(57)【要約】本発明は、生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）ならびに幹細胞および前駆細胞障害の処置のための関連する生成方法および使用方法に関する。本発明は、例えば、Ｓｃａ−１＋およびｃ−ｋｉｔ＋であり、Ｌｉｎｅａｇｅマーカーについて陰性である（例えばＢ２２０−、ＣＤ３−、Ｇｒ−１−、Ｍａｃ−１−、ＴＥＲ１１９−）、単離したｈｅＨＳＣ（例えばＳｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）細胞）を提供する。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ４８−である。
2019507596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）である、単離した非ネイティブの生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）。
【請求項２】
ＣＤ４８−である、請求項１に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３】
ＣＤ１５０＋である、請求項１〜２に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項４】
ＣＤ９３＋である、請求項１〜３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項５】
ＣＤ３４−である、請求項１〜４に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項６】
ＯＰＮ＋である、請求項１〜５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項７】
ヒト造血幹細胞を特定する免疫表現型手段を発現しない、請求項１〜６に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８】
造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させることにより調製される、請求項１〜７に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９】
造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストおよび少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストと接触させることにより調製される、請求項８に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１０】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１〜９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１１】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１〜９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１〜１１に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１〜１１に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１〜１３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である、請求項１〜１４に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１６】
被験体における前記ｈｅＨＳＣの移植に際して、前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す、請求項１〜１５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１７】
前記生着能力が、少なくとも約２倍増大している、請求項１６に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１８】
被験体における生着に際して、前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す、請求項１〜１７に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１９】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約２倍増大している、請求項１８に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２０】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約５０％である、請求項１８に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２１】
実質的に純粋である、請求項１〜２０に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２２】
非静止状態である、請求項１〜２１に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２３】
ＯＰＮ＋である、請求項１〜２２に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２４】
前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む、請求項１〜２３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２５】
前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する、請求項１〜２４に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２６】
前記ｈｅＨＳＣが、天然に存在するＨＳＣと比較して、少なくとも、１つの独特なトランスクリプトームまたは１つの独特な表現型を含む、請求項１〜２５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項２７】
請求項１〜２６に記載のｈｅＨＳＣを複数含む単離した細胞集団であって、天然に存在するＨＳＣ集団と比較して、独特な細胞表面マーカー発現プロファイルを有する、単離した細胞集団。
【請求項２８】
請求項１〜２６に記載のｈｅＨＳＣを複数含む単離した細胞集団であって、天然に存在するＨＳＣ集団と比較して、独特なトランスクリプトームプロファイルを有する、単離した細胞集団。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている、請求項１〜２６に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換されている、請求項１〜２７に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３１】
発現ベクターが、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む、請求項２８に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項２６〜２９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２６〜３０に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３４】
それを必要とする被験体に外因性ポリヌクレオチドを送達するための、請求項１〜２７に記載の単離したｈｅＨＳＣの使用。
【請求項３５】
発現ベクターがｈｅＨＳＣゲノムに組み込まれるのに十分な条件下で前記ｈｅＨＳＣを前記ベクターと接触させることを含む、請求項１〜３１に記載の単離したｈｅＨＳＣを形質転換する方法。
【請求項３６】
内因性ポリヌクレオチドの発現を遮断するように遺伝的に改変されている、請求項１〜３３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項３７】
それを必要とする被験体に、請求項１〜３４に記載の単離したｈｅＨＳＣを含む細胞集団を投与することを含む、幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する方法であって、投与されたｈｅＨＳＣ集団が、前記被験体の骨髄区画に生着し、これにより前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害を処置する、方法。
【請求項３８】
前記細胞集団が、少なくとも４０％のｈｅＨＳＣ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞集団が前記被験体への移植に好適であるかどうかを決定するために、前記細胞集団をアッセイすることをさらに含む、請求項３７〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アッセイが、前記細胞集団におけるＣＤ９３＋細胞の相対的百分率を決定することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ｈｅＨＳＣについて前記細胞集団を富化するステップをさらに含む、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記富化するステップが、ＣＤ９３＋細胞について前記細胞集団を富化することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害が、悪性血液疾患である、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記悪性血液疾患が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ球優勢結節性ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および若年性骨髄単球性白血病からなる群より選択される、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害が、非悪性疾患である、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記非悪性疾患が、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、重度の再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、免疫血球減少症、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ファンコニー貧血、鎌状赤血球症、ベータサラセミアメジャー、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、家族性血球貪食性リンパ組織球症および他の組織球性障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ならびにウィスコット・アルドリッチ症候群からなる群より選択される、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体が、ヒトである、請求項３７〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
被験体における生着に際して、生着した前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、向上した造血機能を示す、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
被験体における生着に際して、生着した前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、向上したＣＤ３４＋数を示す、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記被験体が、単離した前記ｈｅＨＳＣを投与する前に生着のためにコンディショニングされる、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が、Ｇ−ＣＳＦからなる従来の動員レジメンに応答した乏しい動員を示す、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が、Ｇ−ＣＳＦに応答した乏しい動員を示す、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｈｅＨＳＣが、実質的に純粋である、請求項３７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｈｅＨＳＣが、非静止状態である、請求項３７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｈｅＨＳＣが、ＯＰＮ＋である、請求項３７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｈｅＨＳＣが、ＣＤ９３＋である、請求項３７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｈｅＨＳＣが、ＣＤ３４−である、請求項３７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む、請求項３７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞（ＨＳＣ）が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する、請求項３７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
被験体において幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する方法であって、（ａ）前記被験体の骨髄区画において内因性造血幹細胞または前駆細胞集団を枯渇させることと、（ｂ）前記被験体に、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）である、単離した非ネイティブの生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）を投与することとを含み、投与した前記ｈｅＨＳＣが前記被験体の前記骨髄区画内に生着する、方法。
【請求項６１】
前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害が、悪性血液疾患である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記悪性血液疾患が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ球優勢結節性ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および若年性骨髄単球性白血病からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害が、非悪性疾患である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記非悪性疾患が、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、重度の再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、免疫血球減少症、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ファンコニー貧血、鎌状赤血球症、ベータサラセミアメジャー、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、家族性血球貪食性リンパ組織球症および他の組織球性障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ならびにウィスコット・アルドリッチ症候群からなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記被験体が、ヒトである、請求項６０〜６４に記載の方法。
【請求項６６】
被験体における生着に際して、生着した前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、向上した造血機能を示す、請求項６０〜６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ｈｅＨＳＣが、実質的に純粋である、請求項６０〜６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ｈｅＨＳＣが、非静止状態である、請求項６０〜６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ｈｅＨＳＣが、ＯＰＮ＋である、請求項６０〜６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ｈｅＨＳＣが、ＣＤ９３＋である、請求項６０〜６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｈｅＨＳＣが、ＣＤ３４−である、請求項６０〜７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む、請求項６０〜７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞（ＨＳＣ）が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する、請求項６０〜７２に記載の方法。
【請求項７４】
Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）である、単離した非ネイティブの生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）であって、被験体に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせを投与することにより、前記被験体の骨髄区画から前記被験体の末梢区画へ造血幹細胞および／または前駆細胞を動員し、前記被験体の前記末梢区画から、動員した前記造血幹細胞および／または前駆細胞を単離することにより調製される、単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項７５】
少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストおよび少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストを投与することにより被験体の骨髄区画から前記被験体の末梢区画へ造血幹細胞および／または前駆細胞を動員し、前記被験体の前記末梢区画から、動員した前記造血幹細胞および／または前駆細胞を単離することにより調製される、請求項７４に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項７６】
ＣＤ４８−である、請求項７４〜７５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項７７】
ＣＤ１５０＋である、請求項７４〜７６に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項７８】
ＣＤ９３＋である、請求項７４〜７７に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項７９】
ＣＤ３４−である、請求項７４〜７８に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８０】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項７４〜７９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８１】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項７４〜７９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８２】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項７４〜８１に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８３】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、前記ＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である、請求項７４〜７９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８４】
