(57)【要約】  本発明は、２個以上のポリペプチドを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、ポリペプチドをコードする核酸分子及びベクター、並びにインフルエンザの防止又は処置のために組成物、核酸分子及びベクターを使用する方法も提供する。
2019534242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザ感染症を処置又は防止するための同時使用、分離使用又は逐次使用に適した形の組合せ製剤として、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、少なくとも５個の異なるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む免疫原性組成物であって、各ＶＬＰが独立に配列番号１３〜１７のポリペプチドで構成される１個以上のホモ三量体を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、
２個以上のポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、各ポリペプチドが独立に隣接アミノ酸の第１の領域を含み、
（ａ）前記第１の領域のアミノ酸配列がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧ又はＮ又はＥである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸又はＡ又はＳ又はＮ又はＣ又はＥである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
前記２個以上のポリペプチドのアミノ酸配列が異なり、前記組成物がＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる、
免疫原性組成物。
【請求項３】
ポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が第１の領域を含み、
（ａ）前記第１の領域のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザの亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７又はＨ１８の赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン、好ましくはＡ型インフルエンザの亜型Ｈ１、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９又はＨ１１の赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧ又はＮ又はＥである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸又はＡ又はＳ又はＮ又はＣ又はＥである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
組成物。
【請求項４】
前記Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄのアミノ酸配列が配列番号１〜４からなる群から選択される、請求項２又は請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の領域のアミノ酸配列が前記Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有する、請求項２から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥ又はＤである
位置１４６がＴ又はＮである
位置１４７がＲ若しくはＫ若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡ又はＧ又はＫ又はＮ又はＥである
位置１５７がＡ又はＧである
位置１５８がＡ又はＫ又はＥである
位置１５９がＡ、Ｋ、Ｃ、Ｎ又はＳである
位置１６３がＫ又はＲである、
請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸である、
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＮである
位置１４７がＲである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＡである
位置１５９がＫである
位置１６３がＫである、
好ましくは、上記アミノ酸置換のすべてを有する、
請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＮである
位置１４７がＩである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＫ又はＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＡ又はＫである
位置１５９がＫ又はＳである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＮである
位置１４７がＩである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＫである、
好ましくは、上記アミノ酸置換のすべてを有する、
請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴである
位置１４７が正電荷アミノ酸である
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＴである
位置１４７がＲである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＫである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＫである、
好ましくは、上記アミノ酸置換のすべてを有する、
請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴである
位置１４７が正電荷アミノ酸である
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸である
位置１５９がＳである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＴである
位置１４７がＫである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＲである、
好ましくは、上記アミノ酸置換のすべてを有する、
請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ又はＮである
位置１４７が存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＴである
位置１４７が存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＲである、
好ましくは、上記アミノ酸置換のすべてを有する、
請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記２個以上のポリペプチドの前記第１の領域が独立に、配列番号１３〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２又は請求項３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドの１個以上が赤血球凝集素Ｎ末端ｓｔａｌｋ領域に由来する一連の隣接アミノ酸を更に含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがすべて２８０〜３００アミノ酸長である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が前記ポリペプチドの２、３、４又は５個を含み、そのすべてが異なる、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、３個の異なるポリペプチドの１個以上のヘテロ三量体又は同じポリペプチドのホモ三量体を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチドの２個以上をコードする１個以上の核酸分子を含むキット。
【請求項２３】
１個以上のベクターを含むキットであって、前記１個以上のベクターが、請求項１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチドの１個、２個又はそれ以上をコードする核酸分子を含む、キット。
【請求項２４】
前記ベクターがウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクター又は改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のキットを含む組成物。
【請求項２６】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の２個以上のポリペプチドを含むウイルス様粒子。
【請求項２７】
任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、請求項２６に記載のウイルス様粒子を含む組成物。
【請求項２８】
請求項１から２１、２５又は２７のいずれか一項に記載の組成物及びアジュバントを含む、ワクチン組成物。
【請求項２９】
好ましくはＡ型インフルエンザ感染症を処置又は防止するための、同時使用、分離使用又は逐次使用に適した形の組合せ製剤としての、請求項１から２１、２５若しくは２７のいずれか一項に記載の２個以上のポリペプチドを含む組成物又は請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
治療に使用される、又は医薬品として使用される、請求項１から２１、２５若しくは２７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
（ｉ）対象におけるインフルエンザ感染症を防止若しくは処置する方法、又は
（ｉｉ）対象におけるインフルエンザ抗原に対するＴ細胞若しくはＢ細胞応答を誘導する方法
に使用される、請求項１から２１、２５若しくは２７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項２８に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
（ｉ）対象におけるインフルエンザ感染症の防止若しくは処置、又は
（ｉｉ）対象におけるインフルエンザ抗原に対するＴ細胞若しくはＢ細胞応答の誘導
のための医薬品の製造における、請求項１から２１、２５若しくは２７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項２８に記載のワクチン組成物の使用。
【請求項３３】
（ｉ）対象におけるインフルエンザ感染症の防止若しくは処置、又は
（ｉｉ）対象におけるインフルエンザ抗原に対するＴ細胞若しくはＢ細胞応答の誘導
のための方法であって、
請求項１から２１、２５若しくは２７のいずれか一項に記載の組成物又は請求項２８に記載のワクチン組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、
方法。
【請求項３４】
対象におけるインフルエンザ感染症を防止若しくは処置する方法、又は対象におけるインフルエンザ抗原に対するＴ細胞若しくはＢ細胞応答を誘導する方法であって、
（ｉ）有効量の１、２、３、４、５個又はそれ以上の異なるポリペプチドをそれを必要とする対象に同時に、別々に、又は逐次的に投与するステップを含み、
各ポリペプチドが独立に隣接アミノ酸の第１の領域を含み、
（ａ）前記第１の領域のアミノ酸配列がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）前記第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧ又はＮ又はＥである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸又はＡ又はＳ又はＮ又はＣ又はＥである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
好ましくは、前記第１の領域が請求項４から１７のいずれか一項に記載の、
方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドの１個以上が１個以上の三量体の形である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３４又は３５に記載の方法であって、前記方法が、
（ｉｉ）第２のポリペプチド又は第２の三量体の追加免疫を前記対象に投与する追加のステップを含み、任意に、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチド又は第３の三量体の追加免疫を前記対象に投与する追加のステップ
も含み、
前記第２及び第３のポリペプチド／三量体が、好ましくは互いに異なり、好ましくは第１のポリペプチド／三量体と異なる、
方法。
【請求項３７】
前記第１、第２及び第３のポリペプチドが、配列番号１３〜１７を含む若しくはからなるポリペプチドからなる群から独立に選択される、又は前記第１、第２及び第３の三量体が独立に、配列番号１３〜１７を含む若しくはからなるポリペプチドを含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号１４及び１５のポリペプチド又はホモ三量体が最初に前記対象に投与され、配列番号１３及び１６のポリペプチド又はホモ三量体が次に前記対象に投与され、配列番号１７のポリペプチド又はホモ三量体が次いで前記対象に投与される、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチド又は三量体が前記対象にＶＬＰの形で投与される、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドの１個以上をコードする核酸分子が対応するポリペプチドの代わりに前記対象に投与され、好ましくは、前記核酸分子がウイルスベクターである、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン上のエピトープを同定する方法であって、
（ｉ）規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメインポリペプチド上の抗体結合可能部位を同定するステップ、
（ｉｉ）前記抗体結合可能部位内の１個以上の連続又は不連続な一連のｈｅａｄドメインポリペプチドを同定するステップ、及び
（ｉｉｉ）これら一連の限定されたアミノ酸配列の可変性領域を同定するために、これら一連のアミノ酸配列を、前記規定亜型の複数のインフルエンザ株由来の赤血球凝集素ｈｅａｄドメインのアミノ酸配列と比較するステップ
を含み、
それによって、前記規定亜型インフルエンザウイルスの、前記赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内のそれらのアミノ酸組成物中の限定された可変性を有しエピトープを形成する、一連の位置を特定する、
方法。
【請求項４２】
ポリペプチドを製造するプロセスであって、
（ｉ）請求項４１に記載のエピトープを同定する方法を用いて、規定亜型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内の限定された可変性を有する一連のアミノ酸を同定するステップ、
（ｉｉ）隣接アミノ酸の第１の領域を含むポリペプチドを生成するステップ
を含み、
（ａ）前記第１の領域のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザの赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）前記第１の領域が、前記限定された可変性を有するアミノ酸の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換がその位置で保存されるアミノ酸を導入し、
前記ポリペプチドがＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる、
プロセス。
【請求項４３】
免疫原性組成物を製造するプロセスであって、
（ｉ）請求項４１に記載のエピトープを同定する方法を用いて、規定亜型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内の限定された可変性を有する一連のアミノ酸の位置を特定するステップ、
（ｉｉ）隣接アミノ酸の第１の領域を含むポリペプチドを生成するステップであって、
（ａ）前記第１の領域のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザの赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）前記第１の領域が、保存アミノ酸の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、前記置換がその位置で保存されるアミノ酸を導入し、
前記ポリペプチドがＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる、ステップ、及び
（ｉｉｉ）前記ポリペプチドの１個以上を免疫原性組成物中に処方するステップであって、前記組成物が、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤を含む、ステップ
を含む、プロセス。
【請求項４４】
前記ポリペプチドの１個以上が１個以上のホモ三量体の形である、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２個以上のポリペプチドを含む免疫原性組成物に関する。本発明は、ポリペプチドをコードする核酸分子及びベクター、並びにインフルエンザの防止又は処置のために組成物、核酸分子及びベクターを使用する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
季節性インフルエンザは、重篤な疾病及び死を引き起こす重大な公衆衛生問題である。世界的に季節性インフルエンザは、３〜５百万の重篤な疾病及び２５０，０００〜５００，０００人の死を引き起こすと推定される（非特許文献１）。人口統計学的に合併症リスクが最も高いのは、２歳未満の小児、６５歳を超える成人、妊婦、及び糖尿病、又は弱い免疫系などのある種の医学的症状を有するあらゆる年齢の人々である（非特許文献２）。発展途上国における子供の死の大部分がインフルエンザに関連すると推定される。季節性インフルエンザは、労働者の長期欠勤及び生産性の低下も高いレベルで引き起こす。
【０００３】
インフルエンザパンデミックは、保菌動物由来の独特なインフルエンザ株が人間集団において広範に流布し始めると散発的に発生する。最近のインフルエンザパンデミックは２００９年に起こり、３５歳未満の個体における重篤なインフルエンザ疾病及び入院が増加した（非特許文献３、４）。１９１８年のインフルエンザパンデミックは、史上最も重大なパンデミックであり、５０００万〜１億人の死を引き起こした。新しいパンデミック性インフルエンザ株の発生が懸念されている。
【０００４】
インフルエンザ感染由来の疾病を防止する最も有効な方法はワクチン接種である。現在、インフルエンザに対するワクチン接種は、Ａ型インフルエンザのＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２亜型の最近の流行株からなる三価又は四価（ｑｕａｔｒｉｖａｌｅｎｔ）ワクチンを必要とし、１又は２種のＢ型インフルエンザ株も含む（非特許文献５）。インフルエンザの抗原進化が急速であるため、ワクチンを常に更新しなければならず、しばしば時間的制約のために、次のインフルエンザ流行期に対して誤ったワクチン株が選択される。これらの理由のため、通常の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）三価ワクチンは、有効性１０〜６０％と推定され、リスク群の予防接種が毎年行われている（非特許文献６、７）。
【０００５】
その結果、現在のインフルエンザワクチンを改良する明確な社会的及び経済的利点が存在する。これは、自社の新しいインフルエンザワクチンを開発しているＧＳＫ、Ｐｆｉｚｅｒなどの製薬会社によって認識されている。こうした手法は、一般に、免疫選択が弱く、したがって「免疫劣性」であるエピトープを標的にする。
【０００６】
インフルエンザウイルスは、現在、（ｉ）高可変性の高免疫原性（及び防御性）エピトープ、及び（ｉｉ）低免疫原性の不変エピトープを含むと概念化されている。これらは、同時に、絶えず更新されるこれらの部位に対するワクチンを必要とする高度可変エピトープ領域の変化を、ウイルス集団が徐々に増やしながら獲得する「ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｆｔ」の理論の骨格を形成する。唯一の別の選択肢は、自然効力の低い不変エピトープに対する人工的追加免疫と見られている。
【０００７】
本発明者らは、それに対して、インフルエンザウイルスが可変性の低い高免疫原性エピトープも含み、これらの防御エピトープを同定することによって汎用ワクチンを構築することを提案する。この考えは、「ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｔｈｒｉｆｔ」として知られるインフルエンザ進化の代替理論によって支持され、ウイルス動態は、共通エピトープに対する既存の免疫によって推進されるが、こうしたエピトープの存在は、依然疑わしく、ワクチン接種におけるそれらの使用はこれまで議論されなかった。
【０００８】
バイオインフォマティクス、構造分析及び血清学的分析を併用して、主要なインフルエンザ抗原において強力な免疫選択下にある限定された可変性の１種のエピトープである赤血球凝集素（ＨＡ）が今回同定され、特徴づけられた。
【０００９】
ＨＡは、インフルエンザウイルスにおける主要な表面抗原である。それは、シアル酸に結合し、膜融合を惹起し、エンドサイトーシスを引き起こす。それは、一般に５６５／５６６アミノ酸長の三量体タンパク質である。各モノマーは、ｈｅａｄドメイン及びｓｔｅｍドメインからなる。
【００１０】
今回同定されたエピトープは、強力な免疫選択下にあり、したがって「免疫優性」である。これは、可変性が限定されたこのエピトープを標的にすることによってＨ１Ｎ１インフルエンザ株の大部分に対して防御する新しい「汎用」インフルエンザワクチンの設計を可能にした。
【００１１】
その結果、本発明のワクチンは、従来の三価ワクチン及び開発中の他のインフルエンザワクチンを上回る幾つかの利点を有する。
【００１２】
これらの利点としては、以下が挙げられる。
（ｉ）流行インフルエンザ株による感染は、ワクチン防御を潜在的に損なう代わりに強化する。
（ｉｉ）本ワクチンは、開発中の他の「汎用」ワクチンよりも免疫原性が高く、防御の閾値がより低く、防御の寿命がより長いはずである。
（ｉｉｉ）それは、１〜３回しか投与する必要がないはずである（すなわち、初回免疫と追加免疫１回、又は初回免疫と追加免疫２回）。
（ｉｖ）本ワクチンの由来となる理論的及び実験的枠組みの示唆するところによれば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザは、提案するワクチンによって付与される防御を免れる可能性が低い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Lozano, R. et al., 2012. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010 : a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet, 380, pp. 2095-2128.
