(57)【要約】  特に、産物、例えば、組換えタンパク質、例えば、抗体の産生の間の宿主細胞タンパク質を検出する及び／又は定量するための有用な方法及び組成物が、本明細書に開示される。
2019516964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチド、例えば、治療ポリペプチドを含むサンプル中のＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を検出、モニタリング、同定、又は定量する方法であって、
ａ）組換えポリペプチドを含むサンプルを準備又は取得するステップ；
ｂ）該サンプルを、支持体、例えば、不溶性又は固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体とインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；
ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｅ）該抗体に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの存在を該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して検出するステップ；並びに
ｆ）任意選択で、検出されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを定量するステップ；
ｇ）任意選択で、１つ又は複数の検出されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを同定するステップ；及び
ｈ）任意選択で、１つ又は複数の同定されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを定量するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ｉ）前記組換えポリペプチドが、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である、又は
ｉｉ）前記組換えポリペプチドが、表１又は２に開示された１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えポリペプチドが、抗体、例えば、モノクローナル抗体、例えば、治療抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｉ）前記サンプルが、前記組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる、
ｉｉ）前記サンプルが、前記組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる、
ｉｉｉ）前記サンプルが、前記組換えポリペプチドの最終産物から得られる、又は
ｉｖ）前記方法が、前記組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能な抗体が、
ｉ）直接的に検出可能である、
ｉｉ）蛍光試薬によって増幅される、又は
ｉｉｉ）ビオチン化され、前記検出手段が、アビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組換えポリペプチド、例えば、治療ポリペプチド、医薬品を製造する方法であって、
ａ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；
ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；
ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｅ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及び
ｆ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが事前に選択した参照レベル未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップであって、任意選択で、処理するステップは、該ポリペプチド調製物を配合するステップ；該ポリペプチド調製物を医薬品に処理するステップ；該ポリペプチド調製物を第二成分、例えば、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップ；該調製物中の該ポリペプチドの濃度を変化させるステップ；該ポリペプチド調製物を凍結乾燥させるステップ；該ポリペプチドの第一及び第二のアリコートを組み合わせて、第三の、より大きい、アリコートを準備するステップ；該ポリペプチド調製物をより小さいアリコートに分けるステップ；該ポリペプチド調製物を容器、例えば、気密性又は液密性容器に配置するステップ；該ポリペプチド調製物を包装するステップ；該ポリペプチド調製物を含む容器に標識を付けるステップ（例えば、標識化）；該ポリペプチド調製物を異なる位置に輸送するステップ又は移動させるステップの１つ又は複数を含む、該ステップ
を含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法。
【請求項７】
組換えポリペプチド、例えば、治療ポリペプチド、医薬品を製造する方法であって、
ａ）組換えポリペプチドの産生、例えば、発現及び分泌に適切な条件下でＧＳ−ＣＨＯ細胞を培養するステップ、
ｂ）分泌された組換えポリペプチドを宿主細胞から分離するステップ；
ｃ）分泌された組換えポリペプチドを１つ又は複数の精製ステップに供して組換えポリペプチド調製物を産生するステップ；
ｄ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；
ｅ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；
ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｆ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｇ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及び
ｈ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが事前に選択した参照レベル未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップであって、任意選択で、該処理するステップは、該ポリペプチド調製物を配合するステップ；該ポリペプチド調製物を医薬品に処理するステップ；該ポリペプチド調製物を第二成分、例えば、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップ；該調製物中の該ポリペプチドの濃度を変化させるステップ；該ポリペプチド調製物を凍結乾燥させるステップ；該ポリペプチドの第一及び第二のアリコートを組み合わせて、第三の、より大きい、アリコートを準備するステップ；該ポリペプチド調製物をより小さいアリコートに分けるステップ；該ポリペプチド調製物を容器、例えば、気密性又は液密性容器に配置するステップ；該ポリペプチド調製物を包装するステップ；該ポリペプチド調製物を含む容器に標識を付けるステップ（例えば、標識化）；該ポリペプチド調製物を異なる位置に輸送するステップ又は移動させるステップの一つ１つ又は複数を含む、該ステップ
を含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法。
【請求項８】
前記参照レベルが、
ｉ）約１００ｐｐｍ（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１ｐｐｍ未満）、
ｉｉ）１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間、
ｉｉｉ）少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、若しくは１０００ｐｐｍ、又は
ｉｖ）１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、若しくは１０００ｐｐｍ以下である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記参照レベル未満のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの前記レベルが、公衆衛生局（ＰＨＳ）法の３５１条（ａ）下などの、医薬品の市販向け発売のための仕様であり、任意選択で、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの前記レベルが、１、２、若しくはそれを超えるサンプル又はバッチについて獲得される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ）前記組換えポリペプチドが、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片、又は
ｉｉ）前記組換えポリペプチドが、表１又は２に開示された１つである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えポリペプチドが、抗体、例えば、モノクローナル抗体、例えば、治療抗体である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１２】
ｉ）前記サンプルが、前記組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる、
ｉｉ）前記サンプルが、前記組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる、
ｉｉｉ）前記サンプルが、前記組換えポリペプチドの最終産物から得られる、又は
ｉｖ）前記方法が、前記組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む、請求項６から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出可能な抗体が、
ｉ）直接的に検出可能である、
ｉｉ）蛍光試薬によって増幅される、又は
ｉｉｉ）ビオチン化され、前記検出手段が、アビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１４】
組換えポリペプチド医薬品を製造する方法であって、
ａ）ＧＳ−ＣＨＯ細胞の培養物から組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；
ｂ）前記サンプル中のＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）についての値を獲得するステップ、並びに、
ｃ）任意選択で、例えば、獲得された値を参照値と比較することによって獲得された値を評価するステップ；及び
ｄ）任意選択で、該評価に応じて、分類するステップ、選択するステップ、許容するステップ、放出するステップ、医薬品へと処理するステップ、輸送するステップ、異なる位置に移動するステップ、配合するステップ、標識化するステップ、包装するステップ、商取引に放出するステップ、販売するステップ又は該調製物を販売するため申し出るステップ
を含み、該値が、該サンプルに対するポリクローナルＧＳ−ＣＨＯ抗体の結合の関数である、それに比例する、又はそれによって取得されたものであり、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法。
【請求項１５】
前記値が、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法によって決定された、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞における組換えポリペプチドの製造のプロセスを評価する方法であって、
ａ）組換えポリペプチドの産生、例えば、発現及び分泌に適切な条件下でＧＳ−ＣＨＯ細胞を培養するステップ、
ｂ）分泌された組換えポリペプチドを該宿主細胞から分離して、第一のポリペプチド調製物を準備するステップ；
ｃ）任意選択で、該第一のポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；
ｄ）該第一のポリペプチド調製物を精製ステップに供して第二のポリペプチド調製物を産生するステップ；
ｅ）該第二のポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；
ｆ）任意選択で、該第二のポリペプチド調製物を第二、第三、第四、第五、又は第六の精製ステップに供して続くポリペプチド調製物を準備するステップ；
ｇ）任意選択で、ステップｆ）で準備された、任意の続くポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；
ｈ）取られた該サンプルの各々を、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；
ｉ）該サンプルの各々を該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｊ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｋ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及び
ｌ）該定量に基づいて、該プロセスについての決定を下すステップ
を含み、それにより、組換えポリペプチドの製造のプロセスを評価する方法。
【請求項１７】
組換えポリペプチドの精製のプロセスを評価する方法であって、
ａ）第一のポリペプチド調製物を精製ステップに供して第二のポリペプチド調製物を産生するステップ；
ｂ）該第二のポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；
ｃ）任意選択で、該第二のポリペプチド調製物を第二、第三、第四、第五、又は第六の精製ステップに供して続くポリペプチド調製物を準備するステップ；
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で準備された、任意の続くポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；
ｅ）取られた該サンプルの各々を、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；
ｆ）該サンプルの各々を該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｇ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｈ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及び
ｉ）該定量に基づいて、該プロセスについての決定を下すステップ
を含み、それにより、組換え治療薬の精製のプロセスを評価する方法。
【請求項１８】
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの前記レベルと参照レベルを比較するステップを含み、例えば、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの前記レベルが該参照レベル未満である場合、前記組換えポリペプチドの産生における使用のためのプロセスが検証される、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記参照レベルが、
ｉ）１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間、
ｉｉ）少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、若しくは１０００ｐｐｍ、又は
ｉｉｉ）１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、若しくは１０００ｐｐｍ以下である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記精製ステップが、１つ若しくは複数の又は任意の組合せでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、固定化金属キレートクロマトグラフィー、硫安塩析、チオール基吸着、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記精製ステップが、
ｉ）プロテインＡクロマトグラフィー及び１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップ、
ｉｉ）プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＮＢｒクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー及び続くＣＮＢｒクロマトグラフィー、又は
ｉｉｉ）プロテインＡクロマトグラフィー及びＮＨＳクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー及び続くＮＨＳクロマトグラフィー
を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体；
ｂ）任意選択で、検出可能な抗体；
ｃ）任意選択で、洗浄緩衝剤；及び
ｄ）任意選択で、検出試薬、例えば、捕捉試薬と同じであるか、又は蛍光試薬によって増幅されるように修飾されている点だけを除き捕捉試薬と同じである検出試薬を含み、
任意選択で、検出抗体はビオチン化され、前記検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、キット。
【請求項２３】
ポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体の精製調製物であって、任意選択で、該抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体が、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ウシ、マウス、ハムスター、又はヒト抗体である精製調製物。
【請求項２４】
前記調製物が、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である、例えば、前記調製物が、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する又は前記調製物が、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する、請求項２３に記載の精製調製物。
【請求項２５】
プロテインＡクロマトグラフィー、及び１つ又は複数の親和性クロマトグラフィーステップ（例えば、ＣＮＢｒクロマトグラフィー、ＮＨＳクロマトグラフィー）を含む方法によって精製される、請求項２３に記載の精製調製物。
【請求項２６】
抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体のポリクローナル調製物（例えば、本明細書に記載されるポリクローナル調製物）及び表１又は表２から選択される組換えポリペプチドを含む反応混合物。
【請求項２７】
前記抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体に結合する抗体を含む、請求項２６に記載の反応混合物。
【請求項２８】
組換えポリペプチド医薬品のバッチ又はロットが、発売仕様を満足する又は満たすかどうかを決定する方法であって、該発売仕様が、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの事前に選択した参照レベルであり、
ａ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；
ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；
ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｅ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及び
ｆ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが該発売仕様を満足する、満たす、又は未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップであって、任意選択で、処理するステップは、分類するステップ、選択するステップ、許容するステップ、放出するステップ、医薬品へと処理するステップ、輸送するステップ、異なる位置に移動するステップ、配合するステップ、標識化するステップ、包装するステップ、商取引に放出するステップ、販売するステップ又は該調製物を販売するため申し出るステップを含む、該ステップ
を含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品のバッチ又はロットが、発売仕様を満足する又は満たすかどうかを決定する方法。
【請求項２９】
前記値が、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法によって決定された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を作製する方法であって、該方法は、
ａ）宿主細胞（例えば、細胞系、例えば、哺乳動物、げっ歯類、若しくは昆虫細胞又は細胞系、例えば、ＣＨＯ、ＳＰ２、ＮＳＯ宿主細胞）のＨＣＰで免疫化した動物（例えば、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、など）から、抗体、例えば、抗血清を含むサンプルを獲得するステップ；及び
ｂ）例えば、該サンプルをＨＣＰ親和性試薬、例えば、プロテインＡと接触させることによって、該サンプルから抗ＨＣＰ抗体を分離するステップ
を含み；及び
任意選択で、ｂ）は、
ｂ．１）該サンプルから抗体、例えば、ＩｇＧ抗体を分離して、抗体調製物を準備するステップ；及び
ｂ．２）例えば、該抗体調製物をＨＣＰ親和性試薬と接触させることによって、該抗体調製物から抗ＨＣＰ抗体を分離するステップ
を含み、それにより、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を産生する方法。
【請求項３１】
抗体を分離するステップが、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体を、前記抗血清からプロテインＡクロマトグラフィーを含む精製方法により精製するステップを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＣＰ親和性試薬が、基質、例えば、不溶性又は固体基質、例えば、アガロースビーズ、例えば、Ｓｅｐｈａｒａｓｅ、例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）クロマトグラフィー）誘導体化基質と連結したＨＣＰを含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
組換えポリペプチド調製物中のＨＣＰを検出するＥＬＩＳＡにおける使用のための、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を産生する方法であって、
ａ）宿主細胞（例えば、細胞系、例えば、哺乳動物、げっ歯類、若しくは昆虫細胞又は細胞系、例えば、ＣＨＯ、ＳＰ２、ＮＳＯ宿主細胞）のＨＣＰで免疫化した動物（例えば、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、など）から、抗体、例えば、抗血清を含むサンプルを獲得するステップ；
ｂ）該抗血清をプロテインＡ親和性試薬と接触させることによって、該抗血清から抗体を分離して、抗体調製物を準備するステップ；
ｃ）該抗体調製物をＨＣＰ親和性試薬と接触させることによって、該抗体調製物から抗ＨＣＰ抗体を分離するステップ
を含み、それにより、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を産生する方法。
【請求項３４】
前記精製が、
ｉ）少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ、例えば、少なくとも９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ、又は
