(57)【要約】  本発明は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出するアッセイにおけるフィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出するアッセイにおけるフィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤の使用。
【請求項２】
前記アッセイが酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記フィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤が、フィブリノゲンに特異的に結合する、抗体又はその断片、非タンパク質足場、アプタマー又はＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記フィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤が、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
前記フィブリノゲン捕捉剤が、フィブリノゲンに特異的に結合するＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
前記フィブリノゲンがフィブリノゲンα鎖である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体が、以下のステップ：
ａ）フィブリノゲン捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及び
ｂ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤を使用してＣｉｚ１  ｂ変異体を検出するステップ；又は
ａ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及び
ｂ）フィブリノゲン検出剤を使用してフィブリノゲンを検出するステップ、
を含む方法によって検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
対象由来の試料中におけるＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを検出することを含む、対象の癌を診断する方法であって、前記試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの存在は、前記対象が癌を有することを指示し、及び前記方法が、前記試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド複合体を捕捉するステップを含む、方法。
【請求項９】
対象由来の試料中におけるＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを検出することを含む、対象の癌を診断する方法であって、前記試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの存在は、前記対象が癌を有することを指示し、及び前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、配列番号１１として示される配列又は配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含むその断片である、方法。
【請求項１０】
以下のステップ：
ａ）フィブリノゲン捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及び
ｂ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤を使用してＣｉｚ１  ｂ変異体を検出するステップ；又は
ａ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及び
ｂ）フィブリノゲン検出剤を使用してフィブリノゲンを検出するステップ、
を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤が、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する抗体又はその断片、又は非タンパク質足場である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤が、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド又はフィブリノゲンを検出する前記ステップが、抗体ベースのアレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、非抗体タンパク質足場、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析を用いる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチド及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるステップを更に含む、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体が界面活性剤処理によって前記エキソソームコンパートメントから放出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料から前記エキソソーム画分をエンリッチするステップを更に含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記エキソソーム画分を濃縮する前記ステップが、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿又はクロスフロー限外ろ過を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が、肺癌、リンパ腫、腎癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌又は甲状腺癌から選択される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が肺癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
癌療法薬を対象に投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法であって、前記対象が、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法によって癌を有すると同定されている、方法。
【請求項２１】
癌の治療に使用される抗癌薬であって、前記対象が、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法によって癌を有すると同定されている、抗癌薬。
【請求項２２】
肺癌の治療に使用される肺癌抗癌薬であって、前記対象が、請求項１９に記載の方法によって肺癌を有すると同定されている、肺癌抗癌薬。
【請求項２３】
試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるための界面活性剤の使用。
【請求項２４】
試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体を検出する方法であって、前記試料を界面活性剤で処理することにより前記試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるステップと、前記試料中に前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体が存在するかどうかを検出するステップとを含む方法。
【請求項２５】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体がフィブリノゲンとの複合体である、請求項２３に記載の使用又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体を放出させる前に前記試料から前記エキソソーム画分を濃縮するステップを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の使用又は方法。
【請求項２７】
前記エキソソーム画分を濃縮する前記ステップが、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿又はクロスフロー限外ろ過を含む、請求項２６に記載の使用又は方法。
【請求項２８】
フィブリノゲンに特異的に結合する薬剤とＣｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する薬剤とを含むキット。
【請求項２９】
前記フィブリノゲンがフィブリノゲンα鎖である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
フィブリノゲンに特異的に結合する前記薬剤及び／又はＣｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する前記薬剤が、抗体又はその断片、非タンパク質足場又はアプタマーである、請求項２８又は２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、試料中のＣｉｐ１相互作用ジンクフィンガータンパク質（Ｃｉｚ１）の検出に有用なアッセイ及び方法に関する。詳細には、本発明は、癌の診断へのかかるアッセイ及び方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｃｉｐ１相互作用ジンクフィンガータンパク質１（Ｃｉｚ１）（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１３１０１６．１によって例示される）は細胞増殖に必須である。Ｃｉｚ１はＳ期初期の間にＤＮＡ複製部位を形成する核マトリックス結合フォーカスに局在し、サイクリンＡ／サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）２、サイクリンＥ／ＣＤＫ２及びｐ２１ｃｉｐ１を含めた細胞周期調節因子に関連してＤＮＡ複製の開始を促進する。転写との関連では、ＣＩＺ１はそれ自体がエストロゲン受容体（ＥＲ）の正の補因子であるエストロゲン応答性遺伝子であり、標的クロマチンへのＥＲの動員を増進する能力を有する。マウス及びヒトにおいては、Ｃｉｚ１が選択的スプライシングを受けると保存されたアイソフォームが産生される。正常なＣｉｚ１タンパク質は少なくとも２つの定義付けられた機能ドメイン、「複製」ドメイン及び「固定化」ドメインを含む。
【０００３】
Ｃｉｚ１エクソン１４の選択的スプライシングによるＣｉｚ１  ｂ変異体の生成が、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫、甲状腺癌、腎癌及び肝癌を含めた様々な癌で明らかにされている。Ｃｉｚ１の複製ドメイン又は固定化ドメインのいずれかの過剰発現もまた、癌、例えば、ＮＳＣＬＣ、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、膀胱癌及び甲状腺癌で示されている。ドメイン発現と癌のステージとの相関もまた明らかにされている（国際公開第２０１２／０７８２０８号を参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規バイオマーカー及び標的によって肺癌などの癌に罹患している患者の生存率を改善する診断検査及び治療の開発が依然として必要とされていることに対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明者らは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体がフィブリノゲンとの複合体として存在することを明らかにした。これにより、本発明者らは、対象におけるＣｉｚ１  ｂ変異体の存在を検出するための新規アッセイを開発することが可能になった。
【０００６】
更に、本発明者らは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体がペプチド断片として存在し得ることを明らかにした。更に、本発明者らは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体が血液試料のエキソソームコンパートメントに存在し得ることを明らかにした。
【０００７】
これらの知見から、単独である場合又はフィブリノゲンとの複合体である場合のいずれかであるＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの検出アッセイの設計が指南される。
【０００８】
詳細には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体がフィブリノゲンと複合体化するという知見により、フィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を単離するための最初のステップとしてフィブリノゲン又はＣｉｚ１  ｂ変異体の捕捉を利用する検出アッセイ、詳細には診断アッセイを提供することが可能になった。このアッセイは、フィブリノゲン捕捉剤を使用したフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体の単離と、続くＣｉｚ１  ｂ変異体検出剤を使用した、前記単離された複合体内にあり得るＣｉｚ１  ｂ変異体の検出を含み得る。或いは、このアッセイは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用したフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体の単離と、続くフィブリノゲン検出剤を使用した、前記単離された複合体内にあり得るフィブリノゲンの検出を含み得る。
【０００９】
従って、第１の態様において本発明は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出するアッセイにおけるフィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤の使用に関する。
【００１０】
本明細書で使用されるとき、捕捉剤とは、試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を単離（即ち濃縮（enrich））するために用いられる薬剤を指す。例えば、試料は、対象から単離された試料であってもよい。詳細には、試料は、対象から単離された血液試料（例えば血漿試料）であってもよい。
