(57)【要約】本発明は、生体ナノ触媒（ＢＮＣ）の効果を支持すると共に高めるための磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を提供する。新規の足場は、不水溶性架橋ポリマーおよび略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含む。架橋ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、および、任意選択により追加のポリマー材料を含む。足場は、足場の調製中に鋳造を用いることにより任意の形状とし得る。代替的に、足場は、生体触媒反応における使用のためにミクロ粒子に粉砕され得る。代替的に、足場は、バイオ触媒反応における使用のためにビーズの形状とし得る。足場の調製方法および使用方法もまた提供されている。
2019514421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不水溶性架橋ポリマーおよび略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含む磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場であって；前記ポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み；前記ＭＭＰは約５０〜５００ｎｍのサイズであり；前記足場は約１〜約５０μｍのサイズの細孔を含み；前記足場は約２０％〜９５％ｗ／ｗのＭＭＰを含み；前記足場は、合計で約１〜１５ｍ２／ｇの生体ナノ触媒（ＢＮＣ）を組み込むための有効表面積を含み；酵素を組み込むための合計有効表面積は約５０〜２００ｍ２／ｇであり；前記足場は約０．０１〜約１０ｇ／ｍｌ．の嵩密度を有し；および、前記足場は、約１．０×１０−３〜約１×１０−４ｍ３ｋｇ−１の質量磁化率を有する、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項２】
前記足場に対して約０〜９０度の水との接触角を含む、請求項１に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項３】
ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸塩、ポリメチルメタクリレート、ポリ酢酸ビニル、フッ化ビニル樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、フェノール樹脂、レソルシノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、セルロース、ヘミセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサンおよびポリホスファゼンからなる群から選択されるポリマーをさらに含む、請求項１に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項４】
前記足場がＰＶＡおよびＣＭＣを含む、請求項３に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項５】
前記足場がＰＶＡおよびアルギン酸塩を含む、請求項３に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項６】
前記足場がＰＶＡおよびＨＥＣを含む、請求項３に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項７】
前記足場がＰＶＡおよびＥＨＥＣを含む、請求項３に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項８】
前記足場がモノリス形状に形成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項９】
前記足場が特定の生体触媒プロセスに適した形状に形成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項１０】
前記足場が粉末の形態であり、前記粉末が約１５０〜約１０００μｍのサイズの粒子を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項１１】
生体ナノ触媒（ＢＮＣ）をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項１２】
前記ＢＮＣが、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を含み、ならびに、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトララーゼ（ｎｉｔｒａｌａｓｅ）、ヒドラターゼ、脱水酵素、トランスアミナーゼ、エネレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、オキシニトリラーゼ、イソメラーゼおよびリパーゼからなる群から選択される酵素を含む、請求項１１に記載の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場。
【請求項１３】
不水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場の調製方法であって、
ａ．水溶性ポリマーと、水および磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）とを混合して、約３〜５０ｃＰの懸濁液を形成するステップ；
ｂ．架橋試薬を前記混合物に添加するステップ；
ｃ．前記混合物を超音波処理するステップ；
ｄ．前記混合物を約−２００〜０℃の温度で凍結させるステップ；
ｅ．前記混合物を凍結乾燥するステップ；ならびに
ｆ．前記水溶性ポリマーを架橋するステップ；
を含み、
前記架橋するステップで不水溶性ポリマーがもたらされる方法。
【請求項１４】
前記架橋するステップが、紫外光への露出、約６０〜５００℃の温度での前記混合物の加熱、または、これらの組み合わせによって達成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＭＰの磁気モーメントの配列により前記ＭＭＰを組織化するために、前記超音波処理ステップ後に磁界を適用するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶性ポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸塩、ポリメチルメタクリレート、ポリ酢酸ビニル、フッ化ビニル樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、フェノール樹脂、レソルシノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、セルロース、ヘミセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサンおよびポリホスファゼンからなる群から選択されるポリマーをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーがＰＶＡおよびＣＭＣを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーがＰＶＡおよびアルギン酸塩を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーがＰＶＡおよびＨＥＣを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーがＰＶＡおよびＥＨＥＣを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記架橋試薬が、クエン酸、すべてのカルシウム塩、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸（ＢＴＣＡ）、グルタルアルデヒドおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
前記架橋試薬がクエン酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記凍結ステップが、前記モノリス形状である水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場をもたらす、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結ステップが、特定の生体触媒プロセスに適した形状である水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場をもたらす、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記不水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を約１０〜約１０００μｍのサイズの粉末に粉砕するステップをさらに含む、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記不水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場が、約５００〜約５０００μｍのサイズのビーズ形状とされる、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
複数の基質間の反応を触媒する方法であって、前記基質間の前記反応を前記ＢＮＣが触媒する条件下で、請求項１１に記載の前記磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場に前記基質を露出させるステップを含む方法。
【請求項２９】
前記反応が、医薬製品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記反応が、医薬品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記反応が、食品製品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記反応が、衣料品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記反応が、洗剤の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記反応が、燃料製品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記反応が、生化学製品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記反応が、紙製品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応が、プラスチック製品の生産に用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応が、溶液から汚染物を除去するプロセスにおいて用いられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記溶液が水溶液である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書において参照によりその全体が援用される、２０１６年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書に係る利益を主張する。
【０００２】
本発明は、生体ナノ触媒（ＢＮＣ）の効果を支持すると共に高めるための磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を提供する。新規の足場は、不水溶性架橋ポリマーおよび略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含む。架橋ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、および、任意選択により追加のポリマー材料を含む。足場は、足場の調製中に鋳造を用いることにより任意の形状とし得る。一定の実施形態において、足場は、生体触媒反応における使用のためにビーズの形状とし得る。代替的な実施形態において、足場は、生体触媒反応における使用のためにミクロ粒子に粉砕され得る。足場の調製方法および使用方法もまた提供されている。
【背景技術】
【０００３】
磁性酵素の固定化は、酵素周囲に自己アセンブリするメソポーラス磁性クラスタ中への酵素の包括を含む。固定化効率は、酵素およびナノ粒子の初期濃度、酵素表面の性質、酵素の静電位、ナノ粒子表面の性質、ならびに、接触時間を含む多数の要因に応じる。生体触媒プロセスにおける産業的目的のために用いられる酵素は、効率が高く、プロセスの前およびその最中において安定であり、多数回の生体触媒サイクルにわたって再使用可能であり、および、経済的であるべきである。
【０００４】
磁性ナノ粒子のメソポーラス凝集体は、連続するか、または、粒状のマクロポーラス足場に組み込まれ得る。足場は磁性であってもなくてもよい。このような足場は、参照によりその全体が本明細書において援用される、国際公開第２０１４／０５５８５３号パンフレット、および、Ｃｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｔｏｄａｙ  ３４（５）：１５−２０（２０１６）において考察されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、生体ナノ触媒（ＢＮＣ）の効果を支持すると共に高めるための磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を提供する。新規の足場は、不水溶性架橋ポリマーおよび略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含む。架橋ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、および、任意選択により追加のポリマー材料を含む。足場は、足場の調製中に鋳造を用いることにより任意の形状とし得る。代替的に、足場は、バイオ触媒反応における使用のためにミクロ粒子に粉砕され得る。代替的に、足場は、バイオ触媒反応における使用のためにビーズの形状とし得る。足場の調製方法および使用方法もまた提供されている。
【０００６】
それ故、本発明は、不水溶性架橋ポリマーおよび略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含む磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を提供する。ポリマーは、少なくともポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み、サイズが約５０〜５００ｎｍのＭＭＰを有し、約１〜約５０μｍのサイズの細孔を有し、約２０％〜９５％ｗ／ｗのＭＭＰを有し、足場は、合計で約１〜１５ｍ２／ｇの生体ナノ触媒（ＢＮＣ）を組み込むための有効表面積を含み；酵素を組み込むための合計有効表面積は約５０〜２００ｍ２／ｇであり；前記足場は約０．０１〜約１０ｇ／ｍｌ．の嵩密度を有し；および、前記足場は、約１．０×１０−３〜約１×１０−４ｍ３ｋｇ−１の質量磁化率を有する。好ましい実施形態において、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場は、足場に対して約０〜９０度の水との接触角を有する。
【０００７】
好ましい実施形態において、不水溶性架橋ポリマーは実質的にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。さらに好ましい実施形態において、足場は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸塩、ポリメチルメタクリレート、ポリ酢酸ビニル、フッ化ビニル樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、フェノール樹脂、レソルシノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、セルロース、ヘミセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサンおよびポリホスファゼンからなる群から選択されるポリマーをさらに含む。
【０００８】
他のさらに好ましい実施形態において、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場は、ＰＶＡおよびＣＭＣ、ＰＶＡおよびアルギン酸塩、ＰＶＡおよびＨＥＣ、または、ＰＶＡおよびＥＨＥＣを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場はモノリス形状に形成される。他の実施形態において、足場は特定の生体触媒プロセスに適した形状に形成される。他の実施形態において、足場は、粉末の形態であり、前記粉末は約１５０〜約１０００μｍのサイズの粒子を含む。
【００１０】
本発明は、生体ナノ触媒（ＢＮＣ）をさらに含む、本明細書に開示の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＣは、磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を含み、ヒドロラーゼ、ヒドロキシラーゼ、過酸化水素生成酵素（ＨＰＰ）、ニトララーゼ（ｎｉｔｒａｌａｓｅ）、ヒドラターゼ、脱水酵素、トランスアミナーゼ、エネレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペルオキシダーゼ、オキシニトリラーゼ、イソメラーゼおよびリパーゼからなる群から選択される酵素を含む。
【００１１】
本発明は、水溶性ポリマーと、水および磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）とを混合して、約３〜５０ｃＰの懸濁液を形成するステップ；架橋試薬を前記混合物に添加するステップ；前記混合物を超音波処理するステップ；前記混合物を約−２００〜０℃の温度で凍結させるステップ；前記混合物を凍結乾燥するステップ；ならびに、前記水溶性ポリマーを架橋するステップを含む不水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場の調製方法を提供するものであり、ここで、前記架橋するステップで不水溶性ポリマーがもたらされる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本方法において、架橋するステップは、紫外光への露出、約６０〜５００℃の温度での混合物の加熱、または、これらの組み合わせによって達成される。好ましい実施形態において、この方法は、前記ＭＭＰの磁気モーメントの配列によりＭＭＰを組織化するために、超音波処理ステップ後に磁界を適用するステップをさらに含む。
【００１３】
本方法のいくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。他の実施形態において、水溶性ポリマーはさらに、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸塩、ポリメチルメタクリレート、ポリ酢酸ビニル、フッ化ビニル樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、フェノール樹脂、レソルシノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾール、セルロース、ヘミセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサンおよびポリホスファゼンからなる群から選択されるポリマーを含む。
