(57)【要約】  特定の態様において、ANGPT2および/またはPDGFB発現を阻害し、したがって、癌、AMD、およびDMEなどの血管新生関連疾患を処置するのに有用であるRNA複合体(例えば、asiRNAまたは細胞浸透性asiRNAなどの非対称性RNA複合体)が本明細書で提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ANGPT2 mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端とが平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項２】
PDGFB mRNA配列に対する配列相補性を有する少なくとも19ヌクレオチド(nt)長のアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する15〜17nt長のセンス鎖を含むRNA複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の5'末端と前記センス鎖の3'末端とが平滑末端を形成している複合体を形成する、RNA複合体。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が19〜21nt長である、請求項１又は２に記載のRNA複合体。
【請求項４】
前記アンチセンス鎖が19nt長である、請求項１又は２に記載のRNA複合体。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が20nt長である、請求項１又は２に記載のRNA複合体。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が21nt長である、請求項１又は２に記載のRNA複合体。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖が少なくとも24nt長である、請求項１又は２に記載のRNA複合体。
【請求項８】
前記センス鎖が15nt長である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項９】
前記センス鎖が16nt長である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項１０】
前記センス鎖が17nt長である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のRNA複合体。
【請求項１１】
前記センス鎖が、表1、表2、表3、表4、表5及び表6に列挙されているアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、請求項１〜１０のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１２】
前記アンチセンス鎖が、表1、表2、表3、表4、表5及び表6に列挙されているアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、請求項１〜１０のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１３】
前記RNA複合体が細胞によるANGPT2発現を阻害することができる、請求項１及び３〜１２のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１４】
前記RNA複合体が細胞によるPDGFB発現を阻害することができる、請求項２〜１２のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１５】
前記細胞がSK-N-SH細胞である、請求項１３に記載のRNA複合体。
【請求項１６】
前記細胞がA549細胞である、請求項１４に記載のRNA複合体。
【請求項１７】
前記RNA複合体が化学修飾を含む、請求項１〜１６のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項１８】
前記化学修飾が2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合又は疎水性部分である、請求項１７に記載のRNA複合体。
【請求項１９】
前記RNA複合体が疎水性部分を有する、請求項１８に記載のRNA複合体。
【請求項２０】
前記疎水性部分がコレステロール部分である、請求項１９記載のRNA複合体。
【請求項２１】
前記コレステロール部分が、前記センス鎖の3'末端に結合している、請求項２０に記載のRNA複合体。
【請求項２２】
前記RNA複合体が2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項１８に記載のRNA複合体。
【請求項２３】
前記2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖の3'末端に位置する、請求項２２に記載のRNA複合体。
【請求項２４】
前記センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項２３に記載のRNA複合体。
【請求項２５】
前記2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記アンチセンス鎖の3'末端に位置する、請求項２２に記載のRNA複合体。
【請求項２６】
前記アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項２５に記載のRNA複合体。
【請求項２７】
2'-O-メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖の3'末端及び前記アンチセンス鎖の3'末端に位置する、請求項２２に記載のRNA複合体。
【請求項２８】
前記センス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含み、前記アンチセンス鎖の3'末端領域が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む、請求項２７に記載のRNA複合体。
【請求項２９】
前記RNA複合体がホスホロチオエート結合を含む、請求項１７〜２８のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項３０】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３１】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３２】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３３】
前記RNA複合体の前記センス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３４】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３５】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも50%がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３６】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも75%がホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３７】
前記RNA複合体の前記アンチセンス鎖内のリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載のRNA複合体。
【請求項３８】
前記RNA複合体が、表2、表3、表5及び表6に記載されている修飾RNA複合体である、請求項１７に記載のRNA複合体。
【請求項３９】
前記RNA複合体が送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過できる、請求項２９〜３８のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項４０】
前記RNA複合体が細胞毒性ではない、請求項1〜３９のいずれか1項に記載のRNA複合体。
【請求項４１】
細胞によるANGPT2又はPDGFB発現を阻害する方法であって、前記細胞と、請求項1〜４０のいずれか１項に記載のRNA複合体とを接触させることを含む方法。
【請求項４２】
前記細胞がA549細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞がSK-N-SH細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記腫瘍細胞がヒト対象における腫瘍中に存在するものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記がヒト対象の眼に存在するものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載のRNA複合体を投与することを含む、対象における血管新生関連疾患を阻害する方法。
【請求項４８】
血管新生関連疾患が癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
癌が固形腫瘍を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記血管新生関連疾患がAMDである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記AMDがウェット型AMDである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記AMDがドライ型AMDである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記血管新生関連疾患がDMEである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
RNA複合体が送達ビヒクルなしで投与される、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
RNA複合体が腫瘍内に投与される、請求項４８〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
RNA複合体が対象の眼に投与される、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
対象における癌を治療する方法であって、請求項１〜４０のいずれか1項に記載のRNA複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５８】
RNA複合体が送達ビヒクルなしで投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
RNA複合体が腫瘍内投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
RNA複合体が静脈内投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
さらに、第２の癌治療剤を投与することを含む、請求項５７〜６０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６２】
第２の癌治療剤が化学療法剤である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
第２の癌治療剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
対象におけるAMD又はDMEを治療する方法であって、請求項１〜４０のいずれか1項に記載のRNA複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６５】
前記AMDがウェット型AMDである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記AMDがドライ型AMDである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
RNA複合体を前記対象の眼に投与することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
RNA複合体が眼球内に（例えば硝子体に）投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
RNA複合体が送達ビヒクルなしで投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
RNA複合体が非経口投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
請求項１〜３９のいずれか1項に記載のRNA複合体及び製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項７２】
対象における血管新生を阻害する方法であって、請求項７１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項７３】
対象における癌を治療する方法であって、前記対象に請求項７１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７４】
対象における腫瘍に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記医薬組成物を腫瘍内投与することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
さらに、癌治療用の第２の薬剤を投与することを含む、請求項７３〜７５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７７】
第２の薬剤が化学療法剤である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
第２の薬剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
医薬組成物を非経口投与することを含む、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
医薬組成物を経口投与することを含む、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
対象が前記医薬組成物を自己投与する、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
