(57)【要約】イソメロヒドロラーゼタンパク質の機能及び／又は活性及び／又は効力をアッセイする方法が提供される。【選択図】  図７
2019514375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞形質導入を可能にする条件下で、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）を発現する細胞を、イソメロヒドロラーゼタンパク質をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと接触させるステップと、
（ｂ）コードされた前記イソメロヒドロラーゼタンパク質の発現を可能にする条件下で形質導入細胞をインキュベートするステップと、
（ｃ）前記形質導入細胞を収集し、溶解して、コードされた前記イソメロヒドロラーゼタンパク質を含む抽出物を生成するステップと、
（ｄ）前記イソメロヒドロラーゼタンパク質による基質の反応生成物への変換を可能にする時間及び条件下で前記抽出物を前記基質とインキュベートするステップと、
（ｅ）前記反応生成物をカラムクロマトグラフィーに供し、それによってカラムクロマトグラフィーにより精製された反応生成物を生成するステップと、
（ｆ）前記カラムクロマトグラフィーにより精製された反応生成物を質量分析に供し、それによって前記反応生成物を定量するステップであって、前記反応生成物の量はイソメロヒドロラーゼ活性を反映し、それによってイソメロヒドロラーゼ活性を測定するステップと
を含む、イソメロヒドロラーゼ活性を測定する方法。
【請求項２】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、野生型網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、バリアント又は突然変異体網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、哺乳動物網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記イソメロヒドロラーゼタンパク質が、ヒト網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がＬＲＡＴを安定に又は一過性に発現する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がオール−トランス−レチニルエステルを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）が、前記基質の前駆体を前記抽出物に添加することを含み、前記前駆体が、発現された前記ＬＲＡＴによって前記基質に変換される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｄ）が、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及び前記基質の前駆体を前記抽出物に添加することを含み、前記前駆体が、発現された前記ＬＲＡＴによって前記基質に変換される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
添加されるＣＲＡＬＢＰの量が約５０から約５００μｇの間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）も安定に又は一過性に発現する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記前駆体が、オール−トランスレチノールを含むか、又はオール−トランスレチノールからなる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記オール−トランスレチノールが、最終濃度が約１〜約２０ｍＭであるように添加される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応生成物が、１１−シス−レチノールを含むか、又は１１−シス−レチノールからなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）が、暗所、薄暗い光の下又は薄暗い黄色の光の下で実施される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質、前駆体又は反応生成物が非放射性である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）の前記時間が、約３０分〜約２４０分である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前に、前記反応が停止又はクエンチされる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前にアルコールが添加される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｄ）が、前記反応生成物を抽出することを更に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応生成物が有機溶媒により抽出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応生成物がヘキサンにより抽出される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれかが実施例１に記載されているように実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｅ）〜（ｆ）のいずれかが実施例２に記載されているように実施される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０から選択されるいずれかの血清型のカプシドタンパク質配列又は逆方向末端反復配列と７０％以上の配列同一性を有するカプシドタンパク質配列又は逆方向末端反復配列を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０から選択されるいずれかの血清型のカプシドタンパク質又は逆方向末端反復を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）細胞を接触させる前記ステップが、１個の細胞当たり約５００〜約５００万個のＡＡＶベクター粒子の量である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
（ａ）細胞を接触させる前記ステップが、１個の細胞当たり約１，０００〜約１，０００，０００個のＡＡＶベクター粒子の量である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）細胞を接触させる前記ステップが、１個の細胞当たり約２，０００〜約５００，０００個のＡＡＶベクター粒子の量である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
（ｂ）前記形質導入細胞をインキュベートする前記ステップが、約６時間〜約９６時間の時間である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
（ｃ）の前記形質導入細胞を溶解する前記ステップが、凍結融解、超音波処理又はそれらの組合せによる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）の後に生成される総細胞タンパク質の量が決定される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｃ）の後に生成される総細胞タンパク質の量が、ブラッドフォードアッセイによって決定される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記前駆体が、ＤＭＦの１０〜１００％溶液と混合される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
細胞を収集した後であるが、（ｃ）溶解する前記ステップの前に、前記収集した細胞が緩衝液に再懸濁される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｃ）前記形質導入細胞を溶解して抽出物を生成する前記ステップの後、前記抽出物が緩衝液に希釈される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記緩衝液が塩緩衝液である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記緩衝液がＮａＣｌ緩衝液である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｃ）によって生成された前記抽出物が、約１０μｇ〜約２，０００μｇの総細胞タンパク質を含むか、又は約１０μｇ〜約２，０００μｇの総タンパク質となるように調整される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｃ）によって生成された前記抽出物が、約５０μｇ〜約７５０μｇの総細胞タンパク質を含むか、又は約５０μｇ〜約７５０μｇの総タンパク質となるように調整される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（ｄ）インキュベートする前記ステップが約３０〜約４０℃の温度である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記カラムクロマトグラフィーが、１１−シス−レチノールを９−シス−レチノール及び／又は１３−シス−レチノールから分離する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記カラムクロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記カラムクロマトグラフィーが逆相固定相を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記固定相がＣ１８鎖を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記固定相が親水性基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記親水性基がカルバメート基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記固定相がＣ１８鎖内に親水性カルバメート基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記固定相がシリルカルバメート基を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
細胞当たり約１×１０４〜約２×１０６個のＡＡＶベクターゲノムの線形である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
決定係数（Ｒ２）が約０．８５より大きい、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
[0001]本出願は、２０１６年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／３２８，９１６号に対する優先権を主張する。全ての文章、表、配列表及び図面を含む上記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［導入］
[0002]イソメロヒドロラーゼ活性又は効力は、このような酵素によって生成された反応生成物を定量することによって測定することができる。本発明は、イソメロヒドロラーゼ活性及び／又は効力を測定することに関する。
【０００３】
［概要］
[0003]本発明は、イソメロヒドロラーゼ活性を測定及び／又は検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、非放射性イソメロヒドロラーゼ基質又はイソメロヒドロラーゼ基質の前駆体の使用及びイソメロヒドロラーゼによる変換によって生成された非放射性反応生成物の検出を含む。ある特定の実施形態では、方法は、反応生成物を定量し、それによってイソメロヒドロラーゼ活性を測定及び／又は検出するための質量分析の使用を含む。
【０００４】
[0004]特定の実施形態では、イソメロヒドロラーゼ活性を測定及び／又は検出する方法は、（ａ）細胞形質導入を可能にする条件下で、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）を発現する細胞（例えば、真核細胞）を、イソメロヒドロラーゼタンパク質（例えば、ＲＰＥ６５）をコードする導入遺伝子を含むウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）と接触させるステップと、コードされたイソメロヒドロラーゼタンパク質（例えば、ＲＰＥ６５）の発現を可能にする条件下でウイルスベクターにより形質導入された細胞をインキュベートするステップと、形質導入細胞を溶解して、コードされたイソメロヒドロラーゼタンパク質を含む抽出物（例えば、細胞抽出物）を生成するステップと、イソメロヒドロラーゼタンパク質による基質の反応生成物への変換を可能にする時間及び条件下で抽出物（例えば、細胞抽出物）を基質とインキュベートするステップと、反応生成物をカラム（液体）クロマトグラフィーに供し、それによってカラム（液体）クロマトグラフィーにより精製された反応生成物を生成するステップと、前記カラム（液体）クロマトグラフィーにより精製された反応生成物を質量分析に供し、それによって反応生成物を定量するステップであって、反応生成物の量はイソメロヒドロラーゼ活性を反映し、それによってイソメロヒドロラーゼ活性を測定するステップとを含む。
【０００５】
[0005]種々の実施形態では、イソメロヒドロラーゼタンパク質は、網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む。種々の実施形態では、イソメロヒドロラーゼタンパク質は、野生型網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む。種々の実施形態では、イソメロヒドロラーゼタンパク質は、バリアント又は突然変異体網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む。種々の実施形態では、イソメロヒドロラーゼタンパク質は、哺乳動物網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む。種々の実施形態では、イソメロヒドロラーゼタンパク質は、ヒト網膜色素上皮特異的タンパク質、６５−ＫＤ（ＲＰＥ６５）を含む。
【０００６】
[0006]種々の実施形態では、形質導入された細胞は哺乳動物細胞を含む。種々の実施形態では、形質導入された細胞はヒト細胞を含む。種々の実施形態では、形質導入された細胞はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を含む。
【０００７】
[0007]種々の実施形態では、形質導入された細胞は安定に又は一過性にＬＲＡＴを発現する。種々の実施形態では、形質導入された細胞はＣＲＡＬＢＰを安定に又は一過性に発現する。種々の実施形態では、形質導入された細胞はＬＲＡＴ及び／又はＣＲＡＬＢＰを安定に又は一過性に発現する。
【０００８】
[0008]種々の実施形態では、基質はオール−トランス−レチニルエステルを含む。
【０００９】
[0009]種々の実施形態では、ステップ（ｄ）は基質の前駆体を抽出物に添加することを含み、前駆体は、発現されたＬＲＡＴによって基質に変換される。種々の実施形態では、ステップ（ｄ）は、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）及び基質の前駆体を抽出物に添加することを含み、前駆体は、発現されたＬＲＡＴによって基質に変換される。
【００１０】
[0010]種々の実施形態では、添加されるＣＲＡＬＢＰの量は、約５０から約５００μｇの間である。
【００１１】
[0011]種々の実施形態では、前駆体は、オール−トランスレチノールを含むか、又はオール−トランスレチノールからなる。種々の実施形態では、オール−トランスレチノールなどの前駆体は、最終濃度が約１〜約２０ｍＭであるように添加される。
【００１２】
[0012]種々の実施形態では、反応生成物は、１１−シス−レチノールを含むか、又は１１−シス−レチノールからなる。
【００１３】
[0013]種々の実施形態では、ステップ（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）は、暗所、薄暗い光の下又は薄暗い黄色の光の下で実施される。
【００１４】
[0014]種々の実施形態では、基質、前駆体又は反応生成物は非放射性である。
【００１５】
[0015]種々の実施形態では、ステップ（ｄ）の時間は約３０分〜約２４０分である。
【００１６】
[0016]種々の実施形態では、ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前に、反応は停止又はクエンチされる。種々の実施形態では、ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前に、アルコールが添加される。
【００１７】
[0017]種々の実施形態では、ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前に、反応生成物は抽出される。種々の実施形態では、ステップ（ｄ）の後であるが、ステップ（ｅ）の前に、反応生成物は、ヘキサンなどの有機溶媒により抽出される。
