(57)【要約】  本発明は、小滴集合を製造するための方法に関し、該小滴集合は、複数の小滴を含み、ここで、前記小滴はそれぞれ：ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含み、当該方法は：バルク疎水性媒体中に複数の小滴を生成することを含み、ここで、前記小滴はそれぞれ：ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；水性媒体に配置された１つ以上の生体細胞とを含む。本発明はまた、複数の小滴を含む小滴集合に関し、ここで、前記小滴のそれぞれは：（ｉ）ヒドロゲル化合物を含む水性媒体を含み；（ｉｉ）水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含み；かつ、（ｉｉｉ）水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含み、ここで、小滴集合中の少なくとも１つの小滴は、小滴集合中の少なくとも１つのその他の小滴に接触し、接触している小滴の間の境界面として両親媒性分子の層を形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小滴集合を製造するための方法であって、該小滴集合は、複数の小滴を含んでおり、前記小滴はそれぞれ：
ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；
該水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含んでおり、
当該方法は：
バルク疎水性媒体中に複数の小滴を生成することを含んでおり、前記小滴はそれぞれ：
ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；
該水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含んでいる、
前記方法。
【請求項２】
前記ヒドロゲル化合物が多糖であり、好ましくは、前記ヒドロゲル化合物がアガロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水性媒体がさらに、１つ以上の安定化剤を含んでいる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の１つ以上の安定化剤がジペプチドを含む化合物から選択され、好ましくは、前記の１つ以上の安定化剤がＦＭＯＣ基で保護されたジペプチドから選択され、より好ましくは、前記の１つ以上の安定化剤がＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよび／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水性媒体がさらに、細胞外の膜タンパク質を含んでおり、好ましくは、該細胞外の膜タンパク質が、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記水性媒体がさらに、培養培地を含んでおり、好ましくは、該培養培地が、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の塩、グルコースおよび１つ以上のビタミンの水溶液である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記水性媒体が：
（ａ）ヒドロゲルを０．５〜３０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでおり；
（ｂ）培養培地を６０．０〜９０．０体積％の濃度で含んでおり；かつ、
（ｃ）ジペプチドを含む化合物を０．１〜１０．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含んでおり；かつ、必要に応じて、
（ｄ）細胞外の膜タンパク質を０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいる、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記の１つ以上の生体細胞が、２つ以上の異なるタイプの生体細胞から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記小滴のうちの１つ以上がそれぞれ、前記水性媒体中に配置された２つ以上の生体細胞を含んでおり、かつ、ここで、前記の２つ以上の生体細胞は、２つ以上の異なるタイプの生体細胞から選択されるか、または、
（ｂ）前記小滴集合が：
第１の複数の小滴を含んでおり、該小滴はそれぞれ、前記水性媒体中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含んでおり、かつ、
第２の複数の小滴を含んでおり、該小滴はそれぞれ、前記水性媒体中に配置された１つ以上の第２のタイプの生体細胞を含んでいる、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記の１つ以上の生体細胞が哺乳類細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記の１つ以上の生体細胞が、前記水性媒体中に水性媒体１ｍＬあたり１０５〜１０９個の細胞の濃度で配置されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記バルク疎水性媒体が、炭化水素化合物および／またはシリコーン油を含んでおり、好ましくは、該炭化水素化合物がＣ８〜Ｃ１６アルカンであり、より好ましくは、該炭化水素化合物がウンデカンである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バルク疎水性媒体が、（炭化水素）：（シリコーン油）の体積比が５０：５０〜８０：２０であり、好ましくは、体積比が６０：４０〜７０：３０である炭化水素とシリコーン油との混合物を含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記バルク疎水性媒体がさらに、１つ以上の両親媒性化合物を含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記の１つ以上の両親媒性化合物が脂質から選択され、好ましくは、前記の１つ以上の両親媒性化合物がリン脂質から選択され、より好ましくは、前記の１つ以上の両親媒性化合物がホスホコリン脂質から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の複数の小滴を生成することが：
（ｉ）複数の分注ステップを含んでおり、該分注ステップはそれぞれ、前記バルク疎水性媒体中に、ある体積の前記水性媒体を注入することを含んでおり、該体積の前記水性媒体はその中に配置された前記の１つ以上の生体細胞を有している、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記水性媒体の前記体積が０．００１〜１００ｎＬであり、該体積の前記水性媒体はその中に配置された前記の１つ以上の生体細胞を有している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記の複数の小滴を生成することが、１００回以上の分注ステップを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記の複数の小滴を生成することが、小滴を生成するための装置を用いることを含んでおり、
該装置は、
（ａ）少なくとも１つの小滴生成器を含んでおり；
（ｂ）容器を含んでおり、該容器は、前記の少なくとも１つの小滴生成器に対して可動であり；かつ、
（ｃ）制御ユニットを含んでおり、該制御ユニットは、前記の少なくとも１つの小滴生成器からの小滴の分注を制御し、かつ、前記の少なくとも１つの小滴生成器に対する前記容器の移動を制御するように適合されている、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記小滴生成器または各小滴生成器が：
チャンバーを含んでおり、該チャンバーは、前記水性媒体を保持するためのものであり、前記水性媒体中には前記の１つ以上の生体細胞が配置されており；
出口を含んでおり；かつ、
部品を含んでおり、該部品は、前記出口を介してある体積の前記水性媒体を排出し、そのことによって、前記体積を小滴として分注するためのものであって、前記体積の前記水性媒体は、その中に配置された前記の１つ以上の生体細胞を有している、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記出口を介してある体積の前記水性媒体を排出するための部品が、圧電トランスデューサーであり、前記体積の前記水性媒体は、その中に配置された前記の１つ以上の生体細胞を有している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記の少なくとも１つの小滴生成器に対して可動である前記容器が、前記バルク疎水性媒体を含んでいる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記の小滴のうちの少なくとも１つがさらに、前記水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記小滴のうちの少なくとも１つがさらに、前記水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含んでおり、かつ、前記水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層をさらに含む前記小滴のうちの別の１つに接触し、かつ、第１および第２の小滴の間に境界面として両親媒性分子の層が形成される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記小滴集合が、３次元構造体中に配置された複数の小滴を含んでおり、該３次元構造体中の各小滴は、前記水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含んでおり、かつ、前記３次元構造体における各小滴は、該３次元構造体中の少なくとも１つのその他の小滴に接触し、接触している小滴の間に境界面として両親媒性分子の層を形成する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
境界面として前記の第１および第２の小滴の間に形成された両親媒性分子の前記層が、境界面として前記の第１および第２の小滴の間に形成された両親媒性分子の２重層である、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記小滴のうちの１つ以上中の前記水性媒体の表面の周りの両親媒性分子の前記外層がさらに、１つ以上の膜貫通タンパク質を含んでいる、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
当該方法がさらに、複数の小滴を生成するステップの前に、前記水性媒体を調製するステップを含んでおり、該水性媒体は、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有しており、該調製ステップは、水性媒体を提供することと、該水性媒体中に複数の生体細胞を懸濁させることとを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
当該方法がさらにゲル化ステップを含んでおり、該ゲル化ステップは、前記ヒドロゲル化合物を含む前記水性媒体にゲルを形成させることを含んでおり、好ましくは、該ゲル化ステップは、前記小滴集合を１０．０℃より低いか、またはそれに等しい温度まで冷却することと、前記ヒドロゲル化合物を有する前記水性媒体にゲルを形成させることとを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法
【請求項３０】
当該方法がさらに、前記の複数の細胞を培養して細胞化した小滴集合を製造することを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
当該方法がさらに、前記小滴集合を前記バルク疎水性媒体から単離することを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
複数の小滴を含む小滴集合であって、前記小滴はそれぞれ：
（ｉ）ヒドロゲル化合物を含む水性媒体を含んでおり；
（ｉｉ）該水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含んでおり；
（ｉｉｉ）該水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含んでおり、
ここで、当該小滴集合中の少なくとも１つの小滴は、当該小滴集合中の少なくとも１つのその他の小滴に接触し、接触している小滴の間に境界面として両親媒性分子の層を形成する、
前記小滴集合。
【請求項３３】
前記ヒドロゲル化合物が多糖であり、好ましくは、前記ヒドロゲル化合物がアガロースである、請求項３２に記載の小滴集合。
【請求項３４】
前記水性媒体がさらに、１つ以上の安定化剤を含んでおり、好ましくは、該１つ以上の安定化剤がジペプチドを含む化合物から選択され、より好ましくは、該１つ以上の安定化剤がＦＭＯＣ基で保護されたジペプチドから選択され、最も好ましくは、該１つ以上の安定化剤がＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよび／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンである、請求項３２または請求項３３に記載の小滴集合。
【請求項３５】
前記水性媒体が、細胞外の膜タンパク質を含んでおり、好ましくは、該細胞外の膜タンパク質が、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンを含んでいる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の小滴集合。
