(57)【要約】本発明は、癌、例えばＰＤＡＣを有する対象由来のＤＮＡを含有する試料中の大型組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを検出することを含む、エピジェネティックリプログラミングのための標的の同定方法に関する。本発明はまた、原発腫瘍における転移傾向を同定するための差次的に発現される遺伝子の使用を提供し、遺伝子は、本明細書の表中の遺伝子、酸化ストレス遺伝子、ＥＭＴ遺伝子、免疫学的応答遺伝子、ＤＮＡ修復遺伝子、グルコース代謝遺伝子、ｏｘＰＰＰ遺伝子、およびＰＧＤ遺伝子から選択される。さらに、本発明は、作用物質または化合物と接触する前後に対象からの試料を分析すること、およびエピゲノム変化に対する作用物質または化合物の効果を測定することを含む、ｏｘＰＰＰの阻害を含むエピゲノム変化に影響を及ぼすための作用物質または化合物を同定するための方法を提供する。
2019535017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピジェネティックリプログラミングのための標的の同定方法であって、
癌を有する対象由来のＤＮＡを含有する試料中の大型組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを検出することを含む、方法。
【請求項２】
前記試料は固形腫瘍由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象は、ＰＤＡＣを有する、または、ＰＤＡＣおよび／もしくはその転移を有する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出は、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３および／またはＨ４Ｋ２０Ｍｅ３の分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出は、Ｈ３Ｋ２７Ａｃおよび／またはＨ３Ｋ９Ａｃの分析を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出は、ウエスタンブロッティングによる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記検出は、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３および／またはＨ４Ｋ２０Ｍｅ３に対する抗体についてのＣｈＩＰによるものであり、任意にその後に配列決定が続く、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出は、Ｈ３Ｋ２７Ａｃおよび／またはＨ３Ｋ９Ａｃに対する抗体についてのＣｈＩＰによるものであり、任意にその後に配列決定が続く、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出は、全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子発現分析をさらに含む、請求項２〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
転移についてのドライバー変異が存在しない、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
ユークロマチンアイランドおよび／またはユークロマチンＬＯＣＫの分析をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ試料中のユークロマチンドメイン（ＥＣＤ）ＥＣＤの変化を同定する方法であって、
治療計画の前後でのＥＣＤの分析を含み、治療計画に対する応答性の予後または分析を提供する、方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ試料中のＬＯＣＫの変化を同定する方法であって、
治療計画の前後でのＬＯＣＫの分析を含み、治療計画に対する応答性の予後または分析を提供する、方法。
【請求項１５】
前記分析がコンビナトリアル法によるものである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
原発腫瘍における転移傾向を同定するための、差次的に発現される遺伝子の使用であって、
該遺伝子は、本明細書の表中の遺伝子、酸化ストレス遺伝子、ＥＭＴ遺伝子、免疫学的応答遺伝子、ＤＮＡ修復遺伝子、グルコース代謝遺伝子、ｏｘＰＰＰ遺伝子、およびＰＧＤ遺伝子から選択される、使用。
【請求項１７】
ｏｘＰＰＰ阻害を含むエピゲノム変化を逆転させるかまたはそれに影響を及ぼすための方法。
【請求項１８】
ＰＧＤＲＮＡｉを含むエピゲノム変化を逆転させるかまたはそれに影響を及ぼすための方法。
【請求項１９】
６ＡＮを含むエピゲノム変化を逆転させるかまたはそれに影響を及ぼすための方法。
【請求項２０】
エピゲノム変化に影響を与える作用物質または化合物を同定するための方法であって、
作用物質または化合物と接触させる前後に、請求項１に記載の対象由来の試料を分析し、ｏｘＰＰＰの阻害を含むエピゲノム変化に対する作用物質または化合物の効果を測定することを含む、方法。
【請求項２１】
前記方法が、腫瘍球アッセイ、マトリゲルアッセイ、器官型間質への細胞の注入からなる群から選択される方法を含む、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
それを必要とする対象を治療するのに使用するための、請求項２０に記載の方法によって同定された作用物質または化合物。
【請求項２３】
前記対象が癌を患っている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がＰＤＡＣを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記使用が転移治療および／または予防のためのものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記作用物質または化合物が、化学療法または放射線療法または他の治療計画による治療の前に、それと同時に、またはその後に、投与される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１６年１０月６日に出願された米国第６２／４０５，１５５号の優先権の利益を主張し、その全体内容が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
添付の配列表の材料は、参照により本出願に組み込まれる。付随する配列表のテキストファイル、ファイル名JHU4080_1WO_1WO_Sequence_Listingは、２０１７年１０月４日に作成され、９ｋｂである。ファイルは、Windows OSを使用しているコンピュータでMicrosoft Wordを使用して評価できる。
【０００３】
政府サポートの記述
本研究は、ＮＩＨ助成金ＣＡ３８５４８（ＡＰＦ）、国立衛生研究所助成金ＣＡ１４０５９９、ＣＡ１７９９９１（ＣＩＤ）、ＡＡＣＲ膵臓癌アクションネットワーク指導者助成金助成金（ＯＧＭ）、Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  ＧＩ  ＳＰＯＲＥ（ＯＧＭ）、アメリカ癌協会からバンダービルト−イングラム癌センター（ＯＧＭ）およびＣＡ１８０６８２（ＡＭＭ）からの助成金によって支援された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の分野
本発明は、概して遺伝子分析に関し、より具体的には癌および癌の進行および転移に対する後成的影響に関する。
【０００５】
背景情報
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の進行の進展中に、原発性腫瘍の増殖、領域の広がり、遠位転移、および患者の死亡を促進する不均一なサブクローン集団が出現する。しかしながら、転移の遺伝学は未治療の患者における原発腫瘍のそれを大部分反映しており、そしてＰＤＡＣドライバー突然変異は全てのサブクローンによって共有されている。このことは、エピジェネティックな過程が転移の間に機能的であるかもしれないという可能性を高める。ここで我々は、遠位転移の自然な進化の歴史の間に全体的なクロマチン修飾の著しいエピジェネティックなリプログラミングを検出した。ゲノムワイドマッピングは、これらの全体的な変化が、ユークロマチンおよび大型組織化クロマチンＫ９修飾（ＬＯＣＫ）ヘテロクロマチンを含む悪性形質を集合的に特定する、ゲノム全体にわたる何千もの大クロマチンドメインを標的とすることを明らかにした。これらの変化と並行して、遠位転移はペントースリン酸経路（ｏｘＰＰＰ）の酸化的分岐への依存を共進化させ、ｏｘＰＰＰ阻害は再プログラムされたクロマチンを選択的に逆転させ、腫瘍形成能を遮断した。このように、多様な代謝、エピジェネティック、および腫瘍形成プログラムが膵臓癌進行の進展の間に出現した。
【０００６】
ほとんどのヒトの癌の生存率の著しい進歩にもかかわらず、ＰＤＡＣは８％の生存率でほぼ普遍的に致死的なままである。事実、ＰＤＡＣは２０２０年までに西欧諸国における癌による死亡の第２位の原因となると予測されている。原発性ＰＤＡＣは、異なるサブクローン集団を含むことが示されている。しかしながら、これらのサブクローンは同一のドライバー突然変異を共有し、そして転移の遺伝的性質は原発腫瘍のそれを大部分反映する。さらに、サブクローンは、そのユニークなプログレッサー変異によって遺伝的に定義されているが、そのすべてがパッセンジャー事象であるとは限らないにしても大多数である。このことは、疾患の進展の自然なヒストリーにおいて、どのメカニズムが進行および転移を促進するのかについて疑問を投げかける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一つの前転移候補はエピゲノム制御である。特に、本発明者らは、特に大型組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを含むヘテロクロマチンドメイン内での、ＰＤＡＣサブクローン進展および遠位転移中の大規模エピゲノム変化の役割を調査したかった。これらの領域は、ゲノムの半分以上を占め、互いに部分的に重複し、そしてＰＤＡＣを含む多くのヒトの癌においてみられるため、大規模エピジェネティックリプログラミングのための選択可能な標的を表し得る。したがって、これらの領域内のエピゲノム異常調節が腫瘍進行の主要な選択的な力となり得ることが仮定され、一貫した転移特異的ドライバー変異の欠如を付与した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、癌を有する対象からのＤＮＡを含有する試料中の大型組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを検出することを含む、エピジェネティックリプログラミングのための標的の同定方法に関する。例えば、この方法は、ＰＤＡＣおよび／またはその転移を有するかまたは有する危険性がある対象に適用される。一態様では、検出は、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３および／またはＨ４Ｋ２０Ｍｅ３の分析を含む。他の態様では、検出は、Ｈ３Ｋ２７Ａｃおよび／またはＨ３Ｋ９Ａｃの分析を含む。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、原発腫瘍における転移傾向を同定するための差次的に発現される遺伝子の使用を提供し、ここで遺伝子は本明細書の表中の遺伝子、酸化ストレス遺伝子、ＥＭＴ遺伝子、免疫学的応答遺伝子、ＤＮＡ修復遺伝子、グルコース代謝遺伝子、ｏｘＰＰＰ遺伝子、およびＰＧＤ遺伝子から選択される。別の実施形態では、本発明は、ｏｘＰＰＰの阻害を含むエピゲノム変化に影響を与える作用物質（薬剤）または化合物を同定する方法であって、作用物質または化合物と接触する前後に対象からの試料を分析し、エピゲノム変化に対する作用物質または化合物の効果を測定することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１ａ〜ｅは、遠位転移の進展中の全体的なエピジェネティックリプログラミングに関する。図１ａは一連の免疫組織化学的染色である。図１ｂは一連の免疫組織化学的染色である。図１ｃは一連の免疫組織化学的染色である。図１ｄは一連の免疫組織化学的染色である。図１ｅは一連の免疫組織化学的染色である。図１ｆは一連のウエスタンブロット画像である。図１ｇは一連のグラフ表示データである。
【図２】図２ａ〜２ｄは、ＰＤＡＣサブクローン進化の間のクロマチンドメインのエピゲノムリプログラミングに関する。図２ａはデータのグラフ表示である。図２ｂはデータのグラフ表示である。図２ｃはデータのグラフ表示である。図２ｄはデータのグラフ表示である。図２ｅはデータのグラフ表示である。
【図３】図３ａ〜ｇは、多様な悪性特性をコードする再プログラムされたクロマチンドメインに関する。図３ａはデータのグラフ表示である。図３ｂは一連のウエスタンブロット画像である。図３ｃはデータのグラフ表示である。図３ｄは一連のウエスタンブロット画像である。図３ｅは一連のウエスタンブロット画像である。図３ｆはデータのグラフ表示である。図３ｇは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。
【図４】図４ａ〜４ｆは、遠位転移性サブクローンにおける高活性グルコース代謝および６ＰＧ枯渇に関する。図４ａはデータのグラフ表示である。図４ｂはデータのグラフ表示である。図４ｃはデータのグラフ表示である。図４ｄは概略図である。図４ｅは一連のデータのグラフ表示である。図４ｆはデータのグラフ表示である。
【図５】図５ａ〜５ｄは、遠位転移性サブクローンにおけるＰＧＤ依存性に関する。図５ａは一連のウエスタンブロット画像である。図５ｂは一連のウエスタンブロット画像である。図５ｃは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。
【図６】図６ａ〜６ｆは、再プログラムされたクロマチン、腫瘍形成能、および悪性遺伝子発現プログラムの６ＡＮによる逆転に関する。図６ａはデータの一連のグラフ表示である。図６ｂはデータの一連のグラフ表示である。図６ｃは、腫瘍形成アッセイおよび関連のグラフプロットの一連の画像である。図６ｄは一連の画像および関連するグラフプロットである。図６ｅは一連のグラフプロットである。図６ｆは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。
【図７】図７ａ〜７ｂは、遠位転移サブクローンにわたる再プログラムされたクロマチンに関する。図７ａは一連のウエスタンブロット画像である。図７ｂは一連のウエスタンブロット画像である。
【図８】図８ａ〜８ｅは、再プログラムされたヒストン修飾の特異性に関する。図８ａは一連の免疫組織化学的染色である。図８ｂはデータのグラフ表示である。図８ｃは表である。図８ｄは一連のウエスタンブロット画像である。図８ｅは一連のウエスタンブロット画像である。
【図９】図９は、ＬＯＣＫ内のヘテロクロマチン修飾の濃縮に関する一連のグラフプロットである。
【図１０】図１０ａ〜１０ｂは、ＰＤＡＣサブクローン進展の間のＬＯＣＫ中のＨ３Ｋ９Ｍｅ３のリプログラミングに関する。図１０ａはデータのグラフ表示である。図１０ｂはデータのグラフ表示である。
【図１１】図１１ａ〜１１ｂは、ＬＯＣＫ内のＤＥ遺伝子座の局所的リプログラミングに関する。図１１ａはデータの一連のグラフ表示である。図１１ｂはデータの一連のグラフ表示である。
【図１２】図１２は、ＥＣＤ内のユークロマチン修飾の濃縮に関する一連のグラフプロットである。
【図１３】図１３ａ〜１３ｅは、ＰＤＡＣ進展中の大型ＬＯＣＫのリプログラミングに関する。図１３ａはデータのグラフ表示である。図１３ｂはデータのグラフ表示である。図１３ｃはデータのグラフ表示である。図１３ｄはデータのグラフ表示である。図１３ｅはデータのグラフ表示である。
【図１４】図１４ａ〜１４ｆは、Ａ３８サブクローン間の悪性異質性に関する。図１４ａはデータのグラフ表示である。図１４ｂは一連のデータのグラフ表示である。図１４ｃは一連の免疫組織化学的染色である。図１４ｄは一連の免疫組織化学的染色である。図１４ｅは一連のウエスタンブロット画像である。図１４ｆは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。
【図１５】図１５ａ〜１５ｃは、大型ロックおよびＥＣＤを標的とした再編成に関する。図１５ａはデータの一連のグラフ表示である。図１５ｂはデータの一連のグラフ表示である。図１５ｃはデータの一連のグラフ表示である。
【図１６】図１６ａ〜１６ｂは、遠位転移にわたる６ＰＧレベルの枯渇によるグルコース代謝の増強に関する。図１６ａはデータの一連のグラフ表示である。図１６ｂはデータの一連のグラフ表示である。
【図１７】図１７ａ〜１７ｃは、グルコース代謝の６ＡＮ標的化およびＰＰＰのＰＧＤ工程に関する。図１７ａはデータの一連のグラフ表示である。図１７ｂはデータの一連のグラフ表示である。図１７ｃはデータの一連のグラフ表示である。
【図１８】図１８ａ〜１８ｃは、遠位転移サブクローンの再プログラムされたクロマチン状態の６ＡＮ選択的調節に関する。図１８ａは一連のウエスタンブロット画像である。図１８ｂは一連のウエスタンブロット画像である。図１８ｃは一連のウエスタンブロット画像である。
【図１９】図１９ａ〜１９ｄは、ＬＯＣＫ−ＥＩ領域における６ＡＮ調節遺伝子発現に関する。図１９ａはデータの一連のグラフ表示である。図１９ｂはデータの一連のグラフ表示である。図１９ｃはデータの一連のグラフ表示である。図１９ｄはデータの一連のグラフ表示である。
【図２０】図２０ａ〜２０ｃは、遠位転移サブクローンにおける６ＡＮ選択的遮断腫瘍形成に関する。図２０ａは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。図２０ｂは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。図２０ｃは、腫瘍形成アッセイおよび関連するグラフプロットの一連の画像である。
【図２１】図２１ａ〜２１ｃは、６ＡＮに応答したＴＯＰ２Ｂ遺伝子座のリプログラミングに関する。図２１ａはデータの一連のグラフ表示である。図２１ｂはデータの一連のグラフ表示である。図２１ｃはデータの一連のグラフ表示である。
【図２２】図２２は、表現型可塑性の増加を可能にする、本明細書に記載の大規模ヘテロクロマチン領域の喪失と遺伝子発現の変動性の増加とを直接結び付けるデータを示すスクリーンショットである。一例は、ＥＲＫシグナル伝達ならびに腫瘍浸潤および転移に関与する遺伝子ＳＨＣ４である。単細胞ＲＮＡ実験によって測定されたその発現変動統計的指数は、本稿ではＡ３８−５（エピジェネティックに（epigenetically）改変された、遠位転移）系では＋１．１２であり、対応するＡ３８−４１（エピジェネティックに安定、局所侵襲）系では−２．６８であり、ＦＤＲ ｐ値は０．００である。図２２は、３８−５における遺伝子に対するＬＯＣＫの喪失を示すデータを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、前転移性候補がエピゲノム調節であるという重大な発見に基づいている。本発明は、特に大型の組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを含むヘテロクロマチンドメイン内での、ＰＤＡＣサブクローン進展および遠位転移中のラージスケール（大規模）エピゲノム変化の役割の発見に基づく。これらの領域は、ゲノムの半分以上を占め、互いに部分的に重複し、そしてＰＤＡＣを含む多くのヒトの癌において見出されるので、大規模なエピジェネティックなリプログラミングのための選択可能な標的を表す。したがって、本発明者らは、これらの領域内のエピゲノム調節異常が腫瘍進行に対する主要な選択的力となり得ることを仮定し、一貫した転移特異的ドライバー変異の欠如を付与した。
【００１２】
本システムおよび方法を説明する前に、本発明は説明した特定のシステム、方法、および実験条件に限定されず、そのようなシステム、方法、および条件は変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲でのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「本方法」への言及は、本開示などを読めば当業者には明らかとなる、本明細書に記載の１つ以上の方法および／またはタイプのステップを含む。
【００１４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。
【００１５】
本発明は、癌を有する対象からのＤＮＡを含有する試料中の大型組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを検出することを含む、エピジェネティックリプログラミングのための標的の同定方法を提供する。例えば、この方法は、ＰＤＡＣおよび／またはその転移を有するかまたは有する危険性がある対象に適用される。一態様では、検出は、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３および／またはＨ４Ｋ２０Ｍｅ３の分析を含む。
