(57)【要約】  遠心分離検出方法および装置である。この方法は、遠心装置（３）により、被検出物を含む対象サンプルと、検出相と、を含む液相が固相フィルム（２）を流れるように駆動するステップと、液相が固相フィルム（２）を流れる際に、固相フィルム（２）にコーティングされた被検出物の特異性結合物と結合して、検出インジケーター−被検出物−被検出物の特異性結合物の複合物を形成し、複合物が捕捉されて固相フィルム（２）に固定され、検出器（４）が、固相フィルムに間接的に固定された検出インジケーターの量を検出することで、被検出物の含有量を検出するステップと、を含む。この装置は、サンプル投入部材（１）と、固相フィルム（２）と、遠心装置（３）と、検出器（４）とを備え、サンプル投入部材（１）は、遠心ロータ（９）の中部に設けられ、遠心ロータ（９）に接続されている。固相フィルム（２）は、遠心ロータ（９）に設けられ、サンプル投入管（８）に接続されている。検出器（４）は、固相フィルム（２）の片側又は両側に設けられている。感度が高く、検出時間が短い特徴を持つ。
2019507887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心装置により、被検出物を含む対象サンプルと、前記被検出物と直接又は間接的に特異性結合可能な検出インジケーターを含む物質である検出相と、を含む液相が固相フィルムを流れるように駆動するステップと、前記液相が固相フィルムを流れる際に、前記固相フィルムにコーティングされた被検出物の特異性結合物と結合して、検出インジケーター−被検出物−被検出物の特異性結合物の複合物を形成し、前記複合物が捕捉されて前記固相フィルムに固定され、検出器が、前記固相フィルムに間接的に固定された検出インジケーターの量を検出することで、前記被検出物の含有量を検出するステップと、を含む遠心分離検出方法。
【請求項２】
前記方法に用いる装置において、前記遠心装置の回転部材は、平面型のものであるか、或いは、中心から外向きに傾斜するものである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法に用いる装置において、前記遠心装置の回転部材の平面の中部には、前記対象サンプル及び前記検出相のそれぞれの貯蔵装置と、前記対象サンプル及び前記検出相のサンプル投入装置及び駆動装置が設けられ、
前記遠心装置の回転部材の平面の外縁に前記固相フィルムの載置装置が設けられている、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法に用いる装置において、前記検出器は、前記固相フィルムの片側又は両側に設けられている、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遠心装置の回転数及び前記サンプル投入装置のサンプル投入速度は、いずれもプログラム制御方式であり、
前記遠心装置の回転数は、２００〜１００００ｒ／ｍｉｎであり、
前記遠心装置による遠心時間は、１〜５ｍｉｎである、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固相フィルムは、ニトロセルロースフィルム、ポリフッ化ビニリデンフィルム、ナイロンフィルムおよびＤＥＡＥセルロースであり、かつ前記固相フィルムの片面又は両面にバッキングが付いており、
前記検出器は、吸光度、蛍光、化学発光及び画像色デジタル処理のための検出器のうちのいずれかを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被検出物は、免疫活性を有するタンパク質又はタンパク質とカップリングした免疫活性化物質であり、
前記被検出物の特異的結合物は、前記被検出物と特異的に結合される抗原又は抗体であり、
前記検出インジケーターは、金属コロイド、染料、フルオレセイン及び化学発光物質のうちの少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記金属コロイドは、金コロイド、セレンコロイドおよび金コロイド磁性微粒子のうちの少なくとも１種であり、
前記フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネート、テトラエチルローダミン、ローダミンテトラメチルイソチオシアネート、フィコエリトリン、ポリダチンクロロフィルタンパク質、ヨウ化プロピジウム、アロフィコシアニン及びユウロピウム化合物のうちの少なくとも１種であり、
前記化学発光物質は、ルミノールとイソルミノールおよびその誘導体類、アクリジニウムエステルおよびアントラキノン類、（金アルカン）−１，２−ジオキシエタンおよびその誘導体ならびにターピリジンのうちの少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法において、前記複合物には、
１）前記被検出物の特異的結合物に、前記被検出物及び前記検出相の両方と特異的に結合される１次中間相が含まれるもの、
２）前記被検出物の特異的結合物に、前記１次中間相及び前記検出相の両方と特異的に結合される２次中間相が含まれるもの、のうちのいずれかが形成され、
前記１次中間相及び前記２次中間相は、いずれも特異的結合能力を有する抗原、抗体、アビジン、ビオチンおよびその類似体のうちの少なくとも１種であり、
前記結合反応の後に、界面活性剤を含有するリン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液及びTris緩衝液のうちの少なくとも１種である洗浄相で前記固相フィルムを洗浄するステップ、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
免疫製品の含有量の検出における請求項１に記載の方法の応用。
【請求項１１】
サンプル投入部材と、固相フィルムと、遠心装置と、検出器と、を備え、
前記遠心装置は、駆動モータにより駆動される遠心ロータと支持台座とを含み、前記遠心ロータは前記支持台座に支持され、
前記サンプル投入部材は、前記遠心ロータの中部に設けられ、遠心ロータに接続され、前記サンプル投入部材は、液相貯蔵装置とサンプル投入管とを含み、前記液相貯蔵装置は、前記サンプル投入管に連通し、
前記固相フィルムは、前記遠心ロータに設けられ、前記サンプル投入管に接続され、
前記検出器は、前記固相フィルムの片側又は両側に設けられている、ことを特徴とする遠心分離検出装置。
【請求項１２】
前記固相フィルムは、固相フィルム載置装置内に配置され、かつ前記固相フィルム載置装置は前記遠心ロータに設けられ、
前記固相フィルムと前記遠心ロータとは着脱式の構造である、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１３】
前記固相フィルム載置装置は、回転移動式固定装置及び／又は溝形状エクストルージョン型固定装置を含む、ことを特徴とする請求項１２に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１４】
前記固相フィルムは、固相フィルム固定器により固定され、前記固相フィルム固定器は、固相フィルム支持バックシート部材、ラテラルフロー用テストストリップ係止部材および透明な上下埋め込み型部材から選ばれる少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１５】
前記透明な上下埋め込み型部材は、前記固相フィルムの上下両側が硬質透明材料で覆われ、前記固相フィルムの対応する側の前記硬質透明材料の面積が前記固相フィルムの面積以上である、ことを特徴とする請求項１４に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１６】
前記固相フィルムの前記サンプル投入管に接続される一端には、それに連通する液体吸着分散部材がさらに設けられ、前記固相フィルムは、前記遠心ロータの遠位端にて、それに連通する液体収集部材が設けられ、前記液体吸着分散部材は前記サンプル投入管に連通する、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１７】
前記サンプル投入部材は、サンプル投入ポンプを含み、前記サンプル投入ポンプは、前記液相貯蔵装置における液体が前記サンプル投入管に入るように駆動する、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１８】
前記液相貯蔵装置は、対象サンプル貯蔵装置と検出相貯蔵装置とを含み、
前記対象サンプル貯蔵装置及び前記検出相貯蔵装置は、それぞれ前記サンプル投入管に連通し、かつそれぞれ前記サンプル投入ポンプにより駆動される、ことを特徴とする請求項１７に記載の遠心分離検出装置。
【請求項１９】
前記液相貯蔵装置は、洗浄液貯蔵装置をさらに含み、前記洗浄液貯蔵装置は、前記サンプル投入管に連通し、かつ前記サンプル投入ポンプにより駆動される、ことを特徴とする請求項１８に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２０】
前記遠心ロータは、平面型のものであるか、或いは、中心から外向きに傾斜するものであり、
前記遠心装置にハウジングが設けられている、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２１】
前記回転移動式固定装置は、前記遠心ロータに設けられた柱状突起の接続装置であり、前記固相フィルム固定器には、前記柱状突起の接続装置に嵌め合う孔状部材が設けられている、ことを特徴とする請求項２０に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２２】
前記遠心装置、前記サンプル投入部材及び前記検出器のそれぞれにプログラム制御装置が設けられている、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２３】
前記サンプル投入管と前記固相フィルムとは、着脱可能に接続され、
前記液体吸着分散部材と前記サンプル投入管とは、着脱可能に連通する、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２４】
前記固相フィルムの材料は、ニトロセルロースフィルム、ポリフッ化ビニリデンフィルム、ナイロンフィルムおよびＤＥＡＥセルロースのうちのいずれかであり、かつ前記固相フィルムの片面又は両面にバッキングが設けられており、
前記液体吸着分散部材は、金コロイド標識吸着フィルム、蛍光標識抗体吸着フィルム、化学発光標識吸着フィルム、ポリエステル繊維分散フィルム及びガラス繊維分散フィルムのうちの少なくとも１種を含み、
前記検出器は、吸光度、蛍光、化学発光及び画像デジタル処理のための検出器のうちのいずれかを含む、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２５】
前記遠心ロータの平面の中間部分に孔及び／又は透明部材が設けられ、かつ前記孔及び／又は前記透明部材は、それぞれ前記固相フィルムを前記検出器に直接露出させる、ことを特徴とする請求項１１に記載の遠心分離検出装置。
【請求項２６】
免疫製品の検出における請求項１１に記載の遠心分離検出装置の応用。
【請求項２７】
