(57)【要約】本発明は、腫瘍分類のための画像解析システム(100)に関する。本システムは、組織試料の少なくとも1つのデジタル画像(118)を受信し(202)；少なくとも1つの受信された画像にある免疫細胞と腫瘍細胞を特定するために、少なくとも1つの受信された画像を解析し(204)；特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、前記腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞との距離を求め(206)；求められた距離の関数として近接度を算定し(208)；近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類し(210)；かつ分類結果を記憶媒体に記憶し(212)、および/または分類結果をディスプレイ装置(102)に表示する(214)ように構成されている。2019516976.tif 000003
2019516976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍分類のための画像解析方法であって、
・画像解析システム(100)によって、組織試料の少なくとも1つのデジタル画像(118)を受信する工程(202);
・少なくとも1つの受信された画像にある免疫細胞と腫瘍細胞を特定するために、画像解析システムによって、少なくとも1つの受信された画像を解析する工程(204);
・特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、画像解析システムによって、該腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞との距離を求める工程(206);
・画像解析システムによって、求められた距離の関数として近接度を算定する工程(208);
・近接度に応じて、画像解析システムによって、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程(210);ならびに
・画像解析システムによって、分類結果を記憶媒体に記憶する工程(212)、および/または分類結果をディスプレイ装置に表示する工程(214)
を含む、前記方法。
【請求項２】
腫瘍分類のための画像解析方法であって、
・画像解析システム(100)によって、組織試料のデジタル画像(118)を受信する工程;
・少なくとも1つの受信された画像にある腫瘍細胞を特定するために、画像解析システムによって、少なくとも1つの受信された画像を解析する工程;
・腫瘍領域を特定するために、画像解析システムによって、特定された腫瘍細胞を解析する工程であって、該腫瘍領域が、細胞の大部分が腫瘍細胞からなる組織領域である、工程;
・特定された腫瘍領域の1つの中にある免疫細胞または該腫瘍領域の1つの周囲にある境界領域の中にある免疫細胞を特定するために、画像解析システムによって、少なくとも1つの受信された画像を解析する工程であって、該境界の幅が200μm未満である、工程;
・特定された免疫細胞のそれぞれについて、画像解析システムによって、該免疫細胞と、最も近い腫瘍細胞との距離を求める工程;
・画像解析システムによって、求められた距離の関数として近接度を算定する工程;
・近接度に応じて、画像解析システムによって、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程;ならびに
・画像解析システムによって、分類結果を記憶媒体に記憶する工程、および/または分類結果をディスプレイ装置に表示する工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記分類結果を表示する工程が、
・特定された腫瘍細胞の全てを、第1の色を有する第1の画素ブロブとして表す工程;および
・最も近い腫瘍細胞との距離が閾値より小さい特定された免疫細胞の全てを、第2の色を有する第2の画素ブロブとして表す工程;
・第2の画素ブロブを第1の画素ブロブのオーバーレイとして表示する工程
を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記組織試料がホールスライド組織試料であり、前記デジタル画像がホールスライド画像である、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項５】
・特定された腫瘍細胞の腫瘍細胞密度を求めるために、受信されたデジタル画像を解析する工程
をさらに含む、画像解析方法であって、
・前記特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程が、近接度および腫瘍細胞密度を、分類を行うように構成されている分類器に入力する工程を含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項６】
・特定された免疫細胞または特定のタイプの免疫細胞の免疫細胞密度を求めるために、受信されたデジタル画像を解析する工程
をさらに含む、画像解析方法であって、
・前記特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程が、近接度および免疫細胞密度を、分類を行うように構成されている分類器に入力する工程を含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項７】
前記腫瘍細胞の特定が、
・非リンパ系増殖細胞を特定し、該特定された細胞を腫瘍細胞として使用する工程;ならびに/または
・1種もしくは複数種の腫瘍特異的バイオマーカーのセットを発現する細胞を特定し、該特定された細胞を腫瘍細胞として使用する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項８】
・前記免疫細胞の特定が、細胞傷害性T細胞を特定し、特定された細胞傷害性T細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含む;ならびに/または
・前記免疫細胞の特定が、Tヘルパー細胞を特定し、特定されたTヘルパー細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含む;ならびに/または
・前記免疫細胞の特定が、マクロファージを特定し、特定されたマクロファージを、特定された免疫細胞として使用する工程を含む;ならびに/または
・前記免疫細胞の特定が、メモリー細胞を特定し、特定されたメモリー細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含む;ならびに/または
・前記免疫細胞の特定が、B細胞を特定し、特定されたメモリー細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含む;ならびに/または
・前記免疫細胞の特定が、活性化T細胞を特定し、特定された活性化T細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含む;ならびに/または
・前記免疫細胞の特定が、PD1+免疫細胞を特定し、特定されたPD1+免疫細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含み、前記腫瘍細胞の特定が、PDL1+腫瘍細胞を特定し、特定されたPDL1+腫瘍細胞を、特定された腫瘍細胞として使用する工程を含む、
前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項９】
・前記免疫細胞の特定が、調節性T細胞を特定し、免疫応答をブーストする少なくとも1つのタイプの免疫細胞の免疫細胞を特定する工程を含み、かつ
・特定された免疫細胞として、免疫応答をブーストする特定された免疫細胞を選択的に使用するが、特定された調節性T細胞を使用しない、
前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１０】
前記求められた距離の関数として近接度を算定する工程が、
・特定された腫瘍細胞の第1のサブセットおよび第2のサブセットを特定する工程であって、第1のサブセットが、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞と予め規定された距離より短い距離分だけ離れている腫瘍細胞を選択的に含み、第2のサブセットが、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞と少なくとも予め規定された距離分だけ免疫細胞から離れている腫瘍細胞を選択的に含む、工程;
・第1のサブセットに含まれる腫瘍細胞の数と第2のサブセットにある腫瘍細胞の数との比率を算定する工程;ならびに
・比率を近接度として使用する工程であって、比率が大きいほど、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す確率が大きくなる、工程
を含む、請求項1、3〜9のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１１】
前記求められた距離の関数として近接度を算定する工程が、
・特定された免疫細胞の第1のサブセットおよび第2のサブセットを特定する工程であって、第1のサブセットが、免疫細胞に最も近い腫瘍細胞と予め規定された距離より短い距離分だけ離れている免疫細胞を選択的に含み、第2のサブセットが、免疫細胞に最も近い腫瘍細胞と少なくとも予め規定された距離分だけ腫瘍細胞から離れている免疫細胞を選択的に含む、工程;
・第1のサブセットに含まれる免疫細胞の数と第2のサブセットにある免疫細胞の数との比率を算定する工程;ならびに
・比率を近接度として使用する工程であって、比率が大きいほど、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す確率が大きくなる、工程
を含む、請求項2〜9のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１２】
前記予め規定された距離が、特定された免疫細胞の免疫学的に有効な距離であり、該免疫学的に有効な距離が、特定された免疫細胞が直接的または間接的に腫瘍細胞の死滅を誘発することができるか、または腫瘍細胞によるアポトーシスの実行を誘発することができる最大距離である、請求項10〜11のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１３】
前記予め規定された距離が20μm〜50μmの範囲内にある、請求項10〜12のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１４】
前記比率が、予め規定されたパーセント、例えば50％を超える場合、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す、請求項10〜13のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１５】
前記求められた距離の関数として近接度を算定する工程が、
・腫瘍細胞と、特定された免疫細胞の中で腫瘍細胞に最も近いそれぞれの免疫細胞との距離のヒストグラム(502〜506；602〜616；910、912)を作成する工程であって、該ヒストグラムが少なくとも2つの距離ビンを含み、0μmから少なくとも50μmの距離範囲をカバーし、該ビンのそれぞれがヒストグラムのバーに対応し、該バーのそれぞれが、該ビンに分類される、最も近い免疫細胞との距離を有する特定された腫瘍細胞のカウントを示す、工程;
・該バーの中の最初のバーの上端と該バーの中の最後のバーの上端を線でつなぐ工程であって、最初のバーが、最小距離をカバーするビンの中の1つに対応し、最後のバーが、距離範囲の最大距離をカバーするビンの中の1つに対応する、工程;
・線の傾きを求める工程;
・傾きを近接度として使用する工程であって、最初のバーの腫瘍細胞カウントが最後のバーの腫瘍細胞カウントより多いことを傾きが示す場合、分類結果が、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することである、工程
