(57)【要約】  生物学的試料中で、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを検出するためのイムノアッセイの方法であって、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを含む生物学的試料を本発明の抗体と接触させることと、抗体の結合量を測定することとを含む、方法。
2019507731.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントと反応性の抗体であって、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープに結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープが、ＶＩＩ型コラーゲンα１の非コラーゲンアミノ末端ドメインに含まれるか、またはＶＩＩ型コラーゲンα１の中央コラーゲン三重らせんドメインに含まれる、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、アミノ酸配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１）に含まれるＣ末端ネオエピトープに結合する、請求項１から３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、アミノ酸配列ＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号２）を含むＣ末端ネオエピトープに結合する、請求項１から３に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、伸長したアミノ酸配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶＸ−ＣＯＯＨ（配列番号３）を認識せずまたはこれに結合せず、ここで、ＸがＶＩＩ型コラーゲンα１の配列の１つ以上のアミノ酸である、請求項４または５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）に含まれるＮ末端ネオエピトープに結合する、請求項１から３に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲ（配列番号５）を含むＮ末端ネオエピトープに結合する、請求項１から３に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、伸長したアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＸＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号６）を認識せずまたはこれに結合せず、ここで、ＸがＶＩＩ型コラーゲンα１の配列の１つ以上のアミノ酸である、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
生物学的試料中で、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを検出するためのイムノアッセイの方法であって、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１の前記フラグメントを含む前記生物学的試料を、請求項１から９に記載の抗体と接触させることと、前記抗体の結合量を測定することとを含む、方法。
【請求項１１】
前記方法が、生体液中の前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの量を定量化するために使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体液が、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、痰、呼気または尿である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノアッセイが競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記イムノアッセイがラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法によって測定されたＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの量を、既知の疾患重症度の標準的なＶＩＩ型コラーゲン関連疾患試料と相関させて、ＶＩＩ型コラーゲン関連疾患の重症度を評価することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＶＩＩ型コラーゲン関連疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または全身性硬化症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｎ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの前記Ｎ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するＮ末端アミノ酸配列を有するか、またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの前記Ｃ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するＣ末端アミノ酸配列を有する、ペプチド。
【請求項１８】
前記Ｎ末端ネオエピトープのアミノ酸配列がＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）またはＥＡＰＲＶＲ（配列番号５）である、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記Ｃ末端ネオエピトープのアミノ酸配列がＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ（配列番号１）またはＰＰＧＲＬＶ（配列番号２）である、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
ビオチンに結合されている、請求項１７から１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
