(57)【要約】複数の細胞試料を凍結保存するための装置(100)および方法を開示する。装置(100)は、冷却室(102)；冷却室(102)の内部を冷却するように構成された手段を含み、該冷却室(102)の内部を冷却するように構成された手段とは別でありかつ冷却室(102)内に配置されている冷却管（146）をさらに含み、冷却管(146)を通る冷媒の流れをもたらすように構成されている、冷却デバイス(104)；および複数のバイアル(168)が冷却管(146)と係合可能となるように、冷却管(146)に対して移動可能である、細胞試料を保管するための複数のバイアル(168)を支持するための支持体(106)を含む。2019506171.tif 000003
2019506171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
冷却室(102)と、
冷却室(102)の内部を冷却するように構成された手段を含み、該冷却室(102)の内部を冷却するように構成された手段とは別でありかつ冷却室(102)内に配置されている冷却管(146)をさらに含み、冷却管(146)を通る冷媒の流れをもたらすように構成されている、冷却デバイス(104)と、
複数のバイアル(168)が冷却管(146)と係合可能となるように、冷却管(146)に対して移動可能である、細胞試料(180)を保管するための複数のバイアル(168)を支持するための支持体(106)と
を含む、複数の細胞試料(174)を凍結保存するための装置(100)。
【請求項２】
複数のバイアル(168)がバイアル(168)の所定かつ調節可能な高さ(176)で冷却管(146)と係合可能となるように支持体(106)が移動可能であり、高さ(176)が細胞試料(180)の液面(178)に対応する、請求項1記載の装置(100)。
【請求項３】
冷却管(146)が互いに平行に配置されている、請求項1または2のいずれか記載の装置(100)。
【請求項４】
複数のバイアル(168)を受け止めるための複数の区画(170)を支持体(106)が含み、冷却管(146)と区画(170)とが互いに平行に配置され、複数のバイアル(168)が冷却管(146)と冷却管(146)の間に配置可能となるように区画(170)が配置され、複数のバイアル(168)のそれぞれが冷却管(146)の少なくとも1つと個々に係合可能となるように区画(170)が支持体(106)に対して可動性である、請求項1〜3のいずれか一項記載の装置(100)。
【請求項５】
冷却管(146)が予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するよう、冷却管(146)を通る冷媒の十分な流れをもたらすように冷却デバイス(104)が適合されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の装置(100)。
【請求項６】
予冷時間内に冷却管外面シーティング温度に達するまで冷却管(146)の底部から頂部まで冷媒流をもたらすように冷却デバイス(104)が適合されている、請求項5記載の装置(100)。
【請求項７】
冷却室(102)が中に位置する内部ケーシング(108)と、内部ケーシング(108)を収容する外部ケーシング(110)とをさらに含む装置(100)であって、内部ケーシング(108)が下面(122)および上面(124)を含み、下面(122)および上面(124)が孔(126)を含み、下面(122)および上面(124)が穿孔板(128)を含み、穿孔板(128)が孔(126)を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の装置(100)。
【請求項８】
穿孔板(128)が5％〜15％の穿孔比率を含む、請求項7記載の装置(100)。
【請求項９】
支持体(106)が、共通平面(178)内で複数のバイアル(168)を支持するように適合されている、請求項1〜8のいずれか一項記載の装置(110)。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項記載の装置(100)を用いて複数の細胞試料(180)を凍結保存するための方法であって、以下の工程を含む方法：
冷却室を温度保持点まで冷却する工程；
複数のバイアル(168)に液体状態の細胞試料(180)を提供する工程；
支持体(106)に複数のバイアル(168)を装填する工程；
複数のバイアル(168)において温度同期させるように温度保持点で冷却室(102)を保持する工程；
冷却室をバイアル(168)におけるシーディング温度まで冷却する工程；
シーディング温度に達する前に、冷却管(146)が冷却管外面シーディング温度に達するように予冷時間にわたり冷却管(146)を通じて冷媒を供給する工程；
細胞試料(180)におけるシーディングプロセスを開始するよう複数のバイアル(168)が所定時間にわたり冷却管(146)と係合されるように、冷却管外面シーディング温度と前記シーディング温度とが適合する場合に冷却管(146)に対して支持体(106)を移動させる工程；
冷却室(102)を最終温度まで冷却する工程；および
最終温度に達するまで潜熱を制御除去する工程。
【請求項１１】
細胞試料(180)の結晶化が局所的に誘導されるように、所定時間にわたる冷却管(146)との複数のバイアル(168)の局所係合によってシーディングプロセスが開始される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
複数のバイアル(168)が冷却管(146)と係合された場合に所定時間にわたり局所結晶化シードが細胞試料にて形成されるように、冷却管外面シーディング温度に達するまで冷却管(146)を通じて冷媒が供給される、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
前記所定時間が0.5分〜3.0分であり、予冷時間が0.1分〜5.0分である、請求項10〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
全ての細胞試料(180)が実質的に同時に結晶化するように、冷却管外面シーディング温度を有する冷却管(146)を通じて冷媒が供給される、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
温度保持点が好ましくは0℃〜5℃であり、シーディング温度が細胞試料の凍結点〜-15℃であり、最終温度が-120℃〜-190℃であり、冷却管外面シーディング温度が-130℃〜-200℃である、請求項10〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
複数のバイアル(168)が、冷却管(146)と係合するように支持体に対して動かされる、請求項10〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
シーディングが複数のバイアル(168)で誘導された場合に、バイアル(168)が冷却管(146)から離される、請求項10〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
冷却室(102)内の気体冷媒流の速度および温度を制御することによって潜熱が除去される、請求項10〜17のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、複数の細胞試料を凍結保存するための装置および方法に関する。本明細書において用いる「凍結保存」および「凍結保存する」という用語はそれぞれ、約-130℃未満の極低温まで冷却しその温度で保管することによる細胞試料を保存するプロセスを指す。本明細書において用いる「細胞試料」という用語は真核細胞を指す。通常、冷却し凍結するプロセスは液体窒素などの冷媒によって行われる。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
