(57)【要約】【課題】  ハイブリドーマ開発の分野内を含め、対象の抗原に特異的に結合することが可能な抗体を生成する細胞をスクリーニング及び識別することが関心を集めてきた。【解決手段】  マイクロ流体環境内で細胞を生成する抗体をスクリーニングする方法が本明細書に記載される。抗体生成細胞は、Ｂ細胞リンパ球であり得、これは、記憶Ｂ細胞又は血漿細胞であり得る。対象の抗原は、抗体生成細胞の近くに運ばれ得、抗体生成細胞によって生成された抗体による抗原の結合が監視され得る。抗体生成細胞から配列決定ライブラリを得る方法も記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球を検出する方法であって、
Ｂ細胞リンパ球を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入することであって、
前記マイクロ流体デバイスは、
フロー領域及び隔離ペンを有する囲い
を備え、
前記隔離ペンは、単一の開口部を有する分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域は、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、前記保持ペンの前記分離領域は、前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、
Ｂ細胞リンパ球を前記試料から前記隔離ペンの前記分離領域に装填することと、
前記対象の抗原が前記Ｂ細胞リンパ球の近くにあるように、前記対象の抗原を前記囲いの前記フロー領域に導入することと、
前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することと
を含み、
前記隔離ペンの前記分離領域は、少なくとも１つの調整表面を含む、
方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの調整表面は、共有結合で連結された親水性分子の層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有ポリマーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロ流体デバイスの前記囲いは、抗体生成細胞（ＤＥＰ）構成を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロ流体デバイスの前記囲いは、ベース、マイクロ流体回路構造、及びカバーを更に含み、前記ベース、前記マイクロ流体回路構造、及び前記カバーは、一緒にマイクロ流体回路を画定し、前記マイクロ流体回路は、前記フロー領域及び前記隔離ペンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベースは、第１の電極を含み、
前記カバーは、第２の電極を含み、及び
前記ベース又は前記カバーは、電極活性化基板を含み、
前記電極活性化基板は、複数のＤＥＰ電極領域を含む表面を有し、前記電極活性化基板の前記表面は、前記フロー領域の内面を提供する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記接続領域は、約２０μｍから約６０μｍの幅Ｗｃｏｎを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記接続領域は、長さＬｃｏｎを有し、前記接続領域の前記長さＬｃｏｎと前記接続領域の幅Ｗｃｏｎとの比率は、少なくとも１．５の値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分離領域は、前記接続領域の前記幅Ｗｃｏｎよりも大きい幅Ｗｉｓｏを有する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離領域は、約５０μｍから約２５０μｍの幅Ｗｉｓｏを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記隔離ペンは、約０．５ｎＬから約２．５ｎＬの容積を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記隔離ペンの前記分離領域は、被覆材料で被覆された少なくとも１つの表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被覆材料は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有ポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、末梢血の試料、脾臓生検、骨髄生検、リンパ節生検、又は腫瘍生検である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、末梢血の試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、骨髄生検である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞リンパ球は、記憶Ｂ細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞リンパ球は、血漿Ｂ細胞である、請求項１４又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、哺乳動物又は鳥類動物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、又はニワトリから得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物は、前記対象の抗原に対して免疫化されており、前記哺乳動物は、前記対象の抗原に関連付けられた病原体に露出されているか又はそれに対して免疫化されており、前記哺乳動物は、がんを有し、及び前記がんは、前記対象の抗原に関連付けられるか、又は前記哺乳動物は、自己免疫疾患を有し、及び前記自己免疫疾患は、前記対象の抗原に関連付けられる、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、Ｂ細胞リンパ球以外の細胞タイプが枯渇している、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ＣＤ２７を発現するＢ細胞リンパ球について富化されている、請求項１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ＣＤ１３８を発現するＢ細胞リンパ球について富化されている、請求項１又は２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、前記マイクロ流体デバイスに導入される前にデオキシリボヌクレアーゼに接触されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
単一のＢ細胞リンパ球は、前記分離領域に装填される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
複数のＢ細胞リンパ球は、前記分離領域に装填される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｂ細胞リンパ球を、Ｂ細胞活性化を刺激する刺激剤に接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記刺激剤は、ＣＤ４０アゴニストを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記刺激剤は、１つ又は複数のＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記刺激剤は、Ｂ細胞レセプタ（ＢＣＲ）ライゲート分子を更に含み、前記ＢＣＲライゲート分子は、プロテインＡ又はプロテインＧを含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＢＣＲライゲート分子は、微小物体に連結される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、前記Ｂ細胞リンパ球を、ＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞と、ビーズに共役されたプロテインＡとの混合物に接触させることを含み、前記Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、前記混合物を前記隔離ペンの前記分離領域に装填することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｂ細胞リンパ球は、３日から５日の期間にわたって前記刺激剤に略連続して接触される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
培地を前記Ｂ細胞リンパ球に提供することであって、前記培地は、Ｂ細胞の増殖及び／又は活性化を促進する１つ又は複数の薬剤を含む、提供することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記培地は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、及びＢＡＦＦ又はAprilを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記培地は、ＴＬＲアゴニストを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＴＬＲアゴニストは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｂ細胞リンパ球は、３日から５日の期間にわたって培地に提供される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記刺激剤に接触させること及び前記培地を提供することは、略同一の時間期間にわたって実行される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｂ細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域に装填することは、ＤＥＰ力を使用して、前記Ｂ細胞リンパ球を前記分離領域に移動させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｂ細胞リンパ球は、前記フロー領域から前記分離領域に移動される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象の抗原を提供することは、対象の可溶性抗原を含む溶液を、前記フロー領域内に又は前記フロー領域を通して流すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象の抗原は、第１の検出可能な標識に共有結合される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
第１の抗体結合剤を含む微小物体を提供することを更に含み、前記第１の抗体結合剤は、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への対象の抗原の結合を阻害することなく、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体に結合し、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することは、前記対象の抗原の前記微小物体への間接的な結合を検出することを含む、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１の抗体結合剤は、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体のＦｃドメインに結合する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記微小物体を提供することは、前記微小物体を含む溶液を前記フロー領域に流し、且つ前記微小物体が前記隔離ペンの近くに配置されると前記流れを停止させることを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記微小物体を含む前記溶液及び前記対象の可溶性抗原を含む前記溶液は、同じ溶液である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
第２の抗体結合剤を提供することであって、前記第２の抗体結合剤は、第２の検出可能な標識を含む、提供することと、
前記微小物体への前記第２の抗体結合剤の間接的な結合を監視することと
を更に含み、前記第１の検出可能な標識は、前記第２の検出可能な標識と異なる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２の抗体結合剤は、ＩｇＧ抗体に結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象の抗原を提供することは、前記対象の抗原を含む微小物体を提供することを含み、前記微小物体は、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象の抗原の前又は前記対象の抗原と同時に、標識された抗体結合剤を提供すること
を更に含み、前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を前記監視することは、前記対象の抗原への前記標識された抗体結合剤の間接的な結合を検出することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標識された抗体結合剤は、抗ＩｇＧ抗体に結合する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｂ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することは、前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンの全て又は一部を撮像することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記撮像することは、蛍光撮像することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記撮像することは、複数の画像を撮影することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記マイクロ流体デバイスは、複数の前記隔離ペンを含み、各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を有し、前記接続領域のそれぞれは、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、前記方法は、
前記複数のＢ細胞リンパ球の１つ又は複数を前記複数のうちの２つ以上の隔離ペンのそれぞれの前記分離領域に装填することと、
前記対象の抗原が、１つ又は複数のＢ細胞リンパ球が装填された前記２つ以上の隔離ペンのそれぞれの近くにあるように、前記対象の抗原を前記マイクロ流体デバイスに導入することと、
前記装填されたＢ細胞リンパ球のそれぞれによって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することと
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
単一のＢ細胞リンパ球は、前記複数のうちの前記２つ以上の隔離ペンのそれぞれの前記分離領域に装填される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記装填されたＢ細胞リンパ球又は前記装填されたＢ細胞リンパ球のうちのＢ細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を検出することと、
前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するものとして、前記装填されたＢ細胞リンパ球又は前記装填されたＢ細胞リンパ球のうちの前記Ｂ細胞リンパ球を識別することと
を更に含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
対象の抗原に特異的に結合する抗体を特徴付ける方法であって、
前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団を識別することであって、前記識別することは、請求項５９に記載の方法に従って実行される、識別することと、
前記Ｂ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団から、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を分離することと、
前記免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする前記核酸の少なくとも一部及び／又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする前記核酸の少なくとも一部を配列決定することと
を含む方法。
【請求項６１】
前記免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を配列決定することは、
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団のＢ細胞リンパ球を溶解させることと、
前記Ｂ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球から単離されたｍＲＮＡを逆転写することであって、前記ｍＲＮＡは、前記免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードし、それによりＶＨ  ｃＤＮＡを形成する、逆転写することと、
前記ＶＨ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定することと
を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を配列決定することは、
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団のＢ細胞リンパ球を溶解させることと、
前記Ｂ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団から単離されたｍＲＮＡを逆転写することであって、前記ｍＲＮＡは、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードし、それによりＶＬ  ｃＤＮＡを形成する、逆転写することと、
前記ＶＬ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定することと
を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ｍＲＮＡを逆転写することは、前記ｍＲＮＡを捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記逆転写することは、転写スイッチオリゴヌクレオチドの存在下で実行される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球は、溶解される前に前記マイクロ流体デバイスから搬出される、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団を搬出することは、
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に移動させることと、
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球を、前記フロー領域を通して且つ前記マイクロ流体デバイスから流すことと
を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から移動させることは、ＤＥＰ力を使用して、前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団を捕捉し且つ移動させることを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球は、前記マイクロ流体デバイス内で溶解される、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６９】
１つ又は複数の捕捉ビーズを、前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記Ｂ細胞リンパ球の近傍に提供することであって、前記１つ又は複数の捕捉ビーズは、前記ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は前記ＶＬ  ｍＲＮＡに結合することが可能なオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、提供することと、
前記識別されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団を溶解させることと、
前記溶解されたＢ細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記溶解されたＢ細胞リンパ球からの前記ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は前記ＶＬ  ｍＲＮＡを前記１つ又は複数の捕捉ビーズに結合させることと
を更に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記１つ又は複数の捕捉ビーズの各捕捉ビーズは、複数の捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記結合されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は前記結合されたＶＬ  ｍＲＮＡは、前記１つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡに逆転写される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡは、前記１つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、前記マイクロ流体デバイスから搬出される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記配列決定前に前記ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又は前記ＶＬ  ｃＤＮＡを増幅することを更に含む、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項７４】
前記増幅することは、前記Ｂ細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたｍＲＮＡにおいて、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片の表現を増大させることを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記増幅することは、
前記Ｂ細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたｍＲＮＡにおいて、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片の前記表現を増大させる増幅の第１のラウンドと、
前記第１のラウンドにおいて増幅されたＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片にバーコード配列を導入する増幅の第２のラウンドと
を含む、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１６年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４１１，６９０号及び２０１６年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４１２，０９２号の利益を主張する非仮出願であり、これらの開示のそれぞれは、全体的に参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[0002]  ハイブリドーマ開発の分野内を含め、対象の抗原に特異的に結合することが可能な抗体を生成する細胞をスクリーニング及び識別することが関心を集めてきた。更に、高度に発現する抗体生成細胞を識別することが関心を集めている。抗体生成細胞に適した成長環境を可能にする適した環境を提供すること及び結合／発現のアッセイを容易に監視し得る環境を提供することは、難しい問題であった。更に、アッセイ結果と、分泌した抗体の望ましい発現／結合特性を示す特定の細胞との相関を提供することが望ましい。抗体開発の分野のこれらの態様への改善が本明細書において提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
[0003]  本発明は、部分的に、マイクロ流体デバイス内で一次Ｂ細胞を含むＢ細胞リンパ球をスクリーニングして、Ｂ細胞リンパ球が、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するか否かを判断することができるという発見に基づく。したがって、一態様では、対象の抗原に特異的に結合する抗体の抗体生成細胞による発現を検出する方法が提供される。本方法は、抗体生成細胞をマイクロ流体デバイスに導入するステップを含む。抗体生成細胞は、例えば、記憶Ｂ細胞等のＢ細胞リンパ球又は血漿細胞であり得る。
【０００４】
[0004]  マイクロ流体デバイスは、例えば、マイクロ流体チャネルを含み得るフロー領域と、少なくとも１つのマイクロ流体隔離ペン（例えば、複数の隔離ペン）とを含むことができる。各隔離ペンは、分離領域と、分離領域をフロー領域（例えば、マイクロ流体チャネル）に流体的に接続する接続領域とを含むことができる。
【０００５】
[0005]  開示される方法の幾つかは、抗体生成細胞を隔離ペンの分離領域に装填する追加のステップと、対象の抗原が抗体生成細胞の近くにあるように、対象の抗原をマイクロ流体デバイスに導入する追加のステップと、抗体生成細胞によって発現された抗体への対象の抗原の結合を監視する追加のステップとを含む。装填される細胞は、複数の隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスに装填された細胞（例えば、Ｂ細胞）の集団の１つであり得る。そのような実施形態では、１つ又は複数の抗体生成細胞は、複数の隔離ペンのそれぞれの分離領域に装填され得る。幾つかの実施形態では、１つの抗体生成細胞は、各隔離ペンに装填される。対象の抗原は、抗体生成細胞の近傍に提供されると、溶けるか、又は細胞、リポソーム、脂質ナノラフト（lipid nanoraft）若しくは合成ビーズ（例えば、マイクロビーズ又はナノビーズ）等の微小物体に付着され得る。そのような微小物体は、顕微鏡で可視であり得る。対象の抗原と、抗体生成細胞によって生成された抗体との結合を監視することは、標識された対象の抗原を提供し、且つ対象の抗原（例えば、標識された対象の抗原）の直接結合を検出することと、標識された抗体結合剤を提供し、且つ対象の抗原（例えば、対象の抗原を提示する微小物体）への標識された抗体結合剤の間接的な結合を検出することと、抗体結合剤を提供することと、抗体結合剤（例えば、複数の抗体結合剤に連結された微小物体）への標識された対象の抗原の間接的な結合を検出することとを含むことができる。抗体結合剤は、アイソタイプに特異的（例えば、抗ＩｇＧ抗体又はそのＩｇＧ結合断片）であり得る。抗原、又は対象、又は抗体生成剤への標識は、蛍光標識であり得る。
【０００６】
[0006]  抗原結合抗体を発現するものとして識別された抗体生成細胞に対して、開示される方法は、識別された細胞（例えば、Ｂ細胞）を溶解させるステップと、溶解された細胞由来のＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又はＶＬ  ｍＲＮＡを逆転写して、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡをそれぞれ形成するステップと、前記ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定するステップとを更に含むことができる。溶解させるステップ及び逆転写するステップは、マイクロ流体デバイス内又はマイクロ流体デバイス外で実行され得る。例えば、識別された細胞は、細胞溶解及び更なる処理のために搬出され得る（例えば、単一の細胞として）。代替的に、識別された細胞は、装填された隔離ペン内で溶解され得、捕捉ビーズ（すなわちそれらの表面に連結されたオリゴヌクレオチドを有するビーズであり、オリゴヌクレオチドは、ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又はＶＬ  ｍＲＮＡに特異的に結合することが可能である）により、溶解時に解放されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又はＶＬ  ｍＲＮＡを配列決定することができる。捕捉ビーズは、捕捉されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は捕捉されたＶＬ  ｍＲＮＡが逆転写される前又は後のいずれかでマイクロ流体デバイスから搬出され得る。
【０００７】
[0007]  本発明の方法のこれら及び他の特徴及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲において記載されるか又はより詳細に明らかになるであろう。特徴及び利点は、添付の実施例及び特許請求の範囲において特に指摘される手段及び組合せにより実現及び取得され得る。更に、記載されるシステム及び方法の特徴及び利点は、実施により学習され得るか、又は以下に記載される説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】[0008]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイス及び関連付けられた制御機器を含むマイクロ流体デバイスと併用されるシステムの一例を示す。
【図１Ｂ】[0009]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイスの垂直断面図を示す。
【図１Ｃ】[0009]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイスの水平断面図を示す。
【図２Ａ】[0010]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、分離ペンを有するマイクロ流体デバイスの垂直断面図を示す。
【図２Ｂ】[0010]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、分離ペンを有するマイクロ流体デバイスの水平断面図を示す。
【図２Ｃ】[0011]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、隔離ペンの詳細な水平断面図を示す。
【図２Ｄ】[0012]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、分離ペンを有するマイクロ流体デバイスの部分的な水平断面図を示す。
【図２Ｅ】[0013]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、隔離ペンの詳細な水平断面図を示す。
【図２Ｆ】[0013]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、隔離ペンの詳細な水平断面図を示す。
【図２Ｇ】[0014]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、複数の隔離ペンにそれぞれ流体的に接続された複数のフローチャネルを含むフロー領域を有するマイクロ流体デバイスを示す。
【図２Ｈ】[0015]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、ベースの内向き表面及びカバーの内向き表面が調整表面であるマイクロ流体デバイスの部分的な垂直断面図を示す。
【図３Ａ】[0016]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイス及び関連付けられた制御機器と動作可能に結合するように構成されたシステムネストの特定の一例を示す。
【図３Ｂ】[0017]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイスを制御するシステムの光学縦列を示す。
【図４】[0018]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球を検出する例示的なワークフローにおけるステップを示す。
【図５Ａ】[0019]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、複数の隔離ペンにそれぞれ流体的に接続される複数のマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイスの写真表現であり、Ｂ細胞リンパ球をスクリーニングする方法を示す。
【図５Ｂ】[0019]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、複数の隔離ペンにそれぞれ流体的に接続される複数のマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイスの写真表現であり、Ｂ細胞リンパ球をスクリーニングする方法を示す。
【図５Ｃ】[0019]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、複数の隔離ペンにそれぞれ流体的に接続される複数のマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイスの写真表現であり、Ｂ細胞リンパ球をスクリーニングする方法を示す。
【図６Ａ】[0020]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、記憶Ｂ細胞を活性化しスクリーニングする方法の概略表現である。
【図６Ｂ】[0021]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、隔離ペンに移動中の個々の記憶Ｂ細胞の画像の画像である。
【図６Ｃ】[0022]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、多重アッセイの図である。
【図６Ｄ】[0023]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、アッセイ中の記憶Ｂ細胞の蛍光画像である。
【図６Ｅ】[0024]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、記憶Ｂ細胞の多クローン群をアッセイすることで始まり、次に記憶Ｂ細胞の群を続くアッセイのために個々の隔離ペンに分ける、記憶Ｂ細胞をスクリーニングする方法におけるステップの概略表現である。
【図７Ａ】[0025]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、血漿細胞をスクリーニングする方法の概略表現である。
【図７Ｂ】[0026]本明細書に開示される幾つかの実施形態による、アッセイ中の血漿細胞の明視野及び対応する蛍光画像の組である。
【図８】[0027]ＢＣＲ配列決定ライブラリを生成する方法の概略表現である。
【図９Ａ】[0028]単一の細胞の搬出及びｍＲＮＡ捕捉から生成されたｃＤＮＡのサイズ分布の電気泳動図分析のグラフィック表現である。
【図９Ｂ】[0029]本明細書に記載される方法の一実施形態によって生成された単一の細胞増幅産物から生成された電気泳動の写真表現である。
【図１０Ａ】[0030]本明細書に記載される方法の一実施形態による、１９個の個々の細胞から捕捉されたｍＲＮＡから生成された増幅産物の電気泳動の写真表現である。
【図１０Ｂ】[0030]本明細書に記載される方法の一実施形態による、１９個の個々の細胞から捕捉されたｍＲＮＡから生成された増幅産物の電気泳動の写真表現である。
【図１０Ｃ】[0030]本明細書に記載される方法の一実施形態による、１９個の個々の細胞から捕捉されたｍＲＮＡから生成された増幅産物の電気泳動の写真表現である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
[0031]  本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び用途、又は例示的な実施形態及び用途が動作する様式若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。更に、図は、簡易化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、強調されることもあれば、又は他に一定の比率でないこともある。加えて、「上」、「付着」、「接続」、「結合」、又は同様の言葉が本明細書において使用される場合、ある要素（例えば、材料、層、基板等）は、ある要素が他の要素の直接上にあるか、直接付着されるか、直接接続されるか、若しくは直接結合されるか否かに関係なく、又はある要素と別の要素との間に１つ若しくは複数の介在要素があるか否かに関係なく、別の要素の「上」にあり、別の要素に「付着」、「接続」、又は「結合」され得る。また、文脈により別のことが示される場合を除き、方向（例えば、上方、下方、上部、下部、横、上、下、の下、の上、上部の、下部の、横、縦、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供される場合、相対的なものであり、単に例として例示及び考察を容易にするために提供され、限定として提供されるものではない。加えて、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が言及される場合、そのような言及は、リスト自体に列挙された要素のいずれか１つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ、及び／又は列挙された全ての要素の組合せを包含することが意図される。本明細書でのセクション分割は、検討を容易にすることのみを目的とし、考察されるいかなる要素の組合せも限定しない。