前記免疫製品は、抗原、抗体、免疫細胞及び化学成分のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項２６に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遠心分離検出方法および装置に関し、具体的には、それぞれイムノアッセイ技術および機器分析分野に属する遠心分離検出方法および遠心分離検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的検出技術は、免疫学原理に基づいて設計された、抗原、抗体、免疫細胞及び化学成分等を測定する実験手段であり、人と動物の体に由来する病気診断および健康検出が可能なサンプル、および、環境、薬物分析、食品および工業分析用のサンプルに広く適用されている。免疫比濁技術、固相酵素イムノアッセイ技術、化学発光検出技術、免疫蛍光標識技術、フローサイトメトリー法、金コロイド技術等が一般的なものである。
【０００３】
免疫比濁技術は、免疫比濁法とも呼ばれ、可溶性抗原、抗体が液相と特異的に結合し、一定の大きさの複合物を発生させ、光を屈折させるか吸收し、このように屈折又は吸收した後の透過光または散乱光を算出単位とし、定量検出に用いられるが、検出感度が低く、微量検出に適合しない。固相酵素イムノアッセイ技術は、抗原又は抗体の固相化及び抗原又は抗体の酵素標識に基づいて、固相担体の表面に結合される抗原又は抗体はその免疫学活性を保持し、抗原又は抗体の酵素結合物は、その免疫学活性を保有するとともに、酵素の活性を保有し、測定時に、対象サンプル（その中の抗体又は抗原を測定する）および酵素標識抗原又は抗体は、異なるステップによって固相担体の表面の抗原又は抗体と反応し、感度が高く、線形応答範囲が広く、自動化を実現しやすい等のメリットが目立つが、検出反応時間が長いため、その使用が制限されている。免疫化学発光検出技術は、高感度の微量及び極微量分析技術であり、操作が簡便で、感度が高く、線形応答範囲が広く、自動化を実現しやすい等のメリットが目立ち、環境、臨床、薬物分析、食品および工業分析に広く適用され、抗原又は抗体に基づく固相分離手段及び抗原又は抗体の発光試薬標識技術でもあるが、しかし、検出反応時間が長く、検出装置への要求が高いため、その使用が制限されている。免疫蛍光標識技術、フローサイトメトリー法、金コロイド技術も一般的な検出技術であり、広く使用されているが、それなりの欠点があり、検出反応時間が長く、又は感度、正確性に欠けることは、一般的な欠点である。
【０００４】
高感度、すばやさ、小型化、全定量、自動化は、現在のイムノアッセイ技術製品の発展傾向であるが、從來のものは、上記機能を同時に実現できるものがない。このため、高感度、全定量、自動化の特徴を有するとともに、検出をすばやく行い、装置が簡単である新規な検出装置の開発が期待され、使用が簡便で、浪費を低減するとともに、作業効率を大幅に向上させることができ、検出および分析、分離など、様々な分野に重要な実用価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、遠心分離検出方法を提供し、本発明のもう１つの目的は、遠心分離検出装置を提供し、本発明の検出方法は、感度が高く、検出時間が短い特徴を有し、本発明の遠心分離検出装置は、検出速度が高く、感度が高く、使用が簡便である特徴を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に提供される遠心分離検出方法は、遠心装置により、被検出物を含む対象サンプルと、前記被検出物と直接又は間接的に特異性結合可能な検出インジケーターを含む物質である検出相と、を含む液相が固相フィルムを流れるように駆動するステップと、前記液相が固相フィルムを流れる際に、前記固相フィルムにコーティングされた被検出物の特異性結合物と結合して、検出インジケーター−被検出物−被検出物の特異性結合物の複合物を形成し、前記複合物が捕捉されて前記固相フィルムに固定され、検出器が、前記固相フィルムに間接的に固定された検出インジケーターの量を検出することで、前記被検出物の含有量を検出するステップと、を含む。
【０００７】
上述した方法において、前記方法に用いる装置において、前記遠心装置の回転部材は、平面型のものであるか、或いは、中心から外向きに傾斜するものである。
【０００８】
上述した方法において、前記方法に用いる装置において、前記遠心装置の回転部材の平面の中部には、前記対象サンプル及び前記検出相のそれぞれの貯蔵装置と、前記対象サンプル及び前記検出相のサンプル投入装置及び駆動装置が設けられ、
前記遠心装置の回転部材の平面の外縁に前記固相フィルムの載置装置が設けられている。
【０００９】
本発明において、前記固相フィルムのサンプル投入基端側が液体吸着分散装置に接続され、サンプル投入先端側が液体吸着装置に接続され、
前記液体吸着分散装置は、液体をすばやく分散させる特性を有する固相材料を用い、前記固相材料は、ポリエステルセルロースフィルム及び／又はガラスセルロースフィルムであり、具体的には、金コロイド標識吸着フィルム、蛍光標識抗体吸着フィルム、化学発光標識吸着フィルム及び／又は分散フィルムであることができ、前記液体吸着装置は、吸水性材料を用い、前記吸水性材料は、吸水紙及び／又は吸水ゲルである。
【００１０】
上述した方法において、前記方法に用いる装置において、前記検出器は、前記固相フィルムの片側又は両側に設けられている。
【００１１】
上述した方法において、前記遠心装置の回転数及び前記サンプル投入装置のサンプル投入速度は、いずれもプログラム制御方式であり、
前記遠心装置の回転数は、２００〜１００００ｒ／ｍｉｎであり、具体的には、５００〜５０００ｒ／ｍｉｎ、８００〜３０００ｒ／ｍｉｎ又は８００〜２０００ｒ／ｍｉｎであることができ、
前記遠心装置による遠心時間は、１〜５ｍｉｎであることができ、具体的には、１ｍｉｎ又は３ｍｉｎであることができる。
【００１２】
上述した方法において、前記固相フィルムは、ニトロセルロースフィルム、ポリフッ化ビニリデンフィルム、ナイロンフィルムおよびＤＥＡＥセルロースであり、かつ前記固相フィルムの片面又は両面にバッキングが付いており、
前記検出器は、吸光度、蛍光、化学発光及び画像色デジタル処理のための検出器のうちのいずれかを含む。
【００１３】
本発明において、前記ポリフッ化ビニリデンフィルムは、単にＰＶＤＦフィルムと呼ばれ、
前記ＤＥＡＥセルロースフィルムとは、ジエチルアミノエチル(ＤＥＡＥ)をセルロース分子に導入した後製造したシート状薄膜であり、弱塩基性アニオン交換材料である。
上述した方法において、前記被検出物は、免疫活性を有するタンパク質又はタンパク質とカップリングした免疫活性化物質であり、
前記被検出物の特異的結合物は、前記被検出物と特異的に結合される抗原又は抗体であり、
前記検出インジケーターは、金属コロイド、染料、フルオレセイン及び化学発光物質のうちの少なくとも１種である。
【００１４】
上述した方法において、前記金属コロイドは、金コロイド、セレンコロイドおよび金コロイド磁性微粒子のうちの少なくとも１種であり、
前記フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネート（単にＦＩＴＣという）、テトラエチルローダミン、ローダミンテトラメチルイソチオシアネート、フィコエリトリン（単にＰＥという）、ポリダチンクロロフィルタンパク質（単にＰｅｒＣＰという）、ヨウ化プロピジウム（単にＰＩという）、アロフィコシアニン（単にＡＰＣという）及びユウロピウム化合物のうちの少なくとも１種であり、ユウロピウム化合物は、具体的には、酸化ユウロピウムであることができ、
前記化学発光物質は、ルミノールとイソルミノールおよびその誘導体類、アクリジニウムエステルおよびアントラキノン類、（金アルカン）−１，２−ジオキシエタンおよびその誘導体ならびにターピリジンのうちの少なくとも１種である。
【００１５】
上述した方法において、前記複合物には、
１）前記被検出物の特異的結合物に、前記被検出物及び前記検出相の両方と特異的に結合される１次中間相が含まれるもの、
２）前記被検出物の特異的結合物に、前記１次中間相及び前記検出相の両方と特異的に結合される２次中間相が含まれるもの、のうちのいずれかが形成され、
前記１次中間相及び前記２次中間相は、いずれも特異的結合能力を有する抗原、抗体、アビジン、ビオチンおよびその類似体のうちの少なくとも１種であり、
前記結合反応の後に、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液及びTris緩衝液のうちの少なくとも１種である洗浄相で前記固相フィルムを洗浄するステップ、をさらに含む。
【００１６】
本発明の遠心分離検出方法は、免疫製品の含有量の検出に応用される。
【００１７】
本発明に提供される遠心分離検出装置は、サンプル投入部材と、固相フィルムと、遠心装置と、検出器と、を備え、
前記遠心装置は、駆動モータにより駆動される遠心ロータと支持台座とを含み、前記遠心ロータは前記支持台座に支持され、
前記サンプル投入部材は、前記遠心ロータの中部に設けられ、遠心ロータに接続され、前記サンプル投入部材は、液相貯蔵装置とサンプル投入管とを含み、前記液相貯蔵装置は、前記サンプル投入管に連通し、
前記固相フィルムは、前記遠心ロータに設けられ、前記サンプル投入管に接続され、
前記検出器は、前記固相フィルムの片側又は両側に設けられている。
【００１８】
上述した遠心分離検出装置において、前記固相フィルムは、固相フィルム載置装置内に配置され、かつ前記固相フィルム載置装置は前記遠心ロータに設けられ、
前記固相フィルムと前記遠心ロータとは着脱式の構造である。
【００１９】
上述した遠心分離検出装置において、前記固相フィルム載置装置は、回転移動式固定装置及び／又は溝形状エクストルージョン型固定装置である。
上述した遠心分離検出装置において、前記固相フィルムは、固相フィルム固定器により固定され、前記固相フィルム固定器は、固相フィルム支持バックシート部材、ラテラルフロー用テストストリップ係止部材および透明な上下埋め込み型部材から選ばれる少なくとも１種である。
【００２０】
上述した遠心分離検出装置において、前記透明な上下埋め込み型部材は、前記固相フィルムの上下両側が硬質透明材料で覆われ、前記固相フィルムの対応する側の前記硬質透明材料の面積が前記固相フィルムの面積以上である。
【００２１】
上述した遠心分離検出装置において、前記固相フィルムの前記サンプル投入管に接続される一端には、それに連通する液体吸着分散部材がさらに設けられ、前記固相フィルムは、前記遠心ロータの遠位端にて、それに連通する液体収集部材が設けられ、前記液体吸着分散部材は前記サンプル投入管に連通する。
【００２２】
上述した遠心分離検出装置において、前記サンプル投入部材は、サンプル投入ポンプを含み、前記サンプル投入ポンプは、前記液相貯蔵装置における液体が前記サンプル投入管に入るように駆動する。
【００２３】
上述した遠心分離検出装置において、前記液相貯蔵装置は、対象サンプル貯蔵装置と検出相貯蔵装置とを含み、
前記対象サンプル貯蔵装置及び前記検出相貯蔵装置は、それぞれ前記サンプル投入管に連通し、かつそれぞれ前記サンプル投入ポンプにより駆動される。
【００２４】
上述した遠心分離検出装置において、前記液相貯蔵装置は、洗浄液貯蔵装置をさらに含み、前記洗浄液貯蔵装置は、前記サンプル投入管に連通し、かつ前記サンプル投入ポンプにより駆動される。
【００２５】
上述した遠心分離検出装置において、前記遠心ロータは、平面型のものであるか、或いは、中心から外向きに傾斜するものであり、
前記遠心装置にハウジングが設けられている。
【００２６】
上述した遠心分離検出装置において、前記回転移動式固定装置は、前記遠心ロータに設けられた柱状突起の接続装置であり、前記固相フィルム固定器には、前記柱状突起の接続装置に嵌め合う孔状部材が設けられている。
【００２７】
上述した遠心分離検出装置において、前記遠心装置、前記サンプル投入部材及び前記検出器のそれぞれにプログラム制御装置が設けられている。
