(57)【要約】  エキソヌクレアーゼを欠損しているポリメラーゼバリアントを本明細書において記載する。一部のバリアントは、野生型または親ポリメラーゼと同等の鎖置換能力を保持している。一部のバリアントは、野生型または親ポリメラーゼと比較して改良された鎖置換能力を有する。バリアントは、野生型または親ポリメラーゼよりも大きい伸長速度を有することができる。バリアントは、野生型または親ポリメラーゼよりも短い待機時間を有することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する親ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドに由来する改変ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１に記載するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｔ４５、Ｈ１２３、Ｌ１２５、Ｗ１２７、Ｄ１２８、Ｖ１７９、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１５、Ｔ２１６、Ｅ２１９、Ｑ２２１、Ｅ２３９、Ｄ２４１、Ｙ２４２、Ｙ２５９、Ｑ２６０、Ａ２９２、Ｓ２９３、およびＳ２９４の位置に対応する位置で置換を含み、エキソヌクレアーゼを欠損している、前記改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記改変ポリメラーゼが、鎖置換能力を保持している、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記改変ポリメラーゼが、Ｌ１２５Ｋ、Ｄ１２８Ｈ、Ｖ１７９Ｙ、Ｖ１７９Ｒ、Ｓ２１１Ｆ、Ｙ２１２Ｋ、Ｉ２１５Ｌ、Ｔ２１６Ｋ、Ｑ２２１Ｒ、Ｙ２４２Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｓ、Ｙ２５９Ｇ／Ｋ／Ｑ、Ａ２９２Ｋ、Ｓ２９３Ｇ、およびＳ２９４Ｔからなる群から選択される置換を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記改変ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記改変ポリメラーゼが、
ａ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２４２Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｓ
ｂ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２５９Ｇ／Ｋ／Ｑ
ｃ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｄ１２８Ｈ
ｄ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２１２Ｇ
ｅ．  Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２１２Ｋ
のうちの１つから選択される、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記改変ポリメラーゼが、親ポリメラーゼよりも大きい伸長速度を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
伸長速度が、親ポリメラーゼよりも１．５倍〜５倍大きい、請求項６に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
伸長速度が、親ポリメラーゼよりも少なくとも１．５倍大きい、請求項６に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
伸長速度が、親ポリメラーゼよりも少なくとも２倍大きい、請求項６に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
伸長速度が、親ポリメラーゼよりも少なくとも３倍大きい、請求項６に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記改変ポリメラーゼが、野生型または親ポリメラーゼよりも短い平均待機時間を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記改変ポリメラーゼが、配列番号１１のポリメラーゼの待機時間よりも短い平均待機時間を有する、請求項１１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
前記改変ポリメラーゼが、３秒未満の平均待機時間を有する、請求項１１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[1]本明細書においては、特に、エキソヌクレアーゼを欠損しているが、野生型ポリメラーゼと比較して同一のまたは改良された鎖置換能力を有し、産業用途または研究用途で使用するために有利な改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【背景技術】
【０００２】
[2]ＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して相補的なＤＮＡ鎖を合成する酵素のファミリーである。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成する鎖の３’末端に遊離のヌクレオチドを添加し、その結果、新しい鎖を５’から３’への方向に伸長させることができる。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼは、重合活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を有する多機能タンパク質である。例えば、多くのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。これらのポリメラーゼは、誤って組み込まれたヌクレオチドを認識することができ、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、その間違ったヌクレオチドが除去される（この活性は、プルーフリーディングとして知られる）。ヌクレオチドの除去後、ポリメラーゼは正しいヌクレオチドを再挿入することができ、複製が継続できる。多くのＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。
【０００３】
[3]合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）はＤＮＡ鎖中のヌクレオチド配列を同定する。ＳＢＳにおいて使用するポリメラーゼは、成長している鎖にヌクレオチドを加えるだけでなく、成長しているヌクレオチド鎖をプルーフリーディングする。３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼドメインはほとんどのＤＮＡポリメラーゼに備わっている。上記のとおり、エキソヌクレアーゼのプルーフリーディング機能は誤った塩基を訂正できる。ＳＢＳでは、このエキソヌクレアーゼ活性は、シーケンシングの間の欠失／挿入エラーに寄与するので望ましくない。ファミリーＢのポリメラーゼにおいてエキソヌクレアーゼ活性をノックアウトするエキソヌクレアーゼドメイン中の標準的な変異は、典型的には、ポリメラーゼの鎖置換能力を減少させる。
【０００４】
[4]したがって、標準的な変異と比較して変化した鎖置換特性を有するエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼに対する必要性が存在する。詳細には、野生型の親ポリメラーゼと同一であるか、またはそれより改良された鎖置換を有するエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが所望される。鎖置換の改良は、連続するヌクレオチドの組み込みの間の待機時間を改良し（すなわち、待機時間を減少させる）、かつポリメラーゼの伸長／シーケンシング速度を改良させる（すなわち、伸長／シーケンシング速度を増加させる）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[5]本発明は、エキソヌクレアーゼを欠損している改変ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、変異体）を提供する。改変ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して同一のまたは改良された鎖置換能力を有する。選択変異は、例えば高い塩濃度で、例えばタグ付きヌクレオチドなどの改変ヌクレオチドポリリン酸の組み込みを触媒することなど、産業用途または研究用途で使用される条件下での有利な表現型を与える。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[6]一態様においては、エキソヌクレアーゼを欠損している改変ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１に記載するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性のアミノ酸配列を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｔ４５、Ｈ１２３、Ｌ１２５、Ｗ１２７、Ｄ１２８、Ｖ１７９、Ｓ２１１、Ｙ２１２、Ｉ２１５、Ｔ２１６、Ｅ２１９、Ｑ２２１、Ｅ２３９、Ｄ２４１、Ｙ２４２、Ｙ２５９、Ｑ２６０、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、およびそれらの組合せに対応する位置で置換を含む。一部の実施形態においては、改変ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して同一のまたは改良された鎖置換能力を保持している。一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼと比較して同一のまたは改良された鎖置換能力を有する。親ポリメラーゼは、配列番号１、１１、または表１に記載される任意のポリメラーゼから選択される。親ポリメラーゼは、配列番号１との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、またはそれより高い配列同一性を有する。
【０００７】
[7]一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｌ１２５Ｋ、Ｄ１２８Ｈ、Ｖ１７９Ｙ、Ｖ１７９Ｒ、Ｓ２１１Ｆ、Ｙ２１２Ｋ、Ｉ２１５Ｌ、Ｔ２１６Ｋ、Ｑ２２１Ｒ、Ｙ２４２Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｓ、Ｙ２５９Ｇ／Ｋ／Ｑ、Ａ２９２Ｋ、Ｓ２９３Ｇ、およびＳ２９４Ｔから選択される置換に対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｌ１２５Ｋに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｄ１２８Ｈに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｖ１７９Ｙに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｖ１７９Ｒに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｓ２１１Ｆに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２１２Ｋに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｉ２１５Ｌに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｔ２１６Ｋに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｑ２２１Ｒに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２４２Ｇに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２４２Ａに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２４２Ｌに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２４２Ｓに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２５９Ｇに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２５９Ｋに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｙ２５９Ｑに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ａ２９２Ｋに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｓ２９３Ｇに対応する置換を含む。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｓ２９４Ｔに対応する置換を含む。