を含む、請求項1、3〜9のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１６】
前記求められた距離の関数として近接度を算定する工程が、
・免疫細胞と、特定された腫瘍細胞の中で免疫細胞に最も近いそれぞれの腫瘍細胞との距離のヒストグラムを作成する工程であって、該ヒストグラムが少なくとも2つの距離ビンを含み、0μmから少なくとも50μmの距離範囲をカバーし、該ビンのそれぞれがヒストグラムのバーに対応し、該バーのそれぞれが、該ビンに分類される、最も近い腫瘍細胞との距離を有する特定された免疫細胞のカウントを示す、工程;
・該バーの中の最初のバーの上端と該バーの中の最後のバーの上端を線でつなぐ工程であって、最初のバーが、最小距離をカバーするビンの中の1つに対応し、最後のバーが、距離範囲の最大距離をカバーするビンの中の1つに対応する、工程;
・線の傾きを求める工程;
・傾きを近接度として使用する工程であって、最初のバーの免疫細胞カウントが最後のバーの免疫細胞カウントより多いことを傾きが示す場合、分類結果が、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することである、工程
を含む、請求項2〜9のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１７】
・特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す場合、腫瘍を処置するための薬物として、免疫応答をブーストまたは調整する物質を使用するという治療推奨を示すシグナルを選択的に出力する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１８】
・免疫応答をブーストまたは調整する物質に対する腫瘍の応答性の予後を算定するために、MSS-MSI状態指標に加えて、またはMSS-MSI状態指標の代わりに、近接度を使用する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項１９】
前記特定された腫瘍細胞が結腸直腸癌細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項２０】
前記免疫細胞の特定が、異なる免疫細胞タイプ特異的バイオマーカーの存在を表す、少なくとも1つのデジタル画像における画素強度値を解析することによって複数の異なる免疫細胞タイプの免疫細胞を特定する工程、および近接度を算定するために、特定された免疫細胞として、複数の異なる免疫細胞タイプの特定された免疫細胞の全てを使用する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞が、少なくとも、第1の腫瘍タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定され、前記免疫細胞が、少なくとも、第1の免疫細胞タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定される、画像解析方法であって、
・さらなる免疫細胞を、第2の免疫細胞タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定するために、少なくとも1つの受信された画像または組織試料のさらなる画像を解析する工程;および
・さらなる腫瘍細胞を、第2の腫瘍タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定するために、少なくとも1つの受信された画像もしくは組織試料のさらなる画像を解析する工程、または特定された免疫細胞を、さらなる腫瘍細胞として使用する工程;
・特定されたさらなる腫瘍細胞のそれぞれについて、該さらなる腫瘍細胞と、最も近いさらなる免疫細胞との距離を求める工程;
・該求められた距離の関数として、さらなる近接度を算定する工程;
・さらなる近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を下位分類する工程、および/またはあるクラスの物質による腫瘍の治療可能性を予測する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の画像解析方法。
【請求項２２】
・組織試料のデジタル画像(118)を受信し(202)、
・少なくとも1つの受信された画像にある免疫細胞と腫瘍細胞を特定するために、少なくとも1つの受信された画像を解析し(204)、
・特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、該腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞との距離を求め(206)、
・求められた距離の関数として、近接度を算定し(208)、
・近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類し(210)、かつ
・分類結果を記憶媒体に記憶し(212)、および/または分類結果をディスプレイ装置(102)に表示する(214)
ように構成されている、腫瘍分類のための画像解析システム(100)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
発明の分野
本発明は、画像解析の分野、さらに詳細には、画像に基づく腫瘍分類の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景および関連技術
マイクロサテライト不安定性(MSI)とは、DNAミスマッチ修復(MMR)の損傷に起因する遺伝子が極めて変異しやすい状態である。MSIが存在することは、MMRが正常に機能していないという表現型上の証拠であり、従って、潜在的な腫瘍細胞とみなされる細胞の遺伝子状態の指標である。
【０００３】
マイクロサテライト不安定性は、結腸癌、胃癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓胆管癌、尿路癌、脳癌、および皮膚癌に関連することが知られている。MSIは結腸癌の原因として最もよく見られる。毎年、全世界で500,000件を超える結腸癌症例がある。MSI-High(MSI-H)、MSI-Low(MSI-L)、またはマイクロサテライト安定性(MSS)結腸癌によって層別化された7,000人を超える患者からの知見に基づくと、MSI-Hの患者の予後はMSI-L腫瘍またはMSS腫瘍と比較して15％プラスであった。
【０００４】
MSIは、癌の処置のために予後を確かめるための優れたマーカーである。腫瘍の遺伝子情報に基づく、さらなるアプローチが存在する。例えば、早期癌診断と処置を改善することを期待して、腫瘍組織細胞の、基礎となる遺伝子パターンを解読する広範に及ぶ研究が進行中である。次世代配列決定技術の最近の進歩は癌ゲノミクスの分野に大変革をもたらした。しかしながら、相変わらず、これらの研究でひとつ注意することは、特定された大量の遺伝子変異とその解釈である。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明の目的は、独立請求項に記載のように腫瘍細胞を分類するための改善された方法および画像解析システムを提供することである。本発明の態様は従属請求項に示される。本発明の態様は相互排他的でなければ互いに自由に組み合わせることができる。
【０００６】
一局面において、本発明は、腫瘍分類のための画像解析方法に関する。前記方法は、
・画像解析システムによって、組織試料の少なくとも1つのデジタル画像を受信する工程;
・少なくとも1つの受信された画像にある免疫細胞と腫瘍細胞を特定するために、画像解析システムによって、少なくとも1つの受信された画像を解析する工程;
・特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、画像解析システムによって、前記腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞との距離を求める工程;
・画像解析システムによって、求められた距離の関数として近接度(proximity measure)を算定する工程;
・近接度に応じて、画像解析システムによって、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程;ならびに
・画像解析システムによって、分類結果を記憶媒体に記憶する工程、および/または分類結果をディスプレイ装置に表示する工程
を含む。
【０００７】
特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の細胞対非炎症性腫瘍の細胞に分類するための前記アプローチは、以下の複数の理由により有利な場合がある。
【０００８】
免疫細胞と腫瘍細胞の距離は、腫瘍に対する生物の免疫応答に関連する細胞プロセスを、例えば、MSS/MSI状態よりも正確に反映しているように見える。従って、近接度は腫瘍の炎症状態を遺伝子アプローチよりも正確に反映しているように見える(炎症は、非常に一般的に言うと、刺激に対する身体免疫系の応答である)。少なくとも、ある場合では、MSS/MSI状態に基づいて正確に区別されなかった炎症性腫瘍と非炎症性腫瘍が近接度に基づいて正確に区別されたと観察された。
【０００９】
MSI腫瘍における高い突然変異荷重(mutational load)は多くの腫瘍特異的ネオ抗原、典型的にはMSS腫瘍の10〜50倍の腫瘍特異的ネオ抗原を作り出す。これらのネオ抗原の一部は処理され、MHC上に提示され、T細胞によって異物だと認識される。高いネオ抗原負荷(burden)は、MSI腫瘍において腫瘍浸潤リンパ球(「炎症性腫瘍状態」)レベルが高いことの説明の1つとなるかもしれない。MSI腫瘍はMSS腫瘍よりも予後が良好であり、免疫応答をブーストまたは調整する、いくつかのクラスの薬物に良く応答する。腫瘍細胞と免疫細胞の個々の距離に基づいて近接度を求めることによって、炎症性腫瘍対非炎症性腫瘍をさらに正確に分類することが可能になる、および/または(免疫応答をブーストもしくは調整する薬物を処方しても処方しなくても)もっと正確に予後予測を立て、治療推奨を出すことが可能になる。
【００１０】
さらに有益な局面によれば、近接度は、免疫蛍光アッセイによって染色された腫瘍組織試料のデジタル画像から素早く算定することができる。従って、腫瘍細胞の時間がかかり、かつ高価な(そして見かけ通り正確でない)さらなるMSS/MSI状態解析が避けられる可能性がある。
【００１１】
(例えば、様々な免疫スコアの算定と比較して)さらに有益な局面では、個々の免疫細胞と腫瘍細胞の間の距離が求められるので、腫瘍分類と予後の精度の上昇が実現する可能性がある。腫瘍領域の外郭線を大まかに確かめ、次いで、前記腫瘍領域に免疫細胞が含まれるかどうか確かめる代わりに、本発明の態様は、前記の求められた距離の全てから近接度を算定するための基盤として個々の免疫細胞と腫瘍細胞の距離を使用する。この近接度は、腫瘍細胞に対する有効な免疫応答を可能にするほど免疫細胞と腫瘍細胞が互いに十分に近くにあるかどうかもっと正確に指し示すものである。言い換えると、近接度は、例えば、細胞傷害性T細胞、B細胞、メモリー細胞、Tヘルパー細胞、および/またはマクロファージなどの十分に多い数の免疫促進免疫細胞が腫瘍細胞から「免疫学的に有効な距離」の範囲内にあるかどうかを示している。
【００１２】
本明細書で使用する「免疫学的に有効な距離」とは、前記免疫細胞が前記腫瘍細胞を死滅させるほど十分に短い、免疫細胞と、免疫細胞に最も近い腫瘍細胞の間の距離である。腫瘍細胞の死滅は直接的または間接的に行われてもよく、免疫細胞タイプに左右されることがある様々な経路によって行われてもよい。例えば、腫瘍細胞の死滅は、免疫細胞と腫瘍細胞の間の直接的な細胞間相互作用を介して成し遂げられてもよい。または、腫瘍細胞の死滅は、腫瘍細胞の近くでの前記免疫細胞と、さらなる免疫細胞との直接的な相互作用またはシグナル分子に基づく相互作用を介して成し遂げられてもよく、これによって、さらなる免疫細胞は腫瘍細胞を死滅させるか、または腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する。または、腫瘍細胞の死滅は、(例えば、直接的な細胞間相互作用を介して、または免疫細胞によって分泌されたシグナル分子を介して)腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することによって成し遂げられてもよい。
