(57)【要約】  本発明は、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子とその逆方向で作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーター、この双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含む組換えベクターおよび組換えウイルスを提供する。本発明はまた、そのような組換えベクターおよび組換えウイルスを作製する方法、および使用する方法を提供する。
2019514415.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子とその逆方向で作動可能に連結された、配列番号４に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一である配列を含む双方向性プロモーターを含む組換え核酸分子。
【請求項２】
前記双方向性プロモーターは、配列番号４を含む請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記第１および第２の導入遺伝子は異なり、それらの少なくとも１つは抗原をコードする請求項１または２に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む組換えベクターまたは組換えウイルス。
【請求項５】
前記ベクターはプラスミドベクターである請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記ウイルスはアデノウイルスである請求項４に記載の組換えウイルス。
【請求項７】
前記アデノウイルスはＥ１領域に欠失を有する請求項６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
前記アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である請求項６または７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
標的細胞に感染すると、それぞれが強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含む、遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法であって、
ａ）第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子とその逆方向で作動可能に連結された請求項１に記載の双方向性プロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、
ｂ）前記コンストラクトを前記組換えアデノウイルスのゲノムに組み込む工程と
を含む方法。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスは、そのゲノムのＥ１領域に欠失を有する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１および第２の導入遺伝子は異なり、それらの少なくとも１つは抗原をコードする請求項９または１０に記載の組換え核酸分子。
【請求項１２】
前記組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法であって、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターまたは組換えウイルスベクターを細胞に提供する工程を含む方法。
【請求項１４】
少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターまたは組換えウイルスを対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１６】
請求項４〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターまたは組換えウイルスと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種および遺伝子治療における用途のための医薬分野および遺伝子送達分野に関する。より詳しくは、本発明は、プラスミドベクター、ウイルスベクターおよび組換えウイルスなどの組換えベクターによる２つの導入遺伝子の発現のための強力でバランスのとれた双方向性プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えベクターは、異種タンパク質の発現のための種々の分子生物学的用途（例えば、遺伝子治療およびワクチン接種におけるそれらの適用を含む）において広く使用されている。これらの遺伝子治療およびワクチン接種の用途では、ウイルスベクターなどのベクターが、宿主細胞に導入すべき目的の遺伝子（群）のキャリアとして使用される。例えば、ウイルスベクターは、所望の抗原をコードする遺伝子またはその一部を発現させて、免疫応答を惹起するために使用され得る。
【０００３】
最も初期のウイルスベクターは一般に１つの導入遺伝子のみを含み、そして多くのストラテジーが、初期世代ベクターについて発表されている。例えば、発表されたストラテジーは、様々な異なるアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターの使用を報告しており、導入遺伝子発現カセットが、例えば、Ｅ１領域、Ｅ３領域、またはＥ４と右ＩＴＲの間など、アデノウイルスの異なる領域に、配置され得ることを示している。しかし、ワクチンの目的では、保護および広いカバー範囲を達成するために、２つ以上の抗原、または異なる株からの同じ抗原が必要であることが多い。したがって、場合によっては、１つのベクターから少なくとも２つの抗原を発現させることが望ましい。１つのウイルスベクターに２つの抗原をコードさせるための様々な方法が、記載されている。
【０００４】
ｒＡｄを用いる最初の２抗原法では、１つの抗原発現カセットがＥ１領域に配置され、第２のカセットがＥ３領域に配置された（例えば（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。ｒＡｄを用いる異なる２抗原法では、１つの抗原発現カセットがＥ１領域に配置され、第２のカセットがＥ４と右ＩＴＲの間に配置された（例えば（Ｈｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｃｈｅｐｐ−Ｂｅｒｇｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。ｒＡｄを用いる別の２抗原法は、組換えによる遺伝的不安定性を防止するために、２つの異なるプロモーター配列を用いてヘッドトゥーテール方式でＥ１領域に配置された２つの抗原発現カセットを使用することである（例えば（Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃ．Ｄ．Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９））。
【０００５】
２抗原法の別の例は、プラス鎖ＲＮＡウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するものを使用して、２つのタンパク質に翻訳される単一の転写物を産生することである（例えば（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｂｉｆｆｉ，Ｖｉｇｎａ，＆  Ｎａｌｄｉｎｉ，２００５；Ｎａ  ＆  Ｆａｎ，２０１０））。その他の例としては、宿主細胞スプライシング機構の利用、あるいは口蹄疫２Ａ配列などのプラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する「切断」ペプチドまたはその他のウイルスに由来する同等物の使用による、２つのタンパク質に切断されるポリタンパク質の産生が挙げられる。発表された報告によると、これらのストラテジーは全て等しく有用であり成功する。
【０００６】
あるいは、双方向性プロモーターの使用は、ウイルスベクターを用いて２つの抗原を発現するための別の方法である。例えば、レンチウイルスベクター（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ  ＆  Ｗｅｇｅｒ，２０１０）およびアデノウイルスベクター（Ｎａ  ＆  Ｆａｎ，２０１０；Ｐｏｓｔ  ＆  Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ，２００１；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，１９９８；Ｗａｌｔｈｅｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎ，２０００）について、異なる双方向性プロモーターが記載されている。
【０００７】
一般に、２つの異なるタイプの双方向性プロモーター、双方向特性を有する天然に存在する配列、および合成的に設計された双方向性プロモーターが、使用のために公知である。双方向特性を有する天然に存在する配列は、ウイルス、植物または哺乳動物ゲノムにおいて見出すことができる（Ａｎｄｒｉａｎａｋｉ，Ｓｉａｐａｔｉ，Ｈｉｒａｔａ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，＆  Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，２０１０；Ｂａｒｓｋｉ，Ｓｉｌｌｅｒ−Ｌｏｐｅｚ，Ｂｏｈｒｅｎ，Ｇａｂｂａｙ，＆  Ａｇｕｉｌａｒ−Ｃｏｒｄｏｖａ，２００４）。例えば、ヒトゲノム中の多くのプロモーターが、いくつかの双方向特性を有することが報告されている。双方向特性を有するヒトプロモーターは、ＧＡＢＰ部位の過剰提示によって特徴付けられる（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ，＆  Ｍｙｅｒｓ，２００７）。
【０００８】
天然に存在する配列とは対照的に、合成による双方向性プロモーターは、異なる一方向性プロモーターの望ましい特性を利用するように設計することができる。例えば、Ａｍｅｎｄｏｌａらは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来の最小プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）をヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＩ  Ｃ）と組み合わせることによって、レンチウイルスベクターにおいて使用するための２つの異なる合成双方向性プロモーターを作製した（Ａｍｅｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。双方向性プロモーターを構築するために、１つのエンハンサーのみを使用して、一方向性プロモーターは逆向き（ヘッドトゥーヘッド）に構成された。Ａｍｅｎｄｏｌａらによれば、強力な最小プロモーターをこの構成で完全な哺乳動物プロモーターと組み合わせると、両側からの同調発現がもたらされた。しかし、発現能および発現バランスの分析には、完全エンハンサー含有ヒトＣＭＶプロモーターなどの既知の強力な一方向性プロモーターとの完全な比較は含まれなかった。実際、１つのベクターにおいて２つの抗原をコードする多価ウイルスベクターを使用する発表されたストラテジーの殆どで、一価のベクターの重要な特徴が忠実に維持されることを確実にするための系統的分析は行われていない。新たに作製された多価ベクターの重要な特徴としては、例えば、アップスケーリングの間の遺伝的安定性、大規模でのベクターの生産性、両抗原の強力な発現、両抗原のバランスのとれた発現、および挿入された発現カセットから発現された両抗原の免疫原性が挙げられる。
【０００９】
以前に開示された方法と比較して特に良好な結果が得られた、最近記載されたストラテジーでは、双方向性マウスサイトメガロウイルス（ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ｍＣＭＶ）プロモーターを使用して、２つの導入遺伝子を発現した（国際公開第２０１６／１６６０８８Ａ１号パンフレット）。第１の導入遺伝子は一方向に双方向性ｍＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、第２の導入遺伝子はその逆方向に双方向性ｍＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された。双方向性ｍＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄは、遺伝的に安定であると決定され、単一の導入遺伝子のみを有するｒＡｄに匹敵する遺伝的安定性を提供した。さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞応答に関する発現抗原の免疫原性のＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡ分析に基づいて、両導入遺伝子が、両抗原に対する免疫原性応答を生成するのに十分に発現されたことが決定された。したがって、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターは、以前に記載されたいくつかの他のストラテジーよりも優れていることが記載された。しかし、ｍＣＭＶプロモーターの両側の発現レベルのバランスをさらに改善できることが決定された。双方向性ｍＣＭＶプロモーターの右側（３’末端）に位置する抗原の発現は、プロモーターの左側（５’末端）に位置する抗原と比較して、約１０倍高かった。２つのコードされた抗原の発現における不均衡は、より低く発現された抗原と比較して、高度に発現された抗原に対し、より強い免疫応答をもたらす。この種の差次的発現は特定の用途では有用であり得るが、他の用途では、ｍＣＭＶプロモーターのいくつかの利点を、よりバランスのとれた発現、すなわち、双方向性ｍＣＭＶプロモーターおよび文献に記載されている他の双方向性プロモーターよりも強力で、かつバランスのとれた双方向性プロモーターと組み合わせるストラテジーを有することも望ましい。
【００１０】
したがって、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターと比較して、両方とも強力であり、両側からの発現のバランスが改善された双方向性プロモーターを同定し、２つの導入遺伝子の強力でバランスのとれた発現で遺伝的に安定な組換えウイルスを提供することが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含む組換え核酸分子、ならびに、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターを含む）およびウイルスを提供する。本発明の組換えベクターは２つの導入遺伝子を含み、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびＣＡＧ部分の転写方向（５’から３’）は互いから離れる方向に向かい（ヘッドトゥーヘッド配置）、第１の導入遺伝子は左側に一方向に作動可能に連結され、発現は双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分によって制御され、第２の導入遺伝子は右側にその逆方向に作動可能に連結され、発現は双方向性プロモーターのＣＡＧ部分によって制御される。ｈＣＭＶエンハンサーは、２つの異なるプロモーターの間の中間に、ｈＣＭＶプロモーター部分の方向を向いて配置される。エンハンサーは配向非依存性であり得るので、このエンハンサーは、双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびＣＡＧ部分に作動可能に連結された両導入遺伝子の協調発現を提供する。例えば、図１Ｄを参照されたい。図１Ｄは、代表的なｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの異なる構築ブロックの同一性および配向を示す。好ましくは、本発明によるｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、配列番号４に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最大１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、組換えウイルスおよび組換えウイルスベクターは、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）およびｒＡｄベクターである。本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターで生成されたｒＡｄは遺伝的に安定しており、継代１３（ｐ１３）に至るまでＰＣＲ分析によって欠失バンドは検出されず、したがって単一導入遺伝子のみを有するｒＡｄに匹敵する遺伝的安定性を提供する。さらに、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、一方向性プロモーターからの発現に匹敵する強力かつバランスのとれた２つの導入遺伝子の発現を提供する。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、バランスがとれ、かつ強力な発現が重要である、組換え（ウイルス）ベクターを用いる遺伝子治療およびワクチン適用における使用に好適である。
【００１３】
一般的、および好ましい実施形態は、本明細書に添付の独立請求項および従属請求項によってそれぞれ定義され、それらは簡潔さのために参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な態様の他の好ましい実施形態、特徴および利点は、下の詳細な説明と添付の図面とから明らかになるであろう。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、左側のｈＣＭＶプロモーターおよび右側のＣＡＧプロモーターを含む双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを提供するが、この双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは左側に一方向で第１の導入遺伝子に作動可能に連結され、またこの双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは右側にその逆方向で第２の導入遺伝子と作動可能に連結されている。
【００１５】
別の実施形態では、本発明はまた、第１および第２の導入遺伝子を含む組換えウイルスを製造する方法であって、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子とその逆方向で、作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、前記コンストラクトを組換えウイルスのゲノム内に組み込む工程とを含む方法を提供する。
【００１６】
特定の実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルスである。
【００１７】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１領域に欠失を有し、また、特定の実施形態では、このＥ１領域に双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターならびに第１および第２の導入遺伝子を含む。あるいは、組換えアデノウイルスの他の領域もまた使用され得る。例えば、双方向性プロモーター発現カセットはまた、組換えアデノウイルスのＥ４−ｒＩＴＲ領域に配置され得る。
【００１８】
特定の実施形態では、第１および第２の導入遺伝子は異なり、それらの少なくとも１つは抗原をコードする。特定の実施形態では、両者は異なる抗原をコードする。
【００１９】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２６またはヒトアデノウイルス血清型３５である。
【００２０】
別の実施形態では、本発明はまた、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法であって、本発明による組換えベクターを細胞に提供する工程を含む方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明はまた、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明による組換えベクターを対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明はまた、本発明による組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明はまた、本発明による組換えアデノウイルスなどの本組換えベクター、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物はワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１：ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターおよび他の双方向性プロモーターコンストラクトを示す模式図（異なる双方向性プロモーター配列の構築ブロックの同一性および配向の注釈を含む）。Ｐ：プロモーター、Ｅｎｈ：エンハンサー、Ｉ：イントロン。
【図１−２】（上記の通り。）
【図１−３】（上記の通り。）
【図１−４】（上記の通り。）
【図１−５】（上記の通り。）
【図２Ａ】ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションで評価した、異なる双方向性プロモーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの発現。ルシフェラーゼ発現は相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現はＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるプロモーターコンストラクトをスクリーニングする３つの異なる実験の結果を示す。異なる双方向性プロモーターの左側からのルシフェラーゼ発現および右側からのｅＧＦＰ発現の結果の棒グラフを示す。各棒グラフに、ラット−ＣＭＶ−ｂｉｄｉｒ−２、ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  Ｉ、ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩ、およびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１についての、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼまたはｅＧＦＰの陽性対照およびトランスフェクトされていない細胞の陰性対照と比較した結果を、左から右へ順に示す。
【図２Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションで評価した、異なる双方向性プロモーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの発現。ルシフェラーゼ発現は相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現はＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるプロモーターコンストラクトをスクリーニングする３つの異なる実験の結果を示す。異なる双方向性プロモーターの左側からのルシフェラーゼ発現および右側からのｅＧＦＰ発現の結果の棒グラフを示す。各棒グラフに、ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １．１、ｒＣＭＶ−ＣＡＧ、およびｈＣＭＶ−ＣＡＧ４についての、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼまたはｅＧＦＰの陽性対照およびトランスフェクトされていない細胞の陰性対照と比較した結果を、左から右へ順に示す。
【図２Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションで評価した、異なる双方向性プロモーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの発現。ルシフェラーゼ発現は相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現はＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるプロモーターコンストラクトをスクリーニングする３つの異なる実験の結果を示す。異なる双方向性プロモーターの左側からのルシフェラーゼ発現および右側からのｅＧＦＰ発現の結果の棒グラフを示す。各棒グラフに、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２、およびｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ１についての、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼまたはｅＧＦＰの陽性対照およびトランスフェクトされていない細胞の陰性対照と比較した結果を、左から右へ順に示す。