ｉｉ）５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ、例えば、９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ
を除去する、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリクローナル抗体調製物が、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である、例えば、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する又は５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリクローナル抗体が、請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の方法によって作製される、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の方法によって産生される、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物。
【請求項３８】
請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の方法によって産生される、精製ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物。
【請求項３９】
組換えポリペプチドを含むサンプル中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、ＣＨＯ  ＨＣＰ）の検出、モニタリング、同定、又は定量の方法であって、
ａ）組換えポリペプチドを含むサンプルを準備又は取得するステップ；
ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＨＣＰ抗体（例えば、抗ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体）と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＨＣＰ複合体を形成させるステップであって、該ポリクローナル抗体が、請求項２８から３５までのいずれか一項に記載の方法によって産生されている、該ステップ；
ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＨＣＰ複合体から分離するステップ；
ｄ）該固定化された抗体−ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；
ｅ）該抗体に結合したＨＣＰの存在を該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して検出するステップ；及び
ｆ）任意選択で、検出されたＨＣＰのレベルを定量するステップ；
ｇ）任意選択で、１つ又は複数の検出されたＨＣＰを同定するステップ；及び
ｈ）任意選択で、１つ又は複数の同定されたＨＣＰを定量するステップ
を含む方法。
【請求項４０】
前記ポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体が、請求項３０から３５までのいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１６年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３２２，６２１号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照することによってその全体が本明細書に組込まれる。
（発明の分野）
本開示は、産物、例えば、組換えタンパク質、例えば、抗体の産生の間の宿主細胞タンパク質不純物を検出する及び／又は定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、さまざまな製造プロセス後の最終産物中に存在し得る、宿主タンパク質の望まれない複合体混合物である。それらのＨＣＰは、特に、製品の有効性及び患者の安全性に対するリスクを提示し得る。したがって、最終的な生物薬剤製品中のＨＣＰを検出する及び定量するための方法について必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、特に、ＨＣＰの検出のための非常に高感度な方法を提供する。一態様では、組換えポリペプチドを含むサンプル中のＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の検出、モニタリング、同定、又は定量の方法であって、ａ）組換えポリペプチドを含むサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｅ）該抗体に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの存在を該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して検出するステップ；並びにｆ）任意選択で、検出されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを定量するステップ；ｇ）任意選択で、１つ又は複数の検出されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを同定するステップ；及びｈ）任意選択で、１つ又は複数の同定されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを定量するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【０００４】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、治療ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表１に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表２に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、治療抗体である。
【０００５】
いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる。いくつかの実施形態では、方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、直接的に検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、蛍光試薬（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔ）によって増幅される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【０００６】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法であって、ａ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｅ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｆ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが事前に選択した参照レベル未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、処理するステップは、ポリペプチド調製物を配合するステップ；該ポリペプチド調製物を医薬品に処理するステップ；該ポリペプチド調製物を第二成分、例えば、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップ；該調製物中の該ポリペプチドの濃度を変化させるステップ；該ポリペプチド調製物を凍結乾燥させるステップ；該ポリペプチドの第一及び第二のアリコートを組み合わせて、第三の、より大きい、アリコートを準備するステップ；該ポリペプチド調製物をより小さいアリコートに分けるステップ；該ポリペプチド調製物を容器、例えば、気密性又は液密性容器に配置するステップ；該ポリペプチド調製物を包装するステップ；該ポリペプチド調製物を含む容器に標識を付けるステップ（例えば、標識化）；該ポリペプチド調製物を異なる位置に輸送するステップ又は移動させるステップの１つ又は複数を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、処理するステップは、ポリペプチド調製物を賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップを含む。いくつかの実施形態では、参照レベルは、約１００ｐｐｍ（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１ｐｐｍ未満）である。いくつかの実施形態では、参照レベルは、１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間である。いくつかの実施形態では、参照レベルは、少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍである。いくつかの実施形態では、参照レベルは、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、参照レベル未満のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルは、医薬品の市販向け発売のための仕様である。いくつかの実施形態では、参照レベル未満のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルは、公衆衛生局（ＰＨＳ）法の３５１条（ａ）下の医薬品の市販向け発売のための仕様である。いくつかの実施形態では、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルは、１、２、若しくはそれを超えるサンプル又はバッチについて獲得される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、治療ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表１に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表２に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、治療抗体である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる。いくつかの実施形態では、方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、直接的に検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、蛍光試薬によって増幅される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００１１】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法であって、ａ）組換えポリペプチドの産生、例えば、発現及び分泌に適切な条件下でＧＳ−ＣＨＯ細胞を培養するステップ、ｂ）分泌された組換えポリペプチドを宿主細胞から分離するステップ；ｃ）分泌された組換えポリペプチドを１つ又は複数の精製ステップに供して組換えポリペプチド調製物を産生するステップ；ｄ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｅ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｆ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｇ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｈ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが事前に選択した参照レベル未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、処理するステップは、ポリペプチド調製物を配合するステップ；該ポリペプチド調製物を医薬品に処理するステップ；該ポリペプチド調製物を第二成分、例えば、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップ；該調製物中の該ポリペプチドの濃度を変化させるステップ；該ポリペプチド調製物を凍結乾燥させるステップ；該ポリペプチドの第一及び第二のアリコートを組み合わせて、第三の、より大きい、アリコートを準備するステップ；該ポリペプチド調製物をより小さいアリコートに分けるステップ；該ポリペプチド調製物を容器、例えば、気密性又は液密性容器に配置するステップ；該ポリペプチド調製物を包装するステップ；該ポリペプチド調製物を含む容器に標識を付けるステップ（例えば、標識化）；該ポリペプチド調製物を異なる位置に輸送するステップ又は移動させるステップの１つ又は複数を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、処理するステップは、ポリペプチド調製物を賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップを含む。いくつかの実施形態では、参照レベルは、約１００ｐｐｍ（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１ｐｐｍ未満）である。いくつかの実施形態では、参照レベルは、１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間である。いくつかの実施形態では、参照レベルは、少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍである。いくつかの実施形態では、参照レベルは、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍ以下である。いくつかの実施形態では、参照レベル未満のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルは、医薬品の市販向け発売のための仕様である。いくつかの実施形態では、参照レベル未満のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルは、公衆衛生局（ＰＨＳ）法の３５１条（ａ）下の医薬品の市販向け発売のための仕様である。いくつかの実施形態では、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＳＰのレベルは、１、２、若しくはそれを超えるサンプル又はバッチについて獲得される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、治療ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表１に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表２に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、治療抗体である。
いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる。いくつかの実施形態では、方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、直接的に検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、蛍光試薬によって増幅される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００１５】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法であって、ａ）ＧＳ−ＣＨＯ細胞の培養物から組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプル中のＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）についての値を獲得するステップであって、該値は、該サンプルに対するポリクローナルＧＳ−ＣＨＯ抗体の結合の関数である、それに比例する、又はそれによって取得されたものである該ステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、獲得された値を参照値と比較することによって獲得された値を評価するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、評価に応じて、分類するステップ、選択するステップ、許容するステップ、放出するステップ、医薬品へと処理するステップ、輸送するステップ、異なる位置に移動するステップ、配合するステップ、標識化するステップ、包装するステップ、商取引に放出するステップ、販売するステップ又は調製物を販売するため申し出るステップを含む。いくつかの実施形態では、値は、本明細書に記載される方法によって決定された。
【００１６】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、治療ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表１に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表２に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、治療抗体である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる。いくつかの実施形態では、方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、直接的に検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、蛍光試薬によって増幅される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００１８】
一態様では、本開示は、ＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞における組換えポリペプチドの製造のプロセスを評価する方法であって、ａ）組換えポリペプチドの産生、例えば、発現及び分泌に適切な条件下でＧＳ−ＣＨＯ細胞を培養するステップ、ｂ）分泌された組換えポリペプチドを宿主細胞から分離して、第一のポリペプチド調製物を準備するステップ；ｃ）任意選択で、該第一のポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｄ）該第一のポリペプチド調製物を精製ステップに供して第二のポリペプチド調製物を産生するステップ；ｅ）該第二のポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｆ）任意選択で、該第二のポリペプチド調製物を第二、第三、第四、第五、又は第六の精製ステップに供して続くポリペプチド調製物を準備するステップ；ｇ）任意選択で、ステップｆ）で準備された、任意の続くポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｈ）取られた該サンプルの各々を、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｉ）該サンプルの各々を該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｊ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｋ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｌ）該定量に基づいて、該プロセスについての決定を下すステップを含み、それにより、組換えポリペプチドの製造のプロセスを評価する方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、方法は、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルと参照レベルを比較するステップを含み、例えば、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルが、組換えポリペプチドの産生における使用のためにプロセスを検証する該参照レベル未満であるかを比較する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、参照レベルは、ｉ）１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間、ｉｉ）少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍ、又はｉｉｉ）１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍ以下である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、治療ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表１に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表２に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、治療抗体である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる。いくつかの実施形態では、方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、直接的に検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、蛍光試薬によって増幅される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００２３】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチドの精製のプロセスを評価する方法であって、ａ）第一のポリペプチド調製物を精製ステップに供して第二のポリペプチド調製物を産生するステップ；ｂ）該第二のポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｃ）任意選択で、該第二のポリペプチド調製物を第二、第三、第四、第五、又は第六の精製ステップに供して続くポリペプチド調製物を準備するステップ；ｄ）任意選択で、ステップｃ）で準備された、任意の続くポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｅ）取られた該サンプルの各々を、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｆ）該サンプルの各々を該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｇ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｈ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｉ）該定量に基づいて、該プロセスについての決定を下すステップを含み、それにより、組換え治療薬の精製のプロセスを評価する方法を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法は、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルと参照レベルを比較するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルが参照レベル未満である場合、組換えポリペプチドの産生における使用のためのプロセスが検証される。