(57)【要約】  本発明は、生体内持続性、タンパク質安定性、および薬理活性が改善されたＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質およびその用途に関し、具体的には、野生型ＣＣＬ３αまたはＣＣＬ３βのＮ‐末端アミノ酸が欠失し、特定位置のアミノ酸が、野生型ＣＣＬ３αまたはＣＣＬ３β中の同一位置のアミノ酸と異なって置換されたＣＣＬ３変異体および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、およびそのリンパ球減少症、癌治療、または感染治療剤の用途に関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の変異を含むＣＣＬ３変異体と免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質:
（１）野生型ＣＣＬ３のＮ末端から１つまたは２つのアミノ酸が欠失；および
（２）野生型ＣＣＬ３のＮ末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換。
【請求項２】
前記ＣＣＬ３変異体は、野生型ＣＣＬ３αのＮ−末端から１つのアミノ酸が欠失され、Ｎ−末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換されたＣＣＬ３α変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＣＣＬ３変異体は、野生型ＣＣＬ３βのＮ−末端から２つのアミノ酸が欠失され、Ｎ−末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換されたＣＣＬ３β 変異体を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＣＣＬ３変異体は、配列番号２または４で表示される配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＣＣＬ３変異体は、下記式１で表されるリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質:
（ＲＮＴ）ｎＧＲＧＧ（ＥＥＫＫＫ）ｍ    （式１）
前記式中、ｎおよびｍはそれぞれ１〜５である。
【請求項６】
前記リンカーは、配列番号５〜１３番から成る群から選択されるいずれか１つの配列番号で表示される配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤから成る群から選択される一つ以上のＦｃ領域、その断片またはこれらの組み合わせを含むハイブリッドＦｃであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ハイブリッドＦｃは、ＩｇＧ４またはその断片、およびＩｇＤまたはその断片を含むことを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１４で表示される配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１３】
下記のステップを含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質の製造方法:
（ａ）請求項１２に記載の細胞を培養するステップ；および  
（ｂ）前記培養された細胞から融合タンパク質を回収するステップ。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質を含む薬学組成物。
【請求項１５】
癌の治療または予防用であることを特徴とする請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項１６】
放射線治療との併用のための、またはその補助用組成物であることを特徴とする請求項１５に記載の薬学組成物。
【請求項１７】
次の変異を含むＣＣＬ３β（ＣＣ  ｔｙｐｅ  ｌｉｇａｎｄ  ３β）変異体:
（１）野生型ＣＣＬ３βのＮ末端から１つまたは２つのアミノ酸が欠失；およ
（２）野生型ＣＣＬ３βのＮ末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換。
【請求項１８】
配列番号４で表示される配列を含むことを特徴とする請求項１７に記載のＣＣＬ３β変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内持続性、タンパク質安定性、および薬理活性が改善されたＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質およびその用途に関し、具体的には、野生型ＣＣＬ３αまたはＣＣＬ３βのＮ‐末端アミノ酸が欠失し、特定位置のアミノ酸が、野生型ＣＣＬ３αまたはＣＣＬ３β中の同一位置のアミノ酸と異なって置換されたＣＣＬ３変異体および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質、およびそのリンパ球減少症、癌治療、または感染治療剤の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは化学走性を示すサイトカインであって、様々な免疫細胞から分泌され、免疫細胞で発現されるケモカイン受容体と結合して免疫細胞の生体内移動性を促進させる作用をする。中でも、ＣＣＬ３（ＣＣ  ｔｙｐｅ  ｌｉｇａｎｄ  ３）は、マクロファジを始めとする免疫細胞から分泌され、ＣＣＲ１／ＣＣＲ５（ＣＣ  ｔｙｐｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する樹状細胞、Ｔ細胞、単核球、好中球などの免疫細胞の移動性に関与すると知られているケモカインである(Cytokine & Growth Factor Reviews (2002) 13:455-481)。
【０００３】
ＣＣＬ３はＭＩＰ‐１α（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ‐１α）と知られており、マウスの場合は１つの亜型のみが存在するが、ヒトの場合は２つの亜型が存在する(Cytokine & Growth Factor Reviews (2002) 13:455-481)。したがって、マウスと相同性を有するものはα形態（ＬＤ７８αもしくはＣＣＬ３α、以下、ＣＣＬ３α）であり、進化過程中に遺伝子の変異によって生成されたβ形態（ＬＤ７８βもしくはＣＣＬ３β、以下、ＣＣＬ３β）を含む。
【０００４】
従来に、ＣＣＬ３は、マウスの骨髄内の未成熟血液幹細胞の分裂および分化を抑制させ、血中の免疫細胞の濃度を増加させることができると知られている(Nat Rev Immunol.(2006) 6(2):159-64)。そのため、種々の抗癌剤で現れるリンパ球減少症（Ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉａ）の治療のための治療剤のターゲットとして用いられたことがある(Exp. Hematol. (1999) 27:195-202, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002) 13:455-481)。また、血中の樹状細胞の濃度を増加させる効果も有するため、腫瘍特異的抗原を血液に露出させることができる治療法と併用する際に、新しい免疫抗癌剤としての潜在性を有し得ると知られている(Clin Cancer Res. (2008) 14(4):1159-1166, European Journal of Cancer (1998) 34(7):1023-1029)。
【０００５】
一方、ＣＣＬ３は半減期が非常に短く、高濃度で沈殿されるため、生物治療剤として直ちに用いるには適しない。ＣＣＬ３の生体内半減期は、静脈投与時に、ヒトで約１．７時間以内と短い。そのため、ＣＣＬ３を抗癌剤やリンパ球減少症治療剤として開発する場合、毎日投与しなければならないという欠点がある（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９８）３４（７）：１０２３‐１０２９）。また、０．１ｍｇ／ｍＬの低濃度でも、高分子物質の形成によって沈殿が形成されるという欠点がある(Blood. (1995) 86(12):4400-4408)。
【０００６】
