(57)【要約】  本発明は、試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定する方法であって、特に、前記試料中の、塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、ハプトグロビン（ＨＰ）、免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）及びガレクチン１０（ＣＬＣ）から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む方法に関する。本発明のバイオマーカーの使用及び本発明の方法を実施するためのキットもまた記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための方法であって、
前記試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
試料中の１又は２以上のバイオマーカーのレベルを参照値と比較するステップであって、前記参照値と比較した、前記試料中の前記１又は２以上のバイオマーカーの前記レベルが、活動性結核の存在又は非存在を指し示す、ステップと、試料中の結核菌の存在又は非存在を、微生物学的技法を使用して決定する任意のステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのバイオマーカーとしての
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
のうちの１又は２以上の使用。
【請求項４】
結核が、肺結核又は肺外結核である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５】
ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣからなるバイオマーカーの群のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項６】
ＢＡＴＦ２及びＣＤ１７７からなるバイオマーカーの群のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項７】
ＢＡＴＦ２のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項８】
ＢＡＴＦ２のレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を示唆する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項９】
ＢＡＴＦ２のレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を意味する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１０】
ＢＡＴＦ２のレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＢＡＴＦ２のレベルの無変化が、活動性結核の非存在を指し示す、請求項１〜９のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１１】
対象が活動性結核又は非結核性の感染性疾患に罹患しているかどうかを決定するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１２】
非結核性の感染性疾患が、非結核性の肺炎又は非結核性の熱性疾患である、請求項１１に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７からなる群のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜５、１１及び１２のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１４】
ＩＧＪのレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＩＧＪのレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す、請求項１〜５及び１１〜１３のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１５】
ＣＬＣのレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＣＬＣのレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す、請求項１〜５及び１１〜１４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１６】
ＨＰのレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＨＰのレベルの減少が、活動性結核の存在を指し示す、請求項１〜５及び１１〜１５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１７】
ＨＰのレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＨＰのレベルの増加が、非結核性の疾患の存在を指し示す、請求項１〜５及び１１〜１６のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１８】
ＣＤ１７７のレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＣＤ１７７のレベルの減少が、活動性結核の存在を指し示す、請求項１〜６及び１１〜１７のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項１９】
ＣＤ１７７のレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＣＤ１７７のレベルの増加が、非結核性の疾患の存在を指し示す、請求項１〜６及び１１〜１８のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２０】
試料中のバイオマーカーのレベルの変化が、活動性結核の発症を予測する、請求項８、９、１４、１５、１６及び１８のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２１】
ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣのうちの１又は２以上のレベルが決定され、参照値と比較した、試料中のＢＡＴＦ２及び／若しくはＩＧＪ及び／若しくはＣＬＣのレベルの減少、並びに／又はＨＰ及び／若しくはＣＤ１７７のレベルの増加が、活動性結核の非存在並びに／又は抗結核剤を用いる療法の成功を指し示す、請求項２〜７のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２２】
試料及び参照値が、同じ対象に由来する、請求項２１に記載の方法又は使用。
【請求項２３】
ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣのうちの１又は２以上のｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを決定するステップを含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２４】
ｍＲＮＡのレベルが、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ又はＲＮＡ配列決定により決定される、請求項２３に記載の方法又は使用。
【請求項２５】
試料が血液試料である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２６】
参照値が、
（ａ）結核への曝露がこれまでにない対象、
（ｂ）潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する対象、
（ｃ）結核から回復した対象、
（ｄ）非結核性の感染性疾患に罹患している対象、
（ｅ）非結核性の肺炎又は非結核性の熱性疾患に罹患している対象、
（ｆ）活動性結核に罹患している対象
のうちの１又は２以上に由来する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２７】
対象が、ヒト、例えば、ヒト成人又はヒト小児である、請求項１１〜２６のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項２８】
対象がＨＩＶ陰性である、及び／又は参照値がＨＩＶ陰性の対象に由来する、請求項２７に記載の方法又は使用。
【請求項２９】
バイオマーカーのうちの１又は２以上のレベルを決定するステップが、
（ａ）対象における活動性結核の発症の前に、並びに／又は
（ｂ）対象が活動性結核の症状を示している間に、並びに／又は
（ｃ）活動性結核を治療するための、抗結核剤の使用の間及び／若しくは後に
実施される、請求項１１〜２８のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項３０】
活動性結核の治療が必要であることが請求項１〜２９のいずれかに記載の方法により同定された対象における活動性結核を治療する方法であって、治療有効量の抗結核剤を対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３１】
活動性結核の治療が必要であることが請求項１〜３０のいずれかに記載の方法により同定された対象における活動性結核の治療における使用のための、治療有効量の抗結核剤を含む組成物。
【請求項３２】
抗結核剤が、抗生物質、副腎皮質ステロイド、化学療法剤及びＴＮＦ阻害剤からなる群から選択される１又は２以上の抗結核剤である、請求項３０に記載の方法又は請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
抗生物質が、イソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド及びエタンブトールからなる群から選択される１又は２以上である、請求項３２に記載の方法又は組成物。
【請求項３４】
対象が抗結核剤を用いる治療に対して感受性となるかどうかを決定する方法であって、
前記対象から得られた試料中の以下のバイオマーカー：
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
のうちの１又は２以上のレベルを決定するステップを含み、
参照値と比較した、前記試料中の前記１又は２以上のバイオマーカーの前記レベルが、抗結核剤を用いる治療に対する前記対象の感受性を指し示す、前記方法。
【請求項３５】
試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのキットであって、
前記試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
からなる群から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定することが可能な１又は２以上のプライマーの対又はプローブを含み、
使用説明書のセットを含んでいてもよい、前記キット。
【請求項３６】
１又は２以上のプライマーの対又はプローブが、固体支持体上に固定化されている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
試料中の１又は２以上のバイオマーカーのレベルを、プライマーの対又はプローブを使用して決定するための分析デバイスをさらに含む、請求項３５又は３６に記載のキット。
【請求項３８】
プライマーの対又はプローブを使用して試料中で決定された１又は２以上のバイオマーカーのレベルに基づいて対象を分類するためのデータ処理装置を制御するためのプログラムを格納する記憶媒体をさらに含む、請求項３５〜３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
プログラムが、データ処理装置を制御して、試料を得る対象についてのリスク指標を示すための命令を含む、請求項３５〜３８のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
固体支持体上に、請求項３５に記載の１又は２以上のプライマーの対又はプローブを固定化するステップを含む、請求項３６に記載のキットを調製する方法。
【請求項４１】
対象又は前記対象から得られた試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための、請求項３５〜３９のいずれかに記載のキットの使用。
【請求項４２】
試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための方法であって、
（ｉ）前記試料中の以下のバイオマーカー：
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
のうちの１又は２以上のレベルを決定するステップと、
（ii）前記試料中の前記１又は２以上のバイオマーカーの前記レベルを参照値と比較する任意のステップであって、前記参照値と比較した、前記試料中の前記１又は２以上のバイオマーカーの前記レベルが、活動性結核の存在又は非存在を指し示す、任意のステップと
を含む、前記方法。
【請求項４３】
対象が活動性結核又は非結核性の感染性疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法であって、
（ｉ）前記対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定するステップと、
（ii）前記試料中のＢＡＴＦ２のレベルを参照値と比較するステップであって、
前記参照値と比較した、前記対象から得られた前記試料中のＢＡＴＦ２のレベルの減少若しくは無変化が、活動性結核の非存在を指し示すか、又は
前記参照値と比較した、前記対象から得られた前記試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、以下の追加の方法のステップの実行を必要とする、ステップと、
（iii）ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７からなるバイオマーカーの群のレベルを決定するステップと、
（iv）前記試料中のＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７のレベルを参照値と比較するステップであって、
前記参照値と比較した、前記試料中のＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７のレベルが、
（ａ）前記対象における活動性結核の存在及び非結核性の感染性疾患の非存在、又は
（ｂ）前記対象における非結核性の感染性疾患の存在及び活動性結核の非存在
のいずれかを指し示す、ステップと
を含む、前記方法。
【請求項４４】
実質的に本明細書の記載に記載され、付随する実施例を参照する、方法、使用、使用のための組成物、又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核の診断に関する。特に、本発明は、対象における活動性結核の存在又は非存在を、対象から得られた試料中の１又は２以上のバイオマーカーを分析することによって決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、１０，５００，０００人が活動性の結核（ＴＢ、tuberculosis）を発症し、活動性ＴＢにより１，５００，０００人超が死亡している。活動性結核が検査により診断されているのは、およそ６０％の患者においてに過ぎない。このことは、結核菌（Mycobacterium tuberculosis、Ｍｔｂ）の微生物学的同定に依存し、肺外ＴＢの場合、疾患部位から、アクセスするのが難しい試料を得る必要があり、それらの試料は十分な感度を示さないことにより、結核菌の微生物学的同定は一般に十分に機能していない（Boehme CC, Saacks S, O'Brien RJ. The changing landscape of diagnostic services for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med 2013;34:17-31、Norbis L, Alagna R, Tortoli E, Codecasa LR, Migliori GB, Cirillo DM. Challenges and perspectives in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Expert Rev Anti Infect Ther 2014;12:633-647、Denkinger CM, Schumacher SG, Boehme CC, Dendukuri N, Pai M, Steingart KR. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J 2014;44:435-446、WHO | Global tuberculosis report 2015）。最も速い液体培養系は、１０〜１９日後に細菌を検出することができ、最終的に陰性の結果を得るのには６週間が必要であり、それにより、臨床決定が遅れる（Dinnes J, Deeks J, Kunst H, Gibson A, Cummins E, Waugh N, Drobniewski F, Lalvani A. A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection. Health Technol Assess Winch Engl 2007;11:1-196）。
【０００３】
新規のＴＢ診断法の開発は、容易に得られる臨床試料に対する迅速検査に焦点を当てている。これらの診断法は、現在の検査よりも良好な陰性予測値を、特に、疾患部位の臨床での試料採取が困難である場合及び伝染性が高い場合にもたらすことを目指している。それらはまた、多種多様な感染性疾患のリスクを有する、免疫が低下した患者において、及びＴＢの発生率が低く、別の感染症である可能性がより高い地域で、高い陽性予測値をもたらすことも狙っている。
【０００４】
試料を処理する経路が十分に確立された結果として、ＴＢにおける診断用バイオマーカーの発見のために、全血トランスクリプトミクスが、プロテオミクス及びメタボロミクスに先立って出現するに至った（Maertzdorf J, Weiner J, Kaufmann SHE. Enabling biomarkers for tuberculosis control. Int J Tuberc Lung Dis Off J Int Union Tuberc Lung Dis 2012a;16:1140-1148）。このことから、迅速な「試料を投入すれば答えが出る（sample-in, answer-out）」マルチプレックスＰＣＲプラットフォームが開発されるに至った（McHugh L, Seldon TA, Brandon RA, Kirk JT, Rapisarda A, Sutherland AJ, Presneill JJ, Venter DJ, Lipman J, Thomas MR, Klein Klouwenberg PMC, van Vught L, Scicluna B, Bonten M, Cremer OL, Schultz MJ, van der Poll T, Yager TD, Brandon RB. A Molecular Host Response Assay to Discriminate Between Sepsis and Infection-Negative Systemic Inflammation in Critically Ill Patients: Discovery and Validation in Independent Cohorts. PLoS Med 2015;12:e1001916）。いくつかのグループが、健常な未感染者及び潜伏ＴＢ感染（ＬＴＢＩ、latent TB infection）を有する者と比較した、活動性肺ＴＢを有する患者における異なる遺伝子発現シグネチャーを報告した（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977、Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Wilkinson KA, Oni T, Rozakeas F, Xu Z, Rossello-Urgell J, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Lipman M, Wilkinson RJ, O'Garra A. Detectable changes in the blood transcriptome are present after two weeks of antituberculosis therapy. PloS One 2012;7、Cliff JM, Lee J-S, Constantinou N, Cho J-E, Clark TG, Ronacher K, King EC, Lukey PT, Duncan K, Van Helden PD, Walzl G, Dockrell HM. Distinct phases of blood gene expression pattern through tuberculosis treatment reflect modulation of the humoral immune response. J Infect Dis 2013;207:18-29、Maertzdorf J, Weiner J, Mollenkopf H-J, TBornotTB Network, Bauer T, Prasse A, Muller-Quernheim J, Kaufmann SHE. Common patterns and disease-related signatures in tuberculosis and sarcoidosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2012b;109:7853-7858、Boehme CC, Saacks S, O'Brien RJ. The changing landscape of diagnostic services for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med 2013;34:17-31、Kaforou M, Wright VJ, Oni T, French N, Anderson ST, Bangani N, Banwell CM, Brent AJ, Crampin AC, Dockrell HM, Eley B, Heyderman RS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mendelson M, Ottenhoff TH, Zgambo F, Wilkinson RJ, Coin LJ, Levin M. Detection of tuberculosis in HIV-infected and -uninfected African adults using whole blood RNA expression signatures: a case-control study. PLoS Med 2013;10:e1001538、Walter ND, Miller MA, Vasquez J, Weiner M, Chapman A, Engle M, Higgins M, Quinones AM, Roselli V, Canono E, Yoon C, Cattamanchi A, Davis JL, Phang T, Stearman RS, Datta G, Garcia BJ, Daley CL, Strong M, Kechris K, Fingerlin TE, Reves R, Geraci MW. Blood transcriptional biomarkers for active TB among US patients: A case-control study with systematic cross-classifier evaluation. J Clin Microbiol 2015;doi:10.1128/JCM.01990-15、Maertzdorf J, McEwen G, Weiner J, Tian S, Lader E, Schriek U, Mayanja-Kizza H, Ota M, Kenneth J, Kaufmann SH. Concise gene signature for point-of-care classification of tuberculosis. EMBO Mol Med 2015;doi:10.15252/emmm.201505790）。
【０００５】
しかし、種々の研究における、活動性ＴＢと関連がある転写シグネチャーは、わずかなオーバーラップしか示さず、このことは、異なる研究に使用された技術的方法及び分析方法の違い、又はそれぞれの研究における患者コホートの差に起因する可能性が高い。肺外ＴＢにおける血中トランスクリプトームの評価が行われることは比較的少なく、その他の感染性疾患又は炎症性疾患と比較した、ＴＢと関連がある血中の転写シグネチャーの特異性の評価は限られたものしか行われていない。
【０００６】
疾患部位の試料採取に決定的に依存する現在の微生物学的検査の時間的な遅れ及び不十分な感度を克服するために、活動性結核（ＴＢ）のための新規の迅速診断法が必要である。ＴＢと関連がある、マルチパラメトリックな血中トランスクリプトームのシグネチャーについての記載があるが、それらを診断用ツールとして開発するには、依然として、含まれる遺伝子の数が障壁となっている。
【０００７】
直近の研究は、診断用シグネチャーにおける遺伝子の数を低下させることを狙って、成人において、活動性ＴＢとＬＴＢＩを有する若しくは有しない健常者とを識別するためのわずか４〜５１個の遺伝子、又は活動性ＴＢとその他の疾患とを識別するための４４〜１１９個の遺伝子を得るに至った（Kaforou M, Wright VJ, Oni T, French N, Anderson ST, Bangani N, Banwell CM, Brent AJ, Crampin AC, Dockrell HM, Eley B, Heyderman RS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mendelson M, Ottenhoff TH, Zgambo F, Wilkinson RJ, Coin LJ, Levin M. Detection of tuberculosis in HIV-infected and -uninfected African adults using whole blood RNA expression signatures: a case-control study. PLoS Med 2013;10:e1001538、Walter ND, Miller MA, Vasquez J, Weiner M, Chapman A, Engle M, Higgins M, Quinones AM, Roselli V, Canono E, Yoon C, Cattamanchi A, Davis JL, Phang T, Stearman RS, Datta G, Garcia BJ, Daley CL, Strong M, Kechris K, Fingerlin TE, Reves R, Geraci MW. Blood transcriptional biomarkers for active TB among US patients: A case-control study with systematic cross-classifier evaluation. J Clin Microbiol 2015;doi:10.1128/JCM.01990-15、Maertzdorf J, McEwen G, Weiner J, Tian S, Lader E, Schriek U, Mayanja-Kizza H, Ota M, Kenneth J, Kaufmann SH. Concise gene signature for point-of-care classification of tuberculosis. EMBO Mol Med 2015;doi:10.15252/emmm.201505790）。しかし、実用化には、これらの数が、依然として主要な障壁である。
【０００８】