【０００８】
[8]一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２４２Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｓ、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２５９Ｇ／Ｋ／Ｑ、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｄ１２８Ｈ、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２１２Ｇ、またはＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２１２Ｋから選択される。
【０００９】
[9]一実施形態においては、本発明は、親ポリメラーゼよりも大きい伸長速度を有する改変ポリメラーゼを提供する。一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼの伸長速度は、親ポリメラーゼよりも１．５倍〜５倍大きい。一部の実施形態においては、伸長速度は、親ポリメラーゼよりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍大きい。
【００１０】
[10]別の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、配列番号１または１１のポリメラーゼと比較した場合により短い平均待機時間を有する。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、配列番号１のポリメラーゼと比較した場合により短い平均待機時間を有する。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、配列番号１１のポリメラーゼと比較した場合により短い平均待機時間を有する。一実施形態においては、改変ポリメラーゼは、３秒未満の平均待機時間を有する。
【００１１】
[11]全ての実施形態において、ポリメラーゼバリアントは、配列番号１との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、あるいはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１２】
[12]本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は本発明の好ましい実施形態を示すが、この詳細な説明から本発明の範囲および趣旨内の様々な変化および改変が当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は単に説明として提供するものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[13]エキソヌクレアーゼアッセイまたは置換アッセイのいずれかにおいて使用する例示的な鋳型を示す図である（上図）。実施例３および４に関するものである。下図はローリングサークルアッセイを示す。実施例５に関するものである。
【図２】[14]エキソヌクレアーゼアッセイの結果を示す図である。示したバリアントの２つの複製についての経時変化を示す。親ポリメラーゼを対照とした。全ての変異ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性の低減を示すか、またはエキソヌクレアーゼ活性を示さない。実施例３に関するものである。
【図３】[15]置換アッセイの結果を示す図である。示したバリアントの２つの複製についての経時変化を示す。対照は図１におけるものと同一である。Ｌ１２５Ｋを除いて、試験した全ての変異体はこの図において伸長／置換活性を示している。実施例４に関するものである。
【図４】[16]ローリングサークルアッセイの結果を示す図である。アガロースゲルの写真を示している。Ｌ１２５Ｋを除くバリアントは活性を示している。右レーンおよび左レーンには参考用の分子ラダーがある。黄色の線は、配列番号８のポリメラーゼによって産生される期待される伸長産物が見られることになる場所を表す。実施例５に関するものである。
【図５】[17]ローリングサークルアッセイの結果を示す図である。アガロースゲルの写真を示している。レーン１および２０には参考用の分子ラダーがある。レーン８（Ｆ６）はＹ２１２Ｋである。バリアントは、図１および図２に示される英数字の参照番号を用いて特定される。黄色の線は、配列番号８のポリメラーゼによって生産される期待される発現産物が見られることになる場所を表す。実施例５に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[18]これより、以下の定義および例を使用して、単なる参照として本発明を詳細に説明する。本明細書において参照するあらゆる特許および刊行物は、このような特許および刊行物で開示されているあらゆる配列を含めて、参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。
【００１５】
[19]本明細書において別段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）により、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書が当業者に与えられる。本明細書において説明する方法および材料と類似または等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。当技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３年が実施者らに特に向くものである。方法、プロトコールおよび試薬は様々であり得るので、本発明は、記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解するべきである。
【００１６】
[20]数の範囲は、範囲を定める数を含める。約という用語は、本明細書においては、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するよう使用する。例えば「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指す。
【００１７】
[21]別段に示されていない限り、核酸は５’〜３’の方向でそれぞれ左から右に書き、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向でそれぞれ左から右に書く。
[22]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照によって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照によってより充分に定義される。
【００１８】
定義：
[23]アミノ酸：本明細書において使用する場合、「アミノ酸」という用語は、広義には、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態においては、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態においては、アミノ酸は、天然由来のアミノ酸である。一部の実施形態においては、アミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然由来のペプチドにおいて一般に見出される２０種の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるものであるか天然源から得られるものであるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、化学修飾アミノ酸としては、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換体が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、それらの活性に悪影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または、他の化学物質での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与することができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸、および／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。その用語が遊離アミノ酸、またはペプチドの残基のいずれを指すかは、その用語が使用される文脈から明らかになる。本明細書においては、全てのアミノ酸残基配列は、左右の方向が、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式によって示していることに留意するべきである。
【００１９】
[24]塩基対（ｂｐ）：本明細書において使用する場合、塩基対は、２本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との結び付きを指す。
【００２０】
[25]相補的：本明細書において使用する場合、「相補的」という用語は、塩基対形成による２本のポリヌクレオチド鎖の領域間、または２つのヌクレオチド間の配列相補性の広範な概念を指す。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることは公知である。同様に、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドと塩基対形成することができることは公知である。
【００２１】
[26]ＤＮＡ結合親和性：本明細書において使用する場合、「ＤＮＡ結合親和性」という用語は、典型的には、ＤＮＡ核酸に結合することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。一部の実施形態においては、ＤＮＡ結合活性は、２バンドシフトアッセイにおいて測定することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）の９．６３〜９．７５（核酸の末端標識について記載）を参照のこと。結合バッファー（リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、グリセロール１０％、ＫＣｌ２５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ）約１０μｌ中に少なくとも約０．５μｇのポリペプチドを含有する反応混合物を調製する。反応混合物を１０分間、３７℃に加熱する。標識した２本鎖核酸約１×１０４〜５×１０４ｃｐｍ（または約０．５〜２ｎｇ）を反応混合物に加え、さらに１０分間インキュベートする。反応混合物を、０．５倍トリスホウ酸バッファー中の未変性ポリアクリルアミドゲルに載せる。反応混合物を室温で電気泳動に付す。ゲルを乾燥させ、標準的な方法を使用してオートラジオグラフィーに付す。標識した２本鎖核酸の移動度において検出可能な減少がある場合は、ポリペプチドと２本鎖核酸の間に結合複合体が形成していることを示す。このような核酸結合活性は、標準的な濃度測定法を使用して、最初の反応混合物における放射能の総量と比較した結合複合体における放射能の量を測定することにより、定量することができる。ＤＮＡ結合親和性を測定する他の方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｋｏｎｇら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：１９６５〜１９７５を参照のこと）。