【００１０】
[0032]    本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図された目的で機能するのに十分であることを意味する。そのため、「実質的に」という用語は、当業者によって予想されるような、ただし全体性能にそれほど影響を及ぼさない、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からのわずかな有意でない変動を許容する。数値又は数値として表現され得るパラメータ若しくは特性に対して用いられる場合、「実質的に」は、１０パーセント以内を意味する。
【００１１】
[0033]  本明細書で使用される場合、「ones」という用語は、２つ以上を意味する。
【００１２】
[0034]  本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超え得る。
【００１３】
[0035]  本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内において「位置する」を包含する。
【００１４】
[0036]  本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」とは、流体を保持するように構成された１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路であって、各マイクロ流体回路は、領域、流路、チャネル、チャンバ、及び／又はペンを含むが、これに限定されない流体的に相互接続された回路要素で構成される、１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路と、流体（及び任意選択的に流体中に懸濁した微小物体）をマイクロ流体デバイス内及び／又は外に流すように構成される少なくとも１つのポートとを含むデバイスである。通常、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルを含み得るフロー領域及び少なくとも１つのチャンバを含み、約１ｍＬ未満、例えば約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満、又は約２μＬ未満の容量の流体を保持する。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１μＬ〜約２μＬ、約１μＬ〜約３μＬ、約１μＬ〜約４μＬ、約１μＬ〜約５μＬ、約２μＬ〜約５μＬ、約２μＬ〜約８μＬ、約２μＬ〜約１０μＬ、約２μＬ〜約１２μＬ、約２μＬ〜約１５μＬ、約２μＬ〜約２０μＬ、約５μＬ〜約２０μＬ、約５μＬ〜約３０μＬ、約５μＬ〜約４０μＬ、約５μＬ〜約５０μＬ、約１０μＬ〜約５０μＬ、約１０μＬ〜約７５μＬ、約１０μＬ〜約１００μＬ、約２０μＬ〜約１００μＬ、約２０μＬ〜約１５０μＬ、約２０μＬ〜約２００μＬ、約５０μＬ〜約２００μＬ、約５０μＬ〜約２５０μＬ、又は約５０μＬ〜約３００μＬを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第１のポート（例えば、流入口）と流体的に接続される第１の端部と、マイクロ流体デバイスの第２のポート（例えば、流出口）と流体的に接続される第２の端部とを有するように構成され得る。
【００１５】
[0037]  本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１μＬ未満、例えば約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ以下の体積の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路要素を含有するマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個又はそれを超える）を含むであろう。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００ｐＬから１ｎＬ、約１００ｐＬから２ｎＬ、約１００ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから２ｎＬ、約２５０ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから５ｎＬ、約５００ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから１０ｎＬ、約７５０ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから２０ｎＬ、約１から１０ｎＬ、約１から１５ｎＬ、約１から２０ｎＬ、約１から２５ｎＬ又は約１から５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００から２００ｎＬ、約１００から３００ｎＬ、約１００から４００ｎＬ、約１００から５００ｎＬ、約２００から３００ｎＬ、約２００から４００ｎＬ、約２００から５００ｎＬ、約２００から６００ｎＬ、約２００から７００ｎＬ、約２５０から４００ｎＬ、約２５０から５００ｎＬ、約２５０から６００ｎＬ又は約２５０から７５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。
【００１６】
[0038]  マイクロ流体デバイス又はナノ流体デバイスは、本明細書では、「マイクロ流体チップ」若しくは「チップ」又は「ナノ流体チップ」若しくは「チップ」と呼ばれ得る。
【００１７】
[0039]  本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「流体チャネル」とは、水平寸法及び垂直寸法の両寸法よりも有意に長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を意味する。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えばその長さの少なくとも１０倍、その長さの少なくとも２５倍、その長さの少なくとも１００倍、その長さの少なくとも２００倍、その長さの少なくとも５００倍、その長さの少なくとも１，０００倍、その長さの少なくとも５，０００倍又はそれを超え得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、介在する任意の範囲を含めて約５０，０００ミクロンから約５００，０００ミクロンの範囲内である。幾つかの実施形態では、水平寸法は、約１００ミクロンから約１０００ミクロン（例えば、約１５０から約５００ミクロン）の範囲内であり、且つ垂直寸法は、約２５ミクロンから約２００ミクロン、例えば約４０から約１５０ミクロンの範囲内である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多様な空間構成を有し得るため、完全に線状の要素に限定されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、次の構成、即ちカーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク（例えば、複数の異なる流路）及びそれらの任意の組合せのいずれかを有する１つ以上のセクションを含み得る。加えて、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅及び狭窄を有し得る。
【００１８】
[0040]  本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの２つの異なる領域間又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分な大きさのバンプ又は類似のタイプの構造物を意味する。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペン及びマイクロ流体チャネル又はマイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
【００１９】
[0041]  本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの回路要素（又は２つの回路要素間のインターフェース）の幅の狭小化を意味する。狭窄は、例えば、マイクロ流体隔離ペンとマイクロ流体チャネルとの間のインターフェース又はマイクロ流体隔離ペンの分離領域と接続領域との間のインターフェースに位置決めし得る。
【００２０】
[0042]  本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、透過時に光を実質的に変化させることなく可視光を透過させる材料を意味する。
【００２１】
[0043]  本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本発明により分離及び／又は操作され得る任意の顕微鏡的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、微粒子；微小ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）；磁性ビーズ；微小ロッド；微小ワイヤ；量子ドット等の無生物微小物体、細胞；生物学的細胞小器官；ベシクル若しくは複合体；合成ベシクル；リポソーム（例えば、合成若しくは膜標本由来）；脂質ナノラフト等の生物学的微小物体、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞に付着した微小ビーズ、リポソームコーティング微小ビーズ、リポソームコーティング磁性ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、小分子シグナリング部分、又はアッセイで使用可能な他の化学／生物種等の共有結合若しくは非共有結合した部分／分子を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al. (2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”, Methods Enzymol., 464:211-231において説明されている。
【００２２】
[0044]  本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、用語「生体細胞」と同義で使用される。生体細胞の非限定的な例としては、真核細胞、植物細胞、哺乳類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞等の動物細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生細胞等、筋肉、軟骨組織、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織等の組織から解離された細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等の免疫細胞、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳類細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類等からの細胞であり得る。
【００２３】
[0045]  生体細胞のコロニーは、生殖可能なコロニー内の生細胞の全てが単一の親細胞由来の娘細胞である場合、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１４以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１７以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、２０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。「クローン細胞」という用語は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
【００２４】
[0046]  本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２つ以上の細胞（例えば、約２個から約２０個、約４個から約４０個、約６個から約６０個、約８個から約８０個、約１０個から約１００個、約２０個から約２００個、約４０個から約４００個、約６０個から約６００個、約８０個から約８００個、約１００個から約１０００個、又は約１０００個を超える細胞）を指す。
【００２５】
[0041]  本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞の生存及び／又は増殖を続けるのに必要な条件を提供する、流体及び気体の両方の成分と任意選択的に表面とを含む環境を提供することを意味する。
【００２６】
[0048]  本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞を指す場合、細胞数の増大を指す。
【００２７】
[0049]  流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、低分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物等をはじめとする培地中に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。
【００２８】
[0050]  流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」又は「拡散」は、流体培地の成分が濃度勾配の下方に熱力学的に移動することを意味する。
【００２９】
[0051]  「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、点間の圧力差に起因する一方の点から他方の点への流体培地の移動を含み得る。かかるフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期フロー、ランダムフロー、間欠フロー若しくは往復フロー又はそれらの任意の組合せを含み得る。一方の流体培地が他方の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合を生じ得る。
【００３０】
[0052]  「実質的にフローなし」という語句は、時間平均で流体培地中への又は流体培地中での材料の成分（例えば、対象のアナライト）の拡散速度未満の流体培地の流速を意味する。かかる材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に依存し得る。
【００３１】
[0053]  マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填されたときに各領域内の流体が単一体の流体を形成するように接続されることを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも同一の組成であることを意味するものではない。より正確には、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、溶質がそのそれぞれの濃度勾配の下方に移動するとき及び／又はマイクロ流体デバイスを貫流するときに流束内で異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、他の分子等の溶質の濃度が異なる）を有し得る。
【００３２】
[0054]  マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域と「非掃引」領域とを含み得る。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに培地のフローにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全部又は一部を含み得る。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに実質的に流体のフラックスなしにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。拡散を可能とするが、掃引領域と非掃引領域との間で培地が実質的にフローなしとなるように流体接続が構造化される限り、非掃引領域は、掃引領域に流体接続され得る。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ、掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化され得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下にさらに詳細に記載される）は、非掃引領域の例である。
【００３３】
[0055]  本明細書で使用される場合、「流路」とは、培地のフローのトラジェクトリーを画定し、且つその対象となる１つ以上の流体接続回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を意味する。そのため、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路の培地のフローの対象とならない流路を含む回路要素に流体接続し得る。
【００３４】
[0056]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｂ」は、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）ヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであるが、Ａ（アデニン）を含まない。
【００３５】
[0057]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｈ」は、Ａ、Ｃ、及びＴから選択されるヌクレオチドであるが、Ｇを含まない。
【００３６】
[0058]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｄ」は、Ａ、Ｇ、及びＴから選択されるヌクレオチドであるが、Ｃを含まない。
【００３７】
[0059]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｋ」は、Ｇ及びＴから選択されるヌクレオチドである。
【００３８】
[0060]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｎ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴから選択されるヌクレオチドである。
【００３９】
[0061]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｒ」は、Ａ及びＧから選択されるヌクレオチドである。
【００４０】
[0062]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｓ」は、Ｇ及びＣから選択されるヌクレオチドである。
【００４１】
[0063]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｖ」は、Ａ、Ｇ、及びＣから選択されるヌクレオチドであるが、Ｔを含まない。
【００４２】
[0064]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｙ」は、Ｃ及びＴから選択されるヌクレオチドである。
【００４３】
[0065]  本明細書で使用される場合、１つのヌクレオチドを示すのに使用される「Ｉ」は、イノシンである。
【００４４】
[0066]  本明細書で使用される場合、「＊」が後に続くＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇは、そのヌクレオチドのリン酸塩結合におけるホスホロチオエート置換を示す。
【００４５】
[0067]  本明細書で使用される場合、ＩｓｏＧは、イソグアノシンであり、ＩｓｏＣは、イソシチジンであり、ＩｓｏｄＧは、イソグアノシンデオキシリボヌクレオチドであり、ＩｓｏｄＣは、イソシチジンデオキシリボヌクレオチドである。イソグアノシン及びイソシチジンリボ又はデオキシリボヌクレオチドのそれぞれは、通常、ＤＮＡ又はＲＮＡ内に組み込まれたグアニンヌクレオ塩基又はシトシンヌクレオ塩基の異性体であるヌクレオ塩基をそれぞれ含む。
【００４６】
[0068]  本明細書で使用される場合、ｒＧは、通常であればデオキシリボヌクレオチドを含む核酸内に含まれるリボヌクレオチドを示す。全てのリボヌクレオチドを含む核酸は、各ヌクレオチドがリボヌクレオチドであることを示す標識を含まないことがあるが、文脈によって明らかにされる。
【００４７】
[0069]  本明細書で使用される場合、「プライミング配列」とは、より大きいオリゴヌクレオチドの一部であり、プライミング配列が自由３’末端を含むようにより大きいオリゴヌクレオチドから分離したとき、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）重合反応でプライマーとして機能することができるオリゴヌクレオチド配列である。
【００４８】
[0070]  本明細書で使用される場合、μｍは、マイクロメートルを意味し、μｍ３は、立方マイクロメートルを意味し、ｐＬは、ピコリットルを意味し、ｎＬは、ナノリットルを意味し、μＬ（又はｕＬ）は、マイクロリットルを意味する。
【００４９】
装填方法
[0071]  生物学的微小物体又は限定ではなくビーズ等の微小物体の装填は、本明細書に記載される流体フロー、重力、抗体生成細胞（ＤＥＰ）力、エレクトロウェッティング、磁力、又はそれらの任意の組合せの使用を含むことができる。ＤＥＰ力は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）構成による等、光学的に及び／又は時間／空間パターンでの複数の電極／１つの電極の領域の活性化による等、電気的に作動させることができる。同様に、エレクトロウェッティング力も、オプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構成による等、光学的に及び／又は時空間パターンでの複数の電極／１つの電極の領域の活性化による等、電気的に作動させ得る。
【００５０】
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを操作及び観測するシステム
[0072]  図１Ａは、対象の抗原に結合（例えば、特異的に結合）する抗体を分泌する抗体生成細胞のスクリーニング及び検出に使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の一例を示す。マイクロ流体デバイス１００の斜視図は、マイクロ流体デバイス１００内への部分図を提供するためにカバー１１０を部分的に切り欠いて示されている。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流体媒体１８０は、流路１０６を通して流れることができ、任意選択的に、１つ又は複数の微小物体（図示せず）を、マイクロ流体回路１２０内に及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送することができる。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適したマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２つ又は３つ）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それにかかわらず、マイクロ流体デバイス１００は、ナノ流体デバイスであるように構成することができる。図１Ａに示されている実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み、各マイクロ流体隔離ペンは、流路１０６と流通する開口部（例えば、１つの開口部）を有する。更に後述するように、マイクロ流体隔離ペンは、媒体１８０が流路１０６を通して流れている場合でも、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するのに最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前にマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
【００５１】
[0073]  図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０は囲い１０２により画定される。囲い１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、囲い１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
【００５２】
[0074]  図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれが囲い１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等の囲い１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
【００５３】
[0075]  支持構造体１０４は、１つ以上の電極（図示せず）と基板又は複数の相互接続基板とを含み得る。例えば、支持構造体１０４は、電極にそれぞれ電気接続された１つ以上の半導体基板を含み得る（例えば、半導体基板の全部又は一部は、単一電極に電気接続され得る）。支持構造体１０４は、プリント回路基板アセンブリ（「ＰＣＢＡ」）を更に含み得る。例えば、半導体基板は、ＰＣＢＡ上に実装され得る。
【００５４】
[0076]  マイクロ流体回路構造体１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。かかる回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填されたときに流体相互接続が可能な空間又は領域、例えば（１又は複数のフローチャネルを含み得る）フロー領域、チャンバ、ペン、トラップ等を含み得る。図１Ａに例示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路構造体１０８は、フレーム１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。フレーム１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的に又は完全に包囲することができる。フレーム１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に取り囲む比較的剛性の構造体であり得る。例えば、フレーム１１４は、金属材料を含み得る。
【００５５】
[0077]  マイクロ流体回路材料１１６は、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続部を画定するようにキャビティ等によってパターニングされ得る。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過性であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含み得る。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、エッチング可能な材料、例えばシリコーン（例えば、光パターニング可能なシリコーン又は「ＰＰＳ」）、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、かかる材料、即ちマイクロ流体回路材料１１６は、剛性及び／又はガスに対して実質的に不透過性であり得る。それとは関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及びフレーム１１４内に配置され得る。
【００５６】
[0078]  カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
【００５７】
[0079]  幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極をさらに含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
【００５８】
[0080]  図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを操作及び制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６内に組み込まれ、デバイス１９０は図１に示されていない）を含む。
【００５９】
[0081]  電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（後述するように、撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器をさらに含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図４３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）をさらに含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００６０】
[0082]  システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（後述するように、傾斜モジュール１６６の一部）を含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含む囲い１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
【００６１】
[0083]  幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
【００６２】
[0084]  幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。さらに、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。さらに他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
【００６３】
[0085]  システム１５０は培地源１７８をさらに含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００の囲い１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
【００６４】
[0086]  図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６のような、他の制御及び監視機器を制御するマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２をさらに含むことができる。
【００６５】
[0087]  マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
【００６６】
[0088]  培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０を囲い１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、囲い１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及び囲い１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
【００６７】
[0089]  原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、囲い１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
【００６８】
[0090]  撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度をさらに計算することができる。
【００６９】
[0091]  傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
【００７０】
[0092]  図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への１つの開口部を含むが、他の箇所は、ペンが微小物体を流体媒体１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６内又は他のペン内の微小物体からペン内部に実質的に分離することができるように囲まれている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９から拡張して、囲いを提供する。チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、流体媒体１８０のフロー１０６に傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の場所に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、マイクロ流体回路１２０内で１つ又は複数の微小物体を物理的に囲うように構成される。本発明による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
【００７１】
[0093]  マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、ある抗体生成細胞を別の抗体生成細胞から分離する等の抗体生成細胞のスクリーニングに有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、単一の細胞の装填及び／又は抗体生成細胞のコロニー（例えば、クローンコロニー）の成長の促進等の他の利点を提供することもできる。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
【００７２】
[0094]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペンを含み、隔離ペンの２つ以上は、抗体生成細胞をスクリーニングするための異なる利点を提供する異なる構造及び／又は特徴を含む。抗体生成細胞のスクリーニングに有用なマイクロ流体デバイスは、任意の隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０又はその変形形態を含み得、及び／又は後述するように、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆに示されるように構成されたペンを含み得る。
【００７３】
[0095]  図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７をさらに含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
【００７４】
[0096]  幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、それら隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
【００７５】
[0097]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２をさらに含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
【００７６】
[0098]  トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴をさらに含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
【００７７】
[0099]  幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本発明の教示により、前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
【００７８】
[0100]  他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。さらに、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本発明の教示により、前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
【００７９】
[0101]  幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。さらに他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
【００８０】