最近の研究により、活動性ＴＢと関連がある、４つの遺伝子の血中の転写シグネチャー（ＧＢＰ１、ＩＤ３、Ｐ２ＲＹ１４及びＩＦＩＴＭ３）が同定された（Maertzdorf J, McEwen G, Weiner J, Tian S, Lader E, Schriek U, Mayanja-Kizza H, Ota M, Kenneth J, Kaufmann SH. Concise gene signature for point-of-care classification of tuberculosis. EMBO Mol Med 2015;doi:10.15252/emmm.201505790）。ＧＢＰ１及びＰ２ＲＹ１４のみが、ＡｄｊｕＶＩＴ研究コホートにおいて、活動性ＴＢ症例と回復後症例との間で、統計学的に有意な、かつ２倍超の差を示す遺伝子のうちに含まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Boehme CC, Saacks S, O'Brien RJ. The changing landscape of diagnostic services for tuberculosis. Semin Respir Crit Care Med 2013;34:17-31
【非特許文献２】Norbis L, Alagna R, Tortoli E, Codecasa LR, Migliori GB, Cirillo DM. Challenges and perspectives in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Expert Rev Anti Infect Ther 2014;12:633-647
【非特許文献３】Denkinger CM, Schumacher SG, Boehme CC, Dendukuri N, Pai M, Steingart KR. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis. Eur Respir J 2014;44:435-446
【非特許文献４】WHO | Global tuberculosis report 2015
【非特許文献５】Dinnes J, Deeks J, Kunst H, Gibson A, Cummins E, Waugh N, Drobniewski F, Lalvani A. A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection. Health Technol Assess Winch Engl 2007;11:1-196
【非特許文献６】Maertzdorf J, Weiner J, Kaufmann SHE. Enabling biomarkers for tuberculosis control. Int J Tuberc Lung Dis Off J Int Union Tuberc Lung Dis 2012a;16:1140-1148
【非特許文献７】McHugh L, Seldon TA, Brandon RA, Kirk JT, Rapisarda A, Sutherland AJ, Presneill JJ, Venter DJ, Lipman J, Thomas MR, Klein Klouwenberg PMC, van Vught L, Scicluna B, Bonten M, Cremer OL, Schultz MJ, van der Poll T, Yager TD, Brandon RB. A Molecular Host Response Assay to Discriminate Between Sepsis and Infection-Negative Systemic Inflammation in Critically Ill Patients: Discovery and Validation in Independent Cohorts. PLoS Med 2015;12:e1001916
【非特許文献８】Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977
【非特許文献９】Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Wilkinson KA, Oni T, Rozakeas F, Xu Z, Rossello-Urgell J, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Lipman M, Wilkinson RJ, O'Garra A. Detectable changes in the blood transcriptome are present after two weeks of antituberculosis therapy. PloS One 2012;7
【非特許文献１０】Cliff JM, Lee J-S, Constantinou N, Cho J-E, Clark TG, Ronacher K, King EC, Lukey PT, Duncan K, Van Helden PD, Walzl G, Dockrell HM. Distinct phases of blood gene expression pattern through tuberculosis treatment reflect modulation of the humoral immune response. J Infect Dis 2013;207:18-29
【非特許文献１１】Maertzdorf J, Weiner J, Mollenkopf H-J, TBornotTB Network, Bauer T, Prasse A, Muller-Quernheim J, Kaufmann SHE. Common patterns and disease-related signatures in tuberculosis and sarcoidosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2012b;109:7853-7858
【非特許文献１２】Kaforou M, Wright VJ, Oni T, French N, Anderson ST, Bangani N, Banwell CM, Brent AJ, Crampin AC, Dockrell HM, Eley B, Heyderman RS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mendelson M, Ottenhoff TH, Zgambo F, Wilkinson RJ, Coin LJ, Levin M. Detection of tuberculosis in HIV-infected and -uninfected African adults using whole blood RNA expression signatures: a case-control study. PLoS Med 2013;10:e1001538
【非特許文献１３】Walter ND, Miller MA, Vasquez J, Weiner M, Chapman A, Engle M, Higgins M, Quinones AM, Roselli V, Canono E, Yoon C, Cattamanchi A, Davis JL, Phang T, Stearman RS, Datta G, Garcia BJ, Daley CL, Strong M, Kechris K, Fingerlin TE, Reves R, Geraci MW. Blood transcriptional biomarkers for active TB among US patients: A case-control study with systematic cross-classifier evaluation. J Clin Microbiol 2015;doi:10.1128/JCM.01990-15
【非特許文献１４】Maertzdorf J, McEwen G, Weiner J, Tian S, Lader E, Schriek U, Mayanja-Kizza H, Ota M, Kenneth J, Kaufmann SH. Concise gene signature for point-of-care classification of tuberculosis. EMBO Mol Med 2015;doi:10.15252/emmm.201505790
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、活動性結核を、可能な限り最小の数のバイオマーカーを使用して（いくつか態様では、単一の遺伝子のみを使用して）診断するために、代替の血中の転写シグネチャーを提供することを目指すものであり、好ましくは、本発明の転写シグネチャーは、活動性結核を、先行技術の血中の転写シグネチャーよりも高い程度の信頼性で診断することが可能である。本発明はさらに、当技術分野で公知の転写シグネチャーに比して、例えば、活動性結核とその他の熱性疾患とを見分ける能力の観点から、特異性が改善されている血中の転写シグネチャーを提供することも目指す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＴＢへの曝露がこれまでにない無症状の者、潜伏ＴＢ感染（ＬＴＢＩ）を有する者、及びＴＢから回復した者を含む多種多様な研究コホートにおいて、活動性結核（ＴＢ）を有する患者と全ての健常者とを識別する、個々の又は組み合わせの遺伝子を解明することを試みた。次いで本発明者らは、ＴＢと関連がある、抹消血中の遺伝子発現シグネチャーの特異性を、病院を受診した他の感染性疾患患者の多種多様なレパートリー（repertoire）と比較することによってテストし、これらの診断用の転写バイオマーカーに関する評価を、ＨＩＶ感染患者及び肺外ＴＢを有する者まで拡大させた。
【００１２】
したがって、本発明は、活動性結核の存在又は非存在を決定するための、新規かつ厳格な、５つの遺伝子のバイオマーカーシグネチャーを同定している。
【００１３】
したがって、一態様では、本発明は、試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための方法であって、
前記試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２、basic leucine zipper transcription factor ATF-like 2）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７、cluster of differentiation 177）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ、haptoglobin）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ、immunoglobulin J chain）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのバイオマーカーとしての
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
のうちの１又は２以上の使用を提供する。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法及び使用は、バイオマーカーとして、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及び／又はＣＬＣのみの分析を必要とする（すなわち、好ましくは、本発明の方法及び使用は、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及び／又はＣＬＣ以外のタンパク質及びポリヌクレオチドのいかなるバイオマーカーのレベルを決定するステップも含まない）。しかし、誤解を避けるために、本明細書に記載するように、バイオマーカーのレベルを、１又は２以上のハウスキーピング遺伝子、ハウスキーピングタンパク質又はハウスキーピングマーカーと比較することによって標準化することができる。
【００１６】
特に、本発明者らは、多種多様な民族性及びＨＩＶ感染患者を含む複数の研究コホートにわたり、宿主の血中の単一の転写物、すなわち、ＢＡＴＦ２が、活動性の肺ＴＢ及び肺外ＴＢについての高感度のバイオマーカーとして十分であることを示すに至った。
【００１７】
特に、本発明者らは、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの上昇を、単一の高感度のバイオマーカーとして同定し、その妥当性を確認するに至り、このバイオマーカーは、活動性ＴＢと健常者とを識別し、受信者動作特性（ＲＯＣ、receiver operating characteristic）曲線下面積（ＡＵＣ、area under the curve）スコアは、複数のコホートにおいて、ＨＩＶ−１陰性者については、０．９３〜０．９９であり、ＨＩＶ−１感染者については、０．８５である。
【００１８】
さらに、本発明者らは、新規の、４つの遺伝子の血中の転写シグネチャー（これは、上記で言及した５つの遺伝子のシグネチャーのサブセットである）も同定するに至り、このシグネチャーは、活動性ＴＢと、発熱を呈する病院受診者の、多種多様なスペクトルのその他の感染性疾患とを識別するための特異性を提供する。新規の、４つの遺伝子の血中のシグネチャーは、ＣＤ１７７、ハプトグロビン（ＨＰ）、免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）及びガレクチン１０（ＣＬＣ）を含み、０．９４〜１のＲＯＣ  ＡＵＣをもたらす。
【００１９】
したがって、上記の、５つの遺伝子のシグネチャーが、活動性結核についての抹消血中の診断用バイオマーカーを開発するための最良の候補として提案される。血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの上昇は、活動性ＴＢと健常者とを識別する高感度のバイオマーカーを提供し、新規の、４つの遺伝子の転写シグネチャーは、発熱を呈する者において、活動性ＴＢとその他の感染性疾患とを区別する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのキットであって、
前記試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
からなる群から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定することが可能な１又は２以上のプライマーの対又はプローブを含み、
使用説明書のセットを含んでいてもよい、キットを提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、活動性結核の治療が必要であることが本発明の方法により同定された対象における活動性結核の治療における使用のための、治療有効量の抗結核剤を含む組成物を提供する。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、活動性結核の治療が必要であることが本明細書の記載に従って活動性結核の存在又は非存在を決定する方法により同定された対象における活動性結核を治療する方法であって、治療有効量の抗結核剤を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
結核（Ｔｂ、tuberculosis）
結核（ＴＢ）は、細菌である結核菌（Ｍｔｂ）が引き起こす感染症であり、この細菌は、感染している対象の咳又はくしゃみから微小な小滴を吸入することを通して伝播する。
【００２４】
ＴＢは、主として肺を冒す。しかし、ＴＢは、腺、骨及び神経系を含む、身体のいかなる部分も冒し得る。
【００２５】
ＴＢの典型的な症状には、典型的には３週間超続き、血液を伴う場合がある痰を通常もたらす持続性の咳、体重減少、寝汗、高体温（発熱）、疲労及び倦怠、食欲の喪失、腫脹が含まれる。
【００２６】
「活動性結核」は、Ｍｔｂに感染している対象が、疾患の徴候又は症状を示すことを意味する。
【００２７】
Ｍｔｂに曝露した対象が、必ずしも疾患を発症し得るとは限らない。ほとんどの対象が、対象の免疫系の多様な構成要素を使用して、感染と戦うことが可能である。実際に、ＴＢのみに感染している健常対象において、疾患が活動性に移行する機会は、対象の生涯にわたり１０％である。一部には、感染を制御することは可能であるが、体内から感染を完全に除去することが可能でない対象もいる。これらの場合には、感染は維持されて、不活性な状態又は「潜伏」状態で存在する。
【００２８】
したがって、「潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）」とは、Ｍｔｂに感染している対象が、疾患のいかなる徴候及び症状も示さないことを意味する。
【００２９】
何らかの時点で、しばしば対象の免疫系が弱まった場合に、ＬＴＢＩから、活動性の疾患を発症する場合がある。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、結核は、肺結核又は肺外結核である。
【００３１】
「肺結核」は、肺を冒す結核である。例えば、肺結核は、肺において、徴候又は症状を引き起こすことができる。
【００３２】
「肺外結核」は、肺ではない解剖学的部位で発症する結核である。例えば、肺外結核に罹患している対象は、脳又は心膜において、徴候又は症状を示す場合がある。
【００３３】
「活動性結核の存在又は非存在を決定する」とは、対象若しくは対象から得られた試料において活動性結核であると診断する行為（すなわち、陽性の予測）、又は対象若しくは対象から得られた試料において活動性結核ではないと診断する行為（すなわち、陰性の予測）を意味する。
【００３４】
本発明の１又は２以上のバイオマーカーのレベルが、活動性結核の存在又は非存在を指し示す場合がある。例えば、レベルが、対象における活動性結核を単に示唆する場合、又は対象における活動性結核の存在若しくは非存在を決定的に意味する場合がある。
【００３５】
したがって、一実施形態では、本発明の１又は２以上のバイオマーカーのレベルは、活動性結核の存在又は非存在を示唆することができる。別の実施形態では、本発明の１又は２以上のバイオマーカーのレベルは、活動性結核の存在又は非存在を意味することができる。
【００３６】
「熱性疾患」は、発熱又は高い体温を特徴とする疾患である。「感染性疾患」は、感染、例えば、微生物感染を特徴とする疾患である。
【００３７】
「非結核性の熱性疾患」又は「非結核性の感染性疾患」は、結核以外の熱性疾患又は感染性疾患を意味する。
【００３８】
一実施形態では、非結核性の熱性疾患又は感染性疾患に罹患している対象が、病院受診者である。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の方法又は使用は、対象が活動性結核又は非結核性の感染性疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法又は使用である。特に、非結核性の感染性疾患は、非結核性の肺炎又は非結核性の熱性疾患であり得る。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「微生物学的技法」は、試料中の微生物の存在若しくは非存在を検出するため、及び／又は試料中の微生物のレベルを測定するための技法を指す。微生物には、細菌、原生動物、ウイルス、真菌及び藻類が含まれる。
【００４１】
バイオマーカー
本発明における方法及び使用は、１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む。
【００４２】
一実施形態では、本発明の方法又は使用は、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣからなる群から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の方法又は使用は、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣからなるバイオマーカーの群のレベルを決定するステップを含む。
【００４４】
塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）は、活性化因子タンパク質（ＡＰ、activator protein）１転写因子ファミリーに属し、単核球系貪食細胞中でＩＦＮ誘導性に発現し、また、リポ多糖又はＭｔｂによる自然免疫の刺激によって上方制御される。ＢＡＴＦ２は、ＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ、IFN regulatory factor）１と相互作用して、下流の炎症促進性の応答を媒介し、これらのうちのいくつかは、Ｍｔｂに対する宿主応答の構成要素としても認識されている（Murphy TL, Tussiwand R, Murphy KM. Specificity through cooperation: BATF-IRF interactions control immune-regulatory networks. Nat Rev Immunol 2013;13:499-509、Roy S, Guler R, Parihar SP, Schmeier S, Kaczkowski B, Nishimura H, Shin JW, Negishi Y, Ozturk M, Hurdayal R, Kubosaki A, Kimura Y, de Hoon MJL, Hayashizaki Y, Brombacher F, Suzuki H. Batf2/Irf1 induces inflammatory responses in classically activated macrophages, lipopolysaccharides, and mycobacterial infection. J Immunol Baltim Md 1950 2015;194:6035-6044）。全身性のＩＦＮ活性が、活動性ＴＢにおいて広く認識されていることを考慮すると（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977）、ＢＡＴＦ２発現の増加は、Ｍｔｂによる循環血液細胞の直接的な刺激ではなく、ＩＦＮ応答に起因する可能性が最も高い。
【００４５】
免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）は、多量体性のＩｇＡ及びＩｇＭの連結鎖（Ｊ−鎖）としても公知であり、粘膜及び腺の形質細胞が発現する小型のポリペプチドであり、ＩｇＡ及びＩｇＭの高分子の形成を調節する。ＩＧＪが組み込まれて、高分子性のＩｇＡ（ｐＩｇＡ、polymeric IgA）（主として、二量体）及び五量体性のＩｇＭが生じると、これらの抗体は、高い結合価の抗原結合部位を有するようになり（細菌及びウイルスを凝集させるのに適するようになる）、補体活性化の可能性をほとんど又は全く失い（このことにより、非炎症性の様式で作動することが可能になる）。ＩＧＪを含有する高分子のみが、膜貫通型の分泌成分（ＳＣ、secretory component）としても公知の高分子性のＩｇ受容体（ｐＩｇＲ、polymeric Ig receptor）に対して高い親和性を示す。
【００４６】
ハプトグロビン（ＨＰ）は、急性期ヘモグロビン捕捉血漿タンパク質である。ハプトグロビン遺伝子は、プレプロタンパク質をコードし、このプロプレタンパク質はプロセシングされて、アルファ鎖及びベータ鎖の両方をもたらし、続いて、これらの鎖が四量体として組み合わさると、ハプトグロビンが産生される。ハプトグロビンの機能は、遊離の血漿ヘモグロビンに結合することであり、このことにより、分解性の酵素がヘモグロビンにアクセスし、かつ同時に、腎臓からの鉄の喪失を阻止し、腎臓をヘモグロビンによる傷害から保護することも可能になる。この遺伝子は、糖尿病性腎障害、１型糖尿病における冠状動脈疾患の発症、クローン病、炎症性疾患の挙動、原発性硬化性胆管炎、特発性パーキンソン病に対する易罹患性、及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアの発症の低下に関連している。コードされるタンパク質は、細菌に対する抗菌活性も示す。
【００４７】
ガレクチン１０又はシャルコー−ライデン結晶ガレクチン（ＣＬＣ、Charcot-Leyden crystal galectin）は、グリカン結合性タンパク質である。ＣＬＣ遺伝子がコードするタンパク質は、好酸球及び好塩基球中で発現するリゾホスホリパーゼである。これは、リゾホスファチジルコリンを、グリセロホスホコリン及び遊離脂肪酸に加水分解する。このタンパク質は、炭水化物又はＩｇＥに対する結合活性を有し得る。これは、ガレクチンファミリーのベータ−ガラクトシド結合性タンパク質に構造及び機能の両方の点で関連する。これは、炎症及び一部の骨髄性白血病と関連がある場合がある。ＣＬＣは、好酸球性の肺の炎症についてのバイオマーカーとして以前に評価されたことがある（Chua JC, Douglass JA, Gillman A, O'Hehir RE, Meeusen EN. Galectin-10, a potential biomarker of eosinophilic airway inflammation. PloS One 2012;7:e42549）。
【００４８】
分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ、glycosyl-phosphatidylinositol）連結型細胞表面糖タンパク質であり、好中球の活性化において役割を果たし、好中球の亜集団に発現する（Gohring K, Wolff J, Doppl W, Schmidt KL, Fenchel K, Pralle H, Sibelius U, Bux J. Neutrophil CD177 (NB1 gp, HNA-2a) expression is increased in severe bacterial infections and polycythaemia vera. Br J Haematol 2004;126:252-254、Stroncek DF, Shankar RA, Noren PA, Herr GP, Clement LT. Analysis of the expression of NB1 antigen using two monoclonal antibodies. Transfusion (Paris) 1996;36:168-174、Matsuo K, Lin A, Procter JL, Clement L, Stroncek D. Variations in the expression of granulocyte antigen NB1. Transfusion (Paris) 2000;40:654-662）。ＣＤ１７７は、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１、platelet endothelial cell adhesion molecule-1）に結合し、好中球の遊出において機能することができる。ＣＤ１７７遺伝子中の変異は、骨髄増殖性疾患と関連がある。ＣＤ１７７の過剰発現が、真性一次性赤血球増加症を有する患者において見出されている。このタンパク質に対する自己抗体により、肺における輸血反応が生じる場合があり、このタンパク質は、ウェジナー肉芽腫症に関与する恐れがある。
【００４９】
ヒトのＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、公的にアクセス可能なデータベースから、例えば、下記の表に示すような受託番号の下で入手可能である。
【００５０】
【表１】
2019512212.tif 000002
【００５１】
上記遺伝子のさらなるバリアント及びホモログ並びにその他の種中に見出される遺伝子に対応するアミノ酸配列並びにヌクレオチド配列は、類似の公的にアクセス可能なデータベースにおいて、又は上記ヒト配列に対して相同性を示す配列を同定することによって見出すことができる。
【００５２】
本発明のバイオマーカーのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ、messenger RNA）配列を、本明細書では配列番号１〜９として示す。配列番号１は、ヒトＩＧＪのｍＲＮＡ配列であり、配列番号２〜４は、ヒトＨＰのｍＲＮＡ配列の３つの転写物バリアントであり、配列番号５は、ヒトＣＬＣのｍＲＮＡ配列であり、配列番号６は、ヒトＣＬＣのｍＲＮＡ配列であり、配列番号７〜９は、ヒトＢＡＴＦ２のｍＲＮＡ配列の３つの転写物バリアントである。
【００５３】
本発明のバイオマーカーは、配列番号１〜９、又はそれらの誘導体、断片若しくはバリアント、又はそれらに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の同一性を示す配列のうち１若しくは２以上を含むか、又は１若しくは２以上からなることができる。
【００５４】
本発明のプライマー又はプローブは、配列番号１〜９、それらの誘導体、断片若しくはバリアント、それらに対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９９％の同一性を示す配列；又は配列番号１〜９の逆相補体、それらの誘導体、断片若しくはバリアント、若しくはそれらに対して同一性を示す配列のうち１若しくは２以上を含むか、又は１若しくは２以上からなることができる。
【００５５】
特定の実施形態では、配列番号１〜９のいずれにおいても、チミジン（Ｔ、thymidine）塩基を、ウラシル（Ｕ、uracil）塩基で交換することができる。
【００５６】
本発明のバイオマーカーのそれぞれについてのプライマー配列又はプローブ配列の例として、
ＢＡＴＦ２：
TGGAAGTTCAGTTTTGGTGTCTGCTTCAAGAGGGGGTTTTACACTCTGATTCCAGGACAA（配列番号１０）
