(57)【要約】  本発明は、少なくとも５００μｍの粒径を有する生物活性ガラスの粒子を含み、該生物活性ガラスの組成は、４５〜５９重量％のＳｉＯ２、１８〜２５重量％のＮａ２Ｏ、１７〜２５重量％のＣａＯ％および０．１〜６重量％のＰ２Ｏ５である多孔質本体と、生体適合性ポリマーからなり、少なくとも部分的に身体の周りに配置された、厚さ１０μｍ〜２００μｍのフィルムと、を含む骨インプラントに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  少なくとも５００μｍの粒径を有する生物活性ガラスの粒子を含み、該生物活性ガラスの組成は、４５〜５９重量％のＳｉＯ２、１８〜２５重量％のＮａ２Ｏ、１７〜２５重量％のＣａＯ％および０．１〜６重量％のＰ２Ｏ５である多孔質本体と、
−  生体適合性ポリマーからなり、少なくとも部分的に前記本体の周りに配置された、厚さ１０μｍ〜２００μｍのフィルムと、
を含む骨インプラント。
【請求項２】
インプラントが移植された状態で、筋肉、筋膜または骨膜と接触している本体の部分を覆うように、前記フィルムが前記本体の周囲に配置されている請求項１に記載の骨インプラント。
【請求項３】
前記ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ乳酸・グリコール酸共重合、ポリカプロラクトン、天然コラーゲンポリマーからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載の骨インプラント。
【請求項４】
前記生物活性ガラスの粒子の粒径は５００〜３１５０μｍである請求項１乃至３のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項５】
前記フィルムの厚さは１００〜２００μｍである請求項１乃至４のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項６】
前記フィルムは生物活性ガラスを含む請求項１乃至５のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項７】
前記フィルムの生物活性ガラスは平均粒子径４５μｍ未満の粒子を含む請求項６に記載の骨インプラント
【請求項８】
前記生物活性ガラスの組成は、４５〜５４重量％のＳｉＯ２、２２〜２５重量％のＮａ２Ｏ、１９〜２５重量％のＣａＯおよび３．５〜６重量％のＰ２Ｏ５である請求項１乃至７のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項９】
前記生物活性ガラスの組成は、５３重量％のＳｉＯ２、２３重量％のＮａ２Ｏ、２０重量％のＣａＯおよび４重量％のＰ２Ｏ５である請求項１乃至８のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項１０】
前記本体はディスク状に形成されており、前記フィルムは前記ディスクの側面に配置されている請求項１乃至９のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項１１】
前記本体は、焼結生物活性ガラス粒子から形成されている請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項１２】
前記本体は、生分解性ポリマーによって保持された生物活性ガラス粒子から形成されている請求項１乃至９のいずれか一項に記載の骨インプラント。
【請求項１３】
前記生分解性ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、コラーゲンおよびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１２に記載の骨インプラント。
【請求項１４】
生物活性ガラスの粒子を含む多孔質本体を形成すること、
生体適合性ポリマーからなるフィルムを少なくとも部分的に多孔質本体の周囲に配置すること、および
前記組み合わせたものを生体適合性ポリマーのガラス転移温度まで加熱することを備えた請求項１乃至１３の何れか一項に記載の骨インプラントの製造方法。
【請求項１５】
前記生物活性ガラスの粒子を含む多孔質本体は、金型と、焼結およびポリマー結合材料のうちの１つとを使用して製造される請求項１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨インプラントに関する。より具体的には、本発明は骨の全体部を置換することに有用な骨インプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
重大な骨の欠陥の治療と非結合は困難な課題であり、通常、自家移植骨の移植を必要とする。自家移植骨は最も一般的な移植組織の１つであるが、特に子供や高齢者の患者においては供給が限定される等の不利益がある。骨の採取はまたドナー部位の痛みを生じさせそして採取部位の感染および採取部位での骨の再形成における問題のような他の問題を導き得る。生物活性ガラス（ＢＡＧ）ならびに硫酸カルシウムおよびリン酸カルシウムをベースとする合成材料を含む、様々な代用骨が利用可能である。これらの代用骨は、骨形成性、骨形成促進性および骨伝導性特性、ならびに骨形成と成長に影響を及ぼす能力において相違する。
【０００３】
機能回復と骨幹骨欠陥（diaphyseal bone defects）の骨再生はいぜん臨床上の大きな問題である。2000年に、Masqueletとその共同研究者らは、骨幹骨欠損の治療のための2段階法を導入した。これは誘導膜法（membrane-technique）と網状組織の自家移植片（cancellous autografts）の使用を組み合わせたものである。これは今日Masquelet法として知られている。
【０００４】
Masquelet法の第一の手術では、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）スペーサーを骨欠損に挿入する。挿入後、擬似滑膜（a pseudo-synovial membrane）が続いてスペーサーの周りに形成される。第二の手術でスペーサーは取り除かれ、そして欠損は網状組織の自家移植片を用いて再建される。しかしながら、誘導された膜は、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）分泌を増加すると知られているが、誘導能は時間と共に連続的に減少することが観察されている。さらに、この技術は、骨再形成のために効率的なものではあるが、患者に２つの手術を必要とする。
【０００５】