【００１３】
さらに有益な局面では、距離情報は、腫瘍を炎症性腫瘍対非炎症性腫瘍と正確に分類するための入力として用いられる場合があるだけでなく、病理学者が、腫瘍組織内にある炎症領域の場所および分布を容易かつ正確に特定するのを可能にし得る図形出力を作成するのにも用いられる場合がある。
【００１４】
さらに有益な局面では、個々の免疫細胞と腫瘍細胞が特定されたら、隣接する腫瘍細胞と免疫細胞の個々のペアの距離は非常に素早く、かつ効率的に算定することができる。算定された距離は数値であるので、図示された組織試料が何千個もの細胞を含む場合でも、複数の数値の関数である近接度も素早く、かつ比較的少ない計算の手間で算定することができる。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、腫瘍分類のための画像解析方法に関する。前記方法は、
・画像解析システムによって、組織試料の少なくとも1つのデジタル画像を受信する工程;
・少なくとも1つの受信された画像にある腫瘍細胞を特定するために、画像解析システムによって、少なくとも1つの受信された画像を解析する工程;
・腫瘍領域を特定するために、画像解析システムによって、特定された腫瘍細胞を解析する工程であって、該腫瘍領域が、細胞の大部分が腫瘍細胞からなる組織領域である、工程;
・特定された腫瘍領域の1つの中にある免疫細胞または該腫瘍領域の1つの周囲にある境界領域の中にある免疫細胞を特定するために、画像解析システムによって、少なくとも1つの受信された画像を解析する工程であって、該境界の幅が200μm未満である、工程;
・特定された免疫細胞のそれぞれについて、画像解析システムによって、前記免疫細胞と、最も近い腫瘍細胞との距離を求める工程;
・画像解析システムによって、求められた距離の関数として近接度を算定する工程;
・近接度に応じて、画像解析システムによって、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程;ならびに
・画像解析システムによって、分類結果を記憶媒体に記憶する工程、および/または分類結果をディスプレイ装置に表示する工程
を含む。
【００１６】
従って、前記の代替アプローチによれば、最初に、デジタル画像において腫瘍細胞と、対応する腫瘍領域が特定される。次いで、前記腫瘍領域の中にあるか、または前記腫瘍領域と空間的に近接している免疫細胞が特定され、免疫細胞と腫瘍細胞の距離が特定される。このシナリオでは、距離は、(「それぞれの特定された免疫細胞」の場合)個々の特定された免疫細胞から算定されてもよく、(「それぞれの特定された腫瘍細胞」の場合)個々の特定された腫瘍細胞から算定されてもよい。例えば、細胞を特定および/または分類するために、ならびに腫瘍細胞として特定されている似た色の細胞もしくは似た形をした細胞からなるか、または主に、そのような細胞を含む領域を特定するために、グレースケールおよびカラーセグメンテーション法、エッジ検出、ボーティング(voting)、ならびにラジカルシンメトリー(radial symmetry)に基づく画像解析法を使用することができる。さらに、教師あり学習法、例えば、SVM(サポートベクターマシン)、DNN(ディープニューラルネットワーク)、ランダムフォレストなどを用いた様々な機械学習法を用いて細胞をタイプに分類することができる、および/またはスライド上で腫瘍領域、非腫瘍組織領域、およびガラス領域を特定することができる。腫瘍およびその境界における距離測定を制限すると、ホール組織スライドが小さな腫瘍領域しか含まず、免疫細胞の大部分が腫瘍から遠く離れている場合に、前記の遠くにある免疫細胞(腫瘍が炎症腫瘍か非炎症腫瘍に関係なく、前記の遠く離れた領域に存在する可能性がある)の作用によって近接度が変わらないことが確かなものになる可能性がある。
【００１７】
態様によれば、画像解析方法は、特定された腫瘍細胞の腫瘍細胞密度を求めるために、受信されたデジタル画像を解析する工程をさらに含む。特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程は、近接度と腫瘍細胞密度を、分類を行うように構成されている分類器に入力する工程を含む。
【００１８】
態様によれば、画像解析方法は、特定された免疫細胞または特定のタイプの免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、マクロファージなど)の免疫細胞密度を求めるために、受信されたデジタル画像を解析する工程をさらに含む。特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程は、近接度と免疫細胞密度を、分類を行うように構成されている分類器に入力する工程を含む。
【００１９】
態様によれば、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する工程は、近接度、腫瘍細胞密度、および免疫細胞密度を、分類を行うように構成されている分類器に入力する工程を含む。
【００２０】
一部の態様によれば、腫瘍細胞密度の算出は、それぞれの腫瘍細胞について腫瘍細胞密度を個々に求める工程、例えば、前記腫瘍細胞を中心とする予め規定された区域における腫瘍細胞密度を求めることによって腫瘍細胞密度を個々に求める工程を含む。この場合、求められた腫瘍細胞密度値はそれぞれ入力として分類器に送り込むことができる。または、個々の密度値から平均値が算定され、1つの値として分類器に入力される。同様に、腫瘍細胞密度の算出は、それぞれの免疫細胞について免疫細胞密度を個々に求める工程、例えば、前記免疫細胞を中心とする規定された区域における免疫細胞密度を求めることによって免疫細胞密度を個々に求める工程を含む。この場合、求められた免疫細胞密度値はそれぞれ入力として分類器に送り込むことができる。または、平均値が個々の密度値から算定され、1つの値として分類器に入力される。
【００２１】
分類器のさらなる入力パラメータとして細胞密度情報を使用することは、分類の精度が大幅に上昇する可能性があるので有利な場合がある。
【００２２】
態様によれば、分類結果を表示する工程は、特定された腫瘍細胞の全てを、第1の色を有する第1の画素ブロブとして表す工程、および最も近い腫瘍細胞との距離が閾値より小さい特定された免疫細胞の全てを、第2の色を有する第2の画素ブロブとして表す工程を含む。次いで、画像解析システムは、第2の画素ブロブを第1の画素ブロブのオーバーレイとして表示する。
【００２３】
例えば、組織試料は結腸直腸癌の生検試料でもよく、特定された免疫細胞は細胞傷害性T細胞でもよく、距離閾値は35μmでもよい。腫瘍細胞として特定された細胞は全て青色でカラー化されてもよく、第1の画像層に対応してもよい。最も近い腫瘍細胞との距離が35μmより短い免疫細胞として特定された細胞は全てオレンジ色でカラー化され、第2の画像層に対応してもよい。第2の画像層は第1の画像層の上に重ね合わされ、その結果、オレンジ色の「腫瘍親和性(tumor affine)」免疫細胞は少なくとも腫瘍細胞の一部を覆い隠す。この場合、腫瘍組織にあるオレンジ色の領域は炎症領域を示す。作成されたオーバーレイ画像に表示された組織切片がオレンジ色の領域をほとんど含まなければ、免疫応答は極めて弱いと予測されるか、または腫瘍発達に有意な影響を及ぼさないと予測される。この場合、患者は、薬物によるブーストの適用または免疫応答の調整から利益を得ないと予測される。なぜなら、免疫細胞は腫瘍細胞から遠く離れすぎて腫瘍細胞を死滅させることができないからである。従って、病理学者である使用者は、このようなオーバーレイ画像から、特定の腫瘍組織が炎症性か非炎症性かどうか、および/または免疫反応をブーストもしくは調整することが知られている物質を用いた患者の処置が、この腫瘍の処置に有効かどうかすぐに、かつ容易に導き出すことができる。
【００２４】
態様によれば、組織試料はホールスライド組織試料であり、デジタル画像はホールスライド画像である。典型的に、このようなホールスライド組織試料は数千個もの細胞を含むか、または10,000個の細胞さえ含む。従って、近接度は何千個もの隣接する免疫細胞と腫瘍細胞のペアの距離の関数でもよい。
【００２５】
態様によれば、腫瘍細胞の特定は、非リンパ系増殖細胞を特定し、前記特定された細胞を腫瘍細胞として使用する工程を含む。
【００２６】
例えば、増殖細胞は、例えば、KI67タンパク質またはPCNAタンパク質に結合する蛍光染色抗体などの汎用増殖マーカーを用いることによって特定される場合がある。非リンパ系細胞は、例えば、CD3などの代表的な免疫細胞マーカーを発現しない細胞として特定される。従って、発現プロファイルKI67+/CD3-を有する細胞は全て非リンパ系増殖細胞として、従って、腫瘍細胞として特定される。このアプローチは、多くの異なるタイプの腫瘍および多くの異なるタイプの組織に適用可能な、腫瘍細胞を特定する非常に汎用的な手法を提供するので有益な場合がある。
【００２７】
さらに、または代わりに、腫瘍細胞の特定は、1種または複数種の腫瘍特異的バイオマーカーの(特定の)セットを発現する細胞を特定し、前記特定された細胞を腫瘍細胞として使用する工程を含む。
【００２８】
例えば、組織試料中にある細胞のサイトケラチンプロファイル(特定の一組のサイトケラチンが細胞において発現しているかどうかを示すデータ)は、例えば、それぞれのサイトケラチンを選択的に染色する蛍光染料を用いることによって確かめられる。次いで、得られたサイトケラチンプロファイルは、画像解析システムによって、様々な組織、例えば、肝臓、肺、結腸などの既知のサイトケラチンプロファイルと比較される。画像に図示された、組織試料中にある細胞のサイトケラチンプロファイルが、組織試料が採取された組織の代表的なサイトケラチンプロファイルと異なる場合、この「基準から外れた/代表的でない」サイトケラチンプロファイルを有する細胞は自動的または半自動的に腫瘍細胞として特定される。
【００２９】
サイトケラチンは、上皮組織の細胞質内細胞骨格に見出されるケラチン含有中間フィラメントのタンパク質である。例えば、塩基性サイトケラチンCK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、ならびに酸性サイトケラチンCK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK16、CK17、CK18、CK19、およびCK20が知られている。これらのサイトケラチンの発現は臓器特異的または組織特異的であることが多い。従って、様々な腫瘍の存在および/または様々な腫瘍に由来する細胞を検出するために解剖病理学者はサイトケラチン発現プロファイルを使用することができる。
【００３０】
組織試料の組織のタイプおよび/または患者に存在すると疑われる腫瘍のタイプに応じて、他の腫瘍特異的バイオマーカーの存在(十分に高い発現レベル)、例えば、Her2タンパク質fur breast cancerの存在が確かめられる場合がある。
【００３１】
態様によれば、免疫細胞の特定は、細胞傷害性T細胞を特定する工程、および特定された細胞傷害性T細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含むか、またはこれらの工程からなる。例えば、細胞傷害性T細胞において特異的に発現しているCD8タンパク質はバイオマーカーとして用いられる。組織試料中にあるCD8タンパク質に選択的に結合する染料が用いられ、染色された組織試料から、CD8タンパク質の存在を示す画素強度値がある画像が撮影される。画像解析の操作、例えば、閾値に基づくブロブ検出の操作が、CD8バイオマーカーに関連する染色と強度シグナルに対して行われ、対応する画素ブロブはCD8+細胞、従って、細胞傷害性T細胞として特定される。
【００３２】
他の態様によれば、CD8+CD3+細胞(すなわち、CD8タンパク質とCD3タンパク質を両方とも発現する細胞)は細胞傷害性T細胞として特定される。CD3タンパク質は、多くの異なる免疫細胞上で発現しているタンパク質であり、特定のブロブが、例えば、CD8タンパク質を染色するのに用いられる抗体の非特異的染色反応によって生じたアーチファクトではなく本当に免疫細胞であることを確かなものにするのに役立つ、さらなるバイオマーカーとして用いられる。