被験体における移植に際して、前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせを使用して動員した同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す、請求項７４〜８３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８５】
前記生着能力が、少なくとも約２倍増大している、請求項８４に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８６】
被験体における生着に際して、前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせを使用して動員した同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す、請求項７４〜８５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８７】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約２倍増大されている、請求項８６に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８８】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約５０％である、請求項８６に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項８９】
実質的に純粋である、請求項７４〜８８に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９０】
非静止状態である、請求項７４〜８９に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９１】
ＯＰＮ＋である、請求項７４〜９０に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９２】
前記ｈｅＨＳＣが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む、請求項７４〜９１に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９３】
前記ｈｅＨＳＣが、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞（ＨＳＣ）で発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する、請求項７４〜９２に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９４】
ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている、請求項７４〜９３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９５】
ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換されている、請求項７４〜９３に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９６】
前記発現ベクターが、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む、請求項９５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９７】
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項９５に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９８】
前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項９７に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項９９】
それを必要とする被験体に外因性ポリヌクレオチドを送達するための、請求項９４〜９８に記載の単離したｈｅＨＳＣの使用。
【請求項１００】
発現ベクターがｈｅＨＳＣゲノムに組み込まれるのに十分な条件下で前記ｈｅＨＳＣを前記ベクターと接触させることを含む、請求項７４〜９３に記載の単離したｈｅＨＳＣを形質転換する方法。
【請求項１０１】
内因性ポリヌクレオチドの発現を遮断するように遺伝的に改変されている、請求項７４〜１００に記載の単離したｈｅＨＳＣ。
【請求項１０２】
ｈｅＨＳＣ細胞集団を特定する方法であって、以下：
ａ．被験体に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせを投与することにより、前記被験体の骨髄区画から前記被験体の末梢区画へ造血幹細胞および／または前駆細胞を動員し、前記被験体の前記末梢区画から、動員した前記造血幹細胞および／または前駆細胞を単離することと、
ｂ．ＣＸＣＲ２アゴニストを含まない動員レジメンにより、被験体の骨髄区画から前記被験体の末梢区画へ造血幹細胞および／または前駆細胞を動員し、前記被験体の前記末梢区画から、動員した前記造血幹細胞および／または前駆細胞を単離することと、
ｃ．ステップ（ａ）の単離した細胞集団とステップ（ｂ）の単離した細胞集団とで、１つまたは複数の免疫表現型特性および／または機能特性を比較することと、
ｄ．ステップ（ｂ）の単離した細胞集団とは異なる１つまたは複数の免疫表現型特性および／または機能特性を有するステップ（ａ）の動員した細胞集団のサブ集団を特定することと
を含む、方法。
【請求項１０３】
ステップ（ａ）が、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストおよび少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストを投与することを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０４】
ＣＸＣＲ２アゴニストを含まない動員レジメンが、Ｇ−ＣＳＦからなる、請求項９４〜９５に記載の方法。
【請求項１０５】
比較した１つまたは複数の免疫表現型特性および／または機能特性が、生着能力、ドナーキメラ現象の程度および細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つを含む、請求項９４〜９６に記載の方法。
【請求項１０６】
造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させることを含む、ＨＳＣ集団を調製する方法。
【請求項１０７】
前記ＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβ、ＧＲＯβ−Δ４またはそれらのアナログもしくは誘導体である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０８】
ＨＳＣ生成物を製造する方法であって、以下：
ｉ）造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させて、候補生成物を生成することと、
ｉｉ）ｈｅＨＳＣ生成物についての標的発現プロファイルを提供することと、
ｉｉｉ）前記候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の前記標的発現プロファイルに適合するかどうかを決定することと、
ｉｖ）前記候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の前記標的発現プロファイルに適合する場合、ｈｅＨＳＣ生成物として前記候補生成物をリリースすることと
を含む、方法。
【請求項１０９】
前記標的発現プロファイルが、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）細胞を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ４８−細胞を含む、請求項１０８〜１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ１５０＋細胞を含む、請求項１０８〜１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ９３＋細胞を含む、請求項１０８〜１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ３４−細胞を含む、請求項１０８〜１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記標的発現プロファイルが、ＯＰＮ＋細胞を含む、請求項１０８〜１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１０８〜１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１０８〜１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１０８〜１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１０８〜１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１０８〜１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である、請求項１０８〜１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、被験体への移植に際して、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す、請求項１０８〜１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記生着能力が、少なくとも約２倍増大している、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
被験体における生着に際して、前記ｈｅＨＳＣ生成物が、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す、請求項１０８〜１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約２倍増大している、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約５０％増大している、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、非静止状態である、請求項１０８〜１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
１つもしくは複数の細胞表面マーカーおよび／または１つもしくは複数の遺伝子発現プロファイルについて前記候補生成物を富化するステップを追加的に含む、請求項１０８〜１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む、請求項１０８〜１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する、請求項１０８〜１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、天然に存在するＨＳＣと比較して、少なくとも、１つの独特なトランスクリプトームまたは１つの独特な表現型を含む、請求項１０８〜１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている、請求項１０８〜１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換されている、請求項１０８〜１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記発現ベクターが、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項１３１〜１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１３１〜１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、少なくとも４０％のＣＤ９３＋細胞を含む、請求項１０８〜１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、少なくとも約２×１０６個の細胞を含む、請求項１０８〜１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記造血幹細胞および／または前駆細胞が、ヒトまたはマウス細胞である、請求項１０８〜１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する方法であって、以下：
ｉ）造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させて、候補生成物を生成することと、
ｉｉ）ｈｅＨＳＣ生成物についての標的発現プロファイルを提供することと、
ｉｉｉ）前記候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の前記標的発現プロファイルに適合するかどうかを決定することと、
ｉｖ）前記候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の前記標的発現プロファイルに適合する場合、それを必要とする被験体に前記候補生成物を投与することと
を含む、方法。
【請求項１４０】
前記標的発現プロファイルが、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）細胞を含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ４８−細胞を含む、請求項１３９〜１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ１５０＋細胞を含む、請求項１３９〜１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ９３＋細胞を含む、請求項１３９〜１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記標的発現プロファイルが、ＣＤ３４−細胞を含む、請求項１３９〜１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記標的発現プロファイルが、ＯＰＮ＋細胞を含む、請求項１３９〜１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１３９〜１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項１３９〜１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１３９〜１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１３９〜１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を含む、請求項１３９〜１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストが、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、前記少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である、請求項１３９〜１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、被験体への移植に際して、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す、請求項１３９〜１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記生着能力が、少なくとも約２倍増大している、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
被験体における生着に際して、前記ｈｅＨＳＣ生成物が、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す、請求項１３９〜１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約２倍増大している、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ドナーキメラ現象が、少なくとも約５０％増大している、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、非静止状態である、請求項１３９〜１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
１つもしくは複数の細胞表面マーカーおよび／または１つもしくは複数の遺伝子発現プロファイルについて前記候補生成物を富化するステップを追加的に含む、請求項１３９〜１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む、請求項１３９〜１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する、請求項１３９〜１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、天然に存在するＨＳＣと比較して、少なくとも、１つの独特なトランスクリプトームまたは１つの独特な表現型を含む、請求項１３９〜１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている、請求項１３９〜１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換されている、請求項１３９〜１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記発現ベクターが、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている、請求項１６３〜１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ポリヌクレオチドが、外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１６３〜１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、少なくとも４０％のＣＤ９３＋細胞を含む、請求項１３９〜１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ｈｅＨＳＣ生成物が、少なくとも約２×１０６個の細胞を含む、請求項１３９〜１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記造血幹細胞および／または前駆細胞が、ヒトまたはマウス細胞である、請求項１３９〜１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害が、悪性血液疾患である、請求項１３９〜１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記悪性血液疾患が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ球優勢結節性ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および若年性骨髄単球性白血病からなる群より選択される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記幹細胞障害または前記前駆細胞障害が、非悪性疾患である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記非悪性疾患が、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、重度の再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、免疫血球減少症、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ファンコニー貧血、鎌状赤血球症、ベータサラセミアメジャー、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、家族性血球貪食性リンパ組織球症および他の組織球性障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ならびにウィスコット・アルドリッチ症候群からなる群より選択される、請求項１７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮出願第６２／４１３，８２１号、および２０１６年２月２６日に出願された米国仮出願第６２／３００，６９４号の利益を主張し、これらの内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）移植術は現在、悪性および非悪性血液状態の両方を含む、いくつかの幹細胞障害の唯一の根治的処置様式である。しかし、造血性移植がかかる幹細胞障害を有する患者の唯一の根治的選択肢であるという事実にもかかわらず、移植関連罹患率および死亡率が高いままであり、ＨＳＣ移植から利益を受け得る患者の一部分のみが実際に移植を受ける。