【非特許文献２】Mertz, D., Hyong, T. & Johnstone, J., 2013. Populations at risk for severe or complicated influenza illness : systematic review and meta-analysis. British Medical Journal, 5061(August), pp.1-15.
【非特許文献３】Presanis, A.M. et al., 2011. Changes in severity of 2009 pandemic A / H1N1 influenza in England : a Bayesian evidence synthesis. British Medical Journal, (343), pp.1-14.
【非特許文献４】Manicassamy, B. et al., 2010. Protection of mice against lethal challenge with 2009 H1N1 influenza A virus by 1918-like and classical swine H1N1 based vaccines. PLoS Pathogens, 6(1).
【非特許文献５】WHO 2016. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2016-2017 northern hemisphere influenza season.
【非特許文献６】Treanor, J.J. et al., 2012. Effectiveness of Seasonal Influenza Vaccines in the United States During a Season With Circulation of All Three Vaccine Strains., pp.1-9.
【非特許文献７】Belongia, E.A. et al., 2009. Effectiveness of Inactivated Influenza Vaccines Varied Substantially with Antigenic Match from the 2004-2005 Season to the 2006-2007 Season Linked references are available on JSTOR for this article : Effectiveness of Inactivated Influenza Vaccines Varied. The Journal of Infectious Disease, 199(2), pp.159-167.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の一目的は、１つ以上のＡ型インフルエンザ亜型に対して、好ましくはＨ１Ｎ１亜型に対して、防御を付与することができるインフルエンザワクチン組成物を提供することである。
【００１５】
一実施形態においては、したがって、本発明は、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、２個以上のポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、各ポリペプチドが独立に隣接アミノ酸の第１の領域を含み、
（ａ）第１の領域のアミノ酸配列がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧ又はＮ又はＥである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸又はＡ又はＳ又はＮ又はＣ又はＥである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
２個以上のポリペプチドのアミノ酸配列が異なり、組成物がＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる、
免疫原性組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列が第１の領域を含み、
（ａ）第１の領域のアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７又はＨ１８の赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン、好ましくはＡ型インフルエンザ亜型Ｈ１、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９又はＨ１１の赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧ又はＮ又はＥである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸又はＡ又はＳ又はＮ又はＣ又はＥである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である、
ポリペプチドも提供する。
【００１７】
本発明は、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、こうしたポリペプチドを含む組成物（好ましくは、組成物がＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる免疫原性組成物）も提供する。
【００１８】
本発明は、こうしたポリペプチドをコードする核酸分子（好ましくはＤＮＡ分子）も提供し、好ましくはＤＮＡ分子はベクター又はプラスミドである。
【００１９】
好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥ又はＤである
位置１４６がＴ又はＮである
位置１４７がＲ若しくはＫ若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡ又はＧ又はＫ又はＮ又はＥである
位置１５７がＡ又はＧである
位置１５８がＡ又はＫである
位置１５９がＡ、Ｋ、Ｃ、Ｎ又はＳである
位置１６３がＫ又はＲである。
【００２０】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸である、
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である。
【００２１】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＮである
位置１４７がＲである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＡである
位置１５９がＫである
位置１６３がＫである。
【００２２】
好ましくは、１個のポリペプチドの第１の領域は、配列番号１３で与えられるアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００２３】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＮである
位置１４７がＩである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＫ又はＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＡ又はＫである
位置１５９がＫ又はＳである
位置１６３が正電荷アミノ酸である。
【００２４】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＮである
位置１４７がＩである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＡである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＫである。
【００２５】
好ましくは、１個のポリペプチドの第１の領域は、配列番号１４で与えられるアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００２６】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴである
位置１４７が正電荷アミノ酸である
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である。
【００２７】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＴである
位置１４７がＲである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＫである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＫである。
【００２８】
好ましくは、１個のポリペプチドの第１の領域は、配列番号１５で与えられるアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００２９】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴである
位置１４７が正電荷アミノ酸である
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸である
位置１５９がＳである
位置１６３が正電荷アミノ酸である。
【００３０】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＴである
位置１４７がＫである
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＲである。
【００３１】
好ましくは、１個のポリペプチドの第１の領域は、配列番号１６で与えられるアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００３２】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ又はＮである
位置１４７が存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮ又はＥである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫ又はＥである
位置１５９がＳである
位置１６３が正電荷アミノ酸である。
【００３３】
別の好ましい一実施形態においては、（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５がＥである
位置１４６がＴである
位置１４７が存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳである
位置１５５がＨである
位置１５６がＮである
位置１５７がＧである
位置１５８がＫである
位置１５９がＳである
位置１６３がＲである。
【００３４】
好ましくは、１個のポリペプチドの第１の領域は、配列番号１７で与えられるアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００３５】
一実施形態においては、本発明は、免疫原性組成物に関する。
【００３６】
本明細書では「免疫原性」という用語は、Ａ型インフルエンザ亜型に対して特異的免疫応答を誘発する能力を指すものとする。この応答は、例えば、本発明の一組成物が適切な用量で、かつ適切なアジュバントを含む／必要とする可能性がある適切な処方で、投与されたときのものであり得る。最初の用量と類似した又はそれ未満の用量を含む追加免疫が、必要な免疫原性応答を得るのに必要となる可能性がある。
【００３７】
特に、本発明の免疫原性組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体（好ましくは中和抗体）を誘導することができる。
【００３８】
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する対象における防御を提供することができる。
【００３９】
より好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、Ｈ１Ｎ１  Ａ型インフルエンザ亜型に対する対象における抗体（好ましくは中和抗体）を誘導することができる。
【００４０】
対象（例えば、ヒト対象）において中和抗体を誘導する本発明の一組成物の能力は、組成物が投与された対象の血液から血清を精製することによって分析されうる。
【００４１】
抗体は、ＥＬＩＳＡ又はｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ  ｍｉｃｒｏ−ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（ｐＭＮ）によって測定することができる。ＥＬＩＳＡは、これら２つのアッセイのうち最も感度が高く、すべての抗体を定量化する。それに対して、ｐＭＮは感度が低いが、中和抗体を定量化する。
【００４２】
本明細書では「インフルエンザ」という表現は、インフルエンザウイルス、好ましくはＡ型インフルエンザウイルス、より好ましくはＡ型インフルエンザウイルスＨ１亜型、最も好ましくはＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型に関する。
【００４３】
免疫原性組成物は、１個、２個又はそれ以上のポリペプチドを含む。これら２個以上のポリペプチドのアミノ酸配列は、好ましくは異なる。
【００４４】
組成物は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の異なるポリペプチドを含むことができる。
【００４５】
好ましくは、組成物は、２、３、４又は５個の異なるポリペプチド、より好ましくは３個の異なるポリペプチドを含む。
【００４６】
本発明の配列は、Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質のｈｅａｄドメインに由来する、又は基づく。
【００４７】
天然に存在する赤血球凝集素タンパク質は、３個のポリペプチドのホモ三量体である。
【００４８】
本発明の好ましい一組成物においては、組成物は、ホモ三量体を形成する本明細書に定義した３個のポリペプチドを含む。組成物は、本明細書に定義したポリペプチドの１個を超える（例えば、２、３、４、又は５個の）異なるホモ三量体を含むことができる。
【００４９】
別の好ましい一実施形態においては、本発明の３個のポリペプチドは、組成物中でヘテロ三量体を形成する。組成物は、本明細書に定義したポリペプチドの１個を超える（例えば、２、３、４、又は５個の）異なるヘテロ三量体を含むことができる。
【００５０】
各ポリペプチドは独立に、隣接アミノ酸の第１の領域を含む。この領域は、隣接する一連の共有結合したアミノ酸である。
【００５１】
一実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有する。
【００５２】
その意図は、この第１の領域がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインのコンフォーメーションをとることである。
【００５３】
赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、例えば、任意のＡ型インフルエンザ亜型、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７又はＨ１８に由来することができる。
【００５４】
好ましくは、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、インフルエンザＡ  Ｈ１、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９又はＨ１１亜型に由来する。
【００５５】
一実施形態においては、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、インフルエンザＡ  Ｈ１亜型に由来する。
【００５６】
一実施形態においては、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、インフルエンザＡ  Ｈ５亜型に由来する。
【００５７】
一実施形態においては、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、インフルエンザＡ  Ｈ６亜型に由来する。
