(57)【要約】  細胞を培養するための閉鎖型小型デバイスおよびこれらのデバイスの使用方法が開示される。特に、ポイントオブケアでの医療処置の実施を可能にするような、個別化医療用に細胞を製造、増殖、分化および／またはリプログラミングするためのデバイスおよびこのデバイスを使用する方法が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個別化医療のために細胞を培養するためのデバイスであって、
三次元（３Ｄ）ハイドロゲル足場を含む閉鎖型ハウジングと、
細胞培養培地を前記ハウジングに導入するための入口と、
細胞培養培地を前記ハウジングから排出するための出口と
を含む、前記デバイス。
【請求項２】
前記閉鎖型ハウジングは、閉鎖型細胞培養チューブである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記閉鎖型ハウジングは、１０Ｌ未満の容量を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、アルギネートポリマーを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、シート、繊維、中空繊維、球体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される形態である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
前記細胞は、ヒト初代細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、およびそれらの派生物、初代腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
培養のための前記細胞は、ｉＰＳＣである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
請求項１に記載のデバイスを使用して細胞を増殖させる方法であって、
前記閉鎖型ハウジングの前記３Ｄハイドロゲル足場に細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、
細胞培養培地を前記入口から前記閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、
前記細胞を培養するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップは、前記細胞溶液からの細胞を前記３Ｄハイドロゲル足場中に封入するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップを含む前記３Ｄハイドロゲル足場から前記培養された細胞を放出するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびアルギネートリアーゼ溶液からなる群より選択される化学的溶解剤を使用して前記３Ｄハイドロゲル足場を化学的に溶解するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップは、機械力を用いて前記３Ｄハイドロゲル足場を物理的に溶解するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって前記培養された細胞を精製するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養された細胞を遠心分離することによって、または前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって、前記培養された細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記閉鎖型ハウジング内の前記培養された細胞をポイントオブケアに輸送するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーを含む、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、アルギネートポリマーを含む、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記細胞は、ヒト初代細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、およびそれらの派生物、初代腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載のデバイス。
【請求項２０】
請求項１に記載のデバイスを使用して細胞を分化させる方法であって、
前記閉鎖型ハウジングの前記３Ｄハイドロゲル足場中に細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、
細胞分化培地を前記入口から前記閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、
前記細胞を培養するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２１】
前記細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップは、前記細胞溶液からの細胞を前記３Ｄハイドロゲル足場中に封入するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップを含む前記３Ｄハイドロゲル足場から前記培養された細胞を放出するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびアルギネートリアーゼ溶液からなる群より選択される化学的溶解剤を使用して前記３Ｄハイドロゲル足場を化学的に溶解するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップは、機械力を用いて前記３Ｄハイドロゲル足場を物理的に溶解するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって前記培養された細胞を精製するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記培養された細胞を遠心分離することによって、または前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって、前記培養された細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記閉鎖型ハウジング内の前記培養された細胞をポイントオブケアに輸送するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーを含む、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２９】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、アルギネートポリマーを含む、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記細胞は、ヒト初代細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、およびそれらの派生物、初代腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項３１】
