(57)【要約】フローセル及びカートリッジアセンブリは遺伝子シークエンシングのような処理システムに装填することができる。このシステムは、アセンブリを位置付けし、またこの後作動してアセンブリをＸ及びＹ方向の双方における所望基準位置に移動させる。更なる作動によりクランプをフローセル、カートリッジ又はその双方に接触させ、処理中に押下げ保持力を加える。さらに、押下げ保持力は真空チャックによって供給することができる。この押下げ保持力は、マニホールドをフローセルに封止するのに必要な力に対向作用する。【選択図】図１
2019536000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作にあたりフローセルアセンブリを収容する支持体と、
前記フローセルアセンブリの平面に対するＺ-方向に前記フローセルアセンブリを前記支持体に向かう係合状態に引き込むよう作動可能な固定アームと、
前記Ｚ-方向に直交するＸ-方向の第1基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧するよう作動可能な第1駆動素子と、
前記Ｚ-方向及び前記Ｘ-方向に直交するＹ-方向の第２基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧するよう作動可能な第２駆動素子と、並びに
単一の固定操作で、前記固定アームを作動させて前記フローセルアセンブリを前記支持体に向かうＺ-方向に引き込ませること、前記第１駆動素子を作動させて前記フローセルアセンブリを前記Ｘ-方向の前記第１基準位置に押圧すること、及び前記第２駆動素子を作動させて前記フローセルアセンブリを前記Ｙ-方向の前記第２基準位置に押圧することを行う、作動システムと
を備える、システム。
【請求項２】
請求項１記載のシステムにおいて、さらに、前記フローセルが前記第１及び第２の基準位置に位置決めされるとき、前記フローセルアセンブリに対する封止流体流路を形成する流体接続部を備える、システム。
【請求項３】
請求項２記載のシステムにおいて、前記流体接続部はマニホールドを有し、前記マニホールドは、前記作動システムによって移動させられ、前記フローセルアセンブリの流入サイドに配置された第１エラストマー素子、及び前記フローセルアセンブリの流出サイドに配置された第２エラストマー素子との封止流体接続を完遂する、システム。
【請求項４】
請求項３記載のシステムにおいて、前記エラストマー素子の各々は、１つより多い流路を封止するための単一ピース材料を有する、システム。
【請求項５】
請求項３記載のシステムにおいて、前記第１及び第２のエラストマー素子は、同一である、システム。
【請求項６】
請求項２記載のシステムにおいて、前記流体接続部は、前記フローセルアセンブリの流入サイド及び流出サイドにおけるマニホールドによって形成される、システム。
【請求項７】
請求項６記載のシステムにおいて、前記マニホールドは、前記固定アームによって加えられる力に抗して上方にばね押圧偏移させられる、システム。
【請求項８】
請求項１記載のシステムにおいて、前記固定アームは、前記フローセルアセンブリの流入サイドで前記フローセルアセンブリの上側面に接触する少なくとも１つの第１固定アームと、及び前記フローセルアセンブリの流出サイドで前記フローセルアセンブリの上側面に接触する少なくとも１つの第２固定アームとを有する、システム。
【請求項９】
請求項１記載のシステムにおいて、前記単一操作は、前記フローセルアセンブリを前記第１基準位置に向けて移動させる１対の電動モータ、及び前記フローセルアセンブリを前記第２基準位置に向けて移動させる第３モータの作動を含む、システム。
【請求項１０】
請求項１記載のシステムにおいて、前記フローセルアセンブリは、フローセルを包囲するフレーム構体を有し、前記固定アーム、並びに第１駆動素子及び第２駆動素子は、前記フレーム構体、又は前記フローセル、又はその双方に接触する、システム。
【請求項１１】
請求項１記載のシステムにおいて、前記第１駆動素子は、前記フローセルアセンブリを前記第１基準位置に向けて押圧する螺旋状表面を有する、システム。
【請求項１２】
請求項１記載のシステムにおいて、前記固定システムは、押圧偏移ばねによってクランプ位置で安定した状態をとることができ、これにより作動モータは前記フローセルの操作中に滅勢させることができる、システム。
【請求項１３】
操作にあたりフローセルアセンブリを収容する支持体と、並びに
単一操作により、前記フローセルアセンブリに係合して、前記フローセルアセンブリの平面に直交するＺ-方向に前記フローセルアセンブリを前記支持体に向けて押圧し、また前記Ｚ-方向に直交するＸ-方向の第1基準位置、並びに前記Ｚ-方向及び前記Ｘ-方向に直交するＹ-方向の第２基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧する、固定及び位置決めアセンブリと
を備える、固定システム。
【請求項１４】
請求項１３記載の固定システムにおいて、前記固定及び位置決めアセンブリは、前記フローセルアセンブリの流入サイドにおける第１アセンブリ、及び前記フローセルアセンブリの流出サイドにおける第２アセンブリを有し、また前記単一操作は、前記フローセルアセンブリを前記第１基準位置に向けて移動させる１対の電動モータ、及び前記フローセルアセンブリを前記第２基準位置に向けて移動させる第３モータの作動を含む、固定システム。
【請求項１５】
請求項１３記載の固定システムにおいて、前記フローセルアセンブリの流入サイド及び流出サイドに同一のエラストマー素子を配置し、これらエラストマー素子は、前記フローセルが前記第１及び第２の基準位置に位置決めされるとき、前記フローセルアセンブリに対する封止流体流路を確立するよう、前記フローセルアセンブリの流体通路に整合する、固定システム。
【請求項１６】
フローセルアセンブリを処理装置の支持体に配置するステップと、並びに
単一操作により、前記フローセルアセンブリに係合して、前記フローセルアセンブリの平面に直交するＺ-方向に前記フローセルアセンブリを前記支持体に向けて押圧し、また前記Ｚ-方向に直交するＸ-方向の第1基準位置、並びに前記Ｚ-方向及び前記Ｘ-方向に直交するＹ-方向の第２基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧する、固定及び位置決めアセンブリを作動させるステップと