ＣＤ１７７：
CTTGGACACCAGATTCTTTCCCATTCTGTCCATGAATCATCTTCCCCACACACAATCATT（配列番号１１）
HP:
GATAAGATGTGGTTTGAAGCTGATGGGTGCCAGCCCTGCATTGCTGAGTCAATCAATAAA（配列番号１２）
IGJ:
TTGGGTGATGTAAAACCAACTCCCTGCCACCAAAATAATTAAAATAGTCACATTGTTATC（配列番号１３）
CLC:
TCTCCCTGACCAAATTTAATGTCAGCTATTTAAAGAGATAACCAGACTTCATGTTGCCAA（配列番号１４）
が挙げられる
【００５７】
したがって、本発明は、
対象又は前記対象から得られる試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのバイオマーカーとしての
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
のうちの１又は２以上の使用を提供する。
【００５８】
本発明はまた、
対象又は前記対象から得られる試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのバイオマーカーとしての
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
の使用も提供する。
【００５９】
本発明はまた、
対象又は前記対象から得られる試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのバイオマーカーとしての
（ａ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｂ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｃ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｄ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
の使用も提供する。
【００６０】
好ましくは、試料は、対象から得られる。
【００６１】
本発明はまた、対象又は前記対象から得られる試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのバイオマーカーとしての塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）の使用も提供する。
【００６２】
したがって、本発明の方法又は使用は、ＢＡＴＦ２のレベルを決定するステップを含むことができる。
【００６３】
特定の実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルを決定し、ＩＧＪ、ＣＬＣ、ＨＰ及びＣＤ１７７のレベルはいずれも決定しない。
【００６４】
特定の実施形態では、全てのその他のバイオマーカーを排除して、ＢＡＴＦ２のレベルを決定する。換言すると、本発明の方法又は使用は、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定するステップからなる、又はそうするステップから本質的になる。
【００６５】
別の特定の実施形態では、ＩＧＪ、ＣＬＣ、ＨＰ及びＣＤ１７７の全てのレベルを決定するが、ＢＡＴＦ２のレベルは決定しない。
【００６６】
別の特定の実施形態では、全てのその他のバイオマーカーを排除して、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣの全てのレベルを決定する。
【００６７】
上記によれば、特に好ましい、本発明のバイオマーカーの組合せは、ＢＡＴＦ２と、ＩＧＪ、ＣＬＣ、ＨＰ及びＣＤ１７７のうちの１つとである。
【００６８】
上記によれば、特に好ましい、本発明のバイオマーカーの組合せは、ＢＡＴＦ２とＣＤ１７７とである。
【００６９】
上記によれば、特に好ましい、本発明のバイオマーカーの組合せは、ＢＡＴＦ２と、ＩＧＪ、ＣＬＣ、ＨＰ及びＣＤ１７７のうちの任意の２つとである。
【００７０】
上記によれば、特に好ましい、本発明のバイオマーカーの組合せは、ＢＡＴＦ２と、ＩＧＪ、ＣＬＣ、ＨＰ及びＣＤ１７７のうちの任意の３つとである。
【００７１】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００７２】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を示唆する。
【００７３】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を意味する。
【００７４】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの無変化が、活動性結核の非存在を指し示す。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７からなる群のレベルを決定することを含む。
【００７６】
一実施形態では、ＩＧＪのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＩＧＪのレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００７７】
一実施形態では、ＣＬＣのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＣＬＣのレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００７８】
一実施形態では、ＨＰのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＨＰのレベルの減少が、活動性結核の存在を指し示す。
【００７９】
一実施形態では、ＨＰのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＨＰのレベルの増加が、非結核性の疾患の存在を指し示す。
【００８０】
一実施形態では、ＣＤ１７７のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のレベルの減少が、活動性結核の存在を指し示す。
【００８１】
一実施形態では、ＣＤ１７７のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のレベルの増加が、非結核性の疾患の存在を指し示す。
【００８２】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２及びＣＤ１７７のレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のレベルの減少と連動させた、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００８３】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２及びＨＰのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＨＰのレベルの減少と連動させた、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００８４】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２及びＩＧＪのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＩＧＪのレベルの増加と連動させた、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００８５】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２及びＣＬＣのレベルを決定し、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＣＬＣのレベルの増加と連動させた、参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示す。
【００８６】
したがって、本発明の方法又は使用は、バイオマーカーの以下の組合せ：
ＩＧＪ及びＨＰ、
ＩＧＪ及びＣＬＣ、
ＩＧＪ及びＣＤ１７７、
ＨＰ及びＣＬＣ、
ＨＰ及びＣＤ１７７、
ＣＬＣ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ及びＨＰ、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ及びＣＬＣ、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＨＰ及びＣＬＣ、
ＢＡＴＦ２、ＨＰ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＣＬＣ及びＣＤ１７７、
ＩＧＪ、ＨＰ及びＣＬＣ、
ＩＧＪ、ＨＰ及びＣＤ１７７、
ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ、ＨＰ及びＣＬＣ、
ＢＡＴＦ２、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ、ＨＰ及びＣＤ１７７、
ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７、
ＢＡＴＦ２、ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７
のうちのいずれか１つのレベルを決定するステップを包含し、
好ましくは、ＩＧＪ及び／又はＣＬＣのレベルを決定する場合には、参照値と比較した、ＩＧＪ及び／又はＣＬＣのレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示し；好ましくは、ＨＰ及び／又はＣＤ１７７のレベルを決定する場合には、参照値と比較した、ＨＰ及び／又はＣＤ１７７のレベルの減少が、活動性結核の存在を指し示し；好ましくは、ＢＡＴＦ２のレベルを決定する場合には、参照値と比較した、ＢＡＴＦ２のレベルの増加が、活動性結核の存在を指し示すか、又は参照値と比較した、ＢＡＴＦ２のレベルの無変化若しくは減少が、活動性結核の非存在を指し示す。バイオマーカーの上記セットのそれぞれのレベルを決定することにより、全てのその他のバイオマーカーを排除することができる。
【００８７】
本発明のバイオマーカーは、タンパク質又は核酸であり得る。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ、ribonucleic acid）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ、deoxyribonucleic acid）であり得る。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体又はｍＲＮＡであり得る。
【００８８】
好ましい実施形態では、バイオマーカーは、成熟ｍＲＮＡである。
【００８９】
したがって、一実施形態では、本発明の方法又は使用は、ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ、ＣＤ１７７及びＢＡＴＦ２のうちの１又は２以上のｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを決定するステップを含む。
【００９０】
結核の診断は従来から、対象中の結核菌の存在又は非存在を決定することによって実施されている。したがって、本発明の方法又は使用は、対象中の結核菌の存在又は非存在を、従来の微生物学的技法を使用して確認するステップを任意選択で含んでいてもよい。結核菌の存在又は非存在を決定するための従来の微生物学的技法は、当業者にとって馴染みがある技法であろう。
【００９１】
好都合なことに、本願でクレームされたバイオマーカーの使用により、活動性結核の迅速かつ容易な予備診断が可能になり、続いて、これを、結核菌を検出するための従来の微生物学的技法により確認することができる。本願でクレームされたバイオマーカーを使用する活動性結核の陽性の予備診断により、患者の治療を遅滞なく即時に始めることが可能になり、それにより、予後が改善され、かつ同時に、疾患の伝播の可能性も低下する。他方で、本願でクレームされたバイオマーカーを使用する陰性の予備診断により、活動性結核を有しない患者は不必要な治療を回避し、それにより、起こり得る有害作用、例として、薬物からの毒性及び／又は薬物に対する抵抗性、並びに治療した場合に必然的に生じる、貴重な資源の浪費が回避される。
【００９２】
バイオマーカーのレベル
本発明の方法は、
試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む。好ましくは、試料は、対象から得られる。
【００９３】
本発明における方法は、試料中の前記１又は２以上のバイオマーカーのレベルを参照値と比較するステップであって、参照値と比較した、試料中の１又は２以上のバイオマーカーのレベルが、対象における活動性結核の存在又は非存在を指し示す、ステップをさらに含むことができる。
【００９４】
「レベルを決定する」は、特定の物質の量を、定量的に又は半定量的に、測定することを意味する。典型的には、決定により、対象から得られた試料中の物質の絶対レベル、又は参照試料若しくは参照値のレベルと比べた物質のレベルが明らかになる。
【００９５】
物質のレベルは、例えば、統計学的計算のために、所与の試料中で２回以上決定することができる。代わって又は加えて、レベルを、対象から得られた２つ以上の試料中で１又は２回以上決定することもできる。
【００９６】
好ましい実施形態では、本発明のバイオマーカーのレベルは、ｍＲＮＡ転写物の形態で決定される。
【００９７】
一実施形態では、本発明のｍＲＮＡ転写物バイオマーカーのレベルは、参照ｍＲＮＡ転写物バイオマーカーの値のレベルと比べて測定又は決定される。
【００９８】
本発明におけるバイオマーカーのレベルを決定するのに適用可能な技法が、当業者に公知である。
【００９９】
そのような技法として、これらに限定されないが、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ、nuclease protection assay）、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＴ、reverse transcriptase-PCR）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ、quantitative PCR）、アレイ、マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロチップ、ミニ−シーケンシング（mini-sequencing）を含む、ＤＮＡ配列決定、プライマー伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、allele-specific oligonucleotide）を用いるハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ、oligonucleotide ligation assay）、対立遺伝子特異的プライマー（ＡＲＭＳ、allele-specific primer）を使用するＰＣＲ、ドットブロット分析、フラッププローブ切断のアプローチ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ、restriction fragment length polymorphism）、速度論的ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ、インサイツハイブリダイゼーション、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、fluorescent in situ hybridisation）、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ、pulsed field gel electrophoresis）分析、サザンブロット分析、一本鎖高次構造分析（ＳＳＣＡ、single stranded conformation analysis）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ、denaturing gradient gel electrophoresis）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ、temperature gradient gel electrophoresis）、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ、denaturing HPLC）、並びに上記の組合せが挙げられ、これらは全て、当業者に公知である。
【０１００】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡのレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ又はＲＮＡ配列決定のうちの１又は２以上により決定される。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「アレイ」は、特定の化学物質の部分（複数可）（例えば、生体高分子、例として、ポリヌクレオチド配列又はオリゴヌクレオチド配列（核酸）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水化物、脂質等）を担持するアドレス可能な領域の、任意の二次元又は実質的に二次元（及び三次元）の配置を含む。アレイは、高分子性の結合性の物質、例として、ポリペプチド、タンパク質、核酸、多糖、又は合成の模倣物質のアレイであり得る。典型的には、アレイは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、それらの合成の模倣物質等を含む、核酸のアレイである。アレイが核酸のアレイである場合には、核酸は、アレイに、核酸の鎖に沿って任意の点で共有結合性に結合することができるが、一般に、それらの末端のうちの１つ（例えば、３’末端又は５’末端）で結合する。時には、アレイは、ポリペプチド、例えば、タンパク質又はそれらの断片のアレイである。
【０１０２】
本発明と共に使用するためのアレイ又はマイクロチップは典型的には、シリコンチップ上にアレイとして築き上げられている数千個の明確に異なるヌクレオチドプローブからなる。分析しようとする核酸を、蛍光により標識し、チップ上のプローブにハイブリダイズさせる。この方法は、数千個のプローブを一気に並列処理する方法のうちの１つであり、分析を大幅に加速させることができる。いくつかの刊行物に、この方法の使用について記載されている（Nature Genetics, 1996; 14: 441；Nature Genetics, 1996; 14: 450；Science, 1996; 274: 610；Nature Genetics, 1996; 14: 457；Genome Res, 2000;10: 853）。
【０１０３】
ｍＲＮＡバイオマーカーの決定は、逆転写、結果として得られたｃＤＮＡからの、例えば、ＰＣＲによる増幅、並びにゲル電気泳動及び／又は当技術分野で周知の技法を使用する、増幅された核酸の任意選択の配列決定により行うことができる。
【０１０４】
したがって、本発明においてはｍＲＮＡバイオマーカーを、１又は２以上のプライマーの対又はプローブを使用して分析することができる。特に好ましい一実施形態では、プローブは、本明細書に記載する配列番号１０〜１４から選択される。
【０１０５】
好ましい実施形態では、本発明のバイオマーカーのレベルは、タンパク質（ポリペプチド）のレベルを検出することによって決定される。
【０１０６】
本発明のバイオマーカーのレベルを決定するステップには、例えば、フローサイトメトリー、抗体に基づくアレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ、enzyme linked immunosorbent assay）、抗体以外のタンパク質スキャホールド（例えば、フィブロネクチンスキャホールド）、放射免疫アッセイ（RIA、radioimmuno-assay）、ウエスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析等の技法を使用する、ポリペプチドの検出が関与し得る。
【０１０７】
ＥＬＩＳＡを、当技術分野で公知である一般的な方法に従って実施することができる。例えば、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡ又は競合ＥＬＩＳＡであり得る。
【０１０８】
例えば、米国特許第４，２７５，１４９号明細書に開示されているような、そのようなＥＬＩＳＡと共に使用するための、多様な酵素−基質標識が利用可能である。こうした酵素は一般に、発色基質の化学的な変化を触媒し、この変化を検出することができる。例えば、酵素は、基質における色の変化を触媒する場合、又は基質の蛍光若しくは化学発光を変化させる場合がある。酵素標識の例として、ペルオキシダーゼ、例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ、horseradish peroxidase）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類のオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環のオキシダーゼ（例として、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートするための技法が周知である。
【０１０９】
アプタマーを使用する決定もまた、当技術分野で公知である。アプタマーは、ステム、ループ、四重鎖、シュードノット、隆起又はヘアピンの組合せを有するユニークな３Ｄ構造に折り畳まれる、一本鎖のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であり得る。アプタマーの分子認識は、標的化合物との分子間相互作用、例として、芳香環の積重ね、静電的な相互作用及びファンデルワールス相互作用、又は水素結合から生じる。さらに、アプタマーとその標的との間の特異的な相互作用は、アプタマーに、その標的に対するユニークな折畳み構造をとることを命じる適合機構の誘発を通して補完される。アプタマーは、標識分子、例として、染料と連結するように改変して、又はビーズ若しくは基材の表面上に固定化して、種々の形で適用することができる。
【０１１０】
アプタマーは、ナノテクノロジー、マイクロアレイ、マイクロ流体技術、質量分析及びその他の技術とペアで使用して、所与の試料における定量化を行うことができる。
【０１１１】
バイオマーカーのレベルを決定するタイミングは、特に制限されない。典型的には、活動性結核の徴候又は症状を示している対象から得られた試料中で、レベルを決定する。好都合な実施形態では、バイオマーカーのレベルにより、疾患の徴候又は症状をまだ示していない対象から得られた試料中で活動性結核の発症を予測することが可能になる。別の好都合な実施形態では、バイオマーカーのレベルは、抗結核治療又は抗結核療法に対する応答のサロゲートエンドポイントとして用いることが可能である。
【０１１２】
したがって、本発明はまた、疾患の徴候又は症状をまだ示していない対象から得られた試料中で活動性結核の発症を予測するための方法であって、本発明の１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップを含む方法も提供する。本発明のこの態様では、ＢＡＴＦ２は、特に有用なバイオマーカーである。
【０１１３】
したがって、本発明の一実施形態では、本発明のバイオマーカーのうちの１又は２以上のレベルを決定するステップは、
（ａ）対象における活動性結核の発症の前に、並びに／又は
（ｂ）対象が活動性結核の症状を示している間に、並びに／又は
（ｃ）活動性結核を治療するための、抗結核剤の使用の間及び／若しくは後に
実施される。
【０１１４】
例えば、疾患の発症、例えば、活動性結核の徴候又は症状の出現の最長約１２カ月、好ましくは、約３カ月前に、レベルを決定することができる。また、対象の抗結核剤を用いる治療開始からおよそ８週間以上が経過してから、レベルを決定することもできる。
【０１１５】
「バイオマーカーのレベルの増加」又は「増加したバイオマーカーのレベル」は、バイオマーカーの相対レベル又は絶対レベルが、参照（又はベースラインの）値と比較して実質的により高い値を示すことを意味する。
【０１１６】
「バイオマーカーのレベルの減少」又は「減少したバイオマーカーのレベル」は、バイオマーカーの相対レベル又は絶対レベルが、参照（又はベースラインの）値と比較して実質的により低い値を示すことを意味する。
【０１１７】
本発明の実施形態では、参照値と比較した、被検試料中のバイオマーカーのレベルの増加が、対象中の活動性結核の存在を指し示す。本発明の実施形態では、参照値と比較した、被検試料中のバイオマーカーのレベルの減少が、対象中の活動性結核の存在を指し示す。そのような実施形態では、好ましくは、被検試料中のバイオマーカーのレベルは、参照値又は参照値範囲又は参照値範囲の平均と比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも１００％だけ異なる。
【０１１８】
より好ましくは、被検試料中のバイオマーカーのレベルは、参照値又は参照値範囲又は参照値範囲の平均と比較して、少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、８倍又は１０倍だけ異なる。
【０１１９】
最も好ましくは、被検試料中のバイオマーカーのレベルは、参照値範囲の平均と比較して、少なくとも２倍だけ異なる。
【０１２０】
「バイオマーカーのレベルの無変化」は、バイオマーカーの相対レベル又は絶対レベルが、参照値と比較して実質的に同じ値を示すこと、又は参照値範囲内に存在することを意味する。
【０１２１】
一実施形態では、レベルの無変化は、参照値、参照値範囲又は参照値範囲の平均と比較して、２倍以上、例として、１．５倍以上は異ならないレベルを意味する。
【０１２２】
当業者には明らかであろうが、レベルが、参照（又はベースラインの）値と比較して、実質的に増加した、減少した又は変化しないかどうかの実際の決定は、１又は２以上の統計学的分析のアウトカムに依存し得、統計学的分析は全て、当業者に公知であり、当業者にとっては日常的なものである。
【０１２３】
参照値
本発明の特定の実施形態では、バイオマーカーのレベルは、参照値と比較される。
【０１２４】
「参照値」は、これらに限定されないが、参照対象（及び前記対象から得られた試料）から得られる値、又は所定の絶対値を含む。
【０１２５】
典型的には、参照値は、健常対象、特定の状態若しくは疾患に罹患していることが分かっている対象、又は特定の状態若しくは疾患から回復した対象に由来する。
【０１２６】
本発明の文脈では、参照値は、
（ａ）結核への曝露がこれまでにない対象、
（ｂ）潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する対象、
（ｃ）結核から回復した対象、
（ｄ）非結核性の疾患又は非結核性の感染性疾患に罹患している対象、
（ｅ）非結核性の肺炎又は非結核性の熱性疾患に罹患している対象
のうちの１又は２以上に由来し得る。
【０１２７】
参照値は、例えば、正常対象、すなわち、活動性結核に罹患していない対象から、又は上記（ａ）〜（ｅ）のうちのいずれかから得られた試料中に存在するＩＣＪ、ＨＰ、ＣＬＣ、ＣＤ１７７又はＢＡＴＦ２のレベルの所定の測定値であり得る。参照値は、例えば、対照集団の対象、例えば、活動性結核の症状を示さない５、１０、１００、１０００人以上の対象（これらは、被検対象と年齢及び／又は性別が一致する場合、又は一致しない場合のいずれであってもよい）におけるバイオマーカーの平均又は中央値のレベルに基づく場合がある。
【０１２８】
参照値は、被検試料中のバイオマーカーのレベルの決定に対応する方法を使用して、例えば、対照集団の対象から採取した１又は２以上の試料を使用して決定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、参照値試料中のバイオマーカーのレベルを、被検試料に対するアッセイと並行して決定することができる。代替の実施形態では、参照値は、得られた各被検試料に関して、あらかじめ決定しておいてもよく、又は計算若しくは外挿してもよく、参照値について対応する決定を実施する必要はない。
【０１２９】
一実施形態では、参照値は、活動性結核に罹患している対象に由来する。
【０１３０】
一実施形態では、参照値は同じ対象に由来するが、より早期の対象に由来する。したがって、本発明により、対象の状況、例として、対象における疾患の進行を、経時的にモニターすることが可能になり得る。特に、この実施形態は、抗結核療法に対する応答を経時的にモニターする場合に有用になる。
【０１３１】
本発明の参照値はまた、ＨＩＶ陰性の対象に由来する場合もある。
【０１３２】
