(57)【要約】  本発明は、軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料及びその製造方法と応用を提供する。当該再生医学材料は、三次元網目構造を備え、且つ無機物と有機物とからなる複合材料であり、無機物と有機物との質量比は２：１〜４：１である。無機物の質量合計に対して、無機物は１２〜３８％のＳｉＯ２と、３〜５％のＮａ２Ｏと、１５〜２９％のＣａＯと、１０〜３２．５％のＰ２Ｏ５と、１〜５％のイノシトール６リン酸と、１〜５％のシクロヘキサノールリン酸エステルとを含み，残りは不純物で、不純物の含有量は０．５％未満である。有機物の質量合計に対して、有機物は３０〜６０％のカルボキシメチルキトサンと、３０〜６０％のヒアルロン酸ナトリウムとを含む。本発明の再生医学材料は人体にさらに好適な組成及び性質を備えており、細胞の修復と結合、細胞増殖、毛包成長の促進において大きな役割を果たすことができる。
2019506985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料であって、
三次元網目構造を備え、且つ無機物と有機物とからなる複合材料であり、前記無機物と前記有機物との質量比は２：１〜４：１であり、
無機物の質量合計に対して、前記無機物は１２〜３８％のＳｉＯ２と、３〜５％のＮａ２Ｏと、１５〜２９％のＣａＯと、１０〜３２．５％のＰ２Ｏ５と、１〜５％のイノシトール６リン酸と、１〜５％のシクロヘキサノールリン酸エステルとを含み、残りは不純物で、前記不純物の含有量は０．５％未満であり、
前記有機物の質量合計に対して、前記有機物は３０〜６０％のカルボキシメチルキトサンと、３０〜６０％のヒアルロン酸ナトリウムとを含むことを特徴とする軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料。
【請求項２】
前記無機物と前記有機物との質量比は３：１であることを特徴とする請求項１に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料。
【請求項３】
前記無機物におけるカルシウムとリンとの質量比は１．５０〜１．８０であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料。
【請求項４】
前記無機物におけるカルシウムとリンとの質量比は１．６７であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料。
【請求項５】
ｐＨは７．４±１であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料。
【請求項６】
体内における分解時間は４〜１２週間であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料。
【請求項７】
大豆抽出液をリン前駆体とし、オルトケイ酸テトラエチルをケイ素前駆体とし、硝酸カルシウム四水和物、硝酸カルシウム及び塩化カルシウムから選ばれる少なくとも一つをカルシウム前駆体とし、水及び／又はエタノールを反応媒体とし、上記各前駆体と、反応媒体とを混合してゲル前駆体ゾル溶液を調製し、３００〜７００℃において恒温焼成することにより、無機物を得る工程と、
前記無機物をカルボキシメチルキトサンと、ヒアルロン酸ナトリウムと混合し、加熱して溶解する工程と、を含むことを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料の製造方法。
【請求項８】
上記大豆抽出液を調製する方法は、
大豆外皮の粉砕工程と、
粉砕材料の酸浸漬と濾過工程と、
浸出液のアルカリ中和工程と、
カルシウム塩沈殿の溶出工程と、
ＲＨ＋樹脂によるイオン交換工程と、
蒸発濃縮工程と、
大豆抽出液を得る工程と、を含み、
ただし、大豆抽出液におけるヒドロキシリンの含有量は４０〜６０質量％であることを特徴とする請求項７に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料を含むことを特徴とする細胞成長担体。
【請求項１０】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の再生医学材料を用いることを特徴とする軟組織及び硬組織の修復を促進する方法。
【請求項１１】
医薬組成物、医療装置、口腔ケア製品、美容外科用品又は化粧品における請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医学の分野に関し、具体的には再生医学材料及びその製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体活性ガラス及びガラスセラミックスの最も顕著な特徴は、人体にインプラントされた後、その表面状態が、時間が経つにつれて動的に変化し、表面に生体活性を有する炭酸ヒドロキシアパタイト（ＨＣＡ）層を形成し、組織に結合界面を提供することにある。生体活性ガラスの多くはＡ型生体活性材料で、骨形成性（ｏｓｔｅｏｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）も骨誘導（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）作用も有しており、骨とも軟組織とも良好な結合性を有している。生体活性ガラス（ＢＡＧ）は修復分野に用いられる良好な生体材料とされている。このような修復性を示す材料は用途が幅広いだけでなく、多くの分野に係る専門製品においては掛け替えのない優れた効能を果たしており、例えば、スキンケア、シワ対策と美白、火傷、口腔潰瘍、胃腸潰瘍、皮膚化膿、真菌殺滅、骨格修復、軟組織と硬組織との結合などが挙げられる。その登場は人類の健康に大きな貢献をもたらすことが期待される。また、ＢＡＧは表面反応が速く、アモルファスの二次元構造であるため強度と破壊靭性が低く、皮質骨に近い３０〜３５ＭＰaの低い弾性率を有し、生体ガラスを切削できるなど優れた加工性能を備えている。