【００１１】
本明細書で使用されるとき、検出剤とは、捕捉剤を使用して試料から単離（即ち濃縮）された後のフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体に結合させるために用いられる薬剤を指す。このように、検出剤は典型的には捕捉ステップの後に、単離（即ち濃縮）されたフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体の存在を決定するために使用される。
【００１２】
好適には、本アッセイは酵素結合免疫吸着アッセイであってもよい。
【００１３】
フィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤は、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片、非タンパク質足場、アプタマー又はＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドであってもよい。
【００１４】
好ましい実施形態において、フィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤は、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片である。別の好ましい実施形態において、フィブリノゲン捕捉剤は、フィブリノゲンに特異的に結合するＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドである。
【００１５】
フィブリノゲンはフィブリノゲンα鎖であってもよい。
【００１６】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体は、対象由来の試料、例えば、血液、尿、唾液又は気管支肺胞洗浄試料中に検出され得る。
【００１７】
好ましい実施形態において試料は対象由来の血液試料である。特に好ましい実施形態において試料は血漿試料である。
【００１８】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体は、以下のステップ：ａ）フィブリノゲン捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及びｂ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤を使用してＣｉｚ１  ｂ変異体を検出するステップ；又はａ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及びｂ）フィブリノゲン検出剤を使用してフィブリノゲンを検出するステップを含む方法によって検出され得る。
【００１９】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する抗体又はその断片、又は非タンパク質足場であってもよい。
【００２０】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する抗体又はその断片であってもよい。
【００２１】
更なる態様において本発明は、対象由来の試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを検出することを含む、対象の癌を診断する方法に関し、試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの存在は、対象が癌を有することを示し、及びこの方法は、試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド複合体を捕捉するステップを含む。
【００２２】
更なる態様において本発明は、対象由来の試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを検出することを含む、対象の癌を診断する方法に関し、試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの存在は、対象が癌を有することを指示し、及びＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、配列番号１１として示される配列又は配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含むその断片である。
【００２３】
別の態様において本発明は、試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを検出する、例えば対象由来の試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを検出する方法に関し、この方法は、試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド複合体を捕捉するステップを含む。
【００２４】
本方法は、フィブリノゲン捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及びＣｉｚ１  ｂ変異体検出剤を使用してＣｉｚ１  ｂ変異体を検出するステップ；又はＣｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及びフィブリノゲン検出剤を使用してフィブリノゲンを検出するステップを含み得る。
【００２５】
好適には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド又はフィブリノゲンを検出するステップは、抗体ベースのアレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、非抗体タンパク質足場、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析を用い得る。
【００２６】
本方法は、試料のエキソソーム成分からＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチド及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド複合体を放出させるステップを更に含み得る。
【００２７】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド複合体は、ＳＤＳ処理などの界面活性剤処理によってエキソソーム成分から放出させてもよい。
【００２８】
本方法は、試料からエキソソーム画分を濃縮するステップを更に含み得る。
【００２９】
例えば、エキソソーム画分を濃縮するステップは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー又はクロスフロー限外ろ過を含み得る。
【００３０】
癌は、肺癌、リンパ腫、腎癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌又は甲状腺癌から選択されてもよい。
【００３１】
詳細には、癌は肺癌であってもよい。
【００３２】
本発明は更に、癌療法薬を対象に投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法に関し；ここで対象は、本発明の方法によって癌を有すると同定されている。
【００３３】
本発明はまた、癌の治療に使用される抗癌薬も提供し、ここで対象は、本発明の方法によって癌を有すると同定されている。
【００３４】
本発明は更に、肺癌の治療に使用される肺癌抗癌薬を提供し、ここで対象は、本発明の方法によって肺癌を有すると同定されている。
【００３５】
更なる態様において本発明は、試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるための界面活性剤の使用を提供する。
【００３６】
別の態様において本発明は、試料中のＣｉｚ１  ｂ変異体を検出する方法に関し、この方法は、試料を界面活性剤で処理することにより試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるステップ及び試料中にＣｉｚ１  ｂ変異体が存在するかどうかを検出するステップを含む。本方法は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を放出させる前に試料からエキソソーム画分を濃縮するステップを更に含み得る。
【００３７】
エキソソーム画分を濃縮するステップは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー又はクロスフロー限外ろ過を含み得る。
【００３８】
更なる態様において本発明は、フィブリノゲンに特異的に結合する薬剤とＣｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する薬剤とを含むキットを提供する。
【００３９】
フィブリノゲンはフィブリノゲンα鎖であってもよい。
【００４０】
フィブリノゲンに特異的に結合する薬剤及び／又はＣｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する薬剤は、抗体又はその断片、非タンパク質足場又はアプタマーであってもよい。
【００４１】
フィブリノゲンに特異的に結合する薬剤はＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドであってもよい。
【００４２】
本発明の上記の態様のいずれかによれば、Ｃｉｚ１  ｂ変異体は、配列番号１１として示されるＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチド又は配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含むその断片であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ａ）スプライスジャンクション選択的抗Ｃｉｚ１ウサギポリクローナル抗体０４３で検出された、Ｃｉｚ１  ｂ変異体エピトープ含有種。０４３は、抗体２Ｂについて記載されるとおり作成してバリデートしたものであり（Higgins et al.; (2012); PNAS; Nov 6;109(45):E3128-35）、肺癌患者由来の血漿中にウエスタンブロットによってＣｉｚ１  ｂ変異体を検出する能力を有する。ウエスタンブロットは、５人の肺癌患者（様々なステージ）からの代表的な試料０．５ｕｌ及び無疾患者からの５例で実施したもので、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を明らかにする。ｂ）製造者が推奨するとおり使用したInvitrogen全エキソソーム単離キット（カタログ番号４４８４４５０）を用いた、肺癌患者由来の血漿のここに例示されるエキソソームコンパートメントと可溶性コンパートメントとへの分離。画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を明らかにするため０４３でプローブするか、又はタンパク質の他のどこかにあるエピトープを認識する「汎用」Ｃｉｚ１抗体でプローブした（ここに示すデータは、Ｃｉｚ１のＣ末端を検出するＮＢ１００−７４６２４（Ｎｏｖ４）、Novus Biologicalsで生成されている）。レーン１、未処理血漿（０．５ｕｌ）、レーン２、低速クリアリングスピン後（０．５ｕｌ）、レーン３、高速クリアリングスピン後（０．５ｕｌ）、レーン４、エキソソーム試薬添加後（０．５ｕｌ当量）、レーン５、高速スピン上清（ＳＮ、０．５ｕｌ当量）、レーン６、高速スピンペレット（０．５ｕｌ当量）、レーン７、高速スピンペレット（Ｐ、１ｕｌ当量）、レーン８、高速スピンペレット（２ｕｌ当量）。赤色の矢印は重要なレーンを示し、Ｃｉｚ１エピトープの異なる分配を示す。Ｍ、分子量マーカー。ｃ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体がエキソソーム画分のみにあるタイプ１血漿試料と、Ｃｉｚ１  ｂ変異体の画分が可溶性画分にあるタイプ２パターンを示すまれな患者との比較。ｄ）プロトタイプサンドイッチＥＬＩＳＡ（試料を界面活性剤で処理しない）を用いて生成した定量的免疫分析、ｃで示されたタイプ２血漿試料におけるシグナルの増加を示す。ｅ）未処理タイプ１血漿、及び３％ＳＤＳで処理した後（プロテアーゼ阻害薬、ＰＩ、又は１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で試験した）におけるＣｉｚ１  ｂ変異体の分配、可溶性画分へのエピトープのシフトが明らかである。青色の矢印は、エキソソーム単離プロトコルを適用した後の可溶性画分を示す。右側にＭＷマーカーを示す。ＳＮ＝上清、Ｐ＝ペレット（エキソソーム）。ｆ）ＥＬＩＳＡイムノアッセイにおけるＳＤＳ処理したタイプ１血漿の癌特異的シグナルの増強。
【図２−１】Ｃｉｚ１配列
【図２−２】Ｃｉｚ１配列
