(57)【要約】  新規の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及び抗体薬物コンジュゲート並びに抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及び抗体薬物コンジュゲートを使用してがんを治療する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＰＲ１Ｂを発現する腫瘍開始細胞に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
配列番号１を含むヒトＢＭＰＲ１Ｂに結合する、単離された抗体。
【請求項３】
ＢＭＰＲ１Ｂに結合し、
配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）、又は
配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ、又は
配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨ、又は
配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨ、又は
配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨ、又は
配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨ、又は
配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨ、又は
配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨ、又は
配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨ、又は
配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨ、又は
配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨ、又は
配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨ、又は
配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨ、又は
配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨ、又は
配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨ、又は
配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨ、又は
配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨ、又は
配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨ、又は
配列番号８９のＶＬ及び配列番号９３のＶＨ、又は
配列番号３７のＶＬ及び配列番号９５のＶＨ
を含む抗体を含む、又は結合についてこの抗体と競合する、単離された抗体。
【請求項４】
内在化抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒト化若しくはヒト抗体、又はその免疫反応性断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
ビンＡにマッピングされている、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項７】
ビンＥにマッピングされている、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項８】
部位特異的抗体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項９】
ペイロードにコンジュゲートされている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体の全て又は一部をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸又は請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１４】
式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＡＤＣ、又は薬学的に許容されるこの塩（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１〜約２０の整数である）。
【請求項１５】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が、キメラ、ＣＤＲグラフト化、ヒト化若しくはヒト抗体、又はその免疫反応性断片を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
【請求項１６】
Ａｂが、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体である、請求項１４に記載のＡＤＣ。
【請求項１７】
ｎが、約２〜約８の整数を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
【請求項１８】
Ｄが、ドラスタチン、オーリスタチン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ベンゾジアゼピン誘導体、カリケアマイシン及びアマニチンからなる群から選択される化合物を含む、請求項１４に記載のＡＤＣ。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１０又は請求項１９に記載の医薬組成物を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項２１】
がんが、血液悪性腫瘍を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血液悪性腫瘍が、白血病又はリンパ腫を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
がんが固形腫瘍を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
がんが、副腎がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮がん、食道がん、結腸直腸がん、前立腺がん、黒色腫、膵臓がん、肺がん（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺がん及び神経膠芽腫からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
がんが、乳がんを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
がんが、ルミナルＢ乳がんを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
がんが、前立腺がんを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前立腺がんが、前立腺腺癌を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの追加の治療成分を対象に投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞を減少させる方法であって、腫瘍開始細胞及び腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含む腫瘍細胞集団を、請求項１４〜１８に記載のＡＤＣと接触させることを含み、これによって腫瘍開始細胞の頻度を減少させる、方法。
【請求項３１】
接触がインビボで行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
接触がインビトロで行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＡＤＣと接触させることを含む、細胞に細胞毒を送達する方法。
【請求項３４】
接触が、インビトロで行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
接触が、インビボで行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
対象におけるがんを検出、診断又は監視する方法であって、（ａ）腫瘍細胞を請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体と接触させる工程、及び（ｂ）腫瘍細胞における抗体を検出する工程を含む、方法。
【請求項３７】
接触が、インビトロで行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
接触が、インビボで行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（Ａｂ）に薬物（Ｄ）をコンジュゲートする工程を含む、請求項１４に記載のＡＤＣを生成する方法。
【請求項４０】
抗体が部位特異的抗体を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
抗体が、Ｎ２９７Ａ変異を含む、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
部位特異的抗体を選択的に還元する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
薬物（Ｄ）がＰＢＤを含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＡＤＣを凍結乾燥する工程をさらに含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１９に記載の医薬組成物を含有する１つ以上の容器を含む、キット。
【請求項４６】
組成物が、がんを有する対象を治療するためのものであることを表示する、１つ以上の容器に付随するラベル又は添付文書をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
がんを有する対象に対する投与レジメンを表示する、１つ以上の容器に付随するラベル又は添付文書をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
がんが、ルミナルＢ乳がんである、請求項４５〜４７に記載のキット。
【請求項４９】
【化１】
2019522960.tif 000042
2019522960.tif 000043
（式中、Ａｂは、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はその免疫反応性断片を含み、ｎは、約１〜約２０の整数である）
からなる群から選択される構造を含む、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＡＤＣ。
【請求項５０】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が、Ｎ２９７Ａ変異を含む、請求項４９に記載のＡＤＣ。
【請求項５１】
各システインが、ペイロードにコンジュゲートされている２つの不対システインを含む、請求項４９に記載のＡＤＣ。
【請求項５２】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ（配列番号１１０及び１１７）を含む、請求項５１に記載のＡＤＣ。
【請求項５３】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が、ｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ（配列番号１２０及び１２５）を含む、請求項５１に記載のＡＤＣ。
【請求項５４】
以下の構造を含む式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＡＤＣ：
【化２】
2019522960.tif 000044
（式中、Ａｂは、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ（配列番号１１０及び１１７）を含み、ｎは、２である）。
【請求項５５】
以下の構造を含む式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＡＤＣ：
【化３】
2019522960.tif 000045
（式中、Ａｂは、ｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ（配列番号１２０及び１２５）を含み、ｎは、２である）。
【請求項５６】
ヒトＢＭＰＲ１Ｂに結合し、ＢＭＰ４の結合を少なくとも４０％遮断する、単離された抗体。
【請求項５７】
ヒトＢＭＰＲ１Ｂに結合し、ＢＭＰ２の結合を少なくとも２５％遮断する、単離された抗体。
【請求項５８】
式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎであるＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩であって、
ｅ）Ａｂが、請求項５６又は５７に記載の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含み、
ｆ）Ｌが、任意選択的なリンカーを含み、
ｇ）Ｄが、薬物を含み、
ｈ）ｎが、約１〜約２０の整数である、ＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる２０１６年４月２１日に出願された米国仮出願第６２／３２５，９８１号、２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，４０４号及び２０１７年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／４８６，１４０号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１７年４月１９日に作成され、ｓｃ９１０１ＷＯＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、大きさが１２５ＫＢ（１２９，０２１バイト）である。
【０００３】
発明の分野
本出願は、一般に、がん及びがんの再発又は転移の治療、診断又は予防のための、新規の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はその免疫反応性断片、及びそれを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含めた組成物に関する。本発明の選択された実施形態は、腫瘍形成性細胞の頻度の減少を含むがんの治療のための、このような抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又は抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞及び始原細胞の分化及び増殖は、器官形成、細胞修復及び細胞置換の間の組織成長を支援するために協調して働く通常の進行プロセスである。この機構は、生物の必要性に基づいて適切なシグナルのみが生成されることが確実となるように厳しく制御されている。細胞増殖及び分化は、通常、損傷のある細胞若しくは瀕死の細胞の置換のため又は成長のために必要なときにのみ生じる。しかしながら、これらのプロセスの破壊は、様々なシグナル伝達化学物質の過小若しくは過剰な量、微小環境の変化の存在、遺伝子変異又はそれらの組合せなどの多くの要因によって引き起こされ得る。正常な細胞の増殖及び／又は分化の撹乱は、様々な障害、例えばがんのような増殖性疾患を導き得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
がんに対する従来の処置療法としては、化学療法、放射線療法及び免疫療法が含まれる。これらの治療は効果を奏しないことも多く、外科的切除は有効な臨床的代替手段を提供しない場合がある。現行の標準治療の限界は、第１選択治療を行った後に再発した患者の場合に、特に明白である。このような場合に、不応性腫瘍は、侵襲性で不治であることが多く、頻繁に発生する。多くの腫瘍の全体的な生存率は、長年にわたり大きく変化しておらず、少なくともこの原因の１部は、既存の治療法が、再発、腫瘍の再発及び転移を防ぎそこなっていることによる。したがって、増殖性障害に対するより標的化された効能の高い治療法を開発することが、依然として強く必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
広い態様において、本発明は、ヒトＢＭＰＲ１Ｂ決定因子に特異的に結合する、単離抗体及び対応する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）若しくは抗体診断コンジュゲート、又はこれらの組成物を提供する。特定の実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子は、腫瘍細胞上に発現するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質であるが、他の実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子は、腫瘍開始細胞上に発現する。他の実施形態において、本発明の抗体は、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質に結合し、ヒトＢＭＰＲ１Ｂタンパク質（ｈＢＭＰＲ１Ｂ）上のエピトープに結合する抗体との結合について競合する。
【０００７】
選択された実施形態において、本発明は、ヒトＢＭＰＲ１Ｂ（配列番号１）に結合する単離された抗体を含むか、又は結合についてこの単離された抗体と競合する抗体を含み、この単離された抗体は、以下を含む：（１）配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は（２）配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ；又は（３）配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨ；又は（４）配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨ；又は（５）配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨ；又は（６）配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨ；又は（７）配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨ；又は（８）配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨ；又は（９）配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨ；又は（１０）配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨ；又は（１１）配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨ；又は（１２）配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨ；又は（１３）配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨ；又は（１４）配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨ；又は（１５）配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨ；又は（１６）配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨ；又は（１７）配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨ；又は（１８）配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨ；又は（１９）配列番号８９のＶＬ及び配列番号９３のＶＨ；又は（２０）配列番号３７のＶＬ及び配列番号９５のＶＨ。ＳＣ９１．２０（クローン１８）及びＳＣ９１．２７（クローン１９）は、２つの固有の重鎖可変領域（配列番号９３及び９５）と対になった同じ軽鎖可変領域（すなわち、配列番号８９）を有することに留意されたい。同様に、ＳＣ９１．１４（クローン５）は、ＳＣ９１．１８６（クローン２０）と同じＶＬ（配列番号３７）を有するが、この抗体は固有のＶＨ領域（それぞれ、配列番号３９及び配列番号９５）を含む。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＢＭＰＲ１Ｂに結合する抗体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５又は配列番号４９；配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５又は配列番号８９として示される軽鎖可変領域のうちの３つのＣＤＲを有しており、該重鎖可変領域は、配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７；配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３又は配列番号９５として示される重鎖可変領域のうちの３つのＣＤＲを有する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、配列番号１０１を含むＶＬ及び配列番号１０３を含むＶＨ、又は配列番号１０１を含むＶＬ及び配列番号１０５を含むＶＨ、又は配列番号１０１を含むＶＬ及び配列番号１２７を含むＶＨ、又は配列番号１０７を含むＶＬ及び配列番号１０９を含むＶＨを有する、ヒト化抗体を含む。ある特定の実施形態において、これらのヒト化抗体は、部位特異的抗体を含む。他の実施形態において、このような抗体は、Ｎ２９７Ａ変異（ＭＪ変異）を含む。さらに他の実施形態において、本発明の抗体は、ＭＪ変異を有する部位特異的抗体を含むことがある。さらに他の実施形態において、開示したＳＣ９１．１誘導抗体が、安定したＮ５５Ｑ変異を含むことがある。
【００１０】
他の選択された実施形態において、本発明は、ｈＳＣ９１．１（配列番号１１０及び１１１に示される軽鎖及び重鎖を含む）、ｈＳＣ９１．１ＭＪ（配列番号１１０及び１１３に示される軽鎖及び重鎖を含む）、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１（配列番号１１０及び１１５に示される軽鎖及び重鎖を含む）、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ（配列番号１１０及び１１７に示される軽鎖及び重鎖を含む）、ｈＳＣ９１．９（配列番号１２０及び１２１に示される軽鎖及び重鎖を含む）、ｈＳＣ９１．９ＭＪ（配列番号１２０及び１２３に示される軽鎖及び重鎖を含む）及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ（配列番号１２０及び１２５に示される軽鎖及び重鎖を含む）からなる群から選択されるヒト化抗体を含む。
【００１１】
本発明のいくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む。本発明の他の態様において、好ましくは前述の配列の全て又は一部を含めて、抗体は、内在化抗体である。さらに他の実施形態において、抗体は、部位特異的抗体を含む。ある特定の実施形態において、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、ＢＭＰＲ１ＢリガンドであるＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２のＢＭＰＲ１Ｂへの結合を阻害する。他の選択された実施形態において、本発明は、前述の抗体のいずれかを含む抗体薬物コンジュゲートを含む。
【００１２】
ある特定の態様において、本発明は、本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体をコードする核酸、又はその断片を含む。他の実施形態において、本発明は、上記の核酸の１つ以上を含むベクター、又は前記核酸若しくはベクターを含む宿主細胞を含む。
【００１３】
上で言及したように、本発明はさらに、本明細書において開示されている抗体がペイロードにコンジュゲートされている、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートを提供する。ある特定の態様において、本発明は、ｈＢＭＰＲ１Ｂに免疫優先的に（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）会合するか又は結合する、ＡＤＣを含む。本発明の適合抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は一般に、以下の式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ、又は薬学的に許容されるその塩（式中、
ａ）  Ａｂは、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含み、
ｂ）  Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）  Ｄは、薬物を含み、
ｄ）  ｎは、約１〜約２０の整数である）
を含むことができる。
【００１４】
ある特定の態様において、本発明のＡＤＣは、上記のもののような抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はこの免疫反応性断片を含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、放射性同位体、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ベンゾジアゼピン誘導体、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、メイタンシノイド、又は本明細書に記載されている追加の治療成分から選択される、細胞毒性化合物を含む。ある特定の好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、ＰＢＤを含む。
【００１５】
本明細書において開示されている抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを含む医薬組成物が、さらに提供される。ある特定の実施形態において、本組成物は、主要なＡＤＣ種が、存在する種の約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超又はさらには約９５％超を構成する、選択される薬物−抗体比（ＤＡＲ）を含む。いくつかの実施形態において、選択されたＤＡＲは２になる一方、他の実施形態において、選択されたＤＡＲは４になり、他の実施形態において、選択されたＤＡＲは６になり、さらに他の実施形態において、選択されたＤＡＲは８になる。
【００１６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているもののような医薬組成物をがんの治療を必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法である。ある特定の態様において、がんは、例えば、急性骨髄性白血病又はびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫のような血液悪性腫瘍を含む。別の態様において、対象は、固形腫瘍に罹患している。このような実施形態に関すると、がんは、副腎がん、肝臓がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頚がん、子宮がん、食道がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（小細胞と非小細胞の両方）、甲状腺がん及び神経膠芽腫からなる群から好ましくは選択される。ある特定の実施形態において、対象は、乳がんに罹患しており、選択された実施形態において、ルミナルＢ乳がんに罹患している。さらに、選択された実施形態において、上記のがんを治療する方法は、本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣに加えて、少なくとも１つの追加の治療成分を対象に投与することを含む。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞を減少させる方法であって、腫瘍開始細胞集団を明細書に記載されているＡＤＣと接触させる（例えば、インビトロ又はインビボ）ことを含み、これにより腫瘍開始細胞の頻度を減少させる、方法を含む。
【００１８】
一態様において、本発明は、細胞毒を細胞に送達する方法であって、細胞を上記ＡＤＣのいずれかと接触させることを含む、方法を含む。
【００１９】
他の態様において、本発明は、対象におけるがん（例えば乳がん又は血液悪性腫瘍）を検出、診断又は監視する方法であって、腫瘍細胞をＢＭＰＲ１Ｂ検出剤と（例えば、インビトロ又はインビボで）接触させること及び腫瘍細胞と会合したＢＭＰＲ１Ｂ剤を検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子型決定因子と関連する核酸プローブを含む。関連実施形態において、診断方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）又はインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を含む。他の実施形態において、本方法は、循環腫瘍細胞を抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体と接触させることを含む。当業者は、このようなＢＭＰＲ１Ｂ検出剤は、以下に開示されておりかついくつかの標準インビボ画像化技術（例えば、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）のいずれか１つを使用して検出される、エフェクター、マーカー又はレポーターにより標識されてもよく、又はこれらと会合されてもよいことをさらに理解している。
【００２０】
同様に、本発明は、がんのようなＢＭＰＲ１Ｂ関連障害の診断、監視又は治療に有用であるキット又は装置及び関連する方法も提供する。この目的を達成するために、本発明は、好ましくは、ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを含むレセプタクルと、ＢＭＰＲ１Ｂ関連障害を治療、監視若しくは診断するために前記ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを使用するための取扱説明資料とを含む、ＢＭＰＲ１Ｂ関連障害を検出、診断若しくは治療するのに有用な製品、又はこのための投与レジメンを提供する。選択された実施形態において、装置及び関連する方法は、少なくとも１つの循環する腫瘍細胞を接触させることを含む。他の実施形態において、本開示のキットは、キット又は装置がＢＭＰＲ１Ｂに関連するがんの診断、監視又は治療のために用いられることを示す取扱説明書、ラベル、添付文書、読本などを含むか、又はこのための投与レジメンを提供する。
【００２１】
上記は概要であり、したがって、必要により、単純化、一般化及び詳細の省略を含む。結果として、当業者は、この概要が例示にすぎず、決して限定を意図していないことを理解する。本明細書に記載の方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の主題の他の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載の教示から明らかになる。この概要は、以下で詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を紹介するために、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】説明目的のために図示されている個々の分子成分を含む、ＢＭＰＲ１Ｂの注釈つきアミノ酸配列（図１Ａ）を、略図（図１Ｂ）と共に提示する図である。
【図１Ｂ】説明目的のために図示されている個々の分子成分を含む、ＢＭＰＲ１Ｂの注釈つきアミノ酸配列（図１Ａ）を、略図（図１Ｂ）と共に提示する図である。
【図２】試料が、（ＢＲ−ＬｕｍＢ）ＰＤＸ腫瘍（模様入り棒）、ＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸを有するマウスに発生した肺転移（暗灰色棒）、選別した乳がん幹細胞小集団（黒色棒）及び正常組織対照を含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用する、全トランスクリプトーム配列決定を使用して測定された、ＢＭＰＲ１Ｂの発現レベルを示す図である。
【図３】正常組織、及び様々なＰＤＸ腫瘍、及び正常組織対照から単離されたＲＮＡ試料におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された、ＢＭＰＲ１Ｂ転写産物の相対発現レベルを図示している図である。
【図４】正常組織及び様々なＰＤＸ細胞株に由来するＲＮＡ上でのマイクロアレイハイブリダイゼーションによって測定された、ＢＭＰＲ１Ｂ転写産物発現の正規化済み強度値を示す図である。
【図５】公に入出可能なデータセットである、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）から取り出した、正常組織及び原発性腫瘍におけるＢＭＰＲ１Ｂ転写産物の発現レベルを示す図である。
【図６Ａ】ＴＣＧＡデータセットからの原発性ルミナルＡ乳房腫瘍において、ＢＭＰＲ１Ｂ転写産物の高発現及び低発現に基づく、カプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフであり、指標値の閾値は、ＴＰＭ値の相加平均を使用して決定される。
【図６Ｂ】ＴＣＧＡデータセットからの原発性嫌色素性腎細胞癌（ＫＩＣＨ）腫瘍において、ＢＭＰＲ１Ｂ転写産物の高発現及び低発現に基づく、カプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフであり、指標値の閾値は、ＲＰＫＭ値の相加平均を使用して決定される。
【図６Ｃ】ＭＥＴＡＢＲＩＣデータセットからの原発性ルミナルＡ乳房腫瘍において、ＢＭＰＲ１Ｂ転写産物の高発現及び低発現に基づく、カプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフであり、指標値の閾値は、正規化済みＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ−１２Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｅａｄｃｈｉｐ値から誘導される。
【図７Ａ】２種の異なるハイブリドーマスクリーニング法から誘導された例示的な抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の、抗体結合、細胞殺傷、交差反応性及びビニング特徴に関するデータを、表形式及びグラフ表示で提示した図である（スクリーニング１）。
【図７Ｂ】２種の異なるハイブリドーマスクリーニング法から誘導された例示的な抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の抗体結合、細胞殺傷、交差反応性及びビニング特徴に関するデータを、表形式及びグラフ表示で提示した図である（スクリーニング２）。
【図７Ｃ】各スクリーニングエピソードに対する上記の抗体のビンの関数としてプロットした抗体の細胞殺傷活性のデータを、表形式及びグラフ表示で提示した図である（スクリーニング１）。
【図７Ｄ】各スクリーニングエピソードに対する上記の抗体のビンの関数としてプロットした抗体の細胞殺傷活性のデータを、表形式及びグラフ表示で提示した図である（スクリーニング２）。
【図８Ａ】スクリーニング１からの抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体とＢＭＰＲ１Ａホモログとの測定された交差反応性を、表形式で示した図である。
【図８Ｂ】スクリーニング２からの抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体とＢＭＰＲ１Ａホモログとの測定された交差反応性を、表形式で示した図である。
【図９Ａ−１】例示的なマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の軽鎖可変領域（配列番号２１〜９５の奇数番号）の連続的アミノ酸配列を示す、注釈つきアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。
【図９Ａ−２】例示的なマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の軽鎖可変領域（配列番号２１〜９５の奇数番号）の連続的アミノ酸配列を示す、注釈つきアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。
【図９Ｂ−１】例示的なマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の重鎖可変領域（配列番号２１〜９５の奇数番号）の連続的アミノ酸配列を示す、注釈つきアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。
【図９Ｂ−２】例示的なマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の重鎖可変領域（配列番号２１〜９５の奇数番号）の連続的アミノ酸配列を示す、注釈つきアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。
【図９Ｃ−１】上述の軽鎖及び重鎖可変領域（配列番号２０〜９４、偶数番号）をコードする核酸配列を示す図である。
【図９Ｃ−２】上述の軽鎖及び重鎖可変領域（配列番号２０〜９４、偶数番号）をコードする核酸配列を示す図である。
【図９Ｃ−３】上述の軽鎖及び重鎖可変領域（配列番号２０〜９４、偶数番号）をコードする核酸配列を示す図である。
【図９Ｃ−４】上述の軽鎖及び重鎖可変領域（配列番号２０〜９４、偶数番号）をコードする核酸配列を示す図である。
【図９Ｃ−５】上述の軽鎖及び重鎖可変領域（配列番号２０〜９４、偶数番号）をコードする核酸配列を示す図である。
【図９Ｄ−１】ヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。
【図９Ｄ−２】ヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。
【図９Ｅ−１】選択した抗体構築物の完全長重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図９Ｅ−２】選択した抗体構築物の完全長重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図９Ｆ−１】Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ９１．１マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。
【図９Ｆ−２】Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ９１．１マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。
【図９Ｇ−１】Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ９１．９マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。
【図９Ｇ−２】Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ９１．９マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す図である。
【図１０】いくつかの例示的なＰＤＸ腫瘍細胞株における、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現のレベルを例示する図である。
【図１１Ａ】免疫組織化学により決定した、いくつかの例示的なＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ腫瘍細胞株に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１１Ｂ】免疫組織化学により決定した、ＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍マイクロアレイ試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１１Ｃ】免疫組織化学により決定した、ＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍マイクロアレイ試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１１Ｄ】免疫組織化学により決定した、原発性ＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１１Ｅ】免疫組織化学により決定した、原発性ＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１１Ｆ】免疫組織化学により決定した、ヒト前立腺腺癌試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１１Ｇ】免疫組織化学により決定した、ヒト前立腺腺癌試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を、表形式及びグラフ形式で示した図である。
【図１２】様々な乳がんＰＤＸ細胞株を用いて、フローサイトメトリーにより決定した、腫瘍細胞の表面上のＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を示す図であり、ここで、本発明の例示的な抗体（黒色線）を、関連ΔＭＦＩ測定と共に、アイソタイプ対照染色集団（灰色実線）と比較した。
【図１３】ＢＭＰＲ１Ｂ−ポジティブ腫瘍細胞が、腫瘍を規則的に再構成することが可能であり、他方で、ＢＭＰＲ１Ｂ−ネガティブ細胞は、腫瘍をごく希にしか再構成しないことから、ＢＭＰＲ１Ｂが腫瘍形成性に関連することを実証している図である。
【図１４Ａ】マイクロアレイ技術を使用して測定すると、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の発現が、既知の腫瘍形成性ＴＰ５３変異と相関していることを示す図である。
【図１４Ｂ】ＭＳＤを使用して測定すると、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の発現が、既知の腫瘍形成性ＴＰ５３変異と相関していることを示す図である。
【図１５】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、インビトロで、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を内在化して、殺傷する能力を示す図である。
【図１６Ａ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍の成長をインビボで抑制する能力があることを実証する図である。
【図１６Ｂ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍の成長をインビボで抑制する能力があることを実証する図である。
【図１６Ｃ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍において、末梢（循環する腫瘍細胞）腫瘍負荷の成長をインビボで抑制する能力があることを実証する図である。
【図１６Ｄ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍において、遠位（肺転移）腫瘍負荷の成長をインビボで抑制する能力があることを実証する図である。
【図１７Ａ】例示的なヒト化ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、ＰＤＸ細胞株ＢＲ１５９に対して、インビボで、ルミナルＢ腫瘍成長を効果的に抑制することを示す図である。
【図１７Ｂ】例示的なヒト化ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、ＰＤＸ細胞株ＢＲ１６２に対して、インビボで、ルミナルＢ腫瘍成長を効果的に抑制することを示す図である。
【図１８】開示されるＡＤＣを用いて腫瘍を有するマウスを処置することにより、例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、腫瘍開始細胞の頻度を低減する能力を例示している図である。
【図１９Ａ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ特異的抗体が、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４のこれらの受容体ＢＭＰＲ１Ｂへの結合を阻害する能力を証明した図であり、データは表形式で提示されている。
【図１９Ｂ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ特異的抗体の、ＢＭＰ４のこの受容体ＢＭＰＲ１Ｂへの結合を阻害する能力を証明した図であり、データは抗体濃度の関数として提示されている。
【図１９Ｃ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ特異的抗体の、ＢＭＰ４のこの受容体ＢＭＰＲ１Ｂへの結合を阻害する能力を証明した図であり、データは抗体ビンの関数として提示されている。
【図１９Ｄ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ特異的抗体の、ＢＭＰ２のこの受容体ＢＭＰＲ１Ｂへの結合を阻害する能力を証明した図であり、データは抗体濃度の関数として提示されている。
【図１９Ｅ】例示的なＢＭＰＲ１Ｂ特異的抗体の、ＢＭＰ２の受容体ＢＭＰＲ１Ｂへの結合を阻害する能力を証明した図であり、データは抗体ビンの関数として提示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、多くの様々な形態で具現化され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、組織化を目的とするだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
【００２４】
驚くべきことに、ＢＭＰＲ１Ｂの表現型決定因子が、新形成を含む様々な増殖性障害と臨床的に関連すること、並びにＢＭＰＲ１Ｂタンパク質及びその変異体又はアイソフォームが、関連する疾患の治療に利用することができる有用な腫瘍マーカーを提供することが、見出された。この点において、本発明は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体標的化剤と細胞傷害性ペイロードとを含む新規の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及び抗体薬物コンジュゲートを提供する。下記でより詳細に議論されかつ添付の実施例において示されるように、本開示の抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞を除去するのにとりわけ有効であり、したがって、特定の増殖性障害又はその進行若しくは再発の治療及び予防に、有用である。さらに、本開示のＡＤＣ組成物は、操作されて、比較的高いＤＡＲ＝２パーセンテージ及び予期しない安定性を示し得、それにより、同じ成分を含む従来のＡＤＣ組成物と比較した場合に改善された治療指数をもたらし得る。
【００２５】
さらに、細胞表面ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質のようなＢＭＰＲ１Ｂマーカー又は決定因子が、がん幹細胞（腫瘍永続細胞としても公知）と治療上関連し、これを除去するか又は無症状にするために効果的に利用することができることが見出された。本明細書で開示するような抗ＢＭＰＲ１Ｂコンジュゲートの使用によるがん幹細胞を選択的に減少させる又は除去する能力は、驚くべきことである。それはつまり、このような細胞が一般的に多くの従来の治療に抵抗性であることが公知であるからである。すなわち、伝統的及び最近の標的治療方法の有効性は、これらの多様な治療方法にもかかわらず腫瘍成長を永続させることができる抵抗性がん幹細胞の存在及び／又は発生によってしばしば制限されている。さらに、がん幹細胞と会合している決定因子は、低い発現若しくは一貫性のない発現、腫瘍形成性細胞と会合した状態に留まれないこと又は細胞表面上に存在できないことのために、しばしば不十分な治療標的である。従来技術の教示と極めて対照的に、本明細書に開示されたＡＤＣ及び方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服し、このようながん幹細胞の分化を特異的に除去するか、枯渇させるか、沈黙させるか又は促進することにより、潜在する腫瘍成長を持続させるか又は再誘発するがん幹細胞の能力を無効にする。
【００２６】
したがって、本明細書において開示されているもののようなＢＭＰＲ１Ｂコンジュゲートは、選択された増殖性（例えば、新生物）障害又はその進行若しくは再発の治療及び／又は予防に有利に使用され得ることを、特に、留意すべきである。本発明の好ましい実施形態は、とりわけ特定のドメイン、領域若しくはエピトープに関して又はがん幹細胞及び本開示の抗体薬物コンジュゲートとのそれらの相互作用に関連して下記に詳細に議論されるが、本発明の範囲がこのような例示的実施形態によって限定されないことを、当業者が理解することが、理解される。むしろ、本発明の最も広範囲の実施形態及び添付の特許請求の範囲は、いかなる特定の作用機序又は特に標的とされる腫瘍、細胞若しくは分子成分にかかわらず、本開示の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及びコンジュゲート、並びに新生物障害又は細胞増殖性障害を含めた様々なＢＭＰＲ１Ｂ関連障害若しくはＢＭＰＲ１Ｂ媒介障害の治療及び／又は予防におけるこれらの使用を、広く及び明示的に対象としている。
【００２７】
Ｉ．ＢＭＰＲ１Ｂ生理学
骨形成タンパク質受容体タイプ１Ｂ（ＢＭＰＲ１Ｂ。ＡＬＫ６、ＡＭＤＤ、ＢＤＡ２、ＢＤＡ１Ｄ又はＣＤｗ２９３としても知られている）は、ＢＭＰ受容体ファミリーに由来する、５０〜５５ｋＤａの１回膜貫通Ｉ型セリン／トレオニンキナーゼであり、このリガンドは、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーメンバーである。ＢＭＰリガンドは、２つのＩ型受容体タンパク質（このタンパク質のＢＭＰＲ１Ｂが代表的なものである）及び２つのＩＩ型受容体タンパク質（例えば、ＢＭＰＲ２）からなる異種複合体を介して、このシグナルを変換する。ＩＩ型受容体タンパク質は、リガンドに結合することができるが、Ｉ型受容体タンパク質の非存在下では、シグナルを発信することができない。リガンドが複合体に結合すると、通常、ＩＩ型受容体は、Ｉ型受容体をリン酸化して活性化することが可能となり、自己リン酸化をもたらすことにより、受容体媒介性のＳｍａｄ転写調節因子に結合してこれを活性化することが可能となる。
【００２８】
ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の代表的なオルソログには、以下に限定されないが、ヒト（ＮＰ＿００１１９４；図１Ａ中に示されている注釈つき配列）、アカゲザル（ＮＰ＿００１２５３１９２）、ラット（ＮＰ＿００１０１９４３０）及びマウス（ＮＰ＿０３１５８６）が含まれる。ヒトにおいて、ＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子は、染色体位置４ｑ２２−ｑ２４における、約４００ｋＢｐにわたる１３のエクソンからなる。ヒトＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子座の転写は、少なくとも４つのＲＮＡ転写産物：５３２アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿００１２４３７２２）をコードする５３９７ヌクレオチド転写産物（ＮＭ＿００１２５６７９３）；及び固有の５’ＵＴＲを引き起こす様々なエクソンを使用する、３つの他の長い転写産物（ＮＭ＿００１２０３、ＮＭ＿００１２５６７９４、ＮＭ＿００１２５６７９２）をもたらすが、これらの３つの転写産物はそれぞれ、同一の５０２アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿００１１９４により表される）をコードする。
【００２９】
ｈＢＭＰＲ１Ｂに関すると、図１Ａは、注釈つき配列を示しており、ここでは、リーダー配列に下線が引かれていて、細胞外ドメインは太字で書かれ、膜貫通ドメインは四角で囲まれており、グリシン及びセリンリッチな配列には下線が引かれ、保存タンパク質チロシンキナーゼのドメインは太字の斜字で記載されている。図１Ｂは、図１Ａにおける注釈つき配列に対応する分子の主要成分を示す、細胞膜に関連するｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の模式図を提示している。この点において、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイングリシンセリンリッチドメイン及びチロシンキナーゼドメインは、互いの文脈において示されている。
【００３０】
様々なＢＭＰリガンドは、ＢＭＰＲ１Ｂを含有する異種受容体複合体を介してシグナルを発信することができる。ＢＭＰＲ１Ｂ遺伝子中の変異は、短指症及び四肢先端中部異形成のような骨障害にリンクしており（ＯＭＩＭ、ｈｔｔｐ：／／ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／６０３２４８）、後者の四肢先端中部異形成は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーＧＤＦ５の受容体（ＰＭＩＤ：１６０１４６９８）への結合の摂動にリンクし得る。ＢＭＰＲ１Ｂはまた、ＢＭＰ２（ＰＭＩＤ：１４５７６１６７）、ＢＭＰ４（ＰＭＩＤ：１７４２５６０２）及びＢＭＰ７（ＰＭＩＤ：１７６２４３４１）に対する受容体でもある。ＢＭＰはまた、様々な幹細胞／ニッチ相互作用において、重要な役割を果たすことも知られている。例えば、造血系において、胸腺細胞はＢＭＰＲ１Ｂを発現し、Ｔ−細胞分化は、胸腺上皮由来ＢＭＰ２及びＢＭＰ４（ＰＭＩＤ：１７４２５６０２）に対する、ＢＭＰＲ１Ｂ発現性胸腺細胞の応答に一部依存し得る。同様に、ＣＭＬにおける骨髄性白血病前駆体細胞の拡大は、ニッチからの自己分泌ＢＭＰ４及びパラクリンＢＭＰシグナルに該細胞を感作するＢＭＰＲ１Ｂの過剰発現にリンクしている（ＰＭＩＤ：２４１００４４６）。ＢＭＰＲ１Ｂによって媒介される腫瘍微小環境による慢性ＢＭＰ２産生はまた、ルミナル表現型に対する、未熟なヒト乳房上皮細胞の変換を推進することも報告されている（ＰＭＩＤ：２５６０１２０８）。
【００３１】
ＩＩ．がん幹細胞
現在のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞及び腫瘍形成性細胞を含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生能力を有さず、免疫無防備状態マウスに過剰な細胞数で移植された場合でも腫瘍を再現的に形成することができない。本明細書において「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣ）とも称される腫瘍形成性細胞は、通常、０．０１〜１０％の腫瘍の細胞集団率を構成し、腫瘍を形成する能力を有する。造血性悪性腫瘍の場合、ＴＩＣは、特に、急性骨髄性悪性腫瘍（ＡＭＬ）において、１：１０４〜１：１０７と非常に稀な範囲となり得るか、又は例えば、Ｂ細胞系列のリンパ腫において、非常に豊富となり得る。腫瘍形成性細胞は、交換可能にがん幹細胞（ＣＳＣ）とも呼ばれる腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）と、腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）との両方を包含している。
【００３２】
正常組織の細胞ヒエラルキーを支持する正常幹細胞と同様に、ＣＳＣは、多系列分化の能力を維持しながら、無限に自己複製することができる。これに関して、ＣＳＣは、腫瘍形成性後代と非腫瘍形成性後代との両方を生成することができ、連続的単離と少数の単離されたＣＳＣの免疫無防備状態マウスへの移植とによって実証されるように、親腫瘍の異種性細胞組成物を完全に再現することができる。これらの「種細胞」が除去された腫瘍でない限り、腫瘍が転位するか又は再発して疾患の再発及び最終的な進行をもたらす可能性がはるかにずっと高いことを、証拠が示している。
【００３３】