【図３Ａ】ｐｓｈｕｔｔｌｅ２６における双方向性プロモーターｈＣＭＶ−ＣＡＧ４用の双方向性発現カセットの構成（双方向性プロモーターコンストラクトの両側に導入遺伝子を挿入するために使用される制限部位の同一性および位置を含む）。Ｐ：プロモーター、Ｅｎｈ：エンハンサー、Ｉ：イントロン、ＴＧ：導入遺伝子、ｐＡ：ＳＶ４０（右側）または牛成長ホルモン（ＢＧＨ）（左側）に由来するポリアデニル化シグナル。プラスミドベクターｐｓｈｕｔｔｌｅ２６における表示。同じ双方向性発現カセット構成をｐＡｄａｐｔ３５で使用した。
【図３Ｂ】ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターを示す模式図（構築ブロックのヌクレオチド位置を含む）。矢印は転写の方向を表す。
【図４Ａ】Ａ５４９細胞に１０００ＶＰ／細胞で感染させたＡｄ２６ｒＡｄベクターにおける双方向性プロモーターコンストラクトの左側または右側におけるルシフェラーゼおよびｅＧＦＰ導入遺伝子の発現。ルシフェラーゼ発現は相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現はＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターコンストラクトについての結果を、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼまたはｅＧＦＰについての１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞の陽性対照、ならびにエンプティベクターに感染させた細胞と比較する。Ａｄ２６ｒＡｄベクターについて、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４を、双方向性ｍＣＭＶプロモーターとさらに比較する。
【図４Ｂ】Ａ５４９細胞に１０００ＶＰ／細胞で感染させたＡｄ３５ｒＡｄベクターにおける双方向性プロモーターコンストラクトの左側または右側におけるルシフェラーゼおよびｅＧＦＰ導入遺伝子の発現。ルシフェラーゼ発現は相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現はＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターコンストラクトについての結果を、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼまたはｅＧＦＰについての１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞の陽性対照、ならびにエンプティベクターに感染させた細胞と比較する。
【図５】Ｅ１領域に双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを保有し、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの右側または左側にｅＧＦＰおよびルシフェラーゼをコードするＡｄ２６ベクターゲノム上での、連続増殖とそれに続くＰＣＲによる遺伝的安定性試験。パネルの上から下に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＰ５、Ｐ１０、およびＰ１３での連続増殖後の、１ベクター当たり５つのプラークについてのＰＣＲ産物が示される。各パネルのレーン１〜５は、左側にルシフェラーゼ、右側にｅＧＦＰを有する双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを示す。各パネルのレーン６〜１０は、左側にｅＧＦＰ、右側にルシフェラーゼを有する双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを示す。レーン１１はｋＢマーカーを示す。レーン１２は、Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ｅＧＦＰのプラスミド陽性対照を示す。レーン１３は、ｒＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．Ｌｕｃのプラスミド陽性対照を示す。レーン１４は、導入遺伝子を含まない発現カセットのＰＣＲ産物サイズのプラスミド対照を示す。レーン１５は、陰性水ＰＣＲ対照を示す。ラベル表示：Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１３：ウイルス継代数、予想されるＰＣＲ産物以外の追加のバンドは、ＡＧプロモーター部分のＧＣリッチプロモーター配列による非特異的ＰＣＲ産物である、注記：露出過多の画像で欠失バンドの欠如が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
新しい双方向性プロモーターコンストラクトの強度およびバランスを比較した実験結果を本明細書に記載する。結果は、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターが、ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＡｄＡｐｔプラスミドベクターによる一過性トランスフェクション、ならびに一方向で双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターに作動可能に連結された第１の導入遺伝子、およびその逆方向で双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターに作動可能に連結された第２の導入遺伝子を有する双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５によるウイルス感染に基づいて、２つの導入遺伝子の強力かつバランスのとれた発現を提供することを示す。さらに、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを有するｒＡｄは遺伝的に安定しており、継代１３（ｐ１３）に至るまでＰＣＲ分析によって欠失バンドは検出されず、したがって単一導入遺伝子のみを有するｒＡｄに匹敵する遺伝的安定性を提供する。したがって、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを有する本発明のｒＡｄは、バランスがとれ、かつ強力な発現が優先される、遺伝子治療およびワクチン適用における使用に好適である。
【００２６】
したがって、本発明は、第１の導入遺伝子と一方向で作動可能に連結され、第２の導入遺伝子とその逆方向で作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターを含む組換え核酸分子であって、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびＣＡＧ部分の転写方向（５’から３’）は互いから離れる方向に向かい、左側からの発現は双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分によって制御され、右側からの発現は双方向性プロモーターのＣＡＧ部分によって制御される組換え核酸分子に関する。特定の実施形態では、本発明は、細胞において２つの導入遺伝子を発現するための双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むベクター、ウイルスベクター、およびウイルスの使用に関する。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、宿主細胞による異種タンパク質の産生を可能にするのに使用するプラスミドベクターに関する。例えば、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むプラスミドベクターは、異種多サブユニットタンパク質複合体の２つの異なる成分を発現するために使用され得る。このようなプラスミドベクターは、例えば、（１）双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーター、（２）各導入遺伝子のリボソーム結合部位をｍＲＮＡに提供する配列、（３）各導入遺伝子のコード領域、すなわち、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、（４）翻訳開始のための各導入遺伝子のコザックコンセンサス配列、（５）各導入遺伝子のコード全体が読み取られたときに翻訳を終結させる各導入遺伝子の終止配列、および（６）ベクターがゲノムに直接挿入されない場合、ベクター全体が細胞内に一旦再生されることを可能にする複製起点、を含むＤＮＡ配列であり得る。その後、例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって、ベクターを組み込むように宿主細胞を誘導し、宿主細胞の機能の一部として２つの導入遺伝子を発現するように宿主細胞を増殖させる。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むｒＡｄおよびｒＡｄベクター、ならびにｒＡｄおよびｒＡｄベクターを作製および使用する方法に関し、ここで、ｒＡｄおよびｒＡｄベクターは双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターおよび２つの導入遺伝子を含み、第１の導入遺伝子は一方向で双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターに作動可能に連結され、第２の導入遺伝子はその逆方向で双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターに作動可能に連結される。
【００２９】
本発明のｒＡｄは、大規模な量、またはバッチで製造され得る。ｒＡｄの「バッチ」は、単一製造容器内の単回製造工程において製造される組成物であり、あるいは、単一容器（例えば、バイオリアクター、バッグ、フラスコ、ボトル、多回用量バイアル、単回投与バイアル、シリンジなど）内に存在する組成物中の複数のｒＡｄ粒子を指し得る。本発明によるｒＡｄのバッチは、または本発明によるｒＡｄを含む組成物は、好ましくは、少なくとも１０７個のｒＡｄ粒子を含み、特定の実施形態では、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個以上のｒＡｄ粒子、最大で１０２０個のｒＡｄ粒子を含む（例えば、単回製造工程において、大規模バイオリアクター内にて製造される）。バッチまたは組成物は、ｒＡｄ以外のさらなる関連する成分を含んでもよく、含まなくてもよい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、組換えアデノウイルスの「組換え」という用語は、野生型アデノウイルスとは対照的に、人の手によって改変されていることを意味し、例えば、異種遺伝子、遺伝子群、またはその一部、および双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含む。
【００３１】
本明細書中の配列は、当該技術分野で慣用されているように、５’から３’方向で示される。
【００３２】
「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型および／または向性の決定に関与する、アデノウイルスのカプシドのタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、一般的には、繊維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含む。本発明による特定の血清型の（または「それをベースとする」）ｒＡｄは、通常、その特定の血清型の繊維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含み、好ましくはその特定の血清型の繊維、ペントンおよびヘキソンタンパク質を含む。これらのタンパク質は、一般に、ｒＡｄのゲノムによってコードされる。特定の血清型のｒＡｄは、任意選択的に、他のアデノウイルス血清型に由来する他のタンパク質を含有し、かつ／またはコードし得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、ｒＡｄは、少なくとも配列が、野生型からの誘導によってアデノウイルス「をベースとする」。この誘導は、出発物質として野生型ゲノムまたはその一部を使用した分子クローニングにより達成することができる。野生型アデノウイルスゲノムの既知の配列を使用して、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野のビジネスを有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による日常的手順を用いて実施され得るＤＮＡ合成によって、ゲノム（の一部）を新規に作製することもまた可能である。したがって、非限定的な例として、Ａｄ３５のヘキソン、ペントン、および繊維を含むｒＡｄが、Ａｄ３５をベースとするｒＡｄなどと見なされる。
【００３４】
本発明のアデノウイルスベクターは、ｒＡｄベクターと称される。ｒＡｄベクターの調製は、当該技術分野でよく知られている。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明によるｒＡｄベクターは、例えば、Ｅ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域などの、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これはアデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損またはＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子、および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損していてよい。
【００３６】
アデノウイルスベクター、それらを構築する方法、およびそれらを増殖させる方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書、米国特許第６，１１３，９１３号明細書、および米国特許第８，９３２，６０７号明細書、ならびにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、および本明細書で言及されるその他の参考文献に記載されている。一般的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２），およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、ならびに本明細書で言及している他の参考文献に記載されているものなどの、標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
【００３７】
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し、好ましくはマストアデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に属する。それはヒトアデノウイルスであり得るが、他の種に感染するアデノウイルス、例えば、限定はされないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはシミアンアデノウイルス（チンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルスおよび類人猿アデノウイルスを含む）でもあり得る。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ、またはＡｄＨｕ；本発明では、種の指示なしにＡｄに言及される場合にはヒトアデノウイルスを意味し、例えば、簡略表記の「Ａｄ５」は、ヒトアデノウイルス血清型５であるＨＡｄＶ５と同じものを意味する）、またはチンパンジーまたはゴリラアデノウイルスなどのシミアンアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）である。
【００３８】
最も進んだ研究は、ヒトアデノウイルスを用いて実施されており、本発明の特定の態様によればヒトアデノウイルスが好ましい。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスをベースとする。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９または５０をベースとする。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６および３５の内の１つのヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点は、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよび（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に記載されている。Ａｄ２６のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７、２７０、８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレットおよび（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に記載されている。Ａｄ３５のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿００００１９、および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６中に見出される。
【００３９】
シミアンアデノウイルスもまた、一般に、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価を有し、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用した相当量の研究が報告されている（例えば、米国特許第６，０８３，７１６号明細書；ならびに国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１０／０８６１８９号パンフレット；および国際公開第２０１００８５９８４号パンフレット；（Ｂａｎｇａｒｉ  ＆  Ｍｉｔｔａｌ，２００６；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌａｓａｒｏ  ＆  Ｅｒｔｌ，２００９；Ｔａｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、シミアンサルアデノウイルス、例えば、チンパンジーアデノウイルスをベースとする。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０またはＳＡ７Ｐ型をベースとする。アカゲザルアデノウイルスベクターもまた、有用な候補ベクターとして記載されている（例えば、（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）；国際公開第２０１４／０７８６８８号パンフレット）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスはアカゲザルアデノウイルス、例えば、非限定的な例であるＲｈＡｄ５１、ＲｈＡｄ５２もしくはＲｈＡｄ５３（またはｓＡｄ４２８７、ｓＡｄ４３１０ＡもしくはｓＡｄ４３１２；例えば、（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）および国際公開第２０１４／０７８６８８号パンフレットを参照）の内の１つに基づく。
【００４０】
当業者であれば、アデノウイルスに加えて、他のウイルスもまた、本発明の双方向性プロモーターを使用するウイルスベクターとしての使用に好適であることを認識するであろう。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルスおよびレンチウイルスもまた、本発明の双方向性プロモーターを含むように設計することができる。例えば、（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ  ＆  Ｗｅｇｅｒ，２０１０；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，１９９８；Ｗａｌｔｈｅｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎ，２０００）で論じられているような異なるベクターについての総説を参照されたい。
【００４１】
上記のヒトおよび非ヒトアデノウイルスの大多数の配列は知られており、その他については日常的な手順を用いて得られ得る。
【００４２】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
【００４３】
特定の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例えば、これはこのアデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。「Ｅ１領域における欠失」は、野生型アデノウイルスと比較したときのこの領域における欠失を意味し、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５ＫまたはＥ１Ｂ  ２１Ｋコード領域の内の少なくとも１つの欠失、好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ、およびＥ１Ｂ２１Ｋコード領域の欠失を意味する。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域でコードされた機能は、好ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわちＥ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらはプロデューサー細胞内に、例えばそのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内にも欠失を有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要はない。
【００４４】
使用し得るプロデューサー細胞（時に、当該技術分野および本明細書では「パッケージング細胞」または「補完細胞」または「宿主細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖できる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１によって不死化されたヒト網膜細胞、例えば、９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１−形質転換羊膜細胞（例えば、欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１−形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ヒーラ細胞（Ｇａｏ，Ｅｎｇｄａｈｌ，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，２０００）、２９３細胞など、任意のＥ１−補完プロデューサー細胞を使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。
【００４５】
亜群ＣまたはＥアデノウイルスに由来しないＥ１欠損アデノウイルスでは、非亜群ＣまたはＥアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列をＡｄ５などのアデノウイルス亜群ＣのＥ４−ｏｒｆ６で交換することが好ましい。これにより、例えば、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞などのＡｄ５のＥ１遺伝子を発現する良く知られている相補的な細胞株における、このようなアデノウイルスの増殖が可能になる（例えば、（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照。これらはその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４６】
代替の実施形態では、アデノウイルスベクターに（例えば、Ａｄ５の）異種Ｅ４ｏｒｆ６領域を入れる必要はないが、その代わりに、Ｅ１欠損非サブグループＣまたはＥベクターを、例えば、Ａｄ５からのＥ１とＥ４ｏｒｆ６の双方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株などのＥ１および適合性Ｅ４ｏｒｆ６の双方を発現する細胞株において増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載している（Ｂｒｏｕｇｈ，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ｈｓｕ，Ｋｕｌｅｓａ，＆  Ｋｏｖｅｓｄｉ，１９９６）；そのような細胞株を使用したＥ１欠失非亜群Ｃアデノウイルスベクターの生成についてそれぞれ記載している（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を参照）。