細胞の凍結保存がうまくいくことがバイオ医薬品の製造には重要な前提条件である(Seth, G.: Freezing mammalian cells for production of biopharmaceuticals; Methods 56, p. 424-431, 2012（非特許文献1）)。しかしながら、細胞の品質の劣化を避けるためには細胞試料の凍結保存は依然として課題である。
【０００３】
細胞を含有する懸濁液を冷却すると、細胞溶液の凍結点に達した際に懸濁液は必ずしも結晶化しない。むしろ懸濁液は過冷却されるであろう。過冷却とは、液体が凍結または固化することなくその凍結点を下回る、液体の温度の低下として規定される(Wilson, P. W.: Ice Nucleation in nature: supercooling point (SCP) measurements and the role of heterogeneous nucleation. Cryobiology 46, p. 88-98, 2003（非特許文献2）)。過冷却溶液における「シーディング」と呼ばれる最初の氷晶の形成は広範な温度にわたって自然発生的にかまたは、例を挙げると低温パルスによるかもしくは特定の温度での機械的な揺動による選択的誘導によってかのいずれかで起きる(Mazur, Peter: Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 247. C125-C142. 1984（非特許文献3）)。多くの細胞試料を凍結する際には、大幅な過冷却を避けかつすべての試料を同時に結晶化させるためにシーディングの誘導が望ましい(Morris, G.J. & Acton, E.: Controlled ice nucleation in cryopreservation--a review. Cryobiology 66, p. 85-92, 2013（非特許文献4）)。
【０００４】
シーディング中の液体から固体への相変化により結晶化エンタルピー(「潜熱」)が放出され、これがサブクーリングされた媒体における凍結点までの温度上昇を引き起こす。濃縮溶液に氷晶が形成される場合には、溶解した物質は氷に取り込まれるのではなく氷晶間の流体に蓄積し、よって溶液の濃度を上昇させることがある。細胞成分は凍結せず過冷却になる。その後のプロセスは冷却速度に応じて異なる。冷却速度が十分に低い場合には、糖および塩などの細胞内物質が濃縮するような様式で、細胞は外方浸透によって水分を失う。よって、細胞内の過冷却が防止される。さらに、細胞内水の化学ポテンシャルは細胞外水の化学ポテンシャルと平衡を維持する。結果として、細胞は細胞内凍結することなく脱水状態になる(Mazur, Peter: Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 247. C125-C142. 1984（非特許文献3）)。
【０００５】
しかしながら、冷却速度が低すぎる場合には、溶液効果および浸透が細胞を損傷し得る(Fowler, A. & Toner, M.: Cryo-injury and biopreservation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1066, p. 119-135, 2005（非特許文献5）)。対照的に、冷却速度が高い場合には、平衡を達成するには細胞の脱水の速さが十分ではないことがある。よって、細胞内液は、液体から固体への相変化が起こり細胞内に氷が形成されるまで徐々に過冷却される(Mazur, Peter: Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 247. C125-C142. 1984（非特許文献3）)。
【０００６】
要約すると、活性化後の細胞の生存率はいくつかの要因に依存する。重要性が高いものは、シーディング工程および冷却速度である。冷却が速すぎた細胞は、細胞内部の氷の形成および再活性化時の再結晶化効果のために破壊される。冷却が遅すぎた細胞は、溶液効果および浸透圧性損傷に晒される。
【０００７】
したがって、細胞試料を凍結保存するための装置は、低すぎるかまたは高すぎる冷却速度を回避するために、正確で同時かつ再現可能なシーディングおよび後続の冷却を担保する形で構築されなければならない。
【０００８】
従来の装置は、多数の細胞試料を均一条件下で凍結保存しない場合があるためこの課題に十分に対処していない。具体的には、バイアルに保管された単一細胞試料間の温度分布は、バイアルが空間的に次から次へと配置されるため凍結中は不均一になる。これは注入された冷媒の乱流、失速、および不均等な分布を引き起こす冷却室の立体形状のためである。これらの影響がバイアル位置に応じて不均一な熱除去を引き起こす。よって、細胞試料内の温度が正確に制御されない場合があり、これは氷晶化を誘導することに対しては特に関連性がある。それ故、それぞれのバイアル間の冷却速度の違いおよび目標温度分布からの偏差が大きい。さらに、多くの従来の冷凍装置では、氷晶化を誘導するためのシーディング機能は、冷媒が各バイアルとは接触しないので氷晶化を同期的に誘導するのに適していない。よって、氷晶の形成は自然発生的に起き、制御されたものではない。さらに、潜熱は効率的に除去されない場合があるので潜熱の除去は困難であるかまたは問題である。したがって、バイアル内での氷晶の形成までのサブクーリングプロセスの程度および以降のプロセスは互いに異なる。結果として、不均一条件が細胞バンク内および異なる細胞バンク間での製品品質に大きなばらつきをもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Seth, G.: Freezing mammalian cells for production of biopharmaceuticals; Methods 56, p. 424-431, 2012
【非特許文献２】Wilson, P. W.: Ice Nucleation in nature: supercooling point (SCP) measurements and the role of heterogeneous nucleation. Cryobiology 46, p. 88-98, 2003
【非特許文献３】Mazur, Peter: Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol. 247. C125-C142. 1984
【非特許文献４】Morris, G.J. & Acton, E.: Controlled ice nucleation in cryopreservation--a review. Cryobiology 66, p. 85-92, 2013
【非特許文献５】Fowler, A. & Toner, M.: Cryo-injury and biopreservation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1066, p. 119-135, 2005
【発明の概要】
【００１０】
概要
