(57)【要約】標的特異的ガイド核酸および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、試料中の標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。本発明の方法は、試料由来の核酸を複数のガイド核酸（ｇＮＡ）−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップであって、前記複合体は、少なくとも１つの標的へと標的化されており、かつ前記核酸、前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または前記核酸および前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は標識を含むステップを含み得る。
2019506875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的を同定する方法であって、
ａ．試料由来の核酸を複数のガイド核酸（ｇＮＡ）−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップであって、前記複合体は、少なくとも１つの標的へと標的化されており、かつ前記核酸、前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または前記核酸および前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は標識を含む、ステップと、
ｂ．前記標識由来の特定のシグナルを検出することによって達成される、前記試料中の前記標的を同定するステップであって、特定のシグナルの存在は、前記核酸への前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合を示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記核酸が、標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識が、インターカレーター型の標識である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、前記接触ステップの前に標識される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が、前記接触ステップの後に標識される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
小滴を生成するステップをさらに含み、前記小滴のサブセットが、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記小滴のサブセットが、前記核酸に結合したｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの前に標識される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの後に標識される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が、標識を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸および前記複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方が、前記接触ステップの前に標識される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸および前記複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方が、前記接触ステップの後に標識される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸が、接触の前に標識され、かつ前記複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの後に標識される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が、接触の後に標識され、かつ前記複数の前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、前記接触ステップの前に標識される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸が、第１の標識を含み、かつ前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、第２の標識を含み、前記第１の標識および前記第２の標識が、蛍光共鳴エネルギー移動用のドナー／アクセプターペアを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触させるステップが、室温で実行される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記同定するステップが、単一のシグナルを検出することを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記同定するステップが、複数のシグナルを検出することを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ｄＣａｓ９である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記標識が、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標識が、検出可能な標識である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が、臨床試料、法医学的試料、環境試料、メタゲノム試料および食品試料からなる群から選択される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、ヒトに由来する、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、前記接触前に処理されない、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸、前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または前記核酸および前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方が、複数の標識を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記複合体が、複数の標的へと標的化されている、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的が、個体である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的が、病原体である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記病原体が、表１に記載の病原体から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
異なる標的へと標的化された前記複合体が、異なる標識を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
異なる標的へと標的化された前記複合体が、同じ標識を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、基材に付着されている、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記基材が、二次元の基材である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記基材が、三次元の基材を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記基材が、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、既知の順序で基材に付着されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記基材が、再使用可能である、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、溶液中に存在する、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が、少なくとも１つの特異なｇＮＡを含む、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触が、溶液中で行われる、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸が、基材に付着されている、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸が、シークエンシングによってさらに分析される、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸が、せん断される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸が、増幅される、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸が、伸長できないヌクレオチドを用いて１または複数の末端において遮断される、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
複数の標的が、同時に同定される、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
２４時間未満で実行される、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記試料が、事前のスクリーニングステップに供される、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記試料が、複数の検出ステップに供される、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸へのｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合が、標的の存在を示す、請求項１から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
核酸へのｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合の欠如が、標的が存在しないことを示す、請求項１から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸が、ＤＮＡを含む、請求項１から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸が、ＤＮＡである、請求項１から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも１つの標的へと標的化されたガイド核酸（ｇＮＡ）の収集物であって、複数の前記ｇＮＡが標識を含む、収集物。
【請求項６３】
複数の標的へと標的化されている、請求項６２に記載の収集物。
【請求項６４】
前記標的が、個体である、請求項６２から６３のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項６５】
前記標的が、病原体である、請求項６２から６３のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項６６】
前記病原体が、表１に記載の病原体から選択される、請求項６５に記載の収集物。
【請求項６７】
異なる標的へと標的化されている前記ｇＮＡが、異なる標識を含む、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項６８】
異なる標的へと標的化されている前記ｇＮＡが、同じ標識を含む、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項６９】
前記標識が、検出可能な標識である、請求項６２から６８のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項７０】
前記標識が、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項６２から６９のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項７１】
前記ｇＮＡが、２つ以上の標識を含む、請求項６２から７０のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項７２】
前記ｇＮＡが、基材に付着されている、請求項６２から７１のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項７３】
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、請求項７２に記載の収集物。
【請求項７４】
前記基材が、二次元の基材である、請求項７３に記載の収集物。
【請求項７５】
前記基材が、三次元の基材を含む、請求項７３に記載の収集物。
【請求項７６】
前記基材が、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである、請求項７３に記載の収集物。
【請求項７７】
前記ｇＮＡが、既知の順序で基材に付着されている、請求項６２から７６のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項７８】
前記基材が、再使用可能である、請求項７２から７７のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項７９】
前記ｇＮＡが、溶液中に存在する、請求項６２から７１のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項８０】
少なくとも１つの特異なｇＮＡを含む、請求項６２から７９のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項８１】
前記ｇＮＡが、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化している、請求項６２から８０のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項８２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項８１に記載の収集物。
【請求項８３】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される、請求項８２に記載の収集物。
【請求項８４】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である、請求項８１に記載の収集物。
【請求項８５】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ｄＣａｓ９である、請求項８４に記載の収集物。
【請求項８６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である、請求項８１に記載の収集物。
【請求項８７】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する、請求項８１に記載の収集物。
【請求項８８】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、標識をさらに含む、請求項６２から８７のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項８９】
ガイド核酸（ｇＮＡ）−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の収集物であって、前記ｇＮＡが、少なくとも１つの標的へと標的化されており、かつ複数の前記複合体が、標識を含む、収集物。
【請求項９０】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項８９に記載の収集物。
【請求項９１】
複数の前記ｇＮＡが標識を含む、請求項８９に記載の収集物。
【請求項９２】
複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、標識を含む、請求項８９に記載の収集物。
【請求項９３】
複数のｇＮＡおよび複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方が、標識を含む、請求項８９に記載の収集物。
【請求項９４】
前記ｇＮＡが、複数の標的へと標的化されている、請求項８９から９３のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項９５】
前記標的が、個体である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項９６】
前記標的が、病原体である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項９７】
前記病原体が、表１に記載の病原体から選択される、請求項９６に記載の収集物。
【請求項９８】
異なる標的へと標的化されている前記ｇＮＡが、異なる標識を含む、請求項８９から９７のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項９９】
異なる標的へと標的化されている前記ｇＮＡが、同じ標識を含む、請求項８９から９７のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１００】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、異なる標識を含む、請求項８９から９７のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１０１】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、同じ標識を含む、請求項８９から９７のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１０２】
前記標識が、検出可能な標識である、請求項８９から１０１のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１０３】
前記標識が、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８９から１０１のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１０４】
前記複合体が、２つ以上の標識を含む、請求項８９から１０３のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１０５】
前記複合体が、基材に付着されている、請求項８９から１０４のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１０６】
前記ｇＮＡが、前記基材に付着されている、請求項１０５に記載の収集物。
【請求項１０７】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、前記基材に付着されている、請求項１０５に記載の収集物。
【請求項１０８】
前記基材が、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である、請求項１０５に記載の収集物。
【請求項１０９】
前記基材が、二次元の基材である、請求項１０８に記載の収集物。
【請求項１１０】
前記基材が、三次元の基材である、請求項１０８に記載の収集物。
【請求項１１１】
前記基材が、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである、請求項１０８に記載の収集物。
【請求項１１２】
前記複合体が、既知の順序で基材に付着されている、請求項８９から１０５のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１１３】
前記基材が、再使用可能である、請求項８９から１１２のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１１４】
前記複合体が、溶液中に存在する、請求項８９から１０４のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１１５】
少なくとも１つの特異なｇＮＡを含む、請求項８９から１１４のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１１６】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である、請求項８９から１１５のいずれか一項に記載の収集物。
【請求項１１７】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である、請求項１１６に記載の収集物。
【請求項１１８】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、ｄＣａｓ９である、請求項１１７に記載の収集物。
【請求項１１９】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である、請求項１１６に記載の収集物。
【請求項１２０】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する、請求項１１６に記載の収集物。
【請求項１２１】
請求項６２から１２０に記載の収集物のいずれか一つを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年２月２３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／２９８，９３７号の優先権の利益を主張しており、この仮特許出願は、その全体が本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