そこで、ＣＣＬ３を医薬品または免疫抗癌剤として開発するために、野生型ＣＣＬ３の一部のアミノ酸を置換または除去してＣＣＬ３変異体を製作することや、および／またはＣＣＬ３に高分子または追加タンパク質を融合させて融合タンパク質を製作することが考えられる。高分子または追加タンパク質の融合により、その半減期が増加し得ると知られている。例えば、ヒトアルブミンに活性タンパク質を結合させたり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合されることができる。しかしながら、ヒトアルブミンの結合によっては、その滞留時間が僅かに増加するだけであり、ＰＥＧ結合時には、立体障害によって受容体結合親和力が減少し得るという問題がある。
【０００７】
これを考慮して、近年、免疫グロブリン（Ｉｇ）を用いた融合タンパク質によって生体内半減期を増加させるための研究および開発が試されている。ヒトＩｇ（ｈＩｇ）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどの様々な部類（ｃｌａｓｓ）を含み、ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）、ヒトＩｇＧ２（ｈＩｇＧ２）、ヒトＩｇＧ３（ｈＩｇＧ３）、およびヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）と知られた様々な亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）にさらに分類され得る。
【０００８】
また、免疫グロブリンには４つのポリペプチド鎖が含まれるが、２つの重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎｓ）および２つの軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）が四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）を形成するために二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ）により連結されている。各鎖は可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）および不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み、重鎖の不変領域は、アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅｓ）に応じて３つ（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）または４つ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）の部位にさらに分類され、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインを含む。
【０００９】
かかる技術背景下で、本出願の発明者らは、野生型ＣＣＬ３αまたはＣＣＬ３βのＮ‐末端アミノ酸が欠失し、特定位置のアミノ酸が、野生型ＣＣＬ３αまたはＣＣＬ３β中の同一位置のアミノ酸と異なって置換されたＣＣＬ３変異体および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質の場合、生体内半減期を増加させ、安定性を改善するとともに、薬効向上の効果を奏することができることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記のような問題を解決するために、野生型ＣＣＬ３から一部アミノ酸が置換および欠失されたＣＣＬ３変異体および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供するところにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードする核酸, 前記核酸を含むベクター, および前記ベクターで形質転換された細胞を提供するところにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質の製造方法を提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記融合タンパク質を含む薬学組成物を提供するところにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、野生型ＣＣＬ３βから一部アミノ酸が置換および欠失されたＣＣＬ３変異体を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、次の変異を含むＣＣＬ３変異体と免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質を提供する:（１）野生型ＣＣＬ３のＮ末端から１つまたは２つのアミノ酸が欠失；および（２）野生型ＣＣＬ３のＮ末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換。 
【００１６】
本発明はまた、前記融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。 
【００１８】
本発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記融合タンパク質の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、前記融合タンパク質を含む薬学組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、次の変異を含むＣＣＬ３（ＣＣ  ｔｙｐｅ  ｌｉｇａｎｄ  ３）変異体を提供する::（１）野生型ＣＣＬ３βのＮ末端から１つまたは２つのアミノ酸が欠失；および（２）野生型ＣＣＬ３βのＮ末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換。 
【発明の効果】
【００２２】
本発明によるＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質は、ＣＣＬ３の活性減少が最小化されながらも、免疫原性の危険性が少なく、安定性の問題がないとともに、生体内半減期が増加するため、目的とする薬物動態プロファイルを示すことで、体内持続性、タンパク質の物性、および薬理学的効能が改善されることができることを確認した。前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質を含む薬学組成物は、リンパ球減少症、癌または感染治療剤として使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＴＨＰ‐１細胞株を用いて、ＣＣＬ３変異体融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ４０のインビトロ化学走性を測定したグラフである。
【図２】ＴＨＰ‐１細胞株を用いて、ＣＣＬ３とＣＣＬ３変異体融合タンパク質ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５のインビトロ化学走性を測定したグラフである。
【図３】融合タンパク質のＣＣＲ１受容体に対する反応性を評価するために、ＣＣＲ１が発現されている細胞株を用いて、ＣＣＬ３とＣＣＬ３変異体融合タンパク質ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５およびＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５のインビトロ活性を測定した結果を示したものである。
【図４】マウスにＣＣＬ３変異体融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５を用量毎（３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）に静脈注射した後、１４４時間までの血液サンプルのＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５の血中濃度を測定し、薬物動態パラメータを算出した結果を示したものである。
