(57)【要約】【要約諸】  本発明は、Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤の組合せを提供する。本発明はまた、必要とするヒトにおいて癌を処置するための方法であって、そのヒトにＩ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の組合せを薬学上許容可能な担体および薬学上許容可能な希釈剤のうち少なくとも一つとともに投与し、それにより、そのヒトにおいて癌を処置することを含んでなる方法を提供する。本発明はさらに、治療上有効な量のＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量のＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含んでなる第２の医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤との組合せ。
【請求項２】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（Ｉ）：
【化１】
2019535800.tif 000038
［式中、
ＸはＮであり、ＺはＮＲ４であり、かつ、ＹはＣＲ５であるか；または
ＸはＮＲ４であり、ＺはＮであり、かつ、ＹはＣＲ５であるか；または
ＸはＣＲ５であり、ＺはＮＲ４であり、かつ、ＹはＮであるか；または
ＸはＣＲ５であり、ＺはＮであり、かつ、ＹはＮＲ４であり；
ＲＸは、置換されていてもよいＣ１−４アルキルまたは置換されていてもよいＣ３−４シクロアルキルであり；
Ｌ１は、結合、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＢ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＢ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）−、または置換されていてもよいＣ１−６飽和もしくは不飽和炭化水素鎖であり、ここで、前記炭化水素鎖の１以上のメチレン単位は、独立に、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＢ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＢ）ＳＯ２−、または−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）−で置換されていてもよく；
各ＲＡは独立に、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、酸素原子と結合している場合には酸素保護基、および硫黄原子と結合している場合には硫黄保護基からなる群から選択され；
各ＲＢは独立に、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および窒素保護基からなる群から選択されるか、または同じ窒素原子上のＲＢとＲＷは、間にある窒素と一緒に置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；
ＲＷは、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；ただし、Ｌ１が結合である場合には、ＲＷは、水素、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールでなく；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキル、またはＣ３−４シクロアルキルであり；
Ｒ４は、水素、置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル、置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル、置換されていてもよい４〜７員のヘテロシクリル；または置換されていてもよいＣ１−４アルキル−Ｃｙであり；
Ｃｙは、置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル、置換されていてもよい４〜７員のヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；かつ、
Ｒ５は、水素、ハロ、−ＣＮ、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、または置換されていてもよいＣ３−４シクロアルキルである］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１または２に記載の組合せ。
【請求項５】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（ＩＩ）：
【化２】
2019535800.tif 000039
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項６】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、−Ｌ１−ＲＷが置換されていてもよいカルボシクリルである式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物である、請求項４または５に記載の組合せ。
【請求項７】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、化合物Ａ：
【化３】
2019535800.tif 000040
またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１〜２および４〜６のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項８】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（ＩＩＩ）：
【化４】
2019535800.tif 000041
［式中、
【化５】
2019535800.tif 000042
は、単結合または二重結合を表し；
Ｒ１は、水素、Ｒｚ、または−Ｃ（Ｏ）Ｒｚであり、ここで、Ｒｚは、置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−であり；
各Ｒは、独立に、水素または置換されていてもよいＣ１−６脂肪族であり；
Ａｒは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する単環式または二環式芳香環であり、ここで、Ａｒは、原子価が許容する限り、０、１、２、３、４、または５個のＲｙ基で置換され；
各Ｒｙは独立に、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−ＳＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＳＣ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）ＲＢ、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＯＳ（Ｏ）２ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＮＲＢＳＯ２ＲＡ、または−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２からなる群から選択され；
各ＲＡは独立に、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され；
各ＲＢは独立に、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択されるか、または２個のＲＢ基は、それらの間にある原子と一緒に置換されていてもよい複素環式環を形成し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は独立に、水素、ハロ、または置換されていてもよい脂肪族であり；
各ＲＸは独立に、ハロ、−ＣＮ、置換されていてもよい脂肪族、−ＯＲ’、および−Ｎ（Ｒ”）２からなる群から選択され；
Ｒ’は、水素または置換されていてもよい脂肪族であり；
各Ｒ”は独立に、水素または置換されていてもよい脂肪族であるか、または２個のＲ”は、それらの間にある原子と一緒に複素環式環を形成し；かつ、
ｎは、原子価が許容する限り、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１または３に記載の組合せ。
【請求項９】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（Ｘ）：
【化６】
2019535800.tif 000043
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１、３、または８に記載の組合せ。
【請求項１０】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、化合物Ｃ：
【化７】
2019535800.tif 000044
またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１、３、８および９のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１１】
Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤との組合せであって、前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、化合物Ａ：
【化８】
2019535800.tif 000045
またはその薬学上許容可能な塩であり、かつ、前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、化合物Ｃ：
【化９】
2019535800.tif 000046
またはその薬学上許容可能な塩である、組合せ。
【請求項１２】
必要とするヒトにおいて癌を処置する方法であって、前記ヒトに請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組合せを、薬学上許容可能な担体および薬学上許容可能な希釈剤のうち少なくとも一つとともに投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる、方法。
【請求項１３】
治療上有効な量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量のＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる第２の医薬組成物。
【請求項１４】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（Ｉ）：
【化１０】
2019535800.tif 000047
［式中、
ＸはＮであり、ＺはＮＲ４であり、かつ、ＹはＣＲ５であるか；または
ＸはＮＲ４であり、ＺはＮであり、かつ、ＹはＣＲ５であるか；または
ＸはＣＲ５であり、ＺはＮＲ４であり、かつ、ＹはＮであるか；または
ＸはＣＲ５であり、ＺはＮであり、かつ、ＹはＮＲ４であり；
ＲＸは、置換されていてもよいＣ１−４アルキルまたは置換されていてもよいＣ３−４シクロアルキルであり；
Ｌ１は、結合、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＢ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＢ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）−、または置換されていてもよいＣ１−６飽和もしくは不飽和炭化水素鎖であり、ここで、前記炭化水素鎖の１以上のメチレン単位は、独立に、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＢ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＢ）ＳＯ２−、または−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）−で置換されていてもよく；
各ＲＡは独立に、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、酸素原子と結合している場合には酸素保護基、および硫黄原子と結合している場合には硫黄保護基からなる群から選択され；
各ＲＢは独立に、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、および窒素保護基からなる群から選択されるか、または同じ窒素原子上のＲＢとＲＷは、間にある窒素と一緒に置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；
ＲＷは、水素、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；ただし、Ｌ１が結合である場合には、ＲＷは、水素、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールでなく；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキル、またはＣ３−４シクロアルキルであり；
Ｒ４は、水素、置換されていてもよいＣ１−６アルキル、置換されていてもよいＣ２−６アルケニル、置換されていてもよいＣ２−６アルキニル、置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル、置換されていてもよい４〜７員のヘテロシクリル；または置換されていてもよいＣ１−４アルキル−Ｃｙであり；
Ｃｙは、置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル、置換されていてもよい４〜７員のヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、または置換されていてもよいヘテロアリールであり；かつ、
Ｒ５は、水素、ハロ、−ＣＮ、置換されていてもよいＣ１−４アルキル、または置換されていてもよいＣ３−４シクロアルキルである］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（ＩＩ）：
【化１１】
2019535800.tif 000048
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１３、１４、または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤が、−Ｌ１−ＲＷが置換されていてもよいカルボシクリルである式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物である、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ＰＲＭＴ１阻害剤が、化合物Ａ：
【化１２】
2019535800.tif 000049
またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１３〜１４および１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ＩＩ型阻害剤が、式（ＩＩＩ）：
【化１３】
2019535800.tif 000050
［式中、
【化１４】
2019535800.tif 000051
は、単結合または二重結合を表し；
Ｒ１は、水素、Ｒｚ、または−Ｃ（Ｏ）Ｒｚであり、ここで、Ｒｚは、置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−，−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−であり；
各Ｒは、独立に、水素または置換されていてもよいＣ１−６脂肪族であり；
Ａｒは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する単環式または二環式芳香環であり、ここで、Ａｒは、原子価が許容する限り、０、１、２、３、４、または５個のＲｙ基で置換され；
各Ｒｙは独立に、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−ＳＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＳＣ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）ＲＢ、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＯＳ（Ｏ）２ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＮＲＢＳＯ２ＲＡ、または−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２からなる群から選択され；
各ＲＡは独立に、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され；
各ＲＢは独立に、水素、置換されていてもよい脂肪族、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択されるか、または２個のＲＢ基は、それらの間にある原子と一緒に置換されていてもよい複素環式環を形成し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は独立に、水素、ハロ、または置換されていてもよい脂肪族であり；
各ＲＸは独立に、ハロ、−ＣＮ、置換されていてもよい脂肪族、−ＯＲ’、および−Ｎ（Ｒ”）２からなる群から選択され；
Ｒ’は、水素または置換されていてもよい脂肪族であり；
各Ｒ”は独立に、水素または置換されていてもよい脂肪族であるか、または２個のＲ”は、それらの間にある原子と一緒に複素環式環を形成し；かつ、
ｎは、原子価が許容する限り、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である］
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１３または１５に記の組合せ。
【請求項２１】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、式（Ｘ）：
【化１５】
2019535800.tif 000052
の化合物またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１３、１５、または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、化合物Ｃ：
【化１６】
2019535800.tif 000053
またはその薬学上許容可能な塩である、請求項１３、１５、２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
治療上有効な量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量のＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる第２の医薬組成物であって、前記ＰＲＭＴ１阻害剤が、化合物Ａ：
【化１７】
2019535800.tif 000054
またはその薬学上許容可能な塩であり、かつ、前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、化合物Ｃ：
【化１８】
2019535800.tif 000055
またはその薬学上許容可能な塩である、医薬組成物。
【請求項２４】
必要とするヒトにおいて癌を処置する方法であって、前記ヒトに治療上有効な量の請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤と前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が、同時、任意の順序で逐次、全身、経口、静脈内、および腫瘍内から選択される経路で患者に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤および／または前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が経口投与される、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤と前記ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤が約１：１比で投与される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌が固形腫瘍または血液癌である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌が黒色腫、乳癌、リンパ腫、または膀胱癌である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
医薬の製造のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組合せの使用。
【請求項３１】
癌の処置のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において癌を処置する方法およびそのような処置に有用な組合せに関する。特に、本発明は、Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を含む過剰増殖性疾患の有効な治療は、腫瘍学分野において継続的な目標である。一般に、癌は、細胞の分裂、分化およびアポトーシス細胞死を制御する正常なプロセスの調節解除に起因し、制限されない成長、局部的拡大および全身転移の能力を有する悪性細胞の増殖を特徴とする。正常なプロセスの調節解除としては、シグナル伝達経路の異常および正常細胞に見られるものとは異なる因子への応答が含まれる。
【０００３】
アルギニンのメチル化は、遺伝子調節、ＲＮＡプロセシング、ＤＮＡ損傷応答、およびシグナル伝達などの多様な細胞プロセスに関与するタンパク質における重要な翻訳後修飾である。メチル化アルギニンを含有するタンパク質は核および細胞質画分の両方に存在し、アルギニン上へのメチル基の転移を触媒する酵素もまたこれらの細胞下コンパートメントに存在することが示唆される（Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013); Lee, Y. H. & Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol 23, 425-433, doi:10.1210/me.2008-0380 (2009)に総説）。哺乳動物細胞において、メチル化アルギニンは、ω−ＮＧ−モノメチル−アルギニン（ＭＭＡ）、ω−ＮＧ，ＮＧ−非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、またはω−ＮＧ，Ｎ’Ｇ−対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）の３つの主要な形態で存在する。各メチル化状態は、タンパク質間相互作用に異なる影響を及ぼし、従って、基質の生物活性に明瞭に異なる機能的結果を与える能力を持つ(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013))。
【０００４】
アルギニンのメチル化は、主として、メチル基をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）から基質であるアルギニン側鎖に転移してＳ−アデノシル−ホモシステイン（ＳＡＨ）およびメチル化アルギニンを生成するタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）ファミリーの活性を介して、グリシンリッチ、アルギニンリッチ（ＧＡＲ）モチーフの配列要素に生じる。このタンパク質ファミリーは１０種のメンバーからなり、そのうち９種が酵素活性を有することが示されている(Bedford, M. T. & Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell 33, 1-13, doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013 (2009))。ＰＲＭＴファミリーは、酵素反応の生成物によって４つのサブタイプ（Ｉ〜ＩＶ型）に類別される。ＩＶ型酵素は、内部グアニジノ窒素をメチル化し、酵母でのみ記載があり(Fisk, J. C. & Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryot Cell 10, 1013-1022, doi:10.1128/EC.05103-11 (2011))；Ｉ〜ＩＩＩ型酵素は、単一のメチル化事象によってモノメチル−アルギニン（ＭＭＡ、Ｒｍｅ１）を生じる。ＭＭＡ中間体は、比較的存在量の少ない中間体と考えられているが、ＰＲＭＴ７の主要ＩＩＩ型活性の選択基質はモノメチル化型に留まり、一方、Ｉ型およびＩＩ型酵素はＭＭＡからそれぞれ非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ、Ｒｍｅ２ａ）または対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ、Ｒｍｅ２ｓ）への進行を触媒する。ＩＩ型ＰＲＭＴにはＰＲＭＴ５とＰＲＭＴ９が含まれるが、ＰＲＭＴ５は、対称性ジメチル化の形成を担う主要な酵素である。Ｉ型酵素にはＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６およびＰＲＭＴ８が含まれる。ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、およびＰＲＭＴ６は遍在発現するが、ＰＲＭＴ８は主として脳に限られる（Bedford, M. T. & Clarke, S. G. Protein arginine methyla
tion in mammals: who, what, and why. Mol Cell 33, 1-13, doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013 (2009)に総説）。
【０００５】
ＰＲＭＴ１の誤調節および過剰発現は、いくつかの固形癌および造血系癌と関連が見出されている(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013); Yoshimatsu, M. et al. Dysregulation of PRMT1 and PRMT6, Type I arginine methyltransferases, is involved in various types of human cancers. Int J Cancer 128, 562-573, doi:10.1002/ijc.25366 (2011))。ＰＲＭＴ１と癌の生物学との関連は、主として、関連基質上に見られるアルギニン残基のメチル化の調節を介したものであった。いくつかの腫瘍種で、ＰＲＭＴ１は、ヒストンＨ４のメチル化を介して(Takai, H. et al. 5-Hydroxymethylcytosine plays a critical role in glioblastomagenesis by recruiting the CHTOP-methylosome complex. Cell Rep 9, 48-60, doi:10.1016/j.celrep.2014.08.071 (2014); Shia, W. J. et al. PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cell proliferative potential. Blood 119, 4953-4962, doi:10.1182/blood-2011-04-347476 (2012); Zhao, X. et al. Methylation of RUNX1 by PRMT1 abrogates SIN3A binding and potentiates its transcriptional activity. Genes Dev 22, 640-653, doi:10.110
1/gad.1632608 (2008)、ならびに非ヒストン基質に対するその活性を介して(Wei, H., Mundade, R., Lange, K. C. & Lu, T. Protein arginine methylation of non-histone proteins and its role in diseases. Cell Cycle 13, 32-41, doi:10.4161/cc.27353 (2014))、異常な発癌プログラムの発現を駆動し得る。これらの実験系の多くでは、その基質のＰＲＭＴ１依存性ＡＤＭＡ修飾の混乱が癌細胞の増殖能を低下させる(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013))。
【０００６】
ＰＲＭＴ５は、細胞質および核内で数種の複合体として機能し、基質の認識および選択性にはＰＲＭＴ５の結合相手が必要とされる。メチロソームタンパク質５０（ＭＥＰ５０）は、ヒストンおよびその他の基質に対するＰＲＭＴ５の結合および活性に必要とされるＰＲＭＴ５の既知の補因子である(Ho MC, et al. Structure of the arginine methyltransferase PRMT5-MEP50 reveals a mechanism for substrate specificity. PLoS One. 2013;8(2))。
【０００７】
ＰＲＭＴ５は、複数のタンパク質の、優先的にはアルギニン残基およびグリシン残基が豊富な領域で、アルギニンを対称的にメチル化する(Karkhanis V, et al. Versatility of PRMT5-induced methylation in growth control and development. Trends Biochem Sci. 2011 Dec;36(12):633-41)。ＰＲＭＴ５は、スプライシング因子、ヒストン、転写因子、キナーゼおよびその他を含む種々の細胞タンパク質のアルギニンをメチル化する(Karkhanis V, et al. Versatility of PRMT5-induced methylation in growth control and development. Trends Biochem Sci. 2011 Dec;36(12):633-41)。スプライセオソームの複数の成分のメチル化は、スプライセオソームの組み立てに重要な事象であり、ノックダウンまたは遺伝子ノックアウトによるＰＲＭＴ５活性の減弱は、細胞スプライシングの混乱をもたらす(Bezzi M, et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes Dev. 2013 Sep 1;27(17):1903-16)。ＰＲＭＴ５はまた、ヒストンのアルギニン残基（Ｈ３Ｒ８、Ｈ２ＡＲ３およびＨ４Ｒ３）もメチル化し、これらのヒストンマークは、ＲＢおよびＳＴ７などの腫瘍抑制遺伝子の転写サイレンシングに関連する(Wang L, Pal S, Sif S. Protein arginine methyltransferase 5 suppresses the transcription of the RB family of tumor suppressors in leukemia and lymphoma cells. Mol Cell Biol. 2008 Oct;28(20):6262-77)。加えて、Ｈ２ＡＲ３の対称性のジメチル化は、胚性幹細胞における分化遺伝子のサイレンシングに関連付けられている(Tee WW, Pardo M, Theunissen TW, Yu L, Choudhary JS, Hajkova P, Surani MA. Prmt5 is essential for early mouse development and acts in the cytoplasm to maintain ES cell pluripotency. Genes Dev. 2010 Dec 15;24(24):2772-7)。ＰＲＭＴ５はまた、ＥＧＦＲおよびＰＩ３Ｋのメチル化を介して細胞シグナル伝達に役割を果たす(Hsu JM, Chen CT, Chou CK, Kuo HP, Li LY, Lin CY, Lee HJ, Wang YN, Liu M, Liao HW, Shi B, Lai CC, Bedford MT, Tsai CH, Hung MC. Crosstalk between Arg 1175 methylation and Tyr 1173 phosphorylation negatively modulates EGFR-mediated ERK activation. Nat Cell Biol. 2011 Feb;13(2):174-81; Wei TY, Juan CC, Hisa JY, Su LJ, Lee YC, Chou HY, Chen JM, Wu YC, Chiu SC, Hsu CP, Liu KL, Yu CT. Protein arginine methyltransferase 5 is a potential oncoprotein that upregulates G1 cyclins/cyclin-dependent kinases and the phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling cascade. Cancer Sci. 2012 Sep;103(9):1640-50)。
【０００８】
ＰＲＭＴ５は腫瘍形成に関与していることを示唆する証拠が増えている。ＰＲＭＴ５タンパク質は、リンパ腫、神経膠腫、乳癌および肺癌を含むいくつかの癌種で過剰発現され、ＰＲＭＴ５の過剰発現だけで正常な線維芽細胞を悪性移行させるのに十分である(Pal S, Baiocchi RA, Byrd JC, Grever MR, Jacob ST, Sif S. Low levels of miR-92b/96 induce PRMT5 translation and H3R8/H4R3 methylation in mantle cell lymphoma. EMBO J. 2007 Aug 8;26(15):3558-69; Ibrahim R, et al. Expression of PRMT5 in lung adenocarcinoma and its significance in epithelial-mesenchymal transition. Hum Pathol. 2014 Jul;45(7):1397-405; Powers MA, et al. Protein arginine methyltransferase 5 accelerates tumor growth by arginine methylation of the tumor suppressor programmed cell death 4. Cancer Res. 2011 Aug 15;71(16):5579-87; Yan F, et al. Genetic validation of the protein arginine methyltransferase PRMT5 as a candidate therapeutic target in glioblastoma. Cancer Res. 2014 Mar 15;74(6):1752-65)。ＰＲＭＴ５のノックダウンは多くの場合、癌細胞株において細胞の増殖および生存の低減をもたらす。乳癌では、高いＰＤＣＤ４（プログラム細胞死(programmed cell death)４）レベルを伴った高いＰＲＭＴ５発現が全体的な生存の低さを予測する(Powers MA, et al. Cancer Res. 2011 Aug 15;71(16):5579-87)。ＰＲＭＴ５は、ＰＤＣＤ４をメチル化して腫瘍関連機能を変化させる。乳癌の同所モデルにおけるＰＲＭＴ５およびＰＤＣＤ４の共発現は、腫瘍成長を促進する。神経膠腫における高いＰＲＭＴ５発現は高い腫瘍悪性度および全体的な生存の低さに関連し、ＰＲＭＴ５ノックダウンは、同所膠芽腫モデルにおいて生存利益を提供する(Yan F, et al. Genetic validation of the protein arginine methyltransferase PRMT5 as a candidate therapeutic target in glioblastoma. Cancer Res. 2014 Mar 15;74(6):1752-65)。ＰＲＭＴ５の発現および活性の増強は、神経膠腫細胞株におけるいくつかの腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングに寄与する。
【０００９】
ＰＲＭＴ５と癌の間で現在記載されている最も強い作用機構的関連は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）におけるものである。ＰＲＭＴ５は、ＭＣＬにおいて高頻度で過剰発現され、核コンパートメント発現が高く、そこでそれはヒストンのメチル化のレベルを高め、腫瘍抑制遺伝子のサブセットをサイレンシングする。最近の研究は、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５発現の上方調節におけるｍｉＲＮＡの役割を明らかにした。５０を超えるｍｉＲＮＡが、ＰＲＭＴ５  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にアニールすることが予測される。ＭＣＬにおいてｍｉＲ−９２ｂおよびｍｉＲ−９６レベルはＰＲＭＴ５レベルと逆相関すること、およびＭＣＬ細胞におけるこれらのｍｉＲＮＡの下方調節はＰＲＭＴ５タンパク質レベルの上方調節をもたらすことが報告された。ＭＣＬ患者の大多数において転座している癌遺伝子であるサイクリンＤ１はＰＲＭＴ５に関連し、ｃｄｋ４依存的機構を介してＰＲＭＴ５活性を増強する(Aggarwal P, et al. Nuclear cyclin D1/CDK4 kinase regulates CUL4 expression and triggers neoplastic growth via activation of the PRMT5 methyltransferase. Cancer Cell. 2010 Oct 19;18(4):329-40)。ＰＲＭＴ５は、ＤＮＡ複製に負の調節を行ってサイクリンＤ１依存的新生物成長を可能とする重要な遺伝子の抑制を媒介する。ＰＲＭＴ５ノックダウンは、サイクリンＤ１依存的な細胞の悪性移行を阻害して腫瘍細胞の死滅を引き起こす。これらのデータは、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５の重要な役割を強調し、ＰＲＭＴ５阻害はＭＣＬにおける治療戦略として使用可能であることを示唆する。
【００１０】
他の腫瘍種では、ＰＲＭＴ５は、分化、細胞死、細胞周期進行、細胞成長および増殖に役割を果たすと仮定されている。ＰＲＭＴ５と腫瘍形成を関連付ける主要な機構は知られていないが、新たなデータは、ＰＲＭＴ５が遺伝子発現の調節（ヒストンのメチル化、転写因子の結合、またはプロモーターの結合）、スプライシングの変更およびシグナル伝達に寄与することを示唆する。転写因子Ｅ２Ｆ１のＰＲＭＴ５メチル化は、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを促進するその能力を低減する(Zheng S, et al. Arginine methylation-dependent reader-writer interplay governs growth control by E2F-1. Mol Cell. 2013 Oct 10;52(1):37-51)。ＰＲＭＴ５はまた、ＤＮＡ損傷に応答してｐ５３もメチル化し(Jansson M, et al. Arginine methylation regulates the p53 response. Nat Cell Biol. 2008 Dec;10(12):1431-9)、細胞周期の休止を誘導するｐ５３の能力を低減するとともにｐ５３依存性アポトーシスを増強する。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害はｐ５３依存性アポトーシスの誘導を介してＤＮＡ傷害剤に対して細胞を増感させ得ることを示唆する。