核酸ベースの検出方法は、費用効果が高く、迅速で、感度が高く、かつ正確であるべきである。また、検出プラットフォームは、使用および解釈が単純であり、広範な作動条件（温度、湿度、照明条件、およびインフラストラクチャーへのアクセス等）の下で安定であり、好ましくは携帯可能かつ使い捨て可能であるべきである。（Yagerら、Nature、２００６年、４４２巻、４１２〜４１８頁）。さらには、それらは要求される感度および特異性を提供するべきである。（Weiglら、Lab  Chip、２００８年、８巻、１９９９〜２０１４頁）。マルチプレックス試験を実行する能力は検出方法および検出デバイスにとって別の重要な必要条件である。
【０００３】
核酸配列の検出の使用の一つの適用は病原体の検出である。感染性疾患は世界中で依然として罹患および死亡の主要な原因となっている。従来の標準的な病原体検出方法は、細胞培養、ＰＣＲおよび酵素イムノアッセイを含んでおり、これらはしばしば多大な労働力を要し、実行に数時間から数日を要し得る。（Foudehら、Lab  Chip、２０１２年、１２巻、３２４９〜３２６６頁）。世界保健機関の２００４年次報告書では、感染性疾患は、心臓血管疾患に次いで世界中での死亡の二番目に多い原因として特定されている（ＷＨＯ、世界保健報告２００４、ジュネーヴ、２００４年）。この問題は、衛生状態が悪く、診断および治療用の集中施設へのアクセスが限られた地域において特に大きい。先進国においてさえ、食品産業、病原体の大発生および性感染疾患に関して対処すべき問題が残されている。政治面では、生物兵器戦争の脅威もまた現実的な可能性として存在する。効果的な病原体の検出および同定は、感染性疾患の予防および治療にとって決定的に重要である。
核酸配列の検出方法には、病原体の検出および同定に加えて、他の適用がある。例えば、毒素の由来となる植物（例えば、リシンを含有するトウゴマ）の検出、またはヒトの同定もしくは腫瘍のシークエンシングの目的での単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出は、ほんの二つの例である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Yagerら、Nature、２００６年、４４２巻、４１２〜４１８頁
【非特許文献２】Weiglら、Lab  Chip、２００８年、８巻、１９９９〜２０１４頁
【非特許文献３】Foudehら、Lab  Chip、２０１２年、１２巻、３２４９〜３２６６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、費用効果が高く、迅速で、感度が高く、かつ正確であり、なおかつ広範な作動条件下で実施できる核酸の検出および同定方法を提供することが当該技術分野において必要とされている。この必要性に対処する方法および組成物が、本明細書に提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）媒介性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質等の標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）媒介性ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的核酸の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。
【０００７】
一つの態様では、本明細書において、試料中の標的を同定する方法であって、（ａ）試料由来の核酸を複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップであって、前記複合体は、少なくとも１つの標的へと標的化されており、かつ前記核酸、前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または前記核酸および前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は標識を含む、ステップと、（ｂ）前記標識由来の特定のシグナルを検出することによって達成される、前記試料中の前記標的を同定するステップであって、特定のシグナルの存在は、前記核酸への前記ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合を示す、ステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、核酸は、標識を含む。一部の実施形態では、標識は、インターカレーター型の標識である。一部の実施形態では、核酸は、接触ステップの前に標識される。一部の実施形態では、核酸は、接触ステップの後に標識される。一部の実施形態では、複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、標識を含む。一部の実施形態では、複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、接触ステップの前に標識される。一部の実施形態では、複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、接触ステップの後に標識される。一部の実施形態では、核酸および複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は、標識される；一部の実施形態では、これらは両方とも、接触ステップの前に標識される；一部の実施形態では、これらは両方とも、接触ステップの後に標識される。一部の実施形態では、核酸は、接触の前に標識され、かつ複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、接触ステップの後に標識される。一部の実施形態では、核酸は、接触ステップの後に標識され、かつ複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、接触ステップの前に標識される。一部の実施形態では、核酸は、第１の標識を含み、かつｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、第２の標識を含み、第１の標識および第２の標識は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）用のドナー／アクセプターペアを含む。一部の実施形態では、接触させるステップが、室温で実行される。一部の実施形態では、同定するステップは、単一のシグナルを検出することを含む。一部の実施形態では、同定するステップは、複数のシグナルを検出することを含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼタンパク質である。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、オフターゲット結合の低下を呈する。一部の実施形態では、標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、標識は、検出可能な標識である。一部の実施形態では、試料は、臨床試料、法医学的試料、環境試料、メタゲノム試料および食品試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、試料は、ヒトに由来する。一部の実施形態では、試料は、接触前に処理されない。一部の実施形態では、核酸、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または核酸およびｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は、複数の標識を含む。一部の実施形態では、複合体は、複数の標的へと標的化されている。一部の実施形態では、標的は、病原体である。一部の実施形態では、病原体は、表１に記載の病原体から選択される。一部の実施形態では、異なる標的へと標的化された複合体は、異なる標識を含む。一部の実施形態では、異なる標的へと標的化された前記複合体が、同じ標識を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は基材に付着されている。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、基材に付着されている。一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、核酸は、基材に付着されている。一部の実施形態では、基材はシリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である。一部の実施形態では、基材は、二次元の基材である。一部の実施形態では、基材は、三次元の基材を含む。一部の実施形態では、基材は、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである。一部の実施形態では、ｇＮＡまたはｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、既知の順序で基材に付着されている。一部の実施形態では、基材は、再使用可能である。一部の実施形態では、接触は、溶液中で行われる。一部の実施形態では、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、ｇＮＡまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、溶液中に存在する。一部の実施形態では、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、少なくとも１つの特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、せん断される。一部の実施形態では、核酸は、増幅される。一部の実施形態では、核酸は、伸長できないヌクレオチドを用いて１または複数の末端において遮断される。一部の実施形態では、核酸は、同定ステップの後にシークエンシングによってさらに分析される。一部の実施形態では、複数の標的は、同時に同定される。一部の実施形態では、方法は、２４時間未満で実行される。一部の実施形態では、試料は、事前のスクリーニングステップに供される。一部の実施形態では、試料は、複数の検出ステップに供される。一部の実施形態では、核酸へのｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合は、標的の存在を示す。一部の実施形態では、核酸へのｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合の欠如は、標的が存在しないことを示す。一部の実施形態では、該方法は、小滴を生成するステップをさらに含み、小滴のサブセットは、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む。一部の実施形態では、小滴のサブセットは、核酸に結合したｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む。本明細書に提供されているいずれかの実施形態では、試料由来の核酸は、ＤＮＡを含む。本明細書に提供されているいずれかの実施形態では、試料由来の核酸は、ＤＮＡである。本明細書に提供されているいずれかの実施形態では、試料由来の核酸は、ＲＮＡを含む。本明細書に提供されているいずれかの実施形態では、試料由来の核酸は、ＲＮＡである。
【０００８】
別の態様では、本明細書において、少なくとも１つの標的へと標的化されたガイド核酸（ｇＮＡ）の収集物であって、複数のｇＮＡが標識を含む、収集物が提供される。一部の実施形態では、収集物は、複数の標的へと標的化されている。一部の実施形態では、標的は、病原体である。一部の実施形態では、病原体は、表１に記載の病原体から選択される。一部の実施形態では、異なる標的へと標的化されているｇＮＡは、異なる標識を含む。一部の実施形態では、異なる標的へと標的化されているｇＮＡは、同じ標識を含む。一部の実施形態では、標識は、検出可能な標識である。一部の実施形態では、標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ｇＮＡは、２つ以上の標識を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、基材は、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である。一部の実施形態では、基材は、二次元の基材である。一部の実施形態では基材は、三次元の基材を含む。一部の実施形態では、基材は、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである。一部の実施形態では、ｇＮＡは、既知の順序で基材に付着されている。一部の実施形態では、基材は、再使用可能である。一部の実施形態では、ｇＮＡは、溶液中に存在する。一部の実施形態では、収集物は、少なくとも１つの特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化している。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系ニッカーゼタンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系ニッカーゼタンパク質である。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、オフターゲット結合の低下を呈する。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、標識も含む。
【０００９】
別の態様では、本明細書において、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の収集物であって、ｇＮＡが、少なくとも１つの標的へと標的化されており、かつ複数の複合体が、標識を含む、収集物が提供される。一部の実施形態では、複数のｇＮＡは標識を含む。一部の実施形態では、複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、標識を含む。一部の実施形態では、複数のｇＮＡおよび複数の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方が、標識を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、複数の標的へと標的化されている。一部の実施形態では、標的は、病原体である。一部の実施形態では、病原体は、表１に記載の病原体から選択される。一部の実施形態では、異なる標的へと標的化されているｇＮＡは、異なる標識を含む。一部の実施形態では、異なる標的へと標的化されているｇＮＡは、同じ標識を含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、異なる標識を含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、同じ標識を含む。一部の実施形態では、標識は、検出可能な標識である。一部の実施形態では、標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団、フルオロフォア、色原体、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、複合体は、２つ以上の標識を含む。一部の実施形態では、複合体は、基材に付着されている。一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、基材に付着されている。一部の実施形態では、基材は、シリカ、プラスチック、ガラスまたは金属である。一部の実施形態では、基材は、二次元の基材である。一部の実施形態では、基材は、三次元の基材である。一部の実施形態では、基材は、チャンバーを含むかまたは円筒状アレイである。一部の実施形態では、複合体は、既知の順序で基材に付着されている。一部の実施形態では、基材は、再使用可能である。一部の実施形態では、複合体は、溶液中に存在する。一部の実施形態では、収集物は、少なくとも１つの特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、活性がないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ｄＣａｓ９である。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼタンパク質である。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、オフターゲット結合の低下を呈する。
【００１０】
別の態様では、本明細書に記載されている収集物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）および組成物のいずれか一つを含むキットが、本明細書に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、ｇＮＡが標識される第１のスキーム（左）ならびにｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方が標識される第２のスキーム（右）を含む、例示的な標識スキームを図解する。この図では、核酸は基材に付着されている。
【００１２】
【図１Ｂ】図１Ｂは、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的の検出および同定の例示的なスキームを図解しており、試料核酸は基材に付着されており、かつ標識されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を基材上に流している。未結合のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を洗い流した後、標的を同定することができる。
【００１３】
【図２】図２は、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性のマルチプレックス標的検出および同定の例示的なスキームを図解しており、標識されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は溶液中に存在している。
【００１４】
【図３】図３は、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的検出および同定の例示的なスキームを図解しており、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は基材に付着されている。
【００１５】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、キャピラリーアレイベースの方式を使用する、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的検出および同定の例示的なスキームを図解する。図４Ａは、ブロックとして見られる、予め定められた様式でキャピラリー内に区画としてパターン化された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を示す。核酸はキャピラリーを通って流される。キャピラリーの特定部分内に結合した核酸−複合体からのシグナルの検出は、目的の標的の存在を示す。
【００１６】
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、キャピラリーアレイベースの方式を使用する、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的検出および同定の例示的なスキームを図解する。図４Ｂは、標識された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が試料核酸と共にプレインキュベートされた後、キャピラリーアレイを通って流される例示的なスキームを図解しており、キャピラリーアレイもまた、キャピラリー内にブロックとして見られる特定の様式でパターン化された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含有している。このスキームにより、より高感度の標的の検出および同定が可能となる。このスキームでは、核酸は、２つの異なる複合体と会合し、捕捉される。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、キャピラリーアレイベースの方式を使用する、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的検出および同定の例示的なスキームを図解する。図４Ｃは、標識された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が試料核酸と共にプレインキュベートされた後、キャピラリーアレイを通って流される例示的なスキームを図解しており、キャピラリーアレイもまた、キャピラリー内にブロックとして見られる特定の様式でパターン化された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含有している。このスキームにより、より高感度の標的の検出および同定が可能となる。このスキームでは、核酸は、２つの異なる複合体と会合し、捕捉される。
【００１７】
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、キャピラリーアレイベースの方式を使用する、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的検出および同定の例示的なスキームを図解する。図４Ｄは、バーコードのような様式で標的を検出できることを示す。核酸−ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の検出シグナルのバンドパターンは、生体試料中の標的の素性を示す「ＵＰＣバーコード」として働くことができる。例えば、試料中の異なるＥ．ｃｏｌｉ株をバンドパターンにしたがって同定することができる。
【００１８】
【図５】図５は、小滴ベースのアプローチを使用する、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的同定の例示的なスキームを図解する。
【００１９】
【図６】図６は、標的の検出用にローリングサークル増幅を利用するための例示的なスキームを図解する。
【００２０】
【図７】図７は、標的を検出するためにＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用するための例示的なスキームを図解する。
【００２１】
【図８】図８は、標的核酸を検出するためにＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用するための別の例示的なスキームを図解する。
【００２２】
【図９】図９は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質を使用する、標的ＤＮＡの蛍光標識および検出の例示的なスキームを図解する。
【００２３】