【００１４】
さらに好ましい実施形態において、ポリマーは、ＰＶＡおよびＣＭＣ、ＰＶＡおよびアルギン酸塩、ＰＶＡおよびＨＥＣ、または、ＰＶＡおよびＥＨＥＣを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、架橋試薬は、クエン酸、すべてのカルシウム塩、１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸（ＢＴＣＡ）、グルタルアルデヒドおよびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、架橋試薬はクエン酸である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、凍結ステップは、モノリス形状である水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場をもたらす。他の実施形態において、凍結ステップは、特定の生体触媒プロセスに適した形状である水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場をもたらす。他の実施形態において、不水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場は、約１０〜約１０００μｍのサイズの粉末に粉砕される。
【００１７】
本発明は、基質間の反応をＢＮＣが触媒する条件下で、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を基質に露出させるステップを含む、複数の基質間の反応を触媒する方法を提供する。好ましい実施形態において、この反応は、医薬製品、医薬品、食品製品、衣料品、洗剤、燃料製品、生化学製品、紙製品またはプラスチック製品の生産に用いられる。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態は、約５００〜約５０００μｍのサイズのビーズ形状とされる不水溶性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を形成する方法を提供する。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、基質間の反応をＢＮＣが触媒する条件下で、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を基質に露出させるステップを含む、複数の基質間の反応を触媒する方法を提供し、ならびに、この反応は、溶液から汚染物を除去するプロセスにおいて用いられる。好ましい実施形態において、溶液は水溶液である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、磁性足場生成プロセスの例示的なブロック図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、磁性足場ＭＯ３２（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および１３．７５ｍＬの過剰量の水）の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、磁性足場ＭＯ３２−５０−ｈｉ  μ（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％高粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および４３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、乾燥した固体塊を基準として８３％のマグネタイトを含有する、磁性足場ＭＯ３２（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および１３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、乾燥した固体塊を基準として４０％のマグネタイトを含有する失敗した磁性足場ＭＯ４８（０．９０ｇのマグネタイト、１１ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．７１ｍＬの６％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および２３．２ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。
【図４】図４Ａは、乾燥した固体塊を基準として８３％のマグネタイトを含有し、液体窒素浴に垂直に約２Ｇの均一な磁界を適用しながら凍結された磁性足場ＭＯ３２−４０（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および３３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。図４Ｂは、乾燥した固体塊を基準として８３％のマグネタイトを含有し、液体窒素浴に平行に約２Ｇの均一な磁界を適用しながら凍結された磁性足場ＭＯ３２−４０（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および３３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。
【図５】図５は、通常のマグネタイト粉末と比した足場の低減された表面汚損ポテンシャルを示す。
【図６】図６Ａは、アンモニア定量化法で蛍光定量的に計測した固定化ニトリラーゼの活性を示す。３種のサンプルが比較されている：（１）非固定化ニトリラーゼ；（２）磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場ＭＯ３２−４０に鋳型化された、ｐＨ６ニトリラーゼ／２０％充填量のｐＨ３マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ；および、（３）９．５％の最終有効充填量の単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）に鋳型化された、ｐＨ６ニトリラーゼ／２０％充填量のｐＨ３マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ。図６Ｂは、２４５ｎｍでのアセトフェノン吸光度で分光測光法的に計測した固定化ω−トランスアミナーゼの活性を示す。３種のサンプルが比較されている：（１）非固定化ω−トランスアミナーゼ；（２）磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場ＭＯ３２−４０に鋳型化された、ｐＨ７．１５ω−トランスアミナーゼ／２０％充填量のｐＨ３マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ；および、（３）６．２％の有効充填量の単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）に鋳型化された、ｐＨ７．１５ω−トランスアミナーゼ／２０％充填量のｐＨ３マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ。単一のマグネタイト粉末に係る酵素固定化効率が１００％未満であるため、捕捉されていない酵素を除去し、適切な量の水で置き換えて、固定化酵素結果に対する非固定化酵素の寄与を排除した。図６Ｃは、蛍光定量的なｐＨに基づく方法により計測した固定化炭酸脱水酵素の活性を示す。３種のサンプルが比較されている：（１）非固定化炭酸脱水酵素；（２）磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場ＭＯ３２−４０に鋳型化された、ｐＨ６炭酸脱水酵素／２０％充填量のｐＨ１１マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ；および、（３）９．５％の有効充填量の単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）に鋳型化された、ｐＨ６炭酸脱水酵素／２０％充填量のｐＨ１１マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ。図６Ｄは、５００ｎｍでのキノンイミン染料複合体吸光度で分光測光法的に計測した固定化ホースラディッシュペルオキシダーゼの活性を示す。３種のサンプルが示されている：（１）非固定化ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；（２）磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場ＭＯ３２−４０に鋳型化された、ｐＨ５ホースラディッシュペルオキシダーゼ／５％充填量のｐＨ１１マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ；および、３％の有効充填量の単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）に鋳型化された、ｐＨ５ホースラディッシュペルオキシダーゼ／５％充填量のｐＨ１１マグネタイトナノ粒子ＢＮＣから組成されたＢＭＣ。
【図７】図７は、固定化および非固定化クロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）活性を示す。（Ｒ）−リモネンの（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−（＋）−リモネン−１，２−ジオールへの生体触媒転換を、アドレノクロームレポーター反応を用いて４９０ｎｍで分光測光法的に計測した。
【図８】図８は、固定化および非固定化リパーゼ活性を示す。ｐ−ニトロフェノールラウリン酸塩のｐ−ニトロフェノールおよびラウリン酸塩への生体触媒転換を、ｐＨ４で、３１４ｎｍで分光測光法的に計測した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ＢＮＣの効果を支持すると共に高めるための組成物および方法を提供する。これは、最初に、本明細書に開示の磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を用いることで達成される。新規の足場は、不水溶性架橋ポリマーおよび略均一分布の包埋磁性ミクロ粒子（ＭＭＰ）を含む。架橋ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、および、任意選択により追加のポリマー材料を含む。足場は、足場の調製中に鋳造を用いることにより任意の形状とし得る。代替的に、足場は、マクロ粒子に粉砕され、および、生体触媒反応のための規定のサイズにふるいにかけられ得る。足場の調製方法および使用方法もまた提供されている。
【００２２】
被包括酵素を含む自己アセンブリしたメソポーラスナノクラスタは、活性が高く、かつ、頑強である。本技術は、３段階の総合的な組織化レベルでの生化学、ナノテクノロジーおよび生体工学の効果的な融合であり：レベル１は、磁性メソポーラスナノクラスタの合成のための磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を含む酵素の自己アセンブリである。このレベルでは、酵素の固定化および安定化のために分子自己包括メカニズムが用いられる。レベル２は、ＭＮＰの他のマトリックスへの安定化である。レベル３は、レベル１＋２を発送するための生成物の検査およびパッケージングである。酵素に吸着された磁性ナノ粒子のアセンブリは、本明細書においては、「生体ナノ触媒」（ＢＮＣ）とも称される。
【００２３】
ＭＮＰは、温度、イオン強度およびｐＨなどの幅広い範囲の操作条件を許容する。（ＭＮＰのサイズおよび磁化がＮＰの形成および構造に関係し、これらはすべて、被包括酵素の活性に対して顕著な影響を有する。種々の反応条件下におけるその意外な復元力のために、ＭＮＰは、現在他の同様の薬剤が用いられる場合において向上した酵素または触媒薬剤として用いられることが可能である。さらに、これらは、酵素が考慮されていないか、または、適用可能であることが見出されていない他の用途において用いられることが可能である。
【００２４】
ＢＮＣは、磁性ナノ粒子間の間隙空間であるメソ細孔を含む。酵素は、ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部分中に包埋または固定化されていることが好ましい。本明細書において用いられるところ、「磁性」という用語は、永久磁性、超常磁性、常磁性、強磁性およびフェリ磁性挙動を含むすべてのタイプの有用な磁性特徴を包含する。
【００２５】
磁性ナノ粒子またはＢＮＣはナノ単位（すなわち、一般に５００ｎｍ以下）のサイズを有する。本明細書において用いられるところ、「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子が略または実質的に球状である場合には磁性ナノ粒子の直径を指すことが可能である。磁性ナノ粒子が略または実質的に球状ではない（例えば、実質的に卵形または不規則）場合においては、「サイズ」という用語は、磁性ナノ粒子の最大の寸法または３つの寸法の平均のいずれかを指すことが可能である。「サイズ」という用語はまた、磁性ナノ粒子群全体のサイズの平均（すなわち、「平均サイズ」）を指し得る。
【００２６】
異なる実施形態において、磁性ナノ粒子は、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍもしくは１ｎｍのサイズ（正確に、約、以下または未満）、または、前述の例示的なサイズのいずれか２つによって定められる範囲内のサイズを有する。
【００２７】
ＢＮＣにおいて、個別の磁性ナノ粒子は、上記サイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、一次微結晶）であると考えることが可能である。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体はナノ粒子よりもサイズが大きく、一般に少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。異なる実施形態において、凝集体は、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍもしくは８００ｎｍのサイズ（正確に、約、少なくとも、超、以下または未満）、または、前述の例示的なサイズのいずれか２つによって定められる範囲内のサイズを有する。
【００２８】
典型的には、一次および／もしくは凝集磁性ナノ粒子またはそのＢＮＣはサイズにばらつきがあり、すなわち、これらは一般に、狭いまたは広いばらつきでサイズがばらついている。異なる実施形態において、一次もしくは凝集体サイズの任意の範囲が、一次もしくは凝集体サイズの全範囲の主たる割合もしくは副次的な割合を構成することが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５または１０ｎｍ以上、および、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｍ以下）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約５、１０、１５または２０ｎｍ以上、および、約５０、１００、１５０、２００、２５０または３００ｎｍ以下）は、一次粒径の全範囲の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％以上または超を構成する。他の実施形態において、一次粒径の特定の範囲（例えば、約１、２、３、５もしくは１０ｎｍ未満、または、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍ超）または凝集体粒径の特定の範囲（例えば、約２０、１０もしくは５ｎｍ未満、または、約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％もしくは０．１％以下または未満を構成する。
【００２９】
磁性ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）またはそのＢＮＣは、これらを形成する個別の一次微結晶の量に応じて、実質的に多孔度を有さないものを含めて任意の多孔度を有することが可能である。特定の実施形態において、凝集体は、間隙のメソ細孔を含有する（すなわち、パッキング配置によって形成される、一次磁性ナノ粒子間に位置するメソ細孔）ことによりメソポーラスである。メソ細孔は一般に、少なくとも２ｎｍおよび５０ｎｍ以下のサイズである。異なる実施形態において、メソ細孔は、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍの孔径（正確にまたは約）、または、前述の例示的な孔径のいずれか２つによって定められる範囲内の孔径を有することが可能である。粒径の場合と同様に、メソ細孔は典型的にはサイズにばらつきがあり、すなわち、これらは一般に、狭いまたは広いばらつきでサイズがばらついている。異なる実施形態において、メソ孔径の任意の範囲が、メソ孔径の全範囲または総細孔体積の主たる割合もしくは副次的な割合を構成することが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、メソ孔径の特定の範囲（例えば、約２、３または５以上、および、８、１０、１５、２０、２５または３０ｎｍ以下）は、メソ孔径の全範囲または総細孔体積の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％以上または超を構成する。他の実施形態において、メソ孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４もしくは５ｎｍ未満、または、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍ超）は、メソ孔径の全範囲または総細孔体積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％または０．１％以下または未満を構成する。
【００３０】
磁性ナノ粒子は、技術分野において公知である組成のいずれかを有することが可能である。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、磁性を有するゼロ価の金属部分であるか、これを含む。このようなゼロ価の金属のいくつかの例としては、コバルト、ニッケルおよび鉄、ならびに、その混合物および合金が挙げられる。他の実施形態において、磁性ナノ粒子は、コバルト、ニッケルもしくは鉄、または、これらの混合物の酸化物などの磁性金属の酸化物であるかこれらを含む。いくつかの実施形態において、磁性ナノ粒子は、明確なコアと表面部分とを有する。例えば、磁性ナノ粒子は、元素鉄、コバルトまたはニッケルから組成されるコア部分と、金、白金、パラジウムまたは銀の層などの金属酸化物または貴金属コーティングなどの不動態化層から組成される表面部分とを有し得る。他の実施形態において、金属酸化物磁性ナノ粒子もしくはその凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆されている。貴金属コーティングは、例えば、磁性ナノ粒子表面における荷電数を低減させ得、これは、溶液中における分散性を高め、および、ＢＮＣのサイズの制御が良好となり、有利であり得る。貴金属コーティングは、クエン酸塩、マロン酸塩または酒石酸塩などのキレート化有機酸が生体化学反応またはプロセスにおいて用いられる場合における、リーチングによるまたはキレート化による可溶化、酸化から磁性ナノ粒子を保護する。不動態化層は、いずれかの好適な厚さであって、特に、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍもしくは１０ｎｍ（少なくとも、以下または未満、約）、または、これらの値のいずれか２つによって定められる範囲内の厚さを有することが可能である。
