(57)【要約】  本発明は、第ＶＩＩＩ因子に結合する改変ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、配列番号３に示される配列又はその断片又はそれに９０％同一である配列を含む、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含み、該切断型ＶＷＦは、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示される配列若しくはその断片又はそれらに９０％同一である配列を含む、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドであって、該切断型ＶＷＦが、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含み；該切断型ＶＷＦが第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記切断型ＶＷＦが配列番号３に示される配列を含み、前記切断型ＶＷＦが、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含み；前記切断型ＶＷＦが第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記切断型ＶＷＦが、非改変の配列番号３を含む参照ポリペプチドより低い解離速度(off rate)で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも５倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも１０倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも５倍低いＫＤで第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも１０倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記切断型ＶＷＦが少なくとも２つの改変を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記切断型ＶＷＦが少なくとも３つの改変を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記切断型ＶＷＦが配列番号５（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記切断型ＶＷＦが配列番号６（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記切断型ＶＷＦが配列番号７（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記切断型ＶＷＦが配列番号８（Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ）を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１７（Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記切断型ＶＷＦが配列番号９（Ｖ１０８３Ａ）を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１０（Ｓ１０４２Ｔ）を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１１（Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ）を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１２（Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ）を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１３（Ｌ７８１Ｐ）を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７をさらに含む、請求項１から１９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２７０をさらに含む、請求項１から２０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７を欠失する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から２８１３を欠失する、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号３が、位置１の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群から選択されるように改変される、請求項２２又は２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号３が、位置３の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群から選択されるように改変される、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記切断型ＶＷＦが配列番号５（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記切断型ＶＷＦが配列番号６（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記切断型ＶＷＦが配列番号７（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記切断型ＶＷＦが配列番号８（Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記切断型ＶＷＦが配列番号９（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１０（Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１１（Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１２（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１３（Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１４（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１５（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１６（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記切断型ＶＷＦが配列番号１７（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ）を含む、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記切断型ＶＷＦが配列番号３に示される配列又はその断片を含む、第ＶＩＩＩ因子に結合するポリペプチドであって、該配列が少なくとも位置３２０、並びに位置１及び／又は３に改変を含み、その結果、前記切断型ＶＷＦが非改変の配列番号３を含む参照ポリペプチドより低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、ポリペプチド。
【請求項４０】
前記切断型ＶＷＦが少なくとも配列番号３の少なくとも位置１、３及び３２０に改変を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号３が、位置３２０の残基がＡであるように改変される、請求項３８又は３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号３が、位置３の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群から選択されるように改変される、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号３が、位置１の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群から選択されるように改変される、請求項３８から４１までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７をさらに含む、請求項３８から４２までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２７０をさらに含む、請求項３８から４３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から２８１３を欠失する、請求項３８から４３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
半減期延長部分をさらに含む、請求項１から４６までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記半減期延長部分が前記切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばＦｃ断片、トランスフェリン及びその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして知られる大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを含むか又はそれからなる、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記半減期延長部分が前記ポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項４７から４９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記異種アミノ酸配列がアルブミンを含む、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記アルブミンのＮ末端が、直接的に又はスペーサーを介して前記切断型ＶＷＦ配列のＣ末端に融合されている、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記ポリペプチドの天然Ｃ末端の１〜５個のアミノ酸が欠失された、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質であり、該Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が平均して少なくとも１つのシアル酸部分を含む、請求項１から５４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記Ｎ−グリカンの少なくとも６０％が平均して少なくとも１つのα−２，６−シアル酸部分を含む、請求項５５のポリペプチド。
【請求項５７】
二量体である、請求項１から５５までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
第ＶＩＩＩ因子分子と請求項１から５７までのいずれか一項のポリペプチドとを含む複合体。
【請求項５９】
血液凝固障害の処置又は予防で使用するための、請求項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は請求項５８の複合体。
【請求項６０】
前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、請求項５９に記載の使用のためのポリペプチド又は複合体。
【請求項６１】
請求項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は請求項５８の複合体を含む、医薬組成物。
【請求項６２】
医薬的有効量の、請求項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は請求項５８の複合体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、血液凝固障害を処置する方法。
【請求項６３】
前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、請求項６２の方法。
【請求項６４】
血液凝固障害の前記処置のための医薬の調製における、請求項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は請求項５８の複合体の使用。
【請求項６５】
前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、請求項６４の使用。
【請求項６６】
血液凝固障害を処置する方法であって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を投与するステップを含み、投与しようとするポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、方法。
【請求項６７】
血液凝固障害を処置する方法であって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を投与するステップを含み、投与されるポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比が０．５より大きい、方法。
【請求項６８】
前記対象がヒトである、請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが静脈内投与される、請求項６６から６８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）が、参照処置と比べて、請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの同時投与により増大され、前記ポリペプチド及び前記ＦＶＩＩＩが該参照処置において等モル量で投与されることを除き、該参照処置が前記処置と同一である、請求項６６から６９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＦＶＩＩＩの投与頻度が、前記ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて低減される、請求項６６から７０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの血漿半減期が内在性ＶＷＦの血漿半減期よりも長い、請求項６６から７１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの血漿半減期が内在性ＶＷＦの血漿半減期よりも少なくとも２５％長い、請求項７３に記載の方法。
【請求項７４】
（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び（ｉｉ）請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物であって、該組成物中の該ポリペプチドの該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、医薬組成物。
【請求項７５】
血液凝固障害の処置における同時使用、個別使用又は連続使用のための、（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び（ｉｉ）請求項１から５７までのいずれか一項において定義されているポリペプチドを含む医薬キットであって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に該ポリペプチド及び該ＦＶＩＩＩを投与するステップを含み、投与される該ポリペプチドの該内在性ＶＷＦに対するモル比は０．５より大きく、及び／又は投与しようとする該ポリペプチドの投与しようとする該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、医薬キット。
【請求項７６】
ＦＶＩＩＩの前記血漿半減期を改善するため、及び／又はＦＶＩＩＩの前記投与頻度を低減するための、請求項１から５７までのいずれか一項において定義されているポリペプチドの使用。
【請求項７７】
有効量の、請求項１から５７までのいずれか一項において定義されているポリペプチド及びＦＶＩＩＩを、内在性ＶＷＦを有する患者に投与するステップを含む、血液凝固障害を処置する方法であって、投与される該ポリペプチドの該内在性ＶＷＦに対するモル比は０．５より大きく、及び／又は、投与しようとする該ポリペプチドの投与しようとする該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、方法。
【請求項７８】
請求項１から５７までのいずれか一項のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７９】
請求項７８のポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクター。
【請求項８０】
前記プラスミド又はベクターが発現ベクターである、請求項７９のプラスミド又はベクター。
【請求項８１】
請求項７８のポリヌクレオチド又は請求項７９若しくは８０のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項８２】
切断型ＶＷＦを含むポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）切断型ＶＷＦを含む該ポリペプチドが発現するような条件下で、請求項８１の宿主細胞を培養するステップ；及び
（ｉｉ）任意選択で、該切断型ＶＷＦを含む該ポリペプチドを該宿主細胞から又は培養培地から回収するステップ
を含む、方法。
【請求項８３】
第ＶＩＩＩ因子の半減期を増大させる方法であって、該第ＶＩＩＩ因子を請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドと混合するステップを含む、方法。
【請求項８４】
増大したシアリル化を含むＮ−グリカンを含む請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ｉ）請求項１から５７までのいずれか一項に記載の該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供するステップ、及び（ｉｉ）３６．０℃未満の温度で該細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項８５】
請求項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの二量体を生成するか、又は該ポリペプチドの二量体化を増大するための方法であって、（ｉ）請求項１から５７までのいずれか一項に記載の該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供するステップ、及び（ｉｉ）３６．０℃未満の温度で該細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項８６】
前記細胞が、シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸をさらに含む、請求項８４又は８５に記載の方法。
【請求項８７】
（ｉｉ）のステップの前に、前記細胞を３７．０℃±１．０℃の温度で培養し、（ｉｉ）のステップが、前記細胞を３４．０℃±２．０℃の温度で培養するステップを含む、請求項８４から８６までのいずれか一項の方法。
【請求項８８】
（ｉ）請求項８４から８７までのいずれか一項において得られた前記ポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにかけるステップであって、それにより高シアリル化のポリペプチドを低シアリル化のポリペプチドから分離する該ステップ；及びイオン交換カラムから溶出された高シアリル化を有するフラクションを回収するステップ；又は（ｉｉ）請求項８４から８７までのいずれか一項において得られた前記ポリペプチドを、シアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーとインビトロで接触させるステップをさらに含む、請求項８４から８７までのいずれか一項の方法。
【請求項８９】
平均して、得られた前記ポリペプチドの少なくとも７５％の前記Ｎ−グリカンが少なくとも１つのシアル酸部分を含む、請求項８４から８８までのいずれか一項の方法。
【請求項９０】
平均して、得られた前記ポリペプチドの少なくとも５０％が二量体として存在する、請求項８４から８９までのいずれか一項の方法。
【請求項９１】
請求項８４から９０までのいずれか一項の方法により得ることができるポリペプチド。
【請求項９２】
血液凝固障害の処置における使用のための請求項９１に記載のポリペプチドであって、該処置が有効量の該ポリペプチド及び有効量のＦＶＩＩＩを対象に投与するステップを含み、該ポリペプチドが静脈内投与又は皮下投与され、該ＦＶＩＩＩが静脈内投与される、ポリペプチド。
【請求項９３】
前記ポリペプチドの同時投与により、ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）が該ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて増大され、及び／又は前記ＦＶＩＩＩの投与頻度が前記ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて低減される、請求項９１に記載の使用のためのポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全内容が参照として本明細書に組み込まれる、２０１６年１月７日出願のオーストラリア特許出願第２０１６９０００３４号に関連し、優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ポリペプチド、特に、第ＶＩＩＩ因子への改善された結合親和性を示す改変切断型フォンウィルブランド因子に関する。本発明はさらに、当該ポリペプチド及びＦＶＩＩＩを含む複合体、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに当該ポリペプチドを生成する方法に関する。さらに、本発明は、血液凝固障害を処置するための本発明のポリペプチド又は複合体の治療的又は予防的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固因子の欠損によって引き起こされる様々な出血障害が存在する。最も一般的な障害は血友病Ａ及びＢであり、これらは、それぞれ血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子の欠損に起因する。別の既知の出血障害はフォンウィルブランド病である。
【０００４】
血漿では、ＦＶＩＩＩは主にＶＷＦとの非共有結合性複合体に存在し、膜結合型活性化第Ｘ因子生成複合体において活性化第ＩＸ因子の補因子として働く。
【０００５】
細胞受容体とのその相互作用を低減させることによって（ＷＯ０３／０９３３１３Ａ２、ＷＯ０２／０６０９５１Ａ２）、ポリマーをＦＶＩＩＩに共有結合させることによって（ＷＯ９４／１５６２５、ＷＯ９７／１１９５７及びＵＳ４９７０３００）、ＦＶＩＩＩの封入によって（ＷＯ９９／５５３０６）、新規な金属結合部位の導入によって（ＷＯ９７／０３１９３）、ペプチド結合（ＷＯ９７／４０１４５及びＷＯ０３／０８７３５５）若しくはジスルフィド結合（ＷＯ０２／１０３０２４Ａ２）のいずれかによりＡ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合させることによって、又はＡ１ドメインをＡ２ドメインに共有結合させることによって（ＷＯ２００６／１０８５９０）、非活性化ＦＶＩＩＩの半減期を延長するための試みがいくつか行われている。
【０００６】
ＦＶＩＩＩ又はＶＷＦの機能的半減期を増大させるための別のアプローチは、ＦＶＩＩＩのペグ化による（ＷＯ２００７／１２６８０８、ＷＯ２００６／０５３２９９、ＷＯ２００４／０７５９２３）。血漿中に存在するＦＶＩＩＩの半減期を間接的に増大させる目的で、ＶＷＦのペグ化（ＷＯ２００６／０７１８０１）も試みられている。また、ＦＶＩＩＩの融合タンパク質も記載されている（ＷＯ２００４／１０１７４０、ＷＯ２００８／０７７６１６及びＷＯ２００９／１５６１３７）。
【０００７】
様々な形態のフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）において、失われ、機能的に欠陥のある、又は低減した量でのみ得られるＶＷＦは、血漿中に存在する多量体の粘着性糖タンパク質であり、複数の生理的機能を有する。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンなどの細胞外基質の成分との間のメディエーターとして働く。さらに、ＶＷＦは、凝血原ＦＶＩＩＩに対する担体及び安定化タンパク質として働く。ＶＷＦは、２８１３アミノ酸の前駆体分子として、内皮細胞及び巨核球で合成される。野生型ＶＷＦのアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列は、Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４３９３〜４３９７に開示されている。前駆体ポリペプチド、すなわちプレプロＶＷＦは、血漿中で見られる２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド及び２０５０残基のポリペプチドからなる（Ｆｉｓｃｈｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：３４５〜３４８、１９９４）。小胞体でのシグナルペプチドの切断後に、ＶＷＦの２つのモノマーの間にＣ末端ジスルフィド架橋が形成される。分泌経路を通るさらなる輸送の間に、１２個のＮ−連結型及び１０個のＯ−連結型炭化水素側鎖が付加される。重要なことに、ＶＷＦ二量体はＮ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、７４１アミノ酸のプロペプチドは、後期ゴルジ装置でＰＡＣＥ／フューリン酵素によって切断される。プロペプチド及びＶＷＦの高分子量多量体（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）は、内皮細胞のバイベル・パラーデ小体又は血小板のα顆粒中に貯蔵される。
【０００８】
血漿中に一旦分泌されると、プロテアーゼのＡＤＡＭＴＳ１３がＶＷＦのＡ１ドメイン内でＶＷＦを切断する。血漿のＶＷＦは、５００ｋＤａの単一の二量体から１０，０００ｋＤａを超える分子量の２０個を超える二量体からなる多量体にわたる範囲の、ある範囲の多量体からなる。典型的には、ＶＷＦ高分子量多量体（ＶＷＦ−ＨＭＷＭ）が最も強い止血活性を有し、これは、リストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）で測定することができる。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比が高いほど、高分子量多量体の相対量が高い。
【０００９】
ＶＷＦの欠陥は、程度の差はあるが明白な出血の表現型を特徴とするフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）の原因である。３型ＶＷＤは最も重篤な形態であり、ＶＷＦが完全に失われている。１型ＶＷＤはＶＷＦの量的欠失（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｌｏｓｓ）に関しており、その表現型は非常に軽い場合がある。２型ＶＷＤはＶＷＦの質的欠陥に関し、３型ＶＷＤと同じくらい重篤であり得る。２型ＶＷＤは多くの亜型を有し、それらのうちのいくつかは高分子量多量体の欠失又は低下を伴う。２ａ型フォンＶＷＤは、中程度の多量体と大型の多量体の両方の欠失を特徴とする。２Ｂ型ＶＷＤは、最も高分子量の多量体の欠失を特徴とする。
【００１０】
ＶＷＤは最もよくあるヒトの遺伝性出血障害であり、血漿又は組換え起源のＶＷＦを含有する濃縮物を用いる補充療法（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）によって処置することができる。ＶＷＦは、例えばＥＰ０５５０３９９１に記載されているように、ヒト血漿から調製することができる。ＥＰ０７８４６３２は、組換えＶＷＦを生成及び単離する方法を記載している。
【００１１】
