(57)【要約】開示された技術は、創傷（例えば、慢性創傷または感染創傷）の検出のための化学種に関し、このような化合物を含む組成物、基質、キット、包帯材料、および物品、システムを含む。開示される技術はさらに、診断アッセイにおける、ならびに特定の部分および／または反応部位に対する酵素作用に基づく慢性創傷または感染創傷の診断および／または検出における、これらの組成物、キットおよびシステムの使用方法にも関する。開示された技術は、さらに、創傷部位における病原体、例えば細菌および／またはウイルス性物質、例えば酵素および基質の検出に関する。さらなる開示は、複数のマーカーの発現に基づいて創傷を特徴付け、慢性創傷または感染創傷に罹患している患者を治療、管理およびフォローアップするためにこのような情報を使用する方法に関する。  【選択図】図１０Ａ
2019512556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ａ−Ｒ−Ｉ
式Ｉ
［式中、
Ａは、アンカーであり；
Ｒは、酵素認識部位であり；
Ｉは、指標領域である］
で示される化合物を含む、化学種。
【請求項２】
アンカーＡが、指標Ｉに共有結合しているか、または非共有結合的に会合している、請求項１に記載の化学種。
【請求項３】
Ｒが、創傷特異的ヒドロラーゼに特異的である、請求項２に記載の化学種。
【請求項４】
Ａが、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、もしくはキトサン、またはそのモノマー、それらのオリゴマー、それらの誘導体、それらの混合物または組み合わせを含む、請求項１に記載の化学種。
【請求項５】
アンカーＡが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、Ｄ−ガラクトピラノシド、またはそれらの誘導体から選択される多糖類を含む、請求項４に記載の化学種。
【請求項６】
アンカーＡが、ペプチドグリカンまたはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、これらの混合物または組み合わせを含む、請求項４に記載の化学種。
【請求項７】
前記ペプチドグリカンのモノマーが、糖およびアミノ酸、そのオリゴマー、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の化学種。
【請求項８】
前記ペプチドグリカンが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＮＡＧ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃまたはＮＡＭ）またはこれらの組み合わせから選択される交互アミノ糖の少なくとも２単位を含む、請求項６に記載の化学種。
【請求項９】
前記ペプチドグリカン誘導体がカルボキシル化ペプチドグリカンを含む、請求項８に記載の化学種。
【請求項１０】
前記ペプチドグリカン誘導体が、場合により１つ以上のハロゲン、アルコール、エステルまたはアミド基を含むカルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル基を含む、請求項９に記載の化学種。
【請求項１１】
前記ペプチドグリカン誘導体が、１つ以上のカルボキシメチル基を含む、請求項１０に記載の化学種。
【請求項１２】
前記ペプチドグリカン誘導体がハロゲン化されている、請求項６に記載の化学種。
【請求項１３】
アンカーＡが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＮＡＧ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃまたはＮＡＭ）、もしくはそれらのオリゴマーまたはそれらのポリマーからなる群から選択される化合物を含む、請求項４に記載の化学種。
【請求項１４】
反応部位（Ｒ）が、プロテアーゼの部位を含む、請求項１に記載の化学種。
【請求項１５】
前記反応部位（Ｒ）が、エラスターゼであるプロテアーゼの部位を含む、請求項１４に記載の化学種。
【請求項１６】
反応部位（Ｒ）が、アミノ酸配列（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ；（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ；（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚまたは（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚを含み；各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、ｙは、それぞれ独立して、０〜２００から選択される数字であり；Ｌは、連結部分であり、Ｚは、標識である、請求項１５に記載の化学種。
【請求項１７】
ｙが、それぞれ独立して、１〜５０の整数である、請求項１６に記載の化学種。
【請求項１８】
ｙが、それぞれ独立して、１〜１０の整数である、請求項１６に記載の化学種。
【請求項１９】
ｙが、それぞれ独立して、１〜６の整数である、請求項１６に記載の化学種。
【請求項２０】
各ペプチド（ａ）〜（ｄ）が、エラスターゼに対して不安定である、請求項１６に記載の化学種。
【請求項２１】
前記反応部位（Ｒ）が、３Ｃプロテアーゼであるプロテアーゼの部位を含む、請求項１４に記載の化学種。
【請求項２２】
３Ｃプロテアーゼ反応部位（Ｒ）が、アミノ酸配列（ａ）ＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚを含み；Ｘは、それぞれ独立して任意のアミノ酸であり；ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；Ｕは、ＬＥＶＬＦＱから選択されるアミノ酸であり、Ｚは標識である、請求項２１に記載の化学種。
【請求項２３】
（ａ）の各ペプチドが、３Ｃプロテアーゼに対して不安定である、請求項２２に記載の化学種。
【請求項２４】
前記反応部位（Ｒ）が、カテプシンＧであるプロテアーゼの部位を含む、請求項１４に記載の化学種。
【請求項２５】
カテプシンＧプロテアーゼ反応部位（Ｒ）が、アミノ酸配列（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ；または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり；各ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；Ｌは、連結部分であり、Ｚは標識である、請求項２１に記載の化学種。
【請求項２６】
ｙが、それぞれ独立して、１〜３の整数である、請求項２１に記載の化学種。
【請求項２７】
各ペプチド（ａ）〜（ｂ）が、カテプシンＧプロテアーゼに対して不安定である、請求項２５に記載の化学種。
【請求項２８】
前記指標が、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含有する染料またはジクロロトリアジン反応性基を含有する染料を含む、請求項１に記載の化学種。
【請求項２９】
スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含有する染料が、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５もしくは反応性オレンジ１６またはこれらの組み合わせである、請求項２８に記載の化学種。
【請求項３０】
前記ジクロロトリアジン反応性基を含有する染料が、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９もしくは反応性ブラウン１０、またはこれらの組み合わせである、請求項２８に記載の化学種。
【請求項３１】
前記指標が、発光分子、化学発光分子、蛍光染料、蛍光消光剤、脂質、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属および酵素からなる群から選択される検出可能な標識を含む、請求項１に記載の化学種。
【請求項３２】
前記酵素反応部位（Ｒ）が、アンカーと指標との間の結合を介して提供される、請求項１に記載の化学種。
【請求項３３】
Ｒが、ラクタマーゼに特異的である、請求項３２に記載の化学種。
【請求項３４】
前記Ｒが、コンジュゲートされたラクトンおよびアミドを含むラクタム結合を含む、請求項３３に記載の化学種。
【請求項３５】
Ｒが、グリコシダーゼに特異的である、請求項３３に記載の化学種。
【請求項３６】
前記グリコシダーゼが、β−ラクタマーゼである、請求項３３に記載の化学種。
【請求項３７】
以下に記載の配列を含むポリペプチド：
（ａ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、
（ｂ）ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、
（ｃ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、または
（ｄ）ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、
ここで、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｌは、連結部分であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【請求項３８】
ｙが、それぞれ独立して、１〜５０の整数である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
ｙが、それぞれ独立して、１〜１０の整数である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
ｙが、それぞれ独立して、１〜６の整数である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含むペプチドが、それぞれ、個々にエラスターゼに対して不安定である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
アミン保護基をさらに含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基をさらに含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
Ｚが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）によって活性化される、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
Ｚが、インドキシル化合物を含む、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
アンカー領域（Ａ）と、請求項４４に記載のポリペプチドを含む指標領域（Ｉ）とを含む、化学種。
【請求項４７】
前記アンカー領域が、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、もしくはキトサン、またはそのモノマー、それらのオリゴマー、それらの誘導体、それらの混合物または組み合わせを含む、請求項４６に記載の化学種。
【請求項４８】
前記アンカー領域が、ペプチドグリカン、またはそのモノマー、またはそのモノマーのオリゴマーを含む、請求項４６に記載の化学種。
【請求項４９】
前記アンカーが、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能基、フェノールアジド、エポキシド、ペプチドグリカン、脂肪族鎖、脂肪族アルコール鎖、多環式または多芳香族環系、親油性基、およびこれらの組み合わせにコンジュゲートする、請求項４６に記載の化学種。
【請求項５０】
以下に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列：
（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または、
（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）、
式中、
Ｘは、それぞれ独立して任意のアミノ酸であり；
ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；
Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；
Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；
Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；
Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；
Ｌは、連結部分であり；
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【請求項５１】
ｙが、それぞれ独立して、１〜３の整数である、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
配列（ａ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）または（ｂ）ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）を含むペプチドが、それぞれ、個々にカテプシンＧに対して不安定である、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
アミン保護基をさらに含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基をさらに含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
Ｚが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）によって活性化される、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
Ｚが、インドキシル化合物を含む、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
アンカー領域（Ａ）と、請求項５５に記載のポリペプチドを含む指標領域（Ｉ）とを含む、化学種。
【請求項５８】
前記アンカー領域が、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、もしくはキトサン、またはそのモノマー、それらのオリゴマー、それらの誘導体、それらの混合物または組み合わせを含む、請求項５７に記載の化学種。
【請求項５９】
前記アンカー領域が、ペプチドグリカン、またはそのモノマー、またはそのモノマーのオリゴマーを含む、請求項５７に記載の化学種。
【請求項６０】
前記アンカーが、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能基、フェノールアジド、エポキシド、ペプチドグリカン、脂肪族鎖、脂肪族アルコール鎖、多環式または多芳香族環系、親油性基、およびこれらの組み合わせにコンジュゲートする、請求項５９に記載の化学種。
【請求項６１】
（ａ）ＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列であって、Ｘは、それぞれ独立して任意のアミノ酸であり；ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；Ｕは、ＬＥＶＬＦＱから選択されるアミノ酸であり、Ｚは標識である、ポリペプチド配列。
【請求項６２】
各ペプチド（ａ）が、３Ｃプロテアーゼに対して不安定である、請求項６１に記載の化学種。
【請求項６３】
アミン保護基をさらに含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）であるアミン保護基をさらに含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
Ｚが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）によって活性化される、請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
Ｚが、インドキシル化合物を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
アンカー領域（Ａ）と、請求項６１に記載のポリペプチドを含む指標領域（Ｉ）とを含む、化学種。
【請求項６８】
前記アンカー領域が、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、もしくはキトサン、またはそのモノマー、それらのオリゴマー、それらの誘導体、それらの混合物または組み合わせを含む、請求項６７に記載の化学種。
【請求項６９】
前記アンカー領域が、ペプチドグリカン、またはそのモノマー、またはそのモノマーのオリゴマーを含む、請求項６７に記載の化学種。
【請求項７０】
前記アンカーが、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能基、フェノールアジド、エポキシド、ペプチドグリカン、脂肪族鎖、脂肪族アルコール鎖、多環式または多芳香族環系、親油性基、およびこれらの組み合わせにコンジュゲートする、請求項６９に記載の化学種。
【請求項７１】
反射光または電流測定モダリティを用いて固相系に配置された、請求項４６に記載の化学種の変換度を検出するための機器。
【請求項７２】
請求項４６に記載の化学種が、観察者に目に見えるか、または検出可能となるように配置されたスティック、チューブ、チャンバまたは凹部を含む機器。
【請求項７３】
請求項４６に記載の化学種が、有機体からの体液、体液エアロゾルまたは同様のサンプルがチャンバを通過するときに反応して、バイオマーカー酵素の存在度を明らかにするように配置される、スティック、チューブ、チャンバまたは凹部を含む機器。
【請求項７４】
気道からの流体およびエアロゾルとともに使用するための、請求項４６に記載の機器。
【請求項７５】
高減圧療法を受けた創傷被験体からの流体およびエアロゾルと共に使用するための、請求項４６に記載の機器。
【請求項７６】
膀胱からの流体およびエアロゾルとともに使用するための、請求項４６に記載の機器。
【請求項７７】
血液からの流体およびエアロゾルとともに使用するための、請求項４６に記載の機器。
【請求項７８】
下記式（Ｄ）：
【化１】
2019512556.tif 000134
（式Ｄ）
［式中、
Ｒ１＝−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
Ｘ＝−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−
Ｒ２＝限定されないが、以下のものであってもよい。−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール；ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールおよびアルキルヘテロアリール基は、フェロセン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、−ＮＲ４Ｒ５、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＮＨＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｒ４Ｒ５ＮＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）−から独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよく、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、限定されないが、−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ１２）アルケニル、−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキニル、−（Ｃ１−Ｃ８）［（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ］アルキル、−（Ｃ１−Ｃ８）［（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ］アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ１０）アリール−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、−（Ｃ２−Ｃ９）ヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ５）アルキルであってもよく、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびヘテロアリールは、場合により、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシから独立して選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよく、またはＮ（Ｒ４Ｒ５）は、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパンまたはアゾカン、１−置換ピペリジンまたはモルホリン部分であり；Ｙ＝−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−であり、
Ｒ３は、限定されないが、以下のものであってもよい。−Ｃ６−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール；ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールおよびアルキルヘテロアリール基は、フェロセン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、シアノ（−ＣＮ）、アジド（−Ｎ３）、−ＮＲ４Ｒ５、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＮＨＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｒ４Ｒ５ＮＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）−から独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよい］
で示される化合物。
【請求項７９】
式Ａ：
【化２】
2019512556.tif 000135
（式Ａ）
［式中、
Ｙは、ＯまたはＮであり、
Ａｒは、
【化３】
2019512556.tif 000136
【化４】
2019512556.tif 000137
；
またはフェロセンであり；
Ｒは、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールまたはアルキルヘテロアリールであり；
αは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、またはＬであり；
βは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり；
γは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、またはＧであり；
δは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＧまたはＶであり；
εは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、ＶまたはＥであり；
φは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり；
β、γ、δ、εおよびφがそれぞれ結合である場合、αのＮ末端は、Ｘに結合し；
Ｘは、０〜１４個のアミノ酸を含むペプチド鎖であり；
ＰＧが、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ１であり、ここで、Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、ｔ−ブチルまたはメチルフルオレニルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２であり、ここで、Ｒ２は、−Ｃ１−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールまたはアルキルヘテロアリールである］
で示される化合物。
【請求項８０】
式Ｂ：
【化５】
2019512556.tif 000138
（式Ｂ）
［式中、
Ｌは、Ａ、ＡＡ、Ｖまたはトリアゾリルであり、
Ｚは、フェロセン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９または反応性ブラウン１０であり、
αは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、ＲまたはＬから選択され、
βは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり、
γは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり、
δは、結合：アミノ酸なしであるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＧまたはＶであり、
εは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、ＶまたはＥであり、
φは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり、
β、γ、δ、εおよびφがそれぞれ結合である場合、αのＮ末端は、Ｘに結合し；
Ｘは０〜１４個のＡＡを含むペプチド鎖であり、ＡＡは、アミノ酸、ポリアミンまたはポリオキシアルキレンであり；
ＰＧが、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能基、フェノールアジド、エポキシド、ペプチドグリカン、脂肪族鎖、脂肪族アルコール鎖、脂肪族アミン、メルカプトエチル、多環式または多芳香族環系、親油性基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ１であり、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、ｔ−ブチル、メチルフルオレニル、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２であり、ここで、Ｒ２は、−Ｃ１−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールまたはアルキルヘテロアリールである］
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、２０１６年３月３０日に出願された米国仮出願第６２／３１５，５４６号および２０１６年３月３０日に出願された米国仮出願第６２／３１５，５５６号の利益を請求し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、その一部分をなす。
【０００２】
本明細書に記載される実施形態は、一般的に、創傷治癒に関し、特に、創傷の検出および治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物において、皮膚損傷は、治癒した創傷をもたらす細胞性および生化学的事象の組織化された複雑なカスケードを誘発する。創傷治癒は、複雑な動的過程であり、解剖学的連続性および機能の回復をもたらす。理想的に治癒した創傷は、正常な解剖学的構造、機能、および外観に戻った創傷である。典型的な創傷は、「滲出」期、増殖期、修復期および上皮成熟の４つの段階（Ｈａｔｚら、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｍｕｎｉｃｈ，１９９４）または止血期、炎症期、増殖期およびリモデリング期の４つの段階からなるモデルによる（Ｎｗｏｍｅｈら、Ｃｌｉｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．１９９８，２５，３４１）。炎症期の段階は、創傷治癒過程にとって特に重要であり、創傷部位における生化学反応は治癒を促進するが、過剰プロテアーゼの産生による組織破壊も引き起こす。
【０００４】
病原性感染症は、創傷治癒の最も共通する障害の１つである。清浄な創傷からコロニー形成された創傷への進行性の悪化は、病原性微生物によって課されるバイオバーデンの増加と関連することが多い。Ｏｖｉｎｇｔｏｎら、Ｏｓｔｏｍｙ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、４９．７Ａ：８−１２、２００３を参照のこと。感染した創傷は、黄色の外観、痛み、発赤、滲出性の膿のような感染の臨床徴候を特徴とする中間段階であり、定着した創傷は慢性の病原性感染を特徴とし、治癒するのが困難である。創傷の感染も、治癒過程を止めてしまうことがある。例えば、創傷内の病原体は毒素（例えばクロストリジウム種）を産生し、ｐＨを上昇させるアンモニア（例えばプロテウス種）などの有害な代謝産物を生成し、プロテアーゼのような組織溶解酵素を活性化または生成するか、または組織への侵襲を促進し、これにより、創傷の大きさまたは重症度が増加する。
【０００５】
創傷の慢性をチェックするために、臨床および獣医学の設定において、様々な評価技術および／またはツールが使用される。感染した創傷を評価する現在の方法は、主に創傷に関連する様々なパラメータのアッセイに基づく。例えば、創傷は視覚的に評価され、長さおよび深さの測定が行われ、創傷の視覚状態および大きさを追跡するために利用可能なデジタル写真を使用することができる（Ｋｒａｓｎｅｒら、上述）。臨床診療では、感染の診断は、臭い、局所痛の存在、熱、腫脹、放出および赤みなどの二次的パラメータの測定に基づく。炎症および排出などのこれらの臨床指標の多くは、創傷における感染の予測価値が低い。他の例では、創傷部位における病原性菌叢の数およびタイプは、実験および／または臨床診断手順を用いて決定され得る。病院の実験室での微生物学的検査に続く創傷のスワブは、細菌のコロニー形成および感染に関連する菌株の同定の確認のための選択肢であり、したがって、正しい抗生物質コースの処方を可能にする。しかしながら、このプロセスは時間がかかり、労働集約的である。感染の診断の遅延は抗生物質の投与を遅らせる可能性があり、敗血症発症のリスクを高める可能性がある。
【０００６】
既存の臨床診断に関連する最大の欠点の１つは、感染の開始および検出のタイミングに関連する遅れである。例えば、拭き取り手順を用いた感染の陽性同定は、しばしば、創傷部位における微生物の「臨界質量」の達成に依存するため、検出可能なレベルに達するまで早期検出を行うことはできない。また、スワブは周辺組織の細菌叢で汚染されている可能性があり、診断手順が複雑になる。他の欠点には、例えば、サンプリングエラー、スワブの輸送の遅延、分析手順のエラー、および／または報告の誤りが含まれる。Ｂｏｗｌｅｒら、Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１４（２）：２４４-２６９、２００１の総説を参照。
【０００７】
したがって、臨床的感染の早期診断を可能にする、好ましくは感染の臨床症状の発現の前に臨床的診断を可能にする診断試薬および方法に対する差し迫っているものの、満たされていない必要性が存在する。臨床症状の発現前に創傷の臨床感染を予測するのを助ける組成物および方法の必要性も存在する。そのような予後補助は、創傷が悪化し、さらなる感染を予防するために手術または他の劇的な介入が必要となる前に、適切な治療（例えば、抗菌治療）での早期介入を可能にする。さらに、臨床医が可能な限り早期に創傷感染に応答することができれば、その感染症は最小の抗生物質使用でも治療することができる。これは、入院の必要性を低減し、例えば、他の病気の被験者との接触の結果として、二次感染のリスクを低下させるであろう。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書中に開示される技術は、感染および／または慢性創傷を検出する組成物および方法を提供する。開示された技術は、感染した創傷の検出の感度、精度および特異性を高めること、定性的および定量的測定の能力を提供すること、および感染した創傷の検出速度をｉｎ  ｓｉｔｕでおよびリアルタイムで高めることにより、既存のアッセイに改良を加える。本明細書に記載されるアッセイおよび方法は、部分的に、感染したまたは慢性の創傷に存在するバイオマーカーおよび／またはプローブを検出する特異的試薬の使用に基づく。検出プロセスは、感染した創傷に存在するマーカーには特異的であるが、非感染性または非慢性の創傷には特異でない試薬の使用を含むことができ、検出工程は、プローブがマーカーによって作用するときに生成するシグナルの定性的または定量的な測定を含んでいてもよい。検出方法が創傷中に存在する酵素の検出を含む実施形態では、プローブは、酵素に特異的であり、場合により増幅されてもよいシグナルを生成する改変酵素基質を含む。これにより、検出の効率および特異性が大幅に改善される。さらに、１つ以上の標的（例えば、創傷に特異的な酵素）にそれぞれ特異的な複数の検出プローブを使用することができる。これは、偽陽性（例えば、非特異的相互作用および／または標的冗長性による）の発生を最小にしながら、診断アッセイの効率および正確さの両方を最大にするのに大いに役立つ。さらに、本明細書中に開示される実験結果は、新規なプローブおよびそれに基づくアッセイ技術が、様々なタイプの創傷を検出および特徴付けることができることを確認する。最後に、開示された技術の試薬は、慢性創傷の治療および管理を監視および評価するために、抗生物質、抗真菌剤などの治療分子と共に使用され得る。
【０００９】
本明細書に記載の実施形態は、部分的には、免疫系の細胞（それによって生成された酵素を含む）が創傷の早期診断におけるマーカーとして役立つという発見に基づいている。これらの細胞、例えば好中球は、感染に対抗するために創傷部位に動員され、バクテリア（および他の病原体）を巻き込み、および／または酵素でそれらを中和することによって対抗をする。いくつかの酵素は、タンパク質に対して特異性であり（例えば、エラスターゼ、カテプシンＧ、リパーゼなど）、その他は、細胞壁の構成要素に対して特異性であり（例えば、リゾチーム）、その他のものは、タンパク質の変性を媒介する（例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）および他のペルオキシダーゼ）。これらの細胞、例えば好中球は、一般的に短命であり、感染の領域で溶解するとき、酵素を含むそれらのリソソームの内容物を放出し、次いでそれを検出して、創傷の状態の信頼性の高い測定結果を与えることができる。
【００１０】
したがって、本明細書に記載された様々な実施形態は、目的の生物学的サンプル、例えば、創傷組織における骨髄細胞および特に好中球の存在を示す酵素マーカーの検出を利用する。従って、創傷液中のこのような酵素のレベルまたは活性の増加は、細菌攻撃の高まりおよび侵襲性細菌のための妨げられた宿主／細菌平衡の発現に相当する。
【００１１】
一態様では、体液からの酵素活性を検出することができる化学種が提供され、この化学種は、アンカー領域、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域のうち１つ以上を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域のうち、少なくとも３つを含む。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域の１つ、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域の１つ、酵素認識領域の１つ、酵素不安定領域または酵素反応性領域の１つ、指標領域の１つを含む。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域を介して支持材料に結合する。いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも２つの指標領域を含む。いくつかの実施形態では、酵素認識領域は、酵素不安定領域または酵素反応性領域と部分的に、または完全に重なっている。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、酵素不安定領域または酵素反応性領域と部分的に、または完全に重なっている。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、指標領域と部分的に、または完全に重なっている。いくつかの実施形態では、指標領域は、酵素不安定領域または酵素反応性領域と部分的に、または完全に重なっている。いくつかの実施形態では、標的酵素活性によって化学種から一旦分離された指標領域は、リパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される１つ以上の補助酵素と相互作用する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ、酸セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エラスターゼ、カテプシンおよびプロテイナーゼ−３エラスターゼ、リゾチーム、エステラーゼ、リパーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される１つ以上の標的酵素と相互作用する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、酵素不安定領域または酵素反応性領域と１つまたは複数の標的酵素との相互作用により、可視色または検出可能な電子変化を生じさせることができる部分を含み、この部分は、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、フェノール、キノン、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、量子ドット、コロイド状金粒子、またはそれらの類似体から選択される。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２イノフェノール、ＡＢＴＳ（速度は金酸から選択される）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンジジン、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、インドキシル、インジゴ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲおよび４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン、およびそれらの類似体から選択される。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、アニリン類似体である。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、６以上の炭素単位を有するＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲのＮ−アルキル誘導体である。いくつかの実施形態では、指標領域は、酵素不安定領域または酵素反応性領域と１つまたは複数の標的酵素との相互作用によって可視色または検出可能な電子変化を生じさせることができる部分を含み、その部分は、インドキシル類自体、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、及び金コロイド粒子から選択される。いくつかの実施形態では、可視色または検出可能な電子変化を生じさせることができる部分は、帯電した染料またはルミノール誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５、および反応性オレンジ１６から選択される。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９、反応性ブラウン１０から選択される。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、リゾチームに不安定性であるか、またはリゾチームと反応し、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、多糖、グルコサミン、またはペプチドグリカン、ならびに多糖、グルコサミン、またはペプチドグリカンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペプチドグリカンを含み、ペプチドグリカンは、リゾチームに不安定であるか、またはリゾチームと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、フェノール、ナフトール、インドキシルまたはキノンを含み、フェノール、カルボキシアミノフェニル、インドキシルまたはキノンは、ミエロペルオキシダーゼに対して不安定であり、ヘムと反応しない。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペプチド、ペプチド��倣物、またはタンパク質を含み、ペプチド、ペプチド模倣物、またはタンパク質は、エラスターゼに対して不安定であるか、またはエラスターゼと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；Ｌは、連結部分であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子変化を引き起こすことができる部分である。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＡＡＰＶＸｙ−Ｌ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、それぞれ独立して、０〜５０から選択される数字であり；Ｌは、連結部分、例えば、エステルまたはアミドであり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子変化を引き起こすことができる部分である。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペプチド、ペプチド模倣物、またはタンパク質を含み、ペプチド、ペプチド模倣物、またはタンパク質は、カテプシンＧに対して不安定であるか、またはカテプシンＧと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり；各ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；Ｌは、連結部分であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子変化を引き起こすことができる部分である。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能基、フェノールアジド、エポキシド、ペプチドグリカン、脂肪族鎖、脂肪族アルコール鎖、多環式または多芳香族環系、親油性基、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、短時間のＵＶ照射の後に支持材料に結合する。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、支持材料に結合するためのイオン性化学基を含む。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、支持材料への共有結合のための反応性部分を含む。いくつかの実施形態では、アンカー領域および酵素不安定領域はポリペプチドであり、アンカー領域は、ポリマー結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域は、プロテアーゼに対して不安定であり、ポリマー結合ドメインは疎水性結合ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域は、カテプシンまたはエラスターゼに対して不安定である。いくつかの実施形態では、化学種は、低分子種または修飾ポリマーから選択される。
【００１４】
一態様では、本明細書では、感染の検出のための化学種が提供され、化学種は、目に見える色変化を示すｐＨ感受性部分を含む指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、固相への反応を可能にする反応性基をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性部分は、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッド、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、または他のスルホフタレイン染料である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、アンカー領域は、短時間のＵＶ照射の後に支持材料に結合する。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、支持材料に結合するためのイオン性化学基を含む。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、支持材料への共有結合のための反応性部分を含む。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、水性系に殆どまたは全く溶解性を生じさせない疎水性部分を含み、それにより、材料が固相と結合したままになることを可能にする。
【００１６】
いくつかの実施形態では、反応性領域は、細菌酵素β−ラクタマーゼと相互作用する。これは、一般的な抗菌薬を分解することができる細菌性酵素であり、その存在は治療中の医師にとって関心対象である。発色性β−ラクタマーゼ基質は、他のバイオマーカーについて報告する試薬に加えて、一般的に有用である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、反応性領域は、ウイルスプロテアーゼまたは宿主フリンプロテアーゼの基質である。いくつかの実施形態では、開裂生成物の検出には、ポリカチオン性トラップが必要である。特定の実施形態では、これらは架橋されていてもよい。架橋の程度および種類に応じて、これらは、超吸収剤でもあり得る。いくつかの実施形態では、酵素基質は、電子的に検出することができる酸化還元活性種を生じさせることができる。他の実施形態では、固相における酵素生成物の電子的な検出は、反射光によって行われる。本明細書で開示されるのは、モノマー、オリゴマーまたはポリマー性であり得る化学種である。これらは、感染がそうでなければ明らかである前に、創傷または体液中の感染のために選択されたマーカーの検出のための培地として働くように改変される。いくつかの実施形態では、化学種は、哺乳動物における感染を検出するためのものである。いくつかの実施形態では、化学種は、１つ以上の感染のバイオマーカーを検出し、１種類以上のバイオマーカー存在下で、目に見える変化を生じる。いくつかの実施形態では、１種類以上のバイオマーカーは、白血球酵素である。いくつかの実施形態では、１種類以上のバイオマーカーは、エラスターゼ、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ、白血球ペルオキシダーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ、酸性セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）およびプロテイナーゼ−３、β−ラクタマーゼ、および他の類似の酵素、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、化学種は、特定のｐＨ範囲を検出する。いくつかの実施形態では、化学種は、１種類以上の白血球酵素および特定のｐＨ範囲を検出し、１種類以上の白血球酵素および特定のｐＨ範囲が存在する状態では、目に見える変化を生じる。いくつかの実施形態では、目に見える変化は、創傷または体液に共通する色（例えば、赤色、黄色、桃色または褐色）とは容易に区別される色変化である。いくつかの実施形態では、目に見える変化は、蛍光、発光、または屈折、ガス発生、またはポリマー状態の変化などの物理的手段を介して媒介される。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域からなる群から選択される１つ以上の要素を含む。いくつかの実施形態では、体液は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、痰、尿または創傷滲出物である。好ましい実施形態では、体液は、創傷滲出物である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、化学種は創傷包帯に組み込まれ、そこで、化学種は創傷包帯と接触する創傷滲出物と反応する。いくつかの実施形態では、化学種は創傷被覆材に組み込まれ、そこで、化学種は、創傷包帯を通って化学種を含む試薬層に引き上げられた創傷滲出物と反応する。いくつかの実施形態では、化学種は、感染バイオマーカーが存在する場合に、色または他の目に見えるマーカーを生じる指標コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、化学種は、哺乳動物の感染した創傷を診断する方法において使用される。いくつかの実施形態では、化学種は、哺乳動物の創傷を治療する方法において使用される。いくつかの実施形態では、化学種は、哺乳動物の創傷を診断および治療する方法で使用される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、化学種は、配管または他のコンポーネントを介して高減圧創傷治療システムに組み込まれ、そこで、化学種は、機器内の挿入物と接触する高減圧排出物と反応する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、化学種は、管または他の構成要素を介して人工呼吸器システムに組み込まれ、そこで、化学種は、化学種と接触する吸引物、エアロゾルまたは痰排出物と反応する
【００２１】
いくつかの実施形態では、化学種は、ディップスティックに組み込まれ、そこで、外部スワブなどを使用して評価される流体が適用された後に化学種が反応するる。いくつかの実施形態では、化学種は、反射光、アンペロメトリーまたは同様の電気化学的プロセスのいずれかを介して電子的に検出することができる変化を生じさせる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、化学種の使用は、哺乳動物または患者の感染状態の変化を、他の点で明らかである前に検出することを実現可能にする。いくつかの実施形態では、本方法は、哺乳動物または患者の病状の悪化を防止するための治療法を選択するために、引き続く治療の変更またはより詳細な診断の適用がその後に使用される、改善または予防的治療の基礎である。
【００２３】
化学種
【００２４】
いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域からなる群から選択される１つ以上の要素を含む、低分子化学種または修飾ポリマーである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、酵素によって反応する構造である。いくつかの実施形態では、酵素認識部位は、酵素との結合を可能にする構造である。
【００２６】