いくつかの実施形態では、参照レベルは、１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間である。いくつかの実施形態では、参照レベルは、少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍである。いくつかの実施形態では、参照レベルは、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、又は１０００ｐｐｍ以下である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、精製ステップは、１つ若しくは複数の又は任意の組合せでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、固定化金属キレートクロマトグラフィー、硫安塩析、チオール基吸着（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、及び親和性クロマトグラフィーを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、精製ステップは、１つ若しくは複数のアフィニティークロマトグラフィーステップを含む。いくつかの実施形態では、精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィー及び１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップを含む。いくつかの実施形態では、精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＮＢｒクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィー及び続くＣＮＢｒクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィー及びＮＨＳクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、精製ステップは、プロテインＡクロマトグラフィー及び続くＮＨＳクロマトグラフィーを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、精製ステップは、ｉ）プロテインＡクロマトグラフィー及び１つ又は複数のアフィニティークロマトグラフィーステップ、ｉｉ）プロテインＡクロマトグラフィー及びＣＮＢｒクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー及び続くＣＮＢｒクロマトグラフィー、又はｉｉｉ）プロテインＡクロマトグラフィー及びＮＨＳクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー及び続くＮＨＳクロマトグラフィーを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、治療ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表１に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、表２に開示されるものである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、治療抗体である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる。いくつかの実施形態では、方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、直接的に検出可能である。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、蛍光試薬によって増幅される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００３０】
一態様では、ａ）固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体；ｂ）任意選択で、検出可能な抗体；ｃ）任意選択で、洗浄緩衝剤；及びｄ）任意選択で、検出試薬を含むキットが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、検出試薬は、捕捉試薬と同じである。いくつかの実施形態では、検出試薬は、蛍光試薬によって増幅されるように修飾されている点だけを除き捕捉試薬と同じである。いくつかの実施形態では、検出抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００３１】
一態様では、ポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体の精製調製物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体は、ヒツジ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体は、ヤギ、ウマ、ウサギ、ウシ、マウス、ハムスター、又はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、調製物は、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である。いくつかの実施形態では、調製物は、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。いくつかの実施形態では、調製物は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。いくつかの実施形態では、精製方法は、プロテインＡクロマトグラフィー、及び１つ又は複数の親和性クロマトグラフィーステップ（例えば、ＣＮＢｒクロマトグラフィー、ＮＨＳクロマトグラフィー）を含む。
【００３２】
一態様では、抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体のポリクローナル調製物（例えば、本明細書に記載されるポリクローナル調製物）及び表１又は表２から選択される組換えポリペプチドを含む反応混合物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、反応混合物は、抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体に結合する抗体を含む。
【００３３】
一態様では、組換えポリペプチド医薬品のバッチ又はロットは、発売仕様を満足する又は満たすかどうかを決定する方法であって、該発売仕様は、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの事前に選択した参照レベルであり、ａ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｅ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｆ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが該発売仕様を満足する、満たす、又は未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品のバッチ又はロットが、発売仕様を満足する又は満たすかどうかを決定する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、処理するステップは、分類するステップ、選択するステップ、許容するステップ、放出するステップ、医薬品へと処理するステップ、輸送するステップ、異なる位置に移動するステップ、配合するステップ、標識化するステップ、包装するステップ、商取引に放出するステップ、販売するステップ又は調製物を販売するため申し出るステップを含む。いくつかの実施形態では、値は、本明細書に記載される方法によって決定された。
【００３４】
一態様では、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を作製する方法であって、ａ）宿主細胞（例えば、細胞系、例えば、哺乳動物、げっ歯類、若しくは昆虫細胞又は細胞系、例えば、ＣＨＯ、ＳＰ２、ＮＳＯ宿主細胞）のＨＣＰで免疫化した動物（例えば、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、など）から、抗体、例えば、抗血清を含むサンプルを獲得するステップ；及びｂ）例えば、該サンプルをＨＣＰ親和性試薬と接触させることによって、該サンプルから抗ＨＣＰ抗体を分離するステップを含み、それにより、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を産生する方法が、本明細書に開示される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ステップｂ）は、ｂ．１）サンプルから抗体、例えば、ＩｇＧ抗体を分離して、抗体調製物を準備するステップ；及びｂ．２）該抗体調製物から抗ＨＣＰ抗体を分離するステップを含む。いくつかの実施形態では、抗体を分離するステップは、抗体を、親和性試薬、例えば、プロテインＡと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、抗体を分離するステップは、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体を、抗血清からプロテインＡクロマトグラフィーを含む精製方法により精製するステップを含む。いくつかの実施形態では、抗体調製物から抗ＨＣＰ抗体を分離するステップは、該抗体調製物をＨＣＰ親和性試薬と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＰ親和性試薬は、基質、例えば、不溶性又は固体基質、例えば、アガロースビーズ、例えば、Ｓｅｐｈａｒａｓｅ、例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）クロマトグラフィー）誘導体化基質と連結したＨＣＰを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、精製は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、少なくとも９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。
【００３７】
一態様では、組換えポリペプチド調製物中のＨＣＰを検出するＥＬＩＳＡにおける使用のための、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を作製する方法であって、ａ）宿主細胞（例えば、細胞系、例えば、哺乳動物、げっ歯類、若しくは昆虫細胞又は細胞系、例えば、ＣＨＯ、ＳＰ２、ＮＳＯ宿主細胞）のＨＣＰで免疫化した動物（例えば、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、など）から、抗体、例えば、抗血清を含むサンプルを獲得するステップ；ｂ）該抗血清をプロテインＡ親和性試薬と接触させることによって、該抗血清から抗体を分離して、抗体調製物を準備するステップ；ｃ）該抗体調製物をＨＣＰ親和性試薬と接触させることによって、該抗体調製物から抗ＨＣＰ抗体を分離するステップを含み、それにより、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を産生する方法が本明細書に開示される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、精製は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、少なくとも９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、精製は、９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。
【００３９】
一態様では、組換えポリペプチドを含むサンプル中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、ＣＨＯ  ＨＣＰ）の検出、モニタリング、同定、又は定量の方法であって、ａ）組換えポリペプチドを含むサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＨＣＰ抗体（例えば、抗ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体）と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＨＣＰ複合体を形成させるステップであって、該ポリクローナル抗体が、本明細書に記載される任意の方法によって産生されている、該ステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｅ）該抗体に結合したＨＣＰの存在を該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して検出するステップ；及びｆ）任意選択で、検出されたＨＣＰのレベルを定量するステップ；ｇ）任意選択で、１つ又は複数の検出されたＨＣＰを同定するステップ；及びｈ）任意選択で、１つ又は複数の同定されたＨＣＰを定量するステップを含む方法が本明細書に開示される。
【００４０】
一態様では、組換えポリペプチド、例えば、治療ポリペプチドを含むサンプル中のＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の検出、モニタリング、同定、又は定量の方法であって、ａ）組換えポリペプチドを含むサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、支持体、例えば、不溶性又は固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体とインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な試薬、例えば、抗体と接触させるステップ；ｅ）該抗体に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの存在を該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して検出するステップ；並びにｆ）任意選択で、検出されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを定量するステップ；ｇ）任意選択で、１つ又は複数の検出されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを同定するステップ；及びｈ）任意選択で、１つ又は複数の同定されたＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを定量するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｉ）組換えポリペプチドは、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である、又はｉｉ）組換えポリペプチドは、表１又は２に開示された１つである。
【００４２】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体、例えば、モノクローナル抗体、例えば、治療抗体である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ｉ）サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる、ｉｉ）サンプルは、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる、ｉｉｉ）サンプルは、組換えポリペプチドの最終産物から得られる、又はｉｖ）方法は、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、ｉ）直接的に検出可能である、ｉｉ）蛍光試薬によって増幅される、又はｉｉｉ）ビオチン化され、検出手段は、アビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００４５】
一態様では、組換えポリペプチド、例えば、治療ポリペプチド、医薬品の製造方法であって、ａ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｅ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｆ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが事前に選択した参照レベル未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップであって、任意選択で、処理するステップは、該ポリペプチド調製物を配合するステップ；該ポリペプチド調製物を医薬品に処理するステップ；該ポリペプチド調製物を第二成分、例えば、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップ；該調製物中の該ポリペプチドの濃度を変化させるステップ；該ポリペプチド調製物を凍結乾燥させるステップ；該ポリペプチドの第一及び第二のアリコートを組み合わせて、第三の、より大きい、アリコートを準備するステップ；該ポリペプチド調製物をより小さいアリコートに分けるステップ；該ポリペプチド調製物を容器、例えば、気密性又は液密性容器に配置するステップ；該ポリペプチド調製物を包装するステップ；該ポリペプチド調製物を含む容器に標識を付けるステップ（例えば、標識化）；該ポリペプチド調製物を異なる位置に輸送するステップ又は移動させるステップの１つ又は複数を含む、該ステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法が本明細書に開示される。
【００４６】
一態様では、組換えポリペプチド、例えば、治療ポリペプチド、医薬品を製造する方法であって、ａ）組換えポリペプチドの産生、例えば、発現及び分泌に適切な条件下でＧＳ−ＣＨＯ細胞を培養するステップ、ｂ）分泌された組換えポリペプチドを宿主細胞から分離するステップ；ｃ）分泌された組換えポリペプチドを１つ又は複数の精製ステップに供して組換えポリペプチド調製物を産生するステップ；ｄ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを採取するステップ；ｅ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｆ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｇ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｈ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが事前に選択した参照レベル未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップであって、任意選択で、該処理するステップは、該ポリペプチド調製物を配合するステップ；該ポリペプチド調製物を医薬品に処理するステップ；該ポリペプチド調製物を第二成分、例えば、賦形剤又は緩衝剤と組み合わせるステップ；該調製物中の該ポリペプチドの濃度を変化させるステップ；該ポリペプチド調製物を凍結乾燥させるステップ；該ポリペプチドの第一及び第二のアリコートを組み合わせて、第三の、より大きい、アリコートを準備するステップ；該ポリペプチド調製物をより小さいアリコートに分けるステップ；該ポリペプチド調製物を容器、例えば、気密性又は液密性容器に配置するステップ；該ポリペプチド調製物を包装するステップ；該ポリペプチド調製物を含む容器に標識を付けるステップ（例えば、標識化）；該ポリペプチド調製物を異なる位置に輸送するステップ又は移動させるステップの１つ又は複数を含む、該ステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法が本明細書に開示される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、参照レベルは、ｉ）約１００ｐｐｍ（例えば、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、１ｐｐｍ未満）、ｉｉ）１ｐｐｍから１０００ｐｐｍの間、ｉｉｉ）少なくとも１ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、若しくは１０００ｐｐｍ、又はｉｖ）１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｐｍ、２０ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、若しくは１０００ｐｐｍ以下である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、参照レベル未満のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルが、例えば、公衆衛生局（ＰＨＳ）法の３５１条（ａ）下の、医薬品の市販向け発売のための仕様であり、及び任意選択で、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが、１、２、若しくはそれを超えるサンプル又はバッチについて獲得される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ｉ）組換えポリペプチドが、ホモポリマー又はヘテロポリマーポリペプチド、例えば、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子又は酵素、好ましくは、抗体又は抗体断片、例えば、ヒト抗体又はヒト化抗体又はその断片、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ抗体から由来し、典型的にはウサギ起源のヒト化抗体又はその断片である、又はｉｉ）該組換えポリペプチドが、表１又は２に開示された１つである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体、例えば、モノクローナル抗体、例えば、治療抗体である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ｉ）サンプルが、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける下流の処理ステップから得られる、ｉｉ）サンプルが、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける上流の処理ステップから得られる、ｉｉｉ）サンプルが、組換えポリペプチドの最終産物から得られる、又はｉｖ）方法が、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける１つ又は複数のステップから得られる、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超えるサンプルを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は、ｉ）直接的に検出可能である、ｉｉ）蛍光試薬によって増幅される、又はｉｉｉ）ビオチン化され、検出手段が、アビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである。
【００５３】
一態様では、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法であって、ａ）ＧＳ−ＣＨＯ細胞の培養物から組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプル中のＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）についての値を獲得するステップ、及び、ｃ）任意選択で、例えば、獲得された値を参照値と比較することによって獲得された値を評価するステップ；及びｄ）任意選択で、評価に応じて、分類するステップ、選択するステップ、許容するステップ、放出するステップ、医薬品へと処理するステップ、輸送するステップ、異なる位置に移動するステップ、配合するステップ、標識化するステップ、包装するステップ、商取引に放出するステップ、販売するステップ又は該調製物を販売するため申し出るステップを含み、該値は、該サンプルに対するポリクローナルＧＳ−ＣＨＯ抗体の結合の関数である、それに比例する、又はそれによって取得されたものであり、それにより、組換えポリペプチド医薬品を製造する方法が本明細書に開示される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、値は、本明細書に記載される何れかの方法によって決定された。