生物学的試料中でＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの量を測定するためのアッセイキットであって、請求項１から９のいずれかに記載の抗体と、
‐ストレプトアビジンで被覆された９６ウェルプレート
‐ビオチン残基と前記ペプチドの間に位置する任意選択のリンカーを伴う、請求項１７から１９に記載のビオチン化ペプチド、
‐サンドイッチイムノアッセイに使用するためのビオチン化二次抗体
‐請求項１７から１９に記載のキャリブレータペプチド
‐抗体ＨＰＲ標識キット
‐抗体放射性標識キット
‐アッセイ視覚化キット
の少なくとも１つとを含む、アッセイキット。
【請求項２２】
Ｌが任意選択のリンカーであるビオチン化ペプチド、ビオチン−Ｌ−ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ（配列番号７）と、Ｃ末端配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を含むキャリブレータペプチドとを含む、請求項２０に記載のアッセイキット。
【請求項２３】
Ｌが任意選択のリンカーであるビオチン化ペプチドＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ−Ｌ−ビオチン（配列番号８）と、Ｎ末端配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）を含むキャリブレータペプチドとを含む、請求項２０に記載のアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントと反応性である抗体、ＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを検出および定量化するためのアッセイにおける抗体の使用、ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または全身性硬化症を評価するためのアッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＶＩＩ型コラーゲンは、基底膜をその下の間質マトリックスに結合する係留線維の主成分である。これは、２つの非コラーゲン（ＮＣ）ドメインおよび中央のコラーゲン三重らせんドメインを有する３つの同一のα１鎖から成る。ＶＩＩ型コラーゲンは、皮膚および粘膜の基底膜において同定されている［１］。
【０００３】
ＶＩＩ型コラーゲンは、主として、重篤な皮膚疾患である栄養障害型表皮水疱症におけるその役割について検討されてきた。ＶＩＩ型コラーゲンα１鎖の突然変異は、真皮からの表皮の分離、したがって皮膚の水疱形成を引き起こす、異常な係留線維の形成、係留線維の減少または欠如をもたらす［１］。ＶＩＩ型コラーゲンはまた、皮膚および粘膜の水疱形成を引き起こす自己免疫疾患である後天性表皮水疱症における原因タンパク質としても同定されている。この疾患は、ＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメインに対するＩｇＧ自己抗体によって引き起こされる［２］。
【０００４】
ＶＩＩ型コラーゲンに対する自己免疫はまた、炎症性腸疾患および水疱性全身性エリテマトーデスにも関連付けられている［３−４］。
【０００５】
全身性硬化症に罹患している患者の皮膚におけるＶＩＩ型コラーゲンレベルの上方調節が同定されている［５］。全身性硬化症の患者は、皮膚線維症を有し、肺を含む内臓器官の線維症を呈し得る。１つの試験では、喘息のサルモデルにおいて気道の係留線維中のＶＩＩ型コラーゲンタンパク質のレベル低下も同定されている［６］。
【０００６】
ＶＩＩ型コラーゲンに関連する病原性状態を評価するためには、病原性状態に関連する種を検出および定量化することができるアッセイを作製することが必要である。
【０００７】
Ｃｈｅｎら、ＳａｌｅｈらおよびＫｉｍらは、独立して、ＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１またはＮＣ２ドメインに対する自己抗体を検出するためのＥＬＩＳＡを開発した［７−９］。これらの方法は、ＶＩＩ型コラーゲンα１の組換えＮＣ１および／またはＮＣ２ドメインでマイクロタイタープレートを被覆し、関心対象の血清試料を添加し、抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して血清試料中に存在する自己抗体を検出することを含む。
【０００８】
Ｒｅｃｋｅらは、ＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメインに対する自己抗体の生成を記述し、後天性表皮水疱症のヒトエクスビボモデルにおいて潜在的病原性を検討した［１０］。彼らは、これを診断ツールとして使用することを提案した。
【０００９】
Ｓａｋａｉらは、ＶＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体を惹起した［１１］。このｍＡｂは無傷のＶＩＩ型コラーゲンとのみ反応性であった。
【００１０】
ＶＩＩ型コラーゲンを標的とするモノクローナルおよびポリクローナル抗体は、いくつかの供給業者から商業的に入手することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．およびＪ．Ｕｉｔｔｏ．２０１０。ＶＩＩ型コラーゲン：栄養障害型表皮水疱症の原因となる係留線維タンパク質（Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ：ｔｈｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ｆａｕｌｔ  ｉｎ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ．）。Ｂｅｒｍｏｓａ．ＤｅｒｍａｔｏｌＣｌｉｎ．２８：９３−１０５。
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｍ．、Ｇ．Ｈ．Ｋｉｍ、Ｌ．ＰｒａｋａｓｈおよびＤ．Ｔ．Ｗｏｏｄｌｅｙ．２０１２。後天性表皮水疱症：係留線維コラーゲンに対する自己免疫（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．）。Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４５：９１−１０１。