[0102]  図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の実施に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスのさらに別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
【００８１】
[00103]  抗体生成細胞を配置し、培養し、監視し、及び／又はスクリーニングすることができるペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第１４／０６０，１１７号、同第１４／５２０，５６８号、及び同第１４／５２１，４４７号に記載されており、これらは、それぞれ全体的に参照により本明細書に援用される。上記出願のそれぞれは、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又はオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されたマイクロ流体デバイスを更に記載している。例えば、米国特許出願公開第１４／０６０，１１７号の図２に示されている光電子ツイーザデバイスは、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体の群を選択し且つ移動させるために本発明の実施形態において利用することができるデバイスの一例である。
【００８２】
マイクロ流体デバイス構成。
[00104]  上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
【００８３】
[00105]  ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、開放領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、流域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。さらに、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることをさらに理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
【００８４】
[00106]  図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
【００８５】
[00107]  特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、流域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
【００８６】
[00108]  電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
【００８７】
[00109]  
図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
【００８８】
[00110]  幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０８の内面２０６上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００８９】
[00111]  他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
【００９０】
[00112]  フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ｏｈｔａら）（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）に記載されており、それぞれの内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００９１】
[00113]  ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。さらに、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
【００９２】
[00114]  ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をデバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をデバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
【００９３】
[00115]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００９４】
[00116]  更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
【００９５】
[00117]  誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
【００９６】
[00118]  
幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５から３．０ｎｍ）を有する。
【００９７】
[00119]  幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。さらに、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
【００９８】
[00120]  幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
【００９９】
[00121]  したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
【０１００】
[00122]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１０１】
[00123]  マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
【０１０２】
隔離ペン
[00124]  一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例を、図２Ａ〜図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示す。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０を画定する分離構造２３２と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体的に接続する接続領域２３６とを含むことができる。接続領域２３６は、チャネル１２２への基端開口部２３４と、分離領域２４０への先端開口部２３８とを含むことができる。接続領域２３６は、チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８に流れている流体媒体（図示せず）のフローの最大貫入深さが分離領域２４０内に延びないように構成することができる。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、したがってチャネル１２２内の媒体１８０のフローから分離され、フローから実質的に影響を受けないことができる。
【０１０３】
[00125]  図２Ａ〜図２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、チャネル１２２に直接開く１つの開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、チャネル１２２から側方に開く。電極活性化基板２０６は、チャネル１２２並びに隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する隔離ペンの囲い内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はフロー領域のそれぞれ）のフロアを形成するチャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は最も高い隆起部から最も低い窪みまで約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．８μｍ未満、約０．７μｍ未満、約０．６μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．３μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満変化する不規則若しくはパターン化された表面を有し得る。チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の高さ変動は、隔離ペンの壁又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明するが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０にも当てはまる。
【０１０４】
[00126]  したがって、チャネル１２２は、掃引領域の一例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引領域の例であり得る。上述したように、チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体媒体１８０を含むように構成することができる。図２Ａ及び図２Ｂに示される例では、ポート２２２は、チャネル１２２に接続され、流体媒体１８０をマイクロ流体デバイス２３０に導入するか又はマイクロ流体デバイス２３０から除去することができる。流体媒体１８０の導入前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングされ得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体媒体１８０を含むと、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２は、選択的に生成及び停止され得る。例えば、示されているように、ポート２２２は、チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、媒体のフロー２４２は、流入口として機能する１つのポートから、流出口として機能する別のポート２２２へと生成され得る。
【０１０５】
[00127]  図２Ｃは、本発明による隔離ペン２２４の一例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
【０１０６】
[00128]  既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を超えたマイクロ流体チャネル１２２における流体媒体１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への媒体１８０の二次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を二次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち基端開口部２３４から先端開口部２３８への）は、接続領域２３６内への二次フロー２４４の貫入深さＤｐよりも大きい値であるべきである。二次フロー２４４の貫入深さＤｐは、チャネル１２２内を流れる流体媒体１８０の速度並びにチャネル１２２及びチャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、チャネル１２２及び開口部２３４の構成は、一定であるが、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２の流速は、可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、二次フロー２４４の貫入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証する、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２の最大速度Ｖｍａｘを識別することができる。チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２の流速が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果的に生成される二次フロー２４４は、チャネル１２２及び接続領域２３６に制限され得、分離領域２４０外に維持され得る。したがって、チャネル１２２内の媒体１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き出さない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
【０１０７】
[00129]  更に、チャネル１２２内の媒体１８０のフロー２４２の流速がＶｍａｘを超えない限り、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２は、種々の粒子（例えば、マイクロ粒子及び／又はナノ粒子）をチャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを二次フロー２４４の最大貫入深さＤｐよりも大きくすることにより、チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄにおける隔離ペン２２６、２２８）からの種々の粒子で１つの隔離ペン２２４が汚染されることを阻止することができる。
【０１０８】
[00130]  チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、チャネル１２２内の媒体１８０のフロー２４２による影響を受け得るため、チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方では、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、チャネル１２２内の第１の流体媒体１８０の成分（図示せず）は、実質的に、チャネル１２２から接続領域２３６を通した分離領域２４０内の第２の流体媒体２４８内への第１の媒体１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体媒体２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の媒体２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通したチャネル１２２内の第１の媒体１８０への第２の媒体２４８の成分の拡散によってのみ、チャネル１２２内の第１の媒体１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域とフロー領域との間の流体媒体交換の程度は、全体流体交換量の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれを超える割合である。第１の媒体１８０は、第２の媒体２４８と同じ媒体又は異なる媒体であり得る。更に、第１の媒体１８０及び第２の媒体２４８は、同じものから始まり、次に異なることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞による第２の媒体２４８の調整を通して又はチャネル１２２を通して流れる媒体１８０を変更することにより）。
【０１０９】
[00131]  チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２によって生じる二次フロー２４４の最大貫入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存することができる。そのようなパラメータの例には、チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、媒体を接続領域２３６に向け、媒体を接続領域２３６から逸らすか、又はチャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に略直交する方向に媒体を向けることができる）、基端開口部２３４におけるチャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）、基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の媒体１８０及び／又は第２の媒体２４８の粘度等がある。
【０１１０】
[00132]  幾つかの実施形態では、チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、チャネル１２２内の流体媒体１８０のフロー２４２のベクトルに関して以下のように向けることができる：チャネル幅Ｗｃｈ（又はチャネル１２２の断面積）は、媒体１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、チャネル１２２内の媒体１８０のフロー２４２に略平行することができ、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、チャネル１２２内の媒体１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は、単なる例であり、チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであることもできる。
【０１１１】
[00133]  図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎに関して本明細書で識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
【０１１２】
[00134]  図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８における分離領域２４０の幅Ｗｉｓｏは、基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８における分離領域２４０の幅Ｗｉｓｏは、基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎに関して本明細書で識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８における分離領域２４０の幅Ｗｉｓｏは、基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい又は小さい値であり得る。更に、先端開口部２３８は、基端開口部２３４よりも小さい開口部であり得、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間よりも狭い開口部であり得る。例えば、接続領域２３６は、多様な異なるジオメトリ（例えば、接続領域の面取り、接続領域の斜角付け）を使用して、基端開口部と先端開口部との間よりも狭い領域であり得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又は部分の一部を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の一部）。
【０１１３】
[00135]  図２Ｄ〜図２Ｆは、マイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示し、マイクロ流体デバイス２５０、マイクロ流体回路２６２、及びフローチャネル２６４は、図１のマイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４のそれぞれの変形形態である。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ〜図２Ｆに示されているデバイス２５０の隔離ペン２６６は、デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、又は３２０における任意の上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８で置換可能であることを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３２０及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素と同じ又は異なるＤＥＰ構成を有することもできる。
【０１１４】
[00136]  図２Ｄ〜図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造（図２Ｄ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造１０４と同じであるか又は略同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｄ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じであるか又は略同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は、フレーム２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは、図１Ａに示されるデバイス１００のフレーム１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じであるか又は略同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は、複数の隔離ペン２６６を流体的に接続することができる複数のチャネル２６４（２つが示されているが、より多数が存在し得る）を含むことができる。
【０１１５】
[00137]  各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２における先端開口部２７６まで、接続領域２６８は、チャネル２６４を分離領域２７０に流体的に接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体媒体２５４のフロー２７８は、チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の媒体２５４の二次フロー２８２を生成することができる。
【０１１６】
[00138]  図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４への基端開口部２７４と、分離構造２７２への先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、二次フロー２８２の最大貫入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、二次フロー２８２は、分離領域２７０に向けてリダイレクトされずに接続領域２６８内の延びることになる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大貫入深さＤｐ未満の長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、二次フロー２８２は、接続領域２６８を通して延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされることになる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和は、最大貫入深さＤｐよりも大きく、したがって、二次フロー２８２は、分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが貫入深さＤｐよりも大きいか否か、又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が貫入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の媒体２５４のフロー２７８は、貫入深さＤｐを有する二次フローを生成することになり、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（図示されていないが、図２Ｃに示されている微小物体２４６と同じであるか又は略同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の媒体２５４のフロー２７８により分離領域２７０から引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８も、種々の材料（図示せず）をチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０中に引き込まない。したがって、拡散は、チャネル２６４内の第１の媒体２５４内の成分をチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の媒体２５８中に移動させることができる唯一のメカニズムである。同様に、拡散は、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の媒体２５８中の成分を分離領域２７０からチャネル２６４内の第１の媒体２５４に移動させることができる唯一のメカニズムである。第１の媒体２５４は、第２の媒体２５８と同じ媒体であり得、又は第１の媒体２５４は、第２の媒体２５８と異なる媒体であり得る。代替的に、第１の媒体２５４及び第２の媒体２５８は、同じものから始まり、次に例えば分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞による第２の媒体の調整を通して又はチャネル２６４を通して流れる媒体を変更することにより異なり得る。
【０１１７】
[00139]  図２Ｅに示されるように、チャネル２６４内のチャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち図２Ｄにおける矢印２７８で示されるチャネルを通る流体媒体フローの方向を横断して測定される）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１と略直交することができ、したがって先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２と略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって９０°以外であり得る。代替の向きの角度の例には、任意の以下の範囲内の角度がある：約３０°から約９０°、約４５°から約９０°、約６０°から約９０°等。
【０１１８】
[00140]  隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つのみ、３つのみ、４つのみ、５つのみ、又は同様の比較的少数の微小物体を含むように構成することができる。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６μｍ、又は６×１０６立方μｍ、又はそれを超え得る。
【０１１９】
[00141]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：約５０μｍ〜約１０００μｍ、約５０μｍ〜約５００μｍ、約５０μｍ〜約４００μｍ、約５０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約２５０μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約５０μｍ〜約１００μｍ、約７０μｍ〜約５００μｍ、約７０μｍ〜約４００μｍ、約７０μｍ〜約３００μｍ、約７０μｍ〜約２５０μｍ、約７０μｍ〜約２００μｍ、約７０μｍ〜約１５０μｍ、約９０μｍ〜約４００μｍ、約９０μｍ〜約３００μｍ、約９０μｍ〜約２５０μｍ、約９０μｍ〜約２００μｍ、約９０μｍ〜約１５０μｍ、約１００μｍ〜約３００μｍ、約１００μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ、及び約１００μｍ〜約１２０μｍ。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００μｍ〜約８００μｍ、約２００μｍ〜約７００μｍ、又は約２００μｍ〜約６００μｍの範囲内であり得る。上記は、単なる例であり、チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、他の範囲（例えば、任意の上記で列挙した端点により定義される範囲）内であることもできる。更に、チャネル１２２のＷｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のチャネルの領域において任意のこれらの範囲内であるように選択することができる。
【０１２０】
[00142]  幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０μｍから約２００μｍ又は約５０μｍから約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０４平方μｍから約３×１０６平方μｍ、約２×１０４平方μｍから約２×１０６平方μｍ、約４×１０４平方μｍから約１×１０６平方μｍ、約２×１０４平方μｍから約５×１０５平方μｍ、約２×１０４平方μｍから約１×１０５平方μｍ、又は約２×１０５平方μｍから約２×１０６平方μｍの断面積を有する。幾つかの実施形態では、接続領域は、約２０μｍから約１００μｍ、約３０μｍから約８０μｍ、又は約４０μｍから約６０μｍの断面幅を有する。
【０１２１】
[00143]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０μｍ〜１００μｍ、２０μｍ〜９０μｍ、２０μｍ〜８０μｍ、２０μｍ〜７０μｍ、２０μｍ〜６０μｍ、２０μｍ〜５０μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜９０μｍ、３０μｍ〜８０μｍ、３０μｍ〜７０μｍ、３０μｍ〜６０μｍ、３０μｍ〜５０μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜９０μｍ、４０μｍ〜８０μｍ、４０μｍ〜７０μｍ、４０μｍ〜６０μｍ、又は４０μｍ〜５０μｍ。上記は、単なる例であり、チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、他の範囲（例えば、任意の上記で列挙した端点により定義される範囲）内であることもできる。チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のチャネルの領域において任意のこれらの範囲内であるように選択することができる。
【０１２２】
[00144]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００平方μｍ〜５０，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜４０，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜３０，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜２５，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜２０，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜１５，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜１０，０００平方μｍ、５００平方μｍ〜７，５００平方μｍ、５００平方μｍ〜５，０００平方μｍ、１，０００平方μｍ〜２５，０００平方μｍ、１，０００平方μｍ〜２０，０００平方μｍ、１，０００平方μｍ〜１５，０００平方μｍ、１，０００平方μｍ〜１０，０００平方μｍ、１，０００平方μｍ〜７，５００平方μｍ、１，０００平方μｍ〜５，０００平方μｍ、２，０００平方μｍ〜２０，０００平方μｍ、２，０００平方μｍ〜１５，０００平方μｍ、２，０００平方μｍ〜１０，０００平方μｍ、２，０００平方μｍ〜７，５００平方μｍ、２，０００平方μｍ〜６，０００平方μｍ、３，０００平方μｍ〜２０，０００平方μｍ、３，０００平方μｍ〜１５，０００平方μｍ、３，０００平方μｍ〜１０，０００平方μｍ、３，０００平方μｍ〜７，５００平方μｍ、又は３，０００から６，０００平方μｍ。上記は、単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるチャネル（例えば、１２２）の断面積は、他の範囲（例えば、任意の上記で列挙した端点により定義される範囲）内であることもできる。
【０１２３】
[00145]  隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約２０μｍから約３００μｍ、約４０μｍから約２５０μｍ、約６０μｍから約２００μｍ、約８０μｍから約１５０μｍ、約２０μｍから約５００μｍ、約４０μｍから約４００μｍ、約６０μｍから約３００μｍ、約８０μｍから約２００μｍ、又は約１００μｍから約１５０μｍ。上記は、単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、任意の上記で列挙した端点により定義される範囲）内であることもできる。
【０１２４】
[00146]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約２０μｍから約１５０μｍ、約２０μｍから約１００μｍ、約２０μｍから約８０μｍ、約２０μｍから約６０μｍ、約３０μｍから約１５０μｍ、約３０μｍから約１００μｍ、約３０μｍから約８０μｍ、約３０μｍから約６０μｍ、約４０μｍから約１５０μｍ、約４０μｍから約１００μｍ、約４０μｍから約８０μｍ、約４０μｍから約６０μｍ、約５０μｍから約１５０μｍ、約５０μｍから約１００μｍ、約５０μｍから約８０μｍ、約６０μｍから約１５０μｍ、約６０μｍから約１００μｍ、約６０μｍから約８０μｍ、約７０μｍから約１５０μｍ、約７０μｍから約１００μｍ、約８０μｍから約１５０μｍ、及び約８０μｍから約１００μｍ。上記は、単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なる（例えば、任意の上記で列挙した端点により定義される範囲）こともできる。
【０１２５】
[00147]  隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、Ｂ細胞若しくはＴ細胞等の免疫細胞又はハイブリドーマ細胞であり得る生体細胞）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）が配置されることになる隔離ペンの基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意のものであり得る：約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、又は約８０μｍ。上記は、単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なる（例えば、任意の上記で列挙した端点により定義される範囲）こともできる。
【０１２６】
[00148]  隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１０．０、又はそれを超えるもの。上記は、単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なり得る。
【０１２７】
[00149]  マイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０の様々な実施形態では、Ｖｍａｘは、約０．２μＬ／秒、約０．３μＬ／秒、約０．４μＬ／秒、約０．５μＬ／秒、約０．６μＬ／秒、約０．７μＬ／秒、約０．８μＬ／秒、約０．９μＬ／秒、約１．０μＬ／秒、約１．１μＬ／秒、約１．２μＬ／秒、約１．３μＬ／秒、約１．４μＬ／秒、約１．５μＬ／秒、約２．０μＬ／秒、約２．５μＬ／秒、約３．０μＬ／秒、約３．５μＬ／秒、約４．０μＬ／秒、約４．５μＬ／秒、又は約５．０μＬ／秒に設定することができる。
【０１２８】
[00150]  隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、隔離ペンの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、又はそれを超え得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、隔離ペンの容積は、約５×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、又はそれを超え得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約０．５ｎＬから約１０ｎＬ、約１．０ｎＬから約５．０ｎＬ、約１．５ｎＬから約４．０ｎＬ、約２．０ｎＬから約３．０ｎＬ、約２．５ｎＬ、又は上記端点の２つにより定義される任意の範囲であり得る。
【０１２９】
[00151]  様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスが約５個から約１０個の隔離ペン、約１０個から約５０個の隔離ペン、約１００個から約５００個の隔離ペン、約２００個から約１０００個の隔離ペン、約５００個から約１５００個の隔離ペン、約１０００個から約２０００個の隔離ペン、又は約１０００個から約３５００個の隔離ペンを有する本明細書で考察された任意の実施形態におけるように構成された隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、多様な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴を含み得る。
【０１３０】
