(57)【要約】  発光マーカーでマーキングされた試料中の構造高解像度で画像化するための、本発明による方法では、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光(２)が、強度分布によって、強度最大値(３)に隣接する零点(４)を有する試料に向けられる。走査するべき試料の部分範囲は、零点(４)によって走査され、零点(４)の範囲から放出された発光光が記録され、試料中の零点(４)の場所に割り当てられる。その際に、１つの関心対象の複数のサンプルがそれぞれ走査するべき試料(８)の部分範囲と重なり合って配置され、その関心対象の複数のサンプルが周辺条件の変化にさらされ、それにより、これに続いて行われる関心対象の反応が検出される。個々の試料(８)の部分範囲は、周辺条件の変化の最中及び／又は前後で、各零点(４)により走査される。試料の走査すべき部分範囲の寸法が、試料中の零点（４）の強度最大値（３）が隣接している少なくとも１つの方向で、強度最大値（３）のこの方向の間隔（Ｄ０）の７５％以下になるよう限定される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光マーカー（５６、５７）でマーキングされた試料中の構造（８）を高解像度で画像化する方法であって、
−前記発光マーカーによる発光光の放出（５６、５７）に作用する光は、ある強度分布で前記試料（８）に向けられ、該試料は強度最大値（３）に隣接する零点（４）を備えており。
−前記試料（８）の走査すべき部分範囲（７）が前記零点（４）で走査され、及び
−前記零点の範囲（４）から放出される発光光が記録され、及び前記零点の場所（４）が前記試料（８）に割り当てられる方法において、
−関心対象（５５）の複数のサンプルがそれぞれ前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の１つと重なり合って配置されており、
−前記関心対象（５５）の複数の前記サンプルが、このあとで行われる関心対象（５５）の反応を検出するために、変更された周辺条件にさらされ、その際前記個々の試料の部分範囲（８）が周辺条件の変更中及び／又は前後に前記各零点（４）で走査され、及び
−前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の寸法が、試料中の前記零点（４）の前記強度最大値（３）が隣接している少なくとも１つの方向で、前記強度最大値（３）のこの方向の間隔（Ｄ０）の７５％以下になるよう限定されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、複数のサンプルの異なった部分量が前記試料（８）中の前記関心対象（５５）が異なって変更された周辺条件にさらされることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記周辺条件が、化学物質を加えることによって変更されることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の方法であって、前記関心対象（５５）の前記複数のサンプルが前記試料（８）の固定点（５０）に対して定義されたパターン（５１）で配置されており、及び前記走査すべき試料の部分範囲（８）が前記零点（４）で前記試料（８）の前記固定点（５０）に対してアプローチされることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）が反復して前記零点（４）で走査されることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、少なくとも前記走査すべき試料の部分範囲（８）の走査の反復時に前記零点（４）が３ｎ又は２ｎ以下の場所に、前記走査すべき部分範囲（７）ごとに配置されており、その際ｎが空間方向の数であり、その中で前記走査すべき試料の部分範囲（８）が走査されることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）中の複数のサンプルに配置された対象（５５）が分子、タンパク質、複合体、シナプス、膜、細胞成分及びウイルスを含んでいるグループから選択されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の前記寸法が、前記試料中で前記零点（４）の前記強度最大値（３）が隣接している少なくとも１つの方向で、前記強度最大値（３）のこの方向の前記間隔（Ｄ０）の５０％、４５％、２５％又は１０％未満であることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の前記寸法が、前記試料中で前記零点（４）の前記強度最大値（３）が隣接している少なくとも１つの方向で、１つの区間より小さく、該区間の上で前記光の前記強度（Ｉ）が前記零点（４）から出発してこの方向に、前記隣接している強度最大値（３）の前記光の前記強度（Ｉ）の５０％、２５％、１０％又は５％に上昇することを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）を走査する前に、前記走査すべき部分範囲（７）の位置を前記試料（８）中で確定するために、前記試料中の構造（８）が他の方法で画像化され、その際任意で、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の走査が、より大きい試料の部分範囲（８）で前記零点（４）により、前記光の少なくとも５０％小さい強度で及び／又は少なくとも５０％高い走査速度で走査されることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記試料（８）のより大きな範囲を走査するために前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の走査とは異なる他の走査手段が使用されることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記試料（８）のより大きな範囲を走査するために、少なくとも１つの方向に試料ホルダ（２４）が対物レンズ（１７）に対して動かされ、該対物レンズは前記光を前記試料（８）に向けられること、及び／又は前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）を走査するために、少なくとも１つの方向に電気光学的スキャナ、音響光学的偏向器又はガルボミラーが使用されていることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法であって、前記発光マーカーによる発光光の放出（５６、５７）に作用する前記光が、発光可能化光であることを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記発光マーカー（５６、５７）を発光のために励起する及び／又は暗黒状態から励起可能状態に移行することで、前記発光可能化光が前記発光マーカーによる発光光の放出（５６、５７）を可能にすることを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法であって、前記発光マーカーによる発光光の放出（５６、５７）に作用する前記光が発光防止光であり、該発光防止光が前記発光マーカーによる発光光の放出（５６、５７）を前記零点（４）の外で阻止することを特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記発光防止光が刺激光であり、該刺激光が前記発光マーカーによる発光光の放出（５６、５７）を前記零点（４）の外で、刺激された放出によって防止し、その際前記刺激光が励起光（１）と共に前記試料（８）に向けられ、該刺激光が前記発光マーカー（５６、５７）を発光光の放出のために励起し、及び該発光光が最大値（２７）を持つ強度分布を前記発光防止光の前記零点の範囲（４）で備えていることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）を前記零点（４）で走査する前に、追加的にスイッチオフ光（３４）がそのような強度分布で前記試料（８）に向けられること、スイッチング可能な発光マーカーとして形成された発光マーカーが、前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）に隣接する部分範囲（３９）で非活性状態にスイッチオフされ、その際に前記隣接する部分範囲（３９）が前記試料の前記零点（４）の強度最大値（３）が隣接している前記少なくとも１つの方向に、前記走査すべき部分範囲（７）で励起されること、を特徴とする、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記試料が前記走査すべき部分範囲（７）を走査され、その際前記走査すべき部分範囲（７）が前記走査すべき部分範囲（７）の全ての又は選択された位置で前記零点（４）により走査されることを特徴とする、方法。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の方法であって、前記スイッチオフ光（３４）の前記強度分布が前記走査すべき部分範囲（７）で破壊的な干渉によって形成された局部的な強度最小値を備えていることを特徴とする、方法。
【請求項２０】
請求項１７から１９のうちのいずれか一項に記載の方法であって、前記スイッチオフ光（３４）を前記試料（８）に向ける前及び／又はそれと時間的に重なり合って、スイッチオン光（３７）が前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）に向けられ、該スイッチオン光が前記スイッチング可能な発光マーカー（５６、５７）をその活性状態にスイッチオンすることを特徴とする、方法。
【請求項２１】
請求項１７から２０のうちのいずれか一項に記載の方法であって、スイッチオン及び／又はスイッチオフ時に前記スイッチング可能な発光マーカー（５６、５７）から放出される発光光（２０）が記録され、評価され、その際評価の結果は任意であり、
−前記隣接する部分範囲（３９）が境を接する走査すべき部分範囲（７）が前記零点（４）で走査されるかどうか、及び／又は
−励起光（１）が、前記隣接する部分範囲（３９）で限定される走査すべき部分範囲（７）で、前記試料（８）に向けられるかどうか、及び／又は
