(57)【要約】  光を透過させ、水より高い屈折率を有する基板（ＳＢ）と、前記基板の内部に配置され、基板の表面（Ｓ）の方向に光放射を発するのに適した発光装置（ＥＬ）であって、前記放射の少なくとも一部は、前記基板と水との間の界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で前記表面に到達するような発光装置と、少なくとも１つの不透明なマスク（ＭＯ）であって、前記基板の内部又は表面上に、前記放射のうち、前記マスクがなければ前記表面に前記臨界角より小さい入射角で到達するであろう部分を遮断するように配置された不透明なマスクと、を含む全反射蛍光顕微鏡法のための照明装置。かかる照明装置の全反射蛍光顕微鏡への応用。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全反射蛍光顕微鏡法のための照明装置において、
−少なくとも１つのスペクトル範囲の光を透過させ、前記スペクトル範囲内で水より高い屈折率を有する基板（ＳＢ）と、
−前記基板の内部に配置された、前記基板の表面（Ｓ）の方向に前記スペクトル範囲内の光放射を発するのに適した少なくとも１つの発光装置（ＥＬ）であって、前記放射の少なくとも一部が、前記基板と水との間の界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で前記表面に到達するように配置された発光装置と、
−少なくとも１つの不透明なマスク（ＭＯ）であって、前記基板の内部に、又はその前記表面上に、前記放射のうち、前記マスクがなければ前記臨界角より小さい入射角で前記表面に到達したであろう部分を遮断するように配置されたマスクと、
を含む照明装置。
【請求項２】
前記又は少なくとも１つの前記発光装置（ＥＬＤ、ＥＬＤ１、ＥＬＤ２）は指向性の発光を有し、発光パターンは、前記基板の前記表面に対して斜めの方向に極大値を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
指向性の発光を有する複数の前記発光装置（ＥＬＤ１、ＥＬＤ２）を含み、発光パターンは、相互に異なり、前記基板の前記表面に対して斜めのそれぞれの方向に極大値を有する、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
−前記基板の前記表面に垂直な軸（ＡＳ）に対して対称に配置された複数の前記発光装置（ＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３）、又は
−リング状の前記発光装置（ＥＬＡ）
の何れかを含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記スペクトル範囲内の異なる部分の前記光放射を発するのに適した複数の前記発光装置（ＥＬａ、ＥＬｂ、ＥＬｃ）を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
−第一の透明な層（Ｃ１）であって、前記基板の前記表面上に配置され、前記基板より低い屈折率を有し、それによって前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも一部が前記基板と前記第一の透明な層との間の界面に、この界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で到達するような第一の透明な層と、
−第二の透明な層（Ｃ２）であって、前記第一の透明な層の、前記基板と反対の表面上に配置され、前記第一の層より高い屈折率を有する第二の透明な層と、
を含み、
前記第一及び第二の層の厚さは、前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも１つの波長より小さい、請求項１〜５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
その表面上に設置され、前記１つ又は複数の発光装置により照明される金属層（ＣＭ）も含む、請求項１〜６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
全反射蛍光顕微鏡法システムにおいて、
−請求項１〜７の何れか１項に記載の照明装置と、
−前記照明装置の表面（Ｓ）、又は前記表面上にセットされる顕微鏡スライドの表面を観察するように配置され、前記表面と直交する光軸（ＡＯ）を有し、前記照明装置の前記１つ又は複数の発光装置に対してシフトされる顕微鏡対物レンズ（ＯＢＪ）と、
を含むシステム。
【請求項９】
全反射蛍光顕微鏡法のための照明方法において、
−少なくとも１つのスペクトル範囲の光を透過させる基板（ＳＢ）を、前記スペクトル範囲内で前記基板より低い屈折率を有する媒質（ＭＡ）と接触させて設置するステップと、