骨組織工学の分野では、合成ポリマーからなる分解性の生体適合性複合材料、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、またはリン酸カルシウムセラミックまたは生物活性ガラス（ＢＡＧs）と組み合わされた動物由来ポリマーであるコラーゲンが多く研究されている。
【０００６】
いくつかのＢＡＧは、それらが骨伝導性および骨刺激性を有するので、骨代替物として使用するのに適している。これらの特性は、移植直後に始まるガラス表面での溶解プロセスに依存する。反応は急速なナトリウム水素イオン交換とそれに続くシリカの溶解および再重合から始まり、それに続いてガラス表面での核形成及びリン酸カルシウムからヒドロキシアパタイトへの結晶化が起こる。表面反応は、ｐＨの上昇および浸透圧の上昇を引き起こし、それは、ＢＡＧ−Ｓ５３Ｐ４（その組成は以下に示される）について観察される抗菌特性を説明する。
【０００７】
ポリ（α−ヒドロキシエステル）の分解生成物は酸性であり、移植された材料の近傍ではその後ｐＨが低下する。酸性または他の種類の分解生成物は周囲の組織に炎症反応を引き起こす可能性がある。しかしながら、多くの分解性ポリマーは骨形成活性および血管形成活性を欠いている。
【０００８】
既存の血管からの血管の成長を含む血管新生は骨形成の前提条件である。それは、血液形成過程において中心的な役割を果たすことが知られている血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、マルチタスクサイトカイン等の成長因子だけではなく、酸素と、成熟および前駆内皮細胞、白血球および血小板のようないくつかの細胞型に関係する複雑な現象である。
【０００９】
米国特許出願公開第２０１４／０２７７５７８号明細書は、耐荷重適用の欠陥を修復するための生分解性複合骨格を開示している。それは、ポリマー層によって囲まれた、概ね共整列した生分解性ガラス繊維のコアを含む。繊維は、４０〜４２５μmの粒径を有する生分解性ガラス粒子と置換わることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０２７７５７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、上述の課題の少なくとも一部を解決することである。
例えば、本発明は、自家骨の使用を必要としない骨移植材料を提供することを目的とし、それにより骨の採取、骨採取に関連する合併症および術後の痛みの問題を回避する。
他の目的は、従来公知であるMasquelet法がするような第二の手術を必要としない材料を提供することである。
実際に、使用が簡単で安全で、１回の外科手術しか必要とせず、例えば、外科手術に関連する術後感染症の合併症および抗菌効果によるその他の合併症の危険性を減少させながらも患者の苦痛および不快感を少なくする骨インプラント材料を提供することが目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明にかかる骨インプラントは、
−  少なくとも５００μｍの粒径を有する生物活性ガラスの粒子を含み、該生物活性ガラスの組成は、４５〜５９重量％のＳｉＯ２、１８〜２５重量％のＮａ２Ｏ、１７〜２５重量％のＣａＯ％および０．１〜６重量％のＰ２Ｏ５である多孔質本体と、
−  生体適合性ポリマーからなり、少なくとも部分的に本体の周りに配置された、厚さ１０μｍ〜２００μｍのフィルムと、を含む。
【００１３】
本発明は、また、前記骨インプラントの製造方法に関し、
生物活性ガラスの粒子を含む多孔質本体を形成すること、
生体適合性ポリマーからなるフィルムを少なくとも部分的に多孔質本体の周囲に配置すること、および
前記本体とフィルムとを組み合わせたものを生体適合性ポリマーのガラス転移温度まで加熱することを備えている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、一実施形態による骨に移植された骨インプラントを概略的に示す。
【図２Ａ】図２Ａは、他の実施形態による骨に移植された骨インプラントを概略的に示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、他の実施形態による骨に移植された骨インプラントを概略的に示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、他の実施形態による骨に移植された骨インプラントを概略的に示す。
【図３Ａ】図３Ａは、一実施形態による骨インプラントの実用的な使用を概略的に説明する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、一実施形態による骨インプラントの実用的な使用を概略的に説明する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、一実施形態による骨インプラントの実用的な使用を概略的に説明する。
【図４Ａ】図４Ａは、他の実施形態による骨インプラントの別の実用的な使用を概略的に示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、他の実施形態による骨インプラントの別の実用的な使用を概略的に示す。
【図５】図５は、他の実施形態による骨インプラントのさらに別の実用的な使用を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（定義）
本出願で使用される用語は、他に定義されない限り、１９８６年のバイオマテリアルに関するコンセンサス会議で合意されたものである(以下を参照のこと。）。
「Williams, DF (ed.): Definitions in biomaterials: Proceedings of a consensus conference of the European Society for Biomaterials, Chester, England. March 3-5, 1986. Elsevier, Amsterdam 1987, and Williams DF, Black J, Doherty PJ. Second consensus conference on definitions in biomaterials. In: Doherty PJ, Williams RL, Williams DF, Lee AJ (eds). Biomaterial-Tissue Interfaces. Amsterdam: Elsevier, 1992.」
【００１６】
本出願において、生物活性材料とは、生物学的活性を引き出す、又は調節するように設計されている材料を意味する。生物活性材料は、多くは、哺乳動物の組織と化学的に結合することができる界面活性材料である。