請求項７１に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるAMD又はDMEを治療する方法。
【請求項８３】
対象がAMDを有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記AMDがウェット型AMDである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記AMDがドライ型AMDである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
対象がDMAを有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
対象の眼に前記医薬組成物を投与することを含む、請求項８２〜８６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８８】
前記医薬組成物が点眼薬である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記医薬組成物を眼球内（例えば硝子体に）投与することを含む、請求項８２〜８８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９０】
前記医薬組成物を非経口投与することを含む、請求項８２〜８６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９１】
前記医薬組成物を経口投与することを含む、請求項８２〜８６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象が前記医薬組成物を自己投与する、請求項８２〜９１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９３】
さらに、AMD治療用の第２の薬剤を投与することを含む、請求項８２〜８８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９４】
さらに、DME治療用の第２の薬剤を投与することを含む、請求項８２〜８８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２の薬剤がラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、又はアフィベルセプトである、請求項９３又は９４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2016年2月2日に出願された米国特許仮出願第62/290,330号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明はANGPT2およびPDGFBを標的化するRNA複合体を用いる血管新生関連疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、新しい血管の増殖を説明するために使用される用語である。血管の増殖(growth)および増殖(proliferation)は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。一例は、腫瘍発達であり、そこでは、腫瘍内の血管の発達により、腫瘍が酸素および栄養素へのアクセスの増加により増殖することができ、腫瘍生存を増大させ、腫瘍転移を容易にする。血管新生の標的化は、癌を処置するための有望な経路である。
【０００４】
眼における血管新生は通常、眼への十分な酸素および他の必要な栄養素の供給において重要な役割を果たす。しかしながら、過剰かつ異常な血管発達が起こる場合、滲出型加齢黄斑変性（ウェット型AMD）および糖尿病性黄斑浮腫（DME)などの眼疾患が誘導されることがあり、一部の症例では、失明さえもたらし得る。
【０００５】
加齢黄斑変性(AMD)は、眼の黄斑に並ぶ網膜色素上皮の変性の結果生じる疾患であり、失明をもたらす。黄斑は、眼の背部に並ぶ光感受性組織から構成される網膜における小さい領域であり、中心視野において重要な役割を果たす。AMDは、世界中で失明の主要な原因の1つである。AMDは、「滲出型」および「萎縮型」で生じる。滲出型AMDは、網膜における異常な血管増殖の結果である。滲出型AMDでは、血管内皮増殖因子(VEGF)の量の増加がこの新血管形成に寄与し、したがって、治療選択肢は、VEGF阻害剤の使用を含む。しかしながら、VEGF阻害剤で処置された多くの患者は、処置の数年以内に、後期萎縮型黄斑変性の主要な症状である、地図状萎縮(GA)を発症する。糖尿病性黄斑浮腫(DME)は、黄斑内の血管からの流体の漏出のために糖尿病における網膜の膨張の結果生じる疾患である。糖尿病患者における血液循環不良は、網膜における新しい血管の発達を促進し、網膜浮腫は、厚い、または弱い血管壁を有する血管の漏出をもたらし得る。DMEは、糖尿病を有する患者における失明の主因であり、糖尿病患者の10%が黄斑浮腫に罹患する。
【発明の概要】
【０００６】
ある特定の態様においては、ANGPT2(アンギオポエチン2)またはPDGFB(血小板由来増殖因子ベータ)を標的とし、AMD(例えば、滲出型AMD)、DME、および癌などの血管新生関連疾患を処置および/または防止するのに有用であるRNA複合体が本明細書で提供される。ある特定の態様においては、血管新生を阻害するRNA複合体が本明細書で提供される。ある特定の態様においては、そのようなRNA複合体を含む医薬組成物ならびにそのようなRNA複合体および医薬組成物を使用する方法が本明細書で提供される。
【０００７】
ある特定の態様においては、ANGPT2またはPDGFB mRNA配列と相補的な配列を有するアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖と相補的な配列を有するセンス鎖とを含むRNA複合体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態においては、RNA複合体は、細胞によるANGPT2またはPDGFB発現を阻害することができる。いくつかの実施形態においては、RNA複合体は、非対称性低分子二本鎖干渉RNA(asiRNA)である。いくつかの実施形態においては、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、または表6に列挙されるRNA複合体である。いくつかの実施形態においては、本明細書に提供されるRNA複合体は、改変が送達ビヒクルの非存在下で細胞膜の浸透を容易にする化学的改変を含む。いくつかの実施形態においては、改変は、2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合または疎水性部分である。いくつかの実施形態においては、コレステロール部分である。いくつかの実施形態においては、RNA複合体は、表2、表3、表5、または表6に列挙される改変されたRNA複合体である。ある特定の実施形態においては、RNA複合体は、細胞傷害性ではない。
【０００８】
ある特定の態様においては、本明細書で提供されるRNA複合体と、製薬上許容し得る担体とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。ある特定の実施形態においては、医薬組成物は、非経口送達のために製剤化される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、経口送達のために製剤化される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、静脈内送達のために製剤化される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、硝子体内送達のために製剤化される。他の実施形態においては、医薬組成物は、点眼剤として製剤化される。
【０００９】
ある特定の態様においては、細胞と、本明細書で提供されるRNA複合体とを接触させることを含む、細胞によるANGPT2またはPDGFB発現を阻害する方法が本明細書で提供される。
【００１０】
ある特定の態様においては、ヒト被験者に、本明細書で提供されるRNA複合体または医薬組成物を投与することを含む、被験者におけるANGPT2またはPDGFBの遺伝子発現を阻害する方法が本明細書で提供される。ある特定の態様においては、細胞と、本明細書で提供されるRNA複合体とを接触させることを含む、ヒト被験者における血管新生を阻害する方法が本明細書で提供される。ある特定の態様においては、被験者に、本明細書で提供されるRNA複合体または医薬組成物を投与することを含む、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、または癌などの血管新生関連疾患についてヒト被験者を処置する方法が本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ANGPT2を標的とする100種の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。SK-N-SH細胞に、0.1nMのasiRNAをトランスフェクトした。
【図２】ANGPT2を標的とする27種の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図３】ANGPT2を標的とする14種の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図４】ANGPT2を標的とする14種の例示的なasiRNAによるANGPT2タンパク質発現の阻害を示す図である。
【図５】様々な化学的改変が施された例示的なANGPT2標的化細胞浸透性asiRNA(cp-asiRNA、またはcp-asiANGPT2)の遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図６】例示的なcp-asiRNAによるANGPT2 mRNA発現の阻害を示す図である。
【図７】例示的なcp-asiRNAによるANGPT2タンパク質発現の阻害を示す図である。
【図８】異なるアンチセンス鎖長(19または21ヌクレオチド)を有する6種のcp-asiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図９】6種の例示的なcp-asiRNAによるANGPT2タンパク質発現の阻害を示す図である。
【図１０−１】ヒトANGPT2変異体1のmRNA配列を示す図である。
【図１０−２】図１０−１の続きである。
【図１０−３】図１０−１の続きである。
【図１１】PDGFBを標的とする100種の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図１２】PDGFBを標的とする22種の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図１３】PDGFBを標的とする12種の例示的なasiRNAの遺伝子サイレンシング効率を示す図である。
【図１４】PDGFBを標的とする12種の例示的なasiRNAのPDGFBタンパク質発現の阻害を示す図である。
【図１５】例示的なcp-asiRNAによるPDGFB mRNA発現の阻害を示す図である。
【図１６】例示的なcp-asiRNAによるPDGFBタンパク質発現の阻害を示す図である。
【図１７】異なるアンチセンス鎖長(19もしくは21ヌクレオチド)または化学的改変を有する11種のcp-asiRNAのPDGFBタンパク質発現の阻害を示す図である。
【図１８】ヒトPDGFB変異体2のmRNA配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
総論
【００１３】
特定の態様において、本明細書に記載されるのは、ANGPT2またはPDGFBを阻害し、そのため血管新生関連疾患、例えばAMD（例えばウェット(滲出)又はドライ(乾燥)型AMD）、DME、及び癌の治療に有用となる、非対称RNA複合体（たとえば、asiRNAまたはcp-asiRNA）である。いくつかの実施形態において、RNA複合体は、トランスフェクション媒体を必要とせずに、細胞に透過できるように化学的に修飾される。いくつかの実施形態では、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5、または表6に記載のRNA複合体である。特定の態様において、このようなRNA複合体を含む医薬組成物、ならびにそのようなRNA複合体および医薬組成物を使用する方法が本明細書に記載される。
【００１４】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体はasiRNAまたはcp-asiRNAである。本明細書中で用いるasiRNAなる語は、19〜21nt(ヌクレオチド)のアンチセンス鎖と13〜17ntのセンス鎖とを有する二本鎖で非対称のより短い二重小分子干渉RNA分子を意味する。asiRNAに関する追加的情報は、米国特許公開第2012/0238017号およびChangら, Mol. Ther. 17:725-732(2009)(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に見ることができる。  
【００１５】
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、送達ビヒクル、例えばリポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマーを使用して細胞に送達される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、細胞におけるANGPT2またはPDGFBの阻害を媒介するのに、そのような送達ビヒクルの使用を必要としないよう化学修飾される。そのようなRNA複合体は、本明細書において細胞透過性asiRNA(cp-asiRNA)と称される。
【００１６】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここに集める。
【００１７】
本明細書で用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の対象物の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例えば、「an」要素は1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００１８】
本明細書中で用いる「投与する」なる語は、医薬物質または医薬組成物を対象に与えることを意味し、医療従事者による投与および自己投与を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本明細書中で用いる「免疫調節剤（免疫調節薬）」とは、免疫系を弱める、刺激する、又は他の態様で調節する化合物又は組成物をいう。例としては、ロイコトリエン受容体アゴニスト、免疫抑制剤（例えばFK-506）、又はサイトカインが挙げられるがこれに限らない。