【図５】ＣＣＬ３変異体融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５のマウス肝癌に対する腫瘍成長抑制効能を確認した結果を示したものである。
【図６】実験例４での薬物処置スケジュールを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２５】
タンパク質の半減期を増加させるための通常の様々な持続型技術のうちＦｃ融合技術は、体内半減期が増加し、且つ毒性や免疫反応誘発などのような副作用の懸念が少ないという点から、最も多く活用されている。Ｆｃ融合ＣＣＬ３および／またはその変異体を持続型治療用薬物として開発するためには、次のような様々な条件を満たさなければならない。
【００２６】
第一に、融合によるインビトロ活性の減少が少なくなければならない。一般に、ケモカインのように小さいタンパク質は、大きさが相対的に大きいＦｃと融合させる場合、融合位置およびリンカーによってその活性が大きく変わると知られている。したがって、ＣＣＬ３および／またはその変異体とＦｃ融合タンパク質の活性は、融合有無または位置によって変わり得る。
【００２７】
第二に、殆どのバイオ医薬品は、患者で免疫原性が発生し得るという点を考慮すると、融合リンカーまたは突然変異による免疫原性の危険性が少なくなければならない。
【００２８】
第三に、融合位置や突然変異の導入による安定性の問題がないべきである。
【００２９】
第四に、融合した免疫グロブリンの種類（ｉｓｏｔｙｐｅ）によっては、不所望の免疫反応を引き起こし得るため、これに対する代案が必要である。
【００３０】
このような条件を考慮して、本出願の発明者らは、ＣＣＬ３の生理学的活性および物性を改善すべく努力した結果、ＣＣＬ３の特定位置に突然変異を導入し、人為的にＮ‐末端アミノ酸を除去して、免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる場合、ＣＣＬ３の活性を高め、且つ生体内露出程度および半減期が増加し、薬理効能が改善されることを確認した。
【００３１】
これに基づき、一観点において、本発明は、次の変異を含むＣＣＬ３（ＣＣ  ｔｙｐｅ  ｌｉｇａｎｄ  ３）変異体と免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質に関する：（１）野生型ＣＣＬ３のＮ末端から１つまたは２つのアミノ酸が欠失；および（２）野生型ＣＣＬ３のＮ末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換。
【００３２】
前記ＣＣＬ３は、樹状細胞およびＴ細胞、単核球、好中球などの免疫細胞の移動性の恒常性において重要な役割をすると知られているケモカインであって、ヒト、マウス、ブタ、サルなどの哺乳類由来のものであってもよい。例えば、ヒトの場合、２つの亜型が存在する。マウスと相同性を有するものはα形態（以下、ＣＣＬ３α）であり、進化過程中に遺伝子の変異によって生成されたβ形態（以下、ＣＣＬ３β）を含む。具体的に、前記野生型ＣＣＬ３は、例えば、配列番号１で表示される配列を含むヒト野生型ＣＣＬ３αまたは配列番号３で表示される配列を含むヒト野生型ＣＣＬ３βタンパク質であってもよい。
【００３３】
具体的に、前記野生型ＣＣＬ３は、例えば、配列番号１で表示される配列を含むヒト野生型ＣＣＬ３αまたは配列番号３で表示される配列を含むヒト野生型ＣＣＬ３βタンパク質であってもよい。 
【００３４】
一実施例において、前記ＣＣＬ３変異体は、配列番号１で表示される配列を含むヒト野生型ＣＣＬ３αのＮ−末端から一番目のアミノ酸であるアラニンが欠失され、Ｎ−末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換されたＣＣＬ３α変異体を含んでもよい。前記ＣＣＬ３α変異体は、例えば、配列番号２で表示される配列を含んでもよい。
【００３５】
さらに他の実施形態において、前記ＣＣＬ３変異体は、配列番号３で表示される配列を含むヒト野生型ＣＣＬ３βのＮ−末端から２つのアミノ酸であるアラニン-プロリン(AP)が欠失され、Ｎ−末端から２７番アミノ酸であるアスパラギン酸がアラニンで置換されたＣＣＬ３β変異体を含んでもよい。 前記ＣＣＬ３β変異体は、例えば、配列番号４で表示される配列を含んでもよい。 
【００３６】
本明細書において使用された「Ｆｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域及び軽鎖の不変領域１（ＣＬ１）を 含まないタンパク質を意味し、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤで構成された群から選択された一つ以上のＦｃ領域 、これの断片またはこれらの組み合わせを含むハイブリッドＦｃであってもよい。
【００３７】
一実施例において、前記ハイブリッドＦｃは、例えば、ＩｇＤヒンジ領域およびＣＨ２  Ｎ‐末端領域＋ＩＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３領域を含んでもよく、例えば、配列番号１４で表される配列を含んでもよい。前記ハイブリッドＦｃとしては、例えば、韓国登録特許第０８９７９３８号に開示のハイブリッドＦｃの形態を同様に借用して使用可能であり、本明細書に参照として組み込まれる。
【００３８】
さらに他の実施形態において、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４で構成された群から選択された一つ以上のＦｃ領域、これの断片またはこれらの組み合わせを含むハイブリッドＦｃであってもよい。
【００３９】
前記Ｆｃ領域は、免疫グロブリンを構成するＦｃ領域全体を含んでもよく、場合によって、これの断片またはＦｃ領域変異体を含んでもよい。一部のアミノ酸が置換されているかまたは、互いに異なる種類のＦｃ領域を組み合わせたＦｃ領域変異体が含まれてもよい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジ部位で切断されることを予防するために変形されてもよい。また、前記Ｆｃのヒンジ配列は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｙｔｙ: ＡＤＣＣ ）または補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ: ＣＤＣ ）を減少させるためにアミノ酸配列の一部が置換されてもよい。また、前記Ｆｃのヒンジ配列は、Ｆａｂ領域の再配列を抑制するためにアミノ酸配列の一部が置換されてもよい。さらに、Ｆｃ領域Ｃ−末端のリシン（Ｋ）は除去されることができる。
【００４０】
また、本発明のＦｃ断片は、野生型糖鎖、野生型に比べて増加された糖鎖、野生型に比べて減少された糖鎖、または糖鎖が除去された形態であってもよい。前記糖鎖の増加、減少、または除去は、化学的方法、酵素的方法、および微生物を用いた遺伝工学的エンジニアリング方法などのような当業界で公知された通常の方法により行われることができる。
【００４１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＣＬ３変異体がＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に直接連結された形態であってもよく、リンカーを介して連結された形態であってもよい。前記免疫グロブリンＦｃ領域がＣＣＬ３変異体と直接連結された形態である場合、例えば、本発明は、配列番号２のＣＣＬ３α変異体または配列番号４のＣＣＬ３β変異体が配列番号１４のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に連結された形態であってもよい。ＣＣＬ３とＦｃの 連結形態は、ＣＣＬ３がＦｃ領域 のＮ末端に連結された形態が好ましい。
【００４２】
リンカーを介して連結される場合、前記リンカーは、Ｆｃ断片のＮ末端、Ｃ末端、または遊離基（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ）に連結されてもよく、ＣＣＬ３変異体のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に連結されてもよい。リンカーがペプチドリンカーである場合、任意の部位で連結がなされてもよい。例えば、前記リンカーが前記免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端および前記ＣＣＬ３変異体のＮ末端に連結されてもよい。 
【００４３】