【００１７】
この状況において、吸収可能（resorbable）という用語は、長期にわたる移植時において哺乳動物の体内に挿入されたとき、および生理学的環境と接触したときに、材料が崩壊する、すなわち分解することを意味する。
特に、吸収性ガラス（resorbable glass）という用語は、生理学的環境と接触したときにその表面にヒドロキシルカ−ボネートアパタイト層を形成しないシリカリッチガラスを意味する。吸収性ガラスは吸収によって体から消え、その分解／溶解過程の間に細胞または細胞増殖を著しく活性化することはない。
【００１８】
生体材料とは、生体の組織、器官または機能を評価、処理、増強または置換するために生物学的システムと相互作用することを意図した材料を意味する。生体適合性とは、特定の場所で適切な宿主反応を引き起こすことによって安全かつ十分に機能する医療デバイス中で使用される材料の能力を意味する。吸収とは、生体材料の分解を意味する。複合材料とは、例えば、ポリマー及びガラスのようなセラミック材料等のように少なくとも２つの異なる成分を含む材料を意味する。
【００１９】
粒子という用語は、不規則な形をしていて特定の大きさを持つ実体を指す。粒子は繊維とは相違し、繊維は長さおよび直径を有すると定義され、直径はその長さに対して横方向の繊維の最大寸法である。繊維は、繊維の直径の少なくとも約１０倍の長さ方向の寸法を有する。粒径という用語は、粒子の最大寸法を指す。顆粒とは、任意の規則的または不規則な形状を有する粒子を意味する。
【００２０】
本明細書において、略語ｗｔ−％は重量パーセントを表し、典型的には総重量の重量パーセントとして表される。分子量は平均分子量であり、ここでは数平均分子量であり、ｇ／ｍｏｌとして表される。
【００２１】
本発明にかかる骨インプラントは、
−少なくとも５００μｍの粒径を有する生物活性ガラスの粒子を含む多孔質本体であって、前記生物活性ガラスの組成は、４５〜５９重量％のＳｉＯ２、１８〜２５重量％のＮａ２Ｏ、１７〜２５重量％のＣａＯ％および０．１〜６重量％のＰ２Ｏ５、と、
−生体適合性ポリマーであって少なくとも部分的に身体の周りに配置された、厚さ１０μｍ〜２００μｍのフィルムと、を含む。
【００２２】
本発明は、すなわち、生物活性ガラスとポリマーフィルムとを組み合わせた骨インプラントを提供する。薄いフィルム厚（２００μｍ未満）を有するポリマーフィルムと大きい粒子サイズ（５００μｍ超）との組み合わせは相乗効果をもたらす。実際、ポリマーフィルムは、十分な速さの吸収およびその後の組織の内部成長を可能にするのに十分なほど薄い。本インプラントが使用されるためには、大きな粒子が大きい欠陥のために大きな粒子が必要である。実際、小さい粒子は反応性が高すぎ、周囲の組織を刺激する危険性があるため、粒子はより大きいことが要求される。
一実施形態によれば、少なくとも大部分の粒子は、１０００μｍ（１ｍｍ）を超える粒径を有している。例えば、粒子の全量の７０、８０、９０または９５重量％を超えるものが１０００μｍを超える粒径を有している。本出願において、大きな欠陥とは、１０ｃｃ（立方センチメートル）以上のサイズを有する欠陥を意味する。欠陥は、例えば、２０ｃｃ以上の大きさを有することができ、またはさらに大きくてもよい。
【００２３】
骨インプラントは、Masquelet法の材料として使用するのにも特に適している。実際、ＢＡＧ自体は、疑似滑膜の形成に必要な一定量の正の刺激を生じ、そしてこの効果はポリマー材料によってさらに増強される。したがって、ＢＡＧおよびポリマー材料は、骨インプラントが移植されたときにそれらが共に疑似滑膜の形成に影響を与えるように選択される。
骨インプラントは、骨欠陥への移植のためのものであるが、骨欠陥は、事故や外科手術によって引き起こされる可能性があるものであるか、または対象の成長中に形成されたものであってもよい。実際、骨欠陥は、例えば、骨の一部が除去されなければならないほどに砕かれている深刻な事故によって、または骨の一部の除去を必要とする癌などの病気のために引き起こされ得る。
【００２４】
誘導膜Masquelet法では、第二の手術は通常４〜８週間の間に行われる。
誘導された膜は骨形成への改善効果を有するが、しかしそれは時間と共に減少するようである。第二段階の手術を行うのに最適な時期は、インプラント移植後6週間以内であると考えられる。
現在の結果（後述する実施例を参照）によれば、ＶＥＧＦ発現に対するＰＭＭＡの誘導能力は、ほとんどの手術が行われる８週間で最も低いと考えられる。したがって、本骨インプラントはMasquelet法で伝統的に使用されているのと同じ方法で使用することができる材料を提供するが、第二の手術は必要とされない。基本的に感染や創傷の合併症のリスクの半分は単に2度目の手術が必要ないという理由で避け得るため、最終的な結果を著しく改善する。
さらに、ＢＡＧは典型的には抗菌特性を有するため、最初の手術、すなわち骨インプラントの移植後でさえも感染の危険性が減少する。したがって、全体的なコストは大幅に低くなり、患者の満足度は高まると考えられる。
【００２５】
実際、研究においてＢＡＧを（後述される実施例に記載のとおり）分解性ポリマー（ＰＬＧＡ：ポリ乳酸・グリコール酸共重合体）でコーティングすることは、誘導された膜が形成されるまでＢＡＧの周囲組織との反応を遅らせ、それによってＢＡＧの吸収を防ぐことが目的であった。ポリマーが吸収され、残ったものはＢＡＧを取り囲む誘導膜であり、誘導膜からの成長因子分泌が最も高い時点でＢＡＧの好ましい反応を開始したことが観察された。このことは、上述のとおり、Masqueletによって二段階手術が一段階の手術に短縮されたことを示す。
【００２６】
骨インプラントはまた、イオン溶解生成物の放出を介して骨形成および血管形成をさらに促進するために、マグネシウム、フッ素、ホウ素、銅、コバルト、銀、亜鉛およびストロンチウムなどの他の元素を０〜２重量％含有してもよい。
【００２７】
ＢＡＧから形成される本体は多孔質である。気孔率（porosity）は、マイクロコンピュータ断層撮影法による測定で、例えば１０〜９０％または１０〜７０％であってもよい。
この方法は、「Quantitative characterization of porous commercial and experimental bone graft substitutes with microcomputed tomography」  (Yla-Soininmaki A、Moritz N、Turco G、Paoletti S、Aro HT、J Biomed Mater Res B App Biomater 2013年11月 101(8):1538~48 doi 10.1002/jbm.b.32975)に記載されている。