を備える、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記フローセルアセンブリの流入サイド及び流出サイドのエラストマー素子にマニホールドを押し付ける移動によって、前記フローセルアセンブリに対する封止流体流路を確立するステップを備える、方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の方法において、前記フローセルアセンブリは、フローセルを包囲するフレーム構体を有し、固定アーム、並びに第１駆動素子及び第２駆動素子は、前記フローセルにのみ接触し、また前記フレーム構体には接触しない、方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の方法において、前記固定及び位置決めアセンブリを作動させるステップは、前記フローセルアセンブリの流入サイドにおける第１アセンブリ、及び前記フローセルアセンブリの流出サイドにおける第２アセンブリを作動させるステップを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１６記載の方法において、前記単一操作は、前記フローセルアセンブリを前記第１基準位置に向けて移動させる１対の電動モータ、及び前記フローセルアセンブリを前記第２基準位置に向けて移動させる第３モータの作動を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本件出願は、２０１６年１１月２３日出願の米国特許出願第１５／３５９，８４８号及び２０１６年１１月２３日出願の独国特許出願第２０１７８５３号からの優先権を主張し、上述の特許出願は参照により全体が本明細書に組み入れられるものとする。
本発明は、フローセルアセンブリ固定システム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは、多くの目的、とくに、生物学的用途におけるような関心対象である検体の処理及び検出での使用が増加している。このような背景において、マイクロアレイは基板上に形成され、また関心対象分子のような検体を基板上の部位に形成又は堆積させることができる。マイクロアレイは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のストランド（鎖状体）のような生物学的物質を増殖、撮像又は解析するのに使用することができるが、多くの他の検体を装填及び処理することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡに採用されるとき、このようなマイクロアレイはこれら分子断片の結合、増殖（例えば、交雑）及び研究するのに使用することができる。分子が被験者又は患者由来であるとき、処理は断片を形成する核酸の配列（シークエンス）を明らかにすることができ、またこれら核酸シークエンスをつなぎ合わせて被験者のゲノムの部分全体を決定することができる。
【０００３】
多くの用途において、マイクロアレイは処理フローセルと称されるアセンブリ内に設置される。フローセルは、マイクロアレイ及びこれらマイクロアレイ上に装填された分子を保護し、また例えば装填された分子との反応を起こさせるため、マイクロアレイ環境内への他の化学物質導入を可能にする。フローセルは、さらに、分子が結合される部位の撮像を可能にし、また得られた画像データを使用して所望の解析を行うことがよくある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この技術が改良されるにつれて、従来型フローセルの設計、及び処理用に装填されまた適正に位置決めされることができる機器の設計が進化してきた。多くの用途において、これら設計は、フローセルの保護及び堅牢性に関する信頼性のみならず、処理コンポーネント及び撮像コンポーネントに対するフローセル（及びマイクロアレイ）の位置決めを可能にする高度な精度にとって重要である。とくに、撮像に関して、また動きを伴う場合には、フローセルの変位に対して、このようなコンポーネントの許容誤差が厳しく要求されることがあり得る。封止される流体接続も有用であり、これら封止流体接続は迅速かつ正確に行うことができる。さらに、処理能力を向上するため、フローセルの固定及び位置決め、並びに流体接続の遂行を含めて、これら操作の大部分又はすべてを自動化又は半自動化することができる。
【０００５】
したがって、処理及び撮像機器におけるマイクロアレイを収容するための技術を改良していく必要性は継続して存在しており、とくに、信頼性の高いかつ効率的なフローセル設計、及びフローセルを処理機器内に固定するシステムの設計に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、このような必要性に応じるよう設計されたフローセル固定システム及び方法を開示する。本発明の第１態様によれば、マイクロアレイフローセルアセンブリの固定システムは、操作にあたりフローセルアセンブリを収容する支持体と、前記フローセルアセンブリの平面に直交するＺ-方向に前記フローセルアセンブリを前記支持体に向かう係合状態に引き込むよう作動可能な固定アームと、を備えることができる。このシステムは、さらに、前記Ｚ-方向に直交するＸ-方向の第1基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧するよう作動可能な第1駆動素子と、前記Ｚ-方向及び前記Ｘ-方向に直交するＹ-方向の第２基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧するよう作動可能な第２駆動素子と、を備える。作動システムは、単一の固定操作で、前記固定アームを作動させて前記フローセルアセンブリを前記支持体に向かうＺ-方向に引き込ませ、前記第１駆動素子を作動させて前記フローセルアセンブリを前記Ｘ-方向の前記第１基準位置に押圧し、また前記第２駆動素子を作動させて前記フローセルアセンブリを前記Ｙ-方向の前記第２基準位置に押圧することを行う。
【０００７】
さらにマイクロアレイフローセルアセンブリのための固定システムを開示し、この固定システムは、操作にあたりフローセルアセンブリを収容する支持体と、並びに単一操作により、前記フローセルアセンブリに係合して、前記フローセルアセンブリの平面に直交するＺ-方向に前記フローセルアセンブリを前記支持体に向けて押圧し、また前記Ｚ-方向に直交するＸ-方向の第1基準位置、並びに前記Ｚ-方向及び前記Ｘ-方向に直交するＹ-方向の第２基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧する、固定及び位置決めアセンブリとを備えることができる。