同時かつ再現可能な様式でバイアルを凍結させる、複数の細胞試料を凍結保存するための装置および方法が本明細書において開示される。
【００１１】
複数の細胞試料を凍結保存するための開示の装置および方法の態様は独立クレームの特徴を有する。単独の形態でまたはあらゆる任意の組み合わせで実現され得る特定の態様は従属クレームに列挙される。
【００１２】
以下で用いるように、「有する」、「含む(comprise)」もしくは「含む(include)」またはこれらのあらゆる任意の文法的変形は非排他的な形で用いられる。よって、これらの用語は、これらの用語によって導入される特徴の他にこの文脈で記載される実体にはさらなる特徴が存在しない状況、および1つまたは複数のさらなる特徴が存在する状況の両方を指し得る。例としては、「AはBを有する」、「AはBを含む(comprises)」および「AはBを含む(includes)」という表現は、AにはBの他に別の要素が存在しない状況(すなわちAは唯一かつ排他的にBからなる状況)および実体AにはBの他に要素C、要素CおよびD、またはなおさらなる要素などの1つまたは複数のさらなる要素が存在する状況の両方を指し得る。
【００１３】
さらに、特徴または要素が1つまたは複数存在する可能性があることを示す「少なくとも1つ」、「1つまたは複数」という用語または同様の表現は、それぞれの特徴または要素を導入する際には典型的には一度だけ用いられることに留意されたい。以下では、ほとんどの場合に、それぞれの特徴または要素に言及する際には、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」という表現はそれぞれの特徴または要素が1つまたは複数存在する可能性があるという事実に関わらず繰り返されない。
【００１４】
さらに、以下に用いるように、「具体的には」、「より具体的には」、「詳細には」、「より詳細には」という用語または類似の用語は、代替的な可能性を制限することなく任意の特徴と共に用いられる。よって、これらの用語によって導入される特徴は任意の特徴であり、いかなる形であってもクレームの範囲を制限することを意図していない。本発明は、当業者が認識するように代替的な特徴を用いることによって実施されてもよい。同様に、「発明の態様では」または類似の表現によって導入される特徴は、発明の代替的な態様に関して何ら制限することのない、発明の範囲に関して何ら制限することのない、またそのような形で導入された特徴を発明の他の任意のまたは非任意の特徴と組み合わせる可能性に関して何ら制限することのない、任意の特徴であることを意図している。
【００１５】
複数の細胞試料を凍結保存するための開示の装置によると、装置は、冷却室；冷却室の内部を冷却するように構成された手段を含み、該冷却室の内部を冷却するように構成された手段とは別でありかつ冷却室内に配置されている冷却管をさらに含み、冷却管を通る冷媒の流れをもたらすように構成されている、冷却デバイス；および複数のバイアルが冷却管と係合可能となるように、冷却管に対して移動可能である、細胞試料を保管するための複数のバイアルを支持するための支持体、を含む。
【００１６】
本明細書において用いる「冷却管」という用語は、冷媒が流れ得る管またはパイプを指す。具体的には、冷却管は、冷媒が冷却管によって冷却室に供給されない、すなわち冷却管が冷却室と連通した開口または孔を含まないようないわゆる閉鎖冷却系の一部である。冷却室およびその内部は、下でより詳細に説明するように冷却デバイスによって別途冷却されてもよい。
【００１７】
前記装置によると、支持体は、複数のバイアルを受け止めてもよいしまたは複数のバイアルを入れてもよい。複数のバイアルを装填した場合にバイアルを冷却管と接触させるように支持体を移動させてもよい。よって、バイアルは目標時点および/または目標温度で冷却管と係合し得る。換言すると、支持体は、複数のバイアルを冷却管と係合させる位置までの程度または様式で冷却管に対して移動可能である。しがたって、冷却管とのバイアルの係合によってバイアル内で結晶化プロセスを開始するかまたは誘導することが可能である。具体的には、細胞試料の結晶化は、局所的に誘導され、細胞試料の外面全体にわたって完全に誘導されなくてもよい。
【００１８】
支持体は、複数のバイアルがバイアルの所定かつ調節可能な高さで冷却管と係合可能となるように移動可能であってもよい。支持体は、バイアルでの係合点の高さを変更するように調節してもよい。高さは、細胞試料の液面またはバイアルでの任意の他の所望の点に対応してもよい。本明細書において用いる「バイアルの高さ」という用語は、通常バイアルが延びる長手方向でのバイアルの特定の位置を指す。具体的には、高さはバイアルの底部から頂部までの方向の位置として決定される。よって所定の高さでの接触位置はバイアル内の細胞試料の液面の位置によって決定されてもよい。よって、バイアルへの冷気の過度の放射が防止される。さらに、冷却刺激が局所に限定され得る。具体的には、冷却刺激に起因する不均一な温度分布は、局所的な限定された様式で起き得るのみであり、バイアル内での広がりは技術的に可能な限り小さいはずである。
【００１９】
冷却管は互いに平行に配置されてもよい。よって、冷却管の均等な分配がもたらされる。これは、冷却管が互いに均等に離間している場合に特に達成される。
【００２０】
支持体は、複数のバイアルを受け止めるための複数の区画を含んでもよい。区画は、複数のバイアルが冷却管と冷却管の間に配置可能となるように配置されてもよい。例えば、区画は互いに平行に延びるラインとして配置される。
【００２１】
有利には、冷却管と区画とは互いに平行に配置される。よって、バイアルを冷却管と係合させるために支持体が移動されなければならない、区画の冷却管までの距離は、各バイアル毎に同一である。
【００２２】
区画は支持体に対して可動性であってもよい。よって、各バイアルを同一の様式で冷却管と個々に係合させる、冷却管に対するバイアルの位置決めに関するある種の微調整がもたらされる。これは、例えば、区画が支持体において可動性である場合に実現し得る。
【００２３】
区画は複数のバイアルを固定するように適合されてもよい。よって、バイアルは区画によって確実に受け止められる。
【００２４】
区画は、複数のバイアルが冷却管と直接的に係合可能となり得るように形成されてもよい。よって、冷却管の冷気は、いかなる構造部材も介在せずにバイアルに直接的に導入されてもよい。
【００２５】
支持体はレール上を移動可能であってもよい。よって、支持体を移動させるためにどちらかと言えば単純な構成を用いてもよい。
【００２６】
冷却管が予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するように、冷却管を通る冷媒の十分な流れをもたらすように冷却デバイスを適合してもよい。本明細書において用いる「予冷時間」という用語は、冷却室がシーディング温度まで冷却され得る時間に対して相対的に規定される時間を指す。具体的には、予冷時間は冷却室がシーディング温度まで冷却され得る時間よりも短い。換言すると、冷却管は、予冷時間内でありかつ冷却室のシーディング温度が到達される前に、冷却管外面シーディング温度に到達する。よって、シーディングプロセスは、細胞試料の品質を維持するために所望の時間内で確実に開始され得る。
【００２７】
冷却デバイスは環状管部分を含んでもよい。冷却管は環状管部分に接続されてもよい。よって、予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するために冷却管への冷媒の十分な供給がもたらされる。本明細書において用いる「冷却管外面シーディング温度」という用語は、細胞試料のシーディングプロセスを誘導するのに適した、冷却管の外面で規定される温度を指す。換言すると、バイアルが冷却管と係合する際に細胞試料のシーディングプロセスを誘導させるためには、冷却管の温度はその外面では十分に低くなければならない。冷却管の外面での温度は、冷却管の外面に配置された温度センサによって検出してもよい。