【請求項３６】
当該小滴集合が：
第１の複数の小滴を含んでおり、該小滴はそれぞれ、前記水性媒体中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含んでおり、かつ、
第２の複数の小滴を含んでおり、該小滴のそれぞれは、前記水性媒体中に配置された１つ以上の第２のタイプの生体細胞を含んでいる、
請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の小滴集合。
【請求項３７】
前記の複数の小滴がそれぞれ、０．００１〜１００ｎＬの体積を有している、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の小滴集合。
【請求項３８】
当該小滴集合がさらに、請求項５〜８のいずれか一項に記載のものである、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の小滴集合。
【請求項３９】
ヒドロゲル化合物を含む前記水性媒体が、ゲルの形態である、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の小滴集合。
【請求項４０】
バルク疎水性媒体と、前記バルク疎水性媒体中に配置された請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の小滴集合とを含んでいる組成物。
【請求項４１】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法によって取得可能である小滴集合。
【請求項４２】
組成物であって、当該組成物は：
（ｉ）水性媒体を含んでおり、該水性媒体は：
（ａ）ヒドロゲル化合物と；
（ｂ）培養培地と；
（ｃ）ジペプチドを含む１つ以上の化合物とを含んでおり、かつ、
（ｉｉ）該水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含んでいる、
前記組成物。
【請求項４３】
前記水性媒体がさらに：
（ｄ）細胞外の膜タンパク質を含んでいる、
請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記水性媒体が：
（ａ）ヒドロゲルを０．５〜３０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでおり；
（ｂ）培養培地を６０．０〜９０．０体積％の濃度で含んでおり；
（ｃ）ジペプチドを含む１つ以上の化合物を０．１〜１０．０ｍｍｏｌ／Ｌの総濃度で含んでおり；かつ、
（ｄ）細胞外の膜タンパク質を０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでおり、
かつ、前記水性媒体中に配置された前記の１つ以上の生体細胞の濃度が、水性媒体１ｍＬあたり１０５〜１０７個の細胞である、
請求項４２または請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ジペプチドを含む前記の１つ以上の化合物が、ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよび／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンである、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記水性媒体がさらに、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のものである、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、小滴集合（ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ；液滴集合体）を製造するための方法に関する。複数の小滴（ｄｒｏｐｌｅｔ；液滴）を含む小滴集合および本発明の方法に有用である組成物もまた、説明される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
再生医療の分野で用いられてもよく、薬物スクリーニング用の経験モデルとして用いられてもよい、内在特性を有する組織を開発することの需要がある。組織を開発するためには、種々のタイプの複数の細胞が、増殖し、かつ、所望の組織の機能を再現するように、細胞適合環境内に高密度で空間的に配置されなければならない。バイオプリントは、異種の細胞タイプを、方法に基づいて、低細胞密度から高細胞密度の状態で低解像度から高解像度でパターニングする方法を提供した。しかしながら、高解像度のパターニングは、通常、低細胞密度材料を用いることを代償にして行われる。
【０００３】
油中脂質溶液（ｌｉｐｉｄ−ｉｎ−ｏｉｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に形成される水性小滴は、脂質単層に自発的に被覆されるであろう。単層被覆小滴が集められる時、それらは脂質２重層を介して密着するであろう（Ｓｙｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０，  １５５４３〜８  （２００８））。複数の小滴がこれら小滴境界面２重層（ＤＩＢ）を介して密着、接続され得、２Ｄまたは３Ｄにて製造され得る多区画化ネットワーク（ｍｕｌｔｉｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓｅｄ  ｎｅｔｗｏｒｋ）を形成する（Ｖｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ４８〜５２（２０１３）；  Ｍａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４，  ４３７〜４４０  （２００９）；  Ｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １２，  ３５１４〜２０  （２０１２）；  Ｖｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６，  ８０３〜８  （２０１１）；  Ｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ３３３２  （２０１３））。
【０００４】
マルチソームは、バルク水性相（ｂｕｌｋ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）中に懸濁された水性小滴ネットワークである（Ｏｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ２０，  ２３６〜２４６  （２０１５）)。それらは、（ｐＨが下げられるか、または温度が変えられるかのいずれかの時に）破られ得る特定の脂質混合物の使用を介してバルク相（ｂｕｌｋ  ｐｈａｓｅ）と相互作用することが可能である。これら構造体は、金属フープ上の油中脂質溶液をバルク水性相中に懸濁させることと、その後、油中に小滴を形成することとによって作成された。したがって、形成されたマルチソーム構造体はすべて、スフェロイド様のものか、またはエリプソイド構造体であった。
【０００５】
国際公開第２０１４／０６４４５９号パンフレットは、両親媒性分子の外層を有するヒドロゲル塊を含むヒドロゲルネットワークについて説明している。国際公開第２０１４／０８７１７５号パンフレットは、小滴集合を製造するための装置について説明している。
【０００６】
３Ｄの細胞化した足場が再現可能な方式で製造されることを可能にし、かつ、改善されたボクセル解像度および高細胞密度を有する微細構造の細胞を搭載した（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ）足場へのアクセスを可能にする方法を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、液中液３Ｄバイオプリント方法を開発した。驚くべきことに、この方法は、複数の細胞タイプが高解像度の空間的に定められた構造（図２に示されるもののような）へとパターニングされることを可能にする。この方法は、細胞の生体活性を保持しながら、先行する方法に対して有意な改善を提供し、かつ、高解像度の特徴を有する高細胞密度小滴集合の製造を可能にする。本発明の方法によって製造される小滴集合は、培養されて組織様材料をもたらしてもよい、細胞化した足場として役立つ。本発明の方法は、添加物を有する培養培地中で、アガロースから構成される独特のバイオインクを使用する。本発明の方法の利点のいくつかは、以下で説明される。
【０００８】
組織を作成する複数の方法があり、バイオプリントはそのうちの１つに過ぎない。その他の組織製造技術に対するバイオプリントの全般的な利点および現行のバイオプリンターに対する請求されるバイオプリント方法の具体的な利点は、以下で説明される。
【０００９】
本発明の方法は、オルガノイドおよびスフェロイド培養方法に対して利点を有する。ディッシュ中での器官形成（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （８０），  ３４５，  １２４７１２５  １〜９，  ２０１４）およびスフェロイド培養（Ｆｏｔｙ，  Ｒ，  Ｊ．  Ｖｉｓ．  Ｅｘｐ．  ２０，  ４〜７，  ２０１１）のような方法は、ヒドロゲルまたは培養培地内で自然に再分布し、かつ一緒に増殖する細胞の混合物にのみ依拠する。細胞の初期の混合物は、ある割合の分化細胞タイプまたは異質な系統へと分化するであろう単一の多能性細胞株のいずれかから構成される。これら組織が天然の特性を示す一方で、それらは拡散限界内のサイズまでのみ増殖し得、かつ、構造はサンプルのセットにより異なるかも知れない。したがって、研究者による組織構造体に対する制御は、ほとんどない。本発明のバイオプリント方法は、環境内での細胞播種の空間的制御を提供し、このことは、組織の形状および構造が、より良好に定められることを意味する。プリントされた構造体は、オルガノイドよりもいっそう大きくなる潜在能力を有する。
【００１０】
本発明の方法はまた、細胞を搭載したマイクロファイバーおよび細胞シート技術に対して利点を有する。細胞シート技術（ＣＳＴ）（Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，  Ｙ，  ＲＳＣ  Ａｄｖ．  ２，  ２１８４，  ２０１２）は、培養ヒドロゲルまたは支持足場の存在のない、培養された細胞シートの積層を伴う。ＣＳＴ構造体は、構築中、それらの細胞外の膜（ＥＣＭ）の保持に起因して、内在特性を有する組織を形成し得る。しかしながら、該方法はゆっくりであり、かつ、積層前に各層の平行培養を必要とする。単一シート内でのパターニング制御の限界もある。 
【００１１】
細胞を搭載したマクロファイバー（ＣＬＭ）（Ｏｎｏｅ，  Ｈ，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  ２０，  ２３６〜２４６，  ２０１５）は、典型的にはマイクロ流体装置によって作成される細胞を搭載した、ヒドロゲルファイバーである。これらファイバーは、一緒に編まれて３Ｄ構造体を形成し得る。これら構造体は、機能的な組織特性を有することを示し、かつ、糖尿病マウスに埋め込まれてインスリンを放出している（Ｏｎｏｅ，  Ｈ，  Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．  １２，  ５８４〜９０，  ２０１３）。この技術は、しかしながら、製織可能である３Ｄ構造体に限定される。
【００１２】
本発明のバイオプリント方法は、足場内の細胞配置のより高い解像度の空間的制御を提供し、かつ、上記の技術によっては達成不可能である形状または構造体を形成し得る。したがって、異質な細胞の複雑な構造を有する組織は、バイオプリントによってのみ達成可能であるかも知れない。
【００１３】
具体的には、本発明は、小滴集合を製造するための方法を提供し、該小滴集合は、複数の小滴を含み、ここで、前記小滴はそれぞれ：
ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；
水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含み、
当該方法は：
バルク疎水性媒体（ｂｕｌｋ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）中に複数の小滴を生成することを含み、ここで、前記小滴はそれぞれ：
ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；
水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含む。
【００１４】
本発明はまた、複数の小滴を含む小滴集合を提供し、ここで、前記小滴はそれぞれ：
（ｉ）ヒドロゲル化合物を有する水性媒体を含み；
（ｉｉ）水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含み；かつ、
（ｉｉｉ）水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含み、
ここで、小滴集合中の少なくとも１つの小滴は、小滴集合中の少なくとも１つのその他の小滴に接触して、接触している小滴の間の境界面として両親媒性分子の層を形成する。
【００１５】
本発明はさらに、組成物を提供し、当該組成物は： 
（ｉ）水性媒体を含み、該水性媒体は：
（ａ）ヒドロゲル化合物と；
（ｂ）培養培地と；
（ｃ）ジペプチドを有する１つ以上の化合物とを含み、かつ、
（ｉｉ）水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１は、細胞ネットワークの３Ｄプリントを示す概略図、顕微鏡写真およびグラフを示している。