【００１１】
ｐ５３を直接メチル化することに加え、ＰＲＭＴ５は、スプライシング関連機構を介してｐ５３経路を上方調節する。マウス神経系前駆細胞におけるＰＲＭＴ５ノックアウトは、ＭＤＭ４遺伝子のアイソフォームスイッチングを含む細胞スプライシングの変更をもたらす(Bezzi M, et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes Dev. 2013 Sep 1;27(17):1903-16)。Ｂｅｚｚｉらは、ＰＲＭＴ５ノックアウト細胞が長いＭＤＭ４アイソフォームの発現の低下（機能的ｐ５３ユビキチンリガーゼをもたらす）およびＭＤＭ４の短いアイソフォームの発現の増強（不活性リガーゼをもたらす）を示すことを見出した。ＭＤＭ４スプライシングにおけるこれらの変化は、ＭＤＭ４の不活性化をもたらし、ｐ５３タンパク質の安定性を高め、その後、ｐ５３経路の活性化および細胞死を増大させる。ＭＤＭ４選択的スプライシングはまた、ＰＲＭＴ５ノックダウン癌細胞株でも見られた。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害がｐ５３経路の複数のノードを活性化し得ることを示唆する。
【００１２】
癌細胞の増殖および生存の調節に加え、ＰＲＭＴ５は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）にも関連付けられている。ＰＲＭＴ５は転写因子ＳＮＡＩＬに結合し、Ｅ−カドヘリン発現の重要なコリプレッサーとして働き；ＰＲＭＴ５のノックダウンは、Ｅ−カドヘリンレベルの上方調節をもたらす(Hou Z, et al. The LIM protein AJUBA recruits protein arginine methyltransferase 5 to mediate SNAIL-dependent transcriptional repression. Mol Cell Biol. 2008 May;28(10):3198-207)。
【００１３】
癌の治療には多くの最近の進展があるものの、癌の影響に苦しむ個人のより有効かつ／または増強された治療の必要がなおある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１：アルギニン残基上のメチル化の種類。Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013)より。
【図２】図２：癌関連ＰＲＭＴ１基質の機能的クラス。ＰＲＭＴ１の既知の基質およびそれらの癌関連生物学との関連(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013); Shia, W. J. et al. PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cell proliferative potential. Blood 119, 4953-4962, doi:10.1182/blood-2011-04-347476 (2012); Wei, H., Mundade, R., Lange, K. C. & Lu, T. Protein arginine methylation of non-histone proteins and its role in diseases. Cell Cycle 13, 32-41, doi:10.4161/cc.27353 (2014); Boisvert, F. M., Rhie, A., Richard, S. & Doherty, A. J. The GAR motif of 53BP1 is arginine methylated by PRMT1 and is necessary for 53BP1 DNA binding activity. Cell Cycle 4, 1834-1841, doi:10.4161/cc.4.12.2250 (2005); Boisvert, F. M., Dery, U., Masson, J. Y. & Richard, S. Arginine methylation of MRE11 by PRMT1 is required for DNA damage checkpoint control. Genes Dev 19, 671-676, doi:10.1101/gad.1279805 (2005); Zhang, L. et al. Cross-talk between PRMT1-mediated methylation and ubiquitylation on RBM15 controls RNA splicing. Elife 4, doi:10.7554/eLife.07938 (2015); Snijders, A. P. et al. Arginine methylation and citrullination of splicing factor proline- and glutamine-rich (SFPQ/PSF) regulates its association with mRNA. RNA 21, 347-359, doi:10.1261/rna.045138.114 (2015); Liao, H. W. et al. PRMT1-mediated methylation of the EGF receptor regulates signaling and cetuximab response. J Clin Invest 125, 4529-4543, doi:10.1172/JCI82826 (2015); Ng, R. K. et al. Epigenetic dysregulation of leukaemic HOX code in MLL-rearranged leukaemia mouse model. J Pathol 232, 65-74, doi:10.1002/path.4279 (2014); Bressan, G. C. et al. Arginine methylation analysis of the splicing-associated SR protein SFRS9/SRP30C. Cell Mol Biol Lett 14, 657-669, doi:10.2478/s11658-009-0024-2 (2009))。
【図３】図３：化合物Ｄで処理した細胞株のメチルスキャン評価。メチル化変化を有するタンパク質のパーセント（変化の方向性には依存しない）は、示されているように官能基によって類別される。
【図４】図４：化合物ＡによるＰＲＭＴ１に対する阻害の様式。ＩＣ５０値は、１８分のＰＲＭＴ１反応および３パラメーター用量応答式へのデータの当てはめの後に決定した。（Ａ）非競合的阻害の式ＩＣ５０＝Ｋｉ／（１＋（Ｋｍ／［Ｓ］））に当てはめ、［ＳＡＭ］／Ｋｍａｐｐの関数としてプロットした化合物ＡのＩＣ５０値を示す代表的実験。（Ｂ）［ペプチド］／Ｋｍａｐｐの関数としてプロットしたＩＣ５０値を示す代表的実験。挿入図は、ペプチドＨ４  １−２１基質に関するＰＲＭＴ１の化合物Ａ阻害を評価するために混合型阻害の式（ｖ＝最大反応速度＊［Ｓ］／（Ｋｍ＊（１＋［Ｉ］／Ｋｉ）＋［Ｓ］＊（１＋［Ｉ］／Ｋ’）））に当てはめたデータを示す。α値（α＝Ｋｉ’／Ｋｉ）＞０．１ただし＜１０は、混合型阻害剤の指標となる。
【図５】図５：ＰＲＭＴ１に対する化合物Ａの効力。ＰＲＭＴ１活性を、ＳＡＭからＨ４  １−２１ペプチドへの３Ｈの移動を測定する、平衡条件下（Ｋｍａｐｐに相当する基質濃度）で行う放射活性アッセイを用いてモニタリングした。ＩＣ５０値は、データを３パラメーター用量応答式に当てはめることによって決定した。（Ａ）ＰＲＭＴ１：ＳＡＭ：化合物Ａ−３ＨＣｌプレインキュベーション時間の関数としてプロットしたＩＣ５０値。白丸および黒丸は２回の独立した実験を表す（０．５ｎＭ  ＰＲＭＴ１）。挿入図は、６０分のＰＲＭＴ１：ＳＡＭ：化合物Ａ−３ＨＣｌプレインキュベーション後のＰＲＭＴ１活性の化合物Ａ−３ＨＣｌ阻害に関する代表的なＩＣ５０曲線を示す。（Ｂ）塩型により類別されるＰＲＭＴ１の化合物Ａ阻害。ＩＣ５０値は、６０分のＰＲＭＴ１：ＳＡＭ：化合物Ａプレインキュベーションおよび２０分の反応の後に決定した。
【図６】図６：化合物Ａ（橙）およびＳＡＨ（紫）との複合体中のＰＲＭＴ１に関して２．４８Åで解像した結晶構造。挿入図から、化合物がペプチド結合ポケット内に結合し、ＰＲＭＴ１の側鎖と重要な相互作用をなしていることが明らかである。
【図７】図７：化合物ＡによるＰＲＭＴ１相同分子種の阻害。ＰＲＭＴ１活性を、ＳＡＭからＨ４  １−２１ペプチドへの３Ｈの移動を測定する、平衡条件下（Ｋｍａｐｐに相当する基質濃度）で行う放射活性アッセイを用いてモニタリングした。ＩＣ５０値は、データを３パラメーター用量応答式に当てはめることによって決定した。（Ａ）ラット（○）およびイヌ（●）相同分子種に関してＰＲＭＴ１：ＳＡＭ：化合物Ａプレインキュベーション時間の関数としてプロットしたＩＣ５０値。（Ｂ）ラット（○）、イヌ（●）またはヒト（□）ＰＲＭＴ１濃度の関数としてプロットしたＩＣ５０値。（Ｃ）ＩＣ５０値は、６０分のＰＲＭＴ１：ＳＡＭ：化合物Ａプレインキュベーションおよび２０分の反応の後に決定した。データは、化合物Ａの複数の塩型の試験からの平均である。Ｋｉ＊ａｐｐ値は、非競合的阻害剤に関する式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（Ｋｍ／［Ｓ］））およびＩＣ５０の決定がＥＳＩ＊立体配座に代表的なものであるという仮定に基づいて計算した。
【図８】図８：ＰＲＭＴファミリーメンバーに対する化合物Ａの効力。ＰＲＭＴ活性を、６０分のＰＲＭＴ：ＳＡＭ：化合物Ａプレインキュベーションの後に、平衡条件下（Ｋｍａｐｐにおける基質濃度）で行う放射活性アッセイを用いてモニタリングした。化合物ＡのＩＣ５０値は、データを３パラメーター用量応答式に当てはめることによって決定した。（Ａ）データは、化合物Ａの複数の塩型の試験からの平均である。Ｋｉ＊ａｐｐ値は、非競合的阻害剤に関する式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（Ｋｍ／［Ｓ］））およびＩＣ５０の決定がＥＳＩ＊立体配座に代表的なものであるという仮定に基づいて計算した。（Ｂ）ＰＲＭＴ３（●）、ＰＲＭＴ４（○）、ＰＲＭＴ６（黒四角）またはＰＲＭＴ８（□）：ＳＡＭ：化合物Ａプレインキュベーション時間の関数としてプロットしたＩＣ５０値。
【図９】図９：ＭＭＡ細胞内ウエスタン。ＲＫＯ細胞を化合物Ａ−３ＨＣｌ（「化合物Ａ−Ａ」）、化合物Ａ−１ＨＣｌ（「化合物Ａ−Ｂ」）、化合物Ａ−遊離塩基（「化合物Ａ−Ｃ」）、および化合物Ａ−２ＨＣｌ（「化合物Ａ−Ｄ」）で７２時間処理した。細胞を固定し、ＭＭＡを検出するために抗Ｒｍｅ１ＧＧで、シグナルを正規化するために抗チューブリンで染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを用いて画像化した。チューブリンに対するＭＭＡを化合物濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄにて二相曲線フィット式を用いて曲線フィット（Ａ）を作成した。ＥＣ５０（第１変曲点）、標準偏差、およびＮを（Ｂ）に示す。
【図１０】図１０：腫瘍におけるＰＲＭＴ１発現。ｍＲＮＡ発現レベルはｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから入手した。ＡＣＴＢレベルおよびＴＹＲは、それぞれ遍在発現する遺伝子と発現が制限される遺伝子に相当するレベルの発現を示すことが示される。
【図１１】図１１：細胞培養における化合物Ａの抗増殖活性。６日増殖アッセイにおいて１９６のヒト癌細胞株の化合物Ａに対する感受性を評価した。（Ａ）に示されるように、各細胞株のｇＩＣ５０値を推定されるヒト暴露とともに棒グラフで示す。（Ｂ）では細胞傷害性の尺度Ｙｍｉｎ−Ｔ０を棒グラフとしてプロットし、各細胞株のｇＩＣ１００値を赤い点で示す。ラット１４日ＭＴＤから計算したＣａｖｅ（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｃａｖｅ＝２．１μＭ）を赤い破線で示す。
【図１２】図１２：培養細胞におけるアルギニンメチル化マークに対する化合物Ａの影響の経時的推移。（Ａ）化合物Ａで処理したＴｏｌｅｄｏ  ＤＬＢＣＬ細胞におけるＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＭＭＡの変化。メチル化の変化は、チューブリン±ＳＥＭ（ｎ＝３）に対して正規化したものを示す。（Ｂ）アルギニンメチル化マークの代表的ウエスタンブロット。定量した領域をゲルの右に黒いバーで示す。
【図１３】図１３：アルギニンメチル化に対する化合物Ａの用量応答。（Ａ）Ｕ２９３２細胞株における化合物Ａ用量応答からのＭＭＡおよびＡＤＭＡの代表的ウエスタンブロット像。（Ｂ）に関して定量した領域をゲルの左に黒いバーで示す。（Ｂ）７２時間の暴露後に５種のリンパ腫細胞株でＭＭＡの最大誘導の５０％または５０％最大低下ＡＤＭＡに必要とされる最小有効化合物Ａ濃度±標準偏差（ｎ＝２）。６日増殖細胞死アッセイにおける対応するｇＩＣ５０値を赤で示す。
【図１４】図１４：リンパ腫細胞における化合物Ａに応答したアルギニンメチル化マークの持続性。（Ａ）化合物Ａとともに培養したＴｏｌｅｄｏ  ＤＬＢＣＬ細胞株におけるＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＭＭＡに対する変化の安定性。メチル化の変化は、チューブリン±ＳＥＭ（ｎ＝３）に対して正規化したものを示す。（Ｂ）アルギニンメチル化マークの代表的ウエスタンブロット。（Ａ）に関して定量した領域をゲルの横に黒いバーで示す。
【図１５】図１５：リンパ腫細胞株の増殖の経時的推移。細胞増殖は、Ｔｏｌｅｄｏ（Ａ）およびＤａｕｄｉ（Ｂ）細胞株（各細胞株ｎ＝２）で１０日の経時的推移にわたって評価した。一回の生物学的反復の代表的データを示す。
【図１６】図１６：６日目および１０日目におけるリンパ腫細胞株での化合物Ａの抗増殖効果。（Ａ）リンパ腫細胞株における６日（薄い青）および１０日（濃い青）増殖アッセイからの平均ｇＩＣ５０値。（Ｂ）６日（薄い青）および１０日（濃い青）のＹｍｉｎ−Ｔ０と対応するｇＩＣ１００（赤い点）。
【図１７】図１７：サブタイプにより分類されるリンパ腫細胞株における化合物Ａの抗増殖効果。（Ａ）各細胞株のｇＩＣ５０値を棒グラフで示す。（Ｂ）では、細胞傷害性の尺度Ｙｍｉｎ−Ｔ０を棒グラフとしてプロットし、各細胞株のｇＩＣ１００値を赤い点で示す。サブタイプ情報はＡＴＣＣまたはＤＳＭＺ細胞株リポジトリーから収集した。
【図１８】図１８：ヒトリンパ腫細胞株における細胞周期のヨウ化プロピジウムＦＡＣＳ分析。３種のリンパ腫細胞株Ｔｏｌｅｄｏ（Ａ）、Ｕ２９３２（Ｂ）、およびＯＣＩ−Ｌｙ１（Ｃ）を１０日間０、１、１０、１００、１０００、および１０，０００ｎＭの化合物Ａで処理し、処理後３、５、７、１０日目にサンプルを採取した。データは生物学的反復ｎ＝２の平均±ＳＥＭを示す。
【図１９】図１９：化合物Ａで処理したリンパ腫細胞株におけるカスパーゼ−３／７の活性化。アポトーシスを、Ｔｏｌｅｄｏ（Ａ）およびＤａｕｄｉ（Ｂ）細胞株で１０日の経時的推移にわたって評価した。カスパーゼ３／７の活性化は、ＤＭＳＯ処理細胞に対する誘導倍率として示す。各細胞株につき２回の独立した反復を行った。それぞれの代表的データを示す。
【図２０】図２０：Ｔｏｌｅｄｏ異種移植片を担持するマウスにおける化合物Ａの有効性。マウスに、２８日（Ａ）または２４日（Ｂ）の期間にわたり、化合物ＡでＱＤ（３７．５、７５、１５０、３００、４５０、または６００ｍｇ／ｋｇ）経口処置または７５ｍｇ／ｋｇでのＢＩＤ処置（Ｂ）を施し、腫瘍体積を週２回測定した。
【図２１】図２１：６日目および１０日目のＡＭＬ細胞株における化合物Ａの効果。（Ａ）ＡＭＬ細胞株における６日（薄い青）および１０日（濃い青）の増殖アッセイからの平均ｇＩＣ５０値。（Ｂ）６日目（薄い青）および１０日目（濃い青）のＹｍｉｎ−Ｔ０と対応するｇＩＣ１００（赤い点）。
【図２２】図２２：化合物Ａを伴うｃｃＲＣＣ細胞株(cines)のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖の経時的推移。（Ａ）２つのｃｃＲＣＣ細胞株の対照（ＤＭＳＯ）に比べた増殖。一回反復からの代表的曲線を示す。（Ｂ）経時的推移中のｃｃＲＣＣ細胞株のｇＩＣ５０および増殖阻害率％の概要（平均±ＳＤ；各細胞株ｎ＝２）。
【図２３】図２３：ＡＣＨＮ異種移植片における化合物Ａの有効性。２８日の期間にわたって毎日、マウスに化合物Ａの経口処置を施し、腫瘍体積を週２回測定した。
【図２４】図２４：乳癌細胞株における化合物Ａの抗増殖効果。６日増殖アッセイにおける化合物Ａを用いて割り出した乳癌細胞株のｇＩＣ５０の棒グラフおよび増殖阻害率（％）（赤い丸）。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を呈する細胞株を橙で示し、その他のサブタイプは青である。
【図２５】図２５：７日目および１２日目の乳癌細胞株における化合物Ａの効果。乳癌細胞株における７日（薄い青）および１０日（濃い青）の増殖アッセイからの平均増殖阻害率（％）値と対応するｇＩＣ５０（赤い点）。乳癌での長期増殖アッセイで見られた効力および阻害率パーセントの増大は、リンパ腫またはＡＭＬ細胞株では見られず、抗増殖活性が完全に現れるためには、ある種の腫瘍種が化合物Ａに長期間曝される必要があることが示唆される。
【図２６】図２６：ＰＲＭＴにより触媒されるタンパク質アルギニンメチル化の４つのタイプ。
【図２７】図２７：既知のＰＲＭＴ５基質。ＰＲＭＴ５は、複数のタンパク質の、優先的にはアルギニン残基およびグリシン残基が豊富な領域で、アルギニンを対称的にメチル化する(Karkhanis V, et al. Versatility of PRMT5-induced methylation in growth control and development. Trends Biochem Sci. 2011 Dec;36(12):633-41)。これらの基質の大多数は、ＰＲＭＴ５と相互作用するそれらの能力を介して同定された。
【図２８】図２８：ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０複合体活性とサイクリンＤ１癌遺伝子駆動経路の間の分子関係。ＰＲＭＴ５補助調節因子であるＭＥＰ５０はｃｄｋ４基質であり、ＭＥＰ５０のリン酸化は、ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０の活性を増強する。ＰＲＭＴ５活性の増強は、ＣＵＬ４（カリン４）抑制、ＣＤＴ１過剰発現、およびＤＮＡ再複製(Aggarwal P, et al. Nuclear cyclin D1/CDK4 kinase regulates CUL4 expression and triggers neoplastic growth via activation of the PRMT5 methyltransferase. Cancer Cell. 2010 Oct 19;18(4):329-40から採用）を含む、サイクリンＤ１依存的新生物成長に関連する重要な事象を媒介する。
【図２９】図２９：ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０に対する化合物ＩＣ５０値。ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０（４ｎＭ）活性は、化合物Ｃ、化合物Ｆ、化合物Ｂ、または化合物Ｅで処理した後のＳＡＭからＨ４ペプチドへの３Ｈの移動を測定する平衡条件下（基質濃度Ｋｍ ａｐｐａｒｅｎｔ）放射活性アッセイを用いてモニタリングした。ＩＣ５０値は、３パラメーター用量応答式にデータを当てはめることによって決定した。
【図３０】図３０：化合物Ｃおよびシネフンギンとの複合体においてＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０に関して２．８Åで解像した結晶構造。挿入部は、この化合物がペプチド結合ポケット内で結合され、ＰＲＭＴ５骨格と重要な相互作用を形成することを明らかにする。
【図３１】図３１：選択性パネルで試験したメチルトランスフェラーゼを強調する系統樹。化合物Ｃは、他のいずれの供試酵素
【化１】
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よりもＰＲＭＴ５に対してはるかに高い効力
【化２】
2019535800.tif 000003
を示した。ＰＲＭＴ９は、関係を示すために系図内にのみ示し、パネルでは評価しなかった。Ｒｉｃｈｏｎ  ＶＭらから採用した図。
【図３２】図３２：癌細胞株パネルにおいて６日増殖／細胞死アッセイから得られた化合物ＣのｇＩＣ５０値。ＤＬＢＣＬ−びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＧＢＭ−膠芽腫、ＭＣＬ−マントル細胞リンパ腫、ＭＭ−多発性骨髄腫。
【図３３】図３３：癌細胞株パネルにおいて６日増殖／細胞死アッセイから得られた化合物ＣのｇＩＣ１００（黒四角）およびＹｍｉｎ−Ｔ０（バー）値（このアッセイで使用した最高濃度は３０μＭであった）。ＤＬＢＣＬ−びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＧＢＭ−膠芽腫、ＭＣＬ−マントル細胞リンパ腫、ＭＭ−多発性骨髄腫。
【図３４】図３４：１０日２Ｄ増殖アッセイから得られた癌細胞株（ｎ＝２４０）における化合物ＢのｇＩＣ５０値。ＡＬＬ−急性リンパ芽球性白血病、ＡＭＬ−急性骨髄性白血病、ＣＭＬ−慢性骨髄性白血病、ＤＬＢＣＬ−びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＬ−ホジキンリンパ腫、ＨＮ−頭頸部癌、ＭＭ−多発性骨髄腫、ＮＨＬ−非ホジキンリンパ腫、ＮＳＣＬＣ−非小細胞肺癌、ＰＥＬ−原発性滲出液リンパ腫、ＳＣＬＣ−小細胞肺癌、ＴＣＬ−Ｔ細胞リンパ腫。
【図３５】図３５：患者由来腫瘍モデルおよび細胞株腫瘍モデルで行った８〜１３日コロニー形成アッセイから得られた化合物Ｅの相対的ＩＣ５０値。
【図３６】図３６：ＳＤＭＡの化合物Ｃ阻害。（Ａ）３日目の代表的ＳＤＭＡ用量応答曲線（合計ＳＤＭＡをＧＡＰＤＨに対して正規化）（上）ならびに１日目および３日目にＺ１３８細胞から得られたＩＣ５０値（下）。（Ｂ）ＭＣＬ株パネルにおけるＳＤＭＡ  ＩＣ５０値（ＥＰＩＺＹＭＥデータ、４日目）。
【図３７】図３７：ＰＲＭＴ５阻害剤で処理したリンパ腫細胞株における遺伝子発現変化。Ａ．化合物Ｂ（０．１および０．５μＭ）処理（２日および４日）の後にリンパ腫細胞株において差次的に発現される（ＤＥ）遺伝子の定量。Ｂ．リンパ腫株間のＤＥ遺伝子の重複。
【図３８】図３８：ＲＮＡ配列決定により特定された１１の遺伝子のパネルにおける化合物Ｃの遺伝子発現のＥＣ５０値。ＣＤＫＮ１Ａの代表的用量応答曲線（２日および４日、左のパネル）ならびに遺伝子パネルＥＣ５０要約表（右のパネル、４日）。
【図３９】図３９：化合物Ｂはリンパ腫細胞株においてイントロンのサブセットのスプライシングを減弱する。Ａ．細胞スプライシングの調節の機構（Ｂｅｚｚｉ  Ｍ．らから採用）。Ｂ．０．１または０．５μＭの化合物Ｂで処理したリンパ腫株におけるイントロン発現の分析。
【図４０】図４０：化合物Ｂはリンパ腫細胞株において遺伝子のサブセットのスイッチングを誘導する。Ａ．２日間および４日間、化合物Ｂ（０．１および０．５μＭ）で処理した４つのリンパ腫細胞株におけるアイソフォームスイッチの定量。Ｂ．４つのリンパ腫株におけるアイソフォームスイッチの重複。Ｃ．４つ総てのリンパ腫株において選択的スプライシングを受ける遺伝子のリスト（４つの細胞株の重複）。
【図４１】図４１：化合物Ｃで処理したＭＣＬ株におけるＭＤＭ４の選択的スプライシングおよびｐ５３の活性化。Ａ．２日間および３日間１０および２００ｎＭの化合物Ｃまたは５μＭのＮｕｔｌｉｎ−３で処理した４つのマントル細胞リンパ腫のパネルにおけるＭＤＭ４アイソフォームの発現分析（ＭＤＭ４−ＦＬ−ロング；ＭＤＭ４−Ｓ−ショート）。Ｂ．３日間１０および２００ｎＭの化合物Ｃまたは５μＭのＮｕｔｌｉｎ−３で処理したＭＣＬ株におけるｐ５３およびｐ２１発現のウエスタン分析。
【図４２】図４２：化合物ＣはＺ１３８細胞においてＭＤＭ４  ＲＮＡ（Ａ）スプライシングおよびＳＤＭＡ／ｐ５３／ｐ２１レベル（Ｂ）の用量依存的変化を誘導する。
【図４３】図４３：ＭＣＬ細胞株における単剤および組合せとしてのＰＲＭＴ５阻害剤およびイブルチニブの活性。Ａ．６日増殖／細胞死ＣＴＧアッセイにおける化合物ＣおよびイブルチニブのｇＩＣ５０値。Ｂ．ＲＥＣ１細胞における化合物Ｂおよびイブルチニブの組合せ（６日、１：１比）の代表的増殖曲線。Ｃ．６日増殖／細胞死ＣＴＧアッセイにおける示された比率での化合物Ｂ：イブルチニブの併用係数（ＣＩ）。
【図４４】図４４：Ｚ１３８異種移植モデルにおける化合物Ｃの有効性およびＰＤ。Ａ．Ｚ１３８異種移植モデルにおける化合物Ｃの２１日有効性試験。Ｂ．有効性試験の終了時（最終投与の３時間後）に採取した腫瘍から定量したＳＤＭＡウエスタンデータ。
【図４５】図４５：Ｍａｖｅｒ−１異種移植モデルにおける化合物Ｃの有効性およびＰＤ。Ａ．Ｍａｖｅｒ−１異種移植モデルにおける化合物Ｃの２１日有効性試験。Ｂ．有効性試験の終了時（最終投与の３時間後）に採取した腫瘍から定量したＳＤＭＡウエスタンデータ。
【図４６】図４６：７日増殖２Ｄアッセイから得られた乳癌細胞株パネル（ＴＮＢＣ−トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ２−Ｈｅｒ２陽性、ＨＲ−ホルモン受容体陽性）における化合物Ｂ増殖のＩＣ５０値。
【図４７】図４７：ＰＲＭＴ５候補である化合物Ｃ、およびＰＲＭＴ５ツール分子である化合物Ｂを用いた乳癌およびＭＣＬ細胞株において１０〜１２日増殖／細胞死アッセイから得られたＹｍｉｎ−Ｔ０値。
【図４８】図４８：種々の期間、３０、２００および１０００ｎＭ化合物Ｃで処理した乳癌株のヨウ化プロピジウムＦＡＣＳ分析（２、７および１０日、生物学的ｎ＝２、エラーバーは標準偏差を表す）。
【図４９】図４９：乳癌細胞株パネルにおける１μＭ化合物Ｂ処理後のＳＤＭＡ阻害の経時的推移。細胞をＤＭＳＯまたは１μＭの化合物Ｂで示された期間処理し、細胞溶解液を、ＳＤＭＡおよびアクチン抗体を用いるウエスタンブロットにより分析した。各ブロットの最後のレーンはＤＭＳＯ対照の１／２である。
【図５０】図５０：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植モデルにおける化合物Ｃの有効性（左）およびＰＫ／ＰＤ（右）。
【図５１】図５１：ＰＲＭＴ５候補である化合物Ｃ、およびＰＲＭＴ５ツール分子である化合物Ｂを用いたＧＢＭ細胞株における１４日増殖／細胞死ＣＴＧアッセイ（Ｙｍｉｎ  −Ｔ０）。
【図５２】図５２：化合物Ｂ（１μＭ）は、ＳＤＭＡレベルを低減し（Ｂ）、ＭＤＭ４の選択的スプライシングを誘導し（Ａ）、かつ、ＧＢＭおよびリンパ腫細胞株においてｐ５３を活性化する（Ｂ）。
【図５３】図５３：リンパ腫、乳癌、および黒色腫癌細胞株における化合物Ａと化合物Ｂの組合せ。化合物Ａ、化合物Ｂ（ＰＲＭＴ５阻害剤）、または両化合物の固定比（１：１）組合せを用いた６日増殖アッセイから得られたｇＩＣ５０、ｇＩＣ１００、Ｙｍｉｎ−Ｔ０。
【図５４】図５４：化合物Ｂとシスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ＢＥＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、および化合物Ｄとの固定比組合せで処置した種々のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株における、単剤（化合物Ｂ）処置に比べてのｇＩＣ５０およびｇＩＣ１００の変化倍率。
【図５５】図５５：化合物Ｂとシスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ＢＥＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、および化合物Ｄとの固定比組合せで処置した種々の膀胱癌細胞株における、ｇＩＣ５０およびｇＩＣ１００の変化倍率。
【図５６】図５６：種々の濃度の化合物Ｂ、化合物Ｄ、および化合物Ｂと化合物Ｄ組合せで処理した膀胱癌細胞株（Ｔ２４）の増殖アッセイの結果。
【図５７】図５７：化合物Ｂおよび化合物Ｄ単独および組合せで処理した膀胱癌細胞株ＳＷ−７８０およびＴ２４の増殖アッセイの結果（Ｙｍｉｎ−Ｔ０％）。
【図５８】図５８：化合物Ｂと化合物Ｄの組合せで処理した１０種の膀胱癌細胞株および７種のＴＮＢＣ細胞株の増殖アッセイの結果。細胞傷害性応答（負のＹｍｉｎ−Ｔ０％）および細胞増殖抑制応答を受けた膀胱癌およびＴＮＢＣ細胞株のパーセンテージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一つの実施形態では、本発明は、Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤の組合せを提供する。
【００１６】
一つの実施形態では、治療上有効な量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量のＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる第２の医薬組成物が提供される。
【００１７】
一つの実施形態では、必要とするヒトにおいて癌を処置するための方法であって、前記ヒトにＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤の組合せを、薬学上許容可能な担体および薬学上許容可能な希釈剤のうち少なくとも一つとともに投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる方法が提供される。
【００１８】
一つの実施形態では、必要とするヒトにおいて癌を処置するための方法であって、前記ヒトに治療上有効な量の、Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる医薬組成物とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる医薬組成物を投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる方法が提供される。
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、「Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤」または「Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤」は、以下：タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）のうちいずれか１以上を阻害する薬剤を意味する。いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、小分子化合物である。いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、以下：タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、およびタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）のうちいずれか１以上を選択的に阻害する。いくつかの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６、およびＰＲＭＴ８の選択的阻害剤である。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「ＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤」または「ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤」は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）および／またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）を阻害する薬剤を意味する。いくつかの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、小分子化合物である。いくつかの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）および／またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）を選択的に阻害する。いくつかの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、ＰＲＭＴ５の阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、ＰＲＭＴ５の選択的阻害剤である。
【００２１】
アルギニンメチルトランスフェラーゼは、多様な生体プロセスの調節において与えられたそれらの役割を変調するために魅力的な標的である。今般、本明細書に記載の化合物および薬学上許容可能な塩およびそれらの組成物が、アルギニンメチルトランスフェラーゼの阻害剤として有効であることが判明した。
【００２２】
特定の官能基および化学用語の定義を以下にさらに詳細に説明する。化学元素はHandbook of Chemistry and Physics, 第75版の見返しの元素の周期表ＣＡＳバージョンに従って特定され、特定の官能基は一般にそこに記載されているように定義される。加えて、有機化学の一般原則、ならびに特定の官能部分および反応性は、Thomas Sorrell, Organic Chemistry, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 第5版, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989;およびCarruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 第3版, Cambridge University Press, Cambridge, 1987に記載されている。
【００２３】
本明細書に記載の化合物は１以上の不斉中心を含んでなり得るので、種々の異性形、例えば、鏡像異性体および／またはジアステレオマーで存在し得る。例えば、本明細書に記載の化合物は、個々の鏡像異性体、ジアステレオマーもしくは幾何異性体の形態であり得、またはラセミ混合物および１以上の立体異性体が富化された混合物を含む、立体異性体の混合物の形態であり得る。異性体は、キラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ならびにキラル塩の形成および結晶化を含む、当業者に既知の方法によって混合物から単離することができ；または好ましい異性体が不斉合成によって製造され得る。例えば、Jacques et ah, Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et ah, Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw- Hill, NY, 1962);およびWilen, Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)参照。本開示はさらに、本明細書に記載の化合物を、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、あるいは種々の異性体の混合物として包含する。
【００２４】
本発明の化合物は種々の互変異性体として描写され得ることが理解されるべきである。また、化合物が互変異性形を有する場合には、総ての互変異性形が本発明の範囲内に含まれるものとし、本明細書に記載のいずれの化合物の命名もいずれの互変異性形も除外しないことも理解されるべきである。
【化３】
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【００２５】
そうではないことが述べられない限り、本明細書に描写される構造はまた、１以上の同位元素が富化された原子が存在することでのみ異なる化合物を含むことも意味する。例えば、水素の重水素またはトリチウムによる置換、１９Ｆの１８Ｆによる置換、または炭素の１３Ｃ−または１４Ｃ−富化炭素による置換以外は本構造を有する化合物は本開示の範囲内にある。このような化合物は、例えば、分析ツールまたは生物学的アッセイにおけるプローブとして有用である。
【００２６】
「脂肪族」という用語は、本明細書で使用する場合、飽和および不飽和両方の、非芳香族、直鎖（すなわち、非分岐）、分岐、非環式、および環式（すなわち、炭素環式）炭化水素を含む。いくつかの実施形態において、脂肪族基は、１以上の官能基で場合により置換されていてもよい。当業者には、「脂肪族」は本明細書においてアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびシクロアルケニル部分を含むことが意図されることが認識されるであろう。
【００２７】
値の範囲が挙げられている場合には、各値およびその範囲内の下位範囲を包含するものとする。例えば、「Ｃ１−６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１−６、Ｃ１−５、Ｃ１−４、Ｃ１−３、Ｃ１−２、Ｃ２−６、Ｃ２−５、Ｃ２−４、Ｃ２−３、Ｃ３−６、Ｃ３−５、Ｃ３−４、Ｃ４−６、Ｃ４−５、およびＣ５−６アルキルを包含するものとする。
【００２８】
「ラジカル」は、特定の基上の結合点を指す。ラジカルには、特定の基の二価ラジカルが含まれる。
【００２９】
「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子（「Ｃ１−２０アルキル」）を有する直鎖または分岐飽和炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を有する（「Ｃ１−１０アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ１−９アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１−８アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ１−７アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ１−６アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ１−５アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１−４アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１−３アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜２個の炭素原子を有する。（「Ｃ１−２アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２−６アルキル」）。Ｃ１−６アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、イソプロピル（Ｃ３）、ｎ−ブチル（Ｃ４）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｃ４）、ｓｅｃ−ブチル（Ｃ４）、イソ−ブチル（Ｃ４）、ｎ−ペンチル（Ｃ５）、３−ペンタニル（Ｃ５）、アミル（Ｃ５）、ネオペンチル（Ｃ５）、３−メチル−２−ブタニル（Ｃ５）、第三級アミル（Ｃ５）、およびｎ−ヘキシル（Ｃ６）が挙げられる。アルキル基のさらなる例としては、ｎ−ヘプチル（Ｃ７）、およびｎ−オクチル（Ｃ８）などが挙げられる。特定の実施形態において、アルキル基の各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてもよく、例えば、非置換型（「非置換アルキル」）または置換型（「置換アルキル」）である。特定の実施形態において、アルキル基は、非置換Ｃ１−１０アルキル（例えば、−ＣＨ３）である。特定の実施形態において、アルキル基は、置換Ｃ１−１０アルキルである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、アルキル基は１以上のハロゲンで置換されている。「ペルハロアルキル」は、水素原子の総てが独立にハロゲン、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードで置換されている、本明細書で定義されるような置換アルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、１〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１−８ペルハロアルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、１〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ１−６ペルハロアルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、１〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１−４ペルハロアルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、１〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１−３ペルハロアルキル」）。いくつかの実施形態において、アルキル部分は、１〜２個の炭素原子を有する（「Ｃ１−２ペルハロアルキル」）。いくつかの実施形態において、水素原子の総てがフルオロで置換されている。いくつかの実施形態において、水素原子の総てがクロロで置換されている。ペルハロアルキル基の例としては、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＦＣｌ２、および−ＣＦ２Ｃｌなどが挙げられる。
