第３の軽鎖ＣＤＲと組み合わされてもよい。代替的には、特にＣＤＲが高度に相同である場合には、１つの抗体由来のＬＣＤＲ１は、異なる抗体由来のＬＣＤＲ２およびなお別の抗体由来のＬＣＤＲ３と組み合わされてもよい。同様に、特にＣＤＲが高度に騒動である場合には、抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第３のＣＤＲと組み合わされてもよく、または１つの抗体由来のＨＣＤＲ１は、異なる抗体由来のＨＣＤＲ２およびなお別の抗体由来のＨＣＤＲ３と組み合わされてもよい。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、配列番号１、３、５、もしくは７に記載される重鎖可変領域と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号９、１１、１３、もしくは１５に記載される軽鎖可変領域と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上同一であるアミノ酸配列アミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供され、抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３のうちの少なくとも１、２、３、４、５、または全てをさらに含む抗体が提供される。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域との同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列は、軽鎖ＣＤＲのうちの１、２、または３つを含み得る。他の実施形態では、重鎖可変領域との同一性パーセンテージを有するアミノ酸配列は、重鎖ＣＤＲのうちの１、２、または３つを含み得る。
【０１２２】
別の実施形態では、図１２の抗体配列の重鎖可変領域中の３つ全てのＨＣＤＲまたは配列番号１７〜２８に記載されるＣＤＲと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１２３】
関連する実施形態では、図１２の抗体配列の軽鎖可変領域中の３つ全てのＬＣＤＲまたは配列番号２９〜４０に記載されるＣＤＲと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１２４】
さらなる実施形態では、図１２の抗体配列の重鎖および軽鎖可変領域中の６つ全てのＣＤＲまたは配列番号１７〜４０に記載されるＣＤＲと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供される。
【０１２５】
本開示の抗体は、抗体のＣＤＲ領域において１つもしくは２つ、またはそれ以上のアミノ酸置換、例えば、非保存的または保存的置換を有し得ることが企図される。
【０１２６】
関連する実施形態では、フレームワークの残基が改変されている。改変され得る重鎖フレームワーク領域は、重鎖ＣＤＲ残基を囲む、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、およびＨ−ＦＲ４と示される領域内にあり、改変され得る軽鎖フレームワーク領域の残基は、軽鎖ＣＤＲ残基を囲む、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３、およびＬ−ＦＲ４と示される領域内にある。フレームワーク領域内のアミノ酸は、例えば、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークにおいて同定される任意の好適なアミノ酸で置き換えられ得る。
【０１２７】
ＸＰＡ．９２．０１９の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１および９にそれぞれ記載されている。ＸＰＡ．９２．０４１の重鎖および軽鎖アミノ酸配列、配列番号３および１１にそれぞれ記載されている。ＸＰＡ．９２．０４２の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、配列番号５および１３にそれぞれ記載され、ＸＰＡ．９２．０９９の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、配列番号７および１５にそれぞれ記載されている。
【０１２８】
様々な実施形態では、抗体がＩＬ−２と複合体化され、かつ哺乳動物宿主に注射される場合、複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞、または腫瘍応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの１つ以上の増殖をもたらす。
【０１２９】
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体は、受容体サブユニット使用または生物活性に影響を及ぼすＩＬ−２における立体構造変化を誘導する。
【０１３０】
本開示の抗体は、当該技術分野であり、かつ本明細書に記載される抗体のより小さい抗原結合断片として使用され得ることがさらに企図される。
【０１３１】
抗体断片
抗体断片は、無傷の全長抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃａｂ、およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；多重特異性抗体断片、例えば二重特異性、三重特異性などの抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）；ミニボディ；キレート組換え抗体；トリボディまたはバイボディ；細胞内抗体；ナノボディ；小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ＶＨＨ含有抗体；および抗体断片から形成される他のポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１２６−３６、Ｅｙｅｒ＆Ｈｒｕｓｋａ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｎｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ  ５７：４３９−５１３，２０１２を参照されたい。
【０１３２】
抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメイからなる一価の断片である「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化するその能力をその名称が示す、残りの「Ｆｃ」断片と、を産生する。ペプチン処理は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、リンカーペプチドによって結合した抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とするポリペプチドリンカーをさらに含み、これによって一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）がもたらされ、この中でＶＬおよびＶＨ領域は対形成して、単一のタンパク質鎖として作製されることを可能とする合成リンカーを介して一価の分子を形成する（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。ｓｃＦｖの概説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．ｌ  １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。
【０１３３】
さらなる抗体断片には、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）が含まれる。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上での２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによりこれらのドメインに別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出す、二価の抗体である。（例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−６４４８，１９９３、およびＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照されたい）。ダイアボディは、二重特異性または単一特異性であり得る。
【０１３４】
軽鎖を欠く機能的重鎖抗体は、コモリザメ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３，１９９５）、ウォビゴンシャーク（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：３１３−２６，２００１）、ならびにラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびラマなどのラクダ科（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８，１９９３；Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：４１３，１９９８）において天然に存在する。これらの動物では、抗原結合部位は、単一のドメイン、ＶＨＨドメインに減っている。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成し、すなわち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と称される）。ラクダ化ＶＨＨは、報告によれば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有し、かつＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と組換えられる（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（上記））。例えば、ラマＩｇＧ１は、ＶＨがヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有する定常領域と組み替えられる従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプである一方、ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３は、ＣＨ１ドメインを欠き、かつ軽鎖を含有しない重鎖のみのアイソタイプである。ラクダ化ＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性を保有する（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，２００２）ことが見出されている。古典的なＶＨのみの断片は、可溶形態で産生することが困難であるが、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様になるように改変された場合に、可溶性および特異的結合の改善を得ることができる。（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１：２５−３８を参照されたい）。ラクダ化重鎖を有する抗体を生成するための方法は、例えば、米国特許公開第２００５／０１３６０４９号および同第２００５／００３７４２１号に記載されている。
【０１３５】
１５ｋＤａのみの分子量を有する完全に機能的な抗原結合断片である抗体重鎖の可変ドメインは、ナノボディと称される（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディライブラリは、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：２８０７−１２，２００１）に記載されるように免疫化したヒトコブラクダから、またはＲｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（１）：１１１−２４（２００５）に記載されるように組換え法を使用して生成され得る。
【０１３６】
二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディでは、ｓｃＦｖ分子がＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方または両方に融合し、例えば、トリボディを産生するために、２つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合する一方、バイボディにおいては１つのｓｃＦｖがＦａｂのＣ末端に融合する。さらなるＦａｂ系二重特異性フォーマットは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ７：４７０−４８２，２０１５に記載されている。
【０１３７】
ペプチドリンカーを介して（ヒンジレス）、またはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合したｓｃＦｖからなる「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−２３，２００４に記載されている。
【０１３８】
細胞内抗体は、細胞内発現を示し、かつ細胞内タンパク質機能を操作することができる一本鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．９：１０１−１０８，１９９０、Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。抗体構築物を細胞内領域に保持する細胞シグナル配列を含む細胞内抗体は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１，１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（ＦＡＳＥＢＪ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されるように産生され得る。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体に融合している細胞膜透過性抗体である（Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）。
【０１３９】
標的タンパク質に対して特異的であるＳＭＩＰまたは結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体がさらに企図される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実行するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、および米国特許公開第２００３／０１１８５９２号を参照されたい。
【０１４０】
１つ以上のＣＤＲを分子内に共有結合、または非共有結合のいずれかによって組み込んで、イムノアドヘシンとすることができる。イムノアドヘシンは、より大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（複数可）を組み込み得るか、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（複数可）と共有結合させ得るか、またはＣＤＲ（複数可）を非共有結合によって組み込み得る。ＣＤＲは、イムノアドヘシンが目的の特定の抗原に特異的に結合することを許容する。
【０１４１】
したがって、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１、２、および／または３つのＣＤＲ（例えば、任意選択でＣＤＲまたは反復の間にスペーサアミノ酸配列を含む、単独もしくはタンデムでの単一のＣＤＲ、ＣＤＲの２、３、もしくは他の複数の反復、または単独もしくはタンデム反復の２もしくは３つのＣＤＲの組み合わせ）を含む多様な組成物が、当該技術分野で既知の技術によって生成され得る。
【０１４２】
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体またはヒト化抗体は親非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体よりもヒトにおける免疫原性が低いため、それらは、はるかに低いアナフィラキシーの危険性を伴ってヒトの治療のために使用され得る。
【０１４３】
非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合しているキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の標準手順を使用して生成することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８１，６８４１−６８５５（１９８４）およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６，（１９８４）を参照されたい）。
【０１４４】
ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域にグラフトすること（当該技術分野において「ＣＤＲグラフト」によるヒト化と称されるプロセス）、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってそれらをヒト様表面と「クローキング」すること（当該技術分野において「ベニアリング」と称されるプロセス）、または代替的には、（３）抗原結合もしくはタンパク質フォールディングに悪影響を及ぼす可能性が低いが、ヒト環境において免疫原性を低減させる可能性が高いと判定された位置でヒトアミノ酸を置換すること（例えば、ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（商標））を含む多様な方法によって達成され得る。本開示において、ヒト化抗体は、「ＣＤＲグラフトされた」、「ヒト化」、「ベニアリングされた」、および「ＨＵＭＡＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ（商標）」抗体を含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７（１９９４）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４，１９９４、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６（１９９４）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）、およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４：７７３−７８３（１９９１）に開示されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれている。ＣＤＲグラフト技術は当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７（１９８８）を参照されたい。さらなる抗体ヒト化方法は、Ｓａｆｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．２９：１７５−８６，２０１３によって概説されている。
【０１４５】
トランスジェニック動物由来のヒト抗体
標的タンパク質に対するヒト抗体はまた、内因性免疫グロブリン産生を有さず、かつヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を使用して産生され得る。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性化により機能的内因性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示している。ＷＯ９１／００９０６はまた、免疫原に対する免疫応答を高めることができるトランスジェニックの非霊長類哺乳動物宿主を開示し、その抗体は、霊長類定常および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換または不活性化されている。ＷＯ９６／３０４９８および米国特許第６，０９１，００１号は、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を修飾して、例えば、定常または可変領域の全てまたは一部を置き換えて、修飾抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘシステムの使用を開示している。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、トランスジェニックマウスを作製する方法を開示し、そのマウスは、内因性重鎖を欠き、１つ以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する。米国特許第６，１１４，５９８号、同第６，６５７，１０３号、および同第６，８３３，２６８号、Ｇｒｅｅｎ  ＬＬ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１（１），７４−８４，２０１４、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：３５６−３６３，２０１４、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｏｗｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，９０１：１３７−４８，２０１２）も参照されたい。
【０１４６】
上記のトランスジェニック動物を使用して、選択された抗原分子に対する免疫応答を生み出すことができ、抗体産生細胞を動物から取り出し、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。免疫化プロトコル、アジュバントなどは当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるトランスジェニックマウスの免疫化に使用される。この公開は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９、および破傷風毒素を含む多様な抗原分子に対するモノクローナル抗体を開示している。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物活性または生理学的効果を阻害または中和させる能力について試験することができる。ＷＯ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫化したトランスジェニックマウスの免疫細胞由来のＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が好中球のＩＬ−８誘導性機能を遮断したことを開示している。トランスジェニック動物の免疫化に使用した抗原に対する特異性を有するヒトモノクローナル抗体は、ＷＯ９６／３４０９６、および米国特許公開第２００３／０１９４４０４号、および米国特許公開第２００３／００３１６６７号にも開示されている。
【０１４７】
モノクローナル抗体の作製に有用なさらなるトランスジェニック動物には、米国特許第５，７７０，４２９号およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６））に記載されるＭｅｄａｒｅｘ  ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）が含まれ、これは、ヒト抗体の重鎖および軽鎖についてコードする再配列されていないヒト抗体遺伝子由来の遺伝子配列を含有する。ＨｕＭＡｂ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の免疫化により、標的タンパク質に対する完全なヒトモノクローナル抗体の産生が可能となる。
【０１４８】
また、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．４：９１−１０２（２００２））は、ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（ＴＣＭＯＵＳＥ（商標））を記載し、これは、ヒトＤＮＡのメガベースサイズセグメントを含み、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座全体を組み込む。ＴＣＭＯＵＳＥ（商標）は、ＩｇＧの全てのサブクラス（ＩｇＧ１〜Ｇ４）を含む完全に多様なｈＩｇレパートリーを有する。様々なヒト抗原によるＴＣＭＯＵＳＥ（商標）の免疫化により、ヒト抗体を含む抗体応答が生み出される。
【０１４９】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）、ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号、および米国特許公開第２００２／０１９９２１３号も参照されたい。米国特許公開第２００３／００９２１２５号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせるための方法を記載している。ヒト抗体はまた、インビトロで活性化されたＢ細胞によって精製することができる（米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【０１５０】
ディスプレイ技術由来のヒト抗体
組換えヒト抗体のレパートリーを作製するための技術の発展、および繊維状バクテリオファージの表面上でのコードされた抗体断片のディスプレイは、ヒト抗体を直接作製するための手段を提供している。ファージ技術によって生成された抗体は、細菌において抗原結合断片（通常、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として産生され、したがって、エフェクター機能を欠いている。エフェクター機能は、２つの戦略のうちの１つによって導入することができる：断片は、例えば、哺乳動物細胞における発現のために完全抗体へと操作されるか、またはエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片へと操作され得る。