【図１−２】図１は、細胞ネットワークの３Ｄプリントを示す概略図、顕微鏡写真およびグラフを示している。
【図２−１】図２は、３Ｄプリント方法を用いた、２つの細胞タイプの高解像度のパターニングを示す顕微鏡写真を示している。
【図２−２】図２は、３Ｄプリント方法を用いた、２つの細胞タイプの高解像度のパターニングを示す顕微鏡写真を示している。
【図３−１】図３は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を含有するプリントされたネットワークの相間移動および培養を示している。
【図３−２】図３は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を含有するプリントされたネットワークの相間移動および培養を示している。
【図４】図４は、７日間にわたる、ネットワーク内でのプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の発生を示す顕微鏡写真を示している。
【図５】図５は、ネットワークの細胞密度に対するバイオインクの細胞密度の影響を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、小滴集合を製造するための方法を提供し、該小滴集合は、複数の小滴を含み、ここで、前記小滴はそれぞれ：ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含み、当該方法は：バルク疎水性媒体中に複数の小滴を生成することを含み、ここで、前記小滴はそれぞれ：ヒドロゲル化合物を含む水性媒体と；水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞とを含む。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、用語「小滴」は、典型的には、任意の境界を有する（ｂｏｕｎｄ）体積の材料（例えば、液体またはゲルであってもよい）を意味する。小滴の体積は、典型的には１．０ｍＬより少なく、例えば０．１ｍＬより少ない。例えば、５００ｎＬより少ない体積を有する境界を有するある体積の水性媒体は、小滴である。最初に生成される時、小滴は、その特徴通り（ｉｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）実質的に球状であってもよい（例えば、図１ｄに示されるように）。しかしながら、一旦小滴集合中でその他の小滴と接触すると、小滴は様々な形状を採り得る。典型的には、小滴は、０．５より大きいか、またはそれに等しい（例えば、０．６より大きいか、またはそれに等しい）真球度（例えば、小滴と同一の体積の球の表面積の、小滴の実際の表面積に対する割合）を有する。したがって、小滴の最大外形寸法（例えば、長さ）は、典型的には、小滴の最小外形寸法（例えば、幅）の２．０倍より小さいか、またはそれに等しい。小滴を生成することは、典型的には、バルク疎水性媒体内にある体積の水性媒体を配置することを含む。用語「媒体の小滴」は、典型的には、用語「媒体の体積」と同義である。
【００１９】
小滴集合は、典型的には３次元アレイにて配置される、小滴の集合体である（例えば、図１ｅに示されるように）。典型的には、小滴集合中、各小滴は、集合中の少なくとも１つのその他の小滴と接触している。「小滴集合」はまた、「［小滴中に含まれる材料の］体積の集合」と呼ばれてもよい。本発明の方法によって製造される小滴集合は、任意のサイズのものであってもよい。例えば、小滴集合の最大外形寸法は、０．０１ｍｍ〜１００．０ｍｍであってもよい。小滴集合の最大外形寸法が１０．０ｍｍより小さいか、またはそれに等しくてもよい（例えば、５．０ｍｍより小さいか、またはそれに等しくてもよい）場合がある。
【００２０】
ヒドロゲル化合物は、ヒドロゲル化合物の水溶液がゲル化してヒドロゲルを形成することが可能であるような化合物である。典型的には、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体は、水性媒体の温度が特定の温度（その水性媒体中のヒドロゲル化合物のゲル化温度であるであろう）より下まで下げられる時、ゲル化してヒドロゲルを形成するであろう。ヒドロゲル化合物を含む水性組成物は、典型的にはそれ自体ゲルではなく、むしろ自由流動性の液体である。水性組成物がヒドロゲルであるのは、ヒドロゲル化合物を含むかかる水性組成物がゲル化してすぐだけである。ゲルは、「流体によってその全体積の至る所で膨張する、非流動性でコロイド状のネットワークまたはポリマーネットワーク」と定義されてもよい。ヒドロゲルは、「膨潤剤（すなわち、流体）が水であるゲル」と定義されてもよい。
【００２１】
小滴集合はまた、特に小滴集合がゲル化した時、「足場」と呼ばれてもよい。本方法によって製造される小滴集合は、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体を含み、かつ、ゲル化していなくてもよく（すなわち、水性媒体がヒドロゲル化合物を含む自由流動性の液体として留まる場合）、ゲル化していてもよい（すなわち、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体がゲル化してヒドロゲルを形成している場合）。
【００２２】
バルク疎水性媒体は、水性媒体の小滴の体積より多い体積を有する、任意の体積の疎水性媒体である。しばしば、バルク疎水性媒体は、０．５ｍＬより多いか、もしくはそれに等しく、または、１．０ｍＬより多いか、もしくはそれに等しい体積を有する。例えば、バルク疎水性媒体の体積は、１０．０ｍＬより多いか、それに等しくてもよい。疎水性媒体は、典型的には、疎水性の液体（例えば、水と実質的に混和しない液体）である。
【００２３】
ヒドロゲル化合物は、任意の適切なヒドロゲル化合物であってもよい。ヒドロゲル化合物は、典型的には重合体状である。例えば、ヒドロゲル化合物は、多糖、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、多数の疎水基を含むポリマーまたはそれらの誘導体であってもよい。ヒドロゲル化合物は、典型的には多糖である。ヒドロゲル化合物の例としては、アガロース、メチルセルロースおよびヒアルロナンが挙げられる。好ましくは、ヒドロゲル化合物はアガロースである。ヒドロゲル化合物は、典型的には、２０℃より低いゲル化温度を有する。例えば、ヒドロゲル化合物は、１０℃より低いか、もしくはそれに等しい、または、５．０℃より低いか、もしくはそれに等しいゲル化温度を有していてもよい。ゲル化温度は、１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するヒドロゲル化合物の水溶液について測定されたものであってもよい。
【００２４】
水性媒体中のヒドロゲル化合物の濃度は、典型的には、０．０１ｍｇ／Ｌ〜５００．０ｍｇ／Ｌである。例えば、水性媒体中のヒドロゲル化合物の濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜１００．０ｍｇ／Ｌであってもよく、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０．０ｍｇ／Ｌであってもよい。
【００２５】
水性媒体は、水を含む任意の液体媒体であってもよい。典型的には、水性媒体は、８０重量％より多いか、もしくはそれに等しい水、または、９０重量％より多いか、もしくはそれに等しい水を含む組成物である。ヒドロゲル化合物を含む水性媒体は、典型的には、水中に溶解したヒドロゲル化合物を含む。水性媒体は、本明細書に記載のその他の成分を含んでいてもよい。
【００２６】
典型的には、水性媒体はさらに、１つ以上の安定化剤を含む。安定化剤は通常、水性媒体中に溶解している。安定化剤は、小滴集合の安定性を増大させ、かつ／または、小滴集合における小滴中の細胞の分布を改善する剤（例えば、化合物）である。
【００２７】
１つ以上の安定化剤は、典型的には、ジペプチドを含む化合物から選択される。好ましくは、１つ以上の安定化剤は、ＦＭＯＣ基で保護されたジペプチドから選択される。ＦＭＯＣ基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル基である。したがって、ＦＭＯＣ基で保護されたジペプチドは、式ＦＭＯＣ−Ｘ−Ｘの化合物であって、式中、各Ｘは独立してアミノ酸であり、かつ、各ダッシュはペプチド結合である。これは、下式で表されてもよく、式中、Ｒ’およびＲ’’はアミノ酸中の可変基である。
【００２８】
【化１】
2019506884.tif 000002
【００２９】
例えば、Ｒ’およびＲ’’は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）およびＣＨ２Ｐｈから独立に選択されてもよい。好ましくは、Ｒ’およびＲ’’は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）およびＣＨ２Ｐｈから独立に選択される。より好ましくは、１つ以上の安定化剤は、ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシン（ＦＭＯＣ−ＩＧ）および／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニン（ＦＭＯＣ−ＦＦ）である。
【００３０】
水性媒体中の安定化剤の濃度は、典型的には、０．０１〜１００．０ｍｍｏｌ／Ｌである。例えば、１つ以上の安定化剤の濃度は、０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであってもよく、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌであってもよい。 
【００３１】
典型的には、水性媒体はさらに、細胞外の膜タンパク質（ＥＣＭ）を含む。ＥＣＭの例としては、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニンが挙げられる。細胞外の膜タンパク質は、好ましくは、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンを含む。コラーゲンは、Ｉ〜ＸＩＶのコラーゲンタイプのうちのいずれか１つであってもよく、かつ、典型的にはＩ型コラーゲンである。
【００３２】
水性媒体中のＥＣＭの濃度は、典型的には、０．００１ｍｇ／Ｌ〜１００．０ｍｇ／Ｌである。例えば、水性媒体中のＥＣＭの濃度は、０．０１ｍｇ／Ｌ〜１０．０ｍｇ／Ｌであってもよく、０．１ｍｇ／Ｌ〜１．０ｍｇ／Ｌであってもよい。 
【００３３】
水性媒体はしばしば、培養培地をさらに含む。培養培地は、生体細胞を培養するのに適した任意の水性媒体であり、かつ、培養培地は当業者に周知である。培養培地は、典型的には、１つ以上のアミノ酸（例えば、グルタミンまたはそのソース）、１つ以上の塩（例えば、塩化ナトリウムまたはピルビン酸ナトリウム）、グルコースおよび１つ以上のビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ、ＣまたはＤ）の水溶液である。培養培地は、１つ以上の抗生物質をさらに含んでいてもよい。抗生物質の例としては、ペニシリンおよびストレプトマイシンが挙げられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、水性媒体は：（ａ）ヒドロゲルを０．５〜３０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含み；（ｂ）培養培地を６０．０〜９０．０体積％の濃度で含み；かつ、（ｃ）ジペプチドを含む化合物を０．１〜１０．０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む。水性媒体は、必要に応じて、（ｄ）細胞外の膜タンパク質を０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でさらに含んでいてもよい。ｐＨ７．０における培養培地の浸透圧は、典型的には２００〜４００ｍＯｓｍ（例えば、３００〜３５０ｍＯｓｍ）である。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「生体細胞」は周知であり、かつ、膜で囲まれた細胞質を含む細胞（典型的には、核またはリボソームのような小器官を含む）を意味する。本発明の方法において用いられる生体細胞は、原核性であっても真核性であってもよい。生体細胞は、典型的には真核性である。生体細胞は、自然起源のものであってもよく、遺伝学的に（あるいはその他の方法で）改変されていてもよい。しばしば、生体細胞は、哺乳類組織（例えば、マウス、ラット、ヒツジまたはヒト組織）由来の哺乳類細胞である。例えば、生体細胞は、ヒトまたはチンパンジーの組織のような霊長目の動物の組織由来であってもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の生体細胞は、２つ以上の異なるタイプの生体細胞から選択される。図２は、２つ以上の異なるタイプの生体細胞を含有する小滴集合の例を示している。
【００３７】
生体細胞のタイプは、特定の種から採った生体細胞の細胞タイプを意味する。例えば、哺乳類生体細胞タイプの典型的な例としては、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、骨芽細胞、軟骨細胞および間葉系幹細胞が挙げられる。
【００３８】
典型的には、２つ以上の細胞タイプが存在すれば、小滴のうちの１つ以上はそれぞれ、水性媒体中に配置された２つ以上の生体細胞を含み、かつ、２つ以上の生体細胞は、２つ以上の異なるタイプの生体細胞から選択される。したがって、個別の小滴は、２つ以上のタイプの細胞を含んでいてもよい。代替的には、異なる小滴は異なる細胞タイプを含んでいてもよく、異なる細胞タイプを含有する構造的特徴が小滴集合に組み込まれることを可能にする。したがって、小滴集合が、第１の複数の小滴と、第２の複数の小滴とを含んでいてもよい場合があり、第１の複数の小滴の各小滴が水性媒体中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含み、かつ、第２の複数の小滴の各小滴が水性媒体中に配置された１つ以上の第２のタイプの生体細胞を含む。