【００１８】
[0018]種々の実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｄ）のいずれかの方法は、実施例１に記載されているように実施される。
【００１９】
[0019]種々の実施形態では、ステップ（ｅ）〜（ｆ）のいずれかの方法は、実施例２に記載されているように実施される。
【００２０】
[0020]種々の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０から選択されるいずれかの血清型のカプシドタンパク質配列又は逆方向末端反復配列と７０％以上の配列同一性を有するカプシドタンパク質配列又は逆方向末端反復配列を含む。
【００２１】
[0021]種々の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０から選択されるいずれかの血清型のカプシドタンパク質又は逆方向末端反復を含む。
【００２２】
[0022]種々の実施形態では、（ａ）細胞を接触させるステップが、１個の細胞当たり約５００〜約５００万個のＡＡＶベクター粒子の量である。種々の実施形態では、（ａ）細胞を接触させるステップが、１個の細胞当たり約１，０００〜約１，０００，０００個のＡＡＶベクター粒子の量である。種々の実施形態では、（ａ）細胞を接触させるステップが、１個の細胞当たり約２，０００〜約５００，０００個のＡＡＶベクター粒子の量である。
【００２３】
[0023]種々の実施形態では、ステップ（ｂ）は、約６時間〜約９６時間の時間、形質導入細胞をインキュベートすることを含む。
【００２４】
[0024]種々の実施形態では、（ｃ）の形質導入細胞を溶解するステップは、凍結融解、超音波処理又はそれらの組合せによる。
【００２５】
[0025]種々の実施形態では、ステップ（ｃ）の後に生成される総細胞タンパク質の量が決定される。種々の実施形態では、ステップ（ｃ）の後に生成される総細胞タンパク質の量が、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイによって決定される。
【００２６】
[0026]種々の実施形態では、前駆体は、ＤＭＦの１０〜１００％溶液と混合される。
【００２７】
[0027]種々の実施形態では、細胞を収集した後であるが、（ｃ）溶解するステップの前に、収集した細胞は緩衝液に再懸濁される。
【００２８】
[0028]種々の実施形態では、（ｃ）収集した細胞を溶解して抽出物を生成するステップの後、抽出物が緩衝液に希釈される。
【００２９】
[0029]種々の実施形態では、緩衝液は塩緩衝液である。種々の実施形態では、緩衝液はＮａＣｌ緩衝液である。
【００３０】
[0030]種々の実施形態では、ステップ（ｃ）によって生成された抽出物は、約１０μｇ〜約２，０００μｇの総細胞タンパク質を含むか、又は約１０μｇ〜約２，０００μｇの総タンパク質となるように調整される。
【００３１】
[0031]種々の実施形態では、ステップ（ｃ）によって生成された抽出物は、約５０μｇ〜約７５０μｇの総細胞タンパク質を含むか、又は約５０μｇ〜約７５０μｇの総タンパク質となるように調整される。
【００３２】
[0032]種々の実施形態では、（ｄ）インキュベートするステップは約３０〜約４０℃の温度である。
【００３３】
[0033]種々の実施形態では、カラムクロマトグラフィーは、１１−シス−レチノールを９−シス−レチノール及び／又は１３−シス−レチノールから分離する。
【００３４】
[0034]種々の実施形態では、カラムクロマトグラフィーは逆相クロマトグラフィーを含む。種々の実施形態では、カラムクロマトグラフィーは逆相固定相を含む。
【００３５】
[0035]種々の実施形態では、固定相はＣ１８鎖を含む。種々の実施形態では、固定相は親水性基を含む。種々の実施形態では、親水性基はカルバメート基を含む。種々の実施形態では、固定相はＣ１８鎖内に親水性カルバメート基を含む。種々の実施形態では、相はシリルカルバメート基を含む。
【００３６】
[0036]種々の実施形態では、方法は、細胞当たり約１×１０４〜約２×１０６個のＡＡＶベクターゲノムの線形である。
【００３７】
[0037]種々の実施形態では、方法の決定係数（Ｒ２）は約０．８５より大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】視覚サイクルにおけるＲＰＥ６５機能の概要を示す図である。
【図２】全体的なベクターベースのＲＰＥ６５効力アッセイを要約している図である。１１−シス−レチノールはヘキサンにより抽出され、続いて液体クロマトグラフィー／質量分析によって分析される。
【図３】標準曲線（上側パネル）及び液体クロマトグラフィーによる１１−シス−レチノールの溶出プロファイルを示す図である。
【図４】種々の濃度を評価することによるＣＲＡＬＢＰ及びオールトランスレチノール（ａｔＲＯＬ）の最適化を示す図である。このアッセイでは、最適ＣＲＡＬＢＰは１０μΜであり、最適ａｔＲＯＬは１．０μΜである。
【図５】ＲＰＥ６５の合計９回のアッセイによるアッセイの再現性を示す図である。
【図６】ＡＡＶ−ＲＰＥ６５  ＭＯＩの増加に伴う１１−シス−レチノール生成の増加を示す図である。８つの異なるＭＯＩを評価した。ＢＬＯＱ＝定量レベル未満。ＳＤ＝標準偏差。ＣＶ＝変動係数。
【図７】５つの異なるＭＯＩにおける２つの異なるＡＡＶ−ＲＰＥ６５ベクターロットからの１１−シス−レチノール分析を示す図である。
【図８】アッセイ１４からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び製剤緩衝液の特異性試料（明）についてのＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【図９】希釈曲線を示す図である：記号は、１３のアッセイのそれぞれの標的効力値に対してプロットした表１１に記載されている１３のアッセイからの推定相対効力値を表す。適合した回帰直線は、ＰＬＡ  ｖ３．０＝−０．１１２８１５＋１．１６４９９７５＊標的レベルによって報告された相対効力（ＲＰ）である。
【図１０】アナリスト１（又はアナリスト２）、Ｐｒｅｐ  １、９つのＭＯＩに関するプレートマップ例、分析参照標準物対試料（試験品）（レベル１００％精度）を示す図である。
【図１１】アナリスト１（又はアナリスト２）、Ｐｒｅｐ  １、９つのＭＯＩに関するプレートマップ例、分析参照標準物対試料（試験品）（レベル５０％精度）を示す図である。
【図１２】アナリスト１（又はアナリスト２）、Ｐｒｅｐ  １、９つのＭＯＩに関するプレートマップ例、分析参照標準物対試料（試験品）（レベル１５０％精度）を示す図である。
【図１３】表１１から各標的レベルについて推定された相対バイアス（ドット）及びその９０％信頼区間を示す図である。
【図１４】アッセイ１からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び試験品１日目、アナリスト１、５０％（明）に関するＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【図１５】アッセイ２反復からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び試験品１日目、アナリスト１、５０％（明）に関するＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【図１６】アッセイ５からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び試験品１日目、アナリスト１、１００％（明）に関するＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【図１７】アッセイ６反復からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び試験品１日目、アナリスト２、１００％（明）に関するＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【図１８】アッセイ９からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び試験品１日目、アナリスト１、１５０％（明）に関するＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【図１９】アッセイ１０からのＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物（暗）及び試験品１日目、アナリスト２、１５０％（明）に関するＰＬＡ３．０用量応答曲線を示す図である。
【００３９】
［詳細な説明］
[0057]本発明は、イソメロヒドロラーゼタンパク質活性及び／又は機能を測定及び／又は検出する方法を提供する。種々の実施形態では、方法は、特異的であり（緩衝液の不干渉）、希釈直線性を有し、正確であり、広範囲の感染多重度（ＭＯＩ）に対する精密さを有する。例えば、公称の方法濃度(ｎｏｍｉｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ)の５０％〜１５０％の範囲、１個の細胞当たり１．００Ｅ＋０４、２．００Ｅ＋０４、４．００Ｅ＋０４、６．００Ｅ＋０４、８．００Ｅ＋０４、１．６０Ｅ＋０５、３．２０Ｅ＋０５、６．４０Ｅ＋０５、１．２８Ｅ＋０６個のベクターゲノム（ｖｇ）の感染多重度（ＭＯＩ）が、直線性、正確性及び精度データによって支持される。
【００４０】
[0058]本明細書に記載されているイソメロヒドロラーゼタンパク質活性及び／又は機能を測定及び／又は検出する本発明の方法は、薬物物質（ＤＳ）及び薬物製品（ＤＰ）の両方を試験するために適格な方法を含む。システム適合性基準が各分析セットについて満たされた。本発明の方法は、その意図された目的に適切であることが示されている方法を含む。
【００４１】
[0059]本発明において有用なイソメロヒドロラーゼ核酸及びタンパク質配列は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）などのレチノイドイソメロヒドロラーゼを含む。オール−トランス−レチニル−パルミテートヒドロラーゼとも称されるレチノイドイソメロヒドロラーゼ及び他の同義語としてのレチノールイソメラーゼは、１１−シス−レチノールの合成に関与する。（ＲＰＥ６５）は、イソメロヒドロラーゼ活性に関与するか、又はオール−トランス−レチニルエステルを１１−シス−レチノールに変換する脊椎動物の視覚サイクルの酵素である（Ｍｏｉｓｅｙｅｖら、２００５）。オール−トランス−レチノール（ａｔＲＯＬ）はレシチン：レチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）によってエステル化され、次いでエステルは異性化反応のためにＲＰＥ６５に提示される（Ｍｏｉｓｅｙｅｖら、２００３）。
【００４２】
[0060]Ｒｐｅ６５欠損症に関連する疾患には、例えば、レーバー先天性黒内障及び網膜色素変性症２０が含まれる。
【００４３】
[0061]代表的なヒトＲＰＥ６５タンパク質は以下のように示される：
ＭＳＩＱＶＥＨＰＡＧ  ＧＹＫＫＬＦＥＴＶＥ  ＥＬＳＳＰＬＴＡＨＶ  ＴＧＲＩＰＬＷＬＴＧ  ＳＬＬＲＣＧＰＧＬＦ  ＥＶＧＳＥＰＦＹＨＬ  ＦＤＧＱＡＬＬＨＫＦ  ＤＦＫＥＧＨＶＴＹＨ  ＲＲＦＩＲＴＤＡＹＶ  ＲＡＭＴＥＫＲＩＶＩ  ＴＥＦＧＴＣＡＦＰＤ  ＰＣＫＮＩＦＳＲＦＦ  ＳＹＦＲＧＶＥＶＴＤ  ＮＡＬＶＮＶＹＰＶＧ  ＥＤＹＹＡＣＴＥＴＮ  ＦＩＴＫＩＮＰＥＴＬ  ＥＴＩＫＱＶＤＬＣＮ  ＹＶＳＶＮＧＡＴＡＨ  ＰＨＩＥＮＤＧＴＶＹ  ＮＩＧＮＣＦＧＫＮＦ  ＳＩＡＹＮＩＶＫＩＰ  ＰＬＱＡＤＫＥＤＰＩ  ＳＫＳＥＩＶＶＱＦＰ  ＣＳＤＲＦＫＰＳＹＶ  ＨＳＦＧＬＴＰＮＹＩ  ＶＦＶＥＴＰＶＫＩＮ  ＬＦＫＦＬＳＳＷＳＬ  ＷＧＡＮＹＭＤＣＦＥ  ＳＮＥＴＭＧＶＷＬＨ  ＩＡＤＫＫＲＫＫＹＬ  ＮＮＫＹＲＴＳＰＦＮ  ＬＦＨＨＩＮＴＹＥＤ  ＮＧＦＬＩＶＤＬＣＣ  ＷＫＧＦＥＦＶＹＮＹ  ＬＹＬＡＮＬＲＥＮＷ  ＥＥＶＫＫＮＡＲＫＡ  ＰＱＰＥＶＲＲＹＶＬ  ＰＬＮＩＤＫＡＤＴＧ  ＫＮＬＶＴＬＰＮＴＴ  ＡＴＡＩＬＣＳＤＥＴ  ＩＷＬＥＰＥＶＬＦＳ  ＧＰＲＱＡＦＥＦＰＱ  ＩＮＹＱＫＹＣＧＫＰ  ＹＴＹＡＹＧＬＧＬＮ  ＨＦＶＰＤＲＬＣＫＬ  ＮＶＫＴＫＥＴＷＶＷ  ＱＥＰＤＳＹＰＳＥＰ  ＩＦＶＳＨＰＤＡＬＥ  ＥＤＤＧＶＶＬＳＶＶ  ＶＳＰＧＡＧＱＫＰＡ  ＹＬＬＩＬＮＡＫＤＬ  ＳＥＶＡＲＡＥＶＥＩ  ＮＩＰＶＴＦＨＧＬＦＫＫＳ（配列番号１）
【００４４】
[0062]更なるＲＰＥ６５タンパク質には、国際公開第２０１６０１８８１６Ａ１号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものなどのバリアントが含まれる。
【００４５】
[0063]「ベクター」という用語は、小さな担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入若しくは組み込みによって操作することができる他のビヒクルを指す。ベクターは、遺伝子操作（すなわち、「クローニングベクター」）のために、ポリヌクレオチドを細胞に導入／移入するために、及び挿入されたポリヌクレオチドを細胞内で転写又は翻訳するために使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞内での発現に必要とされる必須の調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含有するベクターである。ベクター核酸配列は、一般に、細胞内での増殖のための複製起点及び任意選択でイソメロヒドロラーゼ核酸配列、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、任意選択の選択可能なマーカー、ポリアデニル化シグナルなどの更なるエレメントを少なくとも含有する。
【００４６】
[0064]ＡＡＶベクターはアデノ随伴ウイルスに由来する。ＡＡＶベクターは、それらが、細胞に浸透でき、核酸／遺伝物質を導入でき、その結果、核酸／遺伝物質を細胞内で安定に維持することができるので、遺伝子療法ベクターとして有用である。更に、これらのウイルスは、核酸／遺伝物質を、例えば、第１９染色体の特定の部位などの特定の部位に導入することができる。ＡＡＶはヒトにおける病原性疾患と関連しないので、ＡＡＶベクターは、実質的なＡＡＶの病因又は疾患を引き起こすことなく、ヒト患者に異種核酸配列（例えば、治療用タンパク質及び薬剤）を送達することができる。
【００４７】
[0065]ｒＡＡＶベクターなどのベクターの修飾因子、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの配列の修飾因子としての「組換え」という用語は、組成物が、一般に天然には存在しない様式で操作（すなわち、設計）されていることを意味する。組換えＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＶゲノムに通常は存在しないイソメロヒドロラーゼなどの核酸がウイルスゲノム内に挿入されている場合である。「組換え」という用語は、本明細書においてＡＡＶベクター、並びにＡＡＶベクターを含むポリヌクレオチド、組換え型などの配列を参照して常に使用されているとは限らないが、ポリヌクレオチド、イソメロヒドロラーゼなどは任意のこのような省略にも関わらず明白に含まれる。
【００４８】
[0066]「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶゲノムから野生型ゲノムを除去するために分子法を使用し、イソメロヒドロラーゼをコードする核酸などの非天然（異種）核酸と置き換えることによって、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムに由来する。典型的に、ＡＡＶに関しては、ＡＡＶゲノムの１つ又は両方の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がｒＡＡＶベクターに保持される。ＡＡＶゲノムの全て又は一部が、イソメロヒドロラーゼをコードする異種核酸などのＡＡＶゲノム核酸に関して非天然の配列と置き換えられているので、ｒＡＡＶはＡＡＶゲノムと区別される。従って、非天然の配列の組み込みは、ＡＡＶを「組換え」ＡＡＶベクターと定義し、これは「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。
【００４９】
[0067]組換えＡＡＶベクター配列はパッケージ化することができ、本明細書においてｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の後の感染（形質導入）のための「粒子」と称することができる。組換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子内でカプシドに包まれるか、又はパッケージングされる場合、粒子は、「ｒＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ粒子」又は「ｒＡＡＶビリオン」とも称することができる。このようなｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶビリオンには、ベクターゲノムをカプシドに包むか、又はパッケージングするタンパク質が含まれる。特定の例には、ＡＡＶの場合にはカプシドタンパク質が含まれる。
【００５０】
