(57)【要約】記載するのは新規のＵＴＲ配列を宿すｍＲＮＡに転写され得るＤＮＡ分子であり、前記ＵＴＲ配列は極度に短く、同時に該ＵＴＲ配列を含有するＲＮＡ分子の高い翻訳効率を可能にするという利点を組み合わせている。さらに記載するのは、斯かるＤＮＡ分子を含むベクターと、斯かるベクターを含む宿主細胞である。さらに記載するのは、斯かるＵＴＲを含有する対応ＲＮＡ分子である。さらに記載するのは、上記のＲＮＡ分子とオプションとして医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物、および、ＲＮＡ分子のコード領域を、前記コード領域によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳するために上記ＵＴＲを使用することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡに転写され得るＤＮＡ分子であって、以下のエレメント：
（ａ）その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と；
（ｂ）前記コード配列のすぐ上流にある、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択される配列とを有する一本の鎖を含むか；または相補鎖を含み、
（ｂ１）は、Ｒ１−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１)か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列であり；
（ｂ２）は、Ｒ１−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＴ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡから成る群から選択されるヌクレオチドである、配列か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列であり、
Ｒ１は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターであり、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される前記プロモーターは：
（ｉ）Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；
（ｉｉ）Ｔ３ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
（ｉｉｉ）ＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；および、
（ｉｖ）Ｋ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からなる群から選択される、ＤＮＡ分子。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮがＴ、Ｇ、またはＣからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮはＡではない、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮがＴである、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
請求項３のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか一項に記載のＤＮＡ分子、請求項４に記載のベクター、または請求項５に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【請求項７】
（ａ）その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と；
（ｂ）前記コード配列のすぐ上流にある、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択されるＵＴＲとを含むＲＮＡ分子であって、
（ｂ１）は、配列Ｒ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＵＴＲか、または前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり；
（ｂ２）は、配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである配列のＵＴＲか、または前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり、
Ｒ２は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当するＲＮＡ配列であり、
Ｒ２は、
（ｉ）ＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
（ｉｉ）ＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；
（ｉｉｉ）ＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；および
（ｉｖ）ＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）からなる群から選択され、
３´末端にはポリＡテールを含む、ＲＮＡ分子。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、またはＣからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮはＡではない、請求項７に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮがＵである、請求項８に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記ポリＡテールの長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである、請求項７〜９の何れか一項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項７〜１０の何れか一項に記載のＲＮＡ分子をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項７〜１０の何れか一項に記載のＲＮＡ分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ＲＮＡベースの治療で使用される、請求項１４の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜３の何れか一項に記載のＤＮＡ分子、請求項７〜１０の何れか一項に記載のＲＮＡ分子、請求項１１に記載の核酸分子、請求項４もしくは１２に記載のベクター、または、請求項５もしくは１３に記載の宿主細胞を含む、キット。
【請求項１７】
ＲＮＡ分子のコード領域を、前記コード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質に翻訳するための、請求項７の（ｂ）で定義したＵＴＲの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＵＴＲ配列を宿すｍＲＮＡに転写され得るＤＮＡ分子であって、前記ＵＴＲ配列は極度に短く、同時に該ＵＴＲ配列を含有するＲＮＡ分子の高い翻訳効率を可能にするという利点を組み合わせている、ＤＮＡ分子に関する。さらに、本発明は、斯かるＤＮＡ分子を含むベクターと、斯かるベクターを含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、斯かるＵＴＲを含有する対応ＲＮＡ分子に関する。さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子とオプションとして医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物、および、ＲＮＡ分子のコード領域を、前記コード領域によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳するために上記ＵＴＲを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、新規の薬物実体としてますます重要になってきている。ＤＮＡベースの遺伝子療法とは対照的に、ｍＲＮＡは核に輸送される必要がなく、細胞質においてタンパク質に直接翻訳される（J Control Release, 2011, 150:238-247, and Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489）。これにより、ＤＮＡ遺伝子薬の持つ可能性は低いが実在するリスクである潜在的な挿入変異を避けるのに、ｍＲＮＡがより安全となる。結果として、ｍＲＮＡ療法は、広範な種々の医学的徴候における遺伝子およびタンパク質補充療法の有望な代替として浮上しつつある（J Control Release, 2011, 150:238-247; Eur J Pharm Biopharm, 2009, 71:484-489; Nat Biotech, 2011, 29:154-157, and Nat Rev Genet, 2011, 12:861-874）。しかしながら、ｍＲＮＡの臨床的応用性をさらに確立するためには、従来のｍＲＮＡの強い免疫原性と限定的な安定性を克服しなければならない。これに関しては、ｍＲＮＡの安定性および特にｍＲＮＡの翻訳速度が、想定される医療用途に必須のパラメータとなる。これは、ｍＲＮＡの翻訳速度が、ｍＲＮＡ薬の投与量および投与間隔を決定するからである。
【０００３】
いくつかの戦略が、安定性を高め、細胞または生物に投与されたｍＲＮＡにより引き起こされる免疫原性応答を低減させることの両方において、成功することが分かっている。これには、化学修飾されたヌクレオチドが含まれている；Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2007, 10:523。Kormannらは、ウリジンおよびシチジン残基のわずか２５％を２−チオウリジンおよび５−メチル−シチジンで置換するだけでｍＲＮＡの安定性を高め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、外部投与されたｍＲＮＡにより引き起こされる自然免疫の活性化を低減させるのに十分であることを示した（国際公開第２０１２／０１９５９３６Ａ１号；同２００７０２４７０８Ａ２号）。
【０００４】
また、ｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）がｍＲＮＡの安定性およびｍＲＮＡ翻訳の両方の制御に中心的な役割を果たすことが報告されている。ＵＴＲは、ＲＮＡ結合タンパク質との相互作用を介して、翻訳開始、伸長、および終結、ならびに、ｍＲＮＡの安定化および細胞内局在に影響を与えることが知られている（Briefings in Bioinformatics, 2000, 1:236-249 and Cold Spring Harbor Monograph Archive, 2007, 48:87-128）。ＵＴＲ内の特定のモチーフに応じて、ＵＴＲはｍＲＮＡの代謝回転を高めることも低減させることも可能である（Cell. Mol. Life Sci., 2012, 69:3613-3634; Nucleic Acids Research, 2005, 33:D141-D146; Science, 2005, 309:1514-1518 and Current Protein & Peptide Science, 2012, 13:294-304）。近年、ｍＲＮＡの半減期と、対応するＵＴＲ配列についてのデータが公開されている（Nucleic Acids Research, 2011, 39:556-566 and Nucleic acids research, 37, e115）。
【０００５】
ＵＴＲは、ｍＲＮＡの開始コドンの上流かつ終止コドンの下流にある、ｍＲＮＡ分子の区域であり、つまり、翻訳されない配列である。これらの領域はコード領域と共に転写され、したがって、該領域は成熟ｍＲＮＡに存在するエキソンである。ｍＲＮＡの開始コドンの上流のＵＴＲは、５´ＵＴＲと呼ばれ、いったん転写されると、特に、プロモーターの（残留した３´の）一部に相当する配列およびいわゆるコザック配列を宿す。
【０００６】
コザックコンセンサス配列、コザックコンセンサス、またはコザック配列は、真核生物のｍＲＮＡで生じることが知られている配列で、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有する。コザックコンセンサス配列は、翻訳プロセスの開始において主要な役割を果たす。配列は、それを有名にした人物、Marilyn Kozakにちなんで名付けられた。ｍＲＮＡ分子中のこの配列は翻訳開始部位のリボソームにより認識され、ここからタンパク質がそのｍＲＮＡ分子にコードされている。リボソームは、翻訳を開始するために、この配列かまたは可能性のあるその変種を必要とする。配列は、記号（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧにより特定され、これは、以下のように、幅広いソース（全部で約６９９個）からコザックにより解析されたデータを要約するものである：小文字は、ある位置での最も一般的な塩基を表示し（そうは言っても塩基は変わり得るが）；大文字は、高度に保存された塩基を示し、つまり、「ＡＵＧＧ」配列は一定で、変わることがあったとしてもまれであり、Ｒはプリン（アデニンまたはグアニン）が常にその位置で観察されることを示し（コザックはアデニンがより高頻度であると主張する）；括弧内の配列（（ｇｃｃ））は、異議不明である。
【０００７】
コザックコンセンサス配列は、元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳における開始コドン（ＡＵＧ、Ａは本文脈では位置＋１を定義する）の周りの点変異の解析により、ＡＣＣＡＵＧＧとして定義された。６９９個の脊椎動物のｍＲＮＡのより詳細な変異原性により、ＡＵＧ開始コドンの上流の位置−３のＡが、Ｇでもあり得る、コンセンサス配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧが生じた（Nucleic Acids Res., 1987, 15 (20):8125-8148）。真核細胞におけるプレプロインスリンおよびアルファグロビン翻訳についての研究により、位置−３のプリン（通常はＡ）が効率的な翻訳開始に必須であり、このプリンがない場合、位置＋４のＧが必須であることが明らかになった（J. Cell Biol., 1989, 108:229-41）。ｍＲＮＡ分子から合成されるタンパク質量は、コザックエレメントの配列に強く左右され：タンパク質のＮ末端メチオニンをコードしているＡＵＧ開始コドンが最も重要である。強いコンセンサスのためには、位置＋４（Ｇ）および−３（ＡまたはＧ）のヌクレオチドが、両方ともコンセンサスと一致しなければならない。十分なコンセンサス配列は、これらの２つの部位の一つのみを有する一方、弱いコンセンサス配列は、位置＋４でも−３でも要件を満たさない。−１および−２の２つのシチジン残基は、それほど保存されておらず（Cell, 1986, 44 (2):283-92）、一方、位置−６のＧは翻訳開始のために重要である（Br. J. Haematol., 2004, 124 (2):224-31）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先行技術では、ｍＲＮＡの安定性を高め、細胞または生物に投与されたｍＲＮＡにより引き起こされる免疫原性応答を低減させ、発現効率（つまり、転写効率および／または翻訳効率）を高める手段および方法がすでに説明されているが、発現効率が、例えばｍＲＮＡ薬の投与量および投与間隔を決定し、最終的に、最終生成物、つまりコードされたペプチドまたはタンパク質のバイオアベイラビリティを決定するため、発現効率が想定される医療用途に必須のパラメータとなることから、特に、発現効率（つまり、転写効率および／または翻訳効率）を高めるさらなるまたは代わりの手段に関して、なお改善のニーズがある。同時に、さらに、ｍＲＮＡ薬を生成するコストを低減させ、生成されるｍＲＮＡ分子の収率を高め、実際の導入遺伝子、つまり、所望のポリペプチドをコードするコード領域に利用可能なスペースを、生成されたｍＲＮＡ分子において増大させることに対する一定のニーズが存在する。
【０００９】
本出願は、請求項で定義するような実施形態を提供することにより、このニーズに対応する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
特に、本出願は、驚くべきことに、ＵＴＲ配列のサイズを「最小ＵＴＲ」配列まで縮小し、それにより、ｍＲＮＡ薬の生成コストを低減させ、生成されるｍＲＮＡ分子の収率を高め、実際の導入遺伝子、つまり、所望のポリペプチドをコードするコード領域に利用可能なスペースを、生成されたｍＲＮＡ分子において増大させることが可能であることを見出した。さらに、同時に、この最小ＵＴＲ配列は、驚くべきことに、従来のＵＴＲ配列と比較して、発現率を維持し、さらには改善する一方、この最小ＵＴＲ配列における修飾がｍＲＮＡ分子の発現率さえ高めることを見出した。
【００１１】
この発見は、請求項で特徴付けられる実施形態の提供、特に、斯かる「最小ＵＴＲ」配列を宿すＲＮＡ分子の生成を可能にするＤＮＡ分子の提供および対応のＲＮＡ分子の提供につながる。
【００１２】
第１態様では、対応する分子をＤＮＡレベルで記載する一方、さらに以下では、第２態様において、対応する分子をＲＮＡレベルで記載する。
【００１３】
したがって、第１態様では、本発明は、ｍＲＮＡに転写され得るＤＮＡ分子であって、以下のエレメント：
（ａ）その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と；
（ｂ）前記コード配列のすぐ上流にある、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択される配列とを有する一本の鎖を含むか；または相補鎖を含み、
（ｂ１）は、Ｒ１−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１)か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列であり；
（ｂ２）は、Ｒ１−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＴ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡから成る群から選択されるヌクレオチドである、配列か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列であり、
Ｒ１は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである、ＤＮＡ分子に関する。
【００１４】
ＤＮＡ配列は、その配列が、タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡコピーの配列と同じである場合、「センス」と呼ばれる。反対の、相補的な鎖の配列は、「アンチセンス」配列と呼ばれる。本発明のＤＮＡ分子は、センス鎖を参照することにより、上記の（ａ）および（ｂ）で定義される一方、対応する相補的なアンチセンス鎖は、塩基対合ルールを考慮すれば、当業者により容易に決定され得る。
【００１５】
本発明のＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に転写され得るＤＮＡ分子である。転写は遺伝子発現の第１ステップであり、ここで、ＤＮＡ分子の特定のセグメントが酵素ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡ分子にコピーされる。転写時にＤＮＡ配列がＲＮＡポリメラーゼにより読み取られ、一次転写生成物と呼ばれる、相補的で非平行なＲＮＡ鎖が生成される。
【００１６】
二本のＤＮＡ鎖のうち一つのみが、転写の鋳型として機能する。ＤＮＡのアンチセンス鎖は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより、転写時に３´末端から５´末端へ読み取られる（３´→５´）。相補的ＲＮＡが反対側に５´→３´方向で作られ、これは、ウラシルがチミンにスイッチされることを除き、センス鎖の配列と一致している。この方向性は、ＲＮＡポリメラーゼが、成長するｍＲＮＡ鎖の３´末端にヌクレオチドを加えることだけ可能であるからである。ＤＮＡの非鋳型センス鎖は、その配列が、新しく作られるＲＮＡ転写物と（ウラシルのチミンへの置換を除き）同じであることから、コード鎖と呼ばれる。これは、ＤＮＡ配列を提示する本発明の文脈において、慣習により使用される鎖である。
【００１７】
本発明のＤＮＡ分子は、二本鎖か、一本鎖か、または部分的に二本鎖で部分的に一本鎖であり得る。
【００１８】
本発明のＤＮＡ分子は、２つの主なモジュール（「項目」ともいう）、つまり、（ａ）ポリペプチドをコードし、その５´末端に開始コドンを含むコード領域と、（ｂ）前記コード領域のすぐ上流にある、本明細書の上記の（ｂ１）または（ｂ２）で定義される配列とを含む。斯かるＤＮＡ分子は、転写された場合に、上記の利点を提供する極めて短いＵＴＲ配列を有するｍＲＮＡをもたらす。
【００１９】
さらに、本発明のＤＮＡ分子は、好適には、ｍＲＮＡに転写された場合にコード領域の下流にＵＴＲを生じさせる配列を含む。したがって、本発明のＤＮＡ分子は、好適には、コード領域と、転写時に生成されるｍＲＮＡ分子に（５´および３´の）非翻訳領域（ＵＴＲ）を生じさせる配列とを宿す。
【００２０】
本発明に従って使用する場合、用語「その５´末端に開始コドンを含むコード領域」は、コドンから構成されるＤＮＡ配列に関するものであり、前記コドンはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡ分子に転写され、対応するｍＲＮＡ分子は「遺伝コード」により提供される情報に従って解読され、リボソームによりタンパク質に翻訳され得る。コード領域は、一般に、その５´末端において開始コドンで始まり、終止コドンで終わる。概して、開始コドンはＡＴＧトリプレット（ＲＮＡレベルでのＡＵＧトリプレットに相当する）であり、終止コドンは、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ（ＲＮＡでベルでのＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡに相当する）である。コード領域部分は、タンパク質をコードしていることに加え、エキソンスプライシングエンハンサーまたはエキソンスプライシングサイレンサーとして、プレｍＲＮＡの制御配列として機能し得る。本発明に従って使用するポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子のコード領域は、また、コード配列またはＣＤＳ（coding DNA sequenceに由来する）としても知られており、遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの一部であり、エキソンからなり、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。ｍＲＮＡのコード領域は、エキソンの一部でもある５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）と３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）に隣接している。さらに、ｍＲＮＡ分子は、いわゆる５´キャップとポリＡテールをさらに含み得る。５´キャップ、５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ、およびポリＡテールは、タンパク質に翻訳されないｍＲＮＡ分子の領域である。
【００２１】
本発明に従って用いる場合、用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、翻訳されない開始コドンの上流および終止コドン下流のｍＲＮＡ区域に関し、そのため、それぞれ、５プライム非翻訳領域（５´ＵＴＲ）および３プライム非翻訳領域（３´ＵＴＲ）と称される。これらの領域はコード領域と共に転写され、したがって、該領域は、成熟ｍＲＮＡに存在することから、エキソンである。
【００２２】
本発明で使用する場合、３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンのすぐ後に続くメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）区域に関する。３´ＵＴＲは、３´非翻訳領域内にポリアデニル化およびｍＲＮＡの安定性に影響を与えることが知られている調節領域を含み得る。多くの３´ＵＴＲは、また、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を含有する。さらに、３´ＵＴＲは、好適には、ポリ（Ａ）テールと呼ばれる数百のアデニン残基を、ｍＲＮＡ転写物の末端に付加することを指示する配列ＡＡＵＡＡＡを含有し得る。
【００２３】
５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）（リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても知られている）は、開始コドンのすぐ上流にあるｍＲＮＡ領域である。５´ＵＴＲは転写開始部位で始まり、コード領域の開始コドン（通常はｍＲＮＡのＡＵＧ）の１ヌクレオチド（ｎｔ）前で終わる。真核生物では、５´ＵＴＲの長さは概して１００〜数千ヌクレオチド長であるが、時には、より短いＵＴＲが真核生物で生じる場合がある。
【００２４】
本発明では、プロモーターとコード領域（上記（ｂ１）または（ｂ２）で定義されるような）の間の配列は極めて短く、転写時に、非常に短い「最小の」ＵＴＲ配列を有するｍＲＮＡ分子をもたらす。
【００２５】
ＤＮＡ分子の一モジュール、つまり、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」（モジュール（ａ））は、特に限定されず、所与の細胞で発現する任意の所望のコード領域であり得る。したがって、このモジュールは、所望のポリペプチド、つまり所望の最終生成物をコードするコード領域であり得る。本発明は、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」に関して限定されない。これは、コード領域の性質は、細胞で生成される所望の生成物に左右されるからである。斯かるコード領域は、また、既知の天然配列とは異なり、変異（つまり、点変異、挿入変異、欠失、およびその組み合わせ）を含有するヌクレオチド配列であり得る。さらに、斯かるコード領域は、部分的にまたは十分に、モジュール（ａ）として使用される、天然配列に由来するコドン最適化配列であり得る。コドン最適化は、対象遺伝子に由来するｍＲＮＡの翻訳効率を高めることにより、タンパク質発現を最大化する技法である。天然遺伝子は、利用可能なコドンをランダムに使用せず、同じアミノ酸については特定のコドンに対しある特定の嗜好性を示すことが知られている。したがって、遺伝コードの縮重−１つのアミノ酸がいくつかのコドンによりコードされ得ること−により、対象遺伝子のヌクレオチド配列は、同じまたは別の種の好適なコドンセットに形質転換される。
【００２６】
