(57)【要約】  発明の実施形態は、大きくは、分析対象の検出と、サンプル成分の採集、分離および分析対象の検出を容易にする製品に向けられている。関心のある分析対象について、体液サンプルの、迅速で、容易で、正確で、効率的なテストを可能にする多層デバイスと、成分を採集し、分離し、かつ多層デバイスを用いてテストを行う方法とが、発明の様々な実施形態において記述されている。【選択図】図１
2019512093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層デバイスであって、
ａ）疎水膜に隣接する濾過膜部を備える表部と、
ｂ）採集材と裏カバーを備える裏部と
を備え、前記表部は、前記裏部に隣接してそれに接続されており、前記濾過膜部は、少なくとも一つの濾過膜を備え、前記濾過膜部は、表面及び裏面を有しており、かつ前記疎水膜は、表面及び裏面を有しており、前記濾過膜部の前記裏面は、前記疎水膜の前記表面に隣接しており、前記採集材は、表面及び裏面を有しており、前記疎水膜の前記裏面は、前記採集材の前記表面に隣接しており、かつ前記採集材の前記裏面は、前記裏カバーに隣接している
多層デバイス。
【請求項２】
多層デバイスであって、
ａ）少なくとも一つの切り抜きがある表カバーの層と、濾過膜部の層と、少なくとも一つの切り抜きがある疎水膜の層とを備える表部と、
ｂ）採集材の層と切り抜きのない裏カバーの層とを備える裏部と
を備え、前記表部は、前記裏部に隣接してそれに接続されており、前記濾過膜部は、各々が前記切り抜きの形を有し、細孔のサイズが減少していく濾過膜を２枚備え、前記濾過膜部は、前記表カバーの前記切り抜き内に位置して前記疎水膜に隣接しており、前記疎水膜は、前記濾過膜部と前記採集材との間に挟まれており、前記採集材は、前記疎水膜に隣接しており、かつ、前記採集材は、前記裏カバーより上にある
多層デバイス。
【請求項３】
前記製品は、縁が４つある長方形の形を有している、請求項２に記載の多層デバイス。
【請求項４】
表部の各層と裏部の各層とが、前記長方形の少なくとも一つの縁で結合している、請求項３に記載の多層デバイス。
【請求項５】
表部の各層と裏部の各層とが、取り外し可能である、請求項４に記載の多層デバイス。
【請求項６】
前記採集材の下で、前記裏カバーの上に位置する接触支持層をさらに備える、請求項２に記載の多層デバイス。
【請求項７】
前記接触支持層は、切り抜き内に位置して前記採集材と接触する少なくとも一つの盛り上がった支持体を備える、請求項６に記載の多層デバイス。
【請求項８】
引き続いての分析のための層に取り付けられるウィンドウを備えるウィンドウ支持体をさらに備える、請求項２に記載の多層デバイス。
【請求項９】
前記ウィンドウ支持体は、オンライン検査可能である、請求項８に記載の多層デバイス。
【請求項１０】
引き続いての分析のための前記層は、濾過膜部または採集材である、請求項８に記載の多層デバイス。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの切り抜きは、１つ乃至４つの切り抜きである、請求項２に記載の多層デバイス。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の多層デバイスを用いる方法であって、
ａ）前記多層デバイスの前記濾過膜部にある量の体液サンプルを充当し、
ｂ）前記表部を前記裏部に接触させて約３分間待機し、
ｃ）前記濾過膜部と前記採集材とを前記多層デバイスから分離し、
ｄ）前記濾過膜部および／または前記採集材を乾燥させながら約３０分間待機し、
ｅ）前記濾過膜部および／または前記採集材を分析する
ステップを備える方法。
【請求項１３】
前記量が、約１０マイクロリットルから約１００マイクロリットルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記濾過膜部が、オンライン検出可能ウィンドウ支持体と結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記採集材が、オンライン検出可能ウィンドウ支持体と結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の多層デバイスを用いる方法であって、
ａ）前記多層デバイスの前記濾過膜部にある量の体液サンプルを充当し、
ｂ）前記表部を前記裏部に接触させて約３分間待機し、
ｃ）前記多層デバイスを保管する
ステップを備える方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
ｄ）前記濾過膜部と前記採集材とを前記多層デバイスから分離し、
ｅ）前記濾過膜部および／または前記採集材を分析する
ステップをさらに備える方法。
【請求項１８】
３Ｄプリントによる多層デバイスであって、
（ａ）穴が４つある表カバーの層と、濾過膜部の層と、穴が４つある疎水膜の層とを備える表部と、
（ｂ）採集材の層と、ウィンドウ支持体の層と、盛り上がった接触支持体を有する裏カバーの層とを備える裏部と
を備え、
前記表部は、前記裏部に接続して多層デバイスの中間の層を挟んでおり、前記濾過膜部は、濾過膜ディスクを２枚備えており、前記濾過膜部は、上部濾過膜ディスクと下部濾過膜ディスクを備えており、各濾過膜ディスクには、表面と裏面とがあり、前記上部濾過膜ディスクの前記裏面は、前記下部濾過膜ディスクの前記表面に隣接しており、前記濾過膜部は、前記表カバーの４つの穴の各々の周囲内に中心を同じくして位置しており、かつ前記濾過膜部は、前記疎水膜の４つの穴の各々の周囲内に中心を同じくして位置しており、前記疎水膜は、前記表カバーに隣接しており、かつ前記疎水膜は、前記採集材に隣接しており、前記採集材は、前記ウィンドウ支持体に固定されており、前記ウィンドウ支持体は、ウィンドウを有していて、前記穴および前記採集材は、前記ウィンドウの上に位置しており、かつ前記ウィンドウから露呈する前記採集材は、前記裏カバーの前記盛り上がった接触支持体に隣接している
多層デバイス。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記多層デバイスを用いる方法であって、
ａ）前記多層デバイスの前記濾過膜部にある量の全血を充当し、
ｂ）前記全血の血液成分を分離するのに十分な時間だけ待機し、
ｃ）前記多層デバイスを保管する
ステップを備える方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
ｄ）前記濾過膜部と前記採集材とを前記多層デバイスから分離し、
ｅ）前記濾過膜部と前記採集材とを分析する
ステップをさらに備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の援用］
この国際ＰＣＴ出願は、２０１６年２月２４日に出願された「オピオイド（アヘン様物質）オンライン自動測定用乾燥血漿斑カード」という名称の米国仮特許出願第６２／２９９２２６号に基づく優先権を主張するもので、その仮出願はその全体を参照することによってここに組み入れられる。
【０００２】
［技術分野］
この発明は、一般には、分析対象を検出する液体サンプル成分の分離に関する。より詳しくは、本発明の観点は、赤血球、白血球、血小板および血漿を含むがそれらには限定されない全血の様々な成分を分離する、手軽で正確なデバイス、血液成分の分離のための多層デバイスまたは多層分離デバイスの使用およびそのようなデバイスを用いて、特に、細胞表面や細胞内外の体液における様々な血液成分における分析対象、例えば、必ずしもそれらに限定されるものではないが、化合物、薬物および代謝産物、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、蛋白質、細胞表面および細胞内のマーカー、病原体、バクテリア、ウイルス、微生物その他、を検出する方法に向けられている。
【背景技術】
【０００３】
スポーツの大会によって、あらゆる年齢および国籍の人々が一体化されている。スポーツの強力なプラスの影響力を擁護するには、試合やアスリートが誠実であることを保証しなければならない。その誠実さを維持するために、アスリートが違法に能力向上用の薬物を用いていないと一般の人々が確信できるよう、テスト体制を進化させなければならない。競技アスリートのためのテストに加えて、採用前または現在の従業員、囚人または仮釈放者、軍関係者に対して、また、車両、航空機および船舶事故後や、科学捜査分析において、化学物質のテストがしばしば行われる。例えば、先天性の代謝病がないか新生児を検査するのに乾燥血液斑技術が用いられている。指腹やかかとでの採血によって、量を最小にし、運搬を容易にし、サンプルの安定性を得るのに都合の良いサンプリングが行えるが、なおもいくつかの障害がある。
【０００４】
入手可能な製品やテスト方法には、サンプルの採集や処理、サンプルの収量、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）の互換性および分光光度検出における制限に関して多くの課題がある。採集後の分析の一つの課題は、採集したサンプルの処理に限界があることで、それは、手作業で乾燥血液斑を取り除き、乾燥血液斑の小さな部分（約３ミリメートル乃至６ミリメートル）を打ち抜き、その、より小さなサンプルを溶媒に溶出して標準的な分析をするという手作業による操作および穴の打ち抜きからの検出に関係している。このプロセスは自動化されていない。
【０００５】
乾燥血漿斑（ＤＰＳ）カードは、現在２つあって、ノヴィリティック有限会社から商業的に入手可能なＮＯＶＩＰＬＥＸ（登録商標）カード（キムＪ．Ｈ．他、分析化学２０１３、８５、１１５０１−１１５０８）および、スタームらが以前報告した「自動ＤＰＳカード」（バイオアナリシス２０１５、７、１９８７−２００２）である。採集材またはセルロース紙である血漿採集物質の機能性が、様々な乾燥斑カード間の大きな違いとなる。自動ＤＰＳカードにはワックス境界がある。自動ＤＰＳカードのワックス境界では、濾過された血漿の余分なものが境界内に保持され、その結果、ヘマトクリットの低端および高端で不正確な偏りが生じる。低ヘマトクリットレベルでは、より多くの血漿が利用可能でワックス境界領域内に保持されているが、高ヘマトクリットレベルでは、より少ない血漿しか保持されていない。ＮＯＶＩＰＬＥＸカードの境界は、自動ＤＰＳカードのところで記述されたワックス境界とは異なる。ＮＯＶＩＰＬＥＸカードには、一旦飽和したディスクがあって、濾過された血漿の余分なものは、自由にディスクの外側にまたはディスクを超えて流れる。この作用は、余分な血漿が境界内に捕らえられる自動ＤＰＳカードとは異なっている。一般に、これらの２つのカードは、各々、血漿からＲＢＣを分離するためにカード上の皮膜濾過技法を用いているので、それらの設計は概念的に類似している。しかしながら、カードの構造と各カードのフォーマットにおける血漿の分離法が異なっていて、各々それ独自に不利な点がある。前述の通り、自動ＤＰＳカードは正確でも効率的でもない。自動ＤＰＳカードは、伝えられるところでは、アドビオン社（米国ニューヨーク州イサカ）による液体抽出表面分析（ＬＥＳＡ）（登録商標）ステージとしても知られるサンプル支持デバイスを用いている。ＮＯＶＩＰＬＥＸカードは、血漿斑を生成するのに外部デバイスを必要としないが、自動分析とは互換性がない。その結果、サンプルを取り扱うプロセスが長たらしく、サンプルを含む、小さな、２ｍｍのフィルターディスクを取り除くのにピンセットが必要であるし、さらなるサンプル抽出プロセスのために手作業でそのディスクを移送している。自動ＤＰＳによる血漿の収量は測定されていないが、ＮＯＶＩＰＬＥＸカードでは、約２．５μＬの血漿を分離するのに最低でも２５μＬの血液を必要とする（キムＪ．Ｈ．他、分析化学２０１３、８５、１１５０１−１１５０８）。残念ながら、血漿の収量は低く、すなわち、血液１μＬあたり血漿０．１００μＬである。ＮＯＶＩＰＬＥＸカードからの血漿の収量は、約２．５μＬであり、これは、ほとんどの分析で不十分である。血漿が低量であるのは、最初の血液サンプルが低量であるためではなく、むしろ、血漿採集物質の能力に限界があるためである。スケールを大きくすることはできない。
【０００６】
したがって、サンプルの成分を分離し分析対象を検出する、手軽で、正確で、効率がよく、迅速なシステム、例えば、これらに制限はされないが手動または自動のシステムが必要とされている。より詳しくは、サンプル採集プロセスが簡素化され、コストが低減され、出荷や保存が簡素化された、製品や技法が必要であり、それが克服するのは、全血の成分を分離するのに遠心分離が必要であること（スターム他、バイオアナリシス２０１５、７、１９８７−２００２（「スターム」）、キム他、分析化学２０１３、８５、１１５０１−１１５０８（「キム」）、リ他、急速伝達質量分析２０１２、２６、１２０８−１２１２（「リ」））、現在テストを行うために利用可能なヘマトクリット範囲が狭く、すなわち、Ｈｃｔが４０−５５％（スターム）であること、血漿の収量が低いこと（スターム、キム、リ）、かつ分析の自動化が不完全であることである（キム、リー）。
【発明の概要】
【０００７】
一つの実施形態において、本発明により、例えば、血液成分を採集し分離する多層デバイスが提供され、例えば、全血のような、多層デバイスに充当される体液サンプルから分析対象を検出することが可能となる。一つの実施形態では、その多層デバイスは、本の形に構成される乾燥斑カードであり、本の背を形成する一端に沿って開閉し、薄膜や本の各ページに類似する材料の複数の層を挟む表と裏のカバーがある。あるいは、２つ以上または全ての端部が一時的に結合しまたは結び付くものとし、２つ以上の端部で結合しまたは結び付いた多層デバイスのいずれかまたは全ての層が、お互いからかつそのデバイスから取り外され、取り除かれ、または分離されてもよい。体液サンプルを分離することで、分離された成分を引き続き個別に分析することが可能となる。
【０００８】
別の観点は、望み通りに個別に取り除いたり取り外したりできる層を備える多層デバイスに向けられている。長方形状を有する多層デバイスは、全ての端部で一時的に取り付けられるか結び付けられるかしており、その多層デバイスのいくつかまたは全ての層を取り外したり取り除いたりできる。例えば、いくつかのまたは全ての層の端部にはミシン目が入っていて、その層を、その多層デバイスの残りの部分から破り取ったり取り外したりできるようになっている。あるいは、体液サンプルが漏れないように、また、多層デバイスの各層が、分離されて取り除かれるまで定位置を保つように、全ての層が表裏のカバーの間に強く挟まれている。
【０００９】
一つの観点は、多層デバイスに向けられているが、それは、
【００１０】
ａ）疎水膜に隣接する濾過膜部を備える表部および
【００１１】
ｂ）採集材および裏カバーを備える裏部を備えており、
前記表部は前記裏部に隣接してそれに接続され、前記濾過膜部は少なくとも一つの濾過膜を備え、前記濾過膜ユニットは表面および裏面を有し、かつ前記疎水膜は表面および裏面を有し、前記濾過膜部の前記裏面は前記疎水膜の前記表面に隣接し、前記採集材は表面および裏面を有し、前記疎水膜の前記裏面は前記採集材の前記表面に隣接し、かつ前記採集材の前記裏面は前記裏カバーに隣接する。
【００１２】
別の観点によって、多層デバイスが提供され、それは、
【００１３】
ａ）少なくとも一つの切り抜きがある表カバーの層と、濾過膜部の層と、少なくとも一つの切り抜きと表カバーにおけるのと同数の切り抜きとがある疎水膜の層を備える表部と、
【００１４】
ｂ）採集材の層と、切り抜きのない裏カバーの層とを備える裏部とを備えており、
前記表部は前記裏部に隣接してそれに接続され、前記濾過膜部は少なくとも一つの濾過膜、好ましくは、細孔のサイズが減少していく２つの濾過膜であって、一つの観点においては、各々が前記切り抜きの形を有するものを備え、前記濾過膜部は前記表カバーの前記切り抜き内に位置していて前記疎水膜に隣接し、表カバー、濾過膜部および疎水膜の各層は、切り抜きによって整列され、前記疎水膜は前記濾過膜部と前記採集材に隣接してそれらに挟まれ、前記採集材は前記疎水膜に隣接し、かつ前記採集材は前記裏カバーより上にある。血漿は主には水分であるので、疎水性材が血漿を吸収することはない。切り抜きを有する疎水膜によって、切り抜きの境界を超えて血漿が漏れたり広がったりすることが防止され、そうして乾燥斑をそれらの切り抜きの中で中心に位置させることが可能となる。一つの観点における濾過膜部は、表カバーと疎水膜との間に挟まれている。セルロースや紙などのような吸収性層である採集材は、別の観点において、前記疎水膜と前記裏カバーとの間に挟まれている。多層デバイスは、４つの端部を有する長方形の形をしていて、表部または裏部の各層は一時的に少なくとも一つの端部で結合されていて、十分にきつく接触しているので漏れがあったり層が動いたりすることはなく、かつ表部および裏部の各層は取り外したり取り除いたりすることが可能である。多重デバイスの別の形式では、前記採集材の下でそれに隣接しかつ前記裏カバーより上でそれに隣接する接触支持層がさらに含まれるか、接触支持体が裏カバーの一部を形成し、接触支持層の接触支持体が、好ましくは盛り上がった支持体を含んでいて、その盛り上がった支持体の少なくとも一部が、体液サンプルを置く切り抜き内にはまり込むものとなっている。さらなる観点では、前記多層デバイスが、引き続いての分析のために取り外される層のために、好ましくは濾過膜部および／または採集材のために、少なくとも一つのウィンドウ支持体をも備えているものも含まれる。ウィンドウ支持体は、関心のある分析対象を検出するためにサンプルを露呈するウィンドウを含む層であり、引き続いての分析のための前記層は前記ウィンドウ支持体に取り付けられるか結合され、かつ引き続いての分析のための前記層に結合される前記ウィンドウ支持体は、引き続いての生物学的分析のために前記多層デバイスから取り外されまたは切り離されても良い。
【００１５】
さらなる観点が多層デバイスに向けられており、それは、少なくとも一つの切り抜きがある表カバーの層と、濾過膜部の層と、少なくとも一つの切り抜きがある疎水膜の層とを備える表部と、
【００１６】
ｂ）採集材の層と切り抜きのない裏カバーの層とを備える裏部とを備える。
【００１７】
別の観点において、多層デバイスを使用する方法が、
【００１８】
ａ）適量の体液を、
（ｉ）体液サンプルが置かれるか入れられる少なくとも一つの切り抜きまたは開口のある表カバーの層と、濾過膜部の層と疎水膜の層を備える表部と、
（ｉｉ）採集材の層と切り抜きのない裏カバーの層とを備える裏部とを備え、前記表部が前記裏部に隣接し、前記適量が約１０マイクロリットルから１００マイクロリットルである多層デバイスに充当し、
【００１９】
ｂ）前記表部を前記裏部に接触させて約３分待機し
【００２０】
ｃ）前記濾過膜部および／または前記採集材を前記多層デバイスから分離し、
【００２１】
ｄ）分離された前記濾過膜部および／または前記採集材が乾く間約３０分待機し、
【００２２】
ｅ）前記濾過膜部および／または前記採集材を分析するステップを備えている。
前記濾過膜部および／または前記採集材の分析には、関心のある分析対象を検出するステップも含まれる。
【００２３】
さらなる観点は、多層デバイスを用いる方法に向けられていて、それは、
【００２４】
ａ）ある量の体液サンプルを、前記多層デバイスの前記濾過膜に充当し、
【００２５】
ｂ）前記表部を前記裏部に接触させて約３分待機し、
【００２６】
ｃ）前記多層デバイスを保管するステップを備えている。多層デバイスを分析のための施設に運んでまたは運ばずに２、３分から数日間多層デバイスを保管した後、安全に保管され改ざんができないようにしたサンプルを含む多層デバイスにさらなる作業を加える。多層デバイスを保管した後、前記使用法は、さらに
【００２７】
ｄ）濾過膜部および採集材を多層デバイスから分離し、
【００２８】
ｅ）濾過膜部および／または関心のある分析対象用の採集材を分析するステップを備えており、ここで多層デバイスは３Ｄプリントによるデバイスであるか３Ｄではないプリントによるデバイス、例えば、カード用紙である。
【００２９】
ここに記述される多層デバイスおよび技法の利点には、サンプル採集が簡素化され、コストが低減され、出荷および保管が簡素化され、かつ様々な分野で大きく関心が得られることが含まれる（トラッツェルＬ他、分析方法２０１５、７、７５９６−７６０５、サドンズＮ他、バイオアナリシス２０１４、６、２２１１−２２２７）。本発明の多層デバイスは、ヘマトクリット効果や血漿ではない全血のサンプリングを含む業界の多くの課題を克服するものである（デ・ケッセルＰ．Ｍ他、バイオアナリシス２０１３、５、２０２３−２０４１）。
【００３０】
もう一つの観点において、限定はされないが、自動化された高スループットの分析のような、多層デバイスによって採集され分離された乾燥サンプル斑に見出される分析対象の手軽で迅速な検出分析のために多層デバイスを構成する。したがって、ここに記述される本発明の多層デバイスは、広範囲のヘマトクリットレベル（例えば、２５％−６５％）、全血液サンプルからの高血漿収量および、単一の体液サンプルの複数の成分の分離分析と相性が良くなるように開発されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明は、添付した図面との関連を考慮して詳細な説明を参照するとより良く理解できる。図面における構成要素は必ずしもスケール通りではなく、発明の主旨を示すために強調されている。全図を通して、同様の参照番号は、異なった図面においても対応する部分を示している。
【００３２】
本発明は、部分的には改良された乾燥斑カードに関する。他の分野および使用法においても、本発明は、例えば、それらに限定はされないが、全血、赤血球、血漿、および血小板を含む体液サンプルから化合物、薬物、代謝産物、ホルモン、オピオイド、ウイルス、核酸、蛋白質などを検出する上で有用である。多層デバイスの使用法として、例えば、尿、唾液、涙、羊水、精液のような必ずしも分離を必要としない体液サンプルにおいて関心のある分析対象を検出することもまた期待されている。
【００３３】
各図面は、例示された実施形態に従って、体液サンプルの分離および、化合物、薬物、オピオイド、ホルモン、核酸、蛋白質、その他の存在の測定を含む多層デバイスの様相を描写している。
【００３４】
