(57)【要約】本発明は、膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイド、ならびに、膵島および膵島オルガノイドの迅速でありかつ信頼性のある作製に有用である細胞培養物および方法を特徴とする。本発明はまた、本発明の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイドを用いる、2型糖尿病および膵癌などの膵臓疾患を処置する方法ならびに該膵臓疾患を処置するのに有用な作用物質を同定する方法も特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島オルガノイドを作製する方法であって、ジェランガムを含む3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞を培養する段階を含み、それによって膵島オルガノイドを作製する、方法。
【請求項２】
iPSC由来β様細胞を脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞と共に培養する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
iPSC由来β様細胞をiPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、またはiPSC由来導管様細胞と共に培養する段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
iPSC由来β様細胞、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、またはiPSC由来導管様細胞がヒトのものである、請求項1または3記載の方法。
【請求項５】
脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) である、請求項2記載の方法。
【請求項７】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中にiPSC由来β様細胞を含む細胞培養物。
【請求項８】
脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞をさらに含む、請求項7記載の細胞培養物。
【請求項９】
iPSC由来β様細胞がヒトiPSC由来β様細胞である、請求項7または請求項8記載の細胞培養物。
【請求項１０】
脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) である、請求項8または請求項9記載の細胞培養物。
【請求項１１】
内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) である、請求項8〜10のいずれか一項記載の細胞培養物。
【請求項１２】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中にヒトiPSC由来β様細胞、ヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)、およびヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) を含む、細胞培養物。
【請求項１３】
iPSC由来β様細胞を含む膵島オルガノイドであって、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、膵島オルガノイド。
【請求項１４】
iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、またはiPSC由来導管様細胞をさらに含む、請求項13記載の膵島オルガノイド。
【請求項１５】
脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞をさらに含む、請求項13記載の膵島オルガノイド。
【請求項１６】
脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) であり、かつ／または内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) である、請求項15記載の膵島オルガノイド。
【請求項１７】
KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌をさらに示す、請求項14記載の膵島オルガノイド。
【請求項１８】
Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2からなる群より選択されるβ細胞転写因子を発現する、請求項13記載の膵島オルガノイド。
【請求項１９】
iPSC由来β様細胞、iPSC由来α細胞、iPSC由来δ細胞、iPSC由来導管細胞、脂肪由来幹細胞 (hADSC)、および内皮細胞を含む膵島オルガノイドであって、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を示す、膵島オルガノイド。
【請求項２０】
iPSC由来外分泌成分によって囲まれた請求項13〜19のいずれか一項記載の膵島オルガノイドを含む、膵臓オルガノイド。
【請求項２１】
iPSC由来外分泌成分が、PDX1、Nkx6-1、およびPtf1からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項20記載の膵臓オルガノイド。
【請求項２２】
請求項13〜21のいずれか一項記載のオルガノイドを移植された非ヒト生物。
【請求項２３】
哺乳動物である、請求項22記載の非ヒト生物。
【請求項２４】
マウスである、請求項23記載の非ヒト生物。
【請求項２５】
膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質を同定する方法であって、
(a) 候補作用物質を膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドと接触させる段階；および
(b) 該候補作用物質と接触させたオルガノイドの活性を測定する段階
を含み、オルガノイドの活性が参照と比較して変化した場合に、候補作用物質が、膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質として同定される、方法。
【請求項２６】
膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質を同定する方法であって、
(a) 膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドが移植された非ヒト対象に候補作用物質を投与する段階；および
(b) 該非ヒト対象の膵臓活性を測定する段階
を含み、非ヒト対象の膵臓活性が参照と比較して変化した場合に、候補作用物質が、膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質として同定される、方法。
【請求項２７】
オルガノイドまたは非ヒト対象において膵臓疾患を誘発または模倣する段階をさらに含む、請求項25または請求項26記載の方法。
【請求項２８】
非ヒト対象が肝臓オルガノイドをさらに移植される、請求項25または請求項26記載の方法。
【請求項２９】
以下の作用物質、すなわち遊離脂肪酸 (FFA)、グルコース、およびサイトカインのうちのいずれか1つまたは複数をオルガノイドと接触させることまたは非ヒト対象に投与することによって、疾患が誘発される、請求項27または請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ヒト膵癌微小環境を創出するためにオルガノイドを膵癌細胞、星状細胞、および免疫細胞と共に培養することによって、疾患が模倣される、請求項27または請求項28記載の方法。
【請求項３１】
膵臓活性が、インスリン分泌、β細胞アポトーシス、NDUFA4、ESRRG、G6PC2、MDH1、LDHA、KCNK3、またはMAFAポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現または活性、アミラーゼ分泌、外分泌成分のアポトーシス、コラーゲン合成、および星状細胞活性化からなる群より選択される、請求項25または26記載の方法。
【請求項３２】
候補作用物質がインスリン分泌を増加させる、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
膵臓活性を調節する作用物質として同定された候補作用物質が、膵臓疾患を処置する能力についてさらに試験される、請求項25〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
膵臓疾患が2型糖尿病または膵癌である、請求項25〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
オルガノイドが、請求項13〜20のいずれか一項記載のオルガノイドである、請求項25〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
非ヒト対象がマウスである、請求項26記載の方法。
【請求項３７】
対象における膵臓疾患を処置する方法であって、膵島オルガノイドを対象に移植する段階を含み、該膵島オルガノイドが、iPSC由来β様細胞を含み、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、方法。
【請求項３８】
対象における1型糖尿病を処置する方法であって、膵島オルガノイドを対象に移植する段階を含み、該膵島オルガノイドが、iPSC由来β様細胞を含み、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、方法。
【請求項３９】
膵島オルガノイドが、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、またはiPSC由来導管様細胞をさらに含む、請求項37または38記載の方法。
【請求項４０】
膵島オルガノイドが、脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞をさらに含む、請求項37または38記載の方法。
【請求項４１】
脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) であり、かつ／または内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
膵島オルガノイドが、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌をさらに示す、請求項37または38記載の方法。
【請求項４３】
膵島オルガノイドが、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2からなる群より選択されるβ細胞転写因子を発現する、請求項37〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
膵島オルガノイドが、iPSC由来β様細胞、iPSC由来α細胞、iPSC由来δ細胞、iPSC由来導管細胞、脂肪由来幹細胞 (hADSC)、および内皮細胞を含み、該オルガノイドが血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を示す、請求項37〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
膵島オルガノイドがiPSC由来外分泌成分によって囲まれている、請求項37〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
iPSC由来外分泌成分が、PDX1、Nkx6-1、およびPtf1からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
膵島オルガノイドが、請求項13〜21のいずれか一項記載のオルガノイドである、請求項37〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
対象が免疫抑制剤を投与される、請求項37〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
対象がヒトである、請求項37〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
膵臓疾患が1型糖尿病または2型糖尿病である、請求項37〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞を培養することによって作製された膵島オルガノイド。
【請求項５２】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞およびiPSC由来外分泌成分細胞を培養することによって作製された膵臓オルガノイド。
【請求項５３】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来の肝細胞を培養することによって作製された肝臓オルガノイド。
【請求項５４】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来の心筋細胞を培養することによって作製された心臓オルガノイド。
【請求項５５】
ジェランガムを含む3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来の腸細胞を培養することによって作製された腸オルガノイド。
【請求項５６】
iPSC由来β様細胞、iPSC由来外分泌成分細胞、iPSC由来肝細胞、iPSC由来心筋細胞、またはiPSC由来腸細胞がヒトのものである、請求項51〜55のいずれか一項記載の膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイド。
【請求項５７】
脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞をさらに含む、請求項51〜55のいずれか一項記載の膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイド。
【請求項５８】
脂肪由来幹細胞がヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) であり、かつ／または内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) である、請求項57記載の膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイド。
【請求項５９】
血管新生する、請求項51〜55のいずれか一項記載の膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイド。
【請求項６０】
AFP、ALB、およびCyp3a7からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項53記載の肝臓オルガノイド。
【請求項６１】
インスリンシグナル伝達、パルミチン酸によるインスリン抵抗性、および脂質蓄積を示す、請求項53記載の肝臓オルガノイド。
【請求項６２】
hMlc2a、hNkx2-5、αMHC、およびKCNQ1からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項54記載の心臓オルガノイド。
【請求項６３】
心拍動を示す、請求項54記載の心臓オルガノイド。
【請求項６４】
CDX2、Muc2、およびLgr5からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項55記載の腸オルガノイド。
【請求項６５】
R-スポンジンに応答して出芽を示す、請求項55記載の腸オルガノイド。
【請求項６６】
膵島オルガノイドを作製する方法であって、Wnt4またはWnt5aタンパク質を含む培地中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞を培養する段階を含む、方法。
【請求項６７】
人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞が3次元マトリックス中で培養される、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
Wnt4またはWnt5aタンパク質が組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である、請求項66または請求項67記載の方法。
【請求項６９】
培地が組換えヒトWnt4タンパク質を含む、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
培地が組換えヒトWnt5aタンパク質を含む、請求項68記載の方法。
【請求項７１】
ヒトiPSC由来β様細胞およびWnt4またはWnt5aタンパク質を含む、細胞培養物。
【請求項７２】
ヒトiPSC由来β様細胞が、ジェランガムを含む3次元マトリックス中に存在する、請求項71記載の細胞培養物。
【請求項７３】
Wnt4またはWnt5aタンパク質が組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である、請求項71または請求項72記載の細胞培養物。
【請求項７４】
培地が組換えヒトWnt4タンパク質を含む、請求項73記載の細胞培養物。
【請求項７５】
培地が組換えヒトWnt5aタンパク質を含む、請求項73記載の細胞培養物。
【請求項７６】
Wnt4またはWnt5aタンパク質を含む培地中で培養されたiPSC由来β様細胞を含む膵島オルガノイドであって、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、膵島オルガノイド。
【請求項７７】
KCl刺激インスリン分泌またはグルコース刺激インスリン分泌をさらに示す、請求項76記載の膵島オルガノイド。
【請求項７８】
Fltp遺伝子およびEsrrg遺伝子を発現する、請求項76または請求項77記載の膵島オルガノイド。
【請求項７９】
Wnt4またはWnt5aタンパク質が組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である、請求項76〜78のいずれか一項記載の膵島オルガノイド。
【請求項８０】
培地が組換えヒトWnt4タンパク質を含む、請求項79記載の膵島オルガノイド。
【請求項８１】
培地が組換えヒトWnt5aタンパク質を含む、請求項79記載の膵島オルガノイド。
【請求項８２】
請求項76〜81のいずれか一項記載のオルガノイドを移植された非ヒト生物。
【請求項８３】
人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のオルガノイドを作製するために脂肪由来幹細胞 (ADSC) の自己組織化を増強する方法であって、Wnt5aタンパク質を含む3次元 (3D) 培養マトリックス培地中でADSCを培養する段階を含む、方法。
【請求項８４】
ADSCが、ジェランガムを含む3D培養マトリックス中で培養される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
ADSCの3D培養マトリックス培地が、iPSC由来β様細胞、iPSC由来外分泌成分細胞、iPSC由来肝細胞、iPSC由来心筋細胞、またはiPSC由来腸細胞より選択されるiPSC由来細胞を含む、請求項83または請求項84記載の方法。
【請求項８６】
iPSC由来のオルガノイドが、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドより選択される、請求項83〜85のいずれか一項記載の方法。
【請求項８７】
人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のオルガノイドがヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) 由来のオルガノイドである、請求項85または請求項86記載の方法。
【請求項８８】
Wnt5aタンパク質が組換えヒトWnt5aタンパク質である、請求項83〜87のいずれか一項記載の方法。
【請求項８９】
膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドが、それぞれ、iPSC由来β様細胞、iPSC由来外分泌成分細胞、iPSC由来肝細胞、iPSC由来心筋細胞、またはiPSC由来腸細胞より選択されるiPSC由来細胞に由来する、請求項86〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
iPSC由来細胞がヒトのものである、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
請求項83〜90のいずれか一項記載の方法によって生成された、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年5月25日に出願された米国仮特許出願第62/341,461号の恩典を主張し、その全内容は本明細書において参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府支援の研究に基づいてなされた発明に対する権利の言明
本発明は、米国立衛生研究所により付与された助成金第DK057978号および第DK0909962号の下で、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
動物疾患モデルは疾患の病態形成に対する洞察をもたらし得るが、動物モデルを用いてスクリーニングおよび選択された薬物は、ヒト患者に採用できない場合が多い。進化生物学、分子生物学、および遺伝学的研究により、動物とヒトは大きく異なり得ることが示されるため、ヒト細胞を用いたヒト疾患の再現および機能的なヒト臓器の作製が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
以下に記載されるように、本発明は、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを含むオルガノイドを作製するための組成物および方法を特徴とする。
【０００５】
1つの局面において、本発明は、膵島オルガノイドを作製する方法であって、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞を培養する段階を含み、それによって膵島オルガノイドを作製する、方法を提供する。
【０００６】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中にiPSC由来β様細胞を含む細胞培養物を提供する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中にヒトiPSC由来β様細胞、ヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)、およびヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) を含む、細胞培養物を提供する。
【０００８】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、細胞培養物は脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞を含む。
【０００９】
別の局面において、本発明は、iPSC由来β様細胞を含有する膵島オルガノイドであって、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、膵島オルガノイドを提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、iPSC由来β様細胞、iPSC由来α細胞、iPSC由来δ細胞、iPSC由来導管細胞、脂肪由来幹細胞 (hADSC)、および内皮細胞を含有する膵島オルガノイドであって、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を示す、膵島オルガノイドを提供する。
【００１１】
関連局面において、本発明は、本明細書において詳細に説明される任意の局面のオルガノイドを移植された非ヒト生物を提供する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質を同定する方法であって、候補作用物質を膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドと接触させ；該候補作用物質と接触させたオルガノイドの活性を測定する段階を含み、オルガノイドの活性が参照と比較して変化した場合に、候補作用物質が、膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質として同定される、方法を提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質を同定する方法であって、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドが移植された非ヒト対象に候補作用物質を投与する段階；および該非ヒト対象の膵臓活性を測定する段階を含み、非ヒト対象の膵臓活性が参照と比較して変化した場合に、候補作用物質が、膵臓活性を調節しかつ／または膵臓疾患を処置する作用物質として同定される、方法を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、対象における膵臓疾患を処置する方法であって、膵島オルガノイドを対象に移植する段階を含み、該膵島オルガノイドが、iPSC由来β様細胞を含有し、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、方法を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、対象における1型糖尿病を処置する方法であって、膵島オルガノイドを対象に移植する段階を含み、該膵島オルガノイドが、iPSC由来β様細胞を含有し、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、方法を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞を培養することによって作製された膵島オルガノイドを提供する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞およびiPSC由来外分泌成分細胞を培養することによって作製された膵臓オルガノイドを提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来の肝細胞を培養することによって作製された肝臓オルガノイドを提供する、
【００１９】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来の心筋細胞を培養することによって作製された心臓オルガノイドを提供する、
