(57)【要約】本発明は、ＨＭＢを含む組成物を提供する。ＨＭＢを動物に投与する方法も記載する。ＨＭＢは、オートファジーおよびリポファジーを調節するために投与される。ＨＭＢは、オートファジー仲介による状態または疾患を治療、予防、阻害、遅延または軽減するためにも投与される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類においてオートファジーを調節する方法であって、哺乳類に約０．５ｇから約３０ｇまでのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）を投与することを含み、その際、哺乳類に前記ＨＭＢを前記投与するとオートファジーが調節される、前記方法。
【請求項２】
調節されるオートファジーのタイプがリポファジーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オートファジーが栄養素過剰に際して調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
基礎オートファジーが調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＭＢが、それの遊離酸形、それの塩、それのエステル、およびそれのラクトンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、クロム塩およびカルシウム塩からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オートファジーが１より多い組織タイプにおいて調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オートファジーが少なくとも２つの組織タイプにおいて調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
オートファジーの調節により、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、神経変性障害、メタボリックシンドローム、肝疾患、代謝速度低下、筋疾患、骨関節炎、サルコペニア、癌、肥満症およびインスリン抵抗性からなるリストから選択されるオートファジー関連の疾患または状態が治療、阻害、予防、発症遅延または軽減される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳類においてオートファジー仲介による状態を治療し、または発症の可能性を低減する方法であって、哺乳類に約０．５ｇから約３０ｇまでのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）を投与することを含み、その際、哺乳類に前記ＨＭＢを前記投与すると、哺乳類に前記ＨＭＢを投与するとオートファジー仲介による状態が治療され、あるいはオートファジー仲介による状態の発症の可能性が低減する、前記方法。
【請求項１１】
オートファジー仲介による状態が、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満症、神経変性障害、メタボリックシンドローム、肝疾患、代謝速度低下、筋疾患、サルコペニア、癌、感染症、肥満症およびインスリン抵抗性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類において加齢性の障害を治療、阻害、軽減、遅延または予防する方法であって、哺乳類に有効量のオートファジーモジュレーターを投与することを含み、その際、オートファジーモジュレーターがβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）である、前記方法。
【請求項１３】
加齢性の障害が、癌、サルコペニア、心血管疾患、肝疾患、ＩＩ型糖尿病、神経変性疾患、またはメタボリックシンドロームである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類において少なくとも１つの転写因子の発現または活性を調節する方法であって、哺乳類に有効量のβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）を投与することを含み、その際、転写因子が転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）およびフォークヘッドボックスプロテイン０１（ＦＯＸＯ１）からなるリストから選択される、前記方法。
【請求項１５】
哺乳類において過剰栄養素状態に起因する病的状態を治療、予防、遅延、阻害または軽減する方法であって、哺乳類にオートファジーモジュレーターを投与することを含み、その際、オートファジーモジュレーターが約０．５ｇから約３０ｇまでのβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）である、前記方法。
【請求項１６】
病的状態が、心血管疾患、ＩＩ型糖尿病、癌、インスリン抵抗性、炎症および肥満症からなるリストから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類においてオートファジーを調節することにより長寿を増進する方法であって、哺乳類に有効量のリポファジーモジュレーターを投与することを含み、その際、リポファジーモジュレーターがβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）である、前記方法。
【請求項１８】
哺乳類が老化関連の状態に罹患することなく活動的なライフスタイルを送ることができる期間の長さを増大させる方法であって、哺乳類に有効量のリポファジーモジュレーターを投与することを含み、その際、リポファジーモジュレーターがβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）である、前記方法。
【請求項１９】
哺乳類の健康寿命を延長する方法であって、哺乳類に有効量のリポファジーモジュレーターを投与することを含み、その際、リポファジーモジュレーターがβ−ヒドロキシ−β−メチル酪酸（ＨＭＢ）である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．分野