【００２０】
本明細書中で用いる「干渉核酸」及び「抑制性核酸」は互換的に用いられる。干渉核酸は、一般に、一連の環状サブユニットを含み、それらサブユニットはそれぞれが塩基対形成部分を有し、ワトソン-クリック塩基対形成により核酸(典型的にはRNA)中の標的配列にその塩基対形成部分がハイブリダイズして標的配列内で核酸:オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にするサブユニット間結合により、連結されている。干渉RNA分子には、アンチセンス分子、siRNA分子、asiRNA分子、cp-asiRNA分子、一本鎖siRNA分子、miRNA分子およびshRNA分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような干渉核酸は、mRNAの翻訳を遮断または阻害するように、あるいは天然プレmRNAスプライスプロセシングを阻害するように、あるいは標的化mRNAの分解を誘導するように設計してもよく、それがハイブリダイズする標的配列に対して「指向性である」または「標的化されている」と称されうる。干渉核酸には、例えば、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、2'-O-メチルオリゴヌクレオチドおよびRNA干渉物質(siRNA物質)が含まれうる。RNAi分子は、一般に、標的分子とヘテロ二重鎖を形成することによって作用し、それは選択的に分解又は「ノックダウン」され、それにより標的RNAを不活性化する。幾つかの条件下、干渉RNA分子は、転写物の翻訳を抑止することおよび/または転写物の転写を阻害することにより、標的転写物を不活性化することも可能である。干渉核酸は、より一般的には、前記のようにして標的の核酸に対して標的化されている場合、タンパク質のような生体関連標的に対して「標的化されている」と言われる。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」なる語は互換的に用いられる。それらは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれであれ、任意の組合せおよび任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を果たしうる。以下のものはポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析から定められる遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合には、重合体の構築の前または後で施されうる。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合(コンジュゲート化)によって、さらに修飾されうる。本明細書に記載されている全ての核酸配列において、U核酸塩基はT核酸塩基と交換可能である。
【００２２】
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体（製薬上許容される単体）」なる語は、医薬上許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化材を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる障害又は疾患を「予防」する医薬（治療剤）とは、当該障害又は疾患の発病（発症）前に統計サンプルに投与されたときに、未処置の対照サンプルと比較して当該処置されたサンプルにおける該障害又は疾患の発生を低減するか、或いは未処置の対照サンプルと比較して該障害又は疾患の1以上の症状の重度（重症度）を低減する化合物をいう。
【００２４】
オリゴヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」と言えるのは、そのオリゴマーが、生理的条件下で、45℃より実質的に高い、または少なくとも50℃、または少なくとも60℃〜80℃またはそれを超えるTmで標的にハイブリダイズする場合である。そのようなハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に相当する。所与のイオン強度およびpHにおいて、Tmは、標的配列の50%が相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。さらに、そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対してアンチセンスオリゴマーの厳密な相補性を有する場合だけでなく、「近い」または「実質的な」相補性を有する場合にも生じうる。
【００２５】
本明細書中で用いる「対象（被験体）」なる語は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【００２６】
本明細書中で用いる「治療的有効量」および「有効量」なる語は、いずれかの医学的治療に適用可能な合理的な利益/リスク比で対象中の細胞の少なくとも亜集団において所望の治療効果を得るのに有効な物質の量を意味する。
【００２７】
対象における疾患の「治療」または疾患を有する対象の「治療」は、疾患の少なくとも1つの症状を軽減させ、またはその悪化を防止するように、医薬的治療、例えば薬物の投与、を対象に対して施すことを意味する。
【００２８】
RNA複合体
特定の態様において、ANGPT2及び／又はPDGFB mRNAを標的とし、細胞によるANGPT2及び／又はPDGFB 発現をそれぞれ阻害するRNA複合体を本発明において提供する。一部の実施形態において、細胞はA549細胞である。別の実施形態において、細胞はSK-N-SH細胞である。一部の実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。ヒトANGPT2及びPDGFB mRNAの核酸配列は、それぞれ、図１０及び図１８に提供する。
【００２９】
特定の態様において、ANGPT2及び／又はPDGFB mRNA配列(例えば、ヒトANGPT2及び／又はPDGFB mRNA配列)に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖及びアンチセンス鎖と配列相補性を有するセンス鎖を含むRNA複合体を、本発明において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、細胞によるANGPT2及び／又はPDGFB発現を抑制（阻害）することができる。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNA(asiRNA)である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表1、表2、表3、表4、表5または表6に列挙されているRNA複合体である。本明細書に記載されているRNA複合体はRNA塩基、非RNA塩基またはRNA塩基と非RNA塩基との混合を含有しうる。例えば、本発明で提供する特定のRNA複合体は主にRNA塩基から構成されうるが、DNA塩基または非天然ヌクレオチドをも含有しうる。
【００３０】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は少なくとも19ヌクレオチド(nt)長である。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は19〜21nt長(すなわち、19、20または21ntの長さ)である。幾つかの実施形態においては、少なくとも13、14、15、16、17、18、19、20又は21ntのアンチセンス鎖は、ANGPT2又はPDGFB mRNA配列と相補的である。完全な相補性は必要ではない。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、ANGPT2又はPDGFB mRNA配列と完全に相補的である。
【００３１】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は少なくとも24nt長(例えば、少なくとも25nt長、少なくとも26nt長、少なくとも27nt長、少なくとも28nt長、少なくとも29nt長、少なくとも30nt長または少なくとも31nt長)である。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は124nt長以下(例えば、100nt長以下、90nt長以下、80nt長以下、70nt長以下、60nt長以下、50nt長以下または40nt長以下)である。幾つかの実施態様においては、アンチセンス鎖は31nt長である。幾つかの実施形態においては、少なくとも16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、29、30又は31ntのアンチセンス鎖は、ANGPT2又はPDGFB mRNA配列と相補的である。完全な相補性は必要ではない。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、ANGPT2又はPDGFB mRNA配列と完全に相補的である。
【００３２】
幾つかの実施形態においては、センス鎖は15〜17nt長(すなわち、15nt長、16nt長または17nt長)である。幾つかの実施形態においては、センス鎖の少なくとも15nt、少なくとも16ntまたは少なくとも17ntがアンチセンス鎖の配列に相補的である。幾つかの実施形態においては、センス鎖はアンチセンス鎖の配列に完全に相補的である。
【００３３】
幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端とセンス鎖の3'末端が平滑末端を形成している複合体を形成している。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の5'末端がセンス鎖の3'末端に(例えば、1、2、3、4または5nt)突出している複合体を形成している。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、センス鎖の5'末端がアンチセンス鎖の3'末端に(例えば、1、2、3、4または5nt)突出している複合体を形成している。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖及び/又はセンス鎖は、表1、表2、表3、表4、表5、又は表6に列挙されている配列から選択されるセンス鎖配列及び/又はアンチセンス鎖配列を有する。
【００３５】
幾つかの実施形態においては、本発明において提供するRNA複合体は化学修飾を含み、該修飾は送達ビヒクルの非存在下、細胞膜の透過を促進する。
【００３６】
幾つかの実施形態においては、該修飾は2'-O-メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合または疎水性部分である。一部の実施形態において、本明細書に提供されるRNA複合体は、疎水性部分を有する。一部の実施形態において、疎水性部分は、疎水性の特性を有する任意の化学構造のものであり得る。例えば、一部の実施形態において疎水性部分は脂質、脂肪親和性ペプチド及び／又は脂肪親和性タンパク質である。一部の実施形態において、疎水性部分は脂質、例えばコレステロール、トコフェロール、又は10以上の炭素原子を有する長鎖脂肪酸（例えばステアリン酸若しくはパルミチン酸）である。一部の実施形態において、疎水性部分はコレステロールである。一部の実施形態において、疎水性部分はコレステロール部分である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、表2、表3、表5、又は表6に列挙されている修飾RNA複合体である。特定の実施形態においては、RNA複合体は細胞毒性ではない。  
【００３７】
本明細書に記載されているRNA複合体は種々のオリゴヌクレオチド化学物質を用いうる。オリゴヌクレオチド化学物質の例には、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、ホスホロチオエート、2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドおよびモルホリノ化学(前記のいずれかの組合せを含む)が含まれるが、これらに限定されるものではない。一般に、PNA化学はより短い標的化配列を用いることが可能である。なぜなら、それらは、2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドと比べて比較的高い標的結合強度を有するからである。ホスホロチオエート骨格を有する2'O-Me-修飾オリゴヌクレオチドを作製するために、しばしば、ホスホロチオエートと2'O-Me-修飾化学物質とが組み合わされる。例えば、PCT公開番号WO/2013/112053およびWO/2009/008725(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)を参照されたい。
【００３８】
ペプチド核酸(PNA)は、ピリミジンまたはプリン塩基が結合しているN-(2-アミノエチル)グリシン単位からなる、デオキシリボース骨格と構造的に同形の骨格を有するDNAの類似体である。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含有するPNAは、ワトソン-クリック塩基対形成規則に従い、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識の点でDNAを模倣する。PNAの骨格はホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により形成されており、これにより、それらはアンチセンス用途に好適なものとなる(後記の構造を参照されたい)。骨格は非荷電であるため、通常より大きな熱安定性を示すPNA/DNAまたはPNA/RNA二重鎖が生じる。PNAはヌクレアーゼまたはプロテーゼによっては認識されない。
【００３９】
天然構造に対する根本的な構造変化にかかわらず、PNAはヘリックス形態でのDNAまたはRNAへの配列特異的結合が可能である。PNAの特徴には、相補的DNAまたはRNAに対する高い結合アフィニティ、一塩基ミスマッチによって引き起こされる不安定化効果、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する抵抗性、塩濃度に無関係なDNAまたはRNAとのハイブリダイゼーション、ならびにホモプリンDNAとの三重鎖形成が含まれる。PANAGENE.TMは、それが独占所有するBts PNAモノマー(Bts; ベンゾチアゾール-2-スルホニル基)、および独占所有するオリゴマー化法を開発している。Bts PNAモノマーを使用するPNAオリゴマー化は脱保護、カップリングおよびキャッピングの反復サイクルから構成される。PNAは、当技術分野で公知のいずれかの技術を用いて合成的に製造される。例えば、米国特許第6,969,766号、第7,211,668号、第7,022,851号、第7,125,994号、第7,145,006号および第7,179,896号を参照されたい。また、PNAの製造に関しては、米国特許第5,539,082号、第5,714,331号および第5,719,262号を参照されたい。PNA化合物の更なる教示はNielsenら, Science, 254:1497-1500, 1991に見出されうる。前記のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００４０】
