(57)【要約】一部の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを解析する方法であって、予め決定された偏光状態を有する励起ビームをナノポアへと方向付けるステップと、ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、吸収双極子を有する蛍光標識で標識されており、ナノポアが、移動の間に吸収双極子が励起ビームに実質的に不応答性であるように蛍光標識を空間的に配向する、ステップと、蛍光標識を有するヌクレオチドが、ナノポアを退出し、それらの吸収双極子が、予め決定された偏光状態を有する励起ビームによる励起に応答性になるにつれて、蛍光標識によって生成された蛍光シグナル変化を検出するステップと、蛍光シグナル変化からナノポアを退出するヌクレオチドを識別するステップとを含む、方法を対象にする。
2019522983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
予め決定された偏光状態を有する励起ビームをナノポアへと方向付けるステップと、
前記ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、吸収双極子を有する蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、移動の間に前記吸収双極子が前記励起ビームに実質的に不応答性であるように前記蛍光標識を空間的に配向する、ステップと、
蛍光標識を有するヌクレオチドが、前記ナノポアを退出し、それらの吸収双極子が、前記予め決定された偏光状態を有する前記励起ビームによる励起に応答性になるにつれて、前記蛍光標識によって生成された蛍光シグナル変化を検出するステップと、
前記蛍光シグナル変化から前記ナノポアを退出するヌクレオチドを識別するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドにおける前記蛍光標識が、別個の蛍光シグナルを放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光標識が、相互にクエンチする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記移動させるステップが、１種または複数のクエンチ剤の存在下で移動させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記予め決定された偏光状態が、電場ベクトルを有し、前記ナノポアにおける前記蛍光標識の前記吸収双極子が、前記予め決定された偏光状態の前記電場ベクトルと実質的に直交する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
予め決定された偏光状態を含む励起ビームをナノポアへと方向付けるステップと、
前記ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、吸収双極子を有する蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、移動の間に吸収双極子が前記予め決定された偏光状態の前記励起ビームによる励起に最大限に応答性であるように前記蛍光標識を空間的に配向する、ステップと、
前記ナノポア内でヌクレオチド上の前記蛍光標識によって生成された光学的シグナルを検出するステップと、
前記光学的シグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドを識別するステップと
を含む、方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドにおける前記蛍光標識が、別個の蛍光シグナルを放出する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光標識が、相互にクエンチする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記移動させるステップが、１種または複数のクエンチ剤の存在下で移動させるステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記予め決定された偏光状態が、電場ベクトルを有し、前記ナノポアにおける前記蛍光標識の前記吸収双極子が、前記予め決定された偏光状態の前記電場ベクトルと実質的に整列する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドを解析する方法であって、
予め決定された偏光状態を含む励起ビームをナノポアへと方向付けるステップと、
ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、各々が吸収双極子を有し、鑑別可能な光学的シグナルを放出する異なる蛍光標識で標識されており、前記ナノポアが、移動の間に吸収双極子が前記予め決定された偏光状態の前記励起ビームによる励起に最大限に応答性であるように前記蛍光標識を空間的に配向する、ステップと、
前記ポリヌクレオチドが、前記ナノポアを通過するとき、前記ナノポア内で複数のヌクレオチドから光学的シグナルの時間順のセットを検出するステップと、
ヌクレオチド特異的な光学的シグナルの時間順のセットを形成するために、異なる種類のヌクレオチドからの光学的シグナルを分離するステップと、
前記ヌクレオチド特異的な光学的シグナルの時間順のセットからヌクレオチドの配列を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
前記決定するステップが、前記ヌクレオチド特異的な光学的シグナルの時間順のセットから決定されたヌクレオチドの重複するセグメントから候補配列を形成することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドにおける前記蛍光標識が、別個の蛍光シグナルを放出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光標識が、相互にクエンチする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記移動させるステップが、１種または複数のクエンチ剤の存在下で移動させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記予め決定された偏光状態が、電場ベクトルを有し、前記ナノポアにおける前記蛍光標識の前記吸収双極子が、前記予め決定された偏光状態の前記電場ベクトルと実質的に整列する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１６年７月５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３５８，５５２号に基づく優先権の利益を主張しており、その内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ナノポア配列決定は、１ラン当たりの配列決定にかかる費用の低下、試料調製の単純化、ランタイムの低下、配列読み取りデータの長さの増加、リアルタイム試料解析の提供その他を含む、現在のＤＮＡ配列決定技術における多くの課題を克服するためのアプローチとして提案された。しかし、ナノポアを用いたＤＮＡ解析等、ポリマー解析は、信頼できるナノ構造製作、ＤＮＡ移動速度の制御、明確なヌクレオチド識別、大規模アレイのナノスケールセンサ由来のシグナルの検出および処理等々、それ自体の一連の技術的困難を有する；例えば、Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）。
【０００３】
ヌクレオチドの光学的検出は、例えば、大規模アレイのナノポアから独立的シグナルを収集することの困難等のナノポア配列決定の分野における技術的困難のいくつかに対する潜在的解決策として提案された。しかし、光学的アプローチを実行することに向けた多くの課題、特に、光学的ノイズの著しいバックグラウンドに対して移動ポリヌクレオチド上の単一分子標識から光学的シグナルを測定する困難がある。単一分子からの蛍光シグナルの測定が行われ、蛍光シグナルは、励起光の電場ベクトルの方向により分子の蛍光吸収双極子を整列させることによって最適化されている（例えば、Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）；Moernerら、Review  of  Scientific  Instruments、７４巻（８号）：３５９７〜３６１９頁（２００３年）；Michaletら、Ann.  Rev.  Biophys.  Biomol.  Struct.、３２巻：１６１〜１８２頁（２００３年））が、使用された技術はまだ、ナノポア配列決定に適用されていない。
上述を考慮すると、最適化されたシグナル生成および検出のために蛍光標識を整列または配向させるための方法が利用できれば、ナノポア配列決定における光学的シグナルの低いシグナル対ノイズ比の課題に取り組むことができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Brantonら、Nature  Biotechnology、２６巻（１０号）：１１４６〜１１５３頁（２００８年）
【非特許文献２】Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）
【非特許文献３】Moernerら、Review  of  Scientific  Instruments、７４巻（８号）：３５９７〜３６１９頁（２００３年）
【非特許文献４】Michaletら、Ann.  Rev.  Biophys.  Biomol.  Struct.、３２巻：１６１〜１８２頁（２００３年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明は、優先的励起または静止のために蛍光吸収双極子を整列および／または配向させるための、ナノポアを使用したポリヌクレオチド解析のための方法およびデバイスを対象にする。
【０００６】
一態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを解析する方法であって、（ａ）予め決定された偏光状態を有する励起ビームをナノポアへと方向付けるステップと、（ｂ）ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、吸収双極子を有する蛍光標識で標識されており、ナノポアが、移動の間に吸収双極子が励起ビームに実質的に不応答性であるように蛍光標識を空間的に配向する、ステップと、（ｃ）蛍光標識を有するヌクレオチドが、ナノポアを退出し、それらの吸収双極子が、予め決定された偏光状態を有する励起ビームによる励起に応答性になるにつれて、蛍光標識によって生成された蛍光シグナル変化を検出するステップと、（ｄ）蛍光シグナル変化からナノポアを退出するヌクレオチドを識別するステップとを含む、方法を対象にする。
【０００７】
本発明は、蛍光標識の吸収双極子を空間的に制約および配向させるためにナノポアを使用することにより、光学的に基づくナノポア配列決定の分野における上述の問題を有利に克服する。本発明の上述および他の利点は、多数の実行および適用において例証されており、その一部は、後述および本明細書を通して要約される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、本発明の例示的な実施形態を図解する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、本発明の例示的な実施形態を図解する。
【０００９】
【図２】図２は、相互におよび自己クエンチする蛍光標識を用いる本発明の実施形態を図解する。
【００１０】
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｂは、タンパク質ナノポアおよびバックグラウンドを低下させるためのナノポアアレイ上の金属層を伴う落射照明またはＦＲＥＴ励起によるＴＩＲを使用した、本発明の実施形態を図解する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｂは、タンパク質ナノポアおよびバックグラウンドを低下させるためのナノポアアレイ上の金属層を伴う落射照明またはＦＲＥＴ励起によるＴＩＲを使用した、本発明の実施形態を図解する。
【００１１】
【図３Ｃ】図３Ｃ〜３Ｄは、クエンチ剤を用いる実施形態を図解する。
【図３Ｄ】図３Ｃ〜３Ｄは、クエンチ剤を用いる実施形態を図解する。
【００１２】
【図４】図４は、共焦点落射照明システムの基礎構成要素を図解する。
【００１３】
【図５】図５は、ＦＲＥＴシグナル生成を伴わない、ナノポアアレイの中またはその近傍の光学的標識の励起のためのＴＩＲＦシステムの要素を図解する。
【００１４】
【図６】図６は、複数の光学的標識由来の光を含む光学的シグナルの測定に基づきヌクレオチド配列をコーリングするためのステップを図解するフローチャートである。
【００１５】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、２種および３種の蛍光標識を用いる実施形態を図解する。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、２種および３種の蛍光標識を用いる実施形態を図解する。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、２種および３種の蛍光標識を用いる実施形態を図解する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、様々な修飾および代替形態を受容するが、これらの詳述については、図面に例として示し、詳細に記載する。しかし、その意図するところは、本発明を、記載されている特定の実施形態に限定することではないことを理解されたい。それどころか、その意図するところは、本発明の精神および範囲内に収まるあらゆる修飾、均等物および代替物を網羅することである。例えば、本発明の特定のナノポアの種類および数、特定の標識、ＦＲＥＴペア、検出スキーム、製作アプローチが、説明目的で示されている。しかし、他の種類のナノポア、ナノポアのアレイおよび他の製作技術を利用して、本明細書に記述されているシステムの様々な態様を実行することができるため、本開示が、この点における限定を意図しないことを認められたい。本発明の態様に関するガイダンスは、当業者に周知の多くの利用できる参考文献および専門書に見出すことができ、そのようなものとして、例えば、Cao、Nanostructures  &  Nanomaterials（Imperial  College  Press、２００４年）；Levinson、Principles  of  Lithography、第２版（SPIE  Press、２００５年）；DoeringおよびNishi編、Handbook  of  Semiconductor  Manufacturing  Technology、第２版（CRC  Press、２００７年）；Sawyerら、Electrochemistry  for  Chemists、第２版（Wiley  Interscience、１９９５年）；BardおよびFaulkner、Electrochemical  Methods:  Fundamentals  and  Applications、第２版（Wiley、２０００年）；Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）；Hermanson、Bioconjugate  Techniques、第２版（Academic  Press、２００８年）；その他が挙げられ、これらの関連部分は、参照により本明細書に組み込む。
【００１７】