請求項１に記載のデバイスを使用して細胞をリプログラミングする方法であって、
前記閉鎖型ハウジングの前記３Ｄハイドロゲル足場中に成体細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、
細胞培養培地を前記入口から前記閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、
前記細胞をリプログラミングするステップと
を含む、前記方法。
【請求項３２】
前記細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップは、前記細胞溶液からの細胞を前記３Ｄハイドロゲル足場中に封入するステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップを含む前記３Ｄハイドロゲル足場から前記培養された細胞を放出するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびアルギネートリアーゼ溶液からなる群より選択される化学的溶解剤を使用して前記３Ｄハイドロゲル足場を化学的に溶解するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記３Ｄハイドロゲル足場を溶解するステップは、機械力を用いて前記３Ｄハイドロゲル足場を物理的に溶解するステップを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって前記培養された細胞を精製するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記培養された細胞を遠心分離することによって、または前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって、前記培養された細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記閉鎖型ハウジング内の前記培養された細胞をポイントオブケアに輸送するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーを含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、アルギネートポリマーを含む、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記細胞は、ヒト初代細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、およびそれらの派生物、初代腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年１１月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／４２５，１４１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、閉鎖型小型細胞培養システムにおける初代ヒト細胞、初代ヒト腫瘍細胞、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ヒト誘導多能性幹細胞（ｈＥＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）およびヒト胚性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を含む）およびそれらの派生物（すなわちｈＰＳＣから分化した細胞）などの細胞の個別化された培養、リプログラミング、増殖、分化、および／または下流プロセシングに関する。さらに特に、本開示は、ポイントオブケア（すなわち患者ケアの時間および場所）での医療処置を可能にするような、個別化医療用の細胞を製造、増殖、分化および／またはリプログラミングするための閉鎖型デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
自家細胞は患者由来の細胞を指し、したがって患者への移植後に引き起こす免疫拒絶反応が最小限であるかまたは全くないため細胞療法において用いるのに魅力的である。自家細胞は、Ｔ細胞、軟骨細胞、および間葉系幹細胞などの患者から単離された初代細胞を含む。これらの細胞は、治療できないかまたは現在の治療によってはそれらの進行を変えることができない多数のヒトの疾患を治療するために使用されうる。
【０００４】
自家細胞は、患者特異的なヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）も含む。いくつかのリプログラミング因子を細胞に送達することによって、患者由来の成体細胞（例えば線維芽細胞）が約１ヶ月以内にｉＰＳＣにリプログラミングされうる。ｉＰＳＣは、完全に定義された条件下で長期間培養され、大量に増殖させられうる。これらは、おそらく人体の全ての細胞型にさらに分化させられうる。
【０００５】
自家細胞は、神経膠芽腫細胞などの患者由来の初代腫瘍細胞も含む。これらの細胞は、患者の腫瘍細胞を特異的かつ効率的に死滅させることができる薬物をスクリーニングするために使用されうる。
【０００６】
しかし、自家細胞ベースの個別化医療は、安価になるまでは大勢の患者に利益をもたらすことはできない。現在の技術およびバイオプロセスを用いて個別化細胞をバイオマニュファクチャリングするための費用は非常に高い。例えば、現在のバイオプロセシングを用いて患者特異的なｉＰＳＣベースの自家細胞を作製するためには、患者細胞が収集され、数日間培養され、その後、これらの細胞をｉＰＳＣにリプログラミングするためにリプログラミング因子がこれらの細胞に送達される（これには約一ヶ月かかる）。次に、高品質のｉＰＳＣクローンが選択され、増殖させられ、それらの多能性およびゲノムの完全性が様々なアッセイで特徴付けされ（これには約一〜二ヶ月かかる）、その後、ｉＰＳＣが増殖させられ、所望の細胞に分化させられる。最後に、生産された細胞が精製され、それらの同一性、純度、および効力が特徴付けされ、移植のために処方される。バイオプロセシング全体が数ヶ月かかり、主に２Ｄ開放型培養システム（例えば２Ｄ細胞培養フラスコ）を使用して手動操作を通じて行われるが、これは低い再現性、高い汚染のリスク、および高度な技術を有する技術者の必要につながるプロセシングである。加えて、２Ｄ培養システムは低収率である。例えば、表面積１ｃｍ２当たり約２×１０５個の細胞しか生産され得ず、これは、一人の患者に十分な細胞（約１×１０９個の細胞）を生産するために約８５個の六ウェルプレートが必要となることを意味する。これらのプレートを維持するには大きなインキュベータおよびｃＧＭＰ施設スペース、労力、ならびに試薬が必要である。
【０００７】
多数の患者がｉＰＳＣベースの個別化細胞療法を必要とする場合には、細胞生産は大きな細胞バイオマニュファクチャリングセンターにおいてのみ行われうる（すなわち集中型細胞バイオマニュファクチャリング）。患者の細胞がセンターに送られ、生産された細胞が移植のためにポイントオブケアに送り返される。この集中型バイオマニュファクチャリングは、（ｉ）相互汚染、ならびに（ｉｉ）輸送、物流、追跡、および記録に関連する高いコストおよびリスクを含む追加的な欠点を有する。まとめると、現在の技術を用いて個別化されたｉＰＳＣおよびその派生物をバイオマニュファクチャリングするためのコストは、大多数の患者にとって安価ではない。