−前記試料（８）への前記刺激光の指向が、前記零点（４）の各位置で、前記隣接する部分範囲（３９）に限定される走査すべき部分範囲（７）内で、及び前記零点の範囲（４）から放出される発光光（２０）の記録が、どの条件下で中断されるのか、であることを特徴とする、方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法であって、前記零点の範囲（４）から放出される発光光がポイントセンサ（２１）によって記録され、その位置が、前記試料（８）に対して前記試料（８）の前記走査すべき部分範囲（７）の走査時に変更されないことを特徴とする、方法。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料（８）の前記複数の走査すべき部分範囲（７）が同時に走査されることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光マーカーでマーキングした試料中の構造を高解像度で画像化する方法に関する。
【０００２】
本発明は、高解像度の走査発光顕微鏡法分野に分類され、この分野では、発光光の波長及び場合によって生じ得る励起光の波長において、各試料から放出される発光光が回折限界よりも高い空間解像度であること、この励起光によって空間的に限定されて発光マーカーが発光光の放出のために励起され、試料中の場所に割り当てられること、を可能にする処置が行われる。多くの場合発光マーカーは、励起光による励起後に発光光として蛍光光が放出される蛍光マーカーである。そのため、蛍光顕微鏡検査法と呼ばれる。
【背景技術】
【０００３】
独立請求項のプリアンブルに従った、公知の方法及び走査発光顕微鏡では、空間解像度を高めるために、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光が、隣接する零点の強度最大値を示す強度分布を伴って試料に向けられる。この光は多くの場合発光防止光であり、これにより、零点の外にある発光マーカーによる発光光の放出が阻止される。試料から放出される発光光はこうして零点の場所に配置され得る。なぜならそこに配置された発光マーカーだけが発光光を放出する能力があるからである。
【０００４】
こうしてＳＴＥＤ蛍光顕微鏡検査法ではあらかじめ励起光によって励起された蛍光マーカーが、零点の範囲を除いて、蛍光防止光として刺激光で刺激された放出によって再び鎮静され、その結果零点にある蛍光マーカーだけがその後で適度の蛍光光を放出できる。この蛍光光は、こうして試料中の零点の場所に配置され得る。零点で試料を走査することで、試料中の蛍光マーカーの空間的な分布が特定される。このようにして、蛍光マーカーでマーキングされた試料中の構造の構成と空間分布が画像化され得る。
【０００５】
ＧＳＤ蛍光顕微鏡検査法では、蛍光防止光によって、零点範囲の外にある蛍光マーカーが電子的暗黒状態に移行され、蛍光光の放出のための励起光により励起できなくなる。
【０００６】
ＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡検査法では、蛍光防止光が使用され、フォトクロミック蛍光マーカーが蛍光を発する状態から、零点の範囲を除いて、蛍光を発しない状態に移行する。それに続く、励起光による蛍光マーカーの励起は、蛍光防止光の強度分布の零点の範囲の蛍光マーカーだけに相応して、励起光により蛍光光を放出するよう励起される。こうしてここでも、蛍光マーカーによって試料から放出される蛍光光が、蛍光防止光の強度分布の零点の場所に配置され得る。
【０００７】
ここまで叙述した、高解像度の走査発光顕微鏡法の方法の全てで、各試料中の発光マーカーが一時的に、又は恒久的に色あせてしまい、つまり非活性化してしまい、その結果これがもはや発光光を放出しないという、少なからぬ危険がある。この危険は、零点の範囲の外の全ての発光マーカーで発光光の放出を阻止するため、及び同時に、発光マーカーがまだ発光光を放出できる零点の範囲の空間的な寸法を大幅に狭めるために、発光防止光の強度を非常に高く狭める必要があるという事実による。この発光防止光はこの高い強度により、それらが発光防止光の零点の範囲が近づき、すなわちすでに発光マーカーが初めて零点の範囲に到達し、それによって初めて発光マーカーから放出された発光光が記録されると、早くも試料中の発光マーカーに影響を与える。このことは、記述された方法において色あせる傾向にある発光マーカーが使用され得ないか、又はそれが空間解像度の最大化に望ましいであろう、少なくとも非常に高い強度ではない発光防止光が使用されるという結果をもたらす。
【０００８】
叙述された、一時的及び恒久的な色あせという、高解像度の走査発光顕微鏡法での問題に対処するため、さまざまなアプローチが行われた。特許文献１では、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡検査法の蛍光防止光は比較的大きな時間的間隔でパルスにより、又は試料を高速で走査することで、そのつど零点が試料上に設けられ、その結果、試料の同じ範囲が最適化された時間的反復間隔でのみ、高い強度の蛍光防止光にさらされる。このようにして試料から受け取れる蛍光光の強度が高められる。なぜなら、蛍光マーカーが励起された中間状態からさらなる励起によって永続的に、又は単にゆっくり減衰して暗黒状態にされる比率が格段に低減されるからである。言い換えると、試料の個々の範囲に比較的大きな反復間隔で、蛍光防止光の強度分布で作用することで、特定の期間で試料全体によって受け取られる蛍光光の量が最大化される。この方法は、蛍光マーカーが色あせる傾向も低減する。なぜなら、蛍光マーカーの光化学的破壊が行われる励起された状態が、より強く支配することが防止されるからである。
【０００９】
色あせの傾向がある蛍光マーカーを使用した高解像度の蛍光顕微鏡検査法の実施のために、特許文献２は走査条件を示している。これは、各試料が走査される走査速度及び蛍光防止光の強度分布の光強度と並んで、試料中の蛍光マーカーの性質及び濃度を含み、蛍光光が個別に検出可能なフォトンの形で蛍光防止光の強度分の布零点の範囲から放出され得るように互いに調整される。蛍光マーカーによってマーキングされた試料中の構造の画像は、検出されたフォトンが零点での試料走査を複数回反復中に割り当てられた場所から合成される。このようにして、蛍光マーカーが初めて零点から到達して確認される前に、蛍光マーカーの色あせの確率が低減される。これは、色あせの確率が、個々の蛍光マーカーによって受け取られる蛍光光の強度と相互に関連があることに基づく。蛍光光が個々のフォトンに最小化されるので、色あせの危険も最小化される。しかしながら、基本的に、特許文献２で公知の方法では、個々の蛍光マーカーの零点の蛍光防止光は、やはり隣接する強度最大値の範囲であらかじめ高い強度にさらされて初めて達成される。
【００１０】
高解像度の走査発光顕微鏡法において、色あせに対して敏感な物質を使用することもできるよう、発光マーカーでマーキングされた関心構造が内部にある試料が、測定フロントによってその上を走行され得ることが、特許文献３で公知である。ここでは、光学信号の強度は、光学信号の波長の回折限界より小さい測定フロントの深さを超えて、発光光が放出する発光マーカーの一部が、発光マーカーを発光する状態へと移行して非存在から増加して発光マーカーが発光しない状態へと移行して再び非存在まで低下するように、増加する。測定フロントの範囲からの発光光は検出され、測定フロントの属している位置が試料中に割り当てられる。測定フロントの長手方向の発光光の割り当ては、この場合同じく回折限界を超えた空間解像度によってなされ、例えば記録されたフォトンを唯一の発光マーカーに割り当てた状態で、これが例えばＧＳＤＩＭとして公知の光学顕微鏡法のように行われる。
【００１１】
試料の関心構造の画像化速度を走査発光顕微鏡法において高めるための１つの手段は、試料を発光防止光の複数の零点で平行して走査することである。この場合、試料から放出された発光光は発光防止光の個々の零点とは離れて配置される。特許文献４から、発光防止光から試料中へ２つの互いに直交して伸びるラインパターンが互いに重ね合わせられることで、発光防止光の強度分布が零点のラスターで形成されることが公知である。ここでは、ラインパターン間の干渉が阻止され、その結果その強度分布が加算される。希望の、強度最大値に隣接する発光防止光の強度分布の零点は、２つのライングリッドのライン形状の零点の交差点上に残る。試料を零点のラスター形状の配置の範囲で完全に走査するためには、各零点を、間隔を空けて２つのラインパターンの方向に隣接する零点をずらすだけでよい。ここでも、試料中のほとんどの発光マーカーは、零点に到達しかつそれによって初めて、検出される前に発光防止光の高い光強度にさらされる。発光マーカーはしたがって、色あせすることなくこの高い光強度に耐えるものが選択されなければならない。
【００１２】
非特許文献１では、活性化できる蛍光マーカーでマーキングされた試料中の構造を高解像度で画像化する方法が示されており、重なり合うライン形状又は面形状の光強度分布の零点を備えた試料が、蛍光活性化光及び蛍光励起光によって連続して異なる方向へ走査され、その際に試料から放出される蛍光光がカメラで記録される。検出した光強度の評価から、関心試料中の構造の図が再構成され得、その空間解像度が、それぞれ蛍光光が試料から出ていない蛍光活性化光と蛍光励起光の一致した零点を縮小することで、高められている。この公知の方法でも、蛍光活性化光の零点と同時に蛍光不活性化光として作用する蛍光励起光の零点が、蛍光活性化光と蛍光励起光の強度最大値と隣接する。この強度最大値範囲での、蛍光活性化光と蛍光励起光の高い強度が、試料中の全ての発光マーカーに、これが蛍光活性化光と蛍光励起光の一致している零点の範囲に到達する前に、作用する。これにより、この公知の方法でも、蛍光マーカーの色あせの危険は、関連する測定信号に寄与する前に、すでに非常に高い。
【００１３】
特許文献５から、発光マーカーでマーキングされた試料の構造を空間的に高解像度で画像化する方法が公知である。この方法では、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡検査法で励起光及び刺激光によって発光防止光として作用される試料のように、試料の範囲で、試料から放出されて検出された蛍光光に割り当てられ得、刺激光の零点の範囲を限定している。その際に発光マーカーを、零点に境を接する強度最大値の範囲の刺激光の高い強度から保護しなければならず、試料には追加的に励起防止光が当てられ、その強度分布が局部的に、刺激光の零点と一致する最低値を有する。この励起防止光は特にスイッチオフ光であってよく、この光はスイッチング可能な発光マーカーを励起防止光の最低値の外で非活性状態にスイッチオフし、励起光が発光光の放出のために励起可能でなくする。具体的には、発光マーカーではこれは、高解像度のＲＥＳＯＬＦＴ蛍光顕微鏡検査法で使用されるような、スイッチング可能な蛍光色素であってよい。特許文献５で公知の方法では、発光マーカーがスイッチング可能であることは一次的であるが、これは空間分解能の高めるためではなく、高い強度の刺激光で色あせないように保護するためである。
