(57)【要約】  本発明は、ＥＧＦＲｖIII(上皮成長因子受容体変異体III)に特異的に結合するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供する。本発明は、そのようなＣＡＲ、ＣＡＲをコードする核酸およびそれを作製する方法、操作された免疫細胞および核酸にさらに関する。本発明は、神経膠芽腫のようながんを含むＥＧＦＲｖIII媒介性の病理の処置のために、これらのＣＡＲおよび操作された免疫細胞を使用する治療方法にさらに関する。
2019506394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む上皮成長因子受容体変異体III(ＥＧＦＲｖIII)特異的キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)であって、細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５、９、１１、１３、１５、３７、３９、４１、４３もしくは４８に示される配列を含む重鎖可変(ＶＨ)領域からの３つのＣＤＲを含むＶＨ領域；および配列番号６、１０、１２、１４、１６、３８、４０、４２もしくは４９に示される配列を含む軽鎖可変(ＶＬ)領域からの３つのＣＤＲを含むＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を含む、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項２】
ＶＨ領域が、配列番号５、９、１１、１３、１５、３７、３９、４１、４３、４８に示される配列、もしくはＣＤＲ内にない残基において１つもしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含み、かつ／またはＶＬ領域が、配列番号６、１０、１２、１４、１６、３８、４０、４２、４９に示されるアミノ酸配列、もしくはＣＤＲ内にない残基において１つもしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む、請求項１に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項３】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１または２に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項４】
細胞内シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む、請求項１または２に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項５】
細胞内シグナル伝達ドメインが第１細胞内シグナル伝達ドメインであり、ＣＡＲが第２細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項６】
第１細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、第２細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む、請求項５に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項７】
細胞外リガンド結合ドメインと第１膜貫通ドメインの間にストークドメインをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項８】
ストークドメインが、ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＣＤ２８ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジおよびＦｃγＲＩＩＩαヒンジからなる群から選択される、請求項７に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項９】
第１膜貫通ドメインが、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項１０】
第２細胞外リガンド結合ドメインをさらに含み、第２細胞外リガンド結合ドメインがＥＧＦＲｖIIIに特異的でない、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項１１】
細胞外リガンド結合ドメイン、第１膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、単一のポリペプチド上にある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項１２】
第２膜貫通ドメインをさらに含み、第１膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインが、第１のポリペプチド上にあり、第２膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが、第２のポリペプチド上にあり、第１膜貫通ドメインが、高親和性ＩｇＥ受容体(ＦｃεＲＩ)のα鎖由来の膜貫通ドメインを含み、第２膜貫通ドメインが、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項１３】
同時刺激分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した第３膜貫通ドメインを含む第３のポリペプチドをさらに含み、第３膜貫通ドメインが、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む、請求項１２に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１６】
その細胞表面膜において請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する、操作された免疫細胞。
【請求項１７】
ＥＧＦＲｖIIIに特異的でない別のＣＡＲをさらに含む、請求項１６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１８】
自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１６または１７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項１９】
自殺ポリペプチドがＲＱＲ８である、請求項１８に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２０】
自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと同じ核酸分子の一部であり、自殺ポリペプチドが、ＣＡＲと同じポリペプチド鎖中にある、請求項１８に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２１】
自殺ポリペプチドがリツキシマブにより認識されるエピトープを含む、請求項２０に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２２】
免疫細胞が炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、記憶Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞に由来する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２３】
１以上の内在性遺伝子の破壊をさらに含み、内在性遺伝子が、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体(ＧＲ)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)またはプログラム死−１(ＰＤ−１)をコードする、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２４】
免疫細胞が健常ドナーから得られる、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２５】
免疫細胞が患者から得られる、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２６】
医薬としての使用のための、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２７】
医薬が多形神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、巨細胞膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星状細胞腫、脈絡嚢癌腫、未分化神経節膠腫、松果体芽細胞腫、松果体細胞腫、髄膜腫、髄上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、混合膠腫、頭頚部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、髄芽細胞腫、結腸直腸がん、肛門がん、子宮頸部がん、腎臓がん、皮膚がん、膵臓がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、甲状腺がん、中皮腫、子宮がん、リンパ腫および白血病からなる群から選択される、ＥＧＦＲｖIII関連がんの処置における使用のためのものである、請求項２６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２８】
がんが多形神経膠芽腫、頭頚部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がんまたは前立腺がんである、請求項２６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２９】
免疫細胞を操作する方法であって、
ａ. 免疫細胞を用意し；そして
ｂ. 少なくとも１つの請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを細胞の表面において発現させること
を含む方法。
【請求項３０】
ａ. 免疫細胞を用意し；
ｂ. 前記ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞内に導入し；そして
ｃ. 前記ポリヌクレオチドを細胞内に発現させること
を含む、請求項２９に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項３１】
ａ. 免疫細胞を用意し；
ｂ. 前記ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞内に導入し；そして
ｃ. ＥＧＦＲｖIIIに特異的でない、少なくとも１つの他のＣＡＲを導入すること
を含む、請求項２９に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項３２】
処置を必要とする対象を処置する方法であって、
ａ. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを表面において発現する免疫細胞を用意し；そして
ｂ. 前記免疫細胞を前記患者に投与すること
を含む、方法。
【請求項３３】
請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
対象におけるＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞に関連した状態を処置する方法であって、請求項３３に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
状態ががんである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
がんが多形神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、巨細胞膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星状細胞腫、脈絡叢癌腫、未分化神経節膠腫、松果体芽細胞腫、松果体細胞腫、髄膜腫、髄上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、頭頚部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、髄芽細胞腫、結腸直腸がん、肛門がん、子宮頸部がん、腎臓がん、皮膚がん、膵臓がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、甲状腺がん、中皮腫、子宮がん、リンパ腫および白血病からなる群から選択されるＥＧＦＲｖIII関連がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
がんが多形神経膠芽腫、頭頚部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がんまたは前立腺がんである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、請求項３３に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項３９】
対象におけるＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、請求項３３に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項４０】
ＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、請求項３３に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に関する。ＣＡＲは、リガンド結合ドメイン特性を利用して、免疫細胞の特異性および反応性を選択された標的に向け直すことができる。特に、本発明は、上皮成長因子受容体変異体IIIに特異的に結合するＣＡＲ(ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ)に関する。本発明は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびその表面においてＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する単離細胞にさらに関する。本発明は、その表面においてＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を操作するための方法にさらに関する。本発明は、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)、非小細胞肺がん、頭頸部がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんのような固形腫瘍の処置のために特に有用である。本発明は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを含む免疫細胞(ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞)、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物およびＥＧＦＲｖIII媒介性の病理を処置するためにＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲの腫瘍特異的変異体であるＥＧＦＲ変異体III(ＥＧＦＲｖIII)は、しばしば野生型ＥＧＦＲ遺伝子の増幅を伴うゲノム再編成の産物である。ＥＧＦＲｖIIIは、エクソン２〜７のインフレーム欠失により生成され、ジャンクションにおけるグリシン置換とともに２６７アミノ酸の欠失をもたらす。切断型受容体は、リガンドに結合するその能力を失っているが、構成的キナーゼ活性を獲得している。興味深いことに、ＥＧＦＲｖIIIは、常に、同じ腫瘍細胞中で完全長野生型ＥＧＦＲと同時発現する。さらに、ＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞は、増殖、浸潤、血管新生およびアポトーシスに対する抵抗性の増加を示す。
【０００３】
ＥＧＦＲｖIIIは、多形神経膠芽腫(ＧＢＭ)において最も頻繁に認められる。ＧＢＭの２５〜３５％がこの切断型受容体を保有すると推定される。さらに、その発現は、より高悪性度の表現型および予後不良を反映することが多い。ＧＢＭ以外にも、ＥＧＦＲｖIIIの発現は、非小細胞肺がん、頭頸部がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんのような他の固形腫瘍においても報告されてきた。対照的に、ＥＧＦＲｖIIIは、健康な組織では発現されない。ＥＧＦＲｖIIIは正常組織で発現しないので、腫瘍特異的な標的療法を開発するための理想的な標的である。
【０００４】
悪性腫瘍関連抗原を認識するように遺伝子改変されたＴ細胞の養子移植は、がんを処置するための新しいアプローチとして有望であることが示されている(例えば、Brenner et al., Curent Opinion in Immunology, 22(2):251-257(2010);Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308(2008)参照)。Ｔ細胞は、抗原認識部位およびＴ細胞活性化ドメインからなる融合タンパク質であるキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝子改変可能である(例えば、Eschar et al., Poc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2):720-724(1993)およびSadelain et al., Curr. Opin. Immunol., 21(2):215-223(2009)参照)。したがって、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲおよびＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む抗ＥＧＦＲｖIIIアンタゴニストを使用する、多形神経膠芽腫のような固形腫瘍の処置は、有望な治療剤となる。
【発明の概要】
【０００５】
ＥＧＦＲｖIIIに結合するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)が提供される。ある特定のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、Ｔ細胞中で発現されたときに、ＥＧＦＲｖIIIとの接触によりＴ細胞を活性化するのに有効であることが示されている。有利には、本明細書に提供されるＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、ヒトＥＧＦＲｖIIIに結合する。また有利には、本明細書に提供されるＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＥＧＦＲｖIII発現細胞との接触により脱顆粒活性、インターフェロンガンマ産生の増大および／または細胞傷害活性を示す。
【０００６】
一態様では、本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、第１膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲであって、細胞外リガンド結合ドメインが、(ａ)(ｉ)配列番号６２、６３、６４、７４、７５、７６、８０、８１、８２、８８、８９、９０、１０９、１１０、１１１、１１５、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１３７、１３８もしくは１３９に示される配列を含むＶＨ相補性決定領域１(ＣＤＲ１)；(ii)配列番号７０、７１、７７、７８、８３、８４、８６、８７、９１、９２、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１２７、１２８、１４０もしくは１４１に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；および配列番号７３、７９、８５、１１４、１２０、１２６、１２９もしくは１４２に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変(ＶＨ)領域ならびに／あるいは(ｂ)(ｉ)配列番号１４９、１５６、１５９、１６２、１６５、１８２、１８５、１８７もしくは１９５に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；(ii)配列番号１５２、１５７、１６０、１６３、１８３、１８６、１８８もしくは１９６に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１５３、１５８、１６１、１６４、１８４、１８９もしくは１９７に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変(ＶＬ)領域を含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、第１膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲであって、細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号５、９、１１、１３、１５、３７、３９、４１、４３もしくは４８に示される配列を含む重鎖可変(ＶＨ)領域からの３つのＣＤＲを含むＶＨ領域；および／または配列番号６、１０、１２、１４、１６、３８、４０、４２もしくは４９に示される配列を含む軽鎖可変(ＶＬ)領域からの３つのＣＤＲを含むＶＬ領域を含む一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを提供する。ある実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号５、９、１１、１３、１５、３７、３９、４１、４３もしくは４８に示される配列またはＣＤＲ内にない残基において１つもしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むことができ、かつ／あるいはＶＬ領域は、配列番号６、１０、１２、１４、１６、３８、４０、４２もしくは４９に示されるアミノ酸配列またはＣＤＲ内にない残基において１つもしくは数個の保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含むことができる。例えば、ある実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬ領域は、上記アミノ酸配列またはＣＤＲ内にない残基における１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個以下の保存的置換を有するその変異体を含むことができる。
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、第１膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲであって、細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１１、１５、３０、３７もしくは４１に示される配列を含む重鎖可変(ＶＨ)領域；および／または配列番号１２、１６、３１、３８もしくは４２に示される配列を含む軽鎖可変(ＶＬ)領域を含む一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを提供する。ある実施形態では、ＶＨは、配列番号１１に示される配列を含み、ＶＬは、配列番号１２に示される配列を含む。ある実施形態では、ＶＨは、配列番号１５に示される配列を含み、ＶＬは、配列番号１６に示される配列を含む。ある実施形態では、ＶＨは、配列番号３０に示される配列を含み、ＶＬは、配列番号３１に示される配列を含む。ある実施形態では、ＶＨは、配列番号３７に示される配列を含み、ＶＬは、配列番号３８に示される配列を含む。ある実施形態では、ＶＨは、配列番号４１に示される配列を含み、ＶＬは、配列番号４２に示される配列を含む。
【０００９】
ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、ＣＡＲは、第２細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。ある実施形態では、第２細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むことができる。ある実施形態では、第１細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含み、第２細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含む。
【００１０】
ある実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと第１膜貫通ドメインの間にストーク(stalk)ドメインを含むことができる。ある実施形態では、ストークドメインは：ヒトＣＤ８αヒンジ、ヒトＣＤ２８ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジおよびＦｃγＲIIIαヒンジからなる群から選択され得る。
【００１１】
ある実施形態では、第１膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含むことができる。
【００１２】
ある実施形態では、ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖIIIに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。
【００１３】
ＣＡＲのある実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、第１膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、単一のポリペプチド上にある。
【００１４】
ある実施形態では、ＣＡＲは、第２膜貫通ドメインを含むことができ、第１膜貫通ドメインおよび細胞外リガンド結合ドメインは、第１のポリペプチド上にあり、第２膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、第２のポリペプチド上にあり、第１膜貫通ドメインは、高親和性ＩｇＥ受容体(ＦｃεＲＩ)のα鎖由来の膜貫通ドメインを含み、第２膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。ある実施形態では、ＣＡＲは、同時刺激分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した第３膜貫通ドメインを含む第３のポリペプチドを含むことができ、第３膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγまたはβ鎖由来の膜貫通ドメインを含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、その細胞表面膜において本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する、操作された免疫細胞を提供する。ある実施形態では、操作された免疫細胞は、ＥＧＦＲｖIIIに特異的でない別のＣＡＲを含むことができる。
【００１８】
ある実施形態では、操作された免疫細胞は自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。ある実施形態では、自殺ポリペプチドはＲＱＲ８である。ある実施形態では、自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドとは異なる核酸分子中にある。ある実施形態では、自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと同じ核酸分子の一部である。
【００１９】
ある実施形態では、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを含有する操作された免疫細胞は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲのポリペプチド鎖とは別のポリペプチド鎖中に自殺ポリペプチドを含むことができる。
【００２０】
ある実施形態では、本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、ＣＡＲと同じポリペプチド鎖中に自殺ポリペプチドも含む。例えば、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲのｓｃＦｖとヒンジ配列の間にあってもよい。ある実施形態では、ＣＡＲ中の自殺ポリペプチドは、本明細書に提供されるＲ２フォーマットを有してもよい。ある実施形態では、自殺ポリペプチドはリツキシマブにより認識されるエピトープを含む。
【００２１】