【００２２】
[27]伸長速度：本明細書において使用する場合、「伸長速度」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼがポリマー鎖を伸ばす平均速度を指す。本明細書において使用する場合、高伸長速度は、２ｎｔ／ｓより大きい（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０ｎｔ／ｓより大きい）伸長速度を指す。本出願において使用する場合、「伸長速度」、「伸長速度」、および「組み込み速度」という用語は互換的に使用する。
【００２３】
[28]酵素活性：本明細書において使用する場合、「酵素活性」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼの特異性および効率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は「ポリメラーゼ活性」とも呼ばれ、典型的には、ポリヌクレオチドの鋳型特異的合成を触媒することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。ポリメラーゼの酵素活性は、当技術分野で公知の様々な技術および方法を用いて測定することができる。例えば、ポリメラーゼの段階希釈物を、希釈バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．０  ２０ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＮＰ４０  ０．５％、およびＴｗｅｅｎ−２０  ０．５％）中で調製することができる。各希釈物について５μｌを取り出し、ＴＡＰＳ（ｐＨ９．２５）２５ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ｄＡＴＰ０．２ｍＭ、ｄＧＴＰ０．２ｍＭ、ｄＴＴＰ０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ０．１ｍＭ、活性化ＤＮＡ１２．５μｇ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（０．０５μＣｉ／ｎｍｏｌ）１００μＭ、および滅菌脱イオン水を含有する反応混合物４５μｌに加えることができる。反応混合物を３７℃（または、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでは７４℃）で１０分間インキュベートし、次いで反応物を４℃に急冷して、氷冷した６０ｍＭ  ＥＤＴＡ１０μｌを加えることによって停止させることができる。各反応混合物からアリコート２５μｌを取り出すことができる。組み込まれなかった放射能標識ｄＣＴＰを、ゲルろ過（Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｎ．Ｊ．）によって各アリコートから取り出すことができる。カラム溶離液を、シンチレーション液（１ｍｌ）と混合することができる。シンチレーションカウンターを用いてカラム溶離液中の放射能を定量化して、ポリメラーゼによって合成された産物の量を決定する。ポリメラーゼ活性の１単位は、３０分間に１０ｎモルの産物を合成するために必要なポリメラーゼの量として定義することができる（Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７〜６４７）。ポリメラーゼ活性を測定する他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照のこと）。
【００２４】
[29]精製された：本明細書において使用する場合、「精製された」は、分子が、含有されている試料の少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【００２５】
[30]単離された：「単離された」分子は、通常、例えば分子の自然環境で会合している少なくとも１種の他の分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子としては、その核酸分子を通常発現する細胞に含有された核酸分子が挙げられるが、その核酸分子は、染色体外、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００２６】
[31]相同性％：本明細書においては、「相同性％」という用語は、本明細書の「同一性％」という用語と互換的に使用し、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の間での、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
【００２７】
[32]例えば、本明細書において使用する場合、相同性８０％は、定義済みのアルゴリズムによって決定される配列同一性８０％と同じことを意味し、したがって所与の配列の相同体は、所与の配列ある長さにわたって８０％超の配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、所与の配列、例えば本明細書に記載する本発明のポリペプチドのいずれか１つのコード配列との８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
[33]２つの配列間の同一性を決定するのに使用することができる例示的なコンピュータープログラムとしては、インターネット上で公開されている一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、も参照のこと。
【００２９】
[34]配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列および他の公開データベースの核酸配列と比較して所与の核酸配列を評価する場合には、典型的にはＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋのタンパク質配列および他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、全ての読み枠で翻訳されている核酸配列を検索することに好ましい。ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティー、および１．０のエクステンディッドギャップペナルティーのデフォルトパラメーターを使用し、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用して走らせる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７年を参照のこと。）
[35]２つ以上の配列間での「同一性％」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用し、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１のエクステンディッドギャップペナルティーを含むデフォルトパラメーター、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似度マトリックスを用いて動作させて行う。
【００３０】
[36]改変ＤＮＡポリメラーゼ：本明細書において使用する場合、「改変ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、別の（すなわち、親）ＤＮＡポリメラーゼから生じ、親ＤＮＡポリメラーゼと比較して１つまたは複数のアミノ酸の変化（例えば、アミノ酸の置換、欠失または挿入）を含有するＤＮＡポリメラーゼを指す。一部の実施形態においては、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来のＤＮＡポリメラーゼ、または野生型ＤＮＡポリメラーゼから生じるか、またはそれから改変されている。一部の実施形態においては、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡポリメラーゼまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼから生じるか、またはそれから改変されている。組換えＤＮＡポリメラーゼまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼとしては、キメラＤＮＡポリメラーゼ、融合ＤＮＡポリメラーゼ、または別の改変ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、改変ＤＮＡポリメラーゼは、親ポリメラーゼと比較して変更された表現型を少なくとも１つ有する。
【００３１】
[37]変異：本明細書において使用する場合、「変異」という用語は、親配列に導入された変更を指し、その変更としては、置換、挿入、欠失（切り詰めを含める）が挙げられるが、これらに限定されない。変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質では見出されない新しいまたは変化した特性、特質、機能、表現型、または形質の創造が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
[38]変異体：本明細書において使用する場合、「変異体」という用語は、親タンパク質と比較した場合に変化した特性を示す改変タンパク質を指す。「バリアント」および「変異体」という用語は、本明細書において互換的に使用する。
【００３３】
[39]野生型：本明細書において使用する場合、「野生型」という用語は、天然由来の供給源から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００３４】
[40]忠実度：本明細書において使用する場合、「忠実度」という用語は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の精度、または、鋳型ＤＮＡに結合している誤ったヌクレオチドに対する正しいヌクレオチドのｋｏｆｆの測定差異のいずれかを指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、典型的には、エラー率（不正確なヌクレオチド、すなわち、鋳型依存的な方式で組み込まれていないヌクレオチドを組み込む頻度）によって測定する。ＤＮＡ重合の精度または忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。「高忠実度」という用語は、４．４５×１０−６変異／ｎｔ／倍加未満（例えば、４．０×１０−６、３．５×１０−６、３．０×１０−６、２．５×１０−６、２．０×１０−６、１．５×１０−６、１．０×１０−６、０．５×１０−６変異／ｎｔ／倍加未満）のエラー率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、本明細書に記載するように試験するか、またはＪｏｈｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１０年５月；１８０４（５）：１０４１〜１０４８において記載されているように試験することができる。
【００３５】
[41]ナノポア：本明細書において使用する場合、「ナノポア」という用語は概して、膜に形成された、または他の方法で膜に与えられた細孔、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、ポリマー材料で形成された膜などの合成膜であってもよい。膜はポリマー材料としてもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などの検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。一部の例においては、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。一部のナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素、ＭｓｐＡは、タンパク質ナノポアの例である。