血漿では、ＦＶＩＩＩはＶＷＦに高親和性で結合し、これは、早発性の異化作用からＦＶＩＩＩを保護するので、一次止血におけるその役割に加えて、ＦＶＩＩＩの血漿レベルの調節において重要な役割を果たし、その結果として、二次止血の制御における中心的因子でもある。ＶＷＦに結合した非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は、血漿中で約１２〜１４時間である。ＶＷＦが存在しない、又はほとんど存在しない３型フォンウィルブランド病では、ＦＶＩＩＩの半減期はわずか約６時間であり、ＦＶＩＩＩ濃度の低下が原因で、そのような患者において軽度から中等度の血友病Ａの症状がもたらされる。ＦＶＩＩＩに対するＶＷＦの安定化作用は、ＣＨＯ細胞でＦＶＩＩＩの組換え発現を助長するためにも使用されている（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８９、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本出願人の同時係属国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０３６９において、ＶＷＦのドメインＤ’におけるいくつかのの改変によって第ＶＩＩＩ因子への結合が増大され得ることが開示されている。この出願の開示は、相互参照により本明細書に含まれる。本発明者らは、今回、第ＶＩＩＩ因子へのＶＷＦの結合が、Ｄ’における他の改変によって、特にＤ３ドメインにおける改変によって増大され得ることを見出した。
【００１３】
従って、本発明は、以下の実施形態［１］から［９３］までに関する。
［１］配列番号３に示される配列若しくはその断片又はそれらに９０％同一である配列を含む、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドであって、該切断型ＶＷＦは、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含み；該切断型ＶＷＦが第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合する、ポリペプチド。
［２］前記切断型ＶＷＦが配列番号３に示される配列を含み、前記切断型ＶＷＦが、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含み；前記切断型ＶＷＦが第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合する、項１に記載のポリペプチド。
［３］前記切断型ＶＷＦが、非改変の配列番号３を含む参照ポリペプチドより低い解離速度(off rate)で第ＶＩＩＩ因子に結合する、項１又は２に記載のポリペプチド。
［４］前記改変ポリペプチドが前記参照ポリペプチドより少なくとも５倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、項３に記載のポリペプチド。
［５］前記改変ポリペプチドが前記参照ポリペプチドより少なくとも１０倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、項３に記載のポリペプチド。
［６］前記改変ポリペプチドが前記参照ポリペプチドより少なくとも５倍低いＫＤで第ＶＩＩＩ因子に結合する、項３に記載のポリペプチド。
［７］前記改変ポリペプチドが前記参照ポリペプチドより少なくとも１０倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、項６に記載のポリペプチド。
［８］前記切断型ＶＷＦが少なくとも２つの改変を含む、項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［９］前記切断型ＶＷＦが少なくとも３つの改変を含む、項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１０］前記切断型ＶＷＦが配列番号５（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１１］前記切断型ＶＷＦが配列番号６（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１２］前記切断型ＶＷＦが配列番号７（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１３］前記切断型ＶＷＦが配列番号８（Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ）を含む、項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１４］前記切断型ＶＷＦが配列番号１７（Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）を含む、項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１５］前記切断型ＶＷＦが配列番号９（Ｖ１０８３Ａ）を含む、項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１６］前記切断型ＶＷＦが配列番号１０（Ｓ１０４２Ｔ）を含む、項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１７］前記切断型ＶＷＦが配列番号１１（Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ）を含む、項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１８］前記切断型ＶＷＦが配列番号１２（Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ）を含む、項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［１９］前記切断型ＶＷＦが配列番号１３（Ｌ７８１Ｐ）を含む、項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２０］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７をさらに含む、項１から１９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２１］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２７０をさらに含む、項１から２０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２２］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７を欠失する、項１から１９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２３］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から２８１３を欠失する、項２２に記載のポリペプチド。
［２４］配列番号３が、位置１の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群から選択されるように改変される、項２２又は２３に記載のポリペプチド。
［２５］配列番号３が、位置３の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群から選択されるように改変される、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２６］前記切断型ＶＷＦが配列番号１８（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２７］前記切断型ＶＷＦが配列番号１９（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２８］前記切断型ＶＷＦが配列番号２０（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［２９］前記切断型ＶＷＦが配列番号２１（Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３０］前記切断型ＶＷＦが配列番号２２（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３１］前記切断型ＶＷＦが配列番号２３（Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３２］前記切断型ＶＷＦが配列番号２４（Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３３］前記切断型ＶＷＦが配列番号２５（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３４］前記切断型ＶＷＦが配列番号２６（Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３５］前記切断型ＶＷＦが配列番号２７（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３６］前記切断型ＶＷＦが配列番号２８（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３７］前記切断型ＶＷＦが配列番号２９（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３８］前記切断型ＶＷＦが配列番号３０（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ）を含む、項２２から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［３９］前記切断型ＶＷＦが配列番号３に示される配列又はその断片を含む、第ＶＩＩＩ因子に結合するポリペプチドであって、該配列が少なくとも位置３２０、並びに位置１及び／又は３に改変を含み、その結果、前記切断型ＶＷＦが非改変の配列番号３を含む参照ポリペプチドより低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、ポリペプチド。
［４０］前記切断型ＶＷＦが配列番号３の少なくとも位置１、３及び３２０に改変を含む、項３８に記載のポリペプチド。
［４１］配列番号３が、位置３２０の残基がＡであるように改変される、項３８又は３９に記載のポリペプチド。
［４２］配列番号３が、位置３の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群から選択されるように改変される、項３８から４０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［４３］配列番号３が、位置１の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群から選択されるように改変される、項３８から４１までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［４４］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７をさらに含む、項３８から４２までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［４５］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２７０をさらに含む、項３８から４３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［４６］前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から２８１３を欠失する、項３８から４３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［４７］半減期延長部分をさらに含む、項１から４６までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［４８］前記半減期延長部分が前記切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、項４７に記載のポリペプチド。
［４９］前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばＦｃ断片、トランスフェリン及びその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして知られる大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖（ｓｏｌｖａｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｃｈａｉｎ）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを含むか又はそれからなる、項４８に記載のポリペプチド。
［５０］前記半減期延長部分が前記ポリペプチドにコンジュゲートされている、項４７から４９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［５１］前記半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項５０に記載のポリペプチド。
［５２］前記異種アミノ酸配列がアルブミンを含む、項４９に記載のポリペプチド。
［５３］前記アルブミンのＮ末端が、直接的に又はスペーサーを介して前記改変ポリペプチド配列のＣ末端に融合されている、項５２に記載のポリペプチド。
［５４］前記ポリペプチドの天然Ｃ末端の１から５個のアミノ酸が欠失された、項５３に記載のポリペプチド。
［５５］Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質であり、該Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が平均して少なくとも１つのシアル酸部分を含む、項１から５４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［５６］前記Ｎ−グリカンの少なくとも６０％が平均して少なくとも１つのα−２，６−シアル酸部分を含む、項５５のポリペプチド。
［５７］二量体である、項１から５５までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
［５８］第ＶＩＩＩ因子分子と項１から５７までのいずれか一項のポリペプチドとを含む複合体。
［５９］血液凝固障害の処置又は予防で使用するための、項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は項５８の複合体。
［６０］前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、項５９に記載の使用のためのポリペプチド又は複合体。
［６１］項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は項５８の複合体を含む、医薬組成物。
［６２］医薬的有効量の、項１から５７までのいずれか一項のポリペプチド又は項５８の複合体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、血液凝固障害を処置する方法。
［６３］前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、項６２の方法。
［６４］血液凝固障害の前記処置のための医薬の調製における、項１から５７までのいずれか一項の改変ポリペプチド又は項５８の複合体の使用。
［６５］前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、項６４の使用。
［６６］血液凝固障害を処置する方法であって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を投与するステップを含み、投与しようとするポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、方法。
［６７］血液凝固障害を処置する方法であって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を投与するステップを含み、投与されるポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比が０．５より大きい、方法。
［６８］前記対象がヒトである、項６６又は６７に記載の方法。
［６９］前記ポリペプチドが静脈内投与される、項６６から６８までのいずれか一項に記載の方法。
［７０］ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）が、参照処置と比べて、項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの同時投与により増大され、前記ポリペプチド及び前記ＦＶＩＩＩが該参照処置において等モル量で投与されることを除き、該参照処置が前記処置と同一である、項６６から６９までのいずれか一項に記載の方法。
［７１］前記ＦＶＩＩＩの投与頻度が、前記ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて低減される、項６６から７０までのいずれか一項に記載の方法。
［７２］項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの血漿半減期が内在性ＶＷＦの血漿半減期よりも長い、項６６から７１までのいずれか一項に記載の方法。
［７３］項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの血漿半減期が内在性ＶＷＦの血漿半減期よりも少なくとも２５％長い、項７３に記載の方法。
［７４］（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び（ｉｉ）項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物であって、該組成物中の該ポリペプチドの該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、医薬組成物。
［７５］血液凝固障害の処置における同時使用、個別使用又は連続使用のための、（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び（ｉｉ）項１から５７までのいずれか一項において定義されているポリペプチドを含む医薬キットであって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に該ポリペプチド及び該ＦＶＩＩＩを投与するステップを含み、投与される該ポリペプチドの該内在性ＶＷＦに対するモル比が０．５より大きく、及び／又は投与しようとする該ポリペプチドの投与しようとする該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、医薬キット。
［７６］ＦＶＩＩＩの前記血漿半減期を改善するため、及び／又はＦＶＩＩＩの前記投与頻度を低減するための、項１から５７までのいずれか一項において定義されているポリペプチドの使用。
［７７］有効量の、項１から５７までのいずれか一項において定義されているポリペプチド及びＦＶＩＩＩを、内在性ＶＷＦを有する患者に投与するステップを含む、血液凝固障害を処置する方法であって、投与される該ポリペプチドの該内在性ＶＷＦに対するモル比が０．５より大きく、及び／又は、投与しようとする該ポリペプチドの投与しようとする該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、方法。
［７８］項１から５７までのいずれか一項のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［７９］項７８のポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクター。
［８０］前記プラスミド又はベクターが発現ベクターである、項７９のプラスミド又はベクター。
［８１］項７８のポリヌクレオチド又は項７９若しくは８０のプラスミドを含む宿主細胞。
［８２］切断型ＶＷＦを含むポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）切断型ＶＷＦを含む該ポリペプチドが発現するような条件下で、項８１の宿主細胞を培養するステップ；及び
（ｉｉ）任意選択で、該切断型ＶＷＦを含む該ポリペプチドを該宿主細胞から又は培養培地から回収するステップ
を含む、方法。
［８３］第ＶＩＩＩ因子の半減期を増大させる方法であって、該第ＶＩＩＩ因子を項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドと混合するステップを含む、方法。
［８４］増大したシアリル化を有するＮ−グリカンを含む項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ｉ）項１から５７までのいずれか一項に記載の該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供するステップ、及び（ｉｉ）３６．０℃未満の温度で該細胞を培養するステップを含む、方法。
［８５］項１から５７までのいずれか一項に記載のポリペプチドの二量体を生成するか、又は該ポリペプチドの二量体化を増大するための方法であって、（ｉ）項１から５７までのいずれか一項に記載の該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供するステップ、及び（ｉｉ）３６．０℃未満の温度で該細胞を培養するステップを含む、方法。
［８６］前記細胞が、シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸をさらに含む、項８４又は８５に記載の方法。
［８７］（ｉｉ）のステップの前に、前記細胞を３７．０℃±１．０℃の温度で培養し、（ｉｉ）のステップが、前記細胞を３４．０℃±２．０℃の温度で培養するステップを含む、項８４から８６までのいずれか一項の方法。
［８８］（ｉ）項８４から８７までのいずれか一項において得られた前記ポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにかけるステップであって、それにより高シアリル化のポリペプチドを低シアリル化のポリペプチドから分離する該ステップ；及びイオン交換カラムから溶出された高シアリル化を有するフラクションを回収するステップ；又は（ｉｉ）項８４から８７までのいずれか一項において得られた前記ポリペプチドを、シアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーとインビトロで接触させるステップをさらに含む、項８４から８７までのいずれか一項の方法。
［８９］平均して、得られた前記ポリペプチドの少なくとも７５％の前記Ｎ−グリカンが少なくとも１つのシアル酸部分を含む、項８４から８８までのいずれか一項の方法。
［９０］平均して、得られた前記ポリペプチドの少なくとも５０％が二量体として存在する、項８４から８９までのいずれか一項の方法。
［９１］項８４から９０までのいずれか一項の方法により得ることができるポリペプチド。
［９２］血液凝固障害の処置における使用のための項９１に記載のポリペプチドであって、該処置が有効量の該ポリペプチド及び有効量のＦＶＩＩＩを対象に投与するステップを含み、該ポリペプチドが静脈内投与又は皮下投与され、該ＦＶＩＩＩが静脈内投与される、ポリペプチド。
［９３］前記ポリペプチドの同時投与により、ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）が該ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて増大され、及び／又は前記ＦＶＩＩＩの投与頻度が前記ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて低減される、項９１に記載の使用のためのポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】中性ｐＨのスクリーニングからのサンプルセンサーグラムを示す図である。親和性が最も強く、解離速度が最も遅い２つの候補が丸で囲まれている。
【００１５】
【図２】ｐＨ７での２つの突然変異体Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ候補に関するＣＳＬ６２７の詳細なカイネティックスを示すサンプルセンサーグラムを示す図である。ａ）変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有する第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ；ｂ）変異：Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有する第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ；ｃ）変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗを有する第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ；ｄ）第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ  Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗ。
【００１６】
【図３】ｐＨ５．５での２つの突然変異体Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ候補に関する第ＶＩＩＩ因子の詳細なカイネティックスを示すサンプルセンサーグラムを示す図である。ａ）変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有する第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ；ｂ）変異：Ｓ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙを有する第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ。ｃ）変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗを有する第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ、ｄ）第ＶＩＩＩ因子結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ  Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗ。
【００１７】
【図４】ａ）中性ｐＨでの変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙを有するＣＳＬ６２７結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体：ｂ）中性ｐＨでのＣＳＬ６２７結合野性型Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体。
【００１８】
【図５】ａ）変異：Ｖ１０８３Ａ、Ｓ７６４Ｅ、Ｓ７６６Ｙを有するＣＳＬ６２７結合Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体、ｂ）ｐＨ５．５でのＣＳＬ６２７結合野性型Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ二量体。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書を通して、文脈がそうでないことを要求している場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載の要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を含めるが、任意の他の要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群を除外しないことを意味することは理解されよう。
【００２０】
任意の先行刊行物（若しくはそれに由来する情報）又は公知の任意の事項に対する本明細書における参照は、先行刊行物（若しくはそれに由来する情報）又は公知の事項が、本明細書の関連する努力分野における共通の一般的知識の一部を形成するとの認識又は承認又は何らかの形態の示唆としてみなさず、またみなすべきではない。
【００２１】
本明細書に記載されているすべての刊行物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２２】
単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」には、対象の明細書において使用する場合、文脈が明らかにそうでないことを明記している場合を除き、複数の態様が含まれることに留意されたい。従って、例えば、「一つの薬剤」という言及には、単一の薬剤と共に二つ以上の薬剤が含まれ、「一つの分子」という言及には、単一の分子と共に二つ以上の分子が含まれる等である。
