(57)【要約】  Ｉ型インターフェロン先天性免疫応答を抑制する、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む化合物および組成物が提供される。該組成物におけるグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、好適にはカチオン化されており、一実施形態においてアミノ基で官能化されている。
2019514963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、細胞培養物、組織または対象における抗ウイルス応答を抑制するための、有効量のグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の使用。
【請求項２】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子がカチオン化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子がアミン修飾されている、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子が、非置換であるまたは１つもしくは複数のＮ原子、Ｏ原子、Ｓ原子もしくはハロゲン原子で置換されている、１個から１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル部分を含む短鎖第４級アンモニウム化合物で修飾されている、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、約３０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均粒子径を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも９０％または実質的に全ての前記ナノ粒子が、約４０ｎｍから約１４０ｎｍ、約５０ｎｍから約１３０ｎｍ、約６０ｎｍから約１２０ｎｍ、約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、約８０ｎｍから約１００ｎｍ、約３０ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約７０ｎｍ、約７０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約９０ｎｍ、約９０ｎｍから約１００ｎｍ、約１００ｎｍから約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍから約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍから約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍから約１４０ｎｍ、または約１４０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均直径を有する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、別の分子にさらにコンジュゲートされていない、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、１つまたは複数の小分子にさらにコンジュゲートされており、前記分子は、親水性修飾剤、薬物動態修飾剤、生物活性修飾剤または検出可能修飾剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記対象における抗ウイルス応答を抑制するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記対象がウイルスベクターベースの遺伝子治療患者である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
疾患または状態の治療または予防のための、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾患または状態が自己免疫疾患である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記疾患または状態が炎症性疾患である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記疾患または状態が疼痛である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１５】
前記疾患または状態が敗血症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
組成物が局所的投与のためのものである、請求項９から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
組成物が全身的投与のためのものである、請求項９から１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記細胞培養物における抗ウイルス応答を抑制するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
ワクチン製造のための、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ワクチン製造において感染細胞培養物におけるウイルス成長および複製を増強するための、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
細胞、細胞培養物、組織または対象における抗ウイルス応答を抑制する方法であって、有効量のグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を、前記細胞、前記細胞培養物、前記組織または前記対象に導入または投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子がカチオン化されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子がアミン修飾されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子が、非置換であるまたは１つもしくは複数のＮ原子、Ｏ原子、Ｓ原子もしくはハロゲン原子で置換されている、１個から１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル部分を含む短鎖第４級アンモニウム化合物で修飾されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ナノ粒子が、約３０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均粒子径を有する、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも９０％または実質的に全ての前記ナノ粒子が、約４０ｎｍから約１４０ｎｍ、約５０ｎｍから約１３０ｎｍ、約６０ｎｍから約１２０ｎｍ、約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、約８０ｎｍから約１００ｎｍ、約３０ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約７０ｎｍ、約７０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約９０ｎｍ、約９０ｎｍから約１００ｎｍ、約１００ｎｍから約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍから約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍから約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍから約１４０ｎｍ、または約１４０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均直径を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ナノ粒子が、別の分子にさらにコンジュゲートされていない、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が、１つまたは複数の小分子にさらにコンジュゲートされており、前記分子は、親水性修飾剤、薬物動態修飾剤、生物活性修飾剤または検出可能修飾剤である、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を前記対象に投与することを含む、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象がウイルスベクターベースの遺伝子治療患者である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
疾患または状態の治療または予防のための、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記疾患または状態が自己免疫疾患である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患または状態が炎症性疾患である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患または状態が疼痛である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患または状態が敗血症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
組成物が局所的投与のためのものである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
組成物が全身的投与のためのものである、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞培養物における抗ウイルス応答を抑制するための、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
ワクチン製造のための、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記ワクチン製造において感染細胞培養物におけるウイルスの成長および複製を増強するための、請求項３８または３９に記載の使用。
【請求項４１】
ウイルスベクターベースの遺伝子治療およびグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む、組合せ治療。
【請求項４２】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子がカチオン化されている、請求項４１に記載の組合せ治療。
【請求項４３】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子がアミン修飾されている、請求項４１に記載の組合せ治療。
【請求項４４】
前記グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子が、非置換であるまたは１つもしくは複数のＮ原子、Ｏ原子、Ｓ原子もしくはハロゲン原子で置換されている、１個から１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル部分を含む短鎖第４級アンモニウム化合物で修飾されている、請求項４１に記載の組合せ治療。
【請求項４５】
前記ウイルスベクターベースの遺伝子治療がアデノウイルスである、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の組合せ治療。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国特許出願公開第６２／３３１，６６２号明細書および同第６２／４５４，４２４号明細書に基づく優先権を主張するものであり、これらを参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
この出願は、免疫モジュレーター組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