図１は、本の形をした多層デバイスを示しており、１から６までの番号が組み立ての順番を指示するもので、実施例１にその詳細が記述されている。
【００３５】
図２は、（１）各切り抜き内にはまり込む第１の濾過膜と、（２）切り抜きが４つある表カバーと、（３）各切り抜き内にはまり込み第１の濾過膜に隣接する第２の濾過膜と、（４）切り抜きを含む疎水膜と、（５）切り抜きがなく、切り抜きが位置する切り抜き周囲の輪郭を選択的に有する採集材と、（６）接触支持層と、（７）裏カバーとの７層を含む多層デバイスを示す。
【００３６】
図３は、様々なオピオイドについて中央および周辺のサンプリング位置の結果を示しており、各オピオイドの左側の棒と右側の棒はそれぞれ中央位置と周辺位置を示す。
【００３７】
図４は、継続して流れる窒素で満たされた箱に入れたＲＴ（ＲＴ＋窒素）と、グラシン紙の封筒＋乾燥剤でさらにジップロックの袋に密封されたＲＴ（ＲＴ＋空気）と、グラシン紙の封筒＋乾燥剤でさらにジップロックの袋に密封されて−２０℃に保たれたもの（−２０℃＋空気）との３つの異なる保管条件で、ＬＬＯＱ（５ｎｇ／ｍＬ）でのオピオイドおよび刺激物のカード上での安定性を示す。
【００３８】
図５は、継続して流れる窒素で満たされた箱に入れたＲＴ（ＲＴ＋窒素）と、グラシン紙の封筒＋乾燥剤でさらにジップロックの袋に密封されたＲＴ（ＲＴ＋空気）と、グラシン紙の封筒＋乾燥剤でさらにジップロックの袋に密封されて−２０℃に保たれたもの（−２０℃＋空気）との３つの異なる保管条件で、高ＱＣ（９００ｎｇ／ｍＬ）でのオピオイドおよび刺激物のカード上での安定性を示す。
【００３９】
図６は、ＬＬＯＱ（ＡおよびＢ）および高ＱＣ（ＣおよびＤ）で、３０％、４０％および６０％Ｈｃｔ（ｎ＝３）の血液を用いる多層デバイス分析の精度と確度を示す。
【００４０】
図７は、Ａ）素材のままのサンプル（ＩＳ無しのマトリクス素材）、Ｂ）ゼロサンプル（ＩＳありのマトリクス素材で、分析対象のしるしのみを示す）、Ｃ）ＬＬＯＱサンプル（５ｎｇ／ｍＬの標準液が施されたマトリクス）および、Ｄ）それらを重水素化したＩＳに対して、（１）モルヒネ、（２）コデイン、（３）オキシコドン、（４）アンフェタミン、（５）ヒドロコドン、（６）メタンフェタミン、（７）ＭＤＭＡ、（８）フェンテルミンおよび、（９）メフェドロンを含むように施された血液サンプルからのＳＲＭ  ＬＣ／ＭＳ  クロマトグラムを示す。
【００４１】
図８は、様々なオピオイドについてテストした２５％−６５％のヘマトクリットレベルの結果を示す。
【００４２】
図９は、（Ａ）モルヒネおよび（Ｂ）フェンタニールについての線グラフを示す。
【００４３】
図１０は、様々なオピオイドについて、２０μｌ−５０μｌからの容積測定サンプリングの比較を示す。
【００４４】
図１１は、様々なオピオイドおよび（Ａ）２０μｌ、（Ｂ）３０μｌおよび（Ｃ）５０μＬの全血についての％ＲＥおよび％ＣＶを示す。
【００４５】
図面における各要素が簡潔性および明瞭性のために示されていて全ての関係や選択が示されていないので発明の観点が不明瞭になることが避けられていることを当業者は理解するものである。例えば、商業的に実行可能な実施形態において有用であったり必要であったりする、一般的であってよく理解できる要素はしばしば描写されていないが、それは、本件に開示されるこれらの種々の実施形態の図面において邪魔になるものをより少なくするのに役立っている。さらに、いくつかの作用および／またはステップは、それらが起こる特定の順番で記述されまたは描写されているが、実際には、そのように順序を特定する必要はないということも当業者は理解するものである。ここで用いられる用語や表現は、ここで、そうではない特定の意味が説明されていなければ、それらに各々対応する調査領域および研究領域に関して定義されるものである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
［発明の詳細な説明］
ここで、添付の図面を参照して本発明をより完全に説明するが、それらは、その一部を形成するもので、図示によって本発明が実施される特定の代表的な実施形態を示している。これらの図示と代表的な実施形態が提示されるのは、本件の開示は一つ以上の発明の主旨を例示するもので、いずれの発明をも図示される実施形態に限定することは意図していないという了承のもとにおいてである。本発明は多くの異なる形で実施されるので、ここに説明される実施形態に限定されるという意味に取るべきではなく、むしろこの開示が綿密かつ完璧で、当業者に発明の範囲を完全に伝えるようにこれらの実施形態が提示されている。
【００４７】
ここに記述されるように、代用的な実施形態は、例えば、全血のような体液サンプルを分離し、関心のある分析対象についてそのような体液サンプルを分析する多層デバイスを記述する。本質的に、多層デバイスは、乾燥体液斑サンプルをマイクロサンプリングし、分離しかつ分析する乾燥体液斑デバイスである。多層デバイスまたは多層デバイスカードの一実施形態は、（１）体液サンプル採集のための領域が指定されている濾過膜部と、（２）好ましくはサンプルを特定するラベルがついた支持層または表カバーと、（３）採集材と、（４）図２に例示されているような支持層または裏カバーとを備えている。体液サンプルが多層デバイスに充当され、ここで体液サンプルは、分析対象の存在についてのテストを行うどのような液体でもよく、好ましくは生物学的体液である。体液または体液サンプルに含まれるのは、それらに限定されるものではないが、全血、赤血球、血漿、血漿蛋白質片、大脳脊髄液、または興味のある測定対象を可能性として含み得るあらゆる体液などである。当業者であれば、様々な体液や望まれる分析対象に順応するように、多層デバイスの構成要素を修正することが可能である。例えば、濾過膜の大きさは関心のある分析対象を捕獲しまたは分離するために改変できる。
【００４８】
業界で入手可能な乾燥斑カード用のサンプルには限界があって、特にサンプル量が一貫しておらずそれによって結果にマイナスの影響が及ぼされる。乾燥血液斑（ＤＢＳ）技法においては、全斑分析を用いることでヘマトクリット（Ｈｃｔ）依存の問題は解決できるが、そうするとカード上の斑の血液量が正確であることが必要となる。これを簡単に達成するのは、訓練された人が、例えば、容積測定ピペットのような正確なサンプリングデバイスを用いて、サンプル採集および斑付を行えばということになる。指腹から既知の量の血液を採取する別の方法には、「容積測定の」毛細管サンプリングシステム（ＤＢＳシステム、グランド、スイス）が含まれており、それは、業界で開示されるように参照することでここに組み込まれる（ルーソルドＬ．Ａ他、分析化学２０１５、８７、２０６８−２０７１、ＲヴァープラッツェおよびＪヘニオン、分析化学２０１６、８８、６０７８９−６７９６）。ＤＢＳシステムによって、指腹での採血で５．５μＬという正確な量の全血が提供される。あるいは、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）ピペット（Ｚ６８３７８７アルドリッヒ、ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）リサーチ（登録商標）プラスピペット可変容量０．５μＬ−１０μＬ、シグマ−アルドリッヒ（登録商標）社）のような容積測定ピペットまたはガラスの毛細管（Ｐ２１７４シグマ、ミクロキャピラリー管ＤＲＵＭＭＯＮＤ  ＭＩＣＲＯＣＡＰＳ（登録商標）容積５０μＬ）を用いる。
【００４９】
典型的には、サンプル採集が訓練を受けていない人が行うようであれば、正確なサンプル容量が採集されていることを確認するのに臨界制御点が持ち出される。ここに記述される多層デバイスカード、特には、各層の間に密接な接触があるようなデバイスの応用においては、正確で精密な量測定を得るのに正確なサンプリング量が必ずしも必要とされない。ここに記述される多層デバイスは、約５０マイクロリットル（μＬ）までの、例えば、全血、および約１００μＬまでもの体液サンプル量の広い範囲に対応し、一方、商業的に入手可能であるか現在使われているデバイスのほとんどは、マイクロリットルで一桁の（例えば、５μＬ）量の血液しか取り扱うことができない。
【００５０】
密接な接触が可能な本の形をしたまたはその他の多層デバイスカードには、サンプリングの適量という特性が備わる。リー他が示したように、血漿の一貫性は、血液におけるＨｃｔレベルから独立していることが観察された（バイオメディカルおよびライフサイエンス２０１５、９９１、４６−５２におけるジャーナルオブクロマトグラフィーＢ分析技術）。実施例部門における研究に基づいて、約３０％Ｈｃｔまたは６０％Ｈｃｔのヘマトクリット（Ｈｃｔ）レベルを有する全血から分離される血漿は、紙物質上で一貫して同じ広がりを有し、そうして均質な斑を生成する。均質な斑は、斑の大きさが等しいということと同じではない。それは、斑のサイズに関わらず、斑内の血漿が均質に飽和していることに言及するものである。ここに記述される発明の多層デバイスは、適当な量や業界におけるものより大きな量を結果に悪い影響を与えることなく取扱い処理することができる。実際、記述される多層デバイスが提供するより大きな全血サンプルは、結果としてより大きな赤血球および血漿の収量を生じる。例えば、最初に使用される体液サンプルの量は様々で、最小の量が約１０μＬであるが、その範囲は、約１０μＬから約１００μＬまで、約１０μＬから約７５μＬまで、および約２５μＬから約５０μＬまでに渡っている。
【００５１】
血漿の収量はしばしば低いので、分析対象を検出するのがより難しい。血漿の低い収量は約４μＬ未満、例えば、約２μＬ未満である。しかしながら、ここに記述される多層デバイスにより、約２μＬより大きな血漿の収量、好ましくは約４μＬから約３８μＬの範囲にあって、最初に充当された全血量にもよるが、約４μＬから約１５μＬまでを含む収量が提供される。血漿の収量を決めるいくつかの要因があるが、それには、最初の全血量、採集材および広がったり漏れたりすることによる血漿の損失が含まれる。最初の全血量を大きくして始めると、結果として得られる血漿の収量が大きくなる。血漿の最終的な収量もまた、血漿の採集に用いられる採集材に、すなわち、そのサイズおよび材料のタイプに依存する。採集材料は、好ましくはセルロースか酢酸セルロース紙であるが、それが厚ければ表面領域が増えるのでより大きな量が採集される。平均して、ここでテストされる多層デバイスの全血あたりの血漿は、全血１μＬあたり血漿約０．３０３±０．００７μＬである。多層デバイスによって、全血１μＬあたり血漿約０．１００μＬより大きいものが可能となる。一方、ＮＯＶＩＰＬＥＸカードは結果として全血１μＬあたり血漿約０．１００μＬを生じるが、これは、記述される多層デバイスにおいて達成される量より相当に少ない。さらには、各切り抜きは大きな量、すなわち約１０マイクロリットルから必要であれば約１００マイクロリットル、に適応するので、サンプル／切り抜きあたりの血漿の収量は分析を行うのに十分大きい。他のカードは、単一のサンプルの体液サンプル量を同じにするために複数の体液サンプルを組み合わせる必要がある。
【００５２】
さらには、体液サンプルが全血である実施形態において、多層デバイスは、大きく広い範囲のヘマトクリットレベルを処理することが可能である。ヘマトクリット（Ｈｃｔ）は、血液サンプルにおける赤血球の割合である。例えば、３０％Ｈｃｔを有する２０マイクロリットルの血液サンプルは、約６マイクロリットルの赤血球を有し、一方、４５％Ｈｃｔは約９マイクロリットルの赤血球を有し、かつ６０％Ｈｃｔは約１２マイクロリットルの赤血球を有して残りが血漿である。本発明の実施形態は、単一のまたは濾過膜を２枚組み合わせて用いているが、好ましくは、一つの実施形態において、非対称膜によって、ヘマトクリットが約３０％から約７０％の範囲の血液サンプルを処理することを可能としている。ヘマトクリットレベルがより低いかより高くとも処理はできるが、膜濾過プロセスに関して問題が生じるので効率的ではない。ヘマトクリットが、約３０％またはそれより大きいか、約３５％またはそれより大きいか、約４０％またはそれより大きいか、約４５％またはそれより大きいか、約５０％またはそれより大きいか、約５５％またはそれより大きいか、約６０％またはそれより大きいか、約６５％またはそれより大きいか、約７０％またはそれより小さいか、約６５％またはそれより小さいか、約６０％またはそれより小さいか、約５５％またはそれより小さいか、約５０％またはそれより小さいか、約４５％またはそれより小さいか、約４０％またはそれより小さいか、約３５％またはそれより小さい範囲の全血サンプルが好ましい。しかしながら、ヘマトクリットレベルが、約２０％またはそれより大きいか、約８０％またはそれより小さい全血サンプルも使えるが、それらは効率的ではない。
【００５３】
それらに限定はされないが、例えば、化合物、薬物、薬物の代謝産物、ホルモン、ウイルス、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、蛋白質、細胞表面および細胞内のマーカーなどのような関心のある分析対象あるいは、何らかの既知の方法や、例えば、分光法またはクロマトグラフ法を含むここに記述されるいずれかの手段によって検出可能な何らかの分析対象をテストするために、一つの実施形態は、体液サンプル、例えば、全血を採集するのに多層デバイスを用いることに向けられている。分析対象の例には制限がなく、より具体的には、オピオイド、カンナビノイド、刺激物、能力向上薬物、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、アンフェタミン、メタンフェタミン、メフェドロン、フェンテルミン、３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）、フェンタニール、それらの組み合わせなどが含まれる。とりわけ、アスリートが能力向上薬物を摂取していないことを確認する薬物テストを必要とするスポーツ競技において、ここに記述される方法および多層デバイスは、異物や内因性生物マーカーを含み、それらには限定されない、関心のある分析対象をテストするため、体液サンプルを採集および分離するのに用いられる。
【００５４】
多層デバイスのもう一つの観点は、単一の体液サンプルの様々な成分を採集して分析する能力である。単一の体液サンプルの複数の場所に、とりわけ、その体液サンプルが複数の成分に分離されておれば、様々な分析対象が見出される。業界におけるデバイスとは対象的に、ここに記述される新規の多層デバイスは、単一体液サンプルを都合よく処理し、その単一体液サンプルの成分を分離し、かつその単一体液サンプルの分離された成分を個々に分析する。この二重の機能性は、多数の分析対象のテストを促進し、単一体液サンプルを最大限に利用するのにとりわけ利点がある。この多層デバイスのさらなる利点は、体液サンプル、例えば、白血球のいかなる量でもその多層デバイスに充填できて、なおも量測定の結果が得られるというもので、というのも、濾過膜部が、所定量を可能とする少なくとも一つの所定のサイズを有するからである。フロースルー溶出技術と組み合わせると、採集材に採集された血漿の定量分析が達成される。あるいは、フロースルー溶出技術を用いないなら、採集材から血漿斑が打ち抜かれ、較正曲線を定める時に用いられる同じサイズの斑で分析される。そうすると、充当されるサンプル量の正確さは、現在の技術で一般に必要とされるような要件で無くなる。
【００５５】
もう一つの実施形態は、単一の被験者からの、例えば、全血サンプルの充当によって、例えば、赤血球、白血球、血小板、その他の細胞や、採集されたあるいは保持された血漿を含む層などであるが、それらに限定はされない採集されたまたは保持された細胞成分を含む層が、結果として得られる二重機能の能力を有する多層デバイスに向けられている。それらの細胞成分は、サンプルにおける血漿成分からは分離して分析されるが、各層は、全血の異なる成分において見出される異なる分析対象を含んでいる。例えば、赤血球面の細胞表面蛋白質とその他の成分ならびに赤血球内に含まれる細胞内蛋白質および成分や薬物は、血漿成分とは分離して分析される。本発明の多層デバイスの二重機能能力は、その効率、すなわちサンプリングおよび時間において有利である。その多層デバイスは複数のサンプルに順応でき、引き続いてその複数のサンプルをそれらの細胞成分や血漿成分に分離できるので、複数の分析テストが同時に行われる。
【００５６】
二重機能能力を有する多層デバイスの一つの利点は、それによって薬物や関心のある分析対象の赤血球対血漿分配係数の測定が容易になるというものである。もう一つの利点は、複数組の薬物や分析対象の分析を同時に行えることである。単一の被験者または複数の被験者からの体液サンプルが、同時に処理され、複数の分析対象、すなわち、各切り抜き、窪みまたは開口に置かれるか採集された各対象サンプルについて分析される。例えば、単一の被験者の体液サンプルを含む単一のプロセスにおいて、４種のオピオイドと５種の刺激物についてのテストが同時に行われる。本発明の多層デバイスの複数の層によって、例えば、赤血球、血漿、血小板、などを含む血液成分の分離ならびに、ヘマトクリットレベルが広範囲の溶血のない全血サンプルの処理が可能となる。
【００５７】
ここに記述される多層デバイスは、別の実施形態では、本の体裁をなしていて、一方の側で開閉され、様々な層が本の各ページを構成している。あるいは、２つ以上の側面または端部、例えば、多層デバイスの全ての側面または端部において、多層デバイスは、組み合わされるか、取り付けられるかしており、いくつかのまたは全ての層を取り外したり取り除いたりできる。本発明の多層デバイスはどのような形でも良く、それには、円形、長円形、三角形、正方形、長方形、平行四辺形、ひし形、五角形、六角形、七角形、八角形などが含まれるが、それらに限定されるものではない。多層デバイスの切り抜きや穴も、表カバーと、疎水膜が使われるならそれの切り抜きや穴が同じで有る限り、どんな形でも良く、それには、円形、長円形、三角形、正方形、長方形、平行四辺形、ひし形、五角形、六角形、七角形、八角形などが含まれるが、それらに限定されるものではない。多層デバイスの好ましい形は４つの辺を有する長方形であって、その長辺が、多層デバイスの層がそのまわりに開閉し、結合されまたは取り付けられる少なくとも一辺または一つの側面となっている。長方形の形をした多層デバイスの大きさは、約１インチから約４インチであり、好ましくは約２インチ×約３インチ、例えば、約２インチ×約３．３インチである。しかしながら、他の形やサイズも考慮される。
【００５８】
一つの実施形態は、多層デバイスまたは多層デバイスカードに向けられており、それは、
【００５９】
ａ）疎水膜に隣接する濾過膜部を備える表部と、
【００６０】
ｂ）採集材を備える裏部と
を備え、前記表部は、前記裏部に隣接してそれに接続されており、前記濾過膜部は、少なくとも一つの濾過膜を備え、前記濾過膜部は、表面及び裏面を有しており、かつ前記疎水膜は、表面及び裏面を有しており、前記濾過膜部の前記裏面は、前記疎水膜の前記表面に隣接しており、前記採集材は、表面及び裏面を有しており、かつ前記疎水膜の前記裏面は、前記採集材の前記表面に隣接している。
【００６１】
もう一つの実施形態により、多層デバイスが提供され、それは、
【００６２】
ａ）少なくとも一つの切り抜きがある表カバーの層と、濾過膜部の層と、少なくとも一つの切り抜きがある疎水膜の層とを備える表部と、
【００６３】
ｂ）採集材の層と、切り抜きのない裏カバーの層とを備える裏部と
を備えており、
前記表部は、前記裏部に隣接してそれに接続され、前記濾過膜部は、少なくとも一つの濾過膜、好ましくは、各々が前記切り抜きの形を有し、細孔のサイズが減少していく濾過膜を２枚備え、前記濾過膜部は、前記表カバーの前記切り抜き内に位置して前記疎水膜に隣接し、前記疎水膜は、前記濾過膜部と前記採集材とに隣接するかそれらの間に挟まれており、前記採集材は、前記疎水膜に隣接し、かつ前記採集材は前記裏カバーより上にある。一つの実施形態における濾過膜部は、表カバーと疎水膜との間に挟まれている。もう一つの観点における採集材は、前記疎水膜と前記裏カバーとの間に挟まれている。多層デバイスは、４つの辺を有する長方形の形をしていて、表部または裏部の各層は、少なくとも一つの辺で一時的に結合されており、表部または裏部の各層は、切り離しまたは取り除き可能である。一つの実施形態において、濾過膜部は切り抜きのサイズおよび形を有していて、表カバーの切り抜きまたは窪みの各々にはまり込み、濾過膜部の各層が、濾過膜部の辺と表カバーの切り抜きの壁との密接な接触により、また多層デバイスにおいて全ての層が挟まれていることにより定位置に保たれている。好ましい実施形態は、表カバーの円形の切り抜き内にはまり込むように円形である、これらの濾過膜に向けられており、これらの円形の濾過膜またはディスクは、サンプルの採集および分離ののち、さらなる分析のために簡単に取り外すことができる。例えば、全血が多層デバイスの切り抜きに充当された後、その全血は十分に時間をかけて濾過膜部で濾過され、採集材上にたまる。一つの実施形態において赤血球は濾過膜またはディスク上に残留し、一方、血漿は採集材上にたまる。
【００６４】
多層デバイスのその他の形にさらに含まれるのは、前記採集材に隣接してその下にあり、前記裏カバーに隣接してその上にある接触支持層であり、別の実施形態においては、その接触支持層は裏カバーと結合していて、接触支持体が裏カバーの一部となっており、かつ接触支持層の接触支持体は、好ましくは盛り上がった支持体を含んでいて、その盛り上がった支持体の少なくとも一部が体液サンプルを多く切り抜き内にはまり込むものとなっている。さらなる実施形態は、引き続いての分析のために取り外される層、好ましくは、濾過膜部および／または採集材のための少なくとも一つのウィンドウ支持体も含む前記多層デバイスを備える。ウィンドウ支持体は、関心のある分析対象を検出するために採集されたまたは捕らえられたサンプルを露呈するウィンドウを含む層であり、その、引き続いての分析のための層は、前記ウィンドウ支持体に取り付けられるか結び付けられるかしており、かつ引き続いての分析のための前記層に結び付けられる前記ウィンドウ支持体は、引き続いての生物学的分析のための前記多層デバイスから取り除かれるか取り外されるかする。一つの実施形態では、引き続いて濾過膜部の分析が行われ、各濾過膜またはその部分部分は、例えば、酵素免疫学的検定（ＥＩＡ）による分離分析対象検出分析のために移送される。もう一つの実施形態では、引き続いて採集材の分析が行われ、例えば、全血サンプルからの血漿を、液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析、例えば、固相抽出液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析する。