【００３１】
本発明に有用な磁性材料は技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイトまたは天然磁石）、コバルトおよびニッケルなどの鉱石を含む強磁性体および強磁性材料を含む。他の実施形態においては、希土類磁石が用いられる。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、シスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素等が挙げられる。さらなる実施形態において、磁石は、複合体材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライトおよびアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態において、磁性ナノ粒子は酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａは二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋またはこれらの組み合わせ）であり、および、Ｂは三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋またはこれらの組み合わせ）である）に従う、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ヘマタイト（α−Ｆｅ２Ｏ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｏ３）またはスピネルフェライトといった技術分野において公知である磁性または超常磁性酸化鉄組成物のいずれかであることが可能である。
【００３２】
個別の磁性ナノ粒子もしくはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な程度の磁気を有する。例えば、磁性ナノ粒子、ＢＮＣまたはＢＮＣ足場アセンブリは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｅｍｕ／ｇ以上または以下の飽和磁化（Ｍｓ）を有することが可能である。好ましくは、磁性ナノ粒子、ＢＮＣまたはＢＮＣ−足場アセンブリは、５ｅｍｕ／ｇを超えない（すなわち、以下）または未満の永久磁化（Ｍｒ）を有し、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇまたは０．１ｅｍｕ／ｇ以下または未満の永久磁化（Ｍｒ）を有する。磁性ナノ粒子、ＢＮＣまたはＢＮＣ−足場アセンブリの表面磁界は、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００ガウス（Ｇ）（約または少なくとも）、または、前述の値のいずれか２つによって定められる範囲内の磁界であることが可能である。ミクロ粒子が含まれる場合、ミクロ粒子はまた、上記の磁性強度のいずれかを有し得る。
【００３３】
磁性ナノ粒子もしくはその凝集体は、結果的なＢＮＣを生成するために、用途に応じて飽和度以下または未満で好適な量の酵素を吸着するよう形成可能である。異なる実施形態において、磁性ナノ粒子もしくはその凝集体は、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５または３０ｐｍｏｌ／ｍ２の酵素（約、少なくとも、以下または未満）を吸着し得る。代替的に、磁性ナノ粒子もしくはその凝集体は、例えば、飽和度の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（約、少なくとも、以下または未満）の量の酵素を吸着し得る。
【００３４】
磁性ナノ粒子もしくはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な細孔体積を有する。例えば、磁性ナノ粒子またはその凝集体は、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５もしくは１ｃｍ３／ｇの細孔体積（約、少なくとも、以下または未満）、または、前述の値のいずれか２つによって定められる範囲内の細孔体積を有することが可能である。
【００３５】
磁性ナノ粒子もしくはその凝集体またはそのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁性ナノ粒子もしくはその凝集体は、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ｍ２／ｇ（約、少なくとも、以下または未満）の比表面積を有することが可能である。
【００３６】
ＭＮＰ、その構造、組織化、好適な酵素および使用は、参照によりその全体が本明細書において援用される国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび国際公開第２０１４０５５８５３号パンフレットに記載されている。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒドロラーゼを含む。ヒドロラーゼは、基質として水を用いることで多くの種類の化学結合の加水分解を触媒する。基質は典型的には、破断される結合部位に水素および水酸基を有する。ヒドロラーゼは、酵素のＥＣ番号分類におけるＥＣ３と分類される。ヒドロラーゼは、これらが作用する結合に基づいて数々のサブクラスにさらに分類されることが可能である。例示的なヒドロラーゼおよびこれらが加水分解する結合は以下を含む：ＥＣ３．１：エステル結合（エステラーゼ：ヌクレアーゼ、ホスホジエステラーゼ、リパーゼ、脱リン酸化酵素）、ＥＣ３．２：糖（ＤＮＡグリコシラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．３：エーテル結合、ＥＣ３．４：ペプチド結合（プロテアーゼ／ペプチダーゼ）、ＥＣ３．５：炭素−窒素結合、ペプチド結合以外、ＥＣ３．６酸無水物（ヘリカーゼおよびＧＴＰアーゼを含む酸無水物ヒドロラーゼ）、ＥＣ３．７炭素−炭素結合、ＥＣ３．８ハライド結合、ＥＣ３．９：リン−窒素結合、ＥＣ３．１０：硫黄−窒素結合、ＥＣ３．１１：炭素−リン結合、ＥＣ３．１２：硫黄−硫黄結合、およびＥＣ３．１３：炭素−硫黄結合。
【００３８】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはグリコシドヒドロラーゼである。これらの酵素は、植物材料の分解（例えば、エタノール生成に用いられるグルコースにセルロースを分解するセルラーゼ）、食品生産（例えば、糖転化、マルトデキストリン生成）および紙生産（紙パルプからのヘミセルロースの除去）を含む多様な用途を有する。
【００３９】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはリポラーゼ１００Ｌ（ＥＣ３．１．１．３）である。これは、神経障害性疼痛、不安障害およびてんかんに用いられる抗痙攣薬であるプレガバリン（ＰｆｉｚｅｒからＬｙｒｉｃａ（登録商標）として市販されている）の合成に用いられる。これらの病状は世界人口の約１％に影響を及ぼしている。リポラーゼ１００Ｌは、必要とされる出発材料を３９％低減すると共に、単位当たりの廃棄物を８０％削減することが見出されていた。
【００４０】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはγ−ラクタマーゼ（例えば、ＥＣ３．１．５．４９）である。これは、アバカビル生成（ＨＩＶ／ＡＩＤＳを処置するための抗レトロウイルス薬）のための中間体であるビンスラクタムの形成に用いられる。化学量論的プロセスを触媒性流動プロセスに変更することで、操作単位数が１７から１２に減少すると共に、廃棄率が３５％低減することが見出された。また、有害物質である塩化シアンの使用が最小限である。
【００４１】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはラクターゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．１０８）である。これらの酵素は、乳中のラクトースを単一の糖に分解してラクトースを含まない乳を生産する。この重要な生産物は、ラクトース不耐症である世界人口の略１５％の役に立っている。
【００４２】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはペニシリンアミダーゼ（例えば、ＥＣ３．５．１．１１）である。これらの酵素はペニシリンをカルボキシレートと６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）とに分離する。６−ＡＰＡは、天然および合成ペニシリン誘導体におけるコア構造である。これらの酵素は、特定の感染症と戦うために調整された半合成ペニシリンの生成に用いられる。
【００４３】
いくつかの好ましい実施形態において、ヒドロラーゼはニトララーゼ（例えば、ＥＣ３．５．５．１）である。これらの酵素はニトリルをカルボキシル基に分離する。ニトララーゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒからＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）の生産に用いられる。これは、メソ−３−ヒドロキシグルタロニトリルのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへの反応を触媒し、ここで後者は、アトルバスタチンのコアを形成する。
【００４４】
ヒドロラーゼは、参照によりその全体が本明細書において援用される以下の文献において検討されている：Ａｎａｓｔａｓ，Ｐ．Ｔ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ，２００９；Ｄｕｎｎ，Ｐｅｔｅｒ  Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗ  Ｗｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｄｓ．Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０１０．；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３（１２）：１４７０−９０（２０１０）；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１６（１２）：１９８６−１９９３（２０１２）。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明は、過酸化水素生成（ＨＰＰ）酵素を提供する。一定の実施形態において、ＨＰＰ酵素は、ＥＸ１．１．３亜属であり得るオキシダーゼである。特定の実施形態において、オキシダーゼは、ＥＣ１．１．３．３（リンゴ酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．４（グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．５（ヘキソースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．６（コレステロールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．７（アリール−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．８（Ｌ−グルノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．９（ガラクトースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１１（Ｌ−ソルボースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１２（ピリドキシン４−オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１４（カテコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１５（２−オキシ酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１６（エクジソンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１７（コリンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１８（第二級−アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１９（４−ヒドロキシマンデン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２０（長鎖アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２１（グリセロール−３−リン酸塩オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２２、ＥＣ１．１．３．２３（チアミンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２４（Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２５、ＥＣ１．１．３．２６、ＥＣ１．１．３．２７（ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２８（ヌクレオシドオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．２９（ナシルヘキソサミンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３０（ポリビニルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３１、ＥＣ１．１．３．３２、ＥＣ１．１．３．３３、ＥＣ１．１．３．３４、ＥＣ１．１．３．３５、ＥＣ１．１．３．３６、ＥＣ１．１．３．３７、Ｄ−アラビノノ−ｌ，４−ラクトンオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３８（バニリルアルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．３９（ヌクレオシドオキシダーゼ、Ｈ２Ｏ２形成）、ＥＣ１．１．３．４０（Ｄ−マンニトールオキシダーゼ）またはＥＣ１．１．３．４１（キシリトールオキシダーゼ）であり得る。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒドロキシラーゼを含み得る。ヒドロキシル化は、水酸基（−ＯＨ）を有機化合物に導入する化学プロセスである。ヒドロキシル化は、空気中における有機化合物の酸化的分解における最初のステップである。ヒドロキシル化は、親油性化合物をより容易に排出される親水性物質に転換することによる解毒に関与する。いくつかの薬物（例えば、ステロイド）は、ヒドロキシル化により活性化または非活性化される。ヒドロキシラーゼは技術分野において周知である。例示的なヒドロキシラーゼとしては、プロラインヒドロキシラーゼ、リシンヒドロキシラーゼおよびチロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態はニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含む。これらは、高い光学純度を有するキラルカルボン酸とアンモニアとのニトリルの加水分解を触媒する加水分解酵素（ＥＣ３．５．５．１）である。ＮＩＴ活性は、マンデロニトリルの（Ｒ）−マンデル酸への転換を監視することにより計測し得る。これはｐＨの低下をもたらし、これを分光測光法的に監視し得る。ニトリラーゼは、ビタミンＢ３またはナイアシンとしても知られているニコチン酸の３−シアノピリジンからの生成に用いられる。ニコチン酸は、食品における栄養補助剤食品および薬学的中間体である。例示的な産業的用途が、本明細書における参照によりその全体が本明細書において援用されるＧｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１１（１），１４２（２０１２）において検討されている。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態はヒドラターゼを含む。これらは、水の元素の付加または除去を触媒する酵素である。ヒドロラーゼまたはヒドラーゼとしても知られているヒドラターゼは、Ｃ−Ｏ結合の水和または脱水を触媒し得る。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態はオキシドレダクターゼを含む。これらの酵素は、一の分子から他への電子の移動を触媒する。これには、一の物質から他へのＨおよびＯ原子または電子の移動が含まれる。これらは典型的には、ＮＡＤＰまたはＮＡＤ＋を補助因子として利用する。
【００５０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、ポリ塩化ビフェニルおよびフェノール系化合物などの汚染物質の分解、石炭の分解および木材加水分解産物の発酵の増強に用いられる。本発明はさらに、バイオセンサおよび病害診断におけるこれらの利用を含む。
【００５１】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは脱水素酵素（ＤＨＯ）である。このグループのオキシドレダクターゼは、１種以上の水素化物（Ｈ−）を、通常はＮＡＤ＋／ＮＡＤＰ＋またはＦＡＤもしくはＦＭＮなどのフラビン補酵素といった電子受容体に変換する還元反応によって基質を酸化する。例示的な脱水酵素としては、アルデヒド脱水素酵素、アセトアルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸脱水素酵素、コハク酸脱水素酵素およびリンゴ酸脱水素酵素が挙げられる。
【００５２】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、アトルバスタチン（ＰｆｉｚｅｒからＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）として市販されている）の形成に用いられるオキシドレダクターゼであるケトレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．１８４）である。この生体触媒プロセスは、実質的に出発材料が減少され、有機溶剤の使用が限定され、および、廃棄物流の生分解性が高められるために商業的に重要である。
【００５３】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼは、グルコース脱水素酵素（例えば、ＥＣ１．１．９９．１０）である。これらは、製薬に用いられる補助因子をリサイクルするために製薬会社によって用いられる。これらは、グルコースのグルコネートへの変換を触媒する。ＮＡＤＰ＋はＮＡＤＰＨに還元される。これはアバスタン生成に用いられる。