[00152]  幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスが約１５００個から約３０００個の隔離ペン、約２０００個から約３５００個の隔離ペン、約２５００個から約４０００個の隔離ペン、約３０００個から約４５００個の隔離ペン、約３５００個から約５０００個の隔離ペン、約４０００個から約５５００個の隔離ペン、約４５００個から約６０００個の隔離ペン、約５０００個から約６５００個の隔離ペン、約５５００個から約７０００個の隔離ペン、約６０００個から約７５００個の隔離ペン、約６５００個から約８０００個の隔離ペン、約７０００個から約８５００個の隔離ペン、約７５００個から約９０００個の隔離ペン、約８０００個から約９５００個の隔離ペン、約８５００個から約１０，０００個の隔離ペン、約９０００個から約１０，５００個の隔離ペン、約９５００個から約１１，０００個の隔離ペン、約１０，０００個から約１１，５００個の隔離ペン、約１０，５００個から約１２，０００個の隔離ペン、約１１，０００個から約１２，５００個の隔離ペン、約１１，５００個から約１３，０００個の隔離ペン、約１２，０００個から約１３，５００個の隔離ペン、約１２，５００個から約１４，０００個の隔離ペン、約１３，０００個から約１４，５００個の隔離ペン、約１３，５００個から約１５，０００個の隔離ペン、約１４，０００個から約１５，５００個の隔離ペン、約１４，５００個から約１６，０００個の隔離ペン、約１５，０００個から約１６，５００個の隔離ペン、約１５，５００個から約１７，０００個の隔離ペン、約１６，０００個から約１７，５００個の隔離ペン、約１６，５００個から約１８，０００個の隔離ペン、約１７，０００個から約１８，５００個の隔離ペン、約１７，５００個から約１９，０００個の隔離ペン、約１８，０００個から約１９，５００個の隔離ペン、約１８，５００個から約２０，０００個の隔離ペン、約１９，０００個から約２０，５００個の隔離ペン、約１９，５００個から約２１，０００個の隔離ペン、又は約２０，０００個から約２１，５００個の隔離ペンを有する本明細書で考察された任意の実施形態におけるように構成された隔離ペンを有する。
【０１３１】
[00153]  図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。マイクロ流体デバイス２８０は、図２Ｇに示され、マイクロ流体デバイス１００の様式化図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は、本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２から開く複数の隔離ペンを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び二次フロー２４４の最大貫入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び二次フロー２４４の最大貫入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
【０１３２】
[00154]  図３Ａ及び図３Ｂは、本発明によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２８０、２５０、２９０、３２０）の操作及び観測に使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学作動式動電デバイス１００）と相互作用し、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することが可能なソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、統合された電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイスがソケット３０２によって保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたって印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成することができる。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は、電源１９２の一部であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加可能であることは、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２によって保持されているときに常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、マイクロ流体デバイス３２０において、例えば誘電泳動又はエレクトロウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
【０１３３】
[00155]  図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載することができ、且つＰＣＢＡ３２２内に電気的に統合することができる。例示的な支持体は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されたソケット３０２も同様に含む。
【０１３４】
[00156]  通常、電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、オシロスコープ（図示せず）及び／又は波形生成器から受信した波形を増幅するように構成される波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２によって保持されたマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成することができる。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端（及び波形生成器の先端）における位置における波形を測定し、したがってデバイスに実際に印加される波形の測定におけるより高い精度を保証する。オシロスコープ測定から得られたデータは、例えば、波形生成器へのフィードバックとして提供することができ、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成することができる。波形生成器とオシロスコープとの適した組合せの一例は、Red Pitaya（商標）である。
【０１３５】
[00157]  特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４を検知及び／又は制御するのに使用されるマイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適したマイクロプロセッサの例には、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサがある。コントローラ３０８は、機能及び分析の実行に使用し得、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して、機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インターフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
【０１３６】
[00158]  幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）と、Red Pitayaユニットによって生成された波形を増幅し、増幅された電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含む電気信号生成サブシステム３０４を含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０における増幅電圧を測定し、次にマイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されたＤＣ−ＤＣ変換器の対によって生成される＋６．５Ｖから−６．５Ｖの電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において最大で１３Ｖｐｐの信号が生成される。
【０１３７】
[00159]  図３Ａに示されるように、支持構造３００は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造３００によって保持されたマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成することができる。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面とインターフェースするように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面とインターフェースするように構成することができる。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却された流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含み、冷却された流体を外部リザーバ（図示せず）から受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックに通し、次に冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源によって達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路によって提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路は、デジタル回路によって提供することができる。
【０１３８】
[00160]  幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０を有する）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％）を含むアナログ分圧器回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モータ駆動装置（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ｐｉｎの両方を駆動して、熱電電源を作動させ、それによりペルチェ熱電デバイスを制御することができる。
【０１３９】
[00161]  ネスト３００は、コントローラ３０８のマイクロプロセッサがインターフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信できるようにするシリアルポート３２４を含むことができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インターフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためのスケーリング計算を実行することにより、電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られた温度及び波形データをプロットするように構成することができる。代替又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
【０１４０】
[00162]  上述したように、システム１５０は、撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は、光変調サブシステム３３０（図３Ｂを参照されたい）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイ（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれも、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成することができる。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発光ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を放射することが可能であり得る。適した光変調サブシステム３３０の一例は、Andor Technologies（商標）からのMosaic（商標）システムである。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
【０１４１】
[00163]  特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成することができる。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であり得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載されるように構成することができ、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一部に搭載されるように構成することができる。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
【０１４２】
[00164]  特定の実施形態では、顕微鏡３５０は、１つ又は複数の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は、撮像モジュール１６４によって制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、一方の検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得る一方、他方の検出器は、高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は放射された光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも一部を１つ又は複数の検出器３４８上に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なり得るように異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
【０１４３】
[00165]  特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は、構造化光の生成（例えば、光変調サブシステム３３０を介して）に使用することができ、第２の光源３３４は、非構造化光の生成に使用することができる。第１の光源３３２は、光学作動式動電及び／又は蛍光励起のための構造化光を生成することができ、第２の光源３３４は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して第１の光源３３２を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００によって保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム３３０から受け取り、光学作動式動電デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域で構造化光を結像し、（２）マイクロ流体デバイスからの反射光及び／又は放射光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも一部を検出器３４８に結像するように構成することができる。光学縦列は、デバイスがネスト３００によって保持されているとき、第２の光源から非構造化光を受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域に結像するように更に構成することができる。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は、重複する領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。
【０１４４】
[00166]  図３Ｂでは、第１の光源３３２は、光を光変調サブシステム３３０に供給して示されており、光変調サブシステム３３０は、構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。第２の光源３３４は、ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供して示されている。光変調サブシステム３３０からの構造化光及び第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を一緒に通り、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じてダイクロイックフィルタ３３８）に達し、そこで、光は、対物レンズ３３６を通して下方の試料平面３４２に反射される。次に、試料平面３４２からの反射光及び／又は放射光は、対物レンズ３４０を通り、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に戻る。ダイクロイックフィルタ３４６に達した光の一部のみがダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に達する。
【０１４５】
[00167]  幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は、青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料平面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に達することが可能である。逆に、光変調サブシステム３３０から到来する構造化光は、試料平面３４２から反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波による除外は、仮に光変調サブシステムから放射された光が４９５ｎｍよりも短いあらゆる波長を含まない場合にのみ完全である（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から到来する光が、４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかは、フィルタ３４６を透過して検出器３４８に達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に達する光の量と、第２の光源３３４から検出器３４８に達する光の量とのバランスを変更するように機能する。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強い場合に有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
【０１４６】
被覆溶液及び被覆剤
[00168]  理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス内の生体細胞（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞等の免疫細胞）等の微小物体の培養は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスとマイクロ流体デバイス内に維持される微小物体（例えば、生体細胞）との間に一次界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層が存在するように調整又は被覆された場合に促進され得る（すなわち、微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存性の増大、増殖性の増大、及び／又は可搬性の増大を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体デバイスのカバー、及び／又は回路材料の表面）は、被覆溶液及び／又は被覆剤で処理して、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成する。幾つかの実施形態では、培養され且つ任意選択的にマイクロ流体デバイス内で増殖される微小物体（例えば、生体細胞）は、１つ又は複数の被覆剤を含む被覆溶液に搬入される。
【０１４７】
[00169]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、マイクロ流体デバイス内への微小物体（例えば、生体細胞）の導入前に、コーティング剤を含むコーティング溶液で処理又は「プライミング」される。限定されるものではないが、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、界面活性剤、酵素及びそれらの任意の組合せをはじめとする任意の便利なコーティング剤／コーティング溶液を使用し得る。幾つかの特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面を処理するためにコーティング剤が使用されるであろう。一例では、コーティング剤としてアルキレンエーテル部分を含むポリマーがコーティング溶液に含まれ得る。多様なアルキレンエーテル含有ポリマーが好適であり得る。限定されるものではないが、アルキレンエーテル含有ポリマーの例示的なクラスの１つは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニットのブロックとポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックとを様々な比で及びポリマー鎖内の様々な位置で含む両親媒性非イオン性ブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞に接触した状態で使用するのに好適であることが当技術分野で公知である。このポリマーは、平均分子量Ｍｗが約２０００Ｄａから約２０ＫＤａの範囲内である。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０超（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有し得る。コーティング表面の生成に有用な具体的なPluronic（登録商標）ポリマーとしては、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）が挙げられる。アルキレンエーテル含有ポリマーの他のクラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ又は２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
【０１４８】
[00170]  幾つかの実施形態では、コーティング溶液は、コーティング剤として各種タンパク質及び／又はペプチドを含み得る。具体的な実施形態では、本開示で使用されるコーティング溶液は、アルブミン（例えば、ＢＳＡ）及び／又はアルブミンを含む血清（若しくは複数の異なる血清の組合せ）及び／又は１種以上の他の類似のタンパク質等のタンパク質をコーティング剤として含む。血清は、限定されるものではないが、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等をはじめとする任意の便利な供給源に由来し得る。特定の実施形態では、ブロッキング溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ若しくはそれを超えるもの又はそれらの間の任意の位置を含めて、約１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの範囲内で存在する。特定の実施形態では、コーティング溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％若しくはそれを超えるもの又はそれらの間の任意の位置を含めて、約２０％（ｖ／ｖ）から約５０％ｖ／ｖの範囲内で存在する。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬでコーティング溶液中にコーティング剤として存在するのに対し、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬでコーティング溶液中にコーティング剤として存在する。特定の実施形態では、血清は、３０％でコーティング溶液中にコーティング剤として存在する。
【０１４９】
コーティング材料。
[00171]  実施形態に依存して、上記のコーティング剤／コーティング溶液のいずれも、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成のマイクロ流体デバイス）の内面の１つ以上にコーティングするために使用される各種コーティング材料と交換され得るか又はそれらと組み合わせて使用され得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えばＢ細胞）又はハイブリドーマ細胞のような細胞）の維持及び／又は拡大に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するコーティング材料を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の実質的に全ては、コーティング材料を含む。コーティングされた内面は、フロー領域（例えば、チャネル）、チャンバ若しくは隔離ペンの表面又はそれらの組合せを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、コーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、コーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、コーティング材料でコーティングされる。
【０１５０】
ポリマー系コーティング材料。
[00172]  少なくとも１つの内面は、ポリマーを含むコーティング材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合（又は連結）され得る。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、スターポリマー（スターコポリマー）及びグラフトポリマー又はコームポリマー（グラフトコポリマー）に見られるような様々な構造モチーフを有し得、それらは、全て本明細書に開示される方法に好適であり得る。
【０１５１】
[00173]  ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。多様なアルキレンエーテル含有ポリマーが本明細書に記載のマイクロ流体デバイスに使用するのに好適であり得る。限定されるものではないが、アルキレンエーテル含有ポリマーの例示的なクラスの１つは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニットのブロックとポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックとを様々な比で及びポリマー鎖内の様々な位置で含む両親媒性非イオン性ブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞に接触した状態で使用するのに好適であることが当技術分野で公知である。このポリマーは、平均分子量Ｍｗが約２０００Ｄａから約２０ＫＤａの範囲内である。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０超（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有し得る。コーティング表面の生成に有用な具体的なPluronic（登録商標）ポリマーとしては、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）が挙げられる。アルキレンエーテル含有ポリマーの他のクラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは、約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ又は２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
【０１５２】
[00174]  他の実施形態では、コーティング材料は、カルボン酸部分を含有するポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル部分、アルケニル部分又は芳香族部分を含有するサブユニットであり得る。限定されるものではないが、一例は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）である。
【０１５３】
[00175]  他の実施形態では、コーティング材料は、スルホン酸部分を含有するポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル部分、アルケニル部分又は芳香族部分を含有するサブユニットであり得る。限定されるものではないが、一例は、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。これらの後者の例示的なポリマーは、高分子電解質であり、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えばＢ細胞）又はハイブリドーマ細胞のような細胞）の維持及び／又は拡大に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように表面特性を改変し得る。
【０１５４】
[00176]  幾つかの実施形態では、コーティング材料は、ウレタン部分を含有するポリマー、例えば、限定されるものではないが、ポリウレタンを含み得る。
【０１５５】
[00177]  他の実施形態では、コーティング材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含有するポリマーを含み得る。
【０１５６】
[00178]  他の実施形態では、コーティング材料は、糖部分を含有するポリマーを含み得る。限定されるものではないが、例として、多糖、例えば藻由来のもの又は真菌多糖例えばキサンタンガム若しくはデキストランは、マイクロ流体デバイスにおいて細胞固着を低減又は防止し得る材料の形成に好適であり得る。例えば、約３Ｋｄａのサイズを有するデキストランポリマーは、マイクロ流体デバイス内の表面のコーティング材料を提供するために使用し得る。
【０１５７】
[00179]  他の実施形態では、コーティング材料は、ヌクレオチド部分を含有するポリマー、即ちリボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し得る核酸を含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含有し得るか、又はヌクレオ塩基、リボース若しくはリン酸の部分のアナログ、例えば、限定されるものではないが、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホネート又はホスホロチオエートの部分を含む非天然ヌクレオチド部分を含有し得る。核酸含有ポリマーは、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えばＢ細胞）又はハイブリドーマ細胞のような細胞）の維持及び／又は拡大に好適な有機分子及び／又は親水性分子の層を提供し得る高分子電解質を含み得る。
【０１５８】
[00180]  更に他の実施形態では、コーティング材料は、アミノ酸部分を含有するポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含有するポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、それらはいずれもペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含み得る。限定されるものではないが、一例では、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり得る。幾つかの実施形態では、細胞接着を最適化して細胞成長を促進するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質をコーティング材料中に提供し得る。コーティング材料に含まれ得る細胞マトリックスタンパク質としては、限定されるものではないが、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）又はラミニンが挙げられ得る。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスのコーティング材料中に提供し得る。
【０１５９】
[00181]  更なる実施形態では、コーティング材料は、アミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン及びプトレシンが挙げられる。
【０１６０】
[00182]  幾つかの実施形態では、コーティング材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸部分、糖部分、ヌクレオチド部分又はアミノ酸部分の２つ以上を含有するポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーで調整された表面は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸部分、糖部分、ヌクレオチド部分及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２種以上のポリマーの混合物を含み得、それらは、独立に又は同時にコーティング材料に組み込み得る。
【０１６１】
共有結合した被覆材料
[00183]  幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適し、そのような細胞に調整表面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する共有結合分子を含む。共有結合分子は、結合基を含み、結合基は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適する有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分にも共有結合する。結合基が結合する表面は、マイクロ流体デバイスの基板の表面を含み得、マイクロ流体デバイスがＤＥＰ構成を含む実施形態では、基板の表面は、ケイ素及び／又は二酸化ケイ素を含むことができる。幾つかの実施形態では、共有結合された被覆材料は、マイクロ流体デバイスの内面の略全てを被覆する。
【０１６２】
[00184]  幾つかの実施形態では、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適する有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
【０１６３】
[00185]  マイクロ流体デバイスでの生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適する有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された共有結合部分は、本明細書に記載される任意のポリマーであり得、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、サッカリド部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、アミノ酸部分、核酸部分、又はアミノ部分を含む１つ又は複数のポリマーを含み得る。
【０１６４】
[00186]  他の実施形態では、マイクロ流体デバイスでの生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適する有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された共有結合部分は、アルキル部分等の非ポリマー部分、フルオロアルキル部分（ペルフロロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分又はサッカリド部分を含み得る。
【０１６５】
[00187]  幾つかの実施形態では、共有結合部分は、直鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２個若しくはそれを超える炭素の直鎖）を形成する炭素原子を含むアルキル基であり得る。そのため、アルキル基は、非分岐状アルキルであり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は、置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかは、フッ素化又は過フッ素化し得る）。アルキル基は、非置換炭素の直鎖に連結された置換（例えば、フッ素化又は過フッ素化）炭素の直鎖を含み得る。例えば、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに連結された、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接的又は間接的に（例えば、エーテル結合により）連結し得る。アルキル基の第１のセグメントは、結合基から離れて位置し得、アルキル基の第２のセグメントは結合基に近接して位置し得る。他の実施形態では、アルキル基は、分岐状アルキル基を含み得、アルキル基のアルキル骨格に介在する１つ以上のアリーレン基を更に有し得る。幾つかの実施形態では、アルキル基又はフッ素化アルキル基の分岐状部分又はアリーレン介在部分は、結合基及び表面への共有結合から離れた箇所に位置する。
【０１６６】