【００６５】
多層デバイスに向けられた実施形態は、表部および裏部を備えており、その表部と裏部とは隣接している。表部は、例えば、カードストックのような硬い耐久性のある構造体でできている表カバーと、その表カバーの切り抜きまたは開口を通して全血の体液サンプルと最初に接触する、隣接した濾過膜とを備えている。実施形態は、少なくとも一つの濾過膜、好ましくは２枚の隣接する濾過膜の濾過膜部を備える。濾過膜部に隣接しかつその下に疎水膜がある。多層デバイスの裏部は、裏カバーに隣接する採集材を備える。一つの実施形態において、多層デバイスは、表部がその下にある裏部と常時または一時的に接触することを可能とする形式である。表カバーは、サンプルを置く少なくとも一つの切り抜きまたは開口を有し、一方、裏カバーは切り抜きを有さない。複数の切り抜きは、単一の源からの液体サンプル、例えば、一人の被験者からの全血をテストしたり、またテストを同時に行うための標準対照を含んだりするのに好ましい。
【００６６】
［体液サンプル／濾過膜］
実施形態は、濾過膜部に充当される体液サンプルに向けられるが、濾過膜部は、多層デバイスの表カバーの切り抜き、窪みまたは開口を通して露呈される。濾過膜部は、少なくとも一枚の濾過膜、好ましくは、表カバーの切り抜きの範囲内でお互いに隣接した位置にある２枚の濾過膜である。切り抜きや開口の形が円形であるなら、好ましい濾過膜部は、少なくとも一つの円形濾過膜ディスクを備える。濾過膜は、非対称的であるか、対称的であるか、非対称的および対称的の組み合わせであるか、各々の類似の組み合わせ、すなわち、一つ以上の非対称濾過膜または一つ以上の対称濾過膜の組み合わせであって良い。体液サンプルの成分を十分に濾過し捕獲するように、濾過膜部が選択され、構成される。好ましくは、ここに記述される多層デバイスは、例えば、全血サンプルの成分を分離する濾過膜部を備えており、その濾過膜部は、赤血球を捕獲しかつ血漿がその濾過膜部を通って流れまたは通過できるものとしている。少なくとも２枚の濾過膜が用いられるならば、上部濾過膜と下部濾過膜になるようにそれらが積み重ねられ、双方の濾過膜は、表カバーと疎水膜が用いられるならば、その疎水膜の切り抜きまたは開口と同じ形を有する。
【００６７】
濾過膜部は、少なくとも一つの濾過膜を備え、それは約１ミクロンから約１０ミクロン、約２ミクロンから約５ミクロンの粒子を濾過する。濾過膜は、表または第一の面および裏または第二の面を有し、かつ例えば、全血サンプルからの赤血球のような望まれる粒子の濾過および／または捕獲を可能とし、かつ例えば、血漿のような他の粒子または流体がそれを通過するのを可能とするのに十分な厚みを有する。濾過膜が有する厚みは、約０．１ｍｍから約０．６ｍｍ、約０．１５ｍｍまたはそれより大きいか、約０．２ｍｍまたはそれより小さいか、約０．２６ｍｍまたはそれより大きいかあるいはそれより小さいか、約０．３ｍｍまたはそれより大きいかあるいはそれより小さい範囲にある。しかしながら、厚みがこれらの値を超えたとしても、濾過膜による阻止や防ぎが行われ、そうして濾過を抑制すると思われる。もう一つの実施形態は、隣接する濾過膜を２枚備える濾過膜部に向けられている。隣接する濾過膜が２枚用いられると、第一の濾過膜の裏面が第二の濾過膜の表面に隣接し、サンプルは、第一の濾過膜の表面に入って、第一の濾過膜の裏面から出て、第二の濾過膜の表面に入って、第二の濾過膜の裏面から出る。
【００６８】
濾過膜は、血漿の吸収を避けるために疎水性であるが、他の環境においては親水性であっても良く、また異方性であって、体液サンプルの望まれる成分を濾過したり採集したりするよう機能するものであっても良い。例えば、全血サンプルの望まれる成分には、赤血球や血漿が含まれるが、それらに限定されるものではない。濾過膜は、関心のある粒子を濾過して分離するのに十分な材料を備える。実施形態において、全血成分の濾過を可能とする濾過膜が構成されるのは、極性、非極性、また中間極性の重合体、ポリエステル、ポリスルフォン、ポリカーボネート、ポリメタクリレートなどか、それらの混合または組み合わせからであるが、それらに限定されるものではない。
【００６９】
濾過膜は、体液サンプルの成分を濾過して分離するよう機能する。その体液が、全血であるとき、そのサンプルは、個々の成分、すなわち、赤血球、白血球、血小板、および血漿に分離され、さらなるテストのために、例えば、赤血球を採集し、一方、血漿のような他の成分は、膜を通って濾過できるようにしている。業界において、赤血球は、血漿や血小板よりもサイズが大きく、赤血球は約６マイクロメートル（μｍ）乃至約８μｍであり、白血球は赤血球より大きくてすなわち、約１２μｍ乃至約１５μｍである。望まれる粒子によって、適切な濾過膜の細孔のサイズが選択される。疎水膜に最も近いか隣接する濾過膜は、全血の成分、例えば、赤血球を採集するか捕獲するのに十分な特性を有する。本多層デバイスの一つの利点は、全血の単一の対象サンプルまたは複数の対象サンプルの２つ以上の血液成分を別々に分析するために、それらを分離し、採集し、かつテストできる新規な能力にあって、そのデバイスは、大量のおよびヘマトクリットパーセンテージの範囲が広い全血サンプルに順応する。
【００７０】
もう一つの実施形態は、非対称的な濾過膜に向けられていて、全血サンプルを濾過することを可能とし、濾過膜部内でサイズの異なる成分を分離する。例えば、濾過膜部とその濾過膜によって、全血サンプルから赤血球を捕獲して分離することが可能となり、かつ血漿が濾過膜部を通って流れるようにして、その結果、細胞のない血漿を生じさせている。多層デバイスの一つの実施形態において、非対称濾過膜が用いられる。非対称濾過膜は、サイズが大きい粒子やそれより小さい粒子もその膜に入り込むことを可能とする表面を有し、一方、同じ濾過膜の裏面は、細孔のサイズがより小さく、それによって、サイズが、濾過膜の表面の細孔よりも小さく裏面の細孔よりも大きい粒子が濾過したり通過したりしないようにし、すなわち、ある粒子を捕獲し、またはサイズが濾過膜の裏面の細孔よりも小さい粒子が通過できるようにしている。別の実施形態は、少なくとも一枚の非対称濾過膜または少なくとも２枚の非対称濾過膜を備える濾過膜部に向けられており、ここで、非対称濾過膜は、表面の細孔のサイズが約５ミクロンで、かつ裏面の細孔のサイズが約２．５ミクロンで、それによって約５ミクロンより小さく約２．５ミクロンより大きな粒子を濾過膜中に採集し、また約２．５ミクロンより小さな粒子を次第に濾過して通過させている。もう一つの実施形態は、濾過膜部の濾過膜を２枚用いての連続する濾過に向けられている。赤血球の一部および５ミクロンより大きな粒子は、表または第一の濾過膜上で捕獲され、そして残りの赤血球と２．５ミクロンよりも大きく５ミクロンよりも小さな粒子は、裏または第二の濾過膜上で捕獲される。
【００７１】
細孔のサイズが約１ミクロンであると、下部濾過膜が最適に機能する。本発明の多層デバイスにおいて、濾過膜の細孔のサイズは約１ミクロンから約１０ミクロンの範囲にある。一つの実施形態において、上部の、表の濾過膜は、細孔のサイズが約１０ミクロンで、それによって、大きな粒子を前段階で濾過し、細孔のサイズが約１ミクロンである下部濾過膜の詰まりを緩和する。
【００７２】
単一の濾過膜かまたは多層デバイスの濾過膜を２枚備える二重層濾過膜かを備える濾過膜部は、種類が多様な体液サンプルを処理できる。濾過膜部において濾過膜が２枚用いられると、第一の濾過膜は、表カバーと第二の濾過膜に隣接しており、ここで、第一の、最上位の濾過膜は、細孔のサイズが約３５ミクロンから約３ミクロン、約５ミクロンの範囲にあり、一方、第一の濾過膜と疎水膜とに隣接するかそれらに挟まれている、第二の、下部濾過膜は、サイズが概して第一の濾過膜のそれよりも小さい細孔を有する。第二の濾過膜について好ましい細孔のサイズの範囲は、３ミクロンから約０．２ミクロン、約２．５ミクロンである。濾過膜が２枚のまたは二重層濾過膜の実施形態においては、各濾過膜が、非対称的であるか、非対称的でないか、あるいは一方の濾過膜が非対称的で他方の濾過膜が非対称的ではない。
【００７３】
一つの実施形態は、非対称膜である濾過膜部からなる多層デバイスを備える。もう一つの実施形態は、表部を有する多層デバイスに向けられており、ここで、その濾過膜部は２枚の濾過膜からなる。一つの実施形態において、表の、または最上位の濾過膜層は、商業的に入手可能な製品である表３５μｍ裏５μｍのｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｘ非対称５ｍｍ膜（カナダ、トロントのインターナショナルポイントオブケア社）か、特性がそれに類似するか、望まれる成分を濾過するのに十分なものである濾過膜である。さらに別の実施形態は、裏の、または最下位の濾過膜に向けられていて、それは、商業的に入手可能な製品である表３５μｍ裏２．５μｍのｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ非対称７ｍｍ膜（カナダ、トロントのインターナショナルポイントオブケア社）か、特性がそれに類似するか、望まれる成分を濾過するのに十分な特性を有する濾過膜である。
【００７４】
［疎水膜層］
一つの実施形態において、濾過膜部に隣接してその下にあるか、または濾過膜部と採集材層との間に挟まれているのが疎水膜層であり、それは、サンプルの様々な膜層との接触を完全かつ直接的なものとし、かつサンプル斑を均質なものにするのに役立っている。多層デバイスは、とりわけ、層間が密接して封じられるか接続している多層デバイスにおいては、この疎水膜がなくとも様々な全血成分をうまく分離し採集しているが、疎水膜が含まれることで優れた結果を生じる。あるいは、疎水膜は、採集材に隣接してそれより上に位置しても良い。例えば、きつくまたは密接に閉じることのできない紙または段ボール型のカバーを用いる実施形態において、疎水膜がなければ、濾過の結果、採集材上に円形斑ではなく馬蹄形の斑が生じるが、それは、それに続く好ましい自動分光分析にとって理想的ではない。疎水膜は、サイズ、形および大きさが多層デバイス全体と同じである層であって、表カバーの切り抜きと、サイズ、形および大きさが同じ切り抜きまたは穴を含んでいる。疎水膜は、疎水性のいかなる材料からなっていても良く、好ましくは、ポリエステル、ポリエステル混合体、ポリスルフォン、ポリカーボネートなどである。疎水膜層は、個々の層が、動いたりずれたりしないように配置したり閉じ込めたりするのに十分役立ち、またサンプル斑の均一性にも十分役立つ材料または薄膜である。一つの実施形態において、例えば、赤血球のような全血成分を濾過する濾過膜部に隣接してその下にある疎水膜は、好ましくはポリエステルまたはポリエステル混合体からなり、より好ましくは、厚さが約０．１５８ミリメートルで、坪量が約２３．９ｇ／ｍのアールストロムＨＯＬＬＹＴＥＸ（登録商標）グレード３２５６不織ポリエステル（ペンシルヴェニア州マウントホリースプリングスのアールストロムフィルトレーション社）である。
【００７５】
［採集材層]
疎水膜層の下に位置する、有用な多層デバイスの別の層は、最初に充当された少量の体液サンプルから、濾過された望まれる成分を採集する器として作用する採集材層である。採集されたサンプルを乾かしたのち、採集材上に形成される乾燥斑によって、将来の定量分析のための便利な保管手段が可能となる。全血の他の成分は、前述の血漿または採集材より上の層から分離される。採集材は、全血サンプルを濾過して回収される血漿を吸収および／または採集するよう機能する。採集材は、血漿の捕獲および採集を可能とする性質を有しており、例えば、細孔のサイズが、好ましくは約３５ミクロンから約０．２ミクロンの範囲にあり、厚さが約０．１ミリメートルから約０．６ミリメートル、好ましくは、約０．１９ｍｍである。細孔のサイズは、吸収性の度合いを表す要因である。好ましい実施形態において、採集材は、セルロース、綿くずのパルプから作られる紙セルロースからなるものであっても、また、これに限られるものではないが、酢酸セルロースという材料か、ＷＨＡＴＭＡＮ９０３（英国、スプリングフィールドミルのＷＨＡＴＭＡＮ（登録商標））、ＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）２２６（フィンランド、ヘルシンキのＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）社）などで用いられている材料であっても良い。多層デバイスで用いるのに好ましい採集材は、ＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）６０１セルロース紙（ペンシルヴェニア州マウントホリースプリングスのアールストロムフィルトレーション社）であるが、しかしながら、全血サンプルから、例えば、血漿を分離して採集することができるか、あるいはセルロース紙に類似する性質を有するいかなる材料を用いても良い。採集材としてセルロース紙が望ましいが、それは、それの、切り抜き領域内に斑を集中できる能力であったり、採集されたサンプルに望ましくない化学物質が入らないようにすることに寄与していたり（例えば、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は乾燥斑カードに用いられるそのようなセルロース紙の純度をテストして確認している）かつ、採集されたサンプルに見出される薬物や関心のある分析対象の安定化特性があったりすることによる。サンプル斑を希釈したり、脆かったり未知の安定化特性を有したりする採集材層は、発明にとって理想的でも有用でもない。サンプルの乾燥ステージにおいて、薬物やその他の化学物質の酵素による分解は最小限とされる。しかしながら、それでも薬物やその他の分析対象の化学物質は酸化によって分解する。ある瞬間に、例えば、カンナビノイドのような化学物質は空気や湿気に晒されると不安定であり、それで全血サンプル採集およびテストの業界では、安定性を確認することが必要である。典型的には、不活性気体雰囲気（すなわち、酸素の除去）が用いられるか、シリカゲル乾燥剤が使用される。記述された多層デバイスおよびその使用法のために、サンプル採集の間は必ずしも必要ではないが、それらに限定はされないが、漏れのない容器に保持される窒素またはアルゴンガスのような不活性気体雰囲気が使われる。サンプル採集の間は、多層デバイスでの分析対象の安定性は、不活性気体雰囲気でなくとも十分である。乾燥剤または不活性気体雰囲気の存在は、サンプルが乾燥した後サンプルを移送する間および、何ヶ月にも何年にも渡る長期の保管を含む保管の間有用である。サンプルを含む多層デバイスに入れた乾燥剤は、関心のある分析対象をテストする結果に影響を及ぼすものではない。しかしながら、長期間の保管や保存の間、多層デバイスを、とりわけ濾過膜部および採集材層を保存するのに、不活性気体で、例えば、窒素ガスで満たされた保存デバイスを追加して用い、それによって乾燥斑サンプルにおける分析対象を化学的に安定化させる。特定の分析対象は、サンプル採集および／または保存の間、不活性気体雰囲気または乾燥剤を必要とするが、一般にそれらは必要ではなく、とりわけ、サンプルを収集する時のほとんどの場の設定において好ましいものである。
【００７６】
［支持層］
ここに記述される多層デバイスの他の層に含まれるのは、多層デバイスを支持するものである。表部と裏部を挟む多層デバイスのカバーまたは支持カバーは、それらには限定されないが、例えば、カード用紙、重合体、プラスティック、ナイロン、ポリアミド、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などのような、固くて耐久性のある構造体でできている。とりわけ、３Ｄプリントによる多層デバイスのある層は、重合体、プラスティック、ナイロン、ポリアミド、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などを用いて製造される。支持カバーは、上部または表カバーと下部または裏カバーとからなり、上部カバーは、濾過膜層に隣接しその上にある最上位層で、かつ裏カバーは採集材層またはいくつかの実施形態では接触支持層の下にある最下層である。表カバーは、好ましくは少なくとも１つの切り抜きを有していて、濾過膜部が露呈されるようになっている。もう一つの実施形態は、濾過膜部を露呈する少なくとも２つの切り抜きを含む表カバーを備える多層デバイスに向けられている。好ましい実施形態は、濾過膜部を露呈する切り抜きが４つある表カバーに向けられている。しかしながら、切り抜きの数は、多層デバイスのサイズや大きさおよび、表カバーにおいて受け入れられる切り抜きの数によって決められる。表カバーは、少なくとも１つの切り抜き、少なくとも２つの切り抜き、少なくとも３つの切り抜きおよび、好ましくは、少なくとも４つの切り抜きを有している。対照的に、裏カバーは切り抜きを含んでいない。むしろ、裏カバーは固い構造体で、裏カバーの上にある前述の層の全てを支えるものとなっている。
【００７７】
表カバーは、濾過膜部層が直接露呈されるように切り抜きを有している。体液サンプルは、多層デバイスの濾過膜部に充当されるとき、表カバーの切り抜きの周囲またはその内側にある斑を形成する。濾過膜部は切り抜きと同じかほぼ同じサイズの大きさを有する層であり、表カバーの切り抜きの周囲を超えて伸びるか、またはカバー支持層全体および多層デバイス全体の周囲と同じである。例えば、多層デバイスは、円形の切り抜きがある表カバーを有しており、切り抜きの各々は、例えば、直径約５ｍｍで、濾過膜部が、類似する円形で、例えば、直径が表カバーのそれと同じ、すなわち約５ｍｍのディスクであって、その濾過膜部は、表カバーの切り抜きの周囲および領域内にはまり込むものになっている。あるいは、濾過膜部は表カバーの切り抜きの周囲を超えてそのカバーの周囲の端にまで延びるような大きさを有する層である。もう一つの実施形態は、丸いディスクの形をした、すなわち、表カバーの切り抜き内にはまり込む切り抜きの形をした、少なくとも一つの濾過膜層を備える濾過膜部に向けられている。多層デバイスが、大きさが約２インチ×約３インチの長方形の形をしているならば、別の実施形態において、濾過膜部層は同じ形および大きさを有しており、表カバーの切り抜きが濾過膜部の一部を露呈している。一つの実施形態において、多層デバイスの一つ以上の層上に、例えば、濾過膜部、疎水膜および採集材のいくつかまたは全ての層上に、切り抜きの輪郭が描かれている。
【００７８】
カバーとそれらの間にある層は、好ましくは、本の背に類似する一つの側面で結合されており、ここで介在する各層は取り除いたり取り外したりできる。あるいは、カバーの全ての端部が、閉じた位置における形で結合されているか、一時的に結合されている。例えば、いくつかのまたは全ての端部にミシン目が入っていて、いくつかの層が分離および取り除き可能となっている。多層デバイスの全ての層が結合されて、表部と裏部が閉ざされて接触していると、変質し難い本の形のカードをサンプル採集に用いることができる。
【００７９】
多層デバイスの一つの実施形態は、全血液サンプルを処理し、血液成分を分離し、かつ分析対象を検出する、長方形の、本の形をしたカードに向けられている。製品の層には、間に介在する層を挟む表カバーと裏カバーとが含まれ、ここで、表カバーには、切り抜き、窪みまたは開口が４つあり、表裏の支持カバーは、多層デバイスの少なくとも一つの側面または端部で接続され、開閉されるようになっている。表カバーに隣接してその下にあるのは濾過膜で、それは第一の濾過膜と第二の濾過膜とを備える。表カバーにおいて、切り抜きがあるところはどこでも濾過膜部の第一の濾過膜が露呈されている。そうでなければ、表カバーは、第一の濾過膜とその下にある層を覆っている。別の濾過膜または第二の濾過膜は、第一のまたは最上位の濾過膜に隣接してその下にあり、体液サンプルが、第一のまたは最上位の濾過膜の表面から下方に流れて、濾過膜部の第二の濾過膜の裏面を通って流れる。濾過膜部に隣接してその下にあるのが、疎水膜層で、それもまた支持カバーと同じ大きさを有する。濾過膜部とその下にある疎水膜は、共に、表カバーに一時的に結合されて、表部を形成している。そのような形をとることで、表カバーが持ち上げられるとき、濾過膜部と疎水膜部の下にある全ての層も一斉に同時に持ち上げられる。それらの層のいくつかまたは全ては、引き続いての分析のために、その、本の形をした多層デバイスから取り除かれる。例えば、濾過膜部と採集材層は、一時的に取り付けられているか、少なくとも一端または一側面にミシン目が入っていて、そのミシン目で取り除くか破り取るかし、それによって引き続いての分析のために層を分離する。
【００８０】
本の形をした多層デバイスカードにおいて、疎水膜層に隣接して、その下にあるのが採集材層であり、それは、好ましくは、ユーザーが、全血サンプルから回収される血漿を含むサンプルが最初にどこに置かれたかを観察できるように、表カバーの円形の切り抜きを描く輪郭を有するが、そうでなくとも良い。
【００８１】
もう一つの実施形態には、自動分析のためのウィンドウ支持層、好ましくは、オンライン検索可能ウィンドウ支持層が含まれており、それは、採集材と結合されて、そのウィンドウ支持層が採集材を、とりわけ、全血液サンプルから分離された血漿が斑となっている輪郭が円形の切り抜きを、露呈する開口またはウィンドウを有するようになっている。採集材は、大きさがカバーよりも小さいかまたはカバーと同じである。ウィンドウ支持体には、それらに限定されるものではないが、ＱＲコード（登録商標）またはクイックレスポンスコードを含むバーコードなどの識別が可能なマークがついていて、そのマークには、サンプル番号、サンプルの患者または被験者の識別子あるいは名前、サンプルを特定するためのその他の情報ならびに、それらには限定されないが、時間のトラッキング、書類管理、ＵＲＬ、ＧＰＳなどを含むその他の情報が含まれている。
【００８２】