ＢＡＧの典型的な気孔率は約２４〜３６％であり、気孔性であることによって本体は完全に固体ではなく体液が本体の中心部に入ることができることを意味する。このように本体は連通する多孔性を有している。これによってインプラントの孔内での新しい骨の形成および血管形成が促進される。
本体の気孔率は、例えば、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、または85％から15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85または90%まで等が挙げられる。
【００２８】
本体内のＢＡＧの粒径は少なくとも５００μｍである。ＢＡＧの粒径は典型的には、500〜3150μｍである。粒径は、例えば、500、550、600、650、700、800、850、900、1000、1200、1400、1500、1800、2000、2200、2500、2800または3000μｍ等から550、600、650、700、800、850、900、1000、1200、1400、1500、1800、2000、2200、2500、2800、3000または3150μｍまで等が挙げられる。
【００２９】
ＢＡＧの本体は、少なくとも部分的にポリマーフィルムで覆われている。ポリマーフィルムは本体を完全に覆ってもよい。
一実施形態によれば、インプラントが骨に埋め込まれたときに、筋肉、筋膜または骨膜と接触する本体の部分を覆うようにフィルムは本体の周囲に配置される。
別の実施形態によれば、本体は円板状の形態であり、フィルムは円板状の側面の周りに配置されている。例えば、インプラントが一定の厚さを有する円板、円柱または立方体の形態である場合、フィルムは円板、円柱または立方体の側面に、そして任意に円板の上面および底面を部分的に覆うように配置されうる。
フィルムはまた、部分的にだけ、側面または上面或は底面の一方にのみ配置することもできる。
インプラントは、くさび形または球形の一部（半球など）の形をとることもでき、インプラントができれば、フィルムは、インプラントが配置された際に少なくとも軟組織と接触する表面に配置されることが好ましい。本インプラントは、必要に応じて任意の適切な形状に形成されうる。
【００３０】
ポリマーフィルムは、任意の適切な生体適合性ポリマーから作製することができる。適切なポリマーは、本明細書では、上述したように、インプラントが骨欠陥部分に埋め込まれたときに疑似滑膜の形成を誘導することができるポリマーを意味する。実際、使用されるポリマーは生体適合性ポリマーである。好ましくは、生体適合性ポリマーであって、例えば、以下のようなポリマーが挙げられる。
例えば、Ｐ-メチルエステル、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＳ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、等のポリ（α-エステル）、ポリ（３-ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（プロピレンフマレート）等のポリヒドロキシアルカノエート、並びに芳香族ポリエステルと脂肪族ポリエステルとの共重合体等が挙げられる。
又は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）等のポリウレタンまたはポリ（エーテル）でもよい。
いくつかの他の適切なポリマーは、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリ（エステルアミド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリホスファゼン、ポリホスホエステル、ポリ（アスパラギン酸）、ポリシロキサン等のポリオール、またはコラーゲン、エラスチン、アルブミンまたはフィブリンのようなタンパク質、等である。
さらに、セルロース、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、アルギン酸またはヒアルロン酸などの多糖であってもよい。
さらに、上記に挙げたポリマーの種々の混合物、複合材料、共重合体および修飾物もまた使用され得る。
【００３１】
一実施形態によれば、ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、それらの混合物、およびそれらのポリエチレングリコールとの混合物からなる群から選択されうる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用される場合、その分子量は、例えば1000〜50000ｇ／ｍｏｌ、例えば約300０ｇ／ｍｏｌまたは35000ｇ／ｍｏｌであり得る。
ＰＥＧの分子量は、例えば、1000、2000、3000、4500、4000、7000、10000、15000、20000、27000、30000、35000または40000ｇ／ｍｏｌから2000、3000、4500、5000、7000、10000、15000、20000、27000、30000、35000、40000、45000又は50000ｇ／ｍｏｌまでであり得る。
尚、ポリマーの混合物とは、ポリマーの製造に使用されるモノマーの混合物及び共重合体の両方を意味する。
ポリマーフィルムは骨インプラントの製造中にも形成することができる。すなわち多孔質本体をモノマーまたはモノマーの混合物で被覆した後に重合させることができる。 その場合には、フィルムは、本体の外側表面から一定の距離の本体の内側部分にも存在しうる。
【００３２】
フィルムの厚さは10〜200μｍ、例えば100〜200μｍである。実際、フィルムの厚さは、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170または180μｍから20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190または200μｍまででありうる。
【００３３】
一実施形態では、フィルムは生物活性ガラスを含む。好ましくは、生物活性ガラスは粉末の形態であり、すなわち、それは４５μｍ未満の平均粒径を有する。
使用されるＢＡＧは、本体内で使用されるものと同じでも異なっていてもよく、２つ以上の異なるＢＡＧの混合物でもよい。ＢＡＧの量は、例えば、ＢＡＧを有するフィルムの総重量の１から４０重量％であり得る。
