(57)【要約】  本発明は、細胞培養チャンバーおよびその使用方法を提供する。特定の実施形態では、細胞培養チャンバーおよび方法は、自己抗原提示細胞を使用して、Ｔ細胞の増殖および刺激を提供し、患者の腫瘍を選択的にターゲットにするように患者の自身の免疫システムを動かすことができる治療用Ｔ細胞生産物を提供する。
2019522980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養チャンバーであって、
細胞が付着する第１の材料から構成された底部表面と、
少なくとも１つの追加的な表面であって、該少なくとも１つの追加的な表面は、ガス透過性の第２の材料から構成されている、少なくとも１つの追加的な表面と、
１つまたは複数の入口部と、
１つまたは複数の出口部であって、前記１つまたは複数の入口部および前記１つまたは複数の出口部は、前記底部表面に対して垂直方向の流路に少なくとも部分的に沿って、前記細胞培養チャンバーの中の流体を移動させるように配置されている、１つまたは複数の出口部と、
を含む、細胞培養チャンバー。
【請求項２】
前記底部表面および前記少なくとも１つの追加的な表面は、接着剤を使用することなく互いと接合されている、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項３】
前記第１の材料はポリスチレンを含む、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項４】
前記第２の材料は、３５０［ｃｍ３］［ｃｍ］／［ｃｍ２］［ｓ］［ｃｍＨｇ］以上の酸素に対する透過性、および、２０００［ｃｍ３］［ｃｍ］／［ｃｍ２］［ｓ］［ｃｍＨｇ］以上の二酸化炭素に対する透過性を有する、１つまたは複数の材料を含む、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項５】
前記第２の材料は、シリコーンおよびポリメチルペンテンからなる群から選択される１つまたは複数の材料を含む、請求項４に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項６】
前記少なくとも１つの追加的な表面は、前記第１の材料をさらに含む、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項７】
前記細胞培養チャンバーを第２のベッセルに流体連結するように構成された少なくとも１つの流体コネクターをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項８】
前記第２のベッセルは第２の細胞培養チャンバーである、請求項７に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項９】
前記１つまたは複数の入口部および１つまたは複数の出口部に、流体連結されている１つまたは複数のポンプをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のポンプに動作可能に連結されている１つまたは複数の流体リザーバーをさらに含む、請求項９に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１１】
前記細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーターを測定することができるようなやり方で前記細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている１つまたは複数のセンサーをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のパラメーターは、ｐＨ、溶存酸素、合計バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝産物濃度からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１３】
中央処理装置をさらに含み、該中央処理装置は、前記１つまたは複数のセンサーに通信可能に連結されており、測定された前記１つまたは複数のパラメーターの関数として前記１つまたは複数のポンプの動作状態を調節するように構成されている、請求項１１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１４】
前記細胞培養チャンバーは、インキュベーターの中にフィットするようにサイズ決めおよび構成されている、請求項１０に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のポンプは、前記インキュベーターの中にある、請求項１４に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のポンプは、前記インキュベーターの外側にあり、前記インキュベーターの中の前記細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている、請求項１４に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１７】
前記垂直方向の流路に沿った前記流体の移動は、流体の流量が前記細胞培養チャンバーの中の細胞の沈殿レートに打ち勝つには不十分となるようになっている、請求項１に記載の細胞培養チャンバー。
【請求項１８】
細胞培養システムであって、
細胞培養チャンバーと、
命令を保持したメモリーを含む中央処理装置と、
を含み、前記命令は、前記中央処理装置によって実行可能であり、前記システムに、
前記細胞培養チャンバーのサイズを含むデータを第１の入力として受け取らせ、
前記細胞培養チャンバーの中へ導入されることとなる１つまたは複数の流体の中の、第１の細胞タイプの第１の濃度および第２の細胞タイプの第２の濃度を含むデータを第２の入力として受け取らせ、
前記第１および第２の入力に基づいて、前記第１の細胞タイプおよび前記第２の細胞タイプが前記細胞培養チャンバー内で互いに接触している確率を最大化する、前記細胞培養チャンバーに導入される灌流流体の灌流レートを計算させる、
細胞培養システム。
【請求項１９】
前記第１の細胞タイプは末梢血単核細胞であり、前記第２の細胞タイプは樹状細胞である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
１つまたは複数のポンプをさらに含み、該１つまたは複数のポンプは、１つまたは複数の灌流流体リザーバーに動作可能に連結されているとともに前記中央処理装置に動作可能に連結されており、前記中央処理装置は、前記１つまたは複数のポンプを制御することによって前記灌流流体の前記灌流レートを制御する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記細胞培養チャンバーは、１つまたは複数のセンサーを含み、該１つまたは複数のセンサーは、前記１つまたは複数のセンサーが前記細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーターを測定することができるようなやり方で前記細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記細胞培養チャンバーは、
細胞が付着する第１の材料から構成された底部表面と、
上部表面および１つもしくは複数の側壁部であって、少なくとも該１つもしくは複数の側壁部または該上部表面は、ガス透過性の第２の材料から構成されている、上部表面および１つもしくは複数の側壁部と、
を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
第１の細胞培養チャンバーから第２の細胞培養チャンバーの中へ細胞を移送するための方法であって、
第１の細胞生産物を含む上清を発生させるようなやり方で第１の細胞培養チャンバーの中で細胞を培養するステップと、
前記第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入するステップであって、該ガス流は、前記第１の細胞生産物を含む前記上清を、前記流体コネクターを通して前記第２の細胞培養チャンバーの中へ移送する、ステップと、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記第１の細胞培養チャンバーの中へ前記ガス流を導入するステップは、前記上清の自動化された移送を引き起こす、請求項２３に記載の細胞を移送するための方法。
【請求項２５】
前記方法は、前記第２の細胞培養チャンバーの中で前記第１の細胞生産物をさらに培養するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は、前記第２の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入するステップであって、該ガス流は、さらに培養された前記第１の細胞生産物を含む前記上清を流体コネクターを通して第３の細胞培養チャンバーの中へ移送する、ステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数のセンサーを介して、少なくとも前記第１のまたは第２の細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーターを測定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つまたは複数のパラメーターは、ｐＨ、溶存酸素、合計バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝産物濃度からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つまたは複数のパラメーターの関数として前記第１の細胞生産物の流量を調節するために、フロー発生メカニズムの動作状態を変化させるステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の細胞培養チャンバーは、前記第１の細胞培養チャンバーの底部表面に対して垂直方向の流路に少なくとも部分的に沿って、前記第１の細胞培養チャンバーの中の流体を移動させるように構成されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記垂直方向の流路に沿った前記流体の移動は、流体の流量が前記細胞培養チャンバーの中の細胞の沈殿レートに打ち勝つには不十分となるようになっている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の細胞培養チャンバーは、
細胞が付着する第１の材料から構成された底部表面と、
上部表面および１つもしくは複数の側壁部であって、少なくとも該１つもしくは複数の側壁部または該上部表面は、ガス透過性の第２の材料から構成されている、上部表面および１つもしくは複数の側壁部と、
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
免疫療法生産物を発生させるための方法であって、該方法は、
第１の細胞培養チャンバーの中で末梢血単核細胞および樹状細胞を培養して、Ｔ細胞を含む上清を作り出すステップと、
前記第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入して、前記Ｔ細胞を含む前記上清を流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ移送するステップと、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記第２の細胞培養チャンバーは新鮮な樹状細胞を含み、前記方法は、前記Ｔ細胞をさらに培養するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の培養チャンバーの中での培養は、第１のセットの刺激抗原の存在下で起こり、前記第２の培養チャンバーの中での培養は、第２のセットの刺激抗原の存在下で起こる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のセットの刺激抗原と前記第２のセットの刺激抗原とが同じである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のセットの刺激抗原と前記第２のセットの刺激抗原とが異なっている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
１つまたは複数のセンサーを介して、少なくとも前記第１のまたは第２の細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーターを測定するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数のパラメーターは、ｐＨ、溶存酸素、合計バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝産物濃度からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の細胞培養チャンバーは、前記第１の細胞培養チャンバーの底部表面に対して垂直方向の流路に少なくとも部分的に沿って、前記第１の細胞培養チャンバーの中の流体を移動させるように構成されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記垂直方向の流路に沿った前記流体の移動は、流体の流量が前記細胞培養チャンバーの中の細胞の沈殿レートに打ち勝つには不十分であるようなものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の細胞培養チャンバーは、