好ましい実施形態では、参照値は、ある範囲の値である。例えば、健常対象が、本発明のバイオマーカーのレベルを、特定の「健常な」範囲内に示すことを決定することができる。等しく、活動性結核に罹患している対象は、本発明のバイオマーカーのレベルを、特定の「疾患の」範囲内に示し得る。より多くのデータが得られ、分析されるにつれて、参照値、及び特定の範囲の値としての参照値を、時間の経過と共に最適化することができる。
【０１３３】
一実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定し、結核への曝露がこれまでにない対象と比較して、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のより高いレベルが、活動性結核、例えば、活動性の肺結核又は活動性の肺外結核の存在を指し示す。
【０１３４】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定し、結核から回復した対象と比較して、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のより高いレベルが、活動性結核の存在を指し示す。
【０１３５】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定し、潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する対象と比較して、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のより高いレベルが、活動性結核の存在を指し示す。この実施形態では、対象の一方又は両方が、小児である場合がある。対象、特に、試料を得る対象が、ＨＩＶ陽性又はＨＩＶ陰性である場合がある。活動性結核は、活動性の肺結核である場合がある。
【０１３６】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定し、潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する、ＨＩＶ陰性の対象と比較して、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のより高いレベルが、活動性結核の存在を指し示す。
【０１３７】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定し、
（ａ）結核への曝露がこれまでにない対象、
（ｂ）潜伏結核感染（ＬＴＢＩ）を有する対象、
（ｃ）結核から回復した対象、
（ｄ）非結核性の感染性疾患に罹患している対象、及び
（ｅ）非結核性の肺炎又は非結核性の熱性疾患に罹患している対象
のうちの１又は２以上と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの無変化
が、活動性結核の非存在を指し示す。
【０１３８】
ＢＡＴＦ２のレベルを決定する、いくつかの実施形態では、参照値が、発熱を伴う疾患及び非結核性の熱性疾患に罹患している対象に由来しない。
【０１３９】
一実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルが、活動性結核に罹患している対象から得られた試料中で、結核への曝露がこれまでにない対象又は非結核性の感染性疾患に罹患している対象に由来する参照値と比較して、少なくとも１．５倍、又は少なくとも２倍高い。より好ましくは、ＢＡＴＦ２のレベルが、結核への曝露がこれまでにない対象又は非結核性の感染性疾患に罹患している対象に由来する参照値と比較して、少なくとも３倍高い、又は少なくとも４倍、若しくは少なくとも５倍、若しくは少なくとも６倍、若しくは少なくとも７倍、若しくは少なくとも８倍、若しくは少なくとも９倍、若しくは少なくとも１０倍高い。
【０１４０】
一実施形態では、対象から得られた試料中のＩＧＪのレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＩＧＪのより高いレベルが、活動性結核の存在を指し示す。
【０１４１】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＣＬＣのレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＣＬＣのより高いレベルが、活動性結核の存在を指し示す。
【０１４２】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＨＰのレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＨＰのより低いレベルが、活動性結核の存在を指し示す。
【０１４３】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＨＰのレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＨＰのより低いレベルが、非結核性の疾患の存在を指し示す。
【０１４４】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のより低いレベルは、活動性結核の存在を指し示す。
【０１４５】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のより高いレベルが、非結核性の疾患の存在を指し示す。
【０１４６】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２及びＣＤ１７７のレベルを決定し、結核への曝露がこれまでにない対象又は非結核性の感染性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＣＤ１７７のより低いレベルと連動させた、ＢＡＴＦ２のより高いレベルは、活動性結核、例えば、活動性の肺結核又は活動性の肺外結核の存在を指し示す。
【０１４７】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７のレベルを決定し、非結核性の熱性疾患に罹患している対象と比較して、対象から得られた試料中のＨＰ及びＣＤ１７７のより低いレベルと連動させた、ＩＧＪ及びＣＬＣのより高いレベルが、活動性結核、例えば、活動性の肺結核又は活動性の肺外結核の存在を指し示す。
【０１４８】
関連の実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣのレベルを決定し、参照値、特に、非結核性の熱性疾患に罹患している対象に由来する参照値、と比較して、対象から得られた試料中のＨＰ及びＣＤ１７７のより低いレベルと連動させた、ＩＧＪ、ＣＬＣ及びＢＡＴＦ２のより高いレベルが、活動性結核、例えば、活動性の肺結核又は活動性の肺外結核の存在を指し示す。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、参照値と比較した、試料中の本発明のバイオマーカーのレベルの変化から、活動性結核の発症を予測する。例えば、疾患の徴候又は症状をまだ示していない対象から得られた試料中の本発明のバイオマーカーのレベルの変化から、活動性結核の発症を予測する。
【０１５０】
好ましい実施形態では、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定し、参照値、特に、結核への曝露がこれまでにない対象から得られた参照値、と比較して、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のより高いレベルから、活動性結核の発症を予測する。
【０１５１】
この様式で、本発明の方法又は使用により、活動性結核の発症を、疾患の発症の前の最長１２カ月、例えば、最長３、６又は９カ月にわたり予測することができる。
【０１５２】
好ましい実施形態では、本発明のバイオマーカーのレベル及び／又は参照値は、１又は２以上のハウスキーピング遺伝子、ハウスキーピングタンパク質又はハウスキーピングマーカーと比較することによって標準化される。
【０１５３】
ハウスキーピング遺伝子、ハウスキーピングタンパク質又はハウスキーピングマーカーのレベルは、種々の実験条件に応答して変動するものではないことが当技術分野で公知である。適切なハウスキーピング遺伝子が、当技術分野で公知であり、Silver N., et al (BMC Mol Biol. 2006 Oct 6; 7:33; “Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR”)に記載されている。
【０１５４】
適切な例として、これらに限定されないが、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）、β−アクチン、ＳＤＨＡ（コハク酸デヒドロゲナーゼ、succinate dehydrogenase）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１、hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1）、ＨＢＳ１Ｌ（ＨＢＳ１様タンパク質、HBS1-like protein）、ＡＨＳＰ（アルファヘモグロビン安定化タンパク質、alpha haemoglobin stabilising protein）、及びＢ２Ｍ（ベータ−２−ミクログロブリン、beta-2-microglobulin）が挙げられる。ＧＡＰＤＨが、特に好ましい。当業者であれば、任意のハウスキーピング遺伝子、タンパク質又はマーカーを、本発明の目的で使用することができることを理解するであろう。
【０１５５】
サロゲートエンドポイント
好都合なことに、本発明のバイオマーカーは、抗結核剤を用いる療法の成功のサロゲートエンドポイントとして、（例えば、インビトロで）使用することができる。
【０１５６】
本発明の方法又は使用の一実施形態によれば、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣのうちの１又は２以上のレベルを決定し、参照値と比較した、試料中のＢＡＴＦ２及び／若しくはＩＧＪ及び／若しくはＣＬＣのレベルの減少、並びに／又はＨＰ及び／若しくはＣＤ１７７のレベルの増加は、活動性結核が非存在であること、並びに／又は抗結核剤を用いる療法が成功したこと／効果を示すことを指し示す。
【０１５７】
特定の実施形態では、ＢＡＴＦ２のレベルを決定し、参照値と比較した、試料中のＢＡＴＦ２のレベルの減少は、活動性結核が非存在であること、及び／又は抗結核剤を用いる療法が成功したこと／効果を示すことを指し示す。
【０１５８】
試料及び参照値は、例えば、種々の時点における、同じ対象に由来し得る。この実施形態では、参照値は、より早期の時点（時点「Ａ」）、例えば、活動性結核に罹患しているとき、及び／又は抗結核療法を受けていないとき、及び／又は抗結核療法を開始するのと同じ時期の対象に由来し得る。次いで、（被検）試料を、後の時点（時点「Ｂ」）、例えば、抗結核療法を始めるに至ったとき、抗結核療法が完了するに至ったとき、並びに／又は活動性結核の徴候及び症状が薄れる若しくは最早存在しないようになったときの対象から採取することができる。
【０１５９】
時点「Ａ」と時点「Ｂ」との間の期間は、いずれの長さであってもよい。好都合には、期間は、およそ８週間又は８週間超である。例えば、抗結核療法の開始（参照値はこの時点に由来する）と対象からの（被検）試料の採取との間に、およそ８週間又は８週間超が経過する場合がある。
【０１６０】
キット
本発明は、対象中の活動性結核の存在又は非存在を決定するためのキットであって、
対象から得られた試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
からなる群から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定することが可能な１又は２以上のプライマーの対又はプローブを含み、
使用説明書のセットを含んでいてもよい、キットを提供する。
【０１６１】
一実施形態では、１又は２以上のプライマーの対又はプローブが、固体支持体上に固定化されている。
【０１６２】
本発明のキットは、複数のプローブであって、それぞれが、本発明の代替えのバイオマーカーのうちの１つに特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブを含むことができる。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、用語「プローブ」は、試料中に存在する核酸配列に相補的である核酸（例えば、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列）を指し、したがって、プローブは、妥当な条件下で、試料中に存在する核酸配列に特異的にハイブリダイズする。
【０１６４】
特に好ましい一実施形態では、プローブは、本明細書に記載する配列番号１０〜１４から選択される。
【０１６５】
キットはまた、プローブ／バイオマーカーの組合せのそれぞれに対応する、１又は２以上のハイブリダイゼーションの産物の存在を検出するための手段も含むことができる。
【０１６６】
プローブは、遺伝子のプローブ、例えば、１５〜５０塩基のオリゴマー性のＤＮＡ配列であり得、これらは、バイオマーカーの存在を検出するように合成されている。次いで、プローブは、厳密な条件下で、バイオマーカーにハイブリダイズすることができる。
【０１６７】
代わって、キットは、プライマーの１又は２以上の対を含むこともでき、これらを使用して、それぞれのバイオマーカーを、
ａ）前記試料中の潜在的な核酸バイオマーカー又は核酸のバイオマーカーを含有する部分を増幅し、
ｂ）増幅された核酸の配列決定、例えば、ミニ−シーケンシングを行い、
ｃ）前記試料中のバイオマーカーの存在又は非存在を検出すること
によって検出することができる。
【０１６８】
キットは、逆転写酵素を任意選択で含んでいてもよい。
【０１６９】
用語「プライマー」は、本明細書で使用する場合、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成を誘発する条件下に置かれる場合、すなわち、ヌクレオチド、及び誘発剤、例として、ＤＮＡポリメラーゼが存在し、温度及びｐＨが適切である場合に、合成を開始する点として作用することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。
【０１７０】
プライマー及び／又はプローブは、それらの検出を促進するために標識することができる。そのような標識（レポーターとしてもまた公知である）として、これらに限定されないが、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、金属ゾル、その他の適切な検出可能なマーカー、例として、ビオチン又はハプテン等が挙げられる。使用することができる標識の特定の例として、これらに限定されないが、フルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオセイン、シアニン３（Cy3、Cyanine 3）、シアニン５（Cy5、Cyanine 5）、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、Texas red、ルミナル、ＮＡＤＰＨ及び西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
【０１７１】
キット中で使用されるプローブ及び／又はプライマーは、それらの標的の核酸配列に特異的にハイブリダイズする。それらを、例えば、高い厳密度の条件下でハイブリダイズさせることができる。
【０１７２】
ハイブリダイゼーションの厳密度は、ポリ核酸のハイブリッドが安定である条件を指す。そのような条件は、当業者には明らかである。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ、melting temperature）に反映し、Ｔｍは、配列相同性が１％減少する毎に、およそ１〜１．５℃減少する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度及び温度の関数である。
【０１７３】
本明細書で使用する場合、高い厳密度は、１Ｍのナトリウム中、６５〜６８℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。高い厳密度の条件は、例えば、６×のSSC、５×のデンハート液、１％のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、及び非特異的競合物質としての０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する水溶液中でのハイブリダイゼーションにより提供することができる。
【０１７４】
これらの条件は、改作すること、並びに多様な緩衝液、例えば、ホルムアミドに基づく緩衝液、及び温度を使用して、重複して行うことができることが理解される。デンハート液及びSSCは、その他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者に周知である（例えば、Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York、又はAusubel, et al., eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）。最適なハイブリダイゼーション条件は、経験により決定しなければならない；その理由は、ハイブリダイズする対の長さ及びＧＣ含有量にもまた役割があるからである。
【０１７５】
本発明のキットにおいては、核酸プローブを支持体又は基材とつないで、アレイアッセイにおいて使用しようとする核酸プローブのアレイを提供することができる。適切には、プローブは、あらかじめ合成し、若しくは商業的に得、次いで、基材に結合させる、又は基材上で合成する、すなわち、基材上で、インサイツで合成する。
【０１７６】
利用することができる核酸ハイブリダイゼーションの特定の方法が、核酸のチップ／アレイのハイブリダイゼーションであり、この場合、核酸を、マイクロアレイ等の表面上に固定化させて存在させ、配列中の軽微な変化を検出するのに十分に高感度のハイブリダイゼーションの技法に付す。
【０１７７】
一般に、アレイ技術及び多様な技法、並びにアレイ技術と関連がある適用例は、当業者に公知である。
【０１７８】
本発明におけるキットはさらに、試料中の１又は２以上のバイオマーカーのレベルを、プライマーの対又はプローブを使用して決定するための分析デバイスも含むことができる。
【０１７９】
キットは、プライマーの対又はプローブを使用して試料中で決定された１又は２以上のバイオマーカーのレベルに基づいて対象を分類するためのデータ処理装置を制御するためのプログラムを格納する記憶媒体を含むことができる。
【０１８０】
プログラムは、データ処理装置を制御して、対象についてのリスク指標を示すための命令を含むことができる。
【０１８１】
さらなる態様では、本発明は、本発明におけるキットを調製する方法であって、固体支持体上に、本発明の１又は２以上のプライマーの対又はプローブを固定化するステップを含む方法を提供する。
【０１８２】
その上さらなる態様では、本発明は、対象中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための、本発明のキットの使用を提供する。
【０１８３】
試料
試料は、生物学的試料、例として、対象から得られた血液試料、頬のスワブ、生検標本、組織抽出物、臓器培養物、又は任意のその他の組織若しくは細胞の調製物であってもよく、又はそれらに由来してもよい。
【０１８４】
理論的には、本発明におけるｍＲＮＡ転写物バイオマーカーの存在は、体内の任意の組織からｍＲＮＡを抽出することによって決定することができる。
【０１８５】
試料は、エクスビボの試料であってもよく、又はエクスビボの試料に由来してもよい。
【０１８６】
好ましくは、試料は、血液、特に、抹消血であり、又は血液、特に、抹消血に由来する。
【０１８７】
好ましくは、試料は、全血若しくは全血の画分であり、又は全血若しくは全血の画分に由来する。
【０１８８】
本発明のバイオマーカーがポリペプチド（例えば、ＢＡＴＦ２ポリペプチド）である実施形態では、試料は、血液細胞であり得、又は血液細胞に由来し得る。
【０１８９】
対象
対象は、ヒトであり得る。対象は、任意の年齢、性別又は民族性であり得る。対象は、ヒト成人又はヒト小児であり得る。本発明の文脈では、「ヒト成人」は、試料採取時に年齢が１５歳以上であるヒト対象であり、「ヒト小児」は、試料採取時に年齢が１５歳未満であるヒト対象である。
【０１９０】
対象は、結核の１又は２以上の徴候又は症状を示す場合がある。対象はこれまでに、その他の診断方法により結核を有することが特徴付けられている場合がある。以前の検査結果が、曖昧である場合又は決定的でない場合に、本発明の方法を使用して、診断を確認することができる。
【０１９１】
対象は、活動性結核を発症する素因を有する場合がある。例えば、対象が将来何らかの時点で活動性結核を発症するリスク又は可能性が増加する場合がある。素因は、ＬＴＢＩを有すると診断されていることに起因する場合がある。
【０１９２】
「リスク指標」を計算して、対象が活動性結核を有する可能性の定量分析結果を提供するための方法を、本明細書に記載する。
【０１９３】
リスク指標を、連続的な定量的尺度、例えば、０〜１の確率の推定値として示すことができ、ここで、「０」は、対象が活動性結核に罹患していることがあり得ないことに相当し、「１」は、対象が活動性結核に罹患していることが絶対に確実であることに相当する。
【０１９４】
「結核から回復した対象」はこれまでに活動性結核に罹患したことがあるが、試料採取時には結核の徴候及び症状を示さなかった対象を意味する。例えば、回復した対象は、回復してから２年以上が経過している対象である場合、又はＴＢ療法が完了してから２〜４年が経過している対象である場合がある。
【０１９５】
「健常対象」は、例えば、
（ｉ）Ｍｔｂ若しくは結核への曝露がこれまでにない対象、又は
（ii）ＬＴＢＩを有する対象、又は
（iii）結核から回復した対象、又は
（iv）いかなる疾病にも罹患していない対象
を意味する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、対象が、ＨＩＶ陰性である。
【０１９７】
結核の療法
本発明は、活動性結核の治療が必要であることが本発明の方法により同定された対象における活動性結核の治療における使用のための、治療有効量の抗結核剤を含む組成物を提供する。
【０１９８】
本発明はまた、活動性結核の治療が必要であることが本明細書の記載に従って活動性結核の存在又は非存在を決定する方法により同定された対象における活動性結核を治療する方法であって、治療有効量の抗結核剤を対象に投与するステップを含む方法も提供する。
【０１９９】
特に、本発明は、対象における活動性結核を治療する方法であって、
（ａ）活動性結核の存在を、本明細書の記載に従う方法により決定するステップと、
（ｂ）治療有効量の抗結核剤を対象に投与するステップと
を含む方法を提供する。
【０２００】
対象における活動性結核を治療する方法は、（ｃ）抗結核剤を投与した後に、ステップ（ａ）を繰り返すステップをさらに含むことができる。活動性結核が、（（ａ）で決定された結果と比較して）依然として存在する場合には、対象における活動性結核を治療するための方法は、代替の抗結核剤を対象に投与することを含むステップ（ｄ）をさらに含むことができ、ここで、代替の抗結核剤は、ステップ（ｂ）で投与した抗結核剤とは異なる。
【０２０１】
抗結核剤は、活動性結核の徴候及び／又は症状を治療又は軽減することができる任意の適切な薬剤であり得る。薬剤は、１又は２以上の抗結核剤であり得、これらを、長期に、及び／又は同時に若しくは異なる時期に投与することができる。
【０２０２】
好ましい実施形態では、抗結核剤が、抗生物質、副腎皮質ステロイド、化学療法剤及びＴＮＦ阻害剤からなる群から選択される１又は２以上の抗結核剤である。
【０２０３】
抗生物質又は化学療法剤は、イソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド、ストレプトマイシン、ｐａｒａ−アミノサリチル酸（ＰＡＳ、para-aminosalicylic acid）、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、エタンブトール及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。副腎皮質ステロイドは、プレドニゾロン、デキサメタゾン、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。ＴＮＦ阻害剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、エタネルセプト、及びそれらの組合せからなる群から選択することができる。
【０２０４】
本発明と併せて使用しようとする抗結核剤の適切な投与量及びレジメンを、当業者であれば適切に決定することができる。
【０２０５】
例えば、抗結核剤は、活動性結核の治療のための任意の適切な組成物中に製剤化し、これを対象に投与することができる。特定の実施形態では、有効量の抗結核剤が、対象に投与される。この文脈では、用語「有効量」は、望まれる結果を達成するのに、例えば、活動性結核を治療するのに必要な期間にわたり何回か投与して、効果を示す量を意味する。
【０２０６】
抗結核剤は、多様な技法を使用して対象に投与することができる。例えば、薬剤は、全身投与することができ、これには、筋肉内注射又は静脈内注射を含む、注射による投与、経口投与、舌下投与、経皮投与、皮下投与、鼻腔内投与が含まれる。代わって、活動性結核による影響を受けている部位において、薬剤を直接投与することもできる。
【０２０７】
投与しようとする抗結核剤の濃度及び量は典型的には、例えば、活動性結核の重症度、活動性結核と関連があり、その影響を受けている組織、投与される薬剤のタイプ、投与様式、対象の年齢及び健康状態等に依存して変化する。
【０２０８】
抗結核剤は、医薬組成物中に、薬学的に許容される担体、媒体、賦形剤又は希釈剤と一緒に製剤化することができる。組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤及び多様な適合性の担体を日常的に含有することができる。例えば、抗結核剤は、生理的緩衝溶液中に製剤化することができる。
【０２０９】
薬学的に許容される担体、媒体、賦形剤又は希釈剤の比率及び身元を、選ばれた投与経路、生存細胞との適合性、及び標準的な製剤慣行により決定することができる。一般に、医薬組成物は、薬剤の生物学的特性を顕著に損なうことはないであろう構成要素を用いて製剤化する。適切な担体、媒体、賦形剤及び希釈剤が、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)に記載されている。
【０２１０】
関連の態様では、本発明はまた、対象が抗結核剤を用いる治療に対してに対して感受性となるかどうかを決定する方法であって、
対象から得られた試料中の以下のバイオマーカー：
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）、
のうちの１又は２以上のレベルを決定するステップを含み、
参照値と比較した、試料中の１又は２以上のバイオマーカーのレベルが、抗結核剤を用いる治療に対する対象の感受性を指し示す、方法も提供する。
【０２１１】
追加の態様
本発明はまた、以下の追加の態様も提供する。
【０２１２】
本明細書に記載する実施形態及び任意選択の特徴は全て等しく、以下の追加の態様にも適用される。
【０２１３】
したがって、さらなる態様では、本発明は、試料中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための方法であって、
（ｉ）前記試料中の以下のバイオマーカー：
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
のうちの１又は２以上のレベルを決定するステップと、
（ii）試料中の前記１又は２以上のバイオマーカーのレベルを参照値と比較する任意のステップであって、参照値と比較した、試料中の１又は２以上のバイオマーカーのレベルが、活動性結核の存在又は非存在を指し示す、ステップと
を含む方法を提供する。
【０２１４】
さらなる態様ではその上、本発明は、対象が活動性結核又は非結核性の感染性疾患に罹患しているかどうかを決定するための方法であって、
（ｉ）対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルを決定するステップと、
（ii）試料中のＢＡＴＦ２のレベルを参照値と比較するステップであって、
参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの無変化が、活動性結核の非存在を指し示すか、又は
参照値と比較した、対象から得られた試料中のＢＡＴＦ２のレベルの増加が、以下の追加の方法のステップの実行を必要とする、ステップと、
（iii）ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７からなるバイオマーカーの群のレベルを決定するステップと、
（iv）試料中のＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７のレベルを参照値と比較するステップであって、
参照値と比較した、試料中のＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７のレベルが、
（ａ）対象中の活動性結核の存在及び非結核性の感染性疾患の非存在、又は