干渉核酸は「ロックド核酸」サブユニット(LNA)をも含みうる。「LNA」は、架橋核酸(BNA)と称される修飾クラスのメンバーである。BNAは、C3-エンド(ノーザン)糖パッカー(pucker)中のリボース環のコンホメーションを固定する共有結合により特徴づけられる。LNAの場合、架橋は2'-Oおよび4'-C位間のメチレンから構成される。LNAは骨格の予備構成および塩基スタッキングを増強して、ハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増強する。
【００４１】
LNAの構造は、例えば、Wengelら, Chemical Communications (1998) 455; Tetrahedron (1998) 54:3607およびAccounts of Chem. Research (1999) 32:301; Obikaら, Tetrahedron Letters (1997) 38:8735; (1998) 39:5401およびBioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230に見出されうる。本発明で提供する化合物は1以上のLNAを含むことが可能であり、幾つかの場合には、該化合物はもっぱらLNAから構成されうる。個々のLNAヌクレオシドサブユニットの合成およびオリゴヌクレオチド内へのそれらの組込みのための方法は、例えば、米国特許第7,572,582号、第7,569,575号、第7,084,125号、第7,060,809号、第7,053,207号、第7,034,133号、第6,794,499号および第6,670,461号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。典型的なサブユニット間リンカーはホスホジエステルおよびホスホロチオエート部分を含み、あるいは、非リン含有リンカーが使用されうる。1つの実施形態は、各LNAサブユニットがDNAサブユニットによって分離されているLNA含有化合物である。ある化合物は、交互LNAおよびDNAサブユニットから構成され、この場合、サブユニット間リンカーはホスホロチオエートである。
【００４２】
特定の実施形態においては、RNA複合体はコレステロール部分に連結されている。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はセンス鎖の3'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はアンチセンス鎖の3'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はセンス鎖の5'末端に結合している。幾つかの実施形態においては、コレステロール部分はアンチセンス鎖の5'末端に結合している。
【００４３】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体は2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。2'-O-メチル化ヌクレオシドはリボース分子の2'-OH残基にメチル基を含む。2'-O-Me-RNAはRNAと同じ(または類似した)挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解に対して保護されている。2'-O-Me-RNAは更なる安定化のためにホスホチオアートオリゴヌクレオチド(PTO)とも組み合わされうる。2'-O-Me-RNA(ホスホジエステルまたはホスホチオアート)は当技術分野における通常の技術に従い合成されうる(例えば、参照により本明細書に組み入れるYooら, Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004を参照されたい)。
【００４４】
幾つかの実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドはセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内の2、3、4、5または6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、2'-O-メチルヌクレオシドはアンチセンス鎖の3'末端に位置する。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖の3'末端領域は複数の2'-O-メチル化ヌクレオシド(例えば、3'末端の6ヌクレオシド内の2、3、4、5または6個の2'-O-メチル化ヌクレオシド)を含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖の3'末端領域とアンチセンス鎖の3'末端領域との両方が複数の2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、センス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2、3、4、5、6、7または8個の2'-O-メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2'-O-メチル化ヌクレオシドを含む。幾つかの実施形態においては、アンチセンス鎖は、未修飾ヌクレオシドと交互に存在する2、3、4、5、6、7または8個の2'-O-メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。
【００４５】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体はホスホロチオエート結合を含む。「ホスホロチオエート」(またはS-オリゴ)は、非架橋酸素の1つが硫黄により置換されている通常のDNAのバリアントである。ヌクレオチド結合間の硫化は、5'から3'へのおよび3'から5'へのDNA POL 1エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼS1およびP1、RNアーゼ、血清ヌクレアーゼならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドおよびエキソヌクレアーゼの作用を低減する。ホスホロチオエートは2つの基本的経路により、すなわち、ホスホン酸水素に対する二硫化炭素中の元素硫黄の溶液の作用により、またはテトラエチルチウラムジスルフィド(TETD)または3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシド(BDTD)のいずれかで亜リン酸トリエステルを硫化する方法により得られる(例えば、Iyerら, J. Org. Chem. 55, 4693-4699, 1990を参照されたい)。後者の方法はほとんどの有機溶媒における元素硫黄の不溶性および二硫化炭素の毒性の問題を回避する。また、TETDおよびBDTD法はより高い純度のホスホロチオエートを与える。
【００４６】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%はホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００４７】
幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%はホスホロチオエート結合である。幾つかの実施形態においては、RNA複合体のアンチセンス鎖におけるリボヌクレオチド間の結合の全てがホスホロチオエート結合である。
【００４８】
本明細書に記載されているRNA複合体を細胞と接触させ、または生物(例えば、ヒト)に投与することが可能である。あるいは、RNA複合体をコードする構築物および/またはベクターを細胞または生物と接触させ、あるいは細胞または生物内に導入することが可能である。ある実施形態においては、ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用する。
【００４９】
本明細書に記載されているRNA複合体は、当技術分野で公知の任意の適当な方法により製造されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体は化学合成またはインビトロ転写により製造される。
【００５０】
医薬組成物：
ある特定の態様においては、本明細書で提供されるRNA複合体と、薬学上許容し得る担体とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。ある特定の実施形態においては、医薬組成物は、眼への送達(例えば、点眼剤または注射可能な埋込み体もしくは溶液として)のために製剤化される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、静脈内送達のために製剤化される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、腫瘍内送達のために製剤化される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、腫瘍内投与される。いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、経口または非経口送達のために製剤化される。
【００５１】
いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、AMDまたはDMEの処置のための第2の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態においては、第2の薬剤は、ラニビズマブ（ranibizumab）である。いくつかの実施形態においては、第2の薬剤は、ペガプタニブ（pegaptanib）である。いくつかの実施形態においては、第2の薬剤は、アフィベルセプ（afibercept）トである。いくつかの実施形態においては、第2の薬剤は、ベバシズマブ（bevacizumab）である。
【００５２】
いくつかの実施形態においては、医薬組成物は、癌の処置のための第2の薬剤をさらに含む。ある特定の実施形態においては、第2の治療剤は、化学療法剤、例えば、シクロホスファミド(CTX;例えば、CYTOXANφ)、クロラムブシル(CHL;例えば、LEUKERAN(登録商標))、シスプラチン(Cis P;例えば、PLATINOL(登録商標))、ブスルファン(例えば、MYLERAN(登録商標))、メルファラン、カルムスチン(BCNU)、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン(TEM)、マイトマイシンCなどの、アルキル化剤またはアルキル化作用を有する薬剤; メトトレキサート(MTX)、エトポシド(VP16;例えば、VEPESID(登録商標))、6-メルカプトプリン(6MP)、6-チオグアニン(6TG)、シタラビン(Ara-C)、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン(例えば、XELODA(登録商標))、ダカルバジン(DTIC)などの、代謝拮抗剤; アクチノマイシンD、ドキソルビシン(DXR;例えば、ADRIAMYCIN(登録商標))、ダウノルビシン(ダウノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンなどの抗生物質; ビンクリスチン(VCR)、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイドなどのアルカロイド; ならびにパクリタキセル(例えば、TAXOL(登録商標))およびパクリタキセル誘導体などの他の抗腫瘍剤、細胞増殖抑制剤、デキサメタゾン(DEX;例えば、DECADRON(登録商標))などの糖質コルチコイドおよびプレドニゾンなどのコルチコステロイド、ヒドロキシウレアなどのヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼなどのアミノ酸枯渇酵素、ロイコボリンおよび他の葉酸誘導体、ならびに類似する多様な抗腫瘍剤である。以下の薬剤をさらなる薬剤として使用することもできる:アルニホスチン(例えば、ETHYOL(登録商標))、ダクチノマイシン、メクロレタミン(窒素マスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシンリポ(例えば、DOXIL(登録商標))、ゲムシタビン(例えば、GEMZAR(登録商標))、ダウノルビシンリポ(例えば、DAUNOXOME(登録商標))、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル(例えば、TAXOTERE(登録商標))、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT11(イリノテカン)、10-ヒドロキシ-7-エチル-カンプトテシン(SN38)、フロクスウリジン、フルダラビン、イフォスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル。
【００５３】
いくつかの実施形態においては、第2の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害は、癌細胞が免疫応答を防止する、または下方調節するために産生することができるチェックポイントを阻害することを広く指す。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、限定されるものではないが、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、TIM-3またはVISTAが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に結合し、これを阻害する抗体またはその抗原結合断片であってもよい。免疫チェックポイント阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、AMP-224、AMP-514、STI-A1110、TSR-042、RG-7446、BMS-936559、MEDI-4736、MSB-0020718C、AUR-012およびSTI-A1010が挙げられる。