【図３】Ｃｉｚ１  ｂ変異体約６５〜７０ｋＤａ種は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの抗原性を増大させ得るキャリアタンパク質に安定に結合するＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドである。ａ）従来記載されるとおりの（Higgins et al；上記）、抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体抗体２Ｂによって認識される癌選択的エピトープを示すウエスタンブロット。ｂ）０．５ｕｌの非癌血漿と混合した合成ｂ変異体ペプチド（５０ｎｍｏｌのＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳＲＥＥＷＫＧＳＥＴＹＳＰＮＴＡＹＧＶＤＦＬＶ−配列番号１２）からのＣｉｚ１  ｂ変異体エピトープの再構成。遊離ペプチドは予想よりも３〜４倍大きいＭＷ（７．６ｋＤａではなく約３０ｋＤａ）を示す移動度で移動する（青色の矢印によって示す）。血漿中でインキュベートすると移動度は低下し、抗原性が増加し、及び約８０ｋＤａに新規の種が作り出される（赤色の矢印によって示す）。ｃ）別個の抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体モノクローナル抗体でも同様の結果が生成された。ｄ）参考として、デュプリケートのブロットをエクソン１４ａバージョンのペプチド（ＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＥＥＥＬＣＫＱＲＳＲＤＩＳＲＥＥＷＫＧＳＥＴＹＳＰＮＴＡＹＧＶＤＦＬＶ−配列番号１３）に選択的なモノクローナル抗体でプローブすると、レーン１及び３にペプチドの検出が示される。凡例：レーン１、ＷＴペプチドのみ。レーン２、Ｂ変異体ペプチドのみ。レーン３、ＷＴペプチド＋正常血漿。レーン４、Ｂ変異体ペプチド＋正常血漿。レーン５、正常血漿のみ。結果は、正常血漿がｂ変異体ペプチドを加えたとき約８０ｋＤａにＣｉｚ１  ｂ変異体シグナルを獲得するが、ａ変異体ペプチドを加えても獲得しないことを示している。ｅ）ショートｂ変異体ペプチド（ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳ−配列番号２）を用いると、癌血漿又は非癌血漿のいずれと組み合わせたときも、同様の結果が得られた。ウエスタンブロットは、抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体モノクローナル抗体（左）又は抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体ポリクローナル抗体０４３（右）による結果を示す。凡例：レーン１、Ｂ変異体ペプチドのみ。レーン２、Ｂ変異体ペプチド＋正常血漿。レーン３、Ｂ変異体ペプチド＋肺癌血漿。レーン４、正常血漿単独。レーン５、肺癌血漿単独。新規シグナルの移動度が癌患者血漿の内因性シグナルと同様であることに留意されたい。Ｆ）抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体モノクローナル抗体（上）又は抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体ポリクローナル抗体０４３（下）で検出した、ショートペプチド（ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳ−配列番号２）の癌患者血漿へのタイトレーションを示すウエスタンブロット。グラフは、正常血漿（Ｎ）のシグナルを１に設定した、デンシトメトリーによる結果の定量化を示す。結果は、キャリアタンパク質が４ｎｍｏｌペプチド／０．５ｕｌ血漿まで制限的でないことを示している。全体的に見て、結果は、抗Ｃｉｚ１  ｂ変異体抗体によって検出された内因性ｂ−ｖａｒ６５種が、１つの単一の６５ｋＤａ  Ｃｉｚ１  ｂ変異体種でなく、６５ｋＤａに近いＭＷのＣｉｚ１  ｂ変異体断片とキャリアタンパク質との安定複合体である可能性が高いことを示してい��。
【図４】二次元ゲル手法を用いた単離から、キャリアタンパク質がフィブリノゲンであることが示される。ａ）２００ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール含有及び不含の２％ＳＤＳ試料緩衝液中でインキュベートした後の癌（Ｃ）及び非癌（Ｎ）血漿試料のウエスタンブロット。還元剤の存在下では、抗ｂ変異体抗体により約６５ｋＤａの癌特異的シグナルが生じ、一方、還元剤の非存在下では、癌特異的シグナルは約３４０ｋＤａにまで遅れる。ｂ）一次元ゲル（還元剤なし）を用いてＣｉｚ１  ｂ変異体エピトープを含有する約３４０ｋＤａバンドを単離する。ｃ）還元剤でインキュベートした後バンドを更に分離すると、構成ポリペプチド及び約７０ｋＤａ成分のＣｉｚ１  ｂ変異体エピトープの移動が明らかになる。このバンドを質量分析用に切り出した。ｄ）ＭＡＳＣＯＴは、トリプシン消化後の２つの別個のペプチド質量に基づき１つの有意なアイデンティティを割り当てた。アイデンティティ：フィブリノゲンα鎖。
【図５】精製フィブリノゲン及び合成ペプチドからのＣｉｚ１  ｂ変異体エピトープの再構成。ａ）還元剤の非存在下（２％ＳＤＳローディング緩衝液中）における電気泳動後の、６ｎｍｏｌの精製フィブリノゲン複合体（Sigma、カタログ番号Ｆ３８７９）を示す銀染色ゲル（左）。この実験にはペプチドを含めるが（１００ｐｍｏｌ／レーン）、それらのアミノ酸含有量に起因して銀で十分に染色されない。右側に、２つの抗ｂ変異体抗体でプローブした並行ゲルのウエスタンブロットを示す。Ｌ、ロングＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳＲＥＥＷＫＧＳＥＴＹＳＰＮＴＡＹＧＶＤＦＬＶ（配列番号１２）。Ｓ、ショートＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳ（配列番号２）。ｂ）フィブリノゲンと複合体になったとき、同じ抗体に対して反応性のエピトープを形成する能力に関して様々なＣｉｚ１  ｂ変異体及びａ変異体ペプチドを比較する同様の実験。凡例：１、添加なし。２、ロングＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳＲＥＥＷＫＧＳＥＴＹＳＰＮＴＡＹＧＶＤＦＬＶ（配列番号１２）。３、ＷＴロングペプチドＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＥＥＥＬＣＫＱＲＳＲＤＩＳＲＥＥＷＫＧＳＥＴＹＳＰＮＴＡＹＧＶＤＦＬＶ（配列番号１３）。４、添加なし。５、ショートＣｉｚ１  ｂ変異体ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳ（配列番号２）。６、Ｃ−ＤＥＥγＩＥＶＲＳＲＤＩＳ−ｃｏＮＨ２（配列番号１４）。７、Ｃ−ＤＥγＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳ−ｃｏＮＨ２（配列番号２３）。８、Ｃ−ＤγγγＩγＶＲＳＲＤＩＳ−ｃｏＮＨ２（配列番号１５）。
【図６−１】表１：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１３１０１６．１からの（ＶＥＥＥＬＣＫＱ−配列番号１０を除くことによって特定される）エクソン１４ｂ／エクソン１５ジャンクションを含むＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチド。
【図６−２】表１：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１３１０１６．１からの（ＶＥＥＥＬＣＫＱ−配列番号１０を除くことによって特定される）エクソン１４ｂ／エクソン１５ジャンクションを含むＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチド。
【図７】エクソンジャンクション特異抗体が肺癌患者血漿中のＣＩＺ１  ｂを検出する。Ａ）ＣＩＺ１の翻訳エクソンのマップ、エクソン１４の選択的スプライシングにより指示される８アミノ酸（位置はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１２１２７．２に基づく）が除かれることによって１４ｂ（ＣＩＺ１ｂ）が生じることを示す。また、Ｂで使用される抗体によって検出されるエピトープの位置も示す。Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に変性後のＮＳＣＬＣ患者（ＬＣ）及び正常対照（Ｎ）からの代表的な血漿試料のウエスタンブロット、ＣＩＺ１ｂ抗体２Ｂ及び０４３によって検出されたＬＣにおける６５〜７０ｋＤａのＣＩＺ１  ｂバンド（赤色の矢印、「＊」印付き）、及びエクソン８及びエクソン１７のエピトープによって検出された、Ｎ及びＬＣの両方における５５ｋＤａの「汎用」ＣＩＺ１抗体反応性バンドを示す。また、フィブリノゲンα鎖も示される。Ｃ）ＣＩＺ１ｂ抗体２Ｂで分析した４人の個体からの対の血漿（Ｐ）及び血清（Ｓ）試料におけるＣＩＺ１  ｂレベルの比較。ヒストグラムは、トリプリケート試料から導かれた、６５〜７０ｋＤａ及び５５ｋＤａ実体に関して定量化したバンド強度を標準偏差と共に示す。血清は６５〜７０ｋＤａ  ＣＩＺ１ｂバンドを欠いていることに留意されたい。Ｄ）Ｂのデータの最も単純な解釈を示すモデル、但し、広範な選択的スプライシング及び起こり得る二次修飾は、血漿中における５５ｋＤａ実体の正確なアイデンティティは未確認であることを意味する。Ｅ）肺癌試験セットＡに関する２Ｂ及び０４３ウエスタンブロット結果についての曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線。ドットプロットは２つのデータセット（date sets）間の相関を示す（ＬＣ試料をオレンジ色とする）。閾値（黒色の点線）は、セット中の非癌試料の平均値＋１ＳＤに設定している。これらから、２０例の肺癌試料及び２０例の非癌試料のこのセットについての感度／特異性推定値：２Ｂ、８５／６７．５；０４３、９０／７７．５が得られる。両方の抗体によって特定される任意閾値を使用すると、これらは９０／８７．５である。
【図８】ＣＩＺ１ｂエピトープに対する変性効果。Ａ）左、完全に未変性の条件下（ＳＤＳ又は還元剤の非存在下）で分離した、代表的な肺癌（Ｃ）及び正常（Ｎ）血漿試料（２ｕｌ）のクマシーブルー染色ゲル。ｍはマーカーレーンを示す。中央、ポンソーＳで染色したニトロセルロースへの転写後の並行ゲル。右、ＣＩＺ１ｂ抗体０４３でプローブした同じ膜。下側のパネルは、同様に０４３でプローブした、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した同じ２つの試料（赤色の矢印）を示す。Ｂ）未変性ゲル一次元を４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中に加熱せずに３０分間浸漬し、サイズによって更に分離した（二次元）。ウエスタンブロットによると、非癌試料において抗体２Ｂと反応性の５５ｋＤａの１つのバンド、及び癌試料において２つのバンド（５５及び７０ｋＤａ）が見られる。同じように処理した２つの追加的な癌血漿試料を下側に示す。Ｃ）指示されるとおり還元剤（２００ｍＭ（β−メルカプトエタノール、βＭＥ）有り及び無しで２％ＳＤＳの存在下、指示温度で予めインキュベートした後の、非変性ゲルを通じた代表的癌（Ｃ）及び非癌（Ｎ）血漿試料中の０４３反応性バンドの移動。癌特異的バンド（赤色の囲み線）の還元剤の非存在下における約３４０ｋＤａの相対移動度から還元剤の存在下における約７０ｋＤａへのシフト（還元剤の非存在下であらゆる試料で検出された「汎用」バンドの完全な喪失を伴う）に留意されたい。Ｄ）指示濃度のＤＴＴ、又は１０倍過剰のβＭＥを伴い３７℃で３０分間１％ＳＤＳとインキュベートした後の０４３反応性バンドを示す肺癌患者の血漿。反応性バンドは、それが３４０ｋＤａから７０ｋＤａにシフトし、次に最大還元条件下で失われるものとして示される。抗体Ｆ８５１２で検出した同じ試料中のフィブリノゲンの挙動を比較として示す。Ｅ）ＣＩＺ１ｂペプチド（ｂ６６、表２）を正常（非癌）血漿と組み合わせることにより生成した合成ＣＩＺ１ｂエピトープ（図１０を参照）は内因性エピトープと同様の挙動を示し、高分子量複合体内から約７０ｋＤａ種に解離し、次に最大還元条件下で消失する。フィブリノゲンは抗体ＡＦ４７８６で検出する。βＭＥ濃度は、２００ｍＭのＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用した標準濃度の倍数に基づく。
【図９】ＣＩＺ１ｂバイオマーカーの分解及びイムノアッセイ設計  Ａ）図８に示す結果の概略図、ＣＩＺ１ｂエピトープ（赤色のバー、「＊」印付き）が血漿中にある未変性複合体の複雑性、並びに界面活性剤及び還元剤の破壊効果を示す。未変性条件下では、ＣＩＺ１ｂは、脂質小胞内に包含されている可能性が最も高い７２０ｋＤａを上回る複合体の一部である。ＳＤＳはエピトープを３４０ｋＤａにシフトさせ、及び還元剤はそれを更に、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで典型的に観察される移動度（６５〜７０ｋＤａ）までシフトさせる。過剰な還元剤の存在下では、２Ｂ及び０４３  ＣＩＺ１ｂ抗体の両方についてウエスタンブロットエピトープが失われる。Ｂ）Ａに要約した情報に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットの概略図。
【図１０】精製成分からのＣＩＺ１ｂバイオマーカーの再構成  Ａ）２つの独立した肺癌患者血漿を１％ＳＤＳ（還元剤なし）とインキュベートした後に分離して、染色したゲルから３４０ｋＤａバンドを単離した（左）。バンドのアイデンティティをポンソーＳ染色と、続く並行ゲルの抗ＣＩＺ１ｂ抗体０４３によるウエスタンブロットによって確認した（右）。Ｂ）ゲル切片を２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液（２００ｍＭ  βＭＥ含有）に浸漬し、変性ゲルで分離して７０ｋＤａの０４３反応性種を回収した。ゲル切片としてロードした試料は、溶液中にロードされるマーカーと比較してやや遅れることに留意されたい。クマシーブルー染色により５つの優勢なバンドが現れ、その中には７０ｋＤａのものが含まれ、これを単離して、トリプシン（癌血漿１、Ｃ１）又はＡｓｐＮ（癌血漿２、Ｃ２）のいずれかで消化した。Ｃ）正常ヒト血漿（非癌、Ｎ）のウエスタンブロット、等価なＣＩＺ１ａペプチド（表２）との間では起こらない、血漿中のキャリアタンパク質と指示される長さの合成ＣＩＺ１ｂペプチドとの間の複合体形成によるＣＩＺ１ｂエピトープの再構成を示す。遊離ペプチドが還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予想の３倍の相対移動度で移動する（ｂ６６について７．６ｋＤａではなく約２１ｋＤａ、ｂ１３について１．６ではなく約５ｋＤａ）ことに留意されたい。いずれも、キャリアタンパク質と複合体化しない限り、ウエスタンブロットでＣＩＺ１ｂ抗体によって認識されない。ＣＩＺ１ｂ６６ペプチドについて、約８０ｋＤａに新規の反応性種が作り出され、一方、ＣＩＺ１ｂ１３ペプチドは、肺癌血漿中の内因性エピトープ（Ｃ、レーン１）と同じ移動度に抗原性を増加させる。Ｄ）指示されるとおりのＣＩＺ１ｂ抗体でプローブした、１００ｐｍｏｌの指示ペプチド（表２）との事前のインキュベーション有り及び無しでの、全てのレーンで精製フィブリノゲン（６ｎｍｏｌ）（上）を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット。非還元条件下ではフィブリノゲンは約３４０ｋＤａの見かけの分子量で移動し、これはＣＩＺ１ｂシグナルと共に移動する。Ｅ）モル当量の予め形成したペプチド／フィブリノゲン複合体を分析物として使用した、指示されるとおりのＣＩＺ１ｂ抗体２Ｂ又は０４３によって生成された平均Ａ４５０ｎｍ（トリプリケート分析、ＳＥＭと共に）を示すダイレクトＥＬＩＳＡ。＊＊Ｔ検定ｐ＜０．０５。