一態様では、本発明は、ナノポアおよび光学的検出を使用した、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡその他を解析するための方法およびデバイスを対象にする。一態様では、本発明は、図１Ａで模式的に図解されるように、検出ゾーンを通って一列様式で移動するようにヌクレオチドを制約するためのみでなく、蛍光標識の吸収双極子が、予め決定された偏光状態を有する励起ビームに不応答性であるように移動に際して蛍光標識を配向するために、選択されたナノポアを用いる。ヌクレオチドがナノポアから現れる場合は常に、それらの蛍光標識は、それらが励起ビームによって励起されて、放出される蛍光の急上昇を産生することができるように、回転および移動の自由を得、次に、それらは、現れるヌクレオチドを識別するために使用することができる。一部の実施形態では、励起ビームの予め決定された偏光状態は、ビームの電気的ベクトルが、特定のセットのヌクレオチド標識の吸収双極子と実質的に直交する偏光状態である。一部の実施形態では、予め決定された偏光状態は、円偏光を含むことができる。他の実施形態では、予め決定された偏光状態は、直線偏光を含むことができる。さらなる実施形態では、予め決定された偏光状態は、使用される励起ビームの数およびナノポア（例えば、ナノポアの穿孔の軸）に対するそれらの入射角を含むことができる。一部の実施形態では、各々が、それ自体の予め決定された偏光状態を有する、２つ以上の励起ビームを用いることができる。一部の実施形態では、予め決定された偏光状態は、ナノポアにおいて蛍光標識の吸収双極子と実質的に整列する電場ベクトルを有する。他の実施形態では、予め決定された偏光状態は、ナノポアにおいて蛍光標識の吸収双極子と実質的に直交する電場ベクトルを有する。一部の実施形態では、予め決定された偏光状態は、ナノポアにおいて蛍光標識の吸収双極子と最大限に整列する電場ベクトルを有する。他の実施形態では、予め決定された偏光状態は、ナノポアにおいて蛍光標識の吸収双極子と最大限に直交する電場ベクトルを有する。
【００１８】
上述の態様では、特定のセットのヌクレオチド標識は、それらの吸収双極子が、制限された配向に制約されており、標識を励起ビームに実質的に不応答性にしている一方で、ナノポアの進入口および／または退出口に隣接する標識が、あまり制約されておらず、予め決定された偏光状態を有する光による励起に応答性である、ナノポアの内側のヌクレオチドに付着されたヌクレオチド標識である。一部の実施形態では、本発明の上述の態様は、（ａ）予め決定された偏光状態を有する励起ビームをナノポアへと方向付けるステップと、（ｂ）ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、吸収双極子を有する蛍光標識で標識されており、ナノポアが、移動の間に吸収双極子が励起ビームに実質的に不応答性であるように蛍光標識を空間的に配向する、ステップと、（ｃ）蛍光標識を有するヌクレオチドが、ナノポアを退出し、それらの吸収双極子が、予め決定された偏光状態を有する励起ビームによる励起に応答性になるにつれて、蛍光標識によって生成された蛍光シグナル変化を検出するステップと、（ｄ）蛍光シグナル変化からナノポアを退出するヌクレオチドを識別するステップとによって実行することができる。一部の実施形態では、予め決定された偏光状態は、励起ビームの電場ベクトルを含む平面が、ナノポアの軸に実質的に垂直である、またはナノポアを通した移動方向に実質的に垂直である、円偏光である。一部の実施形態では、ヌクレオチドが、ナノポアを退出するときの蛍光シグナル変化は、蛍光標識の吸収双極子が、可動性になるとき励起および放出可能になる蛍光標識に起因する、蛍光マグニチュードにおける増大である。一部の実施形態では、斯かる蛍光レベル変化は、１ｍ秒未満または０．１ｍ秒未満または０．０１ｍ秒未満の期間内に起こる。一部の実施形態では、斯かる蛍光レベル変化は、蛍光標識が、検出体積から出る、または隣接するヌクレオチドの標識によりクエンチされる、または退色するまで持続する。一部の実施形態では、斯かる変化は、少なくとも０．０１ｍ秒または少なくとも０．１ｍ秒または少なくとも０．５ｍ秒の間持続する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、図１Ｂで模式的に図解されるように、ヌクレオチドが検出ゾーンを通って一列様式で移動するように制約するためにだけではなく、また蛍光標識の吸収双極子が、予め決定された偏光状態を有する励起ビームに最大限に応答性であるように移動の間に蛍光標識を配向させるために、上述のようなナノポアを用いる。この態様では、ヌクレオチドがナノポアの中にある場合は常に、その蛍光標識は、ヌクレオチドを示す光学的シグナルを生成する。図１Ｂの実施形態では、ナノポア（１２９）内の励起ビームの偏光の整列および蛍光標識の配向された吸収双極子は、吸収双極子が、電場ベクトル（１３２）により画定される平面内に実質的にあるように選択される角度θ（１３３）で、励起ビーム（１１８）を、ナノポア（１１６）を含む膜（１１０）へと方向付けることにより達成される。複数の標識されたヌクレオチドが、移動の間にナノポアを占有することが予想されるので（例えば、使用される特定のナノポアに応じて、３〜１０個）、収集された光学的シグナルは、ナノポア内の一部または全てのヌクレオチドの標識からの個々の光学的シグナル、および一部の場合、ナノポアの外側のヌクレオチドの標識からの光学的シグナルを含むことができる。したがって、斯かる実施形態では、追加的なステップまたは検出されたシグナルを分離もしくは別の方法で解析するためのステップが、より十分に後述する通り、斯かる混合された光学的シグナルからヌクレオチド同一性を得るために必要とされ得る。
【００２０】
上述の両方の態様の一部の実施形態では、望まれない光学的シグナルを低下させ、次いで、混合された光学的シグナルから個々のヌクレオチドを識別する困難を低下させるために、相互におよび自己クエンチする蛍光標識を使用することができる。より十分に後述する通り、斯かる実施形態では、隣接するヌクレオチドの標識は、ナノポアの外側の自由溶液中で隣接するヌクレオチドの標識が互いに蛍光放出をクエンチするように、選択される。
【００２１】
最初に説明した態様の例示的な実施形態は、図１Ａ〜１Ｂ、２および３で図解される。図１Ａでは、一本鎖ポリヌクレオチド（１００）は、シス（−）チャンバからトランス（＋）チャンバへ、膜（１１０）内に形成されるナノポア（１１６）を通って移動することが示される。本発明の方法により解析されるポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であることができる。例えば、一部の実施形態では、標識された一本鎖ポリヌクレオチドは、（目的の供給源からの核酸試料の構成要素であり得る）鋳型上で標識された前駆体５’尾状プライマーの存在下にて伸長させ、その後、５’尾部をナノポアに挿入し、移動の過程中に標識された鎖が、鋳型鎖からアンジップすることにより生成される。他の実施形態では、二本鎖伸長産物は、アンジップすることなく、インタクトでナノポアを通して移動させることができる。後者の実施形態では、一本鎖ポリヌクレオチド分析物で使用されるナノポアの直径より大きな直径を有するナノポアが、必要とされ得る。
【００２２】
ポリヌクレオチド（１００）のヌクレオチドは、破線矢印として図解される骨格（１０２）に沿った、黒い（例えば、１１２）または模様入りの（例えば、１０４）丸として図解される。黒い丸は、ある種のヌクレオチド（例えば、Ａ）を表し、一方で、模様入りの黒い丸は、異なる種類のヌクレオチド（例えば、Ｃ、ＧもしくはＴ、または２標識実施形態では、同じ標識を全ての３種に取り付けることができる）を表す。各ヌクレオチドは、ヌクレオチドを示す別個の蛍光シグナルを生成することができる蛍光標識（例えば、１０６）を有する。この場合、２種の蛍光標識、黒い丸（例えば、１１２）により表されるヌクレオチドに付着された「ａ」（例えば、１０５）および模様入りの丸（例えば、１０４）により表されるヌクレオチドに付着された「ｂ」（例えば、１０６）が、表示され、これらは、鑑別可能な光学的シグナルを生成する蛍光標識を表す。蛍光標識、「ａ」および「ｂ」は各々、標識が、共整列した電場ベクトルで励起ビームから光エネルギーを効率的に吸収する方向を画定する吸収双極子を有する。一態様では、本発明は、蛍光吸収双極子および励起ビームの偏光状態が、ナノポアにより構成または配向されて、光学に基づくナノポア配列決定の文脈において単一蛍光標識の検出を最適化することができるという、発明者による認識および見解を含む。この態様の実施形態に従って、ナノポア（１１６）は、蛍光標識、例えば、ナノポア（１１６）の内側の標識「ａ」および「ｂ」の吸収双極子が、ナノポア（１１６）の軸と直交する平面で回転する電場ベクトル（１３２）で円偏光されるものとして示される、励起ビーム（１１８）からの光の偏光状態と実質的に直交する共通の方向（１１４）に配向されるように形成される。すなわち、励起ビーム（１１８）からの光は、電場ベクトルがポリヌクレオチド（１００）の移動方向（例えば、線１０２により画定される）に垂直な平面で円運動するように、円偏光され得る。他の実施形態では、異なる偏光状態を有する励起ビームを用いることができる。
【００２３】
下記によって限定されることを意図するものではないが、ナノポア（例えば、１１６）の直径が、基部に付着された蛍光標識の自由回転のための空間をより少なくしか提供しないため、双極子の配向が起こり、したがって、移動するポリヌクレオチドの標識は、特定の配向に空間的に制約されてナノポアを通る通過を可能にする（その配向が、上述の態様では、それらを予め決定された偏光状態を有する励起ビームによる励起に不応答性にさせる）と考えられる。標識されたヌクレオチドがナノポア（１１６）に進入（１０７）または退出（１１５）する場合は常に、検出される光学的シグナルは、典型的にはヌクレオチド標識の波長特徴に関連した光学的シグナル強度の（それぞれ）減少または増大により顕示され、特定の実施形態の特色、例えば、光学的システムの細部（例えば、落射照明、ＴＩＲ等）、励起ビームの方向、検出ゾーン（例えば、１３０）の広がりまたは体積、用いられる偏光の種類、相互にまたは自己クエンチする標識の存在または非存在、標識の退色傾向等に応じて、影響を受ける。検出ゾーンが、ナノポア（１１６）の進入口（１０７）および退出口（１１５）の両方を包含する一部の実施形態では、（ナノポア（１１６）に進入する際の）自由回転状態から配向状態と（ナノポア（１１６および１２３）を退出する際の）配向状態から自由回転状態との間の遷移は、検出ゾーン（１３０）から収集される光学的シグナル強度（１３１）の急上昇により反映される。斯かる急上昇に寄与する光学的シグナルの構成要素の鑑別する特徴は、ナノポア（１１６）に進入および／または退出するヌクレオチドを識別するために使用することができる。一部の実施形態では、特色（例えば、検出ゾーンまたはシグナル収集体積）は、シグナル強度の急上昇、すなわち、突然のまたは急速な変化が、実質的にナノポア（１１６）を退出する標識されたヌクレオチドのみに起因するように選択される。
【００２４】
一部の実施形態では、蛍光標識は、それらが、自由溶液、すなわち、特に、ナノポアを通して標識されたポリヌクレオチドを移動させるために使用される緩衝液中でポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに付着された場合、自己クエンチする、または相互に互いにクエンチするように選択される。斯かる自己もしくは相互にクエンチする蛍光標識は、バックグラウンドシグナルを低下させ、蛍光標識が励起されることができる時間を限定する、または言い換えると、それらは、蛍光シグナルが、ナノポア（１１６）の退出口（１１５）に隣接する領域に生成される体積を限定する。自己および相互にクエンチする蛍光標識の使用は、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２０１６／０１２２８１２号で開示される。簡潔に説明すると、図２は、別個のシグナルを有する２種の蛍光標識が用いられる場合、自己および相互にクエンチする蛍光標識の使用を図解する。標識された一本鎖ポリヌクレオチド（２００）は、ナノポア（１１６）を通して移動することが示される。図１と同様に、異なる標識「ａ」および「ｂ」は、ここでもまた黒い丸および模様入りの丸として表される、２種の異なる種類のヌクレオチドに付着されている。この場合、「ａ」および「ｂ」は、各々が、同じ標識が自由溶液中で隣接するヌクレオチド上にある場合、自己クエンチする、または異なる標識が自由溶液中で隣接するヌクレオチド上にある場合、相互にクエンチするように選択される。ナノポア（１１６）の内側のヌクレオチド（１１４）の蛍光標識は、励起がほとんどまたは全く起こらないように、吸収双極子が励起ビーム（１１８）の電気的ベクトルと実質的に直交して配向されるように制約される。ヌクレオチドが、ナノポア（１１６）を退出するにつれて、それらの標識は、ポリヌクレオチド（２００）が、トランスチャンバの自由溶液に移動するときに自己または相互にクエンチされた構成を再採用する前に、可動性かつ領域（２０６）において励起を受容するようになる。
【００２５】
上述の通り、多種多様な光学的システムおよびナノポア構成を、本発明により使用することができる。図３Ａは、タンパク質ナノポア（３００）が、脂質二重層（３０２）に配置され、（次いで）これが、不透明層（３０８）（金属層等）、窒化ケイ素層（３１０）およびケイ素支持層（３１２）を含む固体状態（ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ）膜（３０６）の開口部（３０４）にわたって配置された、一実施形態の構成要素を図解する。不透明層（３０８）は、望まれないバックグラウンド蛍光を励起し得る、固体状態膜（３０６）を通した励起ビーム（３１４）の透過を防止または低下させる。異なって標識されたモノマー（上述の通り、黒い丸（３２２）および模様入りの丸（３２４）として図解される）を有するポリヌクレオチド（３２０）が、ナノポア（３００）を通過するとき、吸収双極子（例えば、３０５）は、配向されて励起ビーム（３１４）に不応答性になる。
【００２６】
図３Ｂは、蛍光標識が退出口から現れる（そして移動の自由を得る）場合は常に、それが量子ドット（３１３０）のＦＲＥＴ距離（３１２８）内に入るように、タンパク質ナノポアのトランス側退出口に隣接するタンパク質ナノポア（３００）に付着された量子ドット（３１３０）を有する、図３Ａと同様の構成を図解する。よって、退出の際に、蛍光標識は、ＦＲＥＴ励起することができるようになる。
相互におよび自己クエンチする標識を用いる実施形態
【００２７】
一部の実施形態では、ナノポアを退出するヌクレオチドにおける標識から以外での蛍光放出を低下させるために、クエンチ剤に加えて、自己および相互にクエンチする蛍光標識を使用することができる。斯かる蛍光標識の使用は、参照により組み込む米国特許出願公開第２０１６／０１２２８１２号に開示されている。一部の実施形態では、モノマーは、標的ポリヌクレオチドに付着されながら、少なくとも３種の状態が可能な蛍光標識で標識される：（ｉ）付着された蛍光標識の蛍光が、直接隣接するモノマーにおける蛍光標識によってクエンチされる、実質的にクエンチされた状態；例えば、標識されたポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを試験および操作するために、従来の水溶液において自由である場合、本発明に従ってポリヌクレオチドに付着された蛍光標識は、実質的にクエンチされる。（ｉｉ）付着された蛍光標識の自由溶液移動または整列が撹乱または限定されて、蛍光標識からの検出可能な蛍光シグナルがほとんどまたは全く生成されないように、標識されたポリヌクレオチドが、ナノポアを通って移動している、立体的に制約された状態。（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドがナノポアを通って移動する際に蛍光標識がナノポアを退出するにつれて（「遷移間隔」において）、ポリヌクレオチドに付着された蛍光標識が、立体的に制約された状態からクエンチされた状態へと遷移する、遷移状態。
【００２８】