特定の実施形態では、化学種は、修飾ポリマーである。特定の実施形態では、化学種は、低分子化学種である。本明細書では、アンカー領域、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域からなる群から選択される１つ以上の要素を含む化学種が開示される。いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも１つのアンカー領域、少なくとも１つの酵素認識領域、少なくとも１つの酵素不安定領域または酵素反応性領域、および少なくとも１つの指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域を介して支持材料に結合する。いくつかの実施形態では、化学種は、指標コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも１つの酵素不安定領域または酵素反応性領域、少なくとも１つの酵素認識領域、および少なくとも１つの指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも１つのアンカー領域と、少なくとも１つの指標領域とを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、酵素認識領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、および指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域、酵素認識領域、および酵素不安定領域または酵素反応性領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、酵素認識領域、アンカー領域、および２つの酵素不安定領域または酵素反応性領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、酵素認識領域、アンカー領域、２つの酵素不安定領域または酵素反応性領域、および２つの指標領域を含む。いくつかの実施形態では、化学種は、酵素認識領域、２つの酵素不安定領域または酵素反応性領域、および２つの指標領域を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアンカー領域と、１つ以上の酵素不安定領域または酵素反応性領域とは、互いに部分的に重なっている。いくつかの実施形態では、アンカー領域と、酵素認識領域または酵素不安定領域もしくは酵素反応性領域とは、部分的または完全に互いに重複する。いくつかの実施形態では、酵素認識領域と酵素不安定領域または酵素反応性領域とは、部分的または完全に互いに重複する。いくつかの実施形態では、１つ以上のアンカー領域は、１つ以上の酵素不安定領域または酵素反応性領域内にある。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、酵素不安定領域または酵素反応性領域の中にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の酵素不安定領域または酵素反応性領域は、１つ以上のアンカー領域内にある。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アンカー領域の中にある。
【００２９】
いくつかの実施形態では、化学種のアンカー領域は、化学種を支持材料に結合する。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、イオン性化学基を含む。いくつかの実施形態では、イオン性化学基は、支持材料とイオン結合を形成する。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、疎水性部分を含む。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、支持材料と相互作用し、化学種を支持材料に結合する。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、親水性部分を含む。いくつかの実施形態では、親水性部分は、支持材料と相互作用し、化学種を支持材料に結合する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、アンカー領域は、ビーズ、ポリマー、イオン性化学基を有する物質、親水性部分を有する物質、または疎水性部分を有する物質である。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、ビーズである。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、ポリマーである。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、イオン性化学基を有する物質であり、イオン性化学基は、正に帯電している。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、イオン性化学基を有する物質であり、イオン性化学基は、負に帯電している。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、親水性部分を有する物質である。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、脂肪族鎖または脂肪族アルコールなどの疎水性部分を有する物質である。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、光活性フェニルアジドまたはエポキシド基などの支持材料への共有結合のための反応性部分を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、アンカー領域は、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能な反応性基、またはペプチドグリカン誘導体、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、短時間のＵＶ照射の後に支持材料に結合する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、エラスターゼ、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ、白血球ペルオキシダーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ、酸性セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）およびプロテイナーゼ−３、β−ラクタマーゼ、および他の類似の酵素、またはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の標的酵素と反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、エラスターゼと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、リゾチームと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、カテプシンＧと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ミエロペルオキシダーゼと反応する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、エラスターゼまたはカテプシンＧに対して不安定なペプチド、ペプチド模倣物またはタンパク質、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、エラスターゼに対して不安定なペプチド、ペプチド模倣物またはタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、カテプシンＧに対して不安定なペプチド、ペプチド模倣物またはタンパク質を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、エラスターゼに対して不安定なペプチドを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、独立して０より大きな整数であるか、または各ｙは、独立して１〜５０の整数であるか、または各ｙは、独立して１〜１０の整数であるか、または各ｙは、独立して１〜６の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分であり；ペプチドは、エラスターゼに対して不安定である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸がｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、独立して０より大きな整数であるか、または各ｙは、独立して１〜５０の整数であるか、または各ｙは、独立して１〜１０の整数であるか、または各ｙは、独立して１〜６の整数であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分であり；ペプチドは、エラスターゼに対して不安定である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸がｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり、または各ｙは、独立して１〜１０の整数であるか、または各ｙは、独立して１〜６の整数であり、Ｌは、連結部分であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分であり；ペプチドは、エラスターゼに対して不安定である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸がｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；または、各ｙは、独立して１〜１０の整数であり、または、各ｙは、独立して１〜６の整数であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分であり；ペプチドは、エラスターゼに対して不安定である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸がｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；または、各ｙは、独立して１〜１０の整数であり、または、各ｙは、独立して１〜６の整数であり、Ｕは、アルギニン、リシン、グリシンまたはアラニンから選択されるアミノ酸を表し、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＵＵＵＵＵＵｙ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、各ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；または、各ｙは、独立して１〜１０の整数であり、または、各ｙは、独立して１〜６の整数であり、Ｕは、ＬＥＶＬＦＱから選択されるアミノ酸を表し、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、カテプシンＧに対して不安定なペプチドを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり；各ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；Ｌは、連結部分であり、Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分であり；ペプチドは、カテプシンＧに対して不安定である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸がｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり；各ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；Ｚは、目に見える色変化または検出可能な電子的な変化を引き起こすことができる部分であり；ペプチドは、カテプシンＧに対して不安定である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸がｆｍｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシル、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、または金コロイド粒子である。いくつかの実施形態では、Ｚは、ペルオキシダーゼ基質である。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンジジン、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、インドキシル、インジゴ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンから選択される。いくつかの実施形態では、Ｚは、アリールアミンである。いくつかの実施形態では、Ｚは、アミノフェノールである。いくつかの実施形態では、Ｚは、アミノフェノールエーテルである。いくつかの実施形態では、Ｚは、インドキシルである。いくつかの実施形態では、Ｚは、中性染料である。いくつかの実施形態では、Ｚは、帯電した染料である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、またはこれらの加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、トルイジンブルーである。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性ブラック５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性バイオレット５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性オレンジ１６、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０などである。いくつかの実施形態では、ジクロロトリアジン系の反応性染料は、黒く見える。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｚは、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含む反応性染料である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５または反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、レマゾールブリリアントブルーである。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルーまたは反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５またはレマゾールブリリアントブルーである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、Ｚは、金コロイド粒子である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ｚは、帯電した染料、インドール誘導体またはルミノール誘導体である。いくつかの実施形態では、Ｚは、インドール誘導体である。いくつかの実施形態では、Ｚは、ルミノール誘導体である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、リゾチームと反応する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペプチドグリカンを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、βラクタムである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、フェノール、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシルまたはキノンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、フェノールを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノフェノールを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノフェノールエーテルを含む。いくつかの実施形態では、酵素標識または酵素反応性領域は、インドキシルを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、キノンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ミエロペルオキシダーゼと反応するが、ヘムと反応しない。
【００５１】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、または金コロイド粒子を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペルオキシダーゼ基質を含む。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンジジン、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）および４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、Ｎ−（２−ヒドロキシ）テトラ−デシル−Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲから選択される。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アリールアミンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノフェノールを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、中性染料を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、帯電した染料を含む。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、またはこれらそれぞれの加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、トルイジンブルーである。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性ブラック５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性バイオレット５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性オレンジ１６、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、金コロイド粒子である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、帯電した染料、インドール誘導体またはルミノール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、インドール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ルミノール誘導体を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、指標領域は、通常の周囲照明において目に見える色変化を示す染料を含む。いくつかの実施形態では、染料は、一般に、赤色、黄色または茶色である創傷産物と対照的な色を有する。さらなる実施形態では、染料は、バイオレット、ブルーまたはダークグリーンである。いくつかの実施形態では、染料は、バイオレットである。いくつかの実施形態では、染料は、ブルーである。いくつかの実施形態では、染料は、ダークグリーンである。いくつかの実施形態では、染料は低分子量であり、帯電しており、反応性または連結可能な基を含み、ガンマ線照射に対して安定であり、深く着色している。いくつかの実施形態では、染料は、シブラクロン系染料、アゾ染料およびレマゾール染料、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、シブラクロン（ｃｉｂｒａｃｒｏｎ）系染料から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、アゾ染料から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、レマゾール染料、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、ローダミン、クマリン、シアニン、キサンテン、ポリメチン、ピレン、ジピロメテンホウ素ジフルオリド、ナフタルイミド、フィコビリタンパク質、ペリジニウムクロロフィルタンパク質、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｒｅｄ、ｉＦｌｕｏｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン  ６Ｆ、カルボキシロドール、カルボキシローダミン１１０、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、フィコエリスリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（および−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７−アミノ−４−メチルクマ���ン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲおよびジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、またはこれらのコンジュゲート、またはこれらの組み合わせから選択される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、指標領域は、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０を含む。いくつかの実施形態では、ジクロロトリアジン系の反応性染料は、黒く見える。
【００５７】
いくつかの実施形態では、指標領域は、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含む反応性染料の反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５または反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、レマゾールブリリアントブルーである。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルーまたは反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５またはレマゾールブリリアントブルーである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、指標領域は、通常の周囲照明において色変化を示す粒子（例えば、コロイド状金属または量子ドット）を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、金コロイド粒子を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、指標領域は、ＵＶ光の下で目に見える色変化を示す染料を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、蛍光である染料を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、発光である染料を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、指標領域は、酵素反応性部分を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して肉眼で見えるか、または電子的手段によって検出可能な生成物を生成する。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して肉眼で見える生成物を生成する。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して、電子的手段によって検出可能な生成物を生成する。いくつかの実施形態では、指標領域は、インジゴを産生するために、使用される末端糖に依存して、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼまたはガラクトシダーゼによって開裂するインドキシルグリコシドまたはガラクトシドを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、補助酵素によって酸化されて可視生成物を生成するフェノールまたはナフトールを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、ペルオキシダーゼによって酸化されて可視生成物を生成するフェノールを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、電子的手段によって検出可能なメタロモチーフを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、電子的手段によって検出可能なフェロセンまたはフェロセン類似体を含む。いくつかの実施形態では、補助酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、およびグルコシダーゼから選択される。いくつかの実施形態では、補助酵素は創傷液に存在しない。いくつかの実施形態では、補助酵素が創傷液中に存在する。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して、ＵＶ光の下で見える生成物を生成する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも１つのアンカー領域、少なくとも１つの酵素不安定領域または酵素反応性領域、および少なくとも１つの指標領域から本質的になる。いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも１つの酵素不安定領域または酵素反応性領域および少なくとも１つの指標領域から本質的になる。いくつかの実施形態では、化学種は、少なくとも１つのアンカー領域および少なくとも１つの酵素不安定領域または酵素反応性領域から本質的になる。いくつかの実施形態では、化学種は、アンカー領域なしで支持材料に結合することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中に印刷される。いくつかの実施形態では、レポーター種または化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、全ての方向に同様の毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中に化学結合される。いくつかの実施形態では、化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中にイオン結合される。いくつかの実施形態では、化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中に共有結合される。支持材料には、セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリアクリレートおよび繊維として有用な他の同様のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、支持材料は、セルロースである。いくつかの実施形態では、支持材料は、ポリアミドである。いくつかの実施形態では、支持材料は、ポリエステルである。いくつかの実施形態では、支持材料は、ポリアクリレートである。
【００６３】
いくつかの例では、創傷のｐＨは、血管新生、プロテアーゼ活性、酸素放出、および細菌毒性のような創傷治癒の多くの因子に影響し得る。慢性的な治癒していない創傷は、上昇したアルカリ性環境を有している場合がある。創傷が治癒に向かうにつれて、創傷のｐＨは中性に移行し、次いで酸性になる。創傷のｐＨのモニタリングは、創傷の状態（例えば、感染または感染なし）を評価し、処置に対する創傷の応答を決定するのを助ける方法を提供し得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性部分は、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッド、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、または他のスルホフタレイン染料である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＭＰＯ応答性指標には、分子量が４５９Ｄａより大きいアルキルアニリンアミドが組み込まれている。好ましい実施形態では、この指標は、以下の構造を有する。
【化１】
2019512556.tif 000003
式中、
Ｒ１＝−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
Ｘ＝−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−
Ｒ２＝限定されないが、以下のものであってもよい。
−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールおよびアルキルヘテロアリール基は、フェロセン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、−ＮＲ４Ｒ５、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＮＨＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｒ４Ｒ５ＮＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）−から独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよく、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、限定されないが、以下のものであってもよい。
−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル
−（Ｃ１−Ｃ１２）アルケニル
−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキニル
−（Ｃ１−Ｃ８）［（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ］アルキル
−（Ｃ１−Ｃ８）［（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ］アルケニル
−（Ｃ６−Ｃ１０）アリール−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル
−（Ｃ２−Ｃ９）ヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシから独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよく、
またはＮ（Ｒ４Ｒ５）は、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパンまたはアゾカン、１−置換ピペラジン、またはモルホリン部分であり、
Ｙ＝−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−であり、
Ｒ３は、限定されないが、以下のものであってもよい。
−Ｃ６−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールおよびアルキルヘテロアリール基は、フェロセン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、シアノ（−ＣＮ）、アジド（−Ｎ３）、−ＮＲ４Ｒ５、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＮＨＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｒ４Ｒ５ＮＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）−から独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、指標基質が適所に留まり、適所で反応することが望ましい。従って、水系において溶解度が限られていることが好ましい。固相上に適所に留まる能力は、耐水性として定義され、その測定に使用される手段は実施例１１４に記録されている。好ましい実施形態では、基質の耐水性は１より大きく、さらにより好ましい実施形態では、２より大きい。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、以下の式（式Ｄ）の化合物である。
【化２】
2019512556.tif 000004
（式Ｄ）
式中、
Ｒ１＝−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
Ｘ＝−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−
Ｒ２＝限定されないが、以下のものであってもよい。−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール；ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールおよびアルキルヘテロアリール基は、フェロセン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、−ＮＲ４Ｒ５、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＮＨＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｒ４Ｒ５ＮＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）−から独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよく、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、限定されないが、以下のものであってもよい。−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキル、−（Ｃ１−Ｃ１２）アルケニル、−（Ｃ１−Ｃ１２）アルキニル、−（Ｃ１−Ｃ８）［（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ］アルキル、−（Ｃ１−Ｃ８）［（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ］アルケニル、−（Ｃ６−Ｃ１０）アリール−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、−（Ｃ２−Ｃ９）ヘテロアリール−（Ｃ１−Ｃ５）アルキル；ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびヘテロアリールは、場合により、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシから独立して選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよく、またはＮ（Ｒ４Ｒ５）は、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパンまたはアゾカン、１−置換ピペリジンまたはモルホリン部分であり；Ｙ＝−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−であり、
Ｒ３は、限定されないが、以下のものであってもよい。−Ｃ６−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール；ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールおよびアルキルヘテロアリール基は、フェロセン、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり得る）、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキニル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ６−Ｃ１０）アリール、（Ｃ１−Ｃ９）ヘテロアリール、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、シアノ（−ＣＮ）、アジド（−Ｎ３）、−ＮＲ４Ｒ５、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、Ｒ４ＮＨＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｒ４Ｒ５ＮＣ（＝Ｏ）−、Ｒ４ＯＣ（＝Ｏ）−から独立して選択される１〜５個の置換基で場合により置換されていてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、以下の式（式Ａ）の化合物である。
【化３】
2019512556.tif 000005
（式Ａ）
式中、
Ｙは、ＯまたはＮであり、
Ａｒは、
【化４】
2019512556.tif 000006
またはフェロセンであり；
Ｒは、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールまたはアルキルヘテロアリールであり；
αは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、またはＬであり；
βは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｒ、Ｌ、［１｝または｛２］Ｇであり；
γは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、またはＧであり；
δは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、またはＶであり；
εは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、ＶまたはＥであり；
φは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、またはＧであり；
β、γ、δ、εおよびφがそれぞれ結合である場合、αのＮ末端は、Ｘに結合し；
Ｘは、０〜１４個のアミノ酸を含むペプチド鎖であり；
ＰＧが、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ１であり、ここで、Ｒ１が、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、ｔ−ブチルまたはメチルフルオレニルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２であり、ここで、Ｒ２は、−Ｃ１−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールまたはアルキルヘテロアリールである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、以下の式（式Ｂ）の化合物である。
【化５】
2019512556.tif 000007
（式Ｂ）
式中、
Ｌは、Ａ、ＡＡ、Ｖまたはトリアゾリルであり、
Ｚは、フェロセン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９または反応性ブラウン１０であり、
αは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、ＲまたはＬから選択され、
βは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり、
γは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり、
δは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、ＧまたはＶであり、
εは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、ＶまたはＥであり、
φは、結合であるか、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、ＬまたはＧであり、
β、γ、δ、εおよびφがそれぞれ結合である場合、αのＮ末端は、Ｘに結合し；
Ｘは０〜１４個のＡＡを含むペプチド鎖であり、ＡＡは、アミノ酸、ポリアミンまたはポリオキシアルキレンであり；
ＰＧは、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能基、フェノールアジド、エポキシド、ペプチドグリカン、脂肪族鎖、脂肪族アルコール鎖、脂肪族アミン、メルカプトエチル、多環式または多芳香族環系、親油性基、またはそれらの組み合わせ、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ１であり、Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ３０アルキル、ｔ−ブチル、メチルフルオレニル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ２であり、Ｒ２は、−Ｃ１−Ｃ３０アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリールまたはアルキルヘテロアリールである。
【００７０】
一般に、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、ここで、
一実施形態では、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｌから選択され、
ｂは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｅは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、Ｖ、Ｅから選択され、
ｆは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択される。
【００７１】
別の実施形態では、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、ここで、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｌから選択され、
ｂは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｅは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｅから選択され、
ｆは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択される。
【００７２】
別の実施形態では、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、ここで、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｌから選択され、
ｂは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｅは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｅから選択され、
ｆは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択される。
【００７３】
別の実施形態では、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、ここで、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇから選択され、
ｂは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａ、Ｇから選択され、
ｇは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ａ、Ｇから選択され、
ｅは、アミノ酸なし、または独立して、Ａ、Ｇ、Ｖから選択され、
ｆは、アミノ酸なし、または独立して、Ａ、Ｇから選択される。
【００７４】
特に、別の実施形態では、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、ここで、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆから選択され、
ｂは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａから選択され、
ｇは、アミノ酸なし、または独立して、Ａ、Ｇから選択され、
ｄは、アミノ酸なし、または独立して、Ａ、Ｇから選択され、
ｅは、アミノ酸なし、または独立して、Ａ、Ｇから選択され、
ｆは、アミノ酸なし、または独立して、Ａ、Ｇから選択される。
【００７５】
好ましくは、エラスターゼ基質は、式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆを有し、ここで、
ａは、Ａ、Ｖ、Ｆから選択され、
ｂは、アミノ酸なし、または独立して、Ｐ、Ｆ、Ａから選択され、
ｇは、アミノ酸なし、または独立して、Ａから選択され、
ｄは、アミノ酸なし、または独立して、Ａから選択され、
ｅは、アミノ酸なし、または独立して、Ａから選択され、
ｆは、アミノ酸なし、または独立して、Ａから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、本明細書に開示される化合物の例示的な実施形態を示す。
【図２】図２は、ＭＰＯおよびエラスターゼに対して複数の反応を必要とする、本明細書に開示される化合物の例示的な実施形態を示す（例えば、実施例９、メチル−３−Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−アミド−４−アミノフェノールまたはメチル−３−アミノ−４−Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−アミドベンゾエート）。
【図３Ａ】図３Ａは、エラスターゼに対して複数の反応を必要とする、本明細書に開示される化合物の例示的な実施形態を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、エラスターゼに対して複数の反応を必要とする、本明細書に開示される化合物の例示的な実施形態を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、エラスターゼ基質に対して、アンカーの重複する機能が示されている、エラスターゼに対して反応を必要とする、本明細書に開示される化合物の例示的な実施形態を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＭＰＯ基質に対して、指標および反応性領域の重複する機能が示されている、ＭＰＯに対して反応を必要とする、本明細書に開示される化合物の例示的な実施形態を示す。
【図５】図５は、インドキシルエーテルを含むβ−ラクタマーゼ基質に対する合成経路を示す。
【図６】図６は、インドキシル発色団を含むエステラーゼおよびリパーゼの基質を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例１０３および１０４の方法によって作られる、Ｘ−Ｇａｌ、Ｘ−Ｇｌｕｃペプチドグリカンおよびキトサンの付加物を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例１０３および１０４の方法によって作られる、Ｘ−Ｍａｎ、ペプチドグリカンおよびキトサンの付加物を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、実施例１０３のスズキ生成物による、ペプチドグリカン、キトサンまたはペプチドに接続したインドキシル発色団を含むエステラーゼ基質を示す。
【図８】図８は、ペプチドグリカンのカルボキシメチル化、次いで誘導体化のためのスキームを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、目的の臓器から発する組織または体液における感染の検出に使用するための指標基質を含むチューブを示す。チューブは、ＰＶＣ材料であり、そこに、実施例１８からの基質により印刷された不織布が挿入されている。
【図９Ｂ】図９Ｂは、１つ以上の基質（例えば、実施例１０または１８からのものと、陽性コントロール（中央）として役立つ実施例９５のもの）を含む平らな一連の濾紙を収容するように設計されたチューブのインサートを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実施例１１の基質のための担体として役立つポリオレフィン製内筒を含むチューブを示す。この材料は、中空シリンダーのライニングとして機能する（右）。
【図９Ｄ】図９Ｄは、例示的な形態でのＰＶＣチューブに対する中空ライニングの適合を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例１０および１８からの指標基質を含むスティックを使用して、創傷の陰圧治療から得られた流体の反応を検出することができることを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、同じスティック形態を使用して気道または痰の吸引物をモニタリングし、初期感染を検出することができることを示す。この画像では、エラスターゼまたはＭＰＯに対する応答のためのスティックの較正が示されている。
【図１１】図１１は、カルボキシフェロセンペプチドグリカンコンジュゲートを製造するためのスキームを示す。
【図１２】図１２は、実施例１０の生成物およびＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲの硫酸塩を示す。
【図１３】図１３は、ＭＰＯの反応生成物、実施例１０の生成物およびＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲの一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
以下、様々な態様をより詳細に説明する。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が万全かつ完全であり、その範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
【００７８】
この開示を通じて、様々な特許、特許出願および刊行物が参照されている。これらの特許、特許出願および刊行物の開示は、本開示の日付現在のその当業者に知られている最先端技術をより完全に記載するために、参照により本開示に組み込まれる。この開示は、引用された特許、特許出願及び刊行物と本開示との間に矛盾がある場合に適用される。
【００７９】
Ｉ．定義
【００８０】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値およびその記載された範囲内の他の記載または介在値は、開示内に包含されることが意図される。例えば、１ｍ〜８ｍの範囲が記載されている場合、１ｍ以上の値の範囲と、８ｍ以下の値の範囲だけではなく、２ｍ、３ｍ、４ｍ、５ｍ、６ｍおよび７ｍは明示的に開示されていることを意図している。
【００８１】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」との言及は、単一のポリマーおよび２つ以上の同一または異なるポリマーを含み、「賦形剤」との言及は、単一の賦形剤および２つ以上の同じまたは異なる賦形剤を含む。
【００８２】
数値の直前の「約」という単語は、本開示の内容が他の意味を示していない限り、またはこのような解釈と矛盾していない限り、その値の±１０％の範囲を意味し、例えば、「約５０」は４５から５５を意味し、「約２５，０００」は、２２，５００から２７，５００などを意味する。例えば、「約４９、約５０、約５５」のような数値のリストにおいて、「約５０」は、前の値と後の値との間の間隔の半分未満に延びる範囲を意味し、例えば、４９．５〜５２．５未満を意味する。さらに、「約〜未満」の値または「約〜より大きい」値という表現は、本明細書で提供される「約」という用語の定義を考慮して理解されるべきである。
【００８３】