[0188]  他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアミノ酸を含み得、２つ以上のタイプのアミノ酸を含み得る。そのため、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、細胞の成長、生存能、可搬性又はそれらの任意の組合せをサポートするために双性イオン性表面を提供し得るアミノ酸を含み得る。
【０１６７】
[00189]  共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
【０１６８】
[00190]  共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び／又は流域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。
【０１６９】
[00191]  コーティング材料は、１種類のみの共有結合部分を含み得るか又は２種類以上の異なる共有結合部分を含み得る。例えば、フルオロアルキルで調整された表面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同一の、例えば同一の結合基及び表面への共有結合、同一の全長、並びにフルオロアルキル部分を含む同一の数のフルオロメチレンユニットを有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的に、コーティング材料は、表面に付着された２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、コーティング材料は、特定数のメチレンユニット又はフルオロメチレンユニットを有する共有結合されたアルキル部分又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、より多数のメチレンユニット又はフルオロメチレンユニットを有するアルキル鎖又はフルオロアルキル鎖に付着された共有結合荷電部分を有する分子の更なるセットを更に含み得る。幾つかの実施形態では、２種類以上の共有結合部分を有するコーティング材料は、骨格原子の数がより多い、したがって表面への共有結合の長さがより長い分子の第１のセットが、より嵩高い部分をコーティング表面に呈する能力を提供し得る一方、末端が異なり立体的要求がより低い且つ骨格原子の数がより少ない分子の第２のセットが、全基板表面を官能基化することにより、基板自体を構成するシリコン又はアルミナとの望ましくない接着又は接触を防止するのに役立ち得るように設計し得る。他の例では、共有結合部分は、表面上にランダムに交互電荷を呈する双性イオン性表面を提供し得る。
【０１７０】
調整された表面特性。
[00192]  幾つかの実施形態では、共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成基板表面）に共有結合されたとき、単層を形成し得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分によって形成される調整された表面は、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５から３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。他の実施形態では、共有結合された部分によって形成された調整された表面は、約１０ｎｍから約５０ｎｍの厚さを有し得る。幾つかの実施形態では、調整された表面は、ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイス内の操作で好適には機能するために完全に形成された単層を必要とするものではない。
【０１７１】
[00193]  種々の実施形態では、マイクロ流体デバイスのコーティング材料は、望ましい電気的性質を提供し得る。理論により限定することを意図するものではないが、特定のコーティング材料でコーティングされた表面のロバスト性に影響を及ぼす因子の１つは、固有電荷トラッピングである。様々なコーティング材料が電子をトラップし得るため、コーティング材料が破壊されるおそれがある。コーティング材料の欠陥は、電荷トラッピングを増加させてコーティング材料の更なる破壊をもたらし得る。同様に、様々なコーティング材料が様々な絶縁耐力（即ち絶縁破壊をもたらす最小印加電界）を有するため、電荷トラッピングが影響を受けるおそれがある。特定の実施形態では、コーティング材料は、電荷トラッピングの量を低減又は制限する全体構造（例えば、密充填単層構造）を有し得る。
【０１７２】
[00194]  コーティング材料の組成以外に、コーティング材料の物理的（及び電気的）厚さ等の他の因子が、マイクロ流体デバイスにおいて基板によるＤＥＰ力及び／又はエレクトロウェッティング力の発生に影響を及ぼし得る。コーティング材料を基板上に堆積させる方法（例えば、気相堆積、液相堆積、スピンコーティング又は静電コーティング）を含めて、各種因子がコーティング材料の物理的厚さ及び電気的厚さを変化させ得る。コーティング材料の物理的厚さ及び均一性は、エリプソメータを用いて測定され得る。
【０１７３】
[00195]  電気的性質以外に、コーティング材料は、生物学的分子との併用に有益な性質を有し得る。例えば、フッ素化（又は過フッ素化）アルキル基を含有するコーティング材料は、表面ファウリング量の低減に関して非置換アルキル基と比べて利益を提供し得る。本明細書で使用される表面ファウリングとは、マイクロ流体デバイスの表面上に無差別に堆積された材料の量を意味し、これは、バイオ材料、例えばタンパク質及び分解産物、核酸及び各分解産物の永久的又は半永久的な堆積を含み得る。かかるファウリングは、表面への生物学的微小物体の接着量を増加させる可能性がある。
【０１７４】
[00196]  調整された表面の組成以外に、疎水性材料の物理的厚さ等の他の因子がＤＥＰ力に影響を及ぼし得る。調整された表面を基板に形成する方法（例えば、気相堆積、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、静電コーティング）等の各種因子は、調整された表面の物理的厚さを変化させ得る。調整された表面の物理的厚さ及び均一性は、エリプソメータを用いて測定され得る。
【０１７５】
[00197]  電気的性質に加えて、調整された表面は、生物学的分子との併用に有益な性質も有し得る。例えば、フッ素化（又は過フッ素化）炭素鎖を含有する調整された表面は、表面ファウリング量の低減に関してアルキル末端鎖と比べて利益を提供し得る。本明細書で使用される表面ファウリングとは、マイクロ流体デバイスの表面上への無差別な材料堆積量を意味し、これは、バイオ材料、例えばタンパク質及びその分解産物、核酸及び各分解産物等の永久的又は半永久的な堆積を含み得る。
【０１７６】
[00198]  ＤＥＰ構成で使用され得る調整表面の様々な特性は、以下の表に含まれる。見て分かるように、本明細書に記載されるように全て共有結合された調整表面であったエントリ１から７では、楕円偏光法により測定された厚さは、一貫して、非共有スピン塗布によって形成されたＣＹＴＯＰ表面であるエントリ８よりも薄かった（Ｎ／Ａは、表全体を通して入手可能でなかったデータを表す）。ファウリングは、フッ化表面が、通常、アルキル（炭化水素）調整表面のものよりもファウリング性が低いため、形成モードよりも表面の化学的性質に依存することが分かった。
【０１７７】
【表１】
2019534004.tif 000003
【０１７８】
表面への結合基
[00200]  被覆材料を形成する共有結合部分は、結合基を介して表面に付着する。結合基は、酸化ケイ素（例えば、ＤＥＰ構成基板の場合）、酸化アルミニウム、又は酸化ハフニウム（例えば、ＥＷ構成基板の場合）から形成され得る基板表面の酸化物とのシロキサン含有試薬の反応により形成されるシロキシ結合基であり得る。幾つかの他の実施形態では、結合基は、基板表面の酸化物とのホスホン酸含有試薬の反応により形成されるホスホン酸エステルであり得る。
【０１７９】
複数パート調整表面
[00201]  共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子（例えば、ペルフルオロアルキルシロキサン試薬を含み得るアルキルシロキサン試薬又はフルオロ置換アルキルシロキサン試薬）の反応により形成され得る。代替的に、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分を、それ自体が表面に共有結合する表面修飾リガンドに結合することにより形成され得る。
【０１８０】
共有結合被覆材料の準備方法
[00202]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合する被覆材料は、化学式１の構造を有する。
【化１】
2019534004.tif 000004
【０１８１】
[00203]  被覆材料は、ＤＥＰ構成基板の表面の酸化物に共有結合し得る。ＤＥＰ構成基板は、ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得、酸化物は、基板の固有の化学構造の一部として存在するか、又は後述するように導入され得る。
【０１８２】
[00204]  被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に付着され得、結合基は、シロキサン基又はホスホン酸基の酸化物との反応から形成されるシロキシ基又はホスホン酸エステル基であり得る。マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成された部分に直接又は間接的に接続され得る。結合基ＬＧが部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカー（「Ｌ」）は、存在せず、ｎは、０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬは、存在し、ｎは、１である。リンカーＬは、線形部分の骨格が、当技術分野で既知のように化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１個から２００個の非水素原子を含み得る線形部分を有し得る。これは、幾つかの非限定的な例では、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はホスホン酸基からなる群から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬは、リンカーの骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又は複素環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は、１０個から２０個の原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は、約５個から約２００個の原子、約１０個から約８０個の原子、約１０個から約５０個の原子、又は約１０個から約４０個の原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は、全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は、全てが炭素であるわけではなく、当技術分野で既知のように化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、又はリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
【０１８３】
[00205]  マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が１ステッププロセスで基板の表面に追加される場合、化学式２の分子を使用して、被覆材料を導入し得る。
部分−（Ｌ）ｎ−ＬＧ
化学式２
【０１８４】
[00206]  幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加され得る。生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分がステップ毎に表面に結合される場合、リンカーＬは、化学式３に示されるように結合基ＣＧを更に含み得る。
【化２】
2019534004.tif 000005
【０１８５】
[00207]  幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘと反応ペア部分Ｒｐｘ（すなわち反応部分Ｒｘと反応するように構成された部分）との反応から生じる基を表す。例えば、１つの典型的な結合基ＣＧは、カルボキサミジル基を含み得、これは、活性化エステル、酸塩化物等のカルボン酸の誘導体とアミノ基との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン基、カルボキサミジル基、チオアミジル基、オキシム基、メルカプチル基、ジスルフィド基、エーテル基、アルケニル基、又は反応部分と各反応ペア部分との反応時に形成され得る任意の他の適する基を含み得る。結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の末端（すなわちマイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い末端）に配置され得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、トリアゾリレンであり、これは、アルキン基とアジド基との反応の結果であり、アルキン基及びアジド基のいずれかは、当技術分野で既知のように、クリック結合反応で使用される反応部分Ｒｘ又は反応ペア部分Ｒｐｘであり得る。トリアゾリレン基は、更に置換することもできる。例えば、ジベンゾシクロオクテニル溶融トリアゾリレン基は、ジベンゾシクロオクテニル反応ペア部分Ｒｐｘに結合した部分と、表面修飾分子のアジド反応部分Ｒｘとの反応から生じ得、これについては以下の段落でより詳細に説明する。様々なジベンゾシクロオクテニル修飾分子が当技術分野で既知であり、又は生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を組み込むように合成され得る。
【０１８６】
[00208]  被覆材料が複数ステッププロセスで形成されると、マイクロ流体デバイスにおける免疫細胞（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、部分含有試薬（化学式５）と、修飾リガンドが共有結合する表面を有する基板（化学式６）との反応により導入され得る。
【化３】
2019534004.tif 000006
【０１８７】
[00209]  化学式４の修飾表面には、表面修飾リガンドが付着しており、表面修飾リガンドは、−ＬＧ−（Ｌ’’）ｊ−Ｒｘの化学式を有し、これは、基板の酸化物に結合し、化学式１の調整表面について上述したのと同様に形成される。基板の表面は、上述したＤＥＰ構成基板表面であり得、基板に固有であるか、又は基板に導入される酸化物を含むことができる。結合基ＬＧは、上述したようなものである。リンカーＬ’’は、存在してもよく（ｊ＝１）又は存在しなくてもよい（ｊ＝０）。リンカーＬ’’は、線形部分の骨格が、当技術分野で既知のように化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１個から１００個の非水素原子を含み得る線形部分を有し得る。これは、幾つかの非限定的な例では、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はホスホン酸基の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬ’’は、リンカーの骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又は複素環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、１０個から２０個の炭素原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、約５個から約１００個の原子、約１０個から約８０個の原子、約１０個から約５０個の原子、又は約１０個から約４０個の原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は、全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は、全てが炭素であるわけではなく、当技術分野で既知のように化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、又はリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
【０１８８】
[00210]  反応部分Ｒｘは、表面との表面修飾リガンドの共有結合から離れた表面修飾リガンドの末端に存在する。反応部分Ｒｘは、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を導入するための結合反応に有用な任意の適した反応部分である。幾つかの実施形態では、反応部分Ｒｘは、アジド部分、アミノ部分、ブロモ部分、チオール部分、活性化エステル部分、スクシンイミジル部分、又はアルキニル部分であり得る。
【０１８９】
部分含有試薬
[00211]  部分含有試薬（化学式５）は、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を供給するように構成される。
部分−（Ｌ’）ｍ−Ｒｐｘ
化学式５
【０１９０】
[00212]  部分含有試薬内の生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、反応ペア部分Ｒｐｘと反応部分Ｒｘとの反応により、表面修飾リガンドに結合される。反応ペア部分Ｒｐｘは、各反応部分Ｒｘと反応するように構成された任意の適した反応基である。非限定的な一例では、１つの適した反応ペア部分Ｒｐｘは、アルキンであり得、反応部分Ｒｘは、アジドであり得る。反応ペア部分Ｒｐｘは、代替的に、アジド部分であり得、各反応部分Ｒｘは、アルキンであり得る。他の実施形態では、反応ペア部分Ｒｐｘは、活性エステル機能であり得、反応部分Ｒｘは、アミノ基であり得る。他の実施形態では、反応ペア部分Ｒｐｘは、アルデヒドであり得、反応部分Ｒｘは、アミノであり得る。他の反応部分−反応ペア部分の組合せも可能であり、これらの例は、決して限定ではない。
【０１９１】
[00213]  化学式５の部分含有試薬の生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含め、本明細書に記載される任意の部分を含み得る。
【０１９２】
[00214]  化学式５の部分含有試薬の生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、反応ペア部分Ｒｐｘに直接接続されてもよく（すなわちＬ’、但しｍ＝０）又は間接的に接続されてもよい。反応ペア部分Ｒｐｘが、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に間接的に接続される場合、反応ペア部分Ｒｐｘは、リンカーＬ’（ｍ＝１）に接続され得る。反応ペア部分Ｒｐｘは、リンカーＬ’の第１の末端に接続され得、表面ファウリングを低減し、及び／又は細胞粘着を阻止若しくは低減するように構成された部分をリンカーＬ’の第２の末端に接続し得る。リンカーＬ’は、線形部分の骨格が、当技術分野で既知のように化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１個から１００個の非水素原子を含む線形部分を有し得る。これは、幾つかの非限定的な例では、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はホスホン酸基の任意の組合せで中断され得る。更に、リンカーＬ’は、リンカーＬ’の骨格を中断する１つ又は複数のアリーレン基、ヘテロアリーレン基、又は複素環基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’の骨格は、１０個から２０個の原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’の骨格は、約５個から約１００個の原子、約１０個から約８０個の原子、約１０個から約５０個の原子、又は約１０個から約４０個の原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は、全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は、全てが炭素であるわけではなく、当技術分野で既知のように化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、又はリン原子の任意の可能な組合せを含み得る。
【０１９３】
[00215]  部分含有試薬（式５）が表面改質リガンド（式３）を有する表面と反応する場合、式２の調整された表面を有する基板が形成される。この場合、リンカーＬ’及びリンカーＬ’’は、形式的にはリンカーＬの一部であり、反応性対部分Ｒｐｘと反応性部分Ｒｘとの反応は、式２のカップリング基ＣＧを生成する。
【０１９４】
表面改質試薬。
[00216]  表面改質試薬は、構造ＬＧ−（Ｌ’’）ｊ−Ｒｘ（式４）を有する化合物である。結合基ＬＧは、基板の表面の酸化物に共有結合する。基板は、ＤＥＰ構成基板であり得、シリコン又はアルミナ又は酸化ハフニウムを含み得る。また、酸化物は、基板の天然化学構造の一部として存在し得るか又は本明細書で考察されるように導入し得る。結合基ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と基板の表面上の酸化物との反応によって形成されるシロキシ基又はホスホネートエステル基等の本明細書に記載の任意の結合基であり得る。反応性部分Ｒｘは、以上に記載される。反応性部分Ｒｘは、結合基ＬＧに直接的に（Ｌ’’、ｊ＝０）又はリンカーＬ’’（ｊ＝１）を介して間接的に接続し得る。結合基ＬＧは、リンカーＬ’’の第１の末端に付着し得、反応性部分Ｒｘは、表面改質試薬が式６のように表面に付着されると基板の表面から離れるリンカーＬ’’の第２の末端に接続し得る。
【化４】
2019534004.tif 000007
【０１９５】
[00217]  リンカーＬ’’は、線状部分を有し得、線状部分の骨格は、ケイ素、炭素、窒素、酸素、硫黄及びリンの原子の任意の組合せから選択される１から１００個の非水素原子を含む。限定されるものではないが、幾つかの例として、エーテル、アミノ、カルボニル、アミド又はホスホネートの基の任意の組合せがそれに介在し得る。加えて、リンカーＬ’’は、リンカーＬ’’の骨格に介在する１つ以上のアリーレン、ヘテロアリーレン又はヘテロ環式の基を有し得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、１０から２０原子を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬ’’の骨格は、約５原子から約１００原子、約１０原子から約８０原子、約１０原子から約５０原子又は約１０原子から約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は、全て炭素原子である。他の実施形態では、骨格原子は、全て炭素であるとは限らず、当技術分野で公知の化学結合制限に従ってケイ素、炭素、窒素、酸素、硫黄又はリンの原子の任意の可能な組合せを含み得る。
【０１９６】
[00218]  幾つかの実施形態では、コーティング材料（又は表面改質リガンド）は、化学気相堆積を用いてマイクロ流体デバイスの内面上に堆積される。化学気相堆積を介して、コーティング材料は、コーティング材料を含む分子がマイクロ流体デバイスの内面の分子に共有結合される密充填単層を達成し得る。望ましい充填密度を達成するために、例えばアルキル末端シロキサンを含む分子は、少なくとも１１０℃（例えば、少なくとも１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１６０℃等）の温度で少なくとも１５時間（例えば、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５時間又はそれを超える）の期間にわたり気相堆積され得る。かかる気相堆積は、典型的には、真空下且つ水和硫酸塩（例えば、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）等の水源の存在下で実施される。典型的には、気相堆積の温度及び継続時間を増加させると、向上した疎水性コーティング材料特性が得られる。
【０１９７】
[00219]  気相堆積プロセスは、任意選択的に、例えば、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電体層）のプレクリーニングによって改善され得る。例えば、かかるプレクリーニングは、溶媒浴、例えばアセトン浴、エタノール浴又はそれらの組合せを含み得る。溶媒浴は超音波処理を含み得る。代替的又は追加的に、かかるプレクリーニングは、各種不純物を除去し得ると同時に、酸化表面（例えば、本明細書に記載されるように共有結合修飾し得る表面の酸化物）を導入する酸素プラズマクリーナによるカバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６及び／又は基板の処理を含み得る。酸素プラズマクリーナは、例えば、真空条件下１００Ｗで６０秒間にわたりで操作され得る。代替的に、酸素プラズマクリーナの代わりに、表面を酸化するために過酸化水素等の酸化剤を含む液相処理を使用し得る。例えば、酸素プラズマクリーナの代わりに、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、約３：１から約７：１の範囲内の硫酸対過酸化水素比を有し得るピラニア溶液）を使用し得る。
【０１９８】
[00220]  幾つかの実施形態では、気相堆積は、マイクロ流体デバイス２００をアセンブルしてマイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後にマイクロ流体デバイス２００の内面をコーティングするために使用される。完全にアセンブルされたマイクロ流体回路１２０上に密充填単層を含むコーティング材料を堆積させることは、各種機能性の提供に有益であり得る。理論により限定することを意図するものではないが、完全にアセンブルされたマイクロ流体回路１２０上にかかるコーティング材料を堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６／誘電体層及び／又はカバー１１０との間の結合の弱化によって引き起こされるデラミネーションの防止に有益であり得る。
【０１９９】
[00221]  図２Ｈは、例示的なクラスの被覆材料を含むマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、マイクロ流体デバイス２９０の基板２８６の内面２９４及びカバー２８８の内面２９２の両方に共有結合した密に詰め込まれた分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造を画定するのに使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含め、マイクロ流体デバイス２９０の囲い２８４に近く且つ囲い２８４に向かって内側に面した全ての内面２９４、２９２に堆積することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つ又は幾つかのみに配置することができる。
【０２００】
[00222]  図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、アルキル末端シロキサン分子の単層を含み、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。しかし、上述した任意の被覆材料２９８が使用可能である（例えば、アルキル末端ホスホン酸エステル分子）。より具体的には、アルキル基は、少なくとも１０個の炭素原子（例えば、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２２個、２０個、又はそれを超える炭素原子）の線状鎖を含むことができ、任意選択的に置換アルキル基であり得る。上述したように、密に詰め込まれた分子の単層を含む被覆材料２９８は、最小電荷捕捉、物理的／電気的厚さの低減、及び略均一の表面等のＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイス２９０での使用に有益な機能特性を有することができる。
【０２０１】
[00223]  別の特定の実施形態では、被覆材料２９８は、囲いに面した末端（すなわち内面２９２、２９４に結合せず、囲い２８４に近くの被覆材料２９８の単層の部分）にフルオロアルキル基（例えば、フッ素化アルキル基又はペルフルオロアルキル基）を含むことができる。上述したように、被覆材料２９８は、フルオロアルキル末端シロキサン又はフルオロアルキル末端ホスホン酸エステルの単層を含むことができ、フルオロアルキル基は、被覆材料２９８の囲いに面した末端に存在する。そのような被覆材料２９８は、生物学的微小物体を非生体分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）から分離又は「シールド」することにより、生物学的微小物体（例えば、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）又はハイブリドーマ細胞等の細胞）の維持及び／又は増殖の改善を提供することにおいて機能的利点を提供する。
【０２０２】
[00224]  別の特定の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８は、アニオン、カチオン、双性部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は双性部分をマイクロ流体回路１２０の囲い２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、生成される水和水が、核が非生体分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）と相互作用しないように分ける層（又は「シールド」）として機能するような水分子との強力な水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が遮断剤と併せて使用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、及び／又は双性イオンは、囲い２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）に存在する非共有結合被覆剤の荷電部分（例えば、溶液中のタンパク質）とイオン結合を形成することができる。
【０２０３】
[00225]  更に他の具体的な実施形態では、コーティング材料は、そのエンクロージャ対向末端に親水性コーティング剤を含み得るか又はそれを呈するように化学修飾し得る。幾つかの実施形態では、コーティング剤は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、コーティング剤は、デキストラン等の多糖であり得る。以上で考察される荷電部分（例えば、アニオン性、カチオン性及び双性イオン性の部分）のように、親水性コーティング剤は、得られる水和水が核部と非生物学的分子（例えば、基板のシリコン及び／又は酸化ケイ素）との相互作用を回避する層（又は「シールド」）として作用するように水分子との強い水素結合を形成し得る。
【０２０４】
抗体発現を検出する方法
[00226]  本明細書に開示される方法は、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現する生体細胞を検出又は識別する方法を含む。対象の抗原は、タンパク質、炭水化物基若しくは鎖、タンパク質若しくは炭水化物以外の生物学的若しくは化学的薬剤、又はそれらの任意の組合せであり得る。対象の抗原は、例えば、ウィルス、病原性微生物、病原真菌、病原性原虫等の病原体に関連付けられた抗原等であり得る。代替的に、対象の抗原は、肺がん、乳がん、メラノーマ等のがんに関連付けることができる。更に別の代替形態では、抗原は、多発性硬化症又はＩ型糖尿病等の自己免疫疾患に関連付けられ得る。本明細書で使用される場合、「病原体に関連付けられた」という用語は、対象の抗原を参照して使用されるとき、対象の抗原が病原体によって直接生成されるか、又は病原体と宿主との間の相互作用から生じることを意味する。
【０２０５】
[00227]  対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現する生体細胞を検出する方法は、本明細書に記載されたマイクロ流体デバイスにおいて実行することができる。特に、マイクロ流体デバイスは、１つ又は複数のマイクロ流体チャネルを含み得るフロー領域と、１つの隔離ペン（又は複数の隔離ペン）とを有する囲いを含むことができる。隔離ペンは分離領域及び接続領域を含むことができ、接続領域は、分離領域とフロー領域／マイクロ流体チャネルとの間に流体接続を提供する。隔離ペンは、約０．５ｎＬから約５．０ｎｌ又はその中の任意の範囲（例えば、約０．５ｎｌから約１．０ｎｌ、約０．５ｎｌから約１．５ｎｌ、約０．５ｎｌから約２．０ｎｌ、約１．０ｎｌから約１．５ｎｌ、約１．０ｎｌから約２．０ｎｌ、約１．０ｎｌから約２．５ｎｌ、約１．５ｎｌから約２．０ｎｌ、約１．５ｎｌから約２．５ｎｌ、約１．５ｎｌから約３．０ｎｌ、約２．０ｎｌから約２．５ｎｌ、約２．０ｎｌから約３．０ｎｌ、約２．０ｎｌから約３．５ｎｌ、約２．５ｎｌから約３．０ｎｌ、約２．５ｎｌから約３．５ｎｌ、約２．５ｎｌから約４．０ｎｌ、約３．０ｎｌから約３．５ｎｌ、約３．０ｎｌから約４．０ｎｌ、約３．０ｎｌから約４．５ｎｌ、約３．５ｎｌから約４．０ｎｌ、約３．５ｎｌから約４．５ｎｌ、約３．５ｎｌから約５．０ｎｌ、約４．０ｎｌから約４．５ｎｌ、約４．０ｎｌから約５．０ｎｌ、約４．５ｎｌから約５．０ｎｌ、又は上記端点の１つによって定義される任意の範囲）の容積を有することができる。接続領域は、本明細書に概説したような幅Ｗｃｏｎを有することができる（例えば、約２０μｍから約１００μｍ又は約３０μｍから約６０μｍ）。分離領域は、前記接続領域の幅Ｗｃｏｎよりも大きい幅Ｗｉｓｏを有することができる。特定の実施形態では、分離領域は、約５０μｍから約２５０μｍの幅Ｗｉｓｏを有する。
【０２０６】
[00228]  フロー領域、隔離ペン、及び又は隔離ペンの分離領域は、生体細胞の生存性を促進し、及び／又は生体細胞との相互作用を低減する被覆材料が被覆された少なくとも１つの表面を含むことができる。したがって、例えば、被覆材料は、ハイブリドーマ細胞の生存性を促進し、及び／又はＢ細胞リンパ球（例えば、記憶Ｂ細胞又は血漿細胞）の生存性を促進し、及び／又はマイクロ流体デバイス内の任意のそのような細胞を移動させる能力を促進することができる。これに関連して使用される場合、「生存性を促進する」は、抗体発現生体細胞の生存性が、被覆されていない同等の表面と比較して、被覆された表面でより良好であることを意味する。特定の実施形態では、フロー領域、隔離ペン、及び／又は分離領域は、抗体発現細胞の生存性を促進し、及び／又は抗体発現細胞との相互作用を低減する被覆材料でそれぞれ被覆された複数の表面を有する。被覆材料は、当技術分野で既知の及び／又は本明細書に記載される任意の適した被覆材料であり得る。被覆材料は、例えば、親水性分子を含むことができる。親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、炭水化物基を含むポリマー、アミノ酸（例えば、ＢＳＡ等のタンパク質）を含むポリマー、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。
【０２０７】
[00229]  フロー領域、隔離ペン、及び又は隔離ペンの分離領域は、抗体発現生体細胞の生存性を促進し、及び／又は抗体発現生体細胞との相互作用を低減する少なくとも１つの調整表面を含むことができる。したがって、例えば、調整表面は、ハイブリドーマ細胞の生存性を促進し、及び／又はＢ細胞リンパ球（例えば、記憶Ｂ細胞又は血漿細胞）の生存性を促進し、及び／又はマイクロ流体デバイス内の任意のそのような細胞を移動させる能力を促進することができる。これに関連して使用される場合、「生存性を促進する」は、抗体発現生体細胞の生存性が、調整されていない同等の表面と比較して、調整された表面でより良好であることを意味する。特定の実施形態では、フロー領域、隔離ペン、及び／又は分離領域は、抗体発現細胞の生存性を促進し、及び／又は抗体発現細胞との相互作用を低減することがそれぞれ可能な複数の調整表面を有する。調整表面は、共有結合分子を含むことができる。共有結合分子は、例えば、共有結合親水性分子を含め、当技術分野で既知の及び／又は本明細書に記載される任意の適した分子であり得る。親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、炭水化物基を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。親水性分子は、本明細書に記載されたように、共有結合親水性分子の層を形成することができる。代替的に、共有結合分子は、ペルフルオロアルカン（例えば、共有結合したペルフルオロアルカンの層）を含むことができる。
【０２０８】
[00230]  対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現する生体細胞を検出する方法は、抗体発現生体細胞を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入するステップと、抗体発現生体細胞をマイクロ流体デバイス内の隔離ペンの分離領域に装填するステップと、対象の抗原が抗体発現生体細胞の近くに配置されるように、対象の抗原をマイクロ流体デバイスに導入するステップと、生体細胞によって発現された抗体への対象の抗原の結合を監視するステップとを含むことができる。
【０２０９】