【００４７】
あるいは、増殖させる血清型由来のＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照）。
【００４８】
Ｅ１領域に欠失を有するＡｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスでは、例えば、ｐＩＸ開始コドンのすぐ上流の２４３ｂｐ断片（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端で標識される）などの、ｐＩＸオープンリーディングフレームのすぐ上流の１６６ｂｐまたはこれを含む断片など、アデノウイルスのＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端を保持することが好ましいが、これはｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に部分的に存在することから、アデノウイルスの安定性を高めるためである（例えば、（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；国際公開第２００４／００１０３２号パンフレットを参照。これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
本発明のベクターまたは（アデノ）ウイルスにおける「異種核酸」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、ベクターまたは（アデノ）ウイルスに天然には存在しない核酸である。それは、例えば、標準的な分子生物学的手法によりベクターまたは（アデノ）ウイルス中に導入される。それは、特定の実施形態では、目的タンパク質またはその一部をコードし得る。それは、例えば、アデノウイルスベクターのＥ１またはＥ３欠失領域にクローン化され得る。本発明の好ましい実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーター制御下に２つの導入遺伝子を有する発現カセットが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで行われ得る。導入遺伝子の発現のために多数のプロモーターを使用することができ、それらは当業者に知られている。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター領域」または「プロモーターエレメント」という用語は、同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を制御する核酸配列断片（典型的にはＤＮＡであるがこれに限定されるものではない）を指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および、転写開始に十分な特異的配列を含む。さらに、プロモーター領域は、任意選択的に、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列を含み得る。これらの配列は、シス作用性であっても、トランス作用因子応答性であってもよい。さらに、プロモーターは、調節の性質に応じて、構成的であっても調節的であってもよい。
【００５１】
当業者はプロモーターが核酸配列のストレッチから構築され、しばしば、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ＴＡＴＡボックスなどの一般的転写因子結合部位、特異的転写因子結合部位などのエレメントまたは機能単位を核酸配列のストレッチ中に含むことは認識しているであろう。エンハンサー、時にはプロモーター配列の末端のイントロンなどのさらなる調節配列もまた存在し得る。以下、このような機能単位を「構築ブロック」と称し、これらは核酸のストレッチ中で組み合わされて、機能的プロモーター配列を構築し得る。構築ブロックは互いに直接隣接し得るが、プロモーター機能において直接的な役割を持たない核酸のストレッチによって分離されていてもよい。当業者は、核酸ストレッチ中のヌクレオチドがプロモーター機能に関係しているか否かを試験する方法、および標準的な分子生物学的方法によって、例えば、プロモーター活性を保持しながらその長さを最小化するために、または活性を最適化するために、構築ブロックおよび／またはヌクレオチドを所与のプロモーター配列から除去または付加する方法を知っている。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「エンハンサー」または「エンハンサー構築ブロック」は、遺伝子またはいくつかの遺伝子の転写を刺激または増強するためにタンパク質（アクチベータータンパク質）によって結合され得る、調節ＤＮＡ配列（例えば、５０〜１５００ｂｐ）を指す。これらのアクチベータータンパク質（別名、転写因子）はメディエータ複合体と相互作用し、ポリメラーゼＩＩおよび基本転写因子を動員し、次に遺伝子の転写を開始する。エンハンサーは一般にシス作用性であるが、それらが調節する遺伝子（群）の開始部位の上流または下流に位置し得る。さらに、エンハンサーは前方向または後方向であり得、そして転写に影響を及ぼすために転写開始部位の近くに位置する必要はなく、いくつかは開始部位の数十万塩基対上流または下流に位置することが見出されている。エンハンサーはまた、イントロン内に見出すことができる。
【００５３】
用語「双方向性プロモーター」は、プロモーターエレメントの他にエンハンサーエレメントおよびイントロンエレメントを含み得、そして本明細書中に記載される構築ブロックによって定義される連続遺伝子調節配列をいう。これらの双方向性プロモーターは、双方向性プロモーター配列の両側に配置された導入遺伝子の発現を制御する双方向様式で遺伝子発現を指向する。例えば、本発明の双方向性プロモーターは、２つの異なる導入遺伝子の転写を双方向様式で指向し、そして一方の側に第１のプロモーター構築ブロックが隣接し、他方の側に第２のプロモーター構築ブロックが隣接したエンハンサー構築ブロックを含み、イントロン構築ブロックが、双方向性プロモーターの各末端に、プロモーター構築ブロックに隣接して、つまり、イントロンが各プロモーターの下流で、各導入遺伝子の上流にあるように位置する。隣接するとは、構築ブロック間にいくつかの追加ヌクレオチドが存在し得るため、必ずしも直接接することを意味しないが、双方向性プロモーターがコンパクトなサイズを維持するように、あまり多くの追加配列が付加されないことが好ましいことに留意されたい。また、用語「上流」および「下流」が、当該技術分野で一般に使用されている転写の方向に関するものであることにも留意されたい。例えば、慣例により、上流および下流という用語は、ＲＮＡ転写が起こる５’から３’の方向に関する。上流はＲＮＡ分子の５’末端方向であり、下流は３’末端方向である。二本鎖ＤＮＡを考えると、上流は問題となっている遺伝子のコード鎖の５’末端方向であり、下流は３’末端方向である。ＤＮＡの逆平行性により、これは、鋳型鎖の３’末端が遺伝子の上流にあり、５’末端が下流にあることを意味する。例えば、図１Ｄを参照されたい。図１Ｄは、第１のプロモーター構築ブロックとしてのサイトメガロウイルス主要最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）と、第２のプロモーター構築ブロックとしてのニワトリベータアクチンプロモーターに隣接されたエンハンサー構築ブロックとしてのサイトメガロウイルス主要最初期エンハンサー（ｈＣＭＶエンハンサー）を、ハイブリッドニワトリベータアクチン／（ニワトリベータアクチンプロモーターの下流に隣接した第１のイントロン構築ブロックとしての）ウサギベータグロビンイントロン（ニワトリベータアクチンプロモーターおよびハイブリッドイントロンをまとめて「ＣＡＧ」プロモーター部分と呼ぶ）、および、ｈＣＭＶプロモーター構築ブロックの下流に隣接した第２のイントロン構築ブロックとしてのヒトアポリポタンパク質Ａ−１イントロン（ｈＡｐｏＡ１イントロン）とともに含む、好ましい双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを示す。本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは２つの導入遺伝子に作動可能に連結されており、第１の導入遺伝子はｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに作動可能に連結され、第２の導入遺伝子はＣＡＧプロモーターに作動可能に連結され、第１および第２の導入遺伝子はそれぞれ、それぞれのプロモーターおよびイントロン対の下流に位置し、そして第１および第２の導入遺伝子はｈＣＭＶエンハンサーから外向きの方向に転写される。
【００５４】
本発明の好ましい双方向性プロモーターは、図３Ｂに示すような異なるエレメントの配列位置を持つ、配列番号４を含む双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターであるが、当業者は、異なる構築ブロックの配列および介在配列の長さまたは同一性が、実質的に同様の結果が得られる程度まで変化し得ることは認識していよう。例えば、（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、ＣＡＧプロモーターの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中のイントロンは、より大きなインサートを収容するためにトランケートすることができ、このトランケートされたイントロンを有するＣＡＧプロモーターが発現を増加させたことを示した。ハイブリッドニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンイントロンのトランケート型を、ここでは双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターにおいて使用した。また、（Ｑｕｉｌｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）は、ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡにおける欠失が発現を増強することを示した。したがって、当業者であれば、実質的に同様の結果が得られるように、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのイントロン配列および／または介在配列を微調整することができよう。同様に、異なるエンハンサーを置換について試験し、かつ／または実質的に同様の発現が得られ得るようにエンハンサー配列を微調整することができよう。同様に、ｈＡｐｏＡ１イントロンを他のイントロンによって置換することができ、双方向性プロモーターが依然として活性であると予想される。本明細書中に示すエンハンサーおよびイントロンは好ましいものであり、好適なサイズであり、バランスのとれた発現を生じ、アデノウイルスベクター環境において安定なコンストラクトを生じる。本発明の双方向性プロモーターの構築ブロックそれ自体は個々に既知であり得るが、一連の発明の中で組み合わされたことも、組み合わされることを示唆されたこともない。組み合わされることで、強力でバランスのとれた双方向性プロモーターがもたらされる。本明細書中に示すように、この組み合わせが、驚くべきことに、強力な一方向性ｈＣＭＶプロモーターと比較して、それぞれが同様の程度まで、２つの作動可能に連結された導入遺伝子の転写を可能とし、同時に、アデノウイルスベクターの複雑な環境において、関連した導入遺伝子を有する双方向性プロモーターの安定した配置の維持を可能にすることが見出された。本明細書中に提示したデータは、いくつかの他の同様に設計された双方向性プロモーターが強力なプロモーター活性を欠き、かつ／または不均衡な発現をもたらし、それにより、双方向性プロモーターの一方に作動可能に連結された導入遺伝子の発現が、そのような双方向性プロモーターの他方に作動可能に連結された導入遺伝子と比較して有意に強く（例えば、少なくとも５倍の差）発現されるという点で、既知の同様の構築ブロックに基づいてこのような双方向性プロモーターを作製することが予測不可能であることを示す。両側からの類似の発現レベル（例えば、両側からの発現の差が２倍未満）およびアデノウイルスベクターの環境における安定性の要件を満たすプロモーターが達成可能であるか否かさえも、先験的に予測不可能であった。本発明は、驚くべきことに、���れらの要件を満たす双方向性プロモーターを提供する。
【００５５】
さらなる調節配列もまた、本発明の双方向性プロモーターを含むコンストラクトに付加し得る。「調節配列」という用語は、本明細書中で「調節要素」と同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を調節し、したがって転写調節因子の働きをする核酸断片（典型的にはＤＮＡであるがこれに限定されるものではない）を指す。調節配列はしばしば、転写タンパク質および／または転写因子の核酸結合ドメインによって認識される転写結合ドメインである核酸配列、エンハンサーまたはリプレッサーなどを含む。例えば、調節配列は、テトラサイクリンオペロンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で発現が阻害されるように、１つ以上のテトラサイクリンオペロンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得る。テトラサイクリンの不在下で、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合し、ｔｅｔＯ部位に作動可能に連結される遺伝子の転写を抑制することができる。しかし、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔＲタンパク質の立体構造が変化し、それによりオペレーター配列への結合が妨げられ、作動可能に連結された遺伝子の転写を生じさせる。特定の実施形態では、本発明のｒＡｄは、ｔｅｔＲタンパク質が発現するプロデューサー細胞株で産生されるベクター中で１つ以上の導入遺伝子の発現が阻害されるように、任意選択的に、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターと作動可能に連結されたｔｅｔＯを含み得る。その後、ｔｅｔＲタンパク質を発現しない対象または細胞にベクターが導入されると、発現は阻害されない（例えば、国際公開第０７／０７３５１３号パンフレットを参照されたい）。特定の他の実施形態では、本発明のベクターは、任意選択的に、クマート遺伝子スイッチ系を含み得る。そこでは、発現の調節が、プロモーター下流に配置されたオペレーター部位（ＣｕＯ）へリプレッサー（ＣｙｍＲ）が結合することによって媒介される（例えば、（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を参照）。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「リプレッサー」は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の生成に対して阻害し、干渉し、遅延させ、かつ／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質または他の分子）を指す。例えば、発現カセット内などの発現ベクターに沿う適切な位置での結合部位との干渉によるものである。リプレッサーの例としては、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、ラムダリプレッサー、および当該技術分野で知られている他の適切なリプレッサーが挙げられる。
【００５７】
さらに、本発明のベクター、ウイルスまたはアデノウイルスは、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含み、この双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのｈＣＭＶ部分およびＣＡＧ部分の転写方向（５’から３’）は互いから離れる方向に向かい、また、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターは、第１の導入遺伝子と一方向で作動可能に連結され、第２の導入遺伝子とその逆方向で作動可能に連結されている。したがって、双方向性プロモーターは、ベクターまたは（アデノ）ウイルスゲノムの第１の末端に向けて第１の導入遺伝子の発現を駆動し、ベクターまたは（アデノ）ウイルスゲノムのもう一方の末端に向けて第２の導入遺伝子の発現を駆動する。当業者であれば、提示された配列を変異させることができ、また、日常的な方法によってプロモーター活性を試験し得ることは認識していよう。一般的に、示されたプロモーター配列（エンハンサーおよびイントロン配列を含まない）と少なくとも９０％の同一性を有する配列は依然として機能的活性を有し、したがって、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターと考えられる。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、好ましくは、示されたプロモーター配列（エンハンサーおよびイントロン配列以外）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、好ましくは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。特定の好ましい実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、図１Ｄに示すような構築ブロックを含み、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、第１のプロモーター構築ブロックとしてのｈＣＭＶプロモーターと、第２のプロモーター構築ブロックとしてのニワトリベータアクチンプロモーターに隣接されたエンハンサー構築ブロックとしてのｈＣＭＶエンハンサーを、ハイブリッドニワトリベータアクチン／（ニワトリベータアクチンプロモーターに隣接した第１のイントロン構築ブロックとしての）ウサギベータグロビンイントロン、および、ｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに隣接した第２のイントロン構築ブロックとしてのｈＡｐｏＡ１イントロンとともに含む。特定の好ましい実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、図３に示すような異なるエレメントの配列位置を持つ、配列番号４に対して１００％の同一性を有するが、当業者は、異なる構築ブロックの配列および介在配列の長さがある程度まで変わり得、また、エンハンサーエレメントおよびイントロンエレメントの同一性も実質的に同様の結果が得られる程度まで変化し得ることは認識していよう。
【００５８】
「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」、または「作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された」という用語は、本明細書では同義的に使用され、核酸配列と、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終結部位、ならびに他のシグナル配列などのヌクレオチド制御配列との機能的関係を指し、２つ以上のＤＮＡ断片がそれらの意図した目的のために協力して機能するように結合することを意味する。例えば、典型的にはＤＮＡである核酸配列と、調節配列またはプロモーター領域との作動可能な連結は、ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、それを転写するＲＮＡポリメラーゼによって、そのようなＤＮＡの転写が調節配列またはプロモーターから開始されるような、ＤＮＡと調節配列またはプロモーターとの間の物理的かつ機能的な関係を指す。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、それが発現される細胞型における核酸またはＤＮＡの発現のための調節配列の改変が必要なこともある。そのような改変の望ましさまたは必要性は、経験的に判定され得る。
【００５９】
導入遺伝子の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのいずれかの部分で制御される発現は、強力に発現される。本明細書中で使用される場合、「強力に発現される」または「強力な発現」は、例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、または発光もしくは蛍光を使用する他のアッセイなどの異なるタンパク質検出手法によって測定される、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのいずれかの部分からの発現は、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一の導入遺伝子を発現する一価のベクターからの発現に匹敵するか、またはそれよりもさらに良好であることを意味する。ｈＣＭＶプロモーターはヒトサイトメガロウイルスの主要最初期（ｍＩＥ）領域に由来し、ワクチンおよび遺伝子治療ベクターにおける強力な一方向性遺伝子発現のために頻繁に使用される。例えば、ｈＣＭＶプロモーター配列は、ｈＣＭＶ  ＡＤ１６９株ｍＩＥ遺伝子座（Ｘ０３９２２）に由来し得、そしてＮＦ１結合部位、エンハンサー領域、ＴＡＴＡボックス、および第１のエキソンの一部を含み得る。より短い（例えば、エンハンサーおよびプロモーター領域のみを含み、ＮＦ１結合部位を欠く）またはより長い（例えば、さらなる細胞因子結合部位および第１のイントロン配列を含む）他のｈＣＭＶプロモーター配列が知られている。長さが異なるこれらのｈＣＭＶプロモーターは全て、強力な遍在的に活性なプロモーターであることがわかった。本明細書に記載の発現レベルの比較のために、ｈＣＭＶプロモーター配列は配列番号９であった。例えば、ｒＡｄにおける本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのいずれかの部分からの発現レベルは、配列番号９のｈＣＭＶプロモーターを有する一価のｒＡｄからの発現レベルの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％であることが好ましい。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのいずれかの部分からの発現レベルは、配列番号９のｈＣＭＶプロモーターを有する一価のｒＡｄからの発現レベルの約１００％である。さらに、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一の抗原を発現するｒＡｄから、発現が、有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせるのに十分であることは知られている。そのため、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターによって発現される２つの導入遺伝子の強力な発現は、両方の導入遺伝子に対して顕著なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせると予測される。例えば、２つの導入遺伝子が、対象に投与された際に免疫応答を惹起する抗原をコードする場合、強力な発現は両抗原に対して測定可能な免疫応答を生じさせるであろう。そして、その両抗原に対する免疫応答は、好ましくは、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一の抗原を発現する、対応する一価ベクターまたはｒＡｄによって生じる免疫応答と同じであるか、またはそれよりもさらに良好であろう。
【００６０】
双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの両側の発現はバランスがとれている。本明細書中で使用される場合、「バランスのとれた発現」、「発現のバランス」、「発現バランス」、または発現に言及したときの「バランスのとれた」は、例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、または発光もしくは蛍光を使用する他のアッセイなどの異なるタンパク質発現検出手法による測定で、双方向性プロモーターの一方の側からの発現が、双方向性プロモーターの他方の側からの発現と同等であることを意味する。例えば、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの一方の側からの発現レベルは、この双方向性プロモーターの他方の側からの発現レベルの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％であることが好ましい。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの一方の側からの発現レベルは、この双方向性プロモーターの他方の側からの発現レベルの約１００％である。別の例では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの両側からの発現の比は、１／１、１．１／１、１．２／１、１．３／１、１．４／１、１．５／１、１．６／１、１．７／１、１．８／１、１．９／１、および２／１の範囲である。さらに、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一抗原を発現するｒＡｄから、発現が、有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせるのに十分であることは知られている。そのため、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターによって発現される２つの導入遺伝子のバランスのとれた発現は、両方の導入遺伝子に対して同等のＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせると予測される。例えば、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの一方の側から発現される抗原に対する免疫応答は、この双方向性プロモーターの他方の側から発現される抗原に対する免疫応答の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％であることが好ましい。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの一方の側から発現される抗原に対する免疫応答は、この双方向性プロモーターの他方の側から発現される抗原に対する免疫応答の約１００％である。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターと比較して、発現のバランスが改善されている。双方向性ｍＣＭＶプロモーターの右側（３’末端）に位置する抗原の発現は、プロモーターの左側（５’末端）に位置する抗原と比較して、約１０倍高かった（これは、国際公開第２０１６／１６６０８８号明細書に記載されていた）。