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ全体的に、または完全にということ、例えば、いくつかの所与の量の８０％〜９５％、またはもっと多く、例えば、重量または体積基準で、または測定される任意のパラメータの少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、またはもっと多くを意味する。「実質的に含まない」とは、いくつかの所与の量をほぼ全体的に、または完全に含まないということ、例えば、いくつかの所与の量の約１％〜約２０％に満たないレベルで存在すること、例えば、重量または体積基準で、いくつかの所与の量の１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、または測定される任意のパラメータの％に満たないことを意味する。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、医薬組成物の１〜５重量％以下のレベルでの存在を意味する。
【００８４】
ＩＩ．概説
【００８５】
本明細書では、創傷の治療および診断ならびに創傷管理のための組成物およびシステムが提供され、該組成物は、使用時に、ｉｎ  ｓｉｔｕで創傷内の上昇した酵素レベルの存在を示す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「創傷」は、組織構造の連続性または完全性の物理的破壊を指す。「創傷治癒」は、組織の完全性の回復を意味する。これは、組織完全性の部分的または完全な修復を意味し得ることが理解されるであろう。したがって、創傷の治療は、創傷治癒過程に関連する１つ以上の段階またはプロセスの促進、改善、進行、加速、または他の進歩を指す。
【００８７】
創傷は急性または慢性であり得る。圧迫の痛み、静脈脚の潰瘍および糖尿病性の足の潰瘍を含む慢性的な創傷は、単に治癒しない創傷として記述することができる。慢性創傷の正確な分子病因は完全には理解されていないが、多因子性であることは認められている。急性傷害の間の常在細胞および移動細胞の正常な応答が損なわれるとき、これらの創傷は、炎症応答が長引く、創傷細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングの欠陥および再上皮化の障害によって特徴付けられる。
【００８８】
創傷は、例えば、傷や内部潰瘍などの皮膚の外部構造的完全性が維持される任意の内部創傷、または外部創傷、特に皮膚創傷であってもよく、その結果、組織は任意の内部または外部の身体組織であってもよい。一実施形態では、組織は皮膚（例えばヒトの皮膚）であり、すなわち、創傷は真皮または表皮創傷のような皮膚創傷である。
【００８９】
ヒトの皮膚は、表皮と真皮の２つの異なる層からなり、その下には皮下組織がある。皮膚の主な機能は、外的な外傷および病原性感染、感覚および体温調節から内臓および組織を保護することである。ほとんどの哺乳動物の皮膚組織は、同様に構造化されている。
【００９０】
皮膚の最外層である表皮は厚さ約０．０４ｍｍで無血管であり、４つの細胞型（ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞およびメルケル細胞）からなり、いくつかの上皮細胞層に層別化される。表皮の最も内側の上皮層は基底膜であり、基底膜は真皮と直接接触し、表皮を真皮に固定する。皮膚に発生する全ての上皮細胞分裂は、基底膜で起こる。細胞分裂の後、上皮細胞は表皮の外表面に向かって移動する。この移動の間、細胞は角質化として知られているプロセスを受け、それによって核が失われ、細胞は丈夫で平らで耐性のある非生存細胞に形質転換される。細胞が最も外側の表皮構造である角質層、すなわち下にある組織の乾燥を防ぐのに役立つ乾燥した防水性扁平細胞層に到達すると、移動が完了する。死んだ上皮細胞のこの層は、連続的に剥がされ、基底膜から表面に移動する角化細胞によって置換される。表皮上皮は無血管であるので、基底膜はその栄養供給のために真皮に依存する。
【００９１】
真皮は、表皮に栄養を供給する高度に血管新生された組織層である。さらに、真皮は、神経終末、リンパ管、コラーゲンタンパク質および結合組織を含む。真皮は約０．５ｍｍの厚さであり、主に線維芽細胞およびマクロファージからなる。これらの細胞型は、皮膚を含む全ての動物の結合組織に見出されるタンパク質であるコラーゲンの産生および維持に大きく関与する。コラーゲンは、主に皮膚の弾力性、弾力性を担っている。コラーゲンが豊富な真皮の下に見出される皮下組織は、皮膚の移動性、断熱、カロリー貯蔵、およびその上の組織への血液を提供する。
【００９２】
創傷は、部分的な厚さの創傷または完全な厚さの創傷の２つの一般的なカテゴリーのうちの１つに分類することができる。部分的な厚さの創傷は、真皮血管に損傷を与えずに表皮および表皮に限定される。完全な厚さの創傷は、真皮の破壊を含み、真皮血管の破壊を含むより深い組織層に及ぶ。部分的な厚さの創傷の治癒は、上皮組織の単純な再生によって起こる。完全な厚さの創傷における創傷治癒はより複雑である。本明細書で企図される皮膚創傷は、部分的な厚さまたは完全な厚さの創傷のいずれかであり得る。
【００９３】
本明細書で意図される創傷には、切断および裂傷、外科的切開または創傷、穿刺、擦り傷、擦過傷、圧迫創傷、擦傷、摩擦創傷（例えばおしゃぶりによるもの、摩擦疱疹）、褥瘡潰瘍（例えば、圧迫または床ずれ）、熱による創傷（低熱源および高熱源から直接、または伝導、対流もしくは放射線、および電源のいずれかによる熱傷）、化学的創傷（例えば、酸性またはアルカリ性の火傷）または開いたおできまたは無傷のおできなどの病原性感染（例えば、ウイルス性、細菌性または真菌性）、皮膚発疹、傷、およびニキビなど、慢性創傷（下部脚および足潰瘍、静脈脚潰瘍および圧痛などの糖尿病関連創傷を含む）、皮膚移植片／移植ドナーおよびレシピエント部位、免疫応答状態例えば、乾癬および湿疹、胃または腸の潰瘍、口の潰瘍、損傷した軟骨または骨、切断傷および角膜病変を含む口腔創傷が挙げられる。
【００９４】
化学種およびその組成物
【００９５】
本明細書に記載の実施形態は、慢性創傷を診断および／または治療するために使用可能な化学種を提供する。本明細書に記載の化学種およびその組成物は、哺乳動物の創傷における１つ以上の酵素のレベルを検出する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化学種およびその組成物は、哺乳動物における慢性創傷を診断する方法に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化学種およびその組成物は、哺乳動物における感染創傷を診断する方法に使用される。他の実施形態では、本明細書に記載の化学種およびその組成物は、哺乳動物における創傷を治療する方法に使用される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の化学種およびその組成物は、哺乳動物における感染創傷または慢性創傷を治療する方法に使用される。
【００９６】
他の実施形態では、本明細書に記載の化学種および組成物は、微生物に特異的な１種類以上のバイオマーカーの検出に基づいて、１つ以上の病原性微生物、例えば細菌またはウイルスを診断するために使用され得る。
【００９７】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、体液から酵素活性を検出することができる化学種であって、この化学種は、アンカー領域（Ａ）と、酵素認識部位（Ｒ）と、指標領域（Ｉ）を含む。この実施形態の下では、化学種は、基本化学構造Ａ−Ｒ−Ｉ（式Ｉ）を有し、Ａはアンカー領域であり；Ｒは酵素認識部位であり、Ｉは指標領域である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、アンカー領域（Ａ）は、酵素認識部位（Ｒ）を介し、指標領域（Ｉ）と会合する。この実施形態の下で、酵素認識部位は、酵素に結合することができる構造またはモチーフである。
【００９９】
一実施形態では、酵素認識部位（Ｒ）は天然で、アンカー領域に存在する。酵素によるアンカー領域の骨格の開裂は、フラグメントの動員を引き起こし、フラグメントは、酵素の基質となり得る。
【０１００】
別の実施形態では、酵素認識部位（Ｒ）は、化学修飾を介してアンカー領域（Ａ）に導入される。または、酵素認識部位（Ｒ）は、指標領域（Ｉ）中に天然に存在してもよく、または指標領域（Ｉ）に１つ以上の化学修飾を介して合成的に導入されてもよい。
【０１０１】
一実施形態では、式Ｉの化学種は、指標（Ｉ）と共有結合または非共有結合したアンカー（Ａ）を含み、この場合、認識部位（Ｒ）は、会合部分に配置されていてもよい（例えば、共有結合を介して）。当分野で理解されているように、共有結合は、結合した原子間での電子の共有を含む。対照的に、非共有結合は、例えば、イオン相互作用、静電相互作用、水素結合相互作用、物理化学的相互作用、ファンデルワールス力、ルイス酸／ルイス塩基相互作用、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１０２】
一実施形態では、アンカーＡは、認識部位Ｒを形成するために、共有結合相互作用を介して指標Ｉと会合する。別の実施形態では、アンカーＡは、認識部位Ｒの一部ではない共有結合を介して、指標Ｉと会合する。第２の実施形態の下では、Ｒ全体で指標分子の部分を構成してもよく、指標領域が会合する別個のモチーフまたは部分を構成してもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、化学種は、酵素不安定領域または酵素反応性領域をさらに含む。
【０１０４】
一実施形態では、認識部位（Ｒ）は、リパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の標的酵素と相互作用する。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ、酸セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エラスターゼ、カテプシンおよびプロテイナーゼ−３エラスターゼ、リゾチーム、エステラーゼ、リパーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される１つ以上の標的酵素と相互作用する。
【０１０５】
アンカー領域（Ａ）
【０１０６】
式Ｉの化学種のいくつかの実施形態では、アンカー領域は、多糖、セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ペプチドグリカン、またはキトサン、またはそのモノマー、それらのオリゴマー、それらの誘導体、混合物または組み合わせである化合物を含む。
【０１０７】
一実施形態では、アンカーＡは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、Ｄ−ガラクトピラノシド、またはそれらの誘導体から選択される多糖類を含む。
【０１０８】
一実施形態では、アンカーＡは、ペプチドグリカンまたはそのモノマー、そのオリゴマー、その誘導体、それらの混合物または組み合わせを含む。当業界で理解されているように、ペプチドグリカン（ムレインとも呼ばれる）は、ほとんどの細菌の原形質膜の外側に網目状の層を形成し、例えば細菌の細胞壁を形成する糖およびアミノ酸からなるポリマーである。糖要素は、β−（１，４）結合したＮ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルムラミン酸の交互残基からなる。Ｎ−アセチルムラミン酸には、３〜５個のアミノ酸のペプチド鎖が結合している。ペプチド鎖は、３Ｄ網目状の層を形成する別の鎖のペプチド鎖に架橋することができる。
【０１０９】
したがって、一実施形態では、ペプチドグリカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＮＡＧ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃまたはＮＡＭ）またはそれらの組み合わせから選択される交互アミノ糖の少なくとも２単位、少なくとも３単位、少なくとも４単位、少なくとも５単位、またはもっと多くの単位を含んでいてもよい。より短いフラグメントを含むペプチドグリカンは、天然源または合成源から生成され得る。Ｌｅｅら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．、１１（１８）：２５２５−９、２０１０を参照。
【０１１０】
別の実施形態では、アンカーＡは、ペプチドグリカンまたは多糖誘導体を含む。ペプチドグリカンの例としては、ペプチドグリカン塩、水溶性ペプチドグリカン、カルボキシル化ペプチドグリカンなどが挙げられる。このような誘導体の代表例としては、例えば、場合により１つ以上のハロゲン、アルコール、エステルまたはアミド基を含む、カルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル基を含むペプチドグリカンが挙げられる。他の特定の例には、１つ以上の塩素基を含むハロゲン化ペプチドグリカンが含まれる。可溶性ペプチドグリカンおよびＮｏｃａｒｄｉａｅの細菌または細菌壁に由来するペプチドグリカンの可溶性フラグメントを含む画分は、米国特許第５，０１７，３５９号に記載されている。
【０１１１】
多糖誘導体としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ＣＭＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルヒドロキシエチルセルロース（ＨＰＨＥＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、メチルヒドロキシプロピルセルロース（ＭＨＰＣ）、メチルヒドロキシエチルセルロース（ＭＨＥＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣ−ＡＳ）、疎水性に改質されたヒドロキシエチルセルロース（ｈｍＨＥＣ）、疎水性に改質されたヒドロキシプロピルセルロース（ｈｍＨＰＣ）、疎水性に改質されたエチルヒドロキシエチルセルロース（ｈｍＥＨＥＣ）、疎水性に改質されたカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース（ｈｍＣＭＨＥＣ）、疎水性に改質されたヒドロキシプロピルヒドロキシエチルセルロース（ｈｍＨＰＨＥＣ）、疎水性に改質されたメチルセルロース（ｈｍＭＣ）、疎水性に改質されたメチルヒドロキシプロピルセルロース（ｈｍＭＨＰＣ）、疎水性に改質されたメチルヒドロキシエチルセルロース（ｈｍＭＨＥＣ）、疎水性に改質されたカルボキシメチルメチルセルロース（ｈｍＣＭＭＣ）、スルホエチルセルロース（ＳＥＣ）、ヒドロキシエチルスルホエチルセルロース（ＨＥＳＥＣ）、ヒドロキシプロピルスルホエチルセルロース（ＨＰＳＥＣ）、メチルヒドロキシエチルスルホエチルセルロース（ＭＨＥＳＥＣ）、メチルヒドロキシプロピルスルホエチルセルロース（ＭＨＰＳＥＣ）、ヒドロキシエチルヒドロキシプロピルスルホエチルセルロース（ＨＥＨＰＳＥＣ）、カルボキシメチルスルホエチルセルロース（ＣＭＳＥＣ）、疎水性に改質されたスルホエチルセルロース（ｈｍＳＥＣ）、疎水性に改質されたヒドロキシエチルスルホエチルセルロース（ｈｍＨＥＳＥＣ）、疎水性に改質されたヒドロキシプロピルスルホエチルセルロース（ｈｍＨＰＳＥＣ）または疎水性に改質されたヒドロキシエチルヒドロキシプロピルスルホエチルセルロース（ｈｍＨＥＨＰＳＥＣ）が挙げられる。特に好ましいセルロース誘導体は、例えば、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースなど、水中での熱凝集点を有するセルロースエーテルである。米国特許第８，４６５，５８６号を参照されたい。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書で使用される「ペプチドグリカン誘導体」および「多糖誘導体」は、ペプチドグリカンまたは多糖の塩、アミド、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物またはプロドラッグを含む。そのような誘導体は、そのような誘導体化のための公知の方法を用いて当業者によって容易に調製され得る。特定の実施形態では、誘導体は、実質的な毒性作用を伴わずに動物またはヒトに投与することができ、薬学的に活性であるか、またはプロドラッグである。
【０１１３】
別の実施形態では、誘導体は、ペプチドグリカンまたは多糖化合物の塩、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋またはＢａ２＋であり、好ましくは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋である。帯電したペプチドグリカンまたはナトリウムまたはカルシウム塩などの多糖類の塩は、この定義に含まれる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、誘導体アンカー化合物は、ハロゲン化アンカー化合物、例えばハロゲン化多糖類、ハロゲン化ペプチドグリカン、ハロゲン化ポリアクリレート、ハロゲン化ポリエチレンイミン、ハロゲン化ポリアクリルアミド、ハロゲン化ペプチドグリカンまたはハロゲン化キトサン、またはこれらのモノマー、例えば、ハロゲン化Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＮＡＧ）および／またはハロゲン化Ｎ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃまたはＮＡＭ）である。ハロゲンは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択され、特に、ハロゲンはＣｌである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、誘導体化合物は、アンカー化合物の異性体である。用語「異性体」には、同じ式を有するが、分子中の原子の配置が異なる化合物が含まれる。複数の実施形態では、化合物の異性体は、化合物の「互変異性体」または「立体異性体」である。「立体異性体」という用語は、１つ以上の立体中心のキラリティーが異なる化合物を指す。立体異性体としては、エナンチオマーおよびジアステレオマーが挙げられる。用語「互変異性体」は、エノール−ケトおよびイミン−エナミン互変異性体などのプロトンの位置またはアンカー化合物の互変異性形態が異なる化合物の代替形態を指す。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、アンカー化合物は、１つ以上の前述の化合物の組み合わせまたは混合物を含むことができる。「組み合わせ」という用語には、１つより多くの要素を含有する化合物が含まれ、これらは互いにコンジュゲートしていてもよく、またはコンジュゲートしていなくてもよい。一実施形態では、アンカー化合物は、例えば共有結合または非共有結合相互作用を介して、互いにコンジュゲート化された１つ以上の前述の化合物の組み合わせを含む。特定の例として、アンカーは、キトサンおよびペプチドグリカンの組み合わせを含み得る。米国特許出願公開第２００７／０１６７４００号を参照されたい。別の実施形態では、混合物は、ペプチドグリカンと多糖の混合物の市販の調製物を含み得る（ＰＧ／ＰＳ；Ｌｅｅ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｒａｙｓｏｎ、ＧＡ；米国特許第８，１２９，５１８号を参照）。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、化合物は、上述の高分子化合物の混合物を含む。用語「混合物」は、それらが個々の特性を失う反応が発生しない、２つ以上の物質の混合物を指す。例えば、化合物Ａと化合物Ｂとの混合物は、化合物Ａと化合物Ｂの任意の重量比を含むことができ、混合物の総重量は、１００％に対する量であり、例えば、９９：１の化合物Ａ／化合物Ｂの重量比、または１：９９の化合物Ａ／化合物Ｂの重量比であろう。典型的な混合物は、上述の高分子化合物を約２種類、３種類、４種類、５種類またはもっと多く含むことができる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、アンカーＡは、イオン性化学基、親水性部分を有する物質、または疎水性部分を有する物質、例えば、脂肪族鎖または脂肪族アルコールをさらに含む。アンカーがイオン性化学基を含むいくつかの実施形態では、イオン性化学基は、正に帯電していてもよく、または負に帯電していてもよい。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、光活性フェニルアジドまたはエポキシド基などの支持材料への共有結合のための反応性部分を含む。米国特許出願公開第２０１６／０１５９７７７号を参照されたい。
【０１１９】
ペプチドグリカンおよび／または多糖類、セルロース、グリカンなどの他のグリコシド化合物に反応性基を導入する方法は、当技術分野で公知である。米国特許出願公開第２００５／０１１２６１号を参照されたい。
【０１２０】
指標
【０１２１】
いくつかの実施形態では、化学種は、１つ以上の指標、例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれ以上の指標を含む。そのような組成物は、例えば、同じゲルポリマーまたは異なるゲルポリマーにコンジュゲートした複数の基質を含み得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、指標は、標識化されている。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、エピトープ結合剤または他の基質物質に付着した任意の物質を指し、その物質は、検出方法によって検出可能である。適切な標識の非限定的な例としては、発光分子、化学発光分子、蛍光染料、蛍光消光剤、着色分子、放射性同位体、シンチラント、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体またはそのフラグメント、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属および酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼを含む）が挙げられる。アンカー化合物に標識を結合する方法は、実施例に記載されている。
【０１２３】
特定の実施形態では、指標は、検出可能な標識である標識を用い、標識化される。検出可能な標識は、その存在を直接的または間接的に確認することができる部分である。一般に、標識の検出は、例えばエネルギーの放出のような検出可能なシグナルの生成を含む。標識は、化学的、ペプチド的または核酸的性質のものであってもよいが、これに限定されるものではない。使用される標識の性質は、実施される分析の性質、使用されるエネルギー源および検出器の種類、ポリマー、検体、プローブおよび一次検体および二次検体に特異的な結合パートナーの種類を含む、様々な要因に依存する。
【０１２４】
特定の実施形態では、標識は、それが結合する構成要素、例えばアンカー領域と立体的に、および化学的に適合する。特に、標識は、酵素認識部位（Ｓ）および／または酵素反応性領域（Ｒ）を妨害しない形状および大きさである。
【０１２５】
別の実施形態では、アンカーに結合した指標またはそのモチーフは、リパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、ラクタマーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼまたはこれらの組み合わせの基質である。
【０１２６】
一実施形態では、アンカーに結合した指標またはそのモチーフは、プロテアーゼの基質である。特に、アンカーに結合した指標またはそのモチーフは、エラスターゼの基質である。
【０１２７】
別の実施形態では、アンカーに結合した指標またはそのモチーフは、エラスターゼ、カテプシンＧ、プロテアーゼ３Ｃまたはミエロペルオキシダーゼ（ＭＡＯ）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。
【０１２８】
別の実施形態では、アンカーに結合した指標またはそのモチーフは、リゾチームであるグルコシダーゼ、エラスターゼ、カテプシンＧまたはミエロペルオキシダーゼ（ＭＡＯ）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるプロテアーゼの基質である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ、酸セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エラスターゼ、カテプシンおよびプロテイナーゼ−３Ｃから選択される１つ以上の標的酵素と相互作用する。
【０１３０】
一実施形態では、アンカーに結合した指標（Ｉ）またはそのモチーフは、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシル、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、または金コロイド粒子である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、アンカーに結合した指標（Ｉ）またはそのモチーフは、ペルオキシダーゼ基質である。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２−イノフェノール、ＡＢＴＳ（ｓｔｒａｔｅから選択される。いくつかの実施形態では、酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンジジン、３，４−ジアミノ安息香酸、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、インドキシル、インジゴ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンから選択される。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、アリールアミンである。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、アミノフェノールである。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、アミノフェノールエーテルである。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、インドキシルである。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、中性染料である。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、帯電した染料である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、またはこれらの加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、トルイジンブルーである。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性ブラック５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性バイオレット５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性オレンジ１６、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０である。いくつかの実施形態では、ジクロロトリアジン系の反応性染料は、黒く見える。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含む反応性染料である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５または反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、レマゾールブリリアントブルーである。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルーまたは反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５またはレマゾールブリリアントブルーである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、金コロイド粒子である。いくつかの実施形態では、指標（Ｉ）またはそれに結合する標識は、帯電した染料、インドール誘導体またはルミノール誘導体である。
【０１３４】
特に、アンカーに結合した指標またはそのモチーフは、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含む染料、例えば、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５または反応性オレンジ１６、またはこれらの組み合わせを含むか、またはジクロロトリアジン反応性基を含有する染料、例えば，反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１３５】
アンカー−指標のコンジュゲート
【０１３６】
種々の酵素において、アンカーＡは、例えばグリコシド結合を介し、指標Ｉと直接的にコンジュゲートされる。コンジュゲートのアンカー部分は、例えば、ペプチドグリカンまたはキトサンまたは多糖からなる群から選択され、指標Ｉは、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含有する染料またはジクロロトリアジン反応性基を含有する染料からなる群から選択される。
【０１３７】
マーカー
【０１３８】
本明細書に記載の実施形態は、慢性創傷または感染創傷に存在する様々な生物学的マーカーについてアッセイする化学部分を利用することができる。一実施形態では、マーカーは、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、およびペルオキシダーゼからなる群から選択される酵素である創傷特異的マーカーである。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「創傷特異的酵素」は、創傷において差異のある状態で発現される酵素である。「発現差異」とは、酵素のレベルまたは活性が他の部位、例えば正常組織または周囲組織と比較して、創傷微小環境においてより高いか、または低いことを意味する。特に、発現差異は、正常または未損傷組織と比較して、創傷微小環境における酵素の発現または活性のより高いレベルを意味する。酵素の発現差異は、慣例的手段によって分析することができる。例えば、サンプル中の酵素のレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他のイムノアッセイによって分析することができる。酵素の活性は、例えば質量分析またはＨＰＬＣを用いて、基質の損失速度および／または生成物の形成速度を測定することによって分析することができる。このような技術は当該分野で公知であり、実施例の章に記載されている。
【０１４０】
一実施形態では、マーカーは、ヒドロラーゼである。本明細書で使用される場合、「ヒドロラーゼ」または「加水分解酵素」は、化学結合の加水分解を触媒する酵素、例えばエステラーゼおよびヌクレアーゼ（エステル結合を破壊する）；グリコラーゼ（グリコシド結合を破壊する）；ペプチダーゼ（ペプチド結合を破壊する）などである。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、創傷特異的グリコシドヒドロラーゼは、リゾチームである。リゾチーム（ＵＮＩＰＲＯＴ寄託番号Ｐ６１６２６［ヒト］およびＰ０８９０５［マウス］）は、グリコシドヒドロラーゼであり、その主な機能は、細菌の細胞壁を破壊することである。これは、ペプチドグリカン中のＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基との間の（１→４）−β−結合を加水分解し、キトデキストリン中のＮ−アセチル−Ｄグルコサミン残基の間も加水分解する。リゾチームの天然基質は、細菌細胞壁のペプチドグリカン層である。しかしながら、ムレーン分解産物を含む様々な低分子量基質ならびに合成化合物が、様々な測光、同位体および免疫学的リゾチームアッセイに使用されている。Ｈｏｅｌｔｊｅら、ＥＸＳ、７５：１０５−１０、１９９６。Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ５６３９およびＳｉｇｍａカタログ番号Ｎ８６３８も参照のこと。
【０１４２】
一実施形態では、化学部分の個々の要素は、創傷特異的なヒドロラーゼ、例えば創傷特異的リゾチームによる認識に適合されている。
【０１４３】
これに代えて、またはこれに加えて、化学部分の個々の要素は、他の創傷特異的酵素による認識のために修飾することができる。一実施形態では、さらなる創傷特異的酵素は、プロテアーゼである。本明細書で使用される場合、「創傷特異的プロテアーゼ」は、創傷において差異のある状態で発現されるプロテアーゼである。「発現差異」とは、プロテアーゼのレベルまたは活性が他の部位、例えば正常組織または周囲組織と比較して、創傷微小環境においてより高いか、または低いことを意味する。特に、発現差異は、未損傷組織と比較して、創傷微小環境におけるプロテアーゼの発現または活性のより高いレベルを意味する。プロテアーゼの発現差異は、慣例的手段によって分析することができる。例えば、サンプル中のプロテアーゼのレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイまたは他のイムノアッセイによって分析することができる。プロテアーゼの活性は、例えば質量分析またはＨＰＬＣを用いて、ペプチド基質の損失速度および／または生成物の形成速度を測定することによって分析することができる。このような技術は当該分野で公知であり、実施例の章に記載されている。
【０１４４】
一実施形態では、創傷特異的プロテアーゼは、カテプシンＧ（ＵＮＩＰＲＯＴ寄託番号Ｐ０８３１１［ヒト］およびＰ２８２９３［マウス］）であり、これは、アズロフィル顆粒中に保存されたキモトリプシンファミリーの３つのセリンプロテアーゼの１つである。カテプシンＧ特異的基質は、配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＰｈｅまたはＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ７３８８およびＭ７７７１）を有する。
【０１４５】
別の実施形態では、創傷特異的プロテアーゼは、エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼまたはＨＮＥ）（ＵＮＩＰＲＯＴ受託番号Ｐ０８２４６［ヒト］およびＱ３ＵＰ８７［マウス］）である。ＨＮＥは、キモトリプシンと同じファミリーのセリンプロテイナーゼであり、広い基質特異性を有する。炎症の間に好中球およびマクロファージによって分泌され、細菌および宿主組織を破壊する。一実施形態では、ＨＮＥを検出するための基質は、コア配列アラニン−アラニン−プロリン−バリン（ＡＡＰＶ）を有する。別の実施形態では、ＨＮＥの基質は、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ／Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ（ＡＰＥＥＩ／ＭＲＲＱ）である（Ｋａｓｐｅｒｋｉｅｗｉｃｚら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１１１（７）：２５１８−２５２３，２０１４；Ｋｏｒｋｍａｚら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、８４４：１２５−１３８、２０１２）。
【０１４６】
一実施形態では、酵素不安定領域は、エラスターゼに対して不安定なペプチドを含む。この実施形態の下では、エラスターゼの発色インジケータは高いコントラストであり、したがって、医薬品のｉｎ  ｓｉｔｕで使用される場合には明確な指標として役立つ。
【０１４７】
理想的な基質は、青色、紫色または深緑色になる。それはまた、高い回転率を有する立体的に許容可能な位置に固定される。最新の技術は、その逆である。利用可能な基質は、低分子量であるが黄色の可溶性発色団を生じるｐ−ニトロフェノール基を含む。大部分の熟練した研究者は、基質が水に可溶でなければならないと考え、その理由として、これが、基質が活性部位に到達する最も可能性の高い方法であると推論している。
【０１４８】
対照的に、本明細書に記載された実施形態は、その一般的な理論的根拠から逸脱する。エラスターゼは、固相基質、すなわち定義上不溶性である構造タンパク質を消化するので、これに特異的な基質を適宜適応させなければならないと想定した。このように、指標の色と、それらを使用、例えば電子的に検出することができるシステムの両方を創傷環境に適応させた。
【０１４９】
したがって、本明細書に記載の実施形態は、可溶性基質を使用する技術の教示に反して、青色、紫色または緑色を生じる低水溶性のエラスターゼ基質の使用を企図している。
【０１５０】
なおさらなる実施形態では、創傷特異的酵素は、ペルオキシラーゼであり、より具体的にはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）である。ＭＰＯ（ＵＮＩＰＲＯＴ寄託番号Ｐ０５１６４［ヒト］およびＰ１１２４７［マウス］）は、好中球顆粒球に見られるペルオキシダーゼである。これは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびハロゲン化物（最も一般的には塩化物）の存在下で、次亜塩素酸塩、一重項酸素（１Ｏ２）、塩素（Ｃｌ２）およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）といった抗菌物質を生成する。ＭＰＯは、テトラメチルベンジジンまたは４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジメトキシアニリンを用いて検出することができる。Ａｎｄｒｅｗｓら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２７（２）：３４６−５０、１９８２；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ、７７、５９８−６２５、２００５を参照のこと。
【０１５１】
なおさらなる実施形態では、創傷特異的酵素は、細菌酵素であり、より具体的には、ベータ−ラクタマーゼ（β−ラクタマーゼ）である。β−ラクタマーゼ（寄託番号ＧＯ：０００８８００）は、細菌によって産生されるヒドロラーゼ酵素（ＥＣ  ３．５．２．６）であり（ペニシリナーゼとも呼ばれる）、ペニシリン、セファマイシンおよびカルバペネム（エルタペネム）などのβ−ラクタム系抗生物質に対する多剤耐性を与える。加水分解により、ラクタマーゼ酵素はβ−ラクタム環を開裂させる。
【０１５２】
なおさらなる実施形態では、創傷特異的酵素はウイルス酵素、より具体的にはプロテアーゼ３Ｃである。これらのプロテアーゼはエンテロウイルス、ライノウイルス、アフトウイルスおよびカルディオウイルスによってコードされ、これらはヒトおよび他の哺乳動物に広範な感染を引き起こす。したがって、プロテアーゼ３Ｃは、創傷感染のマーカーとして使用することができる。
【０１５３】
なおさらなる実施形態では、創傷特異的酵素は、ＭＰＯ（ＵＮＩＰＲＯＴ寄託番号Ｐ０５１６４［ヒト］およびＰ１１２４７［マウス］）は、好中球顆粒球に見られるペルオキシダーゼである。これは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびハロゲン化物（最も一般的には塩化物）の存在下で、次亜塩素酸塩、一重項酸素（１Ｏ２）、塩素（Ｃｌ２）およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）といった抗菌物質を生成する。ＭＰＯは、テトラメチルベンジジンまたは４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジメトキシアニリンを用いて検出することができる。Ａｎｄｒｅｗｓら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２７（２）：３４６−５０、１９８２；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ、７７、５９８−６２５、２００５を参照のこと。
【０１５４】
酵素認識部位（Ｒ）
【０１５５】
本明細書に開示される実施形態が創傷特異的マーカーの特異的検出に関する限り、創傷特異的マーカーの酵素認識部位（Ｒ）を含む基質が本明細書に開示される。したがって、一実施形態では、化学部分は、創傷特異的酵素の認識部位、例えば酵素開裂部位を含むアンカー領域Ａまたは指標（Ｉ）を含む。
【０１５６】
一実施形態では、酵素認識部位は、グリコシド結合を含む。本明細書で使用される場合、「グリコシド結合」は、糖（または糖類に由来する分子）のヘミアセタールまたはヘミケタール基と、アルコールなどのいくつかの化合物のヒドロキシル基との間に形成される。グリコシド結合を含む物質は、グリコシドである。「グリコシド」という用語は現在、糖のヘミアセタール（またはヘミケタール）基と、ヒドロキシル以外のいくつかの化学基、例えば−ＳＲ（チオグリコシド）、−ＳｅＲ（セレノグリコシド）、−ＮＲ１Ｒ２（Ｎ−グリコシド）、またはさらには−ＣＲ１Ｒ２Ｒ３（Ｃ−グリコシド）との間に作られる結合を有する化合物も包含するよう拡張されている。
【０１５７】
一実施形態では、本明細書に開示されている化学部分は、グリコラーゼによって開裂する１つ以上のグリコシド結合を含む。ある特定の実施形態では、化学部分は、直接的に、または別の基を介して、アンカーＡと指標Ｉを連結するグリコシド結合を含む。特に、アンカーＡおよび指標Ｉは、１つ以上のグリコシド結合を介して直接結合し、この場合、化学種は、グリコラーゼによって開裂し、したがって、グリコラーゼの検出に使用することができる。
【０１５８】
一実施形態では、指標分子は、ペプチド結合を含む酵素開裂可能なペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」は、２つのアミノ酸間の縮合反応によって作られ、あるアミノ酸の酸部分と、他のアミノ酸のアミノ部分とが反応し、２つのアミノ酸間にペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が生成する。個々のペプチドは、配列特異的プロテアーゼによる認識のモチーフを提供する。本明細書で使用される場合、用語「配列特異的プロテアーゼ」は、その消化のためのペプチドの特異的配列を認識するプロテアーゼ（例えば、カスパーゼ）を意味し、ペプチドをその一端から逐次的に分解するか、または配列非特異的な様式でペプチドを消化する一般的なプロテアーゼ（例えば、トリプシン）とは区別される。配列特異性については、ペプチド基質のアミノ酸配列は、４つ以上のアミノ酸（ａ．ａ．）残基を含むことができる。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、直鎖または分枝鎖のアミノ酸を含む天然ペプチド、ペプチド模倣物、およびその薬学的に許容される塩を含む。典型的には、ペプチドは、互いに共有結合（例えば、ペプチド結合）によって結合した複数の（例えば、２、３、４、５、６、８、１０、またはもっと多くの）アミノ酸残基を含む。「アミノ酸残基」は、本開示のペプチドに組み込まれる個々のアミノ酸単位を意味する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するか、または合成されたアミノ酸、および天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体、立体異性体およびアミノ酸模倣物を意味する。この定義に含まれるのは、天然アミノ酸、例えば、（１）ヒスチジン（Ｈｉｓ）（２）イソロイシン（Ｉｌｅ）（３）ロイシン（Ｌｅｕ）（４）リシン（Ｌｙｓ）（５）メチオニン（Ｍｅｔ）（６）フェニルアラニン（Ｐｈｅ）（７）スレオニン（Ｔｈｒ）（８）トリプトファン（Ｔｒｐ）（９）バリン（Ｖａｌ）（１０）アルギニン（Ａｒｇ）（１１）システイン（Ｃｙｓ）（１２）グルタミン（Ｇｌｎ）（１３）グリシン（Ｇｌｙ）（１４）プロリン（Ｐｒｏ）（１５）セリン（Ｓｅｒ）（１６）チロシン（Ｔｙｒ）（１７）アラニン（Ａｌａ）（１８）アスパラギン（Ａｓｎ）（１９）アスパラギン酸（Ａｓｐ）（２０）グルタミン酸（Ｇｌｕ）（２１）セレノシステイン（Ｓｅｃ）であり、非天然アミノ酸（ａ）シトルリン；（ｂ）シスチン；（ｃ）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）；（ｄ）オルニチン；（ｆ）テアニンおよびアミノ酸誘導体、例えば、ベタイン；カルニチン；カルノシンクレアチン；ヒドロキシトリプトファン；ヒドロキシプロリン；Ｎ−アセチルシステイン；Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ−ｅ）；タウリン；チラミンも含まれる。これらの中で、反応性側鎖を含むアミノ酸、例えば、システイン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸／アスパラギン、グルタミン酸／グルタミン、グリシン、アラニンなどが、基質の修飾に特に使用される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、化学種は、創傷特異的酵素の検出のための１つ以上の酵素不安定領域または酵素反応性領域（Ｒ）を含む。
【０１６１】
酵素がリゾチームなどのグリコシダーゼである一実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、場合によりアセチル化された少なくとも３つのグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンまたはペプチドグリカン単位のアシルキトサンを含む。酵素反応部位は、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０またはそれ以上のグルコサミン単位またはＮ−アセチルグルコサミン単位またはペプチドグリカン単位を含んでいてもよい。一実施形態では、Ｒは、少なくとも３つのグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンまたはそれらの組み合わせを含み、グルコサミンおよび／またはＮ−アセチルグルコサミンは、場合によりアセチル化される。別の実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペプチドグリカンを含み、ここで、ペプチドグリカンは場合によりアセチル化される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、化学部分は、上に開示した１つ以上の創傷特異的プロテアーゼ、例えばカテプシンＧ、およびミエロペルオキシダーゼ、エラスターゼまたはそれらの組み合わせに対する酵素反応部位（Ｒ）を含む。本明細書で使用される場合、用語「プロテアーゼの反応部位」は、プロテアーゼによって、そのプロテアーゼ活性のための基質として（例えば、１つ以上の産物に開裂され得る基質として）認識されるタンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、化学種は、複数のアミノ酸を含むペプチド配列を含むペプチド領域を含む。「複数」という用語は、２つ以上の単位、例えばアミノ酸を意味するが、個々の単位は構造的および／または機能的に異なる必要はない。典型的には、化学種の指標領域（Ｉ）は、創傷特異的プロテアーゼの酵素反応部位として働くペプチドを含む。
【０１６３】
一実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、エラスターゼに対して不安定なペプチド、カテプシンＧ、ミエロペルオキシダーゼまたはそれらの組み合わせを含む。
【０１６４】
一実施形態では、酵素不安定領域は、エラスターゼに対して不安定なペプチドを含む。この実施形態の下では、エラスターゼの発色インジケータは高いコントラストであり、したがって、医薬品のｉｎ  ｓｉｔｕで使用される場合には明確な指標として役立つ。
【０１６５】
理想的な基質は、青色、紫色または深緑色になる。それはまた、高い回転率を有する立体的に許容可能な位置に固定される。最新の技術は、その逆である。利用可能な基質は、低分子量であるが黄色の可溶性発色団を生じるｐ−ニトロフェノール基を含む。大部分の熟練した研究者は、基質が水に可溶でなければならないと考え、その理由として、これが、基質が活性部位に到達する最も可能性の高い方法であると推論している。
【０１６６】
対照的に、本明細書に記載された実施形態は、その一般的な理論的根拠から逸脱する。エラスターゼは、固相基質、すなわち定義上不溶性である構造タンパク質を消化するので、これに特異的な基質を適宜適応させなければならないと想定した。このように、指標の色と、それらを使用、例えば電子的に検出することができるシステムの両方を創傷環境に適応させた。
【０１６７】
したがって、本明細書に記載の実施形態は、可溶性基質を使用する技術の教示に反して、青色、紫色または緑色を生じる低水溶性のエラスターゼ基質の使用を企図している。
【０１６８】
ペプチド配列はしばしばプロテアーゼ基質にとって重要であると考えられるが、エラスターゼは、非常に一般的な加水分解能力を有し、非常に多くの基質を受容する。これは、多くの組織において抗菌防御および免疫細胞転位にも関与しているからである。これに関して、それは多くの異なるペプチドを切断することができる。それは、Ａ、Ｆ、ＶまたはＭと、側鎖の複雑さが限定された単純なアミノ酸との間を良好に切断する。ＡＡＰＶ、ＡＡＰＦ、ＡＡＡＡは全て、よく認識されている標的の例である。明らかなことは、Ｎ末端上の距離が増加するにつれて、アミノ酸があまり重要な役割を果たさないことである。切断部位のＣ末端には、明らかなコンセンサスは存在しないが、複雑さが少ない方が好ましいようである。
【０１６９】
この場合に、より重要なのは２つの因子である。
【０１７０】
アンカーを形成する距離
【０１７１】
発色団の性質
【０１７２】
アンカー部位が近すぎると、酵素の作用が阻害される。したがって、理想的には、切断部位とアンカーとの間に４個以上のアミノ酸が存在する。
【０１７３】
発色団、特にその電荷は重要である。中性発色団は正に帯電した部分よりも好ましく、負に帯電した発色団または染料に対して好ましい。切断部位付近の高密度の負電荷は酵素を阻害する。したがって、陰性染料が使用される場合、それらは、好ましくは、切断部位から２以上のアミノ酸のＣ末端で離間される。
【０１７４】
さらに長いアミノ酸配列は、一般的に妨害されにくいが、経済的でもない。
【０１７５】
一実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１７６】
ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、
ここで、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１７７】
一実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１７８】
ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、
ここで、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１７９】
別の実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１８０】
ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、
ここで、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１８２】
ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、
ここで、各Ｘは、独立して任意のアミノ酸であり、
ｙは、それぞれ独立して、０〜２００の整数であり、
Ｌは、連結部分であり、
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１８３】
別の特定の実施形態では、反応性領域Ｒは、ペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含み、ここで、Ｘ、ＬおよびＺは、それぞれ上述の通りであり、ｙは、それぞれ独立して、１〜５０の整数である。
【０１８４】
なおさらなる実施形態では、反応性領域Ｒは、ペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含み、ここで、Ｘ、ＬおよびＺは、それぞれ上述の通りであり、ｙは、それぞれ独立して、１〜１０の整数である。
【０１８５】
特に、反応性領域Ｒは、ペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含み、ここで、Ｘ、ＬおよびＺは、それぞれ上述の通りであり、ｙは、それぞれ独立して、１〜６の整数である。
【０１８６】
一実施形態では、配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）を含む上述のペプチドは、それぞれ、個々にエラスターゼに対して不安定である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）中の１つ以上のアミノ酸が、アミン保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、カテプシンＧに対して不安定なペプチドを含む。