[00231]  抗体発現生体細胞は、例えば、ハイブリドーマ細胞であり得る。代替的に、抗体発現生体細胞は、Ｂ細胞リンパ球であり得る。Ｂ細胞リンパ球は、例えば、ＣＤ２７＋Ｂ細胞又はＣＤ１３８＋Ｂ細胞であり得る。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、記憶Ｂ細胞である。他の実施形態では、Ｂ細胞は、血漿細胞である。
【０２１０】
[00232]  抗体発現生体細胞をマイクロ流体デバイスに導入することは、抗体発現細胞を含む試料を得ることを含み得る。抗体発現生体細胞がＢ細胞リンパ球である実施形態では、Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）、ウサギ、フェレット、家畜（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ）、ラマ、ラクダ、サル等の哺乳動物、又はニワトリ及びシチメンチョウ等の鳥類から得ることができる。幾つかの実施形態では、哺乳動物は、対象の抗原に対して免疫化されている。幾つかの実施形態では、動物は、対象の抗原に関連付けられた病原体に露出されているか又はそれに感染している。幾つかの実施形態では、動物は、対象の抗原に関連付けられたがんを有する。他の実施形態では、動物は、対象の抗原に関連付けられた自己免疫疾患を有する。Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、末梢血試料（例えば、ＰＢＭＣ）、脾臓生検、骨髄生検、リンパ節生検、腫瘍生検、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【０２１１】
[00233]  Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、所望のＢ細胞リンパ球を富化するように処理する（例えば、負及び／又は正にソートする）ことができる。幾つかの実施形態では、所望のＢ細胞リンパ球は、記憶Ｂ細胞である。他を実施形態では、所望のＢ細胞リンパ球は、血漿細胞である。幾つかの実施形態では、所望のＢ細胞リンパ球は、ＩｇＧ型抗体を発現する。したがって、例えば、試料は、Ｂ細胞リンパ球以外のタイプの細胞を枯渇され得る。試料から非Ｂ細胞の細胞タイプを枯渇させる方法は、当技術分野で周知であり、例えば、DYNABEADS（商標）非接触ヒトＢ細胞試薬（Thermo Fisher）、Ｂ細胞分離キット（Miltenyi）、EasySep  Ｂ細胞富化キット（EasySep）、RosetteSepヒトＢ細胞富化Cocktain（Stem Cell Technologies）で試料を処理することが挙げられる。代替又は追加として、Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、蛍光活性化細胞ソート（ＦＡＣＳ）によりソートされて、不要な細胞タイプを除去し、所望の細胞タイプを富化することができる。ＦＡＣＳソートは、負及び／又は正であり得る。例えば、ＦＡＣＳソートは、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＧ抗体を発現するＢ細胞リンパ球、又はそれらの任意の組合せの試料を枯渇させることができる。代替又は追加として、ＦＡＣＳソートは、ＣＤ２７（又は何らかの他の記憶Ｂ細胞マーカー）を発現するＢ細胞リンパ球又はＣＤ１３８（又は何らかの他の血漿細胞マーカー）を発現するＢ細胞リンパ球について試料を富化することができる。Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、所望のＢ細胞リンパ球を富化する処理が方法の一環として必要でないような富化状態（すなわち前処理された状態）で提供され得る。代替的に、Ｂ細胞リンパ球を含む試料を処理して、所望のＢ細胞リンパ球を富化することは、本発明の方法の一環として実行することができる。
【０２１２】
[00234]  Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、マイクロ流体デバイスへの試料中の細胞の粘着を低減するように処理することができる。例えば、試料は、Benzonase（登録商標）ヌクレアーゼ（Millipore）等のデオキシリボヌクレアーゼを用いて処理することができる。好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼは、最小のプロテアーゼ活性を含む。
【０２１３】
[00235]  抗体発現生体細胞をマイクロ流体デバイスに導入することは、生体細胞を含む試料を、マイクロ流体デバイスの流入口に且つマイクロ流体デバイスのフロー領域の一部を通して流すことにより実行することができる。次に、マイクロ流体デバイスを通る試料の流れを停止させて、抗体発現生体細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ球）を隔離ペンの分離領域に装填することができる。抗体発現細胞を分離領域に装填することは、当技術分野で既知の任意の技法により、又は重力及び／又はＤＥＰ力等の本明細書に開示される任意の技法により実行することができる。特定の実施形態では、１つの抗体発現細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ球）が分離領域に装填される。特定の実施形態では、１つの抗体発現細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ球）がマイクロ流体デバイス内の複数の隔離ペンのそれぞれの分離領域に装填される。
【０２１４】
[00236]  対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現する生体細胞を検出する方法は、Ｂ細胞リンパ球を刺激する刺激剤にＢ細胞リンパ球を接触させるステップを含むことができる。刺激剤は、ＣＤ４０Ｌ等のＣＤ４０アゴニスト、その誘導体、又はＣＤ４０抗体であり得る。刺激剤は、ＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞を含むか、基本的にＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞からなるか、又はＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞からなることができる。ＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞は、Ｔ細胞（例えば、ジャーカットＤ１．１細胞）又はその誘導体であり得る。代替的に、フィーダ細胞は、ＣＤ４０Ｌ発現構造を用いて遺伝子導入／形質転換された細胞株（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）であり得る。刺激剤は、プロテインＡ、プロテインＧ、又は任意の他のＢ細胞レセプタ（ＢＣＲ）超抗原等のＢＣＲ超抗原を更に含むことができる。ＢＣＲ超抗原は、ビーズ、脂質小胞、脂質ナノラフト等の微小物体に付着され得る。したがって、超抗原が被覆された微小物体は、ＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞と混合することができる。混合物は、約１：１のフィーダ細胞対微小物体比、約１：５のフィーダ細胞対微小物体比、又はそれらの間の任意の比を有することができる。代替的に、混合物は、約１：２のフィーダ細胞対微小物体比、約２：１０のフィーダ細胞対微小物体比、又はそれらの間の任意の比を有することができる。刺激剤は、トール様レセプタ（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト）を更に含むことができ、これは、ＣＤ４０アゴニスト又は任意選択的にＢＣＲ超抗原と組み合わされ得る。ＴＬＲアゴニストは、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ２００６）であり得る。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、約１μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬ（例えば、約１．５μｇ／ｍＬから約１５μｇ／ｍＬ、約２．０μｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、又は約２．５μｇ／ｍＬから約５．０μｇ／ｍＬ）の濃度で使用することができる。１日から１０日（例えば、２日から８日、３日から７日、又は４日から６日）の期間にわたってＢ細胞リンパ球を刺激剤に接触させる（例えば、略連続して又定期的／断続的に）ことができる。Ｂ細胞リンパ球が装填された隔離ペン内でＢ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることができる。そのような接触は、Ｂ細胞リンパ球が隔離ペンに装填された後に行うことができる。
【０２１５】
[00237]  対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現する生体細胞を検出する方法は、培地／活性化媒体を抗体発現生体細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ球）に提供するステップを更に含むことができ、Ｂ細胞活性化及び／又は増殖を促進する１つ又は複数の成長誘導剤を含む。１つ又は複数の成長誘導剤は、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、ＢＡＦＦ、及びAprilからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含むことができる。ＩＬ−２は、約２ｎｇ／ｍＬから約５ｕｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬから約２ｕｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬから約１．５ｕｍ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬから約１ｕｇ／ｍＬ、又は約１ｕｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＩＬ−４は、約２ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬから約１０ｎｇ／ｍＬ、又は約５ｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及び／又はＩＬ−２１は、約２ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＢＡＦＦ及び／又はAprilは、約１０ｎｇ／ｍＬから約１００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬから約５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬから約２０ｎｇ／ｍＬ、又は約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供することができる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、約１μｇ／ｍＬから約２０μｇ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬから約１５μｇ／ｍＬ、約２．０μｇ／ｍＬから約１０μｇ／ｍＬ、又は約２０μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。特定の実施形態では、培地媒体は、１日から１０日（例えば、２日から８日、３日から７日、又は４日から６日）の期間の抗体発現生体細胞に提供される。培地媒体は、刺激剤（例えば、ＣＤ４０アゴニスト及び／又はＢＣＲ超抗原）を含むことができる。したがって、例えば、抗体生成細胞がＢ細胞リンパ球である場合、培地媒体をＢ細胞リンパ球に提供することは、活性化剤にＢ細胞リンパ球を接触させるのと同時に実行することができる。特定の実施形態では、刺激剤にＢ細胞リンパ球を接触させるステップ及び培地媒体をＢ細胞リンパ球に提供するステップは、重複する時間（例えば、略同じ時間期間にわたり）に実行される。
【０２１６】
[00238]  特定の実施形態では、対象の抗原が抗体発現生体細胞の近くに配置されるように対象の抗原をマイクロ流体デバイスに導入することは、対象の抗原を生体細胞の１ミリメートル（ｍｍ）以内（例えば、生体細胞の７５０μｍ以内、６００μｍ以内、５００μｍ以内、４００μｍ以内、３００μｍ以内、２００μｍ以内、１００μｍ以内、又は５０μｍ以内）に位置決めすることを含む。特定の実施形態では、方法は、フロー領域／隔離ペンに接続されたマイクロ流体チャネルに１つ又は複数の微小物体を導入することを含み得る。微小物体は、抗ＩｇＧ抗体又は他のＩｇＧ結合剤等の抗体特異結合剤を含むことができる。例えば、図６Ｃを参照されたい。そのような実施形態では、生体細胞によって発現される抗体への対象の抗原の結合の監視は、抗体発現生体細胞によって発現される抗体を介して、標識された対象の抗原の微小物体への間接的な結合を検出することを含む。標識された対象の抗原は、可溶性であり得、蛍光標識等の検出可能な標識を含むことができる。微小物体は、当技術分野で既知及び／又は本明細書に記載される任意の適した微小物体（例えば、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズ）であり得る。対象の抗原を提供するステップは、そのような微小物体を、抗体発現生体細胞が配置された隔離ペンの接続領域に隣接して又は接続領域内に位置決めすることを含み得る。代替的に、対象の抗原を提供するステップは、そのような微小物体を、抗体発現生体細胞が配置された隔離ペンの分離領域に装填することを含み得る。微小物体及び対象の抗原は、混合物として同時に又は順次（微小物体が最初に隔離ペン内に位置決めされる場合）提供することができる。
【０２１７】
[00239]  代替的に、特定の実施形態では、方法は、１つ又は複数の微小物体をフロー領域／隔離ペンに接続されたマイクロ流体チャネルに導入することを含み得、対象の抗原は、微小物体に結合される。そのような実施形態では、抗ＩｇＧ抗体又は他のＩｇＧ結合剤等の可溶性の標識された抗体特異結合剤を提供することもでき、生体細胞によって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することは、抗体発現生体細胞によって発現される抗体を介した微小物体への標識された抗体特異結合剤の間接的な結合を検出することを含む。標識された抗体特異結合剤は、蛍光標識等の検出可能な標識を含むことができる。微小物体は、当技術分野で既知の及び／又は本明細書に記載される任意の適した微小物体（例えば、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズ）であり得る。対象の抗原を提供するステップは、そのような微小物体を、抗体発現生体細胞が配置された隔離ペンの接続領域に隣接して又は接続領域内に位置決めすることを含み得る。対象の抗原を提供するステップは、そのような微小物体を、抗体発現生体細胞が配置された隔離ペンの分離領域に装填することを更に含むことができる。微小物体及び抗体特異結合剤は、混合物として同時に又は順次（微小物体が最初に隔離ペン内に位置決めされる場合）提供することができる。抗体等の対象の分子の発現をスクリーニングする方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号に記載されており、この内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２１８】
[00240]  幾つかの実施形態では、方法は、前記抗体特異結合剤の前又は前記抗体特異結合剤と同時に第２の抗体特異結合剤を提供することを更に含む。例えば、図６Ｃを参照されたい。第２の抗体結合剤は、抗ＩｇＧ抗体又は他のタイプの抗体結合剤であり得、且つ標識され得る（例えば、蛍光標識で）。特定の実施形態では、標識された第２の抗体特異結合剤は、対象の抗原及び第１の抗体特異結合剤と混合して提供される。他の実施形態では、標識された第２の抗体特異結合剤は、対象の抗原及び／又は第１の抗体特異結合剤を提供した後に提供される。
【０２１９】
[00241]  特定の実施形態では、対象の抗原を提供することは、対象の可溶性抗原を含む溶液をマイクロ流体デバイスのフロー領域に通し、抗体発現生体細胞が配置された隔離ペン内に可溶性抗原を拡散させることを含み得る。そのような可溶性抗原は、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）に共有結合することができる。このようにして、抗体を含む対象の分子の発現をスクリーニングする一般的な方法は、例えば、２０１７年４月１４日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０２７７９５号に記載されており、この内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２２０】
[00242]  特定の実施形態では、方法は、生体細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ球）によって発現される抗体への対象の抗原の結合を検出することと、前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するものとして抗体発現生体細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ球）を識別することとを更に含むことができる。
【０２２１】
識別されたＢ細胞リンパ球からの抗体配列の取得
[00243]  配列決定ライブラリを提供し、及び／又は重鎖及び軽鎖抗体配列を抗体発現細胞から得る方法も本明細書に記載される。更に、対象のＢ細胞リンパ球から配列決定ライブラリを得ることは、本明細書に記載される方法以外の方法により実行することもできる。限定ではなく、他の適した方法は、２０１７年９月２９日に出願されたＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５４６２８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０２２２】
捕捉／プライミングオリゴヌクレオチド
[00244]  捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドは、第１のプライミング配列及び捕捉配列を含み得る。捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドは、５’モストヌクレオチド及び３’モストヌクレオチドを含み得る。
【０２２３】
捕捉配列
[00245]  捕捉配列は、溶解された細胞からの核酸を捕捉するように構成されたオリゴヌクレオチド配列である。様々な実施形態では、捕捉配列は、捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドの３’モストヌクレオチドに隣接し得、又は３’モスとヌクレオチドを含み得る。捕捉配列は、約６個から約５０個のヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、捕捉配列は、対象の細胞から解放された核酸にハイブリダイズすることにより核酸を捕捉する。本明細書に記載される方法の幾つかでは、対象のＢ細胞から解放された核酸は、ｍＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡの３’末端にポリＡ配列を有する、ｍＲＮＡを捕捉し、ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る捕捉配列は、ポリＴ配列を含み得る。ポリＴ配列は、約２０個のＴヌクレオチドから１００個を超えるＴヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、ポリＴ配列は、約３０個から約４０個のヌクレオチドを有し得る。ポリＴ配列は、３’末端に２つのヌクレオチドＶＩを更に含み得る。
【０２２４】
第１のプライミング配列
[00246]  捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドの第１のプライミング配列は、捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドの５’モストヌクレオチドに隣接した捕捉配列への５’であり得、又は捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドの５’モストヌクレオチドを含む。第１のプライミング配列は、一般的又は配列固有のプライミング配列であり得る。第１のプライミング配列は、結合すると、逆転写を準備するプライマーに結合し得る。第１のプライミング配列は、約１０個から約５０個のヌクレオチドを含み得る。
【０２２５】
追加のプライミング及び／又はアダプター配列
[00247]  捕捉オリゴヌクレオチドは、任意選択的に、１つ又は複数の追加のプライミング／アダプター配列を有し得、追加のプライミング／アダプター配列は、プライマー拡張（ポリメラーゼによる拡張を含むことができる）の着陸部位又は超並列配列決定アレイ若しくはフローセル内のアンカー部位に相補的にハイブリダイズするための固定化部位のいずれかを提供する。本明細書における方法では、第２の（又は追加の）プライミング配列は、Ｐ１配列（例えば、Illumina sequencing chemistries、ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ（配列番号１）で使用されるような）であり得るが、方法は、そのように限定されない。他のタイプのＮＧＳライブラリ準備のために任意の適するプライミング配列が含まれ得る。幾つかの実施形態では、Ｐ１配列が追加のプライミング配列として含まれる場合、それは、第１のプライミング配列への５’であり得る。追加のＰ１のプライミング配列も捕捉配列への５’であり得る。
【０２２６】
鋳型切り替えオリゴヌクレオチド
[00248]  本明細書で使用される場合、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、鋳型切り替えヌクレオチドに追加されたデオキシシチジンヌクレオチドを使用する、限定ではなくモノニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）等の適切な逆転写の末端トランスフェラーゼ活性を可能にするオリゴヌクレオチドを指す。鋳型切り替えオリゴヌクレオチドと追加されたデオキシシチジンとが塩基ペアリングされると、逆転写酵素は、鋳型鎖を捕捉されたＲＮＡから鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに「切り替え」、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドの５’末端への複製を続ける。したがって、転写ＲＮＡの完全な５’末端が含まれ、更なる増幅のための追加のプライミング配列を導入し得る。更に、ｃＤＮＡは、配列から独立して転写される。
【０２２７】
ＢＣＲ遺伝子配列
[00249]  Ｂ細胞レセプタ遺伝子配列は、バリアブル（Ｖ）、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）、及び一定（Ｃ）セグメントを含む幾つかのサブ領域を解放ＲＮＡにその順序で５’から３’に含む。一定領域は、ポリＡ配列への５’のみである。配列決定ＢＣＲへの幾つかの手法では、ポリＡ配列（テール）を含まない配列決定のための増幅産物を得る選択戦略を構築することが望ましいことがある。更に、一定領域を殆ど保持しない増幅産物を生成することが望ましいことがある。解放された核酸配列のこれらのセクションを除外するように増幅を制限することにより、ＢＣＲのＶ、Ｄ（存在する場合）、及びＪセグメントのよりロバストな配列決定を可能にすることができる。
【０２２８】
[00250]  方法をよりよく理解するために、図８Ａ〜図８Ｈを参照すると、各図８Ａ〜図８Ｈは、単一の細胞からＢＣＲ配列決定ライブラリを得るプロセスにおける異なるポイントに存在する単一の種又は組の関連付けられた複製種を表す。プロセスは、幾つかの単細胞を処理して、ウェルプレート内の特定の発端部位に遡って追跡し得る配列決定ライブラリを提供し得るように多重化され得る。この位置の知識は、細胞が搬出されたマイクロ流体デバイス内の個々の隔離ペンに遡って更に追跡可能であり得る。したがって、生体細胞は、所望の産物を生成するための又は他の細胞を刺激する所望の能力についてアッセイされ得、次に追跡可能に搬出、追跡可能に処理されて、配列決定ライブラリを提供し得、結果的に生成された配列決定から導出されたゲノムデータは、マイクロ流体デバイス内のソース細胞に識別可能に相関付けられ得る。
【０２２９】
[00251]  図８Ａでは、生体細胞が溶解するとｍＲＮＡ８１０が解放される。解放されたｍＲＮＡ８１０は、対象の遺伝子配列８０５を含み得、３’末端にポリＡセグメント８１５を有する。捕捉／プライミングオリゴヌクレオチド８２０は、Ｐ１プライミング配列８２５及びポリＴ捕捉配列（３０個のＴヌクレオチドを表し、捕捉／プライミングオリゴヌクレオチド８２０の３’末端に２ヌクレオチド配列ＮＩを有するＴ３０ＮＩとして図８Ａに示される）を含み得る。幾つかの実施形態では、ポリＴ捕捉配列のＴ３０ＮＩ配列内のＮヌクレオチドは、Ｇ、Ｃ、及びＡから選択する（例えば、Ｔヌクレオチドを除外する）ことができる。捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドは、解放ｍＲＮＡ８１０のポリＡ配列８１５に結合することができる。
【０２３０】
[00252]  図８Ｂでは、逆転写の初期プロセスが表され、逆転写酵素は、鋳型としてｍＲＮＡ８１０を使用して捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドを拡張し、それにより対象の遺伝子８０５を転写に組み入れる。ｍＲＮＡ８１０の３’末端に達すると、逆転写酵素は、幾つかのＣ（ここでは３つのＣとして示される）ヌクレオチドを追加する。
【０２３１】
[00253]  図８Ｃでは、転写切り替えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）８３５は、逆転写反応混合物内に存在し、ＴＳＯは、Ｐ１配列８２５を含み、４ヌクレオチド（Ｎ４）の第１のバーコード８０２を更に含み得る。以下に説明する例では、ＴＳＯ８３５は、配列番号３の配列を有するオリゴヌクレオチドであり得る。第１のバーコード８０２は、配列決定中、幾つかの実験を多重化するのに使用され得、方法は、第１のバーコード８０２が存在することを必要とすることに限定されない。第１のバーコード８０２は、４つのヌクレオチドを有することに限定されず、配列決定ライブラリ生成物を識別可能にする任意の適した数のヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、第１の（多重化）バーコードは、約３個から約１０個のヌクレオチドを有し得る。ＴＳＯは、効率を上げるために、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されたビオチンを更に含み得る。
【０２３２】
[00254]  逆転写では、図８Ｄに示されるように、ＴＳＯは、ｍＲＮＡ８１０の５’末端と整列され、逆転写酵素が「鋳型を切り替え」、３’末端での３つのＣヌクレオチドを超えてｃＤＮＡ８３０を拡張する鋳型としてＴＳＯのデオキシヌクレオチドを使用して、第１の４ヌクレオチドバーコード８０２（Ｎ４）及びＴＳＯのＰ１配列８２５を組み込めるようにする。完全拡張ｃＤＮＡ産物８４０は、ここで、両末端にＰ１プライミング配列、対象の遺伝子８０５、及び任意選択的に第１のバーコード８０２（Ｎ４）を含む。ｃＤＮＡ産物８４０は、依然として捕捉／プライミングオリゴヌクレオチド８２０の捕捉配列から組み込まれたポリＴ−ＮＩ配列も含む。
【０２３３】
[00255]  図８Ｅでは、ｃＤＮＡ８４０は、捕捉されたｍＲＮＡ全体を増幅するために、順方向及び逆方向の両方でＰ１プライマー８４５を使用して増幅することができる。以下に説明する例では、Ｐ１プライマーは、５’末端にビオチンを有し得、配列番号４の配列を有し得る。増幅の産物である配列、すなわち増幅されたｃＤＮＡ８４０は、５’及び３’末端の両方におけるＰ１配列、対象の遺伝子配列８０５、及び第１のバーコード８０２を含め、逆転写ステップから生じた転写の全ての特徴を保持する。第１のバーコードは、対象の遺伝子配列８０５の５’及び増幅産物８４０の５’末端におけるＰ１プライミング配列の３’に組み込まれる。
【０２３４】
[00256]  次に、第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が実行される。図８Ｆは、ＢＣＲ領域のフォーカス領域を選択的に増幅するのに使用されるプライマー構成の概略表現を示す。順方向プライマー８５０は、図８Ｅの増幅に使用されたＰ１配列８２５への３’であるｃＤＮＡ増幅産物８４０の５’領域の部分に結合するように設計される。順方向プライマー８５０は、ウェルプレートのソースウェルを識別するシステムの一環として使用することができる第２の６ヌクレオチドバーコード８０４を含むこともできる。６ヌクレオチドの第２のバーコード８０４が図８Ｅ〜図８Ｈに示されるが、第２のバーコードは、任意の適する数のヌクレオチドを有し得、約３個のヌクレオチドから約１０個のヌクレオチドを有し得る。逆プライマー８５５は、ＢＣＲの結合（Ｊ）領域の３’末端に続く一定領域の５’末端に近い、ＢＣＲの大きい一定領域のサブ領域に結合するように向けられる。これは、バリアブル（Ｖ）（存在する場合）、多様性（Ｄ）、及び結合（Ｊ）のサブ領域の全てが増幅産物の配列決定部分内に入ることを保証する。これは、捕捉／プライミング配列８２０から導入されたＴ３０ＮＩ配列及びＰ１配列８２５を除去する。重鎖並びにカッパ及びラムダ軽鎖の両方のカバレッジを保証するために、逆プライマー８５５の混合物が利用される。
【０２３５】
[00257]  第２のＰＣＲ増幅は、図８Ｇに示されるように、選択及び切断された増幅産物８６０に対して実行される。増幅産物８６０は、対象の遺伝子配列８０５、任意選択的な第１の（多重化）バーコード配列８０２（Ｎ４）、及び第２の（ウェルプレート）バーコード８０４（Ｎ６）を含む。第２のＰＣＲの順方向プライマー８６５は、順方向プライマー８５０によって導入された第２の（ウェルプレート）バーコード８０４への配列５’に結合する。逆プライマー８７０は、逆プライマー８５５（逆プライマー８５５のそれぞれの５’部分）によって導入された共有配列に結合する。逆プライマー８７０は、６ヌクレオチド（Ｎ６）を有する第３の（ウェルプレート）バーコード８０６も含む。６ヌクレオチドの第３の（ウェルプレート）バーコード８０６が図８Ｇ〜図８Ｈに示されるが、第３のバーコードは、任意の適する数のヌクレオチドを有し得、約３個のヌクレオチドから約１０個のヌクレオチドを有し得る。
【０２３６】
[00258]  最終的な増幅産物８８０が図８Ｈに示され、第１の任意選択的な多重化バーコード８０２、対象の遺伝子配列８０５、第２の（ウェルプレート）バーコード８０４、及び第３の（ウェルプレート）バーコード８０６を含む。追加のアダプターが特定の配列決定化学で使用するために存在し得る。
【０２３７】
[00259]  バーコード２及び３は、搬出ウェルプレートのウェルにわたって利用されて、各ソースウェル、したがって配列決定ライブラリが生成された細胞を明解に識別する。経済的な手法は、ウェルプレートのウェルにわたって一意のバーコードの８×１２の分布を使用することであり得、したがって各ウェルを識別するために２０個の一意のバーコードが全体で必要である。複数のウェルプレート試料が配列決定実行で組み合わされる場合、第１の（多重化）バーコードを使用し得るが、１つのみのウェルプレートが配列決定実行で配列決定される場合には必要ない。
【実施例】
【０２３８】
実施例
実施例１  −  ヒトＣＤ４５に結合可能なＩｇＧ抗体をスクリーニングするマウス脾細胞のスクリーニング
[00260]  ヒトＣＤ４５に結合したＩｇＧ型抗体をスクリーニングするマウス脾細胞を識別するためにスクリーニングを実行した。実験設計は、以下のステップを含んだ。
１．ＣＤ４５抗原被覆ビーズの生成；
２．マウス脾細胞の収穫；
３．マイクロ流体デバイスへの細胞の装填；及び
４．抗原特定性のアッセイ。
【０２３９】
【表２】
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【０２４０】
ＣＤ４５抗原被覆ビーズの生成
[00266]  ＣＤ４５抗原被覆微小ビーズを以下のように生成した。
【０２４１】
[00267]  ５０μｇのキャリアなしＣＤ４５を５００μＬＰＢＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁させた。
【０２４２】
[00268]  Slide-A-Lyzer透析ミニカップを５００μＬのＰＢＳで濯ぎ、次にマイクロチューブに添加した。
【０２４３】
[00269]  濯いだ透析ミニカップに５０μＬの０．１μｇ／μＬ  ＣＤ４５溶液を添加した。
【０２４４】
[00270]  １７０μＬのＰＢＳを２ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンに添加し、その後、ＣＤ４５抗原を含む透析ミニカップに４．１μＬのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを添加した。
【０２４５】
[00271]  ＮＧＳ−ＰＥＧ４−ビオチンをＣＤ４５抗原と共に室温で１時間培養した。
【０２４６】
[00272]  培養に続き、透析ミニカップをマイクロチューブから取り外し、第２のマイクロチューブ内の１．３ｍｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に配置し、第１の１時間期間にわたり、ロックした状態で４℃において培養した。透析ミニカップを続けて、新鮮なＰＢＳ（ｐＨ７．２）１．３ｍｌを含む第３のマイクロチューブに移し、第２の１時間期間にわたり、ロックした状態で４℃において培養した。この最後のステップを更に３回繰り返し、合計で５つの１時間培養であった。
【０２４７】
[00273]  １００μＬのビオチン化ＣＤ４５溶液（約５０ｎｇ／μＬ）を標識された管に分注した。
【０２４８】
[00274]  ５００μＬのSpherotechストレプトアビジン被覆ビーズをマイクロチューブに分注し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３回洗浄し（１０００μＬ／洗浄）、３０００ＲＣＦで５分間遠心分離した。
【０２４９】
[00275]  ビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４）５００μＬ中に再懸濁させ、ビーズ濃度５ｍｇ／ｍｌを生成した。
【０２５０】
[00276]  ビオチン化ＣＤ４５タンパク質溶液（５０μＬ）を、再懸濁させたSpherotechのストレプトアビジン被覆ビーズと混合した。混合物をロックした状態で２時間にわたり４°において培養し、次に３０００ＲＣＦで５分間にわたり４℃において遠心分離した。上澄みを破棄し、ＣＤ４５被覆ビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬで３回洗浄した。次に、ビーズを３０００ＲＣＦで更に５分間にわたり４℃において遠心分離した。最後に、ＣＤ４５ビーズを５００μＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４中に再懸濁させ、４℃で貯蔵した。
【０２５１】
マウス脾細胞収穫
[00277]  ＣＤ４５で免疫化したマウスからの脾臓を収穫し、ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳに配置した。ハサミを使用して脾臓を細かく切り刻んだ。
【０２５２】
[00278]  細かく切り刻んだ脾臓を４０μｍ細胞ストレーナーに配置した。１０ｍｌピペットを用いて細胞ストレーナーを通して単細胞を洗浄した。ガラス棒を使用して脾臓を更に破砕し、単細胞を細胞ストレーナーに強制的に通し、その後、１０ｍｌピペットを用いて細胞ストレーナーを通して単細胞を再び洗浄した。
【０２５３】
[00279]  市販のキットを用いて赤血球細胞を溶解させた。
【０２５４】
[00280]  細胞を２００ｘＧで沈降させ、１０ｍｌピペットを用いて未処理の脾細胞をＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ中に濃度２ｅ８細胞／ｍｌで再懸濁させた。
【０２５５】
マイクロ流体デバイスへの細胞の装填
[00281]  マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning（ＯＥＰ（商標））技術が構成されたOptoSelect（商標）デバイス（Berkeley Lights, Inc.）であった。マイクロ流体デバイスは、フロー領域と、それに流体的に接続された複数のNanoPen（商標）チャンバとを含み、チャンバは、約７×１０５立方μｍの容積を有した。マイクロ流体デバイスは、少なくともフローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイスの搭載ステージ、及びカメラを含むプロトタイプシステム（Berkeley Lights, Inc.）で動作した。
【０２５６】
[00282]  脾細胞をマイクロ流体デバイスに搬入し、１つのNanoPenチャンバ当たり２０個〜３０個の細胞を含むNanoPenチャンバに装填した。１００μＬの培地を１μＬ／秒でデバイスに流し、不要な細胞を除去した。温度を３６℃に設定し、培地媒体を０．１μＬ／秒で３０分間灌流させた。図５Ａに示されるような明視野撮像は、NanoPenチャンバ内の細胞の位置を示した。
【０２５７】
抗原特異的アッセイ
[00283]  １：２５００抗マウスヤギＦ（ａｂ’）２−Alexa568を含む培地を準備した。
【０２５８】
[00284]  １００μＬのＣＤ４５ビーズを、抗マウスヤギＦ（ａｂ’）−Alexa568二次抗体の１：２５００希釈液を含む２２μＬの培地中に再懸濁させた。