【０００３】
しがしながら、このような生体ガラスにはいくつかの問題がある。１．分解速度が遅く、完全に分解するには通常１〜２年の時間を要する。２．ｐＨ値が安定せず、１１に達して強アルカリ性となる可能性があるため、一定の細胞毒性を有する。３．このような生体ガラスは溶融急冷により製造されるため、反応温度が１７００〜１９００℃の高温となり、高いエネルギー消費をもたらし、標準的な生産ラインを設置するには１０億元以上が必要となる。４．このような生体ガラスは多孔材料を形成できないため、材料の高度適合と機能拡張を実現するのが困難となる。
したがって、今や上記生体ガラスの代わりとなる新規な再生医学材料が、市場から強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様では、軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料を提供する。前記再生医学材料は三次元網目構造を備え、且つ無機物と有機物とからなる複合材料であり、前記無機物と前記有機物との質量比は２：１〜４：１であり、
【０００５】
前記無機物の質量合計に対して、前記無機物は１２〜３８％のＳｉＯ２と、３〜５％のＮａ２Ｏと、１５〜２９％のＣａＯと、１０〜３２．５％のＰ２Ｏ５と、１〜５％のイノシトール６リン酸と、１〜５％のシクロヘキサノールリン酸エステルとを含み、残りは不純物で、前記不純物の含有量は０．５％未満であり、
前記有機物の質量合計に対して、前記有機物は３０〜６０％のカルボキシメチルキトサンと、３０〜６０％のヒアルロン酸ナトリウムとを含む。
【０００６】
好ましい実施形態では、前記無機物と前記有機物との質量比は３：１である。また、前記無機物におけるカルシウムとリンとの質量比は１．５０〜１．８０で、好ましくは１．６７である。
【０００７】
好ましい実施形態では、前記無機物は、ゾルゲル法により大豆外皮の抽出液をリン前駆体として、３００〜７００℃で恒温焼結して得られる。
【０００８】
本発明のもう一つの態様では、上記軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料を含む細胞成長担体を提供する。好ましくは、前記細胞成長担体は、医療装置、特にインプラントの少なくとも一部である。
【０００９】
本発明のさらにもう一つの態様では、本発明に記載の再生医学材料を用いる軟組織及び硬組織の修復を促進する方法を提供する。
【００１０】
本発明のその他の態様では、医薬組成物、医療装置、口腔ケア製品、美容外科用品又は化粧品の製造における本発明に記載の軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料の応用を提供する。
【００１１】
本発明に係る再生医学材料は、材料の分解速度をより効果的に制御できるため、従来の生体活性ガラスの分解速度を制御可能とし、人工骨材料の産業上の利用分野において新生骨インプラント材料の分解速度を同期させることにより、新生骨における骨構造、形態、機能という三重の修復が実現できないという問題を克服する。骨修復、脊柱と骨欠損、口腔インプラントなどに用いる場合には、本発明の再生医学材料は極めて大きな意義を有している。
【００１２】
本発明においては、大豆抽出液によりリンを導入することで、再生医学材料の分解速度を上げることができ、従来の製造方法により得られる材料は、生体活性の成分範囲が狭く、通常リンの含有量を下げることにより分解速度を制限している。従来の方法により製造される材料においては通常、リン酸、リン酸エチルなどを用い、これらはカルシウム前駆体（例えば硝酸カルシウム）との相溶性に劣るため、沈殿が生じて分離を引き起こしやすい。比較的毒性が高いエチレングリコールを選んで前駆体の濃度を下げる場合は、溶媒を処理する過程で、大量のエネルギーと時間を消費するうえ、標準化される大量生産を実現するのは困難である。
【００１３】
本発明に用いるリン前駆体は、例えば硝酸カルシウムなどの前駆体と共に効果的に溶解でき、しかも溶媒は水、エタノール又はそれらの混合物であるので、毒性が低く、溶媒を除去する温度が低く、カルシウム、ナトリウムなどの前駆体を変更することにより、室温でのゲル形成を実現し、６００℃以内で生体活性ガラスの各物理化学的指標を達成している。従来方法の欠点を克服し、標準化される大量生産を実現している。
【００１４】
本発明の再生医学材料においては、１％〜１０％のケイ素原子が５以上の高配位数を有し、且つこれらの高配位ケイ素が常圧にて形成される。高配位ケイ素は、材料の構造と性能にある程度の影響を与え、例えば、高配位ケイ素による紫外線の吸収ピーク転移が挙げられる。
【００１５】
溶液の合成に関して、現状では、高配位ケイ素は主にＮ、Ｆ又はＣｌと配位し、Оとの配位の例は極めて少ない。外部刺激（例えば温度、溶媒及び照射強度）を変更することによりケイ素原子の配位数を変えることができる。温度が上がると５配位のケイ素が増加し、照射により５配位ケイ素と６配位ケイ素との相互変換が可能である。ポリオールを加えると高配位ケイ素の形成確率の向上に有利となり、ポリオールがОとケイ素原子との配位を促進し高配位ケイ素を形成できる。高配位ケイ素に関しては、通常ガラス材料の高温処理により、ケイ素配位数が４から６となり、主にＳi−О−Ｐ又はＳi−О−Ｓiの形で存在する。Ｐの含有量の増加に伴って、６配位ケイ素が増加し、熱処理によりガラス材料が結晶を形成するが、今までの研究では、中低温、常圧において高配位ケイ素原子を含有するケイ素の固体材料は認められていない。
【００１６】
本発明の再生医学材料は、生体活性ガラスよりも物理化学的指標及び生体指標に優れている。生産するとき、当該材料は、６００℃の低温による省エネルギー化、品質管理が可能な大量生産を実現しており、従来の１７００〜１９００℃での仮焼におけるエネルギー消費が高く、製品合格率が低いなどの欠点を解消している。当該再生医学材料を母体とする場合には、他の医学材料を加えれば、生物学的治療分野への幅広い応用が期待できる。
【００１７】