ＣＡＲ中の自殺ポリペプチドもコードする、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドも、本明細書に提供される。
【００２２】
ある実施形態では、免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、記憶Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞に由来し得る。
【００２３】
ある実施形態では、操作された免疫細胞は、１以上の内在性遺伝子中に破壊を含むことができ、内在性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体(ＧＲ)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)または例えば、プログラム死−１(ＰＤ−１)のような免疫チェックポイントタンパク質をコードする。
【００２４】
ある実施形態では、免疫細胞は、健常ドナーから得られる。ある実施形態では、免疫細胞は、患者から得られる。
【００２５】
別の態様では、本発明は、その細胞表面膜において、本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する、医薬としての使用のための操作された免疫細胞を提供する。ある実施形態では、医薬は、多形神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、巨細胞膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星状細胞腫、脈絡嚢癌腫、未分化神経節膠腫、松果体芽細胞腫、松果体細胞腫、髄膜腫、髄上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、混合膠腫、頭頚部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、髄芽細胞腫、結腸直腸がん、肛門がん、子宮頸部がん、腎臓がん、皮膚がん、膵臓がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、甲状腺がん、中皮腫、子宮がん、リンパ腫および白血病からなる群から選択される、ＥＧＦＲｖIII関連がん(例えば、ＥＧＦＲｖIII発現を伴う何らかのがん)の処置における使用のためのものである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を用意すること；そして少なくとも１つの本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを細胞の表面において発現させることを含む方法を提供する。
【００２７】
ある実施形態では、方法は、免疫細胞を用意すること；上記ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞内に導入すること；そして上記ポリヌクレオチドを細胞内に発現させることを含む。
【００２８】
ある実施形態では、方法は、免疫細胞を用意すること；上記ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞内に導入すること；そしてＥＧＦＲｖIIIに特異的でない、少なくとも１つの他のＣＡＲを導入することを含む。
【００２９】
別の態様では、本発明は、悪性細胞に関連した状態を患う対象を処置する方法であって、本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを表面において発現する免疫細胞を用意すること；そして上記免疫細胞を上記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、対象におけるＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞に関連した状態を処置する方法であって、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む、特許請求される医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、状態はがんである。ある実施形態では、がんは、多形神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、巨細胞膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星状細胞腫、脈絡叢癌腫、未分化神経節膠腫、松果体芽細胞腫、松果体細胞腫、髄膜腫、髄上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、混合膠腫、頭頚部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、髄芽細胞腫、結腸直腸がん、肛門がん、腎臓がん、子宮頸部がん、肝臓がん、膵臓がん、胃がん、甲状腺がん、中皮腫、子宮がんおよび膀胱がんからなる群から選択されるＥＧＦＲｖIII関連がんである。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、対象におけるＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、本明細書に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、３つのＥＧＦＲｖIII抗体：ｍＡｂ  ４２Ｇ９(図１Ａ)、３２Ａ１０(図１Ｂ)および３２Ｇ８(図１Ｃ)の、３つのＦ９８細胞株：Ｆ９８(ＥＧＦＲ陰性)、Ｆ９８−ＥＧＦＲｗｔおよびＦ９８−ＥＧＦＲｖIIIへのＦＡＣＳ結合ヒストグラムの例を示す。Ｘ軸は、蛍光強度であり；Ｙ軸は、最大値のパーセンテージ／normalized to modeである。
【００３６】
【図２Ａ】図２Ａは、異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを含有するＣＡＲについてのＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲの発現を要約する棒グラフを示す。
【００３７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、組換えＥＧＦＲ−ｍＦｃおよびＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃに結合したＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のパーセンテージを要約する棒グラフを示す。
【００３８】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＡＲ  Ｔ細胞における、１０種の異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを含有するＣＡＲの発現を要約する棒グラフを示す。
【００３９】
【図３】図３は、異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の、単独でのまたは様々な細胞株：いかなるＥＧＦＲタンパク質も発現しない細胞(ＮＣＩ−Ｈ５２２およびＵ８７−ＫＯ)、高レベルの野生型ＥＧＦＲを発現する細胞(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔ)、もしくは低レベル(ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII)および高レベル(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)のＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞との共培養に際した、脱顆粒活性を要約する棒グラフを示す。
【００４０】
【図４】図４は、異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による、単独でのまたは様々な細胞株：いかなるＥＧＦＲタンパク質も発現しない細胞(ＮＣＩ−Ｈ５２２およびＵ８７−ＫＯ)、高レベルの野生型ＥＧＦＲを発現する細胞(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔ)、もしくは低レベル(ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII)および高レベル(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)のＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞との共培養に際した、ＩＦＮγ分泌を要約する棒グラフを示す。
【００４１】
【図５】図５は、異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の、野生型ＥＧＦＲ発現細胞株(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔ)対ＩＩ高ＥＧＦＲｖＩ(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)および低ＥＧＦＲｖＩ(ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII)発現細胞株に対する細胞傷害性を比較する棒グラフを示す。
【００４２】
【図６】図６は、異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の、皮下ＧＢＭ異種移植片モデルにおけるＧＢＭ細胞に対する抗腫瘍活性を要約する棒グラフを示す。
【００４３】
【図７】図７は、Ｔ細胞形質導入後４日目、９／１０日目および１４／１５日目における、ＣＡＲの４つの異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現し、ＣＡＲにＣＡＲ内自殺配列Ｒ２を保有するＣＡＲ  Ｔ細胞による、ＣＡＲ発現を要約する棒グラフを示す。
【００４４】
【図８】図８は、Ｔ細胞形質導入後４日目および１４／１５日目における、ＣＡＲの４つの異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現し、ＣＡＲ内自殺配列Ｒ２を保有するＣＡＲ  Ｔ細胞による、ＣＡＲ発現を要約する棒グラフを示す。
【００４５】
【図９】図９は、ＣＡＲの４つの異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローンを発現し、ＣＡＲ内自殺配列Ｒ２を保有するＣＡＲ  Ｔ細胞の、高レベル(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)および低レベル(ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII)ＥＧＦＲｖIII発現細胞株に対する細胞傷害性を要約する棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
本明細書に開示された発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)およびＥＧＦＲｖIII(例えば、ヒトＥＧＦＲｖIII)に特異的に結合するＣＡＲを含む免疫細胞(例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞)を提供する。本発明は、これらのＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物およびこれらのＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞を作製し、使用する方法も提供する。本発明は、がんのような、対象におけるＥＧＦＲｖIII媒介性の病理に関連した状態を処置するための方法も提供する。
【００４７】
一般的技術
本発明の実施は、別段の指示のない限り、当業者の能力の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、免疫学、ウイルス学、モノクローナル抗体の生成および操作の従来技術を採用する。そのような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)；PCR:  The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies:  a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies:  a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using antibodies:  a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)のような文献において十分に説明されている。
【００４８】
定義
本明細書中で使用されるとき、用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、リガンドに結合することができるオリゴまたはポリペプチドをさす。ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができることが好ましい。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特別な疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。
【００４９】
用語「ストークドメイン」または「ヒンジドメイン」は、細胞外リガンド結合ドメインに膜貫通ドメインを連結するために機能する任意のオリゴまたはポリペプチドをさすために、本明細書中で互換的に使用される。特に、ストークドメインは、細胞外リガンド結合ドメインのためのさらなるフレキシビリティおよびアクセシビリティをもたらすために使用される。
【００５０】
用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊機能を遂行するように細胞を導く、タンパク質の部分をさす。
【００５１】
本明細書中で使用されるとき、「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって増殖のような、しかしそれに限定されない、細胞による共刺激反応を仲介するＴ細胞上のコグネート結合パートナーをさす。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【００５２】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上のコグネート共刺激シグナル分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドを担持したＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体との結合により生成した一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化、サイトカイン産生などを含むが、これに限定されない、Ｔ細胞応答を仲介するシグナルを生成する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７−１(ＣＤ８０)、Ｂ７−２(ＣＤ８６)、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド(ＩＣＯＳ−Ｌ)、細胞間接着分子(ＩＣＡＭ)、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０,ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ,ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これに限定されない。共刺激リガンドは、中でも、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのような、しかしこれに限定されない、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含する。
【００５３】
「抗体」は、イムノグロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭化水素、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような標的への特異的結合が可能なイムノグロブリン分子である。本明細書中で使用されるとき、この用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合断片(Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖなど)、一本鎖(ｓｃＦｖ)およびドメイン抗体(例えば、サメおよびラクダ抗体を含む)、ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含むイムノグロブリン分子の任意の他の変更された構成を包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＭのような任意のクラス(またはそのサブクラス)を含み、抗体は、いずれかの特別なクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、イムノグロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。イムノグロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちの数種はさらに、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられ得る。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元形状は周知である。
【００５４】
本明細書中で使用されるとき、抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」なる用語は、所与の抗原(例えば、ＥＧＦＲｖIII)に特異的に結合する能力を保持する、完全な抗体の１以上の断片をさす。抗体の抗原結合機能は、完全な抗体の断片により遂行され得る。抗体の「抗原結合断片」なる用語に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ(ａｂ’)２；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)、ならびに単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)が挙げられる。
【００５５】
抗体、抗体コンジュゲートまたは標的(例えば、ＥＧＦＲｖIIIタンパク質)に「優先的に結合する」または「特異的に結合する」(本明細書では互換的に使用される)ポリペプチドは、当分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定する方法も当分野で周知である。分子は、別の細胞または物質とよりも特別な細胞または物質とより頻繁に、より迅速に、より長い時間および／またはより大きな親和性をもって反応もしくは会合する場合、「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すと言われる。抗体は、それが他の物質よりも大きな親和性、結合活性をもって、より迅速におよび／またはより長い時間結合する場合、標的に「特異的に結合」または「優先的に結合」する。例えば、ＥＧＦＲｖIIIエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、これが他のＥＧＦＲｖIIIエピトープまたは非ＥＧＦＲｖIIIエピトープに結合するよりも大きな親和性、結合活性をもって、より迅速におよび／またはより長い時間このエピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体(または部分もしくはエピトープ)は、第２の標的に特異的または優先的に結合してもよくまたはしなくてもよいことも理解される。そのようなものとして、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を(含み得るが)必ずしも必要としない。必ずではないが、一般に、結合への言及は、優先的な結合を意味する。
【００５６】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独または組み合わせでさす。当分野で知られているとおり、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域(ＣＤＲ)により接続された４つのフレームワーク領域(ＦＲ)からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより一緒にごく接近して保持され、他方の鎖由来のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術：(１)種間配列多様性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD))；および(２)抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948)がある。本明細書中で使用されるとき、ＣＤＲは、いずれかのアプローチによりまたは両アプローチの組み合わせにより定義されるＣＤＲをさし得る。
【００５７】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両者の集積、ＡｂＭ、接触および／または立体構造的定義あるいは当分野で周知の任意のＣＤＲ決定方法により同定された可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによりもともと定義された超可変領域として同定されてもよい。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C参照。ＣＤＲの位置は、もともとはＣｈｏｔｈｉａらにより記載された構造的ループ構造としても同定され得る。例えば、Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989参照。ＣＤＲ同定のための他のアプローチは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの折衷案であり、Oxford Molecular's AbM antibody modellingソフトウエア(現在、Accelrys(登録商標))を使用して導かれる「ＡｂＭ定義」またはMacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996に示された、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」を含む。本明細書中でＣＤＲの「立体構造的定義」と呼ばれる別のアプローチでは、ＣＤＲの位置が、抗原結合にエンタルピーにおいて貢献する残基として定められ得る。例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008参照。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記アプローチの一つに厳密に従わないかもしれないが、それでも、特別な残基もしくは残基群またはＣＤＲ全体でさえ抗原結合に大きく影響しないという予測または実験的知見を踏まえて短くされるかまたは長くされる可能性があるにもかかわらず、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書中で使用されるとき、ＣＤＲは、当分野で知られたアプローチの組み合わせを含む任意のアプローチにより定められるＣＤＲをさし得る。本明細書中で使用される方法は、これらのアプローチのいずれかによって定められるＣＤＲを利用し得る。１を超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張(extended)、ＡｂＭ、接触および／または立体構造による定義に従って定められ得る。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をさし、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある自然起源の突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対するものであり、高度に特異的である。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られているという抗体の特性を示し、何らかの特別な方法による抗体産生を必要とすると理解されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler and Milstein, Nature 256:495, 1975により記載されたハイブリドーマ法により作製されてもよくまたは米国特許第４,８１６,５６７号に記載されたような組換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体は、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990中に記載された技術を使用して生成されたファージライブラリーから単離されてもよい。
【００５９】
本明細書中で使用されるとき、「ヒト化」抗体は、非ヒトイムノグロブリン由来の最小配列を含有するキメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖またはその断片(例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２もしくは抗体の他の抗原結合部分配列)である、非ヒト(例えば、マウス)抗体の形態をさす。ヒト化抗体は、ヒトイムノグロブリン(レシピエント抗体)であって、その中でレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ(ドナー抗体)からの残基で置換されているヒトイムノグロブリンであることが好ましい。ある場合には、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基が、対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも認められないが、抗体の能力をさらに改良し、最適化するために含まれる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、その中ですべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒトイムノグロブリンのＣＤＲ領域に相当し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒトイムノグロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、イムノグロブリン定常領域またはドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒトイムノグロブリンのＦｃの少なくとも一部も含むことが最適である。国際公開第ＷＯ９９／５８５７２号に記載のとおりに改変されたＦｃ領域を有する抗体が好ましい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された１以上のＣＤＲ(ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２またはＣＤＲ  Ｈ３)を有し、これらは、元の抗体からの１以上のＣＤＲに「由来する」１以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【００６０】
本明細書中で使用されるとき、「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体および／または当業者に知られたもしくは本明細書に開示されたヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。そのような例の１つは、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当分野で知られた様々な技術を使用して生成され得る。一実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991)。ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子座が遺伝子導入により内在性遺伝子座の代わりに導入されている動物、例えば、内在性イムノグロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスの免疫化によっても作製され得る。このアプローチは、米国特許第５,５４５,８０７号；同第５,５４５,８０６号；同第５,５６９、８２５号；同第５,６２５,１２６号；同第５,６３３,４２５号；および同第５,６６１,０１６号に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体からもしくはｃＤＮＡのシングルセルクローニングから回収されてもよくまたはインビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991;および米国特許第５,７５０,３７３号参照。