細胞が付着する第１の材料から構成された底部表面と、
上部表面および１つもしくは複数の側壁部であって、少なくとも該１つもしくは複数の側壁部または該上部表面は、ガス透過性の第２の材料から構成されている、上部表面および１つもしくは複数の側壁部と、
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
第１の細胞培養チャンバーから第２の細胞培養チャンバーの中へ細胞を移送するための装置であって、該装置は、
第１の細胞生産物を含む上清を発生させるようなやり方で第１の細胞培養チャンバーの中で細胞を培養する手段と、
前記第１の細胞培養チャンバーから流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ流すために、前記第１の細胞生産物を含む前記上清の自動化された移送を引き起こす手段と、
を含む、装置。
【請求項４４】
免疫療法生産物を発生させるための装置であって、該装置は、
第１の細胞培養チャンバーの中で末梢血単核細胞および樹状細胞を培養してＴ細胞を含む上清を作り出す手段と、
前記第１の細胞培養チャンバーから流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ、前記Ｔ細胞を含む前記上清を移送させる手段と、
を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年６月２９日に出願された米国仮出願第６２／３５６，５０４号明細書、および、２０１６年７月１日に出願された米国仮出願第６２／３５７，９３７号明細書の利益および優先権を主張し、その両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、アメリカ国立科学財団によって付与された認可番号１６４５２０５の下で政府支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、細胞培養チャンバーおよびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞ベースの癌免疫療法は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、樹状細胞ワクチン、および新生抗原ベースのＴ細胞療法に基づく、特定の癌に関する並外れて前途有望な治療に基づいて、大きな注目を集めている。後者の療法では、腫瘍シーケンシング・データからの候補の新生抗原を予測する能力と、患者の中の新生抗原特有のＴ細胞反応のモニタリングが、高度に個人に特化された免疫療法を設計するための基礎を提供する。
【０００５】
癌に関するＴ細胞療法はかなり有望であるが、癌抗原特異的Ｔ細胞の単離、調製、および増殖のための既存のプロセスには制限がある。現在、Ｔ細胞療法は、大きな労働力を要する手動のマルチ・ステップのプロセスを使用して調製されており、これは、そのようなＴ細胞療法を製造する上でのスケーリングに関して重大な課題をもたらす。Ｔ細胞療法生産に関連する複雑な生物学的なプロセス、ならびに、自己細胞処理に関連付けられるバイオプロセスおよび規制要件に起因して、このプロセスを自動化することは成功していない。また、細胞調製の時間、最適な表現型の維持、十分な細胞数への増殖、ならびに、細胞生産物の品質および安全などの、追加的な課題も存在している。
【０００６】
図１に示されているように、自己抗原提示樹状細胞（ＤＣ）によるヒトＴ細胞の刺激のための従来の先行技術プロトコルは、培養プレート同士の間での上清の移送、培地の変化、サイトカインおよび細胞培地の追加などを含むいくつかの手動ステップを伴う。Ｔ細胞は、７日にわたって樹状細胞（ＤＣ）と接触した状態に置かれ、この時間の間にＴ細胞は刺激を受け、増殖する。このプロセスは、典型的には４回繰り返され、それぞれの刺激サイクルは、上清の中のＴ細胞の抽出、および、新鮮なＤＣのプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）を必要とし、一方で、典型的には、それぞれの７日の期間の間に２回、培地および成長因子（サイトカイン）を手動で交換することも必要とする。このプロトコルを実施するために必要とされる手動ステップの数は、とてつもなく高い。たとえば、この従来の４週間のプロトコルを使用する場合には合計でおおよそ４，６５０回の手動ステップがとられ、これらのステップのすべてが、汚染のリスクを増大させ、細胞生産物の品質および安全を損なう可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４００４２号明細書
【特許文献２】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／６０７０１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６５６，１５５号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；  ２０１１
【非特許文献２】Ｖａｌｉｔｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２０１０
【非特許文献３】Ｆｕｌｗｙｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５６，  ９１０  （１９７４）
【非特許文献４】Ｌｉ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９，  １５６４  （１９９７）
【非特許文献５】Ｆｉｅｄｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７０，  １９０９−１９１５  （１９９８）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の生産を自動化する新しい技術を開発する必要性が存在していることを認識している。本発明の例示的な実施形態の細胞培養チャンバーは、上記に説明されている手動プロセスの自動化を可能にするさまざまな技術的特徴を含み、プロセスの中のユーザー介入を劇的に低減させ、それによって、汚染のリスクを著しく低減させる。たとえば、本実施形態の細胞培養チャンバーは、細胞が付着する材料から作製された底部表面と、ガス透過性の材料から作製された少なくとも１つの追加的な表面、たとえば側壁部および／または上部壁部、を含むように製作され得る。このように、先行技術の培養システムと比較したときに、底部表面の付着性性質を犠牲にする必要なく、より高いレベルのガス交換が実現される。追加的に、本実施形態の細胞培養チャンバーは、培養培地およびサイトカインがチャンバーの中へ灌流されることを可能にするように構成されており、より一貫したレベルが維持され得るようになっている。抗原特異的Ｔ細胞および培養プロセスに関わる他の細胞が灌流の間にチャンバーの中に留まることを確保するために、細胞培養チャンバーの１つまたは複数の入口部および出口部は、チャンバーから出て行くときに垂直方向の流路に少なくとも部分的に沿って細胞培養チャンバーの中の流体を移動させるように配置されている。また、細胞培養チャンバーは、互いに流体接続するように構成されており、抗原特異的Ｔ細胞がチャンバー同士の間で自動的に移送され得、新しい細胞培養チャンバーの中でのＴ細胞のさらなる培養および増殖を可能にするようになっている。いくつかの実施形態では、第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入し、第１の細胞生産物を含む上清を流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ移送することによって、移送が達成される。
【００１０】
特定の態様では、例示的な実施形態の細胞培養チャンバーは、同じ患者からの抗原提示細胞を使用して、Ｔ細胞の増殖および刺激を提供し、患者の腫瘍を選択的にターゲットにするように患者の自身の免疫システムを動かすことができる治療用Ｔ細胞生産物を提供する。これらの細胞培養システムおよび方法は、従来のプロトコルと比較して手動ステップの数を大きく低減させる。このように、汚染のリスクが大きく減少され、製造技法のロバスト性および再現性が大きく増加されるが、それらは両方とも、正確なターゲッティングができる個人に特化されたＴ細胞療法などの治療用生産物の安全で信頼性の高い製造に関する重要な考慮事項である。
【００１１】
免疫療法生産物を発生させるプロセスを簡単化し、潜在的に短縮することの他に、例示的な実施形態の細胞培養チャンバーは、細胞ベースの療法のための患者の細胞材料の利用、ならびに、製造プロセスの信頼性およびロバスト性を著しく改善する一方で、コスト低減（たとえば、労働コスト）にもつながる。さらに、方法は、単に数個の患者サンプルの処理から数百の患者サンプルの処理へ容易に拡張可能である。患者の中に治療反応を作り出すことができる数まで抗原提示Ｔ細胞を刺激して増殖させるために、本実施形態の細胞培養チャンバーの構成は、自動化された流体フロー制御が、抗原提示細胞とＴ細胞を含有する細胞とを接触させることを可能にし、また、必要に応じて抗原提示細胞をリフレッシュさせることを可能にする。また、この設計は、容易に拡張可能である。たとえば、並列に配置される一連の細胞培養チャンバーを備えたシステムを設計することによって、単一のシステムが、１〜１０から数百のサンプルの範囲にあるサンプルを処理することが可能である。それぞれのチャンバーは独立して制御され得、任意の所与の時間において利用されるチャンバーの数は、サンプルの数に応じて、スケール・アップまたはスケール・ダウンされ得る。他の実施形態では、ＰＬＣロジック・コントローラーなどの単一の中央コントローラーが、システムの中のチャンバーのすべてを制御する。
【００１２】
次いで例示的な配置が説明され、例示的な配置では、本発明の例示的な実施形態のシステムおよび方法は、１つまたは複数のバイオリアクターを利用し、それぞれが、細胞培養チャンバーを含み、細胞培養チャンバーは、互いに流体連結されるように構成され、患者の細胞材料の処理を実施し、免疫療法生産物を発生させるようになっている。これは本明細書で説明される例示的な配置であり、他の配置も本発明の範囲内にあることを当業者は認識されよう。
【００１３】
この例示的な実施形態では、細胞培養チャンバーが提供され、細胞培養チャンバーは、細胞が付着する第１の材料から構成された底部表面と、少なくとも１つの追加的な表面であって、少なくとも１つの追加的な表面は、ガス透過性の第２の材料を含む、少なくとも１つの追加的な表面と、１つまたは複数の入口部および１つまたは複数の出口部であって、１つまたは複数の入口部および１つまたは複数の出口部は、垂直方向の流路に少なくとも部分的に沿って、細胞培養チャンバーの中の流体を移動させるように配置されている、１つまたは複数の出口部と、を含む。特定の態様では、垂直方向の流路に沿った流体の移動は、流体の流量が細胞培養チャンバーの中の細胞の沈殿レートに打ち勝つには不十分となるようになっている。
【００１４】
少なくとも１つの追加的なガス透過性の表面を設けることは、従来のプロトコルと比較して、より高いレベルのガス交換を可能にし、したがって、より多数の細胞がチャンバーの中で処理されることを可能にする。特定の態様では、底部表面および少なくとも１つの追加的な表面は、接着剤を使用することなく互いと接合される。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加的な表面も第１の材料を含む。
【００１５】
第１の材料は、たとえば、ポリスチレンを含むことが可能である。第２の材料は、３５０の透過性係数以上の酸素に対する透過性、および、２０００の透過性係数以上の二酸化炭素に対する透過性を有する、１つまたは複数の材料を含むことが可能であり、ここで、透過性係数の単位は、［ｃｍ３］［ｃｍ］／［ｃｍ２］［ｓ］［ｃｍＨｇ］である。１つの態様では、第２の材料は、シリコーンおよびポリメチルペンテンのうちの一方または両方から選択される。
【００１６】
特定の態様では、細胞培養チャンバーは、細胞培養チャンバーを第２のベッセルに流体連結するように構成された少なくとも１つの流体コネクターを含み、第２のベッセルは、第２の細胞培養チャンバーであることが可能である。それぞれのチャンバーを通る、および、チャンバー同士の間の、流体のフローを支援するために、細胞培養チャンバーは、１つまたは複数のポンプを含むことが可能である。それぞれのチャンバーが各自のポンプを含むことが可能であり、または、１つまたは複数のポンプが複数のチャンバーに対応することが可能である。他の態様では、細胞培養チャンバーは、１つまたは複数のポンプに動作可能に連結されている１つまたは複数の流体リザーバーをさらに含むことが可能である。流体リザーバーは、栄養素およびサイトカインを含む培地をチャンバーに供給するように構成されている。