【０１５１】
例として、ファージディスプレイ技術における使用のための抗体のライブラリを調製するための１つの方法は、標的抗原またはその抗原部分を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を免疫化して免疫応答を生み出す工程と、免疫化した動物から抗体産生細胞を抽出する工程と、抽出した細胞からＲＮＡを単離する工程と、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生する工程と、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅する工程と、抗体がファージ上に発現されるようにｃＤＮＡをファージディスプレイベクター内に挿入する工程とを含む。本開示の組換え標的特異的抗体は、この方法で得ることができる。
【０１５２】
別の例では、抗体産生細胞が非免疫化動物から抽出され、抽出した細胞からＲＮＡが単離され、逆転写されて、ｃＤＮＡを産生し、プライマーを使用してこれが増幅され、抗体がファージ上に発現されるようにファージディスプレイベクター内に挿入されてもよい。ファージディスプレイプロセスは、繊維状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した免疫選択、およびその後の選択した抗原へのそれらの結合によるファージの選択を模倣する。１つのかかる技術は、ＷＯ９９／１０４９４に記載され、これは、かかるアプローチを使用した、ＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する高親和性および機能的アゴニスト抗体の単離を記載している。この開示の抗体は、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリ、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂファージディスプレイライブラリのスクリーニングによって単離することができる。かかるライブラリの調製およびスクリーニングのための方法論は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい。ファージディスプレイライブラリを生成するための市販のキットが存在する（例えば、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ．ＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリの生成およびスクリーニングに使用することができる他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号、Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号、Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９��４１３３−４１３７、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２、およびＯｍｉｄｆａｒ＆Ｄａｎｅｓｈｐｏｕｒ，Ｅｘｐ．Ｏｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．１０：６５１−６６９，２０１５を参照されたい。
【０１５３】
一実施形態では、所望の特徴を有する標的抗原に対して特異的なヒト抗体を単離するために、所望の特異性を有する抗体断片を選択するためにヒトＶＨおよびＶＬライブラリがスクリーニングされる。この方法で使用される抗体ライブラリは、本明細書において、および当該技術分野において記載されるように調製およびスクリーニングされたｓｃＦｖライブラリであり得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））、およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（１９９３））。抗体ライブラリは好ましくは、抗原として標的タンパク質を使用してスクリーニングされる。
【０１５４】
代替的には、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローニングされ、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリにおいてランダムに組換えられ、次いで、特定の抗原への結合について選択され得る。Ｆａｂ断片はファージ表面上に発現され、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結している。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂコード配列を同時選択し、これは続いて増幅され得る。いくつかのラウンドの抗原結合および再増幅（パニングと呼ばれる手順）を介して、抗原に対して特異的なＦａｂが濃縮され、最終的に単離される。
【０１５５】
１９９４年に、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、抗体のヒト化のためのアプローチが記載された。誘導選択は、マウスモノクローナル抗体のヒト化のためのファージディスプレイ技術の力を利用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）を参照されたい）。この際、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリと組み合わせて提示されてもよく、得られたハイブリッドＦａｂライブラリは次いで、抗原と共に選択され得る。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するための鋳型を提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖がヒトＦｄ断片ライブラリと組み合わされる。得られたライブラリの選択は、完全なヒトＦａｂをもたらす。
【０１５６】
ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を得るための多様な手順が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）を参照されたい）。特に、ファージディスプレイライブラリ由来の抗体のインビトロ選択および進化は、強力なツールとなっている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）、米国特許公開第２００２／０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７、米国特許公開第２００３／０１９０３１７号、ならびに米国特許第６，０５４，２８７号および同第５，８７７，２９３号を参照されたい）。
【０１５７】
Ｆｖ断片は、可溶性断片として発現される相補性鎖との、ファージタンパク質融合（例えば、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩとの）として発現される１つの鎖の会合によって、ファージの表面上に提示される。ファージは、クラスＩファージｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、ｌｋｅ、ＺＪ／Ｚ、Ｆｆのうちの１つ、ならびにクラスＩＩファージＸｆ、Ｐｆ１、およびＰｆ３のうちの１つなどの繊維状ファージであり得ることが企図される。ファージは、Ｍ１３、またはそのｆｄもしくは誘導体であり得る。
【０１５８】
いったん最初のヒトＶＬおよびＶＨセグメントが選択されると、選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの異なる対形成が標的結合についてスクリーニングされる「ミックスアンドマッチ」実験で好ましいＶＬ／ＶＨ対の組み合わせを選択する（例えば、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８８：１１１２０−１１１２３，（１９９１）を参照されたい）。さらに、抗体の質をさらに向上させるために、天然の免疫応答の間の抗体の親和性成熟を担うインビボ体細胞変異プロセスに類似したプロセスにおいて、好ましいＶＬ／ＶＨ対（複数可）のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域の中で、ランダムに変異させてもよい。このインビトロ親和性成熟は、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相補的であるＰＣＲプライマーをそれぞれ使用してＶＬおよびＶＨ領域を増幅することによって達成することができ、これらのプライマーは、得られるＰＣＲ産物が、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内にランダム変異が導入されているＶＬおよびＶＨセグメントをコードするように、ある特定の位置で４つのヌクレオチド塩基のランダムな混合物で「スパイク」されている。これらのランダムに変異したＶＬおよびＶＨセグメントは、標的抗原への結合について再スクリーニングされ得る。
【０１５９】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリ由来の標的特異的抗体のスクリーニングおよび単離に続いて、選択された抗体をコードする核酸がディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収され、標準組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクターへとサブクローニングされ得る。所望の場合、下記のように、核酸をさらに操作して、本開示の他の抗体形態を作製することができる。コンビナトリアルライブラリのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現するために、本明細書に記載されるように、抗体をコードするＤＮＡは、組換え発現ベクターにクローニングされ、哺乳動物宿主細胞に導入される。
【０１６０】
ファージディスプレイ法は、細菌または宿主細胞の変異株において行われ得ることが企図される。変異株は、その中で複製されたＤＮＡがその親ＤＮＡに対して変異することを引き起こす遺伝的欠陥を有する宿主細胞である。例示的な変異株は、ＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５およびＮＲ９０４６  ｍｕｔ  Ｔ１である。
【０１６１】
ファージディスプレイ法がヘルパーファージを使用して行われ得ることも企図される。これは、欠陥のあるファージゲノムを含有する細胞を感染させるために使用され、欠陥を補うように機能するファージである。欠陥のあるファージゲノムは、ファージミド、またはいくつかの機能をコードする遺伝子配列が除去されたファージであり得る。ヘルパーファージの例は、Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩ番号３、およびキャプシドタンパク質に融合した結合分子を提示またはコードするファージである。
【０１６２】
抗体はまた、ＷＯ９２／０１０４７に開示される、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを使用して、他方の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリを感染させ、この明細書に記載されるものなどのファージディスプレイ技術に従って得られた二本鎖特異的結合メンバーが選択される、階層二重コンビナトリアル（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｄｕａｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）アプローチを使用したファージディスプレイスクリーニング法によって生成される。この技術は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））にも開示されている。
【０１６３】
酵母、微生物、および哺乳動物細胞の表面上のペプチドの提示のための方法も、抗原特異的抗体を同定するために使用されている。例えば、米国特許第５，３４８，８６７号、同第５，７２３，２８７号、同第６，６９９，６５８号、Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：３９５−９９（２００１）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（１）４５−５２  （２００３）、Ｓｕｒｇｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４（２００６）を参照されたい。抗体ライブラリは、免疫系におけるＢ細胞による抗体の細胞表面提示を有効に模倣して、アグルチニンなどの酵母タンパク質に結合し得る。
【０１６４】
ファージディスプレイ法に加えて、抗体は、インビトロディスプレイ法および微生物細胞ディスプレイを使用して単離され得、これにはリボソームディスプレイおよびｍＲＮＡディスプレイが含まれる（Ａｍｓｔｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４００−０５（２００１））。リボソームディスプレイを使用したポリペプチドの選択は、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（ＰＮＡＳ，９４：４９３７−４９４２（１９９７））ならびにＫａｗａｓａｋｉに発行された米国特許第５，６４３，７６８号および同第５，６５８，７５４号に記載されている。リボソームディスプレイはまた、抗体の迅速な大規模変異分析にも有効である。選択的変異誘発アプローチはまた、リボソームディスプレイ技術を使用して選択され得る改善された活性を有する抗体を産生する方法を提供する。
【０１６５】
アミノ酸配列バリアント
抗体の１、２、３、４、５、および／または６つのＣＤＲを含む修飾ポリペプチド組成物が生成され得、ＣＤＲは、標的分子に対する特異性または親和性の増加を提供するように改変されている。抗体ＣＤＲ内の部位は典型的には、例えば、最初に保存的選択によって置換し（例えば、疎水性アミノ酸を非同一の疎水性アミノで置換）、次いでより類似していない選択によって置換する（例えば、疎水性アミノ酸を荷電アミノ酸で置換）ことによって連続して修飾され、次いで標的部位において欠失または挿入が行われ得る。例えば、ＣＤＲを囲む保存的フレームワーク配列を使用して、プライマー領域間に位置する抗原特異的ＣＤＲ配列を増幅するためにこれらのコンセンサス配列に対して相補的であるＰＣＲプライマーが生成される。ヌクレオチドおよびポリペプチド配列をクローニングおよび発現するための技術は当該技術分野で十分に確立されている［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］。増幅されたＣＤＲ配列は、適切なプラスミドに結合する。１、２、３、４、５、および／または６つのクローニングされたＣＤＲを含むプラスミドは、任意選択で、ＣＤＲに結合した領域をコードするさらなるポリペプチドを含有する。
【０１６６】
修飾は、以下により詳細に記載される保存的または非保存的アミノ酸置換によって行われ得る。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約１〜２０アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸の範囲である。組換えＤＮＡ技術を使用して抗体ポリペプチド分子におけるアミノ酸の置換を合成的に行い、得られた組換えバリアントを活性についてアッセイすることによって多様性が導入され得る。核酸の改変は、異なる種由来の核酸とは異なる部位（可変位置）、または高度に保存的な領域（定常領域）において行われ得る。抗体配列を改変し、本開示において有用な抗体ポリペプチド組成物を発現するための方法は、当該技術分野で記載されている。例えば、米国特許第８，５６９，４６２号を参照されたい。別の種類のバリアントは、アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、抗体における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。超可変領域またはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のいずれかの中の置換的変異誘発が企図される。保存的置換は、アミノ酸をそのクラスの別のメンバーで置き換えることを含む。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーで置き換えることを含む。
【０１６７】
保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、およびメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）が含まれ、正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）が含まれ、負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）が含まれる。
【０１６８】
抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基はまた、分子の酸化安定性を改善させ、かつ異常な架橋を防止するために、一般的にセリンで置換され得る。逆に、その安定性を改善させるためにシステイン結合（複数可）が抗体に付加されてもよい（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０１６９】
改変された糖鎖付加
親抗体に対して修飾された糖鎖付加パターン、例えば、抗体において見出される１つ以上の炭水化物部分の欠失、および／または抗体に存在しない１つ以上の糖鎖付加部位の付加を有する抗体バリアントも産生し得る。
【０１７０】
抗体の糖鎖付加は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素結合のための認識配列である。ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的な糖鎖付加部位を生み出す。したがって、Ｎ結合型糖鎖付加部位は、アミノ酸配列がこれらのトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにそれを改変することによって抗体に付加され得る。Ｏ結合型糖鎖付加とは、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンを使用してもよい）への糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの結合を指す。Ｏ結合型糖鎖付加部位は、元の抗体の配列に、１つ以上のセリンまたはトレオニン残基を挿入または置換することによって抗体に付加され得る。
【０１７１】
Ｆｃグリカンは、Ｆｃ受容体およびＣ１ｑに対するＩｇＧの結合に影響を及ぼし、したがって、ＩｇＧエフェクター機能にとって重要である。修飾Ｆｃグリカンおよび改変されたエフェクター機能を有する抗体バリアントが産生され得る。例えば、シアル酸、コアフコース、二分Ｎ−アセチルグルコサミン、およびマンノース残基などの修飾末端糖を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対する改変された結合および改変されたＡＤＣＣ活性を有し得る。さらなる例では、修飾末端ガラクトース残基を有する抗体は、Ｃ１ｑに対する改変された結合および改変されたＣＤＣ活性を有し得る（Ｒａｊｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７１−７８，２００８）。
【０１７２】
改善されたＡＤＣＣ活性を呈する、フコシル化が存在しないかまたは低減した抗体分子もまた、本方法における使用のために企図される。これを達成するための多様な方法が当該技術分野で既知である。例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−２２（２００４）、Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：１１１３−２３（１９８９）、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０（２００２）、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７８：３４６６−７３（２００３）、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１７６−８０（１９９９）、Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．９３：８５１−６１（２００６））を参照されたい。抗体の糖鎖付加および方法は、Ｎｉｅｗａ  ａｎｄ  Ｓａｔｏｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０４：９３０−４１，（２０１５）に概説されている。
【０１７３】
改変されたエフェクター機能を有するバリアント
本方法における使用のための抗体の他の修飾が企図される。一態様では、エフェクター機能に関して、例えば、がんの治療における抗体の有効性を高めるために、本明細書において使用される抗体を修飾することが望ましい場合がある。エフェクター機能を修飾するための１つの方法は、システイン残基（複数可）がＦｃ領域内に導入され得、それによりこの領域における鎖内ジスルフィド結合形成を可能にすることを教示する。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力、ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺滅および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｅｘｐ「Ｍｅｄ．」１７６：１１９１−１１９５（１９９２））およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２））を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３））に記載されるようにヘテロ二機能性架橋剤を使用して調製することができる。代替的には、二重Ｆｃ領域を有し、それにより増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９））を参照されたい。
【０１７４】
本開示のある特定の実施形態では、例えば、治療効果を高めるために、無傷の抗体ではなく抗体断片の使用が望ましい場合がある。この場合、その血清半減期を増加させるために抗体断片を修飾すること、例えば、半減期を増加させるために、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（多糖類ポリマーを含む）などの分子を抗体断片に付加することが望ましい場合がある。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加を担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの任意の１つ以上のアミノ酸残基が抗体断片の類似した位置に導入されている領域を構成する。一実施形態では、Ｆｃドメインの１つまたは２つのループからの３つ以上の残基が導入される。別の実施形態では、エピトープは、（例えば、ＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、もしくはＶＨ領域、または１つ以上のかかる領域に導入される。代替的には、エピトープは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取り出され、抗体断片のＣＬ領域もしくはＶＬ領域、またはその両方に導入される。
【０１７６】
本開示の抗体は、ヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するそれらのバリアントを含み得る［例えば、Ｓａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：６３３−９（１９９２）を参照されたい］。
【０１７７】
Ｓｈｉｅｌｄｓらは、全てのヒトＦｃ受容体への結合に関与したＩｇＧ１残渣が、ヒンジに近位のＣＨ２ドメイン内に位置し、かつ以下の２つのカテゴリーに入ることを報告した：１）全てのＦｃＲと直接相互作用し得る位置には、Ｌｅｕ２３４〜Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７、およびＰｒｏ３２９（および場合によりＡｓｐ２６５）が含まれ、２）炭水化物の性質または位置に影響を及ぼす位置には、Ａｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７が含まれる。Ｆｃ受容体ＩＩへの結合に影響を及ぼしたさらなるＩｇＧ１残基は以下の通りである：（最大の影響）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８、ならびに（より少ない影響）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８、およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５Ａ、およびＤ２７０Ａは、結合を低減させた。Ｆｃ受容体ＩＩＩＡへの結合を低減させたさらなるＩｇＧ１残基は、当該技術分野で既知である。Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：４８７−４９０，２００１）、ならびに米国特許第６，１９４，５５１号、同第６，７３７，０５６号、同第５，６２４，８２１号、および米国特許公開第２００４／０１３２１０１号（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）も参照されたい。
【０１７８】
共有結合修飾
共有結合修飾を含む抗体も本方法における使用のために企図される。該当する場合、それらは、化学的合成、または抗体の酵素切断もしくは化学的切断によって作製することができる。抗体の他の種類の共有結合修飾は、抗体の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。