言及したように、モジュール（ａ）は特に限定されず、所与の細胞で発現する任意の所望のコード領域であり得る。従って、本発明の文脈では、「コード領域」は、細胞に導入された場合に、ポリペプチド／タンパク質またはその断片に翻訳可能であるｍＲＮＡ分子に転写され得る、任意のポリ−デゾキシリボヌクレオチド分子を意味すると理解されたい。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」には、ここでは、任意の種類のアミノ酸配列、つまり、ペプチド結合を介して互いに連結し、ペプチドおよび融合タンパク質も含む、２つ以上のアミノ酸鎖が包含される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、細胞または細胞近傍でその機能が必要とされるか、または有益であるポリペプチド／タンパク質またはその断片、例えば、その欠陥型もしくは欠損型が疾患もしくは疾病のトリガーとなるか、その提供が疾患もしくは疾病を軽減もしくは予防し得るタンパク質か、または、身体にとって有益なプロセスを細胞またはその近傍で促進し得るタンパク質をコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。コード領域は、完全タンパク質またはその機能性変異体の配列を含有し得る。さらに、コード領域のデゾキシリボヌクレオチド配列は、因子、誘導因子、制御因子、刺激因子、もしくは酵素として作用するタンパク質、またはその機能性断片をコードし得、この場合、このタンパク質は、障害、特に代謝障害を治療するため、または、新生血管、組織などの形成といった、ｉｎ  ｖｉｖｏのプロセスを開始するためにその機能が必要なものである。ここでは、機能性変異体は、細胞においてその機能が必要であるか、または、その欠陥型または欠損型が病原性であるタンパク質の機能を細胞において担う断片を意味することを理解されたい。
【００２８】
好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療効果もしくは予防効果を有する、治療的または医療的に活性なポリペプチドまたはタンパク質をコードする。したがって、前記「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」を含み、ｍＲＮＡに転写され得る本発明のＤＮＡ分子は、核酸療法および関連用途で使用することができる。本文脈では、本発明に従い、本発明のＤＮＡ分子のｍＲＮＡへの転写、さらには、ポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳は、特に、内因性遺伝子が欠損しているかもしくはサイレントで、遺伝子発現の生成物をもたらさないか、または、不十分なもしくは欠陥のあるもしくは機能不全の生成物をもたらす場合に、例えば、いくつか例を挙げると、嚢胞性線維症、血友病、または筋ジストロフィーのような多くの代謝疾患および遺伝疾患の場合などにおいて、内因性遺伝子発現を補償するか、または、補完することを目的とし得る。本発明のＤＮＡ分子のｍＲＮＡへの転写、さらにはポリペプチドまたはタンパク質への翻訳は、また、遺伝子発現の制御、シグナル伝達、および他の細胞プロセスなどの任意の内因性細胞プロセスと、発現生成物を、相互作用させるかまたは干渉させることも意図し得る。本発明のＤＮＡ分子のｍＲＮＡへの転写、さらにはポリペプチドまたはタンパク質への翻訳は、また、遺伝子導入されたまたは形質導入された細胞が存在するかまたは存在するように作られた生物において、免疫応答を引き起こすことも意図し得る。例は、ワクチン接種のための抗原を提示させるために、樹状細胞などの抗原提示細胞を遺伝子修飾することである。別の例は、本発明のＤＮＡ分子を、ｍＲＮＡへ転写し、さらにはポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳することであり、ここにおいて、前記コード領域はサイトカインをコードする。これは、例えば、腫瘍特異的免疫応答を誘発するために、腫瘍において望ましい場合がある。さらに、本発明のＤＮＡ分子のｍＲＮＡへの転写、さらにはポリペプチドまたはタンパク質への翻訳は、また、再生医療のために、修飾Ｔ細胞または前駆体または幹細胞または他の細胞などの、細胞療法用に一時的に遺伝子修飾された細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｅｘ  ｖｉｖｏで生成することも意図し得る。
【００２９】
他の好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、成長プロセスおよび血管新生において役割を果たすタンパク質をコードし得、これは、例えば、再生の制御に必要であり、そのため、本発明のＲＮＡ分子の導入により特異的に形成することが可能である。これは、例えば、成長プロセスまたは骨異常、組織異常の処置のために、埋め込みおよび移植において有用であり得る。
【００３０】
言及したように、ＤＮＡ分子、および、特に、対応して転写される、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」を含む本発明のＲＮＡ分子は、体内に天然に存在するはずであるが、遺伝子欠損または疾患のために存在しないかまたは欠陥型で存在するかまたは量が非常に少ないポリペプチドまたはタンパク質を、身体に提供しなければならない場合に、適切に使用することが可能である。その欠乏または欠損が疾患と関連するタンパク質およびそれをコードする遺伝子は、既知である。インタクトなポリペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域のそれぞれのインタクトバージョンを、本発明に従って使用することが可能である。
【００３１】
単一遺伝子の変異により引き起こされる多数の遺伝障害が既知であり、ｍＲＮＡ治療アプローチの候補である。嚢胞性線維症、血友病、および他多数の単一遺伝子変異により引き起こされる障害は、ある形質が子孫に現れる可能性に関し、優勢の場合も劣性の場合もある。優勢対立遺伝子は、該対立遺伝子の１コピーのみを有する個体において表現型を表すが、劣性対立遺伝子が顕性になるには、固体は、それぞれの親から１つずつ、２つのコピーを有さなければならない。対称的に、多遺伝子性障害は、２つ以上の遺伝子により引き起こされ、それぞれの疾患の発現はしばしば流動的で、環境因子に関係する。多遺伝子性障害の例は高血圧、コレステロール値の上昇、がん、神経変性障害、精神疾患、および他である。また、これらの場合、これらの遺伝子の１つまたは複数を表す治療用ｍＲＮＡが、その患者にとって有益であり得る。さらに、遺伝障害は、両親の遺伝子から受け継がれていないはずであっても、新たな変異によっても引き起こされ得る。これらの場合も、正しい遺伝子配列を表す治療用ｍＲＮＡが、患者にとって有益であり得る。
【００３２】
目下、２２，９９３件のヒト遺伝子遺伝子障害のエントリーを、それぞれの遺伝子およびその表現型についての説明と共に含むオンラインカタログが、ＯＮＩＭ（Online Mendelian Inheritance in Man）ウェブページ（http://onim.org）で利用可能であり；それぞれの配列はＵｎｉｐｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org）より利用可能である。非限定的な例として、以下の表１は、いくつかの先天的疾患と対応する遺伝子を列挙するものである。細胞シグナル伝達経路の相互作用度が高いため、ある遺伝子の変異は、病原症状の多重化を引き起こし、そのうち特徴的なものだけを表１に列挙する。
【００３３】
本発明の一部の実施形態では、治療用タンパク質は、表１に列挙する細胞タンパク質から選択される。したがって、本発明のＤＮＡ分子は、治療用細胞タンパク質をコードし得、コードされた治療用タンパク質は、表１に列挙するものか、またはその相同体である。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、治療用タンパク質は、表１に列挙する分泌タンパク質から選択される。従って、本発明のＤＮＡ分子は、治療用融合タンパク質をコードし得、コードされる治療用タンパク質またはその相同体は表１に列挙するものであり、第２タンパク質は、治療用タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドである。シグナルペプチドは、短い、典型的には５−３０アミノ酸長の、前記治療用タンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸配列であり、それはある小器官（つまり、小胞体、ゴルジ体、またはエンドソーム）を介して細胞分泌経路に融合タンパク質を導く。従って、斯かる融合タンパク質は細胞もしくは細胞小器官から分泌されるか、または、細胞区画もしくは細胞表面の細胞膜（例えば、マルチスパン膜貫通タンパク質）に挿入される。
【００３５】
したがって、本発明の好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」（モジュール（ａ））は、限定するわけではないが、疾患を引き起こす、疾患にかかりやすくする、または疾患から守る以下の遺伝子をコードし得る。処置（または予防）できる斯かる障害の非限定的例としては、前記ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドが、以下の表１に略述するものからなる群から選択されるものが挙げられる。
【００３６】
一部の実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、天然タンパク質と同じかまたはそれ以上のレベルの細胞活性を含む部分長または完全長のタンパク質に、転写および翻訳され得る。一部の実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療効果または予防効果を有する、治療的または医薬的に活性なポリペプチド、タンパク質またはペプチドをコードし、前記ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、以下の表１に概説するものからなる群から選択される。「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」を使用して、天然タンパク質と同じまたはそれ以下のレベルの細胞活性を有する部分長または全長タンパク質を発現させることができる。これは、ＲＮＡ分子の投与が指示され得る疾患の処置を可能にし得る。
【００３７】
ヒト遺伝子および遺伝障害の非限定的例
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【００３８】
上記表１は、その欠損が、本発明のＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子で処置することが可能な疾患につながる遺伝子の例を示し、前記ＤＮＡ分子（および対応して転写されるＲＮＡ分子）は、上記に開示した欠損遺伝子のタンパク質のインタクトバージョンまたはその機能的断片をコードする、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」を含む。特に好適な実施形態では、以下の遺伝性疾患が言及され得る：例えば、ＳＰＢ（サーファクタントタンパク質Ｂ）欠乏症、ＡＢＣＡ３欠乏症、嚢胞性線維症、およびα１−アンチトリプシン欠乏症などの肺に影響を与える遺伝疾患、または、血漿タンパク質に影響を与える遺伝性疾患（例えば、先天的ヘモクロマトーシス（ヘプシジン欠乏症）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ、ＡＤＡＭＴＳ１３欠乏症）、凝固障害（例えば、血友病ａおよびｂ）および補体欠損症（例えば、タンパク質Ｃ欠乏症）を引き起こす遺伝性疾患、免疫欠如、例えばＳＣＩＤ（ＲＡＧ１、ＲＡＧ２、ＪＡＫ３、ＩＬ７Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ３δ、ＣＤ３εなどの異なる遺伝子における変異によって引き起こされる）または例えばアデノシンデアミナーゼの不足よる欠乏による（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、敗血性肉芽腫症（例えば、ｇｐ−９１−ｐｈｏｘ遺伝子、ｐ４７−ｐｈｏｘ遺伝子、ｐ６７−ｐｈｏｘ遺伝子、またはｐ３３−ｐｈｏｘ遺伝子の変異によって引き起こされる）ならびに、ならびにゴーシェ病、ファブリー病、クラッベ病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩ、糖原病ＩＩ型またはムコ多糖症などの蓄積症。
【００３９】
「その５´末端に開始コドンを含み、ペプチドをコードするコード領域」を含む本発明が有用であり得る他の障害には以下の障害が含まれる：ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；嚢胞性線維症（ＣＦ）；シスチン尿症を含むＳＬＣ３Ａ１関連障害；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィーおよび副腎脊髄神経症；フリードライヒ失調症；ペリツェウス・メルツバッハー病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節硬化症；サンフィリッポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；ＣＴＮＳ関連シスチン症；脆弱性Ｘ症候群、脆弱性Ｘ関連性振戦／失調症候群および脆弱性Ｘ早発卵巣不全症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー・ウィリー症候群；遺伝性出血性毛細血管拡張症（ＡＴ）；ニーマン・ピック病Ｃ１型；若年性ニューロンセロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、青年バッテン病、サンタヴォリ・ハルチア病、ジャンスキー・ビールスコフスキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠乏症を含むニューロンセロイドリポフスチン関連疾患；ＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４およびＥＩＦ２Ｂ５が関連する中枢神経系の髄鞘形成不全／白質消失を伴う小児運動失調；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４が関連する一過性運動失調２型；クラシックレット症候群、ＭＥＣＰ２関連重症新生児脳症およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定型レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；Ｎｏｔｃｈ−３関連の皮質梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性遺伝性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂが関連する発作障害；アルパーズ・フッテンロッハー症候群、ＰＯＬＧ関連感覚性運動失調性神経障害、構音障害および眼麻痺、およびミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺を含むポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖副腎低形成；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；ファブリー病；ならびにウィルソン病。
【００４０】
全てのこれらの疾患において、タンパク質、例えば酵素が欠損しているが、それは本発明のＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡでの処置によって処置され、欠損遺伝子にコードされるタンパク質またはその機能的断片が利用可能となり得る。転写物補充療法／酸素補充療法は、根底にある遺伝子欠損に影響を与えず、患者に欠乏している酵素の濃度を高める。例として、ポンペ病では、転写物補充療法／酵素補充療法により、欠乏しているリソソーム酵素酸アルファ−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）が補充される。
【００４１】
したがって、本発明のモジュール（ａ）の「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」によってコードされ得るタンパク質の非限定的例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、成長ホルモン（ソマトトロピン、ｈＧＨ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ＧＭ−ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＰＳ、タンパク質Ｃ、ヘプシジン、ＡＢＣＡ３およびサーファクタントタンパク質Ｂなどの成長因子である。本発明のＲＮＡで処置可能な疾患のさらなる例は、血友病Ａ／Ｂ、ファブリー病、ＣＧＤ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ハーラー病、Ｘ染色体媒介性Ａ−γ−グロブリン血症、アデノシンデアミナーゼ関連免疫不全症およびＳＰ−Ｂと関連する新生児の呼吸窮迫症候群である。特に好適には、本発明のＤＮＡ分子の「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）またはエリスロポエチンの配列を含有する。本発明のＤＮＡ分子の「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」によってコードされ得るタンパク質のさらなる例は、ヒト成長ホルモンｈＧＨ、ＢＭＰ−２または血管新生因子などの成長因子である。
【００４２】
あるいは、核酸は、全長抗体またはより小さい抗体（例えば、重鎖および軽鎖の両方）をコードして、対象に免疫を付与し得る。別の実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、機能的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をコードし得、これは、生物学的標的（例えば、腫瘍壊死因子などの刺激性サイトカイン）を標的とするおよび／または不活性化するために有用であり得る。同様に、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、例えば、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型もしくは急性溶血性尿毒症症候群の処置に有用な機能性抗ネフローゼ因子抗体をコードする場合もあるし、がんなどの抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）媒介性疾患の治療に有用なＶＥＧＦ抗体をコードする場合もある。
【００４３】
モジュール（a）、つまり「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、ゲノム編集技術において使用され得るポリペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域であり得る。ゲノム編集は、ヌクレアーゼを使用して生物のゲノムにＤＮＡを挿入し、欠落させ、または置換する遺伝子工学の一種である。これらのヌクレアーゼは、ゲノムの所望の位置に部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせる。誘導された二本鎖切断は、非相同末端結合または相同組換えによって修復され、ゲノムに標的変異をもたらし、それによりゲノムを「編集する」。異なるポリペプチドまたはタンパク質を利用する多数のゲノム編集システム、つまり、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が当該技術分野で既知である。ゲノム工学の方法は、Biotechnology, 2013, 31 (7), 397-405に概説されている。
【００４４】
したがって、好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）タンパク質ファミリーのポリペプチドまたはタンパク質、好ましくはＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）をコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。Ｃａｓタンパク質ファミリーのタンパク質、好適にはＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした方法および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集技術において使用され得る。ゲノムの編集、制御および標的化のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Nat. Biotechnol., 2014, 32(4):347-355に概説されている。
【００４５】
別の好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、メガヌクレアーゼをコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。メガヌクレアーゼは、「従来の」エンドデオキシリボヌクレアーゼとは対照的に、大きい認識部位（例えば、１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を認識するエンドデオキシリボヌクレアーゼである。結果として、それぞれの部位は、数回のみ、好適には１回のみ、任意の所与のゲノムに生じる。そのため、メガヌクレアーゼは、最も特異的な天然に存在する制限酵素であると考えられ、したがって、ゲノム編集技術における適切なツールである。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインを操作して、特定の所望のＤＮＡ配列を標的することが可能であり、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の特有の配列を標的することが可能になる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、ＺＦＮを使用して高等生物のゲノムを正確に改変することができ、そのため、ＺＦＮはゲノム編集技術に適したツールである。
【００４７】
別の好適な実施形態では、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）をコードするデゾキシリボヌクレオチド配列を含有する。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することが可能な制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインに融合している融合タンパク質である。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を操作して、実際に任意の所望のＤＮＡ配列に結合させることが可能である。したがって、ヌクレアーゼと組み合わせた場合、特定の所望の場所でＤＮＡを切断することが可能である。
【００４８】
本発明のＤＮＡモジュールは、第２のモジュール（ｂ）として、コード配列のすぐ上流に位置する配列を含む。
【００４９】
より具体的には、本発明のＤＮＡモジュールは、前記コード配列のすぐ上流にモジュール（ｂ）を含み、前記モジュール（ｂ）は、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択される配列であり、
（ｂ１）は、Ｒ１−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1)か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列であり；
（ｂ２）は、Ｒ１−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮが、Ｔ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡから成る群から選択されるヌクレオチドである、配列か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列であり、
Ｒ１は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。
【００５０】
本明細書の上記の項目（ｂ）で定義した配列は、上記の特定の配列に特に限定されるわけではなく、斯かる配列と比較してヌクレオチド付加を示す配列とも関連し、前記付加ヌクレオチドは、上記配列のＲ１の５´末端に付加され得る。付加ヌクレオチドには、最大０（変化なし）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、好適には、最大２０ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖が含まれる。より好適には、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、または１９のヌクレオチドが５´末端に付加される。さらにより好適には、最大３０ヌクレオチドが５´末端に付加される。
【００５１】
プロモーターＲ１の上流のヌクレオチド付加が、本発明のＵＴＲの上記機能的特性を変えることはないため、ヌクレオチドの付加の長さは、最大で４０、５０、６０、７０、８０、９０、またはさらには１００ヌクレオチド、またはさらには、最大で２００、３００、４００、もしくは５００ヌクレオチドでもあり得る。
【００５２】
上記のように、二本鎖ＤＮＡ分子は、２つの逆平行鎖を含み、一方の鎖は、その配列が、タンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡコピーの配列と同じであれば、「センス」鎖と呼ばれる。反対の、相補鎖の配列は、「アンチセンス」配列と呼ばれる。したがって、本発明のＤＮＡ分子は、上記エレメント（ａ）および（ｂ）を有する一本の鎖を含む、ｍＲＮＡに対応する上記ＤＮＡ分子に関するだけでなく、相補鎖、つまり、ｍＲＮＡに転写され得るアンチセンス鎖を含むＤＮＡ分子にも関する。本発明のＤＮＡ分子のこの相補鎖は、塩基対合ルールを与えられると容易に決定することが可能であるアンチセンス鎖を参照することにより、定義される。
【００５３】
本発明のＤＮＡ分子は、また、モジュール（ｂ）内に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターＲ１を含む。好適には、前記プロモーターＲ１は、項目（ｂ１）または（ｂ２）で定義した残りの配列に直接的に、つまり、任意の介在ヌクレオチドの発生なしに、結合する。
【００５４】
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターＲ１の性質は、特に限定されない。対応するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがそれぞれの配列を認識することが可能である限り、任意のプロモーター（およびその変異体）を使用することが可能である。多数のＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとしても知られ、しばしば、ＲＮＡＰまたはＲＮＡｐｏｌと省略される）が、当技術分野で既知である。これらの酵素は、一次転写物ＲＮＡを生成することが可能である。上記で概説したように、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写と呼ばれるプロセスにおいて、ＤＮＡを鋳型として使用して、ＲＮＡ鎖を合成することが可能である。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターとして知られる特定のＤＮＡ配列において、転写を開始する。次に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ鎖に対し相補的なＲＮＡ鎖を生成する。ＲＮＡ鎖にヌクレオチドを付加するプロセスは、伸長反応として知られている。つまり、本発明の文脈では、用語「認識する」は、好適には、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、その対応するプロモーター配列Ｒ１を特異的に検出／結合することが可能であることだけを意味するわけではない。この用語は、また、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始し、次に、伸長反応時にＲＮＡ分子を生成できることも指す。
【００５５】
当業者は、当技術分野で既知の方法により、所与のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、それぞれのプロモーターを認識できるか否かを決定することが可能である。さらに、タンパク質／ＤＮＡ相互作用を評価する周知の方法を使用することにより、所与のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、対応する（未知の）プロモーター配列Ｒ１を特定することが可能であり、逆もまた同じである。
【００５６】
