(57)【要約】  ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＫＤＲの両方に結合する二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質が提供される。この二重特異性結合タンパク質は、免疫抑制及び／または過剰な血管新生を特徴とする疾患及び状態を治療するために有用である。
2019506863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤＬ１に結合する第１の領域及びヒトＫＤＲに結合する第２の領域を含む二重特異性結合タンパク質。
【請求項２】
二重特異性抗体である、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３】
融合タンパク質である、請求項１に記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ、及びｓｃＦｖを含む二重特異性抗体。
【請求項５】
ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧ及びＫＤＲと結合するｓｃＦｖを含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
ＫＤＲと結合するＩｇＧ及びＰＤ−Ｌ１と結合するｓｃＦｖを含む、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変ドメインを含んで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１０〜１２、またはそれぞれ配列番号５８〜６０である、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインを含んで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１３〜１５、またはそれぞれ配列番号６１〜６３である、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインを含んで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号１６〜１８である、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインを含んで、アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１９〜２１である、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインを含んで、アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２〜２４である、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインを含んで、アミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２５〜２７である、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖及び軽鎖が、配列番号３４及び３１、配列番号３０及び３５、配列番号３６及び３１、配列番号３０及び３７、配列番号３８及び３３、配列番号３２及び３９、配列番号４０及び３３、配列番号３２及び４１、配列番号４２及び２９、配列番号２８及び４３、配列番号４４及び２９、配列番号２８及び４５、配列番号４６及び２９、配列配列番号２８及び４７、配列番号４８及び２９、配列番号２８及び４９、配列番号５１及び５０、配列番号５２及び５０、配列番号５３及び５０、配列番号５４及び２９、配列番号５５及び２９、ならびに配列番号５６及び２９からなる群より選択される重鎖／軽鎖対のそれぞれの配列を含む、請求項５または６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
免疫抑制の低減または血管新生の低減を必要とする患者を治療する方法であって、免疫抑制または血管新生のこのような低減を必要とする患者に、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質または請求項４〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項１５】
がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質または請求項４〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記がんが、肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、グリア芽細胞腫、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌及び膵臓癌からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、またはそのポリペプチド鎖をコードする単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む培養された宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の宿主細胞を、前記核酸分子の発現を可能にする条件下で培養することを含む、ポリペプチドの生産方法。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質または請求項４〜１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体のコンジュゲートであって、前記二重特異性結合タンパク質または前記二重特異性抗体が、造影剤、治療剤及び細胞傷害剤からなる群より選択される薬剤にコンジュゲートされる、前記コンジュゲート。
【請求項２２】
医薬組成物であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性結合タンパク質、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、または請求項２１に記載のコンジュゲート、及び
薬学的に許容される担体を含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年２月２日に出願された米国仮出願第６２／２９０，３５０号の優先権を主張する。この出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本明細書において、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する第１の結合領域及びヒトＫＤＲに結合する第２の結合領域を含む二重特異性結合タンパク質が提供される。また、二重特異性結合タンパク質を作製する方法、及び二重特異性結合タンパク質を使用して、免疫抑制を減少もしくは阻害するか、または血管新生を低減もしくは阻害することが望ましい疾患または状態を治療する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
プログラム死１（ＰＤ−１）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡを含む受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４、Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８）。ＰＤ−１は、免疫病理学的状態の進行中に活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上で主にアップレギュレートされる誘導性免疫抑制受容体である。ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用は、ＴＣＲ及びＢＣＲ媒介性の増殖の阻害、ならびに免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）の内因性ＰＤ−１媒介性陰性シグナル伝達を通じた抗原特異的Ｔ細胞のサイトカイン産生及びアポトーシスの誘導を生じる（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５、Ｕｎｋｅｌｅｓｓ  ａｎｄ  Ｊｉｎ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：３３８−３４３、Ｏｋｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１３８６６−７１、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００）。ＰＤ−Ｌ１は、細胞表面糖タンパク質であり、ＰＤ−１の主要なリガンドである。ＰＤ−Ｌ１はまた、細胞活性化後のリンパ系組織及び非リンパ系末梢組織上でも誘導性である。ＰＤ−Ｌ１は、免疫細胞に加えて癌細胞及び間質細胞を含む様々な罹患細胞タイプにおいてアップレギュレートされ、疾患の悪化の経過中に免疫抑制に積極的な役割を果たす（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：１２２９３−７、Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９４７−５３）。ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションは、種々の癌及びウイルス感染における臨床転帰が不良であることに関連づけられている（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．ＢｉｏＭｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１：１−９、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２：６６２−７３）。抗体によるＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の遮断は、前臨床設定及び臨床設定において、ＣＤ８  Ｔ細胞浸潤、ＣＴＬ活性及びＴｈ１サイトカインＩＦＮ−γの存在の増大を促進した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０８２−９２、Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５２−７、Ｆｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．４８：４０９−２１、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ．（２０１２）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌ．１：１２２３−２５）。免疫調節剤としてのＰＤ−Ｌ１抗体は、単独療法として使用される場合、または他の免疫抑制分子に対する抗体と併用される場合に有効であることが示されている。
【０００４】
ＶＥＧＦＲは、受容体型チロシンキナーゼであり、ＰＤＧＦ及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と同じ受容体ファミリーに属する。ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２としても公知）は、ＶＥＧＦアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、及びＥと結合する受容体である。これは、ＶＥＧＦの内皮細胞分化及び分裂促進、血管新生ならびに浸透促進効果に役割を果たす。ＫＤＲは、細胞外ドメインに７個のＩｇ様ループ、膜貫通ドメイン、及びキナーゼインサートによって分割された２個の細胞内チロシンキナーゼドメインからなる２００ｋＤａの糖タンパク質である。第２及び第３のＩｇ様ループは、ＶＥＧＦの高親和性リガンド結合ドメインであり、一方で、第１及び第４のＩｇ様ループは、それぞれリガンド結合及び受容体二量体化を調節する。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ１の２５ｐＭのＫｄと比較して、７５〜２５０ｐＭのＫｄでＫＤＲと結合する。ＫＤＲは、血管内皮細胞の細胞表面上で主に発現される。ＫＤＲは、造血細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、及びいくつかの悪性細胞の細胞表面にも見られる。
【０００５】
血管新生は、新規な血管を発達させる極めて複雑なプロセスであり、これには、既存の血管からの毛細血管内皮細胞の増殖及び遊走ならびに組織浸潤、管状構造への細胞集合、新たに形成する管状集合体の閉回路血管系への連結、ならびに新たに形成された毛細血管の成熟を含む。
【０００６】
血管新生は、胚発育、濾胞増殖及び創傷治癒を含む正常な生理学的プロセスにおいて重要である。過度の血管新生はまた、新生物疾患における、ならびに加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症及び新血管性緑内障などの非腫瘍性疾患においても新血管新生をもたらす。ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））を用いて血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする抗血管新生療法は、ＡＭＤの進行を遅延させるのに有効であることが示されている。
【０００７】
増殖及び転移は新しい血管の形成に依存するため、血管新生は、原発腫瘍の増殖及び転移において重要な役割を果たす。血管新生に起因する血管新生がなければ、腫瘍は壊死性、アポトーシス性になるか、または認められるほどの大きさに成長できない。腫瘍血管新生には、内皮細胞の活性化、増殖、遊走、及び既存の血管からの組織浸潤を含むいくつかのプロセスを含む。これらのプロセスは、腫瘍細胞及びその周囲の間質によるＶＥＧＦのような血管新生増殖因子の産生によって誘発される。
ＫＤＲは、抗癌治療の重要な標的となっている。多くの腫瘍が分泌するＶＥＧＦの量を増大するが、ＫＤＲ分子の数は比較的一定のままであるので、ＫＤＲを標的とすることは、ＶＥＧＦシグナル伝達を抑制する確率を増加させ、したがって腫瘍増殖を阻害する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４
【非特許文献２】Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８
【非特許文献３】Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５
【非特許文献４】Ｕｎｋｅｌｅｓｓ  ａｎｄ  Ｊｉｎ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：３３８−３４３
【非特許文献５】Ｏｋｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１３８６６−７１
【非特許文献６】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００
【非特許文献７】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：１２２９３−７
【非特許文献８】Ｏｈｉｇａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９４７−５３
【非特許文献９】Ｈｏｆｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．ＢｉｏＭｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１：１−９
【非特許文献１０】ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄ．２：６６２−７３
【非特許文献１１】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０８２−９２
【非特許文献１２】Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５２−７
【非特許文献１３】Ｆｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．４８：４０９−２１
【非特許文献１４】Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ．（２０１２）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌ．１：１２２３−２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＫＤＲに結合する二重特異性結合タンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、二重特異性結合タンパク質はＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を遮断する。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を遮断することにより、そのような二重特異性結合タンパク質は、免疫抑制を低減または阻害するのに有用である。ＶＥＧＦとＫＤＲとの相互作用を遮断することにより、そのような二重特異性結合タンパク質は、血管新生を低減または阻害するのに有用である。二重特異性結合タンパク質は、１つの薬剤において、免疫抑制及び血管新生の両方を阻害する能力を組み合わせるのに特に有用である。
【００１０】
一実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＫＤＲに結合する二重特異性抗体が提供される。二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する第一抗原結合部位及びヒトＫＤＲに結合する第二抗原結合部位を含む。また、二重特異性抗体をコードする核酸分子、ならびに核酸を含む発現ベクターであって、原核または真核宿主細胞において核酸を発現することが可能で従って、二重特異性抗体の産生をもたらす発現ベクターも提供される。また、二重特異性抗体の組換え産生のための発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。
【００１１】
本明細書では、ＫＤＲに結合する抗体に連結されたＰＤ−Ｌ１に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体が提供される。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、ＫＤＲに結合するＩｇＧの重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結される。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、ＫＤＲに結合するＩｇＧの軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結される。別の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、ＫＤＲに結合するＩｇＧの重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結される。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、ＫＤＲに結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結される。
【００１２】
本明細書において、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体に連結されたＫＤＲに結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体が提供される。一実施形態では、ＫＤＲ  ｓｃＦｖは、ＰＤ−Ｌ１に結合するＩｇＧの重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結される。別の実施形態では、ＫＤＲ  ｓｃＦｖは、ＰＤ−Ｌ１に結合するＩｇＧの軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結される。別の実施形態において、ＫＤＲ  ｓｃＦｖは、ＰＤ−Ｌ１に結合するＩｇＧの重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結される。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖは、ＰＤ−Ｌ１に結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結される。
【００１３】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列は以下である：
【化１】
2019506863.tif 000003
（配列番号１）。ＣＤＲには下線を付している。
【００１４】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列は以下である：
【化２】
2019506863.tif 000004
（配列番号２）。ＣＤＲには下線を付している。
【００１５】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列は以下である：
【化３】