【００３１】
「アルケニル」は、２〜２０個の炭素原子と１個以上の炭素−炭素二重結合（例えば、１、２、３、または４個の二重結合）、および場合により１以上の三重結合（例えば、１、２、３、または４個の三重結合）を有する直鎖または分岐炭化水素基のラジカル（「Ｃ２−２０アルケニル」）を指す。特定の実施形態において、アルケニルは、三重結合を含まない。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜１０個の炭素原子を有する（「Ｃ２−１０アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ２−９アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ２−８アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ２−７アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２−６アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ２−５アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ２−４アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ２−３アルケニル」）。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１個以上の炭素−炭素二重結合は、内部にあっても（例えば、２−ブテニル）または末端にあってもよい（例えば、１−ブテニル）。Ｃ２−４アルケニル基の例としては、エテニル（Ｃ２）、１−プロペニル（Ｃ３）、２−プロペニル（Ｃ３）、１−ブテニル（Ｃ４）、２−ブテニル（Ｃ４）、およびブタジエニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２−６アルケニル基の例としては、前述のＣ２−４アルケニル基ならびにペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、およびヘキセニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルケニルのさらなる例としては、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、およびオクタトリエニル（Ｃ８）などが挙げられる。特定の実施形態において、アルケニル基の各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてもよく、例えば、非置換型（「非置換アルケニル」）または置換型（「置換アルケニル」）である。特定の実施形態において、アルケニル基は、非置換Ｃ２−１０アルケニルである。特定の実施形態において、アルケニル基は、置換Ｃ２−１０アルケニルである。
【００３２】
「アルキニル」は、２〜２０個の炭素原子と１個以上の炭素−炭素三重結合（例えば、１、２、３、または４個の三重結合）、および場合により１個以上の二重結合（例えば、１、２、３、または４個の二重結合）を有する直鎖または分岐炭化水素基のラジカル（「Ｃ２−２０アルキニル」）を指す。特定の実施形態において、アルキニルは、二重結合を含まない。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子を有する（「Ｃ２−１０アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ２−９アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ２−８アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ２−７アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ２−６アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ２−５アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ２−４アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ２−３アルキニル」）。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１以上の炭素炭素三重結合は、内部にあっても（例えば、２−ブチニル）または末端にあってもよい（例えば、１−ブチニル）。Ｃ２−４アルキニル基の例としては、限定されるものではないが、エチニル（Ｃ２）、１−プロピニル（Ｃ３）、２−プロピニル（Ｃ３）、１−ブチニル（Ｃ４）、および２−ブチニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２−６アルケニル基の例としては、前述のＣ２−４アルキニル基ならびにペンチニル（Ｃ５）、およびヘキシニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルキニルのさらなる例としては、へプチニル（Ｃ７）、およびオクチニル（Ｃ８）などが挙げられる。特定の実施形態において、アルキニル基の各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてもよく、例えば、非置換型（「非置換アルキニル」）または置換型（「置換アルキニル」）である。特定の実施形態において、アルキニル基は、非置換Ｃ２−１０アルキニルである。特定の実施形態において、アルキニル基は、置換Ｃ２−１０アルキニルである。
【００３３】
「縮合」または「オルト縮合」は、本明細書では互換的に使用され、一般に２個の原子と１個の結合を有する２個の環、例えば、下記を指す。
【化４】
2019535800.tif 000005
【００３４】
「架橋された」とは、（１）同じ環の隣接しない２箇所以上の位置を接続する橋頭原子もしくは原子の群；または（２）ある環系の異なる環の２箇所以上の位置を接続する橋頭原子もしくは原子の群を含む環系を指し、それにより、オルト縮合環、例えば、下式を形成しない。
【化５】
2019535800.tif 000006
【００３５】
「スピロ」または「スピロ融合」は、炭素環式または複素環式環系の同じ原子に接続する（ジェミナルアタッチメント）、それにより環、例えば、下式を形成する原子の群を指す。
【化６】
2019535800.tif 000007
【００３６】
橋頭原子におけるスピロ融合も企図される。
【００３７】
「カルボシクリル」または「炭素環式」は、非芳香環系に３〜１４個の環炭素原子（「Ｃ３−１４カルボシクリル」）を有し、ヘテロ原子を有さない非芳香族環式炭化水素基のラジカルを指す。特定の実施形態において、カルボシクリル基は、非芳香環系に３〜１０個の環炭素原子を有し（Ｃ３−１０カルボシクリル」）、ヘテロ原子を有さない非芳香族環式炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの実施形態において、カルボシクリル基は、３〜８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３−８カルボシクリル」）。いくつかの実施形態において、カルボシクリル基は、３〜６個の環炭素原子（「Ｃ３−６カルボシクリル」）を有する。いくつかの実施形態において、カルボシクリル基は、３〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３−６カルボシクリル」）。いくつかの実施形態において、カルボシクリル基は、５〜１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５−１０カルボシクリル」）。例示的Ｃ３−６カルボシクリル基としては、限定されるものではないが、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、およびシクロヘキサジエニル（Ｃ６）などが挙げられる。例示的Ｃ３−８カルボシクリル基としては、限定されるものではないが、前述のＣ３−６カルボシクリル基ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル（Ｃ７）、およびビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）などが挙げられる。例示的Ｃ３−１０カルボシクリル基としては、限定されるものではないが、前述のＣ３＿８カルボシクリル基ならびにシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデセニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ−ｌＨ−インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃiｏ）、およびスピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）などが挙げられる。以上の例が説明するように、特定の実施形態において、カルボシクリル基は単環式（「単環式カルボシクリル」）であるか、または二環式系（「二環式カルボシクリル」）など縮合、架橋またはスピロ縮合環系であり、飽和されていてもまたは部分的に不飽和であってもよい。「カルボシクリル」にはまた、上記に定義されるようなカルボシクリル環が１以上のアリール基またはヘテロアリール基と縮合されている環系も含まれ、ここで、その結合点はカルボシクリル環上にあり、このような場合には、炭素の数はその炭素環系内の炭素の数を示し続ける。特定の実施形態において、カルボシクリル基の各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてよく、例えば、非置換型（非置換カルボシクリル」）または置換型（「置換カルボシクリル」）である。特定の実施形態において、カルボシクリル基は、非置換Ｃ３−１０カルボシクリルである。特定の実施形態において、カルボシクリル基は、置換Ｃ３−１０カルボシクリルである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、「カルボシクリル」は、３〜１４個の環炭素原子を有する単環式、飽和カルボシクリル基（「Ｃ３−１４シクロアルキル」）である。いくつかの実施形態において、「カルボシクリル」は、３〜１０個の環炭素原子を有する単環式、飽和カルボシクリル基（「Ｃ３−１０シクロアルキル」）である。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、３〜８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３−８シクロアルキル」）。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、３〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３−６シクロアルキル」）。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、５〜６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５−６シクロアルキル」）。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、５〜１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５−１０シクロアルキル」）。Ｃ５−６シクロアルキル基の例としては、シクロペンチル（Ｃ５）およびシクロヘキシル（Ｃ５）が挙げられる。Ｃ３−６シクロアルキル基の例としては、前述のＣ５−６シクロアルキル基ならびにシクロプロピル（Ｃ３）およびシクロブチル（Ｃ４）が挙げられる。Ｃ３−８シクロアルキル基の例としては、前述のＣ３−６シクロアルキル基ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）およびシクロオクチル（Ｃ８）が挙げられる。特定の実施形態において、シクロアルキル基の各例は、独立に、非置換型であるか（「非置換シクロアルキル」）または１以上の置換基で置換されている（「置換シクロアルキル」）。特定の実施形態において、シクロアルキル基は、非置換Ｃ３−１０シクロアルキルである。特定の実施形態において、シクロアルキル基は、置換Ｃ３−１０シクロアルキルである。
【００３９】
「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子は独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される、３〜１４員非芳香環系のラジカル（「３〜１４員ヘテロシクリル」）を指す。特定の実施形態において、ヘテロシクリルまたは複素環式は、環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子は独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される３〜１０員非芳香環系のラジカル（「３〜１０員ヘテロシクリル」）を指す。１個以上の窒素原子を含むヘテロシクリル基では、その結合点は、原子価が許す限り、炭素または窒素原子であり得る。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）または二環式系（「二環式ヘテロシクリル」）などの縮合、架橋もしくはスピロ縮合環系であり得、飽和されていてもまたは部分的に不飽和であってもよい。ヘテロシクリル二環式環系は、一方または両方の環に１以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロシクリル」にはまた、上記に定義されるようなヘテロシクリル環が１以上のカルボシクリル基と縮合され、その結合点がカルボシクリルまたはヘテロシクリル環上にある環系も含まれ、このような場合には、環員の数はそのヘテロシクリル環系内の環員の数を示し続ける。特定の実施形態において、ヘテロシクリルの各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてよく、例えば、非置換型（「非置換ヘテロシクリル」）または置換型（置換ヘテロシクリル」）である。特定の実施形態において、ヘテロシクリル基は、非置換３〜１０員ヘテロシクリルである。特定の実施形態において、ヘテロシクリル基は、置換３〜１０員ヘテロシクリルである。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子は独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜１０員非芳香環系（「５〜１０員ヘテロシクリル」）である。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子は独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜８員非芳香環系（「５〜８員ヘテロシクリル」）である。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子は独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜６員非芳香環系（「５〜６員ヘテロシクリル」）である。いくつかの実施形態において、５〜６員ヘテロシクリルは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜３個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５〜６員ヘテロシクリルは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜２個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５〜６員ヘテロシクリルは、窒素、酸素、および硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。
【００４１】
１個のヘテロ原子を含む例示的３員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アジルジニル(azirdinyl)、オキシラニル、およびチオレニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的４員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アゼチジニル、オキセタニル、およびチエタニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ジヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ジヒドロピロリル、およびピロリル−２，５−ジオンが挙げられる。２個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、ジオキソラニル、オキサスルフラニル、ジスルフラニル、およびオキサゾリジン−２−オンが挙げられる。３個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、トリアゾリニル、オキサジアゾリニル、およびチアジアゾリニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的６員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル、およびチアニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含む例示的６員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、ピペラジニル、モルホリニル、ジチアニル、およびジオキサニルが挙げられる。３個のヘテロ原子を含む例示的６員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、トリアジナニル(triazinanyl)が挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的７員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アゼパニル、オキセパニルおよびチエパニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的８員ヘテロシクリル基としては、限定されるものではないが、アゾカニル(azocanyl)、オキセカニル(oxecanyl)、およびチオカニル(thiocanyl)が挙げられる。Ｃ６アリール環と縮合された例示的５員ヘテロシクリル基（本明細書ではまた５，６−二環式複素環式環とも呼ばれる）としては、限定されるものではないが、インドリニル、イソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチエニル、およびベンゾキサゾリノニルなどが挙げられる。アリール環に縮合された例示的６員ヘテロシクリル基（本明細書では６，６−二環式複素環式環とも呼ばれる）としては、限定されるものではないが、テトラヒドロキノリニル、およびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。
【００４２】
「アリール」は、芳香環系中に提供される、６〜１４個の環炭素原子を有し、ヘテロ原子を有さない単環式または多環式（例えば、二環式または三環式）４ｎ＋２芳香環系（例えば、環状配置で共有される６、１０、または１４個のπ電子を有する）のラジカル（「Ｃ６−１４アリール」）を指す。いくつかの実施形態において、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの実施形態において、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１−ナフチルおよび２−ナフチルなどのナフチル）。いくつかの実施形態において、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」としてはまた、上記に定義されるようなアリール環が１以上のカルボシクリル基またはヘテロシクリル基と縮合し、そのラジカルまたは結合点がアリール環上にある環系が含まれ、このような場合には、炭素原子の数はそのアリール環系内の炭素原子の数を示し続ける。特定の実施形態において、アリール基の各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてよく、例えば、非置換型（「非置換アリール」）または置換型（「置換アリール」）である。特定の実施形態において、アリール基は、非置換Ｃ６−１４アリールである。特定の実施形態において、アリール基は、置換Ｃ６−１４アリールである。
【００４３】
「ヘテロアリール」は、芳香環系中に提供される環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子が独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜１４員単環式または多環式（例えば、二環式または三環式）４ｎ＋２芳香環系（例えば、環状配置で共有される６または１０個のπ電子を有する）のラジカル（「５〜１４員ヘテロアリール」）を指す。特定の実施形態において、ヘテロアリールは、芳香環系中に提供される環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子が独立に窒素、酸素および硫黄から選択される５〜１０員単環式または二環式４ｎ＋２芳香環系のラジカル（「５−１０員ヘテロアリール」）を指す。１以上の窒素原子を含むヘテロアリール基では、その結合点は、原子価が許容する限り、炭素原子または窒素原子であり得る。ヘテロアリール二環式環系は、一方または両方の環に１以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロアリール」としては、上記に定義されるようなヘテロアリー環が１以上のカルボシクリル基またはヘテロシクリル基と縮合し、その結合点がヘテロアリール環上にある環系が含まれ、このような場合には、環員の数はそのヘテロアリール環系内の環員の数を示し続ける。「ヘテロアリール」としてはまた、上記に定義されるようなヘテロアリール環が１以上のアリール基と縮合し、その結合点がアリール環上またはヘテロアリール環上のいずれかにある環系も含まれ、このような場合には、環員の数はその縮合（アリール／ヘテロアリール）環系内の環員の数を示し続ける。一方の環がヘテロ原子を含まない二環式ヘテロアリール基（例えば、インドリル、キノリニル、およびカルバゾリルなど）において、結合点はいずれの環にあってもよく、例えば、ヘテロ原子を担持する環（例えば、２−インドリル）またはヘテロ原子を含まない環（例えば、５−インドリル）のいずれにあってもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、芳香環系中に提供される環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子が独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜１４員芳香環系（「５〜１４員ヘテロアリール」）である。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、芳香環系中に提供される環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子が独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜１０員芳香環系（「５〜１０員ヘテロアリール」）である。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、芳香環系中に提供される環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子が独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜８員芳香環系（「５〜８員ヘテロアリール」）である。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、芳香環系中に提供される環炭素原子と１〜４個の環ヘテロ原子を有し、各ヘテロ原子が独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される５〜６員芳香環系（「５〜６員ヘテロアリール」）である。いくつかの実施形態において、５〜６員ヘテロアリールは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜３個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５〜６員ヘテロアリールは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜２個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの実施形態において、５〜６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、および硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。特定の実施形態において、ヘテロアリール基の各例は、独立に、１以上の置換基で場合により置換されてよく、例えば、非置換型（「非置換ヘテロアリール」）または置換型（「置換ヘテロアリール」）である。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、非置換５〜１４員ヘテロアリールである。特定の実施形態において、ヘテロアリール基は、置換５〜１４員ヘテロアリールである。
【００４５】
１個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピロリル、フラニルおよびチオフェニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、およびイソチアゾリルが挙げられる。３個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、トリアゾリル、オキサジアゾリル、およびチアジアゾリルが挙げられる。４個のヘテロ原子を含む例示的５員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、テトラゾリルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的６員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピリジニルが挙げられる。２個のヘテロ原子を含む例示的６員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピリダジニル、ピリミジニル、およびピラジニルが挙げられる。３個または４個のヘテロ原子を含む例示的６員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、それぞれトリアジニルおよびテトラジニルが挙げられる。１個のヘテロ原子を含む例示的７員ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、アゼピニル、オキセピニル、およびチエピニルが挙げられる。例示的６，６−二環式ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ナフチリジニル、プテリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノキサリニル、フタラジニル、およびキナゾリニルが挙げられる。例示的５，６−二環式ヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、下式のいずれか一つが挙げられる：
【化７】
2019535800.tif 000008
2019535800.tif 000009
2019535800.tif 000010
【００４６】
単環式または二環式ヘテロアリール基のいずれにおいても、結合点は、原子価が許容する限り、いずれの炭素原子または窒素原子であってもよい。
【００４７】
「部分的に不飽和」は、少なくとも一つの二重結合または三重結合を含む基を指す。「部分的に不飽和」という用語は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義されるような芳香族基（例えば、アリールまたはヘテロアリール基）を含むことは意図されない。同様に、「飽和」は、二重結合または三重結合を含まない、すなわち、総て単結合を含む基を指す。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本明細書で定義されるような脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール基は、場合により置換されてよい（例えば、「置換」もしくは「非置換」脂肪族、「置換」もしくは「非置換」アルキル、「置換」もしくは「非置換」アルケニル、「置換」もしくは「非置換」アルキニル、「置換」もしくは「非置換」カルボシクリル、「置換」もしくは「非置換」ヘテロシクリル、「置換」もしくは「非置換」アリールまたは「置換」もしくは「非置換」ヘテロアリール基）。一般に、「置換」という用語は、「場合により」という用語が先行していてもいなくても、基（例えば、炭素または窒素原子）上に存在する少なくとも１個の水素が許容される置換基、例えば、置換時に、安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離、またはその他の反応によるなどの変換を自発的に受けない化合物を生じる置換基で置換されることを意味する。特に断りのない限り、「置換」基は、基の１以上の置換可能な位置に置換基を有し、任意の所与の構造中の２箇所以上の位置が置換される場合、置換基は各位置において同じかまたは異なる。「置換」という用語は、安定な化合物の形成をもたらす本明細書に記載される置換基のいずれかを含む、有機化合物の総ての許容される置換基による置換を含むことが企図される。本開示は、安定な化合物に到達するためにあらゆるこのような組合せを企図する。本開示の趣旨では、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たし、安定な部分の形成をもたらす本明細書に記載される任意の好適な置換基を有し得る。
【００４９】
例示的炭素原子置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−Ｓ０３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−ＯＮ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）３＋Ｘ、−Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、−ＳＨ、−ＳＲａａ、−ＳＳＲＣＣ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨＯ、−Ｃ（ＯＲｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２ＯＲａａ、−ＯＳＯ２Ｒａａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−ＯＳｉ（Ｒａａ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−Ｐ（ＲＣＣ）２、−Ｐ（ＲＣＣ）３、−ＯＰ（Ｒｃｃ）２、−ＯＰ（Ｒｃｃ）３、−Ｂ（Ｒａａ）２、−Ｂ（ＯＲｃｃ）２、−ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０ペルハロアルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールが挙げられ、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換され；
あるいは炭素原子上の２個のジェミナル水素は、基＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂ、または＝ＮＯＲｃｃで置換され；Ｒａａの各例は、独立に、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０ペルハロアルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲａａ基は結合して３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換され；
Ｒｂｂの各例は、独立に、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（ＲＣＣ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｓ０２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲＣＣ）Ｎ（ＲＣＣ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＣＣ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲＣＣ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０ペルハロアルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｂｂ基は結合して３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換され；
Ｒｃｃの各例は、独立に、水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０ペルハロアルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｃｃ基は結合して３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換され；
Ｒｄｄの各例は、独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲｅｅ、−ＯＮ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）３＋Ｘ、−Ｎ（ＯＲｅｅ）Ｒｆｆ、−ＳＨ、−ＳＲｅｅ、−ＳＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＯＣＯ２Ｒｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣＯ２Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＳＯ２Ｒｅｅ、−Ｓ０２ＯＲｅｅ、−ＯＳ０２Ｒｅｅ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−Ｓｉ（Ｒｅｅ）３、−ＯＳｉ（Ｒｅｅ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ペルハロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１０員ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリールから選択され、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｇｇ基で置換されるか、または２個のジェミナルＲｄｄ置換基は結合して＝Ｏもしくは＝Ｓを形成し；
Ｒｅｅの各例は、独立に、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ペルハロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、３〜１０員ヘテロシクリル、および３〜１０員ヘテロアリールから選択され、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｇｇ基で置換され；
Ｒｆｆの各例は、独立に、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ペルハロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１０員ヘテロシクリル、Ｃ１−６アリールおよび５〜１０員ヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｆｆ基は結合して３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｇｇ基で置換され；かつ、
Ｒｇｇの各例は、独立に、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ１−６アルキル、−ＯＮ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）３＋Ｘ−、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）２＋Ｘ−、−ＮＨ２（Ｃ１−６アルキル）＋Ｘ−、−ＮＨ３＋Ｘ、−Ｎ（ＯＣ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（ＯＨ）、−ＳＨ、−Ｓ１−６アルキル、−ＳＳ（Ｃ１−６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）、−ＯＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１−６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１−６アルキル）、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１−６アルキル、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−６アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２，−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯ２ＯＣ１−６アルキル、−ＯＳＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＳＯＣ１−６アルキル、−Ｓｉ（Ｃ１−６アルキル）３、−ＯＳｉ（Ｃ１−６アルキル）３  −Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１−６アルキル）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１−６アルキル、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１−６アルキル、−Ｐ（＝Ｏ）２（Ｃ１−６アルキル）、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１−６アルキル）２、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６ペルハロアルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、３〜１０員ヘテロシクリル、５〜１０員ヘテロアリールであるか；または２個のジェミナルＲｇｇ置換基は結合して＝Ｏもしくは＝Ｓを形成することができ；ここで、Ｘは対イオンである。