（ｂ）対象中の非結核性の感染性疾患の存在及び活動性結核の非存在
のいずれかを指し示す、ステップと
を含む方法を提供する。
【０２１５】
さらなる態様ではその上、本発明は、対象中の活動性結核の存在又は非存在を決定するための方法であって、
対象から得られた試料中の、
（ａ）塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様２（ＢＡＴＦ２）、
（ｂ）分化抗原群１７７（ＣＤ１７７）、
（ｃ）ハプトグロビン（ＨＰ）、
（ｄ）免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）、及び
（ｅ）ガレクチン１０（ＣＬＣ）
から選択される１又は２以上のバイオマーカーのレベルを決定するステップ
を含む方法も提供する。
【０２１６】
追加の利点
本発明者らは、活動性ＴＢを有する患者と健常者と、及び活動性ＴＢを有する患者とその他の感染性疾患を有する者とを識別することができる、可能な限り最も少数の、血中の転写物を同定するに至った。
【０２１７】
可能な限り最も少数の転写物を同定することは、分析及び処理が、より安価になり、時間がよりかからず、このことは、続いて、活動性結核の治療が開始されるまで、又は活動性結核ではないと診断されるまでの時間の短縮につながることを意味する。
【０２１８】
本発明はまた、活動性結核についての不必要な微生物学的診断用検査を必要とすることも、不必要な抗結核療法も減らす。活動性結核を有しない患者の不必要な薬物治療からは、毒性及び／又は薬物耐性の起こり得る問題が生じる恐れがあり、コスト／資源の相当な浪費が生じる恐れがある。
【０２１９】
本発明は、活動性ＴＢとその他の熱性疾患とを臨床的に見分けるのに特に好都合である。
【０２２０】
本発明は、ＢＡＴＦ２が、単一のバイオマーカーとして、活動性ＴＢと健常者とを十分に見分けることを示している。このことは、ＨＩＶの状況にかかわらず、当てはまり得る。ＨＩＶ感染症例においては、ＢＡＴＦ２転写物レベルが、活動性ＴＢについてのバイオマーカーとして、陰性予測値を提供する。
【０２２１】
本発明はまた、４つの遺伝子（ＩＧＪ、ＨＰ、ＣＬＣ及びＣＤ１７７）を含む転写シグネチャーを、活動性ＴＢと、非結核性の感染性疾患又は非結核性の熱性疾患を有する病院受診患者とを識別するための単一の確率スコアに要約することができることも示している。
【０２２２】
本発明を使用して、対象の年齢、性別又は民族性にかかわらず、活動性結核の存在又は非存在を決定することができる。
【０２２３】
４つの遺伝子のシグネチャーは、肺外ＴＢ症例と非ＴＢ性肺炎症例とを識別する場合に、独立のデータセットにおいて、等しく十分に機能し、識別のためのこれらの転写シグネチャーは、疾患部位により交絡しなかったことが示されている。
【０２２４】
４つの遺伝子のシグネチャーの、ＴＢとその他の感染症とを識別する能力は、ＴＢの発生率が相対的に低い状況で、熱性の疾病を呈するが、呈示されている状態が肺ＴＢ又は肺外ＴＢに適合する者において、臨床における最も大きな価値をもたらす。
【０２２５】
したがって、本発明は、肺結核及び肺外結核の両方を診断するのに等しく妥当であり、これらの結核を見分けない。
【０２２６】
ここからは、本発明を実施例によりさらに説明し、これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのを支援するのに役立つことを意図し、いかなる場合であっても、実施例により、本発明の範囲を制限する意図はない。
【０２２７】
バリアント、誘導体、アナログ、ホモログ、及び断片
本明細書で言及する特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明はまた、バリアント、誘導体、アナログ、ホモログ、及びそれらの断片の使用も包含する。
【０２２８】
本発明の文脈では、いかなる所与の配列のバリアントも、問題のポリペプチド又はポリヌクレオチドが、その機能を実質的に保持するような様式で、（アミノ酸残基であれ、核酸残基であれ）残基の特定の配列が改変されている配列である。バリアントの配列は、天然に存在するタンパク質又はポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、改変、交換及び／又は変化により得ることができる。
【０２２９】
用語「誘導体」は、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して本明細書で使用する場合、配列から又は配列への、１（又は２以上）のアミノ酸残基の任意の置換、変化、改変、交換、欠失及び／又は付加を含む；ただし、結果として得られるタンパク質又はポリペプチドは、その内在性の機能のうちの少なくとも１つを実質的に保持する。
【０２３０】
用語「アナログ」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して本明細書で使用する場合、任意の模倣物質、換言すると、それが模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内在性の機能うちの少なくとも１つを保有する化合物を含む。
【０２３１】
典型的には、アミノ酸の置換は、例えば、１、２又は３〜１０又は２０個の置換を作製することができる；ただし、改変された配列は、必要な活性又は能力を実質的に保持する。アミノ酸の置換は、天然に存在しないアナログの使用を含むことができる。
【０２３２】
本発明において使用されるタンパク質はまた、サイレント変化をもたらし、その結果、機能的に同等なタンパク質が生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有することもできる。アミノ酸の意図的な置換は、内在性の機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて作製することができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、無荷電の極性の頭部基をもち、類似の親水性の値を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンが含まれる。
【０２３３】
保存的置換を、例えば、下記の表に従って作製することができる。第２列中の同じブロック中にあるアミノ酸、好ましくは、第３列中の同じ行中にあるアミノ酸は、相互に置換することができる。
【０２３４】
【表２】
2019512212.tif 000003
【０２３５】
用語「ホモログ」は、本明細書で使用する場合、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列との特定の相同性を有する実体を意味する。用語「相同性」は、「同一性」と同一視してよい。
【０２３６】
相同配列は、主題の配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％又は９７％又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むことができる。典型的には、ホモログは、主題のアミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から検討することもできるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点から相同性を表現するのが好ましい。
【０２３７】
相同配列は、主題の配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％又は９７％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むことができる。相同性はまた、類似性の観点から検討することもできるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点から相同性を表現するのが好ましい。
【０２３８】
好ましくは、本明細書で詳述する配列番号のうちのいずれか１つに対してあるパーセント同一性を示す配列という場合、参照する配列番号の全長に比して、記述するパーセント同一性を示す配列を指す。
【０２３９】
相同性の比較を、目視により、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて実施することができる。これらの市販されているコンピュータプログラムにより、２又は３以上の配列間で、パーセント相同性又はパーセント同一性を計算することができる。
【０２４０】
パーセント相同性は、連続する配列に比して計算することができ、すなわち、一方の配列を、他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を、他方の配列中の対応するアミノ酸と、一度に一残基ずつ直接比較する。このことは、「非ギャップ」アラインメントと呼ばれている。典型的には、そのような非ギャップアラインメントは、比較的に少ない数の残基にわたってのみ行われる。
【０２４１】
これは、非常に単純でかつ一貫性のある方法であるが、この方法では、例えば、ヌクレオチド配列中の１つの挿入又は欠失が原因で、これ以外には同一の対の配列において、挿入又は欠失以下のコドンがアラインメントから外れる場合があり、したがって、全体を整列させる場合には、パーセント相同性の大きな低下が生じる可能性があることを考慮に入れることができない。結果として、配列比較のほとんどの方法は、起こり得る挿入及び欠失を考慮に入れ、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることがない最適なアラインメントをもたらすように設計されている。このことは、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入して、局地的相同性の最大化に努めることによって達成される。
【０２４２】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメント中に生じる各ギャップに、「ギャップペナルティー」を割り当て、したがって、同一のアミノ酸の数が同じである場合には、２つの比較している配列間のより高い関連性を反映する、可能な限り少数のギャップを有する配列アラインメントは、多くのギャップを有するアラインメントよりも高いスコアを得る。典型的には、ギャップの存在に対しては比較的高いコストを、ギャップ中の後続の各残基に対してはより低いペナルティーを課す「アフィンギャップコスト」が使用される。これが、最も一般的に使用されているギャップスコア化体系である。高いギャップペナルティーはもちろん、より少数のギャップを有する、最適化されたアラインメントをもたらす。ほとんどの整列プログラムにおいて、ギャップペナルティーを改変することが可能である。しかし、そのようなソフトウエアを使用して、配列比較を行う場合には、デフォルト値を使用するのが好ましい。例えば、GCG社製Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列の場合のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについてが、−１２であり、各伸長についてが、−４である。
【０２４３】
したがって、最大のパーセント相同性の計算には、最初に、ギャップペナルティーを考慮に入れて、最適なアラインメントを生成することが必要になる。そのようなアラインメントを実施するのに適切なコンピュータプログラムが、GCG社製Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（University of Wisconsin、U.S.A.、Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387）。配列比較を実施することができるその他のソフトウエアの例として、これらに限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（前記Ausubel et al. (1999) - Ch. 18を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳパッケージソフトが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方が、オフライン検索及びオンライン検索に利用可能である（前記Ausubel et al. (1999), pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。しかし、いくつかの適用例については、GCG社製ＢｅｓｔＦｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれている別のツールもまた、タンパク質配列及びヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である（FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50、FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8を参照されたい）。
【０２４４】
最終的なパーセント相同性は、同一性の観点から測定することができるが、アラインメントの処理自体は典型的には、全か無かの対比較に基づいていない。代わって、化学的類似性又は進化距離に基づいて、それぞれの一対比較にスコアを割り当てる、スケーリングされた類似性スコア行列が、一般に使用される。一般に使用されているそのような行列の例が、ＢＬＯＳＵＭ６２行列、すなわち、ＢＬＡＳＴパッケージソフトのプログラムのためのデフォルト行列である。GCG社製Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公共のデフォルト値を、又は供給されている場合には、専用のシンボル比較表を使用する（さらなる詳細については、ユーザーマニュアルを参照されたい）。いくつか適用例については、GCG社製のパッケージの場合には、公共のデフォルト値を、又はその他のソフトウエアの場合には、デフォルト行列、例として、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用するのが好ましい。
【０２４５】
ソフトウエアが、最適なアラインメントを生成するに至ったら、パーセント相同性、好ましくは、パーセント配列同一性の計算が可能になる。典型的には、ソフトウエアが、これを配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。
【０２４６】
完全長のタンパク質又はポリヌクレオチドの「断片」もまた、バリアントであり、この用語は典型的には、機能上、又は例えば、アッセイの点で所望される、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、完全長のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。
【０２４７】
当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明の多様な改変形態及び変更形態を明らかにするであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連させて記載してきたが、そのような特定の実施形態に、クレームされた本発明を過度に制限してはならないことを理解すべきである。実のところ、本発明を実施するための、記載した様式の多様な改変形態が、当業者には明らかであり、それらは、本発明により網羅されるものとする。
【０２４８】
本発明を、以下の非限定的な実施例により、以下の図を参照しながら、さらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】血中の転写シグネチャーが、活動性ＴＢと関連があることを示すグラフである。（Ａ）ＡｄｊｕＶＩＴコホート中の、ゲノムワイド血中転写物プロファイルにおける、回復後の試料と比較した、活動性ＴＢを有する患者の統計学的に有意な、２倍を超える、転写物存在量の差。（Ｂ）ＡｄｊｕＶＩＴ活動性ＴＢ試料中で、回復後の試料中よりも高いレベルで発現したＡの遺伝子の遺伝子オントロジー分析。（Ｃ）３つの異なる研究から得られた活動性ＴＢと、異なる健常状態、すなわち、ＴＢ回復後（ＡｄｊｕＶＩＴ）、健常ボランティア（Berry）、又は潜伏ＴＢを有する人々（Bloom）との、血中の遺伝子発現の有意差の比較。
【図２】最も優れた識別フィーチャを同定するための、ＳＶＭを使用する、活動性ＴＢ症例と健常例とのトランスクリプトームによる分類を示すグラフである。（Ａ）公開されているデータセットにおける、活動性ＴＢのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）による分類の受信者動作曲線（ＲＯＣ）性能：図１Ｃで同定した血中の転写物５１個を使用して、ＡｄｊｕＶＩＴ活動性ＴＢを有する患者上で、診断時と回復後とを比すようにトレーニングした後に、活動性ＴＢを有するＨＩＶ陰性患者を、健常ボランティア（Berry）又は潜伏ＴＢ（Bloom及びKaforou）と比較した。括弧中に、各コホートについてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。（Ｂ）ＳＶＭトレーニングモデルの活動性ＴＢを有する患者又は回復後の患者における、各遺伝子についての重み付けの順位。（Ｃ）重み付けの順位による累積数の遺伝子を使用して、ＴＢ診断時と回復後とを比した、ＳＶＭによる分類のＲＯＣ  ＡＵＣ。Ｂ−Ｃにおいて、データ点は、データセットをトレーニングセットとテストセットとにランダムに、等しく分割する１００回の反復から得られたＳＶＭの結果の平均±９５％信頼区間を示す。
【図３】血中のＢＡＴＦ２転写物の発現レベルを使用する、活動性ＴＢ症例と健常例との分類を示すグラフである。（Ａ）別個の、ＨＩＶ陰性患者及びＨＩＶ陽性患者のコホートから得られた血液試料中のＢＡＴＦ２遺伝子の相対発現：活動性ＴＢを、回復後の患者（ＡｄｊｕＶＩＴ）、ＬＴＢＩ（Bloom及びKaforou）、又は健常ボランティア（Berry）のいずれかと比較した。箱髭図は、データ点の中央値、四分位及び完全な範囲を示す。＊は、（マン−ホイットニーＵ検定による）０．０００１未満のｐを表す（Ｂ）ＢＡＴＦ２発現の血中レベルのみを使用する、これらのコホートのそれぞれにおける、活動性ＴＢの識別についてのＲＯＣの分析。（Ｃ）ゲノムワイド血中転写物プロファイルを使用する、活動性ＴＢを有する患者又は回復後の患者上でトレーニングした後の、ＨＩＶ陽性患者における活動性ＴＢとＬＴＢＩとのＳＶＭによる識別のＲＯＣ性能。Ｂ−Ｃにおいて、括弧中に、各コホートについてのＲＯＣ曲線下面積を示す。
【図４】最も優れた識別フィーチャを同定するための、ＳＶＭを使用する、活動性ＴＢ症例とその他の発熱コホート症例との、トランスクリプトームによる分類を示すグラフである。（Ａ）発熱を呈して病院を受診した、広範なその他の感染性疾患を有する患者と比較した、ＡｄｊｕＶＩＴコホート中の活動性ＴＢを有する患者から得られた血液試料中のＢＡＴＦ２遺伝子の相対発現レベル、及び（Ｂ）血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベル。（Ｃ）ＢＡＴＦ２遺伝子発現の血中レベルのみ又は血清ＣＲＰの血中レベルのみのいずれかを使用する、活動性ＴＢとその他の発熱症例との識別についてのＲＯＣ分析。括弧中に、各テストについてのＲＯＣ  ＡＵＣを示す。（Ｄ）活動性ＴＢを有する患者又はその他の発熱を呈する患者のＳＶＭトレーニングモデルにおける、各遺伝子についての重み付けの順位。（Ｅ）重み付けの順位による累積数の遺伝子を使用する、活動性ＴＢへ又はその他の発熱へのＳＶＭによる分類のＲＯＣ  ＡＵＣ。Ｄ−Ｅにおいて、データ点は、データセットの半分を、ＳＶＭのためにトレーニングセットとテストセットとにランダムに分けた、１００回の反復から得られた（平均±９５％信頼区間）を示す。
【図５】４つの遺伝子を用いる、活動性ＴＢ症例とその他の発熱コホート症例との、トランスクリプトームによる分類を示すグラフである。（Ａ）活動性ＴＢを有する患者（ＡｄｊｕＶＩＴ）及びその他の発熱コホートの患者の抹消血中の、表示されているそれぞれの遺伝子の相対発現。（Ｂ）ＣＤ１７７遺伝子単独又は表示されている４つの遺伝子全ての発現レベルを使用する、活動性ＴＢ（ＡｄｊｕＶＩＴ）とその他の発熱患者とのＳＶＭによる識別のＲＯＣ分析；これは、使用したデータの半分をトレーニングして、ＳＶＭの重み付けの順位を誘導し、次いで、第２の半分のデータ上でテストすることによって行った。括弧中に、各テストについてのＲＯＣ  ＡＵＣを示す。（Ｃ）ＴＢの症例毎の確率を示すために、表示されている４つの遺伝子全てを使用してトレーニングした半分から誘導した、（Ｂ）の各テスト症例のＳＶＭ分離超平面からの距離の変換。（Ｄ）表示されている遺伝子の発現レベルを使用する、ＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ患者とＡｄｊｕＶＩＴの回復後の患者と、及びＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ患者と発熱コホートの患者とのＳＶＭによる識別のＲＯＣ分析；これは、使用したデータの半分をトレーニングして、ＳＶＭの重み付けの順位を誘導し、次いで、第２の半分のデータ上でテストすることによって行った。括弧中に、各テストについてのＲＯＣ  ＡＵＣを示す。（Ｅ）ＴＢの症例毎の確率を示すために、表示されている５つの遺伝子全てを使用してトレーニングした半分から誘導した、（Ｄ）の各テスト症例のＳＶＭ分離超平面からの距離の変換。
【図６】肺ＴＢ及び肺外ＴＢと、健常例及び非ＴＢ肺炎との識別を示すグラフである。（Ａ）肺ＴＢ（ＰＴＢ、pulmonary TB）を有する患者、肺外ＴＢ（ＥＰＴＢ、extrapulmonary TB）を有する患者の新たな独立のコホート；又は健常ボランティアから得られた血液試料中のＢＡＴＦ２遺伝子の相対発現。（Ｂ）（Ａ）のＢＡＴＦ２レベルに基づく、ＰＴＢと健常ボランティアと、及びＥＴＢと健常ボランティアとのＳＶＭによる識別のＲＯＣ分析。（Ｃ）ＳＶＭモデルを、活動性ＴＢ（ＡｄｊｕＶＩＴ）症例及びその他の発熱症例上で、ＣＤ１７７／ＨＰ／ＩＧＪ／ＣＬＣの相対発現レベルを使用してトレーニングした後の、ＰＴＢ新症例と新たなコホートの非ＴＢ肺炎新症例と、及びＥＴＢ新症例と新たなコホートの非ＴＢ肺炎新症例とのＳＶＭによる識別のＲＯＣ分析。（Ｄ）ＴＢの症例毎の確率を示すために、表示されている４つの遺伝子全てを使用した、（Ｃ）の各テスト症例のＳＶＭ分離超平面からの距離の変換。
【図７】（Ａ）活動性ＴＢを有する患者（ＡｄｊｕＶＩＴコホート）中の血中ＢＡＴＦ２及び血清ＣＲＰ；ＡｄｊｕＶＩＴ活動性ＴＢコホート並びに発熱コホート中の（Ｂ）血中ＣＤ１７７及び血中好中球のカウント数、並びに（Ｃ）血中ハプトグロビン転写物及び血清ＣＲＰ濃度を示す散布図である。
【図８】ＡｄｊｕＶＩＴ活動性ＴＢコホート及びその他の発熱コホートにおける特定の民族性、男性又は４０歳未満の年齢の患者の抹消血中の表示されているそれぞれの遺伝子の相対発現を示すグラフである。
【図９】（Ａ−Ｃ）表示されている民族性のそれぞれにおけるＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣの発現レベルを使用する、活動性ＴＢ（ＡｄｊｕＶＩＴ）とその他の発熱患者とのＳＶＭによる識別のＲＯＣ分析を示すグラフである；これは、各コホート中の（Ａ）ヨーロッパ人及びアメリカ人（ＥＵＲＡＭ、European and American）の患者、（Ｂ）アフリカ系黒人（ＢＬＡＦ、Black African）の患者、並びに（Ｃ）南アジア人（ＳＡＳＩＡ、South Asian）の患者上でトレーニングすることによって行った。（Ｄ−Ｆ）（Ｄ）血中好中球のカウント数、（Ｅ）血中リンパ球のカウント数、又は（Ｆ）年齢のいずれかを使用する、活動性ＴＢ症例とその他の発熱症例との識別についてのＲＯＣ分析。括弧中に、各テストについてのＲＯＣ  ＡＵＣを示す。
【図１０】（Ａ−Ｂ）活動性肺ＴＢ（ＰＴＢ）を有する成人と健常対照（ＨＣ、healthy control）と（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７０６３０）を識別するため；（Ｃ−Ｄ）活動性ＰＴＢを有する成人とＨＣと、及び活動性肺外ＴＢ（ＥＰＴＢ）を有する成人とＨＣと（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６２２２０）を識別するため；（Ｅ−Ｆ）活動性ＴＢを有する成人と潜伏ＴＢ感染（ＬＴＢＩ）を有する成人と（ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０１９９０−１５．）を識別するため；並びに（Ｇ−Ｈ）ＨＩＶ同時感染を有し、活動性ＴＢを有する小児と、ＨＩＶ同時感染を有しない、活動性ＴＢを有する小児とを、又はＨＩＶ同時感染を有し、活動性ＴＢを有する小児と、ＬＴＢＩを有する小児とを識別するための、全血から得られたゲノムワイド転写プロファイルに由来する血中ＢＡＴＦ２転写物の相対レベル（左手のパネル）、並びにＢＡＴＦ２レベルを使用する受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析（右手のパネル）を示すグラフである。ＡＵＣ＝各ＲＯＣ分析についての曲線下面積。
【図１１】全員が活動性ＴＢについて調査されている、これまで未公開の南アフリカ人のコホートにおいて、活動性ＴＢを有する成人と活動性ＴＢを有しない成人とを識別するための、（Ａ）全血から得られたゲノムワイド転写プロファイルに由来する血中ＢＡＴＦ２転写物の相対レベル、及び（Ｂ）ＢＡＴＦ２レベルを使用する受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を示すグラフである。（Ｃ）ＣＤ１７７、ハプトグロビン、免疫グロブリンＪ鎖及びガレクチン１０の血中転写物レベルを使用するサポートベクターマシンモデルを用いて、上記のコホートに属する患者中の活動性ＴＢと、非ＴＢ肺炎を有する病院受診患者とを識別するためのＲＯＣ分析を示すグラフである（ＡＵＣ＝曲線下面積）。（Ｄ）ロジスティック回帰関数を使用して、ＣのＳＶＭモデル内の識別の超平面からの距離をプロットした、ＴＢの症例に特異的な確率を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）健常対照、及び血液試料採取から１２カ月超、３〜１２カ月、又は３カ月未満が経過した後に、活動性ＴＢを発症する患者における、全血から得られたゲノムワイド転写プロファイルに由来する血中ＢＡＴＦ２転写物の相対レベルを示すグラフである。（Ｂ）健常対照と、Ａに表示されている時間間隔のそれぞれにおいて活動性ＴＢを発症する症例とを識別するための、ＢＡＴＦ２レベルを使用する受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を示すグラフである。（ＡＵＣ＝曲線下面積）。（Ｃ−Ｄ）ＴＢ治療着手後の種々の時点における、活動性ＴＢを有する患者の全血から得られたゲノムワイド転写プロファイルに由来する血中ＢＡＴＦ２転写物の相対レベルを示すグラフである。表示されているｐ値は、マン−ホイットニー検定から誘導されている。（Ｅ−Ｆ）入手可能な場合に個々の患者から得られた、ＴＢ治療の第０時と第８週時とに試料採取されて対をなす、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルを示すグラフである。Ｃ及びＥのデータは、ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１０）６１８８９−２に由来し、Ｄ及びＦのデータは、ｄｏｉ：０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６１９１に由来する。
【図１３】（Ａ）遺伝子発現アレイにより測定した、インターフェロン（ＩＦＮ、interferon）β又はＩＦＮγを加えて又は加えずに２４時間刺激した、デュプリケートのＴｈｐ１細胞中の、ＢＡＴＦ２及びＧＡＰＤＨの相対発現を示す図である。（Ｂ）ＩＦＮβ又はＩＦＮγを加えて又は加えずに２４時間刺激したＴｈｐ１細胞のウエスタンブロット分析における、ＢＡＴＦ２：β−アクチンの相対免疫染色（Ｎ＝４）を示すグラフである。［実施例］
【０２５０】
実験方法
研究への参加者
健常ボランティア；ＡｄｊｕＶＩＴ治験（Martineau AR, Timms PM, Bothamley GH, Hanifa Y, Islam K, Claxton AP, Packe GE, Moore-Gillon JC, Darmalingam M, Davidson RN, Milburn HJ, Baker LV, Barker RD, Woodward NJ, Venton TR, Barnes KE, Mullett CJ, Coussens AK, Rutterford CM, Mein CA, Davies GR, Wilkinson RJ, Nikolayevskyy V, Drobniewski FA, Eldridge SM, Griffiths CJ. High-dose vitamin D(3) during intensive-phase antimicrobial treatment of pulmonary tuberculosis: a double-blind randomised controlled trial. Lancet 2011;377:242-250）に動員された、スメア陽性肺ＴＢを有し、診断時の及び回復後２年を超えた患者；Ｎｏｒｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｌｏｎｄｏｎ  ＴＢ  ｓｅｒｖｉｃｅの肺ＴＢ又は肺外ＴＢを有する患者；並びにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ救急科を受診した、３８℃を超える発熱を呈した、又は（３８℃を超える発熱及び胸部Ｘ線検査上の変化に基づいて）肺炎と臨床診断されて、抗菌治療を受けた患者から、血液試料をTempusチューブ又はPaxgeneチューブ中に収集した。