【非特許文献３】Ｈｕｎｄｏｒｆｅａｎ，Ｇ．、Ｍ．Ｆ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＣ．Ｓｉｔａｒｕ．２０１０。炎症性腸疾患におけるＶＩＩ型コラーゲンに対する自己免疫（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．）。Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１４：２３９３−２４０３。
【非特許文献４】Ｇａｍｍｏｎ，Ｗ．Ｒ．、Ｄ．Ｔ．Ｗｏｏｄｌｅｙ、Ｋ．Ｃ．ＤｏｌｅおよびＲ．Ａ．Ｂｒｉｇｇａｍａｎ．１９８５。全身性エリテマトーデスの水疱性発疹における抗基底膜部抗体が後天性表皮水疱症の自己抗原を認識する証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ａｎｔｉ−ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｚｏｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｂｕｌｌｏｕｓ  ｅｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ．）。Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８４：４７２−４７６。
【非特許文献５】Ｒｕｄｎｉｃｋａ，Ｌ．、Ｊ．Ｖａｒｇａ、Ａ．Ｍ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ、Ｒ．Ｖ．Ｉｏｚｚｏ、Ｓ．Ａ．ＪｉｍｅｎｅｚおよびＪ．Ｕｉｔｔｏ．１９９４。全身性硬化症の患者の皮膚におけるＶＩＩ型コラーゲンの発現上昇。トランスフォーミング増殖因子βによる調節（Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ．）。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：１７０９−１７１５。
【非特許文献６】Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｍ．Ｖ．Ｆａｎｕｃｃｈｉ、Ｌ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｍ．Ａ．Ｃａｒｌｓｏｎ、Ｓ．Ｊ．ＮｉｓｈｉｏおよびＤ．Ｍ．Ｈｙｄｅ．２０１０。ハウスダストダニに暴露された乳児アカゲザルの気道基底膜部におけるＶＩＩ型コラーゲン係留線維の減少（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＶＩＩ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｉｒｗａｙ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｔ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ．）。Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９８：Ｌ５４３−Ｌ５４７。
【非特許文献７】Ｃｈｅｎ，Ｍ．、Ｌ．Ｓ．Ｃｈａｎ、Ｘ．Ｃａｉ、Ｅ．Ａ．Ｏ’Ｔｏｏｌｅ、Ｊ．Ｃ．ＳａｍｐｌｅおよびＤ．Ｔ．Ｗｏｏｄｌｅｙ．１９９７。後天性表皮水疱症における抗ＶＩＩ型コラーゲン自己抗体の迅速検出のためのＥＬＩＳＡの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ．）。Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０８：６８−７２。
【非特許文献８】Ｓａｌｅｈ，Ｍ．Ａ．、Ｋ．Ｉｓｈｉｉ、Ｙ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ａ．Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｎ．Ｉｓｈｉｉ、Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｄ．Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ、Ｙ．Ｓｈｉｌｋａｔａ、Ｋ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２０１１。後天性表皮水疱症患者の診断および経時変化の分析のためのＶＩＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡのＮＣ１およびＮＣ２ドメインの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＣ１  ａｎｄ  ＮＣ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）。Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ  ６２：１６９−１７５。
【非特許文献９】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．、Ｙ．Ｈ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｋｉｍ、Ｅ．Ｂ．Ｎｏｈ、Ｓ．Ｅ．Ｋｉｍ、Ａ．Ｖｏｒｏｂｙｅｖ、Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｄ．ＺｉｌｌｉｋｅｎｓおよびＳ．Ｃ．Ｋｉｍ．２０１３。後天性表皮水疱症の患者において酵素結合免疫吸着アッセイによって検出された抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体の血清レベルは、皮膚病変の重症度と相関する（Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ  ａｒｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｌｅｓｉｏｎｓ．）。Ｊ．Ｅｕｒ．Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２７：ｅ２２４−ｅ２３０。