【００３６】
[42]ヌクレオチド：本明細書において使用する場合、ＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニットは、糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素含有複素環塩基からなる。塩基はグリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの３’位または５’位に結合したリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作用的に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書においては典型的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と呼び、本明細書においては、左から右への方向が、５’末端から３’末端への従来の方向になっている式によって表す。本明細書において使用する場合、「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオチドポリリン酸、例えば、ヌクレオチド３、４、５、６、７、または８リン酸を指す。
【００３７】
[43]オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：本明細書において使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３つ超のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、その因子はさらにはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存することになる。オリゴヌクレオチドは、合成によって、またはクローニングによって得ることができる。本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、鎖内で共有結合したヌクレオチド単量体で構成されたポリマー分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。
【００３８】
[44]ポリメラーゼ：本明細書において使用する場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する（すなわち、ポリメラーゼ活性）酵素を指す。通常、その酵素は、ポリヌクレオチドの鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型鎖の５’末端へ進行することになる。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。
【００３９】
[45]プライマー：本明細書において使用する場合、「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、例えば、好適な温度における適切なバッファー（「バッファー」は、ｐＨ、イオン強度、補助因子などを含む）中の４種の異なるヌクレオチド三リン酸および熱安定性酵素の存在下で、核酸合成の開始点の役割を果たすことができる、天然に存在しているものであっても合成によって生成されたものであってもよいオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅効率を最大にするために１本鎖であることが好ましいが、代替的に２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは、まず、その鎖が分離するよう処理し、その後、伸長産物の調製に使用する。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、熱安定性酵素の存在下での伸長産物の合成の出発物質となるのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および方法の用途を含めた多くの因子に依存することになる。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５ヌクレオチドを含有するが、それよりも多いか、または少ないヌクレオチドを含有することができる。短いプライマー分子は概して、鋳型と充分に安定なハイブリッド複合体を形成するにはより低い温度を必要とする。
【００４０】
[46]処理能力：本明細書において使用する場合、「処理能力」は、鋳型に付いてとどまり、複数の改変反応を行うポリメラーゼの能力を指す。「改変反応」としては、重合、およびエキソヌクレアーゼ的切断が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖から酵素が途中で解離することなく一連の重合工程を行うＤＮＡポリメラーゼの能力を指す。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼの「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖からＤＮＡポリメラーゼが途中で解離することなく重合または改変されるヌクレオチドの長さ（例えば、２０ｎｔ、３００ｎｔ、０．５〜１ｋｂ以上）によって測定する。「処理能力」は、ポリメラーゼの性質、ＤＮＡ鋳型の配列、および反応条件、例えば、塩濃度、温度、または特定のタンパク質の存在に依存し得る。本明細書において使用する場合、「高処理能力」という用語は、鋳型との１会合／解離当たり２０ｎｔ超（例えば、４０ｎｔ超、６０ｎｔ超、８０ｎｔ超、１００ｎｔ超、１２０ｎｔ超、１４０ｎｔ超、１６０ｎｔ超、１８０ｎｔ超、２００ｎｔ超、２２０ｎｔ超、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ超、２８０ｎｔ超、３００ｎｔ超、３２０ｎｔ超、３４０ｎｔ超、３６０ｎｔ超、３８０ｎｔ超、４００ｎｔ超、またはそれ以上）の処理能力を指す。処理能力は、本明細書およびＷＯ０１／９２５０１Ａ１（ＭＪ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、２００１年１２月０６日公開）において定義された方法に従って測定することができる。
【００４１】
[47]鎖置換：本明細書において使用する場合、「鎖置換」という用語は、本明細書において記載するように鎖置換活性アッセイを用いて測定される、新生ＤＮＡ鎖の合成中に出会う下流のＤＮＡを置換するポリメラーゼの能力を意味する。ＤＮＡポリメラーゼは、様々な程度の鎖置換活性を有することができる。
【００４２】
[48]合成：本明細書において使用する場合、「合成」という用語は、鋳型依存的な方式で、新しいポリヌクレオチド鎖を作製するか、または現存するポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長する任意のインビトロ方法を指す。本発明による合成には、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列の複製物の数を増加させる増幅が含まれる。ポリヌクレオチドの合成（例えば、増幅）の結果、ヌクレオチドがポリヌクレオチド（すなわちプライマー）に組み込まれ、それによってポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子が形成される。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、さらなるポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用することができる。本明細書において使用する場合、「ＤＮＡ合成」には、ＰＣＲ、ポリヌクレオチドの標識（すなわち、プローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーに対して）、ポリヌクレオチドシーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
[49]鋳型ＤＮＡ分子：本明細書において使用する場合、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えばプライマー伸長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的な核酸鎖が合成される核酸鎖を指す。
【００４４】
[50]鋳型依存的な方式：本明細書において使用する場合、「鋳型依存的な方式」という用語は、鋳型依存的なプライマー分子の伸長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含むプロセスを指す。「鋳型依存的な方式」という用語は、典型的には、新たに合成されるポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的な塩基対形成の周知の規則によって規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチドの合成を指す（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照のこと）。
【００４５】
[51]タグ：本明細書において使用する場合、「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または、原子もしくは分子の集団としてもよい検出可能な部分を指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導的、容量的）性状を示すことができ、その性質は、ナノポアを利用して検出することができる。
【００４６】
[52]タグ付きヌクレオチド：本明細書において使用する場合、「タグ付きヌクレオチド」という用語は、タグが付けられたヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを指す。タグは、糖、リン酸（もしくはポリリン酸）、または塩基に共有結合で付けてもよい。タグは、末端リン酸上にあってもよい。
【００４７】
[53]ベクター：本明細書において使用する場合、「ベクター」という用語は、異なる宿主細胞間の移動用に設計された核酸構造物を指す。「発現ベクター」は、外来性細胞において異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者に知られている。
【００４８】
[54]本明細書において示すポリメラーゼバリアントは、ＷＯ２０１３／１８８８４１（Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｐ  Ｓｅｔ−Ｕｐ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−Ａｃｃｕｒａｃｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、２０１３年１２月１９日公開）において記載されている、チップを用いたポリヌクレオチドシーケンシングに有用である。
【００４９】
[55]ＤＮＡのシーケンシングに用いられるポリメラーゼの望ましい特性は、以下のとおりである。
ａ．遅いｋｏｆｆ（ヌクレオチドに対して）
ｂ．速いｋｏｎ（ヌクレオチドに対して）
ｃ．高忠実度
ｄ．低エキソヌクレアーゼ活性
ｅ．ＤＮＡ鎖置換
ｆ．ｋｃｈｅｍ
ｇ．向上した安定性
ｈ．処理能力
ｉ．塩耐性
ｊ．ナノポアへの取付けの適合性
ｋ．４、５、６、７、または８個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸を組み込む能力
ｌ．シーケンシング精度
ｍ．長いリード長、すなわち長時間連続性解読。
【００５０】
命名法
[56]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字表記および３文字表記を使用する。
【００５１】
[57]参照を容易にするため、本出願のポリメラーゼバリアントは、以下の命名法を使用して記載する。
[58]元のアミノ酸（１つまたは複数）：位置（１つまたは複数）：置換したアミノ酸（１つまたは複数）。この命名法によれば、例えば、位置２４２におけるセリンのアラニンによる置換は、
Ｓｅｒ２４２ＡｌａまたはＳ２４２Ａ
として示す。
【００５２】