【０２５１】
抹消血の転写プロファイリング
Tempus（商標）Spin RNA Isolationキット（Applied Biosystems社製）又はPAXgene 96 Blood RNAキット（PreAnalytiX社製）を使用して、ＲＮＡを抽出した。TURBO DNA-free（商標）キット（Ambion社製）を用いて、ゲノムＤＮＡを除去した。RNeasy MinElute Cleanupキット（Qiagen社製）を使用して、ＲＮＡを濃縮してから、GLOBINclear（商標）キット（Ambion社製）を用いて、グロビンｍＲＮＡを枯渇させ、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製）を使用して、ＲＮＡの品質管理を評価した。次いで、Low Input Quick Amp標識キットを使用して、フルオロフォア標識ｃＲＮＡを生成し、これを、SurePrint G3 Human Gene Expression v3 8x60K又はHuman Gene Expression v2 4x44Kの全ゲノムマイクロアレイ（Agilent Technologies社製）にハイブリダイズさせた。アレイの画像を、Agilent社製の二重レーザーマイクロアレイスキャナーG2565BAを用いて獲得し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウエア（ｖ９．５．１）を用いて分析した。ＬＯＥＳＳ局所線形回帰を使用して、Cy3及びCy5のシグナル強度のｌｏｇ２変換中央値を、全ての試料の平均シグナルに対して、Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ａｇｉｌｐを使用して正規化した（Chain B. agilp: Agilent expression array processing package. at <http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/agilp.html>、Chain B, Bowen H, Hammond J, Posch W, Rasaiyaah J, Tsang J, Noursadeghi M. Error, reproducibility and sensitivity: a pipeline for data processing of Agilent oligonucleotide expression arrays. BMCBioinformatics 2010;11）。
【０２５２】
データの分析
全てのマイクロアレイデータの分析を、ｌｏｇ２変換データに対して実施し（Chain B, Bowen H, Hammond J, Posch W, Rasaiyaah J, Tsang J, Noursadeghi M. Error, reproducibility and sensitivity: a pipeline for data processing of Agilent oligonucleotide expression arrays. BMCBioinformatics 2010;11）、少なくとも１つの試料中でバックグランドの陰性対照のレベルを上回って発現した遺伝子記号がアノテートされているプローブに制限した。ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｖｉｅｗｅｒ  ｖ４．９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｍ４．ｏｒｇ／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ）において、ノンパラメトリックなデータのためのマン−ホイットニーの検定を使用して、０．０５の偽発見率、及び正規化発現値の中央値の２倍を超える差についてのフィルターを用いて、データセット間の遺伝子発現の有意な差を同定した。遺伝子のオントロジー及び経路の分析を、ｉｎｎａｔｅＤＢ中で実施した（Breuer K, Foroushani AK, Laird MR, Chen C, Sribnaia A, Lo R, Winsor GL, Hancock REW, Brinkman FSL, Lynn DJ. InnateDB: systems biology of innate immunity and beyond--recent updates and continuing curation. Nucleic Acids Res 2013;41:D1228-1233）。遺伝子と経路との関連性のネットワーク図を、Ｇｅｐｈｉ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｐｈｉ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／）を使用して生成した。
【０２５３】
高次元空間中のデータの２つのセットを分離する最適な超平面を学習するサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して、異なる試料から得られたトランスクリプトームのデータを分類した（Cristianini N, Shawe-Taylor J. An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-based Learning Methods. Cambridge University Press; 2000）。ＳＶＭのアルゴリズムを、ｋｅｒｎｌａｂパッケージを使用して、線形カーネルを用いて実行するために、Ｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｖ３．０．２）を使用した。独立のデータセット上で、ＳＶＭをトレーニングし、テストした。パッケージは、ロジスティック回帰モデルを、各症例の超平面からのユークリッド距離に適合させることによって、各試料について、二項分類又は確率スコアのいずれかを出力する（Platt J, others. Probabilistic outputs for support vector machines and comparisons to regularized likelihood methods. Adv Large Margin Classif 1999;10:61-74）。パッケージはまた、全体的な分類の決定における各転写物の重要性についての重み付けも出力する。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して、曲線下面積（ＡＵＣ）を要約統計量として用いて、分類性能を評価した。ＲパッケージのｐＲＯＣを使用して、ＳＶＭの出力からＲＯＣ曲線を構築した。
【実施例１】
【０２５４】
活動性ＴＢ及び長期的な回復後における、血中トランスクリプトームの比較
ＡｄｊｕＶＩＴ研究集団は、ＨＩＶ陰性であり、スメア及び培養により陽性となった肺ＴＢを有する患者を含むものであった。我々は、これらの患者において、ＴＢ治療の完了から２〜４年が経過した、回復後の同じコホートから試料採取した対象と比較することによって、抹消血中の活動性ＴＢの転写の転写シグネチャーを同定することを試みた（表１）。この分析から、２０４個のユニークなタンパク質コード転写物の統計学的に有意なかつ２倍超の遺伝子発現の差が明らかになった（図１Ａ）。このコホート中の活動性ＴＢは、免疫応答と関連がある遺伝子の発現の増加と関連があった（図１Ｂ）；このことは、その他の公開されているデータと一致している。我々は、この転写シグネチャーの、活動性ＴＢを有する患者のその他のコホートにおける一般化の可能性を評価するために、ＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ症例中で示された示差的に発現した遺伝子を、公開されている他の２つの血中転写シグネチャーと比較した。上記２つの血中転写シグネチャーは、活動性肺ＴＢを有する成人患者と、健常ボランティア（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977）又はＬＴＢＩを有する対象（Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Wilkinson KA, Oni T, Rozakeas F, Xu Z, Rossello-Urgell J, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Lipman M, Wilkinson RJ, O'Garra A. Detectable changes in the blood transcriptome are present after two weeks of antituberculosis therapy. PloS One 2012;7）との比較によるものである。各研究集団における人口動態学的特徴に差があり、異なるマイクロアレイプラットフォームを使用して、トランスクリプトームを評価したにもかかわらず、５１個のユニークなタンパク質コード転写物が３つの研究全てに共通した（図１Ｃ）。これらの転写物は、インターフェロン（ＩＦＮ）に関連がある経路の構成要素について、有意なエンリッチメントを示した；このことは、以前の研究（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977）と一致している。
【０２５５】
【表３】
2019512212.tif 000004
【実施例２】
【０２５６】
健常状態との比較による活動性ＴＢの、サポートベクターマシンによる分類
我々は、個々の症例をそれらの血中トランスクリプトームにより識別するために、ＳＶＭを使用して、トレーニングデータから識別モデルを誘導し、その後、テスト症例を分類した。我々は、複数のコホートにおいてその他の健常状態と比較して活動性ＴＢ中で示差的に発現した転写物５１個を使用し（図１Ｃ）、ＡｄｊｕＶＩＴ研究のデータセットを使用して、活動性ＴＢ症例と回復後症例とを識別するようにＳＶＭをトレーニングした。我々は、次いで、３つの別個の公開されている研究から得られた、総数３２５症例を含む、ＨＩＶ陰性対象において試料を分類する場合の、このＳＶＭモデルの性能を評価した。これらは、活動性ＴＢ及び健常ボランティア（Berryコホート）（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977）又は活動性ＴＢ及び潜伏ＴＢ（Bloomコホート）（Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Wilkinson KA, Oni T, Rozakeas F, Xu Z, Rossello-Urgell J, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Lipman M, Wilkinson RJ, O'Garra A. Detectable changes in the blood transcriptome are present after two weeks of antituberculosis therapy. PloS One 2012;7）から得られたデータを含む、上記に記載した２つの以前の研究、並びに活動性ＴＢを有する成人患者及び潜伏ＴＢを有する成人患者の多施設アフリカ研究（Kaforouコホート）から得られた追加のデータ（Kaforou M, Wright VJ, Oni T, French N, Anderson ST, Bangani N, Banwell CM, Brent AJ, Crampin AC, Dockrell HM, Eley B, Heyderman RS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mendelson M, Ottenhoff TH, Zgambo F, Wilkinson RJ, Coin LJ, Levin M. Detection of tuberculosis in HIV-infected and -uninfected African adults using whole blood RNA expression signatures: a case-control study. PLoS Med 2013;10:e1001538）を含んだ。ＲＯＣ曲線を使用して、感度と特異性との間のトレードオフを記載した。これらは、優れた分類精度を示す、０．９３〜１．００のＡＵＣを示した（図２Ａ）。
【０２５７】
ＳＶＭモデルは、データの各次元について、分類モデルにおけるその影響に関する「重み付け」を計算する。我々は、５１個の遺伝子を、ＡｄｕｊＶＩＴコホートから得られた活動性ＴＢ症例及び回復後症例の転写データの半分のうちの複数のランダムな試料上でのトレーニングの後に、ＳＶＭの重み付けの平均の順にランク付けた（図２Ｂ）。我々の目的は、活動性ＴＢについての診断用バイオマーカーとして使用することができる、最も少数の転写物を同定することであった。したがって、我々は、トレーニングのためには使用しなかった残りのデータを使用して、重み付けの順位による遺伝子の累積数を、活動性ＴＢ症例と回復後症例とを識別するそれらの能力についてテストした。我々は、試料採取エラーを軽減するために、トレーニング／テストのランダムなシーケンスを１００回実施して、平均ＲＯＣ  ＡＵＣスコアを得た（図２Ｃ）。目覚しいことに、この分析から、塩基性ロイシンジッパー転写因子（ＢＡＴＦ）２についてのＩＦＮ誘導性遺伝子の発現に相当する、最も高くランク付けられた転写物がもっぱら、０．９５を超えるＲＯＣ  ＡＵＣスコアを一貫して達成することが示された。
【実施例３】
【０２５８】
複数の研究コホートにおける、活動性ＴＢと健常状態とのＢＡＴＦ２による識別
我々は、ＡｄｊｕＶＩＴコホートにおいて、抹消血中のＢＡＴＦ２転写物レベルが、活動性ＴＢについてのバイオマーカーであることを同定したので、複数の独立のコホートにおいて、その性能をテストすることを試みた。活動性ＴＢを有する患者中のＢＡＴＦ２発現は、ＨＩＶの状況にかかわらず、健常ボランティア（Berryコホート）（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977）並びにＬＴＢＩを有する患者（Bloomコホート及びKaforouコホート）（Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Wilkinson KA, Oni T, Rozakeas F, Xu Z, Rossello-Urgell J, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Lipman M, Wilkinson RJ, O'Garra A. Detectable changes in the blood transcriptome are present after two weeks of antituberculosis therapy. PloS One 2012;7、Kaforou M, Wright VJ, Oni T, French N, Anderson ST, Bangani N, Banwell CM, Brent AJ, Crampin AC, Dockrell HM, Eley B, Heyderman RS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mendelson M, Ottenhoff TH, Zgambo F, Wilkinson RJ, Coin LJ, Levin M. Detection of tuberculosis in HIV-infected and -uninfected African adults using whole blood RNA expression signatures: a case-control study. PLoS Med 2013;10:e1001538）中のＢＡＴＦ２発現よりも有意に高かった；データは、全部で４０２人の患者から得たものである（図３Ａ）。これらの研究におけるＨＩＶ陰性患者において、抹消血中のＢＡＴＦ２発現が、各コホートにおいて記載されている活動性ＴＢ症例と多様な健常例とを、０．９３〜０．９９のＲＯＣ  ＡＵＣスコアで識別した（図３Ｂ）。KaforouコホートにおけるＨＩＶ感染患者においては、活動性ＴＢ症例とＬＴＢＩ症例とのＢＡＴＦ２レベルによる識別の良好さは劣った（０．８４のＲＯＣ  ＡＵＣ）。このコホートにおいては、活動性ＴＢを有する患者中の高いＢＡＴＦ２発現は、ＨＩＶ同時感染による影響を有意には受けなかったが、ＨＩＶ同時感染を有するＬＴＢＩ症例は、ＨＩＶ陰性症例よりも有意に高いＢＡＴＦ２レベルを示し（図３Ａ）、ＨＩＶ感染患者においては、この測定値による活動性ＴＢと潜伏ＴＢとの正確な識別に部分的な交絡が生じた。ＡｄｊｕＶＩＴ治験から得られたゲノムワイドデータを使用して、活動性ＴＢ症例と回復後症例とを識別するようにトレーニングしたＳＶＭモデルもまた、Kaforouコホートから得られたＨＩＶ感染患者において、活動性ＴＢと潜伏ＴＢとの分類について、０．８５のＲＯＣ  ＡＵＣをもたらした（図３Ｃ）。
【０２５９】
結論として、ゲノムワイド転写データを使用した、ＨＩＶ感染者における活動性ＴＢ症例とＬＴＢＩ症例との識別により、ＢＡＴＦ２自体よりも良好なＲＯＣ  ＡＵＣは得られなかった；このことから、その他の転写物を組み合わせて、ＳＶＭを使用したとしても、より良好な分類精度は得られないであろうことが示唆される。したがって、ＨＩＶ−１感染の状況では、ゲノムワイドレベルまで追加のパラメータを含めたとしても、ＢＡＴＦ２単独よりも良好な分類精度を達成し得ない。
【実施例４】
【０２６０】
その他の熱性の疾病との比較による活動性ＴＢの、サポートベクターマシンによる分類
我々は、ＡｄｊｕＶＩＴコホートの活動性ＴＢ症例の血中トランスクリプトームにおけるＢＡＴＦ２発現レベルを、多種多様なスペクトルの非ＴＢ感染性疾患を呈する、熱性の疾病を有する病院受診患者（発熱コホート）のＢＡＴＦ２発現レベルと比較した（表２）。発熱コホートの試料におけるＢＡＴＦ２レベルは、活動性ＴＢ症例のレベルと重複する広い範囲を示した（図４Ａ、Ｃ）。感染症についてのバイオマーカーとして広く使用されている血清Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）もまた、これら２つの群間で有意な違いはなかった（図４Ｂ、Ｃ）。これらの患者におけるＢＡＴＦ２レベル及びＣＲＰレベルは、比較的弱い相関係数を示し、このことから、これら２つのパラメータは、同時調節されないことが示唆された（図７Ａ）。
【０２６１】
【表４】
2019512212.tif 000005
【０２６２】
次に、我々は、抹消血中の代替の転写物が、活動性ＴＢと、発熱コホートにおいて呈示されているその他の感染症とを区別することができるという仮説をテストした。我々は、組み合わせたＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢと発熱コホートとの転写データのセットの半分を、複数のランダムなサブ試料上でのＳＶＭのトレーニングのために使用して、活動性ＴＢ症例と発熱症例との識別についての、重み付けの平均のそれらの順位を同定した（図４Ｄ）。次いで、我々は、それらの重み付けの順位による累積数の遺伝子を、活動性ＴＢ症例と発熱コホート症例とを識別するそれらの能力についてテストして、それらの分類精度を得た。我々は、毎回データの半分をトレーニングのために、その他の半分をテストのために使用して、トレーニング／テストのランダムなシーケンスを１００回実施し、次いで、平均ＲＯＣ  ＡＵＣスコアを計算した。ＡＵＣスコアは、第１位にランク付けられた遺伝子を単独で使用した場合のおよそ０．８から、上位４つの遺伝子も一緒に使用した場合の０．９５に増加し、さらなる遺伝子を含めることによる追加のゲインはわずかでしかなかった（図４Ｅ）。識別のためのこのシグネチャー中の４つの遺伝子のそれぞれが、発熱コホートの試料と比較して、活動性ＴＢの、有意に異なる血中転写物レベルを示した（図５Ａ）。ＣＤ１７７及びハプトグロビン（ＨＰ）が、発熱コホートの試料中で、より高いレベルで発現し、一方、免疫グロブリンＪ鎖（ＩＧＪ）及びガレクチン１０（ＣＬＣ）が、活動性ＴＢ試料中で、より高いレベルで発現した。
【０２６３】
これら４つの遺伝子の、活動性ＴＢ症例と発熱症例とを識別する可能性の妥当性を確認するために、ＳＶＭモデルを、それらの遺伝子についての転写データを用いて、ＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ症例及び発熱コホート症例のうちの前半全てを使用してトレーニングし、これらの遺伝子の同定には含めなかった、それらの症例のうちの後半全てに対してテストした（図５Ｂ）。４つの遺伝子のシグネチャーは、テスト試料のほとんど完璧な分類をもたらし、ＲＯＣ  ＡＵＣは０．９９であった。比較のために、我々はまた、第１位にランク付けられた遺伝子、すなわち、ＣＤ１７７もテストし、これは、テスト症例の活動性ＴＢと発熱コホートとを、０．９４のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した。ＣＤ１７７の最良の特徴付けは、好中球の亜集団が発現させる表面糖タンパク質であるとすることである（Gohring K, Wolff J, Doppl W, Schmidt KL, Fenchel K, Pralle H, Sibelius U, Bux J. Neutrophil CD177 (NB1 gp, HNA-2a) expression is increased in severe bacterial infections and polycythaemia vera. Br J Haematol 2004;126:252-254、Martineau AR, Timms PM, Bothamley GH, Hanifa Y, Islam K, Claxton AP, Packe GE, Moore-Gillon JC, Darmalingam M, Davidson RN, Milburn HJ, Baker LV, Barker RD, Woodward NJ, Venton TR, Barnes KE, Mullett CJ, Coussens AK, Rutterford CM, Mein CA, Davies GR, Wilkinson RJ, Nikolayevskyy V, Drobniewski FA, Eldridge SM, Griffiths CJ. High-dose vitamin D(3) during intensive-phase antimicrobial treatment of pulmonary tuberculosis: a double-blind randomised controlled trial. Lancet 2011;377:242-250、Matsuo K, Lin A, Procter JL, Clement L, Stroncek D. Variations in the expression of granulocyte antigen NB1. Transfusion (Paris) 2000;40:654-662）、が、好中球のカウント数との相関係数は、ＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢの試料と発熱コホートの試料とにおいては、わずか０．２３に過ぎなかった。このことから、発熱コホートの試料中でのＣＤ１７７のレベルの増加は、循環する好中球の頻度の増加についての単なるサロゲートではないが、これらの症例では、活動性ＴＢと比較して、ＣＤ１７７の転写が上方制御されていることを示し得ることが示唆された。我々はまた、ＨＰが急性相反応物質として認識されていることに注目し、ＨＰ転写物のレベルの循環型ＣＲＰのレベルとの相関性もテストしたが、これら２つのパラメータ間でもまた、ごくわずかな相関性しか見出されなかった。これらのデータから、非ＴＢ感染性疾患症例におけるＨＰ転写物のレベルの増加は、非特異的な急性期応答についてのサロゲートではなく、転写の状況に特異的な上方制御を反映することが示唆された。
【０２６４】
ＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ患者と発熱コホート患者との間に、民族性、年齢及び性別における有意な差があった。しかし、これら２つのコホートを識別する、遺伝子発現の異なるパターンが、民族性の全ての群において明らかに認められ、年齢及び性別による交絡は生じなかった（図８）。さらに、４つの遺伝子のシグネチャーのＳＶＭモデルを、民族性の各群から得られたデータを使用してトレーニングすると、民族性のその他の群全てにおける症例の正確な分類も可能であった（図９Ａ−Ｃ）。さらに、年齢及び血中の好中球又はリンパ球のカウント数の有意差による活動性ＴＢ症例と発熱症例との識別も不十分であった（図９Ｄ−Ｆ）。
【実施例５】
【０２６５】
テスト症例についての単一リスクスコアの誘導
我々は、分類の精度に関する症例毎の信頼性を得るために、各テスト症例のＳＶＭ分離超平面からの距離を、シグモイドロジスティック回帰関数に適合させて、０〜１の間の確率の推定値を得（Platt J, others. Probabilistic outputs for support vector machines and comparisons to regularized likelihood methods. Adv Large Margin Classif 1999;10:61-74）、それにより、我々の４つの遺伝子のシグネチャーから誘導したＳＶＭモデルに基づく、テスト症例のそれぞれについてのリスクスコアを生成した（図５Ｃ）。我々は、ＢＡＴＦ２が、活動性ＴＢ症例と健常例とを識別することができ、追加の４つの遺伝子が、活動性ＴＢと、発熱を呈する、広い範囲のその他の感染性疾患とを識別することができることを考慮して、単一のＳＶＭモデルにおいてＢＡＴＦ２の発現レベルをＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣの発現レベルとを組み合わせて、ＡｄｊｕＶＩＴコホートにおいては、活動性ＴＢ症例と回復後症例とを、発熱コホートにおいては、活動性ＴＢとその他の疾患とを識別することを試みた。５つの遺伝子シグネチャーを使用して、１つの群中のＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ症例の半分及び第２の群中の発熱コホート症例の半分と共にプールした、ＡｄｊｕＶＩＴの回復後ＴＢ症例の半分に対して、ＳＶＭモデルをトレーニングした。次いで、このモデルを使用し、３つの群全てにおいて、残りの第２の半分の症例を分類して、各症例についての活動性ＴＢの単一リスクスコアをもたらし、０．９５のＲＯＣ  ＡＵＣを得た（図５Ｄ−Ｅ）。
【実施例６】
【０２６６】
活動性ＴＢについての血中の転写シグネチャーは、疾患部位に依存しない
ＡｄｊｕＶＩＴコホート、Berryコホート及びBloomコホート中の活動性ＴＢ症例は全て、肺ＴＢ症例であった。ＴＢについての新規の診断用バイオマーカーは特に、現存する微生物学的診断法では、最も低い感度しか得られていない肺外ＴＢに対して求められている。したがって、我々は、追加の症例から得られた血中トランスクリプトームの新たなデータを得て、上記に記載したＢＡＴＦ２及び４つの遺伝子のＴＢ特異的転写シグネチャーの有用性を、健常者、任意の抗生物質治療の前の活動性の肺ＴＢ又は肺外ＴＢ及び非ＴＢ肺炎を比較することによって評価した。健常ボランティアと比較すると、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルは、肺ＴＢ症例及び肺外ＴＢ症例の両方において有意により高かった（図６Ａ）。ＢＡＴＦ２の上昇により、肺ＴＢの症例は、１のＲＯＣ  ＡＵＣで、肺外ＴＢの症例は、０．９８のＲＯＣ  ＡＵＣで分類された（図６Ｂ）。最後に、ＡｄｊｕＶＩＴの活動性ＴＢ症例及び全ての発熱コホート症例を用いて、ＣＤ１７７、ＨＰ、ＩＧＪ及びＣＬＣの４つの遺伝子のＴＢ特異的シグネチャーを使用してトレーニングしたＳＶＭモデルは、新たな肺又は肺外ＴＢ症例と非ＴＢ熱性肺炎とをそれぞれ０．９８及び１のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した（図６Ｃ−Ｄ）。したがって、ＢＡＴＦ２と、４つの遺伝子のＴＢの、血中の転写シグネチャーとは等しく、肺ＴＢ及び肺外ＴＢの両方を分類するのに十分に機能すると我々は結論付けた。
【０２６７】
手短に要約すると、上記の研究から、ＢＡＴＦ２の血中転写物レベルの上昇は、活動性の肺ＴＢ疾患及び肺外ＴＢ疾患と健常状態とを識別し、ＣＤ１７７、ハプトグロビン、免疫グロブリンＪ鎖及びガレクチン１０の血中転写物レベルは、活動性の肺ＴＢ疾患及び肺外ＴＢ疾患とその他の感染性疾患とを識別することが示されており、このことを、表３に要約する。
【０２６８】
【表５】
2019512212.tif 000006
【実施例７】
【０２６９】
活動性結核についてのバイオマーカーのさらなる妥当性確認