グリコーゲンは、動物における短期のエネルギー貯蔵材料である。哺乳動物において、グリコーゲンは筋肉および肝臓の組織に生じる。それは、１０６〜１０８ダルトンの分子量を有するα−１，６−グルコシド連結を介して高度に分岐された１，４−グルカン鎖から構成される。グリコーゲンは、２０〜２００ｎｍの直径を有する高密度粒子の形態で動物組織中に存在する。グリコーゲンは、微生物体中、例えば、細菌および酵母中に蓄積することも見出されている。
【０００４】
フィトグリコーゲンは、それの構造および物理的特性の両方の点でグリコーゲンと非常に似ている多糖類である。それは、それの植物ベースの起源供給源に基づいてグリコーゲンから区別される。最も著名なフィトグリコーゲン供給源は、スイートコーンの穀粒、ならびにイネ、オオムギおよびソルガムの特定の変種である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態において、細胞、細胞培養物、組織または対象における抗ウイルス応答を抑制するための、有効量のグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の使用が提供される。また、有効量のグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を細胞、細胞培養物、組織または対象に導入または投与することを含む、細胞、細胞培養物、組織または対象における抗ウイルス応答を抑制する方法も提供される。
【０００６】
一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子はカチオン化されている。
【０００７】
一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子はアミン修飾されている。
【０００８】
一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、非置換であるまたは１つもしくは複数のＮ原子、Ｏ原子、Ｓ原子もしくはハロゲン原子で置換されている、１個から１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル部分を含む短鎖第４級アンモニウム化合物で修飾されている。
【０００９】
一実施形態において、該ナノ粒子は、約３０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均粒子径を有する。一実施形態において、少なくとも９０％または実質的に全ての該ナノ粒子は、約４０ｎｍから約１４０ｎｍ、約５０ｎｍから約１３０ｎｍ、約６０ｎｍから約１２０ｎｍ、約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、約８０ｎｍから約１００ｎｍ、約３０ｎｍから約４０ｎｍ、約４０ｎｍから約５０ｎｍ、約５０ｎｍから約６０ｎｍ、約６０ｎｍから約７０ｎｍ、約７０ｎｍから約８０ｎｍ、約８０ｎｍから約９０ｎｍ、約９０ｎｍから約１００ｎｍ、約１００ｎｍから約１１０ｎｍ、約１１０ｎｍから約１２０ｎｍ、約１２０ｎｍから約１３０ｎｍ、約１３０ｎｍから約１４０ｎｍ、または約１４０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均直径を有する。
【００１０】
一実施形態において、該ナノ粒子は、別の分子にさらにコンジュゲートされていない。
【００１１】
別の実施形態において、該ナノ粒子は、１つまたは複数の小分子にさらにコンジュゲートされており、ここで該分子は、親水性修飾剤、薬物動態修飾剤、生物活性修飾剤または検出可能修飾剤である。
【００１２】
一実施形態において、対象はウイルスベクターベースの遺伝子治療患者である。
【００１３】
本明細書に記載されている通りの使用および方法は、疾患または状態の治療または予防のためであり得る。
【００１４】
一実施形態において、疾患または状態は自己免疫疾患である。
【００１５】
一実施形態において、疾患または状態は炎症性疾患である。
【００１６】
一実施形態において、疾患または状態は疼痛である。
【００１７】
一実施形態において、疾患または状態は敗血症である。
【００１８】
一実施形態において、該組成物は局所的投与のためである。
【００１９】
一実施形態において、該組成物は全身的投与のためである。
【００２０】
本明細書に記載されている通りの使用および方法は、ワクチンの製造のためであり得る。
【００２１】
一実施形態において、該使用は、ワクチンの製造において感染細胞培養物におけるウイルス成長および複製を増強するためである。
【００２２】
その上提供されるのは、ウイルスベクターベースの遺伝子治療およびグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む組合せ治療である。一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子はカチオン化されている。一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子はアミン修飾されている。一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、非置換であるまたは１つもしくは複数のＮ原子、Ｏ原子、Ｓ原子もしくはハロゲン原子で置換されている、１個から１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル部分を含む短鎖第４級アンモニウム化合物で修飾されている。
【００２３】
一実施形態において、ウイルスベクターベースの遺伝子治療は、アデノウイルスである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子のスキーム図である。
【図２】ニジマス生殖腺細胞（ＲＴＧ−２）細胞株生存能に対するフィトグリコーゲン（ＰＨＸ）および化学的に修飾されたフィトグリコーゲンの影響を示す図である。ＡＢ−アラマーブルー、ＣＦＤＡ−カルボキシフルオレセインジアセテート、アセトキシメチルエステル。ＰＨＸ−フィトグリコーゲンＯＳＡ３−ＯＳＡ−フィトグリコーゲン、ＤＳ＝０．０２  ＮＨ２−アミノ−フィトグリコーゲン、ＤＳ＝０．１  Ｑ１５１−Ｎ−（２−ヒドロキシ）プロピル−３−トリメチルアンモニウム−フィトグリコーゲン、ＤＳ＝１．００。
【図３】ＰＨＸ−ＮＨ２の存在または非存在におけるＶＨＳＶ−ＩＶｂでの感染の７２時間または１４４時間後のＲＴｇｉｌｌ  Ｗ−１細胞におけるＭＸ１（代表的な先天性免疫遺伝子）転写物発現の変化を示す図である。ＲＴｇｉｌｌ  Ｗ−１細胞を７２または１４４時間の間、培地単独（対照）、ＶＨＳＶ−ＩＶｂ、および０．５ｎｇ／ｍＬまたは０．０５ｎｇ／ｍＬのＰＨＸ−ＮＨ２とのＶＨＳＶ−ＩＶｂで処置した。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＭＸ１転写物レベルを測定した。
【図４】ＰＨＸ−ＮＨ２の存在または非存在におけるシロザケレオウイルス（ＣＳＶ）（ＣＳＶ；ＴＣＩＤ５０＝１．９９５×１０４）での感染の２４時間後のＲＴＧ−２細胞におけるＭｘ１転写物発現の変化を示す図である。ＲＴＧ２細胞を２４時間の間、培地単独（対照）、ＣＳＶ、および０．５ｎｇ／ｍＬのＰＨＸ−ＮＨ２とのＣＳＶで処置した。感染の２４時間後、ｑＲＴＰＣＲを使用して、Ｍｘ１の転写物レベルを測定した。β−アクチンに正規化されているとともにＣＳＶ感染細胞に相対的なΔΔＣｑ方法を使用して、発現を算出した。Ｔｕｋｅｙ事後試験を用いる一方向ＡＮＯＶＡを使用して、データを分析した、＊＊＊Ｐ≦０．００１。
【図５】非修飾ＰＨＸまたはＰＨＸ−ＮＨ２の存在または非存在におけるＣＳＶでの感染の７２時間後のＣＨＳＥ−２１４細胞の細胞変性効果を示す図である。ＣＨＳＥ−２１４細胞を７２時間の間、ＣＳＶ、０．０５ｎｇ／ｍＬの非修飾ＰＨＸとのＣＳＶ、または０．０５ｎｇ／ｍＬのＰＨＸ−ＮＨ２とのＣＳＶで処置した。ＣＨＳＥ−２１４細胞を次いで固定し、染色し、合胞体／総面積（＝％合胞体）によって覆われている面積を定量化した。
【図６】ＲＴＧ−２細胞によるＣｙ５．５標識化ＰＨＸ粒子の内部移行を示す図である。Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンナノ粒子とともにインキュベートされたＲＴＧ−２細胞の蛍光共焦点画像。ＲＴＧ細胞を２時間または２０時間の間、ＰＢＳ単独中で処置した（未処置対照細胞）または細胞をＰＨＸ−ＣＹ５で処置した。
【図７】未処置ヌードＣＤ−１マウスにおけるｉ．ｖ．注射後３０分および２４時間でエクスビボにて画像化された臓器における蛍光シグナルの定量化を示す図である。平均蛍光濃度データは、肝臓および腎臓に加えて、高いシグナルが肺および心臓においても検出され得ることを示唆している。３０分での蛍光濃度は２４時間よりも高い。走査前データは、Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンを注射されていないマウスについての蛍光濃度データ（即ち、バックグラウンド自己蛍光）を示している。データは平均＋／−ＳＤとして示されている。
【図８】未処置ヌードＣＤ−１マウスにおけるＣｙ５．５−フィトグリコーゲンのｉ．ｖ．注射後３０分および２４時間でエクスビボにて画像化された脳における蛍光シグナルの定量化を示す図である。データは、走査前（自己蛍光レベル）と比較して、Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンから、脳において測定可能なシグナルがあることを示している。シグナルは３０分で最も高く、２４時間で時間をかけてゆっくり下がる。
【図９】揺動方法を使用する、ＣＨＳＥ−２１４細胞におけるＣＳＶ生成に対するＰＨＸ−ＮＨ２効果の定量化を示す図である。ＰＨＸ−ＮＨ２は、ＣＳＶ単独よりもＣＳＶ力価の９４３．９６％増加（ＳＥＭ＝４３．９７）を引き起こした。（ｐ＞０．０５）。
【図１０】２つの処置、揺動方法および前処置方法を使用する、コイ丘疹性上皮腫（ＥＰＣ）細胞におけるＶＨＳＶ−ＩＶｂ生成に対するＰＨＸ−ＮＨ２効果の定量化を示す図である。前処置方法で、ＰＨＸ−ＮＨ２は、ＶＨＳＶ−ＩＶｂ単独よりもＶＨＳＶ−ＩＶｂ力価の１４７．９６％増加（ＳＥＭ＝１２５．２）を引き起こした。揺動方法で、ＰＨＸ−ＮＨ２は、ＶＨＳＶ−ＩＶｂ力価を２６％（ＳＥＭ＝２５．８８％）減少させた。（ｐ＜０．０５）。
【図１１】前処置方法を使用する、ＣＨＳＥ−２１４細胞における伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）生成に対するＰＨＸ−ＮＨ２効果の定量化を示す図である。ＰＨＸ−ＮＨ２は、ＩＰＮＶ単独よりもＩＰＮＶ力価の４．７２％増加（ＳＥＭ＝１．９９）を引き起こした。（ｐ＝０．６２）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書で使用される場合、「免疫療法」は、免疫応答を誘発、増強または抑制することによって疾患を治療または予防することを指す。免疫応答を導出または増幅するように設計された免疫療法は、活性化免疫療法と称されることがあり、一方、低減または抑制するように設計された免疫療法は、抑制免疫療法と称される。免疫モジュレーターは、免疫療法において使用される活性薬剤を指すために、本明細書において使用される。免疫抑制薬は、抑制免疫療法において使用される免疫モジュレーターを指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、必要な投与量および特定の時間期間の間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。薬理学的薬剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および重量、ならびに個体における所望の応答を導出するための薬理学的薬剤の能力などの因子に従って変動し得る。治療有効量は、治療的に有益な効果が薬理学的薬剤の任意の毒性または有害な効果を上回るものでもある。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、免疫療法を与えられている動物、一実施形態において哺乳動物、一実施形態においてヒト患者を指す。本明細書で使用される場合、「治療」およびその文法的変化は、免疫応答を抑制するために本発明の化合物または組成物を投与することを指す。この治療は、疾患もしくは状態の変更もしくは改善を実現することであってよく、これにはその１つもしくは複数の症状を軽減することを含むことができ、または使用は、疾患もしくは状態を予防するための予防であり得る。治療は、疾患または状態の過程を変更するために、規則的な間隔でまたは疾患もしくは状態の発症より前に、複数用量の投与を必要とすることがある。
