(57)【要約】本発明は、疾患に関する患者由来のマーカーを決定する方法であって末梢血及び罹患組織からのエピゲノミクス及び／又はトランスクリプトーム由来の情報又は末梢血若しくは罹患組織からのエピゲノミクス及びトランスクリプトーム由来の情報がマーカーを得るために使用される方法並びにそれによって得られたマーカーを使用して患者における疾患のリスクを決定する方法に関する。
2019522997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患に関する患者由来のマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料及び罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること及び／又はそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び／又は前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の該少なくとも１つの試料の両方において、前記エピゲノミクスプロファイル及び／又は前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
疾患に関する患者由来のマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料又は罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること並びにそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及びトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料又は前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のいずれかにおいて、前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定すること
を含む、方法。
【請求項３】
前記患者がヒトである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が心不全（ＨＦ）及び／又は拡張型心筋症（ＤＣＭ）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記罹患組織の前記試料が心筋組織から入手される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変化が高メチル化及び／若しくは低メチル化並びに／又はＲＮＡ発現レベルの変化である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記末梢血及び／又は前記罹患組織の複数の試料が前記疾患と診断された患者から入手され又は準備される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の末梢血及び／又は罹患組織の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームを獲得又は準備すること；及び
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を特定すること
を含む、方法。
【請求項９】
前記罹患組織が心筋であり、前記疾患が心不全及び／又は拡張型心筋症である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのエピジェネティックなマーカー及び／又はトランスクリプトームマーカーは、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表１に開示する配列から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において高／低メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表２に開示する配列から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表３に開示する配列から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表４に開示する配列から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関する、ゲノム領域中に、それぞれ、含有され、表５に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表６に開示する配列から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、前記参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関する、ゲノム領域中に含有され、表７に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表８に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、前記参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関する、ゲノム領域中に含有され、表９に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され；及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において異常メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表１０に開示するＡＮＦ及び／又はＢＮＰ遺伝子座及び／又は配列から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数のマーカーの存在が決定される請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
患者における心不全及び／又は拡張型心筋症に関するマーカーとしての請求項１０に記載のマーカーの使用。
【請求項１３】
請求項１０に記載のマーカーを含むデータバンク。
【請求項１４】
患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の末梢血及び／又は罹患組織の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームのデータを獲得又は準備すること；及び
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を決定すること
を含む、方法。
【請求項１５】
実行されると請求項１４に記載の方法を実施するコンピューター実行可能命令を含むコンピュータープログラム製品。
【請求項１６】
心不全及び／又は拡張型心筋症と診断された患者の予後診断の方法及び／又は前記患者の薬物ベースの治療法において前記患者をモニタリングし及び／又は補助する方法であって、請求項１０に記載のマーカーが使用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者由来の疾患に関するマーカーを決定する方法であって、末梢血及び罹患組織からのエピゲノミクス及び／若しくはトランスクリプトーム由来の情報又は末梢血若しくは罹患組織からのエピゲノミクス及びトランスクリプトーム由来の情報がマーカーを獲得するのに使用される方法、並びにそれにより獲得されたマーカーを使用して、患者における疾患のリスクを決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スループットの高い新たな患者試料の解析方法及びそれにより作成される膨大な量のデータを解析するのに十分な演算能力が利用可能であることのおかげで、疾患を診断するためのマーカーの発見は、近年成長している分野である。
【０００３】
これにより、多数の疾患、例えば、心疾患、癌等、に関する様々なマーカーの同定が可能となる。
【０００４】
心不全（ＨＦ）は、一般集団における罹患率及び死亡率の主な原因の１つであり、６５歳を超える高齢者の入院の主因である。現在、一般集団の２％がＨＦを患い、高齢者では、これは、約１０％にまで増える。更に、全ての西洋諸国において、臨床症状ＨＦの有病率の増加が予測される。
【０００５】
ＨＦは、潜在的な心疾患の結果である。ＨＦを発症する２つの最も一般的な理由は、収縮機能障害及び／又は拡張機能障害である。ＨＦ−ｒＥＦとも称される収縮期ＨＦに関して、主な理由は、冠動脈疾患及び心筋梗塞に起因する虚血性心疾患並びに拡張型心筋症（ＤＣＭ）等の非虚血性の原因である。ＤＣＭは、１：２，５００から最大１：５００の推定有病率を有する頻発する心筋疾患であり、遺伝的メカニズム、炎症又は感染によって引き起こされる。疾患の進行性は、米国だけで年間５０，０００件近くの入院及び１０，０００件の死亡の原因となり、若年層における心臓移植の主な原因である。全体として、疾患の発生率は、過去数年間に亘って増加し続けており、ＤＣＭが実質的な遺伝的関与を有することが認識されている。全てのＤＣＭの症例の約３０％〜４０％が、家族集積性を示すと推定され、現在に至るまで、４０個を上回る種々の遺伝子が、遺伝性ＤＣＭを引き起こすことが分かった。
【０００６】
ＨＦ及びＤＣＭの診断及びリスクの階層化は、依然として困難であり、主に症状、心血管撮像パラメーター及びＮ末端ｐｒｏ  ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（Ｎｔ−ＰｒｏＢＮＰ）等のバイオマーカーに依拠する。Ｎｔ−ＰｒｏＢＮＰは、非常に正確であるが、特有の注意点を要する。例えば、年齢、性別、人種、肥満、運動、腎不全及び貧血等の幾つかの交絡因子が、Ｎｔ−ＰｒｏＢＮＰの血漿レベルを変化させる可能性がある。
【０００７】
ＨＦのような疾患をより良好に理解するために、また治療法及び診断戦略を規定するために、より正確な分子バイオマーカーが必要とされる。今では幾つかの研究により、非特許文献１及び非特許文献２に開示されたＤＣＭ又は心不全と関連付けられる共通の遺伝的多型、非特許文献３に開示されたエピジェネティックな変化、又はｍｉＲＮＡ発現パターンが同定されてきた一方で、依然として、ＨＦ／ＤＣＭ並びに他の疾患の信頼性のあるマーカーに対する需要は満たされていない。
【０００８】
心不全は、西洋諸国における入院及び死亡の主因である。過去数十年に亘って、心不全の進行を促進する遺伝的原因及び分子的事象は、部分的に解明されてきたに過ぎない。遺伝的素因（非特許文献４、非特許文献２）の他に、環境要因及びライフスタイルを始めとする更なる側面が、心筋不全の突発及び経過に影響を及ぼすことが長い間知られている（非特許文献５）。かかる外因性の環境要因が、個体の表現型及びその個体の疾患に、どのように影響を及ぼし得るかの正確な作用機序は、基本的に知られていない。
【０００９】
ごく最近、心血管研究は、心臓エピゲノムの役割の解明に対する第一歩となっている。心臓の発達中に、不全の心筋細胞において部分的に再構築されるパターンである、発生遺伝子及びサルコメア遺伝子の、遺伝子本体（ｇｅｎｅ  ｂｏｄｉｅｓ）のメチル化及びヒストンマークの一連の劇的な変化が検出された（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。ストレスに適応して、また肥大中に、ラット由来の人工心臓組織において、類似の観察が成され、これは種間のメチル化ベースの遺伝子パターン形成の保存を示している（非特許文献８）。これらの研究により、心臓におけるエピジェネティックな調節の潜在的に中心的な役割が示され、塩基対分解能でヒストン修飾又はＤＮＡメチル化を評価するための非常に精巧な技術が存在する一方で、患者からの心筋検体の入手可能性の欠如は、複雑な心血管の特徴に対するかかる変化の影響の解明に対する主な障害である（非特許文献９）。従って、主に、動物研究又は非常に小さな臨床コホートの調査は、心不全又は心筋症における心臓ＤＮＡの化学的変化の存在及び役割を一部明らかにし得る。
【００１０】
心不全におけるＤＮＡメチル化に関する先駆け研究の１つは、２０１１年にＲｏｇｅｒ  Ｆｏｏのグループによって刊行された（非特許文献１０）。Ｒｏｇｅｒ  Ｆｏｏらは、心不全におけるエピジェネティックな変化が、ゲノム間で一様に発生するのではなく、プロモーターＣｐＧアイランド、遺伝子内ＣｐＧアイランド及び遺伝子本体において濃縮されることを同定した。この研究の限界は、調査された僅か４つの末期心不全心臓外植片が非常に小さな試料サイズであったことである。２０１３年には、Ｈａａｓらは、非虚血性心不全の主な原因である拡張型心筋症（ＤＣＭ）を患う生存患者における低分解能ＤＮＡメチル化変化のゲノムワイドなシグネチャーを同定し複製することができた（非特許文献３）。この研究において、Ｈａａｓらは、ＡＤＯＲＡ２Ａ及びＬＹ７５等の心不全に潜在的に関与する新規候補遺伝子セットを同定した。別の数少ない利用可能な例により、ヒトにおける心不全中に抑圧されて、補助装置による左心室の機械的な負荷軽減（ｕｎｌｏａｄｉｎｇ）後に再活性化される、ＤＮＡメチル化の下流エフェクターであるメチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）が同定され（非特許文献１１）、これは、心不全に関する標的エピジェネティック療法の潜在的な役割を指し示している。
【００１１】
生化学的ＤＮＡ修飾は、遺伝情報と環境要因とトランスクリプトームとの間の重大な調節層のようである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓら：ＨＢＥＧＦ，ＳＲＡ１，ａｎｄ  ＩＫ：Ｔｈｒｅｅ  ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，３９５−４０３（２００９），ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．０７６６５３．１０８．１９
【非特許文献２】Ｅ．Ｖｉｌｌａｒｄら：Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｗｏ  ｌｏｃｉ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３２，１０６５−７６（２０１１）
【非特許文献３】Ｊ．Ｈａａｓら：Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５，４１３−４２９（２０１３）
【非特許文献４】Ｂ，Ｍｅｄｅｒら：Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ６ｐ２１  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｒｉｓｋ  ｌｏｃｕｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２０１４；３５：１０６９−７７
【非特許文献５】ＣＴ，Ｈａｎｇら：Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｂｒｇｌ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６６：６２−７
【非特許文献６】ＩＡ，Ｓｅｒｇｅｅｖａら：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｐｐａ−Ｎｐｐｂ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１６；１４３：２１３５−４６
【非特許文献７】ＣＭ，Ｇｒｅｃｏら：ＤＮＡ  ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１６；７：１２４１８
【非特許文献８】Ｊ，Ｓｔｅｎｚｉｇら：ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ：ｃｏｍｍｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６；１１１：９
【非特許文献９】ＣＭ．Ｇｒｅｃｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ：Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１５；１２：４８８−９７
【非特許文献１０】Ｍ，Ｍｏｖａｓｓａｇｈら：Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｓｔａｇｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１１；１２４：２４１１−２２
【非特許文献１１】ＳＣ，Ｍａｙｅｒら：Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅａｄｅｒ  ＭｅＣＰ２  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２０１５；１１７：６２２−３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
心筋機能不全及び心不全に結び付けられるエピジェネティックな感受性領域及び新規バイオマーカーを同定するために、本発明者らは、拡張型心筋症（ＤＣＭ）を患う患者及び対照の心筋組織及び血液において、初めてのマルチオミクス研究を実施した。
【００１４】
本発明者らは、ＤＣＭに起因する収縮期心不全を有する密に表現型が決定された患者の大きなコホートにおけるｍＲＮＡ及び全ゲノムシーケンシングと併せて、高分解能のエピゲノムワイドな心臓及び血液ＤＮＡメチル化を初めて精査した。心臓及び血液ＤＮＡメチル化プロファイルのこれまでのところ最も大きなデータセットが提供され、ヒト心不全の明確な特徴である重要なエピゲノムパターンが同定された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、試料、例えば核酸配列、の２つ以上の特徴を考慮することで、マーカー発見の改善が可能であることを見出した。更に、異なる供給源由来の２つ以上の試料を考慮することで、同様にマーカー発見の改善が可能であることを見出した。ここで、１つは、疾患に関連した組織由来であり、更なる１つが、末梢血由来であることが好ましい。
【００１６】
第１の側面において、本発明は、患者由来の疾患に関するマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料及び罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること及び／又はそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び／又は前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料の両方において、前記エピゲノミクスプロファイル及び／又は前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定することを含む、方法に関する。
【００１７】
更に、本発明は、患者由来の疾患に関するマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料又は罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料又は前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること及びそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及びトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料又は前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のいずれかにおいて、前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定することを含む、方法に関する。
【００１８】
また、患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の前記末梢血及び／又は前記罹患組織、例えば心筋（ｍｙｏｃａｒｄ／ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）、の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームを獲得又は準備すること；及び
前記第１又は第２の側面の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を特定することを含む、方法が開示される。
【００１９】
患者における心不全及び／又は拡張型心筋症に関する特異的なマーカーを含むデータバンク、患者における心不全及び／又は拡張型心筋症のリスクを決定する方法におけるこのデータバンクの使用、並びに、患者における心不全及び／又は拡張型心筋症に関するマーカーとしての前記特異的なマーカーの使用が、更に開示される。
【００２０】
更に、患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の末梢血及び／又は罹患組織の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームのデータを獲得又は準備すること；及び
前記第１の態様又は第２の側面の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を特定することを含む、方法、並びに、
実行されると、かかる方法を実施するコンピューター実行可能命令を含むコンピュータープログラム製品が開示される。
【００２１】