[59]複数の変異はプラス記号によって分ける。すなわち、
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は、位置３０および３４における、アラニンとグルタミン酸をそれぞれアスパラギンとセリンに置換する変異を表す。
【００５３】
[60]１つまたは複数の代替アミノ酸残基を所与の位置に挿入することができる場合は、Ａ３０Ｎ／Ｅ、またはＡ３０ＮもしくはＡ３０Ｅとして示す。
[61]別段に述べられていない限り、残基の番号付けは配列番号２（Ｈｉｓタグ付きＰｏｌ６）に関するものである。
【００５４】
ポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発
[62]クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４野生型配列は、本明細書において示しており（配列番号３、核酸コード領域およびＨｉｓタグ；配列番号１、アミノ酸配列）、他の場所で入手可能である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓまたはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＨ２７１１３）。親ポリメラーゼは、配列番号１もしくは１１、または以下のｐｏｌ６バリアントのいずれかから選択することができる。
【００５５】
【表１−１】
2019512217.tif 000002
【００５６】
【表１−２】
2019512217.tif 000003
【００５７】
[63]点変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ２キット（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、製造業者の指示書またはＮＥＢ  Ｑ５突然変異誘発プロトコールに従って導入することができる。
【００５８】
[64]一実施形態においては、配列番号１、８、または親ポリメラーゼと比較して変化した酵素活性を有するバリアントポリメラーゼは、
ａ．  Ｔ４５Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｂ．  Ｈ１２３Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｃ．  Ｌ１２５Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｄ．  Ｗ１２７Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｅ．  Ｄ１２８Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｆ．  Ｙ２１２Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｇ．  Ｅ２１９Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｈ．  Ｅ２３９Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｉ．  Ｄ２４１Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｊ．  Ｙ２４２Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ、
ｋ．  Ｙ２５９Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆまたは
ｌ．  Ｑ２６０Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｈ／Ｓ／Ｙ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｍ／Ｆ
から選択される変異を有する。
【００５９】
[65]プライマーは、営利会社、例えばＩＤＴ  ＤＮＡに注文することができる。
ナノポア構築および挿入
[66]本明細書において記載する方法は、ポリメラーゼがナノポアに付いたナノポアを使用することができる。一部の場合においては、（例えば、各ナノポアで１つのみの核酸分子がシーケンシングされるように）ナノポア１つ当たりただ１つのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、例えばアルファ溶血素（ａＨＬ）を含めた多くのナノポアは、複数のサブユニット（例えば、ａＨＬでは７サブユニット）を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一複製物であり得る。本明細書においては、無改変サブユニット（例えば、ａ−ＨＬ）に対する改変サブユニット（例えば、ａ−ＨＬバリアント）の規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を提供する。本明細書においては、無改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を作製する方法も提供する。
【００６０】
[67]ＷＯ２０１４／０７４７２７（Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の図２７を参照すると、複数のサブユニットを有するタンパク質を構築する方法は、複数の第１のサブユニット２７０５を用意すること、および複数の第２のサブユニット２７１０を用意することを含み、第２のサブユニットは第１のサブユニットと比較すると改変されている。一部の場合においては、第１のサブユニットは野生型（例えば、天然源から精製したもの、または組換えで作製したもの）である。第２のサブユニットは、任意の好適な方法で改変することができる。一部の場合においては、第２のサブユニットは、（例えば、融合タンパク質として）付けられたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を有する。
【００６１】
[68]改変サブユニットは、化学反応性部分（例えば、連結の形成に好適なアジド基またはアルキン基）を含むことができる。一部の場合においては、当該方法は、反応（例えば、Ｃｌｉｃｋ化学付加環化）を行って、実在物（例えば、ポリメラーゼ）を化学反応性部分に付けることをさらに含む。
【００６２】
[69]当該方法は、第１のサブユニットを第２のサブユニット２７１５と第１の比で接触させて、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを有する複数のタンパク質２７２０を形成させることをさらに含むことができる。例えば、ポリメラーゼを付けるのに好適な反応基を有する改変ａＨＬサブユニット１部を、野生型ａＨＬサブユニット６部と混合することができる（すなわち、第１の比は１：６である）。複数のタンパク質は、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの複数の比を有することができる。例えば、混合したサブユニットは、改変サブユニット：無改変サブユニットの化学量論比（例えば、１：６、２：５、３：４）の分布を有するいくつかのナノポアを形成させることができる。
【００６３】
[70]一部の場合においては、タンパク質は、サブユニットを単純に混合することによって形成させる。例えばａＨＬナノポアの場合においては、界面活性剤（例えば、デオキシコール酸）は、ａＨＬ単量体が細孔構造をとることを引き起こすことができる。ナノポアは、脂質（例えば、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）または１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））、および中温（例えば、約１００℃未満）を用いて形成させることもできる。一部の場合においては、ＤＰｈＰＣを緩衝溶液と混合すると、大きな多重膜ベシクル（ＬＭＶ）が生じ、この溶液にａＨＬサブユニットを加えて、混合物を４０℃で３０分間インキュベートすると、細孔が形成する。
【００６４】
[71]異なる２種類のサブユニット（例えば、天然野生型タンパク質と、単一点変異を含有することができる第２のａＨＬ単量体）を使用する場合、得られるタンパク質は、（例えば野生型と変異体タンパク質の）混合化学量論比を有することができる。これらのタンパク質の化学量論比は、細孔形成反応において使用する２種のタンパク質の濃度比に依存した式に従うことができる。この式は以下のとおりである。
１００Ｐｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ−ｍ）！］・ｆｍｕｔｍ・ｆｗｔｎ〜ｍ、式中
Ｐｍ＝ｍ個の変異体サブユニットを有する細孔の確率
ｎ＝サブユニットの総数（例えば、ａＨＬでは７個）
ｍ＝「変異体」サブユニットの数
ｆｍｕｔ＝一緒に混合した変異体サブユニットの割合または比
ｆｗｔ＝一緒に混合した野生型サブユニットの割合または比
[72]当該方法は、複数のタンパク質を分画して、第２のサブユニット２７２５に対する第１のサブユニットの第２の比を有するタンパク質の割合を増やすことをさらに含むことができる。例えば、ただ１つの改変サブユニットを有するナノポアタンパク質を単離することができる（例えば、第２の比は１：６）。しかしながら、いずれの第２の比も好適である。第２の比の分布も分画することができ、例えば、１つまたは２つのいずれかの改変サブユニット有するタンパク質の割合を増やすことができる。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７に示されているように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は７個であるとは限らない（例えば、異なるナノポアを使用することができ、または６個のサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアが形成し得る）。一部の場合においては、１つのみの改変サブユニットを有するタンパク質の割合を増やす。このような場合においては、第２の比は、第１のサブユニット（ｎ−１）個当たり、第２のサブユニット１個であり、ｎはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
【００６５】
[73]第１の比は、第２の比と同じものとすることができるが、必要とされるものではない。一部の場合においては、変異単量体を有するタンパク質は、変異サブユニットを有しないタンパク質よりも低い効率で形成し得る。この場合は、第１の比は、第２の比よりも大きいものとすることができる（例えば、変異サブユニット１：無変異サブユニット６の第２の比がナノポアで所望される場合、好適な数の１：６タンパク質を形成させるには、１：６よりも大きい比でサブユニットを混合することが必要とされてもよい）。
【００６６】
[74]異なる第２のサブユニット比を有するタンパク質は、分離において、異なる挙動を示す（例えば、異なる保持時間を有する）ことができる。一部の場合においては、タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを使用して分画する。第１および第２のサブユニットは、改変を除いては同一とすることができるので、タンパク質における改変の数は、分離の根拠として役割を果たすことができる。一部の場合においては、第１または第２のサブユニットのいずれかは、分画を可能にするか、または分画の効率を改良するよう、（例えば、改変に加えて）精製タグを有する。一部の場合においては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐタグ）、または他のペプチドタグを使用する。一部の例においては、第１および第２のサブユニットはそれぞれ異なるタグを含み、分画工程では、各タグに基づき分画される。Ｈｉｓタグの場合には、低いｐＨでタグに電荷を生じさせる（ヒスチジン残基は、側鎖のｐＫａ未満で正に荷電する）。他のものと比較してａＨＬ分子の１つにおいて電荷が有意に異なることにより、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、０、１、２、３、４、５、６、または７個の「電荷タグ付き」ａＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離することができる。原則的に、この電荷タグは、一定の電荷を運ぶ任意のアミノ酸が糸状に連なるものとすることができる。図２８および図２９では、Ｈｉｓタグに基づくナノポアの分画の例が示されている。図２８では、２８０ナノメートルにおける紫外吸光度、２６０ナノメートルにおける紫外吸光度、および伝導率のプロットが示されている。ピークは、改変サブユニットと無改変サブユニットの様々な比を有するナノポアに一致する。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２９では、ＨｉｓタグとＳｔｒｅｐタグの両方を使用した、ａＨＬナノポアおよびその変異体の分画が示されている。
