(57)【要約】  本発明の一態様は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、シード領域に存在する少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み；ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、またｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。本発明の他の態様は、治療用途に適したこれらのｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物と、例えば様々な病状を治療するために、標的遺伝子の発現をこれらのｄｓＲＮＡ分子を投与することにより阻害する方法とに関する。
2019535288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の熱不安定化修飾またはその前駆体を少なくとも１つ含み、ここで前記センス鎖は、ＡＳＧＰＲリガンドを含む、ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２】
少なくとも４つの２’−フルオロを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項４】
以下の特徴：
ａ）前記二本鎖の熱不安定化修飾が、前記アンチセンス鎖の５’領域の４〜８位に位置する；
ｂ）前記センスおよびアンチセンス鎖の各々が、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；および
ｃ）前記センス鎖の片末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド
を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が、以下の特徴：
ａ）前記二本鎖修飾の熱不安定化修飾は、前記アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；
ｂ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；
ｃ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
ｄ）１８〜３５ヌクレオチド長を有する、
のうち少なくとも２つを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記センス鎖が、以下の特徴：
ａ）前記センス鎖の片末端に結合された前記ＡＳＧＰＲリガンド；
ｂ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；
ｃ）前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示し、前記二本鎖の熱不安定化修飾は前記二本鎖領域内に位置する、
のうち少なくとも１つを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記二本鎖の前記熱不安定化修飾が、
【化１】
2019535288.tif 000056
（式中、Ｂは核酸塩基である）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記安定化修飾が、前記アンチセンス鎖の７位に位置する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、
【化２】
2019535288.tif 000057
である、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１４】
標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の熱不安定化修飾を少なくとも１つ含み、ここで前記ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１５】
約５５℃〜約６７℃の融解温度を有する、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖の少なくとも５０％が、投与後７日目に肝臓に存在する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１７】
以下の特徴：（ｉ）前記アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）前記アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）前記センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）前記センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）前記センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）前記ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；および（ｉｘ）前記センス鎖は、１つ以上のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つをさらに有する、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記センス鎖が２１のヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が２３のヌクレオチドを有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２０】
単独の、または薬学的に許容できる担体もしくは賦形剤と組み合わせた、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を有する遺伝子サイレンシングキット。
【請求項２２】
細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項２３】
前記ｄｓＲＮＡ剤が、皮下または静脈内投与を通じて投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に発現させるステップを含む、方法。
【請求項２５】
ｄｓＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖によって引き起こされるオフターゲット効果を抑制するための方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドを被験者における特異的標的に、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を投与することにより送達するための方法。
【請求項２７】
前記投与するステップが、筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ、静脈内、皮下、脳脊髄、またはそれらの組み合わせを含む投与手段により実施される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２０１６年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４２５，９０７号明細書、２０１７年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５４８，５８９号明細書、および２０１７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，５１４号明細書の利益を主張し、それらすべての内容は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、望まれないオフターゲット効果を低減することによる標的遺伝子発現の阻害にとって有利である特定のモチーフを有するＲＮＡｉ二本鎖剤、および治療用途に適したＲＮＡｉ組成物に関する。加えて、本発明は、例えば様々な疾患の治療を意図した、これらのＲＮＡｉ二本鎖剤を投与することによる標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断し得るという観察を記述するため、Ｆｉｒｅと同僚らによって最初に造られた用語である（非特許文献１；非特許文献２）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を試験するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、そのサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、その二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を有することが知られるが、この活性のタンパク質成分は未知のままであった。
【０００４】
ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果の１つが、ｍｉＲＮＡ様効果であり、ここではＲＮＡ干渉におけるコアエフェクターであるアルゴノートタンパク質が、ＲＮＡ干渉を誘導するために人工的に導入されるｓｉＲＮＡをｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として処理する（非特許文献３）。ｍｉＲＮＡは、遺伝子抑制のため、シード領域（５’末端から２〜９位）と標的ｍＲＮＡとの間の塩基対合を通じて標的遺伝子の多くを認識する。ｓｉＲＮＡによって引き起こされるオフターゲットは、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖のシード領域と１つ以上のｍＲＮＡとの塩基相補性に起因する。ｓｉＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果は、幾つかの試験において報告されており、シード領域の配列に応じて多数の遺伝子の発現に影響し、ｓｉＲＮＡに基づく表現型スクリーニングにおいて最大３０％の陽性ヒットの原因になる程に重大である。加えて、ｍｉＲＮＡの場合、シード領域と標的との間の相互作用が弱くなるとき、それらの３’末端領域内での相補的対合（３’相補的対合）を通じて標的遺伝子をサイレンシングすることも報告されており、それはｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果がかかる機構によって媒介される可能性が高いことを意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００
【非特許文献３】Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１５）４，ｅ２５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ｓｉＲＮＡ遺伝子療法の遺伝子サイレンシングの有効性を損なうことなく、化学修飾の賢明な適用によりｓｉＲＮＡの設計を調節することにより、ｓｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果を除去または低減するような努力が続けられている。本発明は、その効果を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利であるｄｓＲＮＡ分子にとって有効なヌクレオチドまたは化学的モチーフ、および治療用途に適したＲＮＡｉ組成物を提供する。
【０００８】
発明者は、特に、を標的にするｄｓＲＮＡ分子が、アンチセンス鎖がシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつｄｓＲＮＡ分子が約４０℃〜約８０℃の範囲内の融解温度を有する場合、ＲＮＡ干渉を媒介するのに、不安定化修飾を欠いている親ｄｓＲＮＡ分子よりも有効であり得ることを発見している
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡは、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子であって、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位、好ましくは３〜８位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡ分子は、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、６、７、８、９、１０、１１または１２の２’−ＯＭｅ修飾を含む；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｖ）センス鎖は、６、７、８、９、１０、１１または１２の２’−ＯＭｅ修飾を含む；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４または５の２’−デオキシ修飾を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃からの範囲の下端、および約７０℃、７５℃または８０℃からの範囲の上端の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５５℃〜約７０℃の範囲内の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５７℃〜約６７℃の範囲内の融解温度を有する。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６０℃〜約６７℃の範囲内の融解温度を有する。一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６２℃〜約６６℃の範囲内の融解温度を有する。
【００１２】
本発明者らは、少なくとも６０℃の融解温度を有するｄｓＲＮＡ分子が、インビボおよびインビトロでより有効であることも発見している。したがって、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも６０℃の融解温度を有する。
【００１３】
発明者はまた、ｄｓＲＮＡ分子がインビボでより有効であるには、投与後、例えばマウス肝臓において、インビボで７日目、アンチセンス鎖が少なくとも４０〜５０％存在する必要があることを発見した。
【００１４】
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ分子を、皮下または静脈内投与により対象における特異標的に送達するための方法をさらに提供する。本発明は、前記薬剤を皮下または静脈内投与により対象における特異標的に送達するための方法における使用を意図した本発明のｄｓＲＮＡ分子をさらに提供する。
【００１５】
本特許または出願ファイルは、色付きで作成された少なくとも１つの図面を有する。カラー図面付きの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要料金の支払いに応じて特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の一部の例示的な不安定化修飾を示す。
【図２】図２は、インビトロでのコンジュゲート活性に対する、アンチセンス鎖における単一の（Ｓ）−グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾の位置的効果を示す。（Ｓ）−ＧＮＡとの単一置換は、アンチセンスのシード領域（アンチセンス鎖の５〜８位）またはその反対位置で十分な耐容性があるが、感受性位置（アンチセンス鎖の１および２位、ならびにセンス鎖の１１および１２位）において耐容性がない。
【図３】図３は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡに対して目標活性に対する等価性を有したことを示す。
【図４】図４は、本発明の例示的なｄｓＲＮＡが、ラット肝細胞において高用量でオフターゲット活性を有さなかったことを示す。
【図５】図５は、本発明の例示的なｄｓＲＮＡが、同等な遺伝子（ＧＯ１およびＴＴＲ）のノックダウンを有することを示す。
【図６】図６は、本発明の例示的なｄｓＲＮＡが内因性のオフターゲット効果を軽減することを示す。明示されるように、両ｄｓＲＮＡは、それら各々の親ｄｓＲＮＡにより下方または上方制御される遺伝子の数を有意に低減させた。
【図７】図７は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡと同等の効力を有することを示す。
【図８】図８は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡと同等の肝臓蓄積を有することを示す。
【図９】図９は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡと同等のオンターゲット活性を有することを示す。
【図１０】図１０は、様々な濃度で投与される例示的なｄｓＲＮＡの臨床病理学的パラメータを示す。
【図１１】図１１は、本発明の例示的なｄｓＲＮＡを投与することに対する正規化された体重増加および肝臓／体重比を示す。
【図１２】図１２は、異なる配列の特定位置を通じてのΔＴｍとオンおよびオフターゲット活性との間の相関を示す。青色データ点＝オンターゲット活性；赤色データ点＝オフターゲット活性。
【図１３】図１３は、ｄｓＲＮＡ二本鎖の融解温度のインビトロおよびインビボ活性に対する効果を示す。
【図１４】図１４は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡに対して同等の効力を有したが、インビトロでオフターゲット活性を低下させたこと（ＰＭＨ）を示す。
【図１５】図１５は、例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡに対してインビボで同等の効力を有したこと（齧歯類）を示す。
【図１６】図１６は、肝毒性が、親ｄｓＲＮＡに対して（ＥＳＣ）、本発明の例示的なｄｓＲＮＡを有する（ＥＳＣ＋）ラットにおいて軽減されることを示す。
【図１７】図１７は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、親ｄｓＲＮＡに対して、インビボで治療指数において６〜８倍の改善を有した（ラット）ことを示す。
【図１８】図１８は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、ＣＯＳルシフェラーゼ系において、オンターゲット活性について同等のＩＣ５０を有したが、親ｄｓＲＮＡのＡＤ−６１４４４に対して同等濃度ではるかに低いオフターゲット活性を有したことを示す。
【図１９】図１９は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、ＣＯＳルシフェラーゼ系において、オンターゲット活性について同等のＩＣ５０を有したが、親ｄｓＲＮＡのＡＤ−７７４０７に対して同等濃度ではるかに低いオフターゲット活性を有したことを示す。
【図２０】図２０は、本発明に従う例示的位置でのＧＮＡおよび２’−Ｆとの置換が、親ｄｓＲＮＡと比べてインビボ活性に対して有害効果を示さないことを示す。ｄｓＲＮＡの配列が、表９中に列挙される。
【図２１】図２１は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、オフターゲット効果を低下させたことを示す。１０ｎｍのｓｉＲＮＡがトランスフェクトされた（１６時間の処置）Ｈｅｐ３Ｂ細胞からのＲＮＡｓｅｑ。
【図２２】図２２は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、非ヒト霊長類において様々な用量で親ｄｓＲＮＡと比べて同等の単回用量活性を有したことを示す。
【図２３】図２３は、インビボマウス試験における試験設計および試験における例示的なｄｓＲＮＡを示す。ｄｓＲＮＡ配列の配列は、表９に列挙される。
【図２４】図２４は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、ＣＯＳルシフェラーゼ系において、親ｄｓＲＮＡに対して、オンターゲット活性について同等のＩＣ５０を有したが、同等の濃度でオフターゲット活性をほとんど有しなかったことを示す。
【図２５】図２５は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、ＣＯＳルシフェラーゼ系において、親ｄｓＲＮＡに対して、オンターゲット活性について同等のＩＣ５０を有したが、同等の濃度でオフターゲット活性をほとんど有しなかったことを示す。
【図２６】図２６は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、肝臓における蓄積低下に反して、肝臓において親ｄｓＲＮＡと同等の遺伝子ノックダウンを有することを示す。
【図２７】図２７は、本発明に従う例示的なｄｓＲＮＡが、肝臓における蓄積低下に反して、肝臓において親ｄｓＲＮＡと同等の遺伝子ノックダウンを有することを示す。
【図２８】図２８は、（Ｓ）−ＧＮＡおよび（Ｒ）−ＧＮＡの構造の略図である。
【図２９】図２９は、Ａ型およびＢ型ＲＮＡ／ＤＮＡ、ならびに（Ｓ）−ＧＮＡにおける骨格−塩基傾斜（ηＢ）およびヘリカルツイスト値を示す。（Ｒ）−ＧＮＡにおける値は、単純な反転を用いることにより、（Ｓ）−ＧＮＡ値から外挿される。
【図３０】図３０は、ＧＮＡを用いてのｓｉＲＮＡコンジュゲート二本鎖の熱調節の略図である。
【図３１】図３１は、ＰＤＢファイル４Ｗ５Ｏから適応され、ＰｙＭＯＬを用いて作製されたｈＡｇｏ２の構造の略図である。
【図３２Ａ】図３２Ａは、インビボでの例示的なｄｓＲＮＡの位置特異的な代謝安定性を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、得られる薬力学に対する代謝安定性の影響を示す。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、センス鎖に対向するＧＮＡの熱安定化が、例示的なｄｓＲＮＡの代謝安定性および効力を改善することを示す。
【図３３】図３３は、（Ｓ）−ＧＮＡを含有する例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖の熱融解（Ｔｍ）分析を示す折れ線グラフである。
【図３４】図３４Ａは、両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析を示す。  図３４Ｂは、両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析を示す。  図３４Ｃは、両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析を示す。  図３４Ｄは、両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析を示す。  図３４Ｅは、両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析を示す。  図３４Ｆは、両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析を示す。
【図３５】図３５は、イソシチジンおよびイソグアノシンヌクレオチドの構造ならびに「回転された」ＧＮＡ−ＣまたはＧＮＡ−Ｇに対して完全に相補的な塩基対を形成するそれらの可能性を示す。
【図３６】図３６は、インビトロサイレンシングに対する単一（Ｓ）−ＧＮＡ塩基対置換の位置的効果を示す。ガイド鎖の指定位置での塩基対は、対応するＧＮＡ塩基対と置換された。
【図３７】図３７Ａは、２．５ｍｇ／ｋｇで投与された（Ｓ）−ＧＮＡ修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖を有するマウスにおけるＴＴＲのノックダウンを示す棒グラフである。図３７Ａは、肝臓において測定されたＴＴＲ  ｍＲＮＡレベルを示す。エラーバーは、各コホートからの標準偏差を表す（ｎ＝３）。統計学的に有意な比較のみがグラフに示され；他のすべてが、すべて有意であったＰＢＳに対するすべての比較を例外として、有意でない。Ｇ＝ガイド鎖，Ｐ＝パッセンジャー鎖。  ３７Ｂは、２．５ｍｇ／ｋｇで投与された（Ｓ）−ＧＮＡ修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖を有するマウスにおけるＴＴＲのノックダウンを示す棒グラフである。図３７Ｂは、血清において測定されたＴＴＲタンパク質レベルを示す。エラーバーは、各コホートからの標準偏差を表す（ｎ＝３）。統計学的に有意な比較のみがグラフに示され；他のすべてが、すべて有意であったＰＢＳに対するすべての比較を例外として、有意でない。Ｇ＝ガイド鎖，Ｐ＝パッセンジャー鎖。
【図３８Ａ】ＲＩＳＣローディングを遮断することが肝毒性を軽減することを示す。図３８Ａは、５’−リン酸化を阻止することで、ＲＩＳＣローディングを低減するための、ｓｉＲＮＡの５’末端で用いられるヌクレオチド類似体の構造を示す。
【図３８Ｂ】ＲＩＳＣローディングを遮断することが肝毒性を軽減することを示す。図３８Ｂは、剖検（ｎｘ）時、アンチセンス鎖（ＡＳ）についてステムループＲＴ−ｑＰＣＲにより評価されるような、ラットおよびマウス毒性試験における親（ＲＮＡｉ活性型）およびキャッピングされた（ＲＮＡｉ不活性型）ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡにおける肝臓曝露を示す棒グラフである。垂直破線は、別々に実施された試験の境界を画定する。
【図３８Ｃ】ＲＩＳＣローディングを遮断することが肝毒性を軽減することを示す。図３８Ｃは、剖検で測定された血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。群平均間の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７における一元配置分散分析を用いて統計学的有意性について評価された。ｎｓ，有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１。
【図３８Ｄ】ＲＩＳＣローディングを遮断することが肝毒性を軽減することを示す。図３８Ｄは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。ラットでは、肝毒性ｓｉＲＮＡ（ここでｓｉＲＮＡ−１で示される）は、肝細胞変性（括弧で囲まれた領域）、クッパー細胞の過形成および／または白血球浸潤に起因する類洞細胞の増加（＃）、単細胞壊死（＊）、有糸分裂の増加（＾）、および肝細胞空胞化（矢印）を有した。マウスでは、肝毒性ｓｉＲＮＡ（ここでｓｉＲＮＡ−７で示される）は、単細胞壊死ならびにラットにおいて共通に見られる他の所見でのより低い発生率および重症度に関連した。キャッピングされたＲＮＡｉ不活性型ｓｉＲＮＡは、両種において、最小の空胞化を有した、または組織学的所見を有しなかった。マウスにおいて認められる細胞質透明化は、不完全な絶食に起因するグリコゲンに合致し、被験物質に関連すると考えられなかった。
【図３９Ａ】ラット毒性試験におけるＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡでのＲＮＡｉ活性および有毒な肝酵素上昇に対するアンチセンス鎖５’−修飾の効果を示す。図３９Ａは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、５’−キャップの存在下または不在下の、ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの肝臓でのＲＩＳＣローディングを示す棒グラフである。
【図３９Ｂ】ラット毒性試験におけるＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡでのＲＮＡｉ活性および有毒な肝酵素上昇に対するアンチセンス鎖５’−修飾の効果を示す。図３９Ｂは、生理食塩水対照群と比べての、標的ｍＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲによる剖検時に評価され、ハウスキーピングｍＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に正規化された、５’−キャップの存在下または不在下の、肝臓ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。
【図３９Ｃ】ラット毒性試験におけるＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡでのＲＮＡｉ活性および有毒な肝酵素上昇に対するアンチセンス鎖５’−修飾の効果を示す。図３９Ｃは、ＲＩＳＣローディング遮断試験における剖検時に測定された、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および総ビリルビン（ＴＢＩＬＩ）レベルを示す。Ｑ２ｄ，隔日投与；ｉＢ，反転脱塩基；Ｍｏ，モルホリノ；Ｈ，５’−デオキシ。
【図４０】図４０Ａは、ラット毒性試験における有毒な例示的ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対するセンス鎖５’−修飾の効果を示す。図４０Ａは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、ラット毒性試験におけるセンス鎖（ＳＳ）の５’末端に対する修飾の存在下または不在下の、有毒なＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡに対する肝臓曝露を示す棒グラフである。  図４０Ｂは、ラット毒性試験における有毒な例示的ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対するセンス鎖５’−修飾の効果を示す。図４０Ｂは、剖検時に測定された、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。  図４０Ｃは、ラット毒性試験における有毒な例示的ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対するセンス鎖５’−修飾の効果を示す。図４０Ｃは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。有毒なｓｉＲＮＡは、肝細胞変性（括弧）、単細胞壊死（＊）、クッパー細胞の過形成および／または浸潤性白血球に合致する類洞細胞の増加（＃）、および肝細胞空胞化（矢印）からなる顕微鏡所見を有した。センス鎖キャップの付加は、所見の発生率または重症度に対する効果を有しなかった。Ｑ２ｄ，隔日投与；ｉＢ，反転脱塩基；Ｍｏ，モルホリノ。
【図４１】図４１Ａは、ラット毒性試験における例示的な無毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対する５’−修飾の効果を示す。図４１Ａは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、ラット毒性試験におけるセンス鎖とアンチセンス鎖の双方の５’末端側の修飾の存在下または不在下の、無毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡに対する肝臓曝露を示す棒グラフである。  図４１Ｂは、ラット毒性試験における例示的な無毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対する５’−修飾の効果を示す。図４１Ｂは、剖検時に測定された血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。  図４１Ｃは、ラット毒性試験における例示的な無毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対する５’−修飾の効果を示す。図４１Ｃは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。５’−キャップの存在下または不在下での既知の無毒性ｓｉＲＮＡの投与により、両方の場合に最小の肝細胞空胞化（矢印）がもたらされた。Ｑ２ｄ，隔日投与；ｉＢ，反転脱塩基；Ｍｏ，モルホリノ。
【図４２Ａ】ｓｉＲＮＡ化学修飾を変更することが肝毒性を軽減しないことを示す。図４４２Ａは、高２’Ｆおよび低２’ＦのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの同じＰＳの含量および配列を有する化学修飾パターンを示す。
【図４２Ｂ】ｓｉＲＮＡ化学修飾を変更することが肝毒性を軽減しないことを示す。図４２Ｂは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、ラットおよびマウス毒性試験における肝臓曝露を示す棒グラフである。
【図４２Ｃ】ｓｉＲＮＡ化学修飾を変更することが肝毒性を軽減しないことを示す。図４２Ｃは、剖検時にアンチセンスに対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、肝臓でのＲＩＳＣローディングを示す棒グラフである。
【図４２Ｄ】ｓｉＲＮＡ化学修飾を変更することが肝毒性を軽減しないことを示す。図４２Ｄは、剖検時に測定された血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。群平均間の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７における一元配置分散分析を用いて統計学的有意性について評価された。ｎｓ，有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１。
【図４２Ｅ】ｓｉＲＮＡ化学修飾を変更することが肝毒性を軽減しないことを示す。図４２Ｅは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。ラットでは、高２’Ｆおよび低２’Ｆ  ｓｉＲＮＡ−６化合物の双方は、肝細胞変性（括弧）、単細胞壊死（＊）、クッパー細胞の過形成および／または浸潤性白血球に合致する類洞細胞の増加（＃）、および肝細胞空胞化（矢印）に関連した。マウスでは、所見は両方の化学修飾パターンにおける単細胞壊死からなった。
【図４３】図４３は、ｓｉＲＮＡ−６の高２’Ｆバージョン（４８％の２’Ｆと５２％の２’ＯＭｅ）および低２’Ｆバージョン（２１％の２’Ｆと７９％の２’ＯＭｅ）のインビボ効力を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスへの３ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射後、肝臓オンターゲットｍＲＮＡのノックダウンが、生理食塩水対照群と比べて、１４日目および２８日目に標的ｍＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲによって評価され、ハウスキーピングｍＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）に正規化された。
【図４４Ａ】アンチセンス鎖に負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減することを示す。図４４Ａは、ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）を用いてのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡによるラット毒性の予防および処置を示す試験設計である。
【図４４Ｂ】アンチセンス鎖に負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減することを示す。図４４Ｂは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、ラットの予防（ｓｉＲＮＡ−１およびｓｉＲＮＡ−４）または処置（ｓｉＲＮＡ−５）での毒性試験におけるＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡに対する肝臓曝露を示す棒グラフである。
【図４４Ｃ】アンチセンス鎖に負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減することを示す。図４４Ｃは、剖検時にアンチセンス鎖に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）処置の存在下または不在下の、肝臓でのＲＩＳＣローディングを示す棒グラフである。
【図４４Ｄ】アンチセンス鎖に負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減することを示す。図４４Ｄは、剖検時に測定された血清グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）レベルを示す。群平均間の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７における一元配置分散分析を用いて統計学的有意性について評価された。ｎｓ，有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１。
【図４４Ｅ】アンチセンス鎖に負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減することを示す。図４４Ｅは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。単独で、またはスクランブルされた対照（Ｃｔｒ）ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）とともに投与された既知の有毒なｓｉＲＮＡは、肝細胞変性（括弧）、単細胞壊死（＊）、クッパー細胞の過形成および／または浸潤性白血球に合致する類洞細胞の増加（＃）、有糸分裂の増加（＾）、線維症を伴う胆管過形成（＋）、および肝細胞空胞化（矢印）に関連した。相補的ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）の同時投与により、これら所見の重症度が低下し、それらの分布が制限されることが多かった。
【図４５】図４５は、ラット毒性試験におけるＲＮＡｉ活性に対するＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）化合物の効果を示す棒グラフである。生理食塩水対照群と比べての、ｓｉＲＮＡ−１およびｓｉＲＮＡ−５を用いての肝臓オンターゲットｍＲＮＡのノックダウンは、剖検（ｎｘ）時に標的ｍＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲによって評価され、ハウスキーピングｍＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に正規化された。生理食塩水対照群と比べての、ｓｉＲＮＡ−４によるオンターゲット血清タンパク質レベルは、剖検時にＥＬＩＳＡによって評価された。Ｑ２ｄ，隔日投与；ｑｗ，毎週投与。