【００３３】
さらに、または代わりに、免疫細胞の特定は、Tヘルパー細胞を特定する工程、および特定されたTヘルパー細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含むか、またはこれらの工程からなる。例えば、CD4発現細胞(「CD4+細胞」)がTヘルパー細胞として特定される。他の例によれば、CD4とCD3タンパク質を両方とも発現する細胞(「CD4+/CD3+細胞」)がTヘルパー細胞として特定される。再度、CD3タンパク質発現は、ブロブが非特異的染料のブロブではなく本当に免疫細胞であることを確認するための、さらなる指標として用いられた。CD4マーカーの代わりに、またはCD4マーカーに加えて、Tヘルパー細胞を特定するためにT-betマーカーが同様に用いられる場合がある。
【００３４】
さらに、または代わりに、免疫細胞の特定は、メモリー細胞を特定する工程、および特定されたメモリー細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含むか、またはこれらの工程からなる。例えば、CD45RO発現細胞(「CD45RO+細胞」)がメモリー細胞として特定される。
【００３５】
さらに、または代わりに、免疫細胞の特定は、B細胞を特定する工程、および特定されたB細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含むか、またはこれらの工程からなる。例えば、CD20発現細胞(「CD20+細胞」)はB細胞として特定される。
【００３６】
さらに、または代わりに、免疫細胞の特定は、活性化T細胞を特定する工程、および特定された活性化T細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含むか、またはこれらの工程からなる。例えば、CD137発現細胞(「CD37+細胞」)は活性化T細胞として特定される。
【００３７】
さらに、または代わりに、免疫細胞の特定は、PD1+免疫細胞を特定する工程、および特定されたPD1+免疫細胞を、特定された免疫細胞として使用する工程を含む。さらに、腫瘍細胞の特定は、PDL1+腫瘍細胞を特定する工程、および特定されたPDL1+腫瘍細胞を、特定された腫瘍細胞として使用する工程を含む。PDL1+腫瘍細胞は、PDL1タンパク質を発現する腫瘍細胞である。例えば、上述したように、腫瘍細胞は、例えば、KI67タンパク質および/またはPCNAタンパク質を発現し、CD3タンパク質を発現しない細胞として特定することができる。従って、PDL1+腫瘍細胞は、発現プロファイルPDL1+/KI67+/CD3-を有する細胞になるだろう。または、腫瘍細胞を特定するために、細胞が腫瘍細胞であることを示す他の任意のバイオマーカー(例えば、panCK+、または周囲組織のプロファイルから逸脱する特定のサイトカインプロファイル)を使用することができる。
【００３８】
本明細書で使用する、バイオマーカーBMを「発現する」細胞(「BM+細胞」)とは、前記バイオマーカーを少なくとも最小量で発現する細胞を指す。例えば、前記の最小量が発生したかどうかという問題は、それぞれのデジタル画像上の強度値を強度閾値と比較することによって決定することができる。前記閾値は、使用されたバイオマーカーまたは染料に特異的なものでもよい。調べられたバイオマーカーのタイプに応じて、バイオマーカーを「発現する」細胞はまた、前記細胞タイプの「代表的な」細胞または別の参照細胞タイプよりも多量の前記バイオマーカーを発現する細胞でもよい。この場合、「BM+細胞」という表示は、(参照発現レベルと比べて)バイオマーカーBMを過剰発現する細胞を指す。
【００３９】
プログラムデスリガンド1(PDL1)は、妊娠、組織同種異系移植、自己免疫疾患、および他の疾患状態、例えば、肝炎などの特定の事象間に免疫系を抑制することにおいて主な役割を果たす40kDaの1型膜貫通タンパク質である。通常、免疫系は、抗原特異的CD8+T細胞の増殖を誘発することによって外来抗原と反応する。
【００４０】
プログラム細胞死タンパク質1(PD1)は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、T細胞およびプロB細胞上で発現している細胞表面受容体である。PD1は2種類のリガンド、PDL1およびPD-L2に結合する。PD1は免疫チェックポイントであり、T細胞の活性化を阻止することで免疫系をダウンレギュレートすることにおいて重要な役割を果たす。PD1は、活性化T細胞、B細胞、およびマクロファージの表面に発現している。
【００４１】
PD1/PDL1リガンド複合体が形成すると、免疫応答に対する阻害シグナルが伝達される。一部の癌はPDL1発現をアップレギュレートし、それによって宿主免疫系からなんとか逃れようとすると思われる。腫瘍細胞による高発現のPDL1は腫瘍攻撃性の上昇と死亡リスクの上昇に関連すると観察されている。
【００４２】
上述されたPDL1/PD1バイオマーカーを用いることで近接度を算定することによって、腫瘍細胞から免疫学的に有効な距離の中にある免疫細胞がPD1受容体タンパク質を発現しているかどうか確かめることが可能であり、腫瘍細胞がPDL1タンパク質を(過剰)発現しているかどうか確かめることが可能である。
【００４３】
さらに、または代わりに、免疫細胞の特定は、マクロファージを特定する工程、および特定されたマクロファージを、特定された免疫細胞として使用する工程を含むか、またはこれらの工程からなる。例えば、CD163とCD68タンパク質を両方とも発現する細胞(「CD163+/CD68+細胞」)がマクロファージとして特定される。CD163マーカーの代わりに、またはCD163マーカーに加えて、マクロファージを特定するためにCSF1Rマーカーが同様に用いられる場合がある。
【００４４】
バイオマーカーCD3、CD4、CD8、およびKI67を標的とする免疫蛍光アッセイによって染色されたスライドのコホートの自動フルスライド解析から、CD3+/CD8+およびCD3+/CD4+免疫細胞分布の測定および腫瘍区域におけるKI67+非リンパ系増殖細胞(CD3-/KI67+)との近接性は腫瘍区域における免疫応答の強力な指標として役立ち得ることが明らかになると観察された。個々の腫瘍細胞と免疫細胞の距離に基づく近接スコアを算定することによって、最新技術のMSS/MSI状態に基づく分類スキームまたは免疫スコアに基づく分類スキームよりも正確な、特に正確な腫瘍分類方法が提供される。さらに、細胞距離に基づく近接スコアの提唱された算定と、腫瘍分類のためのスコアの使用は、結腸直腸癌において、AJCC/UICC TNM分類よりも高い予後値を有することが観察された。
【００４５】
細胞傷害性T細胞、メモリー細胞、Tヘルパー細胞、およびマクロファージは、免疫応答の開始および/もしくはブーストを担当しているか、または免疫応答を開始および/もしくはブーストすることができる免疫細胞である。それとは反対に、調節性T細胞は免疫応答のダウンレギュレーションに関与することが多い。従って、免疫応答に対してプラスの作用または刺激作用を有する免疫細胞を選択的に特定することによって、および前記のプラスに刺激する免疫細胞の距離を選択的に特定することによって、前記距離から導き出される近接スコアの精度をさらに高めることができる。免疫応答にマイナスの影響を有する可能性がある調節性T細胞の存在は無視され、それにより、主として、調節性T細胞が個々の腫瘍細胞のすぐ近くにあるが、マクロファージ、細胞傷害性T細胞、および/またはTヘルパー細胞が個々の腫瘍細胞のすぐ近くにない状況において、多くの免疫細胞が腫瘍細胞のすぐ近くにあることを示す近接スコアの算定が妨げられる。
【００４６】
態様によれば、免疫細胞の特定は、免疫反応をブーストする1つまたは複数の免疫細胞タイプ(例えば、マクロファージ、細胞傷害性T細胞、メモリー細胞、B細胞、およびTヘルパー細胞)の免疫細胞を特定する工程、および免疫反応を抑制またはダウンレギュレートする免疫細胞タイプ(例えば、調節性T細胞)の免疫細胞を無視する工程(「除去する工程(filtering out)」)を含むか、またはこれらの工程からなる。従って、近接度を算定するために用いられる、特定された免疫細胞の全てが同じ免疫細胞タイプの免疫細胞からなってもよく、複数の異なる免疫細胞タイプの免疫細胞からなってもよい。この場合、近接度を距離の関数(例えば、比率またはヒストグラムの傾き)として算定するために、免疫細胞タイプ特異的な関数(例えば、前記免疫細胞タイプの免疫細胞タイプ特異的な免疫学的に有効な距離に対応する免疫細胞タイプ特異的な距離閾値を用いる)が用いられる。例えば、それぞれの免疫細胞タイプについて個々に免疫細胞の比率が算定されてもよく、前記免疫細胞タイプの免疫学的に有効な距離と同一の免疫細胞タイプ特異的な距離閾値について免疫細胞タイプ特異的な比率が算定されてもよい。次いで、免疫細胞タイプ特異的な比率の平均、例えば、算術平均が最終比率として算定され、例えば、近接度として用いられてもよい。免疫細胞タイプをブーストする異なる免疫応答の免疫学的に有効な距離が同一または非常に似ている場合には、考慮されている複数の免疫細胞タイプまたは全ての免疫細胞タイプについて、比率を算定するために同じ関数、例えば、同じ距離閾値が用いられてもよい。
【００４７】
関連する免疫応答を促す免疫細胞と、その潜在的な標的である腫瘍細胞の間の空間関係のさらに優れており、かつさらに完璧なデータ基盤が提供され、炎症性腫瘍細胞と非炎症性腫瘍細胞へのさらに正確な分類が提供される可能性があるので、(腫瘍細胞と免疫細胞の距離の同じ関数または免疫細胞タイプ特異的な関数を用いて)複数の異なる免疫細胞タイプから1つの近接度を算定する工程は有利な場合がある。
【００４８】
さらに、または代わりに、例えば、組織試料の腫瘍がPDL1+腫瘍かどうか確かめるために、および腫瘍細胞の十分な部分がPD1+免疫細胞の免疫学的に有効な距離の範囲内にあるかどうか確かめるために、複数の個々の近接度が、複数のそれぞれの免疫細胞タイプおよび/または腫瘍細胞タイプについて算定されてもよい。前記のさらなる近接度を用いると、腫瘍をさらに下位分類することが可能になり、処置スキーマをより良く予測することが可能になる場合がある。
【００４９】
態様によれば、免疫細胞の特定は、調節性T細胞を特定する工程、および免疫応答をブーストする少なくとも1つのタイプの免疫細胞の免疫細胞を特定する工程、および特定された免疫細胞として、免疫応答をブーストする特定された免疫細胞を選択的に使用するが、特定された調節性T細胞を使用しない工程を含む。例えば、FoxP3タンパク質を発現する細胞(「FoxP3+細胞」)は調節性T細胞として特定され、腫瘍細胞と免疫細胞の距離が求められる時には無視される。他の態様によれば、FoxP3+/CD3+細胞が調節性T細胞として特定され、CD3バイオマーカーの発現は、ブロブが非特異的染料のブロブではなく本当に免疫細胞であることを確認するための、さらなる指標として用いられる。
【００５０】
態様によれば、近接度は、本発明の態様について本明細書において説明されたように複数回求められ、それによって、それぞれの回で、異なるバイオマーカーを表す画素強度を有する異なるデジタル画像が解析され、異なるバイオマーカーは異なるタイプの免疫細胞(例えば、細胞傷害性T細胞の場合はCD8、調節性T細胞の場合はFoxP3、マクロファージの場合はCD163もしくはCSF1R、B細胞の場合はCD20、活性化T細胞の場合はCD137、T細胞およびプロB細胞のいくつかのサブタイプ(tub-type)の場合はPD1)を示す、ならびに/または異なるタイプの腫瘍細胞(例えば、PDL1+/PDL1腫瘍細胞)を示す。前記複数の近接度はそれぞれ、腫瘍細胞クラスおよび/または予後および/または適切な処置スキームの予測因子として用いられる場合がある。
【００５１】