【００２０】
別の局面において、本発明は、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来の腸細胞を培養することによって作製された腸オルガノイドを提供する、
【００２１】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、本方法は、iPSC由来β様細胞を脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞と共に培養する段階を含む。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、本方法は、iPSC由来β様細胞をiPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、および／またはiPSC由来導管様細胞と共に培養する段階を含む。
【００２２】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドは、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、および／またはiPSC由来導管様細胞を含有する。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドは脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞を含む。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドは、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、および／またはグルカゴン分泌を示す。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドは、β細胞転写因子Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2のうちの1つまたは複数を発現する。ある特定の態様において、膵島オルガノイドは、iPSC由来β様細胞、iPSC由来α細胞、iPSC由来δ細胞、iPSC由来導管細胞、脂肪由来幹細胞 (hADSC)、および内皮細胞を含有し、この場合、該オルガノイドは、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を示す。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドはiPSC由来外分泌成分によって囲まれている。様々な態様において、iPSC由来外分泌成分は、マーカーPDX1、Nkx6-1、およびPtf1のうちの1つまたは複数を発現する。
【００２３】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、本方法は、オルガノイドまたは非ヒト対象において膵臓疾患を誘発または模倣する段階を含む。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、以下の作用物質、すなわち遊離脂肪酸 (FFA)、グルコース、およびサイトカインのうちの1つまたは複数をオルガノイドと接触させることまたは非ヒト対象に投与することによって、疾患が誘発される。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、ヒト膵癌微小環境を創出するためにオルガノイドを膵癌細胞、星状細胞、および免疫細胞と共に培養することによって、疾患が模倣される。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵臓活性は、インスリン分泌、β細胞アポトーシス、NDUFA4、ESRRG、G6PC2、MDH1、LDHA、KCNK3、またはMAFAポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現または活性、アミラーゼ分泌、外分泌成分のアポトーシス、コラーゲン合成、および星状細胞活性化のうちの1つまたは複数である。様々な態様において、非ヒト対象は肝臓オルガノイドもまた移植される。
【００２４】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、候補作用物質はインスリン分泌を増加させる。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵臓活性を調節する作用物質として同定された候補作用物質は、膵臓疾患を処置する能力について試験される。様々な態様において、膵臓疾患は2型糖尿病または膵癌である。
【００２５】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、オルガノイドは、本明細書において詳細に説明される任意の局面によるオルガノイドである。
【００２６】
様々な態様において、非ヒト生物は哺乳動物（例えば、マウス）である。
【００２７】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドは、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、および／またはiPSC由来導管様細胞を含有する。
【００２８】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイドは脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞を含有する。
【００２９】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様においては、対象において膵臓疾患が誘発または模倣される。特定の態様において、膵臓疾患は1型糖尿病または2型糖尿病である。ある特定の態様において、対象は哺乳動物（例えば、ヒト）である。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、対象は免疫抑制剤を投与される。
【００３０】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、肝臓オルガノイドは、マーカーAFP、ALB、およびCyp3a7のうちの1つまたは複数を発現する。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、肝臓オルガノイドは、インスリンシグナル伝達、パルミチン酸によるインスリン抵抗性、および脂質蓄積を示す。
【００３１】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、心臓オルガノイドは、マーカーhMlc2a、hNkx2-5、αMHC、およびKCNQ1のうちの1つまたは複数を発現する。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、心臓オルガノイドは心拍動を示す。
【００３２】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、腸オルガノイドは、マーカーCDX2、Muc2、およびLgr5のうちの1つまたは複数を発現する。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、腸オルガノイドはR-スポンジンに応答して出芽を示す。
【００３３】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、iPSC由来β様細胞、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、および／またはiPSC由来導管様細胞はヒトのものである。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、iPSC由来β様細胞、iPSC由来外分泌成分細胞、iPSC由来肝細胞、iPSC由来心筋細胞、またはiPSC由来腸細胞はヒトのものである。様々な態様において、脂肪由来幹細胞はヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) である。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、内皮細胞はヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) である。
【００３４】
本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドは、脂肪由来幹細胞および／または内皮細胞を含有する。本明細書において詳細に説明される任意の局面の様々な態様において、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドは血管新生する。
【００３５】
別の局面において、本発明は、膵島オルガノイドを作製する方法であって、Wnt4またはWnt5aタンパク質を含む培地中で人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞を培養する段階を含む、方法を提供する。1つの態様において、人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のβ様細胞は3次元マトリックス中で培養される。前述の局面の1つの態様において、Wnt4またはWnt5aタンパク質は組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である。特定の態様において、培地は組換えヒトWnt4タンパク質を含む。別の特定の態様において、培地は組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。
【００３６】
別の局面において、本発明は、ヒトiPSC由来β様細胞およびWnt4またはWnt5aタンパク質を含む、細胞培養物を提供する。1つの態様において、ヒトiPSC由来β様細胞は、ジェランガムを含む3次元マトリックス中に存在する。1つの態様において、Wnt4またはWnt5aタンパク質は組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である。特定の態様において、培地は組換えヒトWnt4タンパク質を含む。別の特定の態様において、培地は組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。
【００３７】
別の局面において、本発明は、Wnt4またはWnt5aタンパク質を含む培地中で培養されたiPSC由来β様細胞を含む膵島オルガノイドであって、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を示す、膵島オルガノイドを提供する。1つの態様において、オルガノイドは、KCl刺激インスリン分泌またはグルコース刺激インスリン分泌をさらに示す。1つの態様において、膵島オルガノイドはFltp遺伝子およびEsrrg遺伝子を発現する。1つの態様において、Wnt4またはWnt5aタンパク質は組換えヒトWnt4またはWnt5aタンパク質である。特定の態様において、培地は組換えヒトWnt4タンパク質を含む。別の特定の態様において、培地は組換えヒトWnt5aタンパク質を含む。
【００３８】
別の局面において、本発明は、上記で説明された局面において定義されたオルガノイドを移植された非ヒト生物を提供する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のオルガノイドを作製するために脂肪由来幹細胞 (ADSC) の自己組織化を増強する方法であって、Wnt5aタンパク質を含む3次元 (3D) 培養マトリックス培地中でADSCを培養する段階を含む、方法を提供する。本方法の1つの態様において、ADSCは、ジェランガムを含む3D培養マトリックス中で培養される。1つの態様において、ADSCは、Wnt5タンパク質、およびiPSC由来β様細胞、iPSC由来外分泌成分細胞、iPSC由来肝細胞、iPSC由来心筋細胞、またはiPSC由来腸細胞より選択されるiPSC由来細胞を含む3D培養マトリックス培地中で培養される。本方法の1つの態様において、iPSC由来のオルガノイドは、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドより選択される。本方法の1つの態様において、人工多能性幹細胞 (iPSC) 由来のオルガノイドは、ヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) 由来のオルガノイドである。本方法の1つの態様において、Wnt5aタンパク質は組換えヒトWnt5aタンパク質である。本方法の1つの態様において、膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドは、それぞれ、iPSC由来β様細胞、iPSC由来外分泌成分細胞、iPSC由来肝細胞、iPSC由来心筋細胞、またはiPSC由来腸細胞より選択されるiPSC由来細胞に由来する。上記のいずれかの1つの態様において、iPSC由来細胞はヒトのものである。別の局面において、本発明は、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドを作製するために脂肪由来幹細胞 (ADSC) の自己組織化を増強する方法であって、Wnt5aタンパク質を含む培地中でADSCを培養する段階を含む、方法を提供する。1つの態様において、ADSCは、ジェランガムを含む3次元マトリックス中で培養される。別の態様において、Wnt5aタンパク質は組換えヒトWnt5aタンパク質である。別の局面において、本発明は、上記で詳細に説明される方法およびその態様のいずれかによって生成された膵島オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイド、心臓オルガノイド、または腸オルガノイドを提供する。
【００４０】
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離されたまたはその他の方法で製造されたものである。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００４１】
定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いられる場合、以下の用語は、特に指定がない限り、以下でそれらに割り当てられる意味を有する。
【００４２】
「AFPポリペプチド」または「αフェトプロテイン」とは、NCBIアクセッション番号NP_001125.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつAFPポリペプチドの生物活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。AFPポリペプチドの例示的な生物活性には、銅、ニッケル、脂肪酸、およびビリルビンへの結合が含まれる。NCBIアクセッション番号NP_001125.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000002
【００４３】
「AFPポリヌクレオチド」とは、AFPポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なAFPポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_001134.2に提供される。NCBI Ref: NM_001134.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000003
【００４４】
「ALBポリペプチド」または「アルブミン」とは、NCBIアクセッション番号NP_000468.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつALBポリペプチドの生物活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。ALBポリペプチドの例示的な生物活性には、脂肪酸、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ホルモン、およびビリルビンへの結合；細胞外液量の安定化；ならびに血漿亜鉛の輸送が含まれる。NCBIアクセッション番号NP_000468.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000004
【００４５】
「ALBポリヌクレオチド」とは、ALBポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なAFPポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_000477.5に提供される。NCBI Ref: NM_000477.5に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000005
【００４６】
「作用物質」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００４７】
「改善する」とは、疾患の発症または進行を低減する、抑制する、減弱させる、軽減する、停止させる、または安定化することを意味する。
【００４８】
「変化」とは、増加または減少を意味する。増加は、例えば、少なくとも約5%、10%、もしくは20%の；少なくとも約25%、50%、75%の、またはさらには100%、200%、300%、もしくはそれ以上の、任意の正の変化である。減少は、負の変化、例えば、少なくとも約5%、10%、もしくは20%の；少なくとも約25%、50%、75%の減少；またはさらには100%、200%、300%、もしくはそれ以上の増加である。
【００４９】
本開示において、「含む (comprises)」、「含むこと (comprising)」、「含有すること (containing)」、および「有すること (having)」などは、米国特許法においてそれらに割り当てられた意味を有してよく、「含む (includes)」、「含むこと (including)」などを意味し得る；「〜から本質的になること (consisting essentially of)」または「本質的になる (consists essentially)」も同様に、米国特許法において割り当てられた意味を有し、本用語は非制限的であり、列挙されたものの基本的または新規な特徴が、列挙されたもの以外の存在によって変化しない限り、列挙されたもの以外の存在を許容するが、先行技術の態様は除外する。
【００５０】
「CDX2ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_001256.3に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_001256.3に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000006
【００５１】
「CDX2ポリヌクレオチド」とは、とは、CDX2ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なCDX2ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_001265.4に提供される。NCBI Ref: NM_001265.4に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000007
【００５２】
「CYP3A7ポリペプチド」または「シトクロムP450」とは、NCBIアクセッション番号NP_000756.3に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_000756.3に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000008
【００５３】
「CYP3A7ポリヌクレオチド」とは、CYP3A7ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なAFPポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_00765.4に提供される。NCBI Ref: NM_00765.4に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000009
【００５４】
「検出する」とは、検出しようとする分析物の存在、非存在、または量を同定することを指す。
【００５５】
「検出可能な標識」とは、関心対象の分子に連結された場合に、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段によって、後者を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度の試薬、（例えば、ELISAにおいて一般的に用いられる）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンが含まれる。
【００５６】
「分化」とは、系列拘束の発生過程を指す。分化は、対応する未分化対照細胞における発現と比較した、1つまたは複数の細胞特異的マーカーの増加を測定することによってアッセイすることができる。「系列」とは細胞発生の経路を指し、その経路において、前駆 (precursor) 細胞または「前駆 (progenitor)」細胞は、漸進的な生理学的変化を起こして、特徴的な機能を有する特定の細胞型になる。いくつかの態様において、細胞型はβ細胞である。いくつかの態様において、細胞型はα細胞、δ細胞、または導管細胞である。いくつかの他の態様において、細胞型は肝細胞である。さらなる他の態様において、細胞型は心筋細胞である。いくつかの態様において、細胞型は腸細胞である。分化は段階的に起こり、それによって細胞は、「最終分化」とも称される完全な成熟に達するまで、徐々により特異的となっていく。「最終分化細胞」とは、特定の系列に拘束され、分化の最終段階に達した細胞（すなわち、完全に成熟した細胞）である。いくつかの態様においては、人工多能性幹細胞 (iPSC) を、β様細胞、α様細胞、δ様細胞、または導管様細胞に分化させる。いくつかの他の態様においては、人工多能性幹細胞 (iPSC) を、肝細胞、心筋細胞、または腸細胞に分化させる。
【００５７】
「脱分化細胞」とは、分化の過程が少なくともある程度逆転した細胞である。脱分化は、例えば、対応する対照細胞における発現と比較した、1つまたは複数の細胞特異的マーカーの発現の減少を同定することによってアッセイすることができる。あるいは、脱分化は、胚性幹細胞、多能性もしくは多分化能細胞型において典型的に発現される、または発生のより早い段階で発現される1つまたは複数のマーカーの増加を測定することによってアッセイすることもできる。いくつかの態様において、脱分化細胞は人工多能性幹細胞 (iPSC) である。ある特定の態様において、脱分化細胞はヒト人工多能性幹細胞 (iPSC) である。
【００５８】
「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷するまたは妨げる任意の状態または障害を意味する。疾患の例には、1型糖尿病、2型糖尿病、および膵癌が含まれる。
【００５９】
「有効量」とは、未処置対象と比較して対象における疾患の症状を改善するのに必要な治療剤またはオルガノイドの量を意味する。疾患を治療的処置する目的で本発明を実施するために用いられる治療剤の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重、および一般的な健康状態に応じて異なる。最終的には、主治医または獣医師が適切な量および投与計画を決定する。そのような量は「有効」量と称される。いくつかの態様において、治療用オルガノイドは膵島オルガノイドである。いくつかの他の態様においては、膵島オルガノイドの有効量が、1型または2型糖尿病を有する対象に投与される。
【００６０】
「ESRRGポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_001230448.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ核内ホルモン受容体活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_001230448.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000010
【００６１】
「ESRRGポリヌクレオチド」とは、ESRRGポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なESRRGポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_001243519.1に提供される。NCBI Ref: NM_001243519.1に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000011
2019516384.tif 000012
2019516384.tif 000013
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「内分泌」とは、血流中への作用物質（例えば、ホルモン）の分泌を指す。「外分泌」とは、導管を通した上皮表面への作用物質の分泌を指す。
【００６３】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この一部は、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含有する。断片は、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有し得る。
【００６４】
「FOXA2ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_068556.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_068556.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000014
【００６５】
「FOXA2ポリヌクレオチド」とは、FOXA2ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なFOXA2ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_021784.4に提供される。NCBI Ref: NM_021784.4に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000015
【００６６】