本発明の再生医学材料においては、好ましくは、カルシウムとリンとの比が人体骨格に相当し、例えば、１．６７前後とする。形成された三次元網目構造及びその孔径は、人体骨格及び軟組織の孔径と一致しており、材料の生体活性、安定性及び制御可能な分解速度を実現している。当該材料は、製造温度が低いため、タンパク質、抗生物質、化学療法薬物など生体活性分子が搭載可能となり、しかも多孔性を備えており、薬物の担持及び放出制御に用いることができる。また、選択されたリン前駆体は天然物質であるため、従来のリン前駆体に比べて毒性が極めて低く、材料の生物適合性を高めることができる。当該材料は擬似体液（ＳＢＦ）の中で、その表面にヒドロキシアパタイトを迅速に形成でき、従来の生体活性ガラスにおける塑性に劣るという欠点を克服でき、制御可能なアモルファス材料、すなわち非晶質構造を形成する。その他の生体活性ガラスは大半結晶であるのに対して、本発明の再生医学材料は非晶質であり、材料粒子が均一で、材料の生体適合性が安定し、優れた分散性能を有し、安定性に優れる。人工骨における圧縮強度と分解速度の制御を実現している。
【００１８】
本発明の再生医学材料は、Ｓiイオン、Ｃaイオン、Ｎaイオン及びＰイオンを含み、各イオンの割合は人体の骨組織におけるイオンと一致する。これらのイオンは高温仮焼されているＳiО２の様々な孔径中に均一に分布し、これにより当該材料がひとりでに体液と８段階の表面反応を行う。
【００１９】
段階１：材料におけるＮa＋とＫ＋が、様々な孔径を有するＳiО２（その孔径は人体骨格の孔径とほぼ一致する）に均一に分布し、体液に接触すると、Ｈ＋及びＨ３О＋と迅速に交換し、例えば、
Ｓｉ−Ｏ−Ｎａ＋＋ＯＨ−→Ｓｉ−ＯＨ＋＋Ｎａ＋＋ＯＨ−
【００２０】
ここで、ＯＨ−は負電荷で、骨組織及び軟組織細胞、成長因子、コラーゲンなどの物質を吸着して、細孔の中で規則的に成長させることにより、人体構造の成長を誘導する有機物質塊を形成する。再生細胞の遺伝子を発現させ、規則的に成長させることにより、骨誘導及び骨伝導性能を形成する。
【００２１】
段階２：Ｓi−О−Ｓi結合が溶液によって遮断され、界面外部で多くのＳi−ОＨを形成する。
【００２２】
段階３：Ｓi−ОＨの重合反応によりＳiО２の多孔質骨格層が形成され、それは水素結合とイオン性アミン結合（−Ｓｉ−Ｏ−Ｈ３Ｎ＋−）を介して各種のタンパク質と結合することで高密度のタンパク質吸着を形成し、シリカゾル層と炭酸ヒドロキシアパタイト層を形成し、当該ヒドロキシアパタイト層は高い比表面積を有するため、大量の生体分子の吸着に好適で、細胞外応答を促進する。比較的少ない負電荷量を持つシリカゾル層に比べて、新生骨はより多くの生体分子を吸着する。
【００２３】
段階４：高配位ケイ素原子６とケイ素原子４が人体におけるカリウムイオンと交換し、安定な三次元網目状の固体構造を形成し、ケイ素原子を遊離状態に変える。人体における化学成分とひとりでに交換して、クリーピング置換の担体を形成する。高配位ケイ素は紫外線の吸収ピーク転移を引き起こし、酸化防止の役割を果たす。
Ｓｉ−ＯＨ＋ＯＨ−Ｓｉ→Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−＋Ｈ２Ｏ
【００２４】
段階５：当該材料又は溶液に由来するＣａ２＋とＰＯ４３−は、ＳiО２のリッチな骨格層に集まってＣａＯ−Ｐ２Ｏ５アモルファス層を形成する。Ｐの割合を調整することにより、新生細胞とインプラントの同期分解を調節する。
【００２５】
段階６：ＯＨ−とＣＯ３２−が溶液から析出されるのに伴って、ＣａＯ−Ｐ２Ｏ５アモルファス層が、炭素を含む炭酸ヒドロキシアパタイト（ＨＣＡ）多結晶に変わり、創面、潰瘍及び軟組織の表面に吸着して、細胞増殖を促進することで、創面の癒合と無痕修復を実現する。
【００２６】
段階７：細胞増殖と規則的な成長を促進し、毛包の形成、成長を促進することで、傷痕の緩和を実現する。
【００２７】
段階８：潰瘍創面、特に口腔潰瘍、子宮頚糜爛はいずれも嫌気性菌によるものである。本発明に係る再生医学材料は、弱アルカリ環境を形成し、嫌気性菌を脱水して死滅させると同時に、嫌気性菌の成長を抑制し、新生細胞の修復と増殖を促進できる。
【００２８】
以上より明らかなように、本発明に係る再生医学材料は、人体に適する各種性質を有するだけではなく、人体とさらに一致する成分と含有量割合も有するため、組織の修復にさらに一層好適なものである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明に係る再生医学材料の蛍光Ｘ線スペクトル（ＸＲＦ）元素分布画像（２１０×２１０μm２）を例示するものであり、ミクロスケールにおいて本発明の材料の化学組成（Ｃa、Ｐ及びＳi）が均一に分布することを示している。
【図２】本発明に係る再生医学材料がＳＢＦ溶液と異なる時間で反応した場合のＸＲＤプロファイルを例示するものである。
【図３】本発明に係る再生医学材料のＳＥＭ−ＥＤＸＳ図を例示するものであり、aは堆積前、ｂはＳＢＦ堆積後（１４ｄ）を示す。
【図４】本発明に係る再生医学材料及びその浸出液と骨芽細胞との相互作用のＭＴＴ値を例示するものである。（a）は再生医学材料を直接１ｄ、６ｄ培養した結果、（ｂ）はＲｅｇｅｓｉ再生医学材料の異なる時間の浸出液を２４ｈ培養した結果を示す。
【図５】前駆骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３）を生体ガラスにおいて異なる時間で培養した場合のＳＥＭ図である。
【図６】本発明に係る再生医学材料タブレットのＳＢＦ溶液におけるｐＨ値の変化を例示するものである。
【図７】本発明に係る再生医学材料の水の中における重量変化を例示するものである。
【図８】Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料を脊柱及び分節骨欠損の修復に用いた場合の効果図である。
【図９】Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料をベースに開発した潰瘍用修復材料（ゲル）の治療効果図である。
