(57)【要約】皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法をここに開示する。本方法は、少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に抗加齢生物活性組成物を適用するステップを含む。抗加齢生物活性組成物は、少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間に適用される。一実施態様では、抗加齢生物活性組成物は、有効量のaNelumbo nuciferct（アネルムボ・ヌシフェルクト）（Sacred Lotus（セイクレド・ロータス））セラム・フラクションを含む。別の実施態様において、抗加齢生物活性組成物は、有効量のChamomillct recutita（カモミリクト・レクティタ）（German Chamomile（ジャーマン・カモミール））フラワーのセラム・フラクションを含む。他の実施態様において、抗加齢生物活性組成物は皮膚科学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
2019506436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法であって、少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に抗加齢生物活性組成物が適用されるステップを含み、
前記抗加齢生物活性組成物は有効量のNelumbo nucifera（ネルムボ・ヌシフェラ）（Sacred Lotus（セイクレド・ロータス））セラム・フラクションを含み、および
前記抗加齢生物活性組成物は少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される、方法。
【請求項２】
前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの有効量は合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある、請求項1の方法。
【請求項３】
前記抗加齢生物活性組成物には、皮膚科学的に許容可能な担体がさらに含まれる、請求項1の方法。
【請求項４】
抗加齢生物活性組成物には、合計組成物の重量で、前記Nacumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの0.001％から99％までが含まれる、請求項3の方法。
【請求項５】
抗加齢生物活性組成物は皮膚の日光への曝露の悪影響を軽減する、請求項1の方法。
【請求項６】
抗加齢生物活性組成物は皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の悪影響を軽減するために相乗的に作用する多機能活性を有する、請求項5の方法。
【請求項７】
抗加齢生物活性組成物は、皮膚水和、皮膚バリア機能、皮膚弛緩、皮膚のしわの外観、排出およびボディコントワリング、皮膚色素形成、および/または皮膚トーンを改善することによって皮膚加齢に関係する皮膚外観属性を改善するのに効果的である、請求項6の方法。
【請求項８】
抗加齢生物活性組成物は、以下のもの：（i）UVA-UVBエリアにおける有益な分光吸収特質；（ii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露後実証された広範囲のUVAおよびUVBスペクトル吸収光安定性と関連した高いUVA：UVB吸光度比；（iii）放射線量が増加するときのUVA1エリアにおける増加した減弱およびUVA/UVB比における同時増加；（iv）フルスペクトルシミュレート太陽曝露に関係する様々なインビトロ細胞培養ベースのバイオアッセイおよび関連する酵素モデルにおいて実証された強力な生物学的活性（特性）；（v）フルスペクトルシミュレート日光によってもたらされる4 MED曝露後の初期（照射前）のDPPHクエンチング能力の95％より高い維持；（vi）皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な悪影響を軽減するために一緒にはたらく多機能活性；および（vii）それらの組合せからなる群より選ばれる特性の相乗的組合せをもつ、請求項1の方法。
【請求項９】
皮膚表面は身体皮膚表面および顔皮膚表面からなる群より選ばれる、請求項1の方法。
【請求項１０】
抗加齢生物活性組成物には、日焼け止め剤アクティブ、抗炎症剤、および皮膚トーン剤からなる群より選ばれる追加原料がさらに含まれる、請求項1の方法。
【請求項１１】
抗加齢生物活性組成物は、皮膚加齢の複数の徴候の外観を改善するのに十分な期間について皮膚加齢の複数の徴候に適用される、請求項1の方法。
【請求項１２】
前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションは自然において見出されない分別プロセスを用いて分離される、請求項1の方法。
【請求項１３】
前記分別プロセスは、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）植物の新鮮な植物バイオマスから導き出される植物細胞ジュースを、凝固した膜フラクションが含まれる凝固した細胞ジュース混合物を産生する植物細胞ジュースが不安定化されるのに有効な時間について2.45GHzよりも高い周波数にて電磁場にさらすこと、および前記凝固した膜フラクションを、前記膜フラクションが実質フリーな細胞質/サイトソル・フラクションを含む生物活性フラクションを産生するために、前記凝固した細胞ジュース混合物から分離すること、次いで細胞質フラクションが、セラム・フラクションを産生するために安定化されるサイトソル・フラクションから分離されることを可能にする追加の処理を続けることを含む、請求項12の方法。
【請求項１４】
皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法であって、抗加齢生物活性組成物を少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に適用するステップを含み、
前記抗加齢生物活性組成物は有効量のChamomilla recutita（カモミラ・レクティタ）（German Chamomile（ジャーマン・カモミール））セラム・フラクションを含み、および
前記抗加齢生物活性組成物は少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される
方法。
【請求項１５】
前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの有効量は合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある、請求項14の方法。
【請求項１６】
前記抗加齢生物活性組成物には、皮膚科学的に許容可能な担体がさらに含まれる、請求項14の方法。
【請求項１７】
抗加齢生物活性組成物には、合計組成物の重量で、前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの0.001％から99％までが含まれる、請求項14の方法。
【請求項１８】
抗加齢生物活性組成物は皮膚の日光への曝露の悪影響を軽減する、請求項14の方法。
【請求項１９】
抗加齢生物活性組成物は、皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の悪影響を軽減するために相乗的にはたらく多機能活性を有する、請求項18の方法。
【請求項２０】
抗加齢生物活性組成物は、皮膚水和、皮膚バリア機能、皮膚弛緩、皮膚のしわの外観、排出およびボディコントワリング、皮膚色素形成、および/または皮膚トーンを改善することによって皮膚加齢に関係する皮膚外観属性を改善するのに効果的である、請求項19の方法。
【請求項２１】
抗加齢生物活性組成物は、以下のもの：（i）UVA-UVBエリアにおける有益な分光吸収特質；（ii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露後実証された広範囲のUVAおよびUVBスペクトル吸収光安定性と関連した高いUVA：UVB吸光度比；（iii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露に関係する様々なインビトロ細胞培養ベースのバイオアッセイおよび関連する酵素モデルにおいて実証された強力な生物学的活性（特性）；（iv）フルスペクトルシミュレート日光によってもたらされる4 MED曝露後の初期（照射前）のDPPHクエンチング能力の95％よりも高い維持；（v）皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な悪影響を軽減するために一緒にはたらく多機能活性；および（vi）それらの組合せからなる群より選ばれる特性の相乗的組合せをもつ、請求項14の方法。
【請求項２２】
皮膚表面は身体皮膚表面および顔皮膚表面からなる群より選ばれる、請求項14の方法。
【請求項２３】
抗加齢生物活性組成物は、日焼け止め剤アクティブ、抗炎症剤、および皮膚トーン剤からなる群より選ばれる追加原料をさらに含む、請求項14の方法。
【請求項２４】
抗加齢生物活性組成物は皮膚加齢の複数の徴候の外観を改善するのに十分な期間について皮膚加齢の複数の徴候に適用される、請求項14の方法。
【請求項２５】
前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションは自然に見出されない分別プロセスを用いて分離される、請求項14の方法。
【請求項２６】
前記分別プロセスは、Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーの新鮮な植物バイオマスから導き出される植物細胞ジュースを、凝固した膜フラクションが含まれる凝固した細胞ジュース混合物を産生する植物細胞ジュースが不安定化されるのに有効な時間について2.45GHzよりも高い周波数にて電磁場にさらすこと、および前記凝固した膜フラクションを、前記膜フラクションが実質フリーな細胞質/サイトソルを含む生物活性フラクションを産生するために、前記凝固した細胞ジュース混合物から分離すること、次いで細胞質フラクションが、セラム・フラクションを産生するために安定化されるサイトソル・フラクションから分離されることを可能にする追加の処理を続けることを含む、請求項25の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2016年2月25日付け出願の、米国仮特許出願第62/299614号の優先権の利益を請求し、その開示はここに参照することによってその全体がここに組み込まれる。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、とりわけ、化粧品の分野に、およびより一層具体的には、生きた植物から得られる原料による日光の悪影響を軽減する分野に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の背景
ヒト皮膚に対する日光の損傷効果はよく知られている。過度に高い曝露は、刺激および炎症を含む急性副作用、例えば、UV誘発日焼けなどのようなものをもたらす。しかしながら、フル太陽放射スペクトルの90％よりも多くがVIS-IRレンジ（VIS-IR範囲とも言う）にあり、そして皮膚損傷へのその潜在的な寄与がますます認識されつつある。太陽曝露が急性の皮膚反応を引き起こすのにエネルギー的に不十分であっても、依然として炎症関連のプロセスのきっかけとなる可能性があり；および蓄積された炎症性傷害（inflammatory damage）は、光老化として知られるプロセスにおいて、皮膚弾力性の低下および望ましくない外観の進行に大きく関与する。
【０００４】
本発明は、本技術においてこれらの、および他の欠点を克服することに向けられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の概略
ここに開示されているのは、とりわけ、生きた植物から得られる原料により日光の悪影響を軽減するために、身体または顔の皮膚の少なくとも一部分での、Nelumbo nucifera Gaertn．（ネルムボ・ヌシフェラ・ヨーゼフ・ゲルトナー）（Sacred Lotus（セイクレド・ロータス））の新鮮な（生きた）全体の植物から、およびChamomilla recutita（カモミラ・レクティタ）（German Chamomile（ジャーマン・カモミール））から収集された新鮮な（生きた）フラワーから取得された本発明での生物学的に活性な原料の、局所適用を含む、美容上のケアの方法である。
【０００６】
一態様では、本開示は、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションを使用する皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法を提供する。この方法には、抗加齢生物活性組成物を、少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に適用するステップが含まれ、そこでは、抗加齢生物活性組成物は有効量のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションを含む。抗加齢生物活性組成物は、少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間に適用される。この方法の一定の実施形態において、抗加齢生物活性組成物は皮膚科学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００７】
別の態様では、本開示は、Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを用いて皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法を提供する。この方法には、抗加齢生物活性組成物を、少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に適用するステップが含まれ、そこでは、抗加齢生物活性組成物は有効量のChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを含む。抗加齢生物活性組成物は少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される。この方法の一定の実施形態において、抗加齢生物活性組成物は皮膚科学的に許容可能な担体をさらに含む。
【０００８】
本開示によれば、ここに記載するセラム・フラクションは、それぞれが、皮膚加齢の悪影響を軽減することに関係する様々な有利な特性の組合せを有することが予想外に見出された。そのような有利な特性には、制限されないが、以下のものが含まれる：（i）UVA-UVBエリアにおける有益な分光吸収特質；（ii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露後実証された広範囲のUVAおよびUVBスペクトル吸収光安定性と関連した高いUVA：UVB吸光度比（UVA：UVB吸光度比の算出がゼロ（UVA吸光度に等しくない）から、最大で1.0（UVA吸光度がUVBに等しい）までの値をもたらすことができることに注目される）；（iii）放射線量が増加するときのUVA1エリアにおける増加した減弱およびUVA/UVB比の同時増加で、それは普通でなく、望ましく、および予期された特性でなく；（iv）フルスペクトルシミュレート太陽曝露に関係する様々なインビトロ（in vitro）細胞培養ベースのバイオアッセイおよび関連する酵素モデルにおいて実証された強力な生物学的活性（特性）；（v）フルスペクトルシミュレート日光によってもたらされる4 MED曝露後の初期（照射前）のDPPHクエンチング能力の95％よりも高い維持で、それは性能の観点からそれらの光安定性を確認され；および（vi）それらの組合せである。本開示のセラム・フラクションはまた、そこで、皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な悪影響を軽減するために一緒にはたらく多機能活性を提供することも見出された。
【０００９】
本開示のセラム・フラクションおよび方法の、既存の皮膚加齢生産物および方法に対する別の利点は、セラム・フラクションが自然には見出されない分別プロセスを用いて生きた植物から導き出されることである。さらに、ここに記載のように、生きた植物から得られるセラム・フラクションは水溶性/混和性であり、および無機粒状物質で、そのような酸化亜鉛の使用を要求されない。追加的に、本開示のセラム・フラクションは、それらが太陽曝露の様々な悪影響を軽減することができる点で有利であり、それは酸化亜鉛のようなそのような無機粒状物質がまず間違いなく行うことができない。
【００１０】
本開示のセラム・フラクションおよび方法の、既存の皮膚加齢生産物および方法に対するさらに別の利点には、セラム・フラクションの優れた安全性および毒性プロファイルが含まれる。ここに示されるように、有利な安全性/毒性プロファイルに基づいて、本開示のセラム・フラクションは、必要か、または望ましいのであれば、当技術での皮膚加齢生産物よりもずっと高い濃度で使用することが可能である。当技術で知られるいくつかの皮膚加齢生産物は、合計重量によって約15％の活性原料の上限を有してもよいが、本開示のセラム・フラクションは、ある適用については「そのまま」（すなわち、100％で供給されるように）用いることができる。
