(57)【要約】  本開示は、組換え生成物、例えば次世代生物製剤の向上した生成及び品質を達成するために脂質代謝をモジュレートするための方法及び組成物を特徴とする。本明細書に記載される脂質代謝のモジュレーションは、例えば、本明細書に記載される脂質代謝モジュレータを細胞又は無細胞系に導入することを含む。本開示は、生成能力が向上し、生成物品質が向上した工学操作細胞、そのような細胞を工学操作する方法、並びにそのような細胞からの生成物を含む調製物及び混合物も包含する。
2019514399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞により生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドを生成する方法であって、
ｉ）脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞を準備するステップ、及び
ｉｉ）例えば該改変による脂質代謝のモジュレーションに適する条件の下で、該細胞を培養するステップを含み、
それによって、該生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドを生成する、方法。
【請求項２】
前記細胞が、ポリペプチド、例えば表２又は３から選択されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変が、前記改変を有していない細胞と比較して前記ポリペプチドの生成の増加又は品質の向上を提供する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）又は外因性ＬＭＭをコードする外因性核酸を前記細胞の中で形成するステップを含み、任意選択で、形成するステップは、脂質代謝モジュレータ、例えばＬＭＭをコードする内因性核酸の発現を増加させる脂質代謝モジュレータをコードする外因性核酸を導入することを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
脂質代謝をモジュレートする第２の改変を含み、第２の改変は、第２のＬＭＭ、例えば第１の改変のＬＭＭと異なるＬＭＭをコードする第２の外因性核酸を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｉ）第２の外因性核酸及び第１の外因性核酸が同じ核酸分子の上に配置される、又は
ｉｉ）第２の外因性核酸及び第１の外因性核酸が異なる核酸分子の上に配置される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の改変が、前記第２の改変を有していない細胞と比較して前記生成物の生成の増加又は品質の向上を提供する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
第２のＬＭＭ又は第２の外因性ＬＭＭをコードする第２の外因性核酸を前記細胞の中で形成するステップを含み、任意選択で、形成するステップは、第２のＬＭＭ、例えばＬＭＭをコードする内因性核酸の発現を増加させる第２のＬＭＭをコードする第２の外因性核酸を導入することを含む、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
脂質代謝をモジュレートするステップが、
ｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）；
ｉｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の活性（例えば、酵素活性）；
ｉｉｉ）細胞に存在する脂質（例えば、リン脂質又はコレステロール）の量；
ｉｖ）脂質ラフトの量又は脂質ラフト形成の速度；
ｖ）細胞膜（例えば、原形質膜、小胞膜又はオルガネラ膜）の流動性、透過性及び／又は厚さ；
ｖｉ）不飽和脂質への飽和脂質の変換又は飽和脂質への不飽和脂質の変換；
ｖｉｉ）飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質の量；
ｖｉｉｉ）ＥＲ活性を増加させる良好な組成を達成するための、前記細胞の中の脂質の組成；
ｉｘ）該ＥＲの拡張（例えば、該ＥＲのサイズ、該ＥＲの膜表面、又は該ＥＲを構成する及び／若しくはその中に存在するタンパク質及び脂質の量）；
ｘ）ゴルジの拡張（例えば、ゴルジの数及びサイズ、ゴルジ表面、又はゴルジの中に存在するタンパク質及び分子の数若しくは量）；
ｘｉ）分泌小胞の量又は分泌小胞の形成；
ｘｉｉ）前記生成物の分泌の量又は速度；
ｘｉｉｉ）増殖能力、例えば増殖速度；
ｘｉｖ）培養生存度又は細胞生存；
ｘｖ）膜受容体の活性化；
ｘｖｉ）折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）；
ｘｖｉｉ）前記生成物の生成の収率又は速度；
ｘｖｉｉｉ）前記生成物の品質（例えば、凝集、グリコシル化不均一性、断片化、適切な折畳み又はアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブル）；並びに／或いは
ｘｉｘ）細胞成長／増殖又は細胞比増殖速度
の１つ又は複数を変更することを含む、例えばもたらす（例えば、改変を有していない細胞と比較して）、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ）前記生成物、例えば組換えポリペプチドの生成が、例えば前記脂質代謝のモジュレーションのない細胞によって生成される生成物のレベル又は量と比較して、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍増加する、又は
ｉｉ）前記生成物、例えば組換えポリペプチドの品質が、例えば前記脂質代謝のモジュレーションのない細胞によって生成される生成物の品質と比較して、例えば、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍増加する、
請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｉ）前記改変が、脂質代謝遺伝子生成物、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物の発現若しくは活性をモジュレートすること、例えば増加させることをもたらす、
ｉｉ）脂質代謝遺伝子生成物、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物の発現をモジュレートする転写調節因子、例えば転写因子の発現若しくは活性が、前記改変によって上方制御される、又は、
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方である、
請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質代謝モジュレータが、
ｉ）脂質代謝遺伝子生成物、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物の発現を媒介する、例えば上方制御する転写調節因子、例えば転写因子；ＳＲＥＢＦ１；若しくはＳＲＥＢＦ２、又はそのいずれかの機能的断片若しくは類似体、又は
ｉｉ）ＳＣＤ１若しくはその機能的断片
を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記改変が、新たな脂質生成、脂肪酸の再エステル化、脂肪酸の飽和又は不飽和化、脂肪酸伸長及びリン脂質生合成の１つ又は複数をモジュレートすること、例えば増加させることをもたらす、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＬＭＭが、飽和から不飽和、例えば一価不飽和への脂質の変換をモジュレートする、例えば増加させる酵素を含み、任意選択で、該酵素がＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４若しくはＳＣＤ１又はその機能的断片若しくは類似体を含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記改変が、
ｉ）脂質代謝遺伝子生成物、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物、若しくはその機能的断片若しくは類似体、又は
ｉｉ）脂質代謝遺伝子生成物、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物をコードする核酸の発現を増加させるｃｉｓ若しくはｔｒａｎｓ調節エレメント
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＬＭＭが、
ｉ）脂質生合成（脂質生成）経路からの１つ又は複数の遺伝子生成物又はその機能的断片若しくは類似体、例えば表１から選択される遺伝子生成物、
ｉｉ）脂肪酸の再エステル化経路からの１つ又は複数の遺伝子生成物又はその機能的断片若しくは類似体、例えば表１から選択される遺伝子生成物、
ｉｉｉ）リン脂質生合成経路からの１つ又は複数の遺伝子生成物又はその機能的断片若しくは類似体、例えば表１から選択される遺伝子生成物、又は、
ｉｖ）脂肪酸の飽和若しくは不飽和化経路からの１つ又は複数の遺伝子生成物又はその機能的断片若しくは類似体、例えば表１から選択される遺伝子生成物
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質代謝モジュレータが、
ｉ）ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば、配列番号１若しくは３４、又はその機能的断片、例えば、配列番号２６、２７若しくは３６と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の同一性；或いは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号１若しくは３４、又はその機能的断片、例えば、配列番号２６、２７若しくは３６から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異、或いは
ｉｉ）ＳＣＤ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３、若しくはその機能的断片と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９若しくは１００％の同一性；又は、ＳＣＤ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３若しくはその機能的断片から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂質代謝モジュレータをコードする前記核酸が、配列番号２、４又は３２から選択される核酸配列のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の同一性を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂質代謝モジュレータをコードする前記核酸がプラスミド又はベクターを含み、任意選択で、前記脂質代謝モジュレータをコードする前記核酸が、トランスフェクション又は形質導入によって前記細胞に導入される、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂質代謝モジュレータをコードする前記核酸が、
ｉ）前記細胞の染色体ゲノムに組み入れられ、任意選択で前記ＬＭＭが安定して発現される、又は、
ｉｉ）前記細胞の染色体ゲノムに組み入れられず、任意選択で前記ＬＭＭが一時的に発現される、
請求項１１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含み、
ｉ）該組換えポリペプチドをコードする該外因性核酸は、ステップｉ）若しくはステップｉｉ）の後に導入され、又は
ｉｉ）該組換えポリペプチドをコードする該外因性核酸は、ステップｉ）若しくはステップｉｉ）の前に導入される、
請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えポリペプチドが、
ｉ）治療的ポリペプチド、
ｉｉ）抗体分子、例えば抗体若しくはその抗体断片、モノクローナル抗体、又は二重特異的分子であるか、或いは、
ｉｉｉ）表２又は３から選択される、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えポリペプチドをコードする前記外因性核酸が、
ｉ）前記細胞の染色体ゲノムに組み入れられるか、又は、
ｉｉ）前記細胞の染色体ゲノムに組み入れられない、
請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、
ｉ）真核細胞、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯動物細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞若しくは植物細胞、又は、
ｉｉ）原核細胞
である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞から選択される、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＥＲプロセシング能力（ＥＲ拡張）又は分泌を向上させる改変を前記細胞に導入するステップをさらに含み、任意選択で、ＥＲプロセシング能力（ＥＲ拡張）を向上させることはＰＤ１、ＢｉＰ、ＥＲＯ又はＸＢＰ１をコードする核酸を導入することを含み、任意選択で、分泌を向上させることはＳＮＡＲＥ機構をモジュレートすること、例えばＳＮＡＲＥ構成成分をコードする核酸を導入することを含む、、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ｉ）前記細胞又は前記細胞の子孫から前記ポリペプチドを得るステップ、
ｉｉ）前記細胞又は前記細胞の子孫によって馴化させた培地から前記ポリペプチドを得るステップ、
ｉｉｉ）前記ポリペプチドを少なくとも１つの細胞又は培地の構成成分から分離するステップ、或いは
ｉｖ）例えば構造部分の活性について又はその存在について、前記ポリペプチドを分析するステップ
のうちの１つ又は複数をさらに含む、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
生成能力が増加した及び／又は生成の品質が向上した細胞を工学操作する方法であって、脂質代謝モジュレータをコードする外因性核酸を前記細胞に導入するステップを含み、それによって、生成能力が増加した及び／又は生成の品質が向上した細胞を工学操作する、方法。
【請求項２９】
脂質代謝モジュレータをコードする前記外因性核酸が、トランスフェクション、形質導入、例えばウイルス性形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション又はリポフェクションによって前記細胞に導入され、任意選択で、脂質代謝モジュレータをコードする前記外因性核酸が前記細胞の染色体ゲノムに組み入れられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を前記細胞に導入するステップをさらに含み、組換えポリペプチドをコードする該外因性核酸は、
ｉ）ＬＭＭをコードする前記外因性核酸を導入する前に、又は
ｉｉ）ＬＭＭをコードする前記外因性核酸を導入した後に
導入される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
ｉ）前記生成能力、例えば生成される組換えポリペプチドの量が、例えば前記脂質代謝のモジュレーションのない細胞の生成能力と比較して、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍増加する、
ｉｉ）生成の品質、例えば該組換えポリペプチドの品質が、例えば前記脂質代謝のモジュレーションのない細胞の生成の品質と比較して、例えば１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、８５％若しくは１００％又はそれより多く増加する、或いは
ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方である、
請求項２８から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、ＳＲＥＢＦ２、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４、ＳＣＤ５からなる群から選択され、前記細胞が、生成物、例えばポリペプチド、例えば、表２若しくは３に提供される組換えポリペプチド又はその機能的断片を生成する、請求項２８から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２８から３２までのいずれか一項によって生成される細胞。
【請求項３４】
脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）をコードする外因性核酸を含む細胞であって、任意選択で、脂質代謝モジュレータをコードする該外因性核酸が該細胞の染色体ゲノムに組み入れられる、細胞。
【請求項３５】
前記細胞が真核細胞、例えばＣＨＯ細胞又はヒト細胞である、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
前記細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞からなる群から選択される、請求項３４又は３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記ＬＭＭが、生成物、例えば本明細書に記載される次世代生物製剤（ＮＧＢ）、例えば二重特異的抗体、融合タンパク質又はグリコシル化タンパク質の発現をモジュレートする、請求項３４に記載の細胞。
【請求項３８】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、ＳＲＥＢＦ２、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４及びＳＣＤ５、又はそれらの機能的断片からなる群から選択される、請求項３７に記載の工学操作された細胞。
【請求項３９】
前記ＬＭＭが、
ｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）；
ｉｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の活性（例えば、酵素活性）；
ｉｉｉ）細胞に存在する脂質（例えば、リン脂質又はコレステロール）の量；
ｉｖ）脂質ラフトの量又は脂質ラフト形成の速度；
ｖ）細胞膜（例えば、原形質膜、小胞膜又はオルガネラ膜）の流動性、透過性及び／又は厚さ；
ｖｉ）不飽和脂質への飽和脂質の変換又は飽和脂質への不飽和脂質の変換；
ｖｉｉ）飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質の量；
ｖｉｉｉ）ＥＲ活性を増加させる良好な組成を達成するための、前記細胞の中の脂質の組成；
ｉｘ）該ＥＲの拡張（例えば、該ＥＲのサイズ、該ＥＲの膜表面、又は該ＥＲを構成する及び／若しくはその中に存在するタンパク質及び脂質の量）；
ｘ）ゴルジの拡張（例えば、ゴルジの数及びサイズ、ゴルジ表面又はゴルジの中に存在するタンパク質及び分子の数若しくは量）；
ｘｉ）分泌小胞の量又は分泌小胞の形成；
ｘｉｉ）前記生成物の分泌の量又は速度；
ｘｉｉｉ）増殖能力、例えば増殖速度；
ｘｉｖ）培養生存度又は細胞生存；
ｘｖ）膜受容体の活性化；
ｘｖｉ）折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）；
ｘｖｉｉ）前記生成物の生成の収率又は速度；
ｘｖｉｉｉ）前記生成物の品質（例えば、凝集、グリコシル化不均一性、断片化、適切な折畳み又はアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブル）；並びに／或いは、
ｘｉｘ）細胞成長／増殖又は細胞比増殖速度
からなる群から選択される前記細胞の１つ又は複数の特性を変更する、請求項３７に記載の工学操作された細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、
ｉ）真核細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞、
ｉｉ）原核細胞、
ｉｉｉ）昆虫細胞、
ｉｖ）植物細胞、
ｖ）酵母細胞、又は
ｖｉ）藻類細胞
からなる群から選択される、請求項３７から３９までのいずれか一項に記載の工学操作された細胞。
【請求項４１】
脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）を発現するように工学操作されたＣＨＯ細胞であって、該ＬＭＭは該ＣＨＯ細胞の１つ又は複数の特性をモジュレートし、該工学操作ＣＨＯ細胞は、
ｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）；
ｉｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の活性（例えば、酵素活性）；
ｉｉｉ）細胞に存在する脂質（例えば、リン脂質又はコレステロール）の量；
ｉｖ）脂質ラフトの量又は脂質ラフト形成の速度；
ｖ）細胞膜（例えば、原形質膜、小胞膜又はオルガネラ膜）の流動性、透過性及び／又は厚さ；
ｖｉ）不飽和脂質への飽和脂質の変換又は飽和脂質への不飽和脂質の変換；
ｖｉｉ）飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質の量；
ｖｉｉｉ）ＥＲ活性を増加させる良好な組成を達成するための、該細胞の中の脂質の組成；
ｉｘ）該ＥＲの拡張（例えば、該ＥＲのサイズ、該ＥＲの膜表面、又は該ＥＲを構成する及び／若しくはその中に存在するタンパク質及び脂質の量）；
ｘ）ゴルジの拡張（例えば、ゴルジの数及びサイズ、ゴルジ表面又はゴルジの中に存在するタンパク質及び分子の数若しくは量）；
ｘｉ）分泌小胞の量又は分泌小胞の形成；
ｘｉｉ）生成物の分泌の量又は速度；
ｘｉｉｉ）増殖能力、例えば増殖速度；
ｘｉｖ）培養生存度又は細胞生存；
ｘｖ）膜受容体の活性化；
ｘｖｉ）折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）；
ｘｖｉｉ）生成の収率又は速度、例えば生成物、例えば次世代生物製剤（ＮＧＢ）、例えば二重特異的抗体；融合タンパク質；又はグリコシル化タンパク質の発現レベル；
ｘｖｉｉｉ）生成物の品質（例えば、凝集、グリコシル化不均一性、断片化、適切な折畳み又はアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブル）；並びに／或いは
ｘｉｘ）細胞成長／増殖又は細胞比増殖速度
からなる群から選択される１つ又は複数の特性のモジュレーションに基づいて選択される、ＣＨＯ細胞。
【請求項４２】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、ＳＲＥＢＦ２、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４及びＳＣＤ５、又はそれらの機能的断片からなる群から選択される、請求項４１に記載の工学操作されたＣＨＯ細胞。
【請求項４３】
前記生成物、例えばＮＧＢが、二重特異的抗体分子、融合タンパク質及びグリコシル化タンパク質からなる群から選択される、請求項４１に記載の工学操作されたＣＨＯ細胞。
【請求項４４】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞からなる群から選択される、請求項４１に記載の工学操作されたＣＨＯ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年５月３日に出願の米国特許出願第６２／３３０９７３号に基づく優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、生成物、例えば組換えタンパク質の生成のために、細胞の脂質代謝経路をモジュレートし、細胞及び細胞系を工学操作するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換え治療的タンパク質は、細胞発現系、例えば哺乳動物の細胞発現系で一般的に発現される。２０１４年に、市場に承認されたバイオ医薬品の総数は２１２であって、ＦＤＡによって市販のために承認された治療的製品の５６％は哺乳動物細胞系で生産される。しかし、生産に伴う高い費用は、包括的な保健医療費の増加の原因となる。
【０００４】
さらに、次世代融合タンパク質、多量体の糖タンパク質又は次世代抗体などの次世代タンパク質生物製剤（ＮＧＢ）は、しばしば複雑な及び／又は非天然の構造を有し、モノクローナル抗体などの分子より発現させるのがより困難であることが証明されつつある。現在の宿主細胞系はＮＧＢの効率的な合成及び分泌のための経路を進化させておらず、増殖の著しい低減、低い生産性をもたらし、不良な生成物品質属性の生成物をしばしばもたらす。したがって、これらのＮＧＢは発現させるのが困難と考えられており、生産性及び生成物の品質は臨床上の及び市場の要求を満たさない。
【０００５】
したがって、最終生成物の品質を維持しつつ、組換えバイオ治療薬を速やかに、効率的に、経済的に、開発及び生産する必要性が高まっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、１つ又は複数の脂質代謝経路の構成成分の過剰発現による脂質代謝経路のモジュレーションが、組換えポリペプチド生成物を生成する細胞の生産性及び生成物品質を増加させるという発見に一部基づく。本明細書で、例えば１つ又は複数の脂質代謝経路をモジュレートすることによる脂質代謝のモジュレーションが、生成物のより高い収量及び向上した品質の生成物を生成する細胞及び無細胞系を工学操作するために使用することができることが実証される。重要なことに、本開示は、脂質代謝に関連した２つ以上のプロセス又は経路をモジュレートする包括的調節因子を使用することによる、脂質代謝の包括的な調節を特徴とし、それによって、向上した生成物生成及び品質を達成する下流の複数の効果をもたらす。本明細書に記載される方法及び組成物は、特に組換え生成物又は次世代生物製剤（例えば、融合タンパク質、二重特異的又はマルチフォーマット抗体分子、多量体タンパク質及びグリコシル化タンパク質）の向上した生産のために、及び、そのような生成物の生成のためのより効率的な系（例えば、細胞系又は無細胞系）の開発のために有益である。
【０００７】
一態様では、本開示は、細胞において本明細書に記載される生成物を生成する方法を特徴とする。一実施形態では、生成物はポリペプチド、例えば組換えポリペプチドである。一実施形態では、本方法は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞を提供するステップ、及び細胞を、例えば改変による脂質代謝のモジュレーションに適する条件の下で、培養するステップを含み、それによって生成物を生成する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、無細胞系において生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドを生成する方法であって、脂質代謝をモジュレートする改変を含む無細胞系、例えば脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞又は細胞系に由来する無細胞系を準備するステップ、及び生成物の生成に適する条件の下に無細胞系を置くステップを含み、それによって、生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドを生成することを特徴とする。一実施形態では、無細胞系は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞又は細胞系に由来する。一実施形態では、無細胞系は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞又は細胞系からの１つ又は複数の構成成分、例えばオルガネラ又はオルガネラの部分を含む。一部の実施形態では、改変は、脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）をコードする外因性核酸を含み、細胞又は細胞系は、ＬＭＭ、例えば、ＳＲＥＢＦ１、ＳＲＥＢＦ２、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４、ＳＣＤ５又はそれらの機能的断片からなる群から選択されるＬＭＭを発現する。一部の実施形態では、ＬＭＭは、以下からなる群から選択される無細胞系の１つ又は複数の特性を変更する：生成される生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチド（ＮＧＢ）の生成、例えば、生成の収率及び速度を増加させる；並びに、品質を増加させる、例えば、凝集を減少させる、グリコシル化の不均一性を減少させる、断片化を減少させる、及び生成物の適切に折り畳まれた対誤って折り畳まれたか、又は折り畳まれていない生成物の比を増加させる。
【０００９】
本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかを使用して生成することができる生成物の例には、組換え生成物、又は少なくとも一部若しくは一部分が遺伝子操作の結果である生成物が含まれる。本明細書に記載される組換え生成物は、診断又は治療目的のために役立つことができる。一実施形態では、生成物は、ポリペプチド、例えば抗体分子（例えば、二重特異的若しくはマルチフォーマット抗体分子）、融合タンパク質又はタンパク複合体；核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子）；或いは脂質封入粒子（例えば、エクソソーム又はウイルス様粒子）を含む。本明細書に記載される方法及び組成物は、例えば多量に又は市販用若しくは治療用のために十分な品質で、生産するのが困難である生成物、例えば次世代生物製剤（例えば、融合タンパク質、二重特異的又はマルチフォーマット抗体分子、多量体タンパク質及びグリコシル化タンパク質）のために特に有益である可能性がある。一実施形態では、例えば生成物を生成するための本明細書に記載される細胞は、生成物を発現する。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載される生成物、例えば表２又は３から選択されるポリペプチドをコードする外因性核酸を含む。生成物のさらなる例は、「生成物」というタイトルのセクションに記載される。
【００１０】
脂質代謝をモジュレートする本明細書に開示される改変は、脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）の発現を増加若しくは減少させるか、又は脂質代謝経路の構成成分の発現若しくは活性を増加若しくは減少させる薬剤若しくは分子を含む。一実施形態では、改変は、核酸、例えばＬＭＭをコードする核酸、又はＬＭＭの発現を阻害するか若しくは減少させる阻害性核酸である。
【００１１】
一実施形態では、改変は、ＬＭＭの発現を増加させ、ＬＭＭをコードする外因性核酸を含む。一実施形態では、本方法は、ＬＭＭ又は外因性ＬＭＭをコードする外因性核酸を細胞の中で形成するステップを含む。一実施形態では、形成するステップは、脂質代謝モジュレータをコードする外因性核酸を導入することを含む。一実施形態では、形成するステップは、ＬＭＭをコードする内因性核酸の発現を増加させる外因性核酸を導入することを含む。本明細書に記載される方法及び組成物のいずれかで使用するのに適するＬＭＭの例は、「脂質代謝のモジュレーション」及び「脂質代謝モジュレータ」というタイトルのセクションでさらに記載する。
【００１２】
一実施形態では、細胞は１つ又は複数の改変を含む。一実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変を含む。一部の実施形態では、細胞は、２つ以上の改変を含む。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変を含む。一実施形態では、細胞は、脂質代謝をモジュレートする１つ又は複数の第２の改変を含む。一実施形態では、第２の改変は、第２のＬＭＭ、例えば第１の改変のＬＭＭと異なるＬＭＭをコードする第２の外因性核酸を含む。一実施形態では、第２の外因性核酸及び第１の外因性核酸は、同じ核酸分子の上に配置される。一実施形態では、第２の外因性核酸及び第１の外因性核酸は、異なる核酸分子の上に配置される。一実施形態では、第２の改変は、第２の改変を有していない細胞と比較して、生成物の生成の増加又は品質の向上を提供する。一実施形態では、本方法は、第２のＬＭＭ又は第２の外因性ＬＭＭをコードする第２の外因性核酸を細胞の中で形成するステップを含む。一実施形態では、形成するステップは、第２のＬＭＭをコードする第２の外因性核酸を導入することを含む。一実施形態では、形成するステップは、ＬＭＭをコードする内因性核酸の発現を増加させる第２の外因性核酸を導入することを含む。
【００１３】
本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかによって脂質代謝をモジュレートすることは、以下のいずれか１つ又は複数を変更すること、例えば増加若しくは減少させることを含むか又はもたらすことができる：
ｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）；
ｉｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の活性（例えば、酵素活性）；
ｉｉｉ）細胞に存在する脂質（例えば、リン脂質又はコレステロール）の量；
ｉｖ）脂質ラフトの量又は脂質ラフト形成の速度；
ｖ）細胞膜（例えば、原形質膜、小胞膜又はオルガネラ膜）の流動性、透過性及び／又は厚さ；
ｖｉ）不飽和脂質への飽和脂質の変換又は飽和脂質への不飽和脂質の変換；
ｖｉｉ）飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質の量；
ｖｉｉｉ）ＥＲ活性を増加させる良好な組成を達成するための、細胞の中の脂質の組成；
ｉｘ）ＥＲの拡張（例えば、ＥＲのサイズ、ＥＲ膜表面、又はＥＲを構成する及び／若しくはその中に存在するタンパク質及び脂質の量）；
ｘ）ゴルジの拡張（例えば、ゴルジの数及びサイズ、ゴルジ表面、又はゴルジの中に存在するタンパク質及び分子の数若しくは量）；
ｘｉ）分泌小胞の量又は分泌小胞の形成；
ｘｉｉ）生成物の分泌の量又は速度；
ｘｉｉｉ）増殖能力、例えば増殖速度；
ｘｉｖ）培養生存度又は細胞生存；
ｘｖ）膜受容体の活性化；
ｘｖｉ）折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）；
ｘｖｉｉ）生成物の収率又は生成速度；
ｘｖｉｉｉ）生成物の品質（例えば、凝集、グリコシル化不均一性、断片化、適切な折畳み又はアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブル）；並びに／或いは
ｘｉｘ）細胞成長／増殖又は細胞比増殖速度。
そのような実施形態では、細胞の前述の特性のいずれかの増加又は減少は、改変を有していない細胞との比較によって判定することができる。
【００１４】
本明細書に記載される方法及び組成物は、改変を有していない細胞と比較して、生成物の生成の増加をもたらす。生成の増加は、細胞によって生成される生成物の増加する量、収率若しくは量及び／又は生成速度の増加によって特徴付けることができ、ここで、生成速度は生成物の経時的な量と同等である。一実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドの生成は、例えば脂質代謝のモジュレーションのない細胞による生成と比較して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、８５％若しくは１００％又はそれより多く；或いは、例えば脂質代謝のモジュレーションのない細胞による生成と比較して、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍増加する。
【００１５】
本明細書に記載される方法及び組成物は、改変を有していない細胞と比較して、生成物の品質（すなわち生成物品質）の向上をもたらすこともできる。生成物の品質（すなわち生成物品質）の向上は、以下の１つ又は複数によって特徴付けることができる：凝集（例えば、凝集体又は凝集の減少）；適切な折畳み又はアセンブリ（例えば、誤って折り畳まれた若しくは折り畳まれてない生成物；又は、部分的に組み立てられた若しくはばらばらの生成物の減少）；翻訳後修飾（例えば、グリコシル化不均一性の増加及び減少、所望の又は所定の翻訳後修飾のより高い百分率）；断片化（例えば、断片化の減少）；ジスルフィド結合スクランブル（例えば、ジスルフィド結合スクランブルによる望ましくないアイソフォーム又は構造の減少）。一実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドの品質は、例えば脂質代謝のモジュレーションのない細胞による生成と比較して、例えば１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、８５％若しくは１００％；又は、例えば脂質代謝のモジュレーションのない細胞によって生成される生成物の品質と比較して、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍増加する。
【００１６】
実施形態では、本明細書に記載される生成物を生成する方法は、１つ又は複数のさらなるステップを含むことができ、それには、限定されるものではないが：ＥＲプロセシング能力（ＥＲ拡張）又は分泌を増加させる改変を細胞に導入するステップ；細胞、又は細胞の子孫、又は細胞若しくは細胞の子孫で馴化させた培地から、生成物を得るステップ；生成物を少なくとも１つの細胞又は培地の構成成分から分離するステップ；及び／或いは例えば構造部分の活性について又はその存在について、生成物を分析するステップが含まれる。一実施形態では、本方法は、ＰＤＩ、ＢｉＰ、ＥＲＯ又はＸＢＰ１をコードする核酸を導入することによってＥＲプロセシング能力（又は、ＥＲ拡張）を増大させるステップをさらに含む。一実施形態では、本方法は、例えばＳＮＡＲＥ構成成分をコードする核酸を導入することによって、分泌経路に関与するＳＮＡＲＥ機構又は他の機構をモジュレートすることによって、分泌能力又は分泌速度を増大させるさらなるステップをさらに含む。