リンカーおよびＦｃが別に発現されてから互いに結合される際に、リンカーは、当業界に公知の架橋剤であってもよい。前記架橋剤は、例えば、１、１-ビス (ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン)(1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane)、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)、４-アジドサリチル酸(4-azidosalicylic acid)のようなＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(N-hydroxysuccinimide ester)、３、３'- ジチオビス (スクシンイミジルプロピオン酸) (3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))のようなスクシンイミジルエステル(disuccinimidyl esters)を含むイミドエステル (imidoesters), およびビス-Ｎ-マレイミド-１、８-オクタンのような2官能性マレイミド(bifunctional maleimides)であってもよいが、これに限定されない。 
【００４４】
また、前記リンカーはペプチドであってもよい。具体的に、前記リンカーは１０〜３０個のアミノ酸残基で構成されたペプチドであってもよい。一実施例において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、下記式１で表されるリンカーを介してＣＣＬ３変異体に連結されてもよい:
（ＲＮＴ）ｎＧＲＧＧ（ＥＥＫＫＫ）ｍ    （式１）
前記式中、ｎおよびｍはそれぞれ１〜５である。前記式中、ｎは、アルギニン‐アスパラギン‐トレオニンアミノ酸の繰り返し回数、ｍは、グルタミン酸‐グルタミン酸‐リジン‐リジン‐リジンアミノ酸の繰り返し回数を表し、ｎおよびｍはそれぞれ１〜３であることが好ましい。
【００４５】
一実施例において、前記リンカーは、ｎおよびｍそれぞれが１〜３であってもよいことを考慮して、配列番号５〜１３番で構成された群から選択されたいずれか１つの配列を含んでもよい。
【００４６】
本発明に係具体的な実施例では、RNTGRGGEEKKK (配列番号５)の配列を含むリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域がＣＣＬ３変異体と連結された構造を含む。実験例によると、配列番号５で表示される配列を含むリンカーを介して免疫グロブリンＦｃに結合されたＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質が優れた化学走性を有することを確認した。
【００４７】
前記融合タンパク質は、１つ以上のＣＣＬ３変異体が結合された形態である二量体または多量体ＣＣＬ３変異体が免疫グロブリンのＦｃ領域に結合された形態であってもよい。また、ＣＣＬ３変異体が結合された免疫グロブリンのＦｃ領域が２つ以上結合された二量体または多量体の形態であってもよい。
【００４８】
他の観点において、本発明は、前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【００４９】
前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸を分離してＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質を組換え的に産生することができる。核酸を分離して、これを複製可能なベクター内に挿入して追加でクローニングしたりまたは追加で発現させる。これを基に、さらに他の観点において、本発明は前記核酸を含むベクターに関する。
【００５０】
本明細書で使われる用語「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有して、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明のＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸の配列は変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【００５１】
本発明の核酸は、前記ヌクレオチド配列に対し実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。実質的な同一性とは、本発明の核酸配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合、最小８０％の相同性、より好ましくは９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性を示す核酸配列を意味する。
【００５２】
前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質をコードする ＤＮＡは、通常の過程を使用して容易に分離または合成する。
【００５３】
本発明で使用する用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段として、プラスミドベクター; コスミドベクター; バクテリオファージベクター; およびアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。許容可能なベクターの成分には、一般に信号配列、複製基点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、および転写終結配列中の一つ以上が含まれるが、それに制限されない。
【００５４】
前記ベクターでＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動的に連結されている。
【００５５】
用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味して、これによって前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または、解読を調節するようになる。
【００５６】
使用されるベクターが原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５ プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、 ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど)、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、ベクターが真核細胞を宿主とする場合には、ほ乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）またはほ乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）ウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００５７】
場合により、ベクターは、それから発現されるＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(Pharmacia, USA) 、マルトース結合タンパク質（NEB, USA）、FLAG(IBI, USA) および6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 等がある。 
【００５８】
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常使用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。 
【００５９】
さらに他の観点においで、本発明は、上述したベクターで形質転換された細胞に関する。前記細胞は原核生物、酵母または 高等真核生物細胞であってもよいが、これに制限されない。
【００６０】