【００２８】
上述した遠心分離検出装置において、前記サンプル投入管と前記固相フィルムとは、着脱可能に接続され、
前記液体吸着分散部材と前記サンプル投入管とは、着脱可能に連通する。
上述した遠心分離検出装置において、前記固相フィルムの材料は、ニトロセルロースフィルム、ポリフッ化ビニリデンフィルム、ナイロンフィルムおよびＤＥＡＥセルロースのうちのいずれかであり、かつ前記固相フィルムの片面又は両面にバッキングが設けられており、
前記液体吸着分散部材は、金コロイド標識吸着フィルム、蛍光標識抗体吸着フィルム、化学発光標識吸着フィルム、ポリエステル繊維分散フィルム及びガラス繊維分散フィルムのうちの少なくとも１種を含み、
前記検出器は、吸光度、蛍光、化学発光及び画像デジタル処理のための検出器のうちのいずれかを含む。
【００２９】
本発明において、前記液体収集装置は、吸水性材料から製造されることができ、具体的には吸水紙及び／又は吸水ゲルであり、前記液体収集装置は液体収集容器であることができる。
【００３０】
上述した遠心分離検出装置において、前記遠心ロータの平面の中間部分に孔及び／又は透明部材が設けられ、かつ前記孔及び／又は前記透明部材は、それぞれ前記固相フィルムを前記検出器に直接露出させる。
【００３１】
本発明に記載の遠心分離検出装置は、免疫製品の検出に応用される。
【００３２】
上述した遠心分離検出装置の応用において、前記免疫製品は、抗原、抗体、免疫細胞及び化学成分のうちの少なくとも１種を含む。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、以上の構成を有するため、以下の利点を有する。
【００３４】
１、本発明では、遠心装置により、検出される液相を固相フィルムを流れるように駆動し、洗浄することにより、被検出物の捕捉結合能力を向上させ、固相フィルムの背景ノイズ干渉を低減し、方法検出感度を向上させ、従来の検出試薬の高感度での検出を実現する。
【００３５】
２、本発明では、遠心装置により、検出される液相を固相フィルムを流れるように駆動することにより、從來のフィルム検出技術では、自然に流れることを必須とし、かつ液体がフィルムにおける流動距離の延長に伴いその速度が低下する現状を改善し、液体がフィルムにて均一な速度で流れることを実現することができ、被検出物がフィルムにて均一に結合することを保証し、検出正確性を向上させることができる。
【００３６】
３、本発明では、遠心装置により、検出される液相を固相フィルムを流れるように駆動することにより、液体がフィルムにて均一な速度で流れることを実現し、検出時間を短縮し、検出をすばやく行う利点を有する。從來のフィルム検出技術では、自然に流れることを必須とし、フィルムにおける液体の流動速度が時間に伴い低下する問題を解消し、１項目ごとの検出に通常１５分間以上かかるという欠点を解消する。
【００３７】
４、本発明では、遠心装置により、液体が流れるように、そしてサンプル投入ポンプでサンプル投入するように駆動し、操作ステップが簡単であり、より簡便な小型化検出装置の開発に寄与する。從來の高感度検出技術では、駆動制御を多ステップ、多環節にわたって行い、検出サンプル、検出相および反応担体の位置変更および移動が一因となる欠点を解消する。
【００３８】
５、本発明は、操作ステップが簡単であり、自動化操作を実現しやすい。本発明の方法は、高感度、全定量、自動化の特徴を有するとともに、検出をすばやく行い、使用装置が簡単である検出技術を有する。使用が簡便であり、原料の浪費を低減するとともに、作業効率を大幅に向上させ、検出および分析、分離など、様々な分野に適用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の実施例１における遠心分離検出装置の模式図である。
【図２】図１に追加した部材の模式図である。
【図３】本発明の実施例２における孔及び／又は透明部材が設けられた遠心分離検出装置の構造の模式図である。
【図４】固相フィルム支持バックシート部材の構造の模式図である。
【図５】図４における固相フィルム固定器の構造の模式図である。
【図６】図５における固相フィルム固定器の回転移動式接続装置の構造の模式図である。
【図７】図１における外向き傾斜型構造を用いる遠心ロータの模式図である。
【図８】固相フィルムとサンプル投入管との接続構造の模式図である。
【図９】遠心ロータの固相フィルム回転移動式接続装置の構造の模式図である。
【図１０】固相フィルム固定器の透明な上下埋め込み型部材の構造の模式図である。
【符号の説明】
【００４０】
１…サンプル投入部材、２…固相フィルム、３…遠心装置、４…検出器、５…ハウジング、６…液相貯蔵装置、７…サンプル投入ポンプ、８…サンプル投入管、９…遠心ロータ、９Ａ…中心外向き傾斜型遠心ロータ、１０…駆動モータ、１１…支持台座、１２…孔及び／又は透明部材、１３…上側検出器、１４…下側検出器、１５…液体吸着分散部材、１６…液体収集部材、１７…固相フィルム支持バックシート、１８…孔状部材、１９…スポット槽、２０…ラテラルフロー用テストストリップ係止部材、２１観察窓、２２…液体収集部材出口、２３…柱状突起、２４…サンプル投入管固定器、２５…液相、２６…固相フィルム載置装置、２７…硬質透明下蓋片、２８…硬質透明上蓋片、２９…フロントベア介在層、３０…リアベア介在層。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
後述する実施例における実験方法は、特に断らない限り、いずれも通常方法である。
【００４２】
以下、図面を結合して本発明をさらに説明するが、本発明は、以下の実施例に限られない。
【００４３】
実施例１、本発明の遠心分離検出方法と従来の検出技術での検出正確性の比較
一、実験材料
抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体（米国Genagates社、そのカタログ番号がＧＰ３０１０４２である）、抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体（米国Genagates社、カタログ番号ＧＰ３００６１６）、分光光度計（上海?華テクノロジーインストルメンツ有限公司、７５２紫外可視分光光度計）、ヒトミオグロビン（Sigma−Aldrich社製、カタログ番号がＦ３８７９−１Ｇである）、BioFlowディスペンサー（米国IMAGENE社）、Indexカッター（米国A−point社）、ＤＢＦ−９００シーリングマシン（温州江南包装工場）、ＡＣＢＯ除湿機（江蘇無錫奥波除湿機会社）、卓上型遠心機（米国Eppendoff社）、ウシ血清アルブミン（単にＢＳＡといい、SIGMA社製、カタログ番号：Ｂ８８９４）、ニトロセルロースフィルム（ＡＥ９９、米国Genagates社製）、ポリエステルセルロースフィルム（Reemay ２０３３、米国Alstrom社製）、吸水紙マット（Grade ４７０、米国Ｓ＆Ｓ社製）、塩化金酸（SIGMA社製、カタログ番号：Ｂ８８９４）、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置（ノルウェーSkannex社製）。
【００４４】
二、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：既知濃度のヒトミオグロビン溶液を取り、サンプル希釈緩衝液（１％ＢＳＡ、１００ｍＭ  グリシン，５０ｍＭ  ＰＢＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈して、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌの一連のヒトミオグロビン溶液を作製した。
【００４５】
金コロイド標識抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体の調製：１０ｍｌの純水を取り、加熱攪拌し、水が沸騰しているとき、５００μｌの１０％塩化金酸溶液を加え、加熱して５分間沸かせ、５００μｌの１２％クエン酸三ナトリウム溶液を加え、この溶液のままで攪拌して１０分間沸騰させ、室温まで自然冷却して、金コロイド溶液を得た。体積１０ｍｌの金コロイド溶液を取り、１０％炭酸カリウムでそのｐＨを８．３に調整し、すぐに抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体１００μgを加え、１０μｇ／ｍｌの最終濃度となり、ビーカーを振り混ぜ、室温にて３０分間置いた後、すぐに１０％ウシ血清アルブミン溶液１００ｕｌを加え、最終濃度が１％となり、同時にビーカーを振盪させ、室温にて３０分間置いた後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を慎重に吸引した。さらに、５ｍｌの５０ｍＭ  リン酸塩(ＰＢＳ)緩衝液を加え、ｐＨが７．４であり、沈殿を懸濁し、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清液を吸引し、沈殿を１％ウシ血清アルブミンおよび３％蔗糖を含有する１．０ｍｌのリン酸緩衝液内に溶解し、４℃にて光を避けて保存した。
【００４６】
金コロイド標識吸着フィルムの調製：０．５％ＰＶＡ（即ち、ポリビニルアルコール）、５０ｍＭ  ＰＢＳ液、０．５％ＢＳＡ、０．８８％ＮａＣｌを含有し、ｐＨが７．４であるポリエステルセルロースフィルム用前処理液を調製し、処理すべきポリエステルセルロースフィルムを前処理液内に入れ、室温にて１時間浸漬し、フィルムを取り出し、３７℃にて乾燥した後、使用のために密封し、直接分散フィルムとして使用してもよい。金コロイド標識抗体溶液を取り、コロイド緩衝液（１％ＢＳＡ、３％蔗糖，５０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を、ＯＤ５３０が３０となるように希釈し、ディスペンサーを起動して、抗体を載せ、加圧窒素ガスをオンにし、ポリエステルセルロースフィルムを取り、フィルムを印刷し始め、フィルム印刷条件として、ノズル移動速度３０ｍｍ／秒、液体推進速度３．０μｌ／ｃｍを設定し、印刷したフィルムを乾燥箱内に入れ、３７℃にて６時間乾燥させ、その後、使用のために乾燥剤付き密封袋内に保存した。金コロイド標識吸着フィルムおよび分散フィルムは、同時に、本発明に記載の液体吸着分散装置でもある。
【００４７】
ポリクローナル抗体印刷フィルムの調製：抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体溶液を取り、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液(ｐＨ７．４)によって、１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように希釈した。ディスペンサーを起動し、抗体を載せ、ニトロセルロースフィルムで被覆されたＰＶＣシート（即ち、ポリ塩化ビニルシート）を取り、フィルムを印刷し始め、フィルム印刷条件として、ノズル移動速度３０ｍｍ／秒、液体推進速度０．５μｌ／ｃｍを設定した。印刷したフィルムを３７℃の乾燥箱内に入れ、６時間を乾燥させ、その後、フィルムを使用のために乾燥剤付き乾燥容器内に保存した。
【００４８】
半製品の組立方法：除湿機を起動し、操作室内の湿度を２５％以下に下げ、ポリクローナル抗体印刷フィルムの両端にそれぞれ吸水紙マットおよび金コロイド標識吸着フィルムを貼り付け、そしてステッカーで表面をシールした。貼り付けられた検出シートをカッターに置いて、３．５ｍｍのテストストリップに切断した。ストリップを乾燥剤付きアルミパウチ密封袋内に入れ、シーリングマシンによってシールし、ラベルを付加した。