【００２３】
切断型ＶＷＦ
本明細書で使用する場合、用語「フォンウィルブランド因子」又は「ＶＷＦ」は、野生型ＶＷＦの生物学的活性、特に、第ＶＩＩＩ因子に結合する能力を有する任意のポリペプチドを意味する。野生型ＶＷＦをコードする遺伝子は９ｋｂのｍＲＮＡに転写され、これは、３１０，０００Ｄａの推定分子量を有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチドに翻訳される。このプレプロポリペプチドは、２２アミノ酸のシグナルペプチド、７４１アミノ酸のプロポリペプチド及び成熟サブユニットを含有する。７４１アミノ酸のプロポリペプチドのＮ末端からの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦをもたらす。ＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。別段指示がない限り、ＶＷＦ分子が配列番号２のすべての残基を含む必要がない場合であっても、本出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸の番号づけは配列番号２を参照する。成熟ＶＷＦのアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書で使用する場合、用語「ＶＷＦ」は、別段指示がない限り、ＶＷＦの成熟形態を意味する。
【００２４】
野生型ＶＷＦのプロポリペプチドは、以下の順序で配列されている複数のドメインを含む：
Ｄ１−Ｄ２−Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＫ。
【００２５】
Ｄ１及びＤ２ドメインは、切断されて成熟ＶＷＦをもたらすプロペプチドを表す。Ｄ’−Ｄ３ドメインは、第ＶＩＩＩ因子への結合を担うアミノ酸を包含する。野性型ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列を配列番号３に示す。カルボキシ末端の９０残基は、「システインノット」スーパーファミリーのタンパク質に相同な「ＣＫ」ドメインを含む。このファミリーのメンバーは、ジスルフィド結合を介して二量体化する傾向がある。
【００２６】
好ましくは、野生型ＶＷＦは、配列番号２で示す成熟ＶＷＦのアミノ酸配列を含む。ＶＷＦの生物学的活性、特に、ＦＶＩＩＩに結合する能力が保持される限り、ＶＷＦへの付加、挿入、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部の欠失も包含される。欠失を有するＶＷＦが少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の野生型ＶＷＦの生物学的活性を保持する場合、本発明の意味において、生物学的活性は保持される。野生型ＶＷＦの生物学的活性は、リストセチン補因子活性（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ  ＡＢら、２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８９：７７〜８５）、血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰ  ＩｂαへのＶＷＦの結合（Ｓｕｃｋｅｒら、２００６．Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１２：３０５〜３１０）又はコラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ＆Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ８０：４６６〜４７１）に関する方法を使用して、当業者が決定することができる。ＶＷＦの生物学的活性がＦＶＩＩＩに結合する能力である場合、これはいくつかの方法で測定することができるが、好ましくは、本明細書の例１に記載されているように測定される。
【００２７】
第ＶＩＩＩ因子
用語「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」は、本明細書で互換的に使用される。「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」は、野生型血液凝固ＦＶＩＩＩ及び野生型血液凝固ＦＶＩＩＩの凝血原活性を有する野生型血液凝固ＦＶＩＩＩの誘導体を含む。誘導体は、野生型ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列と比較して、欠失、挿入及び／又は付加を有し得る。用語ＦＶＩＩＩは、重鎖及び軽鎖を含む、ＦＶＩＩＩのタンパク質分解的にプロセシングを受けた形態、例えば、活性化前の形態を含む。血漿由来及びＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩを含めた組換えＦＶＩＩＩが含まれる。商品の例としては、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）、Ｌｏｃｔａｔｅ（登録商標）及びＮｏｖｏｅｉｇｈｔ（登録商標）が挙げられる。
【００２８】
用語「ＦＶＩＩＩ」は、野生型第ＶＩＩＩ因子の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の生物学的活性を有する任意のＦＶＩＩＩ変異体又は突然変異体を含む。
【００２９】
非限定例として、ＦＶＩＩＩ分子としては、ＡＰＣ切断を防止する又は低減させるＦＶＩＩＩ突然変異体（Ａｍａｎｏ  １９９８．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：５５７〜５６３）、Ａ２ドメインをさらに安定化しているＦＶＩＩＩ突然変異体（ＷＯ９７／４０１４５）、発現が増大したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｓｗａｒｏｏｐら、１９９７．ＪＢＣ  ２７２：２４１２１〜２４１２４）、免疫原性が低減したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｌｏｌｌａｒ  １９９９．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５〜５０８）、別々に発現した重鎖及び軽鎖から再構成されたＦＶＩＩＩ（Ｏｈら、１９９９．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５〜１００）、ＦＶＩＩＩ様ＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）及び／又はＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）の異化作用につながる受容体への結合が低減したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ａｎａｎｙｅｖａら、２００１．ＴＣＭ、１１：２５１〜２５７）、ジスルフィド結合安定化ＦＶＩＩＩ変異体（Ｇａｌｅら、２００６．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．４：１３１５〜１３２２）、分泌特性が向上したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｍｉａｏら、２００４．Ｂｌｏｏｄ  １０３：３４１２〜３４１９）、補因子特異的活性が増大したＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１０２９８〜３０４）、生合成及び分泌が向上した、ＥＲシャペロン相互作用が低減した、ＥＲ−ゴルジ輸送が向上した、活性化が増大した又は不活性化への抵抗性が増大した、及び半減期が向上した、ＦＶＩＩＩ突然変異体（Ｐｉｐｅ  ２００４．Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３０：２２７−２３７によって概説されている）が挙げられる。別の特に好ましい例は、Ｚｏｌｌｎｅｒら、２０１３、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３２：２８０〜２８７に記載されているような組換え型のＦＶＩＩＩである。これらのＦＶＩＩＩ突然変異体及び変異体のすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
好ましくは、ＦＶＩＩＩは配列番号１４で示すＦＶＩＩＩの全長配列を含む。ＦＶＩＩＩの生物学的活性が保持される限り、ＦＶＩＩＩへの付加、挿入、置換、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部の欠失も包含する。改変を有するＦＶＩＩＩが野生型ＦＶＩＩＩの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の生物学的活性を保持する場合、本発明の意味において、生物学的活性は保持される。ＦＶＩＩＩの生物学的活性は、以下に記載のように当業者が決定することができる。
【００３１】
ＦＶＩＩＩの生物学的活性を決定するのに適切な試験は、例えば、１段階又は２段階凝固アッセイ（Ｒｉｚｚａら  １９８２．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ  ａｎｄ  ＦＩＸａ  Ｂｌｏｏｍ編、Ｔｈｅ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ．  ＮＹ  Ｃｈｕｒｃｈｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  １９９２）又は発色性基質ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（Ｓ．Ｒｏｓｅｎ、１９８４．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ３３：１３９〜１４５、補遺）である。これらの参考文献の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３２】
成熟野生型形態のヒト血液凝固ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。特定の配列のアミノ酸位置への言及は、当該ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質における前記アミノ酸の位置を意味し、言及される配列中の他の位置における変異、例えば、欠失、挿入及び／又は置換の存在を除外しない。例えば、配列番号１４に言及する「Ｇｌｕ２００４」における変異は、改変相同体において、配列番号１４の位置１から２３３２のうちの１つ又は複数のアミノ酸が失われていることを除外しない。
【００３３】
上記の定義内の「ＦＶＩＩＩ」及び／又は「ＶＷＦ」は、個体ごとに存在し得、生じ得る、天然の対立遺伝子変異も含む。上記の定義内の「ＦＶＩＩＩ」及び／又は「ＶＷＦ」は、ＦＶＩＩＩ及び／又はＶＷＦの変異体をさらに含む。そのような変異体は、１つ又は複数のアミノ酸残基が野生型配列と異なる。そのような相違の例としては、保存的アミノ酸置換、すなわち、類似した特徴を有する一群のアミノ酸、例えば、（１）小型アミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、及び（６）芳香族アミノ酸の範囲内の置換を挙げることができる。そのような保存的置換の例を表１に示す。
【表１】
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【００３４】
特徴「切断型」は、ポリペプチドが成熟ＶＷＦのアミノ酸配列全体（配列番号２のアミノ酸７６４〜２８１３）を含むのではないということを意味する。典型的には、切断型ＶＷＦは、配列番号２のアミノ酸７６４〜２８１３すべてを含むのではなく、その断片だけ含む。切断型ＶＷＦはまた、ＶＷＦ断片（ａ  ＶＷＦ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）とも、複数形でＶＷＦ断片（ＶＷＦ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）とも呼ぶことができる。
【００３５】
典型的には、切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。好ましくは、切断型ＶＷＦは、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子の成熟形態に結合することができる。別の実施形態において、切断型ＶＷＦは、配列番号１５のアミノ酸配列からなる単鎖第ＶＩＩＩ因子に結合することができる。
【００３６】
本発明の切断型ＶＷＦは、好ましくは、（ａ）配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）その断片を含むか又はそれからなるが、ただし、切断型ＶＷＦはなおもＦＶＩＩＩに結合することができる。より好ましくは、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４２に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）その断片からなるが、ただし、切断型ＶＷＦはなおもＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、（ａ）配列番号２のアミノ酸７６４〜１２４２、又は（ｂ）その断片からなるが、ただし、切断型ＶＷＦはなおもＦＶＩＩＩに結合することができる。
【００３７】
以下により詳細に記載されているように、ポリペプチドは、切断型ＶＷＦを含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を使用する方法によって調製することができる。核酸は、当業者に公知の技術によって、適切な宿主細胞に導入される。
【００３８】
好ましい実施形態において、宿主細胞中の核酸は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）その断片をコードするが、ただし、切断型成熟ＶＷＦはなおもＦＶＩＩＩに結合することができる。より好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１２４２に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は（ｂ）その断片をコードするが、ただし、切断型ＶＷＦはなおもＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１２４２、又は（ｂ）その断片をコードするが、ただし、切断型ＶＷＦはなおもＦＶＩＩＩに結合することができる。特に、この発明によるポリペプチドが二量体である場合、たとえポリペプチドにおける切断型ＶＷＦがＶＷＦ（例えば配列番号２）のアミノ酸１〜７６３を含まなくても、核酸はＶＷＦ（例えば配列番号２）のアミノ酸１〜７６３をコードする配列を含む。
【００３９】
他の実施形態において、切断型ＶＷＦは、それぞれ配列番号２を参照する、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むか又はそれからなる：
７７６〜８０５；７６６〜８０５；７６４〜８０５；７７６〜８１０；７６６〜８１０；７６４〜８１０；７７６〜８１５；７６６〜８１５；７６４〜８１５；７７６〜８２０；７６６〜８２０；７６４〜８２０；７７６〜８２５；７６６〜８２５；７６４〜８２５；７７６〜８３０；７６６〜８３０；７６４〜８３０；７７６〜８３５；７６６〜８３５；７６４〜８３５；７７６〜８４０；７６６〜８４０；７６４〜８４０；７７６〜８４５；７６６〜８４５；７６４〜８４５；７６〜８５０；７６６〜８５０；７６４〜８５０；７７６〜８５５；７６６〜８５５；７６４〜８５５；７７６〜８６０；７６６〜８６０；７６４〜８６０；７７６〜８６４；７６６〜８６４；７６４〜８６４；７７６〜８６５；７６６〜８６５；７６４〜８６５；７７６〜８７０；７６６〜８７０；７６４〜８７０；７７６〜８７５；７６６〜８７５；７６４〜８７５；７７６〜８８０；７６６〜８８０；７６４〜８８０；７７６〜８８５；７６６〜８８５；７６４〜８８５；７７６〜８９０；７６６〜８９０；７６４〜８９０；７７６〜８９５；７６６〜８９５；７６４〜８９５；７７６〜９００；７６６〜９００；７６４〜９００；７７６〜９０５；７６６〜９０５；７６４〜９０５；７７６〜９１０；７６６〜９１０；７６４〜９１０；７７６〜９１５；７６６〜９１５；７６４〜９１５；７７６〜９２０；７６６〜９２０；７６４〜９２０；７７６〜９２５；７６６〜９２５；７６４〜９２５；７７６〜９３０；７６６〜９３０；７６４〜９３０；７７６〜９３５；７６６〜９３５；７６４〜９３５；７７６〜９４０；７６６〜９４０；７６４〜９４０；７７６〜９４５；７６６〜９４５；７６４〜９４５；７７６〜９５０；７６６〜９５０；７６４〜９５０；７７６〜９５５；７６６〜９５５；７６４〜９５５；７７６〜９６０；７６６〜９６０；７６４〜９６０；７７６〜９６５；７６６〜９６５；７６４〜９６５；７７６〜９７０；７６６〜９７０；７６４〜９７０；７７６〜９７５；７６６〜９７５；７６４〜９７５；７７６〜９８０；７６６〜９８０；７６４〜９８０；７７６〜９８５；７６６〜９８５；７６４〜９８５；７７６〜９９０；７６６〜９９０；７６４〜９９０；７７６〜９９５；７６６〜９９５；７６４〜９９５；７７６〜１０００；７６６〜１０００；７６４〜１０００；７７６〜１００５；７６６〜１００５；７６４〜１００５；７７６〜１０１０；７６６〜１０１０；７６４〜１０１０；７７６〜１０１５；７６６〜１０１５；７６４〜１０１５；７７６〜１０２０；７６６〜１０２０；７６４〜１０２０；７７６〜１０２５；７６６〜１０２５；７６４〜１０２５；７７６〜１０３０；７６６〜１０３０；７６４〜１０３０；７７６〜１０３５；７６６〜１０３５；７６４〜１０３５；７７６〜１０４０；７６６〜１０４０；７６４〜１０４０；７７６〜１０４５；７６６〜１０４５；７６４〜１０４５；７７６〜１０５０；７６６〜１０５０；７６４〜１０５０；７７６〜１０５５；７６６〜１０５５；７６４〜１０５５；７７６〜１０６０；７６６〜１０６０；７６４〜１０６０；７７６〜１０６５；７６６〜１０６５；７６４〜１０６５；７７６〜１０７０；７６６〜１０７０；７６４〜１０７０；７７６〜１０７５；７６６〜１０７５；７６４〜１０７５；７７６〜１０８０；７６６〜１０８０；７６４〜１０８０；７７６〜１０８５；７６６〜１０８５；７６４〜１０８５；７７６〜１０９０；７６６〜１０９０；７６４〜１０９０；７７６〜１０９５；７６６〜１０９５；７６４〜１０９５；７７６〜１１００；７６６〜１１００；７６４〜１１００；７７６〜１１０５；７６６〜１１０５；７６４〜１１０５；７７６〜１１１０；７６６〜１１１０；７６４〜１１１０；７７６〜１１１５；７６６〜１１１５；７６４〜１１１５；７７６〜１１２０；７６６〜１１２０；７６４〜１１２０；７７６〜１１２５；７６６〜１１２５；７６４〜１１２５；７７６〜１１３０；７６６〜１１３０；７６４〜１１３０；７７６〜１１３５；７６６〜１１３５；７６４〜１１３５；７７６〜１１４０；７６６〜１１４０；７６４〜１１４０；７７６〜１１４５；７６６〜１１４５；７６４〜１１４５；７７６〜１１５０；７６６〜１１５０；７６４〜１１５０；７７６〜１１５５；７６６〜１１５５；７６４〜１１５５；７７６〜１１６０；７６６〜１１６０；７６４〜１１６０；７７６〜１１６５；７６６〜１１６５；７６４〜１１６５；７７６〜１１７０；７６６〜１１７０；７６４〜１１７０；７７６〜１１７５；７６６〜１１７５；７６４〜１１７５；７７６〜１１８０；７６６〜１１８０；７６４〜１１８０；７７６〜１１８５；７６６〜１１８５；７６４〜１１８５；７７６〜１１９０；７６６〜１１９０；７６４〜１１９０；７７６〜１１９５；７６６〜１１９５；７６４〜１１９５；７７６〜１２００；７６６〜１２００；７６４〜１２００；７７６〜１２０５；７６６〜１２０５；７６４〜１２０５；７７６〜１２１０；７６６〜１２１０；７６４〜１２１０；７７６〜１２１５；７６６〜１２１５；７６４〜１２１５；７７６〜１２２０；７６６〜１２２０；７６４〜１２２０；７７６〜１２２５；７６６〜１２２５；７６４〜１２２５；７７６〜１２３０；７６６〜１２３０；７６４〜１２３０；７７６〜１２３５；７６６〜１２３５；７６４〜１２３５；７７６〜１２４０；７６６〜１２４０；７６４〜１２４０；７７６〜１２４２；７６６〜１２４２；７６４〜１２４２；７６４〜１２４７；７６４〜１４６４；７６４〜１２５０；７６４〜１０４１；７６４〜８２８；７６４〜８６５；７６４〜１０４５；７６４〜１０３５；７６４〜１１２８；７６４〜１１９８；７６４〜１２６８；７６４〜１２７０；７６４〜１２６１；７６４〜１２６４；７６４〜１４５９；７６４〜１４６３；７６４〜１４６４；７６４〜１６８３；７６４〜１８７３；７６４〜１４８２；７６４〜１４７９；７６４〜１６７２；及び７６４〜１８７４。
【００４０】
特定の実施形態において、切断型ＶＷＦは、成熟野生型ＶＷＦと比較して内部欠失を有する。例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６ドメイン又はそれらの組み合わせが欠失され得、Ｄ’ドメイン、Ｄ３ドメイン及びＣＫドメインが保持される。さらなる実施形態において、切断型ＶＷＦは、血小板糖タンパク質Ｉｂα（ＧＰＩｂα）、コラーゲン及び／又はインテグリンαＩＩｂβＩＩＩ（Ｃ１ドメイン内のＲＧＤＳ配列）についての結合部位を含まない。他の実施形態において、切断型ＶＷＦは、ＶＷＦの中央Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３についての切断部位（Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６）を含まない。さらに別の実施形態において、切断型ＶＷＦはＧＰＩｂαについての結合部位を含まず、及び／又はコラーゲンについての結合部位を含まず、及び／又はインテグリンαＩＩｂβＩＩＩについての結合部位を含まず、及び／又はＶＷＦの中央Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３についての切断部位（Ｔｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６）を含まない。
【００４１】
他の実施形態において、切断型ＶＷＦは、前の段落において列挙されているアミノ酸配列のうちの１つに対して、少なくとも９０％、又は少なくとも９１％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるが、ただし、切断型ＶＷＦはＦＶＩＩＩに結合することができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの２つの単量体が共有結合で連結されている場合、本発明において「二量体」と称される。好ましくは、２つの単量体サブユニットは、少なくとも１つのジスルフィド架橋により、例えば１つ、２つ、３つ又は４つのジスルフィド架橋を介して共有結合により連結される。少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、好ましくは、本発明のポリペプチドの切断型ＶＷＦ部分内に位置する。一実施形態において、これらのシステイン残基は、Ｃｙｓ−１０９９、Ｃｙｓ−１１４２、Ｃｙｓ−１２２２、Ｃｙｓ−１２２５若しくはＣｙｓ−１２２７又はそれらの組み合わせである。
【００４３】
本発明のポリペプチドが二量体である場合、切断型ＶＷＦは、好ましくは配列番号２のアミノ酸７６４〜１０９９、アミノ酸７６４〜１１４２、アミノ酸７６４〜１２２２、アミノ酸７６４〜１２２５、アミノ酸７６４〜１２２７、アミノ酸７６４〜１２４２、アミノ酸７６４〜１２４７、又はアミノ酸７６４〜１２７０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含むか又はそれからなるものであり、またＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施形態において、切断型ＶＷＦは、配列番号２のアミノ酸７６４〜１０９９、アミノ酸７６４〜１１４２、アミノ酸７６４〜１２２２、アミノ酸７６４〜１２２５、又はアミノ酸７６４〜１２２７に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるものであり、またＦＶＩＩＩに結合することができる。最も好ましくは、切断型ＶＷＦは、配列番号２のアミノ酸７６４〜１０９９、アミノ酸７６４〜１１４２、アミノ酸７６４〜１２２２、アミノ酸７６４〜１２２５、アミノ酸７６４〜１２２７、アミノ酸７６４〜１２４２、アミノ酸７６４〜１２４７、又はアミノ酸７６４〜１２７０を含むか又はそれからなる。
【００４４】
切断型ＶＷＦは、ＷＯ２０１３／１０６７８７、ＷＯ２０１４／１９８６９９、ＷＯ２０１１／０６０２４２、ＷＯ２０１４／０１１８１９、ＷＯ２０１３／０８３８５８、ＷＯ２０１５／１８５７５８、又はＷＯ２０１３／０９３７６０において開示されているＶＷＦ断片のうちのいずれか１つであってもよく、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
半減期延長部分
切断型ＶＷＦに加えて、本発明のポリペプチドは、半減期延長部分をさらに含み得る。半減期延長部分は、切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列であり得る。或いは、半減期延長部分は、ペプチド結合とは異なる共有結合によって、切断型ＶＷＦを含むポリペプチドに化学的にコンジュゲートされ得る。
【００４６】
本発明の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドの半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸などの半減期延長部分の結合により延長される。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アルブミンなどのＨＬＥＰに化学リンカーを介してコンジュゲートされる。このコンジュゲーション技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ  ＬＬＣによる例示的方式に記載されている（例えば、米国特許第７，２５６，２５３号を参照されたい）。
【００４７】
半減期増大ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド（ＨＬＥＰ）であり、より好ましくは、ＨＬＥＰは、アルブミン又はその断片、免疫グロブリン定常領域及びその部分、例えばＦｃ断片、大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖（例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６〜１１９０）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）又はプロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「半減期増大ポリペプチド」は、好ましくは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンＧの定常領域及びその断片、生理条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー及び免疫グロブリン定常領域の部分に結合することができる領域及びポリペプチドからなる群から選択される。これは、本明細書に記載の完全長の半減期増大タンパク質（例えば、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー若しくは免疫グロブリンＧの定常領域）又は凝固因子の治療活性若しくは生物学的活性を安定化する若しくは延長することができるそれらの１つ又は複数の断片でもよい。そのような断片は、ＨＬＥＰ断片が、ＨＬＥＰのないそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも２５％の機能的半減期の延長をもたらす限り、１０個以上のアミノ酸長のものでもよく、又はＨＬＥＰ配列由来の少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、若しくはそれ以上の連続アミノ酸を含んでいてもよく、又はそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部若しくはすべてを含んでいてもよい。
【００４９】
本発明のポリペプチドのＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＬＥＰの変異体であってもよい。用語「変異体」は、保存的又は非保存的な挿入、欠失及び置換を含み、そのような変化は、切断型ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合活性を実質的に変えない。
【００５０】