【００１７】
脂質代謝のモジュレーション
本開示は、脂質代謝をモジュレートする方法及び組成物を特徴とする。一実施形態では、改変は、１つ又は複数の脂質代謝経路をモジュレートする、例えば増加させることをもたらし、それには、限定されるものではないが以下のものが含まれる：新たな脂質生成、脂肪酸の再エステル化、脂肪酸の飽和又は不飽和化、脂肪酸伸長、及びリン脂質生合成。
【００１８】
脂質代謝をモジュレートするのに適する、本明細書に記載される改変は、脂質代謝経路若しくはＬＭＭの構成成分の発現若しくは活性を増加若しくは減少させる外因性核酸、ＬＭＭポリペプチド、又は脂質代謝経路の構成成分の発現若しくは活性を増加若しくは減少させる他の分子の導入を含む。本開示は、例えば、脂質代謝に関連した構成成分の発現又は活性を増加又は減少させることによって脂質代謝をモジュレートする、脂質代謝モジュレータの使用を特徴とする。一実施形態では、ＬＭＭは、本明細書に記載される包括的な調節因子である。
【００１９】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、例えば包括的な調節因子の発現又は活性を増加又は減少させることによって、脂質代謝の包括的な調節をもたらす。そのような包括的な調節因子は、それが、複数の下流の作用に影響すること、例えば異なる脂質代謝過程又は経路の１つを超える、例えば２、３、４、５、又はそれより多くの構成成分の発現又は活性を増加させることができるように、１つ又は複数の経路において十分に上流にある分子である。脂質代謝過程又は経路の構成成分には、限定されるものではないが、酵素、補因子、又は脂質分子の合成、分解、伸長若しくは構造的立体配座に関与する他の分子を含めることができる。
【００２０】
一実施形態では、本明細書に記載される包括的な調節因子は、脂質代謝の構成成分、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物の発現を上方制御する、例えば増加させる転写因子である。例として、包括的な調節因子は、２つ以上の脂質関連遺伝子生成物、例えば、脂質生合成に関与する酵素及び脂質分子の飽和レベルに関与する酵素の発現を増加させる。
【００２１】
本明細書に記載される方法又は組成物のいずれでも、ＬＭＭは以下のいずれかを含む：脂質代謝の包括的な調節因子、例えば、脂質代謝遺伝子を上方制御する転写因子、又は新たな脂質生成、脂肪酸再エステル化、脂肪酸の飽和若しくは不飽和化、脂肪酸伸長、又はリン脂質生合成経路で役割を果たす構成成分（例えば、酵素、補因子又は分子）。
【００２２】
一実施形態では、脂質代謝モジュレータは、脂質代謝遺伝子生成物の発現を媒介する、例えば上方制御する、転写調節因子、例えば転写因子を含む。脂質代謝遺伝子生成物の例には、限定されるものではないが、表１に提供されるもの、脂質代謝の包括的な調節因子、例えば脂質代謝遺伝子を上方制御する転写因子が含まれる。
【００２３】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１若しくはＳＲＥＢＦ２、又はそれらの機能的断片若しくは類似体を含む。一実施形態では、脂質代謝モジュレータは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号１若しくは３４、又はそれらの機能的断片、例えば、配列番号２６、配列番号２７若しくは配列番号３６と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の同一性；或いは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号１若しくは３４、又はそれらの機能的断片、例えば、配列番号２６、配列番号２７若しくは配列番号３６から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、配列番号２若しくは３２から選択される核酸配列、又は配列番号２６、配列番号２７若しくは配列番号３６をコードする核酸のいずれかと、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の同一性を含む。
【００２４】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４若しくはＳＣＤ５、又はそれらの機能的断片若しくは類似体を含む。一実施形態では、脂質代謝モジュレータは、ＳＣＤ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３、若しくはそれらの機能的断片と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９若しくは１００％の同一性；又は、ＳＣＤ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３若しくはそれらの機能的断片から１、２、若しくは３個以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０個以下のアミノ酸残基の差異を含む。一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、配列番号４から選択される核酸配列のいずれかと、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の同一性を含む。
【００２５】
一実施形態では、ＬＭＭは、表１で提供される構成成分又はその機能的断片のいずれかを含む。一実施形態では、ＬＭＭは、表１で提供される構成成分若しくはその機能的断片のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９若しくは１００％の同一性を含み、又は、表１で提供される構成成分若しくはその機能的断片のいずれかのアミノ酸配列から１、２、若しくは３個以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０個以下のアミノ酸残基の差異を含む。一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、表１で提供される構成成分又はその機能的断片のいずれかをコードする核酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の同一性を含む。
【００２６】
一実施形態では、改変は、脂質代謝遺伝子生成物、例えば表１から選択される脂質代謝遺伝子生成物をコードする核酸の発現を増加させるｃｉｓ又はｔｒａｎｓ調節エレメントを含む。
【００２７】
一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、プラスミド又はベクターを含む。
【００２８】
一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）、形質導入又は本明細書に記載される任意の他の送達方法によって細胞に導入される。
【００２９】
一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、細胞の染色体ゲノムに組み入れられる。一実施形態では、ＬＭＭは、安定して発現される。
【００３０】
一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする核酸は、細胞の染色体ゲノムに組み入れられない。一実施形態では、ＬＭＭは一時的に発現される。
【００３１】
生成物
本明細書に記載される生成物には、ポリペプチド、例えば組換えタンパク質；核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ分子；多量体のタンパク質又は複合体；脂質封入粒子、例えばウイルス様粒子、小胞又はエクソソーム；又は他の分子、例えば脂質が含まれる。一実施形態では、生成物は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドである。例えば、組換えポリペプチドは、発現困難なタンパク質、又は、複合及び／若しくは非天然の構造を有するタンパク質、例えば次世代生物製剤、例えば、二重特異的抗体分子、融合タンパク質若しくはグリコシル化タンパク質であってよい。
【００３２】
本明細書に記載される方法のいずれでも、生成物を生成する方法は、生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を細胞に導入するステップをさらに含む。
【００３３】
一実施形態では、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞を提供した後に導入される。別の実施形態では、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、例えば改変による脂質代謝のモジュレーションに適する条件の下で、細胞を培養した後に導入される。
【００３４】
一実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞を提供する前に導入される。別の実施形態では、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、例えば改変による脂質代謝のモジュレーションに適する条件の下で、細胞を培養する前に導入される。
【００３５】
本明細書に記載される組成物、調製物又は方法のいずれでも、生成物、例えば組換えポリペプチドは、治療的ポリペプチド又は抗体分子、例えば抗体若しくはその抗体断片である。一実施形態では、抗体分子は、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体分子は、二重特異的抗体分子、例えば、ＢｉTE（二重特異的Ｔ細胞誘導抗体）、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化又は転送Ｔ細胞）である。
【００３６】
一実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドは、表２又は３から選択される。
【００３７】
実施形態では、生成物は、細胞によって安定して発現される。一実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、細胞の染色体ゲノムに組み入れられる。代わりに、生成物は、細胞によって一時的に発現される。一実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、細胞の染色体ゲノムに組み入れられない。
【００３８】
宿主細胞
本明細書に記載される生成物を生成するための細胞、及びそのような細胞を工学操作する方法が本明細書で提供される。
【００３９】
本明細書に記載される組成物、調製物又は方法のいずれでも、細胞は真核細胞である。一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、藻類細胞又は植物細胞である。一実施形態では、細胞は、げっ歯動物の細胞である。一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。ＣＨＯ細胞の例には、限定されるものではないが、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞が含まれる。
【００４０】
本明細書に記載される組成物、調製物又は方法のいずれでも、細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１及びＣＨＯＺＮからなる群から選択される。
【００４１】
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞以外の真核細胞、例えば、昆虫、植物、酵母又は藻類の細胞である。一実施形態では、細胞は、原核細胞である。
【００４２】
一態様では、本開示は、増加した生産能力及び／又は向上した生産品質（例えば、１つ又は複数の向上した生成物品質を有する生成物を生成する）を有する細胞を工学操作する方法であって、脂質代謝モジュレータをコードする外因性核酸を細胞に導入するか又は細胞中に形成するステップを含み、それによって、増加した生産能力及び／又は向上した生産品質を有する細胞を工学操作する、方法を特徴とする。一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする外因性核酸は、トランスフェクション、形質導入、例えばウイルス性形質導入、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション又はリポフェクションによって細胞に導入される。一実施形態では、脂質代謝モジュレータをコードする外因性核酸は、細胞の染色体ゲノムに組み入れられる。一実施形態では、本方法は、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を細胞に導入するステップをさらに含む。一実施形態では、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、ＬＭＭをコードする外因性核酸を導入する前に導入される。一実施形態では、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、ＬＭＭをコードする外因性核酸を導入した後に導入される。
【００４３】
一態様では、本開示は、細胞を提供し、本明細書に記載されるＬＭＭを細胞に導入すること、例えばＬＭＭをコードする外因性核酸を導入することによって生成される細胞を特徴とする。
【００４４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載されるＬＭＭをコードする外因性核酸を含む細胞を特徴とする。
【００４５】
一態様では、本開示は、ＬＭＭを生成するように工学操作された細胞を特徴とし、ここで、ＬＭＭは、生成物、例えば本明細書に記載される次世代生物製剤（ＮＧＢ）の発現をモジュレートする。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００４６】
一態様では、本開示は、ＬＭＭを生成するように工学操作されたＣＨＯ細胞を特徴とし、ここで、ＬＭＭは、生成物、例えば本明細書に記載される次世代生物製剤（ＮＧＢ）の発現をモジュレートする。
【００４７】
一態様では、本開示は、ＬＭＭ及びＮＧＢを発現するように工学操作されたＣＨＯ細胞を特徴とし、ここで、集団は、ＮＧＢの高レベル発現のために選択されている。
【００４８】
一態様では、本開示は、ＬＭＭを発現するように工学操作されたＣＨＯ細胞を特徴とし、ここで、ＬＭＭはＣＨＯ細胞の１つ又は複数の特性をモジュレートし、工学操作されたＣＨＯ細胞は、以下からなる群から選択される１つ又は複数の特性のモジュレーションに基づいて選択される、
ｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）；
ｉｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の活性（例えば、酵素活性）；
ｉｉｉ）細胞に存在する脂質（例えば、リン脂質又はコレステロール）の量；
ｉｖ）脂質ラフトの量又は脂質ラフト形成の速度；
ｖ）細胞膜（例えば、原形質膜、小胞膜又はオルガネラ膜）の流動性、透過性及び／又は厚さ；
ｖｉ）不飽和脂質への飽和脂質の変換又は飽和脂質への不飽和脂質の変換；
ｖｉｉ）飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質の量；
ｖｉｉｉ）ＥＲ活性を増加させる良好な組成を達成するための、細胞の中の脂質の組成；
ｉｘ）ＥＲの拡張（例えば、ＥＲのサイズ、ＥＲ膜表面、又はＥＲを構成する及び／若しくはその中に存在するタンパク質及び脂質の量）；
ｘ）ゴルジの拡張（例えば、ゴルジの数及びサイズ、ゴルジ表面又はゴルジの中に存在するタンパク質及び分子の数若しくは量）；
ｘｉ）分泌小胞の量又は分泌小胞の形成；
ｘｉｉ）生成物の分泌の量又は速度；
ｘｉｉｉ）増殖能力、例えば増殖速度；
ｘｉｖ）培養生存度又は細胞生存；
ｘｖ）膜受容体の活性化；
ｘｖｉ）折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）；
ｘｖｉｉ）生成物の生成の収率又は速度；
ｘｖｉｉｉ）生成物の品質（例えば、凝集、グリコシル化不均一性、断片化、適切な折畳み又はアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブル）；並びに／或いは
ｘｉｘ）細胞成長／増殖又は細胞比増殖速度。
【００４９】
本明細書に記載される方法又は細胞、例えば工学操作された細胞のいずれにおいても、細胞は、ＳＲＥＢＦ１、ＳＲＥＢＦ２、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４及びＳＣＤ５からなる群から選択されるＬＭＭ、又はそれらの機能的断片を発現するか又は含む。
【００５０】
本明細書に記載される方法又は細胞、例えば工学操作された細胞のいずれにおいても、細胞は、生成物、例えば組換え生成物、例えば二重特異的抗体、融合タンパク質又はグリコシル化タンパク質からなる群から選択される次世代生物製剤を発現するか又は含む。
【００５１】
本明細書に記載される方法又は細胞、例えば工学操作された細胞のいずれにおいても、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞である。
【００５２】
組成物及び調製物
一態様では、本開示は、本明細書に記載される方法によって作製される、本明細書に記載される生成物の調製物も特徴とする。一実施形態では、重量又は数に基づき、調製物中の生成物の少なくとも７０、８０、９０、９５、９８又は９９％は、適切に折り畳まれるか又は組み立てられる。一実施形態では、重量又は数に基づき、調製物中の生成物の５０％未満、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％は、凝集している。一実施形態では、重量又は数に基づき、調製物中の生成物の５０％未満、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％は、生成物の断片である。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法によって作製されるポリペプチド、例えば、表２又は表３のポリペプチドの調製物を特徴とする。一部の実施形態では、本方法で使用される細胞は、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞である。
【００５４】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞、例えば脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞、及び細胞によって生成される生成物を含む混合物を特徴とする。一実施形態では、混合物は、生成物の重量又は数に基づき、改変なしで見られるであろうものより高い濃度、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％又は３０％高い濃度で、生成物を含む。一実施形態では、重量又は数に基づき、混合物中の生成物の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、適切に折り畳まれるか又は組み立てられる。一実施形態では、重量又は数に基づき、混合物中の生成物の５０％未満、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％は、凝集している。一実施形態では、重量又は数に基づき、混合物中の生成物の５０％未満、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％は、生成物の断片である。一部の実施形態では、生成物は、組換えポリペプチド、例えば表２又は表３の組換えポリペプチドである。
【００５５】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される細胞の培養によって馴化させた培地の調製物を特徴とし、ここで、細胞は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む。一実施形態では、生成物は、重量又は数に基づき、改変なしで見られるであろうものより高い濃度、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％又は３０％高い濃度で、調製物中に存在する。一実施形態では、重量又は数に基づき、調製物中の生成物の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％は、適切に折り畳まれるか又は組み立てられる。一実施形態では、重量又は数に基づき、調製物中の生成物の５０％未満、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％は、凝集している。一実施形態では、重量又は数に基づき、調製物中の生成物の５０％未満、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％は、生成物の断片である。一部の実施形態では、生成物は、組換えポリペプチド、例えば表２又は表３の組換えポリペプチドである。
【００５６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する又は均等である方法及び材料を本発明の実施又は試験で使用することができるが、適する方法及び材料を以下に記載する。本明細書で指摘される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、材料、方法及び実施例は例示されるだけであり、限定することが目的ではない。見出し、小見出し又は番号若しくは文字の付いた要素、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、読みやすさのためにのみ提示される。この文書における見出し又は番号若しくは文字を付けた要素の使用は、ステップ若しくは要素がアルファベット順に実行されること、又はステップ若しくは要素が必ずしもお互いから分離していることを必要としない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、記載及び図面、並びに請求項から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】対照発現ベクター（Ｃｔｒｌ）、又はそのＣ末端でＶ５エピトープタグに融合したＳＣＤ１（ＳＣＤ１−Ｖ５）、若しくはそのＣ末端でＶ５エピトープタグに融合したＳＲＥＢＦ１（ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５）をコードするもので別々にトランスフェクトした、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ工学操作細胞プールで得られた一連の免疫蛍光画像である。プールは抗Ｖ５一次抗体及び二次抗マウスＦＩＴＣ抗体（中央の画像）並びにＤＡＰＩ（左の画像）で画像化され、左と中央の両画像のオーバーレイ（右側の欄）が示される。画像は、ライカ共焦点顕微鏡を使用して生成した。
【図２】対照発現ベクター（対照）又はＳＣＤ１−Ｖ５若しくはＳＲＥＢＦ１−Ｖ５をコードするもののいずれかでトランスフェクトした、ＣＨＯＫ１ＳＶグルタミンシンテターゼノックアウト（ＧＳ−ＫＯ）細胞プールで得られた一連の免疫蛍光画像を示す。プールは抗Ｖ５一次及び抗マウス二次ＴＲＩＴＣ抗体（中央の画像）並びにＤＡＰＩ（左の画像）で画像化され、左と中央の両画像のオーバーレイ（右側の欄）も示される。画像は、ライカ共焦点顕微鏡を使用して生成した。
【図３Ａ】発現困難な組換えＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ融合タンパク質又はＦＰとも呼ばれる）をコードするプラスミドによる一時的トランスフェクションの後の、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）細胞プールで発現された外因性のＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５の判定を示す図である。Ｆｃ融合タンパク質、並びに示したＶ５タグ付きの脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）、ＳＣＤ１又はＳＲＥＢＦ１だけを発現する細胞プールによるエレクトロポレーションの９６時間後に得られた細胞溶解物で、ウェスタンブロット分析を実行した。抗Ｖ５一次抗体及び抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体を、Ｖ５タグ付きのＬＭＭ及び抗β−アクチン又は抗Ｌ７ａ（示したように）の発現を検出するために使用し、続いて、それぞれ抗マウス及び抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体による曝露をＬＭＭ検出のための負荷対照として使用した。
【図３Ｂ】ｅＧＦＰをコードするプラスミドによる一時的トランスフェクションの後の、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）細胞プールで発現された外因性のＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５の判定を示す図である。Ｆｃ融合タンパク質、並びに示したＶ５タグ付きの脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）、ＳＣＤ１又はＳＲＥＢＦ１だけを発現する細胞プールによるエレクトロポレーションの９６時間後に得られた細胞溶解物で、ウェスタンブロット分析を実行した。抗Ｖ５一次抗体及び抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体を、Ｖ５タグ付きのＬＭＭ及び抗β−アクチン又は抗Ｌ７ａ（示したように）の発現を検出するために使用し、続いて、それぞれ抗マウス及び抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体による曝露をＬＭＭ検出のための負荷対照として使用した。
【図３Ｃ】ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）を安定して発現するトランスフェクトされていない細胞プールで発現された、外因性のＶ５タグ付きのＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１の判定を示す図である。Ｆｃ融合タンパク質、並びに示したＶ５タグ付きの脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）、ＳＣＤ１又はＳＲＥＢＦ１だけを発現する細胞プールによるエレクトロポレーションの９６時間後に得られた細胞溶解物で、ウェスタンブロット分析を実行した。抗Ｖ５一次抗体及び抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体を、Ｖ５タグ付きのＬＭＭ及び抗β−アクチン又は抗Ｌ７ａ（示したように）の発現を検出するために使用し、続いて、それぞれ抗マウス及び抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体による曝露をＬＭＭ検出のための負荷対照として使用した。
【図４】ＶｉＣｅｌｌ細胞カウンターを使用して判定したときの、ｅＧＦＰ含有構築物ＪＢ３．３によるトランスフェクションの後に、ＬＭＭ  ＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するように工学操作されたＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞プールの生存可能な細胞濃度を示す図である（ｎ＝２）。
【図５Ａ】ＣＨＯＫ１ＳＶＧＳ−ＫＯ細胞プールを過剰発現する対照、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５のｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後の細胞培養濃度を示す図である。図５Ａは、細胞濃度を示す。下のカラムは生存可能な細胞の濃度を表し、全体のカラムは細胞の全体の濃度を表す；下のエラーバーは生存可能な細胞の標準偏差を表し、上のエラーバーは全体の細胞濃度のそれを表す。統計的有意性は、特定の時点の対照値と比較した両側ｔ検定を使用して計算した：＊両側ｔ検定［ｐ＜０．０５］を使用した生存可能な細胞の濃度の有意性。＋両側ｔ検定［ｐ＜０．０５］を使用した全体の細胞濃度の有意性（ｎ＝３）。
【図５Ｂ】ＣＨＯＫ１ＳＶＧＳ−ＫＯ細胞プールを過剰発現する対照、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５のｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後の培養生存度を示す図である。図５Ｂは、図５Ａに概説されるデータに基づく培養生存度を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。統計的有意性は、特定の時点の対照値と比較した両側ｔ検定を使用して計算した：＊両側ｔ検定［ｐ＜０．０５］を使用した生存可能な細胞の濃度の有意性。＋両側ｔ検定［ｐ＜０．０５］を使用した全体の細胞濃度の有意性（ｎ＝３）。
【図６Ａ】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー生成データを示す図である。中央値は、ｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後に得られ、ここで、試料は、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞プールを過剰発現する、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ１−Ｖ５からとられた（ｎ＝２）。
【図６Ｂ】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー生成データを示す図である。幾何平均値は、ｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後に得られ、ここで、試料は、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞プールを過剰発現する、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ１−Ｖ５からとられた（ｎ＝２）。
【図６Ｃ】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー生成データを示す図である。算術平均値は、ｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後に得られ、ここで、試料は、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞プールを過剰発現する、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ１−Ｖ５からとられた（ｎ＝２）。
【図７Ａ】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー生成データを示す図である。中央値は、ｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後に得られ、ここで、試料は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ由来細胞を過剰発現する、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５からとられた。エラーバーは、標準偏差を示す。統計的有意性は、特定の時点の対照値と比較した両側ｔ検定を使用して計算した（ｎ＝３）。＊は、統計的に有意な値［ｐ＜０．０５］を示す。データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生成した。
【図７Ｂ】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー生成データを示す図である。幾何平均値は、ｅＧＦＰ含有プラスミドによるトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後に得られ、ここで、試料は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ由来細胞を過剰発現する、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５からとられた。エラーバーは、標準偏差を示す。統計的有意性は、特定の時点の対照値と比較した両側ｔ検定を使用して計算した（ｎ＝３）。＊は、統計的に有意な値［ｐ＜０．０５］を示す。データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生成した。
【図７Ｃ】ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー生成データを示す図である。図７Ｃは、測定した算術平均蛍光に全体の細胞濃度（×１０６／ｍｌ）を掛けることによって計算した、培養１ｍｌあたりの全体の蛍光を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。統計的有意性は、特定の時点の対照値と比較した両側ｔ検定を使用して計算した（ｎ＝３）。＊は、統計的に有意な値［ｐ＜０．０５］を示す。データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して生成した。
【図８Ａ】抗体Ａの重鎖及び軽鎖をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における抗体Ａの生成を示す図である。図８Ａは、抗重鎖一次抗体及び抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用して検出したときの、抗体Ａに対応したバンドを示すウェスタンブロットである。
【図８Ｂ】抗体Ａの重鎖及び軽鎖をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞における抗体Ａの生成を示す図である。図８Ｂは、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって判定したときの、対照細胞プールから生成された値と比較した、ＬＭＭ工学操作細胞プールにおける抗体生成の平均変化倍率を示す図である。
【図９Ａ】Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞プールにおけるＦｃ融合タンパク質の生成を示す図である。図９Ａは、抗重鎖一次抗体及び抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用して検出したときの、Ｆｃ融合タンパク質を表すバンドを示すウェスタンブロットである。
【図９Ｂ】Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞プールにおけるＦｃ融合タンパク質の生成を示す図である。図９Ｂは、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって判定したときの、対照細胞プールから生成された値と比較した、ＬＭＭ工学操作細胞プールにおけるＦｃ融合タンパク質生成の平均変化倍率を示す図である。
【図１０Ａ】トランスフェクションから４８、７２及び９６時間後の、抗体Ａの重鎖及び軽鎖をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯ  ＧＳＫＯ細胞プールにおいて良好に発現された抗体Ａの生成を、対照、ヌルＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞プール（選択ＧＳ遺伝子だけを発現し、ＬＭＭ因子のない空のプラスミドを使用して生成された細胞の対照プール）と並べて示す図である。図１０Ａは、抗重鎖一次抗体及び抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用して検出したときの、抗体Ａを表すバンドを示すウェスタンブロットである。
【図１０Ｂ】トランスフェクションから４８、７２及び９６時間後の、抗体Ａの重鎖及び軽鎖をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯ  ＧＳＫＯ細胞プールにおいて良好に発現された抗体Ａの生成を、対照、ヌルＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞プール（選択ＧＳ遺伝子だけを発現し、ＬＭＭ因子のない空のプラスミドを使用して生成された細胞の対照プール）と並べて示す図である。図１０Ｂは、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって判定したときの、対照細胞プール中で生成された値と比較した、ＬＭＭ工学操作細胞プールにおける抗体生成の平均変化倍率を示す図である。
【図１１Ａ】Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞プール又は対照細胞プールにおける発現困難なＦｃ融合タンパク質の相対的な生成を示す図である。図１１Ａは、抗重鎖一次抗体、続く抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体による曝露を使用して検出したときの、一時的に生成された融合タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図１１Ｂ】Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後にＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５を安定して過剰発現するＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞プール又は対照細胞プールにおける発現困難なＦｃ融合タンパク質の相対的な生成を示す図である。図１１Ｂは、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって判定したときの、対照細胞プールと比較した、ＬＭＭ工学操作細胞プールにおけるＦｃ融合タンパク質生成の平均変化倍率を示す。