【００５５】
一態様では、ａ）固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体；ｂ）任意選択で、検出可能な抗体；ｃ）任意選択で、洗浄緩衝剤；及びｄ）任意選択で、検出試薬、例えば、捕捉試薬と同じであるか、又は蛍光試薬によって増幅されるように修飾されている点だけを除き捕捉試薬と同じである検出試薬を含み、任意選択で、検出可能な抗体はビオチン化され、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンである、キットが本明細書に開示される。
【００５６】
一態様では、ポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体の精製調製物であって、任意選択で、該抗ＧＳ−ＣＨＯ抗体が、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ウシ、マウス、ハムスター、又はヒト抗体である精製調製物が本明細書に開示される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、調製物は、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である、例えば、調製物は、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する又は調製物は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。
【００５８】
一態様では、組換えポリペプチド医薬品のバッチ又はロットが、発売仕様を満足する又は満たすかどうかを決定する方法であって、該発売仕様が、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの事前に選択した参照レベルであり、ａ）組換えポリペプチド調製物のサンプルを準備又は取得するステップ；ｂ）該サンプルを、固体支持体に固定化されたポリクローナル抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体と接触させインキュベートして、固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体を形成させるステップ；ｃ）該サンプルを該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体から分離するステップ；ｄ）該固定化された抗体−ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ複合体をＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに結合する検出可能な抗体と接触させるステップ；ｅ）捕捉試薬に結合したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰのレベルを該検出可能な抗体に対する検出手段を使用して定量するステップ；及びｆ）ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの該レベルが該発売仕様を満足する、満たす、又は未満である場合、該調製物の少なくとも一部を医薬品として処理するステップであって、任意選択で、処理するステップは、分類するステップ、選択するステップ、許容するステップ、放出するステップ、医薬品へと処理するステップ、輸送するステップ、異なる位置に移動するステップ、配合するステップ、標識化するステップ、包装するステップ、商取引に放出するステップ、販売するステップ又は該調製物を販売するため申し出るステップを含む、該ステップを含み、それにより、組換えポリペプチド医薬品のバッチ又はロットが、発売仕様を満足する又は満たすかどうかを決定する方法が本明細書に開示される。
【００５９】
一態様では、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を作製する方法であって、該方法は、ａ）宿主細胞（例えば、細胞系、例えば、哺乳動物、げっ歯類、若しくは昆虫細胞又は細胞系、例えば、ＣＨＯ、ＳＰ２、ＮＳＯ宿主細胞）のＨＣＰで免疫化した動物（例えば、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、など）から、抗体、例えば、抗血清を含むサンプルを獲得するステップ；及びｂ）例えば、該サンプルをＨＣＰ親和性試薬、例えば、プロテインＡと接触させることによって、該サンプルから抗ＨＣＰ抗体を分離するステップを含み；及び任意選択で、ｂ）は、ｂ．１）該サンプルから抗体、例えば、ＩｇＧ抗体を分離して、抗体調製物を準備するステップ；及びｂ．２）例えば、該抗体調製物をＨＣＰ親和性試薬と接触させることによって、該抗体調製物から抗ＨＣＰ抗体を分離するステップを含み、それにより、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体調製物を産生する方法が本明細書に開示される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、精製は、ｉ）少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ、例えば、少なくとも９９％の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ、又はｉｉ）５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ、例えば、９９％を超える非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを除去する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ポリクローナル抗体調製物は、実質的に非ＨＣＰ特異的ＩｇＧ非含有である、例えば、０．５％、１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する又は５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満の非ＨＣＰ特異的ＩｇＧを含有する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ヒツジＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体のための例示的な精製プロセスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
ヒト患者に対する投与のため許容される組換え生物薬剤タンパク質に関して、製造及び精製プロセスからもたらされる残留夾雑物が最終的な生物学的産物から除去されることが重要である。これらのプロセス夾雑物には、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、エンドトキシン、ＤＮＡ、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が含まれる。ＨＣＰにより、免疫応答、アジュバント活性、直接的な生物活性又は産物相互作用／分解を含む、産物の安全性プロファイルに影響を及ぼし得る、ある範囲の望ましくない影響が生成され得る。これらの宿主細胞夾雑物には、組換えＤＮＡテクノロジーから由来する生物製剤中のプロセス関連の不純物／夾雑物である、プロセス特異的なＨＣＰが含まれる。
【００６４】
米国及び外国の規制では、そのような夾雑物の除去が要求されることが多い。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、インビボでのヒト使用を意図する生物製剤が、外来性免疫グロブリン及び非免疫グロブリン夾雑物をできる限り非含有であるべきことを要求しており、また潜在的な夾雑物、例えば、ＨＣＰの検出及び定量化のための試験を要求している。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）は、生物工学的／生物学的製品についての試験手順及び受諾判定基準におけるガイドラインを提供している。ガイドラインは、ＨＣＰについて広範囲のタンパク質不純物を検出することが可能な感度の高いイムノアッセイが利用されることを示唆している。免疫グロブリン、ＤＮＡ、エンドドキシン、ウイルスなどを検出するため利用可能な市販のアッセイ及び試薬が存在するにもかかわらず、細胞系特異的なＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの検出及び定量のため利用可能な市販の試薬又は分析方法は現在存在しない。
【００６５】
本開示は、特に、哺乳動物発現系、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ発現系を含む、複数の発現系を支持する、頑健で、感度の高いＨＣＰ  ＥＬＩＳＡプラットホームアッセイ及び使用方法を提供する。ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ方法の質は、主に２つのパラメータ（１）定量化限界（ＬＯＱ）、及び（２）夾雑物として存在する可能性があるＨＣＰのパーセンテージ範囲によって規定される。現在、利用可能なＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、ＬＯＱについて２００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ及びスポット計数による範囲について４０％〜６０％を提供する。本明細書に記載されるＥＬＩＳＡは、２ｎｇ／ｍｇのＬＯＱ及びスポットマッチング（これは、スポット計数よりも良好なアプローチである）による７１％範囲を提供し、これらのパラメータの両方を満たす。プラットホームアッセイは、安定な細胞系及びプロセス（例えば、ＧＳ−ＣＨＯ）からの異なる産物中のＨＣＰ検出を支持することができる。
【００６６】
定義
別途規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は均等な任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい材料及び方法は、本明細書に記載される。本発明の記載及び請求項において、以下の用語は、ある規定が提供される場合、どのように用語が規定されるかに応じて使用される。
【００６７】
本明細書に使用される用語は特定の実施態様を記載する目的のためだけに使用され、限定されることを意図するものではないことも理解される。
【００６８】
文字「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、文字の１つ又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）の文法上の対象を指すため、本明細書に使用される。例示として、「１つの細胞」は、１つの細胞又は１つを超える細胞を意味し得る。
【００６９】
本明細書で使用するように、用語「宿主細胞タンパク質」又は「ＨＣＰ」は、組換えポリペプチド産物を産生するため使用される生物によって産生される又はコードされる及び意図する組換え産物と無関係の任意のタンパク質を指す。ＨＣＰは、最終的な原薬において望ましくない。
【００７０】
本明細書で使用するように、用語「ＧＳ−ＣＨＯ」は、組換えグルタチオン合成酵素（ＧＳ）を発現する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を指す。例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ  ＧＳ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。
【００７１】
本明細書で使用するように、用語「ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ」は、ＧＳ−ＣＨＯ細胞から由来する宿主細胞タンパク質を指す。
【００７２】
本明細書で使用するように、用語「内因性」は、生物、細胞、組織若しくは系からの又は内部で天然で産生される任意の物質を指す。
【００７３】
本明細書で使用するように、用語「外来性」は、生物、細胞、組織若しくは系に導入される又は外部で産生される任意の物質を指す。したがって「外来性核酸」は、生物、細胞、組織若しくは系に導入される又は外部で産生される核酸を指す。一実施形態では、外来性核酸の配列は、外来性核酸が導入される、生物、細胞、組織若しくは系の内部で、天然で産生されない、又は天然で見出すことができない。一実施形態では、外来性核酸の配列は、非天然で生じる配列である、又は非天然で生じる産物をコードする。
【００７４】
本明細書で使用するように、用語「異種性」は、異なる種からの生物、細胞、組織若しくは系に導入される場合、１つの種からの任意の物質を指す。
【００７５】
本明細書で使用するように、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、交換可能に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）、又はＤＮＡ若しくはそのＲＮＡ、及びそのポリマーの単一若しくは二本鎖形態のいずれかの組合せを指す。用語「核酸」には、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡが含まれるが、限定されない。一実施形態では、核酸分子は、合成（例えば、化学的な合成又は人工）又は組換えである。特に限定されない限り、用語は、参照核酸として類似の結合特性を有する及び天然で又は非天然で生じるヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの類似体又は誘導体を含有する分子を包含する。別途示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的な配列並びに明示的に示される配列を暗示的に包含する。特に、縮重コドン置換は、第三の位置の１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンが、混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された、配列を生成させることによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１  （１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５〜２６０８ページ（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８ページ（１９９４））。
【００７６】
本明細書で使用するように、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって又はペプチド結合以外の手段によって共有結合的に連結されるアミノ酸残基を含む化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならない、タンパク質の又はペプチドの配列に含まれ得るアミノの最大数に限界は設定されない。一実施形態では、タンパク質は、１つを超える、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超える、ポリペプチドを含み得、各ポリペプチドは、共有結合性の又は非共有結合性の結合／相互作用のいずれかによって他と関連する。ポリペプチドには、ペプチド結合によって又はペプチド結合以外の手段によって互いに結合される２つ又はそれを超えるアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で使用するように、用語は、短鎖（これは、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーなどとも当技術分野において一般に呼ばれる）及び長鎖（これは、多くのタイプが存在するタンパク質と当技術分野において一般に呼ばれる）の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同的なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質がとりわけ含まれる。
【００７７】
本明細書で使用するように、「産物」は、産物を産生させるため修飾又は操作されている細胞によって産生される（例えば、発現される）、分子、核酸、ポリペプチド、又は任意のそのハイブリッドを指す。一実施形態では、産物は、天然で生じる産物又は非天然で生じる産物、例えば、合成製品である。一実施形態では、産物の一部は、天然で生じるが、産物の別の部分は、非天然で生じる。一実施形態では、産物は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドである。一実施形態では、産物は、診断上の又は前臨床使用のため適切である。別の実施形態では、産物は、治療使用のため、例えば、疾患の処置のため適切である。一実施形態では、産物は、表１又は表２から選択される。一実施形態では、修飾された又は操作された細胞は、発現を制御する又は産物をコードする外来性核酸を含む。他の実施形態では、修飾された又は操作された細胞は、例えば、核酸ではなく、細胞における産物の発現又は構築を制御する、他の分子を含む。
【００７８】
一実施形態では、細胞の修飾は、内因性核酸配列、例えば、内因性遺伝子の発現を制御する又は変更する、例えば、増加させる、核酸配列を含む外来性核酸の導入を含む。そのような実施形態では、修飾された細胞は、細胞によって天然で又は内因性に発現される内因性ポリペプチド産物を産生するが、修飾は、未修飾細胞と比較して、例えば、内因性産物又はポリペプチドの質と比較して、産物の産生及び／又は産物の質を増加させる。
【００７９】
別の実施形態では、細胞の修飾は、本明細書に記載されるような、組換えポリペプチドをコードする外来性核酸の導入を含む。そのような実施形態では、修飾された細胞は、天然で生じ得る又は非天然で生じ得る組換えポリペプチド産物を産生する。そのような実施形態では、修飾された細胞は、細胞によって内因性にも発現され得る又はされ得ない、組換えポリペプチド産物を産生する。組換えポリペプチド産物が細胞によって内因性にも発現される実施形態では、修飾は、未修飾細胞と比較して、例えば、内因性産物又はポリペプチドの質と比較して、産物の産生及び／又は産物の質を増加させる。
【００８０】
本明細書で使用するように、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、本明細書に記載される細胞によって産生され得るポリペプチドを指す。組換えポリペプチドは、ポリペプチドをコードする配列の少なくとも１つのヌクレオチド又はポリペプチドの発現を制御する配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、（細胞の又は前駆細胞の）遺伝的な操作によって形成されたものである。例えば、少なくとも１つのヌクレオチドは、変更され、例えば、それは細胞に導入され又はそれは遺伝的に操作された再構成の産物である。一実施形態では、組換えポリペプチドの配列は、ポリペプチド又はタンパク質の天然で生じるアイソフォームと異なっていない。一実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド又はタンパク質の天然で生じるアイソフォームの配列と異なる。一実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は、同じ種からのものである。一実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞に対して内因性であり、換言すれば、細胞は、第一の種からのものであり、組換えポリペプチドは、その第一の種に対してネイティブである。一実施形態では、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、細胞の内因性ゲノムによってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に同じ、又は１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以下で異なる。一実施形態では、組換えポリペプチド及び細胞は、異なる種からのものであり、例えば、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチドであり、細胞は、非ヒト、例えば、げっ歯類、例えば、ＣＨＯ、又は昆虫細胞である。一実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞に対して外来性であり、換言すれば、細胞は、第一の種からのものであり、組換えポリペプチドは、第二の種からのものである。一実施形態では、ポリペプチドは、合成ポリペプチドである。一実施形態では、ポリペプチドは、非天然で生じる供給源から由来する。一実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチド又はタンパク質の天然で生じるアイソフォームとアミノ酸配列において異ならない、ヒトポリペプチド又はタンパク質である。一実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチド又はタンパク質の天然で生じるアイソフォームと、１、２、３、４、５、１０、１５又は２０アミノ酸残基以下で異なる。一実施形態では、組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチドの天然で生じるアイソフォームと、そのアミノ酸残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１５％以下まで異なる。
【００８１】
用語として「獲得」又は「獲得すること」が、本明細書に使用され、物理的な実体又は値を「直接的に獲得すること」又は「間接的に獲得すること」とは、物理的な実体、又は値、例えば、数的な値の保持を得ることを指す。「直接的に獲得すること」は、物理的な実体又は値を取得するため、プロセスを実施すること（例えば、合成又は分析方法を実施すること）を意味する。「間接的に獲得すること」は、別のパーティー又は供給源（例えば、物理的な実体又は値を直接的に獲得した第三者の研究室）から物理的な実体又は値を受けいれることを指す。物理的な実体を直接的に獲得することには、身体物質、例えば、出発原料における物理的な変化を含むプロセスを実施することが含まれる。例示的な変化には、物理的な実体を２つ又はそれを超える出発原料から作製すること、物質を剪断すること又は断片化すること、物質を分離すること又は精製すること、２つ又はそれを超える分離した実体を混合物に組み合わせること、共有結合又は非共有結合を破壊すること又は形成することを含む化学反応を実施することが含まれる。値を直接的に獲得することには、サンプル又は別の物質における物理的な変化を含むプロセスを実施すること、例えば、物質、例えば、サンプル、分析物、又は試薬における物理的な変化を含む分析用プロセスを実施すること（時々、本明細書で「物理的な分析」と呼ばれる）、分析方法、例えば、物質、例えば、分析物、又は断片又は他のその誘導体を別の物質から分離するステップ又は精製するステップ；分析物、又は断片又は他のその誘導体を、別の物質、例えば、緩衝剤、溶媒、又は反応物と組み合わせるステップ；又は分析物、又は断片又は他のその誘導体の構造を、例えば、分析物の第一と第二の原子の間で、共有又は非共有結合を破壊又は形成することによって、変化させるステップ；又は試薬、又は断片又は他のその誘導体の構造を、例えば、試薬の第一と第二の原子の間で、共有又は非共有結合を破壊又は形成することによって、変化させるステップの一つ１つ又は複数を含む方法を実施することが含まれる。
【００８２】