【００１７】
また、細胞培養チャンバーは、１つまたは複数のセンサーを含むことが可能であり、１つまたは複数のセンサーは、細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーター、たとえば、ｐＨ、溶存酸素、合計バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝産物濃度などを、センサーが測定することを可能にするようなやり方で細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている。細胞培養チャンバーは、中央処理装置をさらに含むことが可能であり、中央処理装置は、１つまたは複数のセンサーに通信可能に連結されており、測定された１つまたは複数のパラメーターの関数として１つまたは複数のポンプの動作状態を調節するように構成されている。電気流体力学メカニズムなどのポンプではなくフロー発生メカニズムが用いられる実施形態では、中央処理装置は、フロー発生メカニズムの動作状態を変化させ、１つまたは複数のパラメーターの関数として第１の細胞生産物の流量を調節することが可能である。
【００１８】
特定の実施形態では、細胞培養チャンバーの中および周りで所望の環境を維持することを助けるために、チャンバーは、インキュベーターの中にフィットするようにサイズ決めおよび構成されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポンプは、インキュベーターの中に位置する。他の実施形態では、１つまたは複数のポンプは、インキュベーターの外側に位置し、インキュベーターの中の細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている。
【００１９】
特定の態様では、システムの少なくとも一部は、使い捨てのコンポーネントを含み、使い捨てのコンポーネントのうちのいくつかまたはすべては、非使い捨てのフレームの中に収容され得る。他の態様では、システムのすべてのコンポーネントが使い捨てである。さらに、いくつかの実施形態では、システムは、患者材料をトラッキングおよび記録するためのサンプル・トラッキング・コンポーネントを含む。
【００２０】
システムおよび方法は、任意の数の追加的なリアクターまたは細胞培養チャンバーが提供され得るように設計されている。いくつかの実施形態では、システムは、図６Ａおよび図６Ｂに示されているように、Ｔ細胞を発生させるための２つ以上のバイオリアクター・チャンバーを含む。図６Ａおよび図６Ｂのシステムは、互いに流体連通している２つの細胞培養チャンバーを有するものとして示されているが、任意の数の追加的なチャンバーがシステムとともに使用され得ることが理解されるべきである。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明のシステムは、たとえば、細胞培養チャンバーのサイズ、ならびに、樹状細胞および末梢血単核細胞を含む２つ以上の細胞タイプの濃度などの、さまざまな入力を所与として、灌流流体の所望の灌流レートを自動的に計算および設定する能力を有している。例示的な配置では、細胞培養システムが提供され、細胞培養システムは、１つまたは複数の細胞培養チャンバーと、命令を保持したメモリーを含む中央処理装置と、を含み、命令は中央処理装置によって実行可能であり、システムに、細胞培養チャンバーのサイズを含むデータを第１の入力として受け取らせ、細胞培養チャンバーの中へ導入されることとなる１つまたは複数の流体の中の、第１の細胞タイプの第１の濃度および第２の細胞タイプの第２の濃度を含むデータを第２の入力として受け取らせ、第１および第２の入力に基づいて、第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプが細胞培養チャンバー内で互いに接触している確率を最大化する、細胞培養チャンバーの中へ導入される灌流流体の灌流レートを計算させるようになっている。特定の態様では、第１の細胞タイプは末梢血単核細胞であり、第２の細胞タイプは樹状細胞である。
【００２２】
中央処理装置は、１つまたは複数の灌流流体リザーバーおよび中央処理装置に動作可能に連結されている１つまたは複数のポンプ（または、バルブ）を制御することによって、灌流流体の灌流レートを制御することが可能である。特定の態様では、１つまたは複数のセンサーは、センサーが細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーターを測定することを可能にするようなやり方で細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている。これらのパラメーターは、ｐＨ、溶存酸素、合計バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝産物濃度を含む。
【００２３】
本発明の別の態様では、第１の細胞培養チャンバーから第２の細胞培養チャンバーの中へ細胞を移送するための方法が提供される。方法は、第１の細胞生産物を含む上清を発生させるようなやり方で第１の細胞培養チャンバーの中で細胞を培養するステップと、第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入し、第１の細胞生産物を含む上清を、流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ移送するステップと、を一般的に含む。流体が第２の細胞培養チャンバーに進入すると、第１の細胞生産物はさらに培養される。
【００２４】
第１の細胞培養チャンバーから第２の細胞培養チャンバーへの流体の移送と同様に、方法は、また、第２の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入し、さらに培養された第１の細胞生産物を含む上清を、流体コネクターを通して第３の細胞培養チャンバーの中へ移送するステップを含むことが可能である。１つの実施形態では、上清の移送は少なくとも３つの異なる時間に起こり、所望の量の抗原提示Ｔ細胞を作り出すために少なくとも４つの培養チャンバーが使用されるようになっている。
【００２５】
さらに、特定の態様では、上述のように、細胞培養チャンバーのうちの１つまたは複数は、灌流流体などの流体をチャンバーを通して垂直方向の流路に沿って移動させるように構成されている（図８Ｃ）。流体の移動は、流体の流量が細胞培養チャンバーの中の細胞の沈殿レートに打ち勝つには不十分となるようになっている。
【００２６】
本発明のさらなる別の態様では、免疫療法生産物を発生させるための方法は、第１の細胞培養チャンバーの中で末梢血単核細胞および樹状細胞を培養して、Ｔ細胞を含む上清を作り出すステップと、第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入し、Ｔ細胞を含む上清を流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ移送するステップと、を含む。特定の態様では、新鮮な樹状細胞は、第２の細胞培養チャンバーの中に含有されており、Ｔ細胞は、第２の細胞培養チャンバーの中でさらに培養される。
【００２７】
第１の培養チャンバーの中での培養は、第１のセットの１つまたは複数の刺激抗原の存在下で起こることが可能であり、第２の培養チャンバーの中での培養は、第２のセットの刺激抗原の存在下で起こることが可能である。特定の実施形態では、第１のセットの刺激抗原と第２のセットの刺激抗原とは同じである。一方、他の実施形態では、第１のセットの刺激抗原と第２のセットの刺激抗原とは異なっている。
【００２８】
先述の内容は、添付の図面に図示されている例示的な実施形態の以下のより具体的な説明から明らかになり、添付の図面において、同様の参照文字は異なる図の全体を通して同じ部分を表している。図面は、必ずしも一定の縮尺であるわけではなく、その代わりに、実施形態を図示することに重点が置かれている。特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を含むこの特許または特許出願刊行物の写しは、要求および必要な料金の支払いをすると庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】免疫療法生産物を作り出すための先行技術の手動技法を示す図である。
【図２】本発明の実施形態による、免疫療法生産物を作り出すための例示的な方法を示す図である。
【図３】１つの細胞培養チャンバーが示されている状態の、１つの実施形態における本発明のシステムを示す概略図である。
【図４Ａ】本発明の実施形態による例示的な細胞培養チャンバー構成を示す図である。
【図４Ｂ】本発明の実施形態による例示的な細胞培養チャンバー構成を示す図である。
【図４Ｃ】本発明の実施形態による例示的な細胞培養チャンバー構成を示す図である。
【図４Ｄ】本発明の実施形態による例示的な細胞培養チャンバー構成を示す図である。
【図４Ｅ】本発明の実施形態による例示的な細胞培養チャンバー構成を示す図である。
【図５】透過性のポリマーを別のポリマーのフレームの中に組み込む構成を有する細胞培養チャンバーの表面を示す図である。
【図６Ａ】細胞培養チャンバー同士を接続し、それらの間で流体を移送するための、プロセスの概略表現図である。図３に示されているような第１の細胞培養チャンバーの概略図である。
【図６Ｂ】細胞培養チャンバー同士を接続し、それらの間で流体を移送するための、プロセスの概略表現図である。第１の細胞培養チャンバーの中の部分的に増殖されたＴ細胞、および、第１の細胞培養チャンバーに接続するために適切な位置へ第２の細胞培養チャンバーを移動することを図示する図である。
【図６Ｃ】細胞培養チャンバー同士を接続し、それらの間で流体を移送するための、プロセスの概略表現図である。第１の細胞培養チャンバーの中へ無菌空気を注入し、増殖されたＴ細胞を含有する上清を第２の細胞培養チャンバーの中へ移送することを図示する図である。
【図７】１つの実施形態による、１つの細胞培養チャンバーの出口部から２つの細胞培養チャンバーの入口部への流体のフローを示す図である。
【図８Ａ】さまざまなチャンバー構成を通る流体のフローを示す図である。細胞培養チャンバーの中への、および、細胞培養チャンバーから外への、平面的な流体のフローを示す図である。
【図８Ｂ】さまざまなチャンバー構成を通る流体のフローを示す図である。細胞培養チャンバーの中への、および、細胞培養チャンバーから外への、平面的な流体のフローを示す図である。
【図８Ｃ】さまざまなチャンバー構成を通る流体のフローを示す図である。対称のインフローおよび垂直方向のアウトフローを備えた構成を示す図である。
【図８Ｄ】さまざまなチャンバー構成を通る流体のフローを示す図である。対称のインフローおよび垂直方向のアウトフローを備えた構成を示す図である。
【図９】Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の相互作用の動態パラメーター（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）・ベースのモデリングを示す図である。
【図１０】特定の実施形態による、本発明のシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明のデバイス、システム、および方法は、自己細胞の培養を伴う、個人に特化されたターゲットにされた癌または感染症の療法のために、十分な量の抗原特異的Ｔ細胞を発生させる方法を自動化し、ならびに、遠隔からモニタリングおよび制御することを可能にする。本発明のシステムおよび方法は、上記で説明した手動プロセスの自動化を可能にするさまざまな技術的特徴を含む。これらの技術的特徴は、それらに限定されないが、１）細胞が付着する材料から作製されている底部表面と、ガス透過性の材料から作製されており、より大きいレベルのガス交換が実現されるようになっている、少なくとも１つの追加的な表面とを含むように、細胞チャンバーを構築することと、２）チャンバーから出て行くときに垂直方向の流路に沿って細胞培養チャンバーの中の流体を移動させ、抗原特異的Ｔ細胞および培養プロセスに関わる他の細胞が培養培地の灌流の間にチャンバーの中に留まることを確保するように、細胞培養チャンバーの１つまたは複数の入口部および出口部を配置することと、３）第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入し、流体コネクターを通して第２の細胞培養チャンバーの中へ細胞を移送することによって、１つのチャンバーから別のチャンバーへ抗原特異的Ｔ細胞を自動的に移送することと、を含む。
【００３１】
本発明の方法、デバイス、およびシステムは、多数の細胞ベースの免疫療法生産物を提供するようにスケール・アップされ得、単一の対象に関して動作させることも、または、並列にいくつかの対象に関して動作させることもできる（それによって、それらの細胞およびその子孫が別々に留まる）。先行技術の方法およびデバイスと比較して、本発明の方法およびシステムは、動作においてロバストであり、高い生産物収量を提供することができ、簡単かつ効率的であり、汚染のリスクがより少なく、労働力のコストを最小に低減させる。