【非特許文献１０】Ｒｅｃｋｅ，Ａ．、Ｃ．Ｓｉｔａｒｕ、Ｇ．Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ、Ｍ．Ｅｖｅｎｓｅｎ、Ｍ．Ｔ．Ｃｈｉｒｉａｃ、Ｒ．Ｊ．ＬｕｄｗｉｇおよびＤ．Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ．２０１０。ＶＩＩ型コラーゲンに対するＩｇＧサブクラス自己抗体の病原性：真皮−表皮分離の誘導（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．）。Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．３４：４３５−４４４。
【非特許文献１１】Ｓａｋａｉ，Ｌ．Ｙ．、Ｄ．Ｒ．Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｐ．ＭｏｒｒｉｓおよびＲ．Ｅ．Ｂｕｒｇｅｓｏｎ．１９８６。ＶＩＩ型コラーゲンは係留線維の主要な構造成分である（Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌｓ．）。Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０３：１５７７−１５８６。
【発明の概要】
【００１２】
現在、ＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントが循環中で検出可能であり、ＶＩＩ型コラーゲンに関連する病理学的状態を評価するための潜在的なバイオマーカーとしての役割を果たし得ることが見出されている。具体的には、ＶＩＩ型コラーゲンα１フラグメントと、病理学的状態であるＣＯＰＤおよび全身性硬化症との間の関連が同定されている。
【００１３】
したがって、第一の態様では、本発明は、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントと反応性の抗体に関し、抗体はＮ末端またはＣ末端ネオエピトープに結合する。
【００１４】
抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体または所望の生物学的活性を示す抗体フラグメントであってもよい。
【００１５】
好ましくは、抗体は無傷のＶＩＩ型コラーゲンα１を認識しないまたはこれに結合しない。
【００１６】
好ましい実施形態では、抗体は、ＶＩＩ型コラーゲンα１の非コラーゲンアミノ末端ドメイン（ＮＣ１）に含まれるか、またはＶＩＩ型コラーゲンα１の中央コラーゲンドメインに含まれるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープに結合し得る。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、抗体は、ＶＩＩ型コラーゲンα１の中央コラーゲンドメインに含まれるＣ末端ネオエピトープに結合し得る。好ましくは、抗体は、アミノ酸配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１）に含まれるＣ末端ネオエピトープに結合する。好ましくは、抗体は、アミノ酸配列ＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号２）を含むかまたはこれから成るＣ末端ネオエピトープに結合する。このＣ末端ネオエピトープは、ＶＩＩ型コラーゲンα１の中央コラーゲンドメイン内のアミノ酸Ｖ１７０９−Ｄ１７１０の間のＶａｌ−Ａｓｐ結合におけるヒトＶＩＩ型コラーゲンα１の切断によって形成され得る。好ましくは、抗体は、伸長したアミノ酸配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶＸ−ＣＯＯＨ（配列番号３）を認識せずまたはこれに結合せず、ここで、ＸはＶＩＩ型コラーゲンα１の配列の１つ以上のアミノ酸である。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、抗体は、ＶＩＩ型コラーゲンα１の非コラーゲンアミノ末端ドメイン（ＮＣ１）に含まれるＮ末端ネオエピトープに結合し得る。好ましくは、抗体は、アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）に含まれるＮ末端ネオエピトープに結合し得る。好ましくは、抗体は、アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲ（配列番号５）を含むかまたはこれから成るＮ末端ネオエピトープに結合する。このＮ末端ネオエピトープは、ＶＩＩ型コラーゲンα１の非コラーゲンアミノ酸末端ドメイン内のアミノ酸Ａ１６−Ｅ１７の間のＡｌａ−Ｇｌｕ結合におけるヒトＶＩＩ型コラーゲンα１の切断によって形成され得る。好ましくは、抗体は、伸長したアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＸＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号６）を認識せずまたはこれに結合せず、ここで、ＸはＶＩＩ型コラーゲンα１の配列の１つ以上のアミノ酸である。
【００１９】
本明細書に記載する抗体は、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープアミノ酸配列に対応する合成ペプチドに対して惹起され得る。
【００２０】
第二の態様では、本発明は、生物学的試料中で、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを検出するためのイムノアッセイの方法に関し、方法は、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを含む生物学的試料を本明細書に記載する抗体と接触させることと、抗体の結合量を測定することとを含む。
【００２１】
この方法は、生体液中のＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの量を定量化するために使用し得る。生体液は、血清、血漿、気管支肺胞洗浄液、痰、唾液、呼気または尿であり得るが、これらに限定されない。
【００２２】
イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得るが、これらに限定されない。イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイであり得るが、これらに限定されない。