一つの実施形態において、開口またはウィンドウのあるウィンドウ支持層、好ましくは、オンライン検索可能ウィンドウ支持層が、疎水膜層に隣接して、その下に位置している。採集材には、オンライン検索可能ウィンドウ層の下側に添付されるか結合されるかする縁端があって、採集材の、濾過されたサンプルが斑をなす輪郭が円形のところが、オンライン検索可能ウィンドウ支持層のウィンドウの開口を通して露呈されている。採集材の周囲をウィンドウ層の下側に添付することで、漏れのない表面領域ができるが、ここで、採集材の周囲は、ウィンドウの開口を超えて延び、密接した、漏れのない物理的な接触をなしている。採集材に結合されるオンライン検索可能ウィンドウ層は、採集材と一緒に、少なくとも一つのミシン目の入った端部で多層デバイスから取り除かれるが、その端部もまた、本の形をした多層デバイスの背を形成する。採集材を備えるオンライン検索可能ウィンドウ層は、採集材の内容に影響を及ぼさずに、ミシン目で破ることで多層デバイスから取り除かれる。あるいは、オンライン検索可能ウィンドウ層は、採集材を挟む２つの層を備えており、ここで、採集材の、輪郭が円形の切り抜きが、オンライン検索可能ウィンドウ層の２つの層の各々においてウィンドウから露呈される。採集材を挟む二層が合わさったオンライン検索可能ウィンドウ層は、さらなる分析、とりわけ関心のある分析のために多層デバイスから取り外されたり切り離されたりする。
【００８３】
多層デバイスで用いられる別の支持層は、多層デバイス構造全体を通して見られるのと同数の切り抜きを含む接触支持層である。この接触支持層は盛り上がっていて、体液サンプルが多層デバイスの全ての層と接触するのに役立っている。たとえこの支持層がなくとも、全血成分の濾過と分離は行い得る。しかしながら、この盛り上がった支持層が含まれることで、濾過膜層、疎水膜層および採集材層の物理的な接触が確かなものとなり、そのことは、均一なサンプル斑の形成と収量とが優れたものになるのに寄与している。多層デバイスの表部と裏部が閉ざされた形になって接触している時、盛り上がった接触支持層は、層の物理的な接触を介して完全な濾過に役立っている。もう一つの実施形態において、濾過膜部と採集材との間の物理的な接触を確実なものとする接触支持層が、ウィンドウ支持層の単数または複数のウィンドウ内の採集材部分に隣接してその下にある。この接触支持層は、例えば、カード用紙、プラスティック、または比較的堅固であるか同様の材料でできている盛り上がったディスクを含み、ここで表層の切り抜きは、輪郭が円形である採集材の切り抜きと整列して配置されている。盛り上がった接触支持体は、ディスクまたはサイズの異なる盛り上がった基台を備えており、ここで、基台の一つは切り抜きと同じサイズで、その下にある基台が切り抜きのサイズよりも直径が少しだけ大きい。別の形付けとしては、表裏のカバーと同じ大きさを有する全体支持層が含まれており、その支持層の盛り上がった部分が、円形のサンプルの切り抜き位置と整列しており、かつ支持層の残りの領域は、盛り上がりがなくて表裏のカバーの大きさまで延びている。もう一つの実施形態が含むのは、接触支持体を含む裏カバーであり、それによって、裏カバーに二重の機能が備えられている。
【００８４】
さらなる実施形態は、本多層デバイスにおいて記述されるような特徴の全てを含み、かつさらに全血サンプルの異なる成分を含有する濾過膜に結合されて、それに隣接する別のウィンドウ支持層を含む。多層デバイスから切り離されるか取り外されるかするとき、その合わさったウィンドウ支持層と濾過膜によって、合わさったウィンドウ支持層と採集材と同じように、関心のある分析対象を引き続いて分析することが可能となる。
【００８５】
この、本の形をした多層デバイスカードの実施形態において、裏部は、ウィンドウ支持層と、採集材と、接触支持層と裏カバーとを備え、これらすべての層は、その、本の形をした多層デバイスの同じ端部の少なくとも一つで、一時的に結合されるか、取り外し可能に結合されている。その、合わさった裏部は、望まれるときに表部と接触状態にされ、あるいは、多層デバイスのいくつかのまたは全ての層を切り離すか取り外すことが可能となるように分離される。
【００８６】
もう一つの実施形態は、多層デバイスに向けられており、それは、
【００８７】
ａ）濾過膜部を備える表部と、
【００８８】
ｂ）少なくとも一つの裏部を備える裏部と
を備え、
前記表部は、前記裏部に接続されるか結合されるか固定されるかしており、前記濾過膜部は、少なくとも一枚の濾過膜を備え、前記濾過膜部は、表面と裏面とを有し、前記採集材は、表面と裏面とを有し、かつ前記濾過膜部の前記裏面は、前記採集材の前記表面に隣接するかその上にある。表部は、濾過膜部の下にあるかそれに隣接し、かつ採集材の上にあるかそれに隣接する疎水膜を選択的に含んでいる。この多層デバイスは、カード用紙かその他の丈夫な構造体を用いるか、あるいは、付加的な製作や３Ｄプリントで製造される。
【００８９】
もう一つの実施形態により多層デバイスが提供され、それは、
【００９０】
ａ）少なくとも一つの切り抜きか穴がある表カバーの層と、各切り抜き内の濾過膜部の層とを備える表部と、
【００９１】
ｂ）採集材の層と裏カバーの層とを備える裏部とを備え、
【００９２】
前記表部は、前記裏部に接続されるか結合されるか固定されるかしており、前記濾過膜部は、少なくとも一枚の濾過膜を、好ましくは、各々が前記切り抜きまたは穴の形を有し、細孔のサイズが減少していく２枚の濾過膜を備えている。少なくとも一つの切り抜きまたは穴は、表カバーと、もし使われているなら疎水膜の、切り抜きまたは穴が同じである限り、例えば、それらに限定はされないが、円形、長円形、三角形、正方形、長方形、平行四辺形、ひし形、五角形、六角形、七角形、八角形などを含むいかなる形でも良く、前記濾過膜部は、好ましくは、前記表カバーの前記切り抜きまたは穴の内に位置して前記裏部に隣接しており、前記濾過膜部は、前記採集材に隣接しており、かつ前記採集材は、前記裏カバーより上にあってそれに隣接している。一つの実施形態における濾過膜は、表カバーと裏部との間に挟まれている。あるいは、濾過膜は、表カバーおよび／または疎水膜の切り抜きまたは穴とは異なる形であっても良い。例えば、一つの実施形態において、表カバーの穴または切り抜きは、円形であり、一方、表カバーの穴または切り抜きの下にある濾過膜部は、その、少なくとも一つの穴または切り抜きの下に十分位広がる大きさであって、好ましくは、表カバーの全ての穴または切り抜きの下に広がる長方形である。しかしながら、この実施形態において、その長方形の濾過膜部には、境目または境界があって、表カバーの切り抜きまたは穴に体液サンプルを充当した後のサンプル斑を中心に集め、濾過膜部が血漿を吸収するのを防いでいる。境界または境目のある濾過膜部を含むことで、疎水膜をなくすことも可能となるが、効果を増すためになおも選択的に用いられても良い。もし疎水膜が用いられるなら、それは、表カバーに提供されている切り抜きまたは穴と、形と大きさが同じ切り抜きまたは穴を、表カバーと同じ数だけ有している。もしその疎水膜が用いられるなら、好ましくは、それは、採集膜の下にあってそれに隣接しているが、しかしながら、別の実施形態においては、疎水膜は、採集材の上にあってそれに隣接していても良い。別の観点における採集材は、前記表部と前記裏カバーとの間に挟まれている。多層デバイスは、４つの端部を有する長方形の形をしているが、表部または裏部の各層は、少なくとも一つの端部で、好ましくは少なくとも２つの端部で、さらに好ましくは少なくとも４つの端部で、一時的に結合されており、かつ表部および裏部の各層は、切り離しまたは取り外しが可能である。この多層デバイスは、３Ｄプリントによって製造されている。
【００９３】
もう一つの実施形態は、血液成分を分離する、３Ｄプリントによる多層デバイスであって、それは、
【００９４】
切り抜きが４つあって、それら４つの切り抜きの各々の内にはまり込むディスクの形をした濾過膜を少なくとも一枚有する表カバーの層を備える表部と、
【００９５】
ウィンドウ支持体に添付される採集材の層と、接触支持体を有する裏カバーの層とを備える裏部とを備えており、
【００９６】
前記表部は、前記裏部に隣接してそれと密接に結合するか接続するかし、ここに記述される多層デバイスの中間の層を挟んでおり、血液成分を十分に分離する各濾過膜が、前記表カバーの前記切り抜きの各々の内に位置して前記裏部に隣接しており、前記濾過膜の各ディスクは、前記採集材に隣接しており、かつ前記採集材は、盛り上がった接触支持体を含む前記裏カバーの上にあってそれに隣接している。一つの実施形態における濾過膜は、表カバーと裏部との間に挟まれている。採集材は、前記表部と、接触支持体を有する前記裏カバーとの間に挟まれている。多層デバイスは、端部が４つある長方形の形をしていて、表部と裏部の各層は、多層デバイスの少なくとも２つの端部で一時的に結合されており、表部と裏部の各層は、それに隣接する層に密接に接触しており、かつ各層は、切り離しや取り外しが可能である。
【００９７】
一つの実施形態は、約２０マイクロリットルの全血を、多層デバイスの各切り抜き内の濾過膜ディスク（〜９ｍｍ厚）に充当して、約３分間室温に保温することに向けられている。分離された血液成分が一旦乾くと、多層デバイスを分解して、濾過膜層と採集材層とを取り外す。その、一枚以上の濾過膜ディスクは、その上に採集された赤血球の細胞分析にかけられ、採集材上の乾燥した血漿斑が、化学分析にかけられる。
【００９８】
一つの実施形態において、多層デバイスに備えられるのは、３Ｄプリントによる表カバーと、接触支持体を有する裏カバーと、ウィンドウ支持体で、そのウィンドウ支持体を通して、開いたウィンドウを覆う採集材層と接触支持体が物理的に接触している。表カバーは、濾過膜部を置く少なくとも一つの、好ましくは４つの切り抜きを備え、また濾過膜部は、少なくとも一枚の濾過膜ディスクを、好ましくは非対称濾過膜ディスクを２枚備え、それらは表カバーの切り抜き内にはまり込んでいる。非対称濾過膜ディスク２枚が積み重なって濾過膜部を形成すると、一方の濾過膜ディスクが、他方の濾過膜ディスクの上に乗って、上部濾過膜ディスクと下部濾過膜ディスクとを備える濾過膜部を形成し、ここで各濾過膜ディスクには表面と裏面とがあり、体液サンプルは最初に上部濾過膜ディスクの表面に接触し、また下部濾過膜ディスクの裏面は、採集材層に隣接し、一方、濾過膜部は、表カバーと採集材との間に挟まれる疎水膜の周囲内にある。別の実施形態として考えられるのは、濾過膜部層、すなわちディスク型でないものであって、濾過膜部層には境界または境目があって、サンプル斑を中心に寄せ、濾過膜部が血漿を吸収することを妨げ、それによって疎水膜を必要のないものとしている。好ましくは、２枚の濾過膜ディスクからなる濾過膜部の裏面は、ウィンドウ支持体に取り付けられるか添付される採集材層に流動的に接続され、ここで採集材は、ウィンドウ支持体の開いたウィンドウを覆っている。ウィンドウ支持体は、採集材層を超えて、表カバー層の端部まで延びる。そのウィンドウ支持体のウィンドウを通して、裏カバーの接触支持体が、採集材層と接触するように置かれている。
【００９９】
３Ｄプリントによる多層デバイスであって、
【０１００】
（ａ）少なくとも穴が一つ、好ましくは穴が４つある表カバーと、濾過膜部と、少なくとも穴が一つ、好ましくは穴が４つある疎水膜とを備え、前記表カバーの穴の数は、前記疎水膜の穴の数と同じである表部と、
【０１０１】
（ｂ）採集材の層と、ウィンドウ支持体の層と、盛り上がった接触支持体を有する裏カバーの層とを備える裏部とを備えており、
【０１０２】
前記表部は、前記裏部に接続するか密接に結合するかして多層デバイスの中間の層を挟んでおり、前記濾過膜部は、濾過膜ディスクを２枚備え、前記濾過膜部は、上部濾過膜ディスクと下部濾過膜ディスクとを備え、各濾過膜ディスクには、表面と裏面とがあり、前記上部濾過膜ディスクの前記裏面は、前記下部濾過膜ディスクの前記表面に隣接しており、前記濾過膜部は、血液成分を分離しまたは十分に分離し、前記表カバーの４つの穴の各々の周囲内に中心を同じくして位置し、かつ前記濾過膜部は、前記疎水膜の４つの穴の各々の周囲内に中心を同じくして位置し、前記疎水膜は、前記表カバーに隣接し、前記疎水膜は、前記採集材に隣接し、かつ前記採集材は、前記裏カバーの前記盛り上がった支持体に隣接している。多層デバイスは、表カバーと、ウィンドウ支持体と、裏カバーとの、３Ｄプリントによる各層を備えている、多層デバイス。
【０１０３】
もう一つの実施形態において、多層デバイスは、表カバーと裏カバーの各層が３Ｄプリントによって備えられており、前記表カバーは、少なくとも一つの穴、好ましくは４つの穴を備え、濾過膜部は、少なくとも一つの濾過膜ディスク、好ましくは２つの濾過膜ディスクを備え、前記濾過膜部は、上部濾過膜ディスクと下部濾過膜ディスクとを備え、各濾過膜ディスクには、表面と裏面とがあり、前記上部濾過膜ディスクの前記裏面は、前記下部濾過膜ディスクの前記表面に隣接し、前記濾過膜部は、前記表カバーの４つの穴の各々の周囲内に中心を同じくして位置しており、また、
【０１０４】
前記裏カバーには、採集材を固定するか、あるいは、疎水膜と前記採集材とを固定するための縁がある溝または窪みがあって、前記疎水膜は、前記表カバーと前記採集材とに隣接し、前記溝または窪みには、前記表カバーの前記穴と整列して位置する盛り上がった接触支持体が含まれており、前記盛り上がった接触支持体は、もしあるならば、前記疎水膜の前記穴と整列して位置しており、前記疎水膜は、前記表カバーに隣接し、前記疎水膜は、前記採集材と前記採集材とに隣接し、かつもしあるならば、前記疎水膜は、濾過膜部と採集材とが流動的に接続され、かつ前記表カバーが、前記裏カバーに結合され、添付され、または固定されるように、前記溝または窪みの中に固定されている。
【０１０５】
濾過膜部は、好ましくは、前もって形成され、かつ前もって定められた量のサンプルを含むディスクの形をした少なくとも一枚の濾過膜を備えている。採集材層上の全血血漿成分のフロースルー溶出を用いるシステムを、質量分光測定と組み合わせて用いるか、あるいは血漿を含む採集材の一部を打ち抜くことによって、採集材層の定量分析を行うことができる。打ち抜かれたサンプル斑のサイズが、較正曲線のサンプルにおいて用いられるもののサイズと同じである限り、採集材層の斑のサイズを気にしなくともよく、それは、前もって定められた量の体液サンプルが、濾過膜部に、すなわち、濾過膜で前もって形成されたディスクに、充当されたからである。これがとりわけ利点となるのは、例えば、容積測定ピペットやマイクロピペットのような容量測定制御デバイスを用いずに多層デバイスに指腹で採血した全血を充当するときである。典型的には、そのような容量測定制御がなければ、体液サンプルの量がバラバラとなり得るので、異なる量の血液から生成される血漿斑のサイズは、分析用の採集材から所定サイズの斑を打ち抜き、かつ同じサイズの斑を較正サンプルに用いることによって分析される。それで、乾燥した血漿斑のフロースルー溶出か、同じサイズのサンプル斑および較正斑かが、引き続いての分析のためのフロースルー溶出以外の技法として用いられる。
【０１０６】
血漿の部分斑ではなく、全体斑を分析に用いるならば、ピペットのような容量測定制御デバイスを用いて既知量の全血サンプルを適用することと、その全血サンプルのヘマトクリットレベルを調節することという２つの条件の元でもまた、定量分析を行うことができる。これらの条件によって、血漿斑のサイズを固定することができる。従って、血漿の全体斑を定量分析に用いることができる。
【０１０７】
３Ｄプリントによる多層デバイスであって、
【０１０８】
（ａ）少なくとも穴が一つ、好ましくは穴が４つある表カバーと、濾過膜ディスクを少なくとも一枚、好ましくは、濾過膜ディスクを２枚備える濾過膜部とを備え、前記濾過膜部が、前記表カバーの穴の各々の内に位置している表部と、
【０１０９】
（ｂ）採集材の層と、盛り上がった接触支持体を有する裏カバーの層とを備える裏部とを備えており、
【０１１０】
前記表部は、前記裏部に接続するか密接に結合するかして多層デバイスの中間の層を挟んでおり、濾過膜ディスクを２枚備える前記濾過膜部は、上部濾過膜ディスクと下部濾過膜ディスクとを備え、各濾過膜ディスクには、表面と裏面とがあり、前記上部濾過膜ディスクの前記裏面は、前記下部濾過膜ディスクの前記表面に隣接しており、前記濾過膜部は、前記表カバーの穴の各々の周囲内に中心を同じくして位置し、かつ前記濾過膜部は、盛り上がった各接触支持体の上に中心を同じくして位置し、前記採集材は、前記採集材に隣接し、前記裏カバーは、前記表カバーの前記切り抜きの各々の内に位置し、前記濾過膜部は、前記採集材に隣接し、前記採集材は、盛り上がった接触支持体を有する裏カバーに隣接してそれに固定されている。
【０１１１】
この３Ｄプリントによる多層デバイスは、サンプル間での汚染を回避するために処理するか、あるいは注意深く消毒して浄化し、新しいまたは未使用の濾過膜ディスクおよび採集材とともに複数回使用しても良い。好ましい実施形態が３Ｄプリントによる多数デバイスに向けられていて、それは、ここに記述され、採集したサンプルを改竄されないよう安全に保管する多層デバイスを結果として生じる、様々な方法のうちのいずれかを用いて作製される。
【０１１２】
［方法／多層デバイスの使用法］
さらなる実施形態は、興味のある分析対象のための体液サンプルを分析する多層デバイスを用いる方法、またはその使用法に向けられている。方法は、例えば、全血のような生体液サンプルを濾過膜部の表面に充当し、その体液サンプルが濾過膜部を通過して採集材上に採集されるのに十分な時間だけサンプルを濾過し、濾過膜部を採集材から分離して、例えば、赤血球が濾過膜部上に捕獲または採集され、血漿が採集材上に捕獲または採集されるものとし、かつ人の手であるいは自動手段による別の実施形態において、望まれる分析対象について分離されて採集されたサンプルを分析するステップを備える。例えば、その分析は自動化されるかオンライン化され、ここで、分析対象は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分光分析（ＭＳ）、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどによって分析される。分析に先立って、一つの実施形態においては、直接溶出および固相抽出（ＳＰＥ）によって分析対象が抽出される。液体サンプルは、約７０μｌ未満、約５０μｌかそれ未満、約２５μｌかそれ未満などのように、少量である。この方法の利点は、遠心分離を用いずにそれを行え、迅速で正確な方法であるというものである。
【０１１３】
もう一つの実施形態は、多層デバイスを用いる方法に向けられていて、それは、
【０１１４】
ａ）（ｉ）体液サンプルを置くか入れるかする切り抜きまたは開口が少なくとも一つある表カバーの層と、濾過膜部の層と、疎水膜の層とを備える表部と、（ｉｉ）採集膜の層と、切り抜きや開口のない裏カバーの層とを備える裏部とを備える多層デバイスであって、濾過膜部は、多層デバイスの表カバーの切り抜きから露呈されており、表部は、前記裏部に隣接しており、表部と裏部とは、物理的に接触して閉じられている多層デバイスに、例えば、ある量の全血など、柔軟な量の体液を多層デバイスに充当するステップであって、体液サンプルは、約１０マイクロリットルから約５０マイクロリットルまでの範囲にある柔軟な量を有し、多層デバイスは、少なくとも一つの濾過膜と、疎水膜と採集材とを備えているステップと、
【０１１５】
ｂ）体液サンプルの充当後、約３分間または体液サンプルを濾過するのに十分な時間だけ待機するが、ここで、表部は、閉じられた形で裏部と接触しているステップと、
【０１１６】
ｃ）濾過膜部層および／または採集材を多層デバイスから分離しまたは取り除くが、ここで、濾過膜部と採集材は、各々、体液サンプルの異なる成分を含んでいるステップと、
【０１１７】
ｄ）約３０分間または、濾過膜部上および採集材上の体液サンプルの成分が十分に乾燥するまで待機するステップと、
【０１１８】
ｅ）関心のある分析対象について、乾燥した体液サンプルの成分を含む濾過膜部および／または採集材を分析するステップを備えている。
【０１１９】
もう一つの実施形態は、多層デバイスを用いる方法に向けられていて、それは、
【０１２０】
ａ）ある量の全血を前記多層デバイスの前記濾過膜部に充当するステップと、
【０１２１】
ｂ）前記全血の血液成分を分離するのに十分な時間だけ待機するステップと、
【０１２２】
ｃ）前記多層デバイスを保管するステップを備えている。
【０１２３】
例えば、ドーピングのためにテストを受ける必要があるアスリートは、ここに記述される多層デバイスを得て、指腹での採血技法を用いることで、ある量の全血を切り抜きの各々に充当して、その全血サンプルの血液成分が分離し、またはその血液成分が乾燥するのに十分な時間だけ待機した後、そのアスリートは、多層デバイスを適切に保管し、その多層デバイスを現場または離れた施設に返却するか送るかして分析を行い、そのアスリートがクリーンであるか、すなわち、全血サンプルに許可されていない薬物または生体成分が混入していなかったか、あるいはドーピングしていた、すなわち、全血サンプルに許可されていない薬物または生体成分が存在していたかを測定する。
【０１２４】
施設が、サンプルを含む多層デバイスを一旦受け取ると、その方法は、さらに、
【０１２５】
ｄ）前記濾過膜部と前記採集材とを前記多層デバイスから分離し、ここで、サンプルは、分離されて乾燥されているステップと、
【０１２６】
ｅ）サンプルを含む前記濾過膜部および／または前記採集材を分析するステップを備えている。テストに従って、内部標準、正の対照および負の対照もまた用いられる。
【０１２７】
全血サンプルが、ここに記述された多層デバイスで、採集され、分離され乾燥された後、濾過膜部および採集材が多層デバイスから分離されて、業界で普通に用いられる既知の技法を用いて別に分析が行われる。これらの技法に含まれるのは、液体クロマトグラフィータンデム質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、ＵＶ検出付きの高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー高解像度質量分光分析（ＬＣ−ＨＲＭＳ）、液体クロマトグラフィー経過時間／質量分光分析（ＬＣ−ＴＯＦ／ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィータンデム質量分光分析（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、ＨＰＬＣダイオードアレイ検出（ＨＰＬＣ−ＤＡＤ）、ガスクロマトグラフィー負イオン化学イオン化質量分光分析（ＧＣ−ＮＩＣＩ−ＭＳ）、ＨＰＬＣ感度増強蛍光検出器（ＨＰＬＣ−ＦＬＵ）、ＬＣ／ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化ＴＯＦ（ＥＳＩ／ＴＯＦ）、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化ＴＯＦ（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）、四極経過時間（ＱＴＯＦ）イオン捕獲、オルビトラップ、誘導結合プラズマ／ＭＳなどであるが、それらに限定されるものではない。
