(57)【要約】  本明細書では、免疫細胞を活性化させる方法が提示される。方法は、免疫細胞の集団を用意するステップと、免疫細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含む。第１の薬剤は、第１の結合性部分に付加した免疫細胞活性化剤を含み、第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む。少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性部分と会合することが可能である。また、免疫細胞を活性化させるためのキットも提示される。【選択図】図２
2019534684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞を活性化させる方法であって、
ａ）免疫細胞の集団を用意するステップと；
ｂ）免疫細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップと
を含み、
第１の薬剤が、第１の結合性部分に付加した免疫細胞活性化剤を含み、
第２の薬剤が、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含み、
少なくとも１つの捕捉オリゴマーが、第１の結合性部分と会合することが可能である
方法。
【請求項２】
第１の結合性部分が、第１の結合性核酸配列である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫細胞活性化剤を、第１の結合性核酸配列に、共有結合を介して付加する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの捕捉オリゴマーが、捕捉オリゴヌクレオチドであり、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と相補的である、請求項１、２、または３記載の方法。
【請求項５】
第２の薬剤が、ローリングサークル法による増幅産物である、請求項１乃至４の一項または複数項記載の方法。
【請求項６】
免疫細胞が、Ｔ細胞であり、免疫細胞活性化剤が、Ｔ細胞活性化剤である、請求項１乃至５の一項または複数項記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞活性化剤が、抗ＣＤ３抗体またはその断片である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞の集団を、抗ＣＤ２８抗体、その断片、抗４−１ＢＢ抗体、その断片、およびこれらの組合せなどのＴ細胞共刺激剤と接触させるステップをさらに含む、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
免疫細胞活性化剤を、第１の結合性核酸配列に、中間結合性部分を介して、非共有結合的に付加する、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
中間結合性部分が、二次抗体、ビオチン、アビジン、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
中間結合性部分を、第１の結合性核酸配列に、共有結合を介して付加する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
中間結合性部分が、非共有結合的相互作用を介して、免疫細胞活性化剤に付加することが可能である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第１の薬剤を、免疫細胞の集団を含有する培地中、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成する、請求項１乃至１２の一項または複数項記載の方法。
【請求項１４】
第２の薬剤が、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーであり、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と相補的である、請求項１乃至１３の一項または複数項記載の方法。
【請求項１５】
免疫細胞が、ナチュラルキラー細胞であり、免疫細胞活性化剤が、抗ＣＤ３３５抗体、抗ＣＤ２４４抗体、抗ＣＤ２抗体、またはこれらの組合せなどのナチュラルキラー細胞活性化剤である、請求項１乃至５、９乃至１４の一項または複数項記載の方法。
【請求項１６】
Ｔ細胞を活性化させる方法であって、
ａ）Ｔ細胞の集団へと、抗ＣＤ３抗体、二次抗体に付加した第１の結合性部分、および少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む第２の薬剤を添加するステップと；
ｂ）Ｔ細胞の集団をインキュベートするステップと
を含み、
二次抗体が、抗ＣＤ３抗体に付加することが可能であり、
少なくとも１つの捕捉オリゴマーが、第１の結合性部分と会合することが可能である
方法。
【請求項１７】
第１の結合性部分が、第１の結合性核酸配列である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
第２の薬剤が、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーであり、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と相補的である、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
Ｔ細胞共刺激剤を、Ｔ細胞の集団へと添加するステップをさらに含む、請求項１６、１７、または１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｔ細胞共刺激剤が、抗ＣＤ２８抗体、その断片、抗４−１ＢＢ抗体、その断片、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２１】
第１の結合性核酸配列に付加した免疫細胞活性化剤と；
少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーと
を含み、
少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、細胞を活性化させるための方法およびキットに関し、より具体的には、免疫細胞を活性化させるための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞療法、例えば、Ｔ細胞療法は、血液腫瘍の処置において、めざましい成功を示しており、充実性腫瘍の処置においても、将来性を示す。これらの療法は一般に、患者またはドナーからの、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞の単離、ならびに、その後における、治療用量をもたらすための、活性化および増殖を必要とする。一般に、この種の個別療法は、がん患者から、血液細胞を摘出するステップと、免疫細胞を単離し、活性化させるステップと、がん細胞を認識し、攻撃するように、それらを遺伝子改変するステップと、遺伝子改変された免疫細胞を増加させるステップと、患者の免疫系が後を引き継ぐことができるように、増加させた免疫細胞を、患者の体内に導入し戻すステップとからなる。活性化は、免疫細胞を遺伝子改変し、それらを頑健に増加させるための、遺伝子素材の効率的な導入に必要とされるので、全工程のうちで、極めて重要な構成要素である。
【０００３】
免疫細胞、とりわけ、Ｔ細胞を活性化させ、増加させるために、複数の技術プラットフォームが存在する。例えば、抗体を、表面へと共有結合的に結合させた、超常磁性で、非発熱性のポリスチレンビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）は、Ｔ細胞を、単離し、活性化させ、増加させるために、最も広く使用されるプラットフォームのうちの１つである。しかし、このようなビーズベースのプラットフォームは、主に、細胞の増加が完了した後で、ビーズの除去が必要であるために、細胞をクラスター化させ、細胞を活性化させるために使用される場合、著明な細胞喪失を被る。ビーズ除去の問題を回避するための代替的な技術は、遺伝子改変のためにウイルスによる形質導入を一般に実行する場合の活性化早期において特に、細胞を活性化させるのに有効でないことが多い。
【０００４】
細胞療法はまた、患者もしくは第三者ドナー、または不死化細胞株から得られるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など、他の免疫細胞によっても実施することができる。一部の態様では、ＮＫ細胞ベースの細胞療法は、患者またはドナーの血液から、ＮＫ細胞を単離するステップと、ナチュラルキラー細胞を活性化させ、増加させるステップと、それらを、患者へと投与するステップとを伴う。ＮＫ細胞を活性化させ、増加させるための既存のプロトコールの大半は、フィーダー細胞との共培養を伴う。このようなフィーダー細胞系は、標準化が困難であり、細胞培養物へと、予測外の要素および汚染を導入しうる。
【０００５】
したがって、免疫細胞を活性化させるために、免疫細胞受容体をクラスター化する（例えば、Ｔ細胞を活性化させるために、細胞表面受容体をクラスター化するための）新奇の手法をもたらし、増殖を増大させる共刺激シグナルをもたらす、新たな技術プラットフォームが所望される。さらに、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの免疫細胞の、制御され、再現可能な活性化を達成するようにデザインされうる、フィーダー細胞非含有の、合成活性化系も必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第２０１６／０６８８１１号
【発明の概要】
【０００７】
一部の実施態様は、免疫細胞を活性化させる方法を対象とする。方法は、免疫細胞の集団を用意するステップと、免疫細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含む。第１の薬剤は、第１の結合性部分に付加した免疫細胞活性化剤を含み、第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む。少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性部分と会合することが可能である。
【０００８】
一部の実施態様は、Ｔ細胞を活性化させる方法を対象とする。方法は、Ｔ細胞の集団へと、抗ＣＤ３抗体、二次抗体に付加した第１の結合性部分、および少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む第２の薬剤を添加するステップを含む。二次抗体は、抗ＣＤ３抗体に付加することが可能であり、少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性部分と会合することが可能である。次いで、Ｔ細胞の集団をインキュベートして、Ｔ細胞を活性化させる。
【０００９】
一部の実施態様は、免疫細胞を活性化させるためのキットを対象とする。キットは、第１の結合性核酸配列に付加した免疫細胞活性化剤と、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーとを含む。少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である。
【００１０】
付属の図を参照しながら、以下の発明を実施するための形態を読めば、本発明のこれらの特徴、態様、および利点、ならびに他の特徴、態様、および利点が、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】肯定的に検証された、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートの、Ｔ細胞への結合についての、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。ＤＮＡ（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を付加した抗ＣＤ２８抗体（抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図１Ｂ】肯定的に検証された、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートの、Ｔ細胞への結合についての、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。付加を施していない、または非修飾の抗ＣＤ２８抗体（陽性対照）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図１Ｃ】肯定的に検証された、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートの、Ｔ細胞への結合についての、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。ＤＮＡ（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を付加した抗ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図１Ｄ】肯定的に検証された、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートの、Ｔ細胞への結合についての、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。付加を施していない、または非修飾の抗ＣＤ３抗体（陽性対照）の、Ｔ細胞への結合を示す図である。
【図１Ｅ】肯定的に検証された、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートの、Ｔ細胞への結合についての、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムである。ＦＩＴＣ標識化二次抗体（陰性対照）と共にインキュベートされた細胞を示す図である。
【図２】Ｔ細胞を活性化させるために、後でＲＣＡ産物を作出するための、一本鎖のＤＮＡ鋳型（ｓｓＲＣＡ）からの、環状のＤＮＡ鋳型の作出について例示する図である。
【図３Ａ】ＤＮＡベースのＴ細胞活性化（ＤＢＴＡ）組成物を使用する、Ｔ細胞の活性化であって、１および４日目において、ＣＤ２５の発現により測定される、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８対照（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）と比べた、Ｔ細胞の活性化についてのグラフ表示である。使用したＤＢＴＡ組成物は、ローリングサークル法による増幅産物であるＲＣＡａｃｔ、第１の結合性ＤＮＡ配列であるｏ２０ｂ（＋）ａｃｔに付加した抗ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、および非修飾抗ＣＤ２８抗体を含むＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ２８］であった。また、ローリングサークル法による増幅（ＲＣＡ）産物を伴う非修飾抗体、遊離ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔを伴う非修飾抗体、非修飾抗体だけ、ＲＣＡ産物だけ、および細胞単独（活性化剤を伴わない「細胞だけ」の対照）を含む、多様な対照も示される。
【図３Ｂ】４および７日目における、図３Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、出発細胞カウントと比べた増加倍数（ｘ倍の増加）として表示される細胞の増加を示す。
【図４Ａ】ＣＤ２５の発現を使用して測定される、２つの異なるＤＢＴＡ組成物により達成される著明な活性化（「細胞だけ」の対照と比べた）を示すグラフ表示である。使用した、異なるＤＢＴＡ組成物は、ｉ）ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ２８］、およびｉｉ）ＲＣＡａｃｔ、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ、および抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔを含むＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］であった。また、対照である、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけの対照も示される。
【図４Ｂ】４および７日後における、図４Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される細胞の増加を示す。
【図５Ａ】ＤＢＴＡの構成要素を、細胞へと、個別に添加し、ｉｎ  ｓｉｔｕで会合させた場合（「ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］」により表される）、それらを細胞へと添加する前にあらかじめ会合させた場合（「あらかじめ会合させたＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］」により表される）と比較して、１日後において高活性化への傾向があることを示すグラフ表示である。
【図５Ｂ】４日後における、図５Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される細胞の増加を示す。