用語として「サンプルを獲得すること」が、本明細書に使用され、サンプルを「直接的に獲得すること」又は「間接的に獲得すること」とは、サンプル、例えば、組織サンプル又は核酸サンプルの保持を得ることを指す。「サンプルを直接的に獲得すること」は、サンプルを取得するため、プロセスを実施すること（例えば、物理的な方法、例えば、手術又は抽出を実施すること）を意味する。「サンプルを間接的に獲得すること」は、別のパーティー又は供給源（例えば、サンプルを直接的に獲得した第三者の研究室）からサンプルを受けいれることを指す。サンプルを直接的に獲得することには、身体物質、例えば、出発原料、例えば、組織、例えば、ヒト患者における組織又は患者から以前に単離されていた組織における物理的な変化を含むプロセスを実施することが含まれる。例示的な変化には、物理的な実体を出発原料から作製すること、組織から摘出すること又は擦過すること；物質（例えば、サンプル組織又は核酸サンプル）を分離すること又は精製すること；２つ又はそれを超える実体を混合物に組み合わせること；共有結合又は非共有結合を破壊すること又は形成することを含む化学反応を実施することが含まれる。サンプルを直接的に獲得することには、例えば、上記のような、サンプル又は別の物質における物理的な変化を含むプロセスを実施することが含まれる。
【００８３】
用語として「下流の処理するステップ」が、本明細書に使用され、組換えタンパク質産物を含有する培地からの細胞の分離の後／のちなどの、選択された分離ステップの後／のち、に続く、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける任意のステップを指す。
【００８４】
用語として「上流の処理するステップ」が、本明細書に使用され、細胞含有培地からの組換えタンパク質産物の分離の前などの、選択された分離ステップの先行する又は前にある、組換えポリペプチドの産生プロセスにおける任意のステップを指す。
【００８５】
用語として「最終産物」が、本明細書に使用され、他の細胞成分から実質的に精製される組換えポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、最終産物は、薬として、貯蔵、輸送、及び／又は使用のため配合される組換えポリペプチドである。
【００８６】
用語として「産生プロセス」が、本明細書に使用され、組換えポリペプチドを産生する方法又は一連のステップを指す。いくつかの実施形態では、産生プロセスは、組換えポリペプチドを産生するため設計された製造プロセスである。いくつかの実施形態では、産生プロセスは、組換えポリペプチドを精製するための方法である。いくつかの実施形態では、産生プロセスは、評価ステップ、分析ステップ、及び／又は前記評価及び分析に基づく決定ステップを更に含む。いくつかの実施形態では、産生プロセスの最終産物は、薬としての使用のため配合される組換えポリペプチドである。
【００８７】
各及びすべての特許、特許出願、及び本明細書に引用された文献の開示は、参照することによってその全体が本明細書に組込まれる。本発明は特定の態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様及びバリエーションが、真の本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような態様及び均等物バリエーションを含むと解釈されることを意図している。
【００８８】
プロセスの一般的な記載
本明細書に記載される方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）として特徴付けされ得る。ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＡバリエーションの一般的な方法は、当業者に公知である。以下は、方法に関与するステップの時系列を説明する単に本明細書に記載される方法の一般的な記載である。開示は、この記載に何らか、限定され又は制限されるべきでない。要素は、説明の目的のために単に記載される。
【００８９】
コーティング剤（例えば、抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体）は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレート）に固定化される。ひとたびコーティング剤が固体支持体に固定化されていると、固体支持体における残存する結合部位は、ブロッキング緩衝剤（例えば、１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．２％カゼイン）を使用してブロックされる。ブロッキング緩衝剤は、オープン結合部位を飽和させるため、固体支持体に対して非特異的に結合することが可能な成分を含有し、したがって、固体支持体における任意の過剰部位に対する遊離リガンドの結合を防止する。コーティング及びブロッキングインキュベーション期間の特定条件は、固体支持体のコーティングを最大化するため選択され；及びバリエーションは、当業者に公知である。固体支持体のコーティング及びブロッキング後、分析される標準及び／又はサンプル（例えば、ＨＣＰについて試験されるサンプル）は、適切な希釈緩衝剤（例えば、１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．２％カゼイン）において適切に希釈され、固定化支持体に添加される。標準／サンプルインキュベーション期間の特定条件は、アッセイの感度を最大化し、解離を最小化するため選択され；バリエーションは、当業者に公知である。
【００９０】
任意の非固定化標準／サンプル（例えば、ＨＣＰ）は、固体支持体を、適切な洗浄緩衝剤（例えば、１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、適切な回数（例えば、３００μｌで３Ｘ）で洗浄するによって除去される。任意の洗浄ステップでの特定の洗浄緩衝剤及び洗浄数は、バックグラウンドを最小化し、感度を最大化するため選択され；及びバリエーションは、当業者に公知である。任意の固定化標準／サンプルは、次に、間接的又は直接的のいずれかで検出することができる。間接的な検出に関して、標準／サンプルにおける対象とする抗原に対する抗体（一次抗体）（例えば、抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体）は、固体支持体に添加され；及びインキュベーション条件はシグナル増幅を最大化するため選択される。任意の非固定化抗体は、次に、固体支持体を、適切な洗浄緩衝剤で適切な回数洗浄することによって除去される。いくつかの手段（検出抗体）によって検出可能及びサンプル中の固定化された標準又はＨＣＰに対して結合することが可能な部分にコンジュゲートした抗体は、次に、固体支持体に添加される。いかなる非結合性の検出抗体も、次に、固体支持体を、適切な洗浄緩衝剤で適切な回数洗浄することによって除去される。コーティング剤に結合した標準／サンプル（例えば、ＨＣＰ）中の対象とする抗原のレベルは、利用される検出抗体に適合する検出系を使用して決定することができる。適切な検出手段は、当業者に公知である。
【００９１】
標準／サンプル中の対象とする抗原の直接検出が利用される例では、一次抗体は、いくつかの手段（検出抗体）によって検出可能な部分にコンジュゲートされ、したがって、検出抗体でもあり、すなわち、一次抗体及び検出抗体は同じである。いかなる非結合性の検出抗体も、次に、固体支持体を、適切な洗浄緩衝剤で適切な回数洗浄することによって除去される。コーティング剤に結合した標準／サンプル（例えば、ＨＣＰ）中の対象とする抗原のレベルは、利用される一次／検出抗体に適合する検出系を使用して決定することができる。適切な検出系は、当業者に公知である。
【００９２】
結果は、特に、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ発現系及びＧＳ−ＣＨＯ発現系を含む、複数の宿主細胞発現系を支持する頑健で、感度の高いＨＣＰ  ＥＬＩＳＡプラットホームアッセイを実証している。ＥＬＩＳＡアッセイの改善された感度は、本明細書に記載されるように、精製されたポリクローナルＨＣＰ抗体を使用しないＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ方法よりも、少なくとも約４０倍良好である。ＨＣＰ抗体精製の間、９９％超の全ＩｇＧは、ＨＣＰに対して免疫応答を示さず、したがって、最終的なＨＣＰ抗体から除去された。産業と規制にまたがって正確にマッチする定量化のための標準は存在しないので、ＨＣＰアッセイの感度は、細胞系及びプロセスに関してアッセイ特異的である。本明細書に記載される方法は、例えば、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、例えば、ＧＳ−ＣＨＯ）、真核生物宿主細胞、原核生物宿主細胞、昆虫細胞を含むが、限定されない、任意の組換え宿主細胞についての頑健で、感度の高いＨＣＰ  ＥＬＩＳＡプラットホームアッセイを生成させるため使用することができる。さらに、本発明の方法は、組換えタンパク質の生産に関する規制要件と関連させて使用することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイは、０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、１．５〜１００、２〜１００、２．５〜１００、３〜１００、０．１〜９０、０．５〜９０、１〜９０、１．５〜９０、２〜９０、２．５〜９０、３〜９０、０．１〜８０、０．５〜８０、１〜８０、１．５〜８０、２〜８０、２．５〜８０、３〜８０、０．１〜７０、０．５〜７０、１〜７０、１．５〜７０、２〜７０、２．５〜７０、３〜７０、０．１〜６０、０．５〜６０、１〜６０、１．５〜６０、２〜６０、２．５〜６０、又は３〜６０ｎｇ／ｍｌを含む濃度範囲での頑健及び信頼のおけるＨＣＰ検出について許容される正確性、精度、及び直線性を実証している。いくつかの実施形態では、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイは、２から６０ｎｇ／ｍｌを含む濃度範囲での頑健及び信頼のおけるＨＣＰ検出について許容される正確性、精度、及び直線性を実証している。いくつかの実施形態では、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイは、３から８０ｎｇ／ｍｌを含む濃度範囲での頑健及び信頼のおけるＨＣＰ検出について許容される正確性、精度、及び直線性を実証している。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界は、０．５ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界は、２ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイの定量化限界は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本発明のＨＣＰ  ＥＬＩＳＡアッセイの検出限界は、３ｎｇ／ｍｌである。
【００９４】
抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体
本明細書に記載される方法は、ＨＣＰの検出のための、抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を提供することができる。抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体は、標準的な分子生物学技術によって作製することができる。抗体は、任意の種から由来し得る。抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル又は本明細書に記載される「抗体」の任意のバリエーションであってもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒツジにおいて作製されるポリクローナル抗体である。抗体は、検出可能な標識、例えば、化学修飾、酵素コンジュゲーション、蛍光色素標識化、ルミネセンス標識化などの付着により直接的に検出可能であり得る。抗体は、直接的に検出可能でなく、検出のための二次的な手段を必要としてもよい。これらのさまざまな特性を有する抗体は、購入又は標準的な分子生物学技術によって作製することができる。
【００９５】
サンプル
サンプルには、組換えタンパク質産生の間の任意の期間（上流又は下流の処理するステップの間の任意の時点）での細胞培養から取られるサンプルが含まれるが、限定されない。例えば、サンプルは、細胞培養（例えば、組換えタンパク質産物の分離の前）から取られ得る。サンプルは、下流の処理するステップの間、例えば、組換えタンパク質産物を含有する培地からの細胞の分離ののちに取られ得る。サンプルは、精製プロセスの間の任意の及び複数の時点に取られ得る。サンプルには、最終産物のサンプルが含まれ得る。したがって、サンプルには、インプロセス産物（最終的な配合の前）及び最終産物（例えば、全ての精製ステップののちの最終的な配合産物）の両方が含まれ得る。
【００９６】
固体支持体
固体支持体には、コーティング剤、例えば、抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体、又はその均等物が固定化され得る、任意の表面が含まれ得る。固定化のために使用される固体支持体は、本質的に水不溶性であり、イムノメトリックアッセイに有用である、任意の不活性な支持体又は担体であってもよく、例えば、表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態における支持体を含む。一般に使用される支持体の例には、９６ウェルマイクロタイタープレート、並びに粒子性材料、例えば、濾紙、アガロース、架橋デキストラン、及び他の多糖を含む、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造された、小シート、セファデックス、塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びアッセイプレート又は試験管が含まれる。或いは、反応性水不溶性マトリックス（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗａｔｅｒ  ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｍａｔｒｉｘ）、例えば、臭化シアン活性化炭水化物が、試薬固定化のコーティングのため適切に利用される。固定化コーティング剤は、マイクロタイタープレート、一例を挙げると、いくつかのサンプルを一度に分析するため使用することができるマルチウェルマイクロタイタープレートにコーティングすることができる。固体支持体表面には、膜、例えば、ニトロセルロース膜、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｌｕｏｒｅｔｈｙｌｅｎｅ）膜、セルロースアセテート膜、硝酸セルロース膜、疎水性基を含有する分子でコーティングされた固体表面、親水性基を含有する分子でコーティングされた固体表面も含まれ得るが、限定されない。固体支持体表面は、マイクロタイタープレート、例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレート、細胞培養プレート、又は任意のそのバリエーションの形態においてであってもよい。
【００９７】
捕捉試薬
用語「捕捉試薬」は、対象とする抗原（例えば、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ）に直接的に結合する抗体を指す。捕捉抗体はまた、タンパク質修飾、例えば、ビオチン標識を有する検出抗体であり得る。抗体は、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ハムスター、サル、チンパンジー、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、霊長類などを含むが、限定されない、異なる種から由来し得る。いくつかの実施形態では、一次抗体は、ヒツジにおいて産生され、親和性精製される抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体である。
【００９８】
検出試薬
用語「検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）」又は「検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は、「抗原」又は「抗体」を検出するため使用される標識抗体を指す。検出抗体はまた、一次抗体であり得る。抗体は、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ハムスター、サル、チンパンジー、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、霊長類などを含むが、限定されない、異なる種から由来し得る。検出抗体において使用される標識は、抗体に対するＨＣＰの結合に干渉しない、任意の検出可能な機能性であってもよい。適切な標識の例は、直接的に検出され得る部分、例えば、蛍光染料、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｔ）、及び放射性標識、並びに検出されるため反応又は誘導体化されなければならない部分、例えば、酵素を含む、イムノアッセイを使用するため公知の多数の標識である。本発明において使用し得る適切な標識化方法には、同位体標識化、化学修飾、酵素コンジュゲーション、蛍光色素標識化、ルミネセンス標識化、及び当業者に一般に公知の他の標識化方法が含まれるが、限定されない。
【００９９】
多種多様な抗原に対する市販の抗体は、当技術分野において公知である。当業者は、抗体又は他の検出剤に関する様々な標識化方法を認識している。標識化方法には、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ（ｇｌａｃｔｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、過酸化水素を利用して色素前駆体を酸化する酵素、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと連結した、複素環オキシダーゼ（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｏｘｉｄａｓｅ）、例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼとＭＵＧ、スピンラベル、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、又は他の酵素などが含まれるが、限定されない。検出剤はまた、放射性同位体、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、又は他の同位体で標識され得る。蛍光色素標識には、フルオロフォア、例えば、希土類錯体（ｒａｒｅ  ｅａｒｔｈ  ｃｈｅａｔ）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅｓ）、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ６１０、７−ＡＡＤ、ヨウ化プロピジウム、Ｃｙ７、フィコエリトリンなどが含まれ得るが、限定されない。検出剤は、蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、カメラ、又はスキャナーによって検出することができる蛍光染料（蛍光色素）によって標識することができる。検出剤はまた、ルミネセンス方法によって検出することができるルミクロムによって標識することができる。或いは、検出剤は、アビジン又はストレプトアビジンに結合することができる、標識ビオチンであってもよい。アビジン又はストレプトアビジンは、ビオチン、ビオチン化抗体、又はビオチン化されたポリペプチドに結合することができる検出剤として使用することができる。
【０１００】
従来の方法は、これらの標識をタンパク質又はポリペプチドに共有結合的に結合させるため利用可能である。一例を挙げると、カップリング剤、例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジンなどは、抗体を上記の蛍光、化学発光、及び  酵素標識でタグ化するため使用され得る。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号（蛍光定量法）及び同第３，６４５，０９０号（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒら  Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５ページ（１９６２）；Ｄａｖｉｄら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４〜１０２１ページ（１９７４）；Ｐａｉｎら  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０：２１９〜２３０ページ（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３０：４０７〜４１２ページ（１９８２）を参照されたい。本明細書における好ましい標識は、８ｐｇ／ｍｌに増幅度及び感度を増加させるための蛍光であり、より好ましくは、シグナルを増幅するための、ビオチンとストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ及びＭＵＧである。
【０１０１】
酵素を含む、このような標識の抗体に対するコンジュゲーションは、イムノアッセイ技術における当業者にとって標準的な操作手順である。例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら  酵素イムノアッセイにおける使用のための酵素−抗体コンジュゲートの調製のための方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｅｄ．  Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ、Ｖｏｌ．  ７３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）、ｐｐ．１４７〜１６６ページを参照されたい。
【０１０２】
検出系
用語「検出系」は、サンプル中のタンパク質又は因子の量又は相対量に関連する情報を含む読み出し情報を与えるため使用することができる手段を指す。検出系の選択は、使用される検出抗体の選択に依存する。例えば、検出抗体が酵素での標識である場合、化学反応が色又は化学発光シグナルをもたらし得る；検出系には、適切な基質及び化学反応に関連する任意の必要な試薬及び化学反応を検出する手段、例えば、視覚的検査、シグナルを検出することが可能な装置、例えば、吸光度プレートリーダー、化学発光プレートリーダー、ＣＣＤカメラなどが含まれ得る；或いは、検出抗体が蛍光性に標識される場合、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光セルソーター、蛍光スキャナー、カメラなどが使用され得る；或いは、検出抗体が同位体標識される場合、Ｘ線フィルム又は他の同位体感受性材料が使用され得る。
【０１０３】
当業者は、使用のため適切な異なる検出系を認識する。これらの検出系には、例えば、レポーター酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｈａｔａｓｅ）（ＡＰ）などの発色反応を使用する検出系が含まれ得る。レポーター酵素は、発色検出のため異なる基質を使用することができる、例えば、ＨＲＰは、発色検出のための基質として４ＣＮ（４−クロロ−１−ナフトール（ｎａｐｔｈｏｌ））、ＤＡＢ／ＮｉＣｌ２（３，３’−ジアミノベンジジン／ＮｉＣｌ２）又はＴＭＢを使用することができる。蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ４８８、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ６１０、７−ＡＡＤ、ヨウ化プロピジウム、Ｃｙ７、フィコエリトリンなどが含まれるが、限定されない。さまざまな及び適切な停止剤は、検出反応を終了させるため使用することができる。使用される特異的な停止剤は、使用される検出剤に依存し、当業者に公知である。例えば、１Ｍ硫酸は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を使用する検出系のための停止基質として使用することができる。
【０１０４】
ブロッキング緩衝剤