【０００８】
さらに、処理装置にフローセルアセンブリを固定する方法を開示し、この固定方法は、フローセルアセンブリを処理装置の支持体に配置するステップと、並びに
単一操作により、前記フローセルアセンブリに係合して、前記フローセルアセンブリの平面に直交するＺ-方向に前記フローセルアセンブリを前記支持体に向けて押圧し、また前記Ｚ-方向に直交するＸ-方向の第1基準位置、並びに前記Ｚ-方向及び前記Ｘ-方向に直交するＹ-方向の第２基準位置に前記フローセルアセンブリを押圧する、固定及び位置決めアセンブリを作動させるステップと、を備えることができる。
【０００９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様並びに利点は、以下の詳細な説明を添付図面に照らし合わせて読むときよりよく理解されるであろうし、図面全体にわたり同様の参照符号は同様の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明技術の態様を採用する、例えば、生物学的サンプル（生物試料）のための例示的マイクロアレイ処理システムの概略図である。
【図２】図１に示したタイプのシステムに設けることができる機能的コンポーネントの概略図である。
【図３】熟考したタイプにおける処理システムのための、フローセル内に装填される例示的マイクロアレイ、カートリッジ、及びステージの頂面から見た斜視図である。
【図４】例示的フローセル、及びフローセルをシステム内に固定し、かつフローセルを所望の基準位置に移動させるためのアセンブリの分解斜視図である。
【図５】例示的なカートリッジ及びフローセルを下側から見た平面図である。
【図６】システムの光学系下側におけるシステム内に装填した例示的カートリッジ及びフローセルの部分縦断面図である。
【図７】フローセルと「コモン」又は入力サイドのための例示的な固定アセンブリの斜視図であり、「クランプアーム上昇」位置にある若干の構造素子を示す。
【図８】フローセルと「コモン」又は入力サイドのための例示的な固定アセンブリの斜視図であり、「クランプアーム上昇」位置にある若干の構造素子を示す。
【図９】フローセルと「コモン」又は入力サイドのための例示的な固定アセンブリの斜視図であり、「クランプアーム上昇」位置にある若干の構造素子を示す。
【図１０】フローセルと「コモン」又は入力サイドのための例示的な固定アセンブリの斜視図であり、「クランプアーム上昇」位置にある若干の構造素子を示す。
【図１１】クランプアームが降下した状態におけるアセンブリの斜視図である。
【図１２】クランプアームが降下した状態におけるアセンブリの斜視図である。
【図１３】クランプアームが降下した状態におけるアセンブリの斜視図である。
【図１４】アセンブリの側面図である。
【図１５】アセンブリの側面図である。
【図１６】フローセルの反対側における例示的固定アセンブリの側面図である。
【図１７】フローセルの反対側における例示的固定アセンブリの側面図である。
【図１８】フローセルの反対側における例示的固定アセンブリの側面図である。
【図１９】アセンブリ内でのフローセル固定及び基準位置への移動の例示的操作を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図面に戻り、また先ず図１につき説明すると、マイクロアレイ処理システムを図解し、また参照符号１０で示す。このシステムは、シーケンシング機器のような他のコンポーネントとは別個であり得るサンプル準備システム１２を備えることができる。サンプル準備システム１２は、分子サンプル又は検体を解析のために準備することができる。図解のようにサンプル（試料）１６は、通常、人間、動物、微生物、植物、又は他のドナーのような個体又は被験者から採取する。勿論、このシステムは、有機物から採取したサンプル以外のサンプル、例えば、非有機的な分子、合成分子、等々を含めて、有機物から採取したサンプル以外のサンプルに使用することができる。サンプルは、ライブラリとして準備することができ、フローセル２０におけるアレイ１８に導入される。アレイは、解析のためにサンプルの分子が付着され増幅される既知の又は決定された場所に画定される部位を有する。流体媒体にサンプルを導入できるよう、並びに、例えば、撮像及び解析における多数の順次の操作が完了するまで周期的に実施することができる、分子のアレイ部位への付着、導入した分子のタグ付け、タグ付けされた分子の撮像、タグのブロッキング、フローセルの洗浄、及び任意な他の処理技術によって、サンプルを解析するのに使用される化学物質を導入できるよう、アレイはフローセルに位置決めされる。フローセル自体は、以下により詳細に説明するよう解析システム内に導入され、かつ所定位置に保持することができるカートリッジ内に維持される。
【００１２】
サンプルをフローセル及びフローセルのカートリッジ内に準備した後、図１に図式的に示したように、シークエンシング機器１４内に配置することができる。この機器は、ステージ及び関連したステージ制御回路２４を有することができる。ステージは、フローセル及びアレイを収納するカートリッジを収容及び固定することができ、また処理中に多軸方向にアレイを変位させるよう作用することができる。例えば、Ｚ軸（垂直方向に指向し得る）方向において、アレイは、例えば、合焦のため撮像光学系に対して接近及び離間する移動をすることができる（及び場合によっては、撮像システムの一部がこのＺ方向に移動することができる）。Ｚ軸に直交するＸＹ面と称することができる平面において、ステージはフローセルを移動させて、アレイを２方向に変位させ、アレイにおけるすべての関心対象エリアを撮像できるようにする（及び、場合によって光学系が代わりに又は付加的にこのＸＹ面に平行に移動することができる）。ステージは、小さいモータ、センサ、並びに他のアクチュエータ又は位置及び移動を検出でき、また制御回路がアレイの位置及び移動を所望通りに調節できるようにするフィードバックデバイスを有するものとすることができる。
【００１３】
機器は、さらに、撮像システム及び関連した制御回路２６を有することができる。撮像のために、又はより全般的にはアレイ部位における分子を検出するために多くの異なる技術を使用することができるとともに、ここに想定する実施形態は、蛍光タグを励起させる波長での共焦点撮像を使用することができる。タグ吸収スペクトルによって励起されるタグは、次にタグ放出スペクトルによって蛍光信号を返す。撮像システムは、このような信号を捕捉し、信号発生部位の解析を可能にする解像度でピクセル化した画像データを処理し、また結果として得られた画像データ（又はそこから派生したデータ）を処理及び保存するよう構成される。