したがって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、そのプロモーターＲ１を認識／結合する能力、および、好適には、転写を開始する能力は、例えばJournal of Biological Chemistry, 1993, 268(26):19299-19304 に記載されているような当技術分野で既知の方法により決定され得、一方、多数のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発見が、Journal of Biological Chemistry, 2005, 280(52): 42477-42485)に概説されている。
【００５７】
好適な実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターＲ１は、バクテリオファージプロモーターである。
【００５８】
単なる例として、当技術分野では、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を認識し、Ｔ３ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは配列ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を認識し、ＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、配列ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を認識し、Ｋ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、配列ＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を認識することが知られている。しかしながら、これらの例は、本発明がこれらのプロモーターおよび対応するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに限定されるわけではないことから、単なる例示を目的として提供するものである。実際には、対応するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、好適にはバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがそれぞれの配列を認識することが可能である限り、任意のプロモーター（およびその変異体）を使用することが可能である。
【００５９】
好適な実施形態では、Ｒ１は：
（ｉ）ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と比較して１〜６個の置換を示し、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列；
（ｉｉ）ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と比較し１〜６個の置換を示し、Ｔ３ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列；
（ｉｉｉ）ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と比較して１〜６個の置換を示し、ＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列；および、
（ｉｖ）ＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と比較して１〜６個の置換を示し、Ｋ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列からなる群から選択される。
【００６０】
別の好適な実施形態では、配列は、１〜３個、４個、または５個の置換を示す配列であり得る。ただし、対応する配列がなお、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、およびＫ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼそれぞれにより認識され得る場合に限る。さらに好適な実施形態では、配列は、１〜２個の置換を示す配列であり得る。ただし、対応する配列がなお、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、およびＫ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼそれぞれにより認識され得る場合に限る。最も好適には、配列は、１個の置換を示す配列であり得る。ただし、対応する配列がなお、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、およびＫ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼそれぞれにより認識され得る場合に限る。
【００６１】
他の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列Ｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列、または、それらと比較して１〜６個の置換を示す配列の何れかに特に限定されるわけではなく、１〜７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個の置換を示す配列でもよい。ただし、対応する配列が、Ｔ７、Ｔ３，ＳＰ６、およびＫ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼそれぞれにより、なお認識され得る場合に限る。
【００６２】
好適な実施形態では、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の配列における上記置換から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の上記配列の位置１１〜１２での５ヌクレオチド「ＣＡＣＴＡ」での置換は除外される、これは、これら５つのヌクレオチドが４つの配列間で保存されるためである。
【００６３】
別の好適な実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の配列における上記置換から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の上記配列の位置４におけるヌクレオチド「Ｔ」の置換は除外される。これは、このヌクレオチドが、４つの配列間で保存されるためである。
【００６４】
別の好適な実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の配列における上記置換から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の上記配列の位置５におけるヌクレオチド「Ａ」の置換は除外される。これは、このヌクレオチドが、４つの配列間で保存されるためである。
【００６５】
別の好適な実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の配列における上記置換から、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６の上記配列の位置１８におけるヌクレオチド「Ｇ」の置換は除外される。これは、このヌクレオチドが、４つの配列間で保存されるためである。
【００６６】
Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、およびＫ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの、そのプロモーターＲ１を認識／結合する能力は、上記で概略したように、当技術分野で既知の方法により決定され得る。
【００６７】
より好適な実施形態では、本発明のＤＮＡ分子は、前記コード配列のすぐ上流にモジュール（ｂ１）を含むＤＮＡ分子であって、前記モジュール（ｂ１）において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮはＴ、Ｇ、またはＣからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮはＡではない、ＤＮＡ分子である。
【００６８】
さらにより好適な実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置の前記ヌクレオチドＮはＴである。
【００６９】
好適な実施形態では、本発明のＤＮＡ分子は、開始コドンの直ぐ下流に続くヌクレオチドがヌクレオチドＧではない、ＤＮＡ分子である。別の好適な実施形態では、本発明のＤＮＡ分子は、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがＡ、Ｔ、およびＣからなる群から選択される、ヌクレオチドである、ＤＮＡ分子である。
【００７０】
さらにより好適な実施形態では、本発明のＤＮＡ分子は、上記で定義するモジュール（ｂ１）を含むＤＮＡ分子であって、前記モジュール（ｂ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されており、開始コドンの直ぐ下流に続くヌクレオチドがＡ、Ｔ、およびＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列である、ＤＮＡ分子である。
【００７１】
別のさらにより好適な実施形態では、本発明のＤＮＡ分子は、上記で定義するモジュール（ｂ２）を含むＤＮＡ分子であって、前記モジュール（ｂ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されており、開始コドンの直ぐ下流に続くヌクレオチドがＡ、Ｔ、およびＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列である、ＤＮＡ分子である。
【００７２】
分子生物学および遺伝学において、上流および下流は両方とも、ＤＮＡ分子の相対的位置を指す。本発明の文脈において、上流はＤＮＡ分子のセンス鎖の５´末端に向かい、下流は分子の３´末端に向かう。
【００７３】
したがって、本発明において、上記の項目（ｂ）で定義する配列は、項目（ａ）のコード領域のすぐ上流、より具体的には、コード領域の開始コドンのすぐ上流に位置する。したがって、本文脈における「すぐ上流」は、項目（ｂ）で定義する配列と、開始コドンで始まるコード配列の間にさらなるヌクレオチドがないことを意味する。したがって、開始コードで始まるコード領域は、本明細書の上記の項目（ｂ）で定義する配列と直接隣接している。
【００７４】
本発明のＤＮＡ分子は、当業者に既知の方法により、組換え的に（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において）または合成的に（例えば、ＰＣＲ反応によりもしくは化学反応において）、生成／合成することができる。
【００７５】
本発明のＤＮＡ分子は、好適には、組換え核酸分子であり、つまり、本発明のＤＮＡ分子は、この組み合わせでは天然には生じないエレメントからなる。本発明の核酸分子は、合成または半合成であり得る。
【００７６】
ＤＮＡ分子は、モジュール（ａ）および（ｂ）（上記の項目（ａ）および（ｂ）それぞれで定義される）の融合ＤＮＡ配列の形態で、つまり、前記モジュールを含有する少なくとも２つのヌクレオチド配列を組み合わせることによって形成される（融合）ＤＮＡ分子の形態で存在し得る。典型的には、以下でさらにより詳細に説明するように、これは、ＲＮＡ分子への転写を可能にする発現ベクターにｃＤＮＡをクローン化することにより達成することが可能である。したがって、本発明のＤＮＡ分子は、融合ＤＮＡ配列、つまり、あるヌクレオチドから別のヌクレオチドの３´炭素に結合したリン酸基を介して２つ以上のポリヌクレオチドを連結し、あるモジュールの各末端と、別のモジュールの末端の間にホスホジエステル結合を形成することにより形成されるキメラ分子であり得る。このように、前記少なくとも２つのモジュールを含有するＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の形態で連結し合う。斯かる組換えＤＮＡ分子は、フレームにおいていったんクローニングされると、次に、前記タンパク質、ポリペプチド、または酵素分子をコードする、それの対応するＲＮＡ核酸配列に転写され得る。
【００７７】
本発明のＤＮＡ分子は、標準的な分子生物学的技法により、ベクター、好適には発現ベクターに導入することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed, 1989を参照）。本発明の意味では、「発現ベクター」または「クローニングベクター」などの用語「ベクター」は、染色体ＤＮＡから独立して細胞内で自己複製し、遺伝物質を細胞に運ぶ媒体として使用され、細胞内で遺伝物質は複製されおよび／または発現する（つまり、ＲＮＡに転写され、アミノ酸配列に翻訳される）、環状二本鎖ＤＮＡユニットとして理解される。外来性ＤＮＡを含有するベクターを、組換えＤＮＡという。ベクター自体は、概して、典型的には、挿入物（例えば、本発明の核酸分子／ＤＮＡ分子）と、ベクターの「骨格」として機能するより大きい配列からなるＤＮＡ配列である。本発明の意味でのプラスミドは、細菌で最も頻繁に見られ、細胞間で遺伝子を転移する組換えＤＮＡ研究に使用され、それ自体は本発明の意味で使用される「ベクター」の亜集団である。
【００７８】
本発明のＤＮＡ分子にさらなる制御配列が付加され得ることは、当業者にとって明らかである。例えば、誘導性発現を可能にする転写エンハンサーおよび／または配列を利用することができる。適切な誘導系は、例えば、Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551)およびGossen, Trends Biotech. 12 (1994), 58-62等に記載されるようなテトラサイクリン制御遺伝子発現、またはCrook, EMBO J. 8 (1989), 513-519等に記載されるようなデキサメタゾン誘導遺伝子発現系である。
【００７９】
本発明は、また、本発明のＤＮＡ分子を含むベクター、好適には発現ベクターにも関する。
【００８０】
本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは例えば遺伝子工学において従来使用されている別のベクターであり得、適切な宿主細胞中でおよび適切な条件下で前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでいてもよい。
【００８１】
本発明のＤＮＡ分子は、好適には、また、ポリＡテールの付加により転写の終了と転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルも含有する。
【００８２】
本発明のＤＮＡ分子とベクターは、細胞への直接導入、または、リポソーム、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）エレクトロポレーション、バリスティック（例えば、遺伝子銃）、もしくは他の送達系を介した導入向けに設計することができる。さらに、バキュロウイルス系を、本発明の核酸分子の真核生物発現系として使用することが可能である。
【００８３】
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞にも関する。したがって、本発明は、本発明のベクターを遺伝子導入または形質転換した宿主または本発明のベクターを担持する非ヒト宿主、つまり、本発明のＤＮＡ分子または斯かるＤＮＡ分子を含むベクターで遺伝子組み換えした宿主細胞または宿主に関する。用語「遺伝子組み換えされた」は、宿主細胞または宿主が、その天然ゲノムに加えて、細胞もしくは宿主またはその先祖／親の１つに導入された本発明のＤＮＡ分子またはベクターを含むことを意味する。ＤＮＡ分子またはベクターは、遺伝子組み換えされた宿主細胞または宿主中に、ゲノムの外側の独立した分子として、好ましくは複製可能な分子として存在する場合もあるし、宿主細胞もしくは宿主のゲノムに安定的に組み込まれる場合もある。本発明のベクターを用いた宿主細胞の形質転換は、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載されるような標準的方法によって行うことが可能である。宿主細胞は、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等に関して、使用される特定の宿主細胞の要件を満たす栄養培地で培養される。
【００８４】
本発明の宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。適切な原核細胞は、大腸菌または枯草菌のような、クローニングに概して使用されるものである。さらに、真核細胞には、例えば、真菌細胞または動物細胞が含まれる。適切な真菌細胞の例は、酵母細胞、好ましくはサッカロミセス属のもの、最も好ましくはサッカロミセス・セレビシエ種のものである。適切な動物細胞は、例えば、昆虫細胞、脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、Ｕ２−ＯＳＨｅｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＰＣ−１２、ＰＣ−３、ＩＭＲ、ＮＴ２Ｎ、Ｓｋ−ｎ−ｓｈ、ＣａＳｋｉ、Ｃ３３Ａなどである。当該技術分野で既知のさらに適切な細胞株は、例えば、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）またはAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）のような細胞株保管所から入手可能である。本発明によれば、初代細胞／細胞培養物は宿主細胞として機能し得ることがさらに想定される。前記細胞は、特に、昆虫（ショウジョウバエ種またはゴキブリ種の昆虫のような）または哺乳動物（ヒト、ブタ、マウスもしくはラットのような）に由来する。前記宿主細胞は、神経芽細胞腫細胞株のような細胞株からの細胞および／またはそれに由来する細胞も含み得る。上記の初代細胞は、当技術分野で周知であり、とりわけ、初代星状膠細胞、（混合）脊髄培養物または海馬培養物が含まれる。
【００８５】
本発明は、本発明のＤＮＡ分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主細胞を含む組成物にも関する。
【００８６】
第２態様では、本発明は、
（ａ）その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と；
（ｂ）前記コード配列のすぐ上流にある、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択されるＵＴＲとを含むＲＮＡ分子に関し、
（ｂ１）は、配列Ｒ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＵＴＲか、または
前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり；
（ｂ２）は、配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである配列のＵＴＲか、または前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり、
Ｒ２は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当するＲＮＡ配列である。
【００８７】
本発明に従って使用するリボ核酸（ＲＮＡ）分子は、Ｇ、Ａ、Ｕ、およびＣと呼ばれるヌクレオチドの鎖として集合したポリマー分子に関する。ＲＮＡの各ヌクレオチドは、１´〜５´の番号が付けられた炭素を有するリボース糖を含有する。窒素塩基は、概して、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）の１´位置に結合する。ポリマーＲＮＡ分子では、リン酸基は、１つのリボースの３´位置および次の５´位置に結合する。したがって、ポリマーＲＮＡ分子のヌクレオチドは互いに共有結合し、一方のヌクレオチドからのリン酸基が、後続のヌクレオチドの３´炭素に結合し、それによってホスホジエステル結合を形成する。したがって、ＲＮＡ鎖は５´末端および３´末端を有し、そのためリボース環上の炭素にちなんで命名される。慣例により、上流および下流は、ＲＮＡ転写が起きる５´から３´方向に関する。好適には、ＲＮＡ分子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である。ｍＲＮＡは、遺伝情報をＤＮＡから、遺伝子発現のタンパク質生成物のアミノ酸配列が特定されるリボソームへ伝達する大きなＲＮＡ分子ファミリーである。ＲＮＡポリメラーゼによる一次転写物ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡとして知られる）の転写に続き、プロセシングされた成熟ｍＲＮＡは、分子生物学のセントラルドグマに要約されるように、アミノ酸のポリマー：タンパク質に翻訳される。ＤＮＡの場合と同様に、ｍＲＮＡの遺伝情報はヌクレオチド配列内にあり、それらは３つの塩基からそれぞれなるコドンに配列される。各コドンは、タンパク質合成を終結させる終止コドンを除き、特定のアミノ酸をコードする。
【００８８】
本発明のＲＮＡ分子は、上記の項目（ａ）および（ｂ）で定義した２つの主要モジュールを含む。さらに、本発明のＲＮＡ分子は、好適には、その３´末端にＵＴＲを含む。したがって、本発明のＲＮＡ分子は、その構造に関して、天然に存在する「正常な」ｍＲＮＡ分子に似ており、コード領域ならびに（５´および３´）非翻訳領域（ＵＴＲ）ならびに任意選択的にポリＡテールを宿す。
【００８９】
本発明に従って使用される用語「その５´末端に開始コドンを含むコード領域」は、遺伝コードによって提供される情報に従いリボソームによって解読され、タンパク質に翻訳されるコドンから構成される配列に関する。コード領域は、一般に、その５´末端の開始コドンで始まり、終止コドンで終わる。概して、開始コドンはＡＵＧトリプレットであり、終止コドンはＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡである。タンパク質をコードしていることに加え、コード領域部分は、エキソンスプライシングエンハンサーまたはエキソンスプライシングサイレンサーとして、プレｍＲＮＡの制御配列として機能し得る。本発明に従って使用するポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子のコード領域は、また、コード配列またはＣＤＳ（coding DNA sequenceに由来）としても知られており、遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの一部であり、エキソンからなり、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。ｍＲＮＡのコード領域は、エキソンの一部でもある５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）と３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）に隣接している。さらに、ｍＲＮＡ分子は、いわゆる５´キャップとポリＡテールをさらに含み得る。５´キャップ、５´ＵＴＲ、３´ＵＴＲ、およびポリＡテールは、タンパク質に翻訳されないｍＲＮＡ分子の領域である。
【００９０】
本発明に従って用いる場合、用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、翻訳されない開始コドンの上流および終止コドン下流のｍＲＮＡ区域に関し、そのため、それぞれ、５プライム非翻訳領域（５´ＵＴＲ）および３プライム非翻訳領域（３´ＵＴＲ）と称される。これらの領域はコード領域と共に転写され、したがって、該領域は成熟ｍＲＮＡに存在することからエキソンである。
【００９１】
本発明で使用する場合、３´非翻訳領域（３´ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンのすぐ後に続くメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）区域に関する。３´ＵＴＲは、ポリアデニル化およびｍＲＮＡの安定性に影響を与えることが知られている３´非翻訳領域内に、調節領域を含み得る。多くの３´ＵＴＲは、また、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を含有する。さらに、３´ＵＴＲは、好適には、ポリ（Ａ）テールと呼ばれる数百のアデニン残基をｍＲＮＡ転写物の末端に付加することを指示する配列ＡＡＵＡＡＡを含有し得る。
【００９２】
本発明で使用する場合、５´非翻訳領域（５´ＵＴＲ）（リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても知られている）は、開始コドンのすぐ上流にあるｍＲＮＡ領域である。５´ＵＴＲは転写開始部位で始まり、コーディング領域の開始コドン（通常はＡＵＧ）の１ヌクレオチド（ｎｔ）前で終わる。真核生物では、５´ＵＴＲの長さは概して１００〜数千ヌクレオチド長であるが、時には、より短いＵＴＲが真核生物で生じる場合がある。
【００９３】
本発明では、最小ＵＴＲ配列を提供することが本発明の目的であることから、５´ＵＴＲは極めて短い。
【００９４】
本発明のＲＮＡ分子は、また、ポリＡテールを含有し得る。ポリＡテールは、ポリアデニル化と呼ばれるプロセスによりプレｍＲＮＡの３´末端に付加される、アデニンヌクレオチド（しばしば数百）の長い配列である。このテールは、核外輸送および翻訳を促進し、ｍＲＮＡを分解から守る。ポリアデニル化とは、ポリ（Ａ）テールをメッセンジャーＲＮＡへ付加することである。ポリ（Ａ）テールは、多数のアデノシン一リン酸からなり；言い換えると、ポリ（Ａ）テールは、アデニン塩基のみを有する一続きのＲＮＡである。真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳用の成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成するプロセスの一部である。
【００９５】
ＲＮＡ分子の一モジュール、つまり、「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」（モジュール（ａ））は、特に限定されず、所与の細胞に発現する任意の所望のコード領域であり得る。用語「その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域」（モジュール（ａ））の好ましい実施形態に関しては、本発明のＤＮＡの文脈において上で述べたのと同じものが、本発明のＲＮＡ分子に準用される。
【００９６】
本発明のＲＮＡ分子は、前記コード配列のすぐ上流にモジュール（ｂ）を含み、前記モジュール（ｂ）は、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択されるＵＴＲであり：
（ｂ１）は、配列Ｒ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＵＴＲか、または、
前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡにより置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり；
（ｂ２）は、配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである配列のＵＴＲか、または前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり
Ｒ２は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当するＲＮＡ配列である。
【００９７】
Ｒ２の性質は特に限定されない。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当する任意のＲＮＡ配列を、使用することが可能である。当業者は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部を、容易に決定できる立場にある。このＲＮＡ配列Ｒ２は、転写されるプロモーターの一部に相当するプロモーター配列であり、つまり、該配列は、いったん転写されると、転写物に実際に存在する。
【００９８】