【００４９】
上記調製されたテストストリップを取り、金コロイド標識吸着フィルムの側が上向きにされるように遠心機用ロータ（外向き傾斜型、直径が３０ｍｍである）内に置き、調製された異なる濃度のヒトミオグロビン溶液８０ｕｌを金コロイド標識吸着フィルムに滴下し、１〜１５分間静置し、２０００回転／分で１分間遠心し、さらに、０．０５％ツイン２０を含むｐＨ７．４の５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液８０ｕｌを金コロイド標識吸着フィルムに滴下し、２０００回転／分で１分間遠心して洗浄し、テストストリップを取り出し、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置（即検出器）に置いてポリクローナル抗体ブロットのバンドのデジタル画像を読み取り、画像処理を行って対応する色度値を取得した。対照テストストリップは遠心処理せず、上記と同様な設定された静置時間を経た後、さらに２．５分間静置してから、対応する色度値を読み取った。
【００５０】
実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。設定された静置時間が異なるテストストリップの検出値を統計学的に算出した。
【００５１】
三、実験結果
本発明の金コロイドをインジケーターとする検出技術による測定結果から、本発明の技術で検出した関連係数ｒの平均値は０．９８８４であることが示され、従来技術で検出（遠心処理省略）した関連係数ｒは０．９５７であり、Ｐ＜０．０５であり、従来技術の検出結果よりも遥かに優れることから、本発明の技術は、従来技術による検出正確性を向上させていることが示唆される。実験結果は、表１に示される。
【００５２】
表１  本発明での金コロイドをインジケーターとする検出結果の正確性分析（単位：信号値）
2019507887.tif 000003
【００５３】
実施例２、本発明の遠心分離検出方法と従来の検出技術での最低検出量の比較
一、実験材料
実施例１と同様であった。
【００５４】
二、実験方法
実施例１と同様であった。
【００５５】
三、実験結果
本発明の金コロイドをインジケーターとする測定結果に基づいて、関連製品の開発によく利用される関連係数ｒの値が０．９８を超える要求を分析利用して、データを統計処理し、ｒの値が０．９８を超える際の最小値を最低検出量とした。その結果、同様な実験条件下で、設定された静置時間が１〜１５分間であり、従来技術による最低検出量は、２５ｎｇ／ｍｌ以上であり、本発明による最低検出量は、いずれも３．１２５ｎｇ／ｍｌであり、検出感度は、従来技術よりも遥かに高いことから、本発明の技術は、従来技術で検出する検出感度を向上させていることが示唆される。実験結果は、表２に示される。
【００５６】
表２  本発明でのコロイドをインジケーターとする検出感度の分析（単位：信号値）
2019507887.tif 000004
【００５７】
実施例３、本発明の遠心分離検出方法の検出特異性への影響
一、実験材料
実施例１と同様であった。
【００５８】
二、実験方法
実施例１と同様であった。
特異性検出に用いるサンプルは、Ａ：５０ｎｇ／ｍｌ  ミオグロビン、Ｂ：１０ｎｇ／ｍｌ  トロポニンＩ、Ｃ：３０ｎｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼアイソザイム、Ｄ：８０ｍｇ／ｍｌ  ヒト血清アルブミン、Ｅ：２０ｍｇ／ｍｌ  コレステロールである。
【００５９】
三、実験結果
本発明の金コロイドをインジケーターとする検出技術によって上記特異性検出サンプルを検出し、実験結果は、表３に示されるようものであり、従来技術と本発明の技術でミオグロビンサンプルを繰り返して検出した平均値は、それぞれ５０．３と５１．０ｎｇ／ｍｌであり、ミオグロビンを含有しない他のサンプルの検出値は、検出方法での検出感度の下限値以下であり、いずれもネガティブであり、かつ明確な呈色反応がない。
【００６０】
表３  本発明と従来技術でミオグロビンの特異性を検出した結果の比較（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2019507887.tif 000005
【００６１】
実施例４、本発明の遠心分離検出方法と従来の化学発光検出技術での検出性能の比較
一、実験材料
ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体（米国Genagates社、カタログ番号ＧＰ３００６１６）、磁性微粒子（ＭＰ−ＣＯＯＨ−２００２０、鄭州英諾生物）、ｐｉｃｏ発光試薬（Thermo scientific）、化学発光検出器（Promega、Glomax Mｕｌti JR Detection System）、その他は実施例１と同様なであった。
【００６２】
二、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：実施例１と同様であった。
１、従来の化学発光検出技術群
磁性微粒子の標識：從來の標識方法を用いて、１ｍｇ／ｍｌの抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体で磁性微粒子を標識し、抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体と磁性微粒子との使用量比率（ｗ／ｗ）が３:１である。各濃度の検出のために３つの平行管を使用し、各管ごとに抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体で標識された磁性微粒子１００μｌを加え、それから、対応する濃度のヒトミオグロビン溶液をそれぞれ１００μｌ加え、結合反応は３７℃で振盪させ６０分間インキュベートするように行われ、マグネットセパレーターで磁性微粒子を吸着分離し、上清を捨て、２００μｌのＰＢＳを加えて３回洗浄し、マグネットセパレーターで磁性微粒子を吸着分離し、上清を捨て、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体２００μｌを加え、結合反応は３７℃で振盪させ６０分間インキュベートするように行われ、マグネットセパレーターで磁性微粒子を吸着分離し、上清を捨て、２００μｌのＰＢＳを加えて３回洗浄し、マグネットセパレーターで磁性微粒子を吸着分離し、上清を捨て、磁性微粒子を発光カップに移行させ、化学発光検出器に入れ、１００μｌの発光基質作動液を加え、２分間反応させた場合、６秒間の発光量を記録した。
【００６３】
２、本発明群
ポリエステルセルロースフィルムの前処理は、実施例１と同様であり、３７℃にて乾燥した後、使用のために密封した。
ポリクローナル抗体印刷フィルムは、実施例１と同様であり、使用のために乾燥剤付き乾燥容器内に保存した。
化学発光標識吸着フィルムの調製：前処理されたポリエステルセルロースフィルムを取り、５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液(ｐＨ７．４)によって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体０．１５ｍｇ／ｍｌを希釈し、ディスペンサーを起動し、抗体を載せ、加圧窒素ガスをオンにし、ポリエステルセルロースフィルムを取り、フィルムを印刷し始め、フィルム印刷条件として、ノズル移動速度３０ｍｍ／秒、液体推進速度３．０μｌ／ｃｍを設定し、印刷したフィルムを冷凍乾燥させ、４℃にて、使用のために密封し保存した。
半製品の組立方法：実施例１と同様であった。
【００６４】
上記調製されたテストストリップを取り、化学発光標識吸着フィルムの側が上向きにされるように遠心機用ロータ（直径が３０ｍｍである）内に置き、調製された異なる濃度のヒトミオグロビン溶液８０ｕｌを化学発光標識吸着フィルムに滴下し、２分間静置し、２０００回転／分で１分間遠心し、さらに、０．０５％ツイン２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液８０ｕｌを化学発光標識吸着フィルムに滴下し、２０００回転／分で１分間遠心して洗浄し、化学発光標識吸着フィルムに１００μｌの発光基質作動液を滴下し、８００回転／分で３０秒間遠心し、ＰＶＣバックシートからニトロセルロースフィルムを剥がし取り、化学発光検出器に入れ、６秒間の発光量を記録した。
【００６５】
三、実験結果
本発明の化学発光検出技術と従来の化学発光検出技術によってヒトミオグロビン溶液を検出した実験結果は、表４に示されるようなものであり、表４から、両者は、いずれも良好な濃度線形関係を呈し、関連係数ｒの値がそれぞれ０．９９３と０．９９２であることが分かる。本発明は、従来の化学発光技術に類似した検出效果を有するが、検出時間を大幅に短縮したことが示唆される。
【００６６】
表４  本発明お従来の化学発光検出技術での検出性能の発光量の比較
2019507887.tif 000006
【００６７】
実施例５、本発明の遠心分離検出方法と従来の化学発光検出技術での検出結果の比較
一、実験材料
実施例４と同様であった。
【００６８】
二、実験方法
標準曲線の作成：既知濃度のヒトミオグロビン溶液を取り、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌのヒトミオグロビン溶液を作製し、本発明と従来の化学発光検出技術をそれぞれ用いて検出して、標準曲線を描いた。既知濃度のヒトミオグロビン１０ｎｇ／ｍｌを対象サンプルとした。他の方法は実施例４と同様であった。
【００６９】
三、実験結果
３回繰り返した実験の具体的な結果は、表５に示される。従来の化学発光検出技術での測定結果は、対象サンプルにおけるヒトミオグロビンの含有量が９．５２ｎｇ／ｍｌであることを示唆し、本発明での測定結果は、対象サンプルのヒトミオグロビンの含有量が９．８２ｎｇ／ｍｌであることを示唆し、２つの実験方法による結果はほぼ一致し、統計学的差異（Ｐ＞０．０５）がないが、本発明の実験完了時間は従来技術よりも短いことが明らかである。
【００７０】
表５  本発明と従来の化学発光検出技術での検出結果の比較（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2019507887.tif 000007
【００７１】
実施例６、本発明の遠心分離検出方法と従来の蛍光イムノアッセイ技術での検出性能の比較
一、実験材料
蛍光マイクロビーズ（使用されるフルオレセインがユウロピウム化合物であり、カタログ番号ＪＹ−ＳＪ１２６、上海傑一バイオ会社）、ＥＤＣ（Pierce社製、カタログ番号２２９８０）、ＮＨＳ（Pierce社製、カタログ番号２４５００）、蛍光定量分析装置（上海巾?バイオ会社、ＨＧ−９８）、その他は実施例１と同様であった。
【００７２】
二、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：実施例１と同様であった。
蛍光マイクロビーズの標識：０．５ｍｌの蛍光マイクロビーズを取り、ＰＨ７．２の０．１Ｍ  ＰＢを用いて４回遠心洗浄し、１３０００ｒｐｍで遠心し、ｐＨ７．２の０．１Ｍ  ＰＢを用いて１ｍｌとなるように再溶解し、１５０ｕｇの抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体を加え、混練し、ｐＨ７．２の０．１Ｍ  ＰＢを１．５ｍｌとなるように加え、４０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ水溶液２５０ｕｌを加えた後、４０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ水溶液２５０ｕｌを加え、混練し、室温で６０分間反応させた。２０ｍｇのＢＳＡを加え、混練し、室温で６０分間反応させた。遠心吸引して上清を捨て、ｐＨ７．６の０．０５Ｍ  Trisを用いて４回遠心洗浄した後、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．６の０．０５Ｍ  Trisを、使用のために、１０ｍｌとなるように再溶解し、４℃にて保存した。