【００３９】
１つ以上の生体細胞は、典型的には哺乳類細胞である。
【００４０】
典型的には、１つ以上の生体細胞は、水性媒体１ｍＬあたり１０５〜１０９個の細胞の濃度で水性媒体中に配置される。例えば、水性媒体中に配置される生体細胞の濃度は、１ｍＬあたり１０５〜１０８個の細胞であってもよく、１ｍＬあたり１０６〜１０９個の細胞であってもよい。好ましくは、水性媒体中の生体細胞の濃度は、１ｍＬあたり１０７個の細胞より高いか、それに等しい。異なる濃度の生体細胞を含む小滴ネットワークが、図５に示されている。
【００４１】
バルク疎水性媒体は、任意の疎水性媒体であってもよい。例えば、バルク疎水性媒体は、有機化合物を含んでいてもよい。典型的には、バルク疎水性媒体は、炭化水素化合物を含む。しばしば、バルク疎水性媒体は、炭化水素化合物および／またはシリコーン油を含む。
【００４２】
炭化水素化合物は、炭素および水素原子のみを含む化合物である。水素化合物の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０アルカン（例えば、６〜１８個の炭素原子を有する直鎖アルカン）およびＣ５〜Ｃ１０シクロアルカン（例えば、シクロペンタンまたはシクロヘキサン）が挙げられる。好ましくは、炭化水素化合物は、Ｃ８〜Ｃ１６アルカン（例えば、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカンまたはドデカン）である。好ましくは、炭化水素化合物はウンデカンである。
【００４３】
シリコーン油は、１つ以上のシロキサン基を含む高分子化合物を含む油である。例えば、シリコーン油は、典型的には、有機側鎖を有する重合シロキサンである。例えば、シリコーン油は、ポリジメチルシロキサン、ポリエチルメチルシロキサンまたはポリジエチルシロキサンを含んでいてもよい。
【００４４】
バルク疎水性媒体は、例えば、（炭化水素）：（シリコーン油）の体積比が５０：５０〜８０：２０である炭化水素とシリコーン油との混合物を含んでいてもよい。好ましくは、該体積比は、６０：４０〜７０：３０である。バルク疎水性媒体は、体積比が６０：４０〜７０：３０であるウンデカンとシリコーン油との混合物であってもよい。
【００４５】
バルク疎水性媒体は、典型的には、１つ以上の両親媒性化合物をさらに含む。両親媒性化合物は、親水基および新油基（例えば、疎水基）を両方とも含む化合物である。両親媒性分子は、典型的には、２重層とミセルとを形成することが可能である。両親媒性分子は、当業者に周知である。
【００４６】
１つ以上の両親媒性化合物は、脂質から選択されてもよい。脂質の例としては、トリグリセリド、脂肪酸およびリン脂質が挙げられる。典型的には、１つ以上の両親媒性化合物は、リン脂質から選択される。リン脂質は、リン酸基で置換されたグリセロール分子と１つ以上の脂肪酸基とを含む化合物である。１つ以上の両親媒性化合物は、好ましくは、ホスホコリン脂質から選択される。
【００４７】
本発明の方法に有用である両親媒性分子の例としては、ジフィタノイルホスファチジルコリン、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン、ｅｇｇ−ＰＣ、水素化ｅｇｇ  ＰＣ、水素化ｓｏｙ  ＰＣ、１−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスホコリン、１−ミリストイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよび１−ステアロイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが挙げられる。
【００４８】
バルク疎水性媒体中の１つ以上の両親媒性化合物の総濃度は、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであってもよい。典型的には、該濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ（例えば、０．５ｍＭ〜５．０ｍＭ）である。例えば、バルク疎水性媒体は、ジフィタノイルホスファチジルコリンまたはジフィタノイルホスファチジルエタノールアミンを０．５ｍＭ〜５．０ｍＭの濃度で含んでいてもよい。
【００４９】
複数の小滴を生成することは、典型的には：（ｉ）複数の分注ステップを含み、該分注ステップそれぞれ、ある体積の水性媒体であって、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有する前記の体積の水性媒体をバルク疎水性媒体に注入することを含む。
【００５０】
水性媒体であって、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有する前記水性媒体の体積は、典型的には、０．００１〜１０００ｎＬである。例えば、水性媒体の体積は、０．１ｎＬ〜５００ｎＬであってもよく、１．０ｎＬ〜３００ｎＬであってもよい。しばしば、注入される水性媒体の体積は、５０ｎＬ〜２５０ｎＬである。
【００５１】
複数の小滴を生成することは、典型的には、１０回以上の分注ステップ（例えば、１００回以上の分注ステップ）を含む。多数の分注ステップ（例えば、１０，０００回以上の分注ステップ）があってもよい場合がある。
【００５２】
典型的には、複数の小滴を生成することは、小滴を生成するための装置を用いることを含み、該装置は、（ａ）少なくとも１つの小滴生成器と；（ｂ）少なくとも１つの小滴生成器に対して可動である容器と；（ｃ）少なくとも１つの小滴生成器からの小滴の分注を制御し、かつ、少なくとも１つの小滴生成器に対する容器の移動を制御するように適合された制御ユニットとを含む。小滴生成器の出口の例が、図１ａおよび図１ｄに部分的に示されている。
【００５３】
小滴生成器（または各小滴生成器）は、例えば：水性媒体であって、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有する前記水性媒体を保持するためのチャンバーと；出口と；前記出口を介してある体積の水性媒体であって、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有する前記体積の水性媒体を排出し、そのことによって前記体積を小滴として分注するための部品とを含んでいてもよい。
【００５４】
本発明の方法における使用に適した小滴生成器および小滴を生成するための装置の例は、国際公開第２０１４／０８７１７５号パンフレット（その全体が参照によって組み込まれる）において説明されている（ｍａｙ  ａｒｅ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ）。前記出口を介してある体積の水性媒体であって、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有する前記体積の水性媒体を排出するための部品は、しばしば、圧電トランスデューサーである。少なくとも１つの小滴生成器に対して可動である容器は、通常、バルク疎水性媒体を含む。
【００５５】
典型的には、該装置は：少なくとも１つの小滴生成器と；少なくとも１つの小滴生成器に対して可動である容器と；制御ユニットとを含み、該制御ユニットは、少なくとも１つの小滴生成器からの小滴の分注を制御し、かつ、少なくとも１つの小滴生成器に対する容器の移動を制御するように適合されており、ここで、該装置は、複数の小滴を含む小滴集合を製造するように適合されており、前記小滴はそれぞれ、（ｉ）小滴媒体を含み、かつ、（ｉｉ）小滴媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含み、ここで、小滴媒体は水性媒体であり、かつ、ここで、前記小滴のうちの少なくとも１つは、前記小滴のうちの別のものに接触して、接触している小滴の間の境界面として前記両親媒性分子の層を形成する。
【００５６】
該装置は、前記小滴集合を製造するように適合されていてもよく、ここで、前記小滴はそれぞれ、前記小滴のうちの別のものに接触して、接触している小滴の間の境界面として前記両親媒性分子の外層を形成する。制御ユニットは、典型的には、前記小滴集合を作成するために、（ａ）小滴生成器または各小滴生成器に対する容器の移動、および（ｂ）小滴の分注をコーディネートするように適合されている。制御ユニットは、コンピューターまたは専用の電子ハードウェアを含んでいてもよい。該装置はしばしば、容器を移動させるためのマイクロマニピュレーターをさらに含み、かつ、ここで、制御ユニットは、マイクロマニピュレーターを用いて容器の移動を制御するように適合されている。該装置はさらに、小滴生成器または各小滴生成器を移動させるためのものであって、かつ、該装置が１つより多い前記小滴生成器を有する時には、小滴生成器の相対的移動をコーディネートするためのものであるマイクロマニピュレーターを含んでいてもよい。各小滴生成器は、典型的には：水性媒体である小滴媒体を保持するためのチャンバーと；出口と；ある体積の前記小滴媒体を前記出口を介して排出し、そのことによって前記体積を小滴として分注するための部品とを含む。該出口は、典型的には、２００μｍより小さい直径を有する。小滴生成器または各小滴生成器が、１ｍｍに等しいか、またはそれより小さい（例えば、１０μｍ〜２００μｍである）直径を有する小滴を分注するように適合されている場合がある。小滴生成器または各小滴生成器は、典型的には、０．００１ｎＬ〜１００ｎＬの体積を有する小滴を分注するように適合されている。制御ユニットは、典型的には、０．０１〜１０ｓ−１の速度で小滴の分注を制御するように適合されている。該装置が、複数の前記小滴生成器を含んでいてもよい場合があり、例えば、第１の小滴生成器は第１の水性媒体を含み、かつ、ここで、第２の小滴生成器は第２の水性媒体を含み、ここで、第１および第２の水性媒体は異なる（典型的には、それらが異なるタイプの生体細胞を含んでいるので）。
【００５７】
典型的には、小滴のうちの少なくとも１つは、水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層をさらに含む。両親媒性分子の外層を含む小滴の概略的な例が、図１ａに示されている。両親媒性分子のかかる外層は、図１ｂに見られ得る。典型的には、前記小滴のうちの少なくとも１つはさらに、水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含み、かつ、水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層をさらに含む前記小滴のうちの別の１つに接触し、かつ、ここで、両親媒性分子の層は、第１および第２の小滴の間に境界面として形成される。
【００５８】
小滴集合は、しばしば、３次元構造体中に配置された複数の小滴を含み、ここで、３次元構造体中の各小滴は、水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含み、かつ、ここで、３次元構造体中の各小滴は、３次元構造体中の少なくとも１つのその他の小滴に接触し、接触している小滴の間の境界面として両親媒性分子の層を形成する。
【００５９】
３次元構造体は、異なる小滴の層を含んでいてもよく、ここで、小滴の層はそれぞれ、その中に配置されたあるタイプの生体細胞を含み、かつ、生体細胞のタイプは異なる層のそれぞれで異なる。 
【００６０】
第１および第２の小滴の間に境界面として形成される両親媒性分子の層は、典型的には、第１および第２の小滴の間に境界面として形成される両親媒性分子の２重層である。小滴のうちの１つ以上における水性媒体の表面の周りの両親媒性分子の外層が、１つ以上の膜貫通タンパク質をさらに含んでいてもよい場合がある。
【００６１】
水および酸素のような気体といった小さい分子のみが、２重層に浸透し得、このことは、小滴の内容物が単離されたままであることを意味する。アルファヘモリシンのようなタンパク質孔が存在すれば、しかしながら、孔を通過し得る小さい分子は、かかる境界面を越えて流れ得る。そのようであるので、突発的で迅速なコミュニケーション特性が、小滴の通路の各所でタンパク質孔を含有する小滴ネットワーク内で見られた。ネットワークはまた、それらが異なる塩濃度の領域を含有している時、協働性を示した。なぜなら、小滴が浸透を介して浸透圧的に均衡し、全ネットワークの形状を変形させ得る（すなわち、ネットワークが新たな形状へと折り畳まれ得る）局所的な小滴の体積の変化を引き起こすからである。
【００６２】
バルク疎水性媒体が、膜貫通タンパク質をさらに含む場合がある。
【００６３】
しばしば、当該方法はさらに、複数の小滴を生成するステップの前に、水性媒体であって、その中に配置された１つ以上の生体細胞を有する前記水性媒体を調製するステップを含み、該調製ステップは、水性媒体を提供することと、複数の生体細胞を水性媒体中に懸濁させることとを含む。
【００６４】
本方法はさらに、ゲル化ステップを含んでいてもよく、該ゲル化ステップは、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体にゲルを形成させることを含む。典型的には、ゲル化ステップは、１０．０℃より低いか、またはそれに等しい温度まで小滴集合を冷却することと、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体にゲルを形成させることとを含む。代替的なゲル化方法（例えば、ＵＶ光への曝露）が用いられてもよい。
【００６５】
本方法はさらに、複数の生体細胞を培養して、細胞化した小滴集合を製造することを含んでいてもよい。複数の細胞を培養することは、典型的には、生体細胞の密度を増大させることを含む。小滴集合は、培養前に培養培地へと移されてもよい。生体細胞の培養は、図４に見られ得、該図中、図４ａ〜図４ｃでは、明視野共焦点顕微鏡写真が、ネットワーク（小滴集合）が７日間にわたって暗く不透明になることを示している。なぜなら、生体細胞が増殖したからである。
【００６６】