【００１１】
この発明のこれらの、および他の目的、特長、および利点は、添付図面と併用されて本発明の種々の態様の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の態様を例示する目的で、図面には本発明の一定の実施形態が示される。もっとも、本発明は、図面において描かれる実施形態の正確な配置および手段に制限されない。さらに、もしも同様の参照番号が図面に含まれるならば、類似または同じ要素を識別することを意味する。
【図１】本発明の生物活性抗加齢原料を調製するためのプロセスの一実施形態を示す概略図である。
【図２】5％Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの正規化吸光度スペクトル、照射前後-のものを示す。
【図３】5％Chamomilla recutita（Matricaria（マトリカリア））（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの正規化吸光度スペクトル、照射前後-を示す。
【図４】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関するヒアルロン酸蛍光染色の定量化からの結果のグラフである。
【図５】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関するフィラグリン蛍光染色の定量化からの結果のグラフである。
【図６】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関するAQP3蛍光染色の定量化からの結果のグラフである。
【図７】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関する蛍光色素浸透（fluorescent dye penetration）の定量化からの結果のグラフである。
【図８】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関するコラーゲンI蛍光染色の定量化からの結果のグラフである。
【図９】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関する分化した3T3-L1におけるグリセロール放出の定量化からの結果のグラフである。
【図１０】本発明のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの一実施形態に関するFontana Masson（フォンタナ・マッソン）染色の定量化からの結果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下は詳細な記載である。
本開示は、とりわけ、日光の皮膚への悪影響を軽減するための方法を提供する。本開示はまた、身体または顔の皮膚の少なくとも一部分での、Nelumbo nucifera Gaertn.（Sacred Lotus）の新鮮な（生きた）全体の植物から、およびChamomilla recutita（German Chamomile）から収集された新鮮な（生きた）フラワーから得られる本発明の生物学的に活性な原料の、局所適用を含む美容上のケアの方法にも関する。本開示はまた、これらの生物活性な植物性の（botanical）美容上組成物を調製する方法、およびこれらの組成物を、様々な調剤物において、および局所的な皮膚適用として使用することに関する。
【００１４】
ここに記載のすべての数値範囲はより一層狭い範囲を含めてあり；線引きされた上限および下限の範囲は、明示的に線引きされてないさらなる範囲を作り出すために交換可能である。
【００１５】
本開示において記載され、および使用される組成物は、ここに記載される必須成分ならびに随意成分を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり得る。ここに使用されるように、「から本質的になる」は、組成物または成分が追加の原料を含み得るが、それは追加の原料がクレームする組成物または方法の基本的および新規な特徴を質料的に（実質に関してとも言う）変えない場合だけであることを意味する。
【００１６】
組成物に関して使用されるように、用語「適用する」または「適用」は、本発明の組成物をヒトの皮膚表面、例えば、表皮などのようなものに適用または広げることを意味する。
【００１７】
ここに使用されるように、用語「皮膚科学的に許容可能」は、記載された組成物または成分が、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応、およびその他同種類のものなどを伴わずにヒトの皮膚組織と接触させて使用するのに適することを意味する。
【００１８】
ここに使用されるように、用語「有効量」は、肯定的な外観（positive appearance）を有意に誘導、および/または利益を感知するのに十分な化合物または組成物の量を意味するが、重大な副作用を避けるのに十分低い（すなわち、理にかなった利益対リスク比を提供するために、当業者の健全な判断（sound judgment）の範囲内である）。
【００１９】
一態様では、本開示は、皮膚加齢に関連する皮膚外観を改善する方法を提供する。この方法には、抗加齢生物活性組成物を、少なくとも一の加齢の徴候（兆候と言うこともある）を有する皮膚表面に適用するステップが含まれる。抗加齢生物活性組成物は少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される。
【００２０】
特定の態様において、本開示は、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションを使用する皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法を提供する。この方法には、抗加齢生物活性組成物を、少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に適用するステップが含まれ、そこでは、抗加齢生物活性組成物は有効量のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションを含む。抗加齢生物活性組成物は少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される。
【００２１】
一実施形態では、前記Nacumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの有効量は、合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある。
【００２２】
一実施形態では、抗加齢生物活性組成物には、有効量のNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよび皮膚科学的に許容可能な担体が含まれる。より一層詳細な実施形態では、抗加齢生物活性組成物には、合計組成物の重量で、前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの0.001％から99％までが含まれる。
【００２３】
別の態様では、本開示は、Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを用いて皮膚加齢に関係する皮膚外観を改善する方法を提供する。この方法は、抗加齢生物活性組成物を、少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に適用するステップが含まれ、そこでは、抗加齢生物活性組成物は有効量のChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを含む。抗加齢生物活性組成物は、少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される。
【００２４】
一実施形態では、前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの有効量は、合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある。
【００２５】
一実施形態では、抗加齢生物活性組成物は、有効量のChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションおよび皮膚科学的に許容可能な担体を含む。より一層詳細な実施形態では、抗加齢生物活性組成物には、合計組成物の重量で、前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの0.001％から99％までが含まれる。
【００２６】
本開示によれば、抗加齢生物活性組成物は日光への皮膚の曝露の悪影響を軽減する。
【００２７】
本開示によれば、抗加齢生物活性組成物は、皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の悪影響を軽減するために相乗的に作用する多機能活性を有する。
【００２８】
本開示によれば、抗加齢生物活性組成物は、皮膚水和（skin hydration）、皮膚バリア機能、皮膚弛緩、皮膚のしわの外観、排出（drainage、排液とも言う）およびボディコントワリング（body contouring、体形矯正とも言う）、皮膚色素形成（skin pigmentation）、および/または皮膚トーン（皮膚色調とも言う）を改善することによって皮膚加齢に関係する皮膚外観属性（skin appearance attributes、皮膚外観特性とも言う）を改善するのに効果的である。
【００２９】
本開示によれば、抗加齢生物活性組成物は、以下のもの：（i）UVA-UVBエリア（領域とも言う）における有益な分光吸収特質；（ii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露後実証された広範囲のUVAおよびUVBスペクトル吸収光安定性と関連した高いUVA：UVB吸光度比；（iii）放射線量が増加するときのUVA1エリアにおける増加した減弱およびUVA/UVB比の同時増加；（iv）フルスペクトルシミュレート太陽曝露に関係する様々なインビトロ細胞培養ベースのバイオアッセイおよび関連する酵素モデルにおいて実証された強力な生物学的活性（特性）；（v）フルスペクトルシミュレート日光によってもたらされる4 MED曝露後の初期（照射前）のDPPHクエンチング能力（quenching capacities、消光能とも言う）の95％よりも高い維持；（vi）皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な悪影響を軽減するために一緒にはたらく多機能活性；および（vii）それらの組合せからなる群より選ばれる特性の相乗的組合せをもつ。
【００３０】
本開示の方法の様々な実施形態によれば、皮膚表面は身体皮膚表面および顔皮膚表面からなる群より選ばれる。
【００３１】
本開示の方法の一定の実施形態において、抗加齢生物活性組成物は、日焼け止め剤アクティブ（sunscreen active、日焼け止め剤活性物質とも言う）、抗炎症剤、および皮膚トーン剤（skin tone agent）からなる群より選ばれる追加原料がさらに含まれる。
【００３２】
本開示の方法の他の実施形態では、抗加齢生物活性組成物は、皮膚加齢の複数の徴候の外観を改善するのに十分な期間について、皮膚加齢の複数の徴候に適用される。
【００３３】
本開示の方法に従って、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションまたはChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションは、自然において見出されない分別（分画とも言う）プロセスを用いて分離される。一実施形態では、分別プロセスには、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）植物またはChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーの新鮮な植物バイオマスから導き出される植物細胞ジュース（植物細胞汁とも言う）を、凝固した（coagulated）膜フラクションが含まれる凝固した細胞ジュース混合物を産生する植物細胞ジュースが不安定化されるのに有効な時間について2.45GHzよりも高い周波数にて電磁場にさらす（供するとも言う）こと、および前記凝固した膜フラクションを、前記膜フラクションが実質フリーな細胞質/サイトソル（cytosole、cytosolか？、サイトゾル、細胞質ゾル、細胞基質とも言う）・フラクションを含む生物活性フラクションを産生するために、前記凝固した細胞ジュース混合物から分離すること、次いで細胞質フラクションが、セラム・フラクションを産生するために安定化されるサイトゾル・フラクションから分離されることを可能にする追加の処理を続けることが含まれる（図1）。
【００３４】
上記のように、一旦、植物細胞ジュースが膜フラクションおよび細胞ジュース上清、すなわち、細胞質/サイトゾル・フラクション30に分離されると、それは、細胞質フラクションがサイトゾル・フラクションから分離されることを可能にする追加の処理を受ける。
【００３５】
細胞質フラクションの十分な分離を評価するための定量的基準は、検出可能なレベルの高分子量タンパク質の不存在および/またはサイトゾル・フラクションにおけるリブロース1,5-ビホスファートカルボキシラーゼオキシゲナーゼの不存在である。
【００３６】
サイトゾル・フラクションは、細胞内水において溶解した低分子量の水溶性成分を含有する。サイトゾル・フラクションは、クリア（透明とも言う）な液体であり、それは黄色で、およびわずかに特有の臭いを有する。不安定なサイトゾル・フラクションは、数時間のうちに、重い沈殿物および特徴のない強い臭いを含む暗褐色の懸濁物に不可逆的に転換される。結果として、サイトゾル・フラクションは美容上原料として使用することができない。後に続く記載された手順は、安定で、および活性なセラム・フラクション（しょう液（漿液）画分とも言う）を産生するために、サイトゾル・フラクションの精製を可能にする。このことは、望ましくない沈殿物の生成および色および臭いの悪化をもたらす不可逆的転換の原因となる主成分を、サイトゾル・フラクションから除去することによって達成される。この手順には、pH調整、熱処理、冷却、真空ろ過、および安定化が、米国特許第7,442,391号、第8,101,212号、第8,277,852号および第8,318,220号に説明されるように含まれ、それらはすべてが参照することによってここに組み込まれる。
【００３７】
サイトゾル・フラクションを生成した後、次いでそれを、セラム・フラクションを産生させるために安定化ステップに供する（図1）。本発明での安定化ステップにおいて使用するのに適する薬剤には、制限されないが、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、EDTA四ナトリウム、ペンチレングリコール、メタ重亜硫酸ナトリウムが含まれる。
【００３８】
本開示による生物活性原料は、Nelumbo nucifera Gaertn.（Sacred Lotus）の新鮮な（生きた）全体の植物から、およびChamomilla recutita（German Chamomile）から収集された新鮮な（生きた）フラワー（花とも言う）から、米国特許第7,442,391号；第7,473,435号；第7,537,791号；第8,043,635号；第8,101,212号；第8,277,852号；第8,318,220号；米国特許出願公開第US-2015/0258012A1号およびUS-2016/0000851A1号；およびPCT/EP2013/073565号に記載されるプロセスに従って得ることができ、それらの開示内容はすべて参照によってここに組み込まれ、および日光の様々な悪影響を軽減するそれらの能力について評価される。
【００３９】