【００２３】
この方法は、方法によって測定されたＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの量を、既知の疾患重症度の標準的なＶＩＩ型コラーゲン関連疾患試料と相関させて、ＶＩＩ型コラーゲン関連疾患の重症度を評価する工程をさらに含み得る。
【００２４】
このようなＶＩＩ型コラーゲン関連疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または全身性硬化症であり得るが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の方法は、このようなＶＩＩ型コラーゲン関連疾患の定量、診断および／または予後において利用し得ることが想定される。
【００２６】
第三の態様では、本発明はペプチドに関し、ペプチドは、Ｎ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントのＮ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するＮ末端アミノ酸配列を有するか、またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントのＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するＣ末端アミノ酸配列を有する。好ましくは、ペプチドは、１０アミノ酸残基の長さ、より好ましくは９アミノ酸残基、より好ましくは８アミノ酸残基、より好ましくは７アミノ酸残基、最も好ましくは６アミノ酸残基の長さである。ペプチドはビオチン化されていてもよい。
【００２７】
好ましい実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）またはＥＡＰＲＶＲ（配列番号５）を有する。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ（配列番号１）またはＰＰＧＲＬＶ（配列番号２）を有する。
【００２９】
第四の態様では、本発明は、生物学的試料中でＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントの量を測定するためのアッセイキットに関し、キットは、本明細書に記載する抗体と、
‐ストレプトアビジンで被覆された９６ウェルプレート
‐ビオチン残基とペプチドの間に位置する任意選択のリンカーを伴う、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するビオチン化ペプチド、
‐サンドイッチイムノアッセイに使用するためのビオチン化二次抗体
‐Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するキャリブレータペプチド
‐抗体ＨＰＲ標識キット
‐抗体放射性標識キット
‐アッセイ視覚化キット
の少なくとも１つとを含む。
【００３０】
好ましくは、アッセイキットは、Ｌが任意選択のリンカーであるビオチン化ペプチド、ビオチン−Ｌ−ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ（配列番号７）と、Ｃ末端配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を含むキャリブレータペプチドとを含む。
【００３１】
好ましくは、アッセイキットは、Ｌが任意選択のリンカーであるビオチン化ペプチド、ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ−Ｌ−ビオチン（配列番号８）と、Ｎ末端配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）を含むキャリブレータペプチドとを含む。
【００３２】
定義
用語「抗体」は、最も広い意味で本発明に従って使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体フラグメントを包含する。
【００３３】
本発明による「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域または可変領域を含む、無傷の抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＦｃフラグメントが含まれる。
【００３４】
本発明による「ＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメント」は、ＶＩＩ型コラーゲンのプロテアーゼ切断によって生成されるペプチドフラグメントを意味する。
【００３５】
本発明による「Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープ」は、ＶＩＩ型コラーゲンα１のプロテアーゼ切断部位で形成されるＮ末端またはＣ末端エピトープを意味する。例えば、ＶＩＩ型コラーゲンα１の以下の配列：
．．．ＰＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ↓ＤＴＧＰＧＡＲＥＫＧＥ．．．
は、Ｖ１７０９−Ｄ１７１０ペプチド結合の間の部位でプロテアーゼによって切断された場合、記号「↓」で表されるように、Ｎ末端ネオエピトープＨ２Ｎ−ＤＴＧＰＧＡＲＥＫＧＥ．．．およびＣ末端ネオエピトープ．．．ＰＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨを生成する。
【００３６】
本明細書で使用される「Ｃ７」は、Ｃ末端ネオエピトープＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１）を含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを指す。
【００３７】
本明細書で使用される「ＮＢ６７７」は、Ｎ末端ネオエピトープＨ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）を含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントを指す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】「Ｃ７」アッセイの検量線を示す。
【図２】「Ｃ７」とＣＯＰＤとの相関を示す。
【図３】「Ｃ７」と全身性硬化症との相関を示す。