しばしば、本方法はさらに、小滴集合をバルク疎水性媒体から単離することを含む。このことは、小滴集合をバルク疎水性媒体から物理的に取り出すことによってなされてもよく、代替的には、バルク疎水性媒体を除去することによって（例えば、それが排出されることを可能にすることによって）なされてもよい。
【００６７】
本発明はまた、複数の小滴を含む小滴集合を提供し、ここで、前記小滴はそれぞれ：（ｉ）ヒドロゲル化合物を含む水性媒体を有し；（ｉｉ）水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含み；かつ、（ｉｉｉ）水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含み、ここで、当該小滴集合中の少なくとも１つの小滴は、当該小滴集合中の少なくとも１つのその他の小滴に接触して、接触している小滴の間の境界面として両親媒性分子の層を形成する。
【００６８】
当該小滴集合の成分および特徴は、本発明の方法について上記されたものであってもよい。
【００６９】
ヒドロゲル化合物は、典型的には多糖、好ましくはアガロースである。水性媒体は、典型的には、１つ以上の安定化剤をさらに含む。１つ以上の安定化剤は、好ましくは、ＦＭＯＣ基で保護されたジペプチドのようなジペプチドを含む化合物から選択される。１つ以上の安定化剤は、最も好ましくは、ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよび／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンである。例えば、水性媒体は、ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよびＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンを含んでいてもよい。水性媒体がさらに、コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンのような細胞外の膜タンパク質を含んでいてもよい場合がある。
【００７０】
いくつかの実施形態では、当該小滴集合は：第１の複数の小滴と第２の複数の小滴とを含み、第１の複数の小滴はそれぞれ、水性媒体中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含み、かつ、第２の複数の小滴はそれぞれ、水性媒体中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含む。
【００７１】
本発明の小滴集合では、複数の小滴はそれぞれ、典型的には、０．００１〜１００ｎＬの、または、上記に記載の体積を有する。
【００７２】
本発明の小滴集合は、それが細胞を搭載した足場であるようにゲル化していてもよい。したがって、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体が、ゲルの形態である場合がある。
【００７３】
本発明はまた、バルク疎水性媒体と、バルク疎水性媒体中に配置された本明細書に記載の小滴集合とを含む組成物を提供する。
【００７４】
本発明はまた、本明細書に記載の方法によって取得可能である小滴集合を提供する。
【００７５】
本発明はまた、組成物を提供し、当該組成物は：（ｉ）水性媒体を含み、該水性媒体は：（ａ）ヒドロゲル化合物と；（ｂ）培養培地と；（ｃ）ジペプチドを含む１つ以上の化合物を含み、かつ、（ｉｉ）水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞を含む。当該組成物中の成分は、本明細書に記載のものであってもよい。 
【００７６】
水性媒体はさらに：（ｄ）細胞外の膜タンパク質を含んでいてもよい。ＥＣＭは、例えば、コラーゲンであってもよく、Ｉ型コラーゲンであってもよい。
【００７７】
水性媒体は、好ましくは：（ａ）ヒドロゲルを０．５〜３０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含み；（ｂ）培養培地を６０．０〜９０．０体積％の濃度で含み；（ｃ）ジペプチドを含む１つ以上の化合物を０．１〜１０．０ｍｍｏｌ／Ｌの総濃度で含み；かつ、（ｄ）細胞外の膜タンパク質を０．００１〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含み、かつ、ここで、水性媒体中に配置された１つ以上の生体細胞の濃度は、水性媒体１ｍＬあたり１０５〜１０７個の細胞である。ジペプチドを含む１つ以上の化合物は、典型的には、ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよび／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンである。
【００７８】
本発明はまた、小滴集合を安定させるための、ジペプチドを含む１つ以上の化合物の使用を提供する。ジペプチドを含む１つ以上の化合物は、ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシンおよび／またはＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニンであってもよい。
【実施例】
【００７９】
概要
細胞を搭載した小滴集合（足場）が、高細胞密度かつ高解像度である小滴ネットワークとして細胞を搭載したバイオインク（続いて、ゲル化した）を３Ｄパターニングすることによって製造された（図１に示されるように）。結果として生じた足場は、バルク培養培地（ｂｕｌｋ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）へと相間移動した（図３ａに概略的に示されるように）。含まれるステップは：（ｉ）足場溶液を作成すること；（ｉｉ）足場溶液中で採取された細胞をバイオインクとして再懸濁させること；（ｉｉｉ）小滴ネットワークへのバイオインクの３Ｄ小滴プリント；（ｉｖ）細胞足場のゲル化および相間移動である。細胞足場は、その後、１週間以上の間、培養され得、生物活性を示す高密度の微細組織を形成する（図４に示されるように）。
【００８０】
図１ａは、バイオプリント方法の概略図を示している。小滴分注ノズルが、細胞含有バイオインクの小滴を脂質が豊富な油へと吐出する。小滴が、油容器のプログラミングされた移動によって空間的に配置される。小滴の層が、小滴境界面２重層の形成を介して密着する。図１ｂは、無細胞のプリントされたネットワーク（１１×１４×７個の小滴）内の小滴境界面２重層（黄色で染色されている）を示す共焦点蛍光顕微鏡写真である。２重層は、スルホローダミン−１０１（〜１０μＭ）をプリント溶液に添加することによって視覚化された。（スケールバー＝１００μｍ）。油下でのプリントされた小滴中の平均ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞密度をバイオインク中の細胞密度の関数として示すヒストグラムが、図１ｃに示されている。細胞密度は、小滴あたりの細胞の平均数（ｎ＝２５）÷平均小滴体積として計算された。エラーバーが、小滴サイズのバラツキおよび小滴あたりの細胞の複合誤差（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｅｒｒｏｒ）を表す。ガラスノズル（ｄ＝〜１５０μｍ）から吐出された１ｎＬの小滴（ｄ＝１３０μｍ）の連続層としてプリントされた細胞ネットワークの明視野顕微鏡写真が、図１ｄに示されている。油下でのプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ネットワーク（１１×１４×２個の小滴）の共焦点蛍光顕微鏡写真が、図１ｅに示されている。生／死細胞染色が、カルセイン−ＡＭ（ＣＡＭ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をそれぞれ用いて実行された。目に見えるのは、生存率が８５％である（手での細胞計数によって測定される）、ほぼ７００個の細胞である（スケールバー＝１５０μｍ）。１５×１０６個の細胞ｍＬ−１でプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ネットワーク（７×８×４個の小滴）に対して実行された生／死アッセイの高倍率共焦点蛍光顕微鏡画像が、図１ｆに示されており、平均占有率は、小滴あたり３８個の細胞である（スケールバー＝７５μｍ）。
【００８１】
ステップは以下で簡潔に説明され、かつ、さらなる詳細は実験の詳細のセクションにて見られ得る。
【００８２】
足場溶液：
足場溶液は、必要とされる場合、追加的な細胞特異的添加物を有するバルク細胞培養培地（ｂｕｌｋ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）中のヒドロゲルから作成される。用いられたヒドロゲルは、ゲル化温度が極低温であるアガロースであった。なぜなら、これから構成されるバイオインクが、室温でゾル（またはプレゲル液体）としてプリントされ、その後、冷蔵庫内で４℃でゲル化し得るからである。用いられた添加物は、ＦＭＯＣ−ジペプチド（ＦＭＯＣ−ＩＧおよびＦＭＯＣ−ＦＦ）であり、ネットワーク安定化剤として作用し（すなわち、癒合を防止した）、かつ、ネットワーク内の小滴と小滴との接着を増大させた。小滴と小滴との接着は、図１ｂに見られ得る。細胞外のマトリックスタンパク質（ＥＣＭ）もまた、バイオインクを補うのに用いられ、かつ、これらはＩ型コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンのいずれかであった。なぜなら、これらが細胞のための接着部位を提供するからである。これらＥＣＭが足場内の細胞増殖を促すことが経験的に注目された。実験の大部分において、用いられたＥＣＭ添加物はＩ型コラーゲンであった。
【００８３】
採取された細胞のバイオインクとしての再懸濁：
標準的な２Ｄ培養法によって増殖した細胞が、培養フラスコから採取され、かつ、遠心分離されてペレットを得た。この細胞ペレットは、その後、典型的な細胞密度である１５×１０６個の細胞／ｍＬで足場溶液中に再懸濁された。細胞はこの高密度で再懸濁された。なぜなら、細胞が、プリントされた構造体中に互いに複数の接点を形成し、かつ、その他の観察されたより低い細胞密度の足場よりも良好に増殖し得ることを見出したからである。用いられた哺乳類細胞株は、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨＥＫ−２９３／ＹＦＰ、ＨＥＫ−２９３／ＣＦＰ、ヒツジ間葉系幹細胞、ヒツジ骨芽細胞、マウス軟骨細胞およびマウス３次ニューロスフェアを含んでいた。
【００８４】
小滴ネットワークの３Ｄバイオプリント：
細胞を搭載した小滴ネットワークとしてバイオインクをプリントするために、３Ｄ小滴プリンターが用いられた。プリントは、まず、バイオインクを搭載したプリントノズルを油中脂質溶液の浴槽へと降下させること、および、小滴を再現可能に形成したプリントパラメーターを見出すことによって進行した。これら条件は、その後、空間的に配置された小滴の連続する積層（アップロードされた「プリントマップ」に基づく）によって、３Ｄ小滴ネットワークのプリントを自動化するのに用いられ得た。用いられた最適化されたプリント油は、１．２ｍＭのＤＰｈＰＣを含有する、ウンデカン：シリコーン油の体積比が６５：３５である混合物であった。この油は、理想のプリント（最適化された小滴沈降速度）を可能にするために設計され、かつ、ＤＰｈＰＣは、それが安定的な２重層を形成するので用いられた。バイオインクプリントされたネットワークについて、構造体がいかなる小滴と小滴との癒合もほとんど示さず、かつ、ぎっしり詰まった構造体を形成したことが観察された。かかるぎっしり詰まった小滴ネットワークは、図１ｅおよび図１ｆに示されている。
【００８５】
本発明の方法は、２つの細胞タイプの高解像度のパターニングを可能にする。図２ａ〜図２ｄは、本発明の方法によって製造された、プリントされた細胞を搭載した小滴集合の共焦点蛍光顕微鏡写真を示している。Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（ＤＲ）またはＲｅｄ  ＣＭＰＴＸ（ＲＣ）ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ商標色素で染色されたＨＥＫ−２９３細胞は、それぞれ偽似カラーの（ｆａｌｓｅ−ｃｏｌｏｕｒｅｄ）青色および黄色であった。図２ａは、正方形ネットワーク（８×９×４個の小滴）内のＹ形構造体を示しており、平均的な特徴の幅は、１８０μｍである（スケールバー＝２００μ）。図２ｂは、プリントされたネットワーク内に見られ得るＲＣ染色ＨＥＫ−２９３細胞の単一の集団を示す定められた高さｚにおける断面を示しており、前記のプリントされたネットワークは、２つの別個の層を含んでいた：下方のＲＣ染色ＨＥＫ−２９３細胞、小滴３つ分の厚さ；上方のＤＲ染色ＨＥＫ−２９３細胞、小滴４つ分の厚さ（スケールバー＝２５０μｍ）。図２ｃは、正方形ネットワーク（１０×１２×５個の小滴）内のＨＥＫ−２９３細胞の十字パターンを示している（スケール＝２５０μｍ）。図２ｄは、図２ｃにおけるパターニングされたＨＥＫ−２９３細胞の高倍率画像を示している（スケールバー＝１００μｍ）。図２ｅ〜図２ｈは、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ商標染色ＨＥＫ−２９３細胞を含むラメラネットワークの横からの３Ｄ画像を示している。下方のＲＣ染色ＨＥＫ−２９３細胞層、小滴３つ分の厚さ；上方のＲＣ染色ＨＥＫ−２９３細胞層、小滴３つ分または４つ分の厚さ。画像：０日目、図２ｅ、プリント直後および図２ｆ、培養培地への移動直後；図２ｇ、培養３日目ならびに；図２ｈ、培養５日目。（スケールバー＝２５０μｍ）。
【００８６】
ネットワークのゲル化およびゲル被覆（相間移動の準備）：