【００５４】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＰ４５０（ＥＣ１．１４．１４．１）である。これは、製薬産業において困難な酸化に用いられる。Ｐ４５０により、天然補助因子（例えば、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋）に付随するコスト、不一致性および非効率性が低減される。
【００５５】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはＥＣ１．１１．１．６などのカタラーゼである。これは、食品産業において、チーズの生産に先立つ乳からの過酸化水素の除去、および、グルコン酸などのｐＨ調整剤の生成のために用いられる。カタラーゼはまた、生地産業において布から過酸化水素を除去するために用いられる。
【００５６】
いくつかの好ましい実施形態において、オキシドレダクターゼはグルコースオキシダーゼ（例えば、ノタチン、ＥＣ１．１．３．４）である。これは、グルコースの過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する。これは、例えば、ペルオキシダーゼなどの酵素を消費する過酸化水素のための、酸化剤としての過酸化水素の生成に用いられる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明は、フリーラジカル生成（ＦＲＰ）酵素を包含する。いくつかの実施形態において、ＦＲＰはペルオキシダーゼである。ペルオキシダーゼは生体系中に広く見られ、フェノールから芳香族アミンにわたる多種多様な芳香族化合物を酸化するために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水に還元するオキシドレダクターゼのサブセットを形成する。ペルオキシダーゼはきわめて効力が高い酵素であるが、過剰量の過酸化物の存在下における強力な阻害のために、産業上の環境において採用することが困難であることでもよく知られている。本発明は、高い反応交換回数および低い阻害を提供するものである。それ故、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素が産業規模で用いられ得る。
【００５８】
ペルオキシダーゼは亜属ＥＣ１．１１．１に属する。一定の実施形態において、ＥＣ１．１１．１酵素は、より具体的には、例えば、ＥＣ１．１１．１．１（ＮＡＤＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．２（ＮＡＤＰＨペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．３（脂肪酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．４、ＥＣ１．１１．１．５（チトクロム−ｃペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．６（カタラーゼ）、ＥＣ１．１１．１．７（ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．８（ヨージドペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．９（グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１０（クロリドペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１１（Ｌ−アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１２（リン脂質−ヒドロ過酸化物グルタチオンペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１３（マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１４（ジアリールプロパンペルオキシダーゼ）またはＥＣ１．１１．１．１５（ペルオキシレドキシン）であることが可能である。
【００５９】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）は、セイヨウワサビ植物であるセイヨウワサビ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）の根に見出されるヘム含有オキシドレダクターゼ酵素である。これは、通常、過酸化水素と一緒に発色性基質に作用して鮮やかに着色された生成物複合体をもたらすために、生化学シグナル増幅因子およびトレーサとして通例用いられる。これは、目標分子の分光測光法における検出性を向上させる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のこの特徴は、げっ歯類の神経系毛細管の浸透性の研究に適用されている。本発明のいくつかの実施形態において、ＨＲＰは、種々の芳香族化合物の分解能のために、フェノール系排水の可能な修復ストラテジーの一部として用いられる。参照により本明細書においてその全体が援用されている、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ，１５（５），９７４−９８０（２０１４）を参照のこと。
【００６０】
他の実施形態において、ペルオキシダーゼはまた、例えば、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼまたは万能ペルオキシダーゼといった官能性によってさらに特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、真菌性、微生物性、動物または植物ペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、クラスＩ、クラスＩＩ、またはクラスＩＩＩペルオキシダーゼとして特定され得る。ペルオキシダーゼはまた、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、プロスタグランジンＨシンターゼ（ＰＧＨＳ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チトクロムｃペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ピーナッツペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、カブペルオキシダーゼ、タバコペルオキシダーゼ、トマトペルオキシダーゼ、オオムギペルオキシダーゼまたはペルオキシダシンと特定され得る。特定の実施形態において、ペルオキシダーゼはホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【００６１】
ラクトペルオキシダーゼ／グルコースオキシダーゼ（ＬＰ／ＧＯＸ）抗菌系は、乳、唾液、涙および粘液などの体液中に自然に生じる（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００））。この系は、哺乳類および高等生物に無害である２種の天然化合物チオシアネート（ＳＣＮ−）およびヨウ化物（Ｉ−）を利用する（Ｗｅｌｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５８７（２０１１））。ＬＰは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下におけるチオシアネートおよびヨウ化物イオンのそれぞれ次亜チオシアン酸塩（ＯＳＣＮ−）および次亜ヨウ素酸（ＯＩ−）への酸化を触媒する。この系中のＨ２Ｏ２は、酸素の存在下におけるβ−Ｄ−グルコースに対するＧＯＸの活性によってもたらされる。これらのフリーラジカル化合物は次いで、細菌の細胞膜中のスルフヒドリル基を酸化して（Ｐｕｒｄｙ，Ｔｅｎｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９（３），１１８７（１９８３）；Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８９（２），２１５−２４（２０００）膜透過性の機能障害をもたらし（Ｗａｎ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３６２，３５５−３６２（２００１））、最終的に微生物細胞を死滅させる。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態はトランスフェラーゼを含む。「トランスフェラーゼ」は特定の官能基を一の分子から他の分子に転移させる酵素分類を指す。転移される基の例としては、メチル基およびグリコシル基が挙げられる。トランスフェラーゼは、発癌化学物質および環境汚染物質などの物質の処理に用いられる。また、これらは、ヒトの体内に見出される有害化学物質および代謝産物と戦うまたは中和するために用いられる。
【００６３】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはトランスアミナーゼである。トランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸とα−ケト酸との間の反応を触媒する。これらは、アミノ酸の合成において重要である。転移においては、一の分子におけるＮＨ２基が他の分子における他の基（例えば、ケト基）由来の＝Ｏと交換される。
【００６４】
さらに好ましい実施形態において、トランスアミナーゼはω−トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１８）である。これは、とりわけ、シタグリプチン（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．により、抗糖尿病薬Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標）として市販されている）の合成に用いられる。改変ω−トランスアミナーゼは、生体触媒活性を例えば２５，０００倍向上させて、シタグリプチン収率の合計で１３％の増加およびプロセス廃棄物全体における１９％の低減をもたらすことが見出されている。
【００６５】
基質に対する高い立体選択性および生成物に対する高い立体特異性により、ω−トランスアミナーゼは、人工的なアミノ酸および光学的に純粋なキラルアミンまたはケト酸の形成に利用することが可能である（Ｍａｔｈｅｗ  ＆  Ｙｕｎ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ２（６），９９３−１００１（２０１２））。ω−トランスアミナーゼはまた、活性な薬学的中間体の生体触媒キラル分解における用途を有し、従来の化学的方法よりもプロセスを簡素化する（Ｓｃｈａｅｔｚｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８１（１９）：８２４４−４８（２００９））。前述の文献は参照によりそれらの全体が援用される。
【００６６】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはチミジル酸シンテターゼ（例えば、ＥＣ２．１．１．４５）である。これらの酵素は、糖ヌクレオチドおよびオリゴ糖の生産に用いられる。これらは、例えば、以下の反応を触媒する。
【数１】
2019514421.tif 000003
【００６７】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（例えば、ＥＣ２．５．１．１８）である。これらの酵素は、グルタチオンを他のトリペプチドに触媒する。これらは、食品産業において酸化剤として、ならびに、製薬産業における抗老化薬および皮膚配合物の形成に用いられる。
【００６８】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはグルコキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２）である。これらの酵素は、グルコースのグルコース−６−リン酸塩へのリン酸化を促進させる。これらは、食品産業において生成物流中におけるグルコース濃度を低減するために、ならびに、製薬産業において糖尿病薬物を形成するために用いられる。
【００６９】
いくつかの好ましい実施形態において、トランスフェラーゼはリボフラビンキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．２６）である。さらに好ましい実施形態において、リボフラビンキナーゼは、食品産業におけるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の生成に用いられる。ＦＭＮは、オレンジ−赤色の食品着色添加剤であり、および、過剰量のリボフラビン（ビタミンＢ２）を分解する薬剤である。リボフラビンキナーゼは、例えば以下の反応を触媒する。
【数２】
2019514421.tif 000004
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態はエネレダクターゼ（ＥＲＥＤＳ）を含む。これらの酵素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−に依存する形式でアルケン還元を触媒する。エネレダクターゼの例としては、オキシドレダクターゼのＦＭＮ−含有旧黄色酵素（ＯＹＥ）ファミリー（ＥＣ１．６．９９）、クロストリジウムエン酸レダクターゼ（ＥｎｏＲｓ、Ｃ１．３．１．３１）、フラビン非依存性中間鎖脱水素酵素／レダクターゼ（ＭＤＲ；ＥＣ１．３．１）、短鎖脱水素酵素／レダクターゼ（ＳＤＲ；ＥＣ１．１．１．２０７−８）、ロイコトリエンＢ４脱水素酵素（ＬＴＤ）、キノン（ＱＯＲ）、プロゲステロン５ｂ−レダクターゼ、ラットプレゴンレダクターゼ（ＰＧＲ）、タバコ二重結合レダクターゼ（ＮｔＤＢＲ）、シアノバクテリアＯＹＥ、カセイ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）由来のＬａｃＥＲ、アクロモバクター属の一種（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＪＡ８１）由来のＡｃｈｒ−ＯＹＥ４、および、イースト菌ＯＹＥが挙げられる。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態はイミンレダクターゼ（ＩＲＥＤＳ）を含む。イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤ）は光学的に純粋な第二級環式アミンの合成を触媒する。これらは、ケトンまたはアルデヒド基質および第一級または第二級アミン基質を転換して、第二級または第三級アミン生成化合物を形成し得る。例示的なＩＲＥＤは、パエニバチルスエルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ  Ｂ６９）、ストレプトマイセスイポモエアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｉｐｏｍｏｅａｅ  ９１−０３）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０）およびアセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）由来のものである。ＩＲＥＤは、参照によりその全体が本明細書において援用されている国際公開第２０１３１７００５０号パンフレットにおいて詳細に検討されている。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はリアーゼである。これらは、加水分解または酸化以外のプロセスによって基質から原子群が除去される脱離反応を触媒する。度々、新たな二重結合または環構造がもたらされる。リアーゼの７つのサブクラスが存在する。好ましい実施形態において、ペクチンリアーゼは、高エステル化ペクチン（例えば、果実中）の小分子への分解に用いられる。本発明の他の好ましい実施形態は、オキシニトリラーゼ（マンデロニトリルリアーゼまたは脂肪族（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとも称される）を含む。これらは、マンデロニトリルをシアン化水素＋ベンズアルデヒドに開裂する。
【００７３】
好ましい実施形態において、リアーゼは、ヒドロキシニトリルリアーゼ（例えば、ＥＣ４．１．２、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）リアーゼの突然変異）である。ヒドロキシニトリルリアーゼは、幅広い範囲の化学反応および酵素反応に対する多用途の構築ブロックとして役立つことが可能であるシアノヒドリンの形成を触媒する。これらは、酵素スループットおよび低ｐＨでの安定性の向上に用いられると共に、クロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））の生成に用いられる。反応プロセスは、参照により本明細書においてその全体が援用されているＧｌｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４８１５（２００３）に記載されている。
【００７４】
他の好ましい実施形態において、リアーゼは２−デオキシ−Ｄ−リボースリン酸塩アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。これは、例えばＬｉｐｉｔｏｒ生成といったスタチン側鎖の形成に用いられる。
【００７５】
他の好ましい実施形態において、リアーゼは、（Ｒ）−マンデロニトリルリアーゼ（ＨＮＬ、ＥＣ４．１．２．１０）である。これは、ジルチアゼムの生成に用いられる前駆体シアノヒドリンであるスレオ−３−アリール−２，３−ジヒドロキシプロパン酸の合成に用いられる。ジルチアゼムは、高血圧および胸痛（アンギーナ）を処置する強心薬である。血圧を低下させることで、脳卒中および心臓発作のリスクが低減される。これはカルシウムチャネル遮断薬である。ジルチアゼムおよびその生成は、共に参照によりそれらの全体が援用される、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  ａｎｄ  Ａｓａｎｏ，ＡＣＳ  Ｃａｔａｌ．１：１１２１−４９（２０１１）およびＡｅｈｌｅ  Ｗ．２００８．Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｗｅｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，ＧｍｂＨ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【００７６】
他の好ましい実施形態において、リアーゼはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１）である。これは、３−シアノピリジンをニオコチンアミド（ビタミンＢ３、ナイアシンアミド）に転換するために商業的に用いられる。これはまた、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）における活性薬学処方成分であるレベチラセタムの調製にも用いられる。
【００７７】