【図１２Ａ】対照（空）、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５遺伝子のいずれかを含有するプラスミド構築物で一時的にトランスフェクトされている、抗体Ａを安定して発現するＣＨＯ細胞系からの、４８及び７２時間後に収集した上清からの抗体Ａ生成の分析を示す図である。図１２Ａは、細胞からの上清のウェスタンブロットを示す；抗体Ａは、抗重鎖一次抗体、続く抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体による曝露を使用して検出された。
【図１２Ｂ】対照（空）、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５遺伝子のいずれかを含有するプラスミド構築物で一時的にトランスフェクトされている、抗体Ａを安定して発現するＣＨＯ細胞系からの、４８及び７２時間後に収集した上清からの抗体Ａ生成の分析を示す図である。図１２Ｂは、トランスフェクションから１６８時間後に上清に存在する抗体Ａの相対的なレベルをバンドが示す、クーマシー分析を示す。
【図１３】対照（空）、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５遺伝子のいずれかを含有するプラスミド構築物で一時的にトランスフェクトされた、抗体Ａを安定して発現するＣＨＯ細胞系からの、４８、７２、９６及び１４４時間後に収集した上清からの抗体Ａ生成の分析を示す図であり、容積測定抗体濃度を判定するために、プロテインＡ八重項分析が使用された（ｎ＝２）。
【図１４】対照（空）、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５遺伝子のいずれかを含有するプラスミド構築物で一時的にトランスフェクトされた、抗体Ａを安定して発現するＣＨＯ細胞系からの、４８、７２、９６及び１４４時間後に収集した上清試料からのＦＣ融合タンパク質の分析を示す図であり、ＦＣ融合タンパク質の比生産性を判定するために、生存可能な細胞数及びプロテインＡ力価の測定が使用された。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１５Ａ】対照、ＳＣＤ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ１−Ｖ５含有ベクターを安定して組み入れ、その後抗体Ａ構築物を安定して組み入れたＣＨＯ細胞プールから、４８、７２、９６及び１４４時間後に収集した上清試料からの抗体Ａ生成の分析を示す図である。図１５Ａは容積測定抗体濃度を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１５Ｂ】対照、ＳＣＤ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ１−Ｖ５含有ベクターを安定して組み入れ、その後抗体Ａ構築物を安定して組み入れたＣＨＯ細胞プールから、４８、７２、９６及び１４４時間後に収集した上清試料からの抗体Ａ生成の分析を示す図である。図１５Ｂは抗体Ａの比生産性を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１６Ａ】対照、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５含有ベクターを安定して組み入れ、その後ＦＣ融合タンパク質構築物を安定して組み入れたＣＨＯ細胞プールから、４８、７２、９６及び１４４時間後に収集した上清試料からのＦＣ融合タンパク質生成の分析を示す図である。図１６Ａは容積測定ＦＣ融合タンパク質濃度を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１６Ｂ】対照、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ４１０−Ｖ５含有ベクターを安定して組み入れ、その後ＦＣ融合タンパク質構築物を安定して組み入れたＣＨＯ細胞プールから、４８、７２、９６及び１４４時間後に収集した上清試料からのＦＣ融合タンパク質生成の分析を示す図である。図１６ＢはＦＣ融合タンパク質の比生産性を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１７Ａ】トランスフェクションの４８及び９６時間後の、イムノサイトカイン及び無ＬＭＭ（対照）、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１又はＳＲＥＢ４１１遺伝子のいずれかの発現に適当な遺伝子をコードする核酸構築物の一時的トランスフェクションの後の、ＣＨＯ  ＧＳＫＯ細胞からのイムノサイトカイン発現のウェスタン分析を示す図である。上清試料は低減され、存在するバンドは、抗重鎖一次抗体、続く抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体への曝露を使用して検出された。下のバンドは天然の重鎖抗体を表し、上のバンドはサイトカインに融合している重鎖分子を示す。
【図１７Ｂ】トランスフェクションの９６時間後に得られた試料の相対的なイムノサイトカイン存在度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
現在及び次世代の生物製剤の両方は、患者での治療有用性が増加し続けているので、治療的使用のための高いグレードの品質を有する多量の次世代生物製剤品に対する要求並びに生産のための効率的な手段及び生産細胞系の効率的な開発に対する要求は拡大している。さらに、多くの次世代生物製剤は、当技術分野で公知の従来の発現技術を使用して、従来の細胞系において発現させ、生成するのが困難である。現在の方法は、臨床使用のために必要とされる大きな量で及び高いグレードの品質で、これらの生成物を生成するのに十分でない。このように、本開示は、現在の生成方法から得られる収量及び品質と比較して向上した品質を有する生成物、例えば次世代生物学的製剤のより高い収量を得るための方法及び組成物を特徴とする。本明細書に記載される方法及び組成物は、組換え生成物を生成するために現在使用される細胞発現系と比較して、向上した生産性、生成物品質、堅牢性及び／又は培養生存度を有する細胞又は細胞系を工学操作するためにも有益である。
【００５９】
定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業技術者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する又は均等であるいかなる方法及び材料も本発明の実施で及び／又は試験のために使用することができるが、好ましい材料及び方法を本明細書に記載する。本発明の記載及び請求において、以下の専門用語は、定義が提供される場合、それが定義される通りに使用される。
【００６０】
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載することのみが目的であり、限定するものではないことも理解されたい。
【００６１】
冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書でその冠詞の文法上の目的語の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「細胞」は、１つの細胞又は１つを超える細胞を意味することができる。
【００６２】
本明細書で用いる「脂質代謝経路の構成成分」は、直接的又は間接的に、脂質を合成する、脂質を分解する、１つの脂質種から別の脂質種に脂質を変換する、又は脂質を改変する、分子、ポリペプチド又は酵素を指す。一実施形態では、構成成分は、酵素基質、酵素反応生成物又は酵素補因子であってよい。一実施形態では、脂質代謝経路の構成成分は、ＬＭＭである。一実施形態では、脂質代謝経路の構成成分は、表１に提供される。
【００６３】
本明細書で用いる「内因性」は、生物体、細胞、組織若しくは系からの又はその中に天然に生成される任意の物質を指す。
【００６４】
本明細書で用いる「外因性」は、生物体、細胞、組織若しくは系に導入される又はその外で生成される任意の物質を指す。したがって、「外因性核酸」は、生物体、細胞、組織若しくは系に導入される又はその外で生成される核酸を指す。一実施形態では、外因性核酸の配列は、外因性核酸が導入される生物体、細胞、組織若しくは系の中で天然に生成されないか、又は天然に見出すことができない。実施形態では、天然に存在しない生成物又は天然に存在しない部分を含有する生成物は、本明細書に記載される宿主細胞に関して外因性物質である。
【００６５】
本明細書で用いる「形成すること」は、細胞に導入すること、細胞の中で合成すること、又はＬＭＭ若しくは外因性ＬＭＭをコードする核酸が細胞の中に位置することをもたらす任意の他の過程を指す。
【００６６】
本明細書で用いる「異種」は、異なる種から生物体、細胞、組織又は系に導入されるときの、１つの種からの任意の物質を指す。実施形態では、異種物質は、１つ又は複数の種からの部分又は天然に存在しない部分を含む物質も包含する。例として、一実施形態では、融合タンパク質の一部がヒトであり、融合タンパク質の一部が細菌であり、融合タンパク質の一部が天然に存在せず、核酸がヒト細胞に導入される融合タンパク質をコードする核酸は、異種核酸である。
【００６７】
本明細書で用いる「脂質代謝経路」は、脂質若しくは脂質関連分子の合成、脂質若しくは脂質関連分子の伸長、脂質若しくは脂質関連分子の分解、脂質若しくは脂質関連分子の膜への組込み、脂質若しくは脂質関連分子の飽和の状態（例えば、飽和若しくは不飽和）、又は、脂質若しくは脂質関連分子の化学構造の変換若しくは改変（例えば、再エステル化）に関連した過程を指す。一実施形態では、脂質代謝経路は、脂質合成、脂質伸長、脂質分解、膜の組成若しくは流動性の変化、脂質ラフトの形成若しくはモジュレーション、又は脂質の改変若しくは変換（例えば、脂質の飽和若しくは不飽和化又は脂質の再エステル化）をもたらす。脂質代謝経路の例には、限定されるものではないが、以下が含まれる：新たな脂質生成、脂肪酸の再エステル化、脂肪酸の飽和、脂肪酸の不飽和化、脂肪酸伸長及びリン脂質生合成、及び折り畳まれていないタンパク質の応答。
【００６８】
本明細書で用いる「脂質代謝モジュレータ」又は「ＬＭＭ」は、以下の１つ又は複数をモジュレートする、例えば増加又は減少させる、分子、遺伝子生成物、ポリペプチド又は酵素を指す：脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写又は翻訳）；脂質代謝経路に関与する構成成分、例えば遺伝子生成物の活性（例えば、酵素活性）；細胞に存在する脂質のレベル又は量；脂質ラフトのレベル若しくは量又は脂質ラフト形成の速度；細胞膜、例えば、原形質膜又はオルガネラ膜の流動性、透過性又は厚さ；不飽和脂質への飽和脂質の変換又はその逆；細胞中の飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質のレベル又は量；ＥＲの活性に好ましい影響を及ぼす好ましい脂質組成を達成する脂質組成；ＥＲの拡張；ゴルジの拡張；分泌小胞のレベル若しくは量又は分泌小胞の形成；分泌のレベル又は速度；膜受容体の活性化又は不活性化（例えば、ＡＴＲ（例えば、多価不飽和脂肪酸残基を含有する細胞膜ホスファチジルコリンの増加はＡＴＲの活性化を通してｐ５３のリン酸化を誘導する（Ｔｈｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＲ））。Ｚｈａｎｇ  ＸＨ、Ｚｈａｏ  Ｃ、Ｍａ  ＺＡ。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２００７年１２月１日；１２０（Ｐｔ  ２３）：４１３４〜４３ページ  ＰＭＩＤ：１８０３２７８６；ＡＴＲ（血管拡張性失調症突然変異  −  及びＲａｄ３−関連キナーゼ）は、哺乳動物の細胞における軽度の低体温によって活性化され、その後ｐ５３を活性化する（ＡＴＲ（ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ−ａｎｄ  Ｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｌｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｐ５３）。Ｒｏｏｂｏｌ  Ａ、Ｒｏｏｂｏｌ  Ｊ、Ｃａｒｄｅｎ  ＭＪ、Ｂａｓｔｉｄｅ  Ａ、Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＥ、Ｄｕｎｎ  ＷＢ、Ｇｏｏｄａｃｒｅ  Ｒ、Ｓｍａｌｅｓ  ＣＭ。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０１１年４月１５日；４３５（２）：４９９〜５０８ページ。ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２０１０１３０３。ＰＭＩＤ：２１２８４６０３を参照）及び、ＳＲＥＰＢ（例えば、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２０１６年３月２１日；１２（５）：５６９〜７９ページ。ｄｏｉ：１０．７１５０／ｉｊｂｓ．１４０２７。ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１６。低密度リポタンパク質受容体経路の調節不全は、脂質障害媒介器官損傷に関与する（Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｉｎｊｕｒｙ）。Ｚｈａｎｇ  Ｙ、Ｍａ  ＫＬ、Ｒｕａｎ  ＸＺ、Ｌｉｕ  ＢＣを参照）；及びさらなる受容体、例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１６年３月１７日���ｐｉｉ：Ｓ１３８８〜１９８１（１６）３００７１〜３ページ。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｌｉｐ．２０１６．０３．０１９を参照）の活性化又は不活性化；並びに／又は折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）。一実施形態では、ＬＭＭはポリペプチドを含む。一実施形態では、ＬＭＭは、転写調節因子、例えば転写因子を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１又はその機能的断片（例えば、ＳＲＥＢＦ−４１０）を含む。一実施形態では、ＬＭＭは酵素を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１又はその機能的断片を含む。
【００６９】
本明細書で「脂質代謝をモジュレートする改変」という表現の中で用いる「改変」は、本明細書に記載される脂質代謝経路の構成成分、例えば遺伝子生成物の発現又は活性の増加若しくは減少を実行することが可能である因子を指す。実施形態では、改変は、例えば改変の不在下での構成成分の発現又は活性と比較して、脂質代謝経路の構成成分の発現又は活性の増加、例えば、脂質代謝経路の構成成分の発現又は活性における、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍以上の増加をもたらす。実施形態では、改変は、例えば改変の不在下での構成成分の発現又は活性と比較して、脂質代謝経路の構成成分の発現又は活性の減少、例えば、脂質代謝経路の構成成分の発現又は活性における、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍以上の減少をもたらす。脂質代謝経路の構成成分の発現又は活性が減少する一部の実施形態では、構成成分は、脂質代謝経路の負の調節因子である。一実施形態では、改変は、脂質代謝モジュレータをコードする異種又は外因性の核酸配列を含む。一実施形態では、改変は、例えば、細胞の脂質代謝をモジュレートするために分子又はポリペプチドの存在下で細胞を培養することによる、細胞に導入することができる外因性脂質代謝モジュレータ、例えば、低分子又はポリペプチドである。
【００７０】
本明細書で互換的に使用される用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）、又はＤＮＡ若しくはそのＲＮＡの組合せ、及び一本鎖、二本鎖又は三本鎖形態のそのポリマーを指す。用語「核酸」には、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸分子は合成であり（例えば、化学合成され若しくは人工的であり）、又は組換えである。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸に類似した結合特性を有し、天然に存在する又は存在しないヌクレオチドに類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの類似体又は誘導体を含有する分子を包含する。特に指示されない限り、特定の核酸配列は、明示的に示される配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、変性コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的な配列も暗に包含する。具体的には、変性コドン置換は、１つ又は複数の選択される（又は全ての）コドンの第３位が混合基及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１ページ（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８ページ（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８ページ（１９９４））。
【００７１】
本明細書に互換的に使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合されるアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に限界はない。一実施形態では、タンパク質は、１を超える、例えば、２、３、４、５又はそれより多いポリペプチドを含むことができ、ここで、各ポリペプチドは共有又は非共有結合／相互作用によって別のポリペプチドに会合している。ポリペプチドは、ペプチド結合によって又はペプチド結合以外の手段によって互いに連結される２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で用いる本用語は、当技術分野で一般的に例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短い鎖、並びに、当技術分野で多くのタイプがあるタンパク質と一般的に呼ばれるより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同的なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。
【００７２】
「組換え生成物」は、細胞又は無細胞系によって生成することができる生成物を指す。生成物は、分子、核酸、ポリペプチド又はそれらの任意のハイブリッドであってよい。組換え生成物とは、生成物の少なくとも１つの構成成分又は生成物の生成若しくは発現を制御する配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、遺伝子操作によって形成されたものである。組換え生成物又は組換え生成物をコードする構築物を生成するために本明細書で用いられる遺伝子操作は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ発現技術（例えば、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）に記載されている）；部位特異的、スキャニング又はランダム突然変異誘発；ＣＲＩＳＰＲをベースとした戦略を用いるゲノム改変戦略；及び、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をベースとした戦略を包含する。例として、組換え生成物が核酸である実施形態では、組換え核酸の少なくとも１つのヌクレオチド、又は組換え核酸の生成、例えば転写を制御する配列の少なくとも１つのヌクレオチドは、遺伝子操作によって形成された。一実施形態では、組換え生成物は、組換えポリペプチドである。一実施形態では、組換え生成物は、天然に存在する生成物である。一実施形態では、組換え生成物は、天然に存在しない生成物、例えば合成生成物である。一実施形態では、組換え生成物の一部は天然に存在するが、組換え生成物の別の部分は天然に存在しない。別の実施形態では、組換え生成物の第１の部分は天然に存在する分子であるが、組換え生成物の別の部分は第１の部分と異なる別の天然に存在する分子である。
【００７３】
「組換えポリペプチド」は、本明細書に記載される細胞によって生成することができるポリペプチドを指す。組換えポリペプチドとは、ポリペプチドをコードする配列の少なくとも１つのヌクレオチド又はポリペプチドの発現を制御する配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、遺伝子操作又は人為操作（細胞又は前駆細胞の）によって形成されたものである。例えば、少なくとも１つのヌクレオチドが変更された、例えば、それは細胞に導入された、又はそれは遺伝子操作された再配列の生成物である。一実施形態では、組換えポリペプチドの配列は、ポリペプチド又はタンパク質の天然に存在する又は天然に存在しないアイソフォームと異ならない。一実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド又はタンパク質の天然に存在する又は存在しないアイソフォームの配列と異なる。一実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は、同じ種に由来する。一実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞の内因性ゲノムによってコードされるポリペプチドと同じであるか、実質的に同じであるか、又は、１％以下、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％異なる。一実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は同じ種に由来する、例えば、組換えポリペプチドはヒトポリペプチドであり、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は異なる種に由来する、例えば、組換えポリペプチドはヒトポリペプチドであり、細胞は非ヒト、例えば、げっ歯動物、例えばＣＨＯ、他の哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、ウイルス細胞又は細菌細胞である。一実施形態では、組換えポリペプチドは細胞に外因性である、言い換えると、細胞は第１の種に由来し、組換えポリペプチドは第２の種に由来する。一実施形態では、ポリペプチドは合成ポリペプチドである。一実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しない供給源に由来する。一実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチド又はタンパク質の天然に存在する又は天然に存在しないアイソフォームとアミノ酸配列が異ならない、ヒトポリペプチド又はタンパク質である。一実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチド又はタンパク質の天然に存在する又は天然に存在しないアイソフォームと、１以下、２、３、４、５、１０、１５又は２０アミノ酸残基で異なる。一実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチドの天然に存在するアイソフォームと、そのアミノ酸残基の１％以下、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％又は１５％で異なる。組換えポリペプチドの一部がヒトポリペプチドの天然に存在する又は天然に存在しないアイソフォームの一部に由来する配列を含む実施形態では、組換えポリペプチドのその部分は、天然に存在する又は天然に存在しないアイソフォームの対応する部分と、１以下、２、３、４、５、１０、１５若しくは２０アミノ酸残基、又はそのアミノ酸残基の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％若しくは１５％異なる。
【００７４】
本明細書で用いる「相同的」、「同一性」又は「類似性」は、２つのポリマー分子の間の、例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子の間の、又は２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンによって占有されるならば、それらはその位置で相同性又は同一である。２つの配列の間の相同性は、一致する又は相同的位置の数の一次関数である；例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマー中の５つの位置）が相同性であるならば、２つの配列は５０％相同性である；位置の９０％（例えば、１０のうちの９つ）が一致するか又は相同性であるならば、２つの配列は９０％相同性である。
【００７５】
本明細書で用いる用語「次世代生物製剤」又は「ＮＧＢ」は、細胞を含む生物学的組成物又は細胞によって生成される組成物を指す。生物学的組成物は、少なくとも１つの天然の構成成分による組成物、少なくとも１つの天然の構成成分及び少なくとも１つの非天然の構成成分による組成物、少なくとも１つの天然の構成成分及び少なくとも１つの天然の構造物による組成物、並びに少なくとも１つの天然の構成成分及び少なくとも１つの非天然の構造物による組成物、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。次世代生物製剤は、複合体及び／又は非天然の構造物をしばしば含む。次世代生物製剤の例には、限定されるものではないが、融合タンパク質、酵素又は組換え酵素、タンパク質又は組換えタンパク質、延長された半減期を有する組換え因子、長時間作用性の治療法による成長ホルモン、多量体の糖タンパク質、次世代抗体、抗体断片又は抗体様タンパク質（ＡＬＰ）、ベシクル、エクソソーム、リポソーム、ウイルス及びウイルス様粒子、ムチン、ナノ粒子、細胞抽出物、及び試薬として使用される細胞が含まれる。
【００７６】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、ここに参照により本明細書に完全に組み込まれる。本発明を具体的態様に関して開示されたが、本発明の真の精神及び範囲を逸脱しない範囲で、本発明の他の態様及び変形を当業者が考案することができることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様及び均等な変形を含むと解釈されるものとする。
【００７７】
脂質代謝のモジュレーション
本開示は、例えば、脂質代謝のモジュレーションをもたらす改変を細胞又は無細胞系に導入することによって、細胞又は無細胞系において脂質代謝をモジュレートするための、方法及び組成物を特徴とする。実施形態では、本開示は、脂質代謝に関与する経路又は過程の複数の態様、例えば、新たな脂質生成、脂肪酸の再エステル化、脂肪酸の飽和又は不飽和化、脂肪酸伸長及びリン脂質生合成経路に影響する、包括的な調節因子の使用を特徴とする。例として、包括的な調節因子は、１つ又は複数の脂質代謝経路又は過程の上流にあり、そのために、包括的な調節因子は脂質代謝のいくつかの、例えば２つ以上の下流の過程又は下流の構成成分に影響を与える。一実施形態では、包括的な調節因子は、異なる脂質代謝過程又は経路に関与する１つを超える、例えば２つ以上の標的遺伝子の発現を活性化することができる転写因子である。したがって、いかなる理論にも束縛されることを望むことなく、本明細書に記載される包括的な調節因子の使用は、脂質代謝の単一の標的だけ又は他の構成成分をモジュレートする下流エフェクターの使用と比較して、より大きな増加を細胞の生成能力、堅牢性及び生存においてもたらすことができる。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、複数の脂質代謝経路の包括的又はより広範囲のモジュレーションは、細胞の生成能力、生成物品質及び堅牢性の向上に関与するより多くの過程に影響することによって、細胞の生成能力を増加させると考えられている。
【００７８】
本明細書に記載される脂質代謝経路は、脂質又は脂質関連分子の合成、分解、変換又は改変に関する過程を指す。脂質分子には、限定されるものではないが、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質及びステロール脂質、例えばコレステロール及びポリケチドが含まれる。脂質代謝経路の例には、限定されるものではないが以下が含まれる：新たな脂質生成、脂肪酸の再エステル化、脂肪酸の飽和、脂肪酸の不飽和化、脂肪酸伸長及びリン脂質生合成。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞を提供する。脂質代謝をモジュレートする改変は、脂質代謝に関与する構成成分の発現を増加又は減少させる因子であってよい。一部の実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、脂質代謝モジュレータ（ＬＭＭ）をコードする外因性核酸を含む。そのような実施形態では、ＬＭＭをコードする外因性核酸は、本明細書に記載される核酸送達方法又は技術、例えば、形質導入又はトランスフェクションのいずれかによって細胞に導入される。
【００７９】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、脂質代謝をモジュレートする１つ又は複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変を含む細胞を提供する。脂質代謝をモジュレートする２つ以上の改変を細胞が含む実施形態では、脂質代謝をモジュレートする各改変は、ＬＭＭをコードする外因性核酸を含む。一実施形態では、ＬＭＭをコードする２つ以上の外因性核酸の各々は、同じ核酸分子の中に位置することができるか、又は２つ以上の異なる核酸分子上に置かれる。ＬＭＭをコードする２つ以上の核酸配列を細胞が含むそのような実施形態では、ＬＭＭは互いに異なる、例えば、異なるポリペプチド配列をコードするか又は異なる機能を有する。
【００８０】
実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＬＭＭをコードする外因性核酸を導入して発現させることによる細胞での脂質代謝のモジュレーションは、以下の１つ又は複数を変更する、例えば増加又は減少させる：
ｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）；
ｉｉ）脂質代謝経路に関与する構成成分の活性（例えば、酵素活性）；
ｉｉｉ）細胞に存在する脂質（例えば、リン脂質又はコレステロール）の量；
ｉｖ）脂質ラフトの量又は脂質ラフト形成の速度；
ｖ）細胞膜（例えば、原形質膜、小胞膜又はオルガネラ膜）の流動性、透過性及び／又は厚さ；
ｖｉ）不飽和脂質への飽和脂質の変換又は飽和脂質への不飽和脂質の変換；
ｖｉｉ）飽和脂質又は不飽和脂質、例えば一価不飽和脂質の量；
ｖｉｉｉ）ＥＲ活性を増加させる良好な組成を達成するための、細胞中の脂質の組成；
ｉｘ）ＥＲの拡張（例えば、ＥＲのサイズ、ＥＲ膜表面、又はＥＲを構成する及び／若しくはその中に存在するタンパク質及び脂質の量）；
ｘ）ゴルジの拡張（例えば、ゴルジの数及びサイズ、ゴルジ表面又はゴルジの中に存在するタンパク質及び分子の数若しくは量）；
ｘｉ）分泌小胞の量又は分泌小胞の形成；
ｘｉｉ）生成物の分泌の量又は速度；
ｘｉｉｉ）増殖能力、例えば、増殖速度；
ｘｉｖ）培養生存度又は細胞生存；
ｘｖ）膜受容体の活性化；
ｘｖｉ）折り畳まれてないタンパク質の応答（ＵＰＲ）；
ｘｖｉｉ）生成物の生成の収率又は速度；
ｘｖｉｉｉ）生成物の品質（例えば、凝集、グリコシル化不均一性、断片化、適切な折畳み又はアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブル）；並びに／或いは
ｘｉｘ）細胞成長／増殖又は細胞比増殖速度。
【００８１】
一実施形態では、脂質代謝のモジュレーションは、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞と比較して、上記の特性のいずれかにおける増加、例えば、上記の特性のいずれかにおける、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％、又はそれより多い、或いは、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍以上の増加をもたらす。一実施形態では、脂質代謝のモジュレーションは、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞と比較して、上記の特性のいずれの減少、例えば、上記の特性のいずれかにおける、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％、又はそれより多い、或いは、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍以上の減少をもたらす。
【００８２】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、１つ又は複数の脂質代謝経路に関与する構成成分の発現又は活性を増加又は減少する。脂質代謝をモジュレートする改変が脂質代謝経路の構成成分の発現、例えば転写若しくは翻訳の増加、又はその活性の増加をもたらす実施形態では、構成成分は、脂質代謝経路の正の調節因子である。脂質代謝をモジュレートする改変が脂質代謝経路の構成成分の発現、例えば転写若しくは翻訳の減少、又はその活性の減少をもたらす実施形態では、構成成分は、脂質代謝経路の負の調節因子である。脂質代謝経路の遺伝子の発現、例えば転写及び／又は翻訳を定量化するためのアッセイは当技術分野で公知であり、遺伝子をコードするｍＲＮＡの量を定量化すること；又は遺伝子生成物若しくはポリペプチドの量を定量化すること；ＰＣＲをベースとしたアッセイ、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ；ノーザンブロット；又はマイクロアレイを含む。脂質代謝経路の構成成分、例えば脂質代謝経路の酵素の活性を定量化するためのアッセイは、脂質代謝経路の特定の構成成分に特異的である。
【００８３】
細胞の脂質代謝のモジュレーションが細胞中の脂質のレベル又は量の増加をもたらす実施形態では、細胞中の脂質の全体のレベル又は全体の量を増加させることができる。別の実施形態では、細胞中の１種又は複数種の脂質、例えばリン脂質又はコレステロールのレベル又は量を増加させることができる。細胞中の脂質（例えば、全体の又は選択された脂質種）のレベル又は量の増加は、脂質代謝をモジュレートする改変を含まない細胞と比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の細胞、例えば生細胞中の脂質のレベル又は量の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、３倍、４倍若しくは５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍の増加を含む。細胞中の脂質のレベル又は量を定量化するためのアッセイは当技術分野で公知であり、酵素アッセイ及び酸化アッセイ、並びに特定のコンパートメント（例えば、オルガネラ）中の又は全細胞からの脂質構成成分の質量分析による測定が含まれる。
【００８４】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、細胞生存の増加をもたらす。例えば、細胞生存は、細胞アポトーシス、例えば、死滅させられたか又は死滅した細胞の数又は量を判定又は定量化することによって測定することができる。細胞生存の増加は、脂質代謝をモジュレートする改変を含まない細胞と比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の細胞、例えば生細胞の数の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、３倍、４倍若しくは５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍の増加を含む。代わりに、細胞生存の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションのない細胞と比較して、脂質代謝のモジュレーションの後のアポトーシス細胞の数の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又はそれより多い減少を含む。細胞生存又はアポトーシスを検出するための方法、例えばアネキシンＶアッセイは当技術分野で公知であり、本明細書で実施例に記載される。
【００８５】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、培養生存度の増加をもたらす。例えば、培養生存度は、生の細胞、例えば、培養若しくは細胞集団の中の生細胞、又は生存可能であることに関した特性、例えば、増殖マーカー、インタクトなＤＮＡを有するか、又はアポトーシスマーカーを提示しない細胞の数又は量を判定又は定量化することによって測定することができる。培養生存度の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションのない細胞と比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の細胞、例えば生細胞の数の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれより多い、或いは、１倍、２倍、３倍、４倍若しくは５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍、又はそれより多い増加を含む。培養生存度を判定するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書で例３に記載する。培養生存度を評価するための他の方法には、限定されるものではないが、トリパンブルー排除方法と、続く血球計数器又はＶｉ−ＣＥＬＬ細胞（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した計数が含まれる。生存可能なバイオマスを判定するための他の方法には、高周波インピーダンス又はキャパシタンスを使用した方法（例えば、Ｃａｒｖｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄ、２００６、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５０：３５〜４８ページ）、又はラマン分光法を使用した方法（例えば、Ｍｏｒｅｔｔｏ等、２０１１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ、Ｖｏｌ．１４）が含まれる。