【０１７９】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロメルキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０１８０】
他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒスチジル、リジニルアルギニル、チロシル、グルタミニル、およびアスパラギニル水酸化が含まれる。かかる修飾を作製するための方法は、米国特許第８，９２６，９７６号（参照により本明細書に組み込まれる）および当該技術分野において開示されている。
【０１８１】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ＲおよびＲ’は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１８２】
他の修飾には、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１８３】
別の種類の共有結合修飾は、グリコシドを抗体に化学的または酵素的に連結させることを含む。これらの手順は、それらがＮ結合型またはＯ結合型糖鎖付加のための糖鎖付加能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としない点で有利である。使用される連結モードに応じて、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１））に記載されている。
【０１８４】
抗体上に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的糖鎖除去は、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物に曝露することを必要とする。この処理は、抗体を無傷のままにしながら、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の切断をもたらす。化学的糖鎖除去は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７））によって、およびＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１））によって記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７））によって記載されるように、多様なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１８５】
抗体の別の種類の共有結合修飾は、抗体を、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランなどの多糖類ポリマーのうちの１つに結合することを含む。かかる方法は、当該技術分野で既知である。
【０１８６】
誘導体
上記のように、本開示の抗体物質およびポリペプチドに関連して使用される場合、誘導体とは、ユビキチン化、治療剤または診断剤へのコンジュゲーション、標識化（例えば、放射性核種または様々な酵素による）、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）などの共有ポリマー結合、およびオルニチンなどのアミノ酸の化学的合成による挿入または置換などの技術によって化学的に修飾されたポリペプチドを指す。本明細書に開示される抗体の誘導体も治療剤として有用であり、本明細書の方法において使用され得る。
【０１８７】
コンジュゲート部分は、共有結合で、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、もしくは水素結合を介して、例えば、放射性ヌクレオチドの組み込み、またはストレプトアバジンによって認識されるビオチン化ヌクレオチドによって、抗体物質内に組み込まれるかまたはそれに結合し得る。
【０１８８】
抗体は、フレキシブルリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３によって、ＩＬ−２またはそのバリアントと共有結合し得る。例えば、Ｔｏｍａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，８７１−８７６（２０１３）を参照されたい。
【０１８９】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を抗体物質に結合させて、より長いインビボ半減期を提供することができる。ＰＥＧ基は、任意の好都合な分子量のものであってもよく、直鎖状または分岐状であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａの範囲となる。ＰＥＧ基は、一般的に、ＰＥＧ部分上の天然のまたは操作された反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）から抗体物質上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのアシル化または還元的アルキル化を介して本開示の抗体物質に結合することになる。抗体物質へのＰＥＧ部分の付加は、当該技術分野で周知の技術を使用して行うことができる。例えば、国際公開第ＷＯ９６／１１９５３号および米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。
【０１９０】
抗体物質のＰＥＧとのライゲーションは通常、水層で行われ、逆相分析ＨＰＬＣによって容易に監視することができる。ＰＥＧ化された物質は、分取ＨＰＬＣによって精製され、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびレーザ脱離質量分析によって特性評価される。
【０１９１】
抗体コンジュゲート
抗体は、その「裸の」もしくはコンジュゲートされていない形態で投与され得るか、または他の治療剤もしくは診断剤に直接コンジュゲートされ得るか、またはかかる他の治療剤もしくは診断剤を含む担体ポリマーに間接的にコンジュゲートされ得る。
【０１９２】
抗体は、放射性同位体、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光または発光または生物発光標識（例えば、ＦＩＴＣもしくはローダミンなど）、常磁性原子などの使用を介して検出可能に標識化され得る。かかる標識化を達成するための手順は当該技術分野で周知であり、例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）、Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）、Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照されたい。
【０１９３】
抗体部分のコンジュゲーションは、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。一般的な技術は、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）、およびＳｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号にも記載されている。この一般的な方法は、酸化炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン機能を有し、かつ複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素加数（ｂｏｒｏｎ  ａｄｄｅｎｄ）、または他の治療剤を充填した担体ポリマーと反応させることを含む。この反応は、最初のシッフ塩基（イミン）結合をもたらし、これを二級アミンへの還元によって安定化させて、最終コンジュゲート形成をすることができる。
【０１９４】
担体ポリマーは、例えば、アミノデキストランまたは少なくとも５０アミノ酸残基のポリペプチドであり得る。薬物または他の薬剤を担体ポリマーにコンジュゲートさせるための様々な技術が当該技術分野で既知である。アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を使用することができるが、ポリペプチド担体は、鎖中に少なくとも５０アミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００アミノ酸残基を有しなければならない。アミノ酸のうちの少なくともいくつかは、リジン残基またはグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基でなければならない。リジン残基のペンダントアミン、ならびにグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素加数、または他の治療剤の結合に好都合である。好適なポリペプチド担体の例としては、得られた充填担体およびコンジュゲートに所望の可溶性特性を付与する、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、ならびにこれらのアミノ酸および他のアミノ酸（例えば、セリン）の混合ポリマーが挙げられる。抗体がコンジュゲートされ得る薬剤の例としては、本明細書に記載される細胞傷害性剤または化学療法剤のいずれかが挙げられる。
【０１９５】
代替的には、コンジュゲート抗体は、抗体成分を治療剤と直接コンジュゲートすることによって調製することができる。一般的な手順は、治療剤が酸化した抗体成分に直接結合することを除き、コンジュゲートの間接的方法と類似している。例えば、抗体の炭水化物部分をポリエチレングリコールに結合させて、半減期を延長することができる。
【０１９６】
代替的には、治療剤は、ジスルフィド結合形成を介して、またはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）ポロプリオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二機能性架橋剤を使用して、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合されてもよい。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４）。かかるコンジュゲーションのための一般的な技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）におけるＵｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）におけるＰｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」を参照されたい。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、意味度エステルの二機能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルエルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの多様な二機能性タンパク質結合剤が当該技術分野で既知である。
【０１９７】
抗体の組換え産生
本明細書に記載される抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）単離および配列決定され得る。これは通常、抗体をコードするＤＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）のクローニングを必要とする。クローニングおよび配列決定は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準技術を使用して行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９４））（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１９８】
配列決定は、標準技術を使用して行われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）ＰＮＡＳ  ７４：５４６３−５４６７（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。クローニングされた核酸の配列を、ヒト免疫グロブリンおよびｃＤＮＡの公開された配列と比較することによって、当業者は、配列決定される領域に応じて、（ｉ）免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系列利用、ならびに（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞変異のプロセスから得られた配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列を決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの情報源は、国立衛生研究所の国立医学図書館の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ）である。
【０１９９】
いったん単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に置かれ、これは次いで、免疫グロブリンタンパク質を別様に産生しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞（例えば、２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体の組換え産生は、当該技術分野で周知である。
【０２００】
抗体の組換え産生のために、それをコードする核酸は、単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のためにのために複製可能なベクター内に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般的に、当該技術分野で既知であり記載されている、シグナル配列、複製開始点、１つ以上の選択的マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０１】
様々な実施形態では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６に記載されるヌクレオチド配列は、本明細書の抗体またはその断片の発現に有用である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、異なる核酸分子が標的特異的抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする。他の実施形態では、同じ核酸分子が標的特異的抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする。一実施形態では、核酸は、本開示の抗体の標的特異的抗体、ならびに本明細書に記載される核酸によってコードされるポリペプチドのいずれかをコードする。
【０２０３】
一態様では、本開示の核酸分子は、配列番号９、１１、１３、もしくは１５に記載される、抗体ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９のＶＬアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその一部を含む。関連する態様では、ＶＬアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。いくつかの実施形態では、核酸は、当該抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、当該部分は、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む連続した部分である。一実施形態では、当該部分は、任意選択で異なるヒトまたはヒトコンセンサスフレームワークを有し、かつ任意選択で連続した３つのＣＤＲ中に１つ、または最大で２つ、または最大で３つの変異を有する、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１、２、または３つを含む。
【０２０４】
一実施形態では、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５のいずれか１つに記載される可変領域アミノ酸配列を有する、機能的断片を含む抗原結合化合物を提供する。関連する実施形態では、前述の抗原結合化合物は、本開示の１つ以上のＣＤＲ配列を含み、所望の生物活性を呈する、完全集合四量体抗体、モノクローナル抗体ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；多重特異性抗体、抗体断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；ｓｃＦｖもしくは一本鎖抗体断片；ダイアボディ；トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体；キレート化組換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはこれらの抗体のうちのいずれか１つのバリアントもしくは誘導体、または２つ以上の抗体の混合物からなる群から選択される。本開示の抗原結合化合物は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、好ましくは、ＩＬ−２に対して１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３Ｍ以下の結合親和性を保持する。
【０２０５】
一態様では、本開示の抗体は、図１２に対形成されるように、アミノ酸配列番号１、３、５、または７および配列番号９、１１、１３、または１５にそれぞれ記載される重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む。抗体は、上記のアミノ酸配列に記載される抗体の全てまたは一部を含み得ることがさらに企図される。一実施形態では、抗体は、図１２に対形成されるように、配列番号１７〜２８の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３のうちの少なくとも１つ、または配列番号２９〜４０の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。
【０２０６】
一実施形態では、重鎖は、重鎖ＣＤＲ３配列として同定されたアミノ酸配列を含む。かかる「重鎖ＣＤＲ３配列」（ＨＣＤＲ３）は、図１２、および配列番号１９、２２、２５、または２８に記載される重鎖ＣＤＲ３配列として同定されたアミノ酸配列を含む。代替的には、ＨＣＤＲ３配列は、図１２において同定される任意のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の変化（例えば、置換、挿入、または欠失）を含有するアミノ酸配列を含む。好ましい置換には、図１２の別のＨＣＤＲ３内の対応する位置におけるアミノ酸への置換が含まれる。代替的には、ＨＣＤＲ３配列は、本明細書に記載される配列から判定されたＨＣＤＲ３のコンセンサスアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２０７】
上記のＨＣＤＲ３配列を含む重鎖は、配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、または図１２においてＨＣＤＲ１として同定されたアミノ酸配列、配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、または図１２において同定された任意のＨＣＤＲ１と比較して１つ以上のアミノ酸の変化、好ましくは図１２の別のＨＣＤＲ１内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列、または本明細書に記載されるＨＣＤＲ１のコンセンサス配列のうちのいずれかを含む「重鎖ＣＤＲ１配列」（ＨＣＤＲ１）をさらに含み得る。
【０２０８】
代替的には、上記のＨＣＤＲ３配列を含む重鎖は、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、または図１２においてＨＣＤＲ２として同定されたアミノ酸配列、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、または図１２において同定された任意のＨＣＤＲ２と比較して１つ以上のアミノ酸の変化、好ましくは図１２の別のＨＣＤＲ２内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列、または本明細書に記載されるＨＣＤＲ２のコンセンサス配列のうちのいずれかを含む「重鎖ＣＤＲ２配列」（ＨＣＤＲ２）をさらに含み得る。
【０２０９】
上記の重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖はまた、（ａ）上記の重鎖ＣＤＲ１配列、および（ｂ）上記の本発明の重鎖ＣＤＲ２配列の両方を含み得る。
【０２１０】
本開示の一態様は、下記の重鎖ＣＤＲ配列のうちのいずれか１、２、および／または３つを含む重鎖を含む標的抗原に結合する抗体を提供する。
【０２１１】
上記の重鎖ＣＤＲ配列はいずれも、ＣＤＲのいずれかの末端に付加されたアミノ酸を含んでもよい。アミノ酸類似体を含有するバリアントまたは誘導体の親和性成熟または調製を含む、本発明の抗体および抗原結合化合物のバリアントおよび誘導体の調製は、本明細書においてさらに詳細に記載される。例示的なバリアントには、アミノ酸配列内の対応するアミノ酸の保存的または非保存的置換、または異なるヒト抗体配列の対応するアミノ酸でのアミノ酸の置き換えを含有するものが含まれる。
【０２１２】
上記の重鎖のいずれか１つを含む抗体は、軽鎖、好ましくは標的抗原に結合する軽鎖、最も好ましくは下記の軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖をさらに含み得る。
【０２１３】
本開示の別の態様は、下記の軽鎖ＣＤＲ配列のうちのいずれか１、２、および／または３つを含む軽鎖を含む標的抗原に結合する抗体を提供する。
【０２１４】
好ましくは、軽鎖は、軽鎖ＣＤＲ３配列として同定されたアミノ酸配列を含む。かかる「軽鎖ＣＤＲ３配列」（ＬＣＤＲ３）は、図１２中、および配列番号３１、３４、３７、または４０内の軽鎖ＣＤＲ３配列として同定されたアミノ酸配列を含む。代替的には、軽鎖ＣＤＲ３配列は、図１２において同定される任意の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の変化（例えば、置換、挿入、または欠失）を含有するアミノ酸配列を含む。好ましい置換には、図１２の別の軽鎖ＣＤＲ３内の対応する位置におけるアミノ酸への置換が含まれる。
【０２１５】
上記の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、または図１２において軽鎖ＣＤＲ１として同定されたアミノ酸配列、配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、または図１２において同定された任意の軽鎖ＣＤＲ１と比較して１つ以上のアミノ酸の変化、好ましくは図１２の別の軽鎖ＣＤＲ１内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列のうちのいずれかを含む「軽鎖ＣＤＲ１配列」をさらに含み得る。
【０２１６】
代替的には、上記の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖は、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、または図１２において軽鎖ＣＤＲ２として同定されたアミノ酸配列、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、または図１２において同定された任意の軽鎖ＣＤＲ２と比較して１つ以上のアミノ酸の変化、好ましくは図１２の別の軽鎖ＣＤＲ２内の対応する位置におけるアミノ酸への置換を含有するアミノ酸配列のうちのいずれかを含む「軽鎖ＣＤＲ２配列」をさらに含み得る。
【０２１７】
関連する態様では、本開示は、配列番号１７〜２８の少なくとも１つのＨＣＤＲまたは配列番号２９〜４０のＬＣＤＲを含み、重鎖可変領域のフレームワーク領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ヒト抗体由来のフレームワーク領域を含む、精製されたポリペプチドを企図する。別の実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、異なるヒト抗体配列とより同種になるようにアミノ酸置換によって化学的に改変されている。例えば、各重鎖フレームワーク領域（Ｈ−ＦＲ１−４）内で、重鎖可変領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの天然フレームワーク領域残基がアミノ酸置換によって改変され、各軽鎖フレームワーク領域（Ｌ−ＦＲ１−４）内で、軽鎖可変領域の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの天然フレームワーク残基がアミノ酸置換によって改変されていることが企図される。
【０２１８】
上記の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖はまた、（ａ）上記の軽鎖ＣＤＲ１配列、および（ｂ）上記の軽鎖ＣＤＲ２配列の両方を含み得る。
【０２１９】
上記の軽鎖可変領域のいずれか１つを含む抗体は、任意選択で図１２に記載されるように対形成された重鎖可変領域、好ましくは標的抗原に結合する重鎖可変領域、最も好ましくは上記の重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域をさらに含み得る。
【０２２０】
なお別の実施形態では、抗体は、配列番号１、３、５、および７からなる群から選択される重鎖可変領域と、配列番号９、１１、１３、および１５からなる群から選択される軽鎖可変領域とを含む。
【０２２１】