[0068]ベクター「ゲノム」とは、ｒＡＡＶ粒子を形成するために最終的にパッケージングされるか、又はカプシドに包まれる組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドが組換えＡＡＶベクターを構築又は製造するために使用される場合、ＡＡＶベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は「プラスミドバックボーン」と呼ばれ、これは、増殖及び組換えウイルス産生に必要とされるプロセスである、プラスミドのクローニング及び増幅にとって重要であるが、それ自体はｒＡＡＶ粒子にパッケージングされないか、又はカプシドに包まれない。従って、ベクター「ゲノム」とは、ｒＡＡＶによってパッケージングされるか、又はカプシドに包まれる核酸を指す。
【００５１】
[0069]「ＡＡＶヘルパー機能」とは、後で生産的なＡＡＶ複製及びパッケージングのためにトランスで機能するＡＡＶ遺伝子生成物及びＡＡＶベクターを提供するように発現することができるＡＡＶ由来のコード配列（タンパク質）を指す。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要ＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐの両方を含む。Ｒｅｐ発現生成物は、とりわけ、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションを含む多くの機能を有することが示された。Ｃａｐ発現生成物（カプシド）は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターゲノムから失われているトランスでのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
【００５２】
[0070]「ＡＡＶヘルパー構築物」とは、一般に、例えば、対象に対する遺伝子療法によって、目的の核酸配列を送達するための形質導入ＡＡＶベクターを生成するために使用されるＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸配列を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子の一過性の発現を提供して、ＡＡＶベクター複製に必須である、失われているＡＡＶ機能を補完するために一般に使用される。ヘルパー構築物は、一般に、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠失しており、それら自体では、複製もパッケージングもすることができない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス又はビリオンの形態であってもよい。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現生成物の両方をコードするプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５などの多くのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと）。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現生成物をコードする多くの他のベクターが記載されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第６，３７６，２３７号を参照のこと）。
【００５３】
[0071]「補助機能」という用語は、ＡＡＶが複製に関して依存性である、非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能を指す。この用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ  ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ  ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現生成物の合成及びＡＡＶカプシドパッケージングに関与する部分を含む、ＡＡＶ複製に必要とされるタンパク質及びＲＮＡを含む。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来していてもよい。
【００５４】
[0072]「補助機能ベクター」とは、一般に、補助機能を提供するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。そのような配列は補助機能ベクターにあってもよく、適切な宿主細胞にトランスフェクトされていてもよい。補助機能ベクターは宿主細胞によるｒＡＡＶビリオン生成を支援することができる。補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態であってもよい。更に、アデノウイルス遺伝子の完全な補完は補助機能に必要とされない。例えば、ＤＮＡ複製及び後期遺伝子合成を行うことができないアデノウイルス突然変異体は、ＡＡＶ複製に許容されることが報告されている（Ｉｔｏら、（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：３１７）。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の突然変異体はＡＡＶ複製を支援することが示されており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域が補助機能を提供することにおそらく関与していないことを示している（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５）。Ｅ１領域を欠損しているか、又はＥ４領域を欠失しているアデノウイルスはＡＡＶ複製を支援することができない。従って、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接的又は間接的に、ＡＡＶ複製に必要とされるようである（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５）。他の特徴付けられたアデノウイルス突然変異体は以下を含む：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）、前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１）、前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｉ  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ  ｅｄ．、１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、前出）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に突然変異を有するアデノウイルスによって提供される補助機能の研究により、矛盾する結果がもたらされたが、Ｅ１Ｂ５５ｋはＡＡＶビリオン生成に必要とされることがある一方で、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要とされない（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０）。更に、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：９３８−９４５は、種々のアデノウイルス遺伝子をコードする補助機能ベクターを記載している。例示的な補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４  ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ  ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及び無傷のＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠いているアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。このような補助機能ベクターは、例えば、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。
【００５５】
[0073]本明細書に使用される場合、「血清型」という用語は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に異なるカプシドを有するＡＡＶを指すために使用される特質である。血清学的弁別性は、別のＡＡＶと比較して、抗体と、あるＡＡＶとの間の交差反応性の欠如に基づいて決定される。交差反応性の差異は、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の差異に起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３配列の差異に起因する）。
【００５６】
[0074]従来の定義の下で、血清型は、目的のウイルスが中和活性について全ての存在し、特徴付けられた血清型に特異的な血清に対して試験されており、目的のウイルスを中和する抗体は見出されていないことを意味する。多くの天然に存在するウイルス単離株が発見され、及び／又はカプシド突然変異体が生成されているので、現在存在する血清型のいずれかとの血清学的差異は存在していてもよいか、又はしていなくてもよい。従って、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差異を有さない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又はバリアントである。多くの場合、中和活性についての血清学的試験は、血清型の従来の定義に従って、突然変異ウイルスが別の血清型であるかどうかを決定するために、カプシド配列の修飾を有する突然変異ウイルスに対して依然として実施されている。従って、便宜上、及び繰り返しを避けるために、「血清型」という用語は、血清学的に異なるウイルス（例えば、ＡＡＶ）並びに血清学的に異ならず、所与の血清型のサブグループ又はバリアントの範囲内であってもよいウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広範に指す。
【００５７】
[0075]ｒＡＡＶベクターは任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノム若しくは粒子（カプシドタンパク質）は、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１などの任意のＡＡＶ血清型に基づいていてもよい。このようなベクターは、同じ株又は血清型（又はサブグループ又はバリアント）に基づいていてもよいか、又は互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、ある血清型ゲノムに基づくｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノム若しくは粒子（カプシド）は、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の１つ又は複数と同一であってもよい。更に、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノムは、ベクターゲノムをパッケージングするカプシドタンパク質の１つ又は複数とは異なるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）血清型ゲノムに基づいていてもよく、この場合、３つのカプシドタンパク質のうちの少なくとも１つは、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はそれらのバリアントであってもよい。従って、ｒＡＡＶベクターは、特定の血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列、並びに混合血清型を含む。
【００５８】
[0076]種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１カプシドタンパク質と少なくとも７０％又はそれ以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）同一であるカプシド配列を含むか、又はそれからなる。種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つ又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１逆方向末端反復（ＩＴＲ）と少なくとも７０％又はそれ以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など）同一である配列を含むか、又はそれからなる。
【００５９】
[0077]ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１などのｒＡＡＶ、並びにバリアント、ハイブリッド及びキメラ配列は、１つ又は複数の機能的ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接した異種ポリヌクレオチド（イソメロヒドロラーゼ配列）を含むように、当業者に公知である組換え技術を使用して構築することができる。このようなベクターは、全体的又は部分的に欠失しているが、組換えベクターのｒＡＡＶベクター粒子への救出、複製、及びパッケージングに必要な場合、少なくとも１つの機能的フランキングＩＴＲ配列（複数可）を保持している野性型ＡＡＶ遺伝子のうちの１つ又は複数を有する。従って、ｒＡＡＶベクターゲノムは、複製及びパッケージングのためにシスで必要とされる配列（例えば、機能的ＩＴＲ配列）を含む。
【００６０】
[0078]ｒＡＡＶビリオンを生成するための方法は当該技術分野において公知である。例えば、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）との同時感染と併せたＡＡＶベクター及びＡＡＶヘルパー配列を使用するトランスフェクション、又は組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及び補助機能ベクターによるトランスフェクション。ｒＡＡＶビリオンを生成するための非限定的な方法は、例えば、米国特許第６，００１，６５０号及び同第６，００４，７９７号に記載されている。組換えｒＡＡＶベクター生成（すなわち、細胞培養系におけるベクター生成）の後、ｒＡＡＶビリオンは、宿主細胞及び細胞培養上清から得ることができ、任意選択で精製することができる。
【００６１】
[0079]「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドの全ての形態を指すために本明細書において交換可能に使用される。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、並びにスプライスされた又はスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小若しくは短ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小分子若しくは低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランス−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。核酸には、天然に存在する、合成、及び意図的に修飾又は改変されたポリヌクレオチドが含まれる。核酸は、一重、二重、又は三重、線状又は環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸を説明する際に、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’の方向に配列を提供する慣例に従って本明細書に記載することができる。
【００６２】
[0080]「宿主細胞」は、例えば、ＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶヘルパー構築物、補助機能ベクター、又は他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することができるか、又は使用されている、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を意味する。この用語は、トランスフェクトされている元の細胞の子孫を含む。従って、「宿主細胞」とは、一般に、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされている細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的、又は意図的な突然変異に起因して、元の親と形態において、又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補体において必ずしも完全に同一でなくてもよいことは理解される。例示的な宿主細胞には、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞が含まれる。
【００６３】