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、一次移植片における腫瘍成長を促進する能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、少数の高精製ＴＰｒｏｇの免疫無防備状態マウスへの連続移植により実証されるように、通常、限定された数の細胞分裂しかできないからである。ＴＰｒｏｇはさらに、初期ＴＰｒｏｇと後期ＴＰｒｏｇとに分けることができ、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）及び腫瘍細胞構造を再現する能力の差異によって区別され得る。いずれもＣＳＣと同程度に腫瘍を再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇの方が、後期ＴＰｒｏｇよりも、親腫瘍の特徴を再現する能力が高い。前述の区別にかかわらず、一部のＴＰｒｏｇ集団は稀に、ＣＳＣに通常属する性質である自己再生能力を獲得し、それ自体がＣＳＣになることができる。
【００３４】
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期ＴＰｒｏｇ及び後期ＴＰｒｏｇの両方）並びに（ｉｉ）最終分化腫瘍細胞及び腫瘍浸潤性細胞（例えば、ＣＳＣに由来し、通常、腫瘍バルクを含むことがある、線維芽細胞／間質、内皮及び造血性細胞のような非腫瘍形成性細胞）よりも、高い腫瘍形成性を示し、多くの場合、比較的より静止している。従来の治療及びレジメンが、大部分は、腫瘍を減量させ、急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されていることを考慮すると、ＣＳＣは、したがって、より急速に増殖するＴＰｒｏｇ及び他のバルクな腫瘍細胞集団、例えば非腫瘍形成性細胞よりも、従来の治療及びレジメンに対して耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療に対して相対的に化学療法耐性にし得る他の特徴は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズム及び抗アポトーシス遺伝子発現の向上である。このようなＣＳＣの特性は、進行した病期の新生物を有する患者に持続的な応答をもたらすための標準治療レジメンの失敗を示唆している。なぜなら、標準的化学療法では、継続的な腫瘍成長及び再発を実際に促進しているＣＳＣが、有効に標的とされていないためである。
【００３５】
驚くべきことに、ＢＭＰＲ１Ｂ発現が、様々な腫瘍形成性細胞小集団を本明細書に記載される治療に対して感受性にする形で、これらの細胞小集団と関連していることが分かった。本発明は、特に腫瘍形成性細胞を標的化するために有用であり、腫瘍形成性細胞を、鎮静するか、敏感にするか、中和するか、頻度を減少させるか、ブロックするか、破棄するか、それに干渉するか、減少させるか、妨害するか、抑制するか、制御するか、枯渇させるか、和らげるか、媒介するか、縮小させるか、再プログラムするか、消去するか、殺傷するか又は他の方法で阻害する（集約して、「阻害する」）ために使用可能であり、したがって増殖性障害（例えば、がん）の治療、管理及び／又は予防を容易にする抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を提供する。好都合には、本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、対象に投与した際に、ＢＭＰＲ１Ｂの決定因子の型（例えば、表現型又は遺伝子型）にかかわらず、好ましくは、腫瘍形成性細胞の頻度又は腫瘍形成性を減少させるように選択されてもよい。腫瘍形成性細胞の頻度の減少は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害若しくは根絶、（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大若しくは再発の制御、（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持又は増殖の中断又は（ｉｖ）これら以外の腫瘍形成性細胞の生存、再生及び／若しくは転移を妨げることの、結果として生じ得る。いくつかの実施形態において、腫瘍形成性細胞の阻害は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として生じ得る。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害又は除去、腫瘍形成性細胞の能力の改変（例えば、分化若しくはニッチ破壊の誘導による）又は腫瘍環境若しくは他の細胞に影響を及ぼす腫瘍形成性細胞の能力に対する他の方法による干渉のうち、いずれによるものであっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持及び／又は転移並びに再発の阻害により、より有効にＢＭＰＲ１Ｂ関連障害を治療することを可能にする。本開示の抗体の同じ特徴は、標準治療レジメンに耐性又は不応性であることが立証された再発性腫瘍の治療で、抗体を特に有効にすることが、さらに理解される。
【００３６】
腫瘍形成性細胞の頻度の減少を評価するために使用され得る方法としては、限定されないが、細胞数測定又は免疫組織化学的分析、好ましくはインビトロ又はインビボ限界希釈分析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２及びＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）が挙げられる。
【００３７】
インビトロ限界希釈分析は、断片化又は非断片化腫瘍細胞（例えば、それぞれ処理又は未処理細胞）を固体培地で培養してコロニーを形成させ、成長したコロニーをカウントし、特徴付けることにより行ってもよい。又は腫瘍細胞を、液体培地を含有するウェルを有するプレート上に段階希釈し、各ウェルを、接種後、好ましくは接種から１０日より後の任意の時点において、コロニー形成について陽性であるか陰性であるかでスコア化してもよい。
【００３８】
インビボ限界希釈分析は、未処理対照又は選択した治療剤に曝露した腫瘍のいずれかからの腫瘍細胞を、免疫無防備状態マウスに段階希釈で移植し、この後、各マウスの腫瘍形成について陽性であるか陰性であるかをスコア化することによって実施される。スコア化は、移植した腫瘍が検出可能となった後の任意の時点で行ってよいが、好ましくは移植から６０日以上経過した後で行う。腫瘍形成性細胞の頻度を決定するための限界希釈実験の結果の解析は、好ましくは、ポアソン分布統計を使用することによるか又は腫瘍がインビボで生成されるか否かの能力のような予め定義された確定事象の頻度を評価することにより（Ｆａｚｅｋａｓら、１９８２、ＰＭＩＤ：７０４０５４８）、行われる。
【００３９】
フローサイトメトリー及び免疫組織化学も、腫瘍形成性細胞の頻度を決定するために使用され得る。両方の技術が、腫瘍形成性細胞を濃縮することが知られている、当該技術分野で認識されている細胞表面タンパク質又はマーカーに結合する１つ以上の抗体又は試薬を利用する（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当該技術分野で公知であるように、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））は、腫瘍形成性細胞を含む様々な細胞集団を特徴付け、単離、精製、濃縮又は分類するためにも使用され得る。フローサイトメトリーは、細胞の混合集団が懸濁されている流体の流れを、秒あたり最大何千もの粒子の物理的及び／又は化学的特徴を測定できる電子的検出装置を通して通過させることによって、腫瘍形成性細胞のレベルを測定する。免疫組織化学は、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する標識化抗体又は試薬で組織試料を染色することにより、インサイチュ（例えば、組織切片内）で腫瘍形成性細胞の視覚化を可能にするという点で、さらなる情報を提供する。
【００４０】
したがって、本発明の抗体は、例えば、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介の薄片化又はＦＡＣＳなどの方法による、腫瘍形成性細胞の同定、特徴付け、監視、単離、薄片化又は集団若しくは小集団の富化に有用であり得る。ＦＡＣＳは、特異的な細胞表面マーカーに基づいて９９．５％を超える純度で細胞小集団を単離するために使用される、信頼性のある方法である。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の特徴付け及び操作のための他の適合技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６及び１２／７５７，６４９において見ることができる。
【００４１】
下記に列挙するのは、ＣＳＣ集団に関連し、ＣＳＣを単離又は特徴付けるために使用されてきたマーカーである：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＬＤＨ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＥＬＣ１２Ａ、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＮＡＮＯＧ、ＮＢ８４、ＮＥＳ、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、ＯＳＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＭＡＲＣＡ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＦＲＣ、ＴＲＫＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１及びＣＴＮＮＢ１。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６及び２０１１／００２０２２１参照。
【００４２】
同様に、特定の腫瘍型のＣＳＣに関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋並びに当該技術分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３参照。本発明に関して特に関心がもたれるのは、固形腫瘍におけるＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型、及び白血病におけるＣＤ３４＋ＣＤ３８−を含むＣＳＣ調製物である。
【００４３】
「正」、「低」及び「負」の発現レベルがマーカー又はマーカー表現型に適用されるとき、以下のように定義される。負（つまり、「−」）の発現を有する細胞は、本明細書において、蛍光チャネル中のアイソタイプ対照抗体を、別の蛍光チャネルの目的の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で観察した発現の９５パーセンタイル以下で発現する細胞として定義される。当業者は、この負の事象を定義するための手法が、「１を引いた蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）」又は「ＦＭＯ」染色と呼ばれることを認識する。上記で述べたＦＭＯ染色手法を用いてアイソタイプ対照抗体で観察された発現の９５パーセンタイルを上回る発現を有する細胞は、「正」（つまり「＋」）と定義される。本明細書で定義するとき、様々な細胞集団が広範に「正」と定義される。抗原の平均発現観測値が、上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色を用いて決定された９５パーセンタイルを上回る場合、細胞は正として定義される。正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回るが、９５パーセンタイルの１標準偏差以内である場合、「低発現」（つまり、「ｌｏ」）の細胞と称され得る。代替的に、正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回り、９５パーセンタイルを上回る１標準偏差より大きい場合、「高発現」（つまり、「ｈｉ」）の細胞と称され得る。他の実施形態において、９９パーセンタイルは、好ましくは、負と正のＦＭＯ染色の間の分界点として使用することができ、いくつかの実施形態において、パーセンタイルは９９％より大きくなり得る。
【００４４】
ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−マーカー表現型及びすぐ上に例示された表現型は、標準的フローサイトメトリー解析並びにさらなる解析のためにＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団を、特徴付け、単離、精製又は濃縮する細胞選別技術と組み合わせて使用され得る。
【００４５】
したがって、腫瘍形成性細胞の頻度を減少させる本発明の抗体の能力は、上記に記載の技術及びマーカーを使用して決定され得る。いくつかの場合には、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、腫瘍形成性細胞の頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又はさらには３５％減少させ得る。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の頻度の減少は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％程度であり得る。ある特定の実施形態において、本開示の化合物は、腫瘍形成性細胞の頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらには９５％減少させ得る。腫瘍形成性細胞の頻度の何らかの減少は、腫瘍形成能、残留性、再発性及び新生物の攻撃性の対応する減少をもたらし得ることが理解される。
【００４６】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．抗体の構造
抗体並びにそのバリアント及び誘導体は、承認されている命名法及び番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；又はＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
【００４７】
「抗体」又は「無傷な（ｉｎｔａｃｔ）抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合にＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む）定常領域とを含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、可変長のプロリン及びシステインリッチセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域（様々なＩｇＧサブクラスにおいて約１０から約６０のアミノ酸）によって分離されている。軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖は、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体（組換え産生ヒト抗体を含む）、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えば、これらのムテイン及びバリアント、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖ及びＳｃＦｖＦｃ）並びにＦｃ融合及び他の修飾を含むそれらの誘導体、並びに決定因子との優先的会合又は結合を示すものであればあらゆる他の免疫反応分子を含む。さらに、文脈上の制約によって他に指示されない限り、用語は、さらに全ての抗体のクラス（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）並びに全てのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含む。様々な抗体のクラスに対応する重鎖定常領域は、通常、対応するギリシャ語の小文字α、δ、ε、γ及びμでそれぞれ示される。いずれかの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の１つに割り当てることができる。
【００４９】
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識及び結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である）。ＶＨ及びＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、又はより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる４つの可変性の少ない領域によって囲まれ分離されている。ＶＨ及びＶＬ領域間の非共有結合性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。
【００５０】
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域及びＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；又はＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ又はＡｂＭ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供されるスキームの１つに従い得る。当該技術分野で周知のように、可変領域残基の番号付けは、典型的にはＣｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔに示されている通りである。Ａｂｙｓｉｓウエブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）及びＡｂＭによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基を下の表１に示す。ＭａｃＣａｌｌｕｍは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを用いていることに注意されたい。
【００５１】
【表１】
2019522960.tif 000002
【００５２】
抗体配列における可変領域及びＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）に従って、又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されており、これらを通じてアクセスされ得る。
【００５３】
好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  ｂｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。ここに添付されている図９Ｆ及び９Ｇは、ＳＣ９１．１及びＳＣ９１．９抗体の場合の例示的な重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）の注釈における、このような解析の結果を示している。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
【００５４】
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８〜８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１と報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」又は「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」又は「Ｅｕインデックス」又は「Ｅｕ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら（前掲）に示されている。本発明に適合する例示的なカッパ（配列番号５）及びラムダ（配列番号８）軽鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
【００５５】
【化１】
2019522960.tif 000003
【００５６】
【化２】
2019522960.tif 000004
【００５７】
同様に、本発明に適合する例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
【００５８】
【化３】
2019522960.tif 000005
【００５９】
当業者は、野生型（例えば、配列番号２、５又は８を参照）の、又は不対システイン（例えば、配列番号３、４、６、７、９又は１０を参照）を与えるように本明細書において開示されている通りに操作されている、このような重鎖及び軽鎖定常領域配列が、本開示の重鎖及び軽鎖可変領域と、標準的な分子生物学技術を使用して作動可能に会合させられて、本発明のＢＭＰＲ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートに組み込まれ得る完全長抗体を提供することができることを、理解する。本発明の選択された抗体を含む、完全長重鎖及び軽鎖の配列（ｈＳＣ９１．１、ｈＳＣ９１．１ＭＪ、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ、ｈＳＣ９１．９、ｈＳＣ９１．９ＭＪ、ｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ）は、ここに添付されている図９Ｅに示されている。
【００６０】
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋又は結合、つまり鎖間及び鎖内ジスルフィド結合がある。当該技術分野で周知のように、鎖間ジスルフィド結合の位置及び数は、免疫グロブリンのクラス及び種類によって変化する。本発明は、抗体の任意のクラス又は特定のサブクラスに限定されるものではないが、例示の目的で、ＩｇＧ１免疫グロブリンが本開示を通して使用される。野生型ＩｇＧ１分子には、１２の鎖内ジスルフィド結合（それぞれ重鎖に４つとそれぞれ軽鎖に２つ）と、４つの鎖間ジスルフィド結合とがある。鎖内ジスルフィド結合は、一般にやや保護されており、鎖間結合よりも相対的に還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能で、通常は比較的還元されやすい。２つの鎖間ジスルフィド結合は、重鎖間に存在し、さらにそれぞれの重鎖からそれぞれの軽鎖に存在するジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合に必須ではないことが実証されている。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、重鎖に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含有しており、これらのシステインが、構造的な支えと共にＦａｂの動きを容易にする柔軟性をもたらす。重／重ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６及びＣ２２９（Ｅｕ番号付け）に位置し、一方でＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖間（重／軽）のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパ又はラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上流ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
【００６１】
Ｂ．抗体生成及び産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
【００６２】
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；及びＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫適格性の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）を、抗原性タンパク質又は抗原性タンパク質を含む細胞若しくは調製物で免疫化する。一定時間後に、ポリクローナル抗体含有血清を、動物を出血させるか又は屠殺することにより取得する。血清は動物から取得した形態で使用されてもよく、又は抗体を部分的若しくは完全に精製して免疫グロブリン分画若しくは単離された抗体調製物を得てもよい。
【００６３】
この点において、本発明の抗体は、免疫適格性の動物において、免疫応答を誘発するいかなるＢＭＰＲ１Ｂ決定因子からも生成することができる。本明細書において使用する場合、「決定因子」又は「標的」は、特定の細胞、細胞集団若しくは組織において又はこれらの上で、同定可能的に会合するか又は特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー又は因子を意味する。決定因子又は標的は、形態的性質の場合もあり、機能的性質の場合もあり、又は生化学的性質の場合もあり、表現型であることが好ましい。好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞型又はある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の点又は特定の微小環境における細胞の間）によって異なって発現（過剰発現又は過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質又はそのスプライスバリアント、アイソフォーム、ホモログ若しくはファミリーメンバー、又はこれらの特異的ドメイン、領域若しくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」又は「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入された場合に、免疫応答を刺激することができ、そして免疫応答により生じる抗体によって認識される、任意のＢＭＰＲ１Ｂタンパク質又はこの任意の断片、領域若しくはドメインを意味する。本明細書において検討されるＢＭＰＲ１Ｂ決定因子の存在又は不在は、細胞、細胞小集団又は組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞又はＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
【００６４】
任意の形態の抗原又は抗原を含有する細胞若しくは調製物を、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。本明細書に示す用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片又は選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一若しくは複数のドメイン又は全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はタンパク質を含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、これらの表面上の抗原の少なくとも一部を発現する細胞により免疫化されている）又は可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分しか免疫化されていない）又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。抗原は、遺伝的に修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしていてもよい。任意のベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド及びカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
【００６５】
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。当該技術分野で公知であるように、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
【００６６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））又はこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第１版  ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ、第１版  ２０１０；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ．  Ａｎｔｏｎｙ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２００９；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓ、第２版  １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマ及び生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体の産生後、特に有効な抗体を、様々なスクリーニングプロセスを通じて、例えば、決定因子に対するそれらの親和性又は内在化速度に基づいて、選択してもよい。本明細書に記載されるように産生される抗体を、「出所（ｓｏｕｒｃｅ）」抗体として使用することができ、さらに、例えば、標的への親和性を改善する、細胞培養における産生性を向上させる、インビボでの免疫原性を減少させる、多重特異的構築物を生成するなどのために、修飾してもよい。モノクローナル抗体の産生及びスクリーニングのより詳細な説明は、下記及び添付の実施例に示される。
【００６７】
３．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体及び／又は下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を指す。
【００６８】
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。技術の１つは、（好ましくはヒト）抗体のライブラリがファージ上に合成されている、ファージディスプレイであり、この技術において、ライブラリは、目的の抗原又はこの抗体結合部分を用いてスクリーニングされ、抗原に結合するファージが単離され、これらから免疫反応性断片を得ることができる。このようなライブラリを調製してスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用することができる他の方法及び試薬もある（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照）。
【００６９】
一実施形態において、組換えヒト抗体は、上記の通り調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることにより単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリである。
【００７０】
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）により産生された抗体は、中程度の親和性（Ｋａは、約１０６〜１０７Ｍ−１）を有することができるが、親和性成熟は、当該技術分野において記載されている二次ライブラリから構築及び再選択することにより、インビトロにおいて模倣され得る。例えば、変異は、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、インビトロにおいてランダムに導入され得る（ＬｅｕｎｇらのＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）に報告されている）。さらに、親和性成熟は、選択された個々のＦｖクローンにおいて、例えば、目的のＣＤＲにかかるランダム配列を有するプライマーを用いるＰＣＲを使用して１種以上のＣＤＲをランダムに変異させることにより、及びより高次の親和性クローンをスクリーニングすることによって、行われ得る。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。別の有効な手法は、未免疫ドナーから得た天然Ｖドメインバリアントのレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及びＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されている、数回のチェーンリシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ以下の解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【００７１】
他の実施形態において、同様の手順は、これらの表面に結合ペアを発現する、真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリを使用して用いられ得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））。他の実施形態において、ヒト結合ペアは、酵母のような真核細胞において生成するコンビナトリアル抗体ライブラリから単離され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技術により、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを有利なことに可能にし、候補配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリングによる）。
【００７２】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することにより、作製することもできる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察される。この産生は、遺伝子再配列、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６並びにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１及び６，１５０，５８４；並びにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得る又はインビトロで免疫化され得る）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７（Ｉ）：８６−９５（１９９１）；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。
【００７３】
出所が何であろうとも、ヒト抗体配列は、当該技術分野において公知の分子操作技術を使用して作製され、本明細書に記載されている発現システム及び宿主細胞に導入され得ることが理解される。このような非天然に組換えにより産生したヒト抗体（及び、対象組成物）は、本開示の教示と完全に適合し、本発明の範囲内に明示的に保持されている。ある特定の選択態様において、本発明のＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、細胞結合剤として作用する、組換えにより産生したヒト抗体を含む。
【００７４】
４．誘導された抗体
出所抗体は、上記のように生成され、選択され、単離された後、改善された医薬的特徴を有する抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体となるようにさらに改変されてもよい。好ましくは、出所抗体は、所望の治療学的特性を有する誘導抗体をもたらすように、公知の分子操作技術を使用して修飾又は改変されてもよい。
【００７５】
４．１．キメラ及びヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、免疫特異的にＢＭＰＲ１Ｂに結合するマウスモノクローナル抗体を含み、この抗体は、「出所」抗体と考えることができる。選択された実施形態において、本発明の抗体は、このような「出所」抗体から、出所抗体の定常領域及び／又はエピトープ結合アミノ酸配列の任意選択の修飾を通じて誘導され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、出所抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合又は組合せを通じて変化する場合、出所抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、出所抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲ又はドメイン又は全重鎖及び軽鎖可変領域）がアクセプター抗体配列と組み合わされるか又はアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラ、ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導」抗体は、例えば、決定因子に対する親和性を改善するか、抗体安定性を改善するか、細胞培養物における産生及び収率を改善するか、インビボでの免疫原性を低減するか、毒性を低減するか、活性部分のコンジュゲーションを促進するか、又は多重特異的抗体を作製するなどのために、細胞を産生する抗体に由来する遺伝物質、及び下記に記載されている標準的な分子生物学的技術を使用して産生され得る。このような抗体は、出所抗体から、化学的手段又は翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターン又はペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
【００７６】
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種又はクラス由来の共有結合的に連結されたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにこのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７）。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域に作動可能に連結されている選択されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域の全て又はほとんどを含んでもよい。他の選択された実施形態において、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、本明細書において開示されているマウス抗体から「誘導」され得、重鎖及び軽鎖可変領域の全体未満を含む。
【００７７】
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、「ＣＤＲグラフト化」抗体であり、この場合に、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属しており、抗体の残りは別の種から大きく誘導されるか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属している。ヒトで使用するために、１つ以上の選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたマウスから取得される１つ以上のＣＤＲを含む。
【００７８】
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト化」抗体は、１つ以上の非ヒト抗体（ドナー又は出所抗体）に由来する１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、「逆変異」が、ヒト化抗体に導入されていてもよい。この逆変異では、レシピエントのヒト抗体の可変領域の１つ以上のＦＲが、非ヒト種ドナー抗体の対応する残基によって置換されている。このような逆変異は、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性及び抗体安定性を改善し得る。様々なドナー種由来の抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類が挙げられる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに洗練するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。出所抗体由来のマウス成分及びアクセプター抗体由来のヒト成分を含む、本発明に適合するＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体は、下記実施例に示すように提示され得る。
【００７９】
当該技術分野で認識されている様々な技術を使用して、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するかを決定し、本発明に従ってヒト化構築物を提供することができる。適合するヒト生殖系列配列の編纂及びそれらのアクセプター配列としての適性を決定するための方法は、例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８〜４６３８）に開示されている。ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１〜６７４、２００５）を使用して適，合するアクセプター配列を同定してもよい。さらに、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列もまた適合するアクセプター配列であり得、本教示に従って使用し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、マウス由来フレームワーク配列との相同性と、出所抗体及びアクセプター抗体のＣＤＲ古典的構造の解析とに基づいて選択される。次いで、誘導された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の誘導された配列が、当該技術分野で認識されている技術を使用して合成され得る。
【００８０】
例として、ＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体並びに関連する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０及び５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、（ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１及び７，０８７，４０９を参照。
【００８１】
ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体の可変領域のヒトアクセプター可変領域の配列同一性又はホモロジーは、本明細書で議論したように決定されそして本明細書で議論したように測定されるとき、好ましくは少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似度を上方調節させて置換の保存的性質を正しくしてもよい。
【００８２】
添付の図９Ａ及び９Ｂに示される注釈の付されたＣＤＲ及びフレームワーク配列は、専売のＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに従って定義されていることが理解される。しかしながら、本明細書で説明され、また図９Ｆ及び９Ｇに示されるように、当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭ又はＭａｃＣａｌｌｕｍらによって提供される定義に従って、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔらと同様に容易に同定し得る。このように、前述のシステムのいずれかに従って誘導された１つ以上のＣＤＲを含む抗ＢＭＰＲ１Ｂヒト化抗体は、本発明の範囲内に明確に保持される。
【００８３】
４．２．部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒又は他の抗がん剤へのコンジュゲーションを容易にするために（下記でより詳細に議論されるように）操作されてもよい。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製にとって、抗体上の細胞毒の位置及び薬物抗体比（ＤＡＲ）の観点から、均質なＡＤＣ分子集団を含むことが有利である。本発明に基づいて、当業者は本明細書に記載されるような部位特異的操作構築物を容易に作製することができる。本明細書で使用するとき、「部位特異的抗体」又は「部位特異的構築物」は、重鎖又は軽鎖のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、改変又は（好ましくは別のアミノ酸で）置換されて少なくとも１つの遊離システインを与えている抗体又はその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」は、部位特異的抗体と、不対又は遊離システインにコンジュゲートした少なくとも１つの細胞毒又は他の化合物（例えば、レポーター分子）とを含むＡＤＣを意味する。ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含む。他の実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。さらに他の実施形態において、遊離システインを、抗体のアミノ酸配列内（例えば、ＣＨ３ドメイン内）へと改変させてもよい。いずれにしても、部位特異的抗体は、様々なアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤであることができ；これらのクラス内で、抗体は、様々なサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であることができる。ＩｇＧ構築物に関して、抗体の軽鎖は、Ｃ２１４がそれぞれ組み込まれたカッパ又はラムダのいずれかのアイソタイプを含んでもよく、選択された実施形態において、Ｃ２１４は、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基がないことにより、不対であってもよい。
【００８４】
したがって、本明細書において使用する場合、用語「遊離システイン」又は「不対システイン」は、他に文脈により指示されていない限り、相互に交換可能に使用することができる用語であり、天然に存在しているか又は分子操作技術を使用して選択された残基位置に特別に組み込まれているかにかかわらず、生理学的条件下において天然に存在している（「又は未処理の」）ジスルフィド結合の部分ではない、抗体の任意のシステイン（又はチオール含有）成分（例えば、システイン残基）を意味するものとする。ある特定の選択された実施形態において、遊離システインは、天然の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋パートナーが置換されたか、除去されたか又は他の方法で変化したことにより生理学的条件下で天然に存在しているジスルフィド架橋が破壊され、それによって部位特異的コンジュゲーションに適切な不対システインとなっている、天然のシステインを含み得る。他の好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは、抗体の重鎖又は軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置されているシステイン残基を含む。コンジュゲーションの前に、遊離又は不対システインが、チオール（還元されたシステイン）として、キャッピングされたシステイン（酸化されている）として又は系の酸化状態に依存した同一又は異なる分子上の別のシステイン若しくはチオール基との非天然分子内又は分子間ジスルフィド結合（酸化されている）の一部として、存在してもよいことが認識される。下記でより詳細に説明するように、適切に操作された抗体構築物の穏やかな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。したがって、特に好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは（天然に存在するものか又は組み込まれたものかにかかわらず）、選択的還元及びこの後のコンジュゲーションを受けて、均一なＤＡＲ組成物をもたらす。
【００８５】
本開示の改変コンジュゲート調製物により示される好ましい特性は、コンジュゲーションの位置及び組成物の絶対的ＤＡＲ値の観点からコンジュゲーションを詳細に指定し、作製されたコンジュゲートを大きく限定する能力に基づき、少なくとも部分的に、予測されるものであることが理解される。従来の多くのＡＤＣ調製物と異なり、本発明は、ランダムコンジュゲーション部位及び比較的制御されていないＤＡＲ種を生成する抗体の部分的又は完全な還元に、完全に依拠する必要はない。むしろ、特定の態様において、本発明は、好ましくは、標的化抗体を改変して天然に存在する（つまり「未処理の（ｎａｔｉｖｅ）」）鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋の１つ以上を破壊することにより又は任意の位置にシステイン残基を導入することにより、１つ以上の所定の不対（又は遊離の）システイン部位を用意する。この目的のために、選択された実施形態において、システイン残基は、標準的分子操作技術を使用して、抗体（又はそれらの免疫反応性断片）の重鎖若しくは軽鎖のいずれの場所に組み込まれてもよく又は付加されてもよいことが理解される。他の好ましい実施形態において、天然ジスルフィド結合の破壊は、後にコンジュゲーション部位として使用され得る非天然システインの導入（後に遊離システインを含む）との組合せで行われ得る。
【００８６】
ある特定の実施形態において、操作された抗体は、鎖内又は鎖間システイン残基に少なくとも１つのアミノ酸欠失又は置換を含む。本明細書で使用するとき、「鎖間システイン残基」は、抗体の軽鎖と重鎖との間又は抗体の２つの重鎖間のいずれかの天然のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を意味し、一方で、「鎖内システイン残基」は、同じ重鎖又は軽鎖内の別のシステインと天然に対をなしているシステイン残基である。一実施形態において、鎖間システイン残基の欠失又は置換は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、システイン残基の置換又は欠失は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対形成しており、１つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインが相補的重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと対形成している抗体の相補的な構造により、いずれかの軽鎖又は重鎖の単一のシステインの変異又は欠失によって、操作された抗体における２つの不対システイン残基が生じる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、鎖間システイン残基は欠失している。他の実施形態において、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）で置換されている。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、スレオニン若しくはグリシン）又は親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン）残基での置き換えを生じ得る。選択された実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられている。
【００８８】
本発明で意図されるいくつかの実施形態において、欠失又は置換システイン残基は、軽鎖（カッパ又はラムダのいずれか）上にあり、したがって重鎖上に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失又は置換システイン残基は重鎖上にあり、軽鎖定常領域上に遊離のシステインを残す。アセンブリにおける無傷な抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかの単一システインの欠失又は置換は、２つの不対システイン残基を有する部位特異的抗体をもたらすことが理解される。
【００８９】
一実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパ又はラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が欠失又は置換されている。別の実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が欠失又は置換されている。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位又は２２９位のシステインが欠失又は置換されている。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンに置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、軽鎖に好ましい遊離システインをもたらす。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンに置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、重鎖に好ましい遊離システインをもたらす。このような部位特異的構築物は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されている。適合する部位特異的構築物の概要を直下の表２に示す。ここで、番号付けは一般的にＫａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」又は天然の改変のない定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を指す（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステイン残基が欠失していることを示す）。
【００９０】
【表２】
2019522960.tif 000006
【００９１】
本発明の部位特異的構築物と適合可能な例示的な操作された軽鎖及び重鎖定常領域が直下に示されており、ここで、配列番号３及び４は、それぞれ、Ｃ２２０Ｓ  ＩｇＧ１及びＣ２２０ΔＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、配列番号６及び７は、それぞれ、Ｃ２１４Ｓ及びＣ２１４Δカッパ軽鎖定常領域を含み、配列番号９及び１０は、それぞれ、例示的なＣ２１４Ｓ及びＣ２１４Δラムダ軽鎖定常領域を含む。各場合において、改変されたか又は欠失したアミノ酸の部位は（隣接残基と共に）、下線を付されている。
【００９２】
【化４】
2019522960.tif 000007
【００９３】
【化５】
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【００９４】
【化６】
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【００９５】
【化７】
2019522960.tif 000010
【００９６】
【化８】
2019522960.tif 000011
【００９７】
【化９】
2019522960.tif 000012
【００９８】
上で議論した通り、重鎖及び軽鎖バリアントはそれぞれ、本開示の重鎖及び軽鎖可変領域（又は、ヒト化若しくはＣＤＲグラフト化構築物のような、この誘導体）と作動可能に会合されて、本明細書において開示されている部位特異的抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体をもたらすことができる。このような操作された抗体は、開示されるＡＤＣにおける使用に、特に適合可能である。
【００９９】