【００５８】
一実施形態においては、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、インフルエンザＡ  Ｈ９亜型に由来する。
【００５９】
一実施形態においては、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインは、インフルエンザＡ  Ｈ１１亜型に由来する。
【００６０】
好ましくは、インフルエンザＡ  Ｎ亜型は、Ｎ１である。
【００６１】
Ｈ１、Ｈ５、Ｈ６及びＨ１１赤血球凝集素ポリペプチドのコンセンサスアミノ酸配列を本明細書ではそれぞれ配列番号９〜１２として示す。Ｈ９赤血球凝集素ポリペプチドのコンセンサスアミノ酸配列を本明細書では配列番号２３として示す。
【００６２】
Ｈ９配列は、必要な変更を加えて、本明細書に開示されるＨ１、Ｈ５、Ｈ６又はＨ９の実施形態の代わりに本明細書で使用することができる。
【００６３】
本明細書で使用するアミノ酸配列番号は、配列番号９で示されるＡ  Ｈ１型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに付与される番号に基づく。
【００６４】
なお、Ａ  Ｈ１型インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドに付番する方法は３つあり、本明細書を通して線形の付番が用いられ、Ｍｅｔ＝１である。
【００６５】
ＨＡポリペプチドは、２つの領域、ＨＡ１領域及びＨＡ２領域を含む。これらの領域は、潜在的切断部位によって分離される。
【００６６】
Ｈ１切断部位コンセンサス配列はＰＳＩＱＳＲ／ＧＬＦ（配列番号２４）であり、Ｈ５切断部位コンセンサス配列はＰＱＲＫＫＲ／ＧＬＦ（配列番号２５）であり、Ｈ６切断部位コンセンサス配列はＰＱＩＥＴＲ／ＧＬＦ（配列番号２６）であり、Ｈ９切断コンセンサス配列はＰＳＲＳＳＲ／ＧＬＦ（配列番号２７）であり、Ｈ１１切断部位コンセンサス配列はＰＡＩＡＴＲ／ＧＬＦ（配列番号２８）である。
【００６７】
ＨＡ１とＨＡ２へのＨＡ０の切断は、Ｒ／ＧＬＦ間で生じ、プロテアーゼによって行われる。上記切断部位は、すべて一塩基として記述される。一部のＨ５ウイルスにおいては、多塩基切断部位が存在し、これは、重要な位置の塩基位置に複数のアルギニン残基（Ｒ）及び／又はリジン残基（Ｋ）を有することによって、一塩基部位とは異なる。
【００６８】
切断部位の更なる詳細は、Ｓｕｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０１０年９月、Ｖｏｌ．８４、Ｎｏ．１７、ｐ．８６８３〜８６９０に見つけることができる。
【００６９】
ＨＡ１領域は、ｓｔａｌｋの１〜６０個のアミノ酸、続いてｈｅａｄドメイン、次いで追加のｓｔａｌｋのアミノ酸を含む。ＨＡ２領域は、ｓｔａｌｋのアミノ酸のみを含む。
【００７０】
赤血球凝集素のｈｅａｄドメインは、ＨＡ１領域内の２個のシステインの間に存在すると定義される。第１のシステインは一般に位置５８、５９又は６０であり、第２のシステインは一般に２９０、２９１又は２９２である。
【００７１】
Ａ  Ｈ１型インフルエンザ赤血球凝集素においては、これらのシステインは、一部のＨ１赤血球凝集素において位置１４７のアミノ酸の欠如のために位置５９及び２９１／２９２にある。
【００７２】
Ｈ６赤血球凝集素では、ｈｅａｄドメインは、位置５８と２９２の間の配列に対応する。
【００７３】
しかし、Ｈ５及びＨ１１赤血球凝集素では、ｈｅａｄドメインはそれぞれ位置５８〜２９０の間の領域に対応する。
【００７４】
Ｈ９赤血球凝集素では、ｈｅａｄドメインは位置６０〜２９０の間の領域に対応する。
【００７５】
Ｈ１、Ｈ５、Ｈ６及びＨ１１赤血球凝集素ｈｅａｄドメインのコンセンサスアミノ酸配列を本明細書ではそれぞれ配列番号１〜４として示す。
【００７６】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有する。
【００７７】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有する。
【００７８】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有する。
【００７９】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有する。
【００８０】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号９の位置８３、８５、１４６〜１４９、１５１、１５４〜１５９及び１６３に対応する位置以外の位置におけるＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する。
【００８１】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号９の位置８３、８５、１４６〜１４９、１５１、１５４〜１５９及び１６３に対応する位置以外の位置における（好ましくは配列番号１の）Ａ  Ｈ１型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する。
【００８２】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号９の位置８３、８５、１４６〜１４９、１５１、１５４〜１５９及び１６３に対応する位置以外の位置における（好ましくは配列番号２の）Ａ  Ｈ６型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する。
【００８３】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号９の位置８３、８５、１４６〜１４９、１５１、１５４〜１５９及び１６３に対応する位置以外の位置における（好ましくは配列番号３の）Ａ  Ｈ５型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する。
【００８４】
一部の実施形態においては、第１の領域のアミノ酸配列は、配列番号９の位置８３、８５、１４６〜１４９、１５１、１５４〜１５９及び１６３に対応する位置以外の位置における（好ましくは配列番号４の）Ａ  Ｈ１１型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列相同性を有する。
【００８５】
一部の実施形態においては、各ポリペプチドは独立に、Ｎ及び／又はＣ末端において第１の領域に隣接結合する１個以上のアミノ酸を更に含む。
【００８６】
追加のＮ末端アミノ酸は、好ましくは、赤血球凝集素Ｎ末端ｓｔａｌｋ領域に由来する、好ましくはインフルエンザＡ  Ｈ亜型、最も好ましくはＨ１、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９又はＨ１１亜型の赤血球凝集素Ｎ末端ｓｔａｌｋ領域に由来する、一連の隣接アミノ酸である。
【００８７】
好ましくは、Ａ型インフルエンザ亜型の赤血球凝集素Ｎ末端柄領域の５８〜６０個のアミノ酸は、ポリペプチドの１個以上における第１の領域のＮ末端に隣接結合する。
【００８８】
一部の実施形態においては、このｓｔａｌｋ領域のアミノ酸配列は、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸１〜５９、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸１〜５８、
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸１〜５８、又は
（ｉｖ）配列番号１２のアミノ酸１〜５８
に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列相同性を有する。
【００８９】
追加のＣ末端アミノ酸は、存在する場合、好ましくは、Ａ型インフルエンザ亜型、好ましくはＨ１、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ９又はＨ１１の赤血球凝集素Ｃ末端ｓｔａｌｋ領域に由来する一連の隣接アミノ酸（例えば、１〜３００、１〜２００、１〜１００、１〜５０又は１〜１０アミノ酸）である。
【００９０】
好ましくは、一連の隣接アミノ酸は、ｈｅａｄ領域が由来する同じＡ型インフルエンザ亜型の赤血球凝集素ｓｔａｌｋ領域に由来する。
【００９１】
一部の実施形態においては、ポリペプチドは、Ａ型インフルエンザ亜型ＨＡ２領域を含まない。
【００９２】
一部の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号９〜１２のＨＡ２領域を含まない。
【００９３】
一部の好ましい実施形態においては、１個、２個又はそれ以上のポリペプチドの１個以上又はすべては独立に、本明細書に定義した第１の領域を含むインフルエンザＡ  ＨＡ１ドメイン、最も好ましくは本明細書に定義した第１の領域を含むインフルエンザＡ  Ｈ１、Ｈ５、Ｈ６又はＨ１１亜型ＨＡ１ドメインを含む。
【００９４】
好ましくは、ポリペプチドは独立に６００未満、より好ましくは４００未満、最も好ましくは３００未満のアミノ酸長である。
【００９５】
好ましくは、ポリペプチドは独立に２５０〜３５０、より好ましくは２８０〜３００アミノ酸長、最も好ましくは２９０〜２９２アミノ酸長である。
【００９６】
ポリペプチドの第１の領域は、配列番号１における位置に対応する指定位置に１つ以上のアミノ酸置換を有する。
【００９７】
例えば、ポリペプチドの第１の領域は、指定アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個を有し得る。
【００９８】
好ましくは、ポリペプチドの第１の領域は、指定の１４個のアミノ酸置換のすべてを有する。
【００９９】
本明細書では「正電荷アミノ酸」という用語は、リジン、アルギニン及びヒスチジンを含む。本明細書では「負電荷アミノ酸」という用語は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
【０１００】
一部の好ましい実施形態においては、ポリペプチドのアミノ酸配列は独立に配列番号１３〜１７のアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【０１０１】
本発明のポリペプチドは、組換え法によって生成させることができる。例えば、こうした技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第４版）Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ．Ｇｒｅｅｎ及びＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されている。
【０１０２】
あるいは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を化学合成によって生成させることもできる。次いで、こうしたヌクレオチド配列を適切な宿主細胞形質転換又は導入用ベクターに連結することができる。次いで、ポリペプチドをこうした宿主細胞中で発現させることができる。
【０１０３】
既存のＨＡ遺伝子の改変の場合、「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２０１６）、Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｄｏｕｄｎａ（カリフォルニア大学、バークレー）及びＰｒａｓｈａｎｔ  Ｍａｌｉ（カリフォルニア大学、サンディエゴ）編に記載のものなどのＣＲＩＳＰＲに基づく技術を使用することもできる。ＴＡＬＥＮに基づく技術を使用することもできる。
【０１０４】
あるいは、本発明のポリペプチドを標準的な化学的ペプチド合成技術によって合成することができる。配列のＣ末端アミノ酸を不溶性担体に結合させ、続いて残りのアミノ酸を連続付加するペプチドの固相合成を例えば使用することができる。
【０１０５】
更なる一実施形態においては、本発明は、本発明の１個以上のポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。好ましくは、核酸分子は、本発明のポリペプチドの１個、２個又はそれ以上、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個をコードする。
【０１０６】
好ましいヌクレオチド配列としては、Ａ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができるポリペプチドをコードする、配列番号１８〜２２を含むもの、及びそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の配列相同性を有するヌクレオチド配列が挙げられる。
【０１０７】
配列番号１３〜１７のポリペプチドをコードする核酸分子も好ましい。
【０１０８】
本明細書では「核酸配列」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用され、いかなる長さ制限を伴わない。これらは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡ配列を含む。
【０１０９】
本発明の核酸分子としては、それらの自然環境から取り出された単離された核酸分子、組換え若しくはクローン化したＤＮＡ単離物、及び化学的に合成されたアナログ、又は異種系によって生物学的に合成されたアナログが挙げられる。
【０１１０】
本発明の核酸分子は、当該技術分野で公知の任意の手段によって調製することができる。例えば、多量のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞における複製によって生成させることができる。原核又は真核細胞に導入し、その中で複製することができる、組換え核酸コンストラクト、一般にＤＮＡコンストラクトに、所望の断片をコードする天然又は合成ＤＮＡ断片を組み入れることができる。通常、ＤＮＡコンストラクトは、酵母若しくは細菌などの単細胞宿主における自己複製に適しているが、培養された昆虫、哺乳動物、植物又は他の真核細胞系のゲノムへの導入及び組み込みに意図されてもよい。
【０１１１】
本発明の核酸分子は、化学合成によって、例えば、ホスホルアミダイト法又はトリエステル法によって、生成させることもでき、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うことができる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、鎖を適切な条件下で一緒にアニーリングすることによって、又はＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖に適切なプライマー配列を付加することによって、化学合成の一本鎖生成物から得ることができる。
【０１１２】
核酸分子中の最初の（例えば、野生型）コドンは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／で入手可能なものなどのオンラインツールを用いて、所望の細胞系における発現に対して最適化することができる。
【０１１３】
本発明の一実施形態においては、したがって、核酸分子は、宿主細胞、好ましくはヒト細胞における発現に対してコドンが最適化される。
【０１１４】
本明細書では「本発明の生成物」という用語は、とりわけ、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明のベクター、本発明の粒子、及び本発明の組成物を指す。
【０１１５】
本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター又はプラスミドも提供する。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
【０１１６】
ベクター及び／又はプラスミドは、ポリペプチドをコードする配列に使用可能に結合した１個以上の制御配列、例えば、１個以上のエンハンサー、プロモーター及び／又は転写終結配列を含むことができる。
【０１１７】
特に好ましい一実施形態においては、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、Ａ型インフルエンザ感染症を処置又は防止するための同時使用、分離使用又は逐次使用に適した形の組合せ製剤として、配列番号１３〜１７のポリペプチドをコードする１個、２個又はそれ以上のベクターを含む免疫原性組成物が提供される。