「GATA6ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_005248.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_005248.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000016
【００６７】
「GATA6ポリヌクレオチド」とは、GATA6ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なKCNK3ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_005257.5に提供される。NCBI Ref: NM_005257.5に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000017
2019516384.tif 000018
【００６８】
「ジェランガム」とは、以下の分子構造のうちのいずれか1つを有する反復単位を伴った直鎖を有する多糖を意味する。
ジェランガム‐高アシル型
2019516384.tif 000019
ジェランガム‐低アシル型
2019516384.tif 000020
【００６９】
前述の構造中、「Ac」は酢酸基を指し、「Gly」はグリセリン酸基を指し、「M+」は一価カチオンである。いくつかの態様において、ジェランガムはKELCOGEL（登録商標）ジェランガムである。
【００７０】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸塩基間の、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型水素結合であってよい水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対形成する相補的核酸塩基である。
【００７１】
「免疫抑制剤」または「免疫抑制薬」とは、対象中の移植された臓器またはオルガノイドの、拒絶反応などの免疫反応を抑制または予防する作用物質を意味する。免疫抑制薬の例には、バシリジマブ (basilizimab)、抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブ、プレドニゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリン、シロリムス、メトトレキサート、インターフェロン、およびタクロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
「人工多能性幹細胞」または「iPSC」とは、細胞中で1つまたは複数の転写因子を外因的に発現させることによって多能性を獲得した分化型の体細胞を意味する。「iPSC由来細胞」とは、人工多能性幹細胞に由来する細胞である。「iPSC由来β様細胞」、「iPSC由来α様細胞」、「iPSC由来δ様細胞」または「iPSC由来導管様細胞」とは、人工多能性幹細胞に由来し、かつそれぞれβ細胞、α細胞、δ細胞、または導管細胞の特徴を有する細胞である。
【００７３】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見出される通常それに付随する成分が様々な程度まで除去されている物質を指す。「単離する」とは、最初の供給源または周囲からのある程度の分離を示す。「精製する」とは、単離よりも高度の分離を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物もタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさず、または他の有害事象を引き起こさないように、他の物質が十分に除去されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技法によって生成された場合には、細胞物質、ウイルス物質、もしくは培養液を実質的に含まないのであれば、または化学合成された場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないのであれば、精製されている。純度および均一性は典型的には、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じることを示し得る。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質に関して、異なる修飾は異なる単離されたタンパク質を生じる場合があり、それらは別々に精製され得る。
【００７４】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子の由来元である生物の天然ゲノムにおいてこの遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えば、DNA）を意味する。したがって本用語は、例えば、ベクター中に；自己複製プラスミドもしくはウイルス中に；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれている；あるいは他の配列とは独立した別個の分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生じたcDNAまたはゲノム断片もしくはcDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。加えて、本用語は、DNA分子から転写されたRNA分子、および付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００７５】
「単離されたポリペプチド」とは、天然でそれに付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然で会合しているタンパク質および天然有機分子を含まずに、少なくとも60重量%である場合に、単離されている。調製物は、少なくとも75重量%、少なくとも90重量%、および少なくとも99重量%の本発明のポリペプチドであってよい。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；またはタンパク質を化学合成することによって、得られ得る。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
【００７６】
「KCNK3ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_002237.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつカリウムチャネル活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_002237.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000021
【００７７】
「KCNK3ポリヌクレオチド」とは、KCNK3ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なKCNK3ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_002246.2に提供される。NCBI Ref: NM_002246.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000022
2019516384.tif 000023
【００７８】
「KCNQ1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_000209.2（アイソフォーム1）またはNP_861463.1（アイソフォーム2）に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつカリウムチャネル活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_000209.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000024
【００７９】
「KCNQ1ポリヌクレオチド」とは、KCNQ1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なKCNQ1ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_00218.2に提供される。NCBI Ref: NM_00218.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000025
2019516384.tif 000026
【００８０】
「LGR5ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_003658.1（アイソフォーム1）、NP_001264155.1（アイソフォーム2）、またはNP_001264156.1（アイソフォーム3）に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ膜貫通シグナル伝達受容体活性またはGタンパク質共役型受容体活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_003658.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000027
【００８１】
「LGR5ポリヌクレオチド」とは、LGR5ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なLGR5ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_003667.3に提供される。NCBI Ref: NM_003667.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000028
2019516384.tif 000029
2019516384.tif 000030
【００８２】
「LDHAポリペプチド」または「乳酸脱水素酵素Aポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_005557.1（アイソフォーム1）、NP_001128711.1（アイソフォーム2）、NP_001158886.1（アイソフォーム3）、NP_001158887.1（アイソフォーム4）、またはNP_001158888.1（アイソフォーム5）に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ脱水素酵素活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_005557.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000031
【００８３】
「LDHAポリヌクレオチド」または「乳酸脱水素酵素Aポリヌクレオチド」とは、LDHAポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なLDHAポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_005566.3に提供される。NCBI Ref: NM_005566.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000032
【００８４】
「MAFAポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_963883.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_963883.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000033
【００８５】
「MAFAポリヌクレオチド」とは、MAFAポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なMAFAポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_201589.3に提供される。NCBI Ref: NM_201589.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000034
【００８６】
本明細書で用いられる場合、「マーカー」とは、疾患もしくは障害に関連して、または特定の細胞型に関連して、発現レベルまたは活性が変化する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、β細胞のマーカーは、Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、またはFoxa2である。いくつかの態様において、肝細胞のマーカーは、AFP、ALB、またはCyp3a7である。いくつかの他の態様において、心筋細胞のマーカーは、hM1c2a、hNkx2-5、αMHC、またはKCNQ1である。さらなる他の態様において、小腸細胞のマーカーは、CDX2、Muc2、またはLgr5である。
【００８７】
「αMHCポリペプチド」または「ミオシン重鎖 (MHC) αポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_002462.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつアクチン結合活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_002462.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000035
【００８８】
「αMHCポリヌクレオチド」とは、αMHCポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なαMHCポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_002471.3に提供される。NCBI Ref: NM_002471.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000036
2019516384.tif 000037
2019516384.tif 000038
【００８９】
「MLC2Aポリペプチド」または「ヒトMLSC2A (hMLC2A) ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_067046.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつカルシウム結合活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_067046.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000039
【００９０】
「MLC2Aポリヌクレオチド」とは、MLC2Aポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なMLC2Aポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_021223.2に提供される。NCBI Ref: NM_021223.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000040
【００９１】
「MUC2ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_002448.3に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつMUC2ポリペプチドの生物活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。MUC2ポリペプチドの例示的な生物活性には、ゲルへの重合、ならびに腸およびその他の粘膜含有臓器の上皮の被覆が含まれる。NCBIアクセッション番号NP_002448.3に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000041
2019516384.tif 000042
2019516384.tif 000043
【００９２】
「MUC2ポリヌクレオチド」とは、MUC2ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なMUC2ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_002457.3に提供される。NCBI Ref: NM_002457.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000044
2019516384.tif 000045
2019516384.tif 000046
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2019516384.tif 000048
2019516384.tif 000049
【００９３】
「NKX2-5ポリペプチド」または「ヒトNKX2-5 (hNKX2-5) ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_004378.1（アイソフォーム1）、NP_001159647.1（アイソフォーム2）、またはNP_001159648.1（アイソフォーム3）に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_004378.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000050
【００９４】
「NKX2-5ポリヌクレオチド」とは、NKX2-5ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNKX2-5ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_004387.3に提供される。NCBI Ref: NM_004387.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000051
【００９５】
「NEUROD1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_002491.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_002491.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000052
【００９６】
「NEUROD1ポリヌクレオチド」とは、NEUROD1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNEUROD1ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_002500.4に提供される。NCBI Ref: NM_002500.4に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000053
【００９７】
「NKX6-1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_006159.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_006159.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000054
【００９８】
「NKX6-1ポリヌクレオチド」とは、NKX6-1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNKX6-1ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_006168.2に提供される。NCBI Ref: NM_006168.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000055
【００９９】
「NDUFA4ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_002480.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつNADH脱水素酵素活性および酸化還元酵素活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_002480.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000056
【０１００】
「NDUFA4ポリヌクレオチド」とは、NDUFA4ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なNDUFA4ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_002489.3に提供される。NCBI Ref: NM_002489.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000057
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「作用物質を得ること」などにおける「得ること」は、その作用物質を合成すること、購入すること、またはその他の方法で取得することを含む。
【０１０２】
「臓器」とは、生物学的機能を果たす細胞の集合体を意味する。1つの態様において、臓器には、膀胱、脳、神経組織、グリア組織、食道、ファロピウス管、心臓、膵臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、乳房、骨格筋、皮膚、骨、および軟骨が含まれるが、これらに限定されない。臓器の生物学的機能は、当業者に公知の標準法を用いてアッセイすることができる。
【０１０３】
「オルガノイド」とは、臓器の構造および機能を模倣する、インビトロで作製された身体を意味する。「オルガノイド」および「ミニ臓器」は、本明細書において互換的に用いられる。「膵島オルガノイド」は、膵島の構造および機能を模倣する、インビトロで作製された細胞塊である。膵島の例示的な機能には、非限定的に、グルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)、塩化カリウム (KCl) 刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、またはグルカゴン分泌が含まれる。「膵島オルガノイド」および「ミニ膵島」は、本明細書において互換的に用いられる。「膵臓オルガノイド」は、膵臓の構造および機能を模倣する、インビトロで作製された身体である。膵臓の例示的な機能には、非限定的に、グルコース代謝および血糖濃度を調節する、グルコースおよびグルカゴンなどのホルモンの内分泌、ならびに炭水化物、タンパク質、および脂質の分解を助ける消化酵素の外分泌が含まれる。「膵臓オルガノイド」および「ミニ膵臓」は、本明細書において互換的に用いられる。
【０１０４】
「PAX4ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_006184.2に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_006184.2に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000058
【０１０５】
「PAX4ポリヌクレオチド」とは、PAX4ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPAX4ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_006193.2に提供される。NCBI Ref: NM_006193.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000059
【０１０６】
「PAX6ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_001297090.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_001297090.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000060
【０１０７】
「PAX6ポリヌクレオチド」とは、PAX6ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPAX6ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_001310161.1に提供される。NCBI Ref: NM_001310161.1に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000061
2019516384.tif 000062
2019516384.tif 000063
【０１０８】
「PDX1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_000200.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_000200.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000064
【０１０９】
「PDX1ポリヌクレオチド」とは、PDX1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPDX1ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_000209.3に提供される。NCBI Ref: NM_000209.3に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000065
【０１１０】
「PTF1ポリペプチド」とは、NCBIアクセッション番号NP_835455.1に提供される配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつ転写因子活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。NCBIアクセッション番号NP_835455.1に提供されるアミノ酸配列を、以下に示す。
2019516384.tif 000066
【０１１１】