【図４６Ａ】シード領域を交換することが肝毒性を軽減することを示す。図４６Ａは、肝毒性および非肝毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの間で交換するシードの化学構造を示す。
【図４６Ｂ】シード領域を交換することが肝毒性を軽減することを示す。図４６Ｂは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、ラット毒性試験における親およびシードが交換されたＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡに対する肝臓曝露を示す棒グラフである。
【図４６Ｃ】シード領域を交換することが肝毒性を軽減することを示す。図４６Ｃは、剖検時のアンチセンス鎖に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、肝臓でのＲＩＳＣローディングを示す棒グラフである。
【図４６Ｄ】シード領域を交換することが肝毒性を軽減することを示す。図４６Ｄは、剖検時に測定された血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。群平均間の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７における一元配置分散分析を用いて統計学的有意性について評価された。ｎｓ，有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１。
【図４６Ｅ】シード領域を交換することが肝毒性を軽減することを示す。図４６Ｅは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。有毒なｓｉＲＮＡは、肝細胞変性（括弧）、単細胞壊死（＊）、クッパー細胞の過形成および／または浸潤性白血球に合致する類洞細胞の増加（＃）、および肝細胞空胞化（矢印）を有した一方で、無毒性ｓｉＲＮＡは、最小の空胞化のみを有した。有毒な骨格における無毒性シードは、完全な無毒性ｓｉＲＮＡと同等であり、無毒性骨格における有毒なシードは、単細胞壊死、類洞細胞の増加および空胞化を有したが、完全長の有毒化合物よりも低い重症度グレードであった。
【図４７Ａ】ｓｉＲＮＡのオフターゲットがインビトロおよびインビボでシード相補性に富むことを示す。図４７Ａは、４つの異なる配列のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの１０ｎＭのトランスフェクションから２４時間後のラット肝細胞における全体的遺伝子発現変化を示すボルケーノプロットである。
【図４７Ｂ】ｓｉＲＮＡのオフターゲットがインビトロおよびインビボでシード相補性に富むことを示す。図４７Ｂは、５０ｍｇ／ｋｇでのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの皮下投与から２４時間後のラット肝臓における全体的遺伝子発現変化を示すボルケーノプロットである。２つの親ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡおよび反転脱塩基（ｉＢ）キャップで遮断されたそれらのＲＮＡｉ不活性型バージョンが示される。青色点，調整されたＰ値≦０．０５；赤色点，調整されたＰ値＞０．０５；Ｎ＝動物３匹／群。倍数変化について調整されたＰ値は、複数の検定補正を伴うワルド検定を用いてＤＥＳｅｑ２で算出された。シード豊富でのＰ値は、フィッシャー直接確率法を用いて算出された。分散は、統計学的に比較された群間で類似した。
【図４８】図４８Ａは、シード媒介性塩基対合を不安定化することがオフターゲット効果を最小化し、肝毒性を軽減することを示す。図４８Ａは、有毒な例示的ｓｉＲＮＡ−５のアンチセンス鎖の７位での熱不安定化グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾を示す。  図４８Ｂは、シード媒介性塩基対合を不安定化することがオフターゲット効果を最小化し、肝毒性を軽減することを示す。図４８Ｂは、親またはＧＮＡ修飾ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの１０ｎＭのトランスフェクションから２４時間後のラット肝細胞における全体的遺伝子発現変化を示すボルケーノプロットである。Ｎ＝３回の技術的反復。  図４８Ｃは、シード媒介性塩基対合を不安定化することがオフターゲット効果を最小化し、肝毒性を軽減することを示す。図４８Ｃは、剖検（ｎｘ）時にアンチセンス鎖（ＡＳ）に対するステムループ逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって評価された、ラット毒性試験における親およびシード修飾ｓｉＲＮＡ−５に対する肝臓曝露を示す棒グラフである。  図４８Ｄは、シード媒介性塩基対合を不安定化することがオフターゲット効果を最小化し、肝毒性を軽減することを示す。図４８Ｄは、剖検時のアンチセンス鎖に対するステムループＲＴ−ｑＰＣＲによって評価された、肝臓でのＲＩＳＣローディングを示す棒グラフである。  図４８Ｅは、シード媒介性塩基対合を不安定化することがオフターゲット効果を最小化し、肝毒性を軽減することを示す。図４８Ｅは、剖検時に測定された血清グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）レベルを示す。群平均間の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７における一元配置分散分析を用いて統計学的有意性について評価された。ｎｓ，有意でない；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１；＊＊，ｐ＜０．０００１。  図４８Ｆは、シード媒介性塩基対合を不安定化することがオフターゲット効果を最小化し、肝毒性を軽減することを示す。図４８Ｆは、剖検時に収集された肝臓切片のＨ＆Ｅ染色を示す画像である。有毒な親ｓｉＲＮＡ−５は、線維症（円）、肝細胞変性（括弧）、単細胞壊死（＊）、有糸分裂の増加（＾）、クッパー細胞の過形成および／または浸潤性白血球に合致する類洞細胞の増加（＃）、および肝細胞空胞化（矢印）を有した一方で、無毒性ｓｉＲＮＡは、最小の空胞化のみを有した。シードＧＮＡ修飾ｓｉＲＮＡ−５は、変性、単細胞壊死、有糸分裂の増加および空胞化を有したが、親ｓｉＲＮＡ−５よりも低い発生率および重症度グレードであった。Ｎ＝動物４匹／群；ｑｗ，毎週投与；ＧＮＡ，グリコール核酸。
【図４９】図４９Ａは、オンターゲット活性に対する例示的な熱不安定化ＧＮＡシード修飾の効果を示す。図４９Ａは、モックトランンスフェクションと比べての、標的ｍＲＮＡに対する逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により１０ｎＭのトランスフェクション後２４時間目に評価され、ハウスキーピングｍＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に正規化されたラット肝細胞ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。  図４９Ｂは、オンターゲット活性に対する例示的な熱不安定化ＧＮＡシード修飾の効果を示す。図４９Ｂは、生理食塩水対照群と比べての、標的ｍＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲにより剖検時に評価され、ハウスキーピングｍＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）に正規化された肝臓ｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。Ｑｗ，毎週投与；ＧＮＡ，グリコール核酸。
【図５０】ラット肝細胞におけるＴＴＲを標的とする例示的なｄｓＲＮＡのＩＣ５０曲線を示す。
【図５１】マウス肝細胞における第ＩＸ因子（Ｆ９）を標的とするｄｓＲＮＡ例示的なｄｓＲＮＡのＩＣ５０曲線を示す。
【図５２】ＴＴＲに対する本発明の例示的なｄｓＲＮＡが内因性オフターゲット効果を軽減することを示す。図５２は、インビトロでのＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡにおけるオフターゲット効果における位置特異的な低下を示す。明示されるように、ｄｓＲＮＡは、それら各々の親ｄｓＲＮＡにより下方または上方制御された遺伝子の数を有意に減少させた。
【図５３】Ｆ９に対する本発明の例示的なｄｓＲＮＡが内因性オフターゲット効果を軽減することを示す。図５３は、インビトロでのＦ９を標的とするｄｓＲＮＡにおけるオフターゲット効果における位置特異的な低下を示す。明示されるように、ｄｓＲＮＡは、それら各々の親ｄｓＲＮＡにより下方または上方制御された遺伝子の数を有意に減少させた。
【図５４】図５４は、熱不安定化修飾Ｍｏｄ３、６、７、および１０を有する例示的なｄｓＲＮＡによる標的ＴＴＲのノックダウンを示す折れ線グラフである。明示されるように、すべての修飾は、親に類似した活性を維持することができる。
【図５５】図５５は、熱不安定化修飾Ｍｏｄ３、５、６、７、１０、および１２を有する例示的なｄｓＲＮＡによる標的ＧＯ１のノックダウンを示す棒グラフである。明示されるように、すべての修飾は、親に類似した活性を維持することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明者は、特に、ＲＮＡ分子のオフターゲット効果がｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖における特定位置に熱不安定ヌクレオチドを取り込むことにより低減または阻害され得ることを発見している。アンチセンス鎖における特定位置のこれらの熱不安定化修飾を用いることで、ｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低下させていながら、親ｄｓＲＮＡに類似する遺伝子サイレンシング活性を保持することができた。さらに、これらの熱不安定化修飾を含むｄｓＲＮＡ分子により、下方制御または上方制御されるオフターゲット遺伝子の数も、親ｄｓＲＮＡと比べて減少する。
【００１８】
そのようなことから、一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。一般に、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシングおよび／または毒性を低減または最小化しつつ、高度なオンターゲット遺伝子サイレンシングを示す。限定はされないが、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、そのｄｓＲＮＡ分子と置換され得、限定はされないが、インビトロまたはインビボ適用を含む、ＲＮＡ干渉に基づく遺伝子サイレンシング技術において用いることができる。
【００１９】
一般に、当該ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも称される）およびアンチセンス鎖（ガイド鎖とも称される）を含む。ｄｓＲＮＡ分子の各鎖は、１２〜４０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチド長、１７〜３７ヌクレオチド長、２５〜３７ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長の間であり得る。限定はされないが、センスおよびアンチセンス鎖は、等しい長さまたは不等な長さであり得る。
【００２０】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１〜２５、１９〜２５、１９〜２１または２１〜２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。アンチセンス鎖と同様、センス鎖は、一部の実施形態では、１８〜３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は、２１〜２５、１９〜２５、１９〜２１または２１〜２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。
【００２１】
発明者はまた、インビボでより有効であるべきｄｓＲＮＡ分子においては、アンチセンス鎖が幾らかの代謝安定性を有するはずであることを発見した。換言すれば、インビボでより有効であるべきｄｓＲＮＡ分子においては、幾らかの量のアンチセンス鎖が、投与後しばらく経過して、インビボで存在する必要がある場合がある。したがって、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後５日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後６日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後７日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後８日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖ｉの少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後９日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後１０日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後１１日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後１２日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後１３日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後１４日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％が、インビボ投与後１５日目、例えばマウス肝臓においてインビボで存在する。
【００２２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００２３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃のＴｍを有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；およびｖｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００２４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００２５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃（例えば、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃または８０℃）の融解温度を有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００２６】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の５、６、７、または８位に存在する。
【００２７】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の５位に存在する。
【００２８】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の６位に存在する。
【００２９】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の７位に存在する。
【００３０】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の８位に存在する。
【００３１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、かつアンチセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾；および
（ｉｉ）１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の一方または双方をさらに含み；かつ
センス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされるリガンド；
（ｉｉ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；および
（ｉｉｉ）１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の１つ、２つまたは３つを含む。この一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またリガンドはセンス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。
【００３３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドはセンス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖はリガンドを含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、かつアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾はアンチセンス鎖の４〜８位に位置する；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、およびアンチセンス鎖は１８〜３５ヌクレオチド長を有する、の少なくとも２つをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合される；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｉｉｉ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するための十分な相補性を示し、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は前記二本鎖領域内に位置する、の少なくとも１つを有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１】
2019535288.tif 000003
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００３９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化２】
2019535288.tif 000004
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化３】
2019535288.tif 000005
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでリガンドは、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでリガンドは、構造：
【化４】
2019535288.tif 000006
のＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍはｔ的である。
【００４４】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、かつ２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４５】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４６】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ヌクレオチドの２２および２３位の間、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４８】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００４９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２４のヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０または２１または２２ヌクレオチド長であり、かつアンチセンス鎖は、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５０】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ヌクレオチドの２２および２３位の間、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３または４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有し、また任意選択的には、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子はまた、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端を有してもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、かつ二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）センス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）アンチセンスを含み、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここでアンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで少なくとも、センス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンスおよびアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；また前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；またここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的または相補的な位置の間に存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ここで前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖とともに、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで前記センス鎖の３’末端および前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、またここで前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００５９】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００６０】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００６１】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００６２】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃のＴｍは任意選択的である。
【００６３】
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖が、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖が、シード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡが、以下の特徴：
（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；
（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；
（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；
（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；
（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；
（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；
（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および
（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００６４】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に存在する。
【００６５】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の２、３、４、５、６、８または９位に存在する。
【００６６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつアンチセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉｉｉ）２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾；および
（ｉｖ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の一方または双方をさらに含み、かつ
センス鎖は、以下の特徴：
（ｉｖ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；
（ｖ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；および
（ｖｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の１、２または３つを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またリガンドは、センス鎖とコンジュゲートされる。
【００６８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００７０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またここでセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００７１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、かつアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、の少なくとも２つをさらに含み、かつアンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有する。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００７２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合される；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｉｉｉ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示す、のうち少なくとも１つを有し、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置する。
【００７３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化５】
2019535288.tif 000007
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００７４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位以内に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化６】
2019535288.tif 000008
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００７５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含む。
【００７６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化７】
2019535288.tif 000009
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００７７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
【００７８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、構造：
【化８】
2019535288.tif 000010
のＡＳＧＰＲリガンドである。
【００７９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００８０】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００８１】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００８２】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００８３】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００８４】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００８５】
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；および
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、１０、および１１位に２’−Ｆ修飾；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６、７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【００８６】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【００８７】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【００８８】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６、８、９、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【００８９】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；および
（２）（５’末端から数えて）６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾．
を有するアンチセンス鎖を含む。
【００９０】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含む。
【００９１】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【００９２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、
【化９】
2019535288.tif 000011
が挙げられる。
【００９３】
一例では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
【００９４】
場合によっては、アンチセンス鎖のシード領域、例えば、２〜９位、特に３〜９位における２’−フルオロ修飾は、ｄｓＲＮＡのインビトロ効力に対して最小の効果を有しつつ、ｄｓＲＮＡのインビボ活性に悪影響を与え得る。発明者は、特に、かかるｄｓＲＮＡのインビボ活性が、２’−フルオロ修飾の一部または全部をアンチセンス鎖のシード領域、すなわち５’末端から数えて２〜９位、特に３〜９位から除去することにより、親ｄｓＲＮＡに対して匹敵するレベルまで回復し得ることを発見している。
【００９５】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡ以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；（ｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡは、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；および（ｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０全部）をさらに有し、かつ２’−フルオロ修飾は、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に存在しない、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【００９７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またアンチセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９または１０の２’−フルオロ修飾（ここでアンチセンスは、（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾を有しない）；および（ｉｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合の一方または両方をさらに含み；またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；（ｉｉ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および（ｉｖ）１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾、の１、２または３つを含む。  一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【００９８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またアンチセンス鎖は、（ｉ）２、３、４、５、６、７、８、９または１０の２’−フルオロ修飾；および（ｉｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、またセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、またここでセンス鎖は、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；（ｉｉ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および（ｉｖ）１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾、の１、２または３つを含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【００９９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またアンチセンス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、ここでアンチセンス鎖は、任意選択的には、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の２’−フルオロ修飾を含み；またセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、またセンス鎖は、任意選択的には、センス鎖とコンジュゲートされたリガンド、２、３、４もしくは５の２’−フルオロ修飾；および／または１、２、３、４もしくは５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１００】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またアンチセンス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、ここでアンチセンス鎖は、任意選択的には、（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しないという条件で、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の２’−フルオロ修飾を含み；またセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、またセンス鎖は、任意選択的には、センス鎖とコンジュゲートされたリガンド、２、３、４もしくは５の２’−フルオロ修飾；および／または１、２、３、４もしくは５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、またアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、かつ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない。