2019506863.tif 000005
（配列番号３）。ＣＤＲには下線を付している。
【００１６】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化４】
2019506863.tif 000006
（配列番号４）。ＣＤＲには下線を付している。
【００１７】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化５】
2019506863.tif 000007
（配列番号５）。ＣＤＲには下線を付している。
【００１８】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化６】
2019506863.tif 000008
（配列番号６）。ＣＤＲには下線を付している。
【００１９】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化７】
2019506863.tif 000009
（配列番号７）。ＣＤＲには下線を付している。
【００２０】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化８】
2019506863.tif 000010
（配列番号８）。ＣＤＲには下線を付している。
【００２１】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化９】
2019506863.tif 000011
（配列番号９）。ＣＤＲには下線を付している。
【００２２】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、重鎖可変ドメインを含む。そこでＣＤＲ１のアミノ酸配列はＧＦＴＦＳＡＹＲＭＦ（配列番号１０）であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹ（配列番号１２）である。
【００２３】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つのＣＤＲを有する、軽鎖可変ドメインを含む。そこでＣＤＲ１のアミノ酸配列はＴＧＴＳＳＤＶＧＡＹＮＹＶＳ（配列番号１３）であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＤＶＳＮＲＰＳ（配列番号１４）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶ（配列番号１５）である。
【００２４】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する、重鎖可変ドメインを含む。ここでＣＤＲ１のアミノ酸配列はＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧ（配列番号１６）であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＩＹＰＳＧＧＡＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１７）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＧＮＹＦＤＹ（配列番号１８）である。
【００２５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する、軽鎖可変ドメインを含む。ここでＣＤＲ１のアミノ酸配列はＳＧＥＫＬＧＤＥＹＡＳ（配列番号１９）であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＱＤＮＫＲＰＳ（配列番号２０）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＱＡＷＤＳＳＴＬＬ（配列番号２１）である。
【００２６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する、する重鎖可変ドメインを含む。ここでＣＤＲ１のアミノ酸配列はＧＦＴＦＳＷＹＶＭＧ（配列番号２２）であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＩＹＰＱＧＧＡＴＳＹＡＤＳＶＫ（配列番号２３）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＧＮＹＦＤＹ（配列番号２４）である。
【００２７】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する、軽鎖可変ドメインを含む。ここでＣＤＲ１のアミノ酸配列はＲＡＳＱＳＶＳＳＮＹＦＧ（配列番号２５）であり、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号２６）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＱＱＦＤＳＬＰＬＴ（配列番号２７）である。
【００２８】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１０】
2019506863.tif 000012
（配列番号２８）。ＣＤＲには下線を付している。いくつかの例では、ＬＬ（太字）は、ＡＡのような他の残基に変異されてもよい。
【００２９】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１１】
2019506863.tif 000013
（配列番号２９）。ＣＤＲには下線を付している。
【００３０】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１２】
2019506863.tif 000014
（配列番号３０）。ＣＤＲには下線を付している。いくつかの例では、ＬＬ（太字）は、ＡＡのような他の残基に変異されてもよい。
【００３１】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１３】
2019506863.tif 000015
（配列番号３１）。ＣＤＲには下線を付している。
【００３２】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１４】
2019506863.tif 000016
（配列番号３２）。ＣＤＲには下線を付している。いくつかの例では、ＬＬ（太字）は、ＡＡのような他の残基に変異されてもよい。
【００３３】
一実施形態では、ＫＤＲと結合するＩｇＧの軽鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１５】
2019506863.tif 000017
（配列番号３３）。ＣＤＲには下線を付している。
【００３４】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列は以下である：
【化１６】
2019506863.tif 000018
（配列番号５７）。ＣＤＲには下線を付している。また下線を２つのシステイン「Ｃ」に付しており、これはＧから変異されている。
【００３５】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、重鎖可変ドメインを含む。ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ以下である：ＧＦＴＦＳＷＹＬＭＫ、ＹＩＧＳＳＧＧＦＴＡＹＡＤＳＶＫＧ、及びＥＤＤＦＧＡＭＤＶ（配列番号５８〜６０）。
【００３６】
一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、軽鎖可変ドメインを含む。そこでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ以下である：ＲＡＳＱＴＶＳＫＹＦＮＷ、ＡＴＳＴＬＱＳ、及びＱＱＳＹＴＴＰＷＴ（配列番号６１〜６３）。
【００３７】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化１７】
2019506863.tif 000019
（配列番号６４）。ＣＤＲには下線を付している。
【００３８】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの重鎖のアミノ酸配列は以下である：
【化１８】
2019506863.tif 000020
（配列番号６６）。ＣＤＲには下線を付している。また下線を２つのアラニン［ＡＡ］に付しており、これは、ロイシンＬＬから変異されている。
【００３９】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化１９】
2019506863.tif 000021
（配列番号６５）。ＣＤＲには下線を付している。
【００４０】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は以下である：
【化２０】
2019506863.tif 000022
（配列番号６７）。ＣＤＲには下線を付している。
【００４１】
本発明はまた、二重特異性結合タンパク質の、例えば、限定するものではないが、画像化剤、治療剤または細胞傷害性剤へのコンジュゲートを提供する。
【００４２】
本発明はさらに、二重特異性結合タンパク質及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００４３】
一実施形態では、ヒトＰＤＬ１及びヒトＫＤＲに結合することができる融合タンパク質が提供される。融合タンパク質は、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する部分及びヒトＫＤＲに結合する部分を含んでもよい。一実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する融合タンパク質の部分は、抗体またはそのＰＤ−Ｌ１結合断片である。一実施形態では、ヒトＫＤＲに結合する融合タンパク質の部分は、抗体またはそのＫＤＲ結合断片である。一実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する融合タンパク質の部分は、抗体またはそのＰＤ−Ｌ１結合断片であり、ヒトＫＤＲに結合する融合タンパク質の部分は、抗体またはそのＫＤＲ結合断片である。
【００４４】
本明細書に開示される有効量の二重特異性抗体またはその断片を投与することを含む、対象におけるヒトＰＤ１とヒトＰＤ１Ｌとの相互作用を阻害する方法を提供する。本明細書に開示される二重特異性抗体もしくはその断片、または本明細書に開示される融合タンパク質の有効量を投与することを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１によって媒介される免疫抑制を阻害する方法がさらに提供される。
【００４５】
ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する細胞または組織に対する免疫応答を刺激する方法であって、有効量の本明細書中に開示される二重特異性抗体もしくはその断片、または本明細書に開示される融合タンパク質を対象に投与することを含む方法が、さらに提供される。ある特定の実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する細胞または組織は、新生物細胞または感染細胞である。
【００４６】
本発明の二重特異性抗体またはその断片の有効量と細胞を接触させることを含む、ヒトＫＤＲまたはマウスＫＤＲの活性化を中和する方法を提供する。
【００４７】
また、本発明の二重特異性抗体またはその断片の有効量を対象に投与することを含む、血管新生を阻害する方法も提供される。
【００４８】
本発明の二重特異性抗体またはその断片の有効量を対象に投与することを含む、腫瘍増殖を低減させる方法も提供される。
【００４９】
本明細書中に開示される二重特異性抗体またはその断片の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、腫瘍性疾患が、肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、グリア芽細胞腫、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌及び膵臓癌からなる群より選択される方法が本明細書で開示される。
【００５０】
本明細書において、本発明の以下の番号付けされた非限定的な実施形態が提供される。
１．ヒトＰＤＬ１に結合する第１の領域及びヒトＫＤＲに結合する第２の領域を含む二重特異性結合タンパク質。
２．二重特異性抗体である、実施形態１の二重特異性結合タンパク質。
３．融合タンパク質である、実施形態１の二重特異性結合タンパク質。
４．ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ及びｓｃＦｖを含む二重特異性抗体。
５．ＰＤ−Ｌ１と結合するＩｇＧ及びＫＤＲと結合するｓｃＦｖを含む、実施形態４に記載の二重特異性抗体。
６．ＫＤＲに結合するＩｇＧ及びＰＤ−Ｌ１と結合するｓｃＦｖを含む、実施形態４の二重特異性抗体。
７．ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変ドメインを含み、そこでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０〜１２、またはそれぞれ配列番号５８〜６０である、実施形態５または６に記載の二重特異性抗体。
８．ヒトＰＤ−Ｌ１と結合し、３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインを含み、そこでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１３〜１５、またはそれぞれ配列番号６１〜６３である、実施形態５または６の二重特異性抗体。
９．ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインを含み、そこでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１６〜１８である、実施形態５または６に記載の二重特異性抗体。
１０．ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインを含み、そこでアミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９〜２１である、実施形態５または６に記載の二重特異性抗体。
１１．ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する重鎖可変ドメインを含み、そこでアミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２２〜２４である、実施形態５または６に記載の二重特異性抗体。
１２．ヒトＫＤＲと結合し、３つのＣＤＲを有する軽鎖可変ドメインを含み、そこでアミノ酸配列ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２５〜２７である、実施形態５または６に記載の二重特異性抗体。
１３．重鎖及び軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖が、配列番号３４及び３１、配列番号３０及び３５、配列番号３６及び３１、配列番号３０及び３７、配列番号３８及び３３、配列番号３２及び３９、配列番号４０及び３３、配列番号３２及び４１、配列番号４２及び２９、配列番号２８及び４３、配列番号４４及び２９、配列番号２８及び４５、配列番号４６及び２９、配列配列番号２８及び４７、配列番号４８及び２９、配列番号２８及び４９、配列番号５１及び５０、配列番号５２及び５０、配列番号５３及び５０、配列番号５４及び２９、配列番号５５及び２９、ならびに配列番号５６及び２９からなる群より選択される重鎖／軽鎖対のそれぞれの配列を含む、実施形態５または６の二重特異性抗体。
１４．免疫抑制または血管形成を低減させる必要がある患者を治療する方法であって、免疫抑制または血管新生のそのような低減を必要とする患者に、実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質または実施形態４〜１３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質を投与することを含む、方法。
１５．癌の治療方法であって、それを必要とする患者に実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質または実施形態４〜１３のいずれか１つの二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
１６．癌が、肺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、グリア芽細胞腫、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、及び膵臓癌からなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。
１７．実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質、実施形態４〜１３のいずれか１つの二重特異性抗体、またはそのポリペプチド鎖をコードする単離された核酸分子。
１８．実施形態１７の核酸分子を含むベクター。
１９．実施形態１８のベクターを含む培養宿主細胞。
２０．核酸分子の発現を可能にする条件下で実施態様１９の宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドを産生する方法。
２１．実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質、または実施形態４〜１３のいずれか１つの二重特異性抗体のコンジュゲートであって、二重特異性結合タンパク質または二重特異性抗体が、造影剤、治療剤、及び細胞傷害剤からなる群より選択される剤にコンジュゲートされる、コンジュゲート。
２２．医薬組成物であって、
実施形態１〜３のいずれか１つの二重特異性結合タンパク質、実施形態４〜１３のいずれか１つの二重特異性抗体、または実施形態２１のコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【００５１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特長、目的、及び利点は、記載及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、ＰＤ−Ｌ１結合領域及びＫＤＲ結合領域を含む二重特異性抗体を構築し得る４つの可能な様式を示す。それぞれの場合において、二重特異性抗体は、他方の結合領域を含むｓｃＦｖに共有結合した結合領域の１つを含むＩｇＧを含む。ＩｇＧは、従来の２アーム抗体描写を用いて示されている。ｓｃＦｖは細長い楕円形である。図１Ａは、ＩｇＧ重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されたｓｃＦｖを示す。図１Ｂは、ＩｇＧ軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されたｓｃＦｖを示す。図１Ｃは、ＩｇＧ軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されたｓｃＦｖを示す。図１Ｄは、ＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されたｓｃＦｖを示す。
【図２】Ｄ７Ａ８と称されるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ａ１と称されるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３４及び３１）を示す。
【図３】Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ａ１と称されるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０及び３５）を示す。
【図４】Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ａ１と称されるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３６及び３１）を示す。
【図５】Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ａ１と称されるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３０及び３７）を示す。
【図６】Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３８及び３３）を示す。
【図７】Ｄ７Ａ８と称されるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２及び３９）を示す。
【図８】Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４０及び３３）を示す。
【図９】Ｄ７Ａ８と称されるＰＤ−Ｌ１特異的ｓｃＦｖが、Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３２及び４１）を示す。
【図１０】Ｂ１Ａ１と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４２及び２９）を示す。
【図１１】Ｂ１Ａ１と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８及び４３）を示す。