「PTF1ポリヌクレオチド」とは、PTF1ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なPTF1ポリヌクレオチド配列は、NCBI Ref: NM_178161.2に提供される。NCBI Ref: NM_178161.2に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000067
【０１１２】
「Wnt3aポリヌクレオチド」とは、Wnt3aポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチド、またはヒトWnt3aポリヌクレオチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。例示的なヒトWnt3aポリヌクレオチド配列は、NCBI GenBankアクセッション番号AB060284.1に提供される。NCBI GenBankアクセッション番号AB060284.1に提供されるポリヌクレオチド配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000068
【０１１３】
「Wnt3aポリペプチド」とは、Wnt3aポリペプチドもしくはその断片、またはヒトWnt3aポリペプチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを意味する。例示的なヒトWnt3aポリペプチド配列は、NCBI GenBank: AAI03924.1に提供される。GenBank: AAI03924.1に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000069
【０１１４】
「Wnt4ポリヌクレオチド」とは、Wnt4ポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチド、またはヒトWnt4ポリヌクレオチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。例示的なヒトWnt4ポリヌクレオチド配列は、NCBI GenBankアクセッション番号AY009398.1に提供される。アクセッション番号NCBI Ref NG_008974.1は、参照標準Wnt4aポリヌクレオチド配列である。NCBI GenBankアクセッション番号AY009398.1に提供されるポリヌクレオチド配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000070
【０１１５】
「Wnt4ポリペプチド」とは、Wnt4ポリペプチドもしくはその断片、またはヒトWnt4ポリペプチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを意味する。例示的なヒトWnt4ポリペプチド配列は、NCBI GenBankアクセッション番号：AAG38658.1に提供される。GenBankアクセッション番号：AAG38658.1に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000071
【０１１６】
「Wnt5aポリヌクレオチド」とは、Wnt5aポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチド、またはヒトWnt5aポリヌクレオチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。ヒトWnt5aをコードする例示的なポリヌクレオチド配列は、参照標準配列であるNCBI Ref: GenBank NM_003392に提供される。6194ヌクレオチドを有するWnt5aゲノム配列のヌクレオチド658〜1800が、ヒトWnt5aポリペプチドをコードする。NCBI Ref: GenBank NM_003392の塩基658〜1800に提供されるヒトWnt5aコード配列のポリヌクレオチド配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000072
【０１１７】
「Wnt5aポリペプチド」とは、Wnt5aポリペプチドもしくはその断片、またはヒトWnt5aポリペプチド配列と少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドを意味する。例示的なヒトWnt5a（アイソフォーム1）ポリペプチド配列は、UniProtKB識別子：P41221-1に提供される。UniProtKB識別子：P41221-1に提供される配列を、以下に転載する。
2019516384.tif 000073
【０１１８】
「前駆細胞」とは、（例えば、分化または分裂によって）内皮細胞を生じることができる多分化能幹細胞を意味する。内皮細胞を生じることができる前駆細胞は、本明細書において記載されるような適切なインビトロまたはインビボ条件下で増殖された場合に、この能力を表し得る。
【０１１９】
「子孫」とは、本発明の多分化能幹細胞に由来する細胞を意味する。子孫には、非限定的に、前駆細胞、分化細胞、および最終分化細胞が含まれる。
【０１２０】
「〜に由来する」とは、子孫細胞を得る過程を意味する。
【０１２１】
「減少する」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
【０１２２】
「参照」または「対照」とは、標準状態を意味する。例えば、未処理の細胞、組織、または臓器が参照として用いられる。
【０１２３】
「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる規定の配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットまたは全体；例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列であってよい。ポリペプチドに関して、参照ポリペプチド配列の長さは一般的に、少なくとも約16アミノ酸、少なくとも約20アミノ酸、または少なくとも約25アミノ酸である。参照ポリペプチド配列の長さは、約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸であってよい。核酸に関して、参照核酸配列の長さは一般的に、少なくとも約50ヌクレオチド、少なくとも約60ヌクレオチド、または少なくとも約75ヌクレオチドである。参照核酸配列の長さは、約100ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、またはそれらの前後のもしくはそれらの間の任意の整数であってよい。
【０１２４】
「体」細胞とは、対象の組織から得られた細胞を指す。そのような対象は、発生の出生後段階にある（例えば、成人、幼児、小児である）。対照的に、「胚細胞」または「胚性幹細胞」は、発生の出生前段階にある胚に由来する。
【０１２５】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識しそれと結合するが、本発明のポリペプチドを天然で含む試料、例えば生体試料中の他の分子を実質的に認識せず、それと実質的に結合しない化合物または抗体を意味する。
【０１２６】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内在性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1本の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が含まれる。そのような核酸分子は、内在性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示す。内在性配列と「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも1本の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される遺伝子）またはその一部の間で対形成して二本鎖分子を形成することを意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【０１２７】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約750 mM NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウム未満、約500 mM NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウム未満、または約250 mM NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウム未満である。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミドまたは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件には通常、少なくとも約30℃、少なくとも約37℃、および少なくとも約42℃の温度が含まれる。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の濃度、および担体DNAを含めるかまたは含めないかなどの様々な付加的パラメータが、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。1つの態様において、ハイブリダイゼーションは、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム、および1% SDS中、30℃で行われる。別の態様において、ハイブリダイゼーションは、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、および100μg/ml変成サケ精子DNA (ssDNA) 中、37℃で行われる。さらなる別の態様において、ハイブリダイゼーションは、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、および200μg/ml ssDNA中、42℃で行われる。これらの条件の有用な変動は、当業者に容易に明らかであろう。
【０１２８】
大部分の適用に関して、ハイブリダイゼーションに続く洗浄段階もまた、ストリンジェンシーが異なる。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度によって、および温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによって、または温度を上げることによって高めることができる。例えば、洗浄段階のためのストリンジェントな塩濃度は、約30 mM NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウム未満、または約15 mM NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウム未満である。洗浄段階のためのストリンジェントな温度条件には通常、少なくとも約25℃、少なくとも約42℃、および少なくとも約68℃の温度が含まれる。1つの態様において、洗浄段階は、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中、25℃で行われる。別の態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中、42℃で行われる。さらなる別の態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中、68℃で行われる。これらの条件の付加的な変動は、当業者に容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York)；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【０１２９】
「実質的に同一の」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ）と少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。そのような配列は、比較に用いられた配列とアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、またはさらには少なくとも99%同一である。
【０１３０】
配列同一性は典型的には、配列解析ソフトウェア（例えば、the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705の配列解析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を一致させる。保存的置換には典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの中での置換が含まれる。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムを使用することができ、e-3〜e-100の確率スコアが、密接に関連した配列を示す。
【０１３１】
本明細書において用いられる「自己複製」という用語は、幹細胞が分裂して、母細胞のものとは区別できない発生能力を有する1つ（非対称性分裂）または2つ（対照性分裂)の娘細胞を生じる過程を指す。自己複製は、増殖および未分化状態の維持の両方を含む。
【０１３２】
「幹細胞」という用語は、自己複製して複数の細胞系列に分化する能力を有する多能性細胞または多分化能幹細胞を意味する。
【０１３３】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、齧歯類、もしくはネコなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。
【０１３４】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の値のすべての省略表現であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
【０１３５】
「組織」とは、類似の形態および機能を有する細胞の集合体を意味する。
【０１３６】
本明細書で用いられる場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、障害および／またはそれに伴う症状を軽減することまたは改善することを指す。除外されてはいないが、障害または状態を処置することは、障害、状態、またはそれに伴う症状が完全に取り除かれることを必要としないことが認識される。
【０１３７】
「血管新生した」とは、血管を有することを意味する。いくつかの態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは血管新生している。
【０１３８】
具体的に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられる場合、「または」という用語は包括的であると理解される。具体的に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられる場合、「1つの (a)」、「1つの (an)」、および「その」という用語は、単数または複数であると理解される。
【０１３９】
具体的に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容値の範囲内、例えば平均の2標準偏差内にあると理解される。約は、記載値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%以内にあると理解され得る。文脈から別段に明白でない限り、本明細書において提供される数値はすべて、約という用語によって修飾されている。
【０１４０】
本明細書における変数の任意の定義における化学基の一覧の列挙は、任意の単一基または列挙された基の組み合わせとしての、その変数の定義を含む。本明細書における変数または局面についての態様の列挙は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部と組み合わせた、その態様を含む。
【０１４１】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のいずれか1つまたは複数と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ディッシュ中でモデル化され得るヒト疾患の様々な症状を示す概略である。機能的なヒト臓器の作製は、薬物スクリーニングおよび疾患モデル化における新たな治療戦略を提供する。3Dヒトミニ臓器をディッシュ中で作製するための新規な技法が、本明細書において記載される。この技法を用いて、ヒト2型糖尿病をディッシュ中でモデル化して、ヒト2型糖尿病などの遺伝子、患者、または環境特異的疾患において有効な薬物を見出すことができる。
【図２−１】図2Aは、器官形成におけるヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) の有用性を示す、一連の顕微鏡写真である。本明細書における研究において、ヒト脂肪由来幹細胞が、自己組織化されたオルガノイド（器官原基）を作製するための新規な供給源であることが見出された。図2は、プレート上 (2D) で培養されたヒトiPSC由来の膵臓前駆細胞（PP、15日目〜19日目）、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)、およびhADSCの外観を、3次元マトリゲル中で（Matrigel（登録商標）系、それぞれPP部細胞分化培地、内皮細胞増殖培地、およびhADSC増殖培地中で24時間）培養されたものと比較する。図2Bは、ADSCが、Matrigel中で培養された場合に次第に自己組織化する能力を実証する、一連の顕微鏡写真である。図2Cは、Matrigel中で増殖された場合にスフィア形成に必要とされる最小細胞数を実証する、表示の密度で播種されたhADSCの一連の画像である。図2Dは、ヒートマップとして示される、Matrigel中での48時間の培養中にhADSCにおいて起こる転写変化を示す。遺伝子発現の統計学的に異なる変化が、Matrigel中での表示時間後の細胞のRNA-Seq解析によって決定された。Matrigel中での培養中に変化した生物学的経路は、DAVIDソフトウェアを用いて同定された。図2Eは、Matrigel中で培養することによるヒト島様オルガノイドの作製を記述する概略図である。図2Fは、24ウェルプレートの単一ウェル内のヒト島様オルガノイドの画像である。図2Gは、hiPSC由来膵臓前駆細胞、HUVEC、およびhADSCをMatrigel中で1〜5日間共培養することによって作製されたヒト島様オルガノイドの一連の画像である。GFPを用いてヒトインスリン発現（緑色、1枚目のパネル）を示し、mCherryを用いてHUVEC細胞を標識し（赤色、2枚目のパネル）、明視野画像（3枚目のパネル）、およびGFP画像とmCherry画像を重ね合わせたもの（4枚目のパネル）。
【図２−２】図2-1の説明を参照のこと。
【図２−３】図2-1の説明を参照のこと。
【図２−４】図2-1の説明を参照のこと。
【図２−５】図2-1の説明を参照のこと。
【図２−６】図2-1の説明を参照のこと。
【図２−７】図2-1の説明を参照のこと。
【図３−１】図3A〜3Fは、定量的インスリン分泌アッセイとしてプロインスリンルシフェラーゼレポーター系を用いた、INS-1細胞、マウス島、およびヒト島のインスリン分泌の特徴づけを示すプロット、画像、および概略図である。図3Aは、ラットβ細胞株INS-1細胞中の安定発現インスリンレポーターの作製を示す概略図であり、この場合、ルシフェラーゼ発現がプロインスリンプロモーターの制御下にある。図3Bは、3 mM グルコース (G3)、20 mM グルコース (G20)、20 mM グルコース (G20) + 100 nM エキセンディン-4 (Ex-4)、または20 mM 塩化カリウム (KCl) による処理に応答して、INS-1レポーター細胞において誘導されたルシフェラーゼ活性を示すプロットである。図3Cは、96ウェルプレートの1つのウェル内の単一マウス島を示す画像である。アッセイの2日前に、マウス島にプロインスリン-ルシフェラーゼレンチウイルスレポーター構築物を感染させた。図3Dは、プロインスリンルシフェラーゼレポーターを感染させた個々のマウス島からの、3 mM グルコース (G3mM) および20 mM グルコース (G20mM) に応答したルシフェラーゼ活性（左側）、ならびに個々のアッセイの平均値（右側）を示す、一連のプロットである。図3Eは、96ウェルプレートの1つのウェル内の単一ヒト島を示す画像である。アッセイの2日前に、ヒト島にプロインスリン-ルシフェラーゼレンチウイルスレポーター構築物を感染させた。図3Fは、プロインスリンルシフェラーゼレポーターを感染させた個々のヒト島からの、3 mM グルコース (G3mM) および20 mM グルコース (G20mM) に応答したルシフェラーゼ活性（左側）、ならびに個々のアッセイの平均値（右側）を示す、一連のプロットである。図3Dおよび3Fは、グルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) が、レンチウイルスルシフェラーゼレポーターによる感染後に、それぞれ単一のマウス島およびヒト島から測定され得ることを示す。
【図３−２】図3-1の説明を参照のこと。
【図４−１】図4A〜4Iは、ディッシュ中での機能的な、血管新生したヒト膵島の作製を示すプロット、画像、グラフ、および概略図である。図4Aは、機能的な、血管新生したヒト膵島をジェランガム中で作製するための図式を示す概略図である。図4Bはヒト島様ミニ臓器を示す。上部パネルは、3Dジェランガム懸濁液中で増殖された島様オルガノイド（下部パネル）のインスリン陽性細胞（インスリンプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質発現（左側））および位相差画像（左側）を示す。電子顕微鏡画像により、β様細胞中のインスリン顆粒およびhADSC中の脂肪滴が明らかになる。図4Cは、本明細書に記載される方法によって作製されたヒト島様ミニ臓器が、ヒト島と形態学的に同一であることを示す。図4Dおよび4Eは、qPCRによって測定された、β細胞決定（図4D）およびミトコンドリア機能（図4E）に関連した遺伝子の相対的発現を示す。島様細胞クラスター（ジェランガム中で培養された膵臓前駆細胞に由来、35日目）ならびに島様オルガノイド（ジェランガム中でHUVECおよびhADSCと共培養された膵臓前駆細胞に由来）を、解析する前にインスリン発現細胞（GFP陽性）と非発現細胞（GFP陰性）にFACS選別し、ヒト島における遺伝子発現と比較した。図4Fは、3Dジェランガム培養において調製された、選択された島様オルガノイド調製物、およびヒト島における、20 mM グルコースに曝露して30分後のc-ペプチド分泌の変化倍率によって測定された、グルコース刺激インスリン分泌を示す。図4Gは、本明細書に記載される方法によって作製されたヒト島様ミニ臓器が、機能的血管新生化を発達させ得ることを示す。ヒト島様オルガノイドをマトリゲルに移し、内皮増殖培地の存在下で増殖させた。インスリンを発現する細胞は、緑色蛍光として可視化される。上部パネルは、内皮細胞増殖培地 (ECM) による刺激の24時間後および48時間後のHUVEC細胞伸長を示す、細胞の蛍光画像である。下部パネルは、本実験および本知見を要約する概略図である。図4Hは、本明細書に記載される方法によって作製されたヒト島様ミニ臓器が、1型糖尿病の公知のマウスモデルであるNODSCIDにおいて血糖を調節し得ることを説明するグラフを示す。このマウスモデルでは、SCID（重症複合免疫不全）変異が、糖尿病易発性の非肥満糖尿病 (NOD) バックグラウンドに導入されている。このマウスモデルにおける複数の免疫学的欠損は、ヒト造血細胞で動物を再構成するための系を提供する。図4H中のグラフは、hiPSC由来ヒト島様オルガノイド (n=1000)、（四角付きの点線）；ヒト島 (n=1000)、（破線）の腎臓被膜への移植；またはモック処置（白丸付きの実線）の後に、1型糖尿病を誘発するためにストレプトゾトシン (STZ) (180 mg/kg) で処置したNODSCIDマウスにおける血糖レベルを示す。図4Iは、本明細書に記載される方法によって作製されたヒト島様ミニ臓器（「ヒト島オルガノイド」）が、食後にインスリンを分泌し得ることを説明する棒グラフを示す。図4Iのグラフは、ランダムな給餌条件（左側のバー）、8時間の絶食条件（中央のバー）、および再給餌条件（右側のバー）下の、図4Hに記載された移植の4週間後のNODSCIDマウスにおけるヒトc-ペプチドの血清レベル (pmol/L) を示す。ヒトc-ペプチドレベルは、内因性のマウスインスリンと異なる、移植片からのインスリン分泌の測定を提供する。
【図４−２】図4-1の説明を参照のこと。
【図４−３】図4-1の説明を参照のこと。
【図４−４】図4-1の説明を参照のこと。
【図４−５】図4-1の説明を参照のこと。
【図４−６】図4-1の説明を参照のこと。
【図５−１】図5A〜5Eは、3Dジェランガム培養における機能的島様オルガノイドの作製を示す図およびプロットである。図5Aは、インスリン発現 (GFP) およびインスリン分泌（ルシフェラーゼ）に関する二重レポーターを安定して組み入れているhiPSCの作製を記述する概略図である。図5Bは、二重レポーターを組み入れているhiPSCの分化中の、ヒトインスリンの発現増加を示す棒グラフである。図5Cは、本明細書に記載される方法を用いて作製されたヒト島様オルガノイドとヒト島からのグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) を比較する棒グラフである。GSISは、3mMおよび20 mMグルコースに応じて、単一の島様オルガノイドまたはヒト島において分泌ルシフェラーゼを用いて測定されたものである。矢印は、グルコース負荷に応答してインスリン分泌を増加させ得る機能的オルガノイドを示す。図5Dは、本明細書に記載されるように調製された島様オルガノイドの個々のバッチと陰性対照としてのマウス島のインスリン分泌を比較する棒グラフである。インスリン分泌は、培養の133日後に、3 mM グルコース (G3mM)、20 mM グルコース (G20mM)、20 mM グルコース (G20mM) およびエキセンディン-4 (Ex4)、または20 mM 塩化カリウム (KCl20mM) に応じて測定された。応答は、プールされたオルガノイド（オルガノイド100個／試料）からの分泌ルシフェラーゼ活性として測定された。図5Eは、細胞内インスリンの尺度としての細胞内ルシフェラーゼ活性を示す（オルガノイド100個／試料）。
【図５−２】図5-1の説明を参照のこと。
【図５−３】図5-1の説明を参照のこと。