【図４】「ＮＢ６７７」アッセイの検量線を示す。
【図５】全身性硬化症における血清Ｃ７の臨床評価。健常ドナー（ｎ＝７０）および全身性硬化症を有する患者のコホート（ＳＳｃ；ｎ＝１１９）において血清Ｃ７レベルを評価した。データはテューキーの箱ひげ図として提示する。統計的有意性は、マン‐ホイットニー検定によって評価した。＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
例１−ＣＯＰＤバイオマーカー（「Ｃ７」アッセイ）
理論的根拠
ＣＯＰＤを有する患者、特発性肺線維症（ＩＰＦ）を有する患者および健常ドナーからの血清試料に関して質量分析を実施した。
【００４０】
最初の質量分析は、血清中のＶＩＩ型コラーゲンに由来するペプチドを同定した。ＩＭＡＣ  Ｃｕビーズを用いて血清からペプチドを単離した。個々のペプチドについての同一性の有意性閾値は５１であった。血清試料は、オービトラップ（ＯｒｂｉＢ）装置を用いて分析した。
【００４１】
Ｃ末端ネオエピトープＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（「Ｃ７」）（配列番号１）を含むＶＩＩ型コラーゲンα１のフラグメントは、ＣＯＰＤ試料中で見出されたが、ＩＰＦまたは健常ドナー試料中では認められなかった。ネオエピトープは、ヒトＶＩＩ型コラーゲンの１７０９位‐１７１０位のアミノ酸Ｖａｌ−Ａｓｐの間に位置する切断部位に対応する。この切断に関与するプロテアーゼは未だ不明である。この配列をＢＬＡＳＴを用いて分析し、ＶＩＩ型コラーゲンα１鎖にユニークであることが判明した。
【００４２】
抗体
モノクローナル抗体を、Ｃ末端ネオエピトープのアミノ酸配列ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１）に対して惹起させた。
【００４３】
簡単に述べると、フロイントの不完全アジュバントを使用して、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを乳化抗原２００μＬおよびＣ７合成ペプチド（ＫＬＨ−ＣＧＧ−ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ、配列番号９）５０μｇで皮下免疫した。安定な血清力価レベルに達するまで、２週間ごとに免疫を行った。最も高い血清力価を有するマウスを融合のために選択した。マウスを１ヶ月間休息させ、次いで、細胞融合のために脾臓を単離する３日前に、０．９％塩化ナトリウム溶液１００μＬ中のＣ７ペプチド５０μｇで静脈内に追加免疫した。マウスの脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫融合パートナー細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞を半固体培地法を用いてクローニングし、さらなる増殖のために９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。モノクローナル増殖を促進するために、標準的な限界希釈法を用いた。
【００４４】
ＥＬＩＳＡ
Ｃ７に対して惹起させたモノクローナル抗体を使用した競合ＥＬＩＳＡを、以下の手順を用いて実施した。
【００４５】
ストレプトアビジン被覆プレートをアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＴＢＳ−ＢＴＢ、２ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で希釈した２．５ｎｇ／ｍＬのビオチン標識ペプチド（ビオチン−ＫＫＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ、配列番号１０）１００μＬ／ウェルで被覆し、２０℃にて、３００ｒｐｍで振とうしながら３０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（２０ｎＭ  ＴＲＩＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で５回洗浄した。試料または標準ペプチド（２０μＬ）を二重測定において添加し、続いて直ちに、アッセイ緩衝液で希釈した２００ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ標識モノクローナル抗体１００μＬ／ウェルを添加し、プレートを２０℃にて３００ｒｐｍで振とうしながら３時間インキュベートした。標準ペプチドは、１２５ｎｇ／ｍＬの出発濃度で、１１ポイントの検量線を作成するために２倍に希釈した合成ペプチド（ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶ、配列番号１）であった（図１）。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液中で５回洗浄した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１００μＬを添加し、暗所で２０℃にて１５分間インキュベートした。ＴＭＢの酵素反応を停止させるために、０．１％硫酸１００ｍＬを添加し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで吸光度を測定した。検量線は、４パラメトリック数学的適合モデルを用いてプロットした。各ＥＬＩＳＡプレートは、アッセイ間変動を観測するためにキット対照および社内品質管理試料の両方を含んだ。すべての試料をアッセイの範囲内で測定した。検出の下限（ＬＬＯＤ）未満のすべての試料にはＬＬＯＤの値を割り当てた。
【００４６】
Ｃ７  ＥＬＩＳＡの技術的特徴は以下のとおりである。
【００４７】
【表１】
2019507731.tif 000003
【００４８】
ＥＬＩＳＡは、標準ペプチドに対しては反応性が見られたが、伸長ペプチド（ＧＰＰＧＰＰＧＲＬＶＤ、配列番号１１）には見られなかったので、切断部位に特異的であることが示され、このアッセイが無傷のＶＩＩ型コラーゲンタンパク質を認識しないことを指し示した（図１）。
【００４９】
臨床的有用性
ＣＯＰＤ
ＣＯＰＤを有する６８名の患者のコホートでは、健常ドナーと比較してＣ７の血清レベルが有意に上昇していた（図２）。
【００５０】
これらの結果は、ＣＯＰＤを同定する上でのＣ７アッセイの有用性を示し、例えば診断または予後予測ツールとして、ＣＯＰＤを評価するのに有用であることを実証し得る。
【００５１】
全身性硬化症