【０１１８】
好ましくは、初回免疫は、配列番号１４及び１５をコードするベクター（単数又は複数）を用いて対象に投与され、次いで第１の追加免疫は、配列番号１３及び１６をコードするベクター（単数又は複数）を用いて投与され、次いで最終追加免疫は、配列番号１７をコードするベクターを用いて投与される。
【０１１９】
一部の実施形態においては、ベクターはウイルスベクター、例えばポックスウイルスベクターである。
【０１２０】
別の実施形態においては、ベクターは、アデノウイルスベクター又は改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）ウイルスベクターである。
【０１２１】
好ましくは、ベクターは非複製ベクターである。
【０１２２】
非複製ポックスウイルス及びアデノウイルスは、遺伝物質を標的細胞に送達するベクターとして使用することができるウイルス群である。ウイルスベクターは、抗原送達ビヒクルとして働き、ウイルスエレメントを細胞表面分子との結合を介して自然免疫系を活性化する力も有する。所与の抗原をコードする核酸を運ぶ組換えウイルスベクターを生成することができる。次いで、ウイルスベクターを使用して核酸を標的細胞に送達することができ、コードされた抗原が標的細胞自体の分子機構によって産生される。「非自己」として、産生された抗原は、標的対象において免疫応答を発生する。
【０１２３】
任意の１つの特別な理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、本発明のベクターを用いた抗原送達が、対象における応答の中でもＴ細胞応答を刺激すると考える。したがって、本発明者らは、本発明がインフルエンザ感染症に対する防御を与える１つの方法が、Ｔ細胞応答及び細胞性免疫系を刺激することによると考える。さらに、体液性（抗体）防御を得ることもできる。
【０１２４】
本発明のベクターは、非複製ポックスウイルスベクターとすることができる。本明細書では、非複製（又は複製欠損型）ウイルスベクターは、標的細胞の感染後に増殖的に複製する能力を欠くウイルスベクターである。したがって、非複製ウイルスベクターは、標的細胞の感染後にそれ自体のコピーを生成することができない。したがって、非複製ウイルスベクターは、有利なことに、複製能力のあるウイルスベクターに比べて改善された安全性プロファイルを有することができる。
【０１２５】
一実施形態においては、非複製ポックスウイルスベクターは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ＮＹＶＡＣワクシニアウイルスベクター、カナリアポックス（ＡＬＶＡＣ）ベクター及び鶏痘（ＦＰＶ）ベクターから選択される。ＭＶＡとＮＹＶＡＣはどちらもワクシニアウイルスの弱毒化誘導体である。ワクシニアウイルスに比べて、ＭＶＡは、約２００個のオープンリーディングフレームのうち約２６個が欠損している。
【０１２６】
一実施形態においては、非複製ポックスウイルスベクターはＭＶＡベクターである。
【０１２７】
本発明のベクターはアデノウイルスベクターとすることができる。一実施形態においては、アデノウイルスベクターは非複製アデノウイルスベクターである（非複製については上で定義した）。アデノウイルスは、Ｅｌ又はＥｌとＥ３の両方の遺伝子領域の欠損によって非複製にすることができる。あるいは、アデノウイルスは、Ｅｌ又はＥｌ及びＥ３遺伝子領域を非機能的にするような前記遺伝子領域の変更によって非複製にすることができる。例えば、非複製アデノウイルスは、機能的Ｅｌ領域を欠くことができ、又は機能的Ｅｌ及びＥ３遺伝子領域を欠くことができる。このようにして、アデノウイルスは、大部分の哺乳動物細胞系において複製不能になり、免疫哺乳動物において複製しない。最も好ましくは、ＥｌとＥ３の両方の遺伝子領域の欠損がアデノウイルス中に存在し、したがってより大きい導入遺伝子を挿入することができる。これは、より大きい抗原を発現させるのに、又は複数の抗原が単一のベクター中で発現されるとき、又はＣＭＶプロモーターなどの大きいプロモーター配列を使用するときに特に重要である。Ｅｌ領域と同様にＥ３の欠損は、特に組換えＡｄ５ベクターで好ましい。任意に、Ｅ４領域を操作することもできる。
【０１２８】
一実施形態においては、アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスベクター、サルアデノウイルスベクター、Ｂ群アデノウイルスベクター、Ｃ群アデノウイルスベクター、Ｅ群アデノウイルスベクター、アデノウイルス６ベクター、ＰａｎＡｄ３ベクター、アデノウイルスＣ３ベクター、ＣｈＡｄＹ２５ベクター、ＡｄＣ６８ベクター及びＡｄ５ベクターから選択される。
【０１２９】
本発明のウイルスベクターは、上述したように、単一の抗原を標的細胞に送達するのに使用することができる。有利なことに、本発明のウイルスベクターは、複数の（異なる）抗原を標的細胞に送達するのに使用することもできる。
【０１３０】
一実施形態においては、本発明のベクターは、更に、アジュバント（例えば、コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）致死毒素、又はフラゲリン）をコードする核酸配列を含む。
【０１３１】
（上述したように）ベクターをコードする核酸配列は、当該技術分野で公知の組換え核酸を操作及び生成する任意の技術を使用して生成させることができる。一態様においては、本発明は、本発明のベクターをコードする核酸分子を含む核酸を供給すること、宿主細胞に核酸分子を導入すること、ベクターの増殖に適した条件下で宿主細胞を培養すること、及びベクターを宿主細胞から得ることを含む、（上述したように）ベクターを作製する方法を提供する。
【０１３２】
本明細書では「導入」は、核酸分子を細胞中に導入する任意の非ウイルス方法を意味することがある。核酸分子は、宿主細胞に導入するのに適切な任意の核酸分子とすることができる。したがって、一実施形態においては、核酸分子はプラスミドである。宿主細胞は、ベクター（すなわち、上述したように、非複製ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクター）が増殖し得る任意の細胞とすることができる。本明細書では「ベクターの増殖に適した条件下で宿主細胞を培養すること」は、選択された宿主細胞に適切であり、ベクターを宿主細胞中で生成することができる、当該技術分野で公知の任意の細胞培養条件及び技術の使用を意味する。本明細書では「ベクターを得ること」は、ベクターを宿主細胞から分離するのに適切である当該技術分野で公知の任意の技術の使用を意味する。したがって、宿主細胞を溶解させて、ベクターを放出させることができる。続いて、当該技術分野で公知の任意の適切な方法又は複数の方法を用いてベクターを単離し、精製することができる。
【０１３３】
本発明は、本発明の核酸分子、ベクター又はプラスミドを含む宿主細胞も提供する。好ましくは、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。真核生物宿主細胞の例としては、酵母及び哺乳動物細胞が挙げられる。
【０１３４】
宿主細胞は、好ましくは、ベクター（例えば、上述したように、非複製ポックスウイルスベクター又はアデノウイルスベクター）が成長又は増殖し得る細胞である。宿主細胞は、２９３細胞（ＨＥＫ、すなわちヒト胎児由来腎細胞としても知られる）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＣＬ８１．１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎）、プライマリーＣＥＦ細胞（ニワトリ胚線維芽細胞）、アヒル胚線維芽細胞、又はＤＦ−１細胞から選択することができる。
【０１３５】
別の実施形態においては、宿主細胞はヒト細胞（例えば、単離ヒト細胞）である。
【０１３６】
更なる一実施形態においては、本発明の１個、２個又はそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のポリペプチドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）が提供される。粒子は、好ましくは免疫原性である。
【０１３７】
ウイルス様粒子は、ウイルスに似ているが、ウイルス性遺伝物質を含まないので非感染性である。粒子は、多量体リポタンパク質粒子として記述することもできる。
【０１３８】
適切な系で発現されると、これらのＶＬＰは、前記ポリペプチドの１個以上のモノマーで構成されるリポタンパク質構造／粒子を自発的に構築することができる。
【０１３９】
本発明は、本発明の１個、２個又はそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のポリペプチド（好ましくは、異なるポリペプチド）がＶＬＰに共有結合した、ＶＬＰも提供する。例えば、本発明のポリペプチドは、化学架橋剤、反応性非天然アミノ酸又はＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ反応を用いて、ＶＬＰに共有結合することができる。
【０１４０】
特に好ましい一実施形態においては、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤と共に、Ａ型インフルエンザ感染症を処置又は防止するための同時使用、分離使用又は逐次使用に適した形の組合せ製剤として、少なくとも５個の異なるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む免疫原性組成物であって、各ＶＬＰが独立に配列番号１３〜１７のポリペプチドからなる又は構成される１個以上のホモ三量体を含む、免疫原性組成物が提供される。
【０１４１】
好ましくは、初回免疫は、配列番号１４及び１５のホモ三量体を用いて対象に投与され、第１の追加免疫は、配列番号１３及び１６のホモ三量体を用いて投与され、最終追加免疫は、配列番号１７のホモ三量体を用いて投与される。
【０１４２】
本発明は、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に、本発明の１個、２個若しくはそれ以上のポリペプチド、本発明の１個以上の核酸分子、本発明の１個以上のベクター、又は本発明のＶＬＰを含む組成物も提供する。
【０１４３】
組成物は、好ましくは免疫原性組成物である。
【０１４４】
薬学的に許容される担体として使用するのに適切な物質は、当該技術分野で公知である。薬学的に許容される担体の非限定的例としては、水、食塩水及びリン酸緩衝食塩水が挙げられる。しかし、一部の実施形態においては、組成物は、凍結乾燥形態であり、その場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）などの安定剤を含むことができる。一部の実施形態においては、チオメルサール又はアジ化ナトリウムなどの防腐剤と一緒に組成物を処方して、長期貯蔵を容易にすることが望ましい場合もある。緩衝剤の例としては、コハク酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐＨ７．４）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４５】
薬学的に許容される担体に加えて、本発明の組成物は、更に、塩、賦形剤、希釈剤、アジュバント、免疫調節剤及び／又は抗菌化合物の１つ以上と組み合わせることができる。
【０１４６】
一実施形態においては、本発明の生成物は、活性成分少なくとも１０％若しくは２５％、又は活性成分少なくとも４０％、又は活性成分少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％若しくは７５％などの活性成分（すなわち、ポリペプチド、核酸、ベクター又はＶＬＰ）５％〜９５％を含むことができる。
【０１４７】
本発明の生成物は、投与処方に適合した様式で、かつ予防及び／又は治療上有効であるような量で、投与することができる。
【０１４８】
本発明の生成物の投与は、一般に、従来の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内又は粘膜経路による。投与は、非経口投与、例えば、皮下又は筋肉内注射によることができる。
【０１４９】
したがって、本発明の生成物は、注射用として、溶液又は懸濁液として、調製することができる。あるいは、注射前の液体の溶液又は懸濁液に適切な固体剤形を調製することができる。製剤を乳化することもでき、又はペプチドをリポソーム若しくはマイクロカプセルに封入することもできる。活性成分は、薬学的に許容され該活性成分と適合性である賦形剤と混合される場合がある。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど及びこれらの組合せである。さらに、必要に応じて、本発明の生成物は、湿潤剤、乳化剤及び／又はｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含むこともできる。
【０１５０】
別の投与方法に適切な追加の処方としては、経口処方、又はエアロゾルとして散布するのに適切な処方が挙げられる。経口処方は、通常採用される賦形剤、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形をとる。
【０１５１】
（上述したように）本発明の生成物を対象の呼吸器系に向けることが望ましい場合もある。治療上の／予防上の組成物又は医薬品を肺の感染部位に効率的に送るには、経口又は鼻腔内投与によることができる。
【０１５２】
鼻腔内投与処方は、点鼻薬又は鼻腔噴霧剤の形とすることができる。鼻腔内処方は、５００〜４０００μｍ、１０００〜３０００μｍ、１００〜１０００μｍなどの１００〜５０００μｍの範囲の近似直径を有する液滴を含むことができる。あるいは、体積に関して、液滴は、０．１〜５０μｌ若しくは１．０〜２５μｌ、又は０．００１〜１μｌなどの約０．００１〜１００μｌの範囲とすることができる。
【０１５３】
あるいは、治療上の／予防上の処方又は医薬品はエアロゾル処方とすることができる。エアロゾル処方は、粉末、懸濁液又は溶液の形をとることができる。エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能力に関連する。より小さい粒子は、より大きい粒子よりも呼吸気道を肺胞に向かって更に下方に進むことができる。一実施形態においては、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支及び肺胞の全長に沿った送達を促進するような直径分布を有する。あるいは、粒径分布は、呼吸気道の特定の部分、例えば肺胞を標的にするように選択することができる。医薬品のエアロゾル送達の場合、粒子は直径がおよそ０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜２５μｍ、より好ましくは１〜５μｍの範囲とすることができる。
【０１５４】
エアロゾル粒子は、噴霧器（例えば、経口）又は鼻腔噴霧剤による送達用とすることができる。エアロゾル処方は、任意に噴霧剤及び／又は界面活性剤を含むことができる。
【０１５５】
好ましくは、本発明の組成物は、任意に１種以上のアジュバントとの、例えば非経口投与に適切なワクチン組成物である。
【０１５６】
本明細書では、ワクチンは、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、イヌ又はネコ対象、特にヒト対象）などの動物対象に投与したときに、感染症に対して防御免疫応答を刺激する処方である。免疫応答は、体液性及び／又は細胞性免疫応答であり得る。したがって、ワクチンは、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞を刺激することができる。
【０１５７】
適切なアジュバントの例としては、以下からなる群から選択されるものが挙げられる。
−水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなどの金属塩、
−水中油型乳濁液、
−トール様受容体作動物質（トール様受容体２作動物質、トール様受容体３作動物質、トール様受容体４作動物質、トール様受容体７作動物質、トール様受容体８作動物質、トール様受容体９作動物質など）、
−サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ並びにＱＳ７及び／又はＱＳ２１などのその誘導体、
−ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、
−３Ｄ−ＭＰＬ、
−（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイルオキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシ］］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル二水素ホスファート）、
−ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（二水素ホスファート）、及び
−ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−二水素ホスファート１０−（６−アミノヘキサノアート）、
又はそれらの組合せ。
【０１５８】
好ましくは、アジュバントは、以下を含む群から選択される。
−水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなどの金属塩と会合したサポニン、
−例えば水中油型処方としての、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１及びＣｐＧオリゴヌクレオチド、
−リポソームの形のサポニンは、例えば、ＱＳ２１、ステロールなどのステロールを更に含む、及び
−ＩＳＣＯＭ。
【０１５９】
幾つかの特に好ましい実施形態においては、アジュバントはサポニンを含む。サポニンは、多数の植物種に存在するステロイド又はトリテルペノイドグリコシドである。
【０１６０】
サポニン系アジュバントは、部分的に、注射部位に抗原提示細胞が入るのを刺激し、局所リンパ節において抗原提示を増強することによって作用する。
【０１６１】
好ましくは、アジュバントは、サポニン、コレステロール及びリン脂質、例えば、ＩＳＣＯＭ  Ｍａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｎｏｖａｖａｘ）を含む。
【０１６２】
Ｍａｔｒｉｘ−Ｍにおいては、精製サポニン画分は、合成コレステロール及びリン脂質と混合されて、種々のワクチン抗原を用いて容易に処方することができる安定な粒子を形成する。Ｍａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）は、細胞性免疫応答と抗体性免疫応答の両方を誘導する。
【０１６３】
幾つかの別の好ましい実施形態においては、アジュバントは、水中スクアレン油型ナノエマルジョン乳濁液、例えば、ＡｄｄａＶａｘ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を含む。
【０１６４】
スクアレンは、フロイントアジュバントに使用されるパラフィン油よりも容易に代謝される油である。水中スクアレン油型乳濁液は、細胞性（Ｔｈ１）免疫応答と体液性（Ｔｈ２）免疫応答の両方を誘発することが知られている。このクラスのアジュバントは、ＡＰＣの動員及び活性化並びにマクロファージ及び顆粒球によるサイトカイン及びケモカイン産生の刺激によって作用すると考えられる。
【０１６５】
組成物は、更に界面活性剤を含むことができる。適切な界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０など）、ｂｒｉｊｉ及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１６６】
ワクチン製剤は、「Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖｏｌｌｅｒら編、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ、ボルティモア、メリーランド、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９７８に概説されている。リポソーム内の封入は、例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号に記述されている。
【０１６７】
各ワクチン用量中に存在する本発明のポリペプチド、核酸分子、ベクター又は粒子の量は、一般的なワクチンにおける重大な有害副作用なしに免疫防御反応を誘導する量として選択される。こうした量は、どの特異的免疫原が採用されるか、ワクチンがアジュバントを含むかどうかに応じて変わる。一般に、各用量は、タンパク質１〜１０００μｇ、例えば１０〜１００μｇなどの１〜２００μｇ、より具体的には１０〜４０μｇを含むと予想される。特定のワクチンの最適量は、抗体価及び対象における他の応答の観察を含む標準的な研究によって確認することができる。最初のワクチン接種後、対象は、好ましくは、約４週間で追加免疫を受け、続いて感染リスクが存在する限り、６か月ごとに繰り返し追加免疫を受ける。本発明の生成物に対する免疫応答は、アジュバント及び／又は免疫賦活薬の使用によって強化される。
【０１６８】
本発明のアジュバントに使用されるサポニンの量は、１〜１０００μｇ／回、一般に１〜２５０μｇ／回などの１〜５００μｇ／回、より具体的には１〜１００μｇ／回（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０μｇ／回）とすることができる。
【０１６９】
本発明は、好ましくはＡ型インフルエンザ感染症を処置又は防止するための、同時使用、分離使用又は逐次使用に適した形の組合せ製剤として、本発明の２個以上のポリペプチド、本発明の２個以上の粒子、本発明の２個以上の核酸、本発明の２個以上のベクター及び本発明の２種以上の組成物から選択される２つ以上の成分を含む組合せ製剤も提供する。
【０１７０】
更に別の一態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。
【０１７１】
更なる実施形態においては、本発明は、治療に使用される、又は医薬品として使用される、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を提供する。
【０１７２】
更なる一態様においては、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染症を防止又は処置する方法に使用される、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を提供する。
【０１７３】
更なる一態様においては、本発明は、対象におけるインフルエンザ抗原に対してＴ細胞又はＢ細胞応答を誘導する方法に使用される、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を提供する。
【０１７４】
特に、本発明の非複製ポックスウイルスベクターは、細胞性免疫系を介して防御免疫応答を刺激するのに使用することができる。一実施形態においては、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔh細胞）である。一実施形態においては、Ｔ細胞はＴh１７細胞である。
【０１７５】
更なる実施形態においては、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染症を防止又は処置する方法に使用される医薬品の製造における、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物の使用を提供する。
【０１７６】
更なる実施形態においては、本発明は、対象におけるインフルエンザ抗原に対してＴ細胞又はＢ細胞応答を誘導する方法に使用される医薬品の製造における、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物の使用を提供する。
【０１７７】
本発明は、有効量の本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を対象に投与することを含む、インフルエンザ感染しやすい対象を処置する方法も提供する。
【０１７８】
本発明は、有効量の本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象におけるインフルエンザ抗原に対してＴ細胞又はＢ細胞応答を誘導する方法も提供する。
【０１７９】
本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を類似の使用及び方法で使用して、インフルエンザ抗原に対して中和抗体を生体内で産生することもできる。
【０１８０】
好ましくは、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素タンパク質、より好ましくは赤血球凝集素タンパク質のＨＡ１又はｈｅａｄドメインである。
【０１８１】
好ましくは、インフルエンザはＡ型インフルエンザである。
【０１８２】
インフルエンザ感染症を処置／防止するための使用及び方法の有効性は、（例えば、ＥＬＩＳＡによって）対象の血液中のインフルエンザウイルスに対する中和抗体の有無を証明することによって調べることができる。
【０１８３】
インフルエンザ、好ましくはＡ型インフルエンザの処置若しくは防止のための、又はインフルエンザウイルス、好ましくはＡ型インフルエンザウイルスに対する対象においてＴ細胞若しくはＢ細胞応答を誘導するための、同時使用、分離使用又は逐次使用に適した形の組合せ製剤として、本明細書に定義した２個以上のポリペプチド、２個以上の核酸分子、又は２個以上のベクター若しくはプラスミドを含む免疫原性組成物も提供される。
【０１８４】
対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１８５】
本明細書では「防止」という用語は、インフルエンザ感染症の開始を防止すること、及び／又はインフルエンザ感染症の強さの重症度を低下させることを含む。したがって、「防止」は、ワクチン接種を包含する。
【０１８６】
本明細書では「処置」という用語は、治療及び防止／予防処置（暴露後予防を含む）を包含し、インフルエンザ感染症の感染後治療及び回復を含む。上記方法及び使用の各々は、治療有効量などの有効量の本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を対象に投与するステップを含むことができる。
【０１８７】
本明細書では、有効量は、所望の生物学的結果を得るのに十分な投与量又は量である。本明細書では、治療有効量は、対象（哺乳動物対象、特にヒト対象など）に単回又は複数回投与すると、障害又は再発性障害の少なくとも１つの症候を処置、防止、治癒、遅延、重症度軽減、改善するのに、又はこうした処置の非存在下で予想されるよりも対象を延命するのに、有効である量である。
【０１８８】
したがって、投与される活性成分の量は、処置対象、防御免疫応答を生じる対象の免疫系の能力、及び必要な防御の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各対象に特有であり得る。対象への投与は、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物（すなわち、本発明の生成物）を対象に投与することを含むことができ、本発明の生成物が複数回逐次投与される（例えば、組成物が２、３又は４回投与される）。したがって、一実施形態においては、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物が対象に投与され、次いで本発明の同じ生成物（又はほぼ同様の生成物）が再度異なる時間に投与される。
【０１８９】
一実施形態においては、対象への投与は、本発明のポリペプチド、本発明の粒子、本発明の核酸、本発明のベクター、又は本発明の組成物を対象に投与することを含み、本発明の前記生成物が別の免疫原性組成物の実質的に前に、それと同時に、又はそれに続いて投与される。
【０１９０】
本発明は、初回免疫−追加免疫の投薬計画にも及ぶ。
【０１９１】
例えば、初回免疫及び／又は追加免疫を本発明の１種以上の生成物を用いて行うことができる。生成物は、対象に逐次的に、同時に、又は別々に投与することができる。
【０１９２】
本発明の好ましい初回免疫−追加免疫戦略は、対象におけるインフルエンザ感染症を防止若しくは処置する方法、又は対象におけるインフルエンザ抗原に対してＴ細胞若しくはＢ細胞応答を誘導する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）有効量の１、２、３、４、５個又はそれ以上の異なるポリペプチドをそれを必要とする対象に同時に、別々に、又は逐次的に投与するステップ
を含み、
各ポリペプチドが独立に隣接アミノ酸の第１の領域を含み、
（ａ）第１の領域のアミノ酸配列がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）第１の領域が配列番号９の以下の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、
位置８３がＥである
位置８５が負電荷アミノ酸である
位置１４６がＴ、Ｎ、Ｉ又はＡである
位置１４７が正電荷アミノ酸若しくはＩである、又は存在しない
位置１４８がＧである
位置１４９がＶである
位置１５１がＡである
位置１５４がＳ又はＰである
位置１５５がＨである
位置１５６が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧ又はＮ又はＥである
位置１５７が正電荷アミノ酸又はＡ又はＧである
位置１５８が正電荷アミノ酸又はＡ又はＳ又はＮ又はＣ又はＥである
位置１５９がＫ又はＡ又はＳ又はＮ又はＣである
位置１６３が正電荷アミノ酸である。
【０１９３】
好ましいＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン配列及び第１の領域置換を、必要な変更を加えて、本明細書に開示する。
【０１９４】
ポリペプチドは、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤及びアジュバントと共に、医薬組成物、好ましくはワクチン組成物の形とすることができる。
【０１９５】
好ましくは、（上で定義した）ポリペプチドの１個以上は、１個以上の三量体の形である。一部の実施形態においては、三量体はホモ三量体である。別の実施形態においては、三量体はヘテロ三量体である。
【０１９６】
好ましくは、方法は、
（ｉｉ）第２のポリペプチドの追加免疫を前記対象に投与する追加のステップ、及び任意に、
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドの追加免疫を前記対象に投与する追加のステップ
も含み、
（上で定義した）第２及び第３のポリペプチドが、好ましくは互いに異なり、好ましくは第１のポリペプチドと異なる。
【０１９７】
好ましくは、方法は、
（ｉｉ）第２の三量体の追加免疫を対象に投与する追加のステップ、及び任意に、
（ｉｉｉ）第３の三量体の追加免疫を対象に投与する追加のステップ
も含み、
第２及び第３の三量体が、好ましくは互いに異なり、好ましくは第１の三量体と異なる。
【０１９８】
好ましくは、第１、第２及び第３のポリペプチドは、配列番号１３〜１７を含む、又はからなる、ポリペプチドからなる群から独立に選択される。
【０１９９】
好ましくは、第１、第２及び第３の三量体は独立に、配列番号１３〜１７を含む、又はからなる、ポリペプチドからなる。
【０２００】
好ましい一実施形態においては、配列番号１４及び１５のポリペプチド又はホモ三量体が最初に対象に投与され、配列番号１３及び１６のポリペプチド又はホモ三量体が次に対象に投与され、配列番号１７のポリペプチド又はホモ三量体が次いで対象に投与される。
【０２０１】
別の好ましい一実施形態においては、ポリペプチド又は三量体がＶＬＰの形で投与され、すなわち、ポリペプチド（単数又は複数）三量体（単数又は複数）を含むＶＬＰが投与される。
【０２０２】
別の好ましい一実施形態においては、核酸分子（好ましくはベクター）が対象に投与され、核酸分子は、上で定義したポリペプチドの１個以上をコードする。好ましいベクターについては本明細書で述べる。
【０２０３】
一実施形態においては、第１及び第２の生成物が初回免疫−追加免疫投与手順の一部として投与される。したがって、第１の生成物を対象に「初回免疫」として投与することができ、続いて第２の生成物を同じ対象に「追加免疫」として投与することができる。
【０２０４】