【図１０】Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料の塗布しやすさを示す実験図であり、本発明に係る再生医学材料は体表面温度において融解してフィルムになることを示している。
【図１１】再生医学材料の創面癒合に与える影響を示す実験図であり、本発明に係る再生医学材料は、創面癒合の速度と質を高めており、毛包を形成したことを示している。
【図１２】再生医学材料を複合海綿骨として多孔質支持体を充填する場合の骨欠損部位の再生を示す図であり、海綿骨の力学的性能と類似し、本発明に係る材料が欠損部位の骨再生を促進したことを示している。
【図１３】本発明に係る再生医学材料と、対照となる４５Ｓ材料との比較における生成した骨の性能比較である。４５Ｓは、分解速度が速く崩れやすく、硬度が高く周囲の骨折を引き起こしやすいことを示している。
【図１４】４５Ｓ浸出液のＨaｃaｔ細胞の増殖に与える影響を示す。
【図１５】４５Ｓ粉末の分解実験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本項では、本発明に係るいくつかの例示的な実施形態について詳しく説明するが、本発明は、以下の詳細な説明に限定されるものではなく、本発明に係るいくつかの態様、特性及び実施形態に関するより詳しい説明として見なされるべきである。
【００３１】
なお、本発明に用いる用語は、特定の実施形態を説明するために用いるものに過ぎず、本発明に対する限定を構成しない。また、本発明に記載の数値範囲については、当該範囲の上限と下限の間における各値も開示されており、記載される各値、記載される範囲における各値もしくはその他記載される値あるいは該当範囲における各値によるより小さい範囲はいずれも本発明に含まれている。これらのより小さい範囲の上限と下限は独立して該当範囲に含まれるか、あるいは除外されてもよい。
【００３２】
特記のない限り、本発明に用いる技術と科学用語はいずれも当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本発明おいては好ましい材料及びその応用について記載されているだけであるが、本発明の実施又は関連テストに際し、本発明に記載の材料と類似する又は均等な材料であれば、いずれも使用可能である。本明細書で言及される文献は全て援用する形で組み込むことで、該当文献に関連する方法及び／又は材料の開示と説明に用いる。組み込まれる文献に矛盾がある場合、本明細書に記載される内容に準拠する。
【００３３】
本発明において、特記のない限り、名詞用語は単数形態と複数形態の両方を含む。本発明における「少なくとも一つ」又は「少なくとも一種」という文言は、単に「一つ」又は「一種」を含む場合のみを指すのではなく、「複数」又は「複数種」の場合も含まれている。
【００３４】
本発明における用語「再生医学材料」とは、軟組織再生機能を促進する三次元網目構造を備える無機−有機複合材料を指し、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料又はＲｅｇｅｓｉなどと呼ばれる場合もある。これらの呼び方は、本発明では同じ意味を有する。好ましくは、再生医学材料では前記無機物と前記有機物との質量比は２：１〜４：１である。前記質量比が２：１未満であると、得られる再生医学材料は、硬度が充分でなくなり、細胞成長の担体として好適でなくなる。一方、前記質量比が４：１を超えると、無機物における各元素の含有量は人体組織、特に骨格などの硬組織における各元素と大きな差が生じるため、組織、特に硬組織の再生にとって不利となる。好ましくは、無機物と有機物との質量比は２．５：１〜３．８：１で、より好ましくは２．６：１〜３．５：１で、さらに好ましくは２．８：１〜３．４：１で、例えば３：１などである。
【００３５】
本発明においては、無機物の質量合計に対して、無機物におけるＳiО２の含有量は１２〜３８％で、好ましくは１５〜３５％で、より好ましくは１６〜３３％で、さらに好ましくは１８〜３０％で、例えば２０％、２５％、２８％、２９％などである。無機物におけるＮa２Оの含有量は３〜５％で、好ましくは３．５〜４．５％で、より好ましくは３．６〜４．２％で、さらに好ましくは４％である。無機物におけるＣaОの含有量は１５〜２９％で、好ましくは１６〜２７％で、より好ましくは１８〜２５％で、さらに好ましくは２０〜２２％である。無機物におけるＰ２О５の含有量は１０〜３２．５％で、好ましくは１２〜３０％で、より好ましくは１４〜２８％で、さらに好ましくは１６〜２６％で、特に好ましくは１８〜２４％、２０〜２２％である。本発明においては、イノシトール６リン酸の含有量は１〜５％で、好ましくは２〜４％で、より好ましくは３％である。本発明におけるシクロヘキサノールリン酸エステルの含有量は１〜５％で、好ましくは２〜４％で、より好ましくは３％である。無機物における上記各成分の含有量があまりに低かったり高かったりすると、再生医学材料における各元素の含有量は生体、例えば人体内の硬組織である骨格の元素含有量と一致しなくなり、組織の再生と修復にとって不利となる。
【００３６】
本発明においては，イノシトール６リン酸とシクロヘキサノールリン酸エステルは単独の成分として加えられてもよいが、又は大豆抽出液に含んで製造する過程で加えてもよい。
【００３７】
本発明において、無機物のうち上記各成分以外は、いずれも本発明を製造する過程で生じる不可避の不純物である。不純物としてその含有量は通常、０．５質量％未満で、好ましくは０．４質量％未満で、より好ましくは０．２質量％で、特に好ましくは０．１質量％未満で、最も好ましくは０である。
【００３８】
本発明においては、有機物の質量合計に対して、有機物におけるカルボキシメチルキトサンの含有量は３０〜６０％で、好ましくは４０〜５５％で、より好ましくは４５〜５０％で、さらに好ましくは４８％である。ヒアルロン酸ナトリウムの含有量は３０〜６０％で、好ましくは４０〜５５％で、より好ましくは４５〜５０％で、さらに好ましくは４８％である。
【００３９】