−前記透明基板の内部に配置された発光装置（ＥＬ）を、それが前記スペクトル範囲内の光放射を前記基板の表面（Ｓ）の方向に発するように作動させるステップであって、前記発光装置は、前記放射の少なくとも一部が、前記基板と前記光学媒質との間の界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で前記表面に到達するようにするステップと、
を含み、
それによって前記基板の前記表面においてエバネッセント波（ＯＥ）が生成される方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの不透明なマスク（ＭＯ）は、前記基板の内部に、又はその前記表面上に、前記放射のうち前記マスクがなければ前記臨界角より小さい入射角で前記表面に到達したであろう部分を遮断するように配置される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記媒質は水性である、請求項９及び１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記又は少なくとも１つの前記発光装置は、指向性の発光を有し、発光パターンは前記基板の前記表面に対して斜めの方向に極大値を有する、請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
−第一の透明な層（Ｃ１）は、前記基板の前記表面上に配置され、前記基板より低い屈折率を有し、それによって前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも一部が、基板／第一の透明な層の界面に、この界面に関する全反射の臨界角より大きいか、これと等しい入射角で到達し、
−第二の透明な層（Ｃ２）は、前記第一の透明な層の、前記基板と反対の表面上に配置され、前記第一の層より高い屈折率を有し、
前記第一及び第二の層の厚さは、前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも１つの波長より小さい
請求項９〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
金属層（ＣＭ）は、前記基板の前記表面上、又はその付近に配置され、それによって前記エバネッセント波により表面プラズモンが励起される、請求項９〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの蛍光体を含む試料（ＥＣＨ）は、前記基板の前記表面と接触するか、そこに近接している状態にされ、それによって前記蛍光体の蛍光発光は前記エバネッセント波又は前記表面プラズモンに関連するエバネッセント波により励起され、前記試料の少なくとも１つの蛍光画像が顕微鏡対物レンズにより取得される、請求項９〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
−前記１つ又は複数の発光装置は、前記エバネッセント波が前記基板の前記表面上の様々な地点において異なる侵入長を有するように配置され、
−前記基板は前記試料に対して移動され、前記試料と前記基板との間の複数の様々な相対的位置に関する複数の蛍光画像が取得され、
−前記方法はまた、前記蛍光画像に基づいて、前記試料の内部の前記蛍光体の分布の３次元画像を再構成するステップも含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全反射蛍光顕微鏡法のための照明装置に関し、かかる装置を使用する全反射蛍光顕微鏡検査の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法とは、観察対象の試料中に含まれる蛍光分子の励起が試料保持スライド近接部分にあるナノスケールの厚さの領域に限定される蛍光顕微鏡技術である。特に、それによって細胞膜上に局所化された構造とプロセスを、回折限界よりはるかに高い軸方向の空間分解能で選択的に観察することが可能となる。さらに、それによって、より従来的な落射蛍光方式と比較して、蛍光画像中でよりよいコントラストが得られ、光褪色の影響を低減させることができる。
【０００３】
全反射蛍光顕微鏡法の基本的原理が図１Ａに示されている。屈折率ｎ１＜ｎ２の周囲媒質ＭＡと接触する表面Ｓを有する、屈折率ｎ２の基板ＳＢの場合を考える。例えば、基板ＳＢは、試料保持スライド、又はその上にスライドがセットされるガラス製要素からなっていてもよく、周囲媒質ＭＡは懸濁液として蛍光体で標識された細胞を含む水溶液であってもよい。光ビームＦＬＩは基板ＳＢから進んで表面Ｓに入射し、その伝播方向は、表面に対する法線ｚと、臨界値θｃ（臨界角）
【数１】