【００２８】
本開示は、免疫抑制における使用のためのグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子に関する。例えば、該ナノ粒子は、臓器移植において使用することができる。
【００２９】
本開示は、免疫療法における使用のためのグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む医薬および生体医用組成物に関する。
【００３０】
本開示は、ワクチンの製造における使用のためのグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子に関する。
【００３１】
本開示は、ウイルスベクターベースの遺伝子治療およびグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を含む組合せ治療に関する。
【００３２】
一実施形態において、脊椎動物におけるＩ型インターフェロン応答を抑制できる化合物および組成物が提供される。先天性免疫応答は脊椎動物間で高度に保存されるので、実施例の所見は、ヒトを含めて他の動物に拡大することができる。本明細書に記載されている化合物および組成物のＩＦＮ抑制能力は、以下に限定されることなく、敗血症性ショックの治療および遺伝子治療のためのアデノウイルスとの組合せにおける治療を含めて、多数の潜在的な治療的使用を有する。
【００３３】
フィトグリコーゲンは、１１〜１２の平均鎖長を有するα−Ｄグルコース鎖の分子で構成されており、１→４連結であるとともに分岐点は１→６で生じ、約６％から約１３％の分岐度である。一実施形態において、フィトグリコーゲンは、天然供給源から誘導されるフィトグリコーゲンおよび合成フィトグリコーゲンの両方を含む。本明細書で使用される場合、「合成フィトグリコーゲン」という用語は、植物誘導材料、例えばデンプンを含む基質上の酵素的プロセスを使用して調製されたグリコーゲン様生成物を含む。
【００３４】
グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンを生成するための大部分の公知の方法および大部分の市販供給源の産出物は、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲン粒子の両方を含む高多分散性生成物、ならびにグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンの他の生成物および分解生成物である。
【００３５】
一実施形態において、単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子が使用されている。好ましい実施形態において、フィトグリコーゲンナノ粒子が使用されている。さらに好ましい実施形態において、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子が使用されている。一実施形態において、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子は、Ｍｉｒｅｘｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃによって製造されたＰｈｙｔｏＳｐｈｅｒｉｘ（商標）である。
【００３６】
図１に示されている通り、各フィトグリコーゲン／グリコーゲン粒子は、非常に高い分子量（最大１０７Ｄａまで）を特徴とする高分岐グルコースホモポリマーで作製された単一分子である。球状のものは、出発材料および濾過工程を変えることによって、直径が３０から１５０ｎｍの範囲の異なるサイズで製造することができる。フィトグリコーゲン／グリコーゲン粒子上の表面基の高密度は、フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子の高濃度での水溶液のための水中における速い溶解、低い粘度および剪断減粘効果など、フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子の様々な独特の特性をもたらす。これは、匹敵する分子量の線状低分岐多糖類の高い粘度および難溶性と対照的である。さらに、それは、例えば水またはＤＭＳＯにおける高度濃縮（最大３０％まで）安定分散液の製剤化を可能にする。
【００３７】
一実施形態において、フィトグリコーゲンは、本明細書に記載されている方法に従って製造された単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を指す。記載されている方法は、各々が単一のフィトグリコーゲン分子である実質的に球状のナノ粒子の生成を可能にする。
【００３８】
本明細書において教示されている通りのナノ粒子は、それらを免疫抑制医薬組成物における使用に特に好適な多数の特性を有する。
【００３９】
これらのフィトグリコーゲンナノ粒子は非毒性であり、公知のアレルゲン性を有さず、人体のグリコーゲン分解酵素（例えば、アミラーゼおよびホスホリラーゼ）によって分解することができる。酵素分解の生成物は、グルコースの非毒性分子である。
【００４０】
グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、一般に光安定性であり、広範囲のｐＨ、電解質、例えば塩濃度にわたって安定である。
【００４１】
さらに、多くの現存の薬物は身体から速やかに排出されて、投与量の増加の必要性に至る。フィトグリコーゲンおよびグリコーゲンナノ粒子のコンパクトな球状の性質は、効果的な細胞取込みと関連し、一方、グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンの高分岐の性質は、ゆっくりとした酵素分解と関連する。さらに、高分子量（１０６〜１０７Ｄａ）は、より長い血管内保持時間と関連すると考えられる。
【００４２】
グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、デンプンと比較して、よりゆっくりとしたインビボ速度の消化に基づく糖尿病薬を対象とした組成物において特別な有用性を有することができる。
【００４３】
フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子は、医薬および生体医用用途において使用される材料に対する多数の必要条件、すなわち、異なる組織における予測可能な体内分布および関連した薬物動態；親水性；生分解性；ならびに非毒性に取り組む特性、を有する。
【００４４】
実施例において実証されている通り、本発明者らは、本明細書において提供されている通りの免疫抑制化合物が、異なる型の細胞によって細胞内に蓄積され得ることを見出した。
【００４５】
本出願人に譲渡されているとともにこの開示が参照によりそれ全体で組み込まれる米国特許出願公開第２０１００２７２６３９号明細書は、細菌および甲殻類のバイオマスからグリコーゲンナノ粒子の生成のためのプロセスを提供する。開示されているプロセスは、機械的または化学処理による細胞崩解；遠心分離による不溶性細胞構成成分の分離；酵素処理と、それに続く、粗多糖類、脂質およびリポ多糖類（ＬＰＳ）を含有する抽出物を生成する透析または代替としてフェノール−水抽出による、細胞溶解物からのタンパク質および核酸の排出；不溶性ＬＰＳ生成物の沈殿をもたらす、弱酸加水分解または多価カチオンの塩を用いる処理によるＬＰＳの排出；ならびに限界濾過および／またはサイズ排除クロマトグラフィーによるグリコーゲン富化画分の精製；好適な有機溶媒を用いるグリコーゲンの沈殿、または濃縮グリコーゲン溶液は限界濾過によってもしくは超遠心分離によって得ることができる；ならびにグリコーゲンの粉末を生成するための凍結乾燥の工程を、一般に含む。細菌バイオマスから生成されたグリコーゲンナノ粒子は、ＭＷｔ  ５．３〜１２．７×１０６Ｄａを特徴とし、直径が３５〜４０ｎｍの粒子サイズを有し、単分散であった。
【００４６】
フィトグリコーゲンの単分散組成物を生成する方法は、本出願人に譲渡されているとともにこの開示が参照によりそれ全体で組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１４／１７２７８６号パンフレット下で公表された「Ｐｈｙｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された国際特許出願に記載されている。一実施形態において、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を生成する記載の方法は以下を含む：ａ．約０から約５０℃の間の温度で水中に崩解フィトグリコーゲン含有植物材料を浸漬する工程；ｂ．工程（ａ．）の生成物を固体−液体分離にかけることで、水性抽出物を得る工程；ｃ．工程（ｂ．）の水性抽出物を、約０．０５μｍから約０．１５μｍの間の最大平均細孔サイズを有するマイクロ濾過材料に通過させる工程；およびｄ．工程ｃ．からの濾液を限界濾過にかけ、約３００ｋＤａ未満、一実施形態において約５００ｋＤａ未満の分子量を有する不純物を除去して、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を含む水性組成物を得る工程。該方法の一実施形態において、フィトグリコーゲン含有植物材料は、コーン、イネ、オオムギ、ソルガムまたはその混合物から選択される穀類である。一実施形態において、工程ｃ．は、工程（ｂ．）の水性抽出物を、（ｃ．１）約１０μｍから約４０μｍの間の最大平均細孔サイズを有する第１のマイクロ濾過材料；（ｃ．２）約０．５μｍから約２．０μｍの間の最大平均細孔サイズを有する第２のマイクロ濾過材料、および（ｃ．３）約０．０５から０．１５μｍの間の最大平均細孔サイズを有する第３のマイクロ濾過材料に通過させる工程を含む。該方法は、単分散フィトグリコーゲンナノ粒子を含む水性組成物を、アミロスクロース、グリコシルトランスフェラーゼ、分岐酵素またはその任意の組合せを使用する酵素処理にかける工程（ｅ．）をさらに含むことができる。該方法は、フィトグリコーゲン材料を分解する化学処理、酵素処理またはサーモ処理の使用を回避する。水性組成物は、さらに乾燥させることができる。
【００４７】
一実施形態において、該組成物は、スイートコーン（トウモロコシ変種サッカラータ（Zea mays var.saccharata）およびトウモロコシ変種ルゴサ（Zea mays var.rugosa））から得られる。一実施形態において、スイートコーンは、標準（ｓｕ）型または糖増強（ｓｅ）型である。一実施形態において、該組成物は、スイートコーンのデント段階またはミルク段階の穀粒から得られる。動物源または細菌源からのグリコーゲンとは異なり、フィトグリコーゲンの使用は、プリオンまたはエンドトキシンでの汚染のリスクを低減し、これは、これらの他の供給源と関連し得る。
【００４８】
実施例１においておよび「Ｐｈｙｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された国際特許出願において詳述されている通りにフィトグリコーゲンナノ粒子を生成する方法は、医薬グレード条件下での調製に適している。
【００４９】
ナノ粒子の組成物の多分散性指数（ＰＤＩ）は、動的光散乱（ＤＬＳ）技法によって決定することができ、この実施形態において、ＰＤＩは、平均直径に対する標準偏差の比の平方として決定される（ＰＤＩ＝（σ／ｄ）２）。ＰＤＩは、ポリマーの分子量の分布を介して表すこともでき、この実施形態において、Ｍｎに対するＭｗの比として定義され、ここで、Ｍｗは重量平均モル質量であり、Ｍｎは数平均モル質量である（以降、このＰＤＩ測定は、ＰＤＩ＊と称される）。第１の場合において、単分散材料はゼロ（０．０）のＰＤＩを有し、第２の場合において、ＰＤＩ＊は１．０である。
【００５０】
一実施形態において、単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む、それから本質的になるまたはそれからなる医薬組成物が提供される。好適には、該ナノ粒子は、さらに下記で考察されている通りに官能化、特にカチオン化される。一実施形態において、医薬組成物は、動的光散乱によって測定される場合に約０．３未満、約０．２未満、約０．１５未満、約０．１０未満または０．０５未満のＰＤＩを有する単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。一実施形態において、医薬組成物は、ＳＥＣ  ＭＡＬＳによって測定される場合に約１．３未満、約１．２未満、約１．１５未満、約１．１０未満または１．０５未満のＰＤＩ＊を有する単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。