本発明において、好ましくは、前記無機物におけるカルシウムとリンとの質量比は１．５〜１．８で、好ましくは１．６７である。当該範囲内におけるカルシウムとリンとの割合は生体、例えば人体におけるカルシウムとリンとの割合に合致する。
【００４０】
なお、本発明においては、再生医学材料における上記成分の含有量及び各成分同士の割合は人体の硬組織における各元素の含有量及び割合に基づいて設定される。人体、性別及び年齢層によって硬組織における各元素の含有量は異なる。したがって、本発明に係る再生医学材料における各成分の含有量及び割合が異なる場合もあるが、全体的にはこれらの含有量及び割合は上記の範囲を超えてはならない。
【００４１】
例えば、高齢者の場合、好ましい成分含有量及び割合は以下のとおりであってもよい。
【００４２】
無機物の質量合計に対して、
ＳiО２        ３６％、
ＮaО         ３％、
ＣaО         ２５％、
Ｐ２О５        ２８％、
イノシトール６リン酸    ４％、
シクロヘキサノールリン酸エステル ４％である。
有機物の質量合計に対して、
カルボキシメチルキトサン   ５０％、
ヒアルロン酸ナトリウム    ５０％である。
【００４３】
高齢者層の場合、好ましいカルシウムとリンとの質量比は１．６７である。
若年者層の場合、好ましい成分含有量及びその割合は適宜調整される。
【００４４】
本発明に係る軟組織及び硬組織の修復を促進する再生医学材料の製造方法においては、７．４までの低ｐＨ値、Ｐの放出制御など有益な技術効果を実現するには、特定の植物抽出液を選択する必要があり、前記植物抽出液として大豆抽出液が好ましい。いくつかの実施形態では、大豆抽出液の調製方法は、大豆外皮の粉砕工程と、粉砕材料の酸浸漬と濾過工程と、浸出液のアルカリ中和工程と、カルシウム塩沈殿の溶出工程と、ＲＨ＋樹脂によるイオン交換工程と、蒸発濃縮工程と、大豆抽出液を得る工程とを含み、ただし、大豆抽出液におけるヒドロキシリンの含有量は、４０〜６０質量％が必要である。
【００４５】
具体的には、本発明における大豆抽出液の調製手順は以下のとおりである。
【００４６】
粉砕後に篩分けして約２０メッシュの大豆外皮を得、６倍量の水を加える。７％の塩酸を用いてｐＨを１．５〜２に調整し、室温において撹拌して浸漬する。吸引濾過し、１．２％の塩酸で残渣を洗い出して捨て、濾過液を合わせる。浸出液に石灰を加えて中和することでｐＨを約６．５とし、カルシウム塩沈殿を得て１ｈ静置し、吸引濾過し、濾過液を捨てて、再び蒸留水を用いて、得られた沈殿物を２〜３回洗浄し、浄化されたカルシウム塩を得る。前記カルシウム塩に少量の希塩酸を加えて希スラリーを調製し、しばらくしてから２／３倍量のＨ型強酸性陽イオン交換樹脂を入れる。０．５ｈ軽く撹拌し、カルシウム塩を可溶性塩溶液に変える。吸引濾過、洗浄、分離し、一次抽出液を得る。
【００４７】
上記の可溶性カルシウム塩溶液をイオン交換カラムにかけ、流速を制御しながらイオン交換を行う。このとき、溶液におけるＭｇ２＋、Ｃa２＋などの不純物イオンが交換によりＲＨ＋樹脂に移動し、Ｈ＋イオンが交換される。約１％の量の活性炭を用いて１〜２回脱色し、分離し、そして脱色液を減圧蒸発して濃縮し、温度を７０〜８０℃前後に制御し、瓶内の溶液がやや粘稠になると、大豆抽出液が得られる。ただし、そのヒドロキシリンの含有量は、４０〜６０質量％が必要である。
【００４８】
本発明に記載の植物抽出液から本発明に係る再生医学材料を得られる理由はまだ解明されていないが、植物抽出液はカルシウムの前駆体（例えば硝酸カルシウム）との相溶性が高められ、沈殿が生じないこと、また、植物抽出液は天然成分であるため、毒性がないことが推測される。この他に、大豆抽出液に含まれる各種のその他元素と本発明におけるその他原料との相互作用により予期せぬ効果がもたらされることも一因になり、また、大豆抽出液における各元素の含有量は人体における各元素の組成と類似するため、生体の組成と類似する再生医学材料を容易に得ることも考えられる。
【００４９】
また、植物抽出液は材料を三次元構造にできる様々な成分を有し、これらの成分は相互作用することで低温における再生医学材料の製造という目的を達成する。従来方法の欠点を克服し、標準化される大量生産を実現している。
【００５０】
本発明において、ケイ素前駆体及びカルシウム前駆体としては、本分野で通常使用される前駆体を用いてもよい。また、本発明に係る製造方法においては、水及び／又はエタノールを反応媒体として用いてもよい。本発明においては、上記物質で調製されたゲル前駆体ゾル溶液は比較的低い温度において焼結する必要がある。例えば、３００〜７００℃において焼結し、さらに前記温度は、４００〜６００℃、例えば５００℃などが好ましい。
【００５１】
本発明において、「細胞成長担体」とは、骨細胞や真皮細胞を含むがこれらに限定されない細胞の成長と増殖に好適な基質を指すものである。好ましくは、本発明に係る再生医学材料自体は、そのまま担体として用いられる。場合によっては、本発明に係る再生医学材料と本分野で通常使用される他の材料とを組み合わせ、あるいは複合させて担体として用いてもよい。
【００５２】
実施例
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料の製造方法
下記の成分含有量に基づき、対応する含有量の前駆体をゲル前駆体溶液（硝酸カルシウム四水和物を塩化カルシウム又は硝酸カルシウムと置き換えても結果に影響はない）。
【００５３】
無機物の質量合計に対して、
ＳiО２        ３６％、
ＮaО         ３％、
ＣaО         ２５％、
Ｐ２О５        ２８％、
イノシトール６リン酸    ４％、
シクロヘキサノールリン酸エステル ４％である。
【００５４】