【図１２】Ｂ１Ａ１と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４４及び２９）を示す。
【図１３】Ｂ１Ａ１と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８及び４５）を示す。
【図１４】Ｂ１Ｃ４Ａ７と称されるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＰＤ−Ｌ１特異的ＩｇＧ抗体の重鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４６及び２９）を示す。
【図１５】Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖定常ドメインのカルボキシ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８及び４７）を示す。
【図１６】Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４８及び２９）を示す
【図１７】Ｂ１Ｃ４Ａ７と呼ばれるＫＤＲ特異的ｓｃＦｖが、Ｄ７Ａ８と呼ばれるＫＤＲ特異的ＩｇＧ抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ末端に連結されている二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８及び４９）を示す。
【図１８】ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の構造を示す。抗ＶＥＧＦＲ２抗体Ｂ１Ａ１（ヒト、ラット及びサルのＶＥＧＦＲ２に結合）及びＢ１Ｃ４Ａ７（ヒト、マウス、ラット及びサルのＶＥＧＦＲ２に結合）を、従来のＩｇＧ１として用いた。抗ＰＤＬ１抗体Ｄ７Ａ８（マウス、ラット及びサルのＰＤＬ１への結合）を一本鎖可変断片に再フォーマットし、Ｂ１Ａ１またはＢ１Ｃ４Ａ７のいずれかのｃ末端に付加した。「ＬＡＬＡバージョン」とは、２つのロイシン残基（例えば、上記の配列番号２８、３０、及び３２のＬＬの太字）を２つのアラニン（ＡＡ）で置換することによってＣＨ２領域が変異した抗体を意味する。
【図１９】プロテインＡ精製後の二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２０−１】ＵＰＬＣシステムにおけるプロテインＡ精製二重特異性抗体のサイズ排除クロマトグラム（２８０ｎｍでのＵＶトレース）を示す。
【図２０−２】ＵＰＬＣシステムにおけるプロテインＡ精製二重特異性抗体のサイズ排除クロマトグラム（２８０ｎｍでのＵＶトレース）を示す。
【図２１−１】ＰＢＳ緩衝液中の二重特異性抗体のＤＳＣ走査の結果を示す。
【図２１−２】ＰＢＳ緩衝液中の二重特異性抗体のＤＳＣ走査の結果を示す。
【図２２】マウス血清中において３７℃で５日間処理した二重特異性抗体のウエスタンブロッティングの結果を示す。
【図２３】ヒト及びマウスのＶＥＧＦＲ２、ならびにヒト及びマウスのＰＤＬ１に対するＥＣ５０を決定するための二重特異性抗体Ａ７−Ａ８の用量応答ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２４】ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１−ＰＤ１についての二重特異性抗体Ａ７−Ａ８のＩＣ５０を決定するための用量応答ブロッキングＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２５】細胞発現のヒトまたはマウスＶＥＧＦＲ２及びヒトまたはマウスＰＤＬ１への結合を示す。
【図２６】表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって調べられた二重特異性抗体Ａ７−Ａ８と受容体ｈＶＥＧＦＲ２及びｈＰＤＬ１との相互作用を示す。
【図２７】固定されたｈＶＥＧＦＲ２表面上で複合体、及び交差結合性ＥＬＩＳＡの溶液中の複合体を示すスキームを示す。
【図２８】二重特異性抗体Ａ７−Ａ８が、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に同時に結合できることを、交差結合性ＥＬＩＳＡによって検査して示す。
【図２９】二重特異性抗体Ａ７−Ａ８によるＫＤＲ−ＰＡＥ（ｈＶＥＧＦＲ２）及びＥＯＭＡ（ｍＶＥＧＦＲ２）におけるＶＥＧＦＲ２及び下流分子のＶＥＧＦ刺激性リン酸化の阻害を示す。
【図３０】二重特異性抗体Ａ７−Ａ８の存在下におけるサイトカインＩＬ２及びＩＮＦγの分泌を示す。
【図３１】ヒト及びマウスＶＥＧＦＲ２、ならびにヒト及びマウスＰＤＬ１に対するＥＣ５０を決定するための二重特異性抗体Ａ１−Ａ８の用量応答ＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図３２】ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１−ＰＤ１についての二重特異性抗体Ａ１−Ａ８のＩＣ５０を決定するための用量応答ブロッキングＥＬＩＳＡ結果を示す。
【図３３】ヒトまたはマウスＶＥＧＦＲ２及びヒトまたはマウスＰＤＬ１を発現する細胞への結合を示す。
【図３４】表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって調べられた二重特異性抗体Ａ１−Ａ８と受容体ｈＶＥＧＦＲ２及びｈＰＤＬ１との相互作用を示す。
【図３５】二重特異性抗体Ａ１−Ａ８が、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に同時に結合しできることを、交差結合性ＥＬＩＳＡによって検査して示す。
【図３６】ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡの１．５μｇ／ｍｌ（７．５ｎＭ）の存在下において、ＶＥＧＦＲ２及びＭＡＰＫの両方のリンタンパク質バンドは、抗体処理なしのバンドよりもかなり弱かったことが示す図である。
【図３７】二重特異性抗体Ａ１−Ａ８及びＡ７−Ａ８の存在下におけるサイトカインＩＬ２及びＩＮＦγの分泌を示す。
【図３８】ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）に関するＣＴ２６試験結果を示す。
【図３９】図３９Ａ及び３９Ｂは、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）に関するＭＣ３８試験結果を示す。
【図４０】分解されたバンドが観察されたＢｓＡｂ（Ｂ１Ａ１−Ａ１１）及びＢｓＡｂ（Ｂ１Ｃ４Ａ７−Ａ１１）バリアントについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【図４１】配向を変化させた後に分解されたバンドが観察されなかったＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）及びＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）バリアントについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【図４２】ＰＤＬ１及びＶＥＧＦＲ２への結合を示す。
【図４３】リガンドと受容体の遮断相互作用を示す。
【図４４−１】ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）、ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）＿３０及びＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）＿３０ｃｃの共通の軽鎖配列（配列番号５０）ならびに３つの重鎖配列（配列番号５１〜５３）を示す。
【図４４−２】ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）、ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）＿３０及びＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）＿３０ｃｃの共通の軽鎖配列（配列番号５０）ならびに３つの重鎖配列（配列番号５１〜５３）を示す。
【図４５−１】ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）、ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）＿３０及びＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）＿３０ｃｃの共通の軽鎖配列（配列番号２９）及び３つの重鎖配列（配列番号５４〜５６）を示す。
【図４５−２】ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）、ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）＿３０及びＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）＿３０ｃｃの共通の軽鎖配列（配列番号２９）及び３つの重鎖配列（配列番号５４〜５６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
免疫細胞上のＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用は、免疫細胞による増殖及びサイトカイン産生を阻害する。ＰＤ−Ｌ１はまた、癌を含む種々の組織において誘導性であり、かつアップレギュレートされる。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１はともに、免疫抑制において役割を果たす。本明細書において、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、ヒトＰＤ−１とのその相互作用を遮断する二重特異性抗体またはそのような二重特異性抗体の抗原結合断片などの新規な二重特異性結合タンパク質が提供される。
【００５４】
二重特異性抗体はまた、ヒトＫＤＲに結合し、ヒトＶＥＧＦとのその相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＫＤＲへのリガンド結合（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｅの１つ以上の結合）を遮断する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＫＤＲの活性化を中和する。二重特異性抗体は、例えば、固形及び非固形腫瘍、ならびに過剰増殖性障害を含む腫瘍性疾患を治療するために使用され得る。したがって、ＫＤＲの活性化を中和する方法、腫瘍関連血管新生の阻害を含む腫瘍増殖を阻害する方法、及び血管新生関連障害を治療する方法が提供される。
【００５５】
また、ＰＤＬ１及びＫＤＲに結合する二重特異性抗体または抗体断片を含むキットも提供される。
【００５６】
二重特異性抗体は、ＫＤＲ阻害の任意の特定の機構によって制限されない。１つの二重特異性抗体が従う機構は、必ずしも別の二重特異性抗体が従う機構と同じではない。いくつかの可能性のある機構としては、ＶＥＧＦリガンドのＫＤＲの細胞外結合ドメインへの結合の防止、及び受容体の二量体化またはオリゴマー化の防止が含まれる。しかし、他の機構を排除することはできない。
【００５７】
二重特異性抗体は、ＫＤＲの活性化を阻害する。ＫＤＲ阻害の１つの尺度は、受容体のチロシンキナーゼ活性の低下である。チロシンキナーゼ阻害は、受容体の自己リン酸化レベルを測定するなどの周知の方法を用いて決定され得る。ＫＤＲの阻害は、天然または合成のＫＤＲ基質及びＫＤＲシグナル伝達経路の他の成分のリン酸化事象の阻害または調節によっても観察され得る。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットでホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出され得る。チロシンキナーゼ活性のいくつかのアッセイは、Ｐａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．，２８３：１４３３−４４（１９９７）及びＢａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．,Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．,６２：１４３−５０（１９９８）に記載されている。
【００５８】
インビボアッセイも利用することができる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の有無の下で受容体リガンドで刺激された細胞株を用いた分裂促進アッセイによって観察することができる。例えば、ＶＥＧＦで刺激したＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ）を用いてＫＤＲ阻害をアッセイしてもよい。別の方法は、例えば、マウスに注射されたヒト腫瘍細胞を用いて、ＶＥＧＦ発現腫瘍細胞の増殖の阻害について試験することを含む。例えば、米国特許第６，３６５，１５７号（Ｒｏｃｋｗｅｌｌら）を参照のこと。
【００５９】
本明細書中に開示される二重特異性結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）は、当該技術分野で公知の方法によって作製され得る。そのような方法は、結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）またはその一部をコードする核酸の使用を含み得る。本明細書に開示される結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）を作製するために使用され得るベクターとしては、ｐＢｈ１（Ｄｙａｘ）またはｐｃＤＮＡ（商標）３．４  ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のようなＨＥＫ２９３細胞においてタンパク質を発現するのに適した一過性発現ベクターが挙げられる。ＣＨＯ−Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中のｐＣＨＯ．１またはＣＨＯ−Ｋ（Ｌｏｎｚａ）中のＧＳベクターのような、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現に適した安定な発現ベクター。当業者は、本明細書中に開示される結合タンパク質（例えば、二重特異性抗体）またはその一部を作製するためのガイダンスについて、以下の刊行物を参考にしてもよい：Ｌｕ  Ｄ  ａｎｄ  Ｚｈｕ  Ｚ．（２０１４）；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＩｇＧ−ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｈｕｍａｎｎａ  ｐｒｅｓｓ；ＩＳＳＮ  １０６４−３７４５、Ｍａｒｖｉｎ  Ｊ．Ｓ．，Ｚｈｕ  Ｚ．（２００６）Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｕａｌ−ｍｏｄａｌｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｋｉｌｌｉｎｇ  ｔｗｏ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｓｔｏｎｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．９，１８４−１９３、Ｌｕ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｋｏｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，１９６６５−１９６７２、Ｄｅｍａｒｅｓｔ  Ｓ．Ｊ（２０１１）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｍＡｂｓ  ３，３３８−３５１、Ｓｐｉｅｓｓ  Ｃ．，Ｚｈａｉ  Ｑ．，Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．（２０１５）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７，９５−１０６、Ｃｒｏａｓｄａｌｅ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ１  ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＧＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｕｍｏ��  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６，２０６−２１８。
【００６０】
本明細書に記載の重鎖及び軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの特定方式に従って特定される。最初の２つの重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲについて別個だが重複する位置を提供する、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの一般の方式に従って特定される。多数の重鎖及び軽鎖の比較は、ＣＤＲ配列の多くの間で顕著な類似性を示す。したがって、多くのＣＤＲが配列間で混合され、合わせられることが予想されるであろう。
【００６１】
本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質または二重特異性抗体は、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入及び／または付加を有してもよい。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体またはタンパク質は、上で開示した重鎖可変ドメインの１つ及び上記の軽鎖可変ドメインの１つを含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体またはその結合断片は、上で開示された可変ドメイン配列のうちの１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する上記開示の可変ドメインの１つ以上を含む。エフェクター機能を減少させるために、（ＣＨ２ドメインにおける）ＩｇＧ１の２３４または２３５に対応する位置のロイシンを、アラニン（例えば、上記のＬＡＬＡバージョンまたはＬＡＬＡ変異）に突然変異させてもよい。さらに、熱安定性を改善するために、２つの可変ドメインのような２つのドメイン間に１つ以上のジスルフィド結合を導入するための突然変異を作製してもよい。例えば、配列番号５７の４４位及び２４８位の残基に対応する残基を、ジスルフィド結合を導入するようにシステインに変異させてもよい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特に示すか文脈上明らかでない限り、全抗体及び任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、一実施形態では、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、を含む糖タンパク質またはその抗原結合断片を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）及び重鎖定常領域からなる。ある特定の天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。ある特定の天然に存在する抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されており、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域とともに点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は最も広い意味で使用され、具体的には所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を包括する。例としては、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「抗体断片」とは、インタクトな抗体の抗原結合及び／もしくは可変領域ならびに／またはＦｃＲ結合能を保持する抗体のＦｃ領域を一般に含む、インタクトな抗体の一部を含んでもよい。抗体断片の例としては、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。好ましくは、抗体断片は、ＩｇＧ重鎖の定常領域全体を保持し、ＩｇＧ軽鎖を含む。
【００６４】
本明細書で使用する抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、抗原（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１またはＫＤＲ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分／断片」という用語に包含される結合断片の例にとしては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、ならびに（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）が挙げられる。単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または合成リンカーによって連結された２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせは、抗原に結合することができる場合、抗体の抗原結合ドメインを含み得る。