【００５１】
一実施形態において、医薬組成物は、約３０ｎｍから約１５０ｎｍの間の平均粒子径を有する単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。一実施形態において、医薬組成物は、約６０ｎｍから約１１０ｎｍの平均粒子径を有する単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の組成物を含む、それから本質的になるまたはそれからなる。他の実施形態において、約４０から約１４０ｎｍ、約５０ｎｍから約１３０ｎｍ、約６０ｎｍから約１２０ｎｍ、約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、約８０ｎｍから約１００ｎｍの平均粒子径を有するナノ粒子を含む、それから本質的になるまたはそれからなる組成物が提供される。
【００５２】
フィトグリコーゲンおよびグリコーゲンナノ粒子の化学修飾
グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子に特定の特性を付与するため、それらは、炭水化物化学について共通の多数の方法を介して化学的に修飾することができる。
【００５３】
したがって、一実施形態において、該ナノ粒子は修飾される。結果として得られた生成物は、本明細書において相互交換可能に、官能化または修飾されたナノ粒子または誘導体と称される。官能化は、ナノ粒子の表面で、または粒子の表面および内部の両方で実施することができるが、単一分岐ホモポリマーとしてのグリコーゲンまたはフィトグリコーゲン分子の構造は維持される。一実施形態において、官能化は、ナノ粒子の表面で実施される。当業者によって理解される通り、化学修飾は、非毒性であるとともにヒトの消費にとって一般に安全であるべきである。
【００５４】
本発明の一部の実施形態において、グリコーゲン／フィトグリコーゲンの化学的特徴を、その親水性の、わずかに負に電荷された未変性状態から、正に荷電された状態または部分的にもしくは高度に疎水性である状態に変化させることは有利である。J.F Robyt, Essentials of Carbohydrate Chemistry, Springer, 1998；およびM. Smith, and J. March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure Advanced Organic Chemistry, Wiley, 2007は、多糖類の化学的加工のある特定の例を提供している。
【００５５】
該ナノ粒子は、直接的に官能化されるか、または１つもしくは複数の中間体リンカーもしくはスペーサーが使用され得て間接的に官能化されるかの、いずれであってもよい。該ナノ粒子は、１つまたは１つ超の官能化工程、例えば２つ以上の官能化工程にかけることができる。
【００５６】
様々な誘導体は、グリコーゲン／フィトグリコーゲンのヒドロキシル基の化学的官能化によって生成することができる。こうした官能基としては、以下に限定されないが、求核基および求電子基、ならびに酸性基および塩基性基、例えば、カルボニル基、アミン基、チオール基、カルボキシル基、およびヒドロカルビル基、例えばアルキル基、ビニル基およびアリル基が挙げられる。
【００５７】
一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、少なくとも陽性表面電荷を有するように修飾される（カチオン化される）。一実施形態において、該ナノ粒子は、アミン（ＮＨ２）基によって修飾される。
【００５８】
好適には、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、第１級、第２級、第３級または第４級のアミノ基であってよいアミノ基で修飾される。
【００５９】
一実施形態において、官能化ナノ粒子は、短鎖第４級アンモニウム化合物で修飾されている。短鎖第４級アンモニウム化合物は、非置換であるまたは１つもしくは複数のＮ原子、Ｏ原子、Ｓ原子もしくはハロゲン原子で置換されている、１個から１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルキル部分を含む。
【００６０】
ある特定の実施形態において、２つ以上の異なる化学化合物を使用して、多官能性誘導体を生成する。
【００６１】
グルコースサブユニット上の第１級ヒドロキシル基の反応性（水性環境における）は低い。そうであっても、エポキシド、無水物またはアルキルハロゲン化物との反応は可能であり、対応するエーテルまたはエステル連結を形成する。エポキシド官能性基または無水物官能性基を有する水溶性化学物質は、塩基性ｐＨ（例えば８〜１１）でグリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子と（適切な触媒の存在下にて）反応する。グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子の安定性を維持するため、ｐＨは、好ましくは８から１０の間、最適には８から９の間である。ヒドロキシル反応性はこうした条件において低く、著しい官能化を得るのに著しい過剰の反応性化合物（反応物）が必要であり得る。水性環境における誘導体化がしばしば好ましいが、一部の反応（例えばアルキルハロゲン化物との）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはピリジンなどの有機溶媒中で最も良好に行われる。当分野の技術者に明らかである通り、相対的に温和な条件で低毒性および反応性を有する水溶性化合物が特に好適である。
【００６２】
例として、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンのヒドロキシル基を活性化するための最も単純な手法は、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４および／またはＣ−６の位置でグルコースヒドロキシル基の選択的酸化によるカルボニル基の導入である。ペルサルフェート、ペリオデート（例えば、過ヨウ素酸カリウム）、臭素、無水酢酸、（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシル（ＴＥＭＰＯ）、デス−マーチンペルヨージナンなど、用いることができる幅広い酸化還元開始剤がある。
【００６３】
カルボニル基で官能化されたグリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、第１級または第２級アミン基を保有する化合物に対して易反応性である。これは、還元剤例えば、水素化ホウ素ナトリウム（式２）を用いてアミンにさらに還元することができるイミン形成（式１）をもたらす。この還元工程は、イミン中間体よりも安定であるアミノ生成物を提供し、ヒドロキシル基における未反応カルボニルも変換する。カルボニルの排出は、非標的性分子（例えば、血漿タンパク質）との誘導体化ナノ粒子の非特異的相互作用の可能性を有意に低減する。
（式１）Ｐ／Ｇ  ＮＡＮＯ−ＣＨ＝Ｏ＋Ｈ２Ｎ−Ｒ  →  Ｐ／Ｇ  ＮＡＮＯ−ＣＨ＝ＮＨ−Ｒ＋Ｈ２Ｏ
【００６４】
【化１】
2019514963.tif 000003
【００６５】
カルボニル化合物とアミノ化合物との間の反応、ならびに還元工程は、同じ反応混合物に導入される好適な還元剤を用いて、１つの容器において同時に行うことができる。この反応は、直接還元的アミノ化として公知である。ここで、カルボニル基（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム）の存在下でイミンを選択的に還元する任意の還元剤が使用され得る。
【００６６】
カルボニル官能化ナノ粒子からのアミノ官能化ナノ粒子の調製のため、任意のアンモニウム塩または第１級もしくは第２級アミン含有化合物が使用され得る（例えば、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ヒドラジン、エチレンジアミンまたはヘキサンジアミン）。この反応は、水または水性極性有機溶媒（例えば、エチルアルコール、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ）中で行うことができる。
【００６７】
ナノ粒子の還元的アミノ化は、以下の２つの工程プロセスによって達成することもできる。第１の工程は、アリル化、即ち、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）の存在下で臭化アリルとの反応によって、ヒドロキシルをアリル基に変換することである。第２の工程において、アリル基は、二官能性アミノチオール化合物（例えば、アミノエタンチオール）と反応する。
【００６８】
アミノ官能化ナノ粒子は、さらなる修飾に適している。アミノ基は、カルボニル化合物（アルデヒドおよびケトン）、カルボン酸およびそれらの誘導体（例えば、塩化アシル、エステル）、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリドなどに対して反応性がある。
【００６９】
置換度は、コンジュゲートされるべき分子の分子量および特性（電荷、疎水性など）に依存する。置換度は、誘導体化されたグルコース単位の％として表される。例えば、薬物が１００Ｄａの分子量を有するとともに置換度が５０％ならば、１ｇのフィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子は０．２８ｇの薬物を担持する。小分子（＜１００Ｄａ）について、置換度＞３０％が一般に達成されて、メチル基について１００％も高くなった。より大きい分子（これは、該粒子の細孔構造を貫通することができない）は、フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子の表面だけでコンジュゲートさせることができ、置換度はより低く、一般に０．１〜２．０％である。
【００７０】
修飾ナノ粒子は、いくつか名前を挙げると生体分子、小分子、治療剤、薬学的に活性部分、巨大分子、診断用標識、ならびに上記の様々な組合せから選択される１種または複数の化合物に、さらにコンジュゲートさせることができる。ナノ粒子は、葉酸、抗体、アプタマー、タンパク質、リポタンパク質、ホルモン、荷電分子、多糖類および低分子量リガンドなど、特定の組織標的性分子でさらに修飾することができる。２種以上の異なる化学化合物を使用して、多官能性誘導体を生成することができる。例えば、１種の化学化合物は、抗体およびアプタマーなどの特異的結合性生体分子のリストから選択することができ、一方、第２の修飾剤は、診断用標識または治療薬のリストから選択される。
【００７１】
修飾グリコーゲンもしくはフィトグリコーゲンナノ粒子のアミン基または非修飾ナノ粒子のヒドロキシル基に結合できる官能基を保有する化学化合物は、官能化フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子に直接付着させることができる。しかしながら、一部の用途について、化学化合物は、ポリマースペーサーまたは「リンカー」を介して付着させることができる。これらは、アミノ、カルボニル、スルフヒドリル、スクシミジル、マレイミジル、およびイソシアネート、（例えばジアミノヘキサン）、エチレングリコビス（スルホスクシンイミジルスクシネート（sulfosuccimidylsuccinate））、ジスルホスクシミジルタルタレート、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（sulfosuccimidylpropionate））、アミノエタンチオールなどの官能基を保有するホモまたはヘテロ二官能性リンカーであってよい。
【００７２】
フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子にコンジュゲートされている分子の位置は、分子の分子量に依存する。小分子（ＭＷ＜１００Ｄａ）は、粒子構造に侵入することができ、そのため、粒子表面内および粒子表面に位置する。ＭＷ＞１００Ｄａを有する分子は、粒子表面に主に位置する。
【００７３】
フィトグリコーゲンナノ粒子が内部移行される場合、コンジュゲート分子は、細胞ヒドロラーゼによって放出される。放出の速度は、小分子によるフィトグリコーゲン誘導体化、例えば、メチル化、ヒドロキシプロピル化の程度によって制御することができる（これは、多糖類鎖に対するヒドロラーゼの親和性、およびそのため加水分解の速度に影響する）。