【００１６】
本明細書で使用されているように、リプログラミング（初期化）は、部分的または最終的に分化した体細胞の分化状態を変化または逆転させるプロセスを指すことを意図している。体細胞のリプログラミングは、体細胞の分化状態の部分的または完全な逆転であり得る。例示的な態様において、リプログラミングは完了し、体細胞はｉＰＳ細胞にリプログラミングされる。ただし、リプログラミングは、それほど分化されていない状態への逆戻りなどのように、部分的な場合がある。例えば、最終分化細胞を多分化能細胞などのより低い分化状態の細胞に戻す。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、多能性細胞は、インビトロで長期間（１年以上）分裂する潜在能力を有し、そして３つすべての胚性胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する細胞に分化する独特の能力を有する細胞を含む。
【００１８】
本発明と共に使用するための体細胞は、初代細胞または不死化細胞であり得る。このような細胞は、動物から新たに単離されたものなどの初代細胞（非不死化細胞）であり得るか、または細胞株（不死化細胞）に由来し得る。例示的な態様では、体細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞またはマウス細胞などである。それらは、皮膚、脳、肺、膵臓、肝臓、脾臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道、および他の尿中臓器、あるいは概して生きている体細胞を含む臓器または組織からのもの、あるいは血球からのもののような、しかしこれらに限定されない、様々な器官から周知の方法によって得ることができる。本発明において有用な哺乳動物体細胞は、例として、成体幹細胞、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核球、線維芽細胞、心筋細胞、他の既知の筋肉細胞、および概して任意の生きた体細胞を含む。特定の実施形態では、線維芽細胞が使用される。本明細書中で使用される場合、体細胞という用語はまた、成体幹細胞を含むことを意図する。成体幹細胞は、特定の組織の全ての細胞型を生じさせることができる細胞である。例示的な成体幹細胞には、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞が含まれる。
【００１９】
本明細書で論じるように、メチル化パターンの変化は、分化の様々な段階で「オン」または「オフ」になる重要な因子の遺伝子発現を調節するように働く細胞の分化または脱分化の間に起こる。そのように、当業者は、多くの種類の作用物質が体細胞の１つ以上の核酸配列のメチル化状態を変化させて本発明での使用に適し得る多能性を誘導することができることを理解するであろう。
【００２０】
本明細書で使用される作用物質は、体細胞の１つまたは複数の核酸配列のメチル化状態を変化させることができる任意の作用物質を含むことを意図している。例えば、本発明の方法のいずれにも有用な作用物質は、任意の種類の分子、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチドミメティック、ビニル性ペプトイドのようなペプトイド、有機分子または有機小分子のような化学化合物であり得る。様々な態様において、作用物質は、ＤＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子、例えばマイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなどのポリヌクレオチドであり得る。
【００２１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一本鎖ＲＮＡ分子であり、その発現はメチル化によって調節されて、細胞の分化および脱分化中の遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすことが知られている。したがって、作用物質は、ｍｉＲＮＡの発現を阻害または誘導するものであり得るか、または模倣ｍｉＲＮＡであり得る。本明細書中で使用される場合、それらの内因性対応物と同じまたは実質的に同じ機能を有する、細胞に外因的に導入されたマイクロＲＮＡを意味することが意図される「模倣」マイクロＲＮＡ。
【００２２】
本発明の様々な態様では、１つまたは複数の核酸配列のメチル化状態を変える作用物質は核リプログラミング（初期化）因子である。核リプログラミング因子は、多能性を誘導する遺伝子であり得、そして多能性幹細胞の表現型のような、初期細胞のものより原始的である表現型に分化または半分化細胞を再プログラムするために利用される。当業者は、そのような遺伝子および作用物質が、体細胞のゲノムに組み込まれている１つまたは複数のそのような遺伝子の発現時、または体細胞と遺伝子の作用物質または発現産物との接触時に、体細胞から多能性幹細胞を生成することができることを理解するであろう。本明細書中で使用される場合、多能性を誘導する遺伝子は、多能性と関連し、そして遺伝子の組込みおよび発現の際に体細胞から多能性幹細胞のような低分化細胞を生成し得る遺伝子を指すことを意図する。多能性遺伝子の発現は、典型的には多能性幹細胞に限定されており、多能性幹細胞の機能的同一性にとって極めて重要である。
【００２３】
いくつかの遺伝子が多能性と関連し、そしてリプログラミング因子として本発明と共に使用するのに適していることが見出された。そのような遺伝子は当技術分野において公知であり、例として、ＳＯＸファミリー遺伝子（ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８）、ＫＬＦファミリー遺伝子（ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）、ＭＹＣファミリー遺伝子（Ｃ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ）、ＳＡＬＬ４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＳＴＥＬＬＡ、ＮＯＢＯＸ、ＰＯＵ５Ｆ１またはＳＴＡＴファミリー遺伝子が挙げられる。ＳＴＡＴファミリーメンバーは、例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂ）、およびＳＴＡＴ６を含み得る。場合によっては、多能性を誘導するために１つの遺伝子のみを使用することが可能であり得るが、概して、多能性を誘導するためには１つより多い遺伝子の発現が必要とされる。例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の遺伝子が、ポリシストロニック構築物として体細胞ゲノムに同時に組み込まれて、そのような遺伝子の同時発現を可能にし得る。例示的な局面において、多能性を誘導するために、ＯＣＴ４、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣを含む４つの遺伝子が利用される。本発明での使用に適したリプログラミング因子として知られるさらなる遺伝子は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／９９７，１４６号および米国特許出願第１２／２８９，８７３号に開示されている。
【００２４】
これらの遺伝子の全ては、ヒトを含む哺乳動物に一般的に存在し、したがって、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびサルを含むがこれらに限定されない哺乳動物由来の遺伝子などの任意の哺乳動物由来の相同体が本発明において使用され得る。さらに、野生型遺伝子産物に加えて、いくつか（例：１から１０、１から６、１から４、１から３、および１または２）のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含み、野生型遺伝子産物と同様の機能を有する変異型遺伝子産物もまた使用され得る。さらに、因子の組み合わせは野生型遺伝子または遺伝子産物の使用に限定されない。例えば、Ｍｙｃキメラまたは他のＭｙｃ変異体を野生型Ｍｙｃの代わりに使用することができる。
【００２５】
本発明は、核リプログラミング因子の特定の組み合わせに限定されない。本明細書中で考察されるように、核リプログラミング因子は１つ以上の遺伝子産物を含み得る。核リプログラミング因子はまた、本明細書中で考察されるような遺伝子産物の組み合わせを含み得る。各核リプログラミング因子は、単独でまたは本明細書に開示されるような他の核リプログラミング因子と組み合わせて使用され得る。さらに、本発明の核リプログラミング因子は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／９９７，１４６号に論じられているように、スクリーニング方法により同定することができる。さらに、本発明の核リプログラミング因子は、分化、発生、増殖などに関する１以上の因子および他の生理活性を有する因子、ならびに核リプログラミング因子として機能し得る他の遺伝子産物を含み得る。
【００２６】
核リプログラミング因子はタンパク質またはペプチドを含み得る。タンパク質は、本明細書で論じられるように遺伝子から、またはそのタンパク質と他のタンパク質、ペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態で産生され得る。タンパク質またはペプチドは、蛍光タンパク質および／または融合タンパク質であり得る。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質またはヒスチジンタグなどのペプチドとの融合遺伝子産物もまた使用され得る。さらに、ウイルスＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドとの融合タンパク質を調製して使用することにより、細胞膜を介した核リプログラミング因子の細胞内取り込みを促進することができ、それによって、融合タンパク質を培地に添加することによってのみリプログラミングの誘導を可能にし、したがって遺伝子導入などの複雑な操作を回避する。そのような融合遺伝子産物の調製方法は当業者に周知であるので、当業者は目的に応じて適切な融合遺伝子産物を容易に設計し調製することができる。
【００２７】
特定の実施形態では、作用物質は、本明細書に記載の表に列挙されている任意の遺伝子などの１つまたは複数の核酸配列のメチル化状態を変化させる。
【００２８】
それらの多能性の特徴を評価するためのリプログラミングされた体細胞の発現プロファイリングもまた行われ得る。多能性に関連する個々の遺伝子の発現もまた試験され得る。さらに、胚性幹細胞表面マーカーの発現を分析することができる。本明細書で使用されるとき、「発現」は、材料または物質の生産、ならびに材料または物質の生産のレベルまたは量を指す。したがって、特定のマーカーの発現を測定することは、発現されているマーカーの相対量または絶対量のいずれかを検出すること、または単にマーカーの有無を検出することを指す。本明細書中で使用される場合、「マーカー」とは、観察または検出され得る任意の分子をいう。例えば、マーカーは、これに限定されないが、核酸、例えば、特定の遺伝子の転写産物、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質、または小分子などを含み得る。
【００２９】
多能性幹細胞と関連することが当該分野で公知である種々の遺伝子の検出および分析は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、またはそれらの組み合わせなどの遺伝子の分析を含み得るがこれらに限定されない。ｉＰＳ細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；ＡＢＣＧ２；ステージ特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；ＳＳＥＡ−３；ＳＳＥＡ−４；ＴＲＡ−１−６０；ＴＲＡ−１−８１、Ｔｒａ−２−４９／６Ｅ；ＥＲａｓ／ＥＣＡＴ５、Ｅ−カドヘリン、β−ＩＩＩ−チューブリン、γ平滑筋アクチン（γ−ＳＭＡ）；線維芽細胞増殖因子４（Ｆｇｆ４）；クリプト（Ｃｒｙｐｔｏ）、Ｄａｘ１；ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）；Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）；ＥＳ細胞関連転写物１（ＥＣＡＴ１）；ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２；ＥＣＡＴ３；ＥＣＡＴ６；ＥＣＡＴ７；ＥＣＡＴ８；ＥＣＡＴ９；ＥＣＡＴ１０；ＥＣＡＴ１５−１；ＥＣＡＴ１５−２；Ｆｔｈｌｌ７；Ｓａｌｌ４；未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）；Ｒｅｘ１；ｐ５３；Ｇ３ＰＤＨ；ＴＥＲＴを含むテロメラーゼ；サイレントＸ染色体遺伝子；Ｄｎｍｔ３ａ；Ｄｎｍｔ３ｂ；ＴＲＩＭ２８；タンパク質１５含有Ｆボックス（Ｆｂｘ１５）；Ｎａｎｏｇ／ＥＣＡＴ４；Ｏｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；Ｅｓｒｒｂ；ＴＤＧＦ１；ＧＡＢＲＢ３；Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３；ＧＤＦ３；ＣＹＰ２５Ａ１；発達多能性関連２（ＤＰＰＡ２）；Ｔ細胞リンパ腫ブレークポイント１（Ｔｃｌ１）；ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ；ＤＰＰＡ４；並びに、多能性についての他の一般的なマーカー、例えば細胞を再プログラムするために誘導の間に使用される任意の遺伝子を含む多能性細胞マーカーをいくつでも発現することができる。ｉＰＳ細胞はまた、ｉＰＳ細胞が誘導される分化細胞に特徴的なマーカーの下方制御によっても特徴付けられ得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「分化」とは、それらの細胞に特定の特殊機能を引き受けさせ、特定の他の特殊機能単位に変化する能力を喪失させるように細胞内で起こる変化を指す。分化可能な細胞は、全能性、多能性または多分化能性細胞のいずれであってもよい。 分化は成熟した成体細胞に関して部分的または完全であり得る。
【００３１】
「分化細胞」とは、特定の分化した、すなわち非胚性の状態を有する非胚性、非単為生殖性または非多能性細胞を指す。３つの最も初期の分化細胞型は内胚葉、中胚葉、および外胚葉である。
【００３２】
多能性はまた、細胞を適切な動物、例えばＳＣＩＤマウスに注射し、分化した細胞および組織の産生を観察することによって確認することもできる。多能性を確認するさらに別の方法は、本発明の多能性細胞を用いてキメラ動物を作製し、そして導入された細胞の異なる細胞型への寄与を観察することである。キメラ動物を作製するための方法は当技術分野において周知であり、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６４２，４３３号に記載される。
【００３３】
多能性を確認するためのさらに別の方法は、分化を促進する条件下（例えば、線維芽細胞支持細胞層の除去）で培養したときに、胚様体および他の分化細胞型への細胞分化を観察することである。
【００３４】
本発明の様々な態様では、メチル化状態はＭ値に変換される。本明細書中で使用される場合、Ｍ値は、全（Ｃｙ３）およびＭｃｒＢＣ分画ＤＮＡ（Ｃｙ５）からの強度の対数比であり得る：正および負のＭ値は、それぞれメチル化および非メチル化部位と定量的に関連する。
【００３５】
本発明の様々な態様において、大型低メチル化ブロックが同定される。メチル化の測定可能な減少があるとき、低メチル化が存在する。いくつかの実施形態において、分析されたメチル化部位の５０％未満がメチル化されていない場合、ＤＮＡブロックは低メチル化されている。ＤＮＡブロック。メチル化状態を測定するための方法は、本明細書に提供されており、そして当該分野において公知である。いくつかの実施形態では、メチル化状態はＭ値に変換される。本明細書中で使用される場合、Ｍ値は、トータル（Ｃｙ３）およびＭｃｒＢＣ分画ＤＮＡ（Ｃｙ５）からの強度の対数比であり得る：正および負のＭ値は、それぞれメチル化および非メチル化部位と定量的に関連する。Ｍ値は実施例に記載のように計算される。いくつかの実施形態では、−０．５〜０．５の範囲のＭ値は、対照プローブによって定義されるように非メチル化部位を表し、０．５〜１．５の値はメチル化のベースラインレベルを表す。
【００３６】
遺伝子のメチル化状態を分析するための多数の方法が当該分野で公知であり、本発明の方法において使用されて、１つ以上のＤＭＲの低メチル化または高メチル化のいずれかを同定し得る。様々な実施形態において、本発明の方法におけるメチル化状態の決定は、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、メチル化特異的ＰＣＲ、バイサルファイトパイロシーケンシング、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限分析、マイクロアレイ技術、およびプロテオミクスからなる群から選択される１つ以上の技術によって行われる。本明細書の実施例に例示されるように、メチル化の分析は重亜硫酸塩ゲノム配列決定によって実施することができる。亜硫酸水素塩処理は、非メチル化であるが、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するＤＮＡを修飾する。亜硫酸水素塩処理は、ＭＥＴＨＹＬＥＡＳＹ亜硫酸水素塩修飾キット（Human Genetic Signatures）を使用して実施することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、重亜硫酸塩パイロシーケンシング（これは、複数の連続したＣｐＧ部位を個々に高精度および再現性で定量的に測定する、ＤＮＡメチル化の配列決定に基づく分析）が使用され得る。
【００３８】
プライマーによって結合された部位およびプライマーからの伸長方向に応じて、上記のプライマーを異なる対で使用することができることが認識されるであろう。さらに、追加のプライマー、特に本明細書に開示されるプライマーに対応するプライマーを用いて分析されたものと同じメチル化部位の分析を可能にするプライマーを低メチル化ブロック内で同定できることが認識されよう。
【００３９】
変化したメチル化は、メチル化における検出可能な差異を同定することによって同定することができる。例えば、低メチル化は、亜硫酸水素塩処理後にウラシルまたはシトシンが特定の位置に存在するかどうかを同定することによって決定することができる。亜硫酸水素塩処理後にウラシルが存在する場合、その場合、残渣はメチル化されていない。メチル化の測定可能な減少があるとき、低メチル化が存在する。
【００４０】
代替の実施形態では、低メチル化ブロックのメチル化を分析する方法は、ＤＭＲ内のメチル化残基に特異的なプライマー対を用いた増幅を含み得る。これらの実施形態において、少なくとも１つのプライマーの選択的ハイブリダイゼーションまたは結合は、標的ＤＮＡ配列のメチル化状態に依存する（Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9821 (1996)）。例えば、増幅反応は重亜硫酸塩処理に先行することができ、そしてプライマーは重亜硫酸塩処理に依存する様式で標的配列に選択的にハイブリダイズすることができる。例えば、１つのプライマーは、標的配列の１つ以上の塩基が亜硫酸水素塩処理によって改変され、それによってメチル化された標的配列に特異的である場合にのみ、標的配列に選択的に結合することができる。
【００４１】
低メチル化ブロックのメチル化状態を決定するための他の方法が当該分野で公知であり、これにはアレイベースのメチル化分析およびサザンブロット分析が含まれるがこれらに限定されない。
【００４２】
増幅反応を使用する方法、例えば１つ以上の低メチル化ブロックの低メチル化または高メチル化を検出するための上記の方法は、リアルタイム検出増幅手順を利用することができる。例えば、この方法は分子ビーコン技術(Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14: 303 (1996))またはＴａｑｍａｎ（商標）技術(Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7276 (1991))を利用することができる。
【００４３】