好適な実施形態では、プロモーターＲ２は、バクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当するＲＮＡ配列である。
【００９９】
好適な実施形態では、プロモーターＲ２は、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＫ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当するＲＮＡ配列である。
【０１００】
これを例示するため、非限定的例として、Ｒ２は、以下のＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；つまり、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター）、ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４；つまり、Ｔ３ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター）、ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；つまり、ＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター）、およびＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；つまり、Ｋ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター）というプロモーター配列の、下線をひいた配列である。下線を引いた配列は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始する各プロモーターの一部に相当し、従って、該配列は、いったん転写されると、ＲＮＡ分子に（つまり、転写物に）実際に存在する。
【０１０１】
配列Ｒ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＵＴＲと比較して、または配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＵＴＲと比較して、上記置換の何れかを有するＵＴＲ配列は、配列Ｒ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＵＴＲを含むＲＮＡ分子および配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＵＴＲを含むＲＮＡ分子それぞれと同じかまたは類似した、好適にはより高い翻訳効率を示すＲＮＡ分子をもたらし得る。本明細書に記載するＵＴＲを含む所与のＲＮＡ分子の翻訳効率は、当技術分野で既知の方法および以下に記載する方法によって、当業者により決定され得る。
【０１０２】
翻訳効率とは、細胞内でのポリペプチドまたはタンパク質へのｍＲＮＡ翻訳の速度である。所与のｍＲＮＡの翻訳効率は、時間単位当たりで、ｍＲＮＡ当たりで翻訳されるタンパク質またはポリペプチドの数として測定される。翻訳とは、細胞リボソームがタンパク質を生成するプロセスであり、これは当業者に周知である。簡潔に言えば、翻訳では、ＤＮＡからの転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がリボソームによって解読されて、特定のアミノ酸鎖またはポリペプチドもしくはタンパク質が生成される。
【０１０３】
したがって、上記の置換の何れかを有する修飾ＵＴＲ配列を宿す所与のＲＮＡ分子の翻訳効率は、好適には、同じ所与のＲＮＡで、上記で定義したＲ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはＲ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）それぞれのＵＴＲを有するＲＮＡの翻訳効率と比較して、同じであるか、または高い。したがって、単位時間当たりで、ＲＮＡ当たりで翻訳される、上記の置換の何れかを有する修飾ＵＴＲ配列を宿すＲＮＡ分子のコード領域によりコードされるタンパク質またはポリペプチドの数は、単位時間当たりで、ＲＮＡ当たりで翻訳される、上記で定義したＲ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）またはＲ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のＵＴＲそれぞれを宿すＲＮＡ分子のコード領域によりコードされるタンパク質またはポリペプチドの数と少なくとも同じであるか、または、好適にはそれより多い。
【０１０４】
本発明の文脈では、翻訳効率は、好適には、ある時点において、細胞中で各タンパク質をコードするｍＲＮＡの量に対する、同じ時点で、前記細胞内でタンパク質に翻訳されたｍＲＮＡの割合である。したがって、翻訳効率は、ある時点において細胞内でタンパク質に翻訳されたｍＲＮＡと、各タンパク質をコードするｍＲＮＡの量の商である。両パラメータ、つまり、タンパク質に翻訳されたｍＲＮＡと各タンパク質をコードするｍＲＮＡの量は、当技術分野で既知の方法により求めることが可能である。非限定的例として、細胞内でタンパク質に翻訳されたｍＲＮＡの量は、例えば、フローサイトメトリー（ＦＣ）により求めるように求めることが可能である一方、各タンパク質をコードするｍＲＮＡの量は、例えば、ｑＰＣＲにより測定することが可能である。
【０１０５】
本明細書の上記の項目（ｂ）で定義するＵＴＲは、上記の特定の配列に特に限定されるわけではなく、斯かる配列と比較してヌクレオチド付加を示す配列を含むＵＴＲ配列とも関連し、前記付加ヌクレオチドは、上記ＵＴＲの５´末端に付加され得る。付加ヌクレオチドは、最大０（変化なし）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、好適には、最大２０ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖を含む。より好適には、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９ヌクレオチドが５´末端に付加される。さらにより好適には、最大３０ヌクレオチドが５´末端に付加される。
【０１０６】
ヌクレオチドの付加は各ＵＴＲの上記機能的特性を変えない可能性が高いという理由に照らして、ヌクレオチドの付加の長さは、これらの配列が、本明細書の項目（ｂ）で定義するＵＴＲと（上記の翻訳効率の点で）同様の機能を有する限り、最大４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ヌクレオチドか、またはさらには、２００、３００、４００、もしくは５００ヌクレオチドであってもよい。
【０１０７】
好適な実施形態では、本明細書の上記の項目（ｂ１）で定義するＵＴＲの最大長さは、１１、１２、または１３ヌクレオチドである。好適には、本明細書の上記の項目（ｂ１）で定義するＵＴＲの最大長さは、Ｒ２がＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）またはＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）である場合、１３ヌクレオチドである。
【０１０８】
好適には、本明細書の上記の項目（ｂ１）で定義するＵＴＲの最大長さは、Ｒ２がＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）またはＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）である場合、１１ヌクレオチドである。
【０１０９】
別の好適な実施形態では、本明細書の上記の項目（ｂ２）で定義するＵＴＲの最大長さは、１２、１３、または１４ヌクレオチドである。好適には、本明細書の上記の項目（ｂ２）で定義するＵＴＲの最大長さは、Ｒ２がＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）またはＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）である場合、１４ヌクレオチドである。
【０１１０】
好適には、本明細書の上記の項目（ｂ２）で定義するＵＴＲの最大長さは、Ｒ２がＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）またはＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）である場合、１２ヌクレオチドである。
【０１１１】
上記ＵＴＲを含有する本発明のＲＮＡ分子は、当業者に既知の方法により、組み換え的に（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で）または合成的に生成／合成することができる。
【０１１２】
ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、通常、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが結合しＲＮＡ合成を開始する、二本鎖プロモーター領域を含有する線形ＤＮＡ鋳型を要する一方、コード領域は二本鎖である場合も、一本鎖である場合もある。線形ＤＮＡ鋳型が一本鎖コード領域を含有する場合、コード領域のアンチセンス鎖（つまり、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼにより読み取られる鎖）は鋳型の一部である。共通のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、およびＫ１１ポリメラーゼである。その各プロモーターの完全配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６に示す。
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための転写鋳型としては、例えば、ＲＮＡ前駆体から合成されたｃＤＮＡ鋳型、ＰＣＲにより生成された鋳型、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、およびプラスミド構成体が挙げられる。多く広く使用されているプラスミドクローニングベクターには、多数のクローニング部位の各側でファージポリメラーゼプロモーターが位置して、多数のクローニング部位に挿入されたヌクレオチド配列鎖の何れかの転写を可能にする。一般に使用されるクローニングベクターとしては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＣＲＩＩ、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。Ａｍｂｉｏｎ社のベクターのｐＴＲＩＰＬＥｓｃｒｉｐｔファミリーは、直列した３つのファージポリメラーゼプロモーターを全て（多数のクローニング部位の同じ側に）含有し、３つのポリメラーゼ、ＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３をいずれも使用可能にする。
【０１１４】
本発明のＲＮＡ分子は、当業者に既知の方法により、ｉｎ  ｖｉｖｏ系において組換え的に生成することができる。
【０１１５】
あるいは、本発明のＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用して生成することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は、一般に既知であり、通常、ＲＮＡ分子を「コードしている」ＤＮＡ配列を含有する精製された線形ＤＮＡ鋳型を必要とし、前記ＤＮＡ配列は、適切なプロモーターの制御下にある。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は、また、一般に、リボヌクレオチド三リン酸、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびに、ＤＮＡ配列を本発明の対応するＲＮＡ分子にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写するための酵素活性を提供する適切なＲＮＡポリメラーゼを必要とする。
【０１１６】
さらに、ＲＮＡ分子は、例えば、固相支持体および標準技法を使用する自動化ヌクレオチド配列合成装置において、従来の化学合成により、または、個々のＤＮＡ配列の化学的合成およびそれに続く該ＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ転写により、化学的に合成され得る。
【０１１７】
上記によれば、本発明は、ＲＮＡ分子／ポリリボ核酸分子、好適には修飾ポリリボ核酸分子を提供し、前記ＲＮＡ分子の一モジュール、つまり「その５´末端に開始コドンを含むコード領域」（モジュール（ａ））は、ポリペプチドをコードする。用語核酸およびポリヌクレオチドは区別なく使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。用語ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語リボ核酸およびポリリボヌクレオチドは区別なく使用され、ある実施形態では、ヌクレオチドの５０％超がリボヌクレオチドであるヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。ある実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオチドの６０％、７０％、７５％、８０％、９０％超、９５％超、９９％超または１００％がリボヌクレオチドであるヌクレオチドポリマーを含む。１つまたは複数のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるポリリボヌクレオチドは、修飾ポリリボヌクレオチドと称され得る。しかしながら、用語ポリリボヌクレオチドは、修飾ポリリボヌクレオチドを含み得る。
【０１１８】
ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドの配列は、例えば、対象の遺伝子の遺伝情報を含む任意の適切な核酸に由来し得る。核酸の例としては、対象の遺伝子を含む任意の細菌または古細菌細胞由来のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡが挙げられる。ポリヌクレオチドは、変異遺伝子および遺伝子多型を担持する核酸に由来し得る。本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、特に限定されないが、モジュールＡとして、所与の細胞で発現する任意の所望のコード領域を含み得る配列を含む。好適な実施形態では、前記配列は、上記で概説した所望のポリペプチド／タンパク質をコードするコード領域であり得る。好適には、上記に従って、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、モジュールＡの開始コドンの上流（５´）に位置する非翻訳配列、モジュールＡの終止コドンの下流（３´）に位置する非翻訳配列、またはモジュールＡの開始コドンの上流（５´）に位置する非翻訳配列とモジュールＡの終止コドンの下流（３´）に位置する非翻訳配列の両方をさらに含む。好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドであり得る。
【０１１９】
４つの古典的リボヌクレオチド、つまり、アデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンに加えて、これらの核酸塩基の各々の類似体が多数存在する。場合によっては、文献を通しておよび文献中で、これらの類似体、またはこれら類似体の１つまたは複数を含むＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、修飾されている（例えば、修飾ヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチド）と言われる。いくつかの類似体は、上記の標準的な核酸塩基とは異なるが、自然界に存在し得る。他の類似体は天然に存在しない。いずれのタイプの類似体についても考える。
【０１２０】
ある実施形態では、本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体を含む（例えば、ポリリボヌクレオチドは、修飾ポリリボヌクレオチドを含む）。例示的なヌクレオチド類似体を以下に提供する（例えば、Ｕの類似体；Ｃの類似体；Ａの類似体；Ｇの類似体）。さらに、ある実施形態では、本開示のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドまたは他の核酸は、ホスホジエステル骨格または核酸塩基間の結合において（付加的または代替的に）修飾を含む場合がある。本開示のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドの一部または全てを形成することが可能な例示的な核酸には、限定されないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ベータ−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、アルファ−Ｌ−リボ立体配置を有するアルファ−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２´−アミノ官能化を有する２´−アミノ−ＬＮＡ、および２´−アミノ官能化を有する２´−アミノ−アルファ−ＬＮＡを含むＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドが挙げられる。
【０１２１】
ある実施形態では、修飾は、１つまたは複数のヌクレオシドまたは核酸／ポリヌクレオチド分子の骨格上にあり得る。ある実施形態では、修飾は、ヌクレオシドおよび骨格結合の両方にあり得る。ある実施形態では、修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチド内に導入され得る。ある実施形態では、修飾リボヌクレオチド／ヌクレオチドは、また、古典的な／天然のリボヌクレオチド／ヌクレオチドの共有結合修飾によって、転写後に合成され得る。
【０１２２】
本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドであり得、ある実施形態では、プリンの類似体および／またはピリミジンの類似体を含み得る。特定の実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、ウリジンの類似体および／またはシチジンの類似体などのピリミジン類似体を含む。ある実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、ウリジンの類似体およびシチジンの類似体を含む。ある実施形態では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、アデノシンの類似体および／またはグアノシンの類似体を含まない。ある実施形態では、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、ウリジンの単一タイプの類似体およびシチジンの単一タイプの類似体を含む（例えば、単一タイプの類似体であって、単一分子の類似体ではない−単一の類似体は、本明細書に記載のいくつかのパーセンテージのいずれかで存在し得る）。他の実施形態では、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、ウリジンおよび／またはシチジンの２つ以上のタイプの類似体、ならびに任意選択的に、存在する場合には、アデノシンおよび／またはグアノシンの１つまたは複数（つまり何れか一方はないか、または両方）の類似体を含む。
【０１２３】
一部の場合では、修飾ウリジン（例えば、ウリジンの類似体）は、２−チオウリジン、５´−メチルウリジン、シュードウリジン、５−ヨードウリジン（Ｉ５Ｕ）、４−チオウリジン（Ｓ４Ｕ）、５−ブロモウリジン（Ｂｒ５Ｕ）、２´−メチル−２´−デオキシウリジン（Ｕ２´ｍ）、２´−アミノ−２´−デオキシウリジン（Ｕ２´ＮＨ２）、２´−アジド−２´−デオキシウリジン（Ｕ２´Ｎ３）、および２´−フルオロ−２´−デオキシウリジン（Ｕ２´Ｆ）から選択される。一部の場合では、修飾シチジン（例えば、シチジンの類似体）は、５−メチルシチジン、３−メチルシチジン、２−チオ−シチジン、２´−メチル−２´−デオキシシチジン（Ｃ２´ｍ）、２´−アミノ−２´−デオキシシチジン（Ｃ２´ＮＨ２）、２´−フルオロ−２´−デオキシシチジン（Ｃ２´Ｆ）、５−ヨードシチジン（Ｉ５Ｃ）、５−ブロモシチジン（Ｂｒ５Ｃ）および２´−アジド−２´−デオキシシチジン（Ｃ２´Ｎ３）から選択される。類似体に言及する場合、上記は、それらの５´三リン酸型の類似体も指すことに留意されたい。ある実施形態では、シチジン類似体は５−ヨードシチジンであり、ウリジン類似体は５−ヨードウリジンである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドである。一部の場合では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、非修飾（または無修飾）ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドと比較して、少なくとも２５％、より安定している。一部の場合では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドと比較し、少なくとも３０％より安定、少なくとも３５％より安定、少なくとも４０％より安定、少なくとも４５％より安定、少なくとも５０％より安定、少なくとも５５％より安定、少なくとも６０％より安定、少なくとも６５％より安定、少なくとも７０％より安定、少なくとも７５％より安定、少なくとも８０％より安定、少なくとも８５％より安定、少なくとも９０％より安定、少なくとも９５％より安定であり得る。ある実施形態では、安定性はｉｎ  ｖｉｖｏで測定される。特定の実施形態では、安定性はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される。ある実施形態では、安定性は、ポリリボヌクレオチドの半減期を測定することによって定量化される。
【０１２５】
本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、同じ形態で修飾されたヌクレオチド、または異なる修飾ヌクレオチドの混合物を有し得る。修飾ヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡにおいて天然に存在するか、または天然に存在しない修飾を有し得る。種々の修飾ヌクレオチドの混合物を使用することが可能である。例えば、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは天然の修飾を有し得、別の部分はｍＲＮＡに天然に見られない修飾を有する。さらに、いくつかの修飾ヌクレオチドは塩基修飾を有し得る一方、他の修飾ヌクレオチドは糖修飾を有する。同様に、全ての修飾が塩基修飾であるか、または全ての修飾が糖修飾であるか、またはそれらの任意の適切な混合物である可能性がある。一部の場合では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドの安定性を、修飾ポリリボヌクレオチド内の修飾塩基の性質を変えることによって選択的に最適化することが可能である。
【０１２６】
Ｕの類似体の非限定的例
【表２】
2019512260.tif 000013
【０１２７】
Ｃの類似体の非限定的例
【表３−１】
2019512260.tif 000014
【表３−２】
2019512260.tif 000015
【０１２８】
Ａの類似体の非限定的例
【表４−１】
2019512260.tif 000016
【表４−２】
2019512260.tif 000017
【０１２９】
Ｇの類似体の非限定的例
【表５】
2019512260.tif 000018
【０１３０】
ある実施形態では、類似体（例えば、修飾ヌクレオチド）は、以下を含む群から選択することが可能である：ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−ヨードウリジン、５−ヨードシチジン、５−アザ−ウリジン、２´−アミノ−２´−デオキシシチジン、２´−フルオロ−２´−デオキシシチジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−ｌ−メチル−シュードウリジン、２−チオ−ｌ−メチル−シュードウリジン、１−メチル−ｌ−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−ｌ−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−ｌ−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−ｌ−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−ｌ−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−ｌ−メチル−シュードイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン���６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン。
【０１３１】
ある実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、シュードウリジンを含まない。ある実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、５−メチルシチジンを含まない。ある実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、５−メチルウリジンを含まない。ある実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、Ｕの類似体およびＣの類似体を含み、斯かるＵの類似体は全て同じ類似体であっても、異なる類似体（例えば、複数のタイプの類似体）であってもよく、斯かるＣの類似体は全て同じ類似体であっても、異なる類似体（例えば、複数のタイプの類似体）であってもよい。ある実施形態では、本発明の修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、アデノシンの類似体およびグアノシンの類似体を含まない。
【０１３２】
本明細書で詳細に記載するように、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドが修飾ポリリボヌクレオチドを含む場合、類似体は、化合物中でヌクレオチドの特定の割合として存在し得る（例えば、所与の核酸塩基の所与のパーセンテージは、本明細書に記載するように、類似体であってもよい）。
【０１３３】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドである。ある実施形態では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドの少なくとも約５％は、本明細書に記載の類似体クレオチドなどの、修飾されたまたは天然に存在しない（例えば、類似体もしくは修飾された）アデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。一部の場合では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％は、修飾または天然に存在しない（例えば、類似体もしくは修飾された）、アデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。一部の例では、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドの多くとも約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％は、修飾または天然に存在しない、アデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを含む。
【０１３４】