【００２８】
環状管部分は冷却管を囲む。冷却管は環状管部分と接続された端部を含んでもよい。よって、各冷却管には、予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に到達するために環状管部分から冷媒が供給されてもよい。
【００２９】
環状管部分は、冷媒を供給するための流入口を含んでもよい。よって、冷媒はいくつかの位置で環状管部分に供給されてもよく、これは環状管部分に冷媒をより効果的に分配するのに役立つ。
【００３０】
環状管部分は、各セグメントが流入口の少なくとも1つに関連付けられたセグメントに分割されてもよい。よって、各セグメントに冷媒が供給されてもよい。
【００３１】
環状管部分は分割壁によってセグメントに分割されてもよい。よって、各セグメントは別のセグメントから独立しており、個別に冷媒が供給されてもよい。
【００３２】
流入口は互いから均等に離間されてもよい。よって、冷媒の十分な供給がもたらされる。これはまた予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するための、冷却管を通る冷媒の十分な流れを引き起こす。
【００３３】
環状管部分の内径は冷却管の内径より大きくてもよい。よって、十分な量の冷媒が環状管部分から冷却管に確実に供給され得る。
【００３４】
予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するまで冷却管の底部から頂部まで冷媒流をもたらすように冷却デバイスを適合してもよい。本明細書において用いる「底部」および「頂部」という用語は冷却室に対する向きを指す。冷却室は、基本的には垂直方向および重力方向それぞれに向いているので、冷却管が水平方向および重力方向に直交する方向それぞれに配置される場合があったとしても、冷媒は、冷却管の下側または冷却管より下方の位置で供給され、冷却管の上側または冷却管より上方の位置で冷却管から排出される。よって、冷媒が用いられ、より高い温度および/または液体から気体への相変化を有するようになった後には、冷媒は従来の対流効果を用いて冷却管から取り出され得る。これにより、冷却管内の気体冷媒の蓄積が防止される。
【００３５】
冷却室は筒形であってもよい。こうして、冷却室内で冷媒の温度の層状の栓流を向上させる相称的な配置がもたらされる。
【００３６】
装置は、冷却室が中に位置する内部ケーシングと、内部ケーシングを収容する外部ケーシングとをさらに含んでもよい。よって、冷却室は熱的に隔離され得る。
【００３７】
冷却室の内部を冷却するように構成された手段は、冷却室の内部を冷却するための冷媒を注入するためのノズルであってもよいし、またはそれ含んでもよい。よって、冷媒は温度を均一に低下するために冷却室内に分配され得る。
【００３８】
ノズルは内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間に設けられてもよい。よって、ノズルはコンパクトな様式で配置され得る。
【００３９】
内部ケーシングは下面および上面を含んでもよく、下面および上面は孔を含んでもよい。例えば、下面および上面は穿孔板を含んでもよく、穿孔板は孔を含む。穿孔板は5％〜15％の穿孔比率を含んでもよい。穿孔比率は板の半径にわたって変化してもよい。換言すると、穿孔板の半径方向外側部分の穿孔比率は、半径方向中間部分および/または半径方向内側部分と異なってもよい。さらに、下面での穿孔板の穿孔比率は、上面での穿孔板の穿孔比率と異なってもよい。本明細書において用いる「穿孔比率」という用語は、孔が形成された穿孔板の表面積に対するまたはそれとの関連での孔の断面積または開口面積の比率を指す。よって、冷媒は均等に分配され得る。具体的には、穿孔板は、冷媒の充満または滞留、および内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間における冷媒の均一な層流を引き起こす。
【００４０】
装置は、内部ケーシングの上面と外部ケーシングとの間に設けられたファンをさらに含んでもよい。よって、冷媒流を生成することができる。
【００４１】
冷却デバイスは、内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間に位置する流入口と、流入口をノズルまで接続する分配管とを含んでもよい。よって、冷媒は冷却室の断面全体に分配され得る。これは、内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間におけるノズルの均等な分配によって特に達成される。
【００４２】
ノズルは共通平面内に配置されてもよい。よって、ノズルは支持体に対して所定の同一距離を有する。
【００４３】
流入口は冷却室の中心軸上に位置してもよい。よって、流入口からノズルまで冷媒の同一の流れがもたらされる。
【００４４】
流入口および分配管は、分配管と、内部ケーシングおよび外部ケーシング内の流れとの接触面積が最小になるように位置させてもよい。よって、流入口の分配管が生成する、管に沿った流れの対流冷却が最小になる。出てくる冷媒のみが流れを冷却する。
【００４５】
装置は、内部ケーシングと外部ケーシングとの間に配置された中間ケーシングをさらに含んでもよい。中間ケーシングは冷媒のための流出口を含んでもよい。外部ケーシングは冷媒のための流出口を含んでもよい。中間ケーシングの流出口と外部ケーシングの流出口は互いに接続される。よって、冷媒の所定の流れがもたらされる。
【００４６】
中間ケーシングは下面および上面を含んでもよい。中間ケーシングの流出口は下面に位置してもよく、外部ケーシングは下面と上面とを含んでもよく、外部ケーシングの流出口は上面に位置してもよい。よって、ケーシングの底部から頂部への使用済み冷媒の流れがもたらされる。
【００４７】
共通平面内で複数のバイアルを支持するように支持体を適合してもよい。よって、冷媒の層状の栓流は各バイアルにて同じ熱当量を除去する。
【００４８】
バイアルにおける細胞試料のシーディングプロセスが冷却管とのバイアルの係合によって開始されるよう冷却管に液体状態の冷媒を供給するように冷却デバイスを適合してもよい。よって、細胞試料は規定した条件下で凍結し得る。
【００４９】
複数の細胞試料を凍結保存するための開示の方法によれば、上記のような装置が用いられる。方法は次の工程を含む：
冷却室を温度保持点まで冷却する工程；
複数のバイアルに液体状態の細胞試料を提供する工程；
支持体に複数のバイアルを装填する工程；
複数のバイアルにおける温度同期の目的のために温度保持点で冷却室を保持する工程；
冷却室をバイアルにおけるシーディング温度まで冷却する工程；
シーディング温度に達する前に、冷却管が冷却管外面シーディング温度に達するように予冷時間にわたり冷却管を通じて冷媒を供給する工程；
細胞試料におけるシーディングプロセスを開始するよう複数のバイアルが所定時間にわたり冷却管と係合されるように、冷却管外面シーディング温度とシーディング温度とが適合する場合に冷却管に対して支持体を移動させる工程；
冷却室を最終温度まで冷却する工程；および
最終温度に達する範囲内で潜熱を制御除去する工程。
【００５０】
よって、細胞試料は、細胞試料の生存率に悪影響が及ぶことなく、規定した条件下で凍結保存され得る。具体的には、冷却管とのバイアルの係合によって、細胞試料の局所的および時間制限されたサブクーリングがもたらされる。