また、メチル軽鎖（その全体が参照により本明細書に組み込まれるTrinh et al., Methods 25(4):456-62 (2001)）、メチル重鎖(Epigenomics, Berlin, Germany)、またはＳＮｕＰＥ（一塩基プライマー伸長）（例えば、Watson et al., Genet Res. 75(3):269-74 (2000)を参照されたい。）も、ＤＭＲの変化したメチル化を同定することに関する本発明の方法において使用することができる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「選択的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」とは、関連するヌクレオチド配列を無関係のヌクレオチド配列から区別し得る、中程度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな生理学的条件下でのハイブリダイゼーションをいう。
【００４５】
当技術分野において公知のように、核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に依存して変化するであろう。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（たとえば、相対ＧＣ：ＡＴコンテンツ）、および核酸の種類、例えばオリゴヌクレオチドまたは標的核酸配列がＤＮＡまたはＲＮＡであるかどうかは、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮することができる。追加の考慮事項は、核酸の１つが、例えばフィルター上に固定化されているかどうかである。適切なストリンジェントな条件を選択するための方法は、経験的に決定され得るか、または種々の式を使用して推定され得、そして当該分野において周知である（例えば、Sambrook et al., 上記参照,1989）。
【００４６】
漸進的により高いストリンジェントな条件の例は以下の通りである：ほぼ室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェントな条件）；約４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度のストリンジェントな条件）；約６８℃で０．１ＸＳＳＣ（高ストリンジェントな条件）。洗浄は、これらの条件のうちの１つのみ、例えば高ストリンジェントな条件を使用して実施することができ、または各条件を例えば１０〜１５分間、上に列挙した順序で使用することができ、記載されているステップのいずれかまたはすべてを繰り返す。
【００４７】
評価されているＤＭＲに関連するＤＮＡのメチル化の程度は、評価されているＤＭＲと関連しており、異なる程度のＤＮＡメチル化を示しているゲノムＤＮＡを同定し識別するためのプローブによる蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定することができる。ＦＩＳＨは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、de Capoa et al. (Cytometry. 31:85-92, 1998)に記載されている。この場合、生物学的試料は、典型的には、短期間の培養を行うのに十分な全細胞または核を含むものである。通常、試料は、１０〜１０，０００個、または例えば１００〜１０，０００個の全細胞を含む試料であろう。
【００４８】
さらに、上記のように、メチルライト（methyl light）、メチルヘビー（methyl heavy）、およびアレイベースのメチル化分析は、次に非メチル化およびメチル化ＤＮＡに対応する様々な形態のオリゴヌクレオチド標的配列のマイクロアレイに対して、ＰＣＲ増幅される亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを用いることによって実施できる。
【００４９】
用語「核酸分子」は、ホスホジエステル結合によって一緒に連結されているデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために本明細書で広く使用されている。そのように、用語「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖であり得るＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むことを意味する。さらに、本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、細胞から単離することができる天然に存在する核酸分子、ならびに、例えば、化学合成の方法により、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるような酵素的方法により調製することができる合成分子を含み、種々の実施形態において、ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド類似体または骨格結合を含み得る。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」もまた、核酸分子を指すために本明細書中で使用される。これらの用語の使用によって互いからのまたは「核酸分子」からの特定の区別は意図されていないが、用語「ポリヌクレオチド」は、概して、ポリペプチドまたはそのペプチド部分をコードする核酸分子に関して使用され、一方、用語「オリゴヌクレオチド」は、概して、プローブ、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子などとして有用なヌクレオチド配列に関して用いられる。もちろん、「オリゴヌクレオチド」もまたペプチドをコードし得ることが認識されるだろう。そのため、さまざまな用語は主に説明の便宜上使用されている。
【００５１】
天然に存在するヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは化学的に合成することができ、または鋳型として適切なポリヌクレオチドを用いて組換えＤＮＡ法を用いて製造することができる。対照的に、ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド類似体または共有結合を含むポリヌクレオチドは一般に化学合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼのような酵素は、特定の種類のヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み込むことができ、したがって適切な鋳型からそのようなポリヌクレオチドを組み換え的に生成するために使用することができる。
【００５２】
別の態様では、本発明は本発明の方法を実施するのに有用なキットを含む。キットに含まれる成分は、メチル化を検出するため、またはメチル化の程度もしくはメチル化の変化を測定するために使用される特定の分析技術、およびアッセイされる１つ以上の低メチル化ブロックを含む多数の要因に依存する。
【００５３】
したがって、本発明は、本発明の１つ以上の低メチル化ブロックのメチル化状態を決定するためのキットを提供する。
【００５４】
ゲノム規模でＤＮＡｍを調べるために、遺伝子およびＣｐＧ含有量に対する位置を含むＤＮＡｍについての先入観にとらわれないマイクロアレイに基づく方法である、包括的なハイスループットアレイベース相対メチル化（ＣＨＡＲＭ）分析を行った。Ｍで示される、得られたＤＮＡｍの定量的測定値は、トータル（Ｃｙ３）およびＭｃｒＢＣ分画ＤＮＡ（Ｃｙ５）からの強度の対数比である：正および負のＭ値は、それぞれメチル化および非メチル化部位と定量的に関連する。各試料について、ｉＰＳ細胞、親の体細胞、およびＥＳ細胞のゲノム全体で約４６０万のＣｐＧ部位を、古典的に定義された全てのＣｐＧアイランド、ならびにゲノムの全ての非反復低ＣｐＧ密度ゲノム領域を含む、カスタムデザインのＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  ＨＤ２マイクロアレイを用いて分析した。メチル化されていない領域が平均して０の値と関連するように、これらのＭ値を標準化するために４，５００の対照プローブを含めた。ＣＨＡＲＭは、他の方法（例えば、プロモーター中）によって同定された既知のメチル化マークに対して９０％の感度で１００％特異的であり、従来の領域事前選択によって同定されなかったゲノムの約半分を含む。ＣＨＡＲＭの結果はまた、定量的バイサルファイトパイロシークエンス分析によっても広く裏付けられている。
【００５５】
本発明の一態様では、メチル化密度は核酸領域について測定される。密度は、例えば、ＤＮＡの低メチル化ブロック領域の指標として使用され得る。約０．２〜０．７、約０．３〜０．７、０．３〜０．６、または０．３〜０．４、または０．３の密度は、低メチル化ブロックを示し得る（計算されたＤＮＡメチル化密度は、各試料について配列決定されたＣｐＧの総数で割ったメチル化ＣｐＧの数である）。メチル化密度を決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、標的ＣｐＧアイランドのメチル化密度を決定するための方法は、Luo et al. Analytical Biochemistry, Vol. 387:2 2009, pp. 143-149により確立されている。この方法では、バイサルファイト変換サンプルＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物のセットをスポットすることによってＤＮＡマイクロアレイを調製した。この方法は、一連の所与の遺伝子の領域メチル化密度の定量分析を可能にするだけでなく、大量の臨床試料についてのメチル化密度の情報、ならびにｉＰＳ細胞の生成および検出に関する本発明の方法における使用も提供し得る。他の方法は当技術分野において周知である（例えば、Holemon et al., BioTechniques, 43:5, 2007, pp. 683-693）。
【００５６】
本発明は、機能的構成要素および様々な処理ステップに関して部分的に説明されている。そのような機能構成要素および処理ステップは、指定された機能を実行し、さまざまな結果を達成するように構成された任意の数の構成要素、動作、および技法によって実現され得る。例えば、本発明は、様々な生物学的試料、バイオマーカー、要素、材料、コンピュータ、データソース、記憶システムおよび媒体、さまざまな機能を実行できる、情報収集技術およびプロセス、データ処理基準、統計分析、回帰分析などを使用することができる。さらに、本発明は医療診断の文脈で説明されているが、本発明は任意の数の用途、環境およびデータ分析と併せて実施することができ、本明細書に記載のシステムは、本発明の単なる例示的用途である。
【００５７】
本発明の様々な態様による分析方法は、例えばコンピュータシステム上で動作するコンピュータプログラムを使用して、任意の適切な方法で実施することができる。本発明の様々な態様による例示的な分析システムは、コンピュータシステム、例えばプロセッサとランダムアクセスメモリ、例えば、リモートアクセス可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピューター、ワークステーションなどとを備える従来のコンピュータシステムと併せて実施することができる。コンピュータシステムはまた、大容量記憶システムおよびユーザインターフェースなどの追加の記憶装置または情報記憶システム、例えば従来のモニタ、キーボードおよび追跡装置を適切に含む。しかしながら、コンピュータシステムは、任意の適切なコンピュータシステムおよび関連機器を含み得、そして任意の適切な方法で構成され得る。一実施形態では、コンピュータシステムはスタンドアロンシステムを含む。別の実施形態では、コンピュータシステムはサーバとデータベースを含むコンピュータのネットワークの一部である。
【００５８】
バイオマーカー情報を受信し、処理し、そして分析するために必要とされるソフトウェアは、単一の装置において実施されてもよく、または複数の装置において実施されてもよい。ソフトウェアは、情報の記憶および処理がユーザに対して遠隔的に行われるようにネットワークを介してアクセス可能であり得る。本発明の様々な態様による分析システムおよびその様々な要素は、データ収集、処理、分析、報告および／または診断などのバイオマーカー分析を容易にするための機能および動作を提供する。本分析システムは、メチル化および試料に関する情報を維持し、分析および／または診断を容易にする。例えば、本実施形態では、コンピュータシステムは、エピゲノムに関する情報を受信、格納、検索、分析、および報告することができるコンピュータプログラムを実行する。コンピュータプログラムは、生データを処理して補助データを生成するための処理モジュール、ならびに生データおよび補助データを分析して疾患状態モデルおよび／または診断情報を生成するための分析モジュールなど、様々な機能または動作を実行する複数のモジュールを含み得る。
【００５９】
分析システムによって実行される手順は、分析および／または疾患診断を容易にするための任意の適切なプロセスを含み得る。一実施形態では、分析システムは、疾患状態モデルを確立し、かつ／または患者の疾患状態を判定するように構成される。疾患状態を決定または同定することは、診断を実行することなど、疾患に対する患者の状態に関する任意の有用な情報を生成し、診断に役立つ情報を提供し、病気の病期や進行を評価し、疾患に対する感受性を示す可能性がある状態を特定し、さらなる検査が推奨される可能性があるかどうかを特定し、１つ以上の治療プログラムの有効性を予測および／または評価すること、あるいはそうでなければ患者の病状、疾患の可能性、または他の健康面を評価することを含み得る。
【００６０】
分析システムはまた、様々な追加のモジュールおよび／または個々の機能を提供し得る。例えば、分析システムはまた、例えば処理および分析機能に関する情報を提供するための報告機能も含み得る。分析システムはまた、アクセス制御や他の管理機能の実行など、さまざまな管理機能および管理機能を提供することができる。
【００６１】
分析システムは、生のバイオマーカーデータおよび／または対象に関するさらなる対象データに基づいて、疾患状態モデルを適切に生成し、および／または患者に診断を提供する。データは任意の適切な生物学的サンプルから取得され得る。
【００６２】
以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図しない。それらは使用され得るものの典型的なものであるが、他の手順、方法論、または当業者に知られている技術が代わりに使用されてもよい。
実施例１
ラージスケールエピゲノムのリプログラミングは、膵癌進行の進展中の同化グルコース代謝を遠位転移に結びつける
【００６３】
背景と仮説
先に論じたように、１つの前転移候補はエピゲノム調節である。特に、大型組織化ヘテロクロマチンリジン（Ｋ）−９修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）および大型ＤＮＡ低メチル化ブロックを含む、特にヘテロクロマチンドメイン内での、ＰＤＡＣサブクローンの進展および遠位転移中のラージスケールエピゲノム変化の役割を調査したいと考えた。これらの領域は、ゲノムの半分以上を占め、互いに部分的に重複し、そしてＰＤＡＣを含む多くのヒトの癌において見出されるので、ラージスケールエピジェネティックリプログラミングのための選択可能な標的を表し得る。したがって、本発明者らは、一貫した転移特異的ドライバー変異がないことを考えると、これらの領域内のエピゲノム異常調節が腫瘍進行の主要な選択的力となり得ると仮定した。
結果
遠位転移の進展の間の全体的なエピジェネティック状態のリプログラミング
【００６４】
この仮説を検証するために、我々は最初にエピジェネティックな修飾の大規模な（ラージスケール）変化がｉｎ  ｖｉｖｏで患者試料のＰＤＡＣ進展中に検出できるかどうかを測定した。我々は以前に迅速な剖検によって個々の患者から一致した原発性（プライマリー）および転移性ＰＤＡＣ病変を収集し、そしてこれらの試料のサブセットにおいて突然変異についての全エキソームとサンガー配列、再編成のためのペアエンド配列、および全ゲノム配列によるサブクローン進展の遺伝的進行を報告した。これらの試料は、腫瘍の進展を研究するのに特に適したユニークなリソースを表し、それらは同じ患者からの一致した原発性および転移性腫瘍から集められたので、それぞれが深く順序付けられ、個々のサブクローンが識別されており、転移特異的なドライバー変異は存在しない。これらの患者から、サブクローン進展の間の全体的なエピゲノムのリプログラミングを試験するために、多様なＰＤＡＣ試料の大きなパネルを選択した。表１にまとめたように、これらの試料は、ＰＤＡＣ進展の多様性（原発腫瘍の異なる領域が腹膜および遠位転移と対になっている）を表しているために選択され、各試料は、配列確認された（サブ）クローン集団を表し、患者は治療されたものと治療されていないものの両方であり、転移特異的なドライバーが存在しない各患者におけるすべてのサブクローンによってドライバー変異が共有され、ホルマリン固定組織はイムノアッセイに利用可能であり、凍結組織は全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定に利用可能であり、細胞株は他の全ての実験に利用可能であった。
【００６５】
表１：ＬＯＣＫエピジェネティック変化を伴うＰＤＡＣ試料の特徴
【表１−１】
2019535017.tif 000003
【表１−２】
2019535017.tif 000004
【表１−３】
2019535017.tif 000005
【００６６】
表１：組織および細胞株試料にわたるＨ３Ｋ９およびＤＮＡメチル化変化の概要。局所領域的広がり（腹膜／腹水）を有する患者からの試料は、複数のアッセイによって示されるように、比較的高い全体的Ｈ３Ｋ９／ＤＮＡメチル化を示し（右２列）、一方、遠位転移を有する患者からの試料は全てのアッセイにわたってメチル化の減少を示し、これは示されるように原発腫瘍において開始された。
【００６７】
略語：Ｇｅｍ．（ゲムシタビン）、Ｂｅｖ．（ベバシズマブ）、Ｔａｘｏｐｒｅｘ．（タキソプレキシン）、Ｔｒｏｘ．（トロキサシタビン）。
【００６８】
上付きの注釈
ａクローン由来は、以前に公表された（参考文献１）および他の未公表の（本文脚注１）全ゲノム配列決定データからの系統学的推定値を表す。
ｂウエスタンブロットデータは、Ａ３８Ｐｅｒ対照（cont.）と比較したＨ３Ｋ９Ｍｅ２シグナルのデンシトメトリー（濃度測定）パーセンテージを反映している。ウエスタンブロットを補足図１に示し、絶対濃度測定値を図の凡例に含まれるｐ値と共に図１ｇに示す。補足データファイル２のＭｂおよびＲＰＫＭ値で詳述されているように、ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、Ａ３８Ｐｅｒ対照（cont.）と比較してＨ３Ｋ９Ｍｅ２が減少したＬＯＣＫ Ｍｂの割合を反映している。補足図１および２に詳述されるように、ＷＧＢＳデータは、Ａ１２４Ｐｒ対照（組織）およびＡ３８Ｐｅｒ対照（細胞株）に対するＬＯＣＫ内のＤＮＡメチル化の割合を反映する。
ｃ化学療法治療を受けた患者からのこの転移は、ＳＭＡＲＣＡ２において、不明瞭な意義のミスセンス変異を有していた。
ｄこれらの細胞株は、迅速剖検コホートからのものではなく、ドライバーの突然変異を過小評価している可能性がある、以前に公表された遺伝子型決定データに依存している。
ｅＡ３２Ｏ細胞株は、広範囲の肺転移を含む非常に侵攻性のある疾患を有する患者の大網腫瘤病変から単離され、他の遠位（肺／肝臓）転移性サブクローンと同様の所見を示した。
【００６９】
我々は、ホルマリン固定組織試料（合計１６のユニークにマッチした、配列確認された腫瘍切片、表１）から分析を始めた。我々は、サブクローン進展の間の選択可能な標的であるかもしれない、ヘテロクロマチンドメイン（Wen et al.（Large histone H3 lysine 9 dimethylated chromatin blocks distinguish differentiated from embryonic stem cells. Nat Genet 41, 246-50 (2009)）およびMcDonald et al.（Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition.Nat Struct Mol Biol 18, 867-74 (2011))で定義されているＬＯＣＫを含む）からの全体的な変化を検出するために、ヘテロクロマチン修飾（例えば、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３）に対する免疫染色を行った。免疫染色は、腹膜癌腫症を呈した患者からの原発腫瘍および腹膜転移サブクローンの両方にわたって、ＰＤＡＣ細胞核のびまん性陽性（＞８０％）のＨ３Ｋ９Ｍｅ２／３染色を明らかにした（図１ａ，ｂおよび表１）。対照的に、遠位転移性疾患を呈した患者からの試料は、サブクローン進展中にＨ３Ｋ９Ｍｅ２／３の進行性の喪失を示した。これは、原発腫瘍における不均一（陽性＋陰性ＰＤＡＣ核の混合物）染色、続いて対をなす転移におけるびまん性陰性（＜２０％）染色または不均一染色の保持のいずれかとして現れた（図１ｃ、ｄおよび表１）。我々はまた、腹膜転移と遠位転移の両方を播種した配列検証された原発腫瘍サブクローンが利用可能であった患者からのサブクローン進展中に同様の結果を観察した。腹膜前駆体は、新生物を創設したクローンに見られるように、ヘテロクロマチン修飾のびまん性に強い染色を保持していた（図１ｅ、上の２つのパネル）。対照的に、遠位転移を播種した原発性腫瘍サブクローンにおいて染色パターンの細胞間異質性が出現し、続いて遠位転移部位における染色のびまん性喪失が続いた（図１ｅ、下の２つのパネル）。このように、遠位転移性疾患を有する患者からの試料にわたる集団的発見は、リプログラミングが原発腫瘍のサブクローン進展の間に開始され、そしてこれらの変化が遠位転移部位自体に腫瘍を形成するサブクローンにおいて受け継がれるかさらには強調されることを示唆する。