【００５４】
特定の実施形態においては、医薬組成物はトランスフェクションビヒクルを含まない。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体および/またはアプタマー)を含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、本明細書に記載されている複数(例えば、2以上)のRNA複合体の組合せを含む。
【００５５】
これらの製剤または組成物の製造方法は、本明細書に記載されているRNA複合体を担体と、そして所望により1以上の補助成分と一緒にする工程を含む。一般に、製剤は、本明細書に記載されている物質を液体担体と均一かつ密に一緒にすることにより製造される。
【００５６】
治療方法
特定の態様において、細胞によるANGPT2又はPDGFB 発現を阻害する方法であって、本発明において提供するRNA複合体と細胞を接触させることを含む方法を本発明において提供する。特定の態様では、細胞と本明細書に提供されるRNA複合体とを接触させることを含む、細胞における血管新生（angiogenesis）を阻害する方法を本明細書において提供する。幾つかの実施形態においては、RNA複合体は、修飾RNA複合体であり、トランスフェクションビヒクルの非存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。幾つかの実施形態においては、送達ビヒクル(例えば、リポソーム、カチオン性重合体、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)、抗体及び/又はアプタマー)の存在下、細胞をRNA複合体と接触させる。
【００５７】
ある特定の態様においては、本明細書で提供されるRNA複合体または医薬組成物を、被験者に投与することを含む、被験者における血管新生を阻害する方法が本明細書で提供される。ある特定の態様においては、ヒト被験者に、本明細書で提供されるRNA複合体または医薬組成物を投与することを含む、AMD、DME、または癌について被験者を処置する方法が本明細書で提供される。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、被験体（対象）は、癌を有する。いくつかの実施形態においては、癌は、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態においては、RNA複合体は、送達ビヒクルなしに投与される。いくつかの実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、腫瘍内投与される。いくつかの実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、第2の癌治療剤と共に投与される。いくつかの実施形態においては、第2の癌治療剤は、化学療法剤である。いくつかの実施形態においては、第2の癌治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、RNA複合体は、被験体の眼に投与される。いくつかの実施形態においては、被験体は、AMD(例えば、滲出型または萎縮型AMD)を有する。いくつかの実施形態においては、被験体は、DMEを有する。いくつかの実施形態においては、被験体は雌性である。いくつかの実施形態においては、被験体は雄性である。ある特定の実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、ヒト被験者の眼に投与される。ある特定の実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、点眼剤である。
【００６０】
ある特定の実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、ヒト被験者の腫瘍に投与される。いくつかの実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、腫瘍内投与される。ある特定の実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、静脈内投与される。
【００６１】
いくつかの実施形態においては、RNA複合体または医薬組成物は、被験体によって自己投与される。いくつかの態様においては、被験体に、本明細書に記載のRNA複合体および/または医薬組成物を投与することによって癌を処置する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の方法を使用して、任意の癌性または前癌性腫瘍を処置することができる。いくつかの実施形態においては、癌は、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態においては、腫瘍および/または腫瘍の一部は、正常な血管新生を有するか、または血管新生が増加している。本明細書で提供される方法および組成物によって処置することができる癌としては、限定されるものではないが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮に由来する癌細胞が挙げられる。さらに、癌は、具体的には、以下の組織型のものであってもよいが、これらのものに限定されない:悪性新生物; 癌腫; 未分化癌腫; 巨細胞および紡錘細胞癌; 小細胞癌; 乳頭癌; 扁平上皮癌; リンパ上皮癌; 基底細胞癌; 毛母癌; 移行細胞癌; 乳頭移行細胞癌; 腺癌; 悪性ガストリノーマ; 胆管癌; 肝細胞癌; 肝細胞癌と胆管癌の混合型; 索状腺癌; 腺様嚢胞癌; 腺腫性ポリープにおける腺癌; 家族性大腸ポリポーシス腺癌; 固形癌; 悪性カルチノイド腫瘍; 気管支肺胞腺癌; 乳頭腺癌; 嫌色素細胞癌; 好酸性癌; 好酸性腺癌; 好塩基性癌; 明細胞腺癌; 顆粒細胞癌; 濾胞状腺癌; 乳頭状濾胞状腺癌; 非被包性硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma); 副腎皮質癌; 類内膜癌; 皮膚付属器癌; アポクリン腺癌; 皮脂腺癌; 耳垢腺癌; 粘液性類表皮癌; 嚢胞腺癌; 乳頭状嚢胞腺癌; 乳頭状漿液嚢胞腺癌; ムチン性嚢胞腺癌; 粘液性腺癌; 印環細胞癌; 浸潤性導管癌; 髄様癌; 小葉癌; 炎症性癌; 乳房パジェット病; 腺房細胞癌; 腺扁平上皮癌; 扁平上皮化生を伴う腺癌; 悪性胸腺腫; 悪性卵巣間質腫; 悪性莢膜腫; 悪性顆粒膜細胞腫; および悪性ロブラストーマ(roblastoma); セルトリ細胞腫; 悪性ライディヒ細胞腫; 悪性脂質細胞腫; 悪性傍神経節腫; 悪性乳房外傍神経節腫; 褐色細胞腫; 血管球血管肉腫; 悪性黒色腫; メラニン欠乏性黒色腫; 表在拡大型黒色腫; 巨大色素性母斑における悪性黒色腫; 類上皮細胞黒色腫; 悪性青色母斑; 肉腫; 線維肉腫; 悪性線維性組織球腫; 粘液肉腫; 脂肪肉腫; 平滑筋肉腫; 横紋筋肉腫; 胎児性横紋筋肉腫; 胞巣状横紋筋肉腫; 間質性肉腫; 悪性混合腫瘍; ミュラー管混合腫瘍; 腎芽細胞腫; 肝芽腫; 癌肉腫; 悪性間葉腫; 悪性ブレンナー腫瘍; 悪性葉状腫瘍; 滑膜肉腫; 悪性中皮腫; 未分化胚細胞腫; 胎生期癌; 悪性奇形腫; 悪性卵巣甲状腺腫; 絨毛癌; 悪性中腎腫; 血管肉腫; 悪性血管内皮腫; カポジ肉腫; 悪性血管外皮細胞腫; リンパ管肉腫; 骨肉腫; 傍骨骨肉腫; 軟骨肉腫; 悪性軟骨芽細胞腫; 間葉性軟骨肉腫; 骨巨細胞腫; ユーイング肉腫; 悪性歯原性腫瘍; エナメル芽細胞歯牙肉腫; 悪性エナメル上皮腫; エナメル芽細胞線維肉腫; 悪性松果体腫; 脊索腫; 悪性神経膠腫; 上衣腫; 星状細胞腫; 原形質性星状細胞腫; 線維性星状細胞腫; 星状芽細胞腫; 膠芽細胞腫; 希突起膠腫; 希突起膠芽細胞腫; 原始神経外胚葉腫瘍; 小脳肉腫; 神経節芽細胞腫; 神経芽細胞腫; 網膜芽細胞腫; 嗅神経腫瘍(olfactory neurogenic tumor); ��性髄膜腫; 神経線維肉腫; 悪性神経鞘腫; 悪性顆粒細胞腫; 悪性リンパ腫; ホジキン病; ホジキンリンパ腫; 側肉芽腫; 悪性小リンパ球性リンパ腫; 悪性びまん性大細胞型リンパ腫; 悪性濾胞性リンパ腫; 菌状息肉腫; その他の特定の非ホジキンリンパ腫; 悪性組織球増殖症; 多発性骨髄腫; 肥満細胞肉腫; 免疫増殖性小腸疾患; 白血病; リンパ性白血病; 形質細胞性白血病; 赤白血病; リンパ肉腫細胞性白血病; 骨髄性白血病; 好塩基球性白血病; 好酸球性白血病; 単球性白血病; 肥満細胞白血病; 巨核芽球性白血病; 骨髄性肉腫; および有毛細胞白血病。
【００６２】
本方法においては、本明細書に記載されているRNA複合体は、例えば、送達ビヒクルを使用しない核酸として(例えば、cp-asiRNAの場合)、送達試薬と併用して、および/または本明細書に記載されているRNA複合体を発現する配列を含む核酸として、対象に投与されうる。幾つかの実施形態においては、当技術分野で公知の任意の核酸送達方法が、本明細書に記載されている方法において用いられうる。適当な送達試薬には、例えば、Mirus Transit TKO親油性試薬; リポフェクチン; リポフェクタミン; セルフェクチン; ポリカチオン(例えば、ポリリシン)、アテロコラーゲン、ナノプレックスおよびリポソームが含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸分子用送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用はMinakuchiら, Nucleic Acids Res., 32(13):e109 (2004); Hanaiら, Ann NY Acad Sci., 1082:9-17 (2006); およびKawataら, Mol Cancer Ther., 7(9):2904-12 (2008)(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。例示的な干渉核酸送達システムは米国特許第8,283,461号、第8,313,772号、第8,501,930号、第8,426,554号、第8,268,798号および第8,324,366号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)で提供されている。
【００６３】
本明細書に記載されている方法の幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているRNA複合体を対象に送達するためにリポソームを使用する。本明細書に記載されている方法における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成性脂質(これは、一般には、中性または負荷電リン脂質およびステロール、例えばコレステロールを含む)から形成されうる。脂質の選択は、一般には、所望のリポソームのサイズおよび血流内のリポソームの半減期のような要因を考慮することによって導かれる。リポソームの製造のための種々の方法が公知であり、例えば、Szokaら, (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; ならびに米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号および第5,019,369号(それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されている。
【００６４】
本方法に使用されるリポソームはまた、単核マクロファージ系(「MMS」)および細網内皮系(「RES」)によるクリアランスを回避するために修飾されうる。そのような修飾リポソームは表面上のまたはリポソーム構造内に取り込まれたオプソニン化抑制部分を有する。
【００６５】
本明細書に記載されているリポソームの製造に使用するためのオプソニン化抑制部分は、典型的には、リポソーム膜に結合した大きな親水性重合体である。本明細書中で用いるオプソニン化抑制部分がリポソーム膜に「結合」していると言えるのは、それが化学的または物理的に、例えば、膜自体の内部への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基への直接結合により、該膜に結合している場合である。これらのオプソニン化抑制性親水性重合体は、例えば米国特許第4,920,016号(その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする)に記載されているとおり、MMSおよびRESによるリポソームの取り込みを有意に減少させる保護表面層を形成する。
【００６６】
幾つかの実施形態においては、リポソームの修飾に適したオプソニン化抑制部分は、約500〜約40,000ダルトンまたは約2,000〜約20,000ダルトンの数平均分子量を有する水溶性重合体である。そのような重合体には、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコール(PPG)誘導体; 例えばメトキシPEGまたはPPG、およびPEGまたはPPGステアラート; 合成重合体、例えばポリアクリルアミドまたはポリN-ビニルピロリドン; 直鎖状、分枝状またはデンドリマー状ポリアミドアミン; ポリアクリル酸; カルボキシルまたはアミノ基が化学結合している多価アルコール、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えばガングリオシドGM1が含まれる。PEG、メトキシPEGもしくはメトキシPPGまたはそれらの誘導体の共重合体も好適である。また、オプソニン化抑制性重合体はPEGおよびポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドのいずれかのブロック共重合体でありうる。また、オプソニン化抑制重合体は、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン; アミノ化多糖またはオリゴ糖(直鎖状または分枝状); あるいはカルボキシル化多糖またはオリゴ糖、例えば、炭酸誘導体と反応してカルボキシル基が結合したものでありうる。幾つかの実施形態においては、オプソニン化抑制部分はPEG、PPGまたはそれらの誘導体である。PEGまたはPEG誘導体で修飾されたリポソームは「PEG化リポソーム」と称されることがある。
【００６７】
本明細書中で開示されている医薬組成物は、任意の適切な投与経路、例えば、静脈内、腫瘍内、眼球内、経口的及び非経口的に送達されうる。特定の実施形態においては、医薬組成物は、(例えば、経口又は静脈内投与により)全身送達される。他の特定の実施形態においては、医薬組成物は局所的（局部的）に眼に、注射により（例えば硝子体内）又は点眼薬により、送達される。
【００６８】