【００５１】
複数のバイアルを支持体に装填する前に冷却室が温度保持点まで予冷されるので、冷却室およびバイアルを一緒に予冷する必要がないため、冷却室に入れられた際のバイアルの最初の冷却工程は速やかに進展するかまたは時間がより短くなる。さらに、冷却室内の温度が温度保持点に保持されるので、各バイアルは、さらに処理される前およびシーディング温度まで冷却される前のそれぞれで確実に同一の温度を有する。よって、バイアルは穏やかな条件下にて短時間でシーディング温度まで冷却され得る。
【００５２】
温度保持点は-2℃〜10℃であってもよい。別の態様によれば、温度保持点は好ましくは0℃〜5℃、例えば4℃であってもよい。
【００５３】
シーディング温度は細胞試料の凍結点〜-15℃であってもよい。温度保持点および/またはシーディング温度は細胞試料内の温度として規定してもよい。
【００５４】
冷却管外面シーディング温度は、細胞試料のシーディングプロセスを誘導させる冷却管の外面上の温度として規定してもよい。換言すると、冷却管の外面上の温度は、バイアルが冷却管と係合すると細胞試料のシーディングプロセスを誘導させるのに十分に低い温度として決定される。
【００５５】
最終温度は-120℃〜-190℃、例えば-185℃であってもよい。
【００５６】
所定時間は0.5分〜3.0分であってもよい。別の態様によれば、所定時間は1.5分〜2.5分、例えば2.0分であってもよい。よって、シーディングプロセスは比較的短時間内に開始されてもよい。
【００５７】
予冷時間は0.1分〜5.0分であってもよい。予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するので、冷却管外面シーディング温度は比較的短時間内に達せられる。
【００５８】
複数のバイアルが所定時間にわたり冷却管に係合され得るので、シーディングは時間制御された様式で起きる。
【００５９】
具体的には、シーディングプロセスは、細胞試料の結晶化が局所的に誘導されるように、冷却管との複数のバイアルの局所係合によって開始されてもよい。
【００６０】
複数のバイアルが冷却管と係合された場合に所定時間にわたり局所結晶化シードが細胞試料にて形成されるように、冷却管外面シーディング温度に達するまで冷媒を冷却管に供給してもよい。
【００６１】
換言すると、細胞試料の結晶化が細胞試料における一時的で局所的かつ強力なまたは集中的なコールドスポットによって行われるように、冷却管外面シーディング温度に達するまでの所定時間にわたる冷却管との複数のバイアルの局所係合によってシーディングプロセスを開始してもよい。
【００６２】
冷媒は、全ての細胞試料が実質的に同時に結晶化するように、冷却管外面シーディング温度を有する冷却管で供給されてもよい。
【００６３】
冷却管外面シーディング温度は-130℃〜-200℃であってもよい。別の態様によれば、冷却管外面シーディング温度は-140℃〜-190℃、例えば-180℃であってもよい。
【００６４】
複数のバイアルは、冷却管と係合するように支持体に対して動き得る。
【００６５】
シーディング温度は細胞試料の凍結温度に近くてもよい。本明細書において用いる「凍結温度に近い」という用語は、偏差が凍結温度を4K以上下回らない温度を指す。
【００６６】
冷却室がシーディング温度まで冷却されるとバイアルは冷却管から離されてもよい。
【００６７】
シーディングが複数のバイアルで誘導された場合に、バイアルは冷却管から離される。
【００６８】
続いて、冷却管は、細胞試料の潜熱が除去され得るように最終温度まで冷却される。
【００６９】
潜熱は消散によって除去されてもよい。具体的には、潜熱は、冷却室内の気体冷媒流の速度および温度を制御することによって除去される。
【００７０】
最終温度は-120℃〜-190℃であってもよい。別の態様によれば、最終温度は-125℃〜-190℃、例えば-180℃であってもよい。
【００７１】
本発明の知見を要約すると、以下の態様が好ましい。
【００７２】
態様1：冷却室と、
冷却室の内部を冷却するように構成された手段を含み、該冷却室の内部を冷却するように構成された手段とは別でありかつ冷却室内に配置されている冷却管をさらに含み、冷却管を通る冷媒の流れをもたらすように構成されている、冷却デバイスと、
複数のバイアルが冷却管と係合可能となるように、冷却管に対して移動可能である、細胞試料を保管するための複数のバイアルを支持するための支持体と
を含む、複数の細胞試料を凍結保存するための装置。
【００７３】
態様2：複数のバイアルがバイアルの所定かつ調節可能な高さで冷却管と係合可能となるように支持体が移動可能である、態様1記載の装置。
【００７４】
態様3：高さが細胞試料の液面に対応している、態様2記載の装置。
【００７５】
態様4：冷却管が互いに平行に配置されている、態様1〜3のいずれか一つに記載の装置。
【００７６】
態様5：冷却管が互いに均等に離間している、態様1〜4のいずれか一つに記載の装置。
【００７７】
態様6：複数のバイアルを受け止めるための複数の区画を支持体が含み、複数のバイアルが冷却管と冷却管の間に配置可能となるように該区画が配置されている、態様4または5記載の装置。
【００７８】
態様7：前記区画が互いに平行に延びるラインとして配置されている、態様6記載の装置。
【００７９】
態様8：冷却管と区画とが互いに平行に配置されている、態様6または7記載の装置。
【００８０】
態様9：複数のバイアルのそれぞれが冷却管の少なくとも1つと係合可能となるように区画が支持体に対して可動性である、態様6〜8のいずれか一つに記載の装置。
【００８１】
態様10：前記区画が支持体において可動性である、態様9記載の装置。
【００８２】
態様11：前記区画が複数のバイアルを固定するように適合されている、態様6〜10のいずれか一つに記載の装置。
【００８３】
態様12：複数のバイアルが冷却管と直接的に係合可能となるように区画が形成されている、態様6〜11のいずれか一つに記載の装置。
【００８４】
態様13：支持体がレール上を移動可能である、態様1〜12のいずれか一つに記載の装置。
【００８５】
態様14：冷却デバイスが、冷却管が接続された環状管部分を含む、態様1〜13のいずれか一つに記載の装置。
【００８６】
態様15：環状管部分が、環状管部分に接続された端部を含む冷却管を囲む、態様14記載の装置。
【００８７】
態様16：環状管部分が、冷媒を供給するための流入口を含む、態様14または15記載の装置。
【００８８】
態様17：環状管部分がセグメントに分割され、各セグメントが流入口の少なくとも1つと関連付けられている、態様16記載の装置。
【００８９】
態様18：環状管部分が分割壁によってセグメントに分割されている、態様17記載の装置。
【００９０】
態様19：セグメントが、冷却管を通る冷媒を実質的に同一の流れにさせるように適合されている、態様17または18記載の装置。
【００９１】
態様20：流入口が互いに均等に離間している、態様16〜19のいずれか一つに記載の装置。
【００９２】
態様21：環状管部分の内径が冷却管の内径よりも大きい、態様14〜20のいずれか一つに記載の装置。
【００９３】
態様22：冷却管が予冷時間内に冷却管外面シーディング温度に達するように、冷却管を通る冷媒の十分な流れをもたらすよう冷却デバイスが適合されている、態様1〜21のいずれか一つに記載の装置。
【００９４】
態様23：予冷時間内に冷却管外面シーティング温度に達するまで冷却管の底部から頂部まで冷媒流をもたらすように冷却デバイスが適合されている、態様22記載の装置。