本出願は、United States Provisional Patent Application No. 62/281,561, 2016年1月21日出願に基づく優先権を主張し、その出願を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、β−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）を含む組成物、ならぴにオートファジーの増強および／または調節が有益となる可能性がある疾患または状態を治療、予防または改善するためにＨＭＢを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
オートファジーという用語は、“自食(self-eating)”と翻訳されるギリシャ語に由来する。それは、体内で細胞破壊後の細胞成分をリサイクルすることに適合した生理的プロセスである。それは基礎状態の間に、ただし、より重要なことに細胞ストレス期間中に、ホメオスタシスまたは正常な機能を維持する。その際、オートファジーは、連続的な細胞生存を可能にするエネルギーを発生することができる細胞内構築ブロックおよび基質の代替源を供給する。このプロセスは、真菌、植物、粘菌、線虫、ショウジョウバエおよび昆虫、げっ歯類（実験用のマウスおよびラット）、ヒトを含めたすべての真核細胞系にみられる。
【０００４】
オートファジーはリソソームにおいて終結する必須の細胞多工程分解経路である。オートファジーは、リソソームへ送達するための凝集タンパク質、欠陥のある細胞小器官または脂肪滴(lipid droplet)からなる細胞質カーゴ（積荷分子）(cargo)を隔離する二重膜結合したベシクル（オートファゴソーム(autophagosome)）の形成を伴なう。このプロセスは、ストレスに際しての細胞の健康および細胞の生存にとって重要である。オートファジーは、細胞質タンパク質凝集物および欠陥のある細胞小器官の分解におけるそれの機能により、細胞タンパク質および細胞小器官の機能の品質管理の維持に寄与する。大部分の細胞にタンパク質ホメオスタシス、すなわち“プロテオスタシス(proteostasis)”および細胞小器官機能を維持する作用をする基礎的割合のオートファジーがあり、ストレスに際してはオートファジーのアップレギュレーションがストレス誘発性の細胞変化を補正してプロテオスタシスを回復する。
【０００５】
オートファジーによるタンパク質および脂質の分解は、それのハウスキーピング機能のほかに、細胞エネルギーを供給する。オートファジーは、カロリー制限、飢餓または運動などのエネルギー問題(energy challenge)によって誘発される。リポファジー(lipophagy)と呼ばれる特定の形態のオートファジーは、オートファゴソームを使って脂質蓄積(lipid store)を可動化する。リソソーム酸性リパーゼにより加水分解された脂質は、ベータ酸化を介してエネルギーを得るために使われる。オートファジーによる脂質異化（リポファジー）は、細胞が脂質蓄積を可動化して細胞ホメオスタシスを維持する非古典的機序である。欠陥リポファジーは代謝性疾患、たとえば脂肪肝疾患、肥満症およびアテローム性動脈硬化症(atherosclerosis)に関連づけられている。運動は筋肉および心臓におけるオートファジーを強力に誘発し、その際、それは耐久性、および筋肉グルコースホメオスタシスに対する運動の有益な効果を仲介する。
【０００６】
基礎オートファジーおよびストレスに応答したそれのアップレギュレーションは、筋肉、肝臓、脳、心臓、腸、膵臓、および脂肪組織などの組織の健康状態を維持するために必須である。たとえば、ＡＴＧ７またはＡＴＧ５をブロックすることにより肝臓におけるオートファジーをブロックすると、小胞体(endoplasmic reticulum)ストレスが生じ、インスリン抵抗性が誘発される。同様に、鍵オートファジータンパク質ＡＴＧ７またはそれの下流メディエーターＡＴＧ５の欠失または抑制によりオートファジーをブロックすることは、神経死および神経学的異常につながる。オートファジー欠損は老化に伴なって起き、それはしばしばタンパク質品質管理の喪失および細胞内損傷の蓄積を特徴とする。一部はこの損傷は、オートファジーを低下させるＡＭＰＫシグナル伝達における加齢性の低下を反映している可能性がある。オートファジーは脂質ホメオスタシスに対する影響を介して老化を調節する。マウスにおいて、鍵オートファジー遺伝子の過剰発現を介した、またはカロリー制限によるオートファジー活性の増強は、アンチエージング表現型を増加させ、寿命を増大させる（２０％）。
【０００７】
オートファジーの転写制御およびエピジェネティック制御については強力な証拠がある(Pietrocola F., Regulation of Autophagy by Stress-Responsive Transcription Factors. Semin. Cancer Biol. 2013; 23:310-322)。哺乳類において、転写因子ＥＢ(transcription factor EB)（ＴＦＥＢ）、およびフォークヘッドボックスプロテイン  クラスＯ(forkhead box protein class O)（ＦＯＸＯ）のメンバーは、オートファジーのマスター転写レギュレーターである。
【０００８】
ＢＮＩＰ３はＦＯＸＯ１の転写ターゲットであり、ＡＭＰＫとは無関係にｍＴＯＲシグナル伝達経路を阻害する。ＴＦＥＢはＣＲＥＢ活性化により転写誘導され、オートファジー関連遺伝子および同様にリソソーム遺伝子の主要な転写レギュレーターである。
【０００９】
ＴＦＥＢは、幾つかのオートファジー遺伝子およびリソソーム遺伝子の発現レベルの管理によりオートファジーの多数の工程、たとえばオートファゴソーム生物発生、基質ターゲティング、およびリソソーム分解を調節することによって、最も包括的な制御をオートファジーに及ぼすと思われる(Settembre C. TFEB Links Autophagy to Lysosomal Biogenesis. Science 2011; 332; 1429-1433)。ＴＦＥＢは、機能をもつ遺伝子の発現をオートファジープロセスのすべての段階において協調させることによりオートファジーフラックス(autophagic flux)を調節する。さらに、ＴＦＥＢは脂肪細胞におけるリポファジーを制御する(Kaur J, Debnath J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015;16(8):461-72)。