特に、提案される本発明のＶＷＦ  ＨＬＥＰ融合構築物は、ＨＬＥＰの天然に存在する多形変異体及びＨＬＥＰの断片を含むことができる。ＨＬＥＰは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ又はブタに由来し得る。非哺乳類のＨＬＥＰは、限定されないが、ニワトリ及びサケが挙げられる。
【００５１】
一実施形態において、ポリペプチドは以下の構造を有する：
ｔＶＷＦ−Ｌ１−Ｈ、［式１］
式中、ｔＶＷＦは切断型ＶＷＦであり、Ｌ１は化学結合又はリンカー配列であり、ＨはＨＬＥＰである。
【００５２】
Ｌ１は、化学結合であってもよいし、或いは互いに同一であっても異なっていてもよい１個又は複数のアミノ酸からなる、例えば、１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個又は１〜３個（例えば、１、２若しくは３個）のアミノ酸からなるリンカー配列であってもよい。通常、リンカー配列は、野生型ＶＷＦの対応する位置に存在しない。Ｌ１に存在する適切なアミノ酸の例としては、Ｇｌｙ及びＳｅｒが挙げられる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、切断不可又は切断可能リンカーであってもよい。切断不可リンカーは、ＷＯ２００７／０９０５８４に例示されているように、交互のグリシン及びセリン残基を含み得る。本発明の別の実施形態において、切断型ＶＷＦ部分とアルブミン部分の間のペプチドリンカーはペプチド配列からなり、これがヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然環境におけるそのようなペプチド配列は、この配列に対する天然の耐性を仮定することができるように、タンパク質表面の近くに位置し、免疫系に対してアクセス可能である。例はＷＯ２００７／０９０５８４に示されている。切断可能なリンカー配列は、例えば、ＷＯ２０１３／１２０９３９  Ａ１に記載されている。
【００５３】
好ましいＨＬＥＰ配列は以下に記載されている。さらに、それぞれのＨＬＥＰの正確な「Ｎ末端アミノ酸」若しくは「Ｃ末端アミノ酸」への融合、又はＨＬＥＰの１つ若しくは複数のアミノ酸のＮ末端欠失を含む、それぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」若しくは「Ｃ末端部分」への融合が本発明に包含される。ポリペプチドは、２つ以上のＨＬＥＰ配列、例えば、２つ又は３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、例えば連続的反復として、縦列にＶＷＦのＣ末端部分に融合され得る。
【００５４】
ＨＬＥＰとしてのアルブミン
用語の「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）及び「ヒトアルブミン」（ＨＡ）及び「アルブミン」（ＡＬＢ）は、本出願において互換的に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広範であり、ヒト血清アルブミン（並びにその断片及び変異体）と他の種由来のアルブミン（並びにその断片及び変異体）を包含する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「アルブミン」は、アルブミンのポリペプチド若しくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つ若しくは複数の機能活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンの断片若しくは変異体を総称的に意味する。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン又はその断片、特に、本明細書に配列番号１６で示すヒトアルブミンの成熟形態若しくは他の脊椎動物由来のアルブミン若しくはその断片、又はこれらの分子の類似体若しくは変異体若しくはその断片を意味する。
【００５６】
特に、提案される本発明のポリペプチドは、ヒトアルブミンの天然及び非天然に存在する多形変異体及びヒトアルブミンの断片を含むことができる。概して、アルブミンの断片又は変異体は、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも４０個、最も好ましくは７０個を超えるアミノ酸長である。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態は、ＦｃＲｎ受容体への増強された結合を有する本発明のポリペプチドのＨＬＥＰとして使用されるアルブミン変異体を含む。そのようなアルブミン変異体は、野生型アルブミンとの切断型ＶＷＦ融合体と比較して、切断型ＶＷＦアルブミン変異体融合タンパク質のより長い血漿半減期をもたらし得る。変異体は、ＷＯ２０１４０７２４８１、ＷＯ２０１２１５０３１９、ＷＯ２０１３１３５８９６、ＷＯ２０１１１２４７１８、ＷＯ２０１１０５１４８９及びＷＯ２０１２０５９４８６に開示されているものを含んでおり、それらの開示は相互参照により組み込まれる。
【００５８】
本発明のポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメイン若しくはドメイン又はそれらの保存的改変体を含むことができる。
【００５９】
ＨＬＥＰとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療用タンパク質の半減期を増大することが当技術分野で公知である（Ｄｕｍｏｎｔ  Ｊ  Ａら、２００６．ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２０：１５１〜１６０）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）及びヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、任意の哺乳動物に由来していてもよいし、それぞれサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来していてもよい。ＩｇＧ及び抗原結合ドメインを有さないＩｇＧ断片もＨＬＥＰとして使用することもできる。治療用ポリペプチド部分は、好ましくは、切断可能でさえあり得る抗体のヒンジ領域又はペプチドリンカーを介して、ＩｇＧ又はＩｇＧ断片に接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療用タンパク質のインビボ半減期を増大するための、免疫グロブリン定常領域への治療用タンパク質の融合を記載している。ＵＳ２００４／００８７７７８及びＷＯ２００５／００１０２５は、免疫グロブリン定常領域のＦｃドメイン又は少なくとも部分と、ペプチドの半減期を増大させ、そうでなければインビボで急速に除去される生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載している。生物学的活性の増大、循環半減期の延長、及びより大きな溶解度を達成したＦｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質が記載されている（ＷＯ２００６／０００４４８）。血清半減期が延長し、インビボでの効力が増大したＦｃ−ＥＰＯタンパク質（ＷＯ２００５／０６３８０８）、並びにＧ−ＣＳＦ（ＷＯ２００３／０７６５６７）、グルカゴン様ペプチド−１（ＷＯ２００５／０００８９２）、凝固因子（ＷＯ２００４／１０１７４０）及びインターロイキン−１０（米国特許第６，４０３，０７７号）とのＦｃ融合体が開示されているが、すべて半減期増大特性を有する。
【００６０】
この発明により使用され得る様々なＨＬＥＰは、ＷＯ２０１３／１２０９３９  Ａ１に詳細に記載されており、その開示は相互参照により本明細書に含まれる。
【００６１】
リンカー配列
この発明によれば、治療用ポリペプチド部分は、ペプチドリンカーによってＨＬＥＰ部分に結合させることができる。リンカーは非免疫原性であるべきであり、切断不可リンカーであっても切断可能リンカーであってもよい。
【００６２】
切断不可リンカーは、ＷＯ２００７／０９０５８４に例示されているように、交互のグリシン及びセリン残基を含み得る。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、ＶＷＦ部分とアルブミン部分の間のペプチドリンカーは、ペプチド配列からなり、これがヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然環境におけるそのようなペプチド配列は、この配列に対する天然の耐性を仮定することができるように、タンパク質表面の近くに位置し、免疫系に対してアクセス可能である。例はＷＯ２００７／０９０５８４に示されている。
【００６４】
切断可能リンカーは、プロテアーゼによる切断を可能にする程十分にフレキシブルでなければならない。好ましい実施形態では、リンカーの切断は、融合タンパク質が改変ＦＶＩＩＩである場合、融合タンパク質内のＦＶＩＩＩの活性化と同程度に速く進行する。
【００６５】
切断可能リンカーは、好ましくは、
（ａ）治療用ポリペプチドの活性化の間にタンパク質分解的に切断されるタンパク質分解的切断部位を含有する場合、投与しようとする治療用ポリペプチド自体、
（ｂ）治療用ポリペプチドの関与によって活性化若しくは形成されるプロテアーゼによって切断される基質ポリペプチド、又は
（ｃ）凝固若しくは線維素溶解に関与するポリペプチド
に由来する配列を含む。
【００６６】
より好ましい実施形態でのリンカー領域はＶＷＦの配列を含み、発現される融合タンパク質の新抗原特性のリスクを低下させるはずである。
【００６７】
リンカーペプチドは、好ましくは、凝固系のプロテアーゼ、例えばＦＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ及びＦＶＩＩａによって切断可能である。
【００６８】
治療用ポリペプチド、切断可能リンカー及びＨＬＥＰの例示的組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０９０５８４（例えば、表２及び図４）並びにＷＯ２００７／１４４１７３（例えば、表３ａ及び３ｂ）に列挙されている構築物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドの又は本発明のポリペプチドと複合体化されたＦＶＩＩＩの機能的半減期は、野生型ＶＷＦの機能的半減期又は野生型ＶＷＦ若しくは上で定義された参照ポリペプチドと複合体化されたＦＶＩＩＩの機能的半減期と比較して、延長される。増大は、１５％超、例えば、少なくとも２０％又は少なくとも５０％であり得る。また、そのような機能的半減期値は、改変ＶＷＦ、又はＦＶＩＩＩと改変ＶＷＦとの複合体が投与された後に、前記哺乳動物から様々な時間間隔で採取された血液試料において、インビトロで測定することができる。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリペプチド、又は本発明のポリペプチドと複合体化されたＦＶＩＩＩは、野生型ＶＷＦ、又は野生型ＶＷＦ若しくは上で定義された参照ポリペプチドと複合体化されたＦＶＩＩＩと比較して、改善されたインビボリカバリーを示す。インビボリカバリーは、インビボで、例えば、正常な動物で、又はＦＶＩＩＩノックアウトマウスのような血友病Ａの動物モデルで決定することができ、ここでは対応する野生型ＶＷＦ又は上で定義された参照ポリペプチドと比較して、ＦＶＩＩＩのパーセンテージの増大が、抗原又は活性アッセイによって、ｉ．ｖ．投与の直後（５〜１０分）の循環中に確認されることが予想される。
【００７１】
インビボリカバリーは、野生型ＶＷＦ、又は上で定義された参照ポリペプチドと複合体化されたＦＶＩＩＩと比較して、好ましくは、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％増大する。
【００７２】
比
以下により詳細に記載されているように、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、又はそれらの混合物であってもよい。本発明によるいずれのモル比も、実際に単量体として又は二量体として存在しても、本発明のポリペプチドの単量体サブユニットのモル濃度の比を意味する。比は、同時投与されるＦＶＩＩＩのモル濃度に対して、又は内在性ＶＷＦサブユニットのモル濃度に対してのいずれかで形成される。本出願におけるＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドの任意の比は、別段指示がなければ、投与しようとする本発明のポリペプチドの量（モル）を投与しようとするＦＶＩＩＩの量（モル）で割ったものを意味する。内在性ＶＷＦは、本発明のポリペプチド及び同時投与されるＦＶＩＩＩを投薬しようとする動物又はヒトの血漿中に天然に存在するＶＷＦである。これは通常、約２〜４０のＶＷＦの単量体サブユニットの様々な異なるオリゴマーからなる。別段指示がなければ、本出願における内在性ＶＷＦに対する本発明のポリペプチドの任意の比は、本発明のポリペプチドの投与直後の本発明のポリペプチドの処置対象の体重１ｋｇ当たりの血漿モル濃度を、処置対象の体重１ｋｇ当たりの内在性ＶＷＦの血漿モル濃度で割ったものを意味する。本発明のポリペプチドの投与直後の処置対象の体重１ｋｇ当たりの本発明のポリペプチドの血漿モル濃度は、投与のすぐ後に投与された本発明のポリペプチドを４０ｍｌ／ｋｇの血漿量で希釈すると仮定して計算される。静脈内投与された場合、投与直後の本発明のポリペプチドの量は、本発明の目的において、投与された量と同じであると仮定される。
【００７３】
本発明のポリペプチドは任意のレベルで投与され得るが、有利性は、本発明のポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比が０．５を超えるレベルで投与することによって達成することができる。処置しようとする対象の血漿中の内在性ＶＷＦの濃度は、例えば、実施例に記載されているように、ＥＬＩＳＡ又は及び活性アッセイにより決定され得る。典型的には、測定される濃度はＵ／ｍＬで示される。この値は、以下に記載されているようにモル濃度に変換することができる。
【００７４】
正常ヒト血漿（ＮＨＰ）は、定義により１Ｕ／ｍＬ又は１００％の濃度でＶＷＦを含有する。これは、約１０μｇ／ｍＬのタンパク質濃度に相当する（Ｈａｂｅｒｉｃｈｔｅｒ  Ｓ．Ｌ．及びＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｒ．Ｒ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ；Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ及びＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ編  Ｍａｒｄｅｒ、Ａｉｒｄ、Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｓｃｈｕｌｍａｎ及びＷｈｉｔｅ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２０１３、ｐｐ１９７〜２０７）。ＮＨＰ中のこのＶＷＦ濃度及び１８〜１９％のグリコシル化を含む約２６７，５００Ｄａの成熟ＶＷＦ単量体の分子量に基づいて、約３７×１０−９Ｍｏｌ／ＬのＶＷＦ単量体単位の血漿モル濃度がＮＨＰに関して計算され得る。
【００７５】
正常ラット又はウサギの血漿中のラット又はウサギＶＷＦサブユニットのモル濃度を計算するため、それぞれ、ヒトＶＷＦに相当する単量体サブユニットの分子量を、仮定される相当する特異的活性（１００Ｕ／ｍｇ）及びラット又はウサギ血漿中の測定された内在性ＶＷＦ活性とともに使用した（２６７，５００Ｄａ）（実施例にも言及する）。
【００７６】
ヒト集団におけるＶＷＦの濃度は、ＮＨＰ中、約６０％から約２００％までのＶＷＦ濃度で変化する。本発明の特定の実施形態において、内在性ＶＷＦの濃度は、ＮＨＰ中の濃度として定義される。他の実施形態において、内在性ＶＷＦの濃度は、処置しようとする対象において決定され、ポリペプチドの用量は、この個々の値に基づく。
【００７７】
投与される本発明のポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比は、好ましくは少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも２５、又は少なくとも３０、最も好ましくは少なくとも４０、又は少なくとも５０、又は少なくとも７５である。
【００７８】
投与しようとする本発明のポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比は、０．５〜１，０００、又は１〜５００、又は２〜４００、又は３〜３００、又は４〜２５０、又は５〜２００、又は６〜１５０、又は７〜１４０、又は８〜１３０、又は９〜１２０、又は１０〜１１０の範囲に及び得る。好ましくは、投与される本発明のポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比は、３〜１００、又は４〜９０、又は５〜８０、又は６〜７５、又は１０〜６０の範囲に及ぶ。
【００７９】
投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、好ましくは少なくとも２、又は少なくとも５、又は少なくとも１０、又は少なくとも２０、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０であり、より好ましくは、比は５０より大きく、又は少なくとも７５、少なくとも１００、又は１００より大きく、又は少なくとも２００であり、最も好ましくは、少なくとも３００、又は少なくとも４００、又は少なくとも５００である。
【００８０】
投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、２〜１０，０００、又は５〜５，０００、又は１０〜４，０００、又は２０〜３，０００、又は３０〜２，０００、又は４０〜１，０００の範囲に及び得る。好ましくは、投与しようとする本発明のポリペプチドの投与しようとするＦＶＩＩＩに対するモル比は、６０〜２，５００、又は１１０〜２，０００、又は１５０〜１，５００、又は２００〜１，０００の範囲に及ぶ。
【００８１】
表１は、本発明による処置の様々な実施形態を要約している。所与の実施形態においては、それぞれ、２列目及び３列目の両方の要件が満たされなければならない。
【表２−１】
2019507587.tif 000003
【表２−２】
2019507587.tif 000004
【表２−３】
2019507587.tif 000005
【００８２】
表１に示した実施形態１〜７２は、本明細書に記載されている本発明の任意の他の実施形態及び態様と組み合わせることができる。本発明による処置のさらなる詳細は、以下にさらに記載されている。
【００８３】
本発明のポリペプチドのＮ−グリカン及びシアリル化
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ−グリカンを含み、前記Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。好ましい実施形態において、前記Ｎ−グリカンの少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。本発明者らは、高度にシアリル化されたＶＷＦ断片を含むポリペプチドが、それ自体の延長された半減期を有するだけでなく、同時投与されるＦＶＩＩＩの半減期も延長することができるということを見出した。換言すると、本発明のポリペプチドの投与は、同時投与されたＦＶＩＩＩの半減期の延長及び／又はクリアランスの低減をもたらす。
【００８４】
本発明のポリペプチドは、好ましくはＮ−グリカンを含み、糖タンパク質のＮ−グリカンのシアリル基の少なくとも５０％は、α−２，６−連結シアリル基である。一般に、末端シアリル基は、α−２，３−又はα−２，６−連結を介してガラクトース基に結合され得る。典型的には、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンは、α−２，３−連結シアリル基よりもα−２，６−連結シアリル基を多く含む。好ましくは、Ｎ−グリカンのシアリル基の少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％は、α−２，６−連結シアリル基である。これらの実施形態は、例えば、哺乳動物細胞におけるヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの同時発現により得ることができる。
【００８５】
一実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。
【００８６】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又はさらに１％未満はアシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわち、それらはシアル酸基を欠いたＮ−グリカンである。別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又はさらに１％未満はアシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわち、それらはシアル酸基を有していない。
【００８７】
上記の実施形態は互いに組み合わせることができる。上述のＮ−グリカンの任意のパーセンテージ、又はシアリル化の程度の任意の指示は、平均パーセンテージ又は程度と理解されたく、すなわち、それらは単一の分子でなく、分子の集団を意味する。糖タンパク質の集団内の個別の糖タンパク質分子のグリコシル化又はシアリル化が多少の不均一性を示すことは明らかである。
【００８８】
二量体
本発明のポリペプチドは高い比率の二量体を有し得るということがさらに見出された。従って、本発明のポリペプチドは、好ましくは二量体として存在する。一実施形態において、ポリペプチドの少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％は二量体として存在する。別の実施形態において、本発明のポリペプチドの二量体：単量体の比は、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５、又は少なくとも３である。最も好ましくは、本発明のすべてのポリペプチドは、二量体で存在する。二量体は単量体と比較した場合に第ＶＩＩＩ因子に対する改善された親和性を有するので、二量体の使用は好ましい。
【００８９】
一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子に対する本発明のポリペプチドの親和性は、同じ第ＶＩＩＩ因子分子に対するヒト天然ＶＷＦの親和性よりも高い。第ＶＩＩＩ因子親和性は、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子、又は配列番号１５を特徴とする第ＶＩＩＩ因子分子に言及し得る。
【００９０】
高比率で二量体を有する本発明のポリペプチドの調製物は、第ＶＩＩＩ因子に対して増大した親和性を有することが見出された。そのような第ＶＩＩＩ因子に対する増大した親和性は、本発明のポリペプチドにより第ＶＩＩＩ因子の増大された安定化をもたらす。或いは、又は増加した二量体比率に対する代替又はそれとの組み合わせにおいても、第ＶＩＩＩ因子に対する親和性を増大させる第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン内の変異を有する本発明によるポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態である。適切な変異は、例えばＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に記載されている。
【００９１】
ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、当分野において公知の方法に従って調製することができる。ＶＷＦのｃＤＮＡ配列（配列番号３）に基づき、上述の切断型ＶＷＦ構築物又は本発明のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを設計し生成することができる。
【００９２】
宿主細胞により分泌されるポリペプチドがＶＷＦのアミノ酸１〜７６３を含んでいない場合でも、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）が配列番号２のアミノ酸２３〜７６３、又は好ましくはアミノ酸１〜７６３に対して、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。最も好ましくは、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号２のアミノ酸２３〜７６３、又は配列番号２のアミノ酸１〜７６３をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
ＤＮＡが正確な方向で発現プラスミド中に挿入されたオープンリーディングフレーム全体を含有する構築物は、タンパク質発現において使用され得る。典型的な発現ベクターは、プラスミド保有細胞の挿入された核酸に対応する多量のｍＲＮＡの合成を方向づけるプロモーターを含有する。これらはまた、宿主生物内でのそれらの自律増殖を可能にする複製起点配列、及び合成されたｍＲＮＡが翻訳される効率を増大させる配列を含み得る。安定的な長期ベクターは、例えば、ウイルス（例えば、エプスタインバーウイルスのゲノム由来のＯｒｉＰ配列）の調節エレメントを使用することによって自由に複製する実体として維持することができる。ゲノムＤＮＡ中にベクターを組み込まれた細胞系も製造することができ、この方式では、遺伝子産物が連続して産生される。
【００９４】
典型的には、提供しようとする細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物宿主細胞に導入することにより得られる。
【００９５】
細胞培養可能であって、糖タンパク質の発現が可能な任意の宿主細胞が本発明により利用され得る。特定の実施形態において、宿主細胞は哺乳動物である。本発明により使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓系（懸濁培養の増殖用にサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３  ２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；水牛ラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８、１９８２）；ＭＲＣ  ５細胞；ＰＳ４細胞；ヒト羊膜細胞（ＣＡＰ）；及びヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。好ましくは、細胞系は、齧歯動物細胞系、特にハムスター細胞系、例えばＣＨＯ又はＢＨＫである。
【００９６】
目的の糖タンパク質の発現を達成するための十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するのに適した方法は、当分野において公知である。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０〜６２５、１９８１；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０〜４６、１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ  １１７，０６０；及びＥＰ  １１７，０５８を参照されたい。哺乳動物細胞については、遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入する一般的な方法としては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂのリン酸カルシウム沈降法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４５７、１９７８）又はＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）法（Ｆｏｃｕｓ  １５：７３、１９９３）が挙げられる。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、米国特許第４，３９９，２１６号においてＡｘｅｌにより記載されている。遺伝子材料を哺乳動物細胞に導入する様々な技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８９、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７〜５３７、１９９０、及びＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８〜３５２、１９８８を参照されたい。
【００９７】
細胞は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する。ポリペプチドは、当業者に公知の方法を使用して、回収及び精製することができる。