一部には、この例は、遷移間隔において、蛍光標識（その他の面では実質的に完全に標識され、自己クエンチされたポリヌクレオチドにおける）が、検出可能な蛍光シグナルを生成することができるという発見の適用である。この発見の根底にあるいかなる理論に限定される意図もないが、遷移間隔において生成された蛍光シグナルが、ナノポアから出現する蛍光標識における自由に回転可能な双極子の存在によるものであり、これにより、蛍光標識が、例えば、直接的励起後にまたはＦＲＥＴを介して、蛍光シグナルを一時的に生成することができるようになると考えられる。立体的に制約された状態と、クエンチされた状態の両方において、双極子は、その回転自由が限定され、これにより、放出した光子の数を低下させるまたは限定する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、通常、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の一本鎖ポリヌクレオチドであるが、特に、一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドが、ナノポアを通って移動するときに、ナノポアを一度に１個ずつ退出するにつれて、付着された蛍光標識によって生成されたシグナルを記録することにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。退出後に、各付着された蛍光標識は、ナノポア中における制約された状態から自由溶液中のポリヌクレオチドにおけるクエンチされた状態へと、遷移間隔において遷移する。言い換えると、一部の実施形態では、本発明の方法のステップは、ナノポアにおける制約された状態から自由溶液中のポリヌクレオチドにおけるクエンチされた状態へと遷移しているときに、各蛍光標識を励起するステップを含む。上述の通り、この遷移間隔または期間において、蛍光標識は、これが付着されたヌクレオチドを示す検出可能な蛍光シグナルを放出することができる。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明は、ナノポアを通したポリヌクレオチドの移動において、モノマーに付着された蛍光標識が、検出可能な蛍光シグナルを産生できない（または実質的にできない）制約された状態へと押し進められるように、蛍光標識およびナノポアを選択することができるという発見の適用を含む。一部の実施形態では、１〜４ｎｍの範囲内の直径を有する穿孔または内腔を有するナノポアが選択される；他の実施形態では、２〜３ｎｍの範囲内の直径を有する穿孔または内腔を有するナノポアが選択される。一部の実施形態では、斯かる穿孔直径は、タンパク質ナノポアによってもたらされる。一部の実施形態では、蛍光標識がナノポアを退出するときは常に、蛍光シグナルを生成することが実質的にできない状態から、これが放出するよう誘導され得る蛍光シグナルによって検出可能かつ識別可能な状態へと遷移するように、斯かるナノポアは、本発明に従って制約された状態へと蛍光標識を押し進めるために使用される。よって、ポリヌクレオチドのモノマーの配列のそれぞれに付着された蛍光標識は、ナノポア退出口に直接隣接する領域（「遷移ゾーン」または「遷移体積」または「検出ゾーン」）において蛍光シグナルを突然生成する際に、順次検出することができる。一部の実施形態では、上述の直径のナノポアにより、有機蛍光色素が、蛍光標識として使用される。一部の実施形態では、少なくとも１種の斯かる有機蛍光色素が、キサンテン色素、ローダミン色素およびシアニン色素からなるセットから選択される。ポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するための一部の実施形態は、（ａ）ナノポアを通してポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのモノマーが、蛍光標識で標識されており、ナノポアが、その穿孔内に、その中で検出可能な蛍光シグナルが実質的に生成されないような、制約された状態へと蛍光標識を制約する、ステップと、（ｂ）予め決定された偏光状態を有する励起ビームをナノポアへと方向付けるステップであって、ナノポアからの各モノマーの退出の際に各モノマーの蛍光標識を励起するステップと、（ｃ）退出する蛍光標識によって生成された検出ゾーンにおける蛍光シグナルを測定するステップであって、蛍光標識が付着されたモノマーを識別するステップと、（ｄ）検出ゾーン外の励起された蛍光標識から蛍光シグナルをクエンチするステップと、（ｄ）蛍光シグナルの配列からポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するステップとにより行うことができる。さらなる実施形態では、蛍光標識は、ＦＲＥＴペアのアクセプターであり、ＦＲＥＴペアの１種または複数のドナーは、退出口のＦＲＥＴ距離内のナノポアに付着される。
【００３０】
一部の実施形態では、上で使用される「実質的にクエンチされた」は、蛍光標識が、隣接する相互にクエンチする標識がないことを除いて同じ条件下で生成されたシグナルから少なくとも３０パーセント低下した蛍光シグナルを生成することを意味する。一部の実施形態では、上で使用される「実質的にクエンチされた」は、蛍光標識が、隣接する相互にクエンチする標識がないことを除いて同じ条件下で生成されたシグナルから少なくとも５０パーセント低下した蛍光シグナルを生成することを意味する。
【００３１】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４種の別々の反応を行うことにより決定され、この反応において、標的ポリヌクレオチドのコピーは、単一の蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有する。斯かる実施形態のバリアントでは、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４種の別々の反応を行うことにより決定され、この反応において、標的ポリヌクレオチドのコピーは、１種の蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のそれぞれを有するが、同時に、同じ標的ポリヌクレオチドにおける他のヌクレオチドは、第２の蛍光標識で標識されている。例えば、第１の蛍光標識が、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＡに付着される場合、第２の蛍光標識は、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＣ、ＧおよびＴ（すなわち、「非Ａ」ヌクレオチド）に付着される。同様に、この例を続けると、第２の反応において、第１の標識は、標的ポリヌクレオチドのＣに付着され、第２の蛍光標識は、標的ポリヌクレオチドのＡ、ＧおよびＴ（すなわち、「非Ｃ」ヌクレオチド）に付着される。ヌクレオチドＧおよびＴについても、同様である。
【００３２】
同じ標識スキームは、ヌクレオチド型のサブセットに関する従来の用語法の観点から表現することができる；よって、上述の例では、第１の反応において、第１の蛍光標識は、Ａに付着され、第２の蛍光標識は、Ｂに付着される；第２の反応において、第１の蛍光標識は、Ｃに付着され、第２の蛍光標識は、Ｄに付着される；第３の反応において、第１の蛍光標識は、Ｇに付着され、第２の蛍光標識は、Ｈに付着される；第４の反応において、第１の蛍光標識は、Ｔに付着され、第２の蛍光標識は、Ｖに付着される。
【００３３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはペプチド等、ポリマーは、単一の種類のモノマーに付着された単一の蛍光標識で標識することができ、例えば、ポリヌクレオチドの全Ｔ（または実質的に全Ｔ）は、蛍光標識、例えば、シアニン色素で標識される。斯かる実施形態では、ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナルの収集物または配列は、特定のポリヌクレオチドのシグネチャーまたはフィンガープリントを形成することができる。一部の斯かる実施形態では、斯かるフィンガープリントは、決定されるべきモノマーの配列に十分な情報を提供しても提供しなくてもよい。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明の特色は、相互にクエンチするセットのメンバーである蛍光色素または標識による、ポリヌクレオチド分析物の実質的にあらゆるモノマーの標識である。ポリヌクレオチド分析物の標識を参照した用語「実質的にあらゆる」の使用は、化学的および酵素的標識技法が、典型的に、１００パーセント未満の効率であることを了承する。一部の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも８０パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。他の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも９０パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。他の実施形態では、「実質的にあらゆる」は、あらゆるモノマーの少なくとも９５パーセントが蛍光標識を付着されていることを意味する。蛍光色素の相互にクエンチするセットは、次の特性を有する：（ｉ）各メンバーは、全メンバーの蛍光をクエンチする（例えば、ＦＲＥＴまたは静的もしくは接触機構によって）、および（ｉｉ）各メンバーは、励起され、非クエンチ状態であると、別個の蛍光シグナルを生成する。すなわち、相互にクエンチするセットが、２種の色素、Ｄ１およびＤ２からなる場合、（ｉ）Ｄ１は、自己クエンチされ（例えば、別のＤ１分子との接触クエンチにより）、これは、Ｄ２によってクエンチされ（例えば、接触クエンチにより）、（ｉｉ）Ｄ２は、自己クエンチされ（例えば、別のＤ２分子との接触クエンチにより）、これは、Ｄ１によってクエンチされる（例えば、接触クエンチにより）。相互にクエンチするセットのための蛍光色素または標識を選択するためのガイダンスは、参照により本明細書に組み込む次の参考文献に見出すことができる：Johansson、Methods  in  Molecular  Biology、３３５巻：１７〜２９頁（２００６年）；Marrasら、Nucleic  Acids  Research、３０巻：ｅ１２２頁（２００２年）；その他。一部の実施形態では、相互にクエンチするセットのメンバーは、芳香環構造等、相互作用を積み重ねることができる構成要素または部分を含む、有機蛍光色素を含む。蛍光色素または標識の例示的な相互にクエンチするセットは、ローダミン色素、フルオレセイン色素およびシアニン色素から選択することができる。一実施形態では、相互にクエンチするセットは、ローダミン色素、ＴＡＭＲＡおよびフルオレセイン色素、ＦＡＭを含むことができる。別の実施形態では、蛍光色素の相互にクエンチするセットは、オレゴングリーン４８８、フルオレセイン−ＥＸ、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＲｅｄ−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、１種または複数のＢＯＤＩＰＹ色素、テキサスレッド、オレゴングリーン５１４、および１種または複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒからなる群から２種またはそれよりも多い色素を選択することにより形成することができる。代表的なＢＯＤＩＰＹ色素は、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０およびＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５を含む。代表的なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、４０５、４３０、４８８、５０���、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０および７９０を含む。
【００３５】
上述の通り、一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが、相互にまたは自己クエンチする蛍光標識で標識されたそれぞれ異なる種類のモノマーを有する別々の反応（各種類のモノマーにつき１種）を行うことにより決定される。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが、同じ相互にクエンチするセットから選択される異なる相互にクエンチする蛍光標識で標識されたそれぞれ異なる種類のモノマーを有する別々の反応（各種類のモノマーにつき１種）を行うことにより決定される。相互にクエンチするセットが、２種の色素のみを含む実施形態では、選択されたモノマー（モノマーＸとする）は、第１の相互にクエンチする色素で標識され、他の全ての種類のモノマー（すなわち、非モノマーＸ）は、同じセット由来の第２の相互にクエンチする色素で標識される。よって、この実施形態のステップは、一方はモノマーＸを示し、他方は非モノマーＸを示す、２種の異なる蛍光シグナルの配列を生成する。
【００３６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの隣接ヌクレオチド等、ポリヌクレオチドにおける隣接するモノマー（同じ種類の）に付着されたときに自己クエンチする、単一の蛍光標識（例えば、複数の種類のモノマーを含むポリヌクレオチドにおける単一種類のモノマーに付着された）を使用することができる。例示的な自己クエンチ蛍光標識として、オレゴングリーン（Oregon  Green）４８８、フルオレセイン−ＥＸ、ＦＩＴＣ、ローダミンＲｅｄ−Ｘ、リサミンローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹＳおよびテキサスレッドが挙げられるがこれらに限定されず、例えば、これらは、Molecular  Probes  Handbook、第１１版（２０１０年）に開示されている。
クエンチ剤を用いる実施形態
【００３７】
本発明の一部の実施形態では、ナノポアデバイスにおいてクエンチ剤を適用して、望まれない蛍光を防止することができる。例えば、クエンチ剤は、トランスチャンバのみ、シスチャンバのみまたはシスおよびトランスチャンバの両方で存在することができる（図３Ｃ）。図３Ｃにおいて、シスチャンバ（３２０２）からトランスチャンバ（３２０４）へと固相膜（３２０８）のナノポア（３２０６）を移動している、標識されたポリヌクレオチド（３２００）が図解されている。トランスチャンバ（３２０４）には、「Ｑ」で表記されている非蛍光クエンチ剤（３２０５）が浸漬されている。本発明のクエンチ剤は、標識されたポリヌクレオチド（３２００）のための移動条件下で可溶性であり、同じ条件下で、クエンチ剤は、実質的な配列特異性なしで、（３２００）等の一本鎖ポリヌクレオチドに結合する。下でより十分に説明される通り、非対称シアニン色素等の多くの周知の有機色素の誘導体と共に、斯かる化合物ならびにオリゴヌクレオチドおよび／またはそのアナログのコンジュゲートを含む、多種類の非蛍光クエンチ剤を本発明による使用に利用できる。本実施形態では、クエンチ剤の種類および濃度ならびに移動スピードの選択は、検出ゾーン（３２１０）を画定する。一部の実施形態では、「検出ゾーン」は、蛍光シグナルが収集されて、標識されたポリヌクレオチドに関する配列情報等の情報が決定される生データを形成する、領域または体積（近接または非近接であり得る）を意味する。検出ゾーン（３２１０）外のトランスチャンバ（３２０４）における蛍光標識は、トランスチャンバ（３２０４）において標識されたポリヌクレオチド（３２００）の部分に結合されたクエンチ剤（３２０５）によって実質的にクエンチされる。一部の実施形態では、クエンチ剤は、より十分に後述する通り、有機色素に基づく１個または複数のクエンチ部分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドまたはアナログを含む。例えば、シスチャンバ（３２０２）における蛍光標識が実質的に励起されないように、固相膜（３２０８）が、不透明層であるまたはこれを含む場合に、トランスチャンバにのみクエンチ剤を有する実施形態を用いることができる。
【００３８】
図３Ｄは、次の要素を含む実施形態を図解する：脂質二重層（３０２）に配置されたタンパク質ナノポア（３００）；バックグラウンド蛍光を防止または低下させるための固相膜（３０６）における不透明層（３０８）による蛍光標識の落射照明；およびトランスチャンバ（３２６）に配置されたクエンチ剤（３１０）。上述の通り、蛍光標識されたヌクレオチド（標識は、（３２２）と同様に「ｆ」で示されている）を有するポリヌクレオチド（３２０）は、シスチャンバ（３２４）からトランスチャンバ（３２６）へとナノポア（３００）を通して移動される。オリゴヌクレオチドクエンチャー（３１０）は、ナノポア（３００）から出現するポリヌクレオチド（３２０）の部分へのオリゴヌクレオチドクエンチャー（３２８）のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で（例えば、濃度、温度、塩濃度その他）、トランスチャンバ（３２６）に配置される。参照により本明細書に組み込むHuberら、米国特許出願公開ＵＳ２０１６／００７６０９１に記載されている通り、ナノポアの移行の際の蛍光標識からのシグナルが抑制されるように、ナノポア（３００）を選択することができる。よって、標識されたヌクレオチドは、領域（３２８）においてナノポア（３００）から出現すると、抑制されなくなり、シグナルを生成することができる。全てではないにしても大部分の形態の直接的照射（例えば、非ＦＲＥＴ）により、斯かる出現した標識は、トランスチャンバ（３２６）へとさらに移動する際に、蛍光を放出し続け、これにより、収集されるシグナルに大いに寄与するであろう。出現しつつあるポリヌクレオチドに結合するトランスチャンバ（３２６）におけるクエンチ剤により、斯かる放出は、有意に低下させることができ、収集されるシグナルを解析してポリヌクレオチド（３２０）に関するヌクレオチド配列情報を得ることができる、検出ゾーン（３２８）を画定することができる。一部の実施形態では、標識されたポリヌクレオチドが、検出ゾーンを通って移動する際に、単一の蛍光標識からの蛍光シグナルが、検出期間において検出ゾーン（３２８）から検出される。他の実施形態では、複数の蛍光シグナルが、予め決定された期間に、検出ゾーン（３２８）において複数の蛍光標識から収集される。一部の実施形態では、斯かる検出期間は、１ミリ秒未満または０．１ミリ秒未満または０．０１ミリ秒未満である。一部の実施形態では、斯かる検出期間は、少なくとも０．０１ミリ秒または少なくとも０．１ミリ秒または少なくとも０．５ミリ秒である。