プリントされたネットワークは、２０〜２５分間、４℃まで冷却することによってゲル化された。ゲル化したカーゴを搭載した（ｃａｒｇｏ−ｌａｄｅｎ）ネットワークは、パターン忠実性における喪失を示さなかった。構造体は、その後、少量のアガロースヒドロゲルで被覆された。まず、プリント油がシリコーン油と交換され、その後、アガロースの小滴がプリントされた構造体と癒合した。油交換は、脂質を除去し、小滴境界面の２重層の形成ではなく癒合が起きることを可能にするためのものであった。被覆された構造体は、その後、ゲル化された（２０〜２５分間、４℃）。
【００８７】
細胞足場の相間移動：
その後、ゲル化し被覆された小滴集合が、油と培養培地との境界面（この場合、細胞培養培地より上に、体積比が３：１であるヘキサデカンと鉱油との混合物がある２相カラム）を通過することによって相間移動した。細胞足場が、上方の油相へとマイクロピペットを用いて移され、かつ、重力によって境界面を通過した。相間移動後、油は除去され、かつ、細胞足場は細胞インキュベーターに貯蔵され、かつ、１週間にわたって培養された。ゲル化および相間移動方法の概略図が、図３ａに示されている。
【００８８】
図３ｂは、油下でのプリント直後に撮像された、正方形ネットワーク（７×８×４個の小滴）としてプリントされた生／死染色ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の３Ｄ画像を示している。プリントされた小滴は、２９×１０６個の細胞ｍＬ−１の平均密度を有し、生存率は９６％であった。（スケールバー＝２００μｍ）。図３ｃは、ゲル封入および培養培地への移動後に撮像された、生／死染色されたプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の３Ｄ画像を示している（スケールバー＝２００μｍ）。０日目の培養培地への移動後における５つのプリントされたネットワークのＨＥＫ−２９３Ｔ細胞生存率（平均値の標準誤差を含む）を示すグラフが、図３ｄに示されている。生存率は、自動物体計数値（補正されないか、または、生および死細胞数を表すために平均細胞サイズに関して解像されるかのいずれかで用いられた）を用いて測定された。図３ｅは、７日目において培養培地中のネットワークに対して実行された免疫細胞化学の３Ｄ画像を示しており：細胞核はＤＡＰＩで染色され；生細胞の細胞質はＣＡＭで染色され；かつ、有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストン−３  ＩＣＣ、ＰＨ−３が用いられた（スケールバー＝２００μｍ）。
【００８９】
図４は、７日間にわたるネットワーク内のプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の発生を示している。図４ａ〜図４ｉは、７日間の細胞培養にわたる個別のプリントされたＨＥＫ−２９３細胞ネットワークの画像を示している。ネットワークは、１５×１０６個の細胞ｍＬ−１および１５μｇ  ｍＬ−１のＩ型コラーゲンを含有するバイオインクを用いてプリントされた。構築物は、０日目（左側のカラム）、３日目（中央のカラム）および７日目（右側のカラム）に撮像された。図４ａ〜図４ｃは、ネットワークの明視野共焦点顕微鏡画像であり、図中、ネットワークは７日間にわたって暗く不透明になった。なぜなら、細胞が増殖したからである。図４ｄ〜図４ｆは、培養の過程の間ずっと高生存率を示す、生／死染色細胞ネットワークの３Ｄ画像を示している。図４ｇ〜図４ｉは、プリントされた細胞ネットワークの拡大部分を示す、明視野および蛍光の合成顕微鏡写真を示している。細胞は、個別の実体から高密度の細胞クラスターへと増殖した。ｉ、７日目の細胞クラスターは、１４０μｍまでの幅であった。スケールバーは：ａ〜ｆ、２５０μｍ；ｇ〜ｈ、１００μｍおよび；ｉ、３０μｍである。
【００９０】
図５は、ネットワークの細胞密度に対するバイオインクの細胞密度の影響を示している。図５ａ〜図５ｄは、異なるバイオインクの細胞密度においてプリントされた、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞ネットワークの明視野および蛍光共焦点の合成顕微鏡画像を示している：ａ、１×１０６；ｂ、５×１０６；ｃ、１０×１０６および；ｄ、１５×１０６個の細胞ｍＬ−１。ネットワークは、生／死色素を含有するバイオインクを用いて作成され、かつ、未だバルク油（ｂｕｌｋ  ｏｉｌ）中にありながらプリント直後に撮像された。画像は：ａ〜ｃ、ネットワーク全体またはｄ、小滴内で区画化された（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓｅｄ）細胞を示している。図５ｅは、手での計数から計算された、ネットワークａ〜ｄについての小滴あたりの平均細胞数を示しており、ここで、平均小滴サイズは、直径が：ａ、１２０；ｂ、１３５；ｃ、１３０および；ｄ、１３５μｍであった。図５ｆは、小滴の平均細胞占有率÷平均小滴体積として計算された、ａ〜ｄに示されるネットワークの小滴の平均細胞密度を示している。エラーバーは、細胞計数の標準偏差（ｅ）または計数および小滴体積の複合誤差（ｆ）のいずれかを表している。スケールバーは：ａ〜ｃ、２５０μｍおよび；ｄ  ７５μｍである。
【００９１】
実験の詳細：
足場溶液：
このセクションは、相間移動可能な足場を製造するのに用いられた足場溶液（バイオインクとも呼ばれる）について検討する。まず、バイオインクの取り扱いおよび組成が説明され、その後、足場添加物の作成方法が説明される。
【００９２】
溶液の調製の概観
足場溶液１〜３（ＳＳ１〜３）（表１参照）はすべて、同一の方式で製造された：すなわち、足場のバルク相が液体またはプレゲル溶液としてまず調製され、その後、足場添加物が添加され、最終的に、細胞が所望の密度で再懸濁された。
【００９３】
細菌感染を最小限にするために、足場溶液を滅菌するのに種々のステップが採用された。しかしながら、各バイオインク製造は、可能である場合（ｗａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ）、無菌技術を用い、かつ、バイオインク処理が可能であり、層流安全キャビネットにおいて実行された。結果として生じた細胞を搭載したバイオインクは、使用前、ＣＯ２インキュベーター［Ｍｉｄｉ  ４０、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社］において５％のＣＯ２で３７℃で貯蔵された。バイオインクは概して製造から３０分以内にプリントされたが、使用前、最大４時間貯蔵された。
【００９４】
アガロース系溶液（ＳＳ１〜ＳＳ３）
アガロース系足場溶液はすべて、足場添加物を有するか、または有しない、ゲル化点が極低であるアガロースから構成された。これら溶液は液体として調製され、かつ、ＥＣＭタンパク質または細胞が添加されるまで（その時点で溶液は３７℃で保たれた）、アガロースゲルの融解温度より上（すなわち、〜５０℃）で保たれた。細胞の添加前、溶液はそれぞれ、動力が半分に設定されたＬＥＤドライバー［ＬＥＤＤ１Ｂ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社］によって制御されたＵＶ  ＬＥＤ［Ｅｃｌｉｐｓｅ−Ｍ３６５Ｌ２−Ｃ５、ニコン社］の下で３６５ｎｍの波長において１５分間、ＵＶ照射された。アガロース系足場溶液はすべて、作成日に用いられ、かつ、将来の使用のためには貯蔵されなかった。
【００９５】
ＳＳ１およびＳＳ２：ＦＭＯＣ−ＸＸを有するアガロース
ＦＭＯＣ−ジペプチドが添加されたアガロース溶液が、それぞれ体積比が８：１である１３〜１５ｍｇ／ｍＬのアガロースと１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸとの混合物として調製された。元々のアガロース溶液（ＳＳ６）は希釈されておらず、一方で、後者の希釈されたアガロース溶液（ＳＳ７）はまた、１０体積％のＰＢＳを含有していた。足場溶液６については細胞の添加前、足場溶液７についてはＰＢＳの添加前にＵＶ処理が実行された。
【００９６】
足場溶液１の最終組成は、８８．９％の基礎培地および１１．１％の超純水中、１１．６〜１３．３ｍｇ／ｍＬのアガロースおよび１．１ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸであった。
【００９７】
足場溶液２の最終組成は、８０％の基礎培地、１０％の超純水および１０％のＰＢＳ中、１０．４〜１２．０ｍｇ／ｍＬのアガロースおよび１．０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸであった。
【００９８】
ＳＳ３：ＦＭＯＣ−ＸＸとＥＣＭ添加物とを有するアガロース
これらバイオインクは、足場溶液７を種々の濃度のＥＣＭタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンのいずれか）で補うことを伴った。調製は、ＦＭＯＣ−ＸＸ溶液を有するＵＶ滅菌されたアガロースに対して、ＰＢＳ中のＥＣＭタンパク質が所望の濃度で最初に添加され、それに続いてＰＢＳのみが添加されて１０体積％のＰＢＳ画分を与えること以外は、足場溶液７と同一であった。足場溶液はこの段階で、２８００超音波洗浄器［Ｂｒａｎｓｏｎ社］において超音波処理された（５分、４０ｋＨｚ）。ＥＣＭタンパク質は、コラーゲンについて３．５〜３００μｇ／ｍＬであり、かつ、フィブロネクチンおよびラミニンについて０．５〜２０μｇ／ｍＬである濃度範囲の間で補われた。１５μｇ／ｍＬのコラーゲンの添加が、微細組織の増殖のための標準となった。
【００９９】
したがって、標準的な足場溶液３の最終組成は、８０％の基礎培地、１０％の超純水および１０％のＰＢＳ中、１０．４〜１２．０ｍｇ／ｍＬのアガロース、１．０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸおよび１５μｇ／ｍＬのコラーゲンであった。
【０１００】
足場添加物の調製
１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＩＧおよび１０ｍＭのＦＭＯＣ  ＦＦ溶液
ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシン（ＦＭＯＣ−ＩＧ）およびＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニン（ＦＭＯＣ−ＦＦ）の１０ｍＭ溶液が、−２０℃で貯蔵されていた粉末アリコートから調製され、かつ、室温まで昇温させられた。ＦＭＯＣ−ＩＧ（１６ｍｇ）とＦＭＯＣ−ＦＦ（１２ｍｇ）とは、１ＭのＮａＯＨ（１０〜２０μＬ）を有する超純水（１．５ｍＬ）に別々に溶解し、一晩中撹拌された。部分的に可溶化したＦＭＯＣ溶液は、Ｂｒａｎｓｏｎ社の２８００超音波洗浄器において超音波処理され（２０分、３７℃、４０ｋＨｚ）、ｐＨが０．１ｍＭのＮａＯＨを用いて８．５０（ＦＭＯＣ−ＩＧ）または１０．５０（ＦＭＯＣ−ＦＦ）のいずれかに調整され、その後、超純水中で３ｍＬの総体積へと希釈された。ＦＭＯＣ−ＩＧとＦＭＯＣ−ＦＦとは、１週間以内に用いられ、必要であれば使用前にｐＨが調整された。
【０１０１】
１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸ溶液
ＦＭＯＣ−ＸＸ溶液は、ＦＭＯＣ−ＩＧおよびＦＭＯＣ−ＦＦの等しいモル比の溶液であった。１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸ溶液については、１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＦＦと１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＩＧとが体積で１：１の溶液として混合され、その後、超音波処理された（４０ｋＨｚ）。ＦＭＯＣ−ＸＸは、使用日に新たに作成された。
【０１０２】
アガロース溶液
ゲル化点が極低であるアガロース［Ａ５０３０］が、１３〜１５ｍｇ／ｍＬのアガロース溶液を作成するのに用いられた。典型的には、アガロース粉末と基礎培地とが水槽（６５℃）中で温められた。温められたアガロース粉末（典型的には、〜１２ｍｇ）は、温められた基礎培地（典型的には、〜０．８ｍＬ）に溶解した。溶媒化を促進するために、溶液はボルテックス混合され、かつ、必要に応じて、マイクロピペット吸引によって機械的に摂動され、または超音波処理された（４０ｋＨｚ）。アガロース溶液は、一旦作成されると水槽（６５℃）に放置された。基礎培地は、ＨＥＫ−２９３派生細胞株用のＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標、ｏＭＳＣ、骨芽細胞および軟骨細胞用のＤＭＥＭ−ＩＴＳまたはニューロスフェア用のＮＢ−Ａ＋のいずれかであった。
【０１０３】
ＥＣＭタンパク質添加物
ＥＣＭタンパク質が、ストック濃度から活性ゲル形態（すなわち、使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））へと希釈することによって調製された。ＥＣＭタンパク質のストック溶液は、５．０ｍｇ／ｍＬのウシコラーゲンＩ、１．０ｍｇ／ｍＬの天然マウスラミニンおよび１．０ｍｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチンであり、４℃（コラーゲン）または−２０℃（ラミニンおよびフィブロネクチン）のいずれかにおいてアリコートとして貯蔵された。コラーゲンＩゲル使用溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ）が、氷冷試薬を順番に混合することによって調製された：コラーゲンＩストック（５０μＬ）、１０×濃縮ＰＢＳ（８．３μＬ）、１ＮのＮａＯＨ（１．３μＬ）および超純水（２３．８μＬ）。ラミニンおよびフィブロネクチン使用溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）が、ＰＢＳ中で各ストック溶液を希釈することによって作成された（典型的には、１０μＬのタンパク質ストックを９０μＬのＰＢＳで）。ＥＣＭタンパク質使用溶液はすべて、層流生物学的安全キャビネットにおいて、バイオインクへのそれらの添加の直前に調製された。
【０１０４】