本発明において、前記形質転換された細胞として、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチルスおよびバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトミセス（Streptomyces）、 シュードモナス(Pseudomonas) （例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）, プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)またはスタフィロコッカス(Staphylococcus)（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス) (Staphylocus carnosus)のような原核宿主細胞を利用することができる。 
【００６１】
但し、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、COS-7、BHK、 CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK, TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20SまたはＨＴ１０８０であってもよいが、これに制限されない。
【００６２】
さらに他の観点においで、本発明は、（ａ）前記細胞を培養するステップと（ｂ）前記培養された細胞から融合タンパク質を回収するステップと、を含む、ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質の製造方法に関する。
【００６３】
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地から制限せず培養培地を使用することができる。当業者に公示されているその他いずれの必須補充物が適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、発現のために選別された宿主細胞と共にすでに使用されていて、これは当業者に明白である。
【００６４】
前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質の回収は、例えば遠心分離または、限外ろ過によって不純物を除去して、その結果を、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを利用して精製することができる。さらにその他の精製技術、例えば陰イオンまたは、陽イオン交換クロマトグラフィー、疏水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。
【００６５】
さらに他の観点においで、本発明は、前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質 を含む薬学組成物に関する。
【００６６】
前記薬学組成物は、治療有効量のＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含んでもよい。「薬学的に許容される担体」とは、製剤を製剤化または安定化させることを助けるために活性成分に追加できる物質であって、患者に有意な有害毒性効果を引き起こさない。
【００６７】
前記担体は、患者を刺激せずに投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００６８】
薬学的に許容される担体は、滅菌注射可能な溶液剤または分散液剤を即時投与用（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）に製造するための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。製薬活性物質のためのこのような媒質および作用剤の使用は、当業界に公知されている。組成物は、好ましくは、非経口注射用として製剤化される。組成物は、溶液剤、マイクロエマルション剤、リポソーム剤、または高い薬物濃度に適したその他の要求される構造物として製剤化されることができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒質であってもい。一部の場合において、組成物中に、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含ませてもよい。滅菌注射可能な溶液剤は、必要量の活性化合物を、必要に応じて前記記載の成分の１種またはこれらの組み合わせ物とともに、好適な溶媒中に組み込んだ後、滅菌マイクロ濾過を行うことで製造されることができる。一般に、分散液剤は、活性化合物を、基本的な分散媒質および上記に記載のものからのその他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことで製造される。滅菌注射可能な溶液剤を製造するための滅菌粉末の場合、一部の製造方法は、活性成分、および任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌‐濾過したその溶液から生成する真空乾燥および冷凍‐乾燥（凍結乾燥）である。
【００６９】
また、本発明は、前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質を含むＣＣＬ３-関連障害の治療または予防用組成物、または治療が必要な個体にＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質を投与することを含むＣＣＬ３-関連障害を治療または予防する方法に関する。 
【００７０】
前記ＣＣＬ３-関連障害は、例えば、リンパ球減少症、各種癌、感染症を含むことができる。本発明によるＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質は、放射線の照射により誘発された癌細胞の死滅反応と連携して、免疫機能の活性化による癌組織および／または癌細胞の死滅を誘導することができる。これに基づき、一実施例において、癌治療または予防のための放射線治療の併用または補助用組成物であってもよい。
【００７１】
前記放射線としては、例えば、ガンマ線またはＸ線が挙げられ、これに制限されないが、０．１〜５０Ｇｙの線量で照射してもよく、好ましくは０．１〜１０Ｇｙの線量で照射してもよい。前記放射線の照射量は、放射線の副作用による免疫低下などを考慮して適切な範囲内で調節可能である。
【００７２】
前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質は、如何なる経路で投与されてもよい。例えば、直接的（例えば、組織部位に注入、移植、または局部的に投与することで、局所的に）またはシステム的（例えば、非経口または経口）に任意の適切な手段により動物に提供されることができる。
【００７３】
静脈内、皮下、眼（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、腹腔内、筋肉内、口腔、直腸、眼窩内（ｉｎｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）、脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ）、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）、脊髄内（ｉｎｔｒａｓｐｉｎａｌ）、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）、またはエアゾール投与のように非経口的に提供される場合、例えば、水性（ａｑｕｅｏｕｓ）であるか、生理学的に適用可能な体液懸濁液または溶液の部分を含んでもよい。これにより、担体または伝達体（ｖｅｈｉｃｌｅ）が生理学的に許容可能であるため、融合タンパク質に添加して患者に伝達されることができる。したがって、製剤のための体液のような担体として、一般に生理食塩水を含んでもよい。
【００７４】
投与頻度は、用いられる製剤中のＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質の薬動学的パラメータによって変わり得る。典型的に、臨床医は、目的とする効果を達成する投与量に達するまで投与することができる。したがって、単一用量で、時間間隔をあけて２回以上の用量（同一量の目的融合タンパク質を含有しても含有しなくてもよい）で、または移植装置もしくはカテーテルによる連続注入で投与されてもよい。適切な投与量のさらなる高精度化は当業者により日常的になされるものであって、彼らによって日常的に行われる業務領域内に該当する。