【００３２】
図２は、本明細書で説明されるシステムを使用して細胞ベースの免疫療法生産物を発生させるための方法の概観を示している。簡潔に言えば、本発明の特定の実施形態による細胞療法生産物を発生させる際のステップは、細胞培養チャンバーを含有する生物学的リアクターの中でのＴ細胞を含有する細胞と刺激される抗原提示細胞との共培養を含む。増殖された治療用Ｔ細胞生産物を含有する上清が、培養の間に発生させられる。特定の態様では、患者の中に治療反応を引き起こすために十分な所定量の抗原特異的Ｔ細胞を作り出すために、Ｔ細胞は、１つまたは複数の追加的な細胞培養チャンバーの中で追加的な培養を受けなければならない。この追加的な培養を達成するために、上清がその中で発生させられた培養チャンバーから、抗原提示細胞の新鮮な供給を含有する後続の細胞培養チャンバーへの、上清の移送が起こらなければならない。細胞培養チャンバー同士の間の上清の移送は、第１の細胞培養チャンバーの中へのガス流の導入を伴うことが可能であり、このガス流は、第１の細胞生産物を含む上清を、流体コネクターを通して新しい細胞培養チャンバーの中へ移送する。さらに、培養ステップのそれぞれの間に、たとえば培地およびサイトカインを含有する灌流流体が、チャンバーに灌流され得る。特定の態様では、灌流流体はチャンバーを通って垂直方向の流路に沿って流れ、細胞が培養の間にチャンバーの中に留まることを確保するようになっている。本発明のシステムを使用して必要とされる唯一の手動ステップは、１つまたは複数の後続の生物学的リアクターをシステムに提供することであり、それぞれのリアクターは細胞培養チャンバーを含有しており、それぞれのチャンバーは抗原ペプチド・パルス自己抗原提示細胞の新しいバッチを含有している。
【００３３】
本発明の実施形態による細胞ベースの免疫療法生産物を発生させる方法は、先行技術の方法よりもはるかに簡単で効率的である。図１は、以前に説明したように少なくとも４，６５０回の手動ステップを必要とする先行技術の従来プロトコルを示している。それとは対照的に、図２〜図４に示され、説明されるように、および、本明細書で説明されるように、本発明のシステムおよび方法は、下記の表１に示されるように、同じ細胞用量を発生させるためにとる必要がある手動ステップの数を２５分の１に減少することを伴う。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
本発明の細胞培養チャンバーは、免疫療法生産物製造を著しく改善し、比類なき程度の一貫性、品質、安全、経済性、スケーラビリティー、柔軟性、およびポータビリティーを備えたフロー・ベースの免疫療法生産技術を提供する。
【００３６】
次いで例示的な配置が説明され、例示的な配置では、本発明のシステムおよび方法は、１つまたは複数のバイオリアクターを利用し、それぞれのリアクターは、細胞培養チャンバーを含有しており、細胞培養チャンバーは、互いに流体連結されるように構成され、患者の細胞材料の処理を実施し、免疫療法生産物を発生させるようになっている。バイオリアクターは、特定の実施形態では、閉じた環境で提供されることが理解されるべきである。直列および／または並列の処理を可能にするためにモジュール（たとえば、生物学的リアクター）を追加することによって、この例示的な実施形態をスケール・アップすることは当業者の知識内のことであろう。また、当業者は、作り出そうとする生産物に基づいて異なる配置または代替的な配置が望まれる可能性があることを認識されよう。
【００３７】
例示的な実施形態では、図３に示されるように、生物学的リアクター１１０は、細胞培養チャンバー１２０を含むように設けられており、細胞培養チャンバー１２０は、底部表面１２２および少なくとも１つの追加的な表面１２４を含む。底部表面１２２は、細胞が付着する第１の材料から構成されており、少なくとも１つの追加的な表面１２４は、ガス透過性の第２の材料から構成されている。また、細胞培養チャンバーは、１つまたは複数の入口部１２６、１３６、および、１つまたは複数の出口部１２８、１３８を含む。特定の実施形態では、生物学的リアクターはまた、少なくとも１つの灌流流体リザーバー１３２、少なくとも１つの廃棄流体リザーバー１３４、チャンバー１２０を通して灌流流体を移動させるための少なくとも１つのポンプ１４０、ならびに、リザーバー１３２、１３４へおよびリザーバー１３２、１３４から、および、チャンバー１２０を通して、流体を輸送するための関連の入口部１３６および出口部１３８を含む。
【００３８】
細胞培養チャンバー１２０に関して、第１の材料は、生体適合性であり、かつ、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）がそれに付着する、任意の材料であることが可能である。細胞培養チャンバー１２０の中で起こるＴ細胞刺激および増殖プロセスの間に、成熟したＡＰＣは発達し、好ましくは底部表面１２２に付着することとなり、一方、Ｔ細胞は底部表面の上方の上清の中に留まり、増殖されたＴ細胞を別々に取得することをより容易にする。
【００３９】
１つの例示的な実施形態では、第１の材料は、ポリスチレンを含む。培養が起こる底部表面に関してポリスチレンを使用する１つの利益は、ＰＢＭＣから樹状細胞を発生させるプロセスにおいてこの材料が果たす有用な役割である。具体的には、ポリスチレン表面は、ＰＢＭＣの不均質な懸濁液から単球を濃縮するために使用され得る。これは、たとえば、ＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦを含有する培地の中での培養を介して、単球の分化によってＤＣを発生させるために利用される培養プロセスの中の第１のステップである。Ｔ細胞刺激の１回のサイクルの全体を通して樹状細胞生産に関して同じポリスチレン表面を使用することは、バイオプロセスの観点から極めて価値のあることである。その理由は、そうでなければ必要になる多数の移送ステップが排除され、それにより、ＤＣ刺激される治療用Ｔ細胞製造のための閉じたシステムが可能になるからである。
【００４０】
底部表面は、６−ウェル・プレートおよび２４−ウェル・プレート（それぞれ、９．５ｃｍ２および３．８ｃｍ２）などの、従来のウェル・プレートに匹敵する表面積を有することが可能である。また、表面積は、従来のウェル・プレート（たとえば、標準的な細胞培養皿およびフラスコに匹敵する表面積を有する）ものよりも小さくすることも、またははるかに大きくすることも可能であり、たとえば、約２．０ｃｍ２から約２００ｃｍ２の間の表面積、たとえば、約２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９、０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、１００．０、１２５．０、１５０．０、１７５．０、および２００．０ｃｍ２の表面積、および、それらの間の任意の表面積を有していることも理解されるべきである。
【００４１】
少なくとも１つの追加的な表面１２４は、１つまたは複数の側壁部および上部壁部などの、任意の構成を含むことが可能である。１つの実施形態では、図３に示されるように、側壁部は、互いに対して９０度の角度で配置され得、ボックス形状が底部表面１２２と関連して形成されるようになっている。別の実施形態では、少なくとも１つの追加的な表面１２４は、湾曲した側壁部を形成し、図４Ａ〜図４Ｃに示されているように、円柱、楕円柱、または円錐が形成されるようになっている。別の例示的な配置では、少なくとも１つの追加的な表面は、図４Ｄに示されるように、底部表面の上方にドームのような形状を形成することが可能である。さらなる他の実施形態では、側壁部は、図４Ｅに示されるように、三角形の形状を形成することが可能である。上記の例示的な構成は非限定的なものであり、少なくとも１つの追加的な表面が、上述の例示的な構成には提供されていない他の構成を有することが可能であることが理解されるべきである。
【００４２】
別の実施形態では、少なくとも１つの追加的な表面１２４は、第２の材料を含み、第２の材料は、細胞培養チャンバーの中で起こるガス交換を達成するために、ガス透過性である。底部表面が、ポリスチレンなどの細胞が付着する材料から作製されるように、ならびに、側壁部および／または上部壁部などの少なくとも１つの追加的な表面が、少なくとも部分的にガス透過性の材料から作製されるように、細胞培養チャンバーを製作することによって、高い表面積のガス交換が本発明の実施形態のシステムの中で実現される。底部表面以外に、高い透過性を有するより大きい表面を有することは、先行技術の培養システムと比べて底部表面の付着性性質を犠牲にする必要なしに、より高いレベルのガス交換を実現する能力を提示し、先行技術の培養システムは、細胞が付着することができる培養に好適な表面に含まれ得るおよび／または欠如し得る培養培地の量に関して制限されていた。
【００４３】
特定の実施形態では、第２の材料は、３５０の透過性係数以上の酸素に対する透過性、および、２０００の透過性係数以上の二酸化炭素に対する透過性を有する、１つまたは複数の材料を含む。ここで、透過性係数の単位は、［ｃｍ３］［ｃｍ］／［ｃｍ２］［ｓ］［ｃｍＨｇ］である。例示的な材料は、シリコーンを含有する材料、たとえば、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）（それは、高い酸素および二酸化炭素透過性（ポリスチレンおよびＰＭＭＡなどの材料よりも最大で３桁も高い）としてよく知られている）およびポリメチルペンテンなどを含む。１つの例示的な実施形態では、細胞培養チャンバーは、ポリスチレンの床部、ならびに、シリコーンの側壁部および上部壁部を含む。
【００４４】
特定の態様では、第２の材料に加えて、少なくとも１つの追加的な表面１２４は、第１の材料も含むことが可能である。たとえば、および、限定ではないが、追加的な表面１２４、たとえば、１つもしくは複数の側壁部および／または上部壁部は、図５に示されているように、第１の材料（たとえば、ポリスチレン）から作製されたフレームの中に第２の材料（たとえば、シリコーンなどの高透過性ポリマー）を組み込むことが可能である。また、底部表面は、第２の材料も含むことが可能であることが企図される。しかし、いくつかの実施形態では、第２の材料は、底部表面の全体を通して間欠的にのみ分散しており、これにより、細胞が表面に付着することができるように第１の材料が十分な表面積をカバーすることを確保している。
【００４５】
第１の材料および第２の材料は、機械的な締結、接着剤、溶媒結合、および溶接などの、当技術分野において知られている任意の方法を使用して、互いと接合され得る。しかし、本発明の実施形態のシステムおよび方法を使用して作り出される細胞免疫療法生産物は、後に人間の患者に投与されることを考慮して、規制上の問題が、細胞培養チャンバーを組み立てる際に特定の（または、すべての）接着剤を使用することを阻止する可能性がある。したがって、特定の実施形態では、第１および第２の材料は、接着剤を使用することなく接合される。１つの実施形態では、細胞培養チャンバーのすべての表面、たとえば、底部壁部、側壁部、および上部壁部などは、第１の材料（たとえば、ポリスチレン）を含み、また、図５に示されているように、超音波溶接を使用して、第２の材料（たとえば、シリコーン材料）の挿入を可能にするようにカットアウトされた側壁部および／または上部壁部の中の第１の材料の少なくとも一部分と一緒に接合されている。図５に示されているように、孔部は、望まれる任意の形状であることが可能であり、単に円形でないことも可能であることが理解されるべきである。例示的な配置では、第２の材料は、ベッセルのシーリングのためにベッセルの上部開口部の中へ挿入されるストッパーと同じようにして、孔部の中へ別々に挿入され得る。別の例では、図５に示されているように、第２の材料は、第１の材料フレームの外側表面を完全に包含して取り囲むように製作可能であり、第２の材料がフレームの中の孔部を通してアクセス可能であるようになっている。上述の構成は単なる例に過ぎず、第１および第２の材料を接合するための他の構成も、企図される本発明の実施形態であることが理解されるべきである。
【００４６】
１つまたは複数の細胞培養チャンバーの高さは変化することが可能である。たとえば、および、限定ではないが、細胞培養チャンバー高さの例示的な範囲は、０．５ｍｍから１００ｍｍまでのいずれかの高さ、たとえば、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、１００．０ｍｍ、またはそれ以上などの高さ、または、それらの間の任意の高さを含む。特定の実施形態では、チャンバーの高さは、約０．８ｍＬから６ｍＬの体積容量によって、６−ウェル・プレートおよび２４−ウェル・プレートの中で典型的に実施される培養における液体高さ、たとえば、２ｍｍから６ｍｍの間の液体高さに匹敵することが可能である。他の実施形態では、細胞培養チャンバーは、たとえば１０ｍｍから５０ｍｍの間などの大きいサイズであり、約５０ｃｍ２の培養表面をもつ。
【００４７】