【００７０】
我々の分析をより多くの患者サンプルに拡張しそして我々の発見の普遍性を試験するために、我々は上記の患者組織に対応するサブセットを含む８人の患者から集めた１２の低継代細胞株を用いた（表１）。細胞株は、９つの遠位転移サブクローン、図１ｅに提示された患者に対応する対の肝臓および肺転移を伴う腹膜転移、および同じ患者から収集された肺転移と一致する２つの（未創始者）原発性腫瘍サブクローンから単離された。重要なことに、９つの遠位転移細胞株のうち６つが以前に全エキソーム配列決定され、細胞株に存在する突然変異はサンガー配列決定によって検出されるように対応する患者組織にも存在した。急速剖検細胞株は遠位転移を呈した患者から大部分が分離されていたため、他の局所疾患の発生源からの追加のＰＤＡＣサンプルも含まれた：腹膜癌腫症患者２人からの悪性腹水（ＡｓＰＣ１、ＨＰＡＦＩＩ）、および遠位転移のない長期生存者からの原発腫瘍（Ｃａｐａｎ２）。
【００７１】
次に、患者組織に見られるようなクロマチンの全体的な変化が細胞株で維持されているかどうかを調べた。これはゲノムワイドなリプログラミング事象を反映している可能性がある。我々は、よく理解されている機能を有する８つのヒストン修飾についてウエスタンブロットを行うことから始めた。ウェスタンブロットによる局所領域ＰＤＡＣサンプル（Ａ３８Ｐｅｒ、ＡｓＰＣ１、ＨＰＡＦＩＩ、Ｃａｐａｎ２）の比較は、患者の組織で観察された腹膜癌腫症の進展と同様に、試験したすべてのヒストン修飾にわたって最小または非反復的な全体的変化を示した（図７ａ）。対照的に、遠位転移は、図１ｅに提示された患者に対応する対の腹膜（Ａ３８Ｐｅｒ）および遠位転移（Ａ３８Ｌｖ、Ａ３８Ｌｇ）サブクローンの間を含む、特定のヒストン残基（図７ｂ）を標的とするメチル化およびアセチル化の著しいリプログラミングを示した（図１ｆ）。これは、遠位転移におけるＨ３Ｋ９ＡｃおよびＨ３Ｋ２７Ａｃの高アセチル化と共役したＨ３Ｋ９Ｍｅ２／３およびＨ４Ｋ２０Ｍｅ３の再発性の減少として現れた（図１ｇおよび表１に要約され、図７ｂに示される）。Ｈ３Ｋ９メチル化は、ＬＯＣＫを含む広いゲノム領域にわたってヘテロクロマチックエピジェネティック状態をコードするために重要であり、Ｈ３Ｋ２７Ａｃは遺伝子調節エレメントをコードする。我々は、サンプル間でＨ３Ｋ２７Ｍｅ３またはＨ３Ｋ３６Ｍｅ３において一貫した／反復する変化が観察されず（図１ｇ、図７）、そして再プログラムされた修飾自体は増殖速度に依存せず、ＰＤＡＣ化学療法によって誘発され得ないので（図８）、リプログラミングは特異的に見えた。最終的に、局所（腹膜）拡散のない状態で広範囲の遠位転移を示した患者から採取した、合致した原発腫瘍（Ａ１３Ｐｒ１、Ａ１３Ｐｒ２）および遠位転移（Ａ１３Ｌｇ）サブクローンから単離した細胞株のウエスタンブロットも、遠位転移において保持されていた原発腫瘍サブクローン間のＨ３Ｋ９Ｍｅ３およびＨ４Ｋ２０Ｍｅ３において減少を示し（図７ｃ）、遠位転移の進展中にリプログラミングが原発腫瘍において開始したことをさらに示唆している。したがって、集団的な３０人の患者サンプルにわたるインビボ組織およびインビトロ細胞培養の所見は、全体的なエピジェネティック状態が遠位転移の進展の間に再プログラムされたことを強く示唆した。
【００７２】
ＰＤＡＣサブクローン進展のエピゲノムのランドスケープ
我々は次に、ＰＤＡＣゲノム全体にわたって再プログラムされたクロマチン修飾の位置をマッピングすることを望んだ。この目的のために、我々は、ＰＤＡＣ進展のエピジェネティックなランドスケープをクロマチン免疫沈降とそれに続くハイスループットシークエンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）を用いてよく理解された機能を有するヒストン修飾について包括的にマッピングした（ヘテロクロマチン：Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３；ユークロマチン：Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３）。サブクローン進展と悪性進行の多様性をとらえるために、同じ患者からの肺転移（Ａ３８Ｌｇ）合致した腹膜転移（Ａ３８Ｐｅｒ）、および同じ患者からの肺転移（Ａ１３Ｌｇ）にも合致した２つの原発性腫瘍サブクローン（Ａ１３Ｐｒ１、Ａ１３Ｐｒ２）を含む、合致したサブクローンから単離された配列検証細胞株に対してＣｈＩＰ−ｓｅｑを行った。各患者について、全てのサブクローンは、新しい転移特異的ドライバーを獲得することなく同一のドライバー遺伝子突然変異を共有した（表１）。合致する遺伝子発現の変化を同定するために、ＲＮＡ−ｓｅｑも並行して行った。最終的に、本発明者らは、図１に示すホルマリン固定腫瘍切片のサブセットに対応した、これらの細胞株および凍結腫瘍組織にわたる全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定（ＷＧＢＳ）を用いてこれらのデータセットを補完した。ＥＮＣＯＤＥガイドライン（補足データ１）で推奨されているように、各ＣｈＩＰ実験について＞１５．０ｘ１０６（中央値：３２．３ｘ１０６）のユニークアラインメントリードを含め、１９．３ｘ１０９のユニークアラインメントシークエンスリードで１８３データセットを生成した。実験は生物学的複製として実施し、複製間では良好な相関を示した（中央相関係数：０．９５６；範囲：０．７４６〜０．９９７、補足データ１）。我々の知る限りでは、これはヒトの癌の進展的進行の間のエピジェネティックなリプログラミングの最初の包括的なゲノムワイド解析を表している。
【００７３】
全体的なクロマチン修飾は腹膜癌腫症の進展の間に安定して受け継がれたが、遠位転移の間にリプログラミングが出現したので、我々は腹膜サブクローンを遠位転移サブクローンおよびそれらの合致する原発腫瘍サブクローンと比較することから始めた。この分析は、ＰＤＡＣゲノムの＞９５％をカバーする何千ものクロマチンドメインを標的とした、驚くほどかつ予想外の程度のゲノムワイドなエピジェネティックリプログラミングを明らかにした。これらには、ゲノムの約半分を占める大組織化クロマチンリジン（Ｋ）修飾ドメイン（ＬＯＣＫ）に対応するヘテロクロマチン領域、遺伝子が豊富なユークロマチンドメイン（ＥＣＤ）、および他のヘテロクロマチン領域と比較して、独自に再プログラムされた非常に大型のＬＯＣＫドメインの小さなサブセットが含まれる。集団ドメインの特徴は補足データ２に詳述されており、実験にわたる包括的な統計分析は補足データ３に示されている。
【００７４】
我々は最初に、ユークロマチン修飾の枯渇を伴うＨ３Ｋ９Ｍｅ２およびＨ３Ｋ２７Ｍｅ３の強力で広範な濃縮によって定義されるヘテロクロマチンドメインを分析した（図２ａ、図９、および補足的方法）。何千ものヘテロクロマチンドメインが各試料で検出され（範囲：２，００８〜３，１６６）、各サブクローンのゲノムの半分以上を占める大きなブロック様セグメント（中央値長：２３２Ｋｂ〜３１１Ｋｂ）に編成された（平均：ゲノムの６１．７％、範囲：５４．１〜７１．７％、補足データ２）。複数の閾値にわたる感度分析によって測定されるように、ドメインコール（ドメイン呼び出し）は頑強であり（補足データ３）、コールされたヘテロクロマチン領域自体は以前に報告されたＬＯＣＫヘテロクロマチンドメインと有意に重複し（平均：７６．７±１６．９％重複；置換試験によりｐ＜０．０１）、これは、ヘテロクロマチンが主にＬＯＣＫに対応していることを示唆している。免疫染色（図１ａ〜ｄ）およびウエスタンブロットデータ（図１ｅ、ｆ）と同様に、腹膜サブクローンにおいてＬＯＣＫを横切って強いＨ３Ｋ９Ｍｅ２濃縮が検出されたが、これらの同じ領域は、遠位転移およびそれらの対応する原発腫瘍サブクローンにおいて、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２の全体的減少を示した（図２ａ、平均：５９１Ｍｂ／１，４７０Ｍｂ；範囲：２０４−１，１１０Ｍｂ／１，４７０Ｍｂ；カイ二乗によりｐ＜２．２ｅ−１６；表１および補足データ３）。対照的に、ウエスタンブロットの結果（図１ｇ）と同様に、グローバルレベルの高いＨ３Ｋ２７Ｍｅ３が全てのサブクローンにわたってこれらの領域から検出された（図２ａ）。我々はまた、ＬＯＣＫにおけるグローバルＨ３Ｋ９Ｍｅ３リプログラミングの患者特異的パターンを検出した（図１０）。患者Ａ３８では、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３は、Ａ３８Ｐｅｒと比較して、Ａ３８Ｌ９ＬＯＣＫにほとんど存在しなかった（１８４／２０８ＭｂからのＨ３Ｋ９Ｍｅ３の損失、８８．５％、ｐ＜２．２ｅ−１６）。ＬＯＣＫ幅の広いＨ３Ｋ９Ｍｅ３の喪失も、患者Ａ１３のペアの原発性腫瘍サブクローン間で検出され（１０６Ｍｂ／１１８Ｍｂ、Ａ１３Ｐｒ２対Ａ１３Ｐｒ１では９０．０％、ｐ＜２．２ｅ−１６）、ウェスタンブロットの結果と同様であり（補足図１ｃ）、この変化は、遠位転移性サブクローンにおいて受け継がれた（１５２Ｍｂ／１６９Ｍｂ、Ａ１３Ｌｇ対Ａ１３Ｐｒ１において９０．２％、ｐ＜２．２ｅ−１６）。最終的に、局在化したリプログラミングイベントは、ＬＯＣＫ内で差次的に発現される（ＤＥ）遺伝子をコードするクロマチン内でも特異的に検出された（図１１、補足データ３）。これには、上方制御および下方制御されたＬＯＣＫ遺伝子の遺伝子本体に対するＨ３Ｋ３６Ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ｍｅ３における同様の相反的変化と相まって、プロモーターに対するＨ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ９Ｍｅ２における相反的変化が含まれた。これは、ＬＯＣＫ由来のＤＥ遺伝子が、ハイブリッドＬＯＣＫ−ユークロマチンンアイランド（ＬＯＣＫ−ＥＩ）と一致して、遺伝子調節能を有する特定の小領域に位置することを示唆した。まとめると、これらの知見は、ヘテロクロマチンドメイン（ＬＯＣＫ）が遠位転移の進展の間に全体的および局所的���ロマチンリプログラミング事象の両方の主要な標的を表すことを示した。
【００７５】
ＬＯＣＫは、膵臓癌および他のヒトの癌において低メチル化されたＤＮＡであるブロック様領域のサブセットに対応するので、本発明者らはまた、ＤＮＡメチル化変化がＰＤＡＣサブクローン進展中にＬＯＣＫを標的としたかどうかを尋ねた。この分析のために、本発明者らは上記のＣｈＩＰ−ｓｅｑデータを用いて全ての細胞株に対してＷＧＢＳを実施した。細胞株に対応する凍結組織は以前の研究の間に使い果たされていたため、図１ａ（Ａ１２４、局所領域拡散）および図１ｃ（Ａ１２５、遠位転移）に示されたＩＨＣデータを用いて、同じホルマリン固定組織に独自にマッチしたインビボＷＧＢＳ用の７つの他の凍結組織サンプルを選択した。正常膵臓を内部対照として凍結組織試料に含めた。対応するＩＨＣ、ウエスタンブロット、およびＣｈＩＰ−ｓｅｑの知見を有するＷＧＢＳのすべての試料および結果を表１に要約し、統計分析を用いて定量化したＷＧＢＳの結果を表２および３に提示する。これらの実験は、腹膜癌腫症と比較して、遠位転移から単離された細胞株にわたるＬＯＣＫ全体のＤＮＡメチル化の有意な減少を明らかにした（図２ｂ、ｃ、表３）。これらの知見は、同じサンプルについてＣｈＩＰ−ｓｅｑによって検出されたＬＯＣＫ中のＨ３Ｋ９Ｍｅ２の減少と合致し（図２ａ）、低メチル化ブロック領域におけるＤＮＡメチル化のリプログラミングはリプログラムされたヒストンメチル化によるＬＯＣＫを標的とすることを明にした（表１）。凍結組織サンプルからの同じＬＯＣＫ領域の分析はまた、患者Ａ１２４からのＬＯＣＫ（腹膜拡散）および患者Ａ１２５からのファウンダークローン（founder clone）において比較的高いＤＮＡメチル化を明らかにし、一方、原発腫瘍および遠位転移性サブクローンの子孫は、細胞株で見られるよりもさらに顕著なＤＮＡメチル化の著しい喪失を示した（図２ｂ、ｃ、表１、および表２）。ハイブリッドＬＯＣＫ−ＥＩサブ領域において下方制御されたＤＥ遺伝子から強い局在化ＤＮＡ低メチル化も検出されたが、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２と同様に、上方制御された遺伝子は遺伝子の５’末端に急峻な陥没を伴って高メチル化されたままであった（図１１）。したがって、ＤＮＡメチル化は、ヒストン修飾と同様に、原発腫瘍および遠位転移サブクローン由来のＬＯＣＫにわたって全体的かつ局所的に再プログラムされた。集団免疫染色（図１ａ〜ｅ）、ウエスタンブロット（図１ｆ、ｇ）、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ（図２ａ）、およびＷＧＢＳ（図２ｂ、ｃ）のデータ（表１に要約）に基づき、遠位転移の進展の間、全体的なリプログラミングイベントのかなりの部分がヘテロクロマチンドメイン（ＬＯＣＫｓ）を標的としたと結論づける。
【００７６】
表２．ＷＧＢＳによって凍結組織サンプル中に検出されたＬＯＣＫドメイン全体のＣｐＧメチル化レベルの割合。腹膜癌腫症を呈した患者Ａ１２４由来の原発腫瘍および転移性腫瘍の両方において、ＤＮＡメチル化レベルは比較的高かった。同様の高レベルのＤＮＡメチル化が、患者Ａ１２５由来のファウンダークローンにおいても検出され、これは、遠位転移を播種した原発腫瘍サブクローンおよび肝臓転移自体において有意に減少した。Ｐ値は、３％閾値を用いて対応のあるウィルコックス検定（paired wilcox test）で計算した。
【表２】
2019535017.tif 000006
【００７７】
表３．ＷＧＢＳによって細胞株で検出されたＬＯＣＫドメイン全体のＣｐＧメチル化レベルの割合。ＤＮＡメチル化レベルは、細胞株にわたって腹膜サブクローンＡ３８Ｐｅｒについて最も高かった。メチル化は、同じ患者からの遠位転移（Ａ３８Ｌｖ、Ａ３８Ｌｇ）および原発腫瘍前駆体（Ａ１３Ｐｒ１／２）、ならびに患者Ａ１３からの合致する肺転移において有意に減少した。Ｐ値は、３％閾値を用いて対応のあるウィルコックス検定で計算した。
【表３】
2019535017.tif 000007
【００７８】
我々は次に、ヘテロクロマチン修飾の枯渇を伴うグローバルユークロマチン修飾Ｈ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ３６Ｍｅ３の濃縮によって定義されたＥＣＤ内の再プログラミングを分析した（図１２）。ヘテロクロマチンと同様に、何千ものこれらのドメイン（範囲：１，９３５−２，３１８）が、サブクローンにまたがって同程度の長さのゲノムを占めていた大きなブロック様セグメント（中央長：２０７Ｋｂ−２７７Ｋｂ）に分割されていた（平均：ゲノムの２９％；範囲：２３．５％〜３２．０％、補足データ２）。すべてのサブクローンは、活発に転写されるユークロマチンと一致して、Ｈ３Ｋ２７Ａｃの鋭いピークと遺伝子調節要素でのＤＮＡメチル化のディップに挟まれた、遺伝子体上の広範なＨ３Ｋ３６Ｍｅ３シグナルを含むＥＣＤ内の類似のグローバルパターンの修飾を示した（図２ｄ）。しかしながら、ＲＮＡ配列データからＥＤへのＤＥ遺伝子のマッピング（補足データ３）は、これらの遺伝子をコードするクロマチン内の局所リプログラミング事象の明確なパターンを同定した（図２ｅ、補足データ３）。ＥＣＤから上方制御された遺伝子はＨ３Ｋ３６Ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃの両方のレベルの増加を獲得し、これは許容クロマチン状態または機能亢進転写を反映する可能性がある。対照的に、下方制御された遺伝子は、Ｈ３Ｋ２７Ａｃの比較的わずかな減少を伴って非常に減少したＨ３Ｋ３６Ｍｅ３を示し、これは、不活性であるが安定したクロマチン状態または直接の転写抑制を反映し得る。ＬＯＣＫとは異なり、ＤＮＡメチル化はＥＣＤ中のＤＥ遺伝子の周囲で安定したままであった（データは示さず）。したがって、ＥＣＤにおけるリプログラミングは、大部分は局在化されており、クロマチンをコードするＤＥ遺伝子におけるＨ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ３６Ｍｅ３を標的としていた。
【００７９】
最終的に、我々はまた非常に大きなＬＯＣＫドメインのユニークなサブセットを標的とした患者固有のリプログラミングを検出した。これらの領域は他のＬＯＣＫと同様にＤＮＡ低メチル化ブロック内に位置していたが、それらは他のいくつかの点で異なっていた。第１に、これらのドメインはかなり大きかった（メジアン長：他のＬＯＣＫについての２３２〜３１１Ｋｂに対して７３０Ｋｂ〜１，３４０Ｋｂ、補足データ２）。第２に、それらはＨ３Ｋ９Ｍｅ２／Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３をまだ枯渇させているＨ３Ｋ９Ｍｅ３で強く濃縮されていた（図１３および補足データ２）。第３に、それらの存在量は患者特異的であり、患者Ａ１３からのサブクローンは非常に少数のこれらのドメイン（範囲：ゲノムの１．４〜３．５％をカバーする５０〜１１１ドメイン）を保有したが、Ａ３８ゲノムのはるかに高い割合を占めた（範囲：ゲノムの１４．５〜２０．６％をカバーする２２６〜３４４ドメイン、図１３ａおよび補足データ２）。最後に、他のＬＯＣＫにおいて検出されたリプログラミング変化（Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３の喪失およびＤＮＡメチル化）とは異なり、これらのＬＯＣＫにおけるリプログラミングは、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２の増加およびＤＮＡメチル化と結び付いたＨ３Ｋ９Ｍｅ３の喪失を特徴とした（図１３ｂ〜ｅ）。これらの知見の機能的意義は不明であるが、それらは、以下に概説するように、サブクローン進展の間に出現したゲノム不安定性のパターンに対して意味を持ちうる。
【００８０】
再プログラムされたクロマチンドメインは悪性異質性を特定する
サブクローン進展は、個々の患者内で著しい表現型の不均一性を生み出す可能性があり、我々はそのような多様性が上記で検出されたものと同様の大規模なエピジェネティック変化によってコードされ得ると仮定した。したがって、我々は再プログラムされたクロマチンドメインが同じ患者からのＰＤＡＣサブクローン間の不均一な悪性特性をコードしているかもしれないかどうかを徹底的に調査することを望んだ。この目的のために、本発明者らは、同じ患者（Ａ３８ＰｅｒおよびＡ３８Ｌｇ）から適合腹膜および肺転移サブクローンを選択し、サブクローン間で差次的に発現された再プログラム化ＬＯＣＫおよびＥＣＤ遺伝子に対して遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行い（表４〜７、図２ｅおよび図１１に示されるように再プログラムされた遺伝子に由来する）、その後、ＧＯの結果が実験的アッセイによって測定された実際の表現型の差異と一致するかどうかを試験した。この分析は、再プログラムされたＬＯＣＫおよびＥＣＤが、以下に記載されるように、サブクローン進展の間に出現した実質的な表現型の違いをコードすることを明らかにした。
【００８１】
表４：Ａ３８Ｐｅｒと比較して、Ａ３８Ｌｇにおいて再プログラムされたＬＯＣＫから上方制御されたＤＥ遺伝子のＧＯ分析。酸化還元バランス（酸化−還元、ＮＡＤＰ）およびＥＭＴ（細胞接着、遊走）に関与する遺伝子は、ＬＯＣＫにおける再プログラムされたＤＥ遺伝子から上方制御された（補足データ３に詳述）。
【表４】
2019535017.tif 000008
【００８２】
表５：Ａ３８Ｐｅｒと比較して、Ａ３８Ｌｇにおいて再プログラムされたＬＯＣＫから下方制御されたＤＥ遺伝子のＧＯ分析。分化状態（細胞接着、発生、上皮遺伝子）、免疫調節（免疫応答、サイトカイン、炎症）、および環境要因に対する反応（膜貫通シグナル伝達、細胞外マトリックス、分泌、運動）に関与する遺伝子は、再プログラムされたＬＯＣＫから下方制御された（補足データ３に詳述）。
【表５】
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【００８３】