【００５０】
「対イオン」または「アニオン性対イオン」は、電子的中立性を維持するために、カチオン性第四級アミノ基と結合される負電荷を有する基である。例示的対イオンとしては、ハロゲン化物イオン（例えば、Ｆ−、ＣＩ−、Ｂｒ−、Ｉ−）、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＯＨ−、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＳＯ４−、スルホン酸イオン（例えば、メタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、１０−カンファースルホン酸イオン、ナフタレン−２−スルホン酸イオン、ナフタレン−ｌ−スルホン酸−５−スルホン酸イオン、およびエタン−ｌ−スルホン酸−２−スルホン酸イオンなど）、ならびにカルボン酸イオン（例えば、酢酸イオン、エタン酸イオン、プロパン酸イオン、安息香酸イオン、グリセリン酸イオン、乳酸イオン、酒石酸イオン、およびグリコール酸イオンなど）が挙げられる。
【００５１】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素（フルオロ、−Ｆ）、塩素（クロロ、−ＣＩ）、臭素（ブロモ、−Ｂｒ）、またはヨウ素（ヨード、−Ｉ）を指す。
【００５２】
窒素原子は、原子価が許容する限り、置換または非置換であり得、第一級、第二級、第三級、および第四級窒素原子を含み得る。例示的窒素原子置換基(substitutents)としては、限定されるものではないが、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（ＲＣＣ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲＣＣ）Ｎ（ＲＣＣ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＣＣ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲＣＣ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０ペルハロアルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールが挙げられるか、または窒素原子と結合している２個のＲｃｃ基は結合して３〜１４員ヘテロシクリルもしくは５〜１４員ヘテロアリール環を形成し、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲｄｄ基で置換され、かつ、Ｒａａ、Ｒｂｂ、ＲｃｃおよびＲｄｄは上記で定義される通りである。
【００５３】
特定の実施形態において、窒素原子上に存在する置換基は、窒素保護基（アミノ保護基とも呼ばれる）である。窒素保護基としては、限定されるものではないが、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（ＲＣＣ）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲＣＣ）Ｎ（ＲＣＣ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＣＣ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲＣＣ、Ｃ１−１０アルキル｛例えば、アラルキル、へテロアラルキル）、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、Ｃ３−１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６−１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリール基が挙げられ、ここで、各アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アラルキル、アリール、およびヘテロアリールは、独立に、０、１、２、３、４、または５個のＲ基で置換され、かつ、Ｒａａ、Ｒｂｂ、Ｒｃｃ、およびＲｄｄは、本明細書で定義される通りである。窒素保護基は当技術分野で周知であり、引用することにより本明細書の一部とされるProtecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999に詳細に記載されているものが含まれる。
【００５４】
アミド窒素保護基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）としては、限定されるものではないが  ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド(o-nitophenylacetamide)、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシアシルアミノ）アセトアミド、３−｛ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン、ｏ−ニトロベンズアミド、およびｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミドが挙げられる。
【００５５】
カルバミン酸窒素保護基（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａａ）としては、限定されるものではないが、メチルカルバマート、エチルカルバマート(ethyl carbamante)、９−フルオレニルメチルカルバマート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバマート、９−（２，７−ジブロモ）フルオロエニルメチルカルバマート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０、１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバマート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバマート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバマート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチル（Ｔｅｏｃ）カルバマート、２−フェニルエチルカルバマート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバマート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバマート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバマート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバマート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチルカルバマート（Ｂｐｏｃ）、ｌ−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバマート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバマート（Ｐｙｏｃ）、２−｛Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバマート、ｔ−ブチルカルバマート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバマート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバマート（Ｖｏｃ）、アリルカルバマート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバマート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバマート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバマート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバマート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバマート、アルキルジチオカルバマート、ベンジルカルバマート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバマート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバマート(p-nitobenzyl carbamate)、ｐ−ブロモベンジルカルバマート、ｐ−クロロベンジルカルバマート、２，４−ジクロロベンジルカルバマート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバマート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバマート、ジフェニルメチルカルバマート、２−メチルチオエチルカルバマート、２−メチルスルホニルエチルカルバマート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバマート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバマート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバマート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバマート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバマート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバマート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバマート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバマート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバマート、５−ベンズイソキサゾリルメチルカルバマート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバマート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバマート、３，５−ジメトキシベンジルカルバマート、ｏ−ニトロベンジルカルバマート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバマート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバマート、ｔ−アミルカルバマート、Ｓ−ベンジルチオカルバマート、ｐ−シアノベンジルカルバマート、シクロブチルカルバマート、シクロヘキシルカルバマート、シクロペンチルカルバマート、シクロプロピルメチルカルバマート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバマート、２，２−ジメトキシアシルビニルカルバマート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバマート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバマート、１，１−ジメチルプロピニルカルバマート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバマート、２−フラニルメチルカルバマート、２−ヨードエチルカルバマート、イソボルニルカルバマート(isoborynl carbamate)、イソブチルカルバマート、イソニコチニルカルバマート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバマート、１−メチルシクロブチルカルバマート、１−メチルシクロヘキシルカルバマート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバマート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバマート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバマート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバマート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバマート、フェニルカルバマート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバマート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバマート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバマート、および２，４，６−トリメチルベンジルカルバマートが挙げられる。
【００５６】
スルホンアミド窒素保護基（例えば、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａａ）としては、限定されるものではないが、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５、６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７、８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、およびフェナシルスルホンアミドが挙げられる。
【００５７】
他の窒素保護基としては、限定されるものではないが、フェノチアジニル−（１０）−アシル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノアシル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオアシル誘導体、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡ塩基）、５−置換ｌ，３−ジメチル−ｌ，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−ｌ，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−プロオリン(pyroolin)−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタアシルクロム−またはタングステン）アシル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミダート、ジベンジルホスホルアミダート、ジフェニルホスホルアミダート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、および３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）が挙げられる。
【００５８】
特定の実施形態において、酸素原子上に存在する置換基は、酸素保護基（ヒドロキシル保護基とも呼ばれる）である。酸素保護基としては、限定されるものではないが、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（ＲＣＣ）２、−Ｐ（ＲＣＣ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２が挙げられ、ここで、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは本明細書で定義される通りである。酸素保護基は当技術分野で周知であり、引用することにより本明細書の一部とされるProtecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999に詳細に記載されているものが含まれる。
【００５９】
例示的酸素保護基としては、限定されるものではないが、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、ｌ−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジスルフラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシ���シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルマート、ベンゾイルホルマート、アセタート、クロロアセタート、ジクロロアセタート、トリクロロアセタート、トリフルオロアセタート、メトキシアセタート、トリフェニルメトキシアセタート、フェノキシアセタート、ｐ−クロロフェノキシアセタート、３−フェニルプロピオナート、４−オキソペンタノアート（レブリナート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノアート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロアート、アダマントアート、クロトナート、４−メトキシクロトナート、ベンゾアート、ｐ−フェニルベンゾアート、２，４，６−トリメチルベンゾアート（メシトアート）、ｔ−ブチルカルボナート（ＢＯＣ）、アルキルメチルカルボナート、９−フルオレニルメチルカルボナート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカルボナート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカルボナート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカルボナート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカルボナート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカルボナート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカルボナート、アルキルビニルカルボナート、アルキルアリルカルボナート、アルキルｐ−ニトロフェニルカルボナート、アルキルベンジルカルボナート、アルキルｐ−メトキシベンジルカルボナート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカルボナート、アルキルｏ−ニトロベンジルカルボナート、アルキルｐ−ニトロベンジルカルボナート、アルキルＳ−ベンジルチオカルボナート、４−エトキシ−ｌ−ナフチルカルボナート、メチルジチオカルボナート、２−ヨードベンゾアート、４−アジドブチラート、４−ニトロ−４−メチルペンタノアート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾアート、２−ホルミルベンゼンスルホナート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチラート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾアート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセタート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセタート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセタート、クロロジフェニルアセタート、イソブチラート、モノスクシノアート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノアート、ｏ−（メトキシアシル）ベンゾアート、ａ−ナフトアート、ニトラート、アルキルΝ，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチルホスホロジアミダート、アルキルＮ−フェニルカルバマート、ボラート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェナート、スルファート、メタンスルホナート（メシラート）、ベンジルスルホナート、およびトシラート（Ｔｓ）が挙げられる。
【００６０】
特定の実施形態において、硫黄原子上に存在する置換基は、硫黄保護基（チオール保護基とも呼ばれる）。硫黄保護基としては、限定されるものではないが、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３−Ｐ（ＲＣＣ）２、−Ｐ（ＲＣＣ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、および−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２が挙げられ、ここで、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは本明細書で定義される通りである。硫黄保護基は当技術分野で周知であり、引用することにより本明細書の一部とされるProtecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, 1999に詳細に記載されているものが含まれる。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「脱離基」、または「ＬＧ」は、ヘテロリシス結合開裂時に電子対を持って離れる分子フラグメントを指すと当技術分野で理解される用語であり、前記分子フラグメントは陰イオンまたは中性分子である。例えば、Smith, March Advanced Organic Chemistry 6th ed. (501-502)参照。好適な脱離基の例としては、限定されるものではないが、ハリド（例えば、塩化物、臭化物、またはヨウ化物）、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、アルカンスルホニルオキシ、アレンスルホニルオキシ、アルキルカルボニルオキシ（例えば、アセトキシ）、アリールカルボニルオキシ、アリールオキシ、メトキシ、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノ、ピキシル(pixyl)、ハロホルマート、−Ｎ０２、トリアルキルアンモニウム、およびアリールヨードニウム塩が挙げられる。いくつかの実施形態において、脱離基は、スルホン酸エステルである。いくつかの実施形態において、スルホン酸エステルは、式−ＯＳＯ２ＲＬＧ１を含んでなり、式中、ＲＬＧ１は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいヘテロアルキル、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、場合により置換されていてもよいアリールアルキル、および場合により置換されていてもよいヘテロアリールアルキル(heterarylalkyl)からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＬＧｌは、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態において、ＲＬＧｌはメチルである。いくつかの実施形態において、ＲＬＧｌは、置換または非置換アリールである。いくつかの実施形態において、ＲＬＧｌは、置換または非置換(unsubstitued)フェニルである。いくつかの実施形態において、ＲＬＧｌは、下式である。
【化８】
2019535800.tif 000011
【００６２】
いくつかの場合において、脱離基は、トルエンスルホナート（トシラート、Ｔｓ）、メタンスルホナート（メシラート、Ｍｓ）、ｐ−ブロモベンゼンスルホニル（ブロシラート、Ｂｓ）、またはトリフルオロメタンスルホナート（トリフラート、Ｔｆ）である。いくつかの場合において、脱離基は、ブロシラート（ｐ−ブロモベンゼンスルホニル）である。いくつかの場合において、脱離基は、ノシラート（２−ニトロベンゼンスルホニル）である。いくつかの実施形態において、脱離基は、スルホナート含有基である。いくつかの実施形態において、脱離基は、トシラート基である。脱離基はまた、ホスフィンオキシド（例えば、光延反応の際に形成される）またはエポキシドもしくは環式スルファートなどの内部脱離基であってもよい。
【００６３】
これらおよびその他の例示的置換基は実施例および特許請求の範囲にさらに詳細に記載されている。本開示は、上記の置換基の例示的一覧によって何ら限定されるものではない。
【００６４】
「薬学上許容可能な塩」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび他の動物の組織と接触した状態で使用するのに好適であり、かつ妥当なベネフィット／リスク比に見合う塩を指す。薬学的上許容可能な塩は、当技術分野において周知である。例えば、BergeらがJ. Pharmaceutical Sciences (1977) 66: 1-19において薬学上許容可能な塩を詳細に説明している。本明細書に記載される化合物の薬学上許容可能な塩は、好適な無機および有機酸および塩基から誘導されるものを含む。薬学的に許容可能な非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸とともに、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸とともに、またはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩がある。他の薬学上許容可能な塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、および吉草酸塩、などが挙げられる。適当な塩基から誘導される塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学上許容可能な塩としては、適当であれば、第四級塩が挙げられる。
【００６５】
本発明は、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤を提供する。一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は式（Ｉ）の化合物：
【化９】
2019535800.tif 000012
［式中、
ＸはＮであり、ＺはＮＲ４であり、かつ、ＹはＣＲ５であるか；または
ＸはＮＲ４であり、ＺはＮであり、かつ、ＹはＣＲ５であるか；または
ＸはＣＲ５であり、ＺはＮＲ４であり、かつ、ＹはＮであるか；または
ＸはＣＲ５であり、ＺはＮであり、かつ、ＹはＮＲ４であり；
ＲＸは、場合により置換されていてもよいＣ１−４アルキルまたは場合により置換されていてもよいＣ３−４シクロアルキルであり；
Ｌ１は、結合、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＢ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＢ）ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）−、または場合により置換されていてもよいＣ１−６飽和もしくは不飽和炭化水素鎖であり、ここで、前記炭化水素鎖の１以上のメチレン単位は場合により、かつ、独立に、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＢ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）−、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）−、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＢ）−、−ＮＲＢＣ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（ＲＢ）ＳＯ２−、または−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）−で置換され；
各ＲＡは独立に、水素、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、酸素原子と結合している場合には酸素保護基、および硫黄原子と結合している場合には硫黄保護基からなる群から選択され；
各ＲＢは独立に、水素、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、および窒素保護基からなる群から選択されるか、または同じ窒素原子上のＲＢとＲＷは、間にある窒素と一緒に場合により置換されていてもよい複素環式環を形成してもよく；
ＲＷは、水素、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、または場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；ただし、Ｌ１が結合である場合には、ＲＷは、水素、場合により置換されていてもよいアリール、または場合により置換されていてもよいヘテロアリールでなく；
Ｒ３は、水素、Ｃ１−４アルキル、またはＣ３−４シクロアルキルであり；
Ｒ４は、水素、場合により置換されていてもよいＣ１−６アルキル、場合により置換されていてもよいＣ２−６アルケニル、場合により置換されていてもよいＣ２−６アルキニル、場合により置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル、場合により置換されていてもよい４〜７員のヘテロシクリル；または場合により置換されていてもよいＣ１−４アルキル−Ｃｙであり；
Ｃｙは、場合により置換されていてもよいＣ３−７シクロアルキル、場合により置換されていてもよい４〜７員のヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、または場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；かつ、
Ｒ５は、水素、ハロ、−ＣＮ、場合により置換されていてもよいＣ１−４アルキル、または場合により置換されていてもよいＣ３−４シクロアルキルである］
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒ３は、メチルである。一つの側面において、Ｒ４は、水素である。一つの側面において、Ｒ５は、水素である。一つの側面において、Ｌ１は、結合である。
【００６６】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、−Ｌ１−ＲＷが場合により置換されていてもよいカルボシクリルである式（Ｉ）の化合物である。一つの側面において、Ｒ３はＣ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒ３はメチルである。別の側面において、Ｒ４は水素である。一つの側面において、Ｒ５は水素である。一つの側面において、Ｌ１は結合である。
【００６７】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（Ｖ）の化合物
【化１０】
2019535800.tif 000013
［式中、環Ａは場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、または場合により置換されていてもよいヘテロアリールである］
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、環Ａは、場合により置換されていてもよいカルボシクリルである。一つの側面において、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒ３は、メチルである。一つの側面において、Ｒｘは、非置換Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒｘは、メチルである。一つの側面において、Ｌ１は、結合である。
【００６８】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＶＩ）の化合物
【化１１】
2019535800.tif 000014
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、環Ａは、場合により置換されていてもよいカルボシクリルである。一つの側面において、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒ３は、メチルである。一つの側面において、Ｒｘは、非置換Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒｘは、メチルである。
【００６９】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物：
【化１２】
2019535800.tif 000015
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、−Ｌ１−ＲＷは、場合により置換されていてもよいカルボシクリルである。一つの側面において、Ｒ３は、Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒ３は、メチルである。一つの側面において、Ｒｘは、非置換Ｃ１−４アルキルである。一つの側面において、Ｒｘは、メチルである。一つの側面において、Ｒ４は、水素である。
【００７０】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａ：
【化１３】
2019535800.tif 000016
またはその薬学上許容可能な塩である。化合物Ａおよび化合物Ａを製造する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９７１０の少なくとも第１７１頁（化合物１５８）および第２６６頁、段落［００３３１］に開示されている。
【００７１】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａ−３ＨＣｌ、すなわち、化合物Ａの３ＨＣｌ塩である。別の実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａ−１ＨＣｌ、すなわち、化合物Ａの１ＨＣｌ塩である。さらに別の実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａ−遊離塩基、すなわち、化合物Ａの遊離塩基型である。さらに別の実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａ−２ＨＣｌ、すなわち、化合物Ａの２ＨＣｌ塩である。
【００７２】
一つの実施形態では、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄ：
【化１４】
2019535800.tif 000017
またはその薬学上許容可能な塩である。
【００７３】
Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤はさらに、引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９７１０に開示されている。例示的Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９７１０の表１Ａおよび表１Ｂに開示され、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤を製造する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９７１０の少なくとも第２２６頁段落［００２７４］〜第３２８頁段落［０００５０］に記載されている。
【００７４】
本発明はまた、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を提供する。一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＩＩＩ）の化合物：
【化１５】
2019535800.tif 000018
［式中、
【化１６】
2019535800.tif 000019
は、単結合または二重結合を表し；
Ｒ１は、水素、Ｒｚ、または−Ｃ（Ｏ）Ｒｚであり、ここで、Ｒｚは、場合により置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり；
Ｌは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−，−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−であり；
各Ｒは、独立に、水素または場合により置換されていてもよいＣ１−６脂肪族であり；
Ａｒは、独立に窒素、酸素、および硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する単環式または二環式芳香環であり、ここで、Ａｒは、原子価が許容する限り、０、１、２、３、４、または５個のＲｙ基で置換され；
各Ｒｙは独立に、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、場合により置換されていてもよい脂肪族、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、−ＯＲＡ、−Ｎ（ＲＢ）２、−ＳＲＡ、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）ＲＡ、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＳＣ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＮＲＢ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＯＲＡ）ＲＡ、−Ｃ（＝ＮＲＢ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（＝ＮＲＢ）ＲＢ、−Ｃ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＢ）２、−ＮＲＢＣ（＝Ｓ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−ＯＳ（Ｏ）２ＲＡ、−ＳＯ２ＲＡ、−ＮＲＢＳＯ２ＲＡ、または−ＳＯ２Ｎ（ＲＢ）２からなる群から選択され；
各ＲＡは独立に、水素、場合により置換されていてもよい脂肪族、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、および場合により置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され；