【００６５】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかし、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図するものではない。「ヒト」抗体及び「完全ヒト」抗体という用語は、同義語として使用される。
【００６６】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体、例えば、マウス抗体のＣＤＲドメインの外のアミノ酸の一部、大部分または全部が、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。ヒト化型の抗体の一実施形態では、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸のほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のある程度、ほとんどまたは全てのアミノ酸は不変である。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらが特定の抗原に結合する抗体の能力を無効にしない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。
【００６７】
「キメラ抗体」とは、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体、例えば可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体由来である抗体を指す。「ハイブリッド」抗体とは、マウス（親）重鎖及びヒト化軽鎖（またはその逆）などの異なる型の重鎖及び軽鎖を有する抗体を意味する。
【００６８】
「二重特異性」とは、ＰＤ−Ｌ１及びＫＤＲの両方に結合するタンパク質（例えば、抗体）を指す。「二重特異性抗体」とは、２つの異なる重鎖／軽鎖の対を有する人工ハイブリッド抗体であり、異なる抗原に対して特異性を有する２つの抗原結合部位を生じる。二重特異性抗体は、タンパク質の融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、１５４７−１５５３を参照のこと。
【００６９】
本明細書に記載の二重特異性分子は、当該分野で公知の他の方法を使用して、構成的結合特異性をコンジュゲートさせることによって調製され得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、次いで、互いにコンジュゲートされてもよい。共有結合のために様々なカップリング剤または架橋剤を使用してもよい。例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：８６４８）が挙げられる。他の方法としては、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８,１１８−１３２、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５）に記載される方法が挙げられる。好ましい複合化剤は、ＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。抗体はまた、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介してコンジュゲートされてもよい。特に好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に奇数個、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【００７０】
あるいは、両方の結合部分を同じベクターにコードし、発現させて同じ宿主細胞中に組み立ててもよい。本明細書に記載の二重特異性分子は、２つの単鎖抗体を含む単鎖分子、または少なくとも２つの抗体鎖を有する複合体、またはそれらの組み合わせであり得る。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号、及び米国特許第５，４８２，８５８号に見出され得る。特異的標的への二重特異性分子の結合は、当該分野で公知であるか、または本明細書に記載の、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウェスタンブロットアッセイなどの当該分野で認識される方法を用いて確認され得る。
【００７１】
「受容体を阻害する」とは、例えば、受容体の内因性キナーゼ活性を低減及び／または不活性化することにより、受容体がシグナルを伝達する能力を低減及び／または不活性化することを意味する。
【００７２】
「同一性」とは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れた、２つのアミノ酸または核酸配列によって共有される同一の位置の数またはパーセンテージを指す。
【００７３】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ポリマー中のアミノ酸残基の配置を説明するために互換的に使用される。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、標準的な２０の天然に存在するアミノ酸、それに加えて希アミノ酸及び合成アミノ酸類似体から構成され得る。それらは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、任意のアミノ酸鎖であってもよい。
【００７４】
ある場合には、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位で分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するそれらの効果において著しく異なることのない置換基を選択することにより、アミノ酸置換を行うことができる。例えば、天然に存在する残基は、側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：（１）疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）、（２）中性親水性アミノ酸（システイン、セリン及びトレオニン）、（３）酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、（４）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、及びアルギニン）、（５）鎖の配向に影響を及ぼすアミノ酸（グリシン及びプロリン）、ならびに（６）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）。これらの群内でなされた置換は、保存的置換とみなされ得る。置換の例としては限定するものではないが、アラニンに対するバリン、アルギニンに対するリシン、アスパラギンに対するグルタミン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、システインに対するセリン、グルタミンに対するアスパラギン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシンに対するプロリン、ヒスチジンに対するアルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するトレオニン、トレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、及び／またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられる。
【００７５】
配列類似性を決定するための方法及びコンピュータプログラムは公的に利用可能であり、これには、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、及びＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が挙げられる。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、類似性を決定するために用いてもよい。ＢＬＡＳＴプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；ＢＬＡＳＴ  ２．０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）から公的に入手可能である。配列比較において、これらの方法は、様々な置換、欠失及び他の修飾を考慮する。保存的置換としては典型的には、以下の群内の置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【００７６】
本明細書で提供される二重特異性抗体としてはまた、直接的突然変異、親和性成熟方法、ファージディスプレイ、または鎖シャッフリングによって結合特性が改善された抗体も含まれる。親和性及び特異性は、ＣＤＲを変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることによって改変または改善され得る。ＣＤＲは様々な方法で変異されている。１つの方法は、そうでなければ同一の抗原結合部位の集団において、全ての２０個のアミノ酸が特定の位置に見出されるように、個々の残基または残基の組合せを無作為化することである。あるいは、エラープローンＰＣＲ法（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．,２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照のこと）によって、ある範囲のＣＤＲ残基にわたって突然変異が誘導される。例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のミューテーター株で増殖することができる（例えば、Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．,２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照のこと）。これらの突然変異誘発法は、当業者に公知の多くの方法の実例である。
【００７７】
免疫原性を最小にするために、ヒト定常ドメイン配列を含む二重特異性抗体が好ましい。二重特異性抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのような任意の免疫グロブリンクラス、及びそのサブクラスのメンバーであってもよく、そのメンバーを含んでもよく、またはそのメンバーを組み合わせてもよい。抗体クラスは、エフェクター機能（例えば、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を最適化するように選択してもよい。
【００７８】
二重特異性結合タンパク質のある特定の実施形態は、ＰＤ−Ｌ１−及びＫＤＲ結合抗体断片の使用を含む。Ｆｖは、６つの超可変ループ（ＣＤＲ）全てを含む完全な重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む最小の断片である。定常ドメインを欠いており、可変ドメインは非共有結合的に会合される。重鎖及び軽鎖は、ＶＨ及びＶＬドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするリンカーを用いて、単一のポリペプチド鎖（「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」）となるように連結されてもよい。一実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３である。ｓｃＦｖ断片は、抗体全体の定常ドメインを欠くので、抗体全体よりもかなり小さい。ｓｃＦｖ断片はまた、ある特定の実施形態において望ましくない他の生体分子との正常な重鎖定常ドメイン相互作用をもたない。
【００７９】
ＶＨ、ＶＬ、及び必要に応じてＣＬ、ＣＨ１または他の定常ドメインを含む抗体の断片もまた、二重特異性結合タンパク質において使用することができる。パパイン消化によって生成される抗体の一価断片は、Ｆａｂと呼ばれ、重鎖ヒンジ領域を欠く。Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれるペプシン消化によって生成された断片は、重鎖ヒンジを保持し、二価である。そのような断片はまた、組換え生産されてもよい。多くの他の有用な抗原結合抗体断片が、当該技術分野で公知であり、これには、限定するものではないが、ダイアボディー、トリアボディー、単一ドメイン抗体、及び他の一価及び多価型が挙げられる。
【００８０】
一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＰＤ−Ｌ１結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１という結合速度定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋｏｎ）を有する。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、１０２Ｍ-１ｓ-１〜１０３Ｍ−１ｓ−１、１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０４Ｍ−１ｓ−１、１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０５Ｍ−１ｓ−１、または１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０６Ｍ−１ｓ−１という結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００８１】
一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＫＤＲ結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１という結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。ある実施形態では、ＫＤＲ結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、１０２Ｍ-１ｓ-１〜１０３Ｍ−１ｓ−１、１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０４Ｍ−１ｓ−１、１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０５Ｍ−１ｓ−１、または１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０６Ｍ−１ｓ−１という結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【００８２】
一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＰＤ−Ｌ１結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、多くとも約１０−３ｓ−１、多くとも約１０−４ｓ−１、多くとも約１０−５ｓ−１、または多くとも約１０−６ｓ−１という解離速度定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋｏｆｆ）を有する。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、１０−３ｓ−１〜１０−４ｓ−１、１０−４ｓ−１〜１０−５ｓ−１、または１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１という解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００８３】
一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＫＤＲ結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、多くとも約１０−３ｓ−１、多くとも約１０−４ｓ−１、多くとも約１０−５ｓ−１、または多くとも約１０−６ｓ−１という解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。一実施形態では、ＫＤＲ結合領域は、表面プラズモン共鳴によって測定して、１０−３ｓ−１〜１０−４ｓ−１、１０−４ｓ−１〜１０−５ｓ−１、または１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１という解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【００８４】
一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＰＤ−Ｌ１結合領域は、多くとも約１０−７Ｍ、多くとも約１０−８Ｍ、多くとも約１０−９Ｍ、多くとも約１０-１０Ｍ、多くとも約１０−１１Ｍ、多くとも約１０−１２Ｍ、または多くとも１０−１３Ｍという解離定数（ＫＤ）を有する。一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＰＤ−Ｌ１結合領域は、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−１２Ｍ、または１０−１２Ｍ〜１０-１３Ｍというその標的に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００８５】
一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＫＤＲ結合領域は、多くとも約１０−７Ｍ、多くとも約１０−８Ｍ、多くとも約１０−９Ｍ、多くとも約１０-１０Ｍ、多くとも約１０−１１Ｍ、多くとも約１０−１２Ｍ、または多くとも１０−１３Ｍという解離定数（ＫＤ）を有する。一実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質のＫＤＲ結合領域は、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−１２Ｍ、または１０−１２Ｍ〜１０-１３Ｍというその標的に対する解離定数（ＫＤ）を有する。
【００８６】
本明細書に記載の二重特異性結合タンパク質は、造影剤、治療剤、または細胞傷害剤をさらに含むコンジュゲートであってもよい。一実施形態では、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである。別の実施形態では、放射性標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕまたは１５３Ｓｍである。さらに別の実施形態では、治療剤または細胞傷害剤は、抗代謝物、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン（例えば、免疫刺激性サイトカイン）、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、またはアポトーシス剤である。以下に考察するように、免疫刺激性サイトカインは特に重要である。
【００８７】
ヒトＰＤ−Ｌ１と結合して免疫抑制を阻害し、またヒトＫＤＲにも結合して血管新生を阻害すする分子が提供される。一実施形態では、このような分子は、ヒトＰＤ−Ｌ１と結合する第１抗体のＰＤ−Ｌ１結合ドメインと、ヒトＫＤＲと結合する第２抗体のＫＤＲ結合ドメインとを組み合わせる。
【００８８】
分子のＰＤ−Ｌ１結合部分は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン対のような抗体の抗原結合ドメインであってもよい。適切な抗体重鎖及び軽鎖可変ドメインならびにそれらを含む抗体が本明細書に提供される。二重特異性結合タンパク質のＰＤ−Ｌ１結合部分は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、免疫抑制を遮断する任意の薬剤であってもよい。これらとしては、本明細書に開示される抗体に限定されない抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び断片、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１の天然リガンドであるヒトＰＤ１に由来するペプチド及びタンパク質が挙げられる。本明細書中に開示されるように、ＰＤ−Ｌ１結合領域は、ヒトＫＤＲに結合する領域に連結される。
【００８９】
したがって、ある特定の実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、ヒトＰＤ１に対する結合を遮断する領域、及びヒトＫＤＲに結合しヒトＫＤＲに対する結合を遮断する領域を含むハイブリッド分子が提供される。ＰＤ−Ｌ１及びＫＤＲ結合領域は、１つのポリペプチドとしてリンカーによって連結されていてもよい。したがって、ヒトＫＤＲ結合領域に連結されたヒトＰＤ−Ｌ１結合領域が提供される。
【００９０】