【図１０】図１０は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質を使用する、標的核酸のＦＲＥＴ媒介性の検出の例示的なスキームを図解する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
ｇＲＮＡ等の標的特異的（例えば、病原体特異的）ガイド核酸（ｇＮＡ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質等の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的（例えば、病原体）の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。一部の好ましい実施形態では、ｇＮＡはｇＲＮＡであり、かつ核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質である。ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を用いる方法を本明細書中で論じる場合は常に、他の適切な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質およびｇＮＡを用いる関連方法もまた想定される。
【００２５】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００２６】
数値範囲は、その範囲を規定する数を含む。
【００２７】
本明細書を解釈する目的で、次の定義が適用されるが、適切であれば、単数形で使用されている用語は、複数形も含み、その逆もまた真であり得る。下に示す任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾するならば、示されている定義が優先されるものとする。
【００２８】
本明細書で使用するように、単数形である「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、他に断りがなければ、複数形の参照を含む。
【００２９】
本明細書に記載されている本発明の態様および実施形態が、「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
【００３０】
本明細書で使用する用語「約」は、当技術分野の当業者には直ちに分かる、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における、「約」によるある値またはパラメータの参照は、当該値またはパラメータそれ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。
【００３１】
本明細書で使用する用語「核酸」は、１個または複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、ならびにこれらの改変バージョンから選択される１個または複数のサブユニットを含むことができる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、これらの組合せまたは誘導体を含む。核酸は、一本鎖および／または二本鎖であってよい。
【００３２】
核酸は、「ヌクレオチド」を含み、これは、本明細書で使用するように、プリンおよびピリミジン塩基、ならびにこれらの改変バージョンを含有する部分を含むことが意図される。そのような改変には、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、アルキル化されたリボースまたは他の複素環が含まれる。さらに、用語「ヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」にはハプテンまたは蛍光標識を含有する部分が含まれ、従来のリボースおよびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含有することができる。改変ヌクレオシド、改変ヌクレオチドまたは改変ポリヌクレオチドには、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子または脂肪族基で置き換えられるか、エーテル、アミンなどとして官能基化される、糖部分の改変も含まれる。
【００３３】
本明細書に記載されている構造的および機能的特徴のいずれかに関して、これらの特徴を決定する方法は、当技術分野で公知である。
【００３４】
標的
標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。該方法は、標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）（ガイドＲＮＡ等）および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）を利用する。標的は核酸を含有し、該核酸が同定および検出用に利用される。
【００３５】
想定される標的は、試料中の種または属レベルの検出（例えば、ヒトＤＮＡの存在）、病原体（以下の実例用の実施形態において使用されるようなもの）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、縦列反復配列または転座（例えば、腫瘍プロファイリング用または遺伝性疾患の診断用）、個体（例えば、ヒト個体）の指標となるマーカー（ヒトＳＮＰまたはＳＴＲ等）の同定（例えば、法医学的試料中の個体ＤＮＡの同定用）、潜在的な毒素、または動物、真菌および植物（例えば、リシンを含有する、トウゴマの痕跡、食品において使用される原材料）を非限定的に含む。
【００３６】
場合によっては、複合試料中に存在する１または複数の対象のゲノムは実質的に同一であり、標準技術を使用して解明することが困難であり得る。場合によっては、１または複数の対象は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％同一のゲノムを有する。場合によっては、１または複数の対象は、１または複数の異なる微生物株、例えば、１または複数の細菌株、ウイルス株、真菌株等である。
【００３７】
標的核酸配列は、１または複数の遺伝子特徴を含み得る。１または複数の遺伝子特徴は、一つの対象を別の対象から区別し得る。本明細書中で言及するような遺伝子特徴は、ゲノム、遺伝子型、ハプロタイプ、クロマチン、染色体、染色体遺伝子座、染色体材料、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子クラスター、遺伝子座、遺伝子多型、遺伝子突然変異、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、縦列反復配列多型（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列タグ部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写単位、転写産物、遺伝子発現レベル、遺伝子発現状態であり得る。標的核酸配列は、本質的に任意の公知の遺伝子特徴を含み得る。
【００３８】
病原体標的
病原体の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。病原体は、細菌、ウイルス、真菌、藻または原生動物であり得る。病原体は、真核生物または原核生物であり得る。
【００３９】
一部の実施形態では、病原体は細菌である。一実施形態では、病原体は、グラム陰性細菌である。別の実施形態では、病原体は、グラム陽性細菌である。一実施形態では、病原体は、結核を引き起こす細菌である。例示的な実施形態では、病原体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである。別の実施形態では、病原体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌である。別の実施形態では、病原体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌である。例示的な実施形態では、病原体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７である。例示的な実施形態では、病原体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２である。例示的な実施形態では、病原体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ８８である。例示的な実施形態では、病原体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ４５：Ｋ１である。
【００４０】
一部の実施形態では、病原体は、疾患を引き起こす病原体である。一部の実施形態では、病原体は、食物媒介性の感染症を引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、尿路感染症を引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、肺炎を引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、上気道感染症を引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、敗血症または敗血症性ショックを引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、胃腸の病気を引き起こす。一部の実施形態では、病原体は、性感染性の病原体である。
【００４１】
一部の実施形態では、病原体は、生物兵器として使用されるものである。一部の実施形態では、斯かる病原体は、炭疽菌である。例示的な実施形態では、病原体は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓである。例示的な実施形態では、病原体は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓである。
【００４２】
一部の実施形態では、病原体は、真核生物病原体（真核生物体中で病原性）である。
【００４３】
一部の実施形態では、病原体は、哺乳動物病原体である（哺乳類生物体中で病原性であり得る）。一部の実施形態では、病原体は、ヒト病原体である。一部の実施形態では、病原体は、霊長類病原体である。一部の実施形態では、病原体は、非霊長類病原体である。一部の実施形態では、病原体は、サル病原体である。一部の実施形態では、病原体は、家畜類（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタまたはロバ）に特異的である。一部の実施形態では、病原体は、家畜動物（例えば、ネコ、イヌ、アレチネズミ、マウスまたはラット）に特異的である。
【００４４】
一部の実施形態では、病原体は、哺乳動物寄生生物である。一実施形態では、寄生生物は虫である。別の実施形態では、寄生生物は、マラリアを引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物は、リーシュマニア症を引き起こす寄生生物である。別の実施形態では、寄生生物はアメーバである。
【００４５】
一部の実施形態では、病原体は、非哺乳動物病原体である（非哺乳類生物体中で病原性であり得る）。
【００４６】
一部の実施形態では、病原体は、植物病原体である。一部の実施形態では、植物は、コメ、トウモロコシ、小麦、バラ、ブドウ、コーヒー、果実、トマト、ジャガイモまたはワタである。
【００４７】
一部の実施形態では、病原体は、鳥類病原体（鳥および他の鳥類生物体中で病原性）である。鳥類生物体は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモおよびガンを非限定的に含む。
【００４８】
例示的な実施形態では、表１（出典：「Summary  of  Notifiable  Diseases  -  United  States,  2010」CDC、http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5953a1.htm、アクセス日：２０１６年２月１８日）は、本明細書に提供されている方法および組成物を使用して同定され得る例示的な疾患を引き起こす病原体を提供する。
【表１−１】
2019506875.tif 000003
【表１−２】
2019506875.tif 000004
【００４９】
標的特異的ｇＮＡ
標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）が本明細書に提供される。これらの標的特異的ｇＮＡは、試料中の核酸標的の検出および同定のために利用される。ｇＮＡは、結合のために、核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質をｇＮＡと同族の標的にガイドする。
【００５０】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、標識され得る。
【００５１】
少なくとも１つの標的へと標的化されたｇＮＡの収集物も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、標的は、病原体である。一部の実施形態では、標的は、ＳＮＰである。
【００５２】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、単一の標的へと標的化されている。
【００５３】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、複数の標的へと標的化されている。
【００５４】
一部の実施形態では、収集物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２５００、５０００、７５００、またはさらには少なくとも１０，０００の標的へと標的化されたｇＮＡを含む。一部の例示的な実施形態では、収集物は、約１〜３、１〜５、１〜１０、１〜２５、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、５〜１００、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、２５〜５０、２５〜７５、２５〜１００、５０〜７５、５０〜１００、７５〜１００、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、１００〜２００の標的、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、２００〜９００、２００〜１０００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、３００〜９００、３００〜１０００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、４００〜９００、４００〜１０００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、４００〜９００、４００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、６００〜７００、６００〜８００、６００〜９００、６００〜１０００、７００〜８００、７００〜９００、７００〜１０００、８００〜９００、８００〜１０００、９００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、５００〜１０，０００、１０００〜５０００、１０００〜１０，０００、またはさらには約５０００〜１０，０００の標的へと標的化されたｇＮＡを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、標識を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、複数の標的へと標的化されており、かつ、それぞれの個々の標的へと標的化されたｇＮＡは、異なる標識を含むか、またはそれぞれの個々の標的へと標的化されたｇＮＡは、複数の標識を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、収集物中のｇＮＡは、標的生物体のゲノムにわたって１０６ｂｐ毎の、１０５ｂｐ毎の、１０４ｂｐ毎の、１０３ｂｐ毎の、１０２ｂｐ毎の、５０ｂｐ毎の、２５ｂｐ毎の、またはそれ未満毎の間隔の標的配列に向けられた標的化配列を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、収集物中のｇＮＡは、標的生物体のゲノム中の特異な配列に向けられた標的化配列を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、ｇＮＡは、既知の、参照可能な、または予め定められた順序で基材に付着されている。
【００６０】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、溶液中に存在する。
【００６１】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化される。一部の実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、またはさらには少なくとも２０の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。特異的な一実施形態では、本明細書に提供されているｇＮＡの収集物は、ｄＣａｓ９タンパク質、ならびにｄｅａｄＣｐｆ１、ｄｅａｄＣａｓ３、ｄｅａｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄｅａｄＣａｓ１０、ｄｅａｄＣｓｅ１、ｄｅａｄＣｓｙ１、ｄｅａｄＣｓｎ２、ｄｅａｄＣａｓ４、ｄｅａｄＣｓｍ２およびｄｅａｄＣｍ５からなる群から選択される別の活性がないＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲ系タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの標的に標的化されるｇＮＡの収集物は、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも２５００、少なくとも５０００、少なくとも７５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，５００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも７，５００，０００、少なくとも１０，０００，０００の特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの標的に標的化されたｇＮＡの収集物は、少なくとも５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１０〜１００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１０００〜１０，０００、１０００〜１００，０００、１０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、１００，０００〜１０，０００，０００、または１，０００，０００〜１０，０００，０００の特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０の特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、全部で、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０のｇＮＡを含有する。
【００６３】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、任意のプリンまたはピリミジン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、ウラシル、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシル（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、標的化配列を含む第１のＲＮＡ構成成分、および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合性配列を含む第２のＲＮＡ構成成分を含む。一部の実施形態では、第１の構成成分はｃｒＲＮＡを含み、第２の構成成分はｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、２つの構成成分は、共有結合により結合している。一部の実施形態では、２つの構成成分は、共有結合により結合していない。一部の実施形態では、２つの構成成分は、互いに会合している。
【００６５】
病原体特異的ｇＮＡ
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、単一の病原体、少なくとも１つの病原体、または複数の病原体へと標的化されている。一部の実施形態では、病原体は、表１に挙げた疾患の１または複数を引き起こすものである。
【００６６】
一部の実施形態では、収集物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２５００、５０００、７５００、またはさらには少なくとも１０，０００の病原体へと標的化されたｇＮＡを含む。一部の例示的な実施形態では、収集物は、約１〜３、１〜５、１〜１０、１〜２５、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、５〜１００、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、２５〜５０、２５〜７５、２５〜１００、５０〜７５、５０〜１００、７５〜１００、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、１００〜２００の標的、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、２００〜９００、２００〜１０００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、３００〜９００、３００〜１０００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、４００〜９００、４００〜１０００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、４００〜９００、４００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、６００〜７００、６００〜８００、６００〜９００、６００〜１０００、７００〜８００、７００〜９００、７００〜１０００、８００〜９００、８００〜１０００、９００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、５００〜１０，０００、１０００〜５０００、１０００〜１０，０００、またはさらには約５０００〜１０，０００の病原体へと標的化されたｇＮＡを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、同じ属の複数の病原体へと標的化されている。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、異なる属の複数の病原体へと標的化されている。