【０１２８】
体液サンプルまたは全血サンプルが、表カバーの少なくとも一つの切り抜きを通して濾過膜部に充当されるとき、多層デバイスは開いた形でも閉じた形でも良い。多層デバイスが閉じた形にあるのは、表カバーと、濾過膜部と、疎水膜を有する表部と、採集材と、選択的にウィンドウ支持体と、選択的に接触支持体と裏カバーの各層を有する裏部とが、疎水膜および採集材を介して接触している時である。開いた形にあるのは、表部と裏部とが接触していない時、すなわち表部の疎水膜と裏部の採集材が分離しているか接触していないときである。一つの実施形態は、ある量の体液サンプルが充当されるとき閉じた形にある多層デバイスに向けられている。もう一つの実施形態は、最初にある量の体液サンプルが充当されるとき開いた形にあって、その充当の直後から各層が分離されるまでの最初の待機期間、好ましくは約３分間、閉じられている多層デバイスに向けられている。最初の待機期間は約３分間かそれよりも長い時間で、全体液サンプルが濾過されるのに十分な時間である。
【０１２９】
本発明の多層デバイスの一つの利点は、全血のような体液サンプルを異なる成分に分離するのに遠心力を使わずに済むことである。全血液サンプルを遠心分離すると例えば、赤血球を血漿から分離することが可能となる。しかしながら、これは厄介な処置であってさらには必要な体液サンプルの量がずっと大きくなる。ここに記述される多層デバイスによると、遠心分離や、過度に多量の体液サンプルを用いずに血漿を迅速に得る簡単な方法が可能となる。従って、一つの実施形態におけるこの簡単な用法によって、競技中のまたはそうでなくともアンチドーピングのテストが可能となる。この用法の別の実施形態は、例えば、製薬技術においての薬の発見および開発での使用にある。
【０１３０】
業界において利用可能な方法における障害は、サンプル量が一定で限られた量の範囲内になければならないことである。テストのために充当される体液量が少なすぎたり多すぎたりすると、分析が正確でなかったり結果が無効になったりする。しかしながら、本発明の多層デバイスの利点の一つは、広く柔軟な充当量を正確にかつ定量的に処理できる能力にあり、ここでは、サンプルを採集する間に確実に正確な量をサンプリングする必要はない。多層デバイスの丈夫さは、業界における現在の方法において大きく改善されている。例えば、本多層デバイスに有用な、柔軟な、サンプルの充当量は、全血では約１０マイクロリットルから約５０マイクロリットルであり、ここで、多層デバイスの各切り取り領域が受ける量は様々であるが、なおも結果的には正確な分析が行えている。
【０１３１】
引き続いての分析のために採集されたサンプルの量が誤って低くなってしまうことが業界の別の妨げである。しかしながら、利点のある実施形態においては、ここに記述される本多層デバイスが、大量または柔軟な量のサンプルを処理できるだけでなく、例えば、採集材から大量の血漿を採集することもできることが見出された。例えば、採集された量は、約４マイクロリットルかそれ以上から約１５マイクロリットル、例えば、約４．６マイクロリットルから約１４．７マイクロリットルであるがそれに限定されるものではない。表３には、最初の全血量と、濾過膜２枚を備える多層デバイスを用いて結果的に採集される血漿が示されており、ここでの、１マイクロリットルの血液に対する０．３マイクロリットルの血漿は、従来よりも約３倍大きい。採集される赤血球の量（ＲＢＣ）は、例えば、約５μｌから約１００μｌ、より一般的には、約１０μｌから約５０μｌの範囲にある全血サンプル量を含み得る、指腹で採血されたもののような、ここに記述される多層デバイスに充当される全血の量と、採集された全血サンプルのヘマトクリットの直接関数である。ヘマトクリットは、血漿との釣り合いにおいて、血液におけるＲＢＣのパーセントである。ヘマトクリットは、全血サンプルにおいては約３０％から約８０％、より一般的には約３０％から約６０％の範囲にあり得る。
【０１３２】
ここに記述される多層デバイスは、サンプル採集に関する課題を克服している。テストに必要な体液サンプルは極少量であるので、静脈採血士は必要ではない。例えば、全血のサンプルを得るのは、最初に、指腹や踵の、突き刺す領域をアルコールで拭いて消毒し、その領域を消毒した使い捨てのランセットで突き刺すことにより、そうでなければ全血マイクロサンプリングとして知られているものによる。マイクロサンプリングは、主として、例えば、げっ歯類、犬、馬および人間のような哺乳類に用いられる技法であって、被験体のサイズに関わらず被験体への影響が無視できるまでに繰り返し採血される血液量が低減されている。マイクロサンプリングのこれらの利点は、重病人や、新生児や、未熟児に特に関係があって重要であり、ここで、血液サンプルを規則的に収集すると幼児の健康に有害であり得る。そのような病気の幼児から診断テストのためにマイクロリットル量のサンプルを複数回採集しても、今日までの習わし通りミリリットル量のサンプルを取るよりも、彼らの身体に対しての要求や実害がずっと少なくなる。小さな体液サンプルを採集するのは、この技法によるもので、それには、毛細管マイクロサンプリング、ラブオンナチップデバイスその他の少量デバイスが含まれるがそれらに限定されない。乾燥マトリクス斑はまた、血液（乾燥血液斑−ＤＢＳ）や血漿（乾燥血漿斑−ＤＰＳ）、または汗、尿、精液、羊水、涙などについても採集され、「Ｘ」で表される（乾燥Ｘ斑−ＤＸＳ）。
【０１３３】
液体血漿マイクロサンプリングは、全血の採集を含む技法であって、例えば、ＭＹＬＡＲ（登録商標）被覆の毛細管、好ましくは重合体プラグを含むものを用い、その管を遠心分離して赤血球から血漿を分離する（サンプルの大きさによる、赤血球は約７０マイクロリットルの量になる）（ボウエンＣ．Ｌ．他（２０１２）質量分光分析についての第６０回ＡＳＭＳ会議の会報、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー、ＷＰ４９３）。全血の毛細管採集は記述された発明において有用であるが、遠心分離を必要とする完全な技法は好ましい方法ではなく、それは、それが分離のために時間またはコスト効率の良い手段を提供するものではなく遠心分離の追加の処理を必要とするからである。また、液体血漿マイクロサンプリングは、全血細胞サンプルを採集して分離する本発明の手段と比較して出荷および保管費用が節約されるものではない。
【０１３４】
本発明の多層デバイスが克服する、業界において問題の別の課題は、大きく広いヘマトクリット範囲を有する全血の濾過である。一つの実施形態において、本発明は、都合が良いことに、約３０％から約６０％ヘマトクリットレベルという広くて高いヘマトクリットレベルを有する全血を、新規の多層デバイスを通して、溶血を引き起こすことなく濾過する。より広いヘマトクリット範囲を濾過しても不利な結果を引き起こすことはない。ユニークな濾過膜部の構成によってそのような広いヘマトクリット範囲の処理が可能となっている。
【０１３５】
当業者は、ＤＢＳを用いる上での障害を理解している。しかしながら、用法にいくつかの利点があり、また血漿のテストを製薬会社が好むという観点から、ここに記述される新規な多層デバイスは、ＤＢＳカードのあらゆる利点を備えるものとなり、何の不利益も被っていない。例えば、ヘマトクリットの偏りは仮説上存在しておらず、血液よりもむしろ血漿における薬物動態学（ＰＫ）が本発明の多層デバイスの利点となっている。
【０１３６】
［分析の応用］
ここに記述される多層デバイスは様々な分野で使用される。しかしながら、共通の一貫した特徴は、丈夫で、効率的で、信頼できる生体分析法をクロマトグラフィーおよび分光分析技法と結びつけて本製品を用いることである。有用な応用例には、薬品テスト、薬品の発見、および開発、ジェネリックのテスト、科学捜査分析などが含まれるがこれらに限定されるものではない。マイクロサンプリングの後、望まれる、体液サンプルの成分を濾過し、分離および採集し、分析対象を抽出したが、それは、直接溶出とその後に続く固相抽出（ＳＰＥ）によるものであったが、いくつかの実施形態においては、濾過膜および／または採集材層から得られる関心のある分析対象の存在を体液サンプル中に検出する自動分析法が適用され、それには液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどが含まれるが、それらに限定されない。例えば、細胞成分を含む採集材層もまた溶出され、その細胞成分は、業界で普通に知られて用いられている技法で温浸されて、それに続いて、細胞に関係する蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの様々な分析が行われる。本多層デバイスは、完全自動定量分析のための検査が可能であり、一つの実施形態においては、オンライン固相抽出を、直接またはＳＰＥ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを介して質量分析と結びつけており、それに続いてＳＰＥ溶出のクロマトグラフによる分離をＭＳまたはＭＳ／ＭＳに先駆けて行う。
【０１３７】
典型的な実施形態は、マイクロプロセッサ（例えば、インテル社、ＡＭＤまたはモトローラ製）、揮発性および不揮発性メモリー、一つ以上の大量蓄積デバイス（すなわち、ハードドライブ）、マウス、キーボードまたはマイクのような様々なユーザー入力デバイスおよびビデオ表示システムをその他の要素とともに有する、例えば、汎用コンピュータのようなコンピュータやサーバー上で実行される。それらのコンピュータやサーバーは、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＬＩＮＵＸ、ＭＡＣ  ＯＳまたはウィンドウズ（登録商標）（ＸＰ、ＶＩＳＴＡなど）を含むがそれらには限定されない多くのオペレーティングシステムのうちのいずれかでＯＳで稼働している。しかしながら、いかなるオペレーティングシステムでも本発明に適切なものを用いることができると考えられる。ほとんど全ての場合において、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳと結合した商業用のオンラインロボットシステムは、システムソフトウェアによって完全に制御されている。例えば、ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）ワトソンＬＩＭＳ（登録商標）のような研究機関情報管理システム（ＬＩＭＳ）が、記述された実施形態から得られる大量のデータを取り扱う情報管理システムの一例である。コンピュータやサーバーは、ウェブサーバーのクラスターであっても良いが、その各々はＬＩＮＵＸベースであって、ウェブサーバーのクラスターのいずれが、利用な可能なサーバーの、現在要求される負荷に基づいて要求を処理すべきであるかを決める負荷分散装置で支援される。
【０１３８】
コンピュータとサーバーはネットワークを介して接続されるが、それに含まれるのは、インターネット、ＷＡＮ、ＬＡＮ、Ｗｉ−Ｆｉその他のコンピュータネットワーク（現在知られているか将来発明されるもの）および／またはそれらの組み合わせである。当業者が、本明細書、図面、および特許請求の範囲を手にするならば、ネットワークは、様々な構成要素を接続するものであって、それは、銅、光ファイバー、マイクロウェーブ、およびその他の形の無線周波数、電気および／または光通信技法を含む、有線および無線のコンジットを組み合わせたものであるということを理解するものである。また、いずれのネットワークも、異なる方法で他のネットワークに接続されるということも理解される。システム１００におけるコンピュータおよびサーバー間での相互接続がその例である。いずれのデバイスも、一つ以上のネットワークを介して他のデバイスと交信できる。
【０１３９】
代表的な実施形態には、開示されたものを超えてさらなるデバイスやネットワークが含まれる。さらには、一つのデバイスによって実行されると記述された機能を、２つ以上のデバイスに分配して実行しても良い。複数のデバイスを組み合わせて単一のデバイスとしても良く、それによって組み合わせたデバイスの機能を実行する。
【０１４０】
ここに記述される様々な関係要素は、一つ以上のコンピュータ装置を稼働して、ここに記述される機能を促進する。サーバー、ユーザー端末またはデータベースを含む、前述の図面におけるいかなる要素も、ここに記述される機能を促進するために、いくつでも適切な数のサブシステムを用いて良い。
【０１４１】
本願に記述されるソフトウェアの構成要素や機能は、いずれのものも、例えば、通常のまたはオブジェクト指向的な技法を用いて、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋またはＰｅｒｌのような適切なコンピュータ言語を用いる少なくとも一つのプロセッサで実施されるソフトウェアコードまたはコンピュータ読み取り可能インストラクションとして実行される。
【０１４２】
ソフトウェアコードは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、ハードドライブやフロッピーディスクのような磁気媒体またはＣＤ−ＲＯＭのような光媒体といった、一時的ではないコンピュータ読み取り可能媒体に一連のインストラクションまたはコマンドとして蓄積される。そのようなコンピュータ読み取り可能媒体は、単一のコンピュータ装置上またはその内部に備わっており、かつシステムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ装置上またはその内部に存在している。
【０１４３】
前述の通り、本発明は、モジュールにおいてあるいは統合したやり方でコンピュータソフトウェアを用いる制御ロジックの形で実行できるということが理解される。ここに提示される開示や教示に基づけば、当業者であるならば、ハードウェア、ソフトウェアまたはハードウェアとソフトウェアの組み合わせを用いて本発明を実行する他のやり方および／または方法を思いついたり認識したりする。
［実施例］
【実施例１】
【０１４４】
［本の形をした多層デバイスの構成］
濾過膜部を、例えば、ＲＢＣ濾過ディスクを調整するために、直径５ｍｍのＨＡＲＲＩＳ  Ｕｎｉ−Ｃｏｒｅ（登録商標）パンチ（米国、アマゾン社）を用いてｉＰＯＣＤＸ（登録商標）膜フィルターシートを打ち抜いた。ＯＳＢＯＲＮＥアーチパンチ（米国、アマゾン社）を用いて、表カバーまたは表支持層に類似するカード用紙材を用いた直径５ｍｍの切り抜きディスクを備える裏支持層を調整した。図１に示されるように、各材料層を調整した後、最初にポリエステルの疎水膜層（４）を表カバーカード用紙（２）の下側の内側に置き、続いて上部カード用紙または表カバーを通しかつポリエステルの疎水膜層（４）を通して等間隔の穴を４つ打ち抜くことで、カードが組み立てられた。例えば、接着テープのような接着剤を用いて、裏カバーカード用紙（７）の内面に添付されたカバー支持カード用紙材の丸い２枚のディスクから、底が持ち上げられたまたは盛り上がった支持体（６）を作った。そして、セルロースをベースとする紙基板または採集材（５）を直接、底が持ち上げられたまたは盛り上がった支持体または接触支持層の上に置き、ここで、採集材は、サンプルを置く円の輪郭が、表カバーおよび疎水膜（４）の切り抜き穴と整列された。この、本の形をした多層カードには、わずかに異なるＲＢＣフィルター膜ディスクを２枚用いたが、一枚の大きい方（３）は、直径が約７ｍｍから約１１ｍｍであって、もう一枚の小さい方（１）は、直径が約４ｍｍから約６ｍｍであって、最後のステップは、これらの２枚のディスクをカード状または多層デバイス上に重ねておくことであった。大きい方のディスク（３）を、上部カード用紙の内側とポリエステルの疎水膜層との間に、開口した穴の整列を保ちながら挿入した。そして全ての層が接触するように本の形をしたカードを閉じた状態にした。多層デバイスを十分かつ完全に閉じるために、例えば、クリップを４つといった一時的なバインダーを用いる。最後に、小さい方の濾過膜ディスクを、穴が開口している上部カード用紙または表カバーの外側に置いた。そうすると、生体液サンプルを表カバーの穴内であって濾過膜上に置くことができた。
【０１４５】
多層デバイスカードは、異なる材料の層を支持するよう機能するカード用紙（０．３５０ｍｍ厚×７６．２ｍｍ幅×５０．８ｍｍ長）を折ったものであった。例示のために、折り曲げられたカード用紙の上部および下部支持層または支持カバーが引き離された形で図２に示されている。上面から見ると、濾過膜またはｉＰＯＣＤＸ（登録商標）膜ディスク（層１および３）を２枚備えた濾過膜部は、細孔の大きさが非対称であることを特徴としていた。上部ディスクまたは第一の濾過膜（層１）は、薄い方のｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｘ膜（表３５μｍ、裏５μｍ）であって、表３５μｍ裏２．５μｍのｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ膜ディスクである下部ディスクまたは第二の濾過膜（膜３）に密接して直接その上に位置していた。組み合わせて濾過膜部を形成すると、それら２枚のディスクは、溶血の証拠を示さずに、Ｈｃｔ  が６０％までの全血からＲＢＣを連続的かつ効果的に濾過して取り出すことができる。２枚のディスクのサイズ（上部−直径４ｍｍから５ｍｍかつ下部−直径７ｍｍから１１ｍｍ）を適宜選択して、様々なサンプリングの量に順応するようにしてサンプリング量が柔軟なカードの特性を得た。
【０１４６】
濾過速度が一様でなくＨｃｔレベルが異なることが問題であるならば、この課題を避けるように濾過膜が改変される。例えば、上部ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｘ膜にピンホールの穴を開けて小さな貫通孔とし、全血Ｈｃｔ値が多様であっても流れがより均質になるようにした。上部カード用紙または表カバーまたは支持層（層２）を打ち抜いて、濾過膜すなわちｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｘ膜の直径に合致する開口をカード用紙に開けた。これら開口の機能は、第一の濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｘ膜を、第二の濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ膜の上においてその中心に確実に位置させることであった。ＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）３２５６（層４）ポリエステル疎水膜層（０．０５８ｍｍ厚×７６．２ｍｍ幅×２５．４ｍｍ長）を打ち抜いて、直径５ｍｍの開口穴を開け、ＡＶＥＲＹ（登録商標）５６６７の簡単に剥がれる粘着テープで適切な位置に保った。このポリエステルの疎水膜層は、１）第二の濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ膜のフィルターを適切な位置に保ち、かつ２）採集材上に丸くて均質な血漿またはサンプル斑を得るために用いられた。血液が一滴、濾過膜部またはフィルターディスクに充当されると、３０秒未満で第一の濾過膜ディスクを通って血液が急速に拡散かつ吸収されることが目視において示された。水平面でＲＢＣよりも急速に血漿が拡散すると、その結果、第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ膜ディスクの端から血漿が溢れて採集材紙基板に流れ出ることも認められた。疎水膜のポリエステル層がなければ、こうした形で流れた血漿が吸収され始め、濾過膜部ディスクの端から採集材紙基板へと広がり始め、そうしてその結果、血漿斑の形が不均質、例えば、半円形または馬蹄形の斑になる。これを回避するために、第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇディスクと採集材紙基板との間に疎水膜のポリエステル層が入れられた。疎水膜ポリエステルと７ｍｍの第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇディスクとには５ｍｍの開口があり、第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇディスクと採集材セルロース紙基板との間が密接していたが、７ｍｍの第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇディスクとは２ｍｍのずれがあって、第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇディスクの端と採集材紙基板とが直接接触しないものとなっていた。このように、溶血の形跡を残さず丸くて均質な血漿斑が生成された。ポリエステル疎水膜の厚さもまた重要な役割を果たしており、採集材紙基板と、第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇとの間を最大限密接させるものであった。セルロースをベースとする紙基板採集材（層５）は、綿くずパルプから作られるＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）グレード６０１紙（０．１９０ｍｍ厚×７６．２ｍｍ幅×２５．４ｍｍ長）であった。盛り上がった支持体を含み、採集材紙基板の下に密接して位置する接触支持層（層６）は、適正な位置に保たれるカード用紙（直径１１ｍｍの裏ディスクと直径５ｍｍの表ディスク）から得られる丸いディスク２枚を積み重ね、濾過膜部、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）膜フィルターディスクと整列させて、ＡＶＥＲＹ（登録商標）８６６５粘着テープ（７６���２ｍｍ幅×２５．４ｍｍ長）で作製されたが、その接着によって、濾過、斑点付けまたは分析が干渉されない限りいかなる手段によって接着されても良い。裏接触支持体の機能は、採集材紙基板と、濾過膜部、より詳しくは、第二濾過膜、ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ膜との間の物理的な接触を確実に密接にするものである。この、本の形をした多層デバイスは、図１または図２に示されるように、カード一枚当たり４つまでの血漿斑および／または対照を生成する能力がある。多層デバイスカードは、血漿斑を３つ生成するよう構成されたが、それは、使用クランプの４ｍｍというサイズ内に、斑位置４に構成されるクランプヘッドの洗浄位置があるからである。