【００６１】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体のような、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体をさすことが意図される。
【００６２】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸鎖をさすために本明細書中で互換的に使用される。例えば、この鎖は、比較的短く(例えば、１０〜１００アミノ酸)てもよくまたはより長くてもよい。この鎖は、線状または分枝していてもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、かつ／または非アミノ酸により中断されていてもよい。この用語は、自然にまたは介入により；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または標識化構成要素とのコンジュゲーションのような任意の他の操作もしくは修飾により修飾されたアミノ酸鎖も包含する。この定義には、例えば、１以上のアミノ酸の類似体(例えば、非天然アミノ酸などを含む)だけでなく、当分野で知られた他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、一本鎖または会合した鎖として生じ得ると理解される。
【００６３】
「一価抗体」は、１分子当たり(例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ)１つの抗原結合部位を含む。ある場合には、一価抗体は１を超える抗原結合部位を有し得るが、結合部位は異なる抗原に由来する。
【００６４】
「二価抗体」は、１分子(例えば、ＩｇＧ)当たり２つの抗原結合部位を有する。ある場合には、２つの抗原結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は二重特異性であり得る。
【００６５】
「二重特異性(bispecific)」または「二重特異性(dual-specific)」は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体の２つの抗原結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【００６６】
「二機能性」は、２つのアームに同一の抗原結合部位(すなわち、同じアミノ酸配列)を有する抗体であるが、各結合部位は２つの異なる抗原を認識することができる。
【００６７】
本発明の抗体は、当分野で周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術またはそのような技術もしくは当分野ですでに知られた他の技術の組み合わせ(例えば、Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999およびFellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007参照)を使用して生成され得る。
【００６８】
当分野で知られているとおり、本明細書中で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチド鎖をさし、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基および／またはその類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖に組み込まれ得る任意の物質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体のような修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、鎖のアセンブリーの前または後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどにより、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾は、例えば、「キャップ」、１以上の自然起源のヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば、無電荷の結合(例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホアミデート(phosphoamidate)、カルバメートなど)によりおよび荷電した結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)により、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど)のようなペンダント部分を含有するもの、干渉物質(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を含むもの、キレーター(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を含むもの(例えば、アルファアノマー核酸など)だけでなく、ポリヌクレオチドの非修飾形態を含む。さらに、通常は糖に存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され、標準的な保護基によって保護され、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の結合を用意するために活性化されてもよくまたは固相支持体にコンジュゲーションされてもよい。５’および３’末端のＯＨは、アミンまたは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分によってリン酸化または置換されてもよい。他のヒドロキシルも標準的な保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファ−もしくはベータ−アノマー糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースのようなエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシドのような脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当分野で一般に知られたリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し得る。１以上のホスホジエステル結合が、代わりの連結基により置換されてもよい。これらの代わりの連結基は、ホスフェートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオエート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオエート」)、(Ｏ)ＮＲ２(「アミデート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２(「ホルムアセタール」)、式中、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたはエーテル結合(−Ｏ−)を含有してもよい置換もしくは非置換アルキル(１〜２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル(araldyl)により置換さ���ている、実施形態を含むが、これに限定されない。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。先の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書中で言及されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００６９】
当分野で知られているとおり、抗体の「定常領域」は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を単独でまたは組み合わせのいずれかをさす。
【００７０】
本明細書中で使用されるとき、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋(すなわち、混入物を含まない)、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋な材料をさす。
【００７１】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の組込みのためのベクターのレシピエントであることができるかまたはそうであった個別の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、自然の、偶発的なまたは計画的な突然変異のせいで、必ずしも元の親細胞と完全に同一(形態においてまたはゲノムＤＮＡ相補体において)でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、「免疫細胞」は、先天性および／または適応免疫応答の開始および／または遂行に機能的に関与する、造血系起源の細胞をさす。
【００７３】
当分野で知られているとおり、用語「Ｆｃ領域」は、イムノグロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域であってもよい。イムノグロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸びていると定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスのものである。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991。イムノグロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【００７４】
当分野で使用されるとおり、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を言い表す。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するものであり(ガンマ受容体)、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲIIIサブクラスの受容体を含み、これらの受容体のアレル変異体およびオルタナティブスプライシングを受けた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化受容体」)およびＦｃγＲＩＩＢ(「阻害受容体(inhibiting receptor)」)を含み、これらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる、類似したアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995において概説されている。「ＦｃＲ」は、新生児受容体、ＦｃＲｎも含み、これは、母体ＩｇＧの胎児への移行に関与する(Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976；およびKim et al., J. Immunol., 24:249, 1994)。
【００７５】
抗体に関して本明細書中で使用されるとき、用語「競合する」は、第２の抗体の存在下における第１の抗体とそのコグネートエピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下における第１の抗体の結合に比較して検出可能に減少するように、第１の抗体またはその抗原結合断片(または部分)が、第２の抗体またはその抗原結合部分への結合に十分に類似した様式でエピトープに結合することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も、第１の抗体の存在下で検出可能に減少するという別の可能性については、そのとおりであり得るが、その必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体の各エピトープへの結合を阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が、他の抗体のそのコグネートエピトープまたはリガンドとの結合を、同じ、より大きなまたは小さな程度まで検出可能に阻害する場合、抗体は、それらの各エピトープの結合に関して相互に「交差競合する(cross-compete)」と言われる。競合および交差競合する抗体は両方とも本発明に包含される。そのような競合または交差競合がそれにより起こるメカニズム(例えば、立体障害、コンフォメーション変化または共通のエピトープもしくはその一部への結合)に関わらず、当業者は、本明細書に提供される教示に基づいて、そのような競合および／または交差競合抗体が包含され、本明細書に開示された方法に有用であり得ることを理解するだろう。
【００７６】
本明細書中で使用されるとき、「自己」は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、上記患者またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)適合性ドナーに起源を有することを意味する。
【００７７】
本明細書中で使用されるとき、「同種間」は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、上記患者でなく、ドナーに起源を有することを意味する。
【００７８】
本明細書中で使用されるとき、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、以下の：新生物またはがん性細胞の増殖を低減させること(もしくは破壊すること)、新生物細胞の転移を阻害すること、ＥＧＦＲｖIII発現腫瘍のサイズを縮小させることもしくは減少させること、ＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)の寛解、ＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)に起因する症状を減少させること、ＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)を患っている者の生活の質を増大させること、ＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)を処置するために必要とされる他の医薬の用量を減少させること、ＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)の進行を遅らせること、ＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)を治癒させることおよび／またはＥＧＦＲｖIII関連疾患(例えば、がん)を有する患者の生存を延長することのうちの１以上を含むが、それに限定されない。
【００７９】
「軽快させる」は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを投与しない場合に比較して、１以上の症状を和らげることまたはその改善を意味する。「軽快させること」は、症状の持続時間の短縮または低減も含む。
【００８０】
本明細書中で使用されるとき、薬物、化合物または医薬組成物の「有効用量」または「有効量」は、任意の１以上の有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。予防的使用のためには、有益なまたは所望の結果は、疾患の生化学的、組織学的および／または行動的症状、その合併症および疾患の進行の間に表れる中間の病理学的表現型を含む、リスクを排除もしくは低減させること、重症度を和らげること、あるいは疾患の発端を遅らせることを含む。治療的使用のためには、有益なまたは所望の結果は、様々なＥＧＦＲｖIII関連疾患または状態(例えば、多形神経膠芽腫)の１つもしくは複数の症状の発生率を低減させることもしくは軽快、疾患を処置するために必要とされる他の医薬の用量を減少させること、別の医薬の効果を高めることおよび／または患者のＥＧＦＲｖIII関連疾患の進行を遅らせることのような臨床結果を含む。有効用量は、１回または複数回の投与において投与され得る。本発明の目的のためには、薬物、化合物または医薬組成物の有効用量は、直接的または間接的に、予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床的状況において理解されているとおり、薬物、化合物または医薬組成物の有効用量は、別の薬物、化合物または医薬組成物と併せて達成されても、されなくてもよい。よって、「有効用量」は、１以上の治療剤を投与する状況において考慮されてもよく、１以上の他の薬剤と併せて所望の結果が達成され得るかまたはされる場合、単一の薬剤は有効量で与えられると考えられてもよい。
【００８１】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも含むが、これに限定されない。
【００８２】
本明細書中で使用されるとき、「ベクター」は、１以上の目的の遺伝子または配列を宿主細胞にデリバリーし、好ましくは発現させることができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドもしくはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクターおよび産生細胞のようなある特定の真核細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターのようなプロモーターまたはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結される。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わされたときに、成分が生物学的活性を保持することを可能とし、対象の免疫系と反応性でない任意の材料を含む。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水のような任意の標準的な薬学的担体、油／水エマルジョンのようなエマルジョンおよび様々なタイプの湿潤剤が挙げられるが、これに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)または通常の(０.９％)生理食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来方法により製剤化される(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005参照)
【００８５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｋｏｎ」または「ｋａ」は、抗体の抗原への会合の速度定数をさす。具体的には、速度定数(ｋｏｎ／ｋａおよびｋｏｆｆ／ｋｄ)および平衡解離定数は、例えば、完全長抗体および／またはＦａｂ抗体断片と対応する抗原を使用して測定され得る。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数をさす。
【００８７】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＫＤ」は、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をさす。
【００８８】
結合および解離速度定数、ｋｏｎおよびｋｏｆｆそれぞれの決定は、捕捉試薬を介してセンサー表面に低容量で固定化されたリガンドに結合することに関して分析物が一価である条件下で分析物／リガンド相互作用を特徴づけるために、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーを使用して行われ得る。分析は、Karlsson et al., Anal. Biochem 349, 136-147, 2006に記載の動的滴定法を使用して遂行される。Myszka, J. Mol. Recognit 12, 279-284, 1999における推奨により、所与のアッセイのために採用されるセンサーチップ、捕捉試薬およびアッセイバッファーは、センサー表面へのリガンドの安定した捕捉を与え、表面への分析物の非特異的結合を最小化し、速度分析のために適切な分析物結合反応を生じさせるために選択される。分析物／リガンド相互作用による分析物結合反応は、二重参照(double referenced)され、Myszka & Morton et al., Biophys. Chem 64, 127-137 (1997)に記載のグローバルパラメータとしてｋａ、ｋｄおよびＲｍａｘを使用して１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ「物質移動限界モデル」に当てはめられる。平衡解離定数ＫＤは、動的速度定数の比率、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから推定される。そのような決定は、２５℃または３７℃で行われることが好ましい。
【００８９】
本明細書中の「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む(および記載する)。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数的範囲は、範囲を定義する数を含む。一般的に言えば、用語「約」は、変数の示された値および示された値の実験的誤差の範囲内(例えば、平均についての９５％信頼区間内)またはどちらが大きいとしても示された値の１０パーセント以内にある変数のすべての値をさす。用語「約」が期間(年、月、週、日など)との関連で使用される場合、用語「約」は、その期間プラスまたはマイナス１つの次の下位期間(例えば、約１年は、１１〜１３ヶ月を意味し；約６ヶ月は、６ヶ月プラスまたはマイナス１週間を意味し；約１週間は、６〜８日を意味するなど)またはどちらが大きいとしても示された値の１０パーセント以内を意味する。
【００９０】
「含む」という言葉により実施形態が本明細書に記載される場合はいつでも、「からなる」および／または「から本質的になる」という言葉で記載されている点以外は類似する実施形態も提供されていると理解される。
【００９１】
マーカッシュ群または選択肢の他の代替的な群分けの観点から本発明の態様または実施形態が記載される場合、本発明はまとめて列挙された群全体だけでなく、各群メンバーを個別におよび主要群のすべての可能性のある下位群、１以上の群メンバーが存在しない主要群も包含する。本発明は、特許請求される発明におけるいずれか１以上の群メンバーの明白な除外も想定する。
【００９２】
別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。対立する場合、定義を含む本明細書が優先される。本明細書および特許請求の範囲全体を通して、単語「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含むこと(comprising)」のような変化形は、記載された整数または整数の群を含むが、いかなる他の整数または整数の群も排除しないことを暗示していると理解される。文脈による別段の要求のない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００９３】
例示的方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似するまたは等価な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用可能である。材料、方法および例は、単に例示的であり、限定的であることを意図されない。
【００９４】
ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲおよびその作製方法
本発明は、ＥＧＦＲｖIII(例えば、ヒトＥＧＦＲｖIII(例えば、配列番号２０１、受け入れ番号：P00533 Feature Identifier VAR_066493またはＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号AJN69267))に結合するＣＡＲを提供する。本明細書に提供されるＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、一本鎖ＣＡＲおよび多鎖ＣＡＲを含む。ＣＡＲは、非ＭＨＣ拘束性の方法でＥＧＦＲｖIIIに対するＴ細胞特異性および反応性を再指示し、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する能力を有する。非ＭＨＣ拘束性の抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに依存せずに抗原を認識し、こうして、腫瘍エスケープの主要メカニズムをバイパスする能力を与える。
【００９５】
ある実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン［例えば、一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)］、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、１つのポリペプチド、すなわち、一本鎖中にある。多鎖ＣＡＲおよびポリペプチドも本明細書に提供される。ある実施形態では、多鎖ＣＡＲは：膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む、第１のポリペプチドと、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含み、上記ポリペプチドは一緒に集合して、多鎖ＣＡＲを形成する。
【００９６】
ある実施形態では、ＥＧＦＲｖIII特異的多鎖ＣＡＲは、ＩｇＥのための高親和性受容体(ＦｃεＲＩ)に基づく。マスト細胞および好塩基球上に発現されたＦｃεＲＩは、アレルギー反応の引き金を引く。ＦｃεＲＩは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニットおよびジスルフィド結合した２つのγサブユニットからなる４量体錯体である。αサブユニットはＩｇＥ結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を仲介するＩＴＡＭを含有する。ある実施形態では、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインが欠失されてＥＧＦＲｖIII特異的細胞外リガンド結合ドメインで置換されている。ある実施形態では、多鎖ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、ＥＧＦＲｖIIIに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよびＦｃＲβ鎖のＩＴＡＭを含む。ある実施形態では、ＣＡＲは、ＦｃＲγ鎖を含んでも含まなくてもよい。
【００９７】
ある実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルなリンカーにより連結された、標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変(ＶＬ)領域および重鎖可変(ＶＨ)領域を含むｓｃＦｖを含む。一本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを使用することにより軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することによって作製される(Bird et al., Science 242:423-426, 1988)。連結ペプチドの例は、アミノ酸配列(ＧＧＧＧＳ)４(配列番号２０２)を有するＧＳリンカーであり、これは、一方の可変領域のカルボキシル末端と他方の可変領域のアミノ末端の間のおよそ３.５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計され、使用されている(Bird et al., 1988、上記)。一般に、リンカーは短くフレキシブルなペプチドであることができ、約２０以下のアミノ酸残基からなることが好ましい。次に、リンカーは、薬物の結合または固相支持体への結合のような追加の機能のために修飾され得る。一本鎖変異体が、組換えまたは合成のいずれかにより生成され得る。ｓｃＦｖの合成による生成のために、自動合成機が使用可能である。ｓｃＦｖの組換え生成のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドが酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核細胞またはＥ.コリ(E.coli)のような原核細胞のいずれかの好適な宿主細胞に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作により作製され得る。結果としてのｓｃＦｖは、当分野で知られた標準的なタンパク質精製技術を使用して単離され得る。
【００９８】