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より大きい角度θをなす。したがって、ビームＦＬＩは全反射し（ＦＬＲの参照記号は反射ビームを指す）、エバネッセント波ＯＥが周囲媒質ＭＡ中に出現する。このエバネッセント波の強度は、表面Ｓからの距離ｚに伴って指数関数的に減少し、すなわち
【数２】
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であり、侵入長δは
【数３】
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で表され、λは光放射の波長である。エバネッセント波は周囲媒質中に含まれる蛍光体を励起するが、その深度はほぼδに限定され、それは、この範囲を越えるとその強度が急速に無視できる程度となるからである。例えば、λ＝４８８ｎｍ、ｎ２＝１．５１４（ＢＫ７ガラス）、ｎ１＝１．３３（水）、及びθ＝６７°＞θｃ≒６１．４５°、δ≒９３ｎｍである場合、これは、厚さ約１００ｎｍの層の中にある蛍光体だけが励起され、蛍光画像の生成に貢献することを意味する。
【０００４】
図１Ｂ及び１Ｃは、ＴＩＲＦ顕微鏡法で通常使用される２つの構成を示す。
【０００５】
図１Ｂの場合、基板の、周囲媒質ＭＡの反対側にある同じ顕微鏡対物レンズＯＢＪは、全反射によるエバネッセント波の生成と蛍光放射の集光の両方に使用される。対物レンズは一般に油浸型であり、高い開口数（Ｎ．Ｏ．）、例えば約１．４５を有していてもよく、それによって今度は、高い横方向の空間分解能（ｚ方向に垂直）を得ることができ、これは横方向の空間分解能がｄ＝λ／２Ｎ．Ｏ．で表されるからである。これに対して、このような対物レンズは非常に高価であり、大きな収差を生じさせる。
【０００６】
図１Ｃの場合、プリズムＰＲがエバネッセント波の生成に使用され、周囲媒質ＭＡ中に浸漬された対物レンズＯＢＪが蛍光放射の集光に使用される。この構成の対物レンズＯＢＪは水浸型であり、一般に、約１．１という中程度の開口数を有する。図１Ｂの構成と比較して、空間分解能は損なわれるが、コストと収差は低減される。これに対して、プリズムの使用によってこの構成は実現がより複雑かつ困難となる。
【０００７】
複数の代替的構成が科学文献の中で提案されている。
【０００８】
Ａ．Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．による記事、“Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９２，２３３５０３（２００８）には、平面導波路が試料ホルダとして使用される構成が記載されている。外部光源から発せられた光ビームは、回折格子によって導波路と結合される。この方法の主な欠点は、アラインメント手順の複雑さであり、これには専門家のオペレータの介入が必要となる。したがって、この原理に基づく顕微鏡は、光学系のアラインメントの経験を持たない生物学者には簡単に使用できない。
【０００９】
Ａ．Ａｓａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．による記事、“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＧ−ＴＩＲＦＭ）ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８０１（２０１０），１４７−１５５は、実質的に同じ利点と欠点を有する同様のアセンブリを開示しているが、この場合、光はビームコンディショナにより、試料ホルダとしての役割を果たす平面導波路に結合される。
【００１０】
Ｓ．Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．による記事、“Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  ＬＥＤ  ｐｏｗｅｒｅｄ，  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：２１３３（２０１３）は、ディスク型の平面導波路の試料ホルダとしての使用を開示している。この導波路の周囲に配置された発光ダイオード（ＬＥＤ）は、光を後者に、その縁面を介して入射させる。この方式の主な欠点は、その極端に低い効率である。導波路の縁から３ｍｍの位置にある絞りの発光円錐が１４０°であるＬＥＤと、直径２５ｍｍ、厚さ０．１７ｍｍのディスク型導波路の場合を考え、発せられた光のうちディスクの面積１ｍｍ２の中央領域に到達する部分を計算すると、結合効率は約０．０５％であることがわかる。しかも、この値は過大評価であり、それは、入射面からの反射が無視され、導波路の中に侵入する光線の一部が全反射を阻止する伝播方向で侵入するという事実が考慮されていないからである。それゆえ、複数の高出力ＬＥＤを使用することが必要であり、これらは高価で、基板を加熱する原因となり、問題であることが判明するかもしれない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａ．Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９２，２３３５０３（２００８）