表６：Ａ３８Ｐｇと比較して、Ａ３８Ｌｇにおいて再プログラムされたＥＣＤから上方制御されたＤＥ遺伝子のＧＯ分析。翻訳後修飾、細胞周期制御、ＤＮＡ修復、ストレス応答、およびＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質生合成に関与する遺伝子は、再プログラムされたＥＣＤからアップレギュレートされた（補足データ３に詳述）。
【表６】
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【００８４】
表７：Ａ３８Ｐｅｒと比較して、Ａ３８Ｌｇにおいて再プログラムされたＥＣＤから下方制御されたＤＥ遺伝子のＧＯ分析。発癌性シグナル伝達カスケード（Ｓｈ３ドメイン、膜貫通タンパク質、キナーゼ、Ｒａｓシグナル伝達）、細胞運動（創傷、遊走、移動）、および細胞死制御（アポトーシス）に関与する遺伝子は、再プログラムされたＥＣＤから下方制御された（補足データ３に詳述）。
【表７】
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【００８５】
第１に、酸化還元（酸化−還元）バランスに関与する多数のＤＥ遺伝子が、Ａ３８Ｌｇにおいて再プログラムされたＬＯＣＫから上方制御された（表４、補足データ３）。従って、このサブクローンはＨ２Ｏ２媒介酸化ストレスに対して非常に耐性であり（図３ａ）、Ａ３８Ｐｅｒよりも高いオキシドレダクターゼ活性およびＮＡＤＰＨレベルを有していた（図１４ａ、ｂ）。第２に、分化状態（上皮対ＥＭＴ）をコードする遺伝子がＡ３８ＰｅｒおよびＡ３８ＬｇＬＯＣＫから相互に発現され（表５、補足データ３）、タンパク質レベルでのいくつかのよく知られている上皮およびＥＭＴ発現変化（例えばＣＤＨ１／Ｅ−カドヘリン、ＣＤＨ２／Ｎ−カドヘリン）をウエスタンブロットにより確認した（図３ｂ）。さらにＧＯの結果と一致して、Ａ３８Ｐｇは高分化（上皮）形態を維持したが、Ａ３８Ｌｇは複数のインビトロ培養条件にわたって低分化（ＥＭＴ様）であり（図１４ｃ）、免疫蛍光実験は、ＥＭＴがインビボでＡ３８Ｌｇ転移を播種した原発性腫瘍サブクローンに出現したことを示した（図１４ｄ）。我々はまた、免疫関連遺伝子が再プログラムされたＬＯＣＫとは差次的に発現されていることに注目し（表５）、これはＰＤＡＣ免疫療法にとって意味を持ちうる。第３に、ＤＮＡ修復および細胞ストレス応答に関与する遺伝子は、ゲノムの完全性の維持に重要な遺伝子を含む、Ａ３８Ｌｇ由来のＥＣＤにおいて有意に上方制御されていた（ファンコニ貧血症複合体、非相同末端結合、およびＴＯＰ２Ｂ／ＯＧＧ１／ＫＤＭ１Ａ複合体、とりわけ表６、補足データ３）。従って、このサブクローンは、Ａ３８Ｐｅｒと比較してＰＤＡＣ化学療法（ゲムシタビン）に対して非常に耐性であり（図３ｃ）、ウエスタンブロットはヒストンＨ２ＡＸ  Ｓ１３９の過剰リン酸化を示した（γＨ２ＡＸ、活性化ＤＮＡ修復経路のサイン、図３ｄ）。第４に、発癌性シグナル伝達カスケードに関与する遺伝子、特にＫＲＡＳ／ＥＲＫ関連遺伝子は、Ａ３８Ｌｇ由来のＥＣＤにおいて下方制御されていた（表７、補足データ３）。確かに、Ａ３８Ｌｇは、Ａ３８Ｐｅｒと同一のＫＲＡＳＧ１２Ｖ変異を有するにもかかわらず、リン酸化ＥＲＫの喪失（図３ｅ）、ＥＲＫ阻害に対する抵抗性（図３ｆ）、および３Ｄ腫瘍形成アッセイにおいて発癌性ＫＲＡＳのノックダウンに対する最小限の応答（図３ｇ、図１４ｅ、ｆ）を示した。最終的に、この患者からクロマチンドメインへの以前に報告された再配列のマッピングは、再配列が優先的にＥＣＤおよび独特に再プログラムされた大型ＬＯＣＫドメインの小さなサブセットを標的とし、一方、他のＬＯＣＫは強く枯渇したことを明らかにした（図１５）。
【００８６】
したがって、再プログラムされたクロマチンドメインは、悪性遺伝子発現プログラム、異なる表現型特性、および患者Ａ３８のサブクローン進化中に出現したゲノム不安定性のパターンをまとめて特定した。この患者は組織採取前に化学療法を受けたことは珍しく、ＳＭＡＲＣＡ２には不明確なミスセンス変異（ＣＩＤ、未発表の観察）があり、したがってこの場合、後成的選択は遺伝的要因の下流で起こった可能性がある。そのような所見の性質と程度は確かに患者によって異なるが、彼らはＰＤＡＣが同じ患者からの同じ癌においてさえ、サブクローン進展の間にかなりの後成的で悪性の多様性を獲得することができることを意味する。
【００８７】
同化グルコース代謝はエピジェネティック状態と腫瘍形成性を制御する
我々は次に、再発性の転移固有の経路が、全体的なエピジェネティック状態および腫瘍形成の可能性に対する上流制御を発揮するために、サブクローン進展中に選択されたのかどうかを尋ねた。最近のいくつかの研究では、栄養状態と代謝活性を世界レベルのヒストン修飾と結びつけた。急速剖検コホートにおける遠位転移は、グルコースの豊富な供給を提供する臓器（肝臓、肺）から大部分隔離されていたので、我々はこれらのサブクローンにおける再プログラムされたクロマチンおよび腫瘍形成性がグルコース代謝の特定の側面への依存を進化させたかどうか尋ねた。
【００８８】
グルコース代謝の変化（すなわち、ワールブルグ効果）は、新生物細胞および高度に増殖性の細胞の周知の特性である。我々の転移性サブクローンの大部分は実際には培養物中（例えば図８）およびインビボで中程度の増殖速度を示したが、それでもなお我々は遠位転移がグルコース代謝においてさらなる適応を獲得したかどうかを尋ねた。驚くべきことに、増殖性（不死化）正常ＨＰＤＥ細胞および局所領域ＰＤＡＣ試料と比較して、グルコースは遠位転移サブクローンにわたって代謝（オキシドレダクターゼ）活性を強く刺激し（図４ａ）、したがって、グルコースはこれらのサブクローンが酸化ストレスに耐えるために必要であった（図４ｂ、ｃ）。我々は、遠位転移および腹膜癌腫症と比較したそれらの前駆体において上昇したグルコース取り込みおよび乳酸塩分泌を検出したので、遠位転移もグルコースを過剰に消費した（図１６ａ）。過剰なグルコース取り込みが下流の代謝経路に特異的に取り込まれたかどうかを測定するために、同じ患者から対になった腹膜および遠位転移サブクローンを選択し、それらを１３Ｃ［１−２］標識グルコースと共にインキュベートし、液体クロマトグラフィー、続いて高分解能質量分析（ＬＣ−ＨＲＭＳ）により代謝産物へのグルコース取り込みを測定した。これらの実験は、解糖系およびペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の両方へのグルコース侵入の増強と一致して、遠位転移における乳酸塩およびヌクレオチドへのＣ１およびＣ１，２標識グルコースの両方の取り込みの上昇を明らかにした（図４ｄ、ｅ）。
【００８９】
我々は次に、遠位転移がこれらのグルコース駆動経路のいずれかにおいて特定の酵素段階への依存を進化させたのではないかと尋ねた。これは、我々が仮定した過剰消費に続発する代謝産物基質の激しい枯渇として現れるだろう。これを試験するために、ＨＰＤＥ細胞、腹膜癌腫症、遠位転移、および原発腫瘍前駆体サブクローンを含む多様なサンプル群にわたる解糖およびＰＰＰ代謝産物プロファイルを調査した。全ての検出された解糖代謝産物およびペントースリン酸代謝産物の分析（図１６ｂ）は、遠位転移およびそれらの前駆体にわたる６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ）の顕著な、反復的な枯渇を明らかにした（図４ｆ）。６ＰＧは、ＰＰＰの酸化的分枝内で作用する同化グルコース代謝に関与する酵素である６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）の基質である。
【００９０】
グルコースは、経路の酸化的（ｏｘＰＰＰ）または非酸化的（ｎｏｘＰＰＰ）分岐を介してＰＰＰに入る可能性があり、これらは分離されていると考えられている。他の癌におけるいくつかの研究は、ＰＧＤが重要な癌遺伝子であることを示唆しているが、ＰＤＡＣのマウスモデルにおいて原発性腫瘍増殖を推進するのはＫＲＡＳ媒介ｎｏｘＰＰＰ活性化である。ＫＲＡＳおよび他のドライバー変異はＰＤＡＣ進行の初期に獲得され、その後進化するすべてのサブクローンによって共有されるので、我々はＰＧＤ依存性が再プログラムされたクロマチンおよび腫瘍原性を維持するために遠位転移の進化の間に特に選択されたと仮定した。グルコース欠乏、ＰＧＤに対するＲＮＡｉ、および６−アミノニコチンアミド（６ＡＮ、ＰＧＤを優先的に阻害することが報告されているニコチンアミド代謝拮抗薬プロドラッグ）は、腹膜サブクローンにおける全体的なクロマチン修飾に影響を及ぼさず、一方、全ての治療は同じ患者からの対の肺転移の再プログラムされたクロマチン状態を逆転させた（図５ａ）。ＰＧＤノックダウンはＫＲＡＳまたは他のＰＰＰ成分の発現を変化させなかったので、ＰＧＤ機能喪失は特異的にみえた（図５ｂ）。
【００９１】
我々は次に、ＰＧＤノックダウンがより大きなサブクローンのパネルにわたって内在性腫瘍形成能に影響を及ぼし得るかどうかを尋ねた。それらの患者における攻撃的な行動にもかかわらず、遠位転移性サブクローンは免疫不全マウスにおいて転移性腫瘍を効果的に形成することができず、そしてＰＧＤ  ＲＮＡｉは日常的な２−Ｄ培養において増殖したいかなるサブクローンに対しても毒性ではなかった（データは示さず）。これらの制限を回避するために、本発明者らは細胞をＲＮＡｉで処理し、３−Ｄマトリゲル腫瘍形成アッセイを用いて、内在性腫瘍形成能に対するＰＧＤノックダウンの効果を測定した。ＰＧＤ  ＲＮＡｉは、これらのアッセイによって、ＨＰＤＥ細胞が球体を形成する能力または局所領域ＰＤＡＣが腫瘍を形成する能力に最小限の影響しか及ぼさなかった（図５ｃ）。注目すべきことに、ＰＧＤ  ＲＮＡｉは、遠位転移性サブクローンが腫瘍を形成する能力を普遍的に妨害した（図５ｄ）。これらの知見は、ＰＧＤがＰＤＡＣ遠位転移に対する選択性を有する治療標的となり得ることを示唆した。６ＡＮはＰＧＤ標的治療の将来の設計のための有力な化合物を表すことができるので、メタボロミクス、ウエスタンブロット、多重３Ｄ腫瘍形成アッセイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、およびＣｈＩＰ実験を用いた遠位移動に対する活性について厳密に試験した。
【００９２】
６ＡＮ処置は、遠位転移および前駆体サブクローンにおけるグルタミン消費またはグルタミン酸分泌に影響を与えずにグルコース消費および乳酸分泌の速度を遅くし（図１７ａ）、６ＡＮは以前に検出されたグルコースの乳酸およびヌクレオチドへの高取り込みを逆転させた（図１７ｂ）。さらに、ＰＧＤ反応のすぐ上流のグルコースおよび代謝産物の定常状態レベルは６ＡＮに応答して劇的に上昇し、対応する下流代謝産物が減少した（図１７ｃ）。これは他の研究者によって以前に報告された強いＰＧＤ阻害と一致する。
【００９３】
我々は次に、エピジェネティック状態に対する６ＡＮの効果を試験した。驚くべきことに、６ＡＮ処理は、正常細胞または局所領域ＰＤＡＣに対する影響を最小限に抑えながら、いくつかの再プログラムされたクロマチン修飾を遠位転移サブクローンにわたって定量的に逆転させ（図１８ａ、ｂ；図６ａ、ｂに概要が示される）、この効果は培地から６ＡＮを除去しても持続した（図１８ｃ）。これらの変化はＬＯＣＫリプログラミングの側面を反映していたので、ＲＮＡ−ｓｅｑによって同定されるように、６ＡＮによって調節されるＬＯＣＫ  ＤＥ遺伝子のクロマチン状態を調べた（補足データ３、４）。これは、ＤＥ遺伝子が、強いＨ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ３６Ｍｅ３、低いＨ３Ｋ２７Ｍｅ３、ならびにＨ３Ｋ９Ｍｅ２の急激な５’枯渇（ディップ）を有する再プログラムされたハイブリッドＬＯＣＫ−ＥＩ領域内に位置することを明らかにした（図１９ａ、補足データ３）。対照および６ＡＮ処理したＡ３８Ｌｇ細胞に対するＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験はさらに、全体的なＨ３Ｋ９Ｍｅ２の定量的増加がＡ３８Ｌｇ対Ａ３８Ｐｅｒにおいて再プログラムされたＬＯＣＫ領域を標的とすることを示し（図１９ｂ）、
一方、低減されたＨ３Ｋ２７Ａｃは、ＬＯＣＫから抑制された遺伝子を特異的に標的とし、他のＬＯＣＫ遺伝子またはＥＣＤ調節遺伝子には影響を及ぼさなかった（図１９ｃ）。ウエスタンブロットの所見と同様に、６ＡＮに応答してＨ３Ｋ２７Ｍｅ３のレベルは全ての領域にわたって安定したままであった（図１９ｂ、ｄ）。まとめると、これらの実験は、６ＡＮが、遠位転移の進展の間に出現したＬＯＣＫ内のいくつかのクロマチン変化を選択的かつ定量的に標的とすることを実証した。
【００９４】
６ＡＮは全体的なエピジェネティックな状態を調節したため、ＰＧＤノックダウン実験と同様に、それが遠位転移サブクローンにおける腫瘍形成能を選択的にブロックするかもしれないという仮説を立てた。驚くべきことに、６ＡＮは遠位転移性および原発性腫瘍前駆体サブクローンにおける腫瘍形成を選択的かつ強力にブロックしたが、懸濁腫瘍球アッセイ（補足図２０）、マトリゲル腫瘍形成アッセイ（図６ｂ）、およびインビボ患者腫瘍の態様を総括する器官型間質へのＰＤＡＣ細胞の注入（図６ｃ）を含む、複数の３Ｄ腫瘍形成実験プラットフォームにわたって局所領域ＰＤＡＣはブロックしなかった。したがって、ＰＧＤノックダウンと同様に、６ＡＮによるＰＧＤの化学的阻害は、遠位転移性サブクローンの腫瘍形成能を選択的にブロックした。
【００９５】
次に、我々のＲＮＡ−ｓｅｑデータセットを調べて、上記の知見が悪性遺伝子発現プログラムの調節に関連しているのかどうかを調べた。注目すべきことに、Ａ３８Ｌｇからの６ＡＮ下方制御遺伝子の半分以上（９５２／１８３２、５２％、補足データ４）は、このサブクローンで過剰発現された遺伝子に対応した（同じ患者からの腹膜サブクローンと比較して）。さらに、６ＡＮ上方制御遺伝子の大部分は抑制されたＤＥ遺伝子とも合致した（９１４／２１２２、４２％、補足データ４）。さらに顕著なことに、遠位転移サブクローンにまたがって再発的に過剰発現している遺伝子の３分の１近く（２５５／８９１、２９％、補足データ４）は６ＡＮによって下方制御されていた。これらの遺伝子サブセットに対する比較ＧＯ分析は、有糸分裂細胞周期制御、アセチル化、染色体安定性、ＤＮＡ修復、細胞ストレス応答、および同化／生合成活性を含む癌関連機能について強く強化された重複する結果をもたらした（表８〜１０）。
【００９６】
表８：遠位転移において再発的に過剰発現されかつ６ＡＮによって下方制御され、ＲＮＡ配列によって検出された遺伝子のＧＯ分析（補足データ３に詳述）。
【表８】
2019535017.tif 000012
【００９７】
表９：腹膜癌腫症と比較した、遠位転移サブクローンおよび原発性腫瘍前駆体においてＲＮＡ−ｓｅｑによって検出された再発過剰発現遺伝子のＧＯ分析（補足データ３に詳述）。
【表９】
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【００９８】
表１０：ＤＭＳＯ対照細胞と比較して、６ＡＮに応答して下方制御されたＲＮＡ−ｓｅｑによって検出されたＤＥ遺伝子のＧＯ分析（補足データ３に詳述されるＡ３８Ｌｇサブクローン）。
【表１０】
2019535017.tif 000014
【００９９】
上記の知見は、遠位転移サブクローンにおける腫瘍形成性の６ＡＮ除去が、腫瘍形成能を維持するのに重要な癌関連遺伝子のエピジェネティック制御を介して媒介されるかもしれないという仮説を導いた。これを検証するために、詳細な実験のために２つの候補遺伝子を選択した：Ｎ−カドヘリン（ＣＤＨ２）およびトポイソメラーゼ２β（ＴＯＰ２Ｂ）。ＣＤＨ２およびＴＯＰ２Ｂは両方とも癌の進行に重要であると考えられ、ＰＤＡＣにおいて突然変異することは知られておらず、治療的に標的とされ得、ＲＮＡ−ｓｅｑにより遠位転移および原発腫瘍前駆体サブクローンにわたって繰り返し過剰発現され（補足データ３）、ＲＴ−ＰＣＲで確認した６ＡＮによって選択的に抑制された（図６ｅ上のパネル）。さらに、ＣＤＨ２は６ＡＮが標的とする再プログラムされたＬＯＣＫ内に位置し、ＴＯＰ２ＢはＬＯＣＫ境界のすぐ隣に位置していた。対照および６ＡＮ処理細胞で実施したＣｈＩＰ−ｑＰＣＲアッセイは、腹膜サブクローン中のこれらの遺伝子座にわたってＨ３Ｋ９Ｍｅ２およびＨ３Ｋ２７Ａｃについてほぼ同一の濃縮を示した（図６ｅ左パネルおよび図２１ａ）。対照的に、同じ患者からの適合肺転移に対する６ＡＮ治療は、ＣＤＨ２遺伝子領域にわたるＨ３Ｋ２７Ａｃの一致した減少を伴う両方の遺伝子座にわたるＨ３Ｋ９Ｍｅ２の濃縮をもたらした（図６ｅ右パネル、図２１ａ）。これは、６ＡＮ治療の主要な下流効果が過剰発現した癌遺伝子のエピジェネティックな抑制であることを強く示唆していた。したがって、これらの遺伝子のノックダウンが腫瘍形成性を選択的に維持するのに重要であるかどうかを試験するためにＲＮＡｉ実験を行った。確かに、ＲＮＡｉはＣＤＨ２およびＴＯＰ２Ｂを過剰発現する遠位転移および前駆体サブクローンにおける３Ｄ腫瘍形成を選択的に遮断し、ＨＰＤＥ細胞または腹膜癌腫症には影響を及ぼさなかった（図６ｆ）。まとめると、これらの標的検証研究は、６ＡＮ選択的標的遺伝子発現、エピジェネティック状態、および過剰発現癌遺伝子（ＣＤＨ２／ＴＯＰ２Ｂ）の下流の腫瘍形成機能によるＰＧＤ／ｏｘＰＰＰの阻害というシーケンスデータから推論される結論を強く支持した。
図の説明
【０１００】
図１：遠位転移の進展の間の全体的なエピジェネティックなリプログラミング。ａ、広範囲の腹膜癌腫症を呈した２人の患者から収集した６個のサブクローンからの腫瘍切片に対して行ったＨ３Ｋ９Ｍｅ２／３に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色（ａ：患者Ａ１２４、ｂ：患者Ａ１４１）は、全ての原発性腫瘍および腹膜サブクローンにわたって同様の強い核染色を示した。ｂ、広範囲の遠位転移を呈した２人の患者（ｃ：患者Ａ１２５、ｄ：患者Ａ１３２）からの６個のサブクローン上の類似の染色は、転移を播種した原発性腫瘍サブクローンにおいて開始し（中央パネル）、さらに失われた（ｃ）、または肝転移で安定的に遺伝された（ｄ）核染色の進行性の喪失を示した。スケールバー＝ＩＨＣの場合１００μｍ、ＩＦの場合２０μｍ。ｃ、腹膜癌腫症および遠位転移の両方を呈する患者（患者Ａ３８）からの４対のサブクローンを表す腫瘍切片に対して行われた示された修飾に対するＩＨＣは、新生物を創設した親クローンに見られるように、癌腫症を播種した原発腫瘍における腹膜前駆体サブクローンがヘテロクロマチン修飾の強い核染色を受け継いだことを示す。対照的に、遠位転移を播種した原発性腫瘍前駆体サブクローンは、対をなす肺転移において染色の完全な喪失と共に、染色における細胞間変動を示した。ユークロマチン修飾Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３についての染色は、すべてのサブクローンにわたって安定したままであった。ｆ、組織上のＩＨＣと同様に（ｅ）、患者Ａ３８からの腹膜サブクローン（Ｐｅｒ）、肝臓転移、および肺転移から収集した細胞株上のウエスタンブロットもまた、対応するアセチル化の増加と共に、遠位転移サブクローンにおけるヘテロクロマチン修飾の喪失を示した。Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３とＨ３Ｋ３６Ｍｅ３のレベルはサブクローン間で異ならなかった。ｇ、腹膜癌腫症と比較した、遠位転移性サブクローン由来の細胞株にわたる示されたヒストン修飾についてのウエスタンブロット所見のデンシトメトリー概要（補足図１ｂ、ｃ、ｎ＝８生物学的複製、エラーバー＝標準誤差、＊ｐ＜０．０１）。
【０１０１】
図２：ＰＤＡＣサブクローン進展中のクロマチンドメインのエピゲノムリプログラミング。ａ、代表的（左パネル）および総計された（右パネル）ＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験は、腹膜（Ａ３８Ｐｅｒ）と遠位転移および原発腫瘍前駆体サブクローン（他）との間のＬＯＣＫからのＨ３Ｋ９Ｍｅ２の喪失を明らかにした。Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３はすべてのサブクローンで強力なままであった。ｂ、細胞株（Ａ３８、Ａ１３、上のパネル）および凍結組織試料（Ａ１２４、Ａ１２５のパネル）の重亜硫酸塩配列データは、局所的な広域クローンおよび親クローン（Ａ３８Ｐｅｒ、Ａ１２４ＰｒＦ、Ａ１２４Ｐｅｒ、Ａ１２５ＰｒＦ）からの試料が過剰メチル化ＬＯＣＫを有することを示した。対照的に、遠位転移サブクローン（Ａ１２５Ｌｖ１／２、Ａ１３Ｌｇ、Ａ３８Ｌｖ、Ａ３８Ｌｇ）およびそれらの原発性腫瘍サブクローン（Ａ１２５ＰｒＳ、Ａ１３Ｐｒ１、Ａ１３Ｐｒ２）は、同じＬＯＣＫ領域にわたってＤＮＡの低メチル化を示した。ｃ、上記のように、サブクローンにわたって高メチル化対低メチル化を示す個々のＬＯＣＫの例。ｄ、ＥＣＤ内のＨ３Ｋ３６Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、およびＤＮＡメチル化の全体的なレベルは、サブクローン間に明確な差を示さなかった。ｅ、対照的に、遠位転移サブクローンおよび原発腫瘍サブクローン（赤色の線）は、Ａ３８Ｐｅｒ（黒色の線）からの同じＤＥ遺伝子ＥＣＤ領域と比較して、ＥＣＤ内のＤＥ遺伝子にわたって特異的にＨ３Ｋ３６Ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃの局所リプログラミングを示した。