【００１４】
非特許文献２から、共焦点の蛍光顕微鏡検査法による方法が知られている。この方法では、発光マーカーでマーキングされた試料中の構造を画像化するために、試料が焦点を合わせた励起光によって走査される。その際に、焦点を合わせた励起光の試料中の各位置で、試料中の励起された発光マーカーから放出されて検出器に記録されたフォトンの数が希望の信号雑音比に相当する上限値に達すると、励起光がスイッチオフされる。励起光のスイッチオフは、放出されて記録されたフォトンの数が、最大ピクセルドエルタイムの所与の部分期間以内に下限値に達しない場合にも行われる。なぜならこれは、焦点が合わせられた励起光の各位置で発光マーカーが関連する濃度にないことを示しているからである。このようにして、励起光による試料の負荷は、同じ光量を試料に当てた場合と比べて、焦点が合わせられた励起光の各位置で格段に低下する。
【００１５】
非特許文献３では、ＲＥＳＣｕｅ−ＳＴＥＤと名付けられた方法が公知であり、この方法はＲ  Ａ  Ｈｏｅｂｅ他が共焦点の蛍光顕微鏡検査法のために記述した方法がＳＴＥＤ蛍光顕微鏡検査法に継承されている。これによって試料には必要又は有意義な長さだけ、高い強度の刺激光が当てられる。
【００１６】
特許文献６から、発光物質を有している試料の構造を空間的に高解像で画像化するための方法が公知であり、この方法では試料がある測定範囲で、局部的な最小値を有する発光防止光の強度分布が当てられる。その後、試料はその測定範囲で発光励起光が当てられ、この発光励起光が発光物質を電子的な基本状態から発光する状態へと励起し、測定範囲から放出された発光光が記録される。記録された発光光は、試料中の局部的最小値の位置に割り当てられる。発光防止光により、発光物質の電子的な基本状態は、発光物質が電子的な基本状態が損なわれた状態で、発光励起光のための吸収断面積が低減されて備えられるように、損なわれる。加えて、試料には、測定範囲に発光光が記録される前にＳＴＥＤ光が当てられ得、このＳＴＥＤ光は同様に局部的な最小値を測定範囲の中心に備えている。この局部的な最小値がまだ局部的な発光防止光の強度分布の最小値より小さい場合、このことによって発光光の空間的な配置がさらに強く限定され得、それによって空間分解能が構造の写像の際にさらに高められる。ＳＴＥＤ光と蛍光防止光の局部的な最小値は、試料中の蛍光防止光の強度分布の局部的な最小値の全ての位置で、同心円的に互いに配置される。
【００１７】
特許文献７では、試料中の物質の個々の分子の場所を特定する方法が公知である。この方法では、物質の個々の分子が蛍光を発する状態にあり、ここでは励起光によって蛍光光を放出するよう励起可能であり、物質の個々の分子の間隔は最小値に保たれている。物質の個々の分子は、励起光によって蛍光光を放出するよう励起され、その際接近光の強度分布は少なくとも１つの零点を備えている。励起された物質の個々の分子の蛍光光は、励起光の強度分布の少なくとも１つの零点の異なった位置に記録される。その際、その中で励起された物質の個々の分子の蛍光光が記録される、少なくとも１つの零点の直近の隣接位置間の間隔は、最小値の半分以下である。物質の個々の分子の場所は、蛍光光の強度の推移から出て、各分子から、励起光の強度分布の少なくとも１つの零点の位置を経て、試料の関心範囲に導かれる。
【００１８】
特許文献８から、焦点が合わせられたレンズ系の光線に対して光線を動的移転する方法が公知である。この方法は、ＳＴＥＤ顕微鏡で使用可能である。試料を走査する際、高速のアダプティブなラスターサンプルが実現できる。これは背景範囲が暗いために、又は他の理由で、低減されたピクセル数によって高い再生速度を実現するために非関心対象物範囲が抜かされる。
【００１９】
特許文献９では、複屈折クロマティックビーム成形装置付き蛍光光走査型顕微鏡が記述されている。この走査型顕微鏡は、特にＳＴＥＤ顕微鏡である。複屈折クロマティックビーム成形装置を励起光もＳＴＥＤ光も通り抜け、その際ビーム成形装置は励起光の強度最大値の形成に下流に接続された対物レンズの焦点で損なわず、しかしそれとは逆にＳＴＥＤ光が強度最小値の強度分布を励起光の強度最大値の場所に形成するという結果をもたらす。
【００２０】
特許文献１０では、解像度を上げた顕微鏡法が公知である。この方法では、試料が２回、励起光の強度最大値で走査され、試料の２つの画像が生成される。その際に、２つの画像の基礎を成している走査点は、この方法の光学的解像限界の下側でステップ幅１つ分互いにずらされ、結果として生じた画像の違いが空間分解能を高める目的で評価される。相応する方法は特許文献１１でも公知である。
【００２１】
特許文献１２では、中心に零点を備えたビームを形成するためのビーム成形装置が公知である。このビーム成形装置は、ＳＴＥＤ顕微鏡で使用される。ビーム成形装置では、試料の走査時にビームによって調整されるスキャン角度が限定される。なぜなら、これはさまざまな遅延プレートによって中心の零点を形成するために調整されたビームの相対的遅延を損なうからである。
【００２２】
特許文献１３では、空間的に高解像度の試料検査方法が公知である。この方法はスイッチング可能な物質を備えたＲＥＳＯＬＦＴ顕微鏡に数えられる。一実施形態では、この公知の方法は試料を平行して、すなわち同時に複数の部分範囲で検査するために、蛍光防止光の複数の零点の平行形成を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】独国特許出願公開第１０２００５０２７８９６号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２０１１０５１０８６号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１１／１３１５９１号パンフレット
【特許文献４】独国特許出願公告第１０２００６００９８３３号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１４／１０８４５５号パンフレット
【特許文献６】独国特許出願公開第１０２０１３１００１４７号明細書
【特許文献７】独国特許出願公告第１０２０１３１１４８６０号明細書
【特許文献８】国際公開第２０１０／０６９９８７号パンフレット
【特許文献９】米国特許第２０１２／０１０４２７９号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第２３１７３６２号明細書
【特許文献１１】独国特許出願公開第１０２０１３０１７４６８号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１３／０２０１５５８号明細書
【特許文献１３】米国特許第７６７９７４１号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】ＬｉＤ他，“Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５  Ａｕｇ  ２８；３４９（６２５１）
【非特許文献２】Ｒ  Ａ  Ｈｏｅｂｅ他，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｉｇｈｔ−ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｌｉｖｅ−ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ”，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２５，  Ｎｏ．２，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００７，ｐ．２４９−２５３
【非特許文献３】Ｔ．  Ｓｔａｕｄｔ他，“Ｆａｒ−Ｆａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｎａｎｏｓｃｏｐｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｓｔａｔｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅｓ”，  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｏｌ．  １９，  Ｎｏ．６，１４  Ｍａｒｃｈ  ２０１１，ｐ．５６４４−５６５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の課題は、発光マーカーでマーキングされた試料中の構造を高解像度で画像化するための方法、及びそのような方法を実施するための走査発光顕微鏡を提示することであり、これを使用して高い光強度による、試料中の発光マーカーの負荷が根本的に低減され、その結果高い光強度に対して敏感な発光マーカーも使用可能になり、及び各試料中の構造が反復して画像化可能になり、それによって周辺条件の変化に対する関心対象の反応が検出される。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の課題は、独立請求項１に従った方法で解決される。従属請求項は、本発明による方法の好ましい実施形態に関する。
【００２７】
発光マーカーでマーキングされた試料中の構造高解像度で画像化するための、本発明による方法では、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光が、強度分布によって、強度最大値に隣接する零点を有する試料に向けられる。走査するべき試料の部分範囲は、零点によって走査され、零点の範囲から放出された発光光が記録され、試料中の零点の場所に割り当てられる。その際に、１つの関心対象の複数のサンプルがそれぞれ走査するべき試料の部分範囲と重なり合って配置され、その関心対象の複数のサンプルが周辺条件の変化にさらされ、それにより、これに続いて行われる関心対象の反応が検出される。個々の試料の部分範囲は、周辺条件の変化の最中及び／又は前後で、各零点により走査される。走査するべき試料の部分範囲の寸法は、零点が強度最大値によって限定されている、少なくとも１つの方向で、及び好ましくは各方向で、強度最大値との間隔の７５％以下に限定される。
【００２８】
ここで発光マーカーとは、特に蛍光マーカーである。しかし、その発光特性が例えば化学発光又は電界発光をベースにしている他の発光マーカーを使用してもよい。このことは、発光光を放出するための発光マーカーの励起が、本発明による方法において特定のメカニズムに決められていないことを含んでいる。しかし、発光光を放出するための発光マーカーの励起は、しばしば励起光によって行われる。