本発明の更なる態様及び実施形態は、従属請求項において開示されており、これらに限定されないが、下記の説明、図面及び実施例から理解することができる。
【００２２】
添付の図面は、本発明の実施の形態を説明するとともに、それらの更なる理解を伝えるものとする。この説明と関連して、添付の図面は、本発明の概念及び原理の説明として機能を果たす。他の実施形態及び明言した利点の多くは、図面に関連して導き出すことができる。図面の要素は、必ずしも互いに対して縮尺を調整されているわけではない。同一の機能的に等価で等しく作用する特徴部及び構成要素は、特に明記しない限り、図面の各図において同じ参照符号で表わされる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の方法による疾患用のマーカーを発見する概念を概略的に示す図である。
【図２】本発明の方法による疾患用のマーカーを発見する概念を概略的に示す図である。
【図３】本発明の方法による疾患用のマーカーを発見する概念を概略的に示す図である。
【図４】本発明の実施例１で決定するような、増加距離（Ｄ）でのＤＮＡメチル化と遺伝子発現との間の関連に関するシムズ有意水準（ＳＬ）間の関係を示す図である。
【図５】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図６】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図７】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図８】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図９】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１０】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１１】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１２】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１３】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１４】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１５】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１６】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１７】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１８】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図１９】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図２０】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【図２１】本発明の実施例２で言及及び獲得したデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（定義）
特に定義しない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同義である。
【００２５】
「核酸分子」という用語は、定義された配列を有するポリヌクレオチド分子を指す。核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ヌクレオチド類似体分子、並びに、ヌクレオチド類似体又はｃＤＮＡが組み込まれたＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子等の、それらの組合せ及び誘導体を含む。
【００２６】
「核酸配列情報」という用語は、核酸分子の配列から得ることができる情報、例えば配列自体又は参照配列と比較した場合の配列の変動、に関する。
【００２７】
「突然変異」という用語は、参照配列と比較した場合の配列の変動に関する。突然変異は、例えば、１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失、１つ若しくは複数のヌクレオチドの挿入、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの置換、１つのヌクレオチド若しくは複数のヌクレオチドの配列の重複、１つのヌクレオチド若しくは複数のヌクレオチドの配列の転座、及び、特に一塩基多型（ＳＮＰ）に関する。
【００２８】
本発明において、「試料」は、患者の少なくともエピジェネティックな情報及び／又はトランスクリプトームに関する情報を含む試料である。試料の例は、細胞、組織、生検標本、体液、血液、尿、唾液、痰、血漿、血清、細胞培養上清、拭き取り標本等である。
【００２９】
エピゲノミクスプロファイルは、患者において起こり得る全てのエピゲノム修飾、即ち、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化等、の多数に相当する。
【００３０】
トランスクリプトミクスプロファイルは、全ての転写された核酸、即ち、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ等、の多数に相当する。
【００３１】
末梢血は、患者内の血液の循環プールを指す。
【００３２】
幾つかの実施形態によれば、本発明の方法における患者は、脊椎動物、より好ましくは哺乳類であり、ヒト患者が最も好ましい。
【００３３】
本発明内の脊椎動物は、ヒトを含む哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類を始めとする椎骨を有する動物を指す。従って、本発明は、人間医学ばかりでなく、獣医学にも適している。
【００３４】
次世代シーケンシングと称される核酸を配列決定する新規で非常に効率的な方法は、大規模なゲノム解析の可能性を開いた。「次世代シーケンシング」又は「ハイスループットシーケンシング」という用語は、シーケンシングプロセスを並列処理して、一度に数千又は数百万もの配列を生み出すハイスループットシーケンシング技術を指す。その例には、マッシブリーパラレルシグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、ポロニー（Ｐｏｌｏｎｙ）シーケンシング、４５４パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子シーケンシング、単一分子ＳＭＲＴ（商標）シーケンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）シーケンシング、ナノポアＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、アンプリコンシーケンシング、ＧｎｕＢｉｏが挙げられる。
【００３５】
本発明を例示的に詳細に記載する前に、本発明は、本明細書中に記載する方法のプロセス工程の特定の構成要素部分に限定されないことを理解すべきである。というのは、かかる方法は変動し得るからである。また、本明細書中で使用する専門用語は、特定の実施形態についてのみ記述するためのものであり、限定的であることを意図していないことも理解すべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈が明らかにそうでない場合を指示しない限りは、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、単数及び／又は複数の指示対象を含むことに留意されたい。例えば、「ａ」という用語は、本明細書中で使用する場合、単一の実体として、又は「１つ以上」の実体の意味で理解され得る。文脈が明らかにそうでない場合を指示しない限りは、複数形は、単数及び／又は複数の指示対象を含むことも理解すべきである。更に、数値によって区切られるパラメーター範囲が付与される場合は、その範囲は、これらの限界値を含むとされることを理解すべきである。
【００３６】
第１の側面において、本発明は、患者由来の疾患に関するマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料及び罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること及び／又はそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び／又は前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料の両方において、前記エピゲノミクスプロファイル及び／又は前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定することを含む、方法に関する。
【００３７】
従って、この第１の側面では、少なくとも２つの異なる試料を得て、これらの試料を、エピゲノミクスプロファイル、トランスクリプトーム又はその両方に関して解析することができる。これは、例示的な図１及び図２に概略的に示される。
【００３８】
図１によれば、２つの試料、即ち、罹患組織１、例えば心筋、由来の１つの試料及び末梢血２由来の１つの試料が、例えばヒトから、提供される。両方の試料について、エピゲノミクスプロファイル３及びトランスクリプトーム４を得て、本発明の方法で解析して、１つ以上のマーカー５を得る。代替法として、２つの試料が提供される場合に、エピゲノミクスプロファイル３又はトランスクリプトーム４のみを得て、解析することができる（図示していない）。続いて、好ましくは、かかる場合に両方の試料からエピゲノミクスプロファイル３又はトランスクリプトーム４の一方のみを解析する。即ち、一方の試料からのエピゲノミクスプロファイル３を解析せず、他方の試料からのトランスクリプトーム４を解析しない。
【００３９】
図２に示す代替法において、同様に２つの試料、即ち、罹患組織１、例えば心筋、由来の１つの試料及び末梢血２由来の１つの試料が、例えばヒトから、提供される。しかしながら、両方の試料について、エピゲノミクスプロファイル３のみを得て、本発明の方法で解析して、１つ以上のマーカー５を得る。当然、図２に示すスキームにおいて、同様に、エピゲノミクスプロファイル３の代わりにトランスクリプトーム４のみを解析することも可能である。
【００４０】
第２の側面において、本発明は、患者由来の疾患に関するマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料又は罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料又は前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること及びそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及びトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料又は前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のいずれかにおいて、前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定することを含む、方法に関する。
【００４１】
従って、この第２の態様では、少なくとも１つ試料が得られるが、それらは異なる供給源由来ではない。次に、この試料を、エピゲノミクスプロファイル及びトランスクリプトームの両方に関して解析する。これは、例示的な図３に概略的に示される。
【００４２】
図３によれば、１つの試料、即ち、罹患組織１、例えば心筋、由来の１つの試料が、例えばヒトから、提供される。この試料について、エピゲノミクスプロファイル３及びトランスクリプトーム４の両方を得て、本発明の方法で解析して、１つ以上のマーカー５を得る。しかしながら、当然、同様にこの方法における罹患組織１由来の１つの試料の代わりに、末梢血２由来の１つの試料を提供することも可能である。
【００４３】
本発明における疾患は、特に限定されない。幾つかの実施形態によれば、本発明の疾患は、非感染性疾患、特に心血管疾患、である。幾つかの実施形態によれば、疾患は、心不全（ＨＦ）及び／又は拡張型心筋症（ＤＣＭ）である。この場合、罹患組織の試料は、心筋組織から得ることができる。
【００４４】
試料の入手もまた、特に限定されないが、非侵襲的であることが好ましく、例えば、在庫、保管庫等から採取される。
【００４５】
更に、エピゲノミクスプロファイルの獲得並びにトランスクリプトームの解析も、特に限定されず、シーケンシング、ビーズアレイ又はマイクロアレイ技術を始めとする既知の手段を使用して、適切に実行することができる。
【００４６】
また、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームとの比較は、特に限定されず、いかなる形でも、例えば演算プログラム等を使用して、実施することができる。更に、エピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームの変化は、特に限定されない。幾つかの実施形態によれば、変化は、高メチル化及び／又は低メチル化及び／又はクロマチンマークの変化及び／又はＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、非コードＲＮＡ等）発現レベルの変化、例えば、ＲＮＡ発現レベルの増加又は減少であり、ここで、全ての組合せ、例えば、ＲＮＡ発現レベルの減少若しくは増加と組み合わせた高メチル化、又はＲＮＡ発現レベルの減少若しくは増加と組み合わせた低メチル化、が可能である。
【００４７】
対照も同様に限定されず、患者に基づいて、適切に選択することができる。例えば、対照は、前記疾患と診断されていない１人以上の患者から、又は前記疾患に罹患していない公に知られている対照から得ることができる。幾つかの実施形態によれば、前記１つ以上の変化は、前記患者の核酸配列情報、例えばゲノム、に関して決定される。幾つかの実施形態によれば、患者はヒトである。幾つかの実施形態によれば、患者はヒトであり、対照は、例えばＧｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚによって提供されるような参照ゲノムｈｇ１９（ｈｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇｌ９／ｂｉｇＺｉｐｓ／及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ｇｒｃ／ｈｕｍａｎ／からダウンロード可能なＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）である。遺伝子領域は、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９及びＧｅｎｃｏｄｅ１９遺伝子モデル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇ／）に基づく。
【００４８】
幾つかの実施形態によれば、前記末梢血及び／又は前記罹患組織の複数の試料は、前記疾患と診断された患者から入手又は提供される。このようにして、発見したマーカーの統計学的有意性を改善することができる。
【００４９】
更なる側面において、本発明は、患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の前記末梢血及び／又は前記罹患組織、例えば心筋、の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームを獲得又は準備すること；及び
前記第１又は第２の側面の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を特定することを含む、方法に関する。
【００５０】
同様に、試料の入手は、特に限定されないが、非侵襲性であることが好ましく、例えば、在庫、保管庫等から採取される。
【００５１】
幾つかの実施形態によれば、前記罹患組織は、心筋であり、好適には、心不全及び／又は拡張型心筋症である。
【００５２】
心不全及び／又は拡張型心筋症に関して、これらの疾患のリスクの決定の改善のためのマーカーのリストが、第１の側面及び第２の側面の本発明の方法によって見出された。これらを以下の表に示す。
【００５３】
従って、幾つかの実施形態によれば、心不全及び／又は拡張型心筋症のリスクの決定のための前記少なくとも１つのエピジェネティックなマーカー及び／又はトランスクリプトームマーカーは、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、かつＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表１、好ましくは表１ａ、特に好ましくは表１ｂ、に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において高／低メチル化を示し、かつＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表２、好ましくは表２ａ、特に好ましくは表２ｂ、に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表３、好ましくは表３ａ、特に好ましくは表３ｂ、に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表４に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び該参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表５に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表６に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、該参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び該参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表７に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表８に開示する配列から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、前記参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表９に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され、及び／又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において異常メチル化を示し、かつＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表１０に開示するＡＮＦ及び／又はＢＮＰ遺伝子座及び／又は配列から選択される。表１、表１ａ、表１ｂ、表２、表２ａ、表２ｂ、表３、表３ａ、表３ｂ、表４、表６、表８及び表１０において、配列は、参照ゲノムｈｇ１９に関して、各々の染色体（ｃｈｒ．）における開始という表題の欄における位置と終了という表題の欄における位置との間（開始及び終了の表題の下で付与される位置を含む）の核酸配列である。更に、表１、表１ａ、表１ｂ、表２、表２ａ、表２ｂ、表３、表３ａ及び表３ｂにおいて、配列は、簡素化のために、第１欄及び第２欄において並びに第４欄び第５欄において付与されている。即ち、１つの配列は、第１欄及び第２欄における位置の間にあるもの及びそれらの位置を含むものであり、１つの配列は、第４欄及び第５欄における位置の間にあるもの及びそれらの位置を含むものである。表５、表７及び表９は、末梢血において統計学的に有意な異常メチル化（ｄｙｓｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）を示す参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｒｉ４５０Ｋデータベースに関して異なるｃｐｇ  ＩＤ及び末梢血において統計学的に有意な異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関する位置を表わす。
【００５４】
本発明者らは、高／低メチル化が、両方の鎖に、その結果として両方の鎖上の遺伝子に、影響を及ぼし得ることを見出した。本発明者らは、高／低メチル化が、また、遺伝子領域自体に影響を及ぼすだけでなく、詳細には１０，０００塩基対の領域内の、より詳細には１，０００塩基対の領域内の、周囲部位にも影響を及ぼすことを、更に見出した。それにより、コード領域だけでなく、該コード領域の周囲の領域、例えばプロモーター領域、等もまた、影響され得る。従って、最も有意な結果が、非常に限定された領域のみで見出され得る一方で、高／低メチル化は、例えば図４にも示されるように、１０，０００塩基対以内の有意性における有意な変化を伴わずに、前記位置付近の広い領域内で観察された。従って、表１、表２、表３、表４、表６、表８及び表１０は、メチル化の変化、即ち高／低メチル化、によって影響される遺伝子に関して、開始における−１０，０００塩基対及び終了における＋１０，０００の遺伝子範囲に関する各々の範囲を表わすのに対して、表１ａ、表２ａ及び表３ａは、影響される遺伝子の配列範囲を表わし、表１ｂ、表２ｂ及び表３ｂは、最も有意なメチル化の変化を表わす。
【００５５】
表１：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表１】
2019522997.tif 000003
【００５６】