【０００８】
バイオマニュファクチャリングのコストを大幅に低減するための一つの方法は、ポイントオブケアで細胞をバイオマニュファクチャリングするために、個別化された閉鎖型のコンピュータ制御された小型細胞培養デバイスにおいてバイオプロセシングを自動化することである（すなわちｃＧＭＰインボックス生産）。閉鎖型培養デバイスを使用することにより、汚染のリスクが回避され、ｃＧＭＰプロセシングの必要性がなくなる。全ての重要な操作の自動化により、出力の変動が回避され、高度な技術を有する操作者の必要性が低減される。ポイントオブケアでのバイオマニュファクチャリングによって、物流および輸送に関係するコストおよびリスクが低減される。培養システムを小型化することにより、ポイントオブケアで多数の患者のための細胞を同時にバイオマニュファクチャリングすること（すなわちハイスループットバイオマニュファクチャリング）が可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に基づいて、特に個別化医療のためにポイントオブケアで使用されうるような規模で細胞を製造、増殖、分化およびリプログラミングするための閉鎖型小型デバイスが当技術分野において必要である。相互汚染を制限するために閉鎖型デバイスを使い捨てであるように作製できればさらに有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、一般に、閉鎖型培養システムにおける細胞の培養、リプログラミング、増殖、分化および下流プロセシングを対象とする。さらに特に、本開示は、細胞の製造、増殖、分化に、その後さらに培養した細胞の濃縮、精製および輸送に使用されうる閉鎖型ハウジングを含む閉鎖型培養用システムおよびデバイスを対象とする。
【００１１】
一態様では、本開示は、個別化医療のために細胞を培養するためのデバイスを対象とし、本デバイスは、三次元（３Ｄ）ハイドロゲル足場を含む閉鎖型ハウジングと、細胞培養培地をハウジング中に導入するための入口と、細胞培養培地をハウジングから排出するための出口とを含む。
【００１２】
別の態様では、本開示は、本デバイスを使用して細胞を増殖させる方法を対象とし、この方法は、閉鎖型ハウジングの３Ｄハイドロゲル足場中に細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、細胞培養培地を入口から閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、細胞を培養するステップとを含む。
【００１３】
さらに別の態様では、本開示は、本デバイスを使用して細胞を分化させる方法を対象とし、この方法は、閉鎖型ハウジングの３Ｄハイドロゲル足場中に細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、細胞分化培地を入口から閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、細胞を培養するステップとを含む。
【００１４】
別の態様では、本開示は、本デバイスを使用して細胞をリプログラミングする方法を対象とし、この方法は、閉鎖型ハウジングの３Ｄハイドロゲル足場中に成体細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、細胞培養培地を入口から閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、細胞をリプログラミングするステップとを含む。
【００１５】
本開示により、閉鎖型小型培養システムにおける細胞の培養、製造、増殖、分化およびリプログラミングを驚異的に可能にする方法が発見された。本開示の方法およびデバイスは、それらによってポイントオブケアで使用されうる十分な高品質で安価な細胞が可能になるため、個別化医療に大きな影響を与えるであろう。さらに、本デバイスおよび方法は、汚染および相互汚染を制限する様式で細胞を製造、増殖、分化およびリプログラミングするためのより安価な方法を提供することによってバイオ医薬品業界に有利な影響を提供する。
【００１６】
以下の本開示の詳細な説明を考慮すれば、本開示がよりよく理解され、上記以外の特徴、態様および利点が明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、本開示に記載される個別化細胞バイオマニュファクチャリングのための閉鎖型小型細胞培養デバイスを示す。図１Ａは、デバイスの概略図を示す。図１Ｂは、入口および出口が識別された細胞培養デバイスの写真である。図１Ｃは、細胞培養デバイス内のハイドロゲル繊維中の細胞塊の写真である。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、閉鎖型小型細胞培養デバイスにおける個別化されたｉＰＳＣの増殖および神経幹細胞（ＮＳＣ：ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）への分化を示す。図２Ａは、本開示に記載されるバイオプロセシングの方法を示す。図２Ｂは、培地灌流のためのポンプ２１２、培地をストックするための酸素透過性プラスチックバッグ２１４、および閉鎖型１５ｍｌ円錐チューブ２１６を含む小型細胞培養デバイス２１０を示す。さらに、細胞を有する繊維状ハイドロゲル繊維は、チューブ中で懸濁されているのが示される。図２Ｃは、単一ｉＰＳＣを０日目に４℃で１０％ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ溶液と混合し、１５ｍＬ円錐チューブ内の室温の細胞培養培地に注入して細胞を有するハイドロゲル繊維を即座に形成するステップと、細胞をＥ８培地中で５日間培養するステップと、細胞を分化させるために円錐チューブ内の神経誘導培地中で細胞をさらに７日間培養するステップと（培地は連続的に灌流された）、細胞培養チューブを氷上に５分間置くことによってハイドロゲル足場を液化するステップと、チューブを１００ｇで３分間回転させることによって細胞スフェロイドをペレット化するステップと（培地は除去された）、細胞を精製するステップと、磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋ｉＰＳＣを引き下げるために、抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングされた磁気ビーズをチューブに加えるステップと、上清中の精製細胞を新たな閉鎖型チューブ内に移し、閉鎖型チューブを手術室に輸送するステップと、定位注射器を用いてＮＳＣをラット脳に移植するステップとを示す。特に、精製ステップに示されるように、細胞スフェロイドはＡｃｃｕｔａｓｅ中で３７℃で１０分間インキュベートされた。試薬がチューブから除去され、新しい試薬がセプタムキャップを通して滅菌シリンジを用いてチューブに加えられた。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、本開示の小型バイオプロセシング方法における細胞を示す。図３Ａは、バイオプロセシングの０日目、５日目および１２日目のハイドロゲル繊維および細胞の位相画像である。図３Ｂは、１２日目の細胞の生／死染色を示す。図３Ｃは、精製細胞産物の約９７％がＮＳＣマーカー、ＰＡＸ６およびネスチンを発現したことを示す。図３Ｄは、磁気抗ＳＳＥＡ４ビーズによって引き下げられた細胞がＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについて陽性であったことを示す。