一実施形態においては、第１の生成物は、本発明のアデノウイルスベクターの初回免疫であり、第２の生成物は、本発明の非複製ポックスウイルスベクターの追加免疫である。
【０２０５】
一実施形態においては、上記方法の各々は、更に、本発明の生成物の対象への投与のステップを含む。
【０２０６】
一実施形態においては、本発明のポリペプチドが本発明のウイルスベクターの投与とは別に投与される。好ましくは、ポリペプチド及びウイルスベクターが任意の順で逐次投与される。したがって、一実施形態においては、ウイルスベクター（「Ｖ」）及びポリペプチド（「Ｐ」）をＶ−Ｐ又はＰ−Ｖの順で投与することができる。
【０２０７】
ある実施形態においては、上記方法は、更に、対象へのアジュバントの投与を含む。アジュバントは、本発明の生成物のいずれかと共に投与することができる。
【０２０８】
本発明の生成物は、単回投与スケジュールで投与することができる（すなわち、全用量がほぼ１回で投与される）。あるいは、本発明の生成物は、複数回投与スケジュールで投与することができる。
【０２０９】
複数回投与スケジュールは、主要な処置コース（例えば、ワクチン接種）を１〜６回の別々の用量とすることができ、続いて別の用量が免疫応答を維持する、及び／又は強化するのに必要な後続の時間間隔で、例えば（ヒト対象の場合）、第２の用量が１〜４か月で、更に必要に応じて、後続の用量（単数又は複数）が更に１〜４か月後に投与されるものである。
【０２１０】
投与計画は、少なくとも部分的に、個体の必要性によって決定され、開業医（例えば、医師又は獣医師）の判断に左右される。
【０２１１】
同時投与は、（ほぼ）同じ時間の投与を意味する。
【０２１２】
本発明の２種以上の生成物の逐次投与は、生成物が（ほぼ）異なる時間で順次投与されることを意味する。
【０２１３】
例えば、逐次投与は、異なる時間における本発明の２種以上の生成物の投与を包含し得るものであり、異なる時間は日数で分離される（例えば、１、２、５、１０、１５、２０、３０、６０、９０、１００、１５０又は２００日）。
【０２１４】
例えば、一実施形態においては、本発明のワクチンは、「初回免疫−追加免疫」ワクチン接種計画の一部として投与することができる。
【０２１５】
一実施形態においては、本発明の生成物は、例えば、免疫グロブリン、抗生物質、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）及び／又はサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）から選択される１種以上の免疫調節剤と併せて（同時に又は逐次的に）、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、イヌ又はネコ対象）などの対象に投与することができる。
【０２１６】
更なる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの１個以上の製造プロセスを提供し、該プロセスは、前記ポリペプチドの１個、２個又はそれ以上をコードする１個以上の核酸分子を適切な宿主において発現すること、及びポリペプチド生成物（単数又は複数）を回収することを含む。
【０２１７】
好ましくは、宿主はヒト細胞である。
【０２１８】
２個のアミノ酸配列をアラインするのに利用可能なアルゴリズムが多数確立されている。一般に、１個の配列が参照配列として働き、それと被験配列を比較することができる。配列比較アルゴリズムは、参照配列に対する被験配列（単数又は複数）の配列相同性の割合を所定のプログラムパラメータに基づいて計算する。比較のためのアミノ酸配列のアラインメントは、例えば、コンピュータによって実行されるアルゴリズム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ又はＴＦＡＳＴＡ）、又はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムによって行うことができる。
【０２１９】
アミノ酸配列相同性及びヌクレオチド配列相同性の割合は、アラインメントのＢＬＡＳＴ法によって得ることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。好ましくは、標準又はデフォルトのアラインメントパラメータを使用する。
【０２２０】
標準タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）は、タンパク質データベースにおいて類似の配列を見つけるのに使用することができる。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは、類似の局所領域を見つけるように設計されている。配列類似性が全配列に及ぶときには、ｂｌａｓｔｐは、タンパク質同定目的に好ましい結果であるグローバルアラインメントについても報告する。好ましくは、標準又はデフォルトアラインメントパラメータを使用する。ある場合には、「低複雑度フィルター」を外すことができる。
【０２２１】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワードの長さ＝３で行うこともできる。比較のためのギャップアラインメントを得るために、（ＢＬＡＳＴ２．０中の）Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載のように利用することができる。あるいは、（ＢＬＡＳＴ２．０中の）ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）上掲参照）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。
【０２２２】
ヌクレオチド配列比較に関しては、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔ及びｂｌａｓｔｎを使用して、この目的を達成することができる。好ましくは、標準又はデフォルトアラインメントパラメータを使用する。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、極めて類似した配列間の長いアラインメントを効率的に見つけるように特別に設計されている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを使用して、本発明の核酸に類似しているが同一ではないヌクレオチド配列を見つけることができる。
【０２２３】
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリーをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似配列を見つける。このプログラムは、クエリーワードとの完全一致（ワードヒット）を最初に特定する。次いで、ＢＬＡＳＴプログラムは、これらのワードヒットを複数のステップで延長して、最終ギャップアラインメントを生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。
【０２２４】
ＢＬＡＳＴ検索の感度を支配する重要なパラメータの１つは、ワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも高感度である最も重要な理由は、それがより短いデフォルトワードサイズ（１１）を使用することである。このため、ｂｌａｓｔｎは、別の生物由来の関連ヌクレオチド配列とのアラインメントを見つけるのにＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ワードサイズは、ｂｌａｓｔｎにおいて調節可能であり、検索感度を高めるためにデフォルト値から最小値７まで減少させることができる。
【０２２５】
新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｎｅｗｓｌｔｒ／ＦａｌｌＷｉｎｔｅｒ０２／ｂｌａｓｔｌａｂ．ｈｔｍｌ）を用いて、より高感度の検索を行うことができる。このページは、Ｍａら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２  Ｍａｒ；１８（３）：４４０〜５）によって報告されたものに類似したアルゴリズムを使用する。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、アラインメント延長のシーズとしてワードの完全一致を必要とするのではなく、より長いテンプレートウィンドウ内の非連続的なワードを使用する。コーディングモードにおいては、第３の位置における不一致を無視しながら第１及び第２のコドン位置における一致を見つけることに焦点を合わせることによって、第３の塩基のゆらぎを考慮する。同じワードサイズを用いた不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴにおける検索をすると、同じワードサイズを用いた標準ｂｌａｓｔｎよりも感度及び効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔに独特なパラメータは、ワードサイズ１１又は１２、テンプレート：１６、１８又は２１、テンプレート種別：コーディング（０）、非コーディング（１）又は両方（２）である。
【０２２６】
一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴＰ２．５．０＋アルゴリズムは、（ＮＣＢＩから入手可能なものなど）デフォルトパラメータを用いて使用することができる。
【０２２７】
別の実施形態においては、ＢＬＡＳＴ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムを、（ＮＣＢＩから入手可能なものなど）２個のタンパク質配列のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントをギャップコスト：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎ  １で用いて使用することができる。
【０２２８】
本明細書に開示される限定された可変性部位及びその後の限定された可変性エピトープを同定する方法を、すべてのＡ型インフルエンザ亜型に適用することができる。特に、Ｈ３亜型Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスと同様に進化するので、エピトープを同定する本明細書に開示された手法をＡ型インフルエンザのＨ３亜型に特に適用することができる。
【０２２９】
したがって、更なる一実施形態においては、本発明は、規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン上のエピトープを同定する方法を提供し、
該方法は、
（ｉ）規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメインポリペプチド上の可能な抗体結合部位を同定するステップ、
（ｉｉ）抗体結合可能部位内の１個以上の連続又は不連続な一連ｈｅａｄドメインポリペプチドを同定するステップ、及び
（ｉｉｉ）これら一連のアミノ酸配列の限定された可変性領域を同定するために、これら一連のアミノ酸配列を規定亜型の複数のインフルエンザ株由来の赤血球凝集素ｈｅａｄドメインのアミノ酸配列と比較するステップ
を含み、
それによって、規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内のそれらのアミノ酸組成物の限定された可変性を有し、エピトープを形成する、１セットの位置を特定する。
【０２３０】
このようにして同定されるエピトープは、強力な免疫選択下にあり、インフルエンザウイルスの進化を通して限られた数の形態で定期的に繰り返される。
【０２３１】
該方法及びプロセスを任意のインフルエンザウイルスに適用することができる。好ましくは、インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスである。
【０２３２】
インフルエンザウイルスは、任意の亜型、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７又はＨ１８であり得る。好ましくは、インフルエンザウイルスは、Ｈ１又はＨ３亜型である。
【０２３３】
ステップ（ｉ）は、規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメインポリペプチド上の抗体結合可能部位を特定する必要がある。
【０２３４】
これは、赤血球凝集素ｈｅａｄドメインポリペプチドの結晶構造を分析することによって行うことができる。規定亜型のインフルエンザウイルス由来の２個以上のｈｅａｄドメインの結晶構造を並べ、ポリペプチド表面に存在する残基及びそれらの残基の到達性を決定することができる。一般に、位置の到達性はすべての結晶構造において同じであるが、１つの結晶構造における位置が別の結晶構造よりも接近しやすいときには、その位置を限定された可変性部位の誤った特定を防ぐために、より接近しやすいものとする。
【０２３５】
in silico分析を使用して、到達性及び結合部位領域がどのようにして仮想抗体結合部位の可変性に寄与するかを決定することができる。６００Ａ2と１０００Ａ2の間の抗体結合部位を使用して、到達性が＞３０％〜＞１％のアミノ酸の到達性パラメータの可変性を決定することができる。
【０２３６】
ステップ（ｉｉ）は、抗体結合可能部位内の１個以上の連続又は不連続な一連のｈｅａｄドメインポリペプチドを同定する必要がある。これらの範囲は、抗体によって接触することができる。
【０２３７】
抗体結合可能部位が同定されると、抗体結合可能部位内の１個以上の連続又は不連続な一連のｈｅａｄドメインポリペプチドを、例えばＳｗｉｓｓ−ｐｄｂビューアを用いて、同定することができる。
【０２３８】
ステップ（ｉｉｉ）は、これら一連のアミノ酸配列内の限定された可変性領域を同定するために、連続又は不連続な一連のアミノ酸配列を規定亜型の複数のインフルエンザ株由来の赤血球凝集素ｈｅａｄドメインのアミノ酸配列と比較する必要がある。
【０２３９】
例えば、複数のインフルエンザ株配列を、年ごとの規定亜型のインフルエンザ株の赤血球凝集素ｈｅａｄドメインのコンセンサス配列から得ることができる。年ごとのコンセンサス配列は、精選された赤血球凝集素配列を配列を収集した年に基づいて別々のデータセットに分割することによって生成することができる。次いで、Ｒパッケージ「ｓｅｑｉｎｒ」又は別のコンセンサス配列生成プログラムを用いて、コンセンサス配列を生成することができる。
【０２４０】
本明細書では「限定された配列の可変性」という用語は、それらが形成することができる異なるエピトープコンフォーメーションの数が制限されたアミノ酸又はアミノ酸の配列を指す。
【０２４１】
別の実施形態においては、「限定された配列の可変性」という用語は、０、１、２、３又は４（好ましくは０又は１）個の異なるアミノ酸がアミノ酸配列の比較中に見いだされたアミノ酸位置を指す。
【０２４２】
このようにして、エピトープを形成する、規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内の一連の保存アミノ酸を同定することができる。
【０２４３】
該エピトープは、抗体によって結合されるものとすることができる。好ましくは、エピトープは、可変性が限定されたエピトープである。
【０２４４】
本発明は、ポリペプチドを製造するプロセスであって、
（ｉ）本明細書に定義したエピトープを同定する方法を用いて、規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内の可変性が限定された一連のアミノ酸を同定するステップ、
（ｉｉ）隣接アミノ酸の第１の領域を含むポリペプチドを生成するステップ
を含み、
（ａ）第１の領域のアミノ酸配列がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）第１の領域が、可変性が限定されたアミノ酸位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、置換がその位置で保存されるアミノ酸を導入し、
ポリペプチドがＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる、
プロセスも提供する。
【０２４５】
本発明は、免疫原性組成物を製造するプロセスであって、
（ｉ）本明細書に定義したエピトープを同定する方法を用いて、規定亜型のインフルエンザウイルスの赤血球凝集素ｈｅａｄドメイン内の可変性が限定された一連のアミノ酸位置を特定するステップ、