【００３９】
本発明のクエンチ剤は、ナノポア配列決定条件下で、（ｉ）実質的に非蛍光であり、（ｉｉ）一本鎖核酸、特に、一本鎖ＤＮＡに結合し、（ｉｉｉ）非放射的に他の分子から励起エネルギーを吸収し、これを非放射的に放出する、いずれかの化合物（または化合物のセット）を含む。一部の実施形態では、クエンチ剤は、一本鎖ＤＮＡにさらに非共有結合により結合する。より十分に後述する通り、シアニンおよびキサンテン色素等、一般的合成色素の非蛍光誘導体が挙げられるがこれらに限定されない、多種類のクエンチ化合物を本発明による使用に利用できる。クエンチ化合物の選択におけるガイダンスは、参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，３２３，３３７号；同第６，７５０，０２４号および同様の参考文献に見出すことができる。
【００４０】
一部の実施形態では、クエンチ剤は、蛍光をクエンチすることが公知の重原子（臭素またはヨウ素等）により共有結合により修飾された、またはニトロ基もしくはアゾ基等の蛍光をクエンチすることが公知の他の基により共有結合により修飾された、一本鎖ＤＮＡ結合色素であってもよい。一本鎖ＤＮＡに結合することが公知の色素の例は、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ（Zipperら（２００４年）Nucleic  Acids  Research.３２巻（１２号））である。シアニン（cynanine）Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ構造へのニトロ、臭素、ヨウ素および／またはアゾ基の取り込みは、ＤＮＡ上に存在し得る蛍光標識をクエンチする一本鎖ＤＮＡ結合基部分をもたらす。
【００４１】
一部の実施形態では、クエンチ剤は、結合部分および１個または複数のクエンチ部分を含む。結合部分は、実質的な配列特異性なしで一本鎖核酸に結合するいずれかの化合物を含むことができる。結合部分は、ペプチドもしくはオリゴヌクレオチド、または修飾された連結および／もしくはモノマーを有するどちらかのアナログを含むことができる。オリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、デュプレックス形成または非塩基対形成アプタマー結合によるポリヌクレオチドへの結合をもたらすことができる。一部の実施形態では、結合部分は、６〜６０ヌクレオチドの範囲内の長さを有するオリゴヌクレオチドまたはそのアナログを含む。斯かるオリゴヌクレオチドまたはアナログは、１個のクエンチ部分または複数のクエンチ部分にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドまたはアナログにコンジュゲートされた複数のクエンチ部分は、２または３個である。結合部分にコンジュゲートされたクエンチ部分は、同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、結合部分が、オリゴヌクレオチドまたはアナログである場合は常に、２個のクエンチ部分が、そこにコンジュゲートされ、１個はオリゴヌクレオチドの５’端に、もう１個は３’端にある。２〜３個のクエンチ部分を有するオリゴヌクレオチドまたはアナログは、例えば、本明細書に引用されている参考文献に開示されている通り、従来の連結および合成化学を使用して合成することができる。
【００４２】
オリゴヌクレオチドまたはアナログは、単一種として提供することができる、または異なる配列、したがって、異なる結合特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドまたはアナログの混合物として提供することができる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはアナログは、ランダム配列ポリマーである；すなわち、所与の長さのあらゆる可能な配列の混合物として提供される。例えば、斯かるオリゴヌクレオチドまたはアナログは、６−ｍｅｒでは式「ＮＮＮＮＮＮ」、または８−ｍｅｒでは「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧもしくはＴまたはそれらのアナログであり得る）によって表すことができる。
【００４３】
オリゴヌクレオチドに関連した「アナログ」は、１個または複数のヌクレオチドアナログを含むオリゴヌクレオチドを意味する。定義セクションに記載されている通り、「ヌクレオチドアナログ」は、修飾された連結部分、糖部分または塩基部分を有し得るヌクレオチドである。本発明により使用することができる例示的なオリゴヌクレオチドアナログとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）その他が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分は、ユニバーサル塩基を含む；すなわち、塩基対相互作用を不安定化させることなく、４種の天然ヌクレオチドのいずれかを置き換えることができる１個または複数のヌクレオチドアナログを含む。ユニバーサル塩基特性を有するヌクレオチドアナログは、参照により本明細書に組み込むLoakes、Nucleic  Acids  Research、２９巻（１２号）：２４３７〜２４４７頁（２００１年）に記載されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分は、２’−デオキシイノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、３−ニトロピロールヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチドその他を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、クエンチ剤は、一緒に作用して、一本鎖の標識されたポリヌクレオチドの望まれない蛍光シグナルをクエンチする、２個またはそれよりも多い化合物の組合せを含むことができる。例えば、クエンチ剤は、標識されたポリヌクレオチドとデュプレックスを形成することができるオリゴヌクレオチド（例えば、ポリデオキシイノシン）と、別々に、クエンチャーである二本鎖干渉物質を含むことができる。よって、ポリデオキシイノシンが、標識されたポリヌクレオチドに結合する場合は常に、クエンチ干渉物質は、その結果得られるデュプレックスに結合し、ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナルをクエンチする。
【００４６】
標識されたポリヌクレオチドの蛍光標識の蛍光シグナルを検出可能にクエンチすることができるいずれかの合成色素が、本発明の目的に許容されるクエンチ部分である。特に、本発明において使用される通り、クエンチ部分は、標識されたポリヌクレオチドにおける蛍光標識の放出バンドとの少なくともある程度のスペクトル重複を示す吸収バンドを保有する。この重複は、十分なスペクトル重複が存在するという条件で、クエンチ部分（アクセプター）の最大吸光度波長よりも低いまたはさらには高い波長放出最大で起こる蛍光標識（ドナー）の放出により起こり得る。エネルギー移動は、アクセプターのより高い電子状態へのドナーの放出の移動により起こる場合もある。当業者は、使用されている蛍光標識の放出スペクトルに関する該色素の励起バンドの試験により、所与のクエンチ部分の有用性を決定する。
【００４７】
典型的には、本発明における蛍光クエンチは、蛍光標識および本発明のクエンチ部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴまたは電荷移動複合体の形成による）により起こる。ドナーおよびアクセプター化合物のスペクトルおよび電子特性は、標識されたポリヌクレオチドにおける蛍光標識およびクエンチ部分の間の分離距離と同様に、観察されるエネルギー移動の程度に強い効果を有する。分離距離が増加するにつれて、蛍光クエンチの程度が減少する。
【００４８】
色素の最大放出波長が、標識されたポリヌクレオチドに結合される場合、蛍光標識の最大放出波長から十分に分離されているという条件で、クエンチ部分は、任意選択で、蛍光となることができる。しかし、好ましくは、クエンチ部分は、オリゴヌクレオチドまたはアナログに共有結合によりコンジュゲートされる場合、ほんのぼんやりとした蛍光である、または実質的に非蛍光である。実質的に非蛍光は、本明細書において、本明細書における方法のいずれかに関して記載されているアッセイ溶液におけるクエンチ部分の蛍光効率が、５パーセント未満またはこれに等しい、好ましくは、１パーセント未満またはこれに等しいことを示す。他の実施形態では、共有結合により結合されたクエンチ部分は、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満の量子収量を示す。一部の実施形態では、本発明のクエンチオリゴヌクレオチドに関連する蛍光標識の蛍光は、共有結合により結合されたクエンチ部分の非存在下での同じ蛍光標識に関連する同じオリゴヌクレオチドと比べて５０％超クエンチされる。別の実施形態では、蛍光標識は、非標識オリゴヌクレオチドと比べて９０％超クエンチされる。さらに別の実施形態では、核酸染色は、非標識オリゴヌクレオチドと比べて９５％超クエンチされる。
【００４９】
一部の実施形態では、クエンチ部分は、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンゾインドール、オキサゾールもしくはベンゾオキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン（ヒドロキシクマリンおよびアミノクマリン、ならびにそれらのフッ素化およびスルホン化誘導体を含む（参照により組み込む米国特許第５，８３０，９１２号、Geeら（１９９８年）および米国特許第５，６９６，１５７号、Wangら（１９９７年）に記載）、ポリアザインダセン（例えば、全て参照により組み込む、米国特許第４，７７４，３３９号、Hauglandら（１９８８年）；米国特許第５，１８７，２８８号、Kangら（１９９３年）；米国特許第５，２４８，７８２号、Hauglandら（１９９３年）；米国特許第５，２７４，１１３号、Kangら（１９９３年）；米国特許第５，４３３，８９６号、Kangら（１９９５年）；米国特許第６，００５，１１３号、Wuら（１９９９年））、キサンテン、オキサジンもしくはベンゾオキサジン、カルバジン（参照により組み込む米国特許第４，８１０，６３６号、Corey（１９８９年））、またはフェナレノン（phenalenone）もしくはベンズフェナレノン（参照により組み込む米国特許第４，８１２，４０９号、Babbら（１９８９年））であってもよい。
【００５０】
他の実施形態では、実質的に非蛍光色素であるクエンチ部分は、特に、アゾ色素（ＤＡＢＣＹＬまたはＤＡＢＳＹＬ色素およびこれらの構造的アナログ等）、マラカイトグリーンもしくはフェノールレッド等のトリアリールメタン色素、４’，５ｚ−ジエーテル置換フルオレセイン（米国特許第４，３１８，８４６号（１９８２年））または非対称シアニン色素クエンチャー（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９９３７，７１７（１９９９年））を含む。
【００５１】
クエンチ部分がキサンテンである実施形態では、合成色素は、任意選択で、フルオレセイン、ロドール（参照により組み込む米国特許第５，２２７，４８７号、Hauglandら（１９９３年））またはローダミンである。本明細書において、フルオレセインは、ベンゾ−もしくはジベンゾフルオレセイン、セミナフトフルオレセインまたはナフトフルオレセインを含む。同様に、本明細書において、ロドールは、セミナフトロダフルオロ（参照により組み込む米国特許第４，９４５，１７１号、Hauglandら（１９９０年））を含む。キサンテンは、キサンテン色素のフッ素化誘導体（参照により組み込む国際公開番号ＷＯ９７／３９０６４、Molecular  Probes,  Inc.（１９９７年））およびキサンテン色素のスルホン化誘導体（参照により組み込む国際公開番号ＷＯ９９／１５５１７、Molecular  Probes,  Inc.（１９９９年））を含む。本明細書において、オキサジンは、レゾルフィン（resorufm）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジンおよびこれらのベンゾ置換アナログを含む。
【００５２】
さらなる実施形態では、クエンチ部分は、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許第６，３９９，３９２号に記載されている、１個または複数のアミノ窒素原子において、芳香族または芳香族複素環系によって置換された３−および／または６−アミノキサンテンの実質的に非蛍光誘導体である。これらのクエンチ色素は典型的に、５３０ｎｍを上回る吸収最大を有し、観察可能な蛍光がほとんどないまたは全くなく、ケミルミフォア、リン光体またはフルオロフォアによって放出されるもの等、幅広いスペクトルのルミネセンス放出を効率的にクエンチする。一実施形態では、クエンチ色素は、置換ローダミンである。別の実施形態では、クエンチ化合物は、置換ロドールである。
【００５３】
さらに他の実施形態では、クエンチ部分は、参照により本明細書に組み込む次の特許に記載されているＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）化合物（ＢＨＱ）として公知の１種または複数の非蛍光クエンチャーを含むことができる：７，０１９，１２９；７，１０９，３１２；７，５８２，４３２；８，４１０，０２５；８，４４０，３９９；８，６３３，３０７；８，９４６，４０４；９，０１８，３６９；または９，１３９，６１０。
【００５４】
追加的なクエンチ部分は、参照により本明細書に組み込む次のものに開示されている：米国特許第６，６９９，９７５号；同第６，７９０，９４５号；および同第８，１１４，９７９号。
光学的シグナル検出
【００５５】
一部の実施形態では、励起ビーム送達および光学的シグナル収集が単一の対物レンズを通して起こる、落射照明システムは、ポリマー分析物上の標識またはナノポア上のドナーの直接的照射に使用することができる。本発明による使用のための共焦点落射照明システムの基礎構成要素は、図４に図解されている。励起ビーム（４０２）は、ダイクロイック（４０４）へと方向付けられ、励起ビーム（４０２）の焦点を層状の膜（４００）に合わせる（４１０）対物レンズ（４０６）に当たり（４１２）、そこで、標識が、直接的に励起されて、蛍光シグナル等の光学的シグナルを発する、または、ＦＲＥＴ相互作用を介して間接的に励起されて、光学的シグナルを放出する。斯かる光学的シグナルは、対物レンズ（４０６）によって収集され、光学的シグナル（４１１）の光を通過するが励起ビーム（４０２）の光を反射するように選択されたダイクロイック（４０４）へと方向付けられる。光学的シグナル（４１１）は、これがピンホール（４１６）を通って検出器（４１８）に当たるように焦点を合わせるレンズ（４１４）を通過する。
【００５６】