ある実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、(ａ)(ｉ)配列番号６２、６３、６４、７４、７５、７６、８０、８１、８２、８８、８９、９０、９３、９４、９５、９９、１００、１０１、１０９、１１０、１１１、１１５、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１３２、１３３、１３４、１３７、１３８、１３９、１４３、１４４、もしくは１４５に示される配列を含むＶＨ相補性決定領域１(ＣＤＲ１)と；(ii)配列番号６５、６６、６８、６９、７０、７１、７７、７８、８３、８４、８６、８７、９１、９２、９６、９７、９８、１０２、１０３、１０５、１０６、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１２７、１２８、１３０、１３１、１３５、１３６、１４０、１４１、１４６、もしくは１４７に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２と；(iii)配列番号６７、７２、７３、７９、８５、１０４、１０７、１０８、１１４、１２０、１２６、１２９、１４２、もしくは１４８に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域および／または(ｉ)配列番号１４９、１５４、１５６、１５９、１６２、１６５、１６６、１６８、１６９、１７０、１７１、１７３、１７４、１７６、１７８、１８１、１８２、１８５、１８７、１９０、１９２、１９５、もしくは１９８に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；(ii)配列番号１５０、１５２、１５５、１５７、１６０、１６３、１７２、１７５、１７９、１８３、１８６、１８８、１９１、１９３、１９６、もしくは１９９に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および(iii)配列番号１５１、１５３、１５８、１６１、１６４、１６７、１７７、１８０、１８４、１８９、１９４、１９７、もしくは２００に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。ある実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、フレキシブルなリンカーにより一緒に連結されている。ある実施形態では、フレキシブルなリンカーは、配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９９】
ある実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、(ａ)(ｉ)配列番号６２、６３、６４、７４、７５、７６、８０、８１、８２、８８、８９、９０、１０９、１１０、１１１、１１５、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１３７、１３８、もしくは１３９に示される配列を含むＶＨ相補性決定領域１(ＣＤＲ１)；(ii)配列番号７０、７１、７７、７８、８３、８４、８６、８７、９１、９２、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１２７、１２８、１４０、もしくは１４１に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；および(iii)配列番号７３、７９、８５、１１４、１２０、１２６、１２９、もしくは１４２に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域および／または(ｂ)(ｉ)配列番号１４９、１５６、１５９、１６２、１６５、１８２、１８５、１８７、もしくは１９５に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；(ii)配列番号１５２、１５７、１６０、１６３、１８３、１８６、１８８、もしくは１９６に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２と；および(iii)配列番号１５３、１５８、１６１、１６４、１８４、１８９、もしくは１９７に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む。
【０１００】
別の態様では、ＥＧＦＲｖIIIに特異的に結合するＣＡＲが提供され、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインであって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３４、３５、３７、３９、４１、４３、４４、４６、４８、もしくは５０に示されるＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；および／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２９、３１、３３、３６、３８、４０、４２、４５、４７、４９、もしくは５１に示されるＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。ある実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、フレキシブルなリンカーにより一緒に連結されている。ある実施形態では、フレキシブルなリンカーは、配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
ある実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインであって、配列番号５、９、１１、１３、１５、３７、３９、４１、４３、もしくは４８に示されるＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域；および／または配列番号６、１０、１２、１４、１６、３８、４０、４２、もしくは４９に示されるＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。ある実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、フレキシブルなリンカーにより一緒に連結されている。ある実施形態では、フレキシブルなリンカーは、配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲは、表１に列挙される部分軽鎖配列のいずれか１つおよび／または表１に列挙される部分重鎖配列のいずれか１つを有する、細胞外リガンド結合ドメインを含む。表１において、下線を引いた配列は、ＫａｂａｔによるＣＤＲ配列であり、太字はＣｈｏｔｉａによる。表１の異なるｍＡｂは、本明細書中で異なる抗ＥＧＦＲｖIII抗体「クローン」とも呼ばれ得る。
【０１０３】
【表１】
2019506394.tif 000003
【表２】
2019506394.tif 000004
【０１０４】
【表３】
2019506394.tif 000005
【表４】
2019506394.tif 000006
【０１０５】
【表５】
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【表６】
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【０１０６】
ＥＧＦＲｖIIIに対するＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインのＣＤＲ部分も本明細書に提供される(Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲおよびＣＤＲ接触領域を含む)。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当分野の能力範囲内にある。ある実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの組み合わせ(「組み合わせたＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる)であり得ることが理解される。ある実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。言い換えれば、１を超えるＣＤＲを含む実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組み合わせたＣＤＲまたはそれらの組み合わせであってもよい。表２は、本明細書に提供されるＣＤＲ配列の例を提供する。
【０１０７】
【表７】
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【表８】
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【０１０８】
【表９】
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【表１０】
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【０１０９】
【表１１】
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【表１２】
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【０１１０】
本発明は、その特性に大きく影響しない修飾を有する機能的に等価なＣＡＲならびに増強されたまたは減少した活性および／または親和性を有する変異体を含む、表１に示される本発明のＣＡＲおよびポリペプチドの修飾を包含する。例えば、ＥＧＦＲｖIIIへの所望の結合親和性を有する抗体を得るために、アミノ酸配列が突然変異させられてもよい。ポリペプチドの修飾は、当分野で日常的業務であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を含むポリペプチド、機能活性を顕著に害する変化をもたらさないまたはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟させる(増強する)１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、あるいは化学的類似体の使用が挙げられる。
【０１１１】
アミノ酸配列挿入物は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドにわたる長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合物だけでなく、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体は、血液循環における抗体の半減期を増加させる、酵素またはポリペプチドの抗体のＮ末端またはＣ末端への融合を含む。
【０１１２】
置換変異体は、抗体分子中の少なくとも１つの除去されたアミノ酸残基とその場所に挿入された異なる残基を有する。置換突然変異誘発のために最も注目される部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変更も企図される。保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下に表３に示される。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３中に「代表的置換」と表示されるかまたはアミノ酸の種類に関して以下にさらに記載される、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。ある実施形態では、本明細書に提供される抗体の置換変異体は、参照親抗体に比較して、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の保存的置換をＶＨまたはＶＬ領域に有する。ある実施形態では、置換は、ＶＨまたはＶＬ領域のＣＤＲ内にはない。
【０１１３】
【表１３】
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【０１１４】
ある実施形態では、本発明は、ｍ６２Ｇ７、ｈ６２Ｇ７、ｈ６２Ｇ７−Ｈ１４／Ｌ１−ＤＶ、ｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、４２Ｇ９、３２Ａ１０、２０Ｂ９、１４Ｃ１１、２１Ｅ１１、４９Ｂ１１、４６Ｅ１０、１２Ｈ６、１９Ａ９、２１Ｅ７、１１Ｂ１１、１２Ｂ２、１１Ｆ１０、１７Ｇ１１、２９Ｄ５、３０Ｄ８、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３２Ｇ８、３４Ｅ７、２０Ｇ５、Ｃ６およびＢ５を含むＥＧＦＲｖIIIに結合し、ＥＧＦＲｖIIIに結合することに関して、本明細書に記載の抗体または本明細書に記載のＣＡＲ(例えば、表５Ａ)と競合する細胞外リガンド結合ドメインを備えるＣＡＲを提供する。
【０１１５】
ある実施形態では、本発明は、ＣＤＲ接触領域に基づくＥＧＦＲｖIII抗体に対する抗体のＣＤＲ部分を含むＣＡＲを提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原に対する特異性を抗体に植え付ける抗体の領域である。一般に、ＣＤＲ接触領域は、ＣＤＲ中の残基位置および抗体が特定の抗原に結合するための適切なループ構造を維持するために拘束されたＶｅｒｎｉｅｒゾーンを含む。例えば、Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007参照。ＣＤＲ接触領域の決定は、十分に当業者の能力範囲内にある。
【０１１６】
本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲのＥＧＦＲｖIII(例えば、ヒトＥＧＦＲｖIII(例えば、配列番号２０１))に対する結合親和性(ＫＤ)は、約０.００１〜約５０００nMである。ある実施形態では、結合親和性は、約５０００nM、４５００nM、４０００nM、３５００nM、３０００nM、２５００nM、２０００nM、１７８９nM、１５８３nM、１５４０nM、１５００nM、１４９０nM、１０６４nM、１０００nM、９３３nM、８９４nM、７５０nM、７０５nM、６７８nM、５３２nM、５００nM、４９４nM、４００nM、３４９nM、３４０nM、３５３nM、３００nM、２５０nM、２４４nM、２３１nM、２２５nM、２０７nM、２００nM、１８６nM、１７２nM、１３６nM、１１３nM、１０４nM、１０１nM、１００nM、９０nM、８３nM、７９nM、７４nM、５４nM、５０nM、４５nM、４２nM、４０nM、３５nM、３２nM、３０nM、２５nM、２４nM、２２nM、２０nM、１９nM、１８nM、１７nM、１６nM、１５nM、１２nM、１０nM、９nM、８nM、７.５nM、７nM、６.５nM、６nM、５.５nM、５nM、４nM、３nM、２nM、１nM、０.５nM、０.３nM、０.１nM,０.０１nMまたは０.００１nMのいずれかであり得る。ある実施形態では、結合親和性は、約５０００nM、４０００nM、３０００nM、２０００nM、１０００nM、９００nM、８００nM、２５０nM、２００nM、１００nM、５０nM、３０nM、２０nM、１０nM、７.５nM、７nM、６.５nM、６nM,５nM、４.５nM、４nM、３.５nM、３nM、２.５nM、２nM、１.５nM、１nMまたは０.５nM未満のいずれかであり得る。
【０１１７】
本発明によるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続く細胞内シグナル伝達に関与する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０１１８】
ある実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、制限なく、抗原受容体結合に続くシグナル伝達を協力して開始する、Ｔ細胞受容体および共受容体の細胞質配列だけでなく、これらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：抗原依存性の一次活性化を開始するものおよび抗原非依存性の方法で作用して、二次または共刺激シグナルを生成するもの、を含む。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容活性化チロシンモチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼの結合部位として働く様々な受容体の細胞質尾部において見出される、よく定義されたシグナル伝達モチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例としては、非制限的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄが挙げられる。ある実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する、ＣＤ３ζ(ゼータ)シグナル伝達ドメインを含むことができる。ある実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。
【０１１９】
ある実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ(ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３)の断片およびＣＤ２８(ＮＰ＿００６１３０.１)からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。ある実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２１３(ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン)または配列番号２０４(４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン)に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
ＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現される。よって、ＣＡＲは膜貫通ドメインを含むことができる。本明細書に開示されたＣＡＲにとって好適な膜貫通ドメインは、(ａ)細胞、好ましくは、例えば、制限なく、リンパ球細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞のような免疫細胞の表面において発現される能力および(ｂ)予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を導くために、リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力を有する。膜貫通ドメインは、自然のまたは合成の供給源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。非制限的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γもしくはδのようなＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ−２受容体ｐ５５(α鎖)、ｐ７５(β鎖)もしくはγ鎖、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体IIIのサブユニット鎖またはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成的であることができ、ロイシンおよびバリンのような圧倒的に疎水性の残基を含むことができる。ある実施形態では、上記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖に由来する(例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５.１)。ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインと上記膜貫通ドメインの間にストークドメインをさらに含むことができる。ストークドメインは、３００以下のアミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、ＣＤ８、ＣＤ４、もしくはＣＤ２８の細胞外領域のすべてもしくは一部または抗体定常領域のすべてもしくは一部のような自然起源の分子のすべてもしくは一部に由来してもよい。あるいは、ストークドメインは、自然起源のストーク配列に対応する合成配列であってもよくまたは完全に合成のストーク配列であってもよい。ある実施形態では、上記ストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部である(例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５.１)。別の特定の実施形態では、上記膜貫通およびヒンジドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部、好ましくは配列番号２１０および２０８にそれぞれ示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含むものを含む。ある実施形態では、本明細書に開示されたＣＡＲは、ＥＧＦＲｖIIIに特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒトヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含むことができる。
【０１２１】
表４は、本明細書に開示されたＣＡＲにおいて使用可能なドメインの代表的な配列を提供する。
【０１２２】
【表１４】
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【０１２３】
表５Ａは、代表的な本発明のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲのアミノ酸配列を提供する。表５Ａにおいて、シグナル／リーダーペプチド配列は太字であり、ＧＳリンカー((ＧＧＧＧＳ)４(配列番号２０２))は下線を付す。
【０１２４】
【表１５】
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【表１６】
2019506394.tif 000018
【表１７】
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【０１２５】
表５Ｂは、本発明のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲの代表的なｓｃＦｖの核酸配列を提供する。表５Ｂにおいて、ＣＤ８αシグナル／リーダーペプチドをコードする配列は下線を付す。
【０１２６】
【表１８】
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【表１９】
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【０１２７】
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【０１２８】
表５Ｃは、本発明の代表的なＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲの代表的な核酸配列を提供する。
【０１２９】
【表２３】
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【表２４】
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【０１３０】
【表２５】
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【表２６】
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【０１３１】
【表２７】
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【表２８】
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【０１３２】
【表２９】
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【表３０】
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【０１３３】
【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【０１３４】
標的抗原の下方制御または突然変異は、がん細胞において一般的に観察され、抗原欠損エスケープ変異体を生じる。よって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的なものとするために、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、標的中の異なるエレメントに同時に結合し、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強するための、１以上の追加の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上に直列して置かれ、適宜、リンカーによって分離され得る。ある実施形態では、上記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれ得る。ある実施形態では、本発明は、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を用意することと、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を細胞の表面上に発現させることを含む方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を用意し、そしてそれぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む方法を提供する。ＣＡＲの集団により、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超えるＣＡＲが意味される。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、標的中の異なるエレメントに同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を増強することができることが好ましい。本発明は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む、単離された免疫細胞にも関する。
【０１３５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＣＡＲおよびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当分野で知られた手順により作製され、発現され得る。
【０１３６】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞のいずれかを含む組成物(例えば、医薬組成物)を提供する。ある実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を含む。
【０１３７】
発現ベクターおよびポリヌクレオチド組成物の投与が、さらに本明細書に記載される。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。
【０１３９】
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも、本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コードまたはアンチセンス)または二本鎖であってもよく、ＤＡＮ(ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成)またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含む。追加のコードまたは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、そうである必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結されてもよいが、そうである必要はない。
【０１４０】
ポリヌクレオチドは、天然の配列(すなわち、抗体またはその一部をコードする内在性配列)を含み得るかまたはそのような配列の変異体を含み得る。ポリヌクレオチド変異体は、コードされるポリペプチドの免疫活性が天然の免疫活性分子に比べて減少しないように、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫活性に対する効果は、一般に、本明細書に記載のとおりに評価され得る。変異体は、天然の抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、なおより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【０１４１】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に記載の最大の対応についてアラインメントされたときに、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、同じである場合に、「同一」と言われる。２つの配列間の比較は、典型的に、比較ウィンドウの全部にわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し比較することによって、実施される。本明細書中で使用される「比較ウィンドウ」は、その中で、配列が、同数の連続する位置の参照配列に対して、２つの配列が最適に整列された後に比較され得る、少なくとも２０、通常は３０〜約７５または４０〜約５０の連続する位置のセグメントをさす。