システイン残基又は遊離システインを提供するための残基を（天然のジスルフィド結合の破壊とは対照的に）導入又は付加することに関して、抗体又は抗体断片上の適合する位置は、当業者によって容易に判別され得る。したがって、選択された実施形態において、システインは、所望のＤＡＲ、抗体構築物、選択されたペイロード及び抗体標的に応じて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメイン又はそれらの任意の組合せに導入され得る。他の好ましい実施形態において、システインは、カッパ又はラムダＣＬドメイン内に導入されてもよく、特に好ましい実施形態において、ＣＬドメインのｃ末端領域に導入されてもよい。それぞれの場合において、システインの挿入部位に近位の他のアミノ酸残基を変更、除去又は置換して、分子の安定性、コンジュゲーションの効率性を促進させてもよく又は一度付加されたペイロードに保護的環境を与えてもよい。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の任意の接触可能部位にある。このような表面残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が容易に接触可能な部位に位置づけられ、本明細書でさらに記載されているように選択的に還元され得る。ある特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の接触可能部位にある。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が接触可能な部位に位置づけられ、抗体と選択的にコンジュゲートするために使用され得る。ある特定の実施形態において、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（Ｅｕ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（Ｅｕ番号付け）。さらなる置換位置及び適合する部位特異的抗体の作製方法は、その全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，５２１，５４１に記載されている。
【０１００】
本明細書に記載されるような、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するためのストラテジー及び薬物負荷の化学量論は、主に、抗体の保存された定常領域の操作に関わるので、全ての抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体に広く適用可能である。抗体の各クラス及びサブクラスのアミノ酸配列及び天然のジスルフィド結合は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々な抗体の操作された構築物を、過度の実験を必要とせずに容易に作製することができ、したがってこのような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に意図されている。
【０１０１】
４．３．定常領域の修飾又は改変された糖鎖結合
本発明の選択された実施形態は、定常領域（つまりＦｃ領域）の置換又は修飾、例えば、限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異及び／又は修飾を含んでもよく、この置換又は修飾により、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増強又は減少、糖鎖結合及び／又はジスルフィド結合の変化並びに結合特異性の変更を含むがこれらに限定されない特徴が、化合物にもたらされる。
【０１０２】
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎ）に関与するアミノ酸残基の変化を通じて生成することができ、これにより、血清半減期の延長のような細胞毒性の増加及び／又は薬物動態の変化が導かれ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）を参照。
【０１０３】
本発明の実施形態はまた、以下に限定されないが、薬物動態の改変、血清半減期の延長、結合親和性の向上、免疫原性の低下、産生物の増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの増強又は低下、グリコシル化及び／若しくはジスルフィド結合の改変、並びに結合特異性の修正を含めた特徴を有する化合物をもたらし、これらに限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異及び／又は修飾を含めた、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換又は修飾を含むことができる。
【０１０４】
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、細胞毒性の向上、及び／又は血清半減期の延長のような薬物動態の改変をもたらし得る、Ｆｃドメイン及びＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎ）間の相互作用に関与する、アミノ酸残基の変化を通して、生成され得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；及びｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）を参照されたい）。
【０１０５】
選択された実施形態において、インビボ半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失又は付加）することにより生成することができる（例えば、ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照）。このような実施形態に関して、Ｆｃバリアントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より長いか、１０日より長いか、１５日より長いか、好ましくは２０日より長いか、２５日より長いか、３０日より長いか、３５日より長いか、４０日より長いか、４５日より長いか、２カ月より長いか、３カ月より長いか、４カ月より長いか又は５カ月より長い、半減期を与え得る。延長された半減期により血清力価が高くなり、したがって、抗体の投与頻度を減少させそして／又は投与される抗体の濃度を減少させる。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイされ得る。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が向上した又は減少した抗体バリアントを記載している。さらに、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）を参照。
【０１０６】
他の実施形態において、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増強又は低下が導かれ得る。当該技術分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、細胞毒性の１形態を指し、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージ）に存在するＦｃＲへ分泌Ｉｇが結合すると、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合可能となり、この後、細胞毒により標的細胞が殺傷される。本発明の文脈において、抗体バリアントは、「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有し、親若しくは非修飾抗体又は天然のＦｃＲ配列を含む抗体と比較して、結合が増強又は減少している。低下した結合を示すこのようなバリアントは、明らかな結合をほとんど又は全く有さず、例えば、天然配列と比較してＦｃＲに対する結合は、例えば当該技術分野で周知の技術で決定するとき、０〜２０％であり得る。他の実施形態において、バリアントは、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して増強された結合を示す。これらの種類のＦｃバリアントは、本開示の抗体の有効な抗新生物特性を増強するために有利に使用し得ることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、糖鎖結合及び／若しくはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位に対して）、結合特異性の変更、ファゴサイトーシスの増加及び／又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを導く。
【０１０７】
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、例えば、タンパク質（例えばＦｃドメイン中の）に共有結合されている改変された糖鎖結合パターン又は改変された炭化水素組成を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０を参照。操作されたグリコフォームは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強又は減少、標的に対する抗体の親和性の増加又は抗体の産生促進のために、有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域フレームワーク糖鎖結合部位の消去に至り得る置換、したがってこの部位での糖鎖結合を消去し得る置換は、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０及び６，３５０，８６１参照）。逆に、増強されたエフェクター機能又は改善された結合が、１つ以上のさらなる糖鎖結合部位の操作によって、Ｆｃ含有分子に付与されてもよい。
【０１０８】
他の実施形態としては、改変された糖鎖組成を有するＦｃバリアント、例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体又は二分化ＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体が挙げられる。このような改変された糖鎖結合パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、操作された系統若しくはバリアントの発現系統を使用することにより、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））と共発現させることにより、様々な生物又は様々な生物由来の細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後炭水化物を修飾することにより（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）、生成され得る。
【０１０９】
４．４．断片
本発明の実施のためにどの形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択したかにかかわらず、免疫反応断片を、それ自体で又は抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従って使用し得ることが理解される。「抗体断片」は、無傷な抗体の少なくとも１部を含む。本明細書で使用するとき、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片を含んでおり、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原若しくはこの免疫原性断片に免疫特異的に結合するか若しくは反応するか、又は、この断片が由来する無傷抗体と特異的な抗原結合について競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。
【０１１０】
例示的な免疫反応性断片としては、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられる。さらに、活性部位特異的断片は、抗原／基質又は受容体と相互作用する能力を維持し、無傷抗体と同様の様式でそれらを修飾する（ただしおそらくはやや効率が劣る）、抗体の部分を含む。このような抗体断片は、本明細書に記載されるような１つ以上の遊離システインを含むようにさらに操作されてもよい。
【０１１１】
特に好ましい実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ結合ドメインは、ｓｃＦｖ構築物を含む。本明細書において使用する場合、「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、抗原に結合する能力を保持している抗体に由来する一本鎖ポリペプチドを意味する。ｓｃＦｖの例は、組換えＤＮＡ技術によって形成される抗体ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖断片及び免疫グロブリン軽鎖断片のＦｖ領域がスペーサー配列を介して連結されている。ｓｃＦｖを調製するための多様な方法は公知であり、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６９４，７７８に記載された方法を含む。
【０１１２】
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷抗体に存在しているときに通常伴われる少なくとも１つの生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を維持している断片である。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
【０１１３】
当業者であれば十分に認識されるように、断片は、分子操作技術により又は無傷の若しくは完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理（例えばパパイン若しくはペプシン）を介するか又は組換え手段により、取得することができる。抗体断片のより詳細な説明は、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照。
【０１１４】
選択された実施形態において、本発明の抗体断片は、様々な立体構造において使用され得る、ＳｃＦｖ構築物を含む。例えば、このような抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＳｃＦｖ構築物は、腫瘍を治療するための養子免疫遺伝子治療法において使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明の抗体（例えば、ＳｃＦｖ断片）が使用されて、ＢＭＰＲ１Ｂと免疫選択的に反応する、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を生成することができる。本開示によれば、抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＣＡＲは、本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はその免疫反応性断片（例えば、ＳｃＦｖ断片）、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む、融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＣＡＲを発現するよう遺伝子操作されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞又は樹状細胞は、対象の免疫系を刺激するため、具体的にＢＭＰＲ１Ｂを発現する腫瘍細胞を標的とするため、がんに罹患している対象に導入され得る。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞受容体複合体、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来する細胞内ドメインを介して、一次細胞質シグナル伝達配列を開始する細胞内ドメイン、すなわち、抗原依存性一次活性化を開始するための配列を含む。他の実施形態において、本発明のＣＡＲは、二次又は共刺激シグナルを開始する細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ及びグルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子受容体由来の細胞内ドメインを含む（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．ＵＳ／２０１４／０２４２７０１を参照）。
【０１１５】
４．５．多価構築物
他の実施形態において、本発明の抗体及びコンジュゲートは、一価又は多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書で使用するとき、用語「価数」は、抗体に関連した可能な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子又は特異的位置若しくは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価であるとき、分子の各結合部位は、単一抗原位置又はエピトープで特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は同じ又は異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープ若しくは位置に結合してもよい）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照。
【０１１６】
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体であり、２つの鎖が、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９に記載されるように、異なる特異性を有している。他の実施形態には、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体が含まれる。他のより精巧な適合する多重特異的構築物及びそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５並びにＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０及びＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
【０１１７】
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合してもよく、又は異種性ポリペプチド若しくは固形支持材料のような標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合してもよい。選択された実施形態は２つの抗原にのみ結合する（つまり、二重特異的抗体である）ことができるが、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体も本発明に包含される。二重特異的抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化させるために（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共にＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
【０１１８】
５．抗体の組換え産生
抗体及びそれらの断片は、抗体産生細胞及び組換え技術から得られた遺伝子材料を使用して作製又は修飾されてもよい（例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照）。
【０１１９】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分又は他の混入物、例えば、他の細胞核酸若しくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野で周知の他のものを使用して分離されるとき、「単離される」か又は実質的に純粋にされる。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ及びこの人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）であり得、一本鎖若しくは二本鎖又はＲＮＡ、ＲＮＡであってもよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。選択された実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１２０】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記実施例に記載された調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、抗体の軽鎖及び重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体については、抗体をコードしている核酸分子が、ライブラリから収集され得る。
【０１２１】
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーをコードしている別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
【０１２２】
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。例示的ＩｇＧ１定常領域は、配列番号２に示される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０１２３】
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。例示的な適合性カッパ軽鎖定常領域は、配列番号５に示されている一方、例示的な適合性ラムダ軽鎖定常領域は、配列番号８に示されている。
【０１２４】
各場合において、ＶＨ又はＶＬドメインは、これらの各定常領域（ＣＨ又はＣＬ）に作動可能に連結されることができ、この場合、定常領域は、部位特異的定常領域であり、部位特異的抗体をもたらす。選択された実施形態において、得られた部位特異的抗体は、重鎖に２つの不対システイン対を含む一方、他の実施形態において、部位特異的抗体は、ＣＬドメインに２つの不対システインを含む。
【０１２５】
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原又は抗体）が検討される。例えば、誘導されたヒト化抗体ＶＨ又はＶＬドメインは、出所（例えば、マウス）又はアクセプター（例えば、ヒト）ＶＨ又はＶＬドメインと配列類似性を示し得る。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。本明細書で使用するとき、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（つまり、％相同性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数と各ギャップの長さが考慮に入れられる。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１２６】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１〜１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ・レングス・ペナルティ、４のギャップペナルティを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ・ウェイト及び１、２、３、４、５又は６のレングス・ウェイトを使用して決定され得る。
【０１２７】
追加的に又は代替的に、本発明のタンパク質配列は、公的データベースに対して検索を行い、例えば関連する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用されてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップありアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているように利用されてもよい。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されてもよい。
【０１２８】
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換また非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を訂正するために、配列同一性パーセント又は類似度を上昇させるように調整してもよい。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、実施形態において、配列同一性を示すポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能又は活性を保持する。
【０１２９】
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。
【０１３０】
本発明は、プロモーターに作動可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節及びプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞及び宿主発現系も提供する。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、又はポリペプチド及び抗体のいずれかを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））又は哺乳動物細胞若しくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターで同時トランスフェクトされていてもよい。
【０１３２】
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１及び４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォーム又はＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
【０１３３】
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれも使用することができ、例えば、選択された条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的又は部分的に、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７及びＥＰ０３３８８４１並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９及び５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の適合する発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１３４】
本発明の抗体が、組換え発現又は任意の他の開示された技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製又は単離されてもよく、これにより抗体は、同定され、それらの天然環境から分離されそして／若しくは回収され、抗体又は関連ＡＤＣの診断的又は治療的用途に干渉する混入物から分離される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
【０１３５】
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション及び親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。下記の実施例において、適合する方法をより詳細に説明する。
【０１３６】
６．産生後選択
取得される方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローニングされ、そして所望の特徴（例えば、堅固な成長、抗体高産生及び目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴）のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロで又は同系遺伝子免疫無防備状態動物において、インビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマ及び／又はコロニーを選択、クローニング及び拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学及び生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作及び発現させてもよい。
【０１３７】
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）及び抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージ又は酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
【０１３８】
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体又はｓｃＦｖ断片のライブラリがファージ又は酵母で合成されるファージ又は酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原又はその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージ又は酵母を単離して、これらから抗体又は免疫反応性断片を取得し得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージ又は酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用され得る他の方法及び試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利に可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
【０１３９】
ＩＶ．抗体の特徴
ある特定の実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローニングされ、並びに好ましい特性、例えば、堅固な成長、抗体高産生及び下記に詳細に記載されるような望ましい部位特異的抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。他の場合において、抗体の特徴は、動物の接種のために、特定の抗原（例えば、特異的ＢＭＰＲ１Ｂアイソフォーム）又は標的抗原の免疫応答性断片を選択することによって付与されてもよい。さらに他の実施形態において、選択された抗体は、上記のように操作されて、免疫化学的特徴、例えば親和性又は薬物動態が増強又は洗練されてもよい。
【０１４０】
Ａ．中和抗体
選択された実施形態において、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」又は「中和」抗体であってもよい。これは、この抗体が、決定因子と会合することができ、直接的に、又は前記決定因子とリガンド若しくは受容体のような結合パートナーとの会合を阻止することによって、前記決定因子の活性を遮断若しくは阻害することにより、この抗体がなければ分子の相互作用からもたらされるであろう生物学的応答を、遮ることを意味する。中和抗体又はアンタゴニスト抗体は、過剰の抗体が、例えば、標的分子活性によって測定するか又はインビトロでの競合結合アッセイにおいて測定した場合に、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超えて、決定因子に結合したパートナーの結合量を低下させる場合、このリガンド又は基質への決定因子の結合を実質的に阻害する。改変された活性は、当該技術分野で認識されている技術を直接使用して測定されてもよく、又は下流において改変された活性が有する影響（例えば、腫瘍発生又は細胞生存）によって測定されてもよいことが理解される。実施例２１において以下に説明され、図１９Ａ〜１９Ｅに示されている通り、本発明の抗体が、ＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２（ＢＭＰＲ１Ｂの天然リガンド）の結合を遮断又は阻害することができるかどうかを容易に決定することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の例示的な抗体は、以下に説明されている通りに測定すると、少なくとも、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ超で、ＢＭＰ４のＢＭＰＲ１Ｂへの結合を遮断する。他の実施形態において、本発明のある特定の抗体は、以下に説明されている通りに測定すると、少なくとも、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超えて、ＢＭＰ２のＢＭＰＲ１Ｂへの結合を遮断する。このようなアンタゴニスト抗体（例えば、ｈＳＣ９１．１及びｈＳＣ９１．９）を含むある特定のＡＤＣは、腫瘍細胞の殺傷に特に有効であることが示されているので、このような中和抗体又は遮断抗体は、開示されているＡＤＣ及び本明細書において開示されているがんの処置において使用するのに特に適合可能である場合がある。
【０１４１】
Ｂ．内在化抗体
ある特定の実施形態において、抗体は、抗体が決定因子と結合し、腫瘍形成性細胞のような選択された標的細胞に内在化される（任意のコンジュゲートされた薬学的に活性な成分を伴う）ような、内在化抗体を含み得る。内在化する抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現腫瘍形成性細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体又は一部の場合には抗体薬物コンジュゲートの効力に応じて、単一抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分であり得る。本発明に関連して、発現されたＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の実質的な部分が腫瘍形成性細胞表面に会合して残り、それにより本開示の抗体又はＡＤＣの局在化及び内在化を可能にしているという証拠がある。選択された実施形態において、このような抗体は、内在化に際して細胞を殺傷する１つ以上の薬物と会合されるか又はコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、内在化部位特異的ＡＤＣを含む。
【０１４２】
本明細書で使用されるとき、「内在化する」抗体は、関連する決定因子に結合する際に、標的細胞によって（任意のコンジュゲートされた細胞毒と共に）取り込まれる抗体を指す。このような内在化するＡＤＣの数は、決定因子発現細胞、特に、決定因子発現がん幹細胞を殺傷するのに十分であることが好ましい。細胞毒又はＡＤＣの全体としての効力に応じて、一部の場合には、抗体の数分子の細胞内への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分である。例えば、ＰＢＤ又はカリチアマイシンのようなある特定の薬物は強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数分子の内在化が、腫瘍細胞を殺傷するために十分である。抗体が哺乳類細胞に結合して内在化するかどうかは、以下の実施例で記載されるものを含む、当該技術分野で認識されている様々なアッセイ（例えば、Ｍａｂ−Ｚａｐ及びＦａｂ−Ｚａｐのようなサポリンアッセイ；アドバンストターゲティングシステム）により決定され得る。抗体が細胞に内在化するかどうかを検出する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８にも記載されている。
【０１４３】
Ｃ．枯渇抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は枯渇抗体である。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上又は細胞表面近傍で抗原に結合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ又は細胞毒性剤の導入により）細胞の死を誘導するか、促進するか又はもたらす抗体を指す。実施形態において、選択された枯渇抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。
【０１４４】
好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％を殺傷することができる。用語「見かけのＩＣ５０」とは、本明細書において使用する場合、毒素に連結している一次抗体が、この一次抗体によって認識された抗原を発現する細胞の５０パーセントを殺傷した濃度を指す。毒素は、一次抗体に直接コンジュゲートされてもよく、又は一次抗体を認識する二次抗体若しくは抗体断片を介して一次抗体と会合してもよく、これらの二次抗体又は抗体断片は、毒素に直接コンジュゲートされている。枯渇抗体は、５μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有するのが好ましい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、濃縮されたか、区分されたか、精製されたか又は単離された腫瘍形成性細胞、例えば、がん幹細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料又はがん幹細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術が使用され、腫瘍形成性細胞の枯渇が、本明細書に記載の技術に従って監視及び定量されてもよい。
【０１４５】
Ｄ．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＢＭＰＲ１Ｂに対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数又は見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満又は５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＢＭＰＲ１Ｂに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はｋｏｎ（又はｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１４７】
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＢＭＰＲ１Ｂに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満又は１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数又はｋｏｆｆ（又はｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１４８】
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリーを使用して決定され得る。
【０１４９】
Ｅ．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）及びエピトープマッピング
本明細書に開示された抗体は、それらが会合する個別のエピトープの観点で特徴付けることができる。「エピトープ」は、抗体又は免疫反応性断片が特異的に結合する決定因子の部分である。免疫特異的結合は、上記の結合親和性に基づいて又はタンパク質及び／若しくは巨大分子の複雑な混合物における（例えば、競合アッセイにおける）その標的抗原の抗体による優先的な認識により、確認し、定義することができる。「線状エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする、抗原における連続的アミノ酸により形成される。線状エピトープに優先的に結合する能力は、一般に、抗原が変性されたときでも維持される。逆に、「立体エピトープ」は、通常、抗原のアミノ酸配列における非連続的アミノ酸であるが、抗原の二次的、三次的又は四次的構造の概念において、単一の抗体に同時に結合されるために十分に近接している非連続的アミノ酸を含む。立体エピトープを有する抗原が変性されたとき、通常、抗体はもはや抗原を認識しない。エピトープ（連続的又は非連続的）は、特有の空間的立体配置に、通常少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個又は８〜１０個又は１２〜２０個のアミノ酸を含む。
【０１５０】
本発明の抗体は、それらが属する群又は「ビン（ｂｉｎ）」の観点で特徴付けることもできる。「ビニング」は、免疫原性決定因子に同時に結合することができない抗体の対を同定し、それによって結合について「競合する」抗体を同定する、競合的抗体結合アッセイの使用を指す。抗体の競合は、試験される抗体又は免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を予防又は阻害するアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイは、典型的には、固体表面又は細胞、非標識試験抗体及び標識参照抗体に結合した精製抗原（例えば、ＢＭＰＲ１Ｂ又はこのドメイン若しくは断片）の使用が含まれる。競合阻害は、試験抗体の存在下に固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書に記載の実施例で提供される。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、競合抗体は、参照抗体の共通抗原に対する特異的な結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。逆に、参照抗体が結合しているとき、参照抗体は、後で添加する試験抗体（つまり、ＢＭＰＲ１Ｂ抗体）の結合を、好ましくは、少なくとも、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１５１】
一般に、ビニング又は競合結合は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定され得る。このようなイムノアッセイは慣例であり、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；及びＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ参照）。
【０１５２】
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；又は、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリービーズアレイが挙げられる。
【０１５３】
Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模マルチプレックス抗体対合を可能にするビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、抗体の対の標的抗原への同時結合パターンを比較する。抗体の対の１つ（捕捉ｍＡｂ）がＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合し、一方でそれぞれの捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合する。他の抗体（検出因子ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（対合）を解析し、同様の対合プロファイルを有する抗体を会合する。検出因子ｍＡｂ及び捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じか又は密接に関連したエピトープに結合することを示す。一実施形態において、対合プロファイルは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用して決定され、試験される一連の抗体の任意の特定の抗体に最も密接に相関する抗体を同定することができる。実施形態において、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出因子ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７又は０．８９である。さらなる実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２に記載されている。同時に１００種類（又はそれ以上）の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原及び／又は抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力及び解像度がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
【０１５４】
同様に、表面プラズモン共鳴を含むビニング技術は、本発明に適合する。本明細書で使用されるとき、「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、特異的相互作用のリアルタイム解析を可能にする光学的現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システムのような市販の機器を使用して、選択された抗体が、定義された抗原に対する結合に関して互いに競合するか否かを容易に決定することができる。
【０１５５】
他の実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」かを決定するために使用し得る技術は「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中又は異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１及びＡｂ２は「競合する」抗体と決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１及びＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１５６】
競合抗体の群を包含するビンが定義されたら、この抗体の群が結合する抗原上の特異的ドメイン又はエピトープを決定するために、さらなる特徴付けを実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコルを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、ファインエピトープマッピングは、ファージ又は酵母ディスプレイを使用して実施することができる。他の適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）又はペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾のような方法（Ｔｏｍｅｒ、２０００、ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）も、タンパク分解酵素のような酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）；スクシンイミジルエステル及びそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン、遊離アミノ酸のような化学物質を使用して利用することができる。別の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を使用して、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類することができる（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。
【０１５８】
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対するさらなる抗体を、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、選択されたエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。
【０１５９】
Ｖ．抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、薬学的に活性な又は診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）又は「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、会合の方法にかかわらず、任意の薬学的に活性な又は診断的成分と本発明の抗体との共有結合的又は非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態において、この会合は、抗体のリシン又はシステイン残基を通じて達成される。いくつかの実施形態において、薬学的に活性な又は診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲートされ得る。開示されるＡＤＣは、治療及び診断目的のために使用され得る。
【０１６０】
本発明のＡＤＣが使用されて、所定の弾頭を、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞及び／又はＢＭＰＲ１Ｂを発現する細胞）に選択的に送達し得ることが理解される。本明細書において示される場合、用語「薬物」又は「弾頭」は、相互に交換可能に使用され得、任意の生物学的に活性である（例えば、薬学的活性化合物又は治療成分）分子若しくは化合物、又は対象に導入すると、生理学的作用又はレポーター機能を有する検出可能な分子若しくは化合物を意味する。誤解を避けると、このような弾頭には、以下に記載されている抗がん剤又は細胞毒が含まれる。「ペイロード」は、ＡＤＣが標的に到達するまで、比較的安定な医薬品複合体を好ましくはもたらす、任意選択のリンカー化合物（例えば、治療用ペイロード）と組み合わせた薬物又は弾頭を含み得る。例として、コンジュゲート上の弾頭又は薬物は、ペプチド、タンパク質、又はインビボで代謝されて活性剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位体を含み得る。ある特定の実施形態において、薬物又は弾頭は、リンカーを介して、共有結合により抗体にコンジュゲートされる。他の実施形態（例えば、放射性同位体）において、薬物又は弾頭は、抗体に直接コンジュゲートされる、又は抗体に組み込まれる。
【０１６１】
好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロード（例えば、薬物リンカー）を、弾頭の放出及び活性化の前に、比較的非反応性の非毒性状態で標的部位に向かわせる（例えば、本明細書において開示されているＰＢＤＳ１〜５）。弾頭のこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステイン又はリシンを介する）及び過剰にコンジュゲートされた毒性ＡＤＣ種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物により達成される。腫瘍部位への送達時に、弾頭を大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合すると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的毒性を実質的に低減することができる。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞及び組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）が組み込まれたペイロードを含むが、診断剤及び生体適合性修飾剤が組み込まれた他のペイロードも、開示されるコンジュゲートにより、提供される標的化送達から利益を得る場合があることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤又は生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的に又は非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。
【０１６３】
本発明のコンジュゲートは一般的に、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約２０の整数である）
又はその薬学的に許容される塩によって表され得る。
【０１６４】
当業者は、前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカー及び薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々であることを理解する。このように、開示される抗体の反応性残基（例えば、システイン又はリシン）と会合する任意の薬物又は薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対するコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションを含む）を可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明のいくつかの好ましい実施形態は、薬物又は薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーション及び混入物がより少なく、したがって毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。
【０１６５】
Ａ．ペイロード及び弾頭
１．治療剤
議論した通り、本発明の抗体は、治療成分又は抗がん剤のような薬物を含む、任意の薬学的活性化合物、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤（又は細胞毒）、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、又は融合、又は他の方法で会合されてもよい。
【０１６６】
例示的な抗がん剤又は細胞毒（それらのホモログ及び誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリチアマイシン（ｎ−アセチルカリチアマイシンを含む）、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１及びＤＭ−４（免疫原）のようなマイタンシノイド、ベンゾジアゼピン誘導体（免疫原）、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカイン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、酸、若しくは誘導体が挙げられる。
【０１６７】
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチン及びオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾若しくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体又は誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブリン（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体及びチューブリシン、パクリタキセル及びＤＮＡ損傷剤、例えば、カリチアマイシン及びエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン及び５−フルオロウラシル  デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチン及びビンクリスチン及びアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を含む。
【０１６８】
選択された実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と会合され得る（ＢｉＴＥ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
【０１６９】
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含む細胞毒を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、７６Ｂｒ、２１１Ａｔ及び２２５Ａｃが挙げられる。他の放射性核種も診断剤及び治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
【０１７０】
他の選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体弾頭にコンジュゲートされる。本開示の抗体にコンジュゲートされ得る適合ベンゾジアゼピン誘導体（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，４２６，４０２並びにＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８及びＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。ＰＢＤと同様に、適合ベンゾジアゼピン誘導体は、ＤＮＡの副溝に結合し、核酸合成を阻害すると考えられる。このような化合物は、強力な抗腫瘍特性を有することが報告され、したがって、本発明のＡＤＣに用いるのにとりわけ適している。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤ及びその薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を、弾頭として含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７及びＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３及びＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。本発明と適合するＰＢＤ化合物の例は、このすぐ後に一層詳細に議論されている。