一部の実施形態では、モノマー上の標識は、参照により本明細書に組み込む、Soniら、Review  of  Scientific  Instruments、８１巻：０１４３０１頁（２０１０年）で；および米国特許出願公開第２０１２／０１３５４１０号で説明される、図５に示すものと同様の装置を使用して、エバネセント場によって励起することができる。この装置において、ナノポアに関連する各光学的測定が、複数の標識されたモノマー由来の寄与を含むように、ナノポアまたはナノポアアレイのトランス側面の非常に狭い第２のチャンバは、エバネセント場が、根底にあるスライドグラスの表面から伸長して、ナノポアの進入口および退出口の両方に励起ゾーンを確立することを可能にする。２０〜１００ｎｍの範囲内の厚さを有し得る窒化ケイ素層（５０２）において開口部（５００）（脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアを含むことができる）のアレイを形成することができる。窒化ケイ素層（５０２）は、ケイ素支持層（５０３）に形成することができる。第２のチャンバ（５０６）は、窒化ケイ素層（５０２）、二酸化ケイ素層（５０４）によって形成することができ、これは、第２のチャンバ（５０６）の高さおよびスライドグラス（５１０）の表面（５０８）を決定する。二酸化ケイ素層（５０４）は、５０〜１００ｎｍの範囲内の厚さを有し得る。表面（５０８）から窒化ケイ素層（５０２）にわたって伸長する所望のエバネセント場（５０７）は、ＴＩＲが起こるように、スライドグラス（５１０）に対して適切な角度で光線（５１２）を方向付けることにより確立することができる。アレイ（５００）を通して標識されたポリヌクレオチド分析物を駆動するために、第１および第２のチャンバ（５０６および５２１）に作動的に接続された電極を用いて、第１のチャンバ（５１６）においてシス（−）条件を確立することができ、第２のチャンバ（５０６）においてトランス（＋）条件を確立することができる。
混合された光学的シグナルを用いた配列決定
【００５７】
一部の実施形態では、一連の光学的シグナルは、分解能限界区域から測定することができ、各光学的測定は、異なる隣接モノマー（例えば、構成要素シグナルは、回折限界区域内から生成されるため、ポリマーにおけるその順序は、単一の測定から決定することができない）由来の複数の構成要素シグナルを含む。これらの環境下で、ポリマーの光学的に基づくナノポア解析は、（ｉ）２個以上の標識されたモノマーの配列由来の重複する寄与を含み、これにより、単一の測定からモノマーの順序付けを決定することを、不可能ではないとしても困難なものとする光学的測定の時系列を生成し、（ｉｉ）鑑別可能なシグナルを生成するモノマーのための光学的標識を選択することにより、光学的測定を、異なる種類のモノマーにおける異なる標識からの寄与へと分離することができ、これにより、重複する測定が、配列情報へと変換されることを可能にする。
【００５８】
一態様では、本発明の方法は、（ａ）ナノポアを通してポリマーを移動させるステップであって、ポリマーの異なる種類のモノマーが、鑑別可能な光学的シグナルを生成する異なる光学的標識で標識され、ナノポアが、複数のモノマーを包含する励起ゾーンを通って一列で移動するようにモノマーを制約する、ステップと、（ｂ）ポリマーが励起ゾーンを通過するときに、モノマーからの光学的シグナルの時系列を検出するステップと、（ｃ）異なる種類のモノマーからの光学的シグナルを分離するステップと、（ｄ）ポリマーからの分離された光学的シグナルの時系列からモノマーの配列を決定するステップとによって実行することができる。
【００５９】
本発明に従って、標識されたポリマーが、ナノポアおよびその関連する励起ゾーンを通って移動するときに、光学的測定の時間順のセットが記録される。隣接する時点における光学的測定は、各光学的測定が、隣接するモノマーの標識からの寄与を含むという意味で重複している。よって、例えば、３種のモノマーが、各時点でシグナルを生成する場合（例えば、励起ゾーンを左から右に移動するポリマー…−Ａ−（Ｂ−Ｃ−Ｄ）−…のＢ、ＣおよびＤ）、および、連続的測定の間で、１個のモノマーが励起ゾーンを退出し、別のモノマーが励起ゾーンに進入する場合（括弧で示す）（例えば、Ａが進入し、Ｄが退出する：−（Ａ−Ｂ−Ｃ）−Ｄ…）、２個の連続的光学的測定は、同じモノマー由来の寄与を含む（この例では、両方の測定は、ＢおよびＣ由来の寄与を含む）。上述の例は、ナノポアを通ったポリマー移動のごく単純化されたモデルに基づく；しかし、連続的重複光学的測定の概念は、ポリマー移動のより複雑な説明に適用可能である。
【００６０】
ナノポアにおける複数の異なる標識されたモノマー由来の放出は、同じ分解能限界区域から生じるため、モノマーに関する相対的位置情報（特に、配列情報）は、単一の光学的測定から決定することができない。しかし、モノマー特異的シグナルを生成する標識の重複および使用のため、一部の実施形態では、配列情報は、モノマー特異的シグナルの複数の時間順のセットへと分離される場合、光学的シグナル測定の時間順のセットから決定することができる。ハイブリダイゼーションデータから標的ポリヌクレオチド配列を再構築するために、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）において使用されるものと同様のアルゴリズムを使用して、そこで標的ポリヌクレオチドを再構築することができる、例えば、参照により組み込む、米国特許第５，００２，８６７号；Timpら、Biophys.  J.、１０２巻：Ｌ３７〜Ｌ３９頁（２０１２年）；その他。（ｉ）時間順の重複するシグナルおよびシグナルならびに（ｉｉ）それらのモノマー特異的構成要素への分離の制約は、光学的検出の場合の決定ステップを有意に単純化する。
【００６１】
図６は、ナノポア移動の単純モデルに基づき、重複する光学的シグナルの時間順のセットからモノマー配列情報を決定するためのステップの一実施形態を図解する。単純モデルは、各時間ステップ（ナノポアからのポリマーの進入および退出時を除いて）における光学的測定がそれぞれ、同数のモノマー（図６において、「ｎ組」と称され、測定が、ｎ個のモノマー由来の寄与を含むであろうことを示す）由来のシグナル寄与を含むことを仮定する。より複雑なモデルが、移動スピードの局所変動、モノマーの直線的移動における偏差、および他の同様の現象のため、各測定における異なる数の寄与モノマーを可能にし得ることが理解される。すなわち、一部の実施形態では、異なる時間における光学的測定は、異なる数のヌクレオチド由来の寄与を有することができる。一部の実施形態では、異なる数のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドのセグメントに沿って順序付けられる。図６によって図解される決定するステップは、標識されたポリマーが、ナノポアを通過したこと、および、モノマー特異的シグナルへの光学的シグナルの分離を含む、光学的測定の時間順のセットが作製されたことを仮定する（６００）。進入および退出後における励起ゾーン（複数可）には必然的に異なる数のモノマーが存在するため、ポリマーの進入および退出は、別々に処理される。本実施形態では、これらの条件下における最初および最終の光学的測定が、最初および最終のモノマーが、それらのモノマー特異的シグナルから直接的に決定されることを可能にすることが仮定される。他の実施形態では、解析のための標識されたポリマーの調製は、配列決定ステップに役立つ光学的シグナルの公知配列を生成する目的のための、斯かる標識されたポリマーの一端または両端における、複数の予め決定された標識されたヌクレオチドの挿入を含むことができる。斯かる予め決定された標識されたヌクレオチドは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔまたは４５４配列決定における鍵配列と同様のものとなるであろう、例えば、参照により組み込む米国特許第７，５７５，８６５号。
【００６２】
図６に戻ると、決定ステップの初めに、時間指標ｉは、ゼロに設定され；現在の時間ｉにおける候補配列のための指標ｊは、１に設定され（６０２）；モノマー特異的な時間順の光学的シグナルのセットの初期ｎ組が、試験される（６０４）。斯かる試験は、まず、時間ｉにおける測定から、測定と一貫したモノマーのあらゆる可能なｎ組を決定し、次いで、これらのｎ組から、候補配列Ｓｉと適切に重複するものを決定するステップを含む。測定と一貫したセットのためにｎ組をそれぞれ適切に重複させることにより、新しい候補配列Ｓｉ＋１が形成される（そして、配列Ｓｉが伸長される）（６０６）。新しい伸長された候補配列Ｓｉ＋１が保存され、時間ｉ＋１における候補配列の数をもたらす指標Ｊｉ＋１がアップデートされる（６０８）。このステップは、全候補配列Ｓｉが試験されるまで反復され（６１０）、時間順のセットにおける各光学的測定が試験されるまで、各時間ｉにおいて同様の試験が行われる。
ナノポアおよびナノポアアレイ
【００６３】
本発明により使用されるナノポアは、固体状態の膜または同様のフレームワークにおいて構成された、固体状態ナノポア、タンパク質ナノポア、またはタンパク質ナノポア、もしくはカーボンもしくはグラフェンナノチューブ等の有機ナノチューブを含むハイブリッドナノポアであってもよい。ナノポアの重要な特色は、（ｉ）そのモノマーが、シグナル生成領域（または励起ゾーンその他）を順次通過するように、および（ｉｉ）モノマー上の標識の吸収双極子が、配向されるように、ポリヌクレオチド等のポリマー分析物を制約することを含む。すなわち、ヌクレオチド等のモノマーが、検出ゾーン（または励起領域もしくは同様の領域）を一列で通過するように、およびモノマー上の標識が、それらが励起ビームの偏光状態の選択により励起に選択的に不応答性にされ得るように配向されまたは整列するように、ナノポアは、ポリヌクレオチド等のポリマー分析物の移動を制約する。一部の実施形態では、ナノポアの追加的な特色は、一本鎖核酸を通過させるが、二本鎖核酸または等しくかさばった分子を通過させないことを含む。
【００６４】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスに関連して使用されるナノポアは、平面状の表面に規則的に配置され得る、ナノポアのクラスターのアレイ等、アレイの形態で提供される。一部の実施形態では、異なるクラスターのナノポア由来の光学的シグナルが、用いられる光学的検出システムによって鑑別可能となるように、クラスターはそれぞれ、別々の分解能限界区域に存在するが、同じクラスター内のナノポア由来の光学的シグナルは、用いられる光学的検出システムによって斯かるクラスター内の特異的ナノポアに必ずしも割り当てられなくてもよい。
【００６５】
固体状態ナノポアは、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）その他が挙げられるがこれらに限定されない、種々の材料において製作することができる。ＤＮＡ配列決定等、分析的適用のためのナノポアの製作および操作は、参照により本明細書に組み込む次の例示的な参考文献に開示されている：Ling、米国特許第７，６７８，５６２号；Huら、米国特許第７，３９７，２３２号；Golovchenkoら、米国特許第６，４６４，８４２号；Chuら、米国特許第５，７９８，０４２号；Sauerら、米国特許第７，００１，７９２号；Suら、米国特許第７，７４４，８１６号；Churchら、米国特許第５，７９５，７８２号；Bayleyら、米国特許第６，４２６，２３１号；Akesonら、米国特許第７，１８９，５０３号；Bayleyら、米国特許第６，９１６，６６５号；Akesonら、米国特許第６，２６７，８７２号；Mellerら、米国特許出願公開第２００９／００２９４７７号；Howorkaら、国際特許公開ＷＯ２００９／００７７４３；Brownら、国際特許公開ＷＯ２０１１／０６７５５９；Mellerら、国際特許公開ＷＯ２００９／０２０６８２；Polonskyら、国際特許公開ＷＯ２００８／０９２７６０；Van  der  Zaagら、国際特許公開ＷＯ２０１０／００７５３７；Yanら、Nano  Letters、５巻（６号）：１１２９〜１１３４頁（２００５年）；Iqbalら、Nature  Nanotechnology、２巻：２４３〜２４８頁（２００７年）；Wanunuら、Nano  Letters、７巻（６号）：１５８０〜１５８５頁（２００７年）；Dekker、Nature  Nanotechnology、２巻：２０９〜２１５頁（２００７年）；Stormら、Nature  Materials、２巻：５３７〜５４０頁（２００３年）；Wuら、Electrophoresis、２９巻（１３号）：２７５４〜２７５９頁（２００８年）；Nakaneら、Electrophoresis、２３巻：２５９２〜２６０１頁（２００２年）；Zheら、J.  Micromech.  Microeng.、１７巻：３０４〜３１３頁（２００７年）；Henriquezら、The  Analyst、１２９巻：４７８〜４８２頁（２００４年）；Jagtianiら、J.  Micromech.  Microeng.、１６巻：１５３０〜１５３９頁（２００６年）；Nakaneら、J.  Phys.  Condens.  Matter、１５巻、Ｒ１３６５〜Ｒ１３９３頁（２００３年）；DeBloisら、Rev.  Sci.  Instruments、４１巻（７号）：９０９〜９１６頁（１９７０年）；Clarkeら、Nature  Nanotechnology、４巻（４号）：２６５〜２７０頁（２００９年）；Bayleyら、米国特許出願公開第２００３／０２１５８８１号；その他。
【００６６】
一部の実施形態では、本発明は、１個または複数の遮光層、すなわち、１個または複数の不透明層を有するナノポアアレイを含む。典型的には、ナノポアアレイは、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化アルミニウムその他等の材料の薄いシートにおいて製作され、これは特に、使用される厚さ、例えば、５０〜１００ｎｍ未満の厚さでは光を容易に透過する。分析物の電気的検出のため、これは問題とならない。しかし、ナノポアを移動する標識された分子の光学的に基づく検出において、アレイを透過する光は、意図される反応部位の外側で材料を一定に励起し、これにより、例えば、非特異的バックグラウンド蛍光、ナノポアに未だ進入していない分子の標識由来の蛍光その他から光学的ノイズを生成する。一態様では、本発明は、励起ビームからの光を反射および／または吸収する１個または複数の遮光層をナノポアアレイに提供し、これにより、アレイのナノポアに関連する意図される反応部位において生成された光学的シグナルのバックグラウンドノイズを低下させることにより、この問題に取り組む。一部の実施形態では、これは、意図される反応部位における光学的標識が、直接的照射によって励起されることを可能にする。一部の実施形態では、不透明層は、金属層であってもよい。斯かる金属層は、Ｓｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。一部の実施形態では、斯かる金属層は、Ａｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含むことができる。さらに他の実施形態では、斯かる金属層は、アルミニウムもしくは金を含むことができる、またはアルミニウムを唯一含むことができる。不透明層の厚さは、広く変動することができ、層を構成する材料の物理的および化学的特性に依存する。一部の実施形態では、不透明層の厚さは、少なくとも５ｎｍまたは少なくとも１０ｎｍまたは少なくとも４０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚さは、５〜１００ｎｍの範囲内であってもよい；他の実施形態では、不透明層の厚さは、１０〜８０ｎｍの範囲内であってもよい。不透明層は、励起ビームからの光の１００パーセントを遮断（すなわち、反射または吸収）する必要はない。一部の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも１０パーセントを遮断することができ；他の実施形態では、不透明層は、励起ビームからの入射光の少なくとも５０パーセントを遮断することができる。
【００６７】
不透明層またはコーティングは、本技術分野で公知の種々の技法によって固体状態膜に製作することができる。化学的蒸着、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸発およびスパッタリングを含む物理的蒸着、鋳造その他を含む、材料沈着技法を使用することができる。一部の実施形態では、原子層沈着を使用することができ、例えば、参照により組み込む、米国特許第６，４６４，８４２号；Weiら、Small、６巻（１３号）：１４０６〜１４１４頁（２０１０年）を参照。
【００６８】