【０１４２】
比較のための最適な配列のアラインメントは、Lasergene suite of bioinformatics software(DNASTAR, Inc., Madison, WI)のMegalignプログラムを使用し、デフォルトパラメータを使用して実行され得る。このプログラムは、以下の参考文献：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships.  In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153；Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730に記載の数種のアラインメントスキームを具体化する。
【０１４３】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、最適にアラインメントされた２つの配列を、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウ全体にわたって比較することによって決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列(付加または欠失を含まない)に対して、２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセントまたは１０〜１２パーセントの付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセンテージは、両配列中に生じる同一の核酸塩基またはアミノ酸残基の位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、参照配列中の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)でマッチした位置の数で除し、そして結果を１００倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１４４】
変異体は、これに加えてまたはこれとは別に、天然の遺伝子またはその一部もしくは相補体と実質的に相同であり得る。そのようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、天然の抗体(または相補配列)をコードする自然起源のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。
【０１４５】
好適な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、１.０mM  ＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)の溶液で予備洗浄し、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣにおいて終夜ハイブリダイズさせ、続いて、０.１％ＳＤＳを含有する、２×、０.５×および０.２×ＳＳＣそれぞれを用いて６５℃で２０分間、２回洗浄することを含む。
【０１４６】
本明細書中で使用されるとき、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は：(１)洗浄のために、低イオン強度および高温、例えば、５０℃の０.０１５Ｍ塩化ナトリウム／０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０.１％ドデシル硫酸ナトリウムを採用し；(２)ハイブリダイゼーションの間に、ホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃の７５０mM塩化ナトリウム、７５mMクエン酸ナトリウムとともに０.１％ウシ血清アルブミン／０.１％Ｆｉｃｏｌｌ／０.１％ポリビニルピロリドン／５０mMリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６.５を含む、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドを採用し；または(３)４２℃での０.２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)および５５℃での５０％ホルムアミドによる洗浄、続く５５℃でのＥＤＴＡを含有する０.１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄とともに、４２℃の５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０.７５Ｍ  ＮａＣｌ、０.０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム)、５０mM  リン酸ナトリウム(ｐＨ６.８)、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ(５０μg／ml)、０.１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランを採用するものである。当業者は、プローブ長などのような因子に対応するために、必要に応じてどのように温度、イオン強度等を調整するか認識する。
【０１４７】
当業者は、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることを理解する。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の相違のせいで変動するポリヌクレオチドが、本発明により具体的に企図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルは、本発明の範囲内にある。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換のような１以上の突然変異の結果として変更されている内在性遺伝子である。結果として生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、必ずしもそうではない。アレルは、標準的な技術(例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列の比較)を使用して同定され得る。
【０１４８】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法またはＰＣＲを使用して得られ得る。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当分野において周知であり、本明細書に詳細に記載される必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を生成するために、本明細書に提供される配列および市販のＤＮＡ合成装置を使用することができる。
【０１４９】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書においてさらに議論されるとおり、所望の配列を含むポリヌクレオチドが好適なベクター中に挿入可能であり、次にこのベクターが、複製および増幅のために好適な宿主細胞内に導入可能である。ポリヌクレオチドは、当分野で知られた任意の手段により宿主細胞内に挿入され得る。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合またはエレクトロポレーションにより外来性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入されると、外来性ポリヌクレオチドは、非組込み型ベクター(例えば、プラスミド)として細胞内に維持されるかまたは宿主細胞ゲノムに一体化され得る。そのようにして増幅されたポリヌクレオチドは、当分野で周知の方法によって宿主細胞から単離され得る。例えば、Sambrook et al., 1989参照。
【０１５０】
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の複製を可能とする。ＰＣＲ技術は、当分野で周知であり、米国特許第４,６８３,１９５号、同第４,８００,１５９号、同第４,７５４,０６５号および同第４,６８３,２０２号だけでなく、PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994にも記載されている。
【０１５１】
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを好適な宿主細胞内に挿入することによって得られ得る。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されるとき、ＲＮＡは、例えば、上記のSambrook et al., 1989に記載されたような、当業者に周知の方法を使用して単離され得る。
【０１５２】
好適なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得るかまたは当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは使用されることを意図された宿主細胞によって変動し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特別な制限エンドヌクレアーゼの単一標的を有することができ、かつ／またはベクターを含有するクローンを選択することにおいて使用され得るマーカーの遺伝子を保有し得る。好適な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋)およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８のようなシャトルベクターが挙げられる。これらのおよび他の多くのクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような商業的販売者から入手可能である。
【０１５３】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示される。好適な発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミドおよびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクターを含むが、それに限定されない。ベクター構成要素は、一般に、以下の：シグナル配列；複製起点；１以上のマーカー遺伝子；好適な転写制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター)のうちの１以上を含み得るが、それに限定されない。発現(すなわち、翻訳)のためには、通常、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および停止コドンのような、１以上の翻訳制御エレメントも必要とされる。
【０１５４】
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、もしくは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染(例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスのような感染病原体である場合)を含む、多数の適切な手段のいずれかにより、宿主細胞内に導入され得る。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入することの選択は、宿主細胞の特徴に依存することが多い。
【０１５５】
本明細書に開示されたＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞中への導入のためのプラスミドまたは昆虫宿主細胞のトランスフェクションのための、バキュロウイルスベクターのようなウイルスベクターまたは哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのための、プラスミドもしくはレンチウイルスのようなウイルスベクター)中に存在し得る。ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、例えば、制限なく、２Ａペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含むことができる。ピコルナウイルスのアフタウイルス亜群中で同定された２Ａペプチドは、コドンによりコードされた２つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成せずに、１つのコドンから次のコドンへのリボソームの「スキップ」を引き起こす((Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)参照)。「コドン」により、リボソームにより１つのアミノ酸残基に翻訳されるｍＲＮＡ上(またはＤＮＡ分子のセンス鎖上)の３つのヌクレオチドが意味される。よって、インフレームの２Ａオリゴペプチドによりポリペプチドが分離される場合、２つのポリペプチドが、ｉｍＲＮＡ内の単一の連続したオープンリーディングフレームから合成され得る。そのようなリボソームスキップメカニズムは、当分野で周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによりコードされる数種のタンパク質の発現のための数種のベクターにより使用されることが知られている。
【０１５６】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと導くために、ある実施形態では、分泌シグナル配列(シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている)が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に操作可能に連結されている、すなわち、２つの配列が、正しいリーディングフレーム内で連結され、配置されて、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと導く。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列中のどこに配置されてもよい(例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５,０３７,７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５,１４３,８３０号参照)。ある実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２０６または２１４に示されるアミノ酸配列を含む。当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列バリエーションがこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能であることを認識する。ある実施形態では、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞中での発現のために、好ましくはヒト細胞中での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、目的の配列における、ある種の高発現遺伝子において一般に頻繁なコドンで、そのような種の高発現遺伝子において一般に稀なコドンを交換することをさし、そのようなコドンは交換されるコドンと同一のアミノ酸をコードしている。
【０１５７】
免疫細胞を操作する方法
免疫療法における使用のための免疫細胞を調製する方法が、本明細書に提供される。ある実施形態では、方法は、本発明によるＣＡＲを免疫細胞内に導入することと、細胞を増やすことを含む。ある実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を用意することと、細胞の表面において少なくとも１つの上記ＣＡＲを発現させることを含む方法に関する。免疫細胞を操作する方法は、例えば、それぞれが参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ／２０１４／０３９５２３号、同第ＷＯ２０１４／１８４７４１号、同第ＷＯ２０１４／１９１１２８号、同第ＷＯ２０１４／１８４７４４号および同第ＷＯ２０１４／１８４１４３号に記載されている。ある実施形態では、方法は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換することと、細胞中でポリヌクレオチドを発現させることを含む。
【０１５８】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞中での安定した発現のためにレンチウイルスベクター中に存在する。
【０１５９】
ある実施形態では、方法は、少なくとも１つ遺伝子であって、例えば、制限なく、ＴＣＲの構成要素、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子および／または例えば、ＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ−４のような免疫チェックポイントタンパク質を発現する遺伝子を不活性化することにより、細胞を遺伝子改変する工程をさらに含むことができる。遺伝子を不活性化することにより目的の遺伝子が機能性タンパク質形態で発現されないことが意図される。ある実施形態では、不活性化される遺伝子は、例えば、制限なく、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ｄＣＫ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。ある実施形態では、方法は、選択的ＤＮＡ切断により遺伝子を選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼを細胞内に導入することにより、１以上の遺伝子を不活性化することを含む。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、例えば、転写アクチベーター様エフェクター(transcription activator-like effector)ヌクレアーゼ(ＴＡＬＥヌクレアーゼ)またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。
【０１６０】
ある実施形態では、標的遺伝子を不活性化するその能力を増強するために、希少切断性エンドヌクレアーゼとともに追加の触媒ドメインが使用される。例えば、追加の触媒ドメインは、ＤＮＡ末端プロセシング酵素であり得る。ＤＮＡ末端プロセシング酵素の非制限的な例としては、５−３’エキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼおよび鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。そのような触媒ドメインの非制限的な例は、タンパク質ドメインまたはｈＥｘｏｌ(ＥＸＯ１＿ＨＵＭＡＮ)、酵母ＥＸＯｌ(ＥＸＯ１＿ＹＥＡＳＴ)、大腸菌ＥＸＯｌ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、ＴｄＴ(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)、ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２(ＤＡＮ２＿ＹＥＡＳＴ)からなる群から選択されるタンパク質ドメインの触媒活性を有する誘導体から構成される。ある実施形態では、追加の触媒ドメインは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有することができ、ある実施形態では、上記追加の触媒ドメインは、ＴＲＥＸ、より好ましくはＴＲＥＸ２触媒ドメインである(ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／０５８４５８号)。ある実施形態では、上記触媒ドメインは、一本鎖ＴＲＥＸポリペプチドによりコードされる。追加の触媒ドメインは、ヌクレアーゼ融合タンパク質またはキメラタンパク質に融合され得る。ある実施形態では、追加の触媒ドメインは、例えば、ペプチドリンカーを使用して融合される。
【０１６１】
ある実施形態では、方法は、標的核酸配列と外来性核酸との間に相同組換えが起こるように、標的核酸配列の一部に相同な配列を少なくとも含む外来性核酸を、細胞内に導入する工程をさらに含む。ある実施形態では、上記外来性核酸は、標的核酸配列の５’領域および３’領域にそれぞれ相同な第１および第２の部分を含む。外来性核酸は、第１および第２の部分の間に配置され、標的核酸配列の５’および３’領域との相同性を含まない第３の部分も含んでもよい。標的核酸配列の切断に続いて、標的核酸配列と外来性核酸との間に相同組換え事象が刺激される。ある実施形態では、少なくとも約５０bp、約１００bp超または約２００bp超の相同配列が、ドナーマトリックス内で使用され得る。外来性核酸は、例えば、制限なく、約２００bpから約６０００bpまで、より好ましくは約１０００bpから約２０００bpまでであり得る。共有される核酸相同性は、切断部位の上流および下流に隣接する領域に位置し、導入される核酸配列は、２つのアームの間に位置する。
【０１６２】
ある実施形態では、核酸は、上記切断の上流の配列に相同な第１の領域；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体(ＧＲ)、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)および例えば、プログラム死−１(ＰＤ−１)のような免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される、標的遺伝子を不活性化するための配列；ならびに切断の下流の配列に相同な第２の領域を連続して含む。ポリヌクレオチド導入工程は、希少切断性エンドヌクレアーゼの導入または発現と同時、その前または後であり得る。切断事象が起こった標的核酸配列の位置次第で、そのような外来性核酸は、例えば、遺伝子のオープンリーディングフレーム内に外来性遺伝子が位置する場合に遺伝子をノックアウトするためまたは目的の新しい配列もしくは遺伝子を導入するために、使用され得る。そのような外来性核酸を使用することによる配列挿入は、遺伝子の修正もしくは置換(非制限的な例としてのアレルスワップ)によって標的とされた既存の遺伝子を改変するためまたは標的遺伝子の発現(非制限的な例としてのプロモータースワップ)、標的遺伝子の修正もしくは置換を上方もしくは下方制御するために使用可能である。ある実施形態では、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫおよび免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される遺伝子の不活性化は、特定のＴＡＬＥヌクレアーゼにより標的とされた正確なゲノム位置において行うことができ、上記特定のＴＡＬＥヌクレアーゼは切断を触媒し、外来性核酸は、少なくとも相同な領域および相同組換えによって組み込まれたＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ,ｄＣＫ、免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される１つの標的遺伝子を不活性化するための配列を、連続して含む。ある実施形態では、数種の遺伝子が、数種のＴＡＬＥヌクレアーゼをそれぞれ使用し、１つの定められた遺伝子および特定の遺伝子の不活性化のための数個の特定のポリヌクレオチドを特異的に標的化することにより、連続してまたは同時に不活性化され得る。
【０１６３】
ある実施形態では、方法は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ,ｄＣＫ、免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される１以上の追加の遺伝子の不活性化を含む。ある実施形態では、遺伝子の不活性化は、希少切断性エンドヌクレアーゼが、細胞ゲノムの標的配列における切断を特異的に触媒するように、少なくとも１つの希少切断性エンドヌクレアーゼを細胞内に導入し、そして、所望により、切断の上流の配列に相同な第１の領域、細胞のゲノムに挿入される配列および切断の下流の配列に相同な第２の領域を連続して含む外来性核酸を、細胞に導入することにより達成可能であり、ここで、導入された外来性核酸は、遺伝子を不活性化し、少なくとも１つの目的の組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド配列を組み込んでいる。ある実施形態では、外来性ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫおよび免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子内に組み込まれている。
【０１６４】
別の態様では、細胞を遺伝子改変する工程は：免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することにより、Ｔ細胞を改変し、そして、所望により、免疫抑制剤の存在下で細胞を増やすことを含むことができる。免疫抑制剤は、数種の作用メカニズムのうちの１つにより、免疫機能を抑制する薬剤である。免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／または貪欲さを減少させることができる。免疫抑制剤の非制限的な例としては、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン−２α鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイドおよび免疫抑制性抗代謝薬が挙げられる。一部の細胞傷害性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。その他は、Ｔ細胞の活性化によりまたはヘルパー細胞の活性化を阻害することにより作用し得る。本発明による方法は、Ｔ細胞中の免疫抑制剤の標的を不活性化することにより、免疫療法のために免疫抑制抵抗性をＴ細胞に与えることを可能とする。非制限的な例として、免疫抑制剤の標的は、例えば、制限なく、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体(ＧＲ)、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーおよびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーのような免疫抑制剤の受容体であり得る。
【０１６５】
ある実施形態では、方法の遺伝子改変は、希少切断性エンドヌクレアーゼが１つの標的遺伝子中の切断を特異的に触媒し、それにより標的遺伝子を不活性化するように、操作するために与えられた細胞における、その希少切断性エンドヌクレアーゼの発現を含む。ある実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程：細胞培養由来のまたは血液検体由来のようなＴ細胞を用意する工程；免疫抑制の標的を発現するＴ細胞中の遺伝子を選択する工程；ＤＮＡ切断により、好ましくは二本鎖切断することにより、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子を選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼをＴ細胞内に導入する工程；および所望により、免疫抑制剤の存在下で、細胞を増やす工程、のうちの少なくとも１つを含む。
【０１６６】
ある実施形態では、方法は、細胞培養由来または血液検体由来のようなＴ細胞を用意し、免疫抑制剤の標的を発現する、Ｔ細胞中の遺伝子を選択し、ＤＮＡ切断により、好ましくは二本鎖切断により免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子を選択的に不活性することができる希少切断性エンドヌクレアーゼをコードする核酸を用いて、Ｔ細胞を形質転換し、そして、Ｔ細胞中で希少切断性エンドヌクレアーゼを発現させ、そして所望により、免疫抑制剤の存在下で、細胞を増やすことを含む。
【０１６７】
ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、ＣＤ５２またはＧＲを特異的に標的とする。ある実施形態では、不活性化のために選択される遺伝子は、ＣＤ５２をコードし、免疫抑制処置は、ＣＤ５２抗原を標的とするヒト化抗体を含む。ある実施形態では、不活性化のために選択される遺伝子は、ＧＲをコードし、免疫抑制処置は、デキサメタゾンのようなコルチコステロイドを含む。ある実施形態では、不活性化のために選択される遺伝子は、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーまたはその変異体であり、免疫抑制処置は、タクロリムスまたはフジマイシンとしても知られるＦＫ５０６を含む。ある実施形態では、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバーは、ＦＫＢＰ１２またはその変異体である。ある実施形態では、不活性化のために選択される遺伝子は、シクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはその変異体であり、免疫抑制処置は、シクロスポリンを含む。