【０００３】
移植術のためのＨＳＣ供給源として、骨髄それ自体、臍帯血および動員末梢血が挙げられる。定常状態条件下で、ＨＳＣおよび造血前駆細胞（ＨＰＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）は通常、骨髄ニッチ内に存在し、一方で、これらのＨＳＣおよびＨＰＣ集団により生成される成熟細胞は最終的に、骨髄から出て、末梢血に入る。しかしながら、最近の数十年にわたるかなりの証拠から、ＨＳＣおよびＨＰＣ（合わせて「ＨＳＰＣ」と呼ばれる）はまた、骨髄ニッチから出て、末梢血に出入りし、そして今や私たちが知っているように、この末梢への自然な退出（ｅｇｒｅｓｓ）が向上し、骨髄から末梢血へのこれらの細胞の「動員」を可能にし得るということが明らかに示されている。成人の動員ＨＳＣおよびＨＰＣは、自家移植術および同種移植術に広く使用されており、骨髄移植片と比較して改善した患者転帰を有する。
【０００４】
造血増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）は、移植術のためにＨＳＣおよびＨＰＣを動員するために臨床的に広く使用されている。Ｇ−ＣＳＦで動員した末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、より迅速な生着、より短い入院および一部の状況では骨髄移植片と比較して優れた全生存を伴うが、一部の同種設定における骨髄に対するＧ−ＣＳＦで動員した移植片の使用は調査中である。
【０００５】
成功の一方で、Ｇ−ＣＳＦ動員レジメンは、皮下注射の繰返しを含み、多くの場合、骨痛（多くの場合、重度で消耗性の合併症）、吐き気、頭痛および疲労の病的状態を伴う。これらは、正常なボランティアのライフスタイルを破壊するものであり、特に過酷ながん化学療法に耐えている患者にとっては悲惨なものであり得る。また、正常なドナー小集団において、Ｇ−ＣＳＦは、脾臓膨大および脾臓破裂を含む重篤な毒性と関連付けられており、高リスク個体においては、Ｇ−ＣＳＦの凝血原効果は、心筋梗塞および脳虚血のリスクを増大させ得る。ほとんどの患者およびドナーについてのその成功にもかかわらず、Ｇ−ＣＳＦに応答した乏しい動員は、正常で健康なドナーの１５％で起こり、多くの場合、十分な数のＣＤ３４＋細胞を達成するものは、１回を超えるアフェレーシス手技を必要とする。延長されたアフェレーシスセッションの繰返しは、特に自家ドナーでは一般的であり、これは、根底にあるがんおよびその処置と関連付けられる進行中の厳しい試練を与えられている彼らにとって特に困難なものである。自家移植術のための最適ＣＤ３４＋細胞用量を動員することができない患者の最大６０％は、多くの場合、タンデム周期の高用量化学療法を必要とする。これは、特に、多くの場合アフェレーシスの延長を必要とし、移植レシピエントの最も大きな群を構成する、リンパ腫および多発性骨髄腫を有する患者にとって問題である。
【０００６】
ＨＳＰＣを動員するための代替法の利用可能性は、ＨＳＣ移植術と関連付けられる上記の障害に対して高い影響力を有し得る。移植片取得ならびに造血回復および生着を向上させることができる新しい療法剤および方法が必要とされている。また、幹細胞および／または前駆細胞障害、例えば悪性および非悪性血液疾患を処置するために使用され得る生着性の高い細胞が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
幹細胞移植を必要とする患者において、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植関連罹患率および死亡率を低減させ、移植したＨＳＣの生着を向上させることができる新しい組成物、方法および療法への要求が今もなお存在している。本発明は、他の望ましい特徴を有することに加えて、これらの未だ対処されていない要求に取り組むための、さらなる解決策を対象とする。したがって、単離した生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）、さらには、かかるｈｅＨＳＣを調製する関連する方法、ならびに幹細胞および／または前駆細胞障害ならびに幹細胞移植が指示され得る他の疾患の処置のためにかかるｈｅＨＳＣを使用する関連する方法が、本明細書で開示される。
【０００８】
ある特定の態様では、本発明は、Ｓｃａ−１＋およびｃ−ｋｉｔ＋であり、Ｌｉｎｅａｇｅマーカーについて陰性である（例えばＢ２２０−、ＣＤ３−、Ｇｒ−１−、Ｍａｃ−１−、ＴＥＲ１１９−）、単離したｈｅＨＳＣ（例えばＳｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）細胞）を対象とする。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ４８−である。ある特定の態様では、ｈｅＨＳＣは、天然には存在しない、すなわち、機能性（例えば生着性（engraftability））および遺伝子発現を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の点で天然に存在するＨＳＣとは異なる。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ１５０＋である。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびｌｉｎｅａｇｅ陰性である、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）ＳＫＬ細胞である。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、ヒト造血幹細胞を特定する免疫表現型手段を発現しない（例えば、単離したｈｅＨＳＣは、かかるｈｅＨＳＣを他の細胞型から区別するために有用であり得る抗原、マーカーまたは他の特徴を発現しない）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの任意の組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む。例えば、一部の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、（例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞による１つまたは複数の遺伝子の発現と比較して）Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数のそれらの差次的発現に基づいて特徴付けられる。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、オステオポンチンを発現する（例えば、ｈｅＨＳＣは、ＯＰＮ＋である）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、従来の動員レジメンに供した被験体から得たＨＳＣよりも、ＣＤ９３を発現する（例えば、ｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋である）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ３４を発現しないか、またはＣＤ３４−である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋およびＣＤ３４−である。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、非ネイティブ細胞または天然に存在しない細胞である、すなわち、ネイティブＨＳＣまたは天然に存在するＨＳＣに存在しない１つまたは複数の遺伝子型または表現型特徴を有する。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、処置していない宿主および／または従来の動員レジメンで処置した宿主に存在しない細胞集団（例えば異なる遺伝子発現プロファイルまたは異なる表現型プロファイルを有する細胞集団）内からのものである。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、従来の動員レジメンで処置した宿主から得たＨＳＣ集団よりも高い比率のＣＤ９���＋細胞を有するｈｅＨＳＣ集団内からのものである。
【０００９】
Ｇ−ＣＳＦを使用する従来手技は、本分野で公知である。参照により本明細書に組み込む、Schmitt,  Mら「Mobilization  of  PBSC  for  Allogeneic  Transplantation  by  the  Use  of  the  G-CSF  Biosimilar  XM02  in  Healthy  Donors.」Bone  Marrow  Transplantation  ４８巻、７号（２０１３年）：９２２〜９２５頁、PMC.  Web.  ２０１７年２月２４日を参照されたい。
【００１０】
本明細書で使用されるとき、「差次的に発現する」は、細胞集団について使用される場合、参照値よりも少なくとも１０％高いかまたは少なくとも１０％低い発現を意味する（例えば、ｈｅＨＳＣ集団が少なくとも１０％多いかまたは少なくとも１０％少ないＣＤ９３を発現する場合、ｈｅＨＳＣ集団は、従来の固定化技術により得たＨＳＣ集団とは差次的にＣＤ９３を発現する）。本明細書で使用されるとき、「差次的に発現する」は、細胞について使用される場合、細胞が、１つまたは複数の表現型の、参照細胞とは異なる発現パターンを有することを意味する。
【００１１】
本発明のある特定の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、ポリヌクレオチド（例えば外因性ポリヌクレオチド）を発現するように形質転換してもよい。例えば、ある特定の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ポリヌクレオチド（例えば外因性ポリヌクレオチド）を発現するように発現ベクターで形質転換されている。一部の実施形態では、発現ベクターは、レトロウイルス、単純ヘルペス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドを含む。
【００１２】
また、それを必要とする被験体に外因性ポリヌクレオチドを送達するための単離したｈｅＨＳＣの使用が、本明細書で開示される。例えば、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、外因性ポリヌクレオチドを発現するように形質転換してもよく、被験体の組織（例えば骨髄組織）における生着に際して、生着したｈｅＨＳＣは、外因性ポリヌクレオチドを発現し、これにより被験体に発現生成物（例えばタンパク質、酵素またはアミノ酸）を送達する。
【００１３】
また、発現ベクターがｈｅＨＳＣゲノムに組み込まれるのに十分な条件下でｈｅＨＳＣをベクターと接触させるステップを含む、単離したｈｅＨＳＣを形質転換する方法が、本明細書で開示される。また他の実施形態では、本発明の単離したｈｅＨＳＣは、内因性ポリヌクレオチドの発現を遮断するように遺伝的に改変されている。
【００１４】
ある特定の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、実質的に純粋（例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％またはそれよりも高く純粋）である。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、非静止状態である。また、単離したｈｅＨＳＣを調製する方法が、本明細書で開示される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させることにより調製される。一部の実施形態では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストおよび少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストと接触させることにより調製される。一部の実施形態では、かかる接触させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばヒト被験体にＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体およびプレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を投与することにより、行われる。一部の実施形態では、かかる接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。一部のｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態では、かかる接触させることは、被験体において、１回のアフェレーシスセッションで約１×１０６／体重ｋｇ〜１０×１０６／体重ｋｇの細胞用量を回収するのに十分な量の循環末梢血幹細胞を動員する。一部のｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態では、かかる接触させることは、被験体において、１回のアフェレーシスセッションで約２×１０６／体重ｋｇ〜８×１０６／体重ｋｇの細胞用量を回収するのに十分な量の循環末梢血幹細胞を動員する。一部のｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態では、かかる接触させることは、被験体において、１回のアフェレーシスセッションで約３×１０６／体重ｋｇ〜６×１０６／体重ｋｇの細胞用量を回収するのに十分な量の循環末梢血幹細胞を動員する。一部のｉｎ  ｖｉｔｒｏの実施形態では、単離したＨＳＣを、１×１０６〜１．２×１０９個のｈｅＨＳＣ細胞を得るために十分な量の、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させる。
【００１５】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）またはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＡＬＴ１１８８、ＡＬＴ１１８７、ＡＬＴ１１２８、ＡＬＴ１２２８またはＴＧ−００５４またはそれらのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、参照により本明細書に組み込む、Debnath  Bら、「Small  Molecule  Inhibitors  of  CXCR4」、Theranostics  ２０１３年；３巻（１号）：４７〜７５頁で説明されている少なくとも１つの阻害剤を含む。一部の実施形態では、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストは、Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）またはそのアナログもしくは誘導体（例えばＲ−ＢＣ１５４）である。一部の実施形態では、ＶＬＡ−４アンタゴニストは、ＢＩＯ  ５１９２、ナタリズマブ、フィラテグラスト（firategrast）またはそれらのアナログもしくは誘導体である。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である。一部の実施形態では、Ｇｒｏ−ベータアナログまたは誘導体は、その全体を参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ国際出願公開公報ＷＯ／１９９４／０２９３４１で説明されているアミノ酸２位と８位との間のＮ末端で短縮された成熟ｇｒｏ−Ｓタンパク質のアミノ酸配列を含むデスアミノＧｒｏ−ベータタンパク質（ＭＩＰ−２アルファとしても公知）である。他の実施形態では、Ｇｒｏ−ベータアナログまたは誘導体は、その全体を参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，４１３，５１０号で説明されている二量体型改変Ｇｒｏ−ベータタンパク質である。一部の実施形態では、Ｇｒｏ−ベータアナログまたは誘導体は、Bensingerら（参照により本明細書に組み込む、Bone  Marrow  Transplantation（２００９年）、４３巻、１８１〜１９５頁）により説明されている幹細胞および他の白血球の移動を方向付けることに関連するＧｒｏ−ベータアナログである、ＳＢ−２５１３５３である。
【００１６】
本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、被験体の標的組織（例えば被験体の骨髄組織）において生着するそれらの向上した能力により特徴付けられる。したがって、一部の実施形態では、被験体におけるｈｅＨＳＣの投与または移植に際して、かかるｈｅＨＳＣは、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤（例えば動員化学療法剤）もしくはそれらの任意の組み合わせと接触させるかまたはこれで動員した同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す。ある特定の実施形態では、かかる生着能力は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。
【００１７】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、非ネイティブ細胞である、すなわち、ネイティブＨＳＣに存在しない１つまたは複数の遺伝子型または表現型特徴を有する。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、処置していない宿主および／または従来の動員レジメンで処置した宿主に存在しない細胞集団（例えば異なる遺伝子発現プロファイルまたは異なる表現型プロファイルを有する細胞集団）内からのものである。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、従来の動員レジメンで処置した宿主から得たＨＳＣ集団よりも高い比率のＣＤ９３＋細胞を有するｈｅＨＳＣ集団内からのものである。
【００１８】
また、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、それらの生着後にドナーキメラ現象の改善または増大を生成するかまたはもたらすそれらの能力により特徴付けられる。一部の実施形態では、被験体におけるｈｅＨＳＣの生着に際して、ｈｅＨＳＣは、例えばＧ−ＣＳＦ、化学療法剤（例えば動員化学療法剤）もしくはそれらの任意の組み合わせと接触させるかまたはこれで動員した同じ量の造血幹細胞の生着後に観察されるドナーキメラ現象と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す。ある特定の実施形態では、かかるドナーキメラ現象は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。一部の実施形態では、かかるドナーキメラ現象は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれよりも多い。
【００１９】
ある特定の態様では、本発明は、幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する方法を対象とする。かかる方法は、それを必要とする被験体に単離したｈｅＨＳＣ（例えばＳＬＡＭ  ＳＫＬ  ｈｅＨＳＣ）を投与するステップを含み、投与したｈｅＨＳＣは、被験体の組織（例えば被験体の骨髄区画）に生着し、これにより幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する。一部の実施形態では、本明細書で説明する方法は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のｈｅＨＳＣ細胞を含む細胞集団を投与することを含む。
【００２０】
ある特定の態様では、被験体における生着に際して、生着したｈｅＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤（例えば動員化学療法剤）もしくはそれらの任意の組み合わせと接触させるかまたはこれで動員した同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、向上した造血機能を示す。一部の実施形態では、被験体における生着に際して、生着したｈｅＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤もしくはそれらの任意の組み合わせと接触させるかまたはこれで動員した同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、向上したＣＤ３４＋数を示す。ある特定の実施形態では、被験体における生着に際して、生着したｈｅＨＳＣは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤もしくはそれらの任意の組み合わせと接触させるかまたはこれで動員した同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、向上した造血機能を示す。