【０１７２】
本発明に関すると、ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカーのうちのいずれか１つ（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を用いてＢＭＰＲ１Ｂ標的剤に連結されてもよく、特定の実施形態において、二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。ＰＢＤは、以下の一般構造のものである。
【０１７３】
【化１０】
2019522960.tif 000013
【０１７４】
これらは、芳香族Ａ環及びピロロＣ環の両方における置換基の数、種類及び位置並びにＣ環の飽和の程度が異なる。Ｂ環において、ＤＮＡのアルキル化に関与する求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。全ての公知の天然産物は、Ｃ環からＡ環の方を見るときに右回りのねじれをもたらすキラルＣ１１ａ位における（Ｓ）−立体配置を有する。これは、Ｂ型ＤＮＡの副溝に対してイソらせん性となるための適切な三次元形状を天然産物に付与して、結合部位におけるぴったりとした結合をもたらす（Ｋｏｈｎ、Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３−１１頁（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ及びＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、１９巻、２３０−２３７頁（１９８６））。副溝における付加体を形成する天然産物の能力は、ＤＮＡプロセシングを妨害すること及び細胞毒性剤として働くことを可能にする。上で言及したように、これらの効力を増大させるために、ＰＢＤは、本明細書で述べたように抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体にコンジュゲートされ得る二量体でしばしば用いられる。
【０１７５】
本発明のある特定の実施形態において、本開示のモジュレーターにコンジュゲートされ得る適合性ＰＢＤは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に記載されている。この開示は、ある特定の有利な特性を有することが示されている、ＰＢＤ二量体（すなわち、２つのＰＢＤ部分を含むもの）を提供している。この点において、本発明の選択されたＡＤＣは、式（ＡＢ）又は（ＡＣ）を有するＰＢＤ毒素を含む：
【０１７６】
【化１１】
2019522960.tif 000014
式中、
点線は、Ｃ１とＣ２又はＣ２とＣ３との間に二重結合が任意選択で存在していることを示し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、任意選択的に、ハロ又はジハロからさらに選択され、
ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから独立して選択され、
Ｒ６及びＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択され、
Ｒ１０は、本明細書に記載されているＢＭＰＲ１Ｂ抗体、又はこの断片若しくは誘導体に結合しているリンカーであり、
Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立して選択され、
Ｒ１１は、Ｈ又はＲであり、又はＱはＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍとすることができ、Ｍは金属陽イオンであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択され、選択された実施形態において、Ｏを含み、
Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキレン基であり、この鎖は、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は芳香族環、例えば、ベンゼン又はピリジンであり、この環は、置換されていてもよい）により中断されていてもよく、
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル及びＣ５〜２０アリール基からそれぞれ独立して選択され、任意選択的に、基ＮＲＲ’に関連して、Ｒ及びＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員、５員、６員又は７員の複素環式環を形成し、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”及びＲ１１”（存在する場合）は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ及びＲ１１に従って定義され、Ｒｃは、キャッピング基である。
【０１７７】
前述の構造を含む選択された実施形態を、このすぐ後により詳細に記載する。
【０１７８】
二重結合
一実施形態において、Ｃ１とＣ２との間及びＣ２とＣ３との間に存在する二重結合は存在しない。
【０１７９】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【０１８０】
【化１２】
2019522960.tif 000015
【０１８１】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルである場合に、Ｃ２とＣ３との間に存在する。好ましい実施形態において、Ｒ２は、メチル基を含む。
【０１８２】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ１とＣ２との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【０１８３】
【化１３】
2019522960.tif 000016
【０１８４】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルである場合に、Ｃ１とＣ２との間に存在する。好ましい実施形態において、Ｒ２は、メチル基を含む。
【０１８５】
Ｒ２
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択され、ハロ又はジハロから任意選択的にさらに選択される。
【０１８６】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択される。
【０１８７】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ及び＝Ｃ（ＲＤ）２から独立に選択される。
【０１８８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＨである。
【０１８９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲであり、Ｒは、ＣＨ３を含む。
【０１９０】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｏである。
【０１９１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝ＣＨ２である。
【０１９２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内において、＝ＣＨ−ＲＤ基は、下に示すいずれかの立体配置を有し得る。
【０１９３】
【化１４】
2019522960.tif 000017
【０１９４】
一実施形態において、立体配置は、立体配置（Ｉ）である。
【０１９５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０１９６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＦ２である。
【０１９７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲである。
【０１９８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０１９９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ１〜１２アリールである。
【０２００】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０２０１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜７アリールである。
【０２０２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ８〜１０アリールである。
【０２０３】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいフェニルである。
【０２０４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいナフチルである。
【０２０５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいピリジルである。
【０２０６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいキノリニル又はイソキノリニルである。
【０２０７】
一実施形態において、Ｒ２は、１つから３つの置換基を有し、１つ及び２つがより好ましく、一置換基が最も好ましい。置換基は、いずれの位置にあってもよい。
【０２０８】
Ｒ２がＣ５〜７アリール基である場合、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に隣接しない環原子上にある。すなわち、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に対してβ又はγである。したがって、Ｃ５〜７アリール基がフェニルである場合、置換基は、好ましくはメタ位又はパラ位にあり、より好ましくはパラ位にある。
【０２０９】
一実施形態において、Ｒ２は、
【０２１０】
【化１５】
2019522960.tif 000018
（式中、アスタリスクは、結合点を示す）から選択される。
【０２１１】
Ｒ２がＣ８〜１０アリール基、例えば、キノリニル又はイソキノリニルである場合、Ｒ２は、キノリニル環又はイソキノリニル環のいかなる位置におけるいかなる数の置換基も有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、１つ、２つ又は３つの置換基を有し、これらは、近位及び遠位の環のいずれか又は両方（２つ以上の置換基の場合）に存在し得る。
【０２１２】
一実施形態において、Ｒ２が置換されていてもよい場合、置換基は、下の置換基の項に示す置換基から選択される。
【０２１３】
Ｒが置換されていてもよい場合、置換基は、好ましくは以下から選択される：
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ及びチオエーテル。
【０２１４】
一実施形態において、Ｒ又はＲ２が置換されていてもよい場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ及びＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０２１５】
Ｒ２がＣ１〜１２アルキルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０２１６】
Ｒ２がＣ３〜２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ１〜１２アルキル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０２１７】
Ｒ２がＣ５〜２０アリール基である場合、任意選択の置換基は、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ１〜１２アルキル基をさらに含み得る。
【０２１８】
「アルキル」という用語が、アルケニルサブクラス及びアルキニルサブクラス並びにシクロアルキルを含むことが、理解される。したがって、Ｒ２が置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルである場合、アルキル基が、共役系の一部をなし得る、１つ以上の炭素−炭素二重又は三重結合を任意選択的に含むことが理解される。一実施形態において、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重又は三重結合を含み、この結合は、Ｃ１とＣ２との間又はＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートしている。一実施形態において、Ｃ１〜１２アルキル基は、飽和Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、Ｃ２〜１２アルキニル及びＣ３〜１２シクロアルキルから選択される基である。
【０２１９】
Ｒ２上の置換基がハロである場合、置換基は、好ましくはＦ又はＣｌ、より好ましくはＣｌである。
【０２２０】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、アルコキシ基、例えば、Ｃ１〜７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）であってもよく又は、いくつかの実施形態において、Ｃ５〜７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であってもよい。
【０２２１】
Ｒ２上の置換基がＣ１〜７アルキルである場合、置換基は、好ましくはＣ１〜４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）であり得る。
【０２２２】
Ｒ２上の置換基がＣ３〜７ヘテロシクリルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルであり得る。これらの基は、窒素原子を介してＰＢＤ部分の残余部分に結合することができる。これらの基は、例えば、Ｃ１〜４アルキル基によりさらに置換することができる。
【０２２３】
Ｒ２上の置換基がビス−オキシ−Ｃ１〜３アルキレンである場合、これは、好ましくはビス−オキシ−メチレン又はビス−オキシ−エチレンである。
【０２２４】
Ｒ２の特に好ましい置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノ及びメチルチエニルを含む。
【０２２５】
特に好ましい置換Ｒ２基は、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシ−フェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル及びナフチルを含むが、これらに限定されない。
【０２２６】
一実施形態において、Ｒ２は、ハロ又はジハロである。一実施形態において、Ｒ２は、置換基がそれぞれ（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）として下に例示されている、−Ｆ又は−Ｆ２である。
【０２２７】
【化１６】
2019522960.tif 000019
【０２２８】
ＲＤ
一実施形態において、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから独立に選択される。
【０２２９】
一実施形態において、ＲＤは、独立にＲである。
【０２３０】
一実施形態において、ＲＤは、独立にハロである。
【０２３１】
Ｒ６
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立に選択される。
【０２３２】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２及びハロから独立に選択される。
【０２３３】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ及びハロから独立に選択される。
【０２３４】
一実施形態において、Ｒ６は、独立にＨである。
【０２３５】
一実施形態において、Ｒ６及びＲ７は、一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−基を形成しており、ｐは、１又は２である。
【０２３６】
Ｒ７
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立に選択される。
【０２３７】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲである。
【０２３８】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ１〜６アルキルである。
【０２３９】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよい飽和Ｃ１〜６アルキルである。
【０２４０】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ２〜４アルケニルである。
【０２４１】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＭｅである。
【０２４２】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＣＨ２Ｐｈである。
【０２４３】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にアリルである。
【０２４４】
一実施形態において、化合物は、二量体であって、各単量体のＲ７基が一緒になって、単量体を連結する式Ｘ−Ｒ’’−Ｘを有する二量体架橋を形成している。
【０２４５】
Ｒ９
一実施形態において、Ｒ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、  Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立に選択される。
【０２４６】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＨである。
【０２４７】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＲ又はＯＲである。
【０２４８】
Ｒ１０
好ましくは、本明細書に記載されるような適合リンカーは、Ｒ１０位（すなわち、Ｎ１０）における共有結合によりＢＭＰＲ１Ｂ抗体をＰＢＤ薬物部分に結合させる。
【０２４９】
Ｑ
特定の実施形態において、Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立に選択される。
【０２５０】
一実施形態において、Ｑは、独立にＯである。
【０２５１】
一実施形態において、Ｑは、独立にＳである。
【０２５２】
一実施形態において、Ｑは、独立にＮＨである。
【０２５３】
Ｒ１１
選択された実施形態において、Ｒ１１は、Ｈ若しくはＲであり、又はＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍであり得、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２５４】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｈである。
【０２５５】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｒである。
【０２５６】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２５７】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｈである。
【０２５８】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｒである。
【０２５９】
Ｘ
一実施形態において、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択される。
【０２６０】
好ましくは、Ｘは、Ｏである。
【０２６１】
Ｒ’’
Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は環が置換されていてもよい芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって中断されていてよいＣ３〜１２アルキレン基である。
【０２６２】
一実施形態において、Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えば、ベンゼン又はピリジンによって中断されていてよいＣ３〜１２アルキレン基である。
【０２６３】
一実施形態において、該アルキレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＭｅから選択される１つ以上のヘテロ原子並びに／又は環が置換されていてもよい芳香環によって、任意選択的に中断されている。
【０２６４】
一実施形態において、芳香環は、Ｃ５〜２０アリレン基であり、アリレンは、芳香族化合物の２個の芳香環原子から２個の水素原子を除去することにより得られた二価部分に関し、この部分は、５から２０個の環原子を有する。
【０２６５】
一実施形態において、Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は環がＮＨ２により置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２６６】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２６７】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９及びＣ１１アルキレン基から選択される。
【０２６８】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３、Ｃ５及びＣ７アルキレン基から選択される。
【０２６９】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３及びＣ５アルキレン基から選択される。
【０２７０】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３アルキレン基である。
【０２７１】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ５アルキレン基である。
【０２７２】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子及び／又は環が置換されていてもよい芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって、任意選択的に中断されていてよい。
【０２７３】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって、任意選択的に中断されていてよい。
【０２７４】
上に示したアルキレン基は、非置換直鎖脂肪族アルキレン基であり得る。
【０２７５】
Ｒ及びＲ’
一実施形態において、Ｒは、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基から独立に選択される。
【０２７６】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルである。
【０２７７】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ３〜２０ヘテロシクリルである。
【０２７８】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０２７９】
好ましいアルキル基及びアリール基並びに任意選択の置換基の同一性及び数に関する様々な実施形態を、Ｒ２に関して上で述べた。Ｒ２について示した選択は、それがＲに適用されるとき、適切な場合、例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８又はＲ９がＲである場合、全ての他の基Ｒに適用できる。
【０２８０】
Ｒについての選択は、Ｒ’にも適用される。
【０２８１】
本発明のいくつかの実施形態において、−ＮＲＲ’置換基を有する化合物を提供する。いくつかの実施形態において、Ｒ及びＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４、５、６又は７員ヘテロ環を形成している。環は、さらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ又はＳを含み得る。
【０２８２】
一実施形態において、ヘテロ環は、それ自体Ｒ基で置換されている。さらなるＮヘテロ原子が存在する場合、置換基は、Ｎヘテロ原子上に存在し得る。
【０２８３】
前述のＰＢＤに加えて、特定の二量体ＰＢＤは、とりわけ活性であることが示され、本発明と共に用いられ得る。この目的を達成するために、本発明の抗体薬物コンジュゲート（すなわち、本明細書で開示するＡＤＣ１〜６）は、ＰＢＤ１〜５としてこのすぐ後に示すＰＢＤ化合物を含み得る。以下のＰＢＤ１〜５は、本明細書においてより詳細に記載されているもののような、リンカーの分離後に放出される毒性弾頭を含む。薬物−リンカー化合物の成分としてのＰＢＤ１〜５のそれぞれの合成は、このような合成について参照により組み込むＷＯ２０１４／１３０８７９に極めて詳細に示されている。ＷＯ２０１４／１３０８７９を考慮すると、本発明のＡＤＣの選択された弾頭を含み得る細胞毒性化合物を容易に作製し、本明細書で示すように用いることができる。したがって、リンカーからの分離の際に、開示されるＡＤＣから放出され得る選択されたＰＢＤ化合物は、このすぐ後に示される：
【０２８４】
【化１７】
2019522960.tif 000020
【０２８５】
前記二量体ＰＢＤ弾頭のそれぞれが、好ましくは、標的細胞による内在化及びリンカーの破壊に際して放出されることが理解される。下記においてさらに詳細に記載されているように、ある特定のリンカーは、リンカーのいかなる部分も保持することなく、活性なＰＢＤ弾頭の放出を可能にする自己崩壊部分を組み込むことができる切断可能リンカーを含む。放出に際し、ＰＢＤ弾頭は、標的細胞のＤＮＡに結合及び架橋する。このような結合は、報告されている通り、標的がん細胞のＤＮＡヘリックスを歪ませることなく標的がん細胞の分裂を阻止することから、一般的な突発的な薬物耐性現象を潜在的に防ぐと報告されている。他の好ましい実施形態において、弾頭は、自己崩壊部分を含まない切断可能リンカーによってＢＭＰＲ１Ｂ標的部分に結合され得る。
【０２８６】
腫瘍部位におけるこのような化合物の送達及び放出は、本開示により増殖性障害を治療又は管理するのに臨床的に有効であることが証明され得る。該化合物に関して、本開示のＰＢＤのそれぞれが、各Ｃ環における１つのｓｐ２中心のみを有する化合物より、ＤＮＡの副溝における強い結合（したがってより大きい毒性）を可能にし得る、各Ｃ環における２つのｓｐ２中心を有することが理解される。したがって、本明細書に示すＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣに用いる場合、本開示のＰＢＤは、増殖性障害の治療にとりわけ有効であることが証明され得る。
【０２８７】
前述のことは、本発明に適合する例示的ＰＢＤ化合物をもたらし、このことは、本明細書における教示に従って抗ＢＭＰＲ１Ｂコンジュゲートに組み込まれることに成功し得る他のＰＢＤを限定することを決して意味しない。むしろ、本明細書で議論されるようにかつ下記実施例において示されるように、抗体にコンジュゲートされ得る任意のＰＢＤは、本開示のコンジュゲートと適合し、明確に本発明の範囲内にある。
【０２８８】
前述の作用剤に加えて、本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にコンジュゲートされてもよい。ある特定の実施形態において、生物学的応答修飾剤は、インターロイキン２、インターフェロン、又は様々なタイプのコロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）を含む。
【０２８９】
より一般に、関連薬物成分は、所望の生物活性を有するポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；アポトーシス剤、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦα又はＴＮＦβ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）及びＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）が挙げられ得る。
【０２９０】
２．診断剤又は検出剤
他の実施形態において、本発明の抗体又はその断片若しくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチド又はヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア又は放射性同位体であり得る診断剤若しくは検出剤、マーカー又はレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生若しくは進行を監視するのに、又は開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するための若しくは治療の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として、有用であり得る。このようなマーカー又はレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合又は抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離若しくは単離するために又は前臨床的手法若しくは毒性研究においても、有用であり得る。
【０２９１】
このような診断、解析及び／又は検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、８９Ｚｒ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオン及び特定の放射性同位体に放射標識又はコンジュゲートした分子にカップリングすることによって行われ得る。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
【０２９２】
他の実施形態において、抗体又はその断片は、マーカー配列又は化合物、例えば、ペプチド又はフルオロフォアに融合又はコンジュゲートされて、精製又は診断又は分析的手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣなどを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）及び「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
【０２９３】
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに特徴を調整、変化、改善又は緩和するために使用され得る生体適合性修飾因子とコンジュゲートしてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体又は融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成されてもよい。当業者は、ＰＥＧが、多くの様々な分子量及び分子構造で取得され得、これらを選択して抗体に特定の特性を付与することができる（例えば半減期を調節し得る）ことを理解する。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体若しくは抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのコンジュゲーションを通じて又はリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーあり又はなしで、抗体又は抗体断片又は誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする線状又は分岐ポリマー誘導体が使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により密接に監視され得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、開示される抗体は、抗体若しくは抗体断片をインビボでより安定にするために又はインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００及びＷＯ０１／７７１３７；及びＥＰ０４１３，６２２を参照。他の生体適合性コンジュゲートは当業者にとって明らかであり、本明細書に記載の教示に従って容易に同定され得る。
【０２９４】
Ｂ．リンカー化合物
上で示されているように、本発明に適合するペイロードは、１つ以上の弾頭、及び任意選択的に、弾頭を抗体標的剤と会合させるリンカーを含む。多数のリンカー化合物が、関連する弾頭に本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステイン又はリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することが必要とされるにすぎない。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的又はそれ以外のコンジュゲート）を提供するために使用され得る任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
【０２９５】
適合リンカーは、求核性である還元されたシステイン及びリシンに有利に結合し得る。還元されたシステイン及びリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィド及びチオールパラフルオロ反応が挙げられる。本明細書でさらに議論されるように、チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、この速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、及び抗体から血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンへの、マレイミド連結ペイロードの損失又は移行である。しかしながら、いくつかの実施形態において、コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、本明細書で下記の実施例に示される選択的還元及び部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィド及びピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホン及びチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合し、明確に本発明の範囲内に含まれる。
【０２９６】
選択された実施形態において、適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、ＡＤＣの水性媒体及び単量体状態における自由な可溶性を保持する。細胞への移動又は送達の前に、ＡＤＣは、好ましくは安定であり、無傷のままであり、つまり、抗体は薬物部分に連結したままである。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断又は分解されるように設計され得る。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲート又は薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達又は輸送されるまで、安定及び無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；かつ（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果又は細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣ並びに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体及び薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。ＭＭＡＥ及び抗体のような、２つ以上の機能的又は生物学的に活性な部分を結合するために有用な二価のリンカー試薬は公知であり、本明細書における教示と適合するそれらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されている。
【０２９７】
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカー及び非切断可能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー（例えば、オキシム及びヒドロゾン）プロテアーゼ切断可能リンカー及びジスルフィドリンカーを含み得、標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーマル−リソソーマル経路において切断される。細胞毒の放出及び活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾン又はオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーマル特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコール又はアルキルスペーサーを含有する適合性非切断可能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーマル分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、コンジュゲートで使用される特定の薬物、特定の指標及び抗体標的に依存する。
【０２９８】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソーマル又はエンドソーマルプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール−依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、この薬剤はコンジュゲートされると通常減弱化される薬剤であり、かつこのコンジュゲートの血清安定性が比較的高いことである。
【０２９９】
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ほぼリソソームのｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満で不安定（例えば、切断可能）である。
【０３００】
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）又は３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０３０１】
本発明のある特定の態様において、選択されたリンカーは、式
【０３０２】
【化１８】
2019522960.tif 000021
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含み、Ｌ１は、リンカー単位及び任意選択的に切断可能リンカー単位を含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、好ましくは共有結合であり、Ｕは、存在していてもしていなくてもよく、腫瘍部位における弾頭からのリンカーの完全な分離を促進する自己崩壊性単位の全て又は一部を含み得る）の化合物を含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される形態など）において、適合リンカーは、
【０３０４】
【化１９】
2019522960.tif 000022
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含み、Ｌ１は、リンカー及び任意選択的に切断可能リンカーを含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、共有結合である又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊部分を形成する）を含み得る。
【０３０５】
Ｌ１及びＬ２の性質は、存在する場合、広く変動し得ることが理解される。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸若しくは塩基不安定性）、温度の変化又は放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元又は酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
【０３０６】
ある特定の実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含んでもよい。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
【０３０７】
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼ又はペプチダーゼである。
【０３０８】
別の実施形態において、Ｌ１は、カテプシン不安定性リンカーである。
【０３０９】
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１及びＸ２のＮ末端及びＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
【０３１０】
さらに、カルボキシル又はアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕ及びＬｙｓに対して、ＣＯ及びＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
【０３１１】
一実施形態において、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−及び−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
【０３１２】
好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−及び−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
【０３１３】
最も好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−又は−Ｖａｌ−Ａｌａ−又はＶａｌ−Ｃｉｔである。特定の選択された実施形態において、ジペプチドは、−Ｖａｌ−Ａｌａ−を含む。
【０３１４】
一実施形態において、Ｌ２は、共有結合の形態で存在する。
【０３１５】
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。
【０３１６】
一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、これにより弾頭の放出を可能にする。
【０３１７】
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０３１８】
Ｌ１及びＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。
【０３１９】
Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来し得る。
【０３２０】
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来し得る。
【０３２１】
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来し得る。
【０３２２】
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチン及びシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体及び天然に存在するアミノ酸の誘導体；並びに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態及びそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
【０３２３】
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−及びＬ２は、一緒になって基：
【０３２４】
【化２０】
2019522960.tif 000023
（式中、アスタリスクは、薬物又は細胞毒性剤の位置に対する結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である）を形成する。フェニレン環は、１、２又は３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、アルキル又はヒドロキシアルキルで置換されていてもよい。
【０３２５】
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
【０３２６】
一実施形態において、ｎは０又は１である。好ましくは、ｎは０である。
【０３２７】
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
【０３２８】
他の実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカー及びジペプチドを含み、一緒になって、基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成してもよい。他の選択された実施形態において、リンカーは、下記に示すＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ基を含んでもよい：
【０３２９】
【化２１】
2019522960.tif 000024
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは遠位部位が活性化されるとき、以下に示す流れに沿って進み、保護された化合物（つまり、細胞毒）の完全な放出を可能にする：
【０３３０】
【化２２】
2019522960.tif 000025
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分への結合点を示し、Ｌ・は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である）。弾頭の明確な放出は、所望の毒性活性の維持を確実にする。
【０３３１】
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
【０３３２】
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
【０３３３】
ある特定の実施形態において、Ｌ１及びＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
【０３３４】
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的に関して、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ又は本明細書に記載の穏やかな還元剤での処理によってリンカー試薬とコンジュゲートするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
【０３３５】
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合の糖のヒドロキシル又はアミノ基が挙げられる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；及び（ｖ）アルデヒド、ケトン、及びカルボキシル基が挙げられる。
【０３３６】
本発明と適合する例示的な官能基を、すぐ下に示す：
【０３３７】
【化２３】
2019522960.tif 000026
【０３３８】
いくつかの実施形態において、システイン（部位特異的抗体の遊離システインを含む）と薬物リンカー部分との間の結合は、リンカーに存在しているチオール残基及び末端マレイミド基を通じたものである。このような実施形態において、抗体と薬物リンカーとの連結は、
【０３３９】
【化２４】
2019522960.tif 000027
（式中、アスタリスクは、薬物リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す）であってもよい。このような実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインに由来し得る。
【０３４０】
他の適合可能なリンカーに関して、結合部分は、抗体上の活性化残基と反応し得る末端ブロモアセトアミド又はヨードアセトアミドを含んで、所望のコンジュゲートをもたらすことができる。いずれにしても、当業者は、本開示の薬物リンカー化合物のそれぞれと、適合する抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（例えば、部位特異的抗体）とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートすることができる。
【０３４１】
本開示によれば、本発明は、適合する抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を下記からなる群から選択される薬物リンカー化合物にコンジュゲートすることを含む方法を提供する：
【０３４２】
【化２５】
2019522960.tif 000028
2019522960.tif 000029
2019522960.tif 000030
【０３４３】
本出願の目的に関し、ＤＬは、「薬物リンカー」（又は、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ中のリンカー−薬物「Ｌ−Ｄ」）の略称として使用され、上記に示す薬物リンカー１〜６（つまり、ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、ＤＬ５及びＤＬ６）を含む。ＤＬ１及びＤＬ６は、同じ弾頭及び同じジペプチドサブユニットを含むが、連結基スペーサーが異なることに注意されたい。したがって、リンカーの切断によりＤＬ１及びＤＬ６の両方がＰＢＤ１を放出する。
【０３４４】
末端マレイミド部分（ＤＬ１〜ＤＬ４及びＤＬ６）又はヨードアセトアミド部分（ＤＬ５）が付されたリンカーは、本明細書において開示されている当該技術分野で認識されている技術を使用して、選択されたＢＭＰＲ１Ｂ抗体の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートされてもよいことが理解される。前述の化合物に関する合成経路は、前述のＤＬ化合物の合成に関して明示的に参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１４／１３０８７９に示されているが、このようなＰＢＤのリンカーの組合せをコンジュゲートする具体的な方法は、以下の実施例に示されている。
【０３４５】
こうして、選択された態様において、本発明は、このすぐ下のＡＤＣ１〜６に実質的に示されているＢＭＰＲ１Ｂイムノコンジュゲートをもたらす、本開示のＤＬ部分にコンジュゲートされているＢＭＰＲ１Ｂ抗体に関する。したがって、ある特定の態様において、本発明は、以下からなる群から選択される構造を含む、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎのＡＤＣを対象としている：
【０３４６】
【化２６】
2019522960.tif 000031
2019522960.tif 000032
2019522960.tif 000033
（式中、Ａｂは、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はこの免疫反応性断片を含み、ｎは、１〜２０の整数である）。ある特定の実施形態において、ｎは、１〜８の整数であり、選択された実施形態において、ｎは、２又は４を含む。
【０３４７】
当業者は、上述のＡＤＣ構造が式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎにより定義されること、及びこの中に図示されている１つより多い薬物リンカー分子がＢＭＰＲ１Ｂ抗体に共有結合によりコンジュゲートされ得ること（例えば、ｎは約１〜約２０の整数とすることができる）を理解している。より詳細には、下記にさらに詳細に議論するように、１つより多いペイロードが各抗体にコンジュゲートされ得ること、及び上の概略図はそのように解釈されなければならないことが、理解される。例として、上において示されているＡＤＣ３は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８又はそれ超のペイロードにコンジュゲートされているＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含むことができ、このようなＡＤＣの組成物は、薬物がロードされた化学種からなる混合物を一般に含む。
【０３４８】
ある特定の態様において、本発明のＢＭＰＲ１Ｂ  ＰＢＤ  ＡＤＣは、添付されている実施例又はこの免疫反応性断片に示されている抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含む。特定の実施形態において、ＡＤＣ３は、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ（例えば、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３）を含む。他の態様において、本発明のＢＭＰＲ１Ｂ  ＰＢＤ  ＡＤＣは、ｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ（例えば、ｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３）を含む。このような実施形態において、ＡＤＣは、２つのペイロードを好ましくは含む。他の好ましい実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、ｎが２であるＡＤＣ３を含む。
【０３４９】
Ｃ．コンジュゲーション
いくつかの周知の反応を使用して、薬物部分及び／又はリンカーを選択された抗体に結合させ得ることが理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。いくつかの実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニン及びセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて、本開示のペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るためにあつらえられる。
【０３５０】
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミド及びヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよく又はリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件及び試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；及び（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性（又は二価）リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、及び化合物と共有又は非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
【０３５１】
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
【０３５２】