本発明の方法において使用されるセラム・フラクションは、自然に発生しておらず、しかしむしろ人工の製造プロセスを用いて生産される。一実施形態では、この製造プロセスは、植物細胞ジュース（細胞内コロイド分散物）を得、およびそれを、細胞ジュースからの膜フラクションの分離を開始し、膜フラクションが実質フリーな細胞質/サイトゾル・フラクションを得るために、有効な周波数にて電磁波で処理するために、新鮮な生きた植物（新鮮な植物バイオマスとも呼ばれる）をグラインディング（grinding、研削、粉砕などとも言う）およびプレッシング（圧縮とも言う）することを採用する。細胞質/サイトゾル・フラクションは、細胞質/サイトゾル・フラクションをその構成部分、例えば、細胞質フラクションおよびサイトゾル・フラクションに分離するのに有効な条件下でさらに処理される。本発明で使用される新鮮な植物バイオマスからの植物性のフラクションの調製のためのプロセスは、細胞内植物物質（intracellular plant material）、ここでは植物細胞ジュースと称され、膜フラクションを含むものを得るために、新鮮な植物バイオマスのグラインディング（またはマセレーション）およびプレッシングすること、および膜フラクションが実質フリーな（実質含まれないとも言う）細胞質/サイトゾル・フラクションを産生するために、前記細胞ジュース・フラクションから前記膜フラクションの分離のきっかけとなる（トリガーする、誘引するとも言う）のに有効な周波数にて電磁波を用いて前記細胞ジュースを処理することを含む。上述の処理は、前記処理の間に前記細胞ジュースの温度が40℃を超えないように実行されるのが有利である。次いで、膜フラクションは、抗タンパク質分解性、細胞増殖抑制活性、および/または双方の抗タンパク質分解性および細胞増殖抑制活性を見せる安定な植物性の美容上組成物を提供するために利用することができ、そこでは、抗タンパク質分解活性は少なくとも一のプロテイナーゼの抑制に起因し、および細胞増殖抑制活性は少なくとも一の細胞のタイプの細胞増殖の抑制に起因する。細胞質/サイトゾル・フラクションは、ファーマスーティカル（薬、調合薬などとも言う）、コスメティック（化粧品とも言う）、ニュートリショナル（栄養剤とも言う）、セラピューティック（治療用物質、治療剤などとも言う）および/またはパーソナルケア調剤物およびその他同種類のものなどにおける成分としての使用に適する植物性組成物を提供するために利用することができる。細胞質/サイトゾル・フラクションは、細胞質/サイトゾル・フラクションをその構成成分の部分、すなわち細胞質フラクションおよびサイトゾル・フラクションに分離するのに有効な条件下でさらに処理される。細胞質フラクションには、主にタンパク質が含まれる。
【００４０】
一例として、本発明での生物活性植物性美容上組成物を調製するための全体的なプロセスを、図1を参照して以下に記載する。図1に示すように、新鮮な植物バイオマス2を産生するために、新鮮な生きた植物を採取、収集、および洗浄する。この新鮮な植物バイオマスは、細胞内植物物質（細胞ジュース）6および繊維強化物質（プレス-ケーキ）8を産生するために、グラインディング、マセレーション、およびプレッシング4に供される。次いで、細胞ジュース6は、ろ過された植物細胞ジュース12を産生するために、ナイロンメッシュ10を通してろ過される。ろ過された細胞ジュース12は、その不安定化をトリガーする周波数で電磁波処理14にさらされる。次いで、不安定化された細胞ジュースは、沈殿した膜フラクション20および上清で、細胞質/サイトゾル・フラクション30であるものを得るために遠心分離18に供される。膜フラクション20は、生物活性植物性美容上組成物であり、それは、例えば、美容上生産物に、米国特許第7,442,391号、第8,101,212号、第8,277,852号および第8,318,220号において記載されるように添加することができる。植物細胞質/サイトゾル・フラクション30は、以下に記載するように、さらなるプロセスに使用される。
【００４１】
細胞質/サイトゾル・フラクション30は、追加の処理：i、ii、iiiまたはivに供され、以下に概略される。非制限的な例として、処理（i）は、沈殿した細胞質画分36が、サイトゾル・フラクション38を含む上清から分離されることを可能にする等電点沈澱32および次の遠心分離34を、例えば、米国特許第7,442,391号、第8,101,212号、および第8,277,852号に記載されているように含むことができる。あるいはまた、サイトゾル/細胞質フラクションは、（ii）追加の電磁気処理（周波数>7GHzにて）を以下の遠心分離またはろ過と共に、または（iii）膜ろ過、または（iv）限外ろ過、またはそれらの組合せ（i、ii、iii、iv）の結果として、さらに分離することができる。細胞質/サイトゾル・フラクション成分は、「そのまま」利用することができ、またはさらに分離し、および利用することができる。それらはまた、保存剤および抗酸化剤を用いて、例えば、米国特許第7,442,391号；第7,473,435号；第7,537,791号；第8,043,635号；第8,101,212号；第8,277,852号および第8,318,220号に記載のように安定化することができる。
【００４２】
上述したように、一旦、植物細胞ジュースが膜フラクションおよび細胞ジュース上清、すなわち細胞質/サイトゾル・フラクション30に分離されると、それは次のさらなる処理：i、ii、iiiまたはiv（図1）に供され、サイトゾル・フラクションから細胞質フラクションの分離が可能にされる。
【００４３】
細胞質フラクションの十分な分離を評価するための定量的基準は、検出可能なレベルの高分子量タンパク質の不存在および/またはサイトゾル・フラクションでのリブロース1,5-ビホスファートカルボキシラーゼオキシゲナーゼの不存在である。
【００４４】
サイトゾル・フラクションは、細胞内水において溶解した低分子量の水溶性成分を含有する。サイトゾル・フラクションは、クリアな液体であり、それは黄色で、およびわずかな特有の臭いを有する。数時間以内で、不安定なサイトゾル・フラクションは、重い沈殿物および強い非特異的な臭気を含む暗褐色の懸濁物に不可逆的に変換される。その結果、サイトゾル・フラクションは美容上原料として使用することができない。以下に続く記載された手順は、安定な美容上原料である安定で、および活性なセラム・フラクションを産生するために、サイトゾル・フラクションの精製を可能にする。このことは、望ましくない沈殿物の生成および色および臭気の悪化をもたらす不可逆的転換の原因となる主成分を、サイトゾル・フラクションから除去することによって達成される。この手順には、pH調整、熱処理、冷却、真空ろ過、および安定化が、米国特許第7,442,391号、同第8,101,212号、同第8,277,852号および同第8,318,220号に記載されるように含まれ、これらはすべてが参照することによってここに組み込まれる。
【００４５】
サイトゾル・フラクションを生成した後、それは次いで、セラム・フラクション（Serum-Derived Cosmetic Composition、セラム由来美容上組成物）を産生するために安定化ステップに供される。本発明での安定化ステップに使用するのに適した薬剤には、制限されないが、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、メチルパラベンナトリウム、EDTA四ナトリウム、ペンチレングリコール、メタ重亜硫酸ナトリウムが含まれる。
【００４６】
本発明での使用に適した保存剤には、制限されないが、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウムが含まれる。
【００４７】
本発明での使用のために適切な抗酸化剤の例は、メタ重亜硫酸ナトリウムである。
【００４８】
適切なキレート剤の例はEDTA四ナトリウムである。
【００４９】
保存剤ブースターの一例には、ペンチレングリコールが含まれる。
【００５０】
一実施形態では、安定化ステップは、少なくとも一の保存剤、少なくとも一のキレート剤、少なくとも一の抗酸化剤、および少なくとも一の保存的有効性ブースター（preservative efficacy booster）の混合物において細胞セラム・フラクションを、安定化細胞セラム・フラクションを産生するためにインキュベーションすることが含まれる。
【００５１】
別の実施形態において、安定化ステップは、安定化細胞セラム・フラクションを産生するために、少なくとも一の保存剤および少なくとも一の抗酸化剤の混合物において細胞セラム・フラクションをインキュベーションすることを含む。
【００５２】
本発明の一実施形態では、セラム由来美容上組成物（Serum-Derived Cosmetic Composition）は、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションである（また、Nelumbo nucifera抽出物、ハス（蓮）のセラム・フラクション、Recentia(R（商標）)（レセンチア）NNおよびHarmonianceTM（トレード・ネーム、標章）（ハーモニアンス）としても知られる）。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、セラム由来美容上組成物は、Chamomilla recutita（Matricaria）（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションである（カモミール・フラワー・セラム・フラクション、Recentia(R) CR-F、Recentia Chamomilla recutita Zeta Fraction（レセンチア・カモミラ・レクティタ・ゼータ・フラクション）としても知られる）。
【００５４】
本発明はまた、身体または顔の皮膚の少なくとも一部に、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクション（これはまた、ハスのセラム、HarmonianceTMおよびRecentia(R)NNとしても知られる）を、生理学的に許容可能な媒体を含む組成物において、皮膚での日光の悪影響を軽減するために、局所適用することを含めて、美容上のケア方法にも関する。
【００５５】
本発明はまた、身体または顔の皮膚の少なくとも一部に、Chamomilla recutita（Matricaria）（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクション（また、カモミール・フラワーのセラム・フラクション、Recentia(R)CR-F、Recentia Chamomilla recutita Zeta Fractionとしても知られる）を、生理学的に許容可能な媒体を含む組成物において、皮膚での日光の悪影響を軽減するために、局所適用することを含めで、美容上のケア方法にも関する。
【００５６】
本発明の実践のための組成物は、特に、水性、ハイドロ（水）-アルコール性または油性溶液；および水中油型エマルション、油中水型エマルションまたは多重エマルション（multiple emulsions）でありえ；それらはまた、皮膚、粘膜、唇および/または毛への適用に適した懸濁物または粉体の形態であることができる。
【００５７】
これらの組成物は、多少流動性で、およびクリーム、ローション、ミルク、セラム（しょう液）、ポマード、ゲル、ペーストまたはフォームの外観を有していてもよい。それらはまた、固形物形態、例えば、スティックなどのようなものであってもよく、またはエアロゾルの形態で皮膚に適用されてもよい。
【００５８】
これらの組成物にはまた、考えられる適用の分野で普通に使用される任意の添加剤、ならびにそれらの調剤に必要なアジュバント（補助剤とも言う）が含まれ、例えば、溶媒、増粘剤、希釈剤、抗酸化剤、着色剤、日焼け止め、セルフタンニング剤、色素、充填剤、保存剤、香料、臭気吸収体、美容上または製薬上の活性薬剤、精油、ビタミン類、必須脂肪酸類、界面活性剤類、フィルム形成性ポリマー類、およびその他等々のようなものである。
【００５９】
あらゆる場合において、本技術において熟練した者（当業者とも言う）は、本発明の組成物の望ましい有利な特性を妨げないように、前記アジュバント（賦形剤）ならびにその割合が選定されることを確保するであろう。これらのアジュバントは、例えば、本組成物の合計重量の0.01ないし20％に対応し得る。本発明の組成物がエマルションであるとき、脂肪相は、組成物の合計重量に関して5ないし80重量％、および好ましくは5ないし50重量％を占める（represent）ことができる。組成物に使用される乳化剤および共乳化剤（co-emulsifiers）は、当分野で考えられる慣習的に使用されるものから選定される。例えば、それらは、組成物の合計重量に関して、0.3から30重量％までの範囲の割合で使用することができる。
【００６０】
有利には、本発明のために使用することが可能な組成物には、本発明による活性薬剤に加えて、本発明のものと類似および/または相補的な作用を有する少なくとも一の他の活性薬剤を含むことができる。本発明によれば、この活性薬剤は「さらなる活性薬剤」として規定される。
【００６１】
例えば、追加の活性薬剤（群）（（群）は複数もあり得ることを示す）は、日焼け止めアクティブ、抗UV、抗VIS、抗IR、光安定剤、抗加齢、トーニング（調色）、明色化（lightening、美白化とも言う）、水和（hydrating）、排出（draining）、および微小循環-促進剤（microcirculation-promoting agents）、調剤（pharmaceutical）、剥脱性（exfoliating）、スクラビング（scrubbing、洗い掃除）、細胞外マトリクス-刺激（extracellular matrix-stimulating）、エネルギー代謝活性化、抗菌物質（antibacterial）、抗真菌物質（antifungal）、カーミング（calming、鎮静）、抗フリーラジカル、および抗ニキビ剤（anti-acne agents）、抗炎症剤、麻酔剤、加温剤（warming agents）、冷却剤および重量減少剤（weight-loss agents）から選ぶことができる。
【００６２】
そのような追加の薬剤は、次の：ビタミンA、および特に、レチノイン酸、レチノール、レチノールプロピオナート、レチノールパルミタート、ビタミンB3およびより一層詳しくは、ナイアシンアミド、トコフェロールニコチナート、ビタミンB5、ビタミンB6、ビタミンB12、ビタミンC、特に、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、アスコルビルテトラパルミタート、リン酸アスコルビルマグネシウムおよびナトリウム、ビタミンE、F、H、K、PP、コエンザイムQ10、メタロプロテイナーゼインヒビター、TIMPアクチベータ（TIMP活性化剤）、DHEA、それらの前駆体および誘導体；アミノ酸、例えば、アルギニン、オルニチン、ヒドロキシプロプリン（hydroxypropline）、ヒドロキシプロリンジパルマート（hydroxyproline dipalmate）、パルミトイルグリシン、ヒドロキシリジン、メチオニンおよびその誘導体などのようなもの、N-アシルアミノ酸化合物、自然な、または合成のペプチド、ジ-、トリ-、テトラ-、ペンタ-およびヘキサペプチド、およびそれらの親油性誘導体、異性体および他の種、例えば、金属イオン（例えば、銅、亜鉛、マンガン、マグネシウム、およびその他）などのようなものと複合体（錯体）を形成するものを含めたものを含む群から選ばれ得る。例えば、名称MATRIXYLTM（マトリキシル）、ARGIRELINETM（アルギレリン）、COLAXYLTM（コラキシル）、PEPTIDE VINCI 02TM（ペプチド・ビンチ02）、CHRONOGENTM（クロノゲン）、LAMINIXYL ISTM（ラミニキシルIS）、PEPTIDE Q10TM（ペプチドQ10）、ATPeptideTM（ATペプチド）、SURVIXYL ISTM（サバイキシルIS）、NEOMATRIXTM（ネオマトリクス）の下で商業上知られるペプチド、植物ベースのペプチド抽出物、例えば、ソイ（ダイズ）、スペルト（スペルトコムギ）、グレープバイン、ナタネ、リンシード（アマニ）、ライス、コーン、ピー（エンドウ）の抽出物などのようなもの、酵母抽出物類、アルテミア・サリナ（Artemia Salina）抽出物、デヒドロ酢酸（DHA）、合成または自然起源のフィトステロール（植物ステロール）、サリチル酸およびその誘導体、アルファ-およびベータ-ヒドロキシ酸、アミノ糖、グルコサミン、D-グルコサミン、N-アセチル-グルコサミン、N-アセチル-D-グリコサミン、マンノサミン、N-アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、ポリフェノールのN-アセチルガラクトサミン抽出物、イソフラボン、フラボノイド、例えば、ブドウ抽出物、パイン抽出物およびオリーブ抽出物などのようなもの、脂質、例えば、セラミドまたはリン脂質などのようなもの、動物起源の油、例えば、スクアレンまたはスクワランなどのようなもの；植物油、例えば、スイートアーモンド、コプラ、リシン、ホホバ、オリーブ、ナタネ、ラッカセイ（ピーナッツ）、ヒマワリ、コムギ麦芽、トウモロコシ胚芽、ソイ、ワタの種子（綿実）、アルファルファ、ポピー（ケシ）、ウィンタースクワッシュ（クリカボチャ）、イブニング・プリムローズ（マツヨイグサ、月見草）、キビ（アワ、雑穀）、オオムギ、ライムギ、ベニバナ、パッションフルーツ、ヘーゼルナッツ、ヤシ、アプリコット種子、アボカド、およびキンセンカ（カレンジュラ）油などのようなもの；エトキシ化植物油、およびシアバター、すべてのUVスクリーンおよび広域スペクトルの日焼け止めである。
【００６３】
本発明に従って使用することが可能な組成物は、任意の適切な経路、特に外部局所経路によって適用することができ、および組成物の調剤は当業者によって順応される。
【００６４】
有利には、本発明に従う組成物は局所適用に適した形態である。したがって、これらの組成物は、生理学的に許容可能な媒体、すなわち、皮膚および皮膚付属器（skin appendages）と適合性があり、およびすべての美容上形態をカバーしなければならない。
【００６５】
本発明が概して哺乳動物、およびより一層具体的には人間に関係することは明らかである。
【００６６】