【００２１】
一部の実施形態では、被験体（例えばヒト被験体）は、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣを投与する前に生着のためにコンディショニングされる。一部の実施形態では、被験体（例えばヒト被験体）は、従来の動員レジメン、例えばＧ−ＣＳＦに応答した乏しい動員を示す。
【００２２】
また、被験体において幹細胞および／または前駆細胞障害を処置する方法であって、（ａ）被験体の骨髄区画において内因性造血幹細胞または前駆細胞集団を枯渇させることと、（ｂ）被験体に、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）である、単離した非ネイティブｈｅＨＳＣを投与することとを含み、投与したｈｅＨＳＣが被験体の骨髄区画内に生着する、方法が、本明細書で開示される。ある特定の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、ＳＬＡＭ  ＳＫＬ  ｈｅＨＳＣである。
【００２３】
本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、幹細胞および／もしくは前駆細胞障害または幹細胞移植が指示され得る任意の疾患の処置に使用することができる。一部の実施形態では、かかる幹細胞障害または前駆細胞障害は、悪性血液疾患である。例えば、一部の実施形態では、悪性血液疾患は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ球優勢結節性ホジキンリンパ腫（lymphocyte  predominant  nodular  Hodgkin's  lymphoma）、多発性骨髄腫および若年性骨髄単球性白血病からなる群より選択され得る。一部の実施形態では、幹細胞障害または前駆細胞障害は、非悪性疾患である。例えば、一部の実施形態では、非悪性疾患は、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、重度の再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、免疫血球減少症、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ファンコニー貧血、鎌状赤血球症、ベータサラセミアメジャー（beta  thalassemia  major,）、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、家族性血球貪食性リンパ組織球症および他の組織球性障害（histiocytic  disorder）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ならびにウィスコット・アルドリッチ症候群からなる群より選択され得る。
【００２４】
また、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）である、単離した非ネイティブｈｅＨＳＣであって、被験体に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせを投与することにより、被験体の骨髄区画から被験体の末梢区画へ造血幹細胞および／または前駆細胞を動員し、被験体の末梢区画から、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞を単離することにより調製される、単離したｈｅＨＳＣが、本明細書で開示される。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ４８を発現しないか、またはＣＤ４８−である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ１５０を発現するか、またはＣＤ１５０＋である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３を発現するか、またはＣＤ９３＋である。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、ヒト造血幹細胞を特定する免疫表現型手段を発現しない。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、ＳＬＡＭ  ＳＫＬ  ｈｅＨＳＣである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）またはそのアナログもしくは誘導体を含む。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＡＬＴ１１８８、ＡＬＴ１１８７、ＡＬＴ１１２８、ＡＬＴ１２２８またはＴＧ−００５４を含む。一部の実施形態では、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストは、Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）またはそのアナログもしくは誘導体（例えばＲ−ＢＣ１５４）である。一部の実施形態では、ＶＬＡ−４アンタゴニストは、ＢＩＯ  ５１９２またはナタリズマブまたはそれらのアナログもしくは誘導体である。
【００２５】
一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの任意の組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む。例えば、一部の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員したＨＳＣにおける１つまたは複数の遺伝子の発現と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数のそれらの差次的発現に基づいて特徴付けられる。ある特定の態様では、単離したｈｅＨＳＣは、非静止状態である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＯＰＮ＋である（例えば単離したｈｅＨＳＣは、オステオポンチンを発現する）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３を差次的に発現する（例えばｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋である）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ３４を発現しないか、またはＣＤ３４−である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋およびＣＤ３４−である。
【００２６】
本発明のある特定の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている（例えば単離したｈｅＨＳＣは、外因性ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換してもよい）。一部の実施形態では、発現ベクターは、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドを含む。
【００２７】
また、それを必要とする被験体への外因性ポリヌクレオチドの送達をもたらすかまたは他の点で送達を促進するための、単離したｈｅＨＳＣの使用が、本明細書で開示される。例えば、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、外因性ポリヌクレオチドを発現するように形質転換してもよく、被験体の組織（例えば骨髄組織）における生着に際して、生着したｈｅＨＳＣは、外因性ポリヌクレオチドを発現し、これにより被験体に外因性ポリヌクレオチドの発現生成物（例えばタンパク質またはアミノ酸）を送達する。
【００２８】
一部の実施形態では、また、発現ベクターがｈｅＨＳＣゲノムに組み込まれるのに十分な条件下でｈｅＨＳＣをベクターと接触させるステップを含む、単離したｈｅＨＳＣを形質転換する方法が、本明細書で開示される。また他の実施形態では、本発明の単離したｈｅＨＳＣは、内因性ポリヌクレオチドの発現を遮断するように遺伝的に改変されている。
【００２９】
ある特定の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、実質的に純粋である。
【００３０】
本発明の上記の説明ならびに多くの他の特長および付随する利点は、以下の発明を実施するための形態を参照することにより、より良く理解される。
【００３１】
本特許または出願ファイルは、色を付した少なくとも１つの図面を含有する。着色図面を伴うこの特許または特許出願公開のコピーは、申請および必要な料金の支払いをすれば事務局により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、Ｇ−ＣＳＦと比較して、ＣＸＣＲ２アゴニストＧＲＯβとＣＸＣＲ４アンタゴニストプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）との組み合わせが、生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）を動員したことを示す。図１で示すように、Ｇ−ＣＳＦで動員した細胞と比較して、ＧＲＯβおよびＡＭＤ−３１００で動員したｈｅＨＳＣでの生着後にドナーキメラ現象の増大が観察された。この実証において、マウスにつき、１９５個のＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、ＳＫＬ細胞を移植した。
【図２】図２は、図１で示す実証とは別々の独立した実証において、Ｇ−ＣＳＦと比較して、ＣＸＣＲ２アゴニストＧＲＯβとＣＸＣＲ４アンタゴニストプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）との組み合わせが、生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）を動員したことを示す。図２で示すように、Ｇ−ＣＳＦで動員した細胞と比較して、ＧＲＯβおよびＡＭＤ−３１００で動員したｈｅＨＳＣの生着後にドナーキメラ現象の増大が観察された。この実証において、マウスにつき、５０個のＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＳＫＬ細胞を移植した。
【図３】図３は、ある特定の遺伝子が、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した細胞と比較して、ＣＸＣＲ２アゴニストＧＲＯβとＣＸＣＲ４アンタゴニストプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）との組み合わせを使用して動員したｈｅＨＳＣにおいて、より高い発現を示したことを示す。
【図４】図４は、ＣＸＣＲ２アゴニストＧＲＯβとＣＸＣＲ４アンタゴニストプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）との組み合わせを使用して動員したｈｅＨＳＣ（ＴｕｂｅＣ）と比較した、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞（ＨＳＣ）（２つのＴｕｂｅＢ複製物）の間の、上位２０個の区別できる遺伝子を示すヒートマップを示す。Ｓｐｐ１は、オステオポンチンマーカーＩに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、幹細胞移植術ならびに幹細胞および／または前駆細胞障害の処置に関連して有用な、非ネイティブの生着性の高い造血幹細胞（ｈｅＨＳＣ）に関する。単離した非ネイティブｈｅＨＳＣ、それらの使用および製造方法ならびに幹細胞移植術または幹細胞および／もしくは前駆細胞障害の処置と関連する使用のためのかかるｈｅＨＳＣを含むキットが、本明細書で開示される。本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、例えば幹細胞移植術を必要とする任意の疾患の処置と関連して被験体における移植術および／または生着のために有用である。
【００３４】
本明細書で説明する研究は、ＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）とＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォル）との組み合わせと接触させるかまたはこれで動員することにより調製したｈｅＨＳＣが、優れた生着能力、例えば慣例的な動員レジメン（例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または化学療法剤）を使用して動員したＨＳＣまたは末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）と比較して優れた生着能力を示すという驚くべき発見に関する。したがって、本発明のある特定の態様は、１つまたは複数のＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）と１つまたは複数のＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォル）との組み合わせを使用して造血幹細胞および／または前駆細胞を接触させるかまたは動員することにより調製した非ネイティブの単離したｈｅＨＳＣに関する。被験体において造血幹細胞および／または前駆細胞を動員する方法の例は、かかる造血幹細胞および／または前駆細胞を被験体の末梢血に動員するのに十分な量で少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストとの組み合わせを被験体に投与することを含む。本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣ、ならびに関連する、造血幹細胞および／または前駆細胞を動員することによるそれらの調製の方法は、例えば幹細胞および／または前駆細胞障害の処置のための、様々な有用な用途を有する。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明の態様は、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）と少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせを使用して造血幹細胞および／または前駆細胞を接触させるかまたは動員することにより調製した非ネイティブの単離したｈｅＨＳＣに関する。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「動員する」という用語は、第１の位置（例えば被験体の幹細胞ニッチまたは骨髄組織）から第２の位置（例えば被験体の末梢血または器官、例えば脾臓）への造血幹細胞および／または前駆細胞（例えばｈｅＨＳＣ）の遊走を誘導する行為を指す。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で開示する非ネイティブの単離したｈｅＨＳＣは、１つまたは複数のＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）と１つまたは複数のＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォル）との組み合わせをヒト被験体に投与することにより、被験体の幹細胞ニッチから被験体の末梢組織へ造血幹細胞および／または前駆細胞を動員することによって調製することができ、その後、動員したｈｅＨＳＣを、本明細書でさらに説明するように、（例えばアフェレーシスにより）回収または単離してもよい。本明細書で開示するｈｅＨＳＣについて、「単離した」という用語は、ｈｅＨＳＣが、ｈｅＨＳＣが処置される被験体から単離されたときに一緒に存在し得る他の細胞型または細胞材料を実質的に含まないことを意味する。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣまたは単離したｈｅＨＳＣ集団は、例えば細胞が単離されたかまたは富化された不均一な集団と比較して、実質的に純粋なｈｅＨＳＣ集団である（例えば動員した細胞集団と比較して実質的に純粋）。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、ＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）とＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォル）との組み合わせでの処置後に被験体から得た生物学的試料から富化される。一実施形態では、本明細書で開示する動員および回収したｈｅＨＳＣは、同種移植または自家移植と関連して使用することができる。「富化する」または「富化した」という用語は、本明細書で相互変換可能に使用され、ｈｅＨＳＣの収量（割合）が、動員した細胞の割合より少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれよりも多く増大していることを意味する。
【００３７】
ｈｅＨＳＣ集団について本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」という用語は、動員した全細胞集団を構成する細胞について少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋、より一層好ましくは少なくとも約９９％純粋であるｈｅＨＳＣ集団を指す。言い換えると、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、ｈｅＨＳＣ集団について、約２０％よりも少ない、より好ましくは約１５％、１２％、１０％、８％、７％よりも少ない、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％よりも少ない、または１％未満の、本明細書で用語によって定義されるｈｅＨＳＣではない細胞を含有する細胞集団を指す。一部の実施形態では、本発明は、ｈｅＨＳＣ集団を拡大増殖する(expand)方法であって、拡大増殖したｈｅＨＳＣ集団が実質的に純粋な集団である、方法を包含する。
【００３８】
本明細書で開示するある特定の実施形態は、造血幹細胞および／または前駆細胞を動員することによるｉｎ  ｖｉｖｏでのｈｅＨＳＣ調製を企図するが、本発明は、かかるｉｎ  ｖｉｖｏ法に限定されないことを理解するべきである。むしろ、また、例えば造血幹細胞および／または前駆細胞をＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）とＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォル）、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせと接触させることによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈｅＨＳＣを調製する方法が企図される。本明細書で使用されるとき、「接触させる」という用語は、２つまたはそれよりも多い部分を、これらの部分が互いに相互作用し得るように、一緒にすることまたは互いに接近させることを意味する。例えば、本発明の一実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を、ＣＸＣＲ２アゴニストおよび／またはＣＸＣＲ４アンタゴニストと接触させて、ｈｅＨＳＣを生成および／または動員する。
【００３９】
企図されるＣＸＣＲ２アゴニストは、ＣＸＣＲ２受容体（例えばヒトＣＸＣＲ２受容体）を活性化することができる任意の化合物または作用物質を含む。ＣＸＣＲ２アゴニストの例として、ケモカイン、サイトカイン、生物学的薬剤、抗体および小有機分子が挙げられる。例えば、ＣＸＣＲ２受容体を介して作用する、企図されるケモカインとして、ＧＲＯβ、ＧＲＯα、ＧＲＯγ、ＧＣＰ−２（顆粒球走化性タンパク質２：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏ−ａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ＩＬ−８、ＮＡＰ−２（好中球活性化ペプチド２：ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ２）、ＥＮＡ−７８（上皮細胞由来好中球活性化タンパク質７８：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８）および上記のいずれかの改変形が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＸＣＲ２アゴニストは、小有機または無機分子；オリゴ糖；多糖；ペプチド、タンパク質、ペプチドアナログおよび誘導体からなる群より選択される生体高分子；ペプチド模倣薬；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムおよびアプタマーからなる群より選択される核酸；ならびにそれらの任意の組み合わせからなる化合物または作用物質の群から選択される。
【００４０】
ある特定の態様では、ＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβを含む。