【００７３】
蛍光標識抗体吸着フィルムの調製：ポリエステルセルロースフィルム前処理液は実施例１と同様であった。蛍光マイクロビーズ標識抗体溶液を取り、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．６の０．０５Ｍ  Tris緩衝液で３倍希釈し、ディスペンサーを起動し、抗体を載せ、加圧窒素ガスをオンにし、ポリエステルセルロースフィルムを取り、フィルムを印刷し始め、フィルム印刷条件として、ノズル移動速度３０ｍｍ／秒、液体推進速度５．０μｌ／ｃｍを設定し、印刷したフィルムを乾燥箱内に入れ、３７℃にて６時間乾燥させ、その後、使用のために乾燥剤付き密封袋内に保存した。
【００７４】
ポリクローナル抗体印刷フィルムの調製：実施例１と同様であった。
半製品の組立方法：実施例１と同様であった。
上記調製されたテストストリップを取り、蛍光標識抗体吸着フィルムの側が上向きにされるように遠心機用ロータ（直径が３０ｍｍである）内に置き、調製された異なる濃度のヒトミオグロビン溶液８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２分間静置し、２０００回転／分で１分間遠心し、さらに、０．０５％ツイン２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２０００回転／分で１分間遠心して洗浄し、テストストリップを取り出し、蛍光定量分析装置にてポリクローナル抗体ブロットのバンドの蛍光値を読み取った。
【００７５】
従来技術では、対照テストストリップは遠心処理せず、設定された２分間の静置時間の後、さらに２．５分間静置してから、蛍光値を読み取った。
実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【００７６】
三、実験結果
具体的な結果は、表６に示される。本発明の技術は以上のように操作すると、線形反応が良好であり、関連係数ｒの値が０．９９５である。従来技術で測定すると、スポットした後２分間静置し、さらに２．５分間静置するため、線形が不良であり、１２．５ｎｇ／ｍｌ以下のサンプルは、発光量がバックグラウンドレベルに近く、関連係数ｒの値が０．９３７である。このテストストリップは、従来の検出反応時間が１５分間のはずだが、本実験では、スポットした後４．５分間静置し、検出反応がまだ終了していないため、線形がよくなかった。従来技術に比べ、本発明は検出時間を大幅に短縮した。
【００７７】
表６  本発明と従来の蛍光イムノアッセイ技術での検出性能の発光量の比較
2019507887.tif 000008
【００７８】
実施例７、本発明の遠心分離検出方法と従来の蛍光イムノアッセイ技術での検出結果の比較
一、実験材料
ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（米国Genagates社製、カタログ番号ＧＰ３０１２３１）、その他は実施例６と同様であった。
【００７９】
二、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：実施例１と同様であった。１０ｎｇ／ｍｌの既知濃度のヒトミオグロビンの対象サンプルを調製した。
蛍光マイクロビーズの標識：実施例６と同様であった。
蛍光マイクロビーズフィルムの印刷：実施例６と同様であった。
蛍光標識抗体吸着フィルムの調製：実施例６と同様であった。
ポリクローナル抗体印刷フィルムの調製：抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体溶液を取り、５０ｍＭ  リン酸塩緩衝液(ｐＨ７．４)によって、１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように希釈した。ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体溶液を取り、５０ｍＭ  リン酸緩衝液(ｐＨ７．４)で１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように希釈した。ディスペンサーを起動し、抗体を載せ、ニトロセルロースフィルムで被覆されたＰＶＣシートを取り、フィルムを印刷し始め、同じニトロセルロースフィルム上に抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体をテストラインＴとし、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体をコントロールラインＣとしてそれぞれ印刷し、フィルム印刷条件として、ノズル移動速度３０ｍｍ／秒、液体推進速度０．５μｌ／ｃｍを設定し、印刷したフィルムを３７℃乾燥箱内に入れ、６時間乾燥させ、その後、フィルムを使用のために乾燥剤付き乾燥容器内に保存した。
半製品の組立方法：除湿機を起動し、操作室内の湿度を２５％以下に下げ、ポリクローナル抗体印刷フィルムのテストライン側に蛍光標識抗体吸着フィルムを貼り付け、コントロールライン側に吸水紙マットを貼り付け、そしてステッカーで表面をシールした。貼り付けられた検出シートをカッターに置いて、３．５ｍｍのテストストリップに切断した。ストリップを乾燥剤付きアルミパウチ密封袋内に入れ、シーリングマシンによってシールし、ラベルを付加した。
【００８０】
上記調製されたテストストリップを取り、蛍光標識抗体吸着フィルムの側が上向きにされるように遠心機用ロータ（直径が３０ｍｍである）内に置き、調製された異なる濃度のヒトミオグロビン溶液および対象サンプルそれぞれ８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２分間静置し、２０００回転／分で１分間遠心し、さらに、０．０５％ツイン２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２０００回転／分で１分間遠心して洗浄し、テストストリップを取り出し、蛍光定量分析装置にてポリクローナル抗体印刷フィルムにおけるテストラインＴおよびコントロールラインＣの蛍光値を読み取り、Ｔ／Ｃの比を算出し、標準曲線を描き、対象サンプルのミオグロビン濃度を算出した。
【００８１】
従来技術では、対照テストストリップは遠心処理せず、設定された静置時間の後、さらに２．５分間静置してから、蛍光値を読み取り、Ｔ／Ｃの比を算出し、標準曲線を描き、対象サンプルのミオグロビン濃度を算出した。
実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【００８２】
三、実験結果
本発明の技術は以上のように操作すると、標準曲線の線形が良好であり、関連係数ｒの値が０．９９５であり、すぐにサンプル測定を行い、３回にわたる実験は平均して１０．８４ｎｇ／ｍｌであり、検出誤差が１０％以内にあり、要求に合致した。従来技術で測定すると、スポットした後２分間静置し、さらに２．５分間静置するため、検出した標準曲線の線形が不良であり、関連係数ｒの値が０．９３７であった。その後、スポットした後の合計静置時間を従来の製品検出のための１５分間に延ばせば、標準曲線の線形が良好であり、関連係数ｒの値が０．９８９であり、すぐに１５分間の条件に従ってサンプル測定を行い、３回にわたる平均値が９．４９ｎｇ／ｍｌであり、検出誤差が１０％以内にあり、要求に合致した。３回繰り返した実験の具体的な結果は、表７に示される。従来技術に比べ、本発明は検出時間を大幅に短縮した。
【００８３】
表７  本発明の蛍光イムノアッセイ技術での検出結果の分析（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2019507887.tif 000009
【００８４】
実施例８、本発明の遠心分離検出方法（検出器として蛍光検出用のものを用いる）と従来の酵素結合免疫吸着アッセイ技術での検出結果の比較
一、実験材料
蛍光マイクロビーズ（すべてのフルオレセインがユウロピウム化合物でありカタログ番号ＪＹ−ＳＪ１２６、上海傑一バイオ会社）、ＥＤＣ（Pierce社製、カタログ番号２２９８０）、ＮＨＳ（Pierce社製、カタログ番号２４５００）、蛍光定量分析装置（上海巾?バイオ会社、ＨＧ−９８）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体（米国Genagates社、カタログ番号ＧＰ３００６１６）、ｏ-フェニレンジアミン、酵素結合免疫吸着測定器（Bio−Rad、Model ５５０）、健常人血清（健常な志願者が寄付したもの）、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（米国Genagates社製、カタログ番号ＧＰ３０１２３１）、その他は実施例１と同様であった。
【００８５】
二、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：既知濃度のヒトミオグロビン溶液を取り、ＰＢＳ溶液を用いて３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌの一連のヒトミオグロビン溶液を作製し、標準曲線の作成に用いた。既知濃度が８．２ｎｇ／ｍｌのヒトミオグロビンを含む健常人血清を対象サンプルとした。
【００８６】
実験では、本発明の蛍光検出と従来の酵素結合免疫吸着アッセイ技術によってヒトミオグロビン溶液を検出し、標準曲線を描き、そして対象サンプルを測定し、標準曲線により対象サンプルにおけるミオグロビンの濃度を算出した。各サンプルごとに３つの平行管を作った。
【００８７】
１、従来の酵素結合免疫吸着アッセイ技術群
９６ウェルのアッセイプレートを用いて、各管ごとに抗ヒトミオグロビンポリクローナル抗体１００μｌを加え、４℃で一晩コーティングし、３回洗浄し、さらにヒトミオグロビン溶液または対象サンプル１００μｌをそれぞれ加え、結合反応は３７℃で１２０分間インキュベートするように行われ、３回洗浄し、抗ヒトミオグロビンモノクローナル抗体１００μｌを加え、結合反応は３７℃で６０分間インキュベートするように行われ、３回洗浄し、上清を捨て、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体１００μｌを加え、結合反応は３７℃で６０分間インキュベートするように行われ、３回洗浄し、上清を捨て、１００μｌの呈色液（配合：０．１Ｍ  クエン酸２．４３ｍｌ、０．２Ｍ  リン酸水素二ナトリウム２．５７ｍｌ、ｏ-フェニレンジアミン５ｍｇ、過酸化水素５μｌ）を加え、５分間光を避け、２Ｍ  硫酸を加えて、反応を終了させた。酵素結合免疫吸着測定器にてＯＤ４９０の吸光値を読み取り、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｎｇ／ｍｌの濃度に対応するＯＤ値は、それぞれ０．１８２、０．２１５、０．２５６、０．３９８、０．７９１、１．２１２であり、標準曲線を描き、ｒ＝０．９９３であり、対象サンプルにおけるヒトミオグロビンの含有量を算出した。
【００８８】
２、本発明群
蛍光マイクロビーズの標識：実施例６と同様であった。