【実施例２】
【０１４７】
［血液中のオピオイドおよび刺激物のオンラインＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ生体分析と結び付けられる自動フロースルー溶出］
タンデム質量分析検出（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）分析を有する自動オンライン液体クロマトグラフィーに適切な遠心分離を必要とせずに血漿を生成できるヘマトクリット可能な多層デバイスを設計し、開発し、評価するために、全血のマイクロサンプリングから乾燥血漿斑サンプルを調整する多層デバイスが開発された。結果的に生成される乾燥血漿斑からの抽出が行われ、それに続いて、関心のある分析対象、この場合はオピオイドおよび刺激物の、オンライン固相抽出（ＳＰＥ）およびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定が行われた。様々な生理化学特性を有する４種のオピオイドと５種の刺激物が選択されてこの分析においてテストされた。
【０１４８】
一次蓄積溶液を３：７メタノール／水（ｖ／ｖ）で希釈することによって、一連の標準使用溶液が調整された。較正基準もまた、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬおよび１，０００ｎｇ／ｍＬに調整された。品質管理（ＱＣ）サンプルが、５ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび９００ｎｇ／ｍＬに調整された。
【０１４９】
ヘマトクリット測定デバイス−ＳｔａｔＳｐｉｎ（登録商標）ＣｒｉｔＳｐｉｎ（登録商標）（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック社）で最初のヘマトクリット（Ｈｃｔ）レベルを測定することによって、３０％、４５％および６０％のヘマトクリット（Ｈｃｔ）血液のサンプルが調整された。全血サンプルのＨｃｔレベルが測定された。全血を毛細管に入れ、デバイス中において１３，７００ｘｇで二分間回転させた。遠心分離の後、デバイスを用いてＨｃｔレベルを測定した。３０％、４５％および６０％Ｈｃｔの血液を調整するために、１ｍＬの血液を２ｍＬ  ＬｏＢｉｎｄ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）管に入れて３０００ｘｇ乃至５０００ｘｇで３分間回転させ、血漿からＲＢＣを分別した。最初のＨｃｔのレベルを測定して、Ｈｃｔレベルを望ましいものとするために、遠心分離された１ｍＬの血液にどれだけの血漿が加えられるかまたはどれだけの血漿がそこから取り除かれるかを決める計算が行われた。血漿量を調整した後、渦撹拌器でＨｃｔレベルの異なるサンプル間を優しく撹拌し、前述のサンプル調整法に従っての標準添加のために５００μＬが１．５  ＬｏＢｉｎｄ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）に移された。Ｈｃｔ効果の評価がＬＬＯＱ  ＱＣおよびＨＱＣで行われた。Ｈｃｔが４２％の血液を用いて較正曲線が調整された。
【０１５０】
１．５ｍＬ  ＬｏＢｉｎｄ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）管中で、Ｎａ２ＥＤＴＡを含む５００μＬの血液に１０μＬの使用溶液を添加して、全てのサンプルを調整した。続いて、調整されたサンプルは、２００ｒｐｍで撹拌しつつ３０分間３７℃に保温した。較正を行なう８点は、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬで、一方、ＱＣサンプルは、ＬＬＯＱ  ＱＣで５ｎｇ／ｍＬ、低ＱＣ（ＬＱＣ）で１５ｎｇ／ｍＬ、中間ＱＣ（ＭＱＣ）で３００ｎｇ／ｍＬおよび高ＱＣ（ＨＱＣ）で９００ｎｇ／ｍＬであった。保温した後、図１に示される、本の形をしたＤＸＳカードまたは多層デバイスを用いるＤＰＳ調整に先立って、サンプルを３０分間、室温下においた。
【０１５１】
短時間多層デバイスを閉じておいて、少量の血液（約１０μＬから約５０μＬ）を表カバーの切り抜き穴内の上部濾過膜ディスクに充当し、３分間多層デバイスを閉じたままにして濾過プロセスを完了させた。次に、濾過した血漿を含む採集材またはセルロース紙基板を回収した。この実施例においては、サンプリングウィンドウが取り除かれたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ２２６カードであるか、オンライン検査可能なウィンドウ支持層である、適当な紙カード用紙に採集材が添付された。あるいは、採集材は、オンライン検査可能なウィンドウ支持層に前もって添付されている。ＤＢＳＡの自動構成基準に合致するカード用紙であれば使うことができる。
【０１５２】
１．５ｍＬ  ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）管において、１０マイクロリットル（μｌ）の使用溶液を抗凝血剤が添加された５００μｌの全血に加えた。そして、サンプルは２００ｒｐｍの撹拌スピードで３０分間３７℃に保温された。サンプルは、乾燥血漿斑の調整に先立って少なくとも３０分間室温で平衡状態に保たれた。
【０１５３】
少量の全血サンプル（約１５μＬから約５０μＬ）を、体液サンプルを採集するための切り抜き円内の閉じられた多層デバイス、すなわち濾過膜部上に充当して乾燥血漿斑が調整された。３分後にその多層デバイスを開けた。血漿は採集材上に吸収されており乾燥血漿斑を形成していた。乾燥血漿斑を含む採集材を取り外し、自動オンライン分析対象分析に先立って３０分間さらに室温で乾燥させた。ヘマトクリットレベルが６０％のサンプルには溶血がなかったということが認められた。
【０１５４】
関心のある分析対象（および内部標準）に含まれていたのは、モルヒネ（およびモルフィン−ｄ３）、コデイン（およびコデイン−ｄ３）、オキシコドン（およびオキシコドン−ｄ６）、ヒドロコドン（およびヒドロコドン−ｄ３）、アンフェタミン（およびアンフェタミン−ｄ５）、メタンフェタミン（およびメタンフェタミン−ｄ５）、３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）（およびＭＤＤＡ−ｄ５）、フェンテルミン（およびフェンテルミン−ｄ５）およびメフェドロン（およびメフェドロン−ｄ３）である。
【０１５５】
柔軟なサンプリング量という特徴。上述の通り、本の形をした多層デバイスカードは、構造上、ＲＢＣ濾過膜ディスク（ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）ＸおよびＳ／Ｇ膜フィルター）を２枚用いており、Ｈｃｔレベルが６０％までのサンプルについてＲＢＣを連続して効率的に濾過して取り出し、血漿を得るものである。ディスクのサイズは、充当量に依存して決められる。重要なポイントは、ディスクが血液で満たされすぎたり満たされなかったりすることを避けることにある。過度に満たされると、濾過能力の過剰な飽和を引き起こし、その結果全血がディスクの端を通って流出してしまう。満たされなければ、血漿の一部がディスクに保留されてしまい、その結果採集された血漿の利用ができなくなり血漿採集材基板の飽和が不完全になってしまう。そして、飽和が不完全であると、分析が不正確になってしまう。そうして、柔軟なサンプルの充当量範囲（低、中および高）、２つのフィルタの４つの異なるサイズの組み合わせについてのサンプルに対して多層デバイスに能力があるかどうかのテストが評価された。４ｍｍと６ｍｍ、５ｍｍと７ｍｍ、５ｍｍと９ｍｍおよび５ｍｍと１１ｍｍの組み合わせを、１０μＬ、１２．５μＬおよび１５μＬ；  １５μＬ、１７．５μＬおよび２０μＬ；  ２０μＬ、２７．５μＬおよび３５μＬ；  および３５μＬ、４２．５μＬおよび５０μＬの血液に対しそれぞれ評価した。充当量毎の３つの複製（３つの乾燥血漿斑）を、ＨＱＣレベルに添加したＨｃｔが４５％のボランティアの血液を用いて調整した。充当量２０μＬに対し５ｍｍと７ｍｍの組み合わせを用いて較正曲線（ｎ＝２）を調整した。２枚のフィルタディスクのサイズを調整することができることで、多層デバイスにおける柔軟なサンプリング量という特徴が得られる。
【０１５６】
血漿収量。全血のサンプルからどれだけの血漿が生成されたかを多層デバイスカードを用いて測定するために、遠心分離された全血（３μＬ、５μＬ、１０μＬ、１５μＬ、２０μＬおよび３０μＬ）から得られる血漿の斑を採集材または紙基板の小さな一片上に直接付けることで血漿斑（ｎ＝２）を調整した。紙基板の一片は、斑が付けられるのに先立ってかつ付けられた直後に重さを測った。これらのデータを用いて、血漿量対重さの較正曲線がプロットされた。多層デバイスまたはカードサンプルについては、１５μＬ、２０μＬ、３０μＬおよび５０μＬの血液を用いて、本の形をした多層デバイスまたはカードから生成される血漿斑（ｎ＝２）の、充当の前およびその直後の重さを測った。測定された重さを用いて血漿収量を計算した。最初の全血量によって約４μＬから約１５μＬの血漿量が多層デバイスによって生成されたが、平均血漿量対血液量の比が約０．３であり、すなわちＮＯＶＩＰＬＥＸ（登録商標）ＤＰＳカードのそれの約３倍であった。代表的な血漿収量が表３に示されている。分析対象の濃度が溶出位置に影響されるかどうかを評価するために、斑における中央および周辺の溶出位置が比較された。
【０１５７】
中央および周辺のサンプル位置を、全血中のモルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ＡＨ７９２１およびフェンタニールについて計算した。図３に例として示された全ての計算値は、％ＲＥが−１７％であったモルヒネを除き％ＲＥおよび％ＣＶについての受け入れ基準をパスした。添加レベルが１５ｎｇ／ｍＬであったフェンタニールを除く全てのオピオイドについて添加レベルは１５０ｎｇ／ｍＬであった。斑内の濃度分布は、中央位置と周辺位置とで５０％までもの違いがあり得るＤＢＳと比較して、大きく変化に乏しいものであることが分かった。
【０１５８】
方法の実証。米国ＦＤＡのガイドライン（業界用ＦＤＡガイダンス−生体分析法の実証ＵＣＭ３６８１０７  ２０１３，  １−３４）を採用し、線形性、精度、確度、繰越、選択性、回復および安定性を調査して、完全自動オンライン分析用に開発されたＤＰＳカードの機能性を実証した。規定のガイドラインによって、ＬＬＯＱ  ＱＣを除く全てのＱＣレベルについて、受け入れ基準は、確度が、±１５．０％の相対エラー（ＲＥ）内で、かつ精度が、≦１５％の変化係数（ＣＶ）と定義されており、ＬＬＯＱ  ＱＣについては、±２０．０％ＲＥかつ≦２０％ＣＶ（同上）である。相対エラーパーセンテージ（％ＲＥ）は、（測定平均／正常値）−１×１００）で計算され、また変化係数パーセンテージ（％ＣＶ）は、（標準偏差／平均）×１００で計算される。
【０１５９】
短期オンカード安定性。調査されるオピオイドや刺激物のオンカード安定性を評価するために短期間の安定性が調査された。連続して流れる窒素で満たされた箱の中で室温（ＲＴ）に保つ（ＲＴ＋窒素）か、乾燥剤とともにグラシン紙の封筒に入れ、さらにジップロック（登録商標）袋に密封してＲＴに保つ（ＲＴ＋空気）か、乾燥剤とともにグラシン紙の封筒に入れ、さらにジップロック（登録商標）袋に密封して−２０℃に保つ（−２０℃＋空気）かの異なる３つの保管条件で、ＬＬＯＱおよびＨＱＣのＱＣレベル（ｎ＝３）について０日目、３日目、９日目、１４日目および２８日目に評価を行った。各サンプルは、０日目、３日目、９日目、１４日目および２８日目に評価した。各時点で、新鮮な較正曲線を作成した。同じ分析対象について、−２０℃＋空気に保管した時にわずかな低下が認められた。これにより、分析対象のオンカード不安定性または分解は、酸化によるものであることが示唆された。サンプル中の分析対象の不安定性または分解を回避する解決策は、多層デバイスを窒素で満たされた容器中に長期間保管することである。そうして酸素を取り除くことが、酸化による損傷を防げる。その結果によって、図４および図５に示されるとおり、多層デバイスのオンカード安定性は、分析対象と保管状態に依存することが指示された。図４が示したのは、オキシコドン（ｐ＝＜０．００１）、ヒドロコドン（ｐ＝０．００４）およびメフェドロン（ｐ＜０．０００１）を空気があるところ（ＲＴ＋空気および−２０℃＋空気）に保管したときは、２８日目に大きく分解されている（分散分析、ＡＮＯＶＡ）ことである。ＲＴ＋Ｎ２に保管すると、２８日目でも、９つ全ての分析対象についてオンカード安定性が得られる。図５が示したのは、２８日目では、オキシコドン、ヒドロコドンおよびメフェドロンを空気があるところ（ＲＴ＋空気および−２０℃＋空気）に保管したときは、大きく分解されている（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）ことである。ＲＴ＋空気で保管した時は、３日目までに、オキシコドン、ヒドロコドンおよびメフェドロンについて分解（＞５０％）があったが、酸化によるものであり、ゼロ℃未満では、分解速度が遅くなると認められた。最近、空気があるところとＮ２があるところでの保管条件の影響に関して、メフェドロンについて同様のオンカード分解パターンが報告されている（ヴァープラッツェＲ．、ヘニオンＪ．、分析化学、２０１６、８８、６７８９−６７９６）。
【０１６０】
ヘマトクリット効果。ＤＢＳ充当について報告された大きな懸念の一つは、Ｈｃｔの課題であるが、それに対して数多くの可能な解決策が提案されている（デ・ケッセルＰ．Ｍ他、バイオアナリシス２０１３、５、２０２３−２０４１、「デ・ケッセル」）。提案された解決策のうち、大きく期待されたものの一つはＤＰＳに変えることであった（デグロンＪ他、バイオアナリシス２０１５、７、２３７５−２３８５）。本発明の、本の形をした多層デバイスカードがＨｃｔと両立できるかどうか評価するために、Ｈｃｔが３０％、４５％および６０％である血液サンプルを調整してＬＬＯＱ  ＱＣおよびＨＱＣレベルに添加した。その結果、図６に示される通り全ての分析対象について双方のＱＣレベルでＨｃｔの偏りが見られなかった。図６の赤線は、最大受け入れ基準がＬＬＯＱ  ＱＣでは≦±２０％ＲＥおよび高ＱＣではＣＶ≦±１５％ＲＥおよびＣＶであることを指示している。３０％から６０％のＨｃｔ範囲ではヘマトクリットの偏りは観察されなかった。以前開発されたカード（スタームＲ．他、バイオアナリシス２０１５、７、１９８７−２００２）と比較すると、この、本の形をしたＤＰＳカードは、ＲＢＣを濾過したり捕獲できる２枚の濾過膜またはＲＢＣフィルターディスクを組み込んでいる好ましいデザインによってＨｃｔが適用される範囲を広くしているように思われる。
【０１６１】
柔軟なサンプリング量特性。４ｍｍ部分斑分析を用いた。部分斑分析で、４ｍｍ斑領域を乾燥血漿斑内から抽出された。それで、血漿斑が均一であるならば、４ｍｍサンプリング領域が部分的に取られたのが８ｍｍの血漿斑からか１４ｍｍの血漿斑からかによって、また４ｍｍサンプリング領域が得られたのは乾燥血漿斑内の中央領域からか周辺領域からかによって、結果の精度が影響されない。この仮定を支えるために、８ｍｍから１４ｍｍのサイズの血漿斑を生成する１０μＬから５０μＬの範囲にある血液量を、本の形をした多層デバイスを用いて評価した。本の形をした多層デバイスは、異なる血液量に順応するために第一の濾過膜Ｘディスクおよび第二の濾過膜Ｓ／Ｇディスクという異なる濾過膜サイズを有するように誂えられた。５ｍｍおよび７ｍｍの濾過膜ＸおよびＳ／Ｇディスクをそれぞれ備える多層デバイスカードを用いて２０μＬの血液から構成された較正曲線で定量化が行われた。全血の異なる量が充当された中でＨＱＣで比較に値する精度が観察された。％ＲＥの大半は受け入れ限界（≦±１５％）内にあったが、負に偏るという傾向が＜２０μＬの血液で生成される斑から観察され、一方正の偏りが＞２０μＬの血液から生成される斑で観察された。これらの偏りは、サンプルに充当された量と比較される量を用いて較正曲線を調整することで訂正できる。中央対周辺の斑位置もまた、異なる血漿サイズを生成する異なる４つの充当量（１５μＬ、２０μＬ、３５μＬおよび５０μＬ）で評価した。
【０１６２】
表２の結果が示したのは、４つの異なる血液充当量または様々な血漿斑サイズにおいて、中央位置と周辺位置との間に、全ての分析対象について測定されるレベルの違いはないというものであった。ＳＡＦＥＣＡＰ（登録商標）毛細管を用いて遠心分離された２０μＬ、２５μＬおよび３０μＬの血漿で斑点を付けることによって作製された斑点から比較に値するデータが得られたという同様の結果が、以前の調査で報告されている（リーＷ．他、ジャーナルオブクロマトグラフィＢアナリティカルテクノロジーズインザバイオメディカルアンドサイエンスィーズ２０１５，９９１，４６−５２「リー他、２０１５」）。２０μＬ、２５μＬおよび３０μＬの血漿について比較される結果が観察されたが、１０μＬの血漿で負の偏りが観察された（リー他、２０１５）。この調査で用いられたタイプのセルロース紙基板は、本の形をした多層デバイスカードで用いられた採集材や紙基板（ＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）グレード６０１）よりもほぼ２．５倍厚いＤＭＰＫ  Ｃカードであった。より厚い紙基板が用いられると、その紙全体への血漿の広がりや浸透が、ヘニオンらが記述するところの不完全な浸透となる（ヘニオンＪ．他、バイオアナリシス２０１３、５、２５４７−２５６５）。もしそうであるなら、不正確さが、より大きな量よりもより小さな量でより大きな問題となろう。表１および表２に報告される結果によって、血漿の一貫性は血液中のＨｃｔレベルからも充当される血液量からも独立しているという論理的な説明が指示され、かつ本の形をした多層デバイスカードの応用において柔軟なサンプリング特性という機能性が示される。
【０１６３】
【表１】
2019512093.tif 000003
【０１６４】
【表２】
2019512093.tif 000004
【０１６５】
本の形をした多層デバイス対現存するＤＰＳカード。現存するＤＰＳカードには、ここに記述される多層デバイスのそれに最も近いものが２つあって、それらは、ノヴィリティック有限会社から商業的に入手可能なＮＯＶＩＰＬＥＸ（登録商標）カード（キムＪ．Ｈ．他、分析化学２０１３、８５、１１５０１−１１５０８）および、スタームらが以前報告した「自動ＤＰＳカード」（バイオアナリシス２０１５、７、１９８７−２００２）である。一般に、これら２つのカードと本発明の多層デバイスカードのデザインは概念的に類似しており、というのもそれらは各々、血漿からＲＢＣを分離するためのオンカード膜濾過技法を用いているからである。しかしながら、カードの構造と各カードのフォーマットにおける血漿の生成は異なっている。オンカードで血漿斑をうまく生成するのに、本発明の、本の形をした多層デバイスカードは外部デバイスを必要としない。ＮＯＶＩＰＬＥＸ（登録商標）カードもまた血漿斑の生成に外部デバイスを必要としないが、サンプルを取り扱うプロセスが長くかかってしまい、というのもＮＯＶＩＰＬＥＸ（登録商標）カードは自動分析には適合しないので、小さな２ｍｍのディスクを取り外してさらなるサンプル抽出プロセスのためにそのディスクを手で移すのにピンセットが必要であるからである。自動ＤＰＳによる血漿の収量は測定されていないが、ＮＯＶＩＰＬＥＸ（登録商標）カードは、２．５μＬの血漿を生成するのに最低でも２５μＬの血液を必要とする（キムＪ．Ｈ．他、分析化学２０１３、８５、１１５０１−１１５０８）。これは、血液１μＬ当たり０．１００μＬのである。一方、本発明の本の形をした多層デバイスカードは、最初に充当される血液量にも依存するが大量の血漿（４．６μＬから１４．７μＬ）を生成し、これは血漿／血液の量の比より平均して約３倍、すなわち、全血１μＬ当たり血漿０．３０３±０．００７である（表３）。
【０１６６】
【表３】
2019512093.tif 000005
【０１６７】