[0081]「形質導入細胞」は、導入遺伝子（例えば、イソメロヒドロラーゼ配列）が導入されている細胞である。従って、「形質導入」細胞は、外因性分子、例えば、核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞への組み込み後の細胞における遺伝子変化を意味する。「形質導入」はまた、その子孫も含む。細胞（複数可）は増殖（培養）させることができ、導入されたタンパク質（例えば、イソメロヒドロラーゼタンパク質）を発現させるか、又はｒＡＡＶなどのベクターが細胞によって生成される。培養細胞の場合、異種核酸配列などの核酸配列、又は染色体に挿入されているプラスミド若しくはベクターは、複数の細胞継代の過程にわたって維持することができる。
【００６４】
[0082]「細胞株」とは、適切な培養条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで連続的又は長期間の増殖及び分裂が可能な細胞の集団を指す。細胞株は単一の前駆細胞に由来するクローン集団であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。細胞株において、自然発生的又は誘導された変化が、そのようなクローン集団の保存又は移入の間、並びに組織培養における長期間の継代の間、核型において生じる可能性がある。従って、細胞株に由来する子孫細胞は祖先細胞又は培養物と正確に同一でなくてもよい。本発明の活性方法に適用可能な例示的な細胞株は、ＨＥＫ−ＬＲＡＴ細胞などのＨＥＫ２９３である。
【００６５】
[0083]「発現制御エレメント」とは、作動可能に連結している核酸の発現に影響を及ぼす核酸配列（複数可）を指す。プロモーター及びエンハンサーなどの本明細書に記載されている発現制御エレメントを含む制御エレメント。ｒＡＡＶベクターは１つ又は複数の「発現制御エレメント」を含むことができる。典型的に、このようなエレメントは、適切な異種ポリヌクレオチド転写及び適切な場合には翻訳（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンについてのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、及び停止コドンなど）を容易にするために含まれる。このようなエレメントは、典型的に、「シス作用」エレメントと称されているシスで作用するが、トランスでも作用することができる。
【００６６】
[0084]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルにて行うことができる。典型的に、転写をモジュレートする発現制御エレメントが、転写された核酸の５’末端（すなわち、「上流」）の近くに並置される。発現制御エレメントはまた、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流」）に、又は転写産物内（例えば、イントロン内）に位置していてもよい。発現制御エレメントは、転写された配列（例えば、ポリヌクレオチド由来の１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００又はそれ以上のヌクレオチド）に隣接して、又はそれから離れた距離に、更にかなりの距離にさえ位置していてもよい。それにも関わらず、ｒＡＡＶベクターの長さの制限のために、発現制御エレメントは、典型的に、転写された核酸から１〜１０００ヌクレオチド以内にある。
【００６７】
[0085]機能的に、作動可能に連結している核酸の発現は、エレメントが核酸の転写、及び適切な場合、転写物の翻訳をモジュレートするようにエレメント（例えば、プロモーター）によって少なくとも部分的に制御可能である。発現制御エレメントの特定の例はプロモーターであり、これは、通常、転写された配列の５’に位置している。プロモーターは、典型的に、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作動可能に連結している核酸から発現される量を増加させる。
【００６８】
[0086]本明細書に使用される場合、「エンハンサー」とは、選択可能なマーカーなどの核酸配列、又は異種核酸配列に隣接して位置している配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的に、プロモーターエレメントの上流に位置しているが、また、配列の下流又は配列内で機能し、配列の下流又は配列内に位置していてもよい。従って、エンハンサーエレメントは、上流又は下流に、例えば、選択可能なマーカー、並びに／又は治療用タンパク質若しくはポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸の１００塩基対、２００塩基対、又は３００若しくはそれ以上の塩基対内に位置していてもよい。エンハンサーエレメントは、典型的に、プロモーターエレメントによって提供される発現よりも、作動可能に連結している核酸の発現を増加させる。
【００６９】
[0087]「作動可能に連結している」という用語は、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現をもたらすように、配列に対して適切な位置に配置されることを意味する。この同じ定義は、時々、発現ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターにおける核酸配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結エレメント）の配置に適用される。
【００７０】
[0088]核酸と作動可能に連結している発現制御エレメントの例において、関係は、制御エレメントが核酸の発現をモジュレートするようなものである。より詳細には、例えば、作動可能に連結している２つのＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡが、ＤＮＡ配列の少なくとも１つが他の配列に対して生理学的作用を与えることができるような関係で（シス又はトランス）配置されることを意味する。
【００７１】
[0089]従って、ベクターについての更なるエレメントには、限定されないが、発現制御（例えば、プロモーター／エンハンサー）エレメント、転写終結シグナル若しくは終止コドン、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列の１つ以上のコピーなどの配列に隣接している５’若しくは３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）配列）、又はイントロンが含まれる。
【００７２】
[0090]更なるエレメントには、例えば、パッケージングを改善し、混入核酸の存在を低減させるための、例えば、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列が含まれる。ＡＡＶベクターは、典型的に、一般に約４ｋｂ〜約５．２ｋｂ、又はそれよりわずかに大きいサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入を受容する。従って、より短い配列については、ｒＡＡＶ粒子へのベクターパッケージングに許容されるウイルスゲノム配列の正常なサイズに近いか、又はその長さに調整するために、スタッファー又はフィラーを含める。種々の実施形態では、フィラー／スタッファー核酸配列は核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列については、フィラー又はスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされた（例えば、ベクターに挿入された）場合、約３．０〜５．５Ｋｂの間、又は約４．０〜５．０Ｋｂの間、又は約４．３〜４．８Ｋｂの間の全長を有する長さを有する。
【００７３】
[0091]他に定義されない限り、本明細書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料は本明細書に記載されている。
【００７４】
[0092]本明細書に引用されている全ての出願、刊行物、特許及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、それらの全体が参照として組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。
【００７５】
[0093]本明細書に開示されている特徴の全ては任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各々の特徴は、同じ、等価、又は類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられていてもよい。従って、特に明記しない限り、開示された特徴（例えば、イソメロヒドロラーゼ配列、ベクター、ｒＡＡＶベクターなど）は、等価又は類似の特徴の属の例である。
【００７６】
[0094]本明細書に使用されている場合、単数形「一つの（ａ）」、「及び」、及び「その」は、文脈が明らかに別様を示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ＡＡＶベクター」又は「ＡＡＶ粒子」への言及は、複数のこのようなＡＡＶベクター及びＡＡＶ粒子を含み、「細胞」又は「宿主細胞」への言及は、複数の細胞及び宿主細胞を含む。
【００７７】
[0095]本明細書に使用されている場合、「約」という用語は、基準値の１０％（プラス又はマイナス）以内である値を意味する。
【００７８】
[0096]本明細書に使用されている場合、全ての数値又は数値範囲は、文脈が明らかに別様を示さない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の分数を含む。従って、例示するために、８０％又はそれ以上の同一性への言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％など、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％など、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％などを含む。
【００７９】
[0097]より多い（より大きい）又はより小さい整数への言及は、それぞれ、参照の数字より大きい、又は小さい任意の数字を含む。従って、例えば、１００未満への言及は、９９、９８、９７などと下がって数字１までを含み、１０未満は、９、８、７などと下がって数字１までを含む。
【００８０】
[0098]本明細書に使用されている場合、全ての数値又は範囲は包括的である。更に、全ての数値又は範囲は、文脈が明らかに別様を示さない限り、そのような範囲内の値及び整数の分数、並びにそのような範囲内の整数の分数を含む。従って、例示するために、１〜１０などの数値範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５などを含む。従って、１〜５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などと上がって５０を含み、同様に１．１、１．２、１．３、１．４、１．５など、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５などを含む。
【００８１】
[0099]範囲のシリーズへの言及は、シリーズ内の異なる範囲の境界の値を組み合わせた範囲を含む。従って、例示するために、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００の範囲のシリーズへの言及は、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００などの範囲を含む。
【００８２】
[0100]本発明は、一般に、多数の実施形態及び態様を説明するために肯定的な表現を使用して本明細書に開示されている。本発明はまた、物質又は材料、方法ステップ及び条件、プロトコール又は手順などの特定の対象の内容が、全部又は一部排除される実施形態も特に含む。例えば、本発明のある特定の実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが排除される。従って、本発明が何を含まないかについて、本発明が一般に本明細書に表現されていなかったとしても、本発明において明白には排除されない態様がやはり本明細書に開示されている。
【００８３】
[0101]複数の本発明の実施形態が記載されている。しかし、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多様な用途及び条件に合わせて、本発明を改変するために、本発明の様々な変更及び修飾を行うことができる。従って、以下の実施例は、例示することを意図するが、特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１
（プロトコール概要）
[0102]ＲＰＥ６５（ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２）のＨＥＫ−ＬＲＡＴ細胞への対応するウイルス形質導入と共に、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼを有するヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ−ＬＲＡＴ細胞）の細胞培養のためのプロトコールを開発した。このプロトコールの後に、イソメラーゼ／イソメロヒドロラーゼ活性アッセイにおける細胞形質導入から得られたタンパク質の後続の使用を行う。
[0103]ＨＥＫ−ＬＲＡＴ細胞を培養中に増殖させ、その後、平板培養し、形質導入前に３日間増殖させる。形質導入の日に、１ウェルの細胞を計数して細胞数を測定する。形質導入のためのウイルス必要量を細胞数及び所望のＭＯＩに基づいて計算する。形質導入後、細胞を１〜３日間インキュベートし、その後、細胞を分析のために収集する。細胞を収集したら、ペレットを反応緩衝液（１０ｍＭ  ＢＴＰ、１０Ｎ  ＨＣｌによりｐＨ８．０に調整した、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）１００μｌ中でホモジナイズし、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより確認する。１００μｇの総タンパク質を得るのに必要な溶解物の体積を計算し、成分の最終濃度がそれぞれ１０ｍＭ、１００ｍＭ、０．５％及び２５μΜになるように、ＢＴＰ（ｐＨ８．０）、ＮａＣｌ、ＢＳＡ、ＣＲＡＬＢＰ及び水を添加することにより、最終体積を２００μｌにする。この時点から光から保護して、２μＬのオール−トランス−レチノール（１００％ＤＭＦ中で調製した）を添加して、５μΜの最終濃度を得、試料を３７℃にて２時間インキュベートする。２時間後、メタノール中の１０ｍＭ  ＢＨＴ３００μＬを添加し、１分間ボルテックスすることにより反応を停止（クエンチ）させる。次いで試料をヘキサンにより抽出し、分析する。
【００８５】
（機器及び材料）
[0104]一般的な実験機器及び材料（等価の機器に置き換えることができる）。
Ｒａｉｎｉｎ認証ピペット、Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｂｕｒ、ＭＡ
ピペットエイド（Ｐｉｐｅｔ−ａｉｄ）、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ
血清用ピペット、個々に包装されている、ＶＷＲ
微量てんびん、メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）ＡＸ２０５ＤＲ、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
ｐＨメーター、Ｏｒｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
フルオスターオプティマ（ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ）、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ
Ｆｏｒｍａ  ３１００インキュベーター、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ミニボルテックスミキサー、ＶＷＲ
ウォーターバス、ＶＷＲ
冷蔵庫、２〜８℃  Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ
冷凍庫、−３５℃〜−２０℃、Ｋｅｎｍｏｒｅ
冷凍庫、−８０℃、Ｒｅｖｃｏ
清浄器クラスＩＩバイオセーフティーキャビネット（Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔ）（ＢＳＣ）、デルタシリーズ（Ｄｅｌｔａ  Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｌａｂｃｏｎｃｏ
ステリサイクル（Ｓｔｅｒｉ−Ｃｙｃｌｅ）ＣＯ２インキュベーター、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
カウンテス（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ）自動セルカウンター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
カウンテス（商標）セルカウンティングチャンバスライド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、又は等価物。
エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５８０４Ｒ遠心分離器
ビルソニック（Ｖｉｒｓｏｎｉｃ）１００超音波処理器