【００９５】
態様24：冷却室が筒形である、態様1〜23のいずれか一つに記載の装置。
【００９６】
態様25：冷却室が中に位置する内部ケーシングと、内部ケーシングを収容する外部ケーシングとをさらに含む、態様1〜24のいずれか一つに記載の装置。
【００９７】
態様26：冷却室の内部を冷却するよう構成された手段が、冷却室の内部を冷却するための冷媒を注入するためのノズルであるかまたはこれを含む、態様25記載の装置。
【００９８】
態様27：ノズルが内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間に設けられている、態様26記載の装置。
【００９９】
態様28：内部ケーシングが、孔を含む下面および上面を含む、態様27記載の装置。
【０１００】
態様29：下面および上面が、孔を含む穿孔板を含む、態様28記載の装置。
【０１０１】
態様30：穿孔板が5％〜15％の穿孔比率を含む、態様29記載の装置。
【０１０２】
態様30：内部ケーシングの上面と外部ケーシングとの間に設けられたファンをさらに含む、態様28〜30のいずれか一つに記載の装置。
【０１０３】
態様32：冷却デバイスが、内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間に位置する流入口と、流入口をノズルに接続する分配管とを含む、態様27〜31のいずれか一つに記載の装置。
【０１０４】
態様32：ノズルが内部ケーシングと外部ケーシングとの間の空間に均等に分配されている、態様32記載の装置。
【０１０５】
態様34：ノズルが共通平面内に位置している、態様33記載の装置。
【０１０６】
態様35：流入口が冷却室の中心軸上に位置している、態様33または34記載の装置。
【０１０７】
態様36：内部ケーシングと外部ケーシングとの間に配置された中間ケーシングをさらに含む装置であって、中間ケーシングが冷媒のための流出口を含み、外部ケーシングが冷媒のための流出口を含み、中間ケーシングの流出口と外部ケーシングの流出口とが互いに接続されている、態様25〜35のいずれか一つに記載の装置。
【０１０８】
態様37：中間ケーシングが下面および上面を含み、中間ケーシングの流出口が下面に位置し、外部ケーシングが下面および上面を含み、外部ケーシングの流出口が上面に位置する、態様36記載の装置。
【０１０９】
態様38：支持体が複数のバイアルを共通平面内で支持するように適合されている、態様1〜37のいずれか一つに記載の装置。
【０１１０】
態様39：前記共通平面が重力方向に直交するように配置されることに冷却室が適合されている、態様38記載の装置。
【０１１１】
態様40：バイアルにおける細胞試料のシーディングプロセスが冷却管とのバイアルの係合によって開始されるよう冷却管に液体状態の冷媒を供給するように冷却デバイスが適合されている、態様1〜39のいずれか一つに記載の装置。
【０１１２】
態様41：支持体が少なくとも100本のバイアルを受け止めるように適合されている、態様1〜39のいずれか一つに記載の装置。
【０１１３】
態様42：それぞれ10ml〜250mlの体積を有する細胞試料を保管するように適合されたバイアルを受け止めるように支持体が適合されている、態様1〜41のいずれか一つに記載の装置。
【０１１４】
態様43：態様1〜42のいずれか一つに記載の装置を用いて複数の細胞試料を凍結保存するための方法であって、以下の工程を含む方法：
冷却室を温度保持点まで冷却する工程；
複数のバイアルに液体状態の細胞試料を提供する工程；
支持体に複数のバイアルを装填する工程；
複数のバイアルにおける温度同期の目的のために温度保持点で冷却室を保持する工程；
冷却室をバイアルにおけるシーディング温度まで冷却する工程；
シーディング温度に達する前に、冷却管が冷却管外面シーディング温度に達するように予冷時間にわたり冷却管を通じて冷媒を供給する工程；
細胞試料におけるシーディングプロセスを開始するように複数のバイアルが所定時間にわたり冷却管と係合されるように、冷却管外面シーディング温度と前記シーディング温度とが適合する場合に冷却管に対して支持体を移動させる工程；
冷却室を最終温度まで冷却する工程；および
最終温度に達する範囲内で潜熱を制御除去する工程。
【０１１５】
態様44：細胞試料の結晶化が局所的に誘導されるように、所定時間にわたる冷却管との複数のバイアルの局所係合によってシーディングプロセスが開始される、態様43記載の方法。
【０１１６】
態様45：複数のバイアルが冷却管と係合された場合に所定時間にわたり局所結晶化シードが細胞試料にて形成されるように、冷却管外面シーディング温度に達するまで冷却管を通じて冷媒が供給される、態様43または44記載の方法。
【０１１７】
態様46：シーディング温度および/または最終温度が細胞試料における温度として規定される、態様43〜45のいずれか一つに記載の方法。
【０１１８】
態様47：前記所定時間が0.5分〜3.0分、具体的には1.5分〜2.5分であり、予冷時間が0.1分〜5.0分である、態様43〜46のいずれか一つに記載の方法。
【０１１９】
態様48：全ての細胞試料が実質的に同時に結晶化するように、冷却管外面シーディング温度を有する冷却管を通じて冷媒が供給される、態様43〜47のいずれか一つに記載の方法。
【０１２０】
態様49：細胞試料の結晶化が局所的に誘導されるように、冷却管との複数のバイアルの局所係合によってシーディングプロセスが開始される、態様43〜48のいずれか一つに記載の方法。
【０１２１】
態様50：温度保持点が-2℃〜10℃および具体的には0℃〜5℃であり、シーディング温度が細胞試料の凍結点〜-15℃であり、最終温度が-120℃〜-190℃であり、冷却管外面シーディング温度が-130℃〜-200℃および具体的には-140℃〜-190℃である、態様43〜49のいずれか一つに記載の方法。
【０１２２】
態様51：冷媒が冷却管を通って供給された後に液体状態であるように冷却管外面シーディング温度が決定される、態様43〜50のいずれか一つに記載の方法。
【０１２３】
態様52：複数のバイアルが、冷却管と係合するように支持体に対して動かされる、態様43〜51のいずれか一つに記載の方法。
【０１２４】
態様53：シーディングが複数のバイアルで誘導された場合に、バイアルが冷却管から離される、態様43〜52のいずれか一つに記載の方法。
【０１２５】
態様54：潜熱が消散によって除去される、態様43〜53のいずれか一つに記載の方法。
【０１２６】
態様55：潜熱が、冷却室内の気体冷媒流の速度および温度を制御することによって除去される、態様43〜54のいずれか一つに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
発明のさらなる特徴および態様が、具体的には従属請求項とあわせた以下の態様の説明においてより詳細に開示される。そこでは、当業者が理解するようにそれぞれの特徴は単独の形態やあらゆる任意の実施可能な組み合わせで実現されてもよい。発明の範囲は態様によって限定されない。態様は図面では概略的に描かれる。そこでは、これらの図面における同一の参照番号は同一または機能的に同等な要素を指す。
【０１２８】
【図１】図1は複数の細胞試料を凍結保存するための装置を示す。
【図２】図2は装置の断面図を示す。
【図３】図3は冷却管の平面図を示す。
【図４】図4は支持体の動作を示す。
【図５】図5は支持体のさらなる動作を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
態様の詳細な説明