この実施例では、活動性結核（ＴＢ）と潜伏ＴＢ感染と、及び活動性結核（ＴＢ）と健常対照とを識別するために、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルを使用することのさらなる妥当性確認を行った。これらは、ＨＩＶ同時感染を有する又は有しない小児及びＨＩＶ同時感染を有する又は有しない者におけるデータを含む。
【０２７０】
ＢＡＴＦ２レベルの有意な上昇が、活動性ＴＢの発症の最長３カ月前に明らかに認められ、ＴＢ治療開始から８週間後に低下することを我々は示している。したがって、ＢＡＴＦ２転写物レベルを使用して、活動性ＴＢの３カ月以内の発症を予測すること、及び開始から２カ月が経過するまでに治療の成功を予測することができる。
【０２７１】
ＢＡＴＦ２の転写レベルの変化は、タンパク質レベルで検出可能であり、このことは、ＢＡＴＦ２タンパク質の定量アッセイを、転写アッセイの代替えとして使用することができることを意味する。
【０２７２】
さらに、我々は、ＨＩＶ同時感染を有する又は有しない患者を含む、活動性ＴＢとその他の非ＴＢ感染性疾患とを識別するために、血中のＣＤ１７７、ハプトグロビン、免疫グロブリンＪ鎖及びガレクチン１０を使用することのさらなる妥当性確認にも着手するに至った。
【０２７３】
実験方法
患者試料
提示するデータは、これまでに公開されている、ゲノムワイド転写プロファイリングのデータセット、及び新たな患者コホートから得られた試料のＲＮＡの配列決定に由来するものである（表４）。
【０２７４】
臨床試料中の遺伝子発現の分析
遺伝子発現の未加工データを全て、上記の記載に従って正規化してから、標的遺伝子からの発現データを抽出した。ＢＡＴＦ２の発現を使用して、活動性ＴＢの症例と健常者とを見分け、ＣＤ１７７、ハプトグロビン、免疫グロブリンＪ鎖及びガレクチン１０の発現を４つの遺伝子のシグネチャーとして使用して、活動性ＴＢと肺炎とを識別した。後者の場合、（Roe, J. K. et al. Blood transcriptomic diagnosis of pulmonary and extrapulmonary tuberculosis. JCI Insight 1, (2016)）の記載に従って、これまでに公開されている活動性ＴＢ症例及び発熱を呈する病院受診者の多種多様な感染性疾患症例から誘導したサポートベクターマシンモデルを使用して、新規の症例を、活動性ＴＢと非ＴＢ肺炎とに分類した。
【０２７５】
【表６】
2019512212.tif 000007
2019512212.tif 000008
【０２７６】
Ｔｈｐ１細胞中のＢＡＴＦ２の転写物及びタンパク質の測定
以前の記載（Noursadeghi, M. et al. Genome-wide innate immune responses in HIV-1-infected macrophages are preserved despite attenuation of the NF-kappa B activation pathway. J. Immunol. Baltim. Md 1950 182, 319-328 (2009)、Tomlinson, G. S. et al. HIV-1 infection of macrophages dysregulates innate immune responses to Mycobacterium tuberculosis by inhibition of interleukin 10. J. Infect. Dis. (2013). doi:10.1093/infdis/jit621）に従って、Ｔｈｐ１細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮβ又はＩＦＮγを加えて又は加えずに、２４時間インキュベートしてから、細胞可溶化液を収集して、ＲＮＡ及びタンパク質の抽出を行った。次いで、ＲＮＡを、以前の記載（Noursadeghi, M. et al. Genome-wide innate immune responses in HIV-1-infected macrophages are preserved despite attenuation of the NF-kappa B activation pathway. J. Immunol. Baltim. Md 1950 182, 319-328 (2009)、Tomlinson, G. S. et al. HIV-1 infection of macrophages dysregulates innate immune responses to Mycobacterium tuberculosis by inhibition of interleukin 10. J. Infect. Dis. (2013). doi:10.1093/infdis/jit621）に従って、ゲノムワイド転写プロファイリングに供した。また、細胞タンパク質を、以前の記載（Noursadeghi, M. et al. Genome-wide innate immune responses in HIV-1-infected macrophages are preserved despite attenuation of the NF-kappa B activation pathway. J. Immunol. Baltim. Md 1950 182, 319-328 (2009)、Tomlinson, G. S. et al. HIV-1 infection of macrophages dysregulates innate immune responses to Mycobacterium tuberculosis by inhibition of interleukin 10. J. Infect. Dis. (2013). doi:10.1093/infdis/jit621）に従って、βアクチン（AC-15、abcam社製）及びＢＡＴＦ２（EPR10667、abcam社製）のウエスタンブロッティングに供した。Odyssey画像診断システム（LI-COR社製）を用いて、免疫反応性のバンドを定量化した。ＢＡＴＦ２タンパク質の相対発現を、βアクチンの発現に対して正規化した。
［実施例７ａ］
【０２７７】
活動性ＴＢを有する患者と、潜伏ＴＢ感染（ＬＴＢＩ）を有する健常な対照患者及びその他の感染性疾患とを識別するための、ＢＡＴＦ２、ＣＤ１７７、ハプトグロビン、免疫グロブリンＪ鎖及びガレクチン１０の転写物レベルのさらなる妥当性確認
これまでに公開されている２つの研究（Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Rozakeas F, Redford PS, Wang Y, Xu Z, Wilkinson KA, Wilkinson RJ, Kendrick Y, Devouassoux G, Ferry T, Miyara M, Bouvry D, Valeyre D, Dominique V, Gorochov G, Blankenship D, Saadatian M, Vanhems P, Beynon H, Vancheeswaran R, Wickremasinghe M, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Ho L-P, Lipman M, O'Garra A. Transcriptional blood signatures distinguish pulmonary tuberculosis, pulmonary sarcoidosis, pneumonias and lung cancers. PloS One 2013;8:e70630；Blankley, S. et al. A 380-gene meta-signature of active tuberculosis compared with healthy controls. Eur. Respir. J. (2016). doi:10.1183/13993003.02121-2015）に由来するデータにおいて、活動性肺ＴＢを有する成人患者及び活動性肺外ＴＢを有する成人患者中の診断時の血中ＢＡＴＦ２転写物レベルは、健常対照のレベルよりも有意に高かった。受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析において、ＢＡＴＦ２転写物レベルは、活動性ＴＢ症例と健常対照とを正確に識別し、曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９６及び０．９９であった（図１０Ａ−Ｄ）。
【０２７８】
公開されている別の研究に由来する成人中のデータ（Walter ND, Miller MA, Vasquez J, Weiner M, Chapman A, Engle M, Higgins M, Quinones AM, Roselli V, Canono E, Yoon C, Cattamanchi A, Davis JL, Phang T, Stearman RS, Datta G, Garcia BJ, Daley CL, Strong M, Kechris K, Fingerlin TE, Reves R, Geraci MW. Blood transcriptional biomarkers for active TB among US patients: A case-control study with systematic cross-classifier evaluation. J Clin Microbiol 2015;doi:10.1128/JCM.01990-15）においては、活動性肺ＴＢを有する成人患者中の診断時の血中ＢＡＴＦ２転写物レベルは、ＬＴＢＩを有する成人のレベルよりも有意に高く、活動性ＴＢとＬＴＢＩとを、０．９１のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した（図１０Ｅ−Ｆ）。同様に、小児におけるこれまでに公開されている研究（Anderson, S. T. et al. Diagnosis of childhood tuberculosis and host RNA expression in Africa. N. Engl. J. Med. 370, 1712-1723 (2014)）においても、診断時の活動性肺ＴＢの血中ＢＡＴＦ２転写物レベルは、ＨＩＶ陽性小児中及びＨＩＶ陰性小児中の両方で、ＬＴＢＩを有する小児のレベルと比較して有意により高かった。これらのデータにおいて、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルは、活動性ＴＢとＬＴＢＩとを、０．８７及び０．９２のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した（図１０Ｇ−Ｈ）。
【０２７９】
活動性ＴＢについて調査されている成人ＨＩＶ陽性患者及び成人ＨＩＶ陰性患者から得られた新たな（未公開）データにおいて、調査時の血中ＢＡＴＦ２レベルを、現存する微生物学的診断及び臨床判断基準に基づく活動性ＴＢの証拠を有する患者中とそうした証拠を有しない患者中とで比較した。血中ＢＡＴＦ２転写物レベルは、活動性ＴＢを有する患者において、活動性ＴＢを有することが証明されない者と比較して有意により高く、これらの群を、０．９のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した（図１１Ａ−Ｂ）。
【０２８０】
我々はすでに、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）による学習モデルを使用して、ＣＤ１７７、ハプトグロビン、免疫グロブリンＪ鎖及びガレクチン１０のレベルに基づいて、活動性ＴＢを区別することができることを示している。我々のこれまでの観察結果のさらなる妥当性を確認するために、我々は、このＳＶＭモデルの性能を、上記に記載した新たな成人ＨＩＶ陽性患者及び成人ＨＩＶ陰性患者と、別の新たなコホートの、非ＴＢ下気道感染（肺炎）を有する成人患者との識別においてテストした。４つの遺伝子のこのシグネチャーは、活動性ＴＢと肺炎とを、１のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した（図１１Ｃ−Ｄ）。
【０２８１】
総合すると、これらのデータから、全部で６２６人の患者に由来するデータの新たな分析が得られている。重要なことに、我々のさらなる妥当性確認には、小児及び成人のＨＩＶ同時感染を有する又は有しない患者の肺ＴＢ及び肺外ＴＢから得られたデータが含まれている。
［実施例７ｂ］
【０２８２】
血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの上昇は、活動性ＴＢを、疾患の発症の３カ月前に予測することができる
（Zak, D. E. et al. A blood RNA signature for tuberculosis disease risk: a prospective cohort study. Lancet Lond. Engl. (2016). doi:10.1016/S0140-6736(15)01316-1）は、血中の転写物は、活動性ＴＢの発症の前に変化し得ることを示している。したがって、我々は、活動性ＴＢの発症の前に、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルが特異的に上昇するようになるという仮説を、これらのデータにおいてテストした。我々は、２年を超えて試料採取した長期コホートの患者において、活動性ＴＢを発症した患者の区分における血中ＢＡＴＦ２転写物レベルを、活動性ＴＢ疾患の発症の前の多様な時点で、健常状態を維持した患者から得た全ての測定値と比較した。血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの有意な増加が、活動性ＴＢと診断される３〜１２カ月前に得られた試料中に明らかに認められ、さらに有意な増加が、活動性ＴＢが呈示される３カ月以前に得られた試料中に明らかに認められた（図１２Ａ）。血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの上昇は、活動性ＴＢを３カ月以内に発症した患者と健常状態を維持した患者とを、０．８３のＲＯＣ  ＡＵＣで識別した（図１２Ｂ）。
［実施例７ｃ］
【０２８３】
活動性ＴＢの治療開始から８週間後の、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの低下
ＴＢ治療により、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの低下が生じる（Roe, J. K. et al. Blood transcriptomic diagnosis of pulmonary and extrapulmonary tuberculosis. JCI Insight 1, (2016)）。我々はここで、この分析をさらに進めて、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの落下を検出することができる最も早い時点を調査するに至った。我々は、薬物感受性の活動性ＴＢを有する患者の２つのコホートからデータを同定し、これらは、長期にわたる血液試料採取が行われ、かつＴＢ治療開始から６カ月超にわたるフォローアップも行われた、治療の失敗を示唆する、活動性の疾患の早期の再発は示さなかったデータであった（Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Wilkinson KA, Oni T, Rozakeas F, Xu Z, Rossello-Urgell J, Chaussabel D, Banchereau J, Pascual V, Lipman M, Wilkinson RJ, O'Garra A. Detectable changes in the blood transcriptome are present after two weeks of antituberculosis therapy. PloS One 2012;7、Martineau AR, Timms PM, Bothamley GH, Hanifa Y, Islam K, Claxton AP, Packe GE, Moore-Gillon JC, Darmalingam M, Davidson RN, Milburn HJ, Baker LV, Barker RD, Woodward NJ, Venton TR, Barnes KE, Mullett CJ, Coussens AK, Rutterford CM, Mein CA, Davies GR, Wilkinson RJ, Nikolayevskyy V, Drobniewski FA, Eldridge SM, Griffiths CJ. High-dose vitamin D(3) during intensive-phase antimicrobial treatment of pulmonary tuberculosis: a double-blind randomised controlled trial. Lancet 2011;377:242-250）。治療前のレベルと比較すると、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルが、両方の研究において、ＴＢ治療から８週間が経過するまでに有意に低下した。治療前及び８週間後の血液試料から得られた、対をなすデータが利用可能である、これらの研究に属する患者においては、９５％が、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの落下を示した（図１２Ｅ−Ｆ）。これらのデータから、血中ＢＡＴＦ２転写物レベルを、治療開始から８週間経過した時点において、治療に対する応答のサロゲートのバイオマーカーとして使用することができることが示唆される。このことは、特に重要である；というのは、ＴＢ治療を開始した患者のおよそ５０％において、薬物に対して感受性を示すであろうことを示すデータが入手可能でないからである。この状況では、我々のデータから、ＢＡＴＦ２転写物レベルの落下を、経験的薬物治療に対する療法の応答についての証拠として使用することができることが示唆される。
［実施例７ｄ］
【０２８４】
ＢＡＴＦ２転写物レベルの上昇は、ＢＡＴＦ２タンパク質レベルの増加と関連がある
ＢＡＴＦ２は、単核球系貪食細胞中でインターフェロン（ＩＦＮ）誘導性の転写を示す（Murphy TL, Tussiwand R, Murphy KM. Specificity through cooperation: BATF-IRF interactions control immune-regulatory networks. Nat Rev Immunol 2013;13:499-509）。全身性のＩＦＮ活性が、活動性ＴＢにおいて広く認識されている（Berry MPR, Graham CM, McNab FW, Xu Z, Bloch SAA, Oni T, Wilkinson KA, Banchereau R, Skinner J, Wilkinson RJ, Quinn C, Blankenship D, Dhawan R, Cush JJ, Mejias A, Ramilo O, Kon OM, Pascual V, Banchereau J, Chaussabel D, O'Garra A. An interferon-inducible neutrophil-driven blood transcriptional signature in human tuberculosis. Nature 2010;466:973-977）。我々は、Ｔｈｐ１単核球系貪食細胞中でのＢＡＴＦ２のＩＦＮ誘導性の上方制御が、タンパク質レベルにおける発現の増加と関連があるという仮説をテストすることを試みた。我々は、最初に、Ｔｈｐ１細胞のＩＦＮによる刺激が、Ｔｈｐ１細胞中で、ＢＡＴＦ２の転写の上方制御を誘導することを確認し（図１３Ａ）、続いてまた、定量的ウエスタンブロット分析により、これらの細胞中で、ＢＡＴＦ２タンパク質レベルのＩＦＮ誘導性の増加を検出することができることも確認した（図１３Ｂ）。これらのデータから、活動性ＴＢにおける血中ＢＡＴＦ２転写物レベルの増加はまた、血液細胞中のＢＡＴＦ２タンパク質レベルの増加とも関連があり得ることが示唆される。
【０２８５】
配列
配列番号１（ＩＧＪ  ｍＲＮＡ、ヒト）
1 ttgtgattgt ttttagtttg ttagctgcct ggagtgttat tttaagaaag cagaagcacc
61 atcatttgca cactccttat agatcacaca ccttaaccct gacttttttt gctccagttt
121 ttcagaagaa gtgaagtcaa gatgaagaac catttgcttt tctggggagt cctggcggtt
181 tttattaagg ctgttcatgt gaaagcccaa gaagatgaaa ggattgttct tgttgacaac
241 aaatgtaagt gtgcccggat tacttccagg atcatccgtt cttccgaaga tcctaatgag
301 gacattgtgg agagaaacat ccgaattatt gttcctctga acaacaggga gaatatctct
361 gatcccacct caccattgag aaccagattt gtgtaccatt tgtctgacct ctgtaaaaaa
421 tgtgatccta cagaagtgga gctggataat cagatagtta ctgctaccca gagcaatatc
481 tgtgatgaag acagtgctac agagacctgc tacacttatg acagaaacaa gtgctacaca
541 gctgtggtcc cactcgtata tggtggtgag accaaaatgg tggaaacagc cttaacccca
601 gatgcctgct atcctgacta atttaagtca ttgctgactg catagctctt tttcttgaga
661 ggctctccat tttgattcag aaagttagca tatttattac caatgaattt gaaaccaggg
721 cttttttttt tttttgggtg atgtaaaacc aactccctgc caccaaaata attaaaatag
781 tcacattgtt atctttatta ggtaatcact tcttaattat atgttcatac tctaagtatc
841 aaaatcttcc aattatcatg ctcacctgaa agaggtatgc tctcttagga atacagtttc
901 tagcattaaa caaataaaca aggggagaaa ataaaactca aggactgaaa atcaggaggt
961 gtaataaaat gttcctcgca ttcccccccg cttttttttt tttttttgac tttgccttgg
1021 agagccagag cttccgcatt ttctttacta ttctttttaa aaaaagtttc actgtgtaga
1081 gaacatatat gcataaacat aggtcaatta tatgtctcca ttagaaaaat aataattgga
1141 aaacatgttc tagaactagt tacaaaaata atttaaggtg aaatctctaa tatttataaa
1201 agtagcaaaa taaatgcata attaaaatat atttggacat aacagacttg gaagcagatg
1261 atacagactt ctttttttca taatcaggtt agtgtaagaa attgccattt gaaacaatcc
1321 attttgtaac tgaaccttat gaaatatatg tatttcatgg tacgtattct ctagcacagt
1381 ctgagcaatt aaatagattc ataagcataa aaa
配列番号２（ＨＰ  ｍＲＮＡ、ヒト、転写物バリアント１）
1 agcataaaaa gaccagcaga tgccccacag cactgctctt ccagaggcaa gaccaaccaa
61 gatgagtgcc ctgggagctg tcattgccct cctgctctgg ggacagcttt ttgcagtgga
121 ctcaggcaat gatgtcacgg atatcgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc
181 acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac
241 agaaggagat ggagtataca ccttaaatga taagaagcag tggataaata aggctgttgg
301 agataaactt cctgaatgtg aagcagatga cggctgcccg aagccccccg agattgcaca
361 tggctatgtg gagcactcgg ttcgctacca gtgtaagaac tactacaaac tgcgcacaga
421 aggagatgga gtgtacacct taaacaatga gaagcagtgg ataaataagg ctgttggaga
481 taaacttcct gaatgtgaag cagtatgtgg gaagcccaag aatccggcaa acccagtgca
541 gcggatcctg ggtggacacc tggatgccaa aggcagcttt ccctggcagg ctaagatggt
601 ttcccaccat aatctcacca caggtgccac gctgatcaat gaacaatggc tgctgaccac
661 ggctaaaaat ctcttcctga accattcaga aaatgcaaca gcgaaagaca ttgcccctac
721 tttaacactc tatgtgggga aaaagcagct tgtagagatt gagaaggttg ttctacaccc
781 taactactcc caggtagata ttgggctcat caaactcaaa cagaaggtgt ctgttaatga
841 gagagtgatg cccatctgcc taccttcaaa ggattatgca gaagtagggc gtgtgggtta
901 tgtttctggc tgggggcgaa atgccaattt taaatttact gaccatctga agtatgtcat
961 gctgcctgtg gctgaccaag accaatgcat aaggcattat gaaggcagca cagtccccga
1021 aaagaagaca ccgaagagcc ctgtaggggt gcagcccata ctgaatgaac acaccttctg
1081 tgctggcatg tctaagtacc aagaagacac ctgctatggc gatgcgggca gtgcctttgc
1141 cgttcacgac ctggaggagg acacctggta tgcgactggg atcttaagct ttgataagag
1201 ctgtgctgtg gctgagtatg gtgtgtatgt gaaggtgact tccatccagg actgggttca
1261 gaagaccata gctgagaact aatgcaaggc tggccggaag cccttgcctg aaagcaagat
1321 ttcagcctgg aagagggcaa agtggacggg agtggacagg agtggatgcg ataagatgtg
1381 gtttgaagct gatgggtgcc agccctgcat tgctgagtca atcaataaag agctttcttt
1441 tgacccataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa
配列番号３（ＨＰ  ｍＲＮＡ、ヒト、転写物バリアント２）
1 agcataaaaa gaccagcaga tgccccacag cactgctctt ccagaggcaa gaccaaccaa
61 gatgagtgcc ctgggagctg tcattgccct cctgctctgg ggacagcttt ttgcagtgga
121 ctcaggcaat gatgtcacgg atatcgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc
181 acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac
241 agaaggagat ggagtgtaca ccttaaacaa tgagaagcag tggataaata aggctgttgg
301 agataaactt cctgaatgtg aagcagtatg tgggaagccc aagaatccgg caaacccagt
361 gcagcggatc ctgggtggac acctggatgc caaaggcagc tttccctggc aggctaagat
421 ggtttcccac cataatctca ccacaggtgc cacgctgatc aatgaacaat ggctgctgac
481 cacggctaaa aatctcttcc tgaaccattc agaaaatgca acagcgaaag acattgcccc