一部の実施形態では、１〜１００ｎｍチャネルまたは開口部を、膜等、固体基板、通常、平面状基板を通して形成することができ、これを通して、一本鎖ＤＮＡ等の分析物が、移動するように誘導される。他の実施形態では、２〜５０ｎｍチャネルまたは開口部が、基板を通して形成され；さらに他の実施形態では、２〜３０ｎｍまたは２〜２０ｎｍまたは３〜３０ｎｍまたは３〜２０ｎｍまたは３〜１０ｎｍチャネルまたは開口部が、基板を通して形成される。ナノポアを生成する固体状態アプローチは、頑強性および耐久性、ならびにナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハスケールでナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質に基づくシステムと比較して優れた機械的、化学的および熱的特徴、ならびに電子的または光学的読み取り技法と統合する可能性を提案する。他方では、生物学的ナノポアは、特に、１〜１０ナノメートル範囲内の、再現性のある狭い穿孔または管腔を提供すると共に、ナノポアの物理的および／または化学的特性を仕立てるため、ならびに従来のタンパク質工学方法によってＦＲＥＴドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光標識等の化学基または要素を直接的にまたは間接的に取り付けるための技法を提供する。タンパク質ナノポアは典型的に、機械的支持のために繊細な脂質二重層に頼り、正確な寸法を有する固体状態ナノポアの製作は、依然として難易度が高い。一部の実施形態では、固体状態ナノポアは、生物学的ナノポアと組み合わせて、これらの弱点のいくつかを克服する、いわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成し、これにより、生物学的ポアタンパク質の正確さに、固体状態ナノポアの安定性を付与することができる。光学的読み取り技法のため、ハイブリッドナノポアは、ナノポアの正確な位置を提供し、これは、データ取得を大幅に単純化する。
【００６９】
一部の実施形態では、クラスターは、開口部のアレイを含む固相膜によって支持された脂質二重層にタンパク質ナノポアを配置することによって形成することもできる。例えば、斯かるアレイは、固相支持に製作された（例えば、穿孔された、エッチングされたその他）開口部を含むことができる。斯かる開口部の幾何学的配置は、用いられた製作技法に応じて変動し得る。一部の実施形態では、斯かる開口部のそれぞれは、別々の分解能限界区域に関連付けられるまたはこれによって包含される；しかし、他の実施形態では、複数の開口部が、同じ分解能限界区域内に存在してもよい。開口部の断面積は、広く変動することができ、異なるクラスター間と同じであっても同じでなくてもよいが、斯かる面積は通常、従来の製作アプローチの結果として実質的に同じである。一部の実施形態では、開口部は、１０〜２００ｎｍの範囲内の最小線寸法（例えば、円形開口部の場合は直径）を有する、または約１００〜３×１０４ｎｍ２の範囲内の面積を有する。開口部にわたり、脂質二重層が配置され得る。開口部毎のタンパク質ナノポアの分布は、例えば、挿入ステップの際にタンパク質ナノポアの濃度を制御することにより変動され得る。斯かる実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含むことができる。タンパク質ナノポアが開口部にランダムに挿入する一部の実施形態では、平均して１個または複数の開口部を含むクラスターは、ゼロを超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．２５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、０．７５を超える多数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、斯かるクラスターは、１．０を超える多数のタンパク質ナノポアを有する。
【００７０】
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、第１のチャンバおよび第２のチャンバ（「シスチャンバ」および「トランスチャンバ」と称される場合もある）の間に連絡を設置し、第２のまたはトランスチャンバに直面する表面に脂質二重層を支持する、そこを通る開口部のアレイを有するＳｉＮ膜等の固相膜を含む。一部の実施形態では、斯かる固相膜における開口部の直径は、１０〜２００ｎｍの範囲内または２０〜１００ｎｍの範囲内であってもよい。一部の実施形態では、斯かる固相膜は、斯かる二重層が、トランスチャンバに直面する表面における開口部に及ぶ領域において脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアをさらに含む。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、本明細書に記載されている技法を使用して、固相膜のシス側面から挿入される。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたは穿孔を含み、一端に「キャップ」構造を有し、他端に「ステム」構造を有するという点において、α−ヘモリジンと同一または同様の構造を有する（Songら、Science、２７４巻：１８５９〜１８６６頁（１９９６年）の用語法を使用）。一部の実施形態では、斯かるタンパク質ナノポアを使用すると、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバに曝露され、そのステム構造がトランスチャンバに曝露されるように配向されたタンパク質ナノポアをもたらす。
【００７１】
一部の実施形態では、本発明は、特に、ポリヌクレオチドの光学的に基づくナノポア配列決定のために、クラスターにおけるハイブリッドナノポアを用いることができる。斯かるナノポアは、タンパク質ナノポア等のタンパク質バイオセンサが安定的に挿入された、固体状態オリフィスまたは開口部を含む。荷電ポリマーは、従来のタンパク質工学技法によってタンパク質ナノポア（例えば、アルファヘモリジン）に取り付けることができ、その後、適用された電界を使用して、固体状態膜における開口部にタンパク質ナノポアをガイドすることができる。一部の実施形態では、固体状態基板における開口部は、タンパク質よりもわずかに小さくなるように選択され、これにより、これが開口部を通して移動することを防止する。その代わりに、タンパク質は、固体状態オリフィスに包埋されるであろう。
【００７２】
固体状態または合成のナノポアは、上に引用されている参考文献において例証される通り、種々の仕方で調製することができる。一部の実施形態では、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、例えば、参照により本明細書に組み込むYangら、Nanotechnolgy、２２巻：２８５３１０頁（２０１１年）によって開示される通り、種々の材料における合成ナノポアを穿孔することができる。独立した膜となるように加工された薄膜材料、例えば、窒化ケイ素の１個または複数の領域を支持するチップが、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバに導入される。顕微鏡は、低拡大率のために設定されつつ、ＨＩＭモーター制御が使用されて、イオンビームの通路内に独立した膜を届ける。焦点および非点収差（stigmation）を含むビームパラメータは、独立した膜に隣接する領域において、ただし、固体基板上で調整される。パラメータが妥当に固定されたら、独立した膜領域がイオンビーム走査領域の中央に置かれ、ビームがブランクにされるように、チップ位置が移動される。ＨＩＭ視野は、予期されるナノポアパターン全体を含むのに十分であり、将来的な光学的読み取りにおいて有用となるのに十分な（すなわち、光学的拡大率、カメラ分解能等に依存する）寸法（μｍ単位の）に設定される。次に、イオンビームは、ピクセル滞留時間において視野全体にわたって１回ラスターされ、これは、膜自己蛍光の全てまたは大部分の除去に十分な総イオン線量をもたらす。次に、視野は、単一のナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかのリソグラフィーにより画定されたミリングの実行に妥当な値（上で使用されるものよりも小さい）に設定される。パターンのピクセル滞留時間は、試料加工に先立つ較正試料の使用により決定される、１個または複数の予め決定された直径のナノポアをもたらすように設定される。このプロセス全体は、単一のチップにおける所望の領域毎に、および／またはＨＩＭチャンバ内に導入されたチップ毎に反復される。
【００７３】
一部の実施形態では、ポリマー（一本鎖ポリヌクレオチド等）を解析するための上述の方法を実行するためのデバイスは典型的に、層状の膜およびナノポアにわたる電界を確立するための１セットの電極を含む。一本鎖核酸は、チャンバに負電極を置くことにより層状の膜の「シス」側面として構成された、第１のチャンバにおける電解質中に置くことによりナノポアに曝露される。電界の適用により、負の一本鎖核酸は、ナノポアによって捕捉され、チャンバに正電極を置くことにより膜の「トランス」側面として構成された、層状の膜の向こう側の第２のチャンバへと移動される。移動のスピードは、第１および第２のチャンバ中の電解質のイオン強度、ならびにナノポアにわたり適用された電圧に部分的に依存する。光学的に基づく検出において、移動スピードは、例えば、異なる電圧に対しナノポアにつき異なる予想速度でシグナルを生成する、標識された一本鎖核酸の予め決定された標準を使用した、予備的較正測定によって選択され得る。よって、ＤＮＡ配列決定適用のため、移動スピードは、斯かる較正測定からのシグナル速度に基づき選択され得る。結果的に、斯かる測定から、例えば、ナノポアのアレイにわたる、信頼できるヌクレオチド識別を可能にするまたは最大化する、電圧が選択され得る。一部の実施形態では、斯かる較正は、解析されている鋳型の試料由来の核酸を使用して為すことができる（予め決定された標準配列の代わりにまたはそれに加えて）。一部の実施形態では、斯かる較正は、配列決定ランの際にリアルタイムで行うことができ、適用された電圧は、斯かる測定に基づき、例えば、ヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化するように、リアルタイムで修飾することができる。
【００７４】
ナノポアを通るポリマーの移動スピードを制御することは、配列情報を得ることができるデータの収集を可能にするために必要である。移動スピードは、一部には、ナノポアにわたる電圧差（または電場強度）、および核酸ポリマーがナノポアに曝露される（例えば、第１のチャンバの１壁を構成する固相膜に配置される）第１のチャンバの反応混合物における条件に依存する。ナノポアによる核酸ポリマー捕捉速度は、斯かるポリマーの濃度に依存する。一部の実施形態では、ナノポア配列決定のための従来の反応混合物条件、例えば、１Ｍ  ＫＣｌ（またはＮａＣｌ、ＬｉＣｌその他等、均等な塩）およびｐＨ緩衝系（例えば、使用されているタンパク質、例えば、タンパク質ナノポア、ヌクレアーゼその他が変性されないことを確実にする）を、本発明により用いることができる。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝系を使用して、６．８〜８．８の範囲内の値に実質的に一定にｐＨを維持することができる。一部の実施形態では、ナノポアにわたる電圧差は、７０〜２００ｍＶの範囲内であってもよい。他の実施形態では、ナノポアにわたる電圧差は、８０〜１５０ｍＶの範囲内であってもよい。操作に適切な電圧は、従来の測定技法を使用して選択することができる。ナノポアにわたる電流（または電圧）は、市販の機器を使用して容易に測定することができる。移動スピードが所望の範囲内となるように、電圧差を選択することができる。一部の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０００ヌクレオチド未満のスピードを含む。他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒１０〜６００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００〜８００ヌクレオチドであり；他の実施形態では、移動スピードの範囲は、毎秒２００〜５００ヌクレオチドである。
２種または３種の光学的標識を用いる実施形態
【００７５】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方において、わずか２種の異なる種類のヌクレオチドが、選択された種類のヌクレオチドについて鑑別可能な光学的シグナルを生成する、異なる光学的標識で標識される。例えば、各標的ポリヌクレオチドの相補鎖のＣおよびＴは、標識されたアナログによって置換することができ、ＣおよびＴアナログの標識は、別個の光学的シグナルを生成することができる。次に、鎖のヌクレオチドが、それらの標識に光学的シグナルを生成させる光学的検出領域を逐次通過するように制約されるナノポアを通して、標識された鎖を移動することにより、光学的シグネチャーが生成される。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖両方由来の光学的シグネチャーからの情報を組み合わせて、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。
【００７６】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの選択された種類のヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼを使用した伸長反応において、標識されたヌクレオチドアナログによって置換される。標的ポリヌクレオチドの標識された鎖は、鎖のヌクレオチドが光学的シグナルを産生するようにそれらが励起される光学的検出領域を通って一列で移動するように鎖のヌクレオチドを制約する、ナノポアを通して移動される。個々の鎖についての光学的シグナルの収集物は、鎖の光学的シグネチャーと本明細書で称される。例えば、ヘアピンアダプターを介して、鎖およびその相補体（すなわち、センスおよびアンチセンス鎖）が連結された一部の実施形態では、単一の光学的シグネチャーは、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方由来のヌクレオチド上の光学的標識からの光学的シグナルを含み得る。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの異なる鎖は、上述の通り、解析のために、組み合わせるまたは一緒に使用することができる２つの異なる光学的シグネチャーを別々に生成することができる。斯かる別々に解析された鎖は、例えば、（例えば、公知の位置、長さおよび配列パターンならびに迅速な会合を可能にするための多様性で、標的ポリヌクレオチドに付着されたオリゴヌクレオチドセグメントであり得る）分子タグを使用することによって、光学的シグネチャーの生成後に会合することができる。後述する通り、本発明の光学的シグネチャーは、各検出間隔で検出されるシグナルが、分解能限界区域または体積内で放出する複数の光学的標識からの寄与を含み得る点で、混合された光学的シグナルを含むことができる、すなわち、それらは、参照により本明細書に組み込む、Huberら、米国特許出願公開ＵＳ２０１６００７６０９１により説明される通り、（例えば）混合されたＦＲＥＴシグナルであり得る。
【００７７】