初期のびまん性全身性硬化症の２０名の患者では、健常対照と比較してＣ７の血清レベルが有意に上昇していた（ｐ＝０．０２２）（図３）。全身性硬化症の初期段階は高い疾患活動性に関連するが、後期段階の患者は緩やかに進行する。初期びまん性疾患の患者群では、中間の進行速度（皮膚厚さの進行速度によって定義される）を有する亜集団が、対照と比較して有意に高いレベルを有していた（ｐ＝０．０１６）。
【００５２】
後期全身性硬化症と比較した場合の初期段階全身性硬化症におけるＣ７レベルの上昇は、Ｃ７アッセイが全身性硬化症の初期段階と後期段階とを区別することができ、それによって全身性硬化症を評価するための潜在的に有用な診断および／または予後予測ツールを提供し得ることを示唆する。
【００５３】
例２（「ＮＢ６７７」アッセイ）
ＶＩＩ型コラーゲンα１のシグナルペプチドは、アミノ酸１‐１６に見出される［１２］。シグナルペプチドの切断によって形成されるＮ末端ネオエピトープ配列（１７’．ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ’２６）を、ＢＬＡＳＴを用いて分析し、ＶＩＩ型コラーゲンα１鎖にユニークであることが判明した。
【００５４】
ＣＯＰＤについての「Ｃ７」アッセイの成功に続いて、このユニークなＶＩＩ型コラーゲンα１ネオエピトープは、ＣＯＰＤおよび／または全身性硬化症の同定および／または評価にも有用であり得ると考えられる。
【００５５】
抗体
したがって、Ｎ末端ネオエピトープのアミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ（配列番号４）に対するモノクローナル抗体を惹起させた。
【００５６】
簡単に述べると、フロイントの不完全アジュバントを使用して、４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを乳化抗原２００μＬおよびＮＢ６７７合成ペプチド（ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ−ＧＧＣ−ＫＬＨ、配列番号１２）５０μｇで皮下免疫した。安定な血清力価レベルに達するまで、２週間ごとに免疫を行った。最も高い血清力価を有するマウスを融合のために選択した。マウスを１ヶ月間休息させ、次いで、細胞融合のために脾臓を単離する３日前に、０．９％塩化ナトリウム溶液１００μＬ中のＮＢ６７７ペプチド５０μｇで静脈内に追加免疫した。マウスの脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫融合パートナー細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞を半固体培地法を用いてクローニングし、さらなる増殖のために９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。モノクローナル増殖を促進するために、標準的な限界希釈法を用いた。
【００５７】
ＥＬＩＳＡ
モノクローナル抗体を使用した競合ＥＬＩＳＡを、以下の手順を用いて実施した。
【００５８】
ストレプトアビジン被覆プレートを被覆緩衝液（５０ｍＭ  ＰＢＳ−ＢＴＥ、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％ソルビトール）で希釈した２．０ｎｇ／ｍＬのビオチン標識ペプチド（ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ−Ｌｙｓ−ビオチン、配列番号１３）１００μＬ／ウェルで被覆し、２０℃にて、３００ｒｐｍで振とうしながら３０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（２０ｎＭ  ＴＲＩＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で５回洗浄した。標準ペプチド（２０μＬ）を二重測定において添加し、続いて直ちに、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＰＢＳ−ＢＴＢ、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）で希釈した１２０ｎｇ／ｍＬモノクローナル抗体１００μＬ／ウェルを添加し、プレートを、４℃にて３００ｒｐｍで振とうしながら２０時間インキュベートした。標準ペプチドは、１００ｎｇ／ｍＬの出発濃度で、検量線を作成するために２倍に希釈した合成ペプチド（ＥＡＰＲＶＲＡＱＨＲ、配列番号４）であった（図４）。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液中で５回洗浄した。１００μＬ／ウェルの二次ＨＲＰ標識抗体（ウサギ抗マウスＩｇＧ）をアッセイ緩衝液で１：３０００に希釈して添加し、プレートを、２０℃にて３００ｒｐｍで振とうしながら１時間インキュベートした。３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１００μＬを添加し、暗所で２０℃にて１５分間インキュベートした。ＴＭＢの酵素反応を停止させるために、０．１％硫酸１００ｍＬを添加し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで吸光度を測定した。検量線は、４パラメトリック数学的適合モデルを用いてプロットした。ＶＩＩ型コラーゲンα１のＮ末端ネオエピトープに対するモノクローナル抗体は、標準ペプチドに対する反応性による評価で、所望の配列を認識することが確認された。
【００５９】
例３
Ｃ７  ＥＬＩＳＡを、全身性硬化症（ＳＳｃ）を有する患者の第二のより大きなコホートで評価した。ヒト血清における評価の精度を改善するためにＣ７  ＥＬＩＳＡを（前の例と比較して）再較正した。
【００６０】
結果：健常ドナー（ｎ＝７０）における血清レベルをＳＳｃ患者（ｎ＝１１９）と比較することによって、Ｃ７  ＥＬＩＳＡの生物学的関連性を評価した。データを図５に示す。健常ドナー（３．９ｎｇ／ｍＬ［ＩＱＲ２．３‐８．３ｎｇ／ｍＬ］；ｐ＜０．０００１）と比較して、ＳＳｃ患者（９．３ｎｇ／ｍＬ［ＩＱＲ６．７−１３．２］）では血清Ｃ７レベルの中央値が有意に上昇していた。
【００６１】
臨床データは、ＳＳｃを有する患者において血清Ｃ７レベルが上昇することを裏付ける。
【００６２】