蛍光マイクロビーズフィルムの印刷：実施例６と同様であった。
蛍光標識抗体吸着フィルムの調製：実施例６と同様であった。
ポリクローナル抗体印刷フィルムの調製：実施例７と同様であった。
半製品の組立方法：実施例７と同様であった。
【００８９】
上記調製されたテストストリップを取り、蛍光標識抗体吸着フィルムの側が上向きにされるように遠心機用ロータ（直径が３０ｍｍである）内に置き、調製された異なる濃度のヒトミオグロビン溶液および対象サンプルそれぞれ８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２分間静置し、２０００回転／分で１分間遠心し、さらに、０．０５％ツイン２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２０００回転／分で１分間遠心して洗浄し、テストストリップを取り出し、蛍光定量分析装置にてポリクローナル抗体印刷フィルムにおけるテストラインＴおよびコントロールラインＣの蛍光値を読み取り、Ｔ／Ｃの比を算出すると、０．００１、０．００５、０．０２４、０．１３８、０．３７３、０．６８３であり、ｒ＝０．９９１であり、標準曲線を描き、対象サンプルのミオグロビン濃度を算出した。
【００９０】
三、実験結果
具体的な結果は、表８に示される。従来の酵素結合免疫吸着アッセイ技術での測定結果は、対象サンプルのヒトミオグロビンの含有量が７．８９ｎｇ／ｍｌであることを示唆し、本発明での測定結果は、対象サンプルのヒトミオグロビンの含有量が８．１９ｎｇ／ｍｌであることを示唆し、２つの実験方法による結果はほぼ一致し、統計学的差異（Ｐ＞０．０５）がないが、本発明の実験完了時間は従来技術よりも短いことが明らかである。
表８  本発明の蛍光検出と従来の酵素結合免疫吸着アッセイ技術での検出結果の比較（単位：ｎｇ／ｍｌ）
【００９１】
2019507887.tif 000010
【００９２】
実施例９、本発明の遠心分離検出方法での遠心速度の検出結果への影響
一、実験材料
実施例１と同様であった。
【００９３】
二、実験方法
実施例１と同様であった。
【００９４】
三、実験結果
本発明では金コロイドをインジケーターとし、異なる遠心速度で異なる濃度のヒトミオグロビンサンプルを検出し、実験結果は表９に示される。表９から、検出正確性は遠心速度に関係があり、５００、１０００、２０００回転／分の遠心速度では要求に合致する検出結果を獲得し、関連係数ｒの値は、いずれも０．９８よりも大きいことが分かる。３０００、４０００、５０００回転／分の遠心速度で獲得された検出結果によれば、その関連係数ｒの値は、いずれも０．９８よりも小さく、関連する検出要求を満たしていない。本発明でミオグロビン検出を行う最適な遠心速度は２０００回転／分以下に控えるべきであることが示唆される。
【００９５】
表９  遠心速度の検出結果への影響
2019507887.tif 000011
【００９６】
実施例１０、本発明の遠心分離検出方法でのサンプル投入方式の検出結果への影響
一、実験材料
小型遊星減速モータ（出力回転数１０００回転／分、電力１００ｗ）、ステンレス鋼板、ペリスタポンプ（保定創鋭ポンプ、型番ＢＴ１００ＬＣ）、その他は実施例１と同様であった。
【００９７】
二、実験方法
小型遊星減速モータを、回転軸が上向きにされるように直立に取り付けた。ステンレス鋼板から直径３０ｍｍの円形板を作り、その中央を穿孔した。ステンレス鋼製円形板を小型直流モータ軸に水平に固定し、ペリスタポンプをステンレス鋼製円形板の中央に取り付けた。直流モータおよびペリスタポンプを電池に接続した。対象サンプルおよび洗浄液容器をペリスタポンプの上方に固定した。調製されたテストストリップを、吸水マットが外向きにされ、金コロイド標識吸着フィルムが内向きにされるような方向でステンレス鋼製円形板に貼り付けた。ペリスタポンプのピペットの一端を対象サンプルおよび洗浄液容器内に置きながら、他端を金コロイド標識吸着フィルムに固定した。ペリスタポンプのピペットの入液側には、吸液の流れ方向を変更可能な三路スィッチが設けられている。実験時に、まず最初に三路スィッチを対象サンプルの側に置き、金コロイド標識吸着フィルムへ対象サンプル４０ｕｌを滴下し、遠心機を起動し、ペリスタポンプをオンにし、２０ｕｌ／ｍｉｎの速度で金コロイド標識吸着フィルムにサンプルを供給し、２分間後に、三路スィッチを洗浄液側に回転させ、ペリスタポンプの速度を１６０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、３０秒後にペリスタポンプをオフにし、継続して３０秒間遠心し、遠心機を切断し、テストストリップを取り、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置によってミオグロビンのバンド部位での画像色度値を測定した。その他は実施例１と同様であった。
【００９８】
本発明では、対照テストストリップは、サンプル供給ガンによって滴下し遠心機にて遠心するサンプル投入方式を採用し、１回目に８０ｕｌのサンプルを供給した後１分間静置してから、１０００回転／分で１分間遠心し、洗浄液８０ｕｌを加え、１０００回転／分で１分間遠心し、その後、画像色度値を読み取った。
【００９９】
三、実験結果
実験結果は、表１０に示される。２組の実験結果を比較すると、自動サンプル投入方式の検出結果は、手動スポットよりも優れていることを示唆し、関連係数ｒの値はそれぞれ０．９９６と０．９８３である。自動サンプル投入は手動サンプル投入よりも優れていることが示唆される。
【０１００】
表１０  本発明でのサンプル投入方式の検出結果への影響（結果が画像色度値である）
2019507887.tif 000012
【０１０１】
実施例１１、本発明の遠心分離検出方法での検出方式の検出結果への影響
一、実験材料
実施例６と同様であった。
【０１０２】
二、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：実施例１と同様であった。
蛍光マイクロビーズの標識：実施例６と同様であった。
蛍光マイクロビーズフィルムの印刷：実施例６と同様であった。
蛍光標識抗体吸着フィルムの調製：実施例６と同様であった。
ポリクローナル抗体印刷フィルムの調製：実施例７と同様であった。
半製品の組立方法：実施例７と同様であった。
【０１０３】
上記調製されたテストストリップを取り、蛍光標識抗体吸着フィルムの側が上向きにされるように遠心機用ロータ（直径が３０ｍｍである）内に置き、調製された異なる濃度のヒトミオグロビン溶液および対象サンプルそれぞれ８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２分間静置し、２０００回転／分で１分間遠心し、さらに、０．０５％ツイン２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液８０ｕｌを蛍光標識抗体吸着フィルムに滴下し、２０００回転／分で１分間遠心して洗浄し、テストストリップを取り出し、蛍光定量分析装置にてポリクローナル抗体印刷フィルムにおけるテストラインの蛍光値を読み取った。
両側検出は、蛍光定量分析中に、從來の蛍光検出用プローブと対向する側に他の蛍光検出用プローブを取り付け、検出時にＰＶＣバックシートを剥がし、他の条件は変わらず、ポリクローナル抗体印刷フィルムにおけるテストラインの蛍光値を読み取るように行われた。
【０１０４】
三、実験結果
具体的な結果は、表１１に示される。從來の片側検出に比べ、本発明では、両側検出により、読み取った蛍光量を顕著に向上させ、検出感度を向上させることができる。
【０１０５】
表１１  本発明での検出方式の検出結果の発光量への影響
2019507887.tif 000013
【０１０６】
一、実験材料
実施例１と同様であった。
【０１０７】
二、実験方法
対照実験の洗浄ステップでは、洗浄せずに静置した。その他は実施例１と同様であった。
【０１０８】
三、実験結果
実験結果は、表１２に示される。２組の実験結果を比較すると、洗浄を伴う検出結果は、洗浄を伴わない検出結果よりも優れており、関連係数ｒの値はそれぞれ０．９９６と０．９７９である。実験では、サンプル投入後に洗浄を伴うステップは必要であることが示唆される。
【０１０９】
表１２  本発明での洗浄ステップの検出結果への影響（結果が画像色度値である）
2019507887.tif 000014
【０１１０】
実施例１３、水平型遠心分離検出装置の製造
図１に示されるように、本発明の遠心分離検出装置は、サンプル投入部材１と、固相フィルム２と、遠心装置３と、検出器４とを備える。
【０１１１】
図２に示されるように、遠心装置３は、遠心ロータ９、駆動モータ１０と、遠心ロータ９を支持する支持台座１１とを含み、駆動モータ１０によって遠心ロータ９を回動するように駆動する。遠心装置を保護するために、これをハウジング５内に設けてもよい。
【０１１２】
図２に示されるように、サンプル投入部材１は、液相貯蔵装置６、サンプル投入ポンプ７と、サンプル投入管８とを含む。液相貯蔵装置６は、サンプル投入管８に連通し、遠心ロータ９の中部に設けられ、且つサンプル投入ポンプ７によって駆動されてサンプル投入管８内に入る。サンプル投入管８は、遠心ロータ９に設けられている。遠心装置の速度およびサンプル投入装置のサンプル投入速度を制御するために、遠心装置およびサンプル投入部材は、いずれもプログラム制御速度を有する部材に接続されている。
【０１１３】
図２および図４に示されるように、固相フィルム２と遠心ロータ９とは着脱式の構造である。固相フィルム２は、遠心ロータ９の外縁に設けられた固相フィルム載置装置２６内に置かれ、固相フィルム２は、遠心ロータ９の近位端にて、それに連通する液体吸着分散部材１５が設けられ、また、固相フィルム２は、遠心ロータの遠位端にて、それに連通する液体収集部材１６が設けられ、液体吸着分散部材１５は、サンプル投入管８に連通した。固相フィルム２の材料は、ニトロセルロースフィルム、ポリフッ化ビニリデンフィルム、ナイロンフィルムおよびＤＥＡＥセルロースフィルムのうちのいずれかを用い、且つ固相フィルム２の片面または両面にバッキングが設けられている。液体吸着分散部材１５は、金コロイド標識吸着フィルム、蛍光標識抗体吸着フィルム、化学発光標識吸着フィルムおよび分散フィルムのうちの少なくとも１種を含む。液体収集装置１６は、吸水性材料、例えば、吸水紙及び／又は吸水ゲルを用い、液体収集容器を用いてもよい。
【０１１４】
図４、図５に示されるように、固相フィルム２を固定するために設けられた固相フィルム固定器は、図４に示される支持バックシート１７のようなものであり、支持バックシート１７は、ＰＶＣ板、透明なプラスチック板、有機ガラス板などを選択することができる。図５における固相フィルム固定器は、ラテラルフロー用テストストリップ係止部材２０であり、具体的には、孔状部材１８と、スポット槽１９と、観察窓２１と、液体収集部材出口２２とを含む。固相フィルム構造をラテラルフロー用テストストリップ係止構造２０内に入れた後、スポット槽１９の対応する部位が液体吸着分散部材であり、観察窓２１の対応する部位が固相フィルム２であり、液体収集部材出口２２の対応する部位が液体収集部材１６（吸水性材料または液体収集容器）である。
【０１１５】