図1は複数の細胞試料を凍結保存するための装置を示す。装置100は、冷却室102と、冷却デバイス104と、支持体106とを含む。冷却室102は筒形である。具体的には、冷却室102は円筒形である。装置100は、冷却室102が位置するかまたは冷却室102を規定する内部ケーシング108と、内部ケーシング108を収容する外部ケーシング110と、内部ケーシング108と外部ケーシング110との間に配置された中間ケーシング112とをさらに含む。内部ケーシング108、外部ケーシング110および中間ケーシング112は、上部分116と下部分118とを含むモジュール状のケーシングアセンブリ114を形成するように構成されてもよい。換言すると、内部ケーシング108、外部ケーシング110および中間ケーシング112のそれぞれは、下により詳細に説明するように上部分116および下部分118を形成する2つの部分に分割される。上部分116は下部分118の上に配置される。外部ケーシング110は、内部ケーシング108と外部ケーシング110との間に空間120が形成されるように内部ケーシング108を収容する。より具体的には、空間120は内部ケーシング108と中間ケーシング112との間に形成される。
【０１３０】
内部ケーシング108は下面122と上面124とを含む。下面122および上面124は孔126を含む。より具体的には、下面122および上面124は穿孔板128を含む。穿孔板128は孔126を含む。言うまでもなく、下面122および上面124は穿孔板128として設計されてもよい。穿孔板128は5％〜15％、例えば10％の穿孔比率を含む。穿孔比率は板の放射状の範囲にわたって異なってもよい。さらに、下面122での穿孔板128の穿孔比率は、上面124での穿孔板128の穿孔比率と異なってもよい。孔126は円形の断面を有してもよい。孔126によって空間120は冷却室102と流体連通する。中間ケーシング112は下面130と上面132とを含む。中間ケーシングは流出口134をさらに含む。中間ケーシング112の流出口134は下面130に位置する。外部ケーシング110は下面136と上面138とを含む。外部ケーシング110は流出口140をさらに含む。外部ケーシング110の流出口140は上面138に位置する。中間ケーシング112の流出口134と外部ケーシング110の流出口140とは互いに繋がっている。例えば、流出口134、140は外部ケーシング110と中間ケーシング112との間に形成された流路142または空間などによって互いに繋がっている。装置100はファン144をさらに含む。ファン144は内部ケーシング108の上面124と外部ケーシング110との間に設けられる。
【０１３１】
図2は装置100の断面図を示す。冷却デバイス104は、冷却室102の内部を冷却するように適合される。この理由のために、冷却デバイス104は、下にさらに詳細に説明するように冷却室102の内部を冷却するように構成された手段を含む。冷却デバイス104は、冷却室102の内部を冷却するように構成された手段とは別の冷却管146をさらに含む。冷却管146は冷却室102内に配置される。冷却デバイス104は、冷却管146を通る冷媒の流れをもたらすように構成される。冷却管146は互いに平行に配置される。さらに、冷却管146は互いに均等に離間している。冷却デバイス104は環状管部分148をさらに含む。冷却管146は環状管部分148に接続される。具体的には、環状管部分148は冷却管146を囲む。冷却デバイス104は、冷却室102の内部を冷却するように冷却室に冷媒を注入するためのノズル150をさらに含む。よって、ノズル150は冷却室102の内部を冷却する手段としての役割を果たす。ノズル150は、内部ケーシング108と外部ケーシング110との間の空間120に設けられる。冷却デバイス104は、ケーシングアセンブリ114の外側に位置する流入口152と、流入口152をノズル150まで繋ぐ分配管154とをさらに含む。図2に示すように、ノズル150は内部ケーシング108と外部ケーシング110との間の空間120に均等に分配される。例えば、分配管154は流入口152から径方向外方および主にケーシングアセンブリ114の下方に延びる。例えば、分配管154は流入口152の周囲に星形の様式で配置される。さらに、分配管154は、ノズル150に繋がるように、ケーシングアセンブリ114の外側の側面に沿って上方に延び、下部分118を通って空間120内まで延びる。ノズル150から流入口152までの距離が同一になるように分配管154の長さが同一であることに留意されたい。単なる例として、流入口152の周囲で一様の角度位置に配置された10個のノズル150が図2に示されている。言うまでもなく、装置100それぞれの幾何学的形状に応じて、8個、12個、20個などの10個より多いかまたは少ないノズル150を提供してもよい。ノズル150は共通平面156内に位置する。流入口152は冷却室102の中心軸158上に位置する。中心軸158は筒形の冷却室102の円筒軸に相当する。
【０１３２】
図3は冷却デバイス104の一部分の平面図を示す。具体的には、図3は冷却管146および環状管部分148を示す。図3に示すように、冷却管146は環状管部分148に接続された端部160を含む。さらに、環状管部分148は環状管部分148に冷媒を供給するための流入口162を含む。環状管部分148はセグメント164に分割される。各セグメント164は流入口162の少なくとも1つと関連付けられる。具体的には、環状管部分148は分割壁166によってセグメント164に分割される。セグメント164は、冷却管146を通して冷媒を実質的に十分に流れさせるように適合される。流入口162は互いに均等に離間される。さらに、環状管部分148の内径は冷却管146の内径より大きい。この構成で、冷却デバイス104は、下にさらに詳細に説明するように底部から頂部まで冷媒流をもたらすように適合される。具体的には、図3は、20本の冷却管146と、3つの分割壁166によって互いに分割された4つのセグメント164とを示す。これらのセグメント164によって、冷媒は冷却管146を通じて均等に分配される。より具体的には、図3の絵の左側および右側に示すセグメント164は5本の冷却管146に冷媒を供給する一方で、内側のセグメント164は4本の冷却管に冷媒を供給する。
【０１３３】
図1および図2に示すように、支持体106は、細胞試料を保存するための複数のバイアル168を支持するように適合される。支持体106は、複数のバイアル168を受け止めるための複数の区画170を含む。例えば、支持体106は、100本、200本またはさらに多くのバイアル168を受け止めるための100個、200個またはそれ以上の区画170を含む。換言すると、各区画170は1本のバイアル168を受け止めるように適合される。区画170は、複数のバイアル168が冷却管146と冷却管146の間に配置可能となるように配置される。図1および2に示すように、区画170は互いに平行に延びるライン172として配置される。さらに、冷却管146と区画170とは互いに平行に配置される。さらに、区画170は支持体106に対して可動性である。具体的には、区画170は、下にさらに詳細に説明するように支持体106において可動性である。区画170は複数のバイアル168を固定するように適合される。例えば、区画170は、バイアル168をそれらの位置に確実に保持するよう構成された弾性のクランプなどを含む。
【０１３４】