コーティング剤でのインキュベーションののちに、固体支持体における残存するいかなる結合部位もブロックするため使用されるブロッキング緩衝剤が、使用され得る。ブロッキング緩衝剤の例には、カゼイン、例えば、１ＸＰＢＳ中のカゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．１〜１％カゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．１〜０．５％カゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．２％カゼイン；ＢＳＡ、例えば、１ＸＰＢＳ中のＢＳＡ、例えば、１ＸＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜１０％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜２０％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜５０％ＢＳＡ；脱脂乳、魚ゼラチン、又は他の化学試薬が含まれるが、限定されない。上記の任意の試薬又は他の適切な化学試薬は、任意の適切な緩衝剤、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中に希釈され得る。
【０１０５】
洗浄緩衝剤は、さまざまなステップで非結合性の成分を除去するため使用され得る。洗浄緩衝剤の例には、カゼイン、例えば、１ＸＰＢＳ中のカゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．１〜１％カゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．１〜０．５％カゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．２％カゼイン；ＢＳＡ、例えば、１ＸＰＢＳ中のＢＳＡ、例えば、１ＸＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜１０％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜２０％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜５０％ＢＳＡ；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する１ＸＰＢＳ中のＢＳＡ、例えば、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する１ＸＰＢＳ中のＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する１ＸＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０５〜１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有する１ＸＰＢＳ中の１％ＢＳＡ；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、例えば、１ＸＰＢＳ中のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、例えば、１ＸＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０；脱脂乳、カゼイン、魚ゼラチン、又は他の化学試薬が含まれるが、限定されない。洗浄緩衝剤には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００又はＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などを有する溶液中に以下の任意のＢＳＡ、脱脂乳、カゼイン、魚ゼラチン、又は他の化学薬品が含まれ得る。これらの溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）を含むが、限定されない、任意の適切な緩衝剤中に希釈され得る。
【０１０６】
洗浄ステップは、複数回実施することができ、また利用される洗浄緩衝剤に依存することになる。例えば、洗浄するステップは、所与の洗浄期間に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０回を超えて繰り返すことができる。当業者は、使用される洗浄緩衝剤及び他の実験条件に基づいて必要な洗浄ステップの数を決定することができる。
【０１０７】
任意の標準、サンプル、抗体、又は検出剤を希釈するため使用される緩衝剤は、当業者に公知であり、カゼイン、例えば、１ＸＰＢＳ中のカゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．１〜１％カゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．１〜０．５％カゼイン、１ＸＰＢＳ中の０．２％カゼイン；ＢＳＡ、例えば、１ＸＰＢＳ中のＢＳＡ、例えば、１ＸＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜１０％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜２０％ＢＳＡ、１ＸＰＢＳ中の１〜５０％ＢＳＡ；脱脂乳、カゼイン、魚ゼラチン、又は他の化学試薬を含み得るが、限定されない。いくつかの事例では、任意の標準、サンプル、抗体、又は検出剤を希釈するため使用される緩衝剤は、ブロッキング緩衝剤として使用される同じ剤である。
【０１０８】
インキュベーション期間及び温度
さまざまなステップのための適切なインキュベーション期間は、当業者によって決定され得る。特定のインキュベーションステップのための期間は、インキュベーションステップの温度における変化に起因して変更されてもよく、同様に、インキュベーションステップの時間における変化は、インキュベーションステップの温度における変化を必要としてもよい。コーティングステップは、例えば、４℃又は約４℃で終夜、２〜１０℃又は約２〜１０℃で終夜、３７℃又は約３７℃で４時間、３７℃又は約３７℃で２〜４時間、３７℃又は約３７℃で１〜４時間、３２℃又は約３２℃で４時間、３２℃又は約３２℃で２〜４時間、３２℃又は約３２℃で１〜４時間実施されてもよい。ブロッキングステップは、例えば、３２℃又は約３２℃で１時間；３２℃又は約３２℃で１〜２時間；４℃又は約４℃で終夜実施されてもよい。標準／サンプルインキュベーションステップは、例えば、３２℃又は約３２℃で２時間；３２℃又は約３２℃で１〜２時間；４℃又は約４℃で終夜実施されてもよい。一次抗体又は一次／検出抗体インキュベーションステップは、例えば、３２℃又は約３２℃で１時間；３２℃又は約３２℃で１〜２時間；４℃又は約４℃で終夜実施されてもよい。いかなる検出系のインキュベーション期間及び温度も、厳密に利用される検出抗体に依存的であり、当業者に公知である。
【０１０９】
キット
本明細書に記載される方法を実施するため有用な１つ又は複数の要素を含むキットは、任意の必要な成分、試薬、又は本明細書に記載される方法を実施するため必要な材料、及び／又は本明細書に記載される方法を実施するための説明書を含み得るが、限定されない。キットは、任意選択で、本明細書に記載される方法を実施するための、任意の追加の洗浄剤、インキュベーション容器、固体支持体表面などを含み得る。
【０１１０】
キットは、別々のエレメントとして提供され得る又はコーティング剤が前もって固定化されている、コーティング剤のための固体支持体を含み得る。したがって、キットにおけるコーティング剤は、固体支持体に固定化されてもよく、又はそれらは、キットに含まれる若しくはキットと別に提供される支持体に固定化されてもよい。コーティング剤は、マイクロタイタープレートにコーティングされてもよい。一次抗体は、未標識であってもよい又は標識されてもよい。一次抗体は、標識され、検出抗体中にあってもよい。標識が酵素である場合、キットは、酵素によって必要とされる基質及び補助因子を含み得る並びに標識がフルオロフォアである場合、キットは、検出可能な発色団を提供する色素前駆体を含み得る。キットはまた、アッセイを実施するための説明書、及び／又は参照標準、並びに他の添加物、例えば、安定化剤、洗浄及びインキュベーション緩衝剤などを含み得る。
【０１１１】
産物及びそれらをコードする核酸
産物を産生することが可能な細胞又は細胞系を、同定する、選択する、又は作製するための方法が本明細書において提供される。本発明の開示によって包含される産物には、細胞によって産生され得る、例えば、細胞において発現される、分子、核酸、ポリペプチド（例えば、組換えポリペプチド）、又はそのハイブリッドが含まれるが、限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、産物を産生させるため、操作される又は修飾される。そのような修飾には、産物の産生を制御する又はもたらす分子を導入することが含まれる。例えば、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドをコードする外来性核酸を導入することによって修飾され、細胞は、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドの産生、例えば、発現及び分泌に適切な条件下で培養される。別の例では、細胞が、例えば、未修飾細胞において、内因性に産生されるレベル又は量よりも高いレベル又は量のポリペプチドを産生するように、細胞によって内因性に発現されるポリペプチドの発現を制御、例えば、増加させる外来性核酸を導入することによって細胞は修飾される。
【０１１２】
実施形態では、本明細書に記載される方法によって同定される、選択される、又は生成される細胞又は細胞系は、医学的な状態、障害又は疾患の処置に有用な、産物、例えば、組換えポリペプチドを産生する。医学的な状態、障害又は疾患の例には、代謝病又は障害（例えば、代謝酵素欠損）、内分泌障害（例えば、ホルモン欠損）、止血（ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、血栓症、造血障害、肺障害、胃腸障害、免疫調節（例えば、免疫不全）、不妊症、移植、がん、及び感染性疾患が含まれるが、限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、産物は、外来性タンパク質、例えば、細胞によって天然で発現されないタンパク質である。産物は、例えば、薬物スクリーニングのため有用な治療タンパク質又は診断上のタンパク質であり得る。治療又は診断上のタンパク質は、抗体分子、例えば、抗体又は抗体断片、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、レポータータンパク質、治療ペプチド、又はこれらの任意の構造上の及び／又は機能的な断片又はハイブリッドであり得る。
【０１１４】
一実施形態では、産物、例えば、組換えポリペプチドは、抗体分子である。本明細書に包含される産物は、診断及び治療抗体分子を含む。診断抗体分子には、イメージング技術のため有用な、抗体、例えば、モノクローナル抗体又はその抗体断片が含まれる。治療抗体分子は、例えば、疾患又は障害の処置又は予防のため、対象への投与に適切である。
【０１１５】
抗体分子は、タンパク質、又は抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子から由来するポリペプチド配列である。一実施形態では、抗体分子は、完全長抗体又は抗体断片である。抗体及びマルチフォーマットタンパク質は、ポリクローナル又はモノクローナル、複数又は単一鎖、又はインタクトな免疫グロブリンであり得、天然供給源から又は組換え供給源から由来し得る。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。
【０１１６】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の少なくとも一部、又はその組換えバリアントを指す、並びに抗原結合ドメイン、例えば、抗原などの標的に対する抗体断片の認識及び特異的な結合を付与するため十分であるインタクトな抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）ＶＨＨドメイン、及び抗体断片から形成される多重特異的抗体、例えば、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片、及び抗体の単離されたＣＤＲ又は他のエピトープ結合断片が含まれるが、限定されない。抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びｂｉｓ−ｓｃＦｖに組込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６〜１１３６ページ、２００５を参照されたい）。抗原結合断片はまた、ポリペプチド、例えば、フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）に基づく足場にグラフトされ得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する、米国特許第：６，７０３，１９９号を参照されたい）。
【０１１７】
本明細書に記載される方法又は細胞において産生される、例示的な産物、例えば、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドは、以下の表に提供される。
【表１−１】
2019516964.tif 000003
【表１−２】
2019516964.tif 000004
【表１−３】
2019516964.tif 000005
【０１１８】
別の実施形態では、産物は、二重特異性分子である。本明細書に記載の二重特異性分子は、２つ又はそれを超える別個の抗原又は標的に結合することができる分子を含む。一実施形態では、二重特異性分子は、抗体断片を含む。一実施形態では、二重特異性分子は、二重特異性抗体、二重特異性抗体融合タンパク質、又は二重特異性抗体コンジュゲート、Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ）分子、Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）分子、Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  Ｆａｂ（ＤＡＦ）分子、ナノボディ、又は２つの別個の抗原を認識する又は結合する能力を有する分子をもたらす抗体断片の他の配置を含む。
【表２−１】
2019516964.tif 000006
【表２−２】
2019516964.tif 000007
【表２−３】
2019516964.tif 000008
【表２−４】
2019516964.tif 000009
【表２−５】
2019516964.tif 000010
【表２−６】
2019516964.tif 000011
【０１１９】
他の例示的な又は診断上のタンパク質には、Ｌｅａｄｅｒら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：  ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００８、７：２１〜３９ページ（本明細書に参照によって組込まれる）の表１〜１０に記載される任意のタンパク質；又は本明細書に記載される組換えポリペプチドの任意のコンジュゲート、バリアント、類似体、又は機能的な断片が含まれるが、限定されない。
【０１２０】
他の組換え産物には、非抗体足場又は代替タンパク質足場、例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディ及びアドネクチンが含まれるが、限定されない。そのような非抗体足場又は代替タンパク質足場は、１つ又は２つ、又はそれを超える、例えば、１、２、３、４、又は５又はそれを超える、異なる標的又は抗原を認識する又は結合するため操作され得る。
【０１２１】
本明細書に記載される、産物、例えば、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドをコードする核酸、例えば、外来性核酸も本明細書において提供される。所望の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、標準技術を使用して、所望の核酸配列、例えば、遺伝子を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングすることによる、同じものを含むことが公知のベクターから核酸配列を誘導することによる、又は同じものを含有している細胞及び組織から直接的に単離することによる、当技術分野において公知である組換え方法を使用して取得することができる。或いは、組換えポリペプチドをコードする核酸は、クローン化というよりも合成的に産生することができる。組換えＤＮＡ技術及びテクノロジーは、当技術分野において高度に進歩しており、確立している。したがって、本明細書に記載される組換えポリペプチドのアミノ酸配列の知識を有する当業者は、組換えポリペプチドをコードするであろう核酸配列を容易に想定又は生成させることができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、外来性核酸は、宿主細胞によって内因性に発現される産物の発現を制御する。そのような実施形態では、外来性核酸は、内因性産物（本明細書で「内因性産物トランス活性化配列」とも呼ばれる）の発現を増加させる、１つ又は複数の核酸配列を含む。例えば、内因性産物の発現を増加させる核酸配列は、構成的に活性なプロモーター又は、例えば、所望の部位での転写を増加させる、例えば、所望の内因性遺伝子産物の発現を増加させる、より強力なプロモーターを含む。内因性産物トランス活性化配列を含む外来性核酸の導入後、前記外来性核酸は、内因性産物トランス活性化配列が、所望の内因性産物のトランス活性化又は発現を増加するように、例えば、内因性産物をコードするゲノム配列に対して近位である事前に選択した位置で、細胞の染色体ゲノムに組込まれる。内因性産物の発現を増加させるため、細胞を修飾する、例えば、外来性核酸を導入する、他の方法は、例えば、参照することによってその全体が本明細書に組込まれる米国特許第５，２７２，０７１号に記載されている。
【０１２３】
本明細書に記載される産物の発現は、組換えポリペプチド又はその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結すること、及び構築物を発現ベクターに組込むことによって典型的に達成される。ベクターは、真核生物又は原核生物に複製及び組込むため適切であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御のため有用な、他の制御エレメント、例えば、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含有する。
【０１２４】
産物、例えば、組換えポリペプチドをコードする又は内因性産物の発現を制御することができる核酸配列を含む、本明細書に記載される核酸配列は、いくつかのタイプのベクターにクローン化することができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、限定されないベクターにクローン化することができる。特に対象とするベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター（ｐｒｏｂｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）、及びシークエンシングベクターが含まれる。実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクターテクノロジーは、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｖｏｌｕｍｅｓ  １〜４、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、及び他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスを含むが、限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限酵素部位、及び１つ又は複数の選択可能なマーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。ウイルスから由来するベクターは、長期の遺伝子移動を達成させるための適切なツールである、というのも、それらは、導入遺伝子の長期の安定な組込み及び娘細胞におけるその伝播を可能にするからである。
【０１２５】
ベクターはまた、例えば、分泌を促進させるためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子由来）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起源及びＣｏｌＥ１又は当技術分野において公知である他のもの）及び／又は選択を可能にするエレメント、例えば、選択マーカー又はレポーター遺伝子を含み得る。
【０１２６】
一実施形態では、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドの発現のため転写開始を可能にするポリメラーゼの動員に関わるプロモーター配列を更に含む。一実施形態では、本明細書に記載される方法のため適切なプロモーター配列は、多量の転写を駆動し、それ故、標的外来性ｍＲＮＡの大量のコピーを送達する、エンハンサーと通例では関連する。一実施形態では、プロモーターは、両方とも、それらの同名のウイルス又はそれから由来するプロモーターから由来する、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要初期プロモーター（Ｘｉａ、Ｂｒｉｎｇｍａｎｎら  ２００６）及びＳＶ４０プロモーター（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ、Ｍｏｒｙら  １９８４）を含む。いくつかの他の頻度の低いウイルスプロモーターは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列  （ＲＳＶ−ＬＴＲ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲ（Ｐａｐａｄａｋｉｓ、Ｎｉｃｋｌｉｎら  ２００４）を含む発現ベクターに含める際に転写を駆動するため首尾よく利用されている。別の実施形態では、特異的な内因性哺乳動物プロモーターを、対象とする遺伝子の構成的な転写を駆動するため利用することができる（Ｐｏｎｔｉｌｌｅｒ、Ｇｒｏｓｓら  ２００８）。ＣＨＯ特異的チャイニーズハムスター伸長因子１−アルファ（ＣＨＥＦ１α）プロモーターは、ウイルスベース配列を代替する高い収量を提供する（Ｄｅｅｒ、Ａｌｌｉｓｏｎ  ２００４）。プロモーターに加えて、本明細書に記載されるベクターは、上記のようなエンハンサー領域（転写の割合を上方制御する転写因子を動員することができる、コアプロモーターに対して近位である、特異的なヌクレオチドモチーフ領域）を更に含む（Ｒｉｅｔｈｏｖｅｎ  ２０１０）。これらの領域は、プロモーター配列と類似して、ウイルスから由来することが多く、プロモーター配列内に包含され、例えば、ｈＣＭＶ及びＳＶ４０エンハンサー配列である又はアデノウイルス由来配列などに追加的に含まれ得る（Ｇａｉｌｌｅｔ、Ｇｉｌｂｅｒｔら  ２００７）。
【０１２７】
一実施形態では、本明細書に記載される、産物、例えば、ポリペプチド、例えば、組換えポリペプチドを含むベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列を更に含む。一実施形態では、選択可能なマーカーは、グルタミン合成酵素（ＧＳ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する耐性を付与する酵素；又は抗生物質マーカー、例えば、抗生物質、例えば、ハイグロマイシン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオシン、ピューロマイシン、又はブラストサイジンに対する耐性を付与する酵素を含む。別の実施形態では、選択マーカーは、Ｓｅｌｅｘｉｓ選択系（例えば、ＳＵＲＥテクノロジープラットホーム（商標）及びＳｅｌｅｘｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（商標）、Ｓｅｌｅｘｉｓ  ＳＡから市販される）又はＣａｔａｌａｎｔ選択系を含む又はそれに適合する。
【０１２８】