【０１８９】
一実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１９０】
ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、ここで、
Ｘは、それぞれ独立して任意のアミノ酸であり；
ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；
Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；
Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；
Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；
Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；
Ｚは、検出可能な標識を含み；ペプチドは、カテプシンＧに対して不安定である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が、ｔ−ｂｏｃ基で保護される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列中の１つのアミノ酸が、ｆｍｏｃ基で保護される。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【０１９３】
ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）、ここで、
Ｘは、それぞれ独立して任意のアミノ酸であり；
ｙは、それぞれ独立して、０〜６から選択される数字であり；
Ｎ４は、アラニン、グリシン、バリンおよびグルタミンから選択され；
Ｎ３は、アラニン、グリシン、プロリン、リシンおよびセリンから選択され；
Ｎ２は、プロリン、アラニンおよびグリシンから選択され；
Ｎ１は、セリン、リシン、フェニルアラニン、アルギニン、ロイシンおよびメチオニンから選択され；
Ｌは、連結部分であり；
Ｚは、検出可能な標識を含む。
【０１９４】
一実施形態では、配列ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）およびＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）を含む上述のペプチドは、それぞれ、個々に、カテプシンＧに対して不安定である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列配列ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）およびＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）中の１つ以上のアミノ酸が、アミン保護基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノ酸配列（ａ）ＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚを含むペプチドを含み；Ｘは、それぞれ独立して任意のアミノ酸であり；ｙは、それぞれ独立して、１〜５０から選択される数字であり；Ｕは、ＬＥＶＬＦＱから選択されるアミノ酸であり、Ｚは標識である。特に、この実施形態の下では、ｙは、１〜１０から選択される数である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（ａ）ＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ中の１つ以上のアミノ酸が、例えば、ｔ−ｂｏｃ基またはｆｍｏｃ基で保護される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚは、ウイルス３Ｃプロテアーゼに対して不安定である。
【０１９９】
検出可能な標識Ｚ
【０２００】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシル、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、または金コロイド粒子である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２イノフェノール、ＡＢＴＳ（ペルオキシダーゼ基質酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンジジン、３，４−ジアミノ安息香酸、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、インドキシル、インジゴ、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザンから選択されるペルオキシダーゼ基質である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、Ｚは、アリールアミン、アミノフェノール、アミノフェノールエーテル、インドキシル、中性染料、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、またはこれらの加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される帯電した染料である。特に、Ｚは、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、またはその加水分解またはアンモノリシス誘導体から選択される帯電した染料である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０などである。いくつかの実施形態では、ジクロロトリアジン系の反応性染料は、黒く見える。いくつかの実施形態では、Ｚは、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含む反応性染料である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、Ｚは、金コロイド粒子である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、Ｚは、帯電した染料、インドール誘導体またはルミノール誘導体である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、フェノール、アミノフェノール、アミノフェニルエーテル、インドキシルまたはキノンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、フェノールを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノフェノールを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノフェノールエーテルを含む。いくつかの実施形態では、酵素標識または酵素反応性領域は、インドキシルを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、キノンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ミエロペルオキシダーゼと反応するが、ヘムと反応しない。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペルオキシダーゼ基質、アリールアミン、アミノフェノール、中性染料、帯電した染料、ナノ粒子、または金コロイド粒子を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ペルオキシダーゼ基質を含む。いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼ基質は、ｐ−アミノフェノール、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩）、３，３’−ジアミノベンジジン、３，４−ジアミノ安息香酸、ＤＣＰＩＰ、Ｎ，Ｎ−ジメチルーｐ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、ｐ−フェニレンジアミン、４−クロロ−１−ナフトール、ｏ−フェニレンジアミン  Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−アミノフタルヒドラジド、５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）および４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ、Ｎ−（２−ヒドロキシ）テトラ−デシル−Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲから選択される。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アリールアミンを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、アミノフェノールを含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、中性染料を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、帯電した染料を含む。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、トルイジンブルー、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５および反応性オレンジ１６、またはこれらそれぞれの加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、レマゾールブリリアントブルー、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、トルイジンブルーである。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性ブラック５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性バイオレット５、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。いくつかの実施形態では、帯電した染料は、反応性オレンジ１６、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０を含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、Ｚは、金コロイド粒子である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、帯電した染料、インドール誘導体またはルミノール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、インドール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、酵素不安定領域または酵素反応性領域は、ルミノール誘導体を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、指標領域は、通常の周囲照明において目に見える色変化を示す染料を含む。いくつかの実施形態では、染料は、一般に、赤色、黄色または茶色である創傷産物と対照的な色を有する。さらなる実施形態では、染料は、バイオレット、ブルーまたはダークグリーンである。いくつかの実施形態では、染料は、バイオレットである。いくつかの実施形態では、染料は、ブルーである。いくつかの実施形態では、染料は、ダークグリーンである。いくつかの実施形態では、染料は低分子量であり、帯電しており、反応性または連結可能な基を含み、ガンマ線照射に対して安定であり、深く着色している。いくつかの実施形態では、染料は、シブラクロン系染料、アゾ染料およびレマゾール染料、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、シブラクロン（ｃｉｂｒａｃｒｏｎ）系染料から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、アゾ染料から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、レマゾール染料、またはその加水分解誘導体またはアンモノリシス誘導体から選択される。いくつかの実施形態では、染料は、ローダミン、クマリン、シアニン、キサンテン、ポリメチン、ピレン、ジピロメテンホウ素ジフルオリド、ナフタルイミド、フィコビリタンパク質、ペリジニウムクロロフィルタンパク質、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｒｅｄ、ｉＦｌｕｏｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン  ６Ｆ、カルボキシロドール、カルボキシローダミン１１０、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−Ｃｈｒｏｍｅ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、フィコエリスリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル−ａタンパク質）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（および−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７−アミノ−４−メチルクマ���ン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲおよびジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、またはこれらのコンジュゲート、またはこれらの組み合わせから選択される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、指標領域は、ジクロロトリアジン系反応性染料、例えば、反応性ブルー４、反応性レッド１２０、反応性ブルー２、反応性グリーン１９および反応性ブラウン１０を含む。いくつかの実施形態では、ジクロロトリアジン系の反応性染料は、黒く見える。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、指標領域は、スルホニルエチル−硫酸水素塩−反応性基を含む反応性染料の反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルー、反応性バイオレット５または反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、レマゾールブリリアントブルーである。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性オレンジ１６である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５、レマゾールブリリアントブルーまたは反応性バイオレット５である。いくつかの実施形態では、反応性染料は、反応性ブラック５またはレマゾールブリリアントブルーである。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、指標領域は、通常の周囲照明において色変化を示す粒子（例えば、コロイド状金属または量子ドット）を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、金コロイド粒子を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、指標領域は、ＵＶ光の下で目に見える色変化を示す染料を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、蛍光である染料を含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、発光である染料を含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、指標領域は、酵素反応性部分を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して肉眼で見えるか、または電子的手段によって検出可能な生成物を生成する。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して肉眼で見える生成物を生成する。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して、電子的手段によって検出可能な生成物を生成する。いくつかの実施形態では、指標領域は、インジゴを産生するために、使用される末端糖に依存して、ヘキサアミニダーゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼまたはガラクトシダーゼによって開裂するインドキシルグリコシドを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、補助酵素によって酸化されて可視生成物を生成するフェノールを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、ラッカーゼによって酸化されて可視生成物を生成するフェノールを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、電子的手段によって検出可能なメタロモチーフを含む。いくつかの実施形態では、指標領域は、電子的手段によって検出可能なフェロセンまたはフェロセン類似体を含む。いくつかの実施形態では、補助酵素は、リパーゼ、エステラーゼ、ヘキソキサミニダーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼおよびラッカーゼから選択される。いくつかの実施形態では、補助酵素は創傷液に存在しない。いくつかの実施形態では、補助酵素が創傷液中に存在する。いくつかの実施形態では、酵素反応性部分は、補助酵素と相互作用して、ＵＶ光の下で見える生成物を生成する。
【０２１７】
化学種は、複数の酵素認識部位（Ｒ）を含む。
【０２１８】
さらなる実施形態では、複数の酵素認識部位（Ｒ）を個々に、または一緒に含む、アンカーＡと、指標Ｉとを含む化学種が本明細書に開示される。典型的には、そのような化学種は、複数の酵素、例えば、少なくとも１つのプロテアーゼと少なくとも１つのグリコシダーゼとを含む組み合わせをアッセイするために使用される。
【０２１９】
一実施形態では、本明細書で開示されるのは、アンカーＡと、指標Ｉとを含む化学種であり、個々に、または一緒に複数の酵素認識部位（Ｒ）を含み、少なくとも１つの反応部位が、グリコシダーゼ、例えばリゾチームに特異的であり；少なくとも１つの酵素反応部位は、リパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ；酸セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エラスターゼ、ラクタマーゼ、カテプシンおよびプロテイナーゼ−３Ｃ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるプロテアーゼに特異的である化学種である。これらの酵素の個々の反応部位および認識部位は、既に記載されている。
【０２２０】
一実施形態では、本明細書で開示されるのは、アンカーＡと、指標Ｉとを含む化学種であり、個々に、または一緒に複数の酵素認識部位（Ｒ）を含み、少なくとも１つの反応部位が、プロテアーゼエラスターゼに特異的であり；少なくとも１つの酵素反応部位は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、カテプシンおよびプロテイナーゼ−３Ｃからなる群から選択されるプロテアーゼに特異的である化学種である。これらの酵素の個々の反応部位および認識部位は、既に記載されている。
【０２２１】
一実施形態では、本明細書で開示されるのは、アンカーＡと、指標Ｉとを含む化学種であり、個々に、または一緒に複数の酵素認識部位（Ｒ）を含み、少なくとも１つの反応部位が、プロテアーゼエラスターゼに特異的であり；少なくとも１つの酵素反応部位は、β−ラクタマーゼおよびプロテイナーゼ−３Ｃからなる群から選択される細菌酵素に特異的である化学種である。これらの酵素の個々の反応部位および認識部位は、既に記載されている。
【０２２２】
一実施形態では、本明細書で開示されるのは、アンカーＡと、指標Ｉとを含む化学種であり、個々に、または一緒に複数の酵素認識部位（Ｒ）を含み、少なくとも１つの反応部位が、エラスターゼに特異的であり；少なくとも１つの酵素反応部位は、ＭＰＯからなる群から選択されるプロテアーゼに特異的である化学種である。これらの酵素の個々の反応部位および認識部位は、既に記載されている。
【０２２３】
一実施形態では、本明細書で開示されるのは、アンカーＡと、指標Ｉとを含む化学種であり、個々に、または一緒に複数の酵素認識部位（Ｓ）および酵素認識部位（Ｒ）を含み、少なくとも１つの反応部位が、プロテアーゼエラスターゼに特異的であり；少なくとも１つの酵素反応部位は、プロテイナーゼ３Ｃからなる群から選択されるプロテアーゼに特異的である化学種である。これらの酵素の個々の反応部位および認識部位は、既に記載されている。
【０２２４】
酵素基質の組み合わせを使用することのより大きな予測力のために、上に概説したように、複数の反応部位および認識部位を含む化学種の診断有用性は、単一の（例えば、単一型の）反応部位および認識部位を含む化学種と比較して、非常に高いであろうことが想定される。少なくとも、複数の反応／認識部位を含む化学種は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個またはそれ以上のマーカーの同時診断を可能にする。例として、創傷部位における宿主エラスターゼおよび／またはＭＰＯ活性を、本明細書に開示する多重化学種を用いて、病原体由来マーカー（例えば、β−ラクタマーゼまたはウイルスプロテアーゼ３Ｃ特異的反応部位）と同時に検出し、モニタリングすることができる。
【０２２５】
支持材料
【０２２６】
いくつかの実施形態では、化学種のアンカー領域（Ａ）は、例えば、共有結合、イオン相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用、水素結合相互作用、物理化学的相互作用、ファンデルワールス力、ルイス酸／ルイス塩基相互作用、またはこれらの組み合わせを介し、支持材料に化学種を結合する。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、支持マトリックスは、デキストラン、アガロース、シリカ、合成ポリマー、または抗体、リガンドまたはエピトープタグに共有結合したデキストラン、アガロース、シリカまたは合成ポリマーを含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、アンカー領域は、ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化可能反応性基、ペプチドグリカン、キトサン誘導体、またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、アンカー領域は、短時間のＵＶ照射の後に支持材料に結合する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中に印刷される。いくつかの実施形態では、レポーター種または化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、全ての方向に同様の毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中に化学結合される。いくつかの実施形態では、化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中にイオン結合される。いくつかの実施形態では、化学種は、濾紙または創傷液によって濡れることができ、毛細管作用を示す、織布または不織布材料のような支持材料の上または中に共有結合される。支持材料には、セルロース、ポリアミド、ポリエステル、ポリアクリレートおよび繊維として有用な他の同様のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、支持材料は、セルロースである。いくつかの実施形態では、支持材料は、ポリアミドである。いくつかの実施形態では、支持材料は、ポリエステルである。いくつかの実施形態では、支持材料は、ポリアクリレートである。
【０２３０】
さらなる部分
【０２３１】
いくつかの例では、創傷のｐＨは、血管新生、プロテアーゼ活性、酸素放出、および細菌毒性のような創傷治癒の多くの因子に影響し得る。慢性的な治癒していない創傷は、上昇したアルカリ性環境を有している場合がある。創傷が治癒に向かうにつれて、創傷のｐＨは中性に移行し、次いで酸性になる。創傷のｐＨのモニタリングは、創傷の状態（例えば、感染または感染なし）を評価し、処置に対する創傷の応答を決定するのを助ける方法を提供し得る。
【０２３２】
したがって、いくつかの実施形態では、創傷における感染の検出のための化学種は、目に見える色変化を示すｐＨ感受性部分を含む指標領域を含む。一実施形態では、ｐＨ感受性部分は、アルカリ性ｐＨ、例えば、ｐＨ＝７．２−９．５；ｐＨ＝７．２−９．０；ｐＨ＝７．２−８．５；ｐＨ＝７．２−８．０；ｐＨ＝７．５−８．５；ｐＨ＝７．５−９．０；ｐＨ＝８．０−９．０で目に見える色変化を示す。他の実施形態では、ｐＨ感受性部分は、ｐＨ＝７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４または９．５、またはこれらの０．１増分で、目に見える色変化を示す。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性部分は、中性ｐＨ範囲、例えばｐＨ＝６．９、７．０または７．１、またはその０．０５増分で目に見える色変化を示す。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性部分は、酸性ｐＨ、例えば、ｐＨ＝４．５−６．８；ｐＨ＝４．５−６．５；ｐＨ＝５．０−６．８；ｐＨ＝５．４−６．８；ｐＨ＝５．４−６．５で目に見える色変化を示す。他の実施形態では、ｐＨ感受性部分は、ｐＨ＝４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９、またはこれらの０．１増分で、目に見える色変化を示す。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性部分は、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッド、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、ニトラジンイエロー、スルホフタレイン染料、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０２３６】
組成物：
【０２３７】
本明細書に記載の実施形態は、さらに、式Ｉの化合物を含有する組成物に関する。このような組成物は、従来の方法を用いて調製されてもよい。
【０２３８】
一旦配合されると、得られた式Ｉの化合物のストック組成物は、従来の方法を用い（例えば、担体、ゲル化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、乳化剤などを用い）、さらに所望な形態（例えば、ゲル、バーム、ローション、クリーム、ペースト、軟膏など）へと改変されてもよい。例えば、ＷＯ  ２０１３／００４９５３号を参照されたい。
【０２３９】
組成物に使用するための担体としては、限定されないが、水、グリセリン、ジグリセリン、グリセリン誘導体、グリコール、グリコール誘導体、糖類、エトキシル化および／またはプロポキシル化エステルおよびエーテル、尿素、ナトリウムＰＣＡ、アルコール、エタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせが挙げられるだろう。一実施形態では、担体は、プロピレングリコールである。典型的には、組成物は、組成物の約１重量％〜組成物の約９９．９重量％、より典型的には組成物の約２重量％〜約９５重量％、より典型的には組成物の約５重量％〜約９０重量％の量で担体を含有する。
【０２４０】
熱可逆性ゲル化剤は、５０℃などの高温で親水性担体に可溶性、部分的に可溶性または混和性である成分として定義され、ここで、薬剤は、２５℃に冷却したときに担体を増粘する能力を有するが、基材への塗布が必要な場合、５０℃では粘度が低くなる。適切な親水性担体には、水、グリコール、例えばプロピレングリコールが含まれる。組成物に使用するための熱可逆性ゲル化剤は、脂肪酸の塩、例えばステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸カリウムを含むことができる。これらの塩を、組成物に添加することができ、または脂肪酸を添加し、適切な塩基で中和することによりｉｎ  ｓｉｔｕで生成することができる。組成物のｉｎ  ｓｉｔｕでの形成の例は、ステアリン酸および水酸化ナトリウムを提供してステアリン酸ナトリウムを生成することである。他の一般的な熱可逆性（ｈｅｒｍｏｓ−ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）のゲル化剤としては、例えば、ポリエチレングリコールおよび誘導体、例えば、ＰＥＧ−２０、ＰＥＧ−１５０ジステアレート、ＰＥＧ−１５０ペンタエリスリチルテトラステアレート、ジステアレス−７５ＩＰＤＩ、ジステアレス−１００ＩＰＤＩ、脂肪アルコール、例えばセチルアルコール、脂肪酸、例えば、ステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸およびその誘導体、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２４１】
担体および熱可逆性（ｈｅｒｍｏｓ−ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）のゲル化剤に加えて、組成物は、様々な他の成分および要素を含むことができる。組成物に含まれてもよい他の成分の例は、皮膚軟化剤、ステロールまたはステロール誘導体、天然および合成の脂肪または油、増粘剤、レオロジー調整剤、ポリオール、界面活性剤、アルコール、エステル、シリコーン、クレイ、デンプン、セルロース、粒状物、保湿剤、膜形成剤、すべり改質剤、表面改質剤、皮膚保護剤、湿潤剤、日焼け止め剤などである。
【０２４２】
医薬組成物および／または調製物：
【０２４３】
本明細書に記載される実施形態は、さらに、上述の式Ｉの化合物のうち１つ以上と担体とを含む、医薬組成物および／または調製物に関する。「薬学的に許容される」という語句は、合理的な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を引き起こさずに、妥当な利益／リスク比に見合う、ヒトおよび／または他の哺乳動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、塩、組成物、剤形などを指すために本明細書で使用される。いくつかの態様では、「薬学的に許容される」とは、連邦または州政府の規制機関によって承認されたか、または哺乳動物（例えば、動物）、より具体的にはヒトにおいて使用するための米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に挙げられていることを意味する。
【０２４４】
医薬組成物は、当該分野で公知の任意の適切な手段によって調製され得る。このような組成物の例には、（ａ）局所適用、例えば物品（例えば、ガーゼ、パッド、スワブ、包帯）、クリーム、軟膏、ゲル、ローションなど；（ｂ）滅菌溶液または懸濁物としての非経口投与、例えば、皮下、筋肉内または静脈内注射；（ｃ）経口投与、外部適用（例えば、水性および非水性の溶液または懸濁物を含む水薬）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、食品との混合のためのペレット、舌への適用のためのペーストなどに適合するものが挙げられる。
【０２４５】
特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の抗生物質を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、用語「抗生物質」または「抗菌剤」は、微生物の増殖を阻害するか、または微生物を破壊する物質を指す。好ましくは、抗生物質は、感染因子の病原性を抑制し、および／または感染性疾患を治療するのに有用である。抗生物質はまた、微生物、例えば酵母または真菌によって産生される天然形態が構造的に改変された半合成物質も意味する。
【０２４６】
好ましくは、抗生物質は、β−ラクタム（β−ラクタマーゼ阻害剤およびセファロスポリンを含む）、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリンおよび／またはグリシルサイクリンおよび／またはポリミキシンからなる群から選択される。抗菌剤の任意の組み合わせ、例えば、少なくとも１種類のβ−ラクタムと少なくとも１種類のフルオロキノロン；少なくとも１種類のアミノグリコシドと１種類のセファロスポリン；少なくとも１種類のβ−ラクタムと１種類のβ−ラクタマーゼ阻害剤を、場合により、アミノグリコシドなどと一緒に使用してもよい。
【０２４７】
本明細書で使用される場合、用語「β−ラクタム」阻害剤は、天然および半合成ペニシリンおよびペニシリン誘導体、例えば、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリンおよびオキサシリン；メチシリン、ジクロキサシリンおよびフルクロキサシリン；テモシリン；アモキシシリンおよびアンピシリン；アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリンおよびピペラシリン；ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネムおよびＰＺ−６０１；セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロール、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフォタキシムおよびセフポキシム；セフェピムおよびセフピロム；セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピムおよびセフピロム；セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾールおよびフロモキセフ；チゴモナム、ノカルジシンＡおよびタブトキシン；クラブラン酸、モクサラクタムおよびフロモキセが挙げられる。フルオロキノロンには、シプロフロキサシン、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、およびモキシフロキサシンが含まれる。アミノグリコシドには、例えばカナマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシンＢ、ネオマイシンＣ、ネオマイシンＥ（パロモマイシン）およびストレプトマイシンが挙げられ、これには、合成誘導体クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンが含まれる。テトラサイクリンには、天然に存在する化合物（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン）または半合成薬剤（例えば、ライムサイクリン、メクロシン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン）が含まれる。グリシルサイクリン（例えば、ミノサイクリン／チゲサイクリン）は、テトラサイクリンから誘導される。ポリミキシンは、例えば、ポリミキシンＢおよびポリミキシンＥ（コリスチン）を含む。
【０２４８】
特定の実施形態では、組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３１ｍｇ／ｍＬ、３２ｍｇ／ｍＬ、３３ｍｇ／ｍＬ、３４ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、３６ｍｇ／ｍＬ、３７ｍｇ／ｍＬ、３８ｍｇ／ｍＬ、３９ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４１ｍｇ／ｍＬ、４２ｍｇ／ｍＬ、４３ｍｇ／ｍＬ、４４ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ、またはもっと多い濃度で抗生物質を含有していてもよい。例えば、イミペネムおよびエルタペネムは、５０、３０、２０、１５、１０、５および１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。
【０２４９】
創傷包帯：
【０２５０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の創傷包帯材料、例えば式Ｉの化合物を含む創傷包帯が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、創傷包帯は、本明細書に記載の創傷包帯材料、例えば式Ｉの化合物から本質的になる。
【０２５１】
一実施形態では、本明細書に開示される創傷包帯は、生体適合性、生分解性、非免疫原性であり、商業的に容易に入手可能である。
【０２５２】
一実施形態では、式Ｉの化合物は、繊維粒子または粉末粒子のような粒子の形態で提供され、場合により、医薬品を含む。特に、この物質は、ＰＧ繊維を含むことが好ましい。
【０２５３】
組成物は、好ましくは、包帯材料と他の化合物との緊密な混合物を含んでいてもよい。例えば、一実施形態では、緊密な混合物は、包帯材料と、溶媒などの適切なビヒクルとの混合溶液または分散液、またはこのような溶液または分散液から溶媒を除去することによって生成される固体組成物を含む。この実施形態の下では、包帯材料は、材料の少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも１０重量％、２０重量％、３０重量％、５０重量％、７５重量％、９０重量％またはそれ以上を構成する。特定の好ましい実施形態では、この材料は、本質的に包帯材料からなる。
【０２５４】
材料の他の要素としては、０〜２５重量％、例えば、約１〜約２０重量％の１つ以上の他の生体適合性の多糖類、例えば、アルギン酸塩、例えば、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カルシウム、デンプン誘導体、例えば、ナトリウムデンプングリコラート、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロース、またはグリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロン酸またはその塩、コンドロイチン硫酸またはヘパラン硫酸が挙げられるだろう。材料は、約２５重量まで、例えば、約１〜約２０重量％の、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンおよびこれらの混合物からなる群から選択される１種類以上の構造タンパク質も含んでいてもよい。好ましくは、タンパク質はコラーゲンを含み、より好ましくは本質的にコラーゲンからなる。この材料はまた、約２０重量％まで、好ましくは約２重量％〜約１０重量％の水を含むことができる。この材料はまた、０〜４０重量％、例えば約５〜約２５重量％の可塑剤、好ましくは多価アルコール、例えばグリセロールまたはソルビトールを含有してもよい。
【０２５５】
特定の実施形態では、材料は、約１０重量％まで、例えば、約０．０１〜約５重量％、典型的には、約０．１〜約２重量％の１種類以上の治療創傷治癒剤、例えば、非ステロイド抗炎症薬（例えば、アセトアミノフェン）、ステロイド、局所麻酔薬、抗菌剤、または成長因子（例えば、線維芽細胞増殖因子または血小板由来増殖因子）も含んでいてもよい。抗菌剤は、例えば、消毒剤、抗生物質、またはそれらの混合物を含み得る。好ましい抗生物質には、テトラサイクリン、ペニシリン、テラマイシン、エリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリマイシンＢ、ムピロシン、クリンダマイシンおよびそれらの混合物が含まれる。好ましい防腐剤としては、銀（コロイド銀を含む）、銀塩（材料を構成する１種類以上のアニオン性ポリマーの塩を含む）、スルファジアジン銀、クロルヘキシジン、ポビドンヨード、トリクロサン、スクラルファート、四級アンモニウム塩、およびこれらの混合物が挙げられる。開示された技術によるこれらの薬用創傷包帯材料は、使用時に創傷包帯材料が破壊されると、治療薬の持続放出を提供する。
【０２５６】
上述の百分率は、全て乾燥重量基準である。好ましくは、創傷包帯材料と他の補助剤および材料との重量比は、約１：９９〜約９９：１である。より好ましくは、重量比は、約１：９〜約９：１の範囲内、より好ましくは約４：１〜約１：４の範囲内、さらにより好ましくは約２：１〜約１：２の範囲である。
【０２５７】
材料は、粉末、微小球、フレーク、マットまたは膜などの任意の好都合な形態であり得る。
【０２５８】
特定の実施形態では、材料は、局所適用のための半固体またはゲル軟膏の形態である。
【０２５９】
特定の実施形態では、材料は、慢性創傷への適用のための凍結乾燥または溶媒乾燥された生体吸収性スポンジの形態である。好ましくは、スポンジの平均細孔径は、１０〜５００μｍ、より好ましくは約１００〜３００μｍの範囲にある。適したスポンジは、式Ｉの化合物を適切な治療剤と共に含む水性分散液を凍結乾燥または溶媒乾燥させることによって製造される。
【０２６０】
さらに他の実施形態では、材料は可撓性膜の形態であり、連続的または断続的（例えば、穿孔されている）であってもよい。可撓性膜は、可撓性にするための可塑剤、例えばグリセロールを含むことが好ましい。
【０２６１】
ある範囲の制御可能な特性を有する両方のゲル形成ポリマー（例えばセルロース誘導体）の容易な利用可能性は、開示された技術の組成物の特性が、並外れた程度に制御され得ることを意味する。特に、材料の生物学的吸収率、多孔度および密度を制御することができる。
【０２６２】
一実施形態では、本明細書では、式Ｉの化合物を含む組成物の活性層を含む、シート形態の創傷包帯材料が提供される。活性層は、通常、使用時に創傷に接触する層であるが、いくつかの実施形態では、液体透過性トップシートによって創傷から分離することができる。一実施形態では、活性層の面積は、約１ｃｍ２〜約４００ｃｍ２、特に約４ｃｍ２〜約１００ｃｍ２である。
【０２６３】
別の実施形態では、創傷包帯材料は、活性層の創傷に面する側とは反対側の活性層上に延在する裏当てシートをさらに含む。好ましくは、裏当てシートは、活性層の周りに幅１ｍｍ〜５０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ〜２０ｍｍの周辺領域が延在していわゆる島状包帯を形成するように、活性層よりも大きい。そのような場合、裏当てシートは、好ましくは、少なくともその周縁領域に感圧性の医療グレードの接着剤で被覆される。
【０２６４】
包帯材料が裏当てシートを含む実施形態では、裏当てシートは、実質的に液体不透過性である。別の実施形態では、裏当てシートは半透性である。例えば、裏当てシートは、好ましくは水蒸気に対して透過性であるが、液体の水または創傷滲出物に対して透過性ではない。好ましくは、裏当てシートは微生物不透過性でもある。適切な連続適合性の裏当てシートは、好ましくは、裏当てシート単独の水蒸気透過率（ＭＶＴＲ）が、３７．５℃、相対湿度差１００％〜１０％で、３００〜５０００ｇ／ｍ２／２４時間、好ましくは５００〜２０００ｇ／ｍ２／２４時間である。裏当てシートの厚さは、好ましくは１０〜１０００マイクロメートル、より好ましくは１００〜５００マイクロメートルの範囲である。
【０２６５】
裏当てシートを形成するのに適したポリマーとしては、ポリウレタンおよびポリアルコキシアルキルアクリレートおよびメタクリレートが挙げられる。好ましくは、裏当てシートは、主に独立気泡である高密度ブロックポリウレタンフォームの連続層を含む。適切な裏当てシート材料は、ポリウレタンフィルムである。
【０２６６】
接着剤を含む裏当て層を含む創傷包帯において、接着剤層は、水蒸気透過性であり、および／または水蒸気の通過を可能にするようにパターン形成されていなければならない。接着剤層は、島型創傷包帯に従来使用されている種類の連続的な水蒸気透過性の感圧接着剤層、例えばアクリレートエステルコポリマー、ポリビニルエチルエーテルおよびポリウレタンを基剤とする感圧接着剤であることが好ましい。ポリウレタン系感圧接着剤を選択的に使用することができる。
【０２６７】
別の実施形態では、包帯は、多層吸収性物品のさらなる層を備えていてもよく、この層は、活性層と保護シートとの間に構築することができる。例えば、これらの層は、使用中の活性層のための支持体を提供するために、開口されたプラスチックフィルムを含むことができ、この場合、フィルムの開口部はヒドロゲル層の開口部と整合することが好ましい。
【０２６８】
さらに、他の実施形態では、特に包帯が、滲出している創傷に使用される場合、包帯は、活性層と保護シートとの間に吸収層を含むことができる。任意要素の吸収層は、ガーゼ、不織布、超吸収剤、ヒドロゲルおよびそれらの混合物を含む、創傷治癒技術における創傷液、血清または血液を吸収するために従来使用されている任意の層であり得る。好ましくは、吸収層は、開放気泡親水性ポリウレタン発泡体などの吸収性発泡体の層を含む。他の実施形態では、吸収層は、不織繊維ウェブ、例えば、ビスコースステープル繊維のカーディングされたウェブであってもよい。
【０２６９】
特定の実施形態では、創傷包帯は、取り外し可能なカバーシートによって保護されてもよい。カバーシートは、通常、可撓性の熱可塑性材料から形成される。適切な材料には、ポリエステルおよびポリオレフィンが含まれる。好ましくは、カバーシートの接着剤に面する表面は剥離面である。すなわち、活性層に弱く付着している表面および裏当てシート上の接着剤は、カバーシートからのヒドロゲル層の剥離を助ける。例えば、カバーシートは、フルオロポリマーなどの非接着性プラスチックから形成されてもよく、またはシリコーンまたはフルオロポリマー剥離コーティングのような剥離コーティングを備えてもよい。
【０２７０】
一実施形態では、創傷包帯は滅菌され、微生物不透過性容器に包装される。
【０２７１】
キット：
【０２７２】
特定の実施形態では、開示される技術は、式Ｉの化合物を、場合により賦形剤、担体または油と一緒に、１つまたは別々の区画に含むキットを提供する。キットは、さらなる成分、例えばゲル化剤、皮膚軟化剤、界面活性剤、湿潤剤、増粘剤、乳化剤などを１つ以上の区画にさらに含むことができる。キットは、場合により、創傷、例えば、慢性創傷または感染創傷を診断、検出または治療するための物品を配合するための説明書を含むことができる。キットはまた、創傷の治療において、個々にまたは一緒に、要素を使用するための説明書を含むことができる。
【０２７３】
関連する実施形態では、開示される技術は、パッケージと、上述の組成物を含む少なくとも１つの吸収性物品（上述）とを含むキットを提供する。あるいは、キットは、個々の要素を別々に、場合によっては二次情報と一緒に、パッケージ内で、またはパッケージと共に使用することができる。
【０２７４】
本明細書に開示される他の実施形態は、創傷の治療のための包帯を調製するための組成物の使用に関する。好ましくは、創傷は、慢性創傷、例えば、静脈性潰瘍、褥瘡および糖尿病性潰瘍からなる群から選択される創傷である。
【０２７５】
表面：
【０２７６】
開示される技術の実施形態は、上述の式Ｉの化合物を含む表面をさらに提供し、ここで、レポーターまたはペプチドは、パートナー、例えば酵素への結合を可能にするように配向される。好ましくは、表面は、固体支持体の表面である。数多くの多様な固体支持体が、当業者に知られている。有用な固体支持体としては、天然ポリマー炭水化物およびその合成改質された誘導体、架橋または置換された誘導体、例えば、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル、特に、硝酸およびカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステルおよびセルロースエーテル；窒素を含有する天然ポリマー、例えば、タンパク質および誘導体、架橋または変性したゼラチン；ラテックスおよびゴムなどの天然炭化水素ポリマー；適切な多孔性構造を用いて調製されてもよい合成ポリマー、例えば、ビニルポリマー、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解された誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上述の重縮合物のコポリマーおよびターポリマー、例えば、ポリエステル、ポリアミドおよび他のポリマー、例えば、ポリウレタンまたはポリエポキシド；多孔性無機材料、例えば、アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩；およびアルミニウムまたはケイ素の酸化物または水和物、例えば、クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの物質は、上述のポリマー材料とともにフィルターとして使用されてもよい）；および上述の種類の混合物またはコポリマー、例えば、既に存在する天然ポリマーに対して合成ポリマーの重合を開始することによって得られるグラフトコポリマーが挙げられる。
【０２７７】
一実施形態では、支持体は、アレイプレートのウェル、例えばマイクロアレイである。そのようなアレイを構築するための方法は、当技術分野、例えば、Ｃａｏら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７７（２３）：８２１９-８２２５、２０１１で公知である。式Ｉの各化合物（またはペプチド指標のみ）は、アレイ中の物理的欠陥に起因する不規則なデータを排除するために三重にスポットされてもよい。
【０２７８】
システム：
【０２７９】
開示された技術の実施形態は、前述の組成物および／またはキットを含む診断システムをさらに提供する。
【０２８０】
診断システムの様々な要素は、様々な形態で提供され得る。例えば、式Ｉの化合物（例えば、ペプチドレポーターを含む化合物）は、凍結乾燥された試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥された試薬は、凍結乾燥の前に予備混合されて、再構成されたとき、アッセイで使用する準備ができた各要素の適切な比率を有する完全な混合物を形成する。さらに、開示された技術の診断システムは、キットの凍結乾燥された試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。
【０２８１】
核酸
【０２８２】
一実施形態では、以下のペプチドをコードする核酸が本明細書に含まれる：
【０２８３】
ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）、ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１，Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、ＬおよびＺは、それぞれ上述の通りである。
【０２８４】
一実施形態では、本明細書に含まれるのは、以下のペプチドＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）をコードする核酸であり、ここで、Ｘ、ｙ、ＵおよびＺはそれぞれ上に記載されている。
【０２８５】
「核酸」または「核酸配列」という語句は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの任意のフラグメント、ゲノム、または合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、一本鎖または二本鎖であってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表していてもよく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様の物質を表していてもよい。これに関連して、「フラグメント」は、長さが約１０ヌクレオチドより大きく、最も好ましくは長さが少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドである核酸配列を指す。
【０２８６】
本明細書に開示される実施形態は、さらに、上述のポリヌクレオチドのバリアントに関する。
【０２８７】