【図１１】肺癌血漿及び対照（ｎ＝３９非癌、１３肺癌）を使用したイムノアッセイバリデーション。Ａ）抗体０４３によるＣＩＺ１ｂウエスタンブロット。Ｂ）０４３捕捉抗体及び抗フィブリノゲン検出抗体を使用した、血漿中のＣＩＺ１  ｂ抗原についてのサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマット。Ｃ）対のフィブリノゲン抗体を使用した同じ試料中のフィブリノゲンの定量的検出、Ｄ）Ｂに示すものと同様のサンドイッチフォーマットで抗フィブリノゲンを抗ヒトＩｇＧに置き換えたもの。Ｅ）ダイレクトＥＬＩＳＡによる血漿中のＩｇＧの検出。Ｆ）Ｇのデータに対するＣのデータの正規化。いずれの場合にも、受診者動作特性曲線（ＲＯＣ）は、真陽性率及び偽陽性率との間の関係（黒色の点）及びフィッティングしたＲＯＣ曲線の９５％信頼区間（灰色の点）、及び太字の曲線下面積（ＡＵＣ）値を示している。箱ひげ図は、最小値及び最大値、下位四分位点、中央値、及び上位四分位点、及び外れ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
ＣＩＺ１
Ｃｉｐ１相互作用ジンクフィンガータンパク質（Ｃｉｚ１）は、ヒトではＣＩＺ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００４５】
Ｃｉｚ１は哺乳類ＤＮＡ複製の開始を促進し、そこでＣｉｚ１はサイクリンＥ依存性及びＡ依存性プロテインキナーゼの逐次的機能が協調するように助ける（Coverley et al; J Cell Sci. 2005; 118(Pt 1):101-112）。Ｃｉｚ１はサイクリンＥ及びＡ、ＣＤＫ２、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子ｐ２１と直接相互作用し、また、サイクリンＤを含めた、細胞増殖に影響を及ぼす遺伝子の発現を調節することにより、ＤＮＡ複製において間接的な役割も果たす（den Hollander et al; Cancer Res. 2006;66(22):11021-11029）。Ｃｉｚ１は多くの場合に、「核マトリックス」と称される核の塩耐性及びヌクレアーゼ耐性タンパク質成分に結合しており、ＤＮＡ複製部位と部分的に共存するフォーカス内にあり（Ainscough; J Cell Sci. 2007;120(Pt 1):115-124）、ＤＮＡ複製の空間的組織化におけるＣｉｚ１の関与が示唆される。
【００４６】
Ｃｉｚ１の様々なスプライス変異体が当該技術分野において公知である。例えば、国際公開第２００４／０５１２６９号及びRahman et al. (BMC Cancer; 2010; 10:482)に記載されるとおり。
【００４７】
Ｃｉｚ１エクソン１４の選択的スプライシングによるＣｉｚ１  ｂ変異体アイソフォームの生成が、これまで様々な癌で実証されている（（国際公開第２０１２／０１７２０８号）及び（Higgins et al.; PNAS; Nov 6;109(45):E3128-35））。
【００４８】
本明細書に記載されるとおり、Ｃｉｚ１  ｂ変異体アイソフォームは、本明細書においてエクソン１４ｂ（配列番号３）と称されるエクソン１４の変異体を含むＣｉｚ１  ｍＲＮＡ転写物に由来する。Ｃｉｚ１エクソン１４ｂは、エクソン１４ａ（配列番号４）と称される完全長エクソン１４と比較して３’末端の２４ヌクレオチドを欠いている。エクソン１４ａ（ａ変異体）よりむしろエクソン１４ｂを発現するＣｉｚ１転写物が、本明細書では、Ｃｉｚ１  ｂ変異体、ＣＩＺ１ｂ又は単にｂ変異体と称される。Ｃｉｚ１エクソン１４ｂ及び１４ａの対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５（ＬＫＳＬＥＫＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥ）及び配列番号６（ＬＫＳＬＥＫＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＥＥＥＬＣＫＱ）として示される（図２を参照のこと）。
【００４９】
従ってエクソン１４ｂ及びエクソン１５のスプライスジャンクションにわたる配列は、エクソン１４ａ及びエクソン１５のスプライスジャンクションにわたる配列と異なる。詳細には、エクソン１４ｂ及びエクソン１５のジャンクションは、Ｃｉｚ１  ａ変異体タンパク質のエクソン１４ａとエクソン１５との間のジャンクションに存在する配列ＶＥＥＥＬＣＫＱ（配列番号１０）を欠いている。
【００５０】
本発明者らは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドがフィブリノゲンとの複合体として存在することを明らかにした。詳細には、エクソン１４ｂ／エクソン１５ジャンクションにわたるＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドがフィブリノゲンに結合可能であることが示された。対照的に、Ｃｉｚ１  ａ変異体ペプチドはフィブリノゲンに結合することができない。
【００５１】
従って、本明細書に記載されるとき、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドとは、Ｃｉｚ１  ａ変異体タンパク質ではなく、Ｃｉｚ１  ｂ変異体タンパク質に由来し得るペプチドを指す。換言すれば、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドとは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体タンパク質のエクソン１４ｂ及びエクソン１５に由来する、従ってスプライスジャンクションに配列ＶＥＥＥＬＣＫＱ（配列番号１０）を欠いているＣｉｚ１  ｂ変異体タンパク質の一部分を指す。
【００５２】
詳細には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドはエクソン１４ｂ／エクソン１５スプライスジャンクションを含む。換言すれば、ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、Ｃｉｚ１エクソン１４ｂ（配列番号５）及びＣｉｚ１エクソン１５（配列番号７）に由来するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりの配列ＥＶＲを含む。
配列番号１１
ＥＩＡＧＱＤＥＤＨＦＩＴＶＤＡＶＧＣＦＥＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳＲＥＥＷＫＧＳＥＴＹＳＰＮＴＡＹＧＶＤＦＬＶＰ
【００５３】
特に、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドはＣｉｚ１  ａ変異体タンパク質に特異的なアミノ酸を含まず、従って配列ＶＥＥＥＬＣＫＱ（配列番号１０）を含まない。
【００５４】
このように、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、配列番号１１として示されるＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチド又は配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含むその断片であってもよい。
【００５５】
好適には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、配列番号１１の少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０又は少なくとも６０個の連続アミノ酸を含み、且つ配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含んでもよい。
【００５６】
好適には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、配列番号１１の３〜６０、５〜６０、５〜５０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１５〜３０又は１０〜２０個の連続アミノ酸を含むか又はそれからなり、且つ配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含んでもよい。
【００５７】
好適には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは、配列番号１１の１０〜２０個の連続アミノ酸を含むか又はそれからなり、且つ配列番号１１の３６〜３８位に示されるとおりのＥＶＲを含んでもよい。
【００５８】
好適には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドは表１（図６を参照）に示されるペプチドであってもよい。
【００５９】
フィブリノゲン
一態様において、本発明は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出するアッセイにおけるフィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤の使用に関する。
【００６０】
一態様において、本発明は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出するアッセイにおけるフィブリノゲン結合剤の使用に関する。
【００６１】
フィブリノゲン結合剤は、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片、非タンパク質足場又はアプタマーであってもよい。
【００６２】
詳細には、本発明は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出するアッセイにおけるフィブリノゲンに結合する抗体又はその断片の使用を提供する。
【００６３】
フィブリノゲンは、血液凝固、線維素溶解、細胞・マトリックス相互作用、炎症反応、創傷治癒及び新形成に関与する。
【００６４】
フィブリノゲン分子は、各々がコイルドコイルセグメントによって中央のＥドメインに結び付いた２つの外側Ｄドメインからなる細長い４５ｎｍの構造体である。この分子は、Ｎ末端Ｅドメインで５つの対称なジスルフィド架橋によって共につながったα、β、及びγと呼ばれる３つのポリペプチド鎖のセットを２組含む。非対称のジスルフィド架橋はこの領域に「ジスルフィド環」を形成する（Mosesson; 2005; Journal of Thrombosis and Haemostasis; 3(8); 1894-1940）。
【００６５】
フィブリノゲン分子が重合すると、不溶性のフィブリンマトリックスが形成される。フィブリノゲンからフィブリンへの変換はトロンビンによって惹起され、トロンビンがα鎖及びβ鎖からフィブリノペプチドＡ及びＢを切断し、ひいては軟凝血塊の形成に関与するＮ末端重合部位が露出する。軟凝血塊は、種々のモノマーのγ鎖間（より強固）及びα鎖間（より脆弱）のε−（γ−グルタミル）リジン架橋結合を触媒する第ＸＩＩＩＡ因子によって硬い凝血塊に変換される。
【００６６】
α鎖は６１０残基、β鎖は４６１残基、及び主要なγ鎖型であるγＡは４１１残基からなる。各フィブリノゲンα鎖はＮ末端フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）配列を含み、これがトロンビンによって切断されると、ＥＡと呼ばれる重合部位が露出することによりフィブリンアセンブリが惹起される。ＥＡの一つの部分は、残基１７〜２０ｇｌｙ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｖａｌ（ＧＰＲＶ）を含むフィブリンα鎖のＮ末端にあり、もう一つの部分はフィブリンβ鎖の残基１５〜４２の間に位置する。各ＥＡ部位は、γ３３７〜γ３７９に位置する隣接分子のＤドメインにおける構成的相補結合ポケット（Ｄａ）と組み合わせになる。初期ＥＡ：Ｄａ会合により、末端が中央にずれて重なり合うドメイン配置でフィブリン分子が整列して二本鎖のねじれた原繊維を形成する。原繊維はまた横方向にも会合を起こして多重鎖繊維を作り出す（Mosesson；上記）。
【００６７】
例示的なフィブリノゲンαタンパク質は、UniProtKB受託番号Ｐ０２６７１のヒトフィブリノゲンαタンパク質である。この例示される配列は８６６アミノ酸長であり、そのうちアミノ酸１〜１９がシグナルペプチドを形成する。
【００６８】
例示的なフィブリノゲンβタンパク質は、UniProtKB受託番号Ｐ０２６７５のヒトフィブリノゲンβタンパク質である。この例示される配列は４９１アミノ酸長であり、そのうちアミノ酸１〜３０がシグナルペプチドを形成する。
【００６９】
例示的なフィブリノゲンγタンパク質は、UniProtKB受託番号Ｐ０２６７９のヒトフィブリノゲンγタンパク質である。この例示される配列は４５３アミノ酸長であり、そのうちアミノ酸１〜２６がシグナルペプチドを形成する。
【００７０】
用語「フィブリノゲン」は、２つのα鎖、２つのβ鎖及び２つのγ鎖を含む複合体又はそのサブ複合体（例えば完全なフィブリノゲン複合体の全ての鎖を含まないもの）を指し得る。
【００７１】
本発明者らは、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドがフィブリノゲンα鎖との結合能を有することを明らかにしている。このように、詳細な実施形態において、本アッセイ及び方法はフィブリノゲンα鎖の捕捉又は検出を含み得る。例えば本アッセイ及び方法は、フィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体におけるＣｉｚ１  ｂ変異体の捕捉後のフィブリノゲン（例えばフィブリノゲンα鎖）の検出を含み得る。
【００７２】
「フィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体」には、本明細書において参照されるとき、フィブリノゲン及び／又はＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドに加えて他のペプチド及び／又はタンパク質が含まれ得る。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、捕捉剤とは、試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を単離（即ち濃縮）するために用いられる薬剤を指す。例えば、試料は、対象から単離された試料であってもよい。詳細には、試料は、対象から単離された血液試料（例えば血漿試料）であってもよい。
【００７４】
「フィブリノゲン捕捉剤」は、フィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体との結合能を有する実体を指す。好ましくは、「フィブリノゲン捕捉剤」は、フィブリノゲンとの特異的結合能を有する、試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を単離（即ち濃縮）するために用いられる実体である。かかる特異的結合は、試料からのフィブリノゲンの単離／濃縮を可能にし得る。詳細な実施形態において、フィブリノゲン捕捉剤はフィブリノゲンα鎖との特異的結合能を有し得る。