【００７４】
一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子はカチオン化されており、一実施形態においてアミン修飾されているが、別の分子にさらにコンジュゲートされていない。
【００７５】
一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子はカチオン化されており、一実施形態においてアミン修飾されおり、疎水性修飾剤、薬物動態修飾剤、生物活性修飾剤または検出可能修飾剤から選択される薬学的に有用な部分にさらにコンジュゲートされている。
【００７６】
一実施形態において、実質的に単分散グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子；および薬学的に許容される担体を含む免疫抑制組成物が提供される。一実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、対象における免疫応答を誘発、増強または抑制する少なくとも１つの分子に結合されている。一実施形態において、該分子は免疫抑制薬である。
【００７７】
本明細書に記載されている通りの化合物および組成物は、免疫抑制薬として有用である。
【００７８】
実施例において実証されている通り、カチオン化されたグリコーゲン／フィトグリコーゲンナノ粒子、および特にアミン修飾されたナノ粒子は、１型ＩＦＮ依存性先天性抗ウイルス応答のサプレッサーとして作用する。
【００７９】
Ｉ型インターフェロン系は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、それらの受容体を結合するＩＦＮによってトリガーされるシグナル伝達経路、これらの経路によって活性化される転写因子、発現が転写因子活性化の結果として変更される遺伝子（インターフェロン活性化遺伝子またはＩＳＧと呼ばれる）、および最終的に細胞機能の変化からなる。ＩＦＮの発見に至った機能は、感染細胞ならびに隣接している非感染細胞において「抗ウイルス状態」を確立するそれらの能力であった。ＩＦＮは、２つのクラス、Ｉ型およびＩＩ型に分けられる。古典的に、Ｉ型ＩＦＮは先天性抗ウイルス機序に関与し、他方、ＩＩ型ＩＦＮは適応免疫を促進する。Ｉ型インターフェロンは、あらゆる段階のウイルス複製を阻害することが示された。これは、ウイルスの侵入およびアンコーティング、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳の開始、成熟、集合および放出を含む。
【００８０】
Ｉ型ＩＦＮの抗ウイルス効果は、全ての有核細胞の表面上で見出されるそれの同族受容体へのインターフェロンの結合によって開始される。哺乳動物におけるＩＦＮａ／ｂシグナル伝達経路は、５つの主要な工程を伴う。ＩＦＮ結合は、ＩＦＮ受容体の二量体化を引き起こす（１）。この受容体会合は、ヤヌスキナーゼ、Ｊａｋ１およびＴｙｋ２を活性化することによって、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ）／シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）経路を介してシグナル伝達をトリガーする（２）。これらのチロシン−キナーゼは、ＩＦＮ受容体と関連するＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２をリン酸化して、それらの活性化および二量体形成に至る（３）。活性化ＳＴＡＴ１〜２ヘテロ二量体は核へ転位し（４）、ｐ４８（ＩＲＦ−９）と一体になることで、インターフェロン活性化遺伝子（５；ＩＳＧ）のプロモーター領域におけるインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）配列に結合する転写因子ＩＳＧＦ３を形成する（Ｓｔａｒｋら、１９９８）。Ｉ型インターフェロンは、一般に、同じ細胞型内に同じ遺伝子セットを誘発する。これらのＩＳＧこそが、標的細胞中に蓄積して「抗ウイルス状態」を確立する。
【００８１】
Ｉ型インターフェロンの主目的は、ＩＳＧの発現を刺激することであり、これが順じて、非感染細胞内で抗ウイルス状態を与える。インターフェロン誘発因子は、直接的にウイルス複製を制限するかまたは細胞周期および細胞死を調節するかのいずれかの傾向がある。一部のＩＳＧによって刺激されるプログラム細胞死またはアポトーシスは、ウイルス複製を制御する戦略と考えられる。多くのＩＦＮ刺激タンパク質は、ｄｓＲＮＡに曝露されるまで不活性形態で発現される酵素であり、細胞が感染するまで休止状態のままであるとともにそのため無害であるままである抗ウイルス状態を確実にする。
【００８２】
先天性免疫は脊椎動物間で高度に保存される。実施例に関連して、本発明者らは、非修飾またはカチオン化形態の両方におけるおよび特にアミン修飾された場合、グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子が、脊椎動物細胞においてＩ型インターフェロン応答を抑制できることを実証した。したがって、Ｉ型インターフェロン応答を抑制するための免疫抑制化合物および組成物が提供される。
【００８３】
自己免疫疾患が遺伝性素因と関連し得る一方で、自己免疫は、ウイルス感染を含めた環境因子による刺激後にトリガーされ得るだけである。ＩＦＮ依存性抗ウイルス応答の免疫抑制薬は、さらに下記で詳述されている通り多数の疾患または状態の治療または予防において有用であり得る。
【００８４】
敗血症は、感染に対する身体応答がそれ自体の組織および臓器を損傷させる場合に起こる生命を脅かす状態である。重症敗血症は、集中治療室（ＩＣＵ）に入れられる患者において最も共通の診断の１つであり、合衆国において＞７５０，０００人の患者／毎年に影響し、１年当たり＞１７０億ドルのコストがかかる。敗血症は、静脈内流体および抗生物質で通常治療されるが、しかしながら、患者における敗血症症状を低減するためにサイトカイン生成を阻止するのに使用するための承認薬物はない。敗血症のための追加の治療選択肢の必要性が依然としてある。一実施形態において、本明細書に記載されている通りの化合物または組成物を使用してＩ型インターフェロン生成を阻止することを含む、敗血症を治療する新規な方法が提供される。一実施形態において、本明細書に記載されている通りの化合物および組成物は、全身サイトカイン生成を低減するために重症敗血症患者に全身的に導入される。
【００８５】
一実施形態において、免疫抑制組成物は、移植された臓器または組織の拒絶を予防することに使用される。
【００８６】
一実施形態において、免疫抑制組成物は、炎症性疾患、例えば過敏性腸障害の治療において使用される。
【００８７】
別の態様において、本明細書に記載されている免疫抑制化合物および組成物は、自己免疫疾患を治療することに使用される。各種実施形態において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性ループスエリテマトーデス、サルコイドーシス、巣状分節性糸球体硬化症、クローン病、ベーチェット病、天疱瘡および潰瘍性大腸炎である。
【００８８】
別の実施形態において、本明細書に記載されている化合物および組成物は、疼痛、即ち炎症性疼痛の治療に使用される。
【００８９】
単独で使用されるのは別として、本明細書に記載されている通りの免疫モジュレーターは、抗微生物剤もしくは抗がん剤、ワクチンまたは他の免疫モジュレーターなど、他の治療薬との組合せにおいて使用することができる。
【００９０】
一実施形態において、本明細書に記載されている免疫抑制化合物および組成物は、トランスフェクション製剤、および特別な実施形態においてウイルスベクターを使用するトランスフェクションとの組合せにおいて使用することができる。一実施形態において、本発明の化合物および組成物は、遺伝子治療と同時にまたはその直前もしくは直後に投与することができる。ウイルスベクターベースの遺伝子治療は、ウイルスに対する免疫反応を予防するための免疫抑制治療に先行するまたは後続することができる。例えば、アリポジーン・チパルボベック（商品名Ｇｌｙｂｅｒａの下で市場に出ている）は、リポタンパク質リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）の治療のために欧州医薬品庁によって承認された。Ｇｌｙｂｅｒａは、アデノ随伴ウイルスベクターを使用し、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子のコピーを筋細胞に送達する。注射によって投与される治療の前の３日間および注射後の１２週間、患者は免疫抑制治療を投与される。
【００９１】
したがって、一実施形態において、ウイルスベクターベースの遺伝子治療と本明細書に記載されている通りのグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子との組合せ治療が提供される。
【００９２】
別の態様において、本明細書に記載されている免疫抑制化合物および組成物は、ワクチンの製造において使用される。ワクチン生成は、いくつかの段階を伴い、その第１は、抗原それ自体の産生である。ウイルスワクチンの場合において、ウイルスは、培養細胞感染させることによって産生させる。こうした手順からの収量は、本明細書に記載されているような、ウイルスと闘う傾向がある細胞の先天性免疫系および／または応答により、典型的に低い。細胞の免疫系および／または応答を抑制することによって、ウイルスは、より簡便に複製することができ、収量の増加をもたらし、および／またはより高いウイルス力価の生成を可能にする。
【００９３】
したがって、一実施形態において、ワクチンを製造するための、特に、ウイルスおよびウイルス抗原の成長および培養を増加または改善することによってウイルスワクチンの製造を増強するための、本明細書に記載されている免疫抑制化合物および組成物の使用が提供される。例えば、好ましい一実施形態において、本明細書に記載されているグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、ＣＨＳＥ−２１４（マスノスケ胚）細胞株を使用する伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）ワクチンの製造において有用である。
【００９４】
一実施形態において、ウイルスのための供給源として細胞株を使用するワクチン開発における制限因子は、ウイルス生成を低減するＩＦＮ経路である。低レベル（例えば、０．００５ｎｇ／ｍＬ）でのＰＨＸ−ＮＨ２の添加で、ウイルス力価は、ＰＨＸ−ＮＨ２の存在なく感染する細胞と比較して増加する。
【００９５】
本明細書に記載されているグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を使用して増強することができるワクチン製造において使用されるウイルスおよび細胞株の例を、表１にリストする。
【００９６】
【表１−１】
2019514963.tif 000004
【００９７】
【表１−２】
2019514963.tif 000005
【００９８】
製剤化および投与
本発明のナノ粒子は、化合物の他の分子、分子構造または混合物と添加混合、カプセル化またはそうでなければ一体化することもでき、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」は、単独でもまたは生物学的に活性なもしくは診断的に有用な分子にコンジュゲートされていても、官能化されたグリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルであってよい。賦形剤は、液体または固体であってよく、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子および所与の医薬組成物の他の構成成分と組み合わせる場合に、所望のバルク、稠度などを提供するように、予定されている投与方式を念頭において選択される。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの１つまたは複数、ならびにその組合せが挙げられる。薬学的に許容される担体は、薬理学的薬剤の有効期間または有効性を増強する少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、保存料または緩衝液をさらに含むことができる。
【００９９】