異なるタイプの免疫細胞タイプおよび/または癌細胞タイプについて近接度を複数回算定することによって、異なるクラスの免疫応答調整薬物のうちどれが癌の処置に有効か、どれが有効でないかをさらに正確に予測することが可能になる場合がある。異なる免疫細胞と腫瘍細胞タイプの空間近接性に含まれる情報を組み合わせることによって、腫瘍を炎症性腫瘍または非炎症性腫瘍に分類する精度が上昇する場合があり、腫瘍のさらなるサブクラス(例えば、PDL1+腫瘍またはPDL1-腫瘍)への分類が可能になる場合がある。さらに、特定の薬物クラスが腫瘍の処置において有効かどうかを予測する精度が上昇する場合がある。
【００５２】
異なる免疫細胞サブタイプおよび/または異なる腫瘍細胞サブタイプについて複数の近接度を算定する時に、免疫系に対して阻害作用を有する免疫細胞も考慮される。免疫系に対して阻害作用を有する免疫細胞が腫瘍細胞から免疫学的に有効な距離の範囲内に存在しても、腫瘍が炎症性腫瘍だと分からないかもしれないが、免疫系に対して阻害作用を有する免疫細胞と腫瘍細胞との空間近接性に関する情報があると、前記の阻害性免疫細胞タイプを抑制する薬物を適用することによって、腫瘍に対する免疫応答がブーストされる可能性があるかどうか予測することが可能になる場合がある。
【００５３】
態様によれば、画像解析システムは、特定のクラスの薬物が癌の処置に有効かどうか予測したものを自動出力する。
【００５４】
例えば、前記クラスの薬物の1つはPD1阻害剤でもよい。PD1阻害剤は腫瘍を攻撃するために免疫系を活性化し、PD1受容体の活性をブロッキングするか、または別の方法で阻害することによって、いくつかのタイプの癌を処置するのに用いられ、いろいろな成果を収めている。態様によれば、画像解析システムは、近接度によって、PDL1+腫瘍細胞の十分に大きな割合が、予め規定された距離(免疫学的に有効な距離)の範囲内に少なくとも1個のPD1+免疫細胞を含むことが示される場合にのみ、PDL1阻害剤が効果を示すことを予測するように構成されている。免疫細胞が腫瘍細胞から免疫学的に有効な距離の範囲内にない場合、または免疫細胞が前記距離の範囲内でPDL1+腫瘍細胞のすぐそばにあるが、PD1を発現していない場合、画像解析システムは、抗PDL1薬物が腫瘍を処置するのに有効でないと予測するように構成されている。
【００５５】
同様に、免疫応答をブーストまたは調整し、個々の免疫細胞タイプ、例えば、マクロファージ、Tヘルパー細胞、B細胞、細胞傷害性T細胞(T細胞結合剤(T-cell engaging agent))などの活性を特異的に調整する他の薬物クラスが存在する。前記の免疫応答を調整またはブーストする薬物が特定の腫瘍タイプにしか有効でないこともあり得る。複数の異なる免疫細胞タイプおよび/または腫瘍細胞タイプについて近接度を一度に自動算定することによって、定量的な場所情報(細胞間距離が免疫学的に有効な距離より短いかどうか)ならびに細胞クラスに関する定性的な情報が、特定の薬物クラスが癌の処置に有効かどうか予測するための基盤として用いられる。
【００５６】
特定された免疫細胞のそれぞれについて距離が求められる本発明の態様によれば、求められた距離の関数として近接度を算定する工程は、
・特定された腫瘍細胞の第1のサブセットおよび第2のサブセットを特定する工程であって、第1のサブセット(「免疫細胞が近くにある腫瘍細胞」)が、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞と予め規定された距離より短い距離分だけ離れている腫瘍細胞を選択的に含み、第2のサブセット(「免疫細胞が遠くにある腫瘍細胞」)が、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞と少なくとも予め規定された距離分だけ腫瘍細胞から離れている腫瘍細胞を選択的に含み、例えば、予め規定された距離が、特定された免疫細胞の「免疫学的に有効な距離」でもよい、工程;
・第1のサブセットに含まれる腫瘍細胞の数と第2のサブセットにある腫瘍細胞の数との比率を算定する工程;ならびに
・比率を近接度として使用する工程であって、比率が大きいほど、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す確率が大きくなる、工程
を含む。
【００５７】
特定された免疫細胞のそれぞれについて距離が求められる本発明の別の態様によれば、求められた距離の関数として近接度を算定する工程は、
・特定された免疫細胞の第1のサブセットおよび第2のサブセットを特定する工程であって、第1のサブセットが、免疫細胞に最も近い腫瘍細胞と予め規定された距離より短い距離分だけ離れている免疫細胞を選択的に含み、第2のサブセットが、免疫細胞に最も近い腫瘍細胞と少なくとも予め規定された距離分だけ腫瘍細胞から離れている免疫細胞を選択的に含む、工程;
・第1のサブセットに含まれる免疫細胞の数と第2のサブセットにある免疫細胞の数との比率を算定する工程;ならびに
・比率を近接度として使用する工程であって、比率が大きいほど、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す確率が大きくなる、工程
を含む。
【００５８】
態様によれば、予め規定された距離は、免疫細胞の「免疫学的に有効な距離」である。免疫学的に有効な距離とは、特定された免疫細胞が直接的または間接的に腫瘍細胞の死滅を誘発することができるか、または腫瘍細胞によるアポトーシスの実行を誘発することができる最大距離である。
【００５９】
態様によれば、予め規定された距離は15μmより長い。
【００６０】
態様によれば、予め規定された距離は20μm〜50μmの範囲内にあり、例えば、35μmである。
【００６１】
例えば、腫瘍タイプは結腸直腸癌でもよく、距離は35μmでもよい。他の腫瘍タイプの場合、距離はわずかに異なってもよいか、典型的には、20μm〜50μmの範囲内にある。
【００６２】
態様によれば、比率が、予め規定されたパーセントまたは閾値、典型的には50％を超える場合、分類結果は、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを示す。従って、一態様によれば、第1のサブセットに含まれる腫瘍細胞の数が第2のサブセットにある腫瘍細胞の数より多くなる(従って、第1のサブセットにある腫瘍細胞の割合が全腫瘍細胞の50％を超える)場合、分類結果は、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを示す。
【００６３】
腫瘍細胞のそれぞれについて距離の算出に関連する態様によれば、求められた距離の関数として近接度を算定する工程は、
・腫瘍細胞と、特定された免疫細胞の中で腫瘍細胞に最も近いそれぞれの免疫細胞との距離のヒストグラムを作成する工程であって、ヒストグラムが少なくとも2つの距離ビン(distance bin)を含み、0μmから少なくとも50μm(典型的には80μmまで)の距離範囲をカバーし、ビンのそれぞれがヒストグラムのバーに対応し、バーのそれぞれが、前記ビンに分類される、最も近い免疫細胞との距離を有する特定された腫瘍細胞のカウントを示す、工程;
・バーの中で最初のバーの上端と、バーの中で最後のバーの上端を線でつなぐ工程であって、線が直線でも曲線でもよく、例えば、線がバランスライン(balance line)でもよく、最初のバーが、最小距離をカバーするビンの中の1つに対応し、最後のバーが、距離範囲の最大距離をカバーするビンの中の1つに対応する、工程;
・線の傾きを求める工程であって、例えば、最初のバーが、ヒストグラムの左境界に位置してもよく、最後のバーがヒストグラムの右境界に位置してもよく、左側の最初のバーと右側の最後のバーをつなぐ線の傾きが求められてもよい工程;
・傾きを近接度として使用する工程であって、最初のバーの腫瘍細胞カウントが最後のバーの腫瘍細胞カウントより多いことを傾きが示す場合(すなわち、最初のバーがヒストグラムの左側にプロットされていれば負である)、分類結果が、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することである、工程
を含む。
【００６４】
免疫細胞のそれぞれについて距離の算出に関連する態様によれば、求められた距離の関数として近接度を算定する工程は、
・免疫細胞と、特定された腫瘍細胞の中で免疫細胞に最も近いそれぞれの腫瘍細胞との距離のヒストグラムを作成する工程であって、ヒストグラムが少なくとも2つの距離ビンを含み、0μmから少なくとも50μmの距離範囲をカバーし、ビンのそれぞれがヒストグラムのバーに対応し、バーのそれぞれが、前記ビンに分類される、最も近い腫瘍細胞との距離を有する特定された免疫細胞のカウントを示す、工程;
・バーの中で最初のバーの上端と、バーの中で最後のバーの上端を線でつなぐ工程であって、最初のバーが、最小距離をカバーするビンの中の1つに対応し、最後のバーが、距離範囲の最大距離をカバーするビンの中の1つに対応する、工程;
・線の傾きを求める工程;
・傾きを近接度として使用する工程であって、最初のバーの免疫細胞カウントが最後のバーの免疫細胞カウントより多いことを傾きが示す場合、分類結果が、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することである、工程
を含む。
【００６５】
近接度としてヒストグラムの傾きを算定することには、傾きを求めるために算定される必要があるヒストグラムを、組織試料中にある免疫細胞と腫瘍細胞の相対分布を視覚的に表す図形出力として使用できるという利点がある場合がある。ヒストグラムはディスプレイ装置を介して出力されてもよく、それによって、使用者、例えば、病理学者に、免疫細胞と腫瘍細胞の距離分布に関する価値ある情報が提供される。
【００６６】
態様によれば、画像解析システムは、特定された腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを分類結果が示す場合、腫瘍を処置するための薬物として、免疫応答をブーストまたは調整する物質を使用するという治療推奨を示すシグナルを選択的に出力する。
【００６７】
態様によれば、前記方法は、免疫応答をブーストまたは調整する物質に対する腫瘍の応答性の予後を算定するために、MSS-MSI状態指標に加えて、またはMSS-MSI状態指標の代わりに、近接度を使用する工程を含む。
【００６８】
態様によれば、特定された腫瘍細胞は結腸直腸癌細胞である。しかしながら、本発明の態様に従う方法およびシステムはまた、他の腫瘍タイプ、例えば、乳癌、膵臓癌、肺癌などにも適用することができる。
【００６９】
態様によれば、免疫細胞の特定は、少なくとも1つのデジタル画像における画素強度値を解析することによって複数の異なる免疫細胞タイプの免疫細胞を特定する工程であって、画素強度が、異なる免疫細胞タイプ特異的バイオマーカーの存在を表す、工程、および近接度を算定するために、特定された免疫細胞として、複数の異なる免疫細胞タイプの特定された免疫細胞の全てを使用する工程を含む。
【００７０】
態様によれば、腫瘍細胞は、少なくとも、第1の腫瘍タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定される。免疫細胞は、少なくとも、第1の免疫細胞タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定される。前記方法は、
・さらなる免疫細胞を、第2の免疫細胞タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定するために、少なくとも1つの受信された画像または組織試料のさらなる画像を解析する工程;ならびに
・さらなる腫瘍細胞を、第2の腫瘍タイプ特異的バイオマーカーを発現する細胞として特定するために、少なくとも1つの受信された画像もしくは組織試料のさらなる画像を解析する工程、または特定された免疫細胞を、さらなる腫瘍細胞として使用する工程;
・特定されたさらなる腫瘍細胞のそれぞれについて、前記のさらなる腫瘍細胞と、最も近いさらなる免疫細胞との距離を求める工程;または特定されたさらなる免疫細胞のそれぞれについて、前記のさらなる免疫細胞と、最も近いさらなる腫瘍細胞との距離を求める工程;
・前記の求められた距離の関数として、さらなる近接度を算定する工程;
・さらなる近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を下位分類する工程、および/またはあるクラスの物質による腫瘍の治療可能性を予測する工程
をさらに含む。
【００７１】