関連する態様では、核酸分子は、配列番号９、１１、１３、もしくは１５のうちのいずれか１つの軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその一部を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１０、１２、１４、もしくは１６のうちのいずれか１つの軽鎖ヌクレオチド配列、またはその一部を含む。本開示の核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６における配列を含む全ての核酸配列をさらに含み、核酸配列は、本明細書に記載される抗体の重鎖および軽鎖可変領域、または本明細書に記載されかつ配列番号１７〜２８および２９〜４０に記載される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲのアミノ酸配列をコードする、遺伝暗号の多様性に基づく縮重コドン、ならびに本明細書に記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載される抗体の重鎖および軽鎖可変領域、または本明細書に記載されかつ配列番号１７〜２８および２９〜４０に記載される任意のＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲのアミノ酸をコードする核酸配列にハイブリダイズする核酸とを含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号９、１１、１３、または１５に記載されるＶＬアミノ酸配列と少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるＶＬアミノ酸配列をコードする。本開示の核酸分子は、本明細書に記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下で配列番号９、１１、１３、もしくは１５の軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列にハイブリダイズするか、または配列番号１０、１２、１４、もしくは１６の軽鎖可変領域核酸配列を有する核酸を含む。
【０２２３】
本開示の核酸分子は、抗体ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９のいずれか１つのＶＨアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその一部を含むことがさらに企図される。いくつかの実施形態では、核酸は、当該抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、当該部分は、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む連続した部分である。一実施形態では、当該部分は、任意選択で異なるヒトまたはヒトコンセンサスフレームワークを有し、かつ任意選択で連続した３つのＣＤＲ中に１つ、または最大で２つ、または最大で３つの変異を有する、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３領域のうちの少なくとも１、２、または３つを含む。
【０２２４】
関連する態様では、核酸分子は、配列番号１、３、５、もしくは７の重鎖のうちの１つの重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその一部を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２、４、６、もしくは８の重鎖ヌクレオチド配列、またはその一部を含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、３、５、または７に記載されるＶＨアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＶＨアミノ酸配列をコードする。関連する態様では、ＶＨアミノ酸配列は、コンセンサス配列である。本開示の核酸分子は、本明細書に記載されるものなどの高度にストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、もしくは７の重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする核酸配列にハイブリダイズするか、または配列番号２、４、６、もしくは８のうちのいずれか１つの重鎖可変領域核酸配列を有する核酸をさらに含む。
【０２２６】
本開示の核酸は、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９から選択される抗体の全長軽鎖または重鎖をコードし得、全長軽鎖または全長重鎖は、軽鎖定常領域または重鎖定常領域をそれぞれ含み、軽鎖定常領域は任意選択で未修飾のまたは修飾されたカッパまたはラムダ領域を含み、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどのクラスのいずれかの未修飾のまたは修飾された定常領域を含むことがさらに企図される。
【０２２７】
一態様では、全長可変軽鎖抗体は、配列番号９、１１、１３、または１５に記載される配列を含む。全長軽鎖をコードするヌクレオチドは、配列番号９、１１、１３、または１５に記載される配列をコードし、配列番号１０、１２、１４、または１６に記載されるヌクレオチド配列を含むことがさらに企図される。
【０２２８】
一態様では、全長可変重鎖抗体は、配列番号１、３、５、または７のうちのいずれか１つにおける配列を含む。全長重鎖をコードするヌクレオチドは、配列番号１、３、５、または７の配列重鎖をコードし、配列番号２、４、６、または８のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含むことがさらに企図される。
【０２２９】
さらなる実施形態では、本開示は、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む、ＩＬ−２に結合する抗体を提供し、（ａ）軽鎖可変領域は、少なくとも配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号３１、３４、３７、もしくは４０、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含み、かつ／あるいは（ｂ）重鎖可変領域は、少なくとも配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２、および／または配列番号１９、２２、２５、もしくは２８、もしくはそれらと少なくとも８０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３を含む。
【０２３０】
関連する実施形態では、軽鎖可変領域は、少なくとも、配列番号２９、３２、３５、もしくは３８、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１と、配列番号３０、３３、３６、もしくは３９、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２と、配列番号３１、３４、３７、もしくは４０、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３とを含み、かつ／あるいは重鎖可変領域は、少なくとも、配列番号１７、２０、２３、もしくは２６、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ１と、配列番号１８、２１、２４、もしくは２７、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ２と、配列番号１９、２２、２５、もしくは２８、またはそれらと少なくとも９０％同一である配列から選択されるＣＤＲ３とを含む。
【０２３１】
例示的な実施形態では、本開示の抗体は、ヒトカッパ（κ）もしくはヒトラムダ（λ）軽鎖もしくはそれらに由来するアミノ酸配列、またはヒト重鎖もしくはそれらに由来する配列、または一本鎖、二量体、四量体、もしくは他の形態で一緒に重鎖および軽鎖の両方を含む。
【０２３２】
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するための好適な宿主細胞は、上記の原核細胞、酵母、または高等真核生物細胞である。この目的のための好適な原核細胞には、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ  ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１  Ｐ）などのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが含まれる。１つのＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）などの他の株も好適である。これらの例は、限定的ではなく例示的である。
【０２３３】
原核細胞に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物の中でも最も一般的に使用されている。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えばＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ（ＥＰ  １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなど）などの糸状菌などの複数の他の属、種、および株が一般的に利用可能あり、本明細書において有用である。
【０２３４】
糖鎖付加された抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ケムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための多様なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に利用可能であり、かかるウイルスを、本開示に従い、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのための本明細書におけるウイルスとして使用することができる。
【０２３５】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、タバコ、アオウキクサ、および他の植物細胞の植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０２３６】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓細胞株（懸濁培養物における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ならびにヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２３７】
宿主細胞は、抗体産生のために上記の発現またはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中に培養される。さらに、新規のベクター、および選択的マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーでトランスフェクトされた細胞株は、標的に結合する抗体の発現のために特に有用であり、好ましい。
【０２３８】
組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞膜周辺腔において細胞内で産生され得るか、または微生物培養物由来のものを含む培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１の工程として、宿主細胞または溶解断片のいずれかである微粒子片は、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３，１９８８；ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １０：１０５（１９９０）、およびＰＮＡＳ  ９０：４５７−４６１（１９９３）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。また、（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）も参照されたい。
【０２３９】
代替的には、抗体は、原核生物または真核生物のインビトロ転写を使用して無細胞系において合成することができる（Ｓｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｋｕｂｉｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ４：１２−３３，２０１５を参照されたい）。
【０２４０】
抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー陽イオンまたはアビアン（ａｖｉａｎ）交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーは周知の精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依拠する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３）。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプについて、およびヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、最も多くの場合ではアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成され得るよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。回収される抗体に応じて、タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法も利用可能である。
【０２４１】
一実施形態では、ＩＬ−２抗体は、Ｂｅｒｇｍａｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２８３（７），４１８９−４１９９（２００７）およびＧａｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２７；８（１１）：ｅ８１７６８（２０１３）（それらの全体が参照により組み込まれる）においてＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ複合体について記載される方法を使用して、単独で産生され得るか、またはＩＬ−２と共発現され得る。例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−２抗体は、同じ細胞型におけるプラスミド（単一のプラスミドまたは複数のプラスミドのいずれか）上に共発現され得、産生の組換え発現フェーズの間に複合体化することが可能となる。代替的には、ＩＬ−２およびＩＬ−２抗体は、異なる細胞において発現され、その後、別の工程において一緒に複合体化される。
【０２４２】
スクリーニング方法
効果的な治療薬は、重大な毒性を欠く有効な薬剤を同定することに依拠する。抗体は、当該技術分野で既知の方法によって結合親和性についてスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる共分画、共沈殿、架橋、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、ＫｉｎＥｘＡなどを使用することができ、これらは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４３】
生物活性および（例えば、ＩＬ−２抗体による）ＩＬ−２活性の調節を評価するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、中和アッセイによって中和を測定し、５０％極大値をもたらす阻害濃度（ＩＣ５０）の値として表すことができる。ＩＣ５０値は、所与の分子について、第２の分子の最大の生物学的応答または細胞活性の半分の阻害を誘発するために必要な分子の濃度を判定することによって計算することができる。ＩＣ５０が低いほど、所望のタンパク質活性を阻害する分子の効力が高い。
【０２４４】
フローサイトメトリーによるＩＬ−２抗体のスクリーニング
ヒトＩＬ−２受容体ＲαまたはＲβおよびγｃに結合するに結合するＩＬ−２抗体は、ヒトＩＬ−２受容体ＩＬ−２、Ｒα、ＩＬ−２  Ｒβ、またはＲβおよびγｃを天然に含むか、または当該技術分野で既知の方法を使用してそれらを発現するように操作された細胞のフローサイトメトリースクリーニングによって評価することができる。
【０２４５】
ＩＬ−２誘導性増殖のＩＬ−２抗体調節
発光細胞生存アッセイを使用した、ＩＬ−２  Ｒα相互作用を主に遮断する抗体の細胞増殖への効果を含む、異なるＩＬ−２受容体複合体（ＩＬ−２  Ｒ  αβγまたはＩＬ−２  Ｒβγ）を発現する細胞のＩＬ−２誘導性増殖のＩＬ−２抗体調節の評価。例えば、活性は、増殖アッセイによって測定し、ＥＣ５０（５０％極大値をもたらす有効濃度）値として表すことができる。ＥＣ５０値は、所与の分子について、最大の生物学的応答の半分を誘発するために必要な分子の濃度を判定することによって計算することができる。ＥＣ５０が低いほど、所望の活性を誘発する分子の効力が高い。
【０２４６】
ＩＬ−２誘導性ＳＴＡＴ５リン酸化
ＩＬ−２抗体によるＩＬ−２活性の調節は、異なるＩＬ−２受容体複合体（ＩＬ−２  Ｒ  αβγまたはＩＬ−２  Ｒβγ）を発現する細胞における下流転写因子である転写のシグナルトランスデューサおよび活性化因子５（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ５）（ＳＴＡＴ５）のＩＬ−２誘導性活性の測定によって評価することができる。様々な用量のＩＬ−２および抗ＩＬ−２抗体は、異なるＩＬ−２受容体複合体を発現する細胞への添加の前に予め複合体化され得る。リン酸化（活性化、ｐＳＴＡＴ５）およびＳＴＡＴ５の全レベルは、免疫測定法によって測定され、リン酸化ＳＴＡＴ５のパーセントが計算される。ＥＣ５０およびＩＣ５０値は、上記のように計算され得る。
【０２４７】
当該技術分野で既知のＩＬ−２活性を評価する他の方法を使用して、本明細書の抗体の生物学的効果を分析することができる。ＩＬ−２は、マウスまたは他の哺乳動物に投与することができ、その活性は、エフェクター、ヘルパー、または制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞などの免疫細胞の出現頻度または活性を測定することによって分析することができる。
【０２４８】
ＩＬ−２の活性はまた、ＩＬ−２応答性細胞におけるグランザイムＢの上方制御またはインターフェロンガンマを分泌する能力の増加を監視することによって測定することができる。ＩＬ−２活性はまた、ＩＬ−２応答性細胞におけるＫＩ６７検出によって測定することができる。マウスでは、ＢＲＤＵが動物の中に注射されてもよく、ＩＬ−２応答性細胞へのＢＲＤＵの組み込みが測定される。マウスでは、ＣＤ４４ｈｉまたはＣＤ２５ｈｉとなるＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の出現頻度がＩＬ−２活性の尺度となる。これらのアッセイを実施するための方法は、当該技術分野で既知である。
【０２４９】
併用療法
本開示のＩＬ−２抗体は、第２の薬剤と共に投与されてもよく、この併用は、本明細書に記載される疾患または障害を治療するために有用であり得る。ＩＬ−２に対する抗体の使用の場合、２つ以上のＩＬ−２抗体がそれぞれの標的抗原への結合に有効である場合、抗体の併用が、治療される状態または障害に対してなおさらに改善された効力を提供するように、標的抗原の異なるエピトープに対する２つ以上の抗体が混合され得ることが企図される。本発明の１つ以上の抗体を含む組成物は、ＩＬ−２またはＩＬ−２  Ｒに関連する状態または疾患を罹患しているか、罹患しやすいヒトまたは哺乳動物に投与され得る。
【０２５０】
２つの治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間に重複がある限り、薬剤が同じ時間に、または同じ経路によって投与される必要はない。同時または連続的な投与が企図され、および異なる日または週の投与も企図される。
【０２５１】
代替的には、第２の薬剤は、サイトカイン、増殖因子、阻害剤、および他の標的抗原に対する抗体などの他の治療剤であり得る。
【０２５２】
本開示の治療剤は、同じ製剤中で同時に与えられてもよいことが企図される。薬剤は、別個の製剤で同時に投与されることがさらに企図され、同時とは、薬剤が互いの３０分以内に与えられることを指す。第２の薬剤が同時に与えられてもよいことがさらに企図される。
【０２５３】
別の態様では、ＩＬ−２に対する抗体は、他の組成物の投与の前に投与される。事前投与とは、他の薬剤での治療の１週間前から他の薬剤の投与の最大で３０分前までの範囲での、抗体の投与を指す。薬剤は、別の組成物または薬剤の投与に続いて投与されることがさらに企図される。続く投与とは、抗体治療の３０分後から、抗体投与の最大で１週間後、例えば、３０分後、１時間、２時間後、４時間後、１日後、２日後などでの投与を説明することを意図する。第２の薬剤はこの様式で、ＩＬ−２抗体の投与の前に、またはそれに続いて投与され得ることがさらに企図される。
【０２５４】
適宜、他の補助療法が施され得ることがさらに企図される。例えば、患者はまた、適宜、外科療法、化学療法、細胞傷害剤、光線力学療法、免疫調節療法、または放射線療法を施されてもよい。
【０２５５】
本明細書の抗体が第２の薬剤と併用して投与される場合、例えば、第２の薬剤がサイトカインもしくは増殖因子、または化学療法剤である場合、投与はまた、放射療法剤または放射療法の使用を含むことがさらに企図される。抗体組成物と併用して施される放射線療法は、治療する医師によって判定されるように、かつがんの治療を受ける患者に典型的に与えられる線量で施される。
【０２５６】
細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害もしくは妨げ、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、およびＲｅ１８６）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素もしくは合成毒素などの毒素、またはそれらの断片を含むことが意図される。非細胞傷害剤は、細胞の機能を阻害もしくは妨げず、かつ／または細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞傷害剤は、細胞傷害によって活性化され得る薬剤を含み得る。非細胞傷害剤には、ビーズ、リポソーム、マトリックス、または粒子が含まれ得る（例えば、米国特許公開第２００３／００２８０７１号および同第２００３／００３２９９５号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。かかる薬剤は、本開示による抗体とコンジュゲート、連結、結合、または会合していてもよい。
【０２５７】
一実施形態では、第２の薬剤は、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−１阻害剤、またはＰＤＬ−１阻害剤ＰＤ−１）である。他の実施形態では、本発明のＩＬ−２抗体は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞／腫瘍浸潤リンパ球（ＣＡＲＴ／ＴＩＬ）療法または薬剤と併用することができる。他の実施形態では、本発明のＩＬ−２抗体は、ワクチン療法と併用することができる。なお別の実施形態では、本開示のＩＬ−２抗体は、腫瘍特異的抗原を標的とする他の抗体または薬剤と併用することができる。
【０２５８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のヒンジおよび膜貫通ドメインを介して細胞質シグナル伝達領域に結合した、腫瘍特異的抗体の（ｓｃＦｖ）細胞外ドメインからなる受容体複合体が導入されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖によって産生される（Ｈａｊｉ−Ｆａｔａｈａｌｉｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４４：１３３９−１３４９（２０１６）。いくつかのＣＡＲは同時刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、または４１ＢＢ）を発現するように操作され、これにより、これらの細胞により大きな細胞傷害活性が付与され得る。