【００９８】
終末相半減期、ＭＲＴ及びクリアランス
本発明の別の態様は、終末相半減期若しくは平均滞留時間（ＭＲＴ）を増大させるため、又は第ＶＩＩＩ因子のクリアランスを減少させるための、本明細書の上記で定義されているポリペプチドの使用である。薬物動態データを評価するため、線形薬物動態モデル（中央コンパートメントを介した化合物排出）を適用した。従って、本明細書で使用されるいずれかの薬物動態パラメーターは、別段指示がなければ、線形薬物動態モデル（中央コンパートメントを介した化合物排出）に基づいている。
【００９９】
特定の時点ｔでの「半減期」Ｔ１／２（ｔ）は、ｔの時点で存在する血漿濃度Ｃ（ｔ）を半分にするために要する時間、すなわちＣ［ｔ＋Ｔ１／２（ｔ）］＝Ｃ（ｔ）／２である。「終末相半減期」は、ｔが無限になる傾向を有する場合のＴ１／２（ｔ）の限界である。
【０１００】
投与されるＦＶＩＩＩの終末相半減期は、有効量の本発明のポリペプチドが同時投与された場合、ＦＶＩＩＩの単独投与と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも１５０％増大する。本発明の別の態様は、第ＶＩＩＩ因子の終末相半減期を増大させるための、本明細書の上記で定義されているポリペプチドの使用である。
本明細書で使用される場合の用語「ＭＲＴ」は、薬物分子（例えば、本発明のポリペプチド又はＦＶＩＩＩ）が体内に留まる平均時間を意味する。一定クリアランスを用いる線形薬物動態系において、ＭＲＴは、一次モーメント曲線下面積（ＡＵＭＣ）を血漿濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）で割ったものとして計算することができる。一次モーメント曲線は、時間にその時点の血漿濃度を掛けたものである。
【０１０１】
投与されるＦＶＩＩＩのＭＲＴは、有効量の本発明のポリペプチドが同時投与された場合、ＦＶＩＩＩの単独投与と比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも１５０％増大する。本発明の別の態様は、終末相半減期若しくは平均滞留時間（ＭＲＴ）を増大させるため、又は第ＦＶＩＩＩ因子のクリアランスを減少させるための、本明細書の上記で定義されているポリペプチドの使用である。
【０１０２】
本明細書で使用される場合の用語「クリアランス」は、血漿から薬物が除去される速度を意味する。具体的には、これは薬物の現在の排出速度をその現在の血漿濃度で割ったものである。単回静脈内投与の後の線形薬物動態系において、クリアランスは、クリアランスが一定であるという条件下で、血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）に対する用量の比として計算され得る。クリアランスが低いほど、血漿が薬物から除去されるまで長くかかる。
【０１０３】
投与されるＦＶＩＩＩのクリアランスは、有効量の本発明のポリペプチドが同時投与された場合、ＦＶＩＩＩの単独投与と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％減少する。
【０１０４】
本発明はさらに、対象に有効量の本明細書の上記で定義されているポリペプチドを投与するステップを含む、ＭＲＴ若しくは半減期を増大させる方法、又はインビボで第ＶＩＩＩ因子のクリアランスを減少させる方法に関する。
【０１０５】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする患者に、有効量の本明細書の上記で定義されているポリペプチドを投与するステップを含む、血液凝固障害を処置する方法である。
【０１０６】
さらなる態様は、血友病Ａの処置におけるＦＶＩＩＩの投与頻度を減少させるための、本明細書の上記で定義されているポリペプチドの使用である。ＦＶＩＩＩの静脈内投与又は皮下投与の頻度は、週２回に低減され得る。或いは、ＦＶＩＩＩの静脈内投与又は皮下投与の頻度は、週１回、又はさらに少なく、例えば１０日に１回又は１４日に１回に低減され得る。ＦＶＩＩＩは、週２回、５日ごと、週１回、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、若しくは１ヶ月に１回、又は前述の値のうちのいずれか２つの間の任意の範囲、例えば４日ごとから毎月、１０日ごとから２週間ごと、若しくは週に２〜３回等で投与することができる。
【０１０７】
別の態様は、血友病Ａの処置において投与しようとするＦＶＩＩＩの用量を低減するための、本明細書の上記で定義されているポリペプチドの使用である。
【０１０８】
凝固障害の処置
本発明のポリペプチドは、血友病Ａを含む凝固障害を処置するために有用である。用語「血友病Ａ」は、機能的凝固ＦＶＩＩＩの欠乏を意味するが、これは通常、遺伝性である。
【０１０９】
疾患の処置は、いずれかの臨床病期又は顕性化時の疾患のいずれかの形態を有すると既に診断された患者の処置；疾患の症状若しくは徴候の発症若しくは展開若しくは増悪若しくは悪化を遅延させること；並びに／或いは疾患の予防及び／又は重症度を低減させることを包含する。
【０１１０】
本発明のポリペプチドが投与される「対象」又は「患者」は、好ましくはヒトである。特定の態様において、ヒトは小児患者である。他の態様において、ヒトは成人患者である。
【０１１１】
本発明のポリペプチドを含み、任意選択でＦＶＩＩＩを含む組成物が本明細書に記載されている。組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む無菌医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者にそれを投与する所望の方法に応じた）任意の適切な形態であることができる。
【０１１２】
用語「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」は、本明細書において互換的に使用され、血漿由来のＦＶＩＩＩ及び組換えＦＶＩＩＩの両方を包含する。組換えＦＶＩＩＩは、限定するものではないが、完全長ＦＶＩＩＩ、並びに二本鎖Ｂドメイン欠失又は切断型変異体、並びに単鎖Ｂドメイン欠失又は切断型変異体、例えばＷＯ２００４／０６７５６６に記載されるもの、及びＢドメインの外側に変異を有するがＦＶＩＩＩの生物学的活性は有する他のＦＶＩＩＩ変異体を包含する。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、様々な経路、例えば、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋内、局部又は局所投与により患者に投与され得る。いずれかの所与の症例における投与に最も適した経路は、特定のポリペプチド、対象、並びに疾患の性質及び重篤度、並びに対象の身体状態に依存する。典型的には、本発明のポリペプチドは静脈内投与される。
【０１１４】
ポリペプチド及びＦＶＩＩＩは、好ましくは、静脈内投与又は皮下投与される。
【０１１５】
第１の実施形態において、ポリペプチド及びＦＶＩＩＩの両方が静脈内投与される。第２の実施形態において、ポリペプチド及びＦＶＩＩＩの両方が皮下投与される。
【０１１６】
別の実施形態において、ＦＶＩＩＩは静脈内投与され、ポリペプチドは異なる経路を介して投与される。さらなる実施形態において、ポリペプチドは皮下投与され、ＦＶＩＩＩは異なる経路を介して投与される。例えば、ポリペプチドは皮下投与され、ＦＶＩＩＩは静脈内投与され得る。
【０１１７】
さらなる実施形態において、ＦＶＩＩＩは皮下投与され、ポリペプチドは異なる経路を介して投与される。さらなる実施形態において、ポリペプチドは静脈内投与され、ＦＶＩＩＩは異なる経路を介して投与される。例えば、ポリペプチドは静脈内投与され、ＦＶＩＩＩは皮下投与され得る。
【０１１８】
本発明のポリペプチドを用いた総投薬回数、及び処置の長さの決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。投与しようとする本発明のポリペプチドの投与量は、投与しようとするＦＶＩＩＩの濃度、処置しようとする患者における内在性ＶＷＦの濃度、又はその両方に依存する。本出願の発明者らにより定義されている比に基づく有効用量は、本発明のポリペプチドの分子量を考慮に入れ、当業者により決定され得る。ＦＶＩＩＩに関する典型的な用量は、約２０Ｕ／体重ｋｇ〜約１００Ｕ／体重ｋｇの範囲であり得る。
【０１１９】
本発明によれば、本発明のポリペプチドを用いて処置される患者はまた、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を用いて処置される。本発明のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子は、同時に投与されても逐次的様式で投与されてもよく、両方の投与様式は用語「組み合わせ治療」及び「同時投与」に包含される。本発明のポリペプチド及び第ＶＩＩＩ因子は、混合物として、すなわち、同一組成物内で投与されてもよく、又は、別々に、すなわち個別の組成物として投与されてもよい。
【０１２０】
使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、典型的には１０〜１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である。異なる実施形態において、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩの濃度は、本明細書において定義されている本発明のＶＷＦポリペプチドに対する比に関する要件が満たされている条件下で、１０〜８，０００ＩＵ／ｍＬ、又は１０〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、又は２０〜３，０００ＩＵ／ｍＬ、又は５０〜１，５００ＩＵ／ｍＬの範囲、又は３，０００ＩＵ／ｍＬ、又は２，５００ＩＵ／ｍＬ、又は２，０００ＩＵ／ｍＬ、又は１，５００ＩＵ／ｍＬ、又は１，２００ＩＵ／ｍＬ、又は１，０００ＩＵ／ｍＬ、又は８００ＩＵ／ｍＬ、又は７５０ＩＵ／ｍＬ、又は６００ＩＵ／ｍＬ、又は５００ＩＵ／ｍＬ、又は４００ＩＵ／ｍＬ、又は３００ＩＵ／ｍＬ、又は２５０ＩＵ／ｍＬ、又は２００ＩＵ／ｍＬ、又は１５０ＩＵ／ｍＬ、又は１２５ＩＵ／ｍＬ、又は１００ＩＵ／ｍＬ、又は６２．５ＩＵ／ｍＬ、又は５０ＩＵ／ｍＬである。
【０１２１】
「国際単位」又は「ＩＵ」は、「ＩＵ」で較正された国際標準品に対して較正された標準を使用し、ＦＶＩＩＩ活性アッセイ、例えば一段階凝固アッセイ又は発色性基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイにより測定されたＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の尺度単位である。一段階凝固アッセイは、Ｎ  Ｌｅｅ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｌら、Ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｐｏｔｅｎｃｙ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ＦＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）  ３０、５１１  ５１９  （１９８３）に記載されているように、当分野において公知である。一段階アッセイの原理：この試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）−アッセイの改変バージョンとして行われる：血漿をリン脂質及び表面活性剤とともにインキュベートすることで内在凝固系の因子が活性化される。カルシウムイオンの添加によって凝固カスケードが誘発される。測定可能なフィブリン血栓の形成までの時間が決定される。このアッセイは、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の存在下で行われる。欠乏血漿の凝固能は、試験しようとするサンプル中に含まれる凝固第ＶＩＩＩ因子により回復される。凝固時間の短縮は、サンプル中に存在する第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、国際単位で第ＶＩＩＩ因子の既知の活性を有する標準品との直接比較によって定量化される。
【０１２２】
別の標準的なアッセイは、発色性基質アッセイである。発色性基質アッセイは、例えばコアマテックＦＶＩＩＩ試験キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＳｐＡ  Ｖ．  ｌｅ  Ｍｏｎｚａ  ３３８−２０１２８  Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）のように市販で購入することができる。発色性アッセイの原理：カルシウム及びリン脂質の存在下で、第Ｘ因子を、第ＩＸａ因子により第Ｘａ因子へと活性化させる。この反応は、補因子としての第ＶＩＩＩａ因子により刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定しようとするサンプル中のＦＶＩＩＩ由来の反応混合物中の少量のトロンビンにより形成される。最適濃度のＣａ２＋、リン脂質及び第ＩＸａ因子、並びに過剰量の第Ｘ因子を使用する場合、第Ｘ因子の活性化は、第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化第Ｘ因子は、発色性基質Ｓ−２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。従って、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡの放出は、形成されたＦＸａの量に比例するため、サンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。
【０１２３】
医薬組成物
本明細書に記載されている方法に適した本発明のポリペプチドの治療用製剤は、所望の程度の純度を有するポリペプチドを、当分野で典型的に使用されている任意の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（これらはすべて本明細書では「担体」と呼ばれる）、すなわち、緩衝化剤、安定剤、保存料、等張化剤、非イオン性洗浄剤、抗酸化剤、及び他の多様な添加物と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての保管用に調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｏｓｏｌ、ｅｄ．  １９８０）を参照されたい。そのような添加物は、レシピエントに対し、使用される投与量及び濃度で、非毒性でなければならない。
【０１２４】
緩衝化剤は、生理条件に近い範囲にｐＨを維持するのに有用である。これらは約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在し得る。適切な緩衝化剤としては、有機及び無機両方のその酸及び塩、例えばクエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物等）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物等）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物等）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物等）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物等）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物等）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物等）、及び酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物等）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、及びＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を使用することができる。
【０１２５】
保存料は微生物の増殖を遅らせるために添加することができ、０．２％〜１％（Ｗ／Ｖ）の範囲の量で添加することができる。適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、及びヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールが挙げられる。「安定剤」として知られることもある等張化剤は、液体組成物の等張性を保証するために加えることができ、多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが挙げられる。安定剤は、治療剤を可溶化し又は変性若しくは容器壁への付着を防止する、増量剤から添加剤に及ぶ範囲の機能を有し得る広義の賦形剤を意味する。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記に挙げたもの）；アミノ酸、例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等、有機糖又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等（イノシトールなどのシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基又はそれ未満のペプチド）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン  単糖、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖、例えばラクトース、マルトース、スクロース、及び三糖、例えばラフィノース；及び多糖、例えばデキストランであり得る。安定剤は、活性タンパク質の重量部あたり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在することができる。
【０１２６】
非イオン性界面活性剤又は洗浄剤（「湿潤剤」としても知られている）は、治療剤の可溶化の促進、並びに撹拌誘導による凝集に対する治療用タンパク質の保護のために加えることができ、これはまた、タンパク質の変性を生じることなく製剤が圧力付加のせん断面に曝露されることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、又は約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在することができる。
【０１２７】
さらなる多様な賦形剤としては、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、及び共溶媒が挙げられる。
【０１２８】
本明細書における製剤は、本発明のポリペプチドに加えて、第２の治療剤も含有し得る。適切な第２の治療剤の例は以下に示す。
【０１２９】
投薬スケジュールは、疾患の種類、疾患の重篤度、及び本発明のポリペプチドに対する患者の感受性を含む、多数の臨床因子に応じ、月に１回から毎日まで変わり得る。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、週に２回、５日ごと、週に１回、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、又は月に１回、又は前述の値のいずれか２つの間の任意の範囲で、例えば、４週間ごとから毎月、１０日ごとから２週間ごと、又は週に２回から３回等で投与される。
【０１３０】
投与しようとする本発明のポリペプチドの用量は、特定のポリペプチド、対象、並びに疾患の性質及び重篤度、対象の身体状態、治療計画（例えば、第２の治療剤が使用されるか否か）、並びに選択された投与経路によって変わる。適切な用量は、当業者により容易に決定され得る。
【０１３１】
本発明のポリペプチドの最適な量及び個々の投薬の間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに処置される特定の対象の年齢及び状態により決定されること、また医師が使用する適切な用量を最終的に決定するということは、当業者には認識されよう。この投薬は、必要に応じて頻繁に繰り返すことができる。副作用が発生した場合には、投薬の量及び／又は頻度を、通常の臨床診療に従って変更又は低減することができる。
【０１３２】
本発明の一態様によれば、ＦＶＩＩＩへの本発明のポリペプチドの結合親和性は、配列番号３中の改変（単数又は複数）を除き、同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの親和性よりも高い。
【０１３３】
ＶＷＦ分子の第ＶＩＩＩ因子分子への結合親和性は、当分野で使用されている結合アッセイによって決定することができる。例えば、ＶＷＦ分子を固体支持体に固定化し、漸増濃度の第ＶＩＩＩ因子を適用し、一定期間インキュベートし、洗浄した後、結合した第ＶＩＩＩ因子を発色性アッセイによって決定することができる。次いで、スキャッチャード分析又は別の適切な方法によって、親和定数又は解離定数を決定することができる。ヒト第ＶＩＩＩ因子のフォンウィルブランド因子への結合親和性を決定する方法は、Ｖｌｏｔら（１９９５）、Ｂｌｏｏｄ、８５巻、１１号、３１５０〜３１５７に記載されている。
【０１３４】
解離定数を含めた親和性の本明細書における任意の指標は、好ましくは、本発明の改変ＶＷＦ又は本発明のポリペプチドのＦＶＩＩＩへの結合を意味する。ＦＶＩＩＩの単鎖アミノ酸配列を配列番号１５に示す。
【０１３５】
ＦＶＩＩＩとのＶＷＦの相互作用は典型的には速いオン速度を有するので、解離定数における変化は、主として解離速度の変化に依存する。従って、ＶＷＦのＦＶＩＩＩとの相互作用の増大における主な焦点は、ＦＶＩＩＩとＶＷＦの間の解離速度を低下させる試みに関する。好ましくは、野生型ＶＷＦ及びＦＶＩＩＩと比較した場合の改変ＶＷＦ及びＦＶＩＩＩの解離速度は、少なくとも２倍低く、より好ましくは少なくとも５倍低く、好ましくは少なくとも１０倍低く、より好ましくは少なくとも２０倍低い。
【０１３６】
ＶＷＦとＦＶＩＩＩからなる複合体の解離定数は、好ましくは０．２ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１７５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１２５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｎｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．０５ｎｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ以下である。
【０１３７】
本発明のポリペプチドと配列番号１５の第ＶＩＩＩ因子との複合体の解離定数ＫＤは、典型的には、参照ポリペプチド（例えば、配列番号４のポリペプチド）と配列番号１５の第ＶＩＩＩ因子との複合体の解離定数ＫＤの９０％未満である。本発明のポリペプチドと配列番号１４の第ＶＩＩＩ因子との複合体の解離定数ＫＤは、参照ポリペプチド（例えば、配列番号３のポリペプチド）と配列番号１５の第ＶＩＩＩ因子との複合体の解離定数ＫＤの好ましくは７５％未満、より好ましくは５０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満である。
【０１３８】
参照ポリペプチドは、ＶＷＦのＤ’−Ｄ３ドメイン内の変異を除き、そのアミノ酸配列が本発明のポリペプチドのものと同一であるポリペプチドである。すなわち、参照ポリペプチドは、好ましくは、参照ポリペプチドのＤ’−Ｄ３ドメインが配列番号３に示すアミノ酸配列からなるという条件下で、本発明のポリペプチドのものと同一のアミノ酸配列を有する。言い換えると、本発明のポリペプチドと参照ポリペプチドの間の唯一の配列の相違は、Ｄ’−Ｄ３ドメインのアミノ酸配列にある。参照ポリペプチドは、好ましくは、本発明のポリペプチドと同一条件下で調製されている。
【０１３９】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本出願に記載されているように、改変ＶＷＦ又は前記改変ＶＷＦを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド（単数又は複数）」は、一般に、非改変ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよいし、改変ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡであり得る。本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド（単数又は複数）」は、１つ又は複数の改変塩基及び／又は通常とは異なる塩基、例えばイノシンを含むＤＮＡ又はＲＮＡも含む。当業者に既知の多くの有用な目的に役立つ様々な改変をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができることは理解されよう。本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド（単数又は複数）」は、そのような化学的に、酵素的に又は代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、並びにウイルス、及び例えば単純型細胞及び複雑型細胞を含めた細胞の特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態を包含する。
【０１４０】
遺伝暗号の縮重が原因で、所与のポリペプチドが異なるポリヌクレオチドにコードされ得ることは、当業者には理解されよう。これらの「変異体」は、本発明に包含される。
【０１４１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、例えば、限定するものではないが、他の染色体及び染色体外のＤＮＡ及びＲＮＡ等の他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製することができる。当業者に既知の従来の核酸精製方法を使用して、単離されたポリヌクレオチドを得ることができる。この用語はまた、組換えポリヌクレオチド及び化学的に合成されたポリヌクレオチドも含む。
【０１４２】
本発明はさらに、本発明の改変ＶＷＦ又は改変ＶＷＦを含む本発明のポリペプチドを一緒にコードする一群のポリヌクレオチドに関する。群の第１のポリヌクレオチドは、改変ＶＷＦのＮ末端部分をコードすることができ、第２のポリヌクレオチドは改変ＶＷＦのＣ末端部分をコードすることができる。
【０１４３】
本発明のさらに別の態様は、本発明によるポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターである。好ましくは、プラスミド又はベクターは発現ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、ヒト遺伝子療法で使用するためのトランスファーベクターである。
【０１４４】
本発明はまた、上記の群のポリヌクレオチドを含む一群のプラスミド又はベクターに関する。第１のプラスミド又はベクターは、前記第１のポリヌクレオチドを含有することができ、第２のプラスミド又はベクターは、前記第２のポリヌクレオチドを含有することができる。或いは、両方のコード配列は、２つの別々のプロモーター配列、又は１つのプロモーターと配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメント（これは、例えば、成熟ＶＷＦの生成を増強するために、フューリンの発現を導くのに使用することができる）のいずれかを使用して、１つの発現ベクターにクローニングされる。
【０１４５】
本発明のさらに別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、プラスミド若しくはベクター、又は本明細書に記載されている一群のポリヌクレオチド若しくは一群のプラスミド若しくはベクターを含む宿主細胞である。
【０１４６】
本発明の宿主細胞は、改変ＶＷＦ又は前記改変ＶＷＦを含むポリペプチドを生成する方法で用いることができ、これは、本発明の一部である。この方法は、
（ａ）所望の改変タンパク質が発現するような条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること；及び、
（ｂ）任意選択で、宿主細胞から又は培養培地から所望の改変タンパク質を回収すること
を含む。
【０１４７】
本発明の改変ＶＷＦ又は改変ＶＷＦを含むポリペプチドを≧８０％の純度、より好ましくは、≧９５％の純度に精製することが好ましく、巨大分子、特に他のタンパク質及び核酸の混入について９９．９％の純度を超え、感染性及び発熱性因子を含んでいない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、単離された又は精製された本発明の改変ＶＷＦ又は本発明のポリペプチドは、他の無関係なポリペプチドを実質的に含んでいない。