各ＲＢは独立に、水素、場合により置換されていてもよい脂肪族、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、および場合により置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択されるか、または２個のＲＢ基は、それらの間にある原子と一緒に場合により置換されていてもよい複素環式環を形成し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は独立に、水素、ハロ、または場合により置換されていてもよい脂肪族であり；
各ＲＸは独立に、ハロ、−ＣＮ、場合により置換されていてもよい脂肪族、−ＯＲ’、および−Ｎ（Ｒ”）２からなる群から選択され；
Ｒ’は、水素または場合により置換されていてもよい脂肪族であり；
各Ｒ”は独立に、水素または場合により置換されていてもよい脂肪族であるか、または２個のＲ”は、それらの間にある原子と一緒に複素環式環を形成し；かつ、
ｎは、原子価が許容する限り、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である］
またはその薬学上許容可能な塩である。
【００７５】
一つの側面において、Ｌは−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−である。一つの側面において、Ｒ１は水素である。一つの側面において、ｎは０である。
【００７６】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＩＶ）の化合物：
【化１７】
2019535800.tif 000020
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、少なくとも一つのＲｙは−ＮＨＲＢである。一つの側面において、ＲＢは、場合により置換されていてもよいシクロアルキルである。
【００７７】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１８】
2019535800.tif 000021
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、Ｌは−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−である。一つの側面において、Ｒ１は水素である。一つの側面において、ｎは０である。
【００７８】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化１９】
2019535800.tif 000022
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、Ｌは−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−である。一つの側面において、Ｒ１は水素である。一つの側面において、ｎは０である。
【００７９】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＩＸ）の化合物：
【化２０】
2019535800.tif 000023
またはその薬学上許容可能な塩である。
【００８０】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂ：
【化２１】
2019535800.tif 000024
またはその薬学上許容可能な塩である。
【００８１】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（Ｘ）の化合物：
【化２２】
2019535800.tif 000025
またはその薬学上許容可能な塩である。一つの側面において、Ｒｙは−ＮＨＲＢである。一つの側面において、ＲＢは、場合により置換されていてもよいヘテロシクリルである。
【００８２】
特定の実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式（ＸＩ）の化合物：
【化２３】
2019535800.tif 000026
またはその薬学上許容可能な塩であり、式中、Ｘは、−Ｃ（ＲＸＣ）２−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲＸＮ−であり、ここで、ＲＸＣの各例は独立に、水素、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、または場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；ＲＸＮは独立に、水素、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、−Ｃ（＝Ｏ）ＲＸＡ、または窒素保護基であり；ＲＸＡは、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいカルボシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいアリール、または場合により置換されていてもよいヘテロアリールである。
【００８３】
一つの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は化合物Ｃ：
【化２４】
2019535800.tif 000027
またはその薬学上許容可能な塩である。化合物Ｃおよび化合物Ｃを製造する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７７２３５の少なくとも第１４１頁（化合物２０８）および第２９１頁第［００４６４］段落〜第２９４頁第［００４６９］段落に開示されている。
【００８４】
別の実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｅ：
【化２５】
2019535800.tif 000028
またはその薬学上許容可能な塩である。
【００８５】
別の実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｆ：
【化２６】
2019535800.tif 000029
またはその薬学上許容可能な塩である。
【００８６】
ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、さらに、引用することにより本明細書の一部とされるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７７２３５およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４３６７９に開示されている。例示的ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７７２３５の表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表１Ｄ、表１Ｅ、表１Ｆ、および表１Ｇに開示され、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を製造する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７７２３５の少なくとも第２３９頁第［００３５９］段落〜第３０１頁第［００４８５］段落に記載されている。ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤またはＰＲＭＴ５阻害剤の他の限定されない例は、下記の公開特許出願ＷＯ２０１１／０７９２３６、ＷＯ２０１４／１００６９５、ＷＯ２０１４／１００７１６、ＷＯ２０１４／１００７３０、ＷＯ２０１４／１００７６４、およびＷＯ２０１４／１００７３４、および米国仮出願第６２／０１７，０９７号および同第６２／０１７，０５５号に開示されている。これらの特許出願に記載されている一般化合物および特定の化合物は、引用することにより本明細書の一部とされ、本明細書に記載されるような癌を処置するために使用可能である。いくつかの実施形態において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。ＰＲＭＴ５に対するｓｉＲＮＡは、例えば、Mol Cancer Res. 2009 Apr;7(4): 557-69, and Biochem J. 2012 Sep 1;446(2):235-41に記載されている。
【００８７】
一つの実施形態では、Ｉ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤とＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤の組合せが提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、化合物Ａと化合物Ｃの組合せが提供される。
【００８８】
別の実施形態では、必要とするヒトにおいて癌を処置するための方法であって、前記ヒトにＩ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の組合せを、薬学上許容可能な担体および薬学上許容可能な希釈剤のうち少なくとも一つとともに投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる方法が提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、必要とするヒトにおいて癌を処置するための方法であって、前記ヒトに化合物Ａと化合物Ｃの組合せを、薬学上許容可能な担体および薬学上許容可能な希釈剤のうち少なくとも一つとともに投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる方法が提供される。
【００８９】
さらなる実施形態では、治療上有効な量のＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（Ｉ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量のＩＩ型タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＩＩ型ＰＲＭＴ）阻害剤を含んでなる第２の医薬組成物が提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、治療上有効な量の化合物Ａを含んでなる医薬組成物、および治療上有効な量の化合物Ｃを含んで第２の医薬組成物が提供される。
【００９０】
別の実施形態では、医薬の製造のためのＩ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の組合せの使用が提供される。一つの実施形態では、癌の処置のためのＩ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤の組合せが提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、医薬の製造のための化合物Ａと化合物Ｃの組合せが提供される。
【００９１】
一つの実施形態では、医学において同時、個別、または逐次使用するための組合せ製剤としての、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含有する製品が提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、医学において同時、個別、または逐次使用するための組合せ製剤としての、化合物Ａと化合物Ｃを含有する製品が提供される。
【００９２】
さらに別の実施形態では、ヒト対象における癌の処置に同時、個別、または逐次使用するための組合せ製剤としての、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含有する製品が提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、ヒト対象における癌の処置に同時、個別、または逐次使用するための組合せ製剤としての、化合物Ａと化合物Ｃを含有する製品が提供される。
【００９３】
別の実施形態では、ヒト対象における癌の処置に同時、個別、または逐次使用するための組合せ製剤としての、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含有する製品が提供され、ここで、癌は、黒色腫、乳癌、リンパ腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、または膀胱癌である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。一つの実施形態では、ヒト対象における癌の処置に同時、個別、または逐次使用するための組合せ製剤としての、化合物Ａと化合物Ｃを含有する製品が提供され、ここで、癌は、黒色腫、乳癌、リンパ腫、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、または膀胱癌である。
【００９４】
一つの実施形態では、必要とするヒトにおいて癌を処置するための方法であって、前記ヒトに治療上有効な量の、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤を含んでなる医薬組成物とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を含んでなる医薬組成物を投与し、それにより、前記ヒトにおいて癌を処置することを含んでなる方法が提供される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＰＲＭＴ１）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ３（ＰＲＭＴ３）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ４（ＰＲＭＴ４）阻害剤、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ６（ＰＲＭＴ６）阻害剤、またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ８（ＰＲＭＴ８）阻害剤である。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）阻害剤またはタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ９（ＰＲＭＴ９）阻害剤である。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ａである。別の側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｄである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。別の側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｂである。一つの側面において、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、化合物Ｃである。
【００９５】
本明細書の実施例のいずれにおいても、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤およびＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、同時、任意の順序で逐次、全身、経口、静脈内、および腫瘍内から選択される経路で患者に投与される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤および／またはＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、経口投与される。一つの側面において、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤とＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤は、約１：１比で投与される。
【００９６】
本明細書の実施例のいずれにおいても、癌は、固形腫瘍または血液癌である。一つの側面においては、黒色腫、乳癌、リンパ腫、または膀胱癌である。
【００９７】
一つの側面において、癌は、頭頸部癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、多形性膠芽腫、バナヤン−ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス病、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、腎臓癌、肝臓癌、黒色腫、膵臓癌、肉腫、骨肉腫、骨の巨細胞腫瘍、甲状腺癌、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性(myelogenous)白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性(myelogenous)白血病、ＡＭＬ、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫  巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽腫、膀胱癌、尿路上皮癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬粘膜癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）、および精巣癌から選択される。
【００９８】
一つの側面において、本発明の方法は、少なくとも１種類の新生物薬を前記ヒトに投与することをさらに含んでなる。
【００９９】
一つの側面において、前記ヒトは固形腫瘍を有する。一つの側面において、腫瘍は、頭頸部癌、胃癌、黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、食道癌、非小細胞肺癌、前立腺癌、大腸癌、卵巣癌および膵臓癌から選択される。別の側面において、前記ヒトは、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、多発性骨髄腫、慢性リンパ芽球性白血病(chronic lyphomblastic leukemia)（ＣＬＬ）、濾胞性リンパ腫、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの液性腫瘍を有する。
【０１００】
本開示はまた、脳癌（神経膠腫）、膠芽腫、バナヤン−ゾナナ症候群、カウデン病、レルミット−デュクロス病、乳癌、炎症性乳癌、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、骨肉腫、骨の巨細胞腫瘍、甲状腺癌、リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、形質細胞腫、免疫芽球性大細胞白血病、マントル細胞白血病、多発性骨髄腫  巨核芽球性白血病、多発性骨髄腫、急性巨核球性白血病、前骨髄球性白血病、赤白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、神経芽腫、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、中皮腫、食道癌、唾液腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽頭癌、頬粘膜癌、口腔癌、ＧＩＳＴ（消化管間質腫瘍）および精巣癌から選択される癌を処置するまたはその重篤度を軽減するための方法に関する。
【０１０１】
「処置する」およびその文法上の変形は、本明細書で使用する場合、治療的療法を意味する。特定の病態に関して、処置するとは、（１）病態、もしくは病態の生物学的徴候の１以上の寛解または予防、（２）（ａ）病態に繋がる、もしくは病態の原因となる生物学的カスケードの１以上の点への、または（ｂ）病態の生物学的徴候の１以上への干渉、（３）病態もしくはその処置に関連する症状、影響もしくは副作用の１以上の軽減、または（４）病態、もしくは病態の生物学的徴候の１以上の進行の遅延を意味する。予防的療法もまた、企図される療法である。当業者は、「予防」が絶対的な用語ではないことを認識するであろう。医学では、「予防」は、病態またはその生物学的徴候の可能性もしくは重篤度を実質的に引き下げるため、またはそのような病態もしくはその生物学的徴候の発症を遅延させるための薬物の予防的投与を指すと理解される。予防的療法は、例えば、対象が癌を発症する高いリスクがあると考えられる場合、例えば、対象が癌の強い家族歴を有する場合または対象が発癌物質に曝されていた場合に適当である。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「癌」、「新生物」および「腫瘍」という用語は、単数形または複数のいずれかで互換的に使用され、それらを宿主生物に対して病的にする悪性化を受けた細胞を指す。原発性癌細胞は、十分に確立された技術、特に、組織学的検査によって非癌性細胞から容易に識別することができる。癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先に由来するいずれの細胞も含む。これには、転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として発現する癌の種類に言及する場合、「臨床上検出可能な」腫瘍は、例えば、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波もしくは身体検査時の触診、および／または患者から取得可能なサンプル中の１以上の癌特異的抗原の発現のための検出可能であるものなどの手段によって、腫瘍塊に基づいて検出可能なものである。腫瘍は、造血系（または血液性または血液のまたは血液関連）癌、例えば、血液細胞もしくは免疫細胞由来の癌であり得、これは「液性腫瘍」とも呼ばれることがある。血液性腫瘍に基づく臨床病態の特定の例としては、慢性骨髄球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病および急性リンパ球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫、ＭＧＵＳおよびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症などの形質細胞悪性腫瘍；非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫などのリンパ腫などが挙げられる。
【０１０３】
癌は、異常な数の芽細胞または望まれない細胞増殖が存在するか、またはリンパ性および骨髄性(myeloid)悪性腫瘍の両方を含む血液癌として診断されるいずれの癌であってもよい。骨髄性(Myeloid)悪性腫瘍としては、限定されるものではないが、急性骨髄性(myeloid)（または骨髄球性または骨髄性(myelogenous)または骨髄芽球性）白血病（未分化型または分化型）、急性前骨髄性(promyeloid)（または前骨髄球性または前骨髄性(promyelogenous)または前骨髄芽球性）白血病、急性骨髄単球性（または骨髄単芽球性）白血病、急性単球性（または単芽球性）白血病、赤白血病および巨核球性（または巨核芽球性）白血病が挙げられる。これらの白血病は、急性骨髄性(myeloid)（または骨髄球性または骨髄性(myelogenous)）白血病（ＡＭＬ）と総称される場合がある。骨髄性悪性腫瘍としてはまた、限定されるものではないが、慢性骨髄性(myelogenous)（または骨髄性(myeloid)）白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、本態性血小板血症（または血小板増加症）、および真性赤血球増加症(polcythemia vera)（ＰＣＶ）を含む骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）が含まれる。骨髄性(Myeloid)悪性腫瘍にはまた、難治性貧血（ＲＡ）、芽球増加を伴う難治性貧血（ＲＡＥＢ）、および移行期の芽球増加を伴う難治性貧血（ＲＡＥＢＴ）とも呼ばれる骨髄異形成（または骨髄異形成症候群またはＭＤＳ）；ならびに特発性骨髄化生を伴うまたは伴わない骨髄線維症（ＭＦＳ）も含まれる。
【０１０４】
造血系癌としてはまた、リンパ節、脾臓、骨髄、末梢血、および／または節外部位に影響を及ぼし得るリンパ性悪性腫瘍が含まれる。リンパ性癌としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）を含むＢ細胞悪性腫瘍が含まれる。Ｂ−ＮＨＬは、インドレント（または低悪性度）、中悪性度（またはアグレッシブ）または高悪性度（高度アグレッシブ）であり得る。インドレントＢ細胞リンパ腫には、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）；小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）；辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）（節性ＭＺＬ、節外性ＭＺＬ、脾ＭＺＬおよび絨毛リンパ球を伴う脾ＭＺＬを含む)；リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）ならびに粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴまたは節外性辺縁帯）リンパ腫が含まれる。中悪性度Ｂ−ＮＨＬとしては、白血病性浸潤を伴うまたは伴わないマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性大細胞（またはグレード３またはグレード３Ｂ）リンパ腫、および原発性縦隔リンパ腫（ＰＭＬ）が含まれる。高悪性度Ｂ−ＮＨＬとしては、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、バーキット様リンパ腫、小型非切れ込み核細胞性リンパ腫（ＳＮＣＣＬ）およびリンパ芽球性リンパ腫が含まれる。その他のＢ−ＮＨＬとしては、免疫芽球性リンパ腫（または免疫細胞腫）、原発性滲出液リンパ腫、ＨＩＶ関連（またはＡＩＤＳ関連）リンパ腫、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）またはリンパ腫が含まれる。Ｂ細胞悪性腫瘍にはまた、限定されるものではないが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病、急性リンパ性（またはリンパ球性またはリンパ芽球性）白血病、およびキャッスルマン病も含まれる。ＮＨＬにはまた、限定されるものではないが、非特定型Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＯＳ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、血管免疫芽球性リンパ性障害（ＡＩＬＤ）、鼻型ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／Ｔ細胞リンパ腫、ガンマ／デルタリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、およびセザリー症候群を含むＴ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ−ＮＨＬ）も含まれ得る。
【０１０５】
造血系癌にはまた、古典的ホジキンリンパ腫、結節性硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型（ＬＰ）ホジキンリンパ腫、結節性ＬＰホジキンリンパ腫、およびリンパ球減少型ホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫（または疾患）も含まれる。造血系癌にはまた、くすぶり型ＭＭを含む多発性骨髄腫（ＭＭ）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined (or unknown or unclear) significance)（ＭＧＵＳ）、形質細胞腫（骨、髄外）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、形質細胞白血病、および原発性アミロイドーシス（ＡＬ）などの形質細胞疾患または癌も含まれる。造血系癌にはまた、多形核白血球（または好中球）、好塩基球、好酸球、樹状細胞、血小板、赤血球およびナチュラルキラー細胞を含むさらなる造血系細胞のその他の癌も含まれ得る。本明細書で「造血系細胞組織」と呼ばれる造血系細胞を含む組織としては、骨髄；末梢血；胸腺；および末梢リンパ組織、例えば、脾臓、リンパ節、粘膜に関連するリンパ組織（例えば、消化管関連リンパ組織）、扁桃、パイエル板および虫垂、ならびに他の粘膜、例えば、気管支内膜に関連するリンパ組織が含まれる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「化合物Ａ２」という用語は、Ｉ型ＰＲＭＴ阻害剤を意味する。いくつかの実施形態では、化合物Ａ２は、式Ｉ、ＩＩ、Ｖ、またはＶＩの化合物である。好適には、化合物Ａ２は、化合物Ａである。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「化合物Ｂ２」という用語は、ＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤を意味する。いくつかの実施形態において、化合物Ｂ２は、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、またはＸＩの化合物である。好適には、化合物Ｂ２は、化合物Ｃである。
【０１０８】
好適には、本発明の組合せは、「指定期間」内に投与される。
【０１０９】
「指定期間」という用語およびその文法上の変形は、本明細書で使用する場合、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方の投与と化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方の投与の間の時間間隔を意味する。そうではないことが定義されない限り、指定期間は、同時投与を含み得る。そうではないことが定義されない限り、指定期間は、単一日の間の化合物Ａ２および化合物Ｂ２の投与を指す。
【０１１０】
好適には、これらの化合物が「指定期間」内に投与され、かつ、同時に投与されない場合、それらの両方は互いに２４時間内に投与され、この場合、指定期間は約２４時間となり；好適には、それらの両方は互いに約１２時間内に投与され、この場合、指定期間は約１２時間となり；好適には、それらの両方は互いに約１１時間内に投与され、この場合、指定期間は約１１時間となり；好適には、それらの両方は互いに約１０時間内に投与され、この場合、指定期間は約１０時間となり；好適には、それらの両方は互いに約９時間内に投与され、この場合、指定期間は約９時間となり；好適には、それらの両方は互いに約８時間内に投与され、この場合、指定期間は約８時間となり；好適には、それらの両方は互いに約７時間内に投与され、この場合、指定期間は約７時間となり；好適には、それらの両方は互いに約６時間内に投与され、この場合、指定期間は約６時間となり；好適には、それらの両方は互いに約５時間内に投与され、この場合、指定期間は約５時間となり；好適には、それらの両方は互いに約４時間内に投与され、この場合、指定期間は約４時間となり；好適には、それらの両方は互いに約３時間内に投与され、この場合、指定期間は約３時間となり；好適には、それらは互いに約２時間内に投与され、この場合、指定期間は約２時間となり；好適には、それらの両方は互いに約１時間内に投与され、この場合、指定期間は約１時間となる。本明細書で使用する場合、約４５分未満離した化合物Ａ２および化合物Ｂ２の投与は同時投与と見なされる。
【０１１１】
好適には、本発明の組合せが「指定期間」に投与される場合、これらの化合物はある「継続期間」に併用投与される。
【０１１２】
「継続期間」という用語およびその文法上の変形は、本明細書で使用する場合、示された連続日数の間、本発明の両化合物が投与されることを意味する。そうではないことが定義されない限り、連続日数は処置の開始で始めるまたは処置の終了で終わる必要はなく、処置コースのどこかの時点に連続日数が存在すればよいだけである。
「指定期間」の投与に関して：
好適には、両化合物は、少なくとも１日間の指定期間内に投与され、この場合、継続期間は少なくとも１日となり；好適には、処置コース中、両化合物は少なくとも連続３日間の指定期間内に投与され、この場合、継続期間は少なくとも３日となり；好適には、処置コース中、両化合物は少なくとも連続５日間の指定期間内に投与され、この場合、継続期間は少なくとも５日となり；好適には、処置コース中、両化合物は少なくとも連続７日間の指定期間内に投与され、この場合、継続期間は少なくとも７日となり；好適には、処置コース中、両化合物は少なくとも連続１４日間の指定期間内に投与され、この場合、継続期間は少なくとも１４日となり；好適には、処置コース中、両化合物は少なくとも連続３０日間の指定期間内に投与され、この場合、継続期間は少なくとも３０日となる。
【０１１３】
好適には、これらの化合物が「指定期間」中に投与されない場合、それらは逐次に投与される。「逐次投与」という用語およびその文法的派生語は、本明細書で使用する場合、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方が１日１回、連続２日間以上投与され、次いで、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方が１日１回、連続２日間以上投与されることを意味する。また、本明細書では、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方と化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方の逐次投与の間に用いられる休薬日も企図される。本明細書で使用する場合、休薬日は、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方の逐次投与後で化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方の投与前の、化合物Ａ２も化合物Ｂ２も投与されない日の期間である。好適には、休薬日は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日および１４日から選択される日の期間となる。
【０１１４】
逐次投与に関して：
好適には、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方が連続１〜３０日間投与され、次いで、任意選択の休薬日の後に、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方が連続３０日間投与される。好適には、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方が連続１〜２１日間投与され、次いで、任意選択の休薬日の後に、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方が連続１〜２１日間投与される。好適には、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方が連続１〜１４日間投与され、次いで、１〜１４日の休薬日の後に、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方が連続１〜１４日間投与される。好適には、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち一方が連続１〜７日間投与され、次いで、１〜１０日の休薬日の後、化合物Ａ２および化合物Ｂ２のうち他方が連続１〜７日間投与される。
【０１１５】
好適には、化合物Ｂ２がその順序の最初に投与され、次いで、任意選択の休薬日の後に、化合物Ａ２が投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続３〜２１日間投与され、次いで、任意選択の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続３〜２１日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続３〜２１日間投与され、次いで、１〜１４日の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続３〜２１日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続３〜２１日間投与され、次いで、３〜１４日の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続３〜２１日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続２１日間投与され、次いで、任意選択の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続１４日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続１４日間投与され、次いで、１〜１４日の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続１４日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続７日間投与され、次いで、３〜１０日の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続７日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続３日間投与され、次いで、３〜１４日の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続７日間投与される。好適には、化合物Ｂ２が連続３日間投与され、次いで、３〜１０日の休薬日の後に、化合物Ａ２が連続３日間投与される。
【０１１６】
「指定期間」の投与および「逐次」投与に次いで反復投与を行うことができ、または次いで交互投与プロトコールを行うこともでき、休薬日を反復投与または交互投与プロトコールの前に置いてもよいと理解される。
【０１１７】
本発明の方法はまた、癌処置の他の治療法と併用してもよい。
【０１１８】
化合物Ａ２および化合物Ｂ２はいずれの適当な経路で投与してもよい。好適な経路としては、経口、直腸、鼻腔、局所（頬側および舌下を含む）、腫瘍内、膣、および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、くも膜下腔内、および硬膜外を含む）が含まれる。好ましい経路は、例えば、本組合せのレシピエントの状態および処置される癌によって異なり得ることが認識されるであろう。また、投与される薬剤のそれぞれは同じまたは異なる経路で投与されてよいこと、および化合物Ａ２および化合物Ｂ２は医薬組成物／処方物中に一緒に混合されてもよいことも認識されるであろう。
【０１１９】
一つの実施形態において、本発明の組合せの１以上の成分は静脈投与される。別の実施形態において、本発明の組合せの１以上の成分は経口投与される。別の実施形態において、本発明の組合せの１以上の成分は経口投与される。別の実施形態において、本発明の組合せの１以上の成分は全身投与、例えば静脈投与され、本発明の組合せの１以上の他の成分は腫瘍内投与される。いずれかの実施形態において、例えば、本段落において、本発明の組合せは１以上の医薬組成物として投与される。
【０１２０】
一般に、処置される感受性腫瘍に対して活性を有するいずれの抗新生物薬も、本発明における癌の処置において併用投与され得る。このような薬剤の例は、Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita, T.S. Lawrence, and S.A. Rosenberg (編者), 第10版(2014年12月5日), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに見出すことができる。当業者は、薬物および関与する癌の特定の特徴に基づいてどの薬剤組合せが有用であるかを識別することができる。本発明において有用な典型的な抗新生物薬としては、限定されるものではないが、ジテルペノイドおよびビンカアルカロイドなどの抗微小管薬または有糸分裂阻害剤；白金錯体；ナイトロジェンマスタード、オキサザホスホリン、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、およびトリアゼンなどのアルキル化剤；アクチノマイシン、アントラサイクリン、およびブレオマイシンなどの抗生剤；カンプトテシンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；エピポドフィロトキシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；プリンおよびピリミジン類似体ならびに葉酸拮抗化合物などの代謝拮抗物質；ホルモンおよびホルモン類似体；シグナル伝達経路阻害剤；非受容体型チロシンキナーゼ血管新生阻害剤；免疫療法薬；アポトーシス促進薬；細胞周期シグナル伝達阻害剤；プロテアソーム阻害剤；熱ショックタンパク質阻害剤；癌代謝阻害剤；ならびに遺伝子改変Ｔ細胞などの癌遺伝子療法薬が含まれる。