好都合にも単位剤形で存在することができる本発明の医薬製剤は、医薬産業において周知の従来技法に従って調製することができる。こうした技法は、活性成分を医薬担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）と一体化させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体、微粉化固体担体または両方と均一および密接に一体化させること、および次いで必要ならば、生成物を成形（例えば、送達のための特定の粒子サイズに成形）することによって調製される。
【０１００】
医薬組成物を製剤化する目的のため、本明細書において教示されている通りに調製される単分散グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、乾燥粒子／粉末形態で提供することができ、または例えば水溶液中に溶解させることができる。低い粘度が所望される場合、グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、好適には、製剤中に最大約２５％ｗ／ｗまでの濃度で使用することができる。高い粘度が望ましい用途において、グリコーゲンおよびフィトグリコーゲンナノ粒子は、製剤中に約２５％ｗ／ｗを超える濃度で使用することができる。ゲルまたは半固体が望ましい用途において、最大約３５％ｗ／ｗまでの濃度が使用され得る。
【０１０１】
本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかおよび治療されるべき部域に依存して、多数のやり方で投与することができる。前述の一般性を限定することなく、投与経路は、局所的、例えば皮膚へもしくは吸入による、または眼もしくは耳用組成物の形態での投与；経腸的、例えば経口的に（以下に限定されないが、錠剤、カプセルまたは点滴剤の形態を含める）、または坐剤の形態で；あるいは例えば皮下、静脈内、動脈内または筋肉内を含めて非経口であってよい。好適には、敗血症の治療のための化合物および組成物は全身的に投与される。
【０１０２】
一実施形態において、医薬組成物は、経皮送達のための、皮膚への適用のための局所的製剤である。本明細書において開示されている単分散ナノ粒子は、フィルム形成剤として特に有用である。ナノ粒子は単分散であるので、均一な最密フィルムが可能である。該組成物は、低い水分活性を有する安定なフィルムを形成する。したがって、化学的に修飾された場合、それらは、皮膚を横切って生体活性薬を付着および担持するために使用することができる。各種実施形態において、局所的製剤は、ゲル、クリーム、ローションまたは軟膏の形態であり得る。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、インプラントの形態である。好適には、これらのインプラントは生体適合性であり得、それらが細胞、組織またはインビボ機能に対して著しい有害作用を有しないことを意味する。好適には、これらのインプラントは、生体吸収性または生分解性（全体でまたは一部で）であり得る。実施例は、以下に限定されることなく、組織工学用足場を含む。
【０１０４】
別の実施形態において、グリコーゲンまたはフィトグリコーゲンナノ粒子は、局所的（医療）製剤、例えば、ローション、軟膏およびクリームの一部であり得る。
【実施例】
【０１０５】
[実施例１]
スイートコーン穀粒からのフィトグリコーゲンの製造
１ｋｇの凍結スイートコーン穀粒（７５％水分含有量）を２Ｌの脱イオン水と２０℃で混合し、ブレンダーにて３０００ｒｐｍで３分間微粉砕した。マッシュを１２，０００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離した。合わせた上澄み画分を、０．１μｍの孔サイズを有するメンブランフィルターを使用するクロスフロー濾過（ＣＦＦ）にかけた。５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を使用するバッチ透析濾過によって、ならびに室温および６の透析濾過体積で、濾液をさらに精製した。（透析濾過体積は、透析濾過中の操作に導入される総ｍＱ水体積の、残余分体積に対する比である）。
【０１０６】
残余分画分を２．５体積の９５％エタノールと混合し、８，０００×ｇにて１０分間４℃で遠心分離した。残余分を２．５体積の９５％エタノールと混合し、８，０００×ｇにて１０分間４℃で遠心分離した。フィトグリコーゲンを含有するペレットをオーブンにて５０℃で２４時間の間乾燥させ、次いで４５メッシュに製粉した。乾燥フィトグリコーゲンの重量は９７ｇであった。
【０１０７】
動的光散乱（ＤＬＳ）測定によると、生成されたフィトグリコーゲンナノ粒子は、８３．０ｎｍの粒子サイズ直径および０．０８１の多分散性指数を有していた。
【０１０８】
[実施例２]
フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子の修飾。
異なる用途のために合成された化学修飾フィトグリコーゲン／グリコーゲンナノ粒子の例およびそれらの置換度を、表２にリストする。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
フィトグリコーゲンナノ粒子のアミノ化
実施例１に記載されている通りに得られた２００ｍｇのフィトグリコーゲンを２ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解し、２５０ｍｇの乾燥粉末化ＮａＯＨを溶液に添加した。Ｐフィトグリコーゲンを１５分間、塩基性ＤＭＳＯ中で撹拌させておいた後に、１．５ｍＬの２−ブロモエチルアミンヒドロブロミドを添加した。反応を１０分間進行させ、この後、追加の０．５ｍＬのＤＭＳＯを反応バイアルに添加した。反応を次いで４時間の間室温で続けさせた。４時間後、試料を脱イオン水で１０ｍＬに希釈し、この溶液に、２体積のエタノールを添加して、アミノ化ナノ粒子を沈殿させた。エタノール沈殿を合計３回反復した。結果として得られた試料ペレットを分散し、エーテル中で乾燥させ、粉末化最終生成物が得られた。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのピーク積分によって、５．２ｍｏｌ％のグルコース単位をアミノ化した。
【０１１１】
１００ｇのフィトグリコーゲンを水中０．４５ＭのＮａＯＨ溶液５００ｍｌ中に分散し、次いで、２００ｇの２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（９０％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を混合物に添加した。混合物を１２時間の間４０℃で撹拌した。反応が完了した後、過剰量の９５％エチルアルコールを添加して反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を水５００ｍｌ中に分散し０．２ＭのＨＣｌで中和し、９５％アルコールで再び沈殿させた。水沈殿操作においてこの分散液を使用して、生成物を３回洗浄し、次いで、オーブンにて６０℃で１８時間の間乾燥させた。乾燥させた修飾フィトグリコーゲンを２００メッシュ粉末に製粉し、次いで、真空濾過漏斗上のフィルター上に置き、７０％アルコールで２回および９５％アルコールで１回真空下にて洗浄して、カチオン化試薬を除去した。ケーキを５０℃未満で１８時間の間乾燥させた。ＮＭＲ分光法を使用して生成物のＤＳを判定し、１．０７２であることが見出された。
【０１１２】
オクテニルコハク酸無水物修飾フィトグリコーゲン
実施例１に従って生成されたフィトグリコーゲン１００．０ｇを、２Ｌガラス反応容器内の脱イオン水７５０ｍＬ中に分散した。分散液を絶えず撹拌し、３５℃で保持した。３ｍＬのオクテニルコハク酸無水物（ＯＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０℃に加熱し、反応容器中にゆっくり添加した。自動化制御システムを使用して、４％ＮａＯＨ溶液を反応ミックスに添加することによって、ｐＨを８．５に一定に保持した。反応を、絶えず混合することによって３時間の間進行させた。次いで、混合物のｐＨを１ＭのＨＣＩで７．０に調整し、３体積の９５％エタノールと混合し、８，５００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離した。ペレットを水中に再懸濁し、ｐＨを７．０に調整し、溶液を沈殿させ、同じ条件を２回使用して遠心分離した。最終的に、ＯＳＡ修飾フィトグリコーゲンを含有するペレットをオーブンにて５０℃で２４時間の間乾燥させ、次いで４５メッシュに製粉した。ＮＭＲ分光法によって決定された置換度は０．０２４であった。
【０１１３】
[実施例３]
細胞培養物におけるグリコーゲン／フィトグリコーゲンの細胞毒性。
細胞生存能に対するグリコーゲン／フィトグリコーゲンナノ粒子の効果を分析して、粒子の細胞毒性を判定した。冷水を使用してウサギ肝臓、ムール貝およびスイートコーンから、グリコーゲン／フィトグリコーゲンナノ粒子を抽出し、実施例１に記載されている通りに単離した。
【０１１４】
実施例２に記載されている通りにアミノ基（ＮＨ２）、第４級アンモニウム基（Ｑｕａｂ１５１）およびＯＳＡ３でフィトグリコーゲンを官能化することによって、修飾粒子を調製した。
【０１１５】
ニジマス鰓上皮（ＲＴＧ−２）細胞を非修飾および修飾フィトグリコーゲンナノ粒子で３日間処置した。この処置後、培地を除去し、細胞代謝および膜統合性を測定した。細胞生存能の変化を測定するため、２種の蛍光指示染料、アラマーブルー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（図２ａ）およびＣＦＤＡ−ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）（図２ｂ）を使用しており；これらの染料で、細胞代謝および膜統合性をそれぞれ測定する。これらの染料について、より多くの蛍光は、より多くの生細胞を示す。
【０１１６】
任意の処置について、いずれのパラメータの変化も未処置対照細胞と比較して著しくなかった。結果を図２に示す。アッセイのいずれもが、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のフィトグリコーゲンまたはそれの誘導体の存在下での７２時間インキュベーション後、細胞における任意の細胞毒性効果を検出しなかった。
【０１１７】
[実施例４]
先天性免疫遺伝子発現レベルの変化
フィトグリコーゲンナノ粒子（ＰＨＸ−ＮＨ２）のアミン（ＮＨ２）官能化単分散組成物が免疫抑制活性を有しているかどうかを決定するための実験を行った。より具体的には、Ｉ型ＩＦＮ依存性先天性抗ウイルス応答を阻害するための、こうした組成物の能力を調査した。定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣＲによって転写物レベルでの遺伝子発現の変化および細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイを使用することによって抗ウイルス状態の確立の変化を測定することでウイルス誘発性合胞体形成を定量化することによって、このＩＦＮ媒介応答を研究した。こうした組成物がＩＦＮ媒介応答を阻止できるならば、ＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）についての転写物レベルは減少し、ＩＦＮ誘発抗ウイルス状態は損なわれ、したがって、より多くのＣＰＥ（合胞体形成）をもたらす。
【０１１８】
Ｎ．Ｂｏｌｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒｌｏｏ）から得られた３つのサケ科細胞株、ＲＴＧ−２（ニジマス生殖腺起源）、ＲＴｇｉｌｌ  Ｗ−１（ニジマス鰓起源）およびＣＨＳＥ−２１４（マスノスケ胚起源）を、この研究に使用した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）が補充されたリーボビッツＬ−１５培地を用いて、７５ｃｍ２のプラスチック組織培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）中にて２０℃で、ＲＴＧ−２、ＲＴｇｉｌｌ  Ｗ−１およびＣＨＳＥ−２１４を全て日常的に培養した。
【０１１９】