まず、本発明に記載の大豆抽出液３０ｍＬを５０ｍＬのサンプル瓶に加え、そしてオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥОＳ）と、エタノールと水（体積比は約１：１で、上記前駆体を溶解するだけの量でよい）を順に加え、３０ｍiｎ撹拌し、撹拌しながらＣａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ（又は塩化カルシウム又は硝酸カルシウム）を加え、ゲル前駆体ゾル溶液を得た。調製されたゲル前駆体ゾル溶液を室温にて静置し、ゲルになったら（通常２〜１０ｄは必要であるが、各前駆体同士間の比にもよる）、６０℃のオーブンに入れて１ｄ以上熟成させ、そして１２０℃のオーブンに入れて１週間ベークして溶媒を全て蒸発させ、室温に降温した。大気の中で管状炉の温度を室温から５℃／ｍiｎの昇温速度で３００〜４００℃に上げ、乾燥されたゲルを３００〜４００℃の管状炉の中で少なくとも１０ｍｉｎ恒温焼結してから放冷することにより、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料における無機物粉体を得た。
【００５５】
所定の割合でカルボキシメチルキトサンと、ヒアルロン酸ナトリウムとを上記配合粉体と混合し、４５℃に加熱した。溶解し、均一になるまで撹拌し、混合物を得た。医用グリセリン１００ｇを８０℃に予熱しておき、そして上記混合物を医用グリセリンに溶け込ませ、均一になるまで撹拌した（医用グリセリンと生体材料との質量比は５５：４５である）。不純物を除去し、２４ｈ熟成させ、照射滅菌して、本発明に係るＲｅｇｅｓｉ再生医学材料を得た。
【００５６】
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料の性質研究
１．物理化学性質：
蛍光Ｘ線スペクトル（ＸＲＦ）により材料の化学組成を分析した結果、図１に示すように、ミクロスケールにおいて材料の化学組成（Ｃa、Ｐ及びＳi）が均一に分布していることが明らかになった。
【００５７】
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料を擬似体液（ＳＢＦ）に浸漬して堆積実験を行った。Ｘ線回折（ＸＲＤ）により研究した結果、７ｄ堆積した時点で、材料の表面にヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の回折ピークが明らかに認められ（図２参照）、しかも時間が経つにつれてＨＡの回折ピークが強くなることから、材料の表面にはより多くのヒドロキシアパタイトが形成されたことを示している。１４ｄ堆積した時点で、ＨＡの回折ピークに大きな変化は認められず、形成されたＨＡはすでに材料の表面全体を覆ったことを示している。
【００５８】
走査型電子顕微鏡−エネルギー分散Ｘ線スペクトル（ＳＥＭ−ＥＤＸＳ）により材料の表面形状について分析した。図３に示すように、その結果は、ＳＢＦ溶液の中で堆積する前に、材料の表面が平坦で整っており、ＥＤＸＳスペクトル分析したところ主にＳi、Ｐ及びＣaからなるが、ＳＢＦ溶液の中で１４ｄ堆積した後、材料の表面に球状粒子が認められた。球形粒子を拡大観察したところ、これらの粒子は針状のＨＡからなり、またＥＤＸＳスペクトル分析によりＳiの含有量は減少したが、Ｐ及びＣaの含有量（Ｃa／Ｐ〜１．６５）が増加したことが明らかになり、ＨＡの形成がさらに裏づけられた。これらの結果は上記ＸＲＤ結果に一致する。
【００５９】
２．生物学的評価：
２．１．細胞毒性試験：
１％のＲｅｇｅｓｉ再生医学材料粉末を直接１０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液とブレンドし、９６ウェルプレートに入れ、そして前駆骨芽前細胞（ＭＣ３Ｔ３）を１×１０４個／ｍＬで９６ウェルプレートに接種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液を対照群とする。ＣО２インキュベータの中でそれぞれ１ｄ及び６ｄ培養した後、ＭＴＴ試験を行った。ＭＴＴ及びＤＭＳОを順に加え、振盪し、ＥＬＩＳＡ法により５７０ｎｍ波長にて吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定し、測定結果を図４（a）に示す。その結果、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料には細胞毒性がないことが明らかになった。１ｄ培養した時点で、材料の吸光度がブランクサンプルよりやや低かった（約その９２％）ことから、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料には細胞毒性がないことを示し、６ｄ培養した時点で、材料の吸光度値がブランクサンプルと同じであることから、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料には細胞毒性がないことを示している。
【００６０】
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料を５ｍｇ／ｍＬの割合でＤＭＥＭ／Ｆ１２を１０％含む培養液に浸漬し、異なる時間（１ｄ、２ｄ及び３ｄ）浸出した後、遠心分離して上澄み液を分離し、２４ウェルプレート浸出液をブランク対照群とし、いずれも４℃にて保存した。前駆骨芽前細胞（ＭＣ３Ｔ３）を１×１０４個／ｍＬで９６ウェルプレートに接種し、ＣО２インキュベータの中で培養した後、異なる規格の浸出液を加え、２４ｈ後にＭＴＴ試験を行った。ＭＴＴ及びＤＭＳОを順に加え、振盪し、ＥＬＩＳＡにより５７０ｎｍ波長にて吸光度を測定し、測定結果を図４（ｂ）に示す。その結果、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料の異なる時間の浸出液はブランクサンプルの吸光度値とほぼ同じで、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料の浸出液も細胞毒性がないことを示している。
【００６１】
２．２．細胞接着性試験：