【００６７】
[75]一部の場合においては、分画後に、実在物（例えば、ポリメラーゼ）をタンパク質に付ける。タンパク質はナノポアとすることができ、実在物はポリメラーゼとすることができる。一部の例においては、当該方法は、第２の比のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入することをさらに含む。
【００６８】
[76]一部の状況においては、ナノポアは、複数のサブユニットを含むことができる。ポリメラーゼは、サブユニットの１つに付けることができ、サブユニットの少なくとも１つかつ全部未満が、第１の精製タグを含む。一部の例においては、ナノポアはアルファ溶血素またはそのバリアントである。一部の例においては、サブユニットの全てが第１の精製タグまたは第２の精製タグを含む。第１の精製タグは、（例えば、ポリメラーゼが付いたサブユニットにおける）ポリヒスチジンタグとすることができる。
【００６９】
ナノポアに付けられたポリメラーゼ
[77]一部の場合においては、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアに付けられ、かつ／または、ナノポアの近傍に配置される。ポリメラーゼは、ナノポアが膜に組み込まれる前または後に、ナノポアに付けることができる。一部の例においては、ナノポアおよびポリメラーゼは融合タンパク質（すなわち、単一のポリペプチド鎖）である。
【００７０】
[78]ポリメラーゼは、任意の好適な方法でナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、ナノポア（例えば、溶血素）タンパク質単量体に付け、その後、（例えば、ポリメラーゼが付いていないナノポア（例えば、溶血素）単量体６つに対し、ポリメラーゼが付いた単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を構築する。次いでナノポア七量体を膜に挿入することができる。
【００７１】
[79]ポリメラーゼをナノポアに付ける別の方法は、溶血素単量体にリンカー分子を付けるか、または溶血素単量体を、取付け部位を有するよう変異させること、ならびに、その後、（例えば、リンカーおよび／または取付け部位を有しない溶血素単量体６つに対し、リンカーおよび／または取付け部位を有する単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を構築することを含む。次いでポリメラーゼを、（例えば、膜への挿入前に、大量で）取付け部位または取付けリンカーに付けることができる。ポリメラーゼは、（例えば、七量体の）ナノポアを膜に形成させた後で、取付け部位または取付けリンカーに付けることもできる。一部の場合においては、複数のナノポア−ポリメラーゼペアを、バイオチップの（例えば、ウェルおよび／または電極に配置した）複数の膜に挿入する。一部の例においては、ポリメラーゼのナノポア複合体への取付けは、各電極上のバイオチップにおいて行う。
【００７２】
[80]ポリメラーゼは、任意の好適な化学作用（例えば、共有結合および／またはリンカー）を用いてナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、分子ステープル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｐｌｅ）を用いてナノポアに付ける。一部の例においては、分子ステープルは、３種のアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、およびＣで示す）を含む。リンカーＡは溶血素単量体から延びることができ、リンカーＢはポリメラーゼから延びることができ、その場合にリンカーＣは、リンカーＡとリンカーＢを（例えば、リンカーＡとリンカーＢの両方に巻き付くことによって）つなぐことができ、したがってポリメラーゼをナノポアとつなぐことができる。リンカーＣは、リンカーＡまたはリンカーＢの一部分となるよう構築することもでき、したがってリンカー分子の数は減る。
【００７３】
[81]一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を用いてナノポアに連結する。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）は、ＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４−ホルミル安息香酸エステル、芳香族アルデヒド）の間の反応とすることができる。一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｃｌｉｃｋ化学（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を用いてナノポアに連結する。一部の場合においては、溶血素分子にジンクフィンガー変異を導入し、次に分子（例えば、ＤＮＡ中間体分子）を使用してポリメラーゼを溶血素のジンクフィンガー部位に連結する。
【００７４】
[82]ポリメラーゼをナノポアに付けることにおいて使用することができる他のリンカーは、直接の遺伝子連結（例えば、（ＧＧＧＧＳ）１−３アミノ酸リンカー（配列番号１２））、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えば、ＲＳＫＬＧ（配列番号１３））、ソルターゼ媒介連結、およびシステイン修飾による化学連結である。本明細書において有用であると考えられる具体的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）１−３（配列番号１２）、Ｎ末端のＫタグ（ＲＳＫＬＧ（配列番号１３））、ΔＴＥＶ部位（１２〜２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２〜４９）である。
【００７５】
装置のセットアップ
[83]ナノポアは、集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成するか、または他の方法で埋め込んでもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）としてもよい。一部の例においては、集積回路は電界効果トランジスターまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、ナノポアを有するチップもしくは他のデバイスに位置するか、または、チップもしくはデバイスの外部に、例えばオフチップ配置などで位置することができる。半導体は任意の半導体とすることができ、ＩＶ族半導体（例えば、ケイ素）、およびＩＩＩ−Ｖ族半導体（例えば、ヒ化ガリウム）が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスのセットアップについては、例えば、ＷＯ２０１３／１２３４５０を参照のこと。
【００７６】
[84]細孔を用いたセンサー（例えば、バイオチップ）は、単一分子の電子照合に使用することができる。細孔を用いたセンサーは、検出電極に隣接して、またはその近傍に配置された膜に形成された本開示のナノポアを含むことができる。センサーは対電極を含むことができる。膜は、トランス側（すなわち、検出電極に面する側）およびシス側（すなわち、対電極に面する側）を含む。
【００７７】
[85]この後の実験に関する開示においては、以下の略記が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μＬまたはμｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；ｄＮ６Ｐ（デオキシヌクレオチド六リン酸）。
【実施例】
【００７８】
[86]実施例３〜５の親ポリメラーゼは、配列番号１においてＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆの変異を含むもの（配列番号８）であった。
実施例１
定方向突然変異誘発
[87]この実施例では、ｐｏｌ６ポリメラーゼへの所望の位置での変異導入を説明している。
【００７９】
[88]Ｈｉｓタグ付き野生型ｐｏｌ６をコードするＤＮＡを、商業的供給源（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。配列は、シーケンシングによって確かめた。
【００８０】
[89]変異体スクリーニング用に、ポリメラーゼをそのまま発現させた（Ｎ末端Ｈｉｓ−Ｐｏｌ６）。ｐｏｌがチップに付くことを試験するため、ｐｏｌ６のＮ末端またはＣ末端にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを操作して入れた。
【００８１】
[90]Ｐｏｌ６−エキソヌクレアーゼ活性に影響を与える合理的位置は、公知の結晶構造のホモロジーモデリングに基づいて同定した。
[91]最初のスクリーニング用に、合理的位置の各々を、Ｑ５突然変異誘発プロトコールを用いて、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＭｅｔに変異させた。
【００８２】
[92]各突然変異誘発反応用のプライマーは、ＮＥＢ塩基チェンジャープロトコールを用いて設計し、ＩＤＴに９６ウェルプレートフォーマットで注文した。
[93]順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、ＮＥＢから購入したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用して、ハイスループット（ＨＴＰ）フォーマットで５’リン酸化した。典型的な２５μｌ反応物は、１０μＭのプライマー１５μｌ、５倍反応バッファー（ＮＥＢより）５μｌ、ＰＮＫ酵素１．２５μｌ、水３．７５μｌを含有した。反応は３７℃で３０分間行い、酵素は６５℃で２０分間熱失活させた。
【００８３】
[94]ＰＣＲ突然変異誘発は、ＮＥＢからのＱ５ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。典型的な２５μｌ反応物は、Ｑ５バッファー５μｌ、ＧＣエンハンサー５μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ０．５μｌ、１０μＭリン酸化突然変異誘発順方向プライマーおよび逆方向プライマー１．２５μｌ、Ｑ５ポリメラーゼ０．２５μｌ、および５ｎｇ／ｍｌ野生型Ｐｏｌ６鋳型、すなわちＨｉｓ−Ｐｏｌ６  １μｌ、およびＨ２Ｏ１０．７５μｌを含有した。
【００８４】
[95]ＰＣＲが完了したら、Ｄｐｎ１  ０．５μｌをＰＣＲミックス２５μｌに加え、３７℃で１時間インキュベートした。
[96]Ｄｐｎ１で処理したＰＣＲ産物２．５μｌをＢｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス２．５μｌに加える。室温で１時間インキュベートした。
【００８５】
[97]ライゲーションミックス１μｌを、９６ウェルＢＬ２１ＤＥ３細胞（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）２０μｌに加え、氷上で５分間インキュベートする。
[98]ＰＣＲデバイスを使用して、正確に３０秒間、４２℃で熱ショックを与え、氷上に２分間置く。
【００８６】
[99]ＳＯＣ８０μｌを加え、３７℃のインキュベーターで１時間、振盪せずにインキュベートする。
[100]ＳＯＣまたは超純水１００μｌを加え、カナマイシン５０〜１００μｇ／ｍｌを含む４８ウェルＬＢ寒天プレートに蒔く。
【００８７】
実施例２
発現および精製
[101]以下の実施例では、ｐｏｌ６バリアントをハイスループット法を用いてどのように発現させて精製したかを詳しく述べる。
【００８８】