【０１４８】
本発明の様々な生成物は医薬として有用である。従って、本発明は、本明細書に記載されている改変ＶＷＦ若しくは前記改変ＶＷＦを含むポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のプラスミド若しくはベクターを含む医薬組成物に関する。
【０１４９】
本発明はまた、血友病Ａ若しくはＢ又はＶＷＤなどの血液凝固障害に罹患している個体を処置する方法に関する。本方法は、有効量の（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び改変ＶＷＦ若しくは改変ＶＷＦを含むポリペプチド、又は（ｉｉ）ＦＶＩＩＩと改変ＶＷＦとの複合体、又は（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩと本明細書に記載されている改変ＶＷＦを含むポリペプチドとの複合体を前記個体に投与するステップを含む。別の実施形態では、本方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド又は本発明のプラスミド若しくはベクターを個体に投与するステップを含む。或いは、本方法は、有効量の本明細書に記載されている本発明の宿主細胞を個体に投与するステップを含み得る。
【０１５０】
改変ポリペプチドの発現
適切な宿主細胞における組換え突然変異体タンパク質の高レベルでの生成は、当業者に既知の方法に従って、様々な発現系で増殖することができる組換え発現ベクターにおいて、適切な調節エレメントとともに上記の改変ポリヌクレオチド、典型的にはｃＤＮＡを有効な転写単位へアセンブリーすることを必要とする。有効な転写調節エレメントは、天然の宿主として動物細胞を有するウイルスに由来し得るか、動物細胞の染色体ＤＮＡに由来し得る。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス若しくはラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートに由来するプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、又はベータ−アクチン若しくはＧＲＰ７８のような、動物細胞において構成的に強く転写される遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを使用することができる。ｃＤＮＡから転写される安定的な高レベルのｍＲＮＡを得るために、転写単位は、その３’近傍部に、転写終結−ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含有するべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子に由来する。
【０１５１】
次いで、改変ＦＶＩＩＩ及び／又はＶＷＦタンパク質を発現させるのに適切な宿主細胞系のゲノムにｃＤＮＡを組み込む。好ましくは、この細胞系は、正確なフォールディング、ジスルフィド結合形成、アスパラギン連結型グリコシル化、及び他の翻訳後修飾、並びに培養培地中への分泌を確実にするために、脊椎動物起源の動物細胞系であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、新生ポリペプチド鎖のチロシンＯ−硫酸化及びタンパク質分解性プロセシングである。使用することができる細胞系の例は、サルＣＯＳ−細胞、マウスＬ−細胞、マウスＣ１２７−細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胚性腎臓２９３細胞、及びハムスターＣＨＯ−細胞である。
【０１５２】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターを、いくつかの異なる方法で動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、様々な動物ウイルスに基づくベクターから作出することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、好ましくはウシパピローマウイルスに基づくベクターである。
【０１５３】
対応するＤＮＡをコードする転写単位は、ゲノムに組換えＤＮＡが組み込まれた特定の細胞クローンを単離しやすくするために、これらの細胞において優性選択マーカーとして機能し得る別の組換え遺伝子とともに動物細胞に導入することもできる。このタイプの優性選択マーカー遺伝子の例は、ゲンタマイシン（Ｇ４１８）に耐性を付与するＴｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びピューロマイシンに耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。そのような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするものと同じベクターに存在していてもよく、又は宿主細胞のゲノムに同時に導入され、組み込まれ、その結果、異なる転写単位間で堅固な物理的な連結がしばしば生じる別個のベクターにコードされていてもよい。
【０１５４】
所望のタンパク質のｃＤＮＡとともに使用することができる他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位に基づく。このタイプの遺伝子を、内在性のｄｈｆｒ活性を欠く細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入した後、ヌクレオシドを欠く培地でこれらを生育させることが可能になる。そのような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン及びグリシンを含まないＨａｍのＦ１２である。これらのｄｈｆｒ遺伝子を、同じベクター上で又は異なるベクター上で連結されている、上記のタイプのＣＨＯ細胞にＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ転写単位とともに導入することができ、これにより、組換えタンパク質を生成するｄｈｆｒ陽性細胞系を作出することができる。
【０１５５】
細胞毒性ｄｈｆｒ阻害剤であるメトトレキサートの存在下で上記の細胞系が増殖する場合、メトトレキサート耐性の新しい細胞系が出現する。これらの細胞系は、連結されたｄｈｆｒ及び所望のタンパク質の転写単位の数が増加したことにより、組換えタンパク質を増大した速度で生成することができる。漸増濃度のメトトレキサート（１〜１００００ｎＭ）中でこれらの細胞系を増殖させた場合、極めて高速度で所望のタンパク質を生成する新しい細胞系を得ることができる。
【０１５６】
所望のタンパク質を生成する上記の細胞系を、懸濁培養中で、又は様々な固体支持体上のいずれかで大規模に増殖させることができる。これらの支持体の例は、デキストラン若しくはコラーゲンマトリックスに基づくマイクロキャリア、又は中空繊維若しくは様々なセラミック材料の形態の固体支持体である。細胞懸濁培養中で又はマイクロキャリア上増殖させる場合、上記の細胞系の培養は、バッチ培養、又は長期間にわたり条件培地を連続的に生成する灌流培養のいずれかで行うことができる。従って、本発明によれば、上記細胞系は、所望の組換え突然変異体タンパク質を生成するための工業的プロセスの開発に良好に適している。
【０１５７】
精製及び製剤
上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積する組換え改変ＶＷＦタンパク質は、細胞培養培地中の所望のタンパク質と他の物質の間のサイズ、電荷、疎水性、溶解度、特異的親和性等の違いを利用する方法を含めた、様々な生化学的及びクロマトグラフィー的方法によって、濃縮及び精製することができる。
【０１５８】
そのような精製の例は、固体支持体に固定化される、例えばＨＬＥＰ、好ましくはヒトアルブミンに対する、又はそれぞれの凝固因子に対する、モノクローナル抗体への組換え突然変異体タンパク質の吸着である。支持体への改変ＶＷＦの吸着、洗浄及び脱着の後、上記の特性に基づく様々なクロマトグラフィー法によって、タンパク質をさらに精製することができる。
【０１５９】
精製ステップの順序は、例えば、ステップの能力及び選択性、支持体の安定性又は他の態様に従って選択される。好ましい精製ステップとしては、限定するものではないが、イオン交換クロマトグラフィーステップ、免疫アフィニティークロマトグラフィーステップ、アフィニティークロマトグラフィーステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップ、色素クロマトグラフィーステップ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーステップ、マルチモーダルクロマトグラフィーステップ、及びサイズ排除クロマトグラフィーステップが挙げられる。
【０１６０】
ウイルス混入の理論上の危険性を最小限にするために、ウイルスの効果的な不活性化又は除去を提供する、さらなるステップをプロセス中に含むことができる。そのようなステップは、例えば、液体若しくは固体状態での熱処理、溶媒及び／若しくは洗浄剤による処理、可視若しくはＵＶスペクトルでの照射、γ線照射又はナノ濾過である。
【０１６１】
本発明の改変ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）はまた、ヒト遺伝子療法で使用するためのトランスファーベクターに組み込むことができる。
【０１６２】
本明細書に記載されている様々な実施形態を互いに組み合わせることができる。本発明を、以下のそれらの実施例において、より詳細にさらに記載する。本発明の特定の実施形態のこの説明は、添付の図面と併せて行う。
【０１６３】
本発明に記載されている改変ＶＷＦは、治療的使用のための医薬調製物に製剤化することができる。精製タンパク質は従来の生理的に適合する水性緩衝溶液に溶解させることができ、医薬調製物を提供するために、この溶液に、任意選択で医薬品賦形剤を添加することができる。
【０１６４】
そのような医薬担体及び賦形剤、並びに適切な医薬製剤は、当分野で周知である（例えば、「ペプチド及びタンパク質の医薬製剤開発（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｆｒｏｋｊａｅｒら、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）、又は「医薬品賦形剤ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）」、第３版、Ｋｉｂｂｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。標準的な医薬製剤技術は当業者に周知である（例えば、２００５医師用添付文書集（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）（登録商標）、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ、２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００を参照されたい）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む医薬組成物は、凍結乾燥形態又は安定な液体形態で製剤化することができる。当分野で既知の様々な手順によって、ポリペプチド変異体を凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、１種又は複数の医薬的に許容される希釈剤、例えば、無菌の注射用水又は無菌の生理的食塩水を加えることによって、使用前に再構成される。
【０１６５】
本組成物の製剤は、任意の医薬的に適切な投与手段で個体に送達される。様々な送達系が知られており、任意の好都合な経路によって組成物を投与するのに使用することができる。優先的には、本発明の組成物は全身的に投与される。全身的な使用については、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内若しくは経皮）、又は経腸（例えば、経口、腟又は直腸）送達用に製剤化される。最も好ましい投与経路は、静脈内投与及び皮下投与である。製剤は、注入又はボーラス注射によって、連続的に投与することができる。いくつかの製剤は、徐放系を包含する。
【０１６６】
本発明のタンパク質は、治療有効量で患者に投与され、治療有効量は、耐えられない有害な副作用をもたらす用量に達することなく、所望の効果をもたらし、処置を受ける状態又は適応症の重症度又は蔓延を予防又は軽減するのに十分である用量を意味する。正確な用量は、例えば、適応症、製剤及び投与様式のような多くの要因に依存し、それぞれ個々の適応症についての前臨床及び臨床試験において決定されなければならない。
【０１６７】
本発明の医薬組成物は、単独で又は他の治療剤とともに投与することができる。これらの薬剤は、同じ医薬品の一部として組み込むことができる。そのような薬剤の一例は、改変ＶＷＦとＦＶＩＩＩとの組み合わせである。
【０１６８】
「Ｎ−連結型グリカン」は、ポリペプチドのアスパラギン残基に共有結合で連結されたオリゴ糖である。そのようなＮ−連結型グリカン上の末端ガラクトースは、α−２，３−又はα−２，６−連結シアル酸の結合により修飾され得る。
【０１６９】
用語「シアル酸」は、動物オリゴ糖の末端単糖として通常確認されるノイラミン酸のＮ−又はＯ−置換誘導体を意味する（概説については、Ｖａｒｋｉｓ  （１９９２）  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．２  ｎｏ．１  ｐｐ．２５〜４０を参照されたい）。最も一般的なシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸である。「増大したシアリル化」は、糖タンパク質のＮ−グリカンの少なくとも８５％が、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含むことを意味する。非限定的な例として、「少なくとも８５％の増大したシアリル化」は、本発明の例６におけるように、すなわち、全Ｎ−グリカンを目的の所与の糖タンパク質から酵素により切断し、次いでシアル酸を有していない切断されたＮ−グリカン（「アシアロＮ−グリカン」）の量、及びすべての切断されたＮ−グリカンの総量を決定することにより決定される。次いで「少なくとも８５％のシアリル化」は、１５％のアシアロＮ−グリカンの量に相当するか又はすべての切断されたＮ−グリカンの総量より少ない。
【０１７０】
第１のステップにおいて、本発明の方法は、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供するステップを含む。
【０１７１】
以下により詳細に記載されているように、本発明の方法は、切断型ＶＷＦを含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供するステップを含む。核酸は、それ自体は公知である技術によって適切な宿主細胞に導入される。
【０１７２】
細胞の培養
一実施形態において、本発明は、３６．０℃未満の温度で細胞を培養するステップを含む。この方法は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、細胞を培養するステップを含む。
【０１７３】
宿主細胞系を培養するために選択された基礎培地は本発明においては重要ではなく、哺乳動物細胞の培養に適している当分野で公知のいずれか１つ、又はそれらの組み合わせであってよい。ダルベッコ改変イーグル培地、ＨａｍのＦ−１２培地、イーグル最少必須培地、及びＲＰＭＩ−１６４０培地などのような培地が市販されている。組換えインスリンのような増殖因子の添加は任意選択である。一実施形態において、培地は、完全にいずれのタンパク質も含まないか、又は少なくとも組換え産生されていないずれのタンパク質も含まないという意味で「無タンパク質」である。ヒト血清アルブミンは、ポリペプチドの製造のための無血清培地補充物として使用され得る。好ましくは、培地は、組織培養に適しており、合成又は植物性起源のものであるセリンプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤を含有する。
【０１７４】
一般に、本発明は、ポリペプチドの発現に適しているいずれかの細胞培養方法とともに使用され得る。例えば、細胞はバッチで又は流加培養法で増殖させることができ、この場合、培養はポリペプチドの十分な発現の後に終了され、その後発現したポリペプチドが回収される。或いは、細胞は連続培養（例えば、灌流培養）で増殖させることができ、この場合、培養は終了されず、新しい栄養分及び他の成分が定期的に又は連続して培養に添加され、その間発現されたポリペプチドは定期的又は連続的に回収される。後者の実施形態は、方法が本明細書の以下に記載されているように温度シフトを含む場合が好ましい。培養は、バッチ、流加培養又は連続培養のような任意の従来の型の培養でもよいが、好ましくは連続的である。適切な連続培養としては灌流培養が挙げられる。
【０１７５】
細胞は、実施者により選択されたいずれかの都合のよい体積で増殖させることができる。例えば、細胞は、数ミリリットルから数リットルまでの体積の範囲にある小規模反応容器で増殖させることができる。或いは、細胞は、およそ少なくとも１リットルから１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，０００リットル若しくはそれ以上の体積、又はその間のいずれかの体積の範囲の大規模商業用バイオリアクターで増殖させることができる。培養は、典型的には、バイオリアクターで行われ、これは通常、１（一）から１００００（一万）リットルの容量、例えば５、１０、５０、１００、１０００、２５００、５０００又は８０００リットルのステンレス鋼、ガラス又はプラスチックの容器である。容器は、通常は硬質であるが、可撓性プラスチックバッグを、特により小さい体積のために使用することができる。これらは一般的に「単回使用」型のものである。
【０１７６】
ＣＨＯ及びＢＨＫ細胞のような哺乳動物細胞は、一般的には、懸濁培養として培養される。すなわち、細胞は固体支持体に接着させるのではなく、培地中に懸濁される。或いは細胞は、担体上に、特にマイクロキャリア上に固定化される。Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）又はＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）などの多孔性担体が特に適し得る。
【０１７７】
高シアリル化を得るために、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、好ましくは低減した温度で、例えば３６．０℃未満で培養する。「低減した温度」は、それぞれの細胞系の増殖についての最適温度又は通常の温度よりも低い温度を意味する。大部分の哺乳動物細胞について、通常温度は３７℃である。従って、本発明によれば、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、３０．０〜３６．０℃、３０．５〜３５．５℃、３１．０〜３５．０℃、３１．５〜３４．５℃、３２．０〜３４．０℃、又は３２．５〜３３．５℃の低減した温度で培養されることが好ましい。好ましくは、細胞は、３０．０℃±１．０℃、３１．０℃±１．０℃、３２．０℃±１．０℃、３３．０℃±１．０℃、３４．０℃±１．０℃、又は３５．０℃±１．０℃の低減した温度で培養される。
【０１７８】
低減した温度は、発現させようとするポリペプチドのシアリル化を増大させるために十分な時間維持される。好ましくは、低減した温度は、少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、又は少なくとも１４４時間維持される。他の実施形態において、低減した温度は、１時間〜８週間、６時間〜６週間、１２時間〜５週間、１８時間〜４週間、２４時間〜３週間、４８時間〜１４日間、７２時間〜１０日間、又は３〜７日間維持される。
【０１７９】
これを達成するために、培養は培養の過程の間に１又はそれ以上の温度シフトにかけられ得る。培養温度をシフトする場合、その温度シフトは比較的緩やかであり得る。例えば、それは温度変化を完了するまでに数時間又は数日かかってもよい。或いは、温度シフトは、比較的急激であってもよい。温度は、培養プロセスの間に徐々に増加又は減少され得る。或いは、温度は、培養プロセスの間に様々な時間で個別の量だけ増加又は減少され得る。後に続く温度（単数若しくは複数）又は温度範囲（単数若しくは複数）は、最初又は前の温度（単数若しくは複数）又は温度範囲（単数若しくは複数）より低くてもより高くてもよい。当業者には当然のことながら、多数の個別の温度シフトがこの実施形態に包含される。例えば、温度は１回（より高いか又はより低い温度又は温度範囲のいずれかへ）シフトさせることができ、細胞は、この温度又は温度範囲に特定の期間維持され、その後、温度は再び新しい温度又は温度範囲へとシフトさせることができ、これは以前の温度又は温度範囲よりも高いか又はより低い温度又は温度範囲のいずれかであり得る。各個別のシフトのあとの培養温度は一定でも、特定の温度範囲内に維持されてもよい。
【０１８０】
典型的には、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、最初に「通常」温度の３７．０℃±１．０℃で、標的細胞密度が達成されるまで培養される。次いで、初期培養期間の後に、低減した温度まで温度シフトが行われる。低減した温度での培養期間の後に、通常温度への温度シフトを行っても行わなくてもよい。好ましくは、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、最初に３７．０℃±１．０℃で数日間培養され、続いて低減した温度の３１．０〜３５．０℃で製造される。
【０１８１】
本開示に基づいて、当業者は、それぞれの細胞系の特定の必要及び実施者の特定の製造要件に応じて、細胞を増殖するための温度を選択することができる。
【０１８２】
特定の実施形態において、バッチ及び流加培養バイオリアクターは、発現されたポリペプチドが十分に高い力価に達すると終了される。さらに又は或いは、バッチ及び流加培養バイオリアクターは、実施者の必要により決定して、十分に高い密度に達したならば終了することができる。例えば、培養は、細胞が最大生存細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９パーセントに達したならば終了することができる。さらに又は或いは、バッチ及び流加培養バイオリアクターは、乳酸塩及びアンモニウムなどの代謝廃棄産物が過剰に蓄積される前に終了され得る。
【０１８３】
特定の場合、後の製造段階の間に、欠乏したか又は細胞により代謝された栄養分又は他の培地成分を細胞培養物に補充することが有利であり得る。非限定的な例として、細胞培養に、ホルモン及び／若しくは他の増殖因子、無機イオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、及びホスフェート）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシド又はヌクレオチド、微量元素（通常は非常に低い最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、又はグルコース若しくは他のエネルギー源を補充することが有利であり得る。そのような補充成分は、すべて細胞培養物に一度に添加してもよく、又は一連の添加において細胞培養物に供給されてもよく、又は灌流培養中に新鮮な培地と一緒に供給されてもよい。
【０１８４】
バッチ及び流加培養バイオリアクターの代わりに、本発明は、本発明のポリペプチドを発現する細胞が連続灌流バイオリアクターで培養される場合にも実施され得る。
【０１８５】
当業者は、細胞培養の特定の特徴を最適化するために特定の細胞培養条件を調整することができ、これらの細胞培養条件としては、限定するものではないが、増殖速度、細胞生存率、細胞培養の最終細胞密度、乳酸塩及びアンモニウムなどの有害な代謝副生成物の最終濃度、発現されたポリペプチドの力価、オリゴ糖側鎖の程度及び組成、又はこれら若しくは実施者により重要とみなされた他の条件のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【０１８６】
発現されたポリペプチドの単離
一般に、本発明により発現されるポリペプチドを単離及び／又は精製することが典型的には望ましい。特定の実施形態において、発現されたポリペプチドは培地中に分泌され、従って細胞及び他の固形物は、例えば精製プロセスにおける第１のステップとして遠心分離又は濾過により除去され得る。
【０１８７】
発現されたポリペプチドは、標準的な方法により単離及び精製することができ、これらの標準的な方法としては、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心分離、若しくは溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、エタノール沈降、及び／又はタンパク質の精製に利用可能ないずれかの他の技術（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７；  Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｓ．Ｊ．  及び  Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．  （ｅｄｓ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；及びＤｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ、Ｍ．Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎ．  （ｅｄｓ．）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｖｏｌ．１８２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい、これらは各々参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。特に免疫親和性クロマトグラフィーについて、ポリペプチドは、そのポリペプチド対して産生されて固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティカラムにそれを結合することにより単離することができる。或いは、インフルエンザコート配列、ポリ−ヒスチジン、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグが標準的組換え技術によりポリペプチドに結合され、適切なアフィニティカラム上の通過による容易な精製を可能にし得る。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤は、精製プロセスの間にポリペプチドの分解を低減又は排除するためにいずれか又はすべての段階で添加することができる。プロテアーゼ阻害剤は、発現されたポリペプチドを単離及び精製するために細胞を溶解しなければならない場合、特に有利である。さらに又は或いは、グリコシダーゼ阻害剤は、共有結合で結合されたオリゴ糖鎖の酵素的トリミングを低減又は排除するためにいずれか又はすべての段階で添加することができる。
【０１８８】
本発明により発現されるポリペプチドは、伝統的な細胞培養条件下で増殖された場合よりも、より広範なシアリル化を有する。従って、精製ステップで有効であり得る本発明の１つの実用的利点は、本発明の特定の方法により増殖されたポリペプチド上の追加及び／又は変更されたシアル酸残基が、より伝統的な方法によって増殖されたポリペプチドに対して可能である場合よりも、より容易に、又はより高い純度までポリペプチドを精製するために、実施者により使用され得る特有の生化学的特性をそれに付与し得ることである。例えば、ポリペプチドは、シアル酸残基の負電荷を利用して、アニオン交換クロマトグラフィーにより精製又は著しく富化され得る。それにより、高シアリル化を有するポリペプチドのさらなる富化が達成され得る。
【０１８９】
さらなる実施形態において、本発明の方法により得られるポリペプチドのシアリル化は、インビトロでポリペプチドをシアリルトランスフェラーゼと接触させることによりさらに増大させることができる。シアリルトランスフェラーゼは、典型的には、哺乳動物シアリルトランスフェラーゼであり、好ましくは、ヒトシアリルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼは、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ及び／又はα−２，６−シアリルトランスフェラーゼであり得る。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、ヒトα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿７７５４７９−ＳＴ３ＧＡＬ１）及び／又はヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼである。最も好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿００３０２３−ＳＴ６ＧＡＬ１により同定されるヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼである。さらにシアリル基ドナー、又はシアル酸ドナーがインビトロ反応において存在する。適切なドナーとしては、例えば、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮＡＮＡ）、Ｒｏｃｈｅカタログ番号０５  ９７４  ００３  １０３が挙げられる。インビトロシアリル化に適したキットは、Ｒｏｃｈｅから入手可能である（カタログ番号０７  ０１２  ２５０  １０３）。