表１：アガロース系バイオインクの組成。
【０１０５】
【表１】
2019506884.tif 000003
【０１０６】
採取された細胞のバイオインクとしての再懸濁：
細胞は、次のように採取され、かつ、足場溶液へと混合された。ＨＥＫ−２９３Ｔ（すなわち、非接着細胞）については、コンフルエントなＴ２５フラスコ培養物がＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標（５ｍＬ）中に再懸濁され、これのアリコート（典型的には、１〜２ｍＬ）が、５７０２遠心分離機［Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社］中で遠心分離され（３〜５分、３００〜５００×Ｇ）、かつ、結果として生じたペレットが、所望の細胞密度で足場溶液中に再懸濁された。典型的な再懸濁については、１００〜２００μＬの足場溶液が細胞と混合され、１５×１０６個の細胞／ｍＬの溶液を与えた。一方、ＨＥＫ−２９３／ＹＦＰのような接着細胞株については、細胞溶液のアリコートが取得される前に、培養物がまずトリプシン処理され、その後、遠心分離後にＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標（３１９８５−０６２）中に再懸濁された。ＭＳＣ、骨芽細胞または軟骨細胞バイオインクが調製された時、細胞はＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標の代わりにＤＭＥＭ−ＩＴＳ培地中に再懸濁された。ニューロスフェア採取は、それらの継代については、ＮＢ−Ａ＋洗浄後の再播種の代わりに細胞が遠心分離され、かつ、細胞足場溶液中に再懸濁された以外は、同一のプロトコールに追従した。
【０１０７】
細胞懸濁アリコートから所望の密度で細胞を再懸濁させるために、アリコートの細胞密度がまず測定され、かつ、再懸濁体積が方程式３を用いて計算された。この方程式は、溶液の総細胞数（ｎｃｅｌｌｓ）＝細胞密度（ρｃｅｌｌｓ、単位は細胞／ｍＬ）×体積（Ｖｃｅｌｌｓ、単位はｍＬ）  式１から生じる。再懸濁については、細胞の総数は変化せず、したがって、細胞数の式は、元々の体積の溶液と最終（ｆｉｎａｌ）の体積の溶液を方程式２として同等化するのに用いられ得、方程式２は方程式３として再構成され得る。
【０１０８】
【数１】
2019506884.tif 000004
【０１０９】
【数２】
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【０１１０】
【数３】
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【０１１１】
細胞のアリコートの密度を測定する標準的な方法は、１００μＬの細胞アリコートと１００μＬのトリパンブルー溶液（死細胞のみ、濃い青色で染色された）とを混合して計数溶液を製造することであった。この溶液（２×１０μＬ）が、使い捨ての血球計算器チップに添加され、該使い捨ての血球計算器チップはチップのいずれの側面上にもある自動細胞計数器［ＩＩ  ＦＬ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ社］によって読み取られ、値のセットを２つ与えた。自動細胞計数器は、生細胞密度、死細胞密度および総細胞密度を与える。２つの生細胞密度計数の平均が、初期（ｉｎｉｔｉａｌ）細胞密度についての値として用いられ、続いて、方程式３を用いて再懸濁／最終体積を計算するために用いられた。
【０１１２】
小滴ネットワークの３Ｄバイオプリント：
小滴プリンターの概観
小滴を生成するための装置（例えば、小滴ネットワークの３Ｄプリンター）の例の説明は、Ｖｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ４８〜５２  （２０１３）に見られ得る。要すれば、小滴生成器（「ピエゾ」と呼ばれる場合がある）は、突出した先細りのキャピラリーノズルと共に、水性チャンバーの背面を密封する圧電ディスクを含んでいた。ピエゾは、先端部が油中脂質溶液のようなバルク疎水性媒体中に沈められる時、方形波電圧パルスの印加の際にノズルから小滴を吐出し得る（例えば、図１ａまたは図１ｄに示されるように）。プリントステージ（例えば、油容器）を３次元で移動させるのに、電子マイクロマニピュレーターが用いられた。これは、「プリントマップ」を解釈し、かつ、小滴吐出を自動化する、実験室で設計されたプリントソフトウェアとの組み合わせで、空間的に配置された小滴の連続する積層による３Ｄ小滴ネットワークの構築を可能にした。本方法によって製造された層状の３Ｄ構造体が、図２ｅ〜図２ｈに示されている。
【０１１３】
プリンターの準備
プリント前、ピエゾの水性チャンバーと、プリント油容器と、その他のプリント物品とが、超純水およびエタノールで十分に洗浄され、その後、Ｎ２（ｇ）の下で乾かされた。使用の日、キャピラリーは、超純水、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄され、その後、Ｎ２（ｇ）の下で乾かされた。洗浄されたキャピラリーは、続いてプラズマ洗浄装置［Ｆｅｍｔｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ、Ｄｉｅｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社］中に真空密封され、かつ、酸素プラズマで処理された（８分、５〜１０ＳＣＣＭ）。器具が洗浄されると、ピエゾが超純水で充填され、かつ、キャピラリーが挿入された。
【０１１４】
バイオインクを新たに充填するごとの合間に、キャピラリーがビルコン（Ｖｉｒｋｏｎ）、その後で８ＭのＮａＯＨ中に浸すことによって洗浄され、かつ、水性チャンバーに喪失水量が補充された。アガロース系バイオインクについては、キャピラリーがまた、６５℃で純水中に浸すことによって洗浄された。
【０１１５】
プリントされた細胞を搭載した小滴ネットワーク
細胞を搭載した足場が、細胞を含有するアガロース系足場溶液（すなわち、バイオインク）を用いて、１．２ｍＭのＤＰｈＰＣを含有する、体積比が６５：３５である（ウンデカン）：（シリコーン油）の混合物にプリントされた。標準的なプリントプロトコールが、以下に続く。
【０１１６】
バイオインクがボルテックス混合され、かつ、アリコート（１０μＬ）が、ヘキサデカン（８μＬ）と一緒にプリンターの充填用ウェルアレイに配置された。ヘキサデカン（〜１μＬ）がまずプリンターノズルに吸引充填され、バイオインク（１〜６μＬ）がその後に続いた（図１ｄ）。アガロース系バイオインクについては、充填後にガラスキャピラリーの外側先端部が純水中に浸されたレンズ用紙で拭かれた。
【０１１７】
一旦キャピラリーがプリント油（通常、２００μＬ）中に沈められると、ピエゾは、理想的には均一サイズのシングレット小滴の再現可能な吐出用の条件が見出されるまで、種々の電圧パルスで継続的に始動した。典型的な調整パルスパラメーターは、４０〜６３Ｖの電圧で５０〜３５０μｓパルス−幅であった。
【０１１８】
しかしながら、調整パルスは、細胞を搭載した小滴ネットワークを自動的にプリントするのに用いられ得る。典型的には、このプリントパルスの電圧は、一貫した小滴製造を保つために、複数のネットワークのプリントセッションの間ずっと、徐々に増大するであろう。概して、複数のネットワークは、同一のプリントチャンバー内に連続してプリントされ、最後のネットワークは移動前に５分間放置された。バイオインクのプリント順およびプリントパラメーターについての情報が、異なるネットワークタイプについて以下で見られる。
【０１１９】
単一細胞タイプの足場
単一細胞タイプの細胞足場が、７×９または７×８の水平マップ寸法（ｘ×ｙ画素）を有する２〜４層の小滴シートとして主にプリントされた。相間移動する足場（すなわち、小滴集合）については、４層が通常の厚さであった。
【０１２０】
接合足場（２細胞タイプ）
すべての接合足場について、コラーゲンを有している、または有していない細胞を搭載したバイオインクが、まず１型細胞をプリントし、その後、ノズル洗浄およびバイオインク充填の後で２型細胞をプリントするために、単一の小滴生成器を用いてプリントされた（ａｓ  ｐｒｉｎｔｅｄ）。各接合点は、基部がより幅の広い小滴シート（１型細胞）から構成され、その上は、中心に整列したより幅の狭い小滴シート（２型細胞）があった。
【０１２１】
すべての例において、接合ネットワークが次のようにプリントされ、下方の小滴シートが３〜４層についてのフルマップ（すなわち、小滴が各画素において吐出されたマップ）としてプリントされ、その後、時々、構造体の縁部が上にある２つのさらなる層についての中空マップ（すなわち、小滴がマップの縁部においてのみ吐出されたマップ）をプリントすることによって平らにされたであろう。上方の層が同様にプリントされた：３〜４層についてのフルマップ、その後、時々、２層についての中空マップ。特定のマップサイズおよび各接合点についてプリントされた層の数が、表２に要約されている。
【０１２２】
表２：細胞接合点製造についてのプリントの詳細。各接合点のプリントは、上方および下方の層についてのバイオインクの細胞密度とマップ寸法（水平画素ｘ×ｙ×垂直画素ｚ）とを用いて列挙されている。非蛍光細胞は、ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸ（ＲＣ）またはｄｅｅｐ  ｒｅｄ（ＤＲ）ｃｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素で染色された（図２）。
【０１２３】
【表２】
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【０１２４】
パスウェイネットワーク（２細胞タイプ）
すべてのパスウェイ足場について、コラーゲンを有している、または有していない、細胞を搭載したバイオインクが、まず１型細胞をプリントし、その後、ノズル洗浄およびバイオインク充填の後で２型細胞をプリントするために、単一の小滴生成器を用いて作成された。各パスウェイネットワークは、構造的小滴（２型細胞）によって同一の平面およびそれより上で囲まれた、幅の狭いパスウェイ構造（１型細胞）から構成されていた。
【０１２５】
すべての例において、パスウェイネットワークが次のようにプリントされ、パスウェイ小滴が３〜７層についてまずプリントされ、その後、パスウェイの平坦な構造的小滴が２〜６層についてプリントされ、最後に、２層の上部の構造的小滴を有して、ネットワークが徐々に完成され得る。これら３つのマップのそれぞれについてのマップ寸法は、ネットワークプリントの間ずっと一定のままであろうが、設計はパスウェイネットワーク間で変化した（表３参照）。
【０１２６】
表３：細胞パスウェイ構造体の製造のためのプリントの詳細。各パスウェイのプリントは、バイオインクの細胞密度、マップ寸法（水平画素ｘ×ｙ）およびプリントされた層の数（垂直画素ｚ）ならびにパスウェイの幅（マップ中の画素の幅）を用いて列挙されている。各構造体について用いられた細胞は：三叉パスウェイ［１］におけるＨＥＫ−２９３／ＹＦＰ（パス）およびＨＥＫ−２９３／ＣＦＰ（構造体）；三叉パスウェイ［２］におけるＨＥＫ−２９３／ＣＦＰ（パス）およびＨＥＫ−２９３／ＹＦＰ（構造体）；ならびに、三叉パスウェイ［１］におけるＨＥＫ−２９３Ｔ（ＲＣ）（パス）およびＨＥＫ−２９３Ｔ（ＤＲ）（構造体）であった。非蛍光細胞は、ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸ（ＲＣ）またはｄｅｅｐ  ｒｅｄ（ＤＲ）ｃｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素で染色された。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
混合細胞のプリントされたネットワーク
至る所に混合細胞を含有する足場が、体積比が１：１である、バイオインク＋コラーゲン中１０×１０６個のＨＥＫ−２９３Ｔ（ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸで染色された）／ｍＬと、バイオインク＋コラーゲン中１３×１０６個のＨＥＫ−２９３Ｔ（ｄｅｅｐ  ｒｅｄで染色された）／ｍＬとの混合物を含むバイオインクを用いてプリントされた。これらは、４層についての水平的な７×８（ｘ×ｙ）マップとしてプリントされた。
【０１２９】
ネットワークのゲル化およびゲル被覆（相間移動の準備）
足場のゲル化
標準的なバイオインクプリント油に境界のあるＳＳ７またはＳＳ８のいずれかを含むプリントされた足場は、プリント後、静置された（５分）。足場はその後、冷蔵庫においてゲル化された（４℃、２０〜２５分）。ゲル化したネットワークは、直ちに用いられたか、水和チャンバーに貯蔵されたかのいずれかであった。ゲル化後、ネットワーク（すなわち、小滴集合）は、培養培地のような水性相へと移された。
【０１３０】
細胞足場の維持
相間移動した足場は、顕微鏡チャンバースライド［１５４５３４Ｋ、Ｌａｂ−Ｔｅｋ商標］容器を用いて、１４日間まで培養培地（ウェルあたり〜６００μＬ）中で培養された。足場は、培地交換と実験との間は、３７℃、５％のＣＯ２（ｇ）に設定されたＭｉｄｉ４０細胞インキュベーター［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］中で貯蔵された。２〜３日毎に、足場培地は単一のウェルについて交換され、これは次の通り進行した：〜２００〜３００μＬ容器培地が、空気と培地との境界面付近で注意深く除去され、その後、３００μＬの新たな培地がウェルの隅にゆっくりと添加され、この培地の除去および交換は、あと１〜２回繰り返された。培地交換は、層流生物学的安全キャビネット中で実行された。
【０１３１】
ＨＥＫ−２９３Ｔおよび蛍光ＨＥＫ−２９３足場の大部分は、完全に補充された標準的な細胞足場培養培地中で培養された。
【０１３２】
ｏＭＳＣ足場は、標準的な生存率評価のためにはＭＳＣ培養培地中で培養され、かつ、分化実験のためには、ＭＳＣ分化培地またはＭＳＣ対照培地が用いられた。
【０１３３】