【非特許文献２】Ａ．Ａｓａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＬＧ−ＴＩＲＦＭ）ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８０１（２０１０），１４７−１５５
【非特許文献３】Ｓ．Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  ＬＥＤ  ｐｏｗｅｒｅｄ，  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｂａｓｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：２１３３（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上述のような先行技術の欠点を克服することを目的とする。より詳しくは、経済的かつ使用が簡単な全反射蛍光顕微鏡法のための照明装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の、この目的の達成を可能にする１つの主旨は、全反射蛍光顕微鏡法のための照明装置であり、これは、
−少なくとも１つのスペクトル範囲の光を透過させ、前記スペクトル範囲内で水より高い屈折率を有する基板と、
−前記基板の内部に配置された、基板の表面の方向に前記スペクトル範囲内の光放射を発するのに適した少なくとも１つの発光装置であって、前記放射の少なくとも一部が、前記基板と水との間の界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で前記表面に到達するように配置された発光装置と、
−少なくとも１つの不透明なマスクであって、前記基板の内部に、又はその表面上に、前記放射のうち、前記マスクがなければ前記臨界角より小さい入射角で前記表面に到達したであろう部分を遮断するように配置されたマスクと、
を含む。
【００１４】
かかる照明装置の特定の実施形態によれば、
−前記又は少なくとも１つの前記発光装置は指向性の発光を有していてもよく、発光パターンは、基板の前記表面に対して斜めの方向に極大値を有する。
−照明装置は、指向性の発光を有する複数の前記発光装置を含んでいてもよく、発光パターンは、相互に異なり、基板の前記表面に対して斜めのそれぞれの方向に極大値を有する。
−照明装置は、基板の前記表面に垂直な軸に対して対称に配置された複数の前記発光装置か、リング状の前記発光装置の何れかを含んでいてもよい。
−照明装置は、前記スペクトル範囲内の異なる部分の前記光放射を発するのに適した複数の前記発光装置を含んでいてもよい。
−照明装置はまた、第一の透明な層であって、前記基板の表面上に配置され、前記基板より低い屈折率を有し、それによって前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも一部が基板と第一の透明な層との間の界面に、この界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で到達するような第一の透明な層と、第二の透明な層であって、前記第一の透明な層の、前記基板と反対の表面上に配置され、前記第一の層より高い屈折率を有する第二の透明な層と、を含んでいてもよく、前記第一及び第二の層の厚さは、前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも１つの波長より小さい。
−照明装置はまた、その表面上に設置され、前記１つ又は複数の発光装置により照明される金属層も含んでいてよい。
【００１５】
本発明の他の主旨は、全反射蛍光顕微鏡法システムであり、これは、
−かかる照明装置と、
−前記照明装置の表面、又は前記表面上にセットされる顕微鏡スライドの表面を観察するように配置され、前記表面と直交する光軸を有し、照明装置の１つ又は複数の発光装置に対してシフトされる顕微鏡対物レンズと、
を含む。
【００１６】
本発明のまた別の主旨は、全反射蛍光顕微鏡法のための照明方法であり、これは、
−少なくとも１つのスペクトル範囲の光を透過させる基板を、前記スペクトル範囲内で前記基板より低い屈折率を有する媒質と接触させて設置するステップと、
−前記透明基板の内部に配置された発光装置を、それが前記スペクトル範囲内の光放射を前記基板の表面の方向に発するように作動させるステップであって、前記発光装置は、前記放射の少なくとも一部が、前記基板と前記光学媒質との間の界面に関する全反射の臨界角より大きいか、それと等しい入射角で前記表面に到達するように配置されるステップと、