他の好ましい実施形態において、リアーゼはフェニルリン酸塩カルボキシラーゼである。これらは、例えば、室温および大気圧未満のＣＯ２圧下におけるフェノールのリン酸化に用いられる。これらの酵素は、フェノールおよびＣＯ２からの１００％の選択性を伴う４−ＯＨ安息香酸の合成を触媒する。４−ＯＨ安息香酸は、そのエステルの調製に用いられる。さらに好ましい実施形態において、酵素は、化粧品および点眼剤における防腐剤として用いられるパラベンの生成に用いられる。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素は炭酸脱水酵素（例えば、ＥＣ４．２．１．１）である。炭酸脱水酵素は、すべての生体に存在する広範に分布する金属酵素である。これらは知られている中で最も効率的な酵素であり、ＣＯ２交換、ｐＨ調整およびＨＣＯ３−分泌を含む複数の生理学的な役割を果たす。炭酸脱水酵素はまた、ＣＯ２の隔離および方解石の生成において潜在的な産業用途を有する。Ｌｉｎｄｓｋｏｇ  ＆  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，（２０００），Ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ  ＥＸＳ  ９０：１７５−１９５（Ｗ．Ｒ．Ｃｈｅｇｗｉｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．２０００）；Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅｓ：Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｐｐ．１７５−９５（Ｗ．Ｒ．Ｃｈｅｇｗｉｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．２０００）；ＭｃＣａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３０：１４５５−１４５８（２０００）；Ｂｏｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１３：２２−２７（２０１３）を参照のこと。前述の文献は参照によりそれらの全体が援用される。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態において、酵素はイソメラーゼである。イソメラーゼは、分子異性化、すなわち、一の異性体を他のものに転換する反応を触媒する。これらは、結合が破断および形成される分子内転移を促進させることが可能であり、または、これらは、配座変化を触媒することが可能である。イソメラーゼは技術分野において周知である。
【００８０】
好ましい実施形態において、イソメラーゼは糖の生産において用いられる。さらに好ましい実施形態において、イソメラーゼは、グルコースイソメラーゼ、ＥＣ５．３．１．１８である。他の実施形態において、グルコースイソメラーゼは、アクチノプラネスミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種によって産生される。グルコースイソメラーゼは、Ｄ−キシロースおよびＤ−グルコースをＤ−キシルロースおよびＤ−フルクトースに転換し、これは、高フルクトースコーンシロップの生成および生物燃料の分野において重要な反応である。
【００８１】
他の好ましい実施形態において、イソメラーゼはマレエートｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．１）である。これは、マレイン酸のフマル酸への転換を触媒する。フマル酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リンゴ酸、ポリエステル樹脂、食品および飲料添加剤、ならびに、染料用の媒染剤の生体触媒生成に重要である。
【００８２】
他の好ましい実施形態において、イソメラーゼは、リノール酸ｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＥＣ５．２．１．５）である。これは、共役リノール酸（ＣＬＡ）の異性化を触媒する。ＣＬＡは、肥満症、糖尿病、ガン、炎症およびアテローム発生の処置に係る数多くの潜在的な健康上の有益性を有すると報告されている。ＣＬＡの異なる異性体は、異なる生理学的な効果を発揮し得る。それ故、酵素は単一の異性体の調製に用いられる。
【００８３】
本発明の他の好ましい実施形態において、イソメラーゼはトリースリン酸イソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１）である。これは、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸塩およびジヒドロキシアセトンリン酸塩の相互変換を触媒する。トランスケトラーゼまたはアルドラーゼとの組み合わせで、トリースリン酸イソメラーゼは、種々の糖または糖類似体の立体選択的多酵素合成に用いられる。好ましい実施形態は、Ｄ−キシルロース５−リン酸塩のワンポット酵素調製である。この合成は、Ｄ−フルクトース１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１３）によるフルクトース１，６−二リン酸の逆アルドール開裂から開始される。続くラセミ化で、トリースリン酸イソメラーゼによって、トランスケトラーゼ（ＥＣ２．２．１．１）によってキシルロース５−リン酸塩に転換されるＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸塩の２種の均等物の生成が促進される。
【００８４】
本発明の他の実施形態において、酵素はリガーゼである。これらの酵素は、ヌクレオシド−三リン酸の加水分解と組み合わされる２つの分子を一緒に結合する共有結合の形成を触媒する。リガーゼは技術分野において周知であり、通例、組換え核酸用途に用いられる。好ましい実施形態において、ＤＮＡリガーゼはＥＣ６．５．１．１である。
【００８５】
好ましい実施形態において、リガーゼはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２、ＡＣＣ）である。ＡＣＣは、脂質合成のジャンクションおよび酸化経路における役割を有する。これは、本明細書に開示の本発明と共に、抗生物質の生成、糖尿病治療、肥満症および他のメタボリックシンドロームの症状などの臨床目的で用いられる。
【００８６】
他の好ましい実施形態において、リガーゼはプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ、ＥＣ６．４．１．３）である。これは、ミトコンドリアマトリックスにおいてＤ−メチルマロニル−ＣｏＡを生成するプロピオニル−ＣｏＡのビオチン−依存カルボキシル化を触媒する。メチルマロニル−ＣｏＡは、多くの有機化合物の生合成、ならびに、炭素同化プロセスにおける重要な中間体である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、本発明において用いられる酵素を発現する組換え細胞を用いる。組換えＤＮＡ技術は技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、細胞は、酵素を発現するプラスミドなどの発現ベクターで形質転換される。他の実施形態において、ベクターは、例えば転写開始、転写終了、翻訳開始および翻訳終了に係る１つ以上の遺伝子シグナルを有する。ここで、酵素をコードする核酸は、好適な宿主生体中に適当に移された場合に発現されるよう、ベクター中においてクローン化され得る。好適な宿主細胞は、技術分野において周知であるとおりバクテリア、真菌、植物または動物に由来するものであり得る。
【００８８】
ＢＮＣ（レベル１）は酵素固定化能の大部分をもたらすが、往々にして、これらは、標準的な強度の磁石によって容易に捕捉されるには小さすぎる。それ故、マイクロメートル未満の磁性材料（レベル２）が、レベル１に対してバルク磁化および追加的な安定性をもたらすために用いられる。５０〜５００ｎｍの範囲の粒径を有する市販されている非固定化マグネタイト粉末は親水性が高くプラスチックおよび金属表面に貼り付く傾向にあり、これにより、経時的に、所与の反応器系中における実効上の酵素の量が低減されてしまう。加えて、粉末化されたマグネタイトはきわめて高密度であり、それ故、輸送コストが高くなってしまう。また、かなり高価でもあり、特に、１００ｎｍよりも小さい粒径では顕著である。これらの限定事項を克服するために、マグネタイト、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの不水溶性架橋ポリマーから構成される低密度ハイブリッド材料が開発された。これらの材料は、架橋後における水溶性ポリマーの凍結鋳造および凍結乾燥によって形成される。これらの材料は外部表面に対する接着性が低く、マグネタイトの必要量が少なく、純粋なマグネタイト粉末に少なくとも匹敵するレベル１の捕捉を達成する。
【００８９】
一実施形態においては、連続するマクロポーラス足場は架橋ポリマー組成物を有する。このポリマー組成物は、技術分野において公知である固体有機、無機またはハイブリッド有機−無機ポリマー組成物のいずれかであり得、および、バインダとして作用する合成またはバイオポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーマクロポーラス足場は、階層型触媒の使用が意図される水または他の媒質中において溶解または分解しない。合成有機ポリマーのいくつかの例としては、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸またはポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸またはポリメタクリル酸塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール等）、フッ素化ポリマー（例えば、フッ化ビニル樹脂、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン等）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、および、これらのコポリマーが挙げられる。バイオポリマーのいくつかの例としては、多糖類（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロースおよびアルギン酸）、ポリ乳酸およびポリグリコール酸が挙げられる。セルロースの特定の事例においては、セルロースは、微生物由来または藻類由来のセルロースであり得る。無機またはハイブリッド有機−無機ポリマーのいくつかの例としては、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどのゾルゲル合成によって調製されるもの）およびポリホスファゼンが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記のポリマー組成物のいずれか１つ以上の分類または特定のタイプのものがマクロポーラス足場として排除される。
【実施例】
【００９０】
実施例１−マクロポーラスポリマーハイブリッド足場粉末の調製
前駆体溶液を生成するために、ポリマーのストック溶液を最初に調製した。ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＭＷ＝８９，０００〜９８，０００、９９％加水分解）を、７０℃で、１０％ｗ／ｗのストック濃度にＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した。ＨＥＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＭＷ＝２５０，０００）、ＣＭＣ（ジェネリック低粘度、Ｓｉｇｍａ）およびＥＨＥＣ（ＥＨＭ  ３００、Ｂｅｒｍｏｃｏｌｌ）の各々を、２％ｗ／ｖのストック濃度にＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に溶解した。次いで、２種の異なる粒径分布（「ファイン」（Ｆ）、５０〜１００ｎｍおよび「ミディアム」（Ｍ）、１００〜５００ｎｍ）の１．５６〜３．００ｇのマグネタイト粉末（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を計量し、別に置いておいた。用いた各試薬の量は、マグネタイト対ポリマーの所望の比率、ならびに、凍結乾燥後の乾燥固形分の所望の濃度に応じて様々であった。過剰量の水を添加して粘度を低くして、凍結鋳造中における氷の成長と細孔の形成の度合いを増大させた。
【００９１】
凍結鋳造するための溶液の準備ができたら、マグネタイトを固体粉末クエン酸（その後のＰＶＡ架橋ステップ用）と共に、２５０ｍＭの最終濃度にポリマー溶液に添加した。混合物に対して、直ぐに、３５％振幅（１／８インチチップ）で３分間超音波処理を行った。超音波処理後、溶液を液体窒素浴中においてそのまま凍結させ、次いで、−１０℃および０．０１ｔｏｒｒで一晩または乾燥するまで凍結乾燥させた。ＰＶＡ架橋を開始するために、形成した乾燥モノリスを１３０℃のオーブン中に６０〜１２０分間置いた。最後に、モノリスを６０℃の水で洗浄して過剰量の架橋剤を除去し、市販のＷａｒｉｎｇブレンダーで３０〜６０秒間かけて粉砕した。
【００９２】
この実施例においては、足場を管状のモノリス形状に鋳造した。「ＭＯ」は両方のモノリス前駆体溶液を指す。ＭＯの直後に続く最初の数字の組は、配合物番号を示す。それ故、上記の最適化されたモノリスは、３２番目のモノリス配合物における変形である。ハイフンに続く２番目の数字の組は希釈度を示す。未希釈のモノリス（例えば、ＭＯ３２）にはこの数字が付されておらず、上記から算出可能であるとおり、特定の一定質量のマグネタイト、ＰＶＡおよびＣＭＣが溶解された２０ｍＬの総体積に相当する。ＭＯ３２−３０は同一の固体塊を示すが、代わりに３０ｍＬの総体積中に溶解されており、ＭＯ３２−４０は４０ｍＬへの希釈を示し、その他も同様である。前駆体溶液粘度は、株式会社エー・アンド・デイＶｉｂｒｏ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＳＶ−１０（日本国東京豊島区）により室温で計測した。「Ｈｉ  μ」は、高粘度（約２０００〜３８００ｃＰ）ＣＭＣで形成したモノリスを指す。ここで、標識がない場合には、モノリスが低粘度（＜５０ｃＰ）ＣＭＣで形成されていることを示す。
【００９３】
ＭＯ３２（１．８７５ｇのマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］および１３．７５ｍＬの水、０．９６ｇのクエン酸と共に架橋）−総体積約２０ｍＬ。前駆体溶液の粘度は、室温で３．８５ｃＰであった。
【００９４】
ＭＯ３２−３０（１．８７５ｇのマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］および２３．７５ｍＬの水、０．９６ｇのクエン酸と共に架橋）−総体積約３０ｍＬ。前駆体溶液の粘度は室温で２．３３ｃＰであった。
【００９５】
ＭＯ３２−４０−ｈｉ  μ（１．８７５ｇのマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％高粘度カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］（Ａｓｈｌａｎｄ製のＡｑｕａｌｏｎ  ７Ｈ３ＳＸＦＰＨ）および３３．７５ｍＬの水、０．９６ｇのクエン酸と共に架橋）−総体積約４０ｍＬ。前駆体溶液の粘度は室温で３．６５ｃＰであった。
【００９６】
ＭＯ３２−５０−ｈｉ  μ（１．８７５ｇのマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）、３．１２５ｍＬの１０％。ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％高粘度カルボキシメチルセルロース［ＣＭＣ］（Ａｓｈｌａｎｄ製のＡｑｕａｌｏｎ  ７Ｈ３ＳＸＦＰＨ））および４３．７５ｍＬの水、０．９６ｇのクエン酸と共に架橋）−総体積約５０ｍＬ。前駆体溶液の粘度は室温で３．５９ｃＰであった。マグネタイトの質量および細かさは、各配合物において用いたＳｉｇｍａ製のマグネタイトの特徴を示す。ＰＶＡの架橋に用いたクエン酸の質量は既に説明したとおり２５０ｍＭ当量濃度に相当し、以下の式（式１）により、用いたＰＶＡの質量に基づいて算出される。
ｍＣＡ＝（ｍＰＶＡ／０．３１２５）（０．０２ｃＣＡＭＣＡ）（１）
（式中、
ｍＣＡは必要なクエン酸の質量（グラム）である
ｍＰＶＡは溶液中のＰＶＡの合計質量（グラム）である
ｃＣＡはｍｏｌ／Ｌでの目標クエン酸濃度である（ここでは、０．２５Ｍを用いた）
ＭＣＡはクエン酸の分子量である（１９２．２  グラム／ｍｏｌ）。
【００９７】
マグネタイトおよびクエン酸の体積はサンプルの総体積と比してごくわずかであり、計算中においては無視した。
【００９８】
低クエン酸対ポリマー比率（１：１未満）および硬化時間（１時間未満）では、架橋の欠乏がもたらされた。架橋が欠乏している材料は部分的に水に可能性であり、細孔および表面構造が失われてしまう。
【００９９】
４種の配合物を、６本の５０ｍＬチューブを並行して凍結することにより、各々を３００ｍＬの溶液に成功裏にスケールアップさせた。所望のモノリスの目標総乾燥質量ｍＴを想定して、溶液の生成は以下の式を適用することにより容易にスケールアップが可能である。
【数３】
2019514421.tif 000005
（式中、
【０１００】
【表１】
2019514421.tif 000006
【０１０１】
そのままのモノリスはマクロポーラスであった。それぞれ４４９および３．８５μｍの孔径で、ＭＯ３２−３０は６８．０７％の多孔度、および、ＭＯ３２−５０は６７．７％の多孔度を有していた。水銀ポロシメータ（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ＵＳＡ）による計測で、骨格密度は、それぞれ０．８６および０．７１ｇ／ｍｌであった。
【０１０２】
含水量が高い場合には、粘度の高いポリマーを用いて、氷の鋳型化に先だって粒状マグネタイトの良好な懸濁を維持した。固形分の総量を一定に維持しながら、置換度の低い水溶性ポリマーを用いることで粘度を調節した。ポリマーの置換度が低い場合には溶液の粘度は高かった。
【０１０３】
モノリス材料は大部分がマイクロメートル未満のマクロ細孔でマクロポーラスであったが（図２）、メソ細孔はなかった。粉砕後、マクロ細孔が損失されたためにマクロ多孔度は低下した。合計表面積は、破壊された細孔セルによりマクロ細孔の内表面が粒子の外表面となったため、粉砕の最中に保持された。粒径は、粉砕強度およびふるいがけによって制御した。モノリスＭ３２由来のふるいにかけていない粉末は、２．６７ｍ２／ｇ（ラングミュア表面積）の表面積を有していると計測された。モノリスＭ３２−３０由来のふるいにかけていない粉末は、２．８ｍ２／ｇ（ラングミュア表面積）の表面積を有していると計測された。
【０１０４】
ＭＯ３２粉末に対する５０％のＢＮＣ充填量では、計算上の多孔度は、ＢＮＣのメソポーラス構造により２．８ｍ２／ｇから７５ｍ２／ｇに増加した。
【０１０５】
粉砕した材料の合計多孔度および嵩密度は、系中の水の量、架橋性ポリマーの量および前駆体溶液の粘度を調節することにより調整が可能である。これらのパラメータが氷結晶の形成を制御する。
【０１０６】
材料の磁化率を判定するために、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＰＭＳ）ユニットを用いて、最初に磁気モーメント（μ）を異なる磁界強度（Ｈ）で計測した（すなわち、磁性ヒステリシスループ実験を行った）。比較のために、磁性挙動を純粋な５０〜１００ｎｍマグネタイト粉末についても計測した。次いで、これらのモーメントを合計サンプル質量ｍについて標準化した。−５００〜５００Ｏｅ（−３９，７９０Ａ／ｍ〜３９，７９０Ａ／ｍ）の磁界強度については、μとＨとの間の関係がほとんど線形（Ｒ＾２＞０．９８５）であることが判定された。質量磁化率χ（ｍ）を、この高度に線形のドメインにおけるヒステリシス曲線の勾配に基づいて計算した（すなわちχ（ｍ）＝μ／（ｍ＊Ｈ））。
【０１０７】