本発明の別の態様は、上記の抗体またはその鎖をコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製されるかもしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該分野で周知の他の技術などの標準的な技術によって、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製された場合、核酸は「単離されている」か、または「実質的に純粋にされている」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであることができ、イントロン配列を含んでも、または含まなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【００９１】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）については、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収することができる。核酸を含む核酸及びベクターを用いて、上記の抗体またはその鎖を発現させることができる。
【００９２】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用され得る。しかしながら、等価な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの他の形態も含まれる。
【００９３】
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞に天然に存在しない核酸を含む細胞を指すことが意図され、組換え宿主細胞発現ベクターが導入された細胞であってもよい。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫をも指すことが意図されることを理解すべきである。突然変異または環境の影響に起因して、ある特定の改変が続いた世代で起こる場合があるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではないが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に包含される。
【００９４】
二重特異性結合タンパク質は、予防または治療の目的で哺乳動物において使用される場合、一般に、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが理解される。適切な薬学的に許容される担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、スクロース、ポリソルベート、エタノールなどのうちの１つ以上、及びそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される担体は、二重特異性結合タンパク質の保存可能期間または有効性を高める、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、または緩衝剤をさらに含んでもよい。
【００９５】
本明細書に記載の方法では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質の治療有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与する。本明細書で使用される「投与する」という用語は、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質を、求められる結果を達成し得る任意の方法によって哺乳動物に送達することを意味する。投与は、例えば、静脈内であっても、または筋肉内であってもよい。二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、ヒトへの投与に特に有用であるが、他の哺乳類にも同様に投与してもよい。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、実験動物、家庭内のペット、及び家畜を含むが、これらに限定されないことが意図される。「治療上有効な量」とは、哺乳動物に投与された場合に、所望の治療効果を生じるのに有効な二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質の量を意味する。
【００９６】
二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、腫瘍及び他の腫瘍性疾患を阻害するため、ならびに免疫抑制に関連する他の病的状態を治療するために有用である。治療できる腫瘍としては、原発腫瘍、転移性腫瘍、及び難治性腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍としては、化学療法剤単独、抗体単独、放射線単独、またはそれらの組み合わせによる治療に応答し得ないかまたは耐性である腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍はまた、そのような薬剤を用いた治療によって阻害されるようであるが、治療が中止されてから５年まで、場合によっては１０年以上まで再発する腫瘍も含む。二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、血管新生腫瘍及び血管新生していないか、または実質的に血管新生していない腫瘍の治療に有効である。
【００９７】
処置され得る固形腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫及びリンパ腫が挙げられる。そのような腫瘍のいくつかの例としては、表皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば、頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、例としては、小細胞及び非小細胞肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、及び肝臓腫瘍が挙げられる。他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫及び脳転移、黒色腫、胃腸及び腎癌及び肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽細胞腫、好ましくは多形性グリア芽腫、及び平滑筋肉腫が挙げられる。二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質が有効である血管新生皮膚癌の例としては、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌及び皮膚癌（ヒト悪性ケラチノサイトのような悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することによって治療することができる）が挙げられる。
【００９８】
非固形腫瘍の例としては、サイトカインに対して非応答性の白血病、多発性骨髄腫及びリンパ腫が挙げられる。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病または単球性白血病が挙げられる。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【００９９】
二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質はまた、ウイルス感染の治療に使用される。Ｔ細胞におけるＰＤ−１発現は、ＨＩＶ及びＨＣＶ感染患者におけるウイルス負荷と相関し、ＰＤ−１発現は、枯渇したウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーとして同定されている。例えば、ＰＤ−１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することによって回復され得る、損なわれたエフェクター機能及びＰＤ−１関連Ｔ細胞枯渇を示す。これは、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫の回復をもたらし、拮抗性抗体を用いたＰＤ−１シグナル伝達の遮断が、Ｔ細胞エフェクター機能を回復させることを示す。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断に基づく免疫療法は、腫瘍抗原に対するＴ細胞耐性の崩壊をもたらすだけでなく、ウイルス特異的エフェクターＴ細胞を再活性化させ、慢性ウイルス感染における病原体を根絶する戦略も提供する。したがって、本発明の抗体及びハイブリッドタンパク質は、限定するものではないが、ＨＣＶ及びＨＩＶ、ならびにリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を含む慢性ウイルス感染の治療に有用である。
【０１００】
二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、それを必要とする患者に第二の薬剤とともに有利に投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質を、抗新生物剤とともに対象に投与する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、血管新生阻害剤とともに対象に投与される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、抗炎症剤または免疫抑制剤とともに投与される。
【０１０１】
抗腫瘍剤としては、細胞傷害性化学療法剤、標的化小分子及び生物学的分子、及び放射線が挙げられる。化学療法剤の非限定的な例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、イリノテカン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、インターフェロンアルファ、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソール及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０２】
標的化された小分子及び生物学的分子としては、限定するものではないが、チロシンキナーゼのモジュレーター及び受容体チロシンキナーゼの阻害剤などのシグナル伝達経路の構成要素の阻害剤、及び腫瘍特異的抗原に結合する薬剤が挙げられる。腫瘍形成に関与する成長因子受容体の非限定的な例は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）の受容体、ならびに表皮成長因子受容体ファミリーの受容体、例としては、ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４である。
【０１０３】
ＥＧＦＲアンタゴニストとしては、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲリガンドに結合し、リガンド結合及び／または受容体活性化を阻害する抗体が挙げられる。例えば、薬剤は、他のＥＧＦＲファミリーメンバーとの受容体二量体またはヘテロ二量体の形成を遮断し得る。ＥＧＦＲのリガンドとしては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αアンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）及びベータレグリンが挙げられる。ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲの細胞外部分（リガンドの結合を阻害してもしなくてもよい）に外部的に結合することができ、または内部でチロシンキナーゼドメインに結合することができる。ＥＧＦＲアンタゴニストは、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の成分の機能を阻害することによって、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達を阻害する薬剤をさらに含む。ＥＧＦＲと結合するＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、限定するものではないが、生物学的分子、例えば、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的等価物）、及び小分子、例えば、ＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１０４】
低分子及び生物学的阻害剤としては、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤、例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ及びセツキシマブ、ＨＥＲ２の阻害剤（例えば、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン（トラスツズマブ−ＤＭ１；Ｔ−ＤＭ１）及びペルツズマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体及び断片（例えば、ベバシズマブ）、ＣＤ２０を阻害する抗体（例えば、リツキシマブ、イブリツモマブ）、抗ＶＥＧＦＲ抗体（例えば、ラムシルマブ（ＩＭＣ−１１２１Ｂ）、ＩＭＣ−１Ｃ１１、及びＣＤＰ７９１）、抗ＰＤＧＦＲ抗体、及びイマチニブが挙げられる。小分子キナーゼ阻害剤は、特定のチロシンキナーゼに特異的であることができ、または２つ以上のキナーゼの阻害剤であることができる。例えば、化合物Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ、６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン（ＸＬ６４７、ＥＸＥＬ−７６４７及びＫＤ−０１９としても公知）は、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）及びＥｒｂＢ２を含むいくつかの受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のインビトロ阻害剤であり、ある特定のＴＫＩに対する腫瘍の非応答性を生じる経路に関与する、ＳＲＣキナーゼの阻害剤でもある。本発明の一実施形態では、必要な対象の治療は、式Ｉのロー−キナーゼ阻害剤の投与及びＫＤ−０１９の投与を含む。
【０１０５】
ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）は、経口で生物学的に利用可能な別のＡＴＰ部位競合Ｓｒｃ阻害剤である。ダサチニブ（ｄａｓａｔａｎｉｂ）はまた、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の患者における使用についてＦＤＡが承認した）、ならびにｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、ｃ−ＦＭＳ、ＥｐｈＡ２、及びＳＦＫを標的とする。Ｓｒｃ及びＢｃｒ−Ａｂｌの２つの他の経口チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）及びサラカチニブ（ＡＺＤ０５３０）である。
【０１０６】
一実施形態において、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、慢性ウイルス感染を治療するために抗ウイルス剤と組み合わせて使用される。例えば、ＨＣＶについては、以下の薬剤を使用することができる。ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤としては、限定するものではないが、ボセプレビル、テラプレビル（ＶＸ−９５０）、ＩＴＭＮ−１９１、ＳＣＨ−９００５１８、ＴＭＣ−４３５、ＢＩ−２０１３３５、ＭＫ−７００９、ＶＸ−５００、ＶＸ−８１３、ＢＭＳ７９００５２、ＢＭＳ６５００３２及びＶＢＹ３７６が挙げられる。ＨＣＶ非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）阻害剤としては、限定するものではないが、クレミゾール及び他のＮＳ４Ｂ−ＲＮＡ結合阻害剤、例としては、限定するものではないが、ベンズイミダゾールＲＢＩ（Ｂ−ＲＢＩ）及びインダゾールＲＢＩ（Ｉ−ＲＢＩ）が挙げられる。ＨＣＶ非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）阻害剤としては、限定するものではないが、ＢＭＳ−７９００５２、Ａ−６８９、Ａ−８３１、ＥＤＰ２３９、ＧＳ５８８５、及びＰＰ１４６１が挙げられる。ＨＣＶポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）阻害剤としては、限定するものではないが、ヌクレオシド類似体（例えば、バロピシタビン、Ｒ１４７９、Ｒ１６２６、Ｒ７１２８）、ヌクレオチド類似体（例えば、ＩＤＸ１８４、ＰＳＩ−７８５１、ＰＳＩ−７９７７及び非ヌクレオシド類似体（例えば、フィリブビル、ＨＣＶ−７９６、ＶＣＨ−７５９、ＶＣＨ−９１６、ＡＮＡ５９８、ＶＣＨ−２２２（ＶＸ−２２２）、ＢＩ−２０７１２７、ＭＫ−３２８１、ＡＢＴ−０７２、ＡＢＴ−３３３、ＧＳ９１９０、ＢＭＳ７９１３２５）が挙げられる。リバビリンまたはリバビリン類似体、例えば、Ｔａｒｉｂａｖｉｒｉｎ（ビラミジン、ＩＣＮ３１４２）、ミゾリビン（Ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ）、メリメポジブ（Ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ）（ＶＸ−４９７）、ミコフェノール酸モフェチル及びミコフェノール酸塩を使用することができる。
【０１０７】
本発明の二重特異性抗体が、第２の薬剤とともに投与される場合、第１及び第２の薬剤は、順次投与されてもまたは同時に投与することができる。各薬剤は、１回または複数回の用量で投与することができ、この用量は、限定するものではないが、１日２回、毎日、１週間、２週間ごと、及び毎月など、任意のスケジュールで投与することができる。
【０１０８】
本発明は、二重特異性抗体の補助投与も含む。補助的投与は、疾患または疾患の症状を治療するために既に投与されている第１の薬剤に加えて、第２の薬剤が患者に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、補助投与は、第１の薬剤の投与が疾患または疾患の症状を治療しなかったかまたは十分に治療しなかった患者に、第２の薬剤を投与することを含む。他の実施形態では、補助投与は、疾患が第１の薬剤の投与によって効果的に治療された患者に第２の薬剤を投与することを含む。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質の用量を、毎日、隔日、２日おき、３日ごと、週１回、週２回、週３回、または２週ごとに１回対象に投与する。他の実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質の２、３または４用量を、毎日、２日おき、３日ごと、１週間に１回または２週間に１回、対象に投与する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体のような二重特異性結合タンパク質の用量（複数可）は、２日、３日、５日、７日、１４日または２１日間投与される。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質の用量は、１ヶ月、１．５ヶ月、２ヶ月、２．５ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれ以上にわたって投与される。
【０１１０】
投与の方法としては、限定するものではないが、非経口、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、口腔内、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、経粘膜、直腸に、吸入による、または局所に、特に耳、鼻、目、または皮膚への投与方法が挙げられる。投与方式は施術者の裁量に委ねられる。ほとんどの場合、投与は、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質の血流への放出をもたらす。眼疾患の治療のためには、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質の硝子体内投与が好ましい。
【０１１１】
特定の実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質を局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではないが、局所注入、局所適用、注射、カテーテル、またはインプラントによって達成されてもよく、前記インプラントは、多孔性、非多孔性または例えば、サイラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜を含むゼラチン質材料、またはファイバーである。そのような場合、投与は、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質を血流中に実質的に放出させることなく、局所組織を選択的に標的し得る。
【０１１２】
肺投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器の使用、及びエアロゾル化剤を用いた製剤の使用、またはフルオロカーボンもしくは合成肺サーファクタントの灌流を介して使用することができる。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、従来の結合剤及びトリグリセリドなどのビヒクルを用いて座薬として製剤化される。
【０１１３】