【００６８】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、同じ種の複数の病原体へと標的化されている。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、異なる種の複数の病原体へと標的化されている。
【００６９】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、同じ血清型の複数の病原体へと標的化されている。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、異なる血清型の複数の病原体へと標的化されている。
【００７０】
一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、標識を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、複数の病原体へと標的化されており、かつそれぞれの個々の病原体へと標的化されたｇＮＡは、異なる標識を含むか、またはそれぞれの個々の病原体へと標的化されたｇＮＡは、複数の標識を含む。
【００７２】
例示的な実施形態では、ｇＮＡの収集物は、５つの病原体へと標的化されており、該病原体は、エボラ、ＨＩＶ、デング、ジカおよびチクングンヤである。この例示的な収集物では、エボラに特異的なｇＮＡは第１の標識を含み、ＨＩＶに特異的なｇＮＡは第２の標識を含み、デングに特異的なｇＮＡは第３の標識を含み、ジカに特異的なｇＮＡは第４の標識を含み、かつチクングンヤに特異的な病原体特異的ｇＮＡは第５の標識を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、収集物中のｇＮＡは、病原体のゲノムにわたって１０６ｂｐ毎の、１０５ｂｐ毎の、１０４ｂｐ毎の、１０３ｂｐ毎の、１０２ｂｐ毎の、５０ｂｐ毎の、２５ｂｐ毎の、またはそれ未満毎の間隔の標的配列に向けられた病原体配列を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、収集物中の病原体特異的ｇＮＡは、病原体のゲノム中の特異な配列に向けられた標的化配列を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、既知の、参照可能な、または予め定められた順序で基材に付着されている。
【００７６】
一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、溶液中に存在する。
【００７７】
一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化される。一部の実施形態では、本明細書に提供されている病原体特異的ｇＮＡの収集物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、またはさらには少なくとも２０の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。特異的な一実施形態では、本明細書に提供されている病原体特異的ｇＮＡの収集物は、ｄＣａｓ９タンパク質、ならびにｄｅａｄＣｐｆ１、ｄｅａｄＣａｓ３、ｄｅａｄＣａｓ８ａ−ｃ、ｄｅａｄＣａｓ１０、ｄｅａｄＣｓｅ１、ｄｅａｄＣｓｙ１、ｄｅａｄＣｓｎ２、ｄｅａｄＣａｓ４、ｄｅａｄＣｓｍ２およびｄｅａｄＣｍ５からなる群から選択される別の活性がないＣａｓ／ＣＲＩＳＰＲ系タンパク質に対する特異性を呈するメンバーを含む。
【００７８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの病原体特異的に標的化される病原体特異的ｇＮＡの収集物は、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも２５００、少なくとも５０００、少なくとも７５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，５００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも７，５００，０００、少なくとも１０，０００，０００の特異な病原体特異的ｇＮＡを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの病原体に標的化された病原体特異的ｇＮＡの収集物は、少なくとも５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１０〜１００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１０００〜１０，０００、１０００〜１００，０００、１０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、１００，０００〜１０，０００，０００、または１，０００，０００〜１０，０００，０００の特異な病原体特異的ｇＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０の特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、ｇＮＡの収集物は、全部で、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０の病原体特異的ｇＮＡを含有する。
【００７９】
一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、任意のプリンまたはピリミジン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、ウラシル、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシン（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。一部の実施形態では、ｇＮＡは、アデニン、チミン、グアニン、シトシンおよびウラシル（および／またはこれらの改変バージョン）を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、病原体特異的ｇＮＡは、標的化配列を含む第１のＲＮＡ構成成分、および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合性配列を含む第２のＲＮＡ構成成分を含む。一部の実施形態では、第１の構成成分はｃｒＲＮＡを含み、第２の構成成分はｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、２つの構成成分は、共有結合により結合している。一部の実施形態では、２つの構成成分は、共有結合により結合していない。一部の実施形態では、２つの構成成分は、互いに会合している。
【００８１】
標的特異的ｇＮＡの編成
本明細書に提供される標的特異的ｇＮＡは、表面上の領域として編成され得る。例えば、標的特異的ｇＮＡは、アレイまたは他の表面もしくは基材（例えば、ビーズ、プレート）上に、スポット、ブロック、ビーズ、小滴、ウェルまたは他の編成構造として編成され得る。ｇＮＡ集団は、表面上の領域として、例えばウェルまたは小滴等の区画として編成され得る。ｇＮＡ集団は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と共に編成および配置されて、該編成内における標的への結合を可能とし得る。
【００８２】
スポット、ブロック、ビーズ、小滴、ウェルまたは他の編成構造のいずれであっても、所与の領域は、単一の標的化配列を標的にするｇＮＡを含み得る。他の場合には、所与の領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くの標的化配列を標的にするガイド核酸集団を含み得る。単一の領域内の複数の標的化配列は、それぞれが、同じ標的に対する異なる標的化配列（それぞれが特定種の病原体を同定する異なる標的化配列等）であり得る。他の場合には、単一の領域内の複数の標的化配列は、それぞれが、同じ属の異なるメンバー等の異なる標的に対する標的化配列であり得る。
【００８３】
対象特異的領域は、離散的なスポット状またはクラスター状等の、個々に取り扱うことができる（例えば、検出用に個々に取り扱うことができる）方式で表面上に分布させることができる。対象特異的領域に対応する複数のｇＮＡは、ｇＮＡの１または複数のセットとして並べることができる。ｇＮＡの各セット内で、複数のｇＮＡは同一であり得るか、またはそれらは互いに異なり得る。各セット内で、複数のｇＮＡは、それぞれが対象特異的特徴を含み得る。各セット内の複数のｇＮＡは、一つの対象を別の対象から区別する１または複数の対象特異的特徴を含み得る。場合によっては、対象特異的特徴は、円形、正方形または長方形エリア等の、アレイ上のスポットまたはエリアであり得る。場合によっては、対象特異的特徴は、ビーズであり得る。場合によっては、対象特異的特徴は、特徴特異的タグを用いて標識された一連のｇＮＡであり得る。特徴特異的タグは、例えば、特徴特異的バーコード、または特徴特異的標識用の結合性部位であり得る。一部の例では、特徴は、反復的特徴を有する。一部の例では、反復的特徴は同一である。一部の例では、反復的特徴は、同じ標的ポリヌクレオチドを同定するように設計される。一部の例では、反復的特徴は、同じゲノムを同定するように設計される。一部の例では、反復的特徴は、種内の任意の株を同定するように設計される。場合によっては、反復的特徴は、個体を同定するように設計される。
【００８４】
ｇＮＡセット内または対象特異的領域内の複数の特異なｇＮＡは、デバイスからのシグナルを検出するために用いられる検出系の分解能より小さいか、またはそれと同等のサイズのエリア内に配置され得る。複数の特異な、順序を定められたｇＮＡに包含されるエリアは、検出系の分解能未満であってもよいし、検出系の分解能に等しくてもよく、あるいは、セット内の少なくとも２つの無作為に順序を定められた特異なｇＮＡに包含されるエリアが検出系の分解能に概ね相当するか、またはそれ未満である限り、全ての特異なｇＮＡに包含されるエリアは、より大きくてもよい。斯かる場合、複数の特異なｇＮＡまたは特徴からのシグナルを収集し、１ピクセルもしくは数ピクセル、または他の分解能要素に統合することができる。斯かるアプローチにより、非同一のガイド核酸を単一の特徴中に集めるのと類似の結果を達成し得る。
【００８５】
ｇＮＡは、偽陽性を検出するように設計され得る。例えば、ｇＮＡの設計は、セット内の個々のｇＮＡが、他のｇＮＡセット中の個々のガイド核酸にミスマッチな１または複数の塩基を有するように設計されているｇＮＡセットを設計することによって為され得る。場合によっては、ｇＮＡセットは、相補的である。他の場合には、ｇＮＡセットは、非相補的である。別の例では、ｇＮＡセットは、複数の類似株を有する対象生物体を検索するように設計され得る。この例では、標的ではないが標的の配列に非常に近いゲノムを有し、１または複数の個々の特異な特徴を有する株が含有する個々の配列を検出するためのｇＮＡセットを加えてもよい。
【００８６】
領域は、それぞれが相違してよく、この相違は、異なる数のｇＮＡ、異なる種類のｇＮＡ、ｇＮＡによって標的化された異なる対象特異的特徴、特異なｇＮＡの異なる平均的表現を含有すること等を非限定的に含む。
【００８７】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質
本開示の方法は、核酸ガイド化ヌクレアーゼを利用する。本明細書で使用する場合、「核酸ガイド化ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを切断し、特異性を付与するために１つまたは複数の核酸ガイド核酸（ｇＮＡ）を使用する任意のヌクレアーゼである。核酸ガイド化ヌクレアーゼには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質ならびに非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が含まれる。
【００８８】
本明細書で提供される核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＤＮＡによって誘導されるＤＮＡヌクレアーゼ；ＤＮＡによって誘導されるＲＮＡヌクレアーゼ；ＲＮＡによって誘導されるＤＮＡヌクレアーゼ；またはＲＮＡによって誘導されるＲＮＡヌクレアーゼであってよい。ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼであり得る。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、核酸ガイド化ＲＮＡエンドヌクレアーゼである。
【００８９】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系の任意のタンパク質メンバーに結合する核酸配列である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の任意のタンパク質メンバーに結合する核酸配列である。
【００９０】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ＣＡＳクラスＩ  Ｉ型、ＣＡＳクラスＩ  ＩＩＩ型、ＣＡＳクラスＩ  ＩＶ型、ＣＡＳクラスＩＩ  ＩＩ型およびＣＡＳクラスＩＩ  Ｖ型タンパク質からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＩ型系由来のタンパク質を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を含む。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＮｇＡｇｏからなる群から選択される。例示的な実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００９１】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種由来であってよい。
【００９２】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ由来の核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質）由来であるまたはこれに由来する。
【００９３】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、天然に存在するものである。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、操作されたものである。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、単離され、組換えにより製造され、または合成のものである。
【００９４】
一部の実施形態では、天然に存在する核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質を含み、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ−ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２およびＣｍ５を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の操作された例は、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む。「触媒活性がない」または単に「活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質」という用語は、例えば一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の場合、不活性化されたＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を一般に指す。斯かるタンパク質は、任意の核酸中の標的部位（標的部位はｇＮＡによって決定される）に結合し得るが、該タンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断するまたは二本鎖ＤＮＡにニックを入れることができない。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系の触媒活性がないタンパク質は、触媒活性がないＣａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一実施形態では、活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質−ｇＮＡ複合体は、ｇＮＡ配列によって決定される標的に結合する。結合した活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、他のマニピュレーションを進める間、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質による切断を防止することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の操作された例は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質も含む。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼは、単一の不活性触媒ドメインを含有する、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の改変バージョンを指す。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、単一の不活性触媒ドメイン、例えば、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインのいずれかを含有することができる。１個のみの活性ヌクレアーゼドメインにより、核酸ガイド化ヌクレアーゼニッカーゼは、標的ＤＮＡの一方の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作製する。どちらの突然変異体が使用されるかに応じて、ｇＮＡハイブリダイズ鎖または非ハイブリダイズ鎖を切断することができる。反対の鎖を標的とする２個のｇＮＡに結合した核酸ガイド化ヌクレアーゼニッカーゼは、ＤＮＡに二本鎖切断を作製し得る。この「二重ニッカーゼ」戦略は、二本鎖切断が形成される前に、両方のｇＮＡ核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）が部位に特異的に結合することを必要とするため、切断の特異性を増加させることができる。
【００９７】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の操作された例は、標的に類似するが同一でない配列へのオフターゲット結合を低下させるアミノ酸変化を含有する、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の高い特異性の突然変異体も含む。
【００９８】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の操作された例は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系融合タンパク質も含む。例えば、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、別のタンパク質、例えば、活性化因子、リプレッサー、ヌクレアーゼ、酵素、蛍光分子、化学的タグ、放射性タグ、またはトランスポサーゼに融合されてよい。例えば、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＥＧＦＰまたはターミナルトランスフェラーゼに融合され得る。
【００９９】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、基材に付着されている。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、溶液中に存在する。
【０１００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が使用される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型系、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型系およびＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＩ型系由来のタンパク質を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種に由来し得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離される、組換えにより産生されるか、または合成による。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の例は、天然に存在し得る、天然に存在するバージョンを模倣し得る、または操作されたバージョンであり得る。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからであるか、またはこれらに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質に由来する。
【０１０４】
一部の実施形態では、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＣＡＳクラスＩタイプＩ、ＩＩＩもしくはＩＶ、またはＣＡＳクラスＩＩタイプＩＩもしくはＶに属することができ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ〜ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃ２ｃ２およびＣｐｆ１を含むことができる。
【０１０５】
例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ｃａｓ９を含む。