【００１０】
ＴＦＥＢ活性は、多様な代謝性疾患およびリソソーム蓄積症において、加齢に関連するディスオーダード(disordered)タンパク質の蓄積および凝集によって損なわれている可能性がある。正常なオートファジープロセスの崩壊は、代謝障害、たとえば肥満症およびインスリン抵抗性の発症の一因となる。欠損リポファジーが老化のメタボリックシンドロームの根底にある。
【００１１】
オートファジー欠損は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経変性、心筋障害、および骨関節炎の初期にみられる。欠損オートファジーは肥満症関連のインスリン抵抗性の一因となる可能性もあり、オートファジーアップレギュレーション（たとえば、カロリー制限による）はインスリン感受性を改善する。オートファジー機能不全は、神経変性、肝疾患、たとえば肝炎、脂肪肝、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis)（ＮＡＳＨ）、ならびに脂肪肝疾患、癌、自己免疫障害、代謝障害、たとえば糖尿病および／またはインスリン抵抗性、サルコペニア、ならびに心血管障害、たとえば脳卒中(stroke)、心臓委縮、心臓発作、心筋障害、および一過性脳虚血発作(transient ischemic attack)などの疾患の主要な一因でもある。オートファジーは筋ジストロフィーを伴なうヒトにおいて欠損しており、この欠損がこの疾患の発病の一因となることが研究により示された。オートファジー亢進は、栄養飢餓、感染症および老化などのストレスにより誘発される可能性がある。
【００１２】
オートファジーは多少とも諸刃の剣であると考えることができる：それは、腫瘍原性のタンパク質基質、有毒なミスフォールドしたタンパク質、および癌を開始する損傷を受けた細胞小器官を阻止することによって腫瘍抑制因子として作用する可能性があり、なおかつ、より高いオートファジー活性が腫瘍細胞に検出されており、それが腫瘍の生存および増殖を支援している可能性がある。よって、オートファジーを正常化する作用をするオートファジーモジュレーターは、過少または過剰のオートファジーを阻止して正常な細胞機能の制御を補助することができる。
【００１３】
オートファジーは、細胞質内にオートファゴソームを形成する二重膜または多重膜のベシクルを形成することにより開始され、それが細胞質および細胞小器官の一部を飲み込む。オートファゴソームの外膜は次いでリソソームと融合し、内膜およびカーゴはリソソーム内で加水分解酵素により分解され、次いでそれの成分がリサイクルされる。
【００１４】
ＡＴＧ（オートファジー関連）タンパク質が同定され、それらはオートファゴソームの生物発生および成熟にとって必須である。それらの多くは二重に連なる細胞膜に集結する。３１を超えるＡＴＧタンパク質が同定され、それにはオートファゴソーム生物発生を制御する２つの必須ユビキチン様コンジュゲーション系が含まれる。第１の系はＡＴＧ１２−ＡＴＧ５タンパク質の共有結合を生じる。第２の系においては、ＬＣ３タンパク質が脂質分子、一般にホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）にコンジュゲートする。両コンジュゲーション系ともＥ１様酵素（ＡＴＧ７）およびＥ２様酵素（ＡＴＧ３およびＡＴＧ１０）の機能を必要とする。ＡＴＧ１２−ＡＴＧ５安定複合体は最終的に、より大きい複合体をＡＴＧ１６と共に形成し、その結果、ＬＣ３−ＰＥコンジュゲーションを触媒するＥ３様酵素複合体が形成される。ＡＴＧ７は栄養素仲介オートファジーに関与することが示唆されている。
【００１５】
オートファジープロセスの不全は、損傷を受けたミトコンドリアの廃棄不全による廃用性筋委縮(muscle disuse atrophy)の一因となる要因である。ミトコンドリアターンオーバーの低減は、機能不全臓器の蓄積およびそれに続く筋肉損傷につながる。欠陥オートファジーは筋肉の萎縮、衰弱、および筋線維変性として現われる。オートファジーは筋損傷を制限するプロセスであることが示された。
【００１６】
オートファジーの増強は、心血管疾患、非アルコール性脂肪肝およびインスリン抵抗性に対する治療および予防措置の開発における新たなターゲットである。これに対し、オートファジーの阻害は、化学療法薬に対する腫瘍細胞生存を低減することにより癌において有益である可能性がある。
【００１７】
さらに、オートファジーのレベルは年齢と共に漸減し、筋萎縮増大、強度低下、筋肉機能低下、およびサルコペニアを生じることが示された。オートファジープロセスの保存または調節は、オートファジーレベルの漸減から生じるこれらの状態を改善する可能性がある。
【００１８】
老化は、機能不全細胞小器官、欠陥酵素、タンパク性凝集物および／またはＤＮＡ変異にみられるような種々の形態の分子損傷の蓄積を生じる。慢性疾患、たとえば神経変性、ＩＩ型糖尿病または癌の発病は、細胞損傷の蓄積に付随して年齢と共に増加する。オートファジーの正常化または調節はこれらの加齢関連プロセスを減衰または回避する作用をし、よって個体の“健康寿命(health span)”を延長し、それらの寿命を延長する可能性がある。オートファジーおよび／またはリポファジーのモジュレーターは、老化に関連する状態、たとえば認知症、足の痛みもしくは運動性低下、糖尿病、肝障害、および／または心血管障害に煩わされることなく個体が活動的なライフスタイルを送ることができる時間の長さを延長する。これらのモジュレーターは個体が感染症に罹患している期間も低減できる。
【００１９】
初期の研究はオートファジーが異化プロセスとみなされることを示唆しているが、最近の研究は同化経路を持続させかつ可能にすることにおけるこの経路の重要性を強調している。異化分解から生成したオートファジー由来の栄養素はすべて、基礎状態においても飢餓の間も同様に多様な生合成経路を支援することは現在では十分に確立されている。よって、オートファジーは選択的プロセスである。いかにしてオートファジーが種々の栄養素プールを特定の同化機能へ向けて可動化できるかは、なお決定すべきである。本発明は、ＨＭＢが基礎オートファジー、ならびに肥満症などの栄養素過剰およびインスリン抵抗性の期間中のオートファジーのモジュレーターとして作用することを立証する。