表１ａ：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与される好ましいマーカー
【表１ａ】
2019522997.tif 000004
【００５７】
表１ｂ：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与される特に好ましいマーカー
【表１ｂ】
2019522997.tif 000005
【００５８】
表２：ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において高／低メチル化を示し、且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表２】
2019522997.tif 000006
2019522997.tif 000007
【００５９】
表２ａ：ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において高／低メチル化を示し、且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与される好ましいマーカー
【表２ａ】
2019522997.tif 000008
2019522997.tif 000009
【００６０】
表２ｂ：ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において高／低メチル化を示し、且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与される特に好ましいマーカー
【表２ｂ】
2019522997.tif 000010
2019522997.tif 000011
2019522997.tif 000012
【００６１】
表３：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において高／低メチル化を示す（参照ゲノムｈｇ１９に関して）、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表３】
2019522997.tif 000013
2019522997.tif 000014
【００６２】
表３ａ：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示す（参照ゲノムｈｇ１９に関して）、開始及び終了を伴う核酸配列として付与される好ましいマーカー
【表３ａ】
2019522997.tif 000015
2019522997.tif 000016
【００６３】
表３ｂ：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示す（参照ゲノムｈｇ１９に関して）、開始及び終了を伴う核酸配列として付与される特に好ましいマーカー
【表３ｂ】
2019522997.tif 000017
2019522997.tif 000018
【００６４】
メチル化に関するＩＤ番号（メチル．ＩＤ）は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０  ｖ１．２  マニフェスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｉｎｆｉｎｉｕｍ＿ｈｕｍａｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０＿ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｆｉｌｅｓ．ｈｔｍｌ）において列挙されるようなＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐ  ＫｉｔプローブＩＤを指し、遺伝子に関する参照ゲノムに関する個々の二重らせんストランドに対する好ましい読取り方向（ｓｔｒ．；＋又は−）並びに遺伝子名称、遺伝子アンサンブルＩＤ（遺伝子ＩＤ）及び染色体（ｃｈｒ．）は、表１、表１ａ、表１ｂ；表２、表２ａ、表２ｂ；並びに表３、表３ａ及び表３ｂに関して、それぞれ、表１ｃ；表２ｃ及び表２ｄ；並びに表３ｃにおいて見出される。また、開始及び終了は、括弧内の各々の表を用いて付与される。表２ｄに関して、領域全体が、メチル化及び発現レベルで有意に調節解除されることが示されているため、表２、それぞれ表２ａ及び表２ｂは、２つの表２ｃ及び表２ｄに分割されていることに留意すべきである。更に、遺伝子ＩＤ、遺伝子名称及び染色体は、また、表４、表６、表８及び表１０においても付与される。表５、表７及び表９において、メチル化の位置を表わす（核酸塩基又は対での核酸塩基のいずれかを表わす）ｃｐｇ  ＩＤは、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベースに関して付与され、染色体及び位置（ｐｏｓ）は、参照ゲノムに関して付与される。
【００６５】
表４：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す（参照ゲノムｈｇ１９に関して）、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表４】
2019522997.tif 000019
【００６６】
表４におけるマーカーは、特に独立した発見コホート（ＤＣＭ４１名及びＣＴＲＬ３１名）及び検証コホート（ＤＣＭ９名及びＣＴＲＬ２８名）における、統計学的に有意な、特に統計学的に最も有意なバリデートされた異常メチル化を末梢血において示す遺伝子の１０ｋｂ上流／下流のゲノム領域を表わす（ＤＣＭ＝拡張型心筋症、ＣＴＲＬ＝対照）。
【００６７】
表５：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベースに関するｃｐｇ  ＩＤとして付与されそして参照ゲノムｈｇ１９に関して付与される位置（ｐｏｓ）として付与される、マーカー
【表５】
2019522997.tif 000020
【００６８】
表５におけるマーカーは、特に独立した発見コホート（ＤＣＭ４１名及びＣＴＲＬ３１名）及び検証コホート（ＤＣＭ９名及びＣＴＲＬ２８名）における、統計学的に有意な、特に統計学的に最も有意なバリデートされた異常メチル化を末梢血において示す特徴的なｃｐｇ  ＩＤ及びゲノム位置（特に、上位１０）を表わす。
【００６９】
表６：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す（参照ゲノムｈｇ１９に関して）、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表６】
2019522997.tif 000021
【００７０】
表６におけるマーカーは、特に独立した発見コホート（ＤＣＭ４１名及びＣＴＲＬ３１名）及び検証コホート（ＤＣＭ９名及びＣＴＲＬ２８名）における、発見コホート及び検証コホートにおける８５％を上回る曲線下の面積（ＡＵＣ）を有する、バリデートされた異常メチル化を末梢血において示す遺伝子の１０ｋｂ上流／下流のゲノム領域を表わす。
【００７１】
表７：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベースに関するｃｐｇ  ＩＤとして付与されそして参照ゲノムｈｇ１９に関して付与される位置（ｐｏｓ）として付与される、マーカー
【表７】
2019522997.tif 000022
【００７２】
表７におけるマーカーは、末梢血において、特に、発見コホート及び検証コホートにおいて８５％を上回る曲線下の面積（ＡＵＣ）を有する独立した発見コホート（ＤＣＭ４１名及びＣＴＲＬ３１名）及び検証コホート（ＤＣＭ９名及びＣＴＲＬ２８名）において、バリデートされた異常メチル化を示す特徴的なｃｐｇ  ＩＤ及びゲノム位置を、表わす。
【００７３】
表８：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す（参照ゲノムｈｇ１９に関して）、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表８】
2019522997.tif 000023
2019522997.tif 000024
2019522997.tif 000025
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2019522997.tif 000029
【００７４】
表８におけるマーカーは、末梢血において、特に、発見コホート及び検証コホートにおける８０％を上回る曲線下の面積（ＡＵＣ）を有する独立した発見コホート（ＤＣＭ４１名及びＣＴＲＬ３１名）及び検証コホート（ＤＣＭ９名及びＣＴＲＬ２８名）において、バリデートされた異常メチル化を示す遺伝子の１０ｋｂ上流／下流のゲノム領域を表わす。
【００７５】
表９：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベースに関するｃｐｇ  ＩＤとして付与されそして参照ゲノムｈｇ１９に関して付与される位置（ｐｏｓ）として付与される、マーカー
【表９】
2019522997.tif 000030
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【００７６】
表９におけるマーカーは、末梢血において、特に、発見コホート及び検証コホートにおける８０％を上回る曲線下の面積（ＡＵＣ）を有する独立した発見コホート（ＤＣＭ４１名及びＣＴＲＬ３１名）及び検証コホート（ＤＣＭ９名及びＣＴＲＬ２８名）において、バリデートされた異常メチル化を示す特徴的なｃｐｇ  ＩＤ及びゲノム位置を表わす。
【００７７】
表１０：ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において異常メチル化を示し、且つ（参照ゲノムｈｇ１９に関して）ＲＮＡ発現レベルと関連付けられる、開始及び終了を伴う核酸配列として付与されるマーカー
【表１０】
2019522997.tif 000035
【００７８】
表１０におけるマーカーは、ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において異常メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられるマーカーを表わし、遺伝子ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢを表わす。ＡＮＦ及びＢＮＰ遺伝子座は、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）をコードし、後者は、心不全に関する現在の至適基準のバイオマーカーを表わす。本発明者らは、本発明の実施例２に関して、図１７にも示すように、心臓組織（赤色棒）及び末梢血（青色棒）由来のＤＮＡにおいて同じ方向の異常メチル化を見出した。予想どおり、ＮＰＰＡ（ＡＮＦ）及びＮＰＰＢの遺伝子発現は、組織において反対の方向で有意に調節不全にされ（アップレギュレーション、両方に関してｐ＝０．０００１、データは示していない）、ＮＰＰＢの転写物レベルは、患者の血漿中で測定されるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルと高度に相関している（Ｒ２＝０．５５）。従って、両方の遺伝子座のＤＮＡメチル化及びＲＮＡ発現は、心不全に関するバイオマーカーとして機能を果たし得る。
【００７９】
図１７は、図中で、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢ遺伝子座のＤＮＡメチル化を示す。ナトリウム利尿ペプチドは、ＨＦにおける至適基準のバイオマーカーである。ＤＣＭにおいて、５’ＣｐＧの低メチル化は、発現の増加と関連付けられる。血液中では、組織間保存（ｃｒｏｓｓ−ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を表わす同じ方向の異常メチル化が見られる。心不全に関するバイオマーカーとして機能を果たし得る１０ｋｂ上流／下流ウィンドウを有するＡＮＦ（ＮＰＰＡ）及びＮＰＰＢ遺伝子座に関するＨｇ１９座標を表１０に示す。従って、心不全に関するバイオマーカーとしてのＡＮＦ及びＢＮＰ遺伝子座のＤＮＡメチル化及びＲＮＡ発現の使用法も開示される。
【００８０】
表１ｃ：追加のデータを伴う表１、表１ａ及び表１ｂの概要
【表１ｃ】
2019522997.tif 000036
2019522997.tif 000037
【００８１】
表２ｃ：追加のデータを伴う表２、表２ａ及び表２ｂ（部分１）の概要
【表２ｃ】
2019522997.tif 000038
2019522997.tif 000039
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【００８２】
表２ｄ：追加のデータを伴う表２、表２ａ及び表２ｂ（部分２）の概要
【表２ｄ】
2019522997.tif 000048
2019522997.tif 000049
【００８３】
表３ｃ：追加のデータを伴う表３、表３ａ及び表３ｂの概要
【表３ｃ】
2019522997.tif 000050
2019522997.tif 000051
2019522997.tif 000052
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2019522997.tif 000055
【００８４】
幾つかの実施形態によれば、複数のマーカーの存在が特定され、その結果、心不全及び／又は拡張型心筋症のリスクは、より正確に決定することができる。
【００８５】
本発明の更なる側面は、患者における心不全及び／又は拡張型心筋症に関するマーカーとしての、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、好ましくは表１ａ、表２ａ、表３ａ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、特に好ましくは表１ｂ、表２ｂ、表３ｂ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、例えば、表１ａ、表２ａ及び／又は表３ａ、例えば、表１ｂ、表２ｂ及び／又は表３ｂにおけるマーカーの使用に関する。
【００８６】
更に、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、好ましくは表１ａ、表２ａ、表３ａ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、特に好ましくは表１ｂ、表２ｂ及び／又は表３ｂ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、例えば、表１ａ、表２ａ及び／又は表３ａ、例えば、表１ｂ、表２ｂ及び／又は表３ｂ、に開示するマーカーを含むデータバンクが開示される。
【００８７】
幾つかの実施形態によれば、データバンクは、遠隔位置に存在してもよく、地方のクライアントから問い合わせされてもよい。
【００８８】
本発明のデータバンクは、様々な用途で使用することができる。それゆえ、例えば、本発明の態様によれば、データバンクは、患者における心不全及び／又は拡張型心筋症のリスクを決定する方法において使用することができる。
【００８９】
また、本発明の第１及び／又は第２の側面によって獲得されるマーカーを含むデータバンクが開示される。
【００９０】
また、本発明は、更なる側面において、患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の末梢血及び／又は罹患組織の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル及び／又はトランスクリプトームのデータを獲得又は準備すること、及び
前記第１及び／又は第２の側面の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を特定すること、
を含む、方法に関する。
【００９１】
幾つかの実施形態によれば、疾患は、心不全（ＨＦ）及び／又は拡張型心筋症（ＤＣＭ）であり、前記第１及び／又は第２の側面の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーは、少なくとも、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、好ましくは表１ａ、表２ａ、表３ａ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、特に好ましくは表１ｂ、表２ｂ、表３ｂ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、例えば、表１ａ、表２ａ及び／又は表３ａ、例えば、表１ｂ、表２ｂ及び／又は表３ｂに開示されるマーカーである。
【００９２】
更なる側面において、本発明は、実行されると,患者における疾患のリスクを決定する方法を、実施するコンピューター実行可能命令を含むコンピュータープログラム製品に関する。
【００９３】
幾つかの実施形態において、コンピュータープログラム製品は、上記方法を実行するコンピュータープログラムのプログラムコマンド又はプログラムコードが記憶されているものである。幾つかの実施形態によれば、コンピュータープログラム製品は、記憶媒体である。
【００９４】
また、本発明は、患者における疾患のリスクを決定する方法におけるコンピュータープログラム製品の使用に関する。
【００９５】
心不全及び／又は拡張型心筋症と診断された患者の予後診断方法及び／又は該患者のモニタリング方法及び／又は該患者の薬物に基づく治療に役立つ方法が更に開示され、ここで、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、好ましくは表１ａ、表２ａ、表３ａ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、特に好ましくは表１ｂ、表２ｂ、表３ｂ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、例えば、表１ａ、表２ａ及び／又は表３ａ、例えば、表１ｂ、表２ｂ及び／又は表３ｂにおいて開示されたマーカーが使用される。表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、好ましくは表１ａ、表２ａ、表３ａ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、特に好ましくは表１ｂ、表２ｂ、表３ｂ、表４、表５、表６、表７、表８、表９及び／又は表１０、例えば、表１ａ、表２ａ及び／又は表３ａ、例えば、表１ｂ、表２ｂ及び／又は表３ｂに開示されたマーカーは、疾患の経過の予後診断及び疾患のモニタリングを可能にし、疾患の治療上の処置中に、薬物処方等に関する結論を導き出すのに役立ち得る。
【実施例】
【００９６】
ここで、本発明の幾つかの実施例を参照して、本発明について詳細に記載する。しかしながら、これらの実施例は例示であり、本発明の範囲を限定しない。
【００９７】
前部において、幾つかの臨床的観点を、実施例に関連して簡潔に論述している。
【００９８】
臨床的視点
１）新たな事項は何か？
・マルチオミクス研究が、心血管疾患における機能的パターンの検出を可能にすることを本出願は示している。
・エピジェネティックなパターンは、拡張型心筋症に起因する心不全と関連付けられる。更に、マルチオミクス研究設計により、心血管疾患における接続機能層の検出が可能となった。
・個別のゲノム領域のＤＮＡメチル化は、心臓組織と末梢血との間で保存される。ＤＮＡメチル化は、新たな種類の心不全バイオマーカーを表わすことができる。
・ナトリウム利尿因子ＡＮＰ及びＢＮＰの転写調節は、保存されたＤＮＡメチル化と関連付けられる。
【００９９】
２）臨床的意義は何か？
エピジェネティックなメカニズムが慢性心不全に関与し、それは、転換研究（translational research）に関する新たな視点を開放する。診断用の、予後予想用のバイオマーカーとしての及び将来の薬物標的としての調査には、更なる注意が必要である。
【実施例１】
【０１００】
［材料及び方法］
［患者の登録及び研究設計］
本研究は、ハイデルベルグ大学医学部の倫理委員会によって承認されている。参加者は全て、インフォームドコンセントの書面を提出している。非虚血性拡張型心筋症（ＤＣＭ）の診断は、冠動脈造影法によって決定された関連性のある冠動脈疾患（ＣＡＤ）を排除することによって確認された。心臓弁膜症は、ｃＭＲＩ及び／又は心エコー検査によって排除し、心筋炎／炎症性ＤＣＭは、組織病理学検査によって排除した。管理不良高血圧、心筋炎、定期的なアルコール消費又は心毒性化学療法の前歴のある患者もまた排除した。一連の収縮心不全の全体を包含させるために、症候性である初期疾患段階（ＥＦ＜５５％）（呼吸困難、浮腫／うっ血）も包含した。
【０１０１】
ｎ＝１３５のＤＣＭ患者のスクリーニング後に、ｎ＝３８が、全ての包含及び排除の判断基準を満たし、ハイスループット解析に利用可能な十分な量の高品質の左心室生検材料（ＬＶ自由壁）及び末梢血試料を有した。対照ＬＶ生検検体は、正常な収縮機能及び拡張機能を有し、かつ冠動脈造影法及び免疫組織病理学検査によって判断されるような関連性のある血管障害又は急性／慢性臓器拒絶反応に関する形跡を有さない、少なくとも６ヶ月前の心臓移植後の患者（ｎ＝３１）から入手した。全血試料に関する更なる同性別及び同年齢の対照（ｎ＝３１）は、他の心血管疾患に関する形跡を伴わない正常な収縮左心室機能及び拡張左心室機能を有した。
【０１０２】
更に、更なるバリデーションの目的で、心臓移植を受けたｎ＝１１のＤＣＭ患者の左心室心筋及びこれまで健常な交通事故の被害者由来の左心室心筋（ｎ＝５）を包含した。
【０１０３】
平均して、患者は５４歳であり、疾患の発症は、組み入れの１１ヶ月前であった。ＤＣＭ患者の詳細な基本的及び臨床的特徴を下記の表１１に要約する。
【０１０４】
表１１：実施例における患者の詳細な情報
【表１１】
2019522997.tif 000056
2019522997.tif 000057
【０１０５】
［生体材料の加工処理］