【００４１】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ケモカインＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体である。ＧＲＯβの形態の例は、ヒトＧＲＯβポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＰ１３１０４；配列番号１）である。ある特定の態様では、ＧＲＯβの形態の例は、ヒトＧＲＯβ（ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ番号Ｐ１９８７５；配列番号２）である。
【００４２】
ＧＲＯβアナログまたは誘導体の例は、その内容を全体として参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ国際出願公開公報ＷＯ／１９９４／０２９３４１で説明されているアミノ酸２位と８位との間のＮ末端で短縮された成熟ｇｒｏ−Ｓタンパク質のアミノ酸配列を含むデスアミノＧＲＯβタンパク質（ＭＩＰ−２アルファとしても公知）である。別のＧＲＯβアナログまたは誘導体は、その内容を全体として参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，４１３，５１０号で説明されている二量体型改変ＧＲＯβタンパク質である。さらに別のＧＲＯβアナログまたは誘導体の例は、その全内容を参照により本明細書に組み込む、Bensingerら、Bone  Marrow  Transplantation（２００９年）、４３巻、１８１〜１９５頁により説明されている幹細胞および他の白血球の移動を方向付けることに関連するＧＲＯβアナログである、ＳＢ−２５１３５３である。
【００４３】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβ−Δ４（例えば配列番号３）もしくはそのアナログもしくは誘導体であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体およびＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体からなる群より選択される。
【００４４】
企図されるＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＣＸＣＲ４受容体をブロックすることができるかまたはその活性化を防ぐことができる任意の化合物または作用物質を含む。例えば、ＣＸＣＲ４受容体とかかる受容体のリガンドとの結合または相互作用をブロックするかまたはその他の方法で妨害する化合物または作用物質が、企図される。また、活性化ＣＸＣＲ４受容体の下流の効果をブロックする化合物または作用物質が、企図される。一部の実施形態では、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、小有機または無機分子；オリゴ糖；多糖；ペプチド、タンパク質、ペプチドアナログおよび誘導体からなる群より選択される生体高分子；ペプチド模倣薬；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムおよびアプタマーからなる群より選択される核酸；ならびにそれらの任意の組み合わせからなる化合物または作用物質の群から選択される。
【００４５】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、その構造を以下の（Ｉ）に示すプレリキサフォル（以前はＡＭＤ−３１００として公知）またはそのアナログもしくは誘導体である。
【化１】
2019507596.tif 000003
【００４６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＭＯＺＯＢＩＬ（登録商標）またはそのアナログもしくは誘導体である。プレリキサフォルのアナログの例として、以下に示し（それぞれ、ＩＩ〜ＶＩ）、その内容を全体として参照により本明細書に組み込む、De  Clercq、Pharmacol  Ther.（２０１０年）１２８巻（３号）：５０９〜１８頁により説明されている、ＡＭＤ１１０７０、ＡＭＤ３４６５、ＫＲＨ−３９５５、Ｔ−１４０および４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ１４００３が挙げられるが、これらに限定されない。
【化２】
2019507596.tif 000004
【化３】
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【化４】
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【００４７】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、ＡＬＴ１１８８、ＡＬＴ１１８７、ＡＬＴ１１２８、ＡＬＴ１２２８またはＴＧ−００５４またはそれらのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、参照により本明細書に組み込む、Debnath  Bら、「Small  Molecule  Inhibitors  of  CXCR4」、Theranostics  ２０１３年；３巻（１号）：４７〜７５頁で説明されている少なくとも１つの阻害剤を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、非ネイティブの単離したｈｅＨＳＣは、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）と少なくとも１つのα９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストとの組み合わせを使用して造血幹細胞および／または前駆細胞を接触または動員することにより調製される。一部の実施形態では、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストは、Ｎ−（ベンゼンスルホニル）−Ｌ−プロリル−Ｌ−Ｏ−（１−ピロリジニルカルボニル）チロシン（ＢＯＰ）またはそのアナログもしくは誘導体（例えばＲ−ＢＣ１５４）である。一部の実施形態では、非ネイティブの単離したｈｅＨＳＣは、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）と少なくとも１つのＶＬＡ−４アンタゴニストとの組み合わせを使用して造血幹細胞および／または前駆細胞を接触または動員することにより調製される。一部の実施形態では、ＶＬＡ−４アンタゴニストは、ＢＩＯ  ５１９２、ナタリズマブまたはそれらのアナログもしくは誘導体である。
【００４９】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であるか、またはこれを含み、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）またはそのアナログもしくは誘導体であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体からなる群より選択され、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体からなる群より選択される。
【００５０】
少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせは、組み合わせで被験体に直接投与してもよく、またはある特定の態様では、独立して投与してもよい。例えば、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせは、必ずではないが、同時に被験体に投与（例えば静脈内投与）してもよい。一実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、１つまたは複数の用量で投与され、続いて少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストが、１つまたは複数の用量で投与される。
【００５１】
より速い動員を誘導すること（例えばＧ−ＣＳＦを使用して行われる慣例的な動員レジメンと比較して、例えば約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍もしくはそれよりも速いか、またはあるいは、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内もしくはそれよりも速い）およびより多量の動員幹細胞（例えばｈｅＨＳＣ）を生成することに加えて、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯＢ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体）と少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体）、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせは、図３に示す、向上した生着能力および独特な遺伝子シグネチャーにより特徴付けられる非ネイティブ幹細胞を動員する。少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせを使用して動員した幹細胞を説明するために本明細書で使用されるとき、「独特な」という用語は、慣例的な動員レジメンを使用して、例えばＧ−ＣＳＦのみを使用して動員した幹細胞と比較して、かかる動員幹細胞の１つまたは複数の区別できる特徴を指す。例えば、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせを使用して動員した幹細胞は、１つもしくは複数の独特なマーカーもしくは抗原のそれらの発現（例えばＣＤ９３＋）により、またはそれらの独特なトランスクリプトームにより特徴付けることができる。
【００５２】
１つのかかるマーカーであるＣＤ９３は、造血細胞において造血の頂点で発現する。また、ヒトにおけるこれらの初期造血ＣＤ９３発現細胞は、ＣＤ３４について陰性であり得る。少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストとの組み合わせでの処置に際して発生するｈｅＨＳＣ集団は、これもまたＣＤ９３発現を示し、初期系統幹細胞を示し、移植術および／または生着の改善をサポートするように働き得る。
【００５３】
同様に、ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせを使用して動員した幹細胞は、機能の改善により特徴付けることができる。特に、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせを使用して動員したｈｅＨＳＣの生着能力は、造血幹細胞および／または前駆細胞を慣例的な動員剤、例えばＧ−ＣＳＦと接触させた後に動員された幹細胞またはＰＢＳＣの生着能力と比較して、驚くべきことに増大または向上している。
【００５４】
ある特定の態様では、ｈｅＨＳＣは、造血幹細胞および／または前駆細胞を１つまたは複数の化学療法剤（例えば化学療法動員剤）と接触させた後に動員された幹細胞またはＰＢＳＣと比較した、生着能力の増大または向上により特徴付けられる。化学療法剤の例として、パクリタキセル、エトポシド、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、６−チオグアニン、シタラビン、シクロホスファミド、シスプラチンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。ある特定の態様では、かかる化学療法剤は、造血幹細胞および／または前駆細胞を動員する。例えば、かかる化学療法動員剤は、ＥＰＯを含み得る。一部の実施形態では、かかる化学療法動員剤は、幹細胞因子であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、かかる化学療法動員剤は、ＴＰＯであるか、またはこれを含む。さらに他の実施形態では、かかる化学療法動員剤は、副甲状腺ホルモンであるか、またはこれを含む。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、造血系統に分化し、骨髄系（例えば単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）を含む白血球細胞および赤血球細胞、ならびにリンパ系統（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）などの全ての血液細胞型を生じ得る幹細胞を指す。幹細胞は、多数の細胞型を形成するそれらの能力（多分化能(multipotency)）およびそれらの自己再生能力により定義される。造血幹細胞は、例えば、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４８−、ＣＤ１５０＋、ＣＤ２４４−、ｃＫｉｔ＋、Ｓｃａ１＋および系統マーカーの欠損（数ある中でも、Ｂ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｍａｃ１、Ｇｒ１およびＴｅｒ１１９について陰性）などの細胞表面マーカーにより特定することができる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「造血前駆細胞」という用語は、造血細胞系統に拘束され、一般的に自己再生しない、造血系のいくつかの細胞型、例えば顆粒球、単球、赤血球、巨核球、Ｂ細胞およびＴ細胞に分化することができる多能性細胞を包含し、短期造血幹細胞（ＳＴ−ＨＳＣ：ｓｈｏｒｔ  ｔｅｒｍ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多分化能前駆細胞（ＭＰＰ：ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ：ｃｏｍｍｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、顆粒球−単球前駆細胞（ＧＭＰ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ：ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）および拘束されたリンパ球前駆細胞（ＣＬＰ：ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を含むが、これらに限定されない。造血前駆細胞の存在は、完全メチルセルロースアッセイにおけるコロニー形成単位細胞（ＣＦＵ−Ｃ）として機能的に、または当業者に公知のアッセイを使用して細胞表面マーカー（例えばＣＤ４５−、ＣＤ３４＋、Ｔｅｒ１１９−、ＣＤ１６／３２、ＣＤ１２７、ｃＫｉｔ、Ｓｃａ１）の検出を通して表現型的に決定することができる。
【００５７】
一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＳＫＬ細胞を含む。ある特定の態様では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＳＫＬ  ＳＬＡＭ細胞を含む。ある特定の態様では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−である、ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）発現パターンを示す。ＳＬＡＭ発現パターン（ＳＬＡＭコード）は、造血幹細胞および多分化能前駆細胞のサブ集団を特定するために使用される特定のマーカー（ＳＬＡＭマーカー）の発現パターンである。Oguroら（２０１３年）「SLAM  family  markers  resolve  functionally  distinct  subpopulations  of  hematopoietic  stem  cells  and  multipotent  progenitors」、Cell  Stem  Cell、１３巻（１号）、１０２〜１１６頁およびその中で引用される参考文献を参照されたい。
【００５８】
一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ１３３＋細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、骨髄系共通前駆細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、顆粒球／単球前駆細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、巨核球／赤血球前駆細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、拘束されたリンパ球前駆細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、骨髄系共通前駆細胞、顆粒球／単球前駆細胞、巨核球／赤血球前駆細胞の組み合わせを含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ１５０−、ＣＤ４８−、ＣＤ２４４＋細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、ＣＤ１５０−、ＣＤ４８＋、ＣＤ２４４＋細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、Ｓｃａ−１−、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、ＣＤ３４＋、ＣＤ１６／３２ｍｉｄ細胞を含む。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞は、Ｓｃａ−１−、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、ＣＤ３４−、ＣＤ１６／３２ｌｏｗ細胞を含む。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ヒト造血幹細胞を特定する免疫表現型手段を発現しない。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む。例えば、ある特定の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞（ＨＳＣ）における１つまたは複数の遺伝子の発現と比較して、図４で特定される遺伝子のうちの１つまたは複数のそれらの差次的発現に基づいて特徴付けられる。一部の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞（ＨＳＣ）による１つまたは複数の遺伝子の発現と比較して、Ｆｏｓ（例えば配列番号４）、ＣＤ９３（例えば配列番号５）、Ｆｏｓｂ（例えば配列番号６）、Ｄｕｓｐ１（例えば配列番号７）、Ｊｕｎ（例えば配列番号８）、Ｄｕｓｐ６（例えば配列番号９）、Ｃｄｋ１（例えば配列番号１０）、Ｆｉｇｎｌ１（例えば配列番号１１）、Ｐｌｋ２（例えば配列番号１２）、Ｒｓａｄ２（例えば配列番号１３）、Ｓｇｋ１（例えば配列番号１４）、Ｓｄｃ１（例えば配列番号１５）、Ｓｅｒｐｉｎｅ２（例えば配列番号１６）、Ｓｐｐ１（例えば配列番号１７）、Ｃｄｃａ８（例えば配列番号１８）、Ｎｒｐ１（例えば配列番号１９）、Ｍｃａｍ（例えば配列番号２０）、Ｐｂｋ（例えば配列番号２１）、Ａｋｒ１ｃ１（例えば配列番号２２）およびＣｙｐ１１ａ１（例えば配列番号２３）からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数のそれらの差次的発現に基づいて特徴付けられる。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＯＰＮ＋である（例えば単離したｈｅＨＳＣは、オステオポンチンを発現する）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３を差次的に発現する（例えばｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋である）。ある特定の態様では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、非静止状態である。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣは、ＣＤ３４−である。
【００６０】
本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、造血幹細胞および／または前駆細胞をＣＸＣＲ２アゴニストとＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせで動員、またはこれと接触させることにより調製される。本明細書で使用されるとき、「生着性の高い造血幹細胞」および「ｈｅＨＳＣ」という用語は、例えば、１つまたは複数のＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体）および１つまたは複数のＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体）、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの投与後に、被験体の幹細胞ニッチまたは骨髄から被験体の末梢血または器官へ動員された幹細胞またはＰＢＳＣの単離した集団または割合を指す。ある特定の態様では、かかるｈｅＨＳＣは、実質的に純粋である。