具体的には、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30または35重量%から2、3、4、5、10、15、20、25、30、35または40重量％までがあり得る。粉末は、例えばガラス塊またはガラス顆粒を粉砕することによって製造することができる。
【００３４】
生物活性ガラスの組成は上述の通りである。これらの範囲内で、生物活性ガラスの組成に対する１つの好ましい下位の範囲は、４５〜５４重量％のＳｉＯ２、２２〜２５重量％のＮａ２Ｏ、１９〜２５重量％のＣａＯおよび３．５〜６重量％のＰ２Ｏ５である。
生物活性ガラスの別の好ましい組成は、５３重量％のＳｉＯ２、２３重量％のＮａ２Ｏ、２０重量％のＣａＯおよび４重量％のＰ２Ｏ５である。
このガラスはＳ５３Ｐ４ガラスとしても知られており、ＢｏｎＡｌｉｖｅ（登録商標）の商品名で販売されている。
【００３５】
生物活性ガラスのなおさらに好ましい組成は、４５重量％のＳｉＯ２、２４．５重量％のＮａ２Ｏ、２４．５重量％のＣａＯおよび６重量％のＰ２Ｏ５であり、Ｈｅｎｃｈガラスとしても知られており、ＮｏｖａＢｏｎｅ（登録商標）の商品名で販売されている。本体内で使用されるＢＡＧはまた、上記のような２つ以上の異なるＢＡＧの混合物であってもよい。
【００３６】
本体は、焼結生物活性ガラス粒子の形態であってもよく、または、本体は生分解性ポリマーによって連結されている生物活性ガラス粒子の形態であってもよい。
後者の実施形態では、生分解性ポリマーは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール、天然コラーゲンポリマーおよびそれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００３７】
本骨インプラントは様々な方法で製造することができ、そのうちの２つをより詳細に説明する。
ＢＡＧからなる多孔質本体は、ＢＡＧ粒子を型に配置し、液体状のポリマー（例えば溶液）を添加し、続いて凍結乾燥させて、ポリマー溶液から液体を蒸発させることによって製造することができる。
その後、このようにして形成された本体の周りに別に調製されたポリマーフィルムを配置し、フィルムをわずかに軟化させてそれがＢＡＧ製の本体によく接着するように、ほぼポリマーのＴｇ温度まで加熱する。
【００３８】
別の実施形態では、本体は焼結によって製造される。すなわち、ＢＡＧの粒子は型内に配置され、次いで、高温に加熱されて粒子が互いに付着、すなわち焼結される。温度は典型的には約５００〜７００℃である。その後、ポリマーフィルムは、上記のように本体の周りに配置される。
【００３９】
以下、図面を引用して本実施形態について詳細に説明する。
図１は、骨に埋め込まれたときの、一実施形態による骨インプラントを示す。この図は、骨の皮質１、およびその下にある網状骨２を示している。骨インプラント３は、骨の欠陥に埋め込まれている。骨インプラント３は、円筒形の焼結生物活性ガラス粒子でできた本体４を有し、本体４の一端はポリマーフィルム５で覆われている。インプラントが所定の位置にある際に皮質１と接触する本体４の部分はフィルム５によって覆われるようにフィルム５は配置されている。
【００４０】
図２Ａ〜２Ｃは、別の実施形態による骨インプラントを示す図である。図２Ａは、側面６と上面７ａとを有する円板体（ディスク）を示す。底面は図２Ａでは見えないが、本質的に上面７aと平行である。この円板はインプラントの本体を形成し、それは生物活性ガラス粒子でできている。図２Ｂは部分図としてフィルム８によって部分的に覆われた同じディスクを示し、図２Ｃは部分的に覆われたディスクを示す側面図である。該側面図から、フィルム８で側面、底面７ｂおよび上面７ａの一部も覆われていることが分かる。
【００４１】
図３Ａおよび図３Ｂは、一実施形態による骨インプラントの実用的な使用法を示す。この実施形態では、骨インプラントは外部固定装置と共に使用される。
骨１０、１１は欠陥を含み、ここでは骨の断面の全体にわたる部分が欠けている。骨インプラント１４（ここでは断面として示されている）は、本体を形成する３つのディスク１２から構成されている。最外側のディスクは、骨インプラントを骨に固定するように構成された延長部を含み、対応する凹部を骨部分１０、１１の端部に形成することができる。本体の側面はポリマーフィルム１３で覆われている。骨インプラント１４は骨部分１０と１１の間に配置されているように示されている。骨部分はそれ自体は当業者に公知である外部固定装置１５で所定の位置に固定されている。
【００４２】
図４Ａおよび４Ｂは、他の実施形態である、骨インプラントの髄内固定のための実用的使用法を示している。この実施形態では、骨インプラント１６はまた、互いに上下に配置された３つのディスク１７を含み、各ディスク１７は上面から底面まで貫通する穴１８を含む。フィルム１９は、（後述のとおり）釘の周りへのそれらの配置をより容易にするために、（参照番号２３で示される）一点で切り開かれた椎間板を囲むように配置される。
【００４３】
図４Ｂでは、骨インプラント１６が２つの骨部分２０、２１の間に示されており、釘システム２２で固定されており、釘システムの一部が穴を介して骨インプラントを貫通している。
【００４４】
図５は、一実施形態による骨インプラントのさらなる実用的使用を示す。この実施形態では、骨２４にくさび状骨切り術が必要である。切り抜かれたくさびは、本説明に従って作られたくさび型のインプラント２５と置換することができる。インプラントの端部２６はフィルムで覆われている。
【実施例】
【００４５】
本実施例の目的は、インビボでの誘導膜ウサギモデルにおいて、非コーティングＢＡＧ、ＰＭＭＡスペーサーまたは外傷（対照）と比較して、ＰＬＧＡコーティングＢＡＧが膜誘導ＶＥＧＦ発現にどのように影響するかを評価することである。
ヒトとウサギの間には大きなサイズの違いがあるため、本体のＢＡＧ粒子の粒子サイズは５００μｍより小さいものであった。
しかしながら、結果から、ヒトおよびより大きい粒径に変更可能であると判明し、すなわち試験はより小さい粒径にもかかわらず相乗効果を示した。
【００４６】
［材料及び手法］
（生物活性ガラス）
５３％ＳｉＯ２、２３％ＮａＯ、２０％ＣａＯおよび４％重量％Ｐ２Ｏ５の組成を有する生物活性ガラスＳ５３Ｐ４は、ＳｉＯ２用のベルギー砂（Belgian sand）と分析グレードのＮａ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３およびＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏとの混合物から作られた。このガラスを白金るつぼ中で１３６０℃で３時間溶融した。予熱したグラファイト鋳型に流し込んだ後、ガラスを破砕し均質化のために再溶融した。アニーリングしたガラスブロックを粉砕し、３００〜５００μｍのサイズ範囲の画分に篩い分けした。このガラス粒子を窒素雰囲気中７２０℃で９０分間グラファイトモールド中で焼結し、長さ１５ｍｍおよび直径５ｍｍの円筒形ロッドにした。