図３Ｅは、ＨｕＮｕ＋（ヒト核抗原）ＮＳＣが移植後７日目のラット脳において良好に生存したことを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、本開示に記載されるアルギネート中空繊維中での細胞の培養を示す。図４Ａは、単一細胞を含有するヒアルロン酸（ＨＡ）溶液３２０およびアルギネート溶液３２２が自家製マイクロ押出機の中央チャネル３２４およびサイドチャネル３２６にそれぞれ送り込まれて同軸コア−シェル流を形成し、ＣａＣｌ２緩衝剤３２８（１００ｍＭ）中に押出され、それによって即座にアルギネートが架橋されてハイドロゲルシェルが形成されて中空繊維が作製されることを示す概略図である。その後、ＣａＣｌ２緩衝剤を細胞培養培地で置き換え、細胞を中空繊維のコアマイクロスペース中に懸濁し、成長させた。図４Ｂは、最初の２４時間以内に、単一細胞が結合して小さなクラスターを形成したことを示す（すなわち初期クラスタリング段階）。その後、これらの小さなクラスターはスフェロイドとして膨張し（図４Ｃ）、これらが最終的に融合して円筒状細胞塊を形成した（図４Ｄ）（すなわち細胞成長段階）。図４Ｅは、９日目の一つの中空繊維中の円筒状細胞塊を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、本開示に記載されるアルギネートハイドロゲル中空繊維を使用した閉鎖型小型細胞培養デバイスにおける個別化されたｉＰＳＣ増殖およびＮＳＣへの分化を示す。図５Ａは、バイオプロセスの概略図を示す。図５Ｂに示すように、ｉＰＳＣおよびハイドロゲル繊維を、閉鎖型１５ｍｌチューブに押出し、中空繊維中のｉＰＳＣを、自動培地灌流を用いて増殖培地中で５日間増殖させた。次いで、ｉＰＳＣを分化培地中で７日間ＮＳＣに分化させた。０．５ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって繊維を溶解し、細胞スフェロイドを重力によって収穫した。次いで、スフェロイドをＡｃｃｕｔａｓｅで単一細胞に解離した。未分化のｉＰＳＣを磁気抗ＳＳＥＡ−４ビーズで枯渇させた。細胞産物を新しいチューブに移し、遠心分離によって濃縮した。細胞を手術室に輸送し、移植した。
【図６】図６Ａ〜６Ｊは、本開示に記載されるアルギネートハイドロゲル中空繊維を使用した小型バイオプロセスにおけるｉＰＳＣの増殖およびＮＳＣへの分化を示す。図６Ａは、ハイドロゲル繊維中で成長する細胞の、０日目（単一ｉＰＳＣ）、５日目（ｉＰＳＣスフェロイド）および５＋７日目（ＮＳＣ凝集体）の位相画像である。５＋７日目に、４００倍の増殖（図６Ｂ）、４．１×１０８細胞／ｍｌの収率（図６Ｃ）、＞９５％の細胞生存率（図６Ｄ）が達成された。９８％の細胞がＳＳＥＡ陰性であり（図６Ｅ）、検出された死細胞（生／死細胞染色による）は非常に少数であった（図６Ｆ）。図６Ｇおよび６Ｈは、抗ＳＳＥＡ４抗体被覆磁気ビーズによって引き下げられた細胞の＞９９％がＮａｎｏｇ＋／Ｏｃｔ４＋未分化ｉＰＳＣであったことを示す。図６Ｉは、精製細胞産物の＞９９％がＰＡＸ６＋／ネスチン＋ＮＳＣであったことを示す。図６Ｊは、精製ＮＳＣが移植７日後にマウス脳内で良好に生存したことを示す。ＨｕＮｕ：ヒト核抗原。
【図７】図７は、３週間のリプログラミング後に本開示のデバイスで使用される３Ｄハイドロゲル中に形成されたｉＰＳＣコロニーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は様々な修正および代替形態の余地があるが、その特定の実施形態が例として図面に示されており、本明細書の以下に詳述される。しかし、特定の実施形態の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神および範囲内に含まれる全ての修正、等価物および代替形態を網羅するように本開示を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【００１９】
別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の通常の技術を有する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料が本開示の実施または試験において使用されうるが、好ましい方法および材料が以下に記載される。
【００２０】
本開示によれば、限定的な汚染、より低いコスト、高い細胞収率および純度、ならびに個別化医療の提供し易さを可能にするような閉鎖型小型システムにおける細胞の培養、リプログラミング、増殖、分化および下流プロセシングを驚異的に可能にするデバイスおよび方法が発見された。特に、本開示は、３Ｄハイドロゲル足場を用いた閉鎖型小型システムにおいて細胞を製造、増殖、分化およびリプログラミングするための閉鎖型小型デバイスおよびそのデバイスの使用方法を提供する。
【００２１】
細胞の培養／製造／増殖／分化／リプログラミングのためのデバイス
有利には、本開示のデバイスは、ポイントオブケアでの十分かつ安価な個別化細胞のバイオマニュファクチャリングを可能にする。さらに、本デバイスは、汚染を制限しながら高い細胞収率および純度を提供する。一般に、本デバイスは、細胞を有するハイドロゲル足場を含む閉鎖型小型ハウジングと、細胞培養培地をハウジング中に流入させるためのフィルタを備えた入口と、ハウジングから排出培地を流出させるためのフィルタを備えた出口とを含む。本明細書で使用されるところの「小型」とは、容量約１ｍｌ〜約１０００ｍｌを含む、約１ｍｌ〜１０Ｌ未満を含む１０Ｌ未満の容量を有するハウジングを含むデバイスをさす。
【００２２】
さらに特に、図１Ａに示すように、デバイス１００は、閉鎖型ハウジング１１０と、入口１２０と出口１３０とを含む。本明細書で使用されるところの「閉鎖型デバイス」、「閉鎖型システム」、および／または「閉鎖型ハウジング」において言及される「閉鎖型」とは、その周囲との物質の交換がフィルタ１２１、１２３を備えた入口および出口を通してのみ行われうるように密閉されたデバイス、システム、および／またはハウジングをさす。フィルタ１２１、１２３は、環境内のウイルスおよびバクテリアが細胞培養デバイスに入るのを防ぎうる。さらに特に、閉鎖型デバイス、システム、および／またはハウジングは、周囲の物質の少なくとも７０％がデバイス、システム、および／またはハウジングに入るのを好適に防ぎ、より好適には周囲の物質の少なくとも７５％、さらに好適には少なくとも８０％、さらに好適には少なくとも９０％、さらに好適には９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％をも含む少なくとも９５％がデバイス、システム、および／またはハウジングに入るのを防ぐ。
【００２３】
図１Ａに示す閉鎖型ハウジング１１０は、閉鎖型５０ｍｌ円錐チューブであるが、当業者であれば、当該分野で知られている任意の閉鎖培養システム、例えば、より大きなコニカルチューブまたは小容量のプラスチックバッグを理解されたい。通常、円錐チューブが使用されるときには、チューブは、約１ｍｌ〜約１Ｌを含み、約５ｍｌ〜約５０ｍｌを含む、１ｍｌ〜約１０Ｌの容量にサイズ決めされる。プラスチックバッグが使用されるときには、バッグは約１ｍｌ〜約１０Ｌの容量を有し、約１ｍｌ〜約１Ｌを含む。
【００２４】
閉鎖型ハウジング１１０は、三次元（３Ｄ）ハイドロゲル足場１１２を含む。３Ｄハイドロゲル足場は、細胞を有するハイドロゲル前駆体溶液を、細胞培養デバイスのセプタムキャップ１２２（図１Ｂ）を通して、ハイドロゲル前駆体溶液をハイドロゲルに迅速に架橋しうる細胞培養デバイス内の架橋試薬を含む緩衝剤中に押出することによって調製される。