この研究のため、２種の魚類ウイルスを使用した。シロザケレオウイルス（ＣＳＶ）をマスノスケ胚（ＣＨＳＥ−２１４）細胞の単層上で増殖した。コイ丘疹性上皮腫（ＥＰＣ）細胞を使用して、ウイルス性出血性敗血症（ＶＨＳＶ）−ＩＶｂを増殖させた。両ウイルス調製、ウイルス含有培地（５％ＦＢＳを有するＬ−１５）を４〜７日後（完全なＣＰＥが観察された時）に０．４５μｍのフィルターに通して濾過した。短期貯蔵のためにウイルス調製物を−２０℃で、および長期貯蔵のために−８０℃で凍結した。ＥＰＣ細胞上でのＶＨＳＶ−ＩＶｂ調製およびＣＨＳＥ−２１４細胞上でのＣＳＶ調製を滴定することによるＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ方法を使用して、組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）５０／ｍＬ値（５０％組織培養感染用量）を決定した。
【０１２０】
ＰＨＸ−ＮＨ２をウイルスＣＳＶ  １．９９５×１０４、ＰＨＸ−ＮＨ２  ０．５ｎｇ／ｍＬおよびＶＨＳＶ  ２．５×１０５  ＴＣＩＤ５０、ＰＨＸ−ＮＨ２  ０．５ｎｇ／ｍＬおよび０．０５  ｎｇ／ｍＬ；またはＰＢＳ単独（マグネシウムおよびカルシウムなし）と予備混合し、室温で２時間の間揺動した。ＶＨＳＶについて、２時間後、１０％ＦＢＳを有する等体積の２Ｘ  Ｌ−１５を各試料に添加した。ＣＳＶについて、ストック力価が最初にＰＢＳ中で希釈するのに十分高くなかったので、全てのインキュベーションを完全培地中で行い、揺動させた後に等体積の１Ｘ  Ｌ−１５を添加した。ＲＴＧ−２細胞をＣＳＶに２４時間の間感染させ、ＲＴｇｉｌｌ  Ｗ−１細胞をＶＨＳＶに１７度で７２時間の間感染させた。
【０１２１】
製造者の指示に従ってＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ全ＲＮＡミニプレップキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用するＲＮＡ抽出は、オンカラムＤＮａｓｅ  Ｉ消化セット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でＲＮＡを処理することを含む。各反応において、１μｇのＲＮＡ、４μＬのｉＳｃｒｉｐｔおよび最大２０μＬまでのＤＮＡ品質の水を使用するｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して、ｃＤＮＡ合成を行った。ｑＰＣＲ反応の前に、ｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水中で１０分の１に希釈した。
【０１２２】
全てのＰＣＲ反応は以下を含有していた：２μＬの希釈ｃＤＮＡ、２Ｘ  ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、０．２μｍのフォワードプライマー、０．２μＭのリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリー水を１０μＬの総体積まで（ハウスキーピング遺伝子アクチンプライマーは、０．１μＭであった）。ｑＰＣＲプログラムは、９８℃が２分であり、９８℃が５秒、５５℃が１０秒および９５℃が１０秒間の４０回サイクルであった。融解曲線は６５℃から９５℃で完了し、読み取りは５秒毎であった。遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子（βアクチン）に正規化し、未処置対照群を上回る倍率変化として表した。
【０１２３】
非修飾およびアミン官能化単分散フィトグリコーゲンナノ粒子（０．５ｎｇ／ｍＬ）を５％ＦＢＳ  １Ｘ  Ｌ−１５培地中のＣＳＶ（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ  ６．２５×１０４）と予備混合し、室温で２時間の間揺動させた。２時間後、適切な量の５％ＦＢＳ  １Ｘ  Ｌ−１５を徹底的に混合し、各ウェルに添加した。ＣＨＳＥ−２１４を３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種し、２４時間の間２０℃で放置して成長させた。この後、細胞を予備混合ナノ粒子およびＣＳＶで１７℃にて３日間処置した。
【０１２４】
ＣＨＳＥ−２１４を７５μＬ／ウェルの１０％ホルマリンで１０分間固定し、１００μＬ／ウェルのＰＢＳで濯ぎ、７５μＬ／ウェルの１％Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｓｔａｉｎで１０分間染色した。ウェルを次いで、１００μＬ／ウェルのＰＢＳで２回およびＭｉｌｌｉＱ  Ｗａｔｅｒで少なくとも５回洗浄した。Ｑｉ１カメラ付きＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴｉＥ顕微鏡を使用して４Ｘ倍率で、写真を撮った。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ要素ソフトウェアを使用して、合胞体によって覆われた面積および写真の総面積を算出した。％合胞体は、合胞体／総面積＊１００％によって覆われている面積である。ウェル毎に１つの写真を撮り、各写真をウェルの中心で撮り、処置毎に６つのウェルがあった。
【０１２５】
図３から５を参照すると、これらのデータは、ＰＨＸ−ＮＨ２が、２つの魚類細胞株、ＲＴｇｉｌｌ−Ｗ１およびＲＴＧ−２において、それぞれ、２つの水生ウイルス、ＶＨＳＶ−ＩＶｂおよびＣＳＶによって誘発されたＩＳＧ発現を阻止することを示している。それは、未変性ＰＨＸおよびＰＨＸ−ＮＨ２の両方が、ＣＨＳＥ−２１４細胞における全体の抗ウイルス状態を低減しており、それらをＣＳＶ誘発性ＣＰＥ（合胞体形成）に対してより感受性にしていることも示している。このデータは、Ｉ型ＩＦＮ応答に対するＰＨＸの一般の抑制効果を示唆している。
【０１２６】
[実施例５]
ＴＣＰ−１単球のＣｙ５．５−標識化グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子の内部移行。
この研究において使用される粒子への近赤外蛍光染料（Ｃｙ５．５）のコンジュゲーションは、共焦点蛍光顕微鏡法によってナノ粒子取込みの分析を可能にした。Ｃｙ５．５−標識化グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子を、下に記載されている通りに生成した。
【０１２７】
実施例１に従って生成された多糖類ナノ粒子１００ｍｇを、２０ｍＬの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．４中に懸濁させた。対照バイアル（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液を含有する）における温度プローブを用いて、溶液を含有する反応容器をアルミニウム箔で包み、ホットプレート上に３５℃で置いた。１ｍｇのＣｙ５．５−ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ  Ｃｏｒｐ．）を４ｍＬのＤＭＦ中に懸濁させた。１時間の期間中、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステルを１ｍＬのアリコート中に添加した。溶液のｐＨを添加の前後に絶えずチェックして、２ＭのＨＣｌ溶液の添加で８．４に調整した。最終アリコートの後、ＤＭＦ中のＣｙ５．５−ＮＨＳエステルを添加し、ｐＨをモニタリングし、必要に応じて調整した。反応を２時間の間進行させ、さらに、この後、ｐＨを前に記述の通りに２ＭのＨＣｌ溶液で４．０に調整した。
【０１２８】
結果として得られた多糖類ナノ粒子−Ｃｙ５．５コンジュゲートを含有する酸性化溶液に、２体積のエタノールを添加した。この溶液を４℃に冷却し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨て、ペレットを１５ｍＬの脱イオン水中に再懸濁した。２体積のエタノールを再懸濁ペレットに添加し、それを冷却し、前の通りに遠心分離した。捨てた上澄みが清澄および無色になるまで、これを１回さらに反復した。ペレットを最終時に、ホモジナイザーの使用を介して１０ｍＬの無水ジエチルエーテル中に再懸濁した。結果として得られたコンジュゲートを微量熱で蒸発することによって乾固させた。
【０１２９】
ＭＣＰ−１細胞をＣｙ５．５−標識化グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子で、１ｍｇ／ｍｌの濃度にて４℃（陰性対照）および３７℃で、０．５、２、６および２４時間の間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％緩衝ホルマリン溶液中に固定し、再びＰＢＳで洗浄した。次いで、固定細胞をＤＡＰＩ（核）およびＡＦ４８８（細胞膜）で染色した。グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子の内部移行をＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅによって判定した。
【０１３０】
４℃でのインキュベーションは、エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスのプロセスがもはや活性でない場合、ＴＨＰ−１細胞と関連する任意の粒子をもたらさなかった（図６）。このことで、ＴＨＰ−１細胞によるナノ粒子の蓄積が、表面結合によりなかったことが確認された。対照的に、６時間を上回る間の３７℃でのインキュベーションは、細胞質におけるＣｙ５．５−標識化グリコーゲン／フィトグリコーゲン粒子のかなりの蓄積を明らかにした（図６）。しかしながら、０．５〜２時間の時間間隔において、非常に低い取込みがあった。
【０１３１】
[実施例６]
Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンコンジュゲートの注射後の未処置マウスにおける薬物動態（ＰＫ）プロファイル。
Ｃｙ５．５標識化フィトグリコーゲン（０．０８μＭ  Ｃｙ５．５／ｍｇ）を、実施例２に記載されている通りに合成した。
【０１３２】
ヌードＣＤ−１マウス（ｎ＝３）、１８〜２０グラムに、３００ｍｇ／ｋｇマウスの用量でＰＢＳ中に分散されたＣｙ５．５−フィトグリコーゲンを注射した。複数の時間間隔（１５分、１時間、２時間、６時間および２４時間）で、ヘパリン化チューブを使用して、小さな血液試料（５０μｌ）をマウス（顎下静脈）から回収した。サイトフルオリメータープレートリーダーを使用する蛍光によって、これらの時点を分析した。血液中に希釈された公知濃度のＣｙ５．５−Ｐｈｙｔｏｓｐｈｅｒｉｘからなる標準曲線を使用して、ナノ粒子濃度を補間した。
【０１３３】
図７から見ることができる通り、血液中のＣｙ５．５−フィトグリコーゲン濃度は、指数関数的に時間とともに減少し、２４時間までに排出された。排出半減期を２時間であると決定した（算出した）。半減期は、化合物の初期の血中濃度を５０％低減するための、身体によって必要とされる時間期間を指す。
【０１３４】
小動物時間ドメインｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ  ＭＸ２前臨床イメージャを使用して、全ての光学画像化実験を行い、ＡＲＴ  Ｏｐｔｉｘ  Ｏｐｔｉｖｉｅｗ分析ソフトウェア２．０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ）を使用して、画像を分析または蛍光濃度マップとして再構築した。６７０ｎｍのパルスレーザーダイオードを８０ＭＨｚの反復周波数および１２ｐｓ光パルスの時間分解能で、励起のために使用した。蛍光発光を７００ｎｍで、高感受性時間相関単一光子計数システムによって回収し、高速光電子増倍管を介して検出した。
【０１３５】
Ｃｙ５．５標識化フィトグリコーゲン（０．８μＭ  Ｃｙ５．５／ｍｇ）を、実施例２に記載されている通りに合成した。
【０１３６】
未処置動物において、インビボ画像化は、肝臓、肺（全ての時点で）、腎臓（１５分〜６時間）、膀胱（１５分〜６時間）、および脳（１５分〜２時間）におけるＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの強いシグナルを明らかにした（図８）。
【０１３７】
３０分および２４時間でのエクスビボデータで、実際に肺においてＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの有意な取込みがあり、脳においてはそれ程でなかったことが確認された（図８）。脳におけるシグナルは、後期の時点（２４時間）と比較して、より初期の時点（３０分）で最も高かった。Ｃｙ５．５−フィトグリコーゲンナノ粒子はグルコースポリマーであるので、グルコース輸送において非常に活性であることが公知である脳および肺などの臓器は、グルコース輸送体を介してＣｙ５．５−フィトグリコーゲンを蓄積することが可能である。