さらなる局面において、本発明は、
・組織試料の少なくとも1つのデジタル画像を受信し、
・少なくとも1つの受信された画像にある免疫細胞と腫瘍細胞を特定するために、少なくとも1つの受信された画像を解析し、
・特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、前記腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞との距離を求め、
・求められた距離の関数として近接度を算定し、
・近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類し、かつ
・分類結果を記憶媒体に記憶する、および/または分類結果をディスプレイ装置に表示するように構成されている、腫瘍分類のための画像解析システムに関する。
【００７２】
さらなる局面において、本発明は、プロセッサによって実行された時に、本明細書に記載の態様のいずれか1つに従う方法をプロセッサに実行させる命令を備えるコンピュータ可読媒体に関する。
【００７３】
さらなる局面において、本発明は、
・組織試料の少なくとも1つのデジタル画像を受信し、
・少なくとも1つの受信された画像にある腫瘍細胞を特定するために、少なくとも1つの受信された画像を解析し、
・腫瘍領域を特定するために、特定された腫瘍細胞を解析し、
・特定された腫瘍領域の1つの中にある免疫細胞または該腫瘍領域の1つの周囲にある境界領域の中にある免疫細胞を特定するために、少なくとも1つの受信された画像を解析し、
・特定された免疫細胞のそれぞれについて、前記免疫細胞と、最も近い腫瘍細胞との距離を求め、
・求められた距離の関数として近接度を算定し、
・近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類し、かつ
・分類結果を記憶媒体に記憶し、および/または分類結果をディスプレイ装置に表示するように構成されている、腫瘍分類のための画像解析システムであって、腫瘍領域が、細胞の大部分が腫瘍細胞からなる組織領域であり、境界の幅が200μm未満であり、優先的に、境界領域の幅が120μm〜200μmであり、従って、境界領域が、腫瘍領域を取り囲むベルトの形状をとってもよく、ベルトの幅は境界領域の幅である、腫瘍分類のための画像解析システムに関する。
【００７４】
従って、腫瘍領域の周囲にある境界領域の幅は、個々の免疫細胞と腫瘍細胞の距離を数えるのに用いられることになっている区域を(腫瘍領域および腫瘍境界領域)規定する。特定された腫瘍領域の周囲にある境界領域の外郭線内にある免疫細胞を選択的に特定すると、腫瘍に対する免疫応答に決して関与しない、腫瘍から遠く離れた組織領域に通常、分布している免疫細胞を含めることの悪影響を近接度の精度が受けないことが確かなものになる可能性がある。さらに、これにより、腫瘍のすぐ近くにある免疫細胞を除外する狭すぎる境界の悪影響を、近接度の精度が受けないことが確かなものになる可能性がある。腫瘍のすぐ近くにある免疫細胞の位置は腫瘍の炎症状態を予測する鍵となる。
【００７５】
一部の態様によれば、境界領域の幅は、特定の癌タイプについて経験的に求められる。この算出は、画像の中にある、多数の隣接する領域(例えば、予め規定された直径、幅、および/または高さを、例えば、20μm〜40μmの範囲で有する丸、正方形、または長方形)を選択する工程であって、多数の隣接する領域が、腫瘍領域外郭線上にある画素から始まり(「始点領域」)、かつ腫瘍中心から少なくとも200μm半径方向に離れて非腫瘍組織領域まで延びている(隣接する領域の少なくとも1つが「終点領域」と呼ばれる)、工程;前記の隣接する領域のそれぞれにおいて免疫細胞の数を数える工程;隣接する領域の免疫細胞数を始点領域から終点領域の方向にスキャンし、それによって、腫瘍領域の境界から120μm〜200μm離れた範囲の中にあり、かつ基本的に、後でスキャンされる全ての領域と同じ免疫細胞数を有する領域のうち第1の領域を特定する工程であって、この領域は、どの腫瘍組織とも遠く離れた「正常な」非腫瘍組織に典型的な免疫細胞数を含むとみなされる、工程;ならびに境界領域の幅として、特定された領域の位置(例えば、「始点領域」がカバーする腫瘍領域外郭線上にある画素からの、前記特定された領域の中にある画素のいずれか1つの距離)を使用する工程を含む。
【００７６】
本明細書で使用する「腫瘍」または「新生物」とは組織の異常成長であり、腫瘤を形成している時も普通は腫瘍と呼ばれる。この異常成長は、通常、腫瘤を形成するが、常に腫瘤を形成するとは限らない。
【００７７】
本明細書で使用する「炎症性腫瘍」とは、免疫系による局所的な保護応答を観察することができる腫瘍である。前記応答は、腫瘍への形質細胞、リンパ球、および好酸球の浸潤を含んでもよい。
【００７８】
本明細書で使用する「非炎症性腫瘍」とは、前記腫瘍に対する免疫系の応答が観察されないか、または前記腫瘍に対する免疫系の有意な応答が観察されない腫瘍である。
【００７９】
本明細書で使用する「免疫細胞」とは、身体の様々な箇所にある細網内皮系の骨髄造血部分、リンパ系部分、および細網部分において形成され、通常、これらの部位および循環血液中に(まれに、他の組織に)存在する細胞のタイプである。特に、免疫細胞は、リンパ球、例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、およびマクロファージでもよい。
【００８０】
近接度とは、複数の免疫細胞と腫瘍細胞の距離から算定されたデータ値である。例えば、近接度は、数値データ値、例えば、異なる距離群の比率(0〜1の値)もしくはヒストグラムビンをつないだ線の傾き、またはこれから導き出されるデータ値でもよい。近接度は、調べられた腫瘍細胞と免疫細胞の距離の大部分が、予め規定された距離閾値、例えば、免疫細胞の免疫学的に有効な距離より短いかどうか示している可能性がある。
【００８１】
本明細書で使用する「画像解析システム」とは、デジタル画像処理法によってデジタル画像から意味のある情報を抽出するように構成されている電子システム、例えば、コンピュータである。画像解析タスクは、細胞を特定するために、細胞のタイプ(腫瘍細胞または間質細胞、免疫細胞の様々なタイプ)を特定するために、および距離測定のためにカラーデコンボリューション、連結成分分析、および/またはエッジ検出を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
以下において、本発明の態様は、例にすぎないが、以下の図面を参照して、さらに詳細に説明される。
【図１】画像解析システムのブロック図である。
【図２】腫瘍を分類するための画像解析方法のフローチャートである。
【図３】それぞれのMSI腫瘍試料から導き出された3つのオーバーレイ画像を図示する。画像は、腫瘍細胞がある第1の層と、最も近い腫瘍細胞から最大距離の中にある、色の異なる免疫細胞がある第2の層を含む。
【図４Ａ】MSS腫瘍試料に由来する8つのオーバーレイ画像のうち2つを図示する。
【図４Ｂ】MSS腫瘍試料に由来する8つのオーバーレイ画像のうち6つを図示する。
【図５】図3に図示した3つのMSI組織試料に由来する3つのヒストグラムを図示する。
【図６Ａ】図4に図示した8つのMSS組織試料のうち2つに由来するヒストグラムを図示する。
【図６Ｂ】図4に図示した8つのMSS組織試料のうち6つに由来するヒストグラムを図示する。
【図７】図3に図示した3つのMSI組織試料の3つのIHC蛍光画像を図示する。
【図８Ａ】図4に図示した8つのMSS組織試料のうち2つの蛍光画像を図示する。
【図８Ｂ】図4に図示した8つのMSS組織試料のうち6つの蛍光画像を図示する。
【図９】MSI試料(左縦列)およびMSS試料(右縦列)について作成したオーバーレイ画像、IHC蛍光画像、およびヒストグラムの比較を図示する。
【図１０】特定の免疫細胞が、その免疫細胞に最も近い腫瘍細胞から、ある特定の距離の範囲内にある確率密度を示すプロットを図示する。
【図１１】腫瘍を分類するために腫瘍コンテキスト情報を取り込むための、近接性情報および細胞密度情報の組み合わせを図示する。
【図１２】T細胞密度が似ているが、近接度が異なる2人の患者の染色された組織試料を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
詳細な説明
図1は、本発明の態様に従う画像解析システム100のブロック図である。前記システムは、1つまたは複数のプロセッサ104、メインメモリ106、および不揮発性記憶媒体108を備える。前記記憶媒体は、1つまたは複数の画像処理タスクを行うように構成されている1つまたは複数のアプリケーションプログラムまたはモジュール110、114、112、116を備える。例えば、第1のモジュール110は、細胞を表す画素ブロブを特定するために連結成分分析およびエッジ検出ルーチンを行ってもよい。この特定は、同じ組織試料から導き出された異なる単色蛍光顕微鏡画像または明視野顕微鏡画像において行われてもよい。これにより、異なる単色画像の画素強度はそれぞれ特定のバイオマーカーを示す。カラーデコンボリューションアルゴリズムを適用することによって、特定の組織試料のマルチスペクトル蛍光画像から複数の単色蛍光画像を導き出すことができる。
【００８４】
記憶媒体108は、1種または複数種のバイオマーカー特異的染料で染色された組織試料の1つまたは複数のデジタル画像118をさらに備えてもよい。さらに、システム100はディスプレイ102、例えば、LCDディスプレイに連結されるか、またはディスプレイ102、例えば、LCDディスプレイを備える。前記システムは、様々な患者の組織試料のデジタル画像118を表示するために(例えば、図7および図8を参照されたい)、(例えば、図3および図4に示したように)様々な組織画像118から導き出されたオーバーレイ画像を表示するために、近接度のグラフ表示(例えば、図5および図6に図示したヒストグラム)を表示するために、ならびに/または腫瘍分類結果もしくは処置の示唆を表示するためにディスプレイ102を使用する。
【００８５】
例えば、複数種のバイオマーカー特異的染料によって染色されている組織試料、例えば、生検試料が用いられる。この染料の1つまたは複数は、強く増殖している非リンパ系細胞、または腫瘍細胞によって選択的に発現されるタンパク質に選択的に結合する。腫瘍細胞を特定するために、前記染料の強度シグナルと、対応する単色画像をモジュール110によって解析することができる。前記染料の1つまたは複数のさらなる染料が免疫細胞または免疫細胞の特定のサブタイプ、例えば、細胞傷害性t細胞またはTヘルパー細胞に選択的に結合する。免疫細胞を特定するために、前記染料の強度シグナルと、対応する単色画像をモジュール110によって解析することができる。アプリケーションプログラムまたはモジュール110が実行された後には、組織試料内にある腫瘍細胞および免疫細胞と、対応するデジタル画像が特定されている。
【００８６】
次いで、距離測定アプリケーションプログラムまたはモジュール112は、腫瘍細胞と、腫瘍細胞に最も近い隣接する免疫細胞との距離を求めるための入力として、免疫細胞と特定された画素ブロブと、腫瘍細胞と特定された画素ブロブの場所を使用する。例えば、モジュール112は、それぞれの細胞の中心を特定し、それぞれの細胞中心の間の距離を求める。または、モジュール112は、2個の隣接する細胞の外側境界間の距離として距離を求める。
【００８７】
モジュール112によって測定された距離が全て、特定の組織試料についてモジュール112によって提供された距離の全ての関数として近接度を算定するアプリケーションプログラムまたはモジュール114への入力として提供される。モジュール114は、例えば、予め規定された距離閾値の範囲内にある少なくとも1つの免疫細胞が特定された腫瘍細胞と、予め規定された距離閾値の範囲内にある免疫細胞が特定されなかった腫瘍細胞との比率を算定する。さらに、または代わりに、モジュール114は、任意の腫瘍細胞と、腫瘍細胞に最も近い隣接する免疫細胞の間の特定された全ての距離についてヒストグラムを算定してもよく、図5、図6、および図9に図示されるようにヒストグラムビンの傾きを算定してもよい。
【００８８】