を含み、
それによって前記基板の表面においてエバネッセント波が生成される。
【００１７】
かかる方法の特定の実施形態によれば、
−少なくとも１つの不透明なマスクは、前記基板の内部に、又はその表面上に、前記放射のうち前記マスクがなければ前記臨界角より小さい入射角で前記表面に到達したであろう部分を遮断するように配置されてもよい。
−前記媒質は水性であってもよい。
−前記又は少なくとも１つの前記発光装置は、指向性の発光を有し、発光パターンは基板の前記表面に対して斜めの方向に極大値を有する。
−第一の透明な層が前記基板の表面上に配置されてもよく、これは前記基板より低い屈折率を有し、それによって前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも一部が、基板／第一の透明な層の界面に、この界面に関する全反射の臨界角より大きいか、これと等しい入射角で到達し、第二の透明な層が前記第一の透明な層の、前記基板と反対の表面上に配置されてもよく、これは前記第一の層より高い屈折率を有し、前記第一及び第二の層の厚さは、前記１つ又は複数の発光装置により発せられる光放射の少なくとも１つの波長より小さい。
−金属層が前記基板の表面上、又はその付近に配置されてもよく、それによって前記エバネッセント波により表面プラズモンが励起される。
−少なくとも１つの蛍光体を含む試料は、前記基板の表面と接触するか、そこに近接している状態にされてもよく、それによって前記蛍光体の蛍光発光は前記エバネッセント波又は前記表面プラズモンに関連するエバネッセント波により励起され、前記試料の少なくとも１つの蛍光画像が顕微鏡対物レンズにより取得されてもよい。
−前記１つ又は複数の発光装置は、前記エバネッセント波が前記基板の表面上の様々な地点において異なる侵入長を有するように配置されてもよく、前記基板は前記試料に対して移動され、試料と基板との間の複数の様々な相対的位置に関する複数の蛍光画像が取得され、方法はおそらく、前記蛍光画像に基づいて、試料の内部の蛍光体の分布の３次元画像を再構成するステップもまた含む。
【００１８】
本発明のその他の特徴、詳細、及び利点は、例として提供される添付の図面に対して行われている説明を読めばより明瞭となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】先行技術から知られている全反射蛍光顕微鏡法技術を示す。
【図１Ｂ】先行技術から知られている全反射蛍光顕微鏡法技術を示す。
【図１Ｃ】先行技術から知られている全反射蛍光顕微鏡法技術を示す。
【図２】本発明の第一の実施形態を示す。
【図３Ａ】本発明の第一の実施形態を示す。
【図３Ｂ】本発明の第一の実施形態を示す。
【図３Ｃ】本発明の第一の実施形態を示す。
【図４】本発明の第二の実施形態を示す。
【図５】本発明の第三の実施形態を示す。
【図６Ａ】本発明の第四の実施形態を示す。
【図６Ｂ】本発明の第四の実施形態を示す。
【図６Ｃ】本発明の第四の実施形態を示す。
【図７】本発明の第五の実施形態を示す。
【図８Ａ】本発明の第六の実施形態の２つの変形型を示す。
【図８Ｂ】本発明の第六の実施形態の２つの変形型を示す。
【図９】本発明の第七の実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図２の装置は、透明材料から製作された、より正確には近赤外域、可視域、又は近紫外域の少なくとも１つのスペクトル範囲内の光を透過させる平面基板ＳＢを含んでいてもよく、その内部に発光装置ＥＬ、典型的には発光ダイオード等の半導体装置、又は反対の端が外部光源に連結された光ファイバの１端が配置される。例えば、基板ＳＢは、ＰＤＭＳ等のポリマ製であり、鋳造により製造されてもよく、装置ＥＬは鋳型の中に事前に設置されている。図面は、装置ＥＬの、基板から外に出る電気接続を示していない。図２の実施形態において、装置ＥＬは非指向性発光を有し、ある方向に発せられる光の強度は、前記方向と装置の発光面に対する法線との間になされた角度の余弦に比例する（ランベルトの余弦法則）。この発光面は、その上に例えばガラス製の顕微鏡スライドＬＭがセットされる基板ＳＢの表面Ｓに平行であり、有利な態様として、浸漬油ＨＩ（又は、屈折率をマッチさせることのできる他の何れかの材料）が表面ＳとスライドＬＭとの間に設置される。スライドの、基板と反対側の表面は、基板ＳＢ及びスライドＬＭより低い屈折率を有する、例えば水溶液等の周囲媒質ＭＡと接触する。変形型として、基板ＳＢ自体が顕微鏡スライドの役割を果たしてもよい。
【００２１】
不透明なマスクＭＯは、発光装置ＥＬの真上の表面Ｓに近接して（基板の内部、又は表面の外面上に）、前記装置により発せられ、臨界角より小さい入射角で表面Ｓに到達する可能性のある光線の全てを遮断するように配置される。それゆえ、臨界角より大きい入射角を有する光線だけが顕微鏡スライドＬＭに到達し、後者と周囲媒質ＭＡとの間の表面において全反射される。