医薬組成物中のRNA複合体の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴うことなく個々の患者、組成物および投与方法に関して所望の治療応答を得るのに有効なRNA複合体の量が得られるように変動可能である。
【００６９】
選択される投与量レベルは、使用される個々の物質の活性、投与経路、投与時間、使用される個々の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用される個々の化合物と併用される他の薬物、化合物および/または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、病態、全身健康状態および過去の病歴ならびに医学分野でよく知られている同様の要因を含む種々の要因に依存する。
【００７０】
当技術分野における通常の技量を有する医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することが可能である。例えば、医師または獣医は、医薬組成物中で使用される物質の用量を、所望の治療効果を達成する必要レベルより低いレベルで処方および/または投与し、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることが可能である。
【００７１】
一般に、本明細書に記載されているRNA複合体の適当な1日量は、治療効果を得るのに有効な最低用量であるRNA複合体の量である。そのような有効量は、一般に、前記の要因に依存する。
【実施例】
【００７２】
実施例１  ANGPT2を標的化する非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNAについてのスクリーニング
高い効率でANGPT2を阻害する非対称のより短い二本鎖の低分子干渉RNA(asiRNA)を同定するために、100のasiRNAを合成しスクリーニングした。スクリーニングしたasiRNAの核酸配列を表１に示す。  
【００７３】
【表１】
2019506862.tif 000002
2019506862.tif 000003
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【００７４】
表1に挙げたasiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer Inc., Korea)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、SK-N-SH細胞(ATCC)を、100mm細胞培養皿内で、10%ウシ胎児血清(FBS、Gibco)及び100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有する最小必須培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、5x103個のSK-N-SH細胞を96ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、SK-N-SH細胞を0.1 nMのasiRNAでトランスフェクトした。
【００７５】
トランスフェクションの24時間後に、リアルタイムPCRによって、トランスフェクトされた細胞のANGPT2 mRNAレベルを測定した。具体的には、qPCR用のSuperPrep Cell Lysis & RT キット（TOYOBO）をメーカーの説明書にしたがって使用して、全RNAを抽出してcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、THUNDERBIRD（登録商標）Probe qPCR Mix (TOYOBO)をメーカーの説明書にしたがって使用して行った。ANGPT2 TaqMan（登録商標）プローブ(Hs01048042_m1)を用いてANGPT2の増幅を検出した。18S TaqMan（登録商標）プローブ(Hs03928985_g1)を用いて、18Sを内部標準として増幅した。
【００７６】
100のasiRNAのそれぞれによるANGPT2阻害のレベルを図1に示す。asiRNA配列のうち良好なRNAi効力（>30%）を有する27のasiRNA、すなわちasiANGPT2 #15、#16、#18、#19、#20、#23、#24、#31、#37、#38、#39、#44、#50、#54、#55、#58、#61、#63、#71、#72、#80、#81、#83、#87、#93、#94及び#95を追跡調査に使用するために選択した。
【００７７】
実施例２：ANGPT2標的化asiRNAを用いたANGPT2 mRNA発現の阻害
27のasiRNA配列、すなわちasiANGPT2 #15、#16、#18、#19、#20、#23、#24、#31、#37、#38、#39、#44、#50、#54、#55、#58、#61、#63、#71、#72、#80、#81、#83、#87、#93、#94及び#95を、そのANGPT2発現を阻害する能力について試験した。
【００７８】
asiRNAを95℃にて5分間、37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、SK-N-SH細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)及び、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有する最小必須培地(Gibco)で培養した。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、SK-N-SH細胞をasiRNAでトランスフェクトした。
【００７９】
具体的には、RNAiPlus（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAのうち500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。ANGPT2 遺伝子の増幅を、SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)を用いて検出した。GAPDHを内部標準として増幅した。以下のプライマー配列を用いた：
ヒトGAPDH-フォワード5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3'
ヒトGAPDH-リバース5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3' 
ヒトANGPT2-フォワード5'- GCA AGT GCT GGA GAA CAT CA -3' 
ヒトANGPT2-リバース5'- CAC AGC CGT CTG GTT CTG TA-3'
【００８０】
27のasiRNAのANGPT2阻害のレベルを図2に示す。
【００８１】
図２に示すように、最も効率的な14のasiRNA、すなわちasiANGPT2 #15、#16、#18、#19、#23、#31、#37、#44、#54、#58、#72、#87、#93及び#94を追跡調査に使用するために選択した。
【００８２】
実施例３：ANGPT2標的化asiRNAを用いたANGPT2 mRNA発現の阻害
14のasiRNA配列、すなわちasiANGPT2#15、#16、#18、#19、#23、#31、#37、#44、#54、#58、#72、#87、#93及び#94を、1 nMでのトランスフェクションにより、ANGPT2発現を阻害するその能力について試験した。
【００８３】
該asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。適正なストランドアニーリングを、ゲル電気泳動により確認した。スクリーニングのために、100mm細胞培養皿内で、SK-N-SH細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清（FBS、Gibco）及び、100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有する最小必須培地(Gibco)中で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、SK-N-SH細胞を0.3 nMのasiRNAでトランスフェクトした。
【００８４】
具体的には、RNAisoPlus（TaKaRa）を用いて全RNAを抽出した後、抽出RNAの500 ngを、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いて、メーカーの説明書にしたがってcDNA合成に使用した。ANGPT2 遺伝子の増幅は、SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)を用いて検出した。GAPDHは内部標準であった。
【００８５】
14のasiRNAのANGPT2阻害のレベルを図3に示す。
【００８６】
実施例４：ANGPT2標的化asiRNAを用いたANGPT2タンパク質発現の阻害
asiANGPT2の、ANGPT2タンパク質の阻害についての効力を試験した。
【００８７】
asiRNAを95℃にて5分間、さらに37℃にて1時間、1x siRNA二本鎖バッファー(Bioneer)中でインキュベートした。ゲル電気泳動により適正なストランドアニーリングを確認した。
【００８８】
100mm細胞培養皿内で、SK-N-SH細胞(ATCC)を、10%ウシ胎児血清(Gibco)及び100μg/mlペニシリン／ストレプトマイシンを含有する最小必須培地(Gibco)で培養しておいた。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を24ウェルプレートに播種した。メーカーの説明書にしたがってRNAiMAX(Invitrogen)を用いて、SK-N-SH細胞を1 nM asiRNAでトランスフェクトした。
【００８９】
asiRNAトランスフェクションの48時間後に、ウエスタンブロットによりANGPT2タンパク質発現のレベルを測定した。トランスフェクトしたSK-N-SH細胞をSDS溶解バッファー(1%SDS、100mM Tris pH8.8)で溶解した。SK-N-SH細胞の全タンパク質抽出物の10μgを9% SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、以前にメタノール（Merck）で活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて移した。この膜を3% BSA（Bioworld）を用いて室温にて1時間ブロックした後、抗ANGPT2抗体（Santa Cruz）および抗GAPDH抗体（Santa Cruz）を含有する3% BSA中で4℃にて一晩インキュベートした。次いで、膜をlx TBSTで10分間3回洗浄し、HRP結合二次抗体とともに1x TBST中で室温にて1時間インキュベートした。膜をlx TBSTで10分間洗浄し、lx ECLで1分間処理した。次に、ANGPT2およびGAPDHバンドを、ChemiDoc 装置 (Bio-rad)を用いて画像化した。
【００９０】
ウェスタンブロットアッセイの結果を図4に示す。その結果、asiANGPT2#54及びasiANGPT2#94が他のasiANGPT2ストランドと比較して、より高い阻害効率を示した。これらの鎖を化学修飾のために選択した。
【００９１】
実施例５：自己送達のためのasiRNAの化学修飾
選択したasiRNAに化学修飾を施し、修飾されたasiRNAの細胞デリバリーを、他のデリバリー試薬の非存在下で調べた。下記のように、ある種の修飾は、asiRNAのエンドサイトーシスおよび安定性を改善した。このような細胞透過性asiRNA（cp-asiRNA）は、デリバリー試薬の非存在下で細胞内に送達可能である。
【００９２】
8のcp-asiRNA候補（表2）を、SK-N-SH細胞におけるANGPT2 mRNA阻害についてスクリーニングした。SK-N-SH細胞をsp-asiRNAと共に1μMおよび3μMで、デリバリー試薬なしでインキュベートし、ANGPT2 mRNAレベルをリアルタイムPCRにより測定した。
【００９３】
【表２】
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【００９４】
SK-N-SH細胞(ATCC)を、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有する最少必須培地(Gibco)中で培養した。
【００９５】
表2に列挙された潜在的なcp-asiRNAを、OPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で5分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。
【００９６】
処理の1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を、24ウェルプレート中に播種した。処理前に、SK-N-SH細胞を、最少必須培地で洗浄した後、潜在的なcp-asiRNAの存在下、OPTI-MEMバッファー中で8および24時間培養し、各時点で、asiRNAを含有するOPTI-MEM培地を血清含有培地と交換した。
【００９７】
ANGPT2 mRNA発現のレベルを、asiRNA処理の48時間後にリアルタイムPCRを使用して決定した。
【００９８】
実施例６ ANGPT2標的化cp-asiRNAを使用するANGPT2 mRNA発現の阻害
cp-asiRNAによるANGPT2 mRNAの阻害を試験した。それぞれの潜在的なcp-asiRNAを、送達試薬なしに1μMおよび3μMでSK-N-SH細胞と共にインキュベートし、リアルタイムPCRを使用してANGPT2 mRNAレベルを測定した。
【００９９】
SK-N-SH細胞(ATCC)を、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有する最少必須培地(Gibco)中で培養した。
【０１００】
cp-asiRNAを、OPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で5分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。
【０１０１】
処理の1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を、24ウェルプレート中に播種した。処理の直前に、SK-N-SH細胞を、最少必須培地(Gibco)で洗浄した後、潜在的なcp-asiRNAの存在下、OPTI-MEMバッファー中で24時間培養し、その時点で、asiRNAを含有するOPTI-MEM培地を血清含有培地と交換した。
【０１０２】