【０１０２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、かつ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、かつ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および（ｉｖ）アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有する、の少なくとも２つをさらに含み、かつ（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合される；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む；および（ｉｖ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示す、のうち少なくとも１つを有し、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置し、また（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンド、任意選択的には、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１０】
2019535288.tif 000012
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６または７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここで前記センス鎖は、リガンド、任意選択的には少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて５、６または７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンド、任意選択的には少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１１】
2019535288.tif 000013
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンド、任意選択的には少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここでリガンドは、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンド、任意選択的には少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここでリガンドは、構造：
【化１２】
2019535288.tif 000014
のＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１１１】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートし、また任意選択的には、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１２】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１３】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１４】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１５】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２、または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１６】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２、または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１８】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、少なくとも１つのＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１１９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９  １または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０または２１または２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２０】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチド、および１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しないという条件で、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０または２１または２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２１】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、９、１４もしくは１６位に、または２、１４もしくは１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２２】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＡＮ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、９、１４もしくは１６位に、または２、１４もしくは１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端側に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３または４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５、６または７全部）をさらに有し、また任意選択的には、２ヌクレオチドオーバーハングアンチセンス鎖の３’末端側に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端側に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子はまた、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端を有してもよい。
【０１２６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、かつ二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する；および（ｖｉｉｉ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１２９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここでアンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで少なくとも、センス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンスおよびアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；また前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；またアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的または相補的な位置の間に存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；およびセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ここで前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖とともに、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで前記センス鎖の３’末端および前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、またここで前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９クレオチド対長の二本鎖領域を有する；および（ｖｉｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３１】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する；および（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３２】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する；および（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３３】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する；および（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３４】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する；および（ｖｉｉｉ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３５】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、標的遺伝子の発現を阻害することができるｄｓＲＮＡ分子であって、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡ分子は、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここで（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；および（ｉｘ）センス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１３６】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６または７位に存在する。一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて２、３、４、８または９位に存在する。
【０１３７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またアンチセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾（（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）３〜９位に２’−修飾が存在しない）；および（ｉｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合の一方または両方をさらに含み；またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；（ｉｉ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および（ｉｖ）１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾、の１、２、３または４を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、またアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含み、かつ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しない。
【０１３９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、また前記センス鎖は、リガンドを含み、かつ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しない。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１４０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、かつ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しない。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１４１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またここでアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾（ここで（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しない）；（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、の少なくとも２つをさらに含み；かつアンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有する。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１４２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合される；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉｉ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示す；（ｉｖ）センス鎖は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含む、のうち少なくとも１つを有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、前記二本鎖領域内に位置し、かつ（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在しない。
【０１４３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１３】
2019535288.tif 000015
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【０１４４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１４】
2019535288.tif 000016
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【０１４５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５、６または７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて５、６または７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１５】
2019535288.tif 000017
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【０１４７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここでは（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）アンチセンス鎖の３〜９位に２’−修飾が存在せず、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、構造：
【化１６】
2019535288.tif 000018
のＡＳＧＰＲリガンドである。
【０１４９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５０】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、ここではアンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在せず、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５１】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、０または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５２】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、０または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５３】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、かつ０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５４】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５５】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、０、１、２または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５６】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、また０、１、２、または３のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５８】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１５９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１６０】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、またヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１６１】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１６２】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、また任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１６３】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、任意選択的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＬＮＡ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、１４または１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチド２１および２２位の間、ヌクレオチド２２および２３位の間、ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１６４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有しかつアンチセンス鎖は、シード領域内部に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；（ｉｘ）但し、アンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１６５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、シード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の、５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃のＴｍを有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；およびｖｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端、但しアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１６６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、但しアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない。一部の実施形態では、約４０℃〜約８０℃の融解温度は、任意選択的である。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；および
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１６８】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１６９】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１７０】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のＬＮＡ修飾；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１７１】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）１、２および３位の少なくとも１つ（例えば、１、２または３）のＬＮＡ修飾；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１７２】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｖ）少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）のＬＮＡ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１７３】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）１、２および３位の少なくとも１つ（例えば、１、２または３）のＬＮＡ修飾；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１７４】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）三価分岐リンカーを介して結合された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｖ）（５’末端から数えて）１、２および３位の少なくとも１つ（例えば、１、２または３）のＬＮＡ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ならびにヌクレオチド２および３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位の２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間、ヌクレオチド２および３位の間、ヌクレオチド２１および２２位の間、ならびにヌクレオチド２２および２３位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）５、６または７位の二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、ここでｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、またアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１７５】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０または２１または２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。
【０１７６】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、二本鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ分子の二本鎖領域は、１２〜４０ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二本鎖領域は、１４〜４０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２５〜３５ヌクレオチド長、２７〜３５ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、または２１〜２３ヌクレオチド対長の間であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド対長から選択される。
【０１７７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、二本鎖領域は、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド対長である。特定の実施形態では、二本鎖領域は、２１ヌクレオチド対長である。
【０１７８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、鎖の３’末端、または５’末端または両末端に、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含む。オーバーハングは、１〜１０ヌクレオチド長、１〜６ヌクレオチド長、例えば２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長いことの結果、または同じ長さの２本の鎖がねじれ形であることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得る、または他の配列であり得る。第１鎖と第２鎖はまた、例えば、ヘアピンを形成するための追加的塩基により、または他の非塩基リンカーにより連結され得る。
【０１７９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子のオーバーハング領域内のヌクレオチドは、各々独立して、修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば限定はされないが、２’−糖修飾、例えば２’−フルオロ２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン、ＧＮＡ、ＳＮＡ、ｈＧＮＡ、ｈｈＧＮＡ、ｍＧＮＡ、ＴＮＡ、ｈ’ＧＮＡ、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ＴＴは、片鎖上の片末端におけるオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得る、または他の配列であり得る。
【０１８０】
本発明のｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖での５’または３’オーバーハングは、リン酸化されてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは、同じであるかまたは異なり得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の３’末端に存在する。一部の実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一部の実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
【０１８１】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡの干渉活性を、その全体的安定性に影響することなく強化し得るような単一オーバーハングのみを含んでもよい。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、または代替的にはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）またはその逆に位置する平滑末端を有してもよい。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。理論によって拘束されないが、アンチセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングでの非対称平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスに負荷するガイド鎖を支持する。例えば、単一オーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端での平滑末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【０１８２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、また少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３または４ヌクレオチド長である。
【０１８３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、および任意選択的には、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。
【０１８４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子はまた、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端を有してもよい。
【０１８５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、また少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０１８６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有する。
【０１８７】
熱不安定化修飾
上記の通り、ｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害するため、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）熱不安定化修飾を組み込むことにより、ＲＮＡ干渉について最適化され得る。発明者は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低下させていることを発見している。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５またはそれ以上）の熱不安定化修飾を含む。一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２〜９位、または好ましくは４〜８位に位置する。一部のさらなる実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。さらに一部のさらなる実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。用語「熱不安定化修飾」は、より低い完全融解温度（Ｔｍ）（好ましくは、かかる修飾を有しない場合のｄｓＲＮＡのＴｍよりも１、２、３または４℃低いＴｍを有するｄｓＲＮＡをもたらすことになる修飾を含む。一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５または９位に位置する。
【０１８８】
熱不安定化修飾は、限定はされないが、脱塩基修飾；逆鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾、例えば２’−デオキシ修飾または非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を含み得る。
【０１８９】
例示的な脱塩基修飾は、限定はされないが、以下：
【化１７】
2019535288.tif 000019
（式中、Ｒ＝Ｈ，Ｍｅ，ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ’＝Ｈ，Ｍｅ，ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ’’＝Ｈ，Ｍｅ，ＥｔまたはＯＭｅ）
【化１８】
2019535288.tif 000020
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基である）
を含む。
【０１９０】
例示的な糖修飾は、限定はされないが、以下：
【化１９】
2019535288.tif 000021
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基である）
を含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化２０】
2019535288.tif 000022
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【０１９２】
用語「非環状ヌクレオチド」は、例えば、リボース炭素間の結合のいずれか（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、またはＣ１’−Ｏ４’）が不在であり、かつ／またはリボース炭素もしくは酸素の少なくとも１つ（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’またはＯ４’）が独立してまたは組み合わせてヌクレオチドから不在である場合、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
【化２１】
2019535288.tif 000023
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；かつＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である）である。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、ここで糖の結合のいずれかは除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’−Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’およびＣ４’炭素間の炭素−酸素−炭素共有結合）が除去されている単量体を包含する。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素間の炭素−炭素共有結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；およびＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）（ここでそれら全体が参照により援用される）を参照）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック対合に影響することなく、より大きい骨格の柔軟性をもたらす。非環状ヌクレオチドは、２’−５’または３’−５’結合を介して連結され得る。
【０１９３】
用語「ＧＮＡ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似するが、その「骨格」の組成においてホスホジエステル結合によって連結される反復グリセロール単位から構成される点で異なるポリマーであるグリコール核酸を指す。
【化２２】
2019535288.tif 000024
【０１９４】
二本鎖の熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡ二本鎖内で、熱不安定化ヌクレオチドと逆鎖内の対向するヌクレオチドとの間でミスマッチ（すなわち非相補性塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対として、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当該技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対形成もまた、本発明に従う。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド間で生じ得、すなわちミスマッチ塩基対形成は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾と独立して、各々のヌクレオチドからの核酸塩基間で生じ得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’−デオキシ核酸塩基である、ミスマッチ対合における少なくとも１つの核酸塩基を有し；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖内に存在する。
【０１９５】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補性塩基に対する障害されたＷ−Ｃ  Ｈ結合を有するヌクレオチドを含み、例えば、
【化２３】
2019535288.tif 000025
が挙げられる。
【０１９６】
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）、およびミスマッチ修飾のより多くの例が、国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に詳述されている。