【００２９】
発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は、発光マーカーによる発光光の放出を阻止する発光防止光であってよい。例えば発光マーカーを暗黒状態に移行することで阻止するか、又は励起された発光マーカーが刺激された放出によって再び鎮静されることで、発光光の放出が阻止される。しかし、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は、発光マーカーが発光しない状態から、別の発光しない状態へと移行される光であってもよい。これにより、色あせは特によく保護される。その他に、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は、単独ではなく別の光と併せられて初めて、光の強度分布の零点の範囲だけで行われるように、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光であってもよい。
【００３０】
他の一実施形態では、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は発光可能化光であり、この光は例えば発光マーカーを発光のために励起して初めて、発光マーカーによる発光光の放出を可能にする。つまりこれは発光励起光又は発光マーカーは、暗黒状態から励起可能状態に移行される。
【００３１】
発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度分布の零点は、少なくとも光の局部的な強度最小値である。これはしばしば、光の強度が実質的にゼロに戻る強度最小値である。理想的には、光の強度は零点の中心で事実上ゼロに戻る。これはしかし、必ずしも前提条件ではない。光が例えば発光防止光である場合、発光防止光の強度が零点の範囲で、発光マーカーの発光を阻止しない、又は少なくとも実質的に阻止しない、すなわち優勢的に阻止しないという結果をもたらすほどに、小さく維持されるだけで十分である。零点はその際に、発光防止光が発光マーカーによる発光光の放出を少なくとも実質的に阻止する範囲によって限定される。そのなかで発光防止光が発光マーカーによる発光光の放出を少なくとも実質的に阻止する、この範囲の間の全ては、ここでは「零点」又は「零点の範囲」と呼ぶ。
【００３２】
ここで、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度分布の零点に隣接する強度最大値は複数で、これによって零点が例えばリング形状で零点の周囲に広がる強度最大値を取り囲む場合は排除されない。全ての断面で、発光光の放出に作用する光の強度分布により、そのようなリング形状の強度最大値が、零点が断面内で、両側で隣接している２つの強度最大値の形であることが明らかになる。
【００３３】
この零点は、１つ、２つ又は３つの方向で強度最大値と隣接していてよい。これはつまり、面形状、線形状、点形状の零点である。この場合、零点は二次元又は一次元の試料を、線形状又は点形状の零点が試料の次元であらゆる面で強度最大値と隣接するような断面にできる。加えて、空間解像度を画像化の際に全ての方向で最大化するために、試料の全ての次元で強度最大値と隣接していない、零点で走査すべき試料の部分範囲は、異なった方向に走査され得る。走査すべき試料の部分範囲の寸法の限定は、本発明による方法では、試料中の零点が強度最大値と隣接している少なくとも１つの方向で、及び好ましくは全ての方向で、行われる。
【００３４】
試料中の零点に隣接している強度最大値は、しばしば、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度分布の範囲よりも大幅に高い光強度であり、これは直接零点と境を接しており、その中では光がすでに求められている方法で、例えば発光マーカーによる発光光の放出を阻止するように作用する。強度最大値の範囲の強度が非常に高いことは、全体として高い光の強度の結果であり、これもやはり、発光マーカーによる発光光の放出に少なくとも実質的に作用しない零点の範囲が空間的に大きく限定されるための前提条件である。そのため、零点と直接境を接する範囲と、強度分布の強度最大値の間に中間範囲が残り、その中では光強度が強度最大値の光強度を大幅に下回っている。この中間範囲は、本発明による方法では、試料の走査された部分範囲の寸法が、この方向での強度最大値との間隔の７５％を超えないようにすることで、選択的に使用される。走査された各方向の部分範囲の寸法が各方向で強度最大値との間隔の５０％より小さい状態にとどまる場合は、光のフル強度の走査された部分範囲のどの点も、強度最大値にさらされない。しかし、間隔を７５％に限定された状態でも、走査すべき試料の部分範囲に当てられる、発光光の放出に作用する光の平均的な強度が大幅に限定される。走査すべき試料の部分範囲に当てられる光の平均的な強度は、さらに戻れば戻るほど、その寸法が各方向で、強度最大値との間隔を下回ったままになることは自明である。絶対的に、走査すべき部分範囲の寸法は、各方向で、強度最大値の最大３００ｎｍ、好ましくは最大２００ｎｍ及びさらに好ましくは約１００ｎｍの間にあり得る。この絶対的な数値は発光光の、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の、及び／又は場合によってあり得る可視範囲の励起光の、波長と関連している。
【００３５】
試料の走査すべき部分範囲は、本発明による方法を実施する際に単独で、すなわち排他的に走査され、及びそれに応じて試料の関心範囲に向けられる、関心対象の複数のサンプルと重なり合う試料の部分範囲であり得る。
【００３６】
本発明による方法では、基本的に関心対象の全てのサンプルが同じように変化した周辺条件にさらされる。しかし好ましくは、試料中の関心対象の複数のサンプルの異なった部分量が、異なって変化した周辺条件にさらされる。このことは特に、関心対象が異なって変化した周辺条件に対して異なった反応をすることが検知され、互いに比較されることを可能にする。その際この反応は、反応結果に関しても、反応速度に関しても異なり得る。この場合本発明による方法が、走査すべき部分範囲の零点による走査の迅速な反復も有利であることは明かである。
【００３７】
関心対象のサンプルが本発明による方法でさらされる周辺条件は、異なった物理的周辺条件であってよく、例えば異なった温度、異なった電界、磁界及び電磁界及び同類のものである。しかし周辺条件は、化学物質を添加しても変化する。つまり異なった化学的周辺条件も含まれる。具体的な一実施形態では、本発明による方法により、薬物スクリーニングが実施され得、その際に希望の反応が関心対象で引き起こされる物質が探される。このために、関心対象の多くのサンプルが個々に、又は大きな部分量で、異なった物質に対して行われ、希望の反応を引き起こす適正があるか検査される。本発明による方法の高い空間分解能により、その際例えば、関心対象の空間的な変化を、作用の結果として各物質を検出することが可能である。これは、多くの他の方法によって検出できないか又は間接的にしか検出できず、したがって多額の費用がかかる。
【００３８】
例えば言及された薬物スクリーニングを特に効率的に実施するため、関心対象の複数のサンプルは、本発明による方法によって試料の固定点に対して定義されたパターンで配置され得る。これで、走査すべき試料の部分範囲を零点で、試料の固定点に対してアプローチすることが非常に効率的に可能である。このことは、全自動で行われることも可能である。関心対象をパターンに配置することは、例えば免疫反応又はそれと同様の助けを借りて行うことができる。
【００３９】
本発明による方法では、走査すべき試料の部分範囲は、通例反復されて零点で走査され、変化した周辺条件への関心対象の反応が検出される。その際、好ましくは、少なくとも走査すべき試料の部分範囲の走査の反復において、零点が３ｎ以下又はそれどころか２ｎ以下の場所で、走査すべき部分範囲ごとに配置され、その際にｎが空間方向の数であり、その中で走査すべき試料の部分範囲が走査され、関心対象が高解像度に画像化される。それが各走査すべき部分範囲に記録された発光光のためにそれぞれ１つの特定の発光マーカーに割り当てられ得る場合、個々の発光マーカーの場所を個々の走査すべき部分範囲内で検出するためにはこのように少ない零点の場所で十分である。常に発光マーカーのうちの１つだけが発光光を放出する場合、すなわち時間的な区別が可能である場合、又は発光光が例えばその波長によって個々の発光マーカーに割り当てられ得る場合、このような割り当てが可能である。本発明による方法のこの実施形態では、ＭＩＮＦＬＵＸとして公知の方法が使用される。ＭＩＮＦＬＵＸでは、個々の発光マーカーの場所を特定するために、１つの平面で励起光の光強度分布の１つの零点が、試料中の４つの異なる場所に位置決めされ、そのために発光マーカーの発光光強度が検出される。
【００４０】
試料中の複数のサンプル内に割り当てられた関心対象では、これは例えばタンパク質分子、錯体のような分子であり得るが、シナプス、膜、他の細胞成分又は完全なウイルスのような、より複雑な生物学的単位であってもよい。
【００４１】
各零点による、部分範囲の連続する走査の順番は非常に速くてできるため、関心対象の迅速は変化も検出できる。
【００４２】
本発明は、走査され、それによって画像化された試料の部分範囲が非常に小さい状態にとどまることを意図的に妥協している。これはしばしば、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の波長の回折限界のオーダーでの間隔となる。しかし、走査された部分範囲に平均して作用する光強度が大幅に低減されることで、比較的色あせ傾向の強い発光マーカーを問題なく使用でき、又は走査された試料の部分範囲を強度分布の零点で反復走査可能である。
【００４３】
試料の部分範囲を迅速に強度分布の零点で反復走査可能であることは、動的なプロセスで関心試料中の構造を時間的に解像することも可能にする。試料中の発光マーカーは、本発明による方法において特に色あせ傾向が小さいため、つまり特に多くのフォトンを、個々の蛍光マーカーそれぞれが、試料のそれぞれ走査すべき部分範囲で受け取るため、特に多くの画像が試料の走査すべき部分範囲で撮影され得、それによって関心試料中の構造の長期間の変化も観察され得る。一般に、試料の部分範囲は、本発明による方法では、１００ｘ１００=１０，０００画素以下で走査される。これは数ミリ秒間で可能である。これにより、画像周波数１００Ｈｚ以上が実施できる。
【００４４】
しかしまた、本発明による方法では、走査すべき試料の部分範囲は、例えば試料中の個々の蛍光マーカーの移行を、変化した周辺条件が理由で検出するために、試料中の零点の非常に少ない位置でだけ走査され得る。