【図６Ａ】培養下、１日後において、ＣＤ２５の発現により測定されるＴ細胞の活性化であって、全ての場合に、同じＲＣＡａｃｔ濃度（６７ｎＭ）を維持することにより、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］を、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの、抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔに対する異なる比（図中では、抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡにより表される）のほか、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの、ＲＣＡａｃｔに対する異なる比でも使用する、Ｔ細胞の活性化を示すグラフ表示である。図に示される通り：ｉ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：１）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡおよび抗ＣＤ２８−ＤＮＡのいずれも、濃度を１μｇ／ｍＬ（６．７ｎＭ）とした研究を表し；ｉｉ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：２）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を１μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度を２μｇ／ｍＬとしたことを表し；ｉｉｉ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．５：１）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を０．５μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度を１μｇ／ｍＬとしたことを表し；ｉｖ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．２５：０．５）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を０．２５μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたことを表し；ｖ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．２５：０．２５）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を０．２５μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度も０．２５μｇ／ｍＬとしたことを表す。また、対照である、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけの対照も示される。
【図６Ｂ】４および７日後における、図６Ａと同じ培養物による細胞の増加についてのグラフ表示であり、これは、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される細胞の増加を示す。
【図７Ａ】培養下、２４時間後において、ＣＤ２５の発現により測定されるＴ細胞の活性化であって、３つの異なる条件：ｉ）ＲＣＡａｃｔを添加する前に、３０分間にわたり、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ：抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ比を１：１として、細胞を、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔとあらかじめ混合した（「プレインキュベート細胞−ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：１）］」により表される）条件；ｉｉ）３つのＤＢＴＡ構成要素全て（ＲＣＡａｃｔ、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を、個別に、細胞へと、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合のために、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ：抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ比を１：１として添加した（「ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：１）］」により表される）条件；およびｉｉｉ）３つのＤＢＴＡ構成要素全て（ＲＣＡａｃｔ、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を、個別に、細胞へと、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合のために、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ：抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ比を１：２として添加した（「ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：２）］」により表される）条件下におけるＴ細胞の活性化についてのグラフ表示である。全ての場合に、同じＲＣＡａｃｔ濃度を維持した。結果を、対照としての、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけと比較した。
【図７Ｂ】図７Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される、７日後における細胞の増加を示す。
【図８Ａ】培養の１および４日後において、ＣＤ２５の発現により測定されるＴ細胞の活性化であって、ＣｐＧを含有するＲＣＡ鋳型から作製された、ローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）と、ＣｐＧを含有しないＲＣＡ鋳型から作製されたＲＣＡａｃｔとを使用する培養条件下におけるＴ細胞の活性化を示すグラフ表示である。各種のＲＣＡａｃｔについて、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ：ＲＣＡａｃｔを、１：１、１：１０、および１：１００の比として探索した。抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ：ＲＣＡａｃｔの比は、Ａｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡとして表した。ＣｐＧを含有しないＲＣＡ鋳型から作製された、ローリングサークル法による増幅産物には、以下の実験条件：ｉ）比を１：１０とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧなし、１：１０のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；ｉｉ）比を１：１とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧなし、１：１のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；およびｉｉｉ）比を１：１００とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧなし、１：１００のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）を使用した。同様に、ＣｐＧを含有するＲＣＡ鋳型から作製された、ローリングサークル法による増幅産物には、以下の実験条件：ｉ）比を１：１０とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧ、１：１０のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；ｉｉ）比を１：１とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧ、１：１のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；およびｉｉｉ）比を１：１００とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧ、１：１００のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）を使用した。結果を、対照としての、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけと比較した。
【図８Ｂ】図８Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、４および７日後における、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される細胞の増加を示す。
【図９Ａ】抗ＣＤ３抗体、その相補的なＲＣＡ産物、および非修飾抗ＣＤ２８抗体に付加した、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）配列の部分であって、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］により表される、ＭＲＳＡ配列の部分によるＴ細胞の活性化を示すグラフ表示である。結果を、ＲＣＡ産物だけ、非修飾抗体、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）、および細胞だけを含む、異なる対照条件と比較した。
【図９Ｂ】図９Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、４および７日後における、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される細胞の増加を示す。
【図１０Ａ】大型の、ローリングサークル法による増幅（ＲＣＡ）産物を利用した場合における、高度な細胞の活性化（ＣＤ２５の発現％）を示すグラフ表示である。データは、ＭＲＳＡに由来するＲＣＡ産物について示す。ｉ）ＤＢＴＡ（ＭＲＳＡ）１６Ｋｂ  ＲＣＡ産物は、ＲＣＡ産物が約１６キロベース（Ｋｂ）であると予測されるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］を表し；ｉｉ）ＤＢＴＡ（ＭＲＳＡ）１．５Ｋｂ  ＲＣＡ産物は、ＲＣＡ産物（超音波処理による）の標的サイズが１．５ＫｂであったＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］を表し；ｉｉｉ）ＤＢＴＡ（ＭＲＳＡ）０．１５Ｋｂ  ＲＣＡ産物は、ＲＣＡ産物（超音波処理による）の標的サイズが０．１５ＫｂであったＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］を表す。結果を、ＲＣＡ産物だけを伴う対照と比較した。
【図１０Ｂ】４日後および７日後における、図１０Ａと同じ培養物についてのグラフ表示である。
【図１１】ＤＮＡ（Ｄ）：抗体（Ｐ）比（Ｄ／Ｐ）を変化させることにより、抗体−ＤＮＡコンジュゲートを調製した場合のＤＢＴＡ組成物を使用して、１日後におけるＣＤ２５の発現により測定される、Ｔ細胞の活性化を示す図である。ｉ）ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］（Ｄ／Ｐ：２．８〜３．０）は、抗ＣＤ３：ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの比が、２．８〜３．０の間であり、抗ＣＤ２８：ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの比が、２．８〜３．０の間であるＤＢＴＡ組成物を表し；ｉｉ）ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］（Ｄ／Ｐ：１．５〜１．８）は、抗ＣＤ３：ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの比が、１．５〜１．８の間であり、抗ＣＤ２８：ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの比が、１．５〜１．８の間であるＤＢＴＡ組成物を表す。Ｄ／Ｐ比を大きくしたとき、Ｔ細胞の活性化は高度であった。結果を、対照としての、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけと比較した。図１１のデータは、８つの個別の実験から取った平均を表す。
【図１２Ａ】抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ、抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔを、第２の薬剤としてのカチオン性捕捉ポリマー（Ｊｅｔ  ＰＥＩまたはＰＬＬ）と共に使用する、１日後におけるＴ細胞の活性化を示す図である。ＤＢＴＡ組成物を、対照として使用した。実験は、以下の条件：ｉ）ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］；ｉｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、カチオン性捕捉ポリマーとして使用する、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋Ｊｅｔ  ＰＥＩ；およびｉｉｉ）ポリＬ−リシン（ＰＬＬ）を、カチオン性捕捉ポリマーとして使用する、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋ＰＬＬ下で行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけの試料もまた、対照として使用した。
【図１２Ｂ】図１２Ａと同じ培養物についてのグラフ表示であり、これは、４および７日後における、出発細胞カウントと比べた増加倍数として表示される細胞の増加を示す。
【図１３Ａ】ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］を使用する、７日間の増加期間にわたる、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の増加を示す図である。
【図１３Ｂ】ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］を、ＩＬ−２ベースの培地中で使用する、７日間の増加期間にわたる、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の増加を示す図である。
【図１４】ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗４−１ＢＢ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］を使用する、７日間の増加期間にわたる、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の増加を示す図である。
【図１５】二次抗体（抗ＩｇＧ２ａ）、非修飾抗ＣＤ３一次抗体および非修飾抗ＣＤ２８一次抗体、ならびにローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）に付加した、第１の結合性ＤＮＡ配列および／または第２の結合性ＤＮＡ配列（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を含む系を使用する、Ｔ細胞の活性化（ＣＤ２５の発現により測定される）を示す図である。使用した異なる条件は、ｉ）二次抗体−ＤＮＡコンジュゲートが、２μｇ／ｍＬの濃度であり、非修飾一次抗体の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が、１μｇ／ｍＬの濃度であり、ＲＣＡａｃｔが、一次抗体の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に照らして、１０倍モル過剰量である、抗ＩｇＧ２ａ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ（２μｇ／ｍＬ）＋ＲＣＡａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ３＋非修飾抗ＣＤ２８；およびｉｉ）二次抗体−ＤＮＡコンジュゲートが、４μｇ／ｍＬの濃度であり、非修飾一次抗体の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が、１μｇ／ｍＬの濃度であり、ＲＣＡａｃｔが、一次抗体の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に照らして、１０倍モル過剰量である、抗ＩｇＧ２ａ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ（４μｇ／ｍＬ）＋ＲＣＡａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ３＋非修飾抗ＣＤ２８であった。ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］、ならびに非修飾抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍＬ）、およびＩｇＧ２特異的二次抗体（４μｇ／ｍＬ）の混合物を、対照として使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓとして表される）および細胞だけの試料を、さらなる対照として使用した。