さらに、モジュール112によって測定された距離が全て、例えば、図3および図4に図示したように、オーバーレイ画像を作成するアプリケーションプログラムまたはモジュール116への入力として提供される。オーバーレイ画像では、腫瘍細胞は基本画像層に第1の色で表され、腫瘍細胞の少なくとも1つに隣接していると特定されており、かつ前記腫瘍細胞から距離閾値(例えば、予め規定された「免疫学的に有効な距離」)より短い距離の中にあるとさらに特定された免疫細胞は、さらなる画像層に第2の色で表される。さらなる層は基本層の上に示される。カラー化されたオーバーレイ画像である画像118がモジュール116によって作成される、および/またはヒストグラムがディスプレイ102を介して使用者、例えば、病理学者に示される。
【００８９】
図2は、腫瘍を分類するための画像解析方法のフローチャートである。図2に図示した方法は、例えば、図1に図示したように画像解析システム100によって実行することができる。
【００９０】
第1の工程202では、画像解析システムは組織試料のデジタル画像118を受信する。デジタル画像は、カラーデコンボリューションアルゴリズムを適用することにより画像解析システムによって複数の単色画像に分解されるマルチスペクトル蛍光免疫組織化学(IHC)画像でもよい。または、画像解析システムは組織試料の複数の単色デジタル画像を受信してもよい。組織試料のマルチスペクトルデジタル画像および/または複数の単色デジタル画像は、画像習得システムのあるインターフェースを介して得ることができる。または、画像解析システム100は、記憶媒体、例えば、CD-ROMまたはフラッシュドライブから画像を読み取ることによって組織試料のデジタル画像を受信してもよい。
【００９１】
例えば、画像が得られる組織試料は、以下のバイオマーカー:KI67、CD3、およびCD8に選択的に結合する複数種の蛍光染料によって染色されている結腸直腸癌組織試料の生検材料でもよい。KI67シグナルが得られたが、CD3シグナルもCD8シグナルも得られてなかった画素領域が非リンパ系増殖細胞として特定され、従って、腫瘍細胞として特定される。CD3シグナルおよびCD8シグナルが得られた画素領域は細胞傷害性T細胞として特定され、従って、免疫細胞として特定される。本明細書で使用する「KI67シグナル」は、KI67タンパク質を選択的に染料する染料が発する光シグナルであり、これによって、前記光シグナルは、KI67タンパク質を選択的に染色するのに用いられた染料の発光スペクトルを選択的に取り込んだ、それぞれの単色画像において画素強度値の形で表される。この定義は同様に他の「バイオマーカーシグナル」にも当てはまる。
【００９２】
例えば、IHCで染色されたガラススライドのデジタル画像は、Ventana iScan HT Slide Scannerを用いて取得することができる。画像はRoche IRIS Platformを用いて閲覧および編成された。Ventana画像解析ソフトウェアVDP-SKDおよびVentana Digital Pathology Software Development Kitは、細胞境界を特定するために、および別々の組織領域とガラス領域、腫瘍細胞領域と、免疫細胞領域と、主に(例えば、50％超まで)腫瘍細胞からなる腫瘍細胞領域を特定するために画像解析方法の大部分を行うのに用いられた。
【００９３】
第2の工程204では、画像解析システムのモジュール110は、受信されたデジタル画像または組織試料の画像にある免疫細胞と腫瘍細胞を特定するために1つまたは複数の画像解析ルーチンを行う。細胞を検出するための画像解析ルーチン、例えば、連結成分分析、グレースケール、およびカラーセグメンテーション法、強度閾値処理などを介した画像解析ルーチンが当技術分野において公知である。
【００９４】
さらなる工程206では、画像解析システムのモジュール112は、特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞の距離を、例えば、細胞境界の間の距離を測定することによって求める。
【００９５】
工程206が完了した後に、モジュール114は、工程208において、求められた距離の関数として近接度を算定する。例えば、近接度は、少なくとも1つの「近くにある免疫細胞」がある腫瘍細胞と、このような「近くにある免疫細胞」がない腫瘍細胞との比率でもよく、「近くにある免疫細胞」とは、腫瘍細胞から予め規定された(例えば、免疫学的に有効な)最大距離の中にある免疫細胞である。言い換えると、この比率は、近くの免疫細胞が潜在的に攻撃する可能性がある腫瘍細胞と、免疫細胞が攻撃できないように思われる腫瘍細胞との比率を表している。さらに、もしくは代わりに、距離ヒストグラムの2以上のビンの傾きを算定することができる。これによって、負の傾き(短い距離ビンから長い距離ビン)は、腫瘍細胞の大部分が、近くの免疫細胞によって潜在的に攻撃される可能性があることを示しており、正の傾き(短い距離ビンから長い距離ビン)は、腫瘍細胞の大部分が、免疫細胞によって首尾良く攻撃されない可能性が高いことを示している。
【００９６】
工程210では、モジュール114は、近接度に応じて、特定された腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類する。例えば、比率が1より大きい、および/または傾きが負であれば、腫瘍細胞は炎症性腫瘍細胞として分類される。比率が1より小さい、および/または傾きが正であれば、腫瘍細胞は非炎症性腫瘍細胞として分類される。
【００９７】
工程212では、分類結果は記憶媒体108に記憶される。さらに、または代わりに、分類結果はディスプレイ装置102に表示される。例えば、図3および図4に図示したオーバーレイ画像は分類結果のグラフ表示として使用することができる。腫瘍細胞の大部分が、「免疫学的に有効な距離」の範囲内にある免疫細胞で覆われているのであれば、これは、オーバーレイ画像に図示された腫瘍細胞が炎症性腫瘍の腫瘍細胞であることを示している。
【００９８】
図3および図4は、結腸直腸癌(CRC)患者群から作成したオーバーレイ画像を図示する。免疫蛍光アッセイ(CD3/CD4/CD8/Ki67/DAPI)を用いて、結腸直腸癌(CRC)患者(n=23)の初代腫瘍から得た手術試料を染色した。前記患者のMSS/MSI状態は既知であった。KI67+/CD3-細胞は腫瘍細胞だと特定された。CD3+/CD8+細胞は腫瘍細胞だと特定された。
【００９９】
図3は、マイクロサテライト安定性状態が「不安定」(「MSI」)だと特定されたCRC患者のうち3人について画像解析システムによって算定された3つのオーバーレイ画像302〜306を図示する。
【０１００】
各画像は、あらゆる免疫細胞の存在または場所に関係なく、全ての腫瘍細胞が第1の色、例えば、青色でカラー化された第1の層を含む。前記画像302〜306のそれぞれにおいて、前記第1の層は第2の層に重ね合わされ(第2の層で覆われ)、画素ブロブは、少なくとも1つの腫瘍細胞から予め規定された最大距離の中にあると特定されている免疫細胞を表している。例えば、これらの「潜在的に免疫学的に有効な」免疫細胞はオレンジ色でカラー化される。第2の層が、予め規定された最大距離の中にない免疫細胞の存在を示さないことに気付くことが重要である。従って、第2の層は、単に、免疫細胞と腫瘍細胞を異なる色で表した層のオーバーレイではなく、もっと正確に言うと、腫瘍内にある、潜在的に免疫学的に有効な免疫細胞を示した計算結果である。この特定の形のオーバーレイ画像は、腫瘍の炎症状態を、一般的な腫瘍細胞画像層および一般的な免疫細胞画像層の単なる重ね合わせよりも良好かつ正確に示したものであると観察された。
【０１０１】
図3から分かるように、オーバーレイ画像302、304、306のそれぞれにある腫瘍細胞の大部分は「潜在的に免疫学的に有効な免疫細胞」で覆われている。画像306では、最も完全に覆われていることが観察される。従って、オーバーレイ画像302〜306に対応する組織試料の腫瘍細胞は炎症性腫瘍の細胞と分類される。従って、3人の患者について状態「MSI」は、距離に基づく分類結果と「一致」する。
【０１０２】
図4は、マイクロサテライト安定性状態が「安定」している(MSS)、他の8人の患者について導き出された8つのオーバーレイ画像を図示する。図3について既に説明したようにオーバーレイ画像を作成した。オーバーレイ画像402、406〜416は、腫瘍細胞の大部分が、「潜在的に免疫学的に有効な」免疫細胞、すなわち、少なくとも1つの腫瘍細胞から予め規定された最大距離の中にある免疫細胞を表す画素で覆われていないことをはっきりと示している。従って、オーバーレイ画像402、406〜416に対応する組織試料の腫瘍細胞は非炎症性腫瘍の細胞と分類される。対応する7人の患者について、状態「MSS」は、距離に基づく分類結果と「一致」する。
【０１０３】
しかしながら、オーバーレイ画像404では、腫瘍細胞は「潜在的に免疫学的に有効な」免疫細胞でほぼ完全に覆われている。従って、本発明の態様による画像解析システムは、オーバーレイ画像404に図示した組織試料の腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞と分類する。これは、対応する患者の既知の遺伝子MSS状態とは正反対である。病理学者による深く掘り下げた解析から、実際に、オーバーレイ画像404に図示した腫瘍は炎症性腫瘍であることが明らかになった。MSS/MSI状態が処置決定の基盤として用いられていたら、対応する患者には、免疫応答を刺激または調整する薬物が処方されていなかっただろう。しかしながら、処置示唆の基盤として本発明の態様について本明細書において説明したように近接度を用いると、画像解析システムによって、オーバーレイ画像404に対応する患者が、免疫系を刺激するドラゴン(dragon)のサブスクリプションから利益を得る患者であると特定される。
【０１０４】
図5は、同じ3つのMSI組織試料に由来する3つのヒストグラム502、504、506を図示する。これらの算定されたオーバーレイ画像302、304、306を図3に図示した。
【０１０５】
図5、図6、および図9に図示した、それぞれのヒストグラムは4つの距離ビンを備える。第1のビンは0μm〜20μmの距離をカバーし、第2のビンは21μm〜40μmの距離をカバーし、第3のビンは41μm〜60μmの距離をカバーし、最後のビンは61μm〜80μmの距離をカバーする。「距離」という用語は、特定された腫瘍細胞のいずれか1つと、それに最も近い特定された免疫細胞の距離に関する。距離は、組織試料中にある、それぞれの細胞間の「本当の」距離を指す。
【０１０６】
画像解析システムは、1つの画像内にある2個の細胞の境界を隔てる画素数からμmの単位で細胞間距離を算定するための入力として、画像の分解能および/または倍率に関する情報を使用する。それぞれのビンについて、対応するバーがヒストグラムにプロットされる。これによって、それぞれのバーの高さは、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞との距離が前記ビンの中にある腫瘍細胞の数を反映する。
【０１０７】
ヒストグラム502、504、506から推論できるように、腫瘍細胞の大部分は、免疫細胞の免疫学的に有効な距離の範囲内にある距離を表す第1のビンおよび第2のビンに含まれる。第1のビンのバーの上部と最後のビンのバーの上部をつなぐ直線または曲線をプロットし、この線の傾きを求めることによって、負の(下向きの)傾きが特定される。距離ヒストグラムにある負の傾きが、腫瘍の腫瘍細胞が炎症性腫瘍に属することを示す近接度として用いられる。この近接度に基づく分類結果はマイクロサテライト不安定性状態情報「MSI」と一致する。
【０１０８】
図6は、図4にオーバーレイ画像を図示した8つのMSS組織試料から導き出された8つのヒストグラムを図示する。従って、ヒストグラム602〜616は、マイクロサテライト安定性状態が「安定」している(MSS)、8人の患者に対応する。図5について既に説明したようにヒストグラムを作成した。ヒストグラム602、606〜616は全て正の傾きを有する。このことから、腫瘍細胞の大部分は、「免疫学的に有効な」免疫細胞距離を反映する、予め規定された最大距離の範囲内にある隣接する免疫細胞を含まないことがはっきりと分かる。従って、ヒストグラム602、606〜616に対応する組織試料の腫瘍細胞は非炎症性腫瘍の腫瘍細胞と分類される。対応する7人の患者について、状態「MSS」は、傾きに基づく分類結果と「一致する」。