【０１６８】
ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。
【０１６９】
免疫療法に好適なＴ細胞を操作する方法であって、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することにより、Ｔ細胞を遺伝子改変することを含む方法も、本明細書に提供される。ある実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４である。ある実施形態では、細胞を遺伝子改変する方法は、少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を不活性化することによりＴ細胞を改変し、そして細胞を増やすことを含む。免疫チェックポイントタンパク質は、免疫細胞を直接阻害するプログラム死１(ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても知られるＰＤ−１、受け入れ番号ＮＭ＿００５０１８)、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４(ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ−４、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ４１４１２０.１)、ＬＡＧ３(ＣＤ２２３としても知られる、受け入れ番号：ＮＭ＿００２２８６.５)、Ｔｉｍ３(ＨＡＶＣＲ２としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＪＸ０４９９７９.１)、ＢＴＬＡ(ＣＤ２７２としても知られる、受け入れ番号：ＮＭ＿１８１７８０.３)、ＢＹ５５(ＣＤ１６０としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＣＲ５４１８８８.１)、ＴＩＧＩＴ(ＶＳＴＭ３としても知られる、受け入れ番号：ＮＭ：＿１７３７９９)、Ｂ７Ｈ５(Ｃ１０ｏｒｆ５４としても知られる、マウスｖｉｓｔａ遺伝子のホモログ、受け入れ番号：ＮＭ＿０２２１５３.１)、ＬＡＩＲ１(ＣＤ３０５としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＣＲ５４２０５１.１)、ＳＩＧＬＥＣ１０(ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＡＹ３５８３３７.１)、２Ｂ４(ＣＤ２４４としても知られる、受け入れ番号：ＮＭ＿００１１６６６６４.１)を含むが、これに限定されない。例えば、ＣＴＬＡ−４は、ある特定のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞上で発現される細胞表面タンパク質であり；抗原提示細胞上のそのリガンド(Ｂ７−１およびＢ７−２)が結合すると、Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能が阻害される。
【０１７０】
ある実施形態では、細胞を操作するための上記方法は、以下の工程：細胞培養由来または血液検体由来のような、Ｔ細胞を用意する工程；ＤＮＡ切断により、好ましくは二本鎖切断により、免疫チェックポイントタンパク質をコードする１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼをＴ細胞に導入する工程；および細胞を増やす工程、のうちの少なくとも１つを含む。ある実施形態では、方法は、細胞培養由来または血液検体由来のような、Ｔ細胞を用意すること；上記Ｔ細胞に、ＤＮＡ切断により、好ましくは二本鎖切断により、免疫チェックポイントタンパク質をコードする１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトすること；Ｔ細胞内に希少切断性エンドヌクレアーゼを発現させること；細胞を増やすことを含む。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＴＣＲαおよびＴＣＲβからなる群から選択される遺伝子を特異的に標的化する。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。
【０１７１】
ある実施形態では、本発明は、同種間免疫療法に特に好適であり得る。そのような実施形態では、細胞は、Ｔ細胞中のＴ細胞受容体(ＴＣＲ)の構成要素をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活性化し、そしてＴ細胞を増やすことを含む方法により改変し得る。ある実施形態では、方法の遺伝子改変は、希少切断性エンドヌクレアーゼが１つの標的遺伝子における切断を特異的に触媒し、それにより、標的遺伝子を不活性化するように、操作するために提供された細胞における、１つの希少切断性エンドヌクレアーゼの発現に依拠する。ある実施形態では、細胞を操作するための上記方法は、以下の工程：細胞培養由来または血液検体由来のような、Ｔ細胞を用意する工程；ＤＮＡ切断により、好ましくは二本鎖切断により、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)の構成要素をコードする１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼをＴ細胞内に導入する工程；および細胞を増やす工程のうちの少なくとも１つを含む。
【０１７２】
ある実施形態では、方法は、細胞培養由来または血液検体由来のような、Ｔ細胞を用意する工程と；ＤＮＡ切断により、好ましくは二本鎖切断により、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)の構成要素をコードする少なくとも１つの遺伝子を選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼをコードする核酸をＴ細胞にトランスフェクトする工程；Ｔ細胞内に希少切断性エンドヌクレアーゼを発現させる工程；その細胞表面にＴＣＲを発現しない、トランスフェクトされたＴ細胞を選別する工程；および細胞を増やす工程を含む。
【０１７３】
ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼであり得る。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。ある実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードする配列を認識し、切断する。ある実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、配列番号２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４または２２５に示されるアミノ酸配列から選択されるポリペプチド配列を含む。
【０１７４】
ＴＡＬＥヌクレアーゼポリペプチド配列：
リピートＴＲＡＣ  Ｔ０１−Ｌ
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【０１７５】
リピートＴＲＡＣ  Ｔ０１−Ｒ
LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２１９)
【０１７６】
リピートＴＲＢＣ  Ｔ０１−Ｌ
LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２２０)
【０１７７】
リピートＴＲＢＣ  Ｔ０１−Ｒ
NPQRSTVWYLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２２１)
【０１７８】
リピートＴＲＢＣ  Ｔ０２−Ｌ
LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２２２)
【０１７９】
リピートＴＲＢＣ  Ｔ０２−Ｒ
LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２２３)
【０１８０】
リピートＣＤ５２  Ｔ０２−Ｌ
LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２２４)
【０１８１】
リピートＣＤ５２  Ｔ０２−Ｒ
LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE(配列番号２２５)
【０１８２】
別の態様では、細胞を遺伝子改変する別の工程は、ＴＣＲα欠損Ｔ細胞を増やす方法であって、ｐＴα(プレＴＣＲαとしても知られる)またはその機能性変異体をＴ細胞内に導入し、所望により、ＣＤ３複合体の刺激により、細胞を増やすことを含む方法であり得る。ある実施形態では、方法は、ａ)ＣＤ３の細胞表面発現を支援するために、少なくともｐＴαの断片をコードする核酸を用いて細胞を形質転換することと、ｂ)細胞内に上記ｐＴαを発現させることと、ｃ)処務鬼より、ＣＤ３複合体の刺激により、細胞を増やすことを含む。
【０１８３】
免疫療法のためのＴ細胞を調製する方法であって、Ｔ細胞を増やすために、本明細書に提供される方法の工程を含む方法も提供される。ある実施形態では、ｐＴαポリヌクレオチド配列は、無作為にまたは相同組換えにより導入され得る。ある実施形態では、挿入は、ＴＣＲα遺伝子の不活性化と関連し得る。
【０１８４】
ｐＴαの異なる機能性変異体が使用可能である。ペプチドの「機能性変異体」は、ペプチド全体またはその断片のいずれかに実質的に類似する分子をさす。ｐＴαの「断片」またはその機能性変異体は、分子の任意のサブセット、すなわち、完全長ｐＴαよりも短いペプチドをさす。ある実施形態では、ｐＴαまたは機能性変異体は、例えば、完全長ｐＴαまたはＣ末端が切断されたｐＴαバージョンであり得る。Ｃ末端切断型ｐＴαは、Ｃ末端において１以上の残基を欠いている。非制限的な例として、Ｃ末端切断型ｐＴＣＲαバージョンは、タンパク質のＣ末端からの１８、４８、６２、７８、９２、１１０または１１４個の残基を欠いている。ペプチドのアミノ酸配列変異体は、ペプチドをコードするＤＮＡにおける突然変異によって調製され得る。そのような機能性変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失または挿入もしくは置換を含む。最終的なコンストラクトに達するために、最終的なコンストラクトが所望の活性、特に、機能性ＣＤ３複合体の回復、を有するという条件で、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせも行われ得る。好ましい実施形態では、二量体化に影響を及ぼすために、上記の異なるｐＴαバージョンに少なくとも１つの突然変異が導入される。非制限的な例として、突然変異した残基は、少なくともヒトｐＴαタンパク質のＷ４６Ｒ、Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２ＡもしくはＲ１１７Ａであり得るかまたはｐＴαファミリーもしくは相同なメンバーにおいてＣＬＵＳＴＡＬＷ法を使用して位置がアラインメントされ得る。ｐＴαまたは上記のその変異体は、突然変異した残基Ｗ４６Ｒまたは突然変異した残基Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２ＡおよびＲ１１７Ａを含むことが好ましい。ある実施形態では、上記ｐＴαまたは変異体は、非制限的な例としてのＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)およびＣＤ８のようなシグナル伝達ドメインにも融合される。ｐＴαまたは上記変異体の細胞外ドメインは、ＴＣＲαタンパク質の断片、特に、ＴＣＲαの膜貫通および細胞内ドメインに融合され得る。ｐＴα変異体は、ＴＣＲαの細胞内ドメインにも融合され得る。
【０１８５】
ある実施形態では、ｐＴαバージョンは、細胞外リガンド結合ドメインに融合され得る。ある実施形態では、ｐＴαまたはその機能性変異体が、フレキシブルなリンカーで連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽および重可変断片を含む一本鎖抗体断片(ｓｃＦｖ)に融合される。
【０１８６】
用語「ＴＣＲα欠損Ｔ細胞」は、機能性ＴＣＲα鎖の発現を欠く、単離されたＴ細胞をさす。これは、異なる手段、非制限的な例として、いかなる機能性ＴＣＲαもその細胞表面で発現しないようにＴ細胞を操作することによりまたは非常にわずかな機能性ＴＣＲα鎖をその表面において生成するようにＴ細胞を操作することによりまたはＴＣＲα鎖の突然変異型もしくは切断型を発現するようにＴ細胞を操作することにより、達成され得る。ＴＣＲα欠損細胞は、もはやＣＤ３複合体を介して増やすことはできない。よって、この問題を克服し、ＴＣＲα欠損細胞の増殖を可能とするために、ｐＴαまたはその機能性変異体が細胞内に導入され、こうして、機能性ＣＤ３複合体を回復させる。ある実施形態では、方法は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)の１つの構成要素をコードする１つの遺伝子をＤＮＡ切断することにより選択的に不活性化することができる希少切断性エンドヌクレアーゼを上記Ｔ細胞内に導入することをさらに含む。ある実施形態では、希少切断性エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼである。
【０１８７】
別の態様では、本明細書に記載の方法により得られる操作されたＴ細胞が、二重特異性抗体と接触させられ得る。例えば、Ｔ細胞は、患者への投与前にエクスビボ(ex vivo)でまたは患者への投与後にインビボで、二重特異性抗体と接触させられ得る。二重特異性抗体は、標的抗原の近傍に操作された細胞を連れて行くことを容易にする、異なる抗原特性を有する２つの可変領域を含む。非制限的な例として、二重特異性抗体を、腫瘍マーカーおよび例えば、制限なくＣＤ３のようなリンパ球抗原に向けることができ、二重特異性抗体は、任意の循環Ｔ細胞を腫瘍に向け直し活性化する能力を有する。
【０１８８】
ある実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションにより細胞内に直接導入されるｍＲＮＡであり得る。ある実施形態では、細胞中への材料のデリバリーのために生細胞を一過性に透過化するためにｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術が使用可能である。最小限の死亡率を伴う高いトランスフェクション効率のための条件を決定するために、パラメータが改変され得る。
【０１８９】
Ｔ細胞を形質転換する方法も本明細書に提供される。ある実施形態では、方法は、Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、(ａ)１センチメーター当たり約２２５０から３０００Ｖまでの電圧範囲を有する電気パルス；(ｂ)０.１msのパルス幅；(ｃ)工程(ａ)と(ｂ)の電気パルスの間の約０.２〜１０msのパルス間隔；(ｄ)約１００msのパルス幅および工程(ｂ)の電気パルスと工程(ｃ)の第１の電気パルスの間の約１００msのパルス間隔を伴う、約２２５０から３０００Ｖの電圧範囲を有する電気パルス；ならびに(ｅ)約０.２msのパルス幅および４つの電気パルスそれぞれの間の２msのパルス間隔を伴う約３２５Ｖの電圧を有する４つの電気パルスからなる、アジャイル・パルスシーケンスをＴ細胞に印加することを含む。ある実施形態では、Ｔ細胞を形質転換する方法であって、上記Ｔ細胞をＲＮＡと接触させることと、(ａ)１センチメーター当たり約２２５０、２３００、２３５０.２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧を有する電気パルス；(ｂ)０.１msのパルス幅；(ｃ)工程(ａ)と(ｂ)の電気パルスの間の約０.２、０.５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０msのパルス間隔；(ｄ)約１００msのパルス幅および工程(ｂ)の電気パルスと工程(ｃ)の第１の電気パルスの間の約１００msのパルス間隔を伴う、約２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧範囲を有する電気パルス；ならびに(ｅ)約０.２msのパルス幅および４つの電気パルスそれぞれの間の２msのパルス間隔を伴う約３２５Ｖの電圧を有する４つの電気パルスからなる、アジャイル・パルスシーケンスをＴ細胞に印加することを含む方法。上記値の範囲に含まれるいずれの値も本願に開示されている。エレクトロポレーション培地は、当分野で知られた任意の好適な培地である。ある実施形態では、エレクトロポレーション培地は、約０.０１から約１.０ミリジーメンスにわたる範囲の伝導率を有する。
【０１９０】
ある実施形態では、非限定的な例として、ＲＮＡは希少切断性エンドヌクレアーゼ、ハーフＴＡＬＥヌクレアーゼのような希少切断性エンドヌクレアーゼの１つのモノマー、ＣＡＲ、多鎖キメラ抗原受容体の少なくとも１つの構成要素、ｐＴαもしくはその機能性変異体、外来性核酸および／または追加の触媒ドメインをコードする。
【０１９１】
操作された免疫細胞
本発明は、本明細書に記載のＣＡＲポリヌクレオチドのいずれかを含む操作された免疫細胞も提供する。ある実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して、導入遺伝子として免疫細胞内に導入され得る。ある実施形態では、プラスミドベクターは、例えば、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。
【０１９２】
ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内への導入後に、細胞中、インサイチュで合成され得る。あるいは、ＣＡＲポリペプチドは、細胞の外側で生成され、次いで、細胞内に導入され得る。ポリヌクレオチドコンストラクトを細胞内へと導入する方法は、当該分野で既知である。ある実施形態では、細胞のゲノム中にポリヌクレオチドコンストラクトを組み込むために、安定なトランスフェクション法が使用され得る。他の実施形態では、一過性のトランスフェクション法が使用されて一過性にポリヌクレオチドコンストラクトを発現させることができ、ポリヌクレオチドコンストラクトは、細胞のゲノム中に組み込まれない。他の実施形態では、ウイルス媒介性の方法が使用され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどの任意の好適な手段により、細胞内に導入され得る。一過性のトランスフェクション法は、例えば、制限なく、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは微粒子銃を含む。ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターのようなベクター中に含まれ得る。
【０１９３】
本明細書に提供される細胞を操作する上記方法により得られた単離細胞および細胞株も本明細書に提供される。ある実施形態では、単離細胞は、少なくとも１つの上記ＣＡＲを含む。ある実施形態では、単離細胞は、各ＣＡＲが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲの集団を含む。
【０１９４】
上記方法のいずれか１つにより得られた単離された免疫細胞も本明細書に提供される。異種ＤＮＡを発現することができる任意の免疫細胞が、目的のＣＡＲを発現する目的に使用され得る。ある実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。ある実施形態では、免疫細胞は、例えば、制限なく、幹細胞に由来することができる。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より特別には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。単離細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、メモリーＴリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であることもできる。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来することができる。
【０１９５】
増やすことおよび遺伝子改変の前に、細胞の供給源が、多様な非制限的方法により対象から得られ得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの非制限的な供給源から得られ得る。ある実施形態では、利用可能であり、当分野の当業者に知られた任意の数のＴ細胞株が使用され得る。ある実施形態では、細胞は、健常ドナーに、がんと診断された患者にまたは感染症と診断された患者に由来することができる。ある実施形態では、細胞は異なる表現型の特徴を表す細胞の混合集団の一部であり得る。
【０１９６】
上記方法のいずれかによるトランスフェクトされたＴ細胞から得られた細胞株も本明細書に提供される。免疫抑制処置に対して抵抗性である改変細胞も本明細書に提供される。ある実施形態では、本発明による単離細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１９７】
本発明の免疫細胞は、例えば、制限なく、米国特許第６,３５２,６９４号；同第６,５３４,０５５号；同第６,９０５,６８０号；同第６,６９２,９６４号；同第５,８５８,３５８号；同第６,８８７,４６６号；同第６,９０５,６８１号；同第７,１４４,５７５号；同第７,０６７,３１８号；同第７,１７２,８６９号；同第７,２３２,５６６号；同第７,１７５,８４３号；同第５,８８３,２２３号；同第６,９０５,８７４号；同第６,７９７,５１４号；同第６,８６７,０４１号および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に一般的に記載された方法を使用して、Ｔ細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかにおいて活性化され、増やされ得る。Ｔ細胞はインビトロまたはインビボで増やされ得る。一般に、本発明のＴ細胞は、例えば、ＣＤ３  ＴＣＲ複合体およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激して、Ｔ細胞の活性化シグナルを生じさせる薬剤との接触により、増やされ得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール(ＰＭＡ)等の化学物質またはフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)のような有糸分裂促進性レクチンが、Ｔ細胞の活性化シグナルを生じさせるために使用され得る。
【０１９８】
ある実施形態では、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片または抗ＣＤ２抗体との接触により、あるいはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)との接触により、Ｔ細胞がインビトロで刺激され得る。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のためには、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、Ｔ細胞の集団が抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させられ得る。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清(例えば、ウシ胎仔またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦまたは当業者に知られた細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖およびバイアビリティーに必要な因子を含有し得る適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−Ｖｉｖｏ１５、(Ｌｏｎｚａ))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラズマネートまたはＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これに限定されない。培地は、添加されたアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンを含む、無血清のまたは適切な量の血清(または血漿)もしくは定められたホルモン一式および／またはＴ細胞の成長およびＴ細胞を増やすために十分な量のサイトカインを補充したＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含むことができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含められ、対象に輸注されるべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)に維持される。多様な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。
【０１９９】
ある実施形態では、本発明の細胞は、組織または細胞と共培養することにより増やされ得る。細胞は、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後の対象の血液中でも増やされ得る。
【０２００】
ある実施形態では、本発明による単離細胞は、ＣＤ５２、ｄＣＫ、ＧＲ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＨＬＡ,ＴＣＲαおよびＴＣＲβからなる群から選択される１つの不活性化された遺伝子を含み、かつ／あるいはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲおよび／またはｐＴα導入遺伝子を発現する。ある実施形態では、単離細胞は、多鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、本発明による単離細胞は、ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲα、ＣＤＲ５２およびＴＣＲβ、ＧＲおよびＴＣＲα、ＧＲおよびＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＰＤ−１およびＴＣＲα、ＰＤ−１およびＴＣＲβ、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲα、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲβ、ＬＡＧ３およびＴＣＲα、ＬＡＧ３およびＴＣＲβ、Ｔｉｍ３およびＴＣＲα、Ｔｉｍ３およびＴＣＲβ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲα、ＢＴＬＡおよびＴＣＲβ、ＢＹ５５およびＴＣＲα、ＢＹ５５およびＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲα、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲα、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲβ、２Ｂ４およびＴＣＲα、２Ｂ４およびＴＣＲβからなる群から選択される２つの不活性化された遺伝子を含みかつ／あるいはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲおよびｐＴα導入遺伝子を発現する。
【０２０１】
ある実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を不活性化することにより、本発明による細胞中で機能性でないものとされる。ある実施形態では、個体に由来する改変細胞を得るための方法が提供され、細胞は主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)シグナル伝達経路に依存せずに増殖することができる。ＭＨＣシグナル伝達経路に依存せずに増殖できる改変細胞およびこの方法により得られ得る改変細胞は、本発明の範囲に包含される。本明細書に開示される改変細胞は、それを必要とする患者を宿主対移植片(ＨｖＧ)拒絶および移植片対宿主疾患(ＧｖＨＤ)に対して処置するために使用可能であり；したがって、それを必要とする患者を宿主対移植片(ＨｖＧ)拒絶および移植片対宿主疾患(ＧｖＨＤ)に対して処置する方法であって、不活性化されたＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子を含む改変細胞の有効量を上記患者に投与することにより上記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内にある。
【０２０２】