図６、図９に示されるように、固相フィルム載置装置２６として、回転移動式固定装置を用い、柱状突起２３を含み、柱状突起２３は、ラテラルフロー用テストストリップ係止部材２０に設けられた孔状部材１８に嵌め合う。柱状突起２３は、遠心ロータ９に設けられた柱状構造である。使用時に、遠心ロータ９に位置する柱状突起２３をラテラルフロー用テストストリップ係止部材２０の孔状部材１８内に挿入し、サンプル投入管８は、一端がスポット槽１９に接続され、他端が液相存?器６に接続され、液相は、サンプル投入ポンプに駆動されてサンプル投入管８に入り、その後、スポット槽１９に添加される。遠心ロータ９上には、孔状部材１８を介して固相フィルム固定器（例えば、ラテラルフロー用テストストリップ係止部材２０）を固定するための柱状突起２３が均一に分布している。
【０１１６】
図１、図２に示されるように、検出器４は、遠心ロータ９の外縁に設けられ、固相フィルム２側に設けられている。
【０１１７】
図８には、固相フィルム２とサンプル投入管８とが接続される構造が示され、サンプル投入管８を固相フィルム２の上方に設置し、液体吸着分散部材１５に直接接触接続するか、或いは、液相２５を滴下して接触接続する。液相２５は、サンプル投入管８を介して液体吸着分散部材１５に直接添加又は滴下される。
【０１１８】
図１０に示されるように、固相フィルム２を固定するために設けられた別の固相フィルム固定器は、具体的には、硬質透明下蓋片２７と、硬質透明上蓋片２８と、フロントベア介在層２９と、リアベア介在層３０とを含む。検出時に、液相は、遠心によってフロントベア介在層２９を経て、液体吸着分散部材１５に入り、固相フィルム２を流れ、反応後の液相は、リアベア介在層３０から排出される。
【０１１９】
実施例１４、中心外向き傾斜型遠心分離検出装置の製造
図７に示されるように、本発明の中心外向き傾斜型遠心分離検出装置に備えられる部材の種類は、水平型遠心分離装置と同じであり、サンプル投入部材１、固相フィルム２、遠心装置３、検出器４、および対応する構成を備えている。遠心ロータ９として、中心外向き傾斜型である中心外向き傾斜型遠心ロータ９Ａを用い、固相フィルムは、ラテラルフロー用テストストリップ係止部材２０を介して、中心外向き傾斜型遠心ロータ９Ａにて外向きに傾斜するように配置され、中心外向き傾斜型遠心ロータ９Ａの外面或いはその内部に設けられた遠心孔又は介在層内に配置されることができる点で相違する。
【０１２０】
実施例１５、本発明の孔及び／又は透明部材が設けられた遠心分離検出装置の製造
図３に示されるように、実施例１３における配置と同様であったが、遠心ロータ９の平面の中間部分に孔及び／又は透明部材１２が設けられ、かつ孔及び／又は透明部材１２は、固相フィルム２を、直接、検出器の上側検出器１３、下側検出器１４と対向させ、即ち、孔及び／又は透明部材１２は、固相フィルム２を検出器の上側検出器１３、下側検出器１４の間に露出させ、これにより、上側検出器１３、下側検出器１４は、固相フィルム２の検出データを同時に読み取ることができる点で相違する。
本発明の遠心分離検出装置の応用実験：
【０１２１】
実験一、本発明の実施例１３における平面型遠心分離装置の製造および装置の検出效果：
１、実験材料
遊星減速モータ（即ち、遠心装置の駆動モータであり、出力回転数５００〜５０００回転／分、電力６０ｗ、カスタム）、ポテンショメータ、厚さ１．５ｍｍの鉄板、マイクロペリスタポンプ（即ち、サンプル投入部材におけるサンプル投入ポンプであり、保定創鋭ポンプ、型番ＢＷ１００）、ミオグロビン金コロイドテストカード（即ち、固相フィルムの固相フィルムと固相フィルム固定器との一体化構造、常州博聞迪社製）、ヒトミオグロビン（即ち、対象サンプルであり、Sigma−Aldrich社製、カタログ番号がＦ３８７９−１Ｇである）、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置（即ち、検出器であり、ノルウェーSkannex社製）。
【０１２２】
２、実験方法
１）ヒトミオグロビン溶液の調製：既知濃度のヒトミオグロビン溶液を取り、サンプル希釈緩衝液（１％ＢＳＡ、１００ｍＭ  グリシン、５０ｍＭ  ＰＢＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈して、２５、５０、１００、３００、５００ｎｇ／ｍｌの一連のヒトミオグロビン溶液を作製した。
【０１２３】
２）実験ステップ：遊星減速モータを、回転軸が上向きにされるように、予め切断された鉄板上に直立に取り付けた。鉄板から直径３０ｍｍの円形板を作り、その中央を穿孔した。鉄板を遊星減速モータ軸に水平に固定し、ペリスタポンプを鉄板の中央に取り付けた。遊星減速モータをポテンショメータに接続してから、電池に接続した。ペリスタポンプを電池に接続した。対象サンプルおよび洗浄液容器を鉄板に固定した。ミオグロビン金コロイドテストカードを、吸水マットが外向きにされ、金コロイド標識吸着フィルム（即ち、液体吸着分散部材）が内向きにされるような方向で鉄板の外側に貼り付けた。ペリスタポンプのピペットの一端を対象サンプルおよび洗浄液容器内に置きながら、他端をテストカードのスポット槽（金コロイド標識吸着フィルム）に固定した。ペリスタポンプのピペットの入液側には、吸液の流れ方向を変更可能な三路スィッチが取り付けられている。金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置を予め切断された鉄板に固定した。
【０１２４】
ミオグロビン金コロイドテストカードを取り、金コロイド標識吸着フィルム側の近位端を遠心ロータの平面に貼り付けて固定し、ペリスタポンプのピペットの一端を対象サンプルおよび洗浄液容器内に置きながら、他端をテストカードのスポット槽（金コロイド標識吸着フィルム）に固定した。ペリスタポンプのピペットの三路を対象サンプルに向けて開いた。ペリスタポンプをオンにし、その速度を５０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、対象サンプル液がペリスタポンプのピペットのスポット槽側から流れ出て、金コロイド標識吸着フィルムに流れ込むことが観察された。遊星減速モータをオンにし、ポテンショメータによってその速度を１０００回転／分に調整し、２分間遠心した後、三路を洗浄液に回転させ、遊星減速モータの回転数を２０００回転／分に調整し、ペリスタポンプの速度を１５０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、１分間遠心した後、ペリスタポンプをオフにし、遊星減速モータの回転数を５０００回転／分に調整し、継続して３０秒間遠心した後、遊星減速モータをオフにした。テストカードを取り出し、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置に置いてその結果を読み取った。濃度が２５、５０、１００、３００、５００ｎｇ／ｍｌである一連のヒトミオグロビン溶液を順に検出した。実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【０１２５】
また、ミオグロビン金コロイドテストカードを取り、仕様書に従ってカード毎に１００ｕｌの既知濃度の一連のヒトミオグロビン溶液を滴下し、２０分間静置し、テストカードを金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置に置いてその結果を読み取った。実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【０１２６】
３、実験結果
從來の金コロイド固相フィルム検出製品を用いて、本発明の平面型遠心分離装置と從來の通常方法とを比較し、その結果は、表１に示されるようなものであり、本発明の技術と従来技術で検出したサンプルの真値との相関性を観察した。結果から、本発明の技術で検出した関連係数ｒが０．９９８であり、従来技術で検出した関連係数ｒが０．９８３であり、Ｐ＜０．０５であり、従来技術の検出結果よりも遥かに優れていることが示され、同時に、従来技術で検出する検出時間が２０分間であるのに対し、本発明の技術では３．５分間であり、本発明の技術は、従来技術に比べ検出正確性を向上させているとともに、検出時間を短縮していることが示唆される。
【０１２７】
表１  本発明の平面型遠心分離装置の比較実験（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2019507887.tif 000015
【０１２８】
実験二、本発明の実施例１４における外向き傾斜型遠心分離装置の效果の検出
１、実験材料
小型卓上型遠心機（即ち、遠心装置であり、Eppendorf、Minispin、アングルロータ、出力回転数１０００〜１００００回転／分）、厚さ１．５ｍｍの鉄板、直径８ｍｍの鉄棒、マイクロペリスタポンプ（即ち、サンプル投入部材のサンプル投入ポンプであり、保定創鋭ポンプ、型番ＢＷ１００）、ミオグロビン金コロイドテストカード（即ち、固相フィルムの固相フィルムと固相フィルム固定器との一体化構造、常州博聞迪社製）、ヒトミオグロビン（即ち、対象サンプル、Sigma−Aldrich社製、カタログ番号がＦ３８７９−１Ｇである）、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置（即ち、検出器であり、ノルウェーSkannex社製）。
【０１２９】
２、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：実験一における２−１と同様であった。
長さ５０ｍｍの鉄棒を切断し、直径１５０ｍｍの円形鉄板を切断し、鉄棒の一端を円形鉄板の中心に固定し、鉄棒の他端を小型遠心機の遠心ロータの中軸に垂直に固定した。鉄棒の平面の上方にマイクロペリスタポンプ、電池および液相容器を固設した。ミオグロビン金コロイドテストカードを、吸水マットが外向きにされ、金コロイド標識吸着フィルムが内向きにされるような方向でアングルロータの遠心孔内に外向きに傾斜するように固設した。ペリスタポンプのピペットの一端を対象サンプルおよび洗浄液容器内に置きながら、他端をテストカードのスポット槽（金コロイド標識吸着フィルム）に固定した。ペリスタポンプのピペットの入液側には、吸液の流れ方向を変更可能な三路スィッチが取り付けられている。
【０１３０】
ミオグロビン金コロイドテストカードを取り、金コロイド標識吸着フィルム（即ち、液体吸着分散部材）側を近位端としてアングルロータ遠心孔内に置き、ペリスタポンプのピペットの一端を対象サンプルおよび洗浄液容器内に置きながら、他端をテストカードのスポット槽（金コロイド標識吸着フィルム）に固定した。ペリスタポンプのピペットの三路を対象サンプルに向けて開いた。ペリスタポンプをオンにし、その速度を５０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、対象サンプル液がペリスタポンプのピペットのスポット槽側から流れ出て、金コロイド標識吸着フィルムに流れ込むことが観察された。小型遠心機をオンにし、その速度を１０００回転／分に調整し、２分間遠心した後、三路を洗浄液に回転させ、小型遠心機の回転数を２０００回転／分に調整し、ペリスタポンプの速度を１５０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、１分間遠心した後、ペリスタポンプをオフにし、小型遠心機の回転数を５０００回転／分に調整し、継続して３０秒間遠心した後、小型遠心機をオフにした。テストカードを取り出し、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置に置いてその結果を読み取った。濃度が２５、５０、１００、３００、５００ｎｇ／ｍｌである一連のヒトミオグロビン溶液を順に検出した。実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【０１３１】