【００７５】
単位投与量は、ヒトにおいて、０．０１μｇ／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇであり、具体的に、１μｇ／体重ｋｇ〜３０ｍｇ／体重ｋｇである。前記含量が最適量であるが、治療対象疾患および副作用の有無によって変わり得て、最適の投与量は、通常の実験により決定されることができる。融合タンパク質の投与は、周期的なボーラス投与（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｂｏｌｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）によって行われてもよく、外側供給源（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）（例えば、静脈注射保有バック（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｂａｇ））または内側（例えば、生体侵食性インプラント（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ  ｉｍｐｌａｎｔ））からの持続的な静脈内、皮下、または腹膜内投与によって行われてもよい。
【００７６】
投与頻度は状態の重症度によって変わる。頻度は、１週当たり３回〜毎１週または２週毎に１回の範囲であってもよい。
【００７７】
場合によって、前記ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質は、他の生物学的活性分子とともに対象受容体に投与されてもよい。しかし、融合タンパク質および他の分子の最適の組み合わせ、投与形態、定量は、当業界で公知された通常の実験により決定されることができる。
【００７８】
本発明で用いられ「治療有効量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、本発明によるＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質の量を意味する。正確な量は、治療組成物の成分および物理的特徴、意図された患者集団、個々の患者の考慮事項などを含んで決定されるが、これに制限されずに多くの因子によって変わり得て、当業者が容易に決定することができる。これらの要因を完全に考慮すると、副作用なしに最大効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要で、この服用量は、当該分野の専門家によって容易に決定されることができる。
【００７９】
本発明の薬剤学的組成物の服用量は、特に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含んだ多様な要因により変わる。組成物は一日に１回量または、多数回容量でラット、ネズミ、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許された経路、例えば、経口に、直腸に、静脈に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）または脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与されてもよい。
【００８０】
さらに他の観点においで、本発明は、次の変異を含むＣＣＬ３（ＣＣ  ｔｙｐｅ  ｌｉｇａｎｄ  ３）変異体に関する:
（１）野生型ＣＣＬ３βのＮ末端から１つまたは２つのアミノ酸が欠失；およ
（２）野生型ＣＣＬ３βのＮ末端から２７番アスパラギン酸がアラニンで置換。
【００８１】
一実施例において、前記ＣＣＬ３変異体は、例えば、配列番号４で表示されるの配列を含んでもよい。本発明のＣＣＬ３β変異体は上述の構成を同様に含み、重複構成についての説明は、ＣＣＬ３β変異体に関する発明にも同様に適用される。
【００８２】
本発明で用いられる技術用語および科学用語は、特に定義されない限り、この発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を有する。また、従来と同一の技術的構成および作用についての繰り返される説明は省略する。
【００８３】
実施例
以下、本発明を具体的な実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、本発明は下記実施例によって限定されず、本発明の思想と範囲内で様々な変形または修正が可能であることは、通常の技術者にとって自明である。
【００８４】
製造例１．ＣＣＬ３変異体を含む融合タンパク質の製造および精製
ＣＣＬ３‐Ｆｃ構造において、ＣＣＬ３の物性、活性プロファイルを改善させるために、ＣＣＬ３に対する突然変異の研究を行った。
【００８５】
具体的に、ＣＣＬ３タンパク質のα形態（以下、ＣＣＬ３α）とβ形態（以下、ＣＣＬ３β）の活性差が、Ｆｃ融合後にも維持されるかを調べるために変異体を考案した。また、Ｆｃ融合タンパク質形態でＣＣＬ３の沈殿形成を抑制するために、２７番のアスパラギン酸をアラニンで置換した変異体を考案した。
【００８６】
下記表１に、ＣＣＬ３に導入された突然変異の位置、配列情報、目的、および各突然変異の期待効果をまとめた。
【００８７】
【表１】
2019516363.tif 000003
【００８８】
３つの構成要素は、Ｎ‐末端からＣ‐末端に、ＣＣＬ３変異体、リンカー、および融合キャリアの順に発現されるように発現ベクターにアミノ酸をコードした。下記表２に、ＣＣＬ３変異体融合タンパク質の記号、ＣＣＬ３に導入された突然変異配列、融合キャリア配列、リンカー配列をまとめた。
【００８９】
【表２】
2019516363.tif 000004
【００９０】
ＣＣＬ３変異体融合タンパク質を生産するために、各ＣＣＬ３変異体融合タンパク質のアミノ酸配列に基づき、それをコードするヌクレオチド配列を（株）バイオニア社（韓国）に依頼して合成した。各ＣＣＬ３変異体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５´末端と３´末端にそれぞれＮｈｅＩとＮｏｔＩ制限酵素配列を添加し、５´末端の制限酵素配列の後に、タンパク質翻訳のための開始コドンと、発現されたタンパク質を細胞の外に分泌させる誘導配列を挿入した。各ＣＣＬ３変異体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の後には終止コドンを挿入した。ＮｈｅＩとＮｏｔＩの２つの制限酵素配列を用いて、各ＣＣＬ３変異体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列をｐＴｒａｎｓ‐ｅｍｐｔｙ発現ベクターにクローニングした。前記ｐＴｒａｎｓ‐ｅｍｐｔｙ発現ベクターはＣＥＶＥＣ社（ドイツ）から入手し、ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ由来複製起源、ＳＶ４０由来複製起源、アンピシリン耐性遺伝子を有する簡単な構造の発現ベクターである。
【００９１】
製造例１‐２．ＣＣＬ３変異体融合タンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡの製作
製造例１‐１で製作した各発現ベクターを大腸菌に形質転換することで、発現に用いられる多量のプラスミドＤＮＡを得た。各発現ベクターは、細胞壁が弱化した大腸菌中に熱ショックにより形質導入し、ＬＢプレートに塗抹してコロニーを確保した。確保されたコロニーをＬＢ培地に接種した後、３７℃で１６時間培養することで、各発現ベクターを細胞中に有する大腸菌をそれぞれ１００ｍＬずつ確保した。確保された大腸菌は、遠心分離により培養培地を除去した後、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３溶液（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ＃  １２９６３）を添加して細胞壁を破砕し、タンパク質とＤＮＡを分離したＤＮＡ混濁液を確保した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製カラムを用いて、確保したＤＮＡ混濁液からプラスミドＤＮＡを精製した。溶出されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により確認し、ナノドロップ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）を用いて濃度および純度を測定した後、発現に用いた。