別の実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、小胞、特にリポソームに送達される（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３、Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと、一般的には同書を参照のこと）。
【０１１４】
別の実施形態では、二重特異性抗体などの二重特異性結合タンパク質は、制御放出系で送達される（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５〜１３８（１９８４）を参照のこと）。制御放出系の例は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３の総説で考察されている。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用してもよい（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１、またＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照のこと）。
【０１１５】
上記の投与スケジュールは、例示のためにのみ提供されており、限定的であるとみなされるべきではない。当業者は、どのような用量及び投与スケジュールが適切であるかを容易に理解するであろう。
【０１１６】
本明細書に開示された原理の変形が当業者によってなされ得ること、及びそのような変更が本開示の範囲内に含まれることが意図されることが理解され、期待されるべきである。
【０１１７】
本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物は、本開示が関連する最新技術をより完全に説明するために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。以下の実施例は、本開示をさらに例示説明するが、決して本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１１８】
米国仮特許出願第６１／７１０，４２０号、６２／０６１，０９７号、６１／９２７，９０７号ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６３７５４号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１６５７号、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５４５６９号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１  ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対する二重特異性抗体の発現及び物理的特徴付け
本実施例は、ＨＥＫ２９３におけるＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対する二重特異性抗体の一過性発現ならびにプロテインＡによる精製、凝集分析（ＳＥＣ−ＵＰＬＣによる）、血清安定性試験及び熱安定性試験（ＤＳＣを用いたＴｍ測定）を記載する。
【０１２０】
概要
抗体λＲ３Ｂ１（ＶＥＧＦＲ２に対する）を、固定化したＶＥＧＦＲ２上でパンニングすることによって、Ｄｙａｘ  Ｆａｂ  ３１０ファージミドライブラリーから直接単離した。軽鎖プールをλＲ３Ｂ１の重鎖と対にすることによって軽鎖シャッフリングライブラリーを構築した。ヒトＶＥＧＦＲ２及びマウスＶＥＧＦＲ２の両方でスクリーニングした後、ヒトＶＥＧＦＲ２及びマウスＶＥＧＦＲ２の両方に結合することができるＢ１Ｃ４を単離した。その軽鎖ＣＤＲ３ならびに重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２におけるさらなる改変をソフト変異法によって行い、そこではわずか１０％の残基が他の１９のアミノ酸（システインを除く）に変異した。極めてストリンジェントな条件下でソフト変異したライブラリーをスクリーニングすることにより、より高い親和性及びより安定な抗体であるＢ１Ｃ４Ａ７を同定した。
【０１２１】
抗ＰＤＬ１抗体であるｔｃｃＲ３Ｄ７及びｔｃｃＲ３Ａ１１もまた、ＰＤＬ１上でパニングすることによって、Ｄｙａｘ  Ｆａｂ  ３１０ファージミドライブラリーから同定した。ｔｃｃＲ３Ｄ７＿ＨＣＤＲ１ライブラリーから、より高い親和性及びより低い酸化感受性を有する抗体であるＤ７Ａ８を単離し、そこではｔｃｃＲ３Ｄ７重鎖ＣＤＲ１に位置するメチオニンの３つのアミノ酸がランダムに変異した。
【０１２２】
ＢｓＡｂを構築するために、抗ＰＤＬ１抗体Ｄ７Ａ８（またはＡ１１）を、まず、ＶＨ−（ＳＧ４）５−ＶＬの配向で一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に再フォーマットし、次いで、ｓｃＦｖを、リンカー（図１）によって接続して、従来の抗体Ｂ１Ａ１またはＢ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）のＣ末端に付加した。エフェクター機能を減少させるために、Ｂ１Ａ１またはＢ１Ｃ４Ａ７の位置２３４及び２３５（ＩｇＧ１−ＣＨ２ドメイン）のロイシンを、アラニンに変異させた。
【０１２３】
二重特異性抗体（Ａ１−Ａ８）及び（Ａ７−Ａ８）の遺伝子を、哺乳動物発現ベクターｐＢｈ１に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞株で一過的に発現させた。上清を採取し、プロテインＡカラムにロードして二重特異性抗体を精製した。
【０１２４】
二重特異性抗体（Ａ１−Ａ８）及び（Ａ７−Ａ８）の純度及び安定性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣ−ＵＰＬＣ及びＤＳＣを用いて分析した。これら２つの二重特異性抗体の血清安定性を、ウエスタンブロッティング後にマウス血清中のＢｓＡｂをインキュベートすることによって調べた。
【０１２５】
材料及び方法
発現され、試験される単一特異性抗体及び二重特異性抗体
【表１】
2019506863.tif 000023
【０１２６】
発現及び精製
発現、精製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのための材料
発現、精製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのための材料を以下の表に挙げる。
【表２】
2019506863.tif 000024
【０１２７】
発現、精製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥのための方法
二重特異性抗体が担持された哺乳類発現ベクターを、製造指示に従ってＰｏｌｙｊｅｔトランスフェクション試薬を使用することにより、遊離型ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。６日間の培養物を収集し、濾過した上清をＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓタンパク質精製システムに接続したアフィニティーカラムプロテインＡにロードした。精製した抗体を、ＰＢＳに緩衝液交換し、濾過した。抗体濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定することによって得て、理論係数を用いることによって算出した。
【０１２８】
還元剤の有無でローディング色素を添加することにより、抗体試料を還元状態及び非還元状態で調製した。試料管を、１００℃で１０分間加熱し、分子量標準とともに還元及び非還元試料を、４〜１２％のＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＮＯＶＥＸビス−トリスゲルにロードした。そのゲルを２００Ｖの定電圧で約５０分間泳動させた。次いで、ゲルをタンパク質色素でゲル染色し、タンパク質バンドが観察されるまでＱＨ２Ｏ中で脱染色した。ゲルの写真を（図１９）に示す。
【０１２９】
ＵＰＬＣ及びＤＳＣ
ＵＰＬＣ及びＤＳＣの材料
【表３】
2019506863.tif 000025
【０１３０】
ＵＰＬＣ及びＤＳＣの方法
ＵＰＬＣのための方法
機械は製造指示に従ってプログラムした。試料をＵＰＬＣ小容量試料バイアルにまずロードし、１０μｇ試料をロードし、ＢＥＨ２００ＳＥＣカラムに注入した。抗体をｐＨ＝７．４  ＰＢＳ緩衝液中で流速０．４ｍｌ／分で１０分間分離し、カラムから溶出した抗体を、ＴＤＡにより波長２８０ｎＭで検出した。各試料について少なくとも２回の注入を行った。Ｗａｔｅｒｓによって提供されたソフトウェアＥｍｐｏｗｅｒ  ３により各ピークの面積百分率を分析した。
【０１３１】
ＤＳＣの方法
１ｍｇ／ｍｌの濃度の試料を、９６ディープウェルプレートにロードし、続いてＮａｎｏ  ＤＳＣを用いたＤＳＣ分析を行った。十分な試料ブランクを得るために、いくつかの緩衝液（ＰＢＳ）の注入を行った。正確な開始温度を保証するために、試料をランする前に１５分間の事前走査を実施した。６０℃／時間という温度上昇を、２５℃から１００℃までモニタリングしながら行った。分析前に、各抗体から緩衝液のみの試料のサーモグラムを差し引き、Ｎａｎｏ  ＤＳＣソフトウェアを用いてデコンボリューション後にＴｍを算出した。
【０１３２】
マウス血清中での安定性
マウス血清安定性のための材料
【表４】
2019506863.tif 000026
【０１３３】
マウス血清安定性のための方法
二重特異性抗体または単一特異性抗体それぞれ２００ｎｇを、９０％マウス血清に添加し、３７℃で５日間インキュベートした。マウス血清中の熱処理された抗体を、還元条件下で４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲルにロードし、電気泳動した。分離したタンパク質を、製造指示に従ってＰＶＤＦ膜に移した。３％ＰＢＳミルクを用いてブロッキングした後、膜を１／２０００のＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体とともにインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、膜を初めてＥＣＬと反応させた。種々の露出時間点でＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００で写真を撮影し、高品質の画像を得た。
【０１３４】
結果
発現及び精製
二重特異性抗体を担持した哺乳動物発現ベクターを、遊離型ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。二重特異性抗体をプロテインＡで精製し、緩衝液をＰＢＳに交換した。抗体濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ光度計により２８０ｎｍで測定し、理論係数を用いて算出した。結果を以下の表に示す。
【表５】
2019506863.tif 000027
【０１３５】
この結果、二重特異性抗体Ａ１−Ａ８及びＡ７−Ａ８が、ＨＥＫ−２９３細胞において一過的に発現され得ることが示される。プロテインＡ精製及び緩衝液交換後６日目に採取した１Ｌの上清からＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）を１０ｍｇ超えて回収した。
【０１３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
各５μｇの抗体を、還元状態または非還元状態で４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲルにロードした。タンパク質色素で染色し、Ｈ２Ｏで脱染色した後、ゲルの写真を撮った。その結果を図１９に示す。この結果、両方のＢｓＡｂの純度が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって推定され９５％を超えることが示される。
【０１３７】
ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析
ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析を、カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００ＳＥＣ、１．７μｍ、４．６×１５０ｍｍを用いて行った。ＵＰＬＣシステム：ＴＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ、溶離液：ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４、流速：０．４ｍＬ／分、注入：１０μｇ；波長２８０ｎｍ；主要なピークのパーセンテージを、各曲線によって列挙する。各試料について２回の注入を行った。ＵＰＬＣシステムにおけるプロテインＡ精製二重特異性抗体のサイズ排除クロマトグラム（２８０ｎｍでのＵＶトレース）の結果を図２０に示す。ピーク面積対保持時間のパーセンテージを、表に要約する。２回の測定の平均ピーク面積も表に列挙する。
【０１３８】
ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により、それぞれ２％及び１％未満の凝集が検出されたことが判明した。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）の凝集は、濃度が高いほど増大したが、まだ３％未満であったことも判明した。
【０１３９】
ＤＳＣによるＴｍの測定
ＰＢＳ緩衝液中の二重特異性抗体のＤＳＣ走査の結果を、図２１及び下の表に示す。
【表６】
2019506863.tif 000028
【０１４０】
この結果、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡのＴｍ１は、ＤＳＣ走査で測定して約６０℃であり、親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７及びＤ７Ａ８−ＬＡＬＡの最低Ｔｍ１（両者とも約６９℃）より低かった。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）の最も低いＴｍ１は、ｓｃＦｖ抗体断片がＩｇＧほど安定ではないことが報告されているので、ｓｃＦｖ  Ｄ７Ａ８が寄与した。Ｄ７Ａ８の重鎖と軽鎖の可変ドメイン間のより長いリンカーの使用、または２つのドメイン間のジスルフィド結合の付加などのｓｃＦｖのさらなる操作によって、その熱安定性は改善され得る。
【０１４１】
血清安定性
マウス血清中において３７℃で５日間処理された二重特異性抗体のウエスタンブロッティング結果を図２２に示す。図に示されるように、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを３７℃で５日間処理した後、還元状態では短い重鎖及び軽鎖のバンドは観察されなかった。したがって、その結果、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡの両方が、３７℃で５日間までマウス血清中で安定であったことが示される。
【０１４２】
実施例２  ＢＩ特異性抗体（Ａ７−Ａ８）のインビトロでの特徴付け
本実施例は、二重特異性抗体Ａ７−Ａ８のインビトロでの特徴付け、及びその親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対する）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対する）との効力の比較を記述する。
【０１４３】
概要
前の実施例は、ＨＥＫ２９３で一過性に発現されることにより得られ、プロテインＡによって精製された、純粋な二重特異性抗体Ａ７−Ａ８が、ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析によって検出して１％未満のより高い分子量凝集を有することを報告した。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）はまた、３７℃のマウス血清中で５日間まで安定であった。
【０１４４】
ヒト及びマウス種と、単独で親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対する）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対する）と交差反応し得る二重特異性抗体Ａ７−Ａ８を、可溶性及び細胞発現ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１（ヒト及びマウスの両方の種）に対する結合能、反応性受容体（ＶＥＧＦＲ２及びＰＤ１）に結合するリガンド（ＶＥＧＦ及びＰＤＬ１）阻害能、ＶＥＧＦＲ２／下流分子のリン酸化の遮断能力、ならびにサイトカインＩＬ２及びＩＮＦγ分泌の刺激能を試験した。
【０１４５】
材料及び方法
試験する抗体
【表７】
2019506863.tif 000029
【０１４６】
用量応答性結合ELISA
用量応答性結合ELISAのための材料
【表８】
2019506863.tif 000030
【０１４７】
用量応答性結合ＥＬＩＳＡ法
抗原ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（ヒト及びマウス）及びＰＤＬ１−Ｆｃ（ヒト及びマウス）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートに１μｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングした。このプレートを、３％ＰＢＳＭでブロックした。連続的に希釈された二重特異性及び単一特異性の抗体を、ブロックされたプレートに加え、室温（ＲＴ）で約１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ特異性抗体（ＨＲＰ抗ｈＦａｂ）抗体を添加した（３％ＰＢＳＭで１／５０００希釈）。このプレートを再度洗浄し、次いでＴＭＢ反応緩衝液を添加して発色させた。１ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止した後、プレートを、プレートリーダーでＯＤ４５０で読み取った。
【０１４８】
用量応答競合ＥＬＩＳＡ
用量応答競合ＥＬＩＳＡのための材料
【表９】
2019506863.tif 000031
【０１４９】
用量応答競合ＥＬＩＳＡ法
ヒト及びマウスのＰＤＬ１−Ｆｃの両方を、製造業者の指示に従ってビオチンで標識した。
【０１５０】
リガンドＶＥＧＦ（ヒト及びマウス）及びＰＤＬ１（ヒト及びマウス）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートに１μｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングした。このプレートを３％ＰＢＳＭでブロックした。連続的に希釈した抗体を、９６ウェルＰＢＳＭでブロックした丸底プレート中で、ヒトもしくはマウスＶＥＧＦＲ２（最終濃度は０．５μｇ／ｍｌ）またはビオチン標識ヒト及びマウスＰＤＬ１と混合し、ＲＴで１時間インキュベートした。抗体−受容体混合物を、ブロックされたリガンドコーティングプレートにそれぞれ移し、ＲＴでさらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、それぞれ、ＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体（ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２の場合）またはｓｔｒｅｐ−ＨＲＰ（ＰＤ１−ＰＤＬ１の場合）を添加した（３％ＰＢＳＭで１／５０００希釈）。プレートを再び洗浄し、次いでＴＭＢ反応緩衝液を添加して発色させた。１ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止させた後、そのプレートを、プレートリーダーでＯＤ４５０で読み取った。
【０１５１】
Ｂｉａｃｏｒｅによる動態解析
Ｂｉａｃｏｒｅのための材料
【表１０】
2019506863.tif 000032
【０１５２】
Ｂｉａｃｏｒｅのための方法
表面の準備
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて結合親和性を評価した。ＣＭ５チップを、１０μｌ／ｍｌのランニング緩衝液ＨＢＳＥＰ（ランニング緩衝液）中で平衡化した。ＣＭ５チップの２つのフローセルを、１：１のＮＨＳ／ＥＤＣ注入で５分間活性化した。第２のフローセルを、ｐＨ５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した５μｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦＲ２で固定して、４０〜１００ＲＵの固定タンパク質に到達させた。その表面を、引き続いて、エタノールアミンの５分間の注入でブロックした。
【０１５３】
試料ラン
ランは、３０μｌ／分でＨＢＳＥＰランニング緩衝液中で行った。試料をランニング緩衝液中で１．５〜１００ｎＭの範囲の濃度で連続希釈した。試料を２つのフローセル上に３分間の会合時間及び１０分の解離時間で注入した。２０ｍＭ  ＨＣＬの３０秒注入を用いて各結合サイクル後に再生を行った。センサーグラムを各濃度について得て、得られた曲線を、Ｂｉａ評価ソフトウェアを用いてブランクフローセル減法で、１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。
【０１５４】
交差結合性ＥＬＩＳＡ
交差結合性ＥＬＩＳＡのための材料
【表１１】
2019506863.tif 000033