【０１０６】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
【０１０７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％または９０％同一、少なくとも９５％同一または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０１０８】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ｇＮＡ」は、ｇＮＡを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ｇＮＡは、単離されたＮＡとして、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０１０９】
Ｃａｓ９
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質、核酸ガイド化ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９であるかまたはＣａｓ９を含む。本発明のＣａｓ９は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものであってよい。Ｃａｓ９は、天然に存在し得る、天然に存在するバージョンを模倣し得る、または操作されたバージョンであり得る。
【０１１０】
本明細書の実施形態において使用することができるＣａｓ９タンパク質の例は、Ｆ．Ａ．  Ｒａｎ、Ｌ．  Ｃｏｎｇ、Ｗ．Ｘ．  Ｙａｎ、Ｄ．  Ａ．  Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｓ．  Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｊ．  Ｋｒｉｚ、Ｂ．  Ｚｅｔｓｃｈｅ、Ｏ．  Ｓｈａｌｅｍ、Ｘ．  Ｗｕ、Ｋ．Ｓ．  Ｍａｋａｒｏｖａ、Ｅ．Ｖ．  Ｋｏｏｎｉｎ、Ｐ．Ａ．  ＳｈａｒｐおよびＦ．  Ｚｈａｎｇ；「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９」、Ｎａｔｕｒｅ  ５２０巻、１８６〜１９１頁（２０１５年４月９日）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９、に見出すことができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系である。
【０１１２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、ＰＡＭ配列は、標的特異的ガイド配列の３’末端に直に位置するＮＧＧである。例示的な細菌種からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列は、以下を含むこともできる：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＮＧＧ）、Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＮＧＲＲＴ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＮＮＮＧＡ  ＴＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡ）およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＮＡＡＡＡＣ）、これらは全て本発明から逸脱することなく使用可能である。
【０１１３】
例示的な一実施形態では、Ｃａｓ９配列は、例えば、細菌で発現させ、組換え６Ｈｉｓタグ付きタンパク質を精製するために、ＰＣＲによって再増幅され、次にｐＥＴ３０（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）にクローニングされる、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能）から得ることができる。
【０１１４】
「Ｃａｓ９−ｇＮＡ複合体」は、Ｃａｓ９タンパク質およびｇＮＡを含む複合体を指す。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質と、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０１１５】
用語「Ｃａｓ９関連ｇＮＡ」は、前記のようなｇＮＡを指す。Ｃａｓ９関連ｇＮＡは、単離されて、またはＣａｓ９−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０１１６】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、本明細書で提供される実施形態で使用される。
【０１１７】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、任意の細菌または古細菌種からのものであってよい。
【０１１８】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、単離されるか、組換えで生成されるか、または合成のものである。
【０１１９】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ  ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ  ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ｆｌｕｖｉｉｃｏｌａ  ｔａｆｆｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｕｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａからのものであるかまたはそれに由来する。
【０１２０】
一部の実施形態では、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、天然に存在し得る、天然に存在するバージョンを模倣し得る、または操作されたバージョンであり得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、天然に存在する非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉからのアルゴノート）である。
【０１２２】
「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体」は、非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質およびｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）を含む複合体を指す。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、ｇＲＮＡは２つの分子、すなわち標的とハイブリダイズし、配列特異性を提供する１つのＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、およびｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることが可能である１つのＲＮＡ「ｔｒａｃｒＲＮＡ」で構成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含有する単一の分子（すなわち、ｇＲＮＡ）であってよい。
【０１２３】
非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と少なくとも６０％同一（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）であってよい。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、野生型非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質の全ての機能、または、結合活性、ヌクレアーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を含む機能のうち１つもしくは一部だけを有することができる。
【０１２４】
用語「非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ｇＮＡ」は、ｇＮＡを指す。非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質関連ｇＮＡは、単離されたＮＡとして、または非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質−ｇＮＡ複合体の一部として存在することができる。
【０１２５】
触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）が含まれる。用語「触媒活性がない」は、不活性化ヌクレアーゼ、例えば、不活性化ＨＮＨおよびＲｕｖＣヌクレアーゼを有する核酸ガイド化ヌクレアーゼを一般的に指す。そのようなタンパク質は任意の核酸中の標的部位に結合することができるが（標的部位はｇＮＡによって決定される）、タンパク質は核酸を切断することもニックを入れることもできない。
【０１２６】
したがって、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、未結合の核酸および触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼに結合した断片への混合物の分離を可能にする。例示的な一実施形態では、ｄＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体はｇＲＮＡ配列によって決定される標的に結合する。ｄＣａｓ９結合はＣａｓ９による切断を阻止できるが、他の操作は進行する。
【０１２７】
別の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、トランスポザーゼなどの別の酵素に融合させて、その酵素の活性を特異的部位に標的化させることができる。
【０１２８】
一部の実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼは、ｄＣａｓ９、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ３、ｄＣａｓ８ａ〜ｃ、ｄＣａｓ１０、ｄＣｓｅ１、ｄＣｓｙ１、ｄＣｓｎ２、ｄＣａｓ４、ｄＣｓｍ２、ｄＣｍ５、ｄＣｓｆ１、ｄＣ２Ｃ２またはｄＮｇＡｇｏである。
【０１２９】
例示的な一実施形態では、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質は、ｄＣａｓ９である。
【０１３０】
核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼ（ニッカーゼ−核酸ガイド化ヌクレアーゼと互換的に呼ばれる）が含まれる。
【０１３１】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼの操作された例には、単一の不活性触媒ドメインを含有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼまたは非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ニッカーゼが含まれる。
【０１３２】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、Ｃｐｆ１ニッカーゼ、Ｃａｓ３ニッカーゼ、Ｃａｓ８ａ〜ｃニッカーゼ、Ｃａｓ１０ニッカーゼ、Ｃｓｅ１ニッカーゼ、Ｃｓｙ１ニッカーゼ、Ｃｓｎ２ニッカーゼ、Ｃａｓ４ニッカーゼ、Ｃｓｍ２ニッカーゼ、Ｃｍ５ニッカーゼ、Ｃｓｆ１ニッカーゼ、Ｃ２Ｃ２ニッカーゼまたはＮｇＡｇｏニッカーゼである。
【０１３３】
一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。
【０１３４】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ｇＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＮＡに結合した核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは、核酸において二本鎖切断を起こすことができる。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方の核酸ガイド化ヌクレアーゼ／ｇＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加させる。
【０１３５】
例示的な実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的配列に結合するために使用することができる。用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、単一の不活性触媒ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−ドメインを含有する、Ｃａｓ９タンパク質の改変バージョンを指す。１つの活性ヌクレアーゼドメインだけのため、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」を生成する。どの変異体が使用されるかによって、ガイドＲＮＡとハイブリダイズした鎖またはハイブリダイズしていない鎖を切断することができる。反対側の鎖を標的にする２つのｇＲＮＡに結合したＣａｓ９ニッカーゼは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を起こす。この「二重ニッカーゼ」戦略は、両方のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、二本鎖切断が形成される前の部位で特異的に結合することを必要とするので、切断特異性を増加することができる。
【０１３６】
ＤＮＡの捕捉は、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼを使用して実行することができる。例示的な一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼであるニッカーゼは二本鎖核酸の１本の鎖を切断し、二本鎖の領域はメチル化ヌクレオチドを含む。
【０１３７】
解離可能および耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼ
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼが本明細書で提供される方法で使用される（耐熱性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼまたは耐熱性の非ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の核酸ガイド化ヌクレアーゼ）。そのような実施形態では、反応温度が上昇し、タンパク質の解離を誘導する。反応温度は低下し、さらなる切断された標的配列の生成を可能にする。一部の実施形態では、少なくとも７５℃で少なくとも１分の間維持されるとき、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも５０％の活性、少なくとも５５％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも６５％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも７５％の活性、少なくとも８０％の活性、少なくとも８５％の活性、少なくとも９０％の活性、少なくとも９５％の活性、少なくとも９６％の活性、少なくとも９７％の活性、少なくとも９８％の活性、少なくとも９９％の活性または１００％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で、少なくとも８０℃で、少なくとも８５℃で、少なくとも９０℃で、少なくとも９１℃で、少なくとも９２℃で、少なくとも９３℃で、少なくとも９４℃で、少なくとも９５℃、９６℃で、少なくとも９７℃で、少なくとも９８℃で、少なくとも９９℃で、または少なくとも１００℃で少なくとも１分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、少なくとも７５℃で少なくとも１分、２分、３分、４分または５分の間維持されるとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、温度を上昇させ、２５℃〜５０℃に低下させたとき、少なくとも５０％の活性を維持する。一部の実施形態では、温度は、２５℃に、３０℃に、３５℃に、４０℃に、４５℃に、または５０℃に低下させられる。例示的な一実施形態では、耐熱性酵素は、９５℃で１分間の後に少なくとも９０％の活性を保持する。
【０１３８】
一部の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、耐熱性Ｃａｓ９、耐熱性Ｃｐｆ１、耐熱性Ｃａｓ３、耐熱性Ｃａｓ８ａ〜ｃ、耐熱性Ｃａｓ１０、耐熱性Ｃｓｅ１、耐熱性Ｃｓｙ１、耐熱性Ｃｓｎ２、耐熱性Ｃａｓ４、耐熱性Ｃｓｍ２、耐熱性Ｃｍ５、耐熱性Ｃｓｆ１、耐熱性Ｃ２Ｃ２または耐熱性ＮｇＡｇｏである。
【０１３９】
一部の実施形態では、耐熱性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質は、耐熱性Ｃａｓ９である。
【０１４０】
耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、単離すること、例えば、高温菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのゲノムにおける配列相同性によって同定することができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターに次にクローニングすることができる。例示的な一実施形態では、耐熱性のＣａｓ９タンパク質は単離される。
【０１４１】
別の実施形態では、耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼは、非耐熱性の核酸ガイド化ヌクレアーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化によって得ることができる。核酸ガイド化ヌクレアーゼの配列は、その耐熱性を改善するために変異誘発させられ得る。
【０１４２】
標的特異的ｇＮＡと核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質との複合体
標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）と複合体化した核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が、本明細書に提供される。ｇＮＡは、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を標的核酸に向かわせる。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、ＲＮＡガイド化ヌクレアーゼ系であり得る。核酸ガイド化ヌクレアーゼ系は、ＤＮＡガイド化ヌクレアーゼ系であり得る。場合によっては、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質をＲＮＡ標的に向かわせる標的特異的ｇＮＡと複合体化した核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。場合によっては、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質をＤＮＡ標的に向かわせる標的特異的ｇＮＡと複合体化した核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。
【０１４３】
核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化した標的特異的ｇＮＡが、本明細書に提供される。ｇＮＡが少なくとも１つの標的へと標的化されている（例えば、病原体特異的ｇＮＡ）、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の収集物も、本明細書に提供される。
【０１４４】
一部の実施形態では、複合体は、標識を含む。一部の実施形態では、標識は、検出可能な標識である。
【０１４５】
一部の実施形態では、複合体の収集物中のｇＮＡは、複数の標的へと標的化されている。
【０１４６】
一部の実施形態では、複合体は、２以上の標識を含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、複合体は、基材に付着されている。一部の実施形態では、複合体は、既知のまたは予め定められた順序で基材に付着されている。一部の実施形態では、基材は、再使用可能なものである。
【０１４８】
一部の実施形態では、複合体は、溶液中に存在する。
【０１４９】
試料
試料中に存在する核酸に基づく、試料中の標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。
【０１５０】
想定される試料は、生物学的試料、臨床試料、法医学的試料、環境試料、メタゲノム試料等を非限定的に含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、試料は、腫瘍組織試料である。
【０１５２】
一部の実施形態では、試料は、血液、血清、血漿  粘液、毛、尿、糞便、唾液、息、脳脊髄液、リンパ液、組織、皮膚または生検である。
【０１５３】
一部の実施形態では、試料は、食品試料、例えば、肉、乳製品または作物の試料である。
【０１５４】
一部の実施形態では、試料は、織物試料である。
【０１５５】
一部の実施形態では、試料は、土壌試料である。一部の実施形態では、試料は、岩石試料である。一部の実施形態では、試料は、植物試料である。
【０１５６】
一部の実施形態では、試料は、水試料である。
【０１５７】
一部の実施形態では、試料は、空気試料である。一部の実施形態では、試料は、空気清浄器に由来する。
【０１５８】
一部の実施形態では、試料は、加工試料である。一部の実施形態では、試料は、未加工試料である。
【０１５９】
一部の実施形態では、試料は、ＤＮＡを含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、試料は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、試料は、ＲＮＡを含み、逆転写されてｃＤＮＡを生成する。