【００４５】
有利には、走査すべき試料の部分範囲の寸法は、試料中の零点が強度最大値に隣接している各方向で、この方向の強度最大値との間隔の４５％以下、２５％以下、又はそれどころか１０％以下である。発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度に関して、試料中の零点が強度最大値に隣接している、走査すべき試料の部分範囲の各方向の寸法が、光の強度が零点から各方向に、隣接している強度最大値で光の強度の５０％、２５％、１０％又は５％上昇する区間以下である場合有利である。これに応じて、走査すべき範囲内の発光マーカーの最大負荷は、隣接する強度最大値の光の強度の５０％、２５％、１０％又は５％に限定される。
【００４６】
本発明による方法では、発光マーカーでマーキングされた試料中の関心対象のサンプルを、走査すべき試料の部分範囲を零点で走査する前に他の方法で画像化し、走査すべき試料の部分範囲の位置を確定することは、しばしば有意義である。走査すべき試料の部分範囲は、変化した周辺条件が原因で対象の特別な詳細又は対象の展開が生じるように、関心対象のサンプルと重なり合う試料の部分範囲であるこの画像化は、発光光の放出のために局部的又は大面積で発光マーカーを励起して行うことができる。
【００４７】
走査すべき試料の部分範囲を走査する前に、走査すべき試料の部分範囲の位置を確定するために、試料のより大きな範囲を零点で、発光光の放出に作用する光より少なくとも５０％小さい強度で及び／又は少なくとも５０％高い走査速度で走査され得る。この先行する走査では、試料のより大きな範囲の全ての点に、強度最大値の範囲の光の高い強度が当てられる。そのために、この強度が意図的に弱められ、及び／又は短時間だけ発光マーカーに作用する。
【００４８】
本発明による方法の一実施形態では、試料のより大きな範囲を走査するために、個々の走査すべき試料の部分範囲を走査するのとは異なる、他の走査手段が使用される。
【００４９】
試料のより大きな範囲を走査するために異なった走査手段を使用する際、走査すべき試料の部分範囲を確定するために、及びそれに続いて走査すべき試料の部分範囲を走査するために、個々の狭く限定された走査すべき試料の部分範囲の走査には特別に調整された走査手段を使用できる。これは、試料中の走査すべき部分範囲の寸法が小さいために、光強度分布の零点による大きな移行を可能にできないでないが、それによってカバー可能な移行が非常に迅速に及び／又は正確に行われる、走査手段であり得る。こうして、例えば関心対象の迅速な変化を部分範囲内で行うために、非常に迅速な反復走査が走査すべき部分範囲で行われる。
【００５０】
具体的には、試料のより大きな範囲を走査するために、少なくとも１つの方向で試料ホルダが試料のために対物レンズに対して動かされ得、この対物レンズによって光が試料に向けられ、それに対して、個々の走査すべき試料の部分範囲を走査するために、少なくとも１つの方向に電気光学的スキャナ、音響光学的偏向器又はガルボミラーすなわちガルバノメータドライブ付き偏向ミラーが、使用される。個々の走査すべき試料の部分範囲を走査するための装置は、追加の電気光学的又は音響光学的変調器を、移相器として光強度分布の零点の移行のために組み合わせることができる。
【００５１】
すでに言及されたように、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は特に発光防止光であり得、この発光防止光は零点の外で発光マーカーによる発光光の放出を阻止する。例えば、発光防止光は、発光マーカーをスイッチング可能なタンパク質の形で、その中では発光光の放出のために励起できない暗黒状態に移行するか又はスイッチングする。発光防止光は特に励起光と共に、発光マーカーが発光光を放出するために励起されおよび強度最大値の強度分布が発光防止光の零点の範囲を備えている試料に向けられ得る。これは、走査すべき試料の部分範囲のための狭い限界を除いて、ＳＴＥＤ、ＲＥＳＯＬＦＴ又はＧＳＤ蛍光光顕微鏡法の一般的方法に相当する。
【００５２】
本発明による方法の好ましい一実施形態では、特許文献５（ＷＯ２０１４／１０８４５５Ａ１）で公知のコンセプト、ＳＴＥＤ蛍光顕微鏡が、スイッチング可能な発光マーカーと共に実施され、発光マーカーを非活性状態にスイッチングすることで、刺激光の強度最大値の範囲で高い強度から発光マーカーを保護するために、この方法が一部変更した形で適用。具体的には、走査すべき試料の部分範囲を零点で走査する前に、スイッチング可能な発光マーカーを試料の走査すべき部分範囲と隣接する部分範囲内で非活性状態にスイッチオフするような強度分布で、追加のスイッチオフ光が試料に向けられる。この隣接する部分範囲は、試料中の刺激光の零点の強度最大値と隣接している少なくとも１つの方向で、走査すべき部分範囲と隣接している。これにより発光マーカーは、刺激光の強度最大値が生じる場所で、及びこの保護対策なしでは発光マーカーが刺激光の高い強度で走査すべき試料の部分範囲の走査時に色あせしてしまう場所で、非活性状態にスイッチングされる。本発明による方法のこの実施形態では、発光マーカーの色あせがなくなることで、徐々に、また直接隣接するか又はそれどころか互いに重なり合って、走査すべき部分範囲のために実施され得る。言い換えると、試料は走査すべき部分範囲で走査され得、その際に走査すべき部分範囲は全ての又は試料中の少なくとも選択された位置で、零点で走査される。
【００５３】
スイッチオフ光の強度分布は、それぞれ引き続いて走査すべき部分範囲で、破壊的な干渉によって形成された局部的な強度最小値を備えることができ、その強度最小値ではスイッチオフ光は発光マーカーを少なくとも実質的にスイッチオフせず、つまりその中ではそれは発光マーカーを少なくとも実質的に活性状態のままにし、その状態ではそれは励起光によって励起可能である。スイッチング可能な発光マーカーの選択に応じて、この活性状態を必要とする、又は少なくとも有意義にすることができる。スイッチオフ光を試料に向ける前及び／又はそれと時間的に重なり合って、スイッチング可能な発光マーカーをその活性状態にスイッチオンするスイッチオン光が各走査すべき試料の部分範囲に向けられる。
【００５４】
スイッチオン及び／又はスイッチオフ時に放出するスイッチング可能な発光マーカーは、しばしば同じく発光光である。この発光光は本発明による方法では記録され、評価され得る。この評価の目的は例えば、各励起された部分範囲を限定して走査すべき部分範囲がそもそも零点で走査されるのかどうか、又は全体として励起光が当てられるのかどうかを決定することであってよく、その際に放出される発光光は共焦点で記録され、又はまったく励起光が当てられないかどうかを決定することであってよく、なぜならスイッチオン及び／又はスイッチオフ時に記録された発光光の強度が小さいことは、発光マーカーでの関連する濃度がそれぞれ走査すべき部分範囲にあることを示すからである。さらにこの評価は、どんな条件下で刺激光を試料に向け、隣接する部分範囲で限定される走査すべき部分範囲、及び零点の範囲から放出された発光光の記録が、有意義に中断するかを決定するという目的を持っていてよい。つまり、例えば上限値及び／又は下限値は、ＲＥＳＣｕｅ法を実施するために、それぞれ走査すべき部分範囲において、評価の結果に依存して決定され得る。
【００５５】
本発明による方法の特別な一実施形態では、零点の範囲から放出された発光光がポイントセンサで記録され、試料に対するその位置が、試料のそれぞれ走査すべき部分範囲の走査時に変更されない。つまり、発光光がポイントセンサで記録された時には、光発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度分布の零点の位置変化は考慮されない。なぜなら、走査すべき部分範囲の寸法が、試料に対するポイントセンサの検出範囲よりも規則的に小さいため、このことが可能だからである。このことは、各走査すべき部分範囲の中心点に対して共焦点に配置されたポイントセンサにも適用される。ポイントセンサ自体にも、走査すべき試料の部分範囲全体からの発光光が規則的に到達する。なぜならその寸法は規則的に発光光の波長の回折限界を下回るからである。位置が固定されたポイントセンサとは、試料のそれぞれ走査すべき部分範囲の零点が、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光だけに作用することで、移動されるということを意味する。場合によってあり得る励起光も、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光と一緒に移動される必要はない。なぜならその強度最大値も、通常走査すべき試料の部分範囲全てに広がっているからである。
【００５６】
すでに言及されたように、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は別法として発光可能化光であり得、この発光防止光は零点の外で発光マーカーによる発光光の放出をまず第一に可能にする。このことには、発光励起光が試料に向けられた唯一の光であることが含まれる。これには、この光が発光活性化光であり、この光が発光マーカーを暗黒状態から発光のために励起される状態に移行する、すなわち活性化することも含まれる。発光マーカーによる発光光の放出に作用する光は、２つの機能、つまり活性化と励起を持つことも可能であり、そのために波長の異なる２つの成分を備えている。さらに試料の部分範囲が、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度分布の零点で走査される場合、部分範囲内にある発光マーカーが零点に隣接する強度最大値の範囲内で高い光強度が当てられないか、又は少なくとも可能な限り少なく当てられるようにするために、この部分範囲は本発明により小さく保たれる。試料中の発光マーカーによって放出される発光光の検出は、本発明による方法のこの実施形態では、通常１台のカメラで行われ、及び評価は試料中の零点の現在の位置及びそれに伴う、試料から放出されてカメラによって検出される発光光の強度分布の変化という観点から、記録された強度分布を展開することで行われる。
【００５７】
走査すべき部分範囲内でそれぞれただ１つの発光マーカーが検出された発光光を試料から放出する場合、例えば局部的な極値を示す関数を適用することで、試料中のその位置が非常に簡単に、零点の異なった場所に記録された発光光から特定され得、その際に、発光マーカーの探していた位置の適用された関数の極値の場所が同一視される。この方法は、発光マーカーによる発光光の放出に作用し、その強度分布が零点を備えている光が発光防止光である場合でも、それが発光可能化光又は励起光である場合でも、可能である。最初の場合、零点に境を接する発光防止光の強度最大値は、有利には、近くにある他の発光マーカーから放出される発光光が位置調整を妨害することを阻止する。２つ目の場合、各発光マーカーには走査すべき部分範囲内で最小光量しか当てられず、それによって光化学的に与えられる負荷が最小である。