ニコンエクリプス（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＴＥ３００顕微鏡
１．５ｍＬポリプロピレンマイクロバイアル、ＶＷＲ
１５ｍＬポリプロピレンチューブ、ＶＷＲ
５０ｍＬポリプロピレンチューブ、ＶＷＲ
４ｍＬアンバーガラスバイアル、ＶＷＲ
２０ｍＬガラスバイアル、ＶＷＲ
４０ｍＬアンバーガラスバイアル、ＶＷＲ
１５０ｍＬストレージボトル、Ｃｏｒｎｉｎｇ、
９６ウェルプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
セルスクレーパー、Ｆｉｓｈｅｒ
１０ｃｍナンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）細胞培養ディッシュ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
６ウェルプレート、Ｆｉｓｈｅｒ
Ｔ１５０セルバインド（ＣｅｌｌＢｉｎｄ）フラスコ、Ｃｏｒｎｉｎｇ
Ｔ７５セルバインドフラスコ、Ｃｏｒｎｉｎｇ
セルポート（ＣｅｌｌＰｏｒｔ）ソフトウェア、Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
ＬＮ２クリオタンク（Ｃｒｙｏｔａｎｋ）、２３００シリーズ、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
クリオエライト（ＣｒｙｏＥｌｉｔｅ）２ｍＬ低温バイアル、Ｗｈｅａｔｏｎ
２Ｄマトリクスバーコードインサート（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ｉｎｓｅｒｔ）、Ｗｈｅａｔｏｎ
７０％エタノール、ＶＷＲ
トリパンブルー染色０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
任意の更なる一般的実験機器
【００８６】
（試薬）
注記：特に明記しない限り、異なる供給業者からの同等のグレードの材料の置き換えは許容される。
レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼを含むヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ−ＬＲＡＴ）オール−トランス−レチノール、（合成による、≧９５％ＨＰＬＣ、結晶質）、カタログ番号Ｒ７６３２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯから購入した；
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、（ＢＨＴ、ブチル化ヒドロキシトルエン）、カタログ番号Ｂ１３７８−１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ、（ＨＰＬＣグレード、≧９９．９％）、カタログ番号２７０５４７−１Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ；
メタノール、ＭｅＯＨ、（ＵＨＰＬＣグレード）、カタログ番号Ａ４５６−４、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ；
水、ｄＨ２Ｏ、社内供給、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して脱イオン化し、濾過した（０．２μｍ）；
ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＥＭ、高グルコース、カタログ番号１１９６５−０９２、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（１００Ｘ）、（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ−Ｇｌｕｔ）、カタログ番号１０３７８−０１６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
ウシ胎仔血清、認証済み、加熱不活性化した、ＵＳ起源、カタログ番号１００８２−１４７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
ブラストサイジンＳ  ＨＣｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号Ａ１１１３９−０３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、カタログ番号２５２００．０５６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、１Ｘ）、カタログ番号１４１９０−１４４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）、カタログ番号１５５７５−０２０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ；
３７％発煙塩酸（ＨＣｌ）、カタログ番号１００３１７１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；
ＢＴＰ（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン）、カタログ番号：Ｂ６７５５−１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ；
ＮａＣｌ、カタログ番号０２４１−２．５ＫＧ、Ａｍｒｅｓｃｏ；
ＢＳＡ（アルブミン、ウシ血清）、カタログ番号１２６５７９−１００ＧＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；
サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（商標）ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（商標）クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）（ブラッドフォード）タンパク質アッセイ、カタログ番号２３２００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；
ヒトＣＲＡＬＢＰ全長タンパク質、ＥｙｅＣＲＯ；
ヒト網膜色素上皮特異的タンパク質の組換えタンパク質６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）、カタログ番号ＴＰ３１０４３３、Ｏｒｉｇｅｎｅ；
【００８７】
（試薬の調製）
注記：秤量した量及び／又は溶液体積は必要に応じて増加又は減少させてもよい。
ＭｅＯＨ中の１０ｍＭ  ＢＨＴ
ＤＭＦ中の４０μＭ  オール−トランス−レチノール
１００ｍＭ  ＢＴＰ、１０×ストック溶液、ｐＨ８．０
約２８２．３４ｍｇのＢＴＰ（ビス−トリスプロパン、Ｍ．Ｗ．２８２．３３）を秤量し、約９．５ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解する。ＨＣｌによりｐＨ８．０に調整し、次いで最終体積をｄＨ２Ｏにより１０ｍＬにする。４℃にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
１Ｍ  ＮａＣｌ、１０×ストック溶液
約５８４．４ｍｇのＮａＣｌ（塩化ナトリウム、Ｍ．Ｗ．５８．４４）を秤量し、約１０ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解する。４℃にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
５％ＢＳＡ、１０×ストック
約１００．０ｍｇのＢＳＡを秤量し、約２ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解する。４℃にて保存する。３日間で使用期限が切れる。
ＢＴＰ−ＮａＣｌ反応緩衝液、１×溶液
１ｍＬの１０×ＢＴＰを１ｍＬの１０×ＮａＣｌ及び８ｍＬのｄＨ２Ｏと合わせる。十分に混合する。４℃にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
ＤＭＥＭコンプリート
無菌技術を使用したバイオセーフティーキャビネットにおいて、５６．２ｍＬのＨＩ  ＦＢＳ及び５．６ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ−Ｇｌｕｔを５００ｍＬボトルのＤＭＥＭに加える。ボトルを反転させて混合する。調製中にセルポートソフトウェアに加える。２週間で使用期限が切れる。
ブラストサイジンを含むＤＭＥＭコンプリート
無菌技術を使用したバイオセーフティーキャビネットにおいて、０．５６ｍＬのブラストサイジンをフルボトルのＤＭＥＭコンプリートに加える（又は１：１０００にてブラストサイジンをＤＭＥＭコンプリートに加える）。ボトルを反転させて混合する。調製中にセルポートソフトウェアに加える。２週間で使用期限が切れる。
ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ
無菌技術を使用したバイオセーフティーキャビネットにおいて、２．５ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡをフルボトルのｄＰＢＳに加える。ボトルを反転させて混合する。調製中にセルポートソフトウェアに加える。１カ月で使用期限が切れる。
【００８８】
（細胞培養）
１）全ての細胞培養は無菌技術により操作されるべきである。
２）ドキュメンテーション：試薬及び活性は、生成した適切なバーコードを用いて有効な細胞培養ソフトウェアに記録する。ソフトウェアにアクセスできない稀な例では、ソフトウェアに入力するまで実験ノートにデータを記録する。
３）全ての試薬（完全増殖培地、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ）を３７℃の水浴中で予め加温する。
４）生物学的安全キャビネットの内側を７０％エタノールで拭き取る。ＵＶ光に感受性のない全ての材料をキャビネットの内側に置き、細胞培養を開始する前に最低３０分間ＵＶ光を点灯する。
５）解凍のために、バイアルを選択し、解凍前にセルポートソフトウェアを使用して製造クリオタンク（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｒｙｏｔａｎｋ）からバイアルを取り出す。
６）１つのバイアルをクリオタンクから取り出し、水浴中で３７℃にて解凍し、フードに入れる前にＥｔＯＨを用いてバイアルを噴霧する。
７）細胞（１．０×１０Ｅ６細胞／ｍＬにて１ｍＬ）をバイアルから９ｍＬのＤＭＥＭコンプリートを含む１５ｍＬチューブに移す。
８）細胞をピペット操作し、５〜１０回分注することによって穏やかに混合する。
９）細胞を室温にて５分間１２００ＲＰＭで遠心分離し、吸引し、１０ｍＬのＤＭＥＭコンプリートに再懸濁する。
１０）細胞を、１０ｍＬの過剰なＤＭＥＭコンプリート（２０ｍＬの全培地について）を含む１つのコーニングセルバインド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｂｉｎｄ）Ｔ７５に播種した。
１１）フラスコを３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベーターに入れる。
１２）継代：
ａ．全ての試薬（完全増殖培地、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ）を３７℃の水浴中で予め加温する。
ｂ．生物学的安全キャビネットの内側を７０％エタノールで拭き取る。ＵＶ光に感受性のない全ての材料をキャビネットの内側に置き、細胞培養を開始する前に最低３０分間ＵＶ光を点灯する。
ｃ．培養フラスコから培地を吸引する。
ｄ．細胞種類に応じてＥＤＴＡを含むＤＰＢＳを用いて細胞を１回又は２回洗浄する。培養フラスコからＥＤＴＡを含むＤＰＢＳを吸引する。
ｅ．十分な量のトリプシン（０．２５％、ｗ／ｖ）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）溶液を加えて、単層の表面を濡らす（Ｔ７５については１ｍＬ及びＴ１５０については２ｍＬ）。
ｆ．細胞が剥離し始めるまで、フラスコを室温にてインキュベートする。
ｇ．細胞が剥離し始めたら、フラスコを手で穏やかに軽くたたいて、完全な剥離を確実にする。直ちに新鮮な培地を加えて、プロテアーゼ反応を不活性化する。穏やかに５〜１０回上下にピペット操作して、完全な不活性化を確実にし、細胞塊を解離させる。
ｈ．細胞のアリコートを除去し、カウンテス（商標）自動セルカウンターを用いて細胞を計数する。
ｉ．フラスコを所望の継代比率又は細胞密度でインキュベートする（５．０×ｌ０Ｅ５にてＴ１５０フラスコに播種する）。
ｊ．以下の表に従って、フラスコ（複数可）に十分な体積の完全増殖培地を加える：
【表１】
2019514375.tif 000003
ｋ．フラスコを３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベーターに入れる。
ｌ．有効な細胞培養ソフトウェアからのバーコード又はソフトウェアにアクセスできない稀な例では、細胞株、継代数、日付、及びイニシャルをフラスコに標識する。解凍後、１継代の後、ブラストサイジンを含むＤＭＥＭコンプリートをこの時点から培養のために使用する。
【００８９】
（細胞形質導入）
１）全ての細胞培養は無菌技術により操作されるべきである。
２）ドキュメンテーション：試薬及び活性は、生成した適切なバーコードを用いて有効な細胞培養ソフトウェアに記録する。ソフトウェアにアクセスできない稀な例では、ソフトウェアに入力するまで実験ノートにデータを記録する。
３）細胞を解離し、セクション１２ａ〜ｈのステップに従って計数した。
４）細胞を、形質導入のために、１．０×１０Ｅ６細胞／ウェルにて６ウェルプレート（６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｖｅｎｄｅｒ  ＃３５３０４６、Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号０８−７７２−１Ｂ）又は１．０×１０Ｅ６細胞／プレートにて１００ｍｍプレート（１００ｍｍプレート、ナンクロンサーフェス（Ｎｕｎｃｌｏｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ）、Ｖｅｎｄｅｒ  ＃１５０３５０、Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号１２５６５０２０）に播種した。計数のために全ての形質導入プラス１について十分なウェル／プレートを平板培養する。
５）形質導入は播種の１日後に実施する。
６）形質導入の日に、培地、トリプシン及びｄＰＢＳ＋ＥＤＴＡを加温する。
７）ｅＱＣＭから、使用するプレートタイプに適した形質導入テンプレート（ｅＱＣＭに加えられるプロセスにおけるテンプレート）を開いて計算のために使用する。
８）ウェルから培地を吸引して計数する。
９）０．５ｍＬのトリプシンをウェルに加え、細胞が放出されるまで１〜２分インキュベートし、次いで計数のために４．５ｍＬのｄＰＢＳを加える。１００ｍｍディッシュについては、２ｍＬのトリプシンをプレートに加え、細胞が放出されるまで１〜２分インキュベートし、次いで計数のために８ｍＬのｄＰＢＳを加える。
１０）溶液の全てを１５ｍＬチューブに移し、ボルテックスして解離を確実にする。
１１）１０μＬを除去し、１０μＬのトリパンブルーに加え、計数を実施する。
例：      細胞／ｍＬ      体積（ｍＬ）      全細胞
１．７Ｅ＋０５        ５            ８．５Ｅ＋０５
１２）ウイルスプロセス：９つのＭＯＩ及び２つのベクターを用いて３０個のウェルを形質導入する＝３個のウェル／ＭＯＩ。形質導入及びＭＯＩの数は、最適化するまで変更してもよい。
【表２】
2019514375.tif 000004
１３）細胞計数に基づいて、ＡＡＶ処理の体積を計算することができる：
【表３】
2019514375.tif 000005
【表４】
2019514375.tif 000006
１４）表２に示した適切な命名を用いて１５又は５０ｍＬチューブを標識する。
１５）表３及び４のフォーマットに従って、全ての条件＋約５％に適合するように、適切な体積のＡＡＶ処理培地を作製する。
１６）２ｍＬの適切な処理を、標識したウェルの各々に穏やかに加える。無菌完全培地をＮＴＣプレート用の３つのウェルに加える。１０ｍＬの培地を１００ｍｍディッシュに使用する。
１７）プレートを２．５〜３日間インキュベートする。
１８）細胞を採取する前に、形質導入後の細胞生存を示すために顕微鏡で写真を撮る。
１９）細胞ペレットを、全ての細胞がプレートから解離するまで１ｍＬピペットを用いた電力洗浄によって採取し、１５ｍＬチューブに移し、沈降させ（５分間１２００ＲＰＭ）、培地を吸引し、細胞ペレットを、使用するまで−８０℃にて凍結する。
【００９０】
（タンパク質濃度測定）
１）細胞ペレットを、１００μＬの１×ＢＴＰ−ＮａＣｌ反応緩衝液に再懸濁し（凍結した場合、細胞ペレットを再懸濁によって解凍する）、１．５ｍＬチューブに移す。
２）次いで、溶解物を超音波処理器に運ぶ。超音波処理器をレベル１０から１１の間に、リモートコントロールで設定する。各試料を超音波処理する前後に、プローブを水ですすぐ。超音波処理プローブを試料に入れ、プローブのハンドルのボタンを２回押して、２回素早くパルスする。
３）１×ＢＴＰ−ＮａＣｌ反応緩衝液中の試料の各々の１：５及び１：１０希釈液を調製する。