【００２０】
合わせると、本明細書に記載するこれらの研究は、ＦｏｘＯ３依存性転写を介した新たな様式のオートファジー調節を立証し、筋肉におけるオートファジー／リソソーム経路がプロテアソーム経路と協調して制御されることも立証する。
【００２１】
栄養飢餓、不活動または除神経(denervation)、高齢、および癌、糖尿病、敗血症、腎不全などを含めた多くの疾患はすべて、著しい筋肉喪失（萎縮）、強度および持久力の喪失を伴なう。急速な筋肉喪失は、萎縮しつつある筋肉におけるユビキチン−プロテアソーム経路(ubiquitin-proteosomal pathway)の活性化に続くタンパク質破壊の加速に起因する。フォークヘッドファミリーの転写因子のメンバーであるＦｏｘｏ３はこれらの条件下で高度に活性化されて、重要なユビキチンリガーゼを含む一組の萎縮関連遺伝子（“アトロジーン(atrogene)”）の転写を介して筋萎縮を引き起こし、オートファジーも刺激することが示唆されており、これはプロテアソーム系とリソソーム系の協調制御が存在することを示唆する。
【００２２】
同様に、飢餓の間にオートファジーはリポファジーのプロセスを介して脂肪滴を選択的に分解し、これはオートファジーおよびリソソーム生物発生遺伝子の転写を活性化するＴＦＥＢの発現により仲介される。この因子は、リソソームヒドロラーゼ、膜タンパク質、およびオートファジー関連遺伝子の発現を協調させる。栄養素の存在下（および栄養素過剰）では、これらの転写因子の活性は幾つかの他のタンパク質によって調節され、それらのうち最も重要なものはオートファジーとリソソーム生物発生の制御を協調させることに関係するｍＴＯＲタンパク質である。
【００２３】
ＨＭＢ
アルファ−ケトイソカプロエート(Alpha-ketoisocaproate)（ＫＩＣ）は、ロイシンの第１の主要な活性代謝産物である。ＫＩＣ代謝の少量生成物がβ−ヒドロキシ−β−メチルブチレート（ＨＭＢ）である。ＨＭＢは多様な用途に関して有用であることが見出されている。具体的には、U.S. Patent No. 5,360,613 (Nissen)に、ＨＭＢが総コレステロールおよび低密度リポタンパク質コレステロールの血中レベルを低減するのに有用であると記載されている。U.S. Patent No. 5,348,979 (Nissen et al.)には、ＨＭＢがヒトにおいて窒素保持を促進するのに有用であると記載されている。U.S. Patent No. 5,028,440 (Nissen)は、動物において除脂肪組織の発達を増大させるためのＨＭＢの有用性について考察している。同様にU.S. Patent No. 4,992,470 (Nissen)には、ＨＭＢが哺乳類の免疫応答を増強させるのに有効であると記載されている。U.S. Patent No. 6,031,000 (Nissen et al.)には、疾患関連の衰弱を治療するためのＨＭＢおよび少なくとも１種類のアミノ酸の使用が記載されている。
【００２４】
タンパク質分解を抑制するためのＨＭＢの使用は、ロイシンがタンパク質節約特性(protein-sparing characteristics)をもつという所見に由来する。必須アミノ酸であるロイシンは、タンパク質合成のために使われるか、あるいはα−ケト酸（α−ケトイソカプロエート，ＫＩＣ）にアミノ基転移する可能性がある。一経路において、ＫＩＣは酸化されてＨＭＢになる可能性があり、これはロイシン酸化のおおよそ５％を占める。ＨＭＢは筋肉の量および強度の増強においてロイシンに勝る。ＨＭＢの最適効果は、ＨＭＢのカルシウム塩として投与した場合に３．０グラム／日、または０．０３８ｇ／ｋｇ体重／日で達成でき、一方、ロイシンの場合は３０．０グラム／日以上が必要である。
【００２５】
ＨＭＢは、産生または摂取されると２つの結末をもつと思われる。第１の結末は尿中における単純な排出である。ＨＭＢが供給された後、尿濃度が上昇し、その結果、おおよそ２０〜５０％のＨＭＢが尿中へ失われる。もうひとつの結末は、ＨＭＢからＨＭＢ−ＣｏＡへの活性化に関係する。ＨＭＢ−ＣｏＡに変換されると、さらなる代謝、すなわちＨＭＢ−ＣｏＡからＭＣ−ＣｏＡへの脱水またはＨＭＢ−ＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡへの直接変換のいずれかが起きる可能性があり、それにより細胞内コレステロール合成のための基質が供給される。幾つかの研究により、ＨＭＢがコレステロール合成経路に取り込まれ、損傷を受けた細胞膜の再生に使われる新たな細胞膜の供給源となる可能性があることが示された。ヒトの研究は、血漿ＣＰＫ（クレアチンホスホキナーゼ）(creatine phosphokinase)上昇により測定して、激しい運動の後の筋損傷が最初の４８時間以内のＨＭＢ補給で軽減することを示した。ＨＭＢの保護効果は、毎日の連続使用で最大３週間持続する。多数の研究により、ＨＭＢの有効量はＣａＨＭＢ（ＨＭＢカルシウム）として３．０グラム／日（約３８ｍｇ／ｋｇ体重／日）であることが示された。ＨＭＢは安全性について試験され、健康な青少年または高齢者において副作用を示さなかった。Ｌ−アルギニンおよびＬ−グルタミンと組み合わせたＨＭＢも、エイズおよび癌の患者に補給した際、安全であることが示された。
【００２６】
最近、ＨＭＢの新たな送達形態であるＨＭＢ遊離酸が開発された。この新たな送達形態はＣａＨＭＢより速やかに吸収され、より大きな組織クリアランスをもつことが示された。この新たな送達形態はU.S. Patent Publication Serial No. 20120053240に記載されており、それの全体を本明細書に援用する。
【００２７】
ＨＭＢはオートファジーとリポファジーの両方を調節することが意外にも予想外に見出された。本発明は、ＨＭＢの組成物、およびオートファジープロセスを正常化または調節するためにＨＭＢを使用する方法を含む。それらの方法は、ヒトおよび他の動物を栄養素の枯渇と過剰に共通である過度の筋肉衰弱および萎縮の予後から保護すること、ならびにエネルギー供給に必要な脂肪分解経路を活性化することに関する。栄養素過剰および幾つかの疾患（たとえば、敗血症、癌など）が脂肪分解の阻害に関連することは十分に確立されており、これに関してＨＭＢはオートファジー経路を調節して脂肪組織蓄積を可動化し、ベータ酸化を増強し、こうしてエネルギーを供給する。オートファジーおよびリポファジーモジュレーターとしてのＨＭＢの役割を図１に示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】U.S. Patent No. 5,360,613