【０１３８】
インビボ画像化データで、肝臓が主にＣｙ５．５−フィトグリコーゲンの代謝を担っていることが実証された。さらに、肝臓に代謝されて、ナノ粒子は、血流に再侵入するとともに次いで腎系を介して排出され得るより小さいＣｙ５．５標識化グルコース誘導体を生成することが可能である。
【０１３９】
[実施例７]
シロザケレオウイルス（ＣＳＶ）生成、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）−ＩＶｂ生成、および伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）生成に対するフィトグリコーゲンナノ粒子（ＰＨＸ−ＮＨ２）効果。
シロザケレオウイルス（ＣＳＶ）
ＣＨＳＥ−２１４を平板培養する：ＣＨＳＥ−２１４（マスノスケ（Oncorhynchus tshawytscha））を３．２×１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレート中に播種し、処置の前に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を有するリーボビッツＬ−１５培地中で２４時間の間放置して成長させ、細胞再付着を可能にした。細胞を次いで、ＰｈｙｔｏＳｐｈｅｒｉｘ（ＰＨＸ−ＮＨ２）単独で、または混合物の２時間揺動を使用してＣＳＶで処置した。
【０１４０】
２時間の間ＣＳＶおよびＰＨＸ−ＮＨ２を揺動する：以下の混合物を２時間の間揺動させた（Ａ）対照：５％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５を含む２５０μＬの処置培地（ＴＭ）；（Ｂ）ＣＳＶのみ：１５０μＬのＴＭおよび１００μＬのＣＳＶ；ならびに（Ｃ）ＰＨＸ−ＮＨ２とのＣＳＶ：２５μＬの０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＨＸ−ＮＨ２を用いる１２５μＬのＴＭ（０．００５ｎｇ／ｍＬの最終濃度について）および１００μＬのＣＳＶ。最終のＣＳＶ組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）は３．１４×１０４であった。ＰＨＸ−ＮＨ２は、０．００５ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。２時間後、２５０μＬのＴＭをあらゆる微量遠心機チューブに添加し、ピペットによって徹底的に混合した。各微量遠心機チューブから５００μＬを個々のウェルに添加し、１７℃のインキュベーターでおよそ７日間放置してインキュベートさせた。培地を次いで回収し、ＴＣＩＤ５０／ｍＬを下に記載されている通りに算出するまで−２０度で貯蔵した。
【０１４１】
ＣＨＳＥ−２１４を使用するＣＳＶ  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ決定：ＣＨＳＥ−２１４を３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種し、細胞を１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５中で２４時間の間放置して成長させた。細胞を次いで、ウイルス単独の希釈物、または（ＴＭ中１０−１〜１０−１１）を範囲とする希釈物中のウイルス＋ＰＨＸ−ＮＨ２に感染させた。ＴＭ単独を対照ウェルに使用した。これらのプレートを１７℃で７日間インキュベートした。７日後、Ｒｅｅｄ  Ｍｕｅｎｃｈ方法（１）を使用して、ＴＣＩＤ５０／ｍＬを決定した。
【０１４２】
結果を図９に示す。
【０１４３】
ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）−ＩＶｂ
ＥＰＣを平板培養する：ＥＰＣ（コイ丘疹性上皮腫）を５×１０５細胞／ウェルで１２ウェルプレート中に播種し、処置の前に、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５中で２４時間の間放置して成長させ、細胞再付着を可能にした。２つの異なる方法ａ）１時間の前処置またはｂ）下に記載されている通りＶＨＳＶとの混合物の２時間揺動を使用して、細胞をＰＨＸ−ＮＨ２で処置した。全ての処置は、１．７２×１０８のＴＣＩＤ５０／ｍＬを有するＶＨＳＶ−ＩＶｂストックを使用し、ＰＨＸ−ＮＨ２を０．００５ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。
ａ．１時間の間ＰＨＸ−ＮＨ２を用いる前処置：細胞を（ｉ）５％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓが補充されたＬ−１５（処置培地）または（ｉｉ）４７５μＬの培地および２５μＬの０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＨＸ−ＮＨ２（０．００５ｎｇ／ｍＬの最終濃度）で処置した。細胞を１時間の間２０℃でインキュベートした。１時間後、培地を除去し、以下と置き換えた。（Ａ）対照ウェル：５００μＬのＴＭ；（Ｂ）ＰＨＸ−ＮＨ２とのＶＨＳＶ：２５μＬの０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＨＸ−ＮＨ２および５０μＬのＶＨＳＶを用いる４７５μＬのＴＭ；ならびに（Ｃ）ＶＨＳＶ単独：４５０μＬのＴＭおよび５０μＬのＶＨＳＶ。プレートを次いで１７℃に７日間置いた。ＴＣＩＤ５０／ｍＬを下に記載されている通りに算出するまで、培地を−２０℃で貯蔵した。
ｂ．２時間の間ＶＨＳＶおよびＰＨＸ−ＮＨ２を揺動する：以下の混合物を２時間の間揺動した：（Ａ）対照＝２５０μＬのＴＭ、（Ｂ）ＶＨＳＶ単独：２００μＬのＴＭおよび５０μＬのＶＨＳＶ；ならびに（Ｃ）ＰＨＸ−ＮＨ２とのＶＨＳＶ：２５μＬの０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＨＸ−ＮＨ２および５０μＬのＶＨＳＶを用いる１７５μＬのＴＭ。２時間後、２５０μＬのＴＭを各混合物に添加し、ピペットによって徹底的に混合した。５００μＬの各混合物を個々のウェルに添加し、１７℃で７日間インキュベートした。ＴＣＩＤ５０／ｍＬを下に記載されている通りに算出するまで、培地を−２０℃で貯蔵した。
【０１４４】
ＥＰＣを使用するＶＨＳＶ  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ決定：両方法について、同じプロトコールを使用してＴＣＩＤ５０／ｍＬ実験を完了した。ＥＰＣを３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５中で２４時間の間放置して成長させ、細胞が再付着するのを可能にした。細胞を次いで、ＶＨＳＶ単独の希釈物または（ＴＭ中１０−１〜１０−１１）を範囲とする希釈物中のＶＨＳＶ＋ＰＨＸ−ＮＨ２に感染させた。通常のＴＭを対照ウェルに使用した。細胞を１７℃で７日間インキュベートし、この後、Ｒｅｅｄ  Ｍuｅｎｃｈ方法（１）を使用してＴＣＩＤ５０／ｍＬを決定した。
【０１４５】
結果を図１０に示す。
【０１４６】
伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）
ＣＨＳＥ−２１４を平板培養する：ＣＨＳＥ−２１４（マスノスケ（Oncorhynchus tshawytscha））は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５中の１２ウェルプレートにおいておよそ２．４×１０５細胞／ウェルになるまで成長した。細胞を次いで、ＩＰＮＶの添加前の１時間の前処置の間、ＰｈｙｔｏＳｐｈｅｒｉｘ（ＰＨＸ−ＮＨ２）で処置した。全ての処置は、１．０９×１０７のＴＣＩＤ５０／ｍＬを有するＩＰＮＶストックを使用し、ＰＨＸ−ＮＨ２を０．００５ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。処置培地は、２％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５であった。
【０１４７】
１時間の間のＰＨＸ−ＮＨ２を用いる前処置：ＣＨＳＥ−２１４細胞が所望の集密度に達した後、培地を除去し、細胞を、ＰＨＸ−ＮＨ２（５０μＬの０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＨＸ−ＮＨ２および９５０μＬのＴＭ）または培地単独で（５０μＬのホスフェート−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および９５０μＬのＴＭ）のいずれかで１時間の間処置した。１時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞を次いで、以下で処置した：（Ａ）対照：９５０μＬのＴＭ；（Ｂ）ＩＰＮＶ単独：５０μＬのＰＢＳおよび１００μＬのＩＰＮＶおよび８５０μＬのＴＭ；ならびに（Ｃ）ＰＨＸ−ＮＨ２とのＩＰＮＶ：５０μＬの０．１ｎｇ／ｍＬ  ＰＨＸ−ＮＨ２および１００μＬのＩＰＮＶを有する８５０μＬのＴＭ。２時間後、各ウェルから１００μＬを０日目試料として回収し、−８０℃で貯蔵した。細胞を１４℃で７日間インキュベートし、この後、培地を回収し、ＴＣＩＤ５０／ｍＬを下に記載されている通りに算出するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１４８】
ＣＨＳＥ−２１４を使用するＩＰＮＶ  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ決定：ＣＨＳＥ−２１４を播種し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを有するＬ−１５中の９６ウェルプレートにおいて２．４×１０４細胞／ウェルの集密度まで放置して成長させた。細胞を次いで、ＩＰＮＶ単独の０日目および７日目の試料の希釈物、またはＴＭ中１０−１〜１０−１１を範囲とする希釈物中のＩＰＮＶ＋ＰＨＸ−ＮＨ２に感染させた。通常のＴＭを対照ウェルに使用した。細胞を１７℃で７日間インキュベートし、この後、Ｋａｒｂｅｒ方法（２）を使用してＴＣＩＤ５０／ｍＬを決定した。
【０１４９】
結果を図１１に示す。
【０１５０】
考察
シロザケレオウイルス（ＣＳＶ）および伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）はｄｓＲＮＡゲノムを有し、一方、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）−ＩＶｂはマイナスセンスｓｓＲＮＡウイルスである。したがって、ＰＨＸ−ＮＨ２は、異なるゲノムを有するウイルスの複製およびしたがって異なるゲノム複製戦略に影響できる。この阻害効果は、宿主細胞のＩ型ＩＦＮ応答を抑制するためのＰＨＸ−ＮＨ２の能力に基づいていると思われる。阻害の傾向が全ての３つのウイルスについて観察され；一方、ＣＳＶがＰＨＸ−ＮＨ２の統計的に有意な効果を実証した。ＰＨＸ上でのＮＨ２置換度および／または実験条件を最適化することで、増強の改善を提供することができる。
【０１５１】
例えば、ＰＨＸ−ＮＨ２は、ウイルス感染の２時間前に細胞培養培地に添加することができる。ＰＨＸ−ＮＨ２それ自体は、細胞生存能に対するプラス効果を有しており、細胞代謝および細胞分裂を支持する。ＰＨＸ−ＮＨ２処置に続くウイルス力価は、ウイルス単独よりも高く、細胞培養物におけるウイルス生成速度を増加させる。この処置は、Ｉ型ＩＦＮが高いウイルス収量を達成する交絡因子である場合、細胞株ベースのウイルス生成にとって重要である。
参照
(1) Reed, L.J.; Muench, H. (1938). "A simple method of estimating fifty percent endpoints". The American Journal of Hygiene. 27: 493 - 497.
(2) Karber G. (1931) Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Archiv f experiment Pathol u Pharmakol. 162: 480 - 483.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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