生検検体は、標準プロトコルを使用して、心臓カテーテル法を受けたＤＣＭ患者又は心臓移植患者（対照）由来の自由左心室壁（ＬＶ）の先端部から入手した。生検材料を即座に氷冷生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）中で洗浄して、即座に移動して、ＤＮＡ又はＲＮＡを抽出するまで、液体窒素中で保管した。生検材料の識別診断（組織病理学検査）後、残存する材料を均等に解体して、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉキットを使用して、生検材料及び末梢血から単離した。総ＲＮＡは、製造業者のプロトコル（Qiagen社、ドイツ）に従って、ＲＮｅａｓｙキットを使用して、生検材料及び末梢血から抽出した。ＲＮＡ純度及び濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国バークシャー）を使用して、Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｉｃｏアッセイチップを用いて決定した。
【０１０６】
ＤＮＡメチル化プロファイリング及びＲＮＡシーケンシング
メチル化プロファイルは、Ｍ．Ｂｉｂｉｋｏｖａら：  Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ  ＣｐＧ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，９８（４）：ｐ．２８８−９５に記載された手順に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋメチル化アッセイを使用して測定した。本発明者らは、各患者から、ＤＮＡ（血液）２００ｎｇ及びＤＮＡ（生検材料）２００ｎｇを測定に付した。
【０１０７】
［品質管理（ＱＣ）及び信頼性のない測定値の除去］
１０％を超える試料において０．０５を上回る検出ｐ値を有するメチル化部位は、解析から除去した。Ｈａｓｔｉｅ  Ｔ，Ｔ．，Ｒ，Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，Ｂ  Ｃｈｕ，Ｇ，ｉｍｐｕｔｅ：ｉｍｐｕｔｅ：Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ，Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４６．０，２０１６に記載されているように、試料の１０％未満において０．０５を上回る検出ｐ値を有するメチル化レベルは、ｋｎｎインピュテーションによりインピュテーションした。メチル化測定値に対するゲノム変異の影響を低減するために、本発明者らは、全ゲノムシーケンシングによって５０ｂｐのプローブ領域内で発見コホートの１０％を超えるＤＣＭ患者において変異体を見出したメチル化部位全てを排除した。１０％未満のＤＣＭ患者における変異体を有するメチル化レベルはインピュテーションした。本発明者らは、Ｘ染色体及びＹ染色体上のプローブ並びにＣｈｅｎら（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ａ．ら．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＣｐＧｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１３．８（２）：ｐ．２０３−９）によって同定された非標的ＤＮＡとクロスハイブリダイズするプローブ全てを更に除去して、ＱＣに合格した３９４，２４７個のメチル化部位を得た。予測性能は、例えば、用いたハイスループットＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐスクリーニングアレイから単一メチル化部位に関する標的解析アプローチへ切り替えた場合に更に高められ得ることに留意すべきである。
【０１０８】
［全ゲノムシーケンシング］
総ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）１μｇを、ＣｏｖａｒｉｓＴＭ  Ｓ２２０システムを使用して、２００サイクル／バーストでそれぞれ６０秒の２回の処理（ピーク電力＝１４０、デューティ比＝１０）を適用して断片化した。断片化されたｇＤＮＡ  ５００ｎｇを採取して、製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国サンディエゴ）に従って、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ試料作製キットを使用して、全ゲノムライブラリーを作製した。シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００で、シーケンシングフローセルの４つのレーンで、ＴｒｕＳｅｑ  ＳＢＳ  Ｋｉｔ  ｖ３を使用して、またペアードエンドシーケンシングに関して１００ｂｐを２回読み取って実施した。
【０１０９】
生シーケンシング読取りの逆多重化及びｆａｓｔｑファイルの作成は、ＣＡＳＡＶＡ  ｖ.１．８２を使用して行なった。続いて、生読取りデータを、ｂｕｒｒｏｗｓ−ｗｈｅｅｌｅｒのアラインメントツール（ＢＷＡ  ｖ．０．７．５ａ）を用いてヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９、ｈｔｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／）にマッピングして、重複読取りデータに印を付けた（Ｐｉｃａｒｄ−ｔｏｏｌｓ  １．５６）（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）。次に、本発明者らは、各々の最良の実施ガイドライン（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇａｔｋ／ｇｕｉｄｅ／ｂｅｓｔ−ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に記載されている変異体再較正（ｖ．２．８−１−ｇ９３２ｃｄ３ａ）及び変異体コーリング（ｖ．３．３−０−ｇ３７２２８ａｆ）に関する推奨プロトコルに従って、Ｍ．Ａ．ＤｅＰｒｉｓｔｏら：Ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２０１１，４３（５）：ｐ．４９１−８に記載されているように、Ｇｅｎｏｍｅ−Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｔｏｏｌキットを使用した。
【０１１０】
［正規化並びに技術的変動及びバッチの影響の除去］
望まざる技術的変動を除去するために、本発明者らは、全てのメチル測定値に亘って、修正したｄａｎｅｓの正規化手順を適用した。ｄａｎｅｓの正規化は、ｗａｔｅＲｍｅｌｏｎパッケージの一部である。正規化手順は、赤色チャネル及び緑色チャネルの両方のメチル化された生シグナル強度及びメチル化されていない生シグナル強度のアレイ間の分位点正規化に基づき、従って、色素の偏りの原因にもなる。しかしながら、遺伝子発現データに関して当初開発されたアレイ間の分位点正規化は、全体的なメチル化分布が、試料、組織及び疾患状態間で大きく異なり得るため、メチル化データに関して論争の的である。その結果、本発明者らは、アレイ間の正規化に関して、分位点正規化を適用せず、代わりにｃｙｃｌｉｃｌｏｅｓｓの正規化を適用することによって、ｄａｎｅｓの正規化アプローチを修正した。ｃｙｃｌｉｃｌｏｅｓｓの正規化は、効果及び意図において分位点正規化と類似しているが、極端な事例を劇的には正規化せず、主な分布差を保ったままであるという利点を有する。
【０１１１】
バッチの影響を考慮するために、本発明者らは、総計で８個の試料の種々のチップ上について二重反復測定を実施し、Ｍ．Ｅ．Ｒｉｔｃｈｉｅら：ｌｉｍｍａ  ｐｏｗｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２０１５，４３（７）：ｐ．ｅ４７に記載されているように、ｌｉｍｍａパッケージからのｒｅｍｏｖｅＢａｔｃｈＥｆｆｅｃｔ機能のみを使用して、二重反復に基づいて、異なる解析バッチのメチル化値を橋渡しするために二重反復を使用した。バッチブリッジング後、その後の統計解析前に二重反復測定値を平均した。
【０１１２】
［エピゲノムワイドな関連解析］
調節解除されたメチル化部位は、上述したように、ｌｉｍｍａパッケージを使用して、年齢及び性別を含む線形モデリング及び調整ｔ検定によって同定された。
【０１１３】
また、発見コホートにおける潜在的なゲノムインフレーションを補正するために、本発明者らは、メチル化測定値に関する主成分解析を実施して、０．０５以下のＦＤＲ（偽発見率）での既知の交絡因子（例えば、解析日等の技術的交絡因子及び生物学的交絡因子）と関連付けられる主成分（ＰＣ）を同定した。続いて、調節解除されたメチル化部位は、ｌｉｍｍａパッケージを使用して、共変数として年齢及び性別並びに全ての同定されたＰＣを含む線形モデリング及び調整ｔ検定によって、同定された。統計解析は、Ｒ−３．２．２で実行した。有意水準のＦＤＲ補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順を使用して実行した。
【０１１４】
［トランスクリプトーム解析］
ＲＮＡｓｅｑライブラリーは、ＴｒｕｅＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用して作成され、シーケンシングは、ＨｉＳ−ｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）シーケンサーで２×７５ｂｐで実施した。鎖形成されていない（Ｕｎｓｔｒａｎｄｅｄ）ペアードエンド生読取りファイルを、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９及びＧｅｎｃｏｄｅ  １９遺伝子モデル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇ／）を使用して、ＳＴＡＲ  ｖ２．４．１ｃを用いてマッピングした。一意的にマッピングされた読取りのみが、サブリードのｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓプログラム（サブリードバージョン１．４．６．ｐ１）を使用して遺伝子に計数された。統計解析に先立って、非常に低い発現レベル（平均読取り１以下、試料の５０％未満で読取りが検出される）の遺伝子を除去した。計数データは、ｅＱＴＬ（発現量的形質遺伝子座）に関して、Ｓｈａｂａｌｉｎ，Ａ．Ａ．のオリジナルのＭａｔｒｉｘＥＱＴＬ刊行物：Ｍａｔｒｉｘ  ｅＱＴＬ：ｕｌｔｒａ  ｆａｓｔ  ｅＱＴＬ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｉａ  ｌａｒｇｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２．２８（１０）：ｐ．１３５３−８によって、推奨されている分散安定化変換の改良法であるＬｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｗ．Ｈｕｂｅｒ，ａｎｄ  Ｓ．Ａｎｄｅｒｓ：Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ＤＥＳｅｑ２，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，２０１４，１５（１２）：ｐ．５５０に記載されているｒｌｏｇ正規化によって、正規化された。
【０１１５】
［エピゲノム−トランスクリプトーム関連解析］
メチル化部位と遺伝子発現との間のｅＱＴＬ解析は、（メチル化レベルでプロファイリングした総計３８名のＤＣＭ患者及び３１名の対照中）生検試料からの高品質トランスクリプトームデータを獲得することができる３４名のＤＣＭ患者及び２５名の対照に実施した。ＭａｔｒｉｘＥＱＴＬ及び線形モデルを使用して、１９，４１８個の遺伝子の発現プロファイルを、品質管理を合格した３９４，２４７個の遺伝子の１０，０００ｂｐ上流及び下流の範囲並びに遺伝子本体領域における３１１，２２２個のメチル化部位と相関させた。ＲＮＡ発現レベルとの関連は、心筋試料を使用して実施した。
【０１１６】
［所定の定義を有するエピジェネティックな領域］
遺伝子本体及び隣接する非コード調節領域のＤＮＡメチル化は、遺伝子発現にとって重要な調節メカニズムであることが知られている。続いて、領域レベルに関する集約解析に関して、集約有意水準を、全てのメチル化遺伝子座に関してシムズの手順を使用して獲得した。というのは、Ｒ０ＤＬＡＮＤ，Ｅ．Ａ．：Ｓｉｍｅｓ’  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｉｓ  ‘ｖａｌｉｄ  ｏｎ  ａｖｅｒａｇｅ’，Ｂｉｏ−ｍｅｔｒｉｋａ，９３：ｐ．７４２−７４６に記載されているように、シムズの手順が、相関される有意水準に関しても、一般的に良好に機能を果たすことが分かっていたからである。ＤＮＡメチル化とＲＮＡ発現との間の有意な関連に関する距離を決定するために、関連に関する集約有意水準を、増加した距離にある遺伝子本体及び隣接する領域内の全てのメチル化遺伝子座に関して、ｓｉｍｅｓの手順を使用して獲得した。というのは、シムズの手順が、相関される有意水準に関しても、有意な関連に関する集約測定として一般的に良好に機能を果たすことが分かっていたからである。それらの結果を図４に示した。ここで、ＳＬは、シムズの有意水準であり、Ｄは、増加する距離でのＤＮＡメチル化と遺伝子発現との間の関連についての距離である。
【０１１７】
図４に示すように、１０，０００ｂｐまでは、距離０ｂｐからの差が、１未満の標準偏差であるため、１０，０００ｂｐから１００，０００ｂｐまで距離を増加したときに初めて、シムズの測定値（−ｌｏｇ１０シムズ有意水準）が有意に下降し始める（図中の水平線、標準偏差を推定するための置き換えを伴う１０倍の無作為試料採取によって推定されるように）。その結果、カットオフは、１０，０００ｂｐの距離で選択された。
【０１１８】
［エピジェネティックでトランスクリプトミックなマーカー定義］
発見コホートから、まず、分子レベル間（即ち、エピジェネティックでトランスクリプトミックな；Ｃａｔ．４）、組織間（即ち、心臓組織及び血液；Ｃａｔ．２及びＣａｔ．３）又は更にはその両方（Ｃａｔ．１）のいずれかにおいて、ＤＣＭにおけるメチル化プロファイルにおいて一致する調節不全を示す４つの異なるカテゴリーのバイオマーカー（Ｃａｔ．１〜Ｃａｔ．４）を同定した。
【０１１９】
以下のカテゴリー（Ｃａｔ．１〜Ｃａｔ．４）は、ＨＦ及びＤＣＭの分子マーカーについて記載している。
【０１２０】
Ｃａｔ．１ａは、ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、且つＨＦ／ＤＣＭにおいて調節解除される心筋における心臓関連の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと関連付けられるゲノム領域について記載している。遺伝子を表１２に示す。
【０１２１】
表１２：Ｃａｔ．１ａに関するデータ
【表１２】
2019522997.tif 000058
【０１２２】
Ｃａｔ．１ｂは、ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、且つＨＦ／ＤＣＭにおいて調節解除される心筋における未知の心臓関連の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルと関連付けられるゲノム領域について記載している。遺伝子を表１３に示す。
【０１２３】
表１３：Ｃａｔ．１ｂに関するデータ
【表１３】
2019522997.tif 000059
【０１２４】
Ｃａｔ．２は、ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、且つ染色体バンドにおいて、心臓特異的遺伝子とクラスター形成するゲノム領域について記載している。遺伝子を表１４に示す。
【０１２５】
表１４：Ｃａｔ．２に関するデータ
【表１４】
2019522997.tif 000060
【０１２６】
Ｃａｔ．３は、ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示すが、Ｃａｔ．１又はＣａｔ．２の範疇には入らないゲノム領域について記載している。２つのサブカテゴリーを同定した。
【０１２７】
Ｃａｔ．３ａは、心臓関連の遺伝子におけるゲノム領域に関する。遺伝子を表１５に示す。
【０１２８】
表１５：Ｃａｔ．３ａに関するデータ
【表１５】
2019522997.tif 000061
【０１２９】
Ｃａｔ．３ｂは、未知の心臓関連の遺伝子におけるゲノム領域に関する。遺伝子を表１６に示す。
【０１３０】
表１６：Ｃａｔ．３ｂに関するデータ
【表１６】
2019522997.tif 000062
2019522997.tif 000063
【０１３１】
Ｃａｔ．４は、ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において、相関される調節解除されたメチル化及びｍＲＮＡ発現パターンを示すゲノム領域について記載している。遺伝子を表１７に示す。
【０１３２】
表１７：Ｃａｔ．４に関するデータ
【表１７】
2019522997.tif 000064
【０１３３】
更に、下記カテゴリー（Ｃａ．５〜Ｃａ．７）は、更に同定されたＨＦ及びＤＣＭの分子マーカーについて記載している。
【０１３４】
Ｃａｔ．５は、ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し、且つ心筋においてｍＲＮＡ発現レベルと関連付けられるゲノム領域について記載している。遺伝子を表１８に示す。
【０１３５】
表１８：Ｃａｔ．５に関するデータ
【表１８】
2019522997.tif 000065
【０１３６】
Ｃａｔ．６は、ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において同調的なメチル化及び遺伝子発現変化を示し、また遺伝子レベルに関してＨＦ／ＤＣＭと関連付けられるゲノム領域について記載している。遺伝子を表１９に示す。
【０１３７】
表１９：Ｃａｔ．６に関するデータ
【表１９】
2019522997.tif 000066
【０１３８】
Ｃａｔ．７は、ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において同調的なメチル化及び遺伝子発現変化を示すゲノム領域について記載している。遺伝子を表２０に示す。
【０１３９】
表２０：Ｃａｔ．７に関するデータ
【表２０】
2019522997.tif 000067
2019522997.tif 000068
2019522997.tif 000069
【実施例２】
【０１４０】
方法及び結果（概要）：
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０を、生きている被験者の左心室生検材料及び全末梢血におけるＤＮＡメチル化の高密度のエピゲノムワイドなマッピングに使用した。ＲＮＡディープシーケンシングは、並行して同じ試料で実施した。全ての患者の全ゲノムシーケンシングにより、乱雑な遺伝子型誘導性メチル化コールの排除が可能となった。スクリーニング段階で、本発明者らは、ＤＣＭと有意に関連付けられる５９個のエピジェネティックな遺伝子座（ＦＤＲ補正ｐ≦０．０５）を検出し、それらのうちの３つが、ｐ≦５×１０−８でエピゲノムワイドな有意性に達した。これらの遺伝子座のうちの２７個（４６％）が、独立コホートにおいて再現可能であり、重要な心転写調節因子のエピジェネティックな調節の役割を強調する。段階的なマルチオミクス研究設計を使用して、本発明者らは、５１７個のエピジェネティックな遺伝子座のサブセットを、ＤＣＭ及び心臓遺伝子発現と関係付ける。更に、本発明者らは、組織間で保存される特徴的なエピジェネティックなメチル化パターンを同定し、これらのＣｐＧを心不全に関する新規なエピジェネティックなバイオマーカーとした。
【０１４１】
［材料及び方法］
（患者の登録及び研究設計）
本研究に関する患者の組み入れは、ハイデルベルグ大学医学部の倫理委員会によって承認された。参加者は、全て、インフォームドコンセントの書面を提出して、血液及びレフトオーバー（ｌｅｆｔ−ｏｖｅｒ）組織の分子解析を許可した。拡張型心筋症（ＤＣＭ）の診断は、冠動脈造影法によって決定された冠動脈疾患（ＣＡＤ）を排除した後に確認され、心臓弁膜症は、ｃＭＲＩ及び心エコー検査によって排除し、心筋炎／炎症性ＤＣＭは、組織病理学検査によって排除した（Ｐ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ら：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９５  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ／Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９６；９３：８４１−２）。管理不良高血圧、心筋炎、定期的なアルコール消費、不正薬物又は心毒性化学療法の前歴のある患者も、また、排除した。臨床的な一連の収縮心不全を包含させるために、初期であるが症候性の疾患段階（４５％＜ＬＶ−ＥＦ＜５５％）も包含した。
【０１４２】
ｎ＝１３５のＤＣＭ患者のスクリーニング後に、ｎ＝４１が、全ての包含の判断基準を満たし、排除の判断基準を満たさず、骨の折れるＤＮＡメチル化、ゲノム及びｍＲＮＡシーケンシングのハイスループット解析に利用可能な十分量のレフトオーバーＬＶ心室生検材料（ＬＶ自由壁）及び末梢血試料を有した。対照ＬＶ生検検体は、正常な収縮機能及び拡張機能を有し、かつ冠動脈造影法及び免疫組織病理学検査によって判断されるような関連性のある血管障害又は急性／慢性臓器拒絶反応に関する形跡を有さない、心臓移植後の安定かつ無症状の患者（ｎ＝３１；ＨＴＸは、少なくとも６ヶ月前であった。）から入手した。全血液試料に関する対照（ｎ＝３１）は、心血管リスクプロファイル（高血圧、高脂血症）を有したが、心不全又は有意な（＞５０％）冠動脈疾患に関する形跡を伴わない完全に正常な収縮左心室機能及び拡張左心室機能を有した。