図３に関して上記で簡潔に述べたように、特定の実施形態では、バイオリアクター１１０は、１つまたは複数のポンプ１４０も含み、１つまたは複数のポンプ１４０は、細胞培養チャンバーの中へ灌流培地を灌流させるために、細胞培養チャンバー１２０に動作可能に連結されている。また、バイオリアクター１１０は、１つまたは複数の流体リザーバー１３２も含むことが可能である。流体リザーバー１３２は、細胞培養チャンバー１２０と流体連通しており、１つまたは複数のポンプ１４０に動作可能に連結され得る。また、流体リザーバーをポンプおよび細胞培養チャンバーに接続するための１つまたは複数のチューブが設けられる。特定の態様では、１つまたは複数のポンプは、流体リザーバーからの、細胞培養チャンバーを通る、および、廃棄物収集リザーバーの中への、ポンピング流体のために構成されている。図３に示されている例示的な実施形態では、流体は、流体リザーバー１３２から移動し、管１５２を通ってポンプ１４０へ移動し、入口部１３６を介して細胞培養チャンバー１２０の中へ移動し、出口部１３８を介して細胞培養チャンバー１２０から外へ移動し、管１５４を通って移動し、廃棄物収集リザーバー１３４の中へ移動する。
【００４８】
特定の実施形態では、流体リザーバーおよび／または廃棄物収集リザーバーは、１つまたは複数のキャップ付きボトルとしてそれぞれ提供可能であり、１つまたは複数のキャップ付きボトルは、細胞培養チャンバーの中に含有されているか、または、チャンバーに流体連結されているか、のいずれかである。それぞれのリザーバーは、入口ポートおよび出口ポートを含有しているか、または、出口ポート、および、１つまたは複数の細胞培養チャンバーの入口部に流体連結されているベントを含有している。特定の態様では、たとえば、ルアー・コネクター、および、ルアー・コネクターの周りにフィットするようにカットされたシリコーン・ガスケットは、入口部もしくは出口部のいずれか、または、入口部および出口部の両方を通る漏出を防止するために使用され得る。
【００４９】
特定の実施形態では、１つまたは複数の生物学的リアクターは、インキュベーターにフィットするようにサイズ決めおよび構成されており、プロセスがインキュベーターの中で実施されるようになっている。インキュベーターの中の条件は、３７℃の持続的な温度および９５〜１００％の湿度を含む。したがって、材料（流体および生物製剤を含む）がそのような条件の下で増殖する傾向にあることを考慮して、選ばれる材料は、これらの条件に耐える完全性を有していなければならない。さらに、いくつかの場合には、インキュベーターの中の条件は安定したままであり、自動化された温度の記録が可能であり、温度変動の知識を有し、インキュベーターの中で実施される反応の任意の収差と相関する。したがって、任意の動力の供給は、インキュベーターの中の環境を変化させるべきではない。たとえば、特定のポンプは、熱を発生させる。したがって、１つの実施形態では、ポンプは、生物学的リアクターから分離して収容されるが、依然として、リアクターと流体連通し、動作可能に連通している。別の実施形態では、ポンプは、生物学的リアクターに直接的に取り付けられており、インキュベーターの中に位置しているが、熱を受けないか、または、ヒート・シンクおよび／またはファンに動作可能に接続されており、熱を消散させる。構成にかかわらず、ポンプは、生物学的リアクターに、そして、細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている。灌流ベースの自動化された細胞培養システムに関する追加的な詳細、たとえば、オンボードの試薬ストレージによる内皮細胞培養、および、オンボードの使い捨ての蠕動ポンプによって可能になる灌流のための小規模の培養システム、ならびに、ポリスチレン底部表面を備えたチャンバーを使用して単球から樹状細胞を発生させるためのより大規模の培養システムなどが、特許文献１および特許文献２に見出され、その両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００５０】
また、このシステムは、細胞培養リザーバーおよび任意で流体リザーバーの温度を制御するための加熱器を含むことが可能である。そのような構成では、インキュベーターは必要とされず、システムは、電力の供給源のみによって、自律的に動作することが可能である。システムが加熱器を欠いている場合には、システムは、細胞培養インキュベーターの内側で動作させられ得る。
【００５１】
さらなる他の態様では、細胞培養チャンバーは、細胞培養チャンバーに動作可能に連結されている１つまたは複数のセンサー（図示せず）を含む。センサーは、ｐＨ、溶存酸素、合計バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝産物濃度などの、細胞培養チャンバーの中の１つまたは複数のパラメーターを測定することができる。システムが複数の細胞培養チャンバーを含む実施形態では、１つまたは複数のセンサーは、細胞培養チャンバーのうちの１つまたは複数に連結され得る。特定の実施形態では、１つまたは複数のセンサーは、１つまたは複数の細胞培養チャンバーに連結されているが、システムの中のチャンバーのすべてに連結されているわけではない。他の実施形態では、１つまたは複数のセンサーは、システムの中の細胞培養チャンバーのすべてに連結されている。１つまたは複数のセンサーに動作可能に連結されている複数のチャンバーを有するシステムでは、センサーは、それらが連結されているチャンバーのそれぞれにおいて同じであることが可能であり、センサーはすべて異なっていることが可能であり、または、いくつかのセンサーは同じであることが可能であり、かつ、いくつかのセンサーは異なっていることが可能である。特定の態様では、１つまたは複数のセンサーは、命令を実施するための中央処理装置を有するコンピューター・システム（図３には示されていない）に動作可能に連結されており、パラメーターの自動的なモニタリングおよび調節が可能であるようになっている。細胞培養チャンバーを使用して本発明の方法を実装するためのコンピューター・システムに関する追加的な詳細が下記に提供される。
【００５２】
また、図３に示されているように、細胞培養チャンバーは、入口部１２６および出口部１２８を有しており、その両方は、流体コネクターを介してチャンバーを１つまたは複数の追加的なベッセルと流体連結するために使用され得る。特定の実施形態では、追加的なベッセルは、下記でより詳細に説明されるように、１つまたは複数の追加的な細胞培養チャンバーを含む。本発明のシステムは、免疫療法生産物を作り出すために直列に互いに流体接続するように構成された、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、もしくは、それらの間の任意の数の細胞培養チャンバー、または、１００個よりも多い細胞培養チャンバーを含むことが可能である。代替的にまたは追加的に、１つまたは複数の細胞培養チャンバーは、同時に２つ以上の個体に関して免疫療法生産物の生産を可能にするために、互いに並列に配置され得る。好適な実施形態では、バイオリアクターの細胞培養チャンバーは、無菌接続を介して接続されている。
【００５３】
マルチ・バイオリアクター・システムの例示的な構成は、図６Ｂおよび図６Ｃに見ることができ、この構成を使用して実施されるプロセスに関する追加的な詳細が下記に提供される。図６Ｂに示されているように、第２のバイオリアクター２１０が関わる場合に、第２の細胞培養チャンバー２２０は、適切な位置へ移動させられ、第１のチャンバーの出口部および第２のチャンバーの入口部を介して第１の細胞培養チャンバー１２０と接続する。接続は、好ましくは、無菌接続である。その接続は、第１の細胞培養チャンバー１２０の中への無菌空気の注入を可能にし、増殖されたＴ細胞を含有する上清を第２の細胞培養チャンバー２２０の中へ移送する。流体フローの技術分野において知られている代替的な技法が、第１の細胞培養チャンバー１２０から第２の細胞培養チャンバー２２０へ上清を移送するために用いられ得る。また、示されているように、それぞれのバイオリアクターは、それ自身の流体および廃棄物収集リザーバー、ポンプ、ならびに、関連する管を含む。しかし、リザーバーおよびポンプは、バイオリアクター同士の間で共有され得ることが理解されるべきである。
【００５４】
特定の実施形態では、図６Ｂおよび図６Ｃに示されているように、たとえば、１つまたは複数の生物学的リアクターが互いに直列に配置されているときなどに、細胞培養出口部に対する細胞培養入口部の比率が１：１で存在している。他の実施形態では、生物学的リアクターの少なくとも一部分に関して、入口部に対する出口部の比率は１：２である。たとえば、１つの細胞培養チャンバー１２０の出口部は、２つの細胞培養チャンバー２２０ａおよび２２０ｂの入口部に流体接続可能であり、図７に示されているように、第１の細胞培養チャンバー１２０から流れ出る流体が、２つのストリームへと分割されるようになっており、１つのストリームを第２の細胞培養チャンバー２２０ａの中へ送り、第２のストリームを第３の細胞培養チャンバー２２０ｂの中へ送るようになっている。この構成では、第２の細胞培養チャンバー２２０ａおよび第３の細胞培養チャンバー２２０ｂの両方が、Ｔ細胞をさらに刺激および増殖するために使用され得る。追加的に、または代替的に、第２の細胞培養チャンバー２２０ａまたは第３の細胞培養チャンバー２２０ｂのうちの１つは、チャンバーに動作可能に連結されている１つまたは複数のセンサーを使用して、反応およびフロー・パラメーターのモニタリングを可能にするように構成され得る。このように、チャンバーのうちの１つは、追加的なセンサーがないままであり、そのうちのいくつかは、細胞培養チャンバーの壁部を貫通する必要がある可能性があり、それは、漏出および／または汚染のリスクを増大させる可能性がある。
【００５５】
特定の実施形態では、生物学的リアクターの細胞培養チャンバーの中で起こるプロセスの前に、それと同時に、または、それに続いて、さまざまな他のプロセスを達成するためのモジュールを含有するシステムの中に、１つまたは複数の生物学的リアクターが設けられ得る。
【００５６】
システム、および、そのコンポーネントのうちのいくつかまたはすべては、ＣＡＤソフトウェアを使用して設計可能であり、次いで、レーザー・カッターへ移送可能であり、レーザー・カッターは、プラスチックが特定のサイズおよび形状へカットされることを可能にする。入口部および出口部などさまざまな接続は、貫通穴をレーザー・カットすることによって作製可能であり、次いで、それは、手動でタップを切られ、オス型ルアー・フィッティングを受け入れるためのねじ山を提供することが可能である。管が鈍い針部分の上に押し込まれる状態で、ルアー・アダプターを鈍いディスペンシング針に接続することによって、流体は、後に、システムへ導入され得る。流体システム・コンポーネントの構築に関する追加的な詳細は、特許文献１および特許文献２の中に見出され、その両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００５７】
上記の説明は、システム・コンポーネントおよびさまざまな可能な構成に焦点を合わせている。以下の説明は、本発明の例示的な実施形態システムを使用して実施されるプロセスに焦点を合わせている。抗原特異的Ｔ細胞を刺激および増殖するために、プロセスは、細胞培養チャンバーの中の同じ個体から取得されたＡＰＣとＴ細胞を含有する細胞との共培養によって始まる。特定の実施形態では、Ｔ細胞を含有する細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、ＡＰＣは、ＤＣを含む。Ｔ細胞を含有する細胞およびＡＰＣは、約１０００：１から１：１０００の比率（Ｔ細胞を含有する細胞：ＡＰＣ）、たとえば、および、限定ではないが、約１０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：５０、１：７５；１：１００、１：２００：１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００の比率、または、それらの間の任意の比率で、細胞培養チャンバーに提供され得る。１つの態様では、１０：１の比率が好適である。
【００５８】
Ｔ細胞を含有する細胞とＡＰＣとの相互作用からＴ細胞の刺激および増殖を開始させるために、ＡＰＣは、刺激される必要がある。これは、１つまたは複数の刺激分子の使用を通して行われ得る。特定の実施形態では、刺激分子は、腫瘍特異的ではない。他の実施形態では、刺激分子は、腫瘍特異的である。たとえば、刺激分子は、異なる抗原ペプチドなどの、個体の腫瘍の１つまたは複数の特質から選ばれ得る。いくつかの実施形態では、刺激分子は、好ましくは、培養サイクルの始まりのみにおいて追加される。刺激分子は、約数分だけ、１時間、数時間、または、それよりも長い期間にわたって追加され得る。１つの好適な実施形態では、刺激分子は、約１時間の期間にわたって追加される。
【００５９】
２つの細胞材料の培養の間に、より軽い非付着Ｔ細胞を含有した上清が形成され、一方、より重い成熟したＡＰＣ（たとえば、樹状細胞）は底部表面に付着する。ＤＣがＡＰＣとして使用されるそれらの実施形態では、プライマリーＤＣは培養物の中で７日を超えて維持されることはできないため、増殖されたＴ細胞は、７日間の終わりまでに細胞培養チャンバーから抽出されなければならない。したがって、Ｔ細胞の追加的な増殖が望まれる場合には、新鮮な樹状細胞の供給が必要とされる。また、樹状細胞の１つのバッチを使用して細胞を培養することは、７日よりも少ない任意の時間の期間にわたることが可能であることが理解されるべきである。たとえば、細胞は、１分未満から７日までのいずれかの期間にわたって培養可能であり、培養の持続期間は望まれる刺激の程度に依存する。