【０２５９】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は典型的には、新鮮な腫瘍試料から、または血液から単離し、ＩＬ−２で増殖させ、その後、試料を提供した患者に静脈内注入で戻された、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。任意選択で、腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、１つ以上の腫瘍抗原を充填したＡＰＣを使用して実施される。細胞注入後、多くの場合、ＴＩＬの活性を維持するために、患者はＩＬ−２（高用量または低用量のいずれか）を与えられる（Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４（４），ｅ１００２７２０（２０１５））。別の方法では、選択された腫瘍抗原に対して特異的な受容体がＴ細胞に導入される。この方法は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、その後、選択された腫瘍抗原に対して特異的なＴＣＲをＴ細胞に導入し、これらの細胞を増殖させることを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２抗体は、ＩＬ−２またはＩＬ−２バリアントと併用して投与される。様々な実施形態では、抗体は、投与前にＩＬ−２と複合体化され得るか、またはＩＬ−２およびＩＬ−２抗体は、本明細書に記載されるように併用して投与され得る（Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎ，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：４２７−４４６（２０１２）、Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４２：８１５−８２５、Ａｒｅｎａｓ−Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌ．３６：７６３−７７７）。抗体がＩＬ−２と併用して投与される場合、ＩＬ−２の量は、使用される治療量よりも少なく、例えば、７００，０００国際単位（Ｉ．Ｕ）／ｋｇ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）より低い。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、約３００，０００〜６０００，０００Ｉ．Ｕ／ｋｇ、約２５０，０００〜５００，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、約１００，０００〜２５０，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、約１０，０００〜１００，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、または約１，０００〜１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇ、または約約５００〜５，０００Ｉ．Ｕ．／ｋｇの用量で投与される。様々な実施形態では、複合体中のＩＬ−２対ＩＬ−２抗体の比は、モル比に基づき１：１である。様々な実施形態では、複合体中のＩＬ−２対ＩＬ−２抗体の比は、１：１ではなく、例えば、比は、モル比に基づき約５：１、４：１、３：１、２：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０以上である。様々な実施形態では、ＩＬ−２特異的抗体は、本明細書に記載されるＸＰＡ．９２．０１９である。
【０２６１】
様々な実施形態では、ＩＬ−２およびＩＬ−２抗体が投与の前に予め混合されている場合、当該薬剤は、１週間に２回一緒に投与されてもよい。様々な実施形態では、ＩＬ−２は、本明細書に記載される抗体の用量と共に、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、静脈内に投与される。
【０２６２】
ＩＬ−２抗体と関連するＩＬ−２を添加する場合、ＩＬ−２が、順次に、例えば同じ日に投与されることが企図され、ある特定の実施形態では、ＩＬ−２抗体は、ＩＬ−２の投与の前に投与される。様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、１週間に１回投与され、１週間に１回または１週間に複数回のＩＬ−２の投与が抗体の投与に続く。
【０２６３】
様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、１週間に１回投与され、ＩＬ−２治療薬（例えば、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）は、既知の処方スケジュールで、かつより低いＩＬ−２用量で投与される。
【０２６４】
本明細書の抗体とＩＬ−２との併用は、抗腫瘍医薬品としてのＩＬ−２の治療指数（ＴＩ）を増加させることがさらに企図される。様々な実施形態では、本開示の抗ＩＬ−２抗体と併用して投与された場合、ＩＬ−２のＴＩは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上である。
【０２６５】
ＩＬ−２は、抗体投与と同じスケジュールで投与されてもよく、またはＩＬ−２が抗体と別個に投与される場合には、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）などの他のＩＬ−２治療薬について記載されるように、もしくは以前に使用した治療用量と比較して低減された用量で投与されてもよいことが企図される。現在推奨されているＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）（アルデスロイキン）治療レジメンは、８時間ごとに１５分間の静脈注入によって投与される。転移性腎細胞癌（転移性ＲＣＣ）または転移性黒色腫を有する成人患者を治療するために以下のスケジュールが使用されている。各治療方針は、安静期間によって分かれた２つの５日間の治療サイクルからなる。最大で１４回の用量にわたり、８時間ごとに１５分間の静脈注入によって６００，０００国際単位／ｋｇ（０．０３７ｍｇ／ｋｇ）の用量が投与される。９日間の安静の後、耐容される限り、治療方針当たり最大で２８回の用量にわたって、このスケジュールをさらに１４回の用量にわたって繰り返す。このスケジュールは、治療する医師によって必要に応じて修正されてもよい。ＩＬ−２が抗体と共に投与される場合、投薬量は、ＩＬ−２の標準用量と比較して低減されることが企図される。さらなる投与レジメンも詳細な説明において以下に記載される。
【０２６６】
本開示の抗体との使用が企図されるが、それに限定されない化学療法剤および他の薬剤には、表１に列挙されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６７】
（表１）化学療法剤および他の薬剤
2019534710.tif 000002
2019534710.tif 000003
【０２６８】
障害の治療
別の実施形態では、本明細書に記載される抗体のいずれの種類も、本方法において使用され得る。例示的な実施形態では、標的特異的抗体は、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体である。別の例示的な実施形態では、標的はヒトであり、患者はヒト患者である。代替的には、患者は、標的特異的抗体が交差反応する標的タンパク質を発現する哺乳動物であり得る。抗体は、獣医学的目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応する標的タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類）に投与されてもよい。
【０２６９】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載される疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図されるＩＬ−２抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０２７０】
別の実施形態では、本開示は、ＩＬ−２またはＩＬ−２  Ｒの発現の増加に関連付けられる疾患、状態、または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【０２７１】
別の実施形態では、本開示は、がん、微生物感染、喘息、および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患、状態、または障害を治療するための方法を提供する。
【０２７２】
一実施形態では、本開示は、本開示は、がんを治療するか、またはがんの再発を予防するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図されるＩＬ−２抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２７３】
様々な実施形態では、本開示は、ＩＬ−２に基づく療法の１つ以上の副作用を改善させるための方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。かかる副作用の例としては、血管漏出症候群および肺水腫、腎損傷、ＣＮＳ障害、ならびに心臓作用（ならびに、低血圧、下痢、乏尿、悪寒、嘔吐、呼吸困難、発疹、ビリルビン血症、血小板減少、吐き気、錯乱、クレアチニン増加、呼吸障害、昏睡、アシドーシス、無呼吸、急性腎不全、血管凝固異常、呼吸困難、発熱、心停止、心筋梗塞、精神病、敗血症、ＳＧＯＴ増加、昏迷、上室性頻拍、および死などの症状）が挙げられる。
【０２７４】
ＩＬ−２療法を受ける対象において有効なＩＬ−２用量を低減させる方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することを含む、方法も提供される。本明細書に記載されるＩＬ−２抗体の投与は、（ＩＬ−２抗体治療の不在下で必要とされる用量と比較して）治療される疾患または障害の１つ以上の症状を改善するために必要とされるＩＬ−２の用量を減少させることができ、ＩＬ−２治療の治療濃度域を増加させることが企図される。
【０２７５】
本開示の抗体（または本明細書に記載される製剤）で治療することができる例示的な状態または障害としては、がん、例えば、食道癌、膵臓癌、転移性膵臓癌、膵臓の転移性腺癌、膀胱癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、線維性癌、神経膠腫、悪性神経膠腫、びまん性内在性橋グリオーマ、再発性小児脳腫瘍、腎細胞癌、転移性腎明細胞癌、腎臓癌、前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、ＩＶ期前立腺癌、転移性黒色腫、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚の再発性黒色腫、黒色腫脳転移、ＩＩＩＡ期皮膚黒色腫、ＩＩＩＢ期皮膚黒色腫、ＩＩＩＣ期皮膚黒色腫、ＩＶ期皮膚黒色腫、頭頸部の悪性黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮非小細胞肺癌、乳癌、再発性転移性乳癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、進行Ｂ細胞ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含むＨＬ、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、リヒター症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、成人神経膠芽腫、再発性神経膠芽腫、再発性小児横紋筋肉腫、再発性ユーイング肉腫／末梢性原始神経外胚葉性腫瘍、再発性神経芽細胞腫、再発性骨肉腫、結腸直腸癌、上咽頭非角化型癌、再発性上咽頭未分化癌、子宮頸部腺癌、子宮頸部腺扁平上皮癌、子宮頸部扁平上皮癌、再発性子宮頸癌、ＩＶＡ期子宮頸癌、ＩＶＢ期子宮頸癌、肛門管扁平上皮癌、転移性肛門管癌、再発性肛門管癌、再発性頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、卵巣癌、結腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、進行ＧＩ癌、胃腺癌、食道胃接合部腺癌、骨腫瘍、軟部肉腫、骨肉腫、胸腺癌、尿路上皮癌、再発性メルケル細胞癌、ＩＩＩ期メルケル細胞癌、ＩＶ期メルケル細胞癌、骨髄異形成症候群、ならびに再発性菌状息肉症およびセザリー症候群からなる群から選択されるがんが挙げられる。関連する態様では、本開示は、がんを治療するための方法であって、治療有効量の本明細書において企図される抗体または医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫、腎細胞癌、リンパ腫、白血病、肉腫、乳癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、胃癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、頭頚部癌、皮膚癌、および扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される。
【０２７７】
様々な実施形態では、ＩＬ−２と併用して、また任意選択でチェックポイント阻害剤または他の補助的腫瘍学的治療薬と併用して、ＩＬ−２抗体を投与することであって、それにより非ＩＬ−２応答性腫瘍型に対する効果が、増殖および／または転移の阻害に対して感受性となる、投与することを含む、疾患、例えば、がんを治療する方法が本明細書に提供される。
【０２７８】
関連する態様では、がんは転移性である。関連する態様では、転移には、骨、または骨組織、肝臓、肺、腎臓、もしくは膵臓への転移が含まれる。本明細書の方法は、対象における腫瘍サイズもしくは腫瘍量を低減させ、かつ／または対象における転移を低減させることが企図される。
【０２７９】
様々な実施形態では、本方法は、腫瘍サイズを１０％、２０％、３０％以上低減させる。様々な実施形態では、本方法は、腫瘍サイズを１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低減させる。
【０２８０】
様々な実施形態では、本方法は、腫瘍が増殖する能力を低減させ、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）およびｉｒＲＣ（免疫応答基準）を含む当該技術分野における標準的方法によって定義される不変をもたらす。
【０２８１】
一実施形態では、当該治療を必要とする動物におけるがんの治療は、ＩＬ−２に対して特異的である有効量の抗体または本明細書に記載される抗体を含む組成物を、任意選択でＩＬ−２と併用して動物に投与することを含む。
【０２８２】
本開示の方法によって治療することができる状態は、好ましくは、哺乳動物において生じる。哺乳動物には、例えば、ヒトおよび他の霊長類、ならびにイヌおよびネコなどのペットまたはコンパニオン動物、ラット、マウス、およびウサギなどの実験動物、ならびにウマ、ヒツジ、およびウシなどの家畜が含まれる。
【０２８３】
医薬組成物の製剤化
本開示の抗体をヒトまたは試験動物に投与するために、１つ以上の薬学的に許容される担体を含む組成物に抗体を製剤化することが好ましい。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、以下に記載されるような、当該技術分野で周知の経路を使用して投与されたときに、アレルギー反応または他の有害反応を生み出さない分子実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」には、あらゆる臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
【０２８４】
さらに、化合物は、水または一般的な有機溶媒と共に溶媒和物を形成し得る。かかる溶媒和物もまた企図される。
【０２８５】
抗体は、非経口投与、皮下投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、肺内投与、および鼻腔内投与、ならびに局所治療のために所望される場合、病変内投与を含む任意の好適な手段によって投与される。非経口注入には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、または皮下投与が含まれる。さらに、抗体は、特に抗体の投与量を減らしながら、パルス注入によって適切に投与され得る。好ましくは、投与は、投与が短時間であるか慢性であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは静脈内、筋肉内、または皮下注射によって与えられる。局所投与、特に、経皮投与、経粘膜投与、腸内投与、経口投与、または例えば所望の部位の近くに置かれたカテーテルを通した局所投与を含む、他の投与方法が企図される。
【０２８６】
活性成分として本明細書に記載される抗体を含有する本開示の医薬組成物は、投与経路に応じて、薬学的に許容される担体または添加剤を含有し得る。かかる担体または添加剤の例としては、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加剤は、適宜、本開示の投与剤形に応じて、上記またはそれらの組み合わせから選択されるが、それらに限定されない。
【０２８７】
医薬組成物の製剤化は、選択される投与経路によって異なる（例えば、溶液、エマルジョン）。投与される抗体を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中で調製され得る。溶液またはエマルジョンの場合、好適な担体には、例えば、生理食塩水および緩衝媒質を含む、水溶液もしくはアルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれ得る。静脈内ビヒクルには、様々な添加剤、保存剤、または流体、栄養素、もしくは電解質補充薬が含まれ得る。
【０２８８】
多様な水性担体、例えば、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど、および穏やかな化学修飾などに供した、安定性の増強のための他のタンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどが含まれ得る。
【０２８９】
抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合させることによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保管用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、これには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２９０】
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症のために、必要に応じて、２つ以上の活性化合物、特に、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。かかる分子は、好適には、意図される目的のために有効な量の組み合わせで存在する。
【０２９１】
活性成分はまた、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、および名のカプセル）における、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル、またはマクロエマルジョンの中に封入され得る。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２９２】
インビボ投与のために使用される製剤は、滅菌される必要がある。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０２９３】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造のために好適な賦形剤と混合して、活性化合物を含有し得る。かかる賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガント；トラガカントゴムおよびアカシアゴムであり、分散剤または湿潤剤は、天然に生じるホスファチド、例えばレシチン、または脂肪酸との酸化アルキレンの縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、または長鎖脂肪族アルコールとの酸化エチレンの縮合物、例えばヘプタデカエチル−エネオキシカテノール、または脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの酸化エチレンの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、または脂肪酸およびヘキシトール無水物との酸化エチレンの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエートを含有し得る。
【０２９４】
本明細書に記載される抗体は、保管用に凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構築することができる。この技術は、従来の免疫グロブリンで有効であることが示されている。任意の好適な凍結乾燥および再構築技術を用いてもよい。当業者であれば、凍結乾燥および再構築は、異なる程度の抗体活性の喪失をもたらす可能性があり、補うために使用レベルを調節する必要がある場合があることを理解するであろう。
【０２９５】
本明細書に記載されるＩＬ−２抗体は、１つ以上の追加の抗体との共製剤として調製および投与することができる。一態様では、抗体のうちの少なくとも２つは、異なる抗原を認識し、それに結合する。別の態様では、複数の抗体のうちの少なくとも２つは、同じ抗原の異なるエピトープを特異的に認識し、それに結合することができる。
【０２９６】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および１つ以上の保存剤と混合した活性化合物を提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、既に上に述べたものによって例示されている。
【０２９７】
これらの製剤中の抗体の濃度は、例えば、約０．５重量％未満から、通常１重量％または少なくとも約１重量％から、１５または２０重量％まで幅広く変動し得、選択された特定の投与様式に従い、主に液量、粘度などに基づいて選択されることになる。したがって、非経口注射用の典型的な医薬組成物は、１ｍｌの滅菌緩衝水および５０ｍｇの抗体を含有するように作製され得る。静脈注入用の典型的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル液および１５０ｍｇの抗体を含有するように作製され得る。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知または明白であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）により詳細に記載されている。抗体の有効投薬量は、１回の投与につき体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。
【０２９８】
医薬組成物は、滅菌注射用水溶液、油性懸濁液、分散液、または滅菌注射溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末の形態であり得る。懸濁液は、上述の好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用調製物はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であり得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、植物油、リンゲル液、ならびに等張性塩化ナトリウム溶液を含有する溶媒または分散媒質であり得る。さらに、溶媒または懸濁化媒質として滅菌不揮発性油が慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油が用いられ得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製における用途を見出す。
【０２９９】
全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
【０３００】
投与のために有用な組成物は、それらの効力を増加させるために摂取または吸収増強剤と共に製剤化されてもよい。かかる増強剤には、例えば、サリチル酸、グリココール酸／リノール酸、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌａｔｅ）、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプリン酸などが含まれる。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２８２−１２８５（１９９６））およびＯｌｉｙａｉ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５２１−５４４（１９９３））を参照されたい。
【０３０１】
抗体組成物は、その同種の受容体またはリガンドへの標的の結合、標的媒介性シグナル伝達など標的活性を調節する用途のために企図される。特に、組成物は、副作用を実質的に伴わない濃度で阻害特性を呈し、したがって、延長した長期間の治療プロトコルに有用である。例えば、１つ以上の他の薬剤、例えば、ＩＬ−２、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤との抗体の同時投与は、患者における有毒な副作用を効果的に低減させながら、治療される状態または障害の有益な阻害を達成することができる。
【０３０２】
さらに、本開示における使用のために企図される組成物の親水性および疎水性の特性はバランスがとれており、それにより、かかるバランスを欠く他の組成物は有用性が実質的に低い一方、インビトロおよび特にインビボ用途の両方でそれらの有用性を高める。具体的には、本開示における使用のために企図される組成物は、化合物が作用の推定部位へと細胞膜を横切ることを許容する脂質中での溶解度を有しながら、体内での吸収および生物学的利用能を許容する水性媒質中での適切な溶解度を有する。したがって、企図される抗体組成物は、それらが標的抗原活性部位に送達され得る場合に最大限に有効である。
【０３０３】
投与および投与量
一態様では、本開示の方法は、本明細書に記載される抗体を含む医薬組成物を投与する工程を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、滅菌組成物である。
【０３０４】
本開示の方法は、治療薬を哺乳動物対象に直接または間接的に導入するための任意の医学的に許容される手段によって行われ、これには、注射、経口摂取、鼻腔内、局所、経皮、非経口、吸入スプレー、膣内、または腸内投与が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、および槽内注射、ならびにカテーテルまたは注入技術を含む。皮内、腫瘍内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注射、およびまたは特定の部位での外科的移植による投与も企図される。
【０３０５】
一実施形態では、投与は、治療を必要とするがんまたは患部組織の部位で、当該部位への直接注射によってまたは持続送達もしくは持続放出機構を介して行われ、これは製剤を内部に送達することができる。例えば、組成物（例えば、可溶性ポリペプチド、抗体、または小分子）の持続送達が可能な生分解性マイクロスフェアもしくはカプセルまたは他の生分解性ポリマー構成が、がんの近く、またはがんの部位に埋め込まれた本開示の製剤に含まれてもよい。