【０１４３】
独立バリデーションコホートとして、ｎ＝１８のＤＣＭ患者及びｎ＝８のこれまで健常な交通事故の被害者の左心室心筋を包含した。末梢血に関する独立バリデーションコホートは、ｎ＝９のＤＣＭ患者及びｎ＝２８の臨床対照で構成された。上位の血液ベースのマーカーに関する第３の再現コホートは、ｎ＝８２のＤＣＭ患者（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）及びｎ＝１０９の対照（Ｎｏｋｏ／ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｏｊｅｃｔ）を包含した。
【０１４４】
［生体材料の加工処理］
生検検体は、標準プロトコルを使用して、心臓カテーテル法を受けたＤＣＭ患者又は心臓移植患者（対照）由来の自由左心室壁（ＬＶ）の先端部から入手した。生検材料を即座に氷冷生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で洗浄して、移動させて、ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出するまで、液体窒素中で保管した。生検材料の識別診断（組織病理学検査）後、残存する材料を均等に解体して、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＤＮＡは、ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて血液から、またＡｌｌｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて生検材料から、抽出した。総ＲＮＡは、製造業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）に従って、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（血液）又はＡｌｌｐｒｅｐキット（生検材料）を使用して、生検材料及び末梢血から抽出した。ＲＮＡ純度及び濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、英国バークシャー）を使用して、生検材料由来のＲＮＡに関してはＥｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｐｉｃｏアッセイを用いて、また血液由来のＲＮＡに関してはＥｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏアッセイを用いて決定した。
【０１４５】
［ＤＮＡメチル化プロファイリング並びにＲＮＡ及び全ゲノムシーケンシング］
メチル化プロファイルは、上述したような手順に従いＩｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋメチル化アッセイを使用して測定した（Ｍ，Ｂｉｂｉｋｏｖａら：Ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｒｒａｙ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ  ＣｐＧ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１；９８：２８８−９５）。本発明者らは、各患者から、ＤＮＡ（血液及び生検材料）２００ｎｇを測定に付した。１０％を超える試料において０．０５を上回る検出ｐ値を有するメチル化部位は、解析から除去した。１０％未満の試料において０．０５を上回る検出ｐ値を有するメチル化レベルは、ｋｎｎのインピュテーションによりインピュテーションした（Ｈａｓｔｉｅ  Ｔ  Ｔ，  Ｒ，  Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，  Ｂ  Ｃｈｕ，  Ｇ．  ｉｍｐｕｔｅ：ｉｍｐｕｔｅ：Ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ．Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １４６０，２０１６）。メチル化測定値に対するゲノム変動の影響を低減するために、本発明者らは、１０％を超えるＤＣＭ患者中に存在する遺伝子型によって潜在的に影響され、全ゲノムシーケンシングによって評価される５０ｂｐのプローブ領域内に存在するメチル化部位を排除した。１０％未満のＤＣＭ患者における変異体を有するメチル化レベルはインピュテーションした。本発明者らは、Ｘ染色体及びＹ染色体上のプローブ並びにＣｈｅｎら（Ｃｈｅｎ，  ＹＡら，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＣｐＧｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１３；８：ｐ．２０３−９）によって同定された非標的ＤＮＡとクロスハイブリダイズするプローブ全てを更に除去した。最終的に、３９４，２４７個のメチル化部位がＱＣに合格した。
【０１４６】
ＤＮＡメチル化は、これまでに記載されているように（Ｊ，Ｈａａｓら：Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５：４１３−２９）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法によって、上位２個のバイオマーカー候補遺伝子座に関してバリデートした。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡ  ４００ｎｇを、亜硫酸水素ナトリウムで化学的に修飾した。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡを、Ｉｎｆｉｎｉｕｍプローブｃｇ０６６８８６２１及びｃｇ０１６４２６５３（ｃｇ０６６８８６２１プライマー配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＡＧ及びＡＧＧＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＧＧＴＡＧＴＴＴＡＧＧＡ；ｃｇ０１６４２６５３プライマー配列ＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴ及びＧＴＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＴＴＡＧ）を網羅するように設計されたプライマーによって、ＰＣＲ増幅させた。アンプリコンは、Ｔ７ポリメラーゼによって転写されて、続いてＴ−特異的なＲＮアーゼ−Ａ切断された。消化された断片を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦベースの技法（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ）によって定量化した。
【０１４７】
総末梢血ｇＤＮＡ  １μｇを、Ｃｏｖａｒｉｓ（商標）Ｓ２２０システムを使用して、２００サイクル／バーストでそれぞれ６０秒の２回の処理（ピーク電力＝１４０、デューティ比＝１０）を適用して断片化した。断片化されたｇＤＮＡ  ５００ｎｇを採取して、製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、米国サンディエゴ）に従って、ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ試料作製キットを使用して、全ゲノムライブラリーを作製した。シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００で、シーケンシングフローセルの４つレーンで、ＴｒｕＳｅｑ  ＳＢＳ  Ｋｉｔ  ｖ３を使用して、またペアードエンドシーケンシングに関して１００ｂｐを２回読み取って実施した。
【０１４８】
生シーケンシング読取りの逆多重化及びｆａｓｔｑファイルの作成は、ＣＡＳＡＶＡ  ｖ.１．８２を使用して行なった。続いて、生読取りを、ｂｕｒｒｏｗｓ−ｗｈｅｅｌｅｒアラインメントツール（ＢＷＡ  ｖ．０．７．５ａ）（Ｌｉ  Ｈ  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ  Ｒ．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９；２５：１７５４−６０）を用いて、ヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にマッピングして、二重反復読取りに印を付けた（Ｐｉｃａｒｄ−ｔｏｏｌｓ  １．５６）（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）。次に、本発明者らは、変異体再較正（ｖ．２．８−１−ｇ９３２ｃｄ３ａ）及び変異体コーリング（ｖ．３．３−０−ｇ３７２２８ａｆ）に関する推奨プロトコルに従って、各々の最良の実施ガイドライン（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇａｔｋ／ｇｕｉｄｅ／ｂｅｓｔ−ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（Ｍ．Ａ．ＤｅＰｒｉｓｔｏら：Ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ，Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１；４３：４９１−８）に記載されている、Ｇｅｎｏｍｅ−Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｔｏｏｌキットを使用した。
【０１４９】
［統計解析］
正規化並びに技術的影響及びバッチの影響の除去、関連性の統計、過剰提示、並びに遺伝子オントロジー解析に関する詳細な情報に関して、下記を適用する。
【０１５０】
［正規化並びに技術的変動及びバッチの影響の除去］
望まざる技術的変動を除去するために、本発明者らは、全てのメチル測定値に亘って修正したｄａｎｅｓの正規化手順を適用、した。ｄａｎｅｓの正規化は、ｗａｔｅＲｍｅｌｏｎパッケージの一部であり、最初に、Ｐｉｄｓｌｅｙによって記述された（Ｒ．Ｐｉｄｓｌｅｙら：Ａ  ｄａｔａ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｒｒａｙ  ｄａｔａ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３；１４：２９３）。正規化手順は、赤色チャネル及び緑色チャネルのメチル化された生シグナル強度及びメチル化されていない生シグナル強度両方のアレイ間の分位点正規化に基づき、従って、色素の偏りの原因になる。しかしながら、遺伝子発現データに関して当初開発されたアレイ間の分位点正規化は、全体的なメチル化分布が、試料、組織及び疾患状態間で大きく異なり得るため、メチル化データに関して論争の的である。そこで、本発明者らは、アレイ間の正規化に関して、分位点正規化を適用せず、代わりにｃｙｃｌｉｃｌｏｅｓｓの正規化を適用することによって、ｄａｎｅｓの正規化アプローチを修正した。ｃｙｃｌｉｃｌｏｅｓｓの正規化は、効果及び意図において、分位点正規化と類似しているが、極端な事例を劇的には正規化せず、主要な分布差を保ったままであるという利点を有する（ＫＶ  Ｂａｌｌｍａｎ，ＤＥ  Ｇｒｉｌｌ，ＡＬ  Ｏｂｅｒｇ  ａｎｄ  ＴＭ．Ｔｈｅｒｎｅａｕ：Ｆａｓｔｅｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ｌｏｅｓｓ：ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ  ＲＮＡ  ａｒｒａｙｓ  ｖｉａ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４；２０：２７７８−８６）。
【０１５１】
試料は全て、５個の異なるバッチで測定され、各バッチは、他のバッチからの二重反復試料を含有していた。測定バッチによって導入され得る技術的変動を除去するために、総計８個の試料の二重反復測定値を、ｌｉｍｍａパッケージ（ＭＥ  Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｂ  Ｐｈｉｐｓｏｎ，Ｄ  Ｗｕ，Ｙ  Ｈｕ：ＣＷ  Ｌａｗ，Ｗ  Ｓｈｉ  ａｎｄＧＫ  Ｓｍｙｔｈ：ｌｉｍｍａ  ｐｏｗｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５；４３：ｅ４７）からのｒｅｍｏｖｅＢａｔｃｈＥｆｆｅｃｔ機能を使用して、異なる解析バッチのメチル化値（Ｐ．Ｄｕら：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａ−ｖａｌｕｅ  ａｎｄ  Ｍ−ｖａｌｕｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０；１１：５８７）を橋渡しするために使用した。バッチブリッジング後、その後の統計解析前に二重反復測定を平均した。
【０１５２】
［エピゲノムワイドな関連解析］
発見コホートにおけるゲノムインフレーションを補正するために、本発明者らは、メチル化測定値に関する主成分解析を実施して、０．０５以下のＦＤＲで既知の交絡因子（例えば、解析日等の技術的交絡因子及び投薬療法等の生物学的交絡因子）と関連付けられる主成分（ＰＣ）を同定した。表２１及び表２２を参照されたい。
【０１５３】
表２１：ＦＤＲ補正後の主成分と関連付けられる発見コホートにおける心筋組織由来のメチル化測定値に関する交絡因子。続いて、ＰＣ１〜ＰＣ４及びＰＣ６〜ＰＣ７を、潜在的なゲノムインフレーションの補正に使用した。
【表２１】
2019522997.tif 000070
【０１５４】
表２２：ＦＤＲ補正後の主成分と有意に関連付けられると同定された発見コホートにおける末梢血由来のメチル化測定値に関する既知の交絡因子。続いて、ＰＣ１〜ＰＣ４並びに年齢及び性別は、ゲノムインフレーションの補正用に含まれた。
【表２２】
2019522997.tif 000071
【０１５５】
調節解除されたメチル化部位は、ｌｉｍｍａパッケージ（Ｒｉｔｃｈｉｅ  ＭＥ，Ｐｈｉｐｓｏｎ  Ｂ，Ｗｕ  Ｄ，Ｈｕ  Ｙ，Ｌａｗ  ＣＷ，Ｓｈｉ  Ｗ  ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ  ＧＫ．ｌｉｍｍａ  ｐｏｗｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５；４３：ｅ４７）を使用して、共変数として年齢及び性別並びに全ての同定されたＰＣを含む線形モデリング及び調整ｔ検定によって同定された。続いて、メチル化部位を、共変数として性別（年齢は、全ての試料に関して利用可能でなかったため）を含む検証コホートにおいて、一方向に検証した。統計解析は、Ｒ−３．２．２（Ｒ：  Ａ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ［ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ］．２００８）で実行した。有意水準のＦＤＲ補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｙ  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  Ｙ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ−ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊ  Ｒｏｙ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ  Ｂ  Ｍｅｔ．１９９５；５７：２８９−３００）を使用して実施した。発見コホート及び検証コホート由来の有意水準は、独立した検定からの結果を組み合わせるフィッシャーの方法を使用して組み合わせた。
【０１５６】
［トランスクリプトーム解析］
ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、ＴｒｕｅＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を使用して作成され、シーケンシングは、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）シーケンサーで２×７５ｂｐで実施した。試料は、２９８５万個の中央値ペアードエンド読取り計数に対して配列決定した。鎖形成されていないペアードエンド生読取りファイルを、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９及びＧｅｎｃｏｄｅ  １９遺伝子モデル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇ／）を使用して、ＳＴＡＲ  ｖ２．４．１ｃ（Ｄｏｂｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ＴＲ．Ｍａｐｐｉｎｇ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  Ｒｅａｄｓ  ｗｉｔｈ  ＳＴＡＲ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１５；５１：１１  １４  １−１１  １４  １９）でマッピングした。一意的にマッピングされた読取りのみを、サブリードのｆｅａｔｕｒｅ  ｃｏｕｎｔｓプログラム（Ｌｉａｏ  Ｙ，Ｓｍｙｔｈ  ＧＫ  ａｎｄ  Ｓｈｉ  Ｗ．ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｕｒｐｏｓｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４；３０：  ９２３−３０）（サブリードバージョン１．４．６．ｐ１）を使用して遺伝子に計数され、マッピングパーセントは、中央値８８．０８であった。統計解析に先立って、非常に低発現レベル（平均読取り１以下、試料の５０％未満で読取りが検出される）の遺伝子を除去した。計数データは、最初のＭａｔｒｉｘＥＱＴＬの刊行物（Ｓｈａｂａｌｉｎ  ＡＡ．Ｍａｔｒｉｘ  ｅＱＴＬ：ｕｌｔｒａ  ｆａｓｔ  ｅＱＴＬ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｉａ  ｌａｒｇｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１２；２８：１３５３−８）によってｅＱＴＬに関して推奨されている分散安定化変換（Ａｎｄｅｒｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ  Ｗ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔ  ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１１：Ｒ１０６）の改良法であるｒｌｏｇ正規化（Ｌｏｖｅ  ＭＩ，Ｈｕｂｅｒ  Ｗ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓ  Ｓ．Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ＤＥＳｅｑ２．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１５：５５０）によって、正規化した。
【０１５７】
［エピゲノム−トランスクリプトーム関連解析］
メチル化部位と遺伝子発現との間のｅＱＴＬ解析は、同じ生検試料からの高品質のエピゲノム及びトランスクリプトームデータを有する３４名のＤＣＭ患者及び２５名の対照について実施した。ＭａｔｒｉｘＥＱＴＬ（Ｓｈａｂａｌｉｎ  ＡＡ．Ｍａｔｒｉｘ  ｅＱＴＬ：  ｕｌｔｒａ  ｆａｓｔ  ｅＱＴＬ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｉａ  ｌａｒｇｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１２；２８：１３５３−８）及び線形モデルを使用して、１９，４１８個の遺伝子の発現プロファイルを、遺伝子の１０，０００ｂｐ上流及び下流の範囲における並びに遺伝子本体領域における３１１，２２２個のメチル化部位と相関させた。続いて、エピゲノム−トランスクリプトーム関連は、心臓組織検証コホートにおいて一方向に検証された。
【０１５８】
ＤＣＭに関するエピジェネティックなシグネチャーを同定するために、本発明者らは、ｐ≦０．０５の未補正の有意水準で、心筋発見及び検証コホートにおいて、疾患及び遺伝子発現と関連付けられる、メチル化遺伝子座に関してフィルタリングした。心筋組織及び末梢血間のＤＣＭにおける保存されたメチル化の差は、組織間での保存（直接的な相関に関するｋｅｎｄａｌｌの順位検定ｐ≦０．０５）及び同一方向での調節解除されたメチル化状態（方向性ｐ≦０．０５）を更に示すメチル化遺伝子座に関してフィルタリングすることによって同定された。血液細胞の不均一性の影響を最低限に抑えるために、本発明者らは、Ｊａｆｆｅら（Ｊａｆｆｅ  ＡＥ  ａｎｄ  Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ＲＡ．Ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｎ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１４；１５：Ｒ３１）による（Ｈｏｌｍ  Ｓ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｊｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．１９７９；６，６５−７０）補正Ｆ統計学有意水準ｐ≦０．０５で、血液細胞不均一性と関連が付けられることがわかっている全ての部位を排除した。最終的に、予測ＤＣＭモデルが、発見コホートにおいて、ロジスティック回帰モデルに基づくＲ状態パッケージのｇｌｍ機能及び１０回の反復を有する５倍のクロスバリデーションを使用して、心筋組織及び末梢血に関して別々に構築され、続いて、検証コホートにおいて検査された。