【００６１】
「コード配列」、「コードする配列」、または「コードする」という用語は、本明細書で同義的に使用され、適切な調節配列と作動可能に連結されると、インビトロまたはインビボで、転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡ）、核酸配列を指す。
【００６２】
例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）などのポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子の後方に存在してもよい。好ましくは、各導入遺伝子はポリＡシグナルを有し、好ましくは、第１の導入遺伝子のポリＡシグナルは、第２の導入遺伝子のポリＡシグナルと異なる。一実施形態では、第１のポリＡシグナルはＳＶ４０ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナルはウシ成長ホルモンポリＡシグナルである。
【００６３】
イントロンを含む配列は、本発明の双方向性プロモーターの両末端に存在する。これらのイントロンは同じであってもよいが、異なっていることが好ましい。本明細書で使用される場合、イントロンは、当該技術分野で知られている正常な機能と構造を有し、タンパク質合成の情報をコードせず、スプライシングとして知られているプロセスによって、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される核酸中のポリヌクレオチド配列である。イントロンは、スプライス供与部位（イントロンの５’末端、通常ＧＵ配列）およびスプライス受容部位（イントロンの３’末端、通常ＧＡ配列）を含む。組換えアデノウイルス中に導入遺伝子のための空間がより多く残るよう、ウイルスベクターにおいてあまり多くの空間を占めないようにするために、比較的短いイントロンおよびより短いイントロンに改変されたイントロンを使用することが好ましいものの、本発明においては種々の異なるイントロンを潜在的に使用することができる。双方向性プロモーターの一方の側で第１のイントロンを、双方向性プロモーターの他方の側で第２の異なるイントロンを使用する、すなわち、各導入遺伝子の前に異なるイントロン配列が置かれることが好ましい。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロンであり得る。当業者は、多くの異なるイントロンが入手可能であり、使用され得ることを認識している。イントロンは、特にインビボでタンパク質の発現を増大させ得ることが知られている。特に好ましい実施形態では、本発明のプロモーターは、ハイブリッドニワトリベータアクチン／（ニワトリベータアクチンプロモーター構築ブロックに隣接する第１のイントロンとしての）ウサギベータグロビンイントロンを含む。一実施形態では、本発明のプロモーターは、ｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに隣接する第２のイントロンとしてｈＡｐｏＡ１イントロンを含む。特に好ましい実施形態では、本発明のプロモーターは、ハイブリッドニワトリベータアクチン／（ニワトリベータアクチンプロモーター構築ブロックに隣接する第１のイントロンとしての）ウサギベータグロビンイントロン、およびｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに隣接する第２のイントロンとしてのｈＡｐｏＡ１イントロンを含む。
【００６４】
本明細書に記載される実験で例示されるパラメータの内の１つは免疫原性であり、それはワクチン用途における抗原に関連する。しかし、バランスのとれた導入遺伝子発現レベルもまた、免疫応答が主要な目的ではない導入遺伝子、例えば、遺伝子治療目的、異種タンパク質複合体の発現、または２つの抗体鎖の比例発現に使用される２つの異なる導入遺伝子に関連し得ることは、当業者には直ちに明らかであろう。したがって、本発明は、単一組換えベクター、例えば、アデノウイルスベクターからの発現が所望される、導入遺伝子の任意の組み合わせを用いて実施され得る。そのため、導入遺伝子の同一性は本発明では重要でなく、それは任意の導入遺伝子を含むベクターまたはアデノウイルスに適している。好適な導入遺伝子は当業者によく知られており、例えば、遺伝子治療目的などで治療効果を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、またはワクチン接種目的でｒＡｄベクターが使用される場合に免疫応答が所望されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームなどの、導入遺伝子オープンリーディングフレームを含み得る。特に好ましい異種核酸は、免疫応答を生じさせる必要がある抗原決定基をコードする目的遺伝子である。このような抗原決定基もまた、通常、抗原と称される。組換えアデノウイルスが対象に投与されると、抗原に対する免疫応答が生じる。任意の所望の抗原が、アデノウイルスベクターによってコードされ得る。本発明による典型的な実施形態では、抗原は、疾患または病状を引き起こし得る生物に由来する、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。したがって、さらに好ましい実施形態では、前記目的異種核酸は、免疫原性（または抗原性）決定因子をコードする。より好ましくは、前記免疫原性決定因子は、細菌、ウイルス、酵母または寄生生物に由来する抗原である。このような生物によって引き起こされる疾患は、一般に「感染症」と称される（したがって「感染する」生物に限定されず、また宿主に侵入して疾患を引き起こすものも含む）。例えば腫瘍抗原などのいわゆる「自己抗原」もまた最新技術の一部を形成し、本発明による組換えアデノウイルス中の異種核酸によってコードされ得る。抗原決定基（または抗原）を取得する非限定的な例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などのマラリアを引き起こす生物、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの結核を引き起こす生物、酵母、またはウイルスである。他の好ましい実施形態では、フラビウイルス（例えば、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびマールブルグウイルスなどのウイルスに由来する抗原が、本発明による組成物で使用され得る。一実施形態では、前記抗原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するＣＳタンパク質またはその免疫原性部である（ＣＳをコードするアデノウイルスベクターの例については、例えば、（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｏｐｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；国際公開第２００４／０５５１８７号パンフレットを参照されたい。これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、抗原決定基は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂおよび／またはＴＢ１０．４タンパク質またはそれらの免疫原性部分などのマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する、１つの抗原のタンパク質、またはいくつかの抗原の融合タンパク質である（このようなＴＢワクチンウイルスの構築および製造については、例えば、国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレットを参照されたい。これは参照により本明細書に援用される）。さらに別の実施形態では、前記抗原決定基は、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスなどのフィロウイルス由来のＧＰなどのウイルス糖タンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。またさらなる実施形態では、前記免疫原性決定因子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、またはそれらの変異体などのＨＩＶタンパク質に由来する（アデノウイルスベースのＨＩＶワクチンの例については、例えば、国際公開第２００９／０２６１８３号パンフレット、国際公開第２０１０／０９６５６１号パンフレット、国際公開第２００６／１２００３４号パンフレット、国際公開第０２／２２０８０号パンフレット、国際公開第０１／０２６０７号パンフレットを参照されたい）。他の実施形態では、前記抗原決定基は、インフルエンザウイルスに由来する、ＨＡ、ＮＡ、ＭもしくはＮＰタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性部分である（例えば、（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）；（Ｖｅｍｕｌａ  ＆  Ｍｉｔｔａｌ，２０１０）による総説）。他の実施形態では、抗原決定基は、麻疹ウイルスに由来する、ＨＡタンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、国際公開第２００４／０３７２９４号パンフレット）。他の実施形態では、抗原決定基は、狂犬病ウイルスグリコプロテインである（例えば、（Ｚｈｏｕ，Ｃｕｎ，Ｌｉ，Ｘｉａｎｇ，＆  Ｅｒｔｌ，２００６））。さらなる実施形態では、抗原は、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば、国際公開第２０１３／１３９９１１号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１３９９１６号パンフレットを参照）もしくはＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその双方、あるいはその他のＲＳＶタンパク質など、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する。他の実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルスまたは他のウイルスなどの別のウイルス由来である。組換えアデノウイルスは、同じ生物由来の２つの異なる抗原をコードし得る。組換えアデノウイルスはまた、異なる生物に由来する抗原の組み合わせ、例えば、第１の生物に由来する第１の抗原と第２の生物に由来する第２の抗原などをコードしてもよい。例えば、抗原と、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えばＴＬＲ３アゴニスト、例えばｄｓＲＮＡまたはその模倣剤など、抗原と、例えばアジュバントを同一アデノウイルス中にコードすることもまた可能である（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレット）。特定の実施形態では、組換えベクター、例えば組換えアデノウイルスは、それぞれ双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの制御下にある２つの異なる抗原をコードする。他の実施形態では、ベクターまたは組換え（アデノ）ウイルスは、それぞれ双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの制御下にある抗原と免疫モジュレーターとをコードする。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの制御下にある第１および第２の導入遺伝子以外に、さらなる異種配列または導入遺伝子が、ベクターまたは組換え（アデノ）ウイルス中に存在し得る。
【００６５】
本発明はまた、標的細胞に感染すると、それぞれが強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含む、遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法であって、第１の導入遺伝子と一方向で、第２の導入遺伝子とその逆方向で作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、前記コンストラクトを組換えアデノウイルスのゲノムに組み込む工程とを含む方法を提供する。コンストラクトそれ自体の調製は、当業者に知られ、組換えアデノウイルス技術の分野において日常的に行われており、本明細書中に例示される、標準的な分子クローニング方法の使用を包含する（例えば、（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｅｍｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９８７；ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５を参照）。双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは上記のような特徴を有し、日常的な方法によって得ることができる。便宜のため、当業者は、例えば、プラスミド形態の導入遺伝子の容易な操作と導入のために、Ｅ１領域までのゲノムの左部分のための第１の部分、および第１の部分との再結合時に完全なアデノウイルスゲノムをもたらすゲノムの残部のためのより大きな第２の部分など、より小型の断片にクローニングすることで、アデノウイルスゲノムを操作してもよい（例えば、国際公開第９９／５５１３２号パンフレットを参照）。
【００６６】
本発明のｒＡｄは、先行技術で示された２つの導入遺伝子を発現するための種々の代替方法によって調製されるアデノウイルスとは異なり、２つの導入遺伝子を発現することができ、かつ遺伝的に安定であり、さらに、双方向性プロモーターによって駆動される２つの導入遺伝子のバランスのとれた発現も提供するという利点を有する。したがって、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、２つの導入遺伝子を発現するアデノウイルスの遺伝的不安定性の問題、および２つの導入遺伝子の不均衡な発現の問題を解決する。
【００６７】
遺伝的安定性を試験するために、適切な細胞株、例えば、ヘルパー細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）において、ｒＡｄをレスキューし、継代する。ウイルスＤＮＡを特定の継代数で単離し、ｒＡｄゲノムの完全性を以下の１つ以上によって分析し得る：導入遺伝子領域の存在、または欠失バンドが存在しないことに関するＰＣＲ分析、制限断片における差異の有無に関するｒＡｄゲノムの制限消化、および／またはｒＡｄ配列における変異の有無に関するｒＡｄゲノムまたはｒＡｄゲノムのＰＣＲ産物の配列決定。本発明のｒＡｄに関して、「遺伝的に安定な」とは、ヌクレオチド配列が、ｒＡｄの作製のために使用されるプラスミドから、その後のｒＡｄ生産段階まで変化せず、その結果、２つの導入遺伝子を発現するｒＡｄが、大規模バッチ生産に適するように、（例えば、ｈＣＭＶプロモーター後方に）単一導入遺伝子を有する同等のｒＡｄと同じ遺伝的安定性を有することを意味する。例えば、発現カセット側方のプライマーを使用したＰＣＲ分析が、ｒＡｄまたは出発原料のより初期の継代数と比較して欠失断片（バンド）を示さず、かつ／またはＥ１、Ｅ３、およびＥ４領域のＰＣＲ産物の配列決定が、ヌクレオチド配列に変化がないことを裏付ける。双方向性プロモーターを有する発現カセットを含む領域を配列決定することにより、発現カセットを含む領域においてヌクレオチド配列に変化がないことを確認することが好ましい。
【００６８】
単一製造ウイルスバッチの試験消化などの他の試験法と比較して、この試験では遺伝的安定性が完全に評価される。アッセイ感度は、以下の手段、すなわち、いくつかのウイルス集団（プラーク）を単離し、拡張継代に供することによって増大する。拡張継代を発現カセット側方のプライマーを用いたＰＣＲ分析と組み合わせることにより、他の方法では見過ごされるおそれのある、ｒＡｄ集団中の少ない割合の欠失変異体の検出が可能になる。さらに、配列解析の実施により、導入遺伝子のオープンリーディングフレーム中の停止コドンの導入などの点変異の発生が排除される。より具体的には、ウイルス変異は常に偶発事象を呈するので、１つのプラークが安定であっても、別のものは欠失バンドを提示することがある。したがって、遺伝的安定性を正しく評価するために、いくつかのウイルス集団（プラーク）を試験する必要がある。ベクターが親ベクターよりも効率的に複製できる変異が生じた場合、これは変異体バージョンの増生をもたらし得るが、これは本研究で説明されているように拡張継代後にのみ観察されることが多い。本発明のｒＡｄは、ウイルスが大規模生産活動中に十分に安定しているように、用いられる試験系において、少なくとも１０継代まで遺伝的に安定していることが好ましく、少なくとも１３継代まで遺伝的に安定していることがより一層好ましい。最近、双方向ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある２つの導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスが遺伝的に安定であることがわかった。例えば、国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレットを参照されたい。本出願は、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの制御下にある２つの導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスが遺伝的にも安定であり、さらに、２つの導入遺伝子が双方向ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある状況と比較して、２つの導入遺伝子のよりバランスのとれた発現を有することを示す。
【００６９】
本発明の方法により作製される組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスについて上で記載した実施形態にしたがって調製することができる。
【００７０】
本発明はまた、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法であって、本発明によるベクターまたは組換えウイルス、例えば、組換えアデノウイルスを細胞に提供する工程を含む方法を提供する。組換えアデノウイルスを細胞に提供する工程は、アデノウイルスを対象へ投与することによって、またはインビトロもしくはエクスビボでアデノウイルスを細胞へ導入（例えば、感染）することによって行われ得る。特定の実施形態では、本発明は、例えば、組換えアデノウイルスを対象に投与することによる、細胞内での少なくとも２つの導入遺伝子の発現において使用するための組換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００７１】
本発明はまた、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明によるベクター、例えば、組換え（アデノ）ベクターを対象に投与する工程を含む方法を提供する。本発明はまた、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答の誘導において使用するための、本発明によるベクターまたは組換え（アデノ）ベクターを提供する。
【００７２】
本発明はまた、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターまたは本発明の組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。当業者は、これが、一緒になって本発明の単一組換えＤＮＡ分子を形成し得る、少なくとも２つの異なる組換えＤＮＡ分子の組み合わせであってもよいことを認識するであろう。そのような分子は、ゲノムを操作し、新規の組換えアデノウイルスを作製する上で有用である。ゲノムは、許容細胞におけるアデノウイルス複製およびパッケージングに必要なタンパク質をコードする。
【００７３】
本開示に使用される数値に関する用語「約」は、値±１０％を意味する。
【００７４】
プロデューサー細胞は培養されて、細胞およびウイルスの数、ならびに／またはウイルス力価を増大させる。細胞の培養は、本発明による目的ウイルスの代謝、および／または成長、および／または分裂、および／または生成を可能にするために行われる。これは、当業者によく知られた方法によって行うことができ、例えば、適切な培地中で細胞に栄養素を提供することが挙げられるが、これに限定されるものではない。好適な培地は当業者によく知られており、一般に、商業的供給源から大量に得られ、または標準的なプロトコルにしたがってカスタムメイドすることができる。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養するための好適な条件は知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９を参照）。
【００７５】
通常、アデノウイルスは、培養物中の適切なプロデューサー細胞に暴露され、ウイルスが取り込まれる。通常、最適な撹拌は、約５０〜３００ｒｐｍ、典型的には、約１００〜２００、例えば、約１５０であり、ＤＯは、典型的には、２０〜６０％、例えば、４０％であり、最適ｐＨは、６．７〜７．７であり、最適温度は、３０〜３９℃、例えば、３４〜３７℃であり、最適ＭＯＩは、５〜１０００、例えば、約５０〜３００である。通常、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自然に感染し、細胞を感染させるには、プロデューサー細胞をｒＡｄ粒子と接触させれば十分である。一般に、アデノウイルスのシードストックを培養液に加えて感染を開始させ、その後、アデノウイルスはプロデューサー細胞内で増殖する。これらは全て当業者には日常的である。
【００７６】
アデノウイルスの感染後、ウイルスは細胞内で複製し、それにより増幅される。このプロセスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称される。アデノウイルス感染は最終的には、感染した細胞の溶解をもたらす。したがって、アデノウイルスの溶解特性はウイルス産生の２つの異なるモードを可能にする。第１のモードは、細胞溶解に先立ってウイルスを回収し、外部因子を使用して細胞を溶解するものである。第２のモードは、生成されたウイルスによって（殆ど）完全に細胞が溶解した後に、ウイルス上清を回収するものである（例えば、宿主細胞を溶解せず、外部因子によってアデノウイルスを回収することを記載している米国特許第６，４８５，９５８号明細書を参照）。外部因子を使用して細胞を能動的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
【００７７】
能動的な細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に知られており、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８−３５で論じられている。これに関する有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張および／または低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせなどである。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１種の洗浄剤を使用して溶解する。洗浄剤の使用による溶解は、方法が容易であり、かつ容易に拡大可能であるという利点を有する。
【００７８】