【００５８】
走査され、それによって画像化された試料の部分範囲がそれぞれ非常に小さいままであるという本発明による方法の短所は、試料が複数の部分範囲で同時に走査されることで、少なくとも部分的に補われ得る。その際、基本的に公知であるように、特に発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の零点のラスターが使用され得る。しかしその際、零点のラスターは、本発明により、試料が全体として画像化されるほどには、つまりラスター寸法全体ほどにはずらされない。むしろ、その中で試料が走査される個々の部分範囲は、本発明による方法のこの実施形態でも互いに分離されているままである。このようにしてのみ、試料の走査された部分範囲で本発明による発光マーカーの色あせの危険が低減される。本発明のこの並列された実施形態は、スイッチング可能な発光マーカーによって実施され、この発光マーカーはそれぞれ試料の走査すべき部分範囲でのみその蛍光性状態にあり、試料を補って走査すべき部分範囲も走査され得、完全な画像化が可能になることは明らかである。
【００５９】
本発明による方法では、関心対象の複数のサンプルが、複数の走査すべき試料の部分範囲の１つとそれぞれ重なり合って配置されているため、各部分範囲の走査時にはこの対象の部分画像が得られる。この部分画像が統計的に対象に分散され、及びその数が十分大きい場合、そこから関心対象全体の１つの画像が再構成され得る。これが関心対象の異なったサンプルが少なくとも広範囲にわたって一致することを前提とすることは明らかである。部分画像を関心対象の特定の点に割り当てるため、試料中の関心対象のサンプルを追加的に他の方法で画像化でき、それによってその位置と配列を試料の走査された部分範囲に対して特定できる。
【００６０】
本発明による方法を実施するための走査発光顕微鏡は、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光のための光源、光を強度分布によって強度最大値に隣接する零点を備えた試料の方向に向ける光形成手段、走査すべき試料の部分範囲を零点走査する走査手段、零点の範囲から放出される発光光を記録する検出器、及び本発明による方法を実施するための制御装置を備えている。
【００６１】
この検出器は点検出器であってよく、その場合試料に対する点検出器の位置は、試料の走査すべき部分範囲の走査時に固定できる、つまりこれをスキャンから除外することなく試料から放出される発光光が検出できる。なぜなら走査すべき部分範囲は一般に回折限界を下回る寸法であるからである。さらに、試料の走査すべき部分範囲を零点で走査するための、及び試料のより大きな範囲を走査することを企図している走査手段とは異なる、その他の走査手段があってよい。
【００６２】
ここでも、試料のより大きな範囲を走査するための走査手段は、少なくとも１つの方向に光形成手段１つの対物レンズに対して可動の試料ホルダを備えているのに対して、試料の走査すべき部分範囲を走査するための走査手段は、少なくとも１つの方向に電気光学的スキャナ、音響光学的偏向器又はガルボミラーを備えていてよい。
【００６３】
しかしこの検出器は、例えば点検出器であってもよく、これはスキャンから除外された発光光を試料から検出し、又はスキャンから除外されない発光光を試料に対して固定された相対位置で検出するカメラのような平形検出器であってよい。
【００６４】
本発明によるＳＴＥＤ法を実施するための走査発光顕微鏡では、光源が供給する光が刺激光であり、及び別の光源が励起光のために備えられており、その際に光形成手段が光強度分布によって励起光を、発光防止光の零点の範囲に最大値を有している試料の方に向ける。
【００６５】
スイッチング可能な発光マーカーを使用する、本発明による方法を実施するために、走査発光顕微鏡では追加的にスイッチオフ光源がスイッチオフ光のために備えられ、その際に光形成手段がスイッチオフ光を、スイッチング可能な発光マーカーが走査すべき部分範囲と境を接する試料の部分範囲で、非活性状態でスイッチオフされるような強度分布で試料の方に向ける。この隣接する部分範囲は、この場合その中で試料中の刺激光の零点の強度最大値と隣接している少なくとも１つの方向で、走査すべき部分範囲と境を接している。その上、スイッチング可能な発光マーカーをその活性状態でスイッチオンするスイッチオン光のためのスイッチオン光源を備えていてよく、その際に光形成手段がスイッチオフ光を、走査すべき部分範囲にある試料に向ける前及び／又はそれと時間的に重なり合って、試料の部分範囲全体に向ける。
【００６６】
本発明による方法の実験的な検査では、試料中の発光マーカーからのフォトンの収率が、１ファクタ＞１００を達成した。このことは例えば、変化を記録するために、変化した関心構造の画像を１００回多く撮影され得ることを意味している。その上、それぞれ個々の画像のために必要な時間は短い。なぜなら長期的に時間単位当たりより多くのフォトンが試料中の発光マーカーから放出されるからである。
【００６７】
有利には、本発明の発展形態は請求項、説明及び図で示される。説明中に挙げられた特徴と複数の特徴の組合せの利点は単なる例であり、これらの利点を必ず本発明による実施形態で達成する必要なしに、選択的又は追加的に実施されてよい。これによって元の出願書類及び特許の開示内容の観点から、添えられた請求項の対象が変えられることなしに、以下が適用される：その他の特徴は図から、特に示された複数の構成部品の相互の形状及び相対的な寸法、及びその相対的な配置と作用接続から見て取れる。本発明の異なった実施形態の特徴、又は異なった請求項の特徴を組み合わせることは、同様に請求項の選択された後方参照とは相違して可能であり、及びこれによって提案される。これは、独立した図に示されるか又はその説明が挙げられた特徴にも該当する。これらの特徴は、異なった請求項の特徴と組み合わせることもできる。同様に、異なった請求項に挙げられた特徴が本発明の別の実施形態では省略されてもよい。
【００６８】
請求項及び挙げられた特徴の説明の中で、数に関しては、正確にその数が、又は挙げられた数よりも大きな数が、「少なくとも」という明示的な副詞を必要とすることなく、解釈されるものとする。つまり例えば、１つの光源とは、正確に１つの光源、２つの光源又は複数の光源であると解釈されるものとする。この特徴は、他の特徴で補足され得るか、又はそれから各装置が構成されるか又はそれが各方法を備えている、１つの特徴であってよい。
【００６９】
請求項に含まれる符号は、請求項によって保護される対象の範囲を限定するものではない。これは単に、請求項を理解しやすくするためのものである。
【００７０】
以下では、本発明が図に示された好ましい実施例を用いて説明され、記述される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】は、試料中に配置されている発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の例として、励起光及び蛍光防止光の、及び結果として生じた、蛍光光を放出するための試料中の蛍光マーカーの効果的な励起の、模式的強度分布である。
【図２】は、図１に従った蛍光防止光の強度分布のための、図１に従った強度分布による、本発明による方法において試料の走査すべき部分範囲の寸法である。
【図３】は、試料の走査すべき部分範囲の模式的平面図であり、ここでは走査が蛇行軌道に沿って行われる。
【図４】は、試料の走査すべき部分範囲の模式的平面図であり、ここでは走査がらせん軌道に沿って行われる。
【図５】は、本発明による方法を実施するための、蛍光顕微鏡を、例として走査発光顕微鏡を模式的に図示している。
【図６】は、（ａ）あらかじめ撮影した試料の共焦点の画像、及び（ｂ）個々の走査すべき試料の部分範囲が共焦点画像に基づいて選択された後に本発明により撮影された試料の部分画像である。
【図７】は、撮影可能な画像の数と試料の走査された部分範囲の寸法との間の従属関係である。
【図８】は、本発明による方法を実施するための、図５とは異なる蛍光顕微鏡を、例として走査発光顕微鏡を図示している。
【図９】は、その中で走査蛍光顕微鏡によってスイッチオフ光が試料に向けられた、同時に隣接する部分範囲を表示した、走査すべき試料の部分範囲の模式図である。
【図１０】は、試料を走査すべき部分範囲で走査するための、図９に従った試料中の複数の走査すべき部分範囲の配置図である。
【図１１】は、試料中の走査すべき部分範囲の別の配置図である。
【図１２】は、本発明による方法の実施形態のブロック図である。
【図１３】は、図１２に従った本発明による方法による、試料中の走査すべき部分範囲の配置図である。
【図１４】は、関心対象の変化した周辺条件に対する反応の模式図である。
【図１５】は、走査すべき部分範囲を走査する際の、試料のわずかな場所だけにある零点の配置である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
図１では、上は励起光１の強度分布の断面が示されている。励起光１は、幾何学的な焦点Ｆで強度最大値２７が最大強度Ｉを備えている。しかしこの強度Ｉは、各方面で焦点Ｆを大幅に超えて伸びた範囲に分散されており、その回折限界直径は、励起光１の波長ラムダと励起光１の使用対物レンズの焦点Ｆでの焦点合わせのための開口数ＮＡで、ラムダ／ＮＡに相当する。励起光１で達成された試料中の蛍光マーカー励起を、励起光１の強度分布の拡張よりも小さい範囲に限定するために、追加的に蛍光防止光２が試料に向けられ、この光が強度最大値３に隣接する零点４を備えている。この蛍光防止光２は、例えば刺激された放出によって蛍光マーカーを再び鎮静化することで、励起光１によって励起された蛍光マーカーからの蛍光光の放出を阻止する。蛍光防止光２の零点４の範囲５の外側ならどこでも、蛍光防止光２の強度Ｉはこの鎮静化が完全に実行されるほど大きい。つまり、そこに配置された蛍光マーカーは蛍光光を放出しない。反対に、ここで「零点４」とは範囲５全体を意味し、その中では、蛍光防止光２の強度Ｉが、その中に配置された蛍光マーカーによる蛍光光の放出を阻止しないほどに小さく維持される。図１では、下は効果的な蛍光励起６の空間的な分布である。これは範囲５で零点４と境を接している。零点４で試料が走査されると、試料から放出された蛍光光が常に範囲５からのみ出て、それに応じて試料の場所に割り当てられる。
【００７３】