[102]ｐＤ４４１ベクター（発現プラスミド）中のバリアントをコードするＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換し、グリセロールストックを作製した。グリセロールストックから取った微量から開始し、グルコース０．２％およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢでスターター培養物１ｍｌを約８時間増殖させた。対数期のスターター培養物２５μｌを、９６ディープウェルプレートの発現培地１ｍｌ（グルコース０．２％、リン酸カリウム５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ、およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを追加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）自己誘導培地）に移す。プレートを、２５０〜３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３６〜４０時間インキュベートした。
【００８９】
[103]次に細胞を、４℃で３０分間、３２００×ｇにて遠心分離して収集した。デカントして培地を除き、細胞ペレットをあらかじめ冷却した溶解バッファー２００μｌ（リン酸カリウム２０ｍＭ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ１００ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ、ＰＭＳＦ１ｍＭ、１×Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ、リゾチーム１００μｇ／ｍｌ、およびプロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁させ、穏やかに撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。次いで１０倍ストックからの２０μｌを、最終濃度１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ｉに加え、氷上で５〜１０分間インキュベートして溶解液を生成させる。溶解液に、１Ｍリン酸カリウム２００μｌ、ｐＨ７．５（最終濃度は、溶解液４００μｌ中の約０．５Ｍリン酸カリウムとなる）を追加し、４℃で１０分間、約１５００ｒｐｍにて遠心分離することによりＰａｌｌフィルタープレート（部品番号５０５３、３ミクロンフィルター）でろ過する。次いで、澄んだ溶解液を、平衡化した９６ウェルＨｉｓ−Ｐｕｒコバルトプレート（Ｐｉｅｒｃｅ部品番号９００９５）に入れ、１５〜３０分間結合させた。
【００９０】
[104]流出液（ＦＴ）を、５００×Ｇにて３分間遠心分離することによって収集した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー１（リン酸カリウム０．５Ｍ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ１Ｍ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ、およびＴｗｅｅｎ２０  ０．５％）で３回洗浄した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー２（トリス５０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、イミダゾール２０ｍＭ）で２回洗浄した。
【００９１】
[105]Ｐｏｌを、溶出バッファー２００μｌ（トリス５０ｍＭ  ｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％、イミダゾール３００ｍＭ、グリセロール２５％）を使用して溶出させ、１〜２分のインキュベーション後に収集した。溶離液を２〜３回、同じＨｉｓ−Ｐｕｒプレートに再び入れて、溶離液中に濃縮したＰｏｌ６を得る。精製したポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した場合に９５％超の純度である。タンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって評価した場合に約３ｕＭ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）であり、２６０／２８０比は０．６である。
【００９２】
[106]ポリメラーゼ活性は、蛍光置換アッセイによって確認する（実施例４を参照のこと）。
実施例３
エキソ活性アッセイ
[107]この実施例は、バリアントのエキソヌクレアーゼ活性を決定する方法を示す。
【００９３】
[108]アッセイは、蛍光に基づくアッセイである。ヌクレオチドの非存在下かつＭｇ＋２の存在下でポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は開始される。ポリメラーゼはＤＮＡ鋳型から一つずつ残基を除去し始め、そしてそれがかみ続けると消光剤からフルオロフォアを放出し、シグナルを増加させる。図１を参照のこと。
【００９４】
[109]使用した配列は以下のとおりであった。
ヘアピン置換オリゴ（すなわち、ＡＴＴＯ−４８８置換鋳型）
５’−／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧ−３’（配列番号６）
相補的オリゴのショート
５’−ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号７）
[110]使用したフルオロフォアは、Ａｔｔｏ−４８８であった。使用した消光剤は、３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱであった。以下のＰＣＲプロトコールを用いてプライマーを１：１の比で鋳型にアニーリングさせる。
ｉ．  ９５℃で５分間
ｉｉ．  ９３℃で５０秒間、温度が６１℃に達するまで２度／サイクルで減少させる
ｉｉｉ．  ５９℃で２５秒間、温度が３５℃に達するまで２度／サイクルで減少させる
次いで、使用まで４℃で保管した。
【００９５】
[111]バッファーＡ２０μＬ（グルタミン酸カリウム７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ０．２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、ＢＳＡ２５μｇ／ｍｌ、およびＡＴＴＯ−４８８置換鋳型５０ｎＭ（プライマーにあらかじめアニーリングさせた）（最終濃度）、ポリメラーゼ５μＬ（最終濃度１００ｎＭ）、ならびにバッファーＢ１５μＬ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、グルタミン酸カリウム７５ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、ＢＳＡ２５μｇ／ｍｌ、およびＭｇＣｌ２  ５ｍＭ；最終濃度）を混合することによって、最終４０μｌの反応混合物を調製した。
【００９６】
[112]バッファーＡ２０μＬをポリメラーゼ５μＬと混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨプレートリーダーを使用し、それがバッファーＢ１５μＬを加えることによって反応を開始させ、蛍光の増加を２時間にわたって８秒毎に測定（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）するようにプログラムした。対照と比較した場合に２時間にわたって蛍光シグナルの減少が観測された場合、さらなる研究のために変異体を選択した。
【００９７】
[113]選択バリアントの結果を図２に示す。
実施例４
置換アッセイ
[114]この実施例は、エキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ−）バリアントの鎖置換活性を示す。
【００９８】
[115]鎖置換ポリメラーゼアッセイは、合成中に２本鎖ＤＮＡを通って移動する酵素の能力を測定する。このアッセイは蛍光に基づいており、伸長されなかったＤＮＡ鋳型の蛍光は弱く、伸長された鋳型はＤＮＡの一部を置換し、それによりそれらは伸長されなかったＤＮＡ鋳型よりも強い蛍光を発する。図１を参照のこと。Ｍｇ２＋およびヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼはヘアピン鋳型に沿って伸長し、消光剤オリゴを置換して蛍光の増加をもたらす。
【００９９】
[116]使用したフルオロフォアはＣｙ５であり、消光剤は３ＢＨＱ−２であった。
[117]使用した配列は以下のとおりであった。
ヘアピン置換オリゴ（すなわち、Ｃｙ５−置換鋳型）（配列番号４および１４）
５−／５Ｃｙ５／ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  Ｔ／ｉＳｐＣ３／ＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＣＧＧ−３
相補的オリゴのショート（配列番号５）
５’−ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＴ／３ＢＨＱ＿２／−３’
[118]バッファーＡ２３μＬ（グルタミン酸カリウム７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ０．２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、ＢＳＡ２５μｇ／ｍｌ、Ｃｙ５ショート鋳型、およびｄＮ６Ｐ２０μＭ（最終濃度）、ポリメラーゼ４μＬ（最終濃度１００ｎＭ）、バッファーＢ１０μＬ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、グルタミン酸カリウム３００ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、ＢＳＡ２５μｇ／ｍｌ、およびＭｇＣｌ２  ５ｍＭ；最終濃度）、および１Ｍグルタミン酸カリウム８μＬを混合することによって、最終４５μＬの反応混合物を調製した。
【０１００】
[119]バッファーＡ２３μＬをＰｏｌ４μＬと混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨプレートリーダーを使用し、それが１Ｍ  Ｋ−Ｇｌｕ８μＬを加え、５秒間振盪し、５秒間待ち、バッファーＢ１０μＬを加えることによって反応を開始させ、１００秒間、０．１秒毎に蛍光を測定（励起６４８ｎｍ、発光６６８ｎｍ）するようにプログラムした。
【０１０１】
[120]次いで、変曲（ｉｎｆｌｉｃｔｉｏｎ）までの時間、したがってｋｃａｔを計算した。
[121]例示的な置換結果を図３に示す。
【０１０２】
実施例５
ローリングサークルアッセイ
[122]この実施例は、鎖置換、および、鋳型ＤＮＡに基づいて新しい鎖を合成するポリメラーゼの能力を決定する別の方法を示す。
【０１０３】
[123]ローリングサークルアッセイ（ＲＣＡ）は、環状鋳型ＤＮＡを使用して、多くの回数その環を回るＤＮＡポリメラーゼの能力を試験するものである。このアッセイは別の種類の鎖置換アッセイであり、詳細には酵素の鎖置換活性を試験する。それは、ゲルを使用してそれらの移動パターンを測定することによりモニターする。典型的には、酵素がその環を周回する回数が多くなる程、それが合成するＤＮＡ片は大きくなり、生じる断片はゲル上をより遅く移動する。
【０１０４】
[124]バッファーＡ２０μＬ（グルタミン酸カリウム７５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ０．２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、ＢＳＡ２５μｇ／ｍｌ、プライマー（配列番号１０）と複合化したＨＦＣｉｒｃ１０  １００ｎＭ（社内製の環状鋳型；配列番号９）、およびｄＮ６Ｐ４０μＭ；最終濃度）、ポリメラーゼ１０μＬ、およびバッファーＢ２０μＬ（ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、グルタミン酸カリウム３００ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、ＢＳＡ２５μｇ／ｍｌ、およびＭｇＣｌ２  ５ｍＭ；最終濃度）を混合することによって、最終５０μＬの反応混合物を調製した。