【０３０６】
治療用組成物はまた、複数の部位において患者に送達されてもよい。複数回投与は、同時に与えられてもよく、または一定時間にわたって投与されてもよい。ある特定の場合では、治療用組成物の連続フローを提供することが有益である。さらなる療法は、定期的に、例えば、１週間に１回、２週間ごとに１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回、もしくは３カ月ごとに１回、またはより長い間隔で施されてもよい。
【０３０７】
所与の投薬量での抗体組成物の量は、療法が施される個体のサイズおよび治療されている障害の特徴に応じて変動し得る。例示的な治療において、約１ｍｇ／日、５ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、または１０００ｍｇ／日を投与する必要がある場合がある。これらの濃度は、単一の投与剤形として、または複数回用量として投与され得る。最初に動物モデルにおける、およびその後の臨床試験における標準用量応答研究は、特定の疾患状態および患者集団のための最適な投薬量を明らかにする。
【０３０８】
所与の投薬量でのＩＬ−２抗体の量は、療法が施されている固体のサイズおよび治療されている障害の特徴に応じて変動し得ることも本開示において企図される。抗体組成物は、疾患の進行または許容できない毒性が生じるまで１、２、または４週間ごとに週に２回、０．１〜１５ｍｇの用量範囲で３０〜６０分間にわたる静脈注入として投与され得る。様々な実施形態では、抗体組成物は、週に２回、または１、２、もしくは４週間ごとに、０．３〜３０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で皮下または筋肉内に投与され得る。様々な実施形態では、用量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または３０ｍｇ／ｋｇであり得る。様々な実施形態では、抗体組成物は、週に２回、または１、２、もしくは４週間ごとに、０．３〜３ｍｇ／ｋｇの用量範囲で静脈内投与され得る。代替的には、抗体組成物は、週に２回、または１、２、もしくは４週間ごとに、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で皮下または筋肉内に投与され得る。
【０３０９】
様々な実施形態では、ＩＬ−２がＩＬ−２抗体と併用して与えられる場合、投与されるＩＬ−２の用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。様々な実施形態では、ＩＬ−２は、ＩＬ−２抗体と併用して与えられる場合、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、もしくは１．０ｍｇ／ｋｇの用量、または重量で与えられる場合、約１．０μｇ〜５０μｇ、もしくは約１．０μｇ、３．０μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、もしくは５０μｇの用量である。抗ＩＬ２  ｍＡｂの投与量範囲は、０．０５〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。様々な実施形態では、ＩＬ−２抗体は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、もしくは５ｍｇ／ｋｇの用量、または重量で与えられる場合、約５０〜１０００ｍｇ、もしくは約３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、もしくは１０００ｍｇの用量で投与される。例えば、マウスに投与される１：１モル比のｍＡｂ：ＩＬ２は、１５ｕｇ：１．５ｕｇ（すなわち、０．７５ｍｇ／ｋｇ：０．０７５ｍｇ／ｋｇ）として投与され得る。ヒトにおける例示的な投与レジメンは、予め混合されている場合、約０．１ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ  ＩＬ−２、または別個に与えられる場合、１〜５ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ＋０．００５〜０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＩＬ−２であり得る。
【０３１０】
さらなる治療薬が本開示の治療薬と併用して投与される場合、その投与量は修正され得ることは明白であろう。
【０３１１】
キット
さらなる態様として、本開示は、本開示の方法を実践するためにそれらの使用を容易にする様式でパッケージ化された１つ以上の化合物または組成物を含むキットを含む。一実施形態では、かかるキットは、密封ボトルまたは容器などの容器の中にパッケージ化された、本明細書に記載される化合物または組成物を含み、本方法における化合物または組成物の使用を説明するラベルが容器に貼付されているかまたはパッケージに含まれている。好ましくは、化合物または組成物は、単位投与剤形でパッケージ化されている。キットは、特定の投与経路に従う組成物の投与のため、またはスクリーニングアッセイの実践のために好適なデバイスをさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、抗体組成物の使用を説明するラベルを含有する。
【０３１２】
本開示のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図される以下の実施例から明白であろう。
【実施例】
【０３１３】
実施例１：ＩＬ−２に対する高親和性抗体のパニング
１：１０比のＩＬ−２対ビオチン試薬を使用する製造業者のプロトコルに従ってＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、組換えヒトＩＬ−２（Ｃ１２５Ａ変異体、Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）をビオチン化した。
【０３１４】
可溶性パニング法を使用して、ビオチン化ＩＬ−２を用いて一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリ（ＸＯＭＡ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）をパニングした。カッパおよびラムダサブライブラリを別々にパニングした。ファージパニングの最初のラウンドでは、１：１で１０％ミルク／ＰＢＳと混合することによって、ライブラリの５０Ｘライブラリ等価物（カッパでは約７×１０１２ｃｆｕおよびラムダでは約１×１０１３）を室温で１時間、回転させながらブロックした。ブロックファージをストレプトアビジンコーティング磁気ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に添加し、４５分間、回転させながらインキュベートすることによって、ストレプトアビジンに対する結合剤をブロックファージから選択解除した。選択解除工程を再度繰り返した。磁石を使用して、ファージからビーズを分離した。選択解除工程と同時に、室温で４５分間、回転させながらインキュベートすることによって、２００ピコモルのビオチン化ＩＬ−２をストレプトアビジンコーティング磁気ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させた。選択解除したファージを、磁気ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化ＩＬ−２（サブライブラリ当たり１００ｐｍｏｌ）に添加し、１．５時間、回転させながらインキュベートすることによって、選択を行った。選択後、０．５％ミルク／ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで未結合のファージを３回、各５分間ビーズから洗浄し、続いてさらに３回、０．５％ミルク／ＰＢＳで５分間洗浄した。洗浄工程後、１００ｍＭのトリエチルアミンを添加し、回転させながら室温で３０分間インキュベートすることによって、選択したファージをビーズから溶出させた。等容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加して、溶出したファージを中和させた。次いで、溶出および中和したファージを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  Ｎｏ  ３５２０７０）内に採集し、これを使用して対数期増殖ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ細菌細胞（ＯＤ６００  約０．５）を感染させた。感染は、振とうさせずに３７℃で３０分間行い、続いて１００ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で３０分間さらにインキュベートした。１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および２％のグルコースを補充した２ｘＹＴ培地（２ＹＴＣＣｍＧ）の寒天バイオアッセイプレートに細胞をプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートして、一晩菌叢（ｌａｗｎ）を生育させた。
【０３１５】
次のラウンドの入力としての調製において、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを使用して重複感染によって前のラウンドの出力の１００Ｘをレスキューした。これは、前のパニングラウンドの出力から掻き取った細胞を２ｘＹＴＣｍ培地に接種することによって行った。開始培養物についてＯＤ６００ｎｍを測定し、約０．０５の開始ＯＤ６００ｎｍを反映するように調節した。細胞がＯＤ６００ｎｍ約０．５の対数増殖期に達するまで、振とうさせながら細胞を３７℃で増殖させた。細胞を感染多重度（ＭＯＩ）＝約２０、３７℃で３０分間、振とうさせずにＭ１３Ｋ０７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）に感染させ、続いて１５０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃でさらに３０分間インキュベートした。３７℃での感染後、細胞をペレット化し、２５ｕｇ／ｍＬのカナマイシン、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリン、および２％のアラビノースを補充した新しい２ｘＹＴ培地（２ＹＴＣＫＡｒａ）に移した。培養物を２５℃で一晩増殖させた。遠心分離によってファージを細胞および破片から分離し、得られた上清を回収し、次のパニングラウンドのための入力として使用した。各パニングラウンドに使用した入力の量および得られたファージ出力力価によって選択濃縮を監視した。
【０３１６】
２回目および３回目のパニングラウンドでは、１回目のラウンドで従った同じ溶液相プロトコルを使用したが、以下の点が異なる。パニングラウンド２および３に使用したファージ入力量は、約１．０×１０１０ｃｆｕであった。ラウンド２では、２５および１０ピコモルのビオチン化抗原を選択に使用し、ラウンド３では、１０ピコモルのビオチン化抗原を使用した。ラウンド２では、０．５％ミルク／ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで未結合のファージを５回、各５分間ビーズから洗浄し、続いて０．５％ミルク／ＰＢＳでさらに５回、５分間洗浄した。ラウンド３のパニングでは、０．５％ミルク／ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮでビーズを５分間５回洗浄し、その後、０．５％ミルク／ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで３回素早く洗浄し、続いて０．５％ミルク／ＰＢＳで５分間５回、そして３回素早く洗浄した。
【０３１７】
実施例２：周辺質抽出物中の抗体のスクリーニング
ＩＬ−２結合剤のスクリーニングにおける使用のための分泌された抗体断片を含有する細菌周辺質抽出物（ＰＰＥ）は、標準方法によって調製した。個々のコロニーを、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび０．１％のグルコース培地を補充した２ＹＴＣで充填した９６ウェルプレートに採取した。培養物を、対数増殖相（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）に達するまで振とうさせながら３７℃で増殖させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧ最終を添加することによって可溶性断片を産生するようにコロニーを誘導し、振とうしながら２５℃で一晩インキュベートした。可溶性断片抗体を含有するＰＰＥは、完全ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットを（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）を用いて１：３体積比の氷冷ＰＰＢ溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）および再蒸留水（ｄｄＨ２０）を添加する標準方法を使用して、誘導された細胞から調製した。
【０３１８】
ＥＬＩＳＡ
ＰＰＥを以下のようにＥＬＩＳＡによってアッセイした。３８４ウェルのストレプトアビジンコーティングプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）または３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一晩、ストレプトアビジンコーティングプレートについてはビオチン化ＩＬ−２（ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬ）で、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートまたはＰＢＳ（対照として）についてはＩＬ−２（ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬ）でコーティングした。ＰＰＥを５％のＢＳＡ／ＰＢＳで１時間ブロックし、次いで、コーティングされたＥＬＩＳＡプレート（２０  μｌ／ウェル）に添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。結合したｓｃＦｖ断片を、マウス抗Ｖ５  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で１時間検出し、続いてヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡスクリーニングの各段階の後に、ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）で３回の洗浄を実施した。２０μｌ／ウェルの可溶性３．３’，５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬ）を用いて４５０ｎｍ吸光度で発色させ、１ＭのＨ２ＳＯ４（２０μｌ／ウェル）を用いて停止させた。
【０３１９】
一次スクリーニングにおいて、ストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン化ｒｈＩＬ−２への結合がバックグラウンドの３倍を超え、かつストレプトアビジン単独への結合がバックグラウンドの３倍未満であると測定された試料を一次ヒットとして選定した。一次ヒットを採取し、新しいプレートに再配列し、ＰＰＥを調製し、上記のように再スクリーニングした。ＩＬ−２への結合がバックグラウンドの３倍を超え、かつ対照プレート上の結合が３倍未満であると再び測定された試料を二次ヒットとして選定した。二次ヒットを再度再配列し、次いで、三次スクリーニングのためにプレート上に直接コーティングされたｒｈＩＬ−２上でＥＬＩＳＡによってＰＰＥをスクリーニングした。
【０３２０】
再フォーマット化
二次ヒットのＤＮＡ配列を判定し、三次スクリーニングにおいて結合した１３個の固有のクローンをＩｇＧ２フォーマットに再フォーマット化した。選択されたヒットの可変重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）をＰＣＲ増幅し、抗体定常領域配列を含有するプラスミドベクターにクローニングし、標準方法を使用して２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトして、さらなる特性評価のための材料を生成した。
【０３２１】
ＳＰＲによる結合
予備動力学結合分析のために、動力学結合分析のための標準方法を使用して、培養上清中のＩｇＧを、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｘ１００（Ｂｉｏｒａｄ）上の固定された抗ヒトＦｃ表面にわたって注入し、続いて５つの濃度のｒｈＩＬ−２または泳動緩衝液（１％ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋）を注入した。ＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアを使用して、親和性は、１桁または２桁のｎＭ範囲内であることが推定された（表２）。これらの抗体がＩＬ−２受容体結合と競合するかどうかを判定するために、第２の実験は、可溶性ＩＬ−２  Ｒβ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が、同様に捕捉されたＩｇＧによって結合されたＩＬ−２に結合することができるかどうかを試験した。抗体のうちの３個、ＸＰＡ．９２．０１１、ＸＰＡ．９２．０１２、およびＸＰＡ．９２．０１３は、明らかにＩＬ−２  Ｒβの結合を可能にした一方、他の１０個の抗体によって捕捉されたＩＬ−２へのそのような結合は検出されなかった（表２）。
【０３２２】
（表２）ＳＰＲによって測定した、組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）およびＩＬ−２ＲβへのＩＬ−２抗体結合
2019534710.tif 000004
【０３２３】
親和性成熟
迅速速度論で３個のＩＬ−２  Ｒβ許容抗体の親和性が低かったため、軽鎖シャッフリングを使用してこれらを親和性成熟に供した。３個の抗体の各々からのＶＨ領域をＶＬのライブラリにクローニングした。溶液相プロトコルを使用して、この新しいＦａｂライブラリをビオチン化ＩＬ−２に対してパニングした。
【０３２４】
軽鎖シャッフリングされたライブラリのパニング
ファージパニングの最初のラウンドでは、１：１でＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合することによって、親和性成熟ライブラリからの約１×１０１１ファージを室温で１時間、回転させながらブロックした。ブロックファージをストレプトアビジンコーティング磁気ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０に添加し、３０分間、回転させながらインキュベートすることによって、ストレプトアビジンに対する結合剤をブロックファージから選択解除した。選択解除工程を再度繰り返した。磁石を使用して、ファージからビーズを分離した。選択解除工程と同時に、室温で１時間、回転させながらインキュベートすることによって、１０ピコモルのビオチン化ＩＬ−２をストレプトアビジンコーティング磁気ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させた。選択解除したファージを、磁気ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化ＩＬ−２に添加し、１．５時間、回転させながらインキュベートすることによって、選択を行った。選択後、０．５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで未結合のファージを５回、各５分間ビーズから洗浄し、続いてさらに３回、０．５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ＰＢＳで５分間洗浄した。洗浄工程後、１００ｍＭのトリエチルアミンを添加し、回転させながら室温で３０分間インキュベートすることによって、選択したファージをビーズから溶出させた。等容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加して、溶出したファージを中和させた。次いで、溶出中和したファージを５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  Ｎｏ  ３５２０７０）内に採集し、これを使用して対数期増殖ＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ細菌細胞（ＯＤ６００  約０．５）を感染させた。感染は、振とうさせずに３７℃で３０分間行い、続いて１００ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で３０分間さらにインキュベートした。１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および２％のグルコースを補充した２ｘＹＴ培地（２ＹＴＣＣｍＧ）の寒天バイオアッセイプレートに細胞をプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートして、一晩菌叢を生育させた。
【０３２５】
混入した親ｓｃＦｖクローンを除去するために、いずれもｓｃＦｖファージミドを切断するがＦａｂファージミドを切断しないＮｈｅＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）およびＢｓｍＩでラウンド１の出力からのＤＮＡを消化した。得られたＤＮＡをＴＧ１＋ｃｙｔＦｋｐＡ細胞に形質転換し、上記のようにファージを産生した。
【０３２６】
ラウンド１と同様のプロトコルを使用してパニングのさらなるラウンドを完了したが、以下を変更した。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ器具を使用して、ストレプトアビジンコーティング磁気ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０に対する約５×１０１０ファージの選択解除を３０分間、３回行った。１ピコモルのビオチン化ＩＬ−２をストレプトアビジンコーティング磁気ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−２８０上にコーティングし、そこに選択解除したファージを添加し、混合のためにＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒを使用して１時間インキュベートした。最後に、０．５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ／ＰＢＳ−０．１％ＴＷＥＥＮで未結合のファージを５回、各５分間ビーズから洗浄し、続いて０．５％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ／ＰＢＳでさらに５回、５分間洗浄した。
【０３２７】
ＳＰＲによる動力学ランキング
オフレートランキングについてＢｉａｃｏｒｅ  ４０００を使用したＳＰＲによって親和性成熟クローンの一次スクリーニングを実施した。抗Ｆａｂ捕捉試薬を４つ全てのフローセルのスポット１、２、４、および５に固定して、製造業者の指示に従うアミンカップリングおよび試薬（Ｂｉａｃｏｒｅ）によってＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップを調製した。４個のＰＰＥの９６ウェルプレート上記のように調製し、次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ泳動緩衝液（１％ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋）で１：１に希釈し、遠心分離により０．２μｍのＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。希釈し、濾過したＰＰＥを、スポット１または５に３分間注入し、続いて、高性能モードの緩衝液または５０ｎＭ  ＩＬ−２を３０μＬ／分で３分間注入した。分離を５分間監視した。スポット２または４およびＩＬ−２緩衝液注入なしを使用して、ＩＬ−２注入を二重参照した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用してデータを分析した。４５ＲＵを超えるＦａｂを捕捉し、かつ０．０１ｓｅｃ−１未満のオフレートを有する３７個の試料をヒットとして選定し、さらなるスクリーニングに進めた。
【０３２８】
ヒットとして選定した試料を配列決定し、上記のように（ＰＰＥを２分間注入し、ＩＬ−２を３０、１０、３、および０ｎＭで注入したことを除いて）ＳＰＲによって再スクリーニングした。オンレートおよびオフレートの両方を適合させることによってデータを分析し、そこから親和性の予測は１０ｎＭ〜０．０６ｎＭの範囲であることを計算した。
【０３２９】
実施例３：ＩＬ−２調節抗体のさらなるスクリーニング
抗ＩＬ−２抗体の新規のスクリーニングおよび機能的アッセイにおける使用のためにヒトＩＬ−２受容体を発現するようにＣＨＯ−Ｋ１細胞を操作した。当該技術分野で既知である蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）法を使用して、高レベル、中レベル、または低レベルのＩＬ−２  Ｒα（ＣＨＯ／Ｒα）、ＩＬ−２  Ｒβ（ＣＨＯ／Ｒβ）、またはＩＬ−２  Ｒβおよびγｃ（ＣＨＯ／Ｒβγ）を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を選択した。マウス由来のＢａＦ３細胞株をヒトＩＬ−２受容体でトランスフェクトしてＩＬ−２応答性を付与し、得られた細胞株をＩＬ−２に引き離し、増殖アッセイにおける抗体活性の特性評価のために使用した。発現レベル（受容体／細胞の数）を予測し、結合、シグナル伝達、または増殖アッセイにおける最適性能について複数の細胞株を試験した。様々なアッセイにおける使用のために以下の細胞株クローンを選択した（表３）。
【０３３０】
（表３）ヒトＩＬ−２受容体発現レベル（受容体／細胞）