【００４７】
（ポリマーコーティング）
焼結ＢＡＧロッドの一端を被覆するために、ＤＬ−ラクチドとグリコリドとが５０／５０比であるＰＤＬＧ５００２Ａと命名された酸末端乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）（Corbion、Gorinchem、Netherlands）を使用した。
コーティングは、２０重量％のＰＬＧＡを含有するジクロロメタン溶液中に、約２ｍｍのＢＡＧインプラントの端部を浸すことによって行われた。Ｓ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡで部分的にコーティングされたインプラントをその後空気中および真空中で乾燥させた。インプラントを線量２５ｋＧｙでガンマ線滅菌した。生物活性ガラスの表面上のポリマーコーティングの厚さは、インプラントの断面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で取得された画像から決定された。測定は、コーティングの無作為に選択された２５箇所のスポットから行われた。平均コーティング厚は８４μｍであり、標準偏差は５５μｍであった。個々のコーティング厚さ測定における変動は１７μｍから１９２μｍの範囲であった。測定を実行するために使用された画像解像度のために、各個々の測定に対する誤差マージンは約７μｍであった。
【００４８】
（ポリメタクリル酸メチル、ＰＭＭＡ）
市販のＰＭＭＡ骨セメントPalacos＋G（Heraeus Medical GmbH、Wehrheim、ドイツ）を製造業者の指示に従って混合した。動物の手術の前に、長さ１５ｍｍ、直径５ｍｍのＰＭＭＡロッドを滅菌条件下で製造し、オートクレーブオーブン内で滅菌した。
【００４９】
（動物及び手術）
３６匹の骨格的に成熟したウサギ（NZW、Harlan Laboratories）を使用した。動物実験はフィンランド動物実験委員会（ESAVI/440/04.10.07/2014）によって承認され、ヘルシンキ大学の実験動物飼育の原則に厳密に従った。
【００５０】
手術は皮下メデトミジン塩酸塩および塩酸ケタミンを用いて全身麻酔下で行った。骨欠陥は、大腿骨遠位部の外側面部分から内側部分まで６ｍｍの水平方向の穴をあけることによって行った。Ｓ５３Ｐ４、５３Ｐ４＋ＰＬＧＡまたはＰＭＭＡ、各１本の１５×１５ｍｍロッドを、作製した骨欠損に移植した。
Ｓ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡロッドは、被覆端部を軟組織に対して配置されて骨の皮質領域に移植された。ロッドと時点の各組み合わせについて３つの平行実験を用いた。１時点あたり３つの欠陥を対照用に空のままにした。セフロキシム、ブプレノルフィンおよびカルプロフェンは、感染を予防し、痛みを和らげるために術後３日間投与され。術後２、４および８週目に、動物を過量のペントバルビタールで安楽死させた。インプラントの端部ならびに対照の穴の部位に誘導された膜を集めた。組織化学のために、サンプルを１０％ホルマリン中に一晩保存し、次いで洗浄しそしてさらに処理するために７０％エタノール中に保存した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ｑＰＣＲ）分析のためのサンプルをＲＮＡＬａｔｅｒ溶液（ＡＭ７０２０）中に４℃で一晩保存し、次いでさらなる処理を待つために-８０℃で滅菌チューブに保存した。
【００５１】
（リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ））
３０〜５０ｍｇの誘導膜組織試料を、Ultra-Turraxホモジナイザーを用いてＴｒｉｚｏｌ溶液（Invitrogen/Life Technologies Paisley、UK）中でホモジナイズした。製造業者の説明書に従って、RNeasy Mini Kit(Qiagen、Valencia、CA、USA)を用いて全ＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット(BioRad、Hercules、CA、USA)を用いて６００ｎｇの単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＲＮＡを含まない水で１：３に希釈した。ｃＤＮＡ合成は同じ全ＲＮＡサンプルから２回別々に行い、ｑＰＣＲはｉＱ５リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて両方のサンプルについて２回行った。ｑＲＴＰＣＲの反応液は、１０μｌのｉＱ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ、７μｌの水、２μｌのｃＤＮＡ（２０ｎｇ）、１μｌの５μＭプライマーである。プライマー配列は以下の通りである。
VEGF（247bp;製造番号AY196796）
配列表の配列番号１：VEGFセンス
5'-CACCCATGGCAGAAGAAGGA-3'
配列表の配列番号２：VEGFアンチセンス
5'-ATCCGCATGATCTGCATGGT-3'
NF（281bp;製造番号NM_001082263）
配列表の配列番号３：NFセンス
5'-GAGTCCCCAAACAACCTCCA-3'
配列表の配列番号４：NFアンチセンス
5'-TGAGTGAGGAGCACGTAGGA-3'
参照遺伝子として、GAPDH（207bp;登録番号NM_001082253）を以下の配列で使用した。
配列表の配列番号５:GAPDHセンス
5'-CGAGCTGAACGGGAAACTCA-3'
配列表の配列番号６:GAPDHアンチセンス
5'-TGGGTGGCACTGTTGAAGTC-3'
結果は、マイクロソフトエクセルの遺伝子発現マクロ、バージョン１．１（BioRad）を用いて計算した。
【００５２】
(ヘマトキシリンおよびエオシン染色)
誘導された膜のサンプルを、採取後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のためにホルマリンに固定した。試料をパラフィン包埋し、３μｍの切片に切断した。切片を脱パラフィン処理し、Ｈ＆Ｅ染色した。
【００５３】