【０１０５】
[125]バッファーＡ２０μＬをポリメラーゼ１０μＬと混合し、室温で３０分間インキュベートした。バッファーＢ２０μＬを加えることによって反応を開始させた。上記混合物１５μＬをＴ＝０、Ｔ＝２０分、およびＴ＝４０分の時点で取り出し、反応停止剤１５μＬ（ホルムアミド、ＥＤＴＡ５０ｍＭ、オレンジＧ色素）に加えて、反応を停止させた。該時点の試料を５分間９５℃で煮沸した。反応を停止させた混合物３０μＬにＳＹＢＲＧｏｌｄ３μＬを加えた。次いで試料を、１．２％アガロースゲルにおいて、１３０Ｖで約６５〜７５分間泳動させた。ゲルを分析し、対照よりも大きくかつはっきりした産物を持つ変異体をさらなる研究のために選択した。
【０１０６】
[126]例示的な結果を図４および図５に示す。
実施例６
オンチップ活性
[127]この実施例は、バリアントポリメラーゼが改良された鎖置換特性を有することを示す。
【０１０７】
[128]親ポリメラーゼ（配列番号８または配列番号１１）およびバリアントポリメラーゼ（配列番号８または配列番号１１のバックグラウンドにおいてＹ２１２Ｋ）のポリメラーゼをバイオチップ上でアッセイし、ポリメラーゼの１つまたは複数の位置における変異の影響を決定した。交流電圧、すなわち矩形波を使用してナノポアに付けられたＤＮＡポリメラーゼによるタグ付きヌクレオチド分子の捕獲間の時間を測定するようにアッセイを設計した。
【０１０８】
[129]社内製のダンベル鋳型であるシーケンシング鋳型ＨＰ７をこの実施例において使用した。
[130]バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼをＤＮＡ鋳型と接触させてバリアントＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体を形成させた後、バイオチップとも呼ばれる半導体センサーチップのウェル上の脂質二重層に埋め込んだナノポアに該複合体を付ける。脂質二重層は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１８５３（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｉｐｓ」という題名で、２０１４年１０月２３日に出願された）において記載されているように形成させて、バリアントＰｏｌ６ポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体が付いたナノポア、すなわちバリアントＰｏｌ６ナノポアシーケンシング複合体を挿入した。
【０１０９】
[131]代替的には、ナノポアを脂質二重層に埋め込み、バリアントＰｏｌ６−ＤＮＡ複合体をインサイチュで付ける。
[132]バッファー（ＫＧｌｕ３００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ３ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ、ｐＨ８．０）中、各ヌクレオチドが異なるタグを有する、すなわち、４つのヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、およびＣが異なるタグを有する、タグ付きヌクレオチドの混合物を使用し、タグ付きヌクレオチドを０．８３４μｌ／秒の速さでナノポアを通過させた。
【０１１０】
[133]ピークトゥピーク２１０ｍＶの交流電流を２５Ｈｚで印加し、ナノポアに結合したポリメラーゼによりヌクレオチド塩基がコピーＤＮＡ鎖に組み込まれた際にヌクレオチドタグの捕獲を評価した。
【０１１１】
[134]連続するタグ捕獲の間の時間は、本明細書においては待機時間と呼ぶ。待機時間は、やって来るヌクレオチドの会合速度であるｋｏｎ、および下流の鋳型の鎖置換速度であるｋｄｉｓｐｌａｃｅを含む。よって、新しいヌクレオチドに進むポリメラーゼの能力を分析することができ、これは、ポリメラーゼによる相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）の置換に依存する。
【０１１２】
[135]鋳型ＤＮＡの相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）を置換する２つのポリメラーゼの能力は待機時間によって示される。Ｄ４４Ａはエキソヌクレアーゼドメインにおける触媒アスパラギン酸の変異であり、最も一般的に使用されるエキソヌクレアーゼ欠損変異である。これは鎖置換に影響を及ぼし、シーケンシング中の長い待機時間を引き起こす。Ｙ２１２Ｋ（本明細書において示すエキソヌクレアーゼ欠損変異）は改良された鎖置換を有し、より大きい進行速度、および待機時間の減少をもたらす。ｐｏｌ６のＤ４４Ａ変異と比較して、Ｙ２１２Ｋを用いることで進行速度、すなわち伸長またはシーケンシング速度の効果的な倍加が観測された（データ示さず）。
【０１１３】
[136]本明細書において記載される実施例および実施形態は、単なる例示目的のものであり、またその実施例および実施形態を考慮した様々な改変または変化が当業者に提案されることになり、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることになることが理解されよう。本明細書において引用されるあらゆる刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
配列番号１−野生型Ｐｏｌ６（ＤＮＡポリメラーゼ［クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）
【０１１５】
【化１】
2019512217.tif 000004
【０１１６】
配列番号２−Ｐｏｌ６（Ｈｉｓタグ付き）
【０１１７】
【化２】
2019512217.tif 000005
【０１１８】
配列番号３−Ｈｉｓタグ付きＰｏｌ６（ＤＮＡ配列）
【０１１９】
【化３】
2019512217.tif 000006
【０１２０】
配列番号４および１４−ｉＳｐＣ３、３−カーボンスペーサーを有する置換アッセイヘアピンオリゴ
【０１２１】
【化４】
2019512217.tif 000007
【０１２２】
配列番号５−置換アッセイショートオリゴ
【０１２３】
【化５】
2019512217.tif 000008
【０１２４】
配列番号６−エキソヌクレアーゼアッセイヘアピンオリゴ
【０１２５】
【化６】
2019512217.tif 000009
【０１２６】
配列番号７−エキソヌクレアーゼアッセイショートオリゴ
【０１２７】
【化７】
2019512217.tif 000010
【０１２８】
配列番号８−ｐｏｌ６バリアント（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；Ｈｉｓタグなし）
【０１２９】
【化８】
2019512217.tif 000011
【０１３０】
配列番号９−ＨＦＣｉｒｃ１０
【０１３１】
【化９】
2019512217.tif 000012
【０１３２】
配列番号１０−ＨＦＣｉｒｃ１０用プライマー
【０１３３】
【化１０】
2019512217.tif 000013
【０１３４】
配列番号１１−ｐｏｌ６バリアント（Ｄ４４Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；Ｈｉｓタグなし）
【０１３５】
【化１１】
2019512217.tif 000014
【０１３６】
先行技術文献
特許文献
[1]PCT/US2005/009702 (published as WO2006/028508 on 16 March 2006; President and Fellows of Harvard College; entitled METHODS AND APPARATUS FOR CHARACTERIZING POLYNUCLEOTIDES.
[2]PCT/US2011/065640 (published as WO2012/083249 on 21 June 2012; Columbia University; entitled DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MODIFIED NUCLEOTIDES AND NANOPORE DETECTION).
[3]PCT/US2013/068967 (published as WO2014/074727 on 15 May 2014; Genia Technologies; entitled NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).
[4]PCT/US2013/046012 (Genia Technologies, Inc., entitled Chip Set-Up and High-Accuracy Nucleic Acid Sequencing, published 19 Dec 2013 as WO2013/188841).
[5]US 2013/0053544 (Isis Innovation Limited) entitled Peptide Tag Systems That Spontaneously Form an Irreversible Link to Protein Partners via Isopeptide Bonds.
非特許文献
[6]Altschul, S. F., et al., 1990
[7]Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997
[8]Ausubel, Frederick et al., (1992) Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Greene Publishing Associates & John Wiley & Sons. New York, N.Y.
[9]Gardner et al., Nucleic Acids Res. (2012) pages 1-12 (doi: 10.1093/nar/gks330; First published online: May 8, 2012)
[10]Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)
[11]Johnson, et al., Biochim Biophys Acta . 2010 May ; 1804(5): 1041-1048
[12]Kong et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(3):1965-1975)
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[14]Li et al, J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309-17
[15]Sambrook et al., (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)
[16]Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) at 9.63-9.75 (describing end-labeling of nucleic acids). 
[17]Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, New York (1994)
[18]Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987))
[19]Zakari and Howarth, (2010) Spontaneous Intermolecular Amide Bond Formation between Side Chains for Irreversible Peptide Targeting, J. Am. Chem. Soc., 132(13):4526-4527
[20]Zakari, B. et al., (2012) Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion, PNAS 109 (12):E690-E697.
【図１】
2019512217.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019512217.tif 000021
2019512217.tif 000022