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料を、粉末になるまで粉砕した後、打錠した（直径１３ｍｍ、厚み２ｍｍ）。Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料タブレットに対して滅菌と消毒処理を行い、２４ウェルプレートに入れ、前駆骨芽前細胞（ＭＣ３Ｔ３）を１×１０４個／ｍＬで２４ウェルプレートに接種し、それぞれ１ｄ及び３ｄ培養した。そして２．５％のグルタルアルデヒドを用いて４℃にて２４ｈ固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、エタノールで勾配溶出し（５０％、７５％、９５％及び１００％）、自然乾燥させた後、金属溶射を行い、ＳＥＭにより観察し、結果を図５に示す。生体ガラスの表面に骨芽細胞が良好に付着しており、１ｄ培養した時点で、細胞が伸びており、糸状の仮足が認められ、３ｄ培養した時点で、細胞がさらに伸びて増大し、仮足がより明らかに認められた結果となり、これらは、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料が優れた細胞適合性を有し、細胞のＲｅｇｅｓｉ再生医学材料の表面への付着に好適なことを示している。
【００６２】
３．分解実験：
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料タブレット（ＰＳＣ、４５Ｓ５及びＳ７０Ｃ３０）をＳＢＦ溶液に入れてそのｐＨ値の変化を測定し、結果を図６に示す。その結果、４５Ｓ５及びＳ７０Ｃ３０（いずれも報告された製品）のサンプルはいずれもｐＨ値が初期の１６８ｈにおいて上昇したのに対し、ＰＳＣサンプル（本発明に係る再生医学材料）のｐＨ値は同期間において変わらなかった（〜７．４、生理ｐＨ値）ことが明らかになった（図６参照）。先行研究により、ｐＨ値の上昇は細胞の成長に不利な影響をもたらすことが分かっており、４５Ｓ５サンプル及びＳ７０Ｃ３０サンプルの細胞適合性テストを行うときには通常、サンプルをリン酸塩緩衝液に２４ｈ浸漬してサンプル表面のイオンを一部除去することで、それらが細胞を死なせることを防止する必要があるのに対し、ＰＳＣサンプルは安定したｐＨを有するため、通常前処理を行う必要はなく、そのまま細胞適合性実験を行うことができる。しかも、上記実験結果から、ＰＳＣは優れた細胞適合性を有しており、細胞の接着、増殖及び分化にとって有利なことが明らかになった。これらの結果は、ＰＳＣは消毒と滅菌を経てそのまま体内に利用可能なことを示唆している。
【００６３】
Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料タブレットを脱イオン水（５タブレット／５０ｍＬ）に入れて分解実験を行う。各間隔時点において脱イオン水を完全に入れ替え、５タブレットのサンプルを取り出し、紙でその表面の水を吸収し、真空乾燥器に入れて乾燥させ、秤量し、平均値を取得し、結果を図７に示す。その結果、当該材料は６ｄから分解し始め、９ｄから分解が加速し、７０日目に４０％まで分解しており、しかも分解速度が遅くなることが明らかになった。
【００６４】
ＳＢＦ溶液の中でＲｅｇｅｓｉ再生医学材料の分解試験を行う。材料におけるイオンの放出に伴って、材料の表面にＨＡが形成された。最初の１か月に〜８０％に分解しているが、１か月後に材料の表面は完全にＨＡにより覆われたため、その重量がほぼ変わらなくなるので、Ｒｅｇｅｓｉ再生医学材料の分解は体内の新陳代謝におけるその分解速度に準拠すべきである。従来報告された４５Ｓ５生体ガラスの分解は、ほとんど体内にインプラントすることで検討したもので、完全に分解するには約１〜２年の時間を要するという。
【００６５】
脊柱及び分節骨欠損の修復へのＲｅｇｅｓｉ再生医学材料の応用に関する前臨床研究
１．材料学
Ｒｅｇｅｓｉ生体活性ガラスを擬似体液に浸漬し、そのｐＨ値の変化を測定した。生体力学実験によりその体外最大圧縮強度を測定した。電子顕微鏡を用いて材料の微細形状及び接触角を観察し、材料表面に金めっきを吹きつけ、走査により材料の表面形状及び細孔構造を観察した。
【００６６】
２．細胞学
骨芽細胞培養液にそれぞれＲｅｇｅｓｉ生体活性ガラスを入れて実験群とし、対照群としてＧｓｋ材料を選択した。定量的リアルタイムＰＣＲにより当該材料の骨芽細胞Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン及びアルカリホスファターゼ遺伝子の発現に与える影響を測定することにより、当該材料が骨芽細胞の増殖を促進する可能なメカニズムについて検討した。また、上記２種材料の抽出液を用いて骨芽細胞を培養し、ＭＴＴ法により細胞成長曲線を測定し、６段階毒性評価法により相対成長速度（ＲＧＲ＝（実験群／対照群）×１００％）を算出し、毒性の段階評価を行った。骨芽細胞を体外培養し、そしてそれぞれ上記２種の材料に接種し、細胞接着率及び細胞接着力を測定した（接着率＝接着細胞数／細胞数合計×１００％）。マイクロピペット吸引法により細胞の接着力を測定し、走査電子顕微鏡で観察した。細胞と材料との複合試験を行い、それぞれ１．０ｃｍ×１．０ｃｍ×０．５ｃｍの大きさの材料を採取して培養プレート内に置き、細胞懸濁液を材料の表面に接種して複合培養を行った。倒立位相差顕微鏡下において材料表面の細胞成長状態を観察した。
【００６７】
３．動物実験