【００６１】
一部の実施形態では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、慣例的な動員レジメンを使用して動員した細胞または幹細胞（例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員した幹細胞）と比較して、免疫表現型的に独特である。例えば、図３で示すように、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した細胞と比較して、ＣＸＣＲ２アゴニストＧＲＯβとＣＸＣＲ４アンタゴニストプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）との組み合わせを使用して動員したｈｅＨＳＣにおいて、ある特定の遺伝子は、より高い発現を示した。ある特定の態様では、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、オステオポンチンを発現するか、またはオステオポンチン陽性（ＯＰＮ＋）である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３を差次的に発現する（例えばｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋である）。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ３４を発現しないか、またはＣＤ３４−である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ＣＤ９３＋およびＣＤ３４−である。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、慣例的な動員レジメンを使用して動員した単離したＨＳＣ（例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員した幹細胞）と比較して、図３または図４で示す１つまたは複数の遺伝子を差次的に発現する。
【００６２】
一部の実施形態では、（例えば、細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβ）と少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせと接触させることによる）本明細書で開示する方法により単離した細胞集団（すなわち、ｈｅＨＳＣを含むかまたはこれからなる細胞集団）は、従来法により単離した細胞と比較して、本明細書で開示する１つもしくは複数の細胞表面マーカーまたは１つもしくは複数の発現プロファイルを示す、増大または減少した比率の細胞を有する。１つまたは複数の細胞表面マーカーまたは細胞発現プロファイルは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多く増大または減少され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞表面マーカーは、ＣＤ９３である。一部の実施形態では、本明細書で開示する方法を行った後、得た細胞集団が移植術のためのｈｅＨＳＣとして好適であるかどうかを決定するために、得た細胞集団をアッセイして、１つまたは複数の細胞表面マーカーまたは細胞発現プロファイルの出現率（prevalence）が増大しているかまたは減少しているかどうかを決定してもよい。一部の実施形態では、細胞のうちの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くがＣＤ９３＋であるかどうかを決定するために、得た細胞集団をアッセイする。任意の好適なアッセイ（例えばＦＡＣＳ分析）を、決定に使用してもよい。
【００６３】
一部の実施形態では、得た細胞集団を、移植術のために所望のｈｅＨＳＣ集団を得るために、所望の細胞表面マーカーまたは遺伝子発現パターンについてさらに富化してもよい。一部の実施形態では、得た細胞集団を、ＣＤ９３＋細胞またはＣＤ９３＋およびＣＤ３４−細胞について富化してもよい。一部の実施形態では、細胞集団を、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍またはそれよりも多く富化してもよい。一部の実施形態では、細胞集団を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くの、所望の細胞表面マーカーまたは細胞発現パターンを含有する細胞を含有するように富化して（例えばＣＤ９３＋細胞またはＣＤ９３＋／ＣＤ３４−細胞について富化して）もよい。任意の好適な手技（例えばＦＡＣＳソーティング）を、富化に使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、慣例的な動員レジメンを使用して動員した細胞または幹細胞（例えばＧ−ＣＳＦを使用して動員した幹細胞）と比較して、免疫表現型的に独特ではない。かかる単離したｈｅＨＳＣは、慣例的な動員レジメンを使用して動員した細胞または幹細胞と比較して、機能的に独特であってもよい。
【００６４】
ある特定の場合、ＣＸＣＲ２アゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせを投与した１５〜３０分以内に起こり得る動員に際して、動員したｈｅＨＳＣは、本明細書で開示するように（例えばアフェレーシスにより）回収または単離してもよく、それを必要とする被験体における続く移植術に有用である。例えば、かかる動員したｈｅＨＳＣは、被験体への自家移植術のために、またはレシピエント被験体への同種移植術のために回収または単離してもよい。一部の場合、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞の回収または単離は、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの投与後、わずか１５分以内に開始することができる。一部の実施形態では、回収または単離手技は、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの投与後、わずか１０分、１２分、１５分、１８分、２０分、２２分、２５分、３０分、３５分、４０分、４７分、５２分、５８分または１時間で開始することができる。
【００６５】
本開示は、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣを調製するために、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞を回収および／または収集する任意の好適な方法の使用を企図する。一部の実施形態では、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞の回収は、アフェレーシスを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβまたはＧＲＯβ−Δ４）と少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばプレリキサフォル）、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせとの組み合わせは、動員された造血幹細胞および／または前駆細胞を迅速かつ効率的に動員し、慣例的な動員レジメンと比較して増大した効率を示す。その結果、一部の実施形態では、アフェレーシス手技は、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせが、被験体に投与されるのと同じ日に行ってもよい。換言すれば、アフェレーシスにより被験体（例えばドナー）から動員したｈｅＨＳＣを回収することを、動員剤が被験体に投与されるのと同じ日に（例えば保健医療施設への１回の来所中に）行うことができる。一部の実施形態では、アフェレーシス手技は、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβまたはＧＲＯβ−Δ４）、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせが、被験体に投与されるのと同じ日に行ってもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβまたはＧＲＯβ−Δ４）、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの投与は、１回のアフェレーシスセッションで約１×１０６／体重ｋｇ〜１０×１０６体重ｋｇのｈｅＨＳＣ細胞用量を回収するために、被験体においてある量の造血幹細胞および／または前駆細胞を動員する。一部の実施形態では、アフェレーシスの１回のセッションは、約１×１０６／レシピエントの体重ｋｇ〜１０×１０６／レシピエントの体重ｋｇの細胞用量のために十分なｈｅＨＳＣを収集する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβまたはＧＲＯβ−Δ４）、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの投与は、１回のアフェレーシスセッションで約２×１０６／体重ｋｇ〜８×１０６／体重ｋｇの細胞用量のために十分なｈｅＨＳＣを回収するために、被験体においてある量の造血幹細胞および／または前駆細胞を動員する。一部の実施形態では、アフェレーシスの１回のセッションは、約２×１０６／レシピエントの体重ｋｇ〜８×１０６／レシピエントの体重ｋｇの細胞用量のために十分なｈｅＨＳＣを収集する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβまたはＧＲＯβ−Δ４）、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの投与は、１回のアフェレーシスセッションで約３×１０６／体重ｋｇ〜６×１０６／体重ｋｇのｈｅＨＳＣ細胞用量を回収するために、被験体においてある量の造血幹細胞および／または前駆細胞を動員する。一部の実施形態では、アフェレーシスの１回のセッションは、約１×１０６／レシピエントの体重ｋｇ〜１０×１０６／レシピエントの体重ｋｇの細胞用量のために十分なｈｅＨＳＣを収集する。
【００６７】
回収後、本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣは、ドナー被験体に投与もしくは移植してもよく（例えば自家移植）、またはあるいは、それを必要とする異なる被験体に供与してもよい（例えば同種移植）。ある特定の態様では、単離したｈｅＨｓＣの投与または移植は、放射線もしくは化学療法の後またはこれらとの組み合わせで起こる。
【００６８】
本明細書で開示する動員したｈｅＨＳＣは、それらの生着能力の増大（例えば生着能力の２倍増大）により特徴付けられ、この生着能力の増大のために、かかるｈｅＨＳＣは、遺伝子療法と関連した使用に好適である。例えば、細胞の遺伝子操作が、それらの生着能力における対応する低減と関連付けられる場合、本明細書で開示するｈｅＨＳＣの改善したまたは向上した生着能力のために、かかるｈｅＨＳＣは遺伝子操作に対してより耐性になり、その後、それらの生着能力における限定された低減のみが観察され得る。
【００６９】
遺伝子療法は、ｈｅＨＳＣを形質転換し、ｈｅＨＳＣを改変して、遺伝子産物を置換するために、疾患を処置するために、または被験体への植込み後のｈｅＨＳＣの生着を改善するために、使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、発現ベクター（例えば、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクター）で形質転換してもよい。一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣは、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されているか、またはこれをトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの発現生成物は、被験体の細胞が内因的に発現しないかまたは低発現する（under  express）タンパク質である。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「形質転換する」という用語は、ｈｅＨＳＣ内で複製し、そのｈｅＨＳＣで発現する遺伝子産物（例えばアミノ酸、ポリペプチド配列、タンパク質または酵素）をコードする、かつ／またはゲノム内の遺伝子座の発現に影響を及ぼすためにそのｈｅＨＳＣのゲノムに組み込まれる外因性ポリヌクレオチド（例えば核酸または核酸アナログ）をｈｅＨＳＣに導入することを意味する。「形質転換する」という用語は、非限定的に形質転換、トランスフェクション、形質導入または遺伝子移入と本分野で呼ばれる方法を含み、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介エンドサイトーシス、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、遺伝子銃  (ballistic  injection)、ウイルス媒介トランスフェクションなどの技術を含む、かかるポリヌクレオチド（例えば核酸または核酸アナログ）を導入する様々な方法の全てを包含するために使用される。
【００７１】
一部の実施形態では、また、発現ベクターがｈｅＨＳＣゲノムに組み込まれるのに十分な条件下でｈｅＨＳＣをベクターと接触させるステップを含む、単離したｈｅＨＳＣを形質転換する方法が、本明細書で開示される。また他の実施形態では、本発明の単離したｈｅＨＳＣは、内因性ポリヌクレオチドの発現を遮断するように遺伝的に改変されている。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、細胞間で核酸を移入することができる、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルスおよび／またはビリオンなどの、任意の遺伝子構築物を意味する。ベクターは、複製、発現および挿入または組み込みのうちの１つまたは複数を行うことができ得るが、これらの能力の各々を有する必要はない。したがって、用語は、クローニング、発現、相同組換えおよびノックアウトベクターを含む。
【００７３】
ある特定の態様では、生着前に、動員した造血幹細胞および／または前駆細胞を、１つまたは複数の所望のポリヌクレオチドまたは遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、アミノ酸配列タンパク質および／または酵素のうちの１つまたは複数）を発現するように操作してもよい。動員した造血幹細胞および／もしくは前駆細胞を改変してポリヌクレオチドもしくは遺伝子産物を置換するために、または遺伝子産物を付加するか、もしくはノックダウンするために、遺伝子療法を使用してもよい。一部の実施形態では、例えば疾患を処置するために遺伝子操作を行い、その後、遺伝子操作したｈｅＨＳＣを被験体に移植および生着させ得る。例えば、動員したｈｅＨＳＣを、移植したｈｅＨＳＣの生着能力を向上させ得る１つまたは複数のポリヌクレオチドまたは遺伝子を発現するように操作してもよい。
【００７４】
細胞にトランスフェクトするための技術は、本分野で公知である。例示的な実施形態では、遺伝的欠損を有する患者または被験体からの動員した造血幹細胞に、かかる遺伝的欠損を修正するためにポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を挿入するように、遺伝子療法を使用してもよく、その後、修正した、または遺伝子操作した動員した造血幹細胞を、被験体に移植してもよい。
【００７５】
一部の他の実施形態では、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、遺伝子療法のための担体として使用することができる。
【００７６】
一部の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣおよびかかるｈｅＨＳＣを動員する関連する方法は、従来の造血幹細胞および／または前駆細胞動員レジメンに応答した乏しい動員を示した被験体（例えば、Ｇ−ＣＳＦを含むかまたはこれからなる動員レジメン後に十分な数の幹細胞を動員することができなかった被験体）を処置するために有用である。例えば、かかるｈｅＨＳＣおよび本明細書で開示する関連する方法は、幹細胞および／または前駆細胞の動員障害（ｍｏｂｉｌｏｐａｔｈｙ）を示す個体において造血幹細胞および／または前駆細胞動員を向上させるために使用することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示する方法および組成物のいずれかは、例えば糖尿病性幹細胞動員障害を有するかまたはこれを発症するリスクを有する被験体を含む、骨髄からのまた末梢循環への造血幹細胞および／または前駆幹細胞の退出を損なう、根底にある疾患を有する被験体において、かかる造血幹細胞および／または前駆幹細胞を動員することにおける使用に好適であり得る。ある特定の態様では、Ｇ−ＣＳＦを含む動員レジメンに応答して十分な数の造血幹細胞および／または前駆細胞を動員することができなかった被験体（例えばＧ−ＣＳＦ動員レジメンを受容した約５日後に十分な数の幹細胞を動員することができなかった被験体）は、本明細書で開示する方法および組成物を使用する動員についての候補である。ある特定の実施形態では、単離したｈｅＨＳＣを、幹細胞障害または前駆細胞障害の処置のために動員障害を示す被験体に投与してもよい。
【００７７】
動員レジメンを説明するために本明細書で使用されるとき、「従来の」という用語は一般的に、幹細胞を動員するために慣例的に使用されてきた動員レジメンを指す。例えば、従来の動員レジメンは、Ｇ−ＣＳＦを含むか、またはこれからなり、骨髄区画から幹細胞を動員するために歴史的に使用されてきたレジメンを含む。かかる従来の動員レジメンは多くの場合、乏しい動員結果を伴い、多くの場合、長期間にわたり（例えば約５日間にわたり）行われる場合があり、患者を繰返される、長期にわたるアフェレーシス手技に供する。
【００７８】
慣例的な動員レジメンを使用して動員した幹細胞と比較して表現型的に独特であることに加えて、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、それらの機能特性の改善により特徴付けられる。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、それらの生着能力の改善により特徴付けられる。したがって、本明細書で開示する方法のある特定の態様は、投与したｈｅＨＳＣがレシピエント被験体の組織（例えば骨髄組織）に生着するように、必要とする被験体に単離した非ネイティブｈｅＨＳＣを投与するまたは他の方法で移植することを含む。本明細書で使用されるとき、「生着すること」および「生着」という用語は、ｈｅＨＳＣを（例えば注射により）動物に配置または投与することを指し、かかる配置または投与後、ｈｅＨＳＣはｉｎ  ｖｉｖｏで存続する。生着は、例えば進行中の血液細胞形成に寄与する移植したｈｅＨＳＣの能力により、またはかかるｈｅＨＳＣ移植後のドナーキメラ現象を評価することにより、容易に測定することができる。
【００７９】
幹細胞移植術の成功は、被験体の組織（例えば被験体の骨髄組織）において十分な量の移植幹細胞を生着する能力に依存する。本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、それらの生着能力の改善により特徴付けられ、したがって、本発明のある特定の態様は、本明細書で開示する非ネイティブの単離したｈｅＨＳＣを被験体に投与することによる、幹細胞および／もしくは前駆細胞障害または造血幹細胞および／もしくは前駆細胞の移植術を必要とする他の疾患を処置する方法に関する。
【００８０】
また、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、被験体の組織におけるそれらの生着後に、ドナーキメラ現象の向上または改善を達成するそれらの能力により特徴付けられる。例えば、図１で示すように、Ｇ−ＣＳＦで動員した幹細胞と比較して、ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＣＸＣＲ２アゴニスト（例えばＧＲＯβおよびそのアナログもしくは誘導体）と１つまたは複数のＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えばＡＭＤ−３１００およびそのアナログもしくは誘導体）との組み合わせで動員したｈｅＨＳＣの生着後に、ドナーキメラ現象における増大が観察される。本明細書で使用されるとき、「ドナーキメラ現象」という用語は、被験体におけるドナーｈｅＨＳＣの生着後に、かかるｈｅＨＳＣから生じた骨髄細胞の割合または百分率を指す。ある特定の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生着後のドナーキメラ現象は、例えば従来の動員レジメン（例えば、Ｇ−ＣＳＦまたは他の化学療法剤を含むかまたはこれからなる従来の動員レジメン）を使用して動員した同じ量または同様の量の幹細胞の生着後に観察されるドナーキメラ現象と比較して、増大されている。ある特定の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生着後のドナーキメラ現象は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。一部の実施形態では、かかるドナーキメラ現象は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれよりも多い。