図4は第1動作状態の支持体106を示し、図5は第2動作状態の支持体106を示す。図4および5に示すように、支持体106は、複数のバイアル168が図5に示すように冷却管146と係合可能となるよう冷却管146に対して移動可能である。例えば、支持体106はレール174上を移動可能であってもよい。区画170は、複数のバイアル168が冷却管146と直接的に係合可能となるように形成される。換言すると、区画170は、係合時に冷却管146とバイアル168との間にいかなるさらなる構成部材も無く冷却管146がバイアル168に直接的に係合し得るように形成される。具体的には、支持体106は、複数のバイアル168がバイアル168の所定の高さ176で冷却管146と係合可能となるように移動可能である。高さ176はバイアル168に保管された細胞試料180の液面178に対応し、バイアル168が延びる長手方向に沿った位置として規定される。支持体106は、バイアル168の高さ176における係合点を変更するように調節できる。支持体106は、共通平面182内で複数のバイアル168を支持するように適合される。冷却室102は、共通平面182が重力方向に対して直交するように配置される。冷却デバイス104は、細胞試料とバイアル168とのシーディングプロセスが冷却管146とのバイアルの係合によって開始されるように、液体状態の冷媒を冷却管146に供給するように適合される。
【０１３５】
以下、装置100を用いて複数の細胞試料180を凍結保存するための方法を説明する。基本的には、細胞試料180は方法の開始時に液体状態で複数のバイアル168に提供される。冷却室102は温度保持点まで冷却される。温度保持点は細胞試料180の凍結温度に近いがそれより高い。冷却室102を温度保持点まで冷却するために、冷却デバイス104は流入口152から分配管154を通じてノズル150まで液体窒素等の冷媒を供給する。ノズル150は空間120に冷媒を噴霧するかまたは注入するように構成される。また、ファン144が作動される。ノズル150から吐出された冷媒は、図1の矢印184によって示すように内部ケーシング108の下面122に沿って流れ、内部ケーシング108の下面122で穿孔板128の孔126を通って冷却室102の内部に進入し得る。
【０１３６】
次いで、支持体106に複数のバイアル168を装填する。冷却室102の内部では、冷媒は支持体106に提供されたバイアル168および細胞試料180から熱を除去する。これによって、冷媒は加熱され、対流効果によっておよび矢印186に示されるようにファン144に吸い込まれることによって冷却室102の底部から頂部に流れる。加熱された冷媒は、内部ケーシング108の上面124での穿孔板128の孔126を通って冷却室102から出、再び空間120に進入する。ファン144は、加熱された冷媒を矢印188、190によって示されるように中間ケーシング112の流出口134に向けて横方向および下方向に吹き飛ばす。冷媒は、次いで、矢印192によって示されるように流路146内を中間ケーシング112の流出口134から外部ケーシング110の流出口140まで流れ、外部ケーシング110からその流出口140を通って排出される。冷却室102は、複数のバイアル168において温度同期させるように温度保持点で保持される。換言すると、冷却室102は全てのバイアル168が同じ温度を有するまで温度保持点で保持される。温度保持点は0℃〜5℃、例えば2℃である。その後、冷却室102はバイアル168におけるシーディング温度まで冷却される。冷却室102は、ノズル150および冷却室102の内部により多くの冷媒を供給する冷却デバイス104によってシーディング温度までさらに冷却される。シーディング温度は細胞試料の凍結点〜-15℃、例えば-5℃である。同時に、シーディング温度に達する前に、冷却管146が冷却管外面シーディング温度に達するように予冷時間にわたり冷却管146を通じて冷媒が供給される。冷媒は環状管148から冷却管146に供給され、反対に環状管148には流入口162を通って冷媒が供給される。予冷時間は0.1分〜5.0分、例えば3.0分である。冷却管外面シーディング温度は-130℃〜-200℃、具体的には-140℃〜-190℃、例えば-150℃である。冷却デバイスは、予冷時間内に冷却管外面シーティング温度に達するまで冷却管146を通じて底部から頂部まで冷媒流をもたらす。
【０１３７】
冷却管外面シーティング温度とシーティング温度とが適合する、すなわち冷却管外面シーティング温度がシーティング温度に対応する場合に、細胞試料180におけるシーディングプロセスを開始するよう、複数のバイアル168が所定時間にわたり冷却管146と係合されるように支持体106が冷却管146に対して移動される。具体的には、支持体106は、細胞試料180の液面178に対応するバイアル168の所定の高さ176にて複数のバイアル168が冷却管146と係合可能となるように移動可能である。所定時間は0.5分〜3.0分、具体的には1.5分〜2.5分、例えば2.0分である。複数のバイアル168は、冷却管146と係合するように支持体106に対して動かされる。より具体的には、バイアル168が提供された区画170は、ある種の微調整をさせかつバイアル168それぞれを冷却管146と個々に係合させるように支持体106において動かされる。シーディングプロセスは、細胞試料180の結晶化が局所的に誘導されるように、所定時間にわたる冷却管146との複数のバイアル168の局所係合によって開始される。換言すると、細胞試料180の結晶化が細胞試料における一時的で局所的かつ強力なまたは集中的なコールドスポットによって行われるように、冷却管外面シーディング温度に達するまでの所定時間にわたる冷却管146との複数のバイアル168の局所係合によってシーディングプロセスが開始される。冷媒は、複数のバイアル168が冷却管146と係合された場合に所定時間にわたり局所結晶化シードが細胞試料180にて形成されるように、冷却管外面シーディング温度に達するまで冷却管146を通じて供給される。具体的には、全ての細胞試料180が実質的に同時に結晶化するように、冷却管外面シーディング温度を有する冷却管146を通じて冷媒が供給される。
【０１３８】
シーディングが複数のバイアル168で誘導された場合に、バイアル168は冷却管146から離される。さらに、冷却室102は最終温度まで冷却される。最終温度は-120℃〜-190℃、例えば-185℃である。最終温度に達するまで、潜熱は細胞試料180から制御除去される。潜熱は、冷却室102内の気体冷媒流の速度および温度を制御することによって除去される。冷媒の気体流はファン144の操作により生成される。潜熱は消散によって除去される。
【符号の説明】
【０１３９】
100  装置
102  冷却室
104  冷却デバイス
106  支持体
108  内部ケーシング
110  外部ケーシング
112  中間ケーシング
114  ケーシングアセンブリ
116  上部分
118  下部分
120  空間
122  下面
124  上面
126  孔
128  穿孔板
130  下面
132  上面
134  流出口
136  下面
138  上面
140  流出口
142  流路
144  ファン
146  冷却管
148  環状管部分
150  ノズル
152  流入口
154  分配管
156  共通平面
158  中心軸
160  端部
162  流入口
164  セグメント
166  分割壁
168  バイアル
170  区画
172  ライン
174  レール
176  高さ
178  液面
180  細胞試料
182  共通平面
184  矢印
186  矢印
188  矢印
190  矢印
192  矢印
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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