【０１２１】
本方法または組合せとの組合せまたは併用投与に使用するためのさらなる１または複数の有効成分の例として抗新生物薬がある。抗新生物薬の例としては、限定されるものではないが、化学療法薬；免疫調節剤(immuno-modulatory agents)；免疫調節剤(immune-modulators)；および免疫刺激性アジュバントが挙げられる。
【実施例】
【０１２２】
以下、実施例により、本発明の種々の限定されない態様を説明する。
【０１２３】
実施例１
アルギニンのメチル化およびＰＲＭＴ
アルギニンのメチル化は、遺伝子調節、ＲＮＡプロセシング、ＤＮＡ損傷応答、およびシグナル伝達などの多様な細胞プロセスに関与するタンパク質における重要な翻訳後修飾である。メチル化アルギニンを含有するタンパク質は核および細胞質画分の両方に存在し、アルギニン上へのメチル基の転移を触媒する酵素もまたこれらの細胞下コンパートメントに存在することが示唆される（Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013); Lee, Y. H. & Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol 23, 425-433, doi:10.1210/me.2008-0380 (2009)に総説）。哺乳動物細胞において、メチル化アルギニンは、ω−ＮＧ−モノメチル−アルギニン（ＭＭＡ）、ω−ＮＧ，ＮＧ−非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、またはω−ＮＧ，Ｎ’Ｇ−対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）の３つの主要な形態で存在する。各メチル化状態は、タンパク質間相互作用に異なる影響を及ぼし、従って、基質の生物活性に明瞭に異なる機能的結果を与える能力を持つ(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013))。
【０１２４】
アルギニンのメチル化は、主として、メチル基をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）から基質であるアルギニン側鎖に転移してＳ−アデノシル−ホモシステイン（ＳＡＨ）およびメチル化アルギニンを生成するタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）ファミリーの活性を介して、グリシンリッチ、アルギニンリッチ（ＧＡＲ）モチーフの配列要素に生じる（図１）。このタンパク質ファミリーは１０種のメンバーからなり、そのうち９種が酵素活性を有することが示されている(Bedford, M. T. & Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell 33, 1-13, doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013 (2009))。ＰＲＭＴファミリーは、酵素反応の生成物によって４つのサブタイプ（Ｉ〜ＩＶ型）に類別される（図１）。ＩＶ型酵素は、内部グアニジノ窒素をメチル化し、酵母でのみ記載があり(Fisk, J. C. & Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryot Cell 10, 1013-1022, doi:10.1128/EC.05103-11 (2011))；Ｉ〜ＩＩＩ型酵素は、単一のメチル化事象によってモノメチル−アルギニン（ＭＭＡ、Ｒｍｅ１）を生じる。ＭＭＡ中間体は、比較的存在量の少ない中間体と考えられているが、ＰＲＭＴ７の主要ＩＩＩ型活性の選択基質はモノメチル化型に留まり、一方、Ｉ型およびＩＩ型酵素はＭＭＡからそれぞれ非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ、Ｒｍｅ２ａ）または対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ、Ｒｍｅ２ｓ）への進行を触媒する。ＩＩ型ＰＲＭＴにはＰＲＭＴ５とＰＲＭＴ９が含まれるが、ＰＲＭＴ５は、対称性ジメチル化の形成を担う主要な酵素である。Ｉ型酵素にはＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６およびＰＲＭＴ８が含まれる。ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、およびＰＲＭＴ６は遍在発現するが、ＰＲＭＴ８は主として脳に限られる（Bedford, M. T. & Clarke, S. G. Protein arginine
methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell 33, 1-13, doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013 (2009)に総説）。
【０１２５】
ＰＲＭＴ１は、多くの細胞基質上でＭＭＡおよびＡＤＭＡの形成を触媒し得る主要１型酵素である(Bedford, M. T. & Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell 33, 1-13, doi:10.1016/j.molcel.2008.12.013 (2009))。多くの場合で、ＰＲＭＴ１依存性ＡＤＭＡ修飾がその基質の生物活性および輸送に必要とされ(Nicholson, T. B., Chen, T. & Richard, S. The physiological and pathophysiological role of PRMT1-mediated protein arginine methylation. Pharmacol Res 60, 466-474, doi:10.1016/j.phrs.2009.07.006 (2009))、ＰＲＭＴ１の活性は細胞ＡＤＭＡレベルの約８５％を占める(Dhar, S. et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Sci Rep 3, 1311, doi:10.1038/srep01311 (2013); Pawlak, M. R., Scherer, C. A., Chen, J., Roshon, M. J. & Ruley, H. E. Arginine N-methyltransferase 1 is required for early postimplantation mouse development, but cells deficient in the enzyme are viable. Mol Cell Biol 20, 4859-4869 (2000))。ＰＲＭＴ１の完全なノックアウトは、多くの基質にわたってＭＭＡの顕著な増加をもたらし、ＰＲＭＴ１の主要な生物学的機能がＭＭＡをＡＤＭＡに変換することであり、他のＰＲＭＴはＭＭＡを確立および維持可能であることが示唆される(Dhar, S. et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Sci Rep 3, 1311, doi:10.1038/srep01311 (2013))。加えて、恐らくはＡＤＭＡの減少および対応する、ＳＤＭＡ生成ＩＩ型ＰＲＭＴの基質として働き得るＭＭＡの増加の結果であるＰＲＭＴ１の減少時にＳＤＭＡレベルが上昇する。Ｉ型ＰＲＭＴの阻害は、ＡＤＭＡの減少、ＭＭＡの増加、あるいはＳＤＭＡに関連する明瞭に異なるメチル化パターンへの切り替えによって基質機能の変更をもたらし得る(Dhar, S. et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Sci Rep 3, 1311, doi:10.1038/srep01311 (2013))。
【０１２６】
マウスにおけるＰｒｍｔ１遺伝子座の破壊は早期胚性致死をもたらし、同型接合胚は、正常な発生においてＰＲＭＴ１要求を示すＥ６．５を超える発達ができない(Pawlak, M. R., Scherer, C. A., Chen, J., Roshon, M. J. & Ruley, H. E. Arginine N-methyltransferase 1 is required for early postimplantation mouse development, but cells deficient in the enzyme are viable. Mol Cell Biol 20, 4859-4869 (2000); Yu, Z., Chen, T., Hebert, J., Li, E. & Richard, S. A mouse PRMT1 null allele defines an essential role for arginine methylation in genome maintenance and cell proliferation. Mol Cell Biol 29, 2982-2996, doi:10.1128/MCB.00042-09 (2009))。成体においてＰＲＭＴ１の役割をより良く理解するには条件付きまたは組織特異的ノックアウトが必要となろう。Ｐｒｍｔ１ヌルマウスに由来するマウス胚線維芽細胞は、ＤＮＡ損傷応答タンパク質ＭＲＥ１１の低メチル化に関連した成長停止、倍数化、染色体脱安定化、および自発的ＤＮＡ損傷を受け、ゲノムの維持および細胞増殖におけるＰＲＭＴ１の役割が示唆される(Yu, Z., Chen, T., Hebert, J., Li, E. & Richard, S. A mouse PRMT1 null allele defines an essential role for arginine methylation in genome maintenance and cell proliferation. Mol Cell Biol 29, 2982-2996, doi:10.1128/MCB.00042-09 (2009))。ＲＭＴ１タンパク質およびｍＲＮＡは、広範囲の胚組織および成体組織で検出することができ、
細胞のアルギニンメチル化の大部分を担う酵素としてのその機能と一致する。ＰＲＭＴはそれ自体翻訳後修飾を受け、相互作用調節タンパク質に関連するが、ＰＲＭＴ１は、さらなる修飾の必要なく基礎活性を維持する（Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013)に総説）。
【０１２７】
ＰＲＭＴ１および癌
ＰＲＭＴ１の誤調節および過剰発現は、いくつかの固形癌および造血系癌と関連が見出されている(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013); Yoshimatsu, M. et al. Dysregulation of PRMT1 and PRMT6, Type I arginine methyltransferases, is involved in various types of human cancers. Int J Cancer 128, 562-573, doi:10.1002/ijc.25366 (2011))。ＰＲＭＴ１と癌の生物学との関連は、主として、関連基質上に見られるアルギニン残基のメチル化の調節を介したものであった（図２）。いくつかの腫瘍種で、ＰＲＭＴ１は、ヒストンＨ４のメチル化を介して(Takai, H. et al. 5-Hydroxymethylcytosine plays a critical role in glioblastomagenesis by recruiting the CHTOP-methylosome complex. Cell Rep 9, 48-60, doi:10.1016/j.celrep.2014.08.071 (2014); Shia, W. J. et al. PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cell proliferative potential. Blood 119, 4953-4962, doi:10.1182/blood-2011-04-347476 (2012); Zhao, X. et al. Methylation of RUNX1 by PRMT1 abrogates SIN3A binding and potentiates its transcriptional activity. Genes Dev 22, 640-653, doi:10
.1101/gad.1632608 (2008))、ならびに非ヒストン基質に対するその活性を介して(Wei, H., Mundade, R., Lange, K. C. & Lu, T. Protein arginine methylation of non-histone proteins and its role in diseases. Cell Cycle 13, 32-41, doi:10.4161/cc.27353 (2014))、異常な発癌プログラムの発現を駆動し得る。これらの実験系の多くでは、その基質のＰＲＭＴ１依存性ＡＤＭＡ修飾の混乱が癌細胞の増殖能を低下させる(Yang, Y. & Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nat Rev Cancer 13, 37-50, doi:10.1038/nrc3409 (2013))。
【０１２８】
いくつかの研究によって、ＰＲＭＴ１が血液腫瘍および固形腫瘍の発達に関連付けられている。ＰＲＭＴ１は、発現経路の活性化をもたらす、ＭＬＬおよびＡＭＬ１−ＥＴＯ融合物などの重要な駆動因子のメチル化を介して白血病の発症に関連付けられている(Shia, W. J. et al. PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cell proliferative potential. Blood 119, 4953-4962, doi:10.1182/blood-2011-04-347476 (2012); Cheung, N. et al. Targeting Aberrant Epigenetic Networks Mediated by PRMT1 and KDM4C in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Cell 29, 32-48, doi:10.1016/j.ccell.2015.12.007 (2016))。ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現マウスに由来する骨髄細胞におけるＰＲＭＴ１のノックダウンはクローン形成能を抑制し、このモデルにおける白血病表現型の維持におけるＰＲＭＴ１の決定的な必要性を実証した(Shia, W. J. et al. PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cell proliferative potential. Blood 119, 4953-4962, doi:10.1182/blood-2011-04-347476 (2012))。ＰＲＭＴ１はまた、ＭＬＬ融合複合体の成分でもあり、Ｈ４Ｒ３のメチル化に関連する異常な転写活性化を促進し、ＰＲＭＴ１のノックダウンはＭＬＬ−ＥＥＮにより媒介される造血幹細胞の悪性移行を抑制することができる(Cheung, N., Chan, L. C., Thompson, A., Cleary, M. L. & So, C. W. Protein arginine-methyltransferase-dependent oncog
enesis. Nat Cell Biol 9, 1208-1215, doi:10.1038/ncb1642 (2007))。乳癌患者では、高いＰＲＭＴ１発現がより短い無病生存期間および進行した組織学的異型度の腫瘍と相関があることが見出された(Mathioudaki, K. et al. Clinical evaluation of PRMT1 gene expression in breast cancer. Tumour Biol 32, 575-582, doi:10.1007/s13277-010-0153-2 (2011))。この目的で、ＰＲＭＴ１は、転移および癌細胞浸潤の促進に関連付けられ(Gao, Y. et al. The dual function of PRMT1 in modulating epithelial-mesenchymal transition and cellular senescence in breast cancer cells through regulation of ZEB1. Sci Rep 6, 19874, doi:10.1038/srep19874 (2016); Avasarala, S. et al. PRMT1 Is a Novel Regulator of Epithelial-Mesenchymal-Transition in Non-small Cell Lung Cancer. J Biol Chem 290, 13479-13489, doi:10.1074/jbc.M114.636050 (2015))、ＰＲＭＴ１により媒介されるエストロゲン受容体α（ＥＲα）のメチル化は、成長促進シグナル伝達経路を増強することができる。このメチル化駆動機構は、抗エストロゲン作用薬の存在下でさえ、乳癌細胞に成長利益を提供し得る(Le Romancer, M. et al. Regulation of estrogen rapid signaling through arginine methylation by PRMT1. Mol Cell 31, 212-221, doi:10.1016/j.molcel.2008.05.025 (2008))。加えて、ＰＲＭＴ１は、相同組換えおよび非相同末端の末端結合ＤＮＡ修復経路の両方の調節を介してゲノムの安定性およびＤＮＡ傷害剤耐性を増強する(Boisvert, F. M., Rhie, A., Richard, S. & Doherty, A. J. The GAR motif of 53BP1 is arginine methylated by PRMT1 and is necessary for 53BP1 DNA binding activity. Cell Cycle 4, 1834-1841, doi:10.4161/cc.4.12.2250 (2005); Boisvert, F. M., Dery, U., Masson, J. Y. & Richard, S. Arginine methylation of MRE11 by PRMT1 is required for DNA damage checkpoint control. Genes Dev 19, 671-676, doi:10.1101/gad.1279805 (2005))。従って、ＰＲＭＴ１の阻害は、特に、ＤＮＡ修復機構が突然変異によって損なわれている可能性のある腫瘍において（乳癌におけるＢＲＣＡ１など）、ＤＮＡ傷害剤に対して癌を増感させ得る(O'Donovan, P. J. & Livingston, D. M. BRCA1 and BRCA2: breast/ovarian cancer susceptibility gene products and participants in DNA double-strand break repair. Carcinogenesis 31, 961-967, doi:10.1093/carcin/bgq069 (2010))。これらの所見を考え合わせると、腫瘍生物学の臨床的に関連のある側面においてＰＲＭＴ１の重要な役割が示され、ＤＮＡ損傷を促進するものなどの療法との組合せを探索する理論的根拠が示唆される。
【０１２９】
ＲＮＡ結合タンパク質およびスプライシング装置は主要なクラスのＰＲＭＴ１基質であり、それらの生物学的機能ならびに白血病における再発性突然変異を介して癌の生物学に関連付けられている(Bressan, G. C. et al. Arginine methylation analysis of the splicing-associated SR protein SFRS9/SRP30C. Cell Mol Biol Lett 14, 657-669, doi:10.2478/s11658-009-0024-2 (2009); Sveen, A., Kilpinen, S., Ruusulehto, A., Lothe, R. A. & Skotheim, R. I. Aberrant RNA splicing in cancer; expression changes and driver mutations of splicing factor genes. Oncogene 35, 2413-2427, doi:10.1038/onc.2015.318 (2016); Hsu, T. Y. et al. The spliceosome is a therapeutic vulnerability in MYC-driven cancer. Nature 525, 384-388, doi:10.1038/nature14985 (2015))。最近の研究で、ＰＲＭＴ１は、急性巨核球性白血病においてＲＮＡ結合タンパク質ＲＢＭ１５をメチル化することが示された(Zhang, L. et al. Cross-talk between PRMT1-mediated methylation and ubiquitylation on RBM15 controls RNA splicing. Elife 4, doi:10.7554/eLife.07938 (2015))。ＰＲＭＴ１により媒介されるＲＢＭ１５のメチル化は、その発現を調節し、その結果、ＡＭＬ細胞株におけるＰＲＭＴ１の過剰発現は、ＲＢＭ１５の下方調節、それによる分化に重要な遺伝子のプレｍＲＮＡイントロン領域と結合するその能力の妨げによって分化を遮断することが示された。推定ＰＲＭＴ１基質を同定するために、プロテオミクス
アプローチ（メチルスキャン、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ツールとしてのＰＲＭＴ１阻害剤である化合物Ｄに応答してアルギニンのメチル化状態に変化を有するタンパク質を同定した。化合物Ｄで処理した、またＤＳＭＯで処理した細胞抽出物からタンパク質フラグメントを、メチルアルギニン特異的抗体（ＡＤＭＡ、ＭＭＡ、ＳＤＭＡ）を用いて免疫沈降させ、質量分析によってペプチドを同定した。多くのタンパク質がアルギニンメチル化に変化を受けているが、ツール化合物で処理したＡＭＬ細胞株において同定された基質の大多数は転写レギュレーターおよびＲＮＡプロセシングタンパク質であった（図３）。
【０１３０】
まとめると、癌関連経路に及ぼすＰＲＭＴ１の影響は、阻害が抗腫瘍活性をもたらし、ＡＭＬ、リンパ腫、および固形腫瘍適応の処置に新規な治療機構を提供し得ることを示唆している。新たな文献に記載されているように、白血病におけるＡＭＬ−ＥＴＯにより駆動される発癌の阻害、乳癌における増殖促進シグナル伝達の阻害、ならびにＲＮＡ結合タンパク質およびスプライセオソーム装置のメチル化を介したスプライシングの調節を含むいくつかの機構が、血液腫瘍および固形腫瘍におけるＰＲＭＴ１阻害剤の使用の理論的根拠を裏づける。ＰＲＭＴ１を含むＩ型ＰＲＭＴの阻害は、異常な癌細胞の増殖および生存を抑制するための扱いやすい戦略と言える。
【０１３１】
生化学
Ｉ型ＰＲＭＴに対する効力および阻害機構を特徴付けるために化合物Ａを用いて詳細なｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学研究を行った。
【０１３２】
阻害機構
ＰＲＭＴ１に対する化合物Ａの阻害機構を基質競合試験によって調べた。阻害モダリティは、化合物ＡのＩＣ５０値を基質濃度をそのＫｍａｐｐで割った商の関数としてプロットし、得られたプロットを競合、不競合、および非競合的阻害に関するチェン・プルソフの関係と比較することによって検討した(Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. A guide for medicinal chemists and pharmacologists. Methods Biochem Anal 46, 1-265 (2005))。化合物ＡのＩＣ５０値はＳＡＭ濃度の上昇とともに低下し、このことは、化合物ＡによるＰＲＭＴ１の阻害は、非競合的阻害の式に当てはめた場合に１５ｎＭのＫｉａｐｐ値で、ＳＡＭに関して非競合的であったことを示す（図４Ａ）。化合物ＡのＩＣ５０値をＨ４  １−２１ペプチドの関数としてプロットした場合には、明確なモダリティ傾向が見られず（図４Ｂ）、混合型の阻害が示唆された。大域解析を用いてさらなる分析を行ったところ、３．７のα値が得られ、混合型としてのペプチド機構が確認され、１９ｎＭのＫｉａｐｐ値が得られた（図４Ｂ、挿入図）。
【０１３３】
時間依存性および可逆性
様々なＳＡＭ：ＰＲＭＴ１：化合物Ａプレインキュベーション時間および２０分の反応の後にＩＣ５０値を測定することにより化合物Ａの時間依存的阻害を評価した。ＳＡＭと非競合的である阻害機構は、化合物Ａの結合を支持するためにはＳＡＭ：ＰＲＭＴ１複合体の生成が必要であることを暗示し、従って、プレインキュベーション中にＳＡＭ（Ｋｍａｐｐで保持）を含めた。化合物Ａは、より長いプレインキュベーション時間での効力の増大により、ＰＲＭＴ１メチル化事象の時間依存的阻害を示した（図５Ａ）。時間依存的阻害が見られたことから、化合物効力のより良い提示を得るために、さらなるＩＣ５０決定には６０分のＳＡＭ：ＰＲＭＴ１：化合物Ａプレインキュベーションと４０分の反応時間を含んだ。これらの条件では３．１±０．４ｎＭ（ｎ＝２９）のＩＣ５０、すなわち、このアッセイの理論的強結合限界（０．２５ｎＭ）の１０倍を超える。種々のＰＲＭＴ１濃度でＩＣ５０値を調べると、実際の強結合限界が恐らくは低活性画分のために０．２５ｎＭよりも有意に低くなることが明らかであった（図５Ｂ）。化合物Ａの塩形態は、ＰＲＭＴ１に対して決定されたＩＣ５０値に有意な影響を及ぼさなかった（図５Ｂ）。
【０１３４】
時間依存的阻害に関する２つの説明は、遅い結合可逆的阻害と不可逆的阻害である。これらの２つの機構を識別するために、親和性選択質量分析（ＡＳＭＳ）を用いて化合物ＡとＰＲＭＴ１の結合を調べた。ＡＳＭＳはまず、非結合リガンドから結合リガンドを分離し、次に、可逆的に結合したリガンドをＭＳにより検出する。ＰＲＭＴ１：ＳＡＭと化合物Ａとの２時間のプレインキュベーションを用いて、図５Ａに示されるプロフィールに基づいて時間依存的複合体（ＥＳＩ＊）が完全に形成されたことを確認し、ここでは、最大効力は２０分のプレインキュベーション後に見られた。これらの条件下、化合物Ａは、ＡＳＭＳを用いて検出可能であった。このことは、ＡＳＭＳが不可逆的に結合した化合物Ａを検出できないであろうことから、この基本的機構が本来可逆的であることを示唆する。解離速度解析を含む最終的な可逆性試験はまだ行われておらず、この機構はさらに確認されるであろう。
【０１３５】
結晶学
阻害剤結合様式を決定するために、ＰＲＭＴ１およびＳＡＨに結合した化合物Ａの共結晶構造を決定した（分解能２．４８Å）（図６）。ＳＡＨは、ＰＲＭＴ１によるＳＡＭからのメチル基の除去時に形成される生成物であり；従って、ＳＡＨおよびＳＡＭは同様にＰＲＭＴ１の同じポケットを占有するはずである。阻害剤は、ＳＡＨポケットに直接隣接する基質ペプチドによって通常占有されるクレフト内で結合し、そのジアミン側鎖は推定アルギニン基質部位を占有する。末端メチルアミンは、ＳＡＨのチオエーテルから３．６ÅにあるＧｌｕ１６２側鎖残基と水素結合を形成し、ＳＡＨ結合ポケットはＴｙｒ５７およびＭｅｔ６６によって化合物Ａに架橋される。化合物Ａは化合物Ａのピラゾール窒素のプロトンとＧｌｕ６５の酸性側鎖の間の水素結合の形成を介してＰＲＭＴ１と結合し、ジエトキシ分岐シクロヘキシル部分は、Ｔｙｒ５７、Ｉｌｅ６２、Ｔｙｒ１６６およびＴｙｒ１７０によって形成される疎水性の溝内の溶媒露出面に沿って存在する。ＳＡＨと阻害剤結合の間の空間的分離、ならびにＴｙｒ５７などの残基との相互作用は、酵素的研究で明らかになったＳＡＭ非競合的機構を裏づけ得る。化合物Ａが基質ペプチドポケット内で結合し、ジアミン側鎖は基質アルギニン残基のアミンを模倣し得るという所見は、阻害剤モダリティがペプチドと競合し得ることを暗示する。生化学様式の阻害研究は、化合物Ａがペプチドに対する混合型阻害剤であることを裏づける（図４Ｂ）。化合物Ａの時間依存的挙動ならびにペプチドクレフト外の基質ペプチドの非活性部位結合の可能性は両方とも、ペプチドと競合しない阻害様式をもたらす可能性があり、構造研究および生化学研究によって示唆されたモダリティの違いを説明する。
【０１３６】
相同分子種
毒性学研究の解釈を助けるために、化合物Ａの効力を、ＰＲＭＴ１のラットおよびイヌ相同分子種に対して評価した。ヒトＰＲＭＴ１を用いた場合と同様に、化合物ＡはラットおよびイヌＰＲＭＴ１に対して時間依存的阻害を明らかにし、ＩＣ５０値はプレインキュベーションの延長に伴って低下した（図７Ａ）。さらに、一定の範囲の酵素濃度（０．２５〜３２ｎＭ）で化合物Ａの効力の変化は見られず、測定されたＩＣ５０値はヒト、ラットまたはイヌのアッセイの強結合限界に近づくことはなかったことが示唆される（図７Ｂ）。ＩＣ５０値は、ヒトＰＲＭＴ１を評価するために使用したものと同じ条件を用いて決定し、化合物Ａの効力は総ての種で２倍未満の変動であったことが明らかになった（図７Ｃ）。
【０１３７】
選択性
化合物Ａの選択性を、ＰＲＭＴファミリーメンバーのパネルで評価した。代表的Ｉ型ファミリーメンバー（ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６およびＰＲＭＴ８）およびＩＩ型ファミリーメンバー（ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０およびＰＲＭＴ９）に対して、６０分のＳＡＭ：酵素：化合物Ａプレインキュベーション後にＩＣ５０値を決定した。化合物Ａは、総てのＩ型ＰＲＭＴの活性を様々な効力で阻害したが、ＴｙｐｅＩＩファミリーメンバーの阻害はできなかった（図８Ａ）。Ｉ型ＰＲＭＴのさらなる特徴は、増加する酵素：ＳＡＭ：化合物Ａプレインキュベーション時間の後に見られた効力の増大のために、化合物ＡはＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ６およびＰＲＭＴ８の時間依存的阻害剤であったことを明らかにしたが、ＰＲＭＴ３は時間依存的挙動を示さなかった（図８Ｂ）。
【０１３８】
化合物Ａの選択性をさらに特徴付けるために、２１種のメチルトランスフェラーゼの阻害を化合物Ａの単一濃度（１０μＭ、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）で評価した。最高程度の阻害１８％はＰＲＤＭ９に対して見られた。全体的に見れば、化合物Ａは、供試したメチルトランスフェラーゼの最小阻害を示し、それがＩ型ＰＲＭＴの選択的阻害剤であることが示唆される（表１）。さらなる選択性アッセイは、安全性の節で記載される。
【０１３９】
【表１】
2019535800.tif 000030
【０１４０】
まとめると、化合物Ａは、３〜５ｎＭの範囲のＩＣ５０値で、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ６およびＰＲＭＴ８に対して同等の生化学的効力を示すＩ型ＰＲＭＴファミリーメンバーの強力、可逆的、選択的阻害剤である。化合物Ａとの複合体におけるＰＲＭＴ１の結晶構造より、化合物Ａはペプチドポケット内で結合することが明らかであり、結晶構造ならびに酵素的研究の両方がＳＡＭの非競合的機構と一致する。
【０１４１】
生物学
細胞機構の影響
ＰＲＭＴ１の阻害は、ＭＭＡおよびＳＤＭＡの並行増加を伴って、ヒストンＨ４のアルギニン３（Ｈ４Ｒ３ｍｅ２ａ）を含む細胞ＰＲＭＴ１基質に対するＡＤＭＡの減少をもたらすと推定される(Dhar, S. et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Sci Rep 3, 1311, doi:10.1038/srep01311 (2013))。アルギニンのメチル化に対する化合物Ａの効果を評価するために、ＭＭＡの増加に関連する用量応答を、ＭＭＡを検出するための抗体を用いて細胞内ウエスタンアッセイで評価し、細胞機構的ＥＣ５０を１０．１±４．４ｎＭと決定した（図９）。用量応答は、恐らくはＩ型ＰＲＭＴ間の活性の違いまたは特定の基質サブセットに対する効力の違いのために、二相を示した。二相曲線を記述する式を用いてデータの当てはめを行い、供試濃度の範囲で第２変曲点に関連する明白なプラトーが存在しなかったために、第１変曲点が報告された。このアッセイ形式で種々の塩形態を試験し、総てが同等のＥＣ５０値を示し、従って、総ての生物学的試験で互換的であると見なされる（図９）。以下に示すような選択腫瘍種において他のメチル化状態に対する時機、持続性、および影響を調べるためにさらなる研究を行った。ＭＭＡの誘導に対する化合物Ａの効力は、化合物Ａが、細胞内の１型ＰＲＭＴの阻害に関連する生物学的機構を検討するために使用可能であることを示す。
【０１４２】
癌におけるＩ型ＰＲＭＴの発現
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）を介して１００を超える癌から収集された複数の腫瘍種およびｃＢｉｏＰｏｒｔａｌに提示されているその他の原発腫瘍データベースからの遺伝子発現データの解析は、ＰＲＭＴ１が癌で高度に発現され、他の固形腫瘍および血液悪性腫瘍に比べてリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＤＬＢＣＬ）で最高レベルであることを示す（図１０）。一般的なハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢおよび皮膚で選択的に発現される遺伝子であるＴＹＲの発現もまた、それぞれ高い遍在発現または組織限定発現に関連する範囲を特徴付けるために調べた。他の癌の中でもリンパ腫での高い発現から、化合物Ａ阻害の標的が前臨床試験で評価された細胞株に相当する原発腫瘍に存在するというさらなる信頼が得られる。ＰＲＭＴ３、４、および６も一定範囲の腫瘍種で発現されるが、ＰＲＭＴ８発現は、その組織特異的発現を考慮して予想されるように、より限定されると見られる(Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S. & Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. J Biol Chem 280, 32890-32896, doi:10.1074/jbc.M506944200 (2005))。
【０１４３】
細胞表現型効果
化合物Ａを、細胞数の代わりにＡＴＰを定量するＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた６日増殖−細胞死アッセイで、培養腫瘍細胞株増殖を阻害するその能力に関して分析した。全６日アッセイにわたって増殖を許容した条件を特定するために、総ての細胞株の増殖を広範な播種密度で経時的に評価した。細胞を最適な播種密度で播種し、一晩のインキュベーション後に、２０点２倍漸増の化合物を加え、プレートを６日間インキュベートした。反復プレートの細胞を化合物の添加時に採取して開始細胞数（Ｔ０）を定量した。６日の処理後に得られた値をＴ０値の関数として表し、化合物濃度に対してプロットした。Ｔ０値を１００％に対して正規化し、化合物添加時の細胞数を表す。データを４パラメーター式に当てはめて濃度反応曲線を作成し、増殖ＩＣ５０（ｇＩＣ５０）を求めた。ｇＩＣ５０は「増殖ウインドウ」の中点、すなわち、化合物添加時の細胞数（Ｔ０）と６日後の細胞数（ＤＭＳＯ対照）との差である。増殖−細胞死アッセイは正味の集団変化を定量するために使用でき、明らかに、細胞死（細胞傷害性）を化合物添加時の数（Ｔ０）に比べて少ない細胞として定義する。負のＹｍｉｎ−Ｔ０値は細胞死を示し、ｇＩＣ１００値は、１００％の増殖阻害に必要とされる化合物の濃度を表す。化合物Ａの増殖阻害効果を、固形および血液悪性腫瘍に相当する１９６のヒト癌細胞株でこのアッセイを用いて評価した（図１１）。
【０１４４】
化合物Ａは、ほとんどの細胞株で完全に近いまたは完全な増殖阻害を誘導し、一部が負のＹｍｉｎ−Ｔ０値で示されるような細胞傷害性応答を示した（図１１Ｂ）。この効果は、ＡＭＬおよびリンパ腫癌細胞株で最も顕著であり、それぞれ細胞株の５０および５４％が細胞傷害性応答を示した。ラット１４日ＭＴＤ（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｃａｖｅ＝２．１μＭ）から計算した総ＡＵＣまたは暴露（Ｃａｖｅ）を、感受性の評価のための化合物Ａの臨床関連濃度の推定値として用いた。リンパ腫細胞株は２．１μＭ未満のｇＩＣ１００値で細胞傷害性を示したが、評価したあらゆる腫瘍種にわたる多くの細胞株はｇＩＣ５０値≦２．１μＭを示し、患者において抗腫瘍活性に関連する濃度が達成可能であることが示唆される。イヌ２１日ＭＴＤはやや高く（２５ｍｇ／ｋｇ；総ＡＵＣまたはＣａｖｅ＝３．２μＭ）、従って、ラットからのより低い濃度を、細胞株感受性を評価するためのより保存的な標的とする。リンパ腫細胞株はＩ型ＰＲＭＴ阻害に感受性が高く、ｇＩＣ５０中央値は０．５７μＭであり、５４％に細胞傷害性が見られた。固形腫瘍種のうち、黒色腫および腎臓癌細胞株（主として明細胞腎臓癌腫を表す）で化合物Ａの強力な抗増殖活性が見られたが、このアッセイ形式では、応答は圧倒的に細胞増殖抑制であった（図１１、表２）。
【０１４５】
【表２】
2019535800.tif 000031
【０１４６】
化合物Ａの抗増殖効果の評価は、ＰＲＭＴ１の阻害が一定範囲の固形および血液悪性腫瘍を表す細胞株にわたって強力な抗腫瘍活性をもたらすことを示す。これらのデータを考え合わせると、固形および血液悪性腫瘍における臨床開発が正当であることが示唆される。優先される適応としては、以下が含まれる。
・リンパ腫：細胞株の５４％で細胞傷害性
・ＡＭＬ：細胞株の５０％で細胞傷害性
・腎細胞癌：細胞株の６０％でｇＩＣ５０≦２．１μＭ
・黒色腫：細胞株の７１％でｇＩＣ５０≦２．１μＭ
・ＴＮＢＣを含む乳癌：細胞株の４１％でｇＩＣ５０≦２．１μＭ
【０１４７】
リンパ腫の生物学
細胞機構的効果
リンパ腫におけるアルギニンのメチル化に対する化合物Ａの効果を評価するために、ヒトＤＬＢＣＬ細胞株（Ｔｏｌｅｄｏ）を０．４μＭの化合物Ａまたはビヒクルで最大１２０時間処理し、その後、タンパク質溶解液を、種々のアルギニンメチル化状態に対する抗体を用いてウエスタン分析により評価した。予想されるように、化合物暴露時にＡＤＭＡのメチル化は低下したが、ＭＭＡは増加した（図１２）。また、ＳＤＭＡレベルの増加も見られ、ＭＭＡの増加がＳＤＭＡ形成の主要な触媒であるＰＲＭＴ５の潜在的基質のプールに蓄積をもたらしたことが示唆された。多くの基質が様々な動態で検出されたことおよびＤＭＳＯ処理サンプル間でＡＤＭＡレベルに変動があることを考えれば、全レーンおよび顕著な４５ｋＤａバンドの両方がＡＤＭＡを評価するための特徴であった。ＭＭＡの増加は２４時間で明らかになり、４８時間でほぼ最大となったが、４５ｋＤａのＡＤＭＡバンドの低下は、最大効果を達成するために７２〜９６時間を要した。ＳＤＭＡの増加は化合物暴露の４８時間後に明らかとなったが、１２０時間増加し続け、Ｉ型ＰＲＭＴによるＭＭＡのＡＤＭＡへの変換からＩＩ型ＰＲＭＴによるＳＤＭＡへの潜在的スイッチと一致する（図１２）。
【０１４８】
アルギニンのメチル化（ＭＭＡ、ＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ）に対する化合物Ａの効果に関連する用量応答を、リンパ腫細胞株のパネルで決定した（図１３）。ＡＤＭＡ低下を全レーンで、および評価した総ての細胞株で検出不能なレベルにまで低下した単一の４５ｋＤａバンドで評価した。全体的に見れば、最大効果の５０％を達成するために必要とされる濃度は細胞株間で同等であり、６日増殖細胞死アッセイでのｇＩＣ５０には相当せず、この感受性の欠如は不十分な標的結合によっては説明されないことが示唆された。