【００１４】
機器は、さらに、流体システム及び関連した制御回路２８を有する。この流体システムは、アレイの部位に付着できる分子を含む特定流体を、周期的な処理及び解析中の適切な時点でフローセル内に導入させることができる。この目的のために、流体システムは、バルブ、並びにポンプ又は処理中に所望流体にアクセスし、かつ制御した様態でフローセル内に導入させる流体加圧若しくは移送コンポーネントを有することができる。流体システム又は他の並列システムは、さらに、加熱及び冷却の双方によってフォトセル内の温度を制御することができる。
【００１５】
図１におけるブロック３０は機器制御システムを示す。素子のこの集合体は、機器のサブシステム、すなわち、機器のステージ、撮像システム、流体システム、並びに加熱及び冷却するための、またシステムと他のコンポーネントとの間で局所的及び遠隔の双方においてインタフェースをとるための任意な他の補助システムにおける全体的又は監督的又は協調的な制御システムとして見なすことができる。概して、機器制御システム３０は、処理回路３２を有することができ、この処理回路３２は、１つ若しくはそれ以上の汎用目的又は特定用途のプロセッサ若しくはコンピュータを有することができる。メモリ回路３４を使用して、プログラム、設定、制御又は処理のパラメータ、並びに処理回路３２が実施する機器の装填、処理、撮像及び他のタスクを実行するのに望ましい任意な他の情報を記憶する。参照符号３６で示すインタフェース回路は、処理回路３２が他の制御回路を作動させるコマンドを生成しかつ発令できるようにするために、並びにカートリッジ及びフローセルの固定、アレイの移動、アレイの撮像、フローセルにおける流体通過を行う、等々を含めてセンサからのフィードバックを受け取るために必要な任意なインタフェース回路を含むことができる。このようなインタフェース回路は、さらに、オペレーターインタフェース３８を介してオペレーターがシステムと相互作用することを可能にでき、多くの場合、このオペレーターインタフェース３８は、所定設定、サンプル情報、検査情報、状態、エラー、等々を表示するためシステムに統合される。このインタフェース３８は、さらに、オペレーターによるコマンド入力を可能にし得る。
【００１６】
インタフェース回路３６は、さらに、参照符号４０で示すように、システムが外部又は遠隔のシステム及びメモリとのインタフェースを取ることができる。このような外部システムは、機器と同一区域内又は遠隔場所に存在し得る。さらに、多くの解析タスクは、サンプルの処理後に、また相当遅い時点で又は異なる場所であっても、実施することができる。外部メモリは、さらに、クラウドベースのデータ保存を含むことができる。保存したデータ及びその後の解析によれば、画像データを読み出す、サンプル内における分子の同定を行うよう画像データを処理する、分子の伸長した長さのシークエンシング及び編集するためのデータを保存かつ処理する、ゲノムシークエンシング（ゲノム配列決定）をする、等々を可能にすることができる。
【００１７】
図２は、幾分より詳細な機器としてのメモリ回路３４、並びに処理及びインタフェースコンポーネントを示す。上述したように、メモリ回路３４は、データ、設定、及びサンプル処理中に機器で実施されるルーティンを含む。メモリ回路は、任意な所望タイプの揮発性及び不揮発性双方のメモリを含むことができ、例えば、単に例として、プログラマブル・リード・オンリー・メモリ、フラッシュメモリ、ランダム・アクセス・メモリ、オンボード及びオフボード双方のメモリを含むことができる。メモリ回路は、機器設定及びプログラミングにアクセスするため、メモリ回路に保存したルーティンを実施するため、及び画像データ及び他の感知した信号を保存するため、１つ又はそれ以上のプロセッサ３２がアクセス可能である。
【００１８】
図２に示す実施形態において、若干の保存したルーティン又はプログラミングを示す。例えば、メモリ回路は、参照符号４２によって示すカートリッジ及びフローセルの装填（ローディング）及び固定プログラミングを保存する。このようなプログラミングは、カートリッジ及びフローセルを機器内に装填し、この装填は、ここに想定する実施形態では手動で行うが、若干の自動又は半自動装填も考えられる。概して、カートリッジ及びフローセルは、上述したようにサンプルをアレイ内に準備した後のものである。プロセッサは、プログラミングに基づいて、機器のコンポーネントに対してカートリッジ及びフローセルを装填位置に移動させ、所望のＸ及びＹ方向の基準位置に並進移動させ、カートリッジ及びフローセルを所定位置に固定し、真空装置のような関連のコンポーネントを作動させ、カートリッジ及びフローセルに整合する流体マニホールドのような流体コンポーネントの作動を開始させる、等々を行うよう命令することができる。これら処理技術は自動的又は半自動的に行うことができる。このような装填及び固定の詳細を以下に記載する。これとともに、真空チャック及び／又は他のステージ周りのコンポーネントは、カートリッジ及びフローセルのための支持体と見なすことができる。さらに、フローセルをカートリッジ内に装填した後には、本明細書においてこれらはともに「フローセルアセンブリ」と称することができる。
【００１９】
図２における参照符号４４はカートリッジ及びフローセル認識プログラミングを示す。若干の実施形態において、タグ、ラベリング（標識付け）、又は任意な他の所望表記をカートリッジ又はフローセルに設けることができ、機器が検出できる任意の有用な情報、例えば、実施すべき検査又は処理、サンプルの被験者、又は任意な他の関連データを識別できるようにする。プログラミング４４は、データ検出、データ処理、及び機器が実施する撮像及び／又は分子特性評価に関連した所望形式でのデータ保存を可能にする。
【００２０】
流体制御プログラミング４６は、バルブ、ポンプ、圧力及びフローセンサ、マニホールド制御素子、等々のような流体素子のシーケンシング（順序付け）を可能にする。概して、流体制御プログラミングは、カートリッジ及びフローセル固定プログラミングの要素と統合し、フォトセル及びカートリッジを所定位置に固定し、また封止接続を流体マニホールドに対して行った後、流体制御信号を発生できるようにする。
【００２１】