【０１０２】
図３：再プログラムされたクロマチンドメインは異なる悪性特性をコードする。ａ、Ａ３８Ｌｇは、Ａ３８Ｐｅｒと比較してＨ２Ｏ２処理に対して著しく耐性があった。ＭＴＴシグナルは未処理対照に対して正規化された細胞生存率を反映する。ｎ＝４の技術的反復、＊ｐ＜０．０３。ｂ、ＬＯＣＫからの再プログラムされたＤＥ遺伝子のＧＯ分析によって予測されるように、上皮およびＥＭＴの分化に関与するタンパク質についてのウエスタンブロットは、Ａ３８ＰｅｒとＡ３８Ｌｇとの間で差次的に発現された。ｃ、Ａ３８Ｌｇは、ＥＣＤからの再プログラムされたＤＥ遺伝子のＧＯ分析によって予測されるように、Ａ３８Ｐｅｒと比較してゲムシタビンに対して完全に耐性であった。ＭＴＴシグナルは未処理対照に対して正規化された細胞生存率を反映するｎ＝４の技術的反復、＊ｐ＜０．０１。ｄ、Ａ３８Ｌｇは、ウエスタンブロットにより、ＤＮＡ修復経路の活性化と一致して、高レベルのｙＨ２ＡＸを有していた。ｅ、ウエスタンブロットは、Ａ３８Ｌｇが高リン酸化ＥＲＫを失うことを示し、ｆ、Ａ３８Ｐｅｒと比較してＥＲＫ標的治療に耐性であることを示した。ＭＴＴシグナルは、未処理対照に対して正規化した細胞生存率を反映する。ｎ＝４の技術的反復、＊ｐ＜０．０３。ｇ、Ａ３８Ｌｇもまた、Ａ３８Ｐｅｒと比較して、マトリゲル３Ｄ腫瘍形成アッセイによるＫＲＡＳノックダウンに対する感受性を失った。ｎ＝４の技術的反復、＊ｐ＜０．０１。
【０１０３】
図４：遠位転移サブクローンにおけるグルコース過剰代謝と６ＰＧ枯渇。ａ、示されたサブクローン由来の同数（２０Ｋ）の生育停止細胞に対して行われたＭＴＴアッセイは、ＨＰＤＥおよび局所領域ＰＤＡＣ試料と比較して、遠位転移サブクローンにわたって非常に高いシグナル（オキシドレダクターゼ活性）を示した（ｎ＝４の技術的反復）。それぞれについて、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ、＊ｐ＜１０−５）。ｂ、１０ｍＭのグルコースあり（＋）またはなし（−）でインキュベートし、２４時間、１ｍＭのＨ２Ｏ２で処理した（＋、−）表示試料の正規化細胞数は、正常ＨＰＤＥ細胞がいずれのグルコース条件下でもＨ２Ｏ２に対して感受性があることを示し、一方、局所領域のＰＤＡＣ試料は、グルコースの利用可能性に関係なくＨ２Ｏ２に耐性があった（それぞれｎ＝３の技術的複製、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ）。ｃ、対照的に、グルコースが培地中に存在しない場合、遠位転移サブクローンはＨ２Ｏ２に対して感受性があった（それぞれについてｎ＝３の技術的複製、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＜０．００１）。ｄ、解糖およびＰＰＰを通る１３Ｃ−（１，２）−標識グルコースフローの略図。ＰＰＰの酸化分枝に入るグルコースは、６ＰＧからＲｕ５Ｐ（ｍ＋１）への変換中に切断される１つの標識炭素を有するが、解糖または非酸化ＰＰＰを通って移動するグルコースは両方の標識炭素（ｍ＋２）を保持する。クロストークは、いずれかの標識パターンを有するグルコースが他の経路に再侵入して取り込むことを可能にすることに留意されたい。ｅ、ヌクレオチドおよび乳酸塩のＬＣ−ＭＳは、これらの下流代謝産物が、対をなす腹腔サブクローン（Ａ３８Ｐｅｒ、ｎ＝３の生物学的複製物）と比較して、患者Ａ３８（Ａ３８Ｌｇ）からの肺転移におけるグルコースから非常に高い１３Ｃ−１，２標識を獲得したことを示した。エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＜０．０１）。ｆ、６ＰＧについての定常状態ＬＣ−ＨＲＭＳ測定は、腹膜癌腫症およびＨＰＤＥ細胞と比較して、遠位転移およびそれらの前駆体にわたる代謝産物の完全な（ＮＤ：検出されない）またはほぼ完全な喪失を示した（補足図１０ｂ）。
【０１０４】
図５：遠位転移サブクローンにおけるＰＧＤ依存性。ａ、同じ患者からの対になった腹膜（Ａ３８Ｐｅｒ）および遠位転移（Ａ３８Ｌｇ）サブクローンに対して行われた示されたヒストン修飾に対するウエスタンブロットは、培地からのグルコースの除去（左パネル）、ＰＧＤ  ＲＮＡｉ（中央パネル）、および６ＡＮ処置（右パネル）によってＨ３Ｋ９Ｍｅ２／３の再プログラム化およびＡ３８Ｌｇにおけるアセチル化の全体的レベルが逆転したことを示した。ｂ、Ａ３８Ｌｇ上のウエスタンブロットは、ＲＮＡｉによるＰＧＤノックダウンが他のＰＰＰ成分またはＫＲＡＳの発現を混乱させないことを示した。ｃ、ＰＧＤ  ＲＮＡｉは、３Ｄマトリゲルアッセイにおいて腫瘍を形成する正常なＨＰＤＥ細胞または局所領域ＰＤＡＣサンプルの能力に影響を及ぼさなかった（定量化された腫瘍数／ウェルで示される代表的顕微鏡写真、それぞれについてｎ＝４の技術的複製、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．。ｄ、対照的に、ＰＧＤ  ＲＮＡｉは、迅速剖検コホートからの試験に利用可能であった全ての遠位転移サブクローンにわたって腫瘍形成を有意に減少させた（それぞれについてｎ＝４の技術的反復、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＜０．０１）。スケールバー：２００μｍ。
【０１０５】
図６：６ＡＮによる再プログラムされたクロマチン、腫瘍形成性、および悪性遺伝子発現プログラムの逆転。ａ、補足図１２ａに示されるウエスタンブロットのデンシトメトリー概要（ｎ＝８の生物学的複製、エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．、＊ｐ≦０．０１）。６ＡＮは、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３またはＨ４Ｋ２０Ｍｅ３に対する最小のまたは非再発性の効果で、最も遠い転移性サブクローンにわたって再プログラミングされたＨ３Ｋ９Ｍｅ２およびアセチル化を選択的に逆転させた。ｂ、補足図１２ｂに示すウエスタンブロットのデンシトメトリー要約（ｎ＝６の生物学的複製、エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．。６ＡＮは、正常（ＨＰＤＥ、線維芽細胞）または局所領域のＰＤＡＣサンプルにわたってヒストン修飾に対して最小限の影響しか及ぼさなかった。ｃ、６ＡＮは、遠位の転移サブクローンにまたがる３Ｄマトリゲルアッセイ（それぞれについてｎ＝４の技術的反復、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スケールバー：２００μｍ）および３Ｄ腫瘍球アッセイ（補足図１４ｃ）における腫瘍形成を除去した。６ＡＮは、いずれのアッセイによっても局所領域ＰＤＡＣ試料に最小限の影響しか及ぼさなかった（補足図１４ａ、ｂ）。ｄ、６ＡＮはまた、３Ｄ器官型間質培養物に注射した場合に、遠位転移サブクローンが腫瘍を形成する能力を遮断した（それぞれについてｎ＝３の技術的複製、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＜０．０５、スケールバー：２００μｍ）。ｅ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（上のパネル）は、同じ患者からの腹膜サブクローン（Ａ３８Ｐｅｒ）と比較して、遠位転移サブクローン（Ａ３８Ｌｇ）がＣＤＨ２を過剰発現し、その発現が６ＡＮまで抑制されたことを示した。（２つの生物学的複製実験からのｎ＝４のテクニカルＰＣＲ複製、エラーバー：ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＝０．００２）。１．４Ｍｂクロマチンドメインを横切って間隔を空けてＰＣＲプライマー（番号で示す位置）を用いたＨ３Ｋ９Ｍｅ２およびＨ３Ｋ２７ＡｃのＣｈＩＰアッセイは、Ａ３８Ｌｇにおいて対応するＨ３Ｋ２７Ａｃの喪失を伴う、Ａ３８Ｐｅｒに対する影響なしに、遺伝子座を横切るＨ３Ｋ９Ｍｅ２の拡散を６ＡＮが誘発することを示した。（ｎ＝２生物学的複製、エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ．）。ｆ、ＣＤＨ２およびＴＯＰ２Ｂの両方に対するＲＮＡｉは、Ａ３８ＰｅｒまたはＨＰＤＥ細胞に影響を及ぼさずに、ＲＮＡ−ｓｅｑによってこれらの遺伝子を過剰発現した遠位転移および前駆体サブクローンにおける腫瘍形成を選択的に遮断した（それぞれｎ＝４の技術的反復、エラーバー＝ｓ．ｄ．ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スケールバー：２００μｍ）。遺伝子発現の特異的ＲＮＡｉノックダウンを補足図１５ｃ、ｄに示す。
【０１０６】
図７：遠位転移サブクローンにわたって再プログラムされたクロマチン。ａ、ウエスタンブロットは、Ａ３８Ｐｅｒ（Ｐｅｒ）を含む局所領域ＰＤＡＣサンプル間の示されたヒストン修飾について最小のまたは矛盾する変化を示した。ｂ、対照的に、Ａ３８Ｐｅｒと比較して、一群の遠位転移性サブクローンは、特定の修飾において反復性の変化を示した。ｃ、原発性腫瘍サブクローン（Ｐｒ１、Ｐｒ２）と肺ｍｅｔとの間でも同じ患者から再プログラミングが観察された。
【０１０７】
図８：再プログラムされたヒストン修飾の特異性。ａ、Ｋｉ６７染色は、腹膜および血清中で増殖させた適合肺ｍｅｔについて同様の細胞周期速度を示し、無血清培地（ＳＦＭ）は成長を阻止した。ｂ、示された時間についての一連の細胞数は、ＳＦＭにおける等しい増殖速度および増殖停止を確認した。ｃ、血清対ＳＦＭで培養した細胞からのＲＮＡ配列データに対するＧＯ分析は、ＳＦＭにおける増殖停止をさらに確認した（肺データ、腹膜は同一の結果を与えた）。ｄ、ウエスタンブロットは、血清／増殖性（−）およびＳＦＭ／増殖停止（＋）細胞において再プログラムされたクロマチン修飾の持続性を示した。ｅ、ＰＤＡＣ化学療法（Ｇｅｍ：ゲムシタビン、Ｇ＋ＦＵ：ゲムシタビン＋５−フルオロウラシル）による腹膜サブクローンの処置は、腹膜転移と遠位転移との間に見られるようにメチル化の喪失またはアセチル化の獲得を誘発せず、リプログラミングが治療効果と無関係であることを確認した。
【０１０８】
図９：ＬＯＣＫ内のヘテロクロマチン修飾の濃縮。ヒストン修飾についてインプットするために正規化したＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取り密度のプロット（左のラベル）は、各サブクローンについて、ヘテロクロマチン修飾（Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３）がＬＯＣＫ（０％〜１００％、下パネルラベル）と呼ばれる領域に富んでいることを示した（上のグラフに表示）。対照的に、ユークロマチン修飾（Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ）はＬＯＣＫから枯渇した。
【０１０９】
図１０：ＰＤＡＣサブクローン進展の間のＬＯＣＫ中のＨ３Ｋ９Ｍｅ３のリプログラミング。ａ、対になった腹膜（Ａ３８Ｐｅｒ）および肺（Ａ３８Ｌｇ）転移性サブクローンからのＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、（ＬＯＣＫドメインをマークする）Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２と重なる、Ａ３８Ｌｇ中のＨ３Ｋ９Ｍｅ３の劇的な減少を検出した。ｂ、Ａ１３Ｐｒ１原発性腫瘍サブクローンと比較した、Ａ１３Ｐｒ２／Ａ１３ＬｇサブクローンにおけるＬＯＣＫ領域からのＨ３Ｋ９Ｍｅ３の喪失も示す、患者Ａ１３に関する同様のデータ。
【０１１０】
図１１：ＬＯＣＫ内のＤＥ遺伝子座の局所的リプログラミング。ａ、ＲＮＡ配列（遠位ｍｅｔと前駆体対Ａ３８Ｐｅｒ）からＬＯＣＫへのＤＥ遺伝子のマッピングは、ＬＯＣＫで下方制御された遺伝子の周囲のＨ３Ｋ２７Ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃ／Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３／ＤＮＡメチル化における相互変化を明らかにした。ｂ．Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃ／Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３における反対の変化は、ＬＯＣＫにおいて上方制御された遺伝子から検出された。ＤＮＡメチル化はこれらの領域で高いままであった。各比較のＰ値は補足データ３に記載されている。
【０１１１】
図１２：ＥＣＤ内のユークロマチン修飾の濃縮。ヒストン修飾の入力に対して正規化したＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取り密度のプロット（左のラベル）は、ユークロマチン修飾（Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ）が各サブクローンのＥＣＤと呼ばれる領域（０％〜１００％、下パネルラベル）に富むことを示した（グラフの上に表示）。対照的に、ヘテロクロマチン修飾（Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３）はＥＣＤから枯渇した。
【０１１２】
図１３：ＰＤＡＣ進展中の大型ＬＯＣＫのリプログラミング。ａ、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３が濃縮され、そして大きなＬＯＣＫドメインにおいてＤＮＡが低メチル化された。ｂ〜ｃ、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３／２の顕著なリプログラミングおよびＤＮＡメチル化が、Ａ３８大型ＬＯＣＫのサブセットにおいて検出された。ｄ、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ３も大きなＨＰＤＥ  ＬＯＣＫで強化された。ｅ、サンプル間で再プログラムされたドメインの例。
【０１１３】
図１４：Ａ３８サブクローン間の悪性異質性。ａ、オキシドレダクターゼ性能は、血清の不在下で同数の増殖停止細胞に対して行われたＭＴＴアッセイで測定され、ＭＴＴシグナルはウェル当たりの全細胞数に対して正規化された。ＧＯの結果と一致して、Ａ３８Ｌｇはより高いオキシドレダクターゼ活性を有していた。ｎ＝４の技術的反復。ｂ、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰレベルを同数の増殖停止細胞に対して酵素サイクリングアッセイで測定した。より多くのＮＡＤＰＨ／１００万細胞がＡ３８Ｌｇにおいて検出された。ｎ＝２の生物学的複製。ｃ、Ａ３８ＰｅｒおよびＡ３８Ｌｇは、示されるように、患者組織において、および３つの別々のインビトロ培養条件にわたって、十分に／あまり分化していない形態を維持した。ｄ、原発腫瘍由来の固定組織に対して行われたＩＦは、Ｅ３８Ｌｇを播種した前駆体サブクローンにおいてビメンチンの増加と共にＥ−カドヘリンの喪失を示し、ＥＭＴと一致した。ｅ、ＫＲＡＳのＲＮＡｉノックダウンは、懸濁アッセイにおいて、Ａ３８ＬｇよりもＡ３８Ｐｅｒにおいてより効率的にｆ、３Ｄ腫瘍形成を遮断した。ｎ＝４の技術的反復。
【０１１４】
図１５：大型ＬＯＣＫとＥＣＤを標的とした再編成（再配列）。ａ、トータルブレークポイントは、大型ＬＯＣＫまたはＥＣＤ内で大幅に強化されなかった。ｂ、典型的なＬＯＣＫとは異なり、大型ＬＯＣＫ／ＥＣＤブレイクポイントは相同ドメインからのブレイクポイントに有意に結合して再編成を形成した。ｃ、転座および増幅を生じた大型ロック再編成の例。
【０１１５】
図１６：遠位転移に亘って６ＰＧレベルが枯渇したことによるグルコース代謝の増強。ａ、細胞外グルコース消費および乳酸塩分泌は、ｐｅｒと比較して遠位ｍｅｔにおいて上昇した。（ｎ＝３）。ｂ、各サンプルについてプロットされた細胞内代謝産物レベルを伴う解糖（外側）およびＰＰＰ（囲み）代謝産物の概略図。データは、タンパク質に対して正規化したＬＣ−ＭＳシグナルを表す（ｎ＝３〜５）。
【０１１６】
図１７：６ＡＮはグルコース代謝およびＰＰＰのＰＧＤ段階を標的とする。
ａ、６ＡＮは、グルタミン／グルタメートに影響を与えずに、転移性サブクローンにおける細胞外グルコース消費および乳酸分泌の速度を選択的に遅くした。ｂ、６ＡＮは、ＰＰＰの下流の代謝産物への細胞内０１３標識グルコースの取り込みを減少させた。ｃ、６ＡＮは、ＰＧＤ基質（６ＰＧ）および上流の代謝産物（Ｇ１、５Ｌ）の代謝産物レベルを大幅に増加させ、それに対応して下流の産物が減少した。
【０１１７】
図１８：６ＡＮは、遠位転移サブクローンの再プログラムされたクロマチン状態を選択的に調節した。ａ、６ＡＮ処置は、概して、遠位の転移性サブクローンにおける対応するアセチル化の減少を伴って全体的なＨ３Ｋ９Ｍｅ２を増加させた。ｂ、正常細胞および局所領域ＰＤＡＣはそのような変化を示さなかった。ｃ、６ＡＮ変化は３ｄ処理後も持続し（＋）、続いてメディアから６ＡＮを取り除いた（＋−）。
【０１１８】
図１９：６ＡＮ標的化再プログラム化ＬＯＣＫ領域。ａ、６ＡＮを抑制したＤＥ遺伝子をＡ３８ＬｇＬＯＣＫにマッピングすると、これらは再プログラムされたＬＯＣＫ−Ｅ１領域に位置することが明らかになった。ｂ、６ＡＮ処理Ａ３８Ｌｇ対ＤＭＳＯ上のＣｈＩＰ−ｓｅｑは、（Ａ３８ＰｅｒＬＯＣＫに合わせて）再プログラムされた領域からＬＯＣＫ全体のＨ３Ｋ９Ｍｅ２の定量的増加を検出した。ｃ、ＣｈＩＰ−ｓｅｑはまた、ｄ、変化のないＨ３Ｋ２７Ｍｅ３を有するＬＯＣＫにおいて抑制された遺伝子から特異的に６ＡＮ減少したＨ３Ｋ２７Ａｃを検出した。
【０１１９】
図２０：６ＡＮは、遠位転移サブクローンにおいて腫瘍形成を選択的に遮断した。ａ、６ＡＮは、局所領域ＰＤＡＣサンプルが３−Ｄマトリゲルアッセイにおいて、またはｂ、３−Ｄ懸濁腫瘍球アッセイにおいて腫瘍を形成する能力を妨害しなかった。ｎ＝２〜４。ｃ、対照的に、６ＡＮは、３−Ｄ懸濁腫瘍球アッセイ（図示）および３−Ｄマトリゲルアッセイ（図５ｂ）において、遠位転移サブクローンが腫瘍を形成する能力を強くブロックした。ｎ＝４、ｐ＜０．００３。スケールバー：２００μＭ。
【０１２０】
図２１：６ＡＮに応答したＴＯＰ２Ｂ遺伝子座のリプログラミング。ａ、ＲＴ−ｑＰＣＲ（上のパネル）は、６ＡＮがＴＯＰ２Ｂ肺転移性サブクローンを選択的に抑制することを示した。同様に、ＣｈＩＰアッセイは、６ＡＮが肺転移における遺伝子座を横切るＨ３Ｋ９Ｍｅ２の拡散を誘発し、対の腹膜サブクローンには影響を及ぼさないことを示した。ｂ、ｃ代表的なＲＴ−ｑＰＣＲは、ビメンチンに対して最小の効果でＣＤＨ２およびＴＯＰ２ＢのＲＮＡｉノックダウンを確認した（ＥＲＫに対して正規化し、これは全ての条件にわたって等しく発現された）。
ディスカッション
【０１２１】
この研究の最初の主な結果は、転移特異的ドライバー変異、すなわち原発腫瘍のファウンダークローンにはまだ存在していないものの非存在下での遠位転移の進展の間の広範なエピジェネティックなリプログラミングであった。これらは、ヒストンＨ３Ｋ９の大規模なリプログラミングおよび大型ヘテロクロマチンドメイン内のＤＮＡメチル化（ＬＯＣＫおよび低メチル化ブロック）、並びに遺伝子調節修飾の局部的な変化（Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３）を含んでいた。第二に、これらの変化はサブクローン進展中に出現した不均一な悪性特性を特定した。特に、同じ患者からの進展的に分岐（逸脱、相違：divergence）したサブクローンは、オキシドレダクターゼ能力、分化状態、化学療法抵抗性、癌遺伝子依存症、およびゲノム不安定性のパターンを含むそれらの個々の悪性特性と一致する再プログラム領域からの遺伝子発現の変化を示した。第三に、メタボロミクス、ＰＧＤの遺伝的ノックダウン、ＰＧＤの化学的阻害、および下流の標的遺伝子のノックダウンによって示されるように、遠位メタクローンサブクローンにおけるリプログラミングされたクロマチンおよび腫瘍形成性の側面を制御したのはｏｘＰＰＰのＰＧＤ工程であった。これは、この同化グルコース経路が悪性のエピジェネティック状態および腫瘍形成特性を維持するために遠位転移の進展の間に選択されたことを強く示唆する。
【０１２２】
これらの発見はまた私達が他の研究で追求しているいくつかの重要だが複雑な質問を提起する。おそらく最も複雑なのは、患者にわたるサブクローン間のエピジェネティックで悪性の異質性の程度に関するものである。一人の患者でこれに答えるためには、全ゲノムマッピング、ＲＮＡ配列、バイオインフォマティクス、およびいくつかの下流実験アプローチの組み合わせが必要とされた。
我々は、そのような異質性は進展の時間の関数であると仮定する：後期の広範囲に転移性の疾患を呈する患者は、初期の疾患を呈する患者よりも腫瘍におけるサブクローン間のエピジェネティックかつ悪性の分岐を有する可能性がある。この可能性は、そのような悪性の異質性が生じる前に、癌を早期に発見することの差し迫った必要性を強調している。
【０１２３】