【０２５９】
[00285]  再懸濁させたＣＤ４５ビーズを、次に、脾細胞を含むNanoPenチャンバに隣接するが、NanoPenの直接外側に配置されるまで１μＬ／秒の流量でマイクロ流体チップの主チャネルに流した。次に、流体フローを停止させた。
【０２６０】
[00286]  次に、マイクロ流体チップを明視野で撮像して、ビーズ（図示せず）の位置を特定した。次に、テキサスレッドフィルタを使用して細胞及びビーズの画像を捕捉した。１時間にわたって５分毎に、各露出が１０００ｍｓであり、利得が５の状態で画像を撮影した。図５Ｂに示されるように、ビーズ／標識された二次抗体混合物の導入後、５分の時間点での撮像は、幾つかのペン内の細胞の部位で蛍光信号が明らかになることを示した。細胞の標識は、細胞の表面上のＩｇＧの存在を示した。ビーズのおぼろげな標識をこの時点で観測した。
【０２６１】
結果
[00287]  特定のペンからマイクロ流体デバイスの主チャネルに拡散したＩｇＧアイソタイプ抗体の拡散を反映して、ビーズ／抗体混合物導入後２０分の時点において、ＣＤ４５被覆ビーズに結合可能であったビーズでの陽性信号が観測された。ビーズへの抗ＣＤ４５抗体の結合により、二次抗マウスヤギＩｇＧ−５６８がビーズに関連付けられ、検出可能な信号を生成することができた。図５Ｃの白色矢印を参照されたい。
【０２６２】
[00288]  本発明の方法を使用して、陽性信号に関連付けられた脾細胞の各群を分離し、単一の細胞として新しいペンに移し、再アッセイすることができた。このようにして、抗ＣＤ４５ＩｇＧ抗体を発現した単細胞を検出し分離することができた。
【０２６３】
実施例２：マイクロ流体デバイスにおける記憶Ｂ細胞の活性化及びスクリーニング
[00289]  マイクロ流体デバイスにおいて記憶Ｂ細胞をスクリーニングする一般的な方法を図６Ａに概説する。上記方法は、ヒト記憶Ｂ細胞に焦点を当てるが、この方法は、他の動物からのＢ細胞のスクリーニングに使用することもできる。
【０２６４】
記憶Ｂ細胞の収穫
[00290]  凍結したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、１０％ＦＢＳ（Seradigm）で補足した６倍容量のＲＰＭＩ１６４０（Gibco）と混合し、カウントし、５００ｇで５分間遠心分離する。上澄みを吸引し、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に５×１０７細胞／ｍＬ濃度で再懸濁する。
【０２６５】
[00291]  次に、EasySepヒトＢ細胞富化キット（EasySep、番号１９０５４）を使用してＢ細胞富化を実行する。５０μＬのＢ細胞富化カクテルをヒトＰＢＭＣ１ｍＬ毎に添加し、生成された混合物を室温で１０分間培養する。次に、ヒトＰＢＭＣ１ｍＬ毎に７５μＬの磁性粒子を添加し、混合物をよく混合し、室温で１０分間培養する。ＦＡＣＳバッファーを添加することにより、約１．１ｕＬ容量のＰＢＭＣ細胞懸濁液を２．４ｍＬにし、次にピペット操作でよく混合する。次に、ＰＢＭＣ懸濁液を含む管をEasySep磁石（蓋なし）内に配置し、５分間培養する。管をEasySep磁石内に維持しながら、富化Ｂ細胞懸濁液を新しく清潔な管に注ぐ。富化Ｂ細胞懸濁液の細胞カウントを実行し、その後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上澄みを吸引する。
【０２６６】
[00292]  抗ＣＤ２７抗体を含むＦＡＣＳバッファー中に５×１０７細胞／ｍＬ濃度で富化Ｂ細胞ペレットを再懸濁し、次に暗所において２０分間にわたり４℃で培養する。培養後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄し、懸濁液を３００ｇで５分間遠心分離する。最終的な富化Ｂ細胞ペレットを５×１０７細胞／ｍＬ濃度でＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させ、次にピペット先端部をストレーナーの網に（直角に）押し当てた状態において単細胞ストレーナーで濾す。ＦＡＣＳソートまで、濾した細胞懸濁液を氷上に維持する。FACS Aria器具を使用して、Ｂ細胞活性化／培地媒体（ＲＰＭＩ  １６４０（Gibco）、１０％ＦＢＳ（Seradigm）、２ｕｇ／ｍＬ  ＣｐＧ（Invivogen）、１ｕｇ／ｍＬ  ＩＬ−２（Peprotek）、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４（Peprotek）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６（Peprotek）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２１（Peprotek）、及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＡＦＦ（Peprotek））中にＣＤ２７＋Ｂ細胞をソートする。
【０２６７】
[00293]  分離された記憶Ｂ細胞を濃度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、次に可能な限り迅速に実行されるマイクロ流体デバイスへの搬入まで３７℃で培養する。
【０２６８】
マイクロ流体デバイスの準備及び記憶Ｂ細胞の搬入
[00294]  マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning（ＯＥＰ（商標））技術が構成され、共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの層を含む調整された内面を有するOptoSelect（商標）デバイス（Berkeley Lights, Inc.）である。マイクロ流体デバイスは、複数のマイクロ流体チャネルを有するフロー領域と、各マイクロ流体チャネルに流体的に接続された複数の隔離ペン（又はNanoPen（商標）チャンバ）とを含み、隔離ペンは、約５×１０５立方μｍの容積を有する。マイクロ流体デバイスは、Beaconプラットフォーム（Berkeley Lights, Inc.）又はプロトタイプAlphaプラットフォーム（Berkeley Lights, Inc.）で動作し、プラットフォームは、フローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイスの搭載ステージ、及びカメラを含む。
【０２６９】
[00295]  ２５０μＬの１００％二酸化炭素を１２μＬ／秒の流量でマイクロ流体デバイスに流す。この後、イスコフ改変ダルベッコ培地（ATCC）１０００ｍｌ、ウシ胎仔血清（ATCC）２００ｍｌ、pen-strep（Life Technologies）１０ｍｌ、及びPluronic F-127（Life Technologies）１０ｍＬを含むプライミング培地２５０μＬが続く。１０％ＦＢＳ（Seradigm）、１Ｘ  Pen-Strep（Gibco）、及び１Ｘ  Kanamycin Sulfate（Gibco）で補足したＲＰＭＩ  １６４０（Gibco）を含むＢ細胞培地媒体の導入が続く。
【０２７０】
[00296]  次に、懸濁液を流入口に流し、記憶Ｂ細胞がフロー領域／マイクロ流体チャネル内に配置されたときにフローを停止させることにより、上記のように準備した分離した記憶Ｂ細胞懸濁液をマイクロ流体デバイスに搬入する。次に、ペン毎に１つのＢ細胞を目標として、記憶Ｂ細胞を隔離ペンに装填する。光活性化ＤＥＰ力（ＯＥＰ技術）を使用して、記憶Ｂ細胞をフロー領域／マイクロ流体チャネルから隔離ペンの分離領域に移動させる。ＯＥＰを操作するパラメータは、マイクロ流体デバイスにわたってＡＣ電位を印加し（電圧３．５Ｖ、周波数２ＭＨｚ）、構造化光を使用して、個々の細胞を捕獲する光トラップを形成し（図６Ｂに示されるように）、光トラップを８μｍ／秒で移動させることを含む。ペンに入れた後、フロー領域／マイクロ流体チャネルに残っている細胞は、マイクロ流体デバイスから洗い流す。
【０２７１】
記憶Ｂ細胞活性化
[00297]  プロテインＡ（Spherotech）で被覆したビーズを、照射したジャーカットＤ１．１フィーダ細胞と約１：１の比で混合する。次に、ビーズ／フィーダ細胞混合物をマイクロ流体デバイスに流し入れ、記憶Ｂ細胞を含む各隔離ペンにフィーダ細胞及びビーズをバルク装填する。バルク装填は、マイクロ流体デバイスを一端部に傾斜させ、重力により細胞及びビーズを下方の隔離ペンに引っ張ることにより達成される。ビーズ／フィーダ細胞混合物は、各フィーダ細胞及びビーズのそれぞれで約１．５×１０７個／ｍＬの濃度でマイクロ流体デバイスに流入し、このようにバルク装填された隔離ペンは、ペン毎に予想平均で約１０個のフィーダ細胞及び約１０個のビーズを受け取る。
【０２７２】
[00298]  次に、マイクロ流体デバイスを培養ステーションに移し、Ｂ細胞活性化／培地媒体（上記）でマイクロ流体デバイスの流路を４日の期間にわたって灌流する。培養ステーションに維持される間、マイクロ流体デバイスを端部位置で傾斜した状態に維持する。灌流方法は、以下である：Ｂ細胞活性化／培地媒体を０．０２μＬ／秒で１００秒間灌流させ、フローを５００秒間停止し、Ｂ細胞活性化／培地媒体を２μＬ／秒で６４秒間灌流させ、繰り返す。
【０２７３】
活性化記憶Ｂ細胞のアッセイ
[00299]  ４日の培養／活性化後、マイクロ流体デバイスを培養ステーションから取り出し、Beacon／Alphaシステムに戻し、そこで多重アッセイを実行して、ＩｇＧ分泌及び抗原特異性を検出する。図６Ｃに示す多重化アッセイは、抗ヒトＩｇＧ抗体被覆捕捉ビーズ（Spherotech）、抗ヒトＩｇＧ−Alexa Fluor488二次抗体（Invitrogen）、及びAlexa Fluor647カルボン酸スクシンイミジルエステルを使用して標識した対象の抗原を含む。捕捉ビーズ、二次抗体、及び標識した対象の抗原をＢ細胞活性化／培地媒体中で一緒に混合し、マイクロ流体デバイスのフロー領域／マイクロ流体チャネルに流す。フローを停止し、蛍光標識の視覚化に適切なフィルタを使用して、隔離ペンの画像を１０分から２５分の期間にわたって定期的に撮影する。対象の抗原に結合する抗体を分泌する記憶Ｂ細胞は、標識された対象の抗原とＩｇＧ抗体被覆捕捉ビーズとの関連性を誘導する。その結果、蛍光標識された捕捉ビーズの「プルーム」が、フロー領域／マイクロ流体チャネルと、記憶Ｂ細胞が配置された隔離ペンとの間の開口部に出現する。図６Ｄは、記憶Ｂ細胞の典型的なアッセイ結果を示す。
【０２７４】
搬出及び更なる処理
[00300]  次に、ＤＥＰ力を使用して（上述したＯＥＰパラメータを使用して）、対象の抗原に結合する抗体を分泌するものとして識別されたＢ細胞を一度に１つのペンから出し、搬出媒体（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を有するＤＰＢＳ（Lonza）、ＢＳＡ（Sigma）５ｍｇ／ｍＬ、及び１：１００のPluronic（商標）F-127（Thermo Fisher））をマイクロ流体デバイスの流路に流すことにより、マイクロ流体デバイスから９６ウェルプレートのウェルに搬出する。搬出に続き、記憶Ｂ細胞を溶解させ、重鎖及び軽鎖抗体配列をコードする転写をｃＤＮＡに逆転写し、配列決定する。
【０２７５】
結果
[00301]  上記プロトコールと略同じプロトコールを使用して、Ｂ細胞の活性化率（ＩｇＧ分泌の検出により測定される）は、ヒト記憶Ｂ細胞で約１２％に達した。非ヒト哺乳類記憶Ｂ細胞の細胞活性化率は、４０％と高い値に達した。対象の抗原に結合する抗体を発現する活性化された記憶Ｂ細胞の検出率は、対象の抗原に依存するが、通常、１％前後又はそれ未満である。そのようなスクリーニングプロトコールによるヒト記憶Ｂ細胞から得られた推定上のＡｇ＋抗体の関連性をテストする一実験では、Ａｇ結合抗体を分泌するものとして識別された２０個１組の記憶Ｂ細胞をマイクロ流体デバイスから搬出し、それらの抗体重鎖及び軽鎖配列を特定した。ＨＥＫ  ３９３Ｔにおける再発現及びチップアッセイで使用した対象の抗原を用いてのＥＬＩＳＡアッセイに続き、２０個の抗体のうちの１６個（すなわち８０％）がＥＬＩＳＡアッセイにおいて対象の抗原を検出した。これは、本明細書に開示される方法による記憶Ｂ細胞の活性化とスクリーニングとの関連性を確証する。
【０２７６】
変形形態
[00302]  上記方法は、多くの方法で変更することができ、それでもなお記憶Ｂ細胞の直接スクリーニングという目標を達成する。これらの変形形態は、以下を含む。
【０２７７】
[00303]  １．齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）、ウサギ、フェレット、家畜（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ）、ラマ、ラクダ等の他の哺乳類並びにニワトリ及びシチメンチョウ等の鳥類を含むヒト以外の動物から分離された記憶Ｂ細胞のスクリーニング。
【０２７８】
[00304]  ２．記憶Ｂ細胞をペンに入れるため及びペンから出すために使用されるＯＥＰ動作パラメータは、変更され得る。例えば、マイクロ流体デバイスにわたるＡＣ電位は、周波数約１ＭＨｚから約３ＭＨｚで約２Ｖから約５Ｖに設定することができる。特定の例は、（ｉ）電圧約２．５Ｖ及び周波数約３ＭＨｚ並びに（ｉｉ）電圧約４．５Ｖ及び周波数約１ＭＨｚを含む。加えて、構造化光（又は光ケージ）が移動する速度は、約５μｍ／秒から約１０μｍ／秒まで変更することができる。
【０２７９】
[00305]  ３．上述したように、マイクロ流体デバイスは、チップを一端部に傾斜させた状態で培養ステーション上に維持される。代替的に、マイクロ流体デバイスは、標準位置（すなわちマイクロ流体デバイスが略平らに置かれた状態）でBeacon／Alphaシステム上に再び配置することができる。次に、以下のプロトコールに従って、記憶Ｂ細胞培養／活性化媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に灌流させる：Ｂ細胞培養／活性化媒体を０．０１μＬ／秒で２時間、灌流させ、Ｂ細胞培養／活性化媒体を２μＬ／秒で６４秒間灌流させ、繰り返す。
【０２８０】
[00306]  ４．アッセイは、第２の対象の抗原、更には第２及び第３の対象の抗原を含むように更に多重化され得る。例えば、図６Ｃを参照されたい。このようにして、同じ標的タンパク質／分子上の異なるエピトープに結合する抗体、標的タンパク質／分子に対して異なるレベルの種間反応性を示す抗体、又は単に完全に異なる対象の抗原に結合する抗体について記憶Ｂ細胞を同時にスクリーニングすることができる。加えて、第２及び／又は第３の対象の抗原の使用により、高スループットのスクリーニングが可能になる。
【０２８１】
[00307]  ５．マイクロ流体デバイスの隔離ペンのサイズは、例えば、約１．１×１０６立方μｍに増大させることができる。通常、ペンは、約５×１０６立方μｍ又はそれ未満（例えば、約４×１０６立方μｍ、約３×１０６立方μｍ、約２．５×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約１．５×１０６立方μｍ、又はそれ未満）の容積を有する。より大きいサイズは、記憶Ｂ細胞の多クローン群の初期アッセイに有用であり得るが、より大きいサイズは、多重化アッセイを遅らせ、記憶Ｂ細胞の活性化及び成長に潜在的に負の影響を与える恐れもある。
【０２８２】
[00308]  ６．アッセイは、多クローンアッセイとして開始し、次に単クローンアッセイにシフトすることができる。この手法では、隔離ペンにまず複数の記憶Ｂ細胞（例えば、２個から１０個又は４個から１０個）が装填される。この手法がとられる場合、初期アッセイにおいてＡｇ＋を示した隔離ペンを更に分析して、隔離ペン内のいずれの記憶Ｂ細胞がそのＡｇ＋抗体を生成しているかを特定しなければならない。このために、Ａｇ−ペン内の細胞をペンから出し、搬出する（例えば、搬出媒体をフロー領域／マイクロ流体チャネルを通して破棄管に流すことにより）。次に、Ａｇ＋ペン内の細胞をペンから出し、１つの記憶Ｂ細胞をマイクロ流体デバイスのソースペンに隣接して又はソースペンの近傍に配置された空のペンに入れる。次に、Ａｇ＋ペンの多重化アッセイを繰り返し、繰り返されたアッセイでＡｇ＋として識別されたあらゆるペンに配置された記憶Ｂ細胞を搬出して更に処理する。このスループットのより高い多クローン−単クローン手法は、図６Ａに概説する方法に図６Ｅに概説する追加ステップを追加する。
【０２８３】
実施例３：マイクロ流体デバイスにおける血漿細胞のスクリーニング
[00309]  マイクロ流体デバイスにおいて血漿細胞をスクリーニングする一般的な方法を図７Ａに示す。上記方法は、ヒト血漿細胞に焦点を当てるが、この方法は、他の動物からの血漿細胞のスクリーニングに使用することもできる。
【０２８４】
血漿細胞の収穫
[00310]  凍結したヒト骨髄（ＢＭ）細胞を３７℃の水浴で急速解凍し、次に１Ｘデオキシリボヌクレアーゼ（Benzonase（登録商標）、２５，０００Ｕ／ｍＬを含むヌクレアーゼ１０００Ｘストック、Millipore）で補足した、予め加熱した（３７℃）血漿細胞培地媒体（ＲＰＭＩ  １６４０（Gibco）、１０％ＦＣＳ（Hyclone）、１Ｘ非必須アミノ酸（NEAA）溶液（Gibco）、１Ｘピルビン酸ナトリウム（Gibco）、５０ｕＭ  βメルカプトエタノール（Gibco）、及び１Ｘ  pen-strep（Gibco））５ｍＬに滴下する。生成された混合物を３００ｇで１０分間遠心分離し、細胞ペレットをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄する。
【０２８５】
[00311]  抗ＣＤ１３８抗体を含むＦＡＣＳバッファー中に１×１０７細胞／ｍＬ濃度において、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後に得られた細胞ペレットを再懸濁させ、次に４℃で２０分間にわたり暗所で培養する。培養後、細胞をＦＡＣＳバッファー中で２回洗浄し、１×１０７細胞／ｍＬ濃度でＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させる。ＦＡＣＳソートまで細胞懸濁液を氷上に維持する。FACS Aria器具を使用して、４０ｕｇ／ｍＬのＩＬ−６（R&D Systems）で補足した血漿細胞培地媒体（上記）中にＣＤ１３８＋血漿細胞をソートする。
【０２８６】
[00312]  分離された血漿細胞を濃度２×１０６細胞／ｍＬに調整し、次に可能な限り迅速に実行されるマイクロ流体デバイスへの搬入まで３７℃で培養する。
【０２８７】
マイクロ流体デバイスの準備及び血漿細胞の搬入
[00313]  マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning（ＯＥＰ（商標））技術が構成され、共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの層を含む調整された内面を有するOptoSelect（商標）デバイス（Berkeley Lights, Inc.）である。マイクロ流体デバイスは、複数のマイクロ流体チャネルを有するフロー領域と、各マイクロ流体チャネルに流体的に接続された複数の隔離ペン（又はNanoPen（商標）チャンバ）とを含み、隔離ペンは、約５×１０５立方μｍの容積を有する。マイクロ流体デバイスは、Beaconプラットフォーム（Berkeley Lights, Inc.）又はプロトタイプAlphaプラットフォーム（Berkeley Lights, Inc.）で動作し、プラットフォームは、フローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイスの搭載ステージ、及びカメラを含む。
【０２８８】
[00314]  ２５０μＬの１００％二酸化炭素を１２μＬ／秒の流量でマイクロ流体デバイスに流す。この後、イスコフ改変ダルベッコ培地（ATCC）１０００ｍｌ、ウシ胎仔血清（Hyclone）２００ｍｌ、pen-strep（Life Technologies）１０ｍｌ、及びPluronic F-127（Life Technologies）１０ｍＬを含むプライミング培地２５０μＬが続く。４０ｕｇ／ｍＬのＩＬ−６（R&D Systems）で補足した血漿細胞培地媒体（上記）の導入が続く。
【０２８９】
[00315]  次に、懸濁液を流入口に流し、血漿細胞がフロー領域／マイクロ流体チャネル内に配置されたときにフローを停止させることにより、上記のように準備した分離した血漿細胞懸濁液をマイクロ流体デバイスに搬入する。次に、ペン毎に１つの血漿細胞を目標として、血漿細胞を隔離ペンに装填する。光活性化ＤＥＰ力（ＯＥＰ技術）を使用して、血漿細胞をフロー領域／マイクロ流体チャネルから隔離ペンの分離領域に移動させる。ＯＥＰを操作するパラメータは、マイクロ流体デバイスにわたってＡＣ電位を印加し（電圧２．５Ｖ、周波数３ＭＨｚ）、構造化光を使用して、個々の細胞を捕獲する光トラップを形成し（図６Ｂに示されるように）、光トラップを８μｍ／秒で移動させることを含む。ペンに入れた後、フロー領域／マイクロ流体チャネルに残っている細胞は、マイクロ流体デバイスから洗い流す。
【０２９０】
血漿細胞のアッセイ
[00316]  ペンから出した直後、血漿細胞をアッセイして、ＩｇＧ分泌及び抗原特異性を検出する。図６Ｃに示す多重化アッセイは、抗ヒトＩｇＧ抗体被覆捕捉ビーズ（Spherotech）、抗ヒトＩｇＧ−Alexa Fluor488二次抗体（Invitrogen）、及びAlexa Fluor647カルボン酸スクシンイミジルエステル（succinimydyl ester）を使用して標識した対象の抗原を含む。４０ｕｇ／ｍＬのＩＬ−６（R&D Systems）で補足した血漿細胞培地媒体（上記）中で捕捉ビーズ、二次抗体、及び標識した対象の抗原を一緒に混合し、マイクロ流体デバイスのフロー領域／マイクロ流体チャネルに流す。フローを停止し、蛍光標識の視覚化に適切なフィルタを使用して、隔離ペンの画像を１０分から２５分の期間にわたって定期的に撮影する。対象の抗原に結合する抗体を分泌する血漿細胞は、標識された対象の抗原とＩｇＧ抗体被覆捕捉ビーズとの関連性を誘導する。その結果、蛍光標識された捕捉ビーズの「プルーム」が、フロー領域／マイクロ流体チャネルと、血漿細胞が配置された隔離ペンとの間の開口部に出現する。図７Ｂは、血漿細胞の典型的なアッセイ結果を示し、明視野画像は、左パネルにあり、抗ヒトＩｇＧ二次抗体の蛍光画像は、中央パネルにあり、標識された対象の抗原の蛍光画像は、右パネルにある。
【０２９１】
搬出及び更なる処理
[00317]  次に、ＤＥＰ力を使用して（上述したＯＥＰパラメータを使用して）、対象の抗原に結合する抗体を分泌するものとして識別された血漿細胞を一度に１つのペンから出し、搬出媒体（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を有するＤＰＢＳ（Lonza）、ＢＳＡ（Sigma）５ｍｇ／ｍＬ、及び１：１００のPluronic（商標）F-127（Thermo Fisher））をマイクロ流体デバイスの流路に流すことにより、マイクロ流体デバイスから９６ウェルプレートのウェルに搬出する。搬出に続き、血漿細胞を溶解させ、重鎖及び軽鎖抗体配列をコードする転写をｃＤＮＡに逆転写し、配列決定する。
【０２９２】
結果
[00318]  上記プロトコールは、１日未満で実行される。上記と略同じプロトコールを使用して、対象の抗原に結合する抗体を発現する血漿細胞の検出率（対象の抗原に依存する）は、通常、１％前後又はそれ未満であり、そのようなプロトコールにより血漿細胞から得られる推定上のＡｇ＋抗体は、一研究では、８２％と高い率で再発現時にＡｇ特異結合を示した。
【０２９３】
変形形態
[00319]  上記方法は、多くの方法で変更することができ、それでもなお血漿細胞の直接スクリーニングという目標を達成する。これらの変形形態は、以下を含む。
【０２９４】
[00320]  １．齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター）、ウサギ、フェレット、家畜（例えば、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ）、ラマ、ラクダ等の他の哺乳類並びにニワトリ及びシチメンチョウ等の鳥類を含むヒト以外の動物から分離された血漿細胞のスクリーニング。
【０２９５】
[00321]  ２．血漿細胞のＦＡＣＳ分離前に例えばEasySepヒトＢ細胞富化キット（EasySep、番号１９０５４）を使用してＢ細胞富化を実行することができる。
【０２９６】
[00322]  ３．血漿細胞をペンに入れるため及びペンから出すために使用されるＯＥＰ動作パラメータは、変更され得る。例えば、マイクロ流体デバイスにわたるＡＣ電位は、周波数約１ＭＨｚから約３ＭＨｚで約２Ｖから約５Ｖに設定することができる。特定の例は、（ｉ）電圧約３．５Ｖ及び周波数約２ＭＨｚ並びに（ｉｉ）電圧約４．５Ｖ及び周波数約１ＭＨｚを含む。加えて、構造化光（又は光ケージ）が移動する速度は、約５μｍ／秒から約１０μｍ／秒まで変更することができる。
【０２９７】
[00323]  ４．血漿細胞が装填される隔離ペンのサイズは、異なり得る。例えば、ペンは、約１．１×１０６立方μｍの容積を有することができる。通常、ペンは、約５×１０６立方μｍ又はそれ未満（例えば、約４×１０６立方μｍ、約３×１０６立方μｍ、約２．５×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約１．５×１０６立方μｍ、又はそれ未満）の容積を有する。隔離ペンのサイズを低減することにより、多重化アッセイをより高速で実行することができ、それにより血漿細胞が細胞死を受ける恐れがあるスクリーニング期間の長期化を回避する。
【０２９８】
[00324]  ５．Ａｇ＋抗体を発現する血漿細胞を搬出するのではなく、溶解した際尾部により解放されるｍＲＮＡを捕捉するように設計されたバーコード付きビーズの存在下で血漿細胞を隔離ペン内で溶解させることができる。次に、捕捉されたｍＲＮＡを逆転写して、バーコード付きビーズに付着するｃＤＮＡライブラリにすることができ、バーコード付きビーズを搬出し、続けてｃＤＮＡライブラリの配列決定をオフチップで行うことができる。オンチップでの細胞溶解、ｍＲＮＡ捕捉、及びｃＤＮＡライブラリ生成の方法は、例えば、２０１７年９月２９日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第１７／５４６２８号に記載されており、この内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２９９】
実施例４：Ｂリンパ球を発現する抗体の一細胞搬出及びＢ細胞レセプタ領域に向けられた配列決定ライブラリの生成
【０３００】
【表３】
2019534004.tif 000009
【０３０１】
細胞
[00326]  マウス骨髄腫ハイブリドーマ細胞株であるＯＫＴ３をATCC（ATCC（登録商標）カタログ番号ＣＲＬ−８００１（商標））から得た。細胞は、懸濁液細胞株として提供した。約１×１０５生存細胞／ｍＬから約２×１０１５生存細胞／ｍＬで播種し、ガス環境として空気中に５％二酸化炭素を使用して３７℃で培養することにより培地を維持した。ＯＫＴ３細胞の数及び生存性をカウントし、マイクロ流体デバイスへの装填に向けて細胞密度を１×１０６個／ｍｌに調整する。
【０３０２】
搬出プレート
[00327]  ９６ウェルフルスカートプレート（VWRカタログ番号９５０４１−４３６）を細胞搬出に使用した。１０μＬの鉱油（Sigmaカタログ番号Ｍ５９０４）を分注し、続けて５μＬの２Ｘ  ＴＣＬバッファー（Qiagenカタログ番号１０７０４９８）を分注することにより、各プレートを準備した。（Single Cell Lysis Kit、Ambionカタログ番号４４５８２３５又はClontech溶解バッファー、カタログ番号６３５０１３等の他の溶解バッファーも同様に適宜使用し得る）。搬出プレートを２００ｇで１分間にわたり室温において遠心分離し、使用するまで室温で貯蔵した。
【０３０３】
搬出バッファー
[00328]  １μＬ／ｍｌ最終濃度のダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋カルシウム＋マグネシウム（１０００ｍＬ、Lonzaカタログ番号１７−５１３Ｆ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（粉末、５ｇ、Fisher Scientificカタログ番号ＢＰ９７０６−１００）；Pluronic F-127（１０ｍｌ、Life Technologiesカタログ番号５０−３１０−４９４；及び組み換え型リボヌクレアーゼ阻害剤（RNaseOUT）（Life Technologiesカタログ番号１０７７７７０１９）。使用前に搬出バッファーを０．２２μｍフィルタユニット（VWRカタログ番号７３５２０−９８５）で濾過した。
【０３０４】
細胞の搬出及び溶解
[00329]  システムのOptoElectroPositioning（ＯＥＰ）機能を使用して、ＯＫＴ３細胞（任意の種類の一次Ｂ細胞が使用可能である）をマイクロ流体デバイスに流し入れ、NanoPenチャンバに導入して、NanoPenチャンバ毎に１つの細胞の最終分布を提供した。実施例１に記載したＩｇＧアッセイを実行した（抗原特異アッセイを使用することもできる）。対象のＩｇＧ発現（及び任意選択的に抗原特異抗体発現）を有すると識別された細胞を５μＬ搬出容量でウェル毎に１つの細胞で９６ウェルプレートに個々に搬出した。選択された細胞を、その細胞が存在していたNanoPenチャンバから搬出するＯＥＰ力と、次に選択された各細胞を５μＬ容量で個々に搬出するフロー領域／マイクロ流体チャネル内の媒体フローとの混合を使用して搬出を実行した。搬出直後、搬出ウェルプレートを２００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。ＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ合成が実行されるまでプレートを−８０℃で凍結した。これらの条件下でウェルプレートを少なくとも１ヶ月まで適宜維持した。幾つかの状況では、一晩又は１週間までの貯蔵を実行し得る。
【０３０５】
ＲＮＡ分離
[00330]  １細胞搬出プレートを氷上で１５分間解凍し、続けて室温に戻した。RNAClean XP SPRIビーズ（Beckman Coulter番号Ａ６３９８７）を室温に戻し、１０μＬのビーズ混合物（１Ｘ容量）を各ウェルに添加した。（１ｘ容量のＳＰＲＩビーズは、標準１．８ｘから２．２ｘと比較して高いＲＮＡ回収を示した。）
【０３０６】
[00331]  溶菌液とビーズとの混合物を室温で１５分間培養した。この長時間の培養により、解放されたＲＮＡの結合改善が提供された。続けてプレートを９６ウェルプレート磁石（MagWell（商標）Magnetic Separator 96、カタログ番号５７６２４）に移し、５分間培養した。上澄みを慎重に除去し、１００μＬの８０％エタノール（Sigmaカタログ番号Ｅ７０２３、新鮮なものを準備）を添加することにより、エタノール洗浄を実行した。約３０秒後、エタノールを吸引し、エタノール洗浄を繰り返した。最終吸引後、プレートを９６ウェルプレート磁石から取り外し、ビーズを５分間乾燥させた。
【０３０７】
ｃＤＮＡ合成
[00332]  プレートを４Ｃにし、リボヌクレアーゼフリー水（Ambionカタログ番号ＡＭ９９３７）０．８μＬ；１：５Ｍ  ＥＲＣＣコントロールＲＮＡ（ThermoFisher Scientificカタログ番号４４５６７４０）１μＬ；ｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭ、ＮＥＢ、番号Ｎ０４４７Ｌ）１μＬ；ビオチン−ｄＴＶＩ  ＲＮＡ捕捉／プライミングオリゴヌクレオチド（配列番号２）１μＬ；及びRNaseOUT（４Ｕ／μＬ、Life Technologiesカタログ番号１０７７７７−０１９）０．２μＬを含む「ＲＴ混合物１」４ｕｌ中に再懸濁させた。イノシンは、任意の天然ヌクレオチドに結合し得るため、ビオチン−ｄＴＶＩ  ＲＮＡ捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドの捕捉配列の３’イノシンは、解放ＲＮＡへの結合の増大を提供した。３’イノシンを有する捕捉配列は、時間の２５％のみでｍＲＮＡに結合し得る最終的な「Ｎ」ヌクレオチドを含む捕捉配列よりも高い解放ＲＮＡ捕捉を提供することができる。上述したような捕捉／プライミング配列による捕捉の概略を図８Ａに示す。ＥＲＣＣ  ＲＮＡコントロールは、内部ＲＴコントロールを提供し、また逆転写効率を改善したキャリアＲＮＡも提供した。プレートを７２℃で５分間培養し、直ちに４℃にした。ベタイン（５Ｍ、Sigmaカタログ番号Ｂ０３００７５ＶＬ）１μＬ：５Ｘ  ＲＴ混合物（Thermo、番号ＥＰ０７５３）１．５μＬ；ビオチン化バーコード付き鋳型切り替えオリゴヌクレオチド（biot_barcoded TSO；配列番号３）０．５μＬ；１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（１２５ｍＭ、Life Technologiesカタログ番号ＡＭ９５３０Ｇ）０．５μＬ；RNase OUT  ０．４μＬ；及びMaxima RNaseHマイナス逆転写酵素（２００Ｕ／μＬ、Thermo Fisherカタログ番号ＥＰ０７５３）０．１μＬを含む「ＲＴ混合物２」４μＬを各ウェルに添加した。「ＲＴ混合物２」の添加に続き、逆転写を４２℃で９０分間実行し、その後、５０℃で２分間／４２Ｃで２分間のサイクルを１０回続けた。最後の熱サイクル後、７５℃で１５分間の熱失活を続けた。ビオチンバーコード付きＴＳＯの４ヌクレオチドバーコード「ＮＮＮＮ」は、複数の搬出プレート潜在的な多重化配列決定実験の内部バーコード付けを提供し、この方法で必須の特徴ではない。初期鎖伸長の概略を図８Ｂに示し、ＴＳＯ関連付けを図８ｃに示し、逆転写の完全な転写産物を図８Ｄに示す。
【０３０８】
ｍＲＮＡ全体増幅
[00333]  ｃＤＮＡ合成に続き、搬出プレートを２００ｇで５分間遠心分離し、２Ｘ  Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix（Rocheカタログ番号ＫＫ２６０２）１２．５μＬ；Ｐ１プライマー（biot_P1、配列番号４）１μＬ；及びヌクレオチドフリー水（Ambionカタログ番号ＡＭ９９３７）３．５μＬを含むＰＣＲ混合物１７μＬを添加し、ＰＣＲを９８℃で３分間実行し、その後、９８℃で１５秒、６５℃で３０秒、７２℃で５分間のサイクルを２０回続け、最後に７２℃で５分間の最終伸長を実行した。最終伸長時間は、ポリメラーゼが長いｃＤＮＡ分子（２ｋｂを超える）を増幅するのに十分な長さであった。この増幅の概略を図８Ｅに示す。
【０３０９】
ＰＣＲクリーンアップ
[00334]  ２５μＬ（１ｘ容量）のDNAClean SPRIビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号Ａ６２８８１）を各ウェルに添加し、よく混合し、プライマーダイマー及び下流の増幅を汚染する恐れがある短く劣化したＲＮＡ産物を除去した。混合物を室温で１０分間培養した。培養に続き、プレートをウェルプレート磁石に５分間配置した。上澄みを慎重に除去し、１００μＬの８０％エタノール（新鮮なものを準備）を添加することにより、エタノール洗浄を実行した。約３０秒後、エタノールを吸引した。エタノール洗浄手順を１回繰り返した。最後の吸引後、搬出ウェルプレートをウェルプレート磁石から取り外し、ビーズを５分間乾燥させた。１５μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏを用いて、乾燥させたビーズからＤＮＡを溶出させた。図９Ａは、産物のBioAnalyzer電気泳動トレースを示し、トレースは、全長ｃＤＮＡの予期される平均長で約１８００ｂｐ前後の予期される分布を示した。ｃＤＮＡの典型的な量は、増幅及びクリーンアップを実行した後、約２ｎｇから約２０ｎｇであると推定された。
【０３１０】
ＢＣＲ増幅及びバーコーディング
[00335]  単細胞のＢ細胞レセプタ（ＢＣＲ）増幅及びバーコーディングを２ステップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で実行した。
【０３１１】
ＰＣＲ１
[00336]  最初のＰＣＲにおいて、順方向プライマー（ＦＰ１、配列番号５）は、ｂｉｏ＿ｂａｒｃｏｄｅｄ＿ＴＳＯから組み込まれたＰ１配列の３’末端にハイブリダイズするように設計され、それにより上記の全ＲＮＡ増幅ステップにおいて組み込まれたＰ１配列をなくした。逆方向プライマー（ＲＰ１、配列番号６、７、８）は、重鎖及び軽鎖の結合（Ｊ）遺伝子に近いＢ細胞レセプタ遺伝子の一定領域に結合する。ＰＣＲ１の概略を図８Ｆに示す。順方向プライマーは、プレートの１２列にわたる１２個の異なる６ヌクレオチドバーコード（ＮＮＮＮＮＮ）を含んだ。したがって、ＰＣＲ１は、全ＲＮＡ増幅産物からのＲＮＡ配列を含むＢＣＲの選択を実行し、ＢＣＲのバリアブル、結合、及び多様性セグメントに焦点を当てたＢＣＲの領域を更に選択した。この選択的増幅の増幅産物（図８Ｆの増幅産物８６０として示されている）は、ポリＡ／ポリＴ捕捉配列もＢＣＲの一定領域の大半もそれ以上含まず、これらは、いずれも対象のデータを提供しない。
【０３１２】
[00337]  ＰＣＲ１は、増幅されたトランスクリプトーム１μＬ、２Ｘ  Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix  ５μＬ、順方向バーコード付きプライマー（ＦＰ１）０．１μＬ、逆方向重コンスタントプライマー（マウスＨｃのＲＰ１、配列番号６）０．２μＬ、マウスＫｃのＲＰ１とマウスλｃのＲＰ１（配列番号６及び７）との１：１混合物である軽コンスタントプライマー０．１μＬ、及びヌクレアーゼフリー水３．６μＬを含む１０μＬの反応で実行された。サイクル条件：９８℃で３分間、その後、９８℃で２０秒間、７０℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルが５回続き、その後、９８℃で２０秒間、６８℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルが１０回続き、その後、９８℃で２０秒間、６５℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルが１０回続き、最後に７２℃で５分間の伸長。
【０３１３】
ＰＣＲ２