自動フロースルー斑溶出およびオンラインＳＰＥ。この作業で用いられるロボットのシステムが、以前記述された（ヴァープラッツェＲ．、ヘニオンＪ．、薬物テストおよび分析、２０１６、８、３０−３８、スタームＲ．他、バイオアナリシス２０１５、７、１９８７−２００２、オリヴェイラＲ．Ｖ．他、分析化学２０１４、８６、１２４６−１２５３）。簡単に言うと、それには、ＤＢＳＡシステムを用いてのセルロースカード上の乾燥斑の自動フロースルー溶出が含まれていた（オランダ、エモン、スパーク・ホランド）。このシステムは、多層デバイスカードのオンライン検出可能なウィンドウ支持体に添付される採集材を取り上げて、カード上の乾燥斑を探し出し、それに続いて、斑を溶剤で溶出し、それをインラインのＳＰＥ分析対象捕獲／溶出ステップに結びつけたものである。斑の脱離をフロースルー機構によって行うが、ここでは、一対のクランプ（溶剤を送るための配管が備わる）によって、採集材紙基板上にクランプで挟まれた溶出領域を形成するものである。クランプしている位置において、溶出溶剤が採集材紙に導入され、抽出物がインラインＳＰＥカートリッジに送られる。全オンラインシステムの詳細な例示および説明は、参照することによってここに組み入れる（ヴァープラッツェＲ．、ヘニオンＪ．、薬物テストおよび分析、２０１６、８、３０−３８）。現在の調査においては、目に見えないところでのまたはユーザーが定義した斑認識モードに結合され、４ｍｍというクランプサイズを用いる部分斑分析が行われる。採集材／オンラインで検査可能なウィンドウ支持カード毎に４つの斑点があって、乾燥血漿斑としての、１番、２番、および３番斑並びに、サンプルの間に行われるクランプ洗浄位置としての４番斑を含んでいる。４番目の斑または切り抜き領域は、クランプ洗浄のために三角形の位置にある３つの小円からなる。２ｍｍというクランプサイズが用いられると、洗浄位置は各斑の右隅であって、カード毎に４つのサンプル斑を収容できるものとなる。モルヒネ用に分析感度を高めるために４ｍｍというクランプサイズが選ばれた。斑溶出は、２ｍＬの脱離溶剤（Ｈ２Ｏ中０．２％ＮＨ４ＯＨ＋２．５％ＭｅＯＨ）で、１００℃、４ｍＬ／分で行われた。重水素化ＩＳ溶液を２０μＬ含むサンプルループが直接斑溶出ラインに導入された。続いて、溶出溶剤が、あらかじめ調整された（４ｍＬ／分で１ｍＬ  ＭｅＯＨおよび１ｍＬ脱離溶剤）ＳＰＥカートリッジに充填された（ＨｙＳｐｈｅｒｅ（登録商標）Ｃ８ＨＤ、７μｍ、２×１０ｍｍ、スパーク・ホランド）。ＬＣ勾配を用いて、目標となる分析対象を、カートリッジから後のクロマトグラフ分離のためのＬＣカラムへと溶出した。持ち越しを最小限にするために、ＳＰＥカートリッジとＤＢＳクランプとを以下の異なる３つの溶剤（２ｍＬの脱離溶剤、ＦＡが０．１％である４ｍＬのＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ  ＡＣＮ：ＩＰＡ  ２：４：３：１  ｖ／ｖおよび最後に２ｍＬの０．１％  ＦＡ  Ｈ２Ｏ）を作業間に６ｍＬ／分で流して立て続けに洗浄した。
【０１６８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ。ＬＣ−ＭＳ８０５０質量分析計（米国メリーランド州、シマヅ）と組み合わせたＮＥＸＥＲＡ（登録商標）ＵＨＰＬＣシステムで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。データ処理は、シマヅのラボソリューションズ・ソフトウェアを用いて行った。ＬＣカラムは、ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）（米国カリフォルニア州、トランス）のガードＦ５カラム（２．６μｍ、２．１×５ｍｍ）を備えたＫＩＮＥＴＥＸ（登録商標）Ｆ５（２．６μｍ、２．１×５０ｍｍ）であった。移動相は、（Ａ）５ｍＭのギ酸アンモニウムと０．１％ＦＡおよび（Ｂ）ＭｅＯＨとからなるものであった。ＬＣ勾配プログラムは、最初の条件で１０％Ｂ、０．２５分で１０％Ｂ、１．７０分で４０％Ｂ、２．２０分で１００％Ｂ、２．４８分で１００％Ｂおよび２．９０分で元に戻って１０％Ｂであった。オンラインＳＰＥカートリッジを通過した流れの最初の０．２５分は廃棄ポートに行くものとされていた。流速は０．４ｍＬ／分でありＨＰＬＣカラムは５０℃に保たれていた。以下の通りの計器の条件：  ０．５ｋＶなるインターフェース電圧、４００℃なるインターフェース温度、１００℃なる脱溶媒和ライン温度、１４０℃なる熱ブロック温度、３Ｌ／分なる乾燥用Ｎ２ガス流、２Ｌ／分なる噴霧用Ｎ２ガス流および２０Ｌ／分なる加熱用Ｎ２ガス流で、質量分析装置を正イオンエレクトロスプレーイオン化モードで稼働した。各化合物について、表４に列挙されるように２つのＳＲＭの推移がモニターされた。
【０１６９】
【表４Ａ】
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【０１７０】
【表４Ｂ】
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【０１７１】
関心のある分析対象の存在についてテストするのに用いられた計器には、乾燥血液斑（ＤＢＳ）カード自動サンプラー（ＤＢＳ、スパーク・ホランド）と、高圧ディスペンサーポンプ（ＨＰＤ、スパーク・ホランド）と、自動ＳＰＥカートリッジ交換モジュール（ＡＣＥ、スパーク・ホランド）と、ＮＥＸＥＲＡ（登録商標）超高性能液体クロマトグラフィ（ＵＨＰＬＣ、シマヅ）と、ＬＣＭＳ−８０５０  ＭＳ（シマヅ）とが含まれていた。血漿斑の直接オンライン溶出を、クランプ（４ｍｍ）を用いて乾燥血漿斑を含む採集材にクランプすることによって行ったが、ここでは部分斑分析が１００℃で行われた。
【０１７２】
スパーク・ホランドＤＢＳ  ＳＰＥ自動サンプラーシステムを改変してＤＸＳサンプルを分析した。ＨＰＤと注入器ポンプが独立してＩＳループ（２０μｌの重水素化内部標準対照混合物）を備える多重ポートバルブに接続され、もう一つの多重ポートバルブがクランプに接続されて採集材を保持し、ここで、そのクランプは直径が約２ｍｍであり、ＳＰＥカートリッジクランプを備える第三の多重ポートバルブに接続され、第三の多重ポートバルブもまたＬＣカラム、廃棄物の排出、勾配ポンプおよびオンラインＳＰＥ−ＬＣ−ＨＲＡＭＳ  ＤＸＳ抽出分析のためのコンピュータシステムに接続されるようにシステムが設定された。ここに記述される多層デバイスとのコラボで自動システムが用いられるならば、スパーク・ホランドＳＰＥ自動サンプラーシステムを除く他のシステムが用いられる。多層デバイスはまた、例えば、ＣＡＭＡＧ  ＤＢＳ−ＭＳ５００のような別のオンライン自動システムを用いて分析されても良い（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｃａｍａｇ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｄｂｓ／ｄｂｓ−ｍｓ＿５００．ｃｆｍ）。
【０１７３】
ＳＰＥ法は、１ミリリットルのメタノール、１ｍＬ  ０．２％水酸化アンモニウムおよび２．５％メタノール水溶液という条件（６ｍＬ／分で）のもと、１ｍＬ  ０．２％水酸化アンモニウムおよび２．５％メタノール水溶液での溶出（３ｍＬ／分で）かつ２ｍＬ  ０．２５％水酸化アンモニウムおよび２．５％メタノール水溶液、４ｍＬ  ２：４：３：１（ｖ／ｖ）  水／メタノール／アセトニトリル／イソプロパノールでの洗浄（６ｍＬ／分で）で、ＨｙＳｐｈｅｒｅ（登録商標）Ｃ８ＨＤ、７μｍ、２×１０ｍｍカートリッジ（スパーク・ホランド）を使用した。ＬＣプログラム条件（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシマヅ８０５０）は以下の表５に指示されたものであり、ポンプＡ：０．１％ギ酸／水およびポンプＢ：１００％メタノールであって、ＳＰＥカートリッジを通り過ぎた後のＬＣ勾配の最初の０．２５分＊は廃棄に向けられていた。
【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
使用された多層デバイスは多層からなっていた。全血サンプルが濾過膜部の第一層に充当されたが、その濾過膜部は、非対称ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｘ膜（濾過膜ディスクの直径５ｍｍ）の濾過膜と、厚さが０．３５０ｍｍのカード用紙からなる表カバーの厚さが約０．１６０ｍｍから約０．２００ｍｍの切り抜きを有する非対称膜（表細孔サイズ３５μｍ、裏細孔サイズ５μｍ）とを備える。多層デバイスには４つの切り抜きがある。濾過膜部層は、閉じ込められた（すなわち、柔軟ではない）切り抜き層であり、表カバーの切り抜きと同じ大きさである。濾過膜部の第一の層の下に濾過膜部の第二の層があって、それは、非対称ｉＰＯＣＤＸ（登録商標）Ｓ／Ｇ膜（７ｍｍ）の濾過膜と、厚さが約０．２６０ｍｍから約０．３００ｍｍの非対称膜（表細孔サイズ３５μｍ、裏細孔サイズ２．５μｍ）を備える。濾過膜部の下には、表カバーの円形の切り抜きと同じ大きさの切り抜き（例えば、直径５ｍｍ）を４つ有するＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）ＨＯＬＬＹＴＥＸ（登録商標）３２５６ポリエステル膜からなる疎水膜がある。疎水膜の下には、採集材を柔軟なものとするための切り抜きの輪郭であって実際に閉じ込められた切り抜きではない（すなわち柔軟な）採集材がある。採集材は、厚さが０．１９０ｍｍで全血液サンプルから血漿を吸着したＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）６０１セルロース紙からなる。採集材の下には、濾過膜部と疎水膜と採集材との間の物理的な接触を確実に密接なものとする盛り上がった支持層がある。盛り上がった支持層は、厚さが０．７ｍｍのカード用紙から得られる切り抜きディスクであり、ＡＶＥＲＹ８６６５（登録商標）粘着テープを用いて定位置に保持されていた。盛り上がった支持層の下には、上記全ての層を支持する裏カバーがあった。裏層は、約０．３５０ｍｍのカード用紙からなっていた。
【０１７６】
開発された多層デバイスの機能の妥当性は有効であって、４つの品質管理（ＱＣ）レベルで、良好な選択性と、日間の精度および確度の受け入れ可能な限界という結果が示された。検出の最低の限界（ＬＬＯＱ）が、５ｎｇ／ｍＬで達成され、Ｒ２＞０．９９６４で５ｎｇ／ｍＬから１，０００ｎｇ／ｍＬまで線形性が観察された。平均回収率は（＞）８７．９％より大きかった。テストされた多層デバイスはまた、テストされたオピオイドや刺激物について３０％から６０％までのヘマトクリット適合性を示した。短期間の安定性調査では、多層デバイスの安定性は、大気中または雰囲気中に室温で保管された時に限界があって化合物に依存しているということが示唆された。
【０１７７】
図７の、テストされた４種のオピオイドおよび５種の刺激物のクロマトグラムには、以下の表６に示される保留時間（分）を有する内部標準が示された。図７（Ａ）は二重素材サンプル、（Ｂ）は素材サンプル、（Ｃ）はＬＬＯＱサンプル（５ｎｇ／ｍＬ）かつ（Ｄ）は重水素化した内部標準である。
【０１７８】
【表６】
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【０１７９】
ヘマトクリットレベルが３０％、４５％および６０％の血液を用いる乾燥血漿斑分析について精度および確度の結果を図６に示す。異なるヘマトクリットレベルの各々について関心のある分析対象の各々がテストされた。精度の評価は変化係数（ＣＶ）によるが、それは、（標準偏差（ＳＤ）／平均）×１００に等しく、一方、確度の評価は相対誤差（ＲＥ）によるが、それは、［（平均−名目値（nominal））／名目値］  ×１００に等しい。図７（Ａ）は、各ヘマトクリットレベルのＬＬＯＱ  ＱＣ変化係数とテストされた各々の分析対象とを示し、（Ｂ）は相対誤差を示す。図７（Ｃ）は、各ヘマトクリットレベルの高ＱＣ変化係数とテストされた各々の分析対象とを示し、（Ｄ）は相対誤差を示す。より広い範囲のヘマトクリットレベルもまたテストされた。図８および以下の表７は、２５％から６５％のヘマトクリットレベルの、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ＡＨ７９２１およびフェンタニールについてテストされた結果を示す。ＡＨ７９２１およびフェンタニールについて、回収率は、全血におけるヘマトクリットのレベルに反比例することがわかった。一方、モルヒネ、コデイン、オキシコドンおよびヒドロコドンはヘマトクリット適合性があり、ＡＨ７９２１およびフェンタニールはそうでないことが示された。同様の傾向は、ＬＱＣ、ＭＱＣとＨＱＣでも観察された。
【０１８０】
【表７】
2019512093.tif 000010
【０１８１】
オピオイドと刺激物の安定性もまたテストされた。図４は、３つの異なる条件（１）、（２）および（３）で１４日間保管した時のＬＬＯＱ（５ｎｇ／ｍＬ）を示す。
（１）連続して流れる窒素で満たされた箱の中で室温（ＲＴ）に保つ（ＲＴ＋窒素）、
（２）乾燥剤とともにグラシン紙の封筒に入れて室温（ＲＴ）に保つ（ＲＴ＋空気）、そして
（３）乾燥剤とともにグラシン紙の封筒に入れて−２０℃に保つ（−２０℃＋空気）。
【０１８２】
多層デバイスから血漿量を得て比較した。上の表４において、平均血漿／血液量は０．３０３μｌで標準偏差は０．００７であった。
【０１８３】
４種のオピオイドおよび５種の刺激物の線形性と回収率を計算した。以下の表８に結果がまとめられている。
【０１８４】
【表８】
2019512093.tif 000011
【０１８５】
４種のオピオイドと５種の刺激物の日間およびロット間の確度および精度もまた測定され、以下の表９に示されている。
【０１８６】
結論は、実証の結果、本発明の多層デバイスは、分析精度、確度、選択性、回収率および感度が良好であり、機能上の利点があることが示された。テストされた９種の分析対象について製品上での安定性を評価したことにより、多層デバイスの安定性は、室温で空気中に保管した時、化合物に依存することが示唆された。従って、商業化する前に、関心のある各分析対象について製品上での安定性を評価し消費者に適切なインストラクションを提供しなくてはならない。この多層デバイスの利点には、医療の専門家または静脈採血士の助けなしに行えるマイクロサンプリング、遠心分離の使用、オピオイドや刺激物といった関心のある分析対象の分析のために広いヘマトクリットレベルをテストする能力、完全自動オンラインＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析への適合性および血液からの高い血漿収量（すなわち、商業的に利用可能な方法によるよりも大きな収量）が含まれる。
【０１８７】
【表９】
2019512093.tif 000012
【実施例３】
【０１８８】
［多層デバイスをテストするためのテスト化合物］
本発明の多層デバイスを、既知の高血圧およびＡＤＨＤ薬、グァンファシンを用いて［１３Ｃ、１５Ｎ３］内部標準でテストした。グァンファシン（Ｃ９Ｈ９Ｃｌ２Ｎ３Ｏ）は、モノ同位体質量が２４５．０１２３Ｄａであり、一方、内部標準［１３Ｃ，１５Ｎ３］−グァンファシン（１３ＣＣ８Ｈ９Ｃｌ２１５Ｎ３Ｏ）は、モノ同位体質量が２４９．００６７Ｄａである。これらの化合物を、血液：血漿結合比（Ｋｅ／ｐ）が１．５の全血サンプルを用いてテストし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ生体分析を用い、それに続いてここに記述されるプロトコルを用いて分析した。
【実施例４】
【０１８９】
［多層デバイスを用いる方法］
手始めに、全血のような体液サンプルを採集したが、それは採集の前でも後でも、表カバーと裏カバーとの間に挟まれるいずれの層にも触れず、取り分け、表カバーの切り抜きから露呈される濾過膜部を避けて行われた。サンプルを採集した後でも、体液サンプルが充当され、露呈した濾過膜との接触は避けなければならなかった。指腹や踵での採決によるサンプルの収集については、穿刺の場所を選択して７０％イソプロパノールで消毒した。消毒済みの使い捨て標準ランセットを用いた。指または踵を心臓の高さかそれよりも低い位置に維持して消毒した場所をランセットで穿刺した。最初の血の一滴は消毒したガーゼなどで拭い去った。二番目の好ましくは大きな血の一滴が現れた時、少なくとも約１０マイクロリットルから約５０マイクロリットルの量の全血を、消毒した使い捨て毛細管で採集するか、表カバーの切り抜きから露呈する濾過膜部の表面に直接充当した。一つの切り抜きの切り抜き面積が約１０マイクロリットル未満であるなら、二番目の一滴を直ちに加えて、切り抜きの領域が十分な量で満たされるものとした。単一の多層デバイスの切り抜きの円の全てが濾過膜部の一つの側において一旦全血で満たされると、表部の全血サンプルまたは検体は、約３分間閉じた位置で裏部と接触するように、少なくとも濾過膜部、疎水膜および採集材が密接に接触するような位置に置かれた。約３分以上経つと、全血サンプルが濾過部に吸収され血漿が採集材上に採集されていたが、多層デバイスの層を分離して分析対象を分析した。さらに時間をおいて採集したサンプルをさらに乾かすが、好ましくは約３０分間か、分析に先立って採集したサンプルが乾くだけの時間が置かれた。例えば、採集材を、一旦分離して、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＤＰＳ−ＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（乾燥血漿斑−固相抽出−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、タンデム質量分析または、オピオイドを含む分析対象のための同様の技法で分析した。本発明の多層デバイスの大きな利点は、単一の体液サンプルから複数の成分を得ることが可能であることと、同時に複数のテストが行えることである。例えば、赤血球（ＲＢＣ）と血漿とは別々に採集され、また酵素免疫検定（ＥＩＡ）とＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ生体分析は別々に行われた。濾過膜部またはＲＢＣを含むその部分部分は固相酵素免疫検定（ＥＩＡ）で分析し、一方、体液サンプルの血漿を含む採集材はＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。簡単に言うと、ＥＩＡの手順には、濾過膜部を分離することが含まれており、濾過膜部には、切り抜きのサイズ、形および大きさを有するディスクの形をした少なくとも一つの濾過膜層が備わっていて、多層デバイスからのＲＢＣをディスクが含んでいて、各ディスクを個々のマイクロウェルプレートに移して関心のある分析対象についてＲＢＣの分析を行った。多数の濾過膜をマイクロウェルプレートの多数の窪みに移した。各窪みには希釈剤が加えられプレートは保温された（Ｏ／Ｎ；４℃）。そしてプレートをゆっくりと揺らして希釈剤との撹拌を行った。マイクロウェルプレートの各窪みに溶離液を加え、３７℃で９０分間保温した。プレートを多数回洗浄し、各窪みにＩｎＧ−酵素結合体を加えてさらに３７℃で保温した。基板を加えて２５℃で保温した。そして各窪みに停止液を加えて反応を停止させた。そして４０５ｎｍでプレートを読み取って、関心のある分析対象の存在を測定した。
【実施例５】
【０１９０】
［血液中のオピオイドの完全自動オンラインＤＢＳＡ−ＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ生体分析のための多層デバイスのヘマトクリット適合性乾燥血漿斑のマイクロサンプリング］
業界で知られ用いられている乾燥血液斑（ＤＢＳ）技法は、ヘマトクリット適合性に関しての限界に直面している。全斑分析対部分斑分析、簡単に使えるという利点およびサンプリングの複雑さの選択でこの問題は緩和されるが、マイクロサンプリングではなく容量のあるサンプリングが必要とされる。その代わりに、ヘマトクリット適合性のある乾燥血漿斑（ＤＰＳ）カードまたは多層デバイスが開発され、簡単に使えるという利点をもたらし、複雑で容積のあるサンプリングを必要としない。この実施例において、本質的に多層デバイスは、カード用紙カバーをサンドイッチにした形であって、表から裏に向かう順に、２枚の濾過膜（または赤血球（ＲＢＣ）膜フィルタ）の濾過膜部、ポリエステルでできた疎水膜、血漿を採集するセルロースをベースとした紙基板である採集材および、血漿を効率的に吸い上げるための直接的かつ緊密な接触を容易とするための盛り上がった支持体が含まれている。
【０１９１】
単一の多層デバイスを用い、少量の全血を直接ＲＢＣフィルタ上に充当し、続いて、もし最初に開いた形であるならば、その多層デバイスを閉じることで斑を４つ生成した。続いて、血漿採集材を取り除き、完全自動オンラインシステムと適合する別の支持体に取り付けた。使用されたオンラインシステムには、スパーク−ホランドＤＢＳＡ脱離システムと自動オンライン固相抽出（ＳＰＥ）部とが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（シマヅＵＨＰＬＣおよびＲＡＰＴＯＲビフェニルカラム、２．７μｍ，２．１ｍｍ×５０ｍｍを備えた８０５０トリプル四重極）に結合して含まれていた。関心のある６つの分析対象または、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ＡＨ７９２１、フェンタニールを含む代表的なオピオイドと、それらに重水素でラベル付けを行った対応する類似化合物または内部標準が、ＳＲＭ  ＬＣ／ＭＳ正イオンエレクトロスプレーイオン化を通してモニターされた。
【０１９２】
多層デバイスを用いて、被験者一人の全血から生成された乾燥血漿斑を分析した。２ミリメートル（ｍｍ）のクランプを用いての部分斑を選択した。２０マイクロリットル（μｌ）の重水素化内部標準のループが脱離ラインに直接導入されるフロースルー脱離によって、６０℃で１ミリリットル（ｍＬ）の溶出溶剤（０．１％水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）および３％メタノール（ＭｅＯＨ）水溶液）により斑の脱離が行われた。続いて、前もって調整されたＳＰＥカートリッジに脱離されたものを充填した。ＬＣ勾配（Ａ：  ０．１％ギ酸／水およびＢ：  １００％ＭｅＯＨ）を用いてカートリッジから分析対象を溶出した。前置きの結果として、０．２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬという範囲を有するフェンタニールを除く全てについての２ｎｇ／ｍＬから１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲での良好な線形性（Ｒ２＞０．９９０）と、良好な精度（＜２０％ＣＶ）と、もっとも低い較正点（ＬＬＯＱ）での良好な確度（＜２０％ＲＥ）と、マトリックス効果がないということで良好な選択性と、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱの双方で＞９０％という抽出回収率とが示された。サンプリング領域が２ｍｍしかないのに、ｎｇ／ｍＬ未満という低いＬＬＯＱを確立することは、大変であったが、ここに記述された、完全に集積されたオンラインサンプル調整および分析システムによってそれが達成された。
【０１９３】