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオール又はリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬又は化合物−リンカー中間体又は薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基；並びに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物又はリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分又はリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジド基が挙げられる。
【０３５３】
コンジュゲーション試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル及びホスホラミダイトが、一般に挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類又はハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
【０３５４】
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８及び９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、イソシアネート及びイソチオシアネートを含むが、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできる。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、弾頭を抗体に共有結合させるために使用され得る。
【０３５５】
化合物をスレオニン又はセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も、当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリン又はスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的にかつ迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
【０３５６】
いくつかの実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（又はその断片）に、１、２、３、４又はより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。少なくとも部分的には、本明細書に示す改変された遊離システイン部位及び／又は新規コンジュゲーション手法が提供されるため、このような部位特異的抗体又は改変抗体により、コンジュゲート調製物が、向上した安定性及び実質的な均一性を示すことが可能になる。鎖内又は鎖間抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全又は部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元及びそれに対する薬物リンカーの結合をさらに提供する。
【０３５７】
これに関して、部位の改変及び選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなるのを可能にすることが理解される。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的操作及び選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物及び非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物及び本開示の新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態及び／又は薬力学並びに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
【０３５８】
ある特定の実施形態において、部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、還元されると、上記で開示するようなリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる求核性チオール基を含む。上記のように、本発明の抗体は、還元可能な不対の鎖間若しくは鎖内システイン又は導入された非天然システイン、つまりこのような求核性基を提供するシステインを有してもよい。したがって、ある特定の実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物リンカーの末端マレイミド又はハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にされてもよい。したがって、各遊離システインは、理論的には、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬は、本発明に特に適合するが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に一般に公知の様々な反応、条件及び試薬を使用して行われ得ることが理解される。
【０３５９】
さらに、操作された抗体の遊離システインは、選択的に還元されて、部位特異的コンジュゲーションの向上及び望ましくない潜在的な毒性混入物の減少をもたらし得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内又は分子間相互作用を調節することが見出され、選択された還元剤（好ましくは比較的穏やか）と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」又は「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、この選択的な還元は、ある特定の還元剤又はある特定の還元剤濃度の使用により行われ得る。他の実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒の存在下で選択的に還元されている、操作された抗体のコンジュゲーションを意味することが理解される。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤（例えば、アルギニン）の使用は、抗体重鎖及び軽鎖のコンジュゲーションの程度並びに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。適合する抗体構築物並びに選択的コンジュゲーション技術及び試薬は、本明細書に詳細に組み込むＷＯ２０１５／０３１６９８においてこのような方法及び構築物に関して詳細に開示されている。
【０３６０】
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節及び／又は立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋を（水素結合及び静電相互作用を介して）形成することが知られており、好ましい立体配座変化を生じさせ得、そして／又は好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させる安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（及び分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合する、所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は、自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、このような技術は、本開示に従って作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーション及び対応する望ましくないＤＡＲ種のレベルを相当に減少させるために使用され得る。
【０３６１】
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、三級アミン又はグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリン及びシステインを含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、安定化剤は、アルギニンを含む。さらに適合安定化剤は、グアニジン及び塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
【０３６２】
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、関連するｐＫａが、標準的技術を使用して容易に計算又は決定され得、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用され得ることを理解する。
【０３６３】
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションについて部位特異的な還元された遊離のシステインを生じさせる、任意の化合物を含み得る。好ましくは、このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤又は還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」又は「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（任意選択的に安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質又は条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤又は条件（好ましくは安定化剤との組合せ）は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、遊離システインを効果的に還元する（チオールを提供する）ことができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、いくつかの実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明の選択的還元技術に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール及び２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
【０３６４】
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的であることが理解される。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（例えば、各軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上である。
【０３６５】
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生又は保存されるときに、阻止又はキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることが、さらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオン及びスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防又は阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じ又は異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップをはずすことを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップされておらず、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊せず、再配列もしない、キャップ除去反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元又は選択的還元）中に生じることが理解される。
【０３６６】
Ｄ．ＤＡＲ分布及び精製
選択された実施形態において、本発明に適合するコンジュゲーション及び精製方法は、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力を有利にもたらす。この点に関して、本開示の構築物（例えば、部位特異的構築物）及び／又は選択的コンジュゲーションは、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点及び毒素の位置に関して、試料内のＡＤＣ種に均質性を提供する。上記で簡単に議論したように、用語「薬物対抗体比」すなわち「ＤＡＲ」は、ＡＤＣ調製物中の薬物対抗体のモル比を指す。ある特定の実施形態において、コンジュゲート調製物は、このＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、ＡＤＣ調製物内において、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関して、やはり均一である特定薬物のローディング（例えば、２又は４の薬物ローディング）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であることを意味する。本発明の他のある特定の実施形態において、部位特異的抗体及び／又は選択的還元並びにコンジュゲーションの使用を通じて、所望の均質性を達成することができる。他の実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の実施形態において、適合する調製物は、所望の均質性を得るために分析的又は分取クロマトグラフィー技術を使用して精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）又はキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
【０３６７】
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るために、標準的医薬調製方法が使用され得ることが理解される。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）又は混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
【０３６８】
いずれにしても、本開示のＡＤＣ及びその調製物は、抗体の立体構造に依存して、そしてコンジュゲーションを達成するために使用される方法に少なくとも部分的に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分及び抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣあたりの薬物負荷は、１から２０の弾頭を含み得る（すなわち、ｎは１〜２０である）。他の選択された実施形態は、１から１５の弾頭の薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１から１２の弾頭、又はより好ましくは１から１０の弾頭を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、１から８の弾頭を含む。
【０３６９】
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性及び弾頭疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物及び他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い薬物負荷、例えば、＞８又は１０の薬物負荷は、ペイロードによって、ある特定の抗体薬物コンジュゲートの、凝集、不溶性、毒性又は細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７又は８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷性を有し得る）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４又は６であり、いくつかの実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
【０３７０】
本発明により提供される比較的高いレベルの均質性にかかわらず、本開示の組成物は、ある範囲の（ＩｇＧ１の場合は１から８の範囲の）薬物化合物を有するコンジュゲートの混合物を実際に含む。このように、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成要素の抗体のほとんどは、１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（改変された構築物及び選択的還元によりもたらされる相対的なコンジュゲート特異性にもかかわらず、）薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合されていてもよい。つまり、以下のコンジュゲート、本発明の組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するＡＤＣの混合物を含む（遊離システインの交差反応性によって主に引き起こされるある特定の反応混入物を含む）。しかしながら選択的還元及び作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体に対する薬物負荷（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値又は特異度、平均値、範囲又は分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
【０３７１】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の実施形態において、本発明は、２、４、６又は８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された実施形態において、本発明は、２＋／−０．５又は４＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲又は偏差は、いくつかの実施形態において、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６若しくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２若しくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、又はさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．４で、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６又は８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷又は４の薬物負荷を含む）は、組成物中に存在する他の全てのＤＡＲ種に対して測定すると、５０％超の濃度、５５％超の濃度、６０％超の濃度、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度又はさらに９７％超の濃度で存在する。
【０３７２】
以下の実施例において詳述されているように、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ及び電気泳動法のような従来手段により特徴付けられ得る。抗体あたりの薬物の観点でＡＤＣの定量的分布も、決定され得る。ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値は、ＥＬＩＳＡによって決定され得る。しかし、抗体価あたりの薬物分布は、抗体−抗原結合、及びＥＬＩＳＡの検出限界によって認識されない。同様に、抗体−薬物コンジュゲートの検出向けのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体の（抗体の重鎖若しくは軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基などの）どこに結合しているかを決定しない。
【０３７３】
ＶＩ．診断及びスクリーニング
Ａ．診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断又は監視するためのインビトロ及びインビボの方法並びに患者からの細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための方法を提供する。このような方法は、がんを有する個体を治療のために特定すること又はがんの進行を監視する方法であって、患者又は患者から得られた試料を、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子を特異的に認識し、会合することができる検出剤（例えば、抗体又は核酸プローブ）と、（インビボ又はインビトロのいずれかで）接触させること及び試料における検出剤の存在若しくは不在又は会合のレベルを検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、本明細書に記載の検出可能な標識又はレポーター分子と会合した抗体を含む。特定の他の実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、投与され、二次標識抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出される。さらに他の実施形態（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション又はＩＳＨ）において、ゲノムＢＭＰＲ１Ｂ決定因子と反応する核酸プローブは、増殖性障害の検出、診断又は監視に使用される。
【０３７４】
より一般的に、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子の存在及び／又はレベルは、タンパク質又は核酸解析のために当業者に利用可能ないくつかの任意の技術、例えば、直接的物理学的測定（例えば、質量分析）、結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ、凝集アッセイ及びイムノクロマトグラフィーアッセイ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＲＴ−ｑＰＣＲ）技術、分岐オリゴヌクレオチド技術、ノザンブロット技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術並びにインサイチュハイブリダイゼーション技術を使用して測定されてもよい。方法には、化学反応、例えば、光学的吸光度の変化、蛍光の変化、化学発光若しくは電気化学発光の生成、反射率、屈折率若しくは光散乱の変化、検出可能標識の蓄積若しくは表面からの放出、酸化若しくは還元若しくは酸化還元種、電流若しくは電位、磁場の変化などから生じるシグナルの測定を含んでもよい。適切な検出技術は、光発光（例えば、蛍光、時間分解蛍光、エバネッセント波蛍光、アップコンバート性リン、多光子蛍光の測定を介する）、化学発光、電気化学発光、光散乱、光吸収、放射能、磁場、酵素活性（例えば、光吸収若しくは蛍光の変化を生じさせる又は化学発光の放射を生じさせる酵素反応を通じた酵素活性の測定による）を介した標識の測定を通じて、標識された結合試薬の参加を測定することにより、結合事象を検出してもよい。代替的に、標識の使用を必要としない検出技術、例えば、質量（例えば、表面弾性波測定）、屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴測定）又は分析物の固有の発光の測定に基づく技術を使用してもよい。
【０３７５】
いくつかの実施形態において、検出剤と試料中の特定の細胞又は細胞成分との会合は、試料が腫瘍形成性細胞を含む可能性があることを示しており、したがって、がんを有する個体を本明細書に記載の抗体又はＡＤＣを用いて効果的に治療し得ることを示している。
【０３７６】
ある特定の好ましい実施形態において、アッセイには、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ若しくはこの変形（例えば、蛍光、色素生産性、標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢなど）、免疫細胞化学若しくはこの変形（例えば、直接、間接、蛍光、色素生産性など）又はインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）若しくはこの変形（例えば、色素生産性インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）若しくは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＦＩＳＨ又はＲＮＡ−ＦＩＳＨ］））が含まれてもよい。
【０３７７】
この点に関して、本発明のある特定の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のための標識されたＢＭＰＲ１Ｂの使用を含む。より詳細には、ＢＭＰＲ１Ｂ  ＩＨＣは、様々な増殖性障害の診断を補助するため及びＢＭＰＲ１Ｂ抗体療法を含む治療に対する潜在的な応答を監視するための診断ツールとして使用され得る。ある特定の実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、１つ以上のレポーター分子にコンジュゲートされている。他の実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、標識されておらず、１つ以上のレポーター分子に会合している個別の薬剤（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出される。本明細書で議論するように及び下記実施例において示されるように、適合する診断アッセイは、化学的に固定された組織（これらに限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロム及びピクリン酸が挙げられる）並びに包埋された組織（これらに限定されないが、グリコールメタクリレート、パラフィン及び樹脂が挙げられる）、又は凍結を介して保存された組織に対して、実施され得る。このようなアッセイは、治療の決定に対する道筋を立て、投与レジメン及びタイミングを決定するために使用され得る。
【０３７８】
他の特に適合する本発明の態様は、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子を検出又は監視するためのインサイチュハイブリダイゼーションの使用を含む。インサイチュハイブリダイゼーション技術又はＩＳＨは、当業者にとって周知である。簡潔には、細胞を固定し、特定のヌクレオチド配列を含有する検出可能なプローブを固定した細胞に加える。細胞が相補的ヌクレオチド配列を含有する場合には、検出され得るプローブは、それらの配列にハイブリダイズする。本明細書に示す配列情報を使用して、遺伝子型ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子を発現する細胞を特定するようにプローブを設計することができる。プローブは、好ましくは、そのような決定因子に対応するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、不完全な相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナルを最小化するように慣用的に最適化することができるが、好ましくは、プローブは、選択されたＢＭＰＲ１Ｂ決定因子に完全に相補的であることが好ましい。選択された実施形態において、プローブは、プローブに付された蛍光色素で標識されており、つまり標準的蛍光方法により容易に検出可能である。
【０３７９】
インビボの診断治療又は診断に適合するアッセイには、当業者に公知の磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、陽電子放射断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波のような当該技術分野で認識されている画像化又は監視技術を含めてもよい。
【０３８０】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、患者試料（例えば、血漿又は血液）中の特定の決定因子（例えば、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質）のレベルを検出及び定量するために使用することができ、同様に、関連する決定因子が関与する増殖性障害を検出、診断又は監視するために使用することができる。例えば、血液及び骨髄試料は、フローサイトメトリーと組み合わせて使用されて、ＢＭＰＲ１Ｂ発現（又は、別の共発現マーカー）を検出及び測定することができ、疾患の進行及び／又は治療への応答を監視することができる。関連する実施形態において、本発明の抗体は、循環腫瘍細胞をインビボ又はインビトロのいずれかで検出、監視及び／又は定量するために使用され得る（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含み得る。
【０３８１】
本発明のある特定の実施形態において、対象又は対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療又はレジメンのベースラインが確立される前に、本開示の抗体を使用して評価又は特徴付けされ得る。他の例において、腫瘍形成性細胞は、治療された対象に由来する試料から評価され得る。
【０３８２】
別の実施形態において、本発明は、がんの進行及び／又は病因をインビボで分析する方法を提供する。別の実施形態において、がんの進行及び／又は病因のインビボでの解析は、腫瘍の進行の程度を決定することを含む。別の実施形態において、解析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍の進行の解析が、原発性腫瘍に対して行われる。別の実施形態において、解析は、当業者にとって公知のように、がんの種類に応じて経時的に行われる。別の実施形態において、原発性腫瘍の転移性細胞に起因する二次性腫瘍の解析が、さらにインビボで行われる。別の実施形態において、二次性腫瘍の大きさと形状が解析される。いくつかの実施形態において、さらにエクスビボの解析が行われる。
【０３８３】
別の実施形態において、本発明は、がんの進行及び／又は病因をインビボで解析する方法であって、細胞の転移を決定すること又は循環腫瘍細胞のレベルを検出すること及び定量することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞転移の解析は原発性腫瘍から不連続の部位において、細胞の進行性成長を測定することを含む。いくつかの実施形態において、手法は、血管、リンパ、体腔内又はそれらの組合せを通じて分散する腫瘍細胞を監視するために行うことができる。別の実施形態において、細胞転移解析は、細胞遊走、播種、血管外漏出、増殖又はそれらの組合せの結果として行われる。
【０３８４】
ある特定の例において、対象又は対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療の前にベースラインを確立するために、本開示の抗体を使用して評価又は特徴付けてもよい。他の例において、試料は、治療された対象に由来する。いくつかの例において、試料は、対象が治療を開始又は終了してから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６カ月、９カ月、１２カ月又は＞１２カ月後の対象から得られる。ある特定の実施例において、腫瘍形成性細胞は、一定数の投与の後（例えば、治療の２、５、１０、２０、３０回以上の投与の後）に、評価又は特徴付けされる。他の例において、腫瘍形成性細胞は、１回以上の治療を受けてから１週、２週、１カ月、２カ月、１年、２年、３年、４年以上後に、特徴付け又は評価される。
【０３８５】
Ｂ．スクリーニング
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、決定因子との相互作用により腫瘍細胞の機能又は活性を変化させる化合物又は作用因子（例えば、抗体又はＡＤＣ）を同定するために、試料のスクリーニングに使用することができる。一実施形態において、腫瘍細胞は、抗体又はＡＤＣと接触され、この抗体又はＡＤＣは、ある特定の標的（例えばＢＭＰＲ１Ｂ）を発現する細胞について腫瘍をスクリーニングするために使用され、このような細胞を、例えば限定されないが、診断目的などの目的のために同定すること、このような細胞を監視して治療の有効性を決定すること又はこのような標的発現細胞のための細胞集団を濃縮することができる。
【０３８６】
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞を試験薬剤又は化合物に直接的又は間接的に接触させることと、試験薬剤又は化合物が、決定因子会合腫瘍細胞の活性又は機能を調節するかどうか、例えば、細胞の形態又は生存性の変化、マーカーの発現、分化又は脱分化、細胞の呼吸作用、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟性、増殖性、生存性、アポトーシス又は細胞死を調節するかどうかを決定することとを含む。直接的相互作用の一例は物理的相互作用であり、一方で、間接的相互作用としては、例えば、参照実体（例えば、細胞又は細胞培養物）に順に作用する中間的分子に対する組成物の作用が挙げられる。
【０３８７】
スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングを含み、この方法は、例えば、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラーボトル又はプレート上において、任意選択的に所定の位置に配置されたか又は置かれた、細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含み得る。ハイスループットのロボット又は手作業による方法は、化学的相互作用を調べ、短期間に多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナルを利用する、例えば、フルオロフォア又はマイクロアレイを介する技術（Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ、２００７、ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）が開発され、さらに情報を非常に迅速に処理する解析（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０３２６６０参照）が自動化されてきた。スクリーニングされ得るライブラリは、例えば、小分子ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリ及びアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
【０３８８】
ＶＩＩ．医薬調製物及び治療的使用
Ａ．製剤及び投与経路
本発明の抗体又はＡＤＣは、当該技術分野で認識されている技術を使用して様々な方法で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、そのまま又は最小量の付加的成分と共に投与することができ、他方で任意選択的に適切な薬学的に許容される担体を含有するように製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当該技術分野で周知であり、医薬調製物で使用するために商業的供給源から入手可能である、賦形剤、ビヒクル、アジュバント及び希釈剤を含む（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【０３８９】
適切な薬学的に許容される担体は、比較的不活性であり、かつ抗体又はＡＤＣの投与を容易にすることができる物質又は活性化合物を加工して作用部位に送達するために薬学的に最適化された調製物にすることを補助し得る物質を、含む。
【０３９０】
このような薬学的に許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、張度、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集又は溶解度を変えることができる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル剤及び皮膚浸透促進剤を含む。担体のある特定の非限定的例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、ショ糖、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びこれらの組合せを含む。全身投与のための抗体は、経腸的、非経口的又は局所的投与のために製剤化され得る。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的及び経口的薬物送達のための賦形剤及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに示されている。
【０３９１】
経腸投与のために適切な製剤は、硬ゼラチン又は軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ又は吸入剤及びこれらの制御放出形態を含む。
【０３９２】
非経口投与（例えば、注射による）に適切な製剤としては、活性成分が、溶解、懸濁化又は他の方法で（例えば、リポソーム又は他の微小粒子系で）提供される水性又は非水性の、等張性発熱物質不含滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、他の薬学的に許容される抗体、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤及び製剤を、対象とするレシピエントの血液（又は他の関連する体液）と等張にする溶質をさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。このような製剤に使用するための適切な等張の薬学的に許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液又は乳酸リンゲル注射剤を含む。
【０３９３】
特に好ましい実施形態において、本発明の製剤化された組成物は、凍結乾燥して、投与前に再構成することができる粉末形態の抗体又はＡＤＣを提供することができる。注射用溶液の調製のための滅菌粉末は、有効成分を任意選択の共可溶化生体適合性成分と共に含む粉末を生成するために、本開示の抗体又はＡＤＣを含む溶液を凍結乾燥することによって得ることができる。一般的に、分散体又は溶液は、塩基性分散媒又は溶媒（例えば、希釈剤）及び任意選択的に他の生体適合性成分を含む滅菌媒体に、活性化合物を混入することによって調製される。適合する希釈剤は、薬学的に許容されるもの（ヒトへの投与のために安全で、非毒性である）であり、凍結乾燥後に再構成される製剤のような、液体製剤の調製に有用である。例示的希釈剤は、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩液、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む。代替的な実施形態において、希釈剤は、塩及び／又は緩衝剤の水溶液を含み得る。
【０３９４】
特定の好ましい実施形態において、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、薬学的に許容される糖と組み合わせて凍結乾燥される。「薬学的に許容される糖」は、目的のタンパク質と組み合わせた場合、保存時のタンパク質の化学的及び／又は物理的不安定性を著しく予防する又は減少させる分子である。製剤が凍結乾燥され、次いで再構成されることが意図される場合。本明細書で使用される場合、薬学的に許容される糖は、「乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」と称すこともできる。例示的糖及びそれらの対応する糖アルコールは、グルタミン酸一ナトリウム又はヒスチジンのようなアミノ酸；ベタインのようなメチルアミン；硫酸マグネシウムのようなリオトロピック塩；三価又はより高い分子量の糖アルコール、例えば、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールのようなポリオール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；並びにそれらの組合せを含む。さらなる例示的乾燥保護剤は、グリセリン及びゼラチン並びに糖メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース及びスタキオースを含む。還元糖の例は、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソマルツロース及びラクツロースを含む。非還元糖の例は、糖アルコール及び他の直鎖ポリアルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドを含む。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、とりわけ、ラクトース、マルトース、ラクツロース及びマルツロースのような二糖の還元により得られる化合物である。グリコシド側基は、グルコシド側基又はガラクトシド側基であり得る。糖アルコールのさらなる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール及びイソマルツロースである。好ましい薬学的に許容される糖は、非還元糖トレハロース又はショ糖である。薬学的に許容される糖は、タンパク質が保存中の物理的及び化学的安定性及び完全性を（例えば、再構成及び保存後まで）本質的に保持することを意味する「保護量（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）」で、（例えば、凍結乾燥前に）製剤に添加される。
【０３９５】
当業者は、適合可能な凍結乾燥保護剤（ｌｙｐｒｏｔｅｃａｔａｎｔ）が、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約１６５ｍＭ〜約１８５ｍＭの範囲の濃度で、液状製剤又は凍結乾燥製剤に加えてられてもよいことを理解している。ある特定の実施形態において、凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ又は約１０００ｍＭの濃度をもたらすよう添加され得る。ある特定の好ましい実施形態において、凍結乾燥保護剤は、薬学的に許容される糖を含んでもよい。特に好ましい態様において、薬学的に許容される糖は、トレハロース又はスクロースを含む。
【０３９６】
他の選択された実施形態において、本発明の液状製剤及び凍結乾燥製剤は、アミノ酸又はその薬学的に許容される塩を含めた、ある特定の化合物を含んで、安定化剤又は緩衝剤として作用することができる。このような化合物は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ又は約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲の濃度で添加され得る。ある特定の実施形態において、緩衝剤は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ又は約１００ｍＭの濃度をもたらすよう添加され得る。他の選択された実施形態において、緩衝剤は、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ又は約１００ｍＭの濃度をもたらすよう添加され得る。ある特定の好ましい実施形態において、緩衝剤は、ヒスチジン塩酸塩を含む。
【０３９７】
さらに他の選択された実施形態において、本発明の液状製剤及び凍結乾燥製剤は、安定化剤として、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０又はポリソルベート８０のような非イオン性界面活性剤を含んでもよい。このような化合物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．６ｍｇ／ｍｌ又は約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加され得る。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ又は約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらすよう添加され得る。他の選択された実施形態において、界面活性剤は、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ又は約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらすよう添加され得る。ある特定の好ましい実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０又はポリソルベート４０を含む。
【０３９８】
非経口投与（例えば、静脈内注射）向けの開示される抗体又はＡＤＣの適合性製剤は、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの濃度のＡＤＣ又は抗体を含むことができる。ある特定の選択された実施形態において、抗体又はＡＤＣの濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬを含む。他の実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬを含む。
【０３９９】
凍結乾燥粉末から再構成したか否かにかかわらず、液体ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ製剤（例えば、直上に示した）は、投与前にさらに希釈する（好ましくは水性担体中）ことができる。例えば、前述の液体製剤は、投与のための所望の用量レベルを達成するために、０．９％塩化ナトリウム注射剤、ＵＳＰ又は同等物（必要な変更を加えた）を含む注入バッグ中にさらに希釈することができる。特定の態様において、十分に希釈されたＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ溶液は、ＩＶ装置を用いて静脈内注入により投与される。好ましくは、投与されるＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ薬物溶液（静脈内（ＩＶ）注入又は注射にかかわらず）は、透明、無色及び可視粒子状物質不含有である。
【０４００】
本発明の化合物及び組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮及びくも膜下内に投与され得るか、又はそれ以外に移植若しくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルが挙げられる。適切な製剤及び投与経路は、意図する適用及び治療レジメンにより選択され得る。
【０４０１】
Ｂ．投与量及び投与レジメン
特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミング及び反復は、特定の個体並びに実験的検討事項、例えば、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与の頻度の決定は、当業者、例えば、担当医により、状態及び治療される状態の重症度、治療される対象の年齢及び全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。投与の頻度は、選択した組成物の効能及び投与レジメンの評価に基づいて治療の過程を通じて調整され得る。このような評価は、特異的な疾患、障害若しくは状態のマーカーの評価に基づいて行われ得る。個体ががんを有する実施形態において、評価は、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された抗原、増殖性又は腫瘍形成性細胞の数の減少、このような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少又は転移の発生の遅延の測定を含む。
【０４０２】
本発明のＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重及び用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０４０３】
選択された実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、用量あたりおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｋｇ体重で（好ましくは静脈内に）投与される。他の実施形態は、用量あたり約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００又は２０００μｇ／ｋｇ体重での抗体又はＡＤＣの投与を含む。他の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり１２、１４、１６、１８又は２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。さらに他の実施形態において、コンジュゲートは、用量あたり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示を用い、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察並びに標準的な医学及び生化学的技術及び測定に基づいて、様々なＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣのための適切な投与量を容易に決定することができる。
【０４０４】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７に開示されているような体表面積（ＢＳＡ）計算に基づき、予測され得る。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算され、彼又は彼女の身体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートは、１ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の投与量及び１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２又は４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与され得る。当該技術分野で認識されておりかつ経験的な技術が、適切な投与量を決定するために使用され得ることも理解される。
【０４０５】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、特別なスケジュールで投与されてもよい。一般に、ＢＭＰＲ１Ｂコンジュゲートの有効量は、対象に１回以上投与される。より詳細には、ＡＤＣの有効量は、対象に、１カ月に１回、１カ月に１回を超えて又は１カ月に１回未満投与される。ある特定の実施形態において、ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣの有効量は、複数回、例えば少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年又は数年間投与され得る。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６若しくは７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８週間）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８カ月間）またさらには１若しくは数年間が、本開示の抗体又はＡＤＣの投与の間に経過し得る。
【０４０６】
いくつかの実施形態において、コンジュゲート抗体を含む治療の過程は、数週間又は数カ月の期間にわたり、選択された薬物製品を複数回投与することを含む。より詳細には、本発明の抗体又はＡＤＣは、１日毎に１回、２日毎に１回、４日毎に１回、１週間毎に１回、１０日毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月毎に１回、６週間毎に１回、２カ月毎に１回、１０週間毎に１回又は３カ月毎に１回投与され得る。これに関して、患者の応答及び診療に基づき、投与量を変化させてもよく、投与間隔を調整してもよいことが理解される。本発明には、不連続投与又は数回の部分投与に分割された１日用量も包含される。本発明の組成物及び抗がん剤は、交互に、隔日又は隔週で投与されてもよく又は一連の抗体治療を行った後に１つ以上の抗がん剤治療による処置を行ってもよい。いずれにしても、当業者であれば理解するように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、化学療法剤が単独で又は他の化学療法剤との併用で投与される臨床治療において既に採用されている用量程度である。
【０４０７】
別の実施形態において、本発明のＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣは、疾患の初期症状後の腫瘍再発の確率を減少又は無くすための維持療法に使用されてもよい。好ましくは、障害は、治療されたことがあり、最初の腫瘍塊は除去、減少又は他の方法で緩和されており、患者は無症状である又は寛解状態にある。このような場合、標準的診断手法を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くない場合でも、対象は、薬学的に有効な量の本開示の抗体が１回以上投与されてもよい。
【０４０８】
別の好ましい実施形態において、本発明のモジュレーターは、予防的に又は減量手法後の腫瘍転移の可能性を予防又は減少させるためのアジュバント療法として使用され得る。本開示で使用するとき、「減量手法」は、腫瘍塊を減少させるか又は腫瘍負荷若しくは腫瘍増殖を緩和させる任意の手法、技術又は方法を意味する。例示的減量手法としては、限定されないが、外科手術、放射線治療（つまり、ビーム照射）、化学療法、免疫療法又はアブレーションが挙げられる。本開示に鑑みて当業者により容易に決定される適切な時間に、本開示のＡＤＣは、臨床的、診断的又は治療診断的手法により示唆されるように腫瘍転移を低減させるために投与されてもよい。
【０４０９】
本発明のさらに他の実施形態は、本開示の抗体又はＡＤＣを、無症状であるががんを発症するリスクのある対象に投与することを含む。つまり、本発明の抗体又はＡＤＣは、真に予防的な意味において使用することができ、検査若しくは試験を受けて１つ以上の認められた危険因子（例えば、ゲノム指標、家族歴、インビボ又はインビトロ試験結果など）を有するが新生物を発症していない患者に投与されてもよい。
【０４１０】
投与量及びレジメンも、本開示の組成物を個体に１回以上投与して実験的に決定され得る。例えば、個体に、本明細書に記載されるように製造された治療組成物を漸増する投与量で与えてもよい。選択された実施形態において、投与量は、実験的に決定されたか又は観察された副作用又は毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加又は減少又は減弱化されてもよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害又は状態のマーカーを前述のように伴ってもよい。がんに関して、これらには、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された腫瘍形成性抗原、疼痛又は麻痺の減少、会話、視力、呼吸若しくは他の腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増加又は容認された試験若しくは生存の延長によって測定される生活の質の向上の測定が挙げられる。当業者は、投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の病期、新生物状態の個体の他の位置への転移並びに過去及び現在に使用している治療に依存して変わることを認識する。
【０４１１】
Ｃ．抗がん剤
用語「抗がん剤」は、本明細書で使用される場合、「治療成分」の１つのサブセット、つまり、「薬学的に活性な化合物成分」として記載される薬剤のサブセットである。より詳細には、「抗がん剤」は、細胞増殖性障害、例えば、がんを治療するために使用することができる任意の薬剤（又はその薬学的に許容される塩）を意味し、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤が挙げられる。抗がん剤の前述の分類は、互いに排他的なものではなく、選択された薬剤は、１つ以上のカテゴリーに分類され得ることに注意されたい。例えば、ある適合する抗がん剤は、細胞毒性剤でありかつ化学療法剤であると分類することができる。このように、前述の用語のそれぞれは、本開示を考慮し、次に医療分野におけるそれらの使用に応じて解釈すべきである。
【０４１２】