一実施形態では、本明細書に含まれるのは、ペプチドＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）（ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１，Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、ＬおよびＺは、それぞれ上述の通りである）をコードする核酸に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはもっと大きな同一性％を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる上述の核酸配列のバリアントである。
【０２８８】
一実施形態では、本明細書に含まれるのは、ペプチドＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）（ここで、Ｘ、ｙ、ＵおよびＺは、それぞれ上述の通りである）をコードする核酸に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはもっと大きな同一性％を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる上述の核酸配列のバリアントである。
【０２８９】
当業者は、コード核酸配列に到達するために、通常のソフトウェア、例えば、Ｔｈｒｅｅ−ｔｏ−Ｏｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ（それぞれの入力したポリペプチド配列について、３種類の可能性のある核酸配列を作成する）を使用してもよい。Ｔｈｒｅｅ−ｔｏ−Ｏｎｅソフトウェアは、ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇから自由に入手可能である。
【０２９０】
「同一性パーセント」または「同一性％」という語句は、２つ以上のアミノ酸または核酸配列の比較において見出される配列類似性のパーセンテージを指す。同一性パーセントは、例えばＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアパッケージ、ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて電子的に決定することができる。ＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムは、異なる方法（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ）に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作成することができる。（Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４、１９８８）。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムは、全てのペア間の距離を調べることによって、シーケンスをクラスタにグループ化する。クラスタはペアごとに整列され、次にグループに整列される。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａと配列Ｂとの間の類似性のパーセンテージは、配列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基の数を差し引き、配列Ｂのギャップ残基の数を差し引き、これを、配列Ａと配列Ｂとの間のマッチした残基の合計で割り算し、１００を掛け算することによって計算される。２つのアミノ酸配列間の相同性が低いかまたは相同性のないギャップは、類似性のパーセンテージの決定に含まれない。核酸配列間の同一性パーセントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法、またはＪｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法のような当該分野で公知の他の方法によっても計算することができる。（例えば、Ｈｅｉｎら、（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６−６４５を参照）。配列間の同一性は、例えば、ハイブリダイゼーション条件を変化させることによって、当技術分野で公知の他の方法によっても決定することができる。
【０２９１】
別の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはより低いストリンジェンシー条件下で、１つ以上の核酸分子にハイブリダイズするバリアントポリヌクレオチドが本明細書に含まれる。「ハイブリダイゼーション」は、この用語が本明細書で用いられる場合、核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２℃で、約５０％ホルムアミド中で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％ホルムアミドでの減ストリンジェントな条件下で起こり得る。特に、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、および２００μｇ／ｍｌの剪断および変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃での高ストリンジェンシー条件下で生じ得る。ハイブリダイゼーションは、上述のような減ストリンジェンシー条件下で起こり得るが、３５％ホルムアミド中、３５℃の低温で起こり得る。特定のレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的の核酸のプリン対ピリミジン比を計算し、それに応じて温度を調節することによってさらに狭めることができる。上述の範囲および条件の変形は、当該技術分野において周知である。
【０２９２】
本明細書で使用される用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的塩基間の水素結合の形成により２つの核酸配列の間に形成される複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中に存在していてもよく、または溶液中に存在する１つの核酸配列と、固体支持体（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピンまたはガラススライド、または細胞またはその核酸が固定した他の適切な基質）に固定された別の核酸配列との間で作られてもよい。
【０２９３】
別の実施形態では、上述の核酸のポリヌクレオチドフラグメントであるバリアントが本明細書に含まれる。
【０２９４】
本明細書には、１つ以上の核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えばＰＣＲプライマーも含まれる。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅、またはハイブリダイゼーションアッセイまたはマイクロアレイにおいて使用され得る、少なくとも約６ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、当該技術分野で一般的に定義されているように、用語「アンプリマー」、「プライマー」、「オリゴマー」および「プローブ」と実質的に等価である。
【０２９５】
本明細書には、ＰＮＡのような修飾核酸も含まれる。「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、本明細書で使用される場合、リシンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格に連結された少なくとも約５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子または抗遺伝子薬を指す。末端リシンは、組成物に溶解性を付与する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡに優先的に結合し、転写伸長を停止させ、ペグ化されて細胞内の寿命を延ばすことができる。（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９３）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．８：５３−６３を参照）。
【０２９６】
ベクター
【０２９７】
また、上述の核酸の１つ以上を含むベクターが本明細書に含まれる。一実施形態では、ベクターは、１つ以上のさらなる配列と操作可能に連動して、核酸、例えば、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］のためのポリペプチド配列、またはこれらの酵素開裂可能なフラグメントおよび／またはこれらの免疫原性フラグメントをコードする核酸をコードする少なくとも１つのタンパク質を含む。さらなる配列は、性質上合成されていてもよい。「作動可能に会合した」または「作動可能に連結した」という用語は、本明細書で使用される場合、機能的に関連した核酸配列を指す。プロモーターが、コードされたポリペプチドの転写を制御する場合、プロモーターは、コード配列と作動可能に会合しているか、または作動可能に連結されている。作動可能に会合または作動可能に連結された核酸配列は連続的であってもよく、リーディングフレームにおいて、ある遺伝子エレメント、例えばリプレッサー遺伝子はコードされたポリペプチドに連続的に連結されないが、ポリペプチドの発現を制御するオペレーター配列に依然として結合する。
【０２９８】
コドン最適化配列
【０２９９】
本明細書には、上述の核酸配列およびベクターのコドン最適化配列が含まれる。宿主細胞、例えば大腸菌または昆虫Ｈｉ５細胞のような細菌における発現のためのコドン最適化は、アイオワ州コーラルビルのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から自由に入手可能なコドン最適化ツール（ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を用いて日常的に行うことができる。
【０３００】
宿主細胞
【０３０１】
本明細書には、上述の核酸配列およびベクターを含む宿主細胞が含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、標準的な培養条件下、ベクターに含まれる遺伝子配列を組換えにより発現し、ポリペプチド産物、例えば、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］のためのポリペプチド配列、またはこれらの酵素開裂可能なフラグメントおよび／またはこれらの免疫原性フラグメントを作成することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。
【０３０２】
ポリペプチド
【０３０３】
一実施形態では、本明細書には、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］。
一実施形態では、本明細書に含まれるのは、例えば、ポリペプチド配列ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）、またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）、または、ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）（ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、それぞれ上述の通りである）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、またはもっと大きな同一性％を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる上述のポリペプチドのバリアントである。特に、このフラグメントは、本明細書に記載の酵素、例えばリゾチーム、エラスターゼ、カテプシンＧ、ＭＡＯ、プロテイナーゼ３Ｃまたはこれらの組み合わせのための酵素認識部位（Ｒ）の最小構造モチーフを含む。これに代えて、またはこれに加えて、フラグメントペプチドは、抗体またはその抗原結合ドメインによって認識され得る免疫原性分子である。
【０３０４】
相同体
【０３０５】
別の実施形態では、本明細書に含まれるのは、上述のペプチドおよびポリヌクレオチドに対する相同体である。用語「相同性」は、本明細書で使用される場合、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全相同性が存在し得る。「同一性」という単語は、「相同性」という単語に置き換えることができる。同一の配列を少なくとも部分的に阻害して標的核酸にハイブリダイズする部分相補配列は、「実質的に相同性」と呼ばれる。標的配列に対する完全に相補的な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、ストリンジェンシーの低下した条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて調べることができる。実質的に相同な配列またはハイブリダイゼーションプローブは、ストリンジェンシーの低下した条件下で完全に相同な配列の標的配列への結合を競合し、阻害する。このことは、ストリンジェンシーの低下した条件が、２つの配列のお互いの結合が特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることを必要とするため、ストリンジェンシーの低下した条件が、非特異的な結合が許容されるようなものであることを意味するわけではない。非特異的結合が存在しないことは、部分的な相補性の程度（例えば、約３０％未満の相同性または同一性）さえも欠く第２の標的配列の使用によって試験することができる。非特異的結合がない場合、実質的に相同な配列またはプローブは、第２の非相補的標的配列にハイブリダイズしない。
【０３０６】
変異体
【０３０７】
別の実施形態では、本明細書に含まれるのは、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］のためのコアペプチド配列に変異を含むバリアントペプチド、またはこれらの酵素開裂可能なフラグメントである。
【０３０８】
一実施形態では、突然変異は、１〜３このアミノ酸の置換、欠失、付加である。好ましくは、突然変異は、そのように形成された変異ペプチド中の酵素認識部位を変化させない。突然変異が認識部位または開裂部位の組成変化を引き起こす場合、突然変異は、保存されたアミノ酸置換に起因すると考えられる。
【０３０９】
本明細書で使用される場合、「挿入」または「付加」という用語は、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化によって、それぞれ、天然に存在する分子中に見出される配列に、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加をもたらすことを指す。「置換」は、本明細書で使用される場合、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドが、それぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによって置き換えられることを指す。
【０３１０】
抗体
【０３１１】
本明細書中に開示される実施形態は、上述の免疫原性ペプチドの１つ以上に特異的に結合する抗体をさらに含む。
【０３１２】
一実施形態では、抗体は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］。別の実施形態では、抗体は、これらのポリペプチドのフラグメントに結合する。本明細書では、そのような抗体の抗原結合フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメイン（合成によって生成された抗体を含む）（例えばファージディスプレイ技術を使用する）が考えられる。
【０３１３】
一実施形態では、抗体は、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］のためのポリペプチド配列、またはこれらの酵素開裂可能なフラグメントおよび／またはこれらの免疫原性フラグメントに結合する。本明細書では、そのような抗体の抗原結合フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメイン（合成によって生成された抗体を含む）（例えばファージディスプレイ技術を使用する）が考えられる。
【０３１４】
精製された分子
【０３１５】
本明細書には、精製された生体分子、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、および／または抗体分子（それらのコンジュゲートを含む）が含まれる。「実質的に精製された」という用語は、本明細書で使用される場合、その天然の環境から取り出され、単離または分離され、天然に付随する他の要素を少なくとも約６０％含まず、好ましくは約７５％含まず、最も好ましくは約９０％含まない核酸、アミノ酸または抗体を指す。
【０３１６】
本明細書に記載の実施形態では、生体分子は、化学種の様々な成分、例えば、アンカー領域および／または指標領域と組み合わせることによって改変されてもよく、その形態および／または機能性は、任意の天然要素と比較して、顕著に変化する。
【０３１７】
式Ｉの化合物を製造する製造方法：
【０３１８】
本明細書で提供される実施形態は、さらに、その前駆体を含め、式Ｉの化合物を製造する方法に関する。「前駆体」という用語は、中間生成物または最終生成物を生成するための反応剤として使用される任意の化合物を含む。
【０３１９】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、構造Ａ−Ｒ−Ｉを含む式Ｉの化合物を製造する方法であって、Ａが上述のアンカーであり、Ｉが上述の指標であり、アンカーを指標分子に、例えば共有結合を介して結合することを含む。一実施形態では、アンカーまたは指標は、創傷特異的マーカー、例えばヒドロラーゼなどの創傷特異的酵素、より具体的には上述のプロテアーゼまたはグリコシダーゼの認識部位（Ｒ）を含むことができる。この実施形態では、創傷特異的マーカーの基質は、例えば、アミノ酸、糖、ペプチド、多糖、核酸、脂質、ラクタムまたはこれらの組み合わせなどの加水分解可能な基質を含む。
【０３２０】
一実施形態では、アンカーは、ペプチド結合、グリコシド結合、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、無水物結合または同様の結合を介してレポーター分子にコンジュゲート化される。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」は、２つのアミノ酸間の縮合反応によって作られ、あるアミノ酸の酸部分と、他のアミノ酸のアミノ部分とが反応し、２つのアミノ酸間にペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が生成する。一実施形態では、ペプチド結合は、創傷特異的プロテアーゼ、例えばエラスターゼ、カテプシンＧ、プロテイナーゼＣ、またはＭＡＯ、またはそれらの組み合わせを用いて開裂される。本明細書で使用される場合、「グリコシド結合」は、糖（または糖類に由来する分子）のヘミアセタールまたはヘミケタール基と、アルコールなどのいくつかの化合物のヒドロキシル基との間に形成される。一実施形態では、ペプチド結合は、創傷特異的グリコシダーゼ、例えばリゾチームで開裂される。ラクタム結合は、アミドとラクトンとの間に形成され、多くの抗生物質のコア構造に見られる。一実施形態では、ラクタム結合は、β−ラクタマーゼによって開裂される。
【０３２１】
グリコシド、ペプチド、エステル、オキシエステル、アミド（ａｍｉｄｅ）、アミド（ａｍｉｄｏ）、オキシアミド、エーテル、スルホニル、スルフィニル、スルホンアミド、またはアルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノなどの他の結合を生成するための反応性部分をコンジュゲートする方法は、実施例に記載されている。
【０３２２】
別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、構造Ａ−Ｉを含む式Ｉの化合物を製造する方法であって、ここで、ＡおよびＩはそれぞれ、先に記載した通りである。
【０３２３】
一実施形態では、Ａは、グリコシド結合またはペプチド結合を介してＩにコンジュゲートされる。
【０３２４】
別の実施形態では、Ａは、親水性結合または疎水性結合を介してＩにコンジュゲートされる。
【０３２５】
一実施形態では、構造Ａ−Ｉを有する式Ｉの化合物は、最初にアンカー領域Ａを指標領域Ｉとコンジュゲートさせ、式Ｉの化合物を生成することによって合成される。
【０３２６】
別の実施形態では、指標は、遺伝子組み換え技術、例えば適切な宿主細胞において指標領域をコードする核酸を発現し、指標とアンカー領域とを合わせることによって、最初に合成される。この実施形態の下では、一例では、指標領域は、例えば親水的に、または疎水的にアンカー領域に結合する核酸配列を含むように設計される。親水性相互作用の１つの代表的な例は、指標分子中の極性アミノ酸と相互作用する、極性基を含有するアンカー（例えば、部分的にカルボキシル化された糖またはペプチドグリカン）の使用を含む。疎水性相互作用の別の代表的な例は、指標分子中の疎水性アミノ酸残基と相互作用する、非極性基を含有するアンカー（例えば、アミド化またはエステル化された側鎖（またはその誘導体））の使用を含む。
【０３２７】
一実施形態では、ペプチド指標、例えば、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチド：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］（バリアントポリペプチドを含む）を、宿主細胞発現系によって合成してもよい。このような方法は、例えば、上述のポリペプチドまたはバリアントのうち１つ以上をコードする構築物を作成することと、この構築物を適切なベクター（例えば、プラスミドベクターまたはバキュロウイルスベクター）に入れることと、このベクターを用いて、宿主細胞（例えば大腸菌または昆虫Ｈｉ５細胞）にトランスフェクトすることと、適切な条件下で宿主細胞を培養し、前記ベクターの発現を可能にすることと、場合により、発現したポリペプチドを培養物から精製することとを含んでいてもよい。
【０３２８】
別の実施形態では、ペプチド指標、例えば、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチド：ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｚ（配列番号１）、ＸｙＡＡＰＸｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号２）、ＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｚ（配列番号３）またはＸｙＡＡＰ（Ｖ／Ｆ／Ａ）Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号４）；ＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｚ（配列番号５）またはＸｙＮ４Ｎ３Ｎ２Ｎ１Ｘｙ−Ｌ−Ｚ（配列番号６）またはＸｙＵＵＵＵｙ−Ｚ（配列番号７）［ここで、Ｘ、ｙ、Ｎ１〜Ｎ４、Ｌ、ＺおよびＵは、すでに記載した通りである］（バリアントポリペプチドを含む）を、固相ペプチド合成を用いて合成してもよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１４）：２１４９−２１５４を参照）。
【０３２９】
さらに、構造Ａ−Ｒ−Ｉを有する式Ｉの化合物は、単一の反応チャンバまたは複数の反応チャンバで合成することができる。
【０３３０】
診断および治療法：
【０３３１】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物、包帯材料、物品、キットおよびシステムは、創傷、特に慢性創傷または感染創傷の診断または治療に有用である。任意の種類の創傷を診断および／または治療することができるが、実施形態は、創傷液が滲出する創傷の診断および治療に特に適している。例えば、創傷は、慢性または急性の創傷であってもよい。慢性創傷の代表的な例には、例えば、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、褥瘡、糖尿病性潰瘍および未知病因の慢性潰瘍が含まれる。急性創傷の代表的な例には、例えばおそらく意図的手術切開から生じる急性外傷性裂傷が含まれる。
【０３３２】
本明細書で使用される場合、「創傷液」という用語は、創傷の表面に存在するか、または吸引、吸収または洗浄によって創傷表面から除去される任意の創傷滲出物または他の液体（適切には実質的に血液を含まない）を指す。決定、測定または定量化は、患者の体から取り除かれた創傷液に対して適切に実施されるが、創傷液に対してｉｎ  ｓｉｔｕで実施することもできる。「創傷液」という用語は、通常、創傷部位から離れた血液または組織の血漿を意味しない。創傷液は、哺乳動物の創傷液、好適にはヒトの創傷液である。
【０３３３】
一実施形態では、診断方法は、創傷を、本明細書に記載される式Ｉまたは式ＩＩの化合物を含む少なくとも１つの組成物、このような化合物を含む包帯材料、このような材料または化合物を含む物品、このような材料または化合物を含むキット、またはこのような材料または化合物を含むシステムと接触させることと；創傷に関連するパラメータを測定することとを含む。特定の実施形態では、測定されるパラメータは、創傷特異的ヒドロラーゼのレベルまたは活性である。特に、測定されるパラメータは、ヒドロラーゼの活性である。
【０３３４】
前述の実施形態では、測定は、ｉｎ  ｓｉｔｕで、またはｅｘ  ｓｉｔｕで行うことができる。本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｓｉｔｕで」という用語は、システムまたは機器という観点で存在するか、または起こる工程、事象、物体または要素を指し、周囲の環境、例えば、組成物、物品、システムまたは機器と接触する生体材料を含む。一例として、ｉｎ  ｓｉｔｕでの反応は、ヒト皮膚組織によって与えられる要素（例えば、酵素を含む創傷滲出物）を含め、機器中に存在する種々の要素（例えば、式Ｉまたは式ＩＩの化合物）の反応を指していてもよい。この用語は、環境の外側を指すｅｘ  ｓｉｔｕとは対照的である。
【０３３５】
第２の実施形態では、測定は、ｅｘ  ｓｉｔｕで行われ、例えば、開示する技術の装置または機器で分析するために、創傷から流体を取り出して行われる。
【０３３６】
適切には、ｉｎ  ｓｉｔｕで測定が行われる。
【０３３７】
１つの診断的実施形態では、本方法は、レポーター（例えば、創傷特異的酵素によって作用される基質の生成物）のレベルを決定することを含む。より具体的には、本方法は、ヒドロラーゼ酵素産物のレベルを決定することを含む。本明細書で使用される場合、用語「決定する」は、前記ヒドロラーゼの活性またはレベルの数値を測定すること、この活性またはレベルが、所定の範囲より上または下にあるかどうかを確立すること、および／または活性またはレベルの数値と、コントロール標準とを比較することを含む。コントロール標準は、未損傷部位または健常な被験体から得られた生検材料中のヒドロラーゼのレベルまたは活性を決定することを含んでいてもよい。
【０３３８】
ある特定の実施形態では、「決定する」という用語は、リパーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ナプシン（アスパルチルプロテアーゼ）、グルコシルセラミダーゼグルクロニダーゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、カテプシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｚ；酸セラミダーゼ、ラクトフェリン（ＬＦ）、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、エラスターゼ、カテプシンおよびプロテイナーゼ−３またはこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの創傷特異的酵素のパラメーター（例えば、活性またはレベル）を測定すること、前記パラメータが、第１の所定の閾値を超えるかどうかを確立すること、および／またはパラメータの数値とコントロール標準とを比較することを含む。コントロール標準は、未損傷部位または健常な被験体から得られた生検材料中のプロテアーゼのパラメータを決定することを含んでいてもよい。関連する実施形態では、「決定する」という用語は、複数の上述のプロテアーゼと関連するパラメータの加重平均（加重合計）が、上述の荷重平均についての所定の閾値を超えるかどうかを確立することを含む。
【０３３９】
特定の一実施形態では、パラメータは、創傷液中の検体（例えば、プロテアーゼ）の活性レベルである。典型的には、個々の検体の活性は、単位／ｍＬで表される。
【０３４０】
別の実施形態では、パラメータは、創傷液中の検体（例えば、プロテアーゼ）のレベルである。典型的には、量という用語も、特定の検体の指標である。
【０３４１】
本明細書で使用される場合、用語「合わせた量」または「合わせた活性」は、複数の値（例えば、個々の多くの検体について得られた値）に対する数学関数の適用から得られる単一の数値を指す。例えば、「合わせた量」または「合わせた活性」という用語は、個々の値の群の合計または積を指していてもよい。典型的には、「合わせた量」または「合わせた活性」という用語は、個々の値の群の合計に関する。例えば、適切な実施形態では、エラスターゼの量は、エラスターゼ様活性（例えば、Ｕ／ｍＬ）を指し、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の量は、それぞれの検体の総濃度（例えば、ｎｇ／ｍＬ）をいう。
【０３４２】
本明細書で使用される場合、「定量する」という用語は、実験誤差のマージン内で、サンプル中の特定の検体または基質の絶対量を測定することを指す。
【０３４３】
用語「マーカー」または「検体」は、本明細書で定義される装置、機器、キットまたは方法を使用して同定または決定される任意の化学種を指す。開示された技術の装置、機器、キットまたは方法によって決定または同定されたマーカーまたは検体は、前述の酵素の開裂生成物である。
【０３４４】
本明細書で使用される場合、用語「所定の範囲」は、特定の患者のサブクラスの指標となると当業者が理解するであろうデータ範囲またはプロファイルを指す。例えば、所定の範囲は、抗生物質治療のような特定の創傷治療に良好に応答する創傷に典型的なデータ範囲またはプロファイルであってもよい。あるいは、所定の範囲は、適切には、抗生物質治療のような特定の創傷治療に十分には応答しない創傷に典型的なデータ範囲またはプロファイルを指す場合がある。
【０３４５】
本明細書で使用される場合、「所定の閾値」という用語は、例えば、上にさらに説明するように、既知の治癒している創傷および治癒していない創傷について決定されるレベルの統計学的分析に基づく、治癒していない創傷の指標であると当業者が決定するであろう最小レベルを指す。試験が臨床的に有用であるためには、高いプロテアーゼ活性を有する治癒していない創傷が正しく同定されるように、閾値を適切なレベルに設定しなければならない。閾値を上げると、治癒していない創傷のみが閾値を上回る可能性が高くなる。しかし、閾値が高すぎると、高レベルのプロテアーゼに起因する治癒していない創傷は同定されず、臨床的に必要なプロテアーゼ調節治療を受けないことを意味する。
【０３４６】
本明細書で使用される場合、用語「コントロール標準」または「コントロール」は、別のデータ点またはデータセットを定義するか、または正規化するために、参照または比較として使用可能なデータセットまたはプロファイルを指す。例えば、用語「コントロール」または「コントロール標準」は、患者の特定のサブクラスの指標であるデータセットまたはプロファイルであってもよい。適切には、コントロール標準は、治癒している創傷状態または治癒していない創傷状態の指標となるデータセットまたはプロファイルであってもよい。
【０３４７】
適切には、開示された技術の他の態様または実施形態では、「コントロール」または「コントロール標準」は、創傷が、創傷治療（例えば、抗生物質治療）に応答性であるか、非応答性であるかを当業者が決定するための比較ツールとして使用可能なデータセットまたはプロファイルであってもよい。一実施形態では、コントロール標準は、創傷治療に十分に応答しない患者の指標となるデータセットまたはプロファイルである。典型的には、コントロール標準は、創傷治療に十分に応答する患者の指標となるデータセットまたはプロファイルである。本明細書に開示されるような創傷治療に十分に応答する傾向がある患者は、治療に十分に応答しない傾向がある患者よりも低いヒドロラーゼの合わせた量または活性を示す。例えば、本明細書中に開示される創傷治療に良好に応答する傾向がある患者は、少なくとも１つの創傷特異的ヒドロラーゼの合わせた量が、より低い。
【０３４８】
一実施形態では、閾値ヒト好中球エラスターゼ活性は、約５Ｕ／ｍＬ〜約３０Ｕ／ｍＬであり、その間の全ての値、例えば、約６Ｕ／ｍＬ、約７Ｕ／ｍＬ、約８Ｕ／ｍＬ、約９Ｕ／ｍＬ、約１０Ｕ／ｍＬ、約１１Ｕ／ｍＬ、約１２Ｕ／ｍＬ、約１３Ｕ／ｍＬ、約１４Ｕ／ｍＬ、約１５Ｕ／ｍＬ、約１６Ｕ／ｍＬ、約１７Ｕ／ｍＬ、約１８Ｕ／ｍＬ、約１９Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２１Ｕ／ｍＬ、約２２Ｕ／ｍＬ、約２３Ｕ／ｍＬ、約２４Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、またはそれ以上を含み、慢性創傷感染を示す。
【０３４９】
ある特定の実施形態では、少なくとも９．６の閾値ヒト好中球エラスターゼ活性のレベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも２２．９Ｕ／ｍＬのヒト好中球エラスターゼ活性のレベルは、慢性創傷感染を示す。
【０３５０】
一実施形態では、約１０００Ｕ／ｍＬ〜約１００００Ｕ／ｍＬ、その間の全ての値、例えば、約１１００Ｕ／ｍＬ、約１２００Ｕ／ｍＬ、約１３００Ｕ／ｍＬ、約１４００Ｕ／ｍＬ、約１５００Ｕ／ｍＬ、約１６００Ｕ／ｍＬ、約１７００Ｕ／ｍＬ、約１８００Ｕ／ｍＬ、約１９００Ｕ／ｍＬ、約２０００Ｕ／ｍＬ、約２１００Ｕ／ｍＬ、約２２００Ｕ／ｍＬ、約２３００Ｕ／ｍＬ、約２４００Ｕ／ｍＬ、約２５００Ｕ／ｍＬ、約２６００Ｕ／ｍＬ、約２７００Ｕ／ｍＬ、約２８００Ｕ／ｍＬ、約２９００Ｕ／ｍＬ、約３０００Ｕ／ｍＬ、約３２５０Ｕ／ｍＬ、約３５００Ｕ／ｍＬ、約３７５０Ｕ／ｍＬ、約４０００Ｕ／ｍＬ、約４２５０Ｕ／ｍＬ、約４５００Ｕ／ｍＬ、約４７５０Ｕ／ｍＬ、約５０００Ｕ／ｍＬ，約５２５０Ｕ／ｍＬ、約５５００Ｕ／ｍＬ、約５７５０Ｕ／ｍＬ、約６０００Ｕ／ｍＬ、またはそれ以上の閾値リゾチーム活性レベルは、慢性創傷感染を示す。ある特定の実施形態では、少なくとも４８００Ｕ／ｍＬのリゾチーム活性のレベルは、慢性創傷感染を示す。
【０３５１】
一実施形態では、約１０Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬ、この間の全ての値、例えば、約１５Ｕ／ｍＬ、約２０Ｕ／ｍＬ、約２５Ｕ／ｍＬ、約３０Ｕ／ｍＬ、約３５Ｕ／ｍＬ、約４０Ｕ／ｍＬ、約４５Ｕ／ｍＬ、約５０Ｕ／ｍＬ、約５５Ｕ／ｍＬ、約６０Ｕ／ｍＬ、約６５Ｕ／ｍＬ、約７０Ｕ／ｍＬ、約７５Ｕ／ｍＬ、約８０Ｕ／ｍＬ、約８５Ｕ／ｍＬ、約９０Ｕ／ｍＬ、約９５Ｕ／ｍＬ、約１００Ｕ／ｍＬ、約１１０Ｕ／ｍＬ、約１２０Ｕ／ｍＬ、またはそれ以上の閾値カテプシンＧ活性のレベルは、慢性創傷感染を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０Ｕ／ｍＬ、少なくとも４０Ｕ／ｍＬ、少なくとも３０Ｕ／ｍＬ、少なくとも２０Ｕ／ｍＬ、少なくとも１５Ｕ／ｍＬまたは少なくとも１０Ｕ／ｍＬのカテプシンＧ活性レベルは、慢性創傷感染を示す。
【０３５２】
本明細書に開示される実施形態は、さらに、本明細書に記載の組成物、材料、物品、包帯、キットおよび／またはシステムを使用する慢性創傷または感染創傷の治療に関する。治療実施形態は、開示された技術の組成物、材料、物品、包帯、キット、システムまたは機器を、それを必要とする被験体と接触させることを含む。場合により、この方法は、被験体が治療に応答しているかどうかの判定を含んでいてもよい。
【０３５３】
当業者は、創傷が「治療に応答する」か否かを容易に識別することができるであろう。特に、当業者は、創傷治療、特に酸化セルロースを含む創傷包帯での治療に対する良好な応答または不良な応答を予測するか、または指標となる、本特許請求の範囲で同定されるプロテアーゼのレベルを容易に決定することができるであろう。本明細書で使用される「応答性」および「応答物」という用語は、創傷治療、特に薬理学的作用物質（例えば、抗生物質）での治療に十分に応答すると考えられる創傷を指す。同様に、「非応答性」および「非応答物」は、創傷治療、特に薬理学的作用物質（例えば、抗生物質）での治療に十分に応答しないと考えられる創傷を指す。例えば、創傷治療の４週間後に創傷閉鎖が５０％より良好である患者は、前記治療に応答性であると考えられる。
【０３５４】
特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載の組成物、物品、システム、または機器で同時に診断され、治療されてもよい。本明細書で使用される場合、「同時に」という用語は、記載された目的、例えば診断および治療を一緒に行うことを意味する。
【０３５５】
特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載の組成物、物品、システム、または機器で逐次的に診断され、治療されてもよい。本明細書中で使用される場合、用語「逐次的に」は、述べられている目的（例えば、診断および治療）が、時間的または空間的に分割されていることを意味し、例えば、治療の前の診断、または診断の後の治療、またはこれらの組み合わせ、例えば、１回目の診断、治療、２回目の診断を意味する。
【０３５６】
本明細書に記載の実施形態は、さらに、介護者または患者が、創傷が、治癒しそうでないかどうかを迅速かつ確実に決定し、この決定に基づいて適切な治療を選択することを可能にする。例えば、治癒していない創傷は、治癒を促進するために、特殊な創傷包帯、例えば、特殊な治療薬剤を含む創傷包帯の適用を必要とする場合がある。したがって、本明細書に記載の実施形態は、さらに、創傷（例えば、慢性創傷または感染創傷）の治療方法であって、創傷が治癒しているか、治癒していないかを決定することと、その後、治癒していない場合には、創傷に治療薬剤を含む創傷包帯を適用することとを含む、方法を提供する。
【０３５７】
本明細書に記載の実施形態は、感染した創傷の診断または検出のための方法およびアッセイを提供する。これらの方法は、細菌性感染因子の検出に適している。一実施形態では、創傷を、グラム陰性菌に感染させる。典型的なグラム陰性細菌としては、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、およびｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。薬に関連して分類される場合には、呼吸器系の乱れを引き起こすＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、尿路系の乱れを引き起こすＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、消化器系の乱れを引き起こすＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇａｅｒｔｎｅｒ、およびマイクロコッカス、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａが挙げられる。
【０３５８】
別の実施形態では、創傷を、グラム陽性細菌に感染させる。「グラム陽性細菌」とは、テイコ酸（例えば、リポテイコ酸および／または壁テイコ酸）または機能的に等価な糖ポリマー（例えば、ラムノ多糖類、テイクロン酸、アラビノガラクタン、リポマンナン、およびリポアラビノマンナン）をその細胞壁に含む１または複数の細菌を意味する。機能的に等価なグリコポリマーの非限定的な例は、Ｗｅｉｄｅｎｍａｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、６：２７６−２８７、２００８に記載されている。
【０３５９】
細菌には、哺乳動物宿主（例えば、ウシ、ネズミ、ウマ、霊長類、ネコ、イヌ、およびヒトの宿主）に感染する病原性細菌が含まれる。このような病原性細菌の例としては、例えば、細菌種のメンバー、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、ＶｉｂｒｉｏまたはＬｉｓｔｅｒｉａが挙げられる。ヒト宿主に疾患を引き起こす病原性細菌のいくつかの臨床に関連する例としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、バンコマイシン耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＳＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅ���、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓが挙げられる。
【０３６０】
別の実施形態では、感染性細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、カルベペネム耐性Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（ＣＲ−Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ；ＣＲ−Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからなる群から選択される。別の実施形態では、感染性細菌は、多剤耐性Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、薬物耐性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、拡張されたスペクトルを有するβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生する腸内細菌科、バンコマイシン耐性ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、多剤耐性ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、薬物耐性非チフス性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、薬物耐性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉ、薬物耐性Ｓｈｉｇｅｌｌａ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、薬物耐性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび薬物耐性Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからなる群から選択される。別の実施形態では、感染性細菌は、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、エリスロマイシン耐性Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、クリンダマイシン耐性Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓからなる群から選択される。
【０３６１】
特定の実施形態では、慢性創傷または感染創傷は、宿主被験体において見出される。好ましくは、宿主は、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ヒト、家畜、コンパニオン動物、または非家畜動物または野生動物である。一実施形態では、被験体は、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類であってもよい。  別の実施形態では、被験体は、家畜であってもよい。適切な家畜の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカが挙げられるだろう。さらに別の実施形態では、被験体は、コンパニオン動物であってもよい。コンパニオン動物の非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギおよびトリなどのペットが挙げられるだろう。さらに別の実施形態では、被験体は、動物園の動物であってもよい。本明細書で使用される場合、「動物園の動物」は、動物園で見出され得る動物を指す。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型ネコ、オオカミおよびクマが挙げられるだろう。例示的な実施形態では、被験体はヒトである。
【０３６２】
一態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳動物の創傷において１つ以上の酵素のレベルを検出する方法であって、この方法は、（ａ）本明細書に記載の創傷包帯材料を哺乳動物の創傷と接触させた状態で配置する工程と、（ｂ）哺乳動物の創傷と接触した創傷包帯材料と、１つ以上の参照サンプルとを目視で比較する工程と、（ｃ）哺乳動物の創傷と接触した創傷包帯材料におけるレポーター分子の濃度を定性的に決定する工程とを含む。
【０３６３】
好ましくは、診断および治療は、ｉｎ  ｓｉｔｕで行われる。したがって、本明細書に記載の実施形態は、容易で非侵襲的な方法で創傷の診断および治療を可能にする。例えば、診断はリアルタイムで行うことができ、治療は、感染した創傷または患者に（全身的に）適用することができ、例えば、創傷治癒に起因するレポーター分子によって作られるシグナルの消失によって、創傷治療の進行をリアルタイムで監視することができる。
【０３６４】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、化学種を用いて創傷におけるプロテアーゼ活性を検出する方法であって、ここで、化学種は、アンカー領域、酵素不安定領域または酵素反応性領域、指標領域からなる群から選択される１つ以上の要素を含む。別の態様では、本方法は、任意の反応が目に見えるように、固体表面上にＭＰＯ、エラスターゼ、リゾチーム、ホスホリパーゼ、およびカタラーゼの基質を置くことを含む。別の態様では、本方法は、創傷液、涙、硝子体液、ＣＳＦ、気道吸引液または喀痰、滑膜、血液、血漿、血清、尿、腹膜、間質、皮下、胆汁、腸または類似の液体を含む種々の体液と、基質を含有する物質とを接触させ、その後の基質の変化を評価することによって、それらの体液を評価するのに役立つ。
【０３６５】
別の態様では、気道における感染を検出する方法が提供され、特定のサンプリングまたは通気機器との長期接触を介し、化学種を感染器官からの流体と接触させることを含む。
【実施例】
【０３６６】
本明細書に記載の構造、材料、組成物および方法は、代表的な例であることが意図されており、本開示の範囲は実施例の範囲によって限定されないことが理解される。当業者であれば、開示された構造、材料、組成物および方法のバリエーションを用いて、実施形態および開示された技術を実施することができ、そのような変形は本開示の範囲内であるとみなされることを認識するであろう。
【０３６７】
全てのイオン性化合物は、最後のステップに応じて、さらには特定されていないが、種々の対イオンを有する塩として取り扱われ、単離された。
【０３６８】
ポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートの「分子量」は、ＤＭＦ中のエタノールアミンとの反応および４０５ｎｍでの１Ｎ  ＮａＯＨ中の放出されたニトロフェノールの定量によって仮想分子量として決定された。仮想分子量＝物質（ｇ）／反応部位。「Ｈ−ＲＢＢ」は、レマゾールブリリアントブルーＲ（登録商標）とアンモニアとの反応生成物を指し（実施例２９を参照）、「ＲＢＢ」は、末端のそれぞれの基を指し、化合物名における「Ｈ−」は、ヒスチジンではなく水素を指し；「通常の状態」とは、室温、大気圧を意味し、湿度または酸素に対する保護手段は存在せず；ペプチドフラグメントは、当業者に公知の従来の方法によって合成され；任意のペプチドは、１文字コードで記述され；それにもかかわらず、一文字は、ヘテロ原子を指す場合もあり；「ＣＶ」は、ビス−（４−ジメチルアミノフェニル）−（４−［Ｎ−ピペラジノ］フェニル）−カルベニウムイオン（クリスタルバイオレットの誘導体）を意味する。
【０３６９】
実施例１Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−インドキシルエステル
【化６】
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【０３７０】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＯＨ（４３．４７ｇ、７５．１２ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（１４．６２ｇ、９０．１９ｍｍｏｌ）を、粉末漏斗を介し、５００ｍＬ丸底フラスコに直接秤量した。ＤＣＭ（乾燥、１２０ｍＬ）をフラスコに直接添加し、さらなるＤＣＭ（乾燥、３０ｍＬ）を使用して粉末漏斗を洗浄し、これもフラスコに加えた。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間撹拌し、次いでアルゴンを混合物に通しながらさらに４５分間撹拌した。次いで、粉末漏斗を用いてインドキシルを一度に加えた。漏斗をＤＣＭ（乾燥１０ｍＬ）で洗浄し、これも反応混合物に加えた。アルゴンを反応混合物に流しながら室温で攪拌し、撹拌を１時間続け、さらなるＤＣＭ（乾燥、２０ｍＬ）を添加し、混合物にアルゴンを流しながら室温で撹拌を１０分間続けた。その後、アルゴン下、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をブフナー漏斗を介して濾紙で濾過し、分液漏斗に充填した。反応フラスコをＤＣＭ（３０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液−ＤＣＭを、ブフナー漏斗を介して同様に濾過し、分液漏斗にも充填した。水（３５０ｍＬ）を分液漏斗に加えた。抽出後、有機相を回収した。もはや色が洗い流されなくなるまで、分液漏斗をアセトンで洗い流し、その後、水で完全に満たした後、再び空にした。有機相を分液漏斗に再び充填し、水（３５０ｍＬ）でもう一度洗浄した。相分離後、有機相を清浄な三角フラスコに集め、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４、４０．５６ｇ）、濃縮乾固した。粗生成物をジエチルエーテル（６００ｍＬ）に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。固体をガラスフリットで濾別した。一部の固体はフラスコにくっついた。これをＤＣＭ（５０ｍＬ）で溶解し、濃縮乾固し、残りの固体に加えた。全ての固体をジエチルエーテル（６００ｍＬ）に再び懸濁させ、室温で一晩撹拌した。その後、固形物を再びガラスフリットで濾別した。フラスコにくっついた固体をＤＣＭ（５０ｍＬ）で溶解し、濃縮乾固し、残りの固体と合わせた。生成物を、穴をあけた濾紙で覆い、室温で７時間保存し、次いで、オイルポンプで乾燥させ（室温、２時間、０．００８ｍｂａｒ）、４１．４ｇ（７９．４％）の生成物を得た。
【０３７１】
実施例２Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−５−ブロモ−４−クロロ−インドキシルエステル
【化７】
2019512556.tif 000009