【特許文献２】U.S. Patent No. 5,348,979
【特許文献３】U.S. Patent No. 5,028,440
【特許文献４】U.S. Patent No. 4,992,470
【特許文献５】U.S. Patent No. 6,031,000
【特許文献６】U.S. Patent Publication Serial No. 20120053240
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Pietrocola F., Regulation of Autophagy by Stress-Responsive Transcription Factors. Semin. Cancer Biol. 2013; 23:310-322
【非特許文献２】Settembre C. TFEB Links Autophagy to Lysosomal Biogenesis. Science 2011; 332; 1429-1433
【非特許文献３】Kaur J, Debnath J. Autophagy at the crossroads of 異化sm and 同化sm. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015;16(8):461-72
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明の目的のひとつは、オートファジーを調節するのに使用するための組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ＡＴＧ７の発現を増大させるのに使用するための組成物を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、リポファジーを調節するのに使用するための組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＣＲＥＢリン酸化を増大させるのに使用するための組成物を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、転写因子ＴＦＥＢを誘導してオートファジー遺伝子をアップレギュレートするのに使用するための組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、オートファジーを調節するのに使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに他の目的は、ＡＴＧ７の発現を増大させるための組成物を投与する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、リポファジーを調節するのに使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、ＣＲＥＢリン酸化を増大させるのに使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、転写因子ＴＦＥＢの発現または活性を調節するのに使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
【００３５】
本発明の他の目的は、オートファジー関連の状態および疾患を予防、軽減、阻害、治療または遅延するのに使用するための組成物を投与する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下の明細書、図面、および特許請求の範囲を参照すると当業者に明らかになるであろう。
本発明は、これまで遭遇してきた困難を克服することを意図する。そのために、ＨＭＢを含む組成物を提供する。この組成物を投与の必要がある対象に投与する。すべての方法が、動物にＨＭＢを投与することを含む。本発明に含まれる対象には、ヒトおよび非ヒト哺乳類が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、オートファジーおよびリポファジーにおけるＨＭＢの役割を表わす図である。
【図２】図２は、筋肉の筋管におけるＡＴＧ７の発現を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、分化した脂肪細胞におけるイソプロテレノール刺激脂肪分解および基礎脂肪分解を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、分化した脂肪細胞におけるＡＴＧＬおよびＡＴＧ７関連のｍＲＮＡ発現を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒト皮下前駆脂肪細胞における脂肪滴蓄積を示す画像である。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、初代ヒト脂肪細胞におけるＡＭＰＫ活性化を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、初代ヒト脂肪細胞におけるＡＭＰＫ活性化を示す。
【図６】図６は、オートファジー−関連転写因子の遺伝子発現を示す。
【図７】図７は、ＨＭＢが前駆脂肪細胞においてオートファジーに及ぼす効果を視覚化した画像である。
【図８】図８は、ＨＭＢ処理した筋肉（ＨＳＭＭ）および脂肪細胞（ＳＧＢＳ）における蛍光タンパク質(phosphor protein)アッセイの結果を示すチャートである。
【図９】図９は、ＨＭＢが脂肪細胞および筋細胞におけるオートファジーに及ぼす効果をまとめた図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
ＨＭＢは筋細胞および脂肪細胞の両方においてオートファジーおよびリポファジーの両方を調節することが予想外に意外にも見出された。本発明は、ＨＭＢの組成物、およびこれらの細胞タイプの両方においてオートファジーを調節するためにＨＭＢを使用する方法を含む。さらに、ＨＭＢは基礎オートファジーおよび栄養素過剰期間中のオートファジーの両方を調節することが意外にも予想外に見出された。さらに、ＨＭＢはオートファジーに関連する少なくとも２つの経路に対して作用する：転写因子ＦＯＸＯ１に関連するＢＮＩＰ３経路および転写因子ＴＦＥＢに関連するＣＲＥＢ活性化。