【００２５】
通常、３Ｄハイドロゲル足場１１２は、細胞を培養、製造、増殖、分化および／またはリプログラミングするためのハイドロゲル技術分野において公知の任意のポリマーを使用して調製される。例えば、適切な実施形態では、３Ｄハイドロゲル足場は、例えばポリ（エチレングリコール）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などのポリマーを使用して熱可逆性ハイドロゲル足場として調製される。さらに他の適切な実施形態では、３Ｄハイドロゲル足場は、アルギネートポリマーから調製される。適切なアルギネートポリマーは、Ｓｉｇｍａからのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム（＋Ｗ２０１５０２）などの任意の市販または自家精製アルギネートポリマー、ならびにメタクリレート修飾アルギネートなどの修飾アルギネートポリマーを含む。
【００２６】
一般に、本開示のデバイスの閉鎖型ハウジングに使用するための３Ｄハイドロゲル足場は、例えばシート、繊維、中空繊維、球体、およびそれらの組み合わせを含む、当技術分野において公知の任意の形態である。
【００２７】
一般に、細胞はハイドロゲル足場中に封入される。いくつかの適切な実施形態では、細胞は、ハイドロゲル中空繊維によって作られる中空空間中に懸濁される。細胞は、Ｔ細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞などのヒトから単離された初代細胞を含む。細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒト胚性幹細胞およびそれらの派生物（すなわちそれらから分化した細胞）も含む。細胞は、初代ヒト腫瘍細胞も含む。本明細書ではヒト細胞に関して記載されるが、当業者には当然のことながら、本開示のデバイスは本開示の範囲から逸脱することなく他の任意の動物細胞とともに使用されうることが理解されるべきである。
【００２８】
さらに、一実施形態では、細胞は、治療されることが所望される同じ患者由来の細胞であるという点で自家細胞である。別の実施形態では、細胞は同種細胞（例えば別の場所で形成され輸送される）である。
【００２９】
本開示のデバイスは、入口１２０および出口１３０をさらに含む。入口１２０は、細胞培養培地が閉鎖型ハウジング１１０内に入るのを可能にし、出口１３０は、細胞培養培地が閉鎖型ハウジング１１０から出るのを可能にする。特定の実施形態では、入口１２０と流体連通するポンプ（図示せず）を含み、それによって細胞培養培地を培地リザーバ１２４から閉鎖型ハウジング１１０へと送り込むことが有利である。ポンプとの連通において記載されているが、当業者には、本開示のデバイス１００においては、本開示の範囲から逸脱することなく培地リザーバ１２４から閉鎖型ハウジング１１０へ細胞培養培地を流す任意の手段が使用されうることが理解されるべきである。
【００３０】
細胞培養のために使用されると、細胞培養培地は、閉鎖型ハウジング１１０を通して自動的に灌流され、閉鎖型ハウジング１１０から出口１３０を介して排出培地リザーバ１３２に排出される。
【００３１】
細胞培養培地は、細胞の生存、成長、増殖、および分化を支持するのに適した、細胞培養技術分野において知られる任意の培地でありうる。通常、細胞培養培地は、炭素源、窒素源、および成長因子を含むがこれらに限定されない。細胞を培養するのに使用するための具体的な細胞培養培地は、培養される細胞の種類による。細胞培養条件も、細胞の種類、細胞増殖の量、および所望の細胞数によって変動する。
【００３２】
細胞の培養／製造／増殖／分化／リプログラミングの方法
本開示の方法は、個別化された規模で細胞を培養するために使用されうる。本明細書で使用されるところの「細胞を培養すること」または「細胞を培養する」などは、本開示のデバイス内で細胞を製造、増殖、分化、および／またはリプログラミングすることをさす。「リプログラミング」または「リプログラム」とは、成体細胞のｉＰＳＣへの変換、またはある成体細胞型から別の細胞型への変換をさす。本開示の方法は、従来の細胞培養方法に対して少なくとも以下の利点を提供する。（１）細胞を高い体積収率でバイオマニュファクチャリングすることを可能にする。ハイドロゲル足場１ｍｌあたり少なくとも２×１０７個の細胞を生産することができる。一般に、ハイドロゲル足場１ｍｌあたり５．０×１０８個の細胞を生産することができる。（２）ポイントオブケアでの小型デバイスによる個別化医療を可能にする。（３）閉鎖型培養およびポイントオブケアの処置が細胞培養物輸送中の汚染のリスクを除去するため、限定的な汚染および／または相互汚染を可能にする。（４）バッチ間の低いばらつきを可能にする。さらに、細胞を増殖および分化させるためにハイドロゲル足場を使用する方法は、（１）細胞成長のための３Ｄ空間を提供し、（２）その主な要因が従来の３Ｄ懸濁培養技術において低い細胞成長および細胞の体積収率につながる細胞凝集を防ぎ、せん断力を分離するための物理的障壁を提供する、というさらなる利点を提供する。細胞をリプログラミングするためにデバイスを使用する方法は、うまくリプログラミングされた細胞のみが３Ｄハイドロゲル足場中で成長することを可能にし、故に細胞を高純度で生成するというさらなる利点を提供する。
【００３３】
本明細書に記載の方法およびデバイスを用いて培養、製造、増殖、分化、および／またはリプログラミングされうるこのような細胞の非限定的な例は、Ｔ細胞、軟骨細胞、および間葉系幹細胞などのヒトから単離された初代細胞（すなわちヒト初代細胞）を含む。細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒト胚性幹細胞およびそれらの派生物（すなわちそれらから分化した細胞）も含む。細胞は、初代ヒト腫瘍細胞も含む。細胞は、動物細胞、例えばブタ誘導多能性幹細胞または初代ブタ細胞でもあってもよい。ｉＰＳＣを使用してより十分に記載されているが、本明細書に記載の方法およびデバイスは、本開示の範囲から逸脱することなく上に列挙された種類の細胞のいずれとともに使用され得ることを認識されたい。
【００３４】
一般に、細胞を培養する方法は、ハイドロゲル足場中に細胞を封入するかまたは閉鎖型ハウジングのハイドロゲル中空繊維によって作られる中空空間中に細胞を懸濁するステップと、細胞の増殖、分化またはリプログラミングを可能にするために、ハイドロゲル足場中に懸濁された細胞を含む閉鎖型ハウジング中に細胞培養培地を導入するステップと、細胞を培養するステップとを含む。
【００３５】
細胞は、１ミリリットル当たり１〜数十億細胞の範囲の濃度でハイドロゲル足場中に封入または懸濁され、１ミリリットル当たり６．０×１０８細胞まで増殖させられうる。
【００３６】
好適な実施形態では、細胞はハイドロゲル足場中に封入される。他の適切な実施形態では、細胞は、ハイドロゲル中空繊維によって作られる中空空間中に懸濁される。
【００３７】
次に、細胞を培養するために閉鎖型ハウジング中に細胞培養培地が導入される。細胞培養培地は、細胞の生存、成長、増殖、分化およびリプログラミングを支持するのに適した、細胞培養技術分野において知られる任意の培地でありうる。通常、細胞培養培地は、炭素源、窒素源、および成長因子を含むがこれらに限定されない。細胞を培養するのに使用するための具体的な細胞培養培地は、培養される細胞の種類による。