【０１４９】
化合物Ａに応答したアルギニンのメチル化における大域変化の持続期間を決定するために、化合物のウォッシュアウト後に化合物Ａで処理した細胞でＡＤＭＡ、ＳＤＭＡ、およびＭＭＡレベルを評価した（図１４）。Ｔｏｌｅｄｏ細胞を０．４μＭの化合物Ａとともに７２時間培養して、アルギニンメチル化マークに対するロバストな効果を確立した。次に、細胞を洗浄し、化合物Ａ不含培地で培養し、サンプルを１２０時間で毎日採取し、アルギニンのメチル化レベルをウエスタン分析によって調べた。ＭＭＡレベルは急速に低下し、化合物Ａのウォッシュアウト後２４時間でベースラインに戻ったが、ＡＤＭＡおよびＳＤＭＡはそれぞれ２４時間および９６時間でベースラインに戻った。特に、４５ｋＤａ  ＡＤＭＡバンドの回復は、ＡＤＭＡウエスタンブロットで、他のほとんどの種よりも遅れて見られ、化合物Ａによるアルギニンのメチル化変化の持続期間は基質によって変動し得ることが示唆された。ＳＤＭＡは、６時間のウォッシュアウトの後であっても増加し続けると思われた。このことは、ウォッシュアウト後になおベースラインに戻っていなかったＭＭＡの持続的増加と相まって、明確なプラトー無く１２０時間にわたって見られた継続的な増加と一致する（図１２）。各修飾の持続期間は一般に、化合物Ａによってもたらされたアルギニンのメチル化変化の動態を反映し、ＭＭＡが最も急速であった。
【０１５０】
細胞表現型効果
化合物Ａによる増殖阻害に関連する経時的推移を評価するために、リンパ腫細胞株のサブセットで延長期間増殖−細胞死アッセイを行った。従前に記載した６日増殖アッセイと同様に、アッセイの期間中に増殖を確保するために播種密度を最適化し、３〜１０日目から始めて選択された時点でＣＴＧにより細胞数を評価した。ＴｏｌｅｄｏおよびＤａｕｄｉリンパ腫細胞株では、増殖阻害は早ければ６日で見られ、８日で最大となった（図１５）。
【０１５１】
化合物Ａへの延長暴露の効果を測定し、６日のアッセイで細胞増殖抑制応答を示した細胞株がその後の時点で細胞傷害性を受け得るかどうかを決定するために、細胞株のより大きなセットを６日目および１０日目に評価した。化合物Ａに対する暴露の時間延長は、評価したリンパ腫細胞株で効力（ｇＩＣ５０）または細胞傷害性（Ｙｍｉｎ−Ｔ０）に対して最小の効果しかなく（図１６）、６日増殖評価は感受性の評価に利用できることを示す。
【０１５２】
増殖阻害が６日目に見られ、暴露の延長が効力または阻害率％に最小の影響しか持たなかったことを考えて、ホジキンおよび非ホジキンサブタイプを表すリンパ腫細胞株の広域パネルを６日増殖−細胞死アッセイ形式で評価した（図１７）。この形式で総てのサブタイプに同等に感受性が見られ、多くの細胞株が、分類とは非依存的に細胞傷害性を受け（負のＹｍｉｎ−Ｔ０により示される）、化合物Ａは評価したリンパ腫の総てのサブタイプで抗腫瘍効果を有することが示唆された。
【０１５３】
この増殖アッセイ結果は、ＰＲＭＴ１の阻害はリンパ腫細胞株のサブセットで明らかな細胞傷害性を誘導することを示唆する。この効果をさらに解明するために、化合物Ａで処理したリンパ腫細胞株の細胞周期分布を、ヨウ化プロピジウム染色とその後のフローサイトメトリーを用いて評価した。６日増殖アッセイで一定範囲のＹｍｉｎ−Ｔ０およびｇＩＣ５０値を示した細胞株を、アッセイの期間に対数増殖を可能とするように低密度で播種し、様々な濃度の化合物Ａで処理した。増殖−細胞死アッセイ結果と一致して、Ｔｏｌｅｄｏ細胞で、濃度≧１０００ｎＭの化合物Ａでの処理３日後に始まる時間および用量依存的様式で、細胞死の指標であるＧ１未満（＜Ｇ１）での細胞蓄積が見られた（図１８）。濃度≧１００ｎＭでは、７日目までに、Ｇ１未満集団の増加が見られた。６日増殖アッセイで明らかな細胞増殖阻害を受けたＵ２９３２およびＯＣＩ−Ｌｙ１細胞株では、この効果は１０μＭの化合物Ａで顕著であるだけであった。このアッセイ形式では、他の細胞周期での顕著な効果は見られなかった。
【０１５４】
細胞周期のＦＡＣＳ分析を確認するために、カスパーゼ切断の評価を、１０日の経時的推移中のアポトーシスの付加的測定として行った。アッセイ期間中に一貫した増殖を確保するために播種密度を最適化し、発光性カスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてカスパーゼの活性化を評価した。カスパーゼ−Ｇｌｏ  ３／７シグナルを細胞数（ＣＴＧにより評価）に対して正規化し、対照（ＤＭＳＯ処理）細胞に対する誘導倍率として示した。カスパーゼ３／７活性を、化合物Ａへの細胞傷害性応答（Ｔｏｌｅｄｏ）および細胞増殖抑制応答（Ｄａｕｄｉ）を示すＤＬＢＣＬ細胞株において１０日の経時的推移中、モニタリングした（図１９）。増殖−細胞死アッセイで見られたプロフィールと一致して、Ｔｏｌｅｄｏ細胞株は、総ての時点で細胞数の減少を伴うロバストなカスパーゼの活性化を示したが、Ｄａｕｄｉ細胞株でのカスパーゼ活性の誘導はあまり顕著でなく、最高濃度の化合物Ａに限定されていた。
【０１５５】
これらのデータは、細胞周期プロフィールと考え合わせると、化合物ＡはＴｏｌｅｄｏ  ＤＬＢＣＬ細胞株においてカスパーゼにより媒介されるアポトーシスを誘導することを示し、他のリンパ腫細胞株で見られた細胞傷害性は化合物Ａによるアポトーシス経路の活性化を反映し得ることが示唆される。
【０１５６】
マウス異種移植片における抗腫瘍効果
腫瘍増殖に対する化合物Ａの効果をＴｏｌｅｄｏ（ヒトＤＬＢＣＬ）異種移植モデルで評価した。皮下Ｔｏｌｅｄｏ腫瘍を担持する雌ＳＣＩＤマウスの体重を測定し、腫瘍をカリパスで測定し、マウスを腫瘍サイズに従って１０個体ずつの処置群に乱塊法で割り付けた。マウスにビヒクルまたは化合物Ａ（１５０ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを２８日間毎日経口投与した。試験中、週に２回、マウスの体重を測定し、腫瘍測定を行った。総ての用量で有意な腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）が見られ、≧３００ｍｇ／ｋｇの用量で退縮が見られた（図２０、表５）。いずれの用量群でも有意な体重低下は無かった。
【０１５７】
評価した総ての用量で完全なＴＧＩが見られたことを考えて、より低用量の化合物Ａの抗腫瘍効果を試験するため、ならびに毎日（ＱＤ）に対して１日２回（ＢＩＤ）の投与を比較するために第２の試験を行った。この第２の試験では、マウスにビヒクルまたは化合物Ａ（３７．５ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを２４日間ＱＤまたは７５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤで経口投与した。この試験で、７５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ投与は、１５０ｍｇ／ｋｇと同じＴＧＩ（それぞれ９５％および９６％）をもたらし、一方、≦７５ｍｇ／ｋｇのＱＤは部分的ＴＧＩ（≦７９％）をもたらした（図２０、表５）。いずれの用量群でも有意な体重低下は無かった。これらのデータは、同じ総一日用量でのＢＩＤまたはＱＤ投与はいずれも同等の有効性をもたらすはずであることを示唆する。
【０１５８】
さらなる腫瘍種
ＡＭＬ
リンパ腫細胞株に加え、化合物Ａは、６日増殖アッセイで検討したＡＭＬ細胞株のサブセットに強力な細胞傷害活性を示した（表３）。１０中８の細胞株が＜２μＭのｇＩＣ５０値を有し、化合物Ａは５つの細胞株で細胞傷害性を誘導した。ＰＲＭＴ１は、Ｍ２  ＡＭＬサブタイプに特徴的なＡＭＬ−ＥＴＯ融合と相互作用するが(Shia, W. J. et al. PRMT1 interacts with AML1-ETO to promote its transcriptional activation and progenitor cell proliferative potential. Blood 119, 4953-4962, doi:10.1182/blood-2011-04-347476 (2012))、この融合タンパク質を保有する細胞株（Ｋａｓｕｍｉ−１およびＳＫＮＯ−１）は、ｇＩＣ５０により測定されるような、または細胞傷害性を受けた、化合物Ａに対して感受性を示す唯一の細胞株ではなく（表３、図２１）、従って、この発癌性融合タンパク質の存在は、化合物Ａに対するＡＭＬ細胞株の感受性を排他的に予測するものではない。
【０１５９】
【表３】
2019535800.tif 000032
【０１６０】
リンパ腫での研究と同様に、化合物Ａへの暴露延長の効果を測定するため、および６日アッセイで細胞増殖抑制応答を示したＡＭＬ細胞株がその後の時点で細胞傷害性を受け得るかどうかを決定するために、細胞株のセットを６日目および１０日目に評価した。リンパ腫の結果と一致して、化合物Ａへの暴露時間の延長は、評価したＡＭＬ細胞株で効力（ｇＩＣ５０）または細胞傷害性（Ｙｍｉｎ−Ｔ０）に最小の影響しか持たなかった（図２１）。
【０１６１】
腎細胞癌
腎細胞癌細胞株は、他の固形腫瘍種と比較して最低のｇＩＣ５０中央値を有した。供試した細胞株に化合物Ａでの処理時に細胞傷害性応答を示したものは無かったが、総てが完全な増殖阻害を示し、１０のうち６の細胞株がｇＩＣ５０値≦２μＭを有した（表４）。プロファイルした１０のうち７の細胞株が腎臓癌の主要な臨床サブタイプである淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）を表す。
【０１６２】
【表４】
2019535800.tif 000033
【０１６３】
化合物Ａによる腎臓癌細胞株における増殖阻害の経時的推移を評価するために、４種のｃｃＲＣＣ細胞株のパネルで、３、４、５、および６日目にＣＴＧによって細胞増殖を評価した（図２２）。活性の最大変化は３〜４日目に見られ、総ての細胞株がｇＩＣ５０値の低下と増殖阻害の増加を示した。化合物Ａの効力（ｇＩＣ５０により評価）は４つのうち３つの細胞株で４日目までに最大となり、６日のアッセイ期間中、さらなる変化は無かった。加えて、増殖阻害パーセントは評価した総ての細胞株で１００％に達した。よって、ｃｃＲＣＣ細胞株における最大増殖阻害は、細胞株スクリーニング法で用いた６日増殖ウインドウ内に明らかに認められた。
【０１６４】
カスパーゼの活性化を増殖の経時的推移中に評価したところ、Ｙｍｉｎ−Ｔ０値により示されるような明白な細胞傷害性の欠如と一致し、カスパーゼ切断は最高濃度（３０μＭ）でのみ見られ、このことより、アポトーシスはｃｃＲＣＣ細胞株において化合物Ａにより誘導された全体的な増殖阻害効果に最小の寄与しか持たない可能性があることを示す。
【０１６５】
腫瘍増殖に対する化合物Ａの効果を、ヒト腎細胞癌異種移植片（ＡＣＨＮ）を担持するマウスで評価した。皮下ＡＣＨＮ細胞株腫瘍を担持する雌ＳＣＩＤマウスの体重を測定し、腫瘍をカリパスで測定し、腫瘍サイズに従って１０個体ずつの処置群に乱塊法で割り付けた。マウスにビヒクルまたは化合物Ａ（１５０ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを最大５９日間毎日経口投与した。試験中、週に２回、マウスの体重を測定し、腫瘍測定を行った。総ての用量で有意な腫瘍増殖阻害が見られ、≧３００ｍｇ／ｋｇの用量で退縮が見られた。毎日６００ｍｇ／ｋｇで処置した動物に有意な体重低下が見られ、従って、その投与群は３１日目を終了とした（図２３、表５）。
【０１６６】
【表５】
2019535800.tif 000034
【０１６７】
これらのデータを考え合わせると、ヒト固形腫瘍および血液腫瘍の皮下異種移植において、同等の用量で１００％のＴＧＩが達成され得ることが示唆される。
【０１６８】
乳癌
乳癌細胞株は化合物Ａに対して一定範囲の感受性を示し、多くの場合、６日増殖アッセイで部分的増殖阻害を示した（図２４）。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を表す細胞株は、非ＴＮＢＣ細胞株と比較してやや低いｇＩＣ５０中央値を有した（ＴＮＢＣおよび非ＴＮＢＣに関してそれぞれ３．６μＭおよび６．８μＭ）。化合物Ａによる増殖に対する効果は細胞増殖抑制であり、乳癌細胞株の大部分で完全な増殖阻害をもたらさなかったので、化合物Ａに対する感受性が暴露の延長に伴って増加するかどうかを決定するために延長期間増殖−細胞死アッセイを行った。供試した７／１７細胞株で、≧１０％までの最大阻害パーセントの増加およびｇＩＣ５０の２分の１以下への低下が見られた（図２５）。暴露延長アッセイでは、１１／１７細胞株がｇＩＣ５０≦２μＭ（６５％）を有したが、７日アッセイ形式では、７／１７（４１％）がこの判定基準を満たした。
【０１６９】
黒色腫
固形腫瘍種間で、化合物Ａは、黒色腫細胞株に最も強力な抗増殖効果を有した（図１１）。評価した７のうち６細胞株が２μＭ未満のｇＩＣ５０値を有した（表６）。総ての黒色腫細胞株で、ｇＩＣ５０値とは無関係に、化合物Ａの効果は細胞増殖抑制性であった。
【０１７０】
【表６】
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【０１７１】
実施例２
背景
ＰＲＭＴ５は対称性タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼである
タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）は、グリシン残基およびアルギニン残基が豊富な領域（ＧＡＲモチーフ）を含むタンパク質中のアルギニンをメチル化する酵素のサブセットである。ＰＲＭＴは酵素反応の生成物に基づいて４つのサブタイプ（Ｉ〜ＩＶ型）に類別される（図２６、Fisk JC, et al. A type III protein arginine methyltransferase from the protozoan parasite Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 2009 Apr 24;284(17):11590-600）。Ｉ〜ＩＩＩ型酵素は、ω−Ｎ−モノメチル−アルギニン（ＭＭＡ）を生成する。最大のサブタイプであるＩ型（ＰＲＭＴ１、３、４、６および８）は、ＭＭＡを非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）へ進めるが、ＩＩ型は、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を生成する。ＰＲＭＴ９／ＦＢＸＯ１１もまたＳＤＭＡを生成し得るが、ＰＲＭＴ５が対称性ジメチル化を担う主要な酵素である。ＰＲＭＴ５は、細胞質および核で数種の複合体として機能し、基質の認識および選択性にはＰＲＭＴ５の結合相手が必要とされる。メチロソームタンパク質５０（ＭＥＰ５０）は、ヒストンおよびその他の基質に対するＰＲＭＴ５の結合および活性に必要とされるＰＲＭＴ５の既知の補因子である(Ho MC, et al. Structure of the arginine methyltransferase PRMT5-MEP50 reveals a mechanism for substrate specificity. PLoS One. 2013;8(2))。
【０１７２】
ＰＲＭＴ５基質
ＰＲＭＴ５は、スプライシング因子、ヒストン、転写因子、キナーゼおよびその他を含む種々の細胞タンパク質のアルギニンをメチル化する（図２７）(Karkhanis V, et al. Trends Biochem Sci. 2011 Dec;36(12):633-41)。スプライセオソームの複数の成分のメチル化は、スプライセオソームの組み立てに重要な事象であり、ノックダウンまたは遺伝子ノックアウトによるＰＲＭＴ５活性の減弱は、細胞スプライシングの混乱をもたらす(Bezzi M, et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes Dev. 2013 Sep 1;27(17):1903-16)。ＰＲＭＴ５はまた、ヒストンのアルギニン残基（Ｈ３Ｒ８、Ｈ２ＡＲ３およびＨ４Ｒ３）もメチル化し、これらのヒストンマークは、ＲＢおよびＳＴ７などの腫瘍抑制遺伝子の転写サイレンシングに関連する(Wang L, et al. Protein arginine methyltransferase 5 suppresses the transcription of the RB family of tumor suppressors in leukemia and lymphoma cells. Mol Cell Biol. 2008 Oct;28(20):6262-77; Pal S, et al. Low levels of miR-92b/96 induce PRMT5 translation and H3R8/H4R3 methylation in mantle cell lymphoma. EMBO J. 2007 Aug 8;26(15):3558-69)。加えて、Ｈ２ＡＲ３の対称性のジメチル化は、胚性幹細胞における分化遺伝子のサイレンシングに関連付けられている(Tee WW, et al. Prmt5 is essential for early mouse development and acts in the cyto
plasm to maintain ES cell pluripotency. Genes Dev. 2010 Dec 15;24(24):2772-7)。ＰＲＭＴ５はまた、ＥＧＦＲおよびＰＩ３Ｋのメチル化を介して細胞シグナル伝達に役割を果たす(Hsu JM, et al. Crosstalk between Arg 1175 methylation and Tyr 1173 phosphorylation negatively modulates EGFR-mediated ERK activation. Nat Cell Biol. 2011 Feb;13(2):174-81; Wei TY, Juan CC, Hisa JY, Su LJ, Lee YC, Chou HY, Chen JM, Wu YC, Chiu SC, Hsu CP, Liu KL, Yu CT. Protein arginine methyltransferase 5 is a potential oncoprotein that upregulates G1 cyclins/cyclin-dependent kinases and the phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling cascade. Cancer Sci. 2012 Sep;103(9):1640-50)。癌関連経路に関与するタンパク質のメチル化におけるＰＲＭＴ５の役割は以下に説明する。
【０１７３】
ＰＲＭＴ５ノックアウトモデル
ＰＲＭＴ５の完全な欠損は、胚致死性である。ＰＲＭＴ５は胚発生に重要な役割を果たしており、これはＰＲＭＴ５ヌルマウスは胎生３．５〜６．５日目の間に死に至るという事実によって証明される(Tee WW, et al. Prmt5 is essential for early mouse development and acts in the cytoplasm to maintain ES cell pluripotency. Genes Dev. 2010 Dec 15;24(24):2772-7)。初期の研究により、ＨＳＣ（造血幹細胞）およびＮＰＣ（神経系前駆細胞）の発生に重要な役割を果たすことが示唆されている。ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞におけるＰＲＭＴ５のノックダウンは、赤血球分化の増加をもたらす(Liu F, et al. JAK2V617F-mediatedphosphorylation of PRMT5 downregulates its methyltransferase activity and promotes myeloproliferation. Cancer Cell. 2011 Feb 15;19(2):283-94)。ＮＰＣでは、ＰＲＭＴ５は、神経系の分化、細胞の増殖および生存を調節する(Bezzi M, et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes Dev. 2013 Sep 1;27(17):1903-16)。
【０１７４】
癌におけるＰＲＭＴ５
ＰＲＭＴ５は腫瘍形成に関与していることを示唆する証拠が増えている。ＰＲＭＴ５タンパク質は、リンパ腫、神経膠腫、乳癌および肺癌を含むいくつかの癌種で過剰発現され、ＰＲＭＴ５の過剰発現だけで正常な線維芽細胞を悪性移行させるのに十分である(Pal S, et al. Low levels of miR-92b/96 induce PRMT5 translation and H3R8/H4R3 methylation in mantle cell lymphoma. EMBO J. 2007 Aug 8;26(15):3558-69.; Ibrahim R, et al. Expression of PRMT5 in lung adenocarcinoma and its significance in epithelial-mesenchymal transition. Hum Pathol. 2014 Jul;45(7):1397-405; Powers MA, et al. Protein arginine methyltransferase 5 accelerates tumor growth by arginine methylation of the tumor suppressor programmed cell death 4. Cancer Res. 2011 Aug 15;71(16):5579-87; Yan F, et al. Genetic validation of the protein arginine methyltransferase PRMT5 as a candidate therapeutic target in glioblastoma. Cancer Res. 2014 Mar 15;74(6):1752-65)。ＰＲＭＴ５のノックダウンは多くの場合、癌細胞株において細胞の増殖および生存の低減をもたらす。乳癌では、高いＰＤＣＤ４（プログラム細胞死４）レベルを伴った高いＰＲＭＴ５発現が全体的な生存の低さを予測する(Powers MA, et al. Protein arginine methyltransferase 5 accelerates tumor growth by arginine methylation of the tumor suppressor programmed cell death 4. Cancer Res. 2011 Aug 15;71(16):5579-87)。ＰＲＭＴ５は、ＰＤＣＤ４をメチル化して腫瘍関連機能を変化させる。乳癌の同所モデルにおけるＰＲＭＴ５およびＰＤＣＤ４の共発現は、腫瘍成長を促進する。神経膠腫における高いＰＲＭＴ５発現は高い腫瘍悪性度および全体的な生存の低さに関連し、ＰＲＭＴ５ノックダウンは、同所膠芽腫モデルにおいて生存利益を提供する(Yan F, et al. Genetic validation of the protein arginine methyltransferase PRMT5 as a candidate therapeutic target in glioblastoma. Cancer Res. 2014 Mar 15;74(6):1752-65)。ＰＲＭＴ５の発現および活性の増強は、神経膠腫細胞株におけるいくつかの腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングに寄与する。
【０１７５】
ＰＲＭＴ５と癌の間で現在記載されている最も強い作用機構的関連は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）におけるものである。ＰＲＭＴ５は、ＭＣＬにおいて高頻度で過剰発現され、核コンパートメント発現が高く、そこでそれはヒストンのメチル化のレベルを高め、腫瘍抑制遺伝子のサブセットをサイレンシングする。最近の研究は、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５発現の上方調節におけるｍｉＲＮＡの役割を明らかにした。５０を超えるｍｉＲＮＡが、ＰＲＭＴ５  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にアニールすることが予測される。ＭＣＬにおいてｍｉＲ−９２ｂおよびｍｉＲ−９６レベルはＰＲＭＴ５レベルと逆相関すること、およびＭＣＬ細胞におけるこれらのｍｉＲＮＡの下方調節は上方調節ＰＲＭＴ５タンパク質レベルをもたらすことが報告された。ＭＣＬ患者の大多数において転座している癌遺伝子であるサイクリンＤ１はＰＲＭＴ５に関連し、ｃｄｋ４依存的機構を介してＰＲＭＴ５活性を増強する（図２８、Aggarwal P, et al. Cancer Cell. 2010 Oct 19;18(4):329-40）。ＰＲＭＴ５は、ＤＮＡ複製に負の調節を行ってサイクリンＤ１依存的新生物成長を可能とする重要な遺伝子の抑制を媒介する。ＰＲＭＴ５ノックダウンは、サイクリンＤ１依存的な細胞の悪性移行を阻害して腫瘍細胞の死滅を引き起こす。これらのデータは、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５の重要な役割を強調し、ＰＲＭＴ５阻害はＭＣＬにおける治療戦略として使用可能であることを示唆する。
【０１７６】
他の腫瘍種では、ＰＲＭＴ５は、分化、細胞死、細胞周期進行、細胞成長および増殖に役割を果たすと仮定されている。ＰＲＭＴ５と腫瘍形成を関連付ける主要な機構は知られていないが、新たなデータは、ＰＲＭＴ５が遺伝子発現の調節（ヒストンのメチル化、転写因子の結合、またはプロモーターの結合）、スプライシングの変更およびシグナル伝達に寄与することを示唆する。転写因子Ｅ２Ｆ１のＰＲＭＴ５メチル化は、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを促進するその能力を低減する(Zheng S, et al. Arginine methylation-dependent reader-writer interplay governs growth control by E2F-1. Mol Cell. 2013 Oct 10;52(1):37-51)。ＰＲＭＴ５はまた、ＤＮＡ損傷に応答してｐ５３もメチル化し(Jansson M, et al. Arginine methylation regulates the p53 response. Nat Cell Biol. 2008 Dec;10(12):1431-9)、細胞周期の休止を誘導するｐ５３の能力を低減するとともにｐ５３依存性アポトーシスを増強する。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害はｐ５３依存性アポトーシスの誘導を介してＤＮＡ傷害剤に対して細胞を増感させ得ることを示唆する。
【０１７７】
ｐ５３を直接メチル化することに加え、ＰＲＭＴ５は、スプライシング関連機構を介してｐ５３経路を上方調節する。マウス神経系前駆細胞におけるＰＲＭＴ５ノックアウトは、ＭＤＭ４遺伝子のアイソフォームスイッチングを含む細胞スプライシングの変更をもたらす(Bezzi M, et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes Dev. 2013 Sep 1;27(17):1903-16)。Ｂｅｚｚｉらは、ＰＲＭＴ５ノックアウト細胞が長いＭＤＭ４アイソフォームの発現の低下（機能的ｐ５３ユビキチンリガーゼをもたらす）およびＭＤＭ４の短いアイソフォームの発現の増強（不活性リガーゼをもたらす）を示すことを見出した。ＭＤＭ４スプライシングにおけるこれらの変化は、ＭＤＭ４の不活性化をもたらし、ｐ５３タンパク質の安定性を高め、その後、ｐ５３経路の活性化および細胞死を増大させる。ＭＤＭ４選択的スプライシングはまた、ＰＲＭＴ５ノックダウン癌細胞株でも見られた。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害がｐ５３経路の複数のノードを活性化し得ることを示唆する。
【０１７８】
癌細胞の増殖および生存の調節に加え、ＰＲＭＴ５は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）にも関連付けられている。ＰＲＭＴ５は転写因子ＳＮＡＩＬに結合し、Ｅ−カドヘリン発現の重要なコリプレッサーとして働き；ＰＲＭＴ５のノックダウンは、Ｅ−カドヘリンレベルの上方調節をもたらす(Hou Z, et al. The LIM protein AJUBA recruits protein arginine methyltransferase 5 to mediate SNAIL-dependent transcriptional repression. Mol Cell Biol. 2008 May;28(10):3198-207)。
【０１７９】
これらのデータは、複数の癌関連経路の重要なレギュレーターとしてＰＲＭＴ５の役割を強調し、ＰＲＭＴ５阻害剤が血液癌および固形癌において幅広い活性を有し得ることを示唆する。ＭＣＬならびに乳癌および脳癌における治療戦略としてのＰＲＭＴ５阻害剤の強い根拠がある。これらのデータはまた、適当な細胞状況において
・ＭＣＬにおけるサイクリンＤ１依存性機能の阻害；
・ｐ５３経路活性の活性化および変調；
・Ｅ２Ｆ１依存性細胞増殖およびアポトーシス機能の変調；
・Ｅ−カドヘリン発現の脱抑制
のためのＰＲＭＴ５阻害剤の使用の作用機構的根拠を強調する。
【０１８０】
化合物Ｃは、良好な全体的物理的特性および経口バイオアベイラビリティを有するＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０複合体の、中分子量（ＭＷ＝４５２．５５）の強力、選択的、ペプチド  競合、可逆的阻害剤である。化合物Ｃはいくつかの癌関連経路に影響を及ぼし、最終的にｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルの両方で強力な抗癌活性をもたらし、ＭＣＬ、乳癌および脳癌の処置に新規な治療機構を提供する。
【０１８１】
生化学
化合物Ｃは、ＰＲＭＴ５の阻害の効力、可逆性、選択性、および機構を特徴付けるためのいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学アッセイで特性決定を行った。
【０１８２】
化合物Ｃの阻害効力は、ＳＡＭから、ヒストンペプチドライブラリースクリーンから同定されたヒストンＨ４に由来するペプチドへの３Ｈの移動を測定する放射活性アッセイを用いて評価した。効力のいずれの時間依存的増強も捕捉するために、長い反応時間１２０分を使用した。化合物Ｃは、８．７±５ｎＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０を有するＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０の強力な阻害剤であることが判明した。この効力はこのアッセイの強結合限界（２ｎＭ）に近づいたので、この分子の真の効力の上限を表す（図２９）。阻害効力は、いくつかの生物学的試験においてツール化合物として使用された化合物Ｆ、化合物Ｂおよび化合物Ｅ（分子の左側に重要な違い）を含む化合物Ｃの近縁類似体で同等であった。
【０１８３】
化合物Ｃの、ヒストンＨ４以外の細胞基質のＰＲＭＴ５依存的メチル化を阻害する能力を評価するために、ＳｍＤ３、Ｌｓｍ４、ｈｎＲＮＰＨ１およびＦＵＢＰ１（スプライシングおよび転写サイレンシングに関与するこれらの基質の大部分は、以下の生物学の節に記載される細胞メチルスキャン（商標）試験によって発見された）を含む評価のためにＰＲＭＴ５基質のパネルを構築した。化合物Ｃは、ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０により触媒されるこれらの基質の総てのメチル化を効果的に阻害したが、極めて低いＫｍ  ａｐｐａｒｅｎｔが効力の正確な決定を阻んだ。
【０１８４】
安全性試験の解釈を可能とするために、ヒトＰＲＭＴ５アッセイと同様の条件下でＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０複合体のラットおよびイヌ相同分子種に対しても化合物Ｃの効力を評価した。化合物Ｃの効力は、総ての種で３倍未満の変動であった（表７）。
【０１８５】
【表７】
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【０１８６】
阻害の機構および阻害剤の結合様式を決定するために、化合物ＣをＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０複合体および天然産物ＳＡＭ類似体であるシネフンギンと共結晶させた（２．８Å分解能）（図３０）。この阻害剤は、通常基質ペプチドによって占有されているクレフト内の、ＳＡＭポケットを占有するシネフンギンに近接して結合する。テトラヒドロイソキノリンのアリール環は、シネフンギンのアミノ基とπ−アリールスタッキング相互作用をなすと思われる。水素結合は、化合物Ｃのヒドロキシル基とＬｅｕ４３７骨格およびＧｌｕ２４４の間で形成される。水素結合相互作用はまた、ピリミジン環のアミドとＰｈｅ５８０の骨格ＮＨ基の間にも形成される。末端ピペリジンアセトアミドは、明確な臨界接触なく溶媒露出面にある。全体的に見れば、この構造は、ＳＡＭとは競合せず、基質と競合する阻害機構を支持する。
【０１８７】
化合物ＣがＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０の可逆的阻害剤であるかどうかを決定するため、そしてこの阻害機構をさらに探究するために、親和性選択質量分析（ＡＳＭＳ）を用いて種々のＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０複合体に対する化合物Ｃの結合を測定した。ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０をＳＡＭ、シネフンギンまたはＳＡＨとともに含有する二元複合体で、また、ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０：Ｈ４ペプチド：ＳＡＨまたはシネフンギンのデッドエンド三元複合体に対して陽性結合が検出できた。ＡＳＭＳは不可逆的に結合した化合物Ｃを検出できないので、これらの結果は、可逆的結合機構と一致する。１０倍過剰のＨ４ペプチドと競合した場合、化合物Ｃの結合は、ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０：Ｈ４ペプチド：シネフンギン複合体内で低下した。ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０：Ｈ４ペプチド複合体またはＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０単独で化合物Ｃの結合は検出されず、ＳＡＭ結合ポケットが化合物Ｃの結合のために占有される必要があることが示唆された。これらの結果は、ＳＡＭとは競合せず、Ｈ４ペプチドと競合する阻害機構と最も良く合致する。
【０１８８】
Ｉ型およびＩＩ型ＰＲＭＴならびにリシンメチルトランスフェラーゼ（ＫＭＴ）を含んだ酵素パネルで化合物Ｃの選択性を評価した。他のＩＩ型ＰＲＭＴであり、ＴＨＷループを欠損させるための唯一のＰＲＭＴであるＰＲＭＴ９／ＦＢＸＯ１１は、機能的な酵素アッセイが無いために含まれなかった。化合物Ｃは、ＩＣ５０値＞４０μＭのメチルトランスフェラーゼ選択性パネルの１９酵素をいずれも阻害せず、ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０に対して４０００倍を超える選択性が得られた（図３１）。他のメチルトランスフェラーゼを超えるＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０に対する選択性は、本明細書の生物学の節で使用したＰＲＭＴ５ツール化合物（化合物Ｂ、化合物Ｆおよび化合物Ｅ）についても見られた。
【０１８９】
要約すると、化合物Ｃは、ＩＣ５０が８．７±５ｎＭの、ＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０複合体の強力、選択的、可逆的な阻害剤である。化合物Ｃとの複合体としてのＰＲＭＴ５／ＭＥＰ５０の結晶構造およびＡＳＭＳ結合データは、ＳＡＭ非競合性、タンパク質基質競合機構と一致する。
【０１９０】
生物学
概要
ＰＲＭＴ５は、いくつかのヒト癌で過剰発現され、複数の癌関連経路に関連付けられている。ＭＣＬならびに乳癌および脳癌における治療戦略としてのＰＲＭＴ５阻害剤使用の強い根拠がある。ＰＲＭＴ５阻害剤の抗増殖活性の範囲を理解するために、２Ｄおよび３Ｄ増殖アッセイを用いて種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルで化合物Ｃの特性決定を行った。
【０１９１】
適応症の優先順位付け、予測バイオマーカーの発見および合理的組合せ試験の設計に必要なＰＲＭＴ５阻害剤の機構を理解するためには、ＰＲＭＴ５阻害によって影響を受ける遺伝子および経路の特定が重要である。ＰＲＭＴ５阻害に対する応答の生物学を評価するために、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用機構的試験を行った。細胞および異種移植腫瘍でＰＲＭＴ５に対する化合物Ｃの活性をモニタリングするために、いくつかのＰＲＭＴ５基質のアルギニンメチル化レベルを評価した。遺伝子発現、スプライシング、ならびにＰＲＭＴ５活性により調節される他の分子機構および経路に対する化合物Ｃの効果を評価するために、いくつかの細胞株のＲＮＡ配列決定を行った。ＰＲＭＴ５阻害剤で処理した細胞株でｐ５３経路の活性をモニタリングした。
【０１９２】
最後に、前臨床癌モデルでＰＲＭＴ５阻害の有効性を評価し、応答の分子機構および潜在的バイオマーカーを評価するために、ＭＣＬおよび乳癌のいくつかの異種移植モデルで化合物Ｃの活性を試験した。
【０１９３】
細胞株の感受性
種々の腫瘍種におけるＰＲＭＴ５阻害の抗増殖活性を評価するために、癌細胞株の広範なパネルおよび患者由来腫瘍モデルを用い、２Ｄおよび３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで化合物Ｃの特性決定を行った。まず、化合物Ｃを、２Ｄ  ６日増殖／細胞死アッセイにて癌細胞株パネルで評価した（図３２）。ＰＲＭＴ５活性が重要な経路および／または細胞の増殖および生存を調節することが報告されている腫瘍種（例えば、リンパ腫およびＭＣＬ、神経膠腫、乳癌および肺癌株）を表すように細胞株を選択した。全体的に見れば、供試した大多数の細胞株は、１μＭ未満のｇＩＣ５０値を示したが、最も感受性の高いリンパ腫株（マントル細胞リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株）は、１桁のｎＭ範囲のＩＣ５０値を有した。
【０１９４】
化合物Ｃは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、膠芽腫、乳癌および膀胱癌細胞株のサブセットで、６日増殖／細胞死アッセイにおいて、１００ｎＭを超える濃度で細胞傷害性応答を誘導した（図３３、負のＹｍｉｎ−Ｔ０値）。全体的に見れば、ＭＣＬおよびＤＬＢＬＣ株は、最も強い細胞傷害性応答を示した。大多数の乳癌株は低いＹｍｉｎ−Ｔ０値を有し、乳癌モデルでＰＲＭＴ５阻害が完全な増殖阻害をもたらすことが示唆され、一方、残りの細胞株は、部分的な細胞増殖抑制応答を示した（正のＹｍｉｎ−Ｔ０値）。
【０１９５】
ＰＲＭＴ５阻害の抗増殖活性を、ＰＲＭＴ５ツール分子で行った大きな癌細胞株スクリーン（２４０細胞株、１０日２Ｄ増殖アッセイ）でさらに試験した（図３４、図２９における化合物Ｃと化合物Ｂの生化学／細胞活性比較）。全体的に見れば、大多数の細胞株は、１μＭ未満のｇＩＣ５０値を示した。ｇＩＣ５０中央値＜１００ｎＭを有する腫瘍種は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、乳癌、神経膠腫、腎臓癌、黒色腫、および卵巣癌であった。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害剤が種々の血液腫瘍種および固形腫瘍種に対して広範な抗増殖活性を示すことを示唆する。
【０１９６】
軟寒天３Ｄコロニー形成アッセイでの患者由来腫瘍モデルおよび細胞株のパネル（ｎ＝７３）でも、ＰＲＭＴ５ツール化合物を用いた場合、同様の広範囲の抗増殖効果が見られた（図３５）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、黒色腫、結腸癌および神経膠腫の腫瘍を含むモデルの３７％に、１μＭ未満の相対的増殖ＩＣ５０値が見られた。最低のＩＣ５０中央値を有する腫瘍種は、大細胞肺癌、乳癌、腎臓癌および神経膠腫であった。