４）製造業者の指示書（サーモサイエンティフィック（商標）ピアス（商標）クマシー（ブラッドフォード）タンパク質アッセイ、カタログ番号２３２００）に従って希釈アルブミン（ＢＳＡ）標準物を調製する。
５）製造業者の指示書に従って、９６ウェルプレートに５μＬの各々の標準物及び未知の試料希釈物をピペット操作する。全てを二連で実行する。
６）２５０μＬのクマシー試薬（室温に加温した；試薬の繰り返しの加温を避けるために４０ｍＬのアンバーバイアルに４０ｍＬのアリコートを作製し、新たなアリコートを作製する前に室温まで３回アリコートを加温するだけである）を各々のウェルに加える。
７）プレートを室温にて１０分間インキュベートする。
８）フルオスターオプティマを用いて５９５ｎｍでの、又は５９５ｎｍ付近の吸光度を測定し、ブラッドフォード＿ＺＭについての吸光度の下でこの方法を使用する。
ａ．オプティマ−制御プログラムを開く→プログラムの上部にある試験セットアップをクリックする→試験プロトコールをクリックする→左側で吸光度を選択し、方法ブラッドフォード＿ＺＭを選択する→編集をクリックする→レイアウトを選択し、試料をロードする方法に従ってプレートのレイアウトを調整する→ｏｋをクリックして変更を保存する。
ｂ．プログラムの上部にある測定を選択する→方法ブラッドフォード＿ＺＭを選択する→プレートＩＤタブをクリックし、ＩＤＳ（ＩＤ１：プロジェクト名、ＩＤ２：イニシャル、ＩＤ３：日付）を埋める→測定開始をクリックしてプレートを読み取る。
９）実行を保存し、オプティママース（ＯＰＴＩＭＡ  ＭＡＲＳ）データ分析ソフトウェアを開く。開始ファイルをクリックする→ＩＤに基づいて実行用のファイルを選択し、ダブルクリックして開く→プレートグリッドにおける生データの結果を示すために生データの隣のボックスをクリックする→エクセル（Ｅｘｃｅｌ）スプレッドシート「Ｘ」記号のボックスをクリックし、ファイルをエクセルで開く→ファイルを保存し、直ちにｅＱＣＭにファイルをアップロードする。
１０）データ分析：
ａ．ｅＱＣＭから、生データファイル及びブラッドフォード分析テンプレート（ｅＱＣＭに加えられるプロセスにおけるテンプレート）を開く。
【表５】
2019514375.tif 000007
ｂ．標準物についての生の値をコピーし、それらの値を「ブラッドフォード滴定」タブの上部の表にペーストして（表５を参照のこと）、それらの値がバイアルＡ〜Ｈの列の隣に並ぶようにする。これらを重複して実行するので、「複製１及び複製２」の列が存在する。
ｃ．ブランク（標準バイアルＩ）についての生の値である値をコピーしてペーストし、その値を表の「ブランク」の隣のセルにペーストする。
ｄ．「ブランク平均」並びに「正規化した複製１及び２」の値及び「平均」値は自動的に計算される。
ｅ．計算した平均値をコピーし、それらの平均値を、「標準曲線」と標識されたタブの「標準値」の右側の「機器の読み取り」の列にペーストする。これにより、標準曲線は自動的に計算される。
ｆ．「ブラッドフォード滴定」タブに戻り、「複製１及び複製２」についての下部の表（表６を参照のこと）の未知の生データをコピーしてペーストする。「正規化した複製１及び２の値」及び「平均値」は自動的に計算される。試料名はアッセイ毎に変更する必要がある。
【表６】
2019514375.tif 000008
ｇ．計算した平均値をコピーし、「標準曲線」と標識されたタブの標準曲線の右側の「未知の読み取り」の列にそれらの平均値をペーストする。これにより、「計算濃度」が自動的に計算される。
ｈ．「計算濃度」をコピーし、「ブラッドフォード滴定タブ」の下部の表（表６）の「最終ＢＳＡ濃度」の列に結果の値をペーストする。希釈係数を適切な列に加え、「非希釈濃度」は自動的に計算される。
ｉ．見つけやすい場所にファイルを「名前を付けて保存」し、そのファイルに分析日、ブラッドフォード分析、及びプロジェクト情報の名前を付ける。ファイルを直ちにｅＱＣＭにアップロードする。
ｊ．ブラッドフォードの結果をブラッドフォードインデックス及び将来の使用のためのタンパク質使用記録に加える。
ｋ．アッセイに使用するまで、試料を−８０℃に戻す。
【００９１】
（アッセイ試料調製）
１）ｅＱＣＭから、「アッセイプロトコールテンプレート」（ｅＱＣＭに加えられるプロセルにおけるテンプレート）及びブラッドフォード結果を開く。
ａ．試料ＩＤ及び対応するタンパク質濃度をコピーし、「プロトコール」タブの上部の表（表７）にペーストし、「タンパク質体積」は自動的に計算される。採取日を「試料受け取り日」に加える。
【表７】
2019514375.tif 000009
ｂ．試料ＩＤをコピーし、「プロトコール」タブの表８の対応するセルにペーストする。表７からの計算した「タンパク質体積」をコピーし、表８の「総タンパク質μＬ（１００μｇ）」の列の対応するセルにペーストする。「Ｈ２Ｏの体積」は自動的に計算される。
【表８】
2019514375.tif 000010
ｃ．アッセイに使用されているＣＲＡＬＢＰの濃度を２番目の表の下の黒い縁のあるボックスに加え、「ＣＲＡＬＢＰ＊（１８０μｇ〜２５μＭ）（μＬ）」体積は表で自動的に計算される。
ｄ．メタノール中のオール−トランス−レチノール及び１０ｍＭ  ＢＨＴについてのノート番号を生物分析グループから受け取ると、それらを参照のためにテンプレートに加える。
ｅ．見つけやすい場所にファイルを「名前を付けて保存」し、そのファイルに日付、アッセイプロトコール、及びプロジェクト情報の名前を付ける。ファイルを直ちにｅＱＣＭにアップロードする。コピーを印刷してノートに貼り付け、実験室に持っていく。
２）試薬（１０×ＢＴＰ、１０×ＮａＣｌ、及び１０×ＢＳＡ）を室温まで加温する。
３）テンプレートを調製したら、室温にて試料及びアッセイに必要とされるＣＲＡＬＢＰを解凍する。試料が解凍すると、セクション７のステップ２のプロトコールに従ってそれらの試料を再び超音波処理する。
４）２番目の表（表８）に従ってチューブを標識し、以下の順序で反応成分を加える：２番目の表（表８）に従ってｄＨ２Ｏ、１０×ＢＳＡ、１０×ＢＴＰ、１０×ＮａＣｌ、試料タンパク質、及び次いでＣＲＡＬＢＰ。タンパク質を除いて各成分を素早くボルテックスし、その後、その各成分をチューブに加える。これは明所で完了することができる。
５）この時点からは全て、薄暗い黄色の光の下の暗所で行わなければならない。
ａ．オール−トランス−レチノールをボルテックスして、そのオール−トランス−レチノールを試料に添加する前にそのオール−トランス−レチノールが十分に混合していることを確実にする。オール−トランス−レチノールからチップの外側の過剰な量の残留物を注意深く監視しながら、１００％ＤＭＦ中の５００μΜのオール−トランス−レチノール２μｌを各試料に直接注意深く加える。試料間でチップを交換する。
ｂ．オール−トランス−レチノールを試料の全てに添加してから、試料の全てを素早くボルテックスし、それらの試料を３７℃のインキュベーターに２時間置く（試料には黒色のチューブラックの使用が理想的である）。
ｃ．２時間後、メタノール中の１０ｍＭのＢＨＴ３００μＬを加えることによって反応を停止させ、試料を１分間ボルテックスする。
ｄ．分析の前に、試料を箱に入れ、それらの試料が光から十分に保護されていることを確実にする。
【００９２】
実施例２
（方法の概要）
[0105]ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を、反応マトリクスにおける１１−シス−レチノールの分析のために開発した。ＬＬＥ（液液抽出）を使用することによって試料を調製する。反応マトリクスの２００μＬアリコートを、３００μＬのＭｅＯＨ  ｗ／１０ｍＭのＢＨＴ（ＢＨＴ：ブチル化ヒドロキシトルエン）、２０μＬのＳＴＤ又はＱＣ希釈標準溶液、２０μＬの内部標準希釈標準溶液（５００ｎＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５）、及び３００μＬのヘキサンと十分に混合する。試料を激しくボルテックスし、遠心分離する。上部有機層を清浄な９６ウェルプレートに注意深く移し、穏やかなＮ２流下で蒸発乾固する。試料を７５μＬの復元溶液（ＭｅＯＨ  ｗ／１０ｍＭのＢＨＴ：水、３：２ｖ／ｖ）により復元する。１０μＬのＬＬＥ処理済み試料を注入することによって、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを使用して分析を実施する。全ての試料調製物は薄暗い黄色の光の下にある。
【００９３】
[0106]クロマトグラフィーを、ウォーターズアクイティ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍカラムで実施し、陽イオンモードにおいて大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）質量分析によって分析する。アイソクラチック条件を使用し、移動相としてアセトニトリル：メタノール：イソプロピルアルコール：水（４５：２０：５：３０、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を使用して検体を溶出する。０．３５ｍＬ／分の流速で、１１−シス−レチノールは約８．８分で溶出し、オール−トランス−レチノールは約９．６分で溶出し、内部標準物（オール−トランス−レチノール−ｄ５）は約９．５分で溶出する。総実行時間は約１１分である。アッセイの範囲は、２００μＬの反応マトリクス試料体積を使用している間、１１−シス−レチノールについて１〜２５ｎＭである。
【００９４】
（機器）
カラム：ウォーターズアクイティＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ（Ｐ／Ｎ：１８６００２３５２）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム
ウォーターズＸＥＶＯ  ＴＱ−Ｓ質量分析計
ウォーターズアクイティＵＰＬＣ
一般的実験機器（等価の機器に置き換えることができる）
体積測定用ガラス製品、クラスＡ
Ｒａｉｎｉｎ認証ピペット、Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ
微量てんびん、メトラーＡＸ２０５ＤＲ、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
マルチマックス（Ｍｕｌｔｉ−Ｍａｘ）ボルテックスミキサー
サーモライン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）プレートミキサー
冷蔵庫、２〜８℃レブコ（Ｒｅｖｃｏ）
冷凍庫、−３５℃〜−２０℃、レブコ
冷凍庫、−８０℃、
ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＳ−６Ｒ遠心分離器、又は等価物
サーモサイエンティフィックソルバール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｒｖａａｌｌ）Ｔ１遠心分離器、又は等価物
蒸発器、ジマークターボバップ（Ｚｙｍａｒｋ  ＴｕｒｂｏＶａｐ）９６、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ
１．５ｍＬポリプロピレンマイクロバイアル、ＶＷＲ
ホウケイ酸ガラスチューブ、１３×１００ｍｍ、ＶＷＲ
１５ｍＬポリプロピレンチューブ、ＶＷＲ
５０ｍＬポリプロピレンチューブ、ＶＷＲ
４ｍＬアンバーガラスバイアル、ＶＷＲ
９６ウェル、ディープウェルプレート、ＶＷＲ
任意の更なる一般的実験機器
【００９５】
（機器条件）
ＬＣ条件
ＬＣ：ウォーターズアクイティＵＰＬＣ
カラム：ウォーターズアクイティＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ（Ｐ／Ｎ：１８６００２３５２）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ（ＭＰＡ）：アセトニトリル：メタノール：イソプロピルアルコール：水（４５：２０：５：３０、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）
アイソクラチックプログラム：
【表９】
2019514375.tif 000011
流速：３５０μＬ／分
実行時間：約１１分
保持時間：１１−シス−レチノール：約８．８分
オール−トランス−レチノール：約９．６分
オール−トランス−レチノール−ｄ５（ＩＳ）：約９．５分
注入体積：１０μＬ
オートサンプラー温度：約２〜８℃
オートサンプラー洗浄＃１：ＭｅＣＮ：ＩＰＡ：Ｈ２Ｏ：ＦＡ（３：３：３：０．１、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）
オートサンプラー洗浄＃２：水中の１％ギ酸
ＭＳ条件
注記：質量分析計のパラメータは異なるシステムによって変わることがある
質量分析計：ウォーターズＸＥＶＯ  ＴＱ−Ｓ
供給源：ＡＰＣＩ
モード：陽性モードによる多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
【表１０】
2019514375.tif 000012
機器設定：
コロナ：１９μＡ
コロナ：４ｋＶ
コーン：１２Ｖ
コーンガス：１５０Ｌ／時
脱溶媒ガス：３００Ｌ／時
ネブライザーガス：４バール
キャピラリー電圧：３．１ｋＶ
ソース温度：１５０℃
プローブ温度：５００℃
衝突ガス：０．１５ｍＬ／分
注記：コーン及び脱溶媒ガスはＮ２であるが、衝突ガスはアルゴンである。
【００９６】
（材料）
注記：特に明記しない限り、異なる供給業者からの同等のグレードの材料の置き換えは許容される
１１−シス−レチノール、予め秤量した、カタログ番号Ｒ２５２１０５、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カナダから購入した；
オール−トランス−レチノール−ｄ５、カタログ番号Ｒ２５２００２、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カナダから購入した
オール−トランス−レチノール、（合成による、≧９５％ＨＰＬＣ、結晶質）、カタログ番号Ｒ７６３２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯから購入した；
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、（ＢＨＴ、ブチル化ヒドロキシトルエン）、カタログ番号Ｂ１３７８−１００Ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ；
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＭＦ、（ＨＰＬＣグレード、≧９９．９％）、カタログ番号２７０５４７−１Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ；
ヘキサン、（ＨＰＬＣグレード、≧９８．５％）、カタログ番号２９３２５３−２Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＯ；
アセトニトリル、ＭｅＣＮ又はＡＣＮ、（ＵＨＰＬＣグレード）、カタログ番号Ａ９５５−４、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ；
メタノール、ＭｅＯＨ、（ＵＨＰＬＣグレード）、カタログ番号Ａ４５６−４、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＪ；
イソプロピルアルコール、ＩＰＡ、（ＨＰＬＣグレード）、カタログ番号ＰＸ１８３８−１、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．、ＭＡ；
ギ酸、ＦＡ（８８％）（ＧＲ、ＡＣＳグレード）、カタログ番号０１２８−０１、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＰＡ；
水、ｄＨ２Ｏ、社内供給、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して脱イオン化し、濾過した（０．２μｍ）；
ブランク反応マトリクス、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂによって調製した
【００９７】
（試薬の調製）
注記：秤量した量及び／又は溶液体積は必要に応じて増加又は減少させてもよい。
ＭｅＯＨ中の１０ｍＭ  ＢＨＴ
約８９．０４ｍｇのＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン、Ｍ．Ｗ．＝２２０．３６）を秤量し、約４０．４ｍＬのＭｅＯＨに溶解する。室温にて保存する。１週間で使用期限が切れる。
復元溶液（ＭｅＯＨ  ｗ／１０ｍＭ  ＢＨＴ：水、３：２ｖ／ｖ）
ＭｅＯＨ中の１０ｍＭ  ＢＨＴ１２ｍＬを脱イオン水８ｍＬと合わせる。十分に混合する。室温にて保存する。それを同じ日に使用する。
移動相Ａ（ＭＰＡ）アセトニトリル：メタノール：イソプロピルアルコール：水（４５：２０：５：３０、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）
４５０ｍＬのＭｅＣＮ、２００ｍＬのＭｅＯＨ、５０ｍＬのＩＰＡ、及び３００ｍＬの脱イオン水を合わせる。十分に混合する。室温にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
オートサンプラー洗浄液＃１：ＭｅＣＮ：ＩＰＡ：Ｈ２Ｏ：ＦＡ（３：３：３：０．１、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）
３００ｍＬのＭｅＣＮ、３００ｍＬのＩＰＡ、３００ｍＬの脱イオン水及び１０ｍＬのギ酸を合わせる。十分に混合する。室温にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