【００３８】
細胞培養条件は、細胞の種類、細胞増殖／分化／リプログラミングの量、および所望の細胞数によって変動する。十分な細胞増殖／分化／リプログラミングおよび所望の数の細胞に到達すると、３Ｄハイドロゲル足場をハウジング内で化学的または物理的に溶解することによって細胞が３Ｄハイドロゲル足場から放出される。一態様では、足場は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、またはアルギネートリアーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）などの化学的溶解剤を使用して溶解される。別の態様では、ハイドロゲル足場は、温度を４℃未満に下げるなどの物理的方法を使用して溶解される。３Ｄハイドロゲル足場内の細胞の持続期間は、通常数日〜数ヶ月まで変動しうる。
【００３９】
細胞は個別化医療に有用であり、ポイントオブケアで使用されうる。例として、細胞は患者のベッドサイドでの処置において使用されうる。細胞は、変性疾患および損傷の治療、薬物スクリーニングに使用するため、タンパク質の発現のためなどのサイズおよび数で効率的かつ効果的に調製されうる。加えて、細胞は、タンパク質およびワクチンを製造するために使用されうる。さらに他の態様では、細胞は組織工学に使用されうる。
【００４０】
本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮すればより十分に理解されるであろう。
【実施例】
【００４１】
別段の指示がない限り、中空繊維は上述のように調製した。
【００４２】
実施例１
本実施例では、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の増殖および成長を分析した。
【００４３】
方法
小型バイオプロセシング：シリンジを用いて、ｉＰＳＣを含有する４℃のＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ溶液を、１５ｍｌ円錐チューブ内の室温のＥ８培地に注入した。繊維状ハイドロゲルが即座に形成された。可変速度蠕動チュービングポンプ（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して、セプタムキャップを通して培養培地をチューブ内に連続的に灌流した。密閉された酸素透過性プラスチックバッグに培地をストックした。バッグ内の培地を毎日交換した。細胞培養チューブ、ポンプおよび培地バッグを３７℃で細胞培養インキュベータ内に置いた。Ｅ８培地および神経誘導培地を、それぞれ１〜５日目、および６〜１２日目に使用した。１２日目に、ハイドロゲルを液化させてスフェロイドを放出するために、細胞培養チューブを５分間氷上に置いた。チューブを１００ｇで５分間回転させることにより細胞を収集した。細胞ペレットを３７℃で１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅにより処理し、単一細胞に解離した。３００ｇで５分間回転させることにより単一細胞を収集した。細胞を８０μｌのＰＢＳ緩衝剤で再懸濁し、２０μｌの抗ＳＳＥＡ−４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、４℃で１５分間インキュベートした。ＳＳＥＡ４＋ｉＰＳＣを磁石で引き下げ、上清中のＮＳＣを新しいチューブ中に移した。３００ｇで５分間回転させることにより細胞をペレット化し、移植のために手術室に輸送した。
【００４４】
細胞移植：動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ−Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルにしたがって実施した。Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雌ラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。動物に、移植の１日前に開始して腹腔内シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）注射を施した。移植のために、動物を２〜４％のイソフルランで麻酔した。４μｌのＤＭＥＭ培地に懸濁された２×１０５個の細胞を、定位フレーム（ＲＷＤ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）を用い、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して０．５μｌ／分で線条体（ＡＰ＋０．５ｍｍ、ＭＬ±３．０ｍｍ、ＤＶ−６ｍｍ）に注射した。７日目に、ラットをケタミン／キシラジンで麻酔し、ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒドで灌流した。固定後、Ｌｅｉｃａ凍結切片機を用いて脳を連続切片にし（厚さ４０μｍ）、浮遊切片を抗体で染色した。
【００４５】
脳切片を染色するために、サンプルをその後ＰＢＳ＋０．２５％トリトンＸ−１００＋５％ヤギ血清＋一次抗体とともに４℃で４８時間インキュベートした。十分に洗浄した後、２％ＢＳＡ中の二次抗体を加え、４℃で４時間インキュベートした。
【００４６】
結果
ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧハイドロゲルにおける高い細胞収率を利用して、個別化細胞療法のためにｈＰＳＣからＮＳＣを作製するために本開示のプロトタイプデバイスを構築した（図２Ａ〜２Ｋおよび３Ａ〜３Ｅ）。０日目に、単一ｉＰＳＣを１０％ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ溶液と４℃で混合した。シリンジを用いて、混合物を、セプタムキャップを備えた閉鎖された無菌１５ｍｌ円錐チューブに入った室温のＥ８培地に注入した（図２Ｃ）。単一ｉＰＳＣがハイドロゲル中に均一に分布した繊維状ハイドロゲル（直径約１ｍｍ）が即座に形成された。細胞を細胞培養インキュベータ中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ガス透過性バッグにストックされた培地を細胞培養チューブ内に連続的に灌流した（図２Ｂ）。Ｅ８培地を５日間供給し（図２Ｃ）、続いてさらに７日間神経誘導培地を供給した（図２Ｃ）。７日目に、細胞培養チューブを氷上に５分間置くことによってハイドロゲル足場を液化した（図２Ｃ）。チューブを１００ｇで３分間回転させることによって細胞スフェロイドをペレット化した（図２Ｃ）。培地を除去した。細胞スフェロイドをＡｃｃｕｔａｓｅ中で３７℃で１０分間インキュベートした（図２Ｃ）。チューブからの試薬の除去およびチューブへの試薬の添加は、セプタムを通して滅菌シリンジで行った。磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋ｉＰＳＣを引き下げるために、抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングされた磁気ビーズをチューブ中に加えた（図２Ｃ）。上清中の精製細胞を新しい閉鎖チューブに移し（図２Ｃ）、手術室に輸送した。定位注射器を用いてＮＳＣをＳＣＩＤマウスの脳に移植した（図２Ｃ）。
【００４７】