【０１９７】
熱不安定化修飾はまた、対向塩基と水素結合を形成する能力が低下または消失したユニバーサル塩基、およびリン酸修飾を含んでもよい。
【０１９８】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、限定はされないが、逆鎖内の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれるかまたは完全に失われた核酸塩基修飾などの非標準塩基を有するヌクレオチドを含む。これらの核酸塩基修飾は、国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載の通り、ｄｓＲＮＡ二本鎖の中心的領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基修飾は次の通りである。
【化２４】
2019535288.tif 000026
【０１９９】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の塩基に対して相補的な１つ以上のα−ヌクレオチド、例えば、
【化２５】
2019535288.tif 000027
（式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ−アルキルである）
を含む。
【０２００】
天然リン酸ジエステル結合と比べて、ｄｓＲＮＡ二本鎖の熱安定性を低下させることで知られる例示的なリン酸修飾として、
【化２６】
2019535288.tif 000028
が挙げられる。
【０２０１】
Ｒ基におけるアルキルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。Ｒ基における具体的なアルキルとして、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
【０２０２】
一部の実施形態では、例示的な不安定化修飾は、図１に示される。
【０２０３】
熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、ｄｓＲＮＡはまた、１つ以上の安定化修飾を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の安定化修飾を含み得る。限定はされないが、安定化修飾はすべて、片鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の双方は、少なくとも２つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に存在し得；各安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方の安定化修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであってもまたは異なってもよく、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンに対する変化を有し得る。
【０２０４】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定はされないが、アンチセンス鎖における安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４および１６位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４および１６位に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４および１６位に安定化修飾を含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端または３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から−１または＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から−１および＋１位に安定化修飾を含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１および＋２位に少なくとも２つの安定化修飾を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定はされないが、センス鎖における安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、１０および１１位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向的または相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向的または相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３または４つの安定化修飾の遮断を含む。
【０２０８】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖における二本鎖の熱不安定化修飾に対して対向的または相補的な位置に安定化修飾を含まない。
【０２０９】
例示的な熱安定化修飾として、限定はされないが、２’−フルオロ修飾が挙げられる。他の熱安定化修飾として、限定はされないが、ＬＮＡが挙げられる。
【０２１０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも４つ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、２’−フルオロヌクレオチドの全部が片鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の双方は、少なくとも２つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。２’−フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、２’−フルオロ修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に存在し得；各２’−フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方の２’−フルオロ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであってもまたは異なってもよく、センス鎖上での２’−フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’−フルオロ修飾の交互パターンに対する変化を有し得る。
【０２１１】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、アンチセンス鎖における２’−フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４および１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４および１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４および１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’−フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端または３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から−１または＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から−１および＋１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１および＋２位に少なくとも２つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、センス鎖における２’−フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から７、１０および１１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向的または相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向的または相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３または４つの２’−フルオロヌクレオチドの遮断を含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖における二本鎖の熱不安定化修飾に対して対向的または相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含まない。
【０２１６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位）に存在し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。
【０２１７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここでアンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで少なくとも、センス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンスおよびアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；また前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；またここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的または相補的な位置の間に存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０２１８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ここで前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖とともに、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで前記センス鎖の３’末端および前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、またここで前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０２１９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオチドは、修飾されてもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、その修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大量の置換；天然塩基の修飾または置換；およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
【０２２０】
核酸がサブユニットのポリマーであることから、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非連結Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内部で反復される位置で生じる。場合によっては、修飾は核酸中のあらゆる対象位置で生じることになるが、多くの場合、そうならない。例として、修飾は、３’もしくは５’末端位置に限って生じてもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその双方において生じてもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内に限って生じてもよく、またはＲＮＡの一本鎖領域内に限って生じてもよい。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一末端または両末端に限って生じてもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って生じてもよく、または二本鎖および一本鎖領域内、特に末端で生じてもよい。５’末端は、リン酸化され得る。
【０２２１】
例えば、安定性を増強させるか、オーバーハング中に特定塩基を含めるか、または一本鎖オーバーハング中、例えば５’もしくは３’オーバーハング中、または双方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることは可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、３’もしくは５’オーバーハング中の塩基の全部もしくは一部を、例えば本明細書に記載の修飾で修飾してもよい。修飾は、例えばリボース糖の２’位での当該技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば核酸塩基のリボ糖に代わるデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）もしくは２’−Ｏ−メチル修飾の使用、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０２２２】
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立してＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、または２’−フルオロで修飾される。それらの鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。これらの修飾が、アンチセンス鎖に存在する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾に加えて存在することは理解されるべきである。
【０２２３】
少なくとも２つの異なる修飾は、典型的にはセンス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それら２つの修飾は、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾、非環状ヌクレオチドまたはその他であってもよい。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシから選択される、２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）ヌクレオチド、または２’−アラ−Ｆヌクレオチドで修飾される。再び、これらの修飾が、アンチセンス鎖に存在する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾に加えて存在することは理解されるべきである。
【０２２４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、特に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域内に交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」又は「交互パターン」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が１本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じるものを指す。交互ヌクレオチドは、１つ置きのヌクレオチドごとに１つまたは３つのヌクレオチドごとに１つ、または類似パターンを指してもよい。例えば、Ａ、ＢおよびＣの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
【０２２５】
交互モチーフ内に含まれる修飾のタイプは、同じであってもまたは異なってもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互パターン、すなわち１つ置きのヌクレオチドに対する修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」または「ＣＤＣＤＣＤ…」など、交互モチーフ内部の幾つかの修飾の可能性から選択され得る。
【０２２６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンが、アンチセンス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンに対して変化することを含む。センス鎖のヌクレオチドの修飾基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応し、またその逆もいえるような変化であってもよい。例えば、センス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合するとき、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始してもよく、かつアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の３’−５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始してもよい。別の例として、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始してもよく、かつアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の３’−５’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始してもよく、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全な変化または部分的変化が存在する。
【０２２７】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両方の、鎖の任意の位置における任意のヌクレオチド上に生じてもよい。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に生じてもよい；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に交互パターンで生じてもよい；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでもまたは異なってもよく、またセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対して変化を有してもよい。
【０２２８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内部の末端の対合ヌクレオチドと連結するために設けられてもよい。例えば、少なくとも２、３、４、もしくはすべてのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよく、任意選択的には、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合が存在してもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在してもよく、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、かつ３つ目はオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。好ましくは、これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在してもよい。
【０２２９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される、２から１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の１〜１０のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むアンチセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７または８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５または６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３または４のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２３８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端位置の１〜１０以内に１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドは、センスおよび／またはアンチセンス鎖の一端または両端でホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよい。
【０２３９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センスおよび／またはアンチセンス鎖各々の二本鎖の内部領域の１〜１０以内に１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドは、二本鎖領域のセンス鎖の５’末端から数えて８〜１６位でホスホロチオエートメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよく；ｄｓＲＮＡ分子は、任意選択的には、１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を末端１〜１０位以内にさらに含んでもよい。
【０２４０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２４９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０および２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０および２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１および２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１および２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２２および２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２３および２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２５８】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも５のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも６のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも７のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも８のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも９のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１０のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１１のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１２のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１３のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１４のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１５のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１６のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１７のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１８のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置において少なくとも１９のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において８以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において７以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において５以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において４以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において３以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において２以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｒｐ立体配置において１以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、（非限定例として、リン酸ジエステルである）キラルでない８以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない７以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない５以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない４以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない３以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない２以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、キラルでない１以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１０のヌクレオチド間結合、およびキラルでない８以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１１のヌクレオチド間結合、およびキラルでない７以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１２のヌクレオチド間結合、およびキラルでない６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１３のヌクレオチド間結合、およびキラルでない６以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１４のヌクレオチド間結合、およびキラルでない５以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンは、Ｓｐ立体配置における少なくとも１５のヌクレオチド間結合、およびキラルでない４以下のヌクレオチド間結合を含む。一部の実施形態では、Ｓｐ立体配置におけるヌクレオチド間結合は、任意選択的には、隣接的または非隣接的である。一部の実施形態では、Ｒｐ立体配置におけるヌクレオチド間結合は、任意選択的には、隣接的または非隣接的である。一部の実施形態では、キラルでないヌクレオチド間結合は、任意選択的には、隣接的または非隣接的である。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間結合がＲｐであるようなＲｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックがＲｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックがＲｐブロックである。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間結合がＳｐであるようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックがＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックがＳｐブロックである。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲｐおよびＳｐブロックの双方を含む。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上のＲｐを含むが、Ｓｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、１つ以上のＳｐを含むが、Ｒｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチド間結合が天然リン酸結合であるような１つ以上のＰＯブロックを含む。
【０２６０】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、５’−ブロックは、各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々が修飾ヌクレオチド間結合であり、かつ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々がホスホロチオエート結合であり、かつ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’−ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’−ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’−ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’−ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々が修飾ヌクレオチド間結合であり、かつ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックは、ヌクレオチド間結合の各々がホスホロチオエート結合であり、かつ各糖部分が２’−Ｆ修飾を含むようなＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’−ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’−ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、ある領域内にあるタイプのヌクレオシドを含む、またはオリゴヌクレオチドは、特定タイプのヌクレオチド間結合、例えば、天然リン酸結合、修飾ヌクレオチド間結合、Ｒｐキラルヌクレオチド間結合、Ｓｐキラルヌクレオチド間結合などによって後続される。一部の実施形態では、Ａは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ａは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ａは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｕは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｕは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｕは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｃは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｃは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｃは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、Ｇは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｇは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、Ｇは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、ＣおよびＵは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、ＣおよびＵは、Ｒｐによって後続される。一部の実施形態では、ＣおよびＵは、天然リン酸結合（ＰＯ）によって後続される。一部の実施形態では、ＡおよびＧは、Ｓｐによって後続される。一部の実施形態では、ＡおよびＧは、Ｒｐによって後続される。
【０２６２】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１および２２位の間とヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【０２６３】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ならびにヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【０２６４】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間とヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、３、４または５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【０２６５】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間とヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ならびにヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０２６６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖内部に、標的とのミスマッチ、またはその組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内または二本鎖領域内に存在してもよい。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて順位付けされてもよい（例えば、最も簡単な手法は、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーについて、その対合を個別の対合に基づいて検討することであるが、酷似または類似の分析もまた用いることができる）。解離を促進する観点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；かつＩ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非基準もしくは基準以外の対合（本明細書中の他の箇所で記載の通り）は、基準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく；またユニバーサル塩基を含む対合は、基準の対合よりも好ましい。
【０２６７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、二本鎖の５’末端でのアンチセンス鎖の解離を促進するため、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、およびミスマッチ対、例えば非基準もしくは基準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択することができる、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２、３、４、もしくは５つの塩基対の少なくとも１つを含む。
【０２６８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖における５’末端からの二本鎖領域内部の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２もしくは３つの塩基対の少なくとも１つはＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の塩基対はＡＵ塩基対である。
【０２６９】
本発明者らは、４’修飾および／または５’修飾ヌクレオチドを、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置でジヌクレオチドのリン酸ジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、および／またはジチオリン酸（ＰＳ２）結合の３’末端に導入することが、ヌクレオチド間結合に対して立体効果を発揮し、ひいてはそれをヌクレアーゼに対して保護または安定化し得ることを見出した。
【０２７０】
一部の実施形態では、５’修飾ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に５’−アルキル化ヌクレオシドが導入されてもよい。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’−アルキル化ヌクレオシドが、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２７１】