オートサンプラー洗浄液＃２：水中の１％ギ酸（ｖ／ｖ）
１０ｍＬのギ酸を１０００ｍＬの脱イオン水と合わせる。十分に混合する。室温にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
１１−シス−レチノールストック溶液（２．５ｍＭ）
薄暗い黄色の光の下で、１．４６ｍＬのＤＭＦを、予め秤量した１．１１０ｍｇの１１−シス−レチノール（Ｍ．Ｗ．＝２８６．４５、純度９４．１２％）を含有する元のアンバーバイアルに加える。ボルテックスし、容易に溶解する。−８０℃にて保存する。使用期限を決定する。
オール−トランス−レチノールストック溶液（２．５ｍＭ）
薄暗い黄色の光の下で、約２．９７ｍｇのオール−トランス−レチノール（Ｍ．Ｗ．＝２８６．４５、純度９９．４％）を秤量し、約４．１２ｍＬのＤＭＦに溶解する。ボルテックスし、容易に溶解する。−８０℃にて保存する。使用期限を決定する。
オール−トランス−レチノール−ｄ５ストック溶液（１ｍＭ）
薄暗い黄色の光の下で、１．６３ｍＬのＤＭＦを、０．５ｍｇのオール−トランス−レチノール−ｄ５（Ｍ．Ｗ．＝２９１．４８、純度９５％）を含有する元のアンバーバイアルに加える。ボルテックスし、容易に溶解する。−８０℃にて保存する。使用期限を決定する。
ＩＳ希釈標準溶液：５００ｎＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５
薄暗い黄色の光の下で、ＤＭＦ中の１ｍＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５５．０μＬを、１０ｍＬの復元溶液に加える。十分に混合する。−８０℃にて保存する。使用期限を決定する。
システム適合性試料（抽出したＭｉｄ  ＱＣに相当：最終２６．７ｎＭの１１−シス−レチノール／１３３ｎＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５）
薄暗い黄色の光の下で、９６ウェルプレートに、４０μＬのＱＣ−Ｍ希釈標準溶液（復元溶液中の１００ｎＭの１１−シス−レチノール）、４０μＬのＩＳ希釈標準溶液（５００ｎＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５）、及び７０μｌの復元溶液を移す。十分に混合する。
別の選択肢：抽出したＭｉｄ  ＱＣ試料を、「システム適合性試料」として使用することができる。
【００９８】
（イソメロヒドロラーゼ活性アッセイのための用量溶液）
注記：溶液体積は必要に応じて増加又は減少させてもよい。全ての調製物は薄暗い黄色の光の下である。
ＤＭＦ中の１００μＭのオール−トランス−レチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、ＤＭＦ中の２．５ｍＭのオール−トランス−レチノール１６０μＬを、３．８４ｍＬのＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
ＤＭＦ中の４０μＭのオール−トランス−レチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、ＤＭＦ中の２．５ｍＭのオール−トランス−レチノール６４μＬを、３．９４ｍＬのＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
ＤＭＦ中の２０μＭのオール−トランス−レチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、ＤＭＦ中の４０μＭのオール−トランス−レチノール２．００ｍＬを、２．００ｍＬのＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
ＤＭＦ中の１０μＭのオール−トランス−レチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、ＤＭＦ中の２０μＭのオール−トランス−レチノール２．００ｍＬを、２．００ｍＬのＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
３０％ＤＭＦ
６．０ｍＬのＤＭＦを１４ｍＬの脱イオン水と合わせる。十分に混合する。室温にて保存する。１カ月で使用期限が切れる。
３０％ＤＭＦ中の４０μＭのオール−トランス−レチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、ＤＭＦ中の２．５ｍＭのオール−トランス−レチノール６４μＬを、３．９４ｍＬの３０％ＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
３０％ＤＭＦ中の１６μｍのオールトランスレチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、４０μＭのオール−トランス−レチノール１．００ｍＬを、１．５０ｍＬの３０％ＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
３０％ＤＭＦ中の８μＭのオール−トランス−レチノール
４ｍＬのアンバーバイアルにおいて、１６μＭのオール−トランス−レチノール１．００ｍＬを、１．００ｍＬの３０％ＤＭＦと合わせる。十分に混合する。
【００９９】
（バリデーション特定試薬）
注記：溶液体積は必要に応じて増加又は減少させてもよい。
【０１００】
（作業標準物及びＱＣ調製物）
注記：体積は必要に応じて増減させてもよい。
全ての調製物は薄暗い黄色の光の下である。
以下の表に示されているスキームを使用した連続希釈によって希釈標準溶液のセットを調製する。復元溶液（ＭｅＯＨ  ｗ／１０ｍＭ  ＢＨＴ：水、３：２ｖ／ｖ）を使用して全ての希釈標準溶液を調製し、−８０℃にて保存する。
【表１１】
2019514375.tif 000013
【０１０１】
（システム適合性）
・システム適合性は任意選択であるが、推奨される
・ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを約１０分間平衡化する。
・注入システム適合性試料（Ｎ＝５）。
・ＲＴ及びピーク面積についてＲＳＤ（％）を計算する。
【０１０２】
（試料調製）
標準物／ＱＣ試料についてのＬＬＥ（全て薄暗い黄色の光の下で調製）：
１）２０μＬの作業標準物又はＱＣ溶液をエッペンドルフバイアル（１．５ｍＬ）に加える。
２０μＬの復元溶液をこれらの「ブランク」試料に加える。
２）２００μＬの反応マトリクスをピペット操作する。
３）３００μＬのＭｅＯＨ  ｗ／１０ｍＭ  ＢＨＴをピペット操作し、約３秒間穏やかにボルテックスする。
４）２０μＬのＩＳＷＳ（復元溶液中の５００ｎＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５）を加える。
５）３００μＬのヘキサンを各試料バイアルに加える。
６）キャップで覆い、約５分間激しくボルテックスし、約５分間１３，０００ｒｐｍにて遠心分離する。
７）上側の有機層（約２５０μＬ）を清浄な９６ウェルプレートに注意深く移す。
８）ターボバップ（又は等価物）を使用することによって穏やかなＮ２流の下で４０℃にて試料を蒸発乾固する。試料は約３０分乾燥させなければならない。ガス流を約２５の設定で開始する。
９）７５μＬの復元溶液を加え、十分に混合する。約２分間３，０００ｒｐｍにて遠心分離する。
１０）１０μＬの試料を注入することによってＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析する。
発生した試料についてのＬＬＥ（全て薄暗い黄色の光の下で調製）：
ａ）２０μＬの復元溶液、２０μＬのＩＳＷＳ（復元溶液中の５００ｎＭのオール−トランス−レチノール−ｄ５）、及び３００μＬのヘキサンを各試料バイアルに加える（１．５ｍＬのエッペンドルフバイアルにおいて：２時間インキュベートした２００μＬの反応マトリクス試料を３００μＬのＭｅＯＨ  ｗ／１０ｍＭのＢＨＴにより処理して反応をクエンチした）。
ｂ）次いで、上記の「標準物／ＱＣ試料」調製ステップ６〜１０に従う。
【０１０３】
（データ処理）
ウォーターズＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ４．１ソフトウェアを使用してデータを処理する。標準物、ＱＣ及び試料についての計算を、内部標準物に対するピーク面積比を使用して実施する。分析法は１／ｘ２重み付けによる二次回帰モデルを使用する。
【０１０４】
（判定基準）
分析バッチのための判定基準を、バリデーション及び試料分析について以下に記載する。
【０１０５】
実施例３
（バリデーションの概要）
[0107]イソメロヒドロラーゼ活性アッセイ適格性は、他に示さない限り、上記のように実施した。薬物物質（ＤＳ）及び薬物製品（ＤＰ）の両方は同じ製剤を有するので、アッセイは薬物物質（ＤＳ）及び薬物製品（ＤＰ）の両方の試験に適格であった。以下のパラメータを評価した：
−システム適合性及び試料判定
−特異性（製剤緩衝液の不干渉）
−希釈直線性
−精度（室内再現精度）
−相対真度
−範囲
記載した全ての研究は以下のように結論付けた：
−イソメロヒドロラーゼ活性アッセイは、特異的、直線性、正確、及び精確である。
−システム適合性基準は各分析セットについて満たされた。
−公称の方法濃度の５０％〜１５０％の範囲、１個の細胞当たり１．００Ｅ＋０４、２．００Ｅ＋０４、４．００Ｅ＋０４、６．００Ｅ＋０４、８．００Ｅ＋０４、１．６０Ｅ＋０５、３．２０Ｅ＋０５、６．４０Ｅ＋０５、１．２８Ｅ＋０６個のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の感染多重度（ＭＯＩ）が、直線性、真度及び精度データによって支持される。
この方法はその意図した目的に適していることが示された。
略語                            説明
ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２      薬物物質又は薬物製品の命名
１１ｃＲＯＬ                    １１−シス−レチノール
ＣＩ                            信頼区間
ＣＲＡＬＢＰ                    細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質
ＣＶ                            変動係数
ＤＰ                            薬物製品
ＤＳ                            薬物物質
ＧＣＶ                          幾何変動係数
ＨＥＫ                          ヒト胎児腎臓
ＩＰ                            室内再現精度
ｌｎ（ＲＰ）                    自然対数
相対効力ＬＲＡＴ                レシチンレチノール
アシルトランスフェラーゼＭＯＩ  感染多重度
ＲＳ                            参照標準物
ＳＯＰ                          標準的な操作手順
ＳＳＱ                          平方和
ＳＴＤ                          参照標準物（ＰＬＡソフトウェア）
ＴＡ                            試験品
ＵＮＫ又はＵＮＫ１              試験品（ＰＬＡソフトウェア）
ＵＳＰ                          米国薬局方
ｖｇ                            ベクターゲノム
【０１０６】
（分析参照標準物）
分析参照標準物名：          ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２薬物物質
濃度：                      ４．８６ｅ１２ｖｇ／ｍＬ
【０１０７】
（試料（試験品））
試料名：                    ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２薬物物質
濃度：                      ４．８６ｅ１２ｖｇ／ｍＬ
【０１０８】
（細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ））
試料名：                    ＣＲＡＬＢＰ
３．８ｍｇ／ｍＬ；平均２．６７５ｐｍｏｌ
１１ｃＲＯＬ
又は４．０ｍｇ／ｍＬ；平均２．７５８ｐｍｏｌ  １１ｃＲＯＬ
供給業者：                  ＥｙｅＣＲＯ／Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ、ＯＫ
【０１０９】
（ＨＥＫ２９３−ＬＲＡＴ細胞）
試料名：                    ＨＥＫ２９３−ＬＲＡＴ細胞
【０１１０】
（ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２製剤緩衝液）
製剤緩衝液組成：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００１％プルロニックＦ６８、ｐＨ７．３。
【０１１１】
（研究設計、結果の概要及びバリデーションについての推奨）
[0108]システム適合性及び試料判定基準についての結果を評価し、報告した。無効なアッセイ（システム適合性基準を満たさなかった）からの結果は使用しなかった。合格したアッセイからの結果のみを、特異性、相対真度、精度、範囲、及び希釈直線性の評価について使用した。バリデーション判定基準についてのパラメータ、結果及び推奨の概要を表１０に要約する。
【表１２（１）】
2019514375.tif 000014
【表１２（２）】
2019514375.tif 000015
【表１２（３）】
2019514375.tif 000016
【０１１２】
（システム適合性）
（定義）
[0109]システム適合性試験は多くの分析手順の不可欠な部分である。試験は、機器、電子機器、分析操作及び分析される試料が、それ自体で評価できる一体型システムを構成するという概念に基づく。特定の手順に対して確立されるシステム適合性試験パラメータは適格化される手順の種類に依存する。
【０１１３】
（実験設計）
[0110]システム適合性及び試料判定を上記のように各分析セットについて実施した。全ての統計分析はＴｕｎｎｅｌｌ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）によって実施し、データは報告に含めるためにＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓに提供した。
【０１１４】
（判定基準）
（結果、考察及び結論）
[0111]アッセイ判定及び試料判定基準は、適切な場合、各分析セットに対して満たされた。
【０１１５】
[0112]２つのアッセイ、アッセイ６及びアッセイ２を、適格性の間に反復した。アッセイ６（室内再現精度、アナリスト２、１日目、１００％）は、外れ値についての所定の判定基準を満たさず、外れ値の最大数についての警告レベルを不合格とした。外れ値は細胞溶解物の均質性の欠如に起因する可能性が高く、以下に記載しているような、ばらつきがあるタンパク質濃度測定値を生じた。
【０１１６】
[0113]アッセイ６では、タンパク質濃度は試料１２−２−１６−９ＲＳ−Ｃについて異常に低かった。試料１２−２−１６−９ＲＳ−Ｃに対して実施した１回の酵素アッセイは、異常に高濃度の１１−シス−レチノール（１１ｃＲＯＬ）を生じ、必要とされるより多くのタンパク質が酵素活性アッセイに加えられることに起因して、低タンパク質読み取りが不正確であった可能性が示された。同様の観察が試料１２−０２−１６−６ＲＳ−Ａ及び１２−０２−１６−７ＲＳ−Ｂについて行われ、異常に高いタンパク質濃度は、異常に低い１１ｃＲＯＬ濃度をもたらした。これらの試料又はデータ点を技術的外れ値として列挙した。なぜなら、細胞溶解物試料が、ブラッドフォードアッセイに移る前の第１の超音波処理ステップの間に十分に混合されていなかった可能性があり、その結果、不正確なタンパク質読み取りをもたらし、従って、不正確なタンパク質が酵素活性アッセイに加えられたためである。アナリスト２を再訓練し、アッセイ６を反復した。アッセイ６の反復により、アッセイ判定及び試料判定基準が満たされた。
【０１１７】
[0114]アッセイ６についての調査の間、アッセイ２も同様に反復することを決定した。アッセイ２（室内再現精度、アナリスト２、１日目、５０％）はアッセイシステム適合性及び試料判定基準を満たしたが、データは、アッセイ６において識別された同じ理由のために大きなばらつきがあった。アナリスト２を再訓練し、アッセイ２を反復した。アッセイ２の反復により、アッセイ判定及び試料判定基準が満たされた。
【０１１８】
（特異性）
（定義）
[0115]特異性は、試料分析の間に存在すると予想することができる成分の存在下で、試験品（ＴＡ）応答を明確に評価する能力である。典型的に、それらには、不純物、分解物、及び試料マトリクスが含まれる。
【０１１９】
（製剤緩衝液の不干渉−実験設計）
[0116]アッセイの特異性不干渉を、ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２製剤緩衝液を調製し、分析することによって評価した。製剤緩衝液を、参照標準物と同じ希釈体積を使用して希釈し、９つの全てのＭＯＩについてＴＡと同様に処理した（レベル１００％）。
【０１２０】
（判定基準）
（結果、考察及び結論）