ANGPT2 mRNA発現のレベルを、asiRNA処理の48時間後にリアルタイムPCRによって決定した。全RNAを、RNAiso Plus (TaKaRa)を使用して抽出した後、500ngの抽出されたRNAを、高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用して、製造業者の指示書に従ってcDNA合成のために使用した。ANGPT2遺伝子の増幅を、パワーSYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)を使用して検出した。GAPDHを、内部対照として増幅した。
【０１０３】
実施例７ ANGPT2標的化cp-asiRNAを使用するANGPT2タンパク質発現の阻害
cp-asiRNAによるANGPT2タンパク質の阻害を試験した。それぞれの潜在的なcp-asiRNAを、送達試薬なしに1μMおよび3μMでSK-N-SH細胞と共にインキュベートした。SK-N-SH細胞(ATCC)を、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有する最少必須培地(Gibco)中で培養した。
【０１０４】
cp-asiRNAを、OPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で5分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。
【０１０５】
トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を、24ウェルプレート中に播種した。処理の直前に、SK-N-SH細胞を、最少必須培地(Gibco)で洗浄した後、cp-asiRNAの存在下、OPTI-MEMバッファー中で24時間培養し、その時点で、asiRNAを含有するOPTI-MEM培地を血清含有培地と交換した。
【０１０６】
ANGPT2タンパク質発現のレベルを、asiRNA処理の48時間後にウェスタンブロットによって決定した。簡単に述べると、処理されたSK-N-SH細胞を、SDS溶解バッファー(1%SDS、100mM Tris(pH8.8))で溶解した。10μgの全タンパク質抽出物を、9%SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、メタノール(Merck)により既に活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて転移させた。膜を、3%BSA(Bioworld)を用いて室温で1時間ブロックした後、抗ANGPT2抗体(Santa Cruz)および抗GAPDH抗体(Santa Cruz)を含有する3%BSA中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を1xTBSTで10分間、3回洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体と共に、1xTBST中、室温で1時間インキュベートした。膜を1xTBSTで10分間洗浄し、1xECLで1分間処理した。次いで、ANGPT2およびGAPDHバンドを、Chemidoc装置(Bio-rad)を使用して画像化した。
【０１０７】
ウェスタンブロットアッセイの結果を、図7に示す。結果として、センス鎖上に8個の2'-O-メチル化および3個のホスホロチオエート結合を含有し、アンチセンス鎖上に2個の2'-O-メチル化および4個のホスホロチオエート結合を含有するcp-asiANGPT2#54、センス鎖上に8個の2'-O-メチル化および3個のホスホロチオエート結合を含有し、アンチセンス鎖上に2個の2'-O-メチル化および6個のホスホロチオエート結合を含有する潜在的なcp-asiANGPT2#94が、最も高いレベルのANGPT2阻害を示した。
【０１０８】
実施例８ さらなるANGPT2標的化cp-asiRNAを使用するANGPT2 mRNA発現の阻害
異なる鎖長および数の2'-O-メチル化改変およびホスホロチオエート結合を有する様々な潜在的なcp-asiANGPT2構造を合成し、ANGPT2発現を阻害するその能力について試験した(表3)。
【０１０９】
【表３】
2019506862.tif 000009
【０１１０】
表３に列挙された1μMおよび3μMのそれぞれのcp-asiRNAがSK-N-SH細胞中でANGPT2 mRNAを阻害する能力を試験した。
【０１１１】
SK-N-SH細胞(ATCC)を、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有する最少必須培地(Gibco)中で培養した。表3に列挙されたcp-asiRNAを、OPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で5分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。
【０１１２】
トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を、24ウェルプレート中に播種した。処理の前に、SK-N-SH細胞を、最少必須培地(Gibco)で洗浄した後、潜在的なcp-asiRNAの存在下、OPTI-MEMバッファー中で24時間培養し、その時点で、asiRNAを含有するOPTI-MEM培地を血清含有培地と交換した。
【０１１３】
ANGPT2 mRNA発現のレベルを、asiRNA処理の48時間後に決定した。
【０１１４】
図8に示されるように、センス鎖上に8個の2'-O-メチル化および4個のホスホロチオエート結合を含有し、アンチセンス鎖上に2個の2'-O-メチル化および4個のホスホロチオエート結合を含有するcp-asiANGPT2#54、センス鎖上に8個の2'-O-メチル化および3個のホスホロチオエート結合を含有し、アンチセンス鎖上に2個の2'-O-メチル化および6個のホスホロチオエート結合を含有する潜在的なcp-asiANGPT2#94が、ANGPT2阻害能力において、他のcp-asiANGPT2よりも高い効率を示した。
【０１１５】
実施例９ さらなるANGPT2標的化cp-asiRNAを使用するANGPT2タンパク質の阻害
cp-asiRNAを、送達試薬なしに1μMおよび3μMでSK-N-SH細胞と共にインキュベートし、ANGPT2タンパク質レベルをウェスタンブロットにより測定した。SK-N-SH細胞(ATCC)を、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有する最少必須培地(Gibco)中で培養した。
【０１１６】
cp-asiRNAを、OPTI-MEMバッファー(Gibco)中、95℃で5分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。
【０１１７】
トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のSK-N-SH細胞を、24ウェルプレート中に播種した。処理の直前に、SK-N-SH細胞を、最少必須培地(Gibco)で洗浄した後、潜在的なcp-asiRNAの存在下、OPTI-MEMバッファー中で24時間培養し、その時点で、asiRNAを含有するOPTI-MEM培地を血清含有培地と交換した。
【０１１８】
ANGPT2タンパク質発現のレベルを、asiRNA処理の48時間後にウェスタンブロットによって決定した。処理されたSK-N-SH細胞を、SDS溶解バッファー(1%SDS、100mM Tris(pH8.8))で溶解した。10μgの全タンパク質抽出物を、9%SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、メタノール(Merck)により既に活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて転移させた。膜を、3%BSA(Bioworld)を用いて室温で1時間ブロックした後、抗ANGPT2抗体(Santa Cruz)および抗GAPDH抗体(Santa Cruz)を含有する3%BSA中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を1xTBSTで10分間、3回洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体と共に、1xTBST中、室温で1時間インキュベートした。膜を1xTBSTで10分間洗浄し、1xECLで1分間処理した。次いで、ANGPT2およびGAPDHバンドを、Chemidoc装置(Bio-rad)を使用して画像化した。
【０１１９】
ウェスタンブロットアッセイの結果を、図9に示す。結果として、cp-asiANGPT2#54-PS4/19(2,4)が、最も高いレベルのANGPT2阻害を示した。
【０１２０】
実施例１０ PDGFBに特異的な非対称性低分子二本鎖干渉RNAのスクリーニング
高い効率でPDGFBを阻害する非対称性低分子二本鎖干渉RNA(asiRNA)を同定するために、100種のasiRNAを合成し、スクリーニングした。スクリーニングされたasiRNAの核酸配列を、表4に提供する。
【０１２１】
【表４】
2019506862.tif 000010
2019506862.tif 000011
2019506862.tif 000012
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【０１２２】
表4に列挙されたasiRNAを、1x siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。スクリーニングのために、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で培養されたA549細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、5x103個のA549細胞を、96ウェルプレート中に播種した。製造業者の指示書に従ってRNAiMAX(Invitrogen)を使用して、A549細胞に0.1nMのasiRNAをトランスフェクトした。
【０１２３】
トランスフェクトされた細胞中のPDGFB mRNAレベルを、qRT-PCRを使用して、トランスフェクションの24時間後に測定した。具体的には、全RNAを、TOYOBO溶解試薬を使用して抽出した後、1/5容量の反応混合物を、TOYOBO RT試薬(TOYOBO SuperPrep)を使用するcDNA合成のために使用した。合成されたcDNAを希釈した後、THUNDERBIRD(登録商標)Probe qPCR Mix(TOYOBO)を使用して定量的RT-PCRを実施した。標的遺伝子の増幅を、PDGFB TaqMan(登録商標)Probe (Hs00966522_m1)および18S TaqMan(登録商標)Probe (Hs03928985_g1)を使用して検出した。
【０１２４】
100種それぞれのasiRNAによるPDGFB阻害の発現レベルを、図11に提供する。PDGFB mRNAを標的とする22種のasiRNA配列、asiRNA (17)、asiRNA (24)、asiRNA (42)、asiRNA (43)、asiRNA (47)、asiRNA (53)、asiRNA (63)、asiRNA (64)、asiRNA (65)、asiRNA (66)、asiRNA (67)、asiRNA (72)、asiRNA (73)、asiRNA (79)、asiRNA (80)、asiRNA (84)、asiRNA (85)、asiRNA (92)、asiRNA (93)、asiRNA (94)、asiRNA (95)、asiRNA (99)を、フォローアップ試験における使用のために選択した。
【０１２５】
実施例１１ PDGFB標的化asiRNAを使用するPDGFB mRNA発現の阻害
PDGFB mRNAを標的とする22種のasiRNA配列、asiRNA (17)、asiRNA (24)、asiRNA (42)、asiRNA (43)、asiRNA (47)、asiRNA (53)、asiRNA (63)、asiRNA (64)、asiRNA (65)、asiRNA (66)、asiRNA (67)、asiRNA (72)、asiRNA (73)、asiRNA (79)、asiRNA (80)、asiRNA (84)、asiRNA (85)、asiRNA (92)、asiRNA (93)、asiRNA (94)、asiRNA (95)、asiRNA (99)を、異なる濃度でPDGFB発現を阻害するその能力について試験した。asiRNAを、1x siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。スクリーニングのために、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で培養したA549細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、2.5x104個のA549細胞を、24ウェルプレート中に播種した。製造業者の指示書に従ってRNAiMAX(Invitrogen)を使用して、A549細胞にasiRNAをトランスフェクトした。
【０１２６】
トランスフェクトされた細胞中のPDGFB mRNAレベルを、リアルタイムPCRを使用して、トランスフェクションの24時間後に測定した。具体的には、全RNAを、RNAiso Plus (TaKaRa)を使用して抽出した後、製造業者の指示書に従って高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用するcDNA合成のために、500ngの抽出したRNAを使用した。合成されたcDNAを希釈した後、製造業者の指示書に従ってStepOneリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を使用して、定量的リアルタイムPCRを実施した。PDGFB遺伝子の増幅を、パワーSYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)を使用して検出した。GAPDHを内部対照として増幅した。以下のプライマー配列を使用した:
ヒトGAPDH-フォワード5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3'
ヒトGAPDH-リバース5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3' 
ヒトPDGFB-フォワード5'- CAA GGG ACC TGC TCA TCA TAT T-3' 
ヒトPDGFB-リバース5'- TAC CAC AGT CTC CCT CCT ATT T-3'。
【０１２７】