【００８６】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、細胞増殖の増加をもたらす。例えば、細胞の増殖する能力は、細胞の数、細胞倍加又は細胞の増殖速度を定量化又は計数することによって測定することができる。代わりに、増殖する細胞は、例えば、フローサイトメトリー分析による細胞のゲノム含有量（例えば、複製ＤＮＡ）の分析によって、又は増殖マーカー、例えばＫｉ６７、細胞周期に関与するリン酸化サイクリン−ＣＤＫ複合体の存在によって同定することができる。増殖する能力の増加は、脂質代謝のモジュレーションの後の細胞の数、又は増殖マーカーを発現する細胞の数の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍、若しくはそれより多い増加を含む。代わりに、増殖する能力の増加は、脂質代謝のモジュレーションの後の細胞の倍加又は増殖速度の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％若しくはそれより多い、或いは、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍、又はそれより多い増加を含む。細胞計数は細胞計数機を使用して、又は血球計数器の使用によって実行することができる。
【００８７】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、生成能力、例えば、生成される生成物の総量、量若しくは収量、又は生成速度の増加をもたらす。生成される生成物の総量、量又は収量の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞によって生成される生成物の総量、量又は収量と比較して、脂質代謝のモジュレーションの後に生成される生成物の総量、量又は収量の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の増加を含む。生成速度の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞の生成速度と比較して、脂質代謝のモジュレーションの後に生成される生成物の総量、量又は収量の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、若しくはそれより多い増加を含む。一実施形態では、生成速度は、特定の時間単位において生成される生成物の総量、量又は収量を判定することによって決定される。
【００８８】
一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変は、生成物の品質、例えば、凝集、グリコシル化状態若しくは不均一性、断片化、適切な折畳み若しくはアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブルの増加をもたらす。生成物の品質の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞で観察されるものと比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の非凝集生成物の総量若しくは量の増加、非凝集生成物の凝集生成物に対する比の増加、又は凝集生成物の総量若しくは量の減少を含む。生成物の品質の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞で観察されるものと比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の、適切に折り畳まれた若しくは組み立てられた生成物の総量若しくは量の増加、適切に折り畳まれた若しくは組み立てられた生成物対誤って折り畳まれた、折り畳まれてない、部分的に組み立てられた、若しくは組み立てられてない生成物の比の増加、又は誤って折り畳まれた、折り畳まれてない、部分的に組み立てられた、若しくは組み立てられてない生成物の総量若しくは量の減少を含む。生成物の品質の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞で観察されるものと比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の、断片化していない若しくは完全長の生成物の総量若しくは量の増加、又は断片化生成物の総量若しくは量の減少を含む。生成物の品質の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞で観察されるものと比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の、機能的生成物の総量若しくは量の増加、又は非機能的若しくは機能障害生成物の総量若しくは量の減少を含む。生成物の品質の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞で観察されるものと比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の、グリカン不均一性の増加又は減少を含む。生成物の品質の増加は、例えば、脂質代謝のモジュレーションなしの細胞で観察されるものと比較して、脂質代謝のモジュレーションの後の、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、若しくはそれより多い、又は１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍以上の、機能的生成物の総量若しくは量の増加、又は非機能的若しくは機能障害生成物の総量若しくは量の減少を含む。
【００８９】
脂質代謝モジュレータ
本明細書に記載されるように、脂質代謝のモジュレーションは、ＬＭＭを発現させるか若しくは導入することによって、又はＬＭＭの調節を変更することによって達成することができる。一実施形態では、例えば、ＬＭＭをコードする外因性核酸を導入することによって、又は、プロモーターエレメント若しくは他の調節転写エレメントを導入することによって発現を増加させることによって、ＬＭＭは細胞で過剰発現される。別の実施形態では、ＬＭＭの発現又は活性は、例えば、ＬＭＭの阻害剤又は外因性阻害性核酸、例えばＲＮＡ干渉剤を導入することによって阻害又は減少される。阻害性核酸の例には、ＬＭＭ、例えばＬＭＭをコードするｍＲＮＡを標的にする、ショートインタフィアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。一実施形態では、ＬＭＭ活性又は発現を調節する翻訳後修飾又は他の内因性調節機構を変更することによって、ＬＭＭの活性又は発現を増加又は減少する。リン酸化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、アセチル化、メチル化又はグリコシル化を含む（但し、これらに限定されない）翻訳後修飾による調節は、ＬＭＭの発現又は活性を増加又は減少させることができる。例として、翻訳後修飾の調節は、ＬＭＭを改変する酵素若しくは分子のモジュレーションを通して、或いは翻訳後修飾が起こることができないような又はより頻繁に若しくは構成的に起こるようなＬＭＭの改変を通して、達成することができる。ＬＭＭの調節は、ＬＭＭの発現又は活性を増加又は減少させる、例えば、ｍｉＲＮＡ調節、タンパク質切断、特異的アイソフォームの発現、選択的スプライシング及び分解の１つ又は複数を増加又は減少させることができる、内因性調節機構をモジュレートすることを含むこともできる。
【００９０】
一実施形態では、ＬＭＭは、脂質代謝経路の構成成分の発現、例えば転写、又は活性をモジュレートする、例えば増加又は減少させる。別の実施形態では、ＬＭＭは、脂質又は脂質関連分子の合成、分解、伸長又は構造的立体配座（例えば、飽和若しくは不飽和化、又はエステル化）をモジュレートする、例えば増加又は減少させる。脂質代謝経路の例示的なＬＭＭ及び／又は構成成分は、表１に掲載されるが、掲載のものに限定されない。
【表１−１】
2019514399.tif 000003
【表１−２】
2019514399.tif 000004
【００９１】
一実施形態では、ＬＭＭは、例えば表１に提供される脂質代謝経路に関与する構成成分、例えば遺伝子生成物と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％のアミノ酸配列同一性又は相同性を含む；又は、例えば表１に提供される脂質代謝経路に関与する構成成分、例えば遺伝子生成物のアミノ酸配列から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基異で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基が異なる。
【００９２】
一実施形態では、ＬＭＭは、例えば表１に提供される脂質代謝経路に関与する構成成分の機能的断片を含む。本明細書に記載されるＬＭＭの機能的断片は、ＬＭＭの１つ又は複数の機能的ドメインを含むことができる。例として、転写因子であるＬＭＭの機能的断片は、ＤＮＡ結合性ドメイン及びトランス活性化ドメインを含む。例として、酵素であるＬＭＭの機能的断片は、酵素活性を有するドメインを含む。本明細書に記載されるＬＭＭの機能的断片は、機能的活性を、例えば、完全長ＬＭＭの機能的活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％保持する。ＬＭＭの機能的断片は、当業者が実験的に判定することができるか、又は、機能的ドメインの配列相同性に基づくアルゴリズムを使用して予測することができる。例示的なＬＭＭは、以下でさらに記載される。
【００９３】
本明細書に記載される方法の実施形態のいずれでも、ＬＭＭは転写調節因子である。一実施形態では、ＬＭＭは、ＤＮＡに結合するか又はＤＮＡに結合する複合体の中で会合し、脂質代謝に関与する１つ又は複数の遺伝子生成物の転写のためのＲＮＡポリメラーゼを動員するか又はＲＮＡポリメラーゼを動員する複合体の中で会合する、転写因子又は転写活性化因子である。一実施形態では、ＬＭＭは、ステロール結合性エレメント及び／又はＥボックスプロモーター配列に結合する。一実施形態では、ＬＭＭは、ステロール調節エレメント結合性因子１（ＳＲＥＢＦ１）又はステロール調節エレメント結合性因子２（ＳＲＥＢＦ２）又はその機能的断片若しくはアイソフォームを含む。
【００９４】
一実施形態では、ＬＭＭは、包括的な転写活性化因子又は転写因子を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、例えば、表１に提供される脂質代謝経路の２つ以上、例えば、２、３、４、５、６、又はそれより多い構成成分の転写をモジュレートすることが可能である。別の実施形態では、ＬＭＭは、２つ以上の脂質代謝経路の１つ又は複数、例えば、１、２、３、４若しくは５、又はそれより多い構成成分、例えば表１に提供される構成成分及び経路の転写をモジュレートすることが可能である。
【００９５】
ステロール調節エレメント結合性因子１（ＳＲＥＢＦ１）は、標的遺伝子のプロモーター領域に存在するステロール調節エレメント（ＳＲＥ）及びＥボックスプロモーター配列（Ｈａｇｅｎ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｕｅｎｃａ等、２０１０）に結合することによって脂質生成、脂肪酸の再エステル化、脂肪酸の不飽和化及び伸長、並びにリン脂質生合成に関与する遺伝子の転写を上方制御する包括的な転写活性化因子である。ＳＲＥＢＦ１遺伝子自体の転写は、遺伝子のプロモーター領域中の転写調節エレメントの中でもステロール調節エレメント（ＳＲＥ）の存在によって内因的に調節される。これに加えて、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、脂肪酸媒介改変及びタンパク分解性プロセシングを含む多数の翻訳後調節機構が、ＳＲＥＢＦ１周囲に固定されているタイトに制御されているが適応性が高いホメオスタシス系に寄与する。
【００９６】
完全長ＳＲＥＢＦ１は合成されて、主に小胞体（ＥＲ）に局在化する。膜一体化ＳＲＥＢＦ１は、ゴルジへのＳＲＥＢＦ１の移動を促進することができるＳＲＥＢＦ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）と複合体を形成する。しかし、高いステロールレベル（特にコレステロール）が存在する場合は、ＳＣＡＰの立体配置変化が誘導され、それは、膜一体化タンパク質ｉｎｓｉｇ（インスリン誘導遺伝子）への結合を助け、したがってこの複合体の移動を阻害する。ステロールの不在下では、ｉｎｓｉｇはＳＣＡＰに結合せず、したがって、ＣＯＰＩＩ媒介小胞形成、及びゴルジへのＳＲＥＢＦ：ＳＣＡＰ複合体の以降の移動を可能にする。逐次的なタンパク分解性切断は、細胞質に直ちに存在するが核に移動する、ＳＲＥＢＦ１のＮ末端の塩基性ヘリックスループヘリックスロイシンジッパー（ｂＨＬＨｌｚ）を遊離する部位１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）及び部位２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）タンパク質によって媒介されて、ゴルジにおいて起こる。切断されたＳＲＥＢＦ１の上に存在するリジン残基は２６Ｓプロテアソームによってユビキチン化され、分解されるが、このユビキチン化は、核への移動を可能にするリジン残基のアセチル化を通して阻害することができる。最後に、核ＳＲＥＢＦ１は、新たな脂質生成（脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）及びアセチルｃｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ））、脂肪酸の再エステル化（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、グリセロール−３−リン酸（ＧＰＡＴ）及びリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ））、リン脂質生合成（ＣＴＰ：ホスホコリンシチジルトランスフェラーゼ（ＣＣＴ））、脂肪酸脱飽和（ステアロイル−ｃｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１））の役割を担ういくつかの遺伝子の上流の、ステロール調節エレメント（ＳＲＥ）配列に結合することができる。核ＳＲＥＢＦ１は、完全長ＳＲＥＢＦ１遺伝子自体の転写を活性化することも可能であるが、これは同じく遺伝子の上流に位置する肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）プロモーター配列の活性化にも依存する（Ｂｒｏｗｎ、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  １９９７  −  ＢＲＯＷＮ，Ｍ．Ｓ．及びＧＯＬＤＳＴＥＩＮ，Ｊ．Ｌ．、１９９７。ＳＲＥＢＰ経路：膜結合転写因子のタンパク質分解によるコレステロール代謝の調節（Ｔｈｅ  ＳＲＥＢＰ  Ｐａｔｈｗａｙ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｏｕｎｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）。Ｃｅｌｌ、８９（３）、３３１〜３４０ページ）（Ｈａｇｅｎ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｕｅｎｃａ−Ｈａｇｅｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−ＣＵＥＮＣＡ，Ｓ．及びＶＩＤＡＬ−ＰＵＩＧ，Ａ．、２０１０。ＳＲＥＢＰ１による膜脂質組成物のアロスタティック制御（Ａｎ  ａｌｌｏｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＳＲＥＢＰ１）。ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ、５８４（１２）、２６８９〜２６９８ページ）。
【００９７】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１、そのアイソフォーム、又は機能的断片を含む。ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列は、以下で提供される：
MDELAFGEAALEQTLAEMCELDTAVLNDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDAPYAGGETGDTGPSSPGANSPESFSSASLASSLEAFLGGPKVTPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGPGIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFIKADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGMKPEVVETLTPPPSDAGSPSQSSPLSFGSRASSSGGSDSEPDSPAFEDSQVKAQRLPSHSRGMLDRSRLALCVLAFLCLTCNPLASLFGWGILTPSDATGTHRSSGRSMLEAESRDGSNWTQWLLPPLVWLANGLLVLACLALLFVYGEPVTRPHSGPAVHFWRHRKQADLDLARGDFPQAAQQLWLALQALGRPLPTSNLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGQAGGLLRDRGLRKDARASARDAAVVYHKLHQLHAMGKYTGGHLAASNLALSALNLAECAGDAISMATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPLAMQWLCHPVGHRFFVDGDWAVHGAPPESLYSVAGNPVDPLAQVTRLFREHLLERALNCIAQPSPGAADGDREFSDALGYLQLLNSCSDAAGAPACSFSVSSSMAATTGPDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLYPLVEHIPQVLQDTERPLPRAALYSFKAARALLDHRKVESSPASLAICEKASGYLRDSLASTPTGSSIDKAMQLLLCDLLLVARTSLWQRQQSPASVQVAHGTSNGPQASALELRGFQHDLSSLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPARTHQLLDRSLRRRAGSSGKGGTTAELEPRPTWREHTEALLLASCYLPPAFLSAPGQRMSMLAEAARTVEKLGDHRLLLDCQQMLLRLGGGTTVTSS（配列番号１）。
【００９８】
ＳＲＥＢＦ１のヌクレオチド配列は、以下に提供する：
atggacgagctggccttcggtgaggcggctctggaacagacactggccgagatgtgcgaactggacacagcggttttgaacgacatcgaagacatgctccagctcatcaacaaccaagacagtgacttcccgggcctgtttgacgccccctatgctgggggtgagacaggggacacaggccccagcagcccaggtgccaactctcctgagagcttctcttctgcttctctggcctcctctctggaagccttcctgggaggacccaaggtgacacctgcacccttgtcccctccaccatcggcacccgctgctttaaagatgtacccgtccgtgtcccccttttcccctgggcctgggatcaaagaggagccagtgccactcaccatcctacagcctgcagcgccacagccgtcaccggggaccctcctgcctccgagcttccccgcaccacccgtacagctcagccctgcgcccgtgctgggttactcgagcctgccttcaggcttctcagggacccttccaggaaacactcagcagccaccatctagcctgccgctggcccctgcaccaggagtcttgcccacccctgccctgcacacccaggtccaaagcttggcctcccagcagccgctgccagcctcagcagcccctagaacaaacactgtgacctcacaggtccagcaggtcccagttgtactgcagccacacttcatcaaggcagactcactgctgctgacagctgtgaagacagatgcaggagccaccgtgaagactgcaggcatcagcaccctggctcctggcacagccgtgcaggcaggtcccctgcagaccctggtgagtggagggaccatcttggccacagtacctttggttgtggacacagacaaactgcccatccaccgactcgcagctggcagcaaggccctaggctcagctcagagccgtggtgagaagcgcacagcccacaatgccattgagaagcgctaccggtcttctatcaatgacaagattgtggagctcaaagacctggtggtgggcactgaagcaaagctgaataaatctgctgtcttgcgcaaggccatcgactacatccgcttcttgcagcacagcaaccagaagctcaagcaggagaacctgaccctacgaagtgcacacaaaagcaaatcactgaaggacctggtgtcagcttgtggcagtggaggaggcacagatgtgtctatggagggcatgaaacccgaagtggtggagacgcttacccctccaccctcagacgccggctcaccctcccagagtagccccttgtcttttggcagcagagctagcagcagtggtggtagtgactctgagcccgacagtccagcctttgaggatagccaggtcaaagcccagcggctgccttcacacagccgaggcatgctggaccgctcccgcctggccctgtgtgtactggcctttctgtgtctgacctgcaatcctttggcctcgcttttcggctggggcattctcactccctctgatgctacgggtacacaccgtagttctgggcgcagcatgctggaggcagagagcagagatggctctaattggacccagtggttgctgccacccctagtctggctggccaatggactactagtgttggcctgcttggctcttctctttgtctatggggaacctgtgactaggccacactctggcccggctgtacacttctggagacatcgcaaacaagctgacctggatttggcccggggagatttcccccaggctgctcaacagctgtggctggccctgcaagcgctgggccggcccctgcccacctcaaacctggatctggcctgcagtctgctttggaacctcatccgccacctgctccagcgtctctgggtgggccgctggctggcaggccaggccgggggcctgctgagggaccgtgggctgaggaaggatgcccgtgccagtgcccgggatgcggctgttgtctaccataagctgcaccagctgcatgccatgggcaagtacacaggaggacatcttgctgcttctaacctggcactaagtgccctcaacctggctgagtgcgcaggagatgctatctccatggcaacactggcagagatctatgtggcagcggccctgagggtcaaaaccagcctcccaagagccctgcacttcttgacacgtttcttcctgagcagcgcccgccaggcctgcctagcacagagcggctcggtgcctcttgccatgcagtggctctgccaccctgtaggtcaccgtttctttgtggacggggactgggccgtgcacggtgcccccccggagagcctgtacagcgtggctgggaacccagtggatccgctggcccaggtgacccggctattccgtgaacatctcctagagcgagcgttgaactgtattgctcagcccagcccaggggcagctgacggagacagggagttctcagatgcccttggatatctgcagttgctaaatagctgttctgatgctgccggggctcctgcttgcagtttctctgtcagctccagcatggctgccaccactggcccagacccagtggccaagtggtgggcctcactgacagctgtggtgatccactggctgaggcgggatgaagaggcagctgagcgcttgtacccactggtagagcatatcccccaggtgctgcaggacactgagagacccctgcccagggcagctctgtactccttcaaggctgcccgggctctgctggaccacagaaaggtggaatctagcccagccagcctggccatctgtgagaaggccagtgggtacctgcgggacagcttagcctctacaccaactggcagttccattgacaaggccatgcagctgctcctgtgtgatctacttcttgtggcccgtaccagtctgtggcagcggcagcagtcaccagcttcagtccaggtagctcacggtaccagcaatggaccccaggcctctgctctggagctgcgtggtttccaacatgacctgagcagcctgcggcggttggcacagagcttccggcctgctatgaggagggtattcctacatgaggccacagctcggctgatggcaggagcaagtcctgcccggacacaccagctcctggatcgcagtctgaggaggagggcaggttccagtggcaaaggaggcactacagctgagctggagccacggcccacatggcgggagcacaccgaggccctgctgttggcatcctgctatctgccccctgccttcctgtcggctcctgggcagcgaatgagcatgctggccgaggcggcacgcaccgtagagaagcttggcgatcaccggctactgctggactgccagcagatgctcctgcgcctgggcggcggaaccaccgtcacttccagctag（配列番号２）。
【００９９】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号１と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性；或いは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号１から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。
【０１００】
ＳＲＥＢＦ１のアイソフォームは当技術分野で公知であり、アイソフォームａ及びアイソフォームｂ、並びに種又は細胞特異的、例えばＣＨＯ細胞特異的アイソフォーム、例えばアイソフォームｃを含む。ＳＲＥＢＦ１アイソフォームａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１００５２９１．２）を、以下に提供する。
MDEPPFSEAALEQALGEPCDLDAALLTDIEGEVGAGRGRANGLDAPRAGADRGAMDCTFEDMLQLINNQD
SDFPGLFDPPYAGSGAGGTDPASPDTSSPGSLSPPPATLSSSLEAFLSGPQAAPSPLSPPQPAPTPLKMY
PSMPAFSPGPGIKEESVPLSILQTPTPQPLPGALLPQSFPAPAPPQFSSTPVLGYPSPPGGFSTGSPPGN
TQQPLPGLPLASPPGVPPVSLHTQVQSVVPQQLLTVTAAPTAAPVTTTVTSQIQQVPVLLQPHFIKADSL
LLTAMKTDGATVKAAGLSPLVSGTTVQTGPLPTLVSGGTILATVPLVVDAEKLPINRLAAGSKAPASAQS
RGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIIELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLSLRTA
VHKSKSLKDLVSACGSGGNTDVLMEGVKTEVEDTLTPPPSDAGSPFQSSPLSLGSRGSGSGGSGSDSEPD
SPVFEDSKAKPEQRPSLHSRGMLDRSRLALCTLVFLCLSCNPLASLLGARGLPSPSDTTSVYHSPGRNVL
GTESRDGPGWAQWLLPPVVWLLNGLLVLVSLVLLFVYGEPVTRPHSGPAVYFWRHRKQADLDLARGDFAQ
AAQQLWLALRALGRPLPTSHLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLQQDCALRVDASASARDAA
LVYHKLHQLHTMGKHTGGHLTATNLALSALNLAECAGDAVSVATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRF
FLSSARQACLAQSGSVPPAMQWLCHPVGHRFFVDGDWSVLSTPWESLYSLAGNPVDPLAQVTQLFREHLL
ERALNCVTQPNPSPGSADGDKEFSDALGYLQLLNSCSDAAGAPAYSFSISSSMATTTGVDPVAKWWASLT
AVVIHWLRRDEEAAERLCPLVEHLPRVLQESERPLPRAALHSFKAARALLGCAKAESGPASLTICEKASG
YLQDSLATTPASSSIDKAVQLFLCDLLLVVRTSLWRQQQPPAPAPAAQGTSSRPQASALELRGFQRDLSS
LRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPTRTHQLLDRSLRRRAGPGGKGGAVAELEPRPTRREHAEAL
LLASCYLPPGFLSAPGQRVGMLAEAARTLEKLGDRRLLHDCQQMLMRLGGGTTVTSS（配列番号２８）
【０１０１】
ＳＲＥＢＦ１アイソフォームａの核酸配列、又はｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１００５２９１．２）を、以下に提供する。
AGCAGAGCTGCGGCCGGGGGAACCCAGTTTCCGAGGAACTTTTCGCCGGCGCCGGGCCGCCTCTGAGGCC
AGGGCAGGACACGAACGCGCGGAGCGGCGGCGGCGACTGAGAGCCGGGGCCGCGGCGGCGCTCCCTAGGA
AGGGCCGTACGAGGCGGCGGGCCCGGCGGGCCTCCCGGAGGAGGCGGCTGCGCCATGGACGAGCCACCCT
TCAGCGAGGCGGCTTTGGAGCAGGCGCTGGGCGAGCCGTGCGATCTGGACGCGGCGCTGCTGACCGACAT
CGAAGGTGAAGTCGGCGCGGGGAGGGGTAGGGCCAACGGCCTGGACGCCCCAAGGGCGGGCGCAGATCGC
GGAGCCATGGATTGCACTTTCGAAGACATGCTTCAGCTTATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCC
TATTTGACCCACCCTATGCTGGGAGTGGGGCAGGGGGCACAGACCCTGCCAGCCCCGATACCAGCTCCCC
AGGCAGCTTGTCTCCACCTCCTGCCACATTGAGCTCCTCTCTTGAAGCCTTCCTGAGCGGGCCGCAGGCA
GCGCCCTCACCCCTGTCCCCTCCCCAGCCTGCACCCACTCCATTGAAGATGTACCCGTCCATGCCCGCTT
TCTCCCCTGGGCCTGGTATCAAGGAAGAGTCAGTGCCACTGAGCATCCTGCAGACCCCCACCCCACAGCC
CCTGCCAGGGGCCCTCCTGCCACAGAGCTTCCCAGCCCCAGCCCCACCGCAGTTCAGCTCCACCCCTGTG
TTAGGCTACCCCAGCCCTCCGGGAGGCTTCTCTACAGGAAGCCCTCCCGGGAACACCCAGCAGCCGCTGC
CTGGCCTGCCACTGGCTTCCCCGCCAGGGGTCCCGCCCGTCTCCTTGCACACCCAGGTCCAGAGTGTGGT
CCCCCAGCAGCTACTGACAGTCACAGCTGCCCCCACGGCAGCCCCTGTAACGACCACTGTGACCTCGCAG
ATCCAGCAGGTCCCGGTCCTGCTGCAGCCCCACTTCATCAAGGCAGACTCGCTGCTTCTGACAGCCATGA
AGACAGACGGAGCCACTGTGAAGGCGGCAGGTCTCAGTCCCCTGGTCTCTGGCACCACTGTGCAGACAGG
GCCTTTGCCGACCCTGGTGAGTGGCGGAACCATCTTGGCAACAGTCCCACTGGTCGTAGATGCGGAGAAG
CTGCCTATCAACCGGCTCGCAGCTGGCAGCAAGGCCCCGGCCTCTGCCCAGAGCCGTGGAGAGAAGCGCA
CAGCCCACAACGCCATTGAGAAGCGCTACCGCTCCTCCATCAATGACAAAATCATTGAGCTCAAGGATCT
GGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCTGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTACATTCGCTTT
CTGCAACACAGCAACCAGAAACTCAAGCAGGAGAACCTAAGTCTGCGCACTGCTGTCCACAAAAGCAAAT
CTCTGAAGGATCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGGAGGGAACACAGACGTGCTCATGGAGGGCGTGAAGAC
TGAGGTGGAGGACACACTGACCCCACCCCCCTCGGATGCTGGCTCACCTTTCCAGAGCAGCCCCTTGTCC
CTTGGCAGCAGGGGCAGTGGCAGCGGTGGCAGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGG
ACAGCAAGGCAAAGCCAGAGCAGCGGCCGTCTCTGCACAGCCGGGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTGGC
CCTGTGCACGCTCGTCTTCCTCTGCCTGTCCTGCAACCCCTTGGCCTCCTTGCTGGGGGCCCGGGGGCTT
CCCAGCCCCTCAGATACCACCAGCGTCTACCATAGCCCTGGGCGCAACGTGCTGGGCACCGAGAGCAGAG
ATGGCCCTGGCTGGGCCCAGTGGCTGCTGCCCCCAGTGGTCTGGCTGCTCAATGGGCTGTTGGTGCTCGT
CTCCTTGGTGCTTCTCTTTGTCTACGGTGAGCCAGTCACACGGCCCCACTCAGGCCCCGCCGTGTACTTC
TGGAGGCATCGCAAGCAGGCTGACCTGGACCTGGCCCGGGGAGACTTTGCCCAGGCTGCCCAGCAGCTGT
GGCTGGCCCTGCGGGCACTGGGCCGGCCCCTGCCCACCTCCCACCTGGACCTGGCTTGTAGCCTCCTCTG
GAACCTCATCCGTCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTGGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCAGGGGGCCTG
CAGCAGGACTGTGCTCTGCGAGTGGATGCTAGCGCCAGCGCCCGAGACGCAGCCCTGGTCTACCATAAGC
TGCACCAGCTGCACACCATGGGGAAGCACACAGGCGGGCACCTCACTGCCACCAACCTGGCGCTGAGTGC
CCTGAACCTGGCAGAGTGTGCAGGGGATGCCGTGTCTGTGGCGACGCTGGCCGAGATCTATGTGGCGGCT
GCATTGAGAGTGAAGACCAGTCTCCCACGGGCCTTGCATTTTCTGACACGCTTCTTCCTGAGCAGTGCCC
GCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCCTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCCGTGGGCCA
CCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGTCCGTGCTCAGTACCCCATGGGAGAGCCTGTACAGCTTGGCCGGG
AACCCAGTGGACCCCCTGGCCCAGGTGACTCAGCTATTCCGGGAACATCTCTTAGAGCGAGCACTGAACT