【０１９０】
当業者には当然のことながら、正確な精製技術は、精製しようとするポリペプチドの特徴、ポリペプチドが発現される細胞の特徴、及び／又は細胞が増殖された培地の組成に応じて変わる。
【０１９１】
上述のように、本発明は、第２の態様において、増大したシアリル化を有するＮ−グリカンを含むポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドをコードする核酸、並びにα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ及び／又はα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、好ましくはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸を含む細胞を提供することと、
（ｉｉ）ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、細胞を培養すること
を含む、方法に関する。
【０１９２】
α−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、好ましくは、ヒトα−２，３−シアリルトランスフェラーゼである。ヒトα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ配列は配列番号１２に示しており、それに基づいて、当業者はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼのコード配列を含有する適切な発現ベクターを設計することができる。
【０１９３】
α−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、好ましくはヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼである。ヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ配列は配列番号３１に示しており、それに基づいて、当業者は、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼのコード配列を含有する適切な発現ベクターを設計することができる。
【０１９４】
トランスフェクトされた細胞は、公知の培養方法に従って、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することができる。
【０１９５】
ポリペプチドは、確立された精製技術を使用して、回収及び／又は単離することができる。
【０１９６】
本発明のポリペプチド
本発明は、本明細書において記載されている方法によって得ることができるポリペプチドに関する。
【０１９７】
別の態様において、本発明は、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドであって、該切断型ＶＷＦは第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができ、該ポリペプチドはＮ−グリカンを含み、該Ｎ−グリカンの少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、ポリペプチドに関する。好ましい実施形態において、該Ｎ−グリカンの少なくも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む。本発明者らは、高度にシアリル化されたＶＷＦ断片を含むポリペプチドは、延長された半減期自体を有するだけでなく、同時投与されたＦＶＩＩＩの半減期も延長することができるということを実証した。換言すると、本発明のポリペプチドの投与は、同時投与されたＦＶＩＩＩの延長された半減期及び／又は減少したクリアランスをもたらす。
【０１９８】
第５の態様において、本発明は、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドであって、該切断型ＶＷＦは、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができ、該ポリペプチドはＮ−グリカンを含み、ポリペプチドのＮ−グリカンのシアリル基の少なくとも５０％は、α−２，６−連結シアリル基である、ポリペプチドに関する。一般に、末端シアリル基は、α−２，３−又はα−２，６−連結を介してガラクトース基に結合され得る。典型的には、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンは、α−２，６−連結シアリル基をα−２，３−連結シアリル基よりも多く含む。好ましくは、Ｎ−グリカンのシアリル基の少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％は、α−２，６−連結シアリル基である。これらの実施形態は、例えば、ヒトα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを哺乳動物細胞において同時発現させることにより得ることができる。
【０１９９】
一実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９６％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％は、少なくとも１つのシアル酸基を含む。
【０２００】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又はさらに１％未満はアシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらはシアル酸基を欠いたＮ−グリカンである。別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの１５％未満、１２％未満、１０％未満、又は８％未満、又は６％未満、又は５％未満、又は４％未満、又は３％未満、又は２％未満、又はさらに１％未満はアシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらはシアル酸基を有していない。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの２５％未満、２０％未満、１５％未満、又は１０％未満はモノシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらは、１つのシアル酸基を有するＮ−グリカンである。別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの２５％未満、２０％未満、１５％未満、又は１０％未満はモノシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらは、１つのシアル酸基を有するＮ−グリカンである。非限定的な例として、モノシアリル化Ｎ−グリカンの量は、例６に詳述されているようにして決定され得る。
【０２０２】
さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも２０％、又は少なくとも２５％はジシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらは２つのシアル酸基を有するＮ−グリカンである。さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの少なくとも２０％、又は少なくとも２５％はジシアロ−Ｎ−グリカンである。
【０２０３】
さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％はトリシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらは３つのシアル酸基を有するＮ−グリカンである。さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％はトリシアロ−Ｎ−グリカンである。
【０２０４】
さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも５％、又は少なくとも１０％はテトラシアロ−Ｎ−グリカンであり、すなわちそれらは４つのシアル酸基を有するＮ−グリカンである。さらに別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの少なくとも１０％、又は少なくとも１５％はテトラシアロ−Ｎ−グリカンである。
【０２０５】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドのＮ−グリカンの少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％は、２つ又はそれ以上のシアル酸基を含む。別の実施形態において、本発明のポリペプチド内の切断型ＶＷＦのＮ−グリカンの少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％は、２つ又はそれ以上のシアル酸基を含む。
【０２０６】
上述の実施形態は互いに組み合わせることができる。上述のＮ−グリカンの任意のパーセンテージ、又はシアリル化の程度の任意の指示は、平均パーセンテージ又は程度と理解されたく、すなわち、それらは単一の分子ではなく分子の集団を意味する。ポリペプチドの集団内の個別のポリペプチド分子のグリコシル化又はシアリル化が多少の不均一性を示すということは明らかである。
【０２０７】
本発明の別の態様は、（ｉ）本明細書の上記で定義されているポリペプチド、及び（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子を含む医薬キットである。好ましくは、ポリペプチド及びＦＶＩＩＩは、個別の組成物に含有される。
【０２０８】
本発明の別の態様は、血液凝固障害の処置における同時使用、個別使用又は連続使用のための、（ｉ）本明細書の上記で定義されているポリペプチド、及び（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子を含む医薬キットである。
【０２０９】
本明細書で言及されている配列の概要を表３に示す。
【表３−１】
2019507587.tif 000006
【表３−２】
2019507587.tif 000007
【実施例】
【０２１０】
（例１）
ＦＶＩＩＩ結合が改善されたｖＷＦ突然変異体
背景
上述したように、また同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０３６９で論じているように、循環ＦＶＩＩＩの大部分はＶＷＦとの複合体になっている。ヒトでは、ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦの非存在下及び存在下で、それぞれ、およそ２時間及び１６時間のｔ１／２で血液から排除される。ＶＷＦはＦＶＩＩＩ半減期の増大を与えるが、これはまた、それ自体の半減期によって決まるｔ１／２の上限も定める。ＵＳ８，５７５，１０４は、ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質を開示している。この融合タンパク質は、齧歯類モデルにおいて、野生型ＶＷＦよりも５倍長い半減期を有する。この融合タンパク質とＦＶＩＩＩの間の安定な複合体は、ＦＶＩＩＩに対してさらなる半減期の利益を与えることができる。ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ相互作用の平衡結合定数は高いが、結合キネティクスは速く、ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質と複合体になっているいかなるＦＶＩＩＩも、注入の際に内在性のｖＷＦと速やかに交換される。従って、ＶＷＦ−アルブミン融合体とのＦＶＩＩＩの解離速度が天然のＶＷＦとのＦＶＩＩＩの解離速度と実質的に等しいのであれば、ＶＷＦ−アルブミン融合体の使用は、ＦＶＩＩＩの半減期のいかなる実質的な増大も提供しないであろう。
【０２１１】
従って、ＶＷＦ−アルブミン融合体のより長い半減期を活用してＦＶＩＩＩの半減期を延長するためには、ＶＷＦ−アルブミン融合体とのＦＶＩＩＩの解離速度を低下させることが必要である。ＶＷＦのレベルは正常であるが、ＶＷＦがＦＶＩＩＩと結合する能力が著しく低下している２Ｎ型フォンウィルブランド病の患者において行われる測定を活用するモデル化研究から、ＦＶＩＩＩ半減期の臨床的に意味がある向上を提供するためには、少なくとも５倍の解離速度の低下が必要とされることが推定された。ＦＶＩＩＩ  ＶＷＦ−アルブミン融合体の解離速度の低下とＦＶＩＩＩ半減期の増大の間の想定される関連性を表４に示す。
【表４】
2019507587.tif 000008
【０２１２】
ＦＶＩＩＩ  ＶＷＦ−アルブミン融合体の解離速度を低下させる目的で、突然変異体ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質が有意に遅いＦＶＩＩＩの解離速度をもたらし、それによって、ＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質との安定な相互作用を介してＦＶＩＩＩの半減期を延長するための実行可能な選択肢を提供することができるか否かを評価するために実験を実施した。
【０２１３】
結合したＦＶＩＩＩの解離速度を遅くすることを目的に、ｖＷＦのアミノ酸位置７６４、７６５、７６６、７６８、７６９、７７３、８０６及び８０９近傍で一連の突然変異体を構築した。これらの実験では、組換え型のＦＶＩＩＩを使用した。このＦＶＩＩＩは、Ｚｏｌｌｎｅｒら  ２０１３、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３２：２８０〜２８７に記載されている。最初に、上述の残基のうちの１つを、システインを除くすべての遺伝子コードされるアミノ酸へと変異させたｖＷＦ構築物について、ＦＶＩＩＩ結合を測定した。改善された結合体の同定に続いて、変異の組み合わせを含めた、さらなる変異体のセットを生成した。さらに、アルブミン融合体によって提供される半減期の延長がＦｃＲｎ媒介性リサイクルに依存するので、いくつかの突然変異体はｐＨ５．５でも試験した。様々な変異についての結果を表５〜２０に示す。
【０２１４】
方法
ヒトフォンウィルブランド因子のＤ’及びＤ３ドメイン（ｖＷＦ；アミノ酸（ａａ）７６４〜１２７０（配列番号２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５４３に基づく）をコードするコドン最適化合成ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。これを、それ自体のシグナルペプチド（ａａ１〜２２）をコードするように５’末端で、及びＣ末端の８×Ｈｉｓタグをコードするように３’末端で改変した。この構築物（Ｈｕ−ｖＷＦ［７６４〜１２７０］−８Ｈｉｓ）を、開始メチオニン上流のＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＧＣＣＡＣＣ）及びオープンリーディングフレームの３’末端の二重終止コドン（ＴＧＡ）を有するｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に定方向クローニングし、自動シークエンシングによってプラスミド配列を確認した。次いで、この発現プラスミドを鋳型として使用し、標準的なＰＣＲ法を使用して、Ｓｅｒ７６４、Ｌｅｕ７６５、Ｓｅｒ７６６又はＬｙｓ７７３において一重、二重又は三重の残基変化を起こし、上記のように、構築物をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、シークエンシングした。Ｃ末端のＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）とともにＨｕ−ｖＷＦのＤ１及びＤ２ドメイン（ａａ１〜７６２）をコードする第２のコドン最適化ｃＤＮＡも合成し、ＧｅｎｅＡｒｔから得た。これを、ｐｃＤＮＡ３．１に上記のようにクローニングし、シークエンシングした。
【０２１５】
一過的な哺乳類発現のために、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３懸濁細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を、５ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１．１×１０６細胞／ｍｌまで増殖させた。７μＬの２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を、１６７μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに５分間プレインキュベートし、次いで、野生型／突然変異体Ｈｕ−ｖＷＦ［７６４〜１２７０］−８Ｈｉｓをコードする２．５μｇのプラスミドＤＮＡ＋Ｈｕ−ｖＷＦ［１〜７６２］−ＦＬＡＧをコードする２．５μｇのプラスミドＤＮＡに加え、この混合物をさらに２０分間インキュベートした。このＤＮＡ−２９３Ｆｅｃｔｉｎ複合体を、２５０ｒｐｍの振盪インキュベーター中で３７℃、８％ＣＯ２で６日間培養した細胞に加えた。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって培養上清を回収し、これを分析用に４℃で保管した。
【０２１６】
Ｂｉａｃｏｒｅ４０００バイオセンサーを３７℃で使用して、表面プラズモン共鳴によって、結合キネティクスを調べた。各突然変異体を、抗Ｈｉｓ抗体（１４，０００ＲＵ）を予め固定化したＣＭ−５センサーチップ上に、４０〜１５０ＲＵの密度まで細胞培養培地から捕獲した。最初のスクリーニング研究では、捕獲した突然変異体上にＦＶＩＩＩを１ｎＭで５分間注入し、解離を５分間モニターした。次いで、野生型と比べてｋｄの低下を示した突然変異体を、１、０．５及び０．２５ｎＭで５分間注入したＦＶＩＩＩで再検査し、解離を３０分間モニターした。
【０２１７】
参照スポット（固定化された抗Ｈｉｓ抗体のみを含有する）から、及びブランク注入から、シグナルを引くことによってすべてのセンサーグラムをダブルリファレンスした。ダブルリファレンスしたセンサーグラムを１：１カイネティックモデルに当てはめることによって、結合キネティクスを決定した。
【０２１８】
結果
プロリンへのセリン７６４の突然変異誘発は、解離速度がおよそ３．５倍低下し、親和性が４．４倍増大したｖＷＦ変異体を生成した。位置７６５の変異は、野生型ｖＷＦと比較して、いかなるより優れた結合体ももたらさなかった。位置７６６の多数の変異は、解離速度特性が改善され、親和性が野生型ｖＷＦより高い変異体ｖＷＦ分子を生成した（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ及びＡｓｎ）。位置７６４のプロリンが解離速度に有意な増大を与え、一方で、位置７６６の多数の変異が結合に明確に強い影響を与えたことを受けて、Ｓ７６４Ｐと、位置７６６のシステインを除くすべての他の遺伝子コードされるアミノ酸とからなる、一連の突然変異体が生成された。Ｓ７６４Ｐと、位置７６５のシステインを除くすべての他の遺伝子コードされるアミノ酸とを含有する、類似した変異が生成された。いくつかのこれらの二重突然変異体は、野生型ｖＷＦと比較して、有意に遅い解離速度及び高い親和性を有する。特に、Ｓ７６６Ｉと組み合わせたＳ７６４Ｐは、解離速度が２２倍低下し、親和性が３０倍増大したｖＷＦ変異体を生成する。
【０２１９】
（例２）
点突然変異体を有するヒト血清アルブミンｖＷＦ融合体及びＦＶＩＩＩ結合
その後の実験は、ヒト血清アルブミンに融合されたｖＷＦを使用して実施した。ヒトフォンウィルブランド因子のＤ’及びＤ３ドメイン（ｖＷＦ；アミノ酸（ａａ）７６４〜１２４２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５４３に基づく）をコードするコドン最適化合成ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。これを、それ自体のシグナルペプチド（ａａ１〜２２）をコードするように５’末端で、及びグリシンセリンリンカーを介してヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードするように３’末端で改変し、例１に記載されているようにクローニングした。例１に記載されている同様のプロセスを使用して、様々なＶＷＦ変異体を生成し、得られた構築物をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３懸濁細胞に一過的にトランスフェクトした。ｖＷＦ−ＨＳＡタンパク質は、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ヒトアルブミン親和性樹脂を使用して回収物から精製し、ｖＷＦ−ＨＳＡ二量体を調製用サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。ｐＨ７の詳細なカイネティック分析は、対照を含む上位候補について設定した。
【０２２０】
標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学反応を使用して、マウス抗ＨＳＡ抗体をＣＭ５チップ上に固定化した。典型的には、固定化レベルは１０，０００から１２，０００ＲＵの間であった。ｖＷＦ−ＨＳＡ（単量体及び二量体）の各バッチを、０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で、各フローセルの単一スポット上に２分間捕獲した。捕獲レベルは、４０〜１５０ＲＵの範囲であった。抗ｖＷＦは固定化されているが、ｖＷＦ−ＨＳＡは捕獲されていない隣接するスポットを参照として使用した。捕獲は、ＦＶＩＩＩ結合分析前のすべてのサイクルで実施した。
【０２２１】
ＦＶＩＩＩを、相互作用の親和性及び分析のｐＨに応じた変動濃度で、すべてのフローセルのすべてのスポット上に無作為に且つ二重に注入した。ＦＶＩＩＩの結合及び解離を、生じている相互作用に最も適する様々な時間枠にわたってモニターした。
【０２２２】
解離期間後に、２５ｍＭグリシンｐＨ２．６を３０秒注入して表面を再生した。全体にわたってランニングバッファーは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａクエン酸、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．３及びｐＨ５であり、一方、流速は３０μｌ／分であった。各相互作用は、３７℃で４回（ｎ＝４）測定した。
【０２２３】
参照スポットへの結合に対する反応を、ｖＷＦ−ＨＳＡ捕獲スポットの反応から引いた。次いで、ブランク注入からの反応を、すべての他の試料の反応から引いて、ダブルリファレンスしたセンサーグラムを得た。ダブルリファレンスしたセンサーグラムを、マストランスポートリミテーションについての項目を含む１：１カイネティックモデルに当てはめた。結合及び解離速度は全体的に当てはめ、Ｒｍａｘは局所的に当てはめた。得られた結果を表２１及び表２２に示す。
【表５】
2019507587.tif 000009
【表６】
2019507587.tif 000010
【表７】
2019507587.tif 000011
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
2019507587.tif 000017
【表１４】
2019507587.tif 000018
【表１５】
2019507587.tif 000019
【表１６】
2019507587.tif 000020
【表１７】
2019507587.tif 000021
【表１８】
2019507587.tif 000022
【表１９】
2019507587.tif 000023
【表２０】
2019507587.tif 000024
【表２１】
2019507587.tif 000025
【表２２】
2019507587.tif 000026
【０２２４】
（例３）
ＰＣＴ／ＡＵ２０１５／０５０３６９に開示されている研究の延長において、さらなる変異と変異の組み合わせを、Ｄ３ドメインの改変に重点を置いて検討した。これらの実験では、組換え型のＦＶＩＩＩを使用した。このＦＶＩＩＩは、Ｚｏｌｌｎｅｒら  ２０１３、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３２：２８０〜２８７に記載されている。
【０２２５】
方法
ｖＷＦ（７６３〜１２４２）−ＨＳＡをコードし、表２３に列挙した単一変異、二重変異又は三重変異を含有するプラスミド構築物を使用し、例２に記載されている方法を使用して、精製ｖＷＦ−ＨＳＡ二量体タンパク質を生成した。ｐＨ７の詳細なカイネティック分析は、対照を含む上位候補について設定した。
【０２２６】
標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学反応を使用して、マウス抗ＨＳＡ抗体をＣＭ５チップ上に固定化した。典型的には、固定化レベルは約１４，０００ＲＵであった。ｖＷＦ−ＨＳＡの各二量体突然変異体を、０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で、各フローセルの単一スポット上に２分間捕獲した。捕獲レベルは、１００〜２００ＲＵの範囲であった。抗ＨＳＡは固定化されているが、ｖＷＦ−ＨＳＡは捕獲されていない隣接するスポットを参照として使用した。捕獲は、ＦＶＩＩＩ結合分析前のすべてのサイクルで実施した。初回実験において、第ＶＩＩＩ因子は、すべてのスポット並びに５、１及び１．２５ｎＭで使用するすべてのフローセル上に無作為に且つ二重に注入した。この分析の結果を表２３に示す。
【表２３】
2019507587.tif 000027
【０２２７】
（例４）
詳細なカイネティック分析
その後の実験を実施し、ｐＨ７の詳細なカイネティック分析を、対照を含む上位２つの候補について設定した。第ＶＩＩＩ因子を１、０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６ｎＭで注入した。同様の方式で、対照を含む上位２つの候補の詳細なカイネティック分析をｐＨ５．５で設定し、相互作用に最も適した様々な濃度で第ＶＩＩＩ因子を注入した。
【０２２８】
すべての実験を通して、バッファーブランクもすべての捕獲タンパク質に注入した。第ＶＩＩＩ因子の結合及び解離を、「スクリーニング」実験中にそれぞれ３分間モニターした。ＣＳＬ６２７の結合を５分間モニターし、解離は中性ｐＨでの「詳細なカイネティック分析」実験中に２０分間及び６０分間モニターした。ｐＨ５．５では、第ＶＩＩＩ因子の結合及び解離を最も相互作用に適した様々な時間枠でモニターした。
【０２２９】
解離期間後に、２５ｍＭグリシンｐＨ２．６を４５秒注入して表面を再生した。全体にわたってランニングバッファーは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａクエン酸、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．３及びｐＨ５．５であり、一方、流速は３０μｌ／分であった。各相互作用は３７℃で少なくとも２回（ｎ＝２）測定した。
【０２３０】
参照スポットへの結合に対する反応を、ｖＷＦ−ＨＳＡ捕獲スポットの反応から引いた。次いで、ブランク注入からの反応を、すべての他の試料の反応から引いて、ダブルリファレンスしたセンサーグラムを得た。ダブルリファレンスしたセンサーグラムを、マストランスポートリミテーションについての項目を含む１：１カイネティックモデルに当てはめた。結合及び解離速度は全体的に当てはめ、Ｒｍａｘは局所的に当てはめた。得られた結果を表２４及び表２５並びに図１〜３に示す。
【表２４】
2019507587.tif 000028
【表２５】
2019507587.tif 000029
【０２３１】
（例５）
さらなるカイネティック分析
方法の概要：
次いで、同じ実験方法を使用して、さらなる変異の組み合わせを作製し、詳細なカイネティック分析を実施した。
【０２３２】