541 tactttaaca ctctatgtgg ggaaaaagca gcttgtagag attgagaagg ttgttctaca
601 ccctaactac tcccaggtag atattgggct catcaaactc aaacagaagg tgtctgttaa
661 tgagagagtg atgcccatct gcctaccttc aaaggattat gcagaagtag ggcgtgtggg
721 ttatgtttct ggctgggggc gaaatgccaa ttttaaattt actgaccatc tgaagtatgt
781 catgctgcct gtggctgacc aagaccaatg cataaggcat tatgaaggca gcacagtccc
841 cgaaaagaag acaccgaaga gccctgtagg ggtgcagccc atactgaatg aacacacctt
901 ctgtgctggc atgtctaagt accaagaaga cacctgctat ggcgatgcgg gcagtgcctt
961 tgccgttcac gacctggagg aggacacctg gtatgcgact gggatcttaa gctttgataa
1021 gagctgtgct gtggctgagt atggtgtgta tgtgaaggtg acttccatcc aggactgggt
1081 tcagaagacc atagctgaga actaatgcaa ggctggccgg aagcccttgc ctgaaagcaa
1141 gatttcagcc tggaagaggg caaagtggac gggagtggac aggagtggat gcgataagat
1201 gtggtttgaa gctgatgggt gccagccctg cattgctgag tcaatcaata aagagctttc
1261 ttttgaccca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
配列番号４（ＨＰ  ｍＲＮＡ、ヒト、転写物バリアント３）
1 agcataaaaa gaccagcaga tgccccacag cactgctctt ccagaggcaa gaccaaccaa
61 gatgagtgcc ctgggagctg tcattgccct cctgctctgg ggacagcttt ttgcagtgga
121 ctcaggcaat gatgtcacgg atatcgcaga tgacggctgc ccgaagcccc ccgagattgc
181 acatggctat gtggagcact cggttcgcta ccagtgtaag aactactaca aactgcgcac
241 agaaggagat ggagtataca ccttaaatga taagaagcag tggataaata aggctgttgg
301 agataaactt cctgaatgtg aagcagtatg tgggaagccc aagaatccgg caaacccagt
361 gcagcggatc ctgggtggac acctggatgc caaaggcagc tttccctggc aggctaagat
421 ggtttcccac cataatctca ccacaggtgc cacgctgatc aatgaacaat ggctgctgac
481 cacggctaaa aatctcttcc tgaaccattc agaaaatgca acagcgaaag acattgcccc
541 tactttaaca ctctatgtgg ggaaaaagca gcttgtagag attgagaagg ttgttctaca
601 ccctaactac tcccaggtag atattgggct catcaaactc aaacagaagg tgtctgttaa
661 tgagagagtg atgcccatct gcctaccttc aaaggattat gcagaagtag ggcgtgtggg
721 ttatgtttct ggctgggggc gaaatgccaa ttttaaattt actgaccatc tgaagtatgt
781 catgctgcct gtggctgacc aagaccaatg cataaggcat tatgaaggca gcacagtccc
841 cgaaaagaag acaccgaaga gccctgtagg ggtgcagccc atactgaatg aacacacctt
901 ctgtgctggc atgtctaagt accaagaaga cacctgctat ggcgatgcgg gcagtgcctt
961 tgccgttcac gacctggagg aggacacctg gtatgcgact gggatcttaa gctttgataa
1021 gagctgtgct gtggctgagt atggtgtgta tgtgaaggtg acttccatcc aggactgggt
1081 tcagaagacc atagctgaga actaatgcaa ggctggccgg aagcccttgc ctgaaagcaa
1141 gatttcagcc tggaagaggg caaagtggac gggagtggac aggagtggat gcgataagat
1201 gtggtttgaa gctgatgggt gccagccctg cattgctgag tcaatcaata aagagctttc
1261 ttttgaccca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
配列番号５（ＣＬＣ  ｍＲＮＡ、ヒト）
1 catttaaatt ctgcagctca gagattcaca cagaagtctg gacacaattc agaagagcca
61 cccagaagga gacaacaatg tccctgctac ccgtgccata cacagaggct gcctctttgt
121 ctactggttc tactgtgaca atcaaagggc gaccacttgc ctgtttcttg aatgaaccat
181 atctgcaggt ggatttccac actgagatga aggaggaatc agacattgtc ttccatttcc
241 aagtgtgctt tggtcgtcgt gtggtcatga acagccgtga gtatggggcc tggaagcagc
301 aggtggaatc caagaatatg ccctttcagg atggccaaga atttgaactg agcatctcag
361 tgctgccaga taagtaccag gtaatggtca atggccaatc ctcttacacc tttgaccata
421 gaatcaagcc tgaggctgtg aagatggtgc aagtgtggag agatatctcc ctgaccaaat
481 ttaatgtcag ctatttaaag agataaccag acttcatgtt gccaaggaat ccctgtctct
541 acgtgaactt gggattccaa agccagctaa cagcatgatc ttttctcact tcaatcctta
601 ctcctgctca ttaaaactta atcaaacttc acaaaaaaaa aaaaaaaaa
配列番号６（ＣＤ１７７  ｍＲＮＡ、ヒト）
1 aaaggacttg tttcctgctg aaaaagcaga aagagattac cagccacaga cgggtcatga
61 gcgcggtatt actgctggcc ctcctggggt tcatcctccc actgccagga gtgcaggcgc
121 tgctctgcca gtttgggaca gttcagcatg tgtggaaggt gtccgacctg ccccggcaat
181 ggacccctaa gaacaccagc tgcgacagcg gcttggggtg ccaggacacg ttgatgctca
241 ttgagagcgg accccaagtg agcctggtgc tctccaaggg ctgcacggag gccaaggacc
301 aggagccccg cgtcactgag caccggatgg gccccggcct ctccctgatc tcctacacct
361 tcgtgtgccg ccaggaggac ttctgcaaca acctcgttaa ctccctcccg ctttgggccc
421 cacagccccc agcagaccca ggatccttga ggtgcccagt ctgcttgtct atggaaggct
481 gtctggaggg gacaacagaa gagatctgcc ccaaggggac cacacactgt tatgatggcc
541 tcctcaggct caggggagga ggcatcttct ccaatctgag agtccaggga tgcatgcccc
601 agccagtttg caacctgctc aatgggacac aggaaattgg gcccgtgggt atgactgaga
661 actgcgatat gaaagatttt ctgacctgtc atcgggggac caccattatg acacacggaa
721 acttggctca agaacccact gattggacca catcgaatac cgagatgtgc gaggtggggc
781 aggtgtgtca ggagacgctg ctgctcctag atgtaggact cacatcaacc ctggtgggga
841 caaaaggctg cagcactgtt ggggctcaaa attcccagaa gaccaccatc cactcagccc
901 ctcctggggt gcttgtggcc tcctataccc acttctgctc ctcggacctg tgcaatagtg
961 ccagcagcag cagcgttctg ctgaactccc tccctcctca agctgcccct gtcccaggag
1021 accggcagtg tcctacctgt gtgcagcccc ttggaacctg ttcaagtggc tccccccgaa
1081 tgacctgccc caggggcgcc actcattgtt atgatgggta cattcatctc tcaggaggtg
1141 ggctgtccac caaaatgagc attcagggct gcgtggccca accttccagc ttcttgttga
1201 accacaccag acaaatcggg atcttctctg cgcgtgagaa gcgtgatgtg cagcctcctg
1261 cctctcagca tgagggaggt ggggctgagg gcctggagtc tctcacttgg ggggtggggc
1321 tggcactggc cccagcgctg tggtggggag tggtttgccc ttcctgctaa ctctattacc
1381 cccacgattc ttcaccgctg ctgaccaccc acactcaacc tccctctgac ctcataacct
1441 aatggccttg gacaccagat tctttcccat tctgtccatg aatcatcttc cccacacaca
1501 atcattcata tctactcacc taacagcaac actggggaga gcctggagca tccggacttg
1561 ccctatggga gaggggacgc tggaggagtg gctgcatgta tctgataata cagaccctgt
1621 cctttctccc agtgctggga tttctccatg tgagggggca gcaggacacc cagggatcta
1681 gcgtggggga ggagaggagc ctaatgagaa aatgaccatc taaagcctgc ccttcattgg
1741 tctggttcac gtctccaaac cagcttggat ggtagcagag acttcagggt gctccagcca
1801 aacgtatttg ggcatcacca tgacctggga ggggaagatg cactgagacg tatgaggctt
1861 ccagcctagc agccagggcc ctagcacaaa caggaggctc gccccatctg agcaactgca
1921 ggagaggtta gtacagtcat gcattgctta acgacaggga cgtgtcgtta gaaatgtgtc
1981 gttaggtgat tttatgacca taggaacatt gtagcgtgca cttacaccaa cccagatggt
2041 acagcccaat acacacccag gatggacgct agagtcgact gctcctaggc tacaagcctg
2101 cagtgcatgt tatggtgtga atactgcagg caatcttaac accacggcaa gtatttgtgc
2161 atctacacac atctaaacat agaaaaggta cagcataaat acactattgt catctcagca
2221 gaaaaaaaaa aaaaaaaa
配列番号７（ＢＡＴＦ２  ｍＲＮＡ、ヒト、転写物バリアント１）
1 gaaactgaaa cttggccctc tgggggcgga gtggccactg gggatttaaa gagctgccac
61 ttccttaggc ctccagaggg cactgggaag tcacagctgc tgagggacca ctctgctccc
121 ccgcctaagc catgcacctc tgtgggggca atgggctgct gacccagaca gaccccaagg
181 agcaacaaag gcagctgaag aagcagaaga accgggcagc cgcccagcga agccggcaga
241 agcacacaga caaggcagac gccctgcacc agcagcacga gtctctggaa aaagacaacc
301 tcgccctgcg gaaggagatc cagtccctgc aggccgagct ggcgtggtgg agccggaccc
361 tgcacgtgca tgagcgcctg tgccccatgg attgtgcctc ctgctcagct ccagggctcc
421 tgggctgctg ggaccaggct gaggggctcc tgggccctgg cccacaggga caacatggct
481 gccgggagca gctggagctg ttccagaccc cgggttcctg ttacccagct cagccgctct
541 ctccaggtcc acagcctcat gattctccca gcctcctcca gtgccccctg ccctcactgt
601 cccttggccc cgctgtggtt gctgaacctc ctgtccagct gtcccccagc cctctcctgt
661 ttgcctcgca cactggttcc agcctgcagg ggtcttcctc taagctcagt gccctccagc
721 ccagcctcac ggcccaaact gcccctccac agcccctcga gctggagcat cccaccagag
781 ggaagctggg gtcctctccc gacaaccctt cctctgccct ggggcttgca cgtctgcaga
841 gcagggagca caaacctgct ctctcagcag ccacttggca agggctggtt gtggatccca
901 gccctcaccc tctcctggcc tttcctctgc tctcctctgc tcaagtccac ttctaacctg
961 gtcttcggag ctgggttggc cccttctttg ggctcaggaa gcagccttag cacacgggcc
1021 tctcctccct cactactggg tgctgccctg cgtggctgac cagctggccc aggatttcac
1081 agtcgaaaag gaagccacca ctgatgcctc ccactgtgac aggccctgtc accaccaata
1141 tcttatttca acctcacagt tgacctgaga aatcgagatt atcactccac tttttcagac
1201 aaggaaactg aggctcaggg aagccaagtg acaagtccaa ggtcacgaag actttcttgg
1261 agcccgaaac accaccctct gctcctcctt ctcctgtcct ggcccaggca tcctaggggc
1321 tgaaatcctg gaaaccgtgg gctggtgtga gaaggtttgc atgctcagag cagagaaggg
1381 ctctccccac tgcttcgtga ttccagggcc agagccatgc agtcccagaa accccaacct
1441 agctggggca ggtccagagt ccaagccctg gtgggtagag gccaagcaga agccctgaag
1501 tggactcttg cttcccctag tagtgttttc agtgccaaga agctgaaact gtgagctgga
1561 gttggggaga ggtctggaag aggaccatct gggatttcta cagcctgggt acccatagcc
1621 acaccaaggc ttctgggaga ttctgcaggg tcagctttcc aggctgttcc caaatagctc
1681 cctgcctccc cactgcccct aaagccacag cagaagagcc attcatctca taaacaaaaa
1741 ggaagaggaa agaatgagga aggaccctgt gcaaggttat ttgcaggcag ggatgggctt
1801 gtacctgaca gcacccaccc ctgtgtggcc cccaggccct catcaccctc agacccctcc
1861 taagcagttc cctcattgct ctttggacta ggctgacagc aggaagagca gggcccatga
1921 ccgggtggaa gttcagtttt ggtgtctgct tcaagagggg gttttacact ctgattccag
1981 gacaagcact ctgaggcggg tgggggagag aaaccctggc tcttcaccca ggtttcacac
2041 acatgtaaat gaaacactat gttagtatct aacacactcc tggatacaga acacaagtct
2101 tggcacatat gtgatggaaa taaagtgttt tgcaatcttt aa
配列番号８（ＢＡＴＦ２  ｍＲＮＡ、ヒト、転写物バリアント２）
1 agcaagaaag aaggcgagag agaggagacc ggaggtctga gctgcagcca ctacacaggc
61 ctggaattct accacaggga atttggtggg tgcctctaaa gggctttaac ctgcaattaa
121 tgacatggtt gctgaatggc tcctgtgggc aagagaatag gtggtttggg ggacacacgg
181 gttggaggcc cgtgcatatc ccagcagcac gagtctctgg aaaaagacaa cctcgccctg
241 cggaaggaga tccagtccct gcaggccgag ctggcgtggt ggagccggac cctgcacgtg
301 catgagcgcc tgtgccccat ggattgtgcc tcctgctcag ctccagggct cctgggctgc
361 tgggaccagg ctgaggggct cctgggccct ggcccacagg gacaacatgg ctgccgggag
421 cagctggagc tgttccagac cccgggttcc tgttacccag ctcagccgct ctctccaggt
481 ccacagcctc atgattctcc cagcctcctc cagtgccccc tgccctcact gtcccttggc
541 cccgctgtgg ttgctgaacc tcctgtccag ctgtccccca gccctctcct gtttgcctcg
601 cacactggtt ccagcctgca ggggtcttcc tctaagctca gtgccctcca gcccagcctc
661 acggcccaaa ctgcccctcc acagcccctc gagctggagc atcccaccag agggaagctg
721 gggtcctctc ccgacaaccc ttcctctgcc ctggggcttg cacgtctgca gagcagggag
781 cacaaacctg ctctctcagc agccacttgg caagggctgg ttgtggatcc cagccctcac
841 cctctcctgg cctttcctct gctctcctct gctcaagtcc acttctaacc tggtcttcgg
901 agctgggttg gccccttctt tgggctcagg aagcagcctt agcacacggg cctctcctcc
961 ctcactactg ggtgctgccc tgcgtggctg accagctggc ccaggatttc acagtcgaaa
1021 aggaagccac cactgatgcc tcccactgtg acaggccctg tcaccaccaa tatcttattt
1081 caacctcaca gttgacctga gaaatcgaga ttatcactcc actttttcag acaaggaaac
1141 tgaggctcag ggaagccaag tgacaagtcc aaggtcacga agactttctt ggagcccgaa
1201 acaccaccct ctgctcctcc ttctcctgtc ctggcccagg catcctaggg gctgaaatcc
1261 tggaaaccgt gggctggtgt gagaaggttt gcatgctcag agcagagaag ggctctcccc
1321 actgcttcgt gattccaggg ccagagccat gcagtcccag aaaccccaac ctagctgggg
1381 caggtccaga gtccaagccc tggtgggtag aggccaagca gaagccctga agtggactct
1441 tgcttcccct agtagtgttt tcagtgccaa gaagctgaaa ctgtgagctg gagttgggga
1501 gaggtctgga agaggaccat ctgggatttc tacagcctgg gtacccatag ccacaccaag
1561 gcttctggga gattctgcag ggtcagcttt ccaggctgtt cccaaatagc tccctgcctc
1621 cccactgccc ctaaagccac agcagaagag ccattcatct cataaacaaa aaggaagagg
1681 aaagaatgag gaaggaccct gtgcaaggtt atttgcaggc agggatgggc ttgtacctga
1741 cagcacccac ccctgtgtgg cccccaggcc ctcatcaccc tcagacccct cctaagcagt
1801 tccctcattg ctctttggac taggctgaca gcaggaagag cagggcccat gaccgggtgg
1861 aagttcagtt ttggtgtctg cttcaagagg gggttttaca ctctgattcc aggacaagca
1921 ctctgaggcg ggtgggggag agaaaccctg gctcttcacc caggtttcac acacatgtaa
1981 atgaaacact atgttagtat ctaacacact cctggataca gaacacaagt cttggcacat
2041 atgtgatgga aataaagtgt tttgcaatct ttaa
配列番号９（ＢＡＴＦ２  ｍＲＮＡ、ヒト、転写物バリアント３）
1 agcaagaaag aaggcgagag agaggagacc ggaggtctga gctgcagcca ctacacaggc
61 ctggaattct accacaggga atttgcagca cgagtctctg gaaaaagaca acctcgccct
121 gcggaaggag atccagtccc tgcaggccga gctggcgtgg tggagccgga ccctgcacgt
181 gcatgagcgc ctgtgcccca tggattgtgc ctcctgctca gctccagggc tcctgggctg
241 ctgggaccag gctgaggggc tcctgggccc tggcccacag ggacaacatg gctgccggga
301 gcagctggag ctgttccaga ccccgggttc ctgttaccca gctcagccgc tctctccagg
361 tccacagcct catgattctc ccagcctcct ccagtgcccc ctgccctcac tgtcccttgg
421 ccccgctgtg gttgctgaac ctcctgtcca gctgtccccc agccctctcc tgtttgcctc
481 gcacactggt tccagcctgc aggggtcttc ctctaagctc agtgccctcc agcccagcct
541 cacggcccaa actgcccctc cacagcccct cgagctggag catcccacca gagggaagct
601 ggggtcctct cccgacaacc cttcctctgc cctggggctt gcacgtctgc agagcaggga
661 gcacaaacct gctctctcag cagccacttg gcaagggctg gttgtggatc ccagccctca
721 ccctctcctg gcctttcctc tgctctcctc tgctcaagtc cacttctaac ctggtcttcg
781 gagctgggtt ggccccttct ttgggctcag gaagcagcct tagcacacgg gcctctcctc
841 cctcactact gggtgctgcc ctgcgtggct gaccagctgg cccaggattt cacagtcgaa
901 aaggaagcca ccactgatgc ctcccactgt gacaggccct gtcaccacca atatcttatt
961 tcaacctcac agttgacctg agaaatcgag attatcactc cactttttca gacaaggaaa
1021 ctgaggctca gggaagccaa gtgacaagtc caaggtcacg aagactttct tggagcccga
1081 aacaccaccc tctgctcctc cttctcctgt cctggcccag gcatcctagg ggctgaaatc
1141 ctggaaaccg tgggctggtg tgagaaggtt tgcatgctca gagcagagaa gggctctccc
1201 cactgcttcg tgattccagg gccagagcca tgcagtccca gaaaccccaa cctagctggg
1261 gcaggtccag agtccaagcc ctggtgggta gaggccaagc agaagccctg aagtggactc
1321 ttgcttcccc tagtagtgtt ttcagtgcca agaagctgaa actgtgagct ggagttgggg
1381 agaggtctgg aagaggacca tctgggattt ctacagcctg ggtacccata gccacaccaa
1441 ggcttctggg agattctgca gggtcagctt tccaggctgt tcccaaatag ctccctgcct
1501 ccccactgcc cctaaagcca cagcagaaga gccattcatc tcataaacaa aaaggaagag
1561 gaaagaatga ggaaggaccc tgtgcaaggt tatttgcagg cagggatggg cttgtacctg
1621 acagcaccca cccctgtgtg gcccccaggc cctcatcacc ctcagacccc tcctaagcag
1681 ttccctcatt gctctttgga ctaggctgac agcaggaaga gcagggccca tgaccgggtg
1741 gaagttcagt tttggtgtct gcttcaagag ggggttttac actctgattc caggacaagc
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【０２８６】
（参考文献）
選択された参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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