ある実施形態では、免疫細胞は、１以上の化学療法薬に対して抵抗性であるように操作されている。化学療法薬は、例えば、プリンヌクレオチド類似体(ＰＮＡ)であることができ、よって、免疫細胞を、養子免疫療法と化学療法を併せたがんの処置に好適なものとする。代表的なＰＮＡは、例えば、クロファラビン、フルダラビンおよびシタラビンを、単独でまたは組み合わせで含む。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ(ｄＣＫ)により、モノ、ジまたはトリホスフェートＰＮＡに代謝される。それらのトリホスフェート形態は、ＤＮＡ合成に関してＡＴＰと競合し、プロアポトーシス剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ(ＲＮＲ)の強力な阻害剤である。不活性化されたｄＣＫ遺伝子を含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が、本明細書に提供される。ある実施形態では、ｄＣＫノックアウト細胞が、例えば、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによりｄＣＫ遺伝子に対する特異的なＴＡＬヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用するＴ細胞のトランスフェクションにより作製される。ｄＣＫノックアウトＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えば、クロロファラビンおよび／またはフルダラビンを含むＰＮＡに対して抵抗性であり、ＥＧＦＲｖIII発現細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性活性を維持している。別の例では、化学療法薬は、例えば、モノクローナル抗ＣＤ５２抗体(例えば、アレムツズマブ)のようなＣＤ５２標的化分子であり得る。ＣＤ５２は、リンパ球の表面に存在するタンパク質であり、抗ＣＤ５２抗体は、抗体−補体依存性の細胞傷害性により、免疫細胞のアポトーシスおよび溶解を誘導でき、リンパ球の枯渇をもたらす。不活性化されたＣＤ５２遺伝子を含むＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が本明細書に提供される。ある実施形態では、ＣＤ５２ノックアウト細胞は、例えば、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによりＣＤ５２遺伝子に対する特異的なＴＡＬ−ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用する、Ｔ細胞のトランスフェクションにより作製される。ＣＤ５２ノックアウトＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えば、アレムツズマブを含む抗ＣＤ５２分子に対して抵抗性であり、抗ＣＤ５２分子の存在下では、ＥＧＦＲｖIII発現細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性活性を維持している。
【０２０３】
ある実施形態では、本発明の単離細胞または細胞株は、ｐＴαまたはその機能性変異体を含むことができる。ある実施形態では、単離細胞または細胞株は、ＴＣＲα遺伝子を不活性化することにより、さらに遺伝子改変され得る。
【０２０４】
ある実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えば、ＲＱＲ８のような自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１３１５３３９１Ａ号参照。自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ−Ｔ細胞において、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面において発現される。ある実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号２２６に示されるアミノ酸配列を含む。
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPW(配列番号２２６)
【０２０５】
ある実施形態では、自殺ポリペプチドは、アミノ末端にシグナルペプチドも含み得る。自殺ポリペプチドがＣＡＲ−Ｔ細胞の表面において発現される場合、ポリペプチドのＲエピトープ(すなわち、リツキシマブ−ＣＰＹＳＮＰＳＬＣ(配列番号２５６)により認識されるエピトープ)へのリツキシマブの結合は、細胞の溶解を引き起こす。細胞表面に発現される１つのポリペプチド当たり、１を超えるリツキシマブ分子が結合し得る。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、リブキシマブの別々の分子に結合し得る。ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の除去は、例えば、リツキシマブを患者に投与することにより、インビボで起こり得る。導入された細胞を除去するための決断は、例えば、許容できないレベルの毒性が検出される場合など、患者において検出される導入細胞に起因した望ましくない効果から生じる可能性がある。
【０２０６】
ある実施形態では、自殺ポリペプチドは、抗体(例えば、リツキシマブ)により認識される１つ、２つ、３つまたはそれ超のエピトープを含有し得る。
【０２０７】
ある実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞中、ＣＡＲ含有ポリペプチドから別れたポリペプチド中で提供され得る。ある実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞中、ＣＡＲポリペプチドと同じポリペプチド鎖中に提供される。自殺ポリペプチドを含有するＣＡＲにおいては、自殺ポリペプチドは、典型的に、ＣＡＲの細胞外部分において提供される。
【０２０８】
自殺ポリペプチドを含有するＣＡＲにおいて、自殺ポリペプチドは、例えば、リツキシマブにより認識されるエピトープ［ＣＰＹＳＮＰＳＬＣ(配列番号２５６)］のアミノ酸配列の１以上のコピーを含有し得る。自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ中の様々な位置に配置され得る。例えば、自殺ポリペプチドは、ＣＡＲ中でｓｃＦｖのＮ末端にあってもよくまたはｓｃＦｖのＣ末端にあってもよい。ある実施形態では、自殺ペプチドは、ＣＡＲのｓｃＦｖとヒンジ領域の間にあってもよい。ある実施形態では、ＣＡＲは、１を超える自殺ポリペプチドを含有し得る。例えば、ＣＡＲは、ｓｃＦｖのＮ末端の自殺ポリペプチドおよびｓｃＦｖのＣ末端の自殺ポリペプチドを含有し得る。これらのポリペプチドのそれぞれは、リツキシマブにより認識されるエピトープの１以上のコピーを含有し得る。例えば、ＣＡＲは、ｓｃＦｖのＮ末端位置に第１の自殺ポリペプチドを含有してもよく、第１の自殺ポリペプチドは、リツキシマブにより認識されるエピトープのコピーを１つおよびｓｃＦｖのＣ末端位置に第２の自殺ポリペプチドを含有し、第２の自殺ポリペプチドはリツキシマブにより認識されるエピトープのコピーを２つ含有する。
【０２０９】
ＣＡＲ内に自殺ポリペプチド配列を含有するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードする核酸も本明細書に提供される。
【０２１０】
一例では、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲと同じポリペプチド鎖中の自殺ポリペプチドは、本明細書に「Ｒ２自殺配列」として記載されて提供される配列を有し得る。Ｒ２自殺配列は、リツキシマブにより認識されるエピトープ［ＣＰＹＳＮＰＳＬＣ(配列番号２５６)］のコピーを２つ含有する。そのようなＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、本明細書中で「ＥＧＦＲｖIII−Ｒ２  ＣＡＲ」と呼ばれ得る。表５Ｄは、本発明の代表的なＥＧＦＲｖIII−Ｒ２  ＣＡＲのアミノ酸配列を提供する。表５Ｄにおいて、シグナル／リーダーペプチド配列は太字で、ＧＳリンカー((ＧＧＧＧＳ)４(配列番号２０２)(は下線つきで、Ｒ２自殺配列は太字かつ下線つきである。表５Ｅは、本発明の代表的なＥＧＦＲｖIII−Ｒ２  ＣＡＲをコードする代表的な核酸配列を提供する。
【０２１１】
【表３４】
2019506394.tif 000036
【表３５】
2019506394.tif 000037
【０２１２】
【表３６】
2019506394.tif 000038
【表３７】
2019506394.tif 000039
【０２１３】
【表３８】
2019506394.tif 000040
【表３９】
2019506394.tif 000041
【０２１４】
治療応用
上記方法により得られた単離細胞またはそのような単離細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。ある実施形態では、そのような医薬は、固形腫瘍および液性腫瘍を含むがんを処置するために使用され得る。ある実施形態では、がんは、神経膠芽腫(例えば、多形神経膠芽腫)、未分化星状細胞腫、巨細胞膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起神経膠腫、未分化上衣腫、未分化乏突起星状細胞腫、脈絡叢がん、未分化神経節膠腫、松果体芽細胞腫、松果体細胞腫、髄膜腫、髄様上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、混合膠腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、髄芽細胞腫、結腸直腸がん、肛門がん、子宮頸部がん、腎臓がん、皮膚がん、膵臓がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、甲状腺がん、中皮腫、子宮がん、リンパ腫または白血病を含むが、これに限定されないＥＧＦＲｖIII関連がん(例えば、任意のＥＧＦＲｖIIIを発現するがん)である。
【０２１５】
ある実施形態では、本明細書に記載の医薬は、１)ＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍の成長または進行の阻害；２)対象におけるＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞の転移の阻害；および３)ＥＧＦＲｖIIIを発現する悪性細胞を有する対象における腫瘍退縮の誘導に使用され得る。
【０２１６】
ある実施形態では、本発明による単離細胞または単離細胞に由来する細胞株は、それを必要とする患者におけるがんの処置のための医薬の製造において使用され得る。
【０２１７】
患者を処置するための方法も本明細書に提供される。ある実施形態では、方法は、本発明の免疫細胞を、それを必要とする患者に提供することを含む。ある実施形態では、方法は、本発明の形質転換された免疫細胞を、それを必要とする患者に投与する工程を含む。
【０２１８】
ある実施形態では、本発明のＴ細胞は、ロバストなインビボでのＴ細胞の増大を起こすことができ、長期間持続することができる。
【０２１９】
本発明の処置方法は、軽快をもたらす、治癒的であるまたは予防的であり得る。本発明の方法は、自家免疫療法の一部または同種間免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。本発明は、特に、同種間免疫療法に好適である。ドナー由来のＴ細胞は、標準的なプロトコールを使用して非アロ反応性細胞に形質転換され、必要に応じて複製され、それにより、１人または数人の患者に投与され得るＣＡＲ−Ｔ細胞を産生することができる。そのようなＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、「既製の」治療薬として利用可能なものとされ得る。
【０２２０】
開示された方法とともに使用可能な細胞は、例えば、先の項に記載されている。処置は、例えば、がんと診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得るがんは、例えば、上で列挙されたがんのいずれかを含むＥＧＦＲｖIII関連がんを含む。本発明のＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて処置されるがんの種類は、多形神経膠芽腫、頭頸部がん、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がんのような、ある特定の液性および固形腫瘍を含むが、これに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。
【０２２１】
ある実施形態では、処置は、抗体療法、抗体−薬物コンジュゲート療法、化学療法、標的療法、サイトカイン療法、ワクチン療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ナノ粒子療法、ホルモン療法、外科的切除、レーザー光療法、腫瘍治療電場および放射線療法の群から選択される、がんに対する１以上の治療法との組み合わせであり得る。例えば、本発明のＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞は、１)放射線照射、外科的切除、化学療法(例えば、テモゾロミド、プロカルバジン、カルムスチン、ロムスチン、ビンクリスチンなど)、ベバシズマブのような抗体療法、抗血管新生療法および／または腫瘍治療電場を含む、標準治療；２)ＥＧＦＲｖIIIワクチンを含むワクチン；３)ＥＧＦＲ,ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４のようなＨＥＲファミリーの受容体を標的とする、薬物コンジュゲートを含むが、これに限定されない、抗体−薬物コンジュゲート療法；４)キナーゼ阻害剤(例えば、エベロリムス)のような標的療法；ならびに５)抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、抗４−１ＢＢ、抗ＴＩＭ３、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＯＸ４０、抗ＨＶＥＭ、抗ＢＴＬＡ,抗ＣＤ４０、抗ＣＤ４７、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＳＦ１、抗ＭＡＲＣＯ、抗ＩＬ８、抗ＣＸＣＲ４および抗ＣＴＬＡ４抗体を含むが、これに限定されない免疫療法とともに(例えば、その前、同時またはその後に)患者に投与され得る。
【０２２２】
ある実施形態では、処置は、免疫抑制処置を受けている患者に投与され得る。実際に、本発明は、細胞または細胞の集団に依存することが好ましく、細胞または細胞の集団は、少なくとも１つの免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６)の受容体をコードする遺伝子の不活性化により、そのような免疫抑制剤に対して耐性とされている。この態様では、免疫抑制処置は、患者内の本発明によるＴ細胞の選択および増大を助けるはずである。本発明による細胞および細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、埋め込みまたは移植によるものを含む、任意の便利な方法で行われ得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって皮下に、皮内に、腫瘍内に、頭蓋内に、結節内に、髄内に、筋肉内にまたは腹腔内に、投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、静脈内注射により投与されることが好ましい。
【０２２３】
ある実施形態では、処置は、リンパ球枯渇レジメンを受けている患者に投与され得る。細胞傷害性薬物または全身照射による免疫調節エレメントの枯渇は、本発明のＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強することができる。例えば、リンパ球枯渇レジメンにおける細胞傷害性薬物は、フルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはアレムツズマブを含むが、これに限定されない。
【０２２４】
ある実施形態では、細胞または細胞の集団の投与は、例えば、体重１kg当たり、範囲内のすべての整数値の細胞を含む、約１０４個〜約１０９個の細胞の投与を含むことができる。ある実施形態では、細胞または細胞の集団の投与は、体重１kg当たり、範囲内のすべての整数値の細胞を含む、約１０５個〜約１０６個の細胞の投与を含むことができる。細胞または細胞の集団は、１以上の用量で投与され得る。ある実施形態では、細胞の上記有効量が、単一用量として投与され得る。ある実施形態では、細胞の上記有効量は、ある期間にわたり、１を超える用量として投与され得る。投与のタイミングは、管理医師の判断内にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の供給源から得られ得る。個々のニーズが変化する一方、特別な疾患もしくは状態のためのある細胞タイプの有効量の最適範囲の決定は、当業者の能力内にある。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば、同時の処置の種類、処置の頻度ならびに所望の効果の性質に依存する。ある実施形態では、細胞またはそれらの細胞を含む組成物の有効量が、非経口に投与される。ある実施形態では、投与は、静脈内投与であり得る。ある実施形態では、投与は、腫瘍内の注射により直接的に行われ得る。
【０２２５】
キット
本発明は、本方法における使用のためのキットも提供する。本発明のキットは、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは本明細書に記載のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞を含む、１以上の容器および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従う使用のための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、上記治療的処置のための操作された免疫細胞の投与の説明を含む。
【０２２６】
本明細書に記載の操作された免疫細胞の使用に関する指示書は、一般に、意図される処置のための用量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば、マルチドーズパッケージ)または副次的単位用量であり得る。本発明のキットにおいて供給される指示書は、典型的に、ラベルまたは添付文書(例えば、キット中に含まれる紙のシート)上の書面による指示書であるが、機械可読な指示書(例えば、磁気または光記憶ディスクに収容される指示書)も許容可能である。
【０２２７】
本発明のキットは、好適な包装内にある。好適な包装は、バイアル、瓶、ジャー、フレキシブル包装(例えば、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ)などを含むが、これに限定されない。吸入器、経鼻投与装置(例えば、アトマイザー)またはミニポンプのようなインフュージョン装置のような特定の装置と組み合わせた使用のためのパッケージも企図される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は、静脈注射溶液バックまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る)。容器は、無菌のアクセスポートも有し得る(例えば、容器は、静脈注射溶液バックまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも１つの活性剤はＥＧＦＲｖIII抗体である。容器は、第２の薬学的活性剤をさらに含み得る。
【０２２８】
キットは、所望により、バッファーおよび解釈用情報のような追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器および容器上または容器に付随したラベルまたは添付文書を含む。
【０２２９】
米国仮特許出願第６２／２８１,５３３号(２０１６年１月２１日出願)および同第６２／４３１,７５８号(２０１６年１２月８日出願)の内容は、すべての目的のために、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
生物寄託
本発明の代表的な材料は、    にAmerican Type Culture Collection(「ＡＴＣＣ」)、1081 University Boulvard, Manassas, Va., 20110-2209, USAに寄託された。ＡＴＣＣ受け入れ番号＿＿を有するベクター＿＿は、＿＿軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受け入れ番号＿＿を有するベクター＿＿は、＿＿重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の規定およびそれに従う規則(「ブダペスト条約」)の下で行われた。これは、寄託物の生きた培養の維持を寄託日から３０年間保証する。寄託物はブダペスト条約の条項に従ってＡＴＣＣの下で利用可能となり、また、関連する米国特許が発行された際または任意の米国もしくは外国特許出願が一般に公開された際のいずれか早い方において、寄託培養物の子孫の一般への永久的かつ無期限な利用可能性を保証し、米国特許法§１２２およびそれに準じた長官の規則(米国特許法施行規則§１.１４を含み、特に、８８６ＯＧ６３８を参照)に従って米国特許商標庁長官によりその権利があると決定された者へのその子孫の利用可能性を保証する、Pfizer Inc.とＡＴＣＣの間の合意の対象である。
【０２３１】
本願の譲受人は、好適な条件下で培養されたときに、寄託されている材料の培養物が死滅または損失または破壊した場合は、通知して、その材料が直ちに同じもので交換することに合意している。寄託された材料の利用可能性は、政府のその特許法に従う権限の下で付与される権利に違反して本発明を実施することを認めるものと解釈されるべきでない。
【０２３２】
以下の例は、例示の目的のみのために提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を制限することを意図されない。実際に、先の記載から、本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が当業者に明らかとなり、添付された特許請求の範囲に入る。
【実施例】
【０２３３】
実施例１：組換え抗ＥＧＦＲｖIIIマウス−ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体の親和性決定
この実施例は、２５℃および３７℃において、キメラおよびヒト化抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性を決定する。
ハイブリドーマから生成された抗ＥＧＦＲｖIIIマウス(ｍ)抗体、ｍ６２Ｇ７を、配列決定し、マウス−ヒトキメラ抗体としての発現のための好適なベクター中にサブクローニングした。マウス抗体ｍ６２Ｇ７のＣＤＲを、ヒトフレームワークに移植し、ヒトＩｇＧ１組換え抗体、ｈ６２Ｇ７として発現させた。ｈ６２Ｇ７の親和性変異体(affinity variant)を、重鎖および軽鎖のＣＤＲに突然変異を導入することにより作製した。組換え抗ＥＧＦＲｖIIIキメラ抗体ｍ６２Ｇ７およびヒト化ｈ６２Ｇ７抗体の親和性を、研究グレードの抗ヒトＦｃ結合ＣＭ４センサーチップ(GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ)を備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)Ｔ２００バイオセンサーにおいて測定した。次いで、抗ＥＧＦＲｖIII抗体を抗ヒトＦｃにより捕捉した。次いで、モノマーの８−ヒスチジンタグ付きヒトＥＧＦＲｖIII細胞外ドメインを、最高濃度１０００nMの一連の１０倍希釈液の分析物として注入した。ヒトＥＧＦＲｖIIIに対する抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性を、２５℃および３７℃の両方で測定した(表６)。これらの抗体のいずれも、同じアッセイ条件下で１０００nMの８−ヒスチジンタグ付き組換え野生型タンパク質ＥＧＦＲｖIIIｗｔへの検出可能な結合を示さなかった。
【０２３４】
表６においては、ｈ６２Ｇ７の変異体は、重鎖の変異、次いで軽鎖の変異に関して記載される。例えば、抗体クローン「ｈ６２Ｇ７−ＥＱ／Ｌ６」は、ｈ６２−Ｇ７クローンであって、重鎖において「ＥＱ」変異を含有し(本明細書中で「ｈ６２Ｇ７−ＥＱ」とも呼ばれる)、軽鎖において「Ｌ６」変異を含有する(本明細書中で「ｈ６２Ｇ７−Ｌ６」とも呼ばれる)ｈ６２−Ｇ７クローンをさす。これらの重鎖および軽鎖アミノ酸配列を表２に提供する。また、本願においては、ｈ６２Ｇ７変異体は、重鎖または軽鎖変異体のどちらを最初に書いて言及されてもよく、したがって、例えば、「ｈ６２Ｇ７−ＥＱ／Ｌ６」および「ｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ」はどちらもｈ６２Ｇ７−ＥＱ重鎖およびｈ６２Ｇ７−Ｌ６軽鎖を含有する抗体をさす。
【表４０】
2019506394.tif 000042
【０２３５】
実施例２：ヒト抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性決定
この実施例は、３７℃において、様々なヒト抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性を決定する。
ＥＧＦＲｖIIIに対するヒト抗体を生成するために、トランスジェニクＡｌｉｖａＭａｂマウス(Ablexis LLC, San Francisco, CA)を、ＥＧＦＲｖIIIを発現するパラホルムアルデヒドで固定したラット神経膠芽腫細胞株、Ｆ９８−ｎｐＥＧＦＲｖIII(American Type Culture Collection,Manassas, VA)およびＥＧＦＲｖIIIのジャンクション領域に対するペプチド(配列番号２２７：CGSGSGLEEKKGNYVVTDH)を交互に用いて免疫化した。標準的技術を使用してハイブリドーマを生成した。ＥＧＦＲｖIIIに対するこれらのハイブリドーマの結合親和性および特異性を決定するために、培養上清中の抗体を、抗マウスＦｃ結合ＣＭ４センサーチップ(Biacore(商標)AB, Uppsala, Sweden - 現在はGE Healthcare)を備えたＢｉａｃｏｒｅ(商標)Ｔ２００バイオセンサーにより捕捉した。次いで、モノマーの８−ヒスチジンタグ付きヒトＥＧＦＲｖIII細胞外ドメインを、最高濃度１０００nMの一連の１０倍希釈液の分析物として注入した。ヒトＥＧＦＲｖIIIに対する抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性を、３７℃で測定した(表７)。これらのハイブリドーマのいずれも、同じアッセイ条件下で１０００nMの８−ヒスチジンタグ付き組換え野生型タンパク質ＥＧＦＲｖIIIｗｔへの検出可能な結合を示さなかった。
【表４１】
2019506394.tif 000043
【０２３６】
実施例３：フローサイトメトリーによる、ＥＧＦＲｖIII発現細胞株への抗ＥＧＦＲｖIII抗体の結合特異性
この実施例は、ＥＧＦＲｖIII発現細胞への抗ＥＧＦＲｖIII抗体の細胞結合特異性を示す。
ＡｌｉｖａＭａｂマウスから生成された抗ＥＧＦＲｖIII抗体の細胞結合特異性を評価するために、すべてAmerican Type Culture Collection(Manassas, VA)から入手した３種の同質遺伝子的ラット神経膠芽腫細胞株およびヒトがん細胞株：Ｆ９８(ヒトＥＧＦＲのいかなる形態も発現しない)、Ｆ９８−ＥＧＦＲｗｔ(野生型ＥＧＦＲを発現する)、Ｆ９８−ｎｐＥＧＦＲｖIII(ＥＧＦＲｖIIIを発現する)およびＡ４３１(野生型ＥＧＦＲの過剰発現を伴う類表皮がん細胞株)を使用した。細胞染色のために、５００,０００個の細胞を５０μlのハイブリドーマ上清とともに４５分間、４℃でインキュベートし、結合バッファー(ＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水)］＋０.５％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン))を用いて洗浄し、続いて、Jackson ImmunoResearch Loboratories(West Grove, PA)からのＦＩＴＣ−コンジュゲーションヤギ抗マウスＦｃ特異的二次抗体とのインキュベーションを行った。表８Ａおよび８Ｂは、ＥＧＦＲｖIII発現細胞株におけるＥＧＦＲｖIII抗体(クローン２０Ｇ５を除く)の平均蛍光強度(ＭＦＩ)が、非発現細胞株よりも少なくとも１０倍高かったことを示す。図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、クローニングされ、組換えヒトＩｇＧ１抗体、４２Ｇ９(図１Ａ)、３２Ａ１０(図１Ｂ)および３２Ｇ８(図１Ｃ)として発現された３種のＥＧＦＲｖIII特異的クローンの、３つのＦ９８細胞株へのＦＡＣＳ結合ヒストグラムの例を示す。
【０２３７】
【表４２】
2019506394.tif 000044
【０２３８】
【表４３】
2019506394.tif 000045
これらの結果は、ＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞への、抗ＥＧＦＲｖIII抗体の結合特異性を示す。
【０２３９】
実施例４：ファージディスプレイからの完全ヒト抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性決定