【００６０】
例示的な実施形態では、培養物の中で最大で７日後に、増殖されたＴ細胞は、抽出され、および、新しい細胞培養チャンバーへ移送され、新しい細胞培養チャンバーは、たとえば、第１の細胞培養チャンバーの中で使用される同じ抗原ペプチドによってパルス化された（ｐｕｌｓｅｄ）新鮮なＤＣを含有している。刺激プロセスは、Ｔ細胞の治療用量に関して十分に多数の細胞を発生させるために、必要に応じて何回も繰り返され得る。典型的なウェル・プレートのものに匹敵する培養表面積を使用する場合、刺激プロセスは、典型的には、Ｔ細胞の十分な供給を発生させるために４回繰り返される。
【００６１】
ＡＰＣおよびＴ細胞の共培養は、培養培地の中で起こる。例示的な培養培地は、それに限定されないが、ＲＰＭＩ培地、およびＣｅｌｌｇｅｎｉｘ（登録商標）培地を含む。当技術分野において知られている任意の他の適切な培養培地が、本発明の実施形態にしたがって使用され得る。また、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインが、培養培地に追加され得る。
【００６２】
１つの実施形態では、培地およびサイトカインの灌流は、細胞培養チャンバーの中の細胞混合物に提供され、細胞ベースの免疫療法生産物の形成を支援することが可能である。ＤＣによるＴ細胞の刺激に関するプレート・ベースのプロトコルにおいて、おおよそ２ｍＬの培養体積が開始から維持され、サイトカインの輸液は、それぞれの７日の刺激期間内に２回起こる。灌流の主要な利点は、培地およびサイトカインの一貫した局所濃度プロファイルを維持する能力（それは、より大きい収量を確保する）であり、先行技術プレート・ベースのプロトコルと比較して、ＤＣへの単球分化のプロセスの速度を上げる潜在的な能力である。しかし、付着（ＤＣ）および非付着（Ｔ細胞）タイプの組み合わせは、機械的な力に対するＤＣの高い感度とともに、抗原特異的Ｔ細胞の刺激および増殖に対して、特に、細胞培養チャンバーを通る流体のフローに関して、課題をもたらす。したがって、培地およびサイトカインが灌流を介して提供されるそれらの実施形態では、本発明のシステムは、ＤＣなどの特定の抗原提示細胞の剪断感度も考慮に入れながら、バイオリアクターから細胞を除去することなく、栄養素およびサイトカインとともに細胞を供給することができなければならない。本質的に、本発明のいくつかの実施形態のシステムおよび方法は、成長因子をリフレッシュさせ、ＤＣの最小の物理的な刺激を維持しながら、Ｔ細胞増殖を好むオートクリン／パラクリン信号の保持を最適化することを目標としている。これを計算に入れるために、細胞培養チャンバーを通る灌流フローの方向およびレートの両方が考慮に入れられなければならない。
【００６３】
特定の態様では、流体の流量は、抗原提示細胞の沈降レートを下回って維持される。そうであるので、抗原提示細胞は、それらの質量に起因して、培養チャンバー内に留まることとなる。換言すれば、抗原提示細胞は、細胞培養チャンバーの底部に向けて沈むこととなり、したがって、細胞培養チャンバーの中に留まることとなる。
【００６４】
沈降レートよりも低い流量は、等式１にしたがって計算され得る。
【数１】
2019522980.tif 000004
ここで、ｖ＿ｍａｘは、それを超えると細胞が上向きに上昇する液体速度であり、ψは、細胞の形状係数（等しい体積の球の表面積に対する細胞の表面積の比率；細胞は完璧な球形ではなく、この係数は１より小さくなることが予期されることに留意されたい）、ｄ＿ｐは、細胞の体積に等しい体積の球形の粒子の直径であり、μは、細胞を含有する液体の粘度であり、ｇは、重力定数であり、ρ＿ｃｅｌｌは、細胞の密度であり、ρ＿ｌｉｑｕｉｄは、細胞を含有する液体の密度であり、∈は、細胞によって占有されていない関心の体積の割合である。
【００６５】
他の態様では、細胞培養チャンバーの１つまたは複数の入口部１３６、および、１つまたは複数の出口部１３８は、細胞培養チャンバー内の灌流流体などの流体を垂直方向の流路に沿って移動させるように配置されている。この構成は、特に、チャンバーを通る流量が２〜１０Ｌ／ｍｉｎの範囲の中にあるときに、細胞（たとえば、ＤＣおよびＴ細胞の両方）がチャンバーを離れることを防止することを助ける。たとえば、図８Ａおよび図８Ｂに示されているように、平面的なイン／アウトフローは、高い壁剪断均一性の領域を提供するが、チャンバーからの細胞の除去を防止する手段を必要とする。対照的に、図８Ｃおよび図８Ｄに示されているように、対称のインフローおよび垂直方向のアウトフローを備えた構成は、細胞がチャンバーから離れることを防止することが可能である。
【００６６】
４つの入口部および１つの垂直方向の出口部を有するものとして図８Ｃに示されているが、チャンバーから流出する流体がチャンバーの上部から垂直方向に流れる限りにおいて、任意の数の入口部および出口部が提供され得る。たとえば、チャンバーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または、それ以上の灌流流体入口部のうちのいずれかを有することが可能であり、一方、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または、それ以上の灌流流体出口部のうちのいずれかを有することも可能である。追加的に、入口部は、図８Ｃでは対称的なものとして示されているが、また、２つ以上の入口部を含有する構成は、対称的に配置されていないことが企図される。また、入口部は、任意の方向からチャンバーに進入するように、流体を方向付けることが可能である。好適な実施形態では、入口部は、底部表面に対して平行な方向にチャンバーに進入するように、流体を方向付ける。
【００６７】
特定の態様では、培地灌流は、たとえば、１日にまたは１週間に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、または、それ以上の回数などのような、任意の１つの細胞培養チャンバーの中で細胞が培養される時間期間にわたる特定の時点において起こる。他の態様では、培地は、培養の間に連続的に灌流される。連続的な灌流は、プロセス全体を通してほぼ一定の培養体積を維持することを助ける。
【００６８】
特定の態様では、サイトカインは、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、または、それ以上の回数などのような、培養の間の１つまたは複数のポイントにおいて輸液される。代替的に、サイトカインは、培地によって連続的に灌流され得る。それらの実施形態では、連続的な灌流は、サイトカインの一貫した局所濃度プロファイルを維持することを助け、これは、より大きい収量を確保することを助けることが可能であり、また、静的な細胞培養方法と比較して、Ｔ細胞が刺激および増殖される速度を増加させる能力を有している。
【００６９】
灌流パラメーターは、培養サイクルの任意の時間において変化させられ得る。例示的なパラメーターは、それに限定されないが、メジアン流量、サイトカイン濃度、および、培養サイクルの持続期間を含む。これらのパラメーターのそれぞれは、Ｔ刺激の有効性に対する影響を有することが可能である。たとえば、ＤＣへの単球拡散のための培養チャンバーを設計する最近の研究において、特許文献１および特許文献２に説明されているように、我々は、０．１ｄｙｎ／ｃｍ２の壁剪断応力レベルに対応する培地灌流レートが、従来の６−ウェル・プレートまたは２４−ウェル・プレート・ベースのプロトコルを使用して発生させられるものと表現型が同一のＤＣを作り出すことができると判定した。そうであるので、培養サイクルの間に上記に説明されている表現型および関数型の対策のうちの１つまたは複数を測定することによって、有効性に対する１つまたは複数の灌流パラメーターの効果がモニタリング可能となり、適当な調節を可能にする。
【００７０】
特定の態様によれば、刺激有効性が、培養の間の任意のポイントにおいて、好ましくは、７日後に、評価され得る。表現型および関数型の対策の両方が、有効性を評価するために使用され得る。たとえば、細胞数（〜倍の増殖）が、直接的な細胞計数方法を使用して計算され得る。テトラマー染色による抗原特異性の評価を含む、細胞表現型は、フロー・サイトメトリーによって特徴付けられ得る。また、機能アッセイが、増殖されたＴ細胞の能力を評価するために使用され、抗原をロードされたターゲット細胞、および、自己腫瘍細胞を認識することが可能である。結果は、２４−ウェル・プレートおよびＧ−Ｒｅｘ（登録商標）フォーマットの両方において実施されたＤＣベースのＴ細胞刺激に対してベンチマークされ得る。
【００７１】
上記に説明されているように、樹状細胞などのような、特定のＡＰＣは、７日を超えて培養物の中で生き残ることができないので、本発明の特定の実施形態は、セミ・バッチ構成の２つ以上のバイオリアクターを超えて使用したＴ細胞刺激の複数のサイクルを必要とする。それぞれのサイクルは、新鮮に発生させられる自己抗原提示細胞によって実施される。特定の実施形態では、抗原提示細胞は、それぞれの刺激サイクルに関して、同じセットの抗原によってパルス化される。他の実施形態では、異なるセットの抗原が、刺激サイクルのうちの１つまたは複数に関して使用される。
【００７２】
一般的に、図２に示されているように、複数回のサイクルＴ細胞刺激は、第１の細胞生産物を含む上清を発生させるようなやり方で第１の細胞培養チャンバーの中で細胞を培養すること、第２の細胞培養チャンバーを提供すること、および、その後に、第１の細胞培養チャンバーの中へガス流を導入することによって、第１の細胞培養チャンバーから第２の細胞培養チャンバーへ上清を移送することを伴う。
【００７３】
マルチ・リアクター・システムの例示的な構成を、図６Ａ〜図６Ｂに見出すことが可能である。示されているように、プロセスは、成熟した付着されたＤＣを含有する１つのリアクターによって始まり、これは、ＰＢＭＣによってロードされ、培地およびサイトカインの灌流によって７日の初期刺激サイクルを受けることとなる。第１の刺激サイクルの終了に続いて、新鮮なＤＣを含有する、任意でより大きい第２のリアクターが、図６Ｂおよび図６Ｃに図示されているように、第１のリアクターに接続される。次いで、無菌空気の注入は、第１のリアクターから第２のリアクターへ上清を移送する。この第２のバイオリアクターは、使い捨ての蠕動ポンプとともに、オンボードのコンテナの中の培地およびサイトカインのそれ自身の供給を含有することとなる。上清の移送に続いて、第１のリアクターは、切り離されて廃棄され得る。このプロセスは、刺激およびＴ細胞増殖の所望のレベルを実現するために、次第に大きくなるバイオリアクターによって、望まれる回数だけ繰り返され得る。たとえば、１つの実施形態では、４回の刺激サイクルが実施され、３つの異なる時間における新しい細胞培養チャンバーへの上清の移送を伴う。第２のチャンバー２２０は、第１の細胞培養チャンバー１２０よりも大きいものとして示されているが、第２のおよび任意の後続の細胞培養チャンバーは、任意のサイズであることが可能であり、たとえば、第１の細胞培養チャンバーよりも大きいサイズであるか、それと同じサイズであるか、または、それよりも小さいサイズであることが可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、それぞれの後続の細胞培養チャンバーは、上清がそこから移送される先行する細胞培養チャンバーよりもサイズが大きくなっている。
【００７４】
モジュール化された設計は、サイクルの数および抗原提示細胞のタイプの両方の観点から柔軟性を提供し、それは、それぞれのサイクルに関して同じセットの抗原を使用するか、それぞれのサイクルに関して異なるセットの抗原を使用するか、または、前者および後者の組み合わせ、のいずれかによって、調製され得る。特定の態様では、１つの自動化されたプロセスの中で、病気に関連付けられる複数の異なる抗原に特有のＴ細胞を作り出す能力は、複数方向からの攻撃（ｍｕｌｔｉ−ｐｒｏｎｇ  ａｔｔａｃｋ）を可能にするので、病気の治療において有利である。
【００７５】
特定の態様では、計算モデリング・アプローチが、Ｔ細胞とＤＣなどの抗原提示細胞との相互作用を最適化するために使用される。本発明による計算モデルは、灌流の影響、および、刺激に必要とされる最適な時間を考慮に入れ、粒子相互作用ベースのアプローチ、および、動態パラメーター・ベースのアプローチの両方を組み込む。例示的な粒子相互作用ベースのアプローチおよび動態パラメーター・ベースのアプローチは、当技術分野で知られており、そのうちのいくつかは本明細書で説明されている。たとえば、粒子相互作用ベースのアプローチに関して、ＤａｙおよびＬｙｔｈｅは、以下の式を使用して、Ｔ細胞がリンパ節の表面の上のＡＰＣを見つけるために必要とされる時間を説明しており、ここで、Ｄは、Ｔ細胞の拡散率であり、ｂは、半径Ｒの球形のリンパ節の中に中央に位置するＡＰＣの半径である。非特許文献１を参照。
【数２】
2019522980.tif 000005