一部の実施形態では、４’修飾ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入されてもよい。リボース糖の４’位置のアルキル基は、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入されてもよい。リボース糖の４’−Ｏ−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２７２】
一部の実施形態では、５’−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。５’−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’−アルキル化ヌクレオシドは、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２７３】
一部の実施形態では、４’−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。４’−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’−アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２７４】
一部の実施形態では、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。５’−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０２７５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨおよび２’−ＯＭｅを有し、かつＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓを有する）を含み得る。例えば、２’−５’結合修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するかもしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するため、用いることができ、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するため、センス鎖の５’末端で用いることができる。
【０２７６】
別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨおよび２’−ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ−アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するかもしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するため、用いることができ、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するため、センス鎖の５’末端で用いることができる。
【０２７７】
様々な出版物にて、本発明のｄｓＲＮＡとともにすべてを用いることができる多量体ｓｉＲＮＡが記載されている。かかる出版物は、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレット（それら全体がここで援用される）を含む。
【０２７８】
１つ以上の炭水化物部分のｄｓＲＮＡ分子への結合を含むｄｓＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、炭水化物部分は、ｄｓＲＮＡ分子の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば炭水化物リガンドが結合した非炭水化物（好ましくは環状）担体と置換され得る。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書中でリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は炭素環式環系であってもよく、すなわちすべての環原子は炭素原子であるか、または複素環式環系、すなわち１つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってもよい。環状担体は、単環式環系であってもよく、または２つ以上の環、例えば融合環を含んでもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよく、または１つ以上の二重結合を含んでもよい。
【０２７９】
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着されてもよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。「骨格付着点」は、本明細書で用いられるとき、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えばリン酸塩の骨格、もしくは例えば硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。その部分は、例えば糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択的には、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、官能基、例えばアミノ基を含むことが多く、または一般に、別の化学的実体、例えばリガンドの構成環への組み込みまたは繋留に適した結合を可能にする。
【０２８０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、担体を介してリガンドに結合されてもよく、ここで担体は、環式基または非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
【０２８１】
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、任意選択的には、１つ以上のリガンドにコンジュゲートされてもよい。リガンドは、３’末端、５’末端または両末端で、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖に結合され得る。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされてもよい。
【０２８２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、５’リン酸化される、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾は、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ジチオリン酸；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄が置換された一リン酸、二リン酸および三リン酸の任意のさらなる組み合わせ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルケニルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）を含む。一例では、修飾は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖内に配置され得る。
【０２８３】
リガンド
多種多様な実体が、本発明のオリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい部分は、好ましくは共有結合的に、直接的に、または介在テザーを介して間接的にカップリングされたリガンドである。
【０２８４】
好ましい実施形態では、リガンドは、それが中に組み込まれる分子の分布、ターゲティングまたは寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、区画、受容体、例えば、細胞もしくは臓器区画、組織、臓器または身体領域に対して、例えばかかるリガンドを有しない種と比べて、増強された親和性をもたらす。選択された標的に対して増強された親和性をもたらすリガンドはまた、標的化リガンドと称される。
【０２８５】
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物もしくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性および膜融合性を示す、ポリアニオンペプチドまたはペプチドミメティックであってもよい。一部の実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームｐＨでその活性型立体構造を取る。「活性型」立体構造は、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物もしくはその成分の細胞のエンドソームから細胞質への輸送を促進するような立体構造である。例示的なエンドソーム溶解リガンドとして、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２、その全体が参照により援用される）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６、その全体が参照により援用される）、およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８、その全体が参照により援用される）が挙げられる。一部の実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応答して、電荷またはプロトン化にて変化を経ることになる化学基（例えばアミノ酸）を含有してもよい。エンドソーム溶解成分は、線状または分岐状であってもよい。
【０２８６】
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性特性を改善し得、また得られる天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載の単量体および／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を改善してもよい。
【０２８７】
リガンドは、一般に、例えば取り込みを増強するための治療修飾因子；例えば分布を監視するための診断化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を与える部分、を含み得る。一般例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物が挙げられる。
【０２８８】
リガンドは、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質を含み得る。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）であってもよい。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）共重合体、ジビニルエーテル−マレイン無水物共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはαヘリカルペプチドが挙げられる。
【０２８９】
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロトピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチドミメティックまたはアプタマー、であり得る。表２は、標的リガンドおよびそれらの関連受容体の一部の例を示す。
【０２９０】
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０２９１】
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えばがん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ−κＢ活性化因子であり得る。
【０２９２】
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
【０２９３】
リガンドは、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを、例えば炎症性応答を活性化することにより増強し得る。かかる効果を有することになる例示的リガンドは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンを含む。
【０２９４】
一態様では、リガンドは、脂質または脂質に基づく分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
【０２９５】
例えば複合体の標的組織への結合を調節するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
【０２９６】
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
【０２９７】
他の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
【０２９８】
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、またはがん細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＡＳおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）も挙げられる。
【０２９９】
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディアなどのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα−らせん剤である。
【０３００】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５〜５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチドミメティック、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−９４，１９９１、その全体が参照により援用される）から同定されるペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によりコードされ得る。好ましくは、組み込まれた単量体単位を介してｉＲＮＡ剤に繋ぎ止められたペプチドまたはペプチドミメティックは、細胞を標的とするペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤミミックである。ペプチド部分は、約５アミノ酸長〜約４０アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性を増強する、または立体構造的特性を導くため、構造的修飾を有し得る。下記の構造的修飾のいずれかを用いることができる。腫瘍細胞、例えば内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞を標的とするため、ＲＧＤペプチド部分を用いることができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２、その全体が参照により援用される）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進し得る（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３−７８７，２００１、その全体が参照により援用される）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ剤の標的化を促進することになる。ＲＧＤペプチドは、線状または環状であり得、また特定組織への標的化を促進するため、修飾、例えばグリコシル化またはメチル化がなされ得る。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤を、αＶβ３を発現する腫瘍細胞に送達し得る（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１、その全体が参照により援用される）。増殖性細胞内に豊富に存在するマーカーを標的にするペプチドを用いることができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチドミメティックは、がん細胞、特にインテグリンを提示する細胞を標的にし得る。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤミミックを用いることができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にする他の部分を用いることができる。一般に、増殖性細胞および血管新生を制御するため、かかるリガンドを用いることができる。このタイプのリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他のがん遺伝子、例えば本明細書に記載のがん遺伝子を標的にする。
【０３０１】
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα−らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、二連の両親媒性ペプチド、例えばＭＰＧであり得、それはＨＩＶ−１  ｇｐ４１およびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインから誘導される（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３、その全体が参照により援用される）。
【０３０２】
一部の実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α−ヘリカルペプチドであり得る。例示的な両親媒性α−ヘリカルペプチドとして、限定はされないが、セクロピン、リコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン、Ｓ．クラバ（Ｓ．Ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸管抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンが挙げられる。らせん安定性の完全性を維持するため、好ましくは幾つかの要素が考慮されることになる。例えば、最大数のらせん安定化残基が用いられることになり（例えば、ｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、最小数のらせん不安定化残基が用いられることになる（例えば、プロリン、または環状単量体単位。キャッピング残基が検討されることになり（例えば、Ｇｌｙは例示的なＮ−キャッピング残基である、かつ／または、さらなるＨ結合を提供し、らせんを安定化するため、Ｃ末端アミド化を用いることができる。ｉ±３、またはｉ±４位によって分離された、反対の電荷を有する残基間での塩架橋の形成は、安定性をもたらし得る。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性残基のグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
【０３０３】
ペプチドおよびペプチドミメティックリガンドは、天然または修飾ペプチド、例えば、ＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上のアミドを有するペプチド、すなわち、結合が１つ以上の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合と置換されたペプチド；または環状ペプチドを有するものを含む。
【０３０４】
標的リガンドは、特定の受容体を標的とすることができる任意のリガンドであり得る。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖のクラスター、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドはまた、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬおよびＨＤＬリガンドを含む。リガンドはまた、核酸、例えばアプタマーに基づき得る。アプタマーは、修飾されないか、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有し得る。
【０３０５】
エンドソーム放出剤は、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、膜融合ペプチド、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスク化オリゴもしくはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク化もしくは非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスク化もしくは非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーを含む。
【０３０６】
ＰＫ修飾因子は、薬物動態修飾因子を表す。ＰＫ修飾因子は、脂溶性剤（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅｓ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的なＰＫ修飾因子として、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド（ｄｉａｌｋｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。幾つかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清タンパク質、すなわち短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドに結合することも知られており、骨格において複数のホスホロチオエート結合を含むことで、さらにリガンドとして（例えば、ＰＫ調節性リガンドとして）本発明に適する。
【０３０７】
さらに、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、ＰＫ調節性リガンドとして本発明に適する。
【０３０８】
本発明に適した他のリガンドコンジュゲートは、米国特許出願の、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日に出願された米国特許出願第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日に出願された米国特許出願第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日に出願された米国特許出願第１１／１１５，９８９号明細書および２００７年１１月２１日に出願された米国特許出願第１１／９４４，２２７号明細書（あらゆる目的でそれら全体が参照により援用される）に記載されている。
【０３０９】
２つ以上のリガンドが存在するとき、リガンドは、全部が同じ特性を有する、全部が異なる特性を有する、または一部のリガンドが同じ特性を有する一方で、その他は異なる特性を有する可能性がある。例えば、リガンドは、標的化特性を有する、エンドソーム溶解活性を有する、またはＰＫ調節特性を有する可能性がある。好ましい実施形態では、すべてのリガンドが、異なる特性を有する。
【０３１０】
リガンドは、様々な場所、例えば、３’末端、５’末端、および／または内部位置で、オリゴヌクレオチドにカップリングされ得る。好ましい実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば本明細書に記載の担体を介してオリゴヌクレオチドに結合される。リガンドまたはテザーリガンドは、単量体上に、前記単量体が伸長鎖に組み込まれるとき、存在してもよい。一部の実施形態では、リガンドは、前記「前駆体」単量体が伸長鎖に組み込まれた後、「前駆体」単量体へのカップリングを介して組み込まれてもよい。例えば、例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ終端テザー（すなわち、会合されるリガンドを有しない）を有する単量体は、伸長するオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれてもよい。その後の操作において、すなわち前駆体単量体の鎖への組み込み後、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、次いでリガンドの求電子基を前駆体単量体のテザーの末端求核基とカップリングすることにより、前駆体単量体に結合され得る。
【０３１１】
別の例では、クリックケミストリー反応への関与に適した化学基、例えばアジドまたはアルキン終端テザー／リンカーを有する単量体が組み込まれてもよい。その後の操作において、すなわち前駆体単量体の鎖への組み込み後、相補的化学基、例えばアルキンまたはアジドを有するリガンドは、アルキンおよびアジドを一緒にカップリングすることにより、前駆体単量体に結合され得る。
【０３１２】
二重鎖オリゴヌクレオチドにおいては、リガンドは、片鎖または両鎖に結合され得る。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを有する。
【０３１３】
一部の実施形態では、リガンドは、核酸塩基、糖部分、または核酸分子のヌクレオシド間結合にコンジュゲートされ得る。プリン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションは、環内および環外原子を含む、任意の位置で生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位は、コンジュゲート部分に結合される。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体へのコンジュゲーションもまた、任意の位置で生じ得る。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位は、コンジュゲート部分と置換され得る。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子で生じ得る。コンジュゲート部分に結合され得る糖部分の炭素原子の例として、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。１’位もまた、例えば脱塩基残基においてコンジュゲート部分に結合され得る。ヌクレオシド間結合もまた、コンジュゲート部分を有し得る。リン含有結合（例えば、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホロアミド酸など）においては、コンジュゲート部分は、リン原子に直接的に、またはリン原子に結合されたＯ、Ｎ、もしくはＳ原子に結合され得る。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合（例えばＰＮＡ）においては、コンジュゲート部分は、アミンもしくはアミドの窒素原子または隣接する炭素原子に結合され得る。
【０３１４】
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされる。本明細書に記載の通り、リガンドは、センス鎖の３’末端、５’末端または内部位置にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。さらに、リガンドは、センス鎖の核酸塩基、糖部分またはヌクレオチド間結合にコンジュゲートされ得る。
【０３１５】
ＲＮＡ干渉の分野における任意の好適なリガンドが用いられてもよいが、リガンドは、典型的には、炭水化物、例えば、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、多糖である。
【０３１６】
リガンドを核酸にコンジュゲートするリンカーは、上で検討されたものを含む。例えば、リガンドは、一価、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体であり得る。
【０３１７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、二価および三価分岐リンカーにコンジュゲートされ、式（ＩＶ）−（ＶＩＩ）：
【化２７】
2019535288.tif 000029
（式中、ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、独立して、０〜２０の各存在を表し、ここで反復単位は、同じまたは異なる可能性があり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ５Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏの各存在を表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンの各存在を表し、ここで１つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つ以上により中断または終結され得；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化２８】
2019535288.tif 000030
、またはヘテロシクリルの各存在を表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、リガンドを表す；すなわち、各々独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖の各存在を表し；かつ
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）
のいずれかに示される構造を含む。
【０３１８】
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子、例えば式（ＶＩＩ）：
【化２９】
2019535288.tif 000031
（式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す）
のものの発現を阻害するための、ＲＮＡｉ剤との併用において特に有用である。
【０３１９】
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価および三価分岐リンカー基の例として、限定はされないが、以下の化合物：
【化３０】
2019535288.tif 000032
【化３１】
2019535288.tif 000033
が挙げられる。
【０３２０】
定義
本明細書で用いられるとき、用語「ｄｓＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、および「ｉＲＮＡ剤」は、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介し得る薬剤と交換可能に用いられる。便宜上、かかるｍＲＮＡはまた、本明細書中でサイレンシング対象のｍＲＮＡと称される。かかる遺伝子は、標的遺伝子とも称される。一般に、サイレンシング対象のＲＮＡは、内因性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡもまた、標的にされ得る。
【０３２１】
本明細書で用いられるとき、語句「ＲＮＡｉを媒介する」は、配列特異的様式で標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論によって拘束されることを望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉ機構またはプロセス、およびガイドＲＮＡ、例えば２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤が用いられることが考えられる。
【０３２２】
本明細書で用いられるとき、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定かつ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を示すように用いられる用語である。特異的結合は、特異的結合が所望されるような条件下、すなわちアッセイもしくは治療的処置の場合、またはインビトロアッセイの場合での生理的条件下、アッセイが実施されるような条件下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には少なくとも５つのヌクレオチド分異なる。
【０３２３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡ分子が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするような標的ｍＲＮＡに対して「十分に相補的」である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡに対して「正確に相補的」であり、例えば、標的ＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ二本鎖剤はアニールし、例えば、専ら正確な相補性の領域内でワトソン・クリック塩基対からなるハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して正確に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含み得る。さらに、一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、単一ヌクレオチド差異を特異的に区別する。この場合、ｄｓＲＮＡ分子は、正確な相補性が単一ヌクレオチド差異（例えば、その７ヌクレオチド以内の）領域内に見出される場合に限り、ＲＮＡｉを媒介する。
【０３２４】
本明細書で用いられるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、１００、２００、３００、または４００ヌクレオチドより短い長さの核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。
【０３２５】
用語「ＢＮＡ」は、架橋化核酸を指し、制約された、または接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。ＢＮＡは、「固定された」Ｃ３’エンドの糖パッカリングを伴う、５員、６員、またはさらに７員架橋構造を有し得る。架橋は、典型的にはリボースの２’位、４’位に取り込まれ、２’、４’ＢＮＡヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、またはＥＮＡ）をもたらす。ＢＮＡヌクレオチドの例として、以下のヌクレオシド：
【化３２】
2019535288.tif 000034
が挙げられる。
【０３２６】
用語「ＬＮＡ」は、ロックド核酸を指し、制約された、または接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。ＬＮＡは、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’ヒドロキシルを同じリボース糖の４’炭素に連結する余分な架橋（例えば、メチレン架橋またはエチレン架橋）で修飾される。例えば、架橋は、３’エンドＮｏｒｔｈ）立体構造：
【化３３】
2019535288.tif 000035
においてリボースを「ロックし」得る。
【０３２７】
用語「ＥＮＡ」は、エチレン架橋核酸を指し、制約された、または接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。
【０３２８】
「切断部位」は、本明細書中で、ｉＲＮＡ剤を用いることによるＲＩＳＣ機構によって切断される標的遺伝子またはセンス鎖における骨格結合を意味する。また標的切断部位領域は、切断部位の両側に少なくとも１つまたは少なくとも２つのヌクレオチドを含む。センス鎖においては、切断部位は、センス鎖自体がＲＮＡｉ機構により切断されるべき標的であった場合、切断されることになるセンス鎖における骨格結合である。切断部位は、当該技術分野で公知の方法、例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２，１７３−１７８（その全体が参照により援用される）に詳述されるような５’−ＲＡＣＥアッセイを用いて判定され得る。当該技術分野で周知であるように、２つの２１ヌクレオチド長の鎖（ここでそれらの鎖は、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する１９の連続する塩基対の二本鎖領域を形成する）を含む円錐状の二本鎖ＲＮＡｉ剤における切断部位領域の場合、切断部位領域は、センス鎖の５’末端から９〜１２位に対応する。
【０３２９】
切断可能な連結基
切断可能な連結基は、細胞外部で十分に安定であるが、標的細胞への侵入時、切断され、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。本発明に従うｄｓＲＮＡ分子の好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、標的細胞において、または第１の参照状態（例えば、細胞内状態を模倣するかまたは表すように選択され得る）下で、または第２の参照状態（例えば、血液または血清中に見出される状態を模倣するかまたは表すように選択され得る）下で、被験者の血液中よりも少なくとも１０倍以上、好ましくは少なくとも１００倍速く切断される。
【０３３０】
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液中よりも細胞内部により広く存在しているか、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。かかる分解剤の例として、特定の基質用に選択される、または基質特異性を有しないレドックス剤、例えば、細胞内に存在する、酸化もしくは還元酵素または還元によりレドックス切断可能な連結基を分解し得る還元剤、例えばメルカプタン；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を創出し得る薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することにより酸切断可能な連結基を加水分解または分解し得る酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、およびホスファターゼ、が挙げられる。