この美容上の処置方法の特定の実施形態もまた上記の説明からもたらされる。本発明の他の利点および特長は、例示的および非制限的な目的のために提供される例を読むことにより、より一層明らかになるであろう。
【実施例】
【００６７】
以下の例は、本発明の特定の実施形態を例示することを意図しているが、決して本発明の範囲を制限するものではない。
例1
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）およびChamomilla recutita（Matricaria）（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの試験
【００６８】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを評価するために使用される分析的な、細胞培養に基づくバイオアッセイ、酵素アッセイおよびインビトロアッセイの記載および関連する試験結果は、以下に、および表1-8および図2-3において説明する。
【００６９】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの組成を決定するために使用される分析法は以下の通りである。
【００７０】
合計可溶性シュガー：これらのセラム・フラクションにおいて合計可溶性シュガー（合計可溶性糖とも言う）分析は、次の：Yemm（イエム）およびWillis（ウィリス）、Biochem J.（ザ・バイオケミカル・ジャーナル）；57（3）：508-514（1954）によるAnthrone（アントロン）での「Estimation of Carbohydrates in Plant Extracts（植物抽出物での炭水化物（糖質と言うこともある）の推定）」に記載の比色定量法に基づいた。サンプル分析は、以下のアプローチで行った：標準（2糖混合物）はフルクトースおよびグルコースそれぞれ〜（約とも言う）200ppm、合算して414ppmの単糖の組合せから作成した。このストック標準の水による連続希釈を行い、および各溶液の1mLを、72％硫酸での氷冷した2000ppmのアントロンの5mLと反応させた。試薬を100℃で10分間加熱し、およびこれらの溶液の680nmでの吸光度値から4点較正曲線（検量線とも言う）を作り出した。試験サンプルを水において重量に基づいて0.5％溶液に希釈し、そして同じ反応を遂行した。較正曲線に対して比較したこれらの溶液の680nmにおける吸光度を、それらの合計糖濃度を決定するために用いた。サンプルおよび標準については、石英の1cmキュベットを使用し、および純水によりブランク吸光度値を採取した。
【００７１】
合計フェノール化合物含量：これらのセラム・フラクションにおいて合計フェノール化合物含量は、Ainsworth（エーンズワース）およびGillespie（ガレスピー）による「Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent（フォリン-チオカルトー試薬を用いた植物組織における合計フェノール含量および他の酸化基質の推定）」、Nature Protocols（ネイチャー・プロトコルズ）；2：875-877（2007）に記載の方法によって決定した。この論文で説明される比色定量による合計フェノールアッセイは、Folin-Ciocalteu（F-C）試薬を利用する。F-Cアッセイは、アルカリ性媒体においてフェノール化合物からリンモリブデン/リンタングステン酸複合体（錯体）への電子の移動に依存し、それは分光的に765nmで測定される。サンプル分析は、この方法に従って、ステップ5から開始して行った。ステップ5、6および7での容量を、処分可能な減少した容量のキュベットにとって十分な容量を生じさせるために2倍にした。測定のための各サンプルは、個々のキュベットにおいて調製した。ステップ6、F-C試薬添加では、サンプルおよび試薬を混合し、およびカーボナート（炭酸塩）添加前に〜10分間放置した。2時間の終わりに、サンプルおよび標準（クロロゲン酸）溶液を空気に対して765nmで測定し；クロロゲン酸（標準）較正曲線を用いてサンプルにおいて合計フェノール含量を算出した。
【００７２】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクション*についての分析データおよび範囲を以下の表1に示す：
【表１】
2019506436.tif 000003
* Nelumbo nucifera (Sacred Lotus)セラム・フラクションを「そのまま」分析した。
【００７３】
Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクション*の分析データおよび範囲を以下の表2に示す：
【表２】
2019506436.tif 000004
* Chamomilla recutita (German Chamomile)フラワーのセラム・フラクションを「そのまま」分析した。
【００７４】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの安全性および毒物学的プロファイルを、十分に説明された方法を用いて評価した。Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションを最大100％までの濃度（無希釈）で試験した。それは次のようであることが見出された：刺激性でなく（皮膚刺激試験：再構成ヒト表皮において実証され）；非常に良好な耐容性を示し（ヒトにおいて10名のボランティアに対する48時間パッチ試験）；実際的に刺激性でなく（眼刺激はHet-Cam試験を研究し）；刺激性でなく（再構成ヒト角膜上皮（RHCE）長期曝露時間処理試験）；さらに、それは光毒性調査において光毒性の可能性を論証せず（3T3細胞、3T3 NRUPTインビトロ法でのニュートラルレッド取り込み光毒性試験）；非感作物質（ヒト反復傷害性パッチ10％、N>200）、および非遺伝毒性（「Ames（エームズ）」細菌復帰変異（bacterial reverse mutation））である。
【００７５】
Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの安全性および毒物学的プロファイルを、十分に説明された方法を用いて評価した。Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを最大100％（無希釈）までの濃度で試験した。それは次のようであることが見出された：刺激性でなく（皮膚刺激性試験：再構成ヒト表皮において実証され）；非常に良好な耐容性を示し（ヒトにおいて10人のボランティアに対する48時間パッチ試験）；実際的に刺激性でなく（眼刺激はHet-Cam試験を研究し）；刺激性でなく（再構成ヒト角膜上皮（RHCE）長期曝露時間処理試験）；さらに、それは光毒性研究において光毒性の可能性を論証せず（3T3細胞、3T3 NRUPTインビトロ法でのニュートラルレッド取り込み光毒性試験）。
【００７６】
細胞培養に基づくバイオアッセイは、日光に反応して膨大なシグナル伝達物質、例えば、サイトカイン（IL-6）、ケモカイン（IL-8）およびプロスタグランジン（PGE2）などのようなものを放出するヒト皮膚（ヒト表皮ケラチノサイト（(Human Epidermal Keratinocytes）、HEK）からの培養表皮ケラチノサイトを利用する。これらのメディエーター（媒介物とも言う）の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）（ELISA）のような技術によって測定される。これらの炎症メディエーターのHEK放出を減少させることが可能な生物活性成分は、日光曝露からもたらされるヒト皮膚での刺激および炎症の徴候をコントロールするのに役立ち得ることが知られる。正常ヒト成体表皮ケラチノサイト（表皮角化細胞とも言う）（HEK）およびすべての細胞培養供給物は、Life Technologies Co.（ライフ・テクノロジーズ社）（Carlsbad（カールスバード）、CA（カリフォルニア州）、USA（米国））から取得した。細胞を増殖させ、および次いでヒトケラチノサイト増殖サプリメント（HKGS）を添加したケラチノサイト基礎培地154（M154）において5％CO2の雰囲気にて37℃で維持し、および継代2ないし4の間で使用した。実験のために、HEK細胞をトリプシン処理し、96ウェルプレートに播種し、および約80％コンフルエントにまで増殖させた。細胞を1回洗浄し、およびM154をPBSで置換した。洗浄および置換の両方をPBSで行い、M154の光吸収成分を除去した。次いで、HEKを含む96ウェルプレートを、UV透過性の1mm石英シートで覆い、室温を維持しながら制御されたPeltier（ペルチェ）冷却表面の頂上の白色のアンダーレイ（下敷き）上に置き、および同じ石英カバーを通してピラノメーター（全天日射計）を介して測定したとき、約1100W/m2の線量率である20J/cm2の人工的に生産されたフルスペクトル日光のドーズを用いて照射した。次いで、PBSを除去し、およびM154と交換し、そして細胞を試験物質および/またはコントロール（対照）と共に16時間インキュベーションした。照射機器は、Solar Light Company（ソーラー・ライト・カンパニー）、Glenside（グレンサイド）、PA（ペンシルベニア州）から取得し、およびプレーンミラー（plain mirror）、XPS1000高精度電流源、およびPMA2144ピラノメーターを用いるAirmass（エアマス）1.5構成のSolar Simulator（ソーラーシミュレータ）LS1000-6R-002を含む。同じ操作を、日光の存在を除いて、アンストレスト・コントロール（unstressed controls）として役割を果たすHEKを用いて遂行した。インキュベーション後、HEK細胞上清を回収した。Quantikine(R)（クォンティカイン）ELISAキット（R&D Systems Inc（R&Dシステム社）、Minneapolis（ミネアポリス）、MN（ミネソタ州））を、上清においてインターロイキンを定量するために使用した。ヒトIL-8は、ヒトCXCL/IL-8イムノアッセイ（Human CXCL/IL-8 Immunoassay）キット（カタログ番号＃D8000C）により定量し、IL-6は、ヒトIL-6イムノアッセイ（Human IL-6 Immunoassay）キット（カタログ番号＃D6050）によって定量し；およびPGE2は、ParameterTMProstaglandin E2 Assay（（パラメーター・プロスタグランジンE2アッセイ）（カタログ番号＃KGE004B）を用いて定量した。IC50（インターロイキンまたはプロスタグランジンレベルを50％に低下させるのに必要な試験物質の濃度、非照射細胞からのサンプルを0％とし、および照射細胞からのサンプルを100％とみなした）値をSigmaPlot（シグマプロット）10.0（Systat Software（シスタット・ソフトウェア））に適合するシグモイド（S字形）曲線によって算出した。より一層低いIC50値はより一層高い効力および有効性の程度を示す。
【００７７】
ORAC（Oxygen Radical Absorbance Capacity（酸素ラジカル吸収能））は、BioTek（バイオテク）からの「Performing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Assays with Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader（シナジーHTマルチ-デテクション・マイクロプレート・リーダーによる酸素ラジカル吸収能（ORAC）アッセイの実行）」のApplication Note（アプリケーション・ノート）に記載の方法を用いたORAC試験によって決定し[www.biotek.com/resources/docs/ORAC_Assay_Application_Note.pdf」、それはBioTek Instruments Inc.（バイオテク・インスツルメンツ社）（Winooski（ウィヌースキ）、VT（バーモント州））からのSynergy 2（シナジー2）マイクロプレートリーダーを伴う使用のために修飾された。このアッセイでは、AAPH（2,2'-アゾビス2-アミノ-プロパン）は、蛍光プローブ（ナトリウムフルオレセイン）を損傷する活性酸素種を生成する。抗酸化剤で、例えば、(R)-Trolox（トロロクス）メチルエーテルなどのようなものは、この損傷を防止または遅延させ、およびそれらの効果は蛍光測定によって定量することができる。蛍光読取りは、励起波長を485nmに設定し、および放射波長を528nmに設定し、反応容量を200μl、AAPH濃度を55mM、フルオレセインナトリウム濃度を1.33μM、および(R)-トロロクスメチルエーテル濃度を80μMおよび2μM間の範囲にして37℃で2時間の間で連続的に採取した。Sigma-Aldrich（シグマ-アルドリッチ）（St. Louis（セントルイス）、MO（ミズーリ州））から、フルオレセインナトリウム（Fluka（フルカ）46960）、AAPH（Sigma 440914）および(R)-トロロクスメチルエーテル（Fluka 93509）を取得した。AUC（Area Under Curve（曲線下エリア））値を比率の和として算出した（ウェルについて現在の蛍光読取りをウェルについての最初の蛍光読取りで割った）。脱イオン水を有するウェルのAUC値の平均を、抗酸化剤による蛍光の保存に対応するAUCを取得するために、(R)-トロロクスメチルエーテルを有するウェルおよび試験物質を有するウェルのAUCから差し引いた。較正曲線を、(R)-トロロクスメチルエーテル重量相当ORAC活性（(R)-Trolox methyl ether weight-equivalent ORAC activity）を示すウェルの抗酸化物質関連AUCの関数として生成させた。次いで、試験物質についてORAC活性を、抗酸化効果で、1mgの(R)-トロロクスメチルエーテルによって生成されるものに等しいものを達成するために必要な1gの試験物質として算出し、より一層低い数はより一層高いORAC活性を指し示した。
【００７８】
DPPH（2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル）アッセイ。フリーラジカルは、一またはそれよりも多く（一以上とも言う）の不対原子価殻電子（unpaired valence shell electron）を有する分子または原子である。そのような物質は、不安定であることが多いとは限らないが、化学的に一時的であり、および反応性が高い。フリーラジカルは、燃焼、日光による照射、および通常の代謝--特に、細胞呼吸、免疫応答および炎症プロセスを伴うものを含め、多くのプロセスによって生産され得る。生物学的システムでは、フリーラジカルは最も普通に酸素代謝および活性酸素種に関係する。フリーラジカルの高い反応性は、それらが生物学的分子に損傷を与えることを可能にする。そのような反応の生成物がフリーラジカルそれら自体である場合、このことは損傷のカスケードにつながる可能性がある。そのような損傷は炎症反応をトリガーし、有害な自立ループ（self-sustaining loop）に潜在的につながる可能性がある。このことは、フリーラジカル生成環境ストレスに最も曝露される器官として、ヒトの皮膚において特に重要である。したがって、フリーラジカルをクエンチまたはスカベンジする（取り除くとも言う）物質の能力を測定するための方法は、どのような物質が有効な抗酸化物質であるかを定めることにおいて有用であり得、およびフリーラジカルおよびそれらがトリガーするプロセスに関連する皮膚損傷の徴候を軽減および防止するのに役立ち得る。一つの共通のアプローチは、フリーラジカル状態の間に電子非局在化のために強く着色され、およびクエンチされる場合その色を失う安定なフリーラジカルの使用である。DPPHは、そのラジカル形態が固体形態ではバイオレット（紫色）-ブラックであり、そのメタノール溶液ではバイオレットであり、一方、クエンチされた形態は溶液中で淡黄色であるので、比色アッセイでの使用に非常に適した安定な有機フリーラジカルである。この変化は波長515nmでの吸光度の減少として測定することができる。この減少の動力学はまた、試験物質によるフリーラジカルスカベンジング（遊離基捕捉とも言う）の速度に関する定性的な判断を提供し得る。SUN-SRi（Rockwood（ロックウッド）、TN（テネシー州））からのガラス被覆ポリプロピレン96ウェルマイクロタイタープレート（カタログ番号400 062）およびBioTek Instruments Inc（Winooski、VT）からのSynergy 2マイクロプレートリーダーと共に使用するのに適合させた動力学的比色アッセイによって、DPPH（2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル）フリーラジカルスカベンジング活性を定めた。515nmの波長で吸光度を測定した。各マイクロプレートウェルにおける反応容量は200μlであり、114μMに等しいDPPHの初期濃度を有した。DPPH（Sigma D9132）は、Sigma-Aldrich（St. Louis、MO）から取得した。反応の化学量論を計算し、および1mgのDPPHをクエンチするのに必要な1gの試験物質として表し、より一層低い数値はより一層高い活性を示す。この方法は、W. Brand-Williams（ブランド-ウィリアムズ）らによる論文「Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity（抗酸化活性の評価のためのフリーラジカル法の使用）」、LWT-Food Science and Technology（LWT-フード・サイエンス・アンド・テクノロジー）、第28巻、第1号、1995年、第25-30頁に掲載された手法を編集（翻案などとも言う）した。