【００２２】
試料ＥＣＨ、例えば蛍光マーカ（蛍光体）で標識された細胞は、顕微鏡スライド上の、装置ＥＬ及び不透明なマスクＭＯに対して中心からずれた位置に位置付けられる。より詳しくは、試料は、スライドの表面の、装置ＥＬにより発せられた光放射の全反射により生成されるエバネッセント波ＯＥが存在する領域と整列するように位置付けられる。それ自体知られている方法で、これらのエバネッセント波は試料に含まれる蛍光体の蛍光を励起し、表面Ｓに垂直な光軸ＯＡを有する、試料の上方に位置付けられた水浸型の顕微鏡対物レンズＯＢＪが、蛍光放射の集光と、蛍光体の空間分布の画像形成のために使用される。
【００２３】
留意される点として、透明なマスクが臨界角より小さい入射角を有する光線の全てを遮断することは必須ではなく、これは表面Ｓのある領域で起これば十分である。例えば、図２の場合、マスクＭＯは、試料及び対物レンズが見える方向と反対方向に伝搬する、臨界角より小さい入射角の光線は透過させてもよい。しかしながら、マスクＭＯは臨界角より小さい入射角を有する光線の少なくともほとんどを遮断して、対物レンズに到達する可能性のある寄生光の量を最少にすることが好ましい。
【００２４】
基板ＳＢ、透明なマスクＭＯ、及び発光装置ＥＬにより形成されるアセンブリは、試料及び対物レンズとは独立しており、したがって、容易に再使用できる。さらに、非常に安価でありえ、その「モノリシック」構造によって複雑なアラインメント作業を行わずに済む。
【００２５】
図２の装置の有利な特徴は、エバネッセント波ＯＥの侵入長δが表面Ｓの全体にわたって一定しているわけではなく、光線の入射角に依存し、したがって、装置ＥＬの垂直線に関する距離に応じて変化することである。図３Ａ及び３Ｂは、波長λ＝４８８ｎｍの場合、基板の屈折率が１．５１４と等しく、媒質が水溶液であるとすると、入射角が６２°から６７°に変化したときに侵入深さが２９０ｎｍから９０ｎｍに変化することを示している。図３Ｃは、不透明なマスクＭＯの周囲の、円を形成する等侵入長曲線を示す。これは、基板ＳＢを顕微鏡スライドＬＭに対して横方向にシフトさせるだけで特定の用途に適した侵入長を選択できるため、有利である。ある試料について、異なる侵入長で複数の蛍光画像を取得することさえ可能である。これらの画像をペアごとに差し引くことにより、蛍光体の３次元分布をスライス状に再構成し、これを軸方向のナノスケールの分解能で行うことができる。
【００２６】
周囲媒質は空気であり、その上に厚さ０．５ｍｍのガラス製顕微鏡スライドがセットされるＰＤＭＳ（屈折率１．４１）製の基板の表面Ｓの下方１．８ｍｍの位置にある非指向性発光装置ＥＬの場合を考える。このような条件では、全反射は装置ＥＬの中心を通る表面Ｓの法線に中心を置く、直径約４．５ｍｍと等しい円周を越えて起こる。エバネッセント波は、外径が１１ｍｍに到達する円形の環帯内で生成される。装置ＥＬの中心を通る表面Ｓの法線から５ｍｍの水平距離における面積１ｍｍ２において、装置により発せられた光強度全体の０．７％が集光される。この効率は、前述のＳ．Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．の記事において提案された構成を使用して実現されるものより１桁ｓ以上高い。それでもなお、この効率は依然として比較的低いと認めざるを得ず、本発明の他の実施形態ではこれを改善することができる。
【００２７】
このような結果を得る最も簡単な方法は、図２の非指向性エミッタの代わりに指向性発光装置ＥＬＤ（例えば、スーパールミネッセントダイオード又は半導体レーザ）を使用することであり、その発光パターンは、表面Ｓの法線に対して斜めの方向に極大値を有し、好ましくはこの方向は表面Ｓの法線と臨界角より大きい角度をなす。これは図３により示されている。特定のケースにおいて、ＥＬＤ装置の発光が十分な指向性を有する場合には、不透明なマスクＭＰは省かれてもよい。
【００２８】
図５は、複数の指向性発光装置ＥＬＤ１、ＥＬＤ２が横並びに配置されている変形型を示す。これらの装置の発光パターンは異なる方向に極大値を有し、それによって、基板の表面Ｓ上で、図３Ａ〜３Ｃに関して述べたように、エバネッセント波の侵入長の違いにより特徴付けられる領域が画定される。
【００２９】
周囲媒質ＭＡ内で生成されるエバネッセント波の振幅もまた、基板ＳＢの表面上の平面導波路内の励起光放射を捕捉することにより得られてもよい。このような構成は図６Ａに示されている。より正確には、厚さｅｃ１、屈折率ｎｃ１の透明な第一の層Ｃ１は基板ＳＢの表面Ｓを覆い、厚さｅｃ２、屈折率ｎｃ２の第二の透明な層Ｃ２は第一の層の上に、周囲媒質と接触して配置される。厚さｅｃ１及びｅｃ２は、基板の体積内に含まれる発光装置（図示せず）により発せられる光放射の波長を超えない。好ましくは、層Ｃ２は周囲媒質ＭＡ及び観察対象の試料と直接接触し、基板とは別の顕微鏡スライドが介在しない。