【０１６１】
一部の実施形態では、試料中の核酸は、使用前にせん断される。一部の実施形態では、試料中の核酸は、酵素せん断される。一部の実施形態では、試料中の核酸は、機械せん断される。
【０１６２】
一部の実施形態では、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）は、使用前に増幅される。
【０１６３】
一部の実施形態では、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）は、使用前に環状化される。
【０１６４】
一部の実施形態では、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって増幅される。
【０１６５】
一部の実施形態では、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）は、等温増幅技術によって増幅され、該等温増幅技術は、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を非限定的に含む。
【０１６６】
一般に、同定される標的核酸のサイズは、２０ｂｐ〜１０９ｂｐに及ぶ。
【０１６７】
一部の実施形態では、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ジデオキシＣＴＰ（伸長できないヌクレオチド）を用いて遮断される。一部の実施形態では、試料中の核酸（例えば、ＤＮＡ）は、伸長できないヌクレオチドを用いて１または複数の末端において遮断される。
【０１６８】
標識
標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的の検出および同定用の方法および組成物が、本明細書に提供される。該方法は、試料由来の試料中の核酸を標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む、またはＤＮＡである。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡを含む、またはＲＮＡである。
【０１６９】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、標識を含む、または標識され得る。例示に過ぎないが、蛍光ＲＮＡ結合性色素は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＯｌｉＧｒｅｅｎおよびＲｉｂｏＧｒｅｅｎを非限定的に含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、標識を含む、または標識され得る（例えば、標識を付着することができる反応性部位を含む）。
【０１７１】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、標識を含むか、または標識され得る。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、核酸との接触前に標識され、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸との接触後に標識される。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、核酸との接触後に標識され、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、核酸との接触前に標識される。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方は、核酸との接触前に標識される。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方は、核酸との接触後に標識される。
【０１７２】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸は、標識を含むか、または標識され得る。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質および核酸は、標識を含むか、または標識され得る。
【０１７３】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体および核酸は、標識を含むか、または標識され得る。
【０１７４】
一部の実施形態では、同じ標識を使用して、同じ群に属する異なる標的にタグ付けする。例えば、一部の実施形態では、細菌病原体に特異的な全てのｇＮＡは、第１の標識を含み、ウイルス病原体に特異的な全てのｇＮＡは、第２の標識を含み、かつ真菌病原体に特異的な全てのｇＮＡは、第３の標識を含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、異なる標識を使用して、同じ群に属する異なる病原体にタグ付けする。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌に特異的なｇＮＡは、第１の標識を含み、かつＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細菌に特異的なｇＮＡは、第２の標識を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡ１０２および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質１０３を含む複合体は、複数のフルオロフォア、複数の生化学分子（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）、またはこれらの組合せ等の、複数の標識または複数構成成分の標識を用いて標識される（例えば、図１Ａおよび図１Ｂを参照）。場合によっては、標的（例えば、試料ＤＮＡ１０１）は、基材１０４に結合され得る。一部の実施形態では、複数の標識を使用してシグナル増幅カスケードを誘起し得る。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、複数構成成分１０５、１０６、１０７のタグを用いて標識される（例えば、図１Ａの１００を参照）。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方は、複数構成成分の標識１０５、１０８を用いて標識される（例えば、図１Ａの１１０を参照）。一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、複数構成成分のタグを用いて標識される（例えば、図１Ｂを参照）。
【０１７７】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の両方は、同じ標識を用いて標識される。
【０１７８】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、異なる標識を用いて標識される。一部の実施形態では、例えば基材上での両方の標識の検出および局在性は、ｇＮＡと核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質との間で複合体が形成されていることを示す。
【０１７９】
一部の実施形態では、異なる標的を標的化する複合体は、異なる標識を含む。一部の実施形態では、異なる標的を標的化する複合体は、同じ標識を含むが、既知の順序で基材に付着されている。一部の実施形態では、異なる標的を標的化する複合体は、標識を含まない。
【０１８０】
一部の実施形態では、核酸は、標識を含む、または標識され得る。
【０１８１】
一部の実施形態では、核酸標識は、インターカレーター型の標識である。
【０１８２】
一部の実施形態では、核酸標識は、非特異的な核酸結合性標識である。
【０１８３】
一部の実施形態では、核酸は、核酸色素標識を含む。好適な発光性核酸色素の例は、ＥｖａＧｒｅｅｎ色素、ＧｅｌＲｅｄ、ＧｅｌＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（米国特許第５，４３６，１３４号および同第５，６５８，７５１号）、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥｒ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ、ＬＣ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ、ＢＯＸＴＯ、ＢＥＢＯ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ色素、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、エチジウムホモダイマー１、エチジウムホモダイマー２、エチジウムホモダイマー３、ヨウ化プロピジウム、臭化エチジウム、様々なヘキスト色素、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、Ｃｈｒｏｍｏｆｙおよびアクリジンホモダイマーを非限定的に含む。他の核酸色素は、Lee（１９８９年）の米国特許第４，８８３，８６７号、Yueら（１９９６年）の米国特許第５，５８２，９７７号、Yueら（１９９４年）の米国特許第５，３２１，１３０号、Yueら（１９９５年）の米国特許第５，４１０，０３０号、米国特許第５，８６３，７５３号、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２１１０２８号および同第２００８／０１４５５２６号に記載されているものを含む。上記で言及した色素の多くは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｉｏｔｉｕｍおよび多数の他の企業から市販されている。
【０１８４】
一部の実施形態では、核酸は、標的特異的ガイドＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体との接触前に標識される。一部の実施形態では、核酸は、標的特異的ガイドＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体との接触後に標識される。
【０１８５】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、核酸との接触前に標識される。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、核酸との接触後に標識される。
【０１８６】
一部の実施形態では、核酸および標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は、複合体への核酸の接触前に標識される。一部の実施形態では、核酸および標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は、複合体への核酸の接触後に標識される。
【０１８７】
一部の実施形態では、核酸の標識およびｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の標識を検出するために異なる方法が利用される。
【０１８８】
一部の実施形態では、核酸およびｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に基づくシグナル検出用に標識される。例えば、核酸は、ＹＯＹＯ−１インターカレーター色素（ドナー）を用いて標識され得、かつｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、Ｃｙ３（アクセプター）を用いて標識され得る。核酸にｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体が結合した（そしてドナー／アクセプターペアが作製された）時に、増感されたＣｙ３の発光が検出可能となる。例示的なドナー部分は、ＹＯＹＯ−１、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＤＹ−６３０、ＤｉＤ、Ｄｙ−６３５を非限定的に含み、例示的なアクセプター部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０等のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素を非限定的に含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、標識は、さらに標識に結合され得る部分である。
【０１９０】
一部の実施形態では、標識は、検出可能な標識である。
【０１９１】
想定される標識は、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合性断片、ペプチド、発色団、発光団（lumiphore）、フルオロフォア、色素原、ハプテン、抗原、放射性同位元素、磁性粒子、金属ナノ粒子、酸化還元活性マーカー基（酸化還元反応を起こすことができる）、アプタマー、結合ペアの一方のメンバーおよびこれらの組合せを非限定的に含む。
【０１９２】
特異的な実施形態では、標識はフルオロフォアである。フルオロフォアは、ある波長の光を吸収し、異なる波長の光を放出する任意の物質であり得る。典型的なフルオロフォアは、蛍光色素、半導体ナノ結晶、ランタニドキレートおよび蛍光タンパク質を含む。例示的な蛍光色素は、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシロドール、カルボキシローダミン１１０、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、Ｃｙ２（登録商標、Ｃｙ３（登録商標、Ｃｙ３．５（登録商標、Ｃｙ５（登録商標、Ｃｙ５．５（登録商標、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、フィコエリトリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標  ６８０、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ、これらのコンジュゲートおよびこれらの組合せを含む。
【０１９３】
例示的なランタニドキレートは、ユウロピウムキレート、テルビウムキレートおよびサマリウムキレートを含む。
【０１９４】
例示的な酵素は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ノイラミニダーゼ（neurarninidase）、細菌ルシフェラーゼ、昆虫ルシフェラーゼおよびシーパンジールシフェラーゼ（Renilla  koellikeri）を含み、これらは、当該技術分野で公知の好適な基質およびアッセイ条件の存在下で検出可能なシグナルを生成できる。
【０１９５】
例示的なハプテンおよび／または結合ペアのメンバーは、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ビオチンおよび上記したものを含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、核酸、標的特異的ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質またはｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体は、異なる標識を用いて標識される。
【０１９７】
一部の実施形態では、例えば基材上での標識の検出および局在性は、ｇＮＡと核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質との間で複合体が形成されていることを示す。例示的な実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に基づくシグナル検出用に標識される。斯かる実施形態では、一方の標識はドナー部分であり、かつ他方の標識はアクセプター部分である。例えば、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質の標識は、標的特異的ｇＮＡの標識からのシグナルによって消光されない限り（またはその逆）、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質が複合体（ドナー／アクセプターペア）を形成している時に、検出可能である。別のＦＲＥＴペアは、ドナー部分を含むｇＮＡ、およびアクセプター部分を含むｇＮＡである。
【０１９８】
別のＦＲＥＴペアは、ドナー部分を含むｇＮＡ、およびアクセプター部分を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）である。
【０１９９】
別のＦＲＥＴペアは、アクセプター部分を含むｇＮＡ、およびドナー部分を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）である。
【０２００】
別のＦＲＥＴペアは、ドナー部分を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質、およびアクセプター部分を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。
【０２０１】
別のＦＲＥＴペアは、ドナー部分を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質、およびアクセプター部分を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）である。
【０２０２】
別のＦＲＥＴペアは、ドナー部分を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）、およびアクセプター部分を含む核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質である。
【０２０３】
一部の実施形態では、ｇＮＡのみまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質のみが、ＦＲＥＴ標識を含む。
【０２０４】
ＦＲＥＴの実施形態のための例示的なドナー部分は、ＹＯＹＯ−１、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＤＹ−６３０、ＤｉＤ、Ｄｙ−６３５を非限定的に含み、例示的なアクセプター部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０等のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素を非限定的に含む。
【０２０５】
検出
本発明の標識の検出は、当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて実行され得る。例えば、検出は、眼によって、可視変色を検出することによって、分光光度計、蛍光リーダーもしくは蛍光顕微鏡を使用することによって達成され得る。一部の実施形態では、検出のために携帯式装置が利用される。一部の実施形態では、シグナル検出は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に基づくものであり、ＦＲＥＴシグナルは、顕微鏡上でＦＲＥＴチャネルを使用して検出され得る。
【０２０６】
一部の実施形態では、検出は、複数のステップで実行され得る。一部の実施形態では、検出は、複数の検出系で実行される。
【０２０７】
例示的な実施形態では、２ステップ検出が実行される。この実施形態では、溶液中の標識が最初に検出され（例えば、色の変化）、試料に対してさらなる検出ステップが必要とされることを示す。
【０２０８】
基材
本発明は、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的の検出および同定用の方法および組成物を提供する。この目的に有用な様々な基材が、本明細書に提供される。
【０２０９】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、基材に付着されている。一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、既知の／予め定められた／参照可能な順序で基材に付着されている。
【０２１０】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、基材に付着されている。
【０２１１】
一部の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含む複合体は、基材に付着されている。
【０２１２】
一部の実施形態では、標的を同定するために同定される核酸は、基材に付着されている。本明細書に提供されている一部の実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡを含む、またはＤＮＡである。本明細書に提供されている一部の実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡを含む、またはＲＮＡである。
【０２１３】
ｇＮＡ、核酸、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質またはこれらを含む複合体は、無作為ではない化学的または物理的相互作用を通じて基材と会合している場合、基材に付着されている。一部の実施形態では、付着は、共有結合を通じたものである。一部の実施形態では、核酸は、基材表面上のカルボキシル分子に可逆的に結合している。
【０２１４】
基材は、ガラス、プラスチック、シリコン、シリカベースの材料、官能化ポリスチレン、官能化ポリエチレングリコール、官能化有機ポリマー、ニトロセルロースまたはナイロン膜、紙、綿および合成に適した材料でできていてよい。基材は、平坦である必要はない。
【０２１５】
一部の実施形態では、基材は、２次元アレイである。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦である。一部の実施形態では、２次元アレイは、平坦でなく、例えば、アレイは、波状アレイである。
【０２１６】
基材は、球形（例えば、ビーズ）を含む任意の型の形状を含む。基材に付着される材料は、基材の任意の部分に付着されてよい（例えば、多孔性基材材料の内側部分に付着されてよい）。
【０２１７】
一部の実施形態では、基材は、３次元アレイ、例えば、マイクロスフェアである。
【０２１８】
一部の実施形態では、マイクロスフェアは、磁性である。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ガラスである。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、ポリスチレンでできている。一部の実施形態では、マイクロスフェアは、シリカベースである。