【０３３１】
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
【０３３２】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
【０３３３】
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
【０３３４】
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０、または１００倍より迅速に切断される。
【０３３５】
酸化還元切断可能連結基
切断可能な連結基の１つのクラスは、レドックス切断可能な連結基であり、それは本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられてもよく、還元または酸化時に切断される。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。好ましい実施形態では、１つの候補化合物は、血中で最大で１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも２、４、１０、または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
【０３３６】
リン酸ベースの切断可能連結基
リン酸に基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられてもよく、リン酸基を分解または加水分解する薬剤により切断される。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、および−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３３７】
酸切断可能連結基
酸切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられてもよく、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ−ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３３８】
エステルベースの連結基
エステルに基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられてもよく、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３３９】
ペプチドベースの切断基
ペプチドに基づく切断可能な連結基は、本発明に従うｄｓＲＮＡ分子において用いられてもよく、細胞内でペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。本明細書で用いられるとき、「炭水化物」は、少なくとも６つの炭素原子（線状、分岐状または環状であってよい）を有するとともに、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、１つ以上の単糖単位から本質的に構成されるいずれかの炭水化物である化合物；または一部として、各々が少なくとも６つの炭素原子（線状、分岐状または環状であってよい）を有するとともに、酸素、窒素または硫黄原子が各炭素原子に結合された、１つ以上の単糖単位から構成される炭水化物部分を有する化合物を指す。代表的な炭水化物は、糖（約４〜９の単糖単位を有する単糖、二糖、三糖およびオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコゲン、セルロースおよび多糖類ガムなどの多糖を含む。具体的な単糖として、Ｃ５および上記（好ましくはＣ５〜Ｃ８）糖が挙げられ；二糖および三糖として、２または３の単糖単位を有する糖（好ましくはＣ５〜Ｃ８）が挙げられる。
【０３４０】
本発明は、さらに、インビトロで標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書に定義されるようなｄｓＲＮＡ分子の使用に関する。一部の実施形態では、本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を阻害するための、ｄｓＲＮＡ分子の使用に関する。
【０３４１】
本発明は、さらに、被験者における標的遺伝子の発現の阻害における使用を意図した、本明細書に定義されるようなｄｓＲＮＡ分子に関する。被験者は、任意の動物、例えば哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、またはヒトであってもよい。
【０３４２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、緩衝液中で投与される。
【０３４３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ化合物は、被験者への投与を意図して配合され得る。配合されたｓｉＲＮＡ組成物は、種々の状態を想定可能である。幾つかの例では、当該組成物は、少なくとも部分的には、結晶性、均一結晶性、および／または無水性（例えば、８０未満、５０、３０、２０、または１０％の水）である。別の例では、ｓｉＲＮＡは、水相中、例えば水を含む溶液中に存在する。
【０３４４】
水相または結晶組成物は、例えば、送達媒体、例えば、リポソーム（特に水相用）または粒子（例えば、結晶組成物に適し得るような微小粒子）中に取り込まれ得る。一般に、ｓｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載の通り、意図される投与方法に適合するような様式で配合される。例えば、特定の実施形態では、当該組成物は、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動層乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、凍結乾燥、凝縮および他の自己組織化の少なくとも１つにより調製される。
【０３４５】
ｓｉＲＮＡ製剤は、別の薬剤、例えば別の治療薬またはｓｉＲＮＡを安定化する薬剤、例えばｓｉＲＮＡと複合してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合され得る。さらに他の薬剤として、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広範特異性リボヌクレアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
【０３４６】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ製剤は、別のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、第２の遺伝子に関して、または同じ遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介し得る第２のｓｉＲＮＡを含む。さらに他の製剤として、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００以上の異なるｓｉＲＮＡ種を挙げることができる。かかるｓｉＲＮＡは、類似した数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介し得る。
【０３４７】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ製剤は、少なくとも第２の治療薬（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の薬剤）を含む。例えば、ウイルス性疾患、例えばＨＩＶの治療用のｓｉＲＮＡ組成物であれば、既知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含んでもよい。別の例では、がんの治療用のｓｉＲＮＡ組成物であれば、化学療法剤をさらに含んでもよい。
【０３４８】
本発明に従うｄｓＲＮＡ分子の投与に用いることができる例示的な製剤が、以下に検討される。
【０３４９】
リポソーム．説明の簡略化のため、このセクションにおける製剤、組成物および方法は、主に非修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらの製剤、組成物および方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば修飾ｓｉＲＮＡと併せて実施可能であり、かつかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解されてもよい。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシング可能なより大きいｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、もしくはｓｓｉＲＮＡ化合物、もしくはその前駆体をコードするＤＮＡ）製剤は、膜状分子集合体、例えばリポソームまたはミセルでの送達用に配合され得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｓｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｓｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するので、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｓｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｓｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ＲＮＡｉを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｓｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
【０３５０】
ｓｉＲＮＡを含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にｓｉＲＮＡ調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はｓｉＲＮＡと相互作用して、ｓｉＲＮＡ周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ｓｉＲＮＡのリポソーム調製物を得る。
【０３５１】
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨもまた調節して、凝縮を支援し得る。
【０３５２】
送達媒体の構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込んだ安定なポリヌクレオチド送達媒体を作製するための方法についてのさらなる説明が、例えば、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。リポソーム形成はまた、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４（それら全体が参照により援用される）に記載されている例示的方法の１つ以上の態様を含み得る。送達媒体としての使用を意図した適切な大きさの脂質凝集体を調製するために一般に用いられる技術には、超音波処理および凍結−解凍＋放出が含まれる（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１，１９８６を参照、その全体が参照により援用される）。一様に小さく（５０〜２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が所望されるとき、顕微溶液化を用いることができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４（その全体が参照により援用される））。これらの方法は、ｓｉＲＮＡ製剤のリポソームへのパッケージングに容易に適応される。
【０３５３】
ｐＨ感受性である、または負に帯電したリポソームは、核酸分子を封入し、それらと複合体を形成しない。核酸分子と脂質の双方が同様に帯電されることから、複合体形成ではなく反発が生じる。にもかかわらず、一部の核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下で細胞単層に送達するのに用いられている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）２６９−２７４、その全体が参照により援用される）。
【０３５４】
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０３５５】
試験管内でおよびリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【０３５６】
一部の実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ｓｉＲＮＡをマクロファージに送達するのに使用され得る。
【０３５７】
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたｓｉＲＮＡを代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
【０３５８】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質−核酸複合体を形成し、ｓｉＲＮＡ送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、その全体が参照により援用される、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
【０３５９】
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
【０３６０】
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
【０３６１】
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（その全体が参照により援用される、Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
【０３６２】
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびｓｉＲＮＡを皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ｓｉＲＮＡを表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのｓｉＲＮＡの浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、その全体が参照により援用される、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０およびｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
【０３６３】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ｓｉＲＮＡを含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
【０３６４】
ｓｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソームは、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ｓｉＲＮＡを含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにｓｉＲＮＡを送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソームは、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
【０３６５】
本発明に適する他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットもまた、本発明に適する製剤について記載している。
【０３６６】
界面活性剤．説明の簡略化のため、このセクションにおける製剤、組成物および方法は、主に非修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらの製剤、組成物および方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば修飾ｓｉＲＮＡと併せて実施可能であり、かつかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解されてもよい。界面活性剤では、乳剤（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム（上記参照）などの製剤において幅広い用途が見出される。ｓｉＲＮＡ（または前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡにプロセシング可能なより大きいｄｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくは前駆体をコードするＤＮＡ）組成物は、界面活性剤を含み得る。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、界面活性剤を含む乳濁液として配合される。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３６７】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
【０３６８】
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０３６９】
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
【０３７０】
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
【０３７１】
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
【０３７２】
ミセルおよび他の膜状製剤．説明の簡略化のため、このセクションにおけるミセルおよび他の製剤、組成物および方法は、主に非修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらのミセルおよび他の製剤、組成物および方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば修飾ｓｉＲＮＡ化合物と併せて実施可能であり、かつかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解されてもよい。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシング可能なより大きいｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、もしくはｓｓｉＲＮＡ化合物、もしくはその前駆体をコードするＤＮＡ））組成物は、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分がすべて内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
【０３７３】
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
【０３７４】
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
【０３７５】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
【０３７６】
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
【０３７７】
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
【０３７８】
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
【０３７９】
粒子．説明の簡略化のため、このセクションにおける粒子、製剤、組成物および方法は、主に修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して検討される。しかし、これらの粒子、製剤、組成物および方法が、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば非修飾ｓｉＲＮＡ化合物と併せて実施可能であり、かつかかる実施が本発明の範囲内に含まれるように理解されてもよい。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、（例えば前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセシング可能なより大きいｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、もしくはｓｓｉＲＮＡ化合物、もしくはその前駆体をコードするＤＮＡ）製剤は、粒子、例えば微小粒子に組み込まれてもよい。微小粒子が、噴霧乾燥により作製され得るが、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によっても作製されてよい。
【０３８０】
医薬組成物
本発明のｉＲＮＡ剤は、薬学的使用のため、配合されてもよい。本発明は、さらに、本明細書に定義されるようなｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物に関する。薬学的に許容できる組成物は、単独で摂取される、または１つ以上の薬学的に許容できる担体（添加剤）、賦形剤および／または希釈剤と一緒に配合される、先行する実施形態のいずれかにおけるｄｓＲＮＡ分子の１つ以上を治療有効量で含む。
【０３８１】
医薬組成物は、固体または液体形態、例えば、（１）経口投与、例えば水薬（水溶液または非水溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、頬側、舌下、および全身吸収を標的とするもの、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への塗布用のペースト剤；（２）例えば、例えば無菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤としての皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏剤、または徐放性パッチもしくはスプレーとしての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームとして腟内または直腸内；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；または（８）経鼻、に適応するものでの投与に特化して配合されてもよい。皮下または静脈内方法を用いる送達は、特に有利であり得る。
【０３８２】
語句「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、任意の医学的処置に適用可能な合理的なリスク・ベネフィット比で、少なくとも動物における細胞の亜集団において幾らかの所望される治療効果をもたらすのに有効である本発明の化合物を含む化合物、材料、または組成物の量を意味する。
【０３８３】
語句「薬学的に許容できる」は、合理的なリスク・ベネフィット比に適う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の課題もしくは合併症と伴わない、ヒトおよび動物の組織と接触させる使用に適した、健全な医学的判断の範囲内に含まれる、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように本明細書中で用いられる。
【０３８４】
語句「薬学的に許容できる担体」は、本明細書で用いられるとき、対象化合物を１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部へ運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容できる材料、組成物または媒体、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、マグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤のその他の成分に適合しており、かつ患者に対して有害でないという意味で「許容できる」必要がある。薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料の幾つかの例として、（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）平滑剤、例えばマグネシウムステート、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；ならびに（２２）医薬製剤中に用いられる他の無毒性親和性物質、が挙げられる。
【０３８５】
製剤は、便宜上、単位剤形で提示されてもよく、また薬学の技術分野で周知の任意の方法により調製されてもよい。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせ可能な活性成分の量は、治療を受けているホスト、特定の投与様式に応じて変動することになる。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせ可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらすような化合物の量となる。一般に、１００％中でのこの量は、活性成分が約０．１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲となる。
【０３８６】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸、および高分子担体、例えば、ポリエステルおよびポリ無水物からなる群から選択される賦形剤；および本発明の化合物を含む。特定の実施形態では、上記製剤は、本発明の化合物を経口生体利用可能にする。
【０３８７】
ｉＲＮＡ製剤は、別の薬剤、例えば別の治療薬またはｉＲＮＡを安定化する薬剤、例えばｉＲＮＡと複合してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合され得る。さらに他の薬剤として、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの二価カチオンを除去するため）、塩、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広範特異性リボヌクレアーゼ阻害剤）などが挙げられる。
【０３８８】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体、任意選択的には１つ以上の付属成分と会合させるステップを含む。一般に、当該製剤は、本発明の化合物を液体担体、または微粉化された固体担体、または双方と均一かつ緊密に会合させ、次いで必要な場合、生成物を形成させることにより調製される。
【０３８９】
場合によっては、薬剤の効果を延長させるため、皮下または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水難溶性を有する結晶質または非晶質材料の懸濁液の使用により行われてもよい。ここで薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで結晶サイズおよび結晶性形態に依存してもよい。あるいは、非経口的に投与される薬剤形態の遅延吸収は、薬剤を油媒体に溶解または懸濁することによって行われる。
【０３９０】
本発明に記載の化合物は、他の医薬品に類似して、ヒトまたは動物薬において用いられる任意の便宜的方法での投与用に配合されてもよい。
【０３９１】
用語「治療」は、予防、治療および治癒も包含することが意図される。この治療を受けている患者は、一般に、霊長類、特にヒト、および他の哺乳類、例えば、ウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ；ならびに家禽およびペットを含む、需要のある任意の動物である。
【０３９２】
二本鎖ＲＮＡｉ剤は、インビボで細胞において、例えば細胞内に送達される外因性ＤＮＡ鋳型から作製される。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入され、遺伝子療法ベクターとして用いられ得る。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与により（米国特許第５，３２８，４７０号明細書、その全体が参照により援用される）、または定位注射により（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７、その全体が参照により援用される）、被験者に送達され得る。遺伝子療法ベクターの薬剤は、許容できる希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含み得る、または遺伝子送達媒体が包埋される持続放出マトリックスを含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写単位、すなわちｄｓＲＮＡ分子のトップ鎖を含む転写物を生成するものとｄｓＲＮＡ分子のボトム鎖を含む転写物を生成するものと、を含み得る。当該鋳型が転写されるとき、ｄｓＲＮＡ分子が生成され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤断片にプロセシングされる。
【０３９３】
送達の経路
本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子または本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子を含む医薬組成物は、異なる送達経路を用いて被験者に投与され得る。ｉＲＮＡを含む組成物は、種々の経路により被験者に送達され得る。例示的経路は、静脈内、皮下、局所、直腸、肛門、膣、経鼻、肺、眼内を含む。
【０３９４】
本発明のｉＲＮＡ分子および／またはｄｓＲＮＡ分子は、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。かかる組成物は、典型的には、ｉＲＮＡの１種以上および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる担体」は、薬学的投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことが意図される。医薬活性物質におけるかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体または薬剤が活性化合物に不適合でない限り、組成物中でのその使用が検討される。補足的活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０３９５】
本発明の組成物は、局所または全身治療が所望されるか否かに応じて、また治療されるべき領域に対して、多くの方法で投与されてもよい。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、またはくも膜下腔内もしくは脳室内投与を含む。
【０３９６】
投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択されてもよい。例えば、筋細胞を標的にするため、目的の筋肉への筋肉内注射であれば、論理的な選択となる。肺細胞であれば、ｉＲＮＡをエアロゾル形態で投与することにより標的にされてもよい。血管内皮細胞であれば、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングし、ＤＮＡを機械的に導入することにより標的にされ得る。
【０３９７】
用量
一態様では、本発明は、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤を被験者（例えばヒト被験者）に投与する方法を特徴とする。別の態様では、本発明は、被験者における標的遺伝子の発現を阻害することにおける使用を意図した、本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子に関する。当該方法または当該医学的使用は、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤、例えば（ａ）二本鎖部分が１４〜４０ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば２１〜２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内因性または病原体標的ＲＮＡ）に対して相補的であり、また任意選択的には、（ｃ）１〜５ヌクレオチド長の少なくとも１つの３’オーバーハングを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ剤を単位用量で投与することを含む。一部の実施形態では、単位用量は、ＲＮＡ剤の１０ｍｇ／ｋｇ体重未満、または１０未満、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５もしくは０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重、および２００ｎモル未満（例えば、約４．４×１０１６コピー）／ｋｇ体重、またはＲＮＡ剤の１５００未満、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎモル／ｋｇ体重である。
【０３９８】
規定量は、疾患または障害、例えば、標的ＲＮＡに関連した疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であり得る。例えば、単位用量は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋肉内）、吸入投与、または局所適用により投与され得る。一部の実施形態では、用量は、１０未満、５、２、１、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。
【０３９９】
一部の実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない、例えば、２、４、８または３０日ごとよりも少ない頻度で投与される。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度（例えば定期的頻度）で投与されない。例えば、単位用量は、単回投与されてもよい。
【０４００】
一部の実施形態では、有効用量は、他の伝統的な治療様式で投与される。一部の実施形態では、被験者は、ウイルス感染を有し、当該様式は、ｄｓＲＮＡ分子以外、例えばｓｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤である。別の実施形態では、被験者は、アテローム性動脈硬化症を有し、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤が、例えば外科的介入後、例えば血管形成術と組み合わせて、有効用量で投与される。
【０４０１】
一部の実施形態では、被験者に、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤にプロセシング可能なより大きいｄｓＲＮＡ分子、またはｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤、もしくはその前駆体をコードするＤＮＡ）が、初期用量および１回以上の維持用量で投与される。１または複数の維持用量は、初期用量と同じ、または初期用量よりも低い、例えば初期用量よりも半分少ない可能性がある。維持投与計画は、被験者を、０．０１μｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、例えば、１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日の１または複数回用量で治療することを含み得る。維持用量は、例えば、２、５、１０、または３０日ごとに１回以下、投与される。さらに、治療計画は、一時期続いてもよく、その期間は、患者の特定疾患の性質、その重症度および全身状態に応じて変動することになる。特定の実施形態では、当該用量は、１日１回以下、例えば、２４、３６、４８、またはより長時間ごとに１回以下、例えば、５または８日ごとに１回以下、送達されてもよい。治療後、患者は、その状態における変化について、また病態の症状の軽減について監視され得る。当該化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに対して有意に応答しない場合に増加されてもよく、または当該用量は、病態の症状の軽減が認められる場合、病態が消失している場合、もしくは望まれない副作用が認められる場合に低減されてもよい。
【０４０２】
有効用量は、所望されるとき、または特定の環境下で適切と考えられるとき、単回用量または２回以上の用量で投与され得る。反復または頻回注入を容易にすることが望まれる場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または関節内）、またはリザーバーの移植が得策である場合がある。
【０４０３】
一部の実施形態では、当該組成物は、複数のｄｓＲＮＡ分子種を含む。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子種は、天然に存在する標的配列に対して別種と重複せず、またそれらに隣接しない配列を有する。別の実施形態では、複数のｄｓＲＮＡ分子種は、異なる天然に存在する標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、対立遺伝子特異的である。
【０４０４】