【００９２】
製造例１‐３．ＣＡＰ‐Ｔ細胞で融合タンパク質の発現
製造例１‐２で分離した各プラスミドＤＮＡでヒト細胞株を形質転換した。ＰＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養中のＣＡＰ‐Ｔ細胞（ＣＥＶＥＣ）に、ＰＥＩ溶液(Polyplus, Cat# 101-10N)を用いて各プラスミドＤＮＡを形質導入した。ＤＮＡとＰＥＩ溶液の混合液を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（インビトロジェン社）を用いて懸濁した細胞に混合し、３７℃で５時間培養した後、ＰＥＭ培地を添加した。３７℃で５‐７日間培養した後、遠心分離により細胞を除去することで、ＣＣＬ３変異体融合タンパク質が含まれた上清を確保した。
【００９３】
製造例１‐４．ＣＣＬ３変異体融合タンパク質の精製
ＣＣＬ３変異体融合タンパク質を含む培養上清から０．２μｍフィルターにより不純物を除去した後、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液で平衡化した。１ＸＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液でカラムを洗浄した後、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）緩衝液でタンパク質を溶出した。アフィニティクロマトグラフィーにより得たＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５融合タンパク質（配列番号１５）はハイドロキシアパタイトタイプＩ(Ceramic Hydroxyapatite type I, 40 μM, Bio-rad)、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５融合タンパク質（配列番号１６）およびＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ４０融合タンパク質（配列番号１７）はハイドロキシアパタイトタイプＩＩカラムを用いて精製した。ハイドロキシアパタイトカラムを２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．２）緩衝液で平衡化した後、アフィニティクロマトグラフィーで溶出されたＣＣＬ３変異体融合タンパク質をローディングした。具体的に、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）緩衝液でカラムを洗浄し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）緩衝液を濃度勾配で流した後、溶出された分画を分析した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ）実験法を用いて各分画を分析し、高純度のＣＣＬ３変異体融合タンパク質が存在する部分を集めた後、最終緩衝液１ＸＰＢＳで４℃で一晩透析した。３０，０００分子量カットオフの遠心分離フィルターを用いて、透析後に得られたタンパク質原液を３０００ｒｐｍ、４℃で濃縮した。ＣＣＬ３変異体融合タンパク質の濃度はＢＣＡ定量分析により測定した。
【００９４】
実験例１．融合タンパク質のインビトロ活性測定結果
実験例１‐１．リンカー配列による活性測定結果
上記の製造例で製造されたＣＣＬ３変異体融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ４０のインビトロ活性を測定した。
【００９５】
具体的に、融合タンパク質のインビトロ活性を評価するために、ＣＣＬ３の収容体であるＣＣＲ１とＣＣＲ５が発現されているＴＨＰ‐１細胞株（ＡＴＣＣ）を用いた。活性を評価するために、製造例で得られた融合タンパク質が含まれた濃縮物を、分析用培地を用いて１００μｇ／ｍＬの濃度から２倍系列希釈して準備し、ＴＨＰ‐１細胞株は、分析用培地に交替した後、５，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して準備した。ポリカーボネートトレンスウェルシステムを用いて、下側のウェルには、希釈した融合タンパク質６００μＬを処理し、上側のインサートには、希釈したＴＨＰ‐１細胞株１００μＬを処理した後、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで反応させた。２４時間後にインサートを除去した後、トリパンブルー溶液で染色し、移動した細胞個数を細胞計数器を用いて測定した。活性は、分析用培地のみを処理した対照群の細胞数に対する最多移動細胞数の増加量を計算して比較し、その結果を図１に示した。
【００９６】
図１に示されたように、リンカーによる活性測定の結果、融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５が、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ４０に比べて化学走性に優れていることが確認された。
【００９７】
実験例１‐２．ＣＣＬ３変異体による活性測定結果
上記の製造例で製造された配列番号１５の配列を含む融合タンパク質ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５、配列番号１６の配列を含む融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５のインビトロ活性を測定した。
【００９８】
具体的に、製造例で得られた融合タンパク質が含まれた濃縮物を、実験例１‐１と同様の方法により融合タンパク質の化学走性を測定し、その結果は図２に示した。
【００９９】
実験例１‐３．ＣＣＬ３変異体による活性測定結果
上記の製造例で製造された配列番号１５の配列を含む融合タンパク質ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５、配列番号１６の配列を含む融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５のインビトロ活性を測定した。
【０１００】
具体的に、融合タンパク質の受容体ＣＣＲ１に対する反応性を評価するために、ＣＣＬ３の収容体であるＣＣＲ１が発現されているＴａｎｇｏＴＭ  ＣＣＲ１‐ｂｌａ  Ｕ２ＯＳ  ＤＡ細胞株および分析用キット(Invitrogen, Cat# K1793)を用いた。活性を評価するために、ＴａｎｇｏＴＭ  ＣＣＲ１‐ｂｌａ  Ｕ２ＯＳ  ＤＡ細胞株を基本培地(FreeStyleTM Expression Medium)で３１２，５００ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈して準備し、３８４ウェルプレート(Corning, Cat# 3712)に３２μＬ添加した後、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで１６〜２４時間保管した。製造例で得られた融合タンパク質が含まれた濃縮物を、分析用培地(0.5% DMSO in FreeStyleTM Expression Medium)を用いて処理濃度より５倍高いＣＣＬ３は１０μＭ、ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５は２５μＭから２倍系列希釈して準備した。準備した融合タンパク質を、細胞のあるウェルに８μＬずつ添加し、実際の濃度がＣＣＬ３は２μＭ、ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５は５μＭから２倍系列希釈された融合タンパク質が処理されるようにし、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで５時間反応させた。分析用キットに含まれている溶液を用いて６Ｘ基質混合液(6 μL of 1 mM LiveBLAzerTM-FRET B/G (CCF4-AM) Substrate + 60 μL of solution B + 904 μL of Solution C + 30 μL of Solution D)を製造した後、融合タンパク質を処理した３８４ウェルプレートに８μＬずつ添加し、常温で２時間反応させた。マイクロプレートリーダー(Moluecular devices, Flexstation 3)で測定し、反応した細胞と反応しなかった細胞との比率 (Blue/Green Emission ratio)を計算した。その結果を図３に示した。