ニューロスフェア足場は、標準的な細胞足場培養培地またはニューロスフェア培養培地のいずれかにおいて培養された。
【０１３４】
追加的な細胞培養培地：
細胞培養培地の混合物
各細胞タイプに、それに特異的な細胞培養培地組成がある。培養培地はすべて、以下の添加物を有するか、または有しない必須培地から構成された：１０体積％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ商標（グルタミンのソースである）、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、１０〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（緩衝剤）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（抗生物質）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（抗生物質）。これら成分の割合は、表４に見られ得る。
【０１３５】
基礎培地は、異なる細胞株の間で異なり、ＤＭＥＭ、ＭＥＭまたはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ登録商標−Ａのいずれかであった。具体的には３つの異なるＤＭＥＭ培養培地が、ほとんどの細胞株の培養の間中、用いられたが、これらはここで、それらのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の製品コードとともに説明される：ＤＭＥＭ  Ｄ６５４６は、高グルコース培地であり、かつ、すべてのＨＥＫ−２９３細胞株派生物について用いられた；ＤＭＥＭ  Ｄ５５６４は、低グルコース培地であり、かつ、ＭＳＣの培養において用いられた；一方、ＤＭＥＭ  Ｄ５６７１は、ピルビン酸ナトリウムを有さない高グルコース培地であり、かつ、ＭＳＣの分化実験のためのＤＭＥＭ−ＩＴＳベース培地を作成するのに用いられた。各ＤＭＥＭは、（言及がなければ）重炭酸ナトリウム、塩酸ピリドキシンおよび１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを有する高（４５００ｍｇ／Ｌ）グルコースまたは低（１０００ｍｇ／ｍＬ）グルコースのいずれかを含有していた。ＭＳＣの骨形成分化および骨芽細胞の培養については、ＭＥＭ  Ｍ４５２６が用いられたが、これは重炭酸ナトリウムと、標準的なＭＥＭと比較して増大した濃度のアミノ酸とを含有していた。神経細胞は、無血清神経培地であるＮｅｕｒｏｂａｓａｌ登録商標−Ａ（１０８８８−０２２）中で培養された。各細胞株の培養培地の基礎培地もまた、表４に記載されている。
【０１３６】
追加の栄養素または特別な抗生物質もまた、ＨＥＫ−２９３Ｔ以外のすべての細胞株について用いられた。これらは、各細胞タイプについて以下で説明される。
【０１３７】
表４：種々の細胞株を増殖させるのに用いられる標準的な培養培地についての組成。１００×濃縮ストックは、２００ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ商標）と、１０ｍＭのＭＥＭ−ＮＥＡＡと、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを有する１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）である。
【０１３８】
【表４】
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【０１３９】
蛍光ＨＥＫ−２９３培養培地
蛍光タンパク質発現ＨＥＫ−２９３細胞の培養については、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンもまた、添加された。ストックブラストサイジン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）は、ブラストサイジン粉末（５０ｍｇ）をフィルター滅菌された超純水（５ｍＬ）中に溶解することによって調製され、かつ、１０μＬのアリコートとして−２０℃で貯蔵された。ストック溶液は、培養フラスコあたり１μＬ／ｍＬで添加された。
【０１４０】
ヒツジＭＳＣ分化培地
ＭＳＣ分化実験については、細胞は、ＭＳＣ分化培地またはＭＳＣ対照培地中で培養されるが、これら培地の基礎培地は、ＩＴＳ−ＤＭＥＭであって、ＦＢＳで補充されていないが、ＩＴＳ（１０．０ｍｇ／ｍＬのウシインスリン、５．５ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリンおよび６．７μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムで）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ商標、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンならびに１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ  Ｄ５６７１から構成される前記ＩＴＳ−ＤＭＥＭである。０〜７日目用のＭＳＣ分化培地もまた、すべて新たに補充された、１００ｎＭのデキサメタゾン、８０μＭのアスコルビン酸−２−リン酸および１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３を含有していた。７日目の後、ＭＳＣ分化培地は、追加的に、これもまた新たに添加された１０ｎｇ／ｍＬのインスリンを含んでいた。ＭＳＣ対照培地は０〜７日目用のＭＳＣ分化培地と同一であるが、ＴＧＦ−β３は有さない。ＭＳＣ培養についての追加的な栄養添加物の概要は、表５に見られ得る。
【０１４１】
追加の栄養素、デキサメタゾン、アスコルビン酸、ＴＧＦβ３およびインスリンは、すべてストック溶液として粉末試薬から調製されたが、該ストック溶液は、ボルテックス混合され、その後、フィルター滅菌され、かつ、アリコートとして−２０℃で貯蔵された。１００μＭのデキサメタゾンストックは、デキサメタゾン（３．９２５ｍｇ）をエタノール（１ｍＬ）中に溶解することによって調製され、その後、ＩＴＳ−ＤＭＥＭ（１ｍＬ）中で０．０１体積％の溶液へとさらに希釈された。アスコルビン酸については、８０ｍＭのストックが、Ｌ−アスコルビン酸−２リン酸セスキマグネシウム塩水和物を超純水（３ｍＬ）中に溶解することによって作成された。１０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３ストックは、ＴＧＦ−β３を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するフィルター滅菌された４ｍＭの塩酸中に溶解することによって作成された。最後に、１０ｍｇ／ｍＬのストックインスリンは、インスリン（２０ｍｇ）を超純水で希釈した酢酸（２ｍＬ、ｐＨ２．０）中に溶解することによって調製された。
【０１４２】
表５：ＭＳＣ培地に添加された追加の栄養添加物の割合。添加された栄養素は、次のストック溶液、すなわち、１００×濃縮ＩＴＳ（１．００ｍｇ／ｍＬのウシインスリン、０．５５ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリンおよび０．６７μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムで）、１００×濃縮ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、１０μｇ／ｍＬのＦＧＦ、１００μＭのデキサメタゾン、８０ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸、１０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３および１０ｍｇ／ｍＬのインスリンからのものである。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
その他の考え得る培養培地は、以下のものを含む。
【０１４５】
骨芽細胞培養培地
ＭＳＣ骨形成については、骨芽細胞培養培地はまた、５０μＬ／ｍＬのＳｔｅｍＸＶｉｖｏ商標骨原性添加物を含有しており、それは使用の日に供給されたように添加された。骨原性添加物は、−２０℃においてアリコートとして貯蔵されていた。
【０１４６】
ニューロスフェア培養培地
ニューロスフェアは、４体積％のＢ−２７登録商標添加物、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ登録商標−Ａ培地を含んでいたＮＢ−Ａ＋と呼ばれるニューロスフェア培養培地中で培養された。神経幹細胞増殖のために、ＮＢ−Ａ＋は、２０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子および２０ｎｇ／ｍＬの塩基性ＦＧＦでさらに補充された。
【０１４７】
ヒツジＭＳＣおよび軟骨細胞培養培地
ｏＭＳＣ培地はすべて、追加の添加物を伴った；ＭＳＣ培養については、培地はまた、使用の直前に１０μｇ／ｍＬのＦＧＦストックから添加された５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含有していた。軟骨培養培地は、ＭＳＣ培養培地とまったく同一であった。ストックの１０μｇ／ｍＬのＦＧＦ溶液は、ＦＧＦ（５０μｇ）をフィルター滅菌された５ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ溶液（５ｍＬ、ｐＨ７．６）中に溶解することによって作成され、アリコートで−２０℃で貯蔵された。
【０１４８】
その他のプリント技術と比較した本発明の方法の利点
上記の実施例において説明された本発明の方法は、公知のプリント技術と比較される時、いくつかの利点を有する。
【０１４９】
バルブをベースにした小滴バイオプリントと比較してより高い小滴解像度
バルブをベースにしたバイオプリンターは、液体ヒドロゲルの小滴をオンデマンドで作成し、かつ、これらを積層して３Ｄ足場を形成し得る。典型的には、しかしながら、それら小滴の解像度（プリンターボクセル解像度）は、我々の技術より非常に低い（すなわち、１桁低い）。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ５４，  １〜６ａ  （２０１５）は、直径が５００μｍであり、かつ、体積が６５ｎＬである小滴を製造する。Ｇｕｒｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  １１，  ２１５１〜９  （２０１４）は、直径が３００μｍであり、かつ、体積が１４ｎＬである小滴を製造する。最小のマイクロピペットで移される小滴は、典型的には、２００ｎＬの体積および〜０．７ｍｍの直径を有する。本発明の方法は、直径が５０μｍであり、かつ、体積が６５ｐＬである塩ベース溶液の小滴および直径が〜１３０μｍであり、かつ、体積が〜１．２ｎＬであるバイオインクの小滴の製造を可能にする。
【０１５０】
プリントされたヒドロゲル足場の高い細胞密度
最も知られているバイオプリント技術は、１０６個の細胞／ｍＬスケールの細胞密度で実行される。本発明の方法は、１桁大きな密度（例えば、１５×１０６個の細胞／ｍＬ）でのプリントを可能にする。
【０１５１】
足場中の高い生存率
プリント後の細胞生存率は、図３ｃに示されるように８０〜９５％の間である。
【０１５２】
構造体全体にわたる均一な細胞分布
細胞は、本発明の方法を用いて、図１ｅに示されるように均一に分配される。
【０１５３】
支持足場が不要
いくつかのバイオプリント方法は、２次的な支持足場を用いて、それらの細胞を搭載した構造体に堅固性を提供し、または、それらの細胞を搭載した構造体内の多孔性を確保する（Ｄｅｒｂｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８，  ９２１〜６，  ２０１２）。組織が増殖するためには、この支持足場が劣化しなければならないであろうし、このことは、困難な材料設計の制約である。また、かかる足場は、埋め込まれれば、宿主と生体適合性でなければならず、かつ、免疫系による拒絶を回避しなければならないであろう。ヒドロゲルベースの細胞を搭載した足場は、かかる支持足場を必要としない。
【０１５４】
高いパターン解像度
複数の細胞タイプの、十字のパスウェイ、木のような見た目の（ａｒｂｏｒｉｓｅｄ）パスウェイ（血管系または神経組織様構造体）およびネットワーク接合点といった複雑な構造は、本発明の方法によって、高機能解像度（〜２５０μｍ、すなわち、小滴２つ分の幅）でプリントされた。これは、公知の方法（例えば、Ｋｏｌｅｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  ２６，  ３１２４〜３０，  ２０１４）を用いるより、大きなパターン解像度である。この高いパターン解像度は、図２に示されている。
【０１５５】
ｍｍスケールの微細組織の再現可能な製造
本発明の方法によって示された寸法（典型的には、１×１×０．４ｍｍ３）の小さい微細組織の再現可能な製造を示している文献はない。最も知られている技術は、ｃｍスケールの足場を示している。
【０１５６】
足場製造がＥＣＭ添加によって影響を受けない
本発明の方法を用いれば、プリント方法に影響を与えることなく、ある割合の細胞外のマトリックスタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンのような）をバイオインクに添加することが可能である。低い割合のＥＣＭが初期の細胞増殖を補助するのに十分であることが、経験的に注目されている。そのようであるので、代替的なＥＣＭベースの添加物をバイオインクに添加することは実現可能なはずである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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