【０１５９】
次に、遺伝子又は多重遺伝子レベルに関する集約解析に関して、集約有意水準を、全てのメチル化遺伝子座に関してシムズの手順を使用して獲得した（Ｒ０ＤＬＡＮＤ  ＥＡ．Ｓｉｍｅｓ’  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｉｓ  ‘ｖａｌｉｄ  ｏｎ  ａｖｅｒａｇｅ’．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ．９３：７４２−７４６）。
【０１６０】
［過剰提示及び遺伝子オントロジー解析］
染色体バンド、発見コホート及び検証コホートにおける調節解除されたメチル化部位並びに疾患状態及び遺伝子発現と関連付けられるメチル化部位に関する過剰提示解析は、ｐ≦０．０５の閾値を使用して、２×２の分割表でのフィッシャーの正確確率検定に基づいた。
【０１６１】
過剰提示されたＧ０期の同定は、１遺伝子当たりの４５０ｋアレイ上のプローブの数に基づいて、差別的メチル化の蓋然性を考慮して、ｍｉｓｓＭｅｔｈｙｌパッケージ（Ｐｈｉｐｓｏｎ  Ｂ，Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ  Ｊ  ａｎｄ  Ｏｓｈｌａｃｋ  Ａ．ｍｉｓｓＭｅｔｈｙｌ：ａｎ  Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｂｉ−ｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１６；３２：２８６−８）のｇｏｍｅｔｈ機能を使用して実施した。ゲノムワイドなメチル化データに関する遺伝子セット解析を実施する場合の、各遺伝子に関してプロファイリングされたメチル化部位の数が異なることに起因して、激しい偏りが報告されている（Ｐ  Ｇｅｅｌｅｈｅｒ，Ｌ  Ｈａｒｔｎｅｔｔ，ＬＪ  Ｅｇａｎ，Ａ  Ｇｏｌｄｅｎ，Ａｌｉ  ＲＡ  Ｒａｊａ  ａｎｄ  Ｃ．Ｓｅｏｉｇｈｅ：Ｇｅｎｅ−ｓｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｓ  ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｗｈｅｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１３；２９：１８５１−７）ため、これは特に重要である。適用したアプローチは、Ｙｏｕｎｇらによって当初開発された方法論的枠組み（ＭＤ  Ｙｏｕｎｇ，ＭＪ  Ｗａｋｅ−ｆｉｅｌｄ，ＧＫ  Ｓｍｙｔｈ  ａｎｄ  Ａ．Ｏｓｈｌａｃｋ：Ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑ：ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｉａｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１１：Ｒ１４）を使用して、選択の偏りの影響をモデリング及び相殺する。
【０１６２】
実施例２で実行した解析及びそこで獲得した結果に関する更なるデータは、下記の表２３〜表３４に見られる。
【０１６３】
表２３：ＤＭＲにおける結合部位の過剰提示（組織スクリーニング）。
【表２３】
2019522997.tif 000072
【０１６４】
表２４：再現ＤＣＭ関連及び遺伝子発現関連ＤＭＲ（組織スクリーニング＋再現）の過剰提示遺伝子オントロジー期
【表２４】
2019522997.tif 000073
【０１６５】
表２５：組み入れられる患者のベースライン特性（スクリーニング段階、心臓組織＆血液、ｎ＝４１）
【表２５】
2019522997.tif 000074
【０１６６】
表２６：組み入れられるＨＴＸ対照のベースライン特性（スクリーニング段階、心臓組織、ｎ＝３１）
【表２６】
2019522997.tif 000075
【０１６７】
表２７：組み入れられる臨床対照のベースライン特性（スクリーニング段階、血液メチル化、ｎ＝３１）
【表２７】
2019522997.tif 000076
【０１６８】
表２８：組み入れられるＤＣＭ患者のベースライン特性（再現段階、心臓組織、ｎ＝１８）
【表２８】
2019522997.tif 000077
【０１６９】
表２９：組み入れられる事故対照のベースライン特性（再現段階、心臓組織、ｎ＝８）
【表２９】
2019522997.tif 000078
【０１７０】
表３０：組み入れられるＤＣＭ患者のベースライン特性（再現段階Ｉ、血液、ｎ＝９）
【表３０】
2019522997.tif 000079
【０１７１】
表３１：組み入れられる対照のベースライン特性（再現段階Ｉ、血液、ｎ＝２８）
【表３１】
2019522997.tif 000080
【０１７２】
表３２：組み入れられるＤＣＭ患者のベースライン特性（再現段階ＩＩ、血液、ｎ＝８２）
【表３２】
2019522997.tif 000081
【０１７３】
表３３：組み入れられる対照のベースライン特性（再現段階ＩＩ、血液、ｎ＝１０９）
【表３３】
2019522997.tif 000082
【０１７４】
表３４：ＤＣＭと関連付けられる遺伝子座及びＲＮＡ発現
【表３４】
2019522997.tif 000083
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2019522997.tif 000103
相関に関する公称ｐ値。ＤＣＭ関連に関しては、性別、年齢及びＰＣＡの調節。
【０１７５】
［結果］
［ＤＣＭのエピゲノムワイドな関連研究］
この研究における組み入れに関して、収縮不全及びＤＣＭの疑いを有する患者は、広範囲に及ぶ臨床的表現型決定を受ける必要があった。詳細な臨床精密検査からＤＣＭの二次的要因を暗示した患者は全て排除した（材料及び方法の欄を参照）。総計ｎ＝１３５の患者をこの研究に組み入れた。本発明者らは、完全なデータセット及びレフトオーバーとしての十分な心臓生体材料にのみ興味があったため、９４名の個体を排除した。
【０１７６】
最終的なコアコホートにおいて、本発明者らが心臓組織及び末梢血から高品質ＤＮＡメチル化プロファイルを作成することが可能なｎ＝４１の患者を、この研究のスクリーニング段階で使用した。これらの患者又は対照のうち、ＤＮＡメチル化に関するこれまでの研究（Ｈａａｓ  Ｊ，ら，Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５：４１３−２９）と重複するものは、なかった。患者の平均年齢は、５４．１±１２．３であり、６３％が、初期ＮＹＨＡステージであった。従って、中央値ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、８１２ｎｇ／ｌであった。表２５を参照されたい。本発明者らは、対照試料として、心臓移植を受けた後、日常的に左心の心筋生検を受ける、通常の収縮及び拡張心機能を有する、心不全のない３１名の患者からの左心室生検材料を使用した。表２６を参照されたい。患者、対照及び分子表現型決定の概要に関しては、マルチオミクススクリーニング段階における研究コホートの概要を示す図５及び図６を参照されたい。図５は、図中で、スクリーニングを概略的に示す（ここで、ＤＣＭに関してＮ＝４１）。ＲＮＡ６、メチル化７、表現型８、バイオマーカー９及びゲノム１０は、それぞれ、心臓組織Ｈ及び血液Ｂに関して、並びにＨＴＸ対照ＨＴＸ（ここで、Ｎ＝３１）及び臨床的対照ＣＣに関して（ここで、Ｎ＝３１）決定されている。これらのデータは、図７にも示すようなエピゲノムワイドな関連研究１００、図８〜図１０にも示すような心不全関連のエピジェネティックなパターンの同定１０１、図１１〜図１４にも示すような心臓ＲＮＡ転写のエピジェネティックな調節１０２、及び図１５〜図１９にも示すような保存されたエピジェネティックなパターンの同定に使用された。図６は、心臓組織Ｈに関するＤＣＭ（Ｎ＝１８）及び血液Ｂに関するＤＣＭ（Ｎ＝９）についての再現実験Ｒ  Ｉに関するデータ（ここでは同様に、ＲＮＡ６、メチル化７及び表現型８が決定された。）並びにＨに関してＮ＝８及びＢに関してＮ＝２８の健常対照ＨＣにについてのデータを示す。同様に、図６に示す再現実験Ｒ  ＩＩにおいて、ＤＣＭは、Ｎ＝８２であり、ＨＣは、血液Ｂに関して、Ｎ＝１０９であり、ここで、メチル化７及び表現型８が決定された。これらの実験により、表２８にも示すようなエピゲノムワイドな関連遺伝子座のバリデーション１０４、図１１〜図１９にも示すようなＤＣＭ及びｍＲＮＡ関連メチル化シグネチャーのバリデーション１０５、並びに図１５〜図２１にも示すような潜在的なメチル化バイオマーカーのバリデーション１０６が可能となる。
【０１７７】
データの品質管理及び正規化を実施した後、本発明者らは、各ＣｐＧ部位に関するゲノムワイドな関連を算出した。ゴノソームは、解析から排除したプリマヴィスタ（ｐｒｉｍａ  ｖｉｓｔａ）であった。潜在的なエピゲノムワイドなインフレーションに関して調節するために、本発明者らは、メチル化測定に関する主成分（ＰＣ）解析を実施して、交絡因子（バッチの影響等の方法論的交絡因子及び投薬療法等の生物学的交絡因子、ＦＤＲ≦０．０５）と関連付けられるＰＣを同定した。表２１及び表２２を参照されたい。調節不全にされたメチル化部位は、共変数として年齢、性別及び同定された主成分を含む線形モデリング及び調整（ｍｏｄｅｒａｔｅｄ）ｔ検定によって同定された（Ｂ，Ｍｅｄｅｒら：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｘ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１４；６０：１２００−８）。
【０１７８】
４８５，０００個のメチル化部位から、３９４，２４７個が、心筋組織及び血液においてＱＣを合格した。遺伝子型関連メチル化変化を排除した。４２，７４５個のＣｐＧ部位（９．５％）は、ＤＣＭを対照と比較した場合に左心室心筋において差別的にメチル化されることが分かった（ｒａｗ−ｐ≦０．０５）（それらのうちの３３，３９６個が、心臓組織において発現するアノテートされた遺伝子周辺の１０ｋｂのウィンドウ中に存在した）。低メチル化ＣｐＧ部位対高メチル化ＣｐＧ部位の比は、０．９２であった。血液試料中では、３５，５６６個（９％）が、ＤＣＭと関連付けられた（ｒａｗ−ｐ≦０．０５、２８，１５３個が、アノテートされた遺伝子の１０ｋｂのウィンドウ中に存在した）。
【０１７９】
図７は、拡張型心筋症に関するエピゲノムワイドな関連研究のマンハッタンプロットを示し、心臓組織におけるエピゲノムワイドな関連スキャンを示す。−ｌｏｇ１０（ｐ値）は、スクリーニングコホートに関する品質管理基準を合格した単一ＣｐＧに関して示されている。それらがｘ軸上の染色体Ｃｈｒに対してプロットされている。確率値は、共変数として年齢、性別及びＰＣを含む線形モデリング及び調整ｔ検定に基づいた。実線は、ｐ＝５×１０−８のエピゲノムワイドな有意水準を示し、点線は、ｐ＝０．０５の偽発見（ＦＤＲ）有意閾値を示す。プロットにおいて、Ｎは、ＤＣＭに関して４１であり、Ｎは、対照Ｃに関して３１である。
【０１８０】
図７におけるマンハッタンプロットにおいて概要するように、多重実験を補正した後、ＤＣＭにおいて低メチル化された３０個の部位及び高メチル化された２９個の部位を伴う、ＤＣＭ患者の心筋において有意に差別的にメチル化される５９個のＣｐＧを見出している（ＦＤＲ補正されたｐ≦０．０５、点線）。ＦＤＲ有意部位に関するメチル化の差のデルタは、中央値１４．３４％（２．７５％〜６９．９％）であった。最も厳しいカットオフを用いて、本発明者らは、５×１０−８以下のｐ値で、３個のエピゲノムワイドな有意遺伝子座を見出している（実線）。これらの遺伝子座の１番目（ｃｇ１６３１８１８１、ｐ＝２．３×１０−８）は、３番染色体の位置９９７１７８８２上に存在する。それは、ＣＭＳＳ１の遺伝子本体、ＦＩＬＩＰ１Ｌの５’ＵＴＲ領域及びｍｉＲ−５４８Ｇのプロモーター領域の一部内に（転写開始部位の１，５００ｂｐ上流内に）位置する。第２の遺伝子座（ｃｇ０１９７７７６２、ｐ＝２．８×１０−８）は、１９番染色体の位置４，９０９，１９３上に位置する。それは、ＵＨＲＦ１のプロモーター領域及びＣｐＧアイランドｈｒ１９：４，９０９，２６２〜４，９１０，２５６の一部内に存在する。第３の遺伝子座（ｃｇ２３２９６６５２、ｐ＝４．８×１０−８）は、８番染色体の位置１４２，８５２，９３８上に存在し、１０，０００ｂｐの範囲内の任意の既知の遺伝子付近に位置しない。
【０１８１】
これらの知見を再現するために、本発明者らは、ｎ＝１８の独立したＤＣＭ患者及びｎ＝８の交通事故の被害者であるこれまで健常であった対照個体からＤＮＡをエピゲノム型決定した（ｅｐｉｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）。本発明者らが知る限りでは、これらの対照個体は、いかなる心臓病も含まず、定期的な投薬療法も行なわなかった。表３５に示すように、本発明者らは、独立コホートにおいて５９個の遺伝子座のうち２７個（４６％）を首尾よく再現することができた。スクリーニング段階からの最も有意なヒット（ｃｇ１６３１８１８１）もまたバリデートすることができ（再現  ｐ＝０．００４）、組合せフィッシャーのｐ＝２．２３×１０−０９をもたらした。合計で、５個のヒットが、組合せ解析において厳しいゲノムワイドな有意性に取って代わるものであった。
【０１８２】
表３５：再現されたＤＮＡメチル化部位。
【表３５】
2019522997.tif 000104
【０１８３】
［心不全における保存されたＤＮＡメチル化部位］
これまでの研究では、主に低解像度アプローチ又は非常に小さなコホートを使用して、ＤＣＭ及び／又は心不全に関するＤＮＡメチル化パターンを同定した。従って、これらの知見を、現在の研究において再現することができるかどうかを確認するために、本発明者らは、利用可能なこれまでの研究（３４個の遺伝子座）及び現在のデータセットからのメチル化変化を比較した。上記方法は大きく変動して、ＣｐＧは、前者の研究において一様に測定されなかったため、本発明者らは、これまでに述べてきた遺伝子座に関する本発明者らのデータセットのシムズのｐ値集約を使用した。ｐ≦０．０５のカットオフを使用して、本発明者らは、遺伝子ＬＹ７５、ＰＴＧＥＳ、ＣＴＮＮＡＬ１、ＴＮＦＳＦ１４、ＭＲＰＬ１６、ＫＩＦ１７において同じ方向で、ＤＮＡメチル化変化を再現することができた。表３６を参照されたい（Ｊ，Ｈａａｓら：Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５：４１３−２９．、ＣＡ，Ｋｏｃｚｏｒら：Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｍｔＤＮＡ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ：ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３；４５：５９０−６、Ｍ，Ｍｏｖａｓｓａｇｈら：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０；５：ｅ８５６４、Ｐ，Ｇａｒａｇｎａｎｉら：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＬＯＶＬ２  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｇｅ．Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．２０１２；１１：１１３２−４）。表３６は、心不全が、或る規定の頑強なＤＮＡメチル化パターンと関連付けられるという事実を支持する。再現された遺伝子座全てから、ＬＹ７５メチル化パターンが、最も高い有意性を示した（シムズ  ｐ＝０．００２）。
【０１８４】
表３６：これまでの研究からのＤＮＡ遺伝子メチル化の再現
【表３６】
2019522997.tif 000105
【０１８５】
ＬＹ７５遺伝子の遺伝子座の高メチル化を確認することの他に、本発明者らはまた、図８に見られるように、ＤＣＭにおけるＬＹ７５発現レベルの関連付けられるダウンレギュレーションを再現した。図８は、図中で、心筋／心臓組織におけるメチル化及びＬＹ７５の発現を示す。図表は、プロモーター領域におけるｃｇ１０１０７７２５及びＬＹ７５発現レベルの相関を示す。ｘ軸上のｃｇ１０１０７７２５メチル化ベータ（ｃｇ１０１０７７２５  ｍｅｔｈ）に対して、ｙ軸上のＬＹ７５  ｍＲＮＡ発現（ＬＹ７５  ｍＲＮＡ  ｅｘｐ）をプロットし、値は、ＤＣＭ及び対照（ＣＴＲＬ）に関してプロットしている。ＬＹ７５に関して、本発明者らは、ＤＮＡメチル化とｍＲＮＡ発現との間に有意な相関を見出すことができ、それらは、心臓におけるエピジェネティックなコードの調節的役割を強調している（＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１．＊＊＊＝ｐ≦０．００１）。
【０１８６】
組織におけるこれまでの知見の再現の成功に関して、本発明者らは、本発明者らのコホートの全末梢血試料に由来するＤＮＡにおけるＥＬＯＶＬ２、ＦＨＬ２及びＰＥＮＫ（Ｇａｒａｇｎａｎｉら，２０１２）内のＣｐＧアイランドの既知の年齢依存性パターンを首尾良く再現した（シムズの有意水準＜１０〜１４）。
【０１８７】
［ＤＣＭにおけるメチル化パターンの検出］
図９で見られるように、心臓組織におけるＤＮＡメチル化を示す目的変数なしの（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）クラスター解析において、本発明者らは、ＤＮＡメチル化の差がＤＣＭ患者及び対照をクラスター形成することが可能であり、心不全におけるＤＮＡメチル化の乱れ又は再構成を裏付けることを見出した。図９は、図中で、心筋組織におけるクラスター解析を示し、フローｚ−スコアＦＺＳに関する或るカラーキーＣＫとの相関係数を示す。図示するように、症例群及び対照群は非常に良好に、一緒に群を成し、ＤＣＭにおいて保存されたメチル化変化を示す。
【０１８８】
考え得る機能的メチル化パターンに関して検査するために、本発明者らは、まず、ゲノムワイドな転写及びエンハンサー因子結合部位（Ａ.Ｍａｔｈｅｌｉｅｒら：ＪＡＳＰＡＲ  ２０１６：ａ  ｍａｊｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｐｅｎ−ａｃｃｅｓｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６；４４：Ｄ１１０−５）並びにＤＮＡメチル化によるそれらの潜在的な作用に関する過剰提示解析を実施した。アノテートされた配列モチーフ内の１５８,９７９個のＣｐＧから、本発明者らは、表２３に示すように、ＤＣＭにおけるメチル化変化と有意に関連付けられる４個のモチーフを検出した（ＦＤＲ−ｐ≦０．０５）。興味深いことに、３個のモチーフ結合因子（Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ４及びＢｍａｌ１）は、ＤＣＭ及び心不全中の心臓再構築に関与することが知られている（Ｍ．Ｌｅｆｔａ，ＫＳ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＨＺ．Ｆｅｎｇ，ＪＰ  Ｊｉｎ  ａｎｄ，ＫＡ．Ｅｓｓｅｒ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  Ｂｍａｌ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１２；３０３：Ｈ４７５−８５）。
【０１８９】
より大きな一連のＤＮＡメチル化が一緒にクラスター形成して、シス調節要素の抑制を示す十分な形跡が見られる。従って、本発明者らは、特異的な染色体バンドにおけるｒａｗ−ｐ≦０．０５で差別的にメチル化された部位のクラスター形成に関する過剰提示解析を実行して、図１０に見られるように、ＤＣＭにおいて有意に差別的に、メチル化される６個の領域を見出した（ボンフェローニのレベル  ｐ≦０．０５）。図１０は、図中で、染色体バンド過剰提示解析プロット、特に心臓組織におけるエピゲノムワイドな関連染色体バンドスキャンを示す。−ｌｏｇ１０（ｐ値）は、スクリーニングコホートにおける染色体バンドに基づく過剰提示解析（ｐＯＲＡ）に関して示されている。実線は、０．０５のボンフェローニの補正有意水準を示し、点線は、ｐ＝０．０５のＦＤＲ補正有意閾値を示す。
【０１９０】
これらの領域は、心臓発達、心臓機能及び心筋症と関連付けられる顕著な数の遺伝子を受け入れる（ｈｏｓｔ）。例として、本発明者らは、ＤＣＭにおいて差別的にメチル化される遺伝子座１２ｑ２４．２１を見出した（４２５個のメチル化部位のうち７８個が、ｒａｗ−ｐ≦０．０５、フィッシャーの正確確率ｐ＝２×１０−６でＤＣＭと関連を示す）。１２ｑ２４．２１遺伝子座は、心筋症又は心臓発達にこれまでに結び付けられてきた幾つかの遺伝子を保有している。遺伝子の１つは、胚発達及び心発生に関与することが知られている（Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ  ＶＥ．Ｔｈｅ  Ｔ−ｂｏｘ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１４；１４１：３８１９−３３）Ｔ−Ｂｏｘファミリーの一部であるタンパク質をコードするＴＢＸ５である。ＴＢＸ５における突然変異は、最近になって、家族性拡張型心筋症及び孤発性拡張型心筋症を患う患者において示され得る（Ｗ.Ｚｈｏｕ，Ｌ.