GTGTGACCCAGCCCAACCCCAGCCCTGGGTCAGCTGATGGGGACAAGGAATTCTCGGATGCCCTCGGGTA
CCTGCAGCTGCTGAACAGCTGTTCTGATGCTGCGGGGGCTCCTGCCTACAGCTTCTCCATCAGTTCCAGC
ATGGCCACCACCACCGGCGTAGACCCGGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCTCTGACAGCTGTGGTGATCCACT
GGCTGCGGCGGGATGAGGAGGCGGCTGAGCGGCTGTGCCCGCTGGTGGAGCACCTGCCCCGGGTGCTGCA
GGAGTCTGAGAGACCCCTGCCCAGGGCAGCTCTGCACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCCCTGCTGGGCTGT
GCCAAGGCAGAGTCTGGTCCAGCCAGCCTGACCATCTGTGAGAAGGCCAGTGGGTACCTGCAGGACAGCC
TGGCTACCACACCAGCCAGCAGCTCCATTGACAAGGCCGTGCAGCTGTTCCTGTGTGACCTGCTTCTTGT
GGTGCGCACCAGCCTGTGGCGGCAGCAGCAGCCCCCGGCCCCGGCCCCAGCAGCCCAGGGCACCAGCAGC
AGGCCCCAGGCTTCCGCCCTTGAGCTGCGTGGCTTCCAACGGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGGCTGGCAC
AGAGCTTCCGGCCCGCCATGCGGAGGGTGTTCCTACATGAGGCCACGGCCCGGCTGATGGCGGGGGCCAG
CCCCACACGGACACACCAGCTCCTCGACCGCAGTCTGAGGCGGCGGGCAGGCCCCGGTGGCAAAGGAGGC
GCGGTGGCGGAGCTGGAGCCGCGGCCCACGCGGCGGGAGCACGCGGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCT
ACCTGCCCCCCGGCTTCCTGTCGGCGCCCGGGCAGCGCGTGGGCATGCTGGCTGAGGCGGCGCGCACACT
CGAGAAGCTTGGCGATCGCCGGCTGCTGCACGACTGTCAGCAGATGCTCATGCGCCTGGGCGGTGGGACC
ACTGTCACTTCCAGCTAGACCCCGTGTCCCCGGCCTCAGCACCCCTGTCTCTAGCCACTTTGGTCCCGTG
CAGCTTCTGTCCTGCGTCGAAGCTTTGAAGGCCGAAGGCAGTGCAAGAGACTCTGGCCTCCACAGTTCGA
CCTGCGGCTGCTGTGTGCCTTCGCGGTGGAAGGCCCGAGGGGCGCGATCTTGACCCTAAGACCGGCGGCC
ATGATGGTGCTGACCTCTGGTGGCCGATCGGGGCACTGCAGGGGCCGAGCCATTTTGGGGGGCCCCCCTC
CTTGCTCTGCAGGCACCTTAGTGGCTTTTTTCCTCCTGTGTACAGGGAAGAGAGGGGTACATTTCCCTGT
GCTGACGGAAGCCAACTTGGCTTTCCCGGACTGCAAGCAGGGCTCTGCCCCAGAGGCCTCTCTCTCCGTC
GTGGGAGAGAGACGTGTACATAGTGTAGGTCAGCGTGCTTAGCCTCCTGACCTGAGGCTCCTGTGCTACT
TTGCCTTTTGCAAACTTTATTTTCATAGATTGAGAAGTTTTGTACAGAGAATTAAAAATGAAATTATTTA
TAATCTGGGTTTTGTGTCTTCAGCTGATGGATGTGCTGACTAGTGAGAGTGCTTGGGCCCTCCCCCAGCA
CCTAGGGAAAGGCTTCCCCTCCCCCTCCGGCCACAAGGTACACAACTTTTAACTTAGCTCTTCCCGATGT
TTGTTTGTTAGTGGGAGGAGTGGGGAGGGCTGGCTGTATGGCCTCCAGCCTACCTGTTCCCCCTGCTCCC
AGGGCACATGGTTGGGCTGTGTCAACCCTTAGGGCCTCCATGGGGTCAGTTGTCCCTTCTCACCTCCCAG
CTCTGTCCCCATCAGGTCCCTGGGTGGCACGGGAGGATGGACTGACTTCCAGGACCTGTTGTGTGACAGG
AGCTACAGCTTGGGTCTCCCTGCAAGAAGTCTGGCACGTCTCACCTCCCCCATCCCGGCCCCTGGTCATC
TCACAGCAAAGAAGCCTCCTCCCTCCCGACCTGCCGCCACACTGGAGAGGGGGCACAGGGGCGGGGGAGG
TTTCCTGTTCTGTGAAAGGCCGACTCCCTGACTCCATTCATGCCCCCCCCCCCAGCCCCTCCCTTCATTC
CCATTCCCCAACCTAAAGCCTGGCCCGGCTCCCAGCTGAATCTGGTCGGAATCCACGGGCTGCAGATTTT
CCAAAACAATCGTTGTATCTTTATTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGAATGCAATGACTGTTTTTTAC
TCTTAAGGAAAATAAACATCTTTTAGAAACAAAAAAAAAAAA（配列番号２９）
【０１０２】
ＳＲＥＢＦ１アイソフォームｂのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４１６７．３）を、以下に提供する。
MDEPPFSEAALEQALGEPCDLDAALLTDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDPPYAGSGAGGTDPASPDTSSPG
SLSPPPATLSSSLEAFLSGPQAAPSPLSPPQPAPTPLKMYPSMPAFSPGPGIKEESVPLSILQTPTPQPL
PGALLPQSFPAPAPPQFSSTPVLGYPSPPGGFSTGSPPGNTQQPLPGLPLASPPGVPPVSLHTQVQSVVP
QQLLTVTAAPTAAPVTTTVTSQIQQVPVLLQPHFIKADSLLLTAMKTDGATVKAAGLSPLVSGTTVQTGP
LPTLVSGGTILATVPLVVDAEKLPINRLAAGSKAPASAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIIELKDLV
VGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLSLRTAVHKSKSLKDLVSACGSGGNTDVLMEGVKTE
VEDTLTPPPSDAGSPFQSSPLSLGSRGSGSGGSGSDSEPDSPVFEDSKAKPEQRPSLHSRGMLDRSRLAL
CTLVFLCLSCNPLASLLGARGLPSPSDTTSVYHSPGRNVLGTESRDGPGWAQWLLPPVVWLLNGLLVLVS
LVLLFVYGEPVTRPHSGPAVYFWRHRKQADLDLARGDFAQAAQQLWLALRALGRPLPTSHLDLACSLLWN
LIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLQQDCALRVDASASARDAALVYHKLHQLHTMGKHTGGHLTATNLALSAL
NLAECAGDAVSVATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPPAMQWLCHPVGHR
FFVDGDWSVLSTPWESLYSLAGNPVDPLAQVTQLFREHLLERALNCVTQPNPSPGSADGDKEFSDALGYL
QLLNSCSDAAGAPAYSFSISSSMATTTGVDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLCPLVEHLPRVLQE
SERPLPRAALHSFKAARALLGCAKAESGPASLTICEKASGYLQDSLATTPASSSIDKAVQLFLCDLLLVV
RTSLWRQQQPPAPAPAAQGTSSRPQASALELRGFQRDLSSLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASP
TRTHQLLDRSLRRRAGPGGKGGAVAELEPRPTRREHAEALLLASCYLPPGFLSAPGQRVGMLAEAARTLE
KLGDRRLLHDCQQMLMRLGGGTTVTSS（配列番号３０）
【０１０３】
ＳＲＥＢＦ１アイソフォームｂの核酸配列、又はｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４１７６．４）を、以下に提供する。
AGCAGAGCTGCGGCCGGGGGAACCCAGTTTCCGAGGAACTTTTCGCCGGCGCCGGGCCGCCTCTGAGGCC
AGGGCAGGACACGAACGCGCGGAGCGGCGGCGGCGACTGAGAGCCGGGGCCGCGGCGGCGCTCCCTAGGA
AGGGCCGTACGAGGCGGCGGGCCCGGCGGGCCTCCCGGAGGAGGCGGCTGCGCCATGGACGAGCCACCCT
TCAGCGAGGCGGCTTTGGAGCAGGCGCTGGGCGAGCCGTGCGATCTGGACGCGGCGCTGCTGACCGACAT
CGAAGACATGCTTCAGCTTATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTATTTGACCCACCCTATGCT
GGGAGTGGGGCAGGGGGCACAGACCCTGCCAGCCCCGATACCAGCTCCCCAGGCAGCTTGTCTCCACCTC
CTGCCACATTGAGCTCCTCTCTTGAAGCCTTCCTGAGCGGGCCGCAGGCAGCGCCCTCACCCCTGTCCCC
TCCCCAGCCTGCACCCACTCCATTGAAGATGTACCCGTCCATGCCCGCTTTCTCCCCTGGGCCTGGTATC
AAGGAAGAGTCAGTGCCACTGAGCATCCTGCAGACCCCCACCCCACAGCCCCTGCCAGGGGCCCTCCTGC
CACAGAGCTTCCCAGCCCCAGCCCCACCGCAGTTCAGCTCCACCCCTGTGTTAGGCTACCCCAGCCCTCC
GGGAGGCTTCTCTACAGGAAGCCCTCCCGGGAACACCCAGCAGCCGCTGCCTGGCCTGCCACTGGCTTCC
CCGCCAGGGGTCCCGCCCGTCTCCTTGCACACCCAGGTCCAGAGTGTGGTCCCCCAGCAGCTACTGACAG
TCACAGCTGCCCCCACGGCAGCCCCTGTAACGACCACTGTGACCTCGCAGATCCAGCAGGTCCCGGTCCT
GCTGCAGCCCCACTTCATCAAGGCAGACTCGCTGCTTCTGACAGCCATGAAGACAGACGGAGCCACTGTG
AAGGCGGCAGGTCTCAGTCCCCTGGTCTCTGGCACCACTGTGCAGACAGGGCCTTTGCCGACCCTGGTGA
GTGGCGGAACCATCTTGGCAACAGTCCCACTGGTCGTAGATGCGGAGAAGCTGCCTATCAACCGGCTCGC
AGCTGGCAGCAAGGCCCCGGCCTCTGCCCAGAGCCGTGGAGAGAAGCGCACAGCCCACAACGCCATTGAG
AAGCGCTACCGCTCCTCCATCAATGACAAAATCATTGAGCTCAAGGATCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAA
AGCTGAATAAATCTGCTGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTACATTCGCTTTCTGCAACACAGCAACCAGAA
ACTCAAGCAGGAGAACCTAAGTCTGCGCACTGCTGTCCACAAAAGCAAATCTCTGAAGGATCTGGTGTCG
GCCTGTGGCAGTGGAGGGAACACAGACGTGCTCATGGAGGGCGTGAAGACTGAGGTGGAGGACACACTGA
CCCCACCCCCCTCGGATGCTGGCTCACCTTTCCAGAGCAGCCCCTTGTCCCTTGGCAGCAGGGGCAGTGG
CAGCGGTGGCAGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGACAGCAAGGCAAAGCCAGAG
CAGCGGCCGTCTCTGCACAGCCGGGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTGGCCCTGTGCACGCTCGTCTTCC
TCTGCCTGTCCTGCAACCCCTTGGCCTCCTTGCTGGGGGCCCGGGGGCTTCCCAGCCCCTCAGATACCAC
CAGCGTCTACCATAGCCCTGGGCGCAACGTGCTGGGCACCGAGAGCAGAGATGGCCCTGGCTGGGCCCAG
TGGCTGCTGCCCCCAGTGGTCTGGCTGCTCAATGGGCTGTTGGTGCTCGTCTCCTTGGTGCTTCTCTTTG
TCTACGGTGAGCCAGTCACACGGCCCCACTCAGGCCCCGCCGTGTACTTCTGGAGGCATCGCAAGCAGGC
TGACCTGGACCTGGCCCGGGGAGACTTTGCCCAGGCTGCCCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCGGGCACTG
GGCCGGCCCCTGCCCACCTCCCACCTGGACCTGGCTTGTAGCCTCCTCTGGAACCTCATCCGTCACCTGC
TGCAGCGTCTCTGGGTGGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCAGGGGGCCTGCAGCAGGACTGTGCTCTGCG
AGTGGATGCTAGCGCCAGCGCCCGAGACGCAGCCCTGGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCACACCATG
GGGAAGCACACAGGCGGGCACCTCACTGCCACCAACCTGGCGCTGAGTGCCCTGAACCTGGCAGAGTGTG
CAGGGGATGCCGTGTCTGTGGCGACGCTGGCCGAGATCTATGTGGCGGCTGCATTGAGAGTGAAGACCAG
TCTCCCACGGGCCTTGCATTTTCTGACACGCTTCTTCCTGAGCAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAG
AGTGGCTCAGTGCCTCCTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCCGTGGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGG
ACTGGTCCGTGCTCAGTACCCCATGGGAGAGCCTGTACAGCTTGGCCGGGAACCCAGTGGACCCCCTGGC
CCAGGTGACTCAGCTATTCCGGGAACATCTCTTAGAGCGAGCACTGAACTGTGTGACCCAGCCCAACCCC
AGCCCTGGGTCAGCTGATGGGGACAAGGAATTCTCGGATGCCCTCGGGTACCTGCAGCTGCTGAACAGCT
GTTCTGATGCTGCGGGGGCTCCTGCCTACAGCTTCTCCATCAGTTCCAGCATGGCCACCACCACCGGCGT
AGACCCGGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCTCTGACAGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAGGAG
GCGGCTGAGCGGCTGTGCCCGCTGGTGGAGCACCTGCCCCGGGTGCTGCAGGAGTCTGAGAGACCCCTGC
CCAGGGCAGCTCTGCACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCCCTGCTGGGCTGTGCCAAGGCAGAGTCTGGTCC
AGCCAGCCTGACCATCTGTGAGAAGGCCAGTGGGTACCTGCAGGACAGCCTGGCTACCACACCAGCCAGC
AGCTCCATTGACAAGGCCGTGCAGCTGTTCCTGTGTGACCTGCTTCTTGTGGTGCGCACCAGCCTGTGGC
GGCAGCAGCAGCCCCCGGCCCCGGCCCCAGCAGCCCAGGGCACCAGCAGCAGGCCCCAGGCTTCCGCCCT
TGAGCTGCGTGGCTTCCAACGGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGGCTGGCACAGAGCTTCCGGCCCGCCATG
CGGAGGGTGTTCCTACATGAGGCCACGGCCCGGCTGATGGCGGGGGCCAGCCCCACACGGACACACCAGC
TCCTCGACCGCAGTCTGAGGCGGCGGGCAGGCCCCGGTGGCAAAGGAGGCGCGGTGGCGGAGCTGGAGCC
GCGGCCCACGCGGCGGGAGCACGCGGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTACCTGCCCCCCGGCTTCCTG
TCGGCGCCCGGGCAGCGCGTGGGCATGCTGGCTGAGGCGGCGCGCACACTCGAGAAGCTTGGCGATCGCC
GGCTGCTGCACGACTGTCAGCAGATGCTCATGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAGAC
CCCGTGTCCCCGGCCTCAGCACCCCTGTCTCTAGCCACTTTGGTCCCGTGCAGCTTCTGTCCTGCGTCGA
AGCTTTGAAGGCCGAAGGCAGTGCAAGAGACTCTGGCCTCCACAGTTCGACCTGCGGCTGCTGTGTGCCT
TCGCGGTGGAAGGCCCGAGGGGCGCGATCTTGACCCTAAGACCGGCGGCCATGATGGTGCTGACCTCTGG
TGGCCGATCGGGGCACTGCAGGGGCCGAGCCATTTTGGGGGGCCCCCCTCCTTGCTCTGCAGGCACCTTA
GTGGCTTTTTTCCTCCTGTGTACAGGGAAGAGAGGGGTACATTTCCCTGTGCTGACGGAAGCCAACTTGG
CTTTCCCGGACTGCAAGCAGGGCTCTGCCCCAGAGGCCTCTCTCTCCGTCGTGGGAGAGAGACGTGTACA
TAGTGTAGGTCAGCGTGCTTAGCCTCCTGACCTGAGGCTCCTGTGCTACTTTGCCTTTTGCAAACTTTAT
TTTCATAGATTGAGAAGTTTTGTACAGAGAATTAAAAATGAAATTATTTATAATCTGGGTTTTGTGTCTT
CAGCTGATGGATGTGCTGACTAGTGAGAGTGCTTGGGCCCTCCCCCAGCACCTAGGGAAAGGCTTCCCCT
CCCCCTCCGGCCACAAGGTACACAACTTTTAACTTAGCTCTTCCCGATGTTTGTTTGTTAGTGGGAGGAG
TGGGGAGGGCTGGCTGTATGGCCTCCAGCCTACCTGTTCCCCCTGCTCCCAGGGCACATGGTTGGGCTGT
GTCAACCCTTAGGGCCTCCATGGGGTCAGTTGTCCCTTCTCACCTCCCAGCTCTGTCCCCATCAGGTCCC
TGGGTGGCACGGGAGGATGGACTGACTTCCAGGACCTGTTGTGTGACAGGAGCTACAGCTTGGGTCTCCC
TGCAAGAAGTCTGGCACGTCTCACCTCCCCCATCCCGGCCCCTGGTCATCTCACAGCAAAGAAGCCTCCT
CCCTCCCGACCTGCCGCCACACTGGAGAGGGGGCACAGGGGCGGGGGAGGTTTCCTGTTCTGTGAAAGGC
CGACTCCCTGACTCCATTCATGCCCCCCCCCCCAGCCCCTCCCTTCATTCCCATTCCCCAACCTAAAGCC
TGGCCCGGCTCCCAGCTGAATCTGGTCGGAATCCACGGGCTGCAGATTTTCCAAAACAATCGTTGTATCT
TTATTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGAATGCAATGACTGTTTTTTACTCTTAAGGAAAATAAACATC
TTTTAGAAACAAAAAAAAAAAA（配列番号３１）
【０１０４】
ＳＲＥＢＦ１アイソフォームｃの核酸配列、又はＣＤＳ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４４００３）を、以下に提供する。
ATGGACGAGCTGCCTTTCGGTGAGGCGGCTGTGGAACAGGCGCTGGACGAGCTGGGCGAACTGGACGCCGCACTGCTGACCGACATCCAAGACATGCTTCAGCTCATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTGTTTGATTCCCCCTATGCAGGGGGCGGGGCAGGAGACACAGAGCCCACCAGCCCTGGTGCCAACTCTCCTGAGAGCTTGTCTTCTCCTGCTTCCCTGGGTTCCTCTCTGGAAGCCTTCCTGGGGGAACCCAAGGCAACACCTGCATCCTTGTCCCCTGTGCCGTCTGCATCCACTGCTTTAAAGATGTACCCGTCTGTGCCCCCCTTCTCCCCTGGGCCTGGAATCAAAGAAGAGCCAGTGCCACTCACCATCCTGCAGCCCCCAGCAGCACAGCCATCACCAGGGACCCTCCTGCCTCCGAGTTTCCCTCCACCACCCCTGCAGCTCAGCCCGGCTCCTGTGCTGGGGTATTCTAGCCTTCCTTCAGGCTTCTCAGGGACCCTTCCTGGAAATACCCAACAGCCACCATCTAGCCTGTCACTGGCCTCTGCACCAGGAGTCTCGCCCATCTCTTTACACACCCAGGTCCAGAGCTCAGCCTCCCAGCAGCCACTGCCAGCCTCAACAGCCCCTAGAACAACCACTGTGACCTCACAGATCCAGCGGGTCCCAGTCGTACTGCAGCCACATTTCATCAAGGCAGATTCACTGCTACTGACAACTGTAAAAACAGATACAGGAGCCACGATGAAGACGGCTGGCATCAGTACCTTAGCCCCTGGCACAGCCGTGCAGGCAGGCCCCTTGCAGACCCTGGTGAGTGGTGGGACCATCCTGGCCACAGTACCATTGGTTGTGGATACAGACAAACTGCCCATCCATCGACTGGCAGCTGGCAGCAAGGCCCTGGGCTCAGCTCAGAGCCGTGGTGAGAAGCGCACAGCCCACAATGCCATTGAGAAGCGCTACCGTTCCTCTATCAATGACAAGATTGTGGAGCTCAAAGACCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCCGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTATATCCGCTTCTTACAGCACAGCAACCAGAAGCTCAAGCAGGAGAACCTGGCCCTGCGAAATGCCGCTCACAAAAGCAAATCCCTGAAGGACCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGCAGGAGGCACAGATGTGGCTATGGAGGGTGTGAAGCCTGAGGTGGTGGATACGCTGACCCCTCCACCCTCAGACGCTGGCTCGCCCTCCCAGAGTAGCCCCTTGTCCCTCGGCAGCAGAGGTAGCAGCAGTGGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGATAGCCAGGTGAAAGCCCAACGGCTGCACAGTCATGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTAGCCCTGTGTGCGCTGGTCTTCCTGTGTCTGACCTGCAACCCCTTGGCATCACTGTTTGGCTGGGGCATCCCCGGTCCCTCCAGTGCCTCTGGTGCACACCACAGCTCTGGGCGTAGCATGCTGGAGGCCGAGAGCAGAGATGGCTCTAATTGGACCCAGTGGTTGCTGCCACCCCTAGTCTGGCTGGCCAATGGACTACTAGTGTTGGCCTGCCTGGCTCTTCTCTTTGTCTATGGGGAACCTGTGACCCGGCCACACACTAGCCCAGCTGTACACTTCTGGAGACATCGCAAACAGGCTGACCTGGACTTGGCTCGGGGAGATTTTGCCCAGGCTGCTCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCAGGCATTGGGACGGCCCCTGCCCACCTCGAACCTAGACTTGGCCTGCAGCCTGCTTTGGAACCTCATCCGCCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTTGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCTGGGGGCTTGCGGAGAGACTGTGGACTGAGAATGGATGCACGTGCCAGTGCTCGAGATGCGGCTCTCGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCATGCCATGGGCAAATACACAGGAGGGCACCTCATTGCTTCTAACCTGGCACTGAGTGCCCTGAACCTGGCCGAGTGCGCAGGAGATGCTGTATCCATGGCAACGCTGGCAGAGATCTATGTGGCTGCTGCCCTGAGGGTCAAGACCAGTCTCCCAAGAGCCTTGCACTTTTTGACACGTTTCTTCCTGAGTAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCTTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCTGTAGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGGCTGTGCATGGTGCCCCACAGGAGAGCCTGTACAGCGTGGCTGGGAACCCAGTGGATCCCCTCGCCCAGGTGACTCGACTATTCTGCGAACATCTCTTGGAGAGAGCACTGAACTGTATTGCTCAACCCAGCCCGGGGACAGCTGATGGAGACAGGGAGTTCTCTGACGCACTTGGATACCTGCAGTTGCTAAATCGCTGCTCTGATGCTGTCGGGACTCCTGCCTGCAGCTTCTCTGTCAGCTCCAGCATGGCTTCCACCACCGGCACAGACCCAGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCACTGACGGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAAGAGGCAGCTGAGCGCCTATACCCGCTGGTAGAGCGTATGCCCCACGTGCTGCAGGAGACTGAGAGACCCCTGCCCAAGGCAGCTCTGTACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCTCTGCTGGACCACAGAAAAGTGGAGTCTGGCCCAGCCAGCCTGGCCATCTGTGAGAAGGCCAGCGGGTACTTGCGGGACAGCTTAGCCGCTCCACCAACTGGCAGCTCCATTGACAAGGCCATGCAGCTGCTCCTGTGTGATCTACTTCTTGTGGCCCGCACTAGTATGTGGCAGCGCCAGCAGTCACCAGCCTCAGCCCAGGTAGCTCACAGTGCCAGCAATGGATCTCAGGCCTCCGCTTTGGAGCTTCGAGGTTTCCAACAGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGCTTGGCACAGAACTTCCGGCCTGCTATGAGGAGAGTGTTCCTACACGAGGCCACAGCTCGGCTGATGGCAGGGGCAAGTCCTGCCCGGACACACCAGCTCCTGGACCGAAGTCTGCGGAGGCGGGCCGGCTCCAGTGGCAAAGGAGGCACTGTAGCTGAGCTGGAGCCTCGACCCACATGGCGGGAGCACACAGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTATCTGCCACCTGCCTTCCTGTCGGCCCCTGGACAGCAAATGAGCATGTTGGCTGAGGCAGCACGCACTGTAGAGAAGCTTGGTGATCATCGGCTACTGCTTGACTGCCAGCAGATGCTTCTGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAA（配列番号３２）
【０１０５】
ＳＲＥＢＦ１アイソフォームｃの核酸配列、又はｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４４００３）を、以下に提供する。
CTCCTGCGAAGCCTGGCGGGCGCCGCCGCCATGGACGAGCTGCCTTTCGGTGAGGCGGCTGTGGAACAGGCGCTGGACGAGCTGGGCGAACTGGACGCCGCACTGCTGACCGACATCCAAGACATGCTTCAGCTCATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTGTTTGATTCCCCCTATGCAGGGGGCGGGGCAGGAGACACAGAGCCCACCAGCCCTGGTGCCAACTCTCCTGAGAGCTTGTCTTCTCCTGCTTCCCTGGGTTCCTCTCTGGAAGCCTTCCTGGGGGAACCCAAGGCAACACCTGCATCCTTGTCCCCTGTGCCGTCTGCATCCACTGCTTTAAAGATGTACCCGTCTGTGCCCCCCTTCTCCCCTGGGCCTGGAATCAAAGAAGAGCCAGTGCCACTCACCATCCTGCAGCCCCCAGCAGCACAGCCATCACCAGGGACCCTCCTGCCTCCGAGTTTCCCTCCACCACCCCTGCAGCTCAGCCCGGCTCCTGTGCTGGGGTATTCTAGCCTTCCTTCAGGCTTCTCAGGGACCCTTCCTGGAAATACCCAACAGCCACCATCTAGCCTGTCACTGGCCTCTGCACCAGGAGTCTCGCCCATCTCTTTACACACCCAGGTCCAGAGCTCAGCCTCCCAGCAGCCACTGCCAGCCTCAACAGCCCCTAGAACAACCACTGTGACCTCACAGATCCAGCGGGTCCCAGTCGTACTGCAGCCACATTTCATCAAGGCAGATTCACTGCTACTGACAACTGTAAAAACAGATACAGGAGCCACGATGAAGACGGCTGGCATCAGTACCTTAGCCCCTGGCACAGCCGTGCAGGCAGGCCCCTTGCAGACCCTGGTGAGTGGTGGGACCATCCTGGCCACAGTACCATTGGTTGTGGATACAGACAAACTGCCCATCCATCGACTGGCAGCTGGCAGCAAGGCCCTGGGCTCAGCTCAGAGCCGTGGTGAGAAGCGCACAGCCCACAATGCCATTGAGAAGCGCTACCGTTCCTCTATCAATGACAAGATTGTGGAGCTCAAAGACCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCCGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTATATCCGCTTCTTACAGCACAGCAACCAGAAGCTCAAGCAGGAGAACCTGGCCCTGCGAAATGCCGCTCACAAAAGCAAATCCCTGAAGGACCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGCAGGAGGCACAGATGTGGCTATGGAGGGTGTGAAGCCTGAGGTGGTGGATACGCTGACCCCTCCACCCTCAGACGCTGGCTCGCCCTCCCAGAGTAGCCCCTTGTCCCTCGGCAGCAGAGGTAGCAGCAGTGGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGATAGCCAGGTGAAAGCCCAACGGCTGCACAGTCATGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTAGCCCTGTGTGCGCTGGTCTTCCTGTGTCTGACCTGCAACCCCTTGGCATCACTGTTTGGCTGGGGCATCCCCGGTCCCTCCAGTGCCTCTGGTGCACACCACAGCTCTGGGCGTAGCATGCTGGAGGCCGAGAGCAGAGATGGCTCTAATTGGACCCAGTGGTTGCTGCCACCCCTAGTCTGGCTGGCCAATGGACTACTAGTGTTGGCCTGCCTGGCTCTTCTCTTTGTCTATGGGGAACCTGTGACCCGGCCACACACTAGCCCAGCTGTACACTTCTGGAGACATCGCAAACAGGCTGACCTGGACTTGGCTCGGGGAGATTTTGCCCAGGCTGCTCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCAGGCATTGGGACGGCCCCTGCCCACCTCGAACCTAGACTTGGCCTGCAGCCTGCTTTGGAACCTCATCCGCCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTTGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCTGGGGGCTTGCGGAGAGACTGTGGACTGAGAATGGATGCACGTGCCAGTGCTCGAGATGCGGCTCTCGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCATGCCATGGGCAAATACACAGGAGGGCACCTCATTGCTTCTAACCTGGCACTGAGTGCCCTGAACCTGGCCGAGTGCGCAGGAGATGCTGTATCCATGGCAACGCTGGCAGAGATCTATGTGGCTGCTGCCCTGAGGGTCAAGACCAGTCTCCCAAGAGCCTTGCACTTTTTGACACGTTTCTTCCTGAGTAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCTTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCTGTAGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGGCTGTGCATGGTGCCCCACAGGAGAGCCTGTACAGCGTGGCTGGGAACCCAGTGGATCCCCTCGCCCAGGTGACTCGACTATTCTGCGAACATCTCTTGGAGAGAGCACTGAACTGTATTGCTCAACCCAGCCCGGGGACAGCTGATGGAGACAGGGAGTTCTCTGACGCACTTGGATACCTGCAGTTGCTAAATCGCTGCTCTGATGCTGTCGGGACTCCTGCCTGCAGCTTCTCTGTCAGCTCCAGCATGGCTTCCACCACCGGCACAGACCCAGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCACTGACGGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAAGAGGCAGCTGAGCGCCTATACCCGCTGGTAGAGCGTATGCCCCACGTGCTGCAGGAGACTGAGAGACCCCTGCCCAAGGCAGCTCTGTACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCTCTGCTGGACCACAGAAAAGTGGAGTCTGGCCCAGCCAGCCTGGCCATCTGTGAGAAGGCCAGCGGGTACTTGCGGGACAGCTTAGCCGCTCCACCAACTGGCAGCTCCATTGACAAGGCCATGCAGCTGCTCCTGTGTGATCTACTTCTTGTGGCCCGCACTAGTATGTGGCAGCGCCAGCAGTCACCAGCCTCAGCCCAGGTAGCTCACAGTGCCAGCAATGGATCTCAGGCCTCCGCTTTGGAGCTTCGAGGTTTCCAACAGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGCTTGGCACAGAACTTCCGGCCTGCTATGAGGAGAGTGTTCCTACACGAGGCCACAGCTCGGCTGATGGCAGGGGCAAGTCCTGCCCGGACACACCAGCTCCTGGACCGAAGTCTGCGGAGGCGGGCCGGCTCCAGTGGCAAAGGAGGCACTGTAGCTGAGCTGGAGCCTCGACCCACATGGCGGGAGCACACAGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTATCTGCCACCTGCCTTCCTGTCGGCCCCTGGACAGCAAATGAGCATGTTGGCTGAGGCAGCACGCACTGTAGAGAAGCTTGGTGATCATCGGCTACTGCTTGACTGCCAGCAGATGCTTCTGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAAACCTTGGATGGTCTCCCCAGTATTAGAGGCCCTTAAGGACCTTTGTCACTGGCTGTGGTCGTCCAGAGAGGGTGAGCCTGACAAGCAATCAGGATCATGCCGACCTCTAGTGACAAATCTAGAAATTGCAGAGGCTGCACTGGCCCAATGCCACCCTCTTGCTCTGTAGGCACCTTTTTCCTGTCCTATGGAAAGGAACCTTTCCCCTAGCTGAGGGCCACCCTGTCCTGAGGCTCTCACCCACTCCTGGAAGACTTGTATATAGTGTAGATCCAGCTGAGCCAGTTTCCTGTGCAGGCTCATGTACTACTTTAACTTTTGCAAACTTTATTTTCATAGGTTGAGAAATTTTGTACAGAAAATTAAAAAGTGAAATTATTTATA（配列番号３３）