（ｉｉ）隣接アミノ酸の第１の領域を含むポリペプチドを生成するステップであって、
（ａ）第１の領域のアミノ酸配列がＡ型インフルエンザ赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、
（ｂ）第１の領域が、保存アミノ酸の位置に対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換を有し、置換がその位置で保存されるアミノ酸を導入し、
ポリペプチドがＡ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる、ステップ、及び
（ｉｉｉ）ポリペプチドの１個以上を免疫原性組成物中に処方するステップであって、組成物が、任意に１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤を含む、ステップ
を含む、プロセスも提供する。
【０２４６】
該組成物は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する対象において抗体を誘導することができる。
【０２４７】
インフルエンザウイルスＨ３亜型のエピトープに関して、第１の領域のアミノ酸配列は、好ましくは、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４又はＨ１５赤血球凝集素ｈｅａｄドメインに対してと少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％の配列相同性を有する。
【０２４８】
免疫原性組成物は、好ましくは、ワクチン組成物であり、それは、例えば、本明細書に記載の組成物及び投薬計画により、初回免疫−追加免疫−追加免疫として投与することができる。
【０２４９】
本明細書に記載の各参考文献の開示は、参照によってその全体が本明細書に具体的に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】赤血球凝集素（ＨＡ）のモノマー上のエピトープの多座図である。各インフルエンザ株は、可変性の高い特異的エピトープ及び他の株と共有される可変性の低いエピトープを含むと考えられる。
【図２】主要抗原タイプの周期的置換を示す図である。示した変化パターンは３エピトープ系の場合であり、模式図で示した３種の可能な変異体を各々が含む。
【図３】幾つかのインフルエンザ株と周期的交差反応性を示す小児の血漿の「ヒートマップ」である。ヒートマップの左側の年は、ＨＡ１ドメインが採取された株に関する。個々を１２から１７か月まで左から右に整列させた。反応性の割合をヒートマップの右側に示す。
【図４】幾つかの歴史的インフルエンザ株と交差反応性を示す小児の血漿の「ヒートマップ」である。ヒートマップの左側の年は、ＨＡ１ドメインが採取された株に関する。個々を６から１１か月まで左から右に整列させた。反応性の割合をヒートマップの右側に示す。
【図５Ａ】マイクロ中和アッセイを示す図である。ｘ軸は、倍率変化を生じるシュードタイプウイルスのＩＣ５０の比を示す。野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）及び−１４７Ｋ変異体Ａ／ソロモン諸島／３／２００６シュードタイプウイルスを用いたマイクロ中和アッセイ。
【図５Ｂ】マイクロ中和アッセイを示す図である。ｘ軸は、倍率変化を生じるシュードタイプウイルスのＩＣ５０の比を示す。野生型（ＷＴ）及び−１４７Ｋ変異体Ａ／プエルトリコ／８／１９３４シュードタイプウイルスを用いたマイクロ中和アッセイ。
【図５Ｃ】マイクロ中和アッセイを示す図である。ｘ軸は、倍率変化を生じるシュードタイプウイルスのＩＣ５０の比を示す。野生型（ＷＴ）及び−１４７Ｋ変異体Ａ／ＷＳＮ／１９３３シュードタイプウイルスを用いたマイクロ中和アッセイ。
【図６Ａ】キメラＨＡのコンストラクトを用いた逐次ワクチン接種を示す図である。Ｈ６、Ｈ５及びＨ１１  ＨＡ中に置換された（Ｂ）で概説された配列を５群のマウスに逐次的にワクチン接種した。その中に置換された配列がないＨ６、Ｈ５及びＨ１１構築物を更なる２群に逐次的にワクチン接種し、２群を「グレー」及び「パープル」と命名した。更なる２群に偽のワクチン接種をし、「ホワイト」及び「ブラック」と命名した。最初の２回のワクチン接種をＤＮＡの筋肉内注射１００μｇとして投与し、Ａｌｕｍアジュバントと一緒にキメラＨＡ（すなわち、置換を含む又は含まないＨ１１）を示すレンチウイルスの８個のＨＩ単位の筋肉内注射として最終ワクチン接種を投与した。
【図６Ｂ】２１週における採血からの血清０．５μｌを用いたシュードタイプマイクロ中和アッセイを示す図である。広範な中和活性が、２００９年に流行したインフルエンザウイルス由来のＨ１  ＨＡを示すレンチウイルスに対して発生する。
【図６Ｃ】２１週における採血からの血清０．５μｌを用いたシュードタイプマイクロ中和アッセイを示す図である。広範な中和活性が、１９３３年に流行したインフルエンザウイルス由来のＨ１  ＨＡを示すレンチウイルスに対して発生する。
【図６Ｄ】２１週における採血からの血清０．５μｌを用いたシュードタイプマイクロ中和アッセイを示す図である。広範な中和活性が、１９３４年に流行したインフルエンザウイルス由来のＨ１  ＨＡを示すレンチウイルスに対して発生する。
【図６Ｅ】２１週における採血からの血清０．５μｌを用いたシュードタイプマイクロ中和アッセイを示す図である。広範な中和活性が、１９７７年に流行したインフルエンザウイルス由来のＨ１  ＨＡを示すレンチウイルスに対して発生する。
【図６Ｆ】２１週における採血からの血清０．５μｌを用いたシュードタイプマイクロ中和アッセイを示す図である。広範な中和活性が、２００６年に流行したインフルエンザウイルス由来のＨ１  ＨＡを示すレンチウイルスに対して発生する。
【図６Ｇ】Ａ／カリフォルニア／４／２００９を用いたワクチン接種マウスのインフルエンザ感作を示す図である。グラフは、感作中のマウスの毎日の体重減少を表す。
【図６Ｈ】Ａ／カリフォルニア／４／２００９を用いたワクチン接種マウスのインフルエンザ感作を示す図である。グラフは、感作中のマウスの毎日の生存率を表す。
【図６Ｉ】Ａ／ＰＲ／８／１９３４を用いたワクチン接種マウスのインフルエンザ感作を示す図である。グラフは、感作中のマウスの毎日の体重減少を表す。
【図６Ｊ】Ａ／ＰＲ／８／１９３４を用いたワクチン接種マウスのインフルエンザ感作を示す図である。グラフは、感作中のマウスの毎日の生存率を表す。
【図７Ａ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。抗体結合部位をＡ／プエルトリコ／８／１９３４結晶構造に位置付け、それらの部位内の可変性を２，７５６個のＨ１配列のアラインメントを参照することによって決定した。抗体結合に利用可能なＡ／プエルトリコ／８／１９３４結晶構造の部分のみを考慮した。Ａにおいては、８００Ａ2の抗体結合部位を使用して、３つの到達性パラメータに対する可変性を決定した：到達性＞３０％、＞１０％又は＞１％のアミノ酸。
【図７Ｂ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。到達性＞１０％のアミノ酸のデータセットを使用して、３つの結合部位サイズ６００、８００又は１０００Ａ2に対する可変性を決定した。両方の手法で、Ｈ１  ＨＡのｈｅａｄ内の可変性が限定された同じ領域を同定した。これらの領域の１つは、位置１５６／１５８の中央に可変性が限定された本発明者らのエピトープを含む。ＨＡの線形の付番がｘ軸に対して使用される。
【図７Ｃ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｄ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｅ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｆ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｇ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｈ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｉ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図７Ｊ】可変性が限定された部位がＨ１  ＨＡのｈｅａｄに存在することを示す図である。特定のインフルエンザ株由来のＨＡドメインの結晶構造上へ予測される抗体結合部位のマッピング。
【図８Ａ】アミノ酸１５６／１５８周囲の部位に対応する乱れたペプチド配列を示す図である。横及び上からのＡ／ブレビグミッション／１／１９１８の結晶構造を示す。乱れたペプチド配列は、Ｈ１構造上に位置付けられる。アミノ酸位置１４７が（白及び矢印で）強調表示され、Ａ／ブレビグミッション／１／１９１８中に存在するが、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４には存在しない。
【図８Ｂ】アミノ酸１５６／１５８周囲の部位に対応する乱れたペプチド配列を示す図である。横及び上からのＡ／プエルトリコ／８／１９３４の結晶構造を示す。乱れたペプチド配列は、Ｈ１構造上に位置付けられる。アミノ酸位置１４７が（白及び矢印で）強調表示され、Ａ／ブレビグミッション／１／１９１８中に存在するが、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４には存在しない。
【図９Ａ】限定された可変性部位の乱れたペプチド配列の周期的活性を示す図である。年ごとのコンセンサス配列から取られた乱れたペプチド配列をそれらの化学的性質に従う群とすることができる。時間で並べると、乱れたペプチド配列の周期的性質が明らかになる。それらの化学的性質に基づく配列の別の並べ方も可能であり、これは、単に、このエピトープ領域の周期的性質の１つの可能な具体化及び典型である。
【図９Ｂ】限定された可変性部位の乱れたペプチド配列の周期的活性を示す図である。年ごとのコンセンサス配列から取られた乱れたペプチド配列をそれらの化学的性質に従う群とすることができる。時間で並べると、乱れたペプチド配列の周期的性質が明らかになる。それらの化学的性質に基づく配列の別の並べ方も可能であり、これは、単に、このエピトープ領域の周期的性質の１つの可能な具体化及び典型である。
【図９Ｃ】限定された可変性部位の乱れたペプチド配列の周期的活性を示す図である。年ごとのコンセンサス配列から取られた乱れたペプチド配列をそれらの化学的性質に従う群とすることができる。時間で並べると、乱れたペプチド配列の周期的性質が明らかになる。それらの化学的性質に基づく配列の別の並べ方も可能であり、これは、単に、このエピトープ領域の周期的性質の１つの可能な具体化及び典型である。
【図９Ｄ】限定された可変性部位の乱れたペプチド配列の周期的活性を示す図である。年ごとのコンセンサス配列から取られた乱れたペプチド配列をそれらの化学的性質に従う群とすることができる。時間で並べると、乱れたペプチド配列の周期的性質が明らかになる。それらの化学的性質に基づく配列の別の並べ方も可能であり、これは、単に、このエピトープ領域の周期的性質の１つの可能な具体化及び典型である。
【図１０】位置１４７におけるアミノ酸変化が４つの可能性の間で循環するのを示す図である。Ａ．位置１４７におけるアミノ酸の相同性は、１９１８〜１９５７及び１９７７〜２０１５の５つの期間でリジン、アルギニン、イソロイシン及び非存在の間で循環する。
【実施例】
【０２５１】
本発明を以下の実施例によって更に説明する。別段の記載がない限り、部及び割合は重量であり、度はセルシウスである。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、単なる例として示されることを理解されたい。上記考察及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的特徴を確認することができ、その意図及び範囲から逸脱することなく、本発明を種々変更及び改変して多様な使用及び条件に適合させることができる。したがって、本明細書に示し、記載するものに加えて本発明の様々な改変が上記記述から当業者に明らかになるであろう。こうした改変も添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２５２】
実施例１：抗原変異モデル
可変性の低い防御エピトープの存在は、「抗原変異モデル」下のＡ型インフルエンザの個体群動態と一致する。このモデルは、各座がエピトープ領域に対応するウイルスの多座図に基づき、可変性が限定された防御エピトープ及び可変性の高い防御エピトープを含む可能性を有する点で、より広く受け入れられた「抗原変異」モデルの代替を提供する。図１は、これらが赤血球凝集素（ＨＡ）のモノマー上の公知の抗原性部位に位置し得る仕方を示す。インフルエンザの流行挙動は、大部分のインフルエンザ株が可変性の低い領域においてエピトープを共有するので互いに競合するとすれば、抗原変異フレームワーク内で容易に説明することができる（Ｒｅｃｋｅｒら、２００７、Ｗｉｋｒａｍａｒａｔｎａら、２０１３）。したがって、新しい株が変異によって常に生成し得るものの、これらの大部分は、それらの可変性のより低いエピトープに対する既存の免疫応答のために、宿主集団において拡大することができない。これは、抗原タイプの周期的優位をもたらす（図２）。「抗原変異」モデルとは対照的に、流行株間の抗原距離は、必ずしも時間とともに蓄積せず、代わりに、周期的に拡大及び収縮する。
【０２５３】
Ｃａｒｔｅｒら（２０１３）は、抗原変異モデルの証拠を提供している。フェレットを幾つかの歴史的インフルエンザウイルスの１つに感染させた。血清抗体を１４及び８１日目に赤血球凝集素阻害（ＨＡＩ）アッセイによって測定した（図５）。血清抗体は、抗原変異仮説によって予測されるように、歴史的株のウイルスに対する抗体の周期的交差反応性を示した。
【０２５４】
Ｃａｒｔｅｒら（２０１３）において観察された周期的交差反応性は、部分的に、現在の構造バイオインフォマティクス分析によって予測される。例えば、１９５７株によるフェレットの感染は、Ａ／Ｒ／８／１９３４、Ａ／Ｄｅｎ／１／１９５７、Ａ／ＮＣ／２０／１９９９及びＡ／Ｂｒｉｓ／５９／２００７株に対して交差反応性抗体を誘導すると予測される。交差反応性は、感染によってＡ／Ｒ／８／１９３４、Ａ／Ｄｅｎ／１／１９５７及びＡ／ＮＣ／２０／１９９９株の間で認められるが、Ａ／Ｂｒｉｓ／５９／２００７株では認められない。
【０２５５】
実施例２：経時的に分散するＨ１インフルエンザ株に対する乳児血漿の周期的交差反応性
標準化酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  ａｓｓａｙ）を２０１２年に収集された１２〜１７か月齢の小児の血漿を用いて行った。インフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／４／２００９、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７、Ａ／ブレビグミッション／１／１９１８、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９、Ａ／プエルトリコ／８／３４及びＡ／ＷＳＮ／３３由来のＨＡ１ドメインをＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。標準は、成体の血清をそれらの出生日に基づいて使用した。カゼイン（ｃａｅｓｉｎ）のみの対照及び非反応性ヒト血漿又はＶＩ血清対照からなる２つの負の対照を各プレート上で実施した。
【０２５６】
結果を図３に示す。２０１２年に収集された１２〜１７か月齢の８１名の小児の血漿は、インフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／４／２００９、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７及びＡ／ブレビグミッション／１／１９１８由来のＨＡ１ドメイン（ＨＡ  Ｈ１のｈｅａｄドメイン及び茎ドメインの一部）と交差反応したが、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９、Ａ／プエルトリコ／８／３４又はＡ／ＷＳＮ／３３とは交差反応しなかった。すべてのＥＬＩＳＡ結果を３重で完了させ、非反応性ヒト血漿に対して標準化した。ＥＬＩＳＡ結果をＭｉｕｒａら（２００８）に記述された判定基準に基づいて許容又は却下した。