【００８１】
ある特定の態様では、また、本明細書で開示するｈｅＨＳＣは、被験体における生着に際してＣＤ３４＋数の向上または改善を達成するそれらの能力により特徴付けられる。例えば、かかる生着したｈｅＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦまたは本明細書で説明する１つもしくは複数の化学療法剤と接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ＣＤ３４＋数の向上または改善を示す。一部の実施形態では、かかるＣＤ３４＋数は、例えばＧ−ＣＳＦで動員した幹細胞の生着後に観察されるＣＤ３４＋数と比較して、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、１５０％、２００％、３００％またはそれよりも多く増大している。一部の実施形態では、かかるＣＤ３４＋数は、例えばＧ−ＣＳＦで動員した幹細胞の生着後に観察されるＣＤ３４＋数と比較して、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍またはそれよりも多く増大している。
【００８２】
一部の実施形態では、また、被験体に単離した非ネイティブｈｅＨＳＣを投与することを含む、幹細胞もしくは前駆細胞障害または幹細胞の移植術を必要とする疾患を処置する方法であって、投与したｈｅＨＳＣが、被験体の組織（例えば被験体の骨髄区画）に生着し、これにより幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する、方法が、本明細書で開示される。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「処置する」、「処置」、「処置すること」または「好転  (amelioration)」という用語は、幹細胞障害、前駆細胞障害または幹細胞移植術を必要とする任意の疾患について使用される場合、一般的に、目的が、症状または状態の進行または重症度を逆転させるか、緩和するか、好転させるか、阻害するか、減速させるか、または停止させることである、状態のための療法的処置を指す。また、「処置すること」という用語は、状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害効果または症状を低減または緩和することを含む。処置は一般的に、状態または疾患の１つもしくは複数の症状または臨床マーカーが低減された場合、有効である。あるいは、処置は、状態の進行が低減または停止された場合、有効である。すなわち、処置は、症状またはマーカーの改善のみではなく、処置の非存在下で予測され得る症状の進行または悪化の休止または少なくとも減速も含む。有益な、または所望の臨床結果は、１つもしくは複数の症状（複数可）の緩和、欠陥の程度の縮減、例えば本明細書で説明する状態、疾患もしくは障害の安定化状態または本明細書で説明する状態、疾患もしくは障害の開始の遅延もしくは減速および処置の非存在下で予測される寿命と比較した寿命の増大を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、「投与すること」という用語は一般的に、意図される標的組織または作用部位（例えば被験体の骨髄組織）への本明細書で説明するｈｅＨＳＣの送達をもたらす方法または経路による、被験体へのかかるｈｅＨＳＣの配置（例えば被験体へのｈｅＨＳＣの非経口配置）を指す。ある特定の態様では、「投与すること」という用語は、例えば被験体の骨髄組織からのおよび被験体の末梢組織への造血幹細胞および／または前駆細胞の動員（例えば骨髄区画からの、および末梢区画、例えば末梢血液区画の１つまたは複数へのかかる造血幹細胞および／または前駆細胞の動員）のための、被験体への、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせの配置を指す。
【００８５】
本明細書で開示する単離した非ネイティブｈｅＨＳＣは、造血幹細胞および／または前駆細胞の移植術が望ましい任意の疾患、障害、状態または疾患、障害もしくは状態と関連付けられる合併症の処置に有用である。一部の実施形態では、本発明は、末梢血幹細胞移植術を必要とする疾患を処置する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、処置を必要とする被験体において幹細胞障害および前駆細胞障害を処置する方法を提供する。かかる幹細胞および前駆細胞障害の例として、血液悪性疾患および非悪性血液疾患が挙げられる。
【００８６】
一部の実施形態では、疾患、幹細胞障害または前駆細胞障害は、血液悪性疾患である。本明細書で説明するｈｅＨＳＣおよび方法で処置され得る血液悪性疾患の例として、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ球優勢結節性ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および若年性骨髄単球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
一部の実施形態では、疾患、幹細胞障害または前駆細胞障害は、非悪性障害である。本明細書で説明する方法およびｈｅＨＳＣで処置され得る非悪性疾患の例として、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、重度の再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、免疫血球減少症、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ファンコニー貧血、鎌状赤血球症、ベータサラセミアメジャー、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、家族性血球貪食性リンパ組織球症および他の組織球性障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ならびにウィスコット・アルドリッチ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「被験体」という用語は、任意のヒトまたは動物を意味する。ある特定の態様では、動物は、脊椎動物、例えば霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物である。霊長類として、チンパンジー、カニクイザル、クモザルおよびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。げっ歯類として、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物として、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科（feline）の種、例えばイエネコ、イヌ科（canine）の種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウならびに魚類、例えばマス、ナマズおよびサケが挙げられる。患者または被験体は、上記のうちの任意のサブセット（例えば上記の全て）を含むが、１つまたは複数の群または種、例えばヒト、霊長類またはげっ歯類を除外する。ある特定の実施形態では、被験体は、哺乳動物（例えば霊長類またはヒト）である。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、例えば血液悪性疾患の動物モデルを示す、例えば被験体として有利に使用することができる。加えて、本明細書で説明する方法は、家畜化された動物および／またはペットを処置するために使用することができる。被験体は、雄（男性）であっても、または雌（女性）であってもよい。
【００８９】
ある特定の実施形態では、被験体は、（例えば本明細書で説明する血液悪性疾患または非悪性疾患の）処置を必要とする本明細書で説明する状態、疾患、幹細胞障害もしくは前駆細胞障害またはかかる状態と関連する１つもしくは複数の合併症を患うかまたは有すると、以前に診断されたかまたは他の方法で特定され、かつ任意選択で、必ずではないが、状態または状態と関連する１つもしくは複数の合併症についての処置を既に受けた被験体であってもよい。あるいは、また、被験体は、処置の必要のある状態またはかかる状態と関連する１つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていない被験体であってもよい。むしろ、被験体は、状態または状態と関連する１つもしくは複数の合併症についての１つまたは複数のリスク因子を示す被験体を含み得る。
【００９０】
特定の状態（例えば幹細胞障害または前駆細胞障害）について処置の「必要のある被験体」は、その状態を有する被験体、その状態を有すると診断された被験体または所与の参照集団と比較してその状態を発症するリスクが高い被験体であってもよい。一部の実施形態では、本明細書で説明する処置方法は、血液悪性疾患、例えば本明細書で説明する血液悪性疾患と診断された被験体、これを有する疑いがある被験体またはこれを発症するリスクを有する被験体を選択することを含む。一部の実施形態では、本明細書で説明する方法は、非悪性疾患、例えば本明細書で説明する非悪性疾患と診断された被験体、これを有する疑いがある被験体またはこれを発症するリスクを有する被験体を選択することを含む。
【００９１】
本発明の他の態様では、本明細書で説明するｈｅＨＳＣは、本分野で開示する任意の従来法によりＨＳＣ細胞集団を得、本明細書で開示するｈｅＨＳＣについての１つまたは複数の細胞表面マーカーまたは遺伝子発現プロファイルについてＨＳＣ細胞集団を富化することにより生成することができる。一部の実施形態では、得たＨＳＣ細胞集団を、ＣＤ９３＋細胞について富化する。一部の実施形態では、ＨＳＣ細胞集団を、ＣＤ９３＋／ＣＤ３４−細胞について富化する。一部の実施形態では、ＨＳＣ細胞集団を、約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍またはそれよりも多く富化する。一部の実施形態では、細胞集団を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多い、所望の細胞表面マーカーまたは細胞発現パターンを含有する細胞を含有するように富化しても（例えばＣＤ９３＋細胞またはＣＤ９３＋／ＣＤ３４−細胞について富化しても）よい。任意の好適な手技（例えばＦＡＣＳソーティング）を、富化に使用することができる。
【００９２】
本発明の一部の態様は、ｉ）造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させて、候補生成物を生成することと、ｉｉ）ｈｅＨＳＣ生成物についての標的発現プロファイルを提供することと、ｉｉｉ）候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の標的発現プロファイルに適合するかどうかを決定することと、ｉｖ）候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の標的発現プロファイルに適合する場合、ｈｅＨＳＣ生成物として候補生成物をリリースする（release）こととを含む、ＨＳＣ生成物を製造する方法を対象とする。
【００９３】
一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ４８−細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ１５０＋細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ９３＋細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ３４−細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＯＰＮ＋細胞を含む。
【００９４】
「標的発現プロファイル」は、細胞集団におけるｈｅＨＳＣ細胞の存在またはｈｅＨＳＣ細胞のある特定の百分率を示す、トランスクリプトームおよび／または細胞表面マーカープロファイルを指す。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、１つまたは複数の細胞表面マーカーを有する候補生成物または富化候補生成物における少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多い細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ｈｅＨＳＣ生成物を示す候補生成物または富化候補生成物のトランスクリプトームプロファイルであってもよい。一部の実施形態では、トランスクリプトームプロファイルは、図３または図４で示すプロファイルと同様または実質的に同様であってもよい。
【００９５】
一部の実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００９６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である。
【００９７】
本発明の一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、被験体への移植に際して、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す。一部の実施形態では、生着能力は、少なくとも約２倍増大している。ある特定の実施形態では、かかる生着能力は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。
【００９８】
本発明の一部の実施形態では、被験体における生着に際して、ｈｅＨＳＣ生成物は、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す。一部の実施形態では、ドナーキメラ現象は、少なくとも約２倍増大している。ある特定の実施形態では、かかるドナーキメラ現象は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。一部の実施形態では、ドナーキメラ現象は、少なくとも約５０％増大している。
【００９９】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、非静止状態である。
【０１００】
一部の実施形態では、ＨＳＣ生成物を製造する方法は、１つもしくは複数の細胞表面マーカーおよび／または１つもしくは複数の遺伝子発現プロファイルについて候補生成物を富化するステップを追加的に含む。任意の好適な富化方法を使用することができる。一部の実施形態では、方法は、ＦＡＣＳである。
【０１０１】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、天然に存在するＨＳＣと比較して、少なくとも１つの独特なトランスクリプトームまたは１つの独特な表現型を含む。
【０１０２】
本発明の一部の態様では、ｈｅＨＳＣ生成物は、ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換されている。一部の実施形態では、発現ベクターは、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、少なくとも４０％のＣＤ９３＋細胞を含む。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、少なくとも約２×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞は、ヒトまたはマウス細胞である。
【０１０４】
本発明の別の態様は、ｉ）造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させて、候補生成物を生成することと、ｉｉ）ｈｅＨＳＣ生成物についての標的発現プロファイルを提供することと、ｉｉｉ）候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の標的発現プロファイルに適合するかどうかを決定することと、ｉｖ）候補生成物がｈｅＨＳＣ生成物の標的発現プロファイルに適合する場合、それを必要とする被験体に候補生成物を投与することとを含む、幹細胞障害または前駆細胞障害を処置する方法を対象とする。
【０１０５】
一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋およびＬｉｎ−（ＳＫＬ）細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ４８−細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ１５０＋細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ９３＋細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＣＤ３４−細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ＯＰＮ＋細胞を含む。
【０１０６】
「標的発現プロファイル」は、細胞集団におけるｈｅＨＳＣ細胞の存在またはｈｅＨＳＣ細胞のある特定の百分率を示す、トランスクリプトームおよび／または細胞表面マーカープロファイルを指す。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、１つまたは複数の細胞表面マーカーを有する候補生成物または富化候補生成物における少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多い細胞を含む。一部の実施形態では、標的発現プロファイルは、ｈｅＨＳＣ生成物を示す候補生成物または富化候補生成物のトランスクリプトームプロファイルであってもよい。一部の実施形態では、トランスクリプトームプロファイルは、図３または図４で示すプロファイルと同様または実質的に同様であってもよい。
【０１０７】
一部の実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニスト、および少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、α９β１アンタゴニスト、α９β１インテグリン／ＶＬＡ−４アンタゴニストまたはそれらの組み合わせと接触させることは、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、接触させることは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１０８】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβ−Δ４またはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストは、ＧＲＯβまたはそのアナログもしくは誘導体であり、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレリキサフォルまたはそのアナログもしくは誘導体である。
【０１０９】
本発明の一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、被験体への移植に際して、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、生着能力の増大を示す。一部の実施形態では、生着能力は、少なくとも約２倍増大している。ある特定の実施形態では、かかる生着能力は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。
【０１１０】
本発明の一部の実施形態では、被験体における生着に際して、ｈｅＨＳＣ生成物は、Ｇ−ＣＳＦ、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた同じ量の造血幹細胞の生着と比較して、ドナーキメラ現象の増大を示す。一部の実施形態では、ドナーキメラ現象は、少なくとも約２倍増大している。ある特定の実施形態では、かかるドナーキメラ現象は、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍またはそれよりも多く増大している。一部の実施形態では、ドナーキメラ現象は、少なくとも約５０％増大している。
【０１１１】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、非静止状態である。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＨＳＣ生成物を製造する方法は、１つもしくは複数の細胞表面マーカーおよび／または１つもしくは複数の遺伝子発現プロファイルについて候補生成物を富化するステップを追加的に含む。任意の好適な富化方法を使用することができる。一部の実施形態では、方法は、ＦＡＣＳである。