光学系制御プログラミング４８は、処理回路が光学系又はカートリッジ及びフローセルのいずれかを移動させてアレイ部位を撮像できるようにする。サンプルシークエンシング用途においては、例えば、適切な分子を部位に導入及び付着させた後に、流体制御プログラミングがフローセルのフラッシュ洗浄を可能にし、これに続いてフローセルを撮像システムによる撮像に望ましい位置に移動させる。特定サイクルで撮像が完了した後、フローセルを移動させる、光学系を移動させる、シークエンシングの順次の操作をするための流体及び成分を導入させる、等々を行わせる更なる命令を、すべての所望シークエンシングが完了するまで発令することができる。
【００２２】
上述したように、処理回路は、図２には示さないインタフェース回路とともに、システムが種々のアクチュエータ及びセンサを制御できるようにする。図２に図式的に示すように、インタフェース回路５０は、処理のため制御信号を発生し、またフィードバック信号を受信できる。制御信号は、例えば、参照符号５２で示すように種々のモータ及びバルブを制御するために発生することができる。位置センサ、フロー制御センサ、温度センサ、等々のようなセンサ５４からのフィードバック信号もインタフェース回路によって処理回路にフィードバックする。
【００２３】
図３は、処理システムにおける例示的なステージサブアセンブリを示し、このステージサブアセンブリに１つ又はそれ以上のフローセル保持マイクロアレイを解析のために装填することができる。ステージ５６は、全体システム内に組み付け、また上述した制御回路及び光学的コンポーネントとのインタフェースをとるよう設計される。ステージは、とくに、シークエンシング操作のための処理及び解析中に利用される流体ベースの化学物質の流入及び流出を行う流体ライン５８を収容する。１つ又はそれ以上のカートリッジ及びフローセルのアセンブリを収容する窪み６０をステージに設ける。図３に示す実施形態において、例えば、ステージは、それぞれに対応するフローセル６６及び６８を保持する２つのカートリッジ６２及び６４を収容するよう設計する。この構成は、時に「コモン」サイドと称される流入サイド７０と、時に引用「ポスト」サイドと称される反対サイド又は流出サイドとともに、フローセルを通過する流体フローの方向に指向すると考えられる。以下に詳細に説明するように、各カートリッジは、それぞれに対応するフローセルを保持し、また固定アセンブリは、カートリッジ及びフローセルをシステムにおける所定位置に保持し、かつフローセルを処理のための基準位置に移動するようコモンサイド及びポストサイドに設ける。図３に示す実施形態において、この目的のために、クランプ切欠き７４及び７６を各カートリッジの両側サイドに設ける。さらに、Ｘ方向位置決め切欠き７８及び８０を各カートリッジの側面に設ける。クランプアーム８２及び８４は、カートリッジをステージに装填した後、クランプ切欠きに貫入するクランプ位置に移動して、以下に説明するように、カートリッジ及びフローセルを所定位置に保持する。図示の実施形態において、切欠き７８及び８０は、これら切欠き内に突入するピンが、アセンブリを作動させるときカートリッジ及びフローセルを幾分緩く位置決めするとともに、Ｘ方向に移動してカートリッジ及びフローセルを所望のＸ方向基準位置に移動させる寸法にすることに留意されたい。
【００２４】
本明細書においてＸ-、Ｙ-及びＺ-方向又は軸に関しては座標系の方向に言及するものであることに留意されたい。このデカルト座標系において、Ｘ-及びＹ-方向はフローセルの長さ及び幅に整列し、かつ互いに直交する（垂直である）。それらはともにフローセルの平面に対応するＸ-Ｙ平面、又はフローセルの平面に平行な平面を画定する。Ｚ-方向はＸ-及びＹ-方向に対して直交する（垂直である）。多くの実施形態において、撮像光学系は、フローセルの異なる部分の撮像を可能にするようＸ-及びＹ-方向に移動可能であり（又はフローセルがＸ-及びＹ-方向に沿って移動可能であり得る、又は撮像コンポーネント及びフローセルの双方がＸ-及びＹ-方向に沿って移動可能であり得る）、また撮像光学系をフローセルの部位に対して合焦できるよう撮像光学系若しくはフローセル、又はその双方がＺ-方向に移動可能であり得る。
【００２５】
図４は、説明目的のためアセンブリ全体から取り外しかつ分解したステージのコンポーネントを示す。上述したように、カートリッジ６２は、それぞれに対応するフローセル６６を保持する。カートリッジに備え付けた後、カートリッジ及びフローセルは、フローセルを直接取り扱う必要なく操作できるアセンブリとして作用する。図示のカートリッジは、側辺８６及び８８、並びに端部９０及び９２からなるフレーム状構体を有する。クランプ切欠き７４及び７６は、図示のように端部に形成する。Ｘ位置決め切欠き７８は、この実施形態において、側辺８８に形成し、またフォトセルがＸ-方向の所望基準位置に移動する前にフォセルを緩く位置決めするピンを収容する。この図においてフローセルに形成した流路９４が見えており、この流路９４は、処理中に流体化学物質のマイクロアレイにわたる流動を可能にする。タブ又はレッグ９６がカートリッジから突出して、システム内での操作を可能にし、また支持体におけるカートリッジの位置決めを支援する。
【００２６】
カートリッジ及びフローセルの下側位置に真空チャック９８を設ける。真空チャックによれば、フローセルがシステム内にあるとき、フローセルを真空チャックの表面に緊密に係合するよう引き込む負圧を供給することができる。この結果として生ずる力は、フローセルを所定位置に保持する、また処理及び撮像のためより平坦な又はより平面状の表面を維持するよう支援する。
【００２７】
コモンサイド固定アセンブリ１００をカートリッジ及びフローセルの流入サイドに設けるとともに、ポストサイド固定アセンブリ１０２を反対側端部に設ける。さらに、図４には、コモンサイドアセンブリに設けたＹ-位置決めピン１０４が見えている。このピン又は任意な他の適当なＹ-位置決め形体は、アセンブリにおける他の場所に、又は反対側サイド若しくは他の側辺に設けることができる。このピンは、以下に詳述するように、カートリッジ及びフローセルをＹ基準位置に移動させるのを容易にする。さらに、マニホールド１０６及び１０８をそれぞれ固定アセンブリに設け、カートリッジ及びフローセルに係合して流体化学物質の封止流体接続を行うようにする。最後に、図４に示すように、１つ又はそれ以上の電力及び通信接続部１１０は、これらサブアセンブリ間（及び図示しない回路）に設け、カートリッジ及びフローセルを固定及び整合させるための所望シーケンスでアクチュエータに給電する、及びサブアセンブリに関連するセンサからのフィードバックを供給することを可能にし得る。
【００２８】