動態パラメーター・ベースのアプローチに関して、Ｖａｌｉｔｕｔｔｉは、図９に示されているように、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の相互作用のモデルを開発した。非特許文献２。しかし、そのような相互作用は、培養チャンバーまたはバイオリアクターの文脈の中でモデル化されていなかった。
【００７６】
粒子相互作用ベースのアプローチおよび動態パラメーター・ベースのアプローチの両方を、本発明の計算モデルの中へ組み込むことによって、２つの細胞タイプが細胞培養チャンバー内で互いに接触している確率を最大化するために、灌流流体（たとえば、サイトカインを輸液された培地）の最適な灌流レートの自動化された決定およびモニタリングが実現され得る。
【００７７】
たとえば、特定の実施形態では、細胞培養チャンバー、および、中央処理装置によって実行可能な命令を保持したメモリーを含む中央処理装置を含む、細胞培養システムが提供される。特定の態様では、命令は、システムに、細胞培養チャンバーのサイズを含むデータを第１の入力として受け取らせ、細胞培養チャンバーの中へ導入される１つまたは複数の流体の中の、第１の細胞タイプの第１の濃度および第２の細胞タイプの第２の濃度を含むデータを第２の入力として受け取らせ、ならびに、第１および第２の入力に基づいて、第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプが細胞培養チャンバー内で互いに接触している確率を最大化する、細胞培養チャンバーの中へ導入される灌流流体の灌流レートを計算させる。細胞培養システム内の本発明の方法を実装するためのコンピューター・システムに関する追加的な詳細が下記に提供される。
【００７８】
いくつかの態様では、システムは１つまたは複数のポンプも含み、１つまたは複数のポンプは、１つまたは複数の灌流流体リザーバーに動作可能に連結されているとともに中央処理装置に動作可能に連結されており、中央処理装置が、１つまたは複数のポンプを制御することによって、灌流流体の灌流レートを制御するようになっている。
【００７９】
上記に説明されているように、本発明のシステムおよび方法は、モジュール（たとえば、細胞培養チャンバーを含有するバイオリアクターなど）を利用し、モジュールは、個体の細胞材料を処理するために、互いに流体連結されており、免疫療法生産物を作り出す。
【００８０】
本発明のシステムまたはデバイスは、モジュール式であり、直列に（すなわち、流体が１つのデバイスから別のデバイスの中へ流れる）および／または並列に、他の同様のデバイスに流体接続することができ、また、互いに物理的に重ねるように構成可能であり、または、インキュベーターなどのような関連のデバイスの中の物理的な配置が可能である。システムのモジュール式の設計は、具体的には、システム内に含まれることとなる所望のプロセスに応じて、モジュールが柔軟にスイッチ・インおよびスイッチ・アウトされることを可能にする。
【００８１】
本発明の流体デバイスは、細胞培養チャンバーを含む生物学的リアクターを含み、本発明の流体デバイスは、マイクロ流体の実施形態（すなわち、その中の１つまたは複数のチャネルまたはチャンバーが約１μｍから約９９９μｍの範囲にある寸法を有する）またはマクロ流体の実施形態（その中のチャネルまたはチャンバーのすべてが約１ｍｍ以上の寸法を有する）のいずれかで、または、その両方で提供され得る。
【００８２】
流体デバイスは、特定の設計によって必要とされるような、追加的な流体チャネルまたはコンパートメント、ガスケットまたはシール、混合ゾーン、バルブ、ポンプ、ベント、加圧ガスのためのチャネル、導電体、試薬、ポート、および管をさらに含むことが可能である。また、流体デバイスは、１つまたは複数の制御モジュール、送信器、受信器、プロセッサー、メモリー・チップ、バッテリー、ディスプレイ、ボタン、コントロール、モーター、空気圧式アクチュエーター、アンテナ、および電気コネクターなどを含有することが可能である。このデバイスは、好ましくは、哺乳類の細胞に対して毒性がない材料だけを含有しており、この材料は、アルコールおよび／または熱もしくは他の手段の使用による殺菌、たとえば、ガンマ線またはエチレンオキシド・ガスへの露出などによる殺菌に適合している。
【００８３】
機器の材料は、それぞれのプロセスに特有の異なる温度および圧力定格の下での適当な化学的適合性によって選ばれる。追加的に、シリンジポンプ、蠕動ポンプ、圧力ポンプ、および回転ポンプなど、デバイスの中の実装されるポンプの選択は、異なる機能に関するフローおよび圧力要件に応じて、流量がｎＬからｍＬ、および、圧力が１０ｐｓｉから１０，０００ｐｓｉの範囲にある。
【００８４】
また、本発明のシステムは、１つまたは複数のサンプル溶液リザーバーもしくはウェル、または、モジュールのさまざまな入口部において、入口部チャネルに流体連通しているデバイスへサンプルを導入するための他の装置を含むことが可能である。本発明の流体デバイスの上に１つまたは複数のサンプルをロードするために使用されるリザーバーおよびウェルは、それに限定されないが、シリンジ、カートリッジ、バイアル、エッペンドルフ・チューブ、および細胞培養材料（たとえば、９６ウェル・プレート）を含む。
【００８５】
有用である場合、デバイスの表面は、たとえばプラズマへの露出などによってより親水性にされ得、または、１つまたは複数のゲル、化学的機能化コーティング、タンパク質、抗体、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、サイトカイン、または細胞によってコーティングされ得る。本発明の流体デバイスは、好ましくは、動作条件下で流体の漏れがなく、数日から数週間の期間にわたって無菌動作が可能である。また、本発明の流体デバイスは、サンプリング・メカニズムを含み、サンプリング・メカニズムは、新しい材料または汚染物質をシステムへ導入することなくテストするために、流体がシステムから除去されることを可能にする。
【００８６】
特定の態様では、細胞培養システムの少なくとも一部は、使い捨てのコンポーネントを含み、使い捨てのコンポーネントのうちのいくつかまたはすべては、非使い捨てのフレームの中に収容され得る。他の態様では、システムのすべてのコンポーネントが使い捨てである。さらに、いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、患者材料をトラッキングおよび記録するためのサンプル・トラッキング・コンポーネントを含む。
【００８７】
製造プロセスの間の少なくとも１つのステップ、および、ときには、複数のまたはすべてのステップは、さまざまなインライン・プロセス分析ツール（ＰＡＴ）または小型化されたマイクロ総合分析システム（マイクロＴＡＳ）を使用して、生産物特質（たとえば、純度および多形相）に関してモニタリングされる。
【００８８】
上記に説明されているように、本発明の細胞培養システムは、システムの中の流体およびエンティティーの方向およびフローを制御することができる。本発明のシステムは、圧力駆動フロー制御を使用する、たとえば、バルブおよびポンプを利用することが可能であり、細胞、試薬などのフローを、１つまたは複数の方向に、および／または、流体デバイスの１つもしくは複数のチャネルの中へ操作する。しかし、電気浸透フロー制御、電気泳動、および誘電泳動（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；特許文献３）などの他の方法も、単独で、またはポンプおよびバルブと組み合わせて使用され得る。
【００８９】
また、本発明のシステムは、システムを通る流体の移動を制御するために；システムの中のさまざまなパラメーター、たとえば、温度などをモニタリングおよび制御するために；ならびに、細胞ベースの免疫療法生産物の存在、生産物の量（直接的にまたは間接的に）、変換レートなどを検出するために、１つまたは複数の制御システムを含むか、または、１つまたは複数の制御システムに動作可能に連結され得る。また、システムは、たとえば、フィードバック制御を可能にする先進的なリアルタイム・プロセス・モニタリングおよび制御プロセス、ならびに、システムを使用して取得される反応および精製結果を所与として統合およびスケール・アップを可能にするプロセスなど、多数のクラスのソフトウェアを装備していることが可能である。
【００９０】
特定の実施形態では、システムは、マイクロ流体モジュール、ミリ流体モジュール、またはマクロ流体モジュール、および、管の組み合わせを含み、管は、チャネル寸法、フロー幾何学形状、および、デバイスの異なるモジュール同士の間の相互接続の観点から相互交換可能である。それぞれのモジュールおよび管は、特定の機能に関して設計され得る。１つの実施形態では、システムの中のモジュールのすべては、細胞培養およびＴ細胞刺激のために設計されている。他の実施形態では、システムを備えたモジュールは、組織処理、樹状細胞発生、細胞培養、濃度、および／または精製などのような、異なる機能のために設計されており、すべては、免疫療法生産物の連続的な製造のために統合されている。均質なプロセスおよび不均質なプロセスの両方が考えられ、これらはフロー用途に適切である。これらのプロセスは、出発材料および動作条件、たとえば、温度、圧力および流量などに関して、設計および最適化され、フロー・プロセスの間にシステムを容易に停滞させないようになっている。
【００９１】
デバイス・スケール・アップの方法は、それぞれのプロセス定数および次元パラメーターに対して特徴的な無次元パラメーターのセットを上側および下側境界限界値内に維持しながら、モジュール・リアクターの並列追加、または、モジュール・チャネルの拡大によって実施される。プロセス統合および最適化の間に、温度、圧力、流量、およびチャネル寸法を含む、プロセス決定変数は、収量、純度、およびスループットの間の所望のトレード・オフを実現するように変化させられる。最適化プロセスの全体を通して、上述のセットの無次元パラメーターは、動作制約を伴う代数的最適化を受ける。動作制約は、決定変数の下側境界および上側境界である。目的関数は、純度、収量、およびスループット動作変数の組み合わせを考慮する。無次元パラメーターは、デバイスの定常状態品質を決定するが、デバイスのスタート・アップ品質も有用である。その理由は、これが、定常状態に到達するために必要とされる時間を決定し、そして、ラグ・タイムおよび廃棄物の形態の、デバイスの生産性を決定するからである。スタート・アップ・ダイナミクスは、シミュレーションおよび実験の両方を使用して分析され、これらの結果は、リアルタイム・フィードバック制御の実装形態によってスタート・アップ最適化を実施するために使用される。
【００９２】
たとえば、上記に説明したような、システムを通る流体の移動の制御、ならびに、さまざまなパラメーターのモニタリングおよび制御など、本明細書で説明される本開示の態様は、プロセッサー、たとえば、中央処理装置を含む任意のタイプのコンピューティング・デバイス、たとえば、コンピューターまたはプログラマブル論理制御装置（ＰＬＣ）などを使用して、または、それぞれのデバイスがプロセスもしくは方法の少なくとも一部を実施する、コンピューティング・デバイスの任意の組み合わせを使用して、実施され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるシステムおよび方法は、ハンドヘルド・デバイス、たとえば、スマート・タブレット、スマート・フォン、または、システムのために作り出された特殊デバイスによって実施され得る。
【００９３】
本開示の方法は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、ハードワイヤリング、または、これらのうちのいずれかの組み合わせを使用して実施され得る。また、機能を実装する特徴は、さまざまな位置に物理的に位置することができ、それは、異なる物理的な場所において機能の一部分が実装されるように分配されることを含む（たとえば、たとえば、無線接続または有線接続によって、１つの部屋の中にイメージング装置を置き、別の部屋または別個の建物の中にホスト・ワークステーションを置く）。
【００９４】
コンピューター・プログラムの実行のために適切なプロセッサーは、例として、汎用および特殊目的マイクロプロセッサーの両方、ならびに、任意の種類のデジタル・コンピューターの任意の１つまたは複数のプロセッサーを含む。一般的に、プロセッサーは、リード・オンリー・メモリーもしくはランダム・アクセス・メモリーまたはその両方から、命令およびデータを受け取る。コンピューターのエレメントは、命令を実行するためのプロセッサー、ならびに、命令およびデータを記憶するための１つまたは複数のメモリー・デバイスである。一般的に、コンピューターは、また、データを記憶するための１つまたは複数の非一時的な大容量記憶デバイス、たとえば、磁気ディスク、光磁気ディスク、または光ディスクを含むか、または、そこからデータを受け取るかもしくはそこへデータを転送するために、そこに動作可能に連結されているか、または、その両方である。コンピューター・プログラム命令およびデータを具現化するために適切な情報キャリアは、すべての形態の不揮発性のメモリーを含み、それは、例として、半導体メモリー・デバイス（たとえば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ソリッド・ステート・ドライブ（ＳＳＤ）、およびフラッシュ・メモリー・デバイス）；磁気ディスク（たとえば、内部ハード・ディスクまたはリムーバブル・ディスク）；光磁気ディスク；ならびに光ディスク（たとえば、ＣＤおよびＤＶＤディスク）を含む。プロセッサーおよびメモリーは、特殊目的論理回路によって補完され得るか、または、特殊目的論理回路の中に組み込まれ得る。