【０１０１】
図３に示されたように、ＣＣＬ３は０．６３ｎＭ、ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５は１６．０ｎＭ、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５は１１．６ｎＭ水準のＣＣＲ１受容体反応性を確認した。
【０１０２】
実験例２．融合タンパク質の物性評価
実験例２‐１．安定性評価の実験方法
サンプルの初期状態でのタンパク質凝集体の量を測定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ）方法を用いて高分子量凝集体の含量（％ＨＭＷ）を測定した。
【０１０３】
具体的に、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ方法では、東ソー（Ｔｏｓｏｈ）モデルＴＳＫ‐ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いた。緩衝液１ＸＰＢＳをカラムに１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流して平衡化させた。３０，０００分子量カットオフの遠心分離フィルターを用いて、製造例１‐４で得られたＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５タンパク質原液を３０００ｒｐｍ、４℃で９．５ｍｇ／ｍＬ以上の標的濃度に濃縮した。ＢＣＡ定量分析により各サンプルの濃度を測定した後、安定性の評価のために、試料を−７０℃で５週間保管した。高分子量凝集体の比率（％ＨＭＷ）を測定するために、９．５７ｍｇ／ｍＬのサンプルを１ＸＰＢＳで希釈して１ｍｇ／ｍＬとなるようにした後、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣカラムに１００μＬを注入して分析した。
【０１０４】
その結果、表３に示されたように、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５は、％ＨＭＷが低いことが確認された。これは、Ｄ２７Ａ突然変異が導入されることにより、Ｆｃ融合によって妨害されることなくＣＣＬ３変異体融合タンパク質の物性が改善され、％ＨＭＷが大幅で減少したのである。
【０１０５】
【表３】
2019516363.tif 000005
【０１０６】
表３に示されたように、保管初期（保管０日）での％ＨＭＷは、保管５週経過時に、−７０℃の条件で増加せずに維持される様相を示した。これは、突然変異にかかわらず、融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５の安定性が維持されることを示す。
【０１０７】
実験例３．融合タンパク質の薬動力学測定
実験例３‐１．薬動力学測定の実験方法
（株）オリエントバイオ（Ｏｒｉｅｎｔ  ＢＩＯ、韓国）で購入した７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、薬物処理日の前日に、体重の平均値がほぼ等しくなるように群分け（採血時間当たりｎ＝３）した後、サンプルをそれぞれ３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈投与した。血液サンプルは、０．０８３、０．５、１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、および１４４時間後に収集した。融合タンパク質の血中濃度を測定するために、本試験では、ＣＣＬ３に対して免疫反応性を有するＨｕｍａｎ  ＣＣＬ３／ＭＩＰ‐１α  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ(R&D systems, Cat# SMA00)を用いた。マウスに各融合タンパク質を静脈注射した後、１４４時間までの血液サンプルのＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５の血中濃度を測定し、薬物動態パラメータを算出した。
【０１０８】
実験例３‐２．薬動力学活性測定結果
マウスに融合タンパク質を静脈投与した後、時間による血中濃度グラフ（図４）に基づいて薬物動態パラメータを算出し、下記表４に示した。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
薬物の露出程度を表すＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ）を基準として、融合タンパク質の薬動力学プロファイルを比較評価した。
【０１１１】
表４に示されたように、ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５を３、１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈投与した時に、略用量に比例して体内露出度が増加した。また、クリアランス（ＣＬ）と分布容積（Ｖｄｓｓ）は、用量毎に大きく変わらず、３〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲でｌｉｎｅａｒ  ＰＫを示すことが確認された。ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５の半減期（ｔ１／２）は、３、１０ｍｇ／ｋｇの用量毎にそれぞれ２０．４ｈｒ、４５．６ｈｒであって、ＣＣＬ３の半減期（ヒトに静脈投与時に１．７ｈｒ以内）に比べて約１２〜２７倍増加することが確認された。一般に、マウスでの半減期がヒトでの半減期よりも短いことを考慮すると、マウスでＣＣＬ３の半減期に対するＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５の半減期の増加幅はさらに大きいと予想される。
【０１１２】
実験例４．マウスにおける融合タンパク質の活性評価
実験例４‐１．ＢＮＬ  １ＭＥ  Ａ．７Ｒ．１肝癌同種移植マウスでの坑癌効能の実験方法
（株）オリエントバイオ(Orient BIO, Korea)で購入した６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１週間の馴化期間を経てマウス肝癌細胞株であるＢＮＬ  １ＭＥ  Ａ．７Ｒ．１（ＡＴＣＣ）１Ｘ１０７細胞を右後足に注入した。腫瘍の体積が１２０‐１５０ｍｍ３になった時点に、腫瘍体積がほぼ等しくなるように群分けした。各試験群および薬物処置スケジュールは、それぞれ表５および図６のとおりである。薬物の腫瘍成長抑制効能を観察するために、薬物処理最初日から３‐４日毎にカリパス（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて腫瘍の体積を測定した（腫瘍の体積＝長軸Ｘ（短軸）２／２）。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
実験例４‐２．ＢＮＬ  １ＭＥ  Ａ．７Ｒ．１肝癌同種移植マウスでの坑癌効能評価結果
上記の製造例で製造された配列番号１５の配列を含む融合タンパク質ＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５、配列番号１６の配列を含む融合タンパク質ＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５のＢＮＬ  １ＭＥ  Ａ．７Ｒ．１マウス肝癌に対する腫瘍成長抑制効能を確認した。図５に示されたように、放射線照射時点から約１ヶ月後に、６．５Ｇｙの放射線照射のみを実施した群に比べて、１０ｍｇ／ｋｇのＣＣＬ３Ａ‐Ｈ０５を併用処理した群で約２５％の腫瘍成長抑制効能を示し、１０ｍｇ／ｋｇのＣＣＬ３Ｂ‐Ｈ０５を併用処理した群で約７２％の腫瘍抑制効能を示した。
【０１１５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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