【図６Ａ】図6A〜6Hは、ディッシュ中での機能的なヒトミニ臓器の作製を示す概略図および画像である。図6Aは、ヒトの島、膵臓、肝臓、心臓、および腸を含む機能的なヒトミニ臓器の作製を示す概略図である。図6B〜6Cは、ヒト心臓オルガノイドの作製を示す。図6B（上部）は、ヒト多能性幹細胞 (hPSC) を心筋細胞（2Dで培養した場合）またはミニ心臓（3DでhADSCおよびHUVECと共培養した場合）へ分化させるためのプロトコールを説明する概略図を提供する。図6B（左下）は、PPARδアゴニストGW501516を伴うおよび伴わない分化プロトコールの前（0日目）および18日目の、心筋細胞特異的遺伝子ヒトMLC2a (hMLC2a)、ヒトNkx2-5 (hNkx2-5)、αミオシン重鎖 (αMHC)、およびKCNQ1の相対的発現を示すプロットを提供する。図6Bの右下は、hiPSC由来心筋細胞の拍動を示すビデオ顕微鏡写真である。図6Cは、上記の概略図に記載されるようにhiPSC由来心筋細胞をhADSCおよびHUVECと共に培養することによって作製されたヒトミニ心臓様オルガノイドの画像を示す。図6D〜6Fは、ヒト肝臓オルガノイドの作製を示す。図6D（上部）は、ヒト多能性幹細胞 (hPSC) を肝細胞へ分化させるためのプロトコールを説明する概略図を提供する。図6D（左下）は、6つの独立した調製物の分化中の、肝細胞特異的遺伝子AFP、ALB、およびCyp3a7の相対的発現を示すプロットを提供する。図6Dの右下は、hiPSC由来肝細胞を示す顕微鏡写真である。図6Eは、hiPSC由来肝細胞を示す一連の顕微鏡写真である。上部パネルは、機能的成熟を示す、hiPSC由来肝細胞におけるCyp7a1（Cyp7a1-GFPレポーター、左側）およびSREBP1c（SREBP1c-GFPレポーター、右側）の発現を示す。下部パネルは、ホスファチジン酸 (PA) と共に（右側）またはそれを伴わずに（左側）一晩培養されたhiPSC由来肝細胞を示す。左下に示される高倍率の画像は、ホスファチジン酸で処理された肝細胞における脂肪滴の蓄積を明らかにする。図6Fは、ジェランガム3D培養系においてhiPSC由来肝細胞をhADSCおよびHUVECと共に培養することによって作製されたヒトミニ肝臓様オルガノイドを示す。図6G（上部）は、ジェランガム3D培養系においてhADSCおよびHUVECと共培養した場合の、ヒト多能性幹細胞 (hPSC) を腸オルガノイドへ分化させるためのプロトコールを説明する概略図を提供する。下部の画像は、陰窩様構造と一致し、かつ機能的オルガノイドを示す、ヒト腸オルガノイド培養物の出芽を示す。図6H（上部）は、ジェランガム3D培養系においてhADSCおよびHUVECと共培養した場合の、ヒト多能性幹細胞 (hPSC) をミニ膵臓へ分化させるためのプロトコールを説明する概略図を提供する。中央パネルは、膵臓オルガノイドの、インスリンプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質の発現によって示されるインスリン陽性β細胞の画像、および対応する光学顕微鏡画像を示す。外分泌細胞は、非標識のまま残存している細胞である。下部パネルは、96ウェルプレート内の単一膵臓オルガノイドの画像を示す。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｆ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｇ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｈ】図6Aの説明を参照のこと。
【図７】ディッシュ中でのヒト2型糖尿病のモデル化を示す概略図である。肝臓、膵臓、および島などの機能的なヒト臓器の作製は、薬物スクリーニングおよびヒト2型糖尿病のモデル化における新たな戦略を提供する。例えば、脂質が蓄積した肝臓オルガノイドを用いて、初期のインスリン抵抗性表現型を研究することができ、ヒト島様オルガノイドを用いて、後期2型糖尿病において見られるβ細胞死を研究することができる。挿入されたグラフは、漸増濃度のヒトアミロイドポリペプチド (hIAPP) に対する島様オルガノイドの応答を示す。G0/G1期の細胞におけるヨウ化プロピジウム (PI) 染色の増加は、hIAPPが島様オルガノイドにおいてアポトーシスを誘導することを示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、ヒト2型糖尿病および膵癌に関する潜在的候補を薬物スクリーニングし、その後評価するためのプラットフォームを示す概略図である。図8Aは、ヒト2型糖尿病またはヒト膵癌腫瘍形成において使用するための潜在的薬物を、ディッシュ中でスクリーニングするための図式を示す。疾患徴候を逆転させるかまたは軽減する化合物について薬物ライブラリーをスクリーニングする前に、オルガノイド培養物を適切なストレス（例えば、高レベルの遊離脂肪酸 (FFA)、高グルコースレベル、または関連サイトカイン）に曝露して、疾患様表現型を誘導する。図8Bは、2型糖尿病および膵癌腫瘍形成／転移のための潜在的薬物候補をマウスで評価するためのアプローチを示す。疾患を変化させる潜在的薬物候補で処置する前に、個々のヒト臓器（例えば、膵臓）またはヒト臓器の組み合わせ（例えば、膵臓および肝臓）を移植されたマウスを、適切な疾患誘発ストレス要因（例えば、高脂肪／高コレステロール (HF/HC) 食）に曝露する。
【図９】膵臓の構造および膵臓組織を示す概略図および画像、ならびに本明細書において作製された膵島様オルガノイドおよび膵臓オルガノイドの画像のセットである。図9の左側の概略図は、膵臓（上部）および膵島（下部）の解剖学的形態および構造を表す。図9の右上隅の画像は、表示されるように膵島（インスリンプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質によって示される）および外分泌／導管成分を伴うiPSC由来膵臓オルガノイドを示す。図9の右中央の画像は、上の蛍光画像に対応する光学顕微鏡画像を示す。図9の右下隅の画像は、単一の膵島オルガノイドを示す。
【図１０Ａ】図10A〜10Dは、PSCからの島様オルガノイドの作製を要約する、一連の概略図、画像、ヒートマップ、および棒グラフである。図10Aは、ジェランガム中で3Dで培養することによって島様オルガノイドを作製するためのプロトコールを記述する概略図である。図10Bは、本明細書において記載されるような3Dジェランガム培養におけるhPSCの増殖およびその膵臓系列への分化を記録する、一連の画像である。インスリン発現は、21日目に見られる緑色蛍光によって示される。図10Cは、hiPSCが島様オルガノイドへ分化する間の遺伝子発現の変化のヒートマップ表示である。図10Dは、本明細書における方法に記載されるような分化中の、hiPSCならびに2つの幹細胞株（HuES8およびH1ES）における、多能性マーカーNanog、内分泌ホルモンであるインスリン、ソマトスタチン、およびグルカゴン、ならびにβ細胞系列マーカーNkx6-1の相対的発現の変化を報告する、一連の棒グラフである。遺伝子発現はqPCRによって測定された。
【図１０Ｂ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１０Ｃ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１０Ｄ】図10Aの説明を参照のこと。
【図１１】図11Aおよび図11Bは、3D培養のhADSCにおけるWNTタンパク質の役割を説明するヒートマップおよびグラフを示す。図11Aは、3D培養において起こる自発的な自己組織化中のhADSCにおける遺伝子発現変化のヒートマップ表示である。WNT5a経路において誘導される遺伝子が、リストに記載されている。図11Bは、時間経過に伴った、hADSC 3D培養物におけるいくつかの個々のWNTタンパク質の相対的レベルを示すグラフであり、これにより、WNT5aタンパク質が、発現される主要なタンパク質であると同定される。
【図１２−１】図12A〜図12Hは、iPSC由来島オルガノイドの代謝成熟におけるWNTタンパク質の役割を説明する、一連の棒グラフおよび画像である。図12Aは、PBS、WNT3a (500 ng/ml)、WNT4 (100 ng/ml)、またはWNT5a (400ng/ml) で5日間処理した後のiPSC由来島オルガノイド（21日目、hADSCおよびHUVECの非存在下で作製されたもの）におけるFltpおよびEsrrg遺伝子の発現を比較する棒グラフである。図12Bは、支持するhADSCおよびHUVECの非存在下で作製されたhiPSC由来島オルガノイドにおける、漸増用量のWNT4（0、10、25、50、100、200 ng/ml）およびWNT5a（0、25、50、100、200、400 ng/ml）に応答したEsrrg遺伝子発現の誘導を示す棒グラフである。図12Cは、支持するhADSCおよびHUVECの非存在下で作製されたhiPSC由来島オルガノイドにおける、漸増用量のWNT4（0、10、25、50、100、200ng/ml）およびWNT5a（0、25、50、100、200、400ng/ml）に応答した、酸化的リン酸化に関与するミトコンドリア遺伝子（Cox7a2、Ndufal、Ndufa7）、乳酸脱水素酵素 (Ldha)、ならびにFltp（Wnt／平面内細胞極性 (PCP) のエフェクターおよびレポーター遺伝子）の誘導を示す棒グラフである。図12Dは、PBSまたはWNT4 (100 ng/ml) で8日間処理した後のhiPSC由来島オルガノイド（27日目）における、ミトコンドリア（Mitotracker；Mito-Red）およびインスリン（インスリン-GFP）のレベルを示す蛍光画像を示す。図12Eは、PBSまたはWNT4 (100 ng/ml) で8日間処理した後のhiPSC由来島オルガノイド（27日目）のFACS解析の蛍光画像を示す。図12F、12G、および12Hは、PBS、WNT4 (100 ng/ml)、WNT5a (400 ng/ml)、対照線維芽細胞馴化培地 (50%)、またはWNT5aを分泌する線維芽細胞の馴化培地 (50%) で8日間処理した後のhiPSC由来島オルガノイド（27日目）のFACS解析の結果を説明する、一連の棒グラフを示す。使用したWNTタンパク質は、組換えヒト (rh) タンパク質であった。
【図１２−２】図12-1の説明を参照のこと。
【図１２−３】図12-1の説明を参照のこと。
【図１３】hiPSC由来島オルガノイドの機能的成熟におけるWNT4の役割を実証する棒グラフを示す。ヒトiPSC (hiPSC) 由来島オルガノイド（22日目）をPBS（媒体、「Veh」）またはWNT4 (100 ng/ml) で12日間処理し、ヒトc-ペプチドの分泌を、低グルコースレベル（3mM、「G3mM」）、高グルコースレベル（20mM、「G20mM」）、または高KClレベル（20 mM、「KCL20mM」）に応じて測定した。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
発明の詳細な説明
本発明は、拡張可能な、機能的な、血管新生したオルガノイド、特にヒト膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドをインビトロで作製するのに有用である組成物および方法を特徴とする。本発明は、少なくとも部分的に、ジェランガムを含有する3次元マトリックス中で、iPSC由来β様細胞をヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) およびヒト臍帯静脈内皮細胞 (Huvec) と共に培養すると、機能的な膵臓オルガノイドおよび膵島オルガノイドが作製されたという発見に基づく。
【０１４４】
作製されたオルガノイドは、血管新生し、かつグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) などの機能的特性を示した。島移植は、1型糖尿病および後期2型糖尿病などのインスリン欠乏性糖尿病を治癒するための最良の治療法として公知である。最近の研究により、ヒト多能性幹細胞 (PSC) からグルコース応答性のインスリン産生β様細胞を作製する可能性が示されたが、栄養素に応答してインスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンを分泌し得る、機能的な、血管新生した膵島をPSCから作製することは、これまで達成されていない。
【０１４５】
本明細書において記載される研究により、ヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)、HUVEC、およびヒトiPSC由来β様細胞の自己組織化機能を用いることで、機能的な脈管構造を形成する能力を伴った、グルコース応答性のインスリン分泌島様オルガノイドのインビトロ作製が可能になることが実証される。本明細書における研究から、ジェランガムに基づく3D培養系を使用することによる、島様オルガノイド生成の拡張の成功がさらに実証される。インスリン分泌を測定するためにガウシアルシフェラーゼレポーターを使用して、hiPSC由来島様オルガノイドにおける機能的な不均一性が特徴づけられた。理論によって縛られることは意図しないが、本明細書における結果から、新規なヒト島様オルガノイドが、糖尿病の治療的処置を提供する可能性があり、かつ薬物スクリーニング、ゲノム編集、ならびに器官形成および糖尿病の病態形成のモデル化のためのプラットフォームを提供する可能性があることが示唆される。
【０１４６】
膵臓
いくつかの局面において、本発明は膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドを提供する。膵臓は、腹部に位置し、内分泌および外分泌機能を有する臓器である。図9は、膵臓の構造を示す概略図を提供する。内分泌の役割を有する膵臓の部分は、「膵島」（ランゲルハンス島としても公知である）と称される細胞塊である。膵臓の内分泌物は、グルコース代謝および血糖濃度を調節するホルモンを含む。島内には4つの主要な細胞型が存在する：グルカゴン（血糖濃度を上昇させるホルモン）を分泌するα細胞；インスリン（血糖濃度を低下させるホルモン）を分泌するβ細胞；ソマトスタチン（α細胞およびβ細胞を調節するホルモン）を分泌するδ細胞；ならびに膵ポリペプチドを分泌するγ細胞。
【０１４７】
外分泌の役割を有する膵臓の部分は、外分泌成分と称される。膵外分泌物は、小腸に到達し、炭水化物、タンパク質、および脂質の分解を助ける消化酵素を含有する。外分泌成分は、膵腺房と称されるクラスター内に配置された導管を有する。膵臓外分泌物は腺房の管腔内に分泌され、これは蓄積して、膵管および十二指腸に流出する。
【０１４８】
本発明の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイドは、それぞれ膵島および膵臓の構造を模倣する。いくつかの態様において、本発明の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイドは、以下の細胞のうちのいずれか1つまたは複数を含有する：iPSC由来β様細胞、iPSC由来α様細胞、iPSC由来δ様細胞、およびiPSC由来導管様細胞。いくつかの態様において、本発明の膵臓オルガノイドはiPSC由来外分泌成分を含有する。いくつかの態様において、iPSCはヒトiPSC (hiPSC) である。ヒト胚性幹細胞およびヒト人工多能性幹細胞は、（例えば、iPS(IMR-90)-1、iPS(IMR-90)-4、およびiPS(包皮)-1を提供するWiCellから）市販されている。ヒト人工多能性幹細胞は、種々の体細胞型から、当技術分野で公知の方法を用いて作製することもできる (Yu, J., K. Hu, et al. (2009). 「Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.」 Science 324(5928): 797-801)。
【０１４９】
本発明の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイドはまた、膵島および膵臓の機能を示す。ある特定の態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは、以下の機能のうちのいずれか1つまたは複数を示す：グルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌。いくつかの態様において、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドは、転写因子Pdx1、MafA、Pax4、Pax6、NeuroD1、Nkx6-1、Gata6、およびFoxa2のうちのいずれか1つまたは複数を発現する。
【０１５０】
膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドの作製
いくつかの他の局面において、本発明は、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドを作製する方法を特徴とする。最近の研究により、グルコース応答性のインスリン産生β様細胞を作製することが可能であることが示されたが、栄養素に応答してインスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンを分泌し得る膵島を作製する試み、ならびに幹細胞から血管新生化を得る試みは、成功していない。ヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)、およびヒトiPSC由来β様細胞の自己組織化機能を用いることで、機能的な血管新生化が可能な、グルコース応答性のインスリン分泌島様オルガノイドをインビトロで作製することに成功したことを実証する結果が、本明細書において記載される。さらに、ジェランガムに基づく3D培養系を用いて、島様オルガノイドの作製法をスケールアップすることに成功した。インスリン分泌を測定するためにガウシアルシフェラーゼレポーターを使用して、hiPSC由来ヒト島様オルガノイドにおける機能的な不均一性についても調べた。
【０１５１】
機能的なヒト臓器の作製は、薬物スクリーニング、疾患モデル化、およびエンドポイント臓器不全の阻止または予防における新たな治療戦略を提供する。ヒト胚性幹細胞 (hESC) およびヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) からインスリン産生β様細胞への効率的な段階的分化方法が、以前に実証された。D'Amour et alおよびKroon E et alは、4〜5カ月のインビボ成熟後に、グルコースに応答してインスリンを分泌し得るインスリン産生細胞へのhESCの効率的な分化を報告した（D'Amour et al., 2006, Nature biotechnology 24, 1392-1401；Kroon et al., 2008, Nature biotechnology 26, 443-452）。最近、Rezania et al.およびPagliuca et al.は、成熟ヒトβ様細胞の形成をインビトロで誘導する分化方法を報告した、というのは、それらが、最終β細胞マーカーであるMAFAおよびNkx6-1を発現し、かつ部分的な機能性（例えば、インスリン分泌）を示したからである（Rezania et al., 2014, Nature Biotechnology Nov; 32(11):1121-33；Pagliuca et al., 2014, Cell 159, 428-439）。しかしながら、死体のヒト島とは対照的に、それらのβ様細胞は数カ月間にわたるインビボでの機能的成熟を必要とし、かつα細胞（グルカゴン分泌）およびδ細胞（ソマトスタチン分泌）による血糖コントロールなどの、他の膵島細胞型によって提供される機能性を欠いていた。さらに、β様細胞は、ヒト島が天然で有する、間充織および血管新生した内皮細胞の両方を欠いていた。hPSC由来β様細胞とヒト島との間のこれらの決定的な違いは、hPSCに基づく治療法がインスリン依存性糖尿病（1型糖尿病または後期2型糖尿病など）を処置する能力を損ない得る。
【０１５２】
以前に、β細胞の新生児から成体への成熟中に代謝移行が起こり、そこでは、オーファン核内受容体であるエストロゲン関連受容体γ (ERRγ) が、完全に機能的なβ細胞に必要とされる酸化的代謝の増加を調節することが明らかにされた。この結果と一致して、インスリン、MAFA、およびNkx6-1を発現するヒトiPSC由来β様細胞は、ERRγの過剰発現により代謝的に成熟して、その酸化的代謝を増加させ、それによってそのグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) 機能性を増強させ得る。これらの結果から、完全に機能的なβ細胞を作製するためには、PDX1、MAFA、Nkx6-1、およびインスリンなどの系列決定因子の発現に加えて、β細胞の代謝を成熟させるさらなる細胞シグナル伝達が必要とされることが示される。
【０１５３】
初期の膵臓器官形成中に、新たに指定された膵臓細胞が前腸内胚葉シートから生じ、凝縮した組織塊である膵芽を形成し、これは間もなく血管新生する。肝臓の器官形成においても、同様の進行が観察されている。そのような大規模な形態形成変化は、血液灌流前の、内胚葉上皮前駆細胞、間葉系前駆細胞、および内皮前駆細胞の間のシグナルの精巧な組織化 (orchestration) に依存する。Takebe et alは、肝臓内胚葉細胞を内皮系列および間葉系列と共に培養することにより、インビボで迅速に血管新生し、機能的に成熟する肝臓器官原基の作製に成功した (Takebe et al., 2013, Nature 499, 481-484)。
【０１５４】
以前の研究は、成熟した、機能的な、かつ血管新生した、膵臓オルガノイドなどの他のオルガノイド組織型をインビトロで作製する可能性を明らかにしていなかった。さらに、以前の研究は、スケールアップ生成に使用するのに効率的ではないMATRIGEL（登録商標）マトリックスを用いてオルガノイドが作製されたという理由で、拡張可能性の欠如を示した。
【０１５５】
ヒト島において見られるようにインスリンを分泌することができかつ血管新生したヒト島様オルガノイドの大規模作製の成功を実証する研究が、本明細書において記載される。(1) ヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) が自己組織化能を有すること；(2) 後期膵臓前駆細胞が、HUVECおよびhADSCと共培養された場合に、β様細胞に匹敵する効率で島様クラスターを形成し得ること；(3) ヒト島様オルガノイドが、系列決定因子、およびERRγを含む代謝調節因子の改善された発現を有したこと；(4) ガウシアルシフェラーゼプロインスリン系を使用して測定した島インスリン分泌アッセイにより、ヒト島様オルガノイドが、グルコースに応答してインスリンを分泌し得る機能的な細胞を含有することが明らかになったこと；(5) ヒト島様オルガノイドが血管新生化を示したこと；(6) 本明細書に記載される方法によるhiPSC由来のヒト島様オルガノイドが、ディッシュ中で、ヒト島の器官形成ならびに1型および2型糖尿病の病態形成を再現したこと；(7) 本明細書に記載される方法によるhiPSC由来のヒト島様オルガノイドが、1型および2型糖尿病を処置するための、ヒト島移植に取って代わることができる新たな供給源を提供したこと；ならびに (8) 1型糖尿病のSTZ誘発性NODSCIDマウスモデルに移植されたヒト島様オルガノイドが、レシピエント動物において1型糖尿病を改善したことが、本明細書において実証される。（図4Hおよび4I）。
【０１５６】
ヒト島において見られるようにインスリンを分泌することができかつ血管新生する、発生中のヒト島様オルガノイドにおいて、ある特定のWnt（本明細書においては同様に「WNT」）タンパク質の役割を評価した研究もまた、本明細書において記載される。WNT遺伝子ファミリーは、発癌、ならびに細胞運命の調節および胚発生中のパターン形成を含むいくつかの発生過程に関連づけられている分泌型シグナル伝達タンパク質をコードする、構造的に関連した遺伝子からなる。Wntタンパク質は、種々の細胞生物学的過程および発生過程を組織化し (orchestrate)、それらに影響を及ぼすシグナル伝達分子の主要なファミリーを構成する。Wntタンパク質は、いくつかの高度に特殊化したプロセシング酵素が関与する複雑な一連の翻訳後修飾を受ける。細胞から放出されると、Wntタンパク質は細胞外環境において、グリカン、タンパク質結合パートナー（例えば、WIF、Sfrp）、および細胞表面受容体などのいくつかの分子と相互作用する。(Willert, K. et al., 2012, Cold Spring Harbor, Perspectives in Biology, 2012)。(1) Wnt5aが、hADSCの自己組織化を誘導する主要なWntタンパク質であること（図11Aおよび11B）；(2) Wnt5aおよびWnt4がERRγミトコンドリア代謝経路を活性化すること（図12A〜12H）；(3) Wnt4が、hADSCおよびHUVECなどの付加的な細胞型の非存在下で、hiPSC由来島様オルガノイドのインビトロでの機能的成熟を誘導するのに十分であること（図13）が、本明細書において実証される。
【０１５７】
処置の方法
島移植は、1型糖尿病および後期2型糖尿病などのインスリン欠乏性糖尿病を処置するための治療法である。したがって、別の局面において、本発明は、1型または2型糖尿病などの膵臓疾患を処置する方法であって、本発明の膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドを移植によって対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与する段階を含む、方法を提供する。1つの態様は、膵臓の疾患（例えば、1型糖尿病）もしくは障害またはその症状を患っているか、またはそれにかかりやすい対象を処置する方法である。本方法は、疾患もしくは障害またはその症状を処置するのに十分である本発明の膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドを、疾患もしくは障害が処置されるような条件下で哺乳動物に移植する段階を含む。
【０１５８】
本明細書で用いられる場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、障害および／またはそれに伴う症状を軽減することまたは改善することを指す。除外されてはいないが、障害または状態を処置することは、障害、状態、またはそれに伴う症状が完全に取り除かれることを必要としないことが認識される。
【０１５９】
本明細書で用いられる場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、障害または状態を有していないが、それを発症するリスクがあるかまたは発症しやすい対象において、障害または状態を発症する可能性を低下させることを指す。
【０１６０】
本発明の治療方法（予防的処置を含む）は一般に、有効量の膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドを、それを必要とする対象（例えば、動物、ヒト）、例えば哺乳動物、特にヒトに投与（特に、移植）することを含む。膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドの投与は、他の成分と併用して、1型または2型糖尿病などの膵臓疾患を改善する、軽減する、または安定化するのに有効であるオルガノイドの量をもたらす、任意の適切な手段によるものであってよい。
【０１６１】