零点４が試料の走査時に蛍光染料でマーキングされた関心構造に近づくと、蛍光マーカーはまず強度最大値３の範囲に接近し、それによって重なり合った励起光１の強度が、それが範囲５で零点４に達する。特に列単位の試料走査は、最初に蛍光光がそれによって記録される前に、蛍光マーカーに高い光強度を反復して当てることで行われる。これは、初めて零点４から到達される前に、蛍光マーカーがすでに色あせているという結果をもたらす。例えば蛍光マーカーでマーキングされた試料の関心構造の時間的変化を観察するための、同じ試料の反復走査も、この作用でしばしば不可能である。
【００７４】
しかし、図２に示されたように、零点４で走査された試料の範囲が、強度最大値３の間の間隔Ｄ０の最大３／４又は７５％に限定される場合、走査された範囲ですでに蛍光マーカーで平均的な負荷に低下し、この平均的な負荷は、強度最大値３の範囲の蛍光防止光２の高い強度によって、特に図１に従った励起光１の強度と関連して、表れる。走査すべき範囲の寸法が強度最大値３の間隔Ｄ０の半分で、限定が小さくなる場合、この負荷はさらに低下する。寸法がＤ０／２より小さく限定されると、試料の走査すべき部分範囲で、強度最大値３の直近の範囲に１つも点が到達しない。走査すべき範囲の寸法がＤ０／４に限定されると、試料が走査すべき範囲内で与えられる、蛍光防止光２の最大強度は、約Ｉ０／２に限定され、その際Ｉ０は強度最大値３内で蛍光防止光２の最大強度である。
【００７５】
図３は、断面で示された試料８の走査すべき部分範囲７の走査を示しており、ここでは蛇行形状の軌道９の長手方向に零点４の範囲５がある。ここで走査すべき部分範囲７は、強度最大値３内に示され、この場合この強度最大値３の位置は走査すべき部分範囲７の中心点１０で零点４の配置に一致している。これに応じて、強度最大値は、もっと正確に言えば、ここで図３に示された零点４の位置の周りのリング形状の強度最大値３は、続いて走査すべき部分範囲７に伸びており、これが破線１１で示されている。この重なりは、走査すべき部分範囲７がさらにＤ０／２より小さく限定されることで阻止され得る。しかしまた、ここで与えられた、走査すべき部分範囲７の寸法を約２Ｄ０／３へ限定することで、試料８への蛍光防止光２の平均的な照射が部分範囲７で大幅に低減される。
【００７６】
図４は、Ｄ０／２に限定された試料８の走査すべき部分範囲７を示している。ここでは破線１１で示されたリング形状の強度最大値３の伸びが、零点４のどの位置でも、走査すべき部分範囲７で、もう部分範囲７に到達しない。さらに、図４はらせん軌道１２を示しており、これに沿って、走査すべき部分範囲７が中心点１０から出発して走査される。零点４が走査すべき部分範囲７の走査時に動かされる軌道の形状には無関係に、試料８から放出されて記録された蛍光光は試料中の各零点の場所４に割り当てられる。
【００７７】
図５は、本発明による方法を実施するために特に適している走査蛍光顕微鏡１３を示している。この走査蛍光顕微鏡１３は、蛍光防止光２のための光源１４を備えており、その断面が拡大レンズ１５で拡大され、及びその波先がその断面を超えて、位相板１６を使って、対物レンズ４５で試料８に焦点を合わせる際に零点４が隣接している強度最大値３と、図１及び図２に従って、各焦点Ｆの周りに形成されるように変調される。励起光１のために、別の光源１７が拡大レンズ１８と共に備えられている。ダイクロイックミラー１９を使って、励起光１と蛍光防止光２がまとめられ、その結果励起光１は蛍光防止光２の零点４の範囲５でその強度最大値２７を図１に従って備えている。試料から、正確には蛍光防止光２の零点の範囲から放出された蛍光光２０は、ダイクロイックミラー２６によってアウトカップリングされ、点検出器２１を使って記録され、各零点の場所で試料内に配置される。試料の各部分範囲を零点で走査するために、走査手段２２及び２３は２つの互いに直交する走査方向のために備えられており、これらが互いに調整されて走査される。走査手段２２及び２３は、励起光１及び蛍光防止光２の方向にのみ作用し、これらはそれどころか蛍光防止光２の光学経路にのみ配置されている。試料８の走査すべき部分範囲７は寸法が回折限界を下回るため、点検出器２１の試料８に対して固定された配置でも蛍光防止光２の零点の範囲から、試料８から放出された蛍光光２０は常に点検出器２１内に、つまり零点の移行にもかかわらず、走査手段２２及び２３を使用して到達する。本発明により走査される、試料８の走査すべき部分範囲７は、試料８を超えて走査され、例えばまず適切な走査すべき部分範囲の位置を特定するために、別の走査手段を試料ホルダ２４の範囲に備えており、この手段はここでは単に対応するスライドシンボル２５で示されている。
【００７８】
これまでの記述では、空間解像度が関心試料中の構造８の画像化でこのｚ方向にも高めるために、蛍光防止光２の強度分布の零点４が、蛍光防止光２が試料の方に向けられたｚ方向にも、強度最大値３で限定されていてよいということは、明示的に表現されていなかった。それに応じて、走査すべき部分範囲７はこのｚ方向でも最大７５％、好ましくは５０％未満に、光の強度最大値の間隔がこの方向にも限定されるか、又はｚ方向にもその中心点１０で始まって、この中心点１０からの間隔を増大しながら走査される。高められた空間解像度は、ｚ方向への構造の画像化の場合、本発明による方法で、しかし他の処置でもやはり達成でき、例えば蛍光光の放出のための蛍光マーカーの４Ｐｉレイアウト又は２フォトン励起によって、又は他の蛍光顕微鏡検査法分野で公知の処置によって達成できる。ここに記述された方法が他の蛍光顕微鏡検査法分野で公知の処置によって補足され得ることも、基本的に適用される。これに加えて、例えば蛍光防止光２及び／又は励起光１をパルスで当てること、同時に連続的に励起光１又は蛍光防止光２を当てること、定義された時間窓で各パルスなどのあとに蛍光光のゲート記録が行われることなどがある。
【００７９】
この共焦点画像は、図６（ａ）に従い、それによって発光マーカー、ヌクレオポリンｇｐ２１０によってマーキングされた関心構造の試料が撮影された。共焦点画像は関心構造の概要を示す。この概要から、個々の試料の部分範囲が選択され、その中でＳＴＥＤ画像が本発明による方法により撮影された。この部分範囲は励起光の焦点よりも小さい。部分範囲には、関心構造が高い空間解像度で、及び同時に高い発光効率で画像化される。図６（ｂ）に示された、走査された部分範囲を再現する試料の部分画像を撮影するため、波長６３５、出力５μＷの励起光がパルスで、反復速度２０ＭＨｚで試料に向けられた。波長７７５ｎｍのＳＴＥＤ光は、パルス長１．２ｎｓ、出力１５０ｍＷの同期パルスで試料に向けられた。励起光及びＳＴＥＤ光は、１．４ＮＡのオイル逆転対物レンズで試料に焦点が合わせられた。蛍光光はオイル逆転対物レンズとその他のレンズによって点検出器に焦点が合わせられた。
【００８０】
図７は、走査された試料の部分範囲の寸法に応じて、染色された核膜孔タンパク質という例を使って、ＳＴＥＤ走査蛍光顕微鏡により、色あせ傾向が示されている。ｐ１／２は蛍光信号が色あせによって元の値の半分に低下するまでに撮影できる画像の数を表している。試料の走査された部分範囲の寸法がナノメートルで、１／２でグラフ化されている。ＳＴＥＤ性能は１６０ｍＷで、励起性能は２μＷである。それ以外は、図６に従ったＳＴＥＤ条件に相当する。走査された部分範囲の寸法１００ｘ１００ｎｍ２では、色あせは寸法８００ｘ８００ｎｍ２と比べて係数１００低減されている。それに応じて、例えば動的プロセスで観察するために、同じ部分範囲で１００回多く画像が撮影できる。
【００８１】
図８には、走査蛍光顕微鏡１３は図５に示された走査蛍光顕微鏡とは以下の相違点がある。点検出器２１は、試料８から見て、走査手段２２及び２３の後方に配置され、そのために走査手段が試料８から来る蛍光光２０を点検出器２１に対してスキャン回避する。その際、走査手段２２及び２３は、走査すべき部分範囲の蛍光防止光２の零点による走査だけでなく、試料８中での走査すべき部分範囲の基本的な配置又は移動も企図している。図８は、試料８から見て走査手段２２及び２３の前に配置された蛍光光用検出器２８も示している。しかしここではこれは点検出器ではなく、カメラ２９であり、つまり平形検出器である。この検出器２８は、点検出器２１に加えて、又は点検出器２１の代わりに備えられてよく、その際に蛍光光２０を検出器２８からそらすダイクロイックミラー３０が、一時的に又は恒久的に対物レンズ４５と走査手段２２及び２３との間に配置されている。
【００８２】
さらには、走査蛍光顕微鏡１３では、図８に従い、スイッチオフ光源３１が備えられており、これには拡大レンズ３２が割り当てられていて、これによって各走査すべき部分範囲を蛍光防止光２の零点で走査する前にスイッチオフ光３４が用意される。スイッチオフ光３４は、ダイクロイックミラー４３を使用してインカップリングされ、ビーム形成手段３３によって、走査すべき部分範囲と境を接する試料の部分範囲８が試料８中に含まれるスイッチング可能な発光マーカーを非活性状態にスイッチングするように、試料８中の強度分布が形成される。この非活性状態では、試料８中のスイッチング可能な発光マーカーは、励起光１によって蛍光光２０を放出するようには励起され得ない。これに応じて、非活性状態にある発光マーカーでは、刺激光の形で蛍光防止光２による色あせの危険がなくなる。こうして、図８に従ったこの走査蛍光顕微鏡１３を使用してすでに走査された、走査すべき部分範囲に隣接する試料の部分範囲８を、蛍光防止光２の零点で走査し、その際に試料８からの蛍光光２０が記録されることが可能である。なぜならそこにある発光マーカーはあらかじめ走査された走査すべき部分範囲の走査時に色あせることがないからであり、その理由はそれが色あせしないよう保護する非活性状態にあるからである。
【００８３】
隣接する走査すべき部分範囲の発光マーカーを励起光１で蛍光光２０放出のために励起できるよう、これは再びその活性状態になければならない。そのために、発光マーカーがその非活性状態から活性状態に自然に戻るまで待たなければならない。しかし図８に従った走査蛍光顕微鏡１３は、追加的にスイッチオン光源３５と拡大レンズ３６も備えており、それによってスイッチオン光３７がダイクロイックミラー４４を通って試料８に向けられ、それによって次の走査すべき部分範囲の発光マーカーが、まずその活性状態にスイッチングされる。その際、スイッチオン光３７で検出された試料の部分範囲８は、次の走査すべき部分範囲より大きい可能性がある。なぜなら、続いてスイッチオフ光３４によって次の走査すべき部分範囲の外の発光マーカーがその非活性状態に移行されるからである。それゆえに、この走査蛍光顕微鏡１３を使用して、試料８は２段階で、すなわち、大きなステップで走査すべき部分範囲を、小さいステップでそれぞれ走査すべき部分範囲にある蛍光防止光２の零点で、走査され得る。