デジタルカメラ（DFC420およびDFC365FX;Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）に接続されたLeica DM6000 B/M光学顕微鏡を使用して、H&E染色切片を毛細血管床の有無について評価した。倍率１０倍の標準化された領域内の毛細血管床の量は、二人のオーサーズ（ＲＢおよびＧＳ）によって盲検法で以下の３段階スケールに等級分けされた。
１−低密度の毛細血管床
２−中密度の毛細血管床
３−高密度の毛細血管床
【００５４】
（統計分析）
１匹のウサギが原因不明の下痢によって外科的処置の３日後に死亡したため、Ｓ５３Ｐ４とＳ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡの三重測定値と比較される２週間におけるＰＭＭＡの二重試料となった。
【００５５】
一元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの多重比較検定を使用して、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン7.0a、GraphPad Software、Inc.）を使用して統計的差異を計算した。統計的有意性の閾値としてＰ＜０．０５を選択した。
【００５６】
［結果］
（リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR））
対照の膜についてのＶＥＧＦの高発現は２週間で観察されたが、発現レベルは急速に低下し、８週間での分析には適用できなかった。これは、４週間までＶＥＧＦの発現が一定のままであったＰＭＭＡ処置群とは対照的であった。ＰＭＭＡ群と比較して、コーティングされていないＳ５３Ｐ４誘導膜についてのＶＥＧＦの発現は、２週間前および４週間中期の時点で高く上方制御されたが、８週間後期にはＰＭＭＡのレベルまで低下した。興味深いことに、ＰＬＧＡ被覆Ｓ５３Ｐ４（Ｓ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡ）は、ＶＥＧＦ発現のパターンを変化させ、時間とともに減少するのではなく、８週間にわたって低ＶＥＧＦ発現から高ＶＥＧＦ発現への着実な増加を観察することができた。８週間でＰＭＭＡと比較してＰＬＧＡ被覆Ｓ５３Ｐ４について観察された高レベルのＶＥＧＦ発現は有意であった（ｐ＜０．０５）。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2019535338.tif 000003
【００５８】
対照のドリルサンプルについてのＴＮＦ発現は追跡調査を通してずっと低く、８週での分析では不十分であった。ＰＭＭＡのＴＮＦ発現は２週間でピークに達し、追跡調査の終わりに向かって減少傾向にあった。コーティングされていないＳ５３Ｐ４サンプルは４週間でＴＮＦ発現のピークを示した。これはＰＬＧＡ被覆Ｓ５３Ｐ４とは対照的であり、ＰＬＧＡ被覆Ｓ５３Ｐ４のＶＥＧＦ発現パターンと一致するＴＮＦ発現の増加が追跡調査を通して観察された（表２）。しかしながら、異なるインプラント間または時点間で統計的に有意な差は見られなかった。
【００５９】
【表２】
2019535338.tif 000004
【００６０】
［組織学］
対照のドリル膜標本において、２週間で比較的高い毛細管床の存在が観察された。追跡調査期間中その数は減少し、８週間で数個の毛細血管床のみが観察された。ＰＭＭＡ誘導膜は同様のパターンを示したが、対照ドリルよりも８週間で適度に高い毛細管密度が観察された。
【００６１】
ＰＭＭＡ群と比較して、ＢＡＧ誘導膜における毛細血管床の存在は４週および８週でより豊富であった。非被覆Ｓ５３Ｐ４は、異なる時間間隔にわたって非常に安定した高い存在量の毛細管床を示した。Ｓ５３Ｐ４と比較して、ＰＬＧＡコーティングされたＳ５３Ｐ４誘導膜は、毛細管床の量がＳ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡについてさらに高かった４週間を除いて、同様に高い毛細管密度を示した（表３に、３つの平行試料の平均を示す）。
【００６２】
【表３】
2019535338.tif 000005
【００６３】
毛細管床の評価は以下の通りであった。
０＝毛細管なし
１＝毛細管が少ない
２＝中程度の毛細管
３＝高密度毛細管
【００６４】
［考察］
Ｓ５３Ｐ４およびＰＬＧＡ被覆Ｓ５３Ｐ４（Ｓ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡ）ロッドの軟組織界面に形成された誘導膜における血管新生促進活性（pro-angiogenetic activity）を、本明細書記載の時点において２段階誘導膜法で使用される標準材料であるＰＭＭＡと比較することでＶＥＧＦ発現として評価した。試験した材料の組み合わせのうち、Ｓ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡ誘導膜のみがＶＥＧＦ発現の連続的増加を示し、これは８週間でその最高レベルが観察された。我々の知る限りでは、ＶＥＧＦ発現の同様の継続的な増加は以前には報告されていない。同じ期間中、ＰＭＭＡ誘導膜のＶＥＧＦ発現は、インビボのウサギ研究における観察と匹敵するヒトにおける研究と一致して、絶えず減少した。
【００６５】
我々がＢＡＧについて観察した血管新生促進の可能性、すなわちＶＥＧＦ発現の増加は、以前のいくつかのインビトロおよびインビボの研究と一致している。生物活性ガラス４５Ｓ５粒子は、サイズおよび濃度依存的にヒト線維芽細胞からのＶＥＧＦ分泌を増加させることが示されている。生物活性ガラス４５Ｓ５粒子で刺激された線維芽細胞は、科学的刊行物から、ヒト真皮微小血管内皮細胞（human dermal microvascular endothelial cells）の増殖を増加させそして血管新生を増強することが知られている。４５Ｓ５はまた、分解性ポリマーの血管新生促進特性を増大させることがわかった。１０％（ｗ／ｖ）の４５Ｓ５粒子を含有するＰＬＧＡ球は、線維芽細胞によるＶＥＧＦの増加を刺激することが実証されている。純粋なポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）と比較して、ＰＤＬＬＡマトリックスへのＢＡＧの添加もまた、用量依存的にＶＥＧＦ分泌を増加させることによって線維芽細胞における血管新生シグナル伝達を刺激した。
【００６６】
ＢＡＧのＰＬＧＡコーティングが誘導膜におけるＶＥＧＦ発現にどのように影響を及ぼすかは知られていない。しかしながら、一般に、生分解性ポリマーでＢＡＧをコーティングするとガラスの溶解速度が低下することが知られている。誘導された膜における発現パターンは、以下のように説明され得る。すなわち、ＰＬＧＡコーティングされたＳ５３Ｐ４表面で予想される化学反応に従って、ポリマーは分解し、続いてＢＡＧの血管新生能を高める。ポリマーの分解と同時に、溶液中のＢＡＧからのＣａ、Ｎａ、ＰおよびＳｉの連続的放出が移植後に起こることが実証されているので、ＢＡＧでの表面反応が起こり、したがってＢＡＧについて観察されるＶＥＧＦ発現の増加が継続する。