一実施形態では、本明細書に記載される組換え産物をコードする核酸配列を含むベクターは、細胞を同定することに有用である選択マーカーを含む又は細胞は、本明細書に記載される組換え産物をコードする核酸を含む。別の実施形態では、選択マーカーは、本明細書に記載されるように、組換え産物をコードする核酸配列のゲノムへの組込みを含む細胞（単数又は複数）を同定することに有用である。組換えタンパク質をコードする核酸配列が組込まれている細胞（単数又は複数）の同定は、産物を安定的に発現する細胞又は細胞系の選択及び操作のため有用であり得る。
【０１２９】
使用のため適切なベクターは、市販されており、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃから利用可能である、ＧＳ発現系（商標）、ＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系、又はＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶテクノロジーに関連するベクター、例えば、参照することによってその全体が本明細書に組込まれる、Ｆａｎら、Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．  （２０１３）；  １（５）：４８７〜５０２ページに記載されるようなベクターを含む。ＧＳ発現ベクターは、ＧＳ遺伝子、又はその機能的な断片（例えば、ＧＳミニ遺伝子）、及び１つ又は複数、例えば、１、２、若しくは３、又はそれを超える、対象とする遺伝子、例えば、本明細書に記載される組換えポリペプチドをコードする核酸の発現のための効率の高い転写カセットを含む。ＧＳミニ遺伝子は、ゲノムＣＨＯ  ＧＳ遺伝子のイントロン６を含む、例えば、からなる。一実施形態では、ＧＳベクターは、ＳＶ４０Ｌプロモーター及び１つ又は２つのｐｏｌｙＡシグナルと作動可能に連結しているＧＳ遺伝子を含む。別の実施形態では、ＧＳベクターは、ＳＶ４０Ｅプロモーター、ＳＶ４０スプライシング及びポリアデニル化シグナルと作動可能に連結しているＧＳ遺伝子を含む。そのような実施形態では、例えば、対象とする遺伝子の発現のための転写カセット又は本明細書に記載される組換えポリペプチドには、第一のイントロンを含む、ｈＣＭＶ−ＭＩＥ遺伝子からのｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及び５’非翻訳配列が含まれる。他のベクターは、例えば、他の選択マーカーが、本明細書に記載される発現ベクターにおけるＧＳ遺伝子に関して置換された、ＧＳ発現ベクターに基づいて構築することができる。
【０１３０】
本明細書に記載される方法における使用のため適切なベクターには、他の市販のベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＡＴ、ｐｃＤＮＡ３．３ＴＯＰＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、以前はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＴａｒｇｅｔ、ＨａｌｏＴａｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）；ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ｐＣＭＶ６（Ｏｒｉｇｅｎｅ）；ｐＥＥ１２又はｐＥＥ１４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、又はｐＢＫ−ＣＭＶ／ｐＣＭＶ−３Ｔａｇ−７／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれるが、限定されない。
【０１３１】
細胞及び細胞培養
実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞以外の細胞である。一実施形態では、細胞は、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿（ａｐｅ）、イヌ、ウマ、フェレット、又はネコである。実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞又はげっ歯類細胞、例えば、ハムスター細胞、マウス細胞、又はラット細胞である。別の実施形態では、細胞は、カモ、オウム、魚、昆虫、植物、真菌、又は酵母からの細胞である。一実施形態では、細胞は、古細菌である。一実施形態では、細胞は、アクチノバクテリアの種である。
【０１３２】
一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ−由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。
【０１３３】
一実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＧＳＫＯ細胞、ＣＨＯＸｃｅｅｄ細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳ−ＣＨＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｎｃ．）である。
【０１３４】
別の実施形態では、細胞は、ＨｅＩａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ  ｃｅｌｌ、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１、及びＣＨＯＺＮ、又はそれから由来する任意の細胞である。一実施形態では、細胞は、幹細胞である。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載される任意の細胞の分化型である。一実施形態では、細胞は、培養における任意の初代細胞から由来する細胞である。
【０１３５】
一実施形態では、細胞は、組換えポリペプチドをコードする、例えば、組換えポリペプチド、例えば、表１又は２から選択される組換えポリペプチドを発現する外来性核酸を含む、本明細書に記載される、いずれか１つの細胞である。
【０１３６】
一実施形態では、細胞培養は、バッチ培養、フェッド−バッチ培養、ドロー及び充填培養（ｄｒａｗ  ａｎｄ  ｆｉｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、又は連続培養として実施される。一実施形態では、細胞培養は、浮遊培養である。一実施形態では、細胞又は細胞培養は、組換えポリペプチドの発現のためインビボに配置され、例えば、モデル生物又はヒト対象に配置される。
【０１３７】
一実施形態では、培養培地は、血清非含有である。無血清及び無タンパク質培地は、市販されている、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ。
【０１３８】
哺乳動物細胞系のため適切な培地及び培養方法は、一例を挙げると、米国特許第５，６３３，１６２号に記載されるように、当分野において周知である。研究室でのフラスコ又は低密度細胞培養のための及び特定の細胞タイプの必要性に適合される標準的な細胞培養培地の例は、一例を挙げると：Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ、Ｇ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、ｐ．  ５１９  ｆ．  １９６７）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ、Ａ．ら、Ａｍｅｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ、７８、１ｐ．  １７３  ｆｆ、１９６３）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ、Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃ．５３、ｐ２８８  ｆｆ．  １９６５）又はアルブミン、トランスフェリン及びレシチンを欠くＩｓｃｏｖｅｓの改変ＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅｓら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  ｍｅｄ．  １、ｐ．  ９２３  ｆｆ．、１９７８）である。一例を挙げると、ハムのＦ１０又はＦ１２培地は、特にＣＨＯ細胞培養のため設計された。特にＣＨＯ細胞培養に適合させた他の培地は、ＥＰ−４８１７９１に記載される。そのような培養培地がウシ胎児血清（ＦＢＳ、ウシ胎児血清ＦＣＳとも称される）を添加されてもよいことが公知であり、後者は多量のホルモン及び成長因子の天然の供給源を提供する。哺乳動物細胞の細胞培養は、現在では日常的な操作であり、科学のテキストブック及びマニュアル中によりよく記載され、例えば、Ｒ．  Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ、ａ  ｍａｎｕａｌ、４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ／Ｎ．Ｙ．、２０００に詳細に論じられている。
【０１３９】
他の適切な培養方法は、当業者に公知であり、利用される組換えポリペプチド産物及び宿主細胞に依存し得る。細胞によって発現される組換えポリペプチドの発現及び産生のため適切な条件を決定又は至適化することは、当業者の能力の範囲内である。
【０１４０】
一態様では、細胞又は細胞系は、産物、例えば、組換えポリペプチドをコードする、外来性核酸を含む。一実施形態では、細胞又は細胞系は、産物、例えば、治療又は診断上の産物を発現する。所望の  ポリペプチド又はタンパク質を発現させるため細胞を遺伝的に修飾する又は操作するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、トランスフェクション、トランスダクション（例えば、ウイルストランスダクション）、又はエレクトロポレーションを含む。
【０１４１】
本明細書に記載される外来性核酸又はベクターなどの核酸を宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０１２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｖｏｌｕｍｅｓ  １〜４、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照されたい。
【０１４２】
本明細書に記載される外来性核酸又はベクターなどの核酸を宿主細胞に導入するための化学的方法には、コロイド性分散系、例えば、高分子複合体（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む、脂質ベース系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜ベシクル）である。核酸の最新の標的化された送達の他の方法が、利用可能であり、例えば、標的化されたナノ粒子又は他の適切なサブミクロンサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達である。
【０１４３】
実施形態では、外来性核酸の宿主細胞の核酸、例えば、宿主細胞のゲノム又は染色体核酸への組込みが、所望される。外来性核酸の宿主細胞のゲノムへの組込みが起こっているかどうかを決定するための方法には、ＧＳ／ＭＳＸ選択方法が含まれ得る。ＧＳ／ＭＳＸ選択方法は、細胞からのタンパク質の高レベル発現に関して選択するため、組換えＧＳ遺伝子によるグルタミン栄養要求性の補完性を使用する。簡潔に述べると、ＧＳ／ＭＳＸ選択方法は、組換えポリペプチド産物をコードする外来性核酸を含むベクターにおけるグルタミン合成酵素をコードする核酸を含めることを含む。メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）の投与により、組換えポリペプチド及びＧＳの両方をコードする外来性核酸がゲノムに安定的に組込まれた細胞が選択される。ＧＳはいくつかの宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞によって内因性に発現され得るので、ＭＳＸでの選択の濃度及び持続時間は、組換えポリペプチド産物の宿主ゲノムへの安定的な組込みを有する高産生細胞を同定するため、最適化され得る。ＧＳ選択及びその系は、参照することによってその全体が本明細書に組込まれる、Ｆａｎら、Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．  （２０１３）；  １（５）：４８７〜５０２ページに更に記載されるようなベクターを含む。
【０１４４】
外来性核酸が宿主細胞ゲノムに安定的に組込まれている細胞を同定する及び選択するための他の方法には、外来性核酸にレポーター遺伝子を含めること及び細胞におけるレポーター遺伝子の存在の評価、及び外来性核酸のＰＣＲ分析及び検出が含まれるが、限定されない。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して選択される、同定される、又は生成される細胞は、安定的な発現、例えば、組換えポリペプチドをコードする外来性核酸の組込みのための選択方法のみを使用して選択される細胞よりも高い収量のタンパク質産物を産生することが可能である。一実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して選択される、同定される、又は生成される細胞は、タンパク質分解の阻害剤と接触されていなかった細胞、又は安定的な発現、例えば、組換えポリペプチドをコードする外来性核酸の組込みのための選択のみされた細胞と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍又はそれを超える産物、例えば、組換えポリペプチドを産生する。
【０１４６】
細胞系及び組換えポリペプチド産生のための方法
哺乳動物及び微生物選択系の両方における当技術分野における現在の最新技術は、ＲＮＡへのＤＮＡの転写のレベルで選択圧を適用することである。対象とする遺伝子は、対象とする遺伝子の高発現をもたらす可能性が高い、選択マーカーを高レベルで発現させる選択マーカーに厳密に連結される。高レベルで選択マーカーを発現する細胞は、生存及び増殖することができ、発現しないものは、生存及び増殖する可能性が低く、例えば、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｅ）及び／又は死亡する。このような方法で、細胞の集団は、選択マーカーを発現する細胞に関して富化され得ることから、対象とする遺伝子が高レベルであることが含意され得る。この方法は、直接的なタンパク質の発現について非常に成功することが証明されている。
【０１４７】
一態様では、本開示は、産物、例えば、組換えポリペプチドを産生する細胞又は細胞系を生成するための方法を提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法を使用して同定される、分類される、選択される、又は生成される細胞を使用して本明細書に記載される産物、例えば、組換えポリペプチドを産生するための方法を提供する。任意の前述の方法には、産物、例えば、組換えポリペプチドを高産生する能力を有する細胞を、同定する又は作製するため、例えば、細胞をタンパク質分解の阻害剤と接触させることによって、本明細書に記載されるような細胞を評価するステップ、同定するステップ、分類するステップ、又は選択するステップが含まれる。本明細書に記載される方法は、例えば、産生、組換えポリペプチドの発現及び／又は分泌を増加させる。
【０１４８】
理論に縛られることを望まないが、より高い生産が可能な細胞は、タンパク質分解の阻害剤に対して感受性が低いと考えられ、したがって、細胞を、本明細書に記載される外来性核酸を含むタンパク質分解の阻害剤と接触させるステップが、より高い生産が可能な細胞に対する選択をもたらすと考えられる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、追加ステップが、産物の発現、例えば、産物の転写、翻訳、及び／又は分泌、或いは産物の質、例えば、適切なフォールディング及び／又は一次配列の忠実度を改善するため、実施されてもよい。そのような追加ステップには、産物の発現又は産物の質を改善する因子を導入することが含まれる。一実施形態では、産物の発現又は産物の質を改善する因子は、小分子、ポリペプチド、又はタンパク質フォールディングを改善するポリペプチド、例えば、シャペロンタンパク質をコードする核酸であり得る。一実施形態では、核酸は、阻害核酸、例えば、マイクロＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡを含む。一実施形態では、タンパク質フォールディングにおいて支援する因子は、シャペロンタンパク質、例えば、ＢｉＰ、ＰＤ１、又はＥＲＯ１をコードする核酸を含む（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ及びＢｕｌｌｅｉｄ  ２００４；Ｂｏｒｔｈら  ２００５；Ｄａｖｉｓら  ２０００）。産物の収量及び質を改善するための他の追加ステップには、転写因子、例えば、ＳＢＰ１及びＡＴＦ６  （Ｔｉｇｇｅｓ及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ  ２００６；Ｃａｉｎら  ２０１３；Ｋｕら  ２００８）の及びレクチン結合性シャペロンタンパク質、例えば、カルネキシン及びカルレティキュリン（Ｃｈｕｎｇら  ２００４）の過剰発現が含まれる。本明細書に記載されるタンパク質フォールディング及び産物の質及びタンパク質の収量を支援する又は改善する物質の過剰発現は、タンパク質をコードする外来性核酸の導入によって達成することができる。別の実施形態では、産物の発現又は産物の質を改善する因子は、産物の発現又は産物の質を増加させるため細胞培養に添加することができる小分子である。一実施形態では、細胞の培養は、細胞を通常増殖させる温度よりもより低い温度、例えば、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、又は１０℃低い温度で行う。
【０１５０】
本明細書に記載される任意の方法には、高い生産性を有する又は高品質産物を産生する細胞を同定するための追加の選択ステップが更に含まれ得る。例えば、ＦＡＣＳ選択は、所望の特性、例えば、タンパク質フォールディングタンパク質、例えば、シャペロンのより高い発現；又は産物の改善された発現を有する特定の細胞を選択する及び単離するため、利用することができる。
【０１５１】
一態様では、本開示は、組換えポリペプチド産物を回収する又は回復するためのステップを含む方法を提供する。組換えポリペプチドが細胞から分泌される実施形態では、方法には、細胞、細胞集団、又は細胞が培養される培養培地から組換えポリペプチドを、回復する、収集する、又は分離するためのステップが含まれ得る。組換えポリペプチドが細胞内にある実施形態では、組換えポリペプチド産物の精製は、１つ又は複数の任意の以下の細胞によって産生される組換えポリペプチドの分離を含む：宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸、宿主細胞脂質、及び／又は宿主細胞からの他の残屑。
【０１５２】
実施形態では、本明細書に記載されるプロセスは、実質的に純粋なタンパク質産物を提供する。本明細書で使用するように、「実質的に純粋」は、実質的に発熱性物質非含有、実質的に核酸非含有、及び／又は実質的にポリメラーゼ、リボソームタンパク質、及びシャペロンタンパク質などの宿主細胞からの内因性細胞タンパク質酵素及び成分非含有であることを意味する。実質的に純粋なタンパク質産物は、例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の夾雑内因性タンパク質、核酸、又は宿主細胞からの他の高分子を含有する。
【０１５３】
産物、例えば、組換えポリペプチドの回収及び精製のための方法は、当技術分野において確立している。組換えポリペプチド産物を回収するため、物理的な又は化学的な又は物理化学的な方法が使用される。物理的な又は化学的な又は物理化学的な方法は、ろ過方法、遠心分離方法、超遠心方法、抽出方法、凍結乾燥方法、沈殿方法、結晶化方法、クロマトグラフィー方法又はその２つ若しくはそれを超える方法の組合せであり得る。一実施形態では、クロマトグラフィー方法は、１つ又は複数のサイズ排除クロマトグラフィー（又はゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、例えば、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、及び／又は多モードのクロマトグラフィーを含む。
【実施例】
【０１５４】
本発明は、以下の実験例を参照することによって、更に詳細に記載される。これらの例は、単に例示目的のために提供され、別途特定しない限り、限定されることを意図していない。したがって、本発明は、以下の例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明らかとなる、あらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【０１５５】
更に記載されなくとも、当業者は、先行する記載及び以下の例示的な例を使用して、本発明の化合物を作製し、利用し、請求項に記載される方法を実施することができると考えられる。以下の例は、本発明のさまざまな態様を具体的に示しており、残りの開示をいかなる点においても限定するものとして解釈されない。
【０１５６】
（例１）
抗ＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質ポリクローナル抗体の調製
この例に提供される方法は、抗ＧＳ−ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ポリクローナル抗体の調製に関する。抗体を、例２に記載されるＥＬＩＳＡ実験に使用した。
【０１５７】
抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体の産生
３頭のヒツジを、ＧＳ−ＣＨＯヌル細胞系（すなわち、ブランクＧＳベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞）からのＨＣＰで免疫化した。抗原として使用されたＨＣＰは、細胞抽出物（ＣＥ）又は細胞上清（ＳＮ）からのＨＣＰであった。抗原を、標準方法（例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）を参照されたい、米国薬局方（ＵＳＰ）は、公式のアッセイ手順及びガイドラインに関する全てのガイドラインを公開している。ＵＳＰ＜１１３２＞は、「生物製剤中の残留宿主細胞タンパク質測定」（ＵＳＰ３８−ＮＦ３３に対する第二補遺、７６４７〜７６６７）を記載し、２０１５年１２月に公開された）に従って調製した。
ヒツジ抗血清を、さまざまな日付で放血させ、収集した。貯蔵したヒツジ抗血清を、抗ＧＳ  ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を親和性精製するために使用した。
【０１５８】
抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体の精製
精製プロセスは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）アフィニティークロマトグラフィー、濃縮／ダイアフィルトレーション、臭化シアン（ＣＮＢｒ）アフィニティークロマトグラフィー及び最終的なダイアフィルトレーションステップから構成された。独自に、本発明の例示的なプロセスは、プロテインＡ及びＣＮＢｒクロマトグラフィーを、２ステップ親和性精製に組み合わせた。この２ステップ親和性精製により、大多数の非特異的なＩｇＧ（すなわち、ＨＣＰに対して結合しないＩｇＧ）が除去された。現行の精製方法は、粗抗血清（すなわち、精製なし）又は全ＩｇＧ（これは、およそ９９％の非特異的なＩｇＧを有する）の混合物からのＨＣＰ抗体を利用する。
【０１５９】