前置きのデータによっても、約２５％から約６５％の範囲にあるＨＣＴレベルで、溶血のない血漿斑を良好に生成する赤血球濾過が示された。分光光度検定は行わなかったが、そのような検定にも用いられるように、この新規の多層デバイスから生成された溶血のない血漿斑は考慮された。全血と違って、血漿斑の均質性はＨＣＴレベルから独立している。そうすると、様々なＨＣＴレベルから生成される斑の分析は、部分斑分析を用いて行うことができるので、容量がかさむサンプリングは必要とされない。この多層デバイスは、全血約１０μＬから約５０μＬの範囲にあるものは、それに対応してＲＢＣフィルタのサイズを調整することでこれも含んで、柔軟なサンプリング量に対して用いられた。
【実施例６】
【０１９４】
［多層デバイスを用いての分析対象のオンラインＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ生体分析と結合する自動フロースルー溶出］
精度、確度、安定性、斑溶出位置および多層デバイスに充当される全血液サンプルを用いて生成される血漿量がテストされた。
【０１９５】
化学物質、試薬および材料：モルヒネ、［２Ｈ３］−モルヒネ、コデイン、［２Ｈ３］−コデイン、オキシコドン、［２Ｈ６］−オキシコドン、ヒドロコドン、［２Ｈ３］−ヒドロコドン、アンフェタミン、［２Ｈ５］−アンフェタミン、メタンフェタミン、［２Ｈ５］−メタンフェタミン、ＭＤＭＡ、［２Ｈ５］−ＭＤＭＡ、フェンテルミン、［２Ｈ５］−フェンテルミン、メフェドロンおよび［２Ｈ３］−メフェドロンを、ＣＥＲＩＬＬＩＡＮＴ（登録商標）（米国テキサス州ラウンドロック）から購入した。ＬＣ−ＭＳグレード溶媒：アセトニトリル（ＡＣＮ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）およびメタノール（ＭｅＯＨ）を、ハネウェル・バーディック＆ジャクソン（米国ミシガン州マスケゴン）から購入した。ミリＱ水を、社内のＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）システムから得た。ギ酸アンモニウム、水酸化アンモニウムおよびギ酸（ＦＡ）を、ＥＤＭ（登録商標）ケミカルズ社（米国ニュージャージー州ギブスタウン）から得た。健康なボランティアからＮａ２ＥＤＴＡで処理したＭｏｎｏｊｅｃｔ（登録商標）管に人血サンプルを採集して−４℃に保管し、成分の抜け出を考慮して４日以内に用いた。保管用および使用溶液を調整して、キンブル・チェース社（米国ニュージャージー州ヴァインランド）の４ｍＬの琥珀色ホウケイ酸ガラス瓶に保管した。血液サンプルをＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標）社（ドイツ、ハンブルグ）の１．５ｍＬプロテインＬｏＢｉｎｄ管で調整した。容量測定ピペットは、ＲＡＩＮＩＮ（登録商標）インスツルメント有限会社（米国カリフォルニア州オークランド）のＰｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ  ＸＬＳシリーズであった。本の形をした多層デバイスを作製するのに用いた材料や工具は、以下のものを除いてアマゾンで購入した：パーキンエルマー社（米国メリーランド州ボストン）から購入したパーキンエルマー２２６カード、カーヅアンドポケッツ（米国マサチューセッツ州サウスイーストン）の折られたカード用紙（５０．８ｍｍ（長）×７６．２ｍｍ（幅））。グレード６０１セルロース紙基板およびＨｏｌｌｙｔｅｘ（登録商標）３２５６ポリエステル膜（以後、ポリエステル層として言及する）は、ＡＨＬＳＴＲＯＭ（登録商標）フィルトレーション有限会社（米国ペンシルバニア州マウントホリースプリングス）に寄付してもらい、またｉＰＯＣＤＸ（登録商標）膜フィルターは、インターナショナルポイントオブケア社（カナダ、オンタリオ州トロント）に寄付してもらった。
【０１９６】
使用溶液の調製：オピオイドおよび刺激物の標準液およびそれらを重水素化した類似化合物は、それぞれ１ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬのメタノール溶液として購入した。較正物質とＱＣ使用溶液は、仕入れた原料をＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  （３：７  ｖ／ｖ）で希釈して、８点較正物質については、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５０μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、２．５０μｇ／ｍＬ、５．００μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５．０μｇ／ｍＬおよび５０．０μｇ／ｍＬとしたもので、また４ＱＣレベルについては、０．２５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬとしたものである。重水素化した内部標準（ＩＳ）溶液は、５ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ３］−モルヒネと、４ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ３］−コデインと、２．５ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ６］−オキシコドンと、２．５ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ３］−ヒドロコドンと、１０ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ５］−アンフェタミンと、１０ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ５］−メタンフェタミンと、１０ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ５］−ＭＤＭＡと、１０ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ５］−フェンテルミンと、１０ｎｇ／ｍＬの［２Ｈ３］−メフェドロンとのＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  （３：７  ｖ／ｖ）中における混合物であった。全ての溶液は−２０℃で保管された。
【０１９７】
線形性、精度、確度および回収率：バッチ分析において、８種の較正物質の組み合わせを最初に分析してもう一つの組み合わせをバッチの最後に分析した。その２つの組み合わせの間に、４つのＱＣレベル（ｎ＝６）と回収サンプル（ｎ＝２）が分析された。同じボランティアの全血を用いることで、この分析は異なる日に３日繰り返されて日内および日間の精度値および確度値を得た。フロースルー斑溶出の自動プラットフォームは、回復を測定する通常のアプローチが採用できない。これを回避するために、ＬＬＯＱでは連続して５回、ＵＬＯＱでは１０回同じ斑を繰り返し溶出または抽出することで抽出回収率を測定した。回収率は、（第一の抽出の分析対象ピーク領域／５回または１０回の抽出の合計）×１００で計算された。これによって、オンラインＳＰＥ回収率がなくとも相対抽出回収率が提供された。分析対象／ＩＳピーク面積比を用いて較正曲線（ｎ＝２）をプロットし、１／ｘ２加重線形回帰を用いて定量範囲に渡るＲ２≧０．９９６３の線形を有することが観察された（表８）。
【０１９８】
曲線の範囲は、表題の化合物について治療のための範囲と有毒な範囲との双方をカバーしている（レゲンザールＲ．他、Ｊクリンモニットコンプット１９９９、１５、５２９−５４４、シュルツＭ．他、クリティカルケア  ２０１２、１６、Ｒ１３６−Ｒ１３６）。ＤＢＳおよびＤＰＳ分析において、先に記述した通り、ＩＳの導入は様々なやり方で行われる（アブラビーＰ他、分析化学２０１５、８７、４９９６−５００３、バンバーＢ．Ｌ．他、バイオアナリシス２０１３、５、２１３７−２１４５）。この実施例において、ＩＳは、フロースルー溶出溶剤に導入されており、それゆえ内部標準（ＩＳ）は、分析対象回収バイアスやＨｃｔ関連の回収バイアスといったオンカード抽出でのいかなる不一致も補償できない。この問題を回避する一つの方法は、９０％を超える検定回収についてＨｃｔ関連の回収バイアスが観察されないことを報告したアブラビー他（ｏｐ．  ｃｉｔ．）が記したように検定回収を最適化することである。この検定についての回復は、表８に示されるように８７．８％であったアンフェタミンを除く全てについて≧９０．０％であった。日内の精度および確度の結果でもまた、受け入れ可能な値が示された（表１１）。日間の精度および確度は、日内の平均値（ｎ＝３）を用いて計算され、その結果によって、ＬＬＯＱ  ＱＣレベルで２３％であったコデインを除く９つ全ての分析対象について全てのＱＣレベルで受け入れ可能な基準をパスしていることが示された（表９）。
【０１９９】
較正範囲が２ｎｇ／ｍＬから１，０００ｎｇ／ｍＬである、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドンおよびＡＨ７９２１で、線形性もテストされた。フェンタニールもまたテストされて線形性を有することが分かった。フェンタニールの較正範囲は、０．２ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬであった。図９には、モルヒネおよびフェンタニールについての線形性のグラフが示されている。コデイン、オキシコドン、ヒドロコドンおよびＡＨ７９２１はモルヒネと同じような線形性を有することが観察された。以下の表１０には、テストされた化合物の各々についてＲ２値が示されている。
【０２００】
【表１０】
2019512093.tif 000013
【０２０１】
選択性および持ち越し：二重素材（ＩＳのないマトリクス素材）と、素材（ＩＳのあるマトリクス素材）と、個別の６つのマトリクスロット（異なる６人の全血）からＬＬＯＱ（５ｎｇ／ｍＬ）およびＵＬＯＱ（１０００ｎｇ／ｍＬ）レベルに添加されたサンプルとを評価することによって選択性が検定された。持ち越しの効果を評価するために、２つの素材サンプル（血漿斑のない素材カード）をＵＬＯＱの後で分析した。図７に示されるように、二重素材サンプルでは、無視できる持ち越しＩＳのシグナル（トータルＩＳ強度の約１％）が示され、一方、素材サンプルでは、検出できない分析対象シグナルが示された。９つ全ての分析対象においてＬＬＯＱレベルで良好なクロマトグラフの分解度および検出が観察された。異性体のコデインとヒドロコドンおよび異性体のメタンフェタミンおよびフェンテルミンの分離が観察される。ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱでのロット間精度および確度は、全ての分析対象について受け入れ基準内であった（表９）。ＵＬＯＱ較正物質の後に素材斑（サンプル斑のない素材カード）を測定することで持ち越しが評価された。アンフェタミン、メタンフェタミン、ＭＤＭＡおよびフェンテルミンについて受け入れられない（ＬＬＯＱシグナル強度の≧２０％）持ち越しシグナルが観察された。種々の溶剤での洗浄と手順を試したが、その結果示されたのは、改善はあっても受け入れられるレベルまで持ち越しを低減できないということであった。そうして、ＵＬＯＱ較正物質の後に２つの素材（血漿斑のないもの）を続けて用いることでキャリーオーバーの問題が緩和された。洗浄の手順で、測定毎のＬＣ  ＭＳ／ＭＳサイクル時間が、４．３分から６．２分に増大した。
【０２０２】
２０μｌ、３０μｌおよび５０μｌの全血から柔軟な容量でのサンプリングが行われた。テストされたオピオイドは、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ＡＨ７９２１およびフェンタニールであった。３０μＬの全血を用いて較正曲線が調整された。添加されたレベルは、ＬＬＯＱ  ＱＣ（２ｎｇ／ｍＬまたは０．２ｎｇ／ｍＬ）であった。図１０および図１１には、２０μｌ乃至５０μｌの柔軟な容量でのサンプリングについてテストの結果が示されている。図１０の、量が多様な全血サンプル−２０μｌ、３０μｌおよび５０μｌ（各オピオイドについて左から右のカラム）−の各オピオイドのオピオイド濃度は、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドンおよびＡＨ７９２１については同様であったが、フェンタニールは、全ての量においてずっと濃度が低かった。図１１には、ＬＬＯＱ  ＱＣでの精度および確度が、（Ａ）２０μｌ、（Ｂ）３０μｌおよび（Ｃ）５０μｌの全血サンプルについて、相対誤差（ＲＥ）が±２０％で、かつ変化係数（ＣＶ）が２０％で、要求される基準をパスしたことが示されている。
【実施例７】
【０２０３】
［多層デバイスを用いての分析対象のオンラインＳＰＥ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳバイオ分析と結合した自動フロースルー溶出］
ここに記述される多層デバイスに全血を充当して生成される乾燥血漿斑によって、遠心分離を必要とせずに簡単な、現場でのサンプル採集から血漿を生成した赤血球（ＲＢＣ）の濾過が可能となった。全血液サンプルにおける関心のある分析対象を自動で分析するための多層デバイスが開発され、完全自動フロースルー溶出をオンラインＳＰＥ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳと結びつけて用いることで評価が行われた。定量測定に使われる関心のある代表的な分析対象には、４種のオピオイド（モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン）および５種の刺激物（アンフェタミン、メタンフェタミン、３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）、フェンテルミンおよびメフェドロン）が含まれ、一つの方法においては、それらに対応する重水素でラベル付けされた類似化合物を内部標準として用いた。方法を評価した結果、約５ｎｇ／ｍＬから約１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で良好な線形性（Ｒ２≧０．９９６３）が示された。日内および日間の精度および確度は、４つの品質管理（ＱＣ）レベルで受け入れ可能な範囲内にあった。抽出回収率は、定量の下方の限界（ＬＬＯＱ）と定量の上方の限界（ＵＬＯＱ）の双方で≧８７．９％であり、受け入れられる選択性と感度を伴っていた。ＤＰＳオンカード短期安定性は、化合物に依存し、保管に依存していた。評価された、本の形をした多層デバイスのさらなる利点には、Ｈｃｔの適用範囲がより広いこと（３０％から６０％）、自動オンライン分析の適合性、より高い血漿収量、サンプリング量が柔軟であるという特徴が含まれる。
【０２０４】
【表１１Ａ】
2019512093.tif 000014
【０２０５】
【表１１Ｂ】
2019512093.tif 000015
【実施例８】
【０２０６】
［多層デバイスを用いてのＲＢＣおよび網赤血球面蛋白質の分析］
赤血球およびその前駆体を含む多層デバイスの表部にある濾過膜ディスクを、表部から取り外して、免疫検定またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技法を用いて濾過膜の蛋白質とその他の構成要素を分析した。多層デバイスから濾過膜ディスクを取り外した後、そのディスクの一部または濾過膜ディスク全体をエタノールの緩衝溶液で覆って、可溶な蛋白質を取り除くのに十分な時間だけ超音波処理器に入れた。膜に結合した蛋白質を、例えば、バンド３またはトランスフェリン受容体であるがそれらに限られないものを、プロテアーゼ酵素で消化した後に濾過膜から解放して、その結果得られたペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで定量的に分析した。
【０２０７】
業界で知られていたり使われていたりする同様のアプローチを、細胞内蛋白質を定量化するのに用いることができる。
【０２０８】
乾燥した細胞成分を離れた場所で採集し、細胞表面の蛋白質を定量化することができるので、他のサンプル採集技術よりも大きな利点が得られる。例えば、ここに記述される乾燥血液技法を用いれば、血液サンプルを保管する間に観察される、網赤血球の成熟による変化が回避される。
【０２０９】
本発明の例としてまた含まれるのは、
【０２１０】
１．  カード用紙と、そのカード用紙に結合され、採集された血液サンプルの均一性を高めるためにポリエステル膜を備える血漿採集基板とを備える乾燥血漿斑カード。
【０２１１】
２．  紙血漿採集基板によって、採集された血液サンプルの濃度分布が制御される上記第１のカードである乾燥血漿斑カード。
【０２１２】
３．  濃度分布が、採集された血液サンプルの、中央と周辺の位置の間の違いに基づいている上記第２のカードである乾燥血漿斑カード。
【０２１３】
４．  採集された血液サンプルが、採集された血液サンプルのヘマトクリットを測定するために採集される上記第１のカードである乾燥血漿斑カード。
【０２１４】
５．  血漿採集基板には第一端と第二端とがある上記第１のカードである乾燥血漿斑カード。
【０２１５】
６．  第一端と第二端のみがカード用紙に結合され基板の内側の領域がカード用紙から分離されるようにカード用紙に対して外側に紙血漿採集基板が曲がっている上記第５のカードである乾燥血漿斑カード。
【０２１６】
７．  カード用紙と、そのカード用紙に結合され、採集された血液サンプルの均一性を高めるためにポリエステル膜を備える血漿採集基板とを備える乾燥血漿斑カードを提供し；血漿採集基板上に血液サンプルを採集し；かつ採集した血液サンプルをオピオイドについて分析するステップを備える方法。
【０２１７】
８．  紙血漿採集基板によって、採集された血液サンプルの濃度分布が制御される上記第７の方法である方法。
【０２１８】
９．  濃度分布が、採集された血液サンプルの、中央と周辺の位置の間の違いに基づいている上記第８の方法である方法。
【０２１９】
１０．  採集された血液サンプルのヘマトクリットを測定するステップをさらに備える上記第７の方法である方法。
【０２２０】
１１．  血漿採集基板には第一端と第二端とがある上記第７の方法である方法。
【０２２１】
１２．  第一端と第二端のみがカード用紙に結合され基板の内側の領域がカード用紙から分離されるようにカード用紙に対して外側に紙血漿採集基板が曲がっている上記第１１の方法である方法。
【０２２２】
上の記載は例示的であって制限的なものではない。開示を見直すことで、当業者には本発明のバリエーションがたくさん明らかになるであろう。したがって、本発明の範囲は、上の記述を参照することによってではなく、出願中の特許請求の範囲を、それらの範囲全体またはそれと等価のものと共に参照して決められる。
【０２２３】
ここに引用される、全ての特許、特許出願、印刷物、要約、図書、参照マニュアル、要約などの内容は参照することによってその全体がここに組み込まれ、本開示が関係する最新の技術をより完全に記述するものとなる。
【０２２４】
いずれの実施形態もその一つ以上の特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態の一つ以上の特徴と組み合わされる。単数形による記載は、特にそうでない旨の断りがない限り「一つ以上の」ものを意味することを意図している。「および／または」との記載は、特にそうでない旨の断りがない限り、より内包的な意味の用語を表すことを意図している。
【０２２５】
本システムの一つ以上の要素は、特定の機能を達成するための手段として請求項に記載されている。請求されているシステムのある要素を記述するのにそのようなミーンズ・プラス・ファンクションの要素が用いられていれば、本明細書、図面および請求項を手にする当業者は、対応する構造が、汎用のコンピュータ、プロセッサ、またはマイクロプロセッサ（本件に該当するような）であり、それは、特別なプログラミングで、および／または、記述されている機能を達成する一つ以上のアルゴリズムを実行することによって、汎用コンピュータに見られる機能を使って、記述された特定の機能が実施されるようプログラムされているということを理解するものである。当業者であれば理解することであるが、本件の開示では、アルゴリズムが、数式や、フローチャートや記述および／または、記述された処理やそれと等価のものを当業者が実行するのに十分な構造を提供するその他の方法として表現されている。
【０２２６】
本件の開示は多くの異なる形で実施されるが、本件の開示によって、一つ以上の発明の原理が例証され、例示される実施形態に本発明のいずれかを限定することを意図していないという理解のもとで図面や説明が提示されている。
【０２２７】
本発明の開示によって、前述の、長期間感じられてきた必要性に対する解決策が提示される。とりわけ、ここに記述されるシステムおよび方法は、ヘルスケアサービスの提供者の管理力が向上するように構成されている。当業者は、直ちに、前述のシステムおよび方法のさらなる利点や変形例を思いつくであろう。したがって、本件の開示は、そのより広い観点において、特定の細目、代表的なシステムや方法および、上に示され記述される説明的な実施例に限定されるものではない。本件の開示範囲またはその精神から逸脱することなく、前述の明細書には、種々の改変やバリエーションを加えることができ、そのような改変やバリエーションは全て、以下の請求の範囲やそれらと等価な範囲に入るならば、本件の開示でカバーされることを意図している。
【図１】
2019512093.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019512093.tif 000020
【図６Ａ】
2019512093.tif 000021
【図６Ｂ】
2019512093.tif 000022
【図７】
2019512093.tif 000023
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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