好ましい実施形態において、抗がん剤は、がん性細胞又はがん性になる可能性があるか若しくは腫瘍形成性後代（例えば、腫瘍形成性細胞）を発生する可能性がある細胞を、抑制するか若しくは除去する化学剤、又は抑制する若しくは除去するように設計されている化学剤（例えば、化学療法剤）を含み得る。これに関して、選択された化学剤（細胞周期依存性薬剤）は、しばしば細胞の成長又は分裂に必要な細胞内プロセスを対象とし、したがって、一般的に急速に成長しそして分裂するがん性細胞対して、特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を解重合し、したがって、急速に分裂しつつある細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。他の場合において、選択された化学剤は、細胞のライフサイクルのあらゆる点における細胞生存を妨げる細胞周期非依存性薬剤であり、指向性療法（例えば、ＡＤＣ）に有効であり得る。例として、特定のピロロベンゾジアゼピンは、細胞ＤＮＡの副溝に結合し、核への送達により転写を阻害する。併用療法又はＡＤＣ成分の選択に関して、当業者は、本開示を考慮して適合する細胞周期依存性薬剤及び細胞周期非依存性薬剤を容易に同定できることが理解される。
【０４１３】
いずれにしてもまた上記で言及したように、選択された抗がん剤は、本明細書で開示した抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及びＡＤＣに加えて互いに組み合わせて（例えば、ＣＨＯＰ療法）投与することができることが理解される。さらに、選択された実施形態において、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことができ、投与前に抗体と会合していてもよいことがさらに理解される。特定の実施形態において、本開示の抗がん剤は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体と連結されて、本明細書に開示のＡＤＣを提供する。
【０４１４】
本明細書で使用される場合、用語「細胞毒性剤」（又は細胞毒）は、一般的に、細胞の機能を減少若しくは阻害しそして／又は腫瘍細胞の破壊を引き起こすという点で、細胞に毒性がある物質を意味する。特定の実施形態において、物質は、（天然源から精製された若しくは合成により調製された、）生存生物に由来する天然に存在する分子又はその類似体である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素又は酵素的に活性な細菌毒素（例えば、カリチアマイシン、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体内毒素及び菌体外毒素、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モルデクシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質［ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ］、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン及びトリコテセン）又は動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片及び／又はバリアントを含む）が挙げられる。放射性同位体、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイトマイシン、アマニチン及びピロロベンゾジアゼピンを含むさらなる適合する細胞毒性剤を本明細書に示す。
【０４１５】
より一般に本発明の抗体と組み合わせて（又はコンジュゲートして）使用され得る細胞毒性剤又は抗がん剤の例は、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミン及びメチルメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン  ダイネマイシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カンフォスファミド、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、トルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン，ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファーニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリゴマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ラパマイン、ロドルビシン、ゾラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物質、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎物質、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖錯体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロエチルアミン；トリコテシン類（Ｔ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジ��Ａ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａ阻害並びに上記のいずれかの医薬的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体を含む。腫瘍に対するホルモンの作用を調節する又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤並びに抗アンドロゲン剤並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビン及びエスペラミシン並びに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体なども本定義に含まれる。
【０４１６】
適合する細胞毒性剤又は抗がん剤は、商業的又は臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的又は臨床的に利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ  ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（��ＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含み得る。
【０４１７】
用語「薬学的に許容される塩」又は「塩」は、分子又は巨大分子の有機又は無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成され得る。例示的な塩としては、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））が挙げられる。薬学的に許容される塩は、例えば、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子が包含されたものを含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、この塩は複数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有し得る。
【０４１８】
同様に「薬学的に許容される溶媒和物」又は「溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子と分子又は巨大分子との会合物を指す。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これらに限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられる。
【０４１９】
他の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、現在臨床試験にある又は市販のいくつかの抗体（又は免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。本開示の抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、ドゥルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パーサツズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＤＸ−１１０５及びこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
【０４２０】
他の実施形態は、がん治療のために承認された抗体、例えば、これらに限定されないが、リツキシマブ、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブベドチンの使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
【０４２１】
Ｄ．放射線療法
本発明は、抗体又はＡＤＣと、放射線療法（つまり、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組合せも提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本開示の抗体又はＡＤＣは、標的抗がん剤又は他の標的化手段と結び付けて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部がんを有する対象に約６〜７週間投与されてもよい。任意選択的に、放射線療法は、単回用量として又は複数回の連続用量として投与されてもよい。
【０４２２】
ＶＩＩＩ．適応症
本発明は、本発明の抗体及びＡＤＣの、様々な障害、例えば、増殖性障害、新生物、炎症性、血管新生及び免疫学的障害並びに毒素によって引き起こされる障害の診断、診断治療、治療及び／又は予防のための使用を提供する。特定の実施形態において、治療される疾患は、固形腫瘍を含む新生物状態を含む。他の実施形態において、治療される疾患は、血液悪性疾患を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子を発現する腫瘍又は腫瘍形成性細胞を治療するために使用される。好ましくは、治療される「対象」又は「患者」はヒトであるが、本明細書で使用するとき、それらの用語は、あらゆる哺乳動物種を含むものとして表される。
【０４２３】
本発明の化合物及び組成物は、疾患の様々な病期にあり、治療サイクルにおける種々の点にある対象を治療するために用いることができることが理解される。したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体及びＡＤＣは、フロントライン治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の抗体及びＡＤＣは、セカンドライン患者及びサードライン患者（すなわち、同じ状態について以前にそれぞれ１及び２回治療を受けた対象）を治療するために用いられる。さらに他の実施形態は、本開示のＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣにより又は異なる治療剤により３回以上同じ又は関連する状態について治療されたフォースライン患者又はこれより高次の患者（例えば、ＳＣＬＣ又はＢＲ患者）の治療を含む。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体又はＡＤＣを用いて又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。
【０４２４】
ある特定の態様において、増殖性障害は、以下に限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、黒色腫、乳房、胃、卵巣、子宮頚部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞及び非小細胞の両方）、甲状腺、癌、肉腫、神経膠芽腫及び様々な頭頚部の腫瘍を含めた、固形腫瘍を含む。他の好ましい実施形態において、及び以下の実施例に示されているように、開示されるＡＤＣは、乳がん、選択される態様において、ルミナルＢ（ＢＲ−ＬｕｍＢ）乳がんの処置に、特に有効である。ある特定の実施形態において、肺がんは、アントラサイクリン及び／又はタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル又はカバジタキセル）に対して、不応性、再発性又は抵抗性がある。本発明のさらに他の態様において、開示される抗体及びＡＤＣは、甲状腺髄様がん、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）、神経膠芽腫、前立腺神経内分泌がん（ＮＥＰＣ）、悪性度の高い膵消化管神経内分泌がん（ＧＥＰ）及び悪性黒色腫の処置に使用され得る。
【０４２５】
乳がんは、特定されている、いくつかの生物学サブタイプを有する不均質疾患であることが理解される。この点において、乳がんは、現在、エストロゲン受容体（ＥＲ）、黄体ホルモン受容体（ＰＲ）及びｅｒｂＢ２／Ｈｅｒ２の発現に基づいた、少なくとも４種の個別の新生物サブタイプを含むものと認識されている。これらのサブタイプには、基底様／トリプルネガティブ乳がん、Ｈｅｒ２−ポジティブ乳がん、ルミナルＡ乳がん及びルミナルＢ乳がんが含まれる。ルミナルＡは、最も一般的な乳がんのサブタイプ（侵襲性乳がんの４０％）であり、ＥＲ＋及び／又はＰＲ＋／Ｈｅｒ２−状態により特徴付けられ、悪性度の低い腫瘍であり、予後は良好である。ルミナルＢサブタイプは、全ての侵襲性乳がんのほぼ２５％を占め、ＥＲ＋及び／又はＰＲ＋／Ｈｅｒ２＋状態により区別され、転帰は不良である。ネガティブＥＲ、ＰＲ及びＨｅｒ２状態を有する乳がんサブタイプ（全ての侵略性乳がんの２０％）は、通常、トリプルネガティブ乳がん又は基底様乳がんと呼ばれる。Ｈｅｒ２がリッチなサブタイプ（Ｈｅｒ２＋／ＥＲ−／ＰＲ−）は、最も一般性が低く、全ての侵襲性乳がんの１５％である。本発明の抗体及びＡＤＣは、異なるタイプのＢＭＰＲ１Ｂポジティブ乳がんの全てを処置するために使用され得、治療抵抗性が一般的であり、かつ以下の実施例に示されている通り、分子プロファイリングがＢＭＰＲ１Ｂを有望な新規な治療的標的として特定した基底様乳がん及びルミナルＢ乳がんを特に効果的な処置となり得る。
【０４２６】
複数の遺伝子発現検討により、ルミナルＡ及びルミナルＢサブタイプが再生された。どちらのサブタイプも、ルミナルサイトケラチン８／１８、ＥＲ、及びＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）のようなＥＲ活性化に関連する遺伝子の発現を含めた、乳房のルミナル上皮成分を連想させる発現パターンを有する。２つのルミナルサブタイプ間の主な分子区別は、一般に、ルミナルＢは、ＥＲ関連遺伝子の発現はより低く、増殖性遺伝子の発現がより高いことである。いくつかの遺伝子発現検討の調査により、免疫組織化学によって、ルミナルＢ乳がんの約２０％がＨＥＲ２−ポジティブであると指摘された。免疫組織化学によって定義されたＨＥＲ２−ポジティブ腫瘍の約３０％は、ルミナルＢサブタイプに割り当てられる。多数の後続の検討において、ルミナルＢ乳がんは、増殖の向上を伴う、ＥＲポジティブ乳がんと定義された。遺伝子発現検討において、ＣＣＮＢ１、ＭＫＩ６７及びＭＹＢＬ２のような増殖遺伝子は、ルミナルＡサブタイプと比べて、ルミナルＢにおいて一層高く発現され、ルミナルＢ乳がんにおいてやはり観察される、組織学的グレードＩＩＩの割合がより高いことに相関している。増殖は、固有の分子分類を含めた、いくつかの予後予測多重遺伝子シグネチャーの最も重要な特徴として、一貫して特定されてきた。ＥＲ−ポジティブ／ＨＥＲ２−ネガティブ腫瘍において、増殖は、高リスクルミナルＢ腫瘍と低リスクのルミナルＡ腫瘍とを区別する、早期再発リスクの強力な予測因子である。
【０４２７】
未処置ルミナルＢ乳がんにおける全生存は、高リスクとして幅広く認識されている、基底様及びＨＥＲ２−ポジティブサブグループに類似している。７６１名の未処置乳がん患者に、サブタイプと転帰との相関を含めて、固有サブタイプを割り当てるための、５０遺伝子分類器を使用する検討において、参照としてルミナルＡサブタイプを使用する、未処置の早期乳がんの多変数解析により、ルミナルＢ乳がんは、無再発生存期間（ＲＦＳ）に対して、２．４３（Ｐ＜０．０００１）の危険率を有し、ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ２増幅（２．５３、Ｐ＝０．０００１２）腫瘍に対する危険率と類似であることが実証された。トリプルネガティブ／基底様乳がんは、中間の生存期間を有し、死亡は、ルミナルＡ乳がんよりも早く起こった。生存は、Ｈｅｒ２リッチサブタイプ及びルミナルＢサブタイプの両方の場合に、第１の３〜４年間の経過観察の間に、急激に低下し、次いで、経過観察の後続する年数にわたり、低下が減速した。トリプルネガティブサブタイプは、第１の２〜２．５年にわたり類似した早期低下を示し、約１３年間の経過観察までは、より段階的な低下を示した。さらに、ルミナル乳がんは、肺、骨及び胸膜に転移し易いことが明らかである。いくつかの検討により、ルミナルＢ乳がんは、ルミナルＡ乳がんと比べて内分泌療法に対して、及びＨＥＲ２リッチ乳がん及び基底様乳がんに比べて化学療法に対して、比較的、感受性がないことが示唆されている。
【０４２８】
現在の臨床状況と対照的に、本発明のＡＤＣ及び抗体は、以下の実施例に示されているように、抗腫瘍活性を示すことが示された。より詳細には、開示された抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、ルミナルＢ乳がんにおける、腫瘍形成性細胞と効果的かつ特異的に結合することが示されている。選択した腫瘍細胞のこの標的化は、実質的な治療可能性を有する薬剤となることを示している。
【０４２９】
さらに一般に、本発明に従った例示的新生物状態の治療対象は、良性又は悪性；固形腫瘍又は血液悪性腫瘍であり得、限定されないが、以下の群から選択され得る；副腎腫瘍、ＡＩＤＳ関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱がん（扁平上皮がん及び移行上皮がん）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨のう腫（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ  ｂｏｎｅ  ｃｙｓｔ）、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頚部がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、腎明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、深在性良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨格性粘液様軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管がん、胃がん、胃腸、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺障害、頭頚部がん、視床下部、腸がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなど）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、甲状腺髄様がん、多発性内分泌腺腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児科がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体膿瘍腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、希少血液障害（ｒａｒｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎性転移性がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質性障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移性がん及び子宮がん（子宮頸部癌、子宮内膜癌及び平滑筋腫）。ある特定の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、フロントライン治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体若しくはＡＤＣを用いて、又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象、又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。
【０４３０】
血液悪性腫瘍に関すると、本発明の化合物及び方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、ＦＡＢ命名体系（Ｍ０−Ｍ７）、ＷＨＯ分類、分子マーカー／変異、核型、形態学及び他の特徴に基づいた様々なサブタイプのものが認識されている）、系列急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）及び大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）及びＢ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫（古典型ホジキンリンパ腫及び結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）を含む）、非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度リンパ腫／ＮＨＬ濾胞性細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及びバーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む）；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、かさばり病変ＮＨＬ、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、ＡＩＤＳ関連性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、血管性免疫芽細胞性リンパ腺症、びまん性小型切れ込み核細胞、大細胞型免疫芽球性リンパ芽球種、小型非切れ込み核バーキット及び非バーキットリンパ腫、濾胞性の大分割細胞型リンパ腫；濾胞性小型切れ込み核細胞リンパ腫；及び濾胞性混合小型切れ込み核リンパ腫及び大細胞リンパ腫を含めた、様々な白血病の処置に特に有効となり得ることがさらに理解される。Ｇａｉｄｏｎｏら、「Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」、ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ、２巻：２１３１〜２１４５頁（ＤｅＶｉｔａら（編）、第５版、１９９７年）を参照されたい。これらのリンパ腫は、分類体系の変更により、様々な名称を有することが多く、異なる名称に分類されているリンパ腫を有する患者はまた、本発明の組合せ治療レジメンからやはり利益を得ることができることは、当業者に明白となるはずである。
【０４３１】
ＩＸ．製品
本発明は、１つ以上の容器又はレセプタクルを含む医薬パック又はキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体又はＡＤＣを含み得る。このようなキット又はパックは、本質的に診断用又は治療用である。特定の実施形態において、パック又はキットは、１つ以上の追加の薬剤及び任意選択的に１つ以上の抗がん剤を含むか又は含まない、例えば、本発明の抗体又はＡＤＣを含む組成物の所定の量を意味する、単位用量を含む。特定の他の実施形態において、パック又はキットは、がん性細胞の検出、定量化及び／又は視覚化のための結合レポーター分子及び任意選択的に１つ以上の追加の薬剤を含むか又は含まない、検出可能な量の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣを含む。
【０４３２】
いずれにしても本発明のキットは、一般的に、薬学的に許容される製剤を含む適切な容器又はレセプタクル内に、本発明の抗体又はＡＤＣを含み、任意選択的に、同じ又は異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断又は併用療法用のいずれかのために、他の薬学的に許容される製剤又は装置を含んでもよい。診断装置又は機器の例としては、細胞又は増殖性障害に伴うマーカーの検出、監視、定量化又はプロファイルに使用し得るものを含む（このようなマーカーの完全な列挙について、上記参照）。いくつかの実施形態において、装置は、インビボ又はインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、監視、及び／又は定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体又はＡＤＣを抗がん剤又は診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９参照）。
【０４３３】
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は非水性であり得るが、典型的には水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、又は適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の薬学的に許容されるバッファー又は他の希釈剤、例えば、注射用静菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含み得る。キットが、本発明の抗体又はＡＤＣをさらなる治療薬又は薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、又は一方の成分を他方より過剰にして予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体又はＡＤＣ及びいずれかの任意選択の抗がん剤又は他の薬剤（例えば、ステロイド）は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
【０４３４】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の組成物を含む前述のキットは、キットの内容物ががんの治療、予防及び／又は診断のために使用され得ることを示すラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本を含む。他の好ましい実施形態において、キットは、キットの内容物が、がんを患う対象を治療するためのある特定の投与レジメン又は投与量レジメンに従って投与され得ることを示す、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本を含むことができる。特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本は、キットの内容物が、血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の治療、予防及び／若しくは診断のために用いられ得ること、又はこの治療の投与量若しくは投与レジメンを提示することを表示する。他の特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本は、キットの内容物が、肺がん（例えば、腺癌）の治療、予防及び／若しくは診断、又はこの治療のための投与レジメンのために用いられ得ることを表示する。
【０４３５】
適切な容器又はレセプタクルとしては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、注入バッグ（ＩＶバッグ）などが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス又は薬学的に適合するプラスチックなどで形成することができる。特定の実施形態において、レセプタクルは、滅菌アクセスポートを含んでもよい。例えば、容器は、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい。
【０４３６】
いくつかの実施形態において、キットは、抗体及びいずれかの任意選択の成分を患者に投与するための手段、例えば、製剤を対象に注射若しくは導入する又は身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針又はシリンジ（充填済又は空）、点眼器、ピペット又は他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアル又はそれと同様のもの、及び市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアル及び他の装置を配置及び保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
【０４３７】
Ｘ．その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語及び技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両方の終点及び終点の間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０及び２．０と３．０との間の全ての点を含む。
【０４３８】
一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及び化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法及び技術は、一般的に、当該技術分野で周知の及び本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
【０４３９】
ＸＩ．参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願及び出版物並びに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列提出物並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込まれる」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かにかかわらず、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明及び以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は組織化を目的とするものにすぎず、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【０４４０】
上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない。実施例は、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
【０４４１】
配列表のまとめ
表３は、本明細書に含まれているアミノ酸配列及び核酸配列のまとめを示している。
【０４４２】
【表３】
2019522960.tif 000034
2019522960.tif 000035
【０４４３】
腫瘍細胞株のまとめ
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０〜ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前のマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプ及びサブタイプの略称が以下の通り表４に示される：
【０４４４】
【表４】
2019522960.tif 000036
2019522960.tif 000037
【０４４５】
［実施例１］
ＢＭＰＲ１Ｂ発現の特定
全トランスクリプトーム配列決定の使用
固形腫瘍ががん患者に存在するときの、固形腫瘍の細胞異種性を特徴付けて、臨床的関連性のある治療標的を特定するために、当該技術分野で認識されている技術を使用して、大規模なＰＤＸ腫瘍バンクを開発し、維持した。多数の個別の腫瘍細胞株を含む、ＰＤＸ腫瘍バンクを、元々、様々な固形悪性腫瘍に罹患しているがん患者から得られた腫瘍細胞の複数回の継代により、免疫無防備状態マウスにおいて増殖させた。継代の少ないＰＤＸ腫瘍は、この天然環境における腫瘍を代表しており、腫瘍成長を推進する根本的な機構及び現在の治療法に対する耐性への臨床的に関連する洞察を提供する。
【０４４６】
先に言及したように、腫瘍細胞は、２つのタイプの細胞小集団：非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）及び腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）に広く分割され得る。ＴＩＣは、免疫無防備状態マウスに移植すると、腫瘍を形成する能力を有する。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、ＴＩＣのサブセットあり、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。ＮＴＧは、インビボにおいていくらか成長する能力を有しているが、移植されると、元の腫瘍の異種性を再現する腫瘍を形成しない。
【０４４７】
全トランスクリプトーム解析を行うため、ＰＤＸ腫瘍を、これらが８００〜２，０００ｍｍ３に達した後、又はＡＭＬの場合には白血病が骨髄において確立された後（ヒトの元々の＜５％の骨髄細胞性）に、マウスから切除した。切除したＰＤＸ腫瘍を切り離して、当該技術分野で認識されている酵素消化技術を使用し、単一細胞懸濁液に入れた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照）。死滅細胞を検出するための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、マウス細胞を特定するための抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体、及びヒト細胞を特定するための抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体と共に、切り離したバルク腫瘍細胞をインキュベートした。さらに、腫瘍細胞を、ＣＤ３２４＋  ＣＳＣ又はＣＤ３２４−  ＮＴＧ細胞を特定するための、蛍光的にコンジュゲートした抗ヒトＣＤ４６及び／又はＣＤ３２４抗体と共にインキュベートし、次に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ細胞ソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ  ２０１３／０２６０３８５、２０１３／００６１３４０及び２０１３／００６１３４２を参照）。抗ヒトＣＤ４９ｆ及びＥＰＣＡＭ抗体はまた、分化ルミナル、前駆体及び乳房幹細胞／基底上皮細胞、並びに間質細胞を含めた、Ｌｉｍら、２００９年（ＰＭＩＤ：１９６４８９２８）により記載されている、正常なヒト乳房内の４つの異なる小集団を特定するために使用される。
【０４４８】
１％  ２−メルカプトエタノールを補足したＲＬＴｐｌｕｓ  ＲＮＡ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中で細胞を溶解することにより、腫瘍細胞からＲＮＡを抽出し、この溶解物を−８０℃において凍結し、次に、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出するため、溶解物を解凍した。ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び／又はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量した。正常組織のＲＮＡは、様々な供給元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＢｉｏＣｈａｉｎ及びＣｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。得られた全ＲＮＡ調製物は、遺伝配列決定及び遺伝子発現解析によって評価された。
【０４４９】
より詳細には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００又は２５００次世代配列決定システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用する、高品質ＲＮＡの全トランスクリプトーム配列決定を行った。
【０４５０】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ全トランスクリプトーム解析は、上記の通りに単離された、バルク、転移した肺（ＬＵ  ＭＥＴ）又はＣＳＣ腫瘍小集団のいずれかから抽出された、５ｎｇの全ＲＮＡを使用して生成したｃＤＮＡを用いて行われた。ライブラリは、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ試料調製キットｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して作成された。得られたｃＤＮＡライブラリは断片化されて、バーコードが付与された。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからの配列決定データは、遺伝子のエクソン領域へとマッピングされたＦＰＫＭ（１００万あたりのキロ塩基あたりの断片数）計量を使用して、断片発現値として、名目上、表されており、基礎的遺伝子発現解析を、ＦＰＫＭ転写として正規化し、計数することを可能とする。図２に示されている通り、ＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡ発現は、ルミナルＢ（ＢＲ−ＬｕｍＢ）ＰＤＸ腫瘍（模様入り棒）、ＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸを有するマウスにおいて発生した肺転移（暗灰色棒）、及び選別した乳がん幹細胞小集団（黒色棒）において、上方調節されている。ＢＭＰＲ１Ｂ発現は、正常組織及び様々な選別された正常乳房集団の両方におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現よりも、ＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍において一般に高かった。
【０４５１】
ＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍、肺転移及びＣＳＣ集団におけるＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡ発現の向上の特定は、ＢＭＰＲ１Ｂが、診断的標的及び免疫療法的標的としての可能性を有することを示した。さらに、選別した集団において、ＢＭＰＲ１Ｂの発現が増大していることは、ＢＭＰＲ１Ｂが、腫瘍形成性細胞の良好なマーカーとなることを示している。これは、特に、ＢＲ−ＬｕｍＢ由来細胞に、特に該当する。
【０４５２】
［実施例２］
ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する腫瘍中のＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現
腫瘍細胞におけるＢＭＰＲ１Ｂ  ＲＮＡ発現を確認するため、業界の標準プロトコルに従い、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ（商標）ＨＤシステムを使用して、様々なＰＤＸ細胞株に対してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡは、実施例１に記載されている通り、バルクＰＤＸ腫瘍細胞又は選別したＣＳＣ及びＮＴＧ小集団から抽出した。抽出後、１．０ｎｇのＲＮＡを、製造業者の指示に従い、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡに変換した。次に、ＢＭＰＲ１Ｂプローブ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して予め増幅したｃＤＮＡ材料を、後続のｑＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。
【０４５３】
正常組織（ＮｏｒｍＴｏｘ又はＮｏｒｍ）におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現を、乳房（ＢＲ）腫瘍の様々な分子サブタイプ、すなわち無分類ＢＲ、ＢＲ基底様、ＢＢＲ−ＨＥＲ２ポジティブ、ＢＲ−ＬｕｍＡ及びＢＲ−ＬｕｍＢ、並びにＮＳＣＬＣ（ＬＵ−Ａｄ及びＬＵ−ＳＣＣ）、ＯＶ−Ｓ／ＰＳ及び膵臓（ＰＡ−ＰＡＣ／ＰＤＡＣ）ＰＤＸ、並びに原発性前立腺（ＰＲ）腫瘍試料（図３；各ドットは、個々の組織又はＰＤＸ細胞株のそれぞれの平均相対発現量を表し、小さな水平線は、幾何平均を表す）における発現と比較した。「ＮｏｒｍＴｏｘ」は、以下の通り、様々な正常組織：副腎、結腸、脊髄後根神経節、内皮細胞（動脈、静脈）、食道、心臓、腎臓、肺、膵臓、筋骨格、皮膚（線維芽細胞、ケラチノサイト）、小腸、脾臓、胃及び気管の試料を表す。「Ｎｏｒｍ」と表される、別の組の正常細胞は、以下の正常組織の試料を表し、ＡＤＣ型薬物に関する毒性のリスクが低いと推定される：末梢血単核球細胞及び様々な選別された小集団（Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、好中球、Ｔ細胞）、脂肪、膀胱、脳、乳房、子宮頚部、胎児肝臓、メラノサイト、正常骨髄及び様々な選別小集団、卵巣、前立腺、唾液腺、精巣、甲状腺並びに子宮。
【０４５４】
図３は、ＢＲ−Ｌｕｍ  ＰＤＸ及び原発性ＰＲ腫瘍において、ＢＭＰＲ１Ｂ発現量が平均して増加しており、ＢＲ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ、ＰＡ−ＰＡＣ／ＰＤＡＣ及びＯＶの他の分子サブタイプにおいて、より低い発現が観察されたが、幾何平均は、これらの腫瘍片では総合的により低いことを示している。このデータは、Ｌｕｍ−Ｂにおいて、ＢＭＰＲ１Ｂの発現量の増加は早期の知見であることを支持しており、さらに大部分の正常組織と比べて、原発性ＰＲ腫瘍において、過剰発現をしていることを強調している。
【０４５５】
［実施例３］
マイクロアレイ解析を使用する腫瘍中のＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量の決定
様々な腫瘍細胞株におけるＢＭＰＲ１Ｂの発現レベルを決定するマイクロアレイ実験を行い、データを以下の通り解析した。ＢＲ  ＰＤＸ（ＢＲ基底様、ＢＲ−ＣＬＤＮ−低、ＢＲ−ＨＥＲ２、ＢＲ−ＬｕｍＡ、ＢＲ−ＬｕｍＢ、ＢＲ−ＮＬ）の様々な分子サブタイプから、並びに様々な分子サブタイプを代表する原発性ＢＲ腫瘍試料から、実質的に実施例１に記載したように全腫瘍の総ＲＮＡ１〜２μｇを抽出した。さらに、正常組織（例えば、乳房、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、皮膚、脾臓、ＰＢＭＣ及び胃）の試料からＲＮＡを抽出した。ヒトゲノムにおいて、２７，９５８の遺伝子及び７，４１９のｌｎｃＲＮＡに対して設計された、５０，５９９の生物学的プローブを含むＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  ＧＥヒト８ｘ６０  ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して、これらのＲＮＡ試料を解析した。標準的な業界の慣習を使用して、強度値を正規化して変換し、各試料に関する遺伝子発現を定量した。各試料におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現の正規化後の強度が、図４にプロットされており、各腫瘍タイプについて誘導された幾何平均値は、水平の棒により示されている。
【０４５６】
図４をよく精査すると、ＢＭＰＲ１Ｂ発現は、正常組織及び乳がんの他の分子サブタイプと比べて、大部分のＢＲ−ＬｕｍＢ及びＢＲ基底様ＰＤＸ株において上方調節されていることが示される。前述の腫瘍タイプにおける高いＢＭＰＲ１Ｂ発現量の観察により、前の実施例の結果が確認される。
【０４５７】
［実施例４］
がんゲノムアトラスを使用する、腫瘍におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現
様々な腫瘍におけるＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの過剰発現は、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）として知られている原発性腫瘍及び正常試料の、公に入手可能な多量のデータセットを使用して確認した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームからのＢＭＰＲ１Ｂ発現データは、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｏｍｍｏｎｓ（ＧＤＣ）Ｌｅｇａｃｙ  Ａｒｃｈｉｖｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ−ｐｏｒｔａｌ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｌｅｇａｃｙ−ａｒｃｈｉｖｅ）からダウンロードし、ＲＳＥＭからのｓｃａｌｅｄ＿ｅｓｔｉｍａｔｅは、１，０００，０００をかけて、１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）を得た［Ｌｉ及びＤｅｗｅｙ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１１年］。図５は、乳房、前立腺腺癌、卵巣及び嫌色素性腎細胞癌（ＫＩＣＨ）原発性患者試料において、正常組織と比べて、ＢＭＰＲ１Ｂ発現量が増加していることを示している。これらのデータにより、ＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡのレベル向上が、様々な腫瘍タイプにおいて見出され得ることがさらに確認され、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及びＡＤＣは、これらの腫瘍に対する有用な治療剤となり得ることを示している。
【０４５８】
図６Ａは、ＢＲ−ＬｕｍＡ  ＴＣＧＡ腫瘍のサブセットに対するカプランマイヤー生存曲線を示しており、患者の生存データが入手可能であった。ＢＲ−ＬｕｍＡ腫瘍において、ＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量が多いこと、すなわち指標値の閾値を超える発現量、又はＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量が少ないこと、すなわち指標値の閾値未満の発現量であることに基づいて、患者を階層化した。指標値の閾値は、ＴＰＭ値の７５％四分位数である１６６．８として計算した。「リスク数」と以下に列挙されているプロットは、各患者が最初に診断されたその日（０日目）の後、１０００日毎のデータセットに留まっている生存患者の数を示している。２つの生存曲線は、ログランク（マンテル−コックス）検定により、有意差がある（ｐ＝０．０１）、又はゲーハン−ブレスロー−ウィルコクソン検定によりｐ＝０．０９である。これらのデータは、多い発現量のＢＭＰＲ１Ｂを示すＢＲ−ＬｕｍＡ腫瘍を有する患者は、少ない発現量のＢＭＰＲ１Ｂを示すＢＲ−ＬｕｍＡ腫瘍を有する患者と比較して、生存期間がより短いことを示している。
【０４５９】
様々な腫瘍におけるＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの過剰発現はまた、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）として知られている原発性腫瘍及び正常試料の、公に入手可能な多量のデータセットを使用して確認された。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２及びＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑプラットフォームからのＢＭＰＲ１Ｂ発現データは、ＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＤｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ）からダウンロードして解読し、各遺伝子の個々のエクソンからの読取り値を統合し、マップされたリード数１００万あたりのエクソンのキロ塩基あたりのリード数（ｒｅａｄ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）（ＲＰＫＭ）の単一の値を生成した。
【０４６０】
図６Ｂは、ＫＩＣＨ  ＴＣＧＡ腫瘍のサブセットに対するカプランマイヤー生存曲線を示しており、患者の生存データが入手可能であった。ＫＩＣＨ腫瘍における、ＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量が多いこと、すなわち指標値の閾値を超える発現量、又はＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量が少ないこと、すなわち指標値の閾値未満の発現量であることに基づいて、患者を階層化した。指標値の閾値は、ＲＰＫＭ値の８５パーセンタイルである０．６１として計算された。「リスク数」と以下に列挙されているプロットは、各患者が最初に診断されたその日（０日目）の後、５００日毎のデータセットに留まっている生存患者の数を示している。２つの生存曲線は、ログランク（マンテル−コックス）検定により、有意差がある（ｐ＝０．００２０）、又はゲーハン−ブレスロー−ウィルコクソン検定によりｐ＝０．０００１である。これらのデータは、多い発現量のＢＭＰＲ１Ｂを示すＫＩＣＨ腫瘍を有する患者は、少ない発現量のＢＭＰＲ１Ｂを示すＫＩＣＨ腫瘍を有する患者と比較して、生存期間がより短いことを示している。
【０４６１】
ＴＣＧＡデータベースから導かれた結果に基づいて、直下に示した知見を確認するために、他のデータ源と照合する決定を行った。この点に関すると、一般に、ＭＥＴＡＢＲＩＣデータセットと呼ばれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成したデータ（Ｃｕｒｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２年４月１８日；４８６巻（７４０３号）：３４６〜５２頁、ＰＭＩＤ２２５２２９２５）をプローブにして、乳がん患者のある特定のサブセットに関する生存率を決定した。得られたデータは、ここに付け加えた図６Ｃにおいて示されている。
【０４６２】
より詳細には、図６Ｃは、ＢＲ−ＬｕｍＡ  ＭＥＴＡＢＲＩＣデータセット腫瘍のサブセットに対するカプランマイヤー生存曲線を示しており、患者の生存データが入手可能であった。ＢＲ−ＬｕｍＡ  腫瘍における、ＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量が多いこと、すなわち指標値の閾値を超える発現量、又はＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの発現量が少ないこと、すなわち指標値の閾値未満の発現量であることに基づいて、患者を階層化した。発現値は、ＭＥＴＡＢＲＩＣ検討から正規化した値（ＨＴ−１２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｅａｄｃｈｉｐ  Ｋｉｔ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）である。正規化手順は、上記のＣｕｒｔｉｓらにおいて、詳細に記載されている。指標値の閾値は、正規化された発現値の第３の四分位数として計算され、これは、７．４６であると算出された。
【０４６３】
図６Ｃ中、「リスク数」と以下に列挙されているプロットは、各患者が最初に診断されたその日（０日目）の後、２０００日毎のデータセットに留まっている生存患者の数を示している。２つの生存曲線は、ログランク（マンテル−コックス）検定により、有意差がある（ｐ＜０．０００１）か、又はゲーハン−ブレスロー−ウィルコクソン検定によりｐ＝０．００１４である。ＴＣＧＡデータセットからの結果と同様に、これらのデータは、多い発現量のＢＭＰＲ１Ｂを示すＢＲ−ＬｕｍＡ腫瘍を有する患者は、少ない発現量のＢＭＰＲ１Ｂを示すＢＲ−ＬｕｍＡ腫瘍を有する患者と比較して、生存期間がより短いことを示している。
【０４６４】
これらのデータを一緒に見ると、ＫＩＣＨ及びＢＲ−ＬｕｍＡを処置するために抗ＢＭＰＲ１Ｂ治療法が有用であること、及び予後バイオマーカーとしてＢＭＰＲ１Ｂ発現が有用であることを示唆しており、この予後バイオマーカーに基づいて、処置判断を行うことができる。この点において、ＢＭＰＲ１Ｂの高いレベルを示す患者が、標準化学治療の１つ以上の工程を完了するまで待機するよりもすぐに、この患者を処置する方が臨床的に有益となり得る。
【０４６５】
［実施例５］
組換えＢＭＰＲ１Ｂタンパク質のクローニング及び発現並びに細胞表面ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株の操作
ヒトＢＭＰＲ１Ｂ（ｈＢＭＰＲ１Ｂ）のレンチウイルスＤＮＡ構築物
ｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株を生成するため、ｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有するレンチウイルスベクターを、以下のように構築した。まず、標準的な分子クローニング技術を使用して、ＩｇＫシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入し、次いで、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位の上流のＡｓｐ−Ｌｙｓエピトープタグを導入し、ベクターｐＬＭＥＧＰＡを生成した。このデュアルプロモーター構築物は、ＣＭＶプロモーターを使用して、ｃｏｐＧＦＰ  Ｔ２Ａ  Ｐｕｒｏレポーター及び選択可能なマーカーの発現を推進する下流のＥＦ１プロモーターとは無関係のＡｓｐ−Ｌｙｓタグ付け細胞−表面タンパク質の発現を駆動する。ｐＬＭＥＧＰＡ中のＴ２Ａ配列は、ペプチド結合の縮合部のリボソームスキッピングを促進し、２つの独立したタンパク質：Ｔ２Ａペプチドの上流においてコードされるレポーターｃｏｐＧＦＰの高レベル発現と、Ｔ２Ａペプチドの下流においてコードされるＰｕｒｏ選択可能なマーカータンパク質との共発現をもたらし、ピューロマイシンの存在下で、形質導入された細胞の選択が可能になる。
【０４６６】
ｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質をコードする合成ＤＮＡ断片を、設計用の参照としてのＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２０３を使用して、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から注文した。合成遺伝子は、哺乳動物株における発現をコドン最適化し、制限エンドヌクレアーゼ部位に挟み、ｐＬＭＥＧＰＡにおいて、ＩｇＫシグナルペプチド−Ａｓｐ−Ｌｙｓエピトープタグの、下流でのインフレームサブクローニングが可能となるようにする。これにより、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇレンチウイルスベクターが得られ、これは、ｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質のＮ末端に結合したＡｓｐ−Ｌｙｓタグを有する融合タンパク質をコードする。
【０４６７】
ｈＢＭＰＲ１Ｂ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物
ｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質のＥＣＤを含有する融合タンパク質を生成するため、残基Ｋ１４〜Ｒ１２６の間（Ｋ１４、Ｒ１２６を含む）のｈＢＭＰＲ１Ｂ  ＯＲＦの断片を増幅する、鋳型及びプライマーとして、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇ  ＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。標準分子技術を使用して、このＰＣＲ増幅ＤＮＡを、ＣＭＶ駆動発現ベクターに、インフレームで、免疫グロブリンカッパ（ＩｇＫ）単一ペプチド配列の下流に、かつ、インフレームで９ｘ−ヒスチジンタグ（ｐＥＭＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−ＣＨｉｓを与える）又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃタンパク質（ｐＥＭＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃを与える）のどちらか一方をコードするＤＮＡの上流に、サブクローニングした。これらのＣＭＶ駆動発現ベクターにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び／又はＣＨＯ−Ｓ細胞において、高いレベルの一過性発現が可能になる。