【０１０６】
ＳＲＥＢＦ１アイソフォームｃのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４４００３）を、以下に提供する。
MDELPFGEAAVEQALDELGELDAALLTDIQDMLQLINNQDSDFPGLFDSPYAGGGAGDTEPTSPGANSPESLSSPASLGSSLEAFLGEPKATPASLSPVPSASTALKMYPSVPPFSPGPGIKEEPVPLTILQPPAAQPSPGTLLPPSFPPPPLQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLSLASAPGVSPISLHTQVQSSASQQPLPASTAPRTTTVTSQIQRVPVVLQPHFIKADSLLLTTVKTDTGATMKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLALRNAAHKSKSLKDLVSACGSAGGTDVAMEGVKPEVVDTLTPPPSDAGSPSQSSPLSLGSRGSSSGGSDSEPDSPVFEDSQVKAQRLHSHGMLDRSRLALCALVFLCLTCNPLASLFGWGIPGPSSASGAHHSSGRSMLEAESRDGSNWTQWLLPPLVWLANGLLVLACLALLFVYGEPVTRPHTSPAVHFWRHRKQADLDLARGDFAQAAQQLWLALQALGRPLPTSNLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLRRDCGLRMDARASARDAALVYHKLHQLHAMGKYTGGHLIASNLALSALNLAECAGDAVSMATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPLAMQWLCHPVGHRFFVDGDWAVHGAPQESLYSVAGNPVDPLAQVTRLFCEHLLERALNCIAQPSPGTADGDREFSDALGYLQLLNRCSDAVGTPACSFSVSSSMASTTGTDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLYPLVERMPHVLQETERPLPKAALYSFKAARALLDHRKVESGPASLAICEKASGYLRDSLAAPPTGSSIDKAMQLLLCDLLLVARTSMWQRQQSPASAQVAHSASNGSQASALELRGFQQDLSSLRRLAQNFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPARTHQLLDRSLRRRAGSSGKGGTVAELEPRPTWREHTEALLLASCYLPPAFLSAPGQQMSMLAEAARTVEKLGDHRLLLDCQQMLLRLGGGTTVTSS（配列番号３４）
【０１０７】
トランケーションされたＳＲＥＢＦ１アイソフォームｃの核酸配列、又はｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４４００３）、例えばＳＲＥＢ４１１を、以下に提供する。
atggacgagctgcctttcggtgaggcggctgtggaacaggcgctggacgagctgggcgaactggacgccgcactgctgaccgacatccaagacatgcttcagctcatcaacaaccaagacagtgacttccctggcctgtttgattccccctatgcagggggcggggcaggagacacagagcccaccagccctggtgccaactctcctgagagcttgtcttctcctgcttccctgggttcctctctggaagccttcctgggggaacccaaggcaacacctgcatccttgtcccctgtgccgtctgcatccactgctttaaagatgtacccgtctgtgccccccttctcccctgggcctggaatcaaagaagagccagtgccactcaccatcctgcagcccccagcagcacagccatcaccagggaccctcctgcctccgagtttccctccaccacccctgcagctcagcccggctcctgtgctggggtattctagccttccttcaggcttctcagggacccttcctggaaatacccaacagccaccatctagcctgtcactggcctctgcaccaggagtctcgcccatctctttacacacccaggtccagagctcagcctcccagcagccactgccagcctcaacagcccctagaacaaccactgtgacctcacagatccagcgggtcccagtcgtactgcagccacatttcatcaaggcagattcactgctactgacaactgtaaaaacagatacaggagccacgatgaagacggctggcatcagtaccttagcccctggcacagccgtgcaggcaggccccttgcagaccctggtgagtggtgggaccatcctggccacagtaccattggttgtggatacagacaaactgcccatccatcgactggcagctggcagcaaggccctgggctcagctcagagccgtggtgagaagcgcacagcccacaatgccattgagaagcgctaccgttcctctatcaatgacaagattgtggagctcaaagacctggtggtgggcactgaggcaaagctgaataaatctgccgtcttgcgcaaggccatcgactatatccgcttcttacagcacagcaaccagaagctcaagcaggagaacctggccctgcgaaatgccgctcacaaaagcaaatccctgaaggacctggtgtcggcctgtggcagtgcaggaggcacagatgtggctatggagggtgtg（配列番号３５）
【０１０８】
トランケーションされたＳＲＥＢＦ１アイソフォームｃのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２４４００３）、例えばＳＲＥＢ４１１を、以下に提供する。
MDELPFGEAAVEQALDELGELDAALLTDIQDMLQLINNQDSDFPGLFDSPYAGGGAGDTEPTSPGANSPESLSSPASLGSSLEAFLGEPKATPASLSPVPSASTALKMYPSVPPFSPGPGIKEEPVPLTILQPPAAQPSPGTLLPPSFPPPPLQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLSLASAPGVSPISLHTQVQSSASQQPLPASTAPRTTTVTSQIQRVPVVLQPHFIKADSLLLTTVKTDTGATMKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLALRNAAHKSKSLKDLVSACGSAGGTDVAMEGV（配列番号３６）
【０１０９】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のアイソフォームのアミノ酸配列、例えば配列番号２８、３０、３４若しくは３６と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性；又は、ＳＲＥＢＦ１のアイソフォームのアミノ酸配列、例えば配列番号２８、３０、３４若しくは３６から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。
【０１１０】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３４と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の同一性；又は、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３４から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１又はそのアイソフォームの機能的断片、例えばトランケーションされたＳＲＥＢＦ１を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１の機能的断片、例えば配列番号１若しくは３４の機能的断片、又はＳＲＥＢＦ１アイソフォーム、例えば配列番号２８、３０若しくは３６の機能的断片を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１の機能的ドメイン、例えばＳＲＥＢＦ１のトランス活性化ドメインを含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）ドメインを含む。一実施形態では、ＬＭＭは、核に転位することが可能であり及び／又はＳＲＥＢＦ１標的遺伝子の転写を開始することが可能である、ＳＲＥＢＦ１の機能的断片を含む。
【０１１２】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のＮ末端４１０アミノ酸（本明細書でＳＲＥＢＦ４１０とも呼ばれる）、例えば配列番号１のアミノ酸１〜４１０を含む。ＳＲＥＢＦ１のＮ末端４１０アミノ酸のアミノ酸配列を、以下に提供する：
MDELAFGEAALEQTLAEMCELDTAVLNDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDAPYAGGETGDTGPSSPGANSPESFSSASLASSLEAFLGGPKVTPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGPGIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFIKADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGM（配列番号２６）
【０１１３】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のＮ末端４１０アミノ酸のアミノ酸配列、例えば配列番号２６と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性；又は、ＳＲＥＢＦ１のＮ末端４１０アミノ酸のアミノ酸配列、例えば配列番号２６から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。
【０１１４】
別の実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１のアミノ酸９１〜４１０、例えば配列番号１のアミノ酸９１〜４１０を含む。ＳＲＥＢＦ１の９１〜４１０位のアミノ酸のアミノ酸配列を、以下に提供する：
MPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGPGIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFIKADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGM（配列番号２７）
【０１１５】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１の９１〜４１０位のアミノ酸配列、例えば配列番号２７と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性；又は、ＳＲＥＢＦ１の９１〜４１０位のアミノ酸配列、例えば配列番号２７から、１、２若しくは３若以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１又はその機能的断片をコードする、例えば、アミノ酸配列番号１又はその機能的断片をコードする核酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、配列番号２の核酸と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。
【０１１６】
別の実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ２若しくはその機能的断片と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性；又は、ＳＲＥＢＦ２若しくはその機能的断片から、１、２若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。
【０１１７】
一実施形態では、ＬＭＭは酵素を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、飽和脂肪酸を不飽和脂肪酸に変換する酵素を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、飽和脂肪酸を一不飽和脂肪酸、例えば、１つの二重結合を有する脂肪酸に変換する酵素を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、飽和脂肪酸を多価不飽和脂肪酸、例えば、１つを超える、例えば２、３、４、５、又はそれより多い二重結合を有する脂肪酸に変換する酵素を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ２（ＳＣＤ２）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ３（ＳＣＤ３）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ４（ＳＣＤ４）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ５（ＳＣＤ５）、そのアイソフォーム又はその機能的断片を含む。
【０１１８】
ＳＣＤ１は、一不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）への飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の変換の役割を担う、律速酵素である。その遺伝子の発現を、増加する細胞生存、増殖及び腫瘍形成特性に関連付ける研究のために、近年ＳＣＤ１が益々注目されている（Ａｎｇｅｌｕｃｃｉ、Ｍａｕｌｕｃｃｉ等、２０１５）（Ｉｇａｌ  ２０１１）。ＳＣＤ１は、細胞代謝速度制御及び全体的脂質生成の両方において鍵となる役割を演ずることも示された。後者は、主要な生合成経路調節因子アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）との直接的相互作用、並びに、ＳＦＡはＡＣＣを阻害することが知られているので、脂質生合成を増加させる酵素機能を促進するＭＵＦＡへのＳＦＡの変換を通して制御される（Ｉｇａｌ  ２０１０）。ＳＣＤ１の主な調節は、転写活性化を通すものであり、それによって、ＳＲＥＢＦ１などの転写因子は遺伝子のプロモーター領域中のＳＲＥ配列に結合する。ＳＣＤ１は、膜一体化タンパク質としてＥＲに内因的に位置し、ここで、ＳＣＤ１はＭＵＦＡへのＳＦＡの変換を触媒するその酵素機能を実行する。ＭＵＦＡへのＳＦＡの変換（例えば、ＭＵＦＡのＳＦＡに対する比の上方制御）におけるその役割は、脂質ラフトドメインの減少を調節することができ、それは膜流動性の増加を次にもたらすことができる。膜流動性及び膜脂質組成におけるこの変化は、小胞形成、したがって細胞情報交換及びＥＲのサイズ又は形態（例えば、ＥＲ拡張）との関連性を有することもできる。ＳＣＤ１遺伝子のノックダウンは、折り畳まれてないタンパク質の応答を上方制御することも示されている（Ａｒｉｙａｍａ，Ｋｏｎｏ等、２０１０）。さらに、ＳＣＤ１は、次に、ＡＣＣの強力な負の調節因子である細胞パルミチン酸を負に調節する。ＳＣＤ１はＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）のリン酸化状態も制御し、結果として、脂質合成過程における律速酵素ＡＣＣをリン酸化し、したがって阻害するその能力を低減する。最後に、ＳＦＡの不飽和化は、細胞死を引き起こすことができるその蓄積を防止する。このように、ＳＣＤ１のモジュレーションは、増加する脂質生合成、細胞生存及び増殖速度をもたらす。（Ｈａｇｅｎ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｕｅｎｃａ等）、（Ｓｃａｇｌｉａ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ等、２００９）。
【０１１９】
一実施形態では、ＬＭＭはＳＣＤ１を含む。ＳＣＤ１のアミノ酸配列を、以下に提供する：
MPAHMLQEISSSYTTTTTITAPPSGNEREKVKTVPLHLEEDIRPEMKEDIHDPTYQDEEGPPPKLEYVWRNIILMVLLHLGGLYGIILVPSCKLYTCLFGIFYYMTSALGITAGAHRLWSHRTYKARLPLRIFLIIANTMAFQNDVYEWARDHRAHHKFSETHADPHNSRRGFFFSHVGWLLVRKHPAVKEKGGKLDMSDLKAEKLVMFQRRYYKPGLLLMCFILPTLVPWYCWGETFVNSLFVSTFLRYTLVLNATWLVNSAAHLYGYRPYDKNIQSRENILVSLGAVGEGFHNYHHTFPFDYSASEYRWHINFTTFFIDCMAALGLAYDRKKVSKATVLARIKRTGDGSHKSS（配列番号３）
【０１２０】
ＳＣＤ１のヌクレオチド配列を、以下に提供する：
atgccggcccacatgctccaagagatctccagttcttacacgaccaccaccaccatcactgcacctccctccggaaatgaacgagagaaggtgaagacggtgcccctccacctggaagaagacatccgtcctgaaatgaaagaagatattcacgaccccacctatcaggatgaggagggacccccgcccaagctggagtacgtctggaggaacatcattctcatggtcctgctgcacttgggaggcctgtacgggatcatactggttccctcctgcaagctctacacctgcctcttcgggattttctactacatgaccagcgctctgggcatcacagccggggctcatcgcctctggagccacagaacttacaaggcacggctgcccctgcggatcttccttatcattgccaacaccatggcgttccagaatgacgtgtacgaatgggcccgagatcaccgcgcccaccacaagttctcagaaacacacgccgaccctcacaattcccgccgtggcttcttcttctctcacgtgggttggctgcttgtgcgcaaacacccggctgtcaaagagaagggcggaaaactggacatgtctgacctgaaagccgagaagctggtgatgttccagaggaggtactacaagcccggcctcctgctgatgtgcttcatcctgcccacgctggtgccctggtactgctggggcgagacttttgtaaacagcctgttcgttagcaccttcttgcgatacactctggtgctcaacgccacctggctggtgaacagtgccgcgcatctctatggatatcgcccctacgacaagaacattcaatcccgggagaatatcctggtttccctgggtgccgtgggcgagggcttccacaactaccaccacaccttccccttcgactactctgccagtgagtaccgctggcacatcaacttcaccacgttcttcatcgactgcatggctgccctgggcctggcttacgaccggaagaaagtttctaaggctactgtcttagccaggattaagagaactggagacgg gagtcacaagagtagctga
（配列番号４）
【０１２１】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性；又は、ＳＣＤ１のアミノ酸配列、例えば配列番号３から、１、２、若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１の機能的断片、例えば、配列番号３の機能的断片を含む。
【０１２２】
一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１又はその機能的断片をコードする、例えば、アミノ酸配列番号３又はその機能的断片をコードする核酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、配列番号４の核酸と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む。
【０１２３】
別の実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４、ＳＣＤ５若しくはその機能的断片のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性；又は、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４、ＳＣＤ５、若しくはその機能的断片のアミノ酸配列から、１、２、若しくは３以上のアミノ酸残基で且つ５０、４０、３０、２０、１５若しくは１０以下のアミノ酸残基の差異を含む。別の実施形態では、ＬＭＭは、少なくとも含む。
【０１２４】
別の実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４又はＳＣＤ５の機能的断片、例えば、トランケーションされたＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４又はＳＣＤ５を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４又はＳＣＤ５の機能的断片、例えば、配列番号３の機能的断片を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ３、ＳＣＤ４又はＳＣＤ５の機能的ドメイン、例えば、飽和脂肪酸を一不飽和脂肪酸に変換する酵素活性を有するドメインを含む。
【０１２５】
２つ以上のアミノ酸又は核酸配列との関連でパーセント同一性とは、同じである２つ以上の配列を指す。２つの配列が同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの指定された百分率（例えば、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定して又は手動アラインメント及び目視検査によって測定して、比較ウインドウ又は指定領域にわたる最大対応について比較し整列させたとき、指定された領域にわたって又は指定されていないときは全体の配列にわたって、６０％の同一性、任意選択で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有するならば、２つの配列は「実質的に同一である」。一部の実施形態では、アラインメントはギャップ又は挿入配列をもたらすことができ、そこでは、ギャップ若しくは挿入配列に隣接している指定された領域のために配列類似性を判定することができるか、又はギャップ若しくは挿入配列を含む領域にわたって配列類似性を判定することができる。任意選択で、同一性は、長さが少なくとも約５０のアミノ酸又はヌクレオチド、１００のアミノ酸又はヌクレオチド、１５０のアミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって存在する。より好ましくは、同一性は、長さが約２００以上のアミノ酸若しくはヌクレオチド、又は約５００若しくは１０００以上のアミノ酸若しくはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【０１２６】
配列比較のために、一般的に１つの配列が参照配列としての働きをし、それに対して１つ又は複数の試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は代替パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列と比較した試験配列のパーセント配列同一性を次に計算する。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３ページの相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４ページの類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実行によって、又は、手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ等、（２００３）分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照））によって実行することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、及びＭＡＦＦＴなどのアルゴリズムによって、複数の配列アラインメントを実行することができる。２つ以上の配列の間の関係を比較するための他のアルゴリズムには、ヒドンマルコフモデルが含まれる。ヒドンマルコフモデルは、別の後に特定のヌクレオチド（又は、アミノ酸）タイプを有する確率（隠されている確率経路）を記載するモデルである。それは、実際には確率論のモデルであって、アルゴリズムではない。アルゴリズム（又は、アルゴリズムを実行するプログラム）の例は、ＨＭＭＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｏｒｇ／）であり得る。
【０１２７】
パーセント配列同一性及び配列類似性を判定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２ページ；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ等、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０ページにそれぞれ記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を通して公開されている。
【０１２８】
生成物
高収率の生成物及び／又は向上した生成物品質を生成することが可能な細胞又は無細胞発現系を工学操作するか又は作製するための方法及び組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載される生成物には、ポリペプチド、例えば、組換えタンパク質；核酸分子、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子；多量体のタンパク質若しくは複合体；脂質封入粒子、例えばウイルス様粒子、小胞若しくはエクソソーム；又は他の分子、例えば脂質が含まれる。一実施形態では、生成物は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドである。一実施形態では、生成物はエクソソームである。例えば、組換えポリペプチドは、発現困難なタンパク質、又は、複合及び／若しくは非天然の構造を有するタンパク質、例えば次世代生物製剤、例えば、二重特異的抗体分子、融合タンパク質若しくはグリコシル化タンパク質であってよい。
【０１２９】
実施形態では、本明細書に記載される方法又は組成物によって生成される細胞又は細胞系は、医学的な状態、障害又は疾患の処置に有益である生成物、例えば、組換えポリペプチドを生成する。医学的な状態、障害又は疾患の例には、限定されるものではないが、代謝性の疾患又は障害（例えば、代謝性酵素欠乏症）、内分泌障害（例えば、ホルモン欠乏症）、止血の調節不全、血栓症、造血障害、肺障害、胃腸障害、自己免疫性疾患、免疫調節不全（例えば、免疫欠損）、不妊症、移植、がん及び感染性の疾患が含まれる。
【０１３０】
実施形態では、生成物は、外因性タンパク質、例えば、細胞によって天然に発現されないタンパク質である。一実施形態では、タンパク質は１つの種に由来するが、細胞は様々な種に由来する。別の実施形態では、タンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。
【０１３１】
他の実施形態では、生成物は、細胞によって内因的に発現されるタンパク質である。一実施形態では、生成物は、細胞によって内因性又は天然のレベルで内因的に発現されるタンパク質である。本明細書に記載される本方法及び組成物は、内因性生成物、例えば、細胞によって天然に生成される天然に存在する生成物の生成及び品質を増加させるために使用される。別の実施形態では、生成物、例えばタンパク質をコードする外因性核酸は、細胞に導入され、発現される。別の実施形態では、細胞によって内因的に発現される生成物の発現を増加させる外因性核酸が細胞に導入される。例として、外因性核酸は、細胞の内因性生成物の発現を制御するプロモーター（例えば、ＳＲＦプロモーター配列、例えば、転写因子Ａｐ−１はＣＨＯ細胞においてサル２０α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼプロモーター活性を調節するを参照（Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ａｐ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ２０α−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ）。Ｎａｎｊｉｄｓｕｒｅｎ  Ｔ、Ｍｉｎ  ＫＳ。ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ  ３０；１４：７１ページ。ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−１４−７１。ＰＭＩＤ：２５０７３９７２を参照）を活性化する配列を含む。
【０１３２】
組換え生成物は、例えば薬物スクリーニングのために有益である、治療用生成物又は診断用生成物であってよい。治療用又は診断用の生成物には、限定されるものではないが、抗体分子、例えば抗体若しくは抗体断片、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、リポータータンパク質、治療ペプチド、或いはこれらのいずれかの構造的及び／若しくは機能的断片又は混成物を含めることができる。他の実施形態では、治療用又は診断用の生成物は、合成ポリペプチドである、例えば、ここで、全体のポリペプチド又はその部分は、いずれの天然に存在するポリペプチド、例えば上記の天然に存在するポリペプチドに由来しないか、又はそれと任意の配列若しくは構造類似性を有する。
【０１３３】
一実施形態では、組換え生成物は、抗体分子である。一実施形態では、組換え生成物は、治療用抗体分子である。別の実施形態では、組換え生成物は、診断用の抗体分子、例えば、画像化技術又は診断検査のために有益なモノクローナル抗体である。
【０１３４】
本明細書で用いる抗体分子は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来する、タンパク質又はポリペプチド配列である。一実施形態では、抗体分子は、完全長抗体又は抗体断片である。抗体及びマルチフォーマットタンパク質は、ポリクローナル若しくはモノクローナル、多重若しくは単一の鎖、又はインタクトな免疫グロブリンであってよく、天然の供給源又は組換え供給源に由来することができる。抗体は、免疫グロブリン分子のテトラマーであってよい。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒトの又はヒト化抗体であってもよい。一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＥ抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である。
【０１３５】
「抗体断片」は、インタクトな抗体又はその組換えバリアントの少なくとも１つの部分を指し、抗原結合性ドメイン、例えば、抗原などの標的への抗体断片の認識及び特異的結合性を付与するのに十分である、インタクトな抗体の抗原性判定可変領域を指す。抗体断片の例には、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨ）、ラクダのＶＨＨドメイン、並びに、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、及び単離したＣＤＲ又は抗体の他のエピトープ結合性断片などの抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれる。抗原結合性断片は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖに組み込むこともできる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６〜１１３６ページ、２００５を参照）。抗原結合性断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく足場に接ぐこともできる（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する、米国特許第６，７０３，１９９号を参照）。
【０１３６】
本明細書に記載される方法を用いて生成することができる例示的な組換え生成物には、限定されるものではないが、下の表に提供されるものが含まれる。
【表２−１】
2019514399.tif 000005
【表２−２】
2019514399.tif 000006
【表３−１】
2019514399.tif 000007
【表３−２】
2019514399.tif 000008
【表３−３】
2019514399.tif 000009
【表３−４】
2019514399.tif 000010
【表３−５】
2019514399.tif 000011
【表３−６】
2019514399.tif 000012
【０１３７】
一実施形態では、生成物は、表２又は３のポリペプチドから、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下又は５０以下のアミノ酸残基で異なる。別の実施形態では、生成物は、表２又は３のポリペプチドから、そのアミノ酸残基の１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、１０％以下又は１５％以下で異なる。
【０１３８】
一実施形態では、生成物は、核酸分子、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又はそのハイブリッドである。一実施形態では、生成物は、オリガミ核酸分子、例えばオリガミＤＮＡであり、ここで、核酸分子は所定の二次、三次又は四次構造を有する。一実施形態では、オリガミ核酸分子は、機能的活性を有する。一実施形態では、生成物は、脂質膜に封入されたオリガミ核酸分子を含む。一実施形態では、脂質膜は、それを生成した宿主細胞の細胞膜又は細胞膜の構成成分を含む。一実施形態では、脂質封入ＤＮＡは、「覆い隠されたＤＮＡナノデバイスはパイロット任務を生き延びる（Ｃｌｏａｋｅｄ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｄｅｖｉｃｅｓ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｐｉｌｏｔ  ｍｉｓｓｉｏｎ）」、４月２２日、２０１４年、Ｗｙｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｓｐｉｒｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｔ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｗｅｂｓｉｔｅに記載の通りである。
【０１３９】
他の組換え生成物は、非抗体足場又は代替タンパク質足場、例えば、限定されるものではないが、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ及びアドネクチンを含む。
【０１４０】
他の例示的な治療又は診断用のタンパク質には、限定されるものではないが、Ｌｅａｄｅｒ等、「タンパク質治療薬：概要及び薬理学的分類（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００８、７：２１〜３９ページの表１〜１０、及び、Ｗａｌｓｈ、「バイオ医薬品ベンチマーク２０１４（Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ  ２０１４）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４、３２：９９２〜１０００ページ（各々参照により本明細書に組み込まれる）に記載される任意のタンパク質；又は、本明細書に記載される組換えポリペプチドの任意のコンジュゲート、バリアント、類似体若しくは機能的断片が含まれる。