この実施例は、２５℃において、様々なヒト抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性を決定する。
ヒト抗ＥＧＦＲｖIII抗体を配列決定し、組換えヒトＩｇＧ１抗体としての発現のための好適なベクター中にサブクローニングした。抗体の親和性を、抗ヒトＦｃ結合ＣＭ４センサーチップ(GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ)を備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)Ｔ２００バイオセンサーにおいて２５℃で測定した(表９)。抗ＥＧＦＲｖIII抗体を抗ヒトＦｃにより捕捉した。次いで、モノマーの８−ヒスチジンタグ付きヒトＥＧＦＲｖIII細胞外ドメインを、最高濃度１０００nMの一連の１０倍希釈液の分析物として注入した。２つの抗体の中ではＣ６のみが、１０００nMの８−ヒスチジンタグ付き組換え野生型タンパク質ＥＧＦＲｗｔへの非常に弱いが検出可能な結合を２５℃において示した。
【表４４】
2019506394.tif 000046
【０２４０】
実施例５：組換え一本鎖Ｆｖフォーマット抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性決定
この実施例は、様々な組換え一本鎖Ｆｖフォーマット抗ＥＧＦＲｖIII抗体の親和性を３７℃において決定する。
従来の抗体を一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片に変換するために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを、(ＧＧＧＧＳ)４(配列番号２０２)リンカーを介して一緒に結合した。次いで、ｓｃＦｖ断片をヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部分に融合して、組換え発現および精製を容易にした。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質の親和性を、抗ヒトＦｃ結合ＣＭ４センサーチップ(GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ)を備えた表面プラズモン共鳴Ｂｉａｃｏｒｅ(登録商標)Ｔ２００バイオセンサーにおいて３７℃で上記のとおりに測定した。ｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質を抗ヒトＦｃにより捕捉した。次いで、モノマーの８−ヒスチジンタグ付きヒトＥＧＦＲｖIII細胞外ドメインを、最高濃度１０００nMの一連の１０倍希釈液の分析物として注入した。表１０は、ｓｃＦｖ再フォーマット融合タンパク質が、ＥＧＦＲｖIIIへの結合を維持し、ＨＬ(Ｎ末端に重鎖可変ドメインを含む)およびＬＨ(Ｎ末端に軽鎖可変ドメインを含む)方向の両方におけるｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質の親和性が、表６、７および９に列挙されたそれらの従来の抗体カウンターパートに匹敵することを示している。これらのｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質も、１０００nMの８−ヒスチジンタグ付き組換え野生型タンパク質ＥＧＦＲｖIIIｗｔへの結合について２５℃で試験したが、顕著な結合を示したものはなかった。
【０２４１】
【表４５】
2019506394.tif 000047
【０２４２】
実施例６：ＥＧＦＲｖIII特異的キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞の産生および検出
この実施例は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現および抗原結合特異性を決定する。
ＡｌｌＣｅｌｌｓ(Alameda, CA)により提供された健常ドナー由来のＰＢＭＣを、提供者の仕様書に従って融解し、５％ヒト血清を補充したＸ−Ｖｉｖｏ(商標)−１５培地(Lonza, Walkersville, MD)中、終夜培養した。２０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２、５％ヒト血清およびビーズ：細胞比１：１のDynabeads Human T activator CD3/CD28(Life Technologies, Carlsbad, CA)を補充したＸ−Ｖｉｖｏ(商標)−１５培地(Ｌｏｎｚａ)中で３日間、Ｔ細胞を活性化した。次いで、感染多重度(ＭＯＩ)５のＥＦ１αプロモーターの制御下で、ＢＦＰ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ発現カセットを含有する２シストロン性のレンチウイルスベクターを用いてＴ細胞に形質導入した。このコンストラクトにおいては、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、ＢＦＰ(青色蛍光タンパク質)と共発現して、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲの検出を容易にする。ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲは、異なる抗ＥＧＦＲｖIIIクローン(本明細書中、他の場所に記載のｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、Ｃ６、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３０Ｄ８および３２Ｇ８)のＶＨおよびＶＬ配列を含有していた。形質導入後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を１４日以下、培養中に維持した。ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージを、ＢＦＰ(青色蛍光タンパク質)を検出のために使用するフローサイトメトリーにより経時的に(初代Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入後４日目、９日目および１４日目)モニターした(図２Ａ)(ＢＦＰ陽性生存細胞のパーセンテージにより決定した)。
【０２４３】
ＣＡＲの標的結合特異性を決定するために、マウスＩｇＧ１−Ｆｃドメインと融合した、それぞれヒトＥＧＦＲｖIIIまたはヒト野生型ＥＧＦＲの細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃおよびＥＧＦＲ−ｍＦｃを、ＨＥＫ２９３細胞において産生した。異なるＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞をＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃまたはＥＧＦＲ−ｍＦｃタンパク質のいずれか、続いて、ＰＥ−標識ヤギ抗マウスＦｃ二次抗体(Jakson ImmunoResearch)とともにインキュベートし、異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローン(ｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、Ｃ６、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３０Ｄ８および３２Ｇ８)を含有するＣＡＲをコードするベクターを用いたＴ細胞の形質導入後４日目に、フローサイトメトリーにより分析することにより、標的結合特異性を決定した。図２Ｂに示すとおり、クローンｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、２０Ｅ１２、２６Ｂ９および３０Ｄ８のＶＨおよびＶＬ配列を含むＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃに結合するが、ＥＧＦＲ−ｍＦｃには顕著に結合しない。導入後１４日目において、ＢＦＰにより検出した、細胞上のＣＡＲ発現と細胞による組換えＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃの結合の相関関係を決定した。代表的なデータセットを図２Ｃに示し、これは、細胞上でのＢＦＰ検出および細胞による組換えＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃの結合により決定した、形質導入後１４日目におけるＣＡＲ−Ｔ細胞中の１０種の異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローン(ｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、Ｃ６、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３０Ｄ８および３２Ｇ８)を含有するＣＡＲの発現を示している。
これらの結果は、クローンｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、２０Ｅ１２、２６Ｂ９および３０Ｄ８のＶＨおよびＶＬ配列を含むＣＡＲを含有するＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃに結合するが、ＥＧＦＲ−ｍＦｃに顕著には結合しないことを示している。
【０２４４】
実施例７：ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的依存性および非依存性の脱顆粒
この実施例は、標的を発現するがん細胞株の存在下および非存在下における、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の脱顆粒活性を決定する。
ＣＡＲ  Ｔ細胞の脱顆粒活性を評価するために５つの細胞株を使用した。ヒト肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２２および神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧを、American Type Culture Collection(Manassas, VA)から入手し、１０％熱失活したウシ胎仔血清(Mediatech Inc., Manassas, VA)を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ほとんどのがん細胞株がＥＧＦＲｖIIIを発現しないため、ＮＣＩ−Ｈ５２２(検出可能なレベルの野生型ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖIIIを発現しない)に、完全長ＥＧＦＲｖIII遺伝子(配列番号２０１)をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入して、「ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII」を生成し、これは低レベルのＥＧＦＲｖIIIを発現する。様々なＥＧＦＲタンパク質を発現する同質遺伝子的なヒト神経膠芽腫細胞株を生成するために、Ｕ８７ＭＧの内在性野生型ＥＧＦＲ遺伝子を最初にノックアウトして、ＥＧＦＲ−ヌル細胞株「Ｕ８７−ＫＯ」を生成した。次いで、完全長野生型ＥＧＦＲ遺伝子(受け入れ番号ＮＰ＿００５２１９)をコードするレンチウイルスベクターを用いてＵ８７−ＫＯ細胞に形質導入して、ＥＧＦＲ過剰発現細胞株「Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔ」を得た。同様に、「Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII」(ＥＧＦＲｖIIIを過剰発現する)を、完全長ＥＧＦＲｖIII遺伝子(配列番号２０１)をコードするベクターを用いたレンチウイルス形質導入により、Ｕ８７−ＫＯから生成した。
【０２４５】
脱顆粒アッセイのために、様々なＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ(クローンｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、Ｃ６、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３０Ｄ８および３２Ｇ８を含有する)を発現する１００,０００個のＴ細胞を、様々なレベルのＥＧＦＲｖIIIタンパク質またはＥＧＦＲｗｔタンパク質を発現する、同数のがん細胞とともに、９６ウエルプレート中でインキュベートした。共培養を、１００μlの最終容量のＸ−Ｖｉｖｏ(商標)−１５培地(Lonza, Walkersville, MD)中に６時間、３７℃で５％ＣＯ２とともに維持した。共培養の開始時に、最終濃度１μg／mlの抗ＣＤ４９ｄ(BD Pharmingen, San Francisco, LA)、１μg/mlの抗ＣＤ２８(Miltenyi Biotec)および１×Monensin(eBioscience, San Diego, CA)溶液とともに蛍光抗ＣＤ１０７ａ抗体(Miltenyi Biotec, San Diego, CA)を添加することにより、細胞刺激の間にＣＤ１０７ａ染色を行った。６時間のインキュベーション期間後、固定可能なバイアビリティー色素および蛍光色素結合抗ＣＤ８抗体(Miltenyi Biotec)を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。脱顆粒活性を、生存／ＣＤ８＋／ＢＦＰ＋／ＣＤ１０７ａ＋細胞の％として、ＣＤ８＋／ＢＦＰ＋細胞の間でのＣＤ１０７ａ染色についての平均蛍光強度シグナル(ＭＦＩ)を測定することによって決定した。脱顆粒アッセイは、ＣＡＲ形質導入の後の１４日目に行った。図３は、各ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲについて、２人のＰＭＢＣドナーからの結果を示す。クローンＣ６および３２Ｇ８を含有するＣＡＲ  Ｔ細胞を除き、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞をＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIIIおよびＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIIIのようなＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞株と共培養したときにのみ、脱顆粒活性の増加(ＣＡＲ−Ｔ細胞を超える)を観察した。
これらの結果は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖIIIを発現する腫瘍細胞の存在下で脱顆粒活性を示すが、ＥＧＦＲｖIIIを発現しない腫瘍細胞の存在下では脱顆粒活性を示さないことを示している。
【０２４６】
実施例８：ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のインターフェロンガンマ(ＩＦＮγ)分泌
この実施例は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の、標的タンパク質を発現する細胞株との共培養に際した、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌のレベルを示す。
異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローン(ｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、Ｃ６、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３０Ｄ８および３２Ｇ８)を含有する、ＣＡＲを発現するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々なレベルのＥＧＦＲｖIIIまたはＥＧＦＲｗｔタンパク質を発現する同数の細胞(細胞ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII、Ｕ８７−ＫＯ、Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔおよびＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII；それぞれ、実施例７に上記した)と一緒に９６ウエルプレート中でインキュベートした(１００,０００細胞／ウエル)。共培養を、１００μlの最終容量のＸ−Ｖｉｖｏ(商標)−１５培地(Ｌｏｎｚａ)中に１８時間、３７℃で５％ＣＯ２とともに維持した。次いで、上清を収集して凍結した。上清中のＩＦＮγを、ヒトＩＦＮ−ガンマＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット(R&D systems, Minneapolis, MN)を用い、製造者の仕様書に従って測定した。図４に示すとおり、大多数のＣＡＲ  Ｔ細胞に関して、ＩＦＮγ分泌のレベルは共培養した細胞により発現されたＥＧＦＲｖIIIの量と相関し：低発現性ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIIIは、少量のＩＦＮγを誘導し、高発現性Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIIIは、大量のＩＦＮγを誘導した。ＥＧＦＲｖIII特異的クローン３２Ｇ８  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、試験した条件下で顕著なレベルのＩＦＮγを分泌しなかった。一方、ＥＧＦＲｖIII特異的クローンＣ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔまたはＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII細胞のいずれかとの共培養に際し、高レベルのＩＦＮγを分泌した。
これらの結果は、大多数のＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞に関して、ＩＦＮγ分泌のレベルは、共培養した細胞により発現されたＥＧＦＲｖIIIの量と相関することを示す。
【０２４７】
実施例９：ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性
この実施例は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の、標的タンパク質を発現する細胞株との共培養に際した、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を決定する。
異なるＥＧＦＲｖIII特異的クローン(ｈ６２Ｇ７−Ｌ６／ＥＱ、１４Ｃ１１、２０Ｂ９、３２Ａ１０、４２Ｇ９、Ｃ６、２０Ｅ１２、２６Ｂ９、３０Ｄ８および３２Ｇ８)を含有する、ＣＡＲを発現するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、様々なレベルのＥＧＦＲｖIIIタンパク質を発現する２０,０００個の標的細胞と一緒に９６ウエルプレートに播種した(４００,０００細胞／ウエル)。標的細胞は：上記Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔ、ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIIIおよびＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIIIであった。標的(ＥＧＦＲｖIII陽性：ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIIIおよびＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)ならびに対照(ＥＧＦＲｖIII陰性：Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｗｔ)細胞を、プレーティングし、これらをＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞と一緒に共培養する前に、蛍光細胞内色素ＣＦＳＥを用いて標識した。共培養を、５％ＣＯ２とともに３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション期間後、固定可能なバイアビリティー色素を用いて細胞を標識し、フローサイトメトリーにより分析した。各細胞集団(ＥＧＦＲｖIII陽性標的細胞またはＥＧＦＲｖIII陰性対照細胞)のバイアビリティーを決定し、特異的な細胞溶解の％を計算した。細胞傷害性アッセイを、Ｔ細胞のＣＡＲ形質導入の１４日後に行った。３２Ｇ８を除いたすべてのＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、低レベル標的発現細胞(ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII)および高レベル標的発現細胞(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)の両方を様々な程度まで溶解した。加えて、ＥＧＦＲｖIII特異的クローンＣ６  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、野生型ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖIII発現細胞の両方を溶解した(図５)。
これらの結果は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞を効果的に死滅させることを示している。
【０２４８】
実施例１０：Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIIIモデルにおけるＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ研究
この実施例は、皮下Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII  ＧＢＭ異種移植片モデルにおけるＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。
５〜６週齢のＮＳＧマウス(Jackson Laboratory, Sacramento, CA)に、３,０００,０００個のＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII  ＧＢＭ腫瘍細胞(上記)を皮下に埋め込んだ。キャリパー機器により、１週間に１回、腫瘍容積を測定し、以下の式：腫瘍容積＝(長さ×幅２)／２を用いて計算した。腫瘍埋め込み後８日目に、腫瘍サイズにより動物を１群当たり動物５頭に無作為に選び、ボーラス尾静脈注射により、６,０００,０００個の単回用量のＣＡＲ陽性ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞(ＥＧＦＲｖIII特異的クローン１４Ｃ１１、３２Ａ１０または２６Ｂ９を発現する；クローンは、本明細書の他所に記載されている)または同じ総数の非形質導入Ｔ細胞を投与した。図６は、１４Ｃ１１、３２Ａ１０および２６Ｂ９  ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞がＵ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII異種移植片の腫瘍成長をインビボで阻害したが、非形質導入Ｔ細胞は阻害しなかったことを示す。
これらの結果は、ＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖIII発現細胞の腫瘍成長をインビボで効果的に阻害したことを示している。
【０２４９】
実施例１１：Ｒ２自殺配列を含有するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲの表面発現
この実施例は、Ｒ２自殺配列を含有するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲのＴ細胞における発現を示す。
Ｒ２自殺配列は、ＣＤ２０エピトープに基づく自殺配列であり、リツキシマブ認識エピトープの２つのタンデムコピーを含有する。Ｒ２配列を、本明細書の他所に記載の様々なＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲ(１４Ｃ１１、３２Ａ１０、３０Ｄ８および２６Ｂ９)のｓｃＦｖとＣＤ８αヒンジ配列の間に挿入して、様々なＥＧＦＲｖIII−Ｒ２  ＣＡＲ(本明細書中でそれぞれ「１４Ｃ１１−Ｒ２」、「３２Ａ１０−Ｒ２」、「３０Ｄ８−Ｒ２」および「２６Ｂ９−Ｒ２」と呼ばれる)を生成した。ＥＦ１αプロモーターの制御下、５または２５(クローン２６Ｂ９−Ｒ２および３０Ｄ８−Ｒ２に関して)の感染多重度(ＭＯＩ)で様々なＥＧＦＲ−Ｒ２  ＣＡＲ発現カセットを含むレンチウイルスベクターを用いてＴ細胞に形質導入した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、形質導入後１４または１５日まで培養中に維持した。細胞にビオチン化組換えタンパク質：ＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃまたはリツキシマブ(ＥＺ−Ｌｉｎｋ(商標)Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎとコンジュゲートした；ThermoFisheer, Waltham, MA)、続いてＰＥコンジュゲートしたストレプトアビジン(BD Biosiences, San Diego, CA)を使用して、フローサイトメトリーにより経時的に(Ｔ細胞形質導入後４日目、９／１０日目および１４／１５日目)ＣＡＲ発現をモニターした。ビオチン化ＥＧＦＲｖIII−ｍＦｃおよびビオチン化リツキシマブを用いて検出したＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージを、図７および８にそれぞれ示す。非形質導入Ｔ細胞(ＮＴＤ)への結合を、対照として提供する。
これらの結果は、Ｒ２自殺配列を含有するＥＧＦＲｖIII特異的ＣＡＲのＴ細胞中での発現を示している。
【０２５０】
実施例１２：ＥＧＦＲｖIII特異的  Ｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性
この実施例は、標的発現細胞株との共培養に際した、ＥＧＦＲｖIII特異的  Ｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。
実施例１１に記載のＥＧＦＲｖIII−Ｒ２  ＣＡＲ、１４Ｃ１１−Ｒ２、３２Ａ１０−Ｒ２、３０Ｄ８−Ｒ２および２６Ｂ９−Ｒ２を使用して、実施例９に記載のとおりに細胞傷害性アッセイを行った。試験したすべてのＥＧＦＲｖIII特異的  Ｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、低レベル標的発現細胞(ＮＣＩ−Ｈ５２２−ＥＧＦＲｖIII)および高レベル標的発現細胞(Ｕ８７−ＫＯ−ＥＧＦＲｖIII)の両方を様々な程度まで溶解することができた(図９)。
これらの結果は、ＥＧＦＲｖIII特異的  Ｒ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖIIIを発現する細胞を効果的に死滅させることを示している。
【０２５１】
開示された教示を、様々な応用、方法、キットおよび組成物を参照して記載したが、様々な変更および改変が、本明細書の教示および以下の請求項に係る発明から離れることなく行われ得ることが理解されるであろう。上記例は、開示された教示をより良く例示するために提供され、本明細書に提示された教示の範囲を制限することを意図されない。本教示がこれらの例示的な実施形態の観点から記載されたが、当業者は、これらの代表的な実施形態の多くの変形形態および改変形態が、過度の実験をすることなく可能であることを容易に理解する。そのようなすべての変形および改変は、本教示の範囲内にある。
【０２５２】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用されたすべての参考文献およびそこに引用された参考文献は、それらが既に組み込まれていない範囲で、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含むが、これに限定されない、組み込まれた文献および類似する物質の１以上が本願と異なるかまたは矛盾する場合には、本願が優先される。
【０２５３】
上記の記載および実施例は、本発明のある特定の実施形態を詳述し、発明者らにより企図されるベストモードを記載する。しかしながら、上記事項がどれだけ詳しく本文に現れても、本発明は、多くの方法で実践されることができ、本発明は、添付された特許請求の範囲およびこれらの任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019506394.tif 000059
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