異なる濃度の22種のasiRNAによるPDGFB阻害のレベルを、図12に提供する。PDGFB mRNAを標的とする12種のasiRNA、asiRNA (24)、asiRNA (42)、asiRNA (47)、asiRNA (64)、asiRNA (65)、asiRNA (66)、asiRNA (67)、asiRNA (73)、asiRNA (80)、asiRNA (94)、asiRNA (95)、asiRNA (99)を、フォローアップ試験における使用のために選択した。
【０１２８】
実施例１２ PDGFB特異的asiRNAを使用するPDGFBタンパク質発現の阻害
12種のasiRNAを、1x siRNA二本鎖バッファー(STpharm)中、95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(Gibco)および100μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)中で培養したA549細胞(ATCC)を使用した。トランスフェクションの1日前に、9.0x104個のA549細胞を、6ウェルプレート中に播種した。製造業者の指示書に従ってRNAiMAX(Invitrogen)を使用して、A549細胞に0.3nMのasiRNAをトランスフェクトした。
【０１２９】
トランスフェクトされた細胞中のPDGFB mRNAレベルを、リアルタイムPCRを使用して、トランスフェクションの48時間後に測定し、PDGFBタンパク質発現のレベルを、ウェスタンブロットにより決定した。
【０１３０】
具体的には、全RNAを、RNAiso Plus (TaKaRa)を使用して抽出した後、製造業者の指示書に従って高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用するcDNA合成のために、500ngの抽出したRNAを使用した。合成されたcDNAを希釈した後、製造業者の指示書に従ってStepOneリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)を使用して、定量的リアルタイムPCRを実施した。PDGFB遺伝子の増幅を、パワーSYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)を使用して検出した。GAPDHを内部対照として増幅した。以下のプライマー配列を使用した:
ヒトGAPDH-フォワード5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3'
ヒトGAPDH-リバース5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3' 
ヒトPDGFB-フォワード5'- CAA GGG ACC TGC TCA TCA TAT T-3' 
ヒトPDGFB-リバース5'- TAC CAC AGT CTC CCT CCT ATT T-3'。
【０１３１】
mRNAレベルの結果を、図13に示す。PDGFB mRNAを標的とする6種のasiRNA配列、asiRNA (42)、asiRNA (47)、asiRNA (64)、asiRNA (67)、asiRNA (94)、asiRNA (95)が、効率的な遺伝子サイレンシング活性(60%〜)を示す。
【０１３２】
タンパク質レベルの場合、トランスフェクトされたA549細胞を、RIPAバッファー(GE)で溶解した。A549細胞の20μgの全タンパク質抽出物を、10％SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、メタノール(Merck)により既に活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて転移させた。膜を、5%スキムミルク(Seoul Milk)を用いて室温で1時間ブロックした後、抗PDGFB抗体(Abcam)および抗β-アクチン抗体(Santa Cruz)を含有する5%スキムミルク中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を1xTBSTで10分間、3回洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体と共に、5%スキムミルク中、室温で1時間インキュベートした。膜を1xTBSTで10分間洗浄し、1xECLで1分間処理した。次いで、PDGFBおよびβ-アクチンバンドを、Chemidoc装置(Bio-rad)を使用して画像化した。
【０１３３】
ウェスタンブロットアッセイの結果を、図14に示す。A549細胞のasiPDGFB (42, 47, 66, 67, 94, 95)トランスフェクション細胞株において、50%以上のPDGFBタンパク質阻害が確認された(図14)。
【０１３４】
まとめると、PDGFB遺伝子を標的化する5種のasiRNA配列、asiRNA (42)、asiRNA (47)、asiRNA (67)、asiRNA (94)、asiRNA (95)を、フォローアップ試験における使用のために選択した。
【０１３５】
実施例１３ 自己送達のためのasiRNAの化学的改変
実施例3で選択されたasiRNAに化学的改変を施して、改変されたasiRNAの細胞送達を、他の送達ビヒクルの非存在下で試験した。以下に記載されるように、ある特定の改変は、asiRNAのエンドサイトーシスおよび安定性を改善した。そのような細胞浸透性asiRNA (cp-asiRNA)を、送達ビヒクルの非存在下で細胞中に送達することができる。上記の方法を使用して決定した場合の、細胞によるPDGFB mRNAの発現を図15に提供し、PDGFBタンパク質レベルを図16に提供する。
【０１３６】
潜在的なcp-asiRNA(表5)を、A549細胞中での血小板由来増殖因子サブユニットB(PDGFB) mRNA阻害についてスクリーニングした。それぞれの潜在的なcp-asiRNAを、送達ビヒクルなしに1μMおよび3μMでA549細胞と共にインキュベートし、PDGFB発現レベルをqRT-PCRおよびウェスタンブロット試験によって測定した。
【０１３７】
【表５】
2019506862.tif 000017
【０１３８】
A549細胞(ATCC)を、100mmの細胞培養皿中、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)および100μg/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養した。表5に列挙された潜在的なcp-asiRNAを、Opti-MEM (Gibco)中、95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。潜在的なcp-asiRNAの適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。
【０１３９】
cp-asiRNA処理の当日に、9.0x104個の細胞を、6ウェルプレート中に播種した後、Opti-MEM中、潜在的なcp-asiRNAの存在下で24時間培養し、その時点で、cp-asiRNAを含有するOpti-MEM培地を、血清含有培地と交換した。24時間後、A549細胞中のPDGFB mRNAレベルを、qRT-PCRを使用して決定した。具体的には、全RNAを、RNAiPlus(登録商標)(TaKaRa)を使用して抽出した後、500ngの反応混合物を、高容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を使用して、cDNA合成のために使用した。合成されたcDNAを希釈した後、パワーSYBRグリーンPCRマスターMix(Applied Biosystems)を使用して、定量的RT-PCRを実施した。
【０１４０】
cp-asiRNAインキュベーションの48時間後、ウェスタンブロットによりPDGFBタンパク質発現レベルを決定した。簡単に述べると、処理されたA549細胞を、Mammalian Protein Extraction Buffer (GE Healthcare)で溶解した。20μgの全タンパク質抽出物を、10%SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、メタノール(Merck)により既に活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて転移させた。膜を、5%スキムミルク(Seoul Milk)を用いて室温で1時間ブロックした後、抗PDGFB抗体(Abcam)および抗γ-チューブリン抗体(Bethyl)を含有する5%スキムミルク中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をTBSTで10分間、3回洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体(Santa Cruz)と共に、5%スキムミルク中、室温で1時間インキュベートした。膜をTBSTで10分間洗浄し、ECL基質(Thermo Scientific)で処理した。次いで、タンパク質バンドを、Chemidoc装置(Bio-rad)を使用して画像化した。
【０１４１】
9種の潜在的なcp-asiRNAのそれぞれによるPDGFB阻害のレベルを、図15および図16に提供する。試験した潜在的なcp-asiRNAの中から、cp-asiPDGFB 67 (7, 4)を、さらなる試験のために選択した。
【０１４２】
実施例１４ さらなるPDGFB cp-asiRNA構造
異なる化学的改変または配列を有する他の潜在的なPDGFB cp-asiRNA構造を合成し、PDGFB発現を阻害するその能力について試験した(表6)。
【０１４３】
【表６】
2019506862.tif 000018
【０１４４】
表6に列挙されたcp-asiRNAが、A549細胞中でPDGFB発現を阻害する能力を試験した。A549細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)および100ユニット/mlペニシリン100μg/mlを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養した。表6に列挙された潜在的なcp-asiRNAを、Opti-MEM (Gibco)中、95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。潜在的なcp-asiRNAの適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。cp-asiRNA処理の当日に、2.5x104個の細胞を、24ウェルプレート中に播種した後、Opti-MEM中、潜在的なcp-asiRNAの存在下で24時間培養し、その時点で、cp-asiRNAを含有するOpti-MEM培地を、血清含有培地と交換した。24時間後、A549細胞中のPDGFBレベルを決定した。
【０１４５】
cp-asiRNAを、Opti-MEM (Gibco)中、95℃で2分間および37℃で1時間インキュベートした。潜在的なcp-asiRNAの適切な鎖アニーリングを、ゲル電気泳動によって確認した。A549細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)および100ユニット/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)中で培養した。処理の当日に、9x104個のA549細胞を、6ウェルプレート中に播種した後、Opti-MEM中、潜在的なcp-asiRNAの存在下で培養した。24時間後、A549細胞中のPDGFBタンパク質レベルをウェスタンブロットにより決定した。簡単に述べると、処理されたA549細胞を、Mammalian Protein Extraction Buffer (GE Healthcare)で溶解した。20μgの全タンパク質抽出物を、10%SDS-PAGEゲル上にロードし、120Vで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質を、メタノール(Merck)により既に活性化されたPVDF膜(Bio-rad)に、300mAで1時間かけて転移させた。膜を、5%スキムミルク(Seoul Milk)を用いて室温で1時間ブロックした後、抗PDGFB抗体(Abcam)および抗γ-チューブリン抗体(Bethyl)を含有する5%スキムミルク中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をTBSTで10分間、3回洗浄し、HRPコンジュゲート化二次抗体(Santa Cruz)と共に、5%スキムミルク中、室温で1時間インキュベートした。膜をTBSTで10分間洗浄し、ECL基質(Thermo Scientific)で処理した。次いで、標的タンパク質バンドを、Chemidoc装置(Bio-rad)を使用して画像化した。
【０１４６】
図18に見られるように、PDGFB発現について、潜在的なcp-asiPDGFB 67は21ヌクレオチドのアンチセンス鎖からなり、潜在的なcp-asiRNAは19ヌクレオチドのアンチセンス鎖からなり、同様のレベルのPDGFB阻害を示した。そして、cp-aciPDGFB 94(4, 4)、cp-aciPDGFB 95(4, 4)、cp-aciPDGFB 95(2, 4)は、送達ビヒクルなしに効率的なPDGFB阻害を示す。
【０１４７】
文献の援用
本明細書中に挙げられている全ての刊行物、特許および特許出願を、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、それらの全体を参照により本明細書に組み入れる。矛盾する場合には、本明細書における定義を含め本出願が優先する。
【０１４８】
均等物  当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識し、または通常の実験のみを行ってそれらを確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
【図１】
2019506862.tif 000019
【図２】
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【図３】
2019506862.tif 000021
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019506862.tif 000027
【図１０−１】
2019506862.tif 000028
【図１０−２】
2019506862.tif 000029
【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019506862.tif 000035
【図１６】
2019506862.tif 000036
【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
2019506862000001.app
【国際調査報告】
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