【００７９】
DPPHアッセイにおけるNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの評価。試験の直前に、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの5％v/v希釈物を脱イオン水において調製した。これらの希釈物の70マイクロリットルのアリコート（試験セットアップにおいてメニスカスを形成するのに十分な量）ならびにブランクとしての脱イオン水を、石英96ウェルマイクロタイタープレート（クリアボトム、ブラックサイド、Hellma Analytics（ヘルマ・アナリティクス）から取得したもの）のウェルに置いた。プレートを厚さ1ミリメートルの石英シートで覆った。被覆したプレートを、Peltier冷却表面の頂上の白色のアンダーレイ上に置いた（Torrey Pines Scientific heating/chilling dry bath/shaker with microplate holder attachment（マイクロプレート・ホルダー・アタッチメントを有するトリー・パインズ・サイエンティフィック・ヒーティング/チリング・ドライ・バス/シェーカー））。Peltier冷却をセ氏15度に設定した。プレートは、エアマス1.5に対応するフィルタおよびミラー構成を有するソーラーシミュレータ（SolarLightからのLS-1000）を用いて照射した。サンプルの照射に先立ち、1ミリメートルの石英シートを通過するソーラーシミュレータ光について1最小紅斑線量（Minimal Erythemal Dose）（MED）に対応する時間を、データロギングラジオメーターで紅斑検出器を備えたもの（それぞれPMA2100および2101で、共にSolarLightからのもの）を用いて測定した。サンプルを有する石英プレートは、4MEDへの曝露に対応する時間の間照射した。
【００８０】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを、反応容量で約10％v/vないし約0.2％v/vの範囲の濃度にて、上記のようにDPPHクエンチングアッセイにおいて、希釈剤として脱イオン水を用い、-照射前後に-試験した。
【００８１】
表3および4に示されるように、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの両方が、フルスペクトルシミュレート日光によって送られた4 MED曝露後、それらの初期DPPHクエンチング能力（quenching capacities、消光能とも言う）の95％より多くを維持した。
【表３】
2019506436.tif 000005
【表４】
2019506436.tif 000006
【００８２】
臨界波長（CW）、nmは、FDA、Final Rule（最終規則）2011に従って決定した。0.75mg/平方cmフィルムの吸光度は、4 MEDの事前照射後、290nmおよび400nm間で測定した。CWは分光吸光度曲線の積分が290から400nmまでの積分の90％に達する波長として規定された。
【００８３】
Nerumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの吸光度スペクトルおよび光安定性評価：Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの5％v/v希釈物を、試験の直前に脱イオン水において調製した。これらの希釈物の70マイクロリットルのアリコート（試験セットアップにおいてメニスカスを形成するのに十分な量）、ならびにブランクとしての脱イオン水を、石英96ウェルマイクロタイタープレート（クリアボトム、ブラックサイドで、Hellma Analyticsから取得した）のウェルに置いた。プレートを厚さ1ミリメートルの石英シートで覆った。被覆したプレートを、Peltier冷却表面の頂上の白色のアンダーレイ上に置いた（Torrey Pines Scientific heating/chilling dry bath/shaker with microplate holder attachment）。Peltier冷却をセ氏15度に設定した。プレートホルダー温度は18Cであった。プレートは、エアマス1.5に対応するフィルタおよびミラー構成を有するソーラーシミュレータ（SolarLightからのLS-1000）を用いて照射した。サンプルの照射に先立ち、1ミリメートルの石英シートを通過するソーラーシミュレータ光について1最小紅斑線量（MED）に対応する時間を、データロギングラジオメーターで紅斑検出器を備えたもの（それぞれPMA2100および2101で、共にSolarLightからのもの）を用いて測定した。サンプルを有する石英プレートを、1、4、および8MEDsに対応する合計曝露について照射した。1MEDは、この試験では、14分25秒であった。プレートの頂部は照射の間に最大で約36度Cに達した。照射前、ならびに1；4、および8 MEDの合計曝露の後、BioTek Synergy 2マイクロプレートリーダーを用いて、280ナノメートルから500ナノメートルまでの波長でのマイクロタイタープレート内容物の吸光スペクトルを取得した。
【００８４】
脱イオン水を有するウェルで得られた吸光度曲線を、希釈したセラム・フラクションの吸光度曲線から差し引いた。次いで、これらのブランク控除曲線を形状および比率のより一層明確な定性的比較のために正規化した。正規化は、曲線の最大吸光度を1とし、および曲線の最小吸光度を0とした再スケーリングであった。これらの減少の異なる性質は正規化吸光度曲線によって明確に示される。
【００８５】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションのUVA-UVB比は、290nmおよび400nm間で-照射の前後に-測定された正規化された吸光度曲線に基づいて決定された。290-320（UVB領域）の曲線下エリア（曲線下面積とも言う）の比を320nmおよび400nm（UVA領域）の曲線下エリアと比較した。UVA/UVB比は、様々な原料、日焼け止めアクティブおよび完成品の保護可能性（protection potential）および光安定性を決定するためにこの産業によって使用される最適な（of choice）パラメータである。
【００８６】
5％Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの正規化した吸光度スペクトル（図2）は、シミュレーションされたフルスペクトル日光への曝露の増加が、約310nmから約380nmまでの波長の比例的により一層高い減衰を引き起こし、最も顕著な違いは約350ナノメートルでのピークである。照射後のUVA/UVB比での有益な変化（表5に示す）は、UVA1（340nm-400nm）領域での吸光度の増加に主に対応する。
【表５】
2019506436.tif 000007
【００８７】
5％Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの正規化吸光度スペクトル（図3）は、1 MEDへの曝露が約310nmから約340nmまでの比例的により一層低い吸光度を引き起こすことを示す。さらなる照射は吸光度スペクトルの顕著な変化を引き起こさない。したがって、照射後のUVA/UVB比でのわずかな低下（表6に示す）は、主にUVA2領域（320nm-340nm）において、および部分的にUVB領域（290nm-320nm）における吸光度の低下に対応する。
【表６】
2019506436.tif 000008
【００８８】
意外にも、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションおよびChamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの原料が各々、次の相乗的な組合せを有することが見出された：UVA-UVBエリアにおける有益な分光吸収特性が、強力な生物学的活性と併せてフルスペクトル太陽曝露および関連する酵素モデルに関係して様々なインビトロ細胞培養ベースのバイオアッセイにおいて実証された。双方の原料は、フルスペクトルのシミュレーションされた日光によって送られた4 MED曝露後に初期（照射前）のDPPHクエンチング能力を95％よりも高く維持した。
【００８９】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションは、放射線量が増加するにつれてUVA1エリアにおける増加した減弱を示したが、それは普通でなく、望ましく、および予想されない特性である。
【００９０】
Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの活性を以下の表7に概説する。
【表７−１】
2019506436.tif 000009
【表７−２】
2019506436.tif 000010
【００９１】
Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの活性を以下の表8に概説する。
【表８】
2019506436.tif 000011
【００９２】
実験結果は、本発明の原料が皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な有害作用を軽減するために一緒にはたらく多機能活性を提供することを示唆する。
例2
処方において（in Formula）プラシーボと比較したしわ外観に及ぼすNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの効果
【００９３】
目的：この実験の目的はしわ外観に対するNacumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクション（ここではHarmonianceTMとも称する）の効果を研究することであった。
【００９４】
方法論：これは、プラシーボに対する比較二重盲検試験であり、20名のボランティアの顔について8週間にわたって行った。主要な評定基準は、縞投影（fringe projection）3Dイメージング（DermaTOP（ダーマTOP）*）による皮膚トポグラフィ測定に基づいた。
【００９５】
実験プロトコル：顔の各側は、スキンケア処方において0.5％で調剤されたいずれかの生物機能性生成物（biofunctional product）またはそのプラシーボを受けた。その前に、調整相（conditioning phase）が実行され；この研究におけるプラシーボクリームはコンディショニング生成物として使用され、それはD0来診（visit）の8日前に対象に配布された。最初の適用はD0の測定後に研究所で行われた。試験の終わりまで、以下のものが対象によって、1日2回、朝および夕方に行われた。ボランティアは来診日D56の前に夕方にクリームの塗布を中止した。
【００９６】
結果：4週間の適用後、異なるしわパラメータ（容量およびエリア）ならびに皮膚マイクロレリーフ（Rz）は、プラシーボ処置した側と比較して生物機能性の処置した側で著しく減少し、および8週間の適用後に減少し続けた。
【００９７】
さらに、8週間の適用後、0.5％Harmoniance含有クリームで処理した側について、プラシーボ処置した側と比較してしわの数の著しい減少が観察された。
【００９８】
以下の表9-12に、Nacumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの、プラシーボと比較したしわ外観の処置効率に関するデータを提供する。
しわの数の測定
【００９９】
表9は、0.5％Harmoniance処置した側およびプラシーボ処置した側について、縞投影、DXおよびD0間の差異によるしわの数の測定値を例示する。
【表９】
2019506436.tif 000012
DXはD28またはD56である。ns：有意でない；**：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で極めて有意であり；平均+/-sem、n=18。変化の%=100*[(D56Harmoniance-D0Harmoniance)-(D56プラシーボ-D0プラシーボ)]/((D0Harmoniance+D0プラシーボ)/2)。
しわの容量の測定
【０１００】
表10は、0.5％Harmoniance処置した側およびプラシーボ処置した側について、縞投影、DXおよびD0間の差異によるしわの容量（mm3）の測定値を例示する。
【表１０】
2019506436.tif 000013
DXはD28またはD56である。*：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で有意であり；平均+/-sem、n=18。変化の%=100*[(DXHarmoniance-D0Harmoniance)-(DXプラシーボ-D0プラシーボ)]/((D0Harmoniance+D0プラシーボ)/2)。
しわのエリアの測定
【０１０１】
表11は、0.5％Harmoniance処置された側およびプラシーボ処置された側について、縞投影、DXおよびD0間の差異によるしわのエリア（mm2）の測定値を例示する。
【表１１】
2019506436.tif 000014
DXはD28またはD56である。*：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で有意であり；平均+/-sem、n=18。変化の%=100*[(DXHarmoniance-D0Harmoniance)-(DXプラシーボ-D0プラシーボ)]/((D0Harmoniance+D0プラシーボ)/2)。
Rz測定値
【０１０２】
表12は、0.5％Harmoniance処置した側およびプラシーボ処置した側について、縞投影、DXおよびD0間の差異によるRzパラメータ（mm）の測定値を例示する。
【表１２】
2019506436.tif 000015
DXはD28またはD56である。*：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で有意であり；平均+/-sem、n=18。変化の%=100*[(DXHarmoniance-D0Harmoniance)-(DXプラシーボ-D0プラシーボ)]/((D0Harmoniance+D0プラシーボ)/2)。
【０１０３】
一般的結論：二重盲検研究の目的は、プラシーボクリームと比較して、しわ外観に関するHarmoniance含有クリームによる処置の効果をインビボ（in vivo）で評価することであった。
【０１０４】
効果はしわの数ならびにそれらの容量およびエリアの著しい減少によって最初に確認された。
【０１０５】
さらに、皮膚マイクロレリーフ（Rz）は、0.5％Harmonianceで4週間の適用後に著しく減少し、より一層滑らかな皮膚を示唆した。
【０１０６】
からすのあしあと（crow’s feet）のカラー写真において、および皮膚トポグラフィ画像（topography pictures）において、皮膚の平滑化およびしわの減少が観察された。
【０１０７】
現状の下で、これらの結果は、しわ外観を低減するための0.5％Harmonianceの有効性を確認した。
例3
処方においてプラシーボと比較した皮膚の水和に及ぼすNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの効果
【０１０８】
目的：この実験の目的は、皮膚の水和に及ぼすNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクション（ここではHarmonianceTMとも称する）の効果を研究することであった。
【０１０９】
方法論：これは、プラシーボに対する比較二重盲検試験であり、20名のボランティアの前腕に対して6時間の期間にわたって行った。主な評定基準は皮膚水和測定（skin hydration measurement）に基づく。
【０１１０】
実験プロトコル：互いに対向する30cm2の二つのエリアを、前腕上で、スキンケア処方において0.5％で処方された生物機能性生成物またはそのプラシーボのいずれかの測定および適用について定めた。未処置条件についてこれらのエリアの一つの下で第三のエリアを定めた。唯一の適用はT0の測定後に実験室で行った。
【０１１１】
結果：我々は、Harmoniance含有クリームの適用後3時間および6時間の皮膚の水和の、プラシーボクリームと比較した高度に有意な改善に注目した。
【０１１２】
以下の表13-15に、Nacumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションのプラシーボと比較した皮膚水和処置効率に関するデータを提供する。
皮膚水和測定
【０１１３】
水和測定は容量法を用いるCorneometer（コルネオメーター）*CM 825（Courage＆Khazaka（カーリッジ＆カザカ）*）により行った。
【０１１４】