【０３７２】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＯＨ（１１７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（３９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、３ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で５分間撹拌した。次に混合物を室温で５分間撹拌し、混合物にアルゴンを通した後、５−ブロモ−４−クロロ−インドキシル（５０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物にアルゴンを５分間流し続け、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を加え、混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で３．５時間撹拌した。その後、反応混合物を濃縮乾固し、アルゴン雰囲気下、冷凍庫で１８日間保存した。粗生成物をクロマトグラフィーにかけた。１５．８ｇのシリカゲル、溶出液：２％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液。まだ混入物質を含む青色固体（４２ｍｇ）を得た。生成物を、２回目のクロマトグラフィーにかけた。：１３．７ｇのシリカゲル、溶出剤：ＥｔＯＡｃ  ／シクロヘキサン（３：１、２００ｍＬ）を溶出液として開始し、純粋なＥｔＯＡｃへと変化させた。ほぼ無色の固体（３２ｍｇ）が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：８０５，［Ｍ＋Ｎａ］＋：８２８，［Ｍ＋Ｋ］＋：８４４。
【０３７３】
実施例３  Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−インドキシルエステル
【化８】
2019512556.tif 000010
【０３７４】
アルゴン雰囲気下、室温でＦｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＯＨ（３６１ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１２７ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（１９０μＬ、０．９０ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１７９ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。次に、アルゴンを混合物に流しつつ、インドキシル（５５ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応混合物にアルゴンを５分間以上流し続け、次いで、さらなるＤＣＭ（２ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）を加え、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出した（相分離を促進するために、塩水（５ｍＬ）を添加した）。有機相を塩水（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物を、溶媒としてＤＣＭを用いて開始するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１５．０ｇ、４０〜６３μｍ）により精製した。全ての青色および桃色がカラムから洗い落とされるまで、カラムをＤＣＭで溶出した。次に、溶出液を、５％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液に変更した。無色の生成物（８８ｍｇ）およびわずかに桃色の（混入物質を含む）固体（４９ｍｇ）を集めた。
【０３７５】
実施例４：Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−（Ｎ−アセチル）−インドキシルエステル
【化９】
2019512556.tif 000011
【０３７６】
アルゴン雰囲気下、室温で、Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＯＨ（３０５ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（９７．５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。５分後、ＤＩＰＥＡ（１４５．６μＬ、０．８６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１３８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した（混合物１）。並行して、アルゴン雰囲気下、室温でインドキシルアセテート（５０ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。アルゴンを溶液に５分間流してから、ＮａＯＭｅ（１５ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物に、アルゴンをさらに２０分間流し続けた（混合物２）。混合物１を数秒以内に混合物２に添加した。アルゴン流を、反応混合物に流して２時間パージし、次いで、混合物をアルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。混合物を濃縮乾固し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に再び溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×３０ｍＬ）、水（１×２０ｍＬ）および塩水（１×３０ｍＬ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル１５．０ｇ、４０〜６３μｍ、溶出液：ＤＣＭ）により精製し、固体生成物３３ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：８０７；［Ｍ＋Ｎａ］＋：８２９。
【０３７７】
実施例５：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−３−インドールアミド
【化１０】
2019512556.tif 000012
【０３７８】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＯＨおよびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏを、アルゴン雰囲気下、室温で、２５ｍＬの二ッ口丸底フラスコ中でＤＣＭ（乾燥）に溶解した。ＤＩＰＥＡおよびＥＤＣＩ・ＨＣｌを添加した。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌し、次いで、混合物にアルゴンを５分間流した。１Ｈ−インドール−３−アミンを一度に加え、アルゴンを混合物に５分間流し続けた。次いで、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。ＤＣＭ（２５ｍＬ）を加え、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（飽和）で抽出した。抽出後、有機相を塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。合わせた水相をＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）で抽出した。（５％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液：ＥｔＯＡｃ：１スポット；ＤＣＭ  ３スポットを用いた、ＥｔＯＡｃおよびＤＣＭ相のＴＬＣ）両方の有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、別個に濃縮乾固した。ＤＣＭ相からの粗生成物を、溶媒としてＤＣＭを用いて開始するカラムクロマトグラフィーにより精製した。全ての青色および桃色がカラムから洗い落とされるまで、カラムをＤＣＭで溶出した。次に、溶出液を、５％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液に変更した。収集物：３４ｍｇの茶色固体、ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：７６４；［Ｍ＋Ｎａ］＋：７８６。
【０３７９】
実施例６：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−４−メトキシ−１−ナフトールエステル
【化１１】
2019512556.tif 000013
【０３８０】
アルゴン雰囲気下、室温で、Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＯＨ（１６９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（５９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、３ｍＬ）に溶解した。１０分後、４−メトキシ−１−ナフトール（５０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で４５分間撹拌した。ＤＣＭ（３０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加えた。抽出後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製し、ベージュ色の固体５８ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：７３５；［Ｍ＋Ｎａ］＋：７５７。
【０３８１】
実施例７：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−１−ナフトールエステル
【化１２】
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【０３８２】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＯＨ（２４１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１０７ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、４ｍＬ）に懸濁させた。５分後、ＤＩＰＥＡ（１１９μＬ、０．７０ｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１３４ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、１−ナフトール（５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を一度に加え、混合物を室温でアルゴン雰囲気下、週末にわたって撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）および水（２０ｍＬ）を加え、混合物を抽出した。相分離が非常に遅かったため、塩水溶液（１０ｍＬ）を加え、混合物を再び抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製し、生成物１０６ｍｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：７０５；［Ｍ＋Ｎａ］＋：７２７。
【０３８３】
実施例８。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−（２−ナフトール）
【化１３】
2019512556.tif 000015
【０３８４】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＯＨ（２４１ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１０７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下室温で乾燥ＤＣＭ（３ｍＬ）に懸濁させた。５分後、ＤＩＰＥＡ（１１９μＬ、０．７ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１３４ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で４５分間撹拌した。次に２−ナフトール（５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を一度に加え、混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で２時間撹拌した。ＤＣＭ（３０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）を加えた。抽出後、有機相をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固してほぼ無色の固体２５０ｍｇを得た。精製のために、粗生成物をシリカゲルの短いカラム、溶出液：５％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液に流した。収量：１６８ｍｇの無色固体（６８％）。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｈ］−：８５３。
【０３８５】
実施例９：メチル−３−Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−アミド−４−アミノベンゾエートおよびメチル−３−アミノ−４−Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−アミノベンゾエート
【化１４】
2019512556.tif 000016
【０３８６】
アルゴン雰囲気下、室温で、Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＯＨ（２１４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（９１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）に懸濁させた。５分後、ＤＩＰＥＡ（１０５μＬ、０．６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌ（１１５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で４５分間撹拌した。次いで、メチル３，４−ジアミノベンゾエート（５０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を一度に加え、続いてさらなるＤＣＭ（乾燥、１ｍＬ）を加え、混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）を加えた。抽出後、有機相を飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４溶液で乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。溶出液：２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（約１２０ｍＬ）で開始し、次いで、５％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液に変更した。収量：両方の異性体の混合物を含めて９７ｍｇ、１つの異性体のみが１０ｍｇ。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：７２７；［Ｍ＋Ｎａ］＋：７４９。
【０３８７】
実施例１０。Ｎ−（１−［２−ヒドロキシ］テトラデカニル）Ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ  ＲＲ（Ｎ−４−（１，３−ジメトキシ−２−Ｎ−ベンゾイルアミドフェニル）−Ｎ’−ｒａｃ−（２−ヒドロキシ−ｎ−テトラデシル）−アミン）
【化１５】
2019512556.tif 000017
【０３８８】
Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＲＲ染料（７．３ｍｍｏｌ）を３ッ口丸底フラスコに入れ、撹拌しながら（マグネチックスターラー、５００ｒｐｍ）、周囲温度でクロロホルム（３０ｍｌ）に溶解した。３０分後、１，２−エポキシテトラデカン（１１ｍｍｏｌ）を加え、続いて、硫酸（触媒）で処理した。環流するまで温度を上げ、撹拌を１２時間続けた。プロセス制御（ＥＳＩ−ＭＳ（＋ｐ））において、出発物質の完全消費を示したときに、固体を濾別し、気流中で乾燥させた。十分に純粋な形態で所望の生成物を得るためには、いくつかの再結晶段階（エタノール）が必要であった。収量：６００ｍｇ。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性モード）［Ｍ＋Ｈ］＋：４８５。
【０３８９】
実施例１１。Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−（ジアミノ安息香酸）
【化１６】
2019512556.tif 000018
【０３９０】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＯＨ（７１０ｍｇ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）を用いて溶解した。続いてＨＯＢｔ（２１０ｍｇ）およびＤＣＣ（２４０ｍｇ）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。３，４−ジアミノ安息香酸（１６０ｍｇ）およびピリジン（１００μＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）で溶解し、撹拌しながら反応混合物に加えた。１４時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をギ酸０．５％を含むシクロヘキサン／ＤＣＭ／メタノール（４／２／１）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、４００ｍｇの生成物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｈ］＝７８４。
【０３９１】
実施例１２。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−インドキシルエステル
【化１７】
2019512556.tif 000019
【０３９２】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−ＯＨ（９９４ｍｇ、１．５９ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（３０８ｍｇ、１．９０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解した。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌し、アルゴンを混合物に通しながらさらに２０分間撹拌し、その後、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を加えた。アルゴンを反応混合物に流しながら攪拌を２分間続けた後、インドキシル（２０８ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を一度に加えた。溶液にアルゴンを通過させながら撹拌を１５分間続け、その後、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下室温で一晩撹拌した。反応混合物を分液漏斗に充填し、フラスコをＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液−ＤＣＭを分液漏斗に加えた。混合物を水（３０ｍｌ）で洗浄し、有機相と水相との間のスラリーを、有機相と共に回収した。有機相を水（３０ｍＬ）で再び洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に懸濁させ、室温で９０分間撹拌した。次いで固体を濾別し、新鮮なＥｔ２Ｏ（４０ｍＬ）に再懸濁し、室温で一晩撹拌した。固体を濾別し、オイルポンプで乾燥させて、４４４ｍｇ（３８％）の生成物を得た。
【０３９３】
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｈ］＋：７４２；［Ｍ＋Ｎａ］＋：７６４。
【０３９４】
実施例１３：Ｆｍｏｃ−ＡＡＡ−インドキシルエステル
【化１８】
2019512556.tif 000020
【０３９５】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＡ−ＯＨ（１０３ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（１０２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、６ｍＬ）に溶解した。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で１５分間撹拌し、アルゴンを混合物に通しながらさらに１０分間撹拌した。次に、インドキシル（３０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物にアルゴンを通過させながら撹拌を１０分間続け、その後、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄した（有機相と水相との間に多くの固体が存在する）。有機相を集め、水で１回、再び洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した（３３ｍｇのみ）。
【０３９６】
粗生成物をＥｔ２Ｏ（５ｍＬ）に取り、２分間振とうした。液体をデカンテーションし、７ｍｇ（５％）の所望の生成物を得ることができた。
【０３９７】
［Ｍ＋Ｎａ］＋：５９１。
【０３９８】
実施例１４：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＡ−インドキシルエステル
【化１９】
2019512556.tif 000021
【０３９９】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＡ−ＯＨ（２８５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（１０２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を、２５ｍＬの二ッ口丸底フラスコ中のＤＣＭ（乾燥、５ｍＬ）に溶解した（排気しながらヒートガンで加熱し、アルゴン雰囲気下で冷却した）。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で５分間撹拌し、アルゴンを混合物に通しながらさらに１０分間撹拌した。次に、インドキシル（７１ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を一度に加えた。アルゴンを混合物に通過させながら撹拌を１５分間続けた後、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で２日間撹拌した。混合物を分液漏斗に移し、水で２回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物をＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）に取り、室温で３０分間撹拌した。次にそれをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ）により精製して、２５ｍｇ（７％）の所望の生成物を得る。
【０４００】
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｎａ］＋：６８８。
【０４０１】
実施例１５。Ｆｍｏｃ−Ｖ−インドキシルエステル
【化２０】
2019512556.tif 000022
【０４０２】
Ｆｍｏｃ−Ｖ−ＯＨ（５０１ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（２９１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、６ｍＬ）に溶解した。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌し、アルゴンを混合物に通しながらさらに１０分間撹拌した。次いで、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍｌ）、続いてインドキシル（１９９ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物にアルゴンを通過させながら撹拌を１０分間続け、その後、さらなるＤＣＭ（乾燥、２ｍＬ）を添加し、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０４０３】
溶出液：ＤＣＭで開始し（カラムを、全ての青色および桃色がカラムから洗い流されるまで、ＤＣＭで洗浄した）、次いで、溶出液を５％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液に変更した。
【０４０４】
生成物は、最初の着色した画分と共にカラムを下っていった。
【０４０５】
生成物を、溶出液としてＤＣＭを用い、二回クロマトグラフィーにかけた。
以下の画分を集めた：２５〜３５（１３０ｍｇ）
３６〜４４（９２ｍｇ）。
４５〜５２（８１ｍｇ）。
全収量：２２２ｍｇ（３３％）
【０４０６】
画分３６〜４４のみが重量測定可能な固体を与えたので、これらの画分を試験に使用した。
【０４０７】
［Ｍ＋Ｎａ］＋：４７７。
【０４０８】
実施例１６：Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＡ−インドキシルエステル
【化２１】
2019512556.tif 000023
【０４０９】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＡ−ＯＨ（５０３ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（１９１ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、１０ｍＬ）に懸濁させた。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌し、アルゴンを混合物に通しながらさらに１０分間撹拌した。次に、インドキシル（１２５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を一度に加え、続いてさらなるＤＣＭ（乾燥、５ｍＬ）を加えた。混合物中にアルゴンを通しながら室温で撹拌を１５分間続けた後、さらに追加のＤＣＭ（乾燥、５ｍＬ）を加え、アルゴンを混合物に通しながら撹拌をさらに２分間続けた。次いで、アルゴン下、反応混合物を室温で一晩撹拌した。全ての溶媒を一晩蒸発させたので、ＤＣＭ（２５ｍＬ）を加え、混合物を室温で５分間撹拌した後、水（２×２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した。わずか５７ｍｇの粗生成物が得られた。多くの固体が水相中に保持されていたため、この固体を濾別し、乾燥させた。この固体を、上で得られた５７ｍｇと合わせた。合わせた固体をＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）に懸濁させ、室温で一晩撹拌した。固体を濾別し、２２９ｍｇ（３９％）の固体含有生成物および出発物質（ＦｍｏｃＡ−Ａ−Ａ−Ａ−ＯＨ）を得た。
【０４１０】
［Ｍ＋Ｈ］＋：６４０；［Ｍ＋Ｎａ］＋：６６２。
【０４１１】
実施例１７：Ｆｍｏｃ−ＡＰＶ−インドキシルエステル
【化２２】
2019512556.tif 000024
【０４１２】
Ｆｍｏｃ−ＡＰＶ−ＯＨ（４８２ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（１９１ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、１０ｍＬ）に溶解した。混合物を、室温、アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌し、アルゴンを混合物に通しながらさらに１０分間撹拌した。次に、インドキシル（１２５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を一度に加え、続いてさらなるＤＣＭ（乾燥、５ｍＬ）を加えた。混合物にアルゴンを通しながらＲＴで撹拌を１５分間続けた後、さらに追加のＤＣＭ（乾燥、５ｍＬ）を加え、アルゴンを反応混合物に通しながら撹拌を２分間続け、次いで反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物をＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。フラスコに付着したままの固体は、ほんのわずかであった。液体をデカンテーションし、固体を集めた（７６ｍｇ、１７％）。
【０４１３】
［Ｍ＋Ｎａ］＋：６４５。
【０４１４】
実施例１８：Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−インドキシルエステル
【化２３】
2019512556.tif 000025
【０４１５】
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（２．９ｇ、７．５ｍｍｏｌ）およびＣＤＩ（１．４７ｇ、９．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの３ッ口丸底フラスコに直接秤量する。ＤＣＭ（乾燥、５０ｍＬ）を加え、混合物を室温で５分間撹拌し、次いでアルゴンを通しながら室温で１０分間撹拌した。その後、追加のＤＣＭ（乾燥、４ｍＬ）、続いてインドキシル（１．００ｇ、７．６ｍｍｏｌ）を添加した。アルゴン流を混合物に流しつつ、室温で撹拌を３０分間続けた。次いで、追加のＤＣＭ（乾燥、１０ｍＬ）を加え、再び混合物を室温（アルゴン気流下）で２０分間撹拌した。最後に、アルゴン下、混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物を分液漏斗に充填し、フラスコをＤＣＭ（３０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液−ＤＣＭを分液漏斗に同様に充填した。水（１００ｍＬ）を加え、抽出後、有機相を回収し、清浄な分液漏斗に再充填した。有機相を水（１００ｍＬ）で再び洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物をジエチルエーテル（１００ｍＬ）に取り、精製した。それが完全に溶解したので、再び濃縮乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＤＣＭ）により精製した。集めた画分：
２８および２９：１５２ｍｇ
２２〜２７
３０〜４８
【０４１６】
画分２２〜２７を濃縮乾固した。次いで、ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加すると、青色の一部が溶解した。固体を濾別し、再溶解し、再び濃縮乾固して１３２ｍｇの生成物を得た。
【０４１７】
濾液を画分３０〜４８と合わせて、不純な生成物１．００ｇを得た。全収量：１．２８４ｇ（２６．５％）。
【０４１８】
［Ｍ＋Ｎａ］＋：５２５。
【０４１９】
実施例１９：Ａｃ−Ｐｈｅ−インドキシルエステル
【化２４】
2019512556.tif 000026
【０４２０】
Ａｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（１．５５ｇ、７．５ｍｍｏｌ）およびＣＤＩを１００ｍＬの３ッ口丸底フラスコに直接秤量する。ＤＣＭ（乾燥、５０ｍＬ）を加え、混合物を室温で５分間撹拌した。次いで、アルゴンを流しつつ、室温で１５分間撹拌した。１５分後、インドキシルを加えた（１．０１ｇ、７．６ｍｍｏｌ）。アルゴンを流しつつ、混合物を２０分間撹拌し続けた。この時点で、さらにＤＣＭ（乾燥、５ｍＬ）を添加し、撹拌（アルゴン流下）を２３分間続けた。もう１回、ＤＣＭ（乾燥、８ｍＬ）を添加し、室温で撹拌（アルゴン流下）を５分間続けた。次いで、アルゴン下、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を分液漏斗に充填し、フラスコをＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄し、同様に分液漏斗に充填した。水（８０ｍＬ）で洗浄した後、有機相を集め、清浄な分液漏斗に再充填した。混合物を再び水で洗浄し、有機相を集め、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。溶出液：青色と桃色の大部分が洗い流されるまで、ＤＣＭ（圧力下）で開始し、次に溶媒を２％ＭｅＯＨ  ＤＣＭ溶液に変え、クロマトグラフィーを圧力をかけずに続けた。ほとんど純粋な画分のみが回収された：１９６ｍｇ（８％）。
【０４２１】
［Ｍ＋Ｎａ］＋：３４５。
【０４２２】
実施例２０：Ｆｍｏｃ−Ｆ−Ｖ−Ｔ（Ｂｚｌ）−Ｆ−
【化２５】
2019512556.tif 000027
【０４２３】
Ｆｍｏｃ−Ｆ−Ｖ−Ｔ（Ｂｚｌ）−Ｆ−ＯＨ（１．２２８ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、１０ｍＬ）に懸濁させた。ＣＤＩ（２９１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌し、アルゴンを流しながら室温でさらに１５分間撹拌した。ＤＣＭ（乾燥、３ｍｌ）を添加し、混合物を室温でさらに２分間撹拌した後（アルゴン流下）、インドキシル（２００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。混合物を室温（アルゴン気流下）で４５分間撹拌した。その後、追加のＤＣＭ（乾燥、８ｍＬ）を添加し、混合物を室温で５分以上撹拌した後、アルゴンラインを除去し、混合物を室温でアルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加し、残りの青色固体を濾別し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を分液漏斗に充填し、水で２回洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物をＤＣＭ（７ｍＬ）に取り、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで沈殿（５８ｍｇ、５％）を濾別し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。
【０４２４】
［Ｍ＋Ｎａ］＋：９６２。
【０４２５】
実施例２１：β−ラクタムインドキシルエーテル
【化２６】
2019512556.tif 000028
【０４２６】
２５ｍＬの３ッ口丸底フラスコにインドキシル（３２７ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ）を秤量した（フラスコをヒートガンで真空中で加熱し、アルゴン雰囲気下で冷却した）。ＴＨＦ（乾燥、６ｍＬ）を加え、混合物にアルゴンを１０分間流しながら混合物を室温で撹拌した。次にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２２８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を一度に加え、室温で撹拌しながら永続的なアルゴン流を１５分間続けた。この時点で、４−メトキシベンジル３−クロロメチル−７−（２−フェニルアセトアミド）−３−セフェム−４−カルボキシラート（１．０１ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）を一度に加えた。アルゴン流下、室温で混合物の撹拌をさらに３０分間続けた。生成物をＥＳＩ−ＭＳにより検出した。  ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋＝６０６；［Ｍ＋Ｋ］＋＝６２２。
【０４２７】
実施例２２。Ｎ−（プロパルギル）−（ＲＢＢ）
【化２７】
2019512556.tif 000029
【０４２８】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、１，３−双極子［３＋２］環化付加（「クリック化学」に由来する染料コンジュゲート。
【０４２９】
合成：レマゾールブリリアントブルーＲとプロパルギルアミン塩酸塩との反応は、通常条件下、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中で行われた。反応のモニタリングは、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）を用いて行った。生成物を水相から酢酸エチルで抽出し、次の反応（１，３−双極性［２＋３］−環化付加）に使用するのに十分な純度で沈殿させた。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：５３８。
【０４３０】
実施例２３。Ｆｍｏｃ保護された試薬（Ｆｍｏｃ−Ｖ）−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチル）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド）（Ｆｍｏｃ−Ｖ−トリアゾール−ＲＢＢ）
【０４３１】
実施例２２を、ＦＭＯＣ−バリン−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−アジドプロピル、アミドとクリック化学反応条件（ヒューニッヒ塩基、銅触媒）を用いて反応させた。反応生成物は、以下のさらなる実施例において使用される。
【０４３２】
実施例２４。Ｈ−Ｖ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチル）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（Ｈ−Ｖ−トリアゾール−ＲＢＢ）
【化２８】
2019512556.tif 000030
【０４３３】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロックに由来する染料コンジュゲート。
【０４３４】
合成：Ｆｍｏｃ保護試薬（Ｆｍｏｃ−Ｖ−トリアゾール−ＲＢＢ、実施例２３）とメタノール中のピペリジンとの反応を、通常条件下で行った。反応のモニタリングは、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）を用いて行った。生成物は、後の反応（アミド化）に使用するのに十分な純度で真空下で乾燥させて沈殿した。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：７５３。
【０４３５】
実施例２５。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡＶ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチル）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡＶ−トリアゾール−ＲＢＢ）
【化２９】
2019512556.tif 000031
【０４３６】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４３７】
合成：ＤＣＭ中のペンタペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．２当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１．２当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ｖ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチロ）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（１当量；実施例２４）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで、反応混合物を室温で撹拌した。真空中で揮発性物質を単純に除去すると、粗生成物が青色アモルファス固体として得られた。収率：約８３％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１３８５。
【０４３８】
実施例２６。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチル）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−トリアゾール−ＲＢＢ）
【化３０】
2019512556.tif 000032
【０４３９】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４４０】
合成：ＤＣＭ中のトリペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．２当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１．２当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ｖ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチロ）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（１当量；実施例２４）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで、反応混合物を室温で撹拌した。水性処理により、青色アモルファス固体として粗生成物が得られた。収率：約９０％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１２１４。
【０４４１】
実施例２７。Ｈ−ＡＡＰＶＡＶ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチル）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（Ｈ−ＡＡＰＶＡＶ−トリアゾール−ＲＢＢ）
【化３１】
2019512556.tif 000033
【０４４２】
レマゾールブリリアントブルーＲに基づく染料−ペプチドコンジュゲートの合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡＶ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチロ）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（１当量；実施例２５）を、メタノール／ピペリジン（２：１）の混合物を用い、周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１６２
【０４４３】
実施例２８。Ｈ−ＡＡＰＶ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチル）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド）（Ｈ−ＡＡＰＶ−トリアゾール−ＲＢＢ）
【化３２】
2019512556.tif 000034
【０４４４】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４４５】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−｛２−ヒドロキシ−３−［１−（５−（Ｎ−ＲＢＢ−メチロ）１，２，３−トリアゾリル）｝プロピルアミド（１当量；実施例２６）を、メタノール／ピペリジン（２：１）の混合物を用い、周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９９２。
【０４４６】
実施例２９。ＲＢＢ−アミン（Ｈ−ＲＢＢ）
【化３３】
2019512556.tif 000035
【０４４７】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、アミノ化／アミド化のための出発物質に由来する染料コンジュゲート。
【０４４８】
合成：レマゾールブリリアントブルーＲと水酸化アンモニウム溶液との反応を、氷浴で初期冷却しながら、通常条件下で行った。反応をＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）を介してモニタリングした。生成物を水相から濾過し、後の反応（アミド化）に使用するのに十分な純度で沈殿させた。収率：６４％を超える（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：５００。
【０４４９】
実施例３０。（ＲＢＢ）−アミド−Ｆｍｏｃ−アラニン（Ｆｍｏｃ−Ａ−ＲＢＢ）
【化３４】
2019512556.tif 000036
【０４５０】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロックに由来する染料コンジュゲート。
【０４５１】
合成：Ｈ−ＲＢＢ（実施例２９）とＦｍｏｃ−アラニンペンタフルオロフェニルエステルとの反応を、エタノール中、通常条件下で行った。反応のモニタリングは、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）を用いて行った。生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて水相から抽出し、減圧下で乾燥させて沈殿させ、その後の反応（脱保護／アミド化）に使用するのに十分な純度で沈殿させた。収率：９０％を超える（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：７９３。
【０４５２】
実施例３１。ＲＢＢ−アミド−アラニン−ＮＨ２（Ｈ−Ａ−ＲＢＢ）
【化３５】
2019512556.tif 000037
【０４５３】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、アミノ酸ビルディングブロックペプチド合成に由来する染料コンジュゲート。
【０４５４】
合成：Ｆｍｏｃ−Ａ−ＲＢＢ（実施例３０）とメタノール中のピペリジンとの反応を、通常条件下で行った。反応のモニタリングは、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）を用いて行った。生成物は、後の反応（アミド化）に使用するのに十分な純度で真空下で乾燥させて沈殿した。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：５７１。
【０４５５】
実施例３２。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡＡ−ＲＢＢ
【化３６】
2019512556.tif 000038
【０４５６】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４５７】
合成：ＤＣＭ中のペンタペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．２当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１．２当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ａ−ＲＢＢ（１当量；実施例３１）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。水性処理により、青色アモルファス固体として粗生成物が得られた。収率：約５８％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１２０２。
【０４５８】
実施例３３。Ｈ−ＡＡＰＶＡＡ−ＲＢＢ
【化３７】
2019512556.tif 000039
【０４５９】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４６０】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡＡ−ＲＢＢ（１当量、実施例３２）を周囲温度でメタノール／ピペリジン（２：１）の混合物で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９８０。
【０４６１】
実施例３４。アクリルアミド−ＡＡＰＶＡＡ−ＲＢＢ
【化３８】
2019512556.tif 000040
【０４６２】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４６３】
合成：Ｈ−ＡＡＰＶＡＡ−ＲＢＢ（１当量；実施例３３）をメタノールに溶解し、撹拌しながら周囲温度でアクリル酸ペンタフルオロフェニルエステル（１．２当量）で処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応のモニタリングは、約１２時間（一晩）後に、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発性物質の単純な蒸発により、粗生成物を、次の工程のために十分に純粋な青色アモルファス固体として得た。収率：９５％を超える（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：５９９。
【０４６４】
実施例３５。Ｆｍｏｃ−ＶＡ−ＲＢＢ
【化３９】
2019512556.tif 000041
【０４６５】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロックに由来する染料コンジュゲート。
【０４６６】
合成：メタノール中のＨ−Ａ−ＲＢＢ（１当量；実施例３１）の溶液を周囲温度で撹拌しながらＦｍｏｃ−バリン−ＯＰｆｐエステルで処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示した後、反応混合物を水性後処理に付し、ＤＣＭで抽出した。高減圧下でＤＣＭを蒸発させると、粗生成物が青色アモルファス固体として得られた。収率：約４８％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：８９２。
【０４６７】
実施例３６。Ｈ−ＶＡ−ＲＢＢ
【化４０】
2019512556.tif 000042
【０４６８】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロックに由来する染料コンジュゲート。
【０４６９】
合成：Ｆｍｏｃ−ＶＡ−ＲＢＢ（１当量；実施例３５）をメタノール／ピペリジン（２：１）の混合物で周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：６７０。
【０４７０】
実施例３７。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦＡ−ＲＢＢ
【化４１】
2019512556.tif 000043
【０４７１】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４７２】
合成：ＤＣＭ中のテトラペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰＦ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ａ−ＲＢＢ（０．８当量；実施例３１）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。水性後処理と、高減圧下での揮発物質の蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収率：約９８％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１７９。
【０４７３】
実施例３８。Ｈ−ＡＡＰＦＡ−ＲＢＢ
【化４２】
2019512556.tif 000044
【０４７４】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４７５】
合成：撹拌しながら、周囲温度で４５分間、メタノール／ピペリジン（２：１）の混合物でＦｍｏｃ−ＡＡＰＦＡ−ＲＢＢ（１当量）（実施例３７）を処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９５７。
【０４７６】
実施例３９。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ
【化４３】
2019512556.tif 000045
【０４７７】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４７８】