純粋な５０〜１００ｎｍマグネタイト粉末、ならびに、粉末足場ＭＯ３２、ＭＯ３２−３０、ＭＯ３２−４０およびＭＯ３２−５０−ｈｉ  μの質量磁化率はそれぞれ、９．２３・１０−４、６．３４・１０−４、５．６３・１０−４、６．１４・１０−４および６．１６・１０−４ｍ３／ｋｇと計算された。これは、マグネタイトおよび他の同様の磁性鉱物について報告されている典型的な値と一致する。加えて、ポリマーは磁性応答がわずかであるため、ハイブリッド材料感受性の報告されている値は、足場中に残留するマグネタイトのおおよその質量分率（典型的には４０〜９０質量％の範囲）ときわめて良好に対応する。
【０１０８】
図１は、モノリス材料および粉砕された粉末の生成に係る例示的な生成プロセスをブロック図形式で示す。本明細書に開示されているとおり、このプロセスは、条件および材料のより大きな範囲を包含することが可能である。
【０１０９】
図２〜４は、広く多様な条件下で生成されたモノリス材料の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像を示す。示されているすべてのモノリスは、凍結鋳造、凍結乾燥および高温で架橋を行った。凍結鋳造の最中に氷の結晶が成長するに伴って、これらは層状のチャネル構造を形成し、これが、混合ポリマー（ＳＥＭ画像中の滑らかな表面）およびマグネタイト（ＳＥＭ画像中の小さな立方体の結晶）から組成された排除された材料の薄い壁を形成していた。この成長はまた、１〜５０μｍ範囲のマクロ細孔をももたらした。理論に束縛されることは望まないが、前駆体溶液における希釈率が高く、かつ、前駆体溶液の粘度が低いほど、より大きな細孔が形成されることとなる。
【０１１０】
図２Ａは、磁性足場ＭＯ３２（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および１３．７５ｍＬの過剰量の水）の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像を示す。
【０１１１】
図２Ｂは、磁性足場ＭＯ３２−５０−ｈｉ  μ（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％高粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および４３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。図２Ａおよび２Ｂの比較で、前駆体溶液の希釈率を高くすると（より多量の水）、見かけ上の孔径が増加することが分かる。
【０１１２】
図３Ａは、乾燥した固体塊を基準として８３％のマグネタイトを含有する磁性足場ＭＯ３２（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および１３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。
【０１１３】
最適なモノリス生成は、凍結鋳造の最中に生じるポリマーとマグネタイトとにおける相分離が最小限である場合に生じる。粉末に粉砕する際に、多孔性層状ネットワークは、熱処理、粉砕および水中への分散後に保持される。図３Ｂは、乾燥した固体塊を基準としてわずかに４０％のマグネタイトを含有する失敗した磁性足場ＭＯ４８（０．９０ｇのマグネタイト、１１ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．７１ｍＬの６％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および２３．２ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。ポリ（ビニルアルコール）対ＣＭＣの質量比率は、両方の試験について同じであった。両方の画像は、足場を１３０℃で１時間加熱して架橋させた後に撮影した。熱処理された後においても、８３％マグネタイトを含有するモノリス（３（ａ））では氷鋳型化チャネル構造および細孔ネットワークが如何に維持されており、一方で、４０％マグネタイトモノリス（３（ｂ））では溶融し、細孔が融合してしまっていることに注目されたい。マグネタイト含有量の低減は、１００℃超の温度でのポリマーの相転移および相分離により、架橋ステップの最中における細孔構造の完全な損失を招いてしまった。多孔度の損失はまた、硬化の最中にモノリスが顕著に収縮してしまうために、肉眼レベルでも観察された。対照的に、マグネタイトの濃度が高いと、整列した粒子が足場となり、クエン酸と架橋されるに伴ってポリマーがその上に融けていく。この条件においては、マクロ細孔および材料の全体構造は保存された。これは、その上にポリマーが正確に架橋し、十分に分散されたマクロポーラスネットワークを形成することが可能である内部骨格とされるためには、最低限の割合のマグネタイトが必要とされることを示唆していた。
【０１１４】
図４Ａは、乾燥した固体塊を基準として８３％のマグネタイトを含有し、液体窒素浴に垂直に約２Ｇの均一な磁界を適用しながら凍結された磁性足場ＭＯ３２−４０（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および３３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。
【０１１５】
図４Ｂは、乾燥した固体塊を基準として８３％のマグネタイトを含有し、液体窒素浴に平行に約２Ｇの均一な磁界を適用しながら凍結された磁性足場ＭＯ３２−４０（１．８７５ｇのマグネタイト、３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および３３．７５ｍＬの過剰量の水）のＳＥＭ画像を示す。サンプル位置については、各図の左側の概略的な円柱を参照のこと。
【０１１６】
チャネル形成およびマグネタイト配列の方向は、凍結容器に対して外部磁界Ｂ（平行または垂直）を適用することで制御可能である。マグネタイト粒子の初期の配向および配列で、モノリスの凍結の最中における氷の結晶核形成および指向性のある成長を制約することが可能である。肉眼による観察で、層状材料のモノリスの組織化における差異が見られる。凍結時における外部磁界の平行な配向で、きわめて脆弱で鉛直に剥離する材料がもたらされた。凍結時における外部磁界の垂直な配向で、より頑強で水平に剥離する材料がもたらされた。外部磁界を用いて、材料における好ましい開裂設計を誘起させることが可能である。
【０１１７】
得られる架橋材料は溶液中において安定であり、マグネタイト粉末とは異なる表面特性を有していた。図５は、通常のマグネタイト粉末と比した足場の低減された表面汚損ポテンシャルを示す。この写真は、２本のチューブを示す。左側のチューブは、１ｍＬの純粋なマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）を２．５ｍｇ／ｍＬで水溶液中に含んでいた。右側のチューブは、１ｍＬの粉砕した磁性足場ＭＯ３２を同様に２．５ｍｇ／ｍＬで水溶液中に含んでいた。溶液中の磁性材料を引きつけるが、チューブの壁面に付着した磁性材料は引きつけないネオジム磁石を中心に配置した。両方のチューブを、２ヶ月にわたって断続的ではあるが等しく撹拌した。左側のチューブは顕著なファウリングを示していた。右側のチューブは事実上ファウリングを示していなかった。
【０１１８】
最も微細なモノリス粉末（サイズ＜１００μｍ）は、容易にピペットが可能であり、または、非特定的な表面吸着による材料または固定化酵素の損失を伴わない液体の移動により取り扱いが可能である。足場の磁化率は、包埋マグネタイトの量、質量および密度に依存する。
【０１１９】
実施例２−生体触媒における磁性足場の使用
粉砕したモノリス材料からの粉末を用いてＢＮＣを固定化し、固定化酵素活性について普通のマグネタイト粉末と比較した。表２に、ＢＮＣ中に固定化した酵素、その固定化効率および有効充填量割合がまとめられている。
【０１２０】
５０％の粉末に鋳型化されたＢＮＣの５０％充填量に係るＢＭＣ酵素担体（粉末上で鋳型化されたＢＮＣ）の合計表面積は約８０ｍ２／１グラムの材料と推定され、ここで、表面の９５％はＢＮＣによるものであり、５％が足場材料による。モノリス粉末上に固定化されるＢＮＣが多いほど、表面積およびメソポーラス体積が大きくなる。
【０１２１】
【表２】
2019514421.tif 000007
【０１２２】
固定化効率は、固定化された酵素の質量対固定化前の酵素の合計初期質量の比率として定義される。有効充填量は、固定化前の酵素の合計初期質量対用いられた磁性足場の合計質量の比率に固定化効率を乗じたものとして定義される。固定化効率は式７に定義されている。
【数４】
2019514421.tif 000008
【０１２３】
有効充填量は式８に定義されている。
【数５】
2019514421.tif 000009
【０１２４】
本テキストにおいては、充填量（修飾語無し）または公称充填量という用語もまた用いられ得る。これらの用語は有効充填量とは異なっており、式９に定義されている。
【数６】
2019514421.tif 000010
式中：
・ｍＩＥは、固定化に成功した酵素の質量である
・ｍＥは、最初に存在する非固定化酵素合計質量である
・ｍＭＰは、用いられたすべての磁性支持体の合計質量である（これは、マグネタイトナノ粒子の質量および適用される場合には二次足場の質量を含む）
・ηＩは、タンパク質定量化が完了した後に判定される固定化効率である
・ＬＥは、有効酵素質量充填量である
・ＬＥ’は、公称酵素質量充填量である
【０１２５】
固定化ニトリラーゼ
ニトリラーゼ（１４の同等のサブユニット（それぞれＭＷ＝４１ｋＤａ、ｐＩ＝８．１））およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣを２０％充填量（ＬＥ’＝０．２）で合成し、次いで、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場または純粋なマグネタイト粉末に鋳型化して、１０％の総有効充填量（ＬＥ＝０．１）のＢＭＣを形成した。最適化した固定化条件では、ニコチン酸の合成に係る非固定化酵素と比して９５％の保持活性がもたらされた。
【０１２６】
材料および試薬。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現された組換えニトリラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０４５２９、バッチ番号ＢＣＢＬ７６８０Ｖ）、３−シアノピラジン、ｏ−フタルジアルデヒド、２−メルカプトエタノール、ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨおよびエタノールをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、塩化アンモニウムおよび水酸化カリウムは、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）製で、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｔｏｃｋｒｏｏｍ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）で購入した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子を、ＺＹＭｔｒｏｎｉｘ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）でインハウス合成し、ならびに、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を既述のとおりに合成した。ストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製した１８．２ＭΩ−ｃｍ水中に形成した。蛍光強度を、底が黒い蛍光マイクロプレートであるＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５中において、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作するＢｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダを用いて計測した。
【０１２７】
方法。凍結乾燥したニトリラーゼを水中に溶解させた。Ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）ストック溶液（７５ｍＭ）を１００％エタノール中に調製し、氷上で維持するか、または、４℃で保管した。２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）ストック溶液（７２ｍＭ）もまた、使用直前に１００％エタノール中に調製した。緩衝ＯＰＡ／２−ＭＥ試薬を、４５０ｍＬの上記の溶液を、９．１ｍＬの２００ｍＭ  ｐＨ９．０  ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ緩衝剤に添加することにより調製した。使用直前まで緩衝試薬を氷上で維持し、使用時に室温（２１℃）と平衡させた。
【０１２８】
ＢＮＣにおけるニトリラーゼ固定化：ニトリラーゼＢＮＣを、ｐＨを１００ｍＭのＨＣｌおよびＮａＯＨで調節した水中のナノ粒子懸濁液および非固定化酵素溶液を用いて合成した。非固定化ニトリラーゼストックを２５０μｇ／ｍＬに希釈し、ｐＨ６に調節した。５ｍＬの１２５０μｇ／ｍＬ  ＮＰ懸濁液を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＢ−５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｎａｔｏｒを、１／４インチのプローブを使用して出力４０％の設定で用い、１分間超音波処理した。十分に分散させたＮＰ懸濁液をｐＨ３に調節した。２０％の公称充填量のＢＮＣ混合物を、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において組み合わせ、反転させて混合した等しい体積の酵素溶液およびＮＰ懸濁液（それぞれ５００μＬ）で形成した。ＢＮＣ混合物を、ロテータで１０分間穏やかに撹拌した。ＢＭＣ足場におけるニトリラーゼＢＮＣ鋳型化：２５μＬの５０ｍｇ／ｍＬの十分に混合したＢＭＣ足場懸濁液（磁性マクロポーラスポリマーハイブリッドまたは単一のマグネタイト粉末）を１ｍＬのＢＮＣ溶液に添加し、次いで、ロテータで穏やかに１時間撹拌して、１０％公称充填量ＢＭＣを形成した。
【０１２９】
ニトリラーゼ反応および活性判定。ニトリラーゼ（ＮＩＴ）反応および活性判定方法は共に、本明細書における参照によりその全体が本明細書において援用されるＢａｎｅｒｊｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７（３）：２８９−２９３（２００３）に記載されている方法の変形に基づいている。簡潔には、ニトリラーゼは、アンモニアを遊離させることにより３−シアノピリジンのニコチン酸への加水分解を触媒した。イソインドール蛍光色素を形成することによりアンモニアを検出して、酵素活性を蛍光定量的に計測した。ニトリラーゼ反応を、５０℃で２３時間、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において、５０ｍＭの３−シアノピリジン、８７．５ｍＭのＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、ｐＨ９．０および２１８ｎＭ非固定化または固定化ニトリラーゼ（ＮＩＴ）を含有する１ｍＬの合計反応体積を用いて実施した。１３．３５μＬの１００ｍＭのＨＣｌを等しい体積のニトリラーゼ反応混合物に添加することにより反応を停止させた。固定化ＮＩＴを磁気的にペレット化し；その上澄みもペレット化後にＨＣｌで処理した。活性を、ニトリラーゼ反応において形成されたアンモニアの定量化により判定した。緩衝試薬（６２４μＬ）を上澄みに添加し、室温で２０分間穏やかに混合した。インキュベーションの後、１５０μＬの１００ｍＭのＨＣｌをこの溶液に添加して蛍光シグナルを増大させた。強度が最も高いウェルと比較してゲインを自動調節しながら、４１２ｎｍの励起、４６７ｎｍの発光を用いて蛍光強度を計測した。各蛍光読み取り値は、内部線形ＮＨ４Ｃｌ検量線（Ｒ２＞０．９９）を含んでいた。ニトリラーゼ活性の単位（Ｕ）は、８７．５ｍＭのＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ（ｐＨ９．０）中において、５０℃で、１分間に遊離された１μｍｏｌ  ＮＨ３と定義した。
【０１３０】
タンパク質定量化。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有量を、線形ＮＩＴ検量線（Ｒ２＞０．９９）を含む、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（１−２）：２４８−２５４（１９７６）に記載の方法を用いて測定した。この手法で非固定化酵素の量を定量化し、これにより、固定化効率および有効充填量の判定を可能とした。
【０１３１】
結果。対照は、触媒されていないアンモニアの遊離はなかったことを示した。ニトリラーゼＢＮＣを、ＢＭＣの有効充填量１０％について固定化効率＞９９％で、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場において鋳型化した。これは、単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）におけるニトリラーゼＢＮＣの鋳型化と匹敵していた。ＢＭＣ足場は、９５％の固定化効率および９．５％の有効充填量を有していた（表２）。ニトリラーゼハイブリッド足場およびマグネタイト粉末ＢＭＣの活性もまた、非固定化ニトリラーゼと比して大部分が保持（＞９５％）されていた（図６Ａ）。
【０１３２】
固定化ω−トランスアミナーゼ
ω−トランスアミナーゼ（ＭＷ＝１９５ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣを２０％充填量（ＬＥ’＝０．２）で合成し、次いで、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場または純粋なマグネタイト粉末において鋳型化して、１０％の総有効充填量（ＬＥ＝０．１）のＢＭＣを形成した。最適化した固定化条件では、（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミンからのアセトフェノンの合成に係る非固定化酵素と比して、９５％の保持活性がもたらされた。
【０１３３】
材料および試薬。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されたマイコバクテリウムバンバアレニイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉ）由来の組換えω−トランスアミナーゼ（ωＴＡ）、（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）、ピルビン酸ナトリウムおよびアセトフェノン（ＡＰ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）製であった。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、水酸化ナトリウムおよびリン酸塩緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）製であった。マグネタイトナノ粒子、ならびに、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場は、既述のとおり合成した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製した１８．２ＭΩ−ｃｍ水中に形成した。吸光度を、透明なマイクロプレートであるＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ中において、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作するＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダを用いて三重に計測した。