好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドの組み合わせを含有する。好ましくは、本発明のＲＮＡ分子は、国際公開第２０１１／０１２３１６号に記載されているように、修飾および非修飾のヌクレオチドの組み合わせを含有する。斯かるＲＮＡ分子は既知であり、「ＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡ」として商業化もされている。国際公開第２０１１／０１２３１６号に記載のＲＮＡ分子は、安定性の増大および免疫原性の減少を示すことが報告されている。好適な実施形態では、斯かる修飾ＲＮＡ分子において、シチジンヌクレオチドの５〜５０％およびウリジンヌクレオチドの５〜５０％が修飾される。アデノシンおよびグアノシンを含有するヌクレオチドは非修飾でもよい。アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは非修飾でも部分修飾でもよく、好適には非修飾型で存在する。好適には、シチジンヌクレオチドおよびウリジンヌクレオチドの１０〜３５％が修飾され、特に好適には修飾シチジンヌクレオチドの含有量は７．５〜２５％の範囲にあり、修飾ウリジンヌクレオチドの含有量は７．５〜２５％の範囲にある。実際、比較的低い含有量、例えば、それぞれわずか１０％の修飾シチジンおよびウリジンヌクレオチドが所望の特性を達成可能であることが発見されている。修飾シチジンヌクレオチドが５−メチルシチジン残基であり、修飾ウリジンヌクレオチドが２−チオウリジン残基であることが特に好ましい。最も好適には、修飾シチジンヌクレオチドの含有量および修飾ウリジンヌクレオチドの含有量は、それぞれ２５％である。
【０１３５】
ある他の実施形態では、斯かる修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの５〜５０％がＣの類似体であり、ウリジンの５〜５０％がＵの類似体である。ある実施形態では、斯かる修飾ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの５〜４０％がＣの類似体であり、ウリジンの５〜４０％がＵの類似体である。ある実施形態では、斯かる修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの５〜３０％がＣの類似体であり、ウリジンの５〜３０％がＵの類似体である。ある実施形態では、斯かる修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの１０〜３０％がＣの類似体であり、ウリジンの１０〜３０％がＵの類似体である。ある実施形態では、斯かる修飾ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンの５〜２０％がＣの類似体であり、ウリジンの５〜２０％がＵの類似体である。ある実施形態では、斯かる修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンヌクレオチドの５〜１０％およびウリジンヌクレオチドの５〜１０％が修飾される。ある実施形態では、斯かる修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子において、シチジンヌクレオチドの２５％およびウリジンヌクレオチドの２５％が修飾される。ある実施形態では、アデノシンおよびグアノシンを含有するヌクレオチドは非修飾でもよい。ある実施形態では、アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは非修飾でも部分修飾でもよく、好適には非修飾型で存在する。
【０１３６】
上記のように、ある実施形態では、Ｕの類似体は、Ｕの単一タイプの類似体を指す。ある実施形態では、Ｕの類似体は、Ｕの２つ以上のタイプの類似体を指す。ある実施形態では、Ｃの類似体は、Ｃの単一タイプの類似体を指す。ある実施形態では、Ｃの類似体は、Ｃの２つ以上のタイプの類似体を指す。
【０１３７】
ある実施形態では、シチジンの類似体であるＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドにおけるシチジンのパーセンテージは、ウリジンの類似体であるＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドにおけるウリジンのパーセンテージと同じではない。ある実施形態では、シチジンの類似体のパーセンテージは、ウリジンの類似体のパーセンテージよりも低い。上記のように、これは、アデノシンおよびグアノシンの類似体が存在する場合も存在しない場合もあり得るが、ある実施形態では、アデノシン類似体もグアノシン類似体も存在しない。特定の実施形態では、本開示のポリリボヌクレオチドは、１５％未満、１０％未満、５％未満、または２％未満のアデノシン類似体、グアノシン類似体、またはその両方を含む。
【０１３８】
ある実施形態では、本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、シチジンの類似体およびウリジンの類似体を含み、シチジンの５〜２０％がシチジンの類似体であり、ウリジンの２５〜４５％がウリジンの類似体である。言い換えれば、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、修飾および非修飾シチジンならびに修飾および非修飾ウリジンを含み、シチジンの５〜２０％はシチジンの類似体を含む一方、ウリジンの２５〜４５％はウリジンの類似体を含む。他の実施形態では、ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドは、５〜１０％のシチジン類似体および３０〜４０％のウリジン類似体を含み、例えば約７、７．５、または８％などの７〜９％のシチジン類似体、および例えば約３３、３４、３５、３６％などの３２〜３８％のウリジン類似体を含む。
【０１３９】
ある実施形態では、本明細書に記載のウリジン類似体およびシチジン類似体の何れかを使用することができ、任意選択的にシュードウリジンは除く。ある実施形態では、シチジンの類似体は５−ヨードシチジンを含むか、または５−ヨードシチジンからなり（例えば、からなる場合、使用されているのは単一の類似体タイプである）、ウリジンの類似体は５−ヨードウリジンを含むか、または５−ヨードウリジンからなる（例えば、からなる場合、使用されているのは単一の類似体タイプである）。
【０１４０】
上記の何れかのある実施形態では、所与のヌクレオチドの類似体のパーセンテージは、投入パーセンテージ（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の開始などの開始反応における類似体のパーセンテージ）を指す。上記の何れかのある実施形態の何れかでは、所与のヌクレオチドの類似体のパーセンテージは、アウトプット（例えば、合成または転写された化合物におけるパーセンテージ）を指す。
【０１４１】
本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子は、以下により詳細に記載する当業者に既知の方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ系で組み換え的に生成することができる。
【０１４２】
あるいは、本発明の修飾ポリリボヌクレオチド分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において、例えば、以下により詳細に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を用いて生成することができる。ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドを生成することができるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は、本発明の所望の特性を有する修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドを生成するために、修飾および非修飾のヌクレオシド三リン酸の投入混合物を必要とする。ある実施形態では、斯かる投入混合物においてシチジンの５〜５０％がシチジン類似体であり、斯かる投入混合物においてウリジンの５〜５０％がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる投入混合物においてシチジンの５〜４０％がシチジン類似体であり、斯かる投入混合物においてウリジンの５〜４０％がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの５〜３０％がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの５〜３０％がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの５〜３０％がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの１０〜３０％がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの５〜２０％がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの５〜２０％がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの５〜１０％がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの５〜１０％がウリジン類似体である。ある実施形態では、斯かる混合物においてシチジンの２５％がシチジン類似体であり、斯かる混合物においてウリジンの２５％がウリジン類似体である。ある実施形態では、投入混合物は、アデノシンおよび／またはグアノシンの類似体を含まない。他の実施形態では、任意選択的に、投入混合物は、１つまたは複数のアデノシンおよび／またはグアノシン（つまり何れか一方はないか、または両方）の類似体を含む。
【０１４３】
ある実施形態では、投入混合物におけるシチジン類似体であるシチジンのパーセンテージは、投入混合物におけるウリジン類似体であるウリジンのパーセンテージと同じではない。ある実施形態では、投入混合物におけるシチジン類似体のパーセンテージは、投入混合物におけるウリジン類似体のパーセンテージよりも低い。上記のように、これは、投入混合物にアデノシンおよびグアノシンの類似体が存在する場合も存在しない場合もあり得るが、ある実施形態では、投入混合物においてアデノシンの類似体もグアノシンの類似体も存在しない。
【０１４４】
ある実施形態では、本発明のＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチドを生成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系用のヌクレオチド投入混合物は、シチジン類似体およびウリジン類似体を含み、投入混合物のシチジンの５〜２０％がシチジン類似体であり、投入混合物のウリジンの２５〜４５％はウリジン類似体である。言い換えれば、投入混合物は、修飾および非修飾シチジンならびに修飾および非修飾ウリジンを含み、投入混合物のシチジンの５〜２０％がシチジン類似体を含む一方、投入混合物のウリジンの２５〜４５％がウリジン類似体を含む。他の実施形態では、投入混合物は、５〜１０％のシチジン類似体および３０〜４０％のウリジン類似体を含み、例えば約７、７．５または８％などの７〜９％のシチジン類似体、および例えば約３３、３４、３５、３６％などの３２〜３８％のウリジン類似体を含む。
【０１４５】
ある実施形態では、任意選択的にシュードウリジンを除き、本明細書に記載のウリジン類似体およびシチジン類似体の何れかを使用することができる。ある実施形態では、シチジン類似体は５−ヨードシチジンを含むか、または５−ヨードシチジンからなり（例えば、使用されているのが単一のＣ類似体タイプである）、ウリジン類似体は５−ヨードウリジンを含むか、またはそれからなる（例えば、使用されているのが単一のＵ類似体タイプである）。
【０１４６】
例示的な類似体を上記の表に記載する。所望のポリペプチド（モジュール（ａ））をコードする修飾ポリリボヌクレオチドについて、類似体および修飾レベルは、別段の指示がない限り、５´および３´非翻訳領域を含む所望のポリペプチド（モジュール（ａ））をコードするポリリボヌクレオチド全体にわたって考慮される（例えば、修飾レベルは、転写位置に類似体が組み込まれ得るようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応における類似体の投入比に基づく）。 
【０１４７】
さらに、修飾ＲＮＡ分子／ポリリボヌクレオチド分子は、例えば、固相支持体および標準技術を使用する自動ヌクレオチド配列合成装置において、従来の化学合成によって、または個々のＤＮＡ配列の化学合成および後に続くそのｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって、化学的に合成され得る。
【０１４８】
分子生物学および遺伝学において、上流および下流は、両方ともＲＮＡ分子における相対位置を指す。本発明の文脈において、上流はＲＮＡ分子の５´末端に向かい、下流は分子の３´末端に向かう。
【０１４９】
したがって、本発明において、上記の項目（ｂ）で定義するＵＴＲは、項目（ａ）のコード領域のすぐ上流、より具体的には、コード領域の開始コドンのすぐ上流に位置する。したがって、本文脈における「すぐ上流」は、項目（ｂ）で定義するＵＴＲと、開始コドンで始まるコード配列の間にさらなるヌクレオチドがないことを意味する。したがって、開始コードで始まるコード領域は、前記ＵＴＲ配列に直接隣接している。
【０１５０】
ＲＮＡ分子は、モジュール（ａ）および（ｂ）（それぞれ、上記の項目（ａ）および（ｂ）で定義される）の融合ＲＮＡ配列の形態で、つまり、前記モジュールをコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列を組み合わせることによって作成されるハイブリッド遺伝子の発現により形成される（融合）ＤＮＡ分子の形態で存在し得る。典型的には、以下でさらにより詳細に説明するように、これは、ＲＮＡ分子への転写を可能にする発現ベクターにｃＤＮＡをクローン化することにより達成することが可能である。したがって、本発明のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子は、融合ＤＮＡ配列、つまり、あるヌクレオチドから別のヌクレオチドの３´炭素に結合したリン酸基を介して２つ以上のポリヌクレオチドを連結し、あるモジュールの各末端と別のモジュールの末端の間にホスホジエステル結合を形成することにより形成される、キメラ分子であり得る。このように、前記少なくとも２つのモジュールをコードする上記ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子の形態で連結し合う。斯かる組換えＤＮＡ分子は、次に、それの対応するＲＮＡ核酸配列に転写される。
【０１５１】
好適な一実施形態では、Ｒ２は：
（ｉ）ＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
（ｉｉ）ＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；
（ｉｉｉ）ＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；および
（ｉｖ）ＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）からなる群から選択される。
【０１５２】
好適な実施形態では、配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含むＲＮＡ分子がＲＮＡ分子であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮはＵ、Ｇ、またはＣからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮはＡではない。
【０１５３】
別の好適な実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮはＵである。
【０１５４】
好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがヌクレオチドＧではない、ＲＮＡ分子である。別の好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがＡ、Ｕ、およびＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、ＲＮＡ分子である。
【０１５５】
さらにより好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、上記で定義するモジュール（ｂ１）を含むＲＮＡ分子であり、前記モジュール（ｂ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡにより置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されており、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがＡ、Ｕ、およびＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列である。
【０１５６】
さらにより好適な別の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、上記で定義するモジュール（ｂ２）を含むＲＮＡ分子であり、前記モジュール（ｂ２）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されており、開始コドンのすぐ下流に続くヌクレオチドがＡ、Ｕ、およびＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列である。
【０１５７】
上記のように、コザックコンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧはとりわけ、「Ｒ」で表される位置−３（つまり、開始コドンＡＵＧから３ヌクレオチド上流）のヌクレオチドに関し、その位置がプリン（つまり、アデニンまたはグアニン）である限り、変異体であり得る。上記ＵＴＲでは、その位置に対応するヌクレオチドを「Ａ」と定義する。しかしながら、本発明は、または、その位置で「Ｇ」を有する対応するＵＴＲを含むＲＮＡ分子にも関する。
【０１５８】
したがって、好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、上記の項目（ｂ１）で定義したＵＴＲを含有し、（ｂ１）の前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されるか；または、（ｂ２）の前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている。
【０１５９】
上記のように、本発明のＲＮＡ分子は、また、ポリＡテールを宿し得る。本明細書で使用する場合、ポリＡテールは、ＲＮＡの３´末端に位置するアデニンヌクレオチドの配列に関する。ポリＡテールは、一般に、ポリアデニル化と呼ばれるプロセスによりＲＮＡの３´末端に付加される。したがって、本発明は上記ＲＮＡの何れかに関し、該ＲＮＡ分子は、３´末端にポリＡテールを含む。
【０１６０】
ポリＡテールの長さは特に限定されない。しかし、好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、３´末端にポリＡテールを含み、該ポリＡテールの長さは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１１０ヌクレオチドである。より好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、３´末端にポリＡテールを含み、該ポリＡテールの長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。他の好適な実施形態では、本発明のＲＮＡ分子は、３´末端にポリＡテールを含み、該ポリＡテールの長さは、少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチドである。
【０１６１】
本発明のＲＮＡ分子が、本明細書の以下にさらに記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法によって生成される場合、ポリＡテールは、ＲＮＡ分子の３´末端でＵＴＲに隣接するＲＮＡの３´末端に位置する一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ分子が前記ポリＡテールを確実に含有するように、本発明のＲＮＡ分子を宿すプラスミドはポリＡテールの下流でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の前に線形化される。
【０１６２】
上記のように、本発明のＲＮＡ分子は、モジュール（ａ）および（ｂ）の融合ＲＮＡ配列の形態で、つまり、前記モジュールをコードする少なくとも２つのヌクレオチド配列を組み合わせることによって作成されるハイブリッド遺伝子の転写により形成される（融合）ＲＮＡ分子の形態で存在し得る。典型的には、これは、全ＲＮＡ分子の転写を可能にする発現ベクターにｃＤＮＡをクローン化することにより達成される。融合構成体を作成する種々の方法が既知であり、本発明のＲＮＡ分子を「コード」する合成二本鎖核酸分子を生成する核酸合成、ハイブリダイゼーション、および／または増幅が含まれる。斯かる二本鎖核酸分子（つまり、ＤＮＡ分子）は、一方の鎖に（つまり、コード鎖またはセンス鎖に）、本発明のＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ配列を宿し、従って、本発明のＲＮＡ分子を「コード」する。言い換えると、斯かる二本鎖核酸／ＤＮＡ分子は、鎖の上に、本明細書の上記で定義する本発明の転写ＲＮＡ分子に対応する遺伝情報を含む。本発明の文脈における用語「コード」または「コードする」は、その従来の意味、つまり、タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ（および、したがって、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得る遺伝情報）に関して使用されるだけではない。むしろ、本発明の観点からいえば、モジュール（ａ）および（ｂ）をコードする個々のＤＮＡ配列が単一の（キメラ）ＤＮＡ分子に「融合」または連結されている構成体において、構成体は、タンパク質に翻訳されない成分（つまり、モジュール（ｂ））も含む。それでもなお、モジュール（ｂ）に対応するＤＮＡ配列は、ＵＴＲの構造の情報、つまり「コード」を提供し、したがって、本発明における用語「コードする」は、例えば、二本鎖核酸分子中に存在する場合に発現し得る、つまり、転写され得るＵＴＲの遺伝情報にも関する。したがって、本発明の文脈における用語「コードする」は、一般にはタンパク質のコード／発現に関してのみ使用されるが、核酸分子が、タンパク質またはポリペプチドをコードする部分（つまり、モジュール（ａ））とＵＴＲを「コード」する部分（つまり、モジュール（ｂ））を宿す対応するＲＮＡ分子に転写され得ると理解するべきであり、ここで、ＵＴＲはタンパク質またはポリペプチドに翻訳されないため、後者は発現した場合の最終生成物を表す。斯かる二本鎖核酸は、標準的な分子生物学的技法（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed, 1989を参照）によって、発現ベクターに挿入され得る。本発明の意味における「発現ベクター」または「クローニングベクター」などの用語「ベクター」は、細胞内で染色体ＤＮＡとは独立して自己複製し、遺伝物質を細胞に運ぶための運搬体として使用され、そこで自己複製および／または発現し得る（つまり、ＲＮＡに転写され、アミノ酸配列に翻訳される）、環状二本鎖のＤＮＡユニットとして理解される。外来性ＤＮＡを含有するベクターを、組換えＤＮＡという。ベクター自体は、概して、典型的には、挿入物（つまり、タンパク質に翻訳されないモジュール（ｂ）およびモジュール（ａ）コード領域）と、ベクターの「骨格」として機能するより大きい配列とからなるＤＮＡ配列である。本発明の意味でのプラスミドは、細菌で最も頻繁に見られ、細胞間で遺伝子を転移するための組換えＤＮＡ研究に使用され、それ自体は本発明の意味で使用される「ベクター」の亜集団である。
【０１６３】
したがって、本発明は、本発明のＲＮＡ分子をコードする核酸分子にも関する。
【０１６４】
核酸は、例えば、本発明のＲＮＡ分子の２つの主要モジュール（つまり、モジュール（ａ）およびモジュール（ｂ））をコードするＤＮＡである。本発明の上記核酸分子は、好ましくは、組換え核酸分子である。本発明の核酸分子は、合成または半合成であり得る。
【０１６５】
ＲＮＡ分子をコードする本発明の核酸分子にさらなる制御配列を付加可能であることは、当業者にとって明らかである。例えば、誘導性発現を可能にする転写エンハンサーおよび／または配列を利用することができる。適切な誘導系は、例えば、Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551)およびGossen, Trends Biotech. 12 (1994), 58-62に記載されるようなテトラサイクリン制御遺伝子発現、またはCrook, EMBO J. 8 (1989), 513-519に記載されるようなデキサメタゾン誘導性遺伝子発現系である。
【０１６６】
本発明は、また、本発明の核酸分子を含むベクター、好適には、発現ベクターに関する。
【０１６７】
本発明のＲＮＡ分子をコードする核酸分子を含むベクターに関しては、上記で定義した本発明のＤＮＡ分子を含むベクターの文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
【０１６８】
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞にも関する。したがって、本発明は、本発明のベクターを用いて遺伝子導入または形質転換した宿主または本発明のベクターを担持する非ヒト宿主、つまり、本発明の核酸分子または斯かる核酸分子を含むベクターで遺伝子組み換えした、宿主細胞または宿主に関する。
【０１６９】
本発明のＲＮＡ分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞に関しては、上記で定義した本発明のＤＮＡ分子を含むベクターを含む宿主細胞の文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
【０１７０】
本発明は、また、本発明の個々のモジュールまたは本発明のＲＮＡ分子全体をコードする発現ベクターを宿す宿主細胞を、培養培地において培養し、ＲＮＡ分子を宿主細胞または培養培地から回収することにより本発明のＲＮＡ分子を生成する方法にも関する。本発明は、また、本発明の宿主細胞を培養するステップと、任意選択的に培養物からＲＮＡ分子を回収するステップとを含む、本発明のＲＮＡ分子の生成方法にも関し得る。
【０１７１】
本発明のＲＮＡ分子を回収する方法および／またはその後に精製する方法は、当業者に既知である。
【０１７２】
本発明は、また、当業者に既知の方法によって本発明のＲＮＡ分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応で生成する方法にも関する。より具体的には、本発明のＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は一般に知られており、通常、上記で概説したように、モジュール（ｂ）およびモジュール（ａ）を「コード」するＤＮＡ配列を含有する精製線形ＤＮＡ鋳型を必要とし、前記ＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御下にある。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系は、また、一般に、リボヌクレオチド三リン酸、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにＤＮＡ配列の本発明のＲＮＡ分子へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための酵素活性を提供する適切なＲＮＡポリメラーゼも必要とする。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用してＲＮＡ分子を生成するために一般に使用される方法は当業者に周知であり、例えば、Methods Mol. Biol. 703 (2011):29-41に記載されている。