使用できる洗浄剤、およびその使用方法は、当業者に一般に知られている。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ２９−３３で論じられている。洗浄剤としては、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性および非イオン性洗浄剤を挙げることができる。洗浄剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変えることができる。一実施形態では、使用する洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００７９】
ヌクレアーゼを使用して、汚染核酸、すなわち、殆どがプロデューサー細胞由来の核酸を除去することができる。本発明での使用に好適なヌクレアーゼの例としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、または当該技術分野で一般に使用されている任意の他のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、これは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することによって核酸を迅速に加水分解し、それにより細胞溶解産物の粘度を低下させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから商業的に入手し得る（コードＷ２１４９５０）。ヌクレアーゼの使用濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲である。ヌクレアーゼ処理に代えて、またはヌクレアーゼ処理に加えて、臭化ドミフェンなどの選択的沈殿剤を使用して、アデノウイルス精製中に、宿主細胞ＤＮＡをアデノウイルス調製物から選択的に沈殿させることもまた可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；（Ｇｏｅｒｋｅ，Ｔｏ，Ｌｅｅ，Ｓａｇａｒ，＆  Ｋｏｎｚ，２００５）；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照）。
【００８０】
プロデューサー細胞の培養物からアデノウイルスを回収する方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範に記載されている。
【００８１】
特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスは、さらに精製される。アデノウイルスの精製は、例えば国際公開第０５／０８０５５６号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーションまたはクロマトグラフィを用いた分離を含む数工程で行うことができる。清澄化は、ろ過工程により行うことができ、細胞溶解物から細胞残屑および他の不純物を除去する。限外ろ過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用するダイアフィルトレーション、または緩衝液交換は、塩、糖などの除去および交換のための一方法である。当業者は、各精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。また、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも、アデノウイルスベクターの生成および精製方法が記載されている。これらの方法は、宿主細胞を成長させ、この宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、この宿主細胞を回収および溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、この溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフィを用いてウイルスをさらに精製することを含む。
【００８２】
好ましくは、精製に、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１−７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィ工程が使用される。アデノウイルスのさらなる精製に関して、クロマトグラフィ工程を含む多数のプロセスが報告されている。当業者は、これらのプロセスを知っており、プロセスを最適化するために、クロマトグラフ工程の厳密な使用法を変更することができる。例えば、アニオン交換クロマトグラフィ工程によってアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットを参照されたい。多数の他のアデノウイルス精製方法が報告されており、これらは当業者の手の届く範囲にある。アデノウイルスを製造し精製するさらなる方法、例えば、国際公開第００／３２７５４号パンフレット、国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット、国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレット、ならびに米国特許第５，８３７，５２０号明細書および同第６，２６１，８２３号明細書に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ヒトに投与するために、本発明は、ベクターまたは組換えウイルス、例えばｒＡｄと、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を用いることができる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない、または有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。精製されたｒＡｄは、好ましくは滅菌溶液として処方されて投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ｒＡｄは、通常、好適な緩衝液を含む溶液中にあり、ｒＡｄの溶液はまた塩を含有し得る。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれ得る。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ｒＡｄは注射用製剤に製剤化してもよい。これらの製剤は有効量のｒＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンであり、任意選択により安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエアロゾル化し得る（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照）。
【００８４】
例えば、アデノウイルスは、アデノウイルス世界標準にも使用されている緩衝液（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）：２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール中に保存することができる。ヒトへの投与に好適な他の有用な調合緩衝液は、２０ｍＭ  トリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖスクロース、０．０２％ｗ／ｖ  ポリソルベート８０である。組換えアデノウイルスに好適な別の調合緩衝液は、１０〜２５ｍＭ  クエン酸緩衝液  ｐＨ５．９〜６．２、４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート−８０、および任意選択的に０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールを含む。明らかに、他の多くの緩衝液を使用することができ、例えば、欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、および国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見出されるものをはじめとする、精製（アデノ）ウイルス製剤の保存および医薬品投与に好適ないくつかの配合例が知られている。
【００８５】
特定の実施形態では、アデノウイルスを含む組成物は、さらに１種以上のアジュバントを含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増大させるアジュバントは、当該技術分野で知られており、アデノウイルスおよび好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば、国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質と定義される。この場合、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターの免疫応答を増強させるために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルションをはじめとする油エマルション組成物（または水中油型組成物）（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；例えば、ＱＳ２１および免疫賦活性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；および国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物、その例としてモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボース化細菌毒素またはそれらの変異体（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなど）などが挙げられる。例えば、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの目的抗原への融合物をコードする異種核酸（Ｏｇｕｎ，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｈｏｌｄｅｒ，＆  Ｈｉｌｌ，２００８）、またはｄｓＲＮＡなどのＴＬＲ３アゴニストなどのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをコードする異種核酸（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照）などを使用して、ベクターでコードされたアジュバントを使用することも可能である。本発明によるこのようなｒＡｄは、例えば、双方向性プロモーターの一方の側の目的抗原と、双方向性プロモーターの他方の側のＴＬＲ３アゴニストとをコードしてもよい。このようなｒＡｄは、特に、例えば、経口投与などの粘膜経路を介した投与に適している（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量となる濃度で、アジュバントとして含む。
【００８６】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００８７】
本発明による医薬組成物は、特定の実施形態では、ワクチンであり得る。
【００８８】
アデノウイルス組成物は、対象、例えばヒト対象に投与し得る。１回の投与で対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、熟練者に知られているように様々であり得るが、一般に１×１０７ウイルス粒子（ＶＰ）〜１×１０１２ＶＰ、好ましくは１×１０８ＶＰ〜１×１０１１ＶＰ、例えば３×１０８〜５×１０１０ＶＰ、例えば１０９〜３×１０１０ＶＰである。
【００８９】
アデノウイルス組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて行うことができる。非限定的実施形態としては、例えば、皮内や筋肉内などの注射、または皮下もしくは経皮、または例えば、鼻腔内や口腔などの粘膜投与などによる非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は、例えば、腕の三角筋、または大腿の外側広筋への筋肉内注射によって投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与する様々な可能性を認識している。
【００９０】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００９１】
１つ以上のアデノウイルスワクチンの１回以上の追加免疫投与を提供することもまた可能である。追加ワクチン接種を行う場合、一般に、そのような追加ワクチン接種は、組成物を対象に最初に投与（これは、こうした場合、「初回ワクチン接種」と称される）した後、１週間〜１年、好ましくは２週間〜４カ月の時点で、同じ対象に投与されるであろう。他の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質を初回ワクチン接種または追加免疫ワクチン接種として対象に投与することも可能である。
【００９２】
明細書全体にわたって、特許、公開公報、技術論文および学術論文などの各種刊行物が括弧に入れて引用されており、それぞれの完全引用は明細書の最後に見出し得る。これらの引用刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９３】
さらに詳しく説明せずとも、当業者であれば、ここまでの説明と、次の具体的な方法および実施例により、本発明を作成して使用し、かつ請求項に記載された方法を実施することができるであろう。したがって、次の実施例は、本発明のある特定の実施形態、特徴および利点を具体的に示すが、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈されるべきではない。実施例は、単に本発明を明確にするのに役立つに過ぎない。
【００９４】
方法
細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００９５】
ｐＡｄＡｐｔ３５およびｐｓｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドにおけるアデノウイルスベクターの構築
異なる双方向性プロモーターコンストラクトをｐＡｄＡｐｔ３５（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）またはｐｓｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドにクローニングした。Ｐｓｈｕｔｔｌｅ２６は、以前に記載されたｐＡｄａｐｔ２６プラスミド（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に基づいて構築された。Ａｄ２６ベクターゲノムの右側部分を含む２−Ｋｂ断片を合成し、ＣＭＶプロモーターのＳｐｅＩ部位が最初に単一ｂｐ置換の導入によって破壊されたｐＡｄＡｐｔ２６．Ｌｕｃにサブクローニングした。結果として、ｐｓｈｕｔｔｌｅ２６は、Ａｄ２６コスミドとの相同組換えによって、またはＡｄ２６完全長ゲノムプラスミドとの相同組換えによって、アデノウイルスベクターを構築するために使用され得る。
【００９６】
ｐＡｄａｐｔ３５プラスミドおよびｐｓｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドは、１つのプロモーターおよび１つのＳＶ４０由来ポリＡシグナルを有する標準的な一方向性発現カセットのみを有するので、別の導入遺伝子とＢＧＨ  ｐｏｌｙＡシグナルを配置するための制限部位を、融合ＰＣＲによって加えた。ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ−ＢＧＨポリＡ−ＥｃｏＲＩ−ルシフェラーゼ−ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｖｒＩＩを含む融合ＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位を介した分子クローニングによって正しい配向でプラスミドに挿入した。結果として、一方向性ｈＣＭＶプロモーターは、隣接制限部位ＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて双方向性プロモーター配列によって置換され得る。導入遺伝子を双方向性プロモーターの両側に、一方の側にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を使用して、他方の側にＡｖｒＩＩ、ＳａｌＩまたはＫｐｎＩを使用して配置した（図３Ａ）。ＡｖｒＩＩ、ＳａｌＩまたはＫｐｎＩの選択は、プラスミド配列における制限部位の独自性に依存した。異なる双方向性プロモーターコンストラクトを有する完全な双方向性発現カセットをｐＳｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドにクローニングし、ＳｐｅＩまたはＮｏｔＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いてｐＡｄａｐｔ３５プラスミドに移した。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）がＡＴＧ開始コドンの直前に含まれて、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）が各コード配列末端に付加された。本明細書に記載のように、組換えアデノウイルスおよびベクターは、一般に、ｒＡｄまたはｒＡｄベクターと称され、より具体的には、ｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６および関連ベクターと称される。
【００９７】
アデノウイルスの生成、感染および増殖
全てのアデノウイルスを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で、相同組換えにより生成し、以前に報告されているようにして生成した（ｒＡｄ３５では：（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；ｒＡｄ２６では：（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。簡単に記載すると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供された使用説明書にしたがってリポフェクタミンを使用して、プラスミドをコードするｒＡｄベクターでトランスフェクトした。ｒＡｄ３５ベクターをレスキューするために、ｐＡｄＡｐｔ３５プラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用し、一方、ｒＡｄ２６ベクターのために、ｐＳｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用した。十分な細胞変性効果（ＣＰＥ）に達した１日後に細胞を収集し、凍結解凍させ、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。次いで、ウイルスを、マルチウェル２４組織培養プレートの単一のウェルで培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でプラーク精製し、増幅させた。Ｔ２５組織培養フラスコを使用して培養されたＰＥＲ．Ｃ６において、さらに増幅させた。
【００９８】
発現の分析
発現の強さおよび発現バランスの効力を評価するために、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ０２５７２．１）およびホタルルシフェラーゼ（ルシフェラーゼタンパク質アクセッション番号ＡＣＨ５３１６６）をコードするレポーター遺伝子を用いてウイルスベクターを作製した。相対ｅＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびルシフェラーゼ相対発光量（ＲＬＵ）を、ＨＥＫ２９３細胞（ｐＡｄＡｐｔベクターまたはｐｓｈｕｔｔｌｅベクターによる一過性トランスフェクション）またはＡ５４９細胞（ウイルス感染）との各プロモーターおよびレポーター遺伝子の組み合わせについて記録した。ルシフェラーゼ活性は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計内において、０．１％ＤＴＴ（１Ｍ）の存在下、細胞溶解物中で測定した。ｅＧＦＰ蛍光は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）内において、トリプシン処理、遠心分離、およびＰＢＳ／１％ＦＢＳ（非ウイルス物質）またはＣｅｌｌＦｉｘ（ウイルス物質）における細胞ペレットの再懸濁により、測定した。
【００９９】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞内のアデノウイルスベクターの遺伝的安定性試験
ＰＥＲ．Ｃ６細胞内のいくつかの継代を含む生産工程における遺伝的安定性を確実にするために、ワクチンベクターの遺伝的安定性試験を実施した。組換えワクチンベクターの作製、プラーク精製、およびＴ２５形態への増殖を、上述のように行った。簡単に記載すると、組換えウイルスを、Ｅ１相補細胞株ＰＥＲ．Ｃ６において、プラスミドトランスフェクションによって作製し、プラーク精製した。マルチウェル２４（ＭＷ２４）からＴ２５フラスコへの規模拡大のために、５つのプラークを選択した。続いて、新しいＰＥＲ．Ｃ６細胞を、ウイルス継代数１３までＴ２５形態で感染させた。感染の２日後に完全細胞変性効果を与えると予定され、ｒＡｄ３５では５０、ｒＡｄ２６では９００の細胞当たりウイルス粒子比の範囲内にあることが遡及的に判定された、感染性容積を使用して、ウイルスを増殖させた。ウイルスＤＮＡを、ｐ１３材料から単離し、ＰＣＲ分析によって、完全導入遺伝子発現カセットの存在を試験した。ワクチンベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞内で、継代数１３まで増殖させた。感染の２日後に完全なＣＰＥを与える方法で増殖を行った。ｒＡｄ３５ウイルスは完全ＣＰＥの２日後に回収し、一方、ｒＡｄ２６ウイルスは完全ＣＰＥの１日後に回収した。ウイルスＤＮＡを、継代２、継代５、継代１０、および継代１３で単離し、導入遺伝子発現カセットの両側に位置するプライマーを使用したＰＣＲ分析によって、欠失が存在しないことを試験した。欠失変異体の欠如は、以下のパラメータによって定義した：ＰＣＲ産物のバンドサイズは、陽性対照（ウイルスレスキューのために使用されたプラスミドのＰＣＲ産物）に一致し、予測されたＰＣＲ産物を下回るバンドはなく（追加的なバンドが非特異的なＰＣＲ産物であることが示されない限り、それらは陽性対照にも存在するので）、承認されたアッセイ：ＰＣＲ  Ｈ２Ｏ対照においてバンドがない。遺伝的安定性をさらに確認するために、発現カセットといくつかのプラーク隣接領域のＰＣＲ産物の配列を決定した。
【０１００】
実施例１：双方向性プロモーターコンストラクトの設計
強力な双方向マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーターを、以前の研究（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレット）の、アデノウイルスベクターのＥ１領域における双方向性発現カセットからの、２つの抗原の発現に有用なプロモーターとして同定した。ｍＣＭＶ双方向性プロモーターを有するベクターは抗原を発現し、遺伝的に安定であり、コードされた抗原の両方に対する免疫応答を誘導したが、抗原発現および誘導された免疫応答は以下に説明するようにバランスがとれていなかった。双方向性プロモーターの右側に置かれた抗原の発現は、双方向性プロモーターの左側に置かれた抗原よりも高く、双方向性プロモーターの右側に置かれた抗原に対してより高い免疫応答を生じた。ｍＣＭＶの発現レベルの双方向の差は約１０倍であった。しかし、１つの抗原のみを発現する２つのベクターの混合物を置換するために、特定の用途では、両抗原の同等レベルの抗原発現を誘導する、バランスのとれた双方向性プロモーターが望ましい。
【０１０１】
強力でよりバランスのとれた双方向性プロモーターを特定するために、新しい双方向性プロモーターのパネルを設計した。アデノウイルスベクターの全体的なサイズ制限のために、抗原のための十分な空間を保持するために、２ｋＢの最大サイズを有する小さいサイズの双方向性プロモーター設計が好ましかった。さらに、アデノウイルスベクターにおける相同組換えによる欠失を防ぐために、配列同一性の広範なストレッチのない（＜１５ヌクレオチド）のない構築ブロックが好ましかった。本発明の双方向性プロモーターは、双方向性プロモーター配列の両側に配置された遺伝子の発現を制御する双方向様式で遺伝子を発現させる。これらの双方向性プロモーターは、プロモーターエレメントの他にエンハンサーエレメントおよびイントロンエレメントを含み、本明細書中に記載される構築ブロックによって定義される連続遺伝子調節配列である。合成双方向性プロモーターの設計に使用される構築ブロックは、既知の強力な一方向性プロモーター、エンハンサーおよびイントロン配列に由来する。プロモーターは、プロモーター配列の下流に配置された１つの遺伝子の発現を駆動し、通常はＴＡＴＡボックス配列および転写開始部位（ＴＳＳ）を含む。エンハンサー配列は、プロモーターからの遺伝子発現を増強することができる。イントロン配列は、インビトロ、および特にインビボでの遺伝子発現を増加させると報告されている。
【０１０２】
双方向性プロモーターコンストラクトの以下のパネルを設計し、試験した：