合成：ＤＣＭ中のペンタペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．２当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１．２当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−ＲＢＢ（１当量；実施例２９）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで混合物を室温で撹拌した。水性処理により、青色アモルファス固体として粗生成物が得られた。収率：約２３％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１３１。
【０４７９】
代替合成１：ＤＣＭ中のトリペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−ＶＡ−ＲＢＢ（０．８当量；実施例３６）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した（約１５時間、一晩）。水性後処理と、高減圧下での揮発物質の蒸発により、十分に純粋な粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収率：約７０％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１３１。
【０４８０】
代替合成２：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＯＨ（１１０ｍｇ）およびＨＯＢｔ（５０ｍｇ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に懸濁させた。ＤＣＣ（５０ｍｇ）を添加した。５分間撹拌した後、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解したＨ−ＲＢＢ（１００ｍｇ；実施例２９）を添加した。２時間撹拌した後、反応はＭＳにより示されるように完了した。粗混合物をＦｍｏｃ脱保護のために取り出した（実施例４０の代替合成を参照のこと）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１３１。
【０４８１】
実施例４０。Ｈ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ
【化４４】
2019512556.tif 000046
【０４８２】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４８３】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（１当量；実施例３９）をメタノール／ピペリジン（２：１）の混合物で周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９０９。
【０４８４】
代替合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢの粗ＤＭＦ混合物（実施例３９の交互合成２由来）を用いて、ピペリジン（２００μＬ）を加え、混合物を一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をメタノール（約５０ｍＬ）に再溶解した。１０ｍｌになるまで濃縮した後、深青色の上清をジエチルエーテル（２００ｍＬ）に注いだ。沈殿を単離し、乾燥させて１４５ｍｇの微細な青色粉末（Ｈ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９０９。
【０４８５】
実施例４１。Ｆｍｏｃ−Ｖ−ＲＢＢ
【化４５】
2019512556.tif 000047
【０４８６】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロックに由来する染料コンジュゲート。
【０４８７】
合成：メタノール中のＨ−ＲＢＢ（１当量；実施例２９）の溶液を周囲温度で攪拌しながらＦｍｏｃ−バリン−ＯＰｆｐエステルで処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示した後、反応混合物を水性後処理に付し、ＤＣＭで抽出した。高減圧下でのＤＣＭの蒸発により、粗生成物を白色アモルファス固体として得た。収率：約３１％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：８２１。
【０４８８】
実施例４２。Ｈ−Ｖ−ＲＢＢ
【化４６】
2019512556.tif 000048
【０４８９】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲ、ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロックに由来する染料コンジュゲート。
【０４９０】
合成：Ｆｍｏｃ−Ｖ−ＲＢＢ（１当量；実施例４１）をメタノール／ピペリジン（２：１）の混合物で周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：５９９。
【０４９１】
実施例４３。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ
【化４７】
2019512556.tif 000049
【０４９２】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４９３】
合成：ＤＣＭ中のトリペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ｖ−ＲＢＢ（０．８当量；実施例４２）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した（約１５時間、一晩）。水性後処理と、高減圧下での揮発物質の蒸発により、十分に純粋な粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収率：約７０％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１０６０。
【０４９４】
実施例４４。Ｈ−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ
【化４８】
2019512556.tif 000050
【０４９５】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４９６】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（１当量；実施例４３）をメタノール／ピペリジン（２：１）の混合物で周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、十分に純粋な粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：８３８。
【０４９７】
実施例４５。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化４９】
2019512556.tif 000051
【０４９８】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０４９９】
合成：ＤＣＭ中のテトラペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰＦ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−ＲＢＢ（０．８当量；実施例２９）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。水性後処理と、高減圧下での揮発物質の蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収率：約９８％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１０８。
【０５００】
実施例４６。Ｈ−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化５０】
2019512556.tif 000052
【０５０１】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０５０２】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ（１当量）（実施例４５）をメタノール／ピペリジン（２：１）の混合物で周囲温度で４５分間撹拌しながら処理した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応のモニタリング（−ｐ）は、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発物質の単純な蒸発により、粗生成物を青色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：８８６。
【０５０３】
実施例４７。アクリルアミド−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化５１】
2019512556.tif 000053
【０５０４】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０５０５】
合成：Ｈ−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ（１当量；実施例４６）をメタノールに溶解し、撹拌しながら周囲温度でアクリル酸ペンタフルオロフェニルエステル（３当量）で処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応のモニタリングは、約１２時間（一晩）後に、出発物質の消費を示した。真空下での揮発性物質の単純な蒸発により、粗生成物が得られ、これを再びＤＣＭに溶解し、不溶性の白色副生成物が残った。その後、濾過した際に、高減圧下での蒸発により、生成物を、次の工程のために十分に純粋な青色アモルファス固体として得た。収率：約９８％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９４。
【０５０６】
実施例４８。Ｆｍｏｃ−バリン−（３−アジド−２−ヒドロキシ）−プロピルアミド
【化５２】
2019512556.tif 000054
【０５０７】
種類：ペプチド合成のためのアミノ酸ビルディングブロック、１，３−双極子［３＋２］−環化付加のための基質。
【０５０８】
合成：Ｆｍｏｃ−Ｎ−（２−エポキシプロピル−１−アミド）−バリン（１当量）をＤＣＭに溶解した。アジ化ナトリウム（過剰）を水に溶解し、水相を攪拌しながら（＞１０００ｒｐｍ）、周囲温度で有機溶液に添加した。触媒量の相間移動触媒である硫酸水素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを添加し、続いて触媒量の硫酸を添加した。後者は経時的に消費され、ＥＳＩ−ＭＳ（＋ｐ）による反応モニタリングが出発物質の完全な変換を示すまで、定期的に更新する必要があった。水性後処理と、高減圧下での揮発性物質の蒸発により、無色からベージュ色の粗生成物をアモルファス固体として得た。収率：６６％（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｎａ］＋：４６０。
【０５０９】
実施例４９。アクリルアミド−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ
【化５３】
2019512556.tif 000055
【０５１０】
種類：レマゾールブリリアントブルーＲに由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０５１１】
合成：Ｈ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（１当量；実施例４０）をメタノールに溶解し、撹拌しながら周囲温度でアクリル酸ペンタフルオロフェニル活性エステル（１．２当量）で処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応のモニタリングは、約１２時間（一晩）後に、出発物質の消費を示した。高減圧下での揮発性物質の単純な蒸発により、粗生成物を、次の工程のために十分に純粋な青色アモルファス固体として得た。収率：９５％を超える（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９６３。
【０５１２】
実施例５０。ビス−アミノエチル−（レマゾールブラックＢ）
【化５４】
2019512556.tif 000056
【０５１３】
種類：レマゾールブラックＢ、アミノ化／アミド化基質に由来する染料コンジュゲート。
【０５１４】
合成：レマゾールブラックＢ（１当量）を水に溶解し、撹拌しながら周囲温度でアンモニア水（２８〜３０％、過剰）で処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応のモニタリングは、約２０時間（一晩）後に、出発物質の完全な消費を示した。高減圧下での揮発性物質の単純な蒸発により、粗生成物を、次の工程のために十分に純粋な、わずかに紫色の光沢を有する黒色アモルファス固体として得た。収量：定量的（粗生成物）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：７４０。
【０５１５】
実施例５１。アミノエチル−レマゾールブリリアントバイオレット
【化５５】
2019512556.tif 000057
【０５１６】
種類：レマゾールバイオレット５Ｒ、アミノ化／アミド化基質に由来する染料コンジュゲート。
【０５１７】
合成：レマゾールブリリアントバイオレット５Ｒ（１当量）を水に溶解し、攪拌しながら周囲温度でアンモニア水（２８〜３０％、過剰）で処理した。ＥＳＩ−ＭＳイオン化では出発材料も生成物も検出できなかったため、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングは不可能であった。完全な変換を確実にするために長時間反応させた後（９日間）、真空下での揮発性物質の単純な蒸発により、暗紫色のアモルファス固体として粗生成物が得られた。収率：約８２％（粗生成物）。
【０５１８】
実施例５２。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−アミノエチル−（レマゾールブラックＢ）
【化５６】
2019512556.tif 000058
【０５１９】
種類：レマゾールブラックＢ、テトラペプチドビルディングブロック、カテプシン基質に由来する染料コンジュゲート。
【０５２０】
合成：ＤＣＭ中のテトラペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＰＦ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。ビス−アミノエチル−（レマゾールブラックＢ）（０．８当量；実施例５０）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。さらに精製することなく次の工程で使用した。
【０５２１】
実施例５３。Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−アミノエチル−（レマゾールブラックＢ）−（Ｎ’−アセチル）−エチルアミド
【化５７】
2019512556.tif 000059
【０５２２】
種類：レマゾールブラックＢ、カテプシン基質に由来する染料−ペプチドコンジュゲート。
【０５２３】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＦ−アミノエチル−（レマゾールブラックＢ）（実施例５２）の反応混合物を撹拌し、過剰の無水酢酸を用い、周囲温度で４時間処理した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ／＋ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示したとき、反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で蒸発させて、黒色アモルファス粉末を粗生成物として得た。その後、粗生成物をさらに精製することなく使用した。同一性は、エラスターゼとの反応によって帰され、モノアセチル化レマゾールブラックＢアミノ誘導体を生じた。
【０５２４】
実施例５４。ＣＭＣ  ９Ｍ３１Ｆ−ＡＡＰＦＡ−ＲＢＢ
【化５８】
2019512556.tif 000060
【０５２５】
種類：完全なプロトタイプアセンブリ（骨格／切断ユニット／染料）、カテプシン基質。
【０５２６】
合成：Ｂｌａｎｏｓｅ  ＣＭＣ  ９Ｍ３１Ｆ（１当量）を水に溶解し、周囲温度で撹拌しながらＨＯＢｔ（１．２当量）、続いてＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）で０．５時間処理した。Ｈ−ＡＡＰＦＡ−ＲＢＢ（０．１当量；実施例３８）を加え、撹拌を一晩（＞１４時間）続けた。翌日、反応混合物を透析により精製して、青色のゼリ−状物を粗生成物として得た。収量：置換度に依存する。１ｇのブラノースは約１ｇの生成物を与える。得られた生成物はポリマーであり、分光法によって容易に特性決定されなかった。しかし、この生成物は青色であり、この青色は、１０ｋＤａ膜で透析した後の高ＭＷ画分と関係がある。エラスターゼとの反応は、ＥＳＩ  ＭＳを用いて検出され、染料の放出を検出した。
【０５２７】
実施例５５。ＣＭＣ  ９Ｍ３１Ｆ−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化５９】
2019512556.tif 000061
【０５２８】
種類：完全なプロトタイプアセンブリ（骨格／切断ユニット／染料）、カテプシン基質。
【０５２９】
合成：Ｂｌａｎｏｓｅ  ＣＭＣ  ９Ｍ３１Ｆ（１当量）を水に溶解し、周囲温度で撹拌しながらＨＯＢｔ（１．２当量）、続いてＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２当量）で０．５時間処理した。Ｈ−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ（０．１当量；実施例４６）を加え、撹拌を一晩（＞１４時間）続けた。翌日、反応混合物を透析により精製して、青色のゼリ−状物を粗生成物として得た。収量：置換度に依存する。１ｇのブラノースは約１ｇの生成物を与える。得られた生成物はポリマーであり、分光法によって容易に特性決定されなかった。しかし、この生成物は青色であり、この青色は、１０ｋＤａ膜で透析した後の高ＭＷ画分と関係がある。エラスターゼとの反応は、ＥＳＩ  ＭＳを用いて検出され、染料の放出を検出する。
【０５３０】
実施例５６。紙膜に結合したＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ
【化６０】
2019512556.tif 000062
【０５３１】
種類：表面または固相「６６５１」上の完全プロトタイプアセンブリ（アンカー領域／酵素不安定領域または酵素反応性領域／指標領域）、エラスターゼ基質。
【０５３２】
合成：紙膜（１当量）をＤＭＦに浸漬し、続いて周囲温度で、撹拌しつつ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（約１．２当量）、ＤＣＣ（約１．２当量）およびＨ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（約１当量；実施例４０）で処理した。２日間の反応時間後、紙膜を濾別し、水、飽和ＮａＨＣＯ３、エタノール、酢酸エチルで洗浄し、ジエチルエーテルで乾燥させた。処理後、膜はわずかに緑色を呈し、非常に低い程度の装填を示していた。収率：ｎ．ａ．得られた生成物はポリマーであり、分光法によって容易に特性決定されなかった。
【０５３３】
実施例５７。Ｆｍｏｃ−Ｍ−ＲＢＢ
【化６１】
2019512556.tif 000063
【０５３４】
種類：レマゾールブリリアントブルー、アミノ化／アミド化基質のための付加物に由来する染料コンジュゲート。
【０５３５】
合成：Ｈ−ＲＢＢ（１当量；実施例２９）をメタノールに溶解し、撹拌しながらＦｍｏｃ−メチオニンペンタフルオロフェニルエステル（３当量）を周囲温度で添加した。ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングは、出発物質の消費を示しており、高減圧下で揮発物質を蒸発させることによって、反応を止めた。青色アモルファス固体は、次の工程のために十分に純粋な粗生成物として得られた。収量：定量的（染料に由来する）。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：８５３。
【０５３６】
実施例５８。Ｈ−Ｍ−ＲＢＢ
【化６２】
2019512556.tif 000064
【０５３７】
種類：レマゾールブリリアントブルー、アミノ化／アミド化基質に由来するメチオニン−染料コンジュゲート。
【０５３８】
合成：Ｆｍｏｃ−Ｍ−ＲＢＢ（１当量；実施例５７）を周囲温度で撹拌しながらメタノールとピペリジンの混合物（２：１（ｖ／ｖ））に溶解した。短時間（１時間未満）経過後、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングは、出発物質の消費を示しており、高減圧下で揮発物質を蒸発させることによって、反応を止めた。粗生成物として青色のアモルファス固体が残っており、これをアセトニトリルに取った。不溶性白色副生成物を濾別し、再び揮発性物質を高減圧下で除去した。得られた青色アモルファス生成物は、次の工程のために十分に純粋であった。収量：定量的。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｈ］＋＝６３３。
【０５３９】
実施例５９。Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＭ−ＲＢＢ
【化６３】
2019512556.tif 000065
【０５４０】
種類：レマゾールブリリアントブルー、ペンタペプチドビルディングブロック、カテプシン基質に由来する染料コンジュゲート。
【０５４１】
合成：ＤＣＭ中のテトラペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＡＰ−ＯＨ（１当量）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（１．２当量）の混合物を撹拌し、これをＤＣＣ（１．２当量）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ｍ−ＲＢＢ（１当量；実施例５８）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した。反応混合物をさらにＤＣＭで希釈し、尿素種を濾別し、濾液を水性処理に供した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、高減圧下での揮発性物質の蒸発により、青色アモルファス固体を、次の工程のために十分に純粋な粗生成物として得た。収率：８５％を超える。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１１６３。
【０５４２】
実施例６０。Ｈ−ＡＡＡＰＭ−ＲＢＢ
【化６４】
2019512556.tif 000066
【０５４３】
種類：レマゾールブリリアントブルー、ペンタペプチドビルディングブロック、カテプシン基質に由来する染料コンジュゲート。
【０５４４】
合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＭ−ＲＢＢ（１当量；実施例５９）を周囲温度で撹拌しながらメタノールとピペリジンの混合物（２：１（ｖ／ｖ））に溶解した。短時間（１時間未満）経過後、ＥＳＩ−ＭＳ（−ｐ）による反応モニタリングは、出発物質の消費を示しており、高減圧下で揮発物質を蒸発させることによって、反応を止めた。粗生成物として青色のアモルファス固体が残っており、これをアセトニトリルに取った。不溶性白色副生成物を濾別し、再び揮発性物質を高減圧下で除去した。さらなる調査のために十分に純粋な青色アモルファス生成物が得られた。収量：定量的。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９４１
【０５４５】
実施例６１。ポリ−Ｎ−アクロイル−Ｓ−トリチルシステイン
【化６５】
2019512556.tif 000067
【０５４６】
乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）中のポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレート（ＰＡＡ）（７２２ｍｇ）の溶液に、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１０３０ｍｇ）およびトリエチルアミン（４５０μＬ）を添加した。時折超音波処理しながら、全ての固体が溶解するまで反応混合物を注意深く移動させた（すなわち、圧延した）。次に混合物を時折振盪しながら、５４℃まで１５時間加温した。ＭＳによる反応モニタリングがＨ−Ｃｙｓｔ（Ｔｒｔ）−ＯＨの消失を示したとき、エタノールアミン（２５０μＬ）を加えて未反応部位をクエンチし、加温をさらに３０分間続けた。混合物をメタノール（８０ｍＬ）に注いだ。全ての沈殿を単離し、ＤＭＦ（５ｍＬ）で再溶解し、ギ酸（１００μＬ）または飽和塩化カルシウム水溶液（１００μＬ）を加えることによって、メタノール（１００ｍＬ）で再沈殿させた。沈殿を単離し、メタノール（１００ｍＬ）で２時間撹拌し、濾過した。メタノールおよびジエチルエーテルで洗浄した後、５４０ｍｇの生成物を単離した。
【０５４７】
上清を組み合わせ、ニトロフェノールの色が消失するまでギ酸を添加し、上述のような沈殿の再沈殿により、さらに４０５ｍｇの生成物が得られた。総収率：約７０％。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかしながら、トリチルシステインの消失は、提案された構造の強力な裏付けである。）
【０５４８】
この手順を使用して、他のアミンを、活性化ポリアクリレートに添加した（表１を参照）。小規模で実施する場合、ＤＭＦ中の粗反応混合物のゲルクロマトグラフィーが、適切な精製方法であることが判明した。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【０５４９】
表１
【表１】
2019512556.tif 000068
【０５５０】
実施例６２。ポリマー（ポリ−（Ｎ−アクロイル−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ）−コ−（アクロイル−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）に対するペプチド−染料コンジュゲートの連結
【０５５１】
工程Ａ：
【化６６】
2019512556.tif 000069
【０５５２】
Ｈ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（５２ｍｇ；実施例４０）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、エチルジイソプロピルアミン（１０μＬ）と合わせた。クロロ酢酸無水物（１０．８ｍｇ）を加えた。混合物を１時間撹拌し、次に、さらなるクロロ酢酸無水物（８．５ｍｇ）を添加した。さらに２時間攪拌した後、ＭＳは、大部分が変換したことを示した。この溶液５００μＬをポリ−（Ｎ−アクロイル−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ）−コ−（アクロイル−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）（１０４ｍｇ；表１の項目４）およびエチルジイソプロピルアミン（７０μＬ）と合わせた。混合物を６０℃で一晩、次いで８０℃で４０分間加熱した。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ  ２０カラムに適用し、精製した。先に溶出する青色の領域を単離し、８５ｍｇの生成物を得た。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。エラスターゼによる処理は、ＭＳ分析（ｍ／ｚ＝５７１、陰性モード）によって見出されるように、Ａｌａ−ＲＢＢを放出した。
【０５５３】
工程Ｂ：
【化６７】
2019512556.tif 000070
【０５５４】
工程Ａの生成物をＤＣＭ（１ｍＬ）およびメタノール（０．５ｍＬ）で溶解し、トリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）で４０分間処理した。全ての揮発性物質を高減圧下で除去し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）の添加により生成物を沈殿させた。生成物は、青色ポリマー固体であり、ｍ／ｚ＝１２００未満の陰性モードでは観察可能な質量はない。エラスターゼによる処理は、ＭＳ分析（ｍ／ｚ＝５７１、陰性モード）によって見出されるように、Ａ−ＲＢＢを放出した。
【０５５５】
工程Ｃ：
【化６８】
2019512556.tif 000071
【０５５６】
ポリ−Ｎ−アクロイルシステインおよび５３０ｍｇのポリ−Ｎ−アクロイル−Ｓ−トリチルシステインを、１８ｍＬのジクロロメタン、１ｍＬのトリイソプロピルシランおよび２ｍＬのトリフルオロ酢酸の混合物で溶解した。０．５ｍＬの水を加え、混合物を一晩撹拌した。混合物を蒸発させ、水およびジエチルエーテルで洗浄した。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。）
【０５５７】
実施例６３。ポリマーに結合した高負荷のアミノ−ペプチド−染料コンジュゲートの例示的な構築
【化６９】
2019512556.tif 000072
【０５５８】
（ａ）Ｈ−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（６８ｍｇ；実施例４０）をＤＭＦ（１ｍＬ）で溶解した。クロロ酢酸無水物（１６ｍｇ）、続いてエチルジイソプロピルアミン（１００μＬ）を添加した。１時間撹拌した後、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ９００（８０ｍｇ）を添加し、混合物を７０℃で４時間加温した。ポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレート（７５ｍｇ）およびジイソプロピルアミン（１００μＬ）を添加した。２時間撹拌した後、ポリマーの残った反応部位をｎ−ブチルアミンでクエンチした。（１５０μＬ）青色ポリマー生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ  ２０を用いたゲルクロマトグラフィーにより単離し、１０５ｍｇを得た。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【化７０】
2019512556.tif 000073
【０５５９】
（ｂ）クロロアセトアミド−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（工程Ａで調製した）の５８ｍＭ溶液５００μＬおよびエチレンジアミン４μＬを合わせ、６０℃で一晩、８０℃で１時間加熱する。７２ｍｇのポリ（４−ニトロフェニル）アクリレートを５００μＬのＤＭＦに溶解し、７０μＬのトリエチルアミンを添加し、混合物を一晩撹拌する。３００μＬの１Ｍ  ＫＯＨ水溶液を加え、混合物をさらに４５分間圧延する。沈殿を遠心分離によって単離し、その後、０．１Ｍ  ＫＯＨを用いて溶解し、ギ酸を用いて沈殿させた。沈殿物を１ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解し、６ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０のカラムに通した。減圧下で乾燥させると、８４ｍｇの青色がかった固体が得られる。
【化７１】
2019512556.tif 000074
【０５６０】
（ｃ）Ｒ＝Ｈ、ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ。１９０ｍｇのＨ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ（実施例６８ｃ）を３ｍＬのＤＭＦに溶解し、４０ｍｇのクロロ酢酸無水物を添加する。４０μＬのジイソプロピルエチルアミンを加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。クロロ酢酸無水物（１７ｍｇ）およびジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ）の第２バッチをそれぞれ加え、撹拌を１時間続けた。反応混合物をシリカゲルに適用し、ギ酸０．２％を含むシクロヘキサン−メタノール−ジクロロメタン（１６−３−３から３−１−１）の勾配でクロマトグラフィーを行った。生成物画分は６９ｍｇを含み、これを１ｍＬのＤＭＦに溶解した。２０μＬのジイソプロピルエチルアミンを添加し、次いで１２μＬのＪｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤＲ１７６を加える。反応混合物を室温で７２時間撹拌した。質量分析計を用いた分析は、ペプチドに１，２または３回アミンを添加したアルキル化生成物の混合物を示す（陰性モード、ｍ／ｚ＝１１２５＝モノアルキル、単一荷電；ｍ／ｚ＝１０３８＝二重アルキル、二重荷電；ｍ／ｚ＝１５１３＝三重アルキル、二重荷電；およびｍ／ｚ＝１００９＝三重アルキル、三重荷電）である。反応混合物に３８ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートを供給し、室温で１時間撹拌し、次いで５４℃で９０分間保持した。２５０μＬのＮ，Ｎ−ジオクチルアミンを添加し、時々振とうしながら混合物を５４℃でさらに３時間維持する。生成物をアセトンによる沈殿、および水−メタノール  ３−１を有するＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ  ２０  ６ｇのカラムを通してメタノール中溶液の沈殿物のクロマトグラフィーにより単離し（最高分子量画分を集めた）、３１ｍｇの水溶性物質を得た。同じ手順をＨ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢに適用することができる（実施例６８ｃ）。
【０５６１】
実施例６４。Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−（ジアミノ安息香酸）
【化７２】
2019512556.tif 000075
【０５６２】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＯＨ（７１０ｍｇ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）を用いて溶解した。続いてＨＯＢｔ（２１０ｍｇ）およびＤＣＣ（２４０ｍｇ）を加え、混合物を室温で１５分間撹拌した。３，４−ジアミノ安息香酸（１６０ｍｇ）およびピリジン（１００μＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）で溶解し、撹拌しながら反応混合物に加えた。１４時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をギ酸０．５％を含むシクロヘキサン／ＤＣＭ／メタノール（４／２／１）を用いたシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、４００ｍｇの生成物を得た。
【０５６３】
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｈ］＝７８４。
【０５６４】
実施例６５。Ｈ−ＡＡＡＰＶ−（ジアミノ安息香酸）
【化７３】
2019512556.tif 000076
【０５６５】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−（ジアミノ安息香酸）（４００ｍｇ；実施例６４）の溶液に、ピペリジン（０．５ｍＬ）を添加した。混合物を一晩撹拌し、蒸発（１ｍｂａｒ、５５℃）により濃縮した。残渣をジエチルエーテル（２５ｍＬ）で２回、中間濾過した。生成した生成物は、その後の使用のために十分に純粋であった。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｈ］＝５６２。
【０５６６】
実施例６６。ポリ（ＡＡＡＰＶ−｛ジアミノ安息香酸｝アクリルアミド）
【化７４】
2019512556.tif 000077
【０５６７】
［Ｒ＝Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−３−（３，４−ジアミノ安息香酸）］
【０５６８】
システアミン塩酸塩（１１ｍｇ）を、アルゴンで前処理したＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。ポリ−４−ニトロフェニルアクリレート（１２０ｍｇ）およびトリエチルアミン（２００μＬ）を添加した。全プロセス中に酸素を除外するように注意した。混合物を５５℃で１時間撹拌した。Ｈ−ＡＡＡＰＶ−（ジアミノ安息香酸）（２３０ｍｇ；実施例６５）をＤＭＦ（３ｍＬ）で溶解し、アルゴンで処理し、反応混合物に加えた。混合物を６５℃で一晩攪拌した。０．５％ギ酸を含有するメタノール（１００ｍＬ）を含むアルゴン流下で生成物を沈殿させた。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【０５６９】
実施例６７。ポリ−コ−［（Ｎ−メルカプトエチルアクリルアミド）−（ＡＡＡＰＶ−｛ＲＢＢ｝−アクリルアミド）］
【化７５】
2019512556.tif 000078
【０５７０】
［Ｒ＝Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＲＢＢ］
【０５７１】
（ａ）システアミン塩酸塩（２ｍｇ）を、アルゴンで前処理したＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。ポリ−４−ニトロフェニルアクリレート（３６ｍｇ）およびトリエチルアミン（５０μＬ）を添加した。全プロセス中に酸素を除外するように注意した。混合物を５５℃で１時間撹拌した。Ｈ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ（１２５ｍｇ、実施例６８ｃ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、アルゴンで処理し、反応混合物に添加した。混合物を６５℃で一晩攪拌した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ  ２０（６ｇ）のカラムに、反応混合物１ｍｌを、水とメタノールの混合物（４／１、アルゴンで前処理したもの）と一緒に通過させることによって生成物を溶離した。きわめて最初の方の青色溶出液を集め、高減圧下で濃縮した。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【０５７２】
（ｂ）９．５ｍＬのＤＭＦ中の９５ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートの溶液２．２ｍＬをアルゴンで洗い流し、アルゴンを流したＤＭＦ  ７３９μＬ中の３２ｍｇのメルカプトエチルアミン塩酸塩および４５μＬのトリメチルアミンの溶液４６μＬと合わせた。３０分間撹拌した後、４５ｍｇのＨ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ（実施例６８ｃ）および１００μＬのトリエチルアミンを加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を５４℃で９０分間保持した後、１００μＬのエタノールアミンを加え、反応を５４℃でさらに９０分間維持した。この混合物を水−メタノール  ３−１を用いてＳｅｐａｈｄｅｘ  ＬＨ２０  ６ｇのカラムに通すことにより生成物を単離した。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【０５７３】
同じ手順をＨ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢに適用することができる（実施例６８ｃ）。
【０５７４】
ポリ−コ−［（Ｎ−２−｛｛３−（４−アジドフェニル）プロピオニル｝アクリルアミド）−（ＡＡＡＰＶ−｛ＲＢＢ｝−アクリルアミド）］
【化７６】
2019512556.tif 000079
【０５７５】
［Ｒ＝Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＲＢＢ］
【０５７６】
（ｃ）９．５ｍＬのＤＭＦ中の９５ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートの溶液２．２ｍＬを、２．２ｍｇの４−アジドフェニルアラニンおよび５．８μＬのトリメチルアミンと混合した。室温で３０分間撹拌した後、Ｈ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ  ４３ｍｇをトリエチルアミン１００μＬとともに添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。混合物を５４℃で９０分間保持した後、１００μＬのエタノールアミンを加え、反応を５４℃でさらに９０分間維持した。この混合物を水−メタノール  ３−１を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０  ６ｇのカラムに通すことにより生成物を単離した。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【０５７７】
同じ手順をＨ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢに適用することができる。（上述のＲ＝Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＲＢＢの構造）。
【０５７８】
ビーズに結合したＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ
【化７７】
2019512556.tif 000080
または
【化７８】
2019512556.tif 000081
（ｄ）３０ｍｇのＨ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢを９３ｍｇのＳｅｐｈａｂｅａｄｓ  ＥＣＥＰ（エポキシ活性化）および５０μＬのＤＭＦと混合した。混合物を５４℃で７２時間保持し、青色溶出がなくなるまでジクロロメタン−メタノール混合物（３−１）、次いでＤＭＦで洗浄した。
【０５７９】
同じ手順を、Ｈ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢの代わりに、Ｈ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢに適用することができる。
【化７９】
2019512556.tif 000082
【０５８０】
（ｅ）５０ｍｇのＣｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＳｉＣｏｒｅ  ＡｍｉｎビーズをＤＭＦで４回洗浄し、８００μＬのＤＭＦに懸濁した。９０ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートを添加し、混合物を６０℃で３時間振とうした。３２ｍｇのＨ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢ（実施例６８ｃ）および５０μＬのトリエチルアミンを添加した。６０℃での振とうを１６時間続けた。ビーズを遠心分離して除き、上清をデカンテーションして、実施例６７ｇに使用し、ビーズを１００μＬのＤＭＦ中の１０μＬのエタノールアミンで処理した。１．５ｍＬのＤＭＦで５回洗浄した後、ビーズを１．５ｍＬの水で２回洗浄した。ビーズは、洗い流すことができない青色を獲得していた。
【０５８１】
【化８０】
2019512556.tif 000083
（ｆ）３３ｍｇのＨ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢおよび１９ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートを０．５ｍＬのＤＭＦ中で５０μＬのトリエチルアミンと混合し、６０℃で３時間撹拌した。（ｅ）で調製したビーズ（５０ｍｇ）を加え、６０℃で振とうを１６時間続けた。ビーズを遠心分離して除き、上清をデカンテーションして、実施例６７ｇに使用し、ビーズを１００μＬのＤＭＦ中の１０μＬのエタノールアミンで処理した。ビーズを１．５ｍＬのＤＭＦで５回洗浄し、続いて１．５ｍＬの水で２回洗浄した。ビーズは、洗い流すことができない青色を獲得していた。
【０５８２】
ビーズに結合していない高分子材料の単離
【化８１】
2019512556.tif 000084
【０５８３】
（ｇ）（ｅ）と（ｆ）を合わせた上清に１２０μＬのエタノールアミンを添加した。混合物を５４℃で一晩保持した。１％ギ酸を含む２５０ｍＬのジエチルエーテルに注いだ後、不溶物を遠心分離により単離し、２ｍＬのＤＭＦで溶解し、水−メタノール（４−１）を用いて６ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０のカラムに通した。２ｍｇの青色高分子画分を単離することができる。
【０５８４】
実施例６８。疎水性アンカーおよびエラスターゼの開裂部位を有するポリマー結合染料
【化８２】
2019512556.tif 000085
【０５８５】
Ｒ１＝Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−（ＲＢＢおよびＲ２＝Ｈまたは
Ｒ１＝ｎ−オクチルおよびＲ２＝Ｈまたは
Ｒ１＝Ｒ２＝ｎ−オクチル
【０５８６】
（ａ）Ｈ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ（２４０ｍｇ；実施例６８ｃ）およびポリ−（４−ニトロフェニル）アクリレート（１０３ｍｇ）を合わせ、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。トリエチルアミン（６００μＬ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。Ｎ、Ｎ−ジオクチルアミン（１３０μＬ）を添加し、混合物を時々振とうしながら５４℃で５時間保持した。ｎ−オクチルアミン（１５０μＬ）を加え、混合物を５４℃で一晩保持した。
【０５８７】
混合物を、１％ギ酸を含む水（５０ｍＬ）に注いだ。沈殿した物質を遠心分離により集め、温メタノール（１０ｍＬ）で再溶解させた。水（２００ｍＬ、ギ酸０．５％）で２回沈殿させた後、沈殿が現れ、これを濾過によって単離した。青色物質を乾燥し、温メタノール（１０ｍＬ）で再溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させた。濾過および乾燥後、青色粉末が残った。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。）
【化８３】
2019512556.tif 000086
【０５８８】
（ｂ）Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢの合成：１０ｍｌのＤＭＦ中のテトラペプチドＦｍｏｃ−ＡＡＡＰ−ＯＨ（７４０ｍｇ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ）の混合物を撹拌し、これを、ＤＣＣ（１９８ｍｇ）を用い、周囲温度で１５分間処理した。Ｈ−Ｖ−ＲＢＢ（６８０ｍｇ；実施例４２）を一度に加え、ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）による反応モニタリングが出発物質の消費を示すまで反応混合物を室温で撹拌した（約１５時間、一晩）。全ての揮発性物質を減圧下で除去した。固体残渣をシリカゲル１０ｇに適用し、７−２−１から１１−６−５のシクロヘキサン−酢酸エチル−メタノール（それぞれ０．１％のギ酸を含む）の勾配でクロマトグラフィーにかけた。収量：３４２ｍｇ。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）。［Ｍ−Ｈ］−：１１３１。
【化８４】
2019512556.tif 000087
【０５８９】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶＶ−ＯＨから出発して、実施例６８ｂと類似の手順を用いて、Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢを調製した。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１２３０。
【化８５】
2019512556.tif 000088
【０５９０】
（ｃ）Ｈ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢの合成：Ｆｍｏｃ−ＡＡＡＰＶ−ＲＢＢ（３４２ｍｇ、実施例６８ｂ）をＤＭＦ（約１２ｍＬ）で溶解した。ピペリジン（０．５ｍＬ）を添加した。ＭＳによる反応モニタリングが、出発材料の消費（ｍ／ｚ＝１１３１、陰性モード）および生成物の形成を示す（ｍ／ｚ＝９０９、陰性モード）まで混合物を室温で１時間撹拌した。全ての揮発物を減圧下で除去し、残渣をＤＣＭとメタノールの混合物（５：１、５ｍｌ）で３０分間撹拌し、次いでジエチルエーテル（２０ｍｌ）の添加により沈殿させた。沈殿を濾過により単離し、ジエチルエーテル（２５ｍＬ）を用いて６０分間、強く撹拌しながら処理した。吸引濾過し、５４℃で３時間乾燥した後、２８８ｍｇの濃青色の微粉末を単離した。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：９０９。
【化８６】
2019512556.tif 000089
【０５９１】
Ｈ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢの合成は、実施例６８ｃに記載のものと同様の手順を用いて調製した。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：１００８。
【０５９２】
（ｄ）４０ｍｇのＡＡＡＰＶ−ＲＢＢおよび１４ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートを１ｍＬのＤＭＦ中で混合した。全てが溶解したら、１００μＬのトリメチルアミンを添加し、混合物を３０分間撹拌する。２０μＬのＮ，Ｎ−ジオクチルアミンを加え、混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物を６ｇのｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ  ２０のカラムにメタノール−水混合物（１＋３）とともにを２回通して、暗青色のポリマー粉末１３ｍｇを得た。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである）。
【化８７】
2019512556.tif 000090
【０５９３】
（ｅ）Ｎ−［（３−トリエトキシシリル）プロピル］−Ｎ’−  ［ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢ］尿素の合成およびその後の化合物のシリカゲルへの結合：Ｈ−ＡＡＡＰＶＶ−ＲＢＢ（４９ｍｇ；実施例６８ｃ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。（イソシアナトプロピル）トリエトキシシラン（８０μＬ；乾燥ＤＭＦ中の１０％溶液として）を加え、混合物を周囲温度で撹拌した。２時間後、（イソシアナトプロピル）トリエトキシシランの第二部分（８０μＬ；乾燥ＤＭＦ中の１０％溶液として）を加え、混合物を一晩撹拌した。ＥＳＩ−ＭＳによる反応モニタリングが、完全な変換を示したら（陰性モード）（［Ｍ−Ｈ］−：１２５５）、３５ｍｇのシリカゲル（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ  １００、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ、５μｍ、孔径１００Å、仕様表面２８０ｍ２／ｇ）を１００μＬの反応混合物と混合し、振盪しながら７５℃で一晩インキュベートした。生成物を遠心分離により単離し、ＤＭＦ（５×１ｍＬ）および水（２×１ｍＬ）で洗浄した。それは、暗青色の粉末を含み、水またはＤＭＦで５時間以内に青色を浸出しなかった。
【０５９４】
実施例６９。Ｆｍｏｃ−Ａ−（Ｎ−フェニルピペラジニル）アミド
【化８８】
2019512556.tif 000091
【０５９５】