いくつかの局面において、対象には免疫抑制薬がさらに投与される。免疫抑制薬は、対象にオルガノイドを投与（例えば、移植）する前、間、または後に、対象に投与することができる。免疫抑制剤は、移植時の移植オルガノイドの拒絶反応（例えば、急性拒絶反応）を抑制もしくは予防する作用物質、または移植後の免疫抑制を維持する作用物質であってよい。免疫抑制薬には、バシリジマブ、抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブ、プレドニゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリン、シロリムス、およびタクロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
いくつかの態様においては、少なくとも約100,000個、少なくとも約200,000個、少なくとも約300,000個、少なくとも約400,000個、少なくとも約500,000個、少なくとも約600,000個、少なくとも約700,000個、少なくとも約800,000個、少なくとも約900,000個、または少なくとも約100万個の膵島オルガノイドが対象に移植される。いくつかの態様においては、本発明のオルガノイドを移植する前に、対象の島が除去される。いくつかの他の態様において、膵島オルガノイドは、対象の上腹部に注入することによって、対象に移植される。いくつかの態様において、膵島オルガノイドは肝臓内に注入される。膵島オルガノイドは、カテーテルを用いて対象に注入され得る。いくつかの他の態様において、膵臓オルガノイドまたは膵島オルガノイドは、手術によって対象に投与される。別の態様において、膵島オルガノイドは網上に移植される。大網移植には、島オルガノイド（またはその細胞）を自己血漿と混合し、網上に腹腔鏡下で重層する、重層技法を使用することができる。次いで、組換えトロンビン (1000 U/ml) を含有する溶液 (20 ml) を島オルガノイド上に重層し、続いて自己血漿の別の層を重層して、少なくとも1年間にわたり患者において残存し機能し得る生分解性生物学的足場を生成する（例えば、Baidal, D. et al., 2017, N. Engl. J. Med., 376:19を参照されたい）。別の態様においては、レシピエントによる免疫応答を緩和するヒドロゲル生体材料を、島オルガノイド移植に使用することができる（例えば、Vegas, A. et al., 2016, Nature Biotechnology, 34:345-352を参照されたい）。
【０１６３】
対象における移植オルガノイドに対する免疫応答をさらに軽減するために、オルガノイドをヒドロゲル中に封入してから、対象に移植することができる。そのような移植の方法は、Vegas et al., Nature Medicine 2016, doi:10.1038/nm.4030；Vegas et al., Nature Biotechnology 2016, doi:10.1038/nbt.3462にさらに記載されている。いくつかの態様において、ヒドロゲルは、アルギン酸またはアルギン酸誘導体（例えば、トリアゾール-チオモルホリン二酸化物）を含有する。アルギン酸ヒドロゲルの炎症または線維化効果を実質的に軽減する、アルギン酸ヒドロゲルの様々な修飾もまた同定されている (Vegas et al., Nature Biotechnology 2016, doi:10.1038/nbt.3462)。したがって、いくつかの他の態様において、ヒドロゲルは、対象における移植オルガノイドの炎症効果を軽減する化学修飾を含有する。
【０１６４】
スクリーニングアッセイ
本発明の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイドは、インビトロまたはインビボにおいて膵臓の疾患をモデル化するのに有用であり得る。そのような膵臓疾患モデルを使用して、膵臓疾患の処置に有用である薬物を同定することができる。したがって、いくつかの局面において、本発明は、膵臓疾患、特に2型糖尿病および／または膵癌の処置に有用な調節因子、すなわち候補もしくは被験化合物または候補もしくは被験作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、ペプトイド、ポリヌクレオチド、小分子、または他の薬物）を同定するための方法を提供する。1つの態様において、作用物質は本発明のオルガノイドの活性を調節する。
【０１６５】
本発明の被験作用物質は、単独で得ることができ、または生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能性を有するが、酵素消化に抵抗性であり、それにもかかわらず生理活性を保持している新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー；例えば、Zuckermann, R.N. (1994) et al., J. Med. Chem. 37:2678-85を参照されたい）；空間的にアドレス可能な並列固相もしくは液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのうちのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子化合物ライブラリーに適用可能である (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【０１６６】
分子ライブラリーを合成する方法の例は、当技術分野において、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909；Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422；Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678；Cho et al. (1993) Science 261:1303；Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell et al (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233中に見出すことができる。
【０１６７】
化合物のライブラリーは溶液中に提示してもよく（例えば、Houghten (1992), Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ (Lam (1991), Nature 354:82-84)、チップ (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌（Ladner、米国特許第5,223,409号）、胞子（(Ladner 米国特許第5,223,409号）、プラスミド (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)、もしくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390；Devlin (1990) Science 249:404-406；Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382；Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310；Ladner 前記）上に提示してもよい。
【０１６８】
被験作用物質（すなわち、潜在的な阻害剤、アンタゴニスト、アゴニスト）として使用されるべき化合物は、商業的供給源から得ることができ、または当業者に公知の標準的な合成技法および方法論を用いて、容易に入手可能な出発物質から合成することもできる。本明細書に記載の方法によって同定される化合物を合成する上で有用な合成化学変換ならびに保護基方法論（保護および脱保護）は、当技術分野で公知であり、これには、例えば、R. Larock (1989) Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers；T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons (1991)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、ならびにそれらの続版に記載されるようなものが含まれる。
【０１６９】
本発明によって想定される化合物中の置換基と変数の組み合わせは、安定な化合物の形成をもたらすもののみである。本明細書で用いられる「安定な」という用語は、製造を可能にするのに十分な安定性を有し、かつ本明細書において詳述される目的（例えば、輸送、貯蔵、アッセイ、対象への治療的投与）に有用であるよう十分な期間にわたって化合物の完全性を維持する化合物を指す。
【０１７０】
本明細書に記載される化合物は、1つまたは複数の不斉中心を含有してもよく、したがってラセミ体およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在し得る。これらの化合物のそのような異性体はすべて、明らかに本発明に含まれる。本明細書に記載される化合物は複数の互変異性体で表すこともでき、それらのすべてが本明細書に含まれる。化合物はまた、シス-もしくはトランス-、またはE-もしくはZ-二重結合異性体として存在し得る。そのような化合物のそのような異性体はすべて、明らかに本発明に含まれる。
【０１７１】
本発明の被験作用物質はまた、ペプチド（例えば、増殖因子、サイトカイン、受容体リガンド）、またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【０１７２】
本発明のスクリーニング法によって、本発明の膵島オルガノイドおよび膵臓オルガノイドの生物活性を増加または減少させる作用物質が同定される。いくつかの態様においては、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドにおいて、2型糖尿病または膵癌などの膵臓疾患が誘発または模倣される。膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドにおける2型糖尿病は、例えば、オルガノイドを遊離脂肪酸 (FFA)、グルコース、およびサイトカイン（特に、高レベルのグルコースおよび／または高レベルのFFA）と接触させることによって誘発することができる。1つの態様においては、膵臓オルガノイドを膵癌細胞、星状細胞、および免疫細胞と共培養して、インビトロでヒト膵癌微小環境を創出する。
【０１７３】
いくつかの態様においては、オルガノイドを候補作用物質と接触させ、候補作用物質が生物活性、機能、または事象に及ぼす影響をアッセイする。いくつかの態様において、候補作用物質は、米食品医薬品局 (FDA) によって認可された薬物である。例えば、本発明のスクリーニング法においてアッセイされる膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドの生物活性には、インスリン分泌（例えば、グルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)）、β細胞アポトーシス、LDHA活性、K(ATP)チャネル活性、ミトコンドリア機能、NDUFA4、ESRRG、KCNK3、またはMAFAポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルまたは活性、細胞死、細胞増殖、および転移が含まれる。いくつかの態様において、作用物質はGSISを増加させる。
【０１７４】
いくつかの他の態様においては、本発明のオルガノイド（例えば、膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイド）を宿主に移植して、インビボで2型糖尿病または膵癌などの膵臓疾患をモデル化する。臓器またはオルガノイドを移植する方法は、当技術分野で公知である。宿主は、ラットまたはマウスなどの任意の非ヒト哺乳動物であってよい。
【０１７５】
その後の宿主における移植オルガノイドに対する免疫応答を軽減するために、オルガノイドをヒドロゲル中に封入してから、宿主に移植することができる。そのような移植の方法は、Vegas et al., Nature Medicine 2016, doi:10.1038/nm.4030；Vegas et al., Nature Biotechnology 2016, doi:10.1038/nbt.3462にさらに記載されている。いくつかの態様において、ヒドロゲルは、アルギン酸またはアルギン酸誘導体（例えば、トリアゾール-チオモルホリン二酸化物）を含有する。アルギン酸ヒドロゲルの炎症または線維化効果を実質的に軽減する、アルギン酸ヒドロゲルの様々な修飾もまた同定されている (Vegas et al., Nature Biotechnology 2016, doi:10.1038/nbt.3462)。したがって、いくつかの他の態様において、ヒドロゲルは、宿主における移植オルガノイドの炎症効果を軽減する化学修飾を含有する。
【０１７６】
いくつかの態様においては、膵臓オルガノイドおよび肝臓オルガノイドが宿主において同時移植される。肝臓は、膵癌の転移の主要な標的臓器である。マウスではインビボで、ミニ膵臓内およびミニ肝臓内の内皮細胞が互いに関係しあい、膵癌転移のための膵-肝脈管構造ネットワークを創出する。したがって、膵臓オルガノイドおよび肝臓オルガノイドが同時移植された宿主は、ヒト肝臓へのヒト膵癌転移の研究に有用であり得る。
【０１７７】
いくつかの態様においては、本発明のオルガノイドが移植された宿主に環境ストレスを与えて（例えば、高脂肪／高グルコース食を与えるか、または膵癌細胞を投与する）、宿主において膵臓疾患を誘発または模倣する。いくつかの他の態様においては、疾患（例えば、2型糖尿病または膵癌）が誘発された膵島オルガノイドもしくは膵臓オルガノイドおよび／または肝臓オルガノイドを、宿主に移植する。
【０１７８】
いくつかの態様においては、宿主に候補作用物質を投与する。ある特定の態様において、候補作用物質は、米食品医薬品局 (FDA) によって認可された薬物である。いくつかの態様においては、候補作用物質が宿主表現型（膵臓に関連した生物活性もしくは機能、または疾患に関連した活性など）に及ぼす影響をアッセイする。例示的な生物活性には、インスリン分泌（例えば、グルコース刺激インスリン分泌 (GSIS)）、β細胞アポトーシス、LDHA活性、K(ATP)チャネル活性、ミトコンドリア機能、NDUFA4、ESRRG、またはMAFAポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルまたは活性、細胞死、細胞増殖、および転移が含まれる。いくつかの態様において、作用物質はGSISを増加させる。
【０１７９】
本明細書における態様のいずれか1つにおいて、候補作用物質の影響（すなわち、膵臓の活性または機能を調節する能力）は、参照と比較して測定される。参照は、例えば、未処理の膵島オルガノイドまたは膵臓オルガノイドであってよい。いくつかの態様において、参照は、本発明のオルガノイドが移植され、候補作用物質が投与されていない宿主である。
【０１８０】
本発明の方法において有用な作用物質はまた、所望のマーカー（例えば、β細胞運命マーカーとしてのMAFA）の発現の増加を同定することによって検出することもできる。発現のレベルは、遺伝子マーカーによってコードされるmRNAの測定；遺伝子マーカーによってコードされるタンパク質の量の測定；または遺伝子マーカーによってコードされるタンパク質の活性の測定を含むがこれらに限定されない、いくつかの方法で測定することができる。
【０１８１】
マーカーに対応するmRNAのレベルは、インサイチュー形式によって、およびインビトロ形式によって決定することができる。単離されたmRNAは、サザン解析またはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析、およびプローブアレイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用することができる。ある形式では、例えば単離されたmRNAをアガロースゲル上で泳動し、mRNAをゲルからニトロセルロースなどの膜へ転写することにより、mRNA（またはcDNA）を表面上に固定化し、プローブと接触させる。別の形式では、例えば以下に記載される2次元遺伝子チップアレイにおいて、プローブを表面上に固定化し、mRNA（またはcDNA）をプローブと接触させる。当業者は、本明細書に記載されるマーカーによってコードされるmRNAのレベルの検出に使用するために、公知のmRNA検出法を適合させることができる。
【０１８２】
試料中のmRNAのレベルは、例えば、rtPCR（Mullis (1987) 米国特許第4,683,202号）、リガーゼ連鎖反応 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自己持続配列複製 (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-βレプリカーゼ (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製（Lizardi et al.、米国特許第5,854,033号）、または任意の他の核酸増幅法によって核酸を増幅し、続いて当技術分野で公知の技法を用いて増幅分子を検出することによって、評価することができる。本明細書で用いられる場合、増幅プライマーは、遺伝子の5'または3'領域にアニールすることができ（それぞれプラス鎖およびマイナス鎖、またはその逆）、その間に短い領域を含む、一対の核酸分子と定義される。一般に、増幅プライマーは約10〜30ヌクレオチド長であり、約50〜200ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下でかつ適切な試薬を用いて、そのようなプライマーは、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０１８３】
本発明の実践には、特に指示のない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法が利用され、それらは十分に当業者の認識範囲内である。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, second edition (Sambrook, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(Gait, 1984)；「Animal Cell Culture」(Freshney, 1987)；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir, 1996);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel, 1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullis, 1994)；「Current Protocols in Immunology」(Coligan, 1991) などの文献において十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用可能であり、したがって本発明の形成および実践において考慮され得る。特定の態様に特に有用な技法は、以下の項で論じられる。
【０１８４】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１８５】
実施例1：膵臓オルガノイドおよび膵島オルガノイドの作製および特徴づけ
動物疾患モデルは疾患の病態形成に対する洞察をもたらし得るが、動物モデルを用いる選別から同定された薬物は、ヒト患者に採用できない場合が多い。機能的なヒトオルガノイドの作製は、薬物スクリーニングおよび疾患モデル化における新たな治療戦略を提供する（図1）。3Dヒト「ミニ臓器」またはオルガノイドをディッシュ中で作製するための新規な技法が、本明細書において記載される。この技法を用いて、ヒト2型糖尿病などの疾患をディッシュ中でモデル化して、ヒト2型糖尿病などの遺伝子、患者、または環境特異的疾患において有効な薬物を見出すことができる。
【０１８６】
β様細胞を分化させるためのジェランガムに基づく3D培養系の開発
3次元 (3D) 培養系が細胞の自己組織化および組込みの促進に寄与することが公知である。したがって、コラーゲンおよびフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス成分を含有するMATRIGEL（登録商標）マトリックスが、3D培養系の基底として用いられる場合が多い。しかしながら、MATRIGEL（登録商標）マトリックスに基づく3D培養系は、コストがかかり、かつスケールアップが難しいために、大規模なヒトオルガノイドの作製には理想的ではない。費用効果が高くかつ容易に拡張可能な、ジェランガムに基づく3D培養系、およびβ様細胞を分化させるための方法が、本明細書において記載される。完全に化学的に定義された段階的分化プロトコールを用いて（図10A）、ヒト多能性細胞 (hPSC) は、ジェランガムに基づく3D培養系において高い効率および再現性でインスリン産生性の島様の球状細胞塊に分化する（図10B）。単一の解離した多能性幹細胞 (PSC) は、ジェランガムを含有するSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中で5日以内にスフィアを形成するのに成功した。既定の小分子刺激によるジェランガム含有カスタムTeSR（商標）内での分化の15〜21日後に、インスリン陽性GFPクラスターが観察された（図10B）。RNA-seqによる包括的トランスクリプトーム解析により、hiPSCの、Pdx1、Nkx6-1、GATA6、およびMAFBを含むβ細胞系列特異的マーカー遺伝子を発現するインスリン陽性細胞への段階的分化が明らかになった（図10C）。qPCRにより決定された、多能性マーカーNanogの漸進的消失、β細胞特異的マーカーNkx6-1の誘導、ならびに内分泌ホルモンであるインスリン、ソマトスタチン、およびグルカゴンの漸進的誘導により、hiPSCならびにヒトESC株HuES8およびH1ESの島様細胞クラスターへの分化がさらに確認された（図10D）。これらの結果から、ジェランガムに基づく3D培養系が、hPSCから大規模な島様オルガノイドを作製するのに適していることが実証される。
【０１８７】
拡張可能なヒト島様オルガノイドのインビトロでの作製
ヒト胚性幹細胞 (hESC) またはヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) に由来するβ様細胞は、機能性が制限されており、かつヒト島の形態学的および機能的特徴を欠いている。以前の研究により、hiPSC由来肝細胞をヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞 (hMSC) と共培養すると、マトリゲル内で、自己組織化した3D肝芽スフィアが生じることが明らかにされた (Takebe et al., 2013, Nature 499, 481-484)。この研究では、単離された肝細胞の分化と比較して、肝臓「オルガノイド」の系列決定因子の発現が優れていること、およびこれらのオルガノイドがインビボで迅速に血管新生し、機能的に成熟することが見出された。
【０１８８】
本明細書における研究から、2D分化プロトコール (Yoshihara et al, Cell Metab. 23, 622-634) を用いて作製されたhiPSC由来の膵臓前駆細胞 (hiPSC-PP) が、3D MATRIGEL（登録商標）マトリックス中で自己組織化しないことが見出された（図2A）。対照的に、3D MATRIGEL（登録商標）マトリックス中で、HUVEC細胞は迅速に脈管構造様の構造を形成し、ヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC) は自己組織化した（図2A）。MATRIGEL（登録商標）マトリックス中で、分散したhADSC細胞は、4時間以内に突起を突出させ、12時間以内に布様のラッパー (wrapper) を形成し、24〜48時間以内にスフィア様構造をとった（図2B）。さらに、自己組織化のための最小細胞密度が同定された（すなわち、約2 cm2ウェル内のMATRIGEL（登録商標）マトリックス300μl中に細胞約10,000〜20,000個）（図2C）。RNA-seq解析により、hADSC 3D自己組織化中の動的な転写変化が同定され、これにより、3D培養条件下で自己組織化する能力が、ナイーブhADSCの固有の特徴であることが示唆された（図2D）。これらの結果から、自己組織化するオルガノイドを作製するための供給源として、間葉系hADSCが同定される。
【０１８９】
膵臓の器官形成を調査するために、hiPSC-PP（細胞1x106個）細胞を、Matrigelマトリックス中でHUVEC（細胞7x105個）およびhADSC（細胞1〜2x105個）と共培養した（図2E）。この共培養物は、播種の48時間後に、肉眼で見える3D細胞塊を生じた（図2F）。さらに、GFPレポーターの発現に基づいたインスリン発現が播種の5日後に検出され、ヒト島様オルガノイドにおいて培養の時間と共に増加した。加えて、蛍光標識 (mCherry) HUVECによって示されるように、HUVECに基づく内皮細胞が、オルガノイドの内部に組み込まれる（図2G）。
【０１９０】
オルガノイド生成に関するMATRIGEL（登録商標）マトリックスの制限事項には、コストが高いこと、オルガノイドの回収の難しさ、拡張の制限、およびバッチ間のばらつきが含まれる。
【０１９１】
ジェランガムに基づく3D培養を用いて、形態学的に同一のヒト島様オルガノイドを作製する方法が、本明細書に記載される（図4A〜4G）。図4Aは、機能的な、血管新生したヒト膵島をディッシュ中で作製するための図式を示す。ジェランガムに基づく3D培養液50 ml中で、ヒト人工多能性幹細胞由来の膵臓前駆細胞 (hiPSC-PP)（細胞1x108個）を、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)（細胞2〜7x106個）およびヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)（2〜7x106個）などの間質細胞集団と共に培養した（図4B）。図4Bは、ジェランガムに基づく3D培養液中への播種後5日以内に、hiPSC-PPがHUVECおよびhADSCと共に、迅速に島様スフィア構造を形成したことを示す。ヒト島様ミニ臓器は、播種後5日の内にヒトインスリンGFPレポーターを発現し、GFP強度は徐々に増強された。本方法に従ってhiPSC-PP、hADSC、およびHUVECを共培養することで、ヒト島と形態学的に類似したヒト島様オルガノイドが高い再現性で作製された（図4C）。加えて、作製されたヒト島様オルガノイドは、β様細胞中にインスリン顆粒を含有していた（図4B）。遺伝子発現解析から、島様オルガノイドでは、hADSCおよびHUVECとの共培養なしで調製されたものと比較して、インスリン発現細胞集団（GFP濃縮 (GFP +)）において、β細胞運命決定遺伝子（インスリン、Nkx6-1、PCSK1、およびUCN3）ならびにミトコンドリア関連代謝遺伝子（Esrrg、Ndufa1、Ndufa 12、Cox7a2. Atp5b）の発現が増加していることが明らかになった（図4Dおよび4E）。グルコース刺激ヒトc-ペプチド分泌アッセイにより、本方法によって作製された島様オルガノイドが、高 (20 mM) グルコースに応答してヒトc-ペプチドを分泌し得ることが明らかになった（図4F）。