【０１７４】
上記のように、本発明のＲＮＡ分子が、本明細書において以下にさらに記載するようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法によって生成される場合、上記ポリＡテールは、本発明のＲＮＡ分子の一部であり得（必ずしもクローニングベクター上にもともと位置するとは限らない）、ＲＮＡ分子の３´末端に、例えば、ＲＮＡの３´末端でＵＴＲに隣接して位置する。本発明のＲＮＡ分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写方法によって生成される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ分子が前記ポリＡテールを確実に含有するように、本発明のＲＮＡ分子を宿すプラスミドは、ポリＡテールの下流でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の前に線形化される。
【０１７５】
あるいは、本発明のＲＮＡ分子は、また、例えば、固相支持体および標準技術を使用する自動ヌクレオチド配列合成装置において、従来の化学合成によって、化学的に合成され得る。
【０１７６】
本発明は、また、当業者に既知である、上記に概説した方法によって本発明のＲＮＡ分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応で生成し、ＲＮＡ分子を反応から回収する方法にも関する。
【０１７７】
本発明のＲＮＡ分子を回収し、および／またはその後に精製する方法は、当業者に既知である。
【０１７８】
本発明のＲＮＡ分子は、モジュール（ａ）のコード領域によりコードされる任意の所望のポリペプチドまたはタンパク質の効率的な発現のために、当業者に既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系において容易に使用することが可能である。
【０１７９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系は、当技術分野で既知であり、本発明のＲＮＡ分子とともに直接的に使用することが可能である。あるいは、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系は、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系と組み合わせることが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に対応する無細胞系は既知であり、利用可能である。これらのタンパク質合成用無細胞系（ｉｎ−ｖｉｔｒｏタンパク質合成または略してＣＦＰＳとも呼ばれる）は、生細胞を使用することなく、生物学的機構を使用して、ポリペプチドまたはタンパク質の発現／生成を可能にする。これらの系において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成環境は、細胞生存能を維持するのに必要な細胞壁または恒常性条件に制限されず、タンパク質合成を研究するための、タンパク質生成の最適化、タンパク質複合体の最適化、非天然アミノ酸の組み込み、高スループットスクリーン、および合成生物学を含む、いくつかの用途に有利な直接的なアクセスおよび翻訳環境の制御を可能にする。無細胞反応の共通の構成要素としては、細胞抽出物、エネルギー源、アミノ酸供給、マグネシウムなどの補助因子、および所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。細胞抽出物は、対象の細胞を溶解し、細胞壁、ＤＮＡゲノム、および他のデブリを遠心分離することによって得ることができる。残りは、リボソーム、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、翻訳開始および伸長因子、ヌクレアーゼなどを含む、必要な細胞機構である。ＤＮＡから始まるポリペプチドまたはタンパク質の合成のための無細胞系では（つまり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳のステップを含む系では）、一般に、２種類のＤＮＡ、つまり、プラスミドまたは線形発現鋳型（ＬＥＴ）の何れかが使用される。ＲＮＡから始まるポリペプチドまたはタンパク質の合成のための無細胞系では（つまり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ステップのみを含む系では）、ＲＮＡが直接使用され得る。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞反応では、必要なエネルギー源を含有する別の混合物により通常は提供されるエネルギー源を、反応のために抽出物に加えられるアミノ酸供給とともに必要とする。一般のエネルギー源は、ホスホエノールピルビン酸、アセチルリン酸、およびクレアチンリン酸である。一般的に使用される一般の細胞抽出物は、大腸菌（ＥＣＥ）、ウサギ網状赤血球（ＲＲＬ）、コムギ胚芽（ＷＧＥ）、昆虫細胞（ＩＣＥ）から作成される。これらの抽出物は全て、商業的に利用可能である。
【０１８０】
したがって、本発明は、また、本発明のＲＮＡ分子に含有されるコード領域によりコードされる所望のポリペプチドまたはタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳のための、本発明のＲＮＡ分子の使用に関する。
【０１８１】
本発明のＲＮＡ分子の斯かる使用についての好適な実施形態に関しては、上記で定義したＲＮＡの文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
【０１８２】
上記で定義したＲＮＡ分子は、医療機関および特定の疾患の治療、特にＲＮＡベースの治療において特に有用である。したがって、本発明は、また、本発明のＲＮＡ分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。
【０１８３】
用語「処置」などは、本明細書では、概して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用する。したがって、本発明の治療は、特定の疾患の（急性）状態の処置に関し得るが、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で、予防的治療にも関し得る。好適には、用語「処置」は、疾患ならびに／または疾患に起因する有害作用および／もしくは症状を部分的にまたは完全に治すという点で、治療的であると理解するべきである。この点で、「急性」は、対象が疾患の症状を示すことを意味する。言い換えれば、治療される対象は処置を実際に必要としており、本発明の文脈における用語「急性処置」は、疾患の発症または疾患の発生の後に疾患を実際に処置するためにとられる措置に関する。処置は、予防的または予防的処置、つまり、疾患の予防のために、例えば感染症および／または疾患の発症を予防するためにとられる措置であり得る。
【０１８４】
本発明の医薬組成物は、当業者に既知の広範囲の種類の投与形態により投与され得る。投与は、全身的、局所的、経口的、エアロゾル経由であり得、限定するわけではないが、錠剤、注射、吸入器の使用、クリーム、泡、ゲル、ローション、および軟膏が含まれる。
【０１８５】
上記のように、本発明は、有効量の上記の本発明のＲＮＡ分子（または核酸分子、ベクターまたは宿主細胞）と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤または担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０１８６】
賦形剤または担体は、強力な活性成分を含有する増量製剤を目的として、活性成分、つまり本発明のＲＮＡ分子（または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞）と一緒に製剤化される不活性物質である。賦形剤は、しばしば「増量剤」、「充填剤」、または「希釈剤」という。増量は、剤形を製造する際に、薬剤物質の簡便で正確な分配を可能にする。それらはまた、薬物吸収もしくは溶解性の促進、または他の薬物動態学的考察などの、種々の治療強化目的にも役立ち得る。賦形剤はまた、予想される貯蔵期間にわたる変性の防止などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を補助することに加えて、粉末流動性または非粘着特性を促進することなどにより関連する活性物質の取り扱いを補助するために、製造過程において有用であり得る。適切な賦形剤の選択は、投与経路および剤形、ならびに有効成分および他の要因にも左右される。
【０１８７】
したがって、有効量の本発明のＲＮＡ分子（または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞）を含む医薬組成物は、固体、液体、または気体の形態であり得、とりわけ、粉末、錠剤、溶液、またはエアロゾルの形態であり得る。前記医薬組成物は、任意選択的に医薬的に許容される担体および／または希釈剤を含むことが好ましい。
【０１８８】
適切な医薬担体、賦形剤、および／または希釈剤の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。斯かる担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することが可能である。これらの医薬組成物は、適切な投与量で、つまり当業者により当該技術分野で既知の方法により容易に決定され得る「有効量」で対象に投与され得る。投薬計画は主治医および臨床学的因子によって決定されるだろう。医学分野において周知のように、任意の１人の患者への投薬量は、患者または対象のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、ならびに同時投与される他の薬物を含む多くの因子に左右される。
【０１８９】
したがって、好適には、本発明のＲＮＡ分子（または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞）は、有効量で含まれる。用語「有効量」は、医薬組成物を投与する対象において検出可能な治療応答を誘導するのに十分な量を指す。上記によれば、医薬組成物における本発明のＲＮＡ分子（または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞）の含有量は、上記のように処置に有用である限り限定されないが、好適には、全組成物に対して０．００００００１〜１０重量％を含有する。さらに、本明細書に記載のＲＮＡ分子（または、核酸分子、ベクター、または宿主細胞）は、好適には担体において利用される。概して、適切な量の医薬的に許容される塩が、組成物を等張にするために担体において使用される。担体の例としては、限定するわけではないが、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。好適には、許容される賦形剤、担体、または安定剤は、利用する投薬量および濃度で非毒性であり、クエン酸塩、リン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；塩形成対イオン、例えば、ナトリウムおよびカリウム；低分子量（＞１０アミノ酸残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、もしくはゼラチン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；ヒスチジン、グルタミン、リシン、アスパラギン、アルギニン、もしくはグリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む炭水化物；単糖類；二糖類；その他の糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、プルロニックもしくはポリエチレングリコール；メチオニン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む抗酸化剤；ならびに／または保存料、例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）が含まれる。適切な担体およびそれらの製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co.により詳細に記載されている。
【０１９０】
治療の進行は、定期的な評価によってモニタリングすることが可能である。本発明のＲＮＡ分子（もしくは核酸分子、ベクター、もしくは宿主細胞）または本発明の医薬組成物は、滅菌水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョン、ならびにクリームおよび坐剤中にあり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在してよい。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図される用途に応じて、さらなる薬剤を含み得る。前記薬剤は、例えば、商品名Ｔｗｅｅｎで市場で入手可能なポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、プロピレングリコール、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、スクロース、ならびに当業者にとって周知の、医薬組成物の意図された用途に適した他の薬剤であり得る。
【０１９１】
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者に投与するための組成物に関する。
【０１９２】
本発明の医薬組成物は、ＲＮＡベースの治療に使用され得る。上記のように、「ポリペプチドをコードするコード領域」を含む本発明のＲＮＡ分子は、ＲＮＡベースの治療に使用することができ、ここで「ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療的または予防的効果を有する治療的もしくは医薬的に活性なポリペプチドまたはタンパク質をコードする。したがって、好適な実施形態では、本発明の医薬組成物は、上記の表１に列挙した疾患の処置または予防におけるＲＮＡベースの治療に使用することができる。したがって、本発明のＲＮＡベースの治療は、上記の表１に列挙された疾患の処置または予防に使用することができる。
【０１９３】
したがって、上記の表１に記載の遺伝子欠損が、本発明のＲＮＡ分子を用いた転写物補充療法／酵素補充療法によって治療または予防できる疾患につながる場合は、本発明の医薬組成物をＲＮＡベースの治療に使用することができ、ここでＲＮＡ分子は、開示の欠損遺伝子を補うインタクトなバージョンのタンパク質またはその機能的断片をコードする「ポリペプチドのコード領域」を含む。特に好適な実施形態では、本発明の医薬組成物を、ゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ  ＶＩなどのリソソーム病および糖原病、例えば糖原病Ｉ型（フォン・ギールケ病）、ＩＩ型（ポンペ病）、ＩＩＩ型（コリ病）、ＩＶ型（アンダースン病）、Ｖ型（マッカードル病）、ＶＩ型（ハース病）、ＶＩＩ型（垂井病）、ＶＩＩ型、ＩＸ型、Ｘ型、ＸＩ型（ファンコニ・ビッケル症候群）、ＸＩ型、または０型の治療または予防におけるＲＮＡベースの治療に使用することができる。転写物補充療法／酵素補充療法は、有益なことに、根底にある遺伝子欠損に影響を与えず、患者に欠乏している酵素の濃度を高める。例として、ポンペ病では、転写物補充療法／酵素補充療法は、欠乏しているリソソーム酵素酸アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）を補充する。
【０１９４】
他の好適な実施形態では、本発明の医薬組成物を、本発明に従うＲＮＡベースの治療に使用することができ、ここで「ポリペプチドをコードするコード領域」は、治療効果または予防効果を有する治療的または医薬的に活性なポリペプチド、タンパク質またはペプチドをコードし、前記ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、表１に概説するような遺伝子によってコードされる群から選択される。
【０１９５】
他の好適な実施形態では、本発明に従うＲＮＡベースの治療は、がん、心臓血管疾患、ウイルス感染、免疫機能障害、自己免疫疾患、神経障害、遺伝性代謝障害、または遺伝病、または細胞内で生成されるタンパク質もしくはタンパク質断片が患者に有益な効果を有し得る任意の疾患の治療に使用するためのものであり得る。がんの例としては、頭頸部がん、乳がん、腎がん、膀胱がん、肺がん、前立腺がん、骨がん、脳がん、子宮頸がん、肛門がん、結腸がん、大腸がん、虫垂がん、眼がん、胃がん、白血病、リンパ腫、肝臓がん、皮膚がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、精巣がん、甲状腺がん、膣がん、外陰がん、子宮体がん、心臓腫瘍および肉腫が挙げられる。
【０１９６】
心臓血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、肺心疾患および心筋症が挙げられる。
【０１９７】
免疫不全および自己免疫疾患の例としては、限定するわけではないが、リウマチ性疾患、多発性硬化症および喘息が挙げられる。
【０１９８】
ウイルス感染の例としては、限定するわけではないが、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスならびにＢ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスによる感染が挙げられる。
【０１９９】
神経障害の例としては、限定するわけではないが、パーキンソン病、多発性硬化症、および認知症が挙げられる。
【０２００】
遺伝性代謝障害の例としては、限定するわけではないが、ゴーシェ病およびフェニルケトン尿症が挙げられる。
【０２０１】
本発明は、また、ＲＮＡベースの治療の方法にも関する。したがって、本発明は、がん、心臓血管疾患、ウイルス感染、免疫機能障害、自己免疫疾患、神経障害、遺伝性代謝障害、または遺伝病などの疾患を、ＲＮＡベースの治療で処置する方法に関する。処置方法の好適な実施形態に関しては、ＲＮＡ分子または上記で定義したＲＮＡベースの治療で使用するための医薬組成物の文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
【０２０２】
本発明において、対象は、好ましい実施形態では、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、例えばラット、マウス、およびモルモット、または霊長類、例えばゴリラ、チンパンジー、およびヒトなどの哺乳動物である。最も好適な実施形態では、対象はヒトである。
【０２０３】
上記のように、上記で定義したＲＮＡ分子は、医療機関および特定の疾患の処置、特にＲＮＡベースの治療において特に有用である。したがって、本発明は、また、本発明のＲＮＡ分子、核酸分子、ベクター、または宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。
【０２０４】
しかしながら、ＲＮＡ治療では、いくつかのステージでのＲＮＡ分子の効果を鎮めることが望ましいことがしばしばある。
【０２０５】
これは、例えば、本発明のＵＴＲ配列に対し相補的である核酸鎖を使用して、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）機構を使用することにより可能である。実際に、本発明の小サイズの最小ＵＴＲは、このＵＴＲが二次構造も三次構造も形成せず、正常細胞には存在しないことから、このアプローチは実行可能である。したがって、本発明の医薬組成物を使用した上記疾患の処置の後、または上記ＲＮＡベースの治療の後に、斯かるＵＴＲ配列の相補的鎖を医療機関において有利に使用し、それにより、本発明の治療用ＲＮＡ分子を発現停止させることができる。
【０２０６】
したがって、ＲＮＡｉ−アプローチは、また、本発明の文脈では、本発明の治療用ＲＮＡ分子の効果を鎮めるための医薬組成物の調製のために使用することも想定される。
【０２０７】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡを阻害すること」（ＲＮＡｉ／ｉＲＮＡ）は、特定のｍＲＮＡを分解のために標的し、それによりその発現を停止させるために、二本鎖ＲＮＡを使用することを説明する。好適なＲＮＡを阻害する分子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｔＲＮＡからなる群から選択され得る。遺伝子配列に適合するｄｓＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成され、細胞に導入される。ｄｓＲＮＡは、また、センス配向およびアンチセンス配向で標的遺伝子配列を発現するベクターの形態で、例えば、ヘアピンｍＲＮＡの形態で、細胞に導入され得る。センス配列およびアンチセンス配列は、また、別個のベクターより発現し得、それにより、個々のアンチセンス分子およびセンス分子が、その発現時に二本鎖ＲＮＡを形成する。いくつかの場合では、センス配向での配列の発現、または、プロモーター配列の発現さえ、ｄｓＲＮＡを生じさせ、続いて、細胞内の内在増幅機構によりｓｉＲＮＡを生じさせることが当技術分野で知られている。したがって、コード領域によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の活性の低下を引き起こす全ての手段および方法を、本発明に従って使用することができる。例えば、センス構成体、アンチセンス構成体、ヘアピン構成体、センス分子、アンチセンス分子、およびそれらの組み合わせを使用して、これらのｓｉＲＮＡを生成／導入することが可能である。ｄｓＲＮＡは、天然だが、部分的にのみ理解されている、ｄｓＲＮＡ前駆体分子を短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断する高度に保存されたヌクレアーゼダイサーを含むプロセスに供給される。ｓｉＲＮＡの生成および調製ならびに標的遺伝子の発現を阻害する方法は、とりわけ、国際公開第０２／０５５６９３号、Wei (2000) Dev. Biol. 15:239-255；La Count (2000) Biochem. Paras. 111:67-76；Baker (2000) Curr. Biol. 10:1071-1074；Svoboda (2000) Development 127:4147-4156、またはMarie (2000) Curr. Biol. 10:289-292に記載されている。これらのｓｉＲＮＡは、次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、つまり、サイレンシングトリガーに対し相同のメッセンジャーＲＮＡを破壊するマルチ複合体ヌクレアーゼの、配列特異的部分を構築する。Elbashir (2001) EMBO J. 20:6877-6888は、２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖を細胞培養において使用して、哺乳類細胞の遺伝子発現を干渉することができることを示した。ＲＮＡｉは、哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡにより非常に効率的に媒介されるが、安定した細胞株または非ヒト遺伝子導入動物の生成は限定されたことがすでに知られている。しかしながら、新しい世代のベクター、例えば、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、安定して発現させるために利用することができる。哺乳類細胞におけるｓｉＲＮＡの安定発現は、とりわけ、Brummelkamp (2002) Science 296:550-553に示されている。また、Paul (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508は、ヒト細胞における小干渉ＲＮＡの効率的な発現について述べた。哺乳類細胞における短干渉ＲＮＡおよびヘアピンＲＮＡの発現によるＲＮＡ干渉は、また、Yu (2002) PNAS 99:6047-6052により示された。遺伝子サイレンシングのためのｓｈＲＮＡアプローチは当技術分野で周知であり、ｓｔ（小分子）ＲＮＡの使用を含み得る；とりわけ、Paddison (2002) Genes Dev. 16:948-958を参照されたい。これらのアプローチは、ベクターベースであり得、例えば、ｐＳＵＰＥＲベクターまたはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩベクターを、とりわけYu (2002), loc. cit.; Miyagishi (2002), loc. cit. or Brummelkamp (2002), loc. citに例示されているように、利用することができる。本発明の制御配列は、ｐＳＵＰＥＲベクターまたはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩベクターをベースにする系と同様の方法で使用されることが想定される。
【０２０８】
ｓｉＲＮＡを推定し、構築する方法は当技術分野で既知であり、Elbashir (2002) Methods 26:199-213、ｓｉＲＮＡの商業ベンダーのインターネットウェブサイト、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ（https://www1.qiagen.com/GeneGlobe/Default.aspx）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（www.dharmacon.com）；Ｘｅｒａｇｏｎ  Ｉｎｃ.（http://www.dharmacon.com/Default.aspx)、およびＡｍｂｉｏｎ（www.ambion.com）またはＴｏｍ  Ｔｕｓｃｈｌの研究グループのウェブサイト（http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/siRNA.html）に記載されている。さらに、ｓｉＲＮＡを所与のｍＲＮＡ配列から推定するためのプログラムをオンラインで利用可能である（例えば、g. http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlまたはhttp://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/RNAi.html）。２−ｎｔ  ３´オーバーハングのウリジン残基は、活性を失うことなく２´デオキシチミジンで置換することが可能であり、これは、ＲＮＡ合成のコストを著しく低減させ、哺乳類細胞に適用する場合に、ｓｉＲＮＡ二本鎖の耐性を高め得る（Elbashir (2001) loc. cit）。ｓｉＲＮＡは、また、Ｔ７または他のＲＮＡポリメラーゼを使用して、酵素的に合成することができる（Donze (2002) Nucleic Acids Res 30:e46）。効率的なＲＮＡ干渉（ｅｓｉＲＮＡ）を媒介する短ＲＮＡ二本鎖は、また、大腸菌ＲＮａｓｅ  ＩＩＩを用いた加水分解により生成され得る（Yang (2002) PNAS 99:9942-9947）。さらに、真核細胞において、小ヘアピンＲＮＡループに連結した二本鎖ｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターが開発されている（例えば、（Brummelkamp (2002) Science 296:550-553）。これらの構成体の全てを、上記で名づけたプログラムの助けで開発することができる。さらに、配列解析プログラムに組み込まれているか、または別個に売られている、商業的に利用可能な配列予測ツール、例えば、www.oligoEngine.com（シアトル、ワシントン州）により提供されるｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌを、ｓｉＲＮＡ配列予測に使用することができる。
【０２０９】
したがって、特異的な干渉ＲＮＡを、本発明に従って、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質の発現および／または機能のアンタゴニスト／サイレンサーとして使用することが可能である。これらのｓｉＲＮＡは、相補的／アンチセンスおよびセンス鎖により形成され、これにより、アンチセンス／センス鎖は、少なくとも１０、より好適には少なくとも１２、より好適には少なくとも１４、より好適には少なくとも１６、より好適には少なくとも１８、より好適には少なくとも１９、２０、２１、または２２ヌクレオチドを好適には含む。さらにより好適な実施形態では、アンチセンス／センス鎖は、好適には、２５以上のヌクレオチドを含む。