表13は、0.5％Harmoniance処置した側およびプラシーボ処置した側について、水和測定（キャパシタンス、AU）、TXおよびT0間の差を例示する。
【表１３】
2019506436.tif 000016
TXはT3hまたはT6hである。***：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で高度に有意であり；平均+/-sem、n=20。変化の%=100*[(TXHarmoniance-T0Harmoniance)-(TXプラシーボ-T0プラシーボ)]/((T0Harmoniance+T0プラシーボ)/2)。
【０１１５】
我々は、Harmoniance含有クリームでの適用後3hおよび6hの皮膚水和の、プラセボクリームと比較した大いに有意な改善に注目した。
経皮水分喪失（Transepidermal Water Loss）
【０１１６】
Trans epidermal water loss（経皮水分喪失）（TEWL）は、AquaFlux（アクアフラックス）* AF200（Biox（バイオックス）*）により測定したが、それはコンデンサー（凝縮）-チャンバー（密閉チャンバー）測定法である。この密閉-チャンバーの設計は外気の動きによる測定の妨害を排除する。
【０１１７】
T6hでの測定中の技術的問題のために、結果はこの時間について16名のボランティアに与えられた。
【０１１８】
表14は、0.5％Harmoniance処置した側およびプラシーボ処置した側について、TEWL測定（g/m2h）、TXおよびT0間の差を例示する。
【表１４】
2019506436.tif 000017
TXはT3hまたはT6hである。***：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で大いに有意であり；平均+/-sem、T3hでn=20およびT6hでn=16。変化の%=100*[(TXHarmoniance-T0Harmoniance)-(TXプラシーボ-T0プラシーボ)]/((T0Harmoniance+T0プラシーボ)/2)。
【０１１９】
適用後3時間および6時間で、TEWLの大いに有意な減少が観察された。
皮膚柔軟性測定
【０１２０】
柔軟性測定は、Frictiometer（フリクシオメーター、皮膚摩擦計）*FR700（Courage＆Khazaka *）により実行した。
【０１２１】
表15は、0.5％Harmoniance処置側およびプラシーボ処置側について、柔軟性測定（AU）、TXおよびT0間の差異を例示する。
【表１５】
2019506436.tif 000018
TXはT3hまたはT6hである。***：データが正規分布に従うかどうかに依存してスチューデントt検定またはウイルコクソン検定で大いに有意であり；平均+/-sem、n=20。変化の%=100*[(TXHarmoniance-T0Harmoniance)-(TXプラシーボ-T0プラシーボ)]/((T0Harmoniance+T0プラシーボ)/2)。
【０１２２】
適用後3時間および6時間で皮膚柔軟性の非常に有意な改善が観察された。
【０１２３】
一般的結論：二重盲検研究の目的は、皮膚水和に対するHarmoniance含有クリームによる処置の効果をインビボで評価することであった。
【０１２４】
本効果は、一回の単一適用後の皮膚の水和の著しい増加によって最初に確認された。
【０１２５】
さらに、この改善は、TEWLの著しい減少によって特徴付けられ、0.5％でのHarmonianceが皮膚バリア機能を回復し得ることを指し示した。
【０１２６】
フリクシオメーター（frictiometer）を用いた測定は、Harmoniance含有クリームの適用後の皮膚柔軟性の増強を指摘した。
【０１２７】
現状の下、これらの結果は皮膚水和を促進するための0.5％Harmonianceの有効性を確認した。
例4
培養細胞および正常ヒト皮膚生検に対するNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの効果
【０１２８】
目的：本研究では、我々は、4つの異なる軸：皮膚水和およびバリア機能、皮膚弛緩、排出および皮膚色素形成に関与するパラメータに対するNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクション（ここではHarmonianceTMとも称する）の効果をインビトロおよびエクスビボ（ex vivo）で評価した。
A．皮膚生検におけるヒアルロン酸蛍光染色
【０１２９】
皮膚生検：正常なヒトの皮膚は26歳の女性の乳房の形成外科インターベンション（整形手術介入とも言う）に由来した。皮膚生検材料は直径6mmのパンチ（pfm medical（ピーエフエム・メディカル）により取得した。それらを、10％のFBS（Lonza（ロンザ社））、2mMのL-グルタミン（Lonza）および100μg/mLのPrimocin（プリモシン）*（InvivoGen（インビボゲン社））を補充したDMEM 1g/Lグルコース（Lonza）の50％およびHam's-F12（ハムズF12）（Lonza）の50％を含む培養培地にて培養した。皮膚生検材料は5％のCO2を含む加湿雰囲気中37℃で維持した。
【０１３０】
追加実験は、53歳の胸部皮膚および64歳の女性ドナーの腕の皮膚について実行した。
【０１３１】
試薬：ビオチン化ヒアルロン酸結合タンパク質（bHABP）を、Coger（コーガー）から、およびストレプトアビジン-Alexa Fluor（アレクサ・フルーア）*488コンジュゲートを、Invitrogen（インビトロゲン社）から購入した。
【０１３２】
原則：ヒアルロン酸グリコサミノグリカンは、特異的なビオチン化結合タンパク質：bHABPを用いて検出される。蛍光色素に結合したストレプトアビジンによるビオチンの認識は、蛍光顕微鏡下での検査を可能にする。
【０１３３】
処置：皮膚生検材料を、プラシーボ条件においてPBS（Lonza）により、または0.5％か1％で、2回/日、Harmonianceにより、48時間、二重に処置した。20μLの溶液を生検材料の上部に適用した。
【０１３４】
生検材料調製：皮膚の保存および切片を可能にするために、組織を緩衝化10％ホルマリン中で4時間固定した。サンプルを浴に移し、水を除去するためにエタノールで徐々に濃縮し、次いでアルコールを除去するためにキシレンで浴を2回洗浄し、および最後に溶融したパラフィンワックスに包埋した。次いで、埋め込まれた皮膚生検材料を、ミクロトーム（Shandon（シャンドン社））を用いて厚さ4μmの切片に切断し、およびSuperfrost Plus（スーパーフロスト・プラス）*スライド（Thermo Scientific（サーモ・サイエンティフィク社））上に置いた。
【０１３５】
プロトコル：切片を脱パラフィン化し、およびいくつかの連続したキシレン、アルコールおよび水浴で再水和させた。PBS洗浄の後、bHABPを1/400に希釈し、適用し、およびスライドを室温で湿気がある室内において撹拌下に2時間インキュベーションした。PBSでスライドをすすいだ後、ストレプトアビジン、Alexa Fluor*488コンジュゲート、1/1000に希釈したものを、暗所において、室温で、湿気がある部屋において撹拌下に1時間の間適用した。最後に、切片を4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Molecular Probes（モレキュラー・プローブズ）*）により0.3μMにて5分間染色し、およびFluoromount（フルオロマウント）-G*（Electron Microscopy Sciences（エレクトロン・マイクロスコピー・サイエンシーズ社））にマウントした。検出は、20倍の対物レンズを有するZeiss Axiovert（ツァイス・アクシオバート）200M顕微鏡を使用して管理および検査した。写真は、Volocity* acquisition software（ボロシティ*アクイジション・ソフトウェア（Improvision（インプロビジョン））にカップリングされたQimaging（キューイメージング）*EXIブルーカメラで撮影した。
【０１３６】
画像定量化：条件あたり三枚の写真をVolocity* image analysis software（Volocity*画像分析ソフトウェア）（Improvision）により分析し、それは蛍光強度の結果、興味深いゾーンの選定を可能にした。得られた結果は、選定されたゾーンにおける緑色画素強度の和であった。最後に、各写真について、得られた和を、検査した表皮および真皮ゾーンのエリアを考慮することによって調整した。
【０１３７】
統計解析：JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用いて、片側棄却方向（one-tailed direction of rejection）を有する独立サンプルについて統計分析を行った。p≦0.05は有意であり、p≦0.01が非常に有意であり、およびp≦0.005が高度に有意であるとみなされた。
【０１３８】
結果：ヒアルロン酸蛍光染色の定量化を図4に示す。Volocity*画像解析ソフトウェアを伴う。プラシーボに対して統計解析を表現した。（平均値±sem；n=3；*：有意；**：非常に有意；***：スチューデントのt検定で高度に有意）。この実験は、他の2名のドナーで確認された。
【０１３９】
結論：Ex vivo（生体外とも言う）結果は、皮膚生検材料をHarmonianceにより1％にて48時間処置したとき、ヒアルロン酸蛍光染色の増加を示唆した。
B．皮膚生検におけるフィラグリン免疫蛍光染色
【０１４０】
皮膚生検：正常なヒト皮膚は53歳の女性の胸部での形成外科インターベンションに由来した。皮膚生検材料は直径6mmのパンチ（pfm medical）により取得した。それらを、10％のFBS（Lonza）、2mMのL-グルタミン（Lonza）および100μg/mLのPrimocin*（InvivoGen）を補充したDMEM 1g/Lグルコース（Lonza）の50％およびHam's-F12（Lonza）の50％を含む培養培地にて培養した。皮膚生検材料は5％のCO2を含む加湿雰囲気中37℃で維持した。
【０１４１】
追加実験は、64歳の女性ドナーの腕皮膚について実行した。
【０１４２】
抗体：この試験に適用した一次抗体は、次の：抗フィラグリン（Santacruz（サンタクルズ））マウスモノクローナル、1/100に希釈したもので、1時間半の間であった。使用した二次抗体は、次の：Alexa Fluor*488ロバ抗マウス（Invitrogen）、1/1000に希釈したもので、1時間の間であった。
【０１４３】
原則：免疫蛍光は、特異的な一次抗体に結合することによって組織切片において特定のタンパク質の視覚化を可能にする技術である。蛍光色素で標識された二次抗体は、一次抗体を認識するために使用される。次に、免疫蛍光染色されたサンプルは蛍光顕微鏡下で検査される。DAPIによる対比染色は、細胞核を視覚化し、および表皮を局在化させることを可能にする。
【０１４４】
処置：皮膚生検材料を、プラシーボ条件においてPBS（Lonza）で、または1％のHarmonianceで、48時間、1日2回、二重に処置した。20μLの溶液を生検材料の上部に適用した。
【０１４５】
生検材料調製：皮膚の保存および切片を可能にするために、組織を緩衝化10％ホルマリンにおいて4時間固定した。サンプルは、浴に移し、水を除去するためにエタノールで徐々に濃縮し、次いでアルコールを除去するためにキシレンの2回の浴を続け、および最後に溶融したパラフィンワックスにおいて包埋した。次いで、埋め込まれた皮膚生検材料をミクロトーム（Shandon）で4μm厚の切片に切断し、およびPolysine（ポリサイン）*スライド（Thermo Scientific）上に置いた。
【０１４６】
プロトコル：切片を脱パラフィン化し、およびいくつかの連続したキシレン、アルコールおよび水浴により再水和させた。次いで、37℃で15分間、0.25％ペプシン（Zymed（ザイムド）、Invitrogen）/消化を含む非マスキングプロトコルを実行した。PBS洗浄および30分間の5％BSA（Sigma）溶液での非特異的部位の飽和の後、一次抗体を適用し、およびスライドを室温で湿気がある部屋において撹拌しながらインキュベーションした。スライドをPBSですすいだ後、二次抗体を暗所で、室温、湿気がある部屋で撹拌しながら適用した。最後に、細胞核を0.3μMで5分間4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Molecular Probes（モレキュラー・プローブズ）*）で染色し、および切片をFluoromount-G*（Electron Microscopy Sciences）にマウントした。検出は、20倍の対物レンズを有するZeiss Axiovert 200M顕微鏡を使用して管理および検査した。写真は、Volocity* acquisition software（Improvision）にカップリングされたQimaging*EXIブルーカメラで撮影した。
【０１４７】
画像の定量化：条件あたり3枚の写真をVolocity* image analysis software（Improvision）で分析し、それは蛍光強度の結果で興味あるゾーンの選定を可能にした。得られた結果は選定されたゾーンにおける緑色画素強度の和であった。最後に、各写真について、得られた和を、検査した表皮ゾーンの長さの考慮によって調整した。
【０１４８】
統計解析：JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用いて、片側棄却方向を有する独立したサンプルについて統計分析を行った。p≦0.05は有意であり、p≦0.01が非常に有意であり、p≦0.005が高度に有意であるとみなされた。
【０１４９】
結果：フィラグリン蛍光染色の定量化を図5に示す。Volocity* image analysis softwareを伴う。プラシーボと比較して統計解析を表した。（平均±sem；n=3；***：スチューデントのt検定で高度に有意である）。この実験は別のドナーで確認された。
【０１５０】
結論：我々は、48時間、1％のHarmonianceで処置された皮膚生検材料におけるフィラグリン蛍光強度の増強を、プラシーボ処置されたものと比較して観察した。
C．皮膚生検におけるAQP3免疫蛍光染色
【０１５１】
皮膚生検：正常なヒト皮膚は53歳女性の胸部での形成外科インターベンションに由来した。皮膚生検材料は直径6mmのパンチ（pfm medical）により取得した。それらを、10％のFBS（Lonza）、2mMのL-グルタミン（Lonza）および100μg/mLのPrimocin*（InvivoGen）を補充したDMEM 1g/Lグルコース（Lonza）の50％およびHam's-F12（Lonza）の50％を含む培養培地にて培養した。皮膚生検材料は5％のCO2を含む加湿雰囲気において37℃で維持した。
【０１５２】
追加実験は64歳の女性ドナーの腕皮膚について実行した。
【０１５３】
抗体：この試験に適用した一次抗体は、次の：抗AQP3（Santacruz）ヤギポリクローナル、1/100に希釈したもので、1時間半の間であった。使用した二次抗体は、次の：Alexa Fluor*488ロバ抗ヤギ（Invitrogen）、1/1000に希釈したもので、1時間の間であった。
【０１５４】
原理：免疫蛍光は、特異的な一次抗体に結合することによって組織切片において特定のタンパク質の視覚化を可能にする技術である。蛍光色素で標識された二次抗体は一次抗体を認識するために使用される。次に、免疫蛍光染色されたサンプルを蛍光顕微鏡下で検査する。
【０１５５】
処置：皮膚生検材料を、プラシーボ条件においてPBS（Lonza）で、またはHarmonianceで、1％にて、48時間、1日2回で処置した。20μLの溶液を生検材料の上部に適用した。
【０１５６】
生検材料調製：皮膚の保存および切片を可能にするために、組織を緩衝化10％ホルマリンにおいて4時間固定した。サンプルは、浴に移し、水を除去するためにエタノールで徐々に濃縮し、次いでアルコールを除去するためにキシレンの2回の浴を続け、および最後に溶融したパラフィンワックスにおいて包埋した。次いで、埋め込まれた皮膚生検材料をミクロトーム（Shandon）で4μm厚の切片に切断し、およびPolysine*スライド（Thermo Scientific）上に置いた。
【０１５７】
プロトコル：切片を脱パラフィンし、およびいくつかの連続したキシレン、アルコールおよび水浴により再水和させた。次いで、くえん酸緩衝剤0.01M、pH6（Sigma）において沸騰するまで600Wでのマイクロウェーブ曝露を含め、非マスキングプロトコルを実行した。PBS洗浄および30分間の5％BSA（Sigma）溶液での非特異的部位の飽和の後、一次抗体を適用し、およびスライドを室温で湿気がある部屋においてかき混ぜながらインキュベーションした。スライドをPBSですすいだ後、二次抗体を暗所の室温の湿気がある部屋でかき混ぜながら適用した。最後に、切片をFluoromount-G*（Electron Microscopy Sciences）にマウントした。検出は、20倍の対物レンズを有するZeiss Axiovert 200M顕微鏡を使用して管理および検査した。写真は、Volocity* acquisition software（Improvision）にカップリングされたQimaging*EXIブルーカメラで撮影した。