【００７５】
フィブリノゲン捕捉剤は、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片、非タンパク質足場、アプタマー又はＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドであってもよい。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、検出剤とは、捕捉剤を使用して試料から単離（即ち濃縮）された後のフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体に結合させるために用いられる薬剤を指す。このように、検出剤は典型的には捕捉ステップの後に、単離（即ち濃縮）されたフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体の存在を決定するために使用される。
【００７７】
「フィブリノゲン検出剤」は、フィブリノゲンとの結合能を有する実体を指す。好ましくは、「フィブリノゲン検出剤」は、フィブリノゲンとの特異的結合能を有する実体である。かかる特異的結合は、フィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体におけるＣｉｚ１  ｂ変異体の捕捉後のフィブリノゲンの検出を可能にする。詳細な実施形態において、フィブリノゲン捕捉剤又はフィブリノゲン検出剤はフィブリノゲンα鎖との特異的結合能を有し得る。
【００７８】
フィブリノゲン検出剤は、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片、非タンパク質足場、又はアプタマーであってもよい。
【００７９】
フィブリノゲン検出剤は、本明細書に記載されるとおりのアッセイにおけるその検出を可能にする実体で標識されてもよい。例えば、フィブリノゲン検出剤は、本明細書に記載されるとおりの蛍光実体又は酵素−基質標識で標識されてもよい。
【００８０】
抗体
抗体又はその断片とは、親抗体と同じ抗原標的に結合する能力を保持している抗体の任意の一部分を指す−例えばフィブリノゲン抗体又はその断片はフィブリノゲンに結合することが可能である。
【００８１】
フィブリノゲン抗体は当該技術分野において公知である。例えば、ヒツジ抗フィブリノゲンｐＡｂ（ＡＦ４７８６、R&D systems）、ａｂ５８２０７（Abcam）；抗フィブリノゲン、クローン８５Ｄ４（カタログ番号Ｆ９９０２；Sigma Aldrich）；及びフィブリノゲン抗体（ＭＦＢ−ＨＢ）（カタログ番号ＭＡ１−３５３７１；Life Technologies）。
【００８２】
フィブリノゲンα鎖抗体もまた当該技術分野において公知である。例えば、ＥＰＲ２９１８（ａｂ１０８６１６；Abcam）；フィブリノゲン抗体（５Ｃ５）（ＬＦ−ＭＡ０１０８；Pierce）；及びＥＰＲ２９１９（ＴＡ３０７６９７；Origene）。
【００８３】
本発明はまた、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に結合する抗体又はその断片にＣｉｚ１  ｂ変異体を接触させることによりＣｉｚ１  ｂ変異体を検出するステップ又はＣｉｚ１  ｂ変異体／フィブリノゲン複合体を捕捉するステップを含む方法も包含する。Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドに特異的に結合する抗体は、抗体２Ｂについて従来記載されるとおり生成し得る（Higgins et al; 2012; PNAS; Nov 6;109(45):E3128-35）。
【００８４】
抗体はキメラ抗体であってもよい。キメラ抗体は、ある種（例えばマウス）由来の抗体可変ドメインを別の種（例えばヒト）由来の抗体定常ドメインに移植することによって作製し得る。
【００８５】
抗体は、完全長の古典的抗体であってもよい。例えば抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ分子であってもよい。
【００８６】
抗体は機能的抗体断片であってもよい。特異的抗体断片としては、限定はされないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨＩドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨＩドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）単一可変ドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、これらの２つのドメインの会合による抗原結合部位の形成を可能にするペプチドリンカーによって連結されている単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、及び（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」が挙げられる。抗体断片は修飾されてもよい。例えば、これらの分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取り込みによって安定化させることができる。
【００８７】
本明細書に記載される抗体は、多重特異性抗体、特に、「ダイアボディ」と称されることもある二重特異性抗体であってもよい。ダイアボディは、２つ（又はそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体である。ダイアボディは当該技術分野において公知の種々の方法で製造することができ、例えば、化学的に調製するか、又はハイブリッドハイブリドーマから調製することができる。本抗体はミニボディであってもよい。ミニボディは、ｓｃＦｖがＣＨ３ドメインにつなぎ合わされたものを含む最小化された抗体様タンパク質である。ある場合には、ｓｃＦｖをＦｃ領域につなぎ合わせることができ、及びヒンジ領域の一部又は全てを含んでもよい。
【００８８】
本抗体はドメイン抗体（シングルドメイン抗体又はナノボディとも称される）であってもよい。これは、単一モノマーの単一の可変抗体ドメインを含む抗体断片である。シングルドメイン抗体の例としては、限定はされないが、当初ラクダ科動物で見付かったＶＨＨ断片及び当初軟骨魚類で見付かったＶＮＡＲ断片が挙げられる。シングルドメイン抗体はまた、共通のＩｇＧ分子からの二量体可変ドメインをモノマーに分割することによって生成することもできる。
【００８９】
抗体は合成抗体（抗体ミメティクスとも称される）であってもよい。抗体ミメティクスとしては、限定はされないが、アフィボディ（Affibody）、DARPin、アンチカリン（Anticalin）、アビマー（Avimer）、バーサボディ（Versabody）及びデュオカリン（Duocalin）が挙げられる。
【００９０】
アプタマー
フィブリノゲン又はＣｉｚ１  ｂ変異体を特異的に認識するアプタマーは、標準的な核酸合成法を用いて合成してもよく、又は大規模ランダム配列プールから、例えば試験管内進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment：ＳＥＬＥＸ）法を用いて選択してもよい。
【００９１】
アプタマーは、ステム、ループ、四重鎖、シュードノット、バルジ、又はヘアピンの組み合わせを有するユニークな三次元構造に折り畳まれる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ配列であり得る。アプタマーの分子認識は、芳香環のスタッキング、静電相互作用及びファンデルワールス相互作用、又は標的化合物との水素結合など、分子間相互作用から生じる。加えて、アプタマーとその標的との間の特異的相互作用は誘導適合機構を通じて補完され、これによりアプタマーはその標的に対してユニークな折り畳み構造をとることが要求される。アプタマーは、色素などの標識分子を連結するため修飾することができ、又は異なる適用向けにビーズ又は基材の表面上に固定化することができる。
【００９２】
アプタマーは、所与の試料における定量化のためナノテクノロジー、マイクロアレイ、マイクロフルイディクス、質量分析及び他の技術と組み合わせてもよい。
【００９３】
典型的には、フィブリノゲン捕捉剤又はＣｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤はアレイなどの支持体上に固定化されるか、又はビーズなどの固体支持体上に捕捉されることになる。次に、捕捉剤を含む支持体と共に被験試料をインキュベートすると、試料からＣｉｚ１  ｂ変異体／フィブリノゲン複合体を単離／濃縮することができる。支持体（例えば固体支持体）は種々の材料−ガラス、シリカ、プラスチック、ナイロン又はニトロセルロースなどで作られてもよい。固体支持体に取り付ける場合、それは好ましくは剛性であり、平らな表面を有する。
【００９４】
フィブリノゲン捕捉剤又はＣｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤は、ストレプトアビジンビーズによって捕捉することのできるビオチン部分など、固体表面に捕捉されることのできる部分を含み得る。かかる実施形態において、支持体への捕捉は、捕捉剤を試料とインキュベートした後に起こり得る。
【００９５】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体の検出又はＣｉｚ１  ｂ変異体の捕捉
好適には、Ｃｉｚ１  ｂ変異体は、本明細書に記載されるとおりのＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドであってもよい。
【００９６】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体は当該技術分野において公知の種々の好適な方法及び技法を用いて検出し得る。
【００９７】
本方法は、以下のステップ：ａ）フィブリノゲン捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及びｂ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤を使用してＣｉｚ１  ｂ変異体を検出するステップを含み得る。
【００９８】
本方法は、以下のステップ：ａ）Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップ；及びｂ）フィブリノゲン検出剤を使用してフィブリノゲンを検出するステップを含み得る。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、「Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤」は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体との結合能を有する、試料からフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を単離（即ち濃縮）するために用いられる実体を指す。好ましくは、「Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤」は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体との特異的結合能を有する実体である。かかる特異的結合は、試料からのフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体の単離／濃縮を可能にする。
【０１００】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤は、フィブリノゲンに特異的に結合する抗体又はその断片、非タンパク質足場、アプタマー又はＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドであってもよい。
【０１０１】
詳細な実施形態において、Ｃｉｚ１  ｂ変異体／フィブリノゲン複合体は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドに結合する抗体又はその断片を用いて捕捉し得る。Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドに特異的に結合する抗体は、抗体２Ｂについて従来記載されるとおり生成し得る（Higgins et al; 2012; PNAS; Nov 6;109(45):E3128-35）。
【０１０２】
「Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤」は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体との結合能を有する、捕捉剤を使用して試料から単離（即ち濃縮）された後のフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体に結合させるために用いられる実体を指す。好ましくは、「Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤」は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体との特異的結合能を有する実体である。かかる特異的結合は、フィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体の捕捉後のＣｉｚ１  ｂ変異体の検出を可能にする。
【０１０３】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する抗体又はその断片、非タンパク質足場、又はアプタマーであってもよい。
【０１０４】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤は、本明細書に記載されるとおりのアッセイにおけるその検出を可能にする実体で標識されてもよい。例えば、Ｃｉｚ１  ｂ変異体検出剤は、本明細書に記載されるとおりの蛍光実体又は酵素−基質標識で標識されてもよい。
【０１０５】
例えば、Ｃｉｚ１  ｂ変異体を検出する方法は、抗体ベースのアレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、非抗体タンパク質足場、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロッティング、アプタマー又は質量分析を用い得る。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡは、当該技術分野において公知の一般的な方法に従い実施し得る。例えば、ＥＬＩＳＡはサンドイッチ又は競合ＥＬＩＳＡであってもよい。
【０１０７】
サンドイッチＥＬＩＳＡは以下のステップを含み得る：