【０１０９】
しかしながら、ヒストグラム604(オーバーレイ画像404と同じ患者に対応する)では負の傾きが観察され、画像解析システムは、距離ヒストグラム604に対応する腫瘍の腫瘍細胞を炎症性腫瘍として分類する。これは、対応する患者の既知の遺伝子MSS状態とは正反対である。上記で説明したように、深く掘り下げた解析から、実際に、ヒストグラム604に対応する腫瘍が炎症性腫瘍であることが明らかになった。言い換えると、図3および図4に図示した近接度に基づく腫瘍分類、例えば、腫瘍細胞の比率に基づく分類ならびに図5および図6に図示したヒストグラムの傾きに基づく分類は、最新技術のMSS/MSI状態に基づく腫瘍分類よりも正確である。
【０１１０】
図7は、3人の患者のMSI組織試料の3つのIHC蛍光画像702、704、806を図示する。それぞれのオーバーレイ画像を、図3に図示したように作成し、それぞれの距離ヒストグラムを、図5に図示したように作成した。
【０１１１】
図8は、8人の患者のMSI組織試料の8つのIHC蛍光画像802〜816を図示する。それぞれのオーバーレイ画像を、図4に図示したように作成し、それぞれの距離ヒストグラムを、図6に図示したように作成した。IHC画像804は炎症性腫瘍を示し、そのIHC画像はIHC画像802、806〜816よりもIHC画像702〜706と似ている。
【０１１２】
図9は、2つの画像グループの比較を図示する。左側に図示したグループは第1の患者の炎症性CRC腫瘍に対応し、右側に図示したグループは第2の患者の非炎症性CRC腫瘍に対応する。腫瘍細胞はKI67+/CD3-細胞と特定された。免疫細胞(ここでは、細胞傷害性T細胞)はCD8+/CD3+細胞と特定された。最初の(一番上の)横列は、図3および図4について説明した手法と同じ手法で算定したオーバーレイ画像を図示する。2番目の横列は、それぞれの組織試料のIHC蛍光画像を図示する。3番目の横列は、図5および図6について説明したように作成した、それぞれ算定した距離ヒストグラムを図示する。
【０１１３】
炎症性腫瘍組織(左縦列)の場合、オーバーレイ画像902において、腫瘍細胞の大部分は、腫瘍細胞から予め規定された最大距離(免疫学的に有効な距離)の中にあると特定された免疫細胞で覆われている。以下の対応する組織に由来する対応する視野(FOV)902は、かなりの程度の腫瘍免疫浸潤を示す。図5および図6について説明したように求められた対応する距離ヒストグラムの傾きは負である。
【０１１４】
非炎症性腫瘍組織(右縦列)の場合、オーバーレイ画像904において、腫瘍細胞の大部分は、腫瘍細胞から予め規定された最大距離(免疫学的に有効な距離)の中にあると特定された免疫細胞で覆われていない。以下の対応する組織に由来する対応する視野(FOV)908は、免疫細胞による腫瘍浸潤がほとんどないことを示す。求められた対応する距離ヒストグラムの傾きは正である。
【０１１５】
オーバーレイ画像902、904において図で表されたように、およびヒストグラム910、912の傾きで表されたように、異なる腫瘍カテゴリー間で、癌細胞に結合する細胞傷害性t細胞の分布に差異があることは明らかである。
【０１１６】
図10は、特定の免疫細胞が、免疫細胞に最も近い腫瘍細胞からある特定の距離の中にある確率密度を示すプロットを図示する。
【０１１７】
確率密度関数(PDF)とは、ある変数が、ある特定の値をとる相対的な可能性を表した関数である。変数が値の特定の範囲内にある確率は、この範囲にわたる、この変数の密度の積分によって示される。すなわち、変数が値の特定の範囲内にある確率は、密度関数の下にあるが、横軸の上にあり、この範囲の最小値と最大値の間にある面積によって示される。
【０１１８】
確率密度関数はどこでも負でなく、空間全体にわたる積分は1に等しい。
【０１１９】
このプロットは複数の細いMSS曲線を図示する。複数の細いMSS曲線は、それぞれ、MSS試料と分類されている組織試料の画像から得られた、腫瘍細胞と、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞の距離に応じた確率関数を表している。MSS試料の場合、確率密度は、90μmより遠い距離で大きく増加する。太いMSS曲線は、このプロットにおける全MSS曲線の平均を表す。
【０１２０】
このプロットは複数の細いMSI曲線をさらに図示する。複数の細いMSI曲線は、それぞれ、MSI試料と分類されている組織試料の画像から得られた、腫瘍細胞と、腫瘍細胞に最も近い免疫細胞の距離に応じた確率関数を表している。MSI試料の場合、確率密度は、35μmより短い距離で最も大きい。太いMSI曲線は、このプロットにおける全MSI曲線の平均を表す。
【０１２１】
さらに、このプロットは、MMS/MSI状態が未知の組織試料について得られた数本の曲線を含む。
【０１２２】
組織試料における腫瘍細胞と免疫細胞の距離をホールスライドレベルで自動評価すると、腫瘍生物学へのさらに包括的かつ正確な洞察が得られる。
【０１２３】
図11は、腫瘍コンテキスト情報の注釈を含む、染色された結腸直腸癌試料のデジタル画像を図示する。腫瘍を分類するための腫瘍コンテキスト情報として近接性情報と細胞密度情報の組み合わせが取り込まれる。本発明のいくつかの態様について説明したように、腫瘍細胞と免疫細胞の間の近接度は、腫瘍細胞を炎症性腫瘍の腫瘍細胞に、または非炎症性腫瘍の腫瘍細胞として分類するための、価値ある予測パラメータに相当すると観察された。分類結果はまた、免疫系をブーストする薬物によって腫瘍が治療可能かどうか予測するのにも用いられる場合もある。従って、免疫細胞と腫瘍細胞の間の距離と、それから導き出された距離測定は、可能性が高い腫瘍タイプ、腫瘍進行、および治療可能性に関する価値ある予測情報を提供する腫瘍コンテキスト情報に相当する。
【０１２４】
分類の精度は、腫瘍細胞密度および/または免疫細胞密度も求め、入力として使用することでも大幅に上昇することが観察された。従って、態様によれば、(例えば、100μmx100μmあたりの細胞数で測定した)腫瘍細胞密度および/または免疫細胞密度は自動的に求められ、さらなる入力として分類器に送り込まれる。態様によれば、免疫細胞密度は免疫細胞タイプ特異的に求められる(その結果、細胞傷害性t細胞の密度、マクロファージの密度、B細胞の密度などが算定される)。
【０１２５】
従って、分類器のトレーニング期では、任意のトレーニング画像に含まれる、それぞれの腫瘍細胞および/またはそれぞれの免疫細胞に密度情報が割り当てられる。例えば、トレーニング画像にある、それぞれの腫瘍細胞について、幾何学的中心に前記腫瘍細胞を含む約100μmx100μmの正方形の区域または円形の区域が求められる場合がある。次いで、前記区域にある腫瘍細胞の数が自動的に求められ、前記区域の腫瘍細胞密度が算定される。次いで、算定された密度は、区域の中心にある腫瘍細胞に割り当てられる。この手順は、それぞれの腫瘍細胞について繰り返される場合がある。同様に、トレーニング画像にある、それぞれの免疫細胞について、幾何学的中心に前記免疫細胞を含む約100μmx100μmの正方形の区域または円形の区域が求められる場合がある。次いで、前記区域にある免疫細胞の数が自動的に求められ、前記区域の免疫細胞密度が算定される。次いで、算定された密度は、区域の中心にある免疫細胞に割り当てられる。態様によれば、トレーニング期において免疫細胞密度は免疫細胞タイプ特異的に求められる(その結果、細胞傷害性ｔ細胞の密度、マクロファージの密度、B細胞の密度などが算定される)。
【０１２６】
図示した画像において、いくつかの腫瘍細胞(Ki67陽性細胞)と、いくつかの免疫細胞(CD8陽性T細胞)が特定され、腫瘍細胞とT細胞の間の距離が求められた(2つの小さな腫瘍細胞の周囲にある大きな2つの丸を参照されたい)。大きな丸はそれぞれ、距離閾値、例えば、約35μmの距離閾値を表している。特定された腫瘍細胞のそれぞれについて、画像解析システムは前記腫瘍細胞と、最も近い免疫細胞の距離を求め、前記距離が、大きな丸によって示された予め規定された距離閾値より短いかどうか確かめた。腫瘍を「炎症性」または「非炎症性」と分類するために、例えば、それぞれの腫瘍細胞の免疫細胞密度情報に加えて、距離閾値より短い「近い距離」が測定された腫瘍細胞と、距離閾値より長い「遠い距離」が測定された腫瘍細胞の比率が分類器に送り込まれる。
【０１２７】
態様によれば、分類器は、特定された腫瘍細胞を「炎症性腫瘍の腫瘍細胞」に、または「非炎症性腫瘍の腫瘍細胞」として分類する工程が、受信された画像に図示した腫瘍にある腫瘍細胞の大部分の腫瘍細胞密度が、炎症性腫瘍の腫瘍細胞について予想された腫瘍細胞密度の範囲内にあるかどうか、または受信された画像に図示した腫瘍にある腫瘍細胞の大部分の腫瘍細胞密度が、非炎症性腫瘍の腫瘍細胞について予想された腫瘍細胞密度の範囲内にあるかどうかチェックする工程を含むように構成されている。例えば、予想された密度の範囲は、異なるタイプの腫瘍(炎症性/非炎症性の乳癌/結腸癌/肺癌など)について手作業で指定されてもよく、トレーニング期に、さらなるトレーニングパラメータとして腫瘍細胞密度を用いることによって自動的かつ暗黙的に指定されてもよい。
【０１２８】
さらに、もしくは代わりに、分類器は、特定された腫瘍細胞を「炎症性腫瘍の腫瘍細胞」に、または「非炎症性腫瘍の腫瘍細胞」として分類する工程が、空間的に腫瘍の近くにある免疫細胞の大部分の免疫細胞密度が、炎症性腫瘍の状況において予想された免疫細胞密度の範囲内にあるかどうか、または空間的に腫瘍の近くにある免疫細胞の大部分の免疫細胞密度が、非炎症性腫瘍の腫瘍細胞の状況において予想された免疫細胞密度の範囲内にあるかどうかチェックする工程を含むように構成されている。上述したように、免疫細胞密度について予想された密度範囲は、異なるタイプの腫瘍(炎症性/非炎症性の乳癌/結腸癌/肺癌など)について手作業で指定されてもよく、トレーニング期に、さらなるトレーニングパラメータとして腫瘍細胞密度を用いることによって自動的かつ暗黙的に指定されてもよい。
【０１２９】
態様によれば、腫瘍の治療可能性を予測するために、および適用された薬物が腫瘍細胞または免疫細胞に影響を及ぼしたかどうか確かめるために、患者を処置する前、患者を処置している間、および/または患者を処置した後に近接度と細胞密度が複数回求められる。
【０１３０】
さらに、態様によれば、任意の細胞集団(例えば、腫瘍細胞または免疫細胞)と、ある特定の基準点(例えば、免疫細胞、腫瘍細胞、間質細胞、または他の組織、例えば、血管のような細胞集団の細胞とは別の細胞タイプの細胞)との動的な相互作用が確かめられ、トレーニングされていない分類器をトレーニングするための、および/またはトレーニングされた分類器に送り込むための、さらなる予測入力パラメータとして用いられる。
【０１３１】
図12は、T細胞密度が似ているが、近接度が異なる2人の患者A、Bの染色された組織試料を図示する。腫瘍巣(nest)における異なる程度の免疫細胞浸潤が、免疫細胞による腫瘍細胞の認識および/または根絶の重要な徴候を表していると観察された。2つの比較された組織試料において、同じT細胞密度が観察されたが、強く逸脱する近接度が観察された。試料Aでは、腫瘍細胞の4％しかT細胞のすぐ近くに観察されなかったが、試料Bでは、腫瘍細胞の20％超には、すぐ近くに、例えば、約35μmの距離内に少なくとも1つのT細胞があった。免疫細胞による低度の腫瘍浸潤はマイクロサテライト状態「MSS」と相関するのに対して、高度の腫瘍浸潤(試料B)はマイクロサテライト状態「MSI」と相関することが観察された。さらに、近接度を算定すると、優れた炎症性腫瘍/非炎症性腫瘍の分類結果が得られるか、または従来からある高価なMSS/MSI測定よりも優れた炎症性腫瘍/非炎症性腫瘍の分類結果が得られることが観察されたが、これに対して、さらに密度情報を算出および使用すると、近接度のみを使用するよりもかなり正確な分類結果が得られることが観察された。これは、組織の密度も近接度に影響を及ぼすが、近接度は、腫瘍の免疫細胞浸潤の状態よりも、腫瘍が生じた組織のタイプと関連している場合があるからである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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