【０１５８】
画像定量化：条件あたり8枚の写真をVolocity* image analysis software（Improvision）により分析し、それは蛍光強度の結果で興味あるゾーンの選定を可能にした。得られた結果は選定されたゾーンにおける緑色画素強度の和であった。最後に、各写真について、得られた和は検査した表皮ゾーンのエリアを考慮することによって調整した。
【０１５９】
統計解析：JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用い、片側棄却方向を有する独立したサンプルについて、統計分析を行った。p≦0.05は有意であるとみなし、p≦0.01が非常に有意であり、p≦0.005が高度に有意であるとみなした。
【０１６０】
結果：AQP3蛍光染色の定量化を図6に示す。Volocity* image analysis softwareを伴う。プラシーボに対して統計解析を表した。（平均±sem；n=8；***：スチューデントのt検定で高度に有意である）。この実験は別のドナーで確認された。
【０１６１】
結論：我々は、48時間、1％のHarmonianceで処置された皮膚生検材料において、AQP3蛍光強度の増強をプラシーボ処置されたものと比較して観察した。
D．再構成表皮における皮膚バリア機能の評価
【０１６２】
再構成ヒト表皮（RHE）：この研究のために用いたケラチノサイトは、3歳のドナーの包皮から分画したセラム（serum fractioned from）であった。それらは、Serum Free Medium（無血清培地）および100μg/mlのPrimocin*（InvivoGen）において増殖させた。細胞は、5％CO2を含む加湿雰囲気において37℃で維持した。次に、細胞を不活性ポリカーボネート膜（0.5cm2インサート、Nunc）上に播種し、および37℃で化学的に規定された培地（Rosdy（ロスディ）M.およびClauss（クラウス）L.C.、1990；Rosdy M.ら、1993）上で、5％のCO2を含有する加湿雰囲気において、12日間空気浮上させた（air-lifted）。
【０１６３】
追加のデータは、3歳のドナーの包皮から、および24歳のドナーの腹部皮膚から分画したケラチノサイト・セラムを用いて取得した。
【０１６４】
試薬：この研究に使用される蛍光色素はルシファーイエロー（Santacruz）である。
【０１６５】
原則：ルシファーイエロー染料は皮膚バリア完全性を評価することを可能にし、表皮層での染料の浸透は皮膚バリアの透過性と相関する。
【０１６６】
処置：再構築後の17日後に、RHEsを、局所的にストレスを与えたか、またはそうせずに、0.15％SDS（Sigma）で3時間、次いでプラシーボ条件においてPBS（Lonza）で、または0.5％か1％にてHarmonianceで、1日2回、48時間処置した。PBS-リンス後、1mMのルシファーイエロー蛍光色素を添加し、および1時間インキュベーションした。RHEsを再びPBSで洗浄し、およびそれらのインサートから取り出した。
【０１６７】
RHE調製：RHEsの保存を可能にするために、それらを緩衝化10％ホルマリンにおいて4時間固定した。サンプルを浴に移し、エタノールで徐々に濃縮して水を除去し、次いでキシレンの浴を2回続けてアルコールを除去し、および最後に溶融したパラフィンワックスに包埋した。次いで、埋め込まれた皮膚生検材料を、ミクロトーム（Shandon）を用いて厚さ4μmの切片に切断し、およびスライド（Thermo Scientific）上に置いた。
【０１６８】
プロトコル：切片を脱パラフィン化し、およびいくつかの連続したキシレン、アルコールおよび水浴で再水和させた。最後に、細胞核を4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Molecular Probes*）により0.3μMにて5分間染色し、およびFluoromount-G*（Electron Microscopy Sciences）にイメージングのためにマウントした。検出は、20倍の対物レンズを有するZeiss Axiovert 200M顕微鏡を使用して管理および検査した。写真は、Volocity* acquisition software（Improvision）にカップリングされたQimaging*EXIブルーカメラで撮影した。
【０１６９】
画像定量化：条件あたり三枚の写真をVolocity* image analysis software（Improvision）により分析したが、それは蛍光強度の結果、興味深いゾーンの選定を可能にする。得られた結果は蛍光のエリアであった。最後に、各写真について、得られた結果は、全体的な表皮ゾーンのエリアを考慮することによって調整された。
【０１７０】
統計解析：JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用いて、片側棄却方向を有する独立サンプルについて統計分析を行った。p≦0.05は有意であり、p≦0.01が非常に有意であり、およびp≦0.005が高度に有意であるとみなされた。
【０１７１】
結果：蛍光色素浸透の定量化を図7に示す。Volocity*画像解析ソフトを伴う。プラシーボに対して統計解析を表現した。（平均値±sem；n=3；***：スチューデントのt検定で高度に有意）。この実験は他の2名のドナーで確認された。
【０１７２】
結論：我々は、再構成表皮でのSDSストレス後、1％のHarmoniance処置により皮膚バリア回復の改善を観察した。
F．繊維芽細胞でのコラーゲンI免疫蛍光染色
【０１７３】
線維芽細胞：この研究に用いた線維芽細胞は、53歳の女性ドナーの正常ヒト皮膚から取り出した。それらは、10％のFBS（Lonza）、2mMのL-グルタミン（Lonza）および100μg/mLのPrimocin*（InvivoGen）を補充したDMEM 1g/Lグルコース（Lonza）において増殖させた。細胞を、5％CO2を含む加湿雰囲気において37℃で維持した。
【０１７４】
抗体：この試験のために適用した一次抗体は、次の：1/100に希釈した抗コラーゲンI（Rockland（ロックランド社））ラビットポリクローナルで、一時間と三十分であった。使用した二次抗体は、次の：1/1000に希釈したAlexa Fluor*488ロバ抗ラビット（Invitrogen）で、1時間であった。
【０１７５】
原理：免疫蛍光は、特異的な一次抗体に結合することによって細胞において特定のタンパク質の視覚化を可能にする技術である。蛍光色素で標識された二次抗体は一次抗体を認識するために使用される。次いで免疫蛍光染色されたサンプルを蛍光顕微鏡下で検査する。DAPIによる対比染色は細胞核を視覚化することを可能にする。
【０１７６】
細胞調製：細胞を8ウェルガラスチャンバースライド（Falcon（ファルコン社））において播種した。条件ごとに2つのウェルを分析した。
【０１７７】
処置：細胞を、培養培地において直接希釈した0.01％のHarmonianceで、2通り、1日2回、48時間処置し、または処置しなかった。
【０１７８】
プロトコル：処置後、細胞をPBSですすぎ、および冷メタノールにより4℃で4分間固定した。次いで、細胞を、かき混ぜながら、一次抗体と室温でインキュベーションした。三回のPBS洗浄の後、蛍光二次抗体を、暗所、室温で、かき混ぜながら適用した。PBSで他の三回洗浄した後、細胞核を4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Molecular Probes*）により0.3μMで5分間染色し、およびスライドをFluoromount-G*（Electron Microscopy Sciences）においてマウントした。検出は、20倍の対物レンズを備えたZeiss Axiovert 200M顕微鏡を使用して管理および検査した。写真は、Volocity *取得ソフトウェア（Improvision）にカップリングされたQimaging*EXIブルーカメラで撮影した。
【０１７９】
画像定量化：一条件あたり三枚の写真をVolocity*画像分析ソフトウェア（Improvision）で分析し、それはコラーゲンI蛍光強度の結果、細胞を選定することを可能にする。得られた結果は、選定されたゾーンにおける緑色画素強度の和であった。最後に、各写真について、得られた和は細胞のエリアを考慮して調整された。
【０１８０】
統計学的解析：JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用いて、片側棄却方向を有する独立したサンプルについて統計分析を行った。p≦0.05は有意であり、p≦0.01が非常に有意であり、p≦0.005が高度に有意であるとみなされた。
【０１８１】
結果：コラーゲンI蛍光染色の定量化を図8に示す。Volocity*画像解析ソフトウェアを伴う。統計的な分析が未処置のものに対して示された。（平均±sem；n=3；***：スチューデントのt検定で非常に有意である）。
【０１８２】
結論：我々は、0.01％のHarmonianceで48時間処置した線維芽細胞についてコラーゲンI蛍光強度において統計的に有意なin vitro増強を観察した。
G．皮膚生検におけるUVストレス後の弾性繊維
【０１８３】
皮膚生検：正常なヒト皮膚は30歳の女性の胸部での形成外科インターベンションに由来した。直径6mmを有するパンチ（pfm medical）により皮膚生検材料を取得した。それらは、10％のFBS（Lonza）、2mMのL-グルタミン（Lonza）および100μg/mLのPrimocin*（InvivoGen）を補充したDMEM 1g/Lグルコース（Lonza）の50％およびHam's-F12（Lonza）の50％を含む培養培地にて培養した。皮膚生検材料は、5％のCO2を含む加湿雰囲気において37℃で維持した。
【０１８４】
試薬：弾性繊維を染色するために、Elastica Van Gieson（エラスチカ・ワン・ギーソン）染色キット（Merck（メルク社））を用いた。
【０１８５】
原則：レゾルシノール-フクシン溶液は、Weigert（ワイゲルト）に従い、van Giesonのピクロフシン溶液と組み合わせて、弾性繊維（ブラック-パープルにおいて）およびコラーゲン（レッド-ピンクにおいて）の視覚化を可能にする。
【０１８６】
処置：皮膚生検材料は、2通りで、Harmonianceを1％にて用いて、1日2回、48時間、処置するか、または処置しなかった。20μlの溶液を生検材料の上部に適用した。次いで、5J/cm2UVAおよび200mJ/cm2 UVBの単一ドーズで皮膚生検材料にストレスを与え、および染色前に10時間再インキュベーションした。UVAオーブンタイプBLX-E365およびUVBオーブンタイプBLX-E312（Fisher Bioblock Scientific（フィッシャー・バイオブロック・サイエンティフィック））を使用した。
【０１８７】
生検材料調製：皮膚の保存および切片を可能にするために、組織を緩衝化10％ホルマリンにおいて4時間固定した。サンプルは、浴に移し、水を除去するためにエタノールで徐々に濃縮し、次いでアルコールを除去するためにキシレンの2回の浴を続け、および最後に溶融したパラフィンワックスにおいて包埋した。次いで、埋め込まれた皮膚生検材料をミクロトーム（Shandon）で4μm厚の切片に切断し、およびPolysine*スライド（Thermo Scientific）上に置いた。
【０１８８】
プロトコル：切片を脱パラフィン化し、およびいくつかの連続したキシレン、アルコールおよび水浴で再水和させた。PBS洗浄後、切片をWeigertに従ってレゾルシノール-フクシン溶液において15分間インキュベーションした。切片を水において5分間洗浄した。Van Giesonによるピクロフクシン溶液を切片に2分間適用した。いくつかの連続した水、アルコールおよびキシレン浴の後、スライドをEukitt*（オイキット）（O. Kindler（キンドラー））においてマウントし、および40倍の対物レンズを有するEclipse（エクリプス）E600顕微鏡（Nikon（ニコン））を用いて調べた。写真は、QImaging*EXIブルーカメラで撮影し、およびQ-Capture Pro（Q-キャプチャー・プロ）7ソフトウェア（QImaging*）を使用することによって処理した。
【０１８９】
結論：皮膚を1％のHarmonianceで前処理したとき、弾性繊維のより一層良好な組織化が観察された。
H．3T3-L1含脂肪細胞におけるグリセロール放出アッセイ
【０１９０】
3T3-L1含脂肪細胞：3T3-L1前-含脂肪細胞（pre-adipocyte）（ATCC）（PX+8）を、10％のFBS（Lonza）、2mMのL-グルタミンおよび100μg/mLのPrimocin*（InvivoGen）を補充したDMEM 4.5g/Lグルコース（Lonza）において培養した。
【０１９１】
細胞のコンフルエントの2日後、0.5mMのIBMX、1μMのデキサメタゾンおよび10μg/mlのインスリン（Sigma）を培養培地に3日間添加することによって含脂肪細胞（単に脂肪細胞とも言う）への分化を誘導した。その後、IBMXおよびデキサメタゾンを除去し、およびインスリンだけを3ないし4日間維持し；次いで、インスリンも除去し、および細胞は培養培地において別の3日間維持した。
【０１９２】
試薬：グリセロール放出を、Adipolysis Assay Kit（アジポリシス・アッセイ・キット）（Cayman Chemical（ケイマン・ケミカル））を用いて測定した。
【０１９３】
原理：リポリシス（脂肪分解）は、トリグリセリドのグリセロールおよび脂肪酸への加水分解である。グリセロールの放出量は、貯蔵されたトリグリセリドの量および脂肪分解の程度の双方に比例する。
【０１９４】
細胞調製：細胞を24ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific）において播種した。
【０１９５】
処置：分化した細胞を、2通り、培養培地において直接希釈した0.01％のHarmonianceで、または2mMでのカフェインで、1日1回、48時間処置したか、または処置しなかった。
【０１９６】
プロトコル：アッセイは供給者の勧告を用いて実行した。
【０１９７】
統計学的解析：統計分析は、JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用い、片側棄却方向を有する独立したサンプルについて行われた。p≦0.05は有意であり、p≦0.01が非常に有意であり、およびp≦0.005が高度に有意であるとみなされた。
【０１９８】
結果：分化した3T3-L1におけるグリセロール放出の定量化を図9に示す。未処理のものに対して統計的な分析を表した。（平均±sem；n=2；〜：ほぼ有意（nearly significant）；*：スチューデントt検定で有意）。この実験は他の2名のドナーで確認された。
【０１９９】
結論：我々は、0.01％のHarmonianceで48時間処理した3T3-L1のグリセロール放出における統計的に有意なin vitro増強を観察した。
I．皮膚生検におけるメラニン染色
【０２００】
皮膚生検：正常なヒトの皮膚は、52歳の女性の胸部での形成外科インターベンションから由来した。直径6mmのパンチ（pfm medical）を用いて皮膚生検材料を取得した。それらを、10％のFBS（Lonza）、2mMのL-グルタミン（Lonza）および100μg/mLのPrimocin*（InvivoGen）を補充したDMEM 1g/Lグルコース（Lonza）の50％およびHam's-F12（Lonza）の50％を含む培養培地にて培養した。皮膚生検材料は、5％のCO2を含む加湿雰囲気において、37℃で維持した。
【０２０１】
追加の実験を60歳の女性ドナーの腹部皮膚に対して実行した。
【０２０２】
試薬：Fontana-Masson染色は、水酸化アンモニウム（Acros Organics（アクロス・オーガニックス））を硝酸銀溶液（Sigma）に添加することにより形成されるストック溶液調製を必要とする。この溶液を使用前に24時間静置する。
【０２０３】
原理：メラニンはタンパク質に結合するブラウン-ブラック色素のグループである。メラニンはメラノソームにおいてメラノサイトによって合成され、および次いで、基底表皮（basal epidermis）のケラチノサイトに伝達され、そこではそれらは核の上にキャップを形成する。
【０２０４】
Fontana-Masson染色は、外部還元剤を使用せずにアンモニア硝酸銀の溶液を金属銀（ブラウン）に還元するメラニンの能力に基づく。
【０２０５】
処置：皮膚生検材料を、2通り、0.5％-1％-3％でのHarmonianceで、または20mMのこうじ酸で、一日2回、48時間処置したか、または処置しなかった。20μlの溶液を生検材料の上部に適用した。
【０２０６】
生検材料調製：皮膚の保存および切片を可能にするために、組織を緩衝化10％ホルマリンにおいて4時間固定した。サンプルは浴に移し、水を除去するためにエタノールで徐々に濃縮し、次いでアルコールを除去するためにキシレンの2つの浴を続け、および最後に溶融したパラフィンワックスに包埋した。次いで、埋め込まれた皮膚生検材料をミクロトーム（Shandon）で4μm厚の切片に切断し、およびPolysine*スライド（Thermo Scientific）上に置いた。
【０２０７】