【図１６】二次抗体（抗ＩｇＧ１）、非修飾一次抗体（抗ＣＤ３３５および抗ＣＤ２、または抗ＣＤ３３５および抗ＣＤ２４４）、およびローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）に付加した、第１の結合性ＤＮＡ配列および／または第２の結合性ＤＮＡ配列（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を含む系を使用する、ＮＫ細胞の活性化（ＣＤ２５の発現により測定される）を示す図である。使用した異なる条件は、ｉ）抗ＩｇＧ１−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋ＲＣＡａｃｔ＋抗ＣＤ３３５＋抗ＣＤ２；およびｉｉ）抗ＩｇＧ１−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋ＲＣＡａｃｔ＋抗ＣＤ３３５＋抗ＣＤ２４４であった。細胞だけの試料および可溶性抗体だけの試料を、陰性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施は、本明細書で例示だけを目的として提示すべきものであり、付属の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものとしては解釈すべきではない、以下の例から、なおより完全に理解されるであろう。実施例節で使用される一部の略号は、以下の通り：「ｍｇ」：ミリグラム；「ｎｇ」：ナノグラム；「ｐｇ」：ピコグラム；「ｆｇ」：フェムトグラム；「ｍＬ」：ミリリットル；「ｍｇ／ｍＬ」：１ミリリットル当たりのミリグラム；「ｍＭ」：ミリモル濃度；「ｍｍｏｌ」：ミリモル；「ｐＭ」：ピコモル濃度；「ｐｍｏｌ」：ピコモル；「μＬ」：マイクロリットル；「ｍｉｎ．」：分、および「ｈ．」：時間に拡張される。
【００１３】
文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の指示対象を含む。本明細書および特許請求の範囲を通して使用される近似表現は、それが関連する基本的な機能の変化を結果としてもたらさずに、許容可能な形で変動しうる、任意の定量的表示を修飾するのに適用することができる。したがって、「約」などの用語により修飾された値は、指定される正確な値に限定されないものとする。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書および特許請求の範囲で使用される、分子量、反応条件など、成分、特性の数量を表す全ての数は、全ての場合に、「約」という用語により修飾されていると理解するものとする。したがって、逆のことが指し示されない限りにおいて、以下の明細書および添付の特許請求の範囲において明示される数値パラメータは、本発明が得ようとする所望の特性に応じて変動しうる近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効桁数に照らして、常套的な丸めの技法により、少なくとも解釈すべきである。
【００１４】
一部の実施態様は、免疫細胞を活性化させる方法を対象とする。方法は、免疫細胞の集団を用意するステップと、免疫細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含む。第１の薬剤は、第１の結合性部分に付加した免疫細胞活性化剤を含み、第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む。少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性部分と会合することが可能である。
【００１５】
ある特定の実施態様は、患者自身の細胞の回収、操作、および再移入を伴う、自家細胞療法を対象とするが、開示される技法の適用は、同種細胞を含みうる。適用はまた、修飾ヒト細胞、不死化細胞株（例えば、ＮＫ９２細胞株）、または非ヒト細胞も含みうる。開示される技法と共に使用されるものとして想定される細胞ベースの療法は、臓器もしくは組織の再生、がん処置、血液障害、免疫療法、心臓疾患のための療法、または他の任意の細胞ベースの療法を含むがこれらに限定されない。本発明の文脈内では、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞（腫瘍浸潤リンパ球を含む）、またはナチュラルキラー細胞などの免疫細胞型を含むがこれらに限定されない、様々な細胞型を用いることができる。細胞は、末梢血、骨髄、または腫瘍組織など、任意の組織から単離することができる。一部の実施態様は、末梢血から濃縮されたＴ細胞を対象とする。濃縮は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）勾配またはＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する遠心分離により実施することができる。他の一部の実施態様は、ＣＤ２８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋  Ｔ細胞、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞など、Ｔ細胞の特異的な部分集団を対象とする。細胞は、陽性選択法により単離することもでき、陰性選択法により単離することもできる。
【００１６】
本明細書で使用される「第１の薬剤」という用語は、「第２の薬剤」と会合し、免疫細胞など、活性化可能な細胞を、活性化させうる構成要素を指す。第１の薬剤は、「第１の結合性部分」に付加した細胞活性化剤を含む。第１の結合性部分とは、「第２の薬剤」と会合することが可能な分子である。第２の薬剤とは、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む捕捉ポリマーであって、少なくとも１つの捕捉オリゴマーが、第１の結合性部分と会合することが可能な捕捉ポリマーを指す。したがって、第１の薬剤は、第１の結合性部分を介して、第２の薬剤と会合することが可能である。
【００１７】
本明細書で使用される「免疫細胞活性化剤」という用語は、獲得免疫系または自然免疫系（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）の細胞を、増殖、細胞障害潜在力の増強、および／または形質導入のために活性化させうる、任意の薬剤を指す。
【００１８】
「付加した」という用語は、当技術分野で公知の、任意の付加手段を指す。付加は、共有結合の場合もあり、非共有結合的相互作用（例えば、静電相互作用または疎水性相互作用）の場合もある。非共有結合的相互作用はまた、「会合」とも称する。
【００１９】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｓｉｔｕ」という用語は、一般に、元の位置で生じるイベントを指す。ｉｎ  ｓｉｔｕとは、免疫細胞の活性化が生じる培地など、免疫細胞の集団を含有する培地中で生じるイベントを指す場合がある。一部の実施態様では、「ｉｎ  ｓｉｔｕで」とは、細胞培養条件下にある免疫細胞培養培地中で生起するイベントを指す。
【００２０】
一部の実施態様では、細胞活性化剤は、免疫細胞活性化剤であり、第１の結合性部分は、第１の結合性核酸配列である。したがって、第１の薬剤は、第１の結合性核酸配列に付加した免疫細胞活性化剤を含む。このような実施態様では、第２の薬剤は、第１の結合性核酸配列と会合すること（すなわち、非共有結合的相互作用を介して）が可能な、少なくとも１つの「捕捉オリゴマー」を含む。一部の実施態様では、第２の薬剤は、捕捉核酸ポリマーであり、捕捉オリゴマーは、「捕捉オリゴヌクレオチド」である。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマーは、単一の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマーは、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む。複数の捕捉オリゴヌクレオチド中の捕捉オリゴヌクレオチドは全て、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と会合することが可能であることを条件として、同じ種類（すなわち、全ての捕捉オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を有する）の場合もあり、異なる種類（すなわち、各捕捉オリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有するか、または捕捉オリゴヌクレオチドの第１のセットは、第２のセットと比較して、異なるヌクレオチド配列を有する）の場合もある。一部の実施態様では、第２の薬剤は、ローリングサークル法による増幅産物である。ローリングサークル法による増幅産物は、ローリングサークル法による増幅を介して、コンカタマーを形成するように、環状の核酸鋳型を増幅することにより作り出すことができ、この場合、コンカタマーは、環状の核酸鋳型配列のリピート単位を含む。同じ種類または異なる種類の捕捉オリゴヌクレオチドを含む、ローリングサークル法による増幅産物は、核酸鋳型配列を、適切にデザインすることにより作出することができる。例えば、異なる種類の捕捉オリゴヌクレオチドを含む、ローリングサークル法による増幅産物は、目的の配列を含有するように、鋳型核酸配列を調整することにより作り出すことができる。環状の鋳型を操作し、複数のプライマーを使用することによってもまた、複合体構造をもたらすように、ローリングサークル法による増幅産物を調整してデザインすることができる。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマー中の、複数の捕捉オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列のタンデムリピートを含む。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマーは、少なくとも２つの捕捉オリゴヌクレオチドを含み、この場合、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能であり、少なくとも１つの他の捕捉オリゴヌクレオチドは、第２の結合性核酸配列と会合することが可能である。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマー中の捕捉オリゴヌクレオチドの数は、３を超え、好ましくは３０を超え、より好ましくは３００を超える。ある特定の実施態様では、捕捉オリゴヌクレオチドの数は、２０００を超える。したがって、捕捉核酸ポリマーは、同じであるかまたは異なるヌクレオチド配列、分子量、幾何学的配置、および／または反復のパターンを有する、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含みうる。一部の実施態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、約６ヌクレオチド〜約１２ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド〜約５０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチド、または約２５０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの範囲の長さを有しうる。一部の実施態様では、第２の薬剤は、二本鎖の捕捉核酸ポリマーであるが、他の実施態様では第２の薬剤は、一本鎖の捕捉核酸ポリマーである。捕捉核酸ポリマーは、核酸塩基上、糖上、またはリン酸骨格上に修飾を伴う、天然または非天然のヌクレオチドを含みうる。第２の薬剤は、さらに、捕捉オリゴヌクレオチドとは異なる数および／または配列のヌクレオチドを有する、スペーサーオリゴヌクレオチド配列を含む場合もあり、核酸以外のスペーサー分子を含む場合もある。
【００２１】
第１の結合性核酸配列は、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドと相補的である。第１の結合性核酸配列および少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドは、相補的な塩基対ハイブリダイゼーションを介して会合することが可能である。一部の実施態様では、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドの、全てのヌクレオチド残基は、第１の結合性核酸配列内の、相補的なヌクレオチドとハイブリダイズしうる。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、５０ヌクレオチド残基を有する場合があり、５０ヌクレオチド残基の全ては、第１の結合性核酸配列内の、相補的なヌクレオチドとハイブリダイズしうる。一部の実施態様では、捕捉オリゴヌクレオチドの、全てのヌクレオチドは、第１の結合性核酸配列内に、対応する相補的なヌクレオチドを有さない場合がある。一部の実施態様では、捕捉オリゴヌクレオチドと、第１の結合性核酸配列との間には、１または複数の塩基対のミスマッチが存在しうる。さらに他の実施態様では、捕捉オリゴヌクレオチドおよび／または第１の結合性核酸配列は、アジドチミジン、イノシン、またはウリジンなどの修飾塩基、または修飾糖（例えば、２’−Ｏ−アルキル修飾されたフラノシド）、または修飾骨格（例えば、ホスホロチオエート骨格、アルキルホスホネート骨格、ホスホルアミデート骨格）を伴う核酸類似体を含みうる。
【００２２】
他の一部の実施態様では、第２の薬剤は、ヒスチジンまたはリシンなど、カチオン性モノマーの連続的連なりを含有する、少なくとも１つのカチオン性捕捉オリゴマーを含むカチオン性捕捉ポリマーである。一部の実施態様では、カチオン性捕捉ポリマーは、複数のカチオン性捕捉オリゴマーを含む。カチオン性捕捉ポリマーは、全体の電荷が、カチオン性を維持することを条件として、さらに、中性またはアニオン性のスペーサー残基も含みうる。
【００２３】
第１の薬剤または第２の薬剤は、さらに、非相補的なスペーサーヌクレオチド配列を含む場合もあり、核酸以外のスペーサー分子を含む場合もある。一部の実施態様では、第１の結合性部分は、第１の結合性核酸配列、アルギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、またはヒアルロン酸塩など、アニオン性の第１の結合性部分であり、第２の薬剤は、少なくとも１つのカチオン性捕捉オリゴマーを含むカチオン性捕捉ポリマーである。アニオン性の第１の結合性部分は、静電会合を介して、少なくとも１つのカチオン性捕捉オリゴマーと会合することが可能である。さらに他の実施態様では、第１の結合性部分は、カチオン性の第１の結合性部分であり、第２の薬剤は、少なくとも１つのアニオン性捕捉オリゴマーを含む、アニオン性捕捉ポリマーである。
【００２４】
一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤を、共有結合により、第１の結合性部分に付加する。免疫細胞活性化剤を、チオール／マレイミド付加化学反応、またはカルボジイミド／アミン付加化学反応など、当技術分野で公知の、任意の共有結合により、第１の結合性部分に付加することができる。一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤を、非共有結合的相互作用により、第１の結合性部分に付加する。他の一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤を、中間結合性部分を介して、非共有結合的相互作用により、第１の結合性部分に付加するが、この場合、中間結合性部分を、（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用を介して）第１の結合性部分に付加する。一部の実施態様では、中間結合性部分は、共有結合により、第１の結合性部分に付加されており、中間結合性部分は、非共有結合的相互作用により、免疫細胞活性化剤に付加することが可能である。一部の実施態様では、中間結合性部分は、免疫細胞活性化剤に直接付加することが可能である。例えば、中間結合性部分は、二次抗体でありえ、免疫細胞活性化剤は、一次抗体でありうる。一般に、二次抗体は、一次抗体の１種に対するものである。例えば、免疫細胞活性化剤が、マウス抗体である場合、適切な二次抗体は、ヒツジまたはヤギに由来する抗マウスポリクローナル抗体など、マウス免疫グロブリンに対する特異性を伴うポリクローナル抗体の場合もあり、ラット由来抗マウスＦｃ抗体などの抗マウスモノクローナル抗体の場合もある。他の一部の実施態様では、中間結合性部分は、リンカー部分を介して、免疫細胞活性化剤に、間接的に付加することが可能であるが、この場合、リンカー部分を、免疫細胞活性化剤に、共有結合的に付加する。例えば、リンカー部分が、ビオチンまたはこの誘導体である場合、適切な中間結合性部分は、アビジンの場合もあり、ビオチンに特異的な抗体の場合もある。代替的に、リンカー部分が、アビジンである場合、適切な中間結合性部分は、ビオチンの場合もあり、抗アビジン抗体の場合もある。
【００２５】
一部の実施態様では、免疫細胞の集団を接触させる前に、中間結合性部分に付加した第１の結合性部分と、免疫細胞活性化剤とを混合して、あらかじめ形成するか、またはあらかじめ会合させた、第１の薬剤を形成する。このような実施態様では、次いで、免疫細胞を活性化させるために、あらかじめ形成するか、またはあらかじめ会合させた、第１の薬剤を、免疫細胞の集団へと添加することができる。他の一部の実施態様では、中間結合性部分に付加した、第１の結合性部分と、免疫細胞活性化剤とを、あらかじめ混合せずに、培地中に含有される免疫細胞の集団へと、個別に添加する。このような実施態様では、第１の薬剤を、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成する。
【００２６】
一部の実施態様では、本開示は、免疫細胞を活性化させる方法であって、免疫細胞の集団を用意するステップと、免疫細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含む方法に関する。第１の薬剤は、免疫細胞活性化剤と、第１の結合性核酸配列とを含み、この場合、免疫細胞活性化剤は、第１の結合性核酸配列に、中間結合性部分を介して付加されている。中間結合性部分は、第１の結合性核酸配列に、共有結合により付加されており、中間結合性部分は、非共有結合的相互作用により、免疫細胞活性化剤に付加することが可能である。第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含み、少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である。一部の実施態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【００２７】