【０１３４】
方法。凍結乾燥したωＴＡを水中に溶解させた。（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（ＭＢＡ）ストック溶液を、１２．７８μＬのＭＢＡを１００μＬのＤＭＳＯ中に溶解し、次いで、１０ｍＭの最終濃度となるよう総体積を水で１０ｍＬとすることにより調製した。ピルビン酸ナトリウムの４５ｍＭストックを、ピルビン酸ナトリウム粉末を水中に溶解することにより調製した。アセトフェノンストック溶液を、１２μＬのＡＰを水中に溶解することにより調製した。すべてのストック溶液を氷上で維持した。希釈物をアッセイにおいて使用直前に形成し、室温（２１℃）と平衡させた。
【０１３５】
ω−トランスアミナーゼ活性アッセイ。ωＴＡ活性判定方法は、マイクロプレートに適応されたＳｃｈａｅｔｚｌｅ（２００９）に記載の方法に基づいていた。簡潔には、ωＴＡは、ＭＢＡ（アミンドナー）のピルビン酸塩へのアミノ基の転移を触媒して、それぞれＡＰおよびアラニンを形成した。
【化１】
2019514421.tif 000011
【０１３６】
酵素活性を、ＡＰの形成による２４５ｎｍにおける吸光度の増加により計測した。ωＴＡ反応を、２１℃で１時間、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において、５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．１ｍＭのＭＢＡ、１ｍＭのピルビン酸塩および３４９ｎＭのω−トランスアミナーゼを含有する１ｍＬの合計反応体積を用いて行った。固定化ωＴＡを磁気的にペレット化し、その上澄み吸光度を読み取った。ＡＰを、０〜０．１ｍＭのＡＰおよび０〜０．１ｍＭのアラニン（Ｒ２＞０．９９）を含有する線形検量線を用いて定量化した。１単位（Ｕ）のω−トランスアミナーゼ活性は、２１℃で、５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）中において１分間で形成される１μｍｏｌのＡＰと定義した。
【０１３７】
ＢＮＣにおけるω−トランスアミナーゼ固定化：ωＴＡ  ＢＮＣを、ｐＨを１００ｍＭのＨＣｌおよびＮａＯＨで調節した水中のナノ粒子懸濁液および非固定化酵素溶液を用いて合成した。非固定化ωＴＡを２５０μｇ／ｍＬに希釈し、ｐＨ７．１５に調節した。５ｍＬの１２５０μｇ／ｍＬ  ＮＰ懸濁液を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＢ−５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｎａｔｏｒを、１／４インチのプローブを使用して出力４０％の設定で用い、１分間超音波処理した。十分に分散させたＮＰ懸濁液をｐＨ３に調節した。２０％公称充填量のＢＮＣ混合物を、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において組み合わせ、反転させて混合した等しい体積の酵素溶液およびＮＰ懸濁液（それぞれ５００μＬ）で形成した。ＢＮＣ混合物を、ロテータで１０分間穏やかに撹拌した。
【０１３８】
ＢＭＣ足場におけるω−トランスアミナーゼＢＮＣ鋳型化：２５μＬの５０ｍｇ／ｍＬの十分に混合したＢＭＣ足場懸濁液（磁性マクロポーラスポリマーハイブリッドまたは単一のマグネタイト粉末）を１ｍＬのＢＮＣ溶液に添加し、次いで、ロテータで穏やかに１時間撹拌して、１０％公称充填量ＢＭＣを形成した。
【０１３９】
タンパク質定量化。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有量を、線形ωＴＡ検量線（Ｒ２＞０．９９）を含むＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。この手法で非固定化酵素の量を定量化し、これにより、固定化効率および有効充填量の判定を可能とした。
【０１４０】
対照は、触媒されていないアセトフェノン形成はなかったことを示した。ω−トランスアミナーゼＢＮＣを、ＢＭＣの有効充填量１０％について固定化効率＞９９％で、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場において鋳型化した。磁性マクロポーラス足場の固定化効率は、同等の質量の単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）ＢＭＣ足場よりもはるかに優れていた（＞９９％対６２％のωＴＡ固定化効率および１０％対６．２％の有効充填量）。表２を参照のこと。ω−トランスアミナーゼ磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場およびマグネタイト粉末ＢＭＣの活性は、非固定化ω−トランスアミナーゼと比して大部分が保持されていた（＞９５％）（図６Ｂ）。
【０１４１】
固定化炭酸脱水酵素
ウシ炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＮ）（ＭＷ＝３０ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣを２０％充填量（ＬＥ’＝０．２）で合成し、次いで、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場または純粋なマグネタイト粉末に鋳型化して、９．５％総有効充填量（ＬＥ＝０．０９５）のＢＭＣを形成した。最適化した固定化条件では、重炭酸塩の二酸化炭素への脱水に係る非固定化酵素と比して９６±９％の保持活性がもたらされた。
【０１４２】
材料および試薬。ウシ赤血球由来の炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡまたはＣＡＮ）、ＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨおよび８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホネート（ピラニン）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、塩化アンモニウムおよび水酸化カリウムは、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）製で、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｔｏｃｋｒｏｏｍ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）で購入した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子を、既述のとおりＺＹＭｔｒｏｎｉｘ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）でインハウス合成し、ならびに、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を既述のとおり合成した。ストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製した１８．２ＭΩ−ｃｍ水中に形成した。蛍光強度を、底が黒い蛍光マイクロプレートであるＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３９２５中において、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作する、試薬注入システムを備えたＢｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１プレートリーダを用いて計測した。
【０１４３】
方法。凍結乾燥したＣＡＮを水中に溶解させた。試薬Ａは、２ｍＭのＫＨＣＯ３および０．５ｍＭのＢＩＣＩＮＥ−ＫＯＨ緩衝剤を含有していた（ｐＨ８）。試薬Ｂは、５００ｐＭの炭酸脱水酵素、１００ｎＭのピラニン、および０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝剤を含有していた（ｐＨ６）。
【０１４４】
炭酸脱水酵素活性アッセイ。ＣＡＮは、炭酸の二酸化炭素および水への脱水を可逆的に触媒する。標準的な炭酸脱水酵素活性は、Ｗｉｌｂｕｒ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １７６：１４７−１５４（１９４８））のアッセイを用いて計測した。二酸化炭素からの重炭酸塩の形成により引き起こされる、緩衝ＣＯ２飽和溶液中８．３から６．３へのｐＨの低下速度を計測する。代替的な蛍光定量的なｐＨに基づくアッセイを、Ｓｈｉｎｇｌｅｓ  ＆  Ｍｏｒｏｎｅｙ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５２（１）：７３１−７３７（１９９７））に既述されているとおり用いた。簡潔には、ピラニンが蛍光性ｐＨインジケータとして用いられ；重炭酸塩の脱水によるｐＨ増大が蛍光強度の増大に反映される。この反応は、等しい体積の試薬ＡおよびＢを混合することにより開始した。サンプル注入システムを備えるマイクロプレートウェル中において試薬Ａを試薬Ｂに添加し、蛍光の読み取りを直ぐに開始した。高い反応速度のために、すべてのサンプルの読み取りは、１回に１ウェルずつ、３重に行った。ｐＨ感受性（Ｆｓ）および非感受性（Ｆｉｓ）励起波長（それぞれ４６６ｎｍおよび４１３ｎｍ）を５１２ｎｍ発光波長と共に用いて蛍光を計測した。各プレートに含まれていた緩衝標準（ｐＨ６〜１０）に対するＦｓ／Ｆｉｓ対ｐＨの線形較正曲線を用いて、蛍光強度をｐＨに変換した（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ  ＆  ＭｃＣａｒｔｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６（２）：７３１−３７（１９９４））。１単位（Ｕ）のＣＡＮ活性は、上記の条件下における計測の最初の１０秒間の最中の１秒間当たりのｐＨの変化として定義した。前述の文献は、参照により本明細書においてその全体が援用されている。
【０１４５】
ＢＮＣにおける炭酸脱水酵素固定化：ＣＡＮ  ＢＮＣを、ｐＨを１００ｍＭのＨＣｌおよびＮａＯＨで調節した水中のナノ粒子懸濁液および非固定化酵素溶液を用いて形成した。非固定化ＣＡＮを２５０μｇ／ｍＬに希釈し、ｐＨ６に調節した。５ｍＬの１２５０μｇ／ｍＬ  ＮＰ懸濁液を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＢ−５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｎａｔｏｒを、１／４インチのプローブを使用して出力４０％の設定で用い、１分間超音波処理した。十分に分散させたＮＰ懸濁液をｐＨ１１に調節した。２０％公称充填量のＢＮＣ混合物を、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において組み合わせ、反転させて混合した等しい体積の酵素溶液およびＮＰ懸濁液（それぞれ５００μＬ）で形成した。ＢＮＣ混合物を、ロテータで１０分間穏やかに撹拌した。
【０１４６】
ＢＭＣ足場における炭酸脱水酵素ＢＮＣ鋳型化：２５μＬの５０ｍｇ／ｍＬの十分に混合したＢＭＣ足場懸濁液（磁性マクロポーラスポリマーハイブリッドまたは単一のマグネタイト粉末）を１ｍＬのＢＮＣ溶液に添加し、次いで、ロテータで穏やかに１時間撹拌して、１０％公称充填量ＢＭＣを形成した。
【０１４７】
タンパク質定量化。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有量を、線形ＣＡＮ検量線（Ｒ２＞０．９９）、２．５〜１０μｇ／ｍＬを含むＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。この手法で非固定化酵素の量を定量化し、これにより、固定化効率および有効充填量の判定を可能とした。
【０１４８】
結果。対照は、非特異的な反応によるｐＨの変化はなかったことを示した。ＣＡＮ  ＢＮＣを、ＢＭＣの有効充填量９．５％について、固定化効率９５％で、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場において鋳型化した。これは、９５％の固定化効率および９．５％の有効充填量を有していた（表２）単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）ＢＭＣ足場におけるＣＡＮ  ＢＮＣ足場と匹敵していた。炭酸脱水酵素ハイブリッド足場およびマグネタイト粉末ＢＭＣの活性もまた、非固定化炭酸脱水酵素と比して大部分が保持（＞９５％）されていた（図６Ｃ）。
【０１４９】
固定化ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＭＷ＝４４ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣを５％公称充填量（ＬＥ’＝０．０５）で合成し、次いで、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場または純粋なマグネタイト粉末において鋳型化し、３％の総有効充填量（ＬＥ＝０．０３）のＢＭＣを形成した。最適化した固定化条件では、フェノールと４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）との複合体生成に係る非固定化酵素と比して、活性の４〜５倍の向上がもたらされた。
【０１５０】
材料および試薬。セイヨウワサビ（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）根由来のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フェノールおよび４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。過酸化水素、塩酸、水酸化ナトリウムおよびリン酸塩緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）製であり、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｔｏｃｋｒｏｏｍ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）で購入した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子を、既述のとおりＺＹＭｔｒｏｎｉｘ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）でインハウス合成し、ならびに、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場を既述のとおり合成した。ストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製した１８．２ＭΩ−ｃｍ水中に形成した。吸光度を、透明なマイクロプレートであるＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ中において、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作するＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダを用いて三重に計測した。
【０１５１】
方法。凍結乾燥したＨＲＰを水中に溶解してストック溶液を形成した。１２２ｍＭのリン酸塩−緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝剤、ｐＨ７．４、０．６１ｍＭのフェノールおよび０．６１ｍＭの４−ＡＡＰを水中に含有する新たなＨＲＰ試薬を調製した。この溶液を４℃で保管し、使用直前まで暗中に維持し、使用時に室温と平衡させた。
【０１５２】
ＢＮＣにおけるホースラディッシュペルオキシダーゼ固定化：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ＢＮＣを、ｐＨを１００ｍＭのＨＣｌおよびＮａＯＨで調節した水中のマグネタイトナノ粒子（ＮＰ）懸濁液および非固定化酵素溶液を用いて形成した。非固定化ＨＲＰを２５０μｇ／ｍＬに希釈し、ｐＨ５に調節した。５ｍＬの５０００μｇ／ｍＬ  ＮＰ懸濁液を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＢ−５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを、１／４インチプローブを使用して出力４０％の設定で用い、１分間超音波処理した。十分に分散したＮＰ懸濁液をｐＨ１１に調節した。５％公称充填量のＢＮＣ混合物を、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において組み合わせ、反転により混合した、等しい体積酵素溶液およびＮＰ懸濁液（それぞれ５２５μＬ）で形成した。ＢＮＣ混合物を、ロテータで１０分間穏やかに撹拌した。
【０１５３】
ＢＭＣ足場におけるホースラディッシュペルオキシダーゼＢＮＣ鋳型化：２５０μＬの２．５ｍｇ／ｍＬの十分に混合したＢＭＣ足場懸濁液（磁性マクロポーラスポリマーハイブリッドまたは単一のマグネタイト粉末）を５００ｍＬのＢＮＣ溶液に添加し、次いで、ロテータで穏やかに１時間撹拌して、３％公称充填量ＨＲＰ  ＢＭＣを形成した。
【０１５４】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ活性アッセイ。ＨＲＰは、過酸化水素を開始剤として用いるフェノールおよび４−ＡＡＰの非固定化−ラジカル複合体生成を非可逆的に触媒する。
【化２】
2019514421.tif 000012
【０１５５】
得られる生成物は、λ＝５００ｎｍで顕著な吸光度を示す鮮やかなピンク色−赤色のキノンイミン染料である。標準的なセイヨウワサビ活性アッセイ−Ｅｍｅｒｓｏｎ−Ｔｒｉｎｄｅｒ法の生体触媒形態（４８ｔｈ  Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｗａｓｔｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．４２３−４３０（１９９３）では、フェノール系染料生成物の形成によるλ＝５００ｎｍにおける吸光度の増加速度が酵素活性と相互に関連付けられる。固定化および非固定化ＨＲＰの両方に対するＨＲＰバッチ反応を、２１℃で、３０分間、５ｍＬ遠心分離チューブにおいて、反応を開始するために、最初に５０ｍＭのｐＨ７．４リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．２５ｍＭのフェノール、０．２５ｍＭの４−ＡＡＰ、１５ｎＭのＨＲＰおよび０．３ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する３ｍＬの合計反応体積を用いて行った。バッチ反応は穏やかに撹拌した。指定の時点（１、３、３０分間）で、λ＝５００ｎｍでの吸光度読み取り値を三重で得た。対応する量の固定化および非固定化酵素を含有するブランクも調製して、ＢＭＣおよびバックグラウンド物質の吸光度の寄与を差し引いた。ＢＭＣは反応容器中においてかなり希釈されていたため、ＢＭＣ含有ブランクは、ＰＢＳ中の非固定化酵素および水単独と同じ吸光度を有していた。