標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリング化学反応を使用して、マウス抗ＨＳＡ抗体をＣＭ５チップ上に固定化した。典型的には、固定化レベルは約１４，０００ＲＵであった。Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡの各二量体突然変異体を、０．２〜０．７μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度で、各フローセルの単一スポット上に２分間捕獲した。捕獲レベルは、５０〜２５０ＲＵの範囲であった。抗ＨＳＡは固定化されているが、Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡは捕獲されていない隣接するスポットを参照として使用した。捕獲は、ＦＶＩＩＩ（ＣＳＬ６２７）結合分析前のすべてのサイクルで実施した。
【０２３３】
ＣＳＬ６２７は、すべてのフローセルのすべてのスポット上に無作為に且つ二重に注入した。中性ｐＨで、ＣＳＬ６２７を１、０．５、０．２５、０．１２５及び０．０６ｎＭで注入した。結合を５分間モニターし、一方、解離は１ｎＭ濃度で２０分間及び１時間モニターした。バッファーブランクも注入した。ｐＨ５．５で、ＣＳＬ６２７は、様々な濃度で、及び生じている相互作用に最も適する時間枠で注入した。
【０２３４】
解離期間後に、２５ｍＭグリシンｐＨ２．６を４５秒注入して表面を再生した。全体にわたってランニングバッファーは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａクエン酸、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．３及びｐＨ５．５であり、一方、流速は３０μｌ／分であった。各相互作用は３７℃で４回（ｎ＝４）測定した。
【０２３５】
参照スポットへの結合に対する反応は、ｖＷＦ−ＨＳＡ捕獲スポットの反応から引いた。次いで、ブランク注入からの反応を、すべての他の試料の反応から引いて、ダブルリファレンスしたセンサーグラムを得た。ダブルリファレンスしたセンサーグラムを、マストランスポートリミテーションについての項目を含む１：１カイネティックモデルに当てはめた。結合及び解離速度は全体的に当てはめ、Ｒｍａｘは局所的に当てはめた。
【０２３６】
結果を表２６及び表２７並びに図４及び図５に示す。
【表２６】
2019507587.tif 000030
【表２７】
2019507587.tif 000031
【０２３７】
（例６）
ＰＫ分析及びＦＶＩＩＩ半減期への影響
方法
Ｈｕ  ｖＷＦ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰ  Ｓ７６４Ｅ；Ｓ７６６Ｙ変異体を発現する安定なＣＨＯ由来細胞系は標準的な実験方法を使用して生成した。材料は１０Ｌバイオリアクターで安定細胞系から生成し、ｖＷＦ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰ  Ｓ７６４Ｅ；Ｓ７６６Ｙ二量体は前述のようにして精製した。
【０２３８】
野生型及びｖＷＦ  Ｄ’Ｄ３−ＦＰ  Ｓ７６４Ｅ；Ｓ７６６Ｙ変異体のＦＶＩＩＩレベルに対する相対的な影響を評価するため、ＣＤラット（３匹／群）に、組換えＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇのＣＳＬ６２７）及びｖＷＦ−ＦＰタンパク質の組み合わせを表９に示す用量で投与した。静脈内投与の０、３、８、２４、４８、５６及び７２時間後に血漿試料を採取し、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ  ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  ＥＬＩＳＡを使用して、ＦＶＩＩＩレベルを決定した。次いでこのデータを使用し、表２９に示すＦＶＩＩＩ半減期及び平均滞留時間を決定した。
【表２８】
2019507587.tif 000032
【０２３９】
結論：
初期スクリーニングから、変異：Ｓ７６４Ｐ、Ｓ７６６Ｗ、Ｖ１０８３Ａ（ＰＷＡ突然変異体と呼ばれる）及びＳ７６４Ｇ、Ｓ７６６Ｙ、Ｖ１０８３Ａ（ＧＹＡ突然変異体と呼ばれる）を有するＤ’Ｄ３−ＨＳＡは、第ＶＩＩＩ因子に対して最も高い親和性と最も遅い解離速度を有するように思われた。
【０２４０】
中性ｐＨで、ＣＳＬ６２７（第ＶＩＩＩ因子）に対して最も改善された親和性と解離速度を有するｖＷＦ  Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ突然変異体二量体は、５ｐＭのＫＤと１０−５ｌ／ｓの解離速度を有するＳ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＧＹＡ）、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＥＹＡ）、及びＳ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＹＡ）である。これは、野生型二量体と比較して、親和性が約２０倍改善され、解離速度が約４０倍改善されている。
【０２４１】
酸性ｐＨで、ＣＳＬ６２７に対して最も改善された親和性と解離速度を有するｖＷＦ  Ｄ’Ｄ３−ＨＳＡ突然変異体二量体は、５００ｐＭのＫＤと１０−３ｌ／ｓの解離速度を有するＥＹＡであった。これに基づくと、ＥＹＡの親和性及び解離速度の改善は、野生型二量体と比較して、それぞれ約１００倍及び少なくとも１０倍である。
【０２４２】
ＥＹＡ二量体は、中性ｐＨ及び酸性ｐＨの両方で、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉと同様のカイネティック速度とＣＳＬ６２７に対する親和性を有するように思われた。
【配列表フリーテキスト】
【０２４３】
配列番号５〜１３：＜２２３＞ＶＷＦＰＲＴの改変Ｄ’−Ｄ３ドメイン
配列番号１５：＜２２３＞成熟単鎖第ＶＩＩＩ因子
配列番号１７〜３０：＜２２３＞ＶＷＦＰＲＴの改変Ｄ’−Ｄ３ドメイン
【図１】
2019507587.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2019507587000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月7日(2018.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示される配列若しくはその断片又はそれらに９０％同一である配列を含む、切断型フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含むポリペプチドであって、該切断型ＶＷＦが、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含み；該切断型ＶＷＦが第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記切断型ＶＷＦが配列番号３に示される配列を含み、前記切断型ＶＷＦが、Ｓ１、Ｓ３、Ｌ１８、Ｖ４２、Ｓ４３、Ｋ１４９、Ｎ２４８、Ｓ２７９、Ｖ３２０、Ｔ３２５、Ｑ３９５及びＫ４１８からなる群から選択される少なくとも１つの位置に、配列番号３との比較において少なくとも１つの改変を含み；前記切断型ＶＷＦが第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記切断型ＶＷＦが、非改変の配列番号３を含む参照ポリペプチドより低い解離速度(off rate)で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも５倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも１０倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも５倍低いＫＤで第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記切断型ＶＷＦが前記参照ポリペプチドより少なくとも１０倍低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記切断型ＶＷＦが少なくとも２つの改変を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記切断型ＶＷＦが少なくとも３つの改変を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記切断型ＶＷＦが、
配列番号５の配列（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ／Ｖ１０８３Ａ）、
配列番号６の配列（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）、
配列番号７の配列（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）、
配列番号８の配列（Ｎ１０１１Ｓ／Ｖ１０８３Ａ／Ｋ１１８１Ｅ）、
配列番号１７の配列（Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ）、
配列番号９の配列（Ｖ１０８３Ａ）、
配列番号１０の配列（Ｓ１０４２Ｔ）、
配列番号１１の配列（Ｖ８０５Ａ／Ｑ１１５８Ｌ）、
配列番号１２の配列（Ｋ９１２Ｅ／Ｔ１０８８Ｓ）、又は
配列番号１３の配列（Ｌ７８１Ｐ）を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７をさらに含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２７０をさらに含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７を欠失する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から２８１３を欠失する、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号３が、位置１の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群から選択されるように改変される、請求項１３又は１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号３が、位置３の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群から選択されるように改変される、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記切断型ＶＷＦが、
配列番号５の配列（Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ）、
配列番号６の配列（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ）、
配列番号７の配列（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ）、
配列番号８の配列（Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ）、
配列番号９の配列（Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ）、
配列番号１０の配列（Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ）、
配列番号１１の配列（Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ）、
配列番号１２の配列（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ）、
配列番号１３の配列（Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ）、
配列番号１４の配列（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ）、
配列番号１５の配列（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ）、
配列番号１６の配列（Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ）又は
配列番号１７の配列（Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ）を含む、請求項１３から１５までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記切断型ＶＷＦが配列番号３に示される配列又はその断片を含む、第ＶＩＩＩ因子に結合するポリペプチドであって、該配列が少なくとも位置３２０、並びに位置１及び／又は３に改変を含み、その結果、前記切断型ＶＷＦが非改変の配列番号３を含む参照ポリペプチドより低い解離速度で第ＶＩＩＩ因子に結合する、ポリペプチド。
【請求項１９】
前記切断型ＶＷＦが少なくとも配列番号３の少なくとも位置１、３及び３２０に改変を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号３が、位置３２０の残基がＡであるように改変される、請求項１８又は１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３が、位置３の残基がＹ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｒ及びＷからなる群から選択されるように改変される、請求項１８から２０までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号３が、位置１の残基がＧ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、Ａ及びＬからなる群から選択されるように改変される、請求項１８から２１までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２４７をさらに含む、請求項１８から２２までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から１２７０をさらに含む、請求項１８から２３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記切断型ＶＷＦが配列番号２の残基１２４３から２８１３を欠失する、請求項１８から２４までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
半減期延長部分をさらに含む、請求項１から２５までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記半減期延長部分が前記切断型ＶＷＦに融合された異種アミノ酸配列である、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域及びその部分、トランスフェリン及びその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして知られる大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを含むか又はそれからなる、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記半減期延長部分が前記ポリペプチドにコンジュゲートされている、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸及びアルブミン結合リガンド、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記異種アミノ酸配列がアルブミンを含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記アルブミンのＮ末端が、直接的に又はスペーサーを介して前記切断型ＶＷＦ配列のＣ末端に融合されている、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドの天然Ｃ末端の１〜５個のアミノ酸が欠失された、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質であり、該Ｎ−グリカンの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が平均して少なくとも１つのシアル酸部分を含む、請求項１から３３までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Ｎ−グリカンの少なくとも６０％が平均して少なくとも１つのα−２，６−シアル酸部分を含む、請求項３４のポリペプチド。
【請求項３６】
二量体である、請求項１から３５までのいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
第ＶＩＩＩ因子分子と請求項１から３６までのいずれか一項のポリペプチドとを含む複合体。
【請求項３８】
請求項１から３６までのいずれか一項のポリペプチド又は請求項３７の複合体を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
ＦＶＩＩＩの血漿半減期を改善するため、及び／又はＦＶＩＩＩの投与頻度を低減するための、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
血液凝固障害を処置又は予防するための、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、請求項４０の医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１から３６までのいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物であって、該医薬組成物を、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）と組合せて血液凝固障害を処置するための医薬組成物。
【請求項４３】
、
前記ポリペプチドの前記ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記ポリペプチドの内在性ＶＷＦに対するモル比が０．５より大きい、請求項４２又は４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
投与対象がヒトである、請求項４２〜４４の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
静脈内投与される、請求項４２から４５までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが静脈内投与又は皮下投与され、前記ＦＶＩＩＩが静脈内投与される、請求項４２から４６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）が、参照処置と比べて、請求項１から３６までのいずれか一項に記載のポリペプチドの共投与により増大され、前記ポリペプチド及び前記ＦＶＩＩＩが該参照処置において等モル量で投与されることを除き、該参照処置が前記処置と同一である、請求項４２から４７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記ポリペプチドの共投与により、ＦＶＩＩＩの平均滞留時間（ＭＲＴ）が該ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて増大され、及び／又は前記ＦＶＩＩＩの投与頻度が前記ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて低減される、請求項４２から４７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記ＦＶＩＩＩの投与頻度が、前記ＦＶＩＩＩ単独による処置と比べて低減される、請求項４２から４９までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記ポリペプチドの血漿半減期が内在性ＶＷＦの血漿半減期よりも長い、請求項４２から５０までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記ポリペプチドの血漿半減期が内在性ＶＷＦの血漿半減期よりも少なくとも２５％長い、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び（ｉｉ）請求項１から３６までのいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物であって、該組成物中の該ポリペプチドの該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、医薬組成物。
【請求項５４】
血液凝固障害の前記処置のための医薬の調製における、請求項１から３６までのいずれか一項のポリペプチド又は請求項３７の複合体の使用。
【請求項５５】
前記血液凝固障害がフォンウィルブランド病（ＶＷＤ）又は血友病Ａである、請求項５４の使用。
【請求項５６】
血液凝固障害の処置における同時使用、個別使用又は連続使用のための、（ｉ）ＦＶＩＩＩ及び（ｉｉ）請求項１から３６までのいずれか一項において定義されているポリペプチドを含む医薬キットであって、該処置が、内在性ＶＷＦを有する対象に該ポリペプチド及び該ＦＶＩＩＩを投与するステップを含み、投与される該ポリペプチドの該内在性ＶＷＦに対するモル比は０．５より大きく、及び／又は投与しようとする該ポリペプチドの投与しようとする該ＦＶＩＩＩに対するモル比が５０より大きい、医薬キット。
【請求項５７】
請求項１から３６までのいずれか一項のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項５７のポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクター。
【請求項５９】
前記プラスミド又はベクターが発現ベクターである、請求項５８のプラスミド又はベクター。
【請求項６０】
請求項５７のポリヌクレオチド又は請求項５８若しくは５９のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項６１】
切断型ＶＷＦを含むポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）切断型ＶＷＦを含む該ポリペプチドが発現するような条件下で、請求項６０の宿主細胞を培養するステップ；及び
（ｉｉ）任意選択で、該切断型ＶＷＦを含む該ポリペプチドを該宿主細胞から又は培養培地から回収するステップ
を含む、方法。
【請求項６２】
第ＶＩＩＩ因子の半減期を増大させる方法であって、該第ＶＩＩＩ因子を請求項１から３６までのいずれか一項に記載のポリペプチドと混合するステップを含む、方法。
【請求項６３】
増大したシアリル化を含むＮ−グリカンを含む請求項１から３６までのいずれか一項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、（ｉ）請求項１から３６までのいずれか一項に記載の該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供するステップ、及び（ｉｉ）３６．０℃未満の温度で該細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項６４】
請求項１から３６までのいずれか一項に記載のポリペプチドの二量体を生成するか、又は該ポリペプチドの二量体化を増大するための方法であって、（ｉ）請求項１から５７までのいずれか一項に記載の該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を含む細胞を提供するステップ、及び（ｉｉ）３６．０℃未満の温度で該細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項６５】
前記細胞が、シアリルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸をさらに含む、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記シアリルトランスフェラーゼは、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ又はα−２，３−シアリルトランスフェラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
（ｉｉ）のステップの前に、前記細胞を３７．０℃±１．０℃の温度で培養し、（ｉｉ）のステップが、前記細胞を３４．０℃±２．０℃の温度で培養するステップを含む、請求項６３から６６までのいずれか一項の方法。
【請求項６８】
（ｉ）請求項６３から６７までのいずれか一項において得られた前記ポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにかけるステップであって、それにより高シアリル化のポリペプチドを低シアリル化のポリペプチドから分離する該ステップ；及びイオン交換カラムから溶出された高シアリル化を有するフラクションを回収するステップ；又は（ｉｉ）請求項６３から６７までのいずれか一項において得られた前記ポリペプチドを、シアリルトランスフェラーゼ及びシアル酸ドナーとインビトロで接触させるステップをさらに含む、請求項６３から６７までのいずれか一項の方法。
【請求項６９】
平均して、得られた前記ポリペプチドの少なくとも７５％の前記Ｎ−グリカンが少なくとも１つのシアル酸部分を含む、請求６３から６８までのいずれか一項の方法。
【請求項７０】
平均して、得られた前記ポリペプチドの少なくとも５０％が二量体として存在する、請求項６３から６９までのいずれか一項の方法。
【請求項７１】
請求項６３から７０までのいずれか一項の方法により得ることができるポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
切断型ＶＷＦ
本明細書で使用する場合、用語「フォンウィルブランド因子」又は「ＶＷＦ」は、野生型ＶＷＦの生物学的活性、特に、第ＶＩＩＩ因子に結合する能力を有する任意のポリペプチドを意味する。野生型ＶＷＦをコードする遺伝子は９ｋｂのｍＲＮＡに転写され、これは、３１０，０００Ｄａの推定分子量を有する２８１３アミノ酸のプレプロポリペプチドに翻訳される。このプレプロポリペプチドは、２２アミノ酸のシグナルペプチド、７４１アミノ酸のプロポリペプチド及び成熟サブユニットを含有する。７４１アミノ酸のプロポリペプチドのＮ末端からの切断は、２０５０アミノ酸からなる成熟ＶＷＦをもたらす。ＶＷＦプレプロポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。別段指示がない限り、ＶＷＦ分子が配列番号２のすべての残基を含む必要がない場合であっても、本出願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸の番号づけは配列番号２を参照する。成熟ＶＷＦのアミノ酸配列を配列番号４に示す。本明細書で使用する場合、用語「ＶＷＦ」は、別段指示がない限り、ＶＷＦの成熟形態を意味する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
好ましくは、野生型ＶＷＦは、配列番号４で示す成熟ＶＷＦのアミノ酸配列を含む。ＶＷＦの生物学的活性、特に、ＦＶＩＩＩに結合する能力が保持される限り、ＶＷＦへの付加、挿入、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部の欠失も包含される。欠失を有するＶＷＦが少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％の野生型ＶＷＦの生物学的活性を保持する場合、本発明の意味において、生物学的活性は保持される。野生型ＶＷＦの生物学的活性は、リストセチン補因子活性（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ  ＡＢら、２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８９：７７〜８５）、血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰ  ＩｂαへのＶＷＦの結合（Ｓｕｃｋｅｒら、２００６．Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１２：３０５〜３１０）又はコラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ＆Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ８０：４６６〜４７１）に関する方法を使用して、当業者が決定することができる。ＶＷＦの生物学的活性がＦＶＩＩＩに結合する能力である場合、これはいくつかの方法で測定することができるが、好ましくは、本明細書の例１に記載されているように測定される。
【国際調査報告】
2019507587.tif 000038
2019507587.tif 000039
2019507587.tif 000040