一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤は、Ｔ細胞活性化剤でありうる。Ｔ細胞活性化剤の適切な例は、有機低分子（例えば、イオノマイシン、酢酸ミリスチン酸ホルボール）、天然ペプチドもしくは修飾ペプチド、タンパク質（例えば、抗体またはアフィボディー）、非天然のペプチド模倣体、核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアプタマー）、多糖（例えば、レクチンまたは糖）、脂質、酵素、酵素の基質もしくは阻害剤、リガンド、受容体、抗原、またはハプテンを含むがこれらに限定されない。Ｔ細胞活性化剤は、Ｔ細胞内の一次活性化シグナルの送達を結果としてもたらす、Ｔ細胞活性化受容体など、Ｔ細胞表面受容体に結合することにより、Ｔ細胞を活性化させうる。Ｔ細胞活性化受容体の例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＣＤ３受容体を含むがこれらに限定されない。一次活性化シグナルは、抗原特異的なＴ細胞の活性化を刺激するために、ＴＣＲと、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子と共に提示される抗原との結合を介して誘発されうる。一次活性化シグナルはまた、ポリクローナルなＴ細胞の活性化を刺激するために、ＣＤ３受容体と、ＣＤ３受容体へとターゲティングされるリガンドとの結合を介しても誘発されうる。一部の実施態様の例では、Ｔ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体またはその断片（例えば、ＣＤ３受容体結合断片）である。Ｔ細胞活性化剤の他の例は、コンカナバリンＡ、ホルボールエステル（例えば、酢酸ミリスチン酸ホルボール）またはカルシウムイオノフォア（例えば、細胞質内のカルシウム濃度を上昇させるイオノマイシン）など、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤を含む。
【００２８】
一部の実施態様は、Ｔ細胞を活性化させる方法であって、Ｔ細胞の集団を用意するステップと、Ｔ細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含む方法を対象とする。第１の薬剤は、第１の結合性部分に付加したＴ細胞活性化剤を含み、第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む。少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性部分と会合することが可能である。一部の実施態様では、少なくとも１つの捕捉オリゴマーと、第１の結合性部分との会合は、Ｔ細胞活性化剤を、互いと近接させ、Ｔ細胞表面受容体を、クラスター化させる。一部の実施態様では、Ｔ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体である。一部の実施態様では、第１の結合性部分は、第１の結合性核酸配列であり、第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーである。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマーは、ローリングサークル法による増幅産物である。一部の実施態様では、第１の結合性部分は、第１の結合性核酸配列であり、第２の薬剤は、カチオン性捕捉ポリマーである。
【００２９】
一部の実施態様では、Ｔ細胞を活性化させる方法は、複数種類の第１の薬剤の添加を含む。例えば、一部の実施態様では、Ｔ細胞を活性化させる方法は、２つの異なる種類の活性化剤（例えば、抗ＣＤ３抗体およびコンカナバリンＡ）を含む、第１の薬剤の添加を含みうる。例えば、第１の薬剤の１つの種類は、第１の結合性核酸配列に付加した抗ＣＤ３抗体を含むことが可能であり、第１の薬剤の他の種類は、第１の結合性核酸配列に付加したコンカナバリンＡを含みうる。
【００３０】
一部の実施態様では、Ｔ細胞を活性化させる方法は、Ｔ細胞共刺激剤の添加をさらに含む。Ｔ細胞共刺激剤の例は、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、または４−ＩＢＢの受容体などのＴ細胞共刺激性受容体へとターゲティングされるリガンドを含むがこれらに限定されない。一部の実施態様では、Ｔ細胞を活性化させる方法は、２つの異なる種類のＴ細胞共刺激剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体および抗４−ＩＢＢ抗体）の添加を含みうる。一部の実施態様では、Ｔ細胞共刺激剤を、第２の結合性部分に付加することができる。一部の実施態様では、第２の結合性部分は、第２の結合性核酸配列である。このような実施態様では、第２の薬剤は、少なくとも２つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーであり、この場合、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能であり、少なくとも１つの他の捕捉オリゴヌクレオチドは、第２の結合性核酸配列と会合することが可能である。一部の実施態様では、第１の結合性核酸配列と、第２の結合性核酸配列とは、同じヌクレオチド配列を有する。このような実施態様では、少なくとも２つの捕捉オリゴヌクレオチド中の、いずれの捕捉オリゴヌクレオチドも同一であり、第１の結合性核酸配列および第２の結合性核酸配列と相補的である。他の一部の実施態様では、第１の結合性核酸配列と、第２の結合性核酸配列とは、異なる種類であり、同じヌクレオチド配列を有さない。このような実施態様では、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と相補的であり、少なくとも１つの他の捕捉オリゴヌクレオチドが、第２の結合性核酸配列と相補的であるという条件で、捕捉オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの異なる配列を有する。他の一部の実施態様では、第２の薬剤は、カチオン性捕捉ポリマーであり、第２の結合性部分は、アニオン性の第２の結合性部分である。さらに他の実施態様では、第２の薬剤は、アニオン性捕捉ポリマーであり、第２の結合性部分は、カチオン性の第２の結合性部分である。
【００３１】
一部の実施態様では、Ｔ細胞活性化剤を、第１の結合性核酸配列に、中間結合性部分を介して、非共有結合的に付加する。一部の実施態様は、Ｔ細胞を活性化させる方法であって、第１の薬剤を、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成する方法を対象とする。このような実施態様では、方法は、Ｔ細胞の集団へと、Ｔ細胞活性化剤、中間結合性部分に付加した第１の結合性核酸配列、および少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む第２の薬剤を添加するステップと、Ｔ細胞の集団をインキュベートして、Ｔ細胞を活性化させるステップとを含む。中間結合性部分は、Ｔ細胞活性化剤に付加することが可能であり、少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である。
【００３２】
一部の実施態様では、Ｔ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体などの一次抗体であり、中間結合性部分は、二次抗体である。第１の結合性核酸配列は、二次抗体に、共有結合を介して付加されており、二次抗体は、非共有結合的相互作用により、一次抗体に付加することが可能である。
【００３３】
一部の実施態様は、Ｔ細胞を活性化させる方法であって、第１の薬剤と、第２の薬剤と、任意選択で、第２の結合性部分に付加する場合もあり、付加しない場合もあるＴ細胞共刺激剤とを、培地中に用意されたＴ細胞の集団へと、同時に、または任意の順序で逐次的に添加して、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合を可能とする方法を対象とする。さらに他の実施態様では、第１の薬剤と、第２の薬剤と、任意選択で、第２の結合性部分に付加したＴ細胞共刺激剤とを会合させて、あらかじめ会合させた複合体を形成する。次いで、あらかじめ会合させた複合体を、Ｔ細胞の集団へと添加する。好ましい実施態様では、第１の薬剤と、第２の薬剤と、任意選択で、第２の結合性部分に付加したＴ細胞共刺激剤とを、ｉｎ  ｓｉｔｕで会合させる。
【００３４】
一部の実施態様では、Ｔ細胞など、免疫細胞の集団の部分を活性化させるのに十分な時間は、約１分間〜約１４日間の範囲でありうる。ある特定の実施態様では、時間は、約２４時間〜約８日間の範囲でありうる。一部の実施態様では、Ｔ細胞のうちの少なくとも１５％を活性化させる。好ましい実施態様では、Ｔ細胞のうちの少なくとも２５％を活性化させ、より好ましい実施態様では、５０％を超える、Ｔ細胞の大部分を活性化させる。インキュベーションは、温度、湿度、ＣＯ２濃度の環境を制御したバイオリアクター内で、例えば、３７℃および５％ＣＯ２で行うことができる。一部の実施態様では、バイオリアクターを動かさない、静置型バイオリアクター内で、インキュベーションを行いうるのに対し、他の一部の実施態様では、揺動プラットフォーム上に置かれたバイオリアクター内で、インキュベーションを行うこともできる。
【００３５】
一部の実施態様では、本開示は、混合されたＴ細胞の集団から、Ｔ細胞の特異的な部分集団を活性化させ、選択的に増加させる方法を提示する。これは、例えば、Ｔ細胞活性化剤およびＴ細胞共刺激剤の、性質または相対的比率を変化させることにより達成することができる。さらに、本開示は、Ｔ細胞表面受容体のクラスター化を制御し、こうして、例えば、Ｔ細胞活性化剤、および第２の薬剤と会合させるＴ細胞共刺激剤の数またはこれらの間の距離を調整することにより、Ｔ細胞表面受容体の活性化を制御する方法を提示する。第２の薬剤が、捕捉核酸ポリマーである例では、これは、捕捉オリゴヌクレオチドの数および／もしくは長さ、ならびに／またはスペーサーの長さを制御することにより達成することができる。細胞活性化のレベルはまた、第１の薬剤と第２の薬剤との間の会合であって、例えば、Ｔ細胞活性化剤に付加した、第１の結合性部分の数を変化させることによりなされうる会合を制御することによっても制御することができる。一部の実施態様では、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の相対集団は、Ｔ細胞活性化剤およびＴ細胞共刺激剤の、性質または相対的比率を変化させることによりモジュレートすることができる。例えば、Ｔ細胞共刺激剤を、ＣＤ２８受容体に対する抗体から、４−１ＢＢ受容体に対する抗体へと変化させることにより、ＣＤ８細胞の、ＣＤ４細胞に対する比率を増大させることができる。
【００３６】
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、免疫細胞の活性化を評価することができる。一部の実施態様では、ＣＤ２５に対する抗体など、ある特定の抗体の発現を使用して、Ｔ細胞の活性化を測定することができる。ある特定の実施態様では、Ｔ細胞上のＣＤ２５受容体の発現を、標識化抗ＣＤ２５抗体によりアッセイして、標識化細胞を数え上げることができる。ある特定の、他の実施態様では、Ｔ細胞亜型の活性化、増加、および分化は、他のマーカーにより測定することができる。Ｔ細胞の活性化、増加、および／または分化を測定するのに使用される他のマーカーは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ５７、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ１２７、およびＣＤ６２Ｌを含むがこれらに限定されない。
【００３７】
一部の実施態様は、ＮＫ細胞を活性化させる方法であって、ナチュラルキラー細胞の集団を用意するステップと、ナチュラルキラー細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含む方法を対象とする。第１の薬剤は、第１の結合性部分に付加したＮＫ細胞活性化剤を含み、第２の薬剤は、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む。少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性部分と会合することが可能である。一部の実施態様では、ＮＫ細胞活性化剤を、第１の結合性部分に、中間結合性部分を介して付加する。一部の実施態様では、第１の結合性部分は、第１の結合性核酸配列である。
【００３８】
一部の実施態様は、ＮＫ細胞を活性化させる方法であって、第１の薬剤を、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成する方法を対象とする。このような実施態様では、方法は、ＮＫ細胞の集団へと、ナチュラルキラー細胞活性化剤、中間結合性部分に付加した第１の結合性核酸配列、および少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む第２の薬剤を添加するステップと、ＮＫ細胞の集団をインキュベートして、ＮＫ細胞を活性化させるステップとを含む。中間結合性部分は、ナチュラルキラー細胞活性化剤に付加することが可能であり、少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である。
【００３９】
一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤は、ナチュラルキラー細胞活性化剤でありうる。ナチュラルキラー細胞活性化剤の適切な例は、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ２４４（２Ｂ４）などのシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー受容体、ＣＤ２２６などのＤＮＡＸアクセサリー分子、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）、もしくはＮＫｐ８０など、天然細胞傷害作用受容体（ＮＣＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、もしくはＣＤ２７などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、またはＩｌ−２Ｒ、Ｉｌ−１５Ｒ、Ｉｌ−１８Ｒ、もしくはＩｌ−２１Ｒなどのサイトカイン受容体を含むがこれらに限定されない活性化受容体へとターゲティングされるリガンドを含む。ナチュラルキラー細胞活性化剤の適切な例は、有機低分子、天然ペプチドもしくは修飾ペプチド、タンパク質（例えば、抗体またはアフィボディー）、非天然のペプチド模倣体、核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアプタマー）、多糖（例えば、レクチンまたは糖）、または脂質を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
一部の実施態様では、ＮＫ細胞を活性化させる方法は、２つの異なる種類のナチュラルキラー細胞活性化剤（例えば、抗ＣＤ３３５抗体および抗ＣＤ２４４抗体）を含む、第１の薬剤の添加を含む。例えば、第１の薬剤の１つの種類は、第１の結合性核酸配列に付加した抗ＣＤ３３５抗体を含むことが可能であり、第１の薬剤の他の種類は、別の第１の結合性核酸配列に付加した抗ＣＤ２４４抗体を含みうる。さらに別の例では、第１の薬剤の１つの種類は、第１の結合性核酸配列に付加した抗ＣＤ３３５抗体を含むことが可能であり、第１の薬剤の他の種類は、別の第１の結合性核酸配列に付加した抗ＣＤ２抗体を含みうる。
【００４１】
一部の実施態様は、免疫細胞を活性化させる方法であって、免疫細胞の集団を用意するステップと、免疫細胞の集団を、第１の薬剤および第２の薬剤と接触させるステップとを含み、第１の薬剤および第２の薬剤が、細胞を入れるのに適する任意の培地中で可溶性である方法を対象とする。理解される通り、細胞を入れるのに適する培地は、細胞培養培地を含む、任意の等張性培地を含みうる。一部の実施態様では、細胞培養培地は、Ｔ細胞培養培地など、当技術分野で公知である、任意の免疫細胞培養培地を含みうる。例示的な細胞培養培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、ＣｅｌｌＧＲＯ（商標）ＳＣＧＭを含むがこれらに限定されない。細胞培養培地は、無血清の場合もあり、ヒト血清などの血清または血清サプリメントを補充されている場合もある。一部の実施態様では、細胞培養培地に、さらなる増殖因子、およびインターロイキン２（Ｉｌ−２）、インターロイキン７（Ｉｌ−７）、またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５）などのサイトカインをさらに補充する。
【００４２】
一部の実施態様では、第１の薬剤および第２の薬剤は、生体分解性である。一部の実施態様では、分解は、化学的手段により生じる場合もあり、酵素的手段により生じる場合もある。第２の薬剤が、捕捉核酸ポリマーであり、かつ／または第１の結合性部分が、第１の結合性核酸配列である、一部の実施態様では、第１の結合性部分および第２の薬剤は、ヌクレアーゼの添加により、Ｔ細胞に影響を及ぼさずに除去することができる。一部の実施態様では、Ｔ細胞の集団のうちの少なくとも一部を活性化させた後で、ヌクレアーゼを添加する。一部の実施態様では、Ｔ細胞を、少なくとも１０〜１００倍に増加させた後で、分解酵素を添加する。さらに他の実施態様では、Ｔ細胞を細胞培養培地から採取する前の、培養の終了時にヌクレアーゼを添加してから、洗浄し、濃縮し、最終的な製剤を作製する。ヌクレアーゼは、Ｔ細胞集団の少なくとも一部を活性化させた後であり、かつ、Ｔ細胞を、患者へと投与する前である、任意の時点に添加しうることに留意されたい。ある特定の実施態様では、分解の後、第１のおよび第２の薬剤の分解副産物は、Ｔ細胞の洗浄時および濃縮時に除去することができ、さらなる精製ステップは、不要である。他の一部の実施態様では、第２の薬剤および第１の薬剤は、生体適合性であり、血流中で急速に分解しうる。このような場合、Ｔ細胞を患者へと投与する前に、分解酵素の添加が必要とされないこともある。このような可溶性で生体分解性の系の使用は、著明な細胞の喪失をもたらすことが多い磁気的分離など、さらなる精製ステップの必要を回避しうるので、ポリスチレンビーズベースの手法または他の同等なビーズベースの手法より有利である。第２の結合性部分に付加したＴ細胞共刺激剤の添加を含む実施態様では、第２の結合性部分もまた、生体分解性でありうる。