【０４６８】
カニクイザルＢＭＰＲ１Ｂ（ｃＢＭＰＲ１Ｂ）ＤＮＡ構築物
ｃＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株を生成するため、ｃＢＭＰＲ１Ｂタンパク質（ＮＣＢＩ受託番号ＸＰ＿００５５５５５２６から誘導した配列）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ）を上記のレンチウイルスベクターｐＬＭＥＧＰＡの多重クローニング部位にサブクローニングすることにより、レンチウイルスベクターｐＬＭＥＧＰＡ−ｃＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇを構築した。ｐＬＭＥＧＰＡデュアルプロモーターレンチウイルスベクターにより、ＧＦＰ及びピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ選択マーカーと共に、Ｎ末端Ａｓｐ−Ｌｙｓタグ付きｃＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の共発現が可能になる。
【０４６９】
ｃＢＭＰＲ１Ｂタンパク質のＥＣＤを含有する融合タンパク質を生成するために、標準分子技術を使用して、ｃＢＭＰＲ１ＢのＥＣＤをコードする合成ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ）（例えば、残基Ｋ１４〜Ｋ１２６（Ｋ１４、Ｋ１２６を含む））を、ＣＭＶ駆動発現ベクターに、インフレームで、免疫グロブリンカッパ（ＩｇＫ）単一ペプチド配列の下流に、及び９ｘ−ヒスチジンタグ（ｐＥＭＡ−ｃＢＭＰＲ１Ｂ−ＣＨｉｓを与える）又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃタンパク質（ｐＥＭＡ−ｃＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃを与える）のどちらか一方をコードするＤＮＡの場合、上流にインフレームで、サブクローニングした。
【０４７０】
ラットＢＭＰＲ１Ｂ（ｒＢＭＰＲ１Ｂ）ＤＮＡ構築物
ｒＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を過剰発現する細胞株を生成するため、ｒＢＭＰＲ１Ｂタンパク質（ＮＣＢＩ受託番号ＸＭ＿００６２３３３９８に由来する配列）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ）を上記のレンチウイルスベクターｐＬＭＥＧＰＡの多重クローニング部位にサブクローニングすることにより、レンチウイルスベクターｐＬＭＥＧＰＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇを構築した。ｐＬＭＥＧＰＡデュアルプロモーターレンチウイルスベクターは、ＧＦＰ及びピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ選択マーカーと共に、Ｎ末端Ａｓｐ−Ｌｙｓ−タグ付きｒＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の共発現を可能にする。
【０４７１】
ｒＢＭＰＲ１Ｂタンパク質のＥＣＤを含有する融合タンパク質を生成するため、残基Ｋ１４〜Ｋ１２６の間（Ｋ１４、Ｋ１２６を含む）のラットＢＭＰＲ１Ｂ  ＯＲＦの断片を増幅する、鋳型及びプライマーとして、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇ  ＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。標準分子技術を使用して、このＰＣＲ増幅ＤＮＡを、ＣＭＶ駆動発現ベクターに、インフレームで、免疫グロブリンカッパ（ＩｇＫ）単一ペプチド配列の下流に、及び９ｘ−ヒスチジンタグ（ｐＥＭＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−ＣＨｉｓを与える）又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃタンパク質（ｐＥＭＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃを与える）のどちらか一方をコードするＤＮＡの場合、上流にインフレームでサブクローニングした。
【０４７２】
ＢＭＰＲ１Ｂ  ＥＣＤ融合タンパク質の生成
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は懸濁液ＣＨＯ−Ｓ細胞の懸濁液又は接着培養物は、トランスフェクト試薬として、ポリエチレンイミンポリマーを使用して、以下：ｐＥＭＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−ＣＨｉｓ、ｐＥＭＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃ、ｐＥＭＡ−ｃＢＭＰＲ１Ｂ−ＣＨｉｓ、ｐＥＭＡ−ｃＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃ、ｐＥＭＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−ＣＨｉｓ又はｐＥＭＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃのうちの１つから選択される発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトして３〜５日後に、製造業者の指示により、適宜、ニッケル−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムのどちらか一方を使用して、Ｈｉｓ又はＦｃ融合タンパク質を、清澄化した細胞−上清から精製した。
【０４７３】
細胞株の操作
当業者に周知の標準レンチウイルス形質導入技術を使用し、レンチウイルスベクター、すなわちｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇ、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｃＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇ又はｐＬＭＥＧＰＡ−ｒＢＭＰＲ１Ｂ−ＮＦｌａｇを用いて、それぞれ、ｈＢＭＰＲ１Ｂ、ｃＢＭＰＲ１Ｂ又はｒＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を過剰発現する、安定なＨＥＫ２９３Ｔをベースとする細胞株を作製した。形質導入された細胞は、ピューロマイシン、次いで、高発現ＨＥＫ２９３Ｔサブクローンの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、選別した（例えば、ＧＦＰ及びＡｓｐ−Ｌｙｓ−タグに強力に陽性となる細胞）。
【０４７４】
［実施例６］
ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の生成
３匹のマウス、すなわち１匹のＢＡＬＢ／ｃ、１匹のＣＤ−１及び１匹のＦＶＢに、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｈ４  Ｔ２６８４−１ＭＬ）により乳化した、１０μｇのｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質を接種することにより、抗ＢＭＰＲ１Ｂマウス抗体を生成した。最初の接種後、これらのマウスに、等量のＩｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃７７１６１）及び「ＣｐＧ」（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  ＯＤＮ１８２６＃ｔｌｒ１−１８２６−１）により乳化した、１０μｇのｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質により、１週間の間隔で９回、注射した。融合前の最後の注射は、ＰＢＳ中の１０μｇのｈＢＭＰＲ１Ｂを用いた。
【０４７５】
マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径及び内側腸骨）を解離し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を生成し、（２１０×１０６細胞を）エレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、非分泌ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）と、１：１の比で融合した。細胞を、アザセリン、１５％の胎性クローンＩ血清（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＳＨ３００８０−０３）、１０％のＢＭ順化培地（Ｒｏｃｈｅ＃１０６６３５７３００１）、１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−０２５−ＣＩ）、１ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−０６０−ＣＩ）、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３０−００２−ＣＩ）及び１００ＩＵのＬ−グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−００５−ＣＩ）を補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に再懸濁し、１００ｍＬの選択培地を含有する２つのＴ２２５フラスコ中で培養した。フラスコを、７％ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベータにおいて、６日間、置いた。
【０４７６】
融合後６日及び７日目に、ハイブリドーマ細胞をフラスコから選別し、９０μＬの補足したハイブリドーマ選択培地（上記）中の、ウェルあたり細胞１個で、１２Ｆａｌｃｏｎ３８４ウェルプレートに蒔いた（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞ソーターを使用）。未使用ハイブリドーマライブラリ細胞の残りを、今後のライブラリ試験及びスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
【０４７７】
選別したクローナルハイブリドーマを、８日間、培養し、上清を採集して３８４−ウェルプレートに再度並べ、以下の通り、フローサイトメトリーを使用して、形質導入したＨＥＫ／２９３Ｔ細胞の表面に発現したｈＢＭＰＲ１Ｂ（ヒト）及びｒＢＭＰＲ１Ｂ（ラット）に特異的な抗体をスクリーニングした。各ウェル中のｈＢＭＰＲ１Ｂ及びｒＢＭＰＲ１Ｂを安定的に形質導入した２９３Ｔ細胞の混合物を、２５μＬのハイブリドーマ上清と一緒に３０分間、インキュベートし、次に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより洗浄した。試料あたり、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体２５μＬと共に、細胞を１５分間、インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより２回洗浄して、ここに再懸濁した。次に、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）によって解析した。
【０４７８】
この最初のスクリーニング（スクリーニング１）から、いくつかのｈＢＭＰＲ１Ｂ／／ｒＢＭＰＲ１Ｂ免疫特異的抗体（ＳＣ９１．１〜ＳＣ９１．８４と呼ぶ。図７Ａを参照されたい）を特定した。
【０４７９】
続いて、同様のスクリーニング工程を、同一のハイブリドーマライブラリを使用して行い（スクリーニング２）、目的とする、追加の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（ＳＣ９１．１０１〜ＳＣ９１．１９５と呼ぶ、図７Ｂを参照されたい）を得た。今回、ｃＢＭＰＲ１Ｂ発現を安定的に形質導入した２９３Ｔ細胞も使用した。選別したクローナルハイブリドーマを、８日間、培養し、上清を採集して３８４−ウェルプレートに再度並べ、以下の通り、フローサイトメトリーを使用して、形質導入したＨＥＫ／２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）の表面に発現したｈＢＭＰＲ１Ｂ、ｃＢＭＰＲ１Ｂ及びｒＢＭＰＲ１Ｂに特異的な抗体をスクリーニングした。各ウェル中のｈＢＭＰＲ１Ｂ、ｃＢＭＰＲ１Ｂ及びｒＢＭＰＲ１Ｂを安定的に形質導入した２９３Ｔ細胞の混合物を、２５μＬのハイブリドーマ上清と一緒に３０分間、インキュベートし、次に、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより洗浄した。試料あたり、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的二次抗体２５μＬと共に、細胞を１５分間、インキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより２回洗浄して、ここに再懸濁した。次に、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）によって解析した。この第２のスクリーニングにより、本発明における教示と組み合わせて使用することができる、いくつかのｈＢＭＰＲ１Ｂ／ｃＢＭＰＲ１Ｂ／ｒＢＭＰＲ１Ｂ免疫特異的抗体が特定された。
【０４８０】
［実施例７］
ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の特徴
様々な方法を使用して、ビニング、結合親和性、及びヒトＢＭＰＲ１Ｂを発現する細胞を認識して殺傷する能力に関して、実施例６において生成した抗ＢＭＰＲ１Ｂマウス抗体の特徴付けを行った。図７Ａ及び図７Ｂは、いくつかの例示的なマウス抗体に関する、上述の特徴をまとめた表を提示している。
【０４８１】
抗体結合及び親和性：
スクリーン１に関して、ヒト、カニクイザル及びラットＢＭＰＲ１Ｂに対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００及びＴ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、結合速度を測定することにより決定した。抗体を、抗マウス捕捉（ＡＭＣ）チップ上に固定化し、定量的評価（「＋＋＋」、「＋＋」、「＋」）の場合、２００ｎＭの単一濃度、又は平衡定数（ＫＤ）決定の場合、３つの異なる濃度（すなわち２２、６６、２００ｎＭ）のどちらかで、ヒト、カニクイザル及びラットＢＭＰＲ１Ｂを注射した。無関係免疫グロブリンを使用することにより、センソグラムから参照を差し引いて、最後に、１：１結合モデルを使用して当てはめを行った。これらの検討を合わせた結果は、「Ｂｉａｃｏｒｅ」とラベルされている図７Ａの３本の列に見ることができる。
【０４８２】
スクリーン２に関して、ヒト、カニクイザル及びラットＢＭＰＲ１Ｂに対する親和性を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、結合速度を測定することにより決定した。抗体を、抗マウス捕捉（ＡＭＣ）チップ上に固定化し、平衡定数（ＫＤ）決定のため、３つの異なる濃度（２２、６６、２００ｎＭ）において、シングルサイクルカイネティクスにより、ヒト、カニクイザル及びラットＢＭＰＲ１Ｂ−ｈｉｓを注射した。無関係免疫グロブリンを使用することにより、センソグラムから参照を差し引いて、１：１結合モデルを使用して当てはめを行った。これらの検討を合わせた結果は、「Ｂｉａｃｏｒｅ」とラベルを付けた図７Ｂの３本のカラムに見ることができる。
【０４８３】
スクリーニング１からの例示的な抗体もまた、フローサイトメトリーを使用して、この抗体が、細胞表面においてｈＢＭＰＲ１Ｂ及びｒＢＭＰＲ１Ｂと結合する能力を試験した。この目的のため、ｒＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例５により調製）と一緒にしたｈＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現する操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例５により調製）を、表示した抗体と共に３０分間、インキュベートし、製造業者の指示に従い、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータを使用するフローサイトメトリーにより、ｈＢＭＰＲ１Ｂ発現があるかを解析した。抗原発現は、アイソタイプ対照抗体により染色された同一細胞と比較した、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体により染色された操作された細胞の表面に観察される、幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として定量する。平均蛍光強度に関するアッセイの結果が、図７Ａ中、「フローサイトメトリー」とラベルされている列に示されている。データを精査すると、開示される抗体のいくつかが、細胞の表面上のｈＢＭＰＲ１Ｂに結合することが示される。
【０４８４】
スクリーニング２に関すると、フローサイトメトリーを使用して、例示的な抗体をこの抗体が、細胞表面においてｈＢＭＰＲ１Ｂ、ｃＢＭＰＲ１Ｂ及びｒＢＭＰＲ１Ｂと結合する能力を試験した。この目的のため、ｃＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例６により調製）及びｒＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例６により調製）と一緒にしたｈＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現する操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例６により調製）を、表示した抗体と共に３０分間、インキュベートし、製造業者の指示に従い、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータを使用するフローサイトメトリーにより、ｈＢＭＰＲ１Ｂ発現があるかを解析した。抗原発現は、アイソタイプ対照抗体により染色された同一細胞と比較した、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体により染色された操作された細胞の表面に観察される、幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として定量した。平均蛍光強度に関するアッセイの結果が、図７Ｂ中、「フローサイトメトリー」とラベルされている列に示されている。データを精査すると、開示される抗体のいくつかが、細胞の表面上のｈＢＭＰＲ１Ｂに結合することが示される。
【０４８５】
ビニング：
多重化競合免疫アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））を使用して、抗体をビンに群分けした。１０μｇ／ｍＬの濃度の個々の固有の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（捕捉ｍＡｂ）１００μｌを、抗マウスカッパ抗体にコンジュゲートした磁気ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））と共に１時間、インキュベートした（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１年、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。捕捉ｍＡｂ／コンジュゲートビーズ複合体をＰＢＳＴＡバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）により洗浄して、次に、プールした。残りの洗浄用バッファーを除去した後、上記のビーズを２μｇ／ｍＬのｈＢＭＰＲ１Ｂ−Ｈｉｓタンパク質と共に１時間、インキュベートし、次に、ＰＢＳＴＡにおいて洗浄して、ここに再懸濁させた。プールしたビーズ混合物を、各ウェルが固有の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（検出体ｍＡｂ）を含むように９６ウェルプレートに分布させて、振とうしながら、１時間、インキュベートした。洗浄工程後、ＰＥにコンジュゲートした抗マウスカッパ抗体（上において使用したものと同一）を、５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、１時間、インキュベートした。ビーズを再度、洗浄し、ＰＢＳＴＡ中で再懸濁した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値をＬｕｍｉｎｅｘ  ＭＡＧＰＩＸ機器により測定した。抗体対合を、抗体の対のピアソン相関係数から算出した、距離行列の樹状図として視覚化した。ビニングは、抗体の対のＭＦＩ値の樹状図及び解析に基づいて決定した。データが、図７Ａ（スクリーニング１）及び図７Ｂ（スクリーニング２）のそれぞれにおいて、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｂｉｎｎｉｎｇと見出しの付けた列に提示されており、この場合、これらの結果により、スクリーニングした抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を少なくとも６つのビン（Ａ〜Ｆ）に群分けできることが示される。スクリーニング２は、ビンＢとＤとの間に一部、潜在的な重なりがあることを示すこと、及び空欄のセル又は「ｘ」とラベルが付けられているセルは、ビンがそのような特定の抗体に対して決定されなかったことを示すことに留意されたい。
【０４８６】
インビトロでの殺傷：
本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が、生存腫瘍細胞に細胞毒性剤の送達を媒介するために内在化することができるかどうかを判定するため、例示的な抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体及びサポリンに連結している二次抗マウス抗体ＦＡＢ断片を使用して、インビトロでの細胞殺傷アッセイを行った。サポリンは、リボソームを非活性化する植物毒であり、これによって、タンパク質合成を阻害し、細胞が死に至る。サポリンは、細胞内部でしか毒性ではなく、細胞において、リポソームに接近するが、独立して、内在化することはできない。したがって、これらのアッセイにおけるサポリン媒介性の細胞毒性は、会合した抗ＢＭＰＲ１Ｂマウス抗体が標的細胞に結合して内在化した際の、抗マウスＦＡＢ−サポリン構築物の内在化能力を示す。
【０４８７】
ヒトＢＭＰＲ１Ｂ、ラットＢＭＰＲ１Ｂ又はカニクイザルＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（実施例５に従い調製）の単一細胞懸濁液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり５００個の細胞で蒔いた。１日後、２ｎＭに固定した濃度の抗マウスＩｇＧ  ＦＡＢ−サポリン構築物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒になった培養物に、スクリーニング１又はスクリーニング２において特徴付けた精製抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体１００ｐＭを加えた。９６時間インキュベートした後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。二次ＦＡＢ−サポリンコンジュゲートだけとインキュベートした細胞を含有する培養物を使用して、生の発光カウントを１００％参照値として設定し、全ての他の計数物を参照値の割合として算出した。図７Ａ及び図７Ｂにおいて、「インビトロでの殺傷」とラベルが付けられた列に示されている結果は、生存細胞の百分率として表されている。
【０４８８】
これらのデータは、１００ｐＭの濃度の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体−サポリンコンジュゲートのサブセットは、様々な効力で、ヒトＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を効果的に殺傷したことを実証している（図７Ａ及び７Ｂ）。
【０４８９】
抗体が細胞殺傷を媒介する能力にエピトープの位置が役割を果たすかどうかを判定するため、ヒトＢＭＰＲ１Ｂを発現する２９３種の細胞に関して、図７Ａ及び７Ｂに示されている殺傷データをビンによりプロットし、図７Ｃ及び７Ｄを得た。図７Ｃ及び７Ｄを精査すると、ビンＡ、Ｃ又はＥにマッピングしたこれらの抗体は、上において示されているサポリンと組み合わせて使用すると、より高い細胞殺傷活性を示すことが示される。これらのデータは、ビンＡ、Ｃ又はＥにおける抗体は、本明細書において開示されている抗体薬物コンジュゲートの成分として使用すると、特に有効となり得ることを示している。
【０４９０】
［実施例８］
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体とＢＭＰＲ１Ａとの交差反応性
ＢＭＰＲ１Ｂは、１Ａ型受容体であるＢＭＰＲ１Ａと７３％の相同性を共有する、１Ｂ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体である。本発明の抗体がＢＭＰＲ１Ａと交差反応するかどうかを判定するため、ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。
【０４９１】
第１のスクリーニングに関すると、抗体を、既にコーティングしたプレート上に、４種の異なる組換えタンパク質：ＢＭＰＲ１Ｂ−ｈｉｓ、ＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃ、ＢＭＰＲ１Ａ−Ｆｃ及び無関係Ｆｃ−タグ付きタンパク質と共に一晩かけて、０．１ｕｇ／ｍＬでインキュベートした。検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体の使用により達成した。抗体は全て、ｈｉｓ及びＦｃ融合フォーマットの両方において、ＢＭＰＲ１Ｂに関して試験すると、ＥＬＩＳＡポジティブであった。図８Ａにおいて見られる通り、わずか数種のクローンのみが、ＢＭＰＲ１Ａ−Ｆｃに弱く結合することが示された。これは、無関係なＦｃ構築物及びＢＭＰＲ１Ｂ−ｈｉｓへの同時結合のため、非特異的であると疑われた。次に、これらのデータを（上で示した条件を実質的に使用して、データ示さず）Ｂｉａｃｏｒｅと相関づけ、読取り値の組合せにより、試験した抗体全ての中で、ＳＣ９１．３３だけが、ヒトＢＭＰＲ１Ａにいくらか交差反応性を示すことが示された。
【０４９２】
同様に、スクリーニング２からの抗体を０．１ｕｇ／ｍＬで、予めコーティングした２つのプレート上に、０．３ｕｇ／ｍＬの組換えヒトＢＭＰＲ−１Ａ／ＡＬＫ−３−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ：３１５−ＢＲ）と共に、一晩、インキュベートした。各プレートは、マウス抗ｈｉｓ及び抗ｆｃ一次抗体を含有する対照ウェルからなった。検出は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体の使用により達成した。抗ｈｉｓ抗体は全て、ＥＬＩＳＡポジティブであった一方、抗ｆｃ抗体は全て、ｒｈＢＭＰＲ−１Ａ／ＡＬＫ−３−Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａに試験すると、バックグラウンド未満となった。これは、タンパク質のＣ末端上の６−ｈｉｓタグにより予測された。図８Ｂに示されている通り、試験した９２種のマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体のうち、１６種は、ヒトＢＭＰＲ１Ａと交差反応性がある。
【０４９３】
まとめると、これらのデータは、免疫特異的ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、本明細書における教示により、容易に生成されて、選択され、治療有効性のあるＡＤＣを得ることができることを示している。
【０４９４】
［実施例９］
ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の配列決定
実施例６において生成した抗ＢＭＰＲ１Ｂマウス抗体は、以下に記載されている通りに配列決定した。全ＲＮＡを、製造業者の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、選択されたハイブリドーマ細胞から精製した。試料あたり１０４〜１０５個の間の細胞を使用した。単離されたＲＮＡ試料を、使用するまで−８０℃において保存した。
【０４９５】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した８６のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む２つの５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組み合わせて使用して増幅させた。同様に、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した６４の５’Ｖκリーダー配列を含む２つのプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ＶＨ及びＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で４つのＲＴ−ＰＣＲ反応を各ハイブリドーマについて実施し、２つはＶκ軽鎖について、２つはＶＨ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、１．５μＬのＲＮＡ、０．４μＬの１００μＭの重鎖又はカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ並びに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する０．６μＬの酵素ミックスを含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で６０分、９５℃で１５分、続いて３５サイクル×（９４．５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
【０４９６】
抽出されたＰＣＲ産物を、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製及び配列決定サービスのための外部配列決定提供業者（ＭＣＬＡＢ）へと送付した。ヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを特定した。誘導した配列は、専売抗体配列データベースを使用してＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−及びＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
【０４９７】
図９Ａは、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体からのいくつかの新規なマウス軽鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を図示している一方、図９Ｂは、同じ抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体からの新規なマウス重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を図示している。まとめると、マウス軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２１〜５５の奇数番号で示されており、配列番号５３が保存されている。
【０４９８】
より詳細には、図９Ａ及び９Ｂは、配列番号２１のＶＬ及び配列番号２３のＶＨを有するＳＣ９１．１；配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨを有するＳＣ９１．３；配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨを有するＳＣ９１．９；配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨを有するＳＣ９１．１１；配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨを有するＳＣ９１．１４；配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨを有するＳＣ９１．１５；配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨを有するＳＣ９１．１９；配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨを有するＳＣ９１．１１１；配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨを有するＳＣ９１．１１９；配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨを有するＳＣ９１．１２９；配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨを有するＳＣ９１．１３８；配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨを有するＳＣ９１．１４６；配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨを有するＳＣ９１．１４９；配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨを有するＳＣ９１．１５５；配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨを有するＳＣ９１．１６０；配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨを有するＳＣ９１．１７２；配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨを有するＳＣ９１．１８７；配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨを有するＳＣ９１．２０；配列番号８９のＶＬ及び配列番号９３のＶＨを有するＳＣ９１．２７；並びに配列番号３７のＶＬ及び配列番号９５のＶＨを有するＳＣ９１．１８６と称する、いくつかのマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の注釈つきアミノ酸配列を提示している。ＳＣ９１．２０及びＳＣ９１．２７は、２つの固有の重鎖可変領域（配列番号９１及び９３）と対となる同じ軽鎖可変領域（すなわち、配列番号８９）を有することに留意されたい。同様に、ＳＣ９１．１８６は、ＳＣ９１．１４（配列番号３７）と同じ軽鎖を含むが、この抗体は、２つの固有の重鎖（配列番号３９及び９５）を含む。
【０４９９】
開示される抗体（又は、これらを生成するクローン）を、それぞれの可変領域核酸又はアミノ酸の配列番号（図９Ａ〜９Ｃを参照されたい）と一緒にまとめたものが、直下の表５に示されている。
【０５００】
【表５】
2019522960.tif 000038
【０５０１】
図９Ａ及び図９Ｂにおいて、ＶＬ及びＶＨアミノ酸配列に注釈をつけて、Ｋａｂａｔらに準拠して定義される、フレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び相補性決定領域（すなわち、図９Ａ中のＣＤＲＬ１〜ＣＤＲＬ３又は図９Ｂ中のＣＤＲＨ１〜ＣＤＲＨ３）を同定する。可変領域配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースの専売のバージョンを使用して解析し、ＣＤＲ及びＦＲの表示を得た。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従い定義されるが、当業者は、ＣＤＲ及びＦＲの表示はまた、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は他の任意の許容された命名法システムに従って定義され得ることを理解する。さらに、図９Ｃは、図９Ａ及び９Ｂに示されているアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２０〜９４、偶数）を提示している。
【０５０２】
図９Ａ及び９Ｂ、並びに表５において分かる通り、特定のマウス抗体のそれぞれに対する重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列の配列番号は、一般に、連続する奇数である。したがって、モノクローナル抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体であるＳＣ９１．１は、軽鎖及び重鎖可変領域についてそれぞれ、アミノ酸配列番号２１及び２３を含む。ＳＣ９１．３は、配列番号２５及び２７を含む。ＳＣ９１．９は配列番号２９及び３１を含むなどである。上記の通り、図９Ａ及び９Ｂに示されている、連続する番号付けに対する例外は、抗体ＳＣ９１．２０（配列番号８９及び９１）に見出されたものと同一の軽鎖可変領域を含むＳＣ９１．２７（配列番号８９及び９３）、及び抗体ＳＣ９１．１４（配列番号３７及び３９）において見出されたものと同一の軽鎖可変領域を含むＳＣ９１．１８６（配列番号３７及び９５）である。いずれの事象においても、マウス抗体アミノ酸配列（図９Ｃに示されている）をコードする対応するアミノ酸配列は、対応するアミノ酸の配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ９１．１抗体のＶＬ及びＶＨの核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０及び２２である。
【０５０３】
図９Ａ〜９Ｃ中の注釈つきの配列に加えて、図９Ｆ及び９Ｇは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法論を使用して決定した、ＳＣ９１．１及びＳＣ９１．９の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲ表示を提示している。図９Ｇ（ＳＣ９１．１）において、ＶＨ鎖の５５位のアスパラギンアミノ酸の上に、アスタリスクがあることに留意されたい。下記にさらに詳細に議論するように、この位置のアミノ酸はグルタミン（又は他の任意のアミノ酸）に変異して、さらなる分子安定性をもたらすことがある。
【０５０４】
図９Ｆ及び９Ｇに図示されているＣＤＲ表示を、上で議論されているＡｂｙｓｉｓデータベースの専売バージョンを使用して誘導されたことが理解される。本明細書に記載されている通り、当業者は、開示したマウスＣＤＲ（任意選択的に、選択した変異を含む）は、本発明に従って、ヒトフレームワーク配列にグラフト化されて、ＣＤＲグラフト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はヒト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を得ることができることを理解している。さらに、本開示を鑑みると、本明細書の教示に従って、作製及び配列決定された任意の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体のＣＤＲを容易に決定して、この誘導されたＣＤＲ配列を、本発明のＣＤＲグラフト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はヒト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を得るために使用することができると思われる。これは、図９Ａ〜９Ｂに示されている重鎖及び軽鎖可変領域配列を有する抗体に特に当てはまる。
【０５０５】
［実施例１０］
キメラ及びヒト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の生成
キメラ抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を、当該技術分野で認識されている技術を用いて以下のように生成した。
【０５０６】
全ＲＮＡをハイブリドーマ及び増幅したＰＣＲから抽出した。以下のマウス抗体：ＳＣ９１．１及びＳＣ９１．９のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントに関するデータは、対象とする核酸配列の解析から得た（核酸配列に関して、図９Ｃを参照されたい）。抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のフレームワーク配列に特異的なプライマーセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩを用いて消化した。
【０５０７】
ＶＨ及びＶＬ消化ＰＣＲ産物を精製し、ＩｇＨ又はＩｇκ発現ベクターにそれぞれライゲーションした。ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化及び精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物並びに２５ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ中で実施した。コンピテントのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物を用いて形質転換し、濃度１００μｇ／ｍＬでアンピシリンプレートの上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製及び消化後、ＶＨ断片を、ＨｕＩｇＧ１を含むｐＥＥ６．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、Ｈｕ−Ｋａｐｐａ軽鎖定常領域を含むｐＥＥ１２．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
【０５０８】
マウス重鎖及び軽鎖可変領域、並びにヒト定常領域全体を含むキメラ抗体を、トランスフェクト試薬としてヒトＩｇＧ１及びヒトカッパ発現ベクター及びＰＥＩとのＣＨＯ−Ｓ細胞の同時トランスフェクトによって発現させた。上清を、トランスフェクションから３から６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、タンパク質Ａビーズにより精製した。
【０５０９】
専売のコンピュータの支援によるＣＤＲグラフト化法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）及び以下の標準分子操作技術を使用して、マウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体をやはりＣＤＲグラフト化したか、又はヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列及びＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列及びＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔらの番号付けに従って行った。この点に関すると、図９Ｆ及び９Ｇは、マウス抗体ＳＣ９１．１及びＳＣ９１．９に対して、様々な解析スキームを使用して誘導した重鎖及び軽鎖ＣＤＲを示している。マウスＫａｂａｔ  ＣＤＲ及び選択したヒトフレームワークを含む可変領域が一旦、設計されると、これらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。次に、ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
【０５１０】
ヒト化抗体ｈＳＣ９１．１（配列番号１０１及び１０３）、ｈＳＣ９１．１（Ｎ５５Ｑ）（配列番号１０１及び１０５）、ｈＳＣ９１．１ｖ２（Ｎ５５Ｑ）（配列番号１０１及び１２７）及びｈＳＣ９１．９（配列番号１０７及び１０９）のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列が、図９Ｄに示されており、対応するマウス抗体のＶＬ及びＶＨから誘導される（例えば、ｈＳＣ９１．１はＳＣ９１．１から誘導される）。ヒト化ＶＬ及びＶＨの対応する核酸配列はまた、図９Ｄに示されている（配列番号１００〜１０８の偶数番号及び配列番号１２６）。以下の表６は、選択したフレームワークの変化を導入して、選択した抗体の有利な特性を維持していること、及び１つの変化がｈＳＣ９１．１重鎖のＣＤＲ２において発生したことを示している。
【０５１１】
より詳細には、ヒト化工程の間、ＳＣ９１．１のＣＤＲＨ２における予測されるグリコシル化部位は、最終のヒト化抗体の安定性及び均質性を向上させるために、アミノ酸置換Ｎ５５Ｑの使用により取り除いた。この置換は、ｈＳＣ９１．１由来抗体に含まれ、その部位は、図９Ｄにおいて下線が引かれている。他のヒト化構築物（以下により詳細に議論されている、ある特定の部位特異的構築物及びＭＪ変異体を含む）と同様に、これらの詳細が直下の表６に示されている。
【０５１２】
【表６】
2019522960.tif 000039
【０５１３】
次の実施例に示されている通り、表６はまた、本明細書に記載されている通りに作製した、例示的な部位特異的抗体（例えば、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１）の組成を示している。さらに、追加のＭＪ変異Ｎ２９７Ａを有するバリアントを構築して、ヒト化抗体の特性を改善した。
【０５１４】
より詳細には、実施例１１に示されている通り、部位特異的構築物を、図９Ｄに示されているヒト化ＶＬ及びＶＨ配列を使用して作製した。さらに、Ｎ２９７Ａ変異（ＥＵ番号付け）をヒト化抗体に導入して、Ｆｃ受容体への抗体の結合を低下させた。これは、標的外毒性の原因になると考えられる。表６に示されている通り、この修飾は、ｓｓ１又は野生型ヒトＩｇＧ１構築物のどちらかに導入することができた。この場合、Ｎ２９７Ａ修飾は、接尾語ＭＪ（すなわち、ｈＳＣ９１．１ＭＪ及びｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ）により示されている、野生型ｈＳＣ９１．１及び部位特異的ｈＳＣ９１．１ｓｓ１抗体に導入した。同様に、ＭＪ変異をｈＳＣ９１．９ＭＪ抗体及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１抗体に導入して、ｈＳＣ９１．９ＭＪ抗体及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ抗体を得た。各場合において、重鎖を発現するためのプラスミド上において、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して変異を導入し、上記と同じ方法を使用して、抗体を発現させて精製した。
【０５１５】
前述の構築物の他に、キメラＮ５５Ｑ重鎖及びヒト化軽鎖を含むキメラヒト化ＳＣ９１．１抗体を合成した。このハイブリッド抗体（ｈＳＣ９１．１ｖ２）は、Ｎ５５Ｑ変異（図９Ｄに示されている配列番号１２７中に下線が引かれている）を含むマウスＳＣ９１．１  ＶＨ（配列番号２３）を取り込んで、ＣＤＲＨ２における潜在的なグリコシル化部位を除去する。次に、このＮ５５ＱマウスＶＨ領域を、Ｃ２２０Ｓ変異（ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１をもたらす）を含むヒトＩｇＧ１定常領域、並びにＣ２２０Ｓ変異及びＮ２９７Ａ変異（ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１ＭＪをもたらす）を含むヒトＩｇＧ１定常領域と作動可能に結合させた（実施例１１を参照されたい）。各実施形態において、選択された重鎖構築物を標準ｈＳＣ９１．１軽鎖（配列番号１１０）と対にして、無傷抗体を得た。潜在的グリコシル化部位の除去を試験するために使用した、このキメラ構築物は、試験時に完全ヒト化ｈＳＣ９１．１構築物とかなり匹敵することが分かった（データ示さず）。重鎖可変領域ヒトフレームワークが欠如しているにもかかわらず、マウスＳＣ９１．１  Ｎ５５Ｑ  ＶＨ領域のアミノ酸及び核酸配列が、図９Ｄ及び９Ｅに含まれたことに留意されたい。
【０５１６】
ヒト化ＶＨ及びＶＬアミノ酸並びに核酸配列（図９Ｄ）に加えて、図９Ｅは、表６に示されている例示的なヒト化抗体構築物の完全長重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を提示している。ヒト化構築物のそれぞれに結合した核酸及びアミノ酸配列のまとめが、直下の表７に提示されている。いくつかの構築物は、同一のＶＬ、ＶＨ又は完全長配列を異なる配列で使用することに留意されたい。
【０５１７】
【表７】
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【０５１８】
この実施例に示されている例示的なヒト化抗体は、臨床的に適合可能な抗体が、本明細書において開示されている通りに生成されて、誘導され得ることを実証している。本発明のある特定の態様において、このような抗体がＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣに組み込まれて、好都合な治療指数を含む組成物を実現することができる。さらに、以下の実施例に議論されている通り、表７はまた、本明細書に記載されている通りに作製した、選択された部位特異的抗体（ｈＳＣ９１．１ｓｓ１）及び選択された部位特異的ＭＪ抗体（ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ）の配列組成を示している。
【０５１９】
［実施例１１］
部位特異的ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の生成
天然のヒト化ＩｇＧ１に加えて、不対システインをもたらすように変異されている天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域及び重鎖（ＨＣ）定常領域を含む、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（ｈＳＣ９１．１及びｈＳＣ９１．９）を操作したヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＢＭＰＲ１Ｂ部位特異的抗体も構築した。この点において、ＨＣの上部ヒンジ領域中のシステイン２２０（Ｃ２２０）を、セリン（Ｃ２２０Ｓ）により置換して、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ、ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１、ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１ＭＪ及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪを得た。組み立て時に、ＨＣ及びＬＣは、治療剤にコンジュゲートするのに好適な、軽鎖定常領域のｃ末端に２つの遊離システインを含む抗体を形成させる。特に明記しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらにおいて示されているＥＵ番号付けスキームに従う。最後に、これまでの実施例において記載されている通り、ある特定の部位特異的抗体の重鎖定常領域をさらに操作して、Ｎ２９７Ａ変異を取り込ませ、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪを得た。
【０５２０】
天然のヒト化ＩｇＧ１抗体及び部位特異的構築物を生成するため、ＨＣ定常領域（例えば、配列番号２）又はこのＣ２２０Ｓ変異（例えば、配列番号３）を含有する発現ベクターに、ＶＨ核酸をクローニングした。天然のｈＳＣ９１．１  ＨＣ（図９Ｅ、配列番号１１１）、ｈＳＣ９１．１の変異体Ｃ２２０Ｓ  ＨＣ（図９Ｅ、配列番号１１５）、又はＣ２２０Ｓ  Ｎ２９７Ａ変異体ＨＣ（図９Ｅ、配列番号１１７）をコードするベクターに、野生型ＩｇＧ１カッパＬＣ（配列番号５）と作動可能に結合する選択されたＶＬ（ｈＳＣ９１．１、配列番号１００）をコードするベクターを、ＣＨＯ−Ｓ細胞中で、同時トランスフェクトしてｈＳＣ９１．１  ＬＣ（配列番号１１０）を得て、哺乳動物の一過性発現システムを使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体ＨＣを含む、得られた抗ＢＭＰＲ１Ｂ部位特異的抗体は、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１と呼ばれる一方、天然型は、ｈＳＣ９１．１、及びＮ２９７Ａ変異ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪを含む部位特異的構築物と呼ばれる。この点に関すると、完全長ｈＳＣ９１．１部位特異的抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が図９Ｅ（天然ヒト化抗体ｈＳＣ９１．１及びＮ２９７Ａアナログと共に）に示されており、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１は、それぞれ配列番号１１０及び１１５のＬＣ及びＨＣを含み、ｈＳＣ９１．１は、配列番号１１０及び１１１のＬＣ及びＨＣを含み、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪは、それぞれ配列番号１１０及び１１７のＬＣ及びＨＣを含む。ＭＪ及びｓｓ１変異を含むｈＳＣ９１．１重鎖は、配列番号１１３、１１５及び１１７に示されているＮ５５Ｑ変異をさらに含む。いずれの事象においても、適切な配列を使用し、実質的に同じ工程を使用して表７に示されている、ｈＳＣ９１．９アナログを得た。一式の分子の両方に関して、重鎖上の部位特異的変異、ＭＪ変異及びＮ５５Ｑ変異の位置が、図９Ｅにおいて、下線が引かれている。
【０５２１】
改変抗ＢＭＰＲ１Ｂ部位特異的抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付け、正確な変異体が生成されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在及び不在下で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液で染色した（データ示さず）。還元条件下、遊離ＬＣ及び遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下、バンドパターンは、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示す天然ＩｇＧ分子とは異なる。ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドが観察された。さらに、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの顕著なバンドが観察された。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各ＬＣ上のＣ末端における遊離システインにより予測される。
【０５２２】
［実施例１２］
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体−薬物コンジュゲートの調製
抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、さらなるインビトロ及びインビボ試験を行うために、本明細書における教示に従って調製した。
【０５２３】
この目的のため、ＰＢＤ薬物リンカーを含む、選択された薬物リンカー候補をスクリーニングし、どの細胞傷害性ペイロードが開示組成物における使用に特に好適となり得るかを決定した。最初のインビトロスクリーニングプログラムの後に、さらなる分析用にＰＢＤ１及びＰＢＤ３を含むペイロードを選択した。この分析を行うため、ＰＢＤペイロードを、ルミナルＢ腫瘍を含めた、目的とするある特定の腫瘍に高度に発現することが知られている抗原であるＣＤ４６に結合する、試験抗体（ｈＮ１４９）にコンジュゲートした。このコンジュゲーションは、以下に説明されている通りに実質的に行い、得られたＡＤＣ（ｈＮ１４９．ｓｓ１．ＰＢＤ１及びｈＮ１４９．ｓｓ１．ＰＢＤ３）を、インビトロでの細胞殺傷アッセイにおいて試験した。
【０５２４】