上述の通り、一部の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログが、少なくとも２種類のヌクレオチドについて置換されて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップと、（ｂ）前記ヌクレオチドアナログが、同じ少なくとも２種類のヌクレオチドについて置換されて、標識された相補体を形成するように、鎖の相補体をコピーするステップと、（ｃ）標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを一列で通過するように、ナノポアを通して標識された鎖を移動させるステップと、（ｄ）標識された鎖がナノポアを通って移動して、鎖の光学的シグネチャーを産生するとき、光学的標識からの光学的シグナルの時系列を検出するステップと、（ｅ）標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを一列で通過するように、ナノポアを通して標識された相補体を移動させるステップと、（ｆ）標識された相補体がナノポアを通って移動して、相補体の光学的シグネチャーを産生するとき、光学的標識からの光学的シグナルの時系列を検出するステップと、（ｇ）鎖の光学的シグネチャーおよび相補体の光学的シグネチャーから二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとによって実行することができる。一部の実施形態では、ＣおよびＴ、ＣおよびＧ、ＣおよびＡ、ＴおよびＧ、ＴおよびＡまたはＧおよびＡであり得る、２種類のヌクレオチドが標識される。一部の実施形態では、ピリミジンヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、プリンヌクレオチドが標識される。一部の実施形態では、核酸ポリメラーゼを使用したプライマー伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの標識されたアナログｄＮＴＰを組み込むことによって、鎖の選択された種類のヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、その後の反応において異なる種類のヌクレオチドへの異なる標識の取り付けを可能にする直交反応性官能基で、アナログｄＮＴＰが誘導体化される、伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドのアナログｄＮＴＰを組み込むことによって、鎖の選択された種類のヌクレオチドが標識される。この後者の標識化アプローチは、参照により本明細書に組み込む、Jettら、米国特許第５，４０５，７４７号で開示される。
【００７８】
一部の実施形態では、３種類のヌクレオチドが標識され、これは、Ｃを第１の光学的標識で、Ｔを第２の光学的標識で、ならびにＧおよびＡを第３の光学的標識で標識することを含み得る。他の実施形態では、次の群のヌクレオチドは、示される通りに：ＣおよびＧを、それぞれ、第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＡを第３の光学的標識で；ＣおよびＡを、それぞれ、第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＧを第３の光学的標識で；ＴおよびＧを、それぞれ、第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＣおよびＡを第３の光学的標識で；ＡおよびＧを、それぞれ、第１の光学的標識および第２の光学的標識で、ＴおよびＣを第３の光学的標識で標識することができる。
【００７９】
一部の実施形態では、光学的標識は、ナノポアと会合したドナーからのエネルギー移動後に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルを生成する蛍光アクセプター分子である。一部の実施形態では、さらに後述する通り、ドナーは、光学的に活性なナノ粒子、例えば、量子ドット、ナノダイヤモンドその他等であり得る。アクセプター分子とドナーとの特定の組合せの選択は、当業者の設計選択である。そのうちの一部が、より十分に後述される一部の実施形態では、単一の量子ドットがナノポアに付着され、その波長が、アクセプターによって生成されるＦＲＥＴシグナルに寄与しないように十分に分離される励起ビームを使用して励起されて、通常、より低く（すなわち、青く）蛍光を発する。同様に、放出波長が両方のアクセプター分子の吸収バンドと重複して、ＦＲＥＴ相互作用を促進する、量子ドットが選択される。一部の実施形態では、各々の放出波長がアクセプター分子のうちの異なる１つの吸収バンドと最適に重複するように選択される、２個のドナーを、ナノポアの各励起ゾーンについて使用することができる。
【００８０】
図７Ａでは、二本鎖標的ポリヌクレオチド（７００）は、センス鎖（７０１）および相補的アンチセンス鎖（７０２）からなり、これに、従来法、例えば、参照により本明細書に組み込む、Weissmanら、米国特許第６，２８７，８２５号；Schmittら、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／００４４６８を使用して、「Ｙ」アダプター（７０４）および（７０６）がライゲートされる（７０３）。アダプター（それぞれ、７０４および７０６）のアーム（７０８）および（７１０）は、プライマー（７１６）および（７１８）がアニールされる（７０５）、プライマー結合部位を含む。二本鎖部分（７１２）および（７１４）はタグ配列を含むことができ、例えば、１つまたは両方は、後の鎖の再会合のために使用されて、例えば、鎖の各々の光学的シグネチャー由来の配列情報を得ることができる、予め決定された長さおよび組成のランダマーを含み得る。プライマー（７１６）および（７１８）をアニールした後、それらは、（例えば、図解される通り）標識されたｄＵＴＰアナログ（組み込まれたヌクレオチドにおける白い丸として示される標識）および標識されたｄＣＴＰアナログ（組み込まれたヌクレオチドにおける黒い丸として示される標識）ならびに天然非標識ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下で（アナログが、伸長された鎖において十分に置換されるように、非標識ｄＴＴＰも非標識ｄＣＴＰも存在せず）、核酸ポリメラーゼによって伸長する（７０７）ことができる。ＧおよびＡ上の標識の非存在は、組み込まれたヌクレオチドの上の破線として図解される。ノイズを伴わない理想的な検出システムでは、白い丸、黒い丸および破線の配列は、示されるセンスおよびアンチセンス鎖がナノポアの励起ゾーンを通過するとき、示されるセンスおよびアンチセンス鎖によって生成される光学的シグネチャーの優れた表現であり得る。
【００８１】
図７Ｂでは、３種の標識を用いる代替実施形態について、伸長産物（７２０）および（７２２）が図解される。上述の通り、組み込まれた標識されたｄＵＴＰアナログは、白い丸として示され、組み込まれた標識されたｄＣＴＰアナログは、黒い丸として示される。組み込まれた標識されたｄＡＴＰおよびｄＧＴＰアナログは、黒い菱形として示される。
【００８２】
標識するヌクレオチドの種類、塩基に取り付けるための標識およびリンカーの種類、ならびにｄＮＴＰアナログの存在下での伸長反応のための核酸ポリメラーゼの選択におけるガイダンスは、参照により組み込む、次の参考文献：Goodmanら、米国特許第５，９４５，３１２号；Jettら、米国特許第５，４０５，７４７号；Muehleggerら、米国特許出願公開ＵＳ２００４／０２１４２２１；Gillerら、Nucleic  Acids  Research、３１巻（１０号）：２６３０〜２６３５頁（２００３年）；Tasaraら、Nucleic  Acids  Research、３１巻（１０号）：２６３６〜２６４６頁（２００３年）；Augustinら、J.  Biotechnology、８６巻：２８９〜３０１頁（２００１年）；Brakmann、Current  Pharmacuetical  Biotechnology、５巻（１号）：１１９〜１２６頁（２００４年）；その他に見出すことができる。本発明による使用のための例示的な核酸ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ、Ｔａｑ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌ  Ｉ、Ｔｇｏ  ｅｘｏ、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ、その他が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、例示的な核酸ポリメラーゼとして、Ｖｅｎｔ  ｅｘｏおよびＫｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏが挙げられるがこれらに限定されない。ｄＮＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６３５、ＭＲ１２１、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡ、その他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＵＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６６５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ９０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ＭＲ１２１、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡ、その他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＣＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡ、その他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＡＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ａｔｔｏ  ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、その他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＧＴＰアナログのための例示的な蛍光標識として、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、その他が挙げられるがこれらに限定されない。ｄＵＴＰアナログおよびｄＣＴＰアナログのための例示的なペアの蛍光標識として、（ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、（Ａｔｔｏ  ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ａｔｔｏ  ６５５）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ  ３０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ���、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  １、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、（Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ２、Ａｔｔｏ  ６５５）、Ｇｎｏｔｈｉｓ  ｂｌｕｅ  ３、Ｃｙ５）、その他が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
図７Ｃは、例えば、参照により本明細書に組み込む、米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０１５２４９２および同ＵＳ２０１２／００５８４６８で教示される通り、２種の標識が使用され、センスおよびアンチセンス鎖がヘアピンアダプター（７３０）の手段によって連結されている実施形態を図解する。尾状アダプター（７３２）およびヘアピンアダプター（７３０）は、標的ポリヌクレオチド（７００）にライゲートされる。プライマー（７３４）の変性およびアニール後、伸長反応は、鎖（７０１）の標識された相補体であるセグメント（７３６）および鎖（７０１）の標識された逆相補体であるセグメント（７３８）を含む伸長産物（７３５）を産生する。ナノポアを通した伸長産物（７３５）の移動および光学的シグネチャーの生成後、標的ポリヌクレオチド（７００）の配列を決定することができる。任意選択で、ヘアピン（７３０）の配列は、伸長反応中に標識の予め決定されたパターンが組み込まれるように選択することができ、これは、例えば、どこでセグメント（７３６）が終了し、どこでセグメント（７３８）が開始するその他等を示すことにより、光学的シグネチャーの解析を援助するために使用することができる。
定義
【００８４】
「エバネセント場」は、非伝播電磁場を意味する；すなわち、ポインティングベクトルの平均値がゼロである電磁場である。
【００８５】
「ＦＲＥＴ」または「フェルスターまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起されたドナーフルオロフォアから基底状態のアクセプターフルオロフォアへの、無放射双極子−双極子エネルギー移動機構を意味する。ＦＲＥＴ相互作用におけるエネルギー移動の速度は、アクセプターの吸収スペクトルとドナーの放出スペクトルとのスペクトル重複の程度、ドナーの量子収量、ドナーおよびアクセプター遷移双極子の相対的配向性、ならびにドナーおよびアクセプター分子の間の距離に依存する；Lakowicz、Principles  of  Fluorescence  Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）。特に興味深いＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターに移動され、次いで、そのドナーを励起する光（すなわち、「ＦＲＥＴシグナル」）よりも低い周波数を有する光子としてアクセプターによって放出されるエネルギーの部分を生じる相互作用である。「ＦＲＥＴ距離」は、ＦＲＥＴ相互作用が起こり得、ＦＲＥＴアクセプターによって産生される検出可能なＦＲＥＴシグナルが生じ得る、ＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターの間の距離を意味する。
【００８６】
「キット」は、本発明の方法を行うための材料または試薬を送達するためのいずれかの送達系を指す。反応アッセイの文脈において、斯かる送達系は、ある位置から別の位置への、反応試薬（例えば、適切な容器内の、相互にクエンチする蛍光標識等の蛍光標識、蛍光標識連結剤、酵素等）および／または支持材料（例えば、バッファー、アッセイを行うための書面の説明書等）の貯蔵、輸送または送達を可能にする系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含む１個または複数の同封物（例えば、箱）を含む。斯かる内容物は、一緒にまたは別々に、意図される受取人に送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイにおける使用のための酵素を含むことができ、一方、第２またはそれよりも多い容器は、相互にクエンチする蛍光標識を含む。
【００８７】