【００４３】
一部の実施態様では、免疫細胞を活性化させる方法は、外来遺伝子を含むベクターの添加をさらに含む。例えば、Ｔ細胞を活性化させる方法は、さらに、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードする、外来遺伝子を保有するベクターの添加を含む。一部の実施態様では、ベクターは、γ−レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。他の一部の実施態様では、ベクターは、プラスミドベクターである。一部の実施態様では、ベクターを、第１の薬剤と同時に添加するのに対し、他の一部の実施態様では、ベクターを、免疫細胞の集団のうちの、少なくとも一部を活性化させた後で添加する。
【００４４】
一部の実施態様は、第１の結合性核酸配列に付加した免疫細胞活性化剤と、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーとを含み、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドが、第１の結合性核酸配列と相補的であるキットを対象とする。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマーは、ローリングサークル法による増幅産物である。一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤を、第１の結合性核酸配列に、中間結合性部分を介して付加する。
【００４５】
一部の実施態様は、免疫細胞活性化剤と、中間結合性部分に共有結合的に付加した第１の結合性核酸配列と、少なくとも１つの捕捉オリゴマーを含む第２の薬剤とを含むキットを対象とする。中間結合性部分は、免疫細胞活性化剤に付加することが可能であり、少なくとも１つの捕捉オリゴマーは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である。一部の実施態様では、第２の薬剤は、ローリングサークル法による増幅産物などの捕捉核酸配列である。一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤は、抗ＣＤ３３５抗体、抗ＣＤ２４４抗体、抗ＣＤ２抗体、またはこれらの組合せなどのナチュラルキラー細胞活性化剤である。
【００４６】
一部の実施態様は、第１の結合性核酸配列に共有結合的に付加した中間結合性部分と、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーとを含むキットを対象とする。中間結合性部分は、免疫細胞活性化剤に付加することが可能であり、少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドは、第１の結合性核酸配列と会合することが可能である。一部の実施態様では、中間結合性部分は、二次抗体であり、免疫細胞活性化剤は、一次抗体である。一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤は、抗ＣＤ３３５抗体、抗ＣＤ２４４抗体、抗ＣＤ２抗体、またはこれらの組合せなどのナチュラルキラー細胞活性化剤である。他の一部の実施態様では、免疫細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞活性化剤である。
【００４７】
一部の実施態様は、第１の結合性核酸配列に付加したＴ細胞活性化剤と、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含む捕捉核酸ポリマーとを含むキットを対象とする。一部の実施態様では、キットは、Ｔ細胞共刺激剤をさらに含む。一部の実施態様では、Ｔ細胞共刺激剤を、第２の結合性核酸配列に付加する。一部の実施態様では、捕捉核酸ポリマーは、捕捉用ＤＮＡポリマーであり、第１の結合性核酸配列は、第１の結合性ＤＮＡ配列であり、第２の結合性核酸配列は、第２の結合性ＤＮＡ配列である。具体例では、キットは、ローリングサークル法による増幅産物などの捕捉用ＤＮＡポリマーと、第１の結合性ＤＮＡ配列に付加した、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞活性化剤とを含む、ＤＮＡベースのＴ細胞活性化（ＤＢＴＡ）組成物である。一部の例では、ＤＢＴＡ組成物は、抗ＣＤ２８抗体または抗４１ＢＢ抗体などのＴ細胞共刺激剤をさらに含む。一部の例では、Ｔ細胞共刺激剤を、第２の結合性ＤＮＡ配列に付加する。
【実施例】
【００４８】
ＤＮＡベースのＴ細胞活性化（ＤＢＴＡ）組成物は、Ｔ細胞のクラスター化、活性化、およびその後の増加を誘発する系を含有する、代表的な捕捉核酸ポリマーである。可能なＤＢＴＡ組成物の一部は、Ａ）捕捉用ＤＮＡポリマーおよび第１の結合性ＤＮＡ配列に付加したＴ細胞活性化剤；またはＢ）捕捉用ＤＮＡポリマー、第１の結合性ＤＮＡ配列に付加したＴ細胞活性化剤、およびＴ細胞共刺激剤；またはＣ）捕捉用ＤＮＡポリマー、第１の結合性ＤＮＡ配列に付加したＴ細胞活性化剤、および第２の結合性ＤＮＡ配列に付加したＴ細胞共刺激剤である。Ｔ細胞活性化剤が、抗体であり、かつ／またはＴ細胞共刺激剤が、抗体である例では、第１の結合性ＤＮＡ配列に付加したＴ細胞活性化剤および／または第２の結合性ＤＮＡ配列に付加したＴ細胞共刺激剤を、一般に、「抗体−ＤＮＡコンジュゲート」または「Ａｂ−ＤＮＡ」と称する。
【実施例１】
【００４９】
抗体−ＤＮＡ（Ａｂ−ＤＮＡ）コンジュゲートの合成および多様なＤＢＴＡ組成物の作出
ＤＢＴＡ組成物のうちの１つは、４３塩基のオリゴヌクレオチドセグメントによるタンデムリピートを含むヒトベータ−アクチンに由来するローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）などの捕捉用ＤＮＡポリマー、ならびに以下の構成要素：（１）ヒトベータ−アクチンに由来する２０塩基のＤＮＡ配列（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）（配列番号４、第１の結合性ＤＮＡ配列）に共有結合的に付加した抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３、Ｔ細胞活性化剤）、および（２）これもまたヒトベータ−アクチンに由来する２０塩基のＤＮＡ配列（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）（配列番号４、第２の結合性ＤＮＡ配列）に共有結合的に付加した抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体（抗ＣＤ２８）を含む。このようなＤＢＴＡ組成物を、「ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］」と表す。別のＤＢＴＡ組成物は、ローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）、ならびに以下の構成要素：（１）ヒトベータ−アクチンに由来する２０塩基のＤＮＡ配列（ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）（配列番号４、第１の結合性ＤＮＡ配列）に共有結合的に付加した抗ＣＤ３、および（２）抗ＣＤ２８を含む。このようなＤＢＴＡ組成物を、「ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ２８］」と表す。ＲＣＡの鋳型およびローリングサークル法による増幅産物であるＲＣＡａｃｔを作出するためのプライマーの配列、ならびに対応する第１の結合性ＤＮＡ配列、および第２の結合性ＤＮＡ配列を、下記の表１に示す。
【００５０】
【表１】
2019534684.tif 000003
コンジュゲートである、抗ＣＤ３−ＤＮＡおよび抗ＣＤ２８−ＤＮＡの合成
第１の結合性ＤＮＡ配列および第２の結合性ＤＮＡ配列の、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ａｂ）のそれぞれへの共有結合的付加は、下記で記載される、マレイミド−チオールカップリング戦略を介して進める。以下の、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ（抗ＣＤ３−ＤＮＡ）コンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ（抗ＣＤ２８−ＤＮＡ）コンジュゲートの、合成、精製、および特徴付けについての具体的記載は、異なる抗体（Ａｂ）クローンのほか、異なる長さおよび組成の、異なる第１および第２の結合性核酸配列のための、一般的なコンジュゲーション戦略として適合させることができる。
マレイミドにより活性化させた第１の結合性ＤＮＡ配列および第２の結合性ＤＮＡ配列の調製
この例では、第１の結合性ＤＮＡ配列および第２の結合性ＤＮＡ配列は、同じヌクレオチド配列を有する。工程は、第１の結合性ＤＮＡ配列について記載されているが、また、第２の結合性ＤＮＡ配列へも適用される。出発ＤＮＡ配列（ｐｒｏｔ−ｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｎ末端のＣ６スペーサーでキャッピングされた、２０塩基の第１の結合性ＤＮＡ配列に続き、保護された三環式のマレイミド部分（ｐｒｏｔ−ｍａｌ）を含む。反応性マレイミド活性化誘導体（ｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）は、ｐｒｏｔ−ｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔから、逆電子要請型ディールス−アルダー脱保護ステップを介して作出した。マレイミドにより活性化させた第１の結合性ＤＮＡ配列（ｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を、無水トルエン中に懸濁させ（約１ｍｇ／ｍＬ）、９０℃で４時間にわたり加熱した。ベンチトップ型遠心分離を使用して、マレイミドにより活性化させた第１の結合性ＤＮＡ配列（ｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を沈殿させ、溶媒を除去した。沈殿したｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔを、低温エタノール（３×１ｍＬ）で洗浄した。減圧下で、残留有機溶媒をさらに低減したら、洗浄された固体生成物を、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ  ７．３中に溶解させた。ｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの最終濃度は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を介して決定した。結果として得られる原液（ＤＮＡ中に０．５〜１ｍＭ）を、チオール修飾抗体による抗体コンジュゲーションのために、直接使用した。残りのｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ原液は、反応性を著明に喪失させずに、−２０℃で、数カ月間にわたり保管した。
チオール修飾抗体中間体の調製
トラウト試薬（２−イミノチオラン塩酸塩）の１０ｍＭの原液を、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ  ７．３中でまず調製した。次いで、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬの、抗ＣＤ３  Ａｂ（ＯＫＴ３  クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）または抗ＣＤ２８  Ａｂ（９．３クローン、ＧｅｎｅＴｅｘ、ＵＳＡ）溶液を、２０倍濃度のｐＨ  ８．５ホウ酸緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）および１０〜１５ｍＭのトラウト試薬原液の両方と、８：１：１の容量比で混合した。結果として得られる溶液を、完全に混合し、室温で、０．７５〜１．２５時間にわたりインキュベートした。トラウト混合物の未使用分は、反応性を大きく喪失させずに、−２０℃で、数カ月間にわたり保管しうるが、新鮮な溶液が好ましい。抗体を活性化させた後、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．３緩衝液で平衡化させた、従来の脱塩カラム（例えば、ＮＡＰ−５またはＰＤ−１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、反応混合物を精製した。次いで、回収画分を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）により、速やかに解析した。この段階で結果として得られるタンパク質の回収率は、抗体について公知の、２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を使用して測定される、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体のいずれについても、＞６０％であることが典型的であった。
マレイミド活性化ＤＮＡ配列（第１の結合性ＤＮＡ配列および第２の結合性ＤＮＡ配列）の、チオール修飾Ａｂ中間体とのコンジュゲーションであって、Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を作出するコンジュゲーション
抗体−ＤＮＡコンジュゲートを作出するために、ある容量のｍａｌ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔを、調製されたばかりの精製チオール活性化抗体のアリコートへと添加して、１０〜４０：１のｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ：Ａｂの標的モルインプット比を達成した。完全に混合した後、結果として得られる溶液を、２５℃で、一晩（１６〜２４時間）にわたりインキュベートした。最終的なコンジュゲートの精製は、飽和塩化アンモニウム溶液を使用する、Ａｂの選択的沈殿を介して達成する。第一に、総反応容量と等容量の飽和塩化アンモニウム溶液を添加し、完全に混合し、氷上に置いた。１５分後、試料を、１０℃、１５，０００×ｇの相対遠心力（ｒｃｆ）で、１０分間にわたり遠心分離した。上清を除去した後、適切な最小容量の、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌによる、ｐＨ  ７の緩衝液を添加して、最終ペレットを再溶存させた。抗体−ＤＮＡコンジュゲート（Ａｂ−ＤＮＡ）の最終的な回収率および標識化効率は、ＤＮＡ含量（ε＝２１０，１００Ｍ−１ｃｍ−１）を決定するために、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、Ａ２６０の測定（ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）と組み合わせて使用して決定した。これらの条件下で、１つ〜５つの、第１の結合性ＤＮＡ配列を、抗ＣＤ３抗体の各分子に付加することができ、かつ／または１つ〜５つの、第２の結合性ＤＮＡ配列を、抗ＣＤ２８抗体の各分子に付加することができる。付加は、一般に、＞６０％の最終コンジュゲート回収率で達成される。代替的に、抗体−ＤＮＡコンジュゲートの標識化および収率はまた、参考文献である、Anal Chem. 2014 Apr 15; 86(8): 3869-3875の付録に記載されている方法により測定することもできる。コンジュゲート純度のさらなる確認は、解析的サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用し、標準タンパク質サイズの検量線に照らして決定する。典型的な解析的ＳＥＣ条件は、以下の通り：１０μＬの試料注射容量、０．５ｍＬ／分の流量、３０分間にわたる試行であって、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの硫酸ナトリウム、０．０５％のアジドナトリウムによる、ｐＨ  ６．７の緩衝液を、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ３０００ＳＷｘＬカラム（日本、東京、東ソー株式会社）上で使用する試行である。典型的な解析的ＳＥＣの溶出時間は、以下の通り：非標識化Ａｂ＝１６．８〜１７．０分間、付加を施していないｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＝２０．０分間、Ａｂ−ＤＮＡ（Ａｂ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）コンジュゲート混合物＝１０〜１５分間である。精製された最終Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート（沈殿および再懸濁の後の）は、ＳＥＣ解析において、結合しなかったＤＮＡ中間材料または出発材料の、＞９５％の除去を示す。
【実施例２】
【００５１】
抗ＣＤ３−ＤＮＡコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ＤＮＡコンジュゲートについての、Ｔ細胞への結合の検証