プロトコル：切片を脱パラフィン化し、およびいくつかの連続したキシレン、アルコールおよび水浴で再水和させた。次に、100μlのストック溶液を各切片に加え、およびスライドを60℃で10分間インキュベーションした。3分間の蒸留水洗浄後、生検材料を100μlの5％チオ硫酸ナトリウム（Sigma）と共に2分間インキュベーションした。スライドを蒸留水の浴において3分間洗浄し、および最後にいくつかのアルコールおよびキシレン浴において脱水した。それらを、Eukitt*（O. Kindler）にマウントし、20倍の対物レンズと共にEclipse E600顕微鏡（Nikon）を用いて検査した。写真は、QImaging*EXIブルーカメラで撮影し、およびQ-Capture Pro 7ソフトウェア（QImaging*）を使用することによって処理した。
【０２０８】
画像定量化：1条件につき3つの画像を分析した。ImageJソフトウェアは興味深いゾーンを選定することを可能にし、およびこのゾーンにおける強度当たりの画素数を表すヒストグラムを生成する。したがって、すべてのダークピクセル（dark pixel、不点灯ピクセルとも言う）の和（0および175間の強度を有する）が算出され、および取得された和は、検査した表皮ゾーンの長さに対して調節された。（McMullen（マクマレン）R.L.ら、2010）
【０２０９】
統計学的解析：統計分析は、JMP*11ソフトウェア（SAS）およびスチューデントのt検定を用い、片側棄却方向を有する独立したサンプルについて行われた。p≦0.05は有意であり、p≦0.01が非常に有意であり、およびp≦0.005が高度に有意であるとみなされた。
【０２１０】
結果：Fontana Masson染色の定量化を図10に示す。ImageJ解析ソフトウェアを伴う。プラシーに対して統計解析を表した。（平均±SEM；n=3；ns：有意ではない；***：スチューデントのt-検定で非常に有意である）。この実験は別のドナーで確認された。
【０２１１】
結論：1％および3％でのHarmonianceはメラニン含量を減少させるのに大いに役立つ。
J．一般的結論
【０２１２】
この例は、インビトロの（培養された線維芽細胞および3T3-L1含脂肪細胞の）、再構築ヒト表皮およびex vivo（正常ヒト皮膚上）でのHarmonianceの有効性試験を概説した。水和およびバリア機能、皮膚の弛緩、排出および色素形成のマーカーを調べた。
【０２１３】
第一の部分では、1％でのHarmonianceの効果が、ex vivoでの皮膚において、ヒアルロン酸、フィラグリンおよびAQP3タンパク質の発現について観察された。48時間のHarmoniance適用後、これらの皮膚水和マーカーの発現が増加した。
【０２１４】
次いで、SDSストレス後に1％のHarmonianceにより処置した再構築表皮について、皮膚バリア機能を評価した。Harmonianceによる48時間の処置は、SDSストレス効果に対抗することを可能にする。
【０２１５】
次に、コラーゲンおよびエラスチン、皮膚弛緩のマーカーについて、Harmonianceの効果を研究した。我々は、0.01％のHarmonianceで48時間処置した後、線維芽細胞におけるコラーゲンI発現での増加を観察した。さらに、ex vivo皮膚について組み合わせたUVAおよびUVBストレスの後、皮膚をHarmonianceの1％で48時間前処置したとき、弾性繊維のより一層良好な組織化が示された。
【０２１６】
第三の部分では、グリセロール放出、排出能力の指標についてHarmoniance効果を調べた。それを行うために、3T3-L1前-含脂肪細胞にてグリセロール遊離を調べた。分化した細胞に対して0.01％のHarmoniance処置を48時間行った後、グリセロール放出の増強が検出された。
【０２１７】
最後の部分では、皮膚の色素形成を、48時間のHarmoniance処置後に評価した。メラニン含量での減少が用量依存的に観察された。
【０２１８】
Harmonianceは、水和およびバリア機能、皮膚弛緩およびしわの外観、排出およびボディコントワリング、皮膚色素形成およびトーンを含め、皮膚加齢に関係する皮膚外観の最も重要な属性を標的とする。
【０２１９】
上記の例は、本発明の生物活性調剤物の一定の実施形態の非制限的な例である。これらの例は、例示の目的のためにだけ与えられ、本発明の精神および範囲を離れることなく、その多くの変形が可能であるので、本発明の制限として解釈されるべきではなく、そのことは当業者によって認識されるであろう。例では、特に明記しない限り、すべての濃度は重量パーセントとしてリストされ、小量の物質、例えば、希釈剤、充填剤、およびその他同種類のものなどのようなものは除くことができる。したがって、リストされた調剤物は、リストされた成分およびそのような成分に付随する任意の小量の物質を含む。当業者には明らかであるように、これらの小量の物質の選定は、ここに記載されるように本発明を形成するために選定される特定の原料の物理的および化学的特質に依存して変えられる。
【０２２０】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の真の精神および範囲から離れることなく、様々な改変を行うことができ、および等価物に置換することができることは当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、物質、組成物、プロセス、プロセスステップまたはステップ群を、本発明の目的の精神および範囲に対して適合させるために、多くの修飾が行われてもよい。そのような修飾はすべて、ここに添付の請求の範囲の視野に含まれると意図される。
【０２２１】
ここでの参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であると認めるものとして解釈されるべきではない。ここで引用したすべての参考文献は、その全体において参照によりここに組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月9日(2018.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚加齢に関係する皮膚外観の改善用の抗加齢生物活性組成物であって、
有効量のNelumbo nucifera（ネルムボ・ヌシフェラ）（Sacred Lotus（セイクレド・ロータス））セラム・フラクションを含み、
少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に、該少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される、抗加齢生物活性組成物。
【請求項２】
前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの有効量は、合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項３】
皮膚科学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項４】
合計組成物の重量で、前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションを0.001％から99％まで含む、請求項３の抗加齢生物活性組成物。
【請求項５】
皮膚の日光への曝露の悪影響を軽減する、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項６】
皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の悪影響を軽減するために相乗的に作用する多機能活性を有する、請求項５の抗加齢生物活性組成物。
【請求項７】
皮膚水和、皮膚バリア機能、皮膚弛緩、皮膚のしわの外観、排出およびボディコントワリング、皮膚色素形成、および／または皮膚トーンを改善することによって皮膚加齢に関係する皮膚外観属性を改善するのに効果的である、請求項６の抗加齢生物活性組成物。
【請求項８】
以下のもの：（i）UVA-UVBエリアにおける有益な分光吸収特質；（ii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露後実証された広範囲のUVAおよびUVBスペクトル吸収光安定性と関連した高いUVA：UVB吸光度比；（iii）放射線量が増加するときのUVA1エリアにおける増加した減弱およびUVA/UVB比における同時増加；（iv）フルスペクトルシミュレート太陽曝露に関係する様々なインビトロ細胞培養ベースのバイオアッセイおよび関連する酵素モデルにおいて実証された強力な生物学的活性（特性）；（v）フルスペクトルシミュレート日光によってもたらされる4 最小紅斑線量（MED）曝露後の初期（照射前）のDPPHクエンチング能力の95％より高い維持；（vi）皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な悪影響を軽減するために一緒にはたらく多機能活性；および（vii）それらの組合せからなる群より選ばれる特性の相乗的組合せをもつ、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項９】
皮膚表面は、身体皮膚表面および顔皮膚表面からなる群より選ばれる、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１０】
日焼け止め剤アクティブ、抗炎症剤、および皮膚トーン剤からなる群より選ばれる追加原料をさらに含む、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１１】
皮膚加齢の複数の徴候の外観を改善するのに十分な期間について皮膚加齢の複数の徴候に適用される、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１２】
前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションは、自然において見出されない分別プロセスを用いて分離される、請求項１の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１３】
前記分別プロセスは、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）植物の新鮮な植物バイオマスから導き出される植物細胞ジュースを、凝固した膜フラクションが含まれる凝固した細胞ジュース混合物を産生する植物細胞ジュースが不安定化されるのに有効な時間について2.45GHzよりも高い周波数にて電磁場にさらすこと、および前記凝固した膜フラクションを、前記膜フラクションが実質フリーな細胞質／サイトゾル・フラクションを含む生物活性フラクションを産生するために、前記凝固した細胞ジュース混合物から分離すること、次いで細胞質フラクションが、セラム・フラクションを産生するために安定化されるサイトゾル・フラクションから分離されることを可能にする追加の処理を続けることを含む、請求項１２の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１４】
皮膚加齢に関係する皮膚外観の改善用の抗加齢生物活性組成物であって、
有効量のChamomilla recutita（カモミラ・レクティタ）（German Chamomile（ジャーマン・カモミール））セラム・フラクションを含み、
少なくとも一の加齢の徴候を有する皮膚表面に、該少なくとも一の加齢の徴候の外観を改善するのに十分な期間について適用される、抗加齢生物活性組成物。
【請求項１５】
前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションの有効量は、合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１６】
皮膚科学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１７】
合計組成物の重量で、前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションを0.001％から99％まで含む、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１８】
皮膚の日光への曝露の悪影響を軽減する、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項１９】
皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の悪影響を軽減するために相乗的にはたらく多機能活性を有する、請求項１８の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２０】
皮膚水和、皮膚バリア機能、皮膚弛緩、皮膚のしわの外観、排出およびボディコントワリング、皮膚色素形成、および／または皮膚トーンを改善することによって皮膚加齢に関係する皮膚外観属性を改善するのに効果的である、請求項１９の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２１】
以下のもの：（i）UVA-UVBエリアにおける有益な分光吸収特質；（ii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露後実証された広範囲のUVAおよびUVBスペクトル吸収光安定性と関連した高いUVA：UVB吸光度比；（iii）フルスペクトルシミュレート太陽曝露に関係する様々なインビトロ細胞培養ベースのバイオアッセイおよび関連する酵素モデルにおいて実証された強力な生物学的活性（特性）；（iv）フルスペクトルシミュレート日光によってもたらされる4 最小紅斑線量（MED）曝露後の初期（照射前）のDPPHクエンチング能力の95％よりも高い維持；（v）皮膚細胞に対するフルスペクトル日光曝露の様々な悪影響を軽減するために一緒にはたらく多機能活性；および（vi）それらの組合せからなる群より選ばれる特性の相乗的組合せをもつ、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２２】
皮膚表面は、身体皮膚表面および顔皮膚表面からなる群より選ばれる、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２３】
日焼け止め剤アクティブ、抗炎症剤、および皮膚トーン剤からなる群より選ばれる追加原料をさらに含む、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２４】
皮膚加齢の複数の徴候の外観を改善するのに十分な期間について皮膚加齢の複数の徴候に適用される、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２５】
前記Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーのセラム・フラクションは、自然に見出されない分別プロセスを用いて分離される、請求項１４の抗加齢生物活性組成物。
【請求項２６】
前記分別プロセスは、Chamomilla recutita（German Chamomile）フラワーの新鮮な植物バイオマスから導き出される植物細胞ジュースを、凝固した膜フラクションが含まれる凝固した細胞ジュース混合物を産生する植物細胞ジュースが不安定化されるのに有効な時間について2.45GHzよりも高い周波数にて電磁場にさらすこと、および前記凝固した膜フラクションを、前記膜フラクションが実質フリーな細胞質／サイトゾルを含む生物活性フラクションを産生するために、前記凝固した細胞ジュース混合物から分離すること、次いで細胞質フラクションが、セラム・フラクションを産生するために安定化されるサイトゾル・フラクションから分離されることを可能にする追加の処理を続けることを含む、請求項２５の抗加齢生物活性組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一実施形態では、前記Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの有効量は、合計組成物の重量で0.001％から100％までの範囲にある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
目的：この実験の目的は、しわ外観に対するNelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクション（ここではHarmonianceTMとも称する）の効果を研究することであった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
以下の表9-12に、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションの、プラシーボと比較したしわ外観の処置効率に関するデータを提供する。
しわの数の測定
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
以下の表13-15に、Nelumbo nucifera（Sacred Lotus）セラム・フラクションのプラシーボと比較した皮膚水和処置効率に関するデータを提供する。
皮膚水和測定
【国際調査報告】
2019506436.tif 000029