【０１１３】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、化学療法剤またはそれらの組み合わせと接触させた造血幹細胞と比較して、独特なトランスクリプトームを含む。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、Ｇ−ＣＳＦを使用して動員した造血幹細胞が発現する１つまたは複数の遺伝子と比較して、Ｆｏｓ、ＣＤ９３、Ｆｏｓｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｊｕｎ、Ｄｕｓｐ６、Ｃｄｋ１、Ｆｉｇｎｌ１、Ｐｌｋ２、Ｒｓａｄ２、Ｓｇｋ１、Ｓｄｃ１、Ｓｅｒｐｉｎｅ２、Ｓｐｐ１、Ｃｄｃａ８、Ｎｒｐ１、Ｍｃａｍ、Ｐｂｋ、Ａｋｒ１ｃ１およびＣｙｐ１１ａ１からなる群より選択される遺伝子のうちの１つまたは複数を差次的に発現する。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、天然に存在するＨＳＣと比較して、少なくとも１つの独特なトランスクリプトームまたは１つの独特な表現型を含む。
【０１１４】
本発明の一部の態様では、ｈｅＨＳＣ生成物は、ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されている。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、ポリヌクレオチドを発現するように発現ベクターで形質転換されている。一部の実施形態では、発現ベクターは、レトロウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドを含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、少なくとも４０％のＣＤ９３＋細胞を含む。一部の実施形態では、ｈｅＨＳＣ生成物は、少なくとも約２×１０６個の細胞を含む。一部の実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞は、ヒトまたはマウス細胞である。
【０１１６】
一部の実施形態では、幹細胞障害または前駆細胞障害は、悪性血液疾患である。一部の実施形態では、悪性血液疾患は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、リンパ球優勢結節性ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および若年性骨髄単球性白血病からなる群より選択される。一部の実施形態では、幹細胞障害または前駆細胞障害は、非悪性疾患である。一部の実施形態では、非悪性疾患は、骨髄線維症、骨髄異形成症候群、アミロイドーシス、重度の再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、免疫血球減少症、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、慢性炎症性脱髄性多発根神経障害、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ファンコニー貧血、鎌状赤血球症、ベータサラセミアメジャー、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、家族性血球貪食性リンパ組織球症および他の組織球性障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ならびにウィスコット・アルドリッチ症候群からなる群より選択される。
【０１１７】
ある特定の態様では、本明細書で説明するｈｅＨＳＣは、キットの形態で提供することができる。例えば、キットは、１つまたは複数の単離した非ネイティブｈｅＨＳＣおよび必要とする被験体へのかかるｈｅＨＳＣの使用または投与に関する情報材料または教材を含み得る。一部の実施形態では、かかるキットは、少なくとも１つのＣＸＣＲ２アゴニストと、少なくとも１つのＣＸＣＲ４アンタゴニストと、それらを被験体に投与して、造血幹細胞および／または前駆細胞を動員および／または回収し、それによって本明細書で開示する単離したｈｅＨＳＣを調製するための指示とを含み得る。
【０１１８】
本発明はその適用において、説明に記載したまたは例示した詳細に、限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態を包含し、様々な様式で実施または実行することができる。また、本明細書で使用する語法および用語法は、説明の目的のためであり、限定としてみなされるべきではないことが理解されるべきである。
【０１１９】
本発明のある特定の作用物質、化合物、組成物および方法は、ある特定の実施形態に従って特異的に説明されているが、以下の実施例は、本発明の方法および組成物を例示するためにのみ働き、これを限定するとは意図されない。
【０１２０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書でおよび特許請求の範囲で使用されるとき、明らかに反対のものが示されない限り、複数の指示物を含むと理解するべきである。群の１つまたは複数のメンバーの間に「ｏｒ」を含む特許請求の範囲または説明は、反対のものが示されない限り、または文脈からそうではないことが明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、２つ以上または全てが所与の生成物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別途関連する場合、満たされると考えられる。本発明は、群のうちのまさに１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別途関連する実施形態を含む。また、本発明は、２つ以上または全ての群のメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在するか、使用されるか、または別途関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、そうではないことが示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じ得ることが当業者に明らかでない限り、列挙される特許請求の範囲のうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、節、説明用語などが同じ基礎の特許請求の範囲（または関連として任意の他の特許請求の範囲）に依存して別の特許請求の範囲に導入される、全ての変形、組み合わせおよび並べ替えを包含すると理解するべきである。要素が（例えばマーカッシュ群または同様の形式で）リストとして示される場合、要素の各下位群もまた開示され、任意の要素（複数可）は群から除去してもよいことが理解されるべきである。一般的に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特長などを含むことが言及される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、かかる要素、特長などからなるか、または本質的にこれらからなることを理解するべきである。簡潔にするために、それらの実施形態は、各場合において、本明細書であまり多くの単語で具体的に示されていない。また、本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が明細書で列挙されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲から明確に除外することができることを理解するべきである。本発明の背景を説明するために、かつその実施について追加の詳細を提供するために本明細書で参照する出版物および他の参照材料は、参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１  迅速レジメン）
造血動員における未だに存在する欠損に取り組むために、本発明者らは、有効な代替法は、複数回の注射を必要とせず、動員ピーク速度論がより予測可能であり、向上したＣＤ３４＋数および移植に際しての向上した造血機能をもたらす、迅速動員剤の使用であると考える。可能性を有する１つの作用物質は、ＣＸＣＲ２アゴニスト、ＧＲＯβである。ＧＲＯβおよびＧＲＯβ−Δ４（本明細書で集合的に「ＧＲＯβ」と呼ばれる）は、全てのクラスの短期前駆細胞および長期再増殖性細胞を含む、造血幹細胞（ＨＳＣ）を迅速に動員する。マウスにおいて、ＧＲＯβで誘導される動員ピークは、投与の１５〜３０分以内に起こる。さらに、ＧＲＯβ投与後に観察される動員がより速いのみでなく、本発明者らは、少なくとも、動員した幹細胞の生着能力の改善（例えばＣ−ＧＳＦを含む動員レジメンを使用して動員した幹細胞と比較して、骨髄区画から動員した幹細胞の、例えば２倍高い生着能力）およびかかる動員した幹細胞の生着後に観察されるドナーキメラ現象の点から見て、幹細胞の質もまたより高いと考えている。
【０１２２】
これを評価するために、本発明者らは、マウスの大コホート（１群当たり１５〜２０匹）をＧ−ＣＳＦ（１２５μｇ／ｋｇ／日、５日間）またはＧＲＯβ（２．５ｍｇ／ｋｇ）とプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）（５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせのいずれかで動員し、その後、末梢血を分類して高精製ＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞（ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎｅａｇｅ陰性）を得た。
【０１２３】
２つの別々の実験で、本発明者らはその後、（ａ）３００，０００個の全骨髄競合物に対して１９０個のＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞または（ｂ）３００，０００個の全骨髄競合物に対して５０個のＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞のいずれかを競合的に移植した。この実験設計は、動員され得る補助細胞集団（例えば非ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎｅａｇｅ陰性細胞）とは独立した、動員したＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞の生着能力の直接的評価を可能にし、かつＧ−ＣＳＦで動員したドナーまたはＧＲＯβ＋プレリキサフォルで動員したドナーいずれかからの同じ数のＨＳＣが放射線照射レシピエントに導入されるようにＨＳＣ含有量を正規化した。両方の組の実験において図１および２で示すように、ＧＲＯβとプレリキサフォルとの組み合わせにより動員したＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞は、Ｇ−ＣＳＦにより動員した細胞と比較して、優れた生着能力（２倍大きい）を示した。これは、正確に同じ数の表現型的に定義された（ＳＬＡＭ  ＳＫＬ）ＨＳＣを移植したときでさえも明らかであった。
【０１２４】
（実施例２  トランスクリプトームシグネチャー）
過去１０年間にわたり、異なる系統アウトプット、再増殖速度論、寿命の長さを有し、かつおそらく恒常的血液生成に寄与するＨＳＣの中での移植術において生着可能な単位であるＨＳＣとの差を有するＨＳＣを特定することにより、造血幹細胞（ＨＳＣ）プールは機能的に不均一であるという証拠が増加してきている。しかしながら、今日までに、不均一性を研究するために異なるＨＳＣ集団を先を見越して単離する信頼できる方法はない。むしろ、利用可能なデータの多くは、クローン追跡、単細胞移植術などに基づいて得られている。
【０１２５】
砂金採りのように、本発明者らは、血液から不均一なＨＳＣ集団を単離するための「生物学的ふるい」として、ＧＲＯβおよびプレリキサフォルを使用した動員レジメンとＧ−ＣＳＦを使用したレジメンとの差次的動員特性をここで使用することができる。これらの差次的動員特性により、本発明者らは、細胞を破壊することなく、さらなる機能分析のために本明細書で生着性の高いＨＳＣ（ｈｅＨＳＣ）集団と呼ばれる集団を先を見越して単離することができ、かつさらなる分子特徴付けのために公知の予測可能な機能を有する異なるＨＳＣ集団（ｈｅＨＳＣ）を先を見越して単離することができる。
【０１２６】
概念の予備的証拠として、かつ本明細書で説明するアプローチの実行可能性を示すために、実施例１で説明するように、Ｇ−ＣＳＦで、またはＧＲＯβとプレリキサフォル（ＡＭＤ−３１００）との組み合わせで処置または動員したマウスの大コホートから、ＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞を分類した。
【０１２７】
本研究では、２００個の細胞を、５μＬのＴＣＬ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、１０３１５７６番）に直接的に分類した。Ｓｍａｒｔ−Ｓｅｑ２プロトコール（Picelliら、２０１３年）、および続くＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００によるＲＮＡシークエンシングにより、ライブラリー調製を行った。Ｇ−ＣＳＦ動員血液およびＧＲＯβ＋プレリキサフォル動員血液からのＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞に加えて、定常状態骨髄、Ｇ−ＣＳＦ処置マウス群からの骨髄、ＧＲＯβ＋プレリキサフォル処置マウスからの骨髄およびＧＲＯβ（３５０ｎｇ／ｍｌ）＋ＡＭＤ−３１００（１０μｇ／ｍｌ）を加えたＧ−ＣＳＦ動員血液からなる「薬物スパイク」対照（１５分間にわたり、以前のＰＫデータに基づく濃度）を含む、追加の対照試料をシークエンシングし、続いてＦＡＣＳソーティングのために下流の加工処理を行った。これにより、本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦ動員ＨＳＣから単離したものに由来するｈｅＨＳＣと、処置および非処置マウスの骨髄に由来するＨＳＣと、薬物対照とを直接比較し、特異的な差次的動員効果に起因しない、ＧＲＯβ＋プレリキサフォルが遺伝子シグネチャーに対して有し得たあらゆる直接的効果を説明することが可能になった。図３で示すように、ＲＮＡＳｅｑデータを続いて分析した。
【０１２８】
驚くべきことに、図４で示すように、ＧＲＯβ＋プレリキサフォル動員末梢血からの高精製ＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞は、Ｇ−ＣＳＦにより動員したＨＳＣならびに処置または非処置骨髄からのＨＳＣおよび薬物スパイク対照からのＨＳＣと比較して、例えば初期系統幹細胞のマーカーであるＣＤ９３の発現を含む、独特なトランスクリプトームシグネチャーを示した。本発明者らは、上記研究は、予測可能な差次的ＨＳＣ動員の最初の実証であり、優れた臨床的利用性を有するｈｅＨＳＣ細胞を単離するための新しい方法を提供すると考える。
【０１２９】
（実施例３  独特な幹細胞集団の発生）
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生涯の血液細胞生成の頂点にある。最近のクローン分析研究は、ＨＳＣは機能的に不均一であり、恒常的生成に寄与するＨＳＣは移植中に生着するＨＳＣとは区別され得ることを示唆する。本発明者らは、独特なＣＸＣＲ２アゴニスト（Ｎ末端を短縮したＭＩＰ−２ａ）およびＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ−３１００を利用する迅速な動員レジメンを開発した。両方の作用物質を一緒に単回で皮下注射すると、マウスにおける迅速な動員をもたらし、血中前駆細胞含有量は１５分以内にピークに達した。
【０１３０】
観察された動員は、Ｇ−ＣＳＦの５日間レジメンと同等であり、相乗的シグナル伝達の結果であり、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ２ノックアウトマウスではブロックされ（受容体および機構特異性を確証する）、好中球からのＭＭＰ−９の相乗的放出により引き起こされ、これは、ＭＭＰ−９ノックアウトマウス、抗ＭＭＰ−９抗体で処置したマウス、ＴＩＭＰ−１トランスジェニックマウスまたは抗ＧＲ−１抗体を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで好中球を枯渇させたマウスではブロックされた。マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点画像化は、動員レジメンが、末梢血への造血退出のための「出入口の開放」である骨髄の血管透過性における迅速かつ一過的な増大を引き起こしたことを示した。
【０１３１】
迅速レジメンからの２×１０６個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の移植術は、Ｇ−ＣＳＦ動員移植片と比較して、好中球および血小板の、それぞれ４または６日速い回復をもたらした（１群当たりｎ＝１２匹のマウス、Ｐ＜０．０１）。限界希釈の競合的移植において、迅速レジメンは、競合性における２倍を超える向上を示した（処置群当たりｎ＝３０匹のマウス、２回の個々の実験、Ｐ＜０．００１）。加えて、二次的に移植したマウスにおいて、Ｇ−ＣＳＦで動員した移植片が静止状態のままであった一方で、迅速動員した移植片の競合性は、キメラ現象への寄与により測定されるように、増大した（１群当たりｎ＝１６匹のマウス、Ｐ＜０．０１）。驚くべきことに、迅速動員した移植片による短期および長期生着の両方における堅固な向上にもかかわらず、高精製ＨＳＣ集団であるＣＤ１５０＋ＣＤ４８−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋Ｌｉｎｅａｇｅ  ｎｅｇ（ＳＬＡＭ  ＳＫＬ）細胞についての動員したマウスの血液の表現型分析は、Ｇ−ＣＳＦ群より少ない数の表現型的に定義されたＨＳＣを示した。
【０１３２】
上記データは、Ｇ−ＣＳＦと比較して、「生着性の高い」ＨＳＣ（ｈｅＨＳＣ）の独特なサブセットが、Ｎ末端を短縮したＭＩＰ−２ａおよびＡＭＤ−３１００を含む迅速レジメンにより動員されることを示唆する。しかしながら、本発明者らの初期研究は全ＰＢＭＣ画分（臨床アフェレーシス生成物に類似する）を含有する移植片を使用して行われたので、本発明者らは、ｈｅＨＳＣの向上した生着能力への補助細胞の寄与の可能性を排除することはできなかった。
【０１３３】
（実施例４  長期効果）
３回の独立した実験における、実施例３で示した結論に続いて、本発明者らは、マウスの大コホートを、Ｎ末端を短縮したＭＩＰ−２ａ（２．５ｍｇ／ｋｇ）およびＡＭＤ−３１００（５ｍｇ／ｋｇ）を含む迅速レジメンまたはＧ−ＣＳＦ（１２５μｇ／ｋｇ／日、５日間）で動員し、ＰＢＭＣ画分からＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞を分類し、迅速レジメンまたはＧ−ＣＳＦいずれかからの同数のＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞（１９０個または５０個）を競合的に移植し、キメラ現象への寄与を３６週間にわたり追跡した。注目すべきことに、迅速レジメンからのｈｅＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ群からのＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞と比較して競合性における２倍の向上を示した（１群当たりｎ＝１１匹のマウス、Ｐ＜０．０００４）。図１を参照されたい。
【０１３４】
（実施例５  分子細胞ソーティングおよびシグネチャー決定）
ＨＳＣ不均一性についての理解は増大してきているが、分子不均一性を研究するために、公知の生物学的機能を有する異なるＨＳＣ集団を先を見越して単離するための方法はない。本発明者らは、血液から不均一なＨＳＣ集団を単離するために、本発明者らの迅速レジメンおよびＧ−ＣＳＦの差次的動員特性を使用することを求めた。本発明者らは、迅速レジメンまたはＧ−ＣＳＦで動員したマウスからＳＬＡＭ  ＳＫＬ細胞を再びフロー分類し、精製集団のＲＮＡＳｅｑ分析を行った。迅速レジメンにより動員したｈｅＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦで動員したＨＳＣまたは骨髄から得たランダムＨＳＣと比較して、独特なトランスクリプトームシグネチャーを有した（Ｐ＜０．０００００１）。際立ったことに、遺伝子セット富化分析（ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＳＥＡ）は、ｈｅＨＳＣが、胎児肝臓ＨＳＣの遺伝子シグネチャーに非常に顕著にクラスター化される遺伝子シグネチャーを有することを示し、生着性の高い幹細胞のサブセットの選択的回収をさらに示した。本研究者らの結果は、１日で、Ｇ−ＣＳＦと比較して優れた生着特性を有する移植片を動員することができ、かつ堅固な長期生着が可能な未成熟な分子表現型を有する新しいｈｅＨＳＣ集団を選択的に動員する、新しい動員ストラテジを機構的に規定する。
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以下の「ＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ由来である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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