【０１９２】
次いで、インビトロ機能的血管新生化試験を実施した。図4Gは、実施したインビトロ機能的血管新生化試験を示す。ジェランガム中で作製された島様ミニ臓器をMATRIGEL（登録商標）マトリックスに移し、内皮増殖培地 (EGM) 中で培養した。緑色蛍光はインスリン遺伝子の発現を示す。EGMによる刺激の24時間〜48時間以内に、HUVEC細胞の伸長が観察され、これにより、本明細書に記載される方法によって作製されたヒト島様オルガノイドが血管構造を形成する能力を有することが示された。
【０１９３】
プロインスリン-NanoLucガウシアルシフェラーゼアッセイ系を用いる単一島インスリン分泌アッセイの確立
ガウシアルシフェラーゼがプロインスリンのc-ペプチド部分内に配置されたレポーター構築物が、β細胞機能に影響を及ぼすことなくインスリン分泌を正確に測定することが、以前に発表された (Burns et al., 2015, Cell metabolism 21, 126-137)。レンチウイルス系を用いて、このガウシアルシフェラーゼを安定に発現するINS-1細胞を作製した（図3A〜3F）。プロインスリン-NanoLucを安定に発現するINS-1細胞からのルシフェラーゼ分泌は、高グルコース (20mM)、高グルコースおよびエキセンディン-4 (G20mM+Ex4)、ならびに脱分極剤である塩化カリウムに伴って増加し（図3A〜3B）、このレポーター系の有用性が確認された。次に、プロインスリン-NanoLucレポーターを一過性に感染させたマウス島またはヒト島においてインスリン分泌を測定するためのこのレポーターの有益性を評価した。一過性に感染させたマウス島およびヒト島の両方において、20 mM 高グルコースに応答したルシフェラーゼ分泌が検出された（図3C〜3F）。重要なことには、インスリン分泌が単一島のレベルで認定され得るほどに、アッセイ感度は十分であった。これらの結果から、プロインスリン-NanoLucルシフェラーゼレポーターに基づくインスリン分泌アッセイが、ラットβ細胞株INS-1細胞のみならず、初代のマウスおよびヒト初代β細胞にも適用可能であることが示される。
【０１９４】
二重の系列レポーターおよび機能レポーターを組み入れているhiPSC細胞およびhESC細胞の確立
β細胞系列に関するレポーター（ヒトインスリンレポーター）およびβ細胞機能に関するレポーター（プロインスリン-NanoLucレポーター）を安定に発現するヒトiPSCおよびhESC、それぞれhiPSChINS-GFP/Sec-LucおよびhESChINS-GFP/Sec-Lucを作製した（図5A）。最初に、pGreenZeoレンチレポーター（SR10028PA-1、System Bioscience）のヒトインスリンプロモーター配列をpGreenFireレンチレポータープラスミド（TR019PA-1、System Bioscience）に挿入することにより、ヒトインスリンGFPレポーターのネオマイシン耐性構築物を作製した（hINS-GFP-EF1a-Neoと命名）。hINS-GFP-EF1a-Neoレンチウイルスをスピンフェクション（800g、1時間、37度）によってhiPSCおよびhESCに感染させた後、培地を新鮮なSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地に交換した。1度目の感染から3日後に、細胞をSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中の100μg/ml G418で7日間処理した。続いて、hINS-GFP-EF1a-Neoを安定に発現する、選択されたhiPSC細胞およびhESC細胞に、プロインスリン-NanoLuc（Addgene、プラスミド#62057）レンチウイルスをスピンフェクション（800g、1時間、37度）によって感染させ、その後、新鮮なSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地に培地交換した。2度目の感染から3日後に、細胞をSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中の5μg/ml ブラストサイジンおよび100μg/ml G418で7日間処理した。続いて、細胞をSTEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中で維持した（図5A）。二重レポーターを組み入れている、作製された安定な細胞株は、自己複製能および多能性能、ならびにインスリン産生β様細胞に分化する能力を維持した（図5B）。
【０１９５】
プールされたヒト島様オルガノイド培養物は、個々のオルガノイドにおいて見られたばらつきのある機能性にかかわらず、一貫したインスリン分泌を示す
最近の研究によって、グルコースに応答してインスリンを分泌し得る、hESCおよびhiPSCからのインスリン産生β様細胞の作製が報告された（Pagliuca et al. 2014, Cell 159, 428-439；Rezania et al., 2014, Nature Biotechnology Nov; 32(11):1121-33；Russ et al., 2015, EMBO Journal 34, 1759-1772）。しかしながら、グルコース、アミノ酸、脂肪酸、およびGLP-1などのインクレチンを含む栄養シグナルに応答して適切にインスリンを分泌し得る、完全に機能的なヒト島様クラスターは、これまでのところ実証されていない。今日まで、hPSCからインスリン産生β様細胞、グルカゴン産生α様細胞、およびソマトスタチン産生δ様細胞を個々に作製することに、努力の焦点が置かれてきた。しかしながら、これらのアプローチは、間葉系細胞、脂肪細胞、および脈管構造細胞などの、調節に重要な支持細胞を欠いている。島の3D構造がそれらの機能を天然で強化するため、これらの欠損している細胞成分は、島様細胞塊の機能性を損ない得る。加えて、膵島の器官形成はβ細胞のクローン性増殖を伴い、それにより、これらの細胞が島様オルガノイドにおいて複数の機能を有し得ることが示唆される。この考えを試験するため、単一オルガノイドプロインスリン分泌アッセイを実施した。本明細書に記載される方法によって作製されたヒト島様オルガノイドは、ヒト島と形態学的に同一である（図4C）。しかしながら、プロインスリンルシフェラーゼ分泌アッセイによって測定されるように、ヒト島と比較して、個々のヒト島様オルガノイドのグルコース刺激インスリン分泌 (GSIS) 能では顕著なばらつきが認められた（図5C）。プールされたオルガノイドでは、一貫したGSIS機能性が実証された（アッセイにつきオルガノイド10〜100個）（図5D）。さらに、プールされたヒト島様オルガノイドは、GLP-1で共刺激した場合のGSISの増強、および強力なKCl刺激インスリン分泌を示す（図5D）。
【０１９６】
本明細書において作製された、インビトロで培養されたiPSC由来ヒト膵島様オルガノイドは、長期間（133日間）の培養後に、グルコース、GLP1、およびKClに応答する能力を維持していた（図5D）。
【０１９７】
実施例2：ヒトオルガノイドの作製および特徴づけ
本明細書に記載される方法を用いて、ヒトの島、膵臓、肝臓、心臓、および腸を含む機能的なヒトミニ臓器を作製することができる（図6A）。図9は、ヒト膵臓およびその膵臓内のヒト膵島の構造を示す。本明細書に記載される方法を用いて、ヒト膵島ミニ臓器またはオルガノイドは、約30日で作製された。作製された膵島は、ヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) 由来のβ細胞、α細胞、δ細胞、導管細胞、ならびに内皮細胞およびhADSCを含有した。作製された膵島オルガノイドは、インスリン、Nkx6-1、PCSK1、およびUCN3などの重要なβ細胞転写因子、ならびにEsrrg、Ndufa 1、Ndufa 12、Cox7a2、およびAtp5bを含む重要なミトコンドリア代謝遺伝子を発現する（図4D〜4E）。膵島オルガノイドは、少なくとも部分的なGSIS、KCl刺激インスリン分泌、GLP-1刺激インスリン分泌、血管新生化、ソマトスタチン分泌、およびグルカゴン分泌を示した（図4G、5D）。
【０１９８】
ヒトミニ膵臓またはヒト膵臓オルガノイドは、約30日で作製された（図6H）。ヒト膵臓オルガノイドは、オルガノイドの内部にクラスター化されたhiPSC由来の島、および島を取り囲むhiPSC由来の外分泌成分を含有した（図6H）。膵臓オルガノイドはまた、内皮細胞およびhADSCを含有した。ヒト膵臓オルガノイドの機能は、いくつかある試験の中でも特にアミラーゼ分泌試験を用いて実証された。
【０１９９】
ヒトミニ肝臓は、約15日で作製された（図6D〜6F）。ヒトミニ肝臓は、hiPSC由来の肝細胞、内皮細胞、およびhADSCを含有した。ヒトミニ肝臓の機能的特徴の解析から、ミニ肝臓が、AFP、ALB、およびCyp3a7（図6D）、ならびに成熟肝細胞マーカーCyp7a1および脂質生成マーカーSREBP1cを発現することが明らかになった（図6E）。ヒトミニ肝臓はまた、インスリンシグナル伝達、パルミチン酸によるインスリン抵抗性、および脂質蓄積を示した。ヒトミニ肝臓は、糖新生、および薬物代謝に関する代謝機能についてさらに試験される。
【０２００】
ヒトミニ心臓は、約15日で作製された（図6B〜6C）。ヒトミニ膵臓は、hiPSC由来の心筋細胞、内皮細胞、およびhADSCを含有した。ヒトミニ膵臓は、hMlc2a、hNkx2-5、αMHC、およびKCNQ1などの重要な心筋細胞遺伝子を発現し（図6B）、培養において拍動するのが認められた。
【０２０１】
ヒトミニ腸は、約30日で作製された（図6G）ヒトミニ腸は、hiPSC由来の腸細胞、内皮細胞、およびhADSCを含有した。ヒトミニ腸は、小腸マーカーCDX2、Muc2、およびLgr5を発現し、R-スポンジンに応答して腸オルガノイドの出芽を示した。
【０２０２】
実施例3：機能的な膵島オルガノイドの移植は1型糖尿病マウスを救済した
hiPSC由来ヒト島様オルガノイドにおいて、MAFA、UCN3などの特異的機能島マーカー、ならびにERRγ (Esrrg)、Ndufa 1、 Ndufa 12、Cox7a2、およびAtp5bなどのミトコンドリア酸化遺伝子の発現が観察された。注目すべきことには、これらの島様オルガノイドは、ディッシュ中で、ヒト島の発生および糖尿病の病態形成の両方を再現する。これらの機能的島様オルガノイドの移植は、長期生存、迅速な血管新生化、および免疫拒絶反応の軽減を伴って、1型糖尿病マウスを救済する。
【０２０３】
実施例4：ヒト島様オルガノイドにおける薬物スクリーニングおよび疾患モデル化
本明細書に記載される方法による機能的なヒト臓器の作製は、薬物スクリーニングおよび疾患モデル化のための新たな戦略を提供する。具体的には、機能的なオルガノイドを、薬物スクリーニングのための2型糖尿病のモデルとして使用することができる（図7）。ヒト島様オルガノイドは、2型糖尿病患者、および高血糖患者での移植後の島機能不全におけるβ細胞消失の誘導因子であるアミロイドポリペプチド (hIAPP) 毒性に応答し、hIAPPは、ヒト島様オルガノイドにおいて24時間以内に用量依存的にG0/G1停止を誘導した（図7）。
【０２０４】
図8Aは、本明細書における方法によって作製された膵島オルガノイドおよび／または膵臓オルガノイドを用いて、2型糖尿病をモデル化し、薬物を潜在的にスクリーニングするための実験アプローチを示す概略図を提供する。例示的なアッセイでは、3Dミニ臓器を、高レベルの遊離脂肪酸 (FFA) ならびに／またはグルコースおよび選択されたサイトカインなどの、2型糖尿病を誘発するストレス要因に曝露する。次いで、ストレスを与えた3Dミニ臓器を様々な薬物で処理する。いくつかの態様において、薬物は米食品医薬品局 (FDA) によって認可されている。
【０２０５】
アウトプットとして、ヒト膵島オルガノイドにおいて以下のものがアッセイされる：インスリン分泌、β細胞アポトーシス (PI染色)、ルシフェラーゼレポーターを介した乳酸脱水素酵素A (LDHA) 発現、ならびにNDUFA4（ミトコンドリア酸化的リン酸化）、ESRRG（ミトコンドリア機能）、KCNK3（Katpチャネル活性）、およびMAFA（β細胞運命マーカー）を含むマーカー遺伝子の発現の変化。ヒト膵臓オルガノイドについては、アミラーゼ分泌および外分泌細胞のアポトーシス（PI染色）がアッセイされる。肝臓オルガノイドについては、オイルレッドOまたは組織学的検査を用いて、脂質蓄積がアッセイされる。心臓オルガノイドの場合には、心拍動および心臓サイズ（肥大）が測定される。腸オルガノイドは、オイルレッドOまたは組織学的検査を用いて脂質蓄積を測定することにより解析される。
【０２０６】
図8Aはまた、ディッシュ中でのヒト膵癌の腫瘍形成および転移のモデル化、ならびにそれらの疾患を標的化する薬物をスクリーニングする可能性を示す。例示的なアッセイでは、3Dミニヒト膵臓を膵癌細胞、星状細胞、および免疫細胞と共培養して、ディッシュ中でヒト膵癌微小環境を創出する。次いで、様々な薬物（例えば、FDA認可薬物）をスクリーニングして、ミニヒト膵臓微小環境において膵癌の増殖または転移を効果的に抑制する化合物を見出す。アウトプットとして、膵臓オルガノイドについて以下のものが測定される：外分泌細胞のアポトーシス（PI染色）、コラーゲン合成（トリクローム染色）、および星状細胞活性化（GFAP-レポーター）。これらのアッセイで同定された潜在的候補薬物は、膵癌の腫瘍形成および転移のマウスモデルで試験される。遺伝子発現および形態、ならびに細胞死、細胞増殖、および転移の程度が調べられる。
【０２０７】
図8Bは、マウスにおけるヒト2型糖尿病のモデル化を示す概略図を提供する。例示的なアッセイでは、ヒト島オルガノイドおよび／またはヒト肝臓オルガノイドをマウスに移植する。次いで、マウスに、高脂肪食 (HFD) またはサイトカイン注射などの、2型糖尿病を誘発する様々なストレス要因を与える。このアッセイで同定された潜在的候補薬物は、ヒト2型糖尿病マウスモデルにおいてさらに試験される。遺伝子発現および形態ならびに糖尿病の程度が調べられる。
【０２０８】
図8Bはまた、マウスにおけるヒト膵癌の腫瘍形成および転移のモデル化を示す。例示的なアッセイでは、ヒト膵臓オルガノイドおよび／またはヒト肝臓オルガノイドをマウスに移植する。ミニ膵臓を移植されたマウスを用いて、ヒト膵臓微小環境におけるヒト膵癌増殖を研究する。別の例示的なアッセイでは、ミニ膵臓およびミニ肝臓をマウスに同時移植する。肝臓は、膵癌の転移の主要な部位である。インビボでは、ミニ膵臓内およびミニ肝臓内の内皮細胞が、膵癌転移のための膵-肝脈管構造ネットワークを創出する。したがって、ミニ膵臓およびミニ肝臓が同時移植されたマウスを用いて、ヒト膵癌のヒト肝臓への転移を研究する。
【０２０９】
多能性幹細胞 (PSC) から機能的な臓器様クラスターを作製することの最終的な目的は、ヒト疾患の根底にある機構への洞察を得ることである。動物において疾患モデルを開発する観点においては大きな進歩を成し遂げたが、これらのモデルの多くはヒト状態を忠実に再現することができない。膵島の場合、齧歯類とヒトにおけるそれらの発生、細胞構築、および生理機能は著しく異なる。
【０２１０】
本明細書における結果は、以下の材料および方法を用いて得られた。
【０２１１】
3D Kelcogel（登録商標）(3DKG) 培養液
Modernist Pantryから入手したKelcogel（登録商標）F低アシルジェランガム (GG-LA) を、純水中に0.3% (w/v) で懸濁し、90℃で撹拌するかまたは電子レンジにより溶解する。水溶液を、オートクレーブ内で121℃にて20分間滅菌する。この溶液を、TeSR（商標）(Ludwid et al., Nature methods 3, 637-646) またはカスタムTeSR（商標）培地（800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560mg NaHCO3、330mg チアミン、100mg 還元型グルタチオン、3300 mg ビタミンC、14μg セレニウム、10ml NEAA、2ml 微量元素B、1ml 微量元素C、7μl β-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μg ピペコリン酸、インスリン 2mg、1000mlになるよう調整）に最終濃度0.015%で添加する。メチルセルロース (MC) 保存液を最終濃度0.3%になるよう添加する (R&D systems)（例えば、0.3% Kelcogel（登録商標）ストック：Kelcogel（登録商標）F低アシルGG-LA 300mg + MilliQ水 100ml；3DKG Stem TeSR（商標）基礎培地：STEMCELL（商標）TeSR（商標）95ml + 0.3% Kelcogel（登録商標）ストック 5ml + MC保存液 300ul；3DKGカスタムTeSR（商標）基礎培地：カスタムTeSR（商標）培地 95ml + 0.3% Kelcogel（登録商標）ストック 5ml + MC保存液 300ul；最終濃度1%のペニシリン／ストレプトゾシンを3DKG培地に添加する）。
【０２１２】
インビトロでのヒト膵臓内分泌前駆細胞およびβ様細胞の調製
膵臓内分泌細胞 (hiPSC-PE) は、以前に記載された分化方法を用いて、ヒトiPSCから調製した。簡潔に説明すると、HUVEC由来のヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) をStem Cell Core (Salk Institute) から入手した。細胞を、MATRIGEL（登録商標）(BD) コーティングディッシュ上で、完全STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中、加湿5% CO2インキュベーター内で37度で維持した。膵臓分化のために、hiPSCにヒトインスリンレポーターレンチウイルス（pGreenZeroレンチレポーターヒトインスリン、System Biosciences）をスピンフェクション（800g、1時間）によって感染させた。方法1：培地を、100 ng/ml ヒトアクチビン (R&D Systems)、25ng/ml 組換えヒトWnt3a (R&D Systems) を含むカスタムTeSR（商標）培地（800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10ml Glutamax、560 mg NaHCO3、330 mg チアミン、100mg 還元型グルタチオン、3300 mg ビタミンC、14μg セレニウム、10ml NEAA、2ml 微量元素B、1ml 微量元素C、7μl β-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μg PA、インスリン 2mg、1000mlになるよう調整）に交換して2日間置き、次いで100ng/ml ヒトアクチビンを含む分化培地に交換してさらに2日間置いた（段階1、膵臓内胚葉）。続いて、培地を、1uMドルソモルフィン (Calbiochem)、2μM レチノイン酸 (Sigma)、10μM SB431542、および1%のB27サプリメントを伴うカスタムTeSR（商標）培地に置換して7日間置いた（段階2）。次いで培地を、10uM フォルスコリン (Sigma)、10μM デキサメタゾン (Stemgent)、10μM TGFβ RIキナーゼ阻害剤II／Alk5阻害剤II（CalbiochemまたはEnzo）、10μM ニコチンアミド (Sigma)、1μM 3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩 (T3)、および1%のB27サプリメントを伴うカスタムTeSR（商標）培地に置換して4〜5日間置いた（15日目〜21日目、膵臓内分泌前駆細胞）。培地は、毎日（段階1）または1日おきに（段階2および段階3）置換した。
【０２１３】
方法2：培地を、100 ng/ml ヒトアクチビン (R&D Systems)、25ng/ml 組換えヒトWnt3a (R&D Systems) または3μM CHIR99021（AxonもしくはSelleckchem）を含む分化培地 (S1) に交換して1日置き、次いで100ng/ml ヒトアクチビンを含む分化培地 (S1) に交換してさらに2日間置いた（段階1、膵臓内胚葉）。続いて、培地を、50ng/ml FGF7 (R&D Systems) を伴う分化培地 (S2) に置換して2日間置き、次いで50ng/ml FGF7、0.25μM SANT-1 (Sigma)、1μM レチノイン酸 (Sigma)、100nM LDN193189、および100nM α-アミロイド前駆体タンパク質調節因子TPBを伴う分化培地 (S3) に置換して3日間置いた。続いて、培地を、0.25μM SANT-1、50nM レチノイン酸、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S4) に置換して3日間置いた。続いて、培地を、100nM LDN193189、100nM γセクレターゼ阻害剤XX GSiXX (Millipore)、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S5) に置換して7日間置いた。続いて、培地を、10μM トロロクス (Calbiochem)、2μM R428 (Selleckchem)、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S5) に置換してさらに7〜20日間置いた。
【０２１４】
S1培地（MCDB 131培地、8mM グルコース、2.46g/L NaHC03、2% 脂肪酸不含BSA、0.25mM L-アスコルビン酸 0.002% インスリン-トランスフェリン-セレニウム ITS-X (GIBCO)、2mM Glutamax、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）、S2培地（MCDB 131培地、8mM グルコース、1.23g/L NaHC03、2% 脂肪酸不含BSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002% インスリン-トランスフェリン-セレニウム ITS-X (GIBCO)、2mM Glutamax、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）、S3培地（MCDB 131培地、8mM グルコース、1.23g/L NaHC03、2% 脂肪酸不含BSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.5% インスリン-トランスフェリン-セレニウム ITS-X (GIBCO)、2mM Glutamax、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）、S4培地（MCDB 131培地、8mM グルコース、1.23g/L NaHC03、2% 脂肪酸不含BSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002% インスリン-トランスフェリン-セレニウム ITS-X (GIBCO)、2mM Glutamax、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、10μg/ml ヘパリン、10μM 硫酸亜鉛）、S5培地（MCDB 131培地またはBLAR培地、20mM グルコース、1.754g/L NaHC03、2% 脂肪酸不含BSA、0.25mM L-アスコルビン酸、0.002% インスリン-トランスフェリン-セレニウム ITS-X (GIBCO)、2mM Glutamax、1% ペニシリン-ストレプトマイシン）。3次元培養については、hiPSCまたはhESCを、10μM Y-27632を伴う3DKG Stem TeSR（商標）基礎培地中で5〜7日間培養し、次いで培地を、0.015% Kelcogelおよび0.3% メチルセルロースを伴う各分化培地に置換した。
【０２１５】
インビトロでの3次元膵島芽の作製：hADSCおよびHUVECとの共培養によるMatrigel中の島様オルガノイド
初代HUVECおよびヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)（InvitrogenまたはPromoCell）を、15cmディッシュ中で、それぞれEBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS（商標）培地（GIBCO、12747-010、もしくは脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）を用いて、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSC由来の膵臓内分泌前駆細胞をAccutaseで処理し、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013)で処理し、細胞をそれぞれ50 mlチューブ中に収集した。細胞を計数した後、細胞1x106個のhiPS-PP、細胞7x106個のHUVEC、および細胞1〜2x105個のhADSCを、MATRIGEL（登録商標）マトリックス300ulを用いて、24ウェルの1ウェル内で共培養した。ヒト島様オルガノイドの拡張可能な作製のために、細胞1x106個のhiPS-PP（15日目〜21日目）、細胞7x106個のHUVEC、および細胞1〜2x105個のhADSCを、10uM フォルスコリン (Sigma)、10μM デキサメタゾン (Stemgent)、10uM TGFβ RIキナーゼ阻害剤II／Alk5阻害剤II（CalbiochemもしくはEnzo）、10uM ニコチンアミド (Sigma)、1uM 3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩 (T3)、および1%のB27サプリメント、R428 (2μM)、硫酸亜鉛 (10μM)、およびN-Cys (1mM)を伴う3DKGカスタムTeSR（登録商標）培地中で共培養するか（方法1）、または100nM LDN193189、100nM γセクレターゼ阻害剤XX GSiXX (Millipore)、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S5) 中で7日間共培養した。続いて、培地を、10μM トロロクス (Calbiochem)、2μM R428 (Selleckchem)、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S5) に置換してさらに7〜20日間置いた（方法2）。混合された細胞は、数日以内に球状の島様クラスターを形成した。培地は1日おきに交換した。