【０２１０】
上記のように、本発明に従って使用するｓｉＲＮＡを調製する方法は、当技術分野で周知である。本発明で提供する教示に基づき、当業者は、斯かるｓｉＲＮＡを調製するだけでなく、ｓｉＲＮＡが、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能であるか否かを評価できる立場に容易に立つ。本明細書では、上記のｓｉＲＮＡは、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域とＵＴＲ分子を宿す本発明のＲＮＡ分子の分解を招き、それにより、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質のポリペプチド／タンパク質レベルは下げられると考える。
【０２１１】
したがって、本発明は、本明細書で上記したように、本発明のＵＴＲに対し相補的なＲＮＡ分子に関する。
【０２１２】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＵＧＧＣＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１と比較して１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２１３】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＵＧＧＣＮＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２１４】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２１５】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＵＧＧＣＮＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドであるが、Ａがより好適である、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２１６】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＣＧＧＣＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５と比較し、１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２１７】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＣＧＧＣＮＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２１８】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＣＧＧＣＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２１９】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＣＧＧＣＮＧＵＣＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドであるが、Ａがより好適である、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２２０】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＵＧＧＣＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２２１】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＵＧＧＣＮＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２２２】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２２３】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＵＧＧＣＮＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドであるが、Ａがより好適である、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２２４】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＣＧＧＣＧＵＣＣＣ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２２５】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＣＧＧＣＮＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２２６】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＣＧＧＣＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２２７】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＣＧＧＣＮＧＵＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドであるが、Ａがより好適である、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２２８】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＵＧＧＣＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２２９】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＵＧＧＣＮＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２３０】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＵＧＧＣＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２３１】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＵＧＧＣＮＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドであるが、Ａがより好適である、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２３２】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＣＧＧＣＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２３３】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＧＧＣＧＧＣＮＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２３４】
好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＣＧＧＣＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３と比較し１〜４個の置換を示す配列を含む。
【０２３５】
別の好適な実施形態では、本発明のＵＴＲに対し相補的な前記ＲＮＡ分子は、配列ＣＡＵＣＵＣＧＧＣＮＧＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の位置１０のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドであるが、Ａがより好適である、配列か、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４と比較し１〜４個の置換を示す配列を含み、これは、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質をアンタゴナイズする／干渉する／発現停止させることが可能である。
【０２３６】
別の好適な実施形態では、本発明は、開始コドンに対し相補的なトリプレットを超えて伸長する５´末端に追加のヌクレオチドを宿し、本発明のＲＮＡ分子のコード領域にコードされる所望のポリペプチドまたはタンパク質の配列に対し相補的である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜３４からなる群から選択されるＲＮＡ分子に関する。好適には、本発明のＵＴＲ配列に対し相補的な上記配列を含む相補配列（つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜３４からなる群から選択されるＲＮＡ分子）は、好適には、少なくとも１５、より好適には少なくとも１６、より好適には少なくとも１７、より好適には少なくとも１８、より好適には少なくとも１９、より好適には少なくとも２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドを含む。さらにより好適な実施形態では、これらの配列は、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。相補配列の特異性を高めることにより不所望の副作用を防ぐために、５´末端の長さを伸ばすことが望ましい場合がある。
【０２３７】
別の好適な実施形態では、本発明は、上記のＲＮＡ分子の何れかだけでなく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜３４からなる群から選択され、上記のＲＮＡ分子に対し最大で５％、１０％、２０％、または３０％のミスマッチを含む、ＲＮＡ分子にも関する。さらに、ＲＮＡ分子は、本明細書で上記したように化学的に修飾され得る。
【０２３８】
本発明は、また、本発明のＤＮＡ分子、本発明のＲＮＡ分子、本発明の核酸分子、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞を含むキットにも関する。好適な実施形態に関しては、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、核酸分子、ベクター、または宿主細胞の文脈において上で述べたのと同じものが準用される。有利なことに、本発明のキットは、さらに、任意選択的に、上記および以下の使用および方法の実行に必要な緩衝液、保存液、および／または残りの試薬もしくは物質を含む。さらに、本発明のキットの一部は、バイアルもしくはボトルにおいて個別に、または、容器もしくはマルチコンテナユニット中で組み合わせて、パッケージ化することが可能である。本発明のキットは、とりわけ、本発明の方法の実行または本発明のＲＮＡ分子の調製に有利に使用され得、本明細書で言及する種々の応用において、例えば、上記および以下で概説する用途において利用することが可能である。キットに含まれ得る別の構成要素は、キットの使用者に向けられた、キットの使用についての指示書である。キットの製造は、好適には、当業者に既知である標準的な手順に従う。
【０２３９】
本発明は、また、ＲＮＡ分子のコード領域を、前記コード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質に翻訳するために、本明細書で上記したＵＴＲを使用することにも関する。
【０２４０】
より好適な実施形態では、本発明は、また、ＲＮＡ分子のコード領域を、前記コーディングにコードされたポリペプチドまたはタンパク質に翻訳する効率を高めるために、本明細書で上記したＵＴＲを使用することにも関する。
【０２４１】
使用についての好適な実施形態に関しては、本発明のＲＮＡ分子の文脈において上で述べたのと同じものが準用される。
【０２４２】
好適な実施形態では、本発明は、以下の項目１〜２０により特徴付けられる次のものに関する：
【０２４３】
１．ｍＲＮＡに転写され得るＤＮＡ分子であって、以下のエレメント：
（ａ）その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と；
（ｂ）前記コード配列のすぐ上流にある、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択される配列とを有する一本の鎖を含むか；または相補鎖を含み、
（ｂ１）は、Ｒ１−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１)か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列であり；
（ｂ２）は、Ｒ１−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＴ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡから成る群から選択されるヌクレオチドである、配列か；または、
前記配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列であり、
Ｒ１は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである、ＤＮＡ分子。
【０２４４】
２．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される前記プロモーターが：
（ｉ）ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と比較して１〜６個の置換を示し、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列；
（ｉｉ）ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４と比較し１〜６個の置換を示し、Ｔ３ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列；
（ｉｉｉ）ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と比較して１〜６個の置換を示し、ＳＰ６ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列；および、
（ｉｖ）ＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６と比較して１〜６個の置換を示し、Ｋ１１ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列からなる群から選択される、項目１に記載のＤＮＡ分子。
【０２４５】
３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＴ、Ｇ、またはＣからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮはＡではない、項目１または２に記載のＤＮＡ分子。
【０２４６】
４．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮがＴである、項目３に記載のＤＮＡ分子。
【０２４７】
５．項目４のＤＮＡ分子を含むベクター。
【０２４８】
６．項目５のベクターを含む、宿主細胞。
【０２４９】
７．項目１〜４の何れか一つに記載のＤＮＡ分子、項目５に記載のベクター、または項目６に記載の宿主細胞を含む、組成物。
【０２５０】
８．（ａ）その５´末端に開始コドンを含み、ポリペプチドをコードするコード領域と；
（ｂ）前記コード配列のすぐ上流にある、以下の（ｂ１）および（ｂ２）からなる群から選択されるＵＴＲとを含むＲＮＡ分子であって、
（ｂ１）は、配列Ｒ２−ＣＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＵＴＲか、または前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置６のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置７のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置５のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり；
（ｂ２）は、配列Ｒ２−ＣＮＧＣＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、Ｃ、もしくはＡからなる群から選択されるヌクレオチドである配列のＵＴＲか、または前記ＵＴＲ配列において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置７のＣがＡに置換され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置８のＣがＧに置換され；および／もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置６のＡがＧに置換されている配列のＵＴＲであり、
Ｒ２は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成を開始するヌクレオチドで始まるプロモーター領域の一部に相当するＲＮＡ配列である、ＲＮＡ分子。
【０２５１】
９．Ｒ２は、
（ｉ）ＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
（ｉｉ）ＧＧＧＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；
（ｉｉｉ）ＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；および
（ｉｖ）ＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）からなる群から選択される、項目８に記載のＲＮＡ分子。
【０２５２】
１０．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２のヌクレオチドＮがＵ、Ｇ、またはＣからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ヌクレオチドＮはＡではない、項目８または９に記載のＲＮＡ分子。
【０２５３】
１１．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の位置２の前記ヌクレオチドＮがＵである、項目１０に記載のＲＮＡ分子。
【０２５４】
１２．３´末端にポリＡテールを含む、項目８〜１１の何れか一つに記載のＲＮＡ分子。
【０２５５】
１３．前記ポリＡテールの長さは少なくとも１２０ヌクレオチドである、項目８〜１２の何れか一つに記載のＲＮＡ分子。
【０２５６】
１４．項目８〜１３の何れか一つのＲＮＡ分子をコードする核酸分子。
【０２５７】
１５．項目１４の核酸分子を含むベクター。
【０２５８】
１６．項目１５のベクターを含む宿主細胞。
【０２５９】
１７．項目８〜１３の何れか一つに記載のＲＮＡ分子、項目１４に記載の核酸分子、項目１５に記載のベクター、または項目１６に記載の宿主細胞と、任意選択的に医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【０２６０】
１８．ＲＮＡベースの治療で使用される、項目１７の医薬組成物。
【０２６１】
１９．項目１〜４の何れか一つに記載のＤＮＡ分子、項目８〜１３の何れか一つに記載のＲＮＡ分子、項目１４に記載の核酸分子、項目５もしくは１５に記載のベクター、または、項目６もしくは１６に記載の宿主細胞を含む、キット。
【０２６２】
２０．ＲＮＡ分子のコード領域を、前記コード領域にコードされたポリペプチドまたはタンパク質に翻訳するための、項目８（ｂ）で定義したＵＴＲの使用。
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】本発明で使用する個々のルシフェラーゼレポーター構成体の名前と共に、「最小ＵＴＲ」配列を宿す配列を示す図である。配列は、Ｔ７プロモーターと、開始コドンＡＴＧが続くコザックエレメントの一部を宿す。ＴＡＴＡ配列と後続の６塩基（ＧＧＧＡＧＡ）を含む最初の１０塩基は、Ｔ７プロモーターに由来する配列である一方、開始コドンＡＴＧの上流の残りの塩基は、コザックエレメントに属する（ＧＣＣＡＣＣ）。「Ｓｐ３０」は、３０ヌクレオチドのランダム配列である。配列番号９で下線を引いた配列は、長さが３０ヌクレオチドであるヒトαグロビン（「ｈＡｇ」）に由来する５´ＵＴＲ配列である。図１に示す配列１〜９は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７〜４５に対応する。
【図２Ａ】「最小ＵＴＲ」中の余分な「Ｃ」が必須であることを示す図である（図１の配列番号１および番号２）。ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）およびヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、それぞれ、２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体（図１の配列１および２）をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した。ルシフェラーゼの発現を遺伝子導入の２４時間後に測定した。値は３反復の平均±ＳＤ２を表し、該値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。Ａ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞の両方において、Ｃの除去は、より低い発現をもたらした。そのため、この余分なＣを、全てのさらなる構成体の設計に含めた。
【図２Ｂ】「最小ＵＴＲ」中の余分な「Ｃ」が必須であることを示す図である（図１の配列番号１および番号２）。ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）およびヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、それぞれ、２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体（図１の配列１および２）をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した。ルシフェラーゼの発現を遺伝子導入の２４時間後に測定した。値は３反復の平均±ＳＤ２を表し、該値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。Ａ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞の両方において、Ｃの除去は、より低い発現をもたらした。そのため、この余分なＣを、全てのさらなる構成体の設計に含めた。
【図３】示すような個々のヌクレオチドの影響を示し、Ａ５４９遺伝子導入細胞における、余分な「Ｃ」とコザックエレメントの間の距離の影響を実証する図である。材料および方法で記載するように、細胞に遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを実行した。より多い用量が線形範囲を外れたため、６２．５ｎｇ／ウェルまでの用量反応のみをここでは提示する。ヒトαグロビンに由来する５´ＵＴＲを、正の対照として使用した。図１の配列３−８それぞれを宿すＳＮＩＭ  ＲＮＡ分子を用いた遺伝子導入実験を実行した。ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）を、９６ウェルプレートに、２０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体（図１の配列番号３−８）をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した。ルシフェラーゼの発現を遺伝子導入の２４時間後に測定した。値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。値は３反復の平均±ＳＤを表す。肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）では、Ｃとコザックエレメントの間への余分な「Ａ」の挿入（図１の配列番号３）は、著しく低い発現をもたらした（図３）。Ｃとコザックエレメントの間への単一「Ｔ」の挿入（図１の配列番号４）は、正の対照として使用したヒトαグロビンの５´ＵＴＲで達成されるとの同等の発現レベルをもたらした。
【図４】示すような個々のヌクレオチドの影響を示し、ＨｅｐＧ２遺伝子導入細胞における、余分な「Ｃ」とコザックエレメントの間の距離の影響を実証する図である。材料および方法で記載するように、細胞に遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを実行した。より多い用量が線形範囲を外れたため、６２．５ｎｇ／ウェルまでの用量反応のみをここでは提示する。図１の配列番号３−８を用いた遺伝子導入実験を実行した。肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体（図１の配列番号３−８）をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した。ルシフェラーゼの発現を遺伝子導入の２４時間後に測定した。値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。値は３反復の平均±ＳＤを表す。両細胞株（Ａ５４９細胞（図３）およびＨｅｐＧ２（図４））において、Ｃとコザックエレメントの間への余分な「Ａ」の挿入（図１の配列番号３）は、著しく低い発現をもたらした（図３および４）。両細胞タイプにおいて、Ｃとコザックエレメントの間への単一「Ｔ」の挿入（図１の配列番号４）は、正の対照として使用したヒトαグロビンの５´ＵＴＲで達成されるとの同等の発現レベルをもたらした。ＨｅｐＧ２細胞では、配列番号１（図１）も、同等に効果的だった。
【図５】Ａ５４９細胞における、ルシフェラーゼの発現に対するＴＩＳＵエレメントの影響を示す図である。詳細な用量反応と曲線の当てはめを、構成体をコードする選択したルシフェラーゼについて実行した。図２〜４のこれまでのデータに基づき、ＴＩＳＵエレメントを、２つの所望の特質を含有する配列４（図１）の組み合わせに持ち込んだ：（図１の配列番号９を達成するためのＴ７プロモーターとコザックエレメントの間にＣおよび、Ｃとコザックエレメントの間に余分なＴ）。ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）（図５ＡおよびＢ）ならびにヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）（図５ＣおよびＤ）を、９６ウェルプレートに、それぞれ、２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した。ルシフェラーゼの発現を、遺伝子導入の２４時間後と４８時間後に測定した（図５Ｅ）。値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。示すように、Ａ４５９（Ａ、Ｂ）およびＨｅｐＧ２（Ｃ、Ｄ）細胞に、ｍＲＮＡをコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入。ルシフェラーゼの活性を、遺伝子導入の２４時間後（Ａ，Ｃ）および４８時間後（Ｂ，Ｄ）に測定した。値は３反復の平均±ＳＤを表す。両細胞株において、両測定時点で、ＴＩＳＵエレメントを含有するルシフェラーゼ構成体で著しくより高い発現が得られた（図５Ａ〜Ｄ）。