【０１５６】
生成物染料を、５００ｎｍでの吸光係数を用いて定量化した（１２ｍＭ−１ｃｍ−１）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｋｅｓｓｅｙ，Ｊ．（１９９４）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ（ＥＣ  １．１．３．１７）．  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ｓｉｇｍａ／Ｅｎｚｙｍｅ＿Ａｓｓａｙ／ｃ５８９６ｅｎｚ．ｐｄｆ．）。ＨＲＰ活性の１単位（Ｕ）は、２１℃で、５０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中において１分間で形成される１ｍｍｏｌのキノンイミン染料として定義した。
【０１５７】
タンパク質定量化。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有量を、線形ＨＲＰ検量線（Ｒ２＞０．９９）、２．５〜２５μｇ／ｍＬを含むＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。この手法で非固定化酵素の量を定量化し、これにより、固定化効率および有効充填量の判定を可能とした。
【０１５８】
結果。対照は、触媒されていない染料形成はなかったことを示した。ＨＲＰ  ＢＮＣを、ＢＭＣの有効充填量３％について固定化効率＞９９％で、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場において鋳型化した。これは、同様に＞９９％の固定化効率および３％の有効充填量を有していた（表２）単一のマグネタイト粉末（５０〜１００ｎｍ）ＢＭＣ足場における鋳型化されたＨＲＰ  ＢＮＣと匹敵していた。ハイブリッド足場およびマグネタイト粉末ＢＭＣにおけるＨＲＰの活性は、非固定化ＨＲＰと比して４〜５倍（４００〜５００％）向上した（図６（ｄ））。
【０１５９】
固定化クロロペルオキシダーゼ
クロロペルオキシダーゼ（ＭＷ＝４２ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣを４％公称充填量（ＬＥ’＝０．０４）で合成し、次いで、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場において鋳型化して、０．８％の総有効充填量（ＬＥ＝０．００８）のＢＭＣを形成した。この固定化条件では、過ヨウ素酸ナトリウム−エピネフリンレポーター反応による判定で、リモネンの（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−（＋）−リモネン−１，２−ジオールへの酸化に係る非固定化酵素と比して酵素活性の１．６倍の向上をもたらした。
【０１６０】
材料および試薬。カルダリオミセスフマゴ（Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ）由来のクロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）は、Ｂｉｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（ＮｏｒｔｈＬｉｂｅｒｔｙ，ＩＡ，ＵＳＡ）から入手した。過酸化水素、塩酸、水酸化ナトリウムおよびリン酸塩緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）製であった。アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の（Ｒ）−リモネン、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、ウシ肝臓由来のカタラーゼ、ジメチルスルホキシドおよびエピネフリンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。Ｄ−グルコースは、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した。ＢＥＲＭＯＣＯＬＬ（登録商標）ＥＨＭ  ３００置換セルロースは、ＡｋｚｏＮｏｂｅｌ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子は、既述のとおり、Ｚｙｍｔｒｏｎｉｘ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）でインハウス合成し、ならびに、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場ＭＯ３２−４０（３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）中の１．８７５ｇの５０〜１００ｎｍマグネタイト、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および３３．７５ｍＬの水、２５０ｍＭのクエン酸と共に架橋）を合成した。ストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製した１８．２ＭΩ−ｃｍ水中に形成した。吸光度を、透明なマイクロプレートであるＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ中において、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作するＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダを用いて三重に計測した。
【０１６１】
方法。濃縮ＣＰＯ溶液を水中で希釈してストック溶液を形成した。ｐＨ６で１００ｍＭのリン酸塩緩衝剤（ＰＢ）、１００ｍＭのグルコース、０．０１６ｍ／ｖ％のＢＥＲＭＯＣＯＬＬ（登録商標）ＥＨＭ  ３００で乳化させた１００ｍＭのリモネン、および、１ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を水中に含有する一次試薬混合物を新たに調製した。４００μＭのＮａＩＯ４および１０ｍＭのＰＢ（ｐＨ６）を含有する二次レポーター混合物を調製し、ならびに、ＨＣｌ−ＮａＩＯ４中に溶解した５ｍＭのエピネフリンおよびエピネフリン溶液を個別に維持した。すべての反応混合物を４℃で保管し、使用直前まで暗中に維持し、使用時に室温と平衡させた。
【０１６２】
ＢＮＣにおけるクロロペルオキシダーゼ固定化：クロロペルオキシダーゼ（ＣＰＯ）ＢＮＣを、水中のマグネタイトナノ粒子（ＮＰ）懸濁液および非固定化酵素溶液を用いて形成した。非固定化ＣＰＯを１００μｇ／ｍＬに希釈した。５ｍＬの２５００μｇ／ｍＬ  ＮＰ懸濁液を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＢ−５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを、１／４インチプローブを使用して出力４０％の設定で用い、１分間超音波処理した。十分に分散したＮＰ懸濁液をｐＨ１１に調節した。４％公称充填量のＢＮＣ混合物を、２ｍＬ遠心分離マイクロチューブ中において組み合わせ、手で反転により３０秒間混合した、等しい体積酵素溶液およびＮＰ懸濁液（それぞれ５５０μＬ）で形成した。
【０１６３】
ＢＭＣ足場におけるクロロペルオキシダーゼＢＮＣ鋳型化：次いで、１ｍＬのＢＮＣ溶液を５ｍｇの磁性ポリマー足場ＭＯ３２−４０に添加し、次いで、１時間渦流に供して０．８％の公称充填量のＣＰＯ  ＢＭＣを形成した。
【０１６４】
クロロペルオキシダーゼ活性アッセイ。ＣＰＯは、過酸化水素を開始剤として用いる、（Ｒ）−リモネンの（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−（＋）−リモネン−１，２−ジオールへの酸化を触媒する。模擬産業プロセスにおける磁性ポリマー足場材料の使用を実際に示すために、比較的高い（５０ｍＭ）濃度のリモネンを用いた。高い過酸化物濃度による過剰量のＣＰＯの失活を回避するために、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）−グルコース系を組み込んで、Ｈ２Ｏ２をインサイツで増加させながら生成した。形成されたジオールを定量化するために、ＮａＩＯ４およびエピネフリン（アドレナリン）を採用する２ステップレポーター反応を組み込んだ。ＮａＩＯ４およびエピネフリンが単独で組み合わされる場合、得られる生成物は、λ＝４９０ｎｍで顕著な吸光度を示す鮮やかなオレンジ色の種であるアドレノクロームである。しかしながら、一次反応混合物中においていくらかのジオールが存在している場合、これは、過ヨウ素酸ナトリウムをヨウ素酸ナトリウムに還元し、エピネフリンに利用可能なＮａＩＯ４の量を低減してしまい、それ故、４９０ｎｍでの吸光度が低下してしまう。実際上、ジオールは、ＮａＩＯ４との反応のためにエピネフリンと「競合」する。一次およびレポーター反応の両方は、共に参照によりそれらの全体が援用される、Ａｇｕｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０（５２）：６４７−６５３（２００８）、および、Ｓｏｒｏｕｒａｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １８：８８３−８８８（１９９８）に記載されているとおりである。
【０１６５】
リモネンに対するＣＰＯ活性は、基質のみの対照と比して、アドレノクローム形成の低減によるλ＝４９０ｎｍでの吸光度の低減と直接的に相互に関連付けられる。固定化および非固定化ＣＰＯの両方のための一次バッチ反応は、２２℃で、２０時間、２ｍＬ遠心分離チューブにおいて、最終濃度の５０ｍＭのｐＨ６リン酸塩緩衝剤、０．００８ｍ／ｖ％のＢＥＲＭＯＣＯＬＬ（登録商標）ＥＨＭ  ３００で乳化させた５０ｍＭのリモネン、５０ｍＭのグルコース、５０ｎＭのＣＰＯ、５ｎＭの非固定化ＧＯＸ、および、０．５ｖ／ｖ％のＤＭＳＯを含有する１ｍＬの合計反応体積を用いて、実施した。バッチ反応および適切な対照を、暗中に１８ｒｐｍで穏やかにタンブルに供した。２０時間で、一次反応混合物を、レポーターステップに係る調製において希釈した。
【０１６６】
形成されたジオールを定量化するために、４００μＭのＮａＩＯ４、１０ｍＭのｐＨ６リン酸塩緩衝剤、０．６ｖ／ｖ％の一次反応混合物および１００ｎＭのカタラーゼ（残留するＨ２Ｏ２をすべて除去するため）からなる２５０μＬのレポーター反応を行った。このレポーター−一次混合物を、１分間反応に供した。次いで、２０μＬの５ｍＭのエピネフリンを、２５０μＬのレポーター−一次混合物毎に添加した。追加の１分後、４９０ｎｍの波長で吸光度を三重に読み取った。酵素活性は、酵素−および基質−非固定化対照および適切な検量線と比して得られるオレンジ色の種（アドレノクローム）の低減により判定した。
【０１６７】
タンパク質定量化。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有量を、線形ＣＰＯ検量線（Ｒ２＞０．９９）、２．５〜２５μｇ／ｍＬを含むＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。この手法で非固定化酵素の量を定量化し、これにより、固定化効率および有効充填量の判定を可能とした。この場合では、０．８％の公称充填量に対してＢＭＣにおける０．８％の有効充填量のＣＰＯが測定され、これは、１００％の酵素捕捉率を示している。
【０１６８】
結果。酵素−非固定化対照は、略２０％（１０ｍＭ）の触媒されていない生成物の形成が存在していたことを示した。このベースラインの変換について補正することで、ハイブリッド足場ＢＭＣにおけるＣＰＯによるリモネンの転換が、非固定化ＣＰＯと比して６０％向上した（図７）。これは、非固定化ＣＰＯに係る２５ｍＭに対する、固定化ＣＰＯに係る約３２ｍＭの合計（ベースライン＋酵素）ジオール形成に変換される。図６Ｄに示されているとおり、ペルオキシダーゼ活性は、より高い安定性およびＨ２Ｏ２による低い阻害のために、非固定化酵素と比して、ＢＭＣについて増大されていると仮定される。
【０１６９】
固定化リパーゼ
リパーゼ（ＭＷ＝４５ｋＤａ）およびマグネタイトナノ粒子を含有するＢＮＣを４０％の公称充填量（ＬＥ’＝０．４０）で合成し、次いで、磁性マクロポーラスポリマーハイブリッド足場に鋳型化して、３．７８％の総有効充填量（ＬＥ＝０．０３８）のＢＭＣを形成した。この固定化条件では、ｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩のｐ−ニトロフェノールおよびラウリン酸塩への分解に係る非固定化酵素と比して、活性の１００％の保持がもたらされた。
【０１７０】
材料および試薬。アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼ（ＬＩＰ）を、Ｉｎｄｏ  Ｗｏｒｌｄ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，Ｉｎｄｉａ）から入手した。塩酸、水酸化ナトリウムおよびリン酸塩緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＣｅｎｔｅｒＶａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）製であった。ｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩、ｐ−ニトロフェノール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジメチルスルホキシドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マグネタイトナノ粒子を、ポリマーハイブリッド足場ＭＯ３２−４０（３．１２５ｍＬの１０％ポリ（ビニルアルコール）中の１．８７５ｇの５０〜１００ｎｍマグネタイト、３．１２５ｍＬの２％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）および３３．７５ｍＬの水、２５０ｍＭのクエン酸と共に架橋）として合成した。ストック溶液を、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）により精製した１８．２ＭΩ−ｃｍ水中に形成した。吸光度を、透明なマイクロプレートであるＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ中において、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウェアで操作するＢｉｏｔｅｋ  Ｅｐｏｃｈ（商標）プレートリーダを用いて三重に計測した。
【０１７１】
ＢＮＣにおけるリパーゼ固定化：粉末化したリパーゼを水中に溶解させ、遠心分離した。上澄みを用いてストック溶液を形成した。リパーゼ（ＬＩＰ）ＢＮＣを、水中のマグネタイトナノ粒子（ＮＰ）懸濁液および非固定化酵素溶液を用いて形成した。非固定化ＬＩＰストックを５００μｇ／ｍＬに希釈し、ｐＨ７．４に調節した。５ｍＬの１２５０μｇ／ｍＬ  ＮＰ懸濁液を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＦＢ−５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを、１／４インチプローブを使用して出力４０％の設定で用い、１分間超音波処理した。十分に分散したＮＰ懸濁液をｐＨ３に調節した。４０％公称充填量のＢＮＣ混合物を、プラスチック製のディープウェルマイクロプレート中において組み合わせ、６０秒間渦流により混合した、等しい体積酵素溶液およびＮＰ懸濁液（それぞれ７５０μＬ）で形成した。
【０１７２】
ＢＭＣ足場におけるリパーゼＢＮＣ鋳型化：次いで、１．５ｍＬのＢＮＣ溶液を６．５６ｍｇの磁性ポリマー足場ＭＯ３２−４０に添加し、次いで、１時間渦流に供して、５％公称充填量ＬＩＰ  ＢＭＣを形成した。
【０１７３】
リパーゼ活性アッセイ。ＬＩＰは、ｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩（または、いずれかの近似する脂肪酸誘導体）のｐ−ニトロフェノールおよびラウリン酸塩への加水分解を触媒する。リパーゼ活性を、参照により本明細書においてその全体が援用されているＧｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１１：９８−９９（２００２）の方法であって、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（１６−炭素脂肪酸）を用いるよう変更した方法によって計測した。遊離されたニトロフェノールを定量化するために、反応をｐＨ４で維持し、吸光度の読み取り値をλ＝３１４ｎｍで得た。このｐＨでは、＞９９％のニトロフェノールがプロトン化形態にあり、これは、約３１４〜３２０ｎｍに最大吸光度を有する明るい黄色の種である。
【０１７４】
ｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩におけるＬＩＰ活性は、λ＝３１４ｎｍでの吸光度の増大に直接的に関連付けられる。固定化および非固定化ＬＩＰの両方に係るバッチ反応を、４５℃で、３０分間、２ｍＬ遠心分離チューブにおいて、最終濃度の１００ｍＭのｐＨ４リン酸塩−緩衝食塩水、０．５ｍＭのｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩、０．５ｍｇ／ｍＬのＬＩＰおよび２．２ｖ／ｖ％のＤＭＳＯを含有する０．２５ｍＬの合計反応体積を用いて行った。バッチ反応および適切な対照を穏やかな渦流に供した。３０分間で、λ＝３１４ｎｍで吸光度の読み取り値を三重に得た。酵素活性を、酵素−および基質−非固定化対照およびｐＨ４での適切なニトロフェノール検量線と比較した。
【０１７５】
タンパク質定量化。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上澄み中のタンパク質含有量を、線形ＢＳＡ検量線（Ｒ２＞０．９９）、２．５〜１０μｇ／ｍＬを含むＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。この手法で非固定化酵素の量を定量化し、これにより、固定化効率および有効充填量の判定を可能とした。この場合、５％の公称充填量に対して、ＢＭＣにおけるＬＩＰの３．７８％の有効充填量が測定され、これは、７５．６％の酵素捕捉率を示している。
【０１７６】
結果。酵素−非固定化対照は略４．２％（２１μＭ）の触媒されていない生成物の形成が存在していたことを示した。このベースラインの変換について補正することで、ハイブリッド足場ＢＭＣにおけるＬＩＰによるｐ−ニトロフェニルラウリン酸塩の転換が、非固定化ＬＩＰと比して保持された（図８）。これは、固定化および非固定化ＣＰＯの両方に係る約１７０μＭの合計（ベースライン＋酵素）ニトロフェノール形成に変換され、これが、ここに記載されている固定化方法および材料は用いられるリパーゼの活性に悪影響を与えないと考えられることを実証している。
【０１７７】
本明細書において開示され、または、参照されているすべての刊行物および特許文献は、参照によりそれらの全体が援用される。前述の記載は、単なる例示および説明を目的とするためになされている。本記載は、本発明を開示されている詳細な形態に限定することは意図していない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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