【００３０】
第一の透明な層の屈折率ｎｃ１は、基板のｎｓより低く、ｎｃ１＜ｎｓであり、したがって、臨界角があり、基板から進んでその表面Ｓにこの臨界角より大きい入射角で到達する光線は全反射される。それゆえ、層Ｃ１の中でエバネッセント波ＯＥ１が生成される。
【００３１】
第二の透明な層の屈折率ｎｃ２は、第一の層及び周囲媒質のｎ１のどちらよりも高く、ｎｃ２＞ｎｃ１、ｎｃ２＞ｎ１である。これらの条件では、第二の透明な層は平面導波路を形成する。第一の透明な層の中で生成されたエバネッセント波ＯＥ１は、この導波路の導波モードＭＧを励起し、これは他の実施形態のように、周囲媒質内のエバネッセント波ＯＥの出現につながる。数値シミュレーションにより、特定の入射角で、媒質ＭＡ内のエバネッセント波の強度が、透明層Ｃ１及びＣ２が存在しない図２の場合と比較して非常に実質的に増大する（最大３桁まで）ことを検証できる。
【００３２】
数値シミュレーションが、λ＝４７０ｎｍ、ｎｓ＝１．５２、ｎｃ１＝１．２３、ｅｃ１＝４５０ｎｍ、ｎｃ２＝１．７、ｅｃ２＝２９０ｎｍ、ｎ１＝１．３３（周囲媒質は水からなる）の場合について行われた。図６Ｂは、対数目盛上で、ＴＥ偏波（入射面に対して垂直な電界）についての、入射角θ及び波長λに関するエバネッセント波の強度を示すグラフである。エバネッセント波の強度増大が、波長に依存する入射角群でのみ発生することがわかるかもしれない。図６Ｃは、６４．２°と等しい最適な入射角の場合の、層Ｃ２の表面の距離ｚに関する、（入射強度に対して）正規化されたエバネッセント電界の空間強度プロファイル、ＩＮを示す。侵入長は約１１０ｎｍである。
【００３３】
図７に示される他の可能性は、顕微鏡スライドＬＭの表面上（図に示される場合）、又は別の顕微鏡スライドがない場合に基板の表面Ｓ上に薄い金属層ＣＭ（数ナノメートル又は数十ナノメートル）を堆積させることからなる。層ＣＭの厚さ、光放射の波長、及び入射角を適当に選択することによって、表面プラズモンを生成することができ、これはエバネッセント波を大きく増幅させる。この効果については、Ｋ．Ｂａｌａａ  ａｎｄ  Ｅ．Ｆｏｒｔによる記事、“Ｓｕｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＴＩＲＦ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＆  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００９において、全く異なる照明構成で説明されている。
【００３４】
図２の単純な実施形態では、均一な照明（より正確には、エバネッセント波の均質な励起）を得ることができず、それは、表面Ｓに入射する光線が１つの方向から進むものであるからである。図８Ａに示されるように、より均一な照明を得るために、基板の表面Ｓに垂直な軸の周囲で対称に配置された、各々にそれぞれの不透明なマスクＭＯ１、ＭＯ２、ＭＯ３が設けられた複数の発光装置ＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３を使用することができる。表面Ｓの、その上に観察対象の試料を位置付けなければならない有効領域は、この軸の周囲にある。また、環状の発光装置ＥＬＡ、例えばあつらえて作られた発光ダイオードを円形環帯の形状の不透明なマスクＭＯＡと共に使用することも可能である。
【００３５】
ある用途において、試料は異なる励起波長を有する複数の種類の蛍光体を含んでいてもよい。すると、本発明の１つの実施形態による照明装置は、有利な態様として、それぞれの蛍光体の蛍光を励起するのに適した異なる発光波長を有する複数の発光装置を含んでいてもよい。これらの装置は、同時に作動されても、逐次的に作動されてもよい。図９は、軸ＡＳの周囲に対称に配置され、各々にそれぞれの不透明なマスクＭＯ１、ＭＯ２、ＭＯ３が設けられた３つの発光装置ＥＬａ、ＥＬｂ、ＥＬｃを含む本発明の１つの実施形態を示している。
【００３６】
これらの各種の実施形態は相互に組み合わせてもよい。それゆえ、例えば、任意の指向性を有する発光装置の複数の群を多軸の周囲に対称に配置することができ、１つの群の中の各装置は異なる発光波長を有する。同様に、エバネッセント波を増幅するための導波路又は金属層の使用は、指向性発光装置の使用と両立する。また、同じ装置の中で、導波路（図６Ａ参照）と金属層（図４参照）を組み合わせることも可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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