【図６】Ａ５４９細胞（図６Ａ）およびＨｅｐＧ２細胞（図６Ｂ）における、ルシフェラーゼの発現に対するＴＩＳＵエレメントの影響を示す図である。ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）およびヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、それぞれ、２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した（Ｘ軸は、９６ウェルプレートのウェル毎のＳＮＩＭ  ＲＮＡのｎｇ量を示す）。ルシフェラーゼの発現を遺伝子導入の２４時間後に測定した。値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。示すように、Ａ４５９（Ａ）およびＨｅｐＧ２（Ｂ）に、ｍＲＮＡをコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入。
【図７】ｍＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを用いた、マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を示す図である。図７に示すルシフェラーゼ構成体（各ＵＴＲ配列エレメントについては図１を参照）について、Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、６−８週）においてｉｎ  ｖｉｖｏでテストした。この実験セットでは、導入遺伝子の発現を高めることが示されている追加のＵＴＲエレメント（国際公開第２０１２／１７０９３０Ａ１号）も、その有効性についてテストした。このＵＴＲエレメントを含有するルシフェラーゼ構成体は、Ｌｕｃ２−ＳＵＳＡと呼ばれている。２０μｇの各ＳＮＩＭ−ＲＮＡをＬＦ−４４と組み合わせ、Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像化を、ＩＶＩＳ撮像系を利用して注射の６時間後に実行し、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして定量化した値をプロットした。全動物画像化の結果を図７Ａに示し、全臓器を画像化した結果を図７Ｂ（肝臓）、７Ｃ（肺）、７Ｄ（脾臓）それぞれに示す。動物から取った臓器を液体窒素で凍らせ、ホモジナイズした。細胞をＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶解バッファーに溶解し、ルシフェラーゼの活性を測定した。結果を図７Ｅ（肝臓）、７Ｆ（肺）、７Ｇ（脾臓）それぞれに示す。ＴＩＳＵエレメントの挿入は、以前公開された５´および３´ＵＴＲ（国際公開第２０１２／１７０９３０Ａ１号）と比較し、より高い発現をもたらした。Ｃとコザックの間への単一のＴの追加（図１の配列番号４）は、ヒトαグロビンＵＴＲ（図１の配列番号８）で観察されるのと同等の発現レベルをもたらす。ＴＩＳＵエレメントの配列番号４（図１）への追加は、さらに、発現を増大させた（図１の配列番号９）。驚くべきことに、ヒトαグロビンＵＴＲの影響は、配列特異的であるとはいえないことが分かった。ランダムな３０ヌクレオチド配列が、ヒトαグロビン５´ＵＴＲと同様の発現レベルを支持した。細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果およびマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験に基づき、配列番号１、４、７、および９（図１）が、転写物療法用に、「最小ＵＴＲ」を宿す配列の期待の持てる候補として提案される。これらの最小ＵＴＲ配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写時のＲＮＡ生成量に対し悪い影響を与えず、結果として生じるｍＲＮＡは、従来の技術水準のＵＴＲを含有するｍＲＮＡと比較し、さらにより効率的に翻訳される。
【図８】ｍＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを有するマウスの、白血球数（ＷＢＣ）（図８Ａ）、赤血球（ＲＢＣ）（図８Ｂ）、血小板（図８Ｃ）、ヘモグロビン（図８Ｄ）、およびヘマトクリット（図８Ｅ）の値を示す図である。実験を、基本的には、図７に記載するように行い、血液パラメータをＳｙｓｍｅｘ  ＫＸ−２１Ｎ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（イリノイ州、ＵＳＡ）を利用することにより解析した。
【図９】非常に高いＥＰＯ発現を支持することが知られている（国際公開第２０１２／１７０９３０Ａ１号：図１および２）の５´および３´ＵＴＲ（ＳＵＳＡ  ＵＴＲ）を含有するｍＲＮＡをコードするヒトＥＰＯと比較した、ｍＲＮＡをコードするヒトＥＰＯを含有するＴＩＳＵエレメントを用いた発現実験を示す図である。ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）およびヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、それぞれ、２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるＥＰＯを２５０ｎｇ遺伝子導入した。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州、ＵＳＡ）のＨｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＩＶＤ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）により遺伝子導入の２４時間後にＥＰＯ量を定量化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。値は３反復の平均±ＳＤを表す。
【図１０】ヒトＯＴＣを用いた発現実験を示す図である。ヒトＯＴＣについて、ｍＲＮＡをコードするｈＯＴＣを含有するＴＩＳＵエレメントからの発現を、これまでに知られている他の全ての組み合わせと比較し最も高い発現を生成することが知られている５´ヒトαグロビンＵＴＲを含有するｍＲＮＡをコードするｈＯＴＣからの発現と比較した。ヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を９６ウェルプレートに播種し、播種して２４時間後に、細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるｈＯＴＣを遺伝子導入した。遺伝子導入の２４時間後に、細胞を溶解し、ウェスタンブロットを使用してＯＴＣ量を定量化した。ＳＮＩＭ  ＲＮＡをコードするｈＯＴＣを含有する、ｈＡｇとＴＩＳＵエレメントの両方が、同様のレベルのｈＯＴＣ発現をもたらした（図１０Ａ）。ビンキュリンをハウスキーパーとして使用し、帯強度を定量化し、定量化内部標準として使用した（図１０Ｂ）。
【図１１】配列７に存在するランダムな３０ヌクレオチド長のスペーサ（左）と、配列８に存在するヒトαグロビンの５´ＵＴＲ（右）の予想第２構造を示す図である。
【０２６４】
本発明の他の態様および利点を以下の例で記載するが、これは例示のために提供するものであり、限定のためではない。本出願で言及する各刊行物、特許、特許出願、または他の文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２６５】
Ｉ．物質および方法
プラスミドベクター
各５´ＵＴＲ配列をコドン最適化ルシフェラーゼ配列と共にＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔＧ（ニュージャージー州、ＵＳＡ）により合成し、ｐＵＣ５７−Ｋａｎ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）においてクローン化した。ＥＰＯ（コドン最適化ヒトエリスロポエチン）およびＯＴＣ（コドン最適化ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ）の場合、コード配列ルシフェラーゼ遺伝子を、ＥＰＯ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）とＯＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）の遺伝子それぞれのコード配列と置き換えた。構成体において使用するＵＴＲ配列は、各ルシフェラーゼレポーター構成体の名前と共に図１に示す。
【０２６６】
ｍＲＮＡ生成
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡ（ＩＶＴ  ｍＲＮＡ）を生成するために、プラスミドをＢｓｔＢＩ消化により直線化し、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した。精製した直鎖状プラスミドをＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ，ドイツ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として使用した。アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を反応混合物に加えて、５´キャップ化ｍＲＮＡを生成し、ｍＲＮＡをポリアデニル化して（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３´ポリＡテールを生成した。
【０２６７】
加えて、ＳＮＩＭ  ｍＲＮＡの生成については、化学修飾したヌクレオチド、すなわち、メチル−ＣＴＰおよびチオ−ＵＴＰ（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ドイツ）を、ＡＴＰ：ＣＴＰ：ＵＴＰ：メチル−ＣＴＰ：チオ−ＵＴＰ：ＧＴＰが７．５７ｍＭ：５．６８ｍＭ：５．６８ｍＭ：１．８９ｍＭ：１．８９ｍＭ：１．２１ｍＭという最終濃度に加えた。完全ＩＶＴ混合物を３７℃で２時間インキュベーションし、続いて、３７℃で２０分間、ＤＮａｓｅｌでＤＮＡを消化した。ＲＮＡを酢酸アンモニウムで沈殿させ（最終濃度２．５Ｍ）、７０％ＥｔＯＨで洗浄した。洗浄ステップを２回実行した。最終的に、ＲＮＡペレットをＲＮＡｓｅフリー水に再懸濁した。全てのｍＲＮＡを１％アガロースゲル上で検証した。転写ＲＮＡは、ウリジン残基の約２５％が２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）でありシチジン残基の約２５％が５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）であるという点で化学修飾されている。ＵＴＲの配列は図１で提供する。
【０２６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入
ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）およびヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、それぞれ２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、商業的な遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を、１μｇのｍＲＮＡにつき２．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００という比率で使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した（図２−６のＸ軸は、９６ウェルプレートのウェル毎のＳＮＩＭ  ＲＮＡのｎｇ量を示す）。複合体形成を、以下のように準備した：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００とｍＲＮＡを別々にＯｐｔｉＭＥＭ遺伝子導入媒体で希釈し、それぞれ、４５μＬの総体積となるまで加えた。これらの混合物を室温で５分間インキュベーションした。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００溶液をｍＲＮＡ溶液と混ぜ、次に、室温でもう２０分間インキュベーションした。遺伝子導入総体積９０μＬにおいて、細胞を３７℃（５％ＣＯ２レベル）で１時間インキュベーションした。その後、遺伝子導入培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。続いて、細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地を用いて再度インキュベーションした。
【０２６９】
細胞培養
ヒト肺胞腺がん細胞株（Ａ５４９，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）を、１０％ＦＢＳを補充したＨａｍ  Ｆ１２Ｋ培地で増殖させた。ヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２，ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地で培養した。全ての細胞株を、５％ＣＯ２レベルの加湿雰囲気において増殖させた。
【０２７０】
バイオルミネセンス測定
ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）が共通のレポータータンパク質であり、これは、哺乳動物には内因的に存在せず、発光画像法により容易に検出することが可能である。ルシフェラーゼは、バイオルミネセンス発光を生じさせるルシフェリンと酸素の反応を触媒する。
【０２７１】
ヒト肺胞上皮性細胞株（Ａ５４９）およびヒト肝細胞がん細胞株（ＨｅｐＧ２）を、９６ウェルプレートに、それぞれ、２０，０００細胞／ウェルおよび４０，０００細胞／ウェルという密度で播種した。播種して２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を使用して、細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを遺伝子導入した（Ｘ軸は、９６ウェルプレートのウェル毎のＳＮＩＭ  ＲＮＡのｎｇ量を示す）。バイオルミネセンスを遺伝子導入の２４時間後に測定した。値を遺伝子導入量に対しプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによりデータ解析した。
【０２７２】
ホモジナイズした組織可溶化物におけるルシフェラーゼ発現を定量化するため、臓器を動物から採取し、液体窒素で凍らせ、ホモジナイズし、細胞を溶解バッファー（０．１％Ｔｒｉｔｒｏｎ−Ｘ１００を有する２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）に溶解した。
【０２７３】
動物
６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ，Ｒｏｕｔｅ  Ｄｅｓ  Ｃｈｅｎｅｓ  ＳｅｃｓＢＰ５，Ｆ−５３９４０  Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓｔ．Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅより得て、特定病原体除去条件下で維持した。実験前に少なくとも７日間、マウスを動物施設の環境に順応させた。全ての動物手順が地方の倫理員会により承認および制御され、ドイツの動物生態保護法のガイドラインに従って実行された。
【０２７４】
リピドイド製剤
リピドイドを以下のようにｍＲＮＡと共に製剤化した：Ｃ１２−（２−３−２）、ＤＯＰＥ、Ｃｈｏｌ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（３．６：０．１８：０．７６：１重量比）をエタノールに溶解し、１０．５という脂質／ｍＲＮＡ重量比でホタルルシフェラーゼをコードする化学修飾したｍＲＮＡを含む、クエン酸緩衝液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ＝４．５）に速やかに注入して、２０％という最終エタノール濃度を得て、水に対し透析を行った。結果として生じるリピドイド／ｍＲＮＡ複合体は、正に帯電したナノ粒子（９２．６±０．７ｎｍ；２１．０±０．２ｍＶ）をもたらし、これを、拘束したマウスの尾静脈に静脈内注射した。第２実験では、静脈内注射の前にリピドイド／ｍＲＮＡ複合体をＰＢＳに適合させたが、これはほぼ帯電していないナノ粒子（９１．５±０．６ｎｍ；−０．７±０．２ｍＶ）をもたらした。
【０２７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンス画像化を使用した、マウスにおけるＬｕｃ活性の測定
投与して２４時間後に、マウスをメデトミジン（１１．５μｇ／ｋｇ  ＢＷ）、ミダゾラム（１１５μｇ／ｋｇ  ＢＷ）、およびフェンタニル（１．１５μｇ／ｋｇ  ＢＷ）の腹腔内注射により麻酔した。Ｄ−ルシフェリン基質（マウスにつき３ｍｇ／１００μＬＰＢＳ）を、静脈内注射により適用した。１０分後に、ＩＶＩＳ  １００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ，アラメダ，ＵＳＡ）とカメラ設定：Ｂｉｎ（ＨＳ）、視野１０、ｆ１  ｆ−ｓｔｏｐ、高分解能ビニング、および５分の露出時間を使用して、バイオルミネセンスを測定した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５０（Ｘｅｎｏｇｅｎ，アラメダ，ＵＳＡ）を使用して、シグナルを定量化し、解析した。
【０２７６】
ＯＴＣタンパク質についてのウェスタンブロット解析
凍ったプレートを解凍し、プレートにおいて直接的な細胞溶解を実行した。プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡフリー，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ドイツ）およびＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液（２５００Ｕ／ｍＬ），（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を補完した溶解バッファー（２５ｍＭＴＲＩＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）を使用して、タンパク質を溶解した。溶解後に、サンプルをＮｕＰａｇｅ（登録商標）ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  ＢｕｆｆｅｒおよびＳａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）と混ぜ、７０℃で１０分間加熱した。ＮｕＰＡＧＥ  １０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌの上で、ＸＣｅｌｌ４  ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）Ｍｉｄｉ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、ゲル電気泳動を１５μＬの可溶化物を使用して実行した。ＴｒａｎｓＢｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ，ドイツ）を３０分間使用して、タンパク質を転移させた。転移後、膜を３０分間ＮＥＴ−ゼラチンで保護してから、該膜を一晩４℃で一次抗体と共にインキュベーションし、ＮＥＴ−ゼラチン１：２０００（ＯＴＣポリクローナル抗体（Ｃｅｎｔｅｒ），ＡＰ６９２８ｃ−ＡＢ  Ｂｉｏｃａｔ，ドイツ）に希釈した。ＮＥＴ−ゼラチンを用いた３回の洗浄ステップの後、ＮＥＴ−ゼラチンに１:１０，０００で希釈した、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合第２抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ，ｓｃ−２００４，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を室温で一時間加えた。膜を再び、ＮＥＴ−ゼラチンを用いて、シグナルが化学発光基質キット（Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ基質，Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ドイツ）で可視化され、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ，ドイツ）で可視化されるまで、３回洗浄した。
【０２７７】
物質
ＦＢＳ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００、およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ドイツから購入した。無菌ＰＢＳは社内で用意した。Ｈａｍ  Ｆ−１２Ｋ、ＤＭＥＭ、およびトリプシン−ＥＤＴＡをｃ．ｃ．ｐｒｏ  ＧｍｂＨ，ドイツより購入した。
【０２７８】
ＩＩ．結果
ＩＩ．ａ細胞培養実験
【０２７９】
図２ＡおよびＢは、Ｔ７プロモーターとコザックエレメントの間の余分な「Ｃ」が必須であることを示す。その塩基を除去すると、比較する細胞タイプの両方において、発現が低減する。両構成体（図１の配列番号１および２）では、全用量範囲および直線範囲（除外する値：６２．５ｎｇ／ウェルより多い用量は分析から除いた）を、比較の便宜上、別個に提示する。Ａ５４９細胞およびＨｅｐＧ２細胞の両方において、Ｃの除去は、より低い発現をもたらした。そのため、この余分なＣを、全てのさらなる構成体の設計に含めた。
【０２８０】
Ａ５４９およびＨｅｐＧ２細胞で得られた結果に基づき、さらなる実験を、余分な「Ｃ」を含有する構成体を用いて行った（配列番号１：Ｔ７Ｌｕｃ２）。
【０２８１】
図３および図４
配列１を鋳型として使用し、この配列に対し、何れかの単一ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣ：それぞれ図１の配列番号３−６）、または、３０ヌクレオチド長で任意の予想可能な第２構造を欠いたランダム配列（配列７）、またはヒトαグロビン由来の５´ＵＴＲ（配列８）を、調査する「Ｃ」およびコザック配列の間に組み込んだ。
【０２８２】
材料および方法で記載するように、細胞に遺伝子導入し、ルシフェラーゼアッセイを実行した。より多い用量は線形範囲を外れたため、６２．５ｎｇ／ウェルまでの用量反応のみをここでは提示する。ヒトαグロビンに由来する５´ＵＴＲを、正の対照として使用した。
【０２８３】
上記の結果を要約すると、図１〜４は、Ｔ７プロモーターとコザックエレメントの間の余分な「Ｃ」は、最小主義的な５´ＵＴＲを利用することにより高いタンパク質発現を達成することに関し、必須であることを示す。ヌクレオチドを除去することは、発現の低下をもたらす。余分な「Ｃ」とコザックエレメントの間に余分な「Ａ」を追加することは、発現に対し悪い影響を与える。ピリミジン塩基と、最も好適には「Ｔ」をその位置に加えると、ｈＡｇに由来する５´ＵＴＲで観察されるのと同等のレベルが得られる。
【０２８４】
続いて、追加の実験を実行して：
−最良に機能する配列（配列９）と組み合わせた場合のＴＩＳＵの影響を解明し、
−ｈＡｇ由来の５´ＵＴＲの影響が、細胞特異的な影響であるか、または、５´キャップと開始コドンの間の距離が重要であるか否かを決定する。
【０２８５】
図５は、Ａ５４９細胞におけるルシフェラーゼの発現に対するＴＩＳＵエレメントの影響を示す。「ＴＩＳＵエレメント」には、図１に示す配列番号４と比較して、図１の配列番号９の「ＣＣ」の代わりに、「ＡＧ」が組み込まれている。Ａ５４９細胞（図５ＡおよびＢ）ならびにＨｅｐＧ２細胞（図５ＣおよびＤ）は、遺伝子導入の２４時間後（Ａ，Ｃ）および４８時間後（Ｂ，Ｄ）に、配列番号１の「Ｃ」と、この「Ｃ」とコザックエレメントの間に追加の「Ｔ」を有するＴＩＳＵエレメントを含有するルシフェラーゼで、著しくより高いルシフェラーゼ発現を示した。
【０２８６】
図６は、図５と同じだが、３０ヌクレオチドランダム配列を含有する５´ＵＴＲが追加されており、ヒトαグロビンＵＴＲ（図１の配列８）を、同じ長さのランダム配列（図１の配列７）と並べて比較することを可能にした実験の結果を示す。ルシフェラーゼ発現を、示すように、ＳＮＩＭ  ＲＮＡで遺伝子導入した２４時間後に、ＨｅｐＧ２（図６Ａ）およびＡ５４９細胞（図６Ｂ）において測定した。
【０２８７】
図９は、Ａ５４９およびＨｅｐＧ２細胞にそれぞれＳＮＩＭ  ＲＮＡを遺伝子導入した後、標準として使用した国際公開第２０１２／１７０９３０Ａ１号：図１および２）の５´および３´ＵＴＲ（ＳＵＳＡ  ＵＴＲ）を含有するｍＲＮＡをコードするｈＥＰＯと比較した、ｍＲＮＡをコードするｈＥＰＯを含有するＴＩＳＵエレメントを用いた発現実験の結果を示す。ＥＰＯ量を、ＥＬＩＳＡにより、遺伝子導入の２４時間後に定量化した。値は３反復の平均±ＳＤを表す。
【０２８８】
ヒトＡ５４９細胞では、ＴＩＳＵエレメントの組み込みは、５´および３´ＵＴＲの組み込みで達成されるものと比較し、より高い発現をもたらした（図９Ａ）。同等の発現レベルがＨｅｐＧ２細胞でも観察された（図９Ｂ）。これは、特に、ＳＵＳＡ５´および３´ＵＴＲの組み込みが、本発明のＵＴＲと比較し、ＲＮＡを約２００ヌクレオチド長くすることから、驚くべきである。
【０２８９】
図１０は、ヒトＯＴＣを用いた発現実験を示す図である。比較のために、ｍＲＮＡをコードするｈＯＴＣを含有するＴＩＳＵエレメントを、これまでに知られている他の全ての組み合わせと比較し、最も高い発現を生成することが知られている５´ヒトαグロビンＵＴＲを含有するｍＲＮＡをコードするｈＯＴＣからのそれと比較した。
【０２９０】
ＨｅｐＧ２細胞に、ＳＮＩＭ  ＲＮＡ構成体をコードする異なるｈＴＯＣを遺伝子導入し、２４時間後に溶解し、ウェスタンブロッティングによりＯＴＣ量を定量化した。
【０２９１】
ＳＮＩＭ  ＲＮＡをコードするｈＯＴＣを含有する、ｈＡｇとＴＩＳＵエレメントの両方が、同様のレベルのｈＯＴＣ発現をもたらした（図１０Ａ）。ビンキュリンをハウスキーパーとして使用し、帯強度を濃度測定を使用して比較した（図１０Ｂ）。
【０２９２】
ＩＩ．ｂマウスにおけるＬｕｃ２構成体のＩＶ適用
結果を図７および図８に示す。
【０２９３】
以下の構成体をマウスにおけるＩＶ適用に使用した：
Ｌｕｃ２（＋８＋Ａ）
Ｌｕｃ２（＋８＋Ｔ）
Ｌｕｃ２（＋８＋Ｔ）＋ＴＩＳＵ
Ｌｕｃ２−ｈＡｇ
Ｌｕｃ２−Ｓｐ３０
Ｌｕｃ２−ＳＵＳＡ  ＵＴＲ
【０２９４】
２０μｇの各ＳＮＩＭ−ＲＮＡを、ＬＦ−４４と組み合わせ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＩＶ注射した。追加の対照として、５´末端でヒトＣＭＶエンハンサーと隣接し、３´末端でヒト成長ホルモン３´ＵＴＲと隣接しているＬｕｃ２配列（Ｌｕｃ２−ＳＵＳＡ）も、生成した。この構成体においてＵＴＲとして使用される配列は、Ｓｈｉｒｅの特許（国際公開第２０１２／１７０９３０Ａ１号：配列ＩＤ１／図１）から取った。
【０２９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を、ＩＶＩＳ撮像系を利用して注射の６時間後に実行し、光子／秒／ｃｍ２／ｓｒとして定量化した値をプロットした。全動物画像化の結果を図７Ａに示し、全臓器を画像化した結果を図７Ｂ（肝臓）、７Ｃ（肺）、７Ｄ（脾臓）にそれぞれ示す。
【０２９６】
動物から取った臓器を液体窒素で凍らせ、ホモジナイズし、溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図７Ｅ（肝臓）、７Ｆ（肺）、７Ｇ（脾臓）それぞれに示す。
【０２９７】
動物の血液パラメータを、Ｓｙｓｍｅｘ  ＫＸ−２１Ｎ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを利用することにより解析した：ｍＲＮＡ構成体をコードする異なるルシフェラーゼを有するマウスの白血球数（ＷＢＣ）（図８Ａ）、赤血球（ＲＢＣ）（図８Ｂ）、血小板（図８Ｃ）、ヘモグロビン（図８Ｄ）、ヘマトクリット（図８Ｅ）の値 は、有意な差を示さなかった。
【０２９８】
図１１：配列７に存在するランダムな３０ヌクレオチド長のスペーサ（左）と、配列８に存在する同じ長さのヒトαグロビンの５´ＵＴＲ（右）の予想第２構造。両配列の第２構造は似てすらないが、似た発現レベルを生成し（図６Ａおよび６Ｂ）、これは両方とも、Ｔ７Ｌｕｃ２（＋８＋Ｔ）−ＴＩＳＵと比較し、等しく低かった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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