より詳細には、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｆａｌｃｏｎ組織培養プレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり２５，０００個の細胞でルミナルＢ  ＰＤＸ株の単一細胞懸濁液であるＢＲ１６３をプレート培養した。１日後、様々な濃度の精製したｈｕＮ１４９  ＡＤＣ、又はＰＢＤ１若しくはＰＢＤ３にコンジュゲートされているヒトＩｇＧ１対照抗体を培養物に加えた。この細胞を、１週間、インキュベートした。インキュベート後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。未処理細胞を含有する培養物を使用した未処理の蛍光計数物を１００％参照値として設定し、全ての他の計数物を参照値の百分率として算出した。アッセイの結果より、ｈＮ１４９試験抗体にコンジュゲートすると、ＰＢＤ１及びＰＢＤ３のどちらも内在化し、ＢＲ１６３細胞を殺傷することが実証される（データ示さず）。アッセイの結果に基づいて、ＰＢＤ３弾頭をさらなる検討のために選択した。
【０５２５】
この点において、実施例１０及び１１からの選択されたヒト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（天然の部位特異的、及び部位特異的Ｎ２９７Ａ）を、遊離スルフィドリル基を有する末端マレイミド部分を介して、ピロロベンゾジアゼピン細胞毒（ＰＢＤ３）にコンジュゲートし、例示的な抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製した。
【０５２６】
天然の抗体抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを、以下のように調製した。抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体のシステイン結合を、抗体１ｍｏｌあたりトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）の所定のモル数の添加により、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、室温で９０分間、部分的に還元した。次いで、得られた部分還元調製物を、室温において最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ３にコンジュゲートした（ＰＢＤ３の構造は、本明細書の上記に提示されている）。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを６．０に調整した。ＡＤＣの調製は、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで、ダイアフィルトレーションした抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。得られた抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、タンパク質濃度（ＵＶ測定により）、凝集（ＳＥＣ）、薬物対抗体比（ＤＡＲ）（逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により）及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
【０５２７】
部位特異的ヒト化抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ（Ｎ２９７変異を有する及び有していない、例えば、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１及びｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ）を、改良部分還元プロセスを使用してコンジュゲートした。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（Ｃ２１４）上に最大限、コンジュゲートされており、２となる薬物ローディング量を有するＡＤＣを最大化すると同時に、２超となる薬物ローディング量を有するＡＤＣを最小限にするＡＤＣである。コンジュゲーションの特異性をさらに改善するため、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）及び穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して抗体を選択的に還元し、この後、リンカー薬物を用いてコンジュゲーションを行い、次いで、ダイアフィルトレーション及び製剤化工程を行った。
【０５２８】
より詳細には、各抗体の調製は、所定濃度の還元済みグルタチオン（ＧＳＨ）を含む、ｐＨ８．０の１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファー中、室温で最低２時間、選択的に還元した。次いで、全ての調製物を、３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０のバッファーへとバッファー交換し、還元バッファーを除去した。次いで、得られた部分的還元調製物を、室温において最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ３にコンジュゲートした。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮＡＣを添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを６．０に調整した。ＡＤＣの調製物は、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで、ダイアフィルトレーションした抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。
【０５２９】
得られた抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、タンパク質濃度（ＵＶ測定により）、凝集（ＳＥＣ）、薬物対抗体比（ＤＡＲ）（逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により）及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。次に、これらを凍結して、使用するまで保管した。
【０５３０】
［実施例１３］
腫瘍中のＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現
実施例１〜３に記載されている様々な腫瘍と会合するＢＭＰＲ１Ｂ  ｍＲＮＡの転写産物レベルが向上したことを考慮して、ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現もまた、ＰＤＸ腫瘍において向上するかどうかを試験する検討を行った。ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現を検出して定量するため、ＭＳＤディスカバリープラットフォーム（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用する、エレクトロルミネッセンスＢＭＰＲ１ＢサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを開発した。
【０５３１】
ＰＤＸ腫瘍をマウスから切除し、ドライアイス／エタノール上で急速冷凍した。解凍した腫瘍片にタンパク質抽出用バッファー（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を加えて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して微粉砕した。溶解物を遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間、４℃）により清澄化し、各溶解物中の全タンパク質濃度を、ビシンコニン酸を使用して定量した。次に、このタンパク質溶解物を５ｍｇ／ｍＬに正規化し、使用するまで−８０℃において保管した。正常組織は、市販供給元から購入した。
【０５３２】
ＭＳＤアッセイにおいて使用したＥＬＩＳＡサンドイッチ抗体のペアは、捕捉用のＳＣ９１．９及び検出用のＳＣ９１．４６からなった。溶解試料に由来するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質濃度は、上の実施例５に記載されている通り生成した、精製済み組換えｈＢＭＰＲ１Ｂ−ＨＩＳタンパク質を使用して生成した標準タンパク質濃度曲線からの値を内挿することにより決定した。ＢＭＰＲ１Ｂタンパク質標準曲線及びタンパク質定量アッセイを、以下のように行った：
ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬの捕捉抗体ＳＣ９１．９を１５μＬ用いて、ＭＳＤ標準プレートを４℃で一晩、被覆した。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、震とうしながら、３５μＬのＭＳＤ３％ブロッカーＡ溶液中で、１時間、ブロックした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再び洗浄した。１０％タンパク質抽出用バッファーを含有する、ＭＳＤ  １％ブロッカーＡ中の１０×希釈溶解物（又は、段階的に希釈した組換えＢＭＰＲ１Ｂ標準品）１０μＬもウェルに加え、震とうしながら、２時間、インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴ中で再び洗浄した。次に、製造業者のプロトコルに従って、ＭＳＤ（登録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ  ＮＨＳエステルを使用して、ＳＣ９１．４６検出抗体にスルホタグ付けした。洗浄済みプレートに、タグ付けしたＳＣ９１．４６抗体１０μＬを、震とうしながら、ＭＳＤ  １％ブロッカーＡ中、０．５μｇ／ｍＬで、室温で、１時間、加えた。プレートを、ＰＢＳＴ中で洗浄した。界面活性剤を含むＭＳＤ読取り用バッファーＴを水に１Ｘまで希釈し、３５μＬを各ウェルに加えた。標準曲線からの内挿により、ＰＤＸ試料中のＢＭＰＲ１Ｂ濃度を導く、統合ソフトウェア解析プログラムを使用して、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ２４００で読み取った。次に、値を全タンパク質濃度により除算し、全溶解タンパク質１ミリグラムあたりのＢＭＰＲ１Ｂのナノグラム数を得た。
【０５３３】
得られた濃度は図１０に示されており、各点は、単一ＰＤＸ腫瘍株に由来するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質濃度を表している。各点は、単一ＰＤＸ株に由来しているが、大部分の場合、複数の生物学的試料を同一ＰＤＸ株から試験して、値を平均し、データ点を得た。
【０５３４】
図１０は、ＢＲ腫瘍試料の代表的な試料は、高いＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現、特に、ルミナルＢサブタイプを示したことを示している。発現はまた、ＬＵ−ＡＤ／ＳＣＣ及びＯＶ試料のサブセットにも見られた。各試料に関するＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現のレベルは、全タンパク質ｎｇ／ｍｇで与えられており、各腫瘍タイプについて誘導されたメジアンを、水平の棒により示している。試験した正常組織としては、副腎、動脈、結腸、食道、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、末梢神経及び座骨神経、膵臓、筋骨格、皮膚、小腸、脾臓、胃、気管、赤血球及び白血球及び血小板、膀胱、脳、乳房、眼、リンパ節、卵巣、下垂体、前立腺及び脊髄が挙げられる。正常組織（前立腺）の１つしか、アッセイの定量限界値を超えるレベルで検出されなかった。上で説明されているＢＭＰＲ１Ｂ発現に関する、ｍＲＮＡ転写データと合わせると、これらのデータは、ＢＭＰＲ１Ｂが、抗体をベースとする治療的介入にとって魅力的な標的になるという主張を強化するものである。
【０５３５】
［実施例１４］
腫瘍中のＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現の免疫組織化学
免疫組織化学（ＩＨＣ）を、ＰＤＸ腫瘍及び一次ヒト腫瘍組織切片に実施し、腫瘍細胞におけるＢＭＰＲ１Ｂの発現及び位置を評価した。ＩＨＣ適合抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を特定するために、いくつかの例示的な抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を使用して、ＩＨＣをＨＥＫ２９３Ｔ親細胞ペレット又はＢＭＰＲ１Ｂを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞ペレットに実施した。
【０５３６】
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体ＳＣ９１．１５及びＳＣ９１．２７は、試験した本発明の他の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体よりも効果的にＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞ペレットを特異的に検出することができた（データ示さず）。これらの抗体がＢＭＰＲ１Ｂを特異的に検出する能力は、競合実験により確認され、この実験において、関連抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を、５×モル比過剰のｈＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃ又は無関係のタンパク質（ＳＣＲｘ９１−Ｆｃ）と混合し、次に、ＢＭＰＲ１Ｂを発現するＨＥＫ２９３Ｔとインキュベートし、ホルマリンにより固定化し、切片をパラフィンにより埋包（ＦＦＰＦ）した。陽性染色がないことから、ｈＢＭＰＲ１Ｂ−Ｆｃタンパク質は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体がＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合するのを妨害したことが実証された（データ示さず）。
【０５３７】
操作した２９３細胞に加えて、以下に記載した通り、当該技術分野における標準と同様に、ホルマリン固定して、パラフィンに埋包した（ＦＦＰＥ）組織（例えば、腫瘍試料）にＩＨＣを行った。組織の平面切片を切り出し、顕微鏡のガラス製スライド上に載せた。キシレンにより脱パラフィン化した後、５μｍの切片を抗原賦活溶液（Ｄａｋｏ）により、９９℃で２０分間、予備処理し、７５℃まで冷却して、次に、ＰＢＳ中の０．３％過酸化水素、次いでアジビン／ビオチンブロッキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により処理した。次に、ＦＦＰＥスライドを、ＰＢＳバッファー中の３％ＢＳＡ中の１０％ウマ血清により３０分間ブロックし、次に、本発明の一次抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体によりインキュベートし、室温で３０分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌまで希釈した。ＦＦＰＥスライドは、ビオチン−コンジュゲート化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、室温で３０分間、２．５μｇ／ｍｌまで希釈し、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。発色性検出を３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、室温で５分間、展開し、組織をマイヤーヘマトキシリン（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ）により対比染色し、アルコールにより洗浄して、キシレン中に浸漬した。次に、切片を明視野顕微鏡法により観察した。
【０５３８】
発現は、以下の式を使用して、腫瘍細胞の膜染色に関して算出するＨ−スコアアルゴリズムを使用して点数化した；Ｈスコア＝（０の染色強度が％）＊０＋（１＋の染色強度％）＊１＋（２＋の染色強度％）＊２＋（３＋の染色強度％）＊３。したがって、このスコアは、０〜３００の範囲にわたる連続変数を生成する。ＩＨＣ発現はまた、１（最低）〜３＋（最高）の範囲にある任意の強度で標的を発現する細胞全てを考慮に入れて、％正の細胞で点数化される。
【０５３９】
ＩＨＣ試験の結果が、図１１Ａ〜１１Ｇに提示されており、図１１Ａは、いくつかのＢＲ−ＬＵＭＢ  ＰＤＸ株に関する割合及びＨスコアの染色値を示している。より詳細には、図１１Ａは、１３種のＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ株において、ＢＭＰＲ１Ｂの発現をまとめたものであり、ＢＭＰＲ１Ｂは、試験したＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ株の６９％にタンパク質発現を有することが示された。
【０５４０】
図１１Ｂ及び１１Ｃは、Ｈスコア（図１１Ｂ）として、及び正の細胞の割合（図１１Ｃ）として、ヒトルミナル乳房腫瘍マイクロアレイ試料に対するＢＭＰＲ１Ｂの発現をまとめたものである。試料の３３％は、５０より高いＨスコアを有しており、試料の４０％は、任意の強度において、正の百分率の細胞となることを示している。
【０５４１】
図１１Ｄ及び１１Ｅは、Ｈスコア（図１１Ｄ）として、及び正の細胞の割合（図１１Ｅ）として、原発性ルミナル乳がん組織の全切片に対するＢＭＰＲ１Ｂの発現をまとめたものである。試料の４０％は、５０より高いＨスコアを示し、試料の５０％は、任意の強度において、正の百分率の細胞を有する。
【０５４２】
図１１Ｆ及び１１Ｇは、Ｈスコア（図１１Ｆ）として、及び正の細胞の割合（図１１Ｇ）として、ヒト前立腺腺癌試料に対するＢＭＰＲ１Ｂの発現をまとめたものである。試料の２５％は、５０より高いＨスコアを有しており、試料の４０％は、任意の強度において、正の百分率の細胞となることを示している。
【０５４３】
ＢＭＰＲ１Ｂ抗原の比較的高い発現レベルであることにより、本明細書において示されているこれまでの実施例の結果は、治療標的として、ＢＭＰＲ１Ｂの適用可能性をさらに実証することが確認される。
【０５４４】
［実施例１５］
腫瘍中のＢＭＰＲ１Ｂタンパク質発現のフローサイトメトリー検出
フローサイトメトリーを使用して、本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍細胞株の表面上のヒトＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の存在を特異的に検出する能力を評価した。ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍を採取し、当該技術分野で認識されている酵素組織消化技術を使用して切り離し、ＰＤＸ腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を得た（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４２４を参照）。死滅細胞を検出するため、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、マウス細胞を特定するため抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体、及びヒト癌細胞を特定するため、抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体と共に、ＰＤＸ腫瘍単一細胞懸濁液をインキュベートした。得られた単一細胞懸濁液は、ＮＴＧ細胞とＣＳＣの両方を含む、腫瘍細胞のバルク試料を含んだ。上で示した通りに生成した抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体であるＳＣ９１．３を用い、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータを使用して、フローサイトメトリーによって、バルク腫瘍細胞のｈＢＭＰＲ１Ｂ発現を解析した。
【０５４５】
図１２は、抗ｈＢＭＰＲ１Ｂ抗体ＳＣ９１．３が、バルクルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍細胞の表面にｈＢＭＰＲ１Ｂの発現を検出したことを示している。ＢＲ１５４を除く全ての試料において、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体（黒色線）は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（灰色）と比較して、ＢＭＰＲ１Ｂ発現量の増加を検出した。これは、ＢＭＰＲ１Ｂが、いくつかのルミナルＢ腫瘍上で発現されることを実証する。さらに、発現は、アイソタイプ対照抗体により染色された同一細胞と比較した、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体により染色された腫瘍細胞の表面に観察される、幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として定量することができる。解析された腫瘍細胞株のそれぞれに対するΔＭＦＩをまとめた表が、図１２における挿入図として示されている。
【０５４６】
このデータは、図１１ＡにおけるＩＨＣの結果を確認するものであり、この場合、ＢＲ１５４を除くルミナルＢ  ＰＤＸ株はやはり、ＩＨＣによって陽性染色されたことを示している。ＢＲ１５４は、フローサイトメトリーによりｈＢＭＰＲ１Ｂの発現を示さず、このことは、上の実施例１〜３に提示されている低いＲＮＡ発現データに基づくと予測されることであり、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の結合の特異性をさらに実証するものである。まとめると、このデータは、ルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍細胞のＢＭＰＲ１Ｂは、高い割合で発現し、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートによる標的治療に対する実現可能な候補となることを示唆している。
【０５４７】
［実施例１６］
がん幹細胞集団におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現の強化
腫瘍細胞は、２つのタイプの細胞小集団：非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）及び腫瘍開始細胞又は腫瘍形成性細胞に大きく分類することができる。腫瘍形成性細胞は、免疫無防備状態マウスに移植すると、腫瘍を形成する能力を有している一方、非腫瘍形成性細胞は腫瘍を形成しない。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、既に暗示した通り、腫瘍形成性細胞のサブセットであり、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。
【０５４８】
腫瘍におけるＢＭＰＲ１Ｂ発現が、腫瘍形成性の向上と相関し得るかどうかを決定するため、以下の検討を行った。ヒトルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍試料を、免疫無防備状態マウスにおいて成長させて、腫瘍が８００〜２，０００ｍｍ３に到達した後、切除した。腫瘍を切り離して、当該技術分野で認識されている酵素消化技術を使用して単一細胞懸濁液に入れた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照されたい）。ヒト腫瘍細胞とマウス細胞との間を区別するため、ヒトルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍細胞をマウス抗ＣＤ４５又は抗Ｈ２ｋＤ抗体により染色し、ヒト腫瘍細胞とマウス細胞を区別した。腫瘍はまた、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体により染色し、次に、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した。ヒトルミナルＢ  ＰＤＸ腫瘍細胞を分離して、ＢＭＰＲ１Ｂを発現する細胞集団（ＢＭＰＲ１Ｂ−ポジティブ）、及び並列のアイソタイプ染色済み対照試料により定義されている、ＢＭＰＲ１Ｂを発現しない細胞集団（ＢＭＰＲ１Ｂ−ｎｅｇ）に入れた。５匹の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫無防備状態マウスに、５００個のＢＭＰＲ１Ｂ−ポジティブルミナルＢ腫瘍細胞を皮下注射し、５匹のマウスに、５００個のＢＭＰＲ１Ｂ−ｎｅｇルミナルＢ腫瘍細胞を注射した。腫瘍体積を５カ月間、毎週、測定した。
【０５４９】
これらの条件下、ＭＰＲ１Ｂポジティブ腫瘍細胞は、腫瘍をインビボで機能的かつ一貫して再構成することができる一方、ＢＭＰＲ１Ｂネガティブ集団は、５つの移植腫瘍のうちの１つにしか起こらなかった。より重要なことに、図１３に示されている通り、ＢＭＰＲ１Ｂ−ｎｅｇ由来の腫瘍は、５カ月間のインキュベート時間、静的状態のままであった一方、ＢＭＰＲ１Ｂ−ポジティブ由来腫瘍は、連続的に成長し、体積が実質的に増加した。これは、ＢＭＰＲ１Ｂを発現する腫瘍細胞が、ＢＭＰＲ１Ｂを発現しなかった腫瘍細胞よりもかなり腫瘍形成性であることを示しており、このことは、ＢＭＰＲ１Ｂ決定因子を使用して、ヒト腫瘍内の腫瘍形成性小集団を規定することができることを強く支持する。ひいては、この知見は、選択された抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞小集団を標的とするために使用することができ、有意な腫瘍退縮、及び腫瘍再発又は転移の防止をもたらすという概念を支持する。
【０５５０】
［実施例１７］
ＢＭＰＲ１Ｂ発現状態及び体細胞変異
乳房ルミナルＢ（ＢＲ−ＬｕｍＢ）患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）株における、様々な関連遺伝子の変異状態は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の標的化再配列決定を行うことにより決定され得る。驚くべきことに、これらの遺伝子のうちの少なくとも一部における変異は、腫瘍形成性細胞に対するｈＢＭＰＲ１Ｂタンパク質の発現に相関し得、したがって、患者選択用のサロゲートマーカーとして使用され得ることが見出された。
【０５５１】
例示的な実施形態において、ｇＤＮＡの標的化再配列決定は、各ＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ細胞株に由来するｇＤＮＡを使用して行われ、Ｉｏｎ  ＡｍｐｌｉＳｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ２．０、及び複数の遺伝子のコード領域及び非コード領域に及ぶ、最大２５０ｂｐからなる３０００を超えるアンプリコンを包含するＡｍｐｌｉＳｅｑプライマーのカスタムパネル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりライブラリを生成することができる。各試料をＩｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にライゲーションし、各配列決定を実行するための複数の試料をプールすることが可能となり得る。次に、配列決定をＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ機器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して行い、データ解析を行い、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ転写及びタンパク質レベルにおける変化をもたらす、ＢＲ−ＬｕｍＢ関連遺伝子の配列の変形を特定することができる。上で示唆されている通り、ある特定のＢＲ−ＬｕｍＢ関連遺伝子の変異状態をサロゲートバイオマーカーとして使用して、腫瘍細胞がＢＭＰＲ１Ｂを発現する可能性があるか、及び本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣにより処置可能であるかどうかを決定することができる。他の実施形態において、ＢＲ−ＬｕｍＢ関連遺伝子の変異状態を使用して、遺伝的変異と本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体又はＡＤＣによる処置に対する応答との間に相関があるかどうかを判定することができる。さらなる実施形態において、ＢＲ−ＬｕｍＢ関連遺伝子の変異状態を使用して、有効な併用療法となるかを判定することができる。
【０５５２】
目的とする遺伝子に関すると、ＴＰ５３変異状態は、ホルモンポジティブ乳がんにおいて十分に説明されており、ＴＰ５３における変異の不活性化は、疾患進行と相関する（Ｂａｎｅｒｊｉら、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２７２２２０２）。ＢＭＰＲ１Ｂの発現と相関し得るＴＰ５３における変異の重要性を決定するため、ＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ腫瘍を、上記のＩｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ及びＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ技術を使用して、主要ながんドライバー遺伝子の標的化再配列決定について評価した。ＢＭＰＲ１Ｂの発現が高い及び低いＢＲ−ＬｕｍＢ腫瘍をマイクロアレイにより決定して、変異データをＢＭＰＲ１Ｂ発現と相関付けるために使用した。ＴＰ５３における変異は、コドンのミスセンス非同義挿入又は欠失、アンプリコン欠失又はアンプリコン増幅、ナンセンス非同義フレームシフト、及び配列決定した遺伝子のスプライス部位バリアントの改変に至らしめる変異を含めた、配列決定した遺伝子のタンパク質コード領域に発生する任意の非同義改変により定義する。本明細書における教示と共に使用することができる選択されたＴＰ５３変異は、直下の表８中に示されている。
【０５５３】
【表８】
2019522960.tif 000041
【０５５４】
本発明により、表８に示されている（野生型［ＷＴ］株と共に）ＴＰ５３変異を有するＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ腫瘍を、ＢＭＰＲ１Ｂ発現について解析した。精査すると、ＴＰ５３における変異を含むＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ腫瘍株は、ウェルチのＴ検定によって決定される通り、野生型ＰＤＸ腫瘍と比べると、マイクロアレイ及びＭＳＤデータセットにおいて、ＢＭＰＲ１Ｂの発現が一層高いことを明らかに実証しているが、その差異は有意ではなかった（図１４Ａ及び１４Ｂ）。ＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸデータセットにおいて観察された有意性の欠如は、試料サイズが小さいことによる可能性がある。いずれの事象においても、これらのデータは、ＴＰ５３において検出された非同義の変異が、ＢＭＰＲ１Ｂの発現又は発現がないことと相関し得ることを示唆している。したがって、患者集団におけるＢＭＰＲ１Ｂの発現を予測し、腫瘍のこれらのサブセットに対する処置を一層正確に導くためのバイオマーカーとして、このような変異は有用であり得る。
【０５５５】
［実施例１８］
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートは、細胞毒性剤のインビトロでの送達を促進する
本発明の抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣが、生存腫瘍細胞に細胞毒性剤の送達を媒介するために内在化することができるかどうかを判定するため、上の実施例１２に記載されている通りに生成した、抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３（配列番号１１０及び１１７）及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３（配列番号１２０及び１２５）を使用して、インビトロでの、細胞殺傷アッセイを行った。
【０５５６】
ｈＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はナイーブなＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり５００個の細胞で蒔いた。１日後、様々な濃度の精製したＡＤＣ、又はＰＢＤ３にコンジュゲートされているヒトＩｇＧ１対照抗体を培養物に加えた。細胞を、９６時間、インキュベートした。インキュベート後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生存細胞を数えた。未処置細胞を含有する培養物を使用して、生の発光カウントを１００％参照値として設定し、全ての他の計数物を参照値の割合として算出した。図１５は、ｈＢＭＰＲ１Ｂを発現する、処置したＨＥＫ２９３細胞が全て、抗ＢＭＰＲ１Ｂに感受性があったことを示している。さらに、ＡＤＣは、ＢＭＰＲ１Ｂを過剰表現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に比べて、ＢＭＰＲ１Ｂを過剰発現しなかったナイーブなＨＥＫ２９３Ｔ細胞に及ぼす影響はほとんどなく、ＡＤＣのＢＭＰＲ１Ｂ抗原への特異性が実証された（図１５）。
【０５５７】
上の結果は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、ＢＭＰＲ１Ｂを発現する細胞に特異的に内在化して、この細胞に細胞傷害性ペイロードを送達する能力があることを実証している。
【０５５８】
［実施例１９］
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体薬物コンジュゲートは腫瘍成長をインビボで抑制する
例えば、上の実施例１２において記載されている通りに生成した抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣを、以下に実質的に示されている通り、当該技術分野で認識されている技術を使用して試験し、免疫不全マウスにおけるヒトルミナルＢ乳がん（ＢＲ−ＬｕｍＢ）の腫瘍成長を抑制する能力があることを実証する。
【０５５９】
当該技術分野で認識されている技術を使用して、ＢＭＰＲ１Ｂを発現したＰＤＸ腫瘍株（例えば、ＢＲ−ＬｕｍＢ  ＰＤＸ腫瘍株）（ＢＲ１５９、ＢＲ１６２、及びＢＲ１６４）、及びＢＭＰＲ１Ｂを発現しなかった対照腫瘍株を、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹の皮下において成長させる。腫瘍体積及びマウス重量を１週あたり１回又は２回、監視した。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ３に達すると、マウスを無作為に処置群に割り当てて、単回用量の０．１ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３若しくは０．２ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３（図１６Ａ及び１６Ｂ）、又は単回用量の０．２ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３若しくは０．２ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３（図１７Ａ及び１７Ｂ）を、単回用量の０．２ｍｇ／ｋｇの抗ハプテン対照ヒトＩｇＧ  ＡＤＣ又は例えば０．９％生理食塩水のようなビヒクル対照と共に、静脈内注射した。処置後、腫瘍が８００ｍｍ３を超える、又はマウスが健康を害するまで、腫瘍体積及びマウス重量を監視した。
【０５６０】
図１６Ａ、１６Ｂ、１７Ａ及び１７Ｂに示されている通り、開示したＢＭＰＲ１Ｂ  ＰＢＤ３  ＡＤＣは、ＢＭＰＲ１Ｂ発現を示すルミナルＢ乳房腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍成長を実質的に阻害又は抑制する。この点において、例示的なＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ  ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３及びｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３によるＢＲ１６４の処置により、腫瘍収縮は１４０日間、続いた（図１６Ａ）。同様に、それぞれがＰＢＤ３にコンジュゲートされている、例示的な抗体ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１、ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１ＭＪ、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪによる様々なルミナルＢ乳房腫瘍であるＢＲ１５９の処置は、腫瘍抑制が長期間、継続した。ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３とｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３のどちらも、腫瘍成長が再開するまで、１００日間程度、応答した（図１６Ｂ）。同様の結果が、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３及びｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３を使用すると観察され、この場合、少なくとも６０日間程度の腫瘍抑制が観察された（図１７Ａ）。様々なルミナルＢ乳房腫瘍（ＢＲ１６２）を用いたさらに別の実施例において、ｈＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３とｈＳＣ９１．９ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３のどちらも、腫瘍の再成長がほとんど又は全く伴わないで、少なくとも６０日間の程度、継続する結果をもたらした。図１７Ａ及び１７Ｂにおいて示されている検討は、出願時点において進行中であったことに留意されたい。
【０５６１】
一次腫瘍成長の抑制に加え、例示的なＡＤＣ  ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３は、処置後の早くも１週間で、末梢腫瘍負荷をかなり低下させる能力があることを実証した（図１６Ｃ）。末梢の腫瘍負荷のこの低下は、上において言及した検討における、処置対象から得られたマウス血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルの実質的な低下により証拠付けられる。手短に言えば、処置の１週間後にマウスから血液を採取し、製造業者の指示に従って、Ｃｙｔｅｆｉｎｄｅｒ機器（Ｒａｒｅｃｙｔｅ、Ｉｎｃ）を使用してＣＴＣを求めた。対照的に、図１６Ｃにより、ビヒクル対照により処置されたルミナル腫瘍を有するマウスは、循環腫瘍細胞のレベルが比較的高いことを継続して示すことが示されている。これらの観察は、原発性腫瘍の処置に加え、腫瘍が再発及び転移する機会を低減するために、開示されるＡＤＣを有効に使用することができることを示している。
【０５６２】
ルミナルＢ腫瘍を有するマウスにおいて、肺転移を使用して、末梢又は遠位腫瘍負荷をやはり正確に測定することができる。血液をマウスから採取すると同時に、肺組織も得て、標準免疫組織化学技術を使用して染色した。次に、熟練病理学者により肺組織試料を分析し、マウスあたりの、肺間葉上皮移行（ｍｅｔ）コロニーを計数した。生成したデータを精査すると、ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３による処置により、肺転移が完全に解消された（少なくとも、検討において観察可能な程度に）一方、ヒトＩｇＧ  ＡＤＣ対象処置ルミナルＢ腫瘍は依然として、測定可能な肺転移を有することが示された（図１６Ｄ）。図１６Ａ〜１６Ｃ、及び図１７Ａ及び１７Ｂに提示されているデータに加え、図１６Ｄに示されているデータセットは、ＢＭＰＲ１Ｂ  ＰＢＤ  ＡＤＣが、ルミナルＢ腫瘍を有するマウスにおいて、原発性及び遠位腫瘍負荷をかなり小さくするという強力な証拠を提示している。
【０５６３】
［実施例２０］
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体−薬物コンジュゲートによる腫瘍開始細胞頻度の低下
上の実施例において実証されている通り、ＢＭＰＲ１Ｂ発現は、腫瘍形成を伴い、開示されたＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、腫瘍成長を効果的に抑制又は阻止する。抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣによる処置が、薬物抵抗性であり、並びに腫瘍再発及び転移を刺激することが知られている腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の頻度を低減することを示すため、インビボでの、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を以下に記載されているように実質的に行う。
【０５６４】
ＰＤＸ腫瘍（例えば、ＢＲ−ＬｕｍＢ）を、免疫不全のマウスにおいて、皮下で成長させる。腫瘍体積が、平均で１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３のサイズとなると、マウスを無作為に２つの群に分ける。群の１つは、ネガティブ対照としてＰＢＤ３にコンジュゲートしたヒトＩｇＧ１対照抗体を腹腔内に注射した一方、もう一方の群は、抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ  ｈＳＣ９１．１ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３（例えば、実施例１２に調製した通り）を腹腔内注射した。投与して１週間後、各群からの３匹の代表的なマウスを安楽死させて、これらの腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液に分散させる。次に、各処置群からの腫瘍細胞を採取してプールし、実施例１に既に記載した通りに分類する。これらの細胞を、マウス細胞を検出するためＦＩＴＣコンジュゲートした抗マウスＨ２ｋＤ及び抗マウスＣＤ４５抗体により標識し、ヒト細胞を検出するためＥｐＣＡＭを、及び死滅細胞を検出するためＤＡＰＩを標識する。次に、得られた懸濁液をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータを使用してＦＡＣＳにより選別し、生存ヒト腫瘍細胞を単離して採集する。
【０５６５】
マウスの４つのコホートに、抗ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣにより処置した腫瘍に由来する、８７５、１７５、３５又は７の選別した生存ヒト細胞のいずれかを注射する。ネガティブ対照として、マウスの４つのコホートに、未処置（ビヒクル）腫瘍に由来する、６２５、１２５、２５又は５の選別した生存ヒト細胞を移植する。レシピエントマウスにおける腫瘍を毎週、測定し、腫瘍が１５００ｍｍ３に到達する前に、個々のマウスを安楽死させる。レシピエントマウスは、ポジティブ又はネガティブ腫瘍成長を有するとして、点数を付ける。ポジティブ腫瘍成長は、１００ｍｍ３を超過する腫瘍の成長として定義する。これらの検討結果が、本明細書に添付した図１８Ａ及び１８Ｂに提示されている。
【０５６６】
図１８Ａに示されているデータセットは、ＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣ処置した、ルミナルＢ  ＰＤＸ（ＢＲ１５９）腫瘍を有するマウスから得られた腫瘍細胞は、移植すると成長できないことを示している。図１８Ａに詳述されている通り、移植された腫瘍細胞は、１００日目において、移植時に腫瘍が有した体積と同じ又はこれより小さい体積を実際に有した。これは、開示されるＡＤＣが、腫瘍を繰り返して広まる能力を有する腫瘍形成性細胞（例えば、がん幹細胞）を抑制又は排除する能力を有することを示している。図１８Ｂは、腫瘍開始細胞の頻度が、ＳＣ９１．１ｓｓ１ＭＪ  ＰＢＤ３により処置されたマウスにおいて実質的に排除される一方、ビヒクル処置マウスは、依然として、正の腫瘍成長を示すということを示すことによる上記の知見を支持している。当業者は、ポアソン分布統計学（Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各集団におけるＴＩＣの頻度を算出することができることを認識している。これらの算出に基づくと、開示されたＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、このアッセイにおいて、検出限界未満にまで腫瘍開始細胞の頻度を低下させる一方、ビヒクル処置腫瘍は、１０００個の腫瘍細胞あたり２０個の細胞の程度のがん幹細胞の頻度を依然として示す。図１８Ａ及び１８Ｂにおいて示されているデータは、図１６Ａ〜１６Ｄ、及び１７Ａ及び１７Ｂに示されている結果を強く支持し、これらの結果を確認するものであることが理解される。
【０５６７】
［実施例２１］
抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体は、ＢＭＰＲ１ＢとＢＭＰ２／４との間の相互作用をモジュレートする
上記の通り、ＢＭＰＲ１Ｂは、ＢＭＰリガンド、特にＢＭＰ２及びＢＭＰ４の受容体でもある。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを使用するＥＬＩＳＡアッセイを行い、実施例６において生成した抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が、ＢＭＰＲ１Ｂ（受容体）のＢＭＰ２又はＢＭＰ４（リガンド）への結合を拮抗する又は作動させる能力（「ＢＭＰＲ１Ｂ−ＢＭＰ２／４相互作用」）を試験した。この点において、ＢＭＰＲ１Ｂ−ＢＭＰ２／４相互作用をモジュレートする（例えば、ＢＭＰＲ１ＢのＢＭＰ２／４との相互作用を機能的に作動させる又は拮抗する）例示的な抗体は、本明細書に添付されている図１９に示されている。データの精査により、選択された抗体は、ＢＭＰ２又はＢＭＰ４リガンドのＢＭＰＲ１Ｂ受容体への結合を阻害又は遮断することができることを示している。
【０５６８】
より詳細には、ヒトＢＭＰＲ１ＢのヒトＢＭＰ２及びＢＭＰ４に対する結合速度及び親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した。この点において、ヒトＦｃ断片に融合したＢＭＰ２を抗ヒト捕捉（ＡＨＣ）チップに固定化し、速度パラメータ及び平衡定数（ＫＤ）を決定するため、ＢＭＰＲ１Ｂ−ｈｉｓを５種の異なる濃度（２．５、５、１０、２０、４０μＭ）で注射した。別の実験において、ヒトＦｃ断片に融合したＢＭＰＲ１Ｂを抗ヒト捕捉（ＡＨＣ）チップに固定化し、ＢＭＰ４−ｈｉｓを５種の異なる濃度（３１．３、６２．５、１２５、２５０、５００ｎＭ）で注射した。両方の場合において、センソグラムから参照を挿し引き、１：１結合モデルを使用して当てはめた（データ示さず）。ＢＭＰＲ１Ｂは、６１μＭ及び１．２ｎＭのＫＤ値で、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４にそれぞれ結合することが分かった。
【０５６９】
本発明の例示的な抗体が、ＢＭＰＲ１Ｂリガンド結合ＭＳＤ標準に及ぼす影響を決定するため、プレートをＰＢＳ中１００ｎｇ／ｍＬでヒト  ＢＭＰＲ１Ｂ３０μｌによりコーティングし、４℃で一晩、インキュベートした。このプレートをＰＢＳ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）により洗浄した後、プレートを室温で６０分間、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより遮断した。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、ＰＢＳ＋０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＡ）中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中の１０ｕｇ／ｍＬの選択したマウスＢＭＰＲ１Ｂ抗体２５μｌを上記のプレートに加えて、６０分間、インキュベートした。ＰＢＳＴにより洗浄した後、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３５５−ＢＭ−０５０）又はＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３１４−ＢＰ−０５０）２５ｕＬをプレートに加えて、６０分間、インキュベートした。このインキュベート工程中に、ヤギ抗ヒトポリクローナル抗ＢＭＰ２検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ３５５）及びポリクローナル抗ＢＭＰ４検出抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ７５７）を、製造業者のプロトコル（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｒ３２ＡＣ−５）に従い、ＭＳＤ（登録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ  ＮＨＳエステルを使用してスルホタグ付けを行った。ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ＮＨＳ−エステルは、反応性アミンである、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、これは、温和な塩基性条件下、タンパク質の一級アミン基に容易に結合して、安定なアミド結合を形成する。ＰＢＳＴにより洗浄した後、ＰＢＳＴＡ中の２μｇ／ｍｌのスルホタグが標識されているヤギ抗ヒトポリクローナルＢＭＰ２又はＢＭＰ４抗体１０μＬ／ウェルを室温で１時間、加えた。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄して、界面活性剤を含むＭＳＤ読取り用バッファーＴを水中１Ｘまで希釈し、１５０μＬを各ウェルに加えた。プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ２４００で読み取った。データを、抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体を含まない対照ウェルと比較し、結合阻害率を算出した。得られた阻害データは、図１９Ａ中に表形態で示される。
【０５７０】
図１９Ａに示されているデータを精査すると、試験した抗体は、ＢＭＰ２のＢＭＰＲ１Ｂへの結合よりも、ＢＭＰ４の結合を一般に阻害する傾向があることが示される。さらに、結合阻害率にはいくらかのばらつきがあるが、選択した抗体は、ＢＭＰ４及び／又はＢＭＰ２の結合を効果的に遮断した（例えば、ＢＭＰ４の場合、＞５０％であり、ＢＭＰ２の場合、＞２５％である）。すなわち、選択された抗体（ＳＣ９１．１及びＳＣ９１．９を含む）は、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４のＢＭＰＲ１Ｂ受容体への結合を阻害するという点で、拮抗性であることが分かった。
【０５７１】
第２の実験は、選択したマウス抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体の濃度を滴定して、図１９Ｂ（ＢＭＰ４遮断）及び図１９Ｄ（ＢＭＰ２遮断）に示されているリガンド結合曲線を得た以外、実質的に直前に示した通り行った。図１９Ｂ及び１９Ｄにおいて分かる通り、これらの滴定曲線は、例となる抗体は、一般に、ＢＭＰ２を遮断するよりも、ＢＭＰ４の結合を効果的に遮断すること、及びある特定の抗体（例えばＳＣ９１．１及びＳＣ９１．９）は、特に、両方のリガンドの結合の遮断に有効であることを示している。このような知見は、図１９Ａに示されているデータと一致しており、本開示を鑑みると、アンタゴニスト抗ＢＭＰＲ１Ｂ抗体が容易に特定され得ることを確認する。
【０５７２】
最後に、開示される抗体が結合を阻害する能力は、抗体が存在するビンと相関し得る。より詳細には、図１９Ｃ及び１９Ｅは、上の実施例７に示されている通りに決定される、対象となる抗体のビンに対して、選択した抗体によって示される結合阻害率（図１９Ａに示されている通り）をプロットしている。ＢＭＰ４結合の阻害を対象とする、図１９Ｃに示されているデータは、ビンＡ及びＣの抗体が、リガンドの結合を遮断するのに特に、有効である可能性が高いことを示している。同様に、ＢＭＰ２結合の阻害を対象とする、図１９Ｅに示されているデータは、ビンＡ及びＣにおける抗体は、リガンドの結合の遮断に一層有効となる傾向があるが、これらの抗体は、ＢＭＰ４の結合を遮断する程度ではないことを示している。やはり、このデータは、図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｄに示されている結果と一致している。
【０５７３】
一層驚くべきことに、図１９Ａ〜１９Ｅに示されているデータは、上の実施例において生成し、示されている殺傷データとやはり相関しているように思われる。この点に関して、ビンＡ及びＣにおける抗体が、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２の結合を一層効果的に阻害する能力は、上の実施例７において示されている、同一のビンに由来する抗体の、細胞を効果的に殺傷する能力と強く相関している。この観察は、図１９Ｃ及び図１９Ｅ（結合阻害）と、ビンＡ及びＣの抗体が他のビンの抗体よりも一般に活性である図７Ｃ及び７Ｄ（細胞殺傷）とを比較することにより、容易に立証される。
【０５７４】
このようなアンタゴニスト抗体（上の実施例により証拠づけられている）によって示された、腫瘍の抑制又は排除を考慮すると、ＢＭＰＲ１Ｂリガンド結合の遮断は、開示化合物の観察された活性に寄与しており、関連組成物の潜在的な治療指数を向上させることができる。したがって、このような抗体、又はこのような抗体を組み込んだＢＭＰＲ１Ｂ  ＡＤＣは、本明細書における教示に従って使用するのに特に好適となり得る。
【０５７５】
当業者はさらに、本発明が、本趣旨又は中心的な特性から逸脱することなく、他の特定の態様に具現化され得ることを理解している。本発明の上述の記載がこの例示的な実施形態しか開示していないという点において、他の変形が本発明の範囲内であることが企図されることが理解される。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、参照は、本発明の範囲及び内容の指標として添付の特許請求の範囲に対してなされるべきである。
【図１Ａ】
2019522960.tif 000046
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｃ−１】
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【図９Ｃ−２】
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【図９Ｃ−３】
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【図９Ｃ−４】
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【図９Ｃ−５】
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【図９Ｄ−１】
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【図９Ｄ−２】
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【図９Ｅ−１】
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【図９Ｅ−２】
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【図９Ｆ−１】
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【図９Ｆ−２】
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【図９Ｇ−１】
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【図９Ｇ−２】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
2019522960.tif 000099
【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019522960.tif 000104
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