図５は処理のために装填した例示的なカートリッジ及びフローセルの底面側を示す。フローセル６６はカートリッジ６２が形成するフレーム内に配置する。Ｘ-方向位置決め切欠き７８がフローセルに隣接する位置に見てとれる。さらに、クランプ切欠き７４及び７６がフローセルの各端部で見てとれる。フローセルの底面１１２は、カートリッジ及びフローセルをシステム内に装填するとき、上述したように真空チャックに対面し、またこの底面に対する力がフローセルを下方に引き込み、フローセルの係合及び平面性を向上させる。ガスケット１１４及び１１６は、上述したようにマニホールドの上側面を収容するようフローセルに配置し、このマニホールドは、固定アセンブリによってフローセルに係合するよう移動させられる。図示の実施形態において、ガスケットは、成形できるエラストマー材料で形成され、またフローセルの端部に形成した窪み内に挿入される。有利には、これらガスケットは、多重流体流路用に設けることができ、また互いに同一にし、システムにおける部品点数を減らすようにすることができる。
【００２９】
図６は、一実施例における、処理中のカートリッジ及びフローセルとシステムとの間の全体的な関係を示す。カートリッジ２２はシステム内に配置され、また光学系１１８が降下され、光学系の下面１２０がフローセルの上面近傍内の所定位置に延在する。幾つかの実施形態において、光学系は、少なくともＺ-方向（図示の実施形態においては垂直軸であるが、他の実施形態においては、Ｘ-Ｙ-Ｚ座標系は回転又は傾斜することができる）には静止状態をとることができ、またカートリッジ及びフローセルは撮像のために必要に応じて移動する。同様に、光学系及び／又はステージが、撮像のためマイクロアレイを走査するようＸ-及びＹ-方向に移動することができる。図６において固定及びマニホールドシステム全体を参照符号１２２で示す。全体的に、このシステムは、ステージ、ステージのための制御機器、固定アセンブリ、真空チャック、マニホールド及び流体コンポーネント、等々を包含すると見なすことができる。さらに、このシステムは、フローセルの温度を制御する、温度を感知するような付加的コンポーネント及びシステム、並びにバルブ、導管、ポンプ、等々を含むことができる。
【００３０】
固定アセンブリの構造に戻って説明すると、有利には、コモンサイド及びポストサイドにおけるコンポーネントの多くは同一構造にし、システム全体における異なる部品点数を一層減少する。双方の固定アセンブリは、カートリッジ及びフローセルを受け入れる装填又は開放位置に移動するよう設計し、またカートリッジ及びフローセルをＸ-及びＹ-基準位置に移動させ、また処理位置にフローセルを確実にクランプする動作のプログラム化及び自動化シーケンスを担うよう作動することができる。さらに、アセンブリが実施する動作シーケンスは、さらに、処理中に使用される流体のために自動封止接続を可能にする。
【００３１】
図７、８、９及び１０は、コモンサイド固定アセンブリ１００の例示的なコンポーネント及び構造を示すが、これらの多くは、以下に詳述するように、ポストサイドでも同一とすることができる。図示の実施形態において、アセンブリは、位置決め及び係合動作を行う可動コンポーネントを保持する１つ又はそれ以上の構造素子で製作することができるフレームワーク、ハウジング、又は本体を備える。この図解において、若干のカバー、ハウジング、等々は説明目的のため取り外してある。図７及び８で分かるように、例えば、アセンブリはクランプシャフト１２４を有し、このクランプシャフト１２４は、横方向に延在し、またクランプアーム８２を支持する。これらクランプアームは、クランプシャフトにおけるハブと一体化し、摺動係合状態でシャフトに沿って側方に移動することができる。さらに、レバーアーム１２６をクランプアームに一体化して、以下に詳述するようにクランプアームをフローセルに係合するよう押圧させる。ばね１２８（図８参照）をクランプシャフト１２４の一方の端部に設け、クランプアームを一方の側（図７及び８において右下側）に摺動するよう押圧する。このばねは、強制的に反対側（図７で見て右側クランプアーム）における静止螺旋状カム１３０と整合螺旋状カムフォロワ１３２との間を係合させる。１対の係合面１３４をクランプアーム相互間に設け、若干の回転自由度を許容するとともに、係合中には２つのクランプアームが一緒に回転することができるようにする。ばね１３６は、レバーアーム１２６固定し、また以下に詳述するように、クランプアームを係合状態に引っ張り込む力をレバーアームに加えるよう延在することができる。
【００３２】
図７及び８に示す開放位置から、アセンブリが作動するとき、クランプアーム８２は、クランプシャフト１２４の周りに回転することができ、またクランプシャフトに沿って図７に矢印１３８で示すように摺動することができる。すなわち、レバー１２６が下方に移行し、またクランプシャフトが回転してアームを降下させるとき、螺旋状カム１３０に対する螺旋状カムフォロワ１３２の係合により、ばね１２８の力が２つのアームを下方及び側方に摺動させることができる。この運動は、ひいてはカートリッジ及びフローセルをＸ-方向の基準位置に向けて押圧する。この作動の詳細を以下に追加記載する。
【００３３】
これら図においては、マニホールド１０６内に嵌合するばね１４０も見える。これらばねはマニホールドをフローセルに係合するよう上方に押圧する。切欠き及び爪係合を内部に設け、この切欠き及びつめ係合は、カートリッジ及びフローセルを固定アセンブリの開放位置で離脱させるとき、ばね１４０の力とは反対方向の下方にマニホールドを引っ張るようマニホールドを捕捉する。この爪は、図９及び１２で見えており、「Ｐ」で表記付けする。
【００３４】
図７、８につき、また付加的に図９及び１０を見て説明すると、作動構体は、さらに、カムシャフト１４２を有し、このカムシャフト１４２には、カムシャフトとともに回転する１対のカム１４４及び１４６を備え付ける。動作中にカムシャフトが回転するとき、カムの回転によってカムフォロワ１４８は移動する。単独の電動モータ１５０は、カムシャフト１４２、並びにカム１４４及び１４６を含めてアセンブリのコンポーネントすべての運動を駆動する回転出力を供給する。モータ出力軸は駆動ギア１５２を担持し、この駆動ギア１５２は、出力ギア１５４に噛合しかつ出力ギア１５４を駆動する。この出力ギアは、次にばねクランク１５６を回転させ、このばねクランク１５６は、ばねクランクのシャフト１５８に備え付ける。以下に詳述するように、ばねクランク１５６は、上述したレバーアーム１２６の反対側の端部に連結したばね１３６に結合する。
【００３５】