また、ミオグロビン金コロイドテストカードを取り、仕様書に従ってカード毎に１００ｕｌの既知濃度の一連のヒトミオグロビン溶液を滴下し、２０分間静置し、テストカードを金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置に置いてその結果を読み取った。実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【０１３２】
３、実験結果
從來の金コロイド固相フィルム検出製品を用いて、本発明の外向き傾斜型遠心分離装置と從來の通常方法とを比較し、実験結果は、表２に示されるようなものであり、本発明の技術と従来技術で検出したサンプルの真値との相関性を観察した。結果から、本発明の技術で検出した関連係数ｒが０．９９６であり、従来技術で検出した関連係数ｒが０．９８７であり、Ｐ＜０．０５であり、従来技術の検出結果よりも遥かに優れていることが示され、同時に、従来技術で検出する検出時間が２０分間であり、本発明の技術では３．５分間であり、本発明の技術は、従来技術に比べ検出正確性を向上させているとともに、検出時間を短縮していることが示唆される。
【０１３３】
表２  本発明の外向き傾斜型遠心分離装置の比較実験（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2019507887.tif 000016
【０１３４】
実験三、本発明の実施例１５における回転移動式固定装置付き平面型遠心分離装置の検出效果
１、実験材料
遊星減速モータ（即ち、遠心装置的駆動モータであり、出力回転数５００〜５０００回転／分、電力６０ｗ、カスタム）、ポテンショメータ、厚さ１．５ｍｍの鉄板、マイクロペリスタポンプ（即ち、サンプル投入部材のサンプル投入ポンプであり、保定創鋭ポンプ、型番ＢＷ１００）、ミオグロビン金コロイドテストカード（即ち、固相フィルムの固相フィルムと固相フィルム固定器との一体化構造、常州博聞迪社製）、直径３ｍｍの鉄棒（即ち、回転移動式固定装置の柱状突起）、ヒトミオグロビン（即ち、対象サンプルであり、Sigma−Aldrich社製、カタログ番号がＦ３８７９−１Ｇである）、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置（即ち、検出器であり、ノルウェーSkannex社製）。
【０１３５】
２、実験方法
ヒトミオグロビン溶液の調製：実験一における２−１と同様であった。
５つの長さ１０ｍｍ、直径３ｍｍの鉄棒を切断し、実施例１の平面型遠心分離装置の遠心ロータの外側テレセントリック平面に垂直に溶接した。ミオグロビン金コロイドテストカードを取り、サンプル供給槽に近い近位端を穿孔し、溶接された垂直な鉄棒をミオグロビン金コロイドテストカードの近位端孔内に挿入し、金コロイド標識吸着フィルム（即ち、液体吸着分散部材）側の近位端にて遠心ロータの平面に固定し、ペリスタポンプのピペットの一端を対象サンプルおよび洗浄液容器内に置きながら、他端をテストカードのスポット槽（金コロイド標識吸着フィルム）に固定した。ペリスタポンプのピペットの三路を対象サンプルに向けて開いた。ペリスタポンプをオンにし、その速度を５０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、対象サンプル液がペリスタポンプのピペットのスポット槽側から流れ出て、金コロイド標識吸着フィルムに流れ込むことが観察された。遊星減速モータをオンにし、ポテンショメータによってその速度を１０００回転／分に調整し、２分間遠心した後、三路を洗浄液に回転させ、遊星減速モータの回転数を２０００回転／分に調整し、ペリスタポンプの速度を１５０ｕｌ／ｍｉｎに調整し、１分間遠心した後、ペリスタポンプをオフにし、遊星減速モータの回転数を５０００回転／分に調整し、継続して３０秒間遠心した後、遊星減速モータをオフにした。テストカードを取り出し、金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置に置いてその結果を読み取った。濃度が２５、５０、１００、３００、５００ｎｇ／ｍｌの一連のヒトミオグロビン溶液を順に検出した。実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【０１３６】
また、ミオグロビン金コロイドテストカードを取り、仕様書に従ってカード毎に１００ｕｌの既知濃度の系列ヒトミオグロビン溶液を滴下し、２０分間静置し、テストカードを金コロイド定量クロマトグラフィー分析装置に置いてその結果を読み取った。実験を３回にわたって繰り返し、結果として平均値を取った。
【０１３７】
３、実験結果
從來の金コロイド固相フィルム検出製品を用いて、本発明の回転移動式固定装置付き平面型遠心分離装置と從來の通常方法とを比較し、実験結果は、表３に示されるようなものであり、本発明の技術と従来技術で検出したサンプル真値との相関性を観察した。結果から、本発明の技術で検出した関連係数ｒが０．９９８であり、従来技術で検出した関連係数ｒが０．９８８であり、Ｐ＜０．０５であり、従来技術の検出結果よりも遥かに優れていることが示され、同時に、従来技術で検出する検出時間が２０分間のに対し、本発明の技術では３．５分間であり、本発明の技術は、従来技術に比べ検出正確性を向上させているとともに、検出時間を短縮していることが示唆される。
【０１３８】
表３  本発明の回転移動式固定遠心分離装置の比較実験（単位：ｎｇ／ｍｌ）
2019507887.tif 000017
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
１、本発明では、遠心装置により、検出される液相を固相フィルムを流れるように駆動し、洗浄することにより、被検出物の捕捉結合能力を向上させ、固相フィルムの背景ノイズ干渉を低減し、方法検出感度を向上させ、従来の検出試薬の高感度での検出を実現する。
【０１４０】
２、本発明では、遠心装置により、検出される液相を固相フィルムを流れるように駆動することにより、從來のフィルム検出技術では、自然に流れることを必須とし、かつ液体がフィルムにおける流動距離の延長に伴いその速度が低下する現状を改善し、液体がフィルムにて均一な速度で流れることを実現することができ、被検出物がフィルムにて均一に結合することを保証し、検出正確性を向上させることができる。
【０１４１】
３、本発明では、遠心装置により、検出される液相を固相フィルムを流れるように駆動することにより、液体がフィルムにて均一な速度で流れることを実現し、検出時間を短縮し、検出をすばやく行う利点を有する。從來のフィルム検出技術では、自然に流れることを必須とし、フィルムにおける液体の流動速度が時間に伴い低下する問題を解消し、１項目ごとの検出に通常１５分間以上かかるという欠点を解消する。
【０１４２】
４、本発明では、遠心装置により、液体が流れるように、そしてサンプル投入ポンプでサンプル投入するように駆動し、操作ステップが簡単であり、より簡便な小型化検出装置の開発に寄与する。從來の高感度検出技術では、駆動制御を多ステップ、多環節にわたって行い、検出サンプル、検出相および反応担体の位置変更および移動が一因となる欠点を解消する。
【０１４３】
５、本発明は、操作ステップが簡単であり、自動化操作を実現しやすい。本発明の方法は、高感度、全定量、自動化の特徴を有するとともに、検出をすばやく行い、使用装置が簡単である検出技術を有する。使用が簡便であり、原料の浪費を低減するとともに、作業効率を大幅に向上させ、検出および分析、分離など、様々な分野に適用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月11日(2018.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心装置により、被検出物を含む対象サンプルと、前記被検出物と直接又は間接的に特異性結合可能な検出インジケーターを含む物質である検出相と、を含む液相が固相フィルムを流れるように駆動するステップと、前記液相が固相フィルムを流れる際に、前記固相フィルムにコーティングされた被検出物の特異性結合物と結合して、検出インジケーター−被検出物−被検出物の特異性結合物の複合物を形成し、前記複合物が捕捉されて前記固相フィルムに固定され、検出器が、前記固相フィルムに間接的に固定された検出インジケーターの量を検出することで、前記被検出物の含有量を検出するステップと、を含む遠心分離検出方法。
【請求項２】
前記遠心装置の回転数及び前記サンプル投入装置のサンプル投入速度は、いずれもプログラム制御方式であり、
前記遠心装置の回転数は、２００〜１００００ｒ／ｍｉｎであり、
前記遠心装置による遠心時間は、１〜５ｍｉｎである、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記固相フィルムは、ニトロセルロースフィルム、ポリフッ化ビニリデンフィルム、ナイロンフィルムおよびＤＥＡＥセルロースであり、かつ前記固相フィルムの片面又は両面にバッキングが付いており、
前記検出器は、吸光度、蛍光、化学発光及び画像色デジタル処理のための検出器のうちのいずれかを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被検出物は、免疫活性を有するタンパク質又はタンパク質とカップリングした免疫活性化物質であり、
前記被検出物の特異的結合物は、前記被検出物と特異的に結合される抗原又は抗体であり、
前記検出インジケーターは、金属コロイド、染料、フルオレセイン及び化学発光物質のうちの少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記金属コロイドは、金コロイド、セレンコロイドおよび金コロイド磁性微粒子のうちの少なくとも１種であり、
前記フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネート、テトラエチルローダミン、ローダミンテトラメチルイソチオシアネート、フィコエリトリン、ポリダチンクロロフィルタンパク質、ヨウ化プロピジウム、アロフィコシアニン及びユウロピウム化合物のうちの少なくとも１種であり、
前記化学発光物質は、ルミノールとイソルミノールおよびその誘導体類、アクリジニウムエステルおよびアントラキノン類、（金アルカン）−１，２−ジオキシエタンおよびその誘導体ならびにターピリジンのうちの少なくとも１種である、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記方法において、前記複合物には、
１）前記被検出物の特異的結合物に、前記被検出物及び前記検出相の両方と特異的に結合される１次中間相が含まれるもの、
２）前記被検出物の特異的結合物に、前記１次中間相及び前記検出相の両方と特異的に結合される２次中間相が含まれるもの、のうちのいずれかが形成され、
前記１次中間相及び前記２次中間相は、いずれも特異的結合能力を有する抗原、抗体、アビジン、ビオチンおよびその類似体のうちの少なくとも１種であり、
前記結合反応の後に、界面活性剤を含有するリン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液及びTris緩衝液のうちの少なくとも１種である洗浄相で前記固相フィルムを洗浄するステップ、をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
免疫製品の含有量の検出における請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法の応用。
【国際調査報告】
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