【００３９】
ＨＭＢは１より多い系においてオートファジーモジュレーターとして作用する；それは脂肪組織および筋肉におけるオートファジーを調節することをデータが立証している。１つの系におけるオートファジーの修正が他の系に影響を及ぼすことが観察されているので、ＨＭＢは種々の組織間でのオートファジーを協調させ、または調節する。種々の組織間でのこの協調はクロストーク(cross-talk)としても知られており、よってＨＭＢは組織間でのクロストーク剤として作用する。
【００４０】
本発明の組成物および方法はヒトおよび非ヒト動物を含めた動物に対するものである。その動物は健康であってもよく、あるいはある疾患または状態に罹患していてもよい。本発明の組成物および方法は、オートファジーの増強または調節が有益であるいずれかの使用に関するものである。限定ではない例として、オートファジーの調節または増強は、老化に際して、筋萎縮を遅延または反転し、サルコペニアを予防または治療し、運動誘発性の筋肉破壊を含めた筋肉破壊を減衰させるために有益である。オートファジーおよび／またはリポファジーを調節することの他の有益性には、神経筋疾患、神経変性疾患、心血管疾患、代謝性疾患、肝疾患、感染症、および腫瘍形成を含めた癌の軽減または予防が含まれる。
【００４１】
神経変性疾患には、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病およびパーキンソン病が含まれるが、これらに限定されない。
心血管疾患には、脳卒中、心臓委縮、心臓発作、心筋障害、アテローム性動脈硬化症および一過性脳虚血発作が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
肝疾患には、肝炎、肝脂肪変性（脂肪肝）(hepatic steatosis)、肝硬変、非アルコール性脂肪肝疾患(nonalcoholic fatty liver disease)、および非アルコール性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis)（ＮＡＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
栄養素過剰から生じる代謝性疾患には、肥満症、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性が含まれるが、これらに限定されない。
長寿(longevity)の増進は、動物の予想寿命を増大させることを意味する。
【００４４】
動物が活動的なライフスタイルを送ることができる時間の長さを増大させることには、高齢に関連する状態、たとえば限定ではない例として、認知症、足の痛みまたは運動性低下、および心血管機能低下により妨害または阻止されることなく活動的なライフスタイルを維持できる時間の長さを延長することが含まれる。
【００４５】
健康寿命には、個体が全般的に健康であって重篤または慢性的な疾患を伴わない生存期間が含まれる。健康寿命は健康な期間の延長である。
β−ヒドロキシ−β−メチル酪酸、またはβ−ヒドロキシ−イソ吉草酸は、それの遊離酸型で（ＣＨ３）２（ＯＨ）ＣＣＨ２ＣＯＯＨとして表わすことができる。用語“ＨＭＢ”は、上記の化学式をもつ化合物（それの遊離酸型および塩型の両方）、およびその誘導体を表わす。いかなる形態のＨＭＢも本発明に関して使用できるが、好ましくはＨＭＢは遊離酸、塩、エステル、およびラクトンからなる群から選択される。ＨＭＢエステルには、メチルおよびエチルエステルが含まれる。ＨＭＢラクトンには、イソバレリルラクトンが含まれる。ＨＭＢ塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、クロム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルカリ金属塩、およびアルカリ土類金属塩が含まれる。
【００４６】
ＨＭＢおよびそれの誘導体を製造する方法は当技術分野で周知である。たとえば、ＨＭＢはジアセトンアルコールの酸化により合成できる。適切な１方法がCoffman et al., J. Am. Chem. Soc. 80: 2882-2887 (1958)により記載されている。そこに記載されるように、ＨＭＢはジアセトンアルコールのアルカリ性次亜塩素酸ナトリウム酸化により合成される。生成物は遊離酸型で回収され、それを塩に変換することができる。たとえば、Coffman et al. (1958)のものと類似の方法により、ＨＭＢをそれのカルシウム塩として製造でき、その際、ＨＭＢの遊離酸を水酸化カルシウムで中和し、エタノール水溶液から結晶化により回収する。ＨＭＢのカルシウム塩がＭｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アイオワ州エイムズ）から販売されている。
【００４７】
２０年以上前に、ＨＭＢのカルシウム塩がヒトのための栄養補給剤として開発された。試験は、３８ｍｇのＣａＨＭＢ／ｋｇ体重が平均的な者に有効な投与量であると思われることを示した。
【００４８】
ＨＭＢがタンパク質分解を低減しかつタンパク質合成を増大させる分子機構がレポートされた。Eleyらは、ＨＭＢがｍＴＯＲリン酸化によりタンパク質合成を刺激することを示すインビトロ試験を実施した。他の試験は、タンパク質分解誘導因子(proteolysis inducing factor)（ＰＩＦ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、およびアンギオテンシンＩＩによって筋タンパク質の異化を刺激した際、ＨＭＢがユビキチン−プロテアソームタンパク質分解経路（ubiquitin-proteosome proteolytic pathway）の誘導を減衰させることによってタンパク質分解を低減することを示した。さらに他の試験は、ＨＭＢがカスパーゼ−３および−８プロテアーゼの活性化も減衰させることを立証した。
【００４９】