[00338]  ２番目のＰＣＲにおいて、１つの順方向プライマー（ＦＰ２、配列番号９）は、バーコード付きＦＰ１に結合し、８つのバーコード付き（ＮＮＮＮＮＮ）逆方向プライマー（ＲＰ２、配列番号１０）をプレートの８行にわたって使用した。この戦略により、２０のみのバーコードを使用して、９６ウェルプレート全体における各ウェルを一意にバーコード付けすることができる。ｃＤＮＡ合成で使用したbiot_barcoded_TSOから組み込まれた内部プレートバーコードと複数のプレートとを組み合わせることができる。ＰＣＲ２の概略を図８Ｇに示す。最終産物である増幅産物８８０の概略表現を図８Ｈに示す。
【０３１４】
[00339]  ＰＣＲ２は、ＰＣＲ１産物（例えば、図８Ｇの産物８６０）を鋳型として使用して実行される。ＰＣＲ１の産物１μＬ、２Ｘ  Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix  ５μＬ、順方向プライマーＦＰ２  ０．１μＬ、逆方向バーコード付きプライマーＲＰ２  ０．１μＬ、及びヌクレアーゼフリー水３．８μＬを含む１０μＬ反応を実行した。図９Ｂは、この方法により提供された単細胞増幅産物のゲル電気泳動の結果を示した。矢印は、５００ｂｐを表すリファレンスサイジングラダー（reference sizing ladder）（レーンＭ）上の縞を指す。レーン１では、単細胞は、重鎖（Ｈｃ）について増幅され、レーン２では、単細胞は、軽鎖（Ｋｃ）について増幅され、各レーンは、各増幅産物に適切な長さの縞を示した。サイクル条件：ＰＣＲは、９８Ｃで３分間実行され、その後、９８℃で２０秒間、６８℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルが５回続き、その後、９８℃で２０秒間、６５℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルが１５回続き、最後に７２℃で５分間の伸長。
【０３１５】
増幅産物のプーリング、クリーンアップ、及び配列決定
[00340]  増幅産物をプーリングした。１ｘ容量のDNAClean SPRIビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号Ａ６２８８１）を各ウェルに添加し、よく混合した。混合物を室温で１０分間培養した。培養に続き、プレートをウェルプレート磁石に５分間配置した。上澄みを慎重に除去し、１００μＬの８０％エタノール（新鮮なものを準備）を添加することにより、エタノール洗浄を実行した。約３０秒後、エタノールを吸引し、エタノール洗浄をもう一度繰り返した。最後の吸引後、プレートを磁石から取り外し、ビーズを５分間乾燥させた。１５μＬのヌクレアーゼフリー水を用いて、乾燥させたビーズからＤＮＡを溶出させた。
【０３１６】
[00341]  この実験は、Illumina TruSeqに適合されたが、他のアダプターを代わりに使用し得、任意の他の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）機器に適したライブラリを提供し得、又は代替的にサンガーシーケンシングに適するように増幅することもできる。
【０３１７】
[00342]  代替的に、ウェルプレートの個々のプレートから増幅産物が組み合わされない場合、２ラウンドのＰＣＲ及びクリーンアップ後のQubit（商標）での定量化により、約２５ｎｇから約９０ｎｇの増幅産物がウェル毎に生成されたことが示された。これは、上述したような配列決定を経るのに十分であり得る。
【０３１８】
[00343]  図１０Ａ〜図１０Ｃに、特定の増幅産物を検出する能力を確証するゲル電気泳動の結果を示した。この実験では、１９個のＯＫＴ３単細胞を搬出し、上記のように生成された全ＲＮＡ増幅産物を３つの部分に分割した。３つの部分は、それぞれ上述したプライマー及びプロセスを使用して重鎖Ｈｃ、軽鎖カッパＫｃ、及び軽鎖ラムダλｃについて個々に増幅された。図１０Ａでは、重鎖は、１９個全ての単細胞から増幅されたことが示された（かすかな縞は、Qubitを用いた分析により確認された）。図１０Ｂ及び図１０Ｃでは、軽鎖カッパ（図７Ｂ）又は軽鎖ラムダ（図７Ｃ）は、各細胞がカッパ又はラムダのいずれかを有し、両方を有さないことを示した。例えば、レーン８、１２、１３、１４は、ラムダ軽鎖を有し、カッパを有さない一方、レーン９、１０、１１は、カッパ軽鎖を有し、ラムダを有さなかった。ゲルの左端の矢印は、５００ｂｐのサイジングラダー（sizing ladder）における縞を指し、これは、予期される産物のサイズを確証する。
【０３１９】
選択された実施形態のリスト
[00344]  １．対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球を検出する方法であって、Ｂ細胞リンパ球を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域及び隔離ペンを有する囲いを含み、隔離ペンは、単一の開口部を有する分離領域及び接続領域を含み、接続領域は、分離領域とフロー領域との間に流体接続を提供し、保持ペンの分離領域は、マイクロ流体デバイスの非掃引領域である、導入することと、Ｂ細胞リンパ球を試料から隔離ペンの分離領域に装填することと、対象の抗原がＢ細胞リンパ球の近くにあるように、対象の抗原を囲いのフロー領域に導入することと、Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することとを含む方法。
【０３２０】
[00345]  ２．隔離ペンの分離領域は、少なくとも１つの調整表面を含む、実施形態１の方法。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの調整表面は、複数の調整表面を含み得る。
【０３２１】
[00346]  ３．調整表面は、Ｂ細胞リンパ球と実質的に反応しない、実施形態２の方法。
【０３２２】
[00347]  ４．少なくとも１つの調整表面（又は複数のうちの各調整表面）は、共有結合で連結された親水性分子の層を含む、実施形態２又は３の方法。
【０３２３】
[00348]  ５．親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有ポリマーを含む、実施形態４の方法。
【０３２４】
[00349]  ６．マイクロ流体デバイスの囲いは、抗体生成細胞（ＤＥＰ）構成を更に含む、実施形態１から５のいずれか１つの方法。
【０３２５】
[00350]  ７．マイクロ流体デバイスの囲いは、ベース、マイクロ流体回路構造、及びカバーを更に含み、ベース、マイクロ流体回路構造、及びカバーは、一緒にマイクロ流体回路を画定し、マイクロ流体回路は、フロー領域及び隔離ペンを含む、実施形態１から６のいずれか１つの方法。
【０３２６】
[00351]  ８．ベースは、第１の電極を含み、カバーは、第２の電極を含み、及びベース又はカバーは、電極活性化基板を含み、電極活性化基板は、複数のＤＥＰ電極領域を含む表面を有し、電極活性化基板の表面は、フロー領域の内面を提供する、実施形態７の方法。
【０３２７】
[00352]  ９．接続領域は、約２０μｍから約６０μｍの幅Ｗｃｏｎを有する、実施形態１から８のいずれか１つの方法。
【０３２８】
[00353]  １０．接続領域は、長さＬｃｏｎを有し、接続領域の長さＬｃｏｎと接続領域の幅Ｗｃｏｎとの比率は、少なくとも１．５の値を有する、実施形態１から９のいずれか１つの方法。
【０３２９】
[00354]  １１．分離領域は、接続領域の幅Ｗｃｏｎよりも大きい幅Ｗｉｓｏを有する、実施形態９又は１０の方法。
【０３３０】
[00355]  １２．分離領域は、約５０μｍから約２５０μｍの幅Ｗｉｓｏを有する、実施形態９から１１のいずれか１つの方法。
【０３３１】
[00356]  １３．隔離ペンは、約０．５ｎＬから約２．５ｎＬの容積を含む、実施形態１から１２のいずれか１つの方法。
【０３３２】
[00357]  １４．隔離ペンの分離領域は、被覆材料で被覆された少なくとも１つの表面（例えば、複数の表面）を含む、実施形態１から１３のいずれか１つの方法。
【０３３３】
[00358]  １５．被覆材料は、Ｂ細胞リンパ球と実質的に反応しない親水性分子を含む、実施形態１４の方法。
【０３３４】
[00359]  １６．被覆材料は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有ポリマーを含む（例えば、幾つかの実施形態では、ＰＥＧ含有ポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧブロックコポリマーを含む）、実施形態１４又は１５の方法。
【０３３５】
[00360]  １７．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、末梢血の試料、脾臓生検、骨髄生検、リンパ節生検、又は腫瘍生検である、実施形態１から１６のいずれか１つの方法。
【０３３６】
[00361]  １８．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、末梢血の試料である、実施形態１から１６のいずれか１つの方法。
【０３３７】
[00362]  １９．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、骨髄生検である、実施形態１から１６のいずれか１つの方法。
【０３３８】
[00363]  ２０．Ｂ細胞リンパ球は、記憶Ｂ細胞である、実施形態１７又は１８の方法。
【０３３９】
[00364]  ２１．Ｂ細胞リンパ球は、血漿Ｂ細胞である、実施形態１７又は１９の方法。
【０３４０】
[00365]  ２２．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、哺乳動物又は鳥類動物から得られる、実施形態１から２１のいずれか１つの方法。
【０３４１】
[00366]  ２３．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、ニワトリ、フェレット、ブタ、ウマ、ウシ、又はシチメンチョウから得られる、実施形態２２の方法。
【０３４２】
[00367]  ２４．哺乳動物は、対象の抗原に対して免疫化されている、実施形態２２又は２３の実施形態。
【０３４３】
[00368]  ２５．哺乳動物は、対象の抗原に関連付けられた病原体に露出されているか又はそれに対して免疫化されている、実施形態２２又は２３の方法。
【０３４４】
[00369]  ２６．哺乳動物は、がんを有し、及びがんは、対象の抗原が関連付けられる、実施形態２２又は２３の方法。
【０３４５】
[00370]  ２７．哺乳動物は、自己免疫疾患を有し、及び自己免疫疾患は、対象の抗原に関連付けられる、実施形態２２又は２３の方法。
【０３４６】
[00372]  ２８．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、Ｂ細胞リンパ球以外の細胞タイプが枯渇している、実施形態１から２７のいずれか１つの方法。
【０３４７】
[00372]  ２９．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、又はそれらの任意の組合せを発現するＢ細胞リンパ球が枯渇している、実施形態１から２８のいずれか１つの方法。
【０３４８】
[00373]  ３０．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ＣＤ２７を発現するＢ細胞リンパ球について富化されている、実施形態１から１９及び２１から２９のいずれか１つの方法。
【０３４９】
[00374]  ３１．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、ＣＤ１３８を発現するＢ細胞リンパ球について富化されている、実施形態１から２０及び２２から２９のいずれか１つの方法。
【０３５０】
[00375]  ３２．Ｂ細胞リンパ球を含む試料は、マイクロ流体デバイスに導入される前にデオキシリボヌクレアーゼに接触されている、実施形態１から３１のいずれか１つの方法。
【０３５１】
[00376]  ３３．単一のＢ細胞リンパ球は、分離領域に装填される、実施形態１から３２のいずれか１つの方法。
【０３５２】
[00377]  ３４．複数のＢ細胞リンパ球は、分離領域に装填される、実施形態１から３２のいずれか１つの方法。
【０３５３】
[00378]  ３５．Ｂ細胞リンパ球を、Ｂ細胞活性化を刺激する刺激剤に接触させることを更に含む、実施形態１から３４のいずれか１つの方法。
【０３５４】
[00379]  ３６．刺激剤は、ＣＤ４０アゴニストを含む、実施形態３５の方法。
【０３５５】
[00380]  ３７．ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０Ｌ、その誘導体、又は抗ＣＤ４０抗体を含み、任意選択的に、ＣＤ４０アゴニストは、微小物体（例えば、ビーズ）に連結される、実施形態３６の方法。
【０３５６】
[00381]  ３８．刺激剤は、１つ又は複数のＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞（例えば、照射Ｔ細胞）又はその誘導体を含む、実施形態３５の方法。
【０３５７】
[00382]  ３９．刺激剤は、Ｂ細胞レセプタ（ＢＣＲ）ライゲート分子を更に含む、実施形態３５から３８のいずれか１つの方法。
【０３５８】
[00383]  ４０．ＢＣＲライゲート分子は、プロテインＡ又はプロテインＧを含む、実施形態３９の方法。
【０３５９】
[00384]  ４１．ＢＣＲライゲート分子は、微小物体（例えば、ビーズ）に連結される、実施形態３９又は４０の方法。
【０３６０】
[00385]  ４２．Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、Ｂ細胞リンパ球を、ＣＤ４０Ｌ＋フィーダ細胞と、ビーズに共役されたプロテインＡとの混合物（例えば、約１：１から約１：１０の比で）に接触させることを含む、実施形態３５の方法。
【０３６１】
[00386]  ４３．Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、混合物を隔離ペンの分離領域に装填すること（例えば、重力又はＤＥＰ力を使用して）を含む、実施形態４２の方法。
【０３６２】
[00387]  ４４．刺激剤は、トール様レセプタ（ＴＬＲ）アゴニストを更に含む、実施形態３５から４３のいずれか１つの方法。
【０３６３】
[00388]  ４５．ＴＬＲアゴニストは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである、実施形態４４の方法。
【０３６４】
[00389]  ４６．Ｂ細胞リンパ球は、１日から１０日の期間（幾つかの実施形態では、接触期間は３日から５日であり得る）にわたって刺激剤に接触される、実施形態３５から４５のいずれか１つの方法。
【０３６５】
[00390]  ４７．Ｂ細胞リンパ球は、１日から１０日の期間（幾つかの実施形態では、接触期間は３日から５日であり得る）にわたって刺激剤に略連続して接触される、実施形態４６の方法。
【０３６６】
[00391]  ４８．培地をＢ細胞リンパ球に提供することであって、培地は、Ｂ細胞の増殖及び／又は活性化を促進する１つ又は複数の薬剤を含む、提供することを更に含む、実施形態３５から４７のいずれか１つの方法。
【０３６７】
[00392]  ４９．培地は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、及びＢＡＦＦ又はAprilからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤である、実施形態４８の方法。
【０３６８】
[00393]  ５０．培地は、ＴＬＲアゴニストを含む、実施形態４８又は４９の方法。
【０３６９】
[00394]  ５１．Ｂ細胞リンパ球は、１日から１０日の期間（幾つかの実施形態では、接触期間は、３日から５日であり得る）にわたって培地に提供される、実施形態４８から５０のいずれか１つの方法。
【０３７０】
[00395]  ５２．刺激剤に接触させること及び培地を提供することは、略同一の時間期間にわたって実行される、実施形態４８から５０のいずれか１つの方法。
【０３７１】
[00396]  ５３．Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、Ｂ細胞リンパ球をマイクロ流体デバイスに導入する前に実行される、実施形態３５から５２のいずれか１つの方法。
【０３７２】
[00397]  ５４．Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、Ｂ細胞リンパ球をマイクロ流体デバイスに導入した後（例えば、Ｂ細胞リンパ球を隔離ペンの分離領域に装填した後）に実行される、実施形態３ｆから５３のいずれか１つの方法。
【０３７３】
[00398]  ５５．Ｂ細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、監視ステップ中に実行される、実施形態３５から５４のいずれか１つの方法。
【０３７４】
[00399]  ５６．Ｂ細胞リンパ球を隔離ペンの分離領域に装填することは、ＤＥＰ力を使用して、Ｂ細胞リンパ球を分離領域に移動させることを含む、実施形態６の方法。
【０３７５】
[00400]  ５７．Ｂ細胞リンパ球は、フロー領域から分離領域に移動される、実施形態５６の方法。
【０３７６】
[00401]  ５８．対象の抗原を提供することは、対象の可溶性抗原を含む溶液を、フロー領域内に又はフロー領域を通して流すことを含む、実施形態１から５７のいずれか１つの方法。
【０３７７】
[00402]  ５９．対象の抗原は、第１の検出可能な標識（例えば、蛍光標識）に共有結合される、実施形態５８の方法。
【０３７８】
[00403]  ６０．第１の抗体結合剤を含む微小物体を提供することを更に含み、第１の抗体結合剤は、Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を阻害することなく、Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体に結合し、Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することは、対象の抗原の微小物体への間接的な結合を検出することを含む、実施形態５８又は５９の方法。
【０３７９】
[00404]  ６１．第１の抗体結合剤は、Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体のＦｃドメインに結合する、実施形態６０の方法。
【０３８０】
[00405]  ６２．微小物体は、ビーズである、実施形態６０又は６１の方法。
【０３８１】
[00406]  ６３．微小物体を提供することは、微小物体を含む溶液をフロー領域に流し、且つ微小物体が隔離ペンの近くに配置されると流れを停止させることとを含む、実施形態６０から６２のいずれか１つの方法。
【０３８２】
[00407]  ６４．微小物体を提供することは、微小物体を隔離ペンに装填することを更に含む、実施形態６３の方法。
【０３８３】
[00408]  ６５．微小物体を含む溶液及び対象の可溶性抗原を含む溶液は、同じ溶液である、実施形態６３又は６４の方法。
【０３８４】
[00409]  ６６．微小物体を含む溶液及び可溶性抗原又は対象を含む溶液は、異なる溶液であり、微小物体を提供することは、対象の抗原を提供する前に行われる、実施形態６３の方法。
【０３８５】
[00410]  ６７．第２の抗体結合剤を提供することであって、第２の抗体結合剤は、第２の検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含む、提供することと、微小物体への第２の抗体結合剤の間接的な結合を監視することとを更に含む、実施形態６０から６５のいずれか１つの方法。
【０３８６】
[00411]  ６８．第２の抗体結合剤は、ＩｇＧ抗体（例えば、抗ＩｇＧ二次抗体）に結合（任意選択的に特異的に結合）する、実施形態６７の方法。
【０３８７】
[00412]  ６９．第１の検出可能な標識は、第２の検出可能な標識と異なる（且つ別様に検出することができる）、実施形態６７又は６８の方法。
【０３８８】
[00413]  ７０．第２の抗体結合剤を提供することは、可溶性の第２の抗体結合剤を含む溶液を、フロー領域に又はフロー領域に通して流すことを含む、実施形態６７から６９のいずれか１つの方法。
【０３８９】
[00414]  ７１．可溶性の第２の抗体結合剤及び対象の可溶性抗原を含む溶液は、同じ溶液である、実施形態７０の方法。
【０３９０】
[00415]  ７２．可溶性の第２の抗体結合剤及び可溶性抗原又は対象を含む溶液は、異なる溶液である（例えば、順次提供される）、実施形態７０の方法。
【０３９１】
[00416]  ７３．対象の抗原を提供することは、対象の抗原を含む微小物体を提供することを含み、微小物体は、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズである、実施形態１から５７のいずれか１つの方法。
【０３９２】
[00417]  ７４．対象の抗原の前又は対象の抗原と同時に、標識された抗体結合剤を提供することを更に含み、Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することは、対象の抗原への標識された抗体結合剤の間接的な結合を検出することを含む、実施形態７３の方法。
【０３９３】
[00418]  ７５．標識された抗体結合剤は、抗ＩｇＧ抗体（例えば、抗ＩｇＧ二次抗体である）に結合（任意選択的に特異的に結合）する、実施形態７４の方法。
【０３９４】
[00419]  ７６．標識された抗体結合剤は、蛍光標識に共有結合される、実施形態７４又は７５の方法。
【０３９５】
[00420]  ７７．標識された抗体結合剤は、対象の抗原を有する混合物で提供される、実施形態７４から７６のいずれか１つの方法。
【０３９６】
[00421]  ７８．標識された抗体結合剤は、対象の抗原を提供した後に提供される、実施形態７４から７６のいずれか１つの方法。
【０３９７】
[00422]  ７９．Ｂ細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することは、マイクロ流体デバイスの隔離ペンの全て又は一部を撮像することを含む、実施形態１から７８のいずれか１つの方法。
【０３９８】
[00423]  ８０．撮像することは、蛍光撮像することを含む、実施形態７９の方法。
【０３９９】
[00424]  ８１．撮像することは、複数の画像を撮影することを含む、実施形態７９又は８０の方法。
【０４００】
[00425]  ８２．複数の画像は、一定の時間間隔で撮影される、実施形態８１の方法。
【０４０１】
[00426]  ８３．マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を有し、接続領域のそれぞれは、分離領域とフロー領域との間に流体接続を提供し、方法は、複数のＢ細胞リンパ球の１つ又は複数を複数のうちの２つ以上の隔離ペンのそれぞれの分離領域に装填することと、対象の抗原が、１つ又は複数のＢ細胞リンパ球が装填された２つ以上の隔離ペンのそれぞれの近くにあるように、対象の抗原をマイクロ流体デバイスに導入することと、装填されたＢ細胞リンパ球のそれぞれによって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することとを更に含む、実施形態１から８２のいずれか１つの方法。
【０４０２】
[00427]  ８４．単一のＢ細胞リンパ球は、複数のうちの２つ以上の隔離ペンのそれぞれの分離領域に装填される、実施形態８３の方法。
【０４０３】
[00428]  ８５．装填されたＢ細胞リンパ球又は装填されたＢ細胞リンパ球のうちのＢ細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を検出することと、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するものとして、装填されたＢ細胞リンパ球又は装填された複数のＢ細胞リンパ球のうちのＢ細胞リンパ球を識別することとを更に含む、実施形態１から８４のいずれか１つの方法。
【０４０４】
[00429]  ８６．対象の抗原に特異的に結合する抗体を特徴付ける方法であって、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団を識別することであって、識別することは、実施形態８５に記載の方法に従って実行される、識別することと、Ｂ細胞リンパ球又はそのクローン集団から、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を分離することと、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸の少なくとも一部及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸の少なくとも一部を配列決定することとを含む方法。
【０４０５】
[00430]  ８７．免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を配列決定することは、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球を溶解させることと、Ｂ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球から単離されたｍＲＮＡを逆転写することであって、ｍＲＮＡは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードし、それによりＶＨ  ｃＤＮＡを形成する、逆転写することと、ＶＨ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定することとを含む、実施形態８６の方法。
【０４０６】
[00431]  ８８．免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を配列決定することは、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球を溶解させることと、Ｂ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球から単離されたｍＲＮＡを逆転写することであって、ｍＲＮＡは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードし、それによりＶＬ  ｃＤＮＡを形成する、逆転写することと、ＶＬ  ｃＤＮＡの少なくとも一部を配列決定することとを含む、実施形態８６又は８７の方法。
【０４０７】
[00432]  ８９．ｍＲＮＡを逆転写することは、ｍＲＮＡを捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、実施形態８７又は８８の方法。
【０４０８】
[00433]  ９０．逆転写することは、転写スイッチオリゴヌクレオチドの存在下で実行される、実施形態８９の方法。
【０４０９】
[00434]  ９１．識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球は、溶解される前にマイクロ流体デバイスから搬出される、実施形態８７から９０のいずれか１つの方法。
【０４１０】
[00435]  ９２．識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団を搬出することは、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球を隔離ペンの分離領域からマイクロ流体デバイスのフロー領域に移動させることと、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球を、フロー領域を通して且つマイクロ流体デバイスから流すこととを含む、実施形態９１の方法。
【０４１１】
[00436]  ９３．識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球を隔離ペンの分離領域から移動させることは、ＤＥＰ力を使用して、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団を捕捉し且つ移動させることを含む、実施形態９２の方法。
【０４１２】
[00437]  ９４．識別されたＢ細胞リンパ球は、単一の細胞として搬出される、実施形態９１から９３のいずれか１つの方法。
【０４１３】
[00438]  ９５．Ｂ細胞リンパ球のクローン集団の識別されたＢ細胞リンパ球は、群として搬出される、実施形態９１から９３のいずれか１つの方法。
【０４１４】
[00439]  ９６．識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球は、マイクロ流体デバイス内で溶解される、実施形態８７又は８８の方法。
【０４１５】
[00440]  ９７．１つ又は複数の捕捉ビーズを、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球の近傍に提供することであって、１つ又は複数の捕捉ビーズは、ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又はＶＬ  ｍＲＮＡに結合することが可能なオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、提供することと、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団を溶解させることと、溶解されたＢ細胞リンパ球から又はそのクローン集団の溶解されたＢ細胞リンパ球からのＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又はＶＬ  ｍＲＮＡを１つ又は複数の捕捉ビーズに結合させることとを更に含む、実施形態９６の方法。
【０４１６】
[00441]  ９８．１つ又は複数の捕捉ビーズの各捕捉ビーズは、複数の捕捉／プライミングオリゴヌクレオチドを含む、実施形態９４の方法。
【０４１７】
[00442]  ９９．１つ又は複数の捕捉ビーズは、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球の溶解前に提供される、実施形態９７又は９８の方法。
【０４１８】
[00443]  １００．１つ又は複数の捕捉ビーズのそれぞれは、識別されたＢ細胞リンパ球又はそのクローン集団のＢ細胞リンパ球を含む隔離ペンに装填される、実施形態９７から９９のいずれか１つの方法。
【０４１９】
[00444]  １０１．１つ又は複数の捕捉ビーズをマイクロ流体デバイスの実質的にＲＮＡがない領域に移動させることを更に含む、実施形態９７から１００のいずれか１つの方法。
【０４２０】
[00445]  １０２．１つ又は複数の捕捉ビーズをマイクロ流体デバイスの実質的にＲＮＡがない領域に移動させる前に、実質的にＲＮＡがない領域は、いかなるＢ細胞リンパ球も含んでいない、実施形態１０１の方法。
【０４２１】
[00446]  １０３．実質的にＲＮＡがない領域は、識別されたＢ細胞リンパ球が装填された隔離ペンと異なる隔離ペン内にある、実施形態１０１又は１０２の方法。
【０４２２】
[00447]  １０４．結合されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は結合されたＶＬ  ｍＲＮＡは、１つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡに逆転写される、実施形態９７から１０３のいずれか１つの方法。
【０４２３】
[00448]  １０５．結合されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は結合されたＶＬ  ｍＲＮＡは、１つ又は複数の捕捉ビーズがマイクロ流体デバイス内（例えば、隔離ペン内）に含まれている間、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡに逆転写される、実施形態１０４の方法。
【０４２４】
[00449]  １０６．結合されたＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又は結合されたＶＬ  ｍＲＮＡは、逆転写酵素、ヌクレオチド、及び適切なバッファーを、マイクロ流体デバイスのフロー領域内に又はフロー領域を通して流すことにより、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡに逆転写される、実施形態１０４又は１０５のいずれか１つの方法。
【０４２５】
[00450]  １０７．ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡは、１つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、マイクロ流体デバイスから搬出される、実施形態１０４から１０６のいずれか１つの実施形態。
【０４２６】
[00451]  １０８．ＶＨ  ｍＲＮＡ及び／又はＶＬ  ｍＲＮＡをＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡに逆転写する前に１つ又は複数の捕捉ビーズをマイクロ流体デバイスから搬出することを更に含む、実施形態９７から１０４のいずれか１つの方法。
【０４２７】
[00452]  １０９．配列決定前にＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡを増幅することを更に含む、実施形態８７又は８８の方法。
【０４２８】
[00453]  １１０．増幅することは、ＰＣＲ増幅を含む、実施形態１０９の方法。
【０４２９】
[00454]  １１１．増幅することは、Ｂ細胞リンパ球から単離された逆転写されたｍＲＮＡにおいて、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片の表現を増大させることを含む、実施形態１０９又は１１０の方法。
【０４３０】
[00455]  １１２．増幅することは、Ｂ細胞リンパ球から単離された逆転写されたｍＲＮＡにおいて、ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片の表現を増大させる増幅の第１のラウンドと、第１のラウンドにおいて増幅されたＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡ又はその断片にバーコード配列を導入する増幅の第２のラウンドとを含む、実施形態１１１の方法。
【０４３１】
[00456]  １１３．ＶＨ  ｃＤＮＡ及び／又はＶＬ  ｃＤＮＡは、先にＰＣＲ増幅を行うことなく配列決定される、実施形態８７又は８８の方法。
【０４３２】
[00457]  任意の上述した変更形態に加えて、当業者により、この説明の趣旨及び範囲から逸脱せずに多くの他の変形形態及び代替形態の構成が考案され得、添付の特許請求の範囲は、そのような変更形態及び構成の包含を意図する。したがって、情報は、最も実用的であり好ましい態様と現在思われるものと併せて具体的且つ詳細に上述されたが、本明細書に記載される原理及び概念から逸脱せずに、限定ではなく、形態、機能、動作様式、及び使用を含む多くの変更形態がなされ得ることが当業者に明らかであろう。また、本明細書で使用される場合、実施例及び実施形態は、全ての点で例のみであることが意図され、決して限定として解釈されるべきではない。ステップという用語が本明細書で使用されるが、その用語は、単に、説明される方法の異なる部分に注意を向けるために使用され得、方法の任意の部分の開始点若しくは停止点を区切ること又は他に決して限定を意味しないことにも留意されたい。
【０４３３】
【表４】
2019534004.tif 000010
【図１Ａ】
2019534004.tif 000011
【図１Ｂ】
2019534004.tif 000012
【図１Ｃ】
2019534004.tif 000013
【図２Ａ】
2019534004.tif 000014
【図２Ｂ】
2019534004.tif 000015
【図２Ｃ】
2019534004.tif 000016
【図２Ｄ】
2019534004.tif 000017
【図２Ｅ】
2019534004.tif 000018
【図２Ｆ】
2019534004.tif 000019
【図２Ｇ】
2019534004.tif 000020
【図２Ｈ】
2019534004.tif 000021
【図３Ａ】
2019534004.tif 000022
【図３Ｂ】
2019534004.tif 000023
【図４】
2019534004.tif 000024
【図５Ａ】
2019534004.tif 000025
【図５Ｂ】
2019534004.tif 000026
【図５Ｃ】
2019534004.tif 000027
【図６Ａ】
2019534004.tif 000028
【図６Ｂ】
2019534004.tif 000029
【図６Ｃ】
2019534004.tif 000030
【図６Ｄ】
2019534004.tif 000031
【図６Ｅ】
2019534004.tif 000032
【図７Ａ】
2019534004.tif 000033
【図７Ｂ】
2019534004.tif 000034
【図８Ａ】
2019534004.tif 000035
【図８Ｂ】
2019534004.tif 000036
【図８Ｃ】
2019534004.tif 000037
【図８Ｄ】
2019534004.tif 000038
【図８Ｅ】
2019534004.tif 000039
【図８Ｆ】
2019534004.tif 000040
【図８Ｇ】
2019534004.tif 000041
【図８Ｈ】
2019534004.tif 000042
【図９Ａ】
2019534004.tif 000043
【図９Ｂ】
2019534004.tif 000044
【図１０Ａ−１０Ｃ】
2019534004.tif 000045
【配列表】
2019534004000001.app
【国際調査報告】
2019534004.tif 000046
2019534004.tif 000047
2019534004.tif 000048
2019534004.tif 000049