【０１９７】
全体的に見れば、これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害剤が様々な固形癌および血液癌モデルにおいて強力な抗増殖活性を有することを示す。上記の試験で見られた活性、文献仮説および臨床開発の可能性に基づいてさらなる検討のために以下の適応症を選択した：
・ＭＣＬおよびＤＬＢＣＬ（強力な抗増殖性およびＰＲＭＴ５阻害に対する細胞傷害性応答）
・乳癌（細胞株における低ｇＩＣ５０値および完全増殖阻害ならびに患者由来モデルのパネルでのコロニー形成アッセイにおける低ＩＣ５０値）
・膠芽腫（コロニー形成アッセイにおける低ＩＣ５０値）
【０１９８】
リンパ腫の生物学
前述のように、化合物Ｃは、マントル細胞およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫  細胞株のサブセットにおいて強力な細胞傷害性応答を誘導した（図３２〜３３）。ＰＲＭＴ５はＭＣＬにおいて高頻度で過剰発現されることから、ＭＣＬ経路（サイクリンＤ１およびｐ５３など）において重要な役割を果たし、化合物Ｃの活性および機構は、いくつかの細胞作用機構的試験で評価した。化合物Ｃの有効性は、マントル細胞リンパ腫の２つの異種移植モデルで評価した。
【０１９９】
細胞作用機構的試験データ（リンパ腫）
ＳＤＭＡ阻害
ＰＲＭＴ５は、大部分の細胞対称性アルギニンジメチル化を担う。ＰＲＭＴ５阻害を抗癌表現型に結びつける生物学的機構をより良く理解するために、アルギニン残基において対称的にジメチル化される細胞タンパク質のサブセットを認識するＳＤＭＡ抗体を用いて基質を同定した。ＳＤＭＡ抗体を用いた免疫沈降と質量分光分析（メチルスキャン（商標））によるＺ１３８細胞溶解液（対照およびＰＲＭＴ５阻害剤処理細胞由来）において、ＳＤＭＡ抗体により検出されるタンパク質が何であるかを決定した。ＳＤＭＡ含有タンパク質の大部分が細胞スプライシングおよびＲＮＡプロセシングに関与する因子（ＳｍＢ、Ｌｓｍ４、ｈｎＲＮＰＨ１およびその他）、転写に関与する因子（ＦＵＢＰ１）および翻訳に関与する因子であったが、このことは、細胞ＲＮＡのホメオスタシスの重要なレギュレーターとしてのＰＲＭＴ５の役割を強調する。
【０２００】
次に、ＳＤＭＡ抗体をウエスタンアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイで用いて、化合物Ｃ依存的なメチル化阻害を測定した。まず、Ｚ１３８  ＭＣＬ細胞（化合物Ｃ  ｇＩＣ５０  ２．７ｎＭ、ｇＩＣ９５  ８２ｎＭおよびｇＩＣ１００  ８８０ｎＭ、６日増殖／細胞死アッセイにおける細胞傷害性応答、図３２〜３３）を漸増濃度の化合物Ｃで処理して、処理１日後と３日後にＳＤＭＡ阻害の細胞ＩＣ５０を決定した（図３６）。ＳＤＭＡ  ＥＬＩＳＡは、３日目に４．７９ｎＭのＩＣ５０値と、１日目および３日目にそれぞれ７．３および２．３５のＥＣ５０を有し、ＳＤＭＡレベルに時間依存的変化を示した（図３６、パネルＡ）。ＳＤＭＡの完全阻害は、３日目に１９ｎＭを超える濃度で見られた（ＥＣ９０）。Ｚ１３８細胞の完全な増殖阻害は、ｇＩＣ９５（８２ｎＭ）〜ｇＩＣ１００（８８０ｎＭ）（６日増殖／細胞死アッセイ）で見られ、これらの濃度はＳＤＭＡ阻害のＥＣ９０を超える。これらのデータは、Ｚ１３８細胞において完全な増殖阻害および細胞傷害性を惹起するためには、ＰＲＭＴ５活性は＞９０％阻害される必要があることを示唆する。
【０２０１】
ＳＤＭＡレベルの阻害が化合物Ｃに対する細胞増殖応答を予測するかどうかを評価するために、ＭＣＬ細胞株のパネルでＳＤＭＡ  ＩＣ５０値を決定した。ＳＤＭＡ  ＩＣ５０値は５つのＭＣＬ株のパネルで０．３〜１４ｎＭの範囲であった（図３６、パネルＢ）（感受性のＺ１３８、Ｇｒａｎｔａ−５１９、Ｍａｖｅｒ−１および中等度耐性のＭｉｎｏ、およびＪｅｋｏ−１、図３２〜３３）が、このことは、ＳＤＭＡが応答マーカーではなく、むしろＰＲＭＴ５活性のマーカーであって、感受性および耐性モデルにおいてＰＲＭＴ５阻害をモニタリングするために使用できることを示唆する。
【０２０２】
リンパ腫細胞株の遺伝子発現プロフィール
ＰＲＭＴ５は、ヒストンおよびＲＮＡプロセシングに関与するタンパク質をメチル化し、従って、ＰＲＭＴ５阻害は、細胞ｍＲＮＡのホメオスタシスに顕著な効果を有すると予想される。ＰＲＭＴ５により調節され、かつ、ＰＲＭＴ５阻害剤に対する細胞応答に寄与する細胞機構をさらに解読するために、ＰＲＭＴ５阻害に感受性であるリンパ腫モデルにおいて大域遺伝子発現変化を評価した。ＰＲＭＴ５阻害剤処理時にリンパ腫細胞株に見られる遺伝子発現変化を明らかにするために、４つの感受性リンパ腫株（２つのＭＣＬ株−Ｚ１３８およびＧｒａｎｔａ−５１９と２つのＤＬＢＣＬ株−ＤＯＨＨ２およびＲＬ）の特性をＲＮＡ配列決定によって評価した。
【０２０３】
２日間および４日間、漸増濃度のＰＲＭＴ５ツール分子で処理したリンパ腫株で遺伝子発現変化を評価した（図３７）。ＲＮＡ発現に及ぼす影響は時間依存的かつ用量依存的であり、４８の遺伝子が４つのリンパ腫株で共通に調節を受けた。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害は数百の遺伝子に発現変化を惹起し、これらの変化のサブセットが、供試した４つ総ての感受性リンパ腫株で共通であることを示す。ＰＲＭＴ５阻害に対する細胞の応答の機構におけるこれらの遺伝子の関連が評価される。
【０２０４】
ＳＤＭＡおよび遺伝子発現変化
ＲＮＡ−ｓｅｑ試験によって発見された遺伝子発現変化を確認するために、遺伝子サブセット（ロバストな変化を示す遺伝子およびｐ５３経路に関与する遺伝子）の発現のｑＰＣＲ分析を行った。Ｚ１３８細胞を漸増用量の化合物Ｃで２日間および４日間処理し、ＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲにより分析した。図３８は、左のパネルが代表的な用量応答曲線を示し、右のパネルに遺伝子発現ＥＣ５０値（４日目）を要約する。全体的に見れば、供試した１１総ての遺伝子が時間依存的かつ用量依存的な発現変化を示し、ＥＣ５０値は２２〜３３２ｎＭの範囲であり、遺伝子発現ＥＣ５０中央値は２１２ｎＭであった。重要なこととして、遺伝子発現ＥＣ５０中央値は、Ｚ１３８において細胞のメチル化の最大阻害をもたらす化合物Ｃ濃度に相当し（ＳＤＭＡ抗体ＥＬＩＳＡにより測定した場合、図３６）、このことは、遺伝子発現プログラムにおける変化を確立するためには、ＰＲＭＴ５活性のほぼ完全な阻害が必要であることを示唆する。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害の程度と遺伝子発現および増殖表現型の変化との関連を強調し、両方ともＰＲＭＴ５活性のほぼ完全な阻害を必要とする。
【０２０５】
ＰＲＭＴ５の阻害およびスプライシング
ＰＲＭＴ５がスプライセオソームサブユニットをメチル化し、ＰＲＭＴ５の阻害がスプライシングに関与するいくつかのタンパク質のアルギニンメチル化を減弱することから、細胞スプライシングに及ぼすＰＲＭＴ５阻害の影響を調べた。上記のリンパ腫ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットでＲＮＡスプライシングの変化を評価した。
【０２０６】
細胞スプライシングが調節され得る分子機構がいくつかあり（図３９、パネルＡ）、イントロンの保持（Ｂ）は通常、遺伝子発現の変化をもたらし、一方、エキソンスキッピングまたは選択的スプライス部位の使用は、アイソフォームスイッチングをもたらす（Ａ、Ｃ〜Ｅ）。ＰＲＭＴ５ツール化合物処理は、供試した総てのリンパ腫株でイントロン保持の用量依存的かつ時間依存的増加をもたらした（図３９、パネルＢ）。興味深いことに、スプライシング因子マップ分析は、４つ総ての細胞株の保持されたイントロンにおいて、ｈｎＲＮＰＨ１（ＰＲＭＴ５によって直接メチル化）、ｈｎＲＮＰＦ、ＳＲＳＦ１およびＳＲＳＦ５を含む、スプライシング因子結合部位のサブセットが富化されていたことを示唆し、細胞スプライシングに及ぼすＰＲＭＴ５の影響は、スプライセオソーム装置の複数の成分（ＳｍおよびｈｎＲＮＰタンパク質）のメチル化に依存している可能性があることが示唆される。ＰＲＭＴ５阻害はまた、リンパ腫細胞株においてアイソフォームスイッチング（選択的スプライシング）を誘導し（図４０、パネルＡ）、３４の遺伝子が供試した総ての細胞株で一貫して選択的スプライシング変化を示した（図４０、パネルＢおよびＣ）。
【０２０７】
全体的に見れば、数百の遺伝子のスプライシングの変化が観察され、スプライシングに及ぼすＰＲＭＴ５の影響が大域ではなく、むしろ限定数のＲＮＡに特定されることを強調する。このような特異性に関する可能性の一つの説明は、ＰＲＭＴ５がｈｎＲＮＰＨ１およびその他などの特定のスプライシング因子のＲＮＡ結合を直接調節することであり得る。ＰＲＭＴ５阻害剤の作用機構における選択的スプライシング変化の役割を探究し、一つの特定の例を以下の節で述べる。
【０２０８】
ＭＤＭ４のスプライシングおよびｐ５３経路の活性化
ＰＲＭＴ５ノックアウトまたはノックダウンはＭＤＭ４アイソフォームスイッチを生じ、これがｐ５３に対するＭＤＭ４ユビキチンリガーゼ活性の不活性化をもたらすことが報告されている（背景の節に記載）。ＰＲＭＴ５の阻害は、ＲＮＡ−ｓｅｑ試験（ＧＳＥＡ）において供試した４つのリンパ腫株で、ｐ５３経路の活性化をもたらした。ｐ５３の活性化がＭＤＭ４アイソフォームスイッチングに関連するかどうかを理解するために、ＭＤＭ４選択的スプライシングを分析した。ＭＤＭ４アイソフォームスイッチは、４つ総てのリンパ腫株に見られた。次に、ＲＴ−ＰＣＲにより４つのＭＣＬ株のパネルでＭＤＭ４スプライシングの変化が確認された（図４１、パネルＡ、Ｚ１３８、ＪＶＭ−２およびＭＡＶＥＲ−１  ＭＣＬ株は化合物Ｃに感受性であり、ＲＥＣ−１は耐性の最も高いＭＣＬ株である）。Ｚ１３８およびＪＶＭ−２細胞（両方ともｐ５３野生型）では、化合物Ｃは、ＭＤＭ４アイソフォームスイッチングを誘導した。ＭＡＶＥＲ−１およびＲＥＣ−１細胞（両方ともｐ５３突然変異型）では、ＭＤＭ４長鎖型の基底発現は低／検出不能であったので、ＭＤＭ４アイソフォームスイッチングは検出できなかった。次に、ＪＶＭ−２およびＺ１３８細胞では、ｐ５３およびｐ２１（またはｐ５３標的遺伝子であるＣＤＫＮ１Ａ）タンパク質の発現が上昇していた（図４１、パネルＢ）。重要なこととして、Ｚ１３８細胞では、２００ｎＭの化合物Ｃおよび５μＭのＭＤＭ２阻害剤（Ｎｕｔｌｉｎ−３）処理がｐ５３とｐ２１発現を同等のレベルに上昇させた。これらのデータは、ＰＲＭＴ５の阻害が高レベルのＭＤＭ４長鎖アイソフォームを発現する細胞株ではＭＤＭ４スプライシングを調節し、ｐ５３野生型細胞株ではｐ５３経路の活性を誘導することを示唆する。ＰＲＭＴ５阻害に対するｐ５３野生型ＭＣＬ細胞の応答の生物学におけるｐ５３経路の役割が評価される。
【０２０９】
加えて、ＭＤＭ４スプライシング、ＳＤＭＡ阻害およびｐ５３発現における変化の用量応答も、ＰＲＭＴ５阻害、ＭＤＭ４スプライシングおよびｐ５３活性化の関係を評価するために漸増濃度の化合物Ｃで処理したＺ１３８細胞で評価した（図４２、パネルＡおよびＢ）。ＳＤＭＡレベルは、ウエスタンブロットにより、８ｎＭを超える化合物Ｃの濃度では検出不能であった。同時に、ＭＤＭ４スプライシングおよびｐ５３／ｐ２１タンパク質発現の変化は、８ｎＭを超える化合物Ｃの濃度で明白であった。これらの結果から、遺伝子スプライシングおよび次経路の活性に変化が起こる前には（ＭＤＭ４／ｐ５３／ｐ２１）、ＰＲＭＴ５活性が実質的に阻害される必要がある（ウエスタンによりＳＤＭＡレベルは検出不能）ことが示唆される。
【０２１０】
これらのデータから、ＰＲＭＴ５の阻害はＭＤＭ４スプライシングの調節を介して野生型ｐ５３を活性化することが示唆される。このような機構は、血液悪性腫瘍および小児悪性腫瘍などの、ｐ５３が突然変異を受けている頻度の引く癌種において有用であり得る。リンパ腫モデルにおいて、ＰＲＭＴ５の阻害は、ｐ５３経路の有意（ＧＳＥＡ分析）かつ比較的急速な活性化をもたらし、これはおそらく、ＰＲＭＴ５阻害剤で処理した細胞株に見られた増殖／細胞死表現型に寄与する。ＰＲＭＴ５阻害剤により誘導された細胞応答におけるＭＤＭ４／ｐ５３経路の役割をさらに評価するために、ノックダウン／レスキュー試験が使用される。
【０２１１】
ＭＤＭ４アイソフォームの発現およびｐ５３の突然変異は、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５阻害に対する応答の潜在的な予測バイオマーカーである。ＭＣＬ細胞株パネルにおいて、２つの野生型ｐ５３株、Ｚ１３８およびＪＶＭ−２のみが、最も感受性の高い細胞株であった（最低のｇＩＣ５０値および６日増殖／細胞死アッセイで細胞傷害性を示すのは２つのＭＣＬ株のみ）。両細胞株とも、化合物Ｃ処理がＭＤＭ４アイソフォームスイッチおよびｐ５３経路の活性化をもたらした。ＭＣＬ細胞株の数が限定されていることおよび原発性ＭＣＬモデル確立の成功率が極めて低いことは、本発明者らがｐ５３予測バイオマーカー仮説をさらに評価することの妨げとなる。ＰＲＭＴ５阻害剤に対するｐ５３野生型細胞の応答の生物学にｐ５３経路は重要であり得るが、本発明者らのデータは、ＰＲＭＴ５の阻害は機能的ｐ５３の不在下で抗増殖効果もたらす（例えば、Ｍａｖｅｒ−１細胞株）ことから、同様に抗腫瘍有効性を駆動し得る他の経路の重要性を強く示す。
【０２１２】
マントル細胞リンパ腫：化合物Ｃおよびイブルチニブの比較および組合せ活性
ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤イブルチニブは、再発／難治性状況において７０パーセント近いという前例のない全奏効率を有する、ＭＣＬでの使用が最近承認されたものである(Wang ML, et al. N Engl J Med. 2013 Aug 8;369(6):507-16)。しかしながら、イブルチニブで処置された患者の大部分は完全寛解に至らず、無増悪生存期間中央値はおよそ１４か月である。イブルチニブ耐性ＭＣＬにおいて化合物Ｃが使用可能かどうかを理解するために、化合物Ｃおよびイブルチニブ感受性を６日増殖／細胞死アッセイで評価した（図４３、パネルＡ）。化合物Ｃ  ｇＩＣ５０値が低い細胞株（Ｚ−１３８、Ｍａｖｅｒ−１およびＪＶＭ−２）はイブルチニブ耐性であり、一方、イブルチニブ感受性株（Ｍｉｎｏ、Ｊｅｋｏ−１）は化合物Ｃに対して中等度の感受性があるにすぎなかった（図４３、パネルＡ）。このデータは、イブルチニブおよび化合物Ｃの活性プロフィールが重複しないこと、およびイブルチニブ耐性ＭＣＬモデルがＰＲＭＴ５阻害に感受性があることを示唆する。加えて、ＰＲＭＴ５阻害剤およびイブルチニブの組合せは、供試したＭＣＬ株の大部分で相乗的抗増殖活性を示したが（併用指数（ＣＩ）＜１）（図４３、パネルＢおよびＣ）、このことは、これらの２つの化合物の組合せが治療利益の増強を提供し得ることを示唆する。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害剤がイブルチニブ耐性ＭＣＬ患者集団に使用可能であること、およびＰＲＭＴ５阻害剤とイブルチニブの組合せはイブルチニブ不応性および感受性の両状況において探究可能であることを示す。
【０２１３】
マントル細胞リンパ腫モデルにおける有効性
リンパ腫細胞株モデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖／細胞死アッセイにおいて見られた有効性がｉｎ  ｖｉｖｏ状況でも認められるかどうかを試験するために、マントル細胞リンパ腫の異種移植モデル（感受性Ｚ１３８およびＭａｖｅｒ−１細胞株）で化合物Ｃ有効性試験を実施した。まず、Ｚ−１３８  ＭＣＬ異種移植モデルで、腫瘍増殖に対する化合物Ｃ処置の治療効果を２１日有効性試験で試験した。総ての化合物Ｃ用量群の腫瘍はビヒクルサンプルに比べ、最低用量群（２５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）での４０％ＴＧＩという最小値から最高１００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ用量群での＞９０％といった高い値までの範囲の体重および体積における有意な差を示した（示した総ての有効性試験において総ての群で体重減少は見られなかった、図４４、パネルＡ）。ＳＤＭＡウエスタンを用いた腫瘍のＰＤ分析は、総ての用量群で７０％より大きな減少、最高用量群では＞９８％といった高い範囲のメチルマークの減少を示した（図４４、パネルＢ）。
【０２１４】
次に、化合物Ｃの有効性をＭａｖｅｒ−１  ＭＣＬ異種移植モデルで評価した（図４５）。１８日目に測定した総ての化合物Ｃ用量群の腫瘍が、ビヒクルサンプルに比べて、最低用量群での５０％ＴＧＩという最小値から最高用量群での＞９０％といった高い値までの範囲の体積における有意な差を示した。ＳＤＭＡを用いた腫瘍のＰＤ分析は、総ての用量群でメチルマークが８０〜９５％減少したことを示した。
【０２１５】
これらのデータは、化合物Ｃ処置がマントル細胞リンパ腫の異種移植モデルにおい有意な腫瘍増殖阻害（１００％ＴＧＩに近い）をもたらしたことを示す。最大ＴＧＩ（＞９０％）にはＳＤＭＡシグナルのほぼ完全な阻害（＞９０％）が必要であると思われ、腫瘍において有意な有効性を得るためには、ＰＲＭＴ５活性が＞９０％阻害されることが必要であることが示唆される。
【０２１６】
リンパ腫の生物学の概要
・ＰＲＭＴ５と癌の間で現在記載されている最も強い作用機構的関連は、ＭＣＬにおけるものである。ＰＲＭＴ５は、ＭＣＬにおいて高頻度で過剰発現され、核コンパートメント発現が高く、そこでそれはヒストンのメチル化のレベルを高め、腫瘍抑制遺伝子のサブセットをサイレンシングする。重要なこととして、ＭＣＬ患者の大多数において転座している癌遺伝子であるサイクリンＤ１はＰＲＭＴ５に関連し、ｃｄｋ４依存的機構を介してＰＲＭＴ５の活性を増強する。ＰＲＭＴ５は、ＤＮＡ複製に負の調節を行ってサイクリンＤ１依存的新生物成長を可能とする重要な遺伝子の抑制を媒介する。ＰＲＭＴ５ノックダウンは、サイクリンＤ１依存的な細胞の悪性移行を阻害して腫瘍細胞の死滅を引き起こす。これらのデータは、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５の重要な役割を強調し、ＰＲＭＴ５阻害はＭＣＬにおける治療戦略として使用可能であることを示唆する。
【０２１７】
・化合物Ｃは、これまでに供試した最も感受性の高い細胞株に入るＭＣＬ細胞株で増殖を阻害し、細胞死を誘導する（６日増殖／細胞死アッセイ）。供試したＭＣＬ株のパネルでは、３つの細胞株がｇＩＣ５０＜１０ｎＭを有し、２つの細胞株がｇＩＣ５０≦１００ｎＭを示し、１つの細胞株がｇＩＣ５０＞１μＭを有した。ＰＲＭＴ５およびサイクリンＤ１の下流標的に及ぼす化合物Ｃの影響は、それが抗増殖およびアポトーシス誘導応答に寄与するかどうかを評価するために、現在、検討中である。
【０２１８】
・ＭＣＬ株においてＰＲＭＴ５基質を評価するためにＳＤＭＡ抗体メチルスキャン（商標）を使用した。ＳＤＭＡ含有タンパク質の大多数は、細胞スプライシングおよびＲＮＡプロセシング（ＳｍＢ、Ｌｓｍ４、ｈｎＲＮＰＨ１およびその他）、転写（ＦＵＢＰ１）ならびに翻訳に関与する因子であったが、このことは、細胞ＲＮＡのホメオスタシスの重要なレギュレーターとしてのＰＲＭＴ５の役割を強調する。感受性モデルと耐性モデルでＳＤＭＡ  ＩＣ５０値が同等であったＭＣＬ株のパネルにおいてＰＲＭＴ５阻害を評価するために、さらにＳＤＭＡ抗体を使用したところ、ＳＤＭＡが応答のマーカーではなく、ＰＲＭＴ５阻害のマーカーであることが示唆された。
【０２１９】
・化合物Ｃ処理は、ＲＮＡのサブセットにおいてスプライシング変化を誘導し、特に、ＭＣＬおよびＤＬＢＣＬ株ではＭＤＭ４アイソフォームスイッチが見られ、ＰＲＭＴ５阻害がＭＤＭ４のスプライシングの調節を介してｐ５３経路を活性化することが示唆された。ＰＲＭＴ５阻害剤により誘導される細胞応答におけるＭＤＭ４／ｐ５３経路の役割をさらに評価するために、ノックダウン／レスキュー試験が使用される。
【０２２０】
・ＭＤＭ４アイソフォームの発現およびｐ５３突然変異は、ＭＣＬにおけるＰＲＭＴ５阻害に対する応答の潜在的な予測バイオマーカーである。ＭＣＬ細胞株パネルにおいて、２つの野生型ｐ５３株、Ｚ１３８およびＪＶＭ−２は、最も感受性の高い細胞株であった（最低のｇＩＣ５０値および６日増殖／細胞死アッセイで細胞傷害性を示すのは２つのＭＣＬ株のみ）。
【０２２１】
・近年、イブルチニブの臨床探究は、ＭＣＬ処置に対するアプローチを劇的に変化させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、ＰＲＭＴ５阻害剤はイブルチニブ耐性ＭＣＬ患者集団において使用可能であること、およびＰＲＭＴ５阻害剤とイブルチニブの組合せはイブルチニブ不応性および感受性の両状況において探究可能であることを示す。
【０２２２】
・ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、マントル細胞リンパ腫の異種移植モデルにおいて化合物Ｃ処置が有意な腫瘍増殖阻害（１００％ＴＧＩに近い）をもたらすことを示す。腫瘍において最大有効性（ＴＧＩ＞９０％）を得るためには、ＰＲＭＴ５活性のほぼ完全な阻害（＞９０％）が必要とされると思われる。
【０２２３】
乳癌の生物学
細胞株スクリーニングデータは、乳癌細胞株がＰＲＭＴ５阻害に感受性があり、２Ｄ  ６日増殖／細胞死アッセイにおいてほぼ完全な増殖阻害（低Ｙｍｉｎ−Ｔ０、図３２〜３４）を示すことを実証する。加えて、患者由来（ＰＤＸ）腫瘍モデルのパネルにおけるコロニー形成アッセイからのデータは、乳房腫瘍がこのパネルにおいて最も感受性の高い腫瘍に入ることを示唆した（化合物Ｅ相対ＩＣ５０値に基づく、図３５）。よって、乳癌におけるＰＲＭＴ５阻害の役割および治療可能性を評価するために、乳癌細胞株をいくつかの増殖／細胞死および作用機構的試験で評価した。
【０２２４】
種々の乳房腫瘍サブタイプにわたるＰＲＭＴ５阻害剤の活性を理解するために、ＰＲＭＴ５ツール化合物を用いた７日増殖アッセイにおいて乳癌細胞株のパネルの特性評価を行った（図４６）。ＰＲＭＴ５の阻害は、供試した乳癌細胞株の種々のサブタイプにわたり、低いＩＣ５０値で細胞増殖を減弱する。ＩＣ５０中央値は、ＨＥＲ２またはホルモン受容体（ＨＲ）陽性株に比べ、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）細胞株では最低であった。
【０２２５】
６日増殖／細胞死アッセイにおいて、大多数の乳癌細胞株は細胞増殖抑制効果を示した。化合物Ｃに対する長期暴露が応答の細胞増殖抑制性と細胞傷害性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、長期増殖／細胞死アッセイでＰＲＭＴ５阻害剤を評価した（図４７）。ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７細胞では、化合物Ｃ（ならびにツール分子化合物Ｂ）による処理は、化合物への長期暴露（７〜１０日）時に細胞傷害性応答をもたらした。ＺＲ−７５−１細胞では、ＰＲＭＴ５阻害剤は総ての時点（３〜１２日）で細胞増殖抑制応答を誘導し、一方、Ｚ−１３８（ＭＣＬ、対照として含まれる）細胞はこのアッセイの総ての時点（３〜１０日）で顕著な正味の全細胞死を示した。これらのデータは、ＰＲＭＴ５の阻害が乳癌細胞株のサブセットにおいて、長期暴露時に（＞５日）、正味の細胞死（細胞傷害性応答）をもたらすことを示唆する。
【０２２６】
細胞増殖に及ぼす化合物Ｃの影響が細胞周期分布の変化と関連していたかどうかを調べるため、細胞周期に及ぼす化合物Ｃの効果を、ヨウ化プロピジウムＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析を用いて評価した（図４８）。全体的に見れば、ＦＡＣＳ結果は長期増殖データと一致し、４つのうち３つの乳癌株で、長期化合物Ｃ処理が７〜１０日の処理の後に細胞死の誘導をもたらした（＜２Ｎの増加）ことを示す。ＭＣＦ−７細胞（ｐ５３野生型）では、化合物Ｃによる処理は、２日目にＧ１期（２Ｎ）の細胞の集積および細胞周期のＳ期（＞２Ｎおよび＜４Ｎ）の細胞の減少をもたらし、１０日目にｓｕｂ−Ｇ１期（＜２Ｎ）の細胞の集積を証拠とするように実質的な細胞死を示した。ＺＲ−７５−１細胞（ｐ５３野生型）では、化合物Ｃは細胞周期分布にあまり効果は無く、７日目および１０日目にＧ１（２Ｎ）の減少および＞４Ｎ細胞画分の増加が見られた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫＢＲ−３細胞株は、Ｇ１（２Ｎ）期の減少（７日目または１０日目）、Ｇ２／Ｍ（４Ｎ）および＞４Ｎ  ＤＮＡ含量の増加をもって化合物Ｃによる処理に同等の応答を示し、これは細胞死の指標となるｓｕｂＧ１（＜２Ｎ）の細胞の集積と一致した。これらのデータは、ＰＲＭＴ５の阻害が細胞周期における細胞分布に影響を及ぼすこと、およびその表現型の転帰は細胞の状況によって決まることを示唆する。
【０２２７】
ＰＲＭＴ５の活性が感受性および耐性乳癌株において同等の阻害を受けたかどうかを評価するために、ＰＲＭＴ５阻害剤処理の後に細胞においてＳＤＭＡのレベルを測定した（図４９）。全体的に見れば、ＳＤＭＡ低下の時機は、供試した総ての細胞株（感受性および耐性）で同等であった。ＳＤＭＡの最大阻害は３日目に見られた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のＳＤＭＡ  ＩＣ５０は５．４ｎＭであり、Ｚ１３８細胞のＳＤＭＡ  ＩＣ５０と同等であった。これらのデータは、ＳＤＭＡがＰＲＭＴ５触媒活性のマーカーであって、ＰＲＭＴ５阻害に対する抗増殖性応答を予測するものではないことを示す。乳癌株のパネルでＳＤＭＡ  ＩＣ５０値をさらに評価する。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ乳癌モデルにおける有効性
次に、ＰＲＭＴ５阻害の有効性を、乳癌のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで評価した。まず、トリプルネガティブ乳癌異種移植モデルであるＭＤＡ−ＭＢ−４６８を１００ｍｇ／ｋｇ（ＱＤおよびＢＩＤ）および２００ｍｇ／ｋｇ（ＱＤ）の化合物Ｃで処置した（図５０）。最大腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ＝８３％）は１００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ処置群で見られ、ＳＤＭＡ阻害は９０％を超え、一方、１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ処置動物では、化合物Ｃによる処置は効力がなく、ＳＤＭＡ阻害は８０％未満であった。このデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ乳癌異種移植モデルにおいて有意なＴＧＩを得るためには、ＳＤＭＡレベルはほぼ完全に阻害される（＞９０％）必要があることを示唆する。
【０２２９】
乳癌の概要
・乳癌では、高いＰＲＭＴ５発現および高いＰＤＣＤ４（プログラム細胞死４）レベルが全生存率の低さを予測する。
・乳癌細胞株および乳癌患者由来モデルは、２Ｄ成長／細胞死およびコロニー形成アッセイで供試した最も感受性の高いモデルに入った。
・化合物Ｃによる処理は６日増殖／細胞死アッセイで完全な成長阻害をもたらし、ＰＲＭＴ５阻害剤に対する長期暴露は供試した４つのうち３つの細胞株で細胞死を誘導した。
・７日増殖アッセイで、Ｈｅｒおよびホルモン受容体陽性株に比べ、ＴＮＢＣ細胞株はＰＲＭＴ５阻害に対して感受性がより高かった。
・ＳＤＭＡレベルは、ＰＲＭＴ５阻害剤で処理された感受性および耐性乳癌株において低下しており、ＳＤＭＡは応答のマーカーではなく、ＰＲＭＴ５活性のマーカーであることを示唆する。
・ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植モデルにおいて、化合物Ｃによる処置は、１００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ処置群で腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ＝８３％）をもたらし、ＳＤＭＡ阻害は９０％を超え、一方、１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ処置動物では、化合物Ｃによる処置は効力がなく、ＳＤＭＡ阻害は８０％未満であった。このデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏ乳癌異種移植モデルにおいて有意なＴＧＩを得るためには、ＳＤＭＡレベルはほぼ完全に阻害される（＞９０％）必要があることを示唆する。
・全体的に見れば、これらのデータは、乳癌、特に、ＴＮＢＣサブタイプにおける潜在的治療戦略としてのＰＲＭＴ５阻害を示唆する。
【０２３０】
膠芽腫（ＧＢＭ）の生物学
ＰＲＭＴ５タンパク質は、膠芽腫において高頻度で過剰発現され、高いＰＲＭＴ５レベルはＧＢＭ患者の悪性度（グレードＩＶ）および低い生存率の両方と強い相関がある(Yan F, et al. Cancer Res. 2014 Mar 15;74(6):1752-65)。ＰＲＭＴ５のノックダウンはＧＢＭ細胞株の増殖および生存を減弱し、同所性Ｇｌｉ３６異種移植モデルにおいて生存率を有意に改善する(Yan F, et al. Cancer Res. 2014 Mar 15;74(6):1752-65)。ＰＲＭＴ５はまた、神経系前駆細胞の増殖および分化の調節を介して正常なマウスの脳発達に重要な役割を果たす(Bezzi M, et al. Genes Dev. 2013 Sep 1;27(17):1903-16)。
【０２３１】
膠芽腫細胞株モデルは、軟寒天コロニー形成アッセイにおいて最も感受性の高い腫瘍種に入った（図３５）。２Ｄ、６日増殖／細胞死ＣＴＧアッセイでは、ＧＢＭ細胞株は、４０〜２２０００ｎＭの範囲のｇＩＣ５０値を有し、ＳＦ５３９細胞株を除いてその応答は主として細胞増殖抑制であった（図３２および３３）。ＰＲＭＴ５阻害剤に対する長期暴露時の細胞増殖および生存に及ぼすＰＲＭＴ５の阻害の影響を理解するために、２Ｄ、１４日増殖／細胞死ＣＴＧアッセイで化合物Ｃの活性を試験した（図５１）。全体的に見れば、細胞増殖抑制／細胞傷害性応答の性質は化合物に対する長期暴露時も変化せず、ＰＲＭＴ５阻害に応答してアポトーシスを受けた唯一の細胞株がＳＦ５３９であった。
【０２３２】
次に、細胞のメチル化およびｐ５３経路に及ぼす影響を、ＰＲＭＴ５阻害剤で処理したＧＢＭ細胞において、ＳＤＭＡ、ｐ５３およびｐ２１タンパク質レベルならびにＭＤＭ４スプライシングを測定することによって評価した（図５２）。ＰＲＭＴ５の阻害は、供試した総ての細胞株で、それらのＰＲＭＴ５阻害に対する感受性とは無関係に、ＳＤＭＡシグナルの低下をもたらした（図５２、パネルＢ）。ｐ５３突然変異体であって長いＭＤＭ４アイソフォームの低い基底発現を示すＳＦ５３９以外の総ての細胞株に選択的ＭＤＭ４スプライシングが検出された（図５２、パネルＡ）。ｐ５３レベルは総ての細胞株で上昇し、一方、野生型ｐ５３（Ｚ１３８（ＭＣＬ）、Ｕ８７−ＭＧおよびＡ１７２（ＧＢＭ））を有する細胞株にのみｐ２１タンパク質の誘導が見られた。これらのデータは、ＰＲＭＴ５阻害剤はＧＢＭモデルにおいて、リンパ腫モデルで見られる効果と同様に、おそらくはＭＤＭ４活性の不活性化を介してｐ５３経路を活性化し得ることを示唆する。重要なこととしては、ＧＢＭ細胞株の感受性はｐ５３突然変異の状態とは相関せず、このことは、その他の機構がＰＲＭＴ５の阻害によって誘導された増殖阻害表現型に寄与することを示唆する。興味深いことに、ＰＲＭＴ５の阻害は、野生型ｐ５３  ＧＢＭ細胞株において細胞増殖抑制性応答をもたらした。ＰＲＭＴ５阻害に対するＧＢＭ細胞株の応答におけるｐ５３の役割は今後の研究でさらに調べる。加えて、ＧＢＭモデルにおける細胞周期および神経系分化に及ぼすＰＲＭＴ５阻害の影響も探究する。
【０２３３】
膠芽腫の概要
・ＰＲＭＴ５タンパク質は、膠芽腫において高頻度で過剰発現され、高いＰＲＭＴ５レベルは、ＧＢＭ患者における高悪性度（グレードＩＶ）および低い生存率と強い相関がある。
・膠芽腫細胞株モデルは、軟寒天コロニー形成アッセイにおいて最も感受性の高い腫瘍種に入った。
・２Ｄ、６日および１４日増殖／細胞死ＣＴＧアッセイで、ＰＲＭＴ５阻害に対するＧＢＭ応答は主として細胞増殖抑制性であった（４つのうち３つの細胞株、１つの細胞株は細胞傷害性応答であった）。
・ＰＲＭＴ５の阻害は、供試した総ての細胞株で、それらのＰＲＭＴ５阻害に対する感受性とは無関係に、ＳＤＭＡシグナルの低下をもたらした。
【０２３４】
さらなる感受性腫瘍種
細胞株および患者由来モデルスクリーニングデータは、ＰＲＭＴ５阻害剤が広範な腫瘍種において細胞増殖および生存を減弱することを示唆する（図３２〜３５）。
【０２３５】
全体的な生物学の要約
・化合物Ｃは、スプライセオソーム成分、ヒストン、転写因子、およびキナーゼを含む多様な細胞タンパク質で対称性アルギニンジメチル化を阻害する。よって、ＰＲＭＴ５阻害剤は、転写、スプライシング、およびｍＲＮＡ翻訳の変化を含む、複数の機構を介してＲＮＡのホメオスタシスに影響を及ぼす。
・ＰＲＭＴ５の阻害は遺伝子発現およびスプライシングの変化をもたらし、最終的にｐ５３の誘導をもたらす。化合物Ｃはｐ５３ユビキチンリガーゼＭＤＭ４においてアイソフォームスイッチを誘導し、ｐ５３タンパク質を安定化させ、マントル細胞およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫ならびに乳癌および神経膠腫細胞株（これまでに供試した腫瘍種ではこれだけ）において、ｐ５３標的遺伝子発現シグナル伝達を誘導する。
・化合物Ｃは、広範な固形腫瘍細胞株および血液腫瘍細胞株において増殖を阻害し、マントル細胞およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、乳癌、膀胱癌、および神経膠腫細胞株のサブセットで細胞死を誘導する。最も強力な増殖阻害はマントル細胞およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株で見られた。化合物Ｃの有効性を、マントル細胞リンパ腫および乳癌の異種移植モデルで調べたところ、化合物Ｃは腫瘍増殖を有意に阻害した。これらのデータは、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、乳癌および脳癌における治療戦略としての化合物Ｃの使用に強い根拠を提供する。
【０２３６】
実施例３
組合せ
化合物Ａとの組合せの可能性を検討するために、２つの合理的アプローチを実施した。まず、２つの異なるクラスのアルギニンメチルトランスフェラーゼを阻害する組合せ効果を、化合物Ａと、主要なＩＩ型ＰＲＭＴ阻害剤であるＰＲＭＴ５阻害剤（化合物Ｂ）の組合せを用いて検討した。これらの試験では、黒色腫、乳癌、およびリンパ腫細胞株を、化合物Ａおよび化合物Ｂを単剤で、または２０点用量漸増にわたる固定１：１比の各化合物を用いた組合せで処理した。従前に記載されるように、増殖阻害の測定にはＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを使用した。この組合せは、１５／２２の細胞株でいずれの単剤よりも≧５倍効力のあるｇＩＣ５０が得られ、６つの細胞株では≧１０倍の増強が見られた。両方の単剤に細胞増殖抑制応答を示す１５の細胞株において、７株がこの組合せを用いた場合に負のＹｍｉｎ−Ｔ０を持っていたが、このことは細胞傷害性への移行を示す（図５３、表８）。供試した６つのリンパ腫細胞株のうち、５株がいずれかまたは両方の薬剤に対して細胞傷害性を受け、併用処理は３株でｇＩＣ１００に≧５倍の変化をもたらした。これらのデータは、増殖阻害に対する顕著な組合せ効果がＩ型と主要なＩＩ型ＰＲＭＴの同時阻害を介して達成され得ることを示す。
【０２３７】
化合物Ｃ（ＰＲＭＴ５臨床候補）は、現在、第１相臨床医開発下にあり、従って、この組合せの評価は、保証があれば可能と考えられる。この組合せの追加の前臨床試験は、マウス異種移植モデルを用いて行われる予定である。最後に、この組合せ活性は特定の腫瘍種に限定されるとは思われず、これは化合物Ｃまたは化合物Ａのいずれが強力な単剤有効性を有するかということを超えた適応に拡大する機会を与え得ることが示唆される。この仮説を検討するための研究が進行中である。
【０２３８】
【表８】
2019535800.tif 000037
【０２３９】
実施例４
組合せ
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株および膀胱癌細胞株における化合物Ｂと標準化学療法薬の組合せおよび化合物Ｂと化合物Ｄの組合せの活性を測定した。
【０２４０】
図５４は、化合物Ｂとシスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ＢＥＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、および化合物Ｄの固定比組合せで処理した種々のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株における単剤（化合物Ｂ）処理に比べたｇＩＣ５０およびｇＩＣ１００の変化倍率を示す。標準化学療法薬では相乗作用は見られなかった。化合物Ｂと化合物Ｄの組合せにおいて、７株のうち６株のＴＮＢＣ細胞株は＞３倍のｇＩＣ５０変化を示し６株のうち４株はｇＩＣ５０に＞５倍の変化を示した。
【０２４１】
図５５は、化合物Ｂとシスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ＢＥＴ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、および化合物Ｄの固定比組合せで処理した種々の膀胱癌細胞株における単剤（化合物Ｂ）処理に比べたｇＩＣ５０およびｇＩＣ１００の変化倍率を示す。化合物Ｂと化合物Ｄの組合せでは、１０株のうち８株の膀胱癌細胞株が＞３倍のｇＩＣ５０変化を示し、８株にうち３株がｇＩＣ５０に＞５倍の変化を示した。
【０２４２】
図５６は、種々の濃度の化合物Ｂ、化合物Ｄ、および化合物Ｂと化合物Ｄの組合せで処理した膀胱癌細胞株（Ｔ２４）の増殖アッセイの結果を示す。
【０２４３】
図５７は、化合物Ｂおよび化合物Ｄで個々に、また、組み合わせて処理した膀胱癌細胞株ＳＷ−７８０およびＴ２４の増殖アッセイ（Ｙｍｉｎ−Ｔ０％変化）の結果を示す。
【０２４４】
図５８は、化合物Ｂと化合物Ｄの組合せで処理した１０の膀胱癌株および７つのＴＮＢＣ細胞株の増殖アッセイの結果を示す。細胞傷害性応答（負のＹｍｉｎ−Ｔ０％）および細胞増殖抑制応答を受けた膀胱癌およびＴＮＢＣ細胞株のパーセンテージを示す。
【０２４５】
実施例４に記載される結果は、以下の材料および方法を用いて得られたものである。
【０２４６】
材料および方法
細胞株
細胞株はＧＳＫ  ＢｉｏＣａｔ、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、またはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｄａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｂｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）から入手した。総ての細胞株を３７℃、５％ＣＯ２中、推奨される細胞培養培地で維持した。ほとんどの場合、これは１０％ウシ胎仔牛血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地であった。
【０２４７】
標準６日増殖−細胞死アッセイ
細胞増殖アッセイは、細胞株パネルに対して、ＡＰ１２６２８ｖ２（３８４ウェル）に参照されるプロトコールに従って行った。最適な細胞播種は、総ての細胞株について、３８４ウェル形式で一定の播種密度にわたって増殖を監視し、細胞が６日間対数増殖した播種密度を特定することによって決定した。５０ｕＬの細胞を培養培地中、最適な播種密度で３８４ウェルプレートに手で播種した。
【０２４８】
細胞を、２０点２倍希釈系の化合物Ｄおよび化合物Ｂ（≦最高用量１５μＭ）および≦０．１５％ＤＭＳＯで２反復にて手で処理した。プレートを上記の条件で６日間インキュベートした。細胞増殖は、同容量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および発光シグナルを用いて測定した。開始細胞数を表すＴ＝０値を決定するために、化合物添加時に非処理細胞のプレートを読み取った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【国際調査報告】
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