２つのラウンドの精製を実施した、第１及び第２ラウンドは同じ条件であった。精製方法を、１８００ｍｌのヒツジ抗血清での第１ラウンド精製において試験し、確認した。親和性精製した抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰに対する免疫範囲（ｉｍｍｕｎｏｃｏｖｅｒａｇｅ）について、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、及び２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験した。８０００ｍｌの抗血清で開始される第２ラウンド精製において、フロースルーで繰り返しのローディングを実施して、ＭＳＳ及びＣＮＢｒ精製両方におけるＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体の産生を最大化した。
【０１６０】
未処理（ｒａｗ）のヒツジ抗血清（ａｉｎｔｉｓｅｒａ）のＩｇＧ力価はＰｒＡ  ＨＰＬＣにより決定され、ＭＳＳステップの収量は、ＧＳ−ＣＨＯヌル細胞抽出物で免疫化したＣＥヒツジ抗血清について第１ラウンド精製において９６．３３％及び第２ラウンド精製において１２２．８６％であった（１００％を超える収量の矛盾は、タンパク質濃度についての異なる方法により引き起こされた）。全体で、第１ラウンド精製において１０，３１５ｍｇのＩｇＧ及び第２ラウンド精製において６０，５１８ｍｇのＩｇＧを、ＭＳＳクロマトグラフィーから溶出させた。溶出したＭＳＳ  ＩｇＧが、濃縮及びダイアフィルトレーション後の次のステップのＣＮＢｒのため使用された。ＣＮＢｒクロマトグラフィーにおいては、ＣＮＢｒ樹脂を、ＧＳ−ＣＨＯ細胞抽出物と連結し、ＣＥ  ＭＳＳ  ＩｇＧからの抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を親和性精製するため使用した。０．３７％の収量で３９．６ｍｇの抗ＨＣＰ抗体を第１ラウンド精製において精製し、０．６２％の収量で３６１．２ｍｇのＨＣＰ抗体を第２ラウンド精製において産生した。第１ラウンド精製からの抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を、２ＤＥウエスタンブロットにより免疫範囲について試験した。ＧＳ−ＣＨＯヌル細胞系抽出物に対する範囲は、スポット計数に基づいて、ＧＳ−ノックアウト細胞系からの細胞抽出物に対して７２％及び８２％であった。
【０１６１】
第１及び第２ラウンドからの抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を、均一な抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体調製物を生成させるため一緒にプールした。Ａ２８０により決定された３９１ｍｇ抗体の全てを、全精製プロセスについて０．６５％の全累積収量で取得した。最終的な抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を、２ＤＥウエスタンブロットにより免疫範囲について試験した。ＧＳ−ＣＨＯヌル細胞系抽出物に対する範囲は、全スポット計数に基づいてＧＳ−ＣＨＯ細胞系からの細胞抽出物に対して７７％、及びマッチングスポットに基づいて７１％であった。
【０１６２】
この例に記載された例示の精製プロセスは、図１に示される。最終的な抗ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を、例２に記載したＥＬＩＳＡに使用した。最終的な抗体はまた、例２に記載したＥＬＩＳＡに使用するためビオチン化された。
【０１６３】
（例２）
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ
この例に提供される方法は、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰを検出し、定量化するため開発されたサンドイッチＥＬＩＳＡに関連する。ＥＬＩＳＡアッセイ条件が、現行の方法に対して優れた性能であるためであった（例えば、例３を参照されたい）。
ＥＬＩＳＡを、例１に記載した親和性精製したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体で最適化した。ＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり炭酸塩／炭酸水素塩（ｂｉｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）緩衝剤中の２μｇ／ｍｌ  ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体の１００μｌでコーティングし、５±３℃で終夜（１８±２時間）インキュベートした。コーティングしたプレートを、３００μｌの洗浄緩衝剤（１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、続いて１ウェル当たり３００μｌのブロッキング緩衝剤（１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．２％カゼイン）を添加し、６０±５分間、２３±２℃で３００±５０ｒｐｍで振盪してインキュベートした。９つの標準（８０ｎｇ／ｍｌから０．３１ｎｇ／ｍｌ）を、ブロッキング緩衝剤でのＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ標準の２分の１段階希釈によって調製した。例の希釈スキームは、表３に提供される。
【表３】
2019516964.tif 000012
【０１６４】
ＨＣＰスパイク溶液を、表４中の例に従って調製した。
【表４】
2019516964.tif 000013
【０１６５】
サンプルを、予め決められた希釈、例えば、５分の１希釈、１０分の１希釈などでブロッキング緩衝剤で希釈した。プレートを、３００μｌの洗浄緩衝剤（１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。１００μｌ調製サンプル、及びサンプルを、ウェル毎に三連でローディングした。プレートを、次に９０±５分間、２３±２℃で３００±５０ｒｐｍで振盪してインキュベートした。プレートを、３００μｌの洗浄緩衝剤（１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ウェル毎にブロッキング緩衝剤で希釈した１００μｌの２μｇ／ｍｌビオチン化ＳＧ−ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体をローディングした。プレートを、６０±５分間、２３±２℃で３００±５０ｒｐｍで振盪してインキュベートした。プレートを３００μｌの洗浄緩衝剤（１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ブロッキング緩衝剤において１０，０００分の１希釈した１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰをウェル毎にローディングした。プレートを、６０±５分間、２３±２℃で３００±５０ｒｐｍで振盪してインキュベートした。プレートを３００μｌの洗浄緩衝剤（１Ｘ  ＤＰＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ  １Ｃをウェル毎にローディングした。プレートを、１０±１分間、２３±２℃で３００±５０ｒｐｍで振盪してインキュベートした。インキュベーション後、１ウェル当たり５０μｌの停止液（２．５Ｍ硫酸、室温保存）を添加することによって反応を停止させた。プレートリーダーによって６３０ｎｍを参照して４５０ｎｍ波長でプレートを読み取った。データをＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ（Ｖｅｒ  ５．４．３）によって分析し、標準曲線を４パラメータロジスティックフィッティングでプロットした。
【０１６６】
（例３）
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの評価
以下の例は、例２に記載したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰサンドイッチＥＬＩＳＡの評価を提供する。評価の結果は、以下に記載される。
【０１６７】
結果的に、５つのＧＳ−ＣＨＯバルク精製産物、３つのＧＳ−ＣＨＯインプロセス産物及び１つの最終配合緩衝剤を、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡを評価するため試験した。これらの試験サンプルは、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡに関する産物サンプルの代表であった。ＧＳ−ＣＨＯ産物を、２分の１連続希釈を使用して希釈し、例２に記載されたＥＬＩＳＡにおいて試験した。５つのスパイクレベル、１、２、５、１０、及び２０ｎｇ／ｍｌを、産物希釈で試験した。スパイク回収を、各産物に対するアッセイ性能を評価するため使用した。
【０１６８】
５つのバルク精製産物（ＢＤＳ  Ｍａｂ  ＤＶ、Ｍａｂ  ＢＭ、産物Ａ１５、Ｍａｂ  ＤＵ、及びＭａｂ  ＤＨ）及び３つのインプロセスサンプル（Ｍａｂ  ＣＺ、Ｍａｂ  ＢＭ、Ｍａｂ  ＭＳＳ溶出物）及びＭａｂ  ＢＭ最終配合緩衝剤を、試験した。正確性、精度、直線性、作用範囲、検出限界、定量限界、及び特異性を、分析し、以下に記載した。
【０１６９】
正確性
ＥＬＩＳＡの正確性を、全て５つのスパイクレベルの回収により分析した。スパイクレベル５、１０、及び２０ｎｇ／ｍｌの正確性は、７５％から１２５％回収の許容される範囲内であった。２ｎｇ／ｍｌに関して、大多数の産物希釈は、７５％から１２５％回収内の許容される回収を有していた。高レベルの内因性ＨＣＰ濃度は、スパイク２ｎｇ／ｍｌの正確性に影響を及ぼした。１ｎｇ／ｍｌでのスパイクレベルの全体的な正確性は、高い内因性ＨＣＰレベルの影響に起因して許容されるものではなかった。
【０１７０】
ＧＳ−ＣＨＯ産物、ＢＤＳ  ＭＡｂ  ＤＶ、ＭＡｂ  ＢＭ、ＭＡｂ  ＤＵ及びＭＡｂ  ＤＨを、最終的なＥＬＩＳＡ方法で各々３つの希釈で試験した。２、５、１０及び２０ｎｇ／ｍｌでのスパイク対照の回収に関して、全ての結果（ｎ＝３８）は、７５％から１２５％内であった。１ｎｇ／ｍｌでのスパイク対照に関する３８回収のうち５つは、許容される回収の範囲外であった。５つの異なるスパイクレベルからのスパイク回収を算出し、方法の正確性をスパイク回収に基づいて評価した。各ＨＣＰスパイクレベルでの全平均パーセンテージ回収が７５％から１２５％回収の間であった場合、アッセイの正確性は許容されると考えられた。５、１０及び２０ｎｇ／ｍｌのＨＣＰスパイクレベルに関して、各々３つの異なる希釈での４つ全ての試験したＢＤＳ産物の全スパイク回収は、７５％から１２５％回収の間であり、許容された。試験した内因性ＨＣＰは、１．３９５ｎｇ／ｍｌから２４．０４４ｎｇ／ｍｌで変動した。
【０１７１】
２ｎｇ／ｍｌのＨＣＰスパイクレベルに関して、各々２つの異なる希釈での４つ全ての試験したＢＤＳ産物に関するスパイク回収は、低希釈のＢＤＳ産物（例えば、ＢＤＳ  ＭＡｂ  ＤＶにおいて２分の１希釈（２分の１））を除き、７５％から１２５％回収の間であり、許容された。失敗したスパイク回収でのＢＤＳ産物希釈の内因性ＨＣＰ濃度は、１３．４６７ｎｇ／ｍｌから２４．０４４ｎｇ／ｍｌで変動した。許容されたスパイク回収でのＢＤＳ産物希釈の内因性ＨＣＰ濃度は、１．３９５ｎｇ／ｍｌから４．５３６ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１７２】
１ｎｇ／ｍｌのＨＣＰスパイクレベルに関して、異なる希釈での４つの試験したＢＤＳ産物に関するスパイク回収は、７５％から１２５％回収の間であり、許容された。それらの内因性ＨＣＰ濃度は、１．３９５ｎｇ／ｍｌから４．５３６ｎｇ／ｍｌの範囲であった。ＭＡｂ  ＤＶ、ＭＡｂ  ＤＵ、ＭＡｂ  ＢＭに関して２分の１希釈（２分の１）及びＭＡｂ  ＤＨに関して３２分の１希釈（３２分の１）などの、ＢＤＳ産物の最低希釈に関する回収は、７５％から１２５％の範囲外であった。失敗したスパイク回収でのＢＤＳ産物希釈の内因性ＨＣＰ濃度は、１３．４６７ｎｇ／ｍｌから２４．０４４ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１７３】
スパイク回収及びスパイクレベルから、試験サンプル中に存在する高レベル内因性ＨＣＰが、低スパイクレベル、例えば、１ｎｇ／ｍｌ又は２ｎｇ／ｍｌでのスパイク回収の測定の信頼性に影響を及ぼすことが結論付けられた。したがって、全体的な正確性は、許容されると考えられた。
【０１７４】
精度
４つのＧＳ−ＣＨＯ  ＢＤＳ（バルク精製）産物におけるＨＣＰ測定を、再現性精度（ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）及び中間精度（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）について分析した。再現性及び中間精度の両方は、２０％ＣＶ未満であった。ＧＳ−ＣＨＯ産物におけるＨＣＰ濃度の再現性は、２０％ＣＶの許容される範囲の上限であった。精度を、評価全体にわたってアッセイ間対照及びスパイク対照からのＨＣＰ測定で更に分析した。再現性及び中間精度は、高い及び低いアッセイ間対照（ＩＡＣ）の両方に関して１５％ＣＶ未満であった。１、２、５、１０及び２０ｎｇ／ｍｌのスパイク対照に関して、再現性精度及び中間精度は、全て１５％ＣＶ未満であった。
【０１７５】
ＧＳ−ＣＨＯ  ＢＤＳ産物におけるＨＣＰ濃度の測定に関する再現性（アッセイ内）及び中間（アッセイ間）精度を、ＢＤＳ産物における内因性ＨＣＰ不純物の６回の機会の測定から各々決定した。各ＢＤＳ産物における内因性ＨＣＰ濃度を、アッセイ希釈係数を補正して各測定における未スパイクサンプルから算出した。各測定に関して、ＨＣＰを、各産物についての３つの異なる希釈から測定した。各産物におけるＨＣＰ濃度の再現性％ＣＶ及び中間精度％ＣＶを、算出した。４つ全てのＧＳ−ＣＨＯ  ＢＤＳ産物についての再現性精度％ＣＶは、１０．７％から１５．０％の範囲であった。再現性精度％ＣＶは、２０％の標的と比較して、許容された。再現性は、全ての希釈にわたる結果について算出されたことに留意されたい。４つ全てのＧＳ−ＣＨＯ  ＢＤＳ産物についての中間精度％ＣＶは、７．５％から１６．２％（ｎ＝１８）の範囲であり、これは、≦２０％の標的と比較して、許容されると考えられた。
【０１７６】
直線性
直線性は重要なアッセイパラメータであり、これにより、アッセイ応答が、試験サンプル中の分析物濃度と比例し、したがって、サンプルからの応答は、用量反応キャリブレーション曲線から直接的に解釈できることが実証される。ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの直線性を、５つのレベルのＨＣＰスパイクＧＳ−ＣＨＯ産物でのＨＣＰ測定で評価した。直線性（ｒ２）値は、正確性調査及び４つの試験したＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ産物の各アッセイにおいて、０．９８４から１．０００の範囲であった。
【０１７７】
作用範囲
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ標準曲線の作用範囲は、許容される正確性を伴って、２ｎｇ／ｍｌから８０ｎｇ／ｍｌの範囲と決定された。作用範囲は、ＧＳ−ＣＨＯ  ＢＤＳ産物についてのＨＣＰ測定でも試験され、確認された。
【０１７８】
検出限界
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの検出限界（ＬＯＤ）は０．９ｎｇ／ｍｌと決定され、これは、４つのＧＳ−ＣＯ  ＢＤＳ産物についての４１プレートでの６つ全てのアッセイ機会における標準曲線から算出された最大ＬＯＤであった。各アッセイ（プレート）のＬＯＤを、ブランク対照（０ｎｇ／ｍｌの標準）の平均吸光度プラスその標準偏差の２．５倍（有意に異なるシグナルを提供する）での標準曲線から解釈したＨＣＰ濃度から算出した。全ての試験したプレートからの最大ＬＯＤは０．８７５ｎｇ／ｍｌであり、これは０．９ｎｇ／ｍｌに切り上げられた。０．９  ｎｇ／ｍｌは、ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡのＬＯＤと規定された。
【０１７９】
定量限界
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの検出限界（ＬＯＱ）は、２ｎｇ／ｍｌと決定された。ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの定量化限界（ＬＯＱ）を、試験したＧＳ−ＣＨＯ産物に関する、許容される逆算した標準及び許容される正確性の組合せと規定した。許容される逆算（％ＲＥ≦１５％）及び再現性精度（％ＣＶ≦２０％）でのＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの最低標準は、１．２５ｎｇ／ｍｌであった。許容される回収（６回の機会のうち少なくとも３回において７５％から１２５％の間）での各産物についてのＬＯＱは、表１２に要約される。現行の標準ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡについてのＬＯＱは、約２００ｎｇ／ｍｌである。
【表５】
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【０１８０】
特異性
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの特異性を、精製プロセス中にＣＨＰと共精製される可能性がある、プロテインＡ及びＣＨＯ  ＤＮＡの不純物について試験した。プロテインＡ及びＣＨＯ  ＤＮＡ両方に関する特異性％は、９７％から１０３％以内であった。交差反応性％は、プロテインＡ及びＣＨＯ  ＤＮＡ両方において１％未満であった。プロテインＡ及びＣＨＯ  ＤＮＡからの潜在的な陰性又は陽性バイアスは、抗体産物中のＨＣＰを測定している間にＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡにおいて観察されなかったことを特異性の結果は示唆した。
【０１８１】
要約すると、本明細書に記載される例示的な結果は、哺乳動物発現系、例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ発現系を含む、複数の発現系を支持する頑健で、感度の高いＨＣＰ  ＥＬＩＳＡプラットホームアッセイを実証している。ヒツジ中で産生されたポリクローナルＨＣＰ抗体が親和性精製され、モックトランスフェクトされたヌル細胞からの細胞抽出物に対する抗体の免疫範囲は二次元（２Ｄ）ウエスタンブロットのスポットマッチングによって評価された７１％であった。抗体濃度、緩衝系及び検出系を、優れた免疫範囲及びＬＯＱのため、ＥＬＩＳＡ開発の間に最適化した。
【０１８２】
最終的な頑健及び感度の高いＨＣＰ  ＥＬＩＳＡを、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ  （ＩＣＨ）  Ｑ２（Ｒ１）ガイドラインにより評価した。ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡに関するアッセイパラメータを、予め決められた判定基準に対して評価した。測定したＨＣＰ濃度に対する理論上のＨＣＰ濃度の正確性、アッセイ内精度、中間精度及び直線性は、許容された。このＥＬＩＳＡの作用範囲は、２ｎｇ／ｍｌから８０ｎｇ／ｍｌと決定された。ＬＯＱ（ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡの定量化限界）は、複数のバルク精製産物に基づいた許容されるスパイク回収で、２ｎｇ／ｍｌと規定された。ＨＣＰと一緒に主要な不純物供給源である、プロテインＡ及びＣＨＯ  ＤＮＡに対する特異性も許容されることが証明された。
【０１８３】
ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、バイオ精製プロセスの間のＨＣＰ不純物及び最終的なバルク原薬をモニターするためのプラットホームアッセイとして役立ち得る。アッセイは、ＧＳ−ＣＨＯ発現系において産生される産物の検証及びバッチ発売のためにも役立ち得る。更に、本明細書に記載された方法は、組換えタンパク質の生産に関する規制要件と関連させて使用することができる；その理由は、ＩＣＨ  Ｑ６Ｂ  ６．２ガイドラインが、適切な感度の高いイムノアッセイが、生物学的産物中に存在することがあるＨＣＰの範囲を検出するため使用されるべきことを述べているからである。
【０１８４】
安定性
ＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ試薬（具体的にはＨＣＰ分析物）を、貯蔵温度、時間、及び凍結融解条件について試験した。ＭＡｂサンプル内のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの又はＭＡｂサンプル中にスパイクした追加のＧＳ−ＣＨＯ  ＨＣＰの安定性を、５±３℃又は−６５℃以下のいずれかで保存された後のさまざまな時点で評価した。結果は、ｔ＝０日からｔ＝１日貯蔵期間において両方の温度でＨＣＰ不安定性及び潜在的な分解を示したが、ｔ＝１日からｔ＝８５日貯蔵期間においてＨＣＰ安定性を示した。追加のＨＣＰがサンプル中にスパイクされない３つのＭＡｂサンプルのうちの２つに関して、ＨＣＰにおける変化は、両方の貯蔵温度で３０％未満又は３０％と等しく、許容された。これにより、ＭＡｂサンプル中に存在する内因性ＨＣＰが、５±３℃又は−６５℃以下で８５日まで貯蔵する間に安定であることが実証された。ＨＣＰ試験のため−６５℃以下の貯蔵温度がバルク精製サンプルの試験に適切であることが結論付けられ、そのサンプルは−６５℃以下で８５日まで保存することができる。
【０１８５】
頑健性
サンプル調製手順における小さいバリエーションが方法の性能に影響しないことを実証するため、アッセイドリフト、アッセイインキュベーション時間、アッセイインキュベーション温度、及びアッセイ試薬寿命（ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ  ａｇｅ）における頑健性を評価した。
【０１８６】
アッセイドリフトにおける頑健性を、高サンプルｐｇ／ｍｌ又は低サンプルｐｇ／ｍｌを含有するアッセイ間対照（ＩＡＣ）をＥＬＩＳＡプレートのウェルに適用すること、及び、次に、５分間の遅延後、第二セットのＩＡＣをＥＬＩＳＡプレートに適用すること、及び、ＩＡＣにおける差を評価することにより検査した。ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡにおける異なる時間でのサンプルの添加は、アッセイの結果の正確性又は精度に影響せず、全ての結果は、正常なアッセイ変動性内にあり、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、サンプルをＥＬＩＳＡプレートに添加するため必要とされる時間（５分間まで）に関して頑健であると規定された。
【０１８７】
アッセイインキュベーション時間における頑健性を、高サンプルｐｇ／ｍｌ又は低サンプルｐｇ／ｍｌを含有する２つのＭＡｂサンプル及びＩＡＣを３つのＥＬＩＳＡプレートのウェルに適用すること、及び、次に、ＥＬＩＳＡプレートが供されるアッセイステップのインキュベーション時間を変動させることにより検査した。３つのプレートに関するＩＡＣの結果及びＭＡｂサンプルの結果は、許容された。全ての結果は、正常なアッセイ変動性内にあり、試験方法は、アッセイインキュベーション時間におけるバリエーションに対して頑健であると規定された。
【０１８８】
アッセイインキュベーション温度における頑健性を、高サンプルｐｇ／ｍｌ又は低サンプルｐｇ／ｍｌを含有する２つのＭＡｂサンプル及びＩＡＣを３つのＥＬＩＳＡプレートのウェルに適用すること、並びに、次に、１つのプレートを１７℃、１つのプレートを２３℃、及び１つのプレートを２７℃で試験することにより検査した。ＩＡＣの結果及びＭＡｂの結果は、許容された。ＭＡｂサンプルにおけるスパイク対照及びＨＣＰスパイクに関する中間精度は、３つ全てのプレートに関して許容された。全体的に、全ての結果は、正常なアッセイ変動性内にあり、試験方法は、１７±２℃から２５±２℃のアッセイインキュベーション温度におけるバリエーションに対して頑健であると規定された。
【０１８９】
アッセイ試薬寿命における頑健性を、初期調製の１週間、２週間、３週間、及び４週間後に調製したアッセイ試薬（コーティング緩衝剤、ブロッキング緩衝剤、及び洗浄緩衝剤）を使用することにより検査した。全体的に、アッセイ試薬が一か月まで安定であることが結論付けられた。
【図１】
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【国際調査報告】
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