図示の実施形態において、アセンブリは３つの位置間を移動するよう設計し、そのうち１つの位置は図７、８、９及び１０に示す開放位置である。この位置では、カートリッジ及びフローセルを装填することができる。上述したように、装填時には、クランプアームはカートリッジにおけるそれぞれに対応する切欠きから上方に突出する。クランプ及びＸ-方向移動のための機構は、コモンサイド及びポストサイドの双方においてほぼ同一であり、したがって、各機構は類似の主モータ、ギア列、及び移動コンポーネントを有する。カートリッジ及びフローセルを装填した後、両側双方の主モータが付勢され、それぞれに対応するクランプアームを、カートリッジ及びフローセル上方に留まるが、どちらの上面には接触しない「ホバー」位置に移動する。次に、フローセルは適切に位置決めされ、また機構は、カートリッジ及びフローセルがクランプアームの一層の下方移動によってクランプされ、マニホールドの上方押圧偏移の運動を可能にすることによって流体接続が遂行される第３位置にさらに移動する。
【００３６】
図１１〜１５は、コモンサイド固定アセンブリのための機構であって、クランプアーム及び他のコンポーネントがホバー位置及びクランプ位置に向けて移動した状態を示す。図１１に示すように、例えば、モータ１５０は、ギア１５２を担持する出力シャフト１６０を有する。このギアは、出力シャフト１５８に備え付けた出力ギア１５４に噛合する。図１１においてマニホールドの上側面にガスケット接触面１６２が見えており、フローセルがシステム内に完全に固定されかつ係合されるとき、このガスケット接触面は上述したガスケットと接触し、マニホールドとフローセルとの間で封止された流体接続を生ずることに留意されたい。さらに、マニホールドのための押圧偏移ばね１４０を備え付ける支柱１６４が見える。これら支柱によれば、マニホールドを担持し、かつアセンブリ内でのマニホールド整列を維持することができる。
【００３７】
図示の実施形態においてマニホールドが採用されるとき、マニホールドに関して幾つかのポイントに留意されたい。先ず、マニホールドは係合位置に向けて押圧偏移されるよう備え付け、また固定アセンブリの機構の運動によって移動される爪Ｐによって係合位置から下方に引き下げられることに留意されたい。各マニホールドにおける幾分オーバーサイズで細長い開口に挿入される支柱に対して備え付けられていることによって、マニホールドは緩く案内され、かつ「浮遊する（float）」。さらに、マニホールドを包囲するハウジング構体は、同様に、マニホールド周りに緊密過ぎる嵌合をしないようオーバーサイズにし、フローセルのガスケットに係合するとき自由な移動及び自己整列を行うことができるようにする。さらに、マニホールドは、クリーニング又は交換のために構体から容易に取り外すことができる。この取外しのため、ハウジングとマニホールドの背部との間に薄いツールを挿入し、爪を押し下げ、爪を対応する切欠きから外れさせ、マニホールドが支柱から上昇できるようにする（この後、完全に取外し及び／又は交換すべき場合には流体ラインはマニホールドから容易に取り外すことができる）。
【００３８】
さらに、図示の実施形態において、各マニホールドは、封止位置に係合するときフローセルを有する構成によって一層整列する。この整列のため、各マニホールドの頂面における案内開口「ｇ」（図７参照）に係合するピン「ｐ」（図５参照）をカートリッジに設ける。このことは、マニホールドがガスケットに対して適切に整列する支援を行う。
【００３９】
図１２、１３、１４及び１５は、アセンブリにおける主要コンポーネントの運動をもたらすギア列を示す。図示の実施形態において、このギア列は、出力ギア１５４と同一のシャフト１５８ではあるが反対側に取り付けるクランク出力ギア１６６を有する。この場合、上述したモータによる駆動による出力ギア１５４の回転がクランク出力ギア１６６を回転させる。クランク出力ギア１６６はアイドル（遊び）ギアＩを駆動し、このアイドルギアは、「ホームセンサ」又は「フラグ」ギア１６８に噛合かつ駆動する。このギア１６８は、次にカムシャフト１４２に備え付けかつこれを回転させるカムギア１７０に噛合かつ駆動する。最後に、ホームセンサギア１６８は、さらに、クランプシャフト１２４に備え付けかつ一緒に回転するクランプアームギア１７２に噛合かつ駆動する。
【００４０】
モータを作動させることによって、このギア列が多数の移動を実施するよう運動させられる。これら移動としては、フローセルをＸ-方向基準位置に移動させるための、ばね１２８並びに螺旋状カム１３０及びカムフォロワ１３２の作用の下でシャフトに沿うクランプアームの側方摺動、クランプシャフト１２４によるクランプアームの「ホバー」位置（及びその後のフローセル、カートリッジ又はその双方と接触するクランプ位置）への移動、及び（レバーアーム１２６に力を加えるばね１３６の伸張による）ばねクランク１５６のシャフト１５８上での移動がある。同一の動作はカートリッジ及びフローセルの両側サイドで行われる点に留意されたい。
【００４１】
さらに、アセンブリは可動素子の位置をフィードバックするためのセンサを備えることにも留意されたい。図示の実施形態において、このセンサとしては「ホームポジション」センサ１７４（光センサのような）があり、このセンサは、「ホームセンサ」又は「フラグ」ギア１６８の位置又は向きを検出する（例えば、このギアに形成される端縁を検出することによって）。このフィードバックによれば、制御回路が機構は初期又は「ホーム」位置にあることを確認でき、この「ホーム」位置から「ホバー」又は「クランプ」位置への移動が行われる。
【００４２】
さらに、図示の実施形態において、クランプシャフト１４２は、このクランプシャフト１４２とともに回転するフォロワ１７６（図１３参照）を担持する。これらフォロワは、クランプアームのハブに形成した切欠き内に存在し、アームが開放位置に復帰する移動を支援する。
【００４３】
さらに、上述したように、図示の実施形態において、マニホールドは、ばね１４０によって上方の封止係合位置に向けて押圧偏移される。マニホールドの内側に爪が係合する切欠きが形成され、この爪は、上述した一方のカムフォロワによって上方及び下方に移動させられる。したがって、マニホールドは、係合プロセスにおける適切な時点で上方に移動することができ、また機構の逆動作によって下方への離脱移動をすることができる。
【００４４】
上述したように、ポストサイド固定アセンブリ１０２の機構はコモンサイド固定アセンブリ１００のものと同一であるが、図示の実施形態において、ポストサイドのアセンブリには、カートリッジ及びフローセルをＹ-方向基準位置に押圧する機構も設ける。したがって、図１６、１７及び１８により詳細に示すアセンブリ１０２はＹ-方向プッシャー１７８を有し、このＹ-方向プッシャー１７８は、内側のばね１８０（例えば、図１８参照）によって後退位置に押圧偏移される。このアセンブリにおける第２モータ１８２は、ばねの力に抗してプッシャー１７８を図１７の左方に向けて押圧し、Ｙ-方向位置決めピン１０４（図４参照）を移動させてカートリッジに接触させ、またカートリッジをＹ-方向の基準位置に移動させる。したがって、このモータは、図１８に参照符号１８４で示すように、プッシャー及びピンをＹ-方向に移動させることができる。