[0117]製剤緩衝液についての用量応答曲線を図８に示す。分析参照標準物によって誘発された用量応答と比較して、ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２製剤緩衝液では用量応答は観察されなかった。ＰＬＡ  ｖ３．０は本質的にゼロの相対効力の推定値を示した。ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２製剤緩衝液試料は試料勾配基準に合格しなかった。ＰＬＡ  ｖ３．０並列処理評価は、必要とされる分析を支持するためのデータの不足のために拒絶された。このことは、この方法がＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２に特異的であることを結論付ける。
【０１２１】
（希釈直線性）
（定義）
[0118]分析法の直線性は、試料の濃度に正比例する試験結果を得る能力を証明する。
【０１２２】
（実験設計）
[0119]直線性は、ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２分析参照標準物を使用して、以下の９つのＭＯＩ；１．００Ｅ＋０４、２．００Ｅ＋０４、４．００Ｅ＋０４、６．００Ｅ＋０４、８．００Ｅ＋０４、１．６０Ｅ＋０５、３．２０Ｅ＋０５、６．４０Ｅ＋０５、及び１．２８Ｅ＋０６における線形曲線の範囲に対して実証された。
【０１２３】
（判定基準）
（結果、考察及び結論）
[0120]記載されている判定基準が満たされた。決定係数（Ｒ２）は０．９１であった。適合した直線における９５％信頼限界が同一の直線を含むので、アッセイの希釈直線性が図９において確認される。図９における直線性プロットは、表１１における１３のアッセイの値から生成し、推定された相対効力値を、それらのそれぞれの標的効力値に対してプロットする。
【０１２４】
[0121]表１１は、０．５、１．０又は１．５のいずれかの標的相対効力レベルを用いた１３のアッセイの各々について、ＰＬＡ  ｖ３．０によって報告された推定された相対効力を示す。相対効力の自然対数（「ｌｎ（ＲＰ）」）も示し、表１６及び１７に使用する。表１１、表１６及び、表１７の計算に使用した式は全てＵＳＰ＜１０３３＞において与えられていることに留意されたい。アッセイ１４（特異性の下でセクション８．１において説明されている）は、ここでのこの統計分析に含まれていない。なぜなら、試料がＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２を含有せず、結果として、予想されるように、ＰＬＡ  ｖ３．０適合性試験がこの分析データについて計算できなかったためである。
【０１２５】
[0122]表１２は、図９からの単回帰の切片及び勾配の９５％信頼区間推定値を示す。表１２における「目標レベル」という用語は、回帰勾配の推定値を指す。希釈直線性について予想されるように、切片についての信頼区間（すなわち、表１２の下側９５％〜上側９５％の間）は０を含み、勾配についての信頼区間は１を含む。勾配についてのｐ値（Ｐｒｏｂ＞｜ｔ｜）は、勾配がゼロに等しいという統計的検定を表す。観察されたｐ値が非常に低い（＜．０００１）という事実は、勾配がゼロでないという強力な証拠である。
【０１２６】
[0123]表１３は、図９における適合した直線に関連するいくつかの更なる統計的出力を示す。特に、Ｒスクエアは、図９における個々の値の分散の９１．４％が希釈直線性の関係によって説明されることを示す。
【０１２７】
[0124]
【表１３】
2019514375.tif 000017
【表１４】
2019514375.tif 000018
【表１５】
2019514375.tif 000019
【０１２８】
（精度）
（定義）
[0125]ＩＣＨガイドラインＱ２（Ｒ１）によれば、分析手順の精度は、規定された条件下で同じ均質な試料の複数のサンプリングから得られた一連の測定値の間の一致度（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）（分散度）を表す。分析手順の精度は、通常、一連の測定値の分散、標準偏差又は変動係数として表される。
【０１２９】
（室内再現精度−定義）
[0126]室内再現精度は、分析方法の実験の変動：異なる日数、異なるアナリスト、異なる機器などの範囲内を表す。
【０１３０】
（室内再現精度−実験設計）
[0127]方法の室内再現精度は、ＵＳＰ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ＜１０３３＞Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓａｙ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎに記載されている、分散成分分析を使用して決定した。ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２分析参照標準物を試料として使用し、３つの異なる濃度範囲又は３つの異なるＭＯＩレベルのセット：５０％、１００％及び１５０％にて試験した。
【０１３１】
[0128]ＭＯＩ希釈物の調製を、必要とされるベクターの量が細胞数に依存するので、実験ノートに記録した。３つの異なるレベルにおけるＭＯＩについてのマトリクスを表１４に示す。
【表１６】
2019514375.tif 000020
【０１３２】
[0129]室内再現精度を、２日の異なる日にわたって、及び３つの異なる真度のレベル：５０％、１００％及び１５０％にて２人の異なるアナリストによって実施されたアッセイの結果から決定した。アナリスト２、３日目を、室内再現精度に必要とされる３回の独立した調製を支持するために含めた。
【０１３３】
[0130]アナリスト１及びアナリスト２は２人の異なるアナリストであった。複数の人々がアナリスト２となったわけではなかった。
【０１３４】
[0131]分析参照標準物の１つの調製物及びＴＡの１つの試料調製物（分析参照標準物を試料又はＴＡとして使用した）を、１試験日当たり１人のアナリスト当たり１つのＭＯＩで調製した。
【０１３５】
[0132]アナリスト１（又はアナリスト２）は、レベル１００％について以下の９つのＭＯＩにて分析用ＲＳ及びＴＡの両方を調製した（図１０を参照のこと）：１．００Ｅ＋０４、２．００Ｅ＋０４、４．００Ｅ＋０４、６．００Ｅ＋０４、８．００Ｅ＋０４、１．６０Ｅ＋０５、３．２０Ｅ＋０５、６．４０Ｅ＋０５、及び１．２８Ｅ＋０６。５０％及び１５０％のＭＯＩレベルのデフォルトプレートマップをそれぞれ図１１及び図１２に示す。
室内再現精度を決定するためのマトリクスを表１５に示す。
【表１７】
2019514375.tif 000021
上記の方法を試料及びデータ分析のために実施した。
【０１３６】
（判定基準）
（結果、考察及び結論）
[0133]判定基準は満たされた。０．５（５０％）、１．０（１００％）、及び１．５（１５０％）の各々の適格性濃度標的レベルの相対効力についての室内再現精度（ＩＰ）はそれぞれ９．５％、９．９％、及び１５．５％であり、３０％以下である。３つの濃度レベルにて生成したデータからの、ＧＣＶ％の全体推定とも称されている、プールした室内再現精度（ＩＰ）値は１１．３％であり、３０％以下である。ＩＰ結果を表１６及び表１７に報告する。
【０１３７】
[0134]相対バイアスの点及び９０％信頼区間推定値を表１６の最後の３列に示す。３つの標的レベルについての相対バイアスについての点推定値は全て、表１０に示す相対真度についての推奨されたバリデーション判定基準である＋／−２５％以内である。９０％信頼区間は３つ全ての標的レベルの相対効力においてゼロを含む。従って、統計的観点から、これら３つの標的レベルにおいてバイアスについての証拠は存在しない。相対バイアス推定値及びそれらの関連する９０％信頼区間を図１３に示す。９０％区間の全ては、＋／−３０％の相対バイアス範囲の範囲内にあり、このことは、相対バイアスが＋／−３０％以内であるという９５％信頼水準での統計的検定を（各標的レベルに対して別々に）提供する。
【０１３８】
[0135]アナリスト１及びアナリスト２についての３つの異なるレベル（５０％、１００％及び１５０％）のＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２参照標準物及び試験品についてのＰＬＡ３．０選択用量応答曲線を図１４〜図１９に示す。
【表１８】
2019514375.tif 000022
【表１９】
2019514375.tif 000023
【０１３９】
（相対真度）
（定義）
[0136]分析法の真度は、その方法によって得られた試験結果が真の値と一致する程度である。真度は、従来の真の値又は許容される基準値のいずれかとして許容される値と、見出された値との間の一致度を表す。
【０１４０】
（実験設計）
[0137]相対真度（相対バイアスとして計算した）は、室内再現精度試験から得られた相対効力値を使用して、各濃度において計算した。
【０１４１】
（判定基準）
（結果、考察及び結論）
[0138]判定基準は満たされた。相対真度の結果を表１６に報告する。相対バイアスの点及び９０％信頼区間推定値を表１６の最後の３列に示す。
【０１４２】
[0139]０．５（５０％）、１．０（１００％）、及び１．５（１５０％）の各々の標的レベルの相対効力における相対バイアスについての点推定値は、それぞれ−０．６％、＋０．３％、及び＋１０．０％であり、全て、表１０に示す相対真度についての推奨されたバリデーション判定基準である＋／−２５％以内又は−２５％≦ｘ≦＋２５％である。
【０１４３】
[0140]３つ全ての９０％信頼区間はゼロを含み、従って統計的観点から、これら３つの標的レベルにおいてバイアスについての証拠は存在しない。相対バイアス推定値及びそれらの関連する９０％信頼区間を図１３に示す。９０％区間の全ては、＋／−３０％の相対バイアス範囲の範囲内にあり、このことは、相対バイアスが＋／−３０％以内であるという９５％信頼水準での２つの片側統計的検定からの証拠を（各標的レベルに対して別々に）提供する。
【０１４４】
（範囲）
（定義）
[0141]分析方法の範囲は、分析方法が適切なレベルの精度、真度、及び直線性を有することが実証された、上側濃度と下側濃度との間の間隔を示している。
【０１４５】
（実験設計）
[0142]室内再現精度、相対真度及び希釈直線性の評価から導かれた分析及び結論を使用して、結果を、信頼性をもって報告できる範囲を確立した。
【０１４６】
（判定基準）
（結果、考察及び結論）
[0143]公称の方法濃度の５０％〜１５０％の範囲、９つのＭＯＩ（１．００Ｅ＋０４、２．００Ｅ＋０４、４．００Ｅ＋０４、６．００Ｅ＋０４、８．００Ｅ＋０４、１．６０Ｅ＋０５、３．２０Ｅ＋０５、６．４０Ｅ＋０５、１．２８Ｅ＋０６）は、直線性、真度、及び精度データによって支持される。範囲を支持する結果は、この報告の相対真度、室内再現精度、及び希釈直線性のセクションに報告されている。
【０１４７】
（データ分析の変更に対する推奨）
[0144]イソメロヒドロラーゼ活性アッセイ適格性の後に、ＰＬＡアッセイ及び試料適合性限界（マージン（ｍａｒｇｉｎ））を再検討した。表１８は、ＰＬＡ適合性試験の評価並びに表１１の１３の適格性アッセイ及び４つの更なる予備適格性アッセイ（アッセイ１６、１９、２０及び２１）の両方に基づいた限界を示し、それらの予備適格性アッセイは、ＭＯＩの同じ数及びレベルで実行し、適格性分析のために使用されるものと同じＰＬＡテンプレートを使用して分析した。
【表２０（１）】
2019514375.tif 000024
【表２０（２）】
2019514375.tif 000025
【表２０（３）】
2019514375.tif 000026
【０１４８】
[0145]表１８は、１７のアッセイの各々及び以下の分析において分析された１８のＰＬＡ試験名を列挙する：
１．各々の試験統計量の観察された統計的最小値及び最大値
２．適格性研究の間に適用された各々の試験についての「重度レベル」及びマージン。
３．各試験についての「重度レベル」及びマージンは、将来の試験統計値の９９．７３％を含むように片側下側及び上側９５％信頼許容限界に基づいて推奨される。
【０１４９】
[0146]表１８の重度コードは、試験の失敗の事象に基づいて取られるべき行動を示す：
Ｉｎｆ＝情報のみ及び行動を取っていない、
警告＝警告が出された、
Ｒｅｊ＝拒絶された試料／アッセイは報告が出されなかった。
【０１５０】
[0147]分析誤差のために、アッセイ２及び６を再実行する必要があった。これらは、表１１において「２−反復」及び「６−反復」と示されている。元のアッセイ２及び６は、この適合性試験マージン再検討には含まれていない。
【０１５１】
[0148]適格性研究の間に使用した適合性試験マージン（限界）は、限られた数の予備適格性アッセイに基づいて確立した。適格性データ、及び代表的な予備適格性アッセイからのデータは、将来の適切な適合性試験マージンを推定するための、はるかに豊富でより信頼できる基礎を提供する。
【０１５２】
[0149]予備適格性アッセイ１６では、適格性プロトコールを反映させるために最も高いＭＯＩ（２５６Ｋ）をこのＰＬＡ分析のために除去した。これら４つの予備適格性アッセイについて観察された適合性試験の検査により、これらの適合性試験が、適格性アッセイで観察されたように、観察された試験統計量の本質的に同じ分布を示したことが示される。これら４つの更なるアッセイを含めることで、ＰＬＡ適合性試験に対する任意の調整について、十分な情報及び信頼できる決定が導かれるはずである。
【０１５３】
[0150]１３の適格性アッセイ及び４つの更なる代表的な予備適格性試験の全ては、相対効力推定のために使用されるＰＬＡテンプレートにおいて適格性アッセイ及び試料適合性基準に合格した（すなわち、表１８の適格性マージン）。
【０１５４】
[0151]試験限界は、ａ）既知の分析除外を経験せず、ｂ）０．５〜１．５の範囲内の相対効力標的レベルを有し、ｃ）同じ材料に由来する標準物及び試験試料を有し、従って、定義により、試験試料が適切であるという１７のアッセイに基づくので、将来の有効なアッセイは、推奨される適合性試験に合格するはずである。最後の２列における許容限界に基づくマージンは、単にデータのランダムな変動のために、アッセイ又は試料を偶然に失敗する妥当な低い確率を提供すべきＰＬＡ限界の控えめな推定値である。
【０１５５】
[0152]表１８の全ての同等性試験は、９０％信頼区間を利用して９５％信頼水準で行う。表１８の最後の２列の推奨されるマージンは、１７のアッセイからの主要な試験統計量に対する許容限界に基づく。許容差は、観測された下側、又は観測された上側９０％信頼区間のいずれかに基づく。更なる試験に関して、許容差はそれぞれの試験パラメータの点推定値に基づく。
【０１５６】
[0153]表１８の推奨されたマージンの設定において、いくつかの試験は冗長であると考えられ、推奨されなかった。パラメータ比に基づいた試験は、差異に基づいた試験と冗長であり、目的を果たさない。同様に、非並列処理のＳＳＱについての試験は、ヒル係数及び上側漸近線についての同等性試験が既に存在するので、冗長であると考えられる。ＵＮＫのＣパラメータに基づいた試験は、製品の合格限界によって制御される、アッセイの報告できる結果である、ＵＮＫの相対効力に直接関連するので、不必要であると考えられた。
【０１５７】
[0154]ほとんどの場合、表１８の推奨されたマージンは、適格性研究に使用されたマージンと大きく異ならない。いくつかの特定の注釈は以下の通りである：
−表１８の最後の２つの試験は相対効力の推定値を補足し、実際には適合性試験ではない。従って、それらは情報のみのために含まれる。
−許容される外れ値の最大数（５）の変更は推奨されない。
−「勾配」についての同等性アッセイ適合性試験に変更はない。（ここで、ＰＬＡは、ＥＣ５０におけるプロファイルの勾配に関連するが、等価ではないヒル係数を示すために「勾配」という用語を使用することに留意されたい）。
−厳密に正であるべき統計量（例えば、勾配）に対する片側下側許容限界が負である場合、妥当な正の下限マージンが選択された。一例として、適格性に使用した勾配についての推奨された下限マージン（０．２３）を保持した。
−参照及び試験試料は、同じ上側漸近線、勾配、及び回帰Ｒスクエアを有すると予想されるので、これらについてのマージンを、１７の全てのアッセイにわたる両方の試料の種類についての統計量を組み合わせることによって得た。
【０１５８】
（適格性の概要）
[0155]記載した全ての実験は、全てのＳＯＰに記載したシステム適合性及び試料判定基準を満たした。この方法は、その意図する目的に適していることが示された。
【図１】
2019514375.tif 000027
【図２】
2019514375.tif 000028
【図３】
2019514375.tif 000029
【図４】
2019514375.tif 000030
【図５】
2019514375.tif 000031
【図６】
2019514375.tif 000032
【図７】
2019514375.tif 000033
【図８】
2019514375.tif 000034
【図９】
2019514375.tif 000035
【図１０】
2019514375.tif 000036
【図１１】
2019514375.tif 000037
【図１２】
2019514375.tif 000038
【図１３】
2019514375.tif 000039
【図１４】
2019514375.tif 000040
【図１５】
2019514375.tif 000041
【図１６】
2019514375.tif 000042
【図１７】
2019514375.tif 000043
【図１８】
2019514375.tif 000044
【図１９】
2019514375.tif 000045
【配列表】
2019514375000001.app
【国際調査報告】
2019514375.tif 000046
2019514375.tif 000047