１）平均体重７５ｋｇの雄の羊６０頭を用いて、３群に分け、各群２０頭とする。全身麻酔かつ無菌下において前方経路第２腰椎椎体切除術を行って、脊柱分節性骨欠損モデルを構築した。また尺骨中段４．５ｃｍ骨及び骨膜欠損モデルを構築した。円柱状のＲｅｇｅｓｉ生体活性ガラス、ＧSK材料及びＰＭＭＡをそれぞれ椎体切除によりできた隙間及び尺骨欠損部位にインプラントし、３種の修復材料を、それぞれチタン板を用いて隣接する分節の上下椎体及び尺骨の骨欠損修復部位に固定した。術後１週目、６週目及び１２週目に尺骨及び腰椎正側Ｘ線検査を行って骨癒合及び欠損修復状態を観察した。また３つの観察群の動物５頭を屠殺し、手術によりチタン板を取り除き、材料ごと隣接する椎体及び欠損部位にある隣接する尺骨を取り出して次のとおり研究を行った。a．切片を製作し、顕微鏡により材料充填部位における新骨成長及び材料の分解状態を観察した。ｂ．生体力学テストにより検体の圧縮強度及び引張強度を測定した。ｃ．検体をＭｉｃｒｏ−ＣＴシステムに置いて三次元再構成により観察し、Ｍｉｃｒｏｖｉｅｗ  ＡＢＡソフトウェアを用いて骨インプラント部位における新生骨組織のミネラル含有量（ＴＭＣ）及び骨体積率（ＢＶＦ）を定量的に分析した。ｄ．オーバーレイ重畳法（Ｏｖｅｒｌａｙ）を用いて異なる色で各検体の骨インプラント領域内における分解後の材料残留と新生骨を同時に示す。術後２４週目に残りの動物５頭について、全身麻酔かつ無菌下における手術により椎体及び尺骨を固定したチタン板を取り出して創面を縫合し、術後に羊の四肢運動及び活動能力について観察し、術後３２週目に動物を屠殺し、修復した椎体及び尺骨検体を取り出して所定の生物力学テスト及び組織学的分析を行った。
【００６８】
２）ニュージーランドホワイトウサギ８０匹を、去勢群及び偽手術群に分け、それぞれ６０匹及び２０匹とし、両側卵巣去勢によりウサギ骨粗鬆モデルを構築した。去勢群をＲｅｇｅｉ群と、ＰＭＭＡ群と、ブランク対照群とに分けて各群２０匹とし、椎体形成術をシミュレーションし、それぞれＲｅｇｅｉ群ウサギのＬ１及びＬ２椎体に注射用途のＲｅｇｅＳｉ生体活性ガラスを注射し、ＰＭＭＡ群ウサギのＬ１及びＬ２椎体にＰＭＭＡを注射した。各群はいずれも術後１週目、６週目、１２週目及び２４週目に５匹を屠殺し、対応する椎体を取り出し、組織学、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析及び顕微鏡により充填部位の新骨成長及び材料分解の状態を分析し、生体力学実験によりＲｅｇｅｉ生体活性ガラスの圧縮強度及び引張強度を評価した。
【００６９】
上記実験からは、本発明に係るＲｅｇｅｉ材料は、Ｇｓｋ材料群、ＰＭＭＡ群及びブランク対照群に比べて優れた圧縮強度、引張強度及び分解状態などを有することが明らかになった（図８等参照）。
【００７０】
従来の生体活性ガラスの性質研究
４５Ｓの粉末状サンプルをテスト対象とする。
実験手順：
１）４５Ｓを高温高圧にて滅菌する。
２）浸出液の調製：滅菌を経た４５Ｓを所定体積のＭＥＭ培地に浸漬し、３７℃にて２４ｈ浸漬する。それぞれ質量／体積パーセント濃度０．１％、１％及び１０％とする。
３）浸出液から上澄液を分離し、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨを７．２に調整する。０．２２μmの濾過ヘッドで滅菌する。４℃にて保存する。
４）３種の濃度の浸出液にそれぞれ１０％ＦＢＳを加える。
５）ＣＣＫ−８を用いてＨaｃaｔ細胞の増殖能力を測定し、吸光度−時間曲線をプロットする。
【００７１】
テスト結果：
濃度１０％の４５Ｓ浸出液は安定しておらず、保存する間に大量の綿状沈殿物が認められたため、後続のテストを行わなかった。ＣＣＫ−８テストにおいては、１％の浸出液は加えると２日目に細胞が全て死亡しており、濃度０．１％の浸出液には、細胞への明らかな細胞毒性が認められなかったが、図１４からは、テスト後期には細胞成長が対照群より遅くなることが分かる。
補充実験（４５Ｓの蒸留水浸漬によるｐＨ値への影響）
【００７２】
実験手順：４５Ｓを１％の質量／体積パーセント濃度で蒸留水に浸漬し、異なる時点のｐＨ値を測定する。
測定結果：
2019506985.tif 000003
【００７３】
結論：
上記の結果から、浸漬時間の増加に伴って４５Ｓ浸出液のｐＨ値が次第に高くなり、２４ｈにｐＨ値が１３に達している。ｐＨの大幅な上昇により、ＣＣＫ−８テストにおいて高い細胞毒性が示されている。
【００７４】
その他実験
１）高温高圧で滅菌した４５ＳをＭＥＭ培地に加える。４５Ｓの体積パーセント濃度をそれぞれ０．１％、１％及び１０％とする。４５ＳをＭＥＭ培地に加えたら直ちに明らかな色の変化が認められたことから、培地のｐＨが大きく変化したことを示している。２４ｈ浸漬した後、上澄液を分離して１ＭのＨＣｌを用いてｐＨを７．２に調整した。４５Ｓ濃度の上昇に伴って、培地のアルカリ性が高くなり、より多くの量のＨＣｌが必要となる。実験結果を確認するために、４５Ｓを蒸留水に浸漬した後のｐＨ値の変化について測定した。測定結果からも同じく、４５Ｓが大幅なｐＨ上昇を引き起こし、細胞毒性を有することが示されている。
【００７５】
２）４℃の冷蔵庫から予め用意した４５Ｓ浸出液を取り出したところ、濃度１０％のサンプルには大量の白色綿状沈殿物が認められた。３７℃水浴で半時間加熱したところ溶解しなかった。この濃度のサンプルに対しては後続のＣＣＫ−８テストを行わなかった。室温において２週間静置した後、濃度１０％の４５Ｓ粉末はＭＥＭの中でゾル状を呈することから、４５Ｓ粉末の分解速度が速いことを示している（図１５参照）。
【００７６】
３）濃度が０．１％及び１％の浸出液にＦＢＳを加えてＣＣＫ−８テストを行ったところ、濃度１％の浸出液は、細胞が全て死亡しており、極めて高い細胞毒性を有し、濃度０．１％の浸出液は、比較的低い細胞毒性を有することが示されている。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明に係る再生医学材料は、生体骨修復練り歯磨き、組織工学再生、創面修復医用材料に用いることができる。特に組織工学、口腔粘膜、骨修復材料、創面修復などの分野において大きな科学的価値と意義を有し、組織工学、生物学的治療などの分野において大きな貢献をもたらすことが予想される。
【００７８】
本発明の範囲と趣旨から逸脱しないことを前提として、本願明細書の各実施例について様々な改良と変形を加えることができ、当業者にとってこれは自明なことである。本願明細書から得られるその他実施形態も当業者にとっては自明なものである。本願明細書及び関連実施例は例示的なものに過ぎない。
【図１】
2019506985.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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