【００４５】
アセンブリ及びそれらの構成部分の運動は予め設定したルーティンを追従し、このルーティンは先に概要を説明したカートリッジ及びフローセルを適切に位置決め及び固定するための複数移動及び係合のすべてを行うことができる。これらは上述した制御回路によって指令され、また相互に開始される複数プロセスの開始に基づくものであり、これらプロセスは部分的又は完全に自動化され、また例えば、上述した「ホームポジション」センサからのフィードバックに基づくものであり得る。本明細書に想定した実施形態において、係合及び位置決め操作は、係合及び固定プロセスが開始された後には完全に自動化される。
【００４６】
図１９は、上述したアセンブリに対するカートリッジ及びフローセルの係合及び固定を実施する例示的制御論理２００を示す。上述したように組み合わせたカートリッジ及びフローセルを先ずシステムに備え付け、このステップを参照符号２０２で示す。次に、固定システムを作動させて自動プロセスを開始する（ステップ２０４）。この後、デバイスの両側サイドにおける主モータを作動させて、ギア列を動かし、またこれによって、クランプアームを「ホバー」位置に移動する（ステップ２０６）。このことは、さらに、対応する押圧偏移ばねの伸張を伴うばねクランクの運動、並びに支持シャフトに沿うクランプアームの摺動を生ずる。次に、ステップ２０８において、カートリッジに係合し、またＸ-方向の基準位置に移動する。図示の実施形態において、これら直近で述べた２つの操作は、クランプアーム及び螺旋状カムの機械的構成によって同時に行われる。この後、ステップ２１０においてポストサイドの第２モータが作動して、Ｙ-方向ピンをカートリッジに係合させ、カートリッジ及びフローセルをＹ-方向基準位置に移動させる。カートリッジ及びフローセルを適切に位置決めした状態で、ステップ２１２において真空チャックを作動させ、上述したようにフローセルの下側面に抑制保持力を発揮させる。この後、双方のアセンブリにおける主モータをさらに作動させ、クランプアームをクランプ位置に移動させ、このクランプ位置でクランプアームはフローセル、カートリッジ又はその双方に接触し、クランプ及び抑制保持力を発揮させる。この動きは、さらに、マニホールドを押圧偏移係合位置へと釈放させ、フローセルに対する所望の封止流体接続状態にする。アセンブリは、フローセルの処理全体にわたりこの指向性を維持する。カートリッジ及びフローセルを釈放するためには、このプロセス全体を逆に行うことができ、これにより、カートリッジ及びフローセルはシステムから取り外すことができる。
【００４７】
フローセルの固定、フローセルのＸ-方向基準位置への位置決め、フローセルのＹ-方向基準位置への位置決め、及びフローセルの封止流体接続状態への係合は、単一の自動化固定操作で実施されることに留意されたい。すなわち、係合、位置決め、及び固定操作が開始された後、操作はそれ以上の介入を必要としない自動操作で行われる。図示の実施形態において、このことは、３つのモータ、すなわち、「ホバー」位置及びクランプ位置への移動のための、またマニホールド釈放のためのコモンサイド及びポストサイドにおける２つの主モータ、並びにフローセルをＹ-方向基準位置に移動させるための第３モータの係合又は付勢によって行われる。これら操作の幾つかの順番は変更することができ、若干の構体も、上述した単一操作手法から逸脱することなく変更することができる。
【００４８】
さらに、図示の実施形態において、固定、位置決め、及び流体接続の最終的な係合は、ばねによって安定した押圧偏移状態にされる。実際、構体は、上述した３つすべての位置、すなわち、開放、ホバー、及びクランプ位置で安定化した状態となる。このことは、シークエンシング中にモータは付勢又はアクティブ状態にする必要がない限り、モータが誘発するおそれのある振動に起因する移動又は動揺の機会を減少する上で特に有利である。
【００４９】
上述したアセンブリのコンポーネントは、任意の適当な材料で形成することができ、機械的部品（軸受及びばねのような素子以外）の多くは、その最終形態にまで成形する及び／又は成形かつ機械加工することができる。しかし、若干の材料は、所定コンポーネントに形成するのが望ましい。例えば、摩擦を減少するためには、幾つかの部品は、減摩材料で形成又はコーティングすることができる。図示の実施形態において、例えば、クランプシャフト及び螺旋状カムは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）コーティングのようなポリマーでコーティングすることができる。同一の実施形態において、クランプ自体はＰＴＦＥに含侵させた硬質陽極酸化材料で形成することができ、これによりシャフト（とくに、クランプ部品におけるボア）に沿う変位を容易にする。硬質陽極酸化材料は、例えば、金属、セラミック、又はそれらの複合材とすることができる。さらに、ハウジング部品のうち少なくとも幾つかは、構体を幾分断熱する材料、例えば、ポリエーテル・エーテル・ケトン（ＰＥＥＫ）のようなポリマーで形成することができる。この実施形態において、真空チャックは加熱及び冷却してフローセルの温度を制御するため、このような材料の使用は、フローセル温度調節に対する確実な構体効果を簡略化する。
【００５０】
当然のことながら、上述した概念のすべての組合せ（このような概念が相互に一致しないと仮定して）は、本明細書記載の発明要旨の一部であると考えられる。とくに、特許請求の範囲で記載される要旨のすべての組合せは、本明細書記載の発明要旨の一部であると考えられる。さらに、当然のことながら、参照によって本明細書に組み入れられる任意な文献にも見られる本明細書に明確に使用される用語は、本明細書記載の特別な概念に最も一致する意味にふさわしいものであるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019536000.tif 000017
【図１６】
2019536000.tif 000018
【図１７】
2019536000.tif 000019
【図１８】
2019536000.tif 000020
【図１９】
2019536000.tif 000021
【国際調査報告】
2019536000.tif 000022