【００９５】
ユーザーとの相互作用を提供するために、本明細書で説明される主題は、Ｉ／Ｏデバイスを有するコンピューターの上で実装され得、Ｉ／Ｏデバイスは、たとえば、ＣＲＴ、ＬＣＤ、ＬＥＤ、または、ユーザーに情報を表示するための投影デバイス、ならびに、キーボードおよびポインティング・デバイス（たとえば、マウスまたはトラックボール）などの入力または出力デバイスであり、それによってユーザーは入力をコンピューターに提供することが可能である。他の種類のデバイスも、同様に、ユーザーとの相互作用を提供するために使用され得る。たとえば、ユーザーに提供されるフィードバックは、任意の形態の感覚フィードバック（たとえば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、または触覚フィードバック）であることが可能であり、ユーザーからの入力は、音響入力、音声入力、または触覚入力を含む、任意の形態で受け取られ得る。
【００９６】
本明細書で説明されている主題は、バック・エンド・コンポーネント（たとえば、データ・サーバー）、ミドルウェア・コンポーネント（たとえば、アプリケーション・サーバー）、もしくはフロント・エンド・コンポーネント（たとえば、グラフィカル・ユーザー・インターフェースまたはウェブ・ブラウザ（それを通して、ユーザーは、本明細書で説明されている主題の実装形態と相互作用することが可能である）を有するクライアント・コンピューター）、または、そのようなバック・エンド・コンポーネント、ミドルウェア・コンポーネント、およびフロント・エンド・コンポーネントの任意の組み合わせを含む、コンピューティング・システムの中で実装され得る。システムのコンポーネントは、デジタル・データ通信の任意の形態または媒体、たとえば、通信ネットワークなどによって、ネットワークを通して相互接続され得る。通信ネットワークの例は、セル・ネットワーク（たとえば、３Ｇまたは４Ｇ）、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）、およびワイド・エリア・ネットワーク（ＷＡＮ）、たとえば、インターネットを含む。
【００９７】
本明細書で説明される主題は、１つまたは複数のコンピューター・プログラム製品として実装可能であり、それは、たとえば、データ処理装置（たとえば、プログラマブル・プロセッサー、コンピューター、または複数のコンピューター）によって実行するために、または、その動作を制御するために、情報キャリアの中で（たとえば、非一時的なコンピューター可読媒体の中で）有形的に具現化された１つまたは複数のコンピューター・プログラムなどである。コンピューター・プログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェア・アプリケーション、アプリ、マクロ、またはコードとして知られる）は、コンパイル言語または解釈言語（たとえば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ）を含む、任意の形態のプログラミング言語で書かれることができ、また、任意の形態で開発可能であり、スタンド・アロン・プログラムとして、または、モジュール、コンポーネント、サブルーチン、もしくはコンピューティング環境において使用するのに適切な他のユニットとして、展開されることを含む。本発明のシステムおよび方法は、それに限定されないが、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ（登録商標）、アクティブＸ、ＨＴＭＬ５、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、またはＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）を含む、当技術分野において知られている任意の適切なプログラミング言語で書き込まれた命令を含むことが可能である。
【００９８】
コンピューター・プログラムは、必ずしも、ファイルに対応しているわけではない。プログラムは、ファイル、または、ファイルの一部分の中に記憶可能であり、ファイルは、問題のプログラム専用の単一のファイルの中に、または、複数の協調ファイル（たとえば、１つまたは複数のモジュール、サブ・プログラム、または、コードの一部分を記憶するファイル）の中に、他のプログラムまたはデータを保持している。コンピューター・プログラムは、１つのコンピューターの上で実行されるように展開され得るか、もしくは、１つのサイトにおいて複数のコンピューターの上で実行されるように展開され得、または、複数のサイトにわたって分配され、通信ネットワークによって相互接続され得る。
【００９９】
ファイルは、たとえば、ハードドライブ、ＳＳＤ、ＣＤ、または、他の有形の非一時的な媒体の上に記憶される、デジタル・ファイルであることが可能である。ファイルは、ネットワーク（たとえば、ネットワーク・インターフェース・カード、モデム、ワイヤレス・カード、または類似物を通して、たとえば、サーバーからクライアントへ送られるパケットとして）を経由して、１つのデバイスから別のデバイスへ送られ得る。
【０１００】
本発明の実施形態よるファイルの書き込みは、たとえば、粒子を追加、除去、または再配置することによって、有形の非一時的なコンピューター可読の媒体を変換することを伴い（たとえば、読み取り／書き込みヘッドによって、実効電荷または双極子モーメントを磁化のパターンへ）、パターンは、次いで、ユーザーによって望まれ、かつ、ユーザーに有用である、客観的物理現象についての情報の新しいコロケーションを表している。いくつかの実施形態では、書き込むことは、有形の非一時的なコンピューター可読媒体の中の材料の物理的な変換を伴う（たとえば、光学的な読み取り／書き込みデバイスが、次いで、情報の新しい有用なコロケーションを読み取ることができるように、特定の光学的な特性とともに、たとえば、ＣＤ−ＲＯＭに焼き付ける）。いくつかの実施形態では、ファイルに書き込むことは、ＮＡＮＤフラッシュ・メモリー・デバイスなどのような、物理的なフラッシュ・メモリー装置を変換することを含み、また、フローティング・ゲート・トランジスターから作製されるメモリー・セルのアレイの中の物理的なエレメントを変換することによって、情報を記憶することを含む。ファイルを書き込む方法は、当技術分野において周知であり、たとえば、手動でまたは自動的に、プログラムによって、または、ソフトウェアからの保存コマンド、もしくは、プログラミング言語からの書き込みコマンドによって、起動され得る。
【０１０１】
適切なコンピューティング・デバイスは、典型的に、大容量メモリーと、少なくとも１つのグラフィカル・ユーザー・インターフェースと、少なくとも１つのディスプレイ・デバイスとを含み、典型的に、デバイス同士の間の通信を含む。大容量メモリーは、あるタイプのコンピューター可読媒体、すなわち、コンピューター・ストレージ媒体を図示している。コンピューター・ストレージ媒体は、コンピューター可読命令、データ構造、プログラム・モジュール、または他のデータなどのような、情報の記憶のための任意の方法または技術の中で実装される、揮発性の媒体、不揮発性の媒体、リムーバブル媒体、および非リムーバブル媒体を含むことが可能である。コンピューター・ストレージ媒体の例は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュ・メモリー、または他のメモリー技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、または、他の光学ストレージ、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク・ストレージ、または、他の磁気ストレージ・デバイス、無線周波数識別タグ、もしくはチップ、または、所望の情報を記憶するために使用でき、かつ、コンピューティング・デバイスによってアクセスされ得る、任意の他の媒体を含む。
【０１０２】
本発明の方法の実施のために必要であるかまたは最も適するものとして当業者に認識されるように、本発明の実施形態の中で用いられるコンピューター・システムまたはマシンは、１つまたは複数のプロセッサー（たとえば、中央処理装置（ＣＰＵ）、グラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）、または、その両方）、メイン・メモリー、および静的なメモリーを含むことが可能であり、それらは、バスを介して互いに通信する。
【０１０３】
図１０に示されている例示的な実施形態では、システム６００は、コンピューター６４９（たとえば、ラップトップ、デスクトップ、またはタブレット）を含むことが可能である。コンピューター６４９は、ネットワーク６０９を横切って通信するように構成され得る。コンピューター６４９は、１つまたは複数のプロセッサー６５９およびメモリー６６３、ならびに、入力／出力メカニズム６５４を含む。本発明の方法がクライアント／サーバー・アーキテクチャーを用いる場合、本発明の方法の動作は、サーバー６１３を使用して実施可能であり、サーバー６１３は、プロセッサー６２１およびメモリー６２９のうちの１つまたは複数を含み、データ、命令などを取得することができ、または、インターフェース・モジュール６２５を介して結果を提供するか、または、ファイル６１７として結果を提供することができる。サーバー６１３は、コンピューター６４９または端末６６７を通してネットワーク６０９を経由して係合され得るか、または、サーバー６１３は、端末６６７に直接的に接続可能であり、端末６６７は、１つまたは複数のプロセッサー６７５およびメモリー６７９、ならびに、入力／出力メカニズム６７１を含む。
【０１０４】
本発明の例示的な実施形態によるシステム６００またはマシンは、任意のＩ／Ｏ６４９、６３７、または６７１のいずれかに関して、ビデオ・ディスプレイ・ユニット（たとえば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）または陰極線管（ＣＲＴ））をさらに含むことが可能である。また、いくつかの実施形態によるコンピューター・システムまたはマシンは、英数字入力デバイス（たとえば、キーボード）、カーソル制御デバイス（たとえば、マウス）、ディスク・ドライブ・ユニット、信号発生デバイス（たとえば、スピーカー）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロホン、セルラー無線周波数アンテナ、および、ネットワーク・インターフェース・デバイスを含むことが可能であり、それは、たとえば、ネットワーク・インターフェース・カード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、またはセルラー・モデムであることが可能である。
【０１０５】
本発明の例示的な実施形態によるメモリー６６３、６７９、または６２９は、機械可読媒体を含むことが可能であり、本明細書で説明されている方法論または機能のうちの任意の１つまたは複数を具現化する、１つまたは複数のセットの命令（たとえば、ソフトウェア）が、機械可読媒体の上に記憶される。また、ソフトウェアは、完全にまたは少なくとも部分的に、メイン・メモリーの中に、および／または、コンピューター・システムによるその実行の間にプロセッサーの中に、存在することが可能であり、メイン・メモリーおよびプロセッサーは、また、機械可読媒体を構成している。ソフトウェアは、ネットワーク・インターフェース・デバイスを介して、ネットワークを経由して、さらに送信または受信され得る。
【０１０６】
参照による組み込み
特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、ウェブ・コンテンツなどのような、他の文献への参照および引用が、本開示の全体を通して行われた。すべてのそのような文献は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０７】
均等物
本発明は特定の実施形態に関連して説明されてきたが、先述の明細書を読んだ後に、当業者は、本明細書で記述されている組成および方法に対するさまざまな変形例、均等物の置換例、および、他の代替例を実現することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図７】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図８（Ｃ）】
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【図８（Ｄ）】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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