−表面（即ちマイクロタイタープレートウェル）に既知量の捕捉剤を結合させて調製する（例えばＣｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤又はフィブリノゲン捕捉剤）；
−表面上のあらゆる非特異的結合部位をブロックする；
−Ｃｉｚ１  ｂ変異体を含む試料をプレートに加える；
−プレートを洗浄して未結合の抗原を取り除く；
−フィブリノゲン又はＣｉｚ１  ｂ変異体との特異的結合能を有する一次抗体を添加し、抗原に結合させる；
−抗体Ｆｃ領域に特異的に結合する酵素結合二次抗体を検出抗体として加える；
−プレートを洗浄して未結合の抗体−酵素コンジュゲートを取り除いた後、酵素によって色又は蛍光又は電気化学的シグナルに変換される化学物質を添加する；
−プレートウェルの吸光度又は蛍光又は電気化学的シグナルを計測して抗原の存在及び量を決定する。
【０１０８】
詳細な実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるとおりのフィブリノゲン捕捉剤又はＣｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップを含む。
【０１０９】
一実施形態において、本方法は、本明細書に記載されるとおりのＣｉｚ１  ｂ変異体捕捉剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を捕捉するステップと、本明細書に記載されるとおりのフィブリノゲン検出剤を使用してフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を検出するステップとを含むサンドイッチＥＬＩＳＡを含む。
【０１１０】
競合ＥＬＩＳＡは以下のステップを含み得る：
−Ｃｉｚ１  ｂ変異体を含む試料の存在下で、Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する標識抗体をインキュベートする；
−次に結合した抗体／抗原複合体を抗原コーティングウェルに添加する；
−プレートを洗浄し、そのため未結合の抗体が取り除かれる；
−一次抗体に特異的な、且つ酵素にカップリングされた二次抗体を添加する；
−酵素の基質を添加し、及び酵素のその基質との反応によって発色又は蛍光シグナルが生じる；
−反応を停止させてシグナルの最終的な飽和を防ぐ。
【０１１１】
例えば米国特許第４，２７５，１４９号に開示されるとおり、様々な酵素−基質標識が利用可能である。一般に酵素は、検出し得る発色基質の化学的変化を触媒する。例えば、酵素は基質の色の変化を触媒することができ、又は基質の蛍光若しくは化学発光を変化させることができる。酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体にコンジュゲートする技法は周知である。
【０１１２】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドの検出は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドに結合する抗体又はその断片に前記Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを接触させることを含み得る。Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチドに特異的に結合する抗体は、抗体２Ｂについて従来記載されるとおり生成し得る（Higgins et al; 2012; PNAS; Nov 6;109(45):E3128-35）。
【０１１３】
一部の実施形態において、ｂ変異体特異抗体は、配列番号１１の３６〜３８位に示されるＥＶＲ配列を含むエピトープに結合し得る。
【０１１４】
一部の実施形態において、抗体は、ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲＤＩＳ（配列番号２）を含むアミノ酸配列に特異的に結合するが、ＤＥＥＥＩＥＶＥＥＥＬＣＫＱＶＲＳＲＤＩＳ（配列番号９）を含むアミノ酸配列には特異的に結合しない。
【０１１５】
しかしながら、一部の実施形態において、ｂ変異体特異抗体が結合する配列はＣｉｚ１エクソン１４ａ（配列番号６）及びＣｉｚ１エクソン１４ｂ（配列番号５）の両方に存在し得る。かかる実施形態において、ｂ変異体特異抗体は、ＶＥＥＥＬＣＫＱ配列（配列番号１０）の存在が抗体結合を妨げるためＣｉｚ１  ａ変異体に結合することができなくてもよい。他の実施形態において、抗体は、配列がｂ変異体特異的コンホメーション又は構造を呈するため、Ｃｉｚ１エクソン１４ａ及びＣｉｚ１エクソン１４ｂの両方に存在する配列に結合し得る。
【０１１６】
一部の実施形態において、ｂ変異体特異抗体は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体ペプチド／フィブリノゲン複合体によって形成されるエピトープに結合し得る。
【０１１７】
理論によって拘束されるものではないが、Ｃｉｚ１  ｂ変異体がフィブリノゲンに結合すると、Ｃｉｚ１エクソン１４ａ（配列番号６）とＣｉｚ１エクソン１４ｂ（配列番号５）との間で共通するアミノ酸配列を含むエピトープがフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体にユニークなコンホメーションで露出し得る。従ってかかる立体エピトープはＣｉｚ１  ａ変異体には存在しないことになる。
【０１１８】
試料
特定の実施形態において、本発明は、対象から単離された試料を利用する。この試料は「被験試料」と称され得る。従って本方法は、典型的にはヒト又は動物の体外で、例えば試験下の対象から事前に入手した試料に対して実施される。
【０１１９】
試料は、血液、尿、唾液又は気管支肺胞洗浄試料であってもよい。
【０１２０】
好ましい実施形態において、試料は血液試料である。好適には、血液試料は全血試料であってもよい。好適には、血液試料は血液画分、例えば血漿試料であってもよい。
【０１２１】
血液試料の採取技法及び血液画分の分離技法は当該技術分野において周知である。例えば、静脈血試料は患者から針を使用して採取し、プラスチックチューブに入れることができる。採取チューブには、例えば、分離のための抗凝固薬、スプレーコーティングシリカ、又はポリマーゲルが入っていてもよい。血漿は、室温で１３００ＲＣＦで１０分間遠心することにより分離して、小さいプラスチックチューブ内において−８０℃で保存することができる。
【０１２２】
好ましい実施形態において、試料は血液試料、詳細には血漿試料である。好ましい実施形態において、血液試料は採取後、抗凝固薬（例えばヘパリン）で処理される。
【０１２３】
界面活性剤
一実施形態において、本方法は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるため試料を界面活性剤で処理することを含み得る。
【０１２４】
界面活性剤の例としては、限定はされないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びポリソルベート２０が挙げられる。例えば、試料は約１〜５％、好ましくは１〜２％ＳＤＳで処理され得る。
【０１２５】
好適には、本方法は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を更に精製するため試料を還元剤で処理することを更に含み得る。好適な還元剤の例としては、限定はされないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（これは例えば約１０ｍＭ  ＤＴＴの濃度で使用されてもよい）が挙げられる。
【０１２６】
エキソソーム
本方法は、試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるステップを含み得る。好適には、本方法は、試料のエキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体ペプチドを放出させるステップを含み得る。
【０１２７】
エキソソームは、尿、血液（血漿及び血清の両方）、腹水、及び脳脊髄液など、多くの生体液に見られるナノメートルサイズ（３０〜１００ｎｍ）の小胞である。エキソソームは、細胞における多小胞体（ＭＶＢ）の内部小胞として生じ、初めは赤血球及びリンパ球などの循環血液細胞の産物として記載された。
【０１２８】
エキソソームは、比較的高いレベルのコレステロール、スフィンゴミエリン、及びセラミドを含有し、且つ界面活性剤耐性膜ドメイン（脂質ラフト）を含有するリン脂質膜に取り囲まれている（Mathivanan et al., 2010; J Proteomics 73:1907-1920）。
【０１２９】
エキソソームは、膜輸送及び膜融合に関与するタンパク質、例えば、Ｒａｂ、ＧＴＰアーゼ、アネキシン、及びフロチリン、エンドソーム選別輸送複合体（endosomal sorting complex required for transport：ＥＳＣＲＴ）の成分、例えば、Ａｌｉｘ、腫瘍感受性遺伝子１０１（ＴＳＧ１０１）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、インテグリン、及びテトラスパニン、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＣＤ８２などの存在によって特徴付けられる（van der Pol et al.; 2012; 64(3); 676-705）。
【０１３０】
エキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるとは、エキソソームの構造的完全性を破壊して、それまでエキソソームの内部構造の中に隠れていたＣｉｚ１  ｂ変異体エピトープを結合のため露出させることを指す。
【０１３１】
好適には、エキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるとは、試料を界面活性剤で処理することを指し得る。界面活性剤の例としては、限定はされないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びポリソルベート２０が挙げられる。
【０１３２】
一実施形態において、試料は、エキソソームコンパートメントからＣｉｚ１  ｂ変異体及び／又はフィブリノゲン／Ｃｉｚ１  ｂ変異体複合体を放出させるのに好適な濃度の界面活性剤で処理され得る。例えば、試料は、約１〜５％、好ましくは１〜２％ＳＤＳで処理され得る。
【０１３３】
エキソソームエンリッチメント
本方法は、試料からエキソソーム画分を濃縮することを含み得る。
【０１３４】
本明細書で使用されるとき、エキソソーム画分を濃縮（enrich）するとは、エキソソーム画分を精製又は単離することと同義である。
【０１３５】
エキソソームは、超遠心分離（Pisitkun et al (2004) PNAS 101:13368-13373）又は限外ろ過（Cheruvanky et al (2007) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 292:F1657-F1661）など、当該技術分野において公知の方法により精製し得る。遠心に先立ち得る連続フロー電気泳動及びクロマトグラフィー手順が関わる方法もまた公知である（Taylor and Gercel-Taylor (2005) Br J Cancer 92:305-311）。クロスフロー限外ろ過もまた、エキソソーム精製方法の一環として用いられ得る（Lamparski et al (2002) J Immunol. Methods 270:211-226）。
【０１３６】
エキソソームを単離するための市販のキット、例えばInvitrogenが供給する全エキソソーム単離キットもまた利用可能である。
【０１３７】
エキソソームは、分画遠心、膜ろ過、濃縮、レートゾーナル遠心及び免疫捕捉を組み合わせることにより、数多くの細胞株及び体液から単離することができる、エキソソーム（Simpson et al.; Proteomics, 8 (2008), pp. 4083-4099）。
【０１３８】
エキソソームは、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ１０１）、アクアポーリン−２（ＡＱＰ２）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＥＳ）、アネキシンＶ、ポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ）及びＣＤ９など、そのエキソソームマーカーの発現に基づき検出及び／又は精製することができる。例えば、エキソソームはマイクロプレート上に、例えばイムノアフィニティー捕捉によって捕捉し得る。
【０１３９】
単離されたエキソソームの特徴付けは、典型的には、電子顕微鏡法、ＦＡＣＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ウエスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡを用いて実施される（Simpson et al.；上記）及び（van Niel et al; J Biochem (Tokyo), 140 (2006), pp. 13-21）。
【０１４０】
癌
一態様において、本発明は、対象の癌を診断する方法に関する。
【０１４１】
本明細書で使用されるとき、用語「癌」又は「癌性」は、自律的増殖能を有する細胞、即ち、急速に増殖する細胞成長によって特徴付けられる異常状態又は条件を指す。この用語には、病理組織学的タイプ又は侵襲性のステージとは無関係に、あらゆる種類の癌性成長又は発癌過程、転移性組織又は悪性形質転換細胞、組織、若しくは器官を含むことが意図される。用語「癌」には、様々な器官系の悪性病変、例えば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸、生殖器系及び泌尿生殖器系に発症するものなど、並びに悪性病変を含む腺癌、例えば、多くの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／又は精巣腫瘍、非肺小細胞癌、小腸癌及び食道癌などが含まれる。
【０１４２】
好適には、癌は、肺癌、リンパ腫、腎癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌又は甲状腺癌であり得る。
【０１４３】
一実施形態において、癌は肺癌である。肺癌は小細胞肺癌であり得る。肺癌は非小細胞肺癌であり得る。
【０１４４】
対象
対象はヒト又は動物対象であり得る。好ましくは、対象はヒトである。
【０１４５】
対象は、本明細書に記載されるとおりの癌を有するか、又は癌のリスクがあり得る。「癌のリスクがある」とは、疾患のいかなる症状も示していない対象を指す。この対象は癌の素因を有し得るか、又は癌を発症するリスクがあると考えられ得る。