また、ＰＧＤ／ｏｘＰＰＰ活性が全体的なエピジェネティック状態を制御する正確なメカニズムも不明瞭であり、これは複雑である可能性が高い。これは、酸化還元バランス、脂肪酸生合成、および／またはリボース生合成を含む、細胞代謝における既知のｏｘＰＰＰ依存性変化のいずれかを介して媒介される可能性があり、それらはいずれも、クロマチン修飾酵素の全クラスを活性化または阻害する代謝産物補因子の制御を通じて全体的なエピジェネティック状態に影響を及ぼし得る。ＰＧＤ活性自体もまた複雑であり、そして転写過剰発現、転写後抑制、翻訳後修飾、タンパク質間相互作用、基質利用可能性、フィードバック阻害、他の経路とのクロストーク、および高度に保存されているが特徴付けられていない核画分を含む細胞内局在性（C.Lysiotois、私信）を含むいくつかの調節モードを受ける。ＰＧＤ依存性は、異なる患者における遠位転移の進展中にこれらの機構のいずれかによって選択され得る。
【０１２４】
最後の質問は、全体的なエピジェネティックな変化が、サブクローン進展中の遺伝子発現の変化をコードする特定のクロマチンドメインをどのように標的としているかということである。我々は、これらの領域に直接結合する転写因子とクロマチン修飾酵素がリプログラミングイベントの標的化において主要な役割を果たすと仮定し、そしていくつかの候補が我々のＲＮＡ配列データセットにおいて繰り返し過剰発現された。これはヒストンデメチラーゼＫＤＭ１Ａ（ＬＳＤ１）を含み、これは我々が以前にこの酵素がＬＯＣＫリプログラミングを制御することを示し、そして他の研究がそれが乳癌転移を調節することを示したので特に重要である。
【０１２５】
要約すると、ここで報告されている同じサンプルの多くについてのディープシーケンシング研究と組み合わせた我々の発見は、ＰＤＡＣ腫瘍形成を開始するためにドライバー変異が早期に発生し、その後に不均一な代謝、後成的、悪性特性を生み出すサブクローン進化の期間が続くモデルを示唆する。ドライバー変異と同様に、それらを獲得する細胞への適合性の増加を付与するそれらの特性は、浸潤性腫瘍増殖および転移性増殖の間に選択されクローン的に拡大され得る。遠位転移性サブクローンで我々が観察する強いｏｘＰＰＰ−ＰＧＤ依存性は、そのような選択を反映するかもしれない：遠位転移部位は経路に燃料を供給するために十分なグルコースを提供し、経路生成物（グルコース依存性ＮＡＤＰＨ）はその部位内で遭遇する酸素種を減少させ、そして経路それ自体は腫瘍形成を促進するエピジェネティックプログラムに結合される。そのため、ｏｘＰＰＰを標的とすることによる悪性エピジェネティックプログラムの逆転は、すべてのヒト悪性腫瘍の中で最も致命的なものの１つである転移性ＰＤＡＣのための効果的な治療戦略を表し得る。
データ保管
【０１２６】
すべてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、および重亜硫酸塩−ｓｅｑシーケンスデータは、次のＵＲＬ：ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=sxyjkaqsvfalheh&acc=GSE63126
にオンラインで保管されている（ＧＥＯ番号：ＧＳＥ６３１２６）。
方法概要
【０１２７】
組織サンプルおよび細胞株は、以前に記載されたように、迅速剖検によってＰＤＡＣ患者から以前に収集され、配列確認され、そしてマイコプラズマについてモニターされた。低継代（２〜１７）急速剖検細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ中で３７℃で培養した。ＭＴＴアッセイについては、１５，０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに３連で蒔き、１２時間後に処理し、そして２４時間後（グルコース応答）または６日後（化学療法）にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。グルコース応答アッセイについては、栄養素欠乏ＤＭＥＭ（グルコース、グルタミン、ピルビン酸塩、または血清なし）を指示されたようにグルコースを添加して使用した。グルコース依存性酸化ストレス分析のために、細胞を三重に蒔き、そして８０％コンフルエントまで増殖させ、続いて１０ｍＭグルコースおよび１ｍＭＨの２Ｏ２を含むまたは含まない１０％透析ＦＢＳを含有する栄養欠乏ＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、そして生存細胞を血球計で計数した。補足方法に記載されているように、グルコース取り込みおよび乳酸分泌をＹＳＩ７１００バイオアナライザーで測定した。１３Ｃ−１，２グルコース追跡および定常状態代謝産物プロファイリングのために、液体クロマトグラフィー（ＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ）と組み合わせたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＭＳ（ＱＥ−ＭＳ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を前述のように代謝産物の分離および検出に使用した。詳細な条件は補足方法に記載されている。
【０１２８】
記載のようにヒストンを酸抽出し、そして３．５μｇのヒストンについてウエスタンブロットを行い、これを、等しい負荷を確実にするためにウエスタンブロットの前にポンソー染色によってチェックした。デンシトメトリーはＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で抽出し、イソプロパノールで沈殿させた。ゲノムＤＮＡをＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ抽出試薬（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）で精製した。ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織マイクロアレイ切片（ＴＭＡ）上の免疫組織化学、Ｈ＆Ｅ染色、および免疫蛍光を標準的な手順に従って実施した。ウエスタンブロット、ＩＨＣ、およびＣｈＩＰに使用される抗体を表１１に示す。
【０１２９】
表１１：ウエスタンブロット、免疫染色、およびＣｈＩＰ実験に使用された抗体と条件
【表１１】
2019535017.tif 000015
【０１３０】
ＲＮＡｉ実験は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、ＳＩＣ００１）および並行して、示された遺伝子に対して予め設計されたｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド(Sigma, PGD: SASI_Hs02_00334150, CDH2: SASI_Hs01_00153995, TOP2B: SASI_Hs02_00311874)を用いて、ｓｉＲＮＡトランスフェクション（Oligofectamine, Life Technologies）を用いて実施した。突然変異体ＫＲＡＳＧ１２Ｖ（ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣ）（配列番号１）に対するｓｉＲＮＡは特注設計された。トランスフェクション後、細胞をｓｉＲＮＡと４日間インキュベートし、回収した。２−Ｄでの薬物治療のために、細胞を７０〜８０％の密集度まで増殖させ、そして２５０μＭの６ＡＮまたはＤＭＳＯ陰性対照で３日間処理した。
【０１３１】
三次元マトリゲルアッセイは、Cheung et al.（Control of alveolar differentiation by the lineage transcription factors GATA6 and HOPX inhibits lung adenocarcinoma metastasis. Cancer Cell 23, 725-38 (2013)）から適合させた。簡単に説明すると、二次元培養物を単一細胞にトリプシン処理し、４，０００細胞／ｍＬを懸濁し、５％マトリゲル（ＢＤシステム）および２％ＦＢＳ（必要に応じて＋／−ＤＭＳＯ／６ＡＮ）を含有する氷冷ＤＭＥＭ中に混合し、５００μｌを２４ウェルの超低接着プレートに４回重複して播種し、腫瘍増殖を可能にするために少なくとも７日間インキュベートした。その後、整形された腫瘍を数え、代表的な写真をＥＶＯＳ機器で撮影した。記載されているように、超低接着性６ウェルプレート中、２０，０００開始細胞／ウェルで三次元懸濁腫瘍球アッセイを行い、そして腫瘍増殖の少なくとも７日後に腫瘍を計数／写真撮影した。
【０１３２】
器官型腫瘍形成アッセイは、Ridky et al.（P.A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med 16, 1450-5 (2010)）および Andl et al.（Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J Biol Chem 278, 1824-30 (2003)）から適合させた。簡単に説明すると、６ウェル透過性トランスウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３４１４）を、１０×ＤＭＥＭを含む１ｍＬの１型コラーゲン（無細胞層）で覆った。ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ）を氷冷１０×ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５２．５％コラーゲン、および１７．５％マトリゲル（細胞層）の混合物中に懸濁し（１２×１０６細胞／ｍＬ）、十分に混合し、無細胞層上に２ｍＬ／ウェルでプレーティングした。混合物を３７℃で約１５分間部分的に固化させ、続いて１×１０６個のＰＤＡＣ（２０μｌのＤＭＥＭに懸濁）細胞を細胞層に３回注入した。インサートの上下の線維芽細胞増殖培地中で細胞を２４時間インキュベートしてディスクの収縮を開始させた。次いで、ＤＭＳＯまたは６ＡＮを含む新鮮な培地を添加し、さらに６日間２日ごとに補充し、続いてインサートの下にＤＭＳＯまたは６ＡＮを含むＤＭＥＭをさらに７日間添加した（上部には培地なし）。ディスクを採取し、１０％ホルマリン中で一晩固定し、薄切し、パラフィン包埋し、そしてＨ＆Ｅで染色した。腫瘍を撮影し、ｃｅｌｌＳｅｎｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄソフトウェアを使用してＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５３顕微鏡で測定した。
【０１３３】
ウエスタンブロットデンシトメトリー、ＭＴＴアッセイ、および腫瘍測定にＥｘｃｅｌソフトウェアを使用して、図の説明文に示されているように、技術的複製（同時に並行して実施）または生物学的複製（異なる時期に実施）実験から収集したデータについて統計的有意性（両側スチューデントｔ検定）の試験を行った。Hansen et al. (Increased methylation variation in epigenetic domains across cancer types. Nat Genet 43, 768-75 (2011))に記載されているように、全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定およびＲＮＡ配列決定をＨｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行った。超音波処理を用いて固定細胞について先に記載したようにＣｈＩＰアッセイを実施した。ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲの場合、等量の対のインプット／ＩＰ  ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６）によって増幅し、倍増度を計算した。プライマー配列は補足表１２に列挙されている。ＣｈＩＰ−ｓｅｑについては、免疫沈降し、インプットしたＤＮＡをさらに２００〜３００ｂｐフラグメントに剪断し、アガロースゲル上でサイズ選択し、そしてＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）またはＳＯＬｉＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）フォーマットのいずれかで同等の結果で配列決定した。ＩＰ配列決定読み取りをそれらの対応するインプットに対して正規化した。配列決定手順、ドメインコールを含むバイオインフォマティクス方法、および統計分析は、補足的方法の節に詳細に記載されている。
【０１３４】
表１２．ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ実験に使用されるリアルタイムＰＣＲプライマー配列
【表１２】
2019535017.tif 000016
【０１３５】
補足方法
ＹＳＩ代謝物の分析。代謝産物消費量（グルコースおよびグルタミン）および生産量（乳酸塩およびグルタミン酸塩）は、ＹＳＩ７１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定した。指示された細胞株を、−１日目に６ウェルプレートにプレーティングした。０日目に、細胞をカウントするか（３ウェル）、または通常の培地または指示された化合物を補充した培地のいずれかで培養した。細胞プレーティングの７２時間後に、組織培養上清（１ｍＬ、ｎ＝３、各条件）を回収した。組織培養条件は、栄養素の利用可能性および指数関数的な細胞増殖を確実にするために最適化された。代謝産物消費／産生データは、以前に記載されているように（Lee et al.、２０１４：ＰＭＩＤ：２４９９８９１３）、曲線下の細胞数面積に対して正規化した。曲線下面積（ＡＵＣ）は、Ｎ（Ｔ）ｄ／Ｉｎ２（１−２−Ｔ／ｄ）として計算され、ここで、Ｎ（Ｔ）は最終細胞数、ｄは倍増時間、そしてＴは実験時間である。倍増時間はｄ＝（Ｔ）［ｌｏｇ（２）／ｌｏｇ（Ｑ２／Ｑ１）］として計算され、ここでＱ１は血球計を用いた手動計数により決定されるように開始細胞数でありそしてＱ２は最終細胞数である。
【０１３６】
ＬＣ−ＨＲＭＳ代謝産物プロファイリング。ＬＣ−ＨＲＭＳサンプルをLiuらに記載されているように調製し分析した（Development and quantitative evaluation of a high-resolution metabolomics technology. Anal Chem 86, 2175-84 (2014)）。グルコース追跡実験のために、細胞を３連で６ウェルプレートに播種し、７０〜８０％コンフルエントになるまで１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させ、栄養欠乏ＤＭＥＭで２回洗浄し、１０ｍＭの１３Ｃ−１，２標識グルコース（Ｃａｙｍａｎ）および１０％透析ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する栄養欠乏ＤＭＥＭ中でさらに３６時間インキュベートした。追加の複製も含まれ、正規化のために実験の終わりにカウントされた。急速に培地を除去し、１ｍＬの予め冷却された（−８０℃）ＬＣ−ＭＳグレードの８０％メタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって代謝をクエンチし、−８０℃で少なくとも２０分間インキュベートし、続いてメタノール中に掻き取り、そして遠心分離により代謝産物をペレット化した。薬物処理のために、細胞を標準ＤＭＥＭ＋／−ＤＭＳＯ／６ＡＮ中で３６時間インキュベートし、続いて標識グルコース培地＋／−ＤＭＳＯ／６ＡＮ中でさらに３６時間インキュベートし、上記のようにクエンチしそしてペレット化した。ペレットを等容量の１：１ＬＣ−ＭＳグレードのアセトニトリル：メタノールおよび水に再構成し、５μｌを分析のためにＬＣ−ＱＥ−ＭＳに注入した。定常状態測定のために、細胞を増殖培地（ＰＤＡＣ用の１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ、ＨＰＤＥ用のケラチノサイト無血清培地）中でそれらが８０〜９０％コンフルエントに達するまでインキュベートし、続いて血清なしのＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートした（ＰＤＡＣについては、比較のための標準増殖培地ＨＰＤＥ細胞もまた血清を含まなかったので）。次いで代謝をメタノールでクエンチし、代謝産物を上記のようにペレット化した。ペレットをタンパク質含有量（タンパク質１ｍｇあたり１５μＬの１：１アセトニトリル：メタノールおよび１５μＬの水を使用した）に対して正規化した容量に再構成し、ＬＣ−ＱＥ−ＭＳによって分析した。ＬＣ−ＱＥ−ＭＳから収集した生データを、分析に必要とされるように解糖／ＰＰＰ代謝産物を含む標的フレームシードを使用して、Ｓｉｅｖｅ２．０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。異なる試料中の検出されたｍ／ｚおよび相対強度を含む出力ファイルはデータ処理後に得られ、そして各試料からの選択された代謝産物の複製はグラフに示されるようにグラフ化されそして提示された。
【０１３７】
配列決定ライブラリーの調製。２〜１０ｎｇのＩＰ  ＣｈＩＰ  ＤＮＡと１００ｎｇのインプットＤＮＡからライブラリーを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（ＡＰＦ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でシーケンスした。簡単に説明すると、試料をバイオアナライザーで１５０〜２５０ｂｐの品質および濃度について調べた。５８μｌの反応緩衝液中でクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼを用いてＤＮＡを末端修復した。ＩＰ  ＤＮＡについては、クレノウを１：５に希釈した。試料を２０℃で３０分間インキュベートし、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラムで精製した。次いで、Ａ尾部（Ａ−ｔａｉｌ）を、ＮＥＢ緩衝液２中のＫｌｅｎｏｗおよびｄＡＴＰを用いて３７℃で３０分間ＤＮＡに添加し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムで洗浄した。次いで、シークエンシングアダプターを室温で１５分間ＤＮＡに連結し、続いてＭｉｎｉＥｌｕｔｅカラムで洗浄した。次に試料を２％アガロースゲル上に流し、２１６ｂｐ−３６６ｂｐからのＤＮＡ（ＤＮＡ＋アダプター）をゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎＧｅｌ抽出キットを用いて精製した。次いで濃度をバイオアナライザーでチェックし、８ｎｇをＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｆｉｓｈｅｒ）で１５サイクル（１０秒間９８℃、３０秒間６５℃、３０秒間７２℃）ＰＣＲ増幅し、続いて７２℃で５分間増幅した。次に試料をＡｍｐｕｒｅキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で洗浄し、８０％エタノールで洗浄した。クリーンアップの最後にＤＮＡサンプルを１７．５μｌの緩衝液ＥＢ（Ｑｉａｇｅｎ）に再懸濁し、製造者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォーム上で次世代配列決定に供した。ＳＯＬＩＤシークエンシングのために、ＣｈＩＰ  ＤＮＡを調製し、ジョンズホプキンスＣＲＢＩＩコアファシリティで製造元のプロトコルに従って試料を処理した。
【０１３８】
ＢＳ−Ｓｅｑデータ処理。１００ｂｐ対末端ＨｉＳｅｑ２０００シークエンシングリードを、以前にHansen et al.（Increased methylation variation in epigenetic domains across cancer types. Nat Genet 43, 768-75 (2011)）に記載されているように、ＢＳｍｏｕｓｈバイサルファイトアライメントパイプライン（バージョン０．７．１）によってアライメントした。簡潔に説明すると、ヒトゲノム（ｈｇ１９）およびラムダファージゲノムに対してＢｏｗｔｉｅ２（バージョン２．０．１）によって読み取り（リード）を整列（アラインメント）させた。整列後、各ＣｐＧについてのメチル化測定値を整列したリードから抽出した。我々は、マッピング品質＜２０またはシトシン位置＜１０のヌクレオチド塩基品質で測定値を除外し、また、対の両方の５’の１０個のヌクレオチドからの測定値を削除した。次に、ＢＳｍｏｏｔｈのｂｓｓｅｑパッケージを使用して、小および大の示差メチル化領域（ＤＭＲ）を同定した。我々の分析には、すべての試料のうち少なくとも３のカバレッジを持つＣｐＧのみが含まれていた。小さいＤＭＲについては、２０ＣｐＧまたは１ｋｂの滑らかなウィンドウを使用し、小さいＤＭＲを同定するために−４．６、４．６のｔ−統計的カットオフおよび２０％を超えるメチル化差を使用した。一方、大型ＤＭＲについては、２００ＣｐＧまたは１０，０００ｂｐｓの滑らかなウィンドウを使用し、大型ＤＭＲを同定するために、−２，２のｔ−統計的カットオフ、１０％を超えるメチル化差および５ｋｂ超のＤＭＲを使用した。