【０２１９】
一部の実施形態では、基材は、内側表面を有するアレイであり、例えば、ストロー、チューブ、キャピラリー、円柱状またはマイクロ流体チャンバーアレイである。一部の実施形態では、基材は、複数のストロー、キャピラリー、チューブ、シリンダーまたはチャンバーを含む。一部の実施形態では、基材の外側表面は、試料核酸または標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体につながれている。一部の実施形態では、基材の内側表面は、試料核酸または標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体につながれている。一部の実施形態では、基材の外側表面および内側表面の両方は、試料核酸または標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体につながれている。
【０２２０】
ｇＮＡ、核酸、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質または複合体は、リンカーを介して基材に付着され得る。リンカーは、一つの末端において基材に付着可能であり、かつ他の末端においてｇＮＡ、核酸、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質または複合体に付着可能である化学的部分である。リンカーは、２つの実体を連結または結合するが、個々の連結される実体のいずれかの一部分ではない、原子または分子を含む。一般に、リンカー分子は、１〜５００個の直線状に接続された化学結合を含有するオリゴマー鎖部分である。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー、Ｉ−Ｌｉｎｋｅｒ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）修飾因子、アミノ修飾因子、チオール修飾因子（thiol  modiers）等を含有する。一部の実施形態では、ｇＮＡまたは核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を基材表面に付着するために光解離性リンカーが使用され、光の照射により複合体は解放され得る。一部の実施形態では、複合体は、リンカーの部位における酵素消化または化学分解によって解放される。
【０２２１】
一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する抗体で被覆された基材を使用すること、または基材上に核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を直接的に固定化すること等によって、複合体は、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を介して基材に付着される。
【０２２２】
一部の実施形態では、核酸は、既知の順序で基材に付着される。
【０２２３】
一部の実施形態では、ｇＮＡは、基材上でｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写された後、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化される。
【０２２４】
一部の実施形態では、基材は、再使用可能なものである。斯かる実施形態では、基材は、既知の順序で基材に付着された標的特異的ｇＮＡまたは標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体を含み得る。ｇＮＡおよびｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、所与の基材上に、スポット、ブロック、ビーズ、小滴、ウェルまたは他の編成構造として編成され得る。一部の実施形態では、核酸は、引き剥がされ、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体は、再利用のために残される。
【０２２５】
基材は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、２５００、５０００、７５００、またはさらには少なくとも１０，０００の標的に由来するｇＮＡを含有し得る。一部の例示的な実施形態では、基材は、約１〜３、１〜５、１〜１０、１〜２５、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、５〜１００、１０〜２０、１０〜２５、１０〜５０、１０〜７５、１０〜１００、２５〜５０、２５〜７５、２５〜１００、５０〜７５、５０〜１００、７５〜１００、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜３００、１００〜４００、１００〜５００、１００〜６００、１００〜７００、１００〜８００、１００〜９００、１００〜１０００、１００〜２００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、２００〜９００、２００〜１０００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、３００〜９００、３００〜１０００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、４００〜９００、４００〜１０００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、４００〜９００、４００〜１０００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、５００〜９００、５００〜１０００、６００〜７００、６００〜８００、６００〜９００、６００〜１０００、７００〜８００、７００〜９００、７００〜１０００、８００〜９００、８００〜１０００、９００〜１０００、５００〜１０００、５００〜５０００、５００〜１０，０００、１０００〜５０００、１０００〜１０，０００の標的、またはさらには約５０００〜１０，０００の標的へと標的化されたｇＮＡを含む。
【０２２６】
基材は、基材に付着された少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、少なくとも２５００、少なくとも５０００、少なくとも７５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも７５０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも２，５００，０００、少なくとも５，０００，０００、少なくとも７，５００，０００、少なくとも１０，０００，０００の特異なｇＮＡを含み得る。一部の実施形態では、基材は、基材に付着された少なくとも５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１０〜１００、１００〜５００、１００〜１０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１０００〜１０，０００、１０００〜１００，０００、１０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００、１００，０００〜１０，０００，０００、または１，０００，０００〜１０，０００，０００の特異なｇＮＡを含む。一部の実施形態では、基材は、基材に付着した少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０  の特異なｇＮＡを含む。
【０２２７】
本発明の方法
標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を使用する、標的（すなわち、標的核酸、標的ＤＮＡおよび／または標的ＲＮＡ）を検出および同定するための方法が、本明細書に提供される。
【０２２８】
具体的には、試料中の標的を同定する方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）試料由来の核酸を複数のｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体と接触させるステップであって、複合体は、少なくとも１つの標的へと標的化されており、かつ核酸、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、または核酸およびｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の両方は標識を含む、ステップと、（ｂ）標識由来の特定のシグナルを検出することによって達成される、試料中の標的を同定するステップであって、特定のシグナルの存在は、核酸へのｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体の結合を示す、ステップとを含む。本明細書に提供される場合、標的の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれら２つの混合物であり得る。
【０２２９】
本発明の方法は、任意の操作条件下で実行され得る。例えば、該方法は、０℃〜１００℃において実行され得る。一部の実施形態では、該方法は、０℃、２５℃、３７℃、５０℃、７２℃、またはさらには１００℃において実行される。例示的な実施形態では、該方法は、室温において実行される。例示的な実施形態では、該方法は、５０℃〜８０℃の温度範囲において実行される。
【０２３０】
本発明の方法は、１０分以内で、１５分以内で、３０分以内で、６０分以内で、９０分以内で、１２０分以内で、１５０分以内で、１８０分以内で、２１０分以内で、２４０分以内で、２７０分以内で、３００分以内で、３３０分以内で、３６０分以内で、７時間以内で、８時間以内で、９時間以内で、１０時間以内で、１１時間以内で、１２時間以内で、１５時間以内で、２０時間以内で、２４時間以内でまたは３６時間以内で、実行され得る。
【０２３１】
本発明の方法の具体的実施形態を、以下の例示的なスキームとして順次論じる。例示的なスキームは、標的核酸がＤＮＡを含む本発明の実施形態の実例であることに留意すべきである。これは実例に過ぎないこと、および本明細書に提供される方法および組成物は、標的核酸がＤＮＡ、ＲＮＡを含む、またはＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含む場合の標的同定に適用可能であることを理解すべきである。
【０２３２】
本明細書に記載し、提供する通り、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）、ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体、またはこれらの組合せは、標識（例えば、１０５、１０６、１０７、１０８）を含み得る。これは、例えば図１Ａに図解されている。パネル１００は、ｇＮＡ１０２が標識される実施形態を図解する。パネル１１０は、ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質１０３の両方が標識されるスキームを図解する。この図では、同定すべき標的核酸（例えば、ＤＮＡ）１０１は、基材１０４に付着されている。ここおよび下記において、一部の実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、突然変異体である触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質、例えばｄＣａｓ９であり得る。この突然変異体は、標的ＤＮＡに結合するがそれを切断せずに、シークエンシング等の下流の適用のためにＤＮＡをインタクトなままとするので、この突然変異体の使用は有利であり得る。触媒活性がある核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、切断後に標的核酸の一部分に結合したままであり得るので、用いられ得る。
【０２３３】
図１Ｂは、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質媒介性の標的同定の例示的な実施形態を図解する。この実施形態では、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）１０１は、目的の試料から単離および精製され、基材１０４に付着される（例えば、ステップ１２０を参照）。次いで、標識されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体１０９を基材上に流す（例えば、ステップ１３０を参照）。図解の目的のためのこの例示的なスキームでは、ｇＮＡは３つの標的に向けられており、標的の一つに特異的なｇＮＡの各セットは、異なる標識１０５、１０６、１０７を含む。ＤＮＡおよび複合体を結合させた後、未結合の複合体を洗い流す（例えば、ステップ１４０を参照）。標識からのシグナルを読み取り、標的（単数または複数）を同定する。一部の実施形態では、複合体が結合したＤＮＡをさらなる分析のために回収することができる。例えば、ＤＮＡを基材から引き剥がすことができ、複合体に結合したＤＮＡを核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する抗体を使用して精製し、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を変性させることによって回収し、次いでＤＮＡシークエンシング等の下流の分析に供することができる。
【０２３４】
図２に示す別の例示的な実施形態では、目的の試料から核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離し、任意選択で精製する。標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複合体の収集物と共に溶液中で室温においてＤＮＡをインキュベートする２１０。この実施形態では、標的特異的ｇＮＡは、標識を含む。図２におけるこの例示的な実施形態の絵では、複合体の収集物は、３つの標的に特異的なｇＮＡを含み、３つの異なる標識１０５、１０６、１０７を含む。複合体は、試料中の標的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡは、任意選択で、複合体を加える前または後にビーズに結合させることができる。未結合の複合体は、検出前に洗浄除去することができる２２０。試料中の標的ＤＮＡは、標識の存在によって検出することができる。複合体が結合したＤＮＡは、追加的な下流の分析のためにさらに回収することができる。例えば、複合体に結合したＤＮＡを、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質に対する抗体を使用して精製し、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を変性させることによって回収し、そしてＤＮＡシークエンシング、ＳＮＰ分析、ジェノタイピングまたは他の分析等の下流の分析に供することができる。
【０２３５】
別の例示的な実施形態では、標的検出方法は、初期標的スクリーニングステップを含む。一部の実施形態では、試料を得、核酸色素を用いてそれを染色する。これにより、任意の核酸が試料中に存在するかどうかの初期決定が可能となる。他の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む第１の検出用マーカー（ＨＲＰ等）で標識された複合体と共に試料を室温でインキュベートすることによる初期スクリーニングに試料を供する。未結合の複合体を洗浄除去する。ＨＲＰ用の基質を加え、さらにインキュベートする。試料が標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を含有すれば、色が変化する。斯かる迅速な初期スクリーニングステップにより、いずれの試料がより詳細な同定のためのさらなる処理を必要とするかを決定することができる。一部の実施形態では、試料中の標的ＤＮＡのさらなる同定を引き続いて行う。この複数スクリーニングの文脈では、複数構成成分のタグは特に有用であり、例えば、複合体は、初期検出用にＨＲＰ標識を、そしてより詳細な同定用にフルオロフォア標識を含有し得る。
【０２３６】
別の例示的な実施形態（図３）では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複合体は、既知の、参照可能な、かつ予め定められた順序で基材に付着される。ｇＮＡを基材に付着した後に核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化させることもできるし、あるいは核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を基材に付着した後にｇＮＡと複合体化させることもできる。図３に描くのは、ｇＮＡを基材１０４に付着した後に核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質と複合体化させて複合体１０９を形成させる実施形態である（例えば、ステップ３１０を参照）。目的の試料から単離された核酸（例えば、ＤＮＡ）１０１を（例えば、室温で）基材上に流す（例えば、ステップ３２０を参照）。未結合のＤＮＡを洗い流し（例えば、ステップ３３０を参照）、基材上の複合体に結合した標的ＤＮＡをシグナルの検出位置にしたがって同定する。一部の実施形態では、基材上に流す前にＤＮＡ試料を核酸色素３０１を用いて染色する。一部の実施形態では、複合体が結合したＤＮＡを核酸色素３０１を用いて染色する（例えば、ステップ３４０を参照）。標的特異的ｇＮＡは、基材上の既知の位置に配置されているので、シグナルの位置は、標的の素性を示す。一部の実施形態では、ｇＮＡ、複合体または核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、ＦＲＥＴペアの第１のフルオロフォアを含み、かつＤＮＡは、ＦＲＥＴペアの第２のフルオロフォアを用いて染色される。この実施形態では、ドナー／アクセプターペアの相互作用がある時のみ、シグナルが検出される。一部の実施形態では、標的ＤＮＡは回収され、さらに分析される。その後、結合したＤＮＡを基材から取り外し、さらに分析することができる。
【０２３７】
例えば図４Ａ〜４Ｄに示す一つの特定の実施形態では、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複合体は、領域またはブロック（４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６）として見られる特定のパターンを有する区画としてキャピラリー、チャネル、または他のフローシステム４００（例えば、ストロー、チューブ、チャンバーフローセルまたは円筒状アレイ）内につながれている。目的の試料由来の単離および精製された核酸（例えば、ＤＮＡ）４０７をキャピラリーを通して流し、未結合のＤＮＡを洗い流した後、チューブの全長または部分長に沿った色変化の出現が、目的の標的の存在を示す（図４Ａを参照）。一部の実施形態では、未結合のＤＮＡの洗い流しは、例えば取り付けたピペットバルブ（ｂｕｌｂ）を用いてキャピラリー内で行うことができる。一部の実施形態では、単離および精製されたＤＮＡは、キャピラリーに流す前に標識される。一部の実施形態では、単離および精製されたＤＮＡは、キャピラリー内につながれた複合体への結合後に核酸色素を用いて染色される。
【０２３８】
図４Ｂおよび図４Ｃは、標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体４０８を試料ＤＮＡ４０７と共にプレインキュベートした後、アレイ上に領域またはブロック（４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６）としてパターン化された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体も含有するキャピラリーアレイ４００にそれを通過させる例示的なスキームを図解する。このスキームは、標的のより高感度の検出および同定を可能とする。この場合、ｇＮＡ核酸ガイド化ヌクレアーゼ系４０８を試料と共にインキュベートし、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）４０７が試料中に存在すれば、ｇＮＡ核酸ガイド化ヌクレアーゼ４０８はそれに結合する。次いで、この試料ＤＮＡおよび結合したｇＮＡ核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体４１０を、標的ＤＮＡに向けられた共有結合的に連結されたｇＮＡ核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体４１１のキャピラリーアレイと共にさらにインキュベートする。次いで、これらの表面に結合したｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体は、任意の標的ＤＮＡ上にあるそれらの標的を見つけ、それらに結合し、またこの過程において、ＤＮＡに結合した初期ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体を捕捉する。一部の実施形態では、この系は、複数の関連する標識を有する大きい断片を捕捉することができる。検出は、アッセイフォーマットの全体または特定部分の色変化によって読み取ることができる。この例では、キャピラリーアレイを縞模様で示している。これらの縞模様は、目には一つの色または複数の色として見え得る。縞模様が目には一つの色として見える場合、分光計下でのより高感度の検出を使用して詳細な縞模様パターンを調べることができる。
【０２３９】
別の実施形態では、図４Ｄは、バーコード型の様式で病原体を検出できることを示す。このスキームでは、一つのパターンのブロックまたはバンドは一つの特定のサブタイプまたは種を示し、別のパターンは別のサブタイプまたは種を示す。例えば、一つのバンドパターンまたは色は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ等の病原体の属を示し得、他のバンドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのバンド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓのバンド等というように、病原体の種のより狭い定義をさらに示し得る。あるいは、例えば、一つのバンドは、Ｅ．ｃｏｌｉの種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ８８（Ｏ４５：Ｋ１））を示し得、残りのバンドは、ｇＮＡの異なる特異なパターンによって株をさらに定義し得る（例えば、図４Ｄを参照）。このバンドパターンを使用して、ＵＰＣバーコードと同様に、病原体の素性を狭めることができる。病原性および抵抗性等のある特定の特徴に特異的なバンドを使用することもできる。