大部分の場合、臨床試験に用いられてエルゴジェニックエイド（強壮剤）(ergogenic aid)として市販されているＨＭＢは、カルシウム塩型のものであった。最近の進歩によりＨＭＢを栄養補給剤として使用するために遊離酸型として製造できるようになった。最近、新たな遊離酸型のＨＭＢが開発され、それはＣａＨＭＢより速やかに吸収されて、より急速に、より高いピーク血清ＨＭＢレベルをもたらし、かつ血清から組織へのクリアランスの改善をもたらすことが示された。
【００５０】
したがって、特に激しい運動の直前に投与する場合、ＨＭＢ遊離酸はカルシウム塩形より有効なＨＭＢ投与方法である可能性がある。しかし、本発明がいかなる形態のＨＭＢをも包含することは当業者に認識されるであろう。
【００５１】
いずれの形態のＨＭＢも、２４時間で約０．５グラムのＨＭＢ〜約３０グラムのＨＭＢの一般的投与量範囲を生じる様式で送達および／または投与剤形に取り込ませることができる。
【００５２】
投与するまたは投与という用語は、組成物を哺乳類に与えること、組成物を摂取すること、およびその組合わせを含む。
前記組成物を食用形態で経口投与する場合、組成物は好ましくは栄養補助食品(dietary supplement)、食品、または医薬(pharmaceutical medium)の形態、より好ましくは栄養補助食品または食品の形態である。前記組成物を含むいずれか適切な栄養補助食品または食品を本発明に関して使用できる。組成物が形態（たとえば、栄養補助食品、食品または医薬）に関係なくアミノ酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂肪、糖類、無機質および／または微量元素を含有できることは、当業者には理解されるであろう。
【００５３】
組成物を栄養補助食品または食品として調製するために、組成物は普通は組成物が栄養補助食品または食品中に実質的に均一に分布するように混和または混合されるであろう。あるいは、組成物を液体、たとえば水に溶解し、またはエマルジョンに含有させることができる。
【００５４】
栄養補助食品の組成物は、粉末、ゲル、液体であってもよく、あるいは打錠またはカプセル封入されてもよい。
組成物を含むいずれか適切な医薬を本発明に関して使用できるが、好ましくは組成物を適切な医薬用キャリヤー、たとえばデキストロースまたはスクロースと混和する。
【００５５】
さらに、医薬組成物をいずれか適切な様式で静脈内投与することができる。静脈内注入により投与するためには、組成物は好ましくは水溶性、無毒性の形態である。静脈内投与は、特に静脈内（ＩＶ）療法を受けている入院患者に適切である。たとえば、患者に投与されているＩＶ溶液（たとえば、生理食塩水またはグルコース溶液）に組成物を溶解することができる。アミノ酸、ペプチド、タンパク質および／または脂質を含有してもよい栄養補給ＩＶ溶液に組成物を添加することもできる。静脈内投与する組成物の量は、経口投与に用いるレベルと同様であってもよい。静脈内注入は経口投与より制御可能かつ正確である。
【００５６】
組成物を投与する頻度を計算する方法は当技術分野で周知であり、本発明に関してはいずれか適切な投与頻度（たとえば、６ｇ量を１日１回、または３ｇ量を１日２回）をいずれか適切な期間にわたって採用できる（たとえば、１回量を５分間にわたって、または１時間にわたって投与でき、あるいは多数回量を長期間にわたって投与できる）。ＨＭＢは長期間、たとえば数週間、数か月間または数年間にわたって投与できる。組成物は、１日当たり１以上の用量（個別投与量）を含む個別投与量で投与して、１日または２４時間に投与する組成物の全量を構成する１日分の投与量にすることができる。
【００５７】
いずれか適切な用量のＨＭＢを本発明に関して使用できる。適量を計算する方法は当技術分野で周知である。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。本明細書中で全般的に記載し、実施例中に説明する本発明の組成物は、多様な配合および剤形で調製できることは、容易に理解されるであろう。よって、以下の現在好ましい態様の本発明の方法、配合物および組成物のより詳細な記載は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を限定するためのものではなく、それは現在好ましい本発明の態様の代表例にすぎない。
【００５９】
筋細胞におけるオートファジー
培養した初代ヒト骨格筋細胞（ＨＳＭＭ，Ｌｏｎｚａ）をコンフルエンスになるまで増殖させ、筋管に分化させた。次いで、１日置きに培地を交換しながら、これらの細胞にＨＭＢ（１ｍＭ）を４日間補給した（処理グループまたは対照グループについてｎ＝６）。処理の終了時に、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により遺伝子発現（ｍＲＮＡ）を判定した。正規化のために、ｍＲＮＡ信号を同時増幅したリボソームタンパク質３６Ｂ４の信号に対して調整した。ＡＴＧ７遺伝子発現の有意の（ｐ＜０．０１）アップレギュレーションが観察された。結果を図２に示す。
【００６０】
脂肪細胞および前駆脂肪細胞におけるオートファジー
実施例１
脂肪分解および遺伝子発現の判定のために、分化した脂肪細胞を標準増殖培地中においてＨＭＢで処理した。脂肪細胞を１ｍＭ  ＨＭＢで４８時間、前処理して（ｎ＝４）、基礎脂肪分解および１μＭイソプロテレノール刺激脂肪分解を得た（図３Ａ）。９６時間の処理後に脂肪トリグリセリドリパーゼ(adipose triglyceride lipase)（ＡＴＧＬ）およびオートファジー関連タンパク質（ＡＴＧ７）の遺伝子発現が有意に増大していた（図３Ｂ，ｎ＝６）  ＊ｐ＜０．０５。これは、ＨＭＢが古典的なトリグリセリド脂肪分解だけでなくオートファジー仲介による細胞脂質蓄積の可動化（リポファジー）をも活性化することを示唆する。
【００６１】
実施例２