Ｚｈａｏ，ＪＱ．Ｊｉａｎｇ，ＷＦ．Ｊｉａｎｇ，ＹＱ．Ｙａｎｇ  ａｎｄ  ＸＢ．Ｑｉｕ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＴＢＸ５  ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１５；３６：２８２−８）。この遺伝子座内の別の遺伝子は、メディエーター複合体ファミリーの一部であり、また心血管疾患（Ｃ．Ｓｃｈｉａｎｏ，Ａ．Ｃａｓａｍａｓｓｉｍｉ，ＭＴ．Ｖｉｅｔｒｉ，Ｍ．Ｒｉｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｃ．Ｎａｐｏｌｉ；Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１４；１８３９：４４４−５１）及び初期心臓発達に関与することも知られているＭＥＤ１３Ｌであり、乱れると先天的な心臓異常を招く（Ｍ．Ｓａｍａｎｅｋ：Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ，ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ．Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｙｏｕｎｇ．２０００；１０：１７９−８５）。更に、本発明者らは、１２ｑ２４．２１遺伝子座のすぐ傍に心室調節ミオシン軽鎖をコードしているＭＹＬ２遺伝子を見出している。この遺伝子は、初期胚心臓発達中に必須の役割を果たし、心室特異性の最古のマーカーの１つである。ＭＹＬ２における突然変異は、更に、拡張型及び肥大型心筋症と関連付けられる（ＴＸ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，ＫＪ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  ＫＲ．Ｃｈｉｅｎ：Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｒｔ  ｔｕｂｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０：５１５７−６１）。まとめると、本発明者らは、重要な心臓発達ゲノム領域において同調的なＤＮＡメチル化パターン形成に関する形跡を見出した。
【０１９１】
［心臓遺伝子発現に対する差別的なＤＮＡメチル化の影響］
ＤＮＡメチル化の度合いの観察される変化が、また、全般的な遺伝子発現に作用するかどうかを検査するために、本発明者らは、本発明者らの発見コホートにおいてメチル化解析用に採取した同じ生検材料に由来する単離ＲＮＡにおいてポリＡに富んだｍＲＮＡのシーケンシングを実施した。発現とＤＮＡメチル化とを関係付けるために、本発明者らは、ｍｅｔｅＱＴＬ解析を実施して、図１１及び図１２に示すように、ゲノム全体に亘って心臓転写に作用する広範なＤＮＡメチル化部位を同定した。図１１及び図１２は、心臓組織におけるｍＲＮＡ発現のダウンレギュレーション及びアップレギュレーションと関連付けられるメチル化遺伝子座に関するマンハッタンプロットを表わし、図１１は、心臓組織における負の関連に関するエピゲノムワイドなｍｅｔｈＱＴＬスキャンを示し、図１２は、心臓組織における正の関連に関するエピゲノムワイドなｍｅｔｈＱＴＬスキャンを示す。実線は、ｐ＝５×１０−８のエピゲノムワイドな有意水準を示し、点線は、ＦＤＲ−ｐ＝０．０５の（ＦＤＲ）有意閾値を示す。
【０１９２】
プロモーター領域及び転写開始部位の近傍内でのＤＮＡ高メチル化は、転写ダウンレギュレーションと強力に関連付けられ、低メチル化は、アップレギュレーションと強力に関連付けられることが分かった。３’下流領域に関して及び遺伝子本体の末端に対して、本発明者らは、図１３に見られるように、メチル化状態と遺伝子発現レベルとの間で正及び負の相関の比が等しいことを見出している。図１３は、関連遺伝子に対するＣｐＧの位置に応じたＤＮＡメチル化及びｍＲＮＡ発現の相関解析、特に心臓組織におけるメチル化−ｍＲＮＡ関連、を示す。左から右へ、５’上流のＴＳＳ（５’Ｕ  ＴＳＳ）に関する１０ｋｂｐ  １００％〜０％、遺伝子本体（ＧＢ）に関する０％〜１００％、及び３’下流（３’Ｄ）ＣｐＧに関する１０ｋｂｐ  ０％〜１００％の相関係数がプロットされ、０．０５未満の未補正ｐ値は、左上から右下へ細かい平行線を引いた灰色で表わされ、０．０５未満の補正ＦＤＲは、右上から左下へ細かい平行線を引いた濃灰色であり、ゲノムワイドな有意なものは、黒色である。また、右上がり（upslope）及び右下がり（downslope）に関するｍＲＮＡ及びメチル化Ｍｅｔの比、並びにそれらの比ｒも示される。
【０１９３】
ＤＣＭにおいて、及び心臓組織において発現された遺伝子の１０ｋｂ以内で、差別的にメチル化される（ｒａｗ−ｐ≦０．０５）ことが分かった３３，３９６個のＣｐＧ部位から、８，４２０個のＣｐＧは、また、発見コホートにおいて遺伝子発現と有意に関連付けられた（ｒａｗ−ｐ≦０．０５）。ＤＮＡメチル化とｍＲＮＡ存在量（abundancy）との間認定されている観察される重複は、偶然に予測されるものよりも遥かに高く（フィッシャーの正確確率ｐ＝７×１０−６７）、それにより、ＤＮＡメチル化が心臓における遺伝子転写に対して相当強力な機能的影響を有することが示される。
【０１９４】
ＤＣＭ中のこれらの変化の役割を精査し、また、最も妥当な候補を考慮に入れるために、本発明者らは、独立したバリデーション研究を実施した。交通事故の被害者であるバリデーションコホートの対照は、本発明者らが知る限りでは、いかなる心臓病も含まず、投薬療法も行なわなかった。潜在的な生物学的交絡因子を排除するためのみならず、本発明者らは、ポリＡ富化に代わって、ランダムプライマーを使用した種々のｍＲＮＡシーケンシングプロトコルを選択する。試料は、３，７１７万個のペアードエンド読取り計数の中央値に対して配列決定して、マッピングパーセントは、中央値８８．０９であった。これらの２つの独立した研究コホートを組み合わせることによって、本発明者らは、ＤＣＭに関して高信頼性ＤＮＡメチル化及び発現部位のセットを生成することができた。詳細には、図１４及び表３４からわかるように、５１７個の異なるＣｐＧを、（ｉ）ＤＣＭと結び付けられる、及び（ｉｉ）ｍＲＮＡ転写に作用する、という２つのレベルで方向的に再現した（フィッシャーの正確確率ｐ＝１．２×１０−１３４）。図１４は、図中で、ＤＮＡメチル化部位の心筋組織におけるＤＣＭ及び／又はＲＮＡの関連の図表を示す。左側に、ＤＣＭに関するＮ＝４１及び対照Ｃに関するＮ＝３１を用いた場合の心臓組織のスクリーニングＳが示され、右側に、ＤＣＭに関してＮ＝１８及び対照Ｃに関してＮ＝８を用いた場合の心臓組織の再現Ｒが示される。各ＤＣＭ関連ＤＣＭ  ａｓｓ及びｍＲＮＡ関連ｍＲＮＡ  ａｓｓに関して、重複が示され、下部では、ＤＣＭ＆ｍＲＮＡ関連ＤＣＭ＆ｍＲＮＡ  ａｓｓに関して、各々の重複の重複が示される。図表は、ＤＮＡメチル化及びｍＲＮＡ発現の両方が利用可能である発見コホート及び再現コホートにおける、ＤＣＭに結びつけられ及び／又は心臓遺伝子発現と関連付けられる心臓メチル化部位を示す（全て、公称ｐ値＜０．０５で）。５１７個の再現ＣｐＧは、ＤＣＭ及びｍＲＮＡ発現と関連付けられる（ｐ＝１．２×１０−１３４）。
【０１９５】
遺伝子オントロジー過剰提示解析によって示されるように、メチル化部位の宿主遺伝子は、主に、表２４にも示すように、心臓発達及び筋肉機能に結び付けられる経路に関連付けられ、（初期）心不全の経過における重要な機能性遺伝子の発現の同調が、ＤＮＡメチル化によって促進されることを更に示す。
【０１９６】
ゲノムワイドな有意に再現されたメチル化部位（表３５を参照）のうちの２つが、発見コホート及び検証コホートにおいて隣接遺伝子の発現とも関連付けられることが分かった。ｃｇ２５８３８９６８のメチル化の状態は、ＰＬＸＮＡ２発現レベルと関連付けられ（複合ｐ＝０．０２）、またＤＣＭにおいて差別的に発現される（複合ｐ＝３×１０−５）。ｃｇ１４５２３２０４のメチル化の状態は、ＲＧＳ３（Ｇタンパク質シグナル伝達の調節因子３）発現と関連付けられ（複合ｐ＝０．０００４）、本発明者らがＤＣＭにおいて良好に差別的に発現されることを見出した（複合ｐ＝０．０２）。
【０１９７】
［組織間のＤＮＡメチル化パターンの保存］
メチル化解析及び発現解析により、心不全の発病に潜在的に関与する興味深い新たな遺伝子座が解明された。上述したように、本発明者らは例えば、心筋ＬＹ７５メチル化及び発現と、ＤＣＭとの強力な関連を再現することができた。しかしながら、ＬＹ７５メチル化は、末梢血では異なり、末梢血マーカーとしての即時の使用を妨げている。
【０１９８】
従って、潜在的な末梢バイオマーカーを探求するために、本発明者らは、ＤＮＡメチル化変化が、種々の組織間で保存されるかどうかを調査した。探索的解析により示されるように、心臓組織及び血液における保存された一方向に異常メチル化された領域セットは、図１５及び図１６に見られるように、実際に存在する。図１５及び図１６並びに図１７及び図１８及び図１９は、組織間でのＤＮＡメチル化シグネチャーの保存を示す。図１５及び図１６は、心臓組織ＤＭＲと血液ＤＭＲとの間の重複に関する探索的解析を示す。図１５は、特に、心臓Ｈ及び血液Ｂに関する組織間で保存されるＤＣＭ関連ＤＭＲを示し、ここで、組織における相対デルタ−ベータは、５％以上である（心臓組織（Ｎ＝４１  ＤＣＭ、Ｎ＝３１対照）、血液（Ｎ＝４１  ＤＣＭ、Ｎ＝３１対照））。過剰提示遺伝子オントロジーカテゴリーＯＧＯＣ、特に収縮線維部分ＣＦＰ、サルコメアＳＡＲ、収縮線維ＣＦ、Ｉ帯ＩＢ、筋原線維ＭＦ及びＺ盤ＺＤ、が以下の表で見られる。特に、図１６は、心臓Ｈ及び血液Ｂに関する組織間で保存されるＤＣＭ関連ＤＭＲを示し、ここで、組織及び血液における相対デルタ−ベータは、１０％以上である（心臓組織（Ｎ＝４１  ＤＣＭ、Ｎ＝３１対照）、血液（Ｎ＝４１  ＤＣＭ、Ｎ＝３１対照））。過剰提示遺伝子オントロジーカテゴリーＯＧＯＣ、特に出血性細胞接着ＨＣＡ、ｐｍを介した細胞間接着ＣＣＶＰ、細胞−細胞接着ＣＣＡ、生物学的接着ＢＡ、カルシウムイオン結合ＣＩＢ及び細胞接着ＣＡが、以下の表で見られる。５％以上又は１０％以上の相対メチル化ベータを有するＣｐＧに関する組織及び血液におけるメチル化の差（ｒａｗ−ｐ≦０．０５）の一方向的重複を示すベン図を図１５及び図１６に示す。付属の表では、遺伝子オントロジーカテゴリーに関する過剰提示解析を実施した（ＦＤＲ補正ｐ値）。図１７は、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢ遺伝子座のＤＮＡメチル化、特に、組織におけるメチル化Ｍｅｔｈ  Ｔ（左）及び血液におけるメチル化Ｍｅｔｈ  Ｂ（右）、を表わす。ナトリウム利尿ペプチドは、ＨＦにおける至適基準のバイオマーカーである。ＤＣＭにおいて、５’ＣｐＧの低メチル化は、発現の増加と関連付けられる（図示していない）。血液中では、同じ方向の異常メチル化が見出され、未知のメカニズムに起因した組織間保存を示している。図１８及び図１９は、ｃｇ２４８８４１４０のメチル化が、心筋組織及び血液における保存されたメチル化遺伝子座であることを実証している。メチル化は、図１８におけるスクリーニングＳ及び再現Ｒに関して、上部では組織に関するメチル化ベータＭｅｔｈ  ベータＴとして、また下部では血液に関するメチル化ベータＭｅｔｈ  ベータＢとして示される一方で、図１９は、上部ではスクリーニングＳに関して、また下部では再現Ｒに関して、血液における保存されたマーカーパネルを示し、ここで、毎回、感度ｓｅｎｓ（ｙ軸）を、特異度ｓｐｅｃ（ｘ軸）に対してプロットし、曲線下面積ＡＵＣが与えられる。差別的メチル化は、公称ｐ値を使用して示される。ＤＣＭ／心不全の検出のための組織及び血液における差別的かつ定方向メチル化の差を伴う３つのＣｐＧを含むＤＮＡメチル化痕跡のＲＯＣ解析（Ｂ９Ｄ１：ｃｇ２４８８��１４０、ＤＣＬＫ２：ｃｇ１２１１５０８１及びＮＴＭ：ｃｇ２５９４３２７６）。
【０１９９】
カットオフとして組織における５％異常メチル化を使用する場合、本発明者らは、組織及び血液中で同じ方向で変化した３，７９８個もの保存されたメチル化部位を見出している（両群においてｒａｗ−ｐ≦０．０５）。非常に興味深いことに、図１５及び図１６の差し込みの表に見られるように、重複遺伝子は、筋フィラメント構成成分において、非常に富化されている。厳しさを更に増加させたとき（組織及び血液における１０％の相対異常メチル化）、２１７個の保存されたメチル化部位が残っている。この数は、偶然に予測されるよりも遥かに高く（ｐ＝３．２×１０−１３）、当該数のメチル化部位の潜在的に保存された調節を誇示し、それは、新規バイオマーカーとしてそれらのメチル化部位を使用する発想を更に支持する。
【０２００】
この興味深い仮説に倣って、本発明者らは、次に、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢ遺伝子座のエピジェネティックな調節を探究した。この遺伝子座は、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）及び脳性ナトリウム溶液ペプチド（ＢＮＰ）をコードするが、後者は、心不全用の至適基準のバイオマーカーの典型である。驚くことに、本発明者らは、心臓組織（図１７、右上から左下へ細かい平行線を引いた棒）及び末梢血（図１７、左上から右下へ細かい平行線を引いた棒）由来のＤＮＡにおける同じ方向の異常メチル化を見出している。予想どおり、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢの遺伝子発現は、組織において反対方向で有意に調節不全にされ（アップレギュレーション、両方に関してｐ＝０．０００１、データは示していない）、ＮＰＰＢの転写物レベルは、患者の血漿中で測定されるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルと高度に相関する（Ｒ２＝０．５５）。従って、両方の遺伝子座のＤＮＡメチル化は、既に、心不全用の末梢バイオマーカーとして機能を果たし得る。
【０２０１】
[心不全用の潜在的な新規バイオマーカーとしてのエピジェネティックな遺伝子座]
本発明の多段階のマルチオミクス研究設計によって捉えられる結合された生物学的層の力に着手するために、本発明者らは、続いて、遺伝子変動（５０ｂｐのプローブ領域内のＳＮＰ又はＩＮＤＥＬ）によって直接攻撃されるか又は１０ｋｂ領域内の遺伝子変動と関連付けられる（α≦０．０５）ＣｐＧ部位を除去した後、スクリーニングコホート及び再現コホートの心筋組織及び末梢血からのメチル化パターンを比較した。本発明者らは、また、血液細胞不均一性（Ｓ．Ｈｏｌｍ：Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｊｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｅｓｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．１９７９；６，６５−７０）と関連付けられることが示されているＣｐＧ部位全てを除去した。９０，９３５個の残存ＤＮＡメチル化部位から、１７，７０９個が、心臓組織及び血液間で保存され、そのうちの６個（ＯＲ＝１．３８、フィッシャーの正確確率ｐ＝ＮＳ）は、心臓組織においてＤＣＭと関連付けられ、６１２個（ＯＲ＝０．８９、フィッシャーの正確確率ｐ＝０．０１）は、血液において疾患関連を有した。３個のエピジェネティックな遺伝子座は、全ての調査レベルで、組織と血液との間で高度に有意に重複し（ＯＲ＝２８、フィッシャーの正確確率ｐ＜０．００１）、組織間で疾患関連及び合致する異常メチル化を示した。
【０２０２】
解明された遺伝子は、「Ｂ９タンパク質ドメイン１」（Ｂ９Ｄ１、ＤＣＭにおける心臓組織及び血液において低メチル化される）、「ダブルコルチン様キナーゼ２」（ＤＣＬＫ２、低メチル化される）及び「ニューロトリミン（Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ）（ＮＴＭ、高メチル化される）であった。いわゆるＩｇＬＯＮＳに属するニューロトリミン（ＮＴＭ）に関して、タンパク質血液レベルと心不全及び薬物療法を受ける罹患患者の予後との関連が報告されている（ＴＨ  Ｃａｏら：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１５；３８５  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ２６）。組織においてＤＣＭと頑強に関連付けられると同定された図１４に見られるような５１７個のＣｐＧの１つでもあるＢ９Ｄ１（クロスバリデーション中央値ｐ＝４．５５×１０−６）は、図２０に見られるように、血液中で最も有意に関連付けられるヒットの１つであり、心臓組織においてもｍＲＮＡ転写と関連付けられる。
【０２０３】
図２０及び図２１は、バリデーションコホートにおいて検証した上位８個の個々の血液メチル化部位を表わすグラフである。図２０において、図表は、検証したメチル化血液バイオマーカー候補を示し（＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１）、スクリーニングＳ（ＤＣＭ  Ｎ＝４１、対照Ｎ＝３１）及び再現Ｒ（ＤＣＭ  Ｎ＝９、対照Ｎ＝２８、再現Ｉ）に関する血液中のＤＮＡメチル化を示し、ここで、毎回、メチル化ベータＭｅｔｈ  ｂｅｔａは、ｙ軸上にプロットされている。ｃｇ０６６８８６２１は、血液においてのみＤＭＲであるのに対して、ｃｇ０１６４２６５３は、組織及び血液において異常メチル化されている。Ｂ９Ｄ１付近のｃｇ２４８８４１４０は、また、マルチオミクスデータの全ての評価レベルを含む完全に異なる戦略によっても同定される。図２１は、質量分析法を使用したＴｏｐ−２マーカー候補の微細マッピングを示し、特に血液中のＤＮＡメチル化の微細マッピングを示す（再現ＩＩ）（ＤＣＭ  Ｎ＝８２、対照Ｃ  Ｎ＝１０９）。スパイダープロットは、最も有意な血液ベースのＤＭＲに関するリード−ＣｐＧ及び隣接ＣｐＧのメチル化の程度及び有意水準を示す。破線＝ＤＣＭの症例、黒太線＝健常な対照（ＮＳ＝有意でない）。
【０２０４】
Ｂ９Ｄ１における突然変異は、絨毛形成の崩壊に起因して、心臓発達の乱れをもたらし、タンパク質は、心筋及び心筋細胞において高度に発現される（ＷＥ．Ｄｏｗｄｌｅら：Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｉｌｉａｒｙ  Ｂ９  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｕｓｅｓ  Ｍｅｃｋｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１；８９：９４−１１０）。ここで、本発明者らは、図１８及び図１９に例示するように、Ｂ９Ｄ１のメチル化状態が、ＤＣＭに関する診断用バイオマーカーとして機能を果たし得ることを示す。というのは、末梢血発見コホートにおいて８７％を超えるＡＵＣ、並びに、心筋組織及び末梢血検証コホートにおいて頑強な再現を見出したからである。本発明者らは、３−マーカー末梢血メチル化パネル（Ｂ９Ｄ１：ｃｇ２４８８４１４０、ＤＣＬＫ２：ｃｇ１２１１５０８１及びＮＴＭ：ｃｇ２５９４３２７６）に関して、図１８及び図１９に見られるように、発見コホートにおいて９１．５％、そして、バリデーションコホートにおいて８６．９％のＡＵＣを見出している。単一のＢ９Ｄ１  ＤＮＡメチル化及びメチル化マーカーパネルは、このコホートにおいて至適基準のマーカーとしてのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ＡＵＣ  ８５％）よりも優れていた。
【０２０５】
最終的に、本発明者らは、図２０に見られるように、血液単独において最も高い有意性を有するＤＮＡ異常メチル化部位について調査して、バリデーションコホートにおいて、それらの部位を再現した。この戦略による最良の１０個のマーカーの平均ＡＵＣは、スクリーニング段階では０．８９であり、再現では０．７８であった。血液におけるＤＣＭ関連を有する最も有意なマーカーは、ｃｇ０６６８８６２１であり、それは、ＤＣＭでは高メチル化される。このマーカーは、組織において差別的にメチル化されない。首尾よく再現された２番目に有意な血液マーカー（ｒａｗ−ｐ＝８．５×１０−１０）は、ｃｇ０１６４２６５３である（ＢＤＮＦ、脳由来神経栄養因子、それは、心保護因子である；Ｐ．Ｈａｎｇら，Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ａｋｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１７；２１：６８５−６９６）。このメチル化部位は、このリストにおける他のマーカーとして、心臓組織における保存されたメチル化を更に示す（ｒａｗ−ｐ＝９．９×１０−４）。
【０２０６】
表３２及び表３３に見られるように、８２名のＤＣＭの症例及び１０９名の対照の別の独立したセットにおいて、代替法として質量分析法ベースのＤＮＡメチル化定量を使用することによって、本発明者らは、本発明者らのＴｏｐ−２マーカー（ｃｇ０６６８８６２１及びｃｇ０１６４２６５３）の一方向的な有意な異常メチル化及び同じＣｐＧアイランド内のそれらの隣接ＣｐＧを微細マッピングして、完全に再現することが可能であった。
【０２０７】
論述
ＤＣＭに起因する心不全のエピジェネティクスに関する本研究により、心筋疾患における心臓遺伝子転写に関するＤＮＡメチル化パターンの有意な役割が同定された。この研究において同定された再現性のあるＤＮＡメチル化パターン並びに他の研究によるこれまでのエピジェネティックな遺伝子座の再現の成功は、発見の頑強性を強調し、心不全の診断における役割を支持し潜在的に予後判定における役割を支持する。
【０２０８】
心臓エピゲノムは、理解されているとは、とても言えない。基本的に、ヒト組織におけるＤＮＡメチル化変化を信頼性高くマッピングすることができている研究は、ほんの僅かである。オンコロジーでは、腫瘍の外科的切除が、治療法の不可欠な部分であり、従って、外植された組織は、研究に容易に利用可能であるが、心不全の治療法は、ほとんど外科的介入を必要とせず、稀な状態（例えば、閉塞性肥大型心筋症）においてのみ、心筋の切除を必要とする（ＬＫ  Ｋｉｍら，Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｅｐｔａｌ  Ｍｙｅｃｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｓｅｐｔａｌ  Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ：ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｉｎｐａｔｉｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ，２００３−２０１１．ＪＡＭＡ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６；１：３２４−３２）。この研究において、本発明者らは、高品質ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出及び連続した現行の技術水準のシーケンシング及びメチル化マッピングのための既存の方法を改良することにより、ＤＣＭに起因する心不全を患う患者の診断中に採取した生検材料由来の残存心筋組織を評価することができた。最も大きな試料セットを含むことによって、本発明者らは、エピゲノムワイドな有意水準で、疾患関連メチル化マークを検出して、独立コホートにおいてそれらを再現して、それらの心臓遺伝子発現全般に対する影響を示すことができた。