【０１４６】
治療
一態様において本発明は、癌療法薬を対象に投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法に関し；ここで対象は、本発明の方法によって癌を有すると同定されている。
【０１４７】
別の態様において本発明は、癌の治療に使用される抗癌薬を提供し、ここで対象は本発明の方法によって癌を有すると同定されている。更なる態様において、本発明は、肺癌の治療に使用される肺癌抗癌薬に関し、ここで対象は、本発明の方法によって肺癌を有すると同定されている。
【０１４８】
「治療する」又は「治療すること」は、癌療法薬又は抗癌剤の治療的使用を指す。本明細書では、癌療法薬又は抗癌剤は、既存の疾患又は病態を有する対象に、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減し、抑制し又は改善するため、及び／又は疾患の進行を減速させ、抑制し又は阻止するために投与され得る。
【０１４９】
抗癌薬
「抗癌薬」は癌療法薬と同義であり、癌の治療に使用し得る実体を指す。
【０１５０】
抗癌薬は、限定はされないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＣＳＦ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＶＥＧＦ、骨形態形成タンパク質、ＦＧＦ、ＴＮＦ及びＴＧＦβを含めたサイトカイン又は造血因子であり得る。
【０１５１】
抗癌薬は化学療法剤であってもよく、これは細胞傷害性薬物であり得る。企図される化学療法剤としては、限定なしに、アルキル化剤、ニトロソウレア類、エチレンイミン類／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン類、Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；生物学的反応修飾物質、例えば、ＩＦＮα、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦ；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金（platinium）配位錯体、アントラセンジオン類、ヒドロキシウレアなどの置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含めたメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬；プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質ステロイド拮抗薬を含めたホルモン及び拮抗薬；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物を含めたアンドロゲン類；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリドなどの抗アンドロゲン薬；及びフルタミドなどの非ステロイド系抗アンドロゲン薬が挙げられる。
【０１５２】
抗癌薬はｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり得る。
【０１５３】
好適には、抗癌薬は肺癌抗癌薬であり得る。肺癌抗癌薬は、肺癌の治療に使用し得る実体を指す。
【０１５４】
キット
一態様において、本発明は、フィブリノゲンに特異的に結合する薬剤とＣｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する薬剤とを含むキットを提供する。
【０１５５】
フィブリノゲンに特異的に結合する薬剤は、本明細書に記載されるとおりのフィブリノゲン捕捉剤であり得る。
【０１５６】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体に特異的に結合する薬剤は、本明細書に記載されるとおりのＣｉｚ１  ｂ変異体検出剤であり得る。
【０１５７】
用語「〜を含んでいる（comprising）」、「〜を含む（comprises）」及び「〜を含む（comprised of）」は、本明細書で使用されるとき、「〜を包含している（including）」、「〜を包含する（includes）」又は「〜を含有している（containing）」、「〜を含有する（contains）」と同義であり、包含的又は非制限的であって、追加の記載されていないメンバー、要素又は方法ステップを除外しない。用語「〜を含んでいる（comprising）」、「〜を含む（comprises）」及び「〜を含む（comprised of）」にはまた、用語「〜からなる（consisting of）」も包含される。
【０１５８】
ここで実施例を用いて本発明を更に説明するが、これらの実施例は当業者による本発明の実施を補助する役割を果たすことが意図され、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【０１５９】
実施例
実施例１−血液試料からのエキソソーム画分におけるＣｉｚ１  ｂ変異体のエンリッチメント
抗体２Ｂについて従来記載されるとおり（Higgins et al; PNAS 2012; Nov 6;109(45):E3128-35））、抗体０４３を作成してバリデートした。この抗体は、肺癌患者由来の血漿中におけるウエスタンブロットによるＣｉｚ−１  ｂ変異ポリペプチドの検出能を有した（図１ａを参照）。
【０１６０】
製造者が推奨するとおり使用したInvitrogen全エキソソーム単離キット（カタログ番号４４８４４５０）を用いて肺癌患者由来の血漿をエキソソームコンパートメントと可溶性コンパートメントとに分離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、０４３抗体又はタンパク質中の他のどこかにあるエピトープを認識する「汎用」ＣＩＺ１抗体でプローブした（図１ｂに示されるデータはＮＢ１００−７４６２４（Ｎｏｖ４）、Novus Biologicalsで生成される）。
【０１６１】
Ｃｉｚ１  ｂ変異体エピトープ含有種は約７０ｋＤａの相対移動度で移動した。Ｃｉｚ１  ｂ変異体エピトープ含有種は肺癌患者においてエキソソーム画分と共に分画された（図１ｂを参照のこと、赤色及び青色の矢印が、Ｃｉｚ１アイソフォームの異なる分配を示すレーンを示す）。まれな患者において、Ｃｉｚ１  ｂ変異体エピトープ含有種は部分的に非エキソソーム画分と共に分配される（タイプ２、図１ｃ）。これらの患者の血漿は、Ｃｉｚ１  ｂ変異体サンドイッチＥＬＩＳＡで、エキソソームを溶解するためのいかなる前処理もなしに陽性シグナルを生じた。Ｃｉｚ１  ｂ変異体エピトープ含有種が全てエキソソーム画分にある患者については、アッセイ前に血漿（タイプ１）を界面活性剤で処理することによりＣｉｚ１  ｂ変異体エピトープに到達し得る（図１ｅ、図１ｆ）。
【０１６２】
実施例２−合成ｂ変異体ペプチド及びフィブリノゲンからのエピトープの再構成
抗体２Ｂ（図３ａ）及び０４３（図１ａ）は、エクソン１４ｂと１５との間のユニークなジャンクションの領域にあるＣｉｚ１  ｂ変異体を認識する。これらは正常血漿中の約７０ｋＤａの相対移動度の種と反応しないが（図３Ｂ、図３Ｃ）、合成ｂ変異体ペプチドとは実に弱く反応する（図３Ｂ、図３Ｃ）。しかしながら組み合わせると、合成ｂ変異体ペプチドと正常血漿とが約８０ｋＤａの新規の高反応性種を生成する。異なる長さの合成ｂ変異体ペプチド（図３ｅ）、定量的に生成するエピトープ（図３ｆ）でも同様の結果が得られる。
【０１６３】
癌患者由来の血漿中の内因性ｂ変異体エピトープの移動度は還元剤に感受性を有し、ＤＴＴの非存在下で約３４０ｋＤａに移動し、ＤＴＴの存在下で約７０ｋＤａに移動する（図４ａ）。３４０ｋＤａ複合体（図４ｂ）の切り出しと、続く還元時の構成ポリペプチドへの更なる分離により、エピトープは約７０ｋＤａにシフトする（図４ｃ）。このバンドを切り出して溶出すると、質量分析によりフィブリノゲンα鎖が同定された（図４ｄ）。
【０１６４】
精製フィブリノゲン複合体（図５ａ）を合成ｂ変異体ペプチドとインキュベートすると、フィブリノゲン複合体と同様の移動度のｂ変異体エピトープが生成される（図５ａ）。ａ変異体ペプチド、又はｂ変異体ペプチドのカルボキシル化誘導体、又は異なる長さのｂ変異体ペプチドとの比較から、ｉ）エピトープの再構成がｂ変異体含有ペプチドに特異的である、ｉｉ）スプライスジャンクション近傍の特定のＥ残基のカルボキシル化がエピトープの再構成に影響を及ぼす、ｉｉｉ）種々の長さのｂ変異体ジャンクション含有ペプチドがヒト血漿中に天然に存在するエピトープを構成し得ることが示された。
【０１６５】
実施例３−Ｃｉｚ−１  ｂ変異体のバイオマーカーとしての特徴付け
配列
【化１】
2019500618.tif 000002
（配列番号２−ジャンクションは下線を引いたバリンによって示される）の、選択的にスプライシングされた１４ｂ−１５ジャンクションにわたる短いユニークなペプチド（図７Ａ）に対して産生された抗ペプチドウサギポリクローナル抗体２Ｂで、ＣＩＺ１  ｂの分析を行った。生成、バリデーション及び精製戦略は従来記載されるとおりとした（Higgins et al.、上記）。２Ｂのウエスタンブロット反応性プロファイルには、肺癌患者由来の血漿のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける６５〜７０ｋＤａ実体に加えて、全ての人の血漿中の５５ｋＤａ実体が含まれる（図７Ｂ）。癌特異的６５〜７０ｋＤａ種が、本明細書及びHiggins et al.によって言及されるＣＩＺ１  ｂバイオマーカーである。血漿と対照的に、このタンパク質は同じ肺癌患者由来の血清試料中に検出することができなかった（図７Ｃ）ことから、ＣＩＺ１  ｂバイオマーカーは凝固血液中では隔離されていることが示唆される。特に５５ｋＤａ汎用バンドはＣＩＺ１  ｓｐｅｃ７）と共に移動することから、５５ｋＤａ種は完全長ｈＣＩＺ１（これは９９ｋＤａの予想完全長ＭＷを有する、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１２１２７．２）の変異体又はタンパク質分解断片と同定される。エクソン８及びエクソン１７で検出されたバンドの幅は異なり、恐らくこれは、エクソン８エピトープが選択的スプライシング領域内にあるためであり、一方、エクソン１７で検出すれば、エクソン８における選択的スプライシング有り又は無しの種が明らかになり得る。従って癌試料及び同様に非癌血漿試料においても循環系には少なくとも１つの形態のＣＩＺ１タンパク質が存在し、それが正常な生理の一部であることが示唆される。
【０１６６】
エクソン１７及びエクソン８エピトープは、癌患者においてＣＩＺ１ｂ抗体２Ｂによって認識される６５〜７０ｋＤａ種には存在せず、これは、このタンパク質にＣＩＺ１ｂエピトープの上流及び下流の両方の配列が欠損していることを意味する。このデータは、６５〜７０ｋＤａ種が複雑なＣＩＺ１スプライス変異体であるか、又はＣＩＺ１のＣＩＺ１  ｂ断片とキャリアタンパク質との間のＳＤＳ安定複合体であるか、いずれかであることを示唆している（図７Ｄ）。
【０１６７】
２Ｂと同じ免疫プロトコルを使用して（Higgins et al.、上記を参照）、更なる一組のウサギ抗体を生成した。これにより抗体０４３が得られ、これは癌患者の６５〜７０ｋＤａバンドときれいに且つユニークに反応する（図７Ｂ）。従って０４３は、ＥＬＩＳＡを含めた他のアッセイフォーマットで適用性がある検出ツールを提供する。５５ｋＤａ種を認識しないことから、２Ｂと比較してジャンクションフランキング配列がそのエピトープにそれほど寄与しないことが示唆され、５５ｋＤａ種がＣＩＺ１  ｂジャンクションを含有しないことが示唆される。
【０１６８】
これらの２つの抗体がウエスタンブロットによって肺癌患者を識別する能力を直接比較すると、これらが両方ともに識別力を有し、高度な相関があることが示され（図７Ｅ）、しかし顕著には、これらは血漿試験セットにわたって正確に同じプロファイルを共有するわけではない。従って、そのエピトープに幾らかのばらつきはあるが、肺癌患者を非肺癌患者と識別する共通した能力がある。また、その結果を統合して選択性を最大化することに小さい利点もある。
【０１６９】
実施例４−Ｃｉｚ−１  ｂ変異体バイオマーカーの安定性
これらのデータは、ＣＩＺ１ｂが肺癌の強力な循環バイオマーカーであり、臨床実践における応用に大きな潜在的可能性を有するという主張を裏付けている。この潜在的可能性を実現するには、それが多忙な病院で起こる試料処理及び採取レジームのばらつきに耐えるだけの十分なロバスト性を有しなければならない。従って、抗体２Ｂを使用して血漿及び全血中の６５〜７０ｋＤａ癌選択的ＣＩＺ１ｂ種の安定性を試験し、５５ｋＤａ種と比較した。このデータは、３７℃でインキュベートしたときの単離血漿中における少なくとも６時間にわたる安定性を示しており、その後、両方の種で徐々に崩壊する。同様に５０℃までの温度で１時間にわたって比較的変化がなく、及び少なくとも３回の凍結融解サイクルにわたって安定していた。更に、全血を分画せずに最長２４時間まで卓上に放置したときシグナルの喪失はなく、これらは全て、それが様々な臨床状況における応用に好適なロバストなバイオマーカーであることを示している。
【０１７０】
実施例５−Ｃｉｚ−１  ｂ変異体バイオマーカー複合体の解離
未変性条件下で２Ｂ及び０４３の両方が、血漿中に豊富にあるタンパク質と共に移動する７２０ｋＤａを上回る複合体を検出し（図８Ａ）、しかし癌血漿と非癌血漿との間はほとんど識別されない。変性条件下で二次元で更に分離すると、癌特異的６５〜７０ｋＤａ種が明らかになり、及び（２Ｂについて）５５ｋＤａ汎用バンドと分離される（図８Ｂ）。従って完全に未変性のイムノアッセイフォーマットにおけるＣＩＺ１ｂの癌特異的検出は、０４３であっても見込みがない。癌特異的シグナルを明らかにする３つの主要な変性作用因子（熱、ＳＤＳ、還元剤）を、０４３によるＣＩＺ１ｂの移動度及び識別へのそれらの効果に関して評価した。これにより、１％ＳＤＳが主要な反応性種を未変性ゲルの＞７２０ｋＤａから約３４０ｋＤａにシフトさせることが示され（図８Ｃ、右）、癌特異的シグナル、並びに癌試料及び非癌試料の両方で約２００ｋＤａの非特異的バンドが明らかになった。インキュベーション温度を上昇させると、癌特異的種に有害効果があり、３７℃で差が最大に達する。還元剤を含めると、癌特異的シグナルの移動度は６５〜７０ｋＤａの予想位置に更にシフトした（図８Ｃ、左）。
【０１７１】