【０１４１】
核酸
本明細書に記載される脂質代謝モジュレータ及び組換え生成物をコードする核酸、例えば、外因性核酸も本明細書で提供される。所望のＬＭＭ又は組換え生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組換え方法を使用して、例えば、所望の核酸配列、例えば遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすることによって、それを含むことが知られているベクターから核酸配列を導くことによって、又は標準の技術を使用してそれを含有する細胞及び組織から直接的に単離することによって得ることができる。代わりに、ＬＭＭ又は組換えポリペプチドをコードする核酸は、クローニングするより、合成的に生成することができる。組換えＤＮＡ技術及びテクノロジーは高度に進歩し、当技術分野で十分に確立されている。したがって、本明細書に記載される組換えポリペプチドのアミノ酸配列についての知識を有する当業者は、ＬＭＭ又は組換えポリペプチドをコードするであろう核酸配列を容易に想定又は生成することができる。
【０１４２】
ＬＭＭ  ＳＲＥＢＦ１及びＳＣＤ１をコードする例示的な核酸配列を、本明細書においてそれぞれ配列番号３及び配列番号４として提供する。
【０１４３】
所望のポリペプチド、例えば、ＬＭＭ又は組換えポリペプチドの発現は、所望のポリペプチド又はその部分をコードする核酸を作動可能にプロモーターに連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって一般的に達成される。ベクターは、複製及び真核細胞又は原核細胞への組み入れのために適する可能性がある。典型的なクローニングベクターは、他の調節エレメント、例えば、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、プロモーター、選択マーカー、又は所望の核酸配列の発現の調節若しくは同定のために有益なタグを含有する。
【０１４４】
ＬＭＭ又は組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むベクターに、クローニングすることができる。特に重要なベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及び配列決定ベクターが含まれる。実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターの形で細胞に提供することができる。ウイルスベクターテクノロジーは当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、２０１２、分子クローニング：実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有益であるウイルスには、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれる。一般に、適するベクターは、少なくとも１つの生物体において機能的である複製開始点、プロモーター配列、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又は複数の選択マーカーを含有する（例えば、国際公開０１／９６５８４号；国際公開第０１／２９０５８号；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。ウイルスに由来するベクターは、娘細胞における導入遺伝子の長期の安定した組み入れ及びその増殖を可能にするので、長期の遺伝子導入を達成するのに適するツールである。
【０１４５】
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、ベクターは以下の１つ又は複数を含むこともできる：分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子に由来する）、エピソームの複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント（例えばＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１、又は当技術分野で公知の他のもの）、及び／又は選択を可能にするエレメント、例えば、選択マーカー若しくはリポーター遺伝子。
【０１４６】
一実施形態では、ポリペプチド、例えば、ＬＭＭ又は組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチド、例えば、ＬＭＭ又は組換えポリペプチドの発現のために転写開始を可能にするための、ポリメラーゼの動員の役割を担うプロモーター配列をさらに含む。一実施形態では、本明細書に記載される方法に適するプロモーター配列は、多量の転写を促進し、したがって標的外因性ｍＲＮＡの大量のコピーを送達するエンハンサーと通常関連する。一実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要極初期プロモーター（Ｘｉａ、Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ等、２００６）及びＳＶ４０プロモーター（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、Ｍｏｒｙ等、１９８４）を含み、両方ともそれらの同名のウイルス又はそれに由来するプロモーターに由来する。ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲを含め、哺乳動物細胞において発現ベクターへの組み入れによって転写を促進するために、いくつかの他のより一般的でないウイルスプロモーターが首尾よく用いられた（Ｐａｐａｄａｋｉｓ、Ｎｉｃｋｌｉｎ等、２００４）。別の実施形態では、目的の遺伝子の構成的転写を促進するために、特異的な内因性哺乳動物プロモーターを利用することができる（Ｐｏｎｔｉｌｌｅｒ、Ｇｒｏｓｓ等、２００８）。ＣＨＯ特異的チャイニーズハムスター伸長因子１−アルファ（ＣＨＥＦ１α）プロモーターは、ウイルスベースの配列の代替物を高収量でもたらした（Ｄｅｅｒ，Ａｌｌｉｓｏｎ、２００４）。
【０１４７】
非哺乳動物の細胞、例えば、真菌類、昆虫及び植物細胞における発現のために適する他のプロモーターも、当技術分野で公知である。真菌又は酵母宿主細胞において転写を誘導するのに適するプロモーターの例には、限定されるものではないが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｅｅｓｅｉ）、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸプロモーター）、偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリプトファン生合成（ｔｒｐＣプロモーター）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ  ｆｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ（ｇｌａＡ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）  Ｐｌａｃ４−ＰＢＩプロモーター、又はＰＣＴ国際公開第２００５／１００５７３号に記載されているそれらの真菌遺伝子から得られるプロモーターが含まれる。昆虫細胞において転写を誘導するのに適するプロモーターの例には、限定されるものではないが、Ｔ７ラックプロモーター及びポリヘドリンプロモーターが含まれる。植物細胞において転写を誘導するのに適するプロモーターの例には、限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウイルスプロモーターＣａＭＶ３５Ｓが含まれる。原核生物の宿主細胞、例えば細菌細胞において本発明の核酸構築物の転写を誘導するのに適するプロモーターの例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ラックオペロンから得られるプロモーター、大腸菌ｔａｃプロモーター（ハイブリッドプロモーター、ＤｅＢｏｅｒ等、ＰＮＡＳ、１９８３、８０：２１〜２５ページ）、大腸菌ｒｅｃ  Ａ、大腸菌ａｒａＢＡＤ、大腸菌ｔｅｔＡ及び原核生物のベータ−ラクタマーゼである。適するプロモーターの他の例には、ウイルスのプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｍ１３プロモーター及びＳＰ６プロモーターを含む、バクテリオファージに由来するプロモーターが含まれる。
【０１４８】
プロモーターに加えて、本明細書に記載されるベクターは、上記のエンハンサー領域；転写の速度を上方制御するために転写因子を動員することができる、コアプロモーターに近い特異的ヌクレオチドモチーフ領域をさらに含むことができる（Ｒｉｅｔｈｏｖｅｎ、２０１０）。プロモーター配列と同様に、これらの領域はしばしばウイルスに由来し、ｈＣＭＶ及びＳＶ４０エンハンサー配列などのプロモーター配列の中に包含され、又は、アデノウイルス由来配列のようにさらに含まれてもよい（Ｇａｉｌｌｅｔ、Ｇｉｌｂｅｒｔ等、２００７）。
【０１４９】
一実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば、ＬＭＭ又は組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。一実施形態では、選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）への耐性を付与する酵素；又は、抗生物質マーカー、例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオシン、ピューロマイシン又はブラストサイジンなどの抗生物質への耐性を付与する酵素を含む。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書に記載される組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、本明細書に記載される組換え生成物をコードする核酸を含有する１つ又は複数の細胞の同定で有益である選択マーカーを含む。別の実施形態では、選択マーカーは、本明細書に記載される組換え生成物をコードする核酸配列のゲノムへの組み入れを含有する、１つ又は複数の細胞を同定又は選択することにおいて有益である。組換えタンパク質をコードする核酸配列を組み入れた１つ又は複数の細胞の同定は、生成物を安定して発現する細胞又は細胞系の選択及び工学操作に有益である可能性がある。
【０１５１】
一実施形態では、本明細書に記載されるＬＭＭをコードする核酸配列を含むベクターは、ＬＭＭをコードする核酸配列の部位特異的組み入れのための機構を含む。例えば、ベクターは、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）系に適合し、Ｆｌｐリコンビナーゼの存在下で、Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞、例えばＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞のゲノムに存在する所望の部位で、例えば２つのＦＲＴ部位の間で、所望の配列、例えばＬＭＭをコードする核酸配列の組換え及び以降の組み入れを誘導する２つのＦＲＴ部位（特異的ヌクレオチド配列を含む）を含む。所望の生成物をコードする核酸の部位特異的組み入れのために使用される他の系は、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘリコンビナーゼ系又はＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ媒介戦略など、当技術分野において公知である。
【０１５２】
使用に適するベクターは市販されており、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃから入手可能なＧＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、ＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系、又はＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶテクノロジーに関連したベクター、例えばｐＣｏｎベクターが含まれる。さらなるベクターには、限定されるものではないが、他の市販ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＡＴ、ｐｃＤＮＡ３．３ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、以前はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＴａｒｇｅｔ、ＨａｌｏＴａｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）；ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ｐＣＭＶ６（Ｏｒｉｇｅｎｅ）；又は、ｐＢＫ−ＣＭＶ／ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ−７／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれる。
【０１５３】
細胞及び細胞培養
一態様では、本開示は、生成物、例えば、本明細書に記載される組換えポリペプチドを生成する細胞又は細胞系を工学操作又は作製するための方法及び組成物に関する。別の態様では、本開示は、向上した、例えば増加した生産性及び生成物品質を有する細胞又は細胞系を工学操作又は作製するための方法及び組成物に関する。向上した生産性及び生成物品質に関連した特性については、本明細書において、例えば「脂質代謝のモジュレーション」というタイトルのセクションに記載する。
【０１５４】
実施形態では、細胞は、哺乳動物又は非哺乳動物の細胞、例えば、昆虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、古細菌細胞、例えば、古細菌（Ａｒｃａｅａ）の種に由来する細胞、又は細菌細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、イヌ、カモ、ウマ、オウム、フェレット、魚類又はネコに由来する。一実施形態では、細胞は、動物細胞である。実施形態では、細胞は、哺乳動物の細胞、例えば、ヒト細胞又はげっ歯動物細胞、例えば、ハムスター細胞、マウス細胞又はラット細胞である。一実施形態では、細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞である。一実施形態では、細胞は、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）の種、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。
【０１５５】
一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ  Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。
【０１５６】
別の実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ（ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳ−ＫＯ、Ｅｘｃｅｅｄ（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯ  Ｓ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、ＣＨＯＺＮ、若しくはＣＨＯ由来細胞、又はそれらに由来する任意の細胞である。一実施形態では、細胞は、幹細胞である。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養物における任意の一次細胞に由来する細胞である。
【０１５７】
一実施形態では、細胞は、生成物、例えば本明細書に記載される生成物を生成する、本明細書に記載される細胞のいずれか１つである。一実施形態では、細胞は、組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、例えば、組換えポリペプチド、例えば表２又は３から選択される組換えポリペプチドを発現する、本明細書に記載される細胞のいずれか１つである。
【０１５８】
一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、流加培養、ドローアンドフィル培養又は連続培養として実行される。一実施形態では、細胞培養は、接着性の培養である。一実施形態では、細胞培養は、懸濁培養である。一実施形態では、細胞又は細胞培養は、組換えポリペプチドの発現のためにｉｎ  ｖｉｖｏに置かれる、例えば、モデル生物体又はヒト対象に置かれる。
【０１５９】
一実施形態では、培地は、無血清である。
例えば米国特許第５，６３３，１６２号に記載の通りに、哺乳動物細胞系のための他の適する培地及び培養方法は、当技術分野で周知である。実験室フラスコ又は低比重細胞培養のための、及び特定の細胞型のニーズに適合した標準の細胞培養培地の例は、例えば以下の通りである：Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ，Ｇ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、ｐ．５１９ｆ．１９６７）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ａ．等、Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ、７８、１ｐ．１７３ｆｆ、１９６３）、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）、ハムのＦ１２培地（Ｈａｍ，Ｒ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．５３、ｐ２８８ｆｆ．１９６５）又は、アルブミン、トランスフェリン及びレシチンを欠いているＩｓｃｏｖｅｓの改変ＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅｓ等、Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１、ｐ．９２３ｆｆ．、１９７８）。例えば、ハムのＦ１０又はＦ１２培地は、ＣＨＯ細胞培養のために特別に設計された。ＣＨＯ細胞培養に特別に適応させた他の培地は、ＥＰ−４８１７９１に記載されている。他の適する培養方法は当業者に公知であり、利用した組換えポリペプチド生成物及び宿主細胞に依存することができる。細胞によって発現される生成物、例えば組換えポリペプチドの発現及び生成のために適する条件を決定又は最適化することは、当業者の技術の範囲内である。
【０１６０】
細胞の工学操作及び生成物の生成のための方法
本明細書に記載される方法及び組成物は、向上した生産性及び向上した生成物品質を有する細胞又は細胞系を工学操作するのに有益である。実施形態では、細胞は、細胞の脂質代謝がモジュレートされるように改変される。例えば、ＬＭＭをコードする外因性核酸が、細胞に導入される。細胞は、ＬＭＭの発現及び脂質代謝のＬＭＭ媒介モジュレーションに適する条件の下で、その後培養される。その脂質代謝がモジュレートされる細胞の特性については、本明細書で、例えば「脂質代謝のモジュレーション」というタイトルのセクションに記載する。
【０１６１】
一部の実施形態では、細胞は、生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む。別の実施形態では、細胞は、内因性生成物の発現を増加させる外因性核酸をさらに含む。そのような実施形態のいずれでも、生成物をコードするか又は内因性生成物の発現を増加させる外因性核酸は、脂質代謝の改変、例えば、本明細書に記載されるＬＭＭをコードする外因性核酸の導入などの前に導入される。代わりに、他の実施形態では、生成物をコードするか又は内因性生成物の発現を増加させる外因性核酸は、脂質代謝の改変、例えば、本明細書に記載されるＬＭＭをコードする外因性核酸の導入などの後に導入される。実施形態のいずれでも、生成物は、治療又は診断用のタンパク質である。実施形態のいずれでも、生成物は、表２又は３から選択される。
【０１６２】
所望のポリペプチド又はタンパク質、例えば本明細書に記載されるＬＭＭ又は本明細書に記載される生成物を発現するように細胞を遺伝子改変又は工学操作するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、トランスフェクション、形質導入（例えば、ウイルス形質導入）又はエレクトロポレーションが含まれる。
【０１６３】
核酸、例えば、本明細書に記載される外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、２０１２、分子クローニング：実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照。
【０１６４】
核酸、例えば、本明細書に記載される外因性核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質をベースとした系を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。標的化ナノ粒子又は他の適するサブミクロンの大きさの送達系によるポリヌクレオチドの送達などの、核酸の最新技術の標的化送達の他の方法が利用可能である。
【０１６５】
所望のポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるＬＭＭ及び／又は生成物の配列を含有する核酸は細胞に送達され、組換えを通してそのゲノムに組み入れることができる。生じた組換え細胞は、所望のポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるＬＭＭ及び／又は生成物の安定した発現が次に可能であり、このように、長期間にわたって一貫した、効率的なタンパク質生成を可能にする。目的の遺伝子は宿主の染色体で同時に複製されるので、長期にわたる発現を誘導するために単一のＤＮＡ送達過程のみが必要とされるという事実を含む、いくつかの利点が目的の遺伝子の安定した組み入れに付随する；これは、さらなる機構を必要とせずに遺伝子が１つの世代から次の世代に移されることを意味する。理論的には、これは、バッチからバッチへの発酵にわたってより一貫した生成物及び収量をもたらす。これと一致して、安定した発現方法は、本明細書に記載される脂質代謝をモジュレートする改変、例えばＬＭＭをコードする外因性核酸の導入なしで生成されるものと比較して、高い生成物収量を生成することが可能である。
【０１６６】
所望のポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるＬＭＭ及び／又は生成物を安定して過剰発現させる組換え細胞系を確立するプロトコールは、ランダムな組換えによって容易にされる宿主ゲノムへのランダムな部位での線状化ＤＮＡ（通常、プラスミドをベースにした）の組み入れを一般的に含む。宿主ゲノムの特異的領域で発現カセットの組み入れを促進する、部位特異的プロトコールも開発され、実行されている（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ、Ｆｏｘ等、１９９１）。これらのプロトコールは、部位特異的組換えが可能なリコンビナーゼをしばしば活用し、限定されるものではないが、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）系（例えば、Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞を利用する）、ＣＨＯＫ１ＳＶ  Ｆｌｐ細胞系（Ｌｏｎｚａ）（Ｚｈａｎｇ  Ｌ．等（２０１５）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３１：１６４５〜５ページに記載されている；参照により本明細書に完全に組み込まれる）、又は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系が含まれる。
【０１６７】
上記のように、一部の実施形態では、生成物及び／又はＬＭＭをコードする核酸を含むベクターは、トランスフェクトされたプールからの首尾よく発現する細胞の選択を容易にするために、選択マーカーをさらに含む（Ｂｒｏｗｎｅ、Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ  ２００７）。多数の選択方法が市販されているが、これらの中で最も一般的に使用されるものはメトトレキセート（ＭＴＸ）及びＬｏｎｚａのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）系である（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ、Ｒｅｎｎｅｒ等、１９９２、Ｌａｉ、Ｙａｎｇ等、２０１３）。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、テトラヒドロ葉酸への葉酸の変換の役割を担うタンパク質であり、グリシン、プリン及びチミジル酸を生成する必須の生合成経路のために必要である。ＤＨＦＲ活性を阻害するためにＭＴＸを使用することができ、したがって、安定して組み入れられた細胞の選択のために、安定してトランスフェクトされた培養へのＤＨＦＲの組み入れを使用することができる；十分な組換えＤＨＦＲを首尾よく発現する細胞だけが、ＭＴＸを使用した選択を生き延びる（Ｃａｃｃｉａｔｏｒｅ，Ｃｈａｓｉｎ等、２０１０）。一般的に用いられる別の選択方法は、グルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの合成の役割を担う酵素ＧＳの使用であるが、グルタミンは哺乳動物細胞の生存のために不可欠であるので、十分なＧＳを欠いている細胞は培養で生存できない。最初は、ＧＳの阻害剤メチオニンスルフォキシミン（ＭＳＸ）の追加は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞における内因性のＧＳの存在が細胞生存を維持するのに十分でないことを確実にし、したがって、組換え構築物の安定した組み入れを通してもたらされたさらなるＧＳを発現する細胞だけが、選択過程を生き延びる。Ｌｏｎｚａ及び他は、培地中の外因性グルタミンの存在なしで目的の構築物が首尾よく組み入れられていない全ての細胞が消滅するように内因性ＧＳ遺伝子がノックダウン／ノックアウトされた、ＣＨＯ宿主細胞系を今や確立した（Ｆａｎ，Ｋａｄｕｒａ等、２０１２）。耐性遺伝子を抱える細胞だけが選択過程を生き延びるように特定の選択薬剤への耐性を導き出す、多くの他の選択方法が利用可能である；これらには、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン及びゼオシンが含まれる（Ｂｒｏｗｎｅ、Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ、２００７）。実施形態では、ＬＭＭをコードする外因性核酸を含むベクター及び生成物、例えば本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする外因性核酸を含むベクターは、種々の選択マーカーをさらに含む。
【０１６８】
安定して発現する細胞プールの良好な回収の後、単一の細胞を起源とする個々のクローンの単離は、高い生成物収量及び品質が可能である細胞系、又は高い生成物収量及び高品質生成物の最も高い能力を有する細胞系の選択を容易にする。細胞特性の差は、細胞で観察される不均一性、及び組換えＤＮＡの数と特異的組込み部位（単数又は複数）の両方に関連する可能性がある。したがって、複数のクローンを迅速に評価し、高度発現細胞をその後選択するために、クローンスクリーニング特性が開発された。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）は、蛍光強度に基づいて細胞を迅速に分類することができる方法であり、したがって、高度発現クローンを選択するために用いることができる。目的のタンパク質の蛍光性タグ付け（Ｐｏｗｅｌｌ、Ｗｅａｖｅｒ、１９９０）、組換え遺伝子と同時発現される細胞表面分子の蛍光性タグ付け（Ｈｏｌｍｅｓ、Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ、１９９９）及び目的の遺伝子と同時発現されるｅＧＦＰ発現に基づく蛍光強度の検出（Ｍｅｎｇ、Ｌｉａｎｇ等、２０００）を含む、いくつかのプロトコールが確立された。これらの方法で観察される高い蛍光強度は、高レベルの組換えタンパク質生成を示唆し、したがって、これらの細胞は組換え細胞プールから優先的に選択することができる。高度発現組換えクローンを単離するＦＡＣＳベースの選択方法は、細胞と会合したままである組換え生成物により適しており、また、哺乳動物で発現されるバイオ治療組換えタンパク質生成物が分泌されるので、分泌される組換えタンパク質のためのクローンの選択にとってより適当である方法が開発された。例えば、ＣｌｏｎｅＰｉｘは、コロニー周囲の培地への組換え生成物の分泌、及びフルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）との関連付け、したがってコロニー周囲の蛍光性ハロの形成に基づいて、半固体培地の上に増殖するクローンを選び出す、自動化されたコロニー選択方法である（Ｌｅｅ、Ｌｙ等、２００６）。クローンは、コロニーを囲んでいるハロの蛍光強度に基づいて選択される。生産性に特に関心を置いて所望の生物学的特性に基づいて組換え細胞を迅速に単離する、多くの他のクローン選択プロトコールが確立され、Ｂｒｏｗｎｅ及びＡｌ−Ｒｕｂｅａｉ（Ｂｒｏｗｎｅ、Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ、２００７）でレビューされている。本明細書に記載される通りに選択されるクローンの拡張は、細胞系の生成をもたらす。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、生産性が向上した細胞を生成する。細胞の向上した生産性又は生成能力には、生成される生成物のより高い収量若しくは量及び／又は増加した生成速度（単位時間にわたって生成される生成物の収量又は量によって判定される）が含まれる。一実施形態では、細胞の生産性、例えば生成物を生成する能力の向上は、例えば、脂質代謝経路がモジュレートされていない細胞によって生成される生成物の総量、レベル又は量と比較して、生成される生成物の総量、レベル又は量の増加、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の増加；或いは、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍、又はそれより多い増加をもたらす。一実施形態では、細胞の生産性、例えば生成物の生成速度の向上は、例えば、脂質代謝経路がモジュレートされていない細胞によって生成される生成物の生成速度と比較して、生成物の生成速度の増加、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の増加；又は、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍、若しくはそれより多い増加をもたらす。
【０１７０】
細胞を工学操作するための本明細書に記載される方法は、高生産細胞又は高生産細胞系を生成する。高生産細胞又は細胞系は、参照細胞又は本明細書に記載される方法によって選択若しくは工学操作されていない細胞と比較して、より高い収量の組換えポリペプチド生成物を生成することが可能である。一実施形態では、高生産細胞系は、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、又は１００ｇ／Ｌ以上の生成物、例えば組換えポリペプチド生成物を生成することが可能である。一実施形態では、高生産細胞系は、１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、又は１００ｇ／Ｌ以上の生成物、例えば組換えポリペプチド生成物を生成する。生成される生成物の量は、細胞型、例えば種、及び発現させる生成物、例えば組換えポリペプチドによって異なることができる。例として、モノクローナル抗体を発現する高生産ＣＨＯ細胞は、少なくとも１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ又は２５ｇ／Ｌのモノクローナル抗体を生成することが可能である。
【０１７１】
現在当技術分野で公知の従来の方法を使用して細胞又は無細胞系において発現又は生成するのが困難である生成物の発現のために特に有益である可能性がある、方法及び組成物が本明細書に記載される。このように、そのような発現困難な生成物、例えば本明細書に記載される次世代生物製剤を生成する生産細胞系は、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、８５ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、９５ｍｇ／Ｌ、又は１００ｍｇ／Ｌ以上を生成することができる。発現困難なタンパク質のための本明細書に記載される方法及び組成物によって達成される生成能力（例えば、生成物の収量、総量若しくは量、又は生成物の生成速度）は、本明細書に記載される脂質代謝をモジュレートする改変を有しない細胞又は系の生成能力と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、若しくはそれより多く、又は、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍若しくは１００倍以上増加させることができる。
【０１７２】
生成又は分泌される、例えば培養培地に分泌される生成物の総量、レベル又は量を定量化するためのアッセイには、タンパク質定量化アッセイ、例えばブラッドフォードタンパク質アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、イムノブロッティング、例えばウェスタンブロット、及び、例えばナノドロップ装置を使用する自動化された手段が含まれる。増加したタンパク質生成を測定するための他の方法は、当業者に周知である。例えば、組換えタンパク質生成の増加は、ＥＬＩＳＡによって組織培養培地中の濃度を測定することによって、小規模で判定される可能性がある（Ｓｍａｌｅｓ等、２００４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８８：４７４〜４８８ページ）。それは、例えば培地中の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）濃度のハイスループット判定のためにＦｏｒｔｅＢｉｏオクテットによって（Ｍａｓｏｎ等、２０１２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、２８：８４６〜８５５ページ）、又はプロテインＡ  ＨＰＬＣによってより大規模で（Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄ等、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９７：４１０〜４２４ページ）定量的に判定することもできる。生成物、例えば本明細書に記載される組換えポリペプチドの生成を判定するための他の方法は、細胞中の生成物、特に組換えポリペプチドの比生産速度（ｑＰ）、及び／又は生存可能な細胞の濃度（ＩＶＣ）の時間積分を指すことができる。一実施形態では、生成を判定するための方法は、ｑＰ及びＩＶＣの判定の組合せを含む。培養培地におけるポリペプチドの濃度として規定されて、組換えポリペプチド生成又は生産性はこれらの２つのパラメータ（ｑＰ及びＩＶＣ）の機能である。そして、Ｐｏｒｔｅｒ等による計算される。（Ｐｏｒｔｅｒ等、２０１０、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ、２６：１４４６〜１４５５ページ）。タンパク質生成を測定するための方法は、本明細書で提供される実施例においてもさらに詳細に記載される。
【０１７３】
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、生成物品質が向上した細胞を生成する。一実施形態では、生成物の品質の向上は、例えば、脂質代謝経路がモジュレートされていない細胞によって生成される生成物の総量、レベル又は品質と比較して、生成物品質の増加、例えば、生成物品質の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％、又はそれより多くの増加；或いは、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、若しくは１００倍、又はそれより多い増加をもたらす。生成物品質におけるそのような増加は、例えば、以下の１つ又は複数によって例示することができる：
ｉ）非凝集生成物の総量若しくは量の増加（又は凝集生成物の総量若しくは量の減少）；
ｉｉ）適切に折り畳まれたか若しくは組み立てられた生成物の総量若しくは量の増加（又は、誤って折り畳まれた、折り畳まれていない、部分的に組み立てられた、若しくは組み立てられていない、生成物の総量若しくは量の減少）、或いは、適切に折り畳まれた又は組み立てられた生成物対折り畳まれていない、誤って折り畳まれた、部分的に組み立てられた、又は組み立てられていない生成物の比の増加；
ｉｉｉ）完全長生成物の総量若しくは量の増加（又は生成物の断片化の減少）；
ｉｖ）所望の翻訳後修飾の増加（又は、未改変の若しくは誤って改変された生成物の減少）；
ｖ）グリカン不均一性（例えば、グリコシル化された生成物の）の増加又は減少；
ｖｉ）機能的生成物の総量若しくは量の増加（又は非機能的若しくは機能障害生成物の総量若しくは量の減少）、或いは、機能的対非機能的若しくは機能障害生成物の比の増加；並びに／或いは