2019534710.tif 000005
--  ヒトＩＬ−２受容体遺伝子でトランスフェクトされていない
【０３３１】
周辺質抽出物（ＰＰＥ）のフローサイトメトリースクリーニング
所望の特性を有する抗体を同定するために、可溶性抗体断片を含有するＰＰＥを、飽和量のＩＬ−２を含むかまたは含まないＣＨＯ／Ｒα、ＣＨＯ／Ｒβ、ＣＨＯ／Ｒβγ、および親ＣＨＯ−Ｋ１細胞上でスクリーニングした。このスクリーニングは、１）ＣＨＯ／Ｒαまたは親細胞に結合しないクローン、および２）ＩＬ−２の存在下ではＣＨＯ／ＲβまたはＣＨＯ／Ｒβγ細胞に結合するが、ＩＬ−２の不在下ではそれらに結合しないクローンを同定した。細胞をＥｘｃｅｌ３０２および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ＃１４３２４Ｃ−５００ｍＬ）中で増殖させた。試験当日、細胞を洗浄し、染色し、ＦＡＣ緩衝液（ＰＢＳおよび５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム）中で再懸濁化させた。ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ／Ｒβ細胞をＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｃ３４５５４）またはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３４５５７）で染色した。染色したＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ／Ｒβを未染色のＣＨＯ／Ｒβγ細胞と混合した。可溶性抗体断片（ＰＰＥ）を含有する９６ウェルＶ字底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中の各ウェルに、各ウェルが５０，０００個の各細胞型とＩＬ−２（Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ  ＃  ＲＫ６０５６８）とを１００ｎＭの最終濃度で含有するようにＣＨＯｋ１、ＣＨＯｋ１−ＩＬ−２Ｒβ、およびＣＨＯ／Ｒβγ細胞、ならびにＩＬ−２を添加した。ウェルが同じバッチから調製されたＰＰＥを含有する別の別個の９６ウェルＶ字底プレートにおいて、ＣＦＳＥで染色したＣＨＯ−Ｋ１細胞を未染色のＣＨＯ／Ｒα（ウェル当たり５０，０００個の各細胞型）およびＩＬ−２と１００ｎＭの最終濃度で混合した。全ての試料を４℃で１〜２時間インキュベートさせ、次いで、ＦＡＣ緩衝液で洗浄した。次に、１μｇ／ｍＬのマウス抗ｃ−ｍｙｃ（Ｒｏｃｈｅ＃  １１６６７１４９００１）を細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートさせた。インキュベーション後、細胞を再び洗浄し、抗マウス重鎖および軽鎖抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−１３６−１４６）を１：１０００の希釈で細胞に添加し、４℃で３０分〜１時間インキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して試料を分析した。親ＣＨＯ−Ｋ１細胞と比較して少なくとも２倍大きいＣＨＯ／ＲβまたはＣＨＯ／Ｒβγ細胞への結合、かつ２倍未満のＣＨＯ／Ｒα細胞への結合を示した試料をさらなる特性評価のために選択した。
【０３３２】
精製されたＩｇＧのフローサイトメトリースクリーニング
ファージ由来の抗体断片を全長ヒトＩｇＧに再フォーマット化した後、上記のように増殖および染色したＣＨＯ／Ｒα、ＣＨＯ／Ｒβ、ＣＨＯ／Ｒβγ、および親ＣＨＯ−Ｋ１細胞上で精製された抗体をスクリーニングした。抗ＩＬ−２抗体の結合効力を特性評価するために、ＩｇＧを連続的に力価測定し、細胞および固定最終濃度のＩＬ−２（Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ  ＃ＲＫ６０５６８）を含有するウェルに添加した。別の試験では、ＩＬ−２を連続的に力価測定し、細胞および固定量の抗ＩＬ−２抗体を含有するウェルに添加して、抗体の結合効力を測定した。これを４℃で１〜１．５時間インキュベートさせた。抗ヒト重鎖および軽鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１０９−１３６−０８８）を１：１０００で添加し、４℃で３０分〜１時間インキュベートすることによって、結合した抗体を検出した。ＢＤ  ＦＡＣｓ  Ｃａｎｔｏフローサイトメーターを使用して試料を分析した。漸増濃度のＩＬ−２の存在下での、異なるＩＬ−２  Ｒ鎖を発現するＣＨＯ細胞への精製された抗体の結合は、図２Ａ〜２Ｄに示される。一定の［ＩＬ−２］の存在下での、選択した生成された抗体の力価測定は、図３Ａ〜３Ｄに示される。フローサイトメトリーによって測定された細胞に結合する抗体のＥＣ５０は、表４に示される。
【０３３３】
（表４）ヒトＩＬ−２受容体を発現する細胞に結合するＩＬ−２／ｍＡｂ複合体のＥＣ５０（最大結合の半分が認められる抗体の濃度）
2019534710.tif 000006
【０３３４】
実施例４：ＩＬ−２誘導性細胞増殖
背景およびアプローチ
高親和性三量体またはより低い親和性の二量体ＩＬ−２  Ｒ複合体を発現する細胞に対する抗体の相対的効果を評価するために、２つの細胞株を使用する細胞増殖アッセイを用いた。ＮＫ系列のヒト細胞株、ＮＫ−９２、ならびにヒトＩＬ−２受容体βおよびγ鎖でトランスフェクトされたマウスリンパ球細胞株ＢａＦ３はいずれも、ＩＬ−２に応答した増殖活性を示す。ＮＫ−９２細胞株は、三量体高親和性ＩＬ−２受容体複合体を形成するために必要とされる３つ全ての鎖、Ｒα、Ｒβ、およびγｃを発現し、増殖についてＩＬ−２に依存する。ＢａＦ３細胞は通常、増殖についてＩＬ−３に依存するが、ＩＬ−２受容体でトランスフェクトされると、この細胞はＩＬ−３から引き離され、増殖依存のためにＩＬ−２に移行した。これらの実験に使用したＢａＦ３クローンは、ＩＬ−２  Ｒβおよびγｃ鎖のみでトランスフェクトされ、それによりヒトＩＬ−２受容体のより低い親和性の二量体複合体を介してシグナル伝達する。高親和性三量体ＩＬ−２受容体複合体（ＮＫ−９２細胞、ＩＬ−２  Ｒαβγ）またはより低い親和性の二量体複合体（ＢａＦ３細胞、ＩＬ−２  Ｒβγ）のいずれかを発現する細胞に対する、ＩＬ−２誘導性増殖の抗体調節の効果の評価を行った。これにより、ＩＬ−２  Ｒα相互作用を主にブロックした抗体の細胞増殖に対する効果の実証を含む、異なる受容体複合体によって媒介されるＩＬ−２誘導性増殖の阻害の程度の比較が可能となった。
【０３３５】
方法
ＮＫ−９２細胞を、１５ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ，Ｖａｌｌｅｙ  Ｃｏｔｔａｇｅ  ＮＹ）と共に、１２．５％ＦＢＳ、１２．５％ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．２ｍＭイノシトール、０．０２ｍＭ葉酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むαＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。ＢａＦ３  ＩＬ−２  Ｒβγ細胞を、１０％ＦＢＳ、０．４ｍｇ／ｍＬのジェネテシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２を含むＲＰＭ中で維持した。細胞を遠心分離してペレット化し、ＤＰＢＳ中で洗浄し、ＩＬ−２を含まない完全増殖培地中で一晩再懸濁させた。一晩ＩＬ−２を除去した後、細胞を再度洗浄し、ＩＬ−２を含まない細胞それぞれの増殖培地において不透明な平底９６ウェルプレートに２５，０００細胞／ウェルで播種した。
【０３３６】
細胞を添加する前に、ＩＬ−２力価測定物および抗体希釈物を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、これらの試料を培養プレートに添加して、ウェル当たり１００μＬの最終濃度を達成し、プレートを３７℃のインキュベーターの中に４８時間置いた。ＩＬ−２力価測定アッセイにおける最終抗体濃度は、３０μｇ／ｍＬであった。
【０３３７】
インキュベーター中で４８時間後、プレートを取り出し、室温と平衡させた。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ溶液、１００μＬ／ウェル（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを撹拌器に２分間置いて細胞溶解を誘導し、室温でさらに８分間インキュベートし、次いで、５００ｍＳ積分のＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）で読み取った。シグモイド用量応答４パラメータ適合を使用してＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）中で発光値を分析して、図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに提示されるＥＣ５０値を判定した。これらの結果は、ＩＬ−２抗体、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９が、βγ複合体（Ｒβγ）のみを発現する細胞に対してよりも、３つ全ての受容体（Ｒαβγ）を発現する細胞の増殖に対して大きい効果を有することを示す。ＩＬ−２抗体、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９はまた、ＭＡＢ６０２対照抗体よりも大きい程度で、ＩＬ−２  Ｒαβγを発現する細胞（ＮＫ９２およびＣＴＬＬ−２細胞）ならびにＩＬ−２  Ｒβγを発現する細胞（ＢａＦ３細胞）においてＩＬ−２誘導性増殖を阻害することが見出された（それぞれ図５Ａ〜５Ｃ）。
【０３３８】
（表５）増殖アッセイ：ヒト受容体を発現する細胞において未結合のＩＬ−２のＥＣ５０と比較したｍＡｂ／ＩＬ−２複合体のＥＣ５０（倍数ＥＣ５０シフト）
2019534710.tif 000007
【０３３９】
（表６）増殖アッセイ：マウス受容体を発現する細胞において未結合のＩＬ−２のＥＣ５０と比較したｍＡｂ／ＩＬ−２複合体のＥＣ５０（倍数ＥＣ５０シフト）
2019534710.tif 000008
【０３４０】
実施例５：ＳＰＲ研究
Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００を使用するＳＰＲによって、標準捕捉方法を用いて抗体の親和性を測定した。簡潔には、抗ヒト抗体捕捉キット（Ｂｉａｃｏｒｅ）からの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を、製造業者の指示に従ってアミンカップリングによってＣＭ−５センサーチップの４つ全てのフローセルのスポット１、２、４、および５に固定化した。泳動緩衝液は、１％ＢＳＡを含むＨＢＳ−ＥＰ＋であった。２μｇ／ｍＬの抗体を１０μＬ／分の流速で２分間注入した。３倍連続希釈中でｒｈＩＬ−２を０．１１ｎＭ〜１０ｎＭの５つの濃度で三連で３分間注入し、分離を１０分間監視した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用してデータを分析した。親和性は、表７に示される。
【０３４１】
（表７）ヒトＩＬ−２に対する選択された抗体の動力学および親和性
2019534710.tif 000009
【０３４２】
ＩＬ−２を３０ｎＭから１ｎＭへの３倍連続希釈中で４つの濃度で二連で注入したことを除き、上記のようにＳＰＲによってヒト、ウサギ、およびマウスＩＬ−２とのＩＬ−２抗体の種交差反応性を判定した。ヒト配列と比較した他の種由来のＩＬ−２のアミノ酸配列が図６に示される。いくつかの種由来のＩＬ−２の配列は、ＰｕｂＭｅｄ構造データベースから取得した（ブタ：ｃａａ４００７１、ラット：ａａａ４１４２７、ウサギ：ｎｐ＿００１１５６６５２、ヒト：ｎｐ＿０００５７７、マウス：ａａｂ３９２０６）。これらの配列をベクターＮＴＩ（登録商標）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）にインポートし、ａｌｉｇｎｘツールを使用して整列させた。親和性の予測値は、表８に要約されている。
【０３４３】
（表８）種交差反応性：マウス、ラット、またはウサギ由来のＩＬ−２に対するＩＬ−２抗体の親和性
2019534710.tif 000010
【０３４４】
実施例６：内因性発現細胞株での機能性シグナル伝達アッセイ
ＩＬ−２  Ｒα（ＣＤ２５）の存在は、ＩＬ−２サイトカインに対する二量体ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２  Ｒβγ）の親和性を増加させる。ヒトにおいて、ナイーブおよびメモリーＴ細胞、ならびにＣＤ５６ｄｉｍ  ＮＫ細胞を含む多くの免疫細胞は、二量体受容体のみを発現する。対照的に、三量体ＩＬ−２  Ｒ（ＩＬ−２  Ｒαβγ）は、制御性Ｔ細胞、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞、および  は、エフェクターＴ細胞によって一時的に発現される。内因性レベルのＩＬ−２  Ｒ発現を有する細胞株は、受容体およびシグナル伝達成分のレベルを天然比に維持し、無傷であるシグナル伝達経路を含有する。転写因子である転写のシグナルトランスデューサおよび活性化因子５（ＳＴＡＴ５）は、ＩＬ−２受容体を介してＩＬ−２によって媒介される主要な早期シグナル伝達事象である。ＳＴＡＴ５リン酸化の結果として、増殖、生存、およびアポトーシスなどの細胞プロセスに関与する多様な遺伝子の発現が増加する。ヒトＩＬ−２  ＲαβγまたはＩＬ−２  Ｒβγの内因性発現を有する細胞株に対してＩＬ−２シグナル伝達に影響を及ぼす抗ＩＬ−２抗体候補の能力を評価するために、ＳＴＡＴ５ａおよびｂのリン酸化を下記のように測定した。
【０３４５】
ヒトＮＫ−９２細胞株におけるＳＴＡＴ５ａ、ｂのリン酸化
三量体受容体（ＩＬ−２  Ｒαβγ）を発現した細胞上でＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導する抗体／ＩＬ−２複合体の能力を比較するために、ＮＫ−９２細胞株（ＡＴＣＣ）を利用した。これは、増殖についてＩＬ−２に依存し、細胞傷害性能力および特徴的なＮＫ細胞表面マーカーを維持するＮＫ細胞株である。これは、ＣＤ２５（ＩＬ−２  Ｒα）の発現が均一に高い。細胞を２回洗浄し、続いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むがＩＬ−２を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩飢餓させた。翌日、ＰＢＳおよび０．５％ＢＳＡ中、ウェル当たり１００，０００細胞の濃度で細胞を播種した。ＮＫ−９２細胞を含有するプレートにウェル当たり５０μｌを添加する前に、様々な用量のＩＬ−２および１００ｎＭの指定の抗ＩＬ−２抗体を３７℃で１５〜３０分間、事前に複合体化した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、続いて、１００μｌの冷たいＰＢＳを添加して反応を停止させた。プレートを４℃で３分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、上清を除去し、８０μｌの冷たいＭＳＤ溶解緩衝液を各ウェルに添加した。４℃で１時間、振とうプラットフォーム上でインキュベートすることによって細胞を完全に溶解させた。製造業者の指示に従ってＭＳＤ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ  ＳＴＡＴ５ａ，ｂ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅキット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；ｃａｔ．Ｋ１５１６３Ｄ−２）を使用して、全およびリン酸化ＳＴＡＴ５ａ、ｂを測定した。Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でプレートを読み取った。Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ）のシグモイド用量応答式を使用して非線形回帰によって曲線を適合させた。
【０３４６】
予想通り、アイソタイプ対照（抗ＫＬＨ）および抗体対照なしは、ＩＬ−２シグナル伝達に対して高度に感受性であり、それぞれ０．９および０．６ｐＭのＥＣ５０値を有した（図７Ａ）。アイソタイプ対照と比べて、試験した全ての化合物は、ＳＴＡＴ５ａ、ｂのＩＬ−２誘導性リン酸化のＥＣ５０の増加を示した。参照抗体ＭＡＢ６０２は、アイソタイプ対照と比べてＥＣ５０値の１，０００倍シフトを誘導した（０．９ｐＭから９００ｐＭへ）。ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２間の倍数シフトは類似しておりそれぞれ９００ｐＭ、１１５０ｐＭ、および１７００ｐＭのＥＣ５０値の増加であった。ＸＰＡ．９２．０９９は、このアッセイにおいてＥＣ５０値が僅かに小さくシフトし、０．９ｐＭから４６３ｐＭへとシフトした。
【０３４７】
ヒト初代ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５ａ、ｂのリン酸化
抗体／ＩＬ−２複合体が二量体受容体（ＩＬ−２  Ｒβγ）を有する細胞上のＳＴＡＴ５経路を調節する能力を検証するために、精製された初代ＮＫ細胞を利用した。さらなるＣＤ２５＋の枯渇は、二量体ＩＬ−２  Ｒを有する細胞のみが存在することを確実にした。密度勾配遠心分離を使用して、様々なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。簡潔には、５０ｍｌの円錐中で、希釈した全血をＦｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）溶液の上に層形成した。ブレーキなしで室温で３０分間、４００ｘｇで層を遠心分離した。細胞帯を回収し、洗浄し、一定分量で凍結させた。ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５分析用にＮＫ細胞を単離するために、ＰＢＭＣのバイアルを解凍し、製造業者の指示に従ってＭＡＣＳ  ＮＫ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ｃａｔ：１３０−０９２−６５７）ＮＫ細胞を単離した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むがＩＬ−２を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に精製されたＮＫ細胞を一晩静置した。翌日、磁気ビーズ分離を使用してＣＤ２５＋ＮＫ細胞をＮＫ細胞集団から取り出した。簡潔には、細胞をＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）中で再懸濁させ、ビオチン抗ヒトＣＤ２５（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体（５０μｌの細胞溶液ごとに１μｌの抗体）と共にインキュベートした。室温で１０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、４０μｌのＭａｇｎｉＳｏｒｔ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ陽性選択ビーズ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で再懸濁させた。室温で１０分間のさらなるインキュベーション後、体積を２．５ｍＬにし、室温で５分間インキュベートすることによってＥａｓｙＳｅｐ  Ｍａｇｎｅｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離を行った。未結合の細胞を清潔な管に移し、室温でさらに５分間インキュベートして、全てのＣＤ２５＋細胞の完全な枯渇を確実にした。
【０３４８】
ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５ａ、ｂアッセイを完了するために、ＰＢＳおよび０．５％ＢＳＡ中、ウェル当たり１００，０００細胞の濃度でＮＫ細胞を播種した。ＮＫ細胞を含有するプレートにウェル当たり５０μｌを添加する前に、様々な用量のＩＬ−２および１００ｎＭの指定の抗ＩＬ−２抗体を３７℃で１５〜３０分間、事前に複合体化した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、続いて、１００μｌの冷たいＰＢＳを添加して反応を停止させた。プレートを４℃で３分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、上清を除去し、８０μｌの冷たいＭＳＤ溶解緩衝液を各ウェルに添加した。４℃で１時間、振とうプラットフォーム上でインキュベートすることによって細胞を完全に溶解させた。ＭＳＤ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ  ＳＴＡＴ５ａ，ｂ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ  ｋｉｔ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；ｃａｔ．Ｋ１５１６３Ｄ−２）を使用して全およびリン酸化ＳＴＡＴ５ａ、ｂを測定した。Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でプレートを読み取った。Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ）のシグモイド用量応答式を使用して非線形回帰によって曲線を適合させた。
【０３４９】
既存の文献と一致して、二量体受容体は、ＮＫ−９２細胞と比較して、抗体なしおよびアイソタイプ対照（抗ＫＬＨ）試料におけるより高いＥＣ５０値（それぞれ１３３および１２７ｐＭ）に見られるように、ＩＬ−２サイトカインに対してより感受性が低かった（図７Ｂ）。アイソタイプ対照と比べて、試験した全ての化合物は、ＳＴＡＴ５ａ、ｂのＩＬ−２誘導性リン酸化のＥＣ５０値の増加を示した。参照抗体ＭＡＢ６０２は、アイソタイプ対照と比べてＥＣ５０値の１０倍シフトを誘導した（１２８ｐＭから１３０２ｐＭへ）。ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２の倍数シフトは類似しており、それぞれ５０４１ｐＭ、４５２０ｐＭ、および５１２４ｐＭのＥＣ５０値であった。ＸＰＡ．９２．０９９は、このアッセイにおいてＥＣ５０値が他のＸＰＡ．９２抗体より僅かに小さくシフトし、３０５４ｐＭのＥＣ５０値を有した。ヒトＩＬ−２受容体を発現する細胞についてのＥＣ５０の倍数シフトは、表９に要約されている。
【０３５０】
（表９）ｐＳＴＡＴ５ａ、ｂアッセイ：ヒト受容体を内因的に発現する細胞において未結合のＩＬ−２のＥＣ５０と比較したｍＡｂ／ＩＬ−２複合体のＥＣ５０（倍数シフト）
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【０３５１】
マウス初代ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５ａ、ｂのリン酸化
マウスのＮＫ細胞は、それらが二量体ＩＬ−２受容体を排他的に発現する点で、それらのヒト相対物とは異なる。マウスにおけるシグナル伝達に影響を及ぼすＩＬ−２／抗体複合体の能力を測定するために、３匹の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスからの脾臓を得て、１ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の後ろ側を使用して臓器を４０μＭの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）に押し通すことによって単細胞浮遊液を生成した。脾臓細胞を洗浄し、その後、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートさせた。次いで、細胞をＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で洗浄した。製造業者の指示に従ってＭＡＣＳマウスＮＫ単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＮＫ細胞を選別した。細胞を洗浄し、計数し、ＰＢＳおよび０．５％ＢＳＡ緩衝液中で、１００，０００細胞を各ウェルに播種した。ＮＫ細胞を含有するプレートにウェル当たり５０μｌを添加する前に、様々な用量のＩＬ−２および１００ｎＭの指定の抗ＩＬ−２抗体を３７℃で１５〜３０分間、事前に複合体化した。細胞を３７℃で３０分間刺激し、続いて、１００μｌの冷たいＰＢＳを添加して反応を停止させた。プレートを４℃で３分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、上清を除去し、細胞を、８０μｌの冷たいＭＳＤ溶解緩衝液を各ウェルに添加した。４℃で１時間、振とうプラットフォーム上でインキュベートすることによって細胞を完全に溶解させた。ＭＳＤ  Ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ６９４）／Ｔｏｔａｌ  ＳＴＡＴ５ａ，ｂ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅ  ｋｉｔ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；ｃａｔ．Ｋ１５１６３Ｄ−２）を使用して全およびリン酸化ＳＴＡＴ５ａ、ｂを測定した。Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）でプレートを読み取った。Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ）のシグモイド用量応答式を使用して非線形回帰によって曲線を適合させた。
【０３５２】