【００８４】
試料８中の発光マーカーのスイッチオン及び／又はスイッチオフの際に、スイッチオン光３７又はスイッチオフ光３４を使用して、スイッチング可能なさまざまな発光マーカーが蛍光光２０の放出のためにも励起される。この蛍光光２０は、それによってすでに各試料の部分範囲８にある発光マーカーの濃度に関する情報を与える。この情報は、適切に評価されて、次の走査すべき部分範囲を蛍光防止光２の零点で走査することが実行するに値するのかしないのかを決定するために使用され得る。それが実行に値しない場合、そのような走査も実行されず、試料８には不要な蛍光防止光２が当てられない。さらに、発光マーカーのスイッチオン又はスイッチオフ時に記録された蛍光光２０も、走査すべき部分範囲の蛍光防止光２の各零点の場所で記録された蛍光光の上限値及び／又は下限値を確定するために使用可能であり、それが達成されるかされないかで、ＲＥＳＣｕｅ方法において試料８に発光防止光２及び励起光１を当てることが中止される。
【００８５】
最後に図８には、走査蛍光顕微鏡１３を本発明による方法により制御するために、光源１４及び１７の制御装置３８、スイッチオン光源３５、スイッチオフ光源３１、及び走査手段２２及び２３が示されている。
【００８６】
図９は、蛍光防止光の零点が走査すべき部分範囲７の中心点１０にある場合の、走査すべき部分範囲７及びその周囲に広がる蛍光防止光強度最大値３を示している。図９はさらに、リング形状で隣接する部分範囲３９を示しており、その中では部分範囲７が走査される前に試料８にスイッチオフ光３４が当てられて、そこにあるスイッチング可能な発光マーカーがその非活性状態に移動される。部分範囲３９では部分範囲７が空いている。つまり部分範囲７ではスイッチオフ光３４の強度がゼロ又は少なくとも発光マーカーを時間内にスイッチオフするほど小さい。この時間スイッチオフ光３４が試料８に向けられるが十分ではない。スイッチング可能な発光マーカーが少なくとも試料８走査すべき部分範囲７で活性状態にあることを確保するため、スイッチオフ光３４の前及び／又はそれと時間的に重なり合って、スイッチオン光３７が走査すべき部分範囲７を含むリング状の部分範囲４０にわたって、試料８に向けられる。
【００８７】
図１０では、走査すべき部分範囲７で試料８がどのように走査可能であるかが示されている。ここでは図１０（ａ）は、複数の連続する円形の部分範囲７の位置が図９に従って試料８に示しており、そのうちの１つの部分範囲７では軌道９があり、それに沿っての試料８の部分範囲７内で正方形の範囲で走査される。図１０（ｂ）では、どのようにしてような正方形の部分範囲４１で試料８を完全にカバーし、それに応じて完全に撮影可能かが示されている。
【００８８】
図１１（ａ）では、他の形の試料８の部分範囲７の走査が示されている。ここでは円形の部分範囲７の連続する状態で、試料８の六角形の配置が示されている。その際、軌道９はその各部分範囲７に沿って伸び、それによって発光防止光の零点で、規則正しい六角形に走査される。図１１（ｂ）では、どのようにしてような規則正しい六角形４２が試料８全体で確認され、相応に撮影されるかが示されている。
【００８９】
図１２は、ブロック図で示された本発明による方法の実施形態であり、発光マーカーを備えた複数の関心対象のマーク４６から始まっている。ここでは各関心対象は確かに複数の発光マーカーでマーキングされている。しかし各対象当たりの発光マーカーの数は少なくてよく、例えば２つだけである。具体的には、対象の構造をこの２つの関心対象の範囲が現在互いにどれほど離れているかという趣旨で画像化するために例えば２つの同じ又は２つの異なった蛍光マーカーを備えたタンパク質のような、２つの異なった関心対象の範囲であってよい。次に続く、試料８の走査すべき部分範囲７の複数の関心対象の指示４７は、関心対象の部分範囲７それぞれに配置されている。各部分範囲の正確に１つの関心対象の指示４７は、免疫反応をベースに行われ得、それを介してそれぞれ１つの関心対象が、各走査すべき部分範囲７の中心点につなげられる。後続の、試料８中の発光マーカーの場所の特定４８は、走査すべき部分範囲７を、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の、つまり例えば発光励起光の強度分布の零点で走査することで行われる。具体的には、試料８中の発光マーカーの場所は発光光の強度で特定でき、この強度は試料中の零点８の個々の場所で、部分範囲７のそれぞれに関して記録された。これに続いて関心対象の周辺条件の変更４９は、対象の構造及びそれによって試料８中の発光マーカーの相対的な場所に作用し、この作用が特定４８を反復することで確認できる。ここでは特定４８が何度も反復され、その際にこの反復がすでに変更４９中に開始され、関心対象が変更された周辺条件に対する動的な反応を検出するために、その後も継続され得る。
【００９０】
図１３は、固定点５０に対して多数の走査すべき部分範囲７がパターン５１に定義されている試料８を示している。パターン５１はここでは正方形のパターンであり、その中に部分範囲７が行５２と列５３で規則的に配置されている。ここでは走査すべき部分範囲７はどれでも、固定点５０を使用して見つけ出すことができ、発光マーカーによる発光光の放出に作用する光の強度分布の零点でアプローチできる。部分範囲７の中心点５４では、関心対象が前述の免疫反応によってインカップリングされ得、その結果各部分範囲７と重なり合って、それぞれ１つの関心対象に配置されている。
【００９１】
図１４は大幅に模式化した関心対象５５で、これは２つの範囲で２つの個々では異なって示された発光マーカー５６及び５７でマーキングされている。これは、発光マーカー５６及び５７が線形状の対象５５の２つの端部に配置されていることを示している。図１４ａには対象の伸ばされた構造５５が、図１４ｂには曲げられた、又は折りたたまれた構造５５が示されている。図１４ａによる伸ばされた構造と図１４ｂによる折りたたまれた構造との変更点は、変更された周辺条件に対する構造５５の反応であってよく、例えば変更されたｐＨ値又は特定の化学物質が存在することである。ここで、本発明による方法による構造の変更点は、２つの発光マーカー５６及び５７の間隔を検出することで、簡単に記録され得る。加えて、そこから放出される発光光が、波長が異なっていることが理由で、又は時間的に分離可能である場合、２つの発光マーカー５６及び５７の試料中の位置は同時に特定され得る。なぜなら２つの発光マーカー５６及び５７はそれぞれ一時的にしか発光光を放出しないからである。たとえそれが同じであっても２つの発光マーカー５６及び５７のどちらか１つだけによる発光光の一時的放出は、さまざまな状況で、例えば発光マーカー５６及び５７が発光励起光による励起によって一時的に暗黒状態になることで、又は追加的なスイッチオフ光を一時的に暗黒状態にスイッチングされることが可能な、スイッチング可能な発光マーカーとして形成されることで、達成できる。
【００９２】
図１５は、走査すべき部分範囲７の４つの場所５８及び５９を示している。ここには、発光マーカー５６、５７の個々の放出場所を部分範囲７内で特定するために、発光光の放出に作用する光の強度分布の零点を配置され得る。ここでは、場所５８は部分範囲７の中心点５４にあり、場所５９は部分範囲７の辺縁範囲の円弧にある。部分範囲７が４つの零点の場所だけで走査されることで、各発光マーカー５６又は５７の場所を試料の１つの平面で特定するため、この特定は非常に速く行うことができる。さらに、発光光の放出に作用し、かつ零点を持つ強度分布で試料に向けられる光が、励起光であり、つまり各発光マーカー５６、５７にわずかな強度で当てられる場合、その位置を部分範囲７内で特定するためには各発光マーカー５６、５７の非常にわずかなフォトンしか必要としない。このことは、変更された周辺条件に対する関心対象５５の反応を検出するために、敏感な発光マーカーでも反復位置調整を許容する。
【符号の説明】
【００９３】
１  励起光
２  蛍光防止光
３  強度最大値
４  零点
５  範囲
６  励起
７  走査されるべき部分範囲
８  試料
９  軌道
１０  中心点
１１  破線
１２  らせん軌道
１３  走査蛍光顕微鏡
１４  光源
１５  拡大レンズ
１６  位相板
１７  その他の光源
１８  拡大レンズ
１９  ダイクロイックミラー
２０  蛍光光
２１  点検出器
２２  走査手段
２３  走査手段
２４  試料ホルダ
２５  スライドシンボル
２６  ダイクロイックミラー
２７  強度最高値
２８  検出器
２９  カメラ
３０  ダイクロイックミラー
３１  スイッチオフ光源
３２  拡大レンズ
３３  ビーム形成手段
３４  スイッチオフ光
３５  スイッチオン光源
３６  拡大レンズ
３７  スイッチオン光
３８  制御装置
３９  隣接する部分範囲
４０  部分範囲
４１  正方形
４２  六角形
４３  ダイクロイックミラー
４４  ダイクロイックミラー
４５  対物レンズ
４６  マーク（ステップ）
４７  指示（ステップ）
４８  特定（ステップ）
４９  変更（ステップ）
５０  固定点
５１  パターン
５２  列
５３  段
５４  中心点
５５  対象
５６  発光マーカー
５７  発光マーカー
５８  場所
５９  場所
Ｆ  焦点
Ｉ  強度
Ｄ０  間隔
【図１】
2019507921.tif 000003
【図２】
2019507921.tif 000004
【図３】
2019507921.tif 000005
【図４】
2019507921.tif 000006
【図５】
2019507921.tif 000007
【図６】
2019507921.tif 000008
【図７】
2019507921.tif 000009
【図８】
2019507921.tif 000010
【図９】
2019507921.tif 000011
【図１０（ａ）】
2019507921.tif 000012
【図１０（ｂ）】
2019507921.tif 000013
【図１１（ａ）】
2019507921.tif 000014
【図１１（ｂ）】
2019507921.tif 000015
【図１２】
2019507921.tif 000016
【図１３】
2019507921.tif 000017
【図１４（ａ）】
2019507921.tif 000018
【図１４（ｂ）】
2019507921.tif 000019
【図１５】
2019507921.tif 000020
【国際調査報告】
2019507921.tif 000021
2019507921.tif 000022
2019507921.tif 000023
2019507921.tif 000024
2019507921.tif 000025
2019507921.tif 000026