実施例１で調製したＡｂ−ＤＮＡコンジュゲートが、それらの、Ｔ細胞への特異的な細胞結合能力を保持することを確認するために、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ  Ｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、各コンジュゲートバッチについて、検証研究を実施した。Ｎｏｒｍａｌ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ（ＮＰＢ）Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＵＳＡ）を、１０ｍＬの温熱完全Ｘ−ｖｉｖｏ培地（表２を参照されたい）中、３７℃で融解させ、次いで、３００×ｇのｒｃｆで、１０分間にわたり遠心分離した。次いで、細胞を、１０ｍＬの新鮮な完全培地中に再懸濁させ、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−２００システム上で解析して、細胞のカウントおよび生存率を決定した。濃度を、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個へと調整し、ＰＢＳで洗浄した後で、Ｔ細胞を、ＰＢＳ中に１０％のＮｏｒｍａｌ  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ（ＮＧＳ）中、４℃で、１５分間にわたりブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後で、細胞を、１％のＮＧＳ／ＰＢＳ溶液中の抗体および抗体−ＤＮＡコンジュゲートと共に、４℃で、１５分間にわたりインキュベートした。並行する実験において、細胞を、抗ＣＤ３−ＤＮＡ（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、または抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）と共にインキュベートした。付加を施していない、または非修飾の抗ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂと共にインキュベートされた細胞を、陽性対照として使用した。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、抗ＣＤ３  Ａｂおよび抗ＣＤ２８  Ａｂの両方のマウスアイソタイプに特異的な、フルオロフォア標識化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）の、１％ＮＧＳ／ＰＢＳ溶液と共にインキュベートした。二次抗体を標識化するための典型的な希釈率は、１ｍｇ／ｍＬの原液に対して、１：２００である。４℃で１５分間にわたるインキュベーションの後で、細胞を、前出と同様に洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより解析して、Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲートと結合したＴ細胞の百分率を、非標識化Ａｂ（陽性対照）と結合したＴ細胞の百分率と比べて決定した。
【００５２】
図１Ａ〜１Ｅは、抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ、抗ＣＤ２８  Ａｂ（非標識化）、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ、抗ＣＤ３  Ａｂ（非標識化）、およびＦＩＴＣ標識化二次抗体のそれぞれによる、Ｔ細胞への結合についての、代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。これらの特定のＡｂ−ＤＮＡコンジュゲートバッチ（抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）については、高百分率の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の、細胞への結合が観察された（いずれについても、＞８５％）。これらの結果は、ＤＮＡへの付加にもかかわらず、抗ＣＤ３  Ａｂ試料および抗ＣＤ２８  Ａｂ試料の著明な部分が、それらのＴ細胞への結合能力を保持することを指し示す。
【実施例３】
【００５３】
ローリングサークル増幅を使用する、Ｔ細胞活性化のための、捕捉核酸ポリマーの作製
一本鎖ローリングサークル増幅（ｓｓＲＣＡ）の工程であって、ローリングサークル法による増幅産物（例えば、ＲＣＡａｃｔ）を、Ｔ細胞を活性化させるための第２の薬剤として作製する工程は、２つのステップ：１）環状の鋳型を作出する、直鎖状ＤＮＡ鎖のライゲーションと、２）一本鎖のコンカタマーを合成する、ライゲーションされた環状鎖の増幅とを含む。ライゲーションは、製造元のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、ＭＡ、ＵＳＡ）に従い、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用して達した。ライゲーションに、２つのオリゴヌクレオチドを用意した。１つのオリゴヌクレオチド（ＲＣＡａｃｔ  ｎｏ−ＣｐＧ、配列番号３）は、ヒトβ−アクチン遺伝子の、４３塩基のヌクレオチド配列を含有し、５’リン酸基を含有した。この４３塩基のオリゴヌクレオチドは、ライゲーションの後、環状の鋳型を形成した。第２のオリゴヌクレオチドは、２０塩基の長さ（ＲＣＡａｃｔプライマー）であり、４３塩基のオリゴヌクレオチドの両端に対して相補的であった。この第２のオリゴヌクレオチドを使用して、ライゲーション（４３塩基のオリゴヌクレオチドの鋳型依存ライゲーション）の前に、環状鎖を形成し、次いで、かつ、その後のｓｓＲＣＡ反応において、環状鎖を増幅した（図２を参照されたい）。ライゲーションのために、４５０ピコモルの、４３塩基のオリゴヌクレオチドを、１０ｍＭのトリス、ｐＨ  ８と、５０ｍＭの塩化ナトリウムとからなるアニーリング緩衝液１２０μＬの容量中で、３００ピコモルの、２０塩基のオリゴヌクレオチドと混合した。混合物を、９５℃で、２分間にわたり加熱し、次いで、１秒ごとに、温度を０．１℃ずつ下げることにより、＋４℃へと冷却した。冷却した後、混合物を、室温へと暖め、このアニーリング反応物９６μＬを、４８０μＬの最終容量中で、１０ｍＭのＡＴＰを含有する、１０倍濃度のＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ緩衝液４８μＬ、および２４μｌのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（４００単位／μｌ）と混合した。ライゲーション反応物を、２３℃で、２０時間にわたりインキュベートし、次いで、６５℃で、２０分間にわたりインキュベートして、リガーゼを熱殺菌した。
【００５４】
ｓｓＲＣＡ反応は、６９．３μＬの完了ライゲーション反応混合物を、１．０７８ｍＬの最終容量中で、２倍濃度のＰｈｉ２９反応緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのＴＣＥＰ、４０ｍＭの塩化マグネシウム、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、５％（ｖ／ｖ）のポリエチレングリコール、および１．６ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）５５０μＬと混合することにより実施した。混合した後、１ｍｇ／ｍｌのＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ２２μＬを添加して、ローリングサークル法増幅を誘発した。増幅混合物を、３０℃で１８時間にわたりインキュベートし、次いで、６５℃１５分間にわたりインキュベートして、ポリメラーゼを熱殺菌した。完了ｓｓＲＣＡ反応混合物を、３つの個別の試験管へと、等量に分け、３Ｍの酢酸ナトリウム０．１容量と、９５％（ｖ／ｖ）のエタノール２．５容量とを添加することにより沈殿させた。沈殿物を、室温で、３０分間にわたり静置し、次いで、高速（＞２０，０００×ｇ）で、３０分間にわたり遠心分離した。上清を、吸引により除去し、各ＤＮＡペレットを、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール５００μＬですすぎ、次いで、高速（＞２０，０００×ｇ）で、５分間にわたり、再度遠心分離した。上清を、吸引により、再度除去し、ＤＮＡペレットを、ＴＥＴ緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ  ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０）中に再懸濁させた。
【００５５】
ローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）のみかけのサイズは、パルスフィールドゲル電気泳動により、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはラムダのＤＮＡ分子量ラダーと比べて決定した。さらに、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲート（実施例１）の、ＲＣＡａｃｔとのハイブリダイゼーションを確認するために、パルスフィールド解析または非変性アガロースゲルを使用するゲルシフトアッセイを使用した。
【実施例４】
【００５６】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８およびＤＢＴＡ系（ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］およびＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ２８］）を使用する、Ｔ細胞の活性化および増加の比較
ＡｌｌＣｅｌｌｓ（ＵＳＡ、型番ＰＢ００９−ＩＦ）製のヒトＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓの凍結アリコートを、全ての活性化／増加研究に使用した。Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓを、実施例２で記載した通りに、融解させ、加工し、以下の完全Ｘ−Ｖｉｖｏ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）へと添加して、表２に示される通り、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個の初期濃度をもたらした。
【００５７】
【表２】
2019534684.tif 000004
典型的な活性化／増加実験は、ウェル１つ当たり２ｍＬの播種容量を使用する６ウェルフォーマットであって、被験条件１つ当たり、最小で１つのさらなる反復を伴うフォーマットで実施した。製造元の指示書に従い、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（型番１１１．４１Ｄ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を調製した。略述すると、ビーズのアリコートを、０．３ｍＬの完全培地で、３回にわたり洗浄し、試料を、ＤｙｎａＭａｇ−２永久磁石（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）へと適用した後で、上清である洗浄液の除去を行う。完全培地中の再懸濁の後、約３：１のビーズ対細胞比を、初期活性化条件（ウェル１つ当たりの全細胞２×１０６個で始める）に使用するように、ウェル１つ当たり６０μＬのビーズスラリーのアリコートを添加した。
【００５８】
そうでないことが指定されない限りにおいて、ＤＢＴＡの構成要素（抗ＣＤ３−ＤＮＡ、非修飾抗ＣＤ２８または抗ＣＤ２８−ＤＮＡ、およびＲＣＡａｃｔ）のアリコートを、それらのそれぞれの原液（４℃で保管された）から直接、個別に、かつ、連続的に、細胞へと添加した。各ＤＢＴＡ構成要素の添加は、任意の継起順序で行うことができる。標準的なＤＢＴＡ構成要素の初期濃度は、以下の通り：抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ、およびＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔの各々について、１μｇ／ｍＬ（６．７ｎＭ）ずつ、ＲＣＡａｃｔは１０倍モル過剰量（約６７ｎＭ）であった。ＲＣＡａｃｔ濃度は、反復する４３塩基のオリゴヌクレオチドのモル濃度に基づき、ＲＣＡ産物の全長または多分散性には依存しない。全ての適切なＤＢＴＡ構成要素を添加した後、１ｍＬのピペットで、ウェルの内容物を混合した。次いで、プレートを、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気の静置条件下で、１〜７日間またはこれを超える期間にわたり、定期的にアリコートを採取し、増加および解析を継続するために必要に応じ、新鮮な培地で希釈しながら、インキュベートした。細胞の活性化の確認は、２４時間にわたるインキュベーション（１日目）の後で、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ２５の発現を測定することに続き、必要な場合、４および７日目に、さらなる測定を行うことにより達成した。細胞のカウント、生存率、およびサイズ（ブラスティング）も、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ、Ａｌｌｅｒｏｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、４および７日目に、加えて測定した。４日目の細胞カウントに基づき、細胞密度を、ウェル１つ当たり１ｍＬ当たりの細胞２５０，０００個へと低減するように、新鮮な完全培地による、１：４または１：８の希釈を実施した。これは、細胞が、７日目の解析まで、過剰増殖を伴わずに、指数増殖期で増加させることを可能とした。陰性対照（活性化剤を添加しなかった「細胞だけ」の試料群）では、細胞密度を、１ｍＬ当たりの最小の細胞５００，０００個で維持した。フローサイトメトリーを介する、さらなる表現型解析を、７日目に、目的の特定の試料について行った。探索下の細胞表面マーカーのパネルは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ５７、ＣＤ２５、およびＣＤ６２Ｌを含んだ。図３Ａおよび図３Ｂは、抗ＣＤ３抗体だけを、ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔへとコンジュゲートさせ、抗ＣＤ２８は、非修飾可溶性抗体として添加したＤＢＴＡ系（ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ２８］）により、著明な活性化および増加が達成されたことを示す。実験は、１および４日目におけるＣＤ２５の発現、ならびに４および７日目におけるｘ倍の細胞増加を比較する場合の対照としての、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８により実行した。非修飾抗体、ＲＣＡａｃｔ単独、非コンジュゲート結合性核酸配列を伴う非修飾抗体（遊離ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、および細胞を伴う対照試料は、予測される通り、極めて低レベルの活性化および増加を示した。図３Ａおよび３Ｂは、５つの個別の実験、７例の個別のヒトＴ細胞ドナー、および抗体コンジュゲートの４つの異なるバッチに由来するデータを含む。図４Ａおよび図４Ｂは、最良の性能が、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の両方を、結合性ＤＮＡ配列（ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］）に付加したＤＢＴＡ組成物により達成されたことを示す。図４Ａおよび図４Ｂについてのデータは、６例を超える個別のヒトＴ細胞ドナーを包含する、５つを超える個別の実験から取った平均を表す。
【実施例５】
【００５９】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、およびＡｂ−ＤＮＡコンジュゲート（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を伴う、核酸ポリマー（ＲＣＡａｃｔ）によるＤＢＴＡ系を使用する、大スケールのＴ細胞の活性化および増加の比較
実施例４で例示した、６ウェルプレートによる研究に加えて、７２Ｃ  ＶｕｅＬｉｆｅ（登録商標）バッグ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｉｓｇａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｔ細胞の活性化および増加の効率についての、大スケールの比較を実施した。実施例４で記載した、同じ比および構成要素を、直線的にスケーリングして、３２ｍＬの完全Ｘ−Ｖｉｖｏ培地中の細胞３２×１０６個（１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個）の出発条件に適合させた。培養物は、標準的な細胞培養インキュベーター内の７２Ｃ  ＶｕｅＬｉｆｅバッグ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｉｓｇａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に維持した。４日目に、細胞を回収し、新鮮な培地で洗浄し、カウントし、適切な培地容量中で希釈して、１ｍＬ当たりの細胞０．５×１０６個をもたらし、ＶｕｅＬｉｆｅ  ７２Ｃバッグ内に再播種した。６日目に、さらなる増加のために、細胞を希釈し、揺動ＷＡＶＥ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）プラットフォーム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の、Ｗａｖｅバッグ内の２５０ｍＬ中に播種した。８日目までに、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ、Ａｌｌｅｒｏｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、細胞をカウントし、フローサイトメトリーにより、多様なＣＤ表面マーカーの発現について検討した。下記の表３〜５は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）試料およびＤＢＴＡで活性化させた試料の両方について、同等レベルの、ＣＤ２５発現、ｘ倍の増加、細胞サイズ、および生存率を描示する。加えて、８日目のフロー解析は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）およびＤＢＴＡのいずれについても、ＣＤマーカーの全パネルについて、ほぼ同一レベルの表現型の発現を示す。調製物および結果を、下記の表３〜５に例示する。