ハイドロゲル繊維中の単一ｉＰＳＣは、５日目にｉＰＳＣスフェロイドに成長し、その後１２日目にＮＳＣスフェロイドになった（図３Ａ）。１×１０６細胞／ｍｌの初期播種密度で、７日目に２５倍の増殖および２．５×１０７細胞／ハイドロゲル１ｍｌが達成された。１５ｍｌ円錐チューブ内で４ｍｌのハイドロゲル中で合計１．０×１０８個の細胞が生産された。細胞生存率は７日目に９５％超であった。７日目の細胞の２％がＳＳＥＡ４＋であった。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞染色により、死細胞がないかまたは検出不能であることが示された（図３Ｂ）。磁気分離後、生産された細胞はＰＡＸ６およびネスチンを発現し（図３Ｃ）、Ｏｃｔ４＋／Ｎａｎｏｇ＋細胞は検出できなかった。磁気ビーズによって引き下げられた細胞は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの両方を発現した（図３Ｄ）。移植の７日後、マウス脳内に多数のヒト核抗原陽性（ＨｕＮｕ＋）細胞が見出された（図３Ｅ）。
【００４８】
実施例２
本実施例では、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の神経幹細胞（ＮＳＣ）の増殖および成長を分析した。
【００４９】
方法
小型バイオプロセシング：アルギネート中空繊維を加工するために自家製マイクロ押出機を使用した。単一細胞を含有するヒアルロン酸（ＨＡ）溶液およびアルギネート溶液を、自家製マイクロ押出機の中央チャネルおよびサイドチャネル中にそれぞれ送り込み、閉鎖された１５ｍＬ円錐チューブ内のＣａＣｌ２緩衝剤（１００ｍＭ）中に押出して、中空繊維を作製した（図４Ａ、５Ａおよび５Ｂ）。その後、ＣａＣｌ２緩衝剤を細胞培養培地で置き換えた。可変速度蠕動チュービングポンプ（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して、セプタムキャップを通して培養培地をチューブ内に連続的に灌流した。密閉された酸素透過性プラスチックバッグに培地をストックした。バッグ内の培地を毎日交換した。細胞培養チューブ、ポンプおよび培地バッグを３７℃で細胞培養インキュベータ内に置いた。Ｅ８培地および神経誘導培地を、それぞれ１〜５日目、および６〜１２日目に使用した。１２日目に、０．５ｍＭのＥＤＴＡをチューブ中に送り込んだ。アルギネート中空繊維は５分以内に溶解された。チューブを１００ｇで５分間回転させることにより細胞を収集した。細胞ペレットを３７℃で１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅで処理し、単一細胞に解離した。３００ｇで５分間回転させることにより単一細胞を収集した。細胞を８０μｌのＰＢＳ緩衝剤で再懸濁し、２０μｌの抗ＳＳＥＡ−４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、４℃で１５分間インキュベートした。ＳＳＥＡ４＋ｉＰＳＣを磁石で引き下げ、上清中のＮＳＣを新しいチューブ中に移した。３００ｇで５分間回転させることにより細胞をペレット化し、移植のために手術室に輸送した。
【００５０】
細胞移植：動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｂｒａｓｋａ−Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルにしたがって実施した。Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雌ラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得た。動物に、移植の１日前に開始して腹腔内シクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）注射を施した。移植のために、動物を２〜４％のイソフルランで麻酔した。定位フレーム（ＲＷＤ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）を用い、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して４μｌのＤＭＥＭ培地に懸濁された２×１０５個の細胞を０．５μｌ／分で線条体（ＡＰ＋０．５ｍｍ、ＭＬ±３．０ｍｍ、ＤＶ−６ｍｍ）に注射した。７日目に、ラットをケタミン／キシラジンで麻酔し、ＰＢＳ、続いて４％パラホルムアルデヒドで灌流した。固定後、Ｌｅｉｃａ凍結切片機を用いて脳を連続切片にし（厚さ４０μｍ）、浮遊切片を抗体で染色した。
【００５１】
脳切片を染色するために、サンプルをその後ＰＢＳ＋０．２５％トリトンＸ−１００＋５％ヤギ血清＋一次抗体とともに４℃で４８時間インキュベートした。十分に洗浄した後、２％ＢＳＡ中の二次抗体を加え、４℃で４時間インキュベートした。
【００５２】
結果
アルギネート中空繊維における高い細胞収率を利用して、個別化細胞療法のためにｈＰＳＣからＮＳＣを作製するために本開示のプロトタイプデバイスを構築した（図４Ａ〜４Ｅ、５Ａおよび５Ｂ）。０日目に、単一ｉＰＳＣを１％ＨＡ溶液と混合した。マイクロ押出機を用いて、単一細胞を含むＨＡ溶液３２０およびアルギネート溶液３２２を、マイクロ押出機の中央チャネル３２４およびサイドチャネル３２６中にそれぞれ送り込み、閉鎖された１５ｍＬ円錐チューブ内のＣａＣｌ２緩衝剤３２８（１００ｍＭ）中に押出して、中空繊維を作製した（図５Ｂ）。細胞を細胞培養インキュベータ中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ガス透過性バッグにストックされた培地を細胞培養チューブ内に連続的に灌流した（図５Ｂ）。Ｅ８培地を５日間供給し（図５Ｂ）、続いてさらに７日間神経誘導培地を供給した（図５Ｂ）。７日目に、細胞培養チューブを氷上に５分間置くことによってハイドロゲル足場を液化した（図５Ｂ）。チューブを１００ｇで３分間回転させることによって細胞スフェロイドをペレット化した（図５Ｂ）。培地を除去した。細胞スフェロイドをＡｃｃｕｔａｓｅ中で３７℃で１０分間インキュベートした（図５Ｂ）。チューブからの試薬の除去およびチューブへの試薬の添加は、セプタムを通して滅菌シリンジで行った。磁気細胞分離器を用いて未分化ＳＳＥＡ４＋ｉＰＳＣを引き下げるために、抗ＳＳＥＡ４抗体でコーティングされた磁気ビーズをチューブ中に加えた（図５Ｂ）。上清中の精製細胞を新しい閉鎖チューブに移し（図５Ｂ）、手術室に輸送した。定位注射器を用いてＮＳＣをＳＣＩＤマウスの脳に移植した（図５Ｂ）。
【００５３】
ハイドロゲル繊維中の単一ｉＰＳＣは、５日目にｉＰＳＣスフェロイドに成長し、その後１２日目にＮＳＣスフェロイドになった（図６Ａ）。１×１０６細胞／ｍｌの初期播種密度で、７日目に４００倍の増殖および４．０×１０８細胞／ハイドロゲル１ｍｌが達成された。１５ｍｌ円錐チューブ内で４ｍｌのハイドロゲル中で合計１．６×１０９個の細胞が生産された。細胞生存率は７日目に９５％超であった。７日目の細胞の２％がＳＳＥＡ４＋であった。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞染色により、死細胞がないかまたは検出不能であることが示された（図６Ｆ）。磁気分離後、生産された細胞はＰＡＸ６およびネスチンを発現し、Ｏｃｔ４＋／Ｎａｎｏｇ＋細胞は検出できなかった。磁気ビーズによって引き下げられた細胞は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの両方を発現した（図６Ｇ）。移植の７日後、マウス脳内に多数のヒト核抗原陽性（ＨｕＮｕ＋）細胞が見出された（図６Ｊ）。