【００６７】
２週間におけるＳ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡ誘導膜と比較して、Ｓ５３Ｐ４誘導膜のより高いＶＥＦＧ発現は、Ｓ５３Ｐ４から放出されたイオンがＶＥＧＦ発現に積極的に影響を及ぼすこと、およびポリマーがイオン放出および遺伝子発現を効果的に減速させることを示唆する。
この遅延効果は、Ｓ５３Ｐ４の足場（スキャフォールド）のコーティングされていない部分との接触を防止するポリマーバリア、または界面溶液を中和し、したがってガラスからのイオン放出速度を遅くするポリマー分解生成物の能力に依存し得る。
長期の移植では、ポリマーは部分的に分解し、Ｓ５３Ｐ４系構造体からのより高いイオン放出を可能にする。
これは、部分的にポリマーでコーティングされた足場が、コーティングされていない足場よりも、ＶＥＧＦ発現を支持するのに十分な高濃度でより長期間にわたってイオンの連続放出を可能にすることを意味する。
【００６８】
Ｃａ２＋イオンは、Ｃａ２＋の流動に影響を及ぼすことが知られているＶＥＧＦ調節多機能シグナル伝達経路（the VEGF-regulated multifunctional signalling pathway）において重要な役割を果たすことが知られている。血管新生に重要な骨髄由来前駆細胞は、カルシウム感知受容体を介して細胞外カルシウム交換にも反応することが実証されている。Ｓ５３Ｐ４及びＳ５３Ｐ４＋ＰＬＧＡ両方についての高いＶＥＧＦ発現は、ガラスの表面で起こるＣａ２＋のイオン放出に依存し得る。ＢＡＧが取り込まれた足場もまた、血管新生を刺激することが実証されている。そのメカニズムは知られていないが、それらはガラス表面でのＣａ２＋イオン放出に依存すると考えられている。
Ｓ５３Ｐ４によって誘導されたヒト線維芽細胞からのＶＥＧＦ分泌の増加は、より小さい粒子が有利であるが、反応するガラス顆粒の大きさに依存することもまた実証されている。これは、より大きな表面積対溶液体積比を有し、ガラスの溶解プロセスに影響を及ぼす、より小さな粒子から放出されるより高いイオン濃度によって説明され得る。
【００６９】
誘導膜法では、通常、最初の手術から４〜８週間後に２回目の手術が行われるが、２回目の手術を行う最適な時期はＰＭＭＡ移植後１ヶ月以内であると推測されている。これは、ＰＭＭＡ誘導膜の血管新生が１ヶ月齢の試料では十分であり、３ヶ月齢の試料では６０％未満に減少することを示す組織学的観察に基づいている。
ＶＥＧＦ発現に対するＰＭＭＡの誘導能力は、多くの手術が行われる８週間という時間で最も低いようであることから、この知見は我々の研究によって支持されている。
我々の研究では、ＰＭＭＡ誘導膜と対照のドリルの膜は、２週間で最も高い毛細管密度を示し、追跡調査中に高い毛細管密度を示したＢＡＧ誘導膜と比較して、追跡調査中の減少傾向を伴う。
【００７０】
骨折治癒および骨再生は、先天性の免疫系の細胞とさまざまな骨前駆細胞との間の協調的相互作用を含む複雑な過程である。骨折治癒は、軟骨形成および骨形成系統に沿った間葉系幹細胞の漸増及び分化を調節するＴＮＦ等の炎症誘発性サイトカインの産生を特徴とする急性炎症によって開始される。
【００７１】
実際、短期間のＴＮＦ産生は骨再生にとって極めて重要である。骨折治癒後の状態では、骨折部位への血管系の内方成長は骨再生にとって極めて重要である。この血管新生は、ＶＥＧＦなどの成長因子によって媒介される。したがって、ＴＮＦとＶＥＧＦの両方が骨再生の様々な段階において重要な役割を果たすことが示されている。
【００７２】
ＰＭＭＡについてのＴＮＦの発現は、上述したようにＰＭＭＡについての低いＶＥＧＦ発現の観察に従って、８週間の期間中絶えず減少した。臨床的に炎症反応が観察されずに耐容性のある代用骨であることが知られているＳ５３Ｐ４については、４週間でＴＮＦ発現の増加が観察された。
【００７３】
要約すると、我々の研究は、コーティングされていない多孔質Ｓ５３Ｐ４インプラントとコーティングされた多孔質Ｓ５３Ｐ４インプラントの両方がＶＥＧＦおよびＴＮＦの発現に好ましい影響を及ぼしており、その結果、より低いＶＥＧＦ発現、と、対照及びＰＭＭＡサンプルにおいて観察されるよりより少ない毛細血管床と比較して、組織学的試料において観察されるより多くの毛細血管床をもたらす。
【００７４】
ＰＭＭＡの誘導された膜は血管新生改善特性を有することが知られているが、しかしそれは時間の経過と共に減少するように見える。ＰＬＧＡ被覆Ｓ５３Ｐ４の誘導膜において、本発明者らは経時的に増加するＶＥＧＦの誘導発現を観察した。８週間で、ＶＥＧＦの発現は、ＰＭＭＡよりもコーティングされたＳ５３Ｐ４に対して有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【符号の説明】
【００７５】
１：骨の皮質
２：網状骨
３、１４、１６、２５：骨インプラント
４：本体
５、１３：ポリマーフィルム
６：側面
７：上面
８、１９：フィルム
１０、１１、２０、２１、２４：骨
１２、１７：ディスク
１５：外部固定装置
１８：穴
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：ＶＥＧＦセンス
配列番号２：ＶＥＧＦアンチセンス
配列番号３：ＮＦセンス
配列番号４：ＮＦアンチセンス
配列番号５：ＧＡＰＤＨセンス
配列番号６：ＧＡＰＤＨアンチセンス
【図１】
2019535338.tif 000006
【図２Ａ】
2019535338.tif 000007
【図２Ｂ】
2019535338.tif 000008
【図２Ｃ】
2019535338.tif 000009
【図３Ａ】
2019535338.tif 000010
【図３Ｂ】
2019535338.tif 000011
【図４Ａ】
2019535338.tif 000012
【図４Ｂ】
2019535338.tif 000013
【図５】
2019535338.tif 000014
【配列表】
2019535338000001.app
【国際調査報告】
2019535338.tif 000015
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2019535338.tif 000017
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