【００６０】
【表３】
2019534684.tif 000005
【００６１】
【表４】
2019534684.tif 000006
【００６２】
【表５】
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【実施例６】
【００６３】
細胞培養物を添加する前に、あらかじめ会合させたＤＢＴＡ構成要素を併せて添加することの、活性化の開始時における、全てのＤＢＴＡ構成要素の個別の添加との対比での効果
一連のＴ細胞活性化実験を行って、ＤＢＴＡ系の構成要素（例えば、抗ＣＤ３−ＤＮＡ（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、およびＲＣＡａｃｔ）の全てをプレインキュベートするか、またはあらかじめ会合させ、次いで、あらかじめ会合させた複合体を、Ｔ細胞へと添加することの効果を評価した。結果を、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合のために、各個別の構成要素を、Ｔ細胞へと、個別に添加する、標準的なプロトコールと比較した。これらのあらかじめ会合させた試料について、実施例４で使用した、同じ数量および比のＤＢＴＡ構成要素を、１．５ｍＬの試験管に、併せて添加し、完全に混合し、室温で、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、あらかじめ会合させたＤＢＴＡ混合物を、６ウェル−プレート内の、新鮮なＴ細胞培養物へと添加した。並行して、かつ、実施例４で行った通り、あらかじめ会合させなかった、標準的なＤＢＴＡ試料を、Ｔ細胞培養物へと添加した。結果を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）および細胞だけの対照試料（それぞれ、陽性対照および陰性対照）と比較した。
【００６４】
図５Ａおよび図５Ｂは、全てのＤＢＴＡ構成要素（抗ＣＤ３−ＤＮＡ、抗ＣＤ２８−ＤＮＡ、およびＲＣＡａｃｔ）を、添加の前にプレインキュベートする／あらかじめ会合させる（あらかじめ会合させたＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ＋抗ＣＤ２８−ＤＮＡ］）のであれ、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合（ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ＋抗ＣＤ２８−ＤＮＡ］）のために、個別に添加するのであれ、同等なレベルの、早期の活性化（２４時間後におけるＣＤ２５の発現）と、４日目における細胞の増加とが達成されることを示す。図５Ａは、２４時間にわたるインキュベーションの後における、ＣＤ２５の発現を示し、図５Ｂは、４日後における細胞の増加を示す。ＤＢＴＡ試料のいずれのセットも、Ｔ細胞の著明な活性化および増加を引き起こした。このデータは、４例の異なるヒトＴ細胞ドナー、およびＡｂ−ＤＮＡコンジュゲートの４つの異なるバッチを特徴とする、２つの個別の実験から導出した。
【実施例７】
【００６５】
異なるインプットＤＢＴＡ構成要素（Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲートおよびＲＣＡａｃｔ）の数量の、Ｔ細胞活性化効率に対する効果
一連のＴ細胞活性化実験を行って、抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡの異なる比の、Ｔ細胞の活性化および増加に対する効果を評価した。全ての場合に、ＲＣＡａｃｔ濃度を、６７ｎＭに維持する一方で、抗ＣＤ３−ＤＮＡコンジュゲート：抗ＣＤ２８−ＤＮＡコンジュゲートのモル比１：１を、１：２と対比して検討した。実施例４で概括した、他の全てのプロトコール条件を維持した。
【００６６】
図６Ａおよび図６Ｂは、十分なＴ細胞の活性化（２４時間後におけるＣＤ２５の発現）および細胞の増加（４および７日目における）のそれぞれが、Ａｂ−ＤＮＡおよびＲＣＡａｃｔの様々なインプット数量で達成されたことを示す。図６Ａおよび図６Ｂに示される通り：ｉ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：１）は、いずれのＡｂ−ＤＮＡコンジュゲートも、濃度を１μｇ／ｍＬ（６．７ｎＭ）とした研究を表し；ｉｉ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：２）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を１μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度を２μｇ／ｍＬとしたことを表し；ｉｉｉ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．５：１）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を０．５μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度を１μｇ／ｍＬとしたことを表し；ｉｖ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．２５：０．５）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を０．２５μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度を０．５μｇ／ｍＬとしたことを表し；ｖ）抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．２５：０．２５）は、抗ＣＤ３−ＤＮＡの濃度を０．２５μｇ／ｍＬとし、抗ＣＤ２８−ＤＮＡの濃度も０．２５μｇ／ｍＬとしたことを表す。最低レベルのＣＤ２５発現（６０％）は、最低インプット数量のＡｂ−ＤＮＡコンジュゲート（０．２５μｇ／ｍＬのインプットまたは約１．７ｎＭ）およびＲＣＡａｃｔ（約６７ｎＭ）（抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．２５：０．２５）として示される）により達成された。しかし、この活性化レベルもなお、細胞だけの陰性対照（２０％）を超えた。抗ＣＤ３−ＤＮＡコンジュゲートの標準的なインプット数量より低量（０．５μｇ／ｍＬ）（抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（０．５：１）として示される）を使用することによってもなお、著明な活性化（ＣＤ２５の発現に関して９０％）が達成されたことは注目される。この実施例のデータは、５例の異なるヒトＴ細胞ドナー、およびＡｂ−ＤＮＡコンジュゲートの４つの異なるバッチを特徴とする、３つの個別の実験から導出した。ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）および細胞だけの試料を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用した。
【実施例８】
【００６７】
Ｔ細胞を活性化させるために、ＲＣＡポリマー産物を添加する前に、ＤＢＴＡ抗体コンジュゲートを、Ｔ細胞とプレインキュベートすることの効果
抗ＣＤ３−ＤＮＡ抗体コンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ＤＮＡ抗体コンジュゲートを、Ｔ細胞培養物へと添加して、３０分後における、ローリングサークル法による増幅産物（ＲＣＡａｃｔ）の、別個の第２の添加の前に、Ａｂ−ＤＮＡ／細胞プレインキュベート試料を作出することの効果を評価する実験を行った。この研究のために使用した、抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ比は、１：１であった。結果を、全てのＤＢＴＡ構成要素を、ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合のために、個別かつ同時に添加する手順と比較した。この実験では、実施例４で概括した、他の全てのプロトコールの詳細および数量に従った。ｉｎ  ｓｉｔｕにおける会合プロトコールでは、使用した抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ比は、１：１および１：２であった。
【００６８】
図７Ａは、早期の活性化（２４時間後におけるＣＤ２５の発現）の低下を強調し、図７Ｂは、７日目において、Ａｂ−ＤＮＡ／細胞プレインキュベート試料（プレインキュベート細胞−ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：１）］）について、細胞の増加が、ＤＢＴＡ構成要素を同時に添加した手順（ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：１）］およびｉｎ  ｓｉｔｕにおけるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ＤＮＡ：抗ＣＤ２８−ＤＮＡ（１：２）］により表される）と比べて減少したことを示す。
【実施例９】
【００６９】
異なるインプットＡｂ−ＤＮＡコンジュゲート対ＲＣＡ産物比の、Ｔ細胞活性化効率に対する効果
一連のＴ細胞活性化実験を行って、異なるＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔインプット比の、Ｔ細胞活性化効率に対する効果を評価した。全ての場合に、抗ＣＤ３−ＤＮＡ（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）コンジュゲートだけを使用し、図８Ａおよび図８Ｂでは、Ａｂ−ＤＮＡと表した。各Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート試料が、活性化のために、ウェル１つ当たり同じ標準濃度（１μｇ／ｍＬのインプットまたは６．７ｎＭ）を特徴とする一方で、３ｌｏｇ範囲（６．７ｎＭ、６７ｎＭ、および６７０ｎＭ）のインプットＲＣＡａｃｔ産物について探索した。ＣｐＧを含有するＲＣＡ鋳型およびＣｐＧを含有しないＲＣＡ鋳型から作製される、ローリングサークル法による増幅産物（実施例１および表１を参照されたい）について探索した。ＣｐＧを含有しないＲＣＡ鋳型から作製される、ローリングサークル法による増幅産物を使用して、以下の実験条件：ｉ）比を１：１０とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧなし、１：１０のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；ｉｉ）比を１：１とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧなし、１：１のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；およびｉｉｉ）比を１：１００とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧなし、１：１００のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）を使用した。同様に、ＣｐＧを含有するＲＣＡ鋳型から作製される、ローリングサークル法による増幅産物については、以下の実験条件：ｉ）比を１：１０とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧ、１：１０のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；ｉｉ）比を１：１とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧ、１：１のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）；およびｉｉｉ）比を１：１００とするＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ（ＣｐＧ、１：１００のＡｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡにより表される）を使用した。いずれの実験セットについても、最適のＴ細胞活性化（ＣＤ２５の発現により測定される）は、Ａｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡａｃｔ比を１：１０とするときに達成された。活性化効率の低下は、Ａｂ−ＤＮＡ：ＲＣＡの比を増大させたときにも、これを低下させたときにも観察された。しかし、全ての試料は、７日目の実験において、１０倍またはこれを超える細胞の増加を裏付けた。実施例４で概括した、他の全てのプロトコールの詳細および数量を維持した。図８Ａは、１および４日間にわたる培養の後における、ＣＤ２５の発現％を示し、図８Ｂは、４および７日後における、細胞の増加を示す。
【実施例１０】
【００７０】
異なる配列および長さの捕捉オリゴヌクレオチドを有する、代替的なローリングサークル法による増幅産物を使用する、ヒトＴ細胞の活性化および増加の裏付け
本開示についての、前出の全ての例（実施例１〜９）および付随する図（図１〜８）は、ヒトＢ−アクチンに由来する配列を有する、ローリングサークル法による増幅産物を伴うＤＢＴＡ系（実施例１）を用いる。ヒトＴ細胞の活性化および増加の成功はまた、多様なヌクレオチドの配列および長さを有する捕捉オリゴヌクレオチドを含む、代替的な捕捉核酸ポリマーによっても達成することができる。１つの代替的な例は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）ゲノムに由来する、ローリングサークル法による増幅産物を特徴とする。対応する、相補的な第１の結合性ＤＮＡ配列および第２の結合性ＤＮＡ配列を、ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ（配列番号７）と称し、対応するＤＢＴＡ産物を、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］またはＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋抗ＣＤ２８−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ］と称する。これらのＤＢＴＡ構成要素の各々についての、具体的な配列情報を、下記の表６に示す。
【００７１】
【表６】
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図９Ａおよび図９Ｂは、１および４日後におけるＣＤ２５の発現（図９Ａ）、ならびに４および７日後におけるｘ倍の細胞の増加（図９Ｂ）に関して、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］の著明な性能を示す。これらの結果は、上記の例で示した、β−アクチン由来のＤＢＴＡ系（ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋非修飾抗ＣＤ２８］）と同等である。また、非修飾抗体、ローリングサークル法による増幅産物単独（ＲＣＡ産物だけ（ＭＲＳＡ））、および細胞だけの陰性対照による対照実験も実施した。陰性対照は、極めて低レベルの活性化および増加を示した。Ａｂ−ＤＮＡの合成、ローリングサークル法による増幅工程、およびβ−アクチンＤＢＴＡについて上記で記載したモル数量を含む細胞培養プロトコールについて、正確に同じプロトコールに従ったことについて述べておく。
【実施例１１】
【００７２】
切断型の、ローリングサークル法による増幅産物を特徴とする、ＭＲＳＡベースのＤＢＴＡ組成物であるＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ＋非修飾抗ＣＤ２８］を使用する、ヒトＴ細胞の活性化および増加の裏付け
ＭＲＳＡベースのＤＢＴＡ系（全長ＲＣＡ産物を作出するのに使用される一般的な条件については、実施例１０および実施例３を参照されたい）を使用して、異なるサイズのローリングサークル法による増幅（ＲＣＡ）産物を使用するヒトＴ細胞の活性化および増加の効率の比較を行った。これらの実験のために、全長ＲＣＡ産物を、超音波処理条件下に置き、異なる相対サイズ分布をもたらした。超音波処理されたＲＣＡ産物をもたらすために、製造元の推奨インプット条件に従い、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０  Ｆｏｃｕｓｅｄ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（商標）（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いて、大型のゲノムＤＮＡ断片から出発して、１５００塩基（ｂ）および１５０塩基（ｂ）のサイズの断片をもたらした。標的インプットパラメータは、入射ピークパワー、占有率、バースト１つ当たりのサイクル、処理時間、および温度を含む。超音波処理の後で、実施例１の条件に従い、解析的サイズ除外クロマトグラフィーを使用して、産物の相対サイズ分布を確認した。ＲＣＡ産物について、この方法による絶対サイズおよび分子量の決定は知られていないが、小型断片について予測される、溶出時間増大の一般的な傾向が観察された。こうして、以下の溶出時間：約１６Ｋｂ（理論的な最大長）の全長ＲＣＡ産物に対する１０．１分間（空隙容量に対応する）、１．５Ｋｂの超音波処理ＲＣＡ産物に対する１０．８分間、０．１５Ｋｂの超音波処理ＲＣＡ産物に対する１４．８分間、４３塩基の出発ＲＣＡ鋳型（対照注入）に対する１９．２分間、非コンジュゲートｏ２５ｂ（＋）ｍｒｓａ（対照注入）に対する２０．０分間、およびヌクレオチドを含む残留低分子に対する２３．７分間が観察された。１．５Ｋｂの超音波処理産物はまた、ゲル電気泳動によってもサイズ決定したところ、予測される通り、超音波処理は、単一の長さの産物をもたらさないので、サイズが４００〜１６００塩基の範囲（１．５Ｋｂの標的範囲に近い）の断片を含有することが見いだされた。