正常なヒトから分離した皮下前駆脂肪細胞の系統（非糖尿病対照）を用いた。これらの細胞は良好に分化し（参照：図４）、ＨＭＢがリポファジーに及ぼす効果を調べるための良好なインビトロモデルを提供する。ヒト皮下脂肪細胞はコンフルエンス後１４日目に効率的な脂肪滴蓄積を示していた（図４）。分化した脂肪細胞（コンフルエンス後１４日目）を普通増殖培地に補給した１ｍＭ  ＨＭＢで４日間処理した。溶解物をリン酸化ＡＭＰＫ基質（コンセンサスモチーフＬＣＲＸＸｐＳ／ｐＴ）に対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検査してＡＭＰＫ活性化の広域評価を求め、総ＡＭＰＫレベルも測定した。ＨＭＢで処理した脂肪細胞ではＡＭＰＫ基質リン酸化強度が著しく有意に増大し（図５）、一方、総ＡＭＰＫレベルは有意には変化しなかった。図５Ａは１ｍＭ  ＨＭＢで９６時間処理した初代脂肪細胞を示す。細胞を溶解し、リン酸化されたＡＭＰＫターゲットおよび総ＡＭＰＫレベルを調べた（図５Ｂ）。デンシトメトリー結果はＡＭＰＫターゲットのリン酸化における有意の増大を立証した。ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１。この効果は同様に処理したＨＥＫ２９３細胞には観察されず（データを示していない）、これは、ＨＭＢによるＡＭＰＫ制御が細胞特異的であること、ならびにそれがＨＭＢ処理した脂肪細胞におけるオートファジーのアップレギュレーションおよび脂肪分解の増大に寄与することの指標となる。
【００６２】
ＨＭＢ処理した初代脂肪細胞からの遺伝子発現解析により、オートファジーをアップレギュレートする２つの鍵転写因子：ＢＮＩＰ３およびＴＦＥＢについて、ｍＲＮＡレベルの増大が明らかになった。図６は、１ｍＭ  ＨＭＢで９６時間処理した後のヒト初代脂肪細胞におけるこれらのオートファジー関連転写因子の発現を示す。ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５。これらの転写因子は２つの異なるオートファジー経路を表わす。ＢＮＩＰ３はＦｏｘｏ１の転写ターゲットであり、ＡＭＰＫとは無関係にｍＴＯＲシグナル伝達経路を阻害する；ＴＦＥＢはＣＲＥＢ活性化により転写誘導され、オートファジー関連遺伝子および同様にリソソーム遺伝子の主要な転写レギュレーターである。
【００６３】
実施例３
ＨＭＢ活性化されたリポファジーを可視化するための初代脂肪細胞ベースのアッセイ法を開発した。初代前駆脂肪細胞をガラスカバースリップ上で標準増殖培地中において培養し、ＨＭＢで４日間処理した。ＤＡＰＩ含有培地で細胞を固定および封入し、６０×対物レンズでイメージングした。オートファジーベシクルは緑色信号が分解して赤色であり、これはオートファジー活性化の指標となる（図７）。核は青色に染色される（図７）。二重標識ＬＣ３レトロウイルス発現構築体を利用して、２９３ＧＰＧ細胞を用いて組換えレトロウイルスを作成した。初代前駆脂肪細胞にこれらのウイルス粒子を感染させ、感染の４日後に開始してイメージング実験前の２週間、ジェネチシン(geneticin)で選択した。ＬＣ３融合構築体はオートファゴソームを標識し、二重信号を宿す；ＤｓＲｅｄおよびＧＦＰ緑色のプローブ。基底状態では、緑色と赤色の信号が共局在し、融合パネル内に黄色信号が生じる（図７の上パネル；ＨＭＢなし）。オートファジーが活性化されると、ＧＦＰプローブがＡＴＧ４によりＬＣ３から開裂し、分解されて、緑色信号が消失し、融合パネル内の共局在が存在しなくなる。最初の試験はＬＣ３含有レトロウイルスを感染させた前駆脂肪細胞を用い、１ｍＭ  ＨＭＢで４日間処理し、または処理しなかった（図７，上：無ＨＭＢ，下，＋ＨＭＢ）。ＨＭＢ処理後には緑色信号の消失および緑色／赤色共局在の非存在が観察された。さらに、オートファジー斑点サイズの有意の増大が観察された（図７）。
【００６４】
ＨＭＢ処理した筋細胞（ＨＳＭＭ）および脂肪細胞（ＳＧＢＳ）由来の溶解物を、蛍光タンパク質アレイにより分析した。多くのｍＴＯＲターゲットが両細胞系において制御された（図８）。ＨＭＢ処理したＳＧＢＳ脂肪細胞を用いて、シグナル伝達タンパク質アレイ上のセリン１３３におけるＣＲＥＢリン酸化の増大がみられた（図８）。よって、Ｓ１３３におけるＣＲＥＢリン酸化の活性化はこれらの脂肪細胞においてＴＦＥＢの誘導を仲介し、この経路がオートファジーのアップレギュレーションを生じる。
【００６５】
図８に示すように、ＳＧＢＳ脂肪細胞のＨＭＢ処理はＣＲＥＢリン酸化の増大をもたらし、それが転写因子ＴＦＥＢを誘導してオートファジー遺伝子をアップレギュレートする。ＨＳＰ２７リン酸化の増大と共にＹｅｓキナーゼリン酸化の増大がこれらの細胞において立証され、それがオートファジー刺激および脂肪滴クリアランス増大につながる。ｍＴＯＲ経路の活性低下がみられ、その結果、オートファジーの脱阻害が生じる。ｐＳＴＡＴ３およびｐ５３の活性低下がみられ、それはオートファジーを増強する。
【００６６】
同様に図８において、多くのｍＴＯＲターゲットの有意の低減から示されるように筋細胞（ＨＳＭＭ）のＨＭＢ処理はｍＴＯＲ活性の阻害をもたらした：幾つかのトレオニンｐ−部位におけるｐ７０  Ｓ６キナーゼ、ｍＴＯＲ部位におけるＲＳＫ  １／２／３（Ｓ４７３）。これらのデータはオートファジーインヒビターＳＴＡＴ３およびｐ５３の活性化の低減を示す。
【００６７】
ＨＭＢによるＡＭＰＫ活性化はｍＴＯＲ経路を阻害し、よってオートファジーを脱阻害する。
合わせると、ＨＭＢがオートファジーおよび／またはリポファジーに影響を及ぼす幾つかの経路が同定された。これらの経路を図９の図に表わす。
【００６８】
これらの実験例は、ＨＭＢが筋細胞、前駆脂肪細胞および脂肪細胞においてオートファジーおよびリポファジーを調節することを立証する。このオートファジーおよびリポファジーの調節の結果、下記を含めたオートファジーおよびリポファジー関連の疾患および状態が治療、予防、阻害、軽減または遅延される：癌、神経変性疾患、心血管疾患、肝疾患、感染症、筋肉の疾患および障害、ならびに肥満症、インスリン抵抗性およびＩＩ型糖尿病を含めた代謝障害。オートファジーおよびリポファジーのモジュレーターとしてのＨＭＢの使用はまた、寿命および健康寿命を増大させ、老化を遅延し、個体が活動的なライフスタイルを送ることができる期間を延長する。
【００６９】
以上の記載および図面は本発明の具体的態様を含む。以上の態様および本明細書に記載する方法は、当業者の能力、経験および好みに基づいて変更できる。本方法の工程を特定の順序で単に列記したものは、本方法の工程の順序に対する何らかの制限となるものではない。以上の記載および図面は本発明を説明および図示するにすぎず、特許請求の範囲でそのように限定しない限り、本発明はそれらに限定されない。開示内容を見た当業者は本発明の範囲から逸脱することなく本発明の改変および変更を行なうことができるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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