ｖｉｉ）ジスルフィド結合スクランブルの増加又は減少（例えば、例えば抗体分子生成物のジスルフィド結合スクランブルの増加又は減少の結果としての所望のアイソフォーム又は構造体の増加又は減少）。
【０１７４】
本明細書に記載される通りに生成される細胞又は細胞系の生成物品質、例えば生成物品質の向上を測定するための方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、発現される組換えポリペプチド生成物の一次配列の忠実度を判定するための方法は、例えば質量分析など当技術分野で公知である。適切に折り畳まれた生成物、例えば発現される組換えポリペプチドの量又は濃度の増加は、円二色性によって、又は発現される組換えポリペプチドの固有の蛍光を評価することによって判定することができる。機能的生成物の量又は濃度の増加は、組換え生成物、例えば組換えポリペプチドのアイデンティティに依って様々な機能的アッセイを使用して試験することができる。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡ又は他の免疫親和性アッセイによって試験することができる。生成物品質の増加を判定するための、例えば凝集、翻訳後修飾、ジスルフィド結合スクランブルを判定するための他の方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、動的光散乱（ＤＬＳ）アプローチ、及びタンパク質電気泳動（ＰＡＧＥ）方法によって評価することができる。
【０１７５】
一実施形態では、例えば本明細書に記載されるような生成物を生成するための方法は、上記のような脂質代謝をモジュレートする改変を含むように工学操作された細胞を提供することを含む。一実施形態では、脂質代謝をモジュレートする改変を含む細胞は、生成物、例えば本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む。一実施形態では、生成物、例えば本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、脂質代謝をモジュレートする改変を含む工学操作細胞に導入される。別の実施形態では、生成物、例えば本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする外因性核酸は、本明細書に記載されるＬＭＭをコードする外因性核酸の導入の前に細胞に導入される。生成物をコードする外因性核酸は、本明細書に記載される生成物を安定して発現する、例えば過剰発現する細胞の効率的な選択のために、選択マーカーをさらに含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、生成物の発現、例えば、生成物の転写、翻訳及び／若しくは分泌、又は生成物の品質、例えば一次配列の適切な折畳み及び／若しくは忠実度を向上させるために、さらなるステップを実行することができる。そのようなさらなるステップは、生成物発現又は生成物品質を向上させる薬剤を導入することを含む。一実施形態では、生成物発現又は生成物品質を向上させる薬剤は、低分子、ポリペプチド、又はタンパク質の折畳み、例えばシャペロンタンパク質の折畳みを向上させるポリペプチドをコードする核酸であってよい。一実施形態では、タンパク質の折畳みを助ける薬剤は、シャペロンタンパク質、例えば、ＢｉＰ、ＰＤ１又はＥＲＯ１をコードする核酸を含む（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ  ＆  Ｂｕｌｌｅｉｄ  ２００４；Ｂｏｒｔｈ等、２００５；Ｄａｖｉｓ等、２０００）。生成物の収量及び品質を向上させる他のさらなるステップは、ＸＢＰ１及びＡＴＦ６などの転写因子（Ｔｉｇｇｅｓ＆Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ、２００６；Ｃａｉｎ等、２０１３；Ｋｕ等、２００８）、並びにカルネキシン及びカルレティキュリンなどのレクチン結合性シャペロンタンパク質（Ｃｈｕｎｇ等、２００４）の過剰発現を含む。本明細書に記載されるタンパク質の折畳み、生成物品質及び生成物収量を助けるか又は向上させる薬剤の過剰発現は、薬剤をコードする外因性核酸の導入によって達成することができる。別の実施形態では、生成物発現又は生成物品質を向上させる薬剤は、生成物の発現又は生成物の品質を増加させるために細胞培養に加えることができる低分子、例えば、ＤＭＳＯである。一実施形態では、より低い、例えば、細胞を通常増殖させる温度より１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、又は１０℃より低い温度で細胞を培養することは、生産性を向上させることができる。
【０１７７】
本明細書に記載される方法のいずれも、高い生産性を有するか又は高品質の生成物を生成する細胞を同定するための、さらなる選択ステップをさらに含むことができる。例えば、所望の特徴、例えばタンパク質折畳みタンパク質、例えばシャペロンのより高い発現を有する特異的細胞を選択するために、ＦＡＣＳ選択を利用することができる。
【０１７８】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチド生成物を回収するか又は取り出すためのステップを含む方法を提供する。組換えポリペプチドが細胞から分泌される実施形態では、本方法は、細胞、細胞集団、又は細胞が培養された培養培地から、組換えポリペプチドを取り出す、収集する又は分離するためのステップを含むことができる。組換えポリペプチドが細胞の中にある実施形態では、組換えポリペプチド生成物の精製は、細胞によって生成される組換えポリペプチドの以下のいずれかの１つ又は複数からの分離を含む：宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、宿主細胞脂質及び／又は宿主細胞に由来する他のデブリ。
【０１７９】
実施形態では、本明細書に記載される方法は、実質的に純粋なタンパク質生成物を提供する。本明細書で用いる「実質的に純粋な」は、発熱性物質が実質的に含まれない、核酸が実質的に含まれない、並びに／又は宿主細胞に由来する内因性の細胞性タンパク質酵素及び構成成分、例えばポリメラーゼ、リボソームタンパク質及びシャペロンタンパク質が実質的に含まれないことを意味する。実質的に純粋なタンパク質生成物は、例えば２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の、混入する、宿主細胞に由来する内因性のタンパク質、核酸又は他の巨大分子を含有する。
【０１８０】
生成物、例えば組換えポリペプチドの回収及び精製のための方法は、当技術分野で十分確立されている。組換えポリペプチド生成物を回収するために、物理的若しくは化学的又は物理的化学的方法が使用される。物理的若しくは化学的又は物理的化学的方法は、濾過方法、遠心分離方法、超遠心方法、抽出方法、凍結乾燥方法、沈殿方法、クロマトグラフィー方法又はそれらの２つ以上の方法の組合せであってよい。一実施形態では、クロマトグラフィー方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（又は、ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、例えば、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は多モードクロマトグラフィーのうちの１つ又は複数を含む。
【実施例】
【０１８１】
本発明を、以下の実験例を参照して詳細にさらに説明する。これらの実施例は例示だけのために提供され、特記しない限り限定するものではない。したがって、本発明は、いかなる場合も以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明白になるあらゆる変形を包含するものと解釈されるべきである。
【０１８２】
さらなる記載がなくても、当業者は、前述の記載及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製、利用することができ、特許請求される方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に示しており、本開示の残りをいかなる形であれ限定するものと解釈されるべきではない。
【０１８３】
（例１）
脂質代謝モジュレータを過剰発現する安定した細胞の生成
ＣＨＯ細胞における２つの脂質代謝モジュレータＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１の過剰発現の作用を調査するために、これらの遺伝子を首尾よくクローニングし、部位特異的アプローチを使用して接着性のＣＨＯＦｌｐ−Ｉｎ細胞に、及びランダム組み入れアプローチを使用して懸濁ＧＳノックアウト（ＧＳＫＯ）ＣＨＯ細胞に安定して組み入れた。
【０１８４】
ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１含有ＦＲＴベクターの分子クローニング
各タンパク質のＣ末端のＶ５／Ｈｉｓタグの有り無し両方でＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１タンパク質の発現を促進するＦＲＴベースのベクターを生成するために、分子クローニングを実行した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒの市販されているＦｌｐ−Ｉｎ宿主ＣＨＯ細胞プールとこれらのベクターの併用は、安定したＣＨＯ接着細胞プールを生成するために、目的の遺伝子の部位特異的組み入れを可能にした。表４でも詳述されている制限部位に隣接して二本鎖ＤＮＡ断片が生成されるように、これらの遺伝子を増幅するためのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼをベースとしたＰＣＲ反応において、表４に記載されるプライマーを使用した。マウスＰ１９由来のｃＤＮＡ及びＯｒｉｇｅｎｅマウスｃＤＮＡクローン（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１１４８０）から、ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１遺伝子をそれぞれ増幅させた。
【０１８５】
標的遺伝子の良好な増幅の後、適当な制限酵素を用いて二重制限消化をＦＲＴ−Ｖ５ベクターにおいて、並びに以前に生成された目的の遺伝子のＰＣＲ生成物において行った。以降の形質転換の前にライゲーションを一晩インキュベートし、生じたコロニーの上でミニプレップ精製を実行した。
【０１８６】
接着性のＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞を過剰発現するＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１の生成
安定した細胞プールを生成するために、前述のＦＲＴをベースとした構築物をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒの市販の接着性Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞と併用した。目的の遺伝子を含有するＦＲＴベクター及び空のＦＲＴ構築物（対照の細胞プールを生成するために使用された）を、リコンビナーゼ含有ｐＯＧ４４ベクターと一緒にＦｌｐ−Ｉｎ細胞に同時トランスフェクトさせた。ＦＲＴベクター及びＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯゲノムに存在するリコンビナーゼ部位は部位特異的組換えを開始し、選択薬剤としてハイグロマイシンを使用して良好なクローンを単離することができる。部位特異的様式で安定して発現する組換えＣＨＯ接着細胞プールは、製造業者の説明書に従って、例えば、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒの参考文献及びプロトコールウェブサイトから入手可能である、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＦｌｐ−Ｉｎマニュアルに記載の通りに生成された。この方法は、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５  Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯポリクローナル細胞プールを生成し、回収するために使用された。
【０１８７】
ｐｃＤＮＡ３．１ベクターへのＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１の分子クローニング
ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１又はトランケーションされたＳＲＥＢＦ１遺伝子の１つにより工業的に重要なＣＨＯ懸濁細胞において安定して組み入れ、したがって過剰発現させるために、発現ベクターを生成した。ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−Ｈｉｓ／ＴＯＰＯベクターは、目的の遺伝子の発現を促進する、適当なＣＭＶプロモーター及び下流の複数のクローニング部位からなり、さらに、ゲノムへのＤＮＡの組み入れの後に良好なクローンの選択のために利用することができるネオマイシン遺伝子の発現を可能にするエレメントも含む。
【０１８８】
最初に、表４に示すプライマーを使用してＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ１トランケーションを増幅するために、生じたＰＣＲ生成物の側面に制限部位が同時に加えられるように設計された、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＰＣＲプロトコールを使用した。以前に生成されたＳＣＤ１−ＦＲＴベクターは、ＳＣＤ１遺伝子を増幅するための鋳型として使用し、ＯｒｉｇｅｎｅマウスｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１１４８０）は、ＳＲＥＢＦ１遺伝子及びそのトランケーションを増幅するために使用した。ここでＳＲＥＢ４１０と呼ばれるＳＲＥＢＦ１トランケーションは、ＳＲＥＢＦ１のヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）ドメインを含む、４１０アミノ酸の長いポリペプチド配列をコードする。このドメインは、完全長タンパク質から内因的に切断され、既に概説した通り、核へのこの断片の移動及び以降の遺伝子転写活性化を可能にする。核に直接的に位置するタンパク質（この配列によってコードされる）を発現させ、したがって、内因性プロセシングを必要とせずに転写活性化因子としてのその機能を実行する目的で、この領域を増幅するようにプライマーを設計した。
【０１８９】
適当な場合は精製されたＰＣＲ生成物（表４を参照する）で、及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ／ＴＯＰＯで二重制限消化を実行し、ここで、Ｖ５及びＨｉｓタグをコードするインフレーム配列への読み通しを可能にするために、プライマーは終止コドンのない遺伝子を増幅した。Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１又はＳＲＥＢ４１０遺伝子を含有するベクターを得るために、生じたＤＮＡ断片をライゲーションした。これらの反応を形質転換させ、生じたコロニーのいくつかでミニプレップを実行した。制限消化を実行し、生じたＤＮＡ断片をアガロースゲルにかけて、どの試料が良好であるか確認した。
【０１９０】
懸濁ＧＳＫＯ  ＣＨＯ細胞を過剰発現するＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１の生成
工業的に重要な細胞系に挿入された遺伝子の構成的発現の作用を調査するために、化学的に定義された、以前に合成されたｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−Ｈｉｓ／ＴＯＰＯ由来の構築物で安定してトランスフェクトさせた、タンパク質無血清培地で増殖させた懸濁ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞プールを生成した。これを達成するために、ＬｏｎｚａのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主細胞系を使用して安定した組み入れを実行した。最初に、ＳＣＤ１−Ｖ５、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５、ＳＲＥＢ４１０−Ｖ５及び対照（空のｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−Ｈｉｓ／ＴＯＰＯ）構築物を、ＰｖｕＩ制限酵素（ＮＥＢ）による一晩の消化によって線状化した。線状化の後、エタノール沈殿を使用してＤＮＡを精製し、２０μｇのＤＮＡ及び１×１０７の生存可能な細胞を使用してＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞をエレクトロポレーションし、その直後に３７℃でＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するＴ７５フラスコに移し、２０ｍＬの最終容積にした。フラスコは、空気雰囲気中の５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿静止インキュベーターの中に２４時間置いた。Ｇ４１８（Ｍｅｌｆｏｒｄ）選択薬剤の濃縮保存液をＣＤ−ＣＨＯ培地に希釈し、この保存液の５ｍＬをＴ７５フラスコに加えて静かに混合し、２５ｍＬの総量に７５０μｇ／ｍＬの最終濃度を与えた。増殖及び培養生存度を判定するために３〜４日おきに細胞計数を実行し、ＣＤ−ＣＨＯ培地中の７５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を遠心分離及び再懸濁によって概ね６日おきに更新した。細胞が１ｍＬにつき２×１０５の生存可能な細胞数の濃度に到達したならば、細胞を１２５ｍＬエーレンマイヤーフラスコに移し、ルーチンの懸濁細胞培養を確立した。
【表４】
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【０１９１】
（例２）
ＬＭＭを過剰発現する安定した細胞におけるＬＭＭの発現分析
対照（空のｐｃＤＮＡ５  ＦＲＴ）、ＳＣＤ１−Ｖ５又はＳＲＥＢＦ１  Ｖ５を安定して組み入れた、安定したＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞プールの確立の後に、外因性の安定して組み入れられた遺伝子の発現及びさらに発現タンパク質の細胞内位置を確認するために、免疫蛍光法を行った。１０％ＦＢＳを補充したハム栄養ミックスＦ１２培地に、対照、ＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５細胞系を２４ウェルプレートの１ウェルにつき２×１０５の生存可能な細胞で播種した。試料をメタノールで固定し、先ず抗Ｖ５抗体（マウスで生成  −  Ｓｉｇｍａ  Ｖ８０１２）に、続いて抗マウスＦＩＴＣ二次コンジュゲート（ヤギで生成−Ｓｉｇｍａ  Ｆ０２５７）に曝露させた。さらに、細胞性ＤＮＡを染色し、こうして核を強調するために、細胞をＤＡＰＩ染色（１０μｇ／ｍＬの有効保存液）に曝露させた。生じた免疫蛍光画像を、図１に示す。
【０１９２】
ＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５細胞系におけるＦＩＴＣ染色の存在は、外因性／組換え遺伝子が首尾よく発現されたこと、さらに、ＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５タンパク質の細胞内局在化が明白だったことを示す。構成的に発現されたＳＣＤ１−Ｖ５タンパク質は細胞全体に存在し、豊富だったが、画像はそれらの局在化が細胞質及びＥＲにあることを示している。反対に、ＳＲＥＢＦ１−Ｖ５タンパク質は大いにより少ない量で発現されたが、それは非常に顕著に核の周囲に位置し、核の周囲に環を形成した。Ｖ５エピトープ配列が遺伝子の３’末端に加えられること、及び、ＳＲＥＢＦ１の天然の調節のために、特異的ドメインが切断されて細胞の中に再配置されることを考慮することが重要である。成熟した、切断されたｂＨＬＨ（塩基性のヘリックスループヘリックス）領域は、それが脂質生合成及び立体配座に関連して多くの遺伝子の転写活性化の役割を担っているので、きわめて重要である。この領域は遺伝子の５’末端でコードされるので、この領域は３’のＶ５タグの染色により検出されないだろう。したがって、翻訳されたタンパク質の構成的に発現された、切断された部分のいずれかが画像化された細胞に存在するかどうかを判定するのは不可能である。
【０１９３】
工学操作ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ懸濁細胞系においてＳＣＤ１−Ｖ５及びＳＲＥＢＦ１−Ｖ５の存在を判定するために、細胞内のＶ５タグ付きの安定タンパク質の染色を実行した。２４ウェルプレートの中のカバーグラスにこれらの細胞を接着させるために、カバーグラスをポリ−Ｌ−リシンで先ず処理し、１ウェルにつき細胞数２×１０５で細胞を播種し、５％ＣＯ２環境の静止加湿インキュベーターの中で、３７℃で一晩インキュベートさせた。メタノール固定及び透過性化に続いて、抗Ｖ５（マウスで生成−Ｓｉｇｍａ  Ｖ８０１２）を抗マウスＴＲＩＴＣ（ヤギで生成−Ｔ５３９３）二次抗体とコンジュゲートした。生じた画像を図２に示す。
【０１９４】
抗Ｖ５抗体、抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体を使用してウェスタンブロットを実行し、適当な検出系を使用してＶ５タグで脂質構築物の発現をさらに確認した。総タンパク（ブラッドフォードアッセイを使用して判定される）の等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥのために加え、その後、ニトロセルロース上でのウェスタンブロッティングを行った。生じたブロットを図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示すが、Ｖ５タグはＳＣＤ１構築物を発現する細胞だけで検出された。しかし、ＳＲＥＢＦ１構築物で達成された低レベル発現は、この構築物を発現する細胞系におけるＶ５の検出の欠如を説明することができる。
【０１９５】
（例３）
ＬＭＭを過剰発現する安定した細胞の増殖特性
この例では、ＬＭＭ、ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）細胞系を過剰発現するように工学操作された２つの異なる細胞系において、生細胞数、細胞数及び培養生存度などの増殖特性を評価した。ＬＭＭ工学操作細胞系は、例１に記載の通りに生成された。対照細胞系は、空のＶ５タグ付き発現ベクターを発現するように工学操作された。ｅＧＦＰをコードする発現ベクターを、エレクトロポレーションによってＬＭＭ工学操作細胞系にトランスフェクトさせた。１×１０７の生存可能なＬＭＭ工学操作Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞、及び２０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｅＧＦＰコード発現ベクター）を使用して、エレクトロポレーションを実行し、これらの細胞を、ハムの栄養ミックスＦ１２培地中に、約２０又は３２ｍＬの最終容積に希釈した。ｅＧＦＰコード発現ベクターのトランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後に、生存可能な細胞の濃度をＶｉＣｅｌｌ細胞カウンターで判定し、記録した。
【０１９６】
ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１を発現するように工学操作されたＦｌｐ−Ｉｎ（商標）細胞の結果は、図４に示す。ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１を過剰発現する細胞は、対照細胞と比較して全ての時点にわたって生存可能な細胞濃度の多少の増加を一般的に示した。
【０１９７】
ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ４１０を発現するように工学操作されたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞の結果を図５Ａ及び５Ｂに示す。全体の細胞濃度と比較した生存可能な細胞の濃度を図５Ａに示すが、生存可能な細胞の濃度は下方のカラムに表し、カラム全体は計数した細胞の総数を表す。図５Ａに示すように、ＬＭＭ（ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１）の発現は、全ての時点にわたって生存可能な及び全体の細胞数の一般的な増加をもたらす。４８、７２及び９６時間目までに、生存可能な及び全体の細胞濃度は、ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１で工学操作された細胞において有意により高かった。９６時間目に、ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１で工学操作された細胞の生存可能な細胞数は、対照細胞より１ｍＬにつき１×１０６細胞を超えて高かった。培養生存度も計算し、図５Ｂに示す。ＬＭＭで工学操作された細胞は、対照細胞と比較して培養生存度における増加を一般的に示した。
【０１９８】
（例４）
ＬＭＭを過剰発現する安定した細胞におけるｅＧＦＰ誘導蛍光の増加
この例では、組換えタンパク質を生成する生成能力を、例１に記載の通りに、ＬＭＭを安定して発現するように工学操作されたＣＨＯ−Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞系において評価した。例３に記載の通りに、ＬＭＭで工学操作された細胞をｅＧＦＰコード発現ベクターでトランスフェクトさせ、トランスフェクションから２４、４８、７２及び９６時間後にフローサイトメトリーによって生成されたｅＧＦＰの量を測定することによって、生成能力を評価した。細胞のｅＧＦＰ媒介蛍光を測定し、ここに示すデータを生成するために、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器を使用した。
【０１９９】
ｅＧＦＰの生成は、Ｖ５タグ付きのＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１を発現するように工学操作されたＦｌｐ−Ｉｎ細胞で測定した。図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、指定された時点でフローサイトメトリーを使用して記録した、ＬＭＭ工学操作Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞の蛍光中央値、幾何平均蛍光及び算術平均蛍光をそれぞれ示す。蛍光中央値、幾何平均蛍光及び算術平均蛍光のこれらの値はＳＣＤ１過剰発現細胞で増加し、それによって、ＳＣＤ１を安定して発現する細胞が対照細胞と比較してより多くのｅＧＦＰを生成することが可能なことを実証する。
【０２００】
ｅＧＦＰの生成は、Ｖ５タグ付きのＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ４１０を発現するように工学操作されたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞で測定した。蛍光中央値を図７Ａに示し、幾何平均蛍光を図７Ｂに示す。ＳＲＥＢＦ１を過剰発現するように工学操作された細胞で、増加した蛍光中央値及び幾何平均蛍光が観察された。
【０２０１】
ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ由来細胞系で観察された細胞濃度及び増殖特性の差を説明するために、測定した算術平均蛍光に全体の細胞濃度（×１０６／ｍＬ）を掛けることによって培養１ｍＬあたりの全体の蛍光を計算し、計算値を図７Ｃに示す。図７Ｃに示すように、ＳＣＤ１過剰発現細胞は、対照細胞と比較してトランスフェクションの２４時間後に組換えタンパク質（ｅＧＦＰ）の有意に増加した量を生成した。ＳＲＥＢＦ１過剰発現細胞は、対照細胞と比較して試験した全ての時点でｅＧＦＰの増加した量を、並びにトランスフェクションから７２及び９６時間後には有意に増加した量を一般的に生成した。
【０２０２】
一括して、これらのデータは、ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１などのＬＭＭを発現するように細胞を工学操作することは、ｅＧＦＰなどの一時的に発現される組換えタンパク質の生成能力を増加させることを示す。さらに、測定した蛍光によって実証されるように、脂質代謝をモジュレートする改変を有しなかった細胞と比較して、細胞は増加した正しく折り畳まれている機能的ｅＧＦＰを生成し、それによって、脂質代謝のモジュレーションが生成収量及び品質の両方を増加させることを実証した。
【０２０３】
（例５）
ＬＭＭを過剰発現する安定した細胞における生産性の向上
例４に記載される実験と同様に、異なる生成物、例えばモデルＩｇＧ４抗体分子（本明細書で抗体Ａと呼ぶ）及び融合タンパク質（本明細書でＦｃ融合タンパク質又はＦＰと呼ぶ）の生成能力について、ＬＭＭを安定して発現する細胞系を評価した。
【０２０４】
Ｖ５タグ付きのＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ１を安定して発現するＦｌｐ−Ｉｎ細胞（例１に記載の通りに工学操作される）を、抗体Ａ又はＦｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、培養上清中の組換え抗体Ａ及びＦＰの量を、エレクトロポレーションの２４、４８、７２及び９６時間後にウェスタンブロッティングによって判定した。抗体Ａ（図８Ａ）及びＦｃ融合タンパク質（図９Ａ）を検出するために、抗重鎖一次抗体、抗ウサギ−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体及び適当な検出試薬を使用した。抗体Ａ及びＦｃ融合タンパク質の生成の平均変化倍率を、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって判定し、それぞれを図８Ｂ及び９Ｂに示す。外因性ＳＣＤ１を発現する細胞系は、両組換えタンパク質の対照細胞系と比較して増加した生産性を実証した。さらに、この作用は、分析した２４、４８、７２及び９６時間の時点にわたって一貫していた。
【０２０５】
ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ４１０構築物を安定して発現するＬｏｎｚａのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞（例１に記載の通りに工学操作される）を、２つの組換えタンパク質、モデルＩｇＧ４（抗体Ａ）及びＦｃ融合タンパク質で一時的にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、培養上清中の組換え抗体Ａ及びＦＰの量を、抗重鎖一次抗体、抗ウサギ−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体及び適当な検出試薬を使用して２４時間ごとに９６時間までウェスタンブロッティングによって判定した（図１０Ａ及び１１Ａ）。抗体Ａ及びＦｃ融合タンパク質の生成の平均変化倍率を、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって判定し、それぞれを図１０Ｂ及び１１Ｂに示す。外因性ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ４１０を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞系は、両組換えタンパク質の対照細胞系と比較して増加した生産性を実証した（図１０Ｂ及び１１Ｂ）。さらに、この作用は、分析した４８、７２及び９６時間の時点にわたって一貫していた。
【０２０６】
ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ４１０構築物を安定して発現するＬｏｎｚａのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（Ｘｃｅｅｄ（商標））細胞（例１に記載の通りに工学操作される）を、２つの組換えタンパク質、モデルＩｇＧ４（抗体Ａ）及びＦｃ融合タンパク質で安定してトランスフェクトした。図１５Ａ及び１６Ａは、１ｍｌにつき０．２×１０６の生存可能な細胞数での最初の播種から４８、９６、１４４及び１９２時間後の、抗体Ａ及びＦＣ融合タンパク質の容量生産性をそれぞれ示す。結果は、ＳＣＤ１過剰発現細胞プールが、両組換え分子の絶対収率を向上させることを示す。さらに、細胞数を含むように計算した後、両組換え分子の比生産性も、ＳＣＤ１過剰発現細胞プールで大いに増加した（図１５Ｂ及び１６Ｂ）。
【０２０７】
これらの結果は、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ１の機能的断片（ＳＲＥＢＦ４１０）などのＬＭＭを発現するように細胞を工学操作することは、抗体分子及び融合タンパク質などの一時的に発現させた組換えタンパク質の生成能力を増加させることを一括して示す。
【０２０８】
（例６）
樹立された生成細胞系の改良
例４及び５は、ＬＭＭを安定して発現する細胞系は、組換え生成物、例えばＧＦＰ、抗体分子又は融合タンパク質を一時的に発現するとき、向上した生成を有することを実証する。この例では、樹立細胞系における組換え生成物の既存の安定した収率の増強に及ぼすＬＭＭの影響を判定するために、分析を実行した。
【０２０９】
モデルＩｇＧ４抗体分子（抗体Ａ）を安定して発現するように以前に工学操作されたＣＨＯ１２１細胞を使用した。Ｖ５タグ付きのＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びトランケーションされたＳＲＥＢＦ１（ＳＲＥＢＦ４１０）をコードする構築物を、抗体Ａを安定して発現する細胞の中で一時的に発現させた。対照細胞は、空のＶ５タグベクターでトランスフェクトさせた。細胞からの上清を、４８、７２及び１６８時間目に収集した。抗重鎖一次抗体（Ｓｉｇｍａ  １９７６４）、続いて抗ウサギＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａ６１５４）を使用して、生成された抗体Ａの量を判定するためにウェスタンブロット分析を実行し、結果を図１２Ａに示す。示されるように、ＬＭＭ  ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ４１０の発現は、対照と比較して、ＬＭＭの導入の４８及び７２時間後に細胞によって生成される抗体Ａの量の増加をもたらした。ＬＭＭの導入の１６８時間後に生成された抗体Ａの量を示すために、細胞からの上清をクーマシー分析にかけ、ＬＭＭの一時的発現（ＳＣＤ１及びＳＲＥＢＦ４１０）は組換えタンパク質の生成の向上をもたらしたことを実証する（図１２Ｂ）。図１３は、トランスフェクションから４８、７２、９６及び１４４時間後の、ＳＣＤ１及びＳＲＥＢ４１０含有プラスミドによる一時的トランスフェクションの後の平均生成物力価の顕著な増加を強調している、プロテインＡ  ＨＰＬＣを使用した抗体Ａの定量的分析を示す。図１４は、生成物力価を判定するためにプロテインＡ分析を、及び比生産性を判定するために生存可能な細胞数を使用した、ＦＣ融合タンパク質の定量的分析を示す。このデータは、ＬＭＭエレメントを含有するベクターで一時的にトランスフェクトさせた細胞の平均比生産性の増加を示し、ＳＲＥＢＦ１含有構築物が最も高い平均値を与える。
【０２１０】
これらの結果は、樹立細胞系における脂質代謝のモジュレーションが、確立された収量と比較して生成能力をさらに向上させることができることを示す。
【０２１１】
（例７）
組換え遺伝子及びＬＭＭの同時導入による向上した生産性
例示的なイムノサイトカインと、対照（ＬＭＭがない）、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１又はＳＲＥＢ４１１のいずれかとの両方の適当な発現のための遺伝子を含む、プラスミド／構築物を生成した（ＳＲＥＢＦ１由来の配列は、ＣＨＯ特異的であった；ＮＭ＿００１２４４００３、配列番号３４及び３６）。これらの構築物は、ＬｏｎｚａのＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞を一時的にトランスフェクトするために、次に使用した。図１７Ａは、トランスフェクションの４８及び９６時間後に収集した上清のウェスタン分析を示す。使用した上清試料を低減し、固有の重鎖（下方のバンド）及びサイトカイン融合重鎖（上方のバンド）を強調するために、抗重鎖一次抗体及びＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ二次でプロービングすることによって一時的生成物を検出した。トランスフェクトされた構築物へのＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢ４１１遺伝子の組み入れは、トランスフェクションの４８及び９６時間後の両バンド強度の増加をもたらした。さらに、図１７Ｂは、プロテインＡ分析を使用した、トランスフェクションの９６時間後に得られた試料の定量的分析を示す。イムノサイトカインの相対的存在度は、ウェスタン分析で提供されたデータを裏付ける（図１７Ａ）。
【０２１２】
これらのデータは、ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ１の機能的断片（ＳＲＥＢＦ４１１）などのＬＭＭと組換え生成物遺伝子との同時組み入れが、生成能力を向上させることができることを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２１３】
配列番号５〜２５：＜２２３＞／注＝「人工配列の記載：合成プライマー」
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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