１．ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  Ｉ（図１Ａ、配列番号１）
２．ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩ（図１Ｂ、配列番号２）
３．ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１（図１Ｃ、配列番号３）
４．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４（図１Ｄ、配列番号４）
５．ｒＣＭＶ−ＣＡＧ（図１Ｅ、配列番号５）
６．ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２（図１Ｆ、配列番号６）
７．ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １（図１Ｇ、配列番号１０）
８．ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  ２（図１Ｈ、配列番号８）
９．ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １．１（図１Ｉ、配列番号７）
【０１０３】
以前の特許出願（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレット）中の他の双方向性プロモーターコンストラクトもまた試験した：
１．ｍＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．
２．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ
３．ｍＣＭＶ−ＣＡＧ
【０１０４】
双方向性プロモーター設計およびそれらの構築ブロックの模式図を図１に示し、以下により詳細に説明する：
【０１０５】
異なる設計で使用されるプロモーターおよびエンハンサー構築ブロックは、サイトメガロウイルス最初期（ＩＥ）領域（典型的には、本明細書中でｈＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶエンハンサーと称され、時にｈＣＭＶ  ＩＥとも称される）、ニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンプロモーター配列、およびヒト伸長因子１αプロモーター（ｈＥＦ１αプロモーター）配列に由来する。イントロンは、キメラニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビン配列、ｈＥＦ１α第１イントロンおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−１イントロン（ｈＡｐｏＡ１イントロン）に由来する。
【０１０６】
ヒトサイトメガロウイルス主要最初期プロモーターは、種々の哺乳動物細胞株における強力なプロモーターとして知られている（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。ｈＣＭＶおよび他のヘルペスウイルスは、３期、すなわち最初期（ＩＥ）、初期および後期において遺伝子を発現する。主要最初期プロモーターは、種々の哺乳動物細胞株において高レベルで異種遺伝子を活性化する。
【０１０７】
ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期プロモーターおよびエンハンサーは、導入遺伝子発現カセットの設計において最も頻繁に使用される（Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｈｉｔｔ，Ｋｕｎｓｋｅｎ，＆  Ｇｒａｈａｍ，１９９７；Ｃ．Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）が、マウス（ｍＣＭＶ）（Ａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃ．Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ラット（ｒＣＭＶ）（Ｓａｎｄｆｏｒｄ  ＆  Ｂｕｒｎｓ，１９９６；Ｖｏｉｇｔ，Ｓａｎｄｆｏｒｄ，Ｈａｙｗａｒｄ，＆  Ｂｕｒｎｓ，２００５）およびアカゲザル（ｒｈＣＭＶ）（Ｂａｒｒｙ，Ａｌｃｅｎｄｏｒ，Ｐｏｗｅｒ，Ｋｅｒｒ，＆  Ｌｕｃｉｗ，１９９６；Ｃｈａｎ，Ｃｈｉｏｕ，Ｈｕａｎｇ，＆  Ｈａｙｗａｒｄ，１９９６；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｎｓｅｎ，Ｓｔｒｅｌｏｗ，Ｆｒａｎｃｈｉ，Ａｎｄｅｒｓ，＆  Ｗｏｎｇ，２００３）などの他の種に感染するサイトメガロウイルスの主要最初初期プロモーターおよびエンハンサーもまた知られており、強力な発現カセットの設計に使用され得る。ｈＥＦ１αプロモーターもまた、哺乳動物細胞における異種遺伝子発現のための強力なプロモーター配列であると報告されている（Ｋｉｍ，Ｕｅｔｓｕｋｉ，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，＆  Ｓｕｇａｎｏ，１９９０）。
【０１０８】
ｈＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター（Ａ）およびハイブリッドニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンイントロン（Ｇ）配列からなるキメラプロモーターＣＡＧは、異種遺伝子の発現のための強力なプロモーターであると報告され、短縮することができ、抗原の発現に利用することができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらによる研究は、ハイブリッドイントロンが有意に短縮されたΔ８２９ＣＡＧプロモーターバージョンを生じるＣＡＧプロモーターの改変を報告している。このｈＣＭＶエンハンサーを含まないΔ８２９ＣＡＧプロモーターバージョン（Δ８２９ＡＧ）を、双方向性プロモーターの設計のためのビルディングブロックとして使用した（図面においては、ＡＧ部分として示すが、双方向性プロモーターの名称においてはＣＡＧと称し、本明細書全体を通してＣＡＧまたはＡＧと称する）。
【０１０９】
以下に、双方向性プロモーター配列を設計するための構築ブロックの配置を記載する：
【０１１０】
短縮されたＡＧプロモーターおよびｈＥＦ１αプロモーターは、記載された強力な調節配列の重要な部分としてイントロンを有する。ＡＧプロモーターまたはｈＥＦ１αプロモーターが双方向性プロモーター設計において使用された場合、本発明者らはまた、双方向性プロモーター設計の反対側に異種イントロン配列を配置した。ｒＣＭＶ最初期プロモーターの異なる潜在的な双方向性プロモーター設計を、マウスＣＭＶプロモーターの天然の双方向性に基づいて作製した。
【０１１１】
ｈＥＦ１α由来のイントロンおよびｍＣＭＶプロモーター配列の合成組み合わせによって、強力な調節配列が得られることは以前から報告されている。したがって、ｈＥＦ１α配列をｒＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶのようなムロメガロウイルスに由来する別のプロモーター）およびエンハンサーのエレメントと組み合わせて、双方向性プロモーター配列ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１αＩおよびｒＣＭＶ−ｈＥＦ１αＩＩを設計した（例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照）。ｈＥＦ１αイントロンは、発現レベルを増加させると報告されているが、非常に長い配列であるので、本発明者らの設計では、ＣＡＧプロモーターについての実験的方法（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によって記載されるように、ｈＥＦ１αイントロン配列を有意に短縮することを試みた。この目的のために、記載されたスプライスドナー、スプライスアクセプターおよび推定分岐点部位、さらに記載された細胞因子結合部位を保存しながら、イントロン配列の一部を除去した。プロモーター／イントロン組み合わせｈＥＦ１α  Ｉがプロモーター／イントロン組み合わせｈＥＦ１α  ＩＩよりも多くの部位を保存し、双方向性プロモーターｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩおよびｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩが得られる、２種の異なるバージョンの短縮イントロンを設計した。
【０１１２】
さらなる双方向性プロモーターの設計は、アカゲザルＣＭＶ（ｒｈＣＭＶ）、ラットＣＭＶ（ｒＣＭＶ）およびヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）を含む、異なる種に由来するサイトメガロウイルス主要最初期プロモーターのエンハンサーおよびプロモーター配列と組み合わせた、短縮されたＡＧプロモーターに基づく。これらの双方向性プロモーターはい、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４およびｒＣＭＶ−ＣＡＧと呼ばれる。ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１とｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２との間の差異は、ｒｈＣＭＶエンハンサー配列の配向である。
【０１１３】
合成双方向性プロモーター設計に加えて、ｒＣＭＶ  ｍＩＥ領域に由来する潜在的に天然の双方向性プロモーターを、双方向性プロモーター配列ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １およびｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  ２およびｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １．１のベースとして使用した。３つの双方向性プロモーターの設計は全て、ｒＣＭＶエンハンサー配列の両側に推定最小ｒＣＭＶプロモーターおよび推定最小ｒＣＭＶ  ｖＯＸ２プロモーターを有するが、設計はエンハンサー断片の長さおよびエンハンサー断片の配向が異なる。ｖＯＸ２プロモーターは、ＭＩＥ領域のすぐ右側のラット細胞ＣＤ２００（ｖＯＸ２）遺伝子の転写を駆動している（Ｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１１４】
実施例２：レポーター遺伝子の強力でバランスのとれた発現のための異なるプロモーターコンストラクトのスクリーニング
第１のスクリーニング実験において、異なる双方向性プロモーターコンストラクトからの発現を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼおよびｅＧＦＰを使用して、ＨＥＫ２９３における一過性トランスフェクションにより、定量的効力読み出しについて評価した。ｐＡｄａｐｔ３５プラスミドの一過性トランスフェクションでは、双方向性プロモーターは、左側にルシフェラーゼ導入遺伝子を、右側にｅＧＦＰ導入遺伝子を有した。
【０１１５】
異なる双方向性プロモーター設計を有するプラスミドを用いて、３つの独立したトランスフェクション実験を行った。実験１（図２Ａ）では、プロモーターｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．２、ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩ、ｒｈＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩおよびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１を試験した。ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．２、ｒＣＭＶ−ＥＦ１α  ＩＩおよびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１は、一方向制御のｈＣＭＶプロモーター（配列番号９）よりも効力は低いものの、常に双方向性プロモーター機能を示すが、ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  Ｉは、ｅＧＦＰ発現については陰性対照を上回るプロモーター効力を示さず、ルシフェラーゼ発現についてはさほど低いプロモーター効力を示すものではない。実験１において、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１は最も強力な双方向性プロモーターであるが、ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼの発現はいずれも、強力な一方向性ｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるそれぞれの陽性対照よりも低いレベルである。スクリーニング実験２（図２Ｂ）では、プロモーターｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．１．１、ｒＣＭＶ−ＣＡＧおよびｈＣＭＶ−ＣＡＧ４を試験した。ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．１．１プロモーターは両側で低〜検出不可能なプロモーター効力を示した。ｒＣＭＶ−ＣＡＧは、ｈＣＭＶ一方向性対照よりも低いが、双方向性プロモーター効力を示す。対照的に、かつ驚くべきことに、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４は、左側および右側の両方でｈＣＭＶ一方向性対照に対し同等〜より高い効力を有する、強力な双方向性プロモーターである。第３のスクリーニング実験では、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２およびｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．１をｈＣＭＶ−ＣＡＧ４とともに試験した。試験した双方向性プロモーターコンストラクトのセットから、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４が最も有望な候補として特定された。異なる一方向性プロモーター構築ブロックからなる他の合成双方向性プロモーター設計は主に良好な双方向性プロモーター機能を示したが、レポーター遺伝子の発現は一方向性ｈＣＭＶプロモーター制御によって駆動されるよりも低かった。ｒＣＭＶ最初期プロモーターを、マウスＣＭＶ双方向性プロモーターに匹敵するが、さほど強力ではない双方向性プロモーターとして設計することができる。これらの結果は、構築ブロックのいかなる組み合わせが双方向性プロモーターの良好な機能性（両方向における強力な発現、すなわち、ｈＣＭＶ一方向性プロモーターの制御下での発現に類似した発現）を提供するかを予測することは不可能であることを示している。
【０１１６】
構築ブロックの同一性および配向についての注釈を含むｈＣＭＶ−ＣＡＧ４の模式図を図３に示す。双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターの右側は、ｈＣＭＶエンハンサー部分を除き、ニワトリベータアクチンイントロンを含む、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらによって記載される短縮されたＣＡＧプロモーター部分からなる。しかし、ｈＣＭＶエンハンサー部分は、ｈＣＭＶエンハンサーを含むｈＣＭＶプロモーターからなる双方向性プロモーターの左側を指すように逆向きに存在する。プロモーターの右側に内因性イントロンが存在することに加えて、ヒトアポリポ蛋白質Ａ−１（ｈＡｐｏＡ１）由来の異種短鎖イントロンが双方向性プロモーターの左側に配置された。ここでの用語「左」および「右」は説明を容易にするために用いられているが、当業者は双方向性プロモーターコンストラクトもまた向きを変え、逆向きで用いられ得ることをすぐに認識するであろう。ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、約１．４ｋｂという比較的小さいサイズを有し、組換えアデノウイルスベクターにおける双方向性プロモーターとして使用するのに非常に適している。
【０１１７】
実施例３：ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４発現カセットを有するアデノウイルスベクターからの導入遺伝子発現の能力およびバランス
アデノウイルスベクターのＥ１領域からの発現の能力およびバランスをさらに評価するために、本発明者らは、Ｅ１領域にｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性発現カセットを有するＡｄ２６ベクターおよびＡｄ３５ベクターを生成した。４つの異なるベクトル、すなわちＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．Ｌｕｃ、Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ｅＧＦＰ、Ａｄ３５．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ＬｕｃおよびＡｄ３５．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ｅＧＦＰを作成し、非相補性Ａ５４９細胞の形質導入時のレポーター遺伝子発現の能力およびバランスを評価した。形質導入は、１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞で行った。両方のＶＰ／細胞比での結果は類似していたので、１０００ＶＰ／細胞での形質導入の結果のみを図３に示す。１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞での発現の１０倍の差異を推定するために、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する陽性対照ベクターＡｄ．ＬｕｃおよびＡｄ．ｅＧＦＰの形質導入を示す。パネル４Ａは、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４が、１０００ＶＰ／細胞でのＡｄ２６．ＬｕｃおよびＡｄ２６．ｅＧＦＰ対照ベクターに匹敵するかまたはそれよりわずかに低い発現レベルで、Ａｄ２６  Ｅ１双方向性発現カセットからの両レポーター遺伝子の強力な発現を誘導することを示す。Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ｅＧＦＰをＡｄ２６．Ｌｕｃ．ｍＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．ｅＧＦＰとさらに直接比較し、ｍＣＭＶ  ｂｉｄｉｒと比べｅＧＦＰ導入遺伝子の発現の低下を示すが、全体的によりバランスのとれた導入遺伝子の発現も示している。パネル４Ｂは、Ａｄ３５ベクターにおけるｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性発現カセットからの導入遺伝子の発現を示す。興味深いことに、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターのＣＡＧ側によって駆動される発現は、Ａｄ２６ベクターよりもＡｄ３５ベクターにおいてさらに減少しているようである。したがって、強力な双方向性プロモーターは異なる血清型に由来するｒＡｄＶにおいて使用され得るが、異なるプロモーターは１つのｒＡｄＶにおける使用が他のものよりも最適であり得、さらに、プロモーターおよび発現カセットの複雑な設計が最適なウイルスベクターのために必要とされることを例示する。
【０１１８】
実施例４：Ｅ１領域にｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性発現カセットを有するアデノウイルスベクターの遺伝的安定性試験
導入遺伝子の発現に加えて、ＡｄＶを産生している間の遺伝的安定性は、２つの抗原を発現する有用なＡｄＶにとって重要なパラメータである。したがって、先行出願の国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレットに記載のようにして、遺伝的安定性を試験した。簡潔に記載すると、ベクターＡｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ｅＧＦＰおよびＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．Ｌｕｃを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるプラスミドトランスフェクションによって生成し、ウイルス集団をプラークピッキングによって単離した。１ベクター当たり１０個のプラークをウイルス継代数（ｖｐｎ）３まで増殖させた。その後、５つのプラークを選択し、ｖｐｎ１３まで継代を延長した。遺伝的安定性を、Ｅ１発現カセット領域（図４）ならびにＥ３およびＥ４領域（Ｅ３およびＥ４ＰＣＲのデータは示さず）の同一性ＰＣＲによって評価した。小さな欠失または点変異の欠如を、ｖｐｎ１３のＥ１  ＰＣＲ産物の標準的なサンガーシーケンシングによって確認した。Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．ｅＧＦＰおよびＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４．Ｌｕｃの両方の５つのプラークのうちの５つが、ｖｐｎ１３まで遺伝的に安定なままであった。注目すべきことに、欠失バンドはないが、高度にＧＣリッチなＧＡＧプロモーター配列によって引き起こされる非特異的ＰＣＲバンドを表すいくつかのさらなるバンドを、ゲル写真において視ることができる。
【０１１９】
結論
上記のように、新しい双方向性プロモーターコンストラクトのパネルをスクリーニングすることによって、いずれの双方向性プロモーターコンストラクトが所望のプロモーター特性を与えるかを予測することは不可能であることがわかった。実際、非常に類似しているように思われる双方向性プロモーターコンストラクトでさえ、必ずしも同じ結果を与えない。例えば、左側にヒトＣＭＶプロモーターを有し、右側にＣＡＧプロモーターを有する双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、ｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５ベクターのＥ１領域から２つの異なる導入遺伝子を発現する能力およびバランスの両方について特に良好な結果を示した。先験的にｈＣＭＶ−ＣＡＧ４と非常に類似していると考えられて試験されたコンストラクトは、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２およびｒＣＭＶ−ＣＡＧを含んだ。異なる種に由来するものの、これらのコンストラクトもまた左側にＣＭＶプロモーター部分を有し、右側にもＣＡＧプロモーター部分を有する。これらのコンストラクトはたとえコードされたレポーター遺伝子の同調発現を示したとしても、驚くべきことに、発現は、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターからの発現よりも弱く、かつバランスもとれていなかった。さらに、双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターを有するｒＡｄは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＰ１３への連続継代後も遺伝的に安定であることがわかった。したがって、予想できなかったほどに、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターが、驚くべきことに、バランスがとれ、かつ強力な発現が所望される、遺伝子治療およびワクチンに使用することができる組換えウイルスベクターでの使用に好ましい特性を有するプロモーターである。
【０１２０】
【表１】
2019514415.tif 000003
【０１２１】
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ＵＳ５９８１２２５Ａ（１１／９／１９９９）．“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ，ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ”．Ｋｏｃｈａｎｅｋ，Ｓｔｅｆａｎ；Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ，Ｇｕｄｒｕｎ
ＵＳ５９９４１０６Ａ（１１／３０／１９９９）．“Ｓｔｏｃｋｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ”．Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉｍｒｅ；Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅ．；ＭｃＶｅｙ，Ｄｕｎｃａｎ  Ｌ．；Ｂｒｕｄｅｒ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｔ．；Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａｌｅｎａ
ＵＳ５９９４１２８Ａ（１１／３０／１９９９）．“Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”．Ｆａｌｌａｕｘ，Ｆｒｉｔｓ  Ｊａｃｏｂｕｓ；Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃｏｒｎｅｌｉｓ；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ａｌｅｘ  Ｊａｎ；Ｂｏｕｔ，Ａｂｒａｈａｍ；Ｖａｌｅｒｉｏ，Ｄｏｍｅｎｉｃｏ
ＵＳ６０２０１９１Ａ（２／１／２０００）．“Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”．Ｓｃａｒｉａ，Ａｂｒａｈａｍ；Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．；Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｓａｍｕｅｌ  Ｃ．
ＵＳ６０４０１７４Ａ（３／２１／２０００）．“Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅｓ”．Ｉｍｌｅｒ，Ｊｅａｎ  Ｌｕｃ；Ｍｅｈｔａｌｉ，Ｍａｊｉｄ；Ｐａｖｉｒａｎｉ，Ａｎｄｒｅａ
ＵＳ６０８３７１６Ａ（７／４／２０００）．“Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｍ．；Ｆａｒｉｎａ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｆ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｊ．
ＵＳ６１１３９１３Ａ（９／５／２０００）．“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ”．Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅ．；Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉｍｒｅ
ＵＳ６２２５２８９Ｂ１（５／１／２００１）．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉｍｒｅ；Ｒａｎｓｏｍ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｃ．
ＵＳ６２６１８２３Ｂ１（７／１７／２００１）．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ”．Ｔａｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｃｈｕ  Ｔａｙ；Ｖｅｌｌｅｋａｍｐ，Ｇａｒｙ；Ｂｏｎｄｏｃ，Ｊｒ．，Ｌａｕｒｅａｎｏ  Ｌ．
ＵＳ６４８５９５８Ｂ２（１１／２６／２００２）．“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ”．Ｂｌａｎｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｉｓ；Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｊｅａｎ  Ｍａｒｃ
ＵＳ７３２６５５５Ｂ２（２／５／２００８）．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”．Ｋｏｎｚ，Ｊｒ．，Ｊｏｈｎ  Ｏ．；Ｌｅｅ，Ａｎｎ  Ｌ．；Ｔｏ，Ｃｈｉ  Ｓｈｕｎｇ  Ｂｒｉａｎ；Ｇｏｅｒｋｅ，Ａａｒｏｎ  Ｒ
ＵＳ８９３２６０７Ｂ２（１／１３／２０１５）．“Ｂａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄｓ”．Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；Ｖｅｌｌｉｎｇａ，Ｊｏｒｔ
欧州特許文献：
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ＷＯ２００４００１０３２Ａ２（１２／３１／２００３）．“ＳＴＡＢＬＥ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＰＡＧＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＶＯＧＥＬＳ，Ｒｏｎａｌｄ；ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ，Ｊａｎｓ，Ｅｍｃｏ；ＺＵＩＪＤＧＥＥＳＴ，Ｄａｖｉｄ，Ａｄｒｉａｎｕｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒｕｓ
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ＷＯ２００６１０８７０７Ａ１（１０／１９／２００６）．“ＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ”．ＷＥＧＧＥＭＡＮ，Ｍｉｒａｎｄａ
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ＷＯ２００７０７３５１３Ａ２（６／２８／２００７）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＰＲＯＰＡＧＡＴＩＮＧ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＥＮＣＯＤＩＮＧ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＹ  ＧＥＮＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ”．ＧＡＬＬ，Ｊａｓｏｎ，Ｇ．，Ｄ．；ＢＲＯＵＧＨ，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｅ．；ＲＩＣＨＴＥＲ，Ｋｉｎｇ，Ｃ．
ＷＯ２００７１００９０８Ａ２（９／７／２００７）．“ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ”．ＴＵＣＫＥＲ，Ｓｅａｎ，Ｎ．
ＷＯ２００７１０４７９２Ａ２（９／２０／２００７）．“ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ  ＢＡＳＥＤ  ＯＮ  ＳＥＲＯＴＹＰＥ  ２６  ＡＮＤ  ４８，ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ  Ｈ．；ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ
ＷＯ２００７１１０４０９Ａ１（１０／４／２００７）．“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  Ａ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＡＮＤ  ＡＮ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ”．ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ；ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ
ＷＯ２００９０２６１８３Ａ１（２／２６／２００９）．“ＵＳＥ  ＯＦ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＴＯ  ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ＶＡＣＣＩＮＥ−ＩＮＤＵＣＥＤ  Ｔ  ＣＥＬＬ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＨＩＶ  ＧＡＧ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−Ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ，Ｈ．
ＷＯ２００９１１７１３４Ａ２（９／２４／２００９）．“ＡＥＲＯＳＯＬＩＺＥＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ”．ＲＯＥＤＥＲＥＲ，Ｍａｒｉｏ；ＲＡＯ，Ｓｒｉｎｉｖａｓ；ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＡＮＤＲＥＷＳ，Ｃｈａｒｌａ，Ａｎｎｅ
ＷＯ２０１００８５９８４Ａ１（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−  ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００８６１８９Ａ２（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−  ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００９６５６１Ａ１（８／２６／２０１０）．“ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ  Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ  Ｈ．
ＷＯ２０１１０４５３７８Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１１０４５３８１Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＨＩＧＨ  ＣＥＬＬ  ＤＥＮＳＩＴＹ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１３１３９９１１Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ  Ｎ．
ＷＯ２０１３１３９９１６Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ，Ｎ．
他の参考文献：
書籍
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Ｆｒｏｋｊａｅｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｈｏｖｇａａｒｄ  Ｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）
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学術誌
Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．，Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｅｗａｌｄ，Ｂ．Ａ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｅｎｈｏｌｔｚ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，．．．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２００７）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｒａｒｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８１（９），４６５４−４６６３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２６９６−０６
Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．，Ｍａｘｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｆ．，Ｎｇ’ａｎｇ’ａ，Ｄ．，Ｂｏｒｄｕｃｃｈｉ，Ｅ．Ｎ．，Ｉａｍｐｉｅｔｒｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒｉｃａｕｌｔ，Ｃ．Ａ．，．．．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２０１５）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８９（３），１５１２−１５２２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２９５０−１４
Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ，Ｋ．，Ｋｏｎｇ，Ｈ．Ｌ．，Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ，Ａ．，Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，＆  Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．（１９９７）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ７ａ  Ｅ１Ａ−  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７１（１１），８９４６−８９５１．
Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｉｔｔ，Ｍ．，Ｋｕｎｓｋｅｎ，Ｄ．，＆  Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９７）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７８（  Ｐｔ  ７），１６５３−１６６１．ｄｏｉ：１０．１０９９／００２２−１３１７−７８−７−１６５３
Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ．，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｆｆｉ，Ａ．，Ｖｉｇｎａ，Ｅ．，＆  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（２００５）．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｄｕａｌ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３（１），１０８−１１６．
Ａｎｄｒｉａｎａｋｉ，Ａ．，Ｓｉａｐａｔｉ，Ｅ．Ｋ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｒ．Ｋ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，＆  Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．（２０１０）．Ｄｕａｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１７（３），３８０−３８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２００９．１４７
Ｂａｎｇａｒｉ，Ｄ．Ｓ．，＆  Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．（２００６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２４（７），８４９−８６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２００５．０８．１０１
Ｂａｒｒｙ，Ｐ．Ａ．，Ａｌｃｅｎｄｏｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｏｗｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｅｒｒ，Ｈ．，＆  Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｓｕｓ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＵＬ１２１−１１７  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１５（１），６１−７２．ｄｏｉ：１０．１００６／ｖｉｒｏ．１９９６．０００７
Ｂａｒｓｋｉ，Ｏ．Ａ．，Ｓｉｌｌｅｒ−Ｌｏｐｅｚ，Ｆ．，Ｂｏｈｒｅｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｇａｂｂａｙ，Ｋ．Ｈ．，＆  Ａｇｕｉｌａｒ−Ｃｏｒｄｏｖａ，Ｅ．（２００４）．Ｈｕｍａｎ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｌｌｏｗｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３６（３），３８２−３８４，３８６，３８８．
Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，Ｎ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．，Ｚｉｎｎ，Ｋ．，Ｒｈｏｄｅｓ−Ｓｅｌｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｋｏｔｏｖ，Ａ．，Ｋｏｔｏｖａ，Ｏ．，．．．Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．（２００６）．Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７０（５），１４８８−１４９３．
Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｆ．，Ｊａｈｎ，Ｇ．，Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｓｌｅｒ，Ｋ．，Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．，＆  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｗ．（１９８５）．Ａ  ｖｅｒｙ  ｓｔｒｏｎｇ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ，４１（２），５２１−５３０．
Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｈｓｕ，Ｃ．，Ｋｕｌｅｓａ，Ｖ．Ａ．，＆  Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．（１９９６）．Ａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ４．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（９），６４９７−６５０１．
Ｃｈａｎ，Ｙ．Ｊ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，＆  Ｈａｙｗａｒｄ，Ｇ．Ｓ．（１９９６）．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＥＬＫ−１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｂｏｔｈ  ｂａｓａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（１２），８５９０−８６０５．
Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｎ．，Ｊｅａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ｙ．Ｊ．，Ｐｉｚｚｏｒｎｏ，Ｍ．，＆  Ｈａｙｗａｒｄ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｂｅｎｔ  ＤＮＡ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＮＦＩ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ＩＥ９４  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｒｏｍ  ｓｉｍｉａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，６７（１），５１６−５２９．
Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ，Ｐ．，Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｅ．，Ｄｕｒｒｅｒ，Ｌ．，Ｓａｕｖａｇｅ，Ｃ．，＆  Ｉｍｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．（２００７）．Ｔｈｅ  ＩＥ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ＣＭＶ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９６（１），１０６−１１７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２１１７２
Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，＆  Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＣＶ−６８  ａｄａｐｔｅｄ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８３（Ｐｔ  １），１５１−１５５．
Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．，Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ，Ｎ．Ｄ．，＆  Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．（２００７）．Ｔｈｅ  ｅｔｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＢＰ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ，３（１１），ｅ２０８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００３０２０８
Ｆａｌｌａｕｘ，Ｆ．Ｊ．，Ｂｏｕｔ，Ａ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ，Ｉ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｅｈｉｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｊ．，．．．Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９８）．Ｎｅｗ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９（１３），１９０９−１９１７．
Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．，．．．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００１）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７５（２３），１１６０３−１１６１３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２３．１１６０３−１１６１３．２００１
Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｎｇｄａｈｌ，Ｒ．Ｋ．，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）．Ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ１−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１（１），２１３−２１９．ｄｏｉ：１０．１０８９／１０４３０３４００５００１６２８３
Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｌ．，Ａｓｉｅｄｕ，Ｃ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｄ．，．．．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．（２０１１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６（Ａｄ２６）ａｎｄ  Ａｄ３５  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙｐａｓｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ａｄ５  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８５（９），４２２２−４２３３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２４０７−１０
Ｇｏｅｒｋｅ，Ａ．Ｒ．，Ｔｏ，Ｂ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ａ．Ｌ．，Ｓａｇａｒ，Ｓ．Ｌ．，＆  Ｋｏｎｚ，Ｊ．Ｏ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９１（１），１２−２１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０４０６
Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｓｔｒｅｌｏｗ，Ｌ．Ｉ．，Ｆｒａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｇ．，＆  Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｗ．（２００３）．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｈｅｓｕｓ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７７（１２），６６２０−６６３６．
Ｈａｒｒｏ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｎ．，Ｌａｌｌｙ，Ｍ．Ａ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ｄ．，Ｅｄｕｐｕｇａｎｔｉ，Ｓ．，Ｇｏｅｐｆｅｒｔ，Ｐ．Ａ．，．．．Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｄ．Ｖ．（２００９）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｎｅａｒ−ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  １  ｃｌａｄｅ  Ｂ  ｇａｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，２５（１），１０３−１１４．
Ｈａｒｒｏ，Ｃ．，Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｓｔｅｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｒ．Ｙ．，Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｄ．Ｖ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，．．．Ｍｅｒｃｋ，Ｖ．Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．（２００９）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５（ＭＲＫＡｄ５）ａｎｄ  ＭＲＫＡｄ６  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｔｒｉｇｅｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６（９），１２８５−１２９２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＣＶＩ．００１４４−０９
Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，．．．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．（２００６）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  ８），２１３５−２１４３．
Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ，Ｒ．，＆  Ｗｅｇｅｒ，Ｓ．（２０１０）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９７），１４３−１７０．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−３−６４２−００４７７−３＿５
Ｈｏｇａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｍａ，Ｊ．Ｃ．，Ａｓａｔｏ，Ｌ．，Ｏｎｇ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，．．．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｍ．Ｊ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．，１（１），４３−４８．
Ｈｏｌｍａｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．，Ｒａｊａ，Ｎ．Ｕ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，．．．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２００７）．Ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｌｌ  ｆｏｕｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（２），１８２−１８９．
Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ，Ｒ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｋａｓｐｅｒｓ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００４）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １１（Ａｄ１１）ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｌｏｗ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ａｄ５．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７８（２３），１３２０７−１３２１５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２３．１３２０７−１３２１５．２００４
Ｈｕ，Ｘ．，Ｍｅｎｇ，Ｗ．，Ｄｏｎｇ，Ｚ．，Ｐａｎ，Ｗ．，Ｓｕｎ，Ｃ．，＆  Ｃｈｅｎ，Ｌ．（２０１１）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈ５  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ，１５５（１），１５６−１６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２０１０．０９．０１４
Ｋｉｍ，Ｄ．Ｗ．，Ｕｅｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，＆  Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．（１９９０）．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ，９１（２），２１７−２２３．
Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．，Ｚｈｉ，Ｙ．，Ｓｃｈｕｍｅｒ，Ｇ．，Ｇａｏ，Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｆ．，．．．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００６）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３４６（２），３９４−４０１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００５．１０．０４２
Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，＆  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００９）．Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７（８），１３３３−１３３９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００９．１３０
Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ４９：ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ，ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  １０），２８９１−２８９９．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８２０７９−０
Ｍｕｌｌｉｃｋ，Ａ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．，Ｋｏｕｔｒｏｕｍａｎｉｓ，Ｍ．，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，Ｃ．，Ｂｒｏｕｓｓａｕ，Ｓ．，．．．Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６，４３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−６−４３
Ｎａ，Ｍ．，＆  Ｆａｎ，Ｘ．（２０１０）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ａｄ５Ｆ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｄｕａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，３８（６），４４６−４５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１０．０３．００７
Ｎａｎ，Ｘ．，Ｐｅｎｇ，Ｂ．，Ｈａｈｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．，＆  Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，Ｍ．（２００３）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄ７  ｃｏｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄ７ｄｅｌｔａＥ１ｄｅｌｔａＥ３ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ／ｒｅｖ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１０（４），３２６−３３６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０１９０３
Ｏｇｕｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｌ．，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．，＆  Ｈｉｌｌ，Ｆ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ｂｐ）ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ４ｂｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７６（８），３８１７−３８２３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＩＡＩ．０１３６９−０７
Ｏｐｈｏｒｓｔ，Ｏ．Ｊ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｕ，Ｍ．Ｇ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５−ｂａｓｅｄ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７４（１），３１３−３２０．
Ｐｈａｍ，Ｌ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｒｏｓａｌｅｓ，Ａ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．，＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．（２００９）．Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｅ１，Ｅ３  ａｎｄ  Ｅ４  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，１１（３），１９７−２０６．
Ｐｏｓｔ，Ｄ．Ｅ．，＆  Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ，Ｅ．Ｇ．（２００１）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８（２３），１８０１−１８０７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０１６０５
Ｑｕｉｌｉｃｉ，Ｌ．Ｓ．，Ｓｉｌｖａ−Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｉ．，Ａｎｄｒａｄｅ，Ａ．Ｃ．，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，Ｆ．Ｃ．，Ｂｒｉｇｉｄｏ，Ｍ．Ｍ．，＆  Ｍａｒａｎｈａｏ，Ａ．Ｑ．（２０１３）．Ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｒｏｎ  Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ，３５（１），２１−２７．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０５２９−０１２−１０４３−ｚ
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｙａｏ，Ｍ．Ｋ．，Ｔｒａｎ，Ｋ．Ｎ．，Ｃｒｏｙｌｅ，Ｍ．Ａ．，Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．，＆  Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．（２００９）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，４（４），ｅ５３０８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５３０８
Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｄ．，＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，Ｓ．Ｃ．（１９９８）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，８０（１），３５−４７．
Ｓａｎｄｆｏｒｄ，Ｇ．Ｒ．，＆  Ｂｕｒｎｓ，Ｗ．Ｈ．（１９９６）．Ｒａｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｈａｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２２（２），３１０−３１７．ｄｏｉ：１０．１００６／ｖｉｒｏ．１９９６．０４２８
Ｓｃｈｅｐｐ−Ｂｅｒｇｌｉｎｄ，Ｊ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｗｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｊａ，Ｎ．Ｕ．，Ｈｏｅｌ，Ｂ．Ｄ．，．．．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２００７）．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｃ，ＰｒｅＭ，Ｅ，ａｎｄ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（９），１１１７−１１２６．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｌ．，．．．Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＧＰｓ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ，３（６），ｅ１７７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｍｅｄ．００３０１７７
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｙ．，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，．．．Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２００３）．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４２４（６９４９），６８１−６８４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０１８７６
Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．，Ｂｌｅｊｅｒ，Ａ．，Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｕｎ，Ａ．，Ｔｅｓｅｍａ，Ｌ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００７）．Ａ  ＣＤ４６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１５（３），６０８−６１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３０００７８
Ｖｅｍｕｌａ，Ｓ．Ｖ．，＆  Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．（２０１０）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，１０（１０），１４６９−１４８７．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１０．５１９３３２
Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｍｅｅｒｅｎｄｏｎｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ，Ａ．，Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，Ｓｉｊｔｓｍａ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００７）．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８８（Ｐｔ  １１），２９１５−２９２４．
Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｒｉｊｎｓｏｅｖｅｒ，Ｒ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｄａｍｅｎ，Ｉ．，ｄｅ  Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｐ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００３）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７７（１５），８２６３−８２７１．
Ｖｏｉｇｔ，Ｓ．，Ｓａｎｄｆｏｒｄ，Ｇ．Ｒ．，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｇ．Ｓ．，＆  Ｂｕｒｎｓ，Ｗ．Ｈ．（２００５）．Ｔｈｅ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｐｔｕｒｅｄ  ＣＤ２００（ｖＯＸ２）ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ：ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｒａｔ  ＣＭＶ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８６（Ｐｔ  ２），２６３−２７４．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８０５３９−０
Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．，＆  Ｓｔｅｉｎ，Ｕ．（２０００）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｄｒｕｇｓ，６０（２），２４９−２７１．
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｃｕｎ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．，＆  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００６）．Ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ−ｏｒｉｇｉｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４（５），６６２−６７２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００６．０３．０２７
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｌ．，Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，Ｌａｔｉｍｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｐａｒｚｙｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉａｎ，Ａ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２０１０）．Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ−２  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１８（１２），２１８２−２１８９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２０２
【図１−１】
2019514415.tif 000004
【図１−２】
2019514415.tif 000005
【図１−３】
2019514415.tif 000006
【図１−４】
2019514415.tif 000007
【図１−５】
2019514415.tif 000008
【図２Ａ】
2019514415.tif 000009
【図２Ｂ】
2019514415.tif 000010
【図２Ｃ】
2019514415.tif 000011
【図３Ａ】
2019514415.tif 000012
【図３Ｂ】
2019514415.tif 000013
【図４Ａ】
2019514415.tif 000014
【図４Ｂ】
2019514415.tif 000015
【図５】
2019514415.tif 000016
【配列表】
2019514415000001.app
【国際調査報告】
2019514415.tif 000017
2019514415.tif 000018
2019514415.tif 000019