【００７３】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＲＣＡ産物が大型であるほど、１および４日後における活性化（図１０ＡのＣＤ２５発現％を参照されたい）および増加が増大することを示す。しかし、研究の後半では、傾向は、それほど顕著でなくなる。特に、７日目までに、異なるサイズの、３つのＲＣＡ産物全ては、同等レベルの細胞増加をもたらす（図１０Ｂ）。
【実施例１２】
【００７４】
各Ｔ細胞活性化剤および／またはＴ細胞共刺激剤に付加した、結合性ＤＮＡ配列の量を変化させることにより、Ｔ細胞の活性化を制御すること
抗ＣＤ３抗体を付加した第１の結合性ＤＮＡ配列（抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）および抗ＣＤ２８抗体を付加した第２の結合性ＤＮＡ配列（抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）を合成するための実験条件は、ＤＮＡ（Ｄ）：抗体（Ｐ）比の変化をもたらすように、抗体−ＤＮＡコンジュゲートを調製したことを除き、実施例１で記載した通りであった。これは、抗ＣＤ３抗体を付加した第１の結合性ＤＮＡおよび抗ＣＤ２８抗体を付加した第２の結合性ＤＮＡ配列の、ローリングサークル法による増幅産物とのハイブリダイゼーションのレベルを制御する意図で行った。図１１は、２つの異なるＤ／Ｐ比における、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］の性能を示す。ＣＤ２５の発現により測定されるＴ細胞の活性化は、Ｄ／Ｐ比を２．８〜３．０（ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］（Ｄ／Ｐ：２．８〜３．０）により表される）としたとき、Ｄ／Ｐ比を１．５〜１．８（ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］（Ｄ／Ｐ：１．５〜１．８）により表される）としたときと比較して高度であった。Ｄ／Ｐ比を大きくしたとき、観察されるＴ細胞の活性化は高度であった。図１１のデータは、８つの個別の実験から取った平均を表す。
【実施例１３】
【００７５】
Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲートおよびカチオン性捕捉ポリマーを使用する、Ｔ細胞の活性化および増加
抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔを合成するための実験条件については、実施例１において記載した。市販のＪｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ、型番８９１２９−９１４）およびポリＬ−リシン（ＰＬＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ、型番Ｐ９１５５）を、この実験のための第２の薬剤として使用した。本研究で使用したＮ／Ｐ比（カチオン性捕捉ポリマーのアミン基のモルの、結合性ＤＮＡ配列のリン酸基のモルに対する比）は、ｊｅｔ  ＰＥＩ（登録商標）の３のＮ／Ｐ、およびＰＬＬの１のＮ／Ｐであった。抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートおよび抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔコンジュゲートを、１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。実施例１で概括した、他の全てのプロトコールの詳細および数量に従った。Ｔ細胞の活性化については、実施例４で記載したプロトコールに従った。図１２Ａおよび図１２Ｂは、抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ、抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔおよびカチオン性捕捉ポリマー（ＰＥＩまたはＰＬＬ）を使用する、Ｔ細胞の活性化および増殖を示す。
【実施例１４】
【００７６】
ＣＤ４：ＣＤ８Ｔ細胞比の制御
ＡｌｌＣｅｌｌｓ製のヒトＰａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ（型番ＰＢ００９−ＩＦ）の凍結アリコートを、全ての活性化研究および増加研究に使用した。Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓを、実施例２で記載した通りに融解させ、加工し、以下の完全Ｘ−Ｖｉｖｏ培地へと添加して、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個の初期濃度をもたらした。
【００７７】
典型的な活性化／増加実験を、ウェル１つ当たり２ｍＬの播種容量を使用する６ウェルフォーマットであって、被験条件１つ当たり、最小で１つのさらなる反復を伴うフォーマットで実施する。そうでないことが指定されない限りにおいて、ＤＢＴＡ構成要素（抗ＣＤ３−ＤＮＡ、抗ＣＤ２８−ＤＮＡ、およびＲＣＡａｃｔ）のアリコートを、それらのそれぞれの原液から直接、個別に、かつ、連続的に、細胞へと添加した。各ＤＢＴＡ構成要素の添加は、任意の継起順序で行うことができる。標準的なＤＢＴＡ構成要素の初期濃度は、以下の通り：抗ＣＤ３−ＤＮＡ、および抗ＣＤ２８−ＤＮＡについて、１μｇ／ｍＬ（６．７ｎＭ）、ＲＣＡａｃｔは１０倍モル過剰量（約６７ｎＭ）であった。ＲＣＡａｃｔ濃度は、反復する４３塩基のセグメントのモル濃度に基づき、ＲＣＡ産物の全長または多分散性には依存しない。一部の実験では、抗４−１ＢＢ抗体を、Ｔ細胞共刺激剤として使用した。抗４−１ＢＢ−ＤＮＡは、実施例１で記載したプロトコールにより合成した。抗４−１ＢＢ−ＤＮＡは、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。全ての適切な活性化構成要素を添加した後、１ｍＬのピペットで、ウェルの内容物を混合した。次いで、プレートを、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気の静置条件下で、１〜７日間またはこれを超える期間にわたり、定期的にアリコートを採取し、増加および解析を継続するために必要に応じ、新鮮な培地で希釈しながら、インキュベートした。
【００７８】
Ｔ細胞の活性化は、２４時間にわたるインキュベーションの後で、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ２５の発現を測定することに続き、必要な場合、４および７日目に、さらなる測定を行うことにより達成した。ＣＤ４  Ｔ細胞：ＣＤ８  Ｔ細胞の比は、フローサイトメトリー蛍光色素をコンジュゲートさせた抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を使用して追跡した。細胞のカウント、生存率、およびサイズ（ブラスティング）も、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒを使用して、４および７日目に、加えて測定した。４日目の細胞カウントに基づき、細胞密度を、ウェル１つ当たり１ｍＬ当たりの細胞２５０，０００個へと低減するように、新鮮な完全培地による、１：４または１：８の希釈を実施した。これは、細胞を、７日目の解析まで、過剰増殖を伴わずに、指数増殖期で増加させることを可能とした。活性化剤を添加しなかった陰性対照（「細胞だけ」）の試料群では、細胞密度を、１ｍＬ当たりの最小の細胞５００，０００個で維持した。
【００７９】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］、およびＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］のそれぞれを使用する、７日間の増加期間にわたる、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の増加を示す。ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］を、ＩＬ−２ベースの培地中で使用する７日目に、高比率のＣＤ８細胞（１日目と比べた）が観察された。図１４は、ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗４−１ＢＢ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］を使用することにより、ＣＤ８細胞の比率を、ＣＤ４細胞に対してさらに増大させる、別の方式を示す。
【実施例１５】
【００８０】
二次抗体に付加した、第１の結合性ＤＮＡ配列および／または第２の結合性ＤＮＡ配列（二次Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート）、ならびに非修飾の抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を含む系を使用する、Ｔ細胞の活性化
第１の結合性ＤＮＡ配列および／または第２の結合性ＤＮＡ配列を、二次抗体に付加することにより、二次Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲートを作出する：
異なるマウスＩｇＧ亜型をターゲティングする二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、型番１１５−００５−０６２、ヤギ抗マウスＩｇＧ１、型番１１５−００５−２０５、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１＋２ａ＋２ｂ＋３）、型番１１５−００５−１６４、およびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ、型番１１５−００５−２０６）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから得、抗ＣＤ３コンジュゲートおよび抗ＣＤ２８コンジュゲートについて、上記の実施例１で記載した通り、結合性ＤＮＡ配列である、ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔへとコンジュゲートさせた。
【００８１】
Ｔ細胞の活性化は、以下の構成要素、ｉ）２または４μｇ／ｍＬの、二次Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート（抗ＩｇＧ２ａ−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、ｉｉ）濃度を１μｇ／ｍＬとする、非修飾の一次抗体である、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８、ならびにｉｉｉ）１０倍モル過剰量（一次抗体である抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に照らして）のＲＣＡａｃｔを使用して、実施例４に記載した通りに実施した。細胞だけおよびＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、それぞれ、陰性対照および陽性対照として使用した。ＤＢＴＡ［抗ＣＤ３−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ＋抗ＣＤ２８−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ］、ならびに非修飾抗ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）、およびＩｇＧ２特異的二次（４μｇ／ｍＬ）抗体の混合物を、２つのさらなる対照として使用した。図１５は、二次Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート、非修飾の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ならびにＲＣＡａｃｔを使用して、実施例４のＤＢＴＡ組成物を使用して達成されたのと同様のレベルの活性化を達成しうることを示す。
【実施例１６】
【００８２】
ナチュラルキラー細胞の活性化
マウスＩｇＧ１亜型をターゲティングする二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１、型番１１５−００５−２０５）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈから得、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の、結合性ＤＮＡ配列への付加について、上記の実施例１で記載した通り、結合性ＤＮＡ配列である、ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔに付加した。
【００８３】
末梢血ＣＤ５６＋  ＣＤ１６＋ナチュラルキラー細胞（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、型番２Ｗ−５０１）の凍結アリコートを、活性化研究に使用した。使用した培地は、５％のヒトオフクロット血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＶＡ、ＵＳＡ、型番ＨＳ１０１７）、および５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＮＪ、ＵＳＡ、型番２００−０２）を補充した、Ｘ−Ｖｉｖｏ  ２０（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、型番０４−４４８Ｑ）であった。活性化実験は、４８ウェルプレート内で、５００μＬの播種容量および１ｍＬ当たりの細胞１０６個の密度を使用して実施した。活性化のために、一次抗体の２つの組合せ：ｉ）抗ＣＤ３３５＋抗ＣＤ２およびｉｉ）抗ＣＤ３３５＋抗ＣＤ２４４を使用した。抗ＣＤ３３５は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、型番１６−３３５９−８５）から得た。抗ＣＤ２は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＮＪ、ＵＳＡ、型番５５５３２３）から得、抗ＣＤ２４４は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、型番１６−５８３８−８５）から得た。ナチュラルキラー細胞の活性化は、以下の構成要素：二次Ａｂ−ＤＮＡコンジュゲート（ＩｇＧ１−ｏ２０ｂ（＋）ａｃｔ）、非修飾一次抗体の組合せ（抗ＣＤ３３５＋抗ＣＤ２；または抗ＣＤ３３５＋抗ＣＤ２４４）、およびＲＣＡａｃｔを使用して実施した。対照群は、可溶性抗体単独または細胞だけの試料を有した。研究のために使用される抗体の濃度を、表７に示す。
【００８４】
【表７】
2019534684.tif 000009
全ての適切な活性化構成要素を添加した後、１ｍＬのピペットで、ウェルの内容物を混合した。次いで、プレートを、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気の静置条件下で、２４時間にわたりインキュベートした。細胞の活性化の確認は、２４時間にわたるインキュベーション（１日目）の後で、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ２５の発現により達成した。図１５は、二次抗体−ＤＮＡコンジュゲートによる、可溶性抗体および細胞単独と比較して高度なＣＤ２５発現を示す。
【図１Ａ】
2019534684.tif 000010
【図１Ｂ】
2019534684.tif 000011
【図１Ｃ】
2019534684.tif 000012
【図１Ｄ】
2019534684.tif 000013
【図１Ｅ】
2019534684.tif 000014
【図２】
2019534684.tif 000015
【図３Ａ】
2019534684.tif 000016
【図３Ｂ】
2019534684.tif 000017
【図４Ａ】
2019534684.tif 000018
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2019534684.tif 000020
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2019534684.tif 000022
【図６Ｂ】
2019534684.tif 000023
【図７Ａ】
2019534684.tif 000024
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2019534684.tif 000026
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2019534684.tif 000030
【図１０Ｂ】
2019534684.tif 000031
【図１１】
2019534684.tif 000032
【図１２Ａ】
2019534684.tif 000033
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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