【０１３９】
ＲＮＡ‐Ｓｅｑデータ処理１００ｂｐ対末端ＨｉＳｅｑ２０００配列決定リードを、デフォルトパラメーターを用いてＯＳＡ（バージョン２．０．１）によってヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して整列させた。整列後、一意に整列したリードのみをさらなる分析のために残した。遺伝子注釈情報はＥＮＳＥＭＢＬ（ensembl.com、リリース６６）からダウンロードした。全サンプルの各遺伝子についての読み取り数をＨＴＳｅｑ（huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/overview.html）を使用して推定し、次いでＤＥＳｅｑパッケージを使用して示差的に発現された（ＤＥ）遺伝子を同定するために使用した。ＦＤＲ＜０．０１および倍率変化＞１．５を有する遺伝子をＤＥ遺伝子と見なした。
【０１４０】
チップシーケンスデータ処理。４６ｂｐのペアエンドのイルミナＨｉＳｅｑ２０００配列決定データについては、Li et al.（Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-60 (2009)）に記載されているようにデフォルトパラメータを用いてＢＷＡを使用してリードをヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して整列させた。アラインメントの後、重複した読み取りは取り除かれ、ユニークにアラインされた読み取りのみがさらなる分析のために保持された。４８ｂｐのシングルエンドソリッドシークエンシングデータでは、Ｂｏｗｔｉｅ７を使用してデフォルトのパラメータで読み取りをアライメントし、その後の分析のためにユニークにアライメントされた読み取りのみを保持した。狭いヒストン修飾ピーク（Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３とＨ３Ｋ２７Ａｃ）では、デフォルトパラメータ８でＭＡＣＳ２をピークコールに使用した。広域ヒストン修飾濃縮（Ｈ３Ｋ３６Ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、およびＨ３Ｋ９Ｍｅ２／３）については、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づき、広域ヒストンピークを同定するために特別に設計されたＲＳＥＧを使用してピークコーリングを行った（Song et al. (Identifying dispersed epigenomic domains from ChIP-Seq data. Bioinformatics 27, 870-1 (2011))を参照されたい。）。
【０１４１】
大型クロマチンドメインの同定。ＲＳＥＧのピークコーリング結果に基づいて、ヘテロクロマチン修飾（Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２／Ｈ３Ｋ２７Ｍｅ３）のＬＯＣＫドメインを定義する。簡潔に説明すると、５ｋｂより短いピークを最初に除去して、近くに多数の短いピークがある領域をＬＯＣＫと呼ぶことを防止した。次に、２０ｋｂ未満の距離を持つ隣接ピークを１つのドメインにマージした。両方の生物学的複製において同定された１００Ｋｂを超える併合領域はＬＯＣＫと呼ばれた。我々は、５００ｋｂよりも常に大きく、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２が強く濃縮され、Ｈ３Ｋ９Ｍｅ２およびＨ３Ｋ２７Ｍｅ３が枯渇し、そして境界にＨ３Ｋ２７Ｍｅ３の強いピークが隣接しているＬＯＣＫの別の独特なサブセットに気付いた。このため、本発明者らは、これらのＬＯＣＫを、５００ｋｂより大きく、その長さの５０％未満がＨ３Ｋ２７ｍｅ３と重複するＨ３Ｋ９Ｍｅ３領域によって定義した。最後に、対応するユークロマチン性Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３／Ｈ３Ｋ２７Ａｃ調節ピークを有する少なくとも１つの遺伝子を含むヘテロクロマチンドメイン間の広い領域（＞５０ｋｂ）をＥＣＤと定義した。Ｈ３Ｋ２７Ａｃだけでこれらの呼び出しに十分であることがわかったため、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ３はＡ３８Ｐｅｒ／Ｌｇの初期テストデータセットにも使用されたが、後続のデータセットでは必要とされなかった（Ａ１３Ｐｒ１／２、Ａ１３Ｌｇ）。ドメインコールに使用されるすべてのコードは要求に応じて利用可能である。
【０１４２】
異なる遺伝子群を定義する。遺伝子は、ユークロマチン（ＥＣＤに位置する遺伝子領域の＞５０％）またはヘテロクロマチン（ＬＯＣＫおよびＧ−ＬＯＣＫを含むそれらのヘテロクロマチンドメインに位置する遺伝子領域の＞５０％）内に属すると分類された。これらの基準に合わず、「その他」として分類された、一握りの他の遺伝子。ＣｈＩＰ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑの定量化および濃縮プロット。定義された大型クロマチンドメインおよびそれらのフランキング領域上の各ヒストン修飾をプロットするために、本発明者らは、クロマチンドメインのフランキング配列を固定長（ｂｐ）のビン（ｂｉｎ）およびドメイン自体を各ドメイン長の固定百分率のビンに分割した。Hawk et al.（Distinct epigenomic landscapes of pluripotent and lineage-committed human cells. Cell Stem Cell 6, 479-91 (2010)）に記載されているように、ＣｈＩＰ濃縮を測定し正規化した。簡潔に説明すると、配列決定された１００万回の読み取りあたりのビンのキロベースあたりの読み取りの数を、各ＣｈＩＰおよびその入力制御（ＲＰＫＭＣｈＩＰおよびＲＰＫＭｉｎｐｕｔとして示される）について計算した。ＣｈＩＰ濃縮は、ΔＲＰＫＭ＝ＲＰＫＭＣｈＩＰ−ＲＰＫＭｉｎｐｕｔとして測定され、ＣｈＩＰ濃縮領域はΔＲＰＫＭ＞０を有するべきである。次に、すべてのΔＲＰＫＭを０から１の間のスケールに正規化し、すべての大きなクロマチンドメインにわたる平均の正規化ＣｈＩＰ濃縮シグナルを各ヒストンマークについてプロットした。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータもまた、配列決定されそして同様にプロットされた１００万回の読み取り当たりのビンのキロベース当たりの読み取りの数によって正規化された。
【０１４３】
補足データ
補足データ１．これは、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＷＧＢＳ、およびＲＮＡ−ｓｅｑ実験のすべての複製サンプルのシーケンス読み取り数（トータル読み取り数とユニークアラインメント読み取り数）を示し、複製サンプル間の相関係数を含む。
【０１４４】
補足データ１Ａ：すべての複製サンプルについてのＣｈＩＰ−ｓｅｑ読み取りの概要
【表１３−１】
2019535017.tif 000017
【表１３−２】
2019535017.tif 000018
【表１３−３】
2019535017.tif 000019
【０１４５】
補足データ１Ｂ：すべての複製サンプルについてのＷＧＢＳ読み取りの概要
【表１４】
2019535017.tif 000020
【０１４６】
補足データ１Ｃ：すべての複製サンプルについてのＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りの概要
【表１５】
2019535017.tif 000021
【０１４７】
補足データ１Ｄ：各複製についての配列決定相関係数の概要
【表１６】
2019535017.tif 000022
【０１４８】
補足データ２．これは、中央長さ（median length）、範囲、％ゲノム範囲、各ドメインタイプの個々のヒストン修飾レベルを含む、各サンプルのＬＯＣＫ、大型ＬＯＣＫ、およびＥＣＤのクロマチンドメイン呼び出しの概要を提供する。個々のヘテロクロマチン修飾のそれぞれについての中央長さ、範囲、および％ゲノム範囲（ドメインの位置にかかわらず）も個々に含まれる。
【０１４９】
補足データ２Ａ：ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって検出された大型クロマチンドメインの概要
【表１７】
2019535017.tif 000023
【０１５０】
補足データ２Ｂ：ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって検出された広範なヘテロクロマチン修飾の概要
【表１８】
2019535017.tif 000024
【０１５１】
補足データ３．これは、図のラベルによって示されるように、配列決定実験について計算されたすべてのｐ値を提供する。ＬＯＣＫドメインコールの感度分析も含まれる。
【０１５２】
補足ファイル３Ａ：ＬＯＣＫにわたるＨ３Ｋ９Ｍｅ２再プログラミングのｐ値
【表１９】
2019535017.tif 000025
【０１５３】
補足データ３Ｂ：ＤＥ遺伝子から再プログラムされたユークロマチン修飾のｐ値
【表２０】
2019535017.tif 000026
【０１５４】
補足データ３Ｃ：ＬＯＣＫにわたるＨ３Ｋ９Ｍｅ３の再プログラミングのｐ値
【表２１】
2019535017.tif 000027
【０１５５】
補足データ３Ｄ：ＬＯＣＫ ＤＥ遺伝子からの修飾の再プログラミングのｐ値
【表２２】
2019535017.tif 000028
【０１５６】
補足データ３Ｅ：大型ロックドメインにわたる再プログラミングのｐ値
【表２３】
2019535017.tif 000029
【０１５７】
補足データ３Ｆ：６ＡＮ  ＲＮＡ／ＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験のｐ値
【表２４】
2019535017.tif 000030
【０１５８】
補足データ３Ｇ：ＬＯＣＫ感度分析
【表２５】
2019535017.tif 000031
【０１５９】
補足データ４．このファイルには、発現レベル、ｐ値、方向の変化、および各ＤＥ遺伝子がマッピングしたクロマチンドメインを含む、ＲＮＡ−ｓｅｑによって各サンプルで検出されたすべての差次的に発現される（ＤＥ）遺伝子が示される。遠位転移サンプルにわたって、および対照（ＤＭＳＯ）細胞と６ＡＮ処理細胞との間で検出された再発性ＤＥ遺伝子の分析もまた報告されている。
【０１６０】
補足データ４Ａ：ＲＮＡ−ｓｅｑによって検出され、クロマチンドメインにマッピングされたＡ３８ＰｅｒとＡ１３Ｐｒ１の間のＤＥ遺伝子の概要（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com/ ng/journal/ v49/n3/full/ ng.3753.html? foxtrotcallback =true#supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６１】
補足データ４Ｂ：ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出されクロマチンドメインにマッピングされたＡ３８ＰｅｒとＡ１３Ｐｒ２の間のＤＥ遺伝子の概要（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com/ ng/journal/ v49/n3/full /ng.3753.html? foxtrotcallback= true# supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６２】
補足データ４Ｃ：ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出されクロマチンドメインにマッピングされたＡ３８ＰｅｒとＡ１３Ｌｇの間のＤＥ遺伝子の概要（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com/ ng/journal/ v49/n3/full /ng.3753.html? foxtrotcallback= true# supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６３】
補足データ４Ｄ：ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出されクロマチンドメインにマッピングされたＡ３８ＰｅｒとＡ３８Ｌｇの間のＤＥ遺伝子の概要（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com/ ng/journal/ v49/n3/full/ ng.3753.html? foxtrotcallback =true#supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６４】
補足データ４Ｅ：ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出されたＡ３８ＰｅｒとＡ３８Ｌｖの間のＤＥ遺伝子の概要（ＣｈＩＰ−ｓｅｑはクロマチンドメインには実行されない）（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com/ ng/journal/ v49/n3/full/ ng.3753.html?foxtrotcallback =true# supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６５】
補足データ４Ｆ：原発腫瘍前駆体（Ａ１３Ｐｒ１／２）および遠位転移サブクローン（Ａ１３Ｌｇ、Ａ３８Ｌｇ、Ａ３８Ｌｇ）とＡ３８Ｐｅｒの間で反復的に上方／下方制御されたＤＥ遺伝子の概要（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com /ng/journal/ v49/n3/full/ng.3753.html? foxtrotcallback =true#supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６６】
補足データ４Ｇ：ＲＮＡ−ｓｅｑにより検出されクロマチンドメインにマッピングされた対照（ＤＭＳＯ）および６ＡＮ処理Ａ３８Ｌｇ細胞間のＤＥ遺伝子の概要（データは示されていない−ワールドワイドウェブ上の「nature.com/ ng/journal/v49/n3/full/ ng.3753.html? foxtrotcallback= true# supplementary -information」で「補足表７」をクリックすることにより公的に利用可能）。
【０１６７】
補足データ４Ｈ：適合した肺サブクローンと腹膜サブクローンとの間のＤＥ遺伝子（Ａ３８Ｌｇ対Ａ３８Ｐｅｒ）と、対照細胞と６ＡＮ処理したＡ３８Ｌｇ細胞との間のＤＥ遺伝子との間の重複の比較。
【表２６−１】
2019535017.tif 000032
【表２６−２】
2019535017.tif 000033
【表２６−３】
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【表２６−４】
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【表２６−５】
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【表２６−６】
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【表２６−７】
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【表２６−８】
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【表２６−９】
2019535017.tif 000040
【表２６−１０】
2019535017.tif 000041
【表２６−１１】
2019535017.tif 000042
【表２６−１２】
2019535017.tif 000043
【表２６−１３】
2019535017.tif 000044
【表２６−１４】
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【表２６−１５】
2019535017.tif 000046
【表２６−１６】
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【表２６−１７】
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【表２６−１８】
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【表２６−１９】
2019535017.tif 000050
【表２６−２０】
2019535017.tif 000051
【表２６−２１】
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【表２６−２２】
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【表２６−２３】
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【表２６−２４】
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【表２６−２５】
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【表２６−２６】
2019535017.tif 000057
【０１６８】
補足データ４Ｉ：全サンプル（対Ａ３８Ｐｅｒ）およびＤＭＳＯ対６ＡＮ処理Ａ３８Ｌｇ細胞にわたる再発性ＤＥ遺伝子間の重複の比較。
【表２７−１】
2019535017.tif 000058
【表２７−２】
2019535017.tif 000059
【表２７−３】
2019535017.tif 000060
【表２７−４】
2019535017.tif 000061
【表２７−５】
2019535017.tif 000062
【表２７−６】
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【表２７−７】
2019535017.tif 000064
【表２７−８】
2019535017.tif 000065
【表２７−９】
2019535017.tif 000066
【０１６９】
上記実施例を参照して本発明を説明したが、本発明の精神および範囲内で修正および変形が包含されることが理解されるであろう。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１−１】
2019535017.tif 000067
【図１−２】
2019535017.tif 000068
【図１−３】
2019535017.tif 000069
【図２】
2019535017.tif 000070
【図３】
2019535017.tif 000071
【図４】
2019535017.tif 000072
【図５】
2019535017.tif 000073
【図６−１】
2019535017.tif 000074
【図６−２】
2019535017.tif 000075
【図７】
2019535017.tif 000076
【図８】
2019535017.tif 000077
【図９】
2019535017.tif 000078
【図１０】
2019535017.tif 000079
【図１１】
2019535017.tif 000080
【図１２】
2019535017.tif 000081
【図１３】
2019535017.tif 000082
【図１４】
2019535017.tif 000083
【図１５】
2019535017.tif 000084
【図１６】
2019535017.tif 000085
【図１７】
2019535017.tif 000086
【図１８】
2019535017.tif 000087
【図１９】
2019535017.tif 000088
【図２０】
2019535017.tif 000089
【図２１】
2019535017.tif 000090
【図２２】
2019535017.tif 000091
【配列表】
2019535017000001.app
【国際調査報告】
2019535017.tif 000092
2019535017.tif 000093