【０２４０】
別の例示的な実施形態（図５）では、目的の試料から単離および精製されたＤＮＡ５０１を核酸色素５０２を用いて染色し、標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む標識された複合体５０３と共にインキュベートする。核酸（例えば、ＤＮＡ）および複合体の混合物を例えば小滴またはウェル中に分割する。小滴は、ＤＮＡおよび複合体混合物を、小滴を生成する油と合わせ、流体を小滴生成用デバイス（例えば、マイクロ流体のカートリッジ）に移すことによって形成することができる。１０２〜１０１０個の単分散のナノリットルサイズの小滴のエマルジョンを生成することができる。集団中の所与の小滴は、空であり得５０４（場合によっては、得られるほとんどの小滴は空である）、所与の小滴は一つのＤＮＡを含有し得５０５、所与の小滴は、一つの複合体を含有し得５０６、または所与の小滴は、複合体が結合した一つのＤＮＡを含有し得る５０７。標識された複合体および核酸色素で染色されたＤＮＡの両方からのシグナル５０８の検出は、目的の標的ＤＮＡの存在を示す。一部の実施形態では、該手順は、ＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＲａｉｎｄａｎｃｅのＲａｉｎｄｒｏｐ（商標）システム、または他のピコ、ナノもしくはマイクロリットルの小滴形成システム上で実行される。一部の実施形態では、標識された複合体および核酸色素で染色されたＤＮＡの両方からのシグナルを含有する小滴を回収し、結合したＤＮＡを、シークエンシングおよびクローニング等のさらなる下流の分析のために回収する。
【０２４１】
別の例示的な実施形態（図６を参照）では、目的の試料から単離および精製された核酸（例えば、ＤＮＡ）６０１を環状化し、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）６０２によって増幅する。次いで、ＲＣＡの生成物６０３を標的特異的ｇＮＡおよび核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質を含む複合体と共にインキュベートする。ｇＮＡは、標識された核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質をＲＣＡ生成物上の複数コピーの標的に向かわせることにより、一つの標識６０５でＲＣＡ生成物を標識する。一実施形態では、複合体は基材表面に結合されており、ＲＣＡ生成物は基材上に流される。別の実施形態では、ＲＣＡ生成物は基材に付着されており、複合体はＲＣＡ生成物上に洗い流される。別の実施形態では、検出は溶液中で行われる。結合時に、検出された標識に基づいて標的の素性を検出する。
【０２４２】
図７は、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を検出するためにＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用するための例示的なスキームを図解する。この実施形態では、標識された標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体７０１を表面７０２に付着する。次いで、ＤＮＡ７０３を複合体に結合させる。未結合のＤＮＡを洗い流す。ＹＯＹＯ−１等のインターカレーター型色素７０４をＤＮＡに会合させ、このＤＮＡがＦＲＥＴを介してエネルギー７０５を複合体上の標識７０７に移動させることができる。このエネルギー移動７０６は、２つの複合体が近くに来たときにも起こることができ、例えば、２つの触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質が同じ局所領域へと標的化されたときに、それらはＦＲＥＴペアとして作用するのに十分なほど近くにあり得る。別の実施形態では、ＤＮＡ断片の末端近くに結合した標識されたｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ複合体は、別の断片の末端上の標識にエネルギーをＦＲＥＴ移動させ得る。
【０２４３】
別の例示的な実施形態（図８）では、標的特異的ｇＮＡは、標的近傍位置（例えば、１０ｂｐ未満だけ離れている）に結合し、かつフルオロフォアのＦＲＥＴペアのそれぞれ一方で別々に標識されたペアとして、設計および生成される。試料は、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）８０１および非標的核酸（例えば、ＤＮＡ）８０２を含有し得る。ｇＮＡの第１のサブセット８０３は、ＦＲＥＴ用のドナーフルオロフォアである第１のフルオロフォアで標識され、かつｇＮＡの第２のサブセット８０４は、アクセプターフルオロフォアである第２のフルオロフォアで標識される。例えば、ＦＲＥＴペアは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７の標識をそれぞれ含み得る。一例では、ｇＮＡは、触媒活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質８０５（例えば、ｄＣａｓ９）と複合体化され、ＤＮＡ試料と合わせられる。２つのｇＮＡが、近接する標的ＤＮＡに結合した場合８０６、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアは、ＦＲＥＴを可能とするのに十分なほど近接する。活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系−ｇＮＡ複合体は、近接したペア中の標的ＤＮＡに結合し、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアのペア間でＦＲＥＴが起こるのを可能とする。次いで、試料にドナーフルオロフォアの励起波長８０９を照射し、アクセプターの発光波長８１０において発光をモニタリングする。ＦＲＥＴシグナルは、試料中の標的ＤＮＡの存在を反映する。標的へのｇＮＡの結合がない場合８０９、アクセプターの発光波長のシグナルは生成されない。非特異的な単一のｇＮＡ結合および反応溶液単独では、ＦＲＥＴシグナルは生成されない。無関係な標的への活性がない核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ガイドＮＡのまれな非特異的な結合８０８は、ＤＮＡへの単一のｇＮＡの結合をもたらすに過ぎず、ＦＲＥＴを生じない。同様に、溶液中のフルオロフォアは、継続的には近接しないので、反応溶液からのＦＲＥＴシグナルは起こらない（または測定可能なＦＲＥＴシグナルは起こらない）。よって、斯かるアッセイを１チューブの形式で実行することができる。斯かるアッセイは、低濃度試料（例えば、５％未満の標的ＤＮＡ）中の標的ＤＮＡの検出を含む適用のために有用であり得る。
【０２４４】
図９は、ニッカーゼ核酸ガイド化ヌクレアーゼ（例えば、ニッカーゼＣａｓ９）を使用する標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の蛍光標識のスキームを図解する。一例（例えば、図９を参照）では、近接（例えば、約１０ｂｐ未満だけ離れている）するペアとして標的ＤＮＡ９０１に結合するように標的特異的ｇＮＡ９０３を設計する。試料は、非標的ＤＮＡ９０２も含有し得る。ｇＮＡを核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質９０４と複合体化させ、ＤＮＡ試料と合わせる。例示的な核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異を含むニッカーゼＣａｓ９であり、これはＤＮＡの一鎖を切断することしかできず、よって二本鎖切断ではなくニックを生じさせる。この例では、ＤＮＡ試料の３’末端が、ジデオキシＣＴＰ等の伸長できないヌクレオチドを用いて遮断されている（図中の「Ｂ」）。ＤＮＡを反応溶液から回収する。ニッカーゼ−ｇＮＡ複合体は、標的ＤＮＡ上に２つの近位にあるニックを生成して二本鎖切断を生成し得る９０５。２つのニックが近接（例えば、約１０ｂｐまたはそれ未満）している場合、二本鎖切断が生じる。これらの二本鎖切断は、ターミナルトランスフェラーゼを使用するフルオロフォアを用いた末端標識用の唯一の基質である。次いで、試料をターミナルトランスフェラーゼおよび蛍光標識されたｄＣＴＰと共にインキュベートする。非標的ＤＮＡは、ニックがないままであり得る９０６。無関係な標的へのニッカーゼ−ガイドＮＡ複合体のまれな非特異的な結合９０７は、ＤＮＡへの単一のガイドの結合をもたらすに過ぎないため、ＤＮＡへの単一のニックをもたらし、このＤＮＡはターミナルトランスフェラーゼの基質とはならない。蛍光９０８を測定することにより、試料中の標的ＤＮＡの同定および定量を可能とすることができる。ＤＮＡクリーニングおよび濃縮キット（例えば、Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＤＮＡを回収することができる。
【０２４５】
一部の実施形態（例えば、図１０を参照）では、近接（例えば、約１０ｂｐ未満だけ離れている）するペアとして標的核酸（例えば、ＤＮＡ）９０１に結合するように標的特異的ｇＮＡ９０３を設計する。試料は、非標的ＤＮＡ９０２も含有し得る。ＤＮＡ試料の３’末端は、ジデオキシＣＴＰ等の伸長できないヌクレオチドを用いて遮断される（図中の「Ｂ」）。これらのｇＮＡを、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系ニッカーゼタンパク質９０４と複合体化し、ＤＮＡ試料に加え、ニッカーゼ−ｇＮＡ複合体との全ての結合性部位においてＤＮＡ中にニックを生じさせる。２つのニックが近接（例えば、約１０ｂｐまたはそれ未満）している場合、二本鎖切断が生じる１００５。蛍光ドナーとして作用するＤＮＡ結合性色素１００８を用いてＤＮＡ試料全体を標識する。二本鎖は、切断されるが、例えばターミナルトランスフェラーゼを使用することによるアクセプターフルオロフォア１００９を用いた末端標識用の唯一の基質である。ＤＮＡ全体にわたって導入されるドナー標識に対する標的部位のみに導入されるアクセプター標識の近接性により、アクセプターフルオロフォアのＦＲＥＴおよび発光が生じ１０１０、ＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡの定量が可能となる。標的へのｇＮＡの結合がない場合１００６、ニック形成は起こらないため、アクセプターフルオロフォアは付着されない。無関係な標的へのｇＮＡ−ニッカーゼ複合体のまれな非特異的な結合１００７は、ＤＮＡへの単一の複合体の結合を生じさせるに過ぎないため、ＤＮＡへの単一のニックを生じさせ、これはターミナルトランスフェラーゼの基質として働かない。ＤＮＡ全体にわたって導入されるドナー標識に対する標的部位のみに導入されるアクセプター標識の近接性により、アクセプターフルオロフォアのＦＲＥＴおよび発光が生じ、ＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡの定量が可能となる。無関係な標的へのｇＮＡ−ニッカーゼ複合体のまれな非特異的な結合は、ＤＮＡへの単一の複合体の結合を生じさせるに過ぎないため、ＤＮＡへの単一のニックを生じさせ、これはターミナルトランスフェラーゼの基質として働かない。ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォアの近接性により、ＦＲＥＴが生じ得、これを測定してＤＮＡ試料中の標的ＤＮＡの量が算出される。溶液中のフルオロフォアおよびＤＮＡ上のドナーフルオロフォアは継続的には近接しないため、反応溶液からのＦＲＥＴシグナルは起こらない（またはＦＲＥＴシグナルは無視できる程度である）。よって、この実施形態および上記の他のＦＲＥＴベースの実施形態は、洗浄を伴わない１チューブの形式で実行できる可能性があるため、これらのアプローチは迅速な処理および検出のために有利である。斯かるアッセイは、低濃度試料（例えば、５％未満の標的ＤＮＡ）中の標的ＤＮＡの検出を含む適用のために有用であり得る。代替的な実施形態は、アクセプターフルオロフォアおよびドナーフルオロフォアの位置を交換した類似のアプローチを含む。
【０２４６】
核酸は、拡散に加えて様々な手段によって、基材と近接させられ得る。電気泳動および／または流体の流れを使用して表面においてまた表面の近くにおいて核酸を濃縮することができる。他の技術を用いることもできる。例えば、表面は、その表面の全体または一部にわたって（例えば、特徴において）疎水性表面化学を有することができ、疎水性部分を用いて標的核酸をタグ付けして、核酸が表面の疎水性領域へのエネルギー的選好性を有するようにすることができる。別の例では、磁性粒子を用いて標的核酸をタグ付けすることができ、そして磁場を使用して標的核酸をアレイ表面へ導くことができる。
【０２４７】
体積排除性化合物（volume-excluding  compounds）を使用して、試料ＤＮＡ等の試料核酸を効果的に濃縮することもできる。体積排除剤（volume  excluder）を使用して、体積排除剤が占める液体体積から試料物質を排除することにより、残りの液体体積中に試料物質を濃縮することができる。この機序は、基材への試料核酸のハイブリダイゼーション等による、試料物質の捕捉または結合を加速させるのを助けることができる。例えば、体積排除剤をハイブリダイゼーション緩衝液中に含めてハイブリダイゼーションの反応速度を向上させることができる。体積排除剤は、例えばビーズまたはポリマーであり得、硫酸デキストラン、フィコールおよびポリエチレングリコールを非限定的に含む。体積排除剤は、高分子量ポリマーであり得る。体積排除剤は、負に帯電していてもよく、これにより例えば、体積排除剤への核酸の結合を低減し得る。
【０２４８】
キットおよび製品
本出願は、キットを提供し、該キットは、標的特異的ｇＮＡ、標的特異的ｇＮＡの収集物、標識された標的特異的ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）と複合体化した標的特異的ｇＮＡ、基材に付着された標的特異的ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）と複合体化し、かつ基材に付着された標的特異的ｇＮＡ、病原体特異的ｇＮＡ、病原体特異的ｇＮＡの収集物、標識された病原体特異的ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）と複合体化した病原体特異的ｇＮＡ、基材に付着された病原体特異的ｇＮＡ、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質）と複合体化し、かつ基材に付着された病原体特異的ｇＮＡ、基材等に限定されない本明細書に記載されているいずれか１または複数の組成物および収集物を含む。一実施形態では、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質は、Ｃａｓ９である。
【０２４９】
本出願はまた、組成物およびキットを提供し、該組成物および該キットは、本明細書に記載されている、標的特異的ｇＮＡおよび標的特異的ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体（例えば、ｇＮＡ−核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質複合体）を作製し、標識し、または基材に付着する方法を実行するためのあらゆる必須の試薬および説明書を含む。試薬は、検出に必要な色素および蛍光性ヌクレオチドを含み得る。
【０２５０】
本明細書に提供される検出および同定方法の実行前および実行後の情報をモニタリングするコンピューターソフトウェアも、本明細書に提供される。
【０２５１】
以下の実施例は実例の目的のために含めたものであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【実施例】
【０２５２】
（実施例１）
臨床試料中の病原体の検出
この実施例では、臨床試料（例えば、血液、スワブ、脳脊髄液）を得、（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡまたはＲＮＡ抽出キットを使用して）ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する。ＲＮＡを抽出したら、標準的な方法を使用してそれをｃＤＮＡに変換する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してＤＮＡをせん断することができる。次いで、ｄＣａｓ９と複合体化した病原体特異的なｇＲＮＡを既知の特定の順序で含有する基材にＤＮＡを注ぐ。比色計または蛍光の読み取りにより、存在する病原体の種類（例えば、エボラ、ＨＩＶ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ等）を決定する。検出器において使用される特定のｇＲＮＡライブラリーを用意することにより、異なる場合（例えば、肺炎、尿路感染症、食物媒介性の感染症）において病原体を検出することができる。検出器の迅速な読み取りは、培養またはＲＴ−ＰＣＲ等の標準的な方法と比べて試料収集と診断との間の時間を短縮し、検出を現場（例えば、大発生の場所にある現地）で実行することができる。標的ＤＮＡを基材から溶出した後、シークエンシングして病原体に関する追加の情報を得ることもできる。
【０２５３】
（実施例２）
環境試料中の生物兵器（病原体）の検出
この実施例では、環境試料（例えば、空気清浄器、土壌試料、表面スワブ）を得、（例えば、ＭＯ  Ｂｉｏ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ抽出キットを使用して）ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する。ＲＮＡを抽出したら、標準的な方法を使用してそれをｃＤＮＡに変換する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してＤＮＡをせん断することができる。次いで、一連の潜在的な生物兵器剤を標的化するｇＲＮＡを含有する基材にＤＮＡを注ぎ、比色計または蛍光の読み取りにより、存在する病原性生物兵器の種類（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）を決定する。検出器の迅速な読み取りは、ＲＴ−ＰＣＲ等の標準的な方法と比べて試料収集と脅威の検出との間の時間を短縮し、検出を現場（例えば、現地）で実行することができる。標的ＤＮＡを基材から溶出した後、シークエンシングして病原体に関する追加の情報を得ることもできる。
【０２５４】
（実施例３）
毒性植物起源
この実施例では、生物兵器毒素の試料を得、（例えば、ＭＯ  Ｂｉｏ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ抽出キットを使用して）ＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する。ＲＮＡを抽出したら、標準的な方法を使用してそれをｃＤＮＡに変換する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してＤＮＡをせん断することができる。次いで、一連の潜在的な毒素剤を標的化するｇＲＮＡを含有する基材にＤＮＡを注ぐ。例えば、毒素がリシンであれば、トウゴマそれ自体の亜種により、毒素ならびにあり得る亜種およびトウゴマの起源の場所の迅速な同定を可能とし得る。
【０２５５】
（実施例４）
製造物の検証およびバーコード化
製造物に特異的なｇＲＮＡを作製して、材料の異なるロットまたは起源を同定し得、それにより製造物の起源を追跡し得る。例えば、ベークド製品が複数の原料国の原材料を含有すること、または牛肉試料に馬肉が混ざっていることがあり得る。位置特異的なｇＲＮＡのアレイは、施行機関に対して製造物のバルク原材料の位置を教え得る。それはまた、製造物パッケージ上のＤＮＡマーカーを同定することによって、当該国に密輸入された模造品の検出にも有用であり得る。
【０２５６】
（実施例５）
ヒトの同定
この実施例では、ヒトＤＮＡを含有する試料（例えば、法医学的試料）を得、（例えば、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔのキットを使用して）ＤＮＡを抽出する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してＤＮＡをせん断することができる。次いで、ヒトの同定用に選択した一連のＳＮＰを標的化するｇＲＮＡを含有する基材にＤＮＡを注ぎ、比色計または蛍光の読み取りを、各個体に特異となるように選択し得る。異なるＳＮＰの対立遺伝子がｇＲＮＡの差次的な結合を生じるようにｇＲＮＡを選択する。検出器の迅速な読み取りは、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動等の標準的な方法と比べて試料収集と疑わしい者の同定との間の時間を短縮し、検出を現場（例えば、現地）で実行することができる。標的ＤＮＡを基材から溶出した後、シークエンシングして個体に関する追加の情報（例えば、表現型の情報）を得ることもできる。
【０２５７】
（実施例６）
腫瘍ＤＮＡの突然変異の検出
この実施例では、がんのＤＮＡを含有する試料（例えば、腫瘍試料）を得、（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔを使用して）ＤＮＡを抽出する。任意選択で、酵素的または機械的手段を使用してＤＮＡをせん断することができる。次いで、がんにおいてよく見られる一連の突然変異の部位を標的化するｇＲＮＡを含有する基材にＤＮＡを注ぎ、比色計または蛍光の読み取りを、各変異に特異となるように選択し得る。異なるＳＮＰの対立遺伝子がｇＲＮＡの差次的な結合を生じるようにｇＲＮＡを選択する。検出器の迅速な読み取りは、エクソームシークエンシング等の標準的な方法と比べて試料収集と腫瘍プロファイリングとの間の時間を短縮し、検出を現場（例えば、診療所）で実行することができる。標的ＤＮＡを基材から溶出した後、シークエンシングして追加の情報を得ることもできる。
【０２５８】
記載した発明をその特定の実施形態に関して説明したが、本発明の真の精神および範囲から離れることなく、様々な変更を行うことができ、また同等物で置き換えることができることが当業者によって理解されるはずである。加えて、特定の状況、材料、組成物、プロセス、処理ステップ（単数または複数）を記載された発明の目的たる精神および範囲に適応させるために、多くの改変が為され得る。全てのそのような改変は、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０２５９】
本明細書中で参照した特許、特許出願、特許出願公開、学術論文およびプロトコールは、参照することによって、全ての目的のためにそれらの全体が組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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