【０２０９】
心不全は、先進工業国において蔓延する脅威である。有病率は、世界的に、すでに３，７７０万人であり、総医療費は、米国だけで年間２０９億ドルを超える（Ｚｉａｅｉａｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｆｏｎａｒｏｗ  ＧＣ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６；１３：３６８−７８）。罹患患者又はリスクのある個体をより良好に階層化するために、新たな分子バイオマーカーが望まれる。非常に系統的なアプローチによって、本発明者らは、心筋組織及び血液におけるＤＮＡメチル化変化の興味深い重複を見出した。かかる重複は、偶然に予測されるのではなく、血液細胞不均一性及びゲノム変動点から頑強なエピジェネティックなバイオマーカーパターンまでの交絡を回避するための厳しいフィルタリング手段をともなう診断的統計学性能の再現性によって予測される。この初期段階の収縮不全コホートにおいて、本発明者らは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰよりも優れているメチル化マーカーを見出している。しかしながら、予後判定、治療法モニタリング及び意思決定におけるメチル化マーカーの価値は、既存のバイオマーカーよりも優れているという結論を下す前に、綿密に評価されなくてはならない。
【０２１０】
非常に厳しいカットオフ（５×１０−８）を適用して、５個のエピゲノムワイドな有意なヒットが、１番染色体、３番染色体、１４番染色体及び１７番染色体上に位置されることがこの研究で分かった。他のエピゲノムワイドな関連（ＥＷＡ）研究で使用されるゲノムワイドな有意性に関して、より低いカットオフ（１０−６）（ＰＣ．Ｔｓａｉ  ａｎｄ  ＪＴ．Ｂｅｌｌ：Ｐｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１５）を使用する場合、１５個もの遺伝子座を、信頼性高くＤＣＭ及び心不全に結び付けることができる。５個の最も厳しいメチル化マークの上流又は下流にある遺伝子は、全て、心筋組織における発現を示す。発見コホートからの最上位のヒットｃｇ１６３１８１８１は、検証コホートにおいて再現された一方で、１０，０００ｂｐの距離内で遺伝子のメチル化の状況と発現との間に有意な相互作用は見られない。しかしながら、２個のエピゲノムワイドな有意ヒット、即ちｃｇ２５８３８９６８（ＰＬＸＮＡ２の遺伝子本体領域）及びｃｇ１６２５４９４６（ＧＬＩＳ１の遺伝子本体領域内）は、ｍＲＮＡ発現レベルと直接的な関連を示した。ＰＬＸＮＡ２は、プレキシン−Ａファミリーの成員であり、誘導分子（ｇｕｉｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）セマフォリン３Ｃに対する受容体であり、ＧＡＴＡ６関連シグナル伝達経路（Ｋ．Ｋｏｄｏら，ＧＡＴＡ６  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｕｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｆｌｏｗ  ｔｒａｃｔ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｂｙ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｐｌｅｘｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９；１０６：１３９３３−８）及びＨＡＮＤ２関連シグナル伝達経路（Ｙ  Ｍｏｒｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｐ．Ｃｓｅｒｊｅｓｉ．Ｃａｒｄｉａｃ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｎｄ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｏｕｔｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆｉｅｌｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００８；１０３：１４２２−９）の意味合いで、神経堤及び心臓流出路発達に関連して記載されている。
【０２１１】
心不全発病中、胎児性遺伝子プログラムの再発現は、ストレッサーに対する早期適応の中心的な要素であると考えられるが、最終的には適応不全及び疾患進行に至る。この協奏的なスイッチが実現される正確なメカニズムは明らかではない。非コードＲＮＡ及び幾つかのプロモーター要素及び転写因子が関与することは知られている。本発明者らの解析では、本発明者らは、心臓発達の幾つかの重要な調節因子の近傍でのＤＮＡメチル化変化を見出して、再現した。例えば、転写因子ＨＡＮＤ２は、二次心臓領域における心筋細胞分化及び増殖に関与している（ＤＧ，ＭｃＦａｄｄｅｎら：Ｔｈｅ  Ｈａｎｄ１  ａｎｄ  Ｈａｎｄ２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｄｉａｃ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄｏｓａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００５；１３２：１８９−２０１）。心不全の間、カルシニューリン／Ｎｆａｔシグナル伝達及び或るｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２５）は、ＨＡＮＤ２活性化を制御すると考えられる（Ｅ．Ｄｉｒｋｘら：Ｎｆａｔ  ａｎｄ  ｍｉＲ−２５  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｈａｎｄ２  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３；１５：１２８２−９３）。
【０２１２】
本発明者らの研究において、本発明者らは、転写物の調節に有意に関連付けられるＨＡＮＤ２遺伝子座のＤＮＡメチル化の変化を見出した。ＩＲＸ５、ＴＢＸ５、ＴＢＸ３及びＴＢＸ１５並びにそれらの下流エフェクターの幾つかもまた、ＤＣＭの状況で変えられる。全体で、５１７個のＣｐＧが、一方向に再現され、ＤＣＭ及びｍＲＮＡ転写と関連付けられる。５１７個のうち３０７個が、ＤＣＭにおいて低メチル化され、２１０個が、ＤＣＭにおいて高メチル化された。低メチル化部位は、３７４個の遺伝子のアップレギュレーション及び１７３個の遺伝子のダウンレギュレーションと相関した。れは、２．１６のアップレギュレーション比に相当する。高メチル化部位は、２０４個の遺伝子のアップレギュレーション及び１７１個の遺伝子のダウンレギュレーションと相関した（アップレギュレーション比１．１９）。従って、ＤＮＡメチル化は、心不全中に重要な遺伝子の機能的再構築に関与する場合があり、これらの数は、ＤＣＭにおける低メチル化の影響が、主に遺伝子（再）活性化をもたらすように思われる一方で、高メチル化の影響は平衡状態にあることを示している（Ｍ．Ｍｏｖａｓｓａｇｈ：Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｓｔａｇｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１１；１２４：２４１１−２２）。
【０２１３】
発達中に及びｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的条件下で、遺伝子発現を促進する調節原理は、ほんの僅かしか同定されていない（ＩＡ．Ｓｅｒｇｅｅｖａら：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｐｐａ−Ｎｐｐｂ  ｇｅｎｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１６；１４３：２１３５−４６）。本発明者らのデータにより、ＤＮＡメチル化は、この状況で、単独で又は他のメカニズムと呼応して作用し得ることが示される。例として、ＤＮＡメチル化は、ＮＰＰＡ−ＮＰＰＢ遺伝子クラスターに役立ち得る。ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢは、複製によって共通の祖先遺伝子から伝わり、従って、共通のクロマチン調節メカニズムを共有する（Ｍ．Ｈｏｈｌら：ＨＤＡＣ４  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｌｏａｄ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３：１３５９−７０）。同様に、本発明者らは、ＮＰＰＡ及びＮＰＰＢの５’隣接ＣｐＧの組織的な低メチル化を見出したが、これは、転写物心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のアップレギュレーションと関連付けられる。注目すべきことに、本発明者らは、末梢血において、同じ方向の低メチル化を見出しており、これは、異なる組織間の保存された心不全関連ＤＮＡメチル化のパターン形成の興味深い見解を支持する。
【０２１４】
ＤＮＡメチル化の二様性（相同ＤＮＡの２つのコピー）は、遺伝子発現に亘る二成分オンオフ制御を暗示するが、ゲノム全体にわたる相当数の中間メチル化遺伝子座は、このモデル内に収まらない（Ｇ．Ｅｌｌｉｏｔｔら：Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６：６３６３）。本発明者らが知る限りでは、このことは、心不全中に発生するかかるエピジェネティックなパターンの組織間保存を同定した最初の研究である。本発明者らのコホート及び研究設計のおかげで、本発明者らは、観察された調節が、投薬療法又は他の交絡因子のみに起因することを排除することができる。ＮＰＰＡ／ＮＰＰＢの例によって示されるように、本発明者らは、症候群としての心不全が、状況依存性機能のエピゲノムのシグネチャーを表わす種々の細胞型において感度が高いメカニズムに起因するＤＮＡメチル化変化を強いることができると想定している（ＡＡ．Ｐａｉら：Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２０１１；７：ｅ１００１３１６）。
【０２１５】
この研究の潜在的な限界は、エピジェネティックなパターン及びＤＮＡメチル化に影響を及ぼす交絡因子である。技術的展望から、本発明者らは、プローブ領域内での遺伝子変異体及びバッチの影響が、考慮される必要のある重要な観点であることを見出した。この問題に最良に対処するために、本発明者らは、患者の全ゲノムシーケンシングを行なって、それらの部位を同定し、またＩｎｆｉｎｉｕｍプラットフォーム上の異なるアレイ上で、患者のランダム試料を複数回測定して、バッチによって導入される階層を規定した。生物学的レベルで、症例及び対照の薬物療法並びに組織の不均一性は、潜在的な交絡因子であると知られており、本発明者らは、主成分解析により、それを補正した。完全に独立した再現コホートを使用して、本発明者らは、対照の投薬療法、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー生成プロトコル及びメチル化測定バッチの影響等の交絡因子を排除した。質量分析法ベースのＤＮＡメチル化測定を使用して、本発明者らは、マーカーの選択に関する本発明者らのアプローチの信頼性を更に立証した。
【０２１６】
本研究は、本発明者らの知識に、ヒト心臓におけるＤＮＡメチル化の最も包括的なマッピングを提供して、遺伝子変動、ＤＮＡメチル化及び全トランスクリプトーム解析を網羅する包括的なアプローチを使用して、心不全及びＤＣＭに関連付けられる新規遺伝子座を同定する。心血管疾患において、エピジェネティックな研究を推進するために、統計学（検定力計算（ｐｏｗｅｒ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）（ＰＣ．Ｔｓａｉ  ａｎｄ  ＪＴ．Ｂｅｌｌ：Ｐｏｗｅｒ  ａｎｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１５）、エピゲノムワイドな有意水準、差別的なメチル化モデル（Ｓ．Ｗａｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｌｏｃｉ  ｗｉｔｈ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ａｒｒａｙｓ．Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１１；３５：６８６−９４））、種々の生物学的レベルを組み込む適切な研究設計（マルチオミクス）及び適正な対照及び交絡因子の定義に関する新規発想を開発することが必要とされる。特に、心筋組織に関して、健常対照の欠如が、心臓エピジェネティクスの解明を制約している。本研究では、本発明者らは、不全の心筋を、通常の機能を示す移植された心臓及び交通事故に遭ったドナーのより小さな対照群に由来する非不全組織と比較した。重要なことに、本発明者らは、適正な対照を多く得ることができる末梢血におけるＤＮＡメチル化を研究することは価値があることを示す。
【０２１７】
虚血性心不全を含む種々の病因に起因する心不全の長期的なコホートにおいてＤＮＡメチル化マーカーを系統的に評価することは興味深い。ここで検出されるメチル化マーカーの潜在的な効能は、収縮不全及び心不全のより早期の検出に向かうが、それらのマーカーはまた、治療法選択及びモニタリングに関しても評価され得る。
【０２１８】
本明細書に記載する方法により、患者におけるマーカー、特にＨＦ及びＤＣＭのような非感染性疾患に関するマーカー、の発見のための効率的かつ改善されたツールが可能となる。
【０２１９】
本明細書で見いだされるマーカーを用いて、ＨＦ／ＤＣＭの改善された早期検出及び予後判定、治療法決定支援のための患者階層化、並びに最適化された個別化治療が可能となる。
【０２２０】
本発明は、ＨＦ／ＤＣＭ、若しくはＨＦ／ＤＣＭを発症するリスクを示す、又は治療法の効果若しくは治療法の成果の予測のための分子マーカーについて報告する。
【０２２１】
本研究は、心不全を有する生存患者における、本発明者らの知る限り、マルチオミクスアプローチを使用した最初のエピゲノムワイドな関連研究を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月9日(2019.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患に関する患者由来のマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料及び罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること又はそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル又は前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル又はトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の該少なくとも１つの試料の両方において、前記エピゲノミクスプロファイル又は前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
疾患に関する患者由来のマーカーを決定する方法であって、
前記疾患と診断された前記患者の末梢血の少なくとも１つの試料又は罹患組織の少なくとも１つの試料を入手又は準備すること；
前記末梢血の前記少なくとも１つの試料及び前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイルを獲得すること並びにそれらのトランスクリプトームを解析すること；
前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームを、それぞれ、適切な対照のエピゲノミクスプロファイル及びトランスクリプトームと比較すること；及び
前記疾患と診断された前記患者の前記末梢血の前記少なくとも１つの試料又は前記罹患組織の前記少なくとも１つの試料のいずれかにおいて、前記エピゲノミクスプロファイル及び前記トランスクリプトームにおける１つ以上の変化を特定すること
を含む、方法。
【請求項３】
前記患者がヒトである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が心不全（ＨＦ）又は拡張型心筋症（ＤＣＭ）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記罹患組織の前記試料が心筋組織から入手される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変化が高メチル化及び／若しくは低メチル化並びに／又はＲＮＡ発現レベルの変化である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記末梢血又は前記罹患組織の複数の試料が前記疾患と診断された患者から入手され又は準備される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の末梢血又は罹患組織の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル又はトランスクリプトームを獲得又は準備すること；及び
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を特定すること
を含む、方法。
【請求項９】
前記罹患組織が心筋であり、前記疾患が心不全又は拡張型心筋症である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのエピジェネティックなマーカー又はトランスクリプトームマーカーは、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表１に開示する配列から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて心筋組織において高／低メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表２に開示する配列から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において同調的な高／低メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表３に開示する配列から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表４に開示する配列から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関する、ゲノム領域中に、それぞれ、含有され、表５に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表６に開示する配列から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、前記参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関する、ゲノム領域中に含有され、表７に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表８に開示する配列から選択され、又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血において異常メチル化を示す、それぞれ、前記参照Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋデータベース及び前記参照ゲノムｈｇ１９に関する、ゲノム領域中に含有され、表９に開示するｃｐｇ  ＩＤ若しくは位置から選択され；又は、
ＨＦ／ＤＣＭにおいて末梢血及び心筋組織において異常メチル化を示し且つＲＮＡ発現レベルと関連付けられる参照ゲノムｈｇ１９に関するゲノム領域中に含有され、表１０に開示するＡＮＦ又はＢＮＰ遺伝子座又は配列から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
複数のマーカーの存在が決定される請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
患者における心不全又は拡張型心筋症に関するマーカーとしての請求項１０に記載のマーカーの使用。
【請求項１３】
請求項１０に記載のマーカーを含むデータバンク。
【請求項１４】
患者における疾患のリスクを決定する方法であって、
前記患者の末梢血又は罹患組織の少なくとも１つの試料のエピゲノミクスプロファイル又はトランスクリプトームのデータを獲得又は準備すること；及び
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって決定される少なくとも１つのマーカーの存在を決定すること
を含む、方法。
【請求項１５】
実行されると請求項１４に記載の方法を実施するコンピューター実行可能命令を含むコンピュータープログラム製品。
【請求項１６】
心不全又は拡張型心筋症と診断された患者の予後診断の方法又は前記患者の薬物ベースの治療法において前記患者をモニタリングし又は補助する方法であって、請求項１０に記載のマーカーが使用される、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月16日(2019.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
前記変化が高メチル化若しくは低メチル化又はＲＮＡ発現レベルの変化である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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2019522997.tif 000128
2019522997.tif 000129
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