抗体なしおよびアイソタイプ対照のＥＣ５０値は、ヒト初代ＮＫ細胞において見られるものと非常に類似していた（図７Ｃ）（それぞれ１３９ｐＭおよび１１６ｐＭ）。アイソタイプ対照と比べて、試験した全ての化合物は、ＳＴＡＴ５ａ、ｂのＩＬ−２誘導性リン酸化のＥＣ５０値の増加を示した。参照抗体ＭＡＢ６０２は、アイソタイプ対照と比べてＥＣ５０値の３倍シフトを誘導した（１１６ｐＭから３６１ｐＭへ）。ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４１、ＸＰＡ．９２．０４２、よびＸＰＡ．９２．０９９の倍数シフトは各々約１０〜１５倍であり、それぞれ１７２３ｐＭ、１３５２ｐＭ、１６６３ｐＭ、および１９１２のＥＣ５０値であった。ヒトＩＬ−２受容体を発現する細胞についてのＥＣ５０の倍数シフトは、表１０に要約されている。
【０３５３】
（表１０）ｐＳＴＡＴ５ａ、ｂアッセイ：マウス受容体を内因的に発現する細胞において未結合のＩＬ−２のＥＣ５０と比較したｍＡｂ／ＩＬ−２複合体のＥＣ５０（倍数シフト）
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【０３５４】
実施例７：ＩＬ−２／抗体複合体のインビボ投与後のリンパ球サブセットの分析
正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、アイソタイプ対照抗体または抗ＩＬ−２  ｍＡｂのいずれかの５倍過剰量と共に事前にインキュベートした、ビヒクル対照、または１μｇのｈＩＬ−２（図８Ａ〜Ｄ）、または１．５μｇのｈＩＬ−２（図８Ｆおよび８Ｇ）を、示した通り０、２、および４日目に腹腔内注射した。６日目に、標準技術を使用して脾臓を収集し、以下のようにフローサイトメトリーサブセットのために染色した。脾臓を単離し、分離させて、単細胞浮遊液を生成した。ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して赤血球を溶解した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳおよび２％ＦＢＳおよびアジ化ナトリウム（０．１％）中で細胞を２回洗浄し、９６ウェルのＶ字底プレートにプレーティングした（１×１０６細胞／ウェル）。ＦＡＣＳ緩衝液中、以下の蛍光標識抗体のカクテルで細胞を染色した：ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ１２２（ＴＭ−β１）、ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、およびＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、グランザイムＢ（ＧＢ１２）（これらはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した）。試料を染色カクテル中、氷上で２０〜６０分間インキュベートし、２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩまたはＢＤ  Ａｃｃｕｒｉで読み取った。グランザイムＢ染色の分析の場合、表面マーカーで染色し、洗浄した試料を、製造業者の指示に従ってｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定および透過処理し、その後、抗グランザイムＢ抗体で２０〜６０分間、氷上で染色した。試料を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩまたはＢＤ  Ａｃｃｕｒｉで読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）またはＣＦｌｏｗ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを分析した。リンパ球サブセットの分析については、以下のように選別をリンパ球、次いで系列マーカーでゲーティングした：ＣＤ８＋対ＣＤ４発現／ＣＤ８＋細胞のＣＤ４４ｈｉ％；ＣＤ４＋細胞のＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ４４ｈｉ％；ならびにＣＤ８、ＣＤ４、またはＮＫ１．１について陽性の細胞の割合。図８Ａ〜８Ｄは、関連するＴ細胞サブセットの要約を示し、図８Ｅは、図８Ａおよび８Ｂのデータから計算したＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す。図８Ｆは、全リンパ球のＮＫ１．１＋細胞の出現頻度を示す。図８Ｇは、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体との接触後のマウスにおけるＮＫ細胞によるグランザイムＢの産生を示す。
【０３５５】
これらの結果は、抗ＩＬ−２抗体が、インビボでのＣＤ８／ＣＤ４比に対して、ならびにＮＫ細胞レベルおよび活性に対して効果を有することを示す。
【０３５６】
実施例８：皮下肺癌マウスモデルにおける、単独およびチェックポイント阻害剤と併用した抗体／ＩＬ−２複合体での治療
腫瘍異種移植動物モデルにおける抗ＩＬ−２抗体の効果を実証するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにルイス肺癌ＬＬＣ−Ａ９Ｆ１（ＬＬＣ）細胞（２．５×１０５細胞）を皮下接種し、治療せずに１０日間腫瘍を増殖させて、確立させた（治療を１１日目に開始した）。治療のためのランダム化の前に外れ値を除去した。ＬＬＣ腫瘍を各々保有するマウスの６つの群の治療を以下のように治療した：（１）ビヒクルのみの対照、ｎ＝１０匹のマウス；（２）抗ＩＬ−２  ＸＰＡ．９２．０９９モノクローナル抗体と複合体化したＩＬ−２（ＩＬ−２／ｍＡｂ）（ＩＰ注射により４８時間ごとに投与、１μｇのＩＬ−２および５μｇのｍＡｂ）、ｎ＝５匹のマウス；（３）抗ＰＤ−１  ｍＡｂ単独（ＲＭＰ１−１４クローン、Ｂｉｏｘｃｅｌ、１週間に２回２００μｇの投与）、ｎ＝１０匹のマウス；（４）ＩＬ−２／ｍＡｂ（ＸＰＡ．９２．０９９）および抗ＰＤ−１  ｍＡｂの併用、ｎ＝５匹のマウス；（５）抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ単独（ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、Ｂｉｏｘｃｅｌ、１週間に２回２００μｇの投与）、ｎ＝１０匹のマウス；または（６）ＩＬ−２／ｍＡｂ（ＸＰＡ．９２．０９９）および抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの併用、ｎ＝５匹のマウス。腫瘍測定（長さおよび幅）を盲検で実施し、面積をｍｍ２で表した。図９は、上記のように治療した個々のマウスの経時的な腫瘍面積のグラフを示す。治療したマウスの数が有意性を達成するには低すぎたものの、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４のいずれかとのＩＬ−２／抗ＩＬ−２複合体の合わせた効果は、対照または単剤治療よりも大きい程度で腫瘍増殖を低減し、完全奏功を誘導する潜在性を有する（図９）。
【０３５７】
抗ＩＬ−２抗体の抗腫瘍効果をさらに評価するために、より多い数のマウス（ｎ＝１５／群）での実験を実施した。上記のようにマウスにＬＬＣ腫瘍細胞を接種した。腫瘍を確立し、マウスをランダム化したら、各々１５匹のマウスの４つの群を以下のように治療した：（１）ビヒクルのみの対照（ＰＢＳ）；（２）抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４クローン）を２００μｇ皮下（ｓｃ）で１週間に２回投与；（３）ＩＬ−２／ｍＡｂ複合体（クローン９９、４８時間ごと、ＩＰ注射、２μｇのＩＬ−２＋１０μｇのｍＡｂ）；（４）群（２）および（３）に記載されるＩＬ−２／ｍＡｂ９９＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂの併用。腫瘍測定（長さおよび幅）を盲検で実施し、面積をｍｍ２で表した。図１０Ａは、上記の各治療群について経時的な平均腫瘍体積のグラフを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ＩＬ−２／抗ＩＬ−２複合体および抗ＰＤ−１単独療法は、対照で治療したマウスと比較して腫瘍増殖を著しく低減させた一方、抗ＰＤ−１のいずれかとのＩＬ−２／抗ＩＬ−２複合体の合わせた効果は、試薬単独のいずれかのものよりも著しく大きかった。図１０Ｂは、同じ実験からの生存期間プロットを示す。対照群のマウスは完全奏功（検出可能な腫瘍なし）を有さなかったが、かかる完全奏功は、ＩＬ−２／ｍＡｂ９９単独群において１匹、抗ＰＤ−１単独群で２匹、および併用治療群で６匹のマウスによって達成された。
【０３５８】
実施例９：皮下ＬＬＣ腫瘍を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫細胞に対するＩＬ−２／抗体複合体の効果
腫瘍負荷中のインビボでの免疫細胞に対する抗体／ＩＬ−２複合体の効果を評価するために、上記のようにマウスに１×１０６個のＬＬＣ腫瘍を注射した。腫瘍の注射の２１日後に、確立した腫瘍を有するマウスを５匹ずつの群にランダム化し、以下のように治療した：（１）対照（ＡｂまたはＩＬ−２なし）；（２）抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４クローン）、１週間に２回、皮下に２００μｇの投与；（３）２日ごとのＩＰ注射によるＩＬ−２／ｍＡｂ９９複合体（２μｇのＩＬ−２＋１０μｇのｍＡｂ）；（４）群（２）および（３）に記載されるＩＬ−２／ｍＡｂ９９＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂの併用；（５）ＩＬ−２／ｍＡｂ１９複合体（２μｇのＩＬ−２＋１０μｇのｍＡｂ、１、３、５、９、１３、および１７日目のＩＰ注射による）；（６）群（２）および（５）に記載されるＩＬ−２／ｍＡｂ１９＋抗ＰＤ−１  ｍＡｂの併用。治療開始後１９日目に、マウスを犠死させ、以下のように免疫細胞を分析した。脾臓細胞を単離し、細胞表面マーカーの発現について上記のように分析した。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力をアッセイするために、（ＲＰＭＩおよび１０％ＦＢＳ）ならびにブレフレジン（ｂｒｅｆｌｅｄｉｎ）Ａ（Ｇｏｇｌｉｓｔｏｐ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、脾臓細胞をＰＭＡ（ホルボール12-ミリステート13-アセテート、５０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（１μＭ）で１０〜１２時間刺激した。次いで、細胞を細胞外ＣＤ８のために染色し、固定および透過処理（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いで、ＩＦＮγのために細胞内で染色した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩまたはＢＤ  Ａｃｃｕｒｉで試料を読み取り、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）またはＣＦｌｏｗ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の分析のために、細胞をリンパ球およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でゲーティングし、ＩＦＮγ対して陽性の細胞の割合を評価した。図１１のグラフは、ＩＬ−２／ｍＡｂ複合体での治療が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度（図１１Ａ）、および活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（ＣＤ４４ｈｉ％、図１１Ｂ）の増加をもたらした一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞の出現頻度（図１１Ｃ）またはＣＤ２５ｈｉ（Ｔｒｅｇ）であるＣＤ４＋細胞のパーセント（ＣＤ２５ｈｉ％、図１１Ｄ）の増加は見られなかったことを示す。図１１は、ＩＬ−２／ｍＡｂ治療が、ＰＭＡ／Ｉでの刺激に際してＩＦＮγを産生することができたＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度（図１１Ｅ）、ならびにＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比（図１１Ｆ）の増加をもたらしたことをさらに示す。
【０３５９】
実施例１０：ヒト免疫細胞に対するＩＬ−２／抗体複合体の効果
Ｔ細胞およびＮＫ細胞に加えて、他の免疫および非免疫細胞型が、機能性ＩＬ−２受容体を発現する。これらには、Ｂ細胞、単球、顆粒球、およびいくつかの報告では内皮細胞が含まれる。これらの細胞型の多くは、ＩＬ−２Ｒαを構造的に発現するか、またはある特定のサイトカインもしくは刺激因子に応答してそれを発現することができる。ＩＬ−２／ｍＡｂ複合体での治療が三量体ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒαβγ）を発現する細胞における活性化にどのように影響を及ぼすかを検証するために実験を行った。ＰＢＭＣは、相当な割合の様々な免疫細胞サブセットを含有し、それにより、主要な細胞集団に対する抗ＩＬ−２抗体の影響を評価するための有用なツールを提供する。機能性三量体ＩＬ−２Ｒαβγを発現することが報告されている細胞には、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞、活性化ＣＤ８  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、単球、およびＢ細胞が含まれる。活性化の読み出しとして、Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるＩＬ−２シグナル伝達によって誘導されるＣＤ６９マーカーの発現レベルを分析した。さらに、ＩＬ−２／ｍＡｂ複合体治療後のＣＤ４  Ｔ細胞集団におけるＴｒｅｇの出現頻度を判定した。
【０３６０】
密度勾配遠心分離を使用して、様々なドナーからのＰＢＭＣを単離した。５０ｍＬの円錐管中で、希釈した全血をＦｉｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）溶液の上に層形成した。ブレーキなしで室温で３０分間、４００ｘｇで層を遠心分離した。細胞帯を回収し、洗浄し、一定分量で凍結させた。一定分量を完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋２ｍＭのＬ−グルタミン）の中に解凍した。２回洗浄した後、細胞を計数し、５０μｌ容積の９６ウェル丸底プレート中に１×１０６  ＰＢＭＣ／ウェルでプレーティングした。細胞を含有するプレートにウェル当たり５０μｌを添加する前に、様々な用量の組換えヒトＩＬ−２（Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ，Ｉｓｒａｅｌ）および２００ｎＭの指定の抗ＩＬ−２抗体を３７℃で３０分間、事前に複合体化した。その後、プレートを３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、および０．１％アジ化ナトリウム（Ｔｅｋｎｏｖａ））中で細胞を２回洗浄した。試料を室温で１０分間、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸを用いてＦｃブロッキングし（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、各々２つのウェルに分けた。蛍光標識抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の以下のカクテルで１つのセットを染色した：ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＣＤ４（ＯＫＴ４）、ＣＤ８ａ（ＳＫ１）、ＣＤ１２７（Ａ０１９Ｄ５）、ＣＤ２５（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）。蛍光標識抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の以下のカクテルで２つ目のセットを染色した：ＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ５６（ＨＣＤ５６）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）。試料を４℃で６０分間、暗所でインキュベートした。それらをＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、４℃で２０分間、５０μｌのＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いて暗所で固定した。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩで読み取った。３パラメータ適合を使用してＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン７）でデータを分析した。
【０３６１】
リンパ球、続いてＣＤ３−およびＣＤ５６＋集団のゲーティングによってＮＫ細胞を同定した。このＣＤ５６＋集団のうち、最も明るい約１０％は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞を表す。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞では、ＣＤ６９発現に対するＩＬ−２治療の用量依存性効果が認められ、ドナー６０３または６２５についてそれぞれ７．６ｎＭ（図１３Ａ）または９．５ｎＭ（図１３Ｂ）のＥＣ５０値を有した。参照抗体ＭＡＢ６０２は、ＥＣ５０値の５〜１０倍の右シフトを誘導した（図１３Ｃ）。ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４２、またはＸＰＡ．９２．０９９での治療はまた、ＭＡＢ６０２で見られたものと同様のＥＣ５０値の増加を示した（図１３Ｃ）。これは、これらの抗ＩＬ−２抗体が、ＩＬ−２Ｒαβγを発現するＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞上のＩＬ−２誘導性活性化に対する感受性を減少させることを示す。
【０３６２】
Ｔｒｅｇ集団におけるＣＤ６９の誘導を分析するために、以下のプロファイルを発現したリンパ球を分析した：ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＫ細胞と同様に、ＩＬ−２治療の用量依存性効果が認められ、ドナー６０３または６２５についてそれぞれ２８ｎＭ（図１４Ａ）または２２ｎＭ（図１４Ｂ）のＥＣ５０値を有した。参照抗体ＭＡＢ６０２は、ＥＣ５０値の５〜１０倍の右シフトを誘導した（図１４Ｃ）。ＸＰＡ．９２．０４２またはＸＰＡ．９２．０９９での治療はまた、ＭＡＢ６０２と同様のＥＣ５０の増加を示したが、ＸＰＡ．９２．０１９は、１０〜１５倍のより高いシフトを誘導した（図１４Ｃ）。
【０３６３】
ＩＬ−２によって提供されるシグナル伝達は、Ｔｒｅｇ増殖およびホメオスタシスにとって重要である。図１５Ａおよび図１５Ｂに示されるように、このアッセイに使用されるＩＬ−２の濃度では、Ｔｒｅｇの割合は、抗体なし対照では相対的に変化しないままであった。しかしながら、事前に複合体化したＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体の添加は、ドナー６０３（図１５Ａ）および６２５（図１５Ｂ）について、Ｔｒｅｇの出現頻度を用量依存的な様式で減少させた。高濃度のＩＬ−２では、Ｔｒｅｇ細胞の出現頻度は、抗体治療なしの試料と同様であるかまたはそれよりも僅かに高かった。しかしながら、１０ｎｇ／ｍＬ未満のＩＬ−２濃度では、試験した全ての抗体での刺激の２４時間後に、著しくより少ないＴｒｅｇが同定された。これは、ＸＰＡ．９２．０１９、ＸＰＡ．９２．０４２、およびＸＰＡ．９２．０９９抗体が、Ｔｒｅｇホメオスタシスに必要とされるＩＬ−２シグナルを阻害することを示す。
【０３６４】
実施例１１：マウス結腸癌モデルの免疫細胞に対するＩＬ−２／抗体複合体の効果
抗ＩＬ−２抗体／ＩＬ−２複合体が結腸癌の治療において有効であったかどうかを判定するために、マウスにＣＴ２６細胞を皮下移植し、その後、抗体／ＩＬ−２治療を施した。
【０３６５】
腫瘍細胞ＣＴ２６マウス結腸腫瘍細胞をＡＴＣＣから初めに購入した。１つの凍結バイアルから腫瘍細胞を解凍し、１０％の熱不活性化ＦＢＳを含む適切な完全ＲＰＭＩ培養培地を使用してインビトロ培養物中に置いた。
【０３６６】
動物Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した７〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。マウスを４日間順応させ、動物施設で、動物および水が自由に与えられる１８個のケージの各々に４匹のマウスとして収容し、研究の開始前に４日間順応させた。腫瘍細胞の移植（０日目）の前に、腫瘍がカリパスによって測定可能になるまで週に１回、治療開始の前日、ならびに腫瘍増殖および治療中に週に２回マウスの体重を測った。
【０３６７】
治療Ｒｅｐｒｏｋｉｎｅ（Ｉｓｒａｅｌ）からＩＬ−２を得て、ＸＯＭＡから抗ＩＬ−２抗体を調製した。滅菌水中で作製したＩＬ−２のストック溶液を、投与溶液に適切に希釈して、対応する群の各マウスに２００μｌの量で５０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、および１．５μｇを送達した。ＩＬ−２および抗体の組み合わせは、投与の日に投与溶液に一緒に製剤化した。
【０３６８】
インビボ有効性研究：十分な数の細胞がマウスに移植する用意ができるまで、ＣＴ２６細胞培養物を約１週間増殖させた。移植の日に、温かいトリプシン／ＥＤＴＡ溶液での処理、続いて血清含有培地を添加し、滅菌１Ｘ  ＰＢＳ中で２回洗浄した後に、対数期増殖において細胞を培養物から収集した。細胞生存率および接着能力を保存するために、移植の時間まで、およびその間、細胞懸濁液を氷上に残した。最後の遠心分離の後、細胞を計数し、滅菌１Ｘ  ＰＢＳ中、７．５×１０６／ｍｌの最終濃度まで適切に再懸濁させた。０．４％トリパンブルー溶液を使用することによって生存率を判定し、９４．５％であることを見出した。麻酔をかけたマウスの左脇腹に１００ｕｌの量で腫瘍細胞（０．７５×１０６）を皮下移植した。マウスを慎重に監視し、臨床的観察を毎日記録した。治療投与後、マウスの体重を毎日測り、腫瘍増殖を長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）のカリパス測定によって週に２回判定した。腫瘍サイズは、式（Ｌ×Ｗ２）／２）で計算した。腫瘍は、細胞の移植後６日目にカリパス測定可能になり、群の間での同様の腫瘍平均および標準偏差を確実にするコンピュータ生成ランダム化テンプレートを使用してそれらを治療群にランダム化したときに約１００ｍｍ３のサイズに達した。ランダム化の後、腹腔内経路によって試験物をマウスに与えた。
【０３６９】
結果：ＩＬ−２のみで治療した動物における腫瘍増殖帰結の分析は、ビヒクル対照（２０日目に約２６００ｍ３）と比較して、ＩＬ−２  ５０μｇおよび１００μｇで治療した群において１０〜２０日目に腫瘍増殖の減少があったものの（それぞれ２０日目に約１３００ｍ３および４００ｍ３）、これらのマウスは、嗜眠性であり、これらの動物のうちの数匹（３）は死亡した（図１６）。これは、文献における前臨床報告、および臨床における有効なＩＬ−２療法の困難な性質と一致している。２．５ｍｇ／ｋｇ未満のＩＬ−２単独の用量は、最小の抗腫瘍効果を有する。
【０３７０】
対照的に、１：１の比率で抗ＩＬ−２抗体と併用したＩＬ−２の投与は、ビヒクル対照と比較してＩＬ−２：ｍＡｂ併用の治療指数（ＴＩ）の改善、ならびに１：１モル比（１：１０質量比）の重要性およびＩＬ−２  ｍＡｂの存在下での非常に低い用量のＩＬ−２の抗腫瘍効果を示した。表１１に記載されるように、様々な用量のＩＬ−２および抗体をマウスに投与した。
【０３７１】
（表１１）
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【０３７２】
図１７は、１：１比の抗体対ＩＬ−２を受ける動物が、他の比のＩＬ−２／抗体併用治療を受ける動物と比較して改善された効力を有したことを実証する。さらに、これらの動物において、死亡は起こらず、明らかに有害な体重減少または有害な行動の徴候はなかった。
【０３７３】
これらの結果は、抗ＩＬ２  ｍＡｂと併用した非常に低い用量のＩＬ−２は、中程度から良好な抗腫瘍効果を示し、１５ｕｇ：１．５ｕｇ（すなわち、０．７５ｍｇ／ｋｇ：０．０７５ｍｇ／ｋｇ）で投与した１：１モル比のｍＡｂ１９：ＩＬ２が最も有効な比率であることを示す。ｍＡｂ：ＩＬ２  １５ｕｇ：１．５ｕｇ群は、９日目に、他の全ての群とは統計学的に有意に異なっていることに留意されたい。
【０３７４】
ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体治療のモル比の態様をさらに分析するためにさらなる研究を実施した。治療レジメンは、以下の表１２に示される。
【０３７５】
（表１２）
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【０３７６】
結果は図１８に示され、これは、７および１０日目のｍＡｂ：ＩＬ２  １５μｇ：１．５μｇ群におけるより遅い腫瘍増殖が、ビヒクル対照群とは統計学的に有意に異なっていること、およびｍＡｂ：ＩＬ２  ３０μｇ：１．５μｇ群における増殖も対照と比較して低いことを示す。この実験は、抗ＩＬ２  ｍＡｂと併用した非常に低い用量のＩＬ−２が抗腫瘍効果を示し、１５ｕｇ：１．５ｕｇ（すなわち、０．７５ｍｇ／ｋｇ：０．０７５ｍｇ／ｋｇ）で投与した１：１モル比のｍＡｂ：ＩＬ２が、２：１比と少なくとも同様に有効であることを実証する。これらの用量群のいずれにおいても、死亡または目立った有害事象はなかった。したがって、ＩＬ−２単独での同等の効果は一定レベルの死亡を伴う一方、これらの研究では少なくとも６倍（１５：０．５から１５：３．０）の治療指数が示されている。
【０３７７】
上記の例示的な実施例に記載される本発明の多数の修正および変形が当業者には想起されると予想される。したがって、添付の特許請求の範囲に見られる限定のみが本発明に課せられるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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