「ナノポア」は、予め決定されたまたは識別できる順序での基板を通した分析物の通過を可能にする、あるいはポリマー分析物の場合は、予め決定されたまたは識別可能な順序での基板を通したそのモノマー単位の通過を可能にする、基板に位置するいずれかの開口を意味する。後者の場合、予め決定されたまたは識別可能な順序は、ポリマーにおけるモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例として、タンパク質性またはタンパク質に基づくナノポア、合成または固体状態ナノポア、およびタンパク質ナノポアが包埋された固体状態ナノポアを含むハイブリッドナノポアが挙げられる。ナノポアは、１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍの内径を有することができる。タンパク質ナノポアの例として、例えば、参照により本明細書に組み込むRhee,  M.ら、Trends  in  Biotechnology、２５巻（４号）（２００７年）：１７４〜１８１頁；Bayleyら（上に引用）；Gundlachら、米国特許出願公開第２０１２／００５５７９２号；その他に開示されている、アルファ−ヘモリジン、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡおよびＬａｍＢ（マルトポリン）が挙げられるがこれらに限定されない。単一の核酸分子の移動を可能にするいずれかのタンパク質ポアを用いることができる。ナノポアタンパク質は、ポア外部の特異的部位において、またはポア形成タンパク質を構成する１個もしくは複数のモノマー単位外部の特異的部位において、標識することができる。ポアタンパク質は、アルファ−ヘモリジン、ＭｓｐＡ、電位依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、炭疽ポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣおよびＬａｍＢ（マルトポリン）等が挙げられるがこれらに限定されない、タンパク質の群から選択される。固体状態の孔へのポアタンパク質の統合は、荷電ポリマーをポアタンパク質に取り付けることにより達成される。電界を適用した後に、荷電複合体は、固体状態の孔内に電気泳動的に引き寄せられる。合成ナノポアまたは固体状態ナノポアは、様々な形態の固体基板に作製することができ、その例として、シリコーン（例えば、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、プラスチック、ガラス、半導体材料およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。合成ナノポアは、脂質二重層膜に位置する生物学的タンパク質ポアよりも安定的であってもよい。合成ナノポアは、重合エポキシ等が挙げられるがこれに限定されない、適した基板に包埋されたカーボンナノチューブを使用することにより作製することもできる。カーボンナノチューブは、均一かつ明確に定義された化学的および構造的特性を有することができる。１〜数百ナノメートルに及ぶ、様々なサイズのカーボンナノチューブを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、結果として、ナノポアを通した核酸の電気泳動的輸送は、単純かつ予測可能になる（Ito,  T.ら、Chem.  Commun.１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの基板表面は、タンパク質ポアの共有結合による取り付けを可能にするために、または表面特性を光学的ナノポア配列決定に適したものにするために化学修飾されていてよい。斯かる表面修��は、共有結合または非共有結合であってもよい。大部分の共有結合修飾は、オルガノシラン沈着を含み、これに関する最も一般的なプロトコールについて記載する：１）水性アルコールからの沈着。これは、シリル化表面を調製するための最も手軽な方法である。９５％エタノール−５％水の溶液は、ｐＨ４．５〜５．５となるように酢酸で調整される。撹拌しつつシランを添加して、２％最終濃度を得る。加水分解およびシラノール基形成後に、基板を２〜５分間添加する。エタノールに短時間浸漬することにより過剰な材料をすすぎ出した。シラン層の硬化は、５〜１０分間、セ氏１１０度で為される。２）気相沈着。シランは、化学的蒸着方法によって乾燥非プロトン性条件下で基板に適用することができる。このような方法は、単層沈着を好む。閉鎖チャンバ設計において、基板は、５ｍｍ蒸気圧の達成に十分な温度まで加熱される。あるいは、シラン蒸発が観察されるまで真空状態にすることができる。３）スピンオン沈着。スピンオン適用は、最大の官能基付与および多層沈着を好む加水分解性条件下で、または単層沈着を好む乾燥条件下で為すことができる。一部の実施形態では、本発明の方法により単一のナノポアが用いられる。他の実施形態では、複数のナノポアが用いられる。後者の実施形態の一部では、複数のナノポアは、通常、固相膜等の平面状基板に配置された、ナノポアのアレイとして用いられる。ナノポアアレイのナノポアは、例えば、直線的パターンで、規則的に間隔をあけていてよい、またはランダムに間隔をあけていてよい。好まれる実施形態では、ナノポアは、平面状固相基板において直線的パターンで規則的に間隔をあける。
【００８８】
「ナノ構造」（「ナノスケール構造」および「ナノスケール特色」と互換的に使用される）は、数ナノメートル〜数百ナノメートル、例えば、１〜１０００ナノメートルの範囲内の少なくとも一寸法を有する構造を意味する。一部の適用では、斯かる範囲は、２〜５００ナノメートルであり；他の適用では、斯かる範囲は、３〜５００ナノメートルである。ナノ構造の形状および幾何学的配置は、広く変動することができ、ナノポア、ナノウェル、ナノ粒子、および一連の反応の実行に特に適した他のいずれかの簡便な形状が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ナノ構造は、固相膜と操作的に会合したタンパク質ナノポアであってもよい。ナノポアおよびナノウェル等、一部のナノ構造は、固相膜または他の固体等、より大型の一般的な基板に形成されて、ナノポアまたはナノウェルのアレイを形成することができる。特に興味深いナノ構造は、化学的、物理的（例えば、ＦＲＥＴ）、酵素的および／または結合反応、または一連の斯かる反応を支持または含むことができるナノ構造である。一部の実施形態では、ナノウェル等、ナノ構造は、１ナノリットル未満の（１０×−９リットル）、１ピコリットル未満のまたは１フェムトリットル未満の容量を封入する。他の実施形態では、個々のナノウェルのそれぞれは、１０００ゼプトリットル未満の、１００ゼプトリットル、８０ゼプトリットルまたは５０ゼプトリットル未満のまたは１ゼプトリットル未満の、またはさらには１００ヨクトリットル未満の容量を提供する。一部の実施形態では、ナノウェルは、ゼロモード導波を含む。
【００８９】
「ポリマー」は、線形の鎖となるよう接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含むポリヌクレオチドとして、または２種類以上のアミノ酸を含むポリペプチドとして、２型以上のモノマーを含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体またはアナログ、ならびにアミノ酸ならびにその誘導体およびアナログを限定することなく含むことができる。一部の実施形態では、ポリマーは、ホスホジエステル連結またはそのアナログによってヌクレオシドモノマーが接続されたポリヌクレオチドである。
【００９０】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの線形ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソンクリック型の塩基対形成、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたはリバースフーグスティーン型の塩基対形成その他等、モノマー対モノマーの相互作用の規則的パターンとして天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。斯かるモノマーおよびそのヌクレオシド間連結は、天然起源またはそのアナログ、例えば、天然起源のまたは非天然起源のアナログであってもよい。非天然起源のアナログは、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、フルオロフォアまたはハプテン等の標識の取り付けを可能にする連結基を含む塩基その他を含むことができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによるライゲーションその他等、酵素による加工を要求する場合は常に、当業者は、これらの事例におけるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、いずれかまたは一部の位置に、ヌクレオシド間連結、糖部分または塩基のある特定のアナログを含有しないであろうことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは典型的に、「オリゴヌクレオチド」と通常称される場合の数個のモノマー単位、例えば、５〜４０個から、数千個のモノマー単位へと、サイズに幅がある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」等、文字（大文字または小文字）配列によって表される場合は常に、ヌクレオチドが、左から右へ５’→３’順序であり、他に示されていなければ、または文脈から明らかでなければ、「Ａ」が、デオキシアデノシンを表示し、「Ｃ」が、デオキシシチジンを表示し、「Ｇ」が、デオキシグアノシンを表示し、「Ｔ」が、チミジンを表示し、「Ｉ」が、デオキシイノシンを表示し、「Ｕ」が、ウリジンを表示することが理解されるであろう。他に記されていなければ、用語法および原子番号付けの慣習は、StrachanおよびRead、Human  Molecular  Genetics  2（Wiley-Liss、New  York、１９９９年）に開示されているものに従うであろう。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル連結によって連結された４種の天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡはこれらのリボース対応物）を含む；しかし、これは、例えば、修飾された塩基、糖またはヌクレオシド間連結を含む、非天然ヌクレオチドアナログを含むこともできる。当業者には、酵素が、活性のために特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件を有する場合（例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスその他）、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に適切な組成の選択は、十分に、当業者の知識範囲内、特に、Sambrookら、Molecular  Cloning、第２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory、New  York、１９８９年）および同様の参考文献等、専門書からのガイダンス内であることが明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖型または二本鎖型（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドお��びそれぞれの相補体のデュプレックス）のいずれかを指すことができる。当業者には、用語使用の文脈から、いずれの型が、または両方の型が意図されているか明らかになると予想される。
【００９１】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型とデュプレックスを形成した後に、核酸合成の開始点として作用することができ、伸長されたデュプレックスが形成されるように鋳型に沿ってその３’端から伸長されることができる、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は通常、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ等、核酸ポリメラーゼにより行われる。伸長プロセスにおいて付加されたヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲内または１８〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有する。プライマーは、種々の核酸増幅反応、例えば、単一のプライマーを使用した線形増幅反応、または２種またはそれよりも多いプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応において用いられる。特定の適用のためのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参照により組み込む次の参考文献によって証明される通り、当業者に周知のものである：Dieffenbach編、PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual、第２版（Cold  Spring  Harbor  Press、New  York、２００３年）。
【００９２】
「分解能限界区域」は、その中では個々の特色または光放出源を光学的シグナル検出システムによって鑑別することができない、ナノポアまたはナノウェルアレイの表面の区域である。理論によって限定されることを意図するものではないが、斯かる分解能限界区域は、光学的システムの分解能限界（「回折限界」または「回折障壁」と称される場合もある）によって決定される。斯かる限界は、放出源の波長および光学的構成要素によって決定され、ｄ＝λ／ΝＡ（式中、ｄは、解像され得る最小特色であり、λは、光の波長であり、ＮＡは、光の焦点を合わせるために使用される対物レンズの開口数である）によって定義することができる。よって、２個またはそれよりも多いナノポアが、分解能限界区域内に存在し、２個またはそれよりも多い光学的シグナルが、それぞれのナノポアにおいて生成される場合は常に、光学的検出システムは、いずれの光学的シグナルが、いずれのナノポアに由来するか鑑別または決定することができない。本発明に従って、ナノポアアレイの表面は、分解能限界区域に対応する、非重複領域または実質的に非重複領域へと分割または細分することができる。分解能限界区域に対応する斯かる細分化のサイズは、用いられる特定の光学的検出システムに依存し得る。一部の実施形態では、光放出源が、可視スペクトル内に存在する場合は常に、分解能限界区域は、３００ｎｍ２〜３．０μｍ２の範囲内である；他の実施形態では、分解能限界区域は、１２００ｎｍ２〜０．７μｍ２の範囲内である；他の実施形態では、分解能限界区域は、３×１０４ｎｍ２〜０．７μｍ２の範囲内であり、区域の前述の範囲は、ナノポアまたはナノウェルアレイの表面に関連する。一部の実施形態では、可視スペクトルは、約３８０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲内の波長を意味する。
【００９３】
ポリヌクレオチドを参照した「配列の決定」、「配列決定」または「ヌクレオチド配列の決定」または同様の用語は、ポリヌクレオチドの部分的および完全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、例えば、標的ポリヌクレオチドの単にＡおよびＣの配列等、４種の天然ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの完全セットのサブセットの配列を含む。すなわち、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち１、２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチド内における４種類のヌクレオチドのうち２、３または全種の同一性、順序付けおよび位置の決定を含む。一部の実施形態では、配列の決定は、その配列が、２進コード、例えば、「ｃ−（非ｃ）（非ｃ）ｃ−（非ｃ）−ｃ．．．」を表す「１００１０１．．．」その他として表されるような、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内における単一の種類のヌクレオチド、例えば、シトシンの順序付けおよび位置を識別することにより達成することができる。一部の実施形態では、この用語は、標的ポリヌクレオチドのためのフィンガープリントとして機能する標的ポリヌクレオチドの部分列を含むこともできる；すなわち、ポリヌクレオチドのセット、例えば、細胞によって発現される全て異なるＲＮＡ配列内で、標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを独特に識別する部分列。
【００９４】
本開示は、明記されている特定の形態の範囲に限定されることを意図しないが、本明細書に記載されている変種の代替物、修飾および均等物を網羅することを意図する。さらに、本開示の範囲は、本開示を考慮することにより当業者にとって明らかとなり得る他の変種を完全に包含する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2019522983.tif 000003
【図１Ｂ】
2019522983.tif 000004
【図２】
2019522983.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2019522983.tif 000013
【図７Ｂ】
2019522983.tif 000014
【図７Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月27日(2019.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019522983000001.app
【国際調査報告】
2019522983.tif 000016