【０２１６】
インビトロでの3D（3次元）膵島芽の作製：hADSCおよびHUVECとの共培養による、拡張可能なジェランガム中の島様オルガノイド
細胞を上記の通りに調製した。簡潔に説明すると、細胞1x108個のhiPS-PP、細胞2〜7x107個のHUVEC、および細胞5〜7x106個のhADSCを、10μM フォルスコリン (Sigma)、10μM デキサメタゾン (Stemgent)、10μM TGFβ RIキナーゼ阻害剤II／Alk5阻害剤II（CalbiochemもしくはEnzo）、10μM ニコチンアミド (Sigma)、1μM 3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩 (T3)、および1%のB27サプリメント、R428 (2μM)、硫酸亜鉛 (10μM)、およびN-Cys (1mM)を伴う3DKGカスタムTeSR（商標）60〜100ml中で共培養するか（方法1）、または100nM LDN193189、100nM γセクレターゼ阻害剤XX GSiXX (Millipore)、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S5) 中で7日間共培養した。続いて、培地を、10μM トロロクス (Calbiochem)、2μM R428 (Selleckchem)、1mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を伴う分化培地 (S5) に置換してさらに7〜20日間置いた（方法2）。混合された細胞は、数日以内に球状の島様クラスターを形成した。培地は、毎日または1日おきに交換した。
【０２１７】
インビトロでの3D（3次元）膵島芽の作製：hADSCおよびHUVECを使用しない (w/o)、拡張可能なジェランガム3D培養法における島様オルガノイド
iPSCまたはESCを含むヒトPSCは、最初にマトリゲルコーティングプレート中で培養した（2次元 (2D) 培養）。次いで細胞をAccutase（Innovative Cell Technologies, Inc.、San Diego, CA）で処理して単一細胞懸濁液を作製し、PBSで洗浄し、1000〜1300 rpmで5分間遠心分離して細胞をペレット化した。細胞を、10μM Y-27632（RHO/ROCK経路阻害化合物）を伴う3DKG Stem TeSR（商標）基礎培地（Stemcell Technologies、Cambridge, MA）で懸濁し、PSCスフィア増殖が直径50〜100μmに達するまで、さらに5〜7日間培養した。次いで培地を、0.015% Kelcogelおよび0.3% メチルセルロースを補充した分化培地に置換した。培養液を、100 ng/ml ヒトアクチビン (R&D Systems)、25ng/ml 組換えヒトWnt3a (R&D Systems) または3μM CHIR99021、グリコーゲン合成酵素キナーゼGSK-3阻害剤（Axon Medchem、Reston, VA；またはSelleckchem）を含有する分化培地 (S1) に交換して1日置き、次いで100ng/ml ヒトアクチビンを含有する分化培地 (S1) に交換してさらに2日間置いた（段階1、膵臓内胚葉）。続いて、培地を、50ng/ml FGF7 (R&D Systems) を含有する分化培地 (S2) に置換して2日間置き、次いで50ng/ml FGF7、0.25uM SANT-1 (Sigma)、1μM レチノイン酸 (Sigma)、100 nM LDN193189（ALK2およびALK3阻害剤、Sigma）、ならびに100 nM α-アミロイド前駆体タンパク質調節因子TPBを含有する分化培地 (S3) に置換して3日間置いた。続いて、この培地を、0.25μM SANT-1、50 nM レチノイン酸、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を含有する分化培地 (S4) に置換して3日間置いた。続いて、培地を、100 nM LDN193189、100 nM γセクレターゼ阻害剤XX GSiXX (Millipore) 10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を含有する分化培地 (S5) に置換して7日間置いた。続いて、培地を、10uM トロロクス (Calbiochem)、2μM R428 (Selleckchem)、1 mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3を含有する分化培地 (S5) に置換してさらに7〜20日間置いた。インスリン遺伝子発現をレポーター発現またはqPCRのいずれかによって確認した後（典型的には20〜30日目）、培地を、10μM トロロクス (Calbiochem)、2μM R428 (Selleckchem)、1 mM N-アセチルシステイン、10μM Alk5阻害剤II、1μM T3、および100 ng/ml 組換えヒト (rh) Wnt4 (R&D Systems)、400 ng/ml rhWnt5a、または50% Wnt5a馴化培地を含有する分化培地 (S5) に交換して1〜20日間置いた。Wnt5a馴化培地は、L-Wnt5a細胞株（ATCC、CRL-2814）を、10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシンを伴うDMEM中で、細胞がT175-T225 Frasko細胞培養フラスコ中で70〜100%コンフルエンスに到達した後4日間培養することによって調製した。
【０２１８】
インビトロでの3D（3次元）肝芽の作製：器官原基
以前に記載された分化方法を用いて、ヒトiPSC由来の肝細胞 (hiPSC-HE) を調製した。簡潔に説明すると、hiPSCを、MATRIGEL（登録商標）(BD) コーティングディッシュ上で、完全STEMCELL（商標）TeSR（商標）培地中、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で維持した。肝臓分化のために、hiPSC（6ウェル内で90%コンフルエンス）を、RPMI1640培地中の100ng/ml ヒトアクチビン (Sigma)、および25ng/ml 組換えヒトWnt3a (R&D Systems) または3μM CHIR99021、および1% インスリン不含B27サプリメントと共に1日培養し、次いでRPMI培地中の100ng/ml ヒトアクチビンおよび1% インスリン不含B27サプリメントと共にさらに4日間培養した（段階1 肝臓-内胚葉）。続いて、培地を、RPMI1640培地中に10ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4、および1%のB27サプリメントを伴う分化培地に置換して3日間置いた（段階2）。次いで培地を、肝細胞培養液（Lonza、MD、CC-3198、EGFおよびゲンタマイシン／アンホテリシン-Bを除去）中に0.1μM デキサメタゾン、20ng/ml オンコスタチンM (R&D Systems)、および10〜20ng/ml 肝臓増殖因子（HGF、R&D Systems）、および1%のB27サプリメントを伴う分化培地に置換して4〜22日間置いた（15日目〜19日目、膵臓内分泌前駆細胞）。培地は、毎日（段階1）または1日おきに（段階2および段階3）置換した。初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)（InvitrogenまたはPromoCell）を、15cmディッシュ中で、それぞれEBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS培地（GIBCO、12747-010、もしくは脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）を用いて、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSC由来の10日目の肝細胞をAccutaseで処理し、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013)で処理し、細胞をそれぞれ50 mlチューブ中に収集した。細胞を計数した後、細胞1x106個のhiPS-PP、細胞7x106個のHUVEC、および細胞1〜2x105個のhADSCを、マトリゲル300ulを用いて、24ウェルの1ウェル内で共培養した。1〜2日以内に肝臓様オルガノイドが形成された。次いで、MATRIGEL（登録商標）マトリックスから肝臓様オルガノイドを取り出し、3DKGカスタムTeSR（商標）中で培養した。
【０２１９】
インビトロでの3D（3次元）心芽 (heart bud) の作製：器官原基
以前に記載された分化方法を用いて、心筋細胞 (hiPSC-CD) をヒトiPSCから調製した。簡潔に説明すると、hiPSCを、MATRIGEL（登録商標）(BD) コーティングディッシュ上で、完全Stemcell（商標）TeSR（商標）培地中、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で維持した。肝臓分化のために、hiPSC（6ウェル内で90%コンフルエンス）を、RPMI1640培地中の100ng/ml ヒトアクチビン (R&D Systems) および10uM CHIR99021および1% インスリン不含B27サプリメントと共に1日培養し、次いでRPMI培地中の1% インスリン不含B27サプリメントと共にさらに2日間培養した（段階1 心臓-中胚葉）。続いて、培地を、RPMI培地中に5uM IWP-2および1% インスリン不含B27サプリメントを伴うRPMI1640培地に置換して1日置いた（段階2）。次いで培地を、1% インスリン不含B27サプリメントを含むRPMI培地に置換して6日間またはそれ以上置いた（段階3）。心収縮はおよそ13日目に始まった。培地は、毎日（段階1）または1日おきに（段階2および段階3）置換した。初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)（InvitrogenまたはPromoCell）を、15cmディッシュ中で、それぞれEBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS（商標）培地（GIBCO、12747-010、もしくは脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）を用いて、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSC由来の13日目〜15日目の心筋細胞をディスパーゼで処理し、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO、12604-013)で処理し、細胞をそれぞれ50 mlチューブ中に収集した。細胞を計数した後、細胞1x106個のhiPS-PP、細胞7x106個のHUVEC、および細胞1〜2x105個のhADSCを、3DKGカスタムTeSR（商標）培地中で共培養した。収縮可能な心臓様のミニ臓器が数日以内に形成された。
【０２２０】
インビトロでの3D（3次元）腸芽 (intestine bud) の作製：器官原基
以前に記載された分化方法を用いて、腸細胞 (hiPSC-IT) をヒトiPSCから調製した。簡潔に説明すると、hiPSCを、Matrigel（登録商標）(BD) コーティングディッシュ上で、完全Stemcell（商標）TeSR（商標）培地中、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で維持した。肝臓分化のために、hiPSC（6ウェル内で90%コンフルエンス）を、RPMI1640培地中の100ng/ml ヒトアクチビン (R&D Systems)、3uM CHIR99021、2mM Glutamax、および1% インスリン不含B27サプリメントと共に1日培養し、次いでRPMI1640培地中の100ng/ml ヒトアクチビン (R&D Systems)、2mM Glutamax、および1% インスリン不含B27サプリメントと共にさらに3日間培養した（段階1 前腸-内胚葉）。続いて、培地を、500ng/ml Wnt3a、500ng/ml FGF4、および1% B27サプリメントを含むRPMI 1640培地に置換して4日間置いた（段階2）。細胞をMatrigel（登録商標）マトリックスに移し、次いで3D-スフェロイド Matrigel（登録商標）ドーム (dorm) を24ウェルの底に作製した。次いで培地を、1% B27サプリメント、1% N2サプリメント、500ng/ml R-スポンジン、100ng/ml ノギン、50ng/ml EGF、2mM Glutamazx（商標）サプリメント、10uM HEPESを含むDMEM/F12培地に置換して7日間またはそれ以上置いた（段階3）。1週間以内に腸様オルガノイドスフェロイドが観察された。培地は、毎日（段階1）ならびに1日おきに（段階2および段階3）置換した。初代HUVEC細胞およびヒト脂肪由来幹細胞 (hADSC)（InvitrogenまたはPromoCell）を、15cmディッシュ中で、それぞれEBM培地（Ronza、cc-3121）またはMesenProRS（商標）培地（GIBCO（登録商標）、12747-010、もしくは脂肪前駆細胞増殖培地キット、C-27417）を用いて、加湿5% CO2インキュベーター内で37℃で培養した。共培養実験のために、ヒトiPSC由来の腸前駆細胞（7日目）をAccutaseで処理し、HUVECおよびhADSCをTrypLE（GIBCO（登録商標）、12604-013)で処理し、細胞をそれぞれ50 mlチューブ中に収集した。細胞を計数した後、細胞1x106個のhiPS-PP、7x106個のHUVEC細胞、および1〜2x105個のhADSC細胞を、3DKGカスタムTeSR（商標）培地中で共培養した。
【０２２１】
インスリン分泌アッセイ（マウスおよびヒトの初代膵島ならびにヒトiPSC由来細胞）
無傷の島からのインスリン放出は、バッチインキュベーション法を使用してモニターした (Yoshihara et al., 2010, Nat. Commun. 1:127)。簡潔に説明すると、一晩培養した単離膵島（10% (v/v) ウシ胎仔血清および1% (v/v) 抗菌・抗真菌剤 (Gibco) を補充したRPMI-1640）を37℃で30分間、前培養した（129.4 mM NaCl、3.7 mM KCl、2.7 mM CaCl2、1.3 mM KH2PO4、1.3 mM MgSO4、24.8 mM NaHCO3（5% CO2、95% O2で平衡化、pH7.4）、10mM HEPES、および0.2% (v/v) BSA（V画分、Sigma）を含有するクレブス・リンゲル炭酸水素緩衝液 (KRBB) (KRBH）と3 mMグルコース）。次いで、インスリン分泌レベルを決定するために、膵島を3 mMまたは20 mMのグルコースを伴うKRBH緩衝液中でインキュベートした（500μl／島10個）。30分後、遠心分離により島をペレット化し、ELISAによってインスリンレベルを決定した（マウスおよびヒトの島についてそれぞれ、ラット／マウスインスリンELISAキット (Millpore) およびヒトインスリンELISAキット (Millpore)）。ヒトiPSC由来細胞については、細胞（24ウェルのウェル当たり細胞1x106個）を3mM グルコースKRBH緩衝液（500μl／ウェル）中で前培養した。次いで、インスリン分泌レベルの指標としてのc-ペプチド分泌レベルを決定するために、細胞を3 mMまたは20 mMのグルコースを伴うKRBH（200μl／ウェル）中でインキュベートした。30分後、遠心分離により細胞をペレット化し、ヒトc-ペプチドELISAキット (Millpore) によりc-ペプチドレベルを決定した。
【０２２２】
定量的RT-PCR解析
TRIzol試薬 (Invitrogen) およびRNeasyキット (Qiagen) を使用して、全RNAを抽出した。逆転写は、SuperScript III第一鎖合成システムキット (Invitrogen) またはPrimeScript RT試薬キット (TAKARA) を用いて行った。リアルタイム定量的RT-PCR (qPCR) は、SYBRグリーン (Bio-Rad) を使用して行った。
【０２２３】
プロインスリン-NanoLucのためのレンチウイルス生成
プロインスリン-NanoLuc in pLX304（Addgene、#62057）は、Addgeneから入手した。プロインスリン-NanoLucレンチウイルスは、第2世代ウイルスパッケージングシステムを使用して生成した。簡潔に説明すると、14μgのプロインスリン-NanoLuc、6.6μgのPsPAX2パッケージングプラスミド (Addgene 12260)、5.4μgのpMD2.Gエンベローププラスミド (Addgene 12259)、および54μl Lipofectamin2000 (Invitrogen) を使用して、T75フラスコのHEK293LTVパッケージング細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、培地を、10% FBSおよび1% ペニシリン／ストレプトゾシンを伴う新鮮なDMEMに交換した。トランスフェクションの48時間後および96時間後に、それぞれ1日目および3日目としてウイルスを収集し、それらを0.2μm 酢酸セルロースフィルター (VWR) に通した。ウイルスを分注し、使用時まで-80℃で凍結保存した。
【０２２４】
インスリン分泌測定のためのガウシアルシフェラーゼアッセイ
マウス島、ヒト島、およびヒト島様オルガノイドを、10μg/ml Polybrene（登録商標）ポリマー (Santacruz) を伴うそれら各々の増殖培地中にプレーテイングした。次いでウイルスを添加した。一晩培養した後、細胞を新鮮な増殖培地中に入れた。感染の48〜72時間後に、マウス島、ヒト島、およびヒト島用オルガノイドを手動で拾い、次いで単一の島またはオルガノイドとして96ウェルに入れた。次いで、インスリン分泌アッセイを実施した。簡潔に説明すると、単一の島またはオルガノイドを、3mM グルコース KRBBを用いて37℃で30分〜1時間プレインキュベートした。次いで細胞を、3 mMを伴うKRBB（100μl／ウェル）中で30分間インキュベートし、次いで連続して、100nM エキセンディン-4を伴うかもしくは伴わない20 mM グルコース、または20mM KClを伴う3mM グルコース（100μl／ウェル）と共にインキュベートした。インスリン分泌レベルの指標としてのガウシアルシフェラーゼ活性を決定するために、10μlの試料を、PierceガウシアルシフェラーゼFlashアッセイキット（Prod#16159、Thermo Scientific）を用いるルシフェラーゼアッセイに使用した。
【０２２５】
INS-1細胞にウイルスをスピンフェクション（800g、1時間、37℃）によって感染させ、次いで新鮮なINS-1増殖培地に交換した。トランスフェクションの72時間後、プロインスリン-NanoLuc発現細胞を選択するために、INS-1細胞を5μg/ml ブラストサイジン (Invitrogen) で7日間処理した。インスリン分泌アッセイのため、細胞（96ウェルのウェル当たり細胞5x104〜1x105個）を3mM グルコース KRBB（100μl／ウェル）中で前培養した。次いで細胞を、3 mMを伴うKRBB（100μl／ウェル）中でインキュベートし、次いで連続して、100nM エキセンディン-4を伴うかもしくは伴わない20 mM グルコース、または20mM KClを伴う3mM グルコース（100μl／ウェル）と共にインキュベートした。インスリン分泌レベルの指標としてのガウシアルシフェラーゼ活性を決定するために、10μlの試料を、PierceガウシアルシフェラーゼFlashアッセイキット（Prod#16159、Thermo Scientific）を用いるルシフェラーゼアッセイに使用した。
【０２２６】
インビトロでの血管新生化試験
EBM培地 (Ronza, cc-3121) を伴うMatrigel（登録商標）マトリックス 300μlを用いて、ヒト島様オルガノイドを24ウェルプレートの1ウェル中に包埋した。24〜72時間以内に、血管新生化が認められた。
【０２２７】
hADSCの3D培養およびWNTタンパク質発現
hADSCは、3D培養において起こる自発的な自己組織化中に、Wnt遺伝子、特にWnt5a経路における遺伝子の発現に変化を来す。(図11A)。Wnt5aは、時間経過に伴ってhADSC 3D培養物において発現される、Wntタンパク質の中で主要なタンパク質であることが見出された。（図11B）
【０２２８】
実施例5：iPSC由来島オルガノイドの代謝成熟におけるWntタンパク質
PBS、WNT3a (500 ng/ml)、組換えヒト (rh) WNT4 (100 ng/ml)、またはrhWNT5a (400ng/ml) で5日間処理した後のiPSC由来島オルガノイド（21日目、hADSCおよびHUVECとの共培養非存在下で作製されたもの）において、FltpおよびEsrrg遺伝子が発現されることが見出された。（図12A）。図12Bに示されるように、Esrrg遺伝子発現は、支持するhADSCおよびHUVECの非存在下で作製されたhiPSC由来島オルガノイドにおいて、漸増用量のrhWNT4（0、10、25、50、100、200 ng/ml）および rhWNT5a（0、25、50、100、200、400 ng/ml）に応答して誘導された。加えて、酸化的リン酸化に関与するミトコンドリア遺伝子（Cox7a2、Ndufal、Ndufa7）、乳酸脱水素酵素 (Ldha)、ならびにFltp（Wnt／平面内細胞極性 (PCP) のエフェクターおよびレポーター遺伝子）も、支持するhADSCおよびHUVECの非存在下で作製されたhiPSC由来島オルガノイドにおいて、漸増用量のrhWNT4（0、10、25、50、100、200ng/ml）および rhWNT5a（0、25、50、100、200、400ng/ml）に応答して誘導された、（図12C）。ミトコンドリア（Mitotracker；Mito-Red）およびインスリン（インスリン-GFP）のレベルは、PBSまたはWNT4 (100 ng/ml) で8日間処理した後のhiPSC由来島オルガノイド（27日目）において増加していた。（図12D）。ヒトiPSC由来島オルガノイド（27日目）は、PBSまたはWNT4 (100 ng/ml) による8日間の処理後に作製された。（図12E）。インスリン産生は、PBSおよび対照線維芽細胞馴化培地 (50%) と比較して、rhWNT4 (100 ng/ml)、rhWNT5a (400 ng/ml)、または WNT5aを分泌する線維芽細胞の馴化培地 (50%) で8日間処理した後のhiPSC由来島オルガノイド（27日目）において見出された。（図12F〜12H)。rhWnt4 (100 ng/ml) で12日間処理したヒトiPSC (hiPSC) 由来島オルガノイド（22日目）は、低グルコースレベル（3mM、「G3mM」）、高グルコースレベル（20mM、「G20mM」）、または高KClレベル（20 mM、「KCL20mM」）に応じて測定されたヒトc-ペプチドの分泌に基づいて、機能的成熟を示した、（図13）。
【０２２９】
他の態様
前述の説明から、本明細書に記載される発明に変更および修正を加えて、それを様々な使用および条件に適合させることができることが明らかであろう。そのような態様もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２３０】
本明細書における変数の任意の定義における要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ（もしくはサブコンビネーション）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の列挙は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部と組み合わせた、その態様を含む。
【０２３１】
本明細書において引用される特許および出版物はすべて、個々の特許および出版物が詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
2019516384.tif 000074
【図２−１】
2019516384.tif 000075
【図２−２】
2019516384.tif 000076
【図２−３】
2019516384.tif 000077
【図２−４】
2019516384.tif 000078
【図２−５】
2019516384.tif 000079
【図２−６】
2019516384.tif 000080
【図２−７】
2019516384.tif 000081
【図３−１】
2019516384.tif 000082
【図３−２】
2019516384.tif 000083
【図４−１】
2019516384.tif 000084
【図４−２】
2019516384.tif 000085
【図４−３】
2019516384.tif 000086
【図４−４】
2019516384.tif 000087
【図４−５】
2019516384.tif 000088
【図４−６】
2019516384.tif 000089
【図５−１】
2019516384.tif 000090
【図５−２】
2019516384.tif 000091
【図５−３】
2019516384.tif 000092
【図６Ａ】
2019516384.tif 000093
【図６Ｂ】
2019516384.tif 000094
【図６Ｃ】
2019516384.tif 000095
【図６Ｄ】
2019516384.tif 000096
【図６Ｅ】
2019516384.tif 000097
【図６Ｆ】
2019516384.tif 000098
【図６Ｇ】
2019516384.tif 000099
【図６Ｈ】
2019516384.tif 000100
【図７】
2019516384.tif 000101
【図８】
2019516384.tif 000102
【図９】
2019516384.tif 000103
【図１０Ａ】
2019516384.tif 000104
【図１０Ｂ】
2019516384.tif 000105
【図１０Ｃ】
2019516384.tif 000106
【図１０Ｄ】
2019516384.tif 000107
【図１１】
2019516384.tif 000108
【図１２−１】
2019516384.tif 000109
【図１２−２】
2019516384.tif 000110
【図１２−３】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月23日(2019.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019516384000001.app
【国際調査報告】
2019516384.tif 000113
2019516384.tif 000114
2019516384.tif 000115
2019516384.tif 000116