【０１５５】
交差結合性ＥＬＩＳＡ法
ヒトＰＤＬ１−Ｆｃを、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）のビオチン標識キットで、製造業者の指示に従って標識した。
【０１５６】
ヒトＶＥＧＦＲ２を、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレートに１μｇ／ｍｌで４℃で一晩コーティングした。そのプレートを３％ＰＢＳＭでブロックした。１ｎＭの二重特異性抗体または単一特異性抗体を、ＰＢＳＭでブロックした円形９６ウェルプレート中のビオチン標識ｈＰＤＬ１と混合し、ＲＴで１時間インキュベートした。その混合物を、ＰＢＳＭブロックしたｈＶＥＧＦＲ２コーティングプレートに移し、室温でさらに１時間インキュベートした。そのプレートを洗浄した後、ＨＲＰ−ｓｔｒｅｐを添加した（３％ＰＢＳＭで１／５０００希釈）。プレートを再度洗浄し、ＴＭＢ反応緩衝液を添加して発色させた。１ＮのＨ２ＳＯ４で反応を停止した後、プレートを、プレートリーダーでＯＤ４５０で読み取った。
【０１５７】
細胞結合アッセイ
細胞結合のための材料
【表１２】
2019506863.tif 000034
【０１５８】
細胞結合のための方法
ＰＡＥ−ＫＤＲ細胞（１０％熱不活性ＦＢＳを補充したグルタミンを含むＤＭＥＭ中）、ＥＯＭＡ細胞（１０％熱不活性ＦＢＳを添加したグルタミンを含むＤＭＥＭ中）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（グルタミンを含む、１０％熱不活性ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中）及びＢ１６−Ｆ１０細胞（グルタミンを含む、１０％熱不活性ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中）を９０％コンフルエントまで増殖させた。細胞を回収し、まず洗浄し、次いで氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）中に５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウェル丸底マイクロリッタープレートの各ウェルに添加し、スピンダウン（１２００ｒｐｍ、５分間）した。連続希釈した二重特異性抗体及び単一特異性抗体を細胞に添加し、細胞とともに４℃で１時間インキュベートした。２００μｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞を３回洗浄した。その細胞を１００μｌのＰＥ−抗ヒト抗体（１／１００）に再懸濁し、暗所で４℃で少なくとも３０分間インキュベートした。細胞を２００μｌのＰＢＳに３回再懸濁して洗浄し、蛍光を読み取った。
【０１５９】
リン酸化アッセイ
リン酸化アッセイのための材料
【表１３】
2019506863.tif 000035
【０１６０】
リン酸化アッセイのための溶液
１．溶解緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ×１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテイナーゼ阻害剤カクテル（１：５００）：ホスファターゼ阻害剤カクテル２（１：２００）及びホスファターゼ阻害剤カクテル３（１：２００）
２．ストリッピング緩衝液：１００ｍＭの２−メルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム及び６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．７
３．ローディング緩衝液：４ｍｌの１００％グリセロール、２．４ｍｌのｐＨ６．８の１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０．８ｇのＳＤＳ、４ｍｇのブロモフェノールブルー、０．５ｍｌの２−メルカプトエタノール及び３．１ｍｌのｄｄＨ２Ｏ。
【０１６１】
リン酸化アッセイ法
１．５ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培養培地中の１ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたはＥＯＭＡ（１×１０６）細胞中のＰＡＥ／ＫＤＲ（０．４×１０６）細胞を、１２ウェルプレートに添加し、３７℃で４時間インキュベートし、細胞が付着するまで５％ＣＯ２でインキュベートした。培地を除去し、無血清ＤＭＥＭを加えて細胞を一晩放置した。翌日、連続希釈された抗体を細胞に添加し、まず３７℃、５％ＣＯ２で２０分間インキュベートして、次いでＶＥＧＦ（ＰＡＥ／ＫＤＲ及びＥＯＭＡそれぞれ、最終濃度３０ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。細胞混合物を３７℃、５％ＣＯ２でさらに１０分間インキュベートした。この細胞を、無血清培地で１回洗浄した。次いで、１００μｌの溶解緩衝液を添加し、その細胞を皿から剥離して１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、氷上で約２時間インキュベートした。浮いている試料を１０，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離し、上清を回収した。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定した。次いで、３０μｇのタンパク質を８μｌのロード緩衝液と混合し、５分間煮沸した。その混合物を４〜１２％のＮＵＰＡＧＥゲルにロードし、ゲルを泳動してタンパク質を分離した。タンパク質及びマーカーを、一緒にＰＶＤＦ膜上に一晩転写した。翌日、その膜を３％ＰＢＳミルクでブロックし、次いで、抗リン−ＶＥＧＦＲ２（１／１０００）または抗リン−ＭＡＰＫを膜に添加した。その膜を４℃で一晩インキュベートした。膜を０．１％Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄した後、１：１５００の抗ウサギ抗体コンジュゲートＨＲＰを添加し、ＲＴで１時間膜とともにインキュベートした。膜をＰＢＳＴで３回洗浄した後ＥＣＬを添加して、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（リン−タンパク質について）で撮影した。
【０１６２】
予め添加した二次抗体を、膜を５０℃で４５分間ストリッピング緩衝液とともにインキュベートすることによって除去した。膜をＰＢＳＴで２回洗浄し、次いでウサギ抗ＫＤＲ抗体または抗ＭＡＰＫ抗体（１０ｍｌの３％ＰＢＳＭ中、１〜４００希釈）とともにインキュベートした。その膜をウサギ抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。その膜を再び洗浄し、ＨＲＰ−抗ウサギ抗体（１〜１５００希釈）を膜に添加した。ＲＴで１時間インキュベートした後、その膜を３回洗浄して、その後ＥＣＬを加え、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡ４０００（全タンパク質について）で発光画像を撮影した。
【０１６３】
サイトカイン分泌アッセイ
リン酸化アッセイのための材料
【表１４】
2019506863.tif 000036
【０１６４】
リン酸化アッセイ法
製造業者の指示に従ってＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用いて、ＰＢＭＣを、ＬｅｕｋｏＰａｋ（単球、リンパ球、血小板、血漿、及び赤血球を含む高濃度の血球を含む富化白血球搬出液）からＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、ＩＭＤＭ（２ｍＭグルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３．０２４ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを補充）及び１０％ＦＢＳを含有する９６ウェルプレート中で２×１０４細胞／ウェルで培養し、連続希釈された二重特異性抗体またはその親抗体の存在下で、５〜７日間、０．０１μｇ／ｍＬのＳＥＢで活性化した。６日目または７日目に、製造業者の指示に従って、ヒトＩＦＮ−γ及びヒトＩＬ−２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＩＬ−２及びＩＦＮγの測定のために上清を回収した。
【０１６５】
結果
ヒト及びマウスＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に結合する用量応答
親の単一特異性抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対して）とともに、連続希釈したＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを、単独でそれぞれ、ｈＶＥＧＦＲ２、またはｍＶＥＧＦＲ２、またはｈＰＤＬ１及びｍＰＤＬ１でコーティングされた９６ウェルプレートに加え、ＲＴで１時間インキュベートした。その後、プレートをＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ特異性抗体（ヤギ）とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加し、Ａ４５０ｎｍを読み取った。データ点は、二重決定の平均±標準偏差であった。種々の抗原に対するＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−可変スロープ（４パラメーター）」と呼ばれるプログラムを使用して算出し、各グラフの上部に列挙する。結果を図２３に示す。
【０１６６】
この結果、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡが、組換えヒトＶＥＧＦＲ２、マウスＶＥＧＦＲ２、ヒトＰＤＬ１及びマウスＰＤＬ１に強く結合できたことが示される。ＥＣ５０は、それぞれ、ｈＶＥＧＦＲ２に対して０．１２８ｎＭ、ｍＶＥＧＦＲ２に対して０．５９８ｎＭ、ｈＰＤＬ１に対して０．０７９ｎＭ、及びｍＰＤＬ１に対して０．１３７ｎＭであった。ｈＶＥＧＦＲ２及びｍＶＥＧＦＲ２に対するＢ１Ｃ４Ａ７についての関連のＥＣ５０はそれぞれ０．１０７ｎＭ及び０．４６６ｎＭであった。ｈＰＤＬ１及びｍＰＤＬ１対するｄｓＤ７Ａ８について、それぞれ０．１２１ｎＭ及び０．１７２ｎＭであった。
【０１６７】
ＩＣ５０を決定する用量応答アッセイ
ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２相互作用の遮断のために、親の単一特異性抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対して）とともに、連続的に希釈したＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを単独で、ＲＴで１時間、溶液中のヒトまたはマウスのいずれかのＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ（最終０．５μｇ／ｍｌ）の固定量とともにインキュベートし、その後、その混合物をヒトＶＥＧＦまたはマウスＶＥＧＦのいずれかでコーティングした９６ウェルプレートに移し、さらに１時間インキュベートした。固定したｈ／ｍＶＥＧＦに結合したｈ／ｍＶＥＧＦＲ２の量を、プレートとＨＲＰ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体とのインキュベーションにより定量した。
【０１６８】
ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用の遮断のために、親の単一特異性抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対して）とともに、連続的に希釈したＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを単独で、溶液中のヒトまたはマウスのいずれかのＰＤＬ１−Ｆｃ（最終０．５μｇ／ｍｌ）で標識した固定量のビオチンとともにＲＴで１時間インキュベートし、その後、その混合物をヒトＰＤＬ１またはマウスＰＤＬ１のいずれかでコーティングした９６ウェルプレートに移し、さらに１時間インキュベートした。固定したｈ／ｍＰＤ１に結合したｈ／ｍＰＤＬの量を、ＨＲＰ−ｓｔｒｅｐとのプレートのインキュベーションにより定量した。
【０１６９】
その結果を図２４に示す。データ点は二重決定の平均±標準偏差である。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの「ｌｏｇ（インヒビター）対応答−可変スロープ（４パラメーター）」と呼ばれるプログラムを使用して、異なる相互作用のＩＣ５０を算出し、各グラフの上部に列挙する。
【０１７０】
この結果は、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）がリガンドＶＥＧＦまたはＰＤＬ１のそれぞれの受容体ＶＥＧＦＲ２及びＰＤ１への結合を強力に遮断することできたことを示している。ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦＲ２相互作用のＩＣ５０は、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡについては１．２９ｎＭであり、それに対してＢ１Ｃ４Ａ７については１．７２ｎＭであった。ｍＶＥＧＦ−ｍＶＥＧＦＲ２相互作用のＩＣ５０は、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡでは０．８０１ｎＭであり、それに対してＢ１Ｃ４Ａ７では０．９７３ｎＭであった。ｈＰＤＬ１−ｈＰＤ１相互作用のＩＣ５０は、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡについては２．５１ｎＭであり、それに対してｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡについては３．０４ｎＭであった。ｍＰＤＬ１−ｍＰＤ１相互作用のＩＣ５０は、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡでは５．５９ｎＭであり、それに対してｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡでは２．８０ｎＭであった。
【０１７１】
細胞が発現したＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１への結合
親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８（ＰＤＬ１に対して）とともに、連続希釈したＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを単独で、以下の細胞株にまず添加し：ＫＤＲ−ＰＡＥ（ｈＶＥＧＦＲ２）、ＥＯＭＡ（ｍＶＥＧＦＲ２）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｈＰＤＬ１）及びＢ１６−Ｆ１０（ｍＰＤＬ１）、次いで４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性抗体とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、蛍光を読み取った。細胞表面抗原上の抗体の蛍光強度を算出し、抗体濃度に対してグラフ化した。結果を図２５に示す。異なる抗原に対するＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答−可変勾配（４つのパラメーター）」と呼ばれるプログラムを用いて算出し、各グラフの上部に列挙する。
【０１７２】
この結果によって、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡはまた、細胞が発現したヒトＶＥＧＦＲ２、マウスＶＥＧＦＲ２、ヒトＰＤＬ１及びマウスＰＤＬ１に結合できたことが示される。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡのＫＤＲ／ＰＡＥ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢ１６−Ｆ１０に対するＥＣ５０値はそれぞれ０．５３３ｎＭ、０．２２３ｎＭ及び０．１２２ｎＭであった。Ｂ１Ｃ４Ａ７のＫＤＲ／ＰＡＥに対する関連のＥＣ５０は０．５２２ｎＭであり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢ１６−Ｆ１０に対するｄｓＤ７Ａ８に関しては、値はそれぞれ０．１５９ｎＭ及び０．０４２ｎＭであった。ＥＯＭＡ発現のｍＶＥＧＦＲ２に対するＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡのＥＣ５０の決定は、ＥＯＭＡ発現のＰＤＬ１への結合によって妨げられた（図２５）。
【０１７３】
二重特異性抗体Ａ７−Ａ８及びその親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡについてのＥＣ５０及びＩＣ５０を以下の表に列挙する。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡとその関連親抗体であるＢ１Ａ１またはｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡいずれかとの間の極めて近いＥＣ５０及びＩＣ５０によって、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡが、Ｂ１Ａ１またはｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡのいずれかと同様に強力であることが示される。
【０１７４】
【表１５】
2019506863.tif 000037
【０１７５】
動態解析
ｈＶＥＧＦＲ−ＦｃまたはｈＰＤＬ１−Ｆｃを、標準的なアミンカップリング化学を用いて、シリーズＳ  ＣＭ５センサーチップ上にｐＨ５で固定化した。ランニング緩衝液として１×ＨＢＳＥＰを使用して、固定化表面上に１．５〜１００ｎＭの範囲の濃度で３０μｌ／分で抗体を注入した。接触時間（会合段階）は３分であった。解離時間は６〜１０分であった。３０μｌ／分の流速で３０秒間、２０ｍＭのＨＣＬの注入を用いて、各結合サイクル後に再生を行った。センサーグラムを各濃度で得て、得られた曲線をＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。結果を図２６に示す。結合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）（ｋａ）、解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋｄ）及び算出されたＫＤは、各グラフの上部に列挙する。
【０１７６】
Ｂｉａｃｏｒｅによるこの動態分析によって、ｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡが、ＶＥＧＦＲ２またはＰＤＬ１のいずれかに速く会合し、ＶＥＧＦＲ２またはＰＤＬ１のいずれかからゆっくりと解離したことが示される。ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１からの極めて遅い解離速度は、測定装置範囲外であった。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）のＫＤ値は、それぞれｈＶＥＧＦＲ２及びｈＰＤＬ１について約４７ｐＭ及び１．２ｐＭであり、Ｂ１Ｃ４Ａ７についての５２ｐＭ及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡについての７．７ｐＭに匹敵した。
【０１７７】
２つの標的に対する交差結合性ＥＬＩＳＡ
図２７に示すスキーム１を、交差結合性ＥＬＩＳＡに使用した。図に示すように、固定化ｈＶＥＧＦＲ２表面上に複合体２及び３を見出すことができるが、複合体３のみをｓｔｒｅｐ−ＨＲＰによって検出することができる。溶液中に見出すことができる複合体１は、処理中に洗い流される。
【０１７８】
親の単一特異性抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対して）とともに、連続して希釈したＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを単独で、固定量のビオチン標識ヒトＰＤＬ１−Ｆｃ（最終の０．５μｇ／ｍｌ）とともに、溶液中でＲＴで１時間インキュベートし、その後、その混合物をｈＶＥＧＦＲ２でコーティングした９６ウェルプレートに移し、さらに１時間インキュベートした。結合したＢｓＡｂ／ビオチン−ＰＤＬ１複合体は、ＨＲＰ−ｓｔｒｅｐ（スキーム１のように示されている）によって検出することができた。結果を図２８に示す。データ点は、６つの決定の平均±標準偏である。
【０１７９】
図に示すように、交差結合性ＥＬＩＳＡによって検査して、二重特異性抗体Ａ７−Ａ８は、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に同時に結合することができた。この結果、二重特異性抗体の立体配座が第一の標的に結合した後も変化しないことが示される。したがって、第１の標的結合二重特異性抗体は、第２の標的に結合することができた。
【０１８０】
リン酸化アッセイ