顕著には、還元剤の濃度が高いほどＣＩＺ１ｂシグナルの喪失につながった（図８Ｄ、図８Ｅ）。まとめると、これらのデータは、６５〜７０ｋＤａ実体がそれ自体、標準的なＳＤＳＰＡＧＥ変性条件（１０ｍＭ  ＤＴＴ）には耐性があるものの、より攻撃的な処理（５００ｍＭ  ＤＴＴ）には耐えられない複合体であること、及びそれが通常、３４０ｋＤａのより高次の複合体（それ自体が７２０ｋＤａを上回る更に大きい複合体からＳＤＳによって放出される（図９Ａに示される））の中に存在することを示唆している。実際、血漿の分画によってエキソソームコンパートメントをエンリッチすると、５５ｋＤａ種（エクソン１７で検出される）と６５〜７０ｋＤａ種（０４３で検出される）とが差次的に分配され、６５〜７０ｋＤａ種は、エキソソームを含む複合体画分であるペレットにのみ検出された。
【０１７２】
実施例６−Ｃｉｚ−１  ｂ変異体バイオマーカー複合体の同定
これらの観察結果から、６５〜７０ｋＤａ  ＣＩＺ１ｂバンドに対する二段階ゲル精製戦略が可能となる。第一に、２つの独立した肺癌患者血漿から３４０ｋＤａ種を単離し（図１０Ａ）、続いて還元剤の存在下で更に分離した（図１０Ｂ）。質量分析（ＭＳ）による同定のため、癌特異的ウエスタンブロットシグナルに対応する６５〜７０ｋＤａバンドを切り出し、トリプシン又はＡｓｐ−Ｎエンドプロテアーゼのいずれかで消化した。両方の酵素消化及び２人の患者について、Ｍａｓｃｏｔデータベース検索すると単一の有意な同定（Ｐ＜０．０５）が返され、これはＵｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０２６７１；ヒトフィブリノゲンα鎖に対応した。内因性フィブリノゲン分子は、それぞれ６７、５１及び４５ｋＤａの３つの異なる鎖（α、β、及びγ）のセットを２組含む、切断前式量３２６ｋＤａ及び相対移動度約３４０ｋＤａの六量体糖タンパク質である。
【０１７３】
顕著には、いずれの酵素による消化後にも、ＣＩＺ１ｂはバンドに同定されなかった。存在する場合に診断的ＣＩＺ１ｂ断片をＭＳによって観察できるかどうかを決定するため、ショート合成ＣＩＺ１ｂペプチド（ｂ１３）及びロングＣＩＺ１ｂペプチド（ｂ６６、表２）をＡｓｐ−Ｎ（ＣＩＺ１ｂエクソンジャンクションの両側を切断することにより診断的断片ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲ（配列番号１６）を生成する）で消化した。ペプチドはｂ１３及びｂ６６の消化後にＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳによって陽性と同定されたが、消化物中の他のペプチドと比べて強度が低かった。データ依存的取得（ＤＤＡ）及びターゲット選択反応モニタリング（ＳＲＭ）の両方を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって更なる分析を実施し、これにより他の全てのプリカーサーを除外した、ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲ（配列番号１６）の予想される２＋及び３＋イオンのフラグメンテーションによるサイクルに分析を集中させ、この分析の特異性及び感度を最大化した。ＤＤＡ及びＳＲＭの両方の分析でＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲ（配列番号１６）が同定されたことから、化学的に合成したペプチド（ＳＲＭクロマトグラム）から切り出したときこの診断的ペプチドがＭＳによって観察可能であることが示される。
【０１７４】
しかしながら、同じペプチドを正常ヒト血漿にスパイクしてＣＩＺ１ｂを再構成したとき、切り出した６５〜７０ｋＤａバンドに診断的ＤＥＥＥＩＥＶＲＳＲ（配列番号１６）ペプチドは検出されなかった。同定されなかったということは、ｉ）ＣＩＺ１ｂ診断的ペプチドの予想質量を変化させる又は酵素消化を損なう二次的修飾、ｉｉ）試料中のより豊富にあるタンパク質、主にフィブリノゲンα鎖が、イオン抑制を引き起したこと、又はｉｉｉ）ＰＡＧＥ及び消化ステップによって被った損失後に絶対存在量が計測手段の検出限界を下回ったことを反映したものであり得た。ペプチドは強酸性であり、ポジティブモードＭＳではこれがイオン化効率を低下させる可能性があり、そのためＳＲＭであっても存在量の僅かな減少によって検出限界を下回り得ることに留意しなければならない。スパイクしたペプチドを生理学的に意味のあるレベルで確実に検出することができなかった場合、内因性ＣＩＺ１ｂを検出できない可能性が高いと結論付けられ、従って下記の別の手法に従った。
【０１７５】
【表１】
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【０１７６】
実施例７−Ｃｉｚ−１  ｂ変異体バイオマーカー複合体のエピトープ再構成
６５〜７０ｋＤａ癌特異的エピトープが実際にＣＩＺ１ｂ配列を含むことを確認するため、エピトープ再構成戦略を取った。これを達成するため、エクソン１４／１５ジャンクションにわたる一対の合成ペプチド（ＣＩＺ１ｂ１３、及び選択的にスプライシングされる介在配列を含むＣＩＺ１ａ２２、表２）を正常ヒト血漿とインキュベートし（図１０Ｃ）、結果を肺癌患者血漿と比較した。ＣＩＺ１ｂペプチドは内因性エピトープと同等な移動度（６５  ７０ｋＤａ）の０４３及び２Ｂ反応性エピトープを生成したが、ＣＩＺ１ａは生成しなかった。このエピトープは遊離ペプチドの相対分子質量をはるかに上回り、反応物の個々の成分のいずれにも存在しないものである（ペプチドレーン６、７、又は血漿レーン３）。これは、ＣＩＺ１ｂペプチドがヒト血漿中のキャリアタンパク質とＳＤＳ／ＤＴＴ耐性複合体を形成し、２Ｂ及び０４３によって認識されるＣＩＺ１ｂバイオマーカーを再び作り出すことを示唆している。内因性エピトープ（癌血漿レーン１）と再構成エピトープとの間に移動度の差が検出されなかったため、このデータはまた、６５〜７０ｋＤａ癌特異的種に寄与するＣＩＺ１ｂ断片が極めて短く、１０〜２０アミノ酸長程度であることも含意している。更に、個々の分子が必ずしも一様な分子境界を有するわけではなく、このバンドの往々にして拡散する性質を説明する可能性がある。
【０１７７】
モル当量のはるかに長いＣＩＺ１ｂペプチド（ｂ６６、表２）は反応性エピトープを再構成したが効率が低く、２Ｂによってのみ検出可能であった（図１０Ｃレーン２、及びより高濃度で）。このペプチドでは、再構成されたシグナルは、より高い相対分子質量、約８０ｋＤａに移動し、寄与ペプチドのサイズの増加と一致した。重要なことには、再構成されたＣＩＺ１ｂエピトープは、内因性エピトープと同様に、標準変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件（１０ｍＭ  ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、９０℃）に耐えるが、より攻撃的な還元環境によっては解離する。まとめると、これらのデータは、インビボで癌特異的エピトープが、それ自体が６５〜７０ｋＤａ種の質量の大半を占めるフィブリノゲンα鎖にマウントした、エクソン１４ｂ／１５ジャンクションを包含するＣＩＺ１の比較的短い断片で構成されることを示唆している。これを更に確かめるため、精製ヒトフィブリノゲンでエピトープ再構成実験を実施した（図１０Ｄ）。両方の抗体について、フィブリノゲン複合体の移動度（非還元ゲルで３４０ｋＤａ）に反応性エピトープが生成され、等価なＣＩＺ１ａペプチドとの反応性がないことによりシグナルの特異性が確認された。モル当量のＣＩＺ１ａ及びＣＩＺ１ｂペプチドと複合体化したヒトフィブリノゲンを用いたダイレクトＥＬＩＳＡにより（図１０Ｅ）、ｉ）ペプチドａ２２と比べたｂ１３によるエピトープ再構成の特異性、ｉｉ）フィブリノゲン単独による無視できるシグナル、及びｉｉｉ）ペプチドをフィブリノゲンにマウントしたときのより高い反応性が確認された。更に、極めて短いＣＩＺ１ｂペプチドｂ７（表２）を含めると、２Ｂと０４３との違いが明らかになった；２Ｂはｂ７を認識するが、０４３はフィブリノゲンの存在とは無関係な形で認識しない。フィブリノゲンとの複合体としてのＣＩＺ１ｂエピトープの存在は、凝固血液から単離した血清試料ではこのバイオマーカーが枯渇しているという先の観察結果と一致する（図７Ｃ）。
【０１７８】
実施例８−ＣＩＺ１ｂイムノアッセイ
ＣＩＺ１  ｂバイオマーカーの組成の知識に基づき、部分的に変性した血漿における定量的検出能力を有するサンドイッチイムノアッセイフォーマットを設計した。５ｕｌの血漿からのＣＩＺ１ｂ抗体０４３による抗原捕捉及びフィブリノゲンα鎖による検出により、癌特異的シグナルが生成された。具体的には、０４３を用いたウエスタンブロットによってＲＯＣ  ＡＵＣ  ０．８２３（Ｐ＝０．０００２）、及び０４３／抗フィブリノゲンを用いたＥＬＩＳＡによって０．８３０（Ｐ＝０．０００７、図１１Ａ、図１１Ｂ）という結果が生じた。従って、これらの２つの方法は極めて良く似た結果を生み出し、データは有意に相関する。
【０１７９】
フィブリノゲン単独は肺癌のバイオマーカーとしての何らかの潜在的可能性が報告されているため（Allin et al.; 2016; Int J Cancer 139(7):1493-1500）、ヨーク病院（York Hospital）呼吸器内科クリニックにかかる幅広い条件の患者を代表するこのデータセットを使用して、このアッセイのＣＩＺ１  ｂ成分の寄与もまた評価した。線形範囲におけるフィブリノゲンの定量的検出から、このセットにわたる幾らかの識別能力が返されたが、ＲＯＣ  ＡＵＣは０．６２８と比較的低かった（ｐ＝０．２２５）。これは、肺癌患者と悪性疾患を有しない者との間でほとんど差を示さなかったフィブリノゲンのウエスタンブロット評価と一致する。従って、ＣＩＺ１  ｂの捕捉は、このアッセイへの癌選択性の大部分に寄与する要素である。０４３による捕捉後の試料セットを、但し抗フィブリノゲン検出抗体を抗ヒトＩｇＧに置き換えて分析することにより、この構成の特異性を更に試験した（図１１Ｄ）。結果は、患者血漿と対照血漿とが識別されないことを示し、抗フィブリノゲンが、ＣＩＺ１  ｂによって取り戻された癌選択的複合体を特異的に検出する情報性のある検出試薬であることが確認される。最後に、ダイレクトＥＬＩＳＡによるセットＢにわたる全ＩｇＧレベルの計測（図１１Ｅ）を用いて０４３／フィブリノゲンによる生成結果を正規化したが、もたらされた識別の改善は僅かで、ＲＯＣ  ＡＵＣ  ０．８４５であった（ｐ＝０．０００２、図１１Ｆ）。
【０１８０】
０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（プロテアーゼ阻害薬）を補足したＰＢＳ中１００ｕｌの０．５％ｔｗｅｅｎ２０、１％ＳＤＳにおいて５ｕｌの血漿を部分的に変性し、ボルテックスを繰り返しながら２０℃で３０分間インキュベートした後に、ＣＩＺ１  ｂ−フィブリノゲンα鎖複合体ＥＬＩＳＡをサンドイッチＥＬＩＳＡとして実施した。プレート（Nunc Maxisorb、４４２４０４）を１００ｕｌの５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ９．６中、１ｕｇの０４３  ＣＩＺ１ｂ  ｐＡｂプロテインＡ画分によって４℃で一晩コーティングし、次にＰＢＳ中３００ｕｌのろ過済み１％ＢＳＡによって室温で２時間ブロックした。ＰＢＳ中３００ｕｌの０．０５％ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、分析物を穏やかに振盪しながら室温で２時間かけて添加した。５回洗浄した後、捕捉された複合体をヒツジ抗フィブリノゲンｐＡｂ（ＡＦ４７８６、R&D systems）と、続く抗ヒツジＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch、２１３−０３２−１７７）で検出し、結果を１００ｕｌのSure Blue（KPL、５２０００１）を使用して発色させ、FLUOstar OPTIMAプレートリーダー（BMG Labtech）を使用してＡ４５０ｎｍで検出した。
【０１８１】
フィブリノゲンの計測について捕捉抗体はニワトリＩｇＹ（１ｕｇ／ウェル、Genway、１５−２８８−２２８５６）とし、及び分析物濃度は段階希釈によって５桁低下させた。ダイレクトＥＬＩＳＡにおけるヒトＩｇＧの計測については、０．５ｕｌの血漿を１００ｕｌの５０ｍＭ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中でプレートに直接コーティングし、ブロックし、洗浄し、及び抗ＩｇＧ（Jackson Immuno Research、７０９−０３５−１４９）で検出した。合成分析物のダイレクトＥＬＩＳＡについては、１００ｐｍｏｌペプチドと複合体化した０．５ｕｇ精製フィブリノゲン（Sigma、Ｆ３８７９）を上記のとおり１００ｕｌの５０ｍＭ炭酸塩ｐＨ９．６中でプレートにコーティングし、０４３又は２Ｂでプローブし、抗ウサギＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch）で検出した。
【０１８２】
従って、このサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットは病院プラットフォームでのハイスループット適用に好適であり、且つ循環ＣＩＺ１ｂバイオマーカーを確実に定量化することができ、且つ初期肺癌患者の同定に使用することができる。
【０１８３】
上記の明細書において言及される全ての刊行物は、本明細書において参照により援用される。当業者には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の記載される方法及びシステムの様々な改良例及び変形例が明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して説明されているが、特許請求されるとおりの本発明がかかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されなければならない。実際、分子生物学又は関連分野の当業者には自明の、記載される本発明の実施方法の様々な改良例が、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【図６−１４】
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【図６−１５】
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【図６−１６】
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【図６−１７】
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【図６−１８】
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【図６−１９】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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