結論として、本明細書に記載の新規アッセイは、ＶＩＩ型コラーゲンα１のＮ末端またはＣ末端ネオエピトープに特異的な抗体を利用する。我々が知る限り、ＶＩＩ型コラーゲンがＣＯＰＤと関連付けられたのはこれが初めてである。したがって、これらのアッセイは、ＣＯＰＤおよび全身性硬化症を評価するために使用し得ることが想定される。
【００６３】
本明細書では、明確に別段の指示がない限り、単語「または」は、条件のうちの１つだけが満たされることを求める演算子「排他的なまたは」とは対照的に、記載された条件のいずれかまたは両方が満たされた場合に真の値を返す演算子の意味で使用される。単語「含む」は、「から成る」を意味するのではなく、「包含する」の意味で使用される。上記で認められたすべての先行教示は、参照により本明細書に組み込まれる。先行して公表された資料の本明細書における承認は、その教示がその時点でオーストラリアまたは他の場所における共通の一般的な知識であったことの承認または表明であるとみなされるべきではない。
【００６４】
参考文献
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［８］Ｓａｌｅｈ，Ｍ．Ａ．、Ｋ．Ｉｓｈｉｉ、Ｙ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ａ．Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｎ．Ｉｓｈｉｉ、Ｔ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｄ．Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ、Ｙ．Ｓｈｉｌｋａｔａ、Ｋ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２０１１。後天性表皮水疱症患者の診断および経時変化の分析のためのＶＩＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡのＮＣ１およびＮＣ２ドメインの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＮＣ１  ａｎｄ  ＮＣ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）。Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ  ６２：１６９−１７５。
［９］Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．、Ｙ．Ｈ．Ｋｉｍ、Ｓ．Ｋｉｍ、Ｅ．Ｂ．Ｎｏｈ、Ｓ．Ｅ．Ｋｉｍ、Ａ．Ｖｏｒｏｂｙｅｖ、Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｄ．ＺｉｌｌｉｋｅｎｓおよびＳ．Ｃ．Ｋｉｍ．２０１３。後天性表皮水疱症の患者において酵素結合免疫吸着アッセイによって検出された抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体の血清レベルは、皮膚病変の重症度と相関する（Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ａｃｑｕｉｓｉｔａ  ａｒｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｌｅｓｉｏｎｓ．）。Ｊ．Ｅｕｒ．Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２７：ｅ２２４−ｅ２３０。
［１０］Ｒｅｃｋｅ，Ａ．、Ｃ．Ｓｉｔａｒｕ、Ｇ．Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ、Ｍ．Ｅｖｅｎｓｅｎ、Ｍ．Ｔ．Ｃｈｉｒｉａｃ、Ｒ．Ｊ．ＬｕｄｗｉｇおよびＤ．Ｚｉｌｌｉｋｅｎｓ．２０１０。ＶＩＩ型コラーゲンに対するＩｇＧサブクラス自己抗体の病原性：真皮−表皮分離の誘導（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．）。Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．３４：４３５−４４４。
［１１］Ｓａｋａｉ，Ｌ．Ｙ．、Ｄ．Ｒ．Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｐ．ＭｏｒｒｉｓおよびＲ．Ｅ．Ｂｕｒｇｅｓｏｎ．１９８６。ＶＩＩ型コラーゲンは係留線維の主要な構造成分である（Ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌｓ．）。Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０３：１５７７−１５８６。
［１２］Ｕｎｉｐｒｏｔ．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ０２３８８．２０１５年にアクセスした。
【配列表フリーテキスト】
【００６５】
配列表３
＜２２３＞伸長したＣ末端ネオエピトープ
＜２２３＞ＸはＶＩＩ型コラーゲンα１の配列の１つ以上のアミノ酸である
配列表６
＜２２３＞ＸはＶＩＩ型コラーゲンα１の配列の１つ以上のアミノ酸である
＜２２３＞伸長したＮ末端ネオエピトープ
配列表７
＜２２３＞ビオチン残基とペプチドの間に位置する任意選択のリンカーを伴ってビオチン化
＜２２３＞Ｃ末端ネオエピトープ−Ｎ末端でビオチン化
配列表８
＜２２３＞Ｎ末端ネオエピトープ−Ｃ末端でビオチン化
＜２２３＞ビオチン残基とペプチドの間に位置する任意選択のリンカーを伴ってビオチン化
配列表９
＜２２３＞ＣＧＧリンカーに結合したＫＬＨ
＜２２３＞免疫化ペプチド
配列表１０
＜２２３＞ビオチン化
＜２２３＞被覆物ペプチド
配列表１１
＜２２３＞伸長したＣ末端配列
配列表１２
＜２２３＞免疫化ペプチド
＜２２３＞ＫＬＨ結合
配列表１３
＜２２３＞被覆物ペプチド
＜２２３＞ビオチン化
【図１】
2019507731.tif 000004
【図２】
2019507731.tif 000005
【図３】
2019507731.tif 000006
【図４】
2019507731.tif 000007
【図５】
2019507731.tif 000008
【配列表】
2019507731000001.app
【国際調査報告】
2019507731.tif 000009
2019507731.tif 000010
2019507731.tif 000011
2019507731.tif 000012
2019507731.tif 000013