【００５４】
実施例３
本実施例では、本開示の方法およびデバイスを用いてヒト皮膚線維芽細胞をｉＰＳＣにリプログラミングした。
【００５５】
エピソームリプログラミングベクター（例えばＥｐｉ５（商標）Ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｉＰＳＣ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ、ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ１５９６０）をトランスフェクションした線維芽細胞を、Ｅ８培地中の実施例１に記載のように調製した３Ｄ熱可逆ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧハイドロゲル中に封入し、培養した。
【００５６】
図７に示すように、約３週間以内に純粋なｉＰＳＣが生産された。
【００５７】
これらの結果は、細胞を培養および製造するために本開示の方法およびデバイスが使用されうることを実証した。この方法は、研究室、産業界、およびポイントオブケアの両方において、疾病および損傷の治療、薬物のライブラリーのスクリーニング、ならびにタンパク質およびワクチンの製造のための十分かつ高品質な細胞の調製のために有用でありうると考えられる。
【図１Ａ】
2019535284.tif 000003
【図１Ｂ】
2019535284.tif 000004
【図１Ｃ】
2019535284.tif 000005
【図２】
2019535284.tif 000006
【図３】
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【図４Ａ】
2019535284.tif 000008
【図４Ｂ】
2019535284.tif 000009
【図４Ｃ】
2019535284.tif 000010
【図４Ｄ】
2019535284.tif 000011
【図４Ｅ】
2019535284.tif 000012
【図５】
2019535284.tif 000013
【図６】
2019535284.tif 000014
【図７】
2019535284.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月23日(2019.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個別化医療のために細胞を培養するためのデバイスであって、
三次元（３Ｄ）ハイドロゲル足場を含む閉鎖型ハウジングと、
細胞培養培地を前記ハウジングに導入するための入口と、
細胞培養培地を前記ハウジングから排出するための出口と
を含む、前記デバイス。
【請求項２】
前記閉鎖型ハウジングは、閉鎖型細胞培養チューブである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記閉鎖型ハウジングは、１０Ｌ未満の容量を有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、シート、繊維、中空繊維、球体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される形態である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記細胞は、ヒト初代細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、およびそれらの派生物、初代腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーおよびアルギネートポリマーの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
請求項１に記載のデバイスを使用して細胞を増殖させる方法であって、
前記閉鎖型ハウジングの前記３Ｄハイドロゲル足場に細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、
細胞培養培地を前記入口から前記閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、
前記細胞を培養するステップと
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって前記培養された細胞を精製するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載のデバイスを使用して細胞を分化させる方法であって、
前記閉鎖型ハウジングの前記３Ｄハイドロゲル足場中に細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、
細胞分化培地を前記入口から前記閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、
前記細胞を培養するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって前記培養された細胞を精製するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のデバイスを使用して細胞をリプログラミングする方法であって、
前記閉鎖型ハウジングの前記３Ｄハイドロゲル足場中に成体細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップと、
細胞培養培地を前記入口から前記閉鎖型ハウジング中に導入するステップと、
前記細胞をリプログラミングするステップと
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記細胞を含む細胞溶液を懸濁するステップは、前記細胞溶液からの細胞を前記３Ｄハイドロゲル足場中に封入するステップを含む、請求項７、９または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記３Ｄヒドロゲル足場を溶解するステップを含む、前記３Ｄヒドロゲル足場から前記培養細胞を放出するステップをさらに含み、前記３Ｄヒドロゲル足場を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびアルギネートリアーゼ溶液からなる群より選択される化学的溶解剤を使用するステップ、ならびに機械的力を用いるステップの少なくとも１つによって溶解する、請求項７、９または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養された細胞を遠心分離することによって、または前記培養された細胞を前記閉鎖型ハウジング内で抗体被覆磁気ビーズと接触させることによって、前記培養された細胞を濃縮するステップをさらに含む、請求項７、９または１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記３Ｄハイドロゲル足場は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリマーおよびアルギネートポリマーの少なくとも１つを含む、請求項７、９または１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【国際調査報告】
2019535284.tif 000016