血清飢餓状態の細胞を、室温で３０分間様々な量の抗体とともにインキュベートし、続いて３０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ（ＫＤＲ−ＰＡＥの場合）または５０ｎｇ／ｍｌのｍＶＥＧＦ（ＥＯＭＡの場合）を用いてさらに１５分間刺激した。細胞を溶解し、タンパク質濃度を測定した。３０μｇのタンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、受容体及びＭＡＰＫに対する抗ホスホチロシン抗体を用いたイムノブロッティング分析に供した。シグナルは、高感度化学発光を用いて検出された。結果を図２９に示す。
【０１８１】
ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡの効力を、ヒトＶＥＧＦＲ２またはマウスＶＥＧＦＲ２及び下流分子ＭＡＰＫのリン酸化を遮断する能力を試験することによって調べた。図２９によって、ヒトＶＥＧＦＲ２、ｍＶＥＧＦＲ２及びＭＡＰＫのリンタンパク質のバンドが、１００または１０ｎＭのＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢ１Ｃ４Ａ７の存在下でははるかに弱いことが示される。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）及びＢ１Ｃ４Ａ７で処理した場合のバンド密度の差はごくわずかであり、目で区別できなかった。
【０１８２】
サイトカイン分泌アッセイ
親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８（ＰＤＬ１に対して）とともに、連続希釈したＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡを単独で、０．０１ｍｇ／ｍＬのＳＥＢにより活性化されたＰＢＭＣ（ドナーＢＧから）に添加した。６日目に、製造指示に従ってＤｕｏｓｅｔキットを用いることによって、ＩＬ−２及びＩＦＮγの測定のために上清を回収した。結果を図３０に示す。データ点は三連の決定の平均±標準偏差であり、以下の式により算出された：
（試料読み取り−非刺激の読み取り）／（ＳＥＢ刺激の読み取り−非刺激の読み取り）＊１００。
【０１８３】
結果によって、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びｄｓＤ７Ａ８の存在下で、ＳＥＢによって刺激された場合のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ２及びＩＮＦγの分泌が、抗ＶＥＧＦＲ２抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（図３０）よりもかなり高かったことが示される。ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡとｄｓＤ７Ａ８で処理した間に差はなかった。
【０１８４】
まとめると、上記の結果によれば、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡは、その親抗体Ｂ１Ｃ４Ａ７（ＶＥＧＦＲ２に対する）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対する）の効力を保持することが実証される。
【０１８５】
実施例３  二重特異性抗体（Ａ１−Ａ８）のインビトロでの特徴付け
本実施例は、二重特異性抗体Ａ１−Ａ８のインビトロでの特徴付け、及びその親抗体Ｂ１Ａ１（ＶＥＧＦＲ２に対する）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対する）との効力の比較を記述する。
【０１８６】
前の実施例で報告したように、ＨＥＫ２９３における一過性発現によって得られ、プロテインＡによって精製された、純粋な二重特異性抗体Ａ１−Ａ８は、ＳＥＣ−ＵＰＬＣ分析によって検出された１％未満のより高い分子量凝集を有した。ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）はまた、３７℃で５日間のインキュベーション後のマウス血清中で極めて安定であった。
【０１８７】
その親抗体Ｂ１Ａ１（ＶＥＧＦＲ２に対して）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対して）と単独で、ヒト及びマウス種と交差反応し得る二重特異性抗体Ａ１−Ａ８を、可溶性及び細胞発現ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対するその結合能、リガンド（ＶＥＧＦ及びＰＤＬ１）の阻害能、受容体（ＶＥＧＦＲ２及びＰＤ１）への結合能、ＶＥＧＦＲ２／下流分子のリン酸化の遮断能、ならびにサイトカインＩＬ２及びＩＮＦγ分泌の刺激能について試験した。
【０１８８】
材料及び方法
本明細書における材料及び方法は、二重特異性抗体Ａ１−Ａ８を含む以下の抗体を使用したことを除いて、上記実施例２に記載されたものと同じである。
【表１６】
2019506863.tif 000038
【０１８９】
結果
ヒト及びマウスＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対する用量応答結合
ヒト及びマウスのＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対する用量応答を、上と同じ方法で測定した。結果を図３１に示す。
【０１９０】
この結果、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡが、組換えヒトＶＥＧＦＲ２、ヒトＰＤＬ１及びマウスＰＤＬ１に対して強力に結合することができることが示されている。ＥＣ５０は、それぞれ、ｈＶＥＧＦＲ２では０．１２８ｎＭ、ｈＰＤＬ１では０．０８８ｎＭ、及びｍＰＤＬ１では０．１６０ｎＭであり、Ｂ１Ａ１のｈＶＥＧＦＲ２に対する関連ＥＣ５０は、０．１２７ｎＭであり、ｄｓＤ７Ａ８のｈＰＤＬ１及びｍＰＤＬ１に対しては、それぞれ０．１２１ｎＭ及び０．１７２ｎＭである。
【０１９１】
ＩＣ５０を決定する用量応答アッセイ
アッセイは上記の方法で行った。その結果を図３２に示す。データ点は二重の決定の平均±標準偏差である。種々の相互作用についてのＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍの「ｌｏｇ（インヒビター）対応答−可変スロープ（４パラメーター）」と呼ばれるプログラムを使用して、算出し、各グラフの上部に列挙する。
【０１９２】
その結果、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）が、リガンドＶＥＧＦまたはＰＤＬ１のそれぞれの受容体であるＶＥＧＦＲ２及びＰＤ１との結合を強力に遮断することができたことが示される。ｈＶＥＧＦ−ｈＶＥＧＦＲ２相互作用に対するＩＣ５０は、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡでは１．１９ｎＭであり、それに対してＢ１Ａ１では１．６０ｎＭであった。ｈＰＤＬ１−ｈＰＤ１相互作用に対するＩＣ５０は、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡでは２．５１ｎＭであり、それに対してｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡでは３．０４ｎＭであった。ｍＰＤＬ１−ｍＰＤ１相互作用に対するＩＣ５０はＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡでは３．２０ｎＭであり、それに対してｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡでは２．８０ｎＭであった。
【０１９３】
細胞発現されたＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１への結合
結合アッセイは上記の方法で行った。結果を図３３に示す。
【０１９４】
この結果、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡはまた、細胞発現されたヒトＶＥＧＦＲ２、ヒトＰＤＬ１及びマウスＰＤＬ１にも結合することができたことが示される。ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡのＫＤＲ／ＰＡＥ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢ１６−Ｆ１０に対するＥＣ５０値は、それぞれ、０．７７９ｎＭ、０．４０２ｎＭ及び０．１１３ｎＭであった。Ｂ１Ａ１のＫＤＲ／ＰＡＥに対する関連ＥＣ５０値は、０．１７７ｎＭであり、ｄｓＤ７Ａ８のＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢ１６−Ｆ１０に対する関連ＥＣ５０値は、それぞれ、０．１５９ｎＭ及び０．０４２ｎＭであった。（図３３）。
【０１９５】
二重特異性抗体Ａ１−Ａ８ならびにその親抗体Ｂ１Ａ１及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡのＥＣ５０及びＩＣ５０を、以下の表に列挙する。ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡとその関連親抗体であるＢ１Ａ１またはｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡのいずれかとの間の極めて近いＥＣ５０及びＩＣ５０によって、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡが、Ｂ１Ａ１またはｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡのいずれかと同様に強力であることが示される。
【０１９６】
【表１７】
2019506863.tif 000039
【０１９７】
動態解析
動態アッセイは上記の方法で行った。結果を図３４に示す。結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋａ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｄ）及び算出されたＫＤを、各グラフの上部に列挙する。
【０１９８】
Ｂｉａｃｏｒｅによる反応速度論分析（図３４）によって、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡが、ＶＥＧＦＲ２またはＰＤＬ１のいずれかと速く会合し、ＶＥＧＦＲ２またはＰＤＬ１のいずれかに長く滞在したことが示される。ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１への結合の極めて遅い解離速度は、装置の測定範囲外であった。ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）のＫＤ値はｈＶＥＧＦＲ２及びｈＰＤＬ１について、それぞれ約２００ｐＭ及び３．２ｐＭであり、Ｂ１Ａ１についての１６４ｐＭ及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡについての７．７ｐＭに匹敵した。
【０１９９】
２つの標的に対する交差結合性ＥＬＩＳＡ
結合アッセイは上記の方法で行った。その結果を図３５に示す。そのデータ点は、６つの決定の平均±標準偏差である。
【０２００】
図に示すように、交差結合性ＥＬＩＳＡによって検査して、二重特異性抗体Ａ１８は、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に結合することができた（図３６）。この結果は、二重特異性抗体の立体配座が第一の標的への結合後に変化しなかったことを示している。したがって、第１の標的結合二重特異性抗体は、第２の標的に結合することができた。
【０２０１】
リン酸化アッセイ
アッセイは上記の方法で行った。その結果を図３６に示す。
【０２０２】
ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡの効力を、それが、ヒトＶＥＧＦＲ２及び下流分子ＭＡＰＫのリン酸化を遮断する能力を試験することにより検査した。図３６により、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡの１．５μｇ／ｍｌ（７．５ｎＭ）の存在下において、ＶＥＧＦＲ２及びＭＡＰＫの両方のリンタンパク質バンドは、抗体処理なしのバンドよりもかなり弱かったことが示される。この実験では、親抗体の濃度は１．５μｇ／ｍｌ（１０ｎＭ）であった。したがって、この実験では、二重特異性抗体よりも多くの単一特異性抗体を使用した。
【０２０３】
サイトカイン分泌アッセイ
サイトカイン分泌アッセイは、上記の方法で行った。連続的に希釈したＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）を、０．０１μｇ／ｍＬのＳＥＢで活性化したＰＢＭＣ（ドナーＢＧ由来）に添加した。６日目に、ＩＬ−２及びＩＦＮγの測定のために、Ｄｕｏｓｅｔキットを製造業者の指示に従って使用して、上清を収集した。データ点は、二重の決定の平均±標準偏差であった。その結果を図３７に示す。
【０２０４】
この結果、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡ及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）−ＬＡＬＡの存在下で、ＳＥＢによって刺激された場合のＰＢＭＣにおけるサイトカインＩＬ２及びＩＮＦγの分泌が、対照抗体Ｂ１Ａ１及びＢ１Ｃ４Ａ７よりも高かったことが示される（図３７）。
【０２０５】
まとめると、上記の結果、ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）−ＬＡＬＡは、その親抗体Ｂ１Ａ１（ＶＥＧＦＲ２に対する）及びｄｓＤ７Ａ８−ＬＡＬＡ（ＰＤＬ１に対する）の効力を保持することが実証される。
【０２０６】
実施例４  抗腫瘍効果Ｉ
この実施例では、上記ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）を、ＣＴ２６マウス結腸癌細胞に対するその効果について検査した。
【０２０７】
より具体的には、無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地中の０．１ｍＬのＣＴ２６マウス結腸癌腫細胞（０．３×１０６細胞／マウス）を、腫瘍発生のためにマウスの右下腹部に皮下注射した。平均腫瘍サイズが約７５〜１２５ｍｍ３に達したとき、腫瘍サイズに従って５つの実験グループにマウスを無作為に割り当てた。各群は１３匹のマウスからなっていた。マウスを以下の表に示すように抗体で処置した。各用量をＰＢＳで２００μｌに調整し、マウスに腹腔内で、最大３週間まで１週間に２回注射した。体重及び腫瘍体積を毎週２回測定した。結果を以下の表に示す。
【表１８】
2019506863.tif 000040
【０２０８】
その結果、Ｂ１Ｃ４Ａ７、Ｄ７Ａ８、それらの組合せ、及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）が腫瘍の体積を減少させたことが示される。２つの抗体（Ｂ１Ｃ４Ａ７及びＤ７Ａ８）及びＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）の組み合わせは、このＣＴ２６モデルにおける腫瘍体積を減少させることにおいて２つの個々の抗体単独よりも強力であることが見出された。全ての抗体は完全ヒト抗体であったので、２週間を超える治療のために免疫原性が発生した。したがって、治療後３週間までの結果が報告された。この結果によってまた、いずれの処置群においても体重の有意な減少は見られなかったことが示されている（データ示さず）。
【０２０９】
実施例５  抗腫瘍効果ＩＩ
この実施例では、上記ＢｓＡｂ（Ａ１−Ａ８）を、ＭＣ３８マウス大腸癌細胞に対するその効果について試験した。
【０２１０】
各マウスに腫瘍発生のためにＭＣ３８マウス結腸癌腫細胞（１×１０６細胞／マウス）を右下腹部に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約９０ｍｍ３に達したとき、マウスをその腫瘍サイズに応じて９つの実験グループに無作為に割り当てた。各群は１３匹のマウスからなっていた。図３９Ａ及び３９Ｂに示すように、マウスを抗体で処置した。各用量をＰＢＳで２００μｌに調整し、腹腔内で最大３週まで１週に２回動物に注射した。体重及び腫瘍体積を毎週２回測定した。その結果を図３９Ａ及び３９Ｂに示す。
【０２１１】
図面に示されるように、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体であるＢ１Ｃ４Ａ７は、中程度の効力しか示さなかった。対照的に、抗ＰＤＬ１抗体Ｄ７Ａ８、ＢｓＡｂ（Ａ７−Ａ８）、ならびにＢ１Ｃ４Ａ７及びＤ７Ａ８の組み合わせは、腫瘍増殖を完全に阻害し、３群間で有意差は観察されなかった。全ての抗体は完全ヒト抗体であるため、２週間を超える処置に対して免疫原性が発生した。結果は、処置後３週間まで報告された。さらに、３週間で全てのマウスについて有意な体重減少は観察されなかった（データは示されていない）。全ての抗体は、通常のＩｇＧ１バージョン（図３９Ａ）及びＬＡＬＡバージョン（図３９Ｂ）で構築され、ＣＨ２のロイシン２３４及び２３５が、エフェクター機能を減少させるためにアラニンに変異された。これら２つのバージョン間には有意差は観察されなかった。
【０２１２】
実施例６  追加の二重特異性抗体のインビトロでの特徴付け
この実施例では、図１Ａに示される二重特異性抗体のさらなる例（すなわち、ＨＣ−Ｃ末端融合）を生成し、調べた。この目的のために、ＶＥＧＦＲ２及びＰＤＬ１に対する二重特異性抗体の異なる配向を、抗ＰＤＬ１抗体Ａ１１またはＤ７Ａ８及び抗ＶＥＧＦＲ２抗体Ｂ１Ａ１またはＢ１Ｃ４Ａ７を用いて作製した。これらの二重特異性抗体、関連する構成要素、及び結合特異性を、以下の表に列挙する。二重特異性抗体には、以下の２つのリンカーを使用した：
１５ＧＳ：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）
３０ＧＳ：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）。
さらに、突然変異をｓｃＦｖに導入して、２つの可変ドメイン間にジスルフィド結合を付加した。突然変異をまたＣＨ２ドメインにも導入して、エフェクター機能（ＬＡＬＡバージョンＩｇＧ）を減少させ、ここではＣＨ２のＬＬ残基（例えば、配列番号２８、３０及び３２で太字）をＡＡに変更した。
【表１９】
2019506863.tif 000041
【０２１３】
これらの二重特異性抗体の純度及び安定性を、上記の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＵＰＬＣによって分析した。その結果を図４０及び４１に示す。
【０２１４】
図４０に示すように、ＢｓＡｂ（Ｂ１Ａ１−Ａ１１）及びＢｓＡｂ（Ｂ１Ｃ４Ａ７−Ａ１１）バリアントでは、いくつかの分解されたバンドが観察された。
【０２１５】
対照的に、ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）及びＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）バリアントのように配向が変化した後、分解されたバンドは観察されなかった（図４１）。
【０２１６】
ＳＥＣ−ＵＰＬＣの結果によって、ジスルフィド結合が付加されたとき、二重特異性抗体がさらに安定であることが示された。例えば、ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）＿３０ｃｃの場合、単量体は９５．５％を超えるが、Ａ１１  ＩｇＧ、ＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）、及びＢｓＡｂ（Ａ１１−Ｂ１Ａ１）＿３０に関しては、単量体はそれぞれ、９７．８％、９４．３％、９３．８％超であった。同様に、ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）バリアントの中で、ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）＿３０ｃｃに関しては、単量体は、９７．３％を超え、一方で、Ｄ７Ａ８  ＩｇＧ、ＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）及びＢｓＡｂ（Ｄ７Ａ８−Ｂ１Ａ１）＿３０に関しては、単量体はそれぞれ９９％、８６．６％、及び９０．２％超であった。
【０２１７】
ＰＤＬ１及びＶＥＧＲ２に対するこれらの二重特異性抗体の結合を、上と同じ方法で分析した。その結果を図４２に示す。ＰＤＬ１及びＶＥＧＲ２に対するこれらの二重特異性抗体は、親抗体と同様に強力であることが見出された。
【０２１８】
リガンドと受容体との相互作用の遮断も上記の方法で調べた。その結果を図４３に示す。これらの二重特異性抗体は、親抗体と同様に強力であることが見出された。
【０２１９】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析を、上記の方法で行った。その結果を以下の表に示す。
【表２０】
2019506863.tif 000042
【図１】
2019506863.tif 000043
【図２】
2019506863.tif 000044
【図３】
2019506863.tif 000045
【図４】
2019506863.tif 000046
【図５】
2019506863.tif 000047
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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