【０２５７】
この血漿が歴史的Ｈ１Ｎ１株のパネルと周期的に反応したという事実から、本発明者らは、可変性が限定されたエピトープがＨ１  ＨＡのｈｅａｄドメインに存在し、限られた数のコンフォーメーションを介して、宿主集団の免疫変化として循環すると推測する。
【０２５８】
実施例３：可変性が限定されたエピトープの同定
可変性が限定されたエピトープを同定するために、抗体結合部位をＡ／プエルトリコ／８／１９３４結晶構造に位置付け、それらの部位内の可変性を２，７５６個のＨ１配列のアラインメントを参照することによって決定した（図７）。抗体結合に到達しやすいＡ／プエルトリコ／８／１９３４結晶構造の部分のみを考慮した。これを、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４、Ａ／ブレビグミッション／１／１９１８及びＡ／カリフォルニア／０４／２００９の結晶構造を整列させて、タンパク質表面に存在する残基及びそれらの残基の到達性を測定した。一般に、位置の到達性はすべての結晶構造において同じであったが、１つの結晶構造における位置が別の結晶構造よりも到達しやすいときには、その位置を可変性が限定された部位の同定の誤りを防止するためにより到達しやすいとした。ビリオンに含まれるＨＡの部分も分析では考慮しなかった。
【０２５９】
in silico分析を使用して、到達性及び結合部位領域が仮想抗体結合部位の可変性に寄与する仕方を求めた。８００Ａ2の抗体結合部位を使用して、３つの到達性パラメータに対する可変性を決定した：到達性＞３０％、＞１０％又は＞１％のアミノ酸。到達性が＞１０％の位置のデータセットを使用して、３つの結合部位サイズ６００Ａ2、８００Ａ2又は１０００Ａ2に対する可変性を決定した。両方の手法で、Ｈ１  ＨＡのｈｅａｄ内の可変性が限定された同じ領域を同定した（図７）。
【０２６０】
in silico分析から存在すると予測された可変性が限定された部位の分析を、予測エピトープをＡ／プエルトリコ／８／１９３４、Ａ／ブレビグミッション／１／１９１８及びＡ／カリフォルニア／０４／２００９結晶構造にＳｗｉｓｓ−ｐｄｂビューアを用いてマッピングすることによって行った。予測部位を結晶構造にマッピングすることによって、エピトープである可能性がある部位を同定することができた。受容体結合部位（ＲＢＳ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）に近い１部位は、強力な免疫選択下にあることが知られているが可変性が高いと考えられる領域において、この位置１５６／１５８の周囲の８００Ａ2領域上の中央にあった（図８；Ｃａｔｏｎら、１９８２）。
【０２６１】
実施例４：エピトープの循環
１２，４８０個の精選されたＨ１  ＨＡ配列を配列を収集した年に基づいて別々のｆａｓｔａファイルに分割することによって年ごとのコンセンサス配列を生成した。次いで、Ｒパッケージ「ｓｅｑｉｎｒ」を用いて、コンセンサス配列を生成した。
【０２６２】
位置１５６／１５８の周囲の予測結合部位の分析によれば、非荷電残基を有する位置に加えて、保存された、又は類似の残基タイプ間で変化した、荷電残基を見いだすことができる幾つかの位置が存在した。抗体は荷電残基に優先的に結合することが一般に認められており、したがって可能なエピトープ順列を位置１４７、１５６、１５７、１５８及び１５９における荷電アミノ酸の循環に基づいて定義した（Ｋｒｉｎｇｅｌｕｍら、２０１３）。
【０２６３】
位置１４７においては、アミノ酸は、正電荷アミノ酸、リジン又はアルギニン、中性アミノ酸、イソロイシン、及びアミノ酸なしの間で入れ代わった。その結果、部位をこのパターンに基づいて３群に分割した。
【０２６４】
位置１４７の系統発生解析によっても、１９１８〜１９５７及び１９７７〜２０１５の間のヒトにおけるＨ１インフルエンザの進化中にアミノ酸が位置１４７に存在しない株が５回同定された（図１０）。リジン、アルギニン、イソロイシン及びアミノ酸なしの間で循環することも見いだされた。その結果、アルギニンとリジンの両方を正電荷アミノ酸として含むワクチンを有する重要性が強調された。これは、部位が構造的に限定され、少数のコンフォーメーション間で循環することも示した。
【０２６５】
次いで、１４７個の陽性群を位置１５８又は１５９、１５８の正電荷アミノ酸、及び位置１５６又は１５７の正電荷アミノ酸の存在に基づいて更に分割した。
【０２６６】
次いで、アラニン又はアスパラギンが位置１５６に存在するかどうかに基づいて１４７陽性／１５８又は１５７陽性群から追加の群を生成可能にする非荷電アミノ酸の空間充填能力を考察した（図９）。
【０２６７】
実施例５：部位特異的変異誘発による中和の減少
２００６年後半／２００７年前半に採取された６〜１１歳の小児の血清は、歴史的インフルエンザ株由来のＨＡ１ドメインと広く交差反応した（図４）。交差反応性は、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６ＨＡ１ドメインと密接に関連したＡ／ニューカレドニア／２０／１９９９ＨＡ１ドメインに加えて、Ａ／ＷＳＮ／３３由来のＨＡ１ドメインに対して最大になる。交差反応性は、Ａ／カリフォルニア／４／２００９、Ａ／ＵＳＳＲ／９０／１９７７、Ａ／オールバニー／１２／１９５１、Ａ／プエルトリコ／８／３４及びＡ／ブレビグミッション／１／１９１８に対しても認められた。
【０２６８】
マイクロ中和アッセイ（図５）を用いて、リジンが位置１４７に挿入されると、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６シュードタイプレンチウイルスに対する最高３２倍の中和の減少が認められた（ｐ値０．０００５）。位置１４７におけるリジンの挿入でＡ／ＷＳＮ／１９３３シュードタイプレンチウイルスの最高１８．７５倍の中和の減少も認められた（ｐ値０．００５６）。ＵＫコホートからは１１個の血清試料しかＡ／ＰＲ／８／１９３４シュードタイプレンチウイルスと交差反応性を示さなかったが、リジンを位置１４７に挿入すると８個の試料で中和が完全に失われ、３個の試料で減少した。これは、これらの株の間の交差反応性の大部分が、位置１４７における欠損を含むエピトープによって媒介されることを示している。
【０２６９】
このデータは、アミノ酸位置１４７の重要性を強調するものである。Ａ／ソロモン諸島／３／２００６、Ａ／ＰＲ／８／１９３４及びＡ／ＷＳＮ／１９３３株においては、アミノ酸が位置１４７に含まれないことに注目されたい。その代わり、これらのウイルスのモノマーは、５６６個のアミノ酸の代わりに５６５個からなる。
【０２７０】
実施例６：ポリペプチドの合成
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｔｒｉｎｇｓを使用して、Ｈ５、Ｈ６又はＨ１１のＨＡ１ドメイン中に置換された可変性が限定されたエピトープからなるキメラＨＡ分子を合成した。部位の３つのコンフォーメーションを最初に使用した。
【０２７１】
次いで、キメラＨＡ１ドメイン配列をＤＮＡ発現コンストラクト及びレンチウイルス糖タンパク質発現ベクター中に挿入した。ＤＮＡ発現を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で行い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｉｇａ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて精製した。キメラＨＡを示すレンチウイルスをＣａｒｎｅｌｌら（２０１５）に概説された手順によって作製した後、スクロースクッション遠心分離によって精製した。Ｈ６、Ｈ５及びＨ１１  ＨＡ１ドメイン中に置換されたコンフォーメーションを以下に示す（アミノ酸位置を括弧内に示す）：
ブルー：
Ｎ（１４６）、Ｋ（１４７）、Ｇ（１４８）、Ｖ（１４９）、Ａ（１５１）、Ｐ（１５４）、Ｈ（１５５）、Ａ（１５６）、Ｇ（１５７）、Ａ（１５８）、Ｋ（１５９）、Ｋ（１６３）
ＡＡＣ（１４６）ＡＡＧ（１４７）ＧＧＣ（１４８）ＧＴＧ（１４９）ＧＣＣ（１５１）ＣＣＣ（１５４）ＣＡＣ（１５５）ＧＣＣ（１５６）ＧＧＣ（１５７）ＧＣＣ（１５８）ＡＡＧ（１５９）ＡＡＧ（１６３）
ヘイゼル：
Ｎ（１４６）、Ｉ（１４７）、Ｇ（１４８）、Ｖ（１４９）、Ａ（１５１）、Ｓ（１５４）、Ｈ（１５５）、Ａ（１５６）、Ｇ（１５７）、Ｋ（１５８）、Ｓ（１５９）、Ｋ（１６３）
ＡＡＣ（１４６）ＡＴＣ（１４７）ＧＧＣ（１４８）ＧＴＧ（１４９）ＧＣＣ（１５１）ＡＧＣ（１５４）ＣＡＣ（１５５）ＧＣＣ（１５６）ＧＧＣ（１５７）ＡＡＧ（１５８）ＡＧＣ（１５９）ＡＡＧ（１６３）
グリーン：
Ｔ（１４６）、Ｒ（１４７）、Ｇ（１４８）、Ｖ（１４９）、Ａ（１５１）、Ｓ（１５４）、Ｈ（１５５）、Ｋ（１５６）、Ｇ（１５７）、Ｋ（１５８）、Ｓ（１５９）、Ｒ（１６３）
ＡＣＣ（１４６）ＡＧＧ（１４７）ＧＧＣ（１４８）ＧＴＧ（１４９）ＧＣＣ（１５１）ＡＧＣ（１５４）ＣＡＣ（１５５）ＡＡＧ（１５６）ＧＧＣ（１５７）ＡＡＧ（１５８）ＡＧＣ（１５９）ＡＧＧ（１６３）
オレンジ：
Ｔ（１４６）、Ｋ（１４７）、Ｇ（１４８）、Ｖ（１４９）、Ａ（１５１）、Ｓ（１５４）、Ｈ（１５５）、Ｎ（１５６）、Ｇ（１５７）、Ｋ（１５８）、Ｓ（１５９）、Ｒ（１６３）
ＡＣＣ（１４６）ＡＡＧ（１４７）ＧＧＣ（１４８）ＧＴＧ（１４９）ＧＣＣ（１５１）ＡＧＣ（１５４）ＣＡＣ（１５５）ＡＡＣ（１５６）ＧＧＣ（１５７）ＡＡＧ（１５８）ＡＧＣ（１５９）ＡＧＧ（１６３）
レッド：
Ｔ（１４６）、なし（１４７）、）、Ｇ（１４８）、Ｖ（１４９）、Ａ（１５１）、Ｓ（１５４）、Ｈ（１５５）、Ｎ（１５６）、Ｇ（１５７）、Ｋ（１５８）、Ｓ（１５９）、Ｒ（１６３）
ＡＣＣ（１４６）なし（１４７）ＧＧＣ（１４８）ＧＴＧ（１４９）ＧＣＣ（１５１）ＡＧＣ（１５４）ＣＡＣ（１５５）ＡＡＣ（１５６）ＧＧＣ（１５７）ＡＡＧ（１５８）ＡＧＣ（１５９）ＡＧＧ（１６３）
【０２７２】
これらの配列はワクチンコンストラクト中に挿入されたものに対応し、したがって、任意の交差反応性がそれらに直接起因し得る。
【０２７３】
実施例７：マウス感作
マウスインフルエンザ感作を以下のインフルエンザ株を用いて行った。
（ｉ）濃度１×１０5ＰｆｕのＡ／カリフォルニア／４／２００９及び（ｉｉ）濃度１×１０3ＰｆｕのＡ／ＰＲ／８／１９３４。体重変化を毎日監視した。感作実験の最適化によって、マウスにおいてワクチンによって誘導される防御をワクチン接種研究において定量化することができる。
【０２７４】
基本的なワクチン接種手順を図６Ａに示す。
【０２７５】
マウスに以下に概説する配列を逐次的にワクチン接種した。
【０２７６】
【表１】
2019534242.tif 000003
【０２７７】
（ブルー、レッド、ヘイゼル、オレンジ及びグリーンと命名された）６匹のマウスの５群に各々Ｈ６  ＨＡ中に置換されたエピトープの異なるコンフォーメーションを有するＤＮＡ１００μｇの筋肉内注射によって１０週目にワクチン接種した。１３週齢において、同じ群に、Ｈ５  ＨＡ中に置換された同じコンフォーメーションを有するＤＮＡ１００μｇの筋肉内注射によってワクチン接種した。１８週齢において、同じ群に、レンチウイルス上にディスプレイされたＨ１１  ＨＡ中に置換され、Ａｌｕｍアジュバント（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合された同じコンフォーメーションで筋肉内にワクチン接種した。２つの対照群（パープル及びグレー）に、ＨＡをそれらに置換されたエピトープコンフォーメーションなしで上記マウスと同様にワクチン接種した。最後に、２つの更なる対照群（ブラック及びホワイト）に１８週においてＰＢＳ及びＡｌｕｍ（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の偽ワクチンを接種した。１１週、１４週、２０週及び２１週において全群から採血した。２２週において、ブルー、オレンジ、ヘイゼル及びパープル群をマウス用に改変したＡ／カリフォルニア／４／２００９ウイルスに感作させ、毎日計量した。２２週において、レッド、グリーン、グレー及びホワイト群をマウス用に改変したＡ／ＰＲ／８／１９３４ウイルスに感作させ、毎日計量した。結果を図６に示す。
【０２７８】
実施例８：Ｈ３インフルエンザ亜型に対するワクチン接種
可変性が限定された部位及び後続の可変性が限定されたエピトープを同定する方法をＡ型インフルエンザのＨ３亜型に適用する。Ｈ３亜型Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスと同様に進化するので、エピトープを同定するこの手法をＨ３亜型Ａ型インフルエンザに同様に適用可能である。その結果、エピトープは、Ｈ３株の可変性をＨ３インフルエンザのｈｅａｄにマッピングし、可変性が限定された領域を同定し、前記領域をＨ３構造にマッピングして、潜在的エピトープを同定し、次いでコンセンサス配列データを分析して、抗原変異モデルによって予測される周期的に挙動するエピトープを同定することによって、同定することができる。
【０２７９】
このタイプのエピトープコンフォーメーションは、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５のＨＡｈｅａｄドメインに位置し、ＶＬＰ又はウイルスベクターを用いて発現される。ワクチンの組合せを初回免疫−追加免疫−追加免疫として投与する。
【０２８０】
実施例９：ワクチンによって生じる交差反応性
ＥＬＩＳＡアッセイをＡ／ＰＲ／８／１９３４、Ａ／Ｂｅｌ／１９４２、Ａ／オールバニー／１４／１９５１及びＡ／メンフィス／３／１９８７のＨＡ１ドメインに対して行った。相対ＥＬＩＳＡ単位（ＲＥＵ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ  ｕｎｉｔｓ）を各アッセイにおいてＯＤ１．０に達した公知の陽性試料に基づいて計算した。
【０２８１】
【表２】
2019534242.tif 000004
【０２８２】
参考文献
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【配列表フリーテキスト】
【０２８３】
配列番号１：Ｈ１ｈｅａｄドメイン−アミノ酸
配列番号２：Ｈ６ｈｅａｄドメイン−アミノ酸
配列番号３：Ｈ５ｈｅａｄドメイン−アミノ酸
配列番号４：Ｈ１１ｈｅａｄドメイン−アミノ酸
配列番号５：Ｈ１ｈｅａｄドメイン−ヌクレオチド
配列番号６：Ｈ６ｈｅａｄドメイン−ヌクレオチド
配列番号７：Ｈ５ｈｅａｄドメイン−ヌクレオチド
配列番号８：Ｈ１１ｈｅａｄドメイン−ヌクレオチド
配列番号９：Ｈ１赤血球凝集素−アミノ酸
配列番号１０：Ｈ６赤血球凝集素−アミノ酸
配列番号１１：Ｈ５赤血球凝集素−アミノ酸
配列番号１２：Ｈ１１赤血球凝集素−アミノ酸
配列番号１３：ｈｅａｄドメイン（ブルー）−Ｈ１１ｈｅａｄに配置されたアミノ酸ブルー配列
配列番号１４：ｈｅａｄドメイン（ヘイゼル）−Ｈ６ｈｅａｄドメインに配置されたアミノ酸ヘイゼル配列
配列番号１５：ｈｅａｄドメイン（グリーン）−Ｈ６ｈｅａｄドメインに配置されたアミノ酸グリーン配列
配列番号１６：ｈｅａｄドメイン（オレンジ）−アミノ酸
配列番号１７：ｈｅａｄドメイン（レッド）−アミノ酸
配列番号１８：ｈｅａｄドメイン（ブルー）−ヌクレオチド
配列番号１９：ｈｅａｄドメイン（ヘイゼル）−ヌクレオチド
配列番号２０：ｈｅａｄドメイン（グリーン）−ヌクレオチド
配列番号２１：ｈｅａｄドメイン（オレンジ）−ヌクレオチド
配列番号２２：ｈｅａｄドメイン（レッド）−ヌクレオチド
配列番号２３：Ｈ９赤血球凝集素−アミノ酸
配列番号２４：Ｈ１切断部位コンセンサス配列
配列番号２５：Ｈ５切断部位コンセンサス配列
配列番号２６：Ｈ６切断部位コンセンサス配列
配列番号２７：Ｈ９切断コンセンサス配列
配列番号２８：Ｈ１１切断部位コンセンサス配列
【図１】
2019534242.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2019534242.tif 000009
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2019534242.tif 000012
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
2019534242.tif 000018
【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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