本明細書に記載の本発明のｄｓＲＮＡ分子は、幾つかの方法で、哺乳類、特に非ヒト霊長類またはヒトなどの大型哺乳類に投与され得る。
【０４０５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡ剤、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスまたは拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻腔内、尿道または眼内投与である。投与は、被験者または別の人物、例えばヘルスケア提供者によって提供されてもよい。投薬は、測定用量で、または定量用量を送達する計量分配装置で提供され得る。選択された送達様式は、以下により詳細に検討される。
【０４０６】
本発明は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ分子の直腸投与または送達のための方法、組成物、およびキットを提供する。
【０４０７】
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法における使用を意図した本発明のｄｓＲＮＡ分子に関する。
【０４０８】
標的遺伝子の発現を阻害する方法
本発明の実施形態はまた、標的遺伝子の発現を阻害するための方法に関する。当該方法は、先の実施形態のいずれかにおけるｄｓＲＮＡ分子を、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で投与するステップを含む。本発明は、さらに、標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための、本明細書で定義されるようなｄｓＲＮＡ分子の使用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、さらに、インビトロで標的細胞における標的遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡ分子の使用に関する。
【０４０９】
別の態様での本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、本発明のｄｓＲＮＡ分子を前記細胞に提供することを含む、方法に関する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、ヘプシジン、活性化タンパク質Ｃ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子における突然変異、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子における突然変異、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子における突然変異、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子における突然変異、ＲＡＳ遺伝子における突然変異、カベオリンＩ遺伝子における突然変異、ＭＩＢＩ遺伝子における突然変異、ＭＴＡＩ遺伝子における突然変異、Ｍ６８遺伝子における突然変異、腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異、およびｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子における突然変異、からなる群から選択される。
【０４１０】
特定の実施形態では、本発明は、上記の方法における使用を意図した本発明のｄｓＲＮＡ分子に関する。
【０４１１】
本発明は、さらに限定するものと解釈されるべきでない、以下の実施例によりさらに例示される。本願全体を通じて引用される、すべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、ここで参照により明示的に援用される。
【実施例】
【０４１２】
実施例１：ｓｉＲＮＡ二本鎖のインビトロスクリーニング
細胞培養およびトランスフェクション：
ヒトＨｅｐ３Ｂ細胞またはラットＨ．ＩＩ．４．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、トリプシン処理によりプレートから放出させる前、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）を添加したＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃でほぼコンフルエントになるまで増殖させた。９６ウェルプレート内で１４．８μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．２μＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．カタログ番号１３７７８−１５０）を５μＬのｓｉＲＮＡ二本鎖／ウェルに添加することにより、トランスフェクションを実施し、室温で１５分間インキュベートした。次に、約２×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する抗生物質を有しない完全増殖培地８０μＬをｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を、ＲＮＡ精製前、２４時間または１２０時間インキュベートした。１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単回用量実験を実施し、１０ｎＭの最終二本鎖濃度の最大用量で８，４倍連続希釈を用いて用量応答実験を実施した。
【０４１３】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，パーツ番号：６１０−１２）を用いた全ＲＮＡ単離
細胞を収集し、溶解／結合緩衝液１５０μＬに溶解し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度はプロセス全体を通じて同じであった）。１０μＬの磁気ビーズおよび８０μＬの溶解／結合緩衝液の混合物を丸底プレートに添加し、１分間混合した。磁気スタンドを用いて磁気ビーズを捕捉し、上清を除去し、ビーズを阻害しなかった。上清を除去後、溶解細胞を残存ビーズに添加し、５分間混合した。上清を除去後、磁気ビーズを洗浄緩衝液Ａ１５０μＬで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再び捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズを洗浄緩衝液Ｂ１５０μＬで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次にビーズを溶出緩衝液１５０μＬで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させておいた。乾燥後、溶出緩衝液５０μＬを添加し、７０℃で５分間混合した。ビーズを磁気上で５分間捕捉した。上清４０μＬを除去し、別の９６ウェルプレートに添加した。
【０４１４】
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
反応１回あたり、１０倍緩衝液１μＬ、０．４μＬの２５×ｄＮＴＰ、ランダムプライマー１μＬ、逆転写酵素０．５μＬ、リボヌクレアーゼ阻害剤０．５μＬおよびＨ２Ｏ１．６μＬのマスターミックスを、全ＲＮＡ５μＬに添加した。２５℃で１０分、３７℃で１２０分、８５℃で５秒、４℃で保持のステップを通じて、ＢｉＯ−Ｒａｄ  Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。
【０４１５】
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）内の、１ウェルあたり、ＧＡＰＤＨ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２６３１７Ｅ（ヒト）、カタログ番号４３０８３１３（齧歯類））０．５μＬ、ＴＴＲ  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＨＳ００１７４９１４＿ｍ１（ヒト）、カタログ番号Ｒｎ００５６２１２４＿ｍ１（ラット））０．５μＬおよびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４８８７３０１００１）５μＬを含有するマスターミックスに、ｃＤＮＡ２μＬを添加した。Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ  ４８０リアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）で、リアルタイムＰＣＲを実施した。特に断りのない限り、少なくとも２つの独立したトランスフェクションにおいて各二本鎖を試験し、各トランスフェクションを二通りにアッセイした。
【０４１６】
相対倍率変化を計算するため、リアルタイムデータをΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５（Ｌｕｃ標的対照）をトランスフェクトした細胞、またはモックトランスフェクト細胞を用いて実施したアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを用いる４パラメータフィットモデルを用いてＩＣ５０値を算出し、ＡＤ−１９５５をトランスフェクトした細胞またはナイーブ細胞に対して、同じ用量範囲にわたり、またはそれ自身の最低用量まで正規化した。各個別のトランスフェクションについて、また組み合わせて、ＩＣ５０値を算出し、ここでは単一のＩＣ５０を両トランスフェクションからのデータにフィットさせた。
【０４１７】
本発明の様々なモチーフ修飾を有する例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖の遺伝子サイレンシングの結果を下表に示す。
【０４１８】
実施例２：ＲＮＡ合成および二本鎖アニーリング
１．オリゴヌクレオチド合成：
ＡＫＴＡオリゴパイロットシンセサイザーまたはＡＢＩ３９４シンセサイザーで、すべてのオリゴヌクレオチドを合成した。特に指定されない限り、市販の調節された細孔ガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と、標準保護基、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＲＮＡホスホラミダイトとを、オリゴヌクレオチド合成に用いた。２’−Ｆホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトは、（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入した。すべてのホスホラミダイトは、１０％ＴＨＦ／ＡＣＮ（ｖ／ｖ）中、０．２Ｍの濃度で用いたグアノシンを除き、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．２Ｍの濃度で用いた。１６分のカップリング／リサイクリング時間を用いた。アクチベーターは、ＰＯ酸化について、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であった。ヨウ素／水／ピリジンを用い、２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１  ｖ／ｖ）中、ＰＳ−酸化ＰＡＤＳ（２％）を用いた。
【０４１９】
リガンドコンジュゲート鎖を、対応するリガンドを含有する固体支持体を用いて合成した。例えば、配列の３’末端での炭水化物部分／リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃにおける）の導入を、対応する炭水化物固体支持体を用いて合成を開始することによって行った。同様に、３’末端でコレステロール部分を、コレステロール支持体上で合成を開始することにより導入した。一般に、リガンド部分を、トランス−４−ヒドロキシプロリノールに、先の例に記載のような選択したテザーを介して繋ぎ止め、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を得た。次に、ヒドロキシプロリノール−リガンド部分を固体支持体にコハク酸リンカーを介してカップリングし、または標準のホスフィチル化条件を介してホスホラミダイトに変換し、所望される炭水化物コンジュゲート構成要素を得た。フルオロフォア標識ｓｉＲＮＡを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した、対応するホスホラミダイトまたは固体支持体から合成した。室内でオレイルリトコール酸（ＧａｌＮＡｃ）３ポリマー支持体を３８．６μモル／ｇの負荷で室内で作製した。マンノース（Ｍａｎ）３ポリマー支持体についても、４２．０μモル／ｇの負荷で室内で作製した。
【０４２０】
選択したリガンドの所望される位置、例えば配列の５’末端でのコンジュゲーションは、特に指定されない限り、標準のホスホラミダイトカップリング条件下での対応するホスホラミダイトの伸長鎖へのカップリングによって行った。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾールアクチベーターの存在下での無水ＣＨ３ＣＮ中、ホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液の、固体に結合されたオリゴヌクレオチドへのカップリングを１５分延長した。（１）で報告されるような標準のヨウ素‐水を用いて、またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）での処理により、ヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化を行い、１０分の酸化待機時間かけてオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした。ホスホロチオエートは、ＤＤＴＴ（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）、ＰＡＤＳおよび／またはＢｅａｕｃａｇｅ試薬などの硫黄導入試薬を用いることによる亜リン酸エステルのホスホロチオエートへの酸化により導入した。コレステロールホスホラミダイトを室内で合成し、ジクロロメタン中、０．１Ｍの濃度で用いた。コレステロールホスホラミダイトにおけるカップリング時間は、１６分であった。
【０４２１】
２．脱保護−Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成の完了後、支持体を１００ｍｌのガラス瓶（ＶＷＲ）に移した。オリゴヌクレオチドを支持体から切断するとともに、エタノール性アンモニアの混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］８０ｍＬによる塩基およびリン酸基の同時脱保護を５５℃で６．５時間行った。瓶を氷上で短時間冷却し、次にエタノール性アンモニア混合物を新しい２５０ｍｌの瓶に濾過した。ＣＰＧをエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）の４０ｍＬ部分で２回洗浄した。次に、ｒｏｔｏ−ｖａｐにより、混合物の体積を約３０ｍＬまで減少させた。次に、混合物をドライアイス上で凍結し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ上、真空下で乾燥させた。
【０４２２】
３．脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥させた残基を、２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱し、２’位置でｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次に、反応を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調整し、精製まで冷凍庫内で貯蔵した。
【０４２３】
４．分析
緩衝液の精製および選択に先立ち、オリゴヌクレオチドを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析したが、カラムは、配列および／またはコンジュゲートリガンドの性質に依存する。
【０４２４】
５．ＨＰＬＣ精製
逆相分取ＨＰＬＣにより、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドを精製した。室内で充填したＴＳＫゲルカラム上でのアニオン交換ＨＰＬＣにより、非コンジュゲートオリゴヌクレオチドを精製した。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）および１０％ＣＨ３ＣＮ，１Ｍ  ＮａＢｒ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）であった。完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥した。約０．１５ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水で１５０μＬまで希釈し、次にＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のため、特殊なバイアルにピペッティングした。最終的に化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥにより分析した。
【０４２５】
６．ｓｉＲＮＡ製剤
ｓｉＲＮＡの調製のため、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を１倍ＰＢＳ中で９５℃で５分間加熱し、室温まで徐冷した。二本鎖の完全性をＨＰＬＣ分析により確認した。
【０４２６】
実施例３：一部の例示的なｄｓＲＮＡによるオフターゲット効果およびインビボ毒性の緩和
合成および精製
すべてのオリゴヌクレオチドは、汎用的または習慣的サポートを用いて、１μモルの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ１９２シンセサイザー上で調製した。すべてのホスホラミダイトは、カップリング時間を４００秒に延長した点を除き、２−シアノエチルホスホラミダイト用の標準プロトコルを用いて、１００％アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦにおける１００ｍＭの濃度で用いた。新規に形成された結合の酸化を、９：１のアセトニトリル：水における５０ｍＭ  Ｉ２の溶液を用いて行い、リン酸結合をもたらし、９：１のピリジン：アセトニトリルにおける１００ｍＭ  ＤＤＴＴにより、ホスホロチオエート結合をもたらした。トリチルオフの合成後、カラムを４０％水性メチルアミン１５０μＬとともに４５分間インキュベートし、溶液を真空を介して９６ウェルプレートに流した。インキュベーションを反復し、水性メチルアミンの新しい部分を流した後、粗オリゴヌクレオチド溶液を含有するプレートを密封し、室温でさらに６０分間振盪し、すべての保護基を完全に除去した。９：１アセトニトリル：ＥｔＯＨを１．２ｍＬで各ウェルに添加することにより粗オリゴヌクレオチドの沈殿を得た後、−２０℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを３０００ＲＰＭで４５分間遠心分離し、各ウェルから上清を除去し、ペレットを９５０μＬの２０ｍＭ水性ＮａＯＡｃに再懸濁した。最後に、水を用いてＧＥ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）上で各未精製溶液を脱塩し、最終オリゴヌクレオチド生成物を溶出させた。すべての同一性および純度は、各々、ＥＳＩ−ＭＳおよびＩＥＸ  ＨＰＬＣを用いて確認した。
【０４２７】
温度依存性ＵＶ分光学
融解試験は、サーモプログラマーを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ８００分光光度計上での経路長が１ｃｍの石英セルにおいて、０．３３×ＰＢＳ（３．３ｍＭ  Ｎａ／Ｋリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、４６ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．９ｍＭ  ＫＣｌを有する）中、（相補的非修飾ＲＮＡセンス鎖と対合した修飾アンチセンス鎖からなる）１μＭの二本鎖濃度で実施した。試料溶液２００μＬを含有する各キュベットを、軽鉱油１２５μＬでカバーした。１℃／分の加熱速度、１５〜９０℃での融解曲線を２６０ｎｍで監視した。融解温度（Ｔｍ）は、平滑化された加熱曲線の最初の派生物から算出し、報告された値は、少なくとも２つの独立した測定の結果である。
【０４２８】
インビトロレポーターアッセイ
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２でＣＯＳ−７細胞を培養した。細胞を、２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、１０ｎｇのルシフェラーゼレポータープラスミドおよび１０倍希釈中の５０ｆＭ〜５０ｎＭのｓｉＲＮＡとともに９６ウェルプレートに同時トランスフェクトした（１５，０００細胞／ウェル）。製造業者の使用説明書に従い、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のため、細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集した。オンターゲットレポータープラスミドは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’非翻訳（３’ＵＴＲ）におけるアンチセンス鎖に対して完全に相補的な単一の部位を含有した。オフターゲットレポータープラスミドは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにおける２１〜２８ヌクレオチドによって分かれた、４つのタンデムシード相補的部位を含有した。両方のプラスミドが、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクション対照として同時発現した。
【０４２９】
遺伝子発現分析
凍結保存したマウス、ラットまたはヒト肝細胞（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）を、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質混合物を有するＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞を、２μｇ／ｍＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡとともに９６ウェルプレートにトランスフェクトした（２０，０００細胞／ウェル）。細胞を、製造業者の使用説明書に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてのＲＮＡ抽出のため、トランスフェクションから２４時間後に収集し、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてのｃＤＮＡライブラリー調製のために用い、ＨｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑ５００シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した（すべては製造業者の使用説明書に従った）。Ｒａｗ  ＲＮＡｓｅｑのリードを、ｆａｓｔｑ−ｍｃｆを用いて、２５のｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅａｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅおよび３６のｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｌｅｎｇｔｈでフィルタリングした。ＳＴＡＲ（ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ａｌｉｇｎｅｒ）バージョン２．４．２ａを用いて、フィルタリングリードをドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ゲノム（Ｒｎｏｒ＿６．０）に整列した。独自に整列されたリードをｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓバージョン１．５．０．により計数した。差次的遺伝子発現分析をＲパッケージＤＥＳｅｑ２バージョン１．１６．１により実施した。
【０４３０】
５．コードの利用可能性
ＲＮＡｓｅｑデータ分析用に、以下のオープンソースソフトウェアパッケージを用いた。コードは、以下のロケーション：
ｆａｓｔｑ−ｍｃｆ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ／ｅａ−ｕｔｉｌｓ
ＳＴＡＲ  Ａｌｉｇｎｅｒ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｌｅｘｄｏｂｉｎ／ＳＴＡＲ
ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ：ｈｔｔｐ：／／ｓｕｂｒｅａｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ
ＤＥＳｅｑ２：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｍｉｋｅｌｏｖｅ／ＤＥＳｅｑ２
で利用可能である。
【０４３１】
インビボマウスおよびラット試験
すべての試験は、適用可能なものとしての地方、州および連邦規制に合致し、かつＡｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓでの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））によって認可されたプロトコルを用いて実施した。
【０４３２】
マウス薬力学試験では、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、単回用量の媒体対照（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）を投与するか、または０．５もしくは１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを上背に皮下投与した。７または８日目、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ分析のため、肝臓を収集し、冷生理食塩水ですすぎ、直ぐに液体窒素で急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０４３３】
ラット毒性試験では、雄スプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に週あたり３回の反復用量（ｑｗ×３）の媒体対照（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）を投与するか、または３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを上背に皮下投与した。１６日目、臨床病理学的評価のため、血清を収集し、病理組織学的評価とｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ分析のため、肝臓を収集した。
【０４３４】
ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの定量
ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡを抽出し、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ｃＤＮＡに変換し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩで、遺伝子特異的なＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルを評価した。
【０４３５】
ｓｉＲＮＡへの曝露を定量化するため、細胞ペレットを０．２５％トリトンＸ１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、９５℃で１０分間加熱し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、上清に対して逆転写を実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩで、製造業者の使用説明書に従い、ｑＰＣＲを実施した。
【０４３６】
８．マウスにおけるインビボ安定性の評価
試料調製：室温で解凍可能な５０ｍｇの凍結した凍結乾燥マウス肝臓に、プロテイナーゼＫ消化緩衝液０．４３ｍＬを添加した。プロテイナーゼＫ消化緩衝液は、１０５ｍＭトリスＨＣｌ、１７．５％ツイーン２０％、１．２６％トリトンＸ１００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、３ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ、ｐＨ８．０から成った。次に、試料を短時間ボルテックスし（約２０秒）、バスソニケーター内、室温で１０分間超音波処理した。この溶液にプロテイナーゼＫ溶液（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号１９１３３）２０μＬを添加し、試料を５秒間ボルテックスした。試料を振盪下、５０℃で３時間インキュベートした。この後、試料を１２，７００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、それから上清３００μＬを収集した。上清を３つの１００μＬ画分に分け、９６ウェルプレートの別々のウェルに移した。これらの画分に、ｐＨ５．５に調整した溶解ローディング緩衝液（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，カタログ番号ＡＬＯ−８５７９）０．９ｍＬ、続いて０．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度の内部標準オリゴヌクレオチド（１２ｍｅｒのポリ−２’−Ｏ−メチルウリジン）を添加した。
【０４３７】
弱アニオン交換（ＷＡＸ）固相抽出（ＳＰＥ）：自動加圧式マニホールド（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用いて、Ｃｌａｒｉｔｙ  ＯＴＸ  ＷＡＸの９６ウェルプレート（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上でＳＰＥを実施した。ＳＰＥプレートをメタノール１ｍＬ／ウェルで条件づけ、プレートを平衡化緩衝液（５０ｍＭ酢酸アンモニウム、２ｍＭアジ化ナトリウム、ｐＨ５．５）１．９ｍＬで洗浄した。試料をＳＰＥウェルに負荷し、フロースルーを廃棄した。この後、吸着剤を洗浄緩衝液（５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０：５０の水：アセトニトリル、ｐＨ５．５）１．５ｍＬで５回洗浄し、ｓｉＲＮＡを、溶出緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、５０：４０：１０の水：ＡＣＮ：ＴＨＦ、ｐＨ８．８）０．６ｍＬを有する清澄な２ｍＬの９６ディープウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶出した。４０℃および６５ｐｓｉの窒素圧のＴｕｒｂｏｖａｐ窒素マニホールド（Ｂｉｏｔａｇｅ）内で、試料を乾燥するまで蒸発させた。
【０４３８】
ＬＣ−ＭＳおよびデータ分析：試料をＬＣ−ＭＳグレード水４０ｕＬで再構成した。３つの複製試料を再結合させて１２０ｕＬの最終体積にし、ＬＣ−ＭＳ分析を施した。その分析は、オートサンプラー、ＵＶ検出器および恒温カラムコンパートメントを備えるＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００ＵＰＬＣと連携したＴｈｅｒｍｏ  ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計上で実施した。試料（３０μＬ）は、８０℃、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＸＰ  Ｃ８，１３０Å、２．５μｍ、２．１×３０ｍｍのカラムでクロマトグラフィーを行った。試料溶出は、１ｍＬ／分の流速で４．１分以内の、緩衝液Ａ（水中、１６ｍＭトリエチルアミン、２００ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）から３５％緩衝液Ｂ（メタノール）への直線勾配により実施した。質量分析計は、ＨＥＳＩ  ＩＩソースを備え、陰イオンモードで作動させた。データ分析およびシグナルの逆重畳積分は、ＰｒｏｍａｓｓＨＲソフトウェア（Ｎｏｖａｔｉａ  ＬＬＣ）とのインターフェースをもつＸＣａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。
【０４３９】
結果
１．インビトロ試験
インビトロレポーターアッセイの結果を表１および２にまとめる。表１中のデータが示すように、例えばアンチセンス鎖の６〜７位でのグリコール核酸（ＧＮＡ）修飾の例示的パターンは、インビトロでオフターゲット活性を緩和しつつ、オンターゲット活性を保持する。
【０４４０】
【表１】
2019535288.tif 000036
【０４４１】
【表２】
2019535288.tif 000037
【０４４２】
【表３】
2019535288.tif 000038
【０４４３】
２．温度依存性ＵＶ分光
温度依存性ＵＶ分光の結果を表３にまとめる。
【０４４４】
【表４】
2019535288.tif 000039
【０４４５】
３．遺伝子発現分析
等効力のｓｉＲＮＡを用いるインビトロ遺伝子発現分析の結果を図５２および５３に示し、表４にまとめる。表４から明示されるように、アンチセンス鎖の６〜８位（Ｆ９）または５〜８位（ＴＴＲ）でのＧＮＡ修飾が、インビトロでオフターゲット活性を軽減した。
【０４４６】
【表５】
2019535288.tif 000040
【０４４７】
４．インビボでのマウスおよびラット試験
インビボ試験の結果を表５〜７にまとめる。明示されるように、アンチセンス鎖の７位でのＧＮＡ修飾がインビボで効力を保持し（表５）、インビボで毒性を軽減する（表６および７）。表８は、アンチセンス鎖の５、６、７および８位での様々な不安定化修飾についてのインビトロレポーターアッセイデータを示す。
【０４４８】
【表６】
2019535288.tif 000041
【０４４９】
マウスに単回用量のｓｉＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇ（ＧＯ１およびＡＡＴ）または０．５ｍｇ／ｋｇ（ＴＴＲ）で投与し、肝臓ｍＲＮＡのノックダウンを７または８日目に評価した。
【０４５０】
【表７】
2019535288.tif 000042
【０４５１】
【表８】
2019535288.tif 000043
【０４５２】
【表９】
2019535288.tif 000044
【０４５３】
【表１０】
2019535288.tif 000045
【０４５４】
【表１１】
2019535288.tif 000046
【０４５５】
インビボでのマウスの安定性
試験の結果を図３２Ａ〜３２Ｃにまとめる。図３２Ａおよび３２Ｂから明示されるように、インビボ翻訳は、肝臓において残存する完全長アンチセンス鎖の量と標的ノックダウンとの間に強力な相関がある場合、アンチセンス鎖の代謝安定性による影響を受ける。
【０４５６】
ＩＣ５０
例示的なｄｓＲＮＡがＴＴＲまたはＦ９を標的とする場合の試験の結果を、図５０（ＴＴＲ）および図５１（Ｆ９）に示す。
【０４５７】
他の修飾
例示的なｄｓＲＮＡが他の熱不安定化修飾を有する場合の試験の結果を、図５４および５５に示す。明示されるように、すべての試験した修飾は、親と同様の活性を維持することができる。
【０４５８】
実施例４：ｓｉＲＮＡの構造および機能に対するグリコール核酸（ＧＮＡ）の影響
ｓｉＲＮＡ二本鎖の化学修飾は、これらの分子をヌクレアーゼ分解に対して安定化し、細胞へのそれらの取り込みを促進し、また活性ＲＩＳＣの形成およびＲＮＡｉ媒介性標的サイレンシングに影響するのに必要である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の特定位置に組み込まれた熱不安定化修飾は、ＲＩＳＣローディング中での鎖の偏りおよび／またはセンス鎖の解離を改善することにより、効力の増強をもたらし得る。本試験では、発明者は、一部の例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖と関連する範囲内で、単純な３炭素の非環式核酸類似体、グリコール核酸（ＧＮＡ）について検討した。
【０４５９】
１．（Ｓ）−ＧＮＡを有するｓｉＲＮＡ二本鎖の熱融解（Ｔｍ）分析
ｓｉＲＮＡ二本鎖の安定性に対する単一のＧＮＡヌクレオチド組み込みの結果を図３３に示す。ＧＮＡヌクレオチドを、指定位置でセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかに組み込んだ。青点および赤点は各々、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ塩基対を示す。０．２５倍ＰＢＳ中、１μＭの二本鎖濃度で測定を実施した。各データ点は２測定値の平均である。左下挿入図は、二本鎖の任意の位置での単一の（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドの組み込み時の融解温度における平均変化を示す（オーバーハングはこの分析から除外した）。明示されるように、ＧＮＡの組み込みは、得られる二本鎖の位置依存的な熱不安定化をもたらした。不安定化の程度が主にヌクレオチド依存性であった一方、ＡまたはＵヌクレオチドにおける置換は、ＧまたはＣヌクレオチドにおけるＧＮＡ置換と比べて有意により小さいΔＴＭ比をもたらした。
【０４６０】
２．（Ｓ）−および（Ｒ）−ＧＮＡヌクレオチドを有するＲＮＡ二本鎖の結晶構造
両ＧＮＡ−Ｔ立体異性体で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造で修飾されたＲＮＡ二本鎖の結晶構造分析の結果を、図３４Ａ〜３４Ｆに示す。同図中の図３４Ａは、８−ｍｅｒ  ＲＮＡ二本鎖内に組み込まれたＧＮＡ−Ｔ残基（炭素原子を緑色で強調）の結果としての鎖内Ｐ．．．Ｐ距離での変動を示す。図３４Ｂは、ＧＮＡヌクレオチドにおける回転した核酸塩基立体構造を示す（Ｓ）−ＧＮＡ−Ｔ：ＲＮＡ−Ａ塩基対の例である（矢印）。図３４Ｃは、ＧＮＡヌクレオチドが当該構造内部でゴーシュとアンチコンフォメーションの双方の形をとることを示す。図３４Ｄは、（Ｒ）−ＧＮＡ−Ｔ残基が、ＲＮＡ二本鎖および幾何学的対合を（Ｓ）−ＧＮＡ−Ｔ残基よりも大規模に歪めることを示す。２つの１２−ｍｅｒの二本鎖におけるＡ：ＵおよびＧ：Ａ塩基対に隣接する（Ｓ）−ＧＮＡ−Ｔ（緑色）：ＲＮＡ−Ａおよび（Ｒ）−ＧＮＡ−Ｔ（黄色）：ＲＮＡ−Ａの上書きは、（Ｒ）−ＧＮＡ−Ｔで修飾された１２−ｍｅｒにおける隣接Ａ：Ｕ対の破壊を示す（矢印）。図３４Ｅは、リン酸骨格を強調する、ＧＮＡの（Ｓ）−および（Ｒ）−異性体の双方を組み込むＲＮＡ二本鎖の全体的構造を示す。２つの異性体は、全体的なＲＮＡ構造内部に異なって収容され、（Ｒ）−異性体を有する二本鎖においてわずかなねじれを生じさせる（矢印）。図３４Ｆは、（Ｓ）−ＧＮＡ−Ｔ残基が、ヒトＡｇｏ  ２．１４に結合されたガイド鎖ＲＮＡの７位でＲＮＡヌクレオチドをシームレスにかつ最適な幾何学で置換し得ることを示す。ＲＮＡ鎖は、Ｉｌｅ−３６５と会合される部位でのねじれが想定され、ヌクレオチド６および７の塩基の非スタッキングをもたらす。
【０４６１】
明示されるように、（Ｓ）−または（Ｒ）−ＧＮＡのいずれかを有するＲＮＡ二本鎖の結晶構造は、二本鎖構造内部でのグリコール骨格の柔軟性を示し、ＧＮＡ−Ｔ残基の核酸塩基が回転した立体構造との非基準の塩基対をなすことを可能にする。後者の結果は、イソＣおよびイソＧヌクレオチドとのクロスペアリング実験によりさらに支持される（下記に考察される）。さらに、（Ｒ）−異性体の組み込み（好ましくは左巻き二本鎖）は、二本鎖構造全体のより強力な熱不安定化およびより大規模な攪乱をもたらした。
【０４６２】
３．（Ｓ）−ＧＮＡのイソＣおよびイソＧ  ＲＮＡヌクレオチドとのクロスペアリング
例示的なｄｓＲＮＡにおける（Ｓ）−ＧＮＡとイソＣおよびイソＧ  ＲＮＡヌクレオチドとの熱安定性を測定した。結果を表１０にまとめる。イソＣおよびイソＧの構造を図３５に示す。
【０４６３】
【表１２】
2019535288.tif 000047
【０４６４】
４．インビトロｓｉＲＮＡ活性
濃度が１０ｎＭのｓｉＲＮＡでのインビトロサイレンシング活性に対する単一（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチド置換の位置的影響の結果を図３６に示す。ガイドまたはパッセンジャー鎖の指定位置のヌクレオチドを、対応するＧＮＡヌクレオチドと置換した。明示されるように、単一（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドまたは塩基対のｓｉＲＮＡ二本鎖のシードまたは追加的領域への組み込みにより、インビトロで類似レベルでのＴＴＲ  ｍＲＮＡのノックダウンがもたらされた。
【０４６５】
ＴＴＲを標的とする例示的なｄｓＲＮＡのＩＣ５０曲線を図５０に示し、第ＩＸ因子（Ｆ９とも称される）を標的とする例示的なｄｓＲＮＡのＩＣ５０曲線を図５１に示す。
【０４６６】
５．インビボｓｉＲＮＡ活性
２．５ｍｇ／ｋｇで投与される（Ｓ）−ＧＮＡ修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖を有するマウスにおけるＴＴＲのノックダウンの結果を図３７Ａおよび３７Ｂに示す。遺伝子サイレンシングのレベルは、パッセンジャーまたはガイド鎖において単一（Ｓ）−ＧＮＡヌクレオチドを用いて修飾された例示的なｓｉＲＮＡを用いて、インビボで維持した。（Ｓ）−ＧＮＡの単一塩基対を用いる修飾は、効力および効果の持続時間をより低い方へ向けた。
【０４６７】
実施例５：齧歯類毒性試験においてＲＮＡｉ媒介性オフターゲット効果についてスクリーニングすることによる、十分に耐容性のある例示的なＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの選択
１．実験動物のケアおよび使用
すべての試験は、適用可能な場合、地方、州および連邦規制に準じたプロトコルを用いて実施され、Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓで動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。被験物質を０．９％ＮａＣｌで希釈することで適切な投与濃度を得て、Ｎ＝３の動物／群、５ｍＬ／ｋｇの用量体積で雄スプラーグドーリーラット（６〜８週齢）または雄ＣＤ−１マウス（６〜８週齢）の上背に皮下投与した。群平均体重のバイアスを回避するＰｒｉｓｔｉｍａ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｘｙｂｉｏｎ）における分配アルゴリズムを用いて、無作為化を実施した。治験責任医師は、実験中またはアウトカムの評価時、群割当に対して非盲検であった。
【０４６８】
２．臨床病理学
全静脈血を血清分離管（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）に収集し、４℃、３，０００ＲＰＭ（１，４８９ｇ）で１０分間の遠心分離に先立ち、室温で３０分間凝固させておいた。次に、血清をアリコートし、分析まで−８０℃で貯蔵した。ＡＵ４００化学アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて血清化学を分析し、ここで試薬はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｒａｎｄｏｘ、およびＳｅｋｉｓｕｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる提供を受けた。群間差異は、統計学的有意性について、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７での一元配置分散分析を用いて評価した。
【０４６９】
３．病理組織学
Ａｌｎｙｌａｍの標準作業手順に従い、すべての動物を安楽死させ、目的の組織を収集した。ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ  ＶＩＰ  ６Ａ１（Ｓａｋｕｒａ）を用いる通常の処理に先立ち、すべての組織を１０％中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ）で７２時間固定した。組織をトリミングし、パラフィンブロックに包埋し、４ミクロンの切片を作り、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ  Ｐｒｉｓｍａ  Ａ１Ｄ（Ｓａｋｕｒａ）を用いてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ  Ｇｌａｓｓ  ｇ２（Ｓａｋｕｒａ）を用いてカバースリップした。２つの切片を、非盲検的に各肝臓から顕微鏡的に試験し、その後、微妙な所見を確認するための盲検評価を行った。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで類別した（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。
【０４７０】
４．単量体およびオリゴヌクレオチド合成
前述の通り、すべてのオリゴヌクレオチドの合成および特徴づけを行った（Ｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１３６，１６９５８−１６９６１；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１３９，８５３７−８５４６）。２’Ｆ−、２’ＯＭｅ−、およびＬＮＡで修飾されたアデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）のホスホラミダイト単量体、ならびに反転脱塩基（ｉＢ）ホスホラミダイト単量体を商業的供給源から入手した。ＧＮＡホスホラミダイト単量体の合成は以前に報告されている（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１３９，８５３７−８５４６およびその中の参考文献）。５’−デオキシ−５’−（４−モルホリニル）−ウリジン、５’−デオキシ−５’−（４−モルホリニル）−シチジンおよび５’−デオキシウリジンホスホラミダイトを室内で合成した。すべてのオリゴヌクレオチドの同一性および純度は各々、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳおよびＩＥＸ  ＨＰＬＣを用いて確認した。本実施例で用いたｓｉＲＮＡの配列を表１１に示す。
【０４７１】
【表１３】
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【０４７２】
５．全肝臓およびＡｇｏ２関連ｓｉＲＮＡレベルの定量化
ステムループ逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により、肝臓およびＡｇｏ２関連（ＲＩＳＣローディング）ｓｉＲＮＡレベルを定量化した（Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，１７，９８５−９８９）。
【０４７３】
６．ＲＮＡｓｅｑおよびバイオインフォマティクス分析
ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの５０ｍｇ／ｋｇでの単回投与から２４時間後、ラット肝臓を収集し、急速凍結した。ラット肝細胞（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、１０ｎＭ  ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクトから２４時間後、収集した。ラット肝細胞は、マイコプラズマ汚染について試験しなかった。ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出したＲＮＡを、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてのｃＤＮＡライブラリー調製用に用い、ＨｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑ５００シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した（すべては製造業者の使用説明書に従った）。Ｒａｗ  ＲＮＡｓｅｑのリードを、ｆａｓｔｑ−ｍｃｆを用いて、２５のｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅａｎ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅおよび３６のｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｌｅｎｇｔｈでフィルタリングした。ＳＴＡＲ（ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ａｌｉｇｎｅｒ）をデフォルトパラメータで用いて、フィルタリングリードをドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ゲノム（Ｒｎｏｒ＿６．０）に整列した。独自に整列されたリードをｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓにより計数した。差次的遺伝子発現分析をＲパッケージＤＥＳｅｑ２により実施した。
【０４７４】
７．コードの利用可能性
ＲＮＡｓｅｑデータ分析用に、オープンソースＤＥＳｅｑ２  Ｒパッケージを用いた。
【０４７５】
結果
１．アンチセンス鎖のＲＩＳＣローディングを遮断することが肝毒性を軽減する
小さいＲＮＡｉトリガーの効率的なＲＩＳＣローディングおよび活性は、５’末端の一リン酸部分の存在に依存する。内因性ｍｉＲＮＡが、それらの生合成の結果として５’−一リン酸を天然に有する一方で、外因性ｓｉＲＮＡは、細胞内取り込み後のキナーゼによるリン酸化に依存していると考えられる。齧歯類毒性試験において修飾ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡのサブセットの場合（表１１）に認められる肝毒性に対するＲＩＳＣローディングの関係を特徴づけるため、以前に確認された肝毒性を有する二本鎖の５’末端を、５’−リン酸化、ひいてはＲＩＳＣローディングを妨害するように設計された３タイプのヌクレオチド修飾：５’−反転脱塩基（ｉＢ）、５’−デオキシ−５’−（４−モルホリニル）、または５’−デオキシヌクレオチドでキャッピングした（図３８Ａ）。ＲＩＳＣローディングが欠けたこれらのキャッピングされたｓｉＲＮＡは、肝毒性としての以前の短期間反復用量ラット毒性スクリーニング試験にて同定され、齧歯類において予想されたオンターゲット活性の存在下または不在下での様々な標的ｍＲＮＡに対して設計された、それらのＲＮＡｉ活性型対応物と同じＰＳ、２’ＯＭｅ、および２’Ｆ含量を有した。
【０４７６】
肝毒性に対するＲＩＳＣローディングを遮断する効果を、齧歯類において毒性学的用量で試験した。ラットまたはマウスは、薬理学的用量範囲の２〜３ｌｏｇ分の拡張を表す３０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量を５〜９週ごとまたは隔日に受けた。アンチセンス鎖のリン酸化を遮断する５’−キャッピング修飾により、ＲＩＳＣローディング（図３９Ａ）および標的ｍＲＮＡのノックダウン（図３９Ｂ）が親ｓｉＲＮＡと比べて低下した。すべての試験を通じて、同じ配列および骨格化学でのｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性型とＲＮＡｉ不活性型との間で肝臓濃度に有意差がなく（図３８Ｂ）、エンドリソソーム系および細胞内タンパク質が、同等量の各ｓｉＲＮＡにそのＲＩＳＣローディング能力と無関係に曝露されることが確認された。同等の肝臓曝露にもかかわらず、既知の肝毒性ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣローディングを遮断することにより、肝酵素の上昇（図３８Ｃおよび３９Ｃ）や、マウスとラット双方における線維症、単細胞壊死、および肝細胞変性を含む、ほぼすべての顕微鏡的肝臓所見（図３８Ｄおよび表１２）が失われた。重要なことに、センス鎖単独の５’末端（図４０Ａ〜４０Ｃ）または無毒性ツールキットのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ（図４１Ａ〜４１Ｃ）に対してＲＩＳＣローディングを遮断する修飾を設けることは、肝酵素の上昇または顕微鏡的肝臓所見に対する効果を有せず（表１３および１４）、これらの５’−キャップが、ｓｉＲＮＡの細胞内輸送に影響する、または追加的な安全性の傾向を導入する可能性が低いことが示された。
【０４７７】
【表１４】
2019535288.tif 000049
【０４７８】
表１２は、ＲＩＳＣローディングの遮断により肝毒性が軽減されることを示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。
【０４７９】
【表１５】
2019535288.tif 000050
【０４８０】
表１３は、ラット毒性試験における有毒なＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対するセンス鎖５’−修飾の効果を示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。ｉＢ，反転脱塩基；Ｍｏ，モルホリノ。
【０４８１】
【表１６】
2019535288.tif 000051
【０４８２】
表１４は、ラット毒性試験における無毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの肝毒性に対するセンス鎖５’−修飾の効果を示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。ｉＢ，反転脱塩基；Ｍｏ，モルホリノ。
【０４８３】
これらの試験は、ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡのサブセットの齧歯類肝毒性が、アンチセンス鎖のＲＩＳＣローディングに依存しているが、ＲＩＳＣローディングの上流でのｓｉＲＮＡ化学に関連した機構、例えばＰＳまたは２’Ｆなどの比較的疎水性の骨格修飾に結合するエンドリソソーム系または望まれない細胞内タンパク質の攪乱とは無関係であることを示す。
【０４８４】
２．変化するｓｉＲＮＡ化学修飾は肝毒性を軽減しない
さらに、ｓｉＲＮＡ肝毒性に対する２’Ｆおよび２’ＯＭｅ含量の潜在的寄与のリスクを回避するため、肝毒性ｓｉＲＮＡモデルの２つの別々に修飾されたバージョン：高２’−Ｆバージョン（４８％の２’Ｆおよび５２％の２’ＯＭｅ）および低２’−Ｆバージョン（２１％の２’Ｆおよび７９％の２’ＯＭｅ）を齧歯類毒性試験において試験した（図４２Ａ）。両化合物は、同一の配列およびＰＳ含量を有し、強力なサイレンシング活性を保持した（図４３）。これらの化合物は、ラットに１００ｍｇ／ｋｇ、またマウスに２００ｍｇ／ｋｇで毎週、９週にわたり投与した。この頻回投与パラダイムの場合、肝臓曝露（図４２Ｂ）およびＲＩＳＣローディング（図４２Ｃ）は、各試験の終了時、低および高２’−Ｆ  ｓｉＲＮＡについて同等であった。同様に、肝酵素の上昇（図４２Ｄ）および顕微鏡的肝臓所見（図４２Ｅおよび表１５）は、両方の齧歯類種において、この配列における２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅ修飾の数と無関係であった。これらのデータは、ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの齧歯類肝毒性の背後にある駆動力としての、ｓｉＲＮＡ化学修飾に対するさらなる証拠を提示する。
【０４８５】
【表１７】
2019535288.tif 000052
【０４８６】
表１５は、変化するｓｉＲＮＡ化学修飾が肝毒性を軽減しないことを示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。
【０４８７】
３．アンチセンス鎖に負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減する
ＲＩＳＣローディングの上流でのｓｉＲＮＡ化学に関連した機構が、齧歯類における肝毒性に対して有意な影響を有するように思われなかったことから、ＲＮＡｉ媒介性オフターゲット効果を内因性ＲＮＡｉ経路の攪乱と区別することに着目した。当該方法は、ｓｉＲＮＡの化学および配列を変化しないように維持することにより、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣローディングを可能にしたが、ｓｉＲＮＡに負荷されたＲＩＳＣの潜在的なオフターゲットｍＲＮＡへの結合を阻止した。これを達成するため、２タイプのラット毒性試験：予防および治療において、ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）化合物として公知の、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖に相補的なＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされた短い一本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ＲＩＳＣローディングの下流でのＲＮＡｉ活性を遮断した（図４４Ａ）。
【０４８８】
予防試験では、肝毒性ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）分子または同じ長さおよび化学組成の対照のスクランブルされたＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）配列を、初回ｓｉＲＮＡ投与の２４時間前または初回および２回目のｓｉＲＮＡ投与の２４時間前のいずれかに高い薬理学的用量（３または１０ｍｇ／ｋｇ）で前投与した。治療試験では、ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）化合物を、初回ｓｉＲＮＡ投与の２４時間後に高い薬理学的用量（３または１０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。肝毒性ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡは、３０ｍｇ／ｋｇで毎週（３回）または隔日（６回）投与した。相補的なＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）分子およびスクランブルされたＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）分子の双方は、バイオインフォマティクスにより、潜在的にはＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）化合物により遮断され得る、任意の肝臓で発現されるｍｉＲＮＡに対して完全でない相補性を示すことが確認された。
【０４８９】
ｓｉＲＮＡの投与前または投与後のＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）治療により、オンターゲットノックダウンが低下したが（図４５）、肝臓ｓｉＲＮＡレベル（図４４Ｂ）またはＲＩＳＣローディング（図４４Ｃ）に影響しなかった。しかし、対照のスクランブルされたＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）（Ｃｔｒ  ＲＶＲ）でなく、相補的なＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）化合物（ＲＶＲ−１、ＲＶＲ−４、またはＲＶＲ−５）は、それら各々の標的であるｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−４、またはｓｉＲＮＡ−５で認められる肝酵素の上昇を低減し（図４４Ｄ）、顕微鏡的肝臓所見の重症度および発生率を低下させた（図４４Ｅおよび表１６）。単独投与したＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）化合物は、有毒な効果を有しなかった（図４４Ｄ）。ＲＥＶＥＲＳＩＲ（商標）手法を展開することにより、ｓｉＲＮＡ誘導性の肝毒性が、ＲＩＳＣローディングに影響することなく、またｓｉＲＮＡ化学を変化させることなく軽減された。したがって、これらのデータは、肝毒性が、アンチセンス鎖媒介性ＲＮＡｉオフターゲット効果によって駆動されるが、内因性ＲＮＡｉ経路またはｓｉＲＮＡ化学媒介性効果とのＲＩＳＣ複合体における競合によって駆動されないという仮説を支持する。
【０４９０】
【表１８】
2019535288.tif 000053
【０４９１】
表１６は、アンチセンスに負荷されたＲＩＳＣ活性を回復させることが肝毒性を軽減することを示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。
【０４９２】
４．シード領域を交換することが肝毒性を軽減する
ｍｉＲＮＡ機構と同様、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ媒介性オフターゲット効果は、典型的にはガイド鎖のシード領域によって駆動される。これらの効果がＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの観察される齧歯類肝毒性を誘発する場合、ヌクレオチド２〜８外部の隣接領域でない、シード領域の配列が、特定配列が肝毒性に関連するか否かの主要な決定因子であるはずである。この仮説を試験するため、化学修飾パターンを変更することなく、肝毒性ｓｉＲＮＡのシード領域を非肝毒性ｓｉＲＮＡのシード領域と交換し、また逆も同様で、化学修飾パターンを変更することなく、非肝毒性ｓｉＲＮＡのシード領域を肝毒性ｓｉＲＮＡのシード領域と交換した（図４６Ａ）。
【０４９３】
２つのシードが交換されたｓｉＲＮＡを、親の肝毒性および非肝毒性ｓｉＲＮＡとともに、３０ｍｇ／ｋｇの毒性学的用量で隔日６回、ラットに投与した。肝臓曝露は、４つすべての化合物において同等であった（図４６Ｂ）。ＲＩＳＣローディングは、有毒な親ｓｉＲＮＡならびに有毒なシード領域を有するｓｉＲＮＡにおいて、無毒性の親ｓｉＲＮＡまたは無毒性シード領域を有するｓｉＲＮＡと比べてより低かった（図４６Ｃ）。しかし、ＲＩＳＣローディングのレベルがより低いにもかかわらず、これら２つのｓｉＲＮＡは最も肝毒性があり、肝毒性の主要なドライバーとしてのＲＩＳＣローディングにおける競合は議論の的である。有毒なシード領域を無毒性のシード領域と交換することにより、肝酵素の上昇（図４６Ｄ）および顕微鏡的肝臓所見（図４６Ｅおよび表１７）が軽減され、シード領域がｓｉＲＮＡ化学からの寄与がほとんどない肝毒性にとって必要であることが示される。他方、無毒性シード領域を有毒なシード領域と交換することにより、有毒なｓｉＲＮＡの肝毒性が完全には繰り返されなかったが、無毒性の親ｓｉＲＮＡに対して、肝酵素の上昇（図４６Ｄ）および顕微鏡的肝臓所見での重症度の増加（図４６Ｅおよび表１７）が引き起こされた。これは、アンチセンスシード領域に対する相補性がオフターゲット活性にとって要求される一方、ｓｉＲＮＡ３’領域もまた、オフターゲット結合および抑制に寄与することがあることを示唆する。これらのデータは、ＲＮＡｉ媒介性のシードに基づくオフターゲット効果において、またラット肝毒性の主要なドライバーとしての化学媒介性またはＲＮＡｉ経路競合クラス効果に対してさらなる支持をもたらす。
【０４９４】
【表１９】
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【０４９５】
表１７は、シード領域を交換することが、肝毒性を軽減することを示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。
【０４９６】
５．ｓｉＲＮＡオフターゲットはシード相補性に富む
ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ媒介性オフターゲット効果に合致した遺伝子調節不全を引き起こし得ることを確認するため、ＩＣ５０濃度を２〜３ｌｏｇ分上回る１０ｎＭの「毒性学的」用量で２４時間目でのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によるトランスクリプトームに対する全体的効果の評価を意図して、一連のｓｉＲＮＡをラット肝細胞にトランスフェクトした。下方制御された転写物は、アンチセンスシード領域（ヌクレオチド２〜８）に対する完全な相補性に富み、変化の程度は一般に、２倍を超えなかった（図４７Ａおよび表１８）。富化のかかるパターンは、上方制御された転写物において、またはセンス鎖のシード領域に対して認められなかった。同様のオフターゲット特性の特徴が、５０ｍｇ／ｋｇ用量のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡから２４時間後、インビボでラット肝臓において認められた（図４７Ｂ）。調節不全遺伝子の数は、５’−エンドキャップを有する不活性なｓｉＲＮＡの場合に減少し、２’Ｆ、２’ＯＭｅ、またはＰＳ化学および／または他のＲＩＳＣ非依存性因子が、齧歯類毒性試験からの結果に合致する遺伝子調節不全に有意には寄与しないことが示される（図３８Ａ〜３８Ｄ）。これらのデータは、ｓｉＲＮＡ化学に基づくＲＮＡｉ非依存性効果でなく、アンチセンス鎖のｍｉＲＮＡ様活性が、オフターゲット遺伝子発現変化の主要なドライバーであるという結論をさらに支持する。
【０４９７】
【表２０】
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【０４９８】
表１８は、シード媒介性オフターゲット結合を不安定化することが、肝毒性を軽減することを示す。各組織学的所見における重症度グレードの範囲を１〜５のスケールで指定する（ここで１は最小重症度を示し、５は重篤・重症度を示す）。
【０４９９】
６．シード媒介性オフターゲット結合を不安定化する影響
シード媒介性認識がＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡのオフターゲット駆動による肝毒性にとって必要である場合、オフターゲットｍＲＮＡに対するシード領域の結合親和性の低下が緩和効果を有するはずである。この仮説を試験するため、他の熱不安定化修飾を伴う以前の手法と同様、熱不安定化ＧＮＡヌクレオチドを肝毒性ｓｉＲＮＡ−５配列におけるアンチセンス鎖の７位に配置した（図４８Ａ）。
【０５００】
シード媒介性オフターゲット活性が遺伝子発現変化を駆動しているという仮説に合致して、アンチセンス鎖シード領域内にＧＮＡを組み込むことにより、１０ｎＭの高用量でラット肝細胞にトランスフェクトするとき、オフターゲット特性が親ｓｉＲＮＡと比べて低下した一方（図４８Ｂ）、オンターゲット活性は維持された（図４９Ａ）。オフターゲット特性が低下することがインビボで安全性が改善することと解釈されるか否かをさらに試験するため、これら２つの同じｓｉＲＮＡを、３０ｍｇ／ｋｇで毎週３回投与されるラット毒性試験において試験した。親配列と比べて、シード領域内でのＧＮＡヌクレオチド置換は、オンターゲットｍＲＮＡのノックダウン（図４９Ｂ）、肝臓曝露（図４８Ｃ）、またはＲＩＳＣローディング（図４８Ｄ）に影響しなかった。しかし、シード修飾は、肝酵素の上昇（図４８Ｅ）および顕微鏡的肝臓所見（図４８Ｆ）を軽減した。オフターゲット効果における、また肝毒性の主要なドライバーとしての化学毒性またはＲＮＡｉ経路撹乱に対するさらなる証拠を提供することに加えて、これらのデータは、シード媒介性結合の熱不安定化が、インビボでのｓｉＲＮＡのオフターゲット抑制および肝毒性の選択的低減にとって実行可能な方法であるという最初に報告された証拠を提供する。
【０５０１】
本明細書中で参照される米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願および非特許論文のすべてが、それら全体が参照により本明細書中に援用される。実施形態の態様は、さらなる実施形態をさらに提供するため、様々な特許、出願および公開の概念を利用する必要がある場合、変更され得る。
【０５０２】
これらや他の変更は、上記の詳細な説明のおかげで、実施形態に対して行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定するように解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲に権利が付与されている均等物の全範囲とともに、あらゆる考えられる実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月23日(2019.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の熱不安定化修飾またはその前駆体を少なくとも１つ含み、ここで前記センス鎖は、ＡＳＧＰＲリガンドを含む、ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２】
少なくとも４つの２’−フルオロを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項４】
以下の特徴：
ａ）前記二本鎖の熱不安定化修飾が、前記アンチセンス鎖の５’領域の４〜８位に位置する；
ｂ）前記センスおよびアンチセンス鎖の各々が、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；および
ｃ）前記センス鎖の片末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド
を有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖が、以下の特徴：
ａ）前記二本鎖修飾の熱不安定化修飾は、前記アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；
ｂ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；
ｃ）（５’末端から数えて）ヌクレオチド１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
ｄ）１８〜３５ヌクレオチド長を有する、
のうち少なくとも２つを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記センス鎖が、以下の特徴：
ａ）前記センス鎖の片末端に結合された前記ＡＳＧＰＲリガンド；
ｂ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；
ｃ）前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示し、前記二本鎖の熱不安定化修飾は前記二本鎖領域内に位置する、
のうち少なくとも１つを有する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記アンチセンス鎖のヌクレオチド３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記二本鎖の前記熱不安定化修飾が、
【化１】
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（式中、Ｂは核酸塩基である）
からなる群から選択される、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記安定化修飾が、前記アンチセンス鎖の７位に位置する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、二価または三価分岐リンカーを通じて結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、
【化２】
2019535288.tif 000134
である、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１４】
標的遺伝子の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここで前記アンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、前記標的配列に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９のヌクレオチド位置内に二本鎖の熱不安定化修飾を少なくとも１つ含み、ここで前記ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する、二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１５】
約５５℃〜約６７℃の融解温度を有する、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖の少なくとも５０％が、投与後７日目に肝臓に存在する、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１７】
以下の特徴：（ｉ）前記アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）前記アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）前記センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）前記センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）前記センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）前記ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端；および（ｉｘ）前記センス鎖は、１つ以上のＬＮＡ修飾を含む、の少なくとも１つをさらに有する、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖の３〜９位に２’−フルオロ修飾が存在しない、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記センス鎖が２１のヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が２３のヌクレオチドを有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２０】
単独の、または薬学的に許容できる担体もしくは賦形剤と組み合わせた、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を有する遺伝子サイレンシングキット。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む、細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための剤であって、前記ｄｓＲＮＡ分子が前記細胞に導入される、剤。
【請求項２３】
皮下または静脈内投与を通じて投与される、請求項２２に記載の剤。
【請求項２４】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む、細胞における標的遺伝子をサイレンシングするための剤であって、前記ｄｓＲＮＡ分子が前記細胞に発現される、剤。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む、ｄｓＲＮＡ分子の前記アンチセンス鎖によって引き起こされるオフターゲット効果を抑制しながら標的遺伝子の発現の阻害を誘導するための剤。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ分子を含む、ポリヌクレオチドを被験者における特異的標的に送達するための剤。
【請求項２７】
筋肉内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ、静脈内、皮下、脳脊髄、またはそれらの組み合わせを含む投与手段により投与される、請求項２６に記載の剤。
【国際調査報告】
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