Ｆｍｏｃ−Ａ−ＯＨ（１．６９ｇ）およびＨＯＢｔ（１．２ｇ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）に懸濁させた。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）（１．１２ｇ）を加え、混合物を１０分間撹拌した。Ｎ−フェニルピペラジン（６０５ｍｇ）を加え、混合物を室温でさらに６０分間撹拌した。この混合物を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液および１Ｎ  Ｋ２ＣＯ３水溶液で洗浄し（それぞれ２回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。蒸発により、１．３ｇの十分に純粋な生成物が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ＋Ｈ］＝４５６。
【０５９６】
実施例７０。（４−ジメチルアミノフェニル）−（４−［（４−Ｎ−｛Ｎ−Ｆｍｏｃ−アラニル｝）ピペラジノフェニル）−カルベニウムイオン［Ｆｍｏｃ−Ａ−（ＣＶ）］（ａ）およびビス−（４−ジメチルアミノフェニル）−（４−［（Ｎ−ピペラジノ）フェニル）−カルベニウムイオン（ＣＶ）（ｂ）
【化８９】
2019512556.tif 000092
【０５９７】
粗Ｆｍｏｃ−Ａ−Ｎ−フェニルピペラジンアミド（２．５２ｇ、実施例６９）および４，４’−ビス（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ベンゾフェノン（ミヒラーケトン、１．９２ｇ）の混合物に、リン（Ｖ）オキシ塩化物（１．６ｍＬ）を添加し、全てが均一に濡れるまで試薬を混合した。混合物を２時間かけて１００℃まで加熱し、放冷し、アセトンと水の混合物（１：１）を用いて溶解させた。シリカゲル（８ｇ）を、黒色がかった青色溶液に適用し、混合物を蒸発乾固させた。シクロヘキサン−酢酸エチル−メタノールの勾配（８／１／１（０．５％ギ酸を含む）から、３／１／１（酸を含まない）；次いで、３％トリエチルアミンを含有する０／１／１）で溶出させると、１．２２ｇの（ａ）（ｍ／ｚ＝７０６）および７２０ｍｇの（ｂ）（ｍ／ｚ＝４１３）が塩として得られた。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ］＝それぞれ７０６および４１３。
【０５９８】
実施例７１。４−（［４−｛Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ｝アミド  Ｎ−ピペラジノ］フェニル）−ビス−（４−ジメチル−アミノフェニル）−カルベニウムイオン（Ｈ−ＡＡＰＶＡ−ＣＶ）および４−（［４−｛Ｈ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ｝アミド  Ｎ−ピペラジノ］フェニル）−ビス−（４−ジメチル−アミノフェニル）−カルベニウムイオンポリアクリルアミド
【化９０】
2019512556.tif 000093
【０５９９】
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ａ−ＣＶ（９８０ｍｇ；実施例７０ａ）をＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解した。過剰のピペリジン（２ｍＬ）を加え、混合物を一晩撹拌した。全ての揮発性物質を真空中で除去し、残留ピペリジンを＜３０ｍｂａｒ／５０℃で減圧除去した。残渣をシクロヘキサン（３回）で洗浄し、乾燥し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で溶解した。生成物をＭＳにより同定した（ｍ／ｚ＝４８４）。
【０６００】
Ｂ．Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｆｐ（８７０ｍｇ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。全ての揮発物を真空中で除去し、残渣をピペリジン（２ｍＬ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）溶液で処理した。全ての揮発性物質を除去し、混合物をシクロヘキサン（３回）で洗浄し、＜３０ｍｂａｒ／５０℃で減圧乾燥した。混合物をＨＰＬＣで精製して、１１０ｍｇの所望の中間体を得た。
【０６０１】
Ｃ．Ｆｍｏｃ−ＡＡＰ−ＯＨ（１１０ｍｇ）をＨＯＢｔ（５０ｍｇ）と合わせ、ＤＭＦ（２０ｍＬ）に懸濁させた。ＥＤＣＩ（５０ｍｇ）を加え、混合物をさらに１０分間撹拌した。工程Ｂからの中間体（１１０ｍｇ）を加え、混合物をさらに２時間撹拌した。ＭＳ（ｍ／ｚ＝１０４４）による反応モニタリングは、期待される生成物の形成を示した。
【０６０２】
Ｄ．反応混合物をピペリジン（０．５ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。ＭＳは、標的化合物の生成を示した（ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ］＝８２２）。全ての揮発性物質を３０ｍｂａｒ未満／５０℃で真空除去した。エラスターゼによる物質の処理は、ＭＳ分析（ｍ／ｚ＝４８４、陽性モード）によって見出されるように、Ａ−ＣＶを放出した。
【０６０３】
Ｅ．５７９ｍｇのポリ−ｐ−ニトロフェニルアクリレートを６ｍｌのＤＭＦに溶解する。Ｄの残渣を添加し、混合物を室温で７２時間撹拌する。ＭＳは、ｍ／ｚ＝８２２におけるピークの消失を示す。５００μＬのエタノールアミンを添加し、混合物を室温で７時間撹拌する。ＣＶカチオンの青色は、酸性処理によって再確立することができる。１ｍＬの調製物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ  ２０（２０ｍＬ、水／メタノール  ２＋１）のカラムに通す。前面で溶出する青緑色画分を集め、真空乾燥させる。ブタおよびヒトエラスターゼによる処理は、ｍ／ｚ＝４８４における質量ピークの出現によって証明されるように、Ａ−ＣＶを放出する。（材料のポリマー性のため、具体的な特性決定は不可能であった。しかし、Ｓｅｐｈａｄｅｘを通過した物質は高分子量であり、青色であるため、ポリマーへの染料の付着を証明するものである。さらに、反応中の質量スペクトルにおけるｍ／ｚ＝８２２でのピークの消失がこれを裏付けている）。
【０６０４】
実施例７２。ビス−（４−ジメチルアミノフェニル）−（４−［４−Ｎ−｛６−Ｎ−バリノイル）アミノヘキサノイル｝］ピペラジノフェニル）−カルベニウムイオン（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−アミノヘキシル−ＣＶまたはＦｍｏｃ−Ｖ−Ａｈｘ−ＣＶ）
【化９１】
2019512556.tif 000094
【０６０５】
ＤＣＭ（１５ｍＬ）中のＣＶ（７２０ｍｇ；実施例７０ｂ）の溶液に、Ｆｍｏｃ−６−アミノヘキサン酸ペンタフルオロフェニルエステル（１．１８ｇ）を添加した。混合物を１時間撹拌した後、ピペリジン（１ｍＬ）を添加した。１日間撹拌した後、全ての揮発性物質を真空で除去し、残留物をシクロヘキサン（３回）で抽出し、ＤＣＭ（１５ｍＬ）で再溶解させた。Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｆｐ（１．１３ｇ）を加え、混合物を１時間撹拌した。全ての揮発性物質を除去し、残渣をメタノール（２２ｍＬ）および水（３ｍＬ）（３％ギ酸を含む）の混合物で溶解した。調製物を３％ギ酸（５０ｍＬ）を含む水で沈殿させ、遠心分離した。残渣を分取ＨＰＬＣで分離して、１６０ｍｇの黒色がかった青色物質を得た。物質をＤＣＭ（５ｍＬ）で溶解し、ピペリジン（２５０μＬ）で一晩処理した。濃縮し、ＨＰＬＣで精製して、４０ｍｇの所望の生成物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ］＝８４７。
【０６０６】
実施例７３。Ｈ−ＡＡＰＶ−Ａｈｘ−ＣＶ
【化９２】
2019512556.tif 000095
【０６０７】
実施例４２、工程Ｄに記載のＦｍｏｃ−Ｖ−Ａｈｘ−ＣＶ（実施例７１）の処理は、Ｈ−ＡＡＰＶ−Ａｈｘ−ＣＶを生成した。ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）［Ｍ］＝８６４。
【０６０８】
実施例７２の生成物をエラスターゼで処理すると、ＭＳ分析（ｍ／ｚ＝５２６、陽性モードなし）によって見られるＡｈｘ−ＣＶが放出されない。
【０６０９】
実施例７４。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤＲ１７６修飾ヒプロメロース
【化９３】
2019512556.tif 000096
【０６１０】
ヒプロメロース（８９ｋＤａ、５ｇ）をＮＭＰ（１５０ｍＬ）に溶解した。溶解後、トルエン（１００ｍＬ）を添加した。混合物を、ディーンスタークトラップを用いて１時間還流させ、共沸蒸留により水を除去した。乾燥した溶液を０℃まで冷却した。この温度で、塩化トシル（１．４５ｇ）、次いでピリジン（３０ｍＬ）を添加した。混合物をこの温度で１時間維持した。最後にＪｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤＲ１７６（１５ｇ）を加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、混合物を１時間かけて９０℃まで加熱した。反応が完了した後、蒸発によって揮発性物質を除去した。得られた溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０．０００〜２０．０００Ｄａ）。溶液を蒸発乾固させた。得られた生成物をエタノールに溶解し、酢酸エチル／シクロヘキサン（３回）で沈殿させた。生成物は、暗褐色のポリマー膜であった。収量：１．７ｇ；０．３４ｍｍｏｌ／ｇＮ。
【０６１１】
実施例７５。ＥＤＡ修飾ヒプロメロース
【化９４】
2019512556.tif 000097
【０６１２】
ヒプロメロース（８９ｋＤａ、５ｇ）をＮＭＰ（１２０ｍＬ）に溶解した。溶解後、トルエン（５０ｍＬ）を添加した。混合物を、ディーンスタークトラップを用いて１時間還流させ、共沸蒸留により水を除去した。乾燥した溶液を０℃まで冷却した。この温度で、塩化メシル（１．９ｍＬ）、次いでピリジン（２０ｍＬ）を添加した。混合物をこの温度で１時間維持した。最後に、エチレンジアミン（ＥＤＡ、１００ｍＬ）を加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、混合物を１時間かけて９０℃まで加熱した。反応が完了した後、蒸発によって揮発性物質を除去した。得られた溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０．０００〜２０．０００Ｄａ）。溶液を蒸発乾固させ、得られた生成物を酢酸エチル（５回）で抽出した。わずかに黄色の膜。収量：２．９ｇ；０．６７ｍｍｏｌ／ｇＮ。
【０６１３】
実施例７６。ＥＤＡ変性ヒドロキシエチルセルロース
【化９５】
2019512556.tif 000098
【０６１４】
ヒドロキシエチルセルロース（９０ｋＤａ、１０ｇ）をＮＭＰ（２５０ｍＬ）に溶解した。溶解後、トルエン（２００ｍＬ）を添加した。混合物を、ディーンスタークトラップを用いて１時間還流させ、共沸蒸留により水を除去した。乾燥した溶液を０℃まで冷却した。この温度で、塩化トシル（８．８ｇ）、次いでピリジン（３．７５ｇ）を添加した。混合物をこの温度で２時間、室温で５時間保持した。最後に、エチレンジアミン（３０ｍＬ）を加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、混合物を２時間かけて９０℃まで加熱した。反応が完了した後、不溶性物質を濾過により除去した。次いで、蒸発によって揮発性物質を除去した。得られた溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０．０００〜２０．０００Ｄａ）。溶液を蒸発乾固させ、得られた生成物を酢酸エチル（３：１、３回）で抽出した。黄色の膜。収量：３．８５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ／ｇＮ。
【０６１５】
実施例７７。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤＲ  １７６変性ヒドロキシエチルセルロース
【化９６】
2019512556.tif 000099
【０６１６】
ヒドロキシエチルセルロース（２５０ｋＤａ、５ｇ）をＮＭＰ（１６０ｍＬ）に溶解した。溶解後、トルエン（１００ｍＬ）を添加した。混合物を、ディーンスタークトラップを用いて２時間還流させ、共沸蒸留により水を除去した。乾燥した溶液を０℃まで冷却した。この温度で、塩化トシル（４．２ｇ）、次いでピリジン（１．７５ｇ）を添加した。混合物をこの温度で２時間、室温で２時間保持した。最後に、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤＲ  １７６（２０ｍＬ）を加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、混合物を２時間かけて９０℃まで加熱した。反応が完了した後、不溶性物質を濾過により除去した。次いで、蒸発によって揮発性物質を除去した。得られた溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０．０００〜２０．０００Ｄａ）。溶液を蒸発乾固させ、得られた生成物を酢酸エチル（３回）で抽出した。黄色の膜。収量：４．１ｇ、高ＭＷ画分中の０．９９ｍｍｏｌ／ｇＮ。
【０６１７】
実施例７８。トリオキサトリデカンジアミン変性ヒドロキシエチルセルロース
【化９７】
2019512556.tif 000100
【０６１８】
ヒドロキシエチルセルロース（９０ｋＤａ、５ｇ）をＮＭＰ（２００ｍＬ）に溶解した。溶解後、トルエン（１５０ｍＬ）を添加した。混合物を、ディーンスタークトラップを用いて２時間還流させ、共沸蒸留により水を除去した。乾燥した溶液を０℃まで冷却した。この温度で、塩化トシル（４．２ｇ）、次いでピリジン（１．７５ｇ）を添加した。混合物をこの温度で３時間、室温で４時間保持した。最後に、Ｏ、Ｏａｌｂｉｓ（３−アミノプロピル）ジエチレングリコール（５０ｇ）を加え、混合物を室温で１２時間撹拌した。次いで、混合物を３時間かけて９０℃まで加熱した。反応が完了した後、不溶性物質を濾過により除去した。次いで、蒸発によって揮発性物質を除去した。水（１００ｍＬ）を加えた後、得られた溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０．０００〜２０，０００Ｄａ）。溶液を蒸発乾固させ、得られた生成物を酢酸エチル（３回）で抽出した。粘着性の褐色の塊をＰ４Ｏ１０上で乾燥させ、酢酸エチル／エタノール（３：１）で再度抽出した。暗褐色の膜。収量：５．６ｇ；高ＭＷ画分中のＮは０．９８ｍｍｏｌ／ｇであった。
【０６１９】
実施例７９。ＨＥＣ−ＥＤＲ１７６−Ｎ−プロピオニル−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ
【化９８】
2019512556.tif 000101
【０６２０】
Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ  ＥＤＲ１７６変性ヒドロキシエチルセルロース（０．０５ｇ；実施例７７）をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中のアクリルアミド−ＡＡＰＶＡ−ＲＢＢ（実施例４９）（２１ｍｇ）を添加した。混合物を、ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ８．０に調整し、室温で１８時間撹拌した。青色沈殿が生成した。この混合物をＮａＨＣＯ３および水（２回）に対して透析した（ＭＷＣＯ  １２〜１４ｋＤａ）。濾過後、淡青色溶液を蒸発させ、青色の膜を得た。収量：４５ｍｇ、高ＭＷ画分の青色。
【０６２１】
実施例８０。ＨＥＣ−ＰＥＧ２００−Ｎ−プロピオニル−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化９９】
2019512556.tif 000102
【０６２２】
トリオキサトリデカンジアミン修飾ヒドロキシエチルセルロース（０．２２ｇ；実施例７８）をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のアクリルアミド−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ（実施例４７、０．０８５ｇ）を添加した。混合物を、ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ８．０に調整し、室温で１８時間撹拌した。青色沈殿が生成した。この混合物をＮａＨＣＯ３および水（２回）に対して透析した。濾過後、淡青色溶液を蒸発させ、青色の膜を得た。収量：１３７ｍｇ、高ＭＷ画分中の青色。
【０６２３】
実施例８１。ＨＥＣ−ＥＤＡ−Ｎ−プロピオニル−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化１００】
2019512556.tif 000103
【０６２４】
ＥＤＡ修飾ヒドロキシエチルセルロース（０．５４ｇ；実施例７６）をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＡＣＮ（３０ｍＬ）中のアクリルアミド−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ（実施例４７）（０．０８５ｇ）を添加した。混合物を、ＮａＨＣＯ３を用いてｐＨ８．０に調整し、室温で４８時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させた。青色沈殿が生成した。この混合物をＮａＨＣＯ３および水に対して透析した。濾過後、淡青色の溶液を蒸発させて、淡青色の膜を得たが、これは洗浄の際に色を放出しなかった。収量：４００ｍｇ。
【０６２５】
実施例８２。ＰＥＩ−Ｎ−プロピオニル−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ
【化１０１】
2019512556.tif 000104
【０６２６】
ポリエチレンイミン（０．２ｇ；分子量６０〜７５ｋＤａ）をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＡＣＮ（１ｍＬ）中のアクリルアミド−ＡＡＰＦ−ＲＢＢ（１５ｍｇ）（実施例４７）を添加した。混合物を１８時間撹拌した。次いで、溶液をＮａＨＣＯ３および水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １２〜１４ｋＤａ）。濾過後、溶媒を蒸発させた。青い粘着性残渣が得られた。収量：１４０ｍｇ。
【０６２７】
実施例８３。アクリルアミド−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ
【０６２８】
合成：４２０ｍｇのＨ−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（実施例４４）および２００ｍｇの重炭酸ナトリウムを２５ｍＬのＤＭＦに懸濁する。４５μＬの塩化アクリロイルを添加する。２時間後、さらに４０μＬの塩化アクリロイルを加える。反応を一晩で終了した後、混合物を濃縮し、酢酸エチルを用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかけて副生成物および不純物を除去し、次いでメタノールを用いて生成物を溶出する。収量１２５ｍｇ、ＥＳＩ−ＭＳ（陰性）［Ｍ−Ｈ］−：８９２。
【０６２９】
実施例８４。α，ω−ビス（Ｎ−プロピオニル−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ）ＰＥＧ（２４ｋ）
【化１０２】
2019512556.tif 000105
【０６３０】
α，ω−ビス−アミノＰＥＧ（０．３ｇ；ＭＷ２４ｋＤａ、０，１０６ｍｍｏｌ／ｇＮ）をＨ２Ｏ（５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＡＣＮ（２０ｍＬ）中のアクリルアミド−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（３３ｍｇ）（実施例８３）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、溶液を水／エタノール（９：１、２回）および水（２回）中のＮａＨＣＯ３に対して透析した（ＭＷＣＯ  １２〜１４ｋＤａ）。濾過後、溶媒を蒸発させた。染料が高分子量画分と会合した、青色の水溶性固体ポリマーが得られた。収量：１４０ｍｇ。
【０６３１】
実施例８５。α，ω−ビス（Ｎ−プロピオニル−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ）ＰＥＧ（１１ｋ）
【化１０３】
2019512556.tif 000106
【０６３２】
α，ω−ビス−アミノＰＥＧ（０．２５ｇ；ＭＷ１１．４ｋＤａ、０，１９０ｍｍｏｌ／ｇＮ）をＨ２Ｏ（５ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＡＣＮ（２０ｍＬ）中のアクリルアミド−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（３０ｍｇ）（実施例８３）を添加した。混合物を室温で４８時間撹拌した。次いで、溶液を水／エタノール（９：１、２回）および水（２回）中のＮａＨＣＯ３に対して透析した（ＭＷＣＯ  １２〜１４ｋＤａ）。濾過後、溶媒を蒸発させた。青色が、高ＭＷ画分と会合した、青色の水溶性固体が得られた。収量：１２０ｍｇ。
【０６３３】
実施例８６。プロピルアミノプルラン
【化１０４】
2019512556.tif 000107
【０６３４】
シアノエチルプルラン（３．５ｇ）をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ（２００ｍＬ）を添加した。この溶液に６．０ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏを添加した。紫色の溶液を氷浴で冷却した。この温度で、６．８ｇのＮａＢＨ４を６時間かけて添加した。黒色沈殿が生成した。反応混合物を室温でさらに１２時間撹拌した。混合物を酢酸（１０ｍＬ）で酸性化した。１日後、黒色沈殿が溶解し、得られた紫色の溶液を透析にかけた（ＭＷＣＯ  １２〜１４ｋＤａ、水３回）。白色の粘性懸濁物が生成した。生成物を遊離アミンとして単離するために、ＮａＯＨ（約２ｇ）を添加した。粘性の低い生成物は、水に対して透析された。蒸発後、褐色固体が生成し、これは水に不溶性であった。  褐色固体、１．８５ｍｍｏｌ／ｇＮ。収量：２．４ｇ。
【０６３５】
実施例８７。プロピルアミノＨＥＣ
【化１０５】
2019512556.tif 000108
【０６３６】
ＨＥＣ（５．０ｇ、９０ｋＤａ）をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解した。ＮａＯＨ（０．１６ｇ）を添加した。この溶液に、アクリロニトリル（０．８ｍＬ）を４時間以内に（０．２ｍＬずつ）加え、室温でさらに１２時間撹拌した。黄色溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０〜２０ｋＤａ、２回）。得られた溶液（１５０ｍＬ）をＴＨＦ（７５ｍＬ）で希釈した。ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（６．３ｇ）を添加した。４時間以内にＮａＢＨ４（６．８ｇ）を添加することにより還元を達成した。黒色沈殿が生成した。混合物を酢酸（５ｍＬ）で酸性化した。沈殿物の溶解（２日間）後、溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０〜２０ｋＤａ、２回）。蒸発後、黄色の水溶性固体が得られた。収量：３．５ｇ、１．０２ｍｍｏｌ／ｇＮ。
【０６３７】
実施例８８。Ｎ−（プロピオニル−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ）−プロピルアミノＨＥＣ
【化１０６】
2019512556.tif 000109
【０６３８】
プロピルアミノＨＥＣ（５００ｍｇ；実施例８７）をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶解した。アクリルアミド−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（７５ｍｇ）（実施例８３）をＡＣＮ（２５ｍＬ）に溶解した。溶液を合わせ、２４時間撹拌した。次いで、反応混合物を５４℃で２日間維持した。得られた暗青色の溶液を、水／ＥｔＯＨ（９：１、２回）および水（２回）中のＮａＨＣＯ３に対して透析した。１５ｍＬになるまで部分的に蒸発させた後、非常に粘性の青色溶液が得られた。激しく攪拌しながら、この溶液をＡＣＮ（８０ｍＬ）に加えた。得られた青色沈殿物を、上清中にそれ以上の未反応染料が検出されなくなるまでＡＣＮで抽出した。生成物をＡＣＮに貯蔵し、これは、水／ＭｅＯＨに可溶な青色のゴム状固体であった。
【０６３９】
実施例８９。プロピルアミノＨＥＣ（コバルトおよび触媒の濃度がより低い、実施例８７のスケールアップ）
【化１０７】
2019512556.tif 000110
【０６４０】
ヒドロキシエチルセルロース（５０ｇ；９０ｋＤａ）をＨ２Ｏ（５００ｍＬ）に溶解した。ＮａＯＨ（１．６ｇ）を添加した。この溶液に、アクリロニトリル（９．０ｍＬ）を６時間以内に（２．０ｍＬずつ）加え、室温でさらに１２時間撹拌した。混合物を水／ＴＨＦ（１：１；２００ｍＬ）で希釈し、さらなるアクリロニトリル（２ｍＬ）を添加した。室温で１時間攪拌した後、黄色溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０〜２０ｋＤａ、２回、３６時間）。この溶液（１１６０ｍＬ）をＴＨＦ（２５０ｍＬ）で希釈した。ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（２５ｇ）を添加した。１８時間以内に０〜５℃でＮａＢＨ４（４４ｇ）を添加することにより還元を達成した。黒色沈殿が生成した。混合物を酢酸（５０ｍＬ）で酸性化した。３日以内に、黒色沈殿は溶解した。沈殿物の溶解後、溶液を水に対して透析した（ＭＷＣＯ  １０〜２０ｋＤａ、２回）。溶媒を部分的に蒸発させた後、粘稠な黄色溶液が得られた。固形分：約３０ｇ。収量：３０ｇ；乾燥物質中０．８５ｍｍｏｌ／ｇＮ。
【０６４１】
実施例９０。アクリロイル化長鎖ＰＥＧ（２０００）−ＡＡＰＶ−ＲＢＢリンカー。
【０６４２】
１００ｍｇのビス−アミノＰＥＧ２０００をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦ（１ｍＬ）中のアクリロイル化ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（実施例８３）１２ｍｇを加え、混合物を１時間撹拌した。次いで、反応混合物を５４℃で１８時間維持した。溶媒を蒸発させた後、ジエチルエーテルを加えて過剰のビス−アミノＰＥＧを抽出し、生成物を沈殿させた。沈殿物をエーテル（２回）で洗浄し、乾燥させ、ＡＣＮ（２５ｍＬ）に再溶解した。ＮａＨＣＯ３（５０ｍｇ）および塩化アクリロイル（２０μＬ）を加え、混合物を２時間撹拌した。混合物を濾過し、蒸発乾固させた。エーテルで抽出した後、残渣を水／ＡＣＮ（１：１、１ｍＬ）に溶解した。生成物である暗紫色の溶液を、さらに精製することなく使用した。
【０６４３】
実施例９１。［［Ｎ−３−（トリエチオキシリル）プロピルアミノカルボニル］−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ
【０６４４】
２１１ｍｇのＨ−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（実施例４４）を１０ｍＬのＤＭＦに溶解した。６３μＬの３−（トリエトキシシリル）プロピルイソシアネートを一度に加え、撹拌を１０分間続けた。溶媒を除去し、生成物をエーテルで沈殿させた。エーテルで洗浄した後、暗紫色の粉末を得た。収量：１２０ｍｇ；ｍ／ｚ＝１０８５（Ｍ−Ｈ）。
【０６４５】
実施例９２。ＡＡＰＶ−ＲＢＢ標識シリカゲル
【化１０８】
2019512556.tif 000111
【０６４６】
［Ｎ−３−（トリエチオキシリル）プロピルアミノカルボニル］−ＡＡＰＶ−ＲＢＢ（実施例９１）１４ｍｇを１．２ｍＬのＤＭＦに溶解した。この溶液にシリカゲル１００ｍｇを分散させた。次いで、１μＬの硫酸を加え、反応混合物を７５℃まで加熱した。混合物をこの温度で２日間維持した。暗青色のシリカゲルをカラムに移し、アセトニトリル（２００ｍＬ）、水／アセトニトリル（１：１；５００ｍＬ）、水／メタノール（１：１；５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）で洗浄した。結果：６５ｍｇの暗青色粉末（さらなる特性決定のための酵素アッセイを参照）。
【０６４７】
実施例９３。長鎖リンカーを有するペプチド標識されたビーズ球アミン微小球
【０６４８】
アクリロイル化長鎖ＰＥＧ（２０００）−ＡＡＰＶ−ＲＢＢリンカー（０．５ｍＬ；実施例９０）を１ｍＬのビーズ球アミン微小球分散液に添加した。反応を６０℃で２．５日間行った。次いで、微小球を遠心分離し、水／ＡＣＮ（１：１、８回）および水（２回）で洗浄した。得られた薄紫色の沈殿物を水（１ｍＬ）に再懸濁させて、淡紫色の分散液を得た。
【０６４９】
実施例９４。ジアニシジンを用いたＦｍｏｃ−ＡＡＰＶのアミド化
【化１０９】
2019512556.tif 000112
【０６５０】
Ｆｍｏｃ−ＡＡＰＶ（１１６ｍｇ）およびＨＯＢｔ（４０ｍｇ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解した。溶液を氷浴に入れ、ＤＣＣ（４５ｍｇ）を加えた。撹拌を０℃で３０分間、室温でさらに３０分間続けた。次いで、５倍過剰のｏ−ジアニシジン（２５０ｍｇ）を添加した。１２１時間の反応時間後、生成物をＥＳＩ−ＭＳ（陽性モード）［Ｍ＋Ｈ］＋：８０５、［Ｍ＋Ｎａ］＋：８２７）により観察した。
【０６５１】
実施例９５：Ｏ−アリルクロロフェノールレッドの合成
【化１１０】
2019512556.tif 000113
【０６５２】
クロロフェノールレッド（２．７６ｇ）、臭化アリル（１．２９ｍＬ）および炭酸カリウム（１．８ｇ）を乾燥アセトン（５０ｍＬ）中で混合し、９６時間加熱還流した。室温に冷却した後、全ての固体を濾別し、アセトンで洗浄した。合わせた濾液（約７０ｍＬ）を激しく撹拌しながらジエチルエーテル（３５０ｍＬ）に注いだ。攪拌を２０分間続けた後、沈殿を濾過により集め、再溶解し（アセトン５０ｍＬ）、沈殿させた（ジエチルエーテル４００ｍＬ）。３０分間撹拌した後、沈殿物を濾過によって集め、５４℃で乾燥して、２．７２ｇを得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）［Ｍ−Ｈ］−：４６１；その物質はもはやｐＨで色を変えなかった。
【０６５３】
ブロモフェノールレッドと同じ手順で類似の生成物が得られる。（ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）［Ｍ−Ｈ］−：５５１、２Ｂｒの同位体パターン、６４％。）
【０６５４】
実施例９６：Ｃ−アリルクロロフェノールレッドの合成
【化１１１】
2019512556.tif 000114
【０６５５】
Ｏ−アリルクロロフェノールレッド（２ｇ、実施例９５）をニトロベンゼン（１０ｍＬ）に懸濁し、２１０℃の油浴中で７０分間加熱した。ＴＬＣコントロール（シリカゲル、クロロホルム−メタノール  １０−３、２％ギ酸）が、完全な変換を示したら（付加物：Ｒｆ＝０．６５、生成物：Ｒｆ＝０．５５、出発物質は、アンモニアにさらされても色が変わらない、生成物は、アンモニアにさらされると色が暗紫色に変わった）、反応物を室温まで冷却し、次いでジエチルエーテル（５０ｍＬ）で希釈した。沈殿物をデカンテーションにより回収し、メタノール（２５ｍＬ）で再溶解し、激しく撹拌したジエチルエーテル（３００ｍＬ）に注いで沈殿させた。ニトロベンゼンの臭いが検出されなくなるまで溶液沈殿法を繰り返した（２〜３回）。生成物を５４℃で乾燥させ、目的化合物（１．３９ｇ）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）［Ｍ−Ｈ］−：４６１；塩基を用いて処理すると、この物質の色は深紫色に変化した。
【０６５６】
実施例９７：Ｃ−アリルブロモフェノールレッドの合成
【化１１２】
2019512556.tif 000115
【０６５７】
Ｏ−アリルブロモフェノールレッド（６９０ｍｇ、実施例９５）をニトロベンゼン（１０ｍＬ）に懸濁し、２１０℃の油浴中で６０分間加熱した。ＴＬＣコントロール（シリカゲル、クロロホルム−メタノール  １０−３、２％ギ酸）が、完全な変換を示したら（付加物：Ｒｆ＝０．５９、生成物：Ｒｆ＝０．４５、付加物は、アンモニアにさらされても色が変わらない、生成物は、アンモニアにさらされると色が暗紫色に変わった）、反応物を室温まで冷却し、次いでジエチルエーテル（５０ｍＬ）で希釈した。クロロギ酸−メタノール−シクロヘキサン（６−１−４）を用い、シリガゲル上で沈殿をクロマトグラフィーにかけると、２１０ｍｇの目的化合物が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ（陰性モード）［Ｍ−Ｈ］−：５５１（２Ｂｒの同位体パターン）；アンモニアを用いると、色が紫色に変化した。
【０６５８】
実施例９８：ｐＨ感受性部分を含む化学種
【０６５９】
ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッド、チモールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、および他のスルホフタレイン染料から選択されるｐＨ感受性部分を含む化学種は、当該分野で公知の方法を用いてアンカー領域に連結される。例えば、ｐＨ感受性部分は、単結合、アルキレンリンカー、アルケニレンリンカーおよびアルキニレンリンカー、アミドリンカー、またはアミンリンカーを介し、アンカー領域（ポリスチレンビーズ、シリカゲルビーズ、多糖ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、多糖、誘導体化セルロース、ポリアクリレート、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ＵＶ活性化基およびペプチドグリカン誘導体、またはこれらの組み合わせから選択される）に連結する。
【０６６０】
実施例９９：ＥＬＡおよびＣＡＴＧ基質の酵素加水分解の試験
【０６６１】
先の実施例の基質を、ＥＬＡおよびＣＡＴ活性検出の試験における加水分解速度および有用性について試験した。
【０６６２】
エラスターゼ：白血球由来の膵臓ブタエラスターゼおよびヒトエラスターゼを用いたアッセイを、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーｐＨ７（または５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ７）中、（添加した染料の分子量および量に依存して）１Ｕ／ｍＬの酵素、１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの基質を含有する全体積２５μＬで行った。アッセイ混合物の外観は、酵素基質の特性に依存して、透明な溶液、懸濁液またはゲルのいずれかであった。３７℃でインキュベーションを行った。３時間後および２０時間後に、１０μＬのサンプルを採取し、各サンプルに１０μＬのＭｅＯＨを添加することによって酵素を変性させた。混合し、−２０℃で２０分間インキュベートした後、サンプルを１３．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各アッセイは、酵素を含まず、１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの基質を含むコントロールを含んでおり、分析は、酵素を含むアッセイと同じ様式で行い、並行して行った。ＭｅＯＨ沈殿後の上清を、分子の特性および予想開裂生成物の特性に依存して、イオントラップＭＳによって、［Ｍ＋Ｈ］＋または［Ｍ＋Ｈ］−のいずれかで分析した。
【０６６３】
カテプシン：カテプシンＧのアッセイを、０．５Ｕ／ｍＬを含有する全体積２５μＬで行い、開裂が観察された場合には、さらなるアッセイにおいて、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）（または５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭの酢酸ナトリウム混合物ｐＨ７）中、（固定相に添加した染料の分子量および量に依存して）０．１Ｕ／ｍＬの酵素、１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬの基質においてアッセイを行った。アッセイ混合物の外観は、酵素基質の特性に依存して、透明な溶液、懸濁液またはゲルのいずれかであった。インキュベーション、コントロール、サンプリングおよび分析は上述の通りであった。
【０６６４】
これらの研究の結果を表２にまとめている。
【０６６５】
表２：エラスターゼおよびカテプシンＧによる特異的基質の開裂速度のまとめ。
【表２】
2019512556.tif 000116
2019512556.tif 000117
2019512556.tif 000118
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2019512556.tif 000123
ｎ．ｔ．＝試験せず
【０６６６】
実施例１００：架橋したトラップ
【０６６７】
ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣのような四級アミンポリマーを、調製物に応じて、ポリエチレンイミンポリマーと１９：１〜５：１の比で混合した。溶媒は、水とアセトニトリル（１：１  Ｖ／Ｖ）の混合物であり、ポリアミンポリマーの最終濃度は２０％であった。これに、調製物に応じて、３、６、９または１２％Ｖ／Ｖのいずれかに対応する量のエピクロロヒドリンを添加した。混合物を６０℃で一晩還流させ、反応させた。その後、未反応のエピクロロヒドリンを除去するために、凝縮器なしで混合物を加熱する。これに過剰のアンモニア水溶液を添加し、さらに未反応のエポキシドを全てクエンチするために反応させた（この後者の工程は、反応性の結合トラップ材料のため、省略することもできる）。混合物を減圧下で濃縮してアセトニトリルおよびエピクロロヒドリン（クエンチしていない場合）を除去し、蒸発した水を置換した。最終混合物は１０〜４０％のポリアミンＷ／Ｖを含有していた。粘度は架橋度に比例していた。
【０６６８】
実施例１０１：水溜め部または染料トラップとしてのＵＶで開始するカチオン性超吸収剤
【０６６９】
四級アミンポリマー、例えば、ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣを、四級アンモニウム基を含むモノマー、例えば、５：１、７．５：１、１０：１または１５：１の比率の（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリドまたは［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリドと混合した。  この混合物に、ベンゾフェノン、フェナントレンキノンまたはベンゾイルペルオキシドから選択されるラジカル開始剤を添加した。  さらに、ジ（トリメチロール）プロパンテトラアクリレートなどの架橋剤をコリンアクリレートモノマーの１モル当量の１％で添加した。この溶液を、２５％イソプロパノールになるまで希釈した。染料トラップについては、約１μＬの溶液を、ゴムスタンプを用いて、１５ｍｍ２の不織布に対し、紙の領域に塗布した。次いで、２５４ｎＭのＵＶ放射線下、２０分間照射した。機能は、紙または不織布に沿って延伸され、四級アミン基に捕捉されたブリリアントブラック０．５％（Ｗ／Ｖ）を含有する水溶液を用いて実証された。
【０６７０】
水溜め部または超吸収剤として、より厚いポリマーの床が形成された。点、すなわち、直径４ｍｍまたは４μＬを、ガラス、フォームまたは紙のような疎水性表面上に堆積させた。付着物を、手持ちのＵＶランプを用い、２５４ｎｍで３０分間ＵＶ硬化させた。次いでそれらを、鮮やかな黒色染料またはブロモフェノールブルー染料の水懸濁液に入れた。  膨張および染料結合の程度は、超吸収剤または染料トラップとしての可能性を示した。超吸収剤は、水中でその乾燥重量の１００倍を超える吸収能力によって命名される。
【０６７１】
１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）０．３ｍＬの組成物を用い、ガラス表面に堆積させ、その後、照射して平らな円板を得た。４、６、１０、２０または３０μＬを適用すると、ほぼ同様の重量の円板が得られる。水吸収は、以下の表に示されている通りであった。
【０６７２】
【表３】
2019512556.tif 000124
【０６７３】
実施例１０２：ＵＶ開始架橋トラップおよび超吸収剤
【０６７４】
アクリレートの重合によるカチオン性トラップの合成
【０６７５】
１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）１．７７ｍＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６７６】
１ｍＬの（アクリルアミド）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）１．７７ｍＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６７７】
１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）３．５４ｍＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６７８】
１ｍＬの（アクリルアミド）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）３．５４ｍＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６７９】
１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、およびＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８０】
１ｍＬの（アクリルアミド）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、およびＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８１】
１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、グリセロール  １，３−ジグリセロレートジアクリレート１２０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）１．７７ｍＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８２】
１ｍＬの（アクリルアミド）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート（平均Ｍｎは約６９２）５００μＬ、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノンの２−プロパノール溶液（１０％（ｗ／ｖ））２００μＬ、およびＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８３】
１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート１５０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））４０μＬ、およびトリエタノールアミン３０ｍｇを合わせ、２−プロパノール３５０μＬで希釈し、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８４】
１ｍＬの（アクリルアミド）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）、グリセロール  １，３−ジグリセロレートジアクリレート３００μＬ、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノンの２−プロパノール溶液（１０％（ｗ／ｖ））２００μＬ、およびＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））９０μＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８５】
１ｍＬの（アクリルアミド）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド（７５％水溶液）、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート（平均Ｍｎは約６９２）１ｍＬ、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノンの２−プロパノール溶液（１０％（ｗ／ｖ））２００μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））１５０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）２ｍＬを合わせ、激しく混合した。この混合物１μＬを固体担体（ガラス板、濾紙、不織布）に塗布し、２５４ｎｍの光を２０分間照射した。
【０６８６】
染料トラップとして、上述の約１μＬの溶液を、ゴムスタンプを用いて、１５ｍｍ２の紙または不織布の領域に塗布した。次いで、２５４ｎＭのＵＶ放射線下、２０分間照射した。機能は、紙または不織布に沿って延伸され、四級アミン基に捕捉されたブリリアントブラック０．５％（Ｗ／Ｖ）を含有する水溶液を用いて実証された。
【０６８７】
水またはタンパク質溶液がトラップ領域を通過するのを可能にしつつ、目に見える量の化合物を捕捉するのに十分な堆積度を用いて、最適なトラップ効果が得られた。１ｍＬのコリンアクリレート（８０％水溶液）、ジ（トリメチロールプロパン）テトラアクリレート７０μＬ、ベンゾフェンの２−プロパノール溶液（２０％（ｗ／ｖ））５０μＬ、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）の溶液（５０％（ｗ／ｖ））６０μＬ、およびポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（分子量４００，０００〜５００，０００、水中２０％）０．３ｍＬの組成物を用いることは、効果的ではあるが、過剰に担持されてしまう傾向がある。２０％または４０％に希釈し、不織布を含むビスコース上に、１２ｍｍ２あたり０．２〜０．６μＬを付着させた後、２５４ｎｍで手持ちのＵＶランプを３０分間照射すると、適切な流体移動と、適切な捕捉が得られた。  これらの四級アミンは、粘性印刷溶液として最も理想的に適用される。この目的のために、以下のように処方することができる：３．３％のＥｘｉｌｖａ懸濁液１５ｇを脱塩水中で調製した。４％ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣの脱イオン水溶液１２．５ｇを、連続的に攪拌しながら、段階的に添加した。次いで、１０．０ｇの脱塩水を、連続的に攪拌しながら、段階的に添加した。次いで、５０ｇの水性Ａｅｒｏｓｉｌ  ２００ゲルを、脱塩水（１０％Ｗ／Ｗ）中のＡｅｒｏｓｉｌ  ２００の水和によって調製した。４％ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣ脱塩水溶液５ｇを、Ａｅｒｏｓｉｌゲルに段階的に添加した。Ａｅｒｏｓｉｌ／ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣゲルを少量ずつＥｘｉｌｖａ／ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣゲルに加え、混合した。最後に、さらに７．５ｇの４％ＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣを混合物に添加した。得られた１００ｇ溶液は、５％のＡｅｒｏｓｉｌ２００，０．５％のＥｘｉｌｖａおよび１％のＰｏｌｙＤＡＤＭＡＣを含有していた。このインク配合物は、ＵＶ２５４ｎｍ下での暴露のために０．００２％フルオレセインＷ／Ｗで標識することができる。
【０６８８】
実施例１０３。５−（ｐ−アミノメチル）フェニル−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
【化１１３】
2019512556.tif 000125
【０６８９】
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＸＧａｌ、１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をｐ−アミノベンジルボロン酸（３８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）と共に丸底フラスコに入れた。この種を周囲温度で攪拌しながら（マグネチックスターラー、３００ｒｐｍ）、アセトニトリル（３ｍＬ）および水（約０．５ｍＬ）で部分希釈した。撹拌しながら、ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＡ、７８μＬ、０．５５ｍｍｏｌ）、次いで酢酸パラジウム（ＩＩ）（Ｐｄ（ＯＡｃ）２  ３ｍｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン種（ＴＰＰＴＳ、２１．３ｍｇ、０．０３７５ｍｍｏｌ）を添加した。系を８０℃まで加熱し、処理を４８時間続けた。反応の進行をＥＳＩ−ＭＳによってモニターした。室温に冷却した後、沈殿物を濾去し（所望の生成物は溶液中にとどまる）、反応混合物を直接、ω−ブロモアルキル化ペプチドグリカン誘導体のさらなる処理に使用した。
【０６９０】
実施例１０４：５−（ｐ−アミノメチル）フェニル−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＰＧ付加物
【化１１４】
2019512556.tif 000126
【０６９１】
乾燥したω−ブロモアルキル化ペプチドグリカン（５５ｍｇ）をエッペンドルフチューブに入れ、５−（ｐ−アミノメチル−）フェニル−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのアセトニトリル／水（６：１）溶液（１．５ｍＬ、過剰）を周囲温度で加えた。反応系を７２時間振盪した。その後、沈殿物を水およびエタノールで連続的に洗浄し、続いて透析精製（水、７２時間）して低分子ＸＧａｌ種の除去を確実にした。透析に際して、生成物を凍結乾燥して黄色の粉末を得た。
【０６９２】
実施例１０５：エピブロモヒドリンを用いたペプチドグリカンのＯ−アルキル化
【化１１５】
2019512556.tif 000127
【０６９３】
乾燥したペプチドグリカン（ＰＧ）（１．０ｇ）を３ッ口丸底フラスコに入れ、ゆっくりと攪拌しながら（マグネチックスターラー）周囲温度で１，４−ジオキサン（３ｍｌ）に懸濁した。エピブロモヒドリン（３００μＬ、３．５ｍｍｏｌ）を添加し、続いて過塩素酸７０％（３０μＬ）を添加した。周囲条件での処理を３時間続けた。その後、反応混合物を紙フィルターに注ぎ、続いて水、１，４−ジオキサンおよびジエチルエーテルで洗浄した。濾過し、アルキル化ＰＧを真空中で乾燥させ、さらなる処理のために冷蔵庫に保存した。収量：１，０６ｇを超える。（全体的な収量を正確に決定することはできない。）
【０６９４】
調製のための使用には、実施例１０４および図７Ａ〜Ｃのような発色基質の固定化が含まれる。また、活性化されたＰＧを用いて、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、エステラーゼまたはホスファターゼなどの二次酵素を結合させることができる。
【０６９５】
このような材料を形成するための一般的な方法は、ＰＧおよびエピブロムヒドリンの新しく活性な生成物を取り出し、次いでそれを水およびバッファーをいくつか変えつつ洗浄することである。次にそれを限定量のグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、ペルオキシダーゼ、エステラーゼまたはホスファターゼと混合し、撹拌しながら反応させる。反応後、これを酢酸アンモニウムバッファーで洗浄して、残りのＢｒ基をクエンチし、固定化されていない酵素を除去する。
【０６９６】
リゾチームのアッセイを実施するために、共有結合した基質を含有するＰＧを、同種補助酵素に結合したＰＧと混合する。リゾチームによる分解において、補助酵素は、リゾチームの作用によってやはりより可溶性にされる結合基質を活性化するために利用可能になる。したがって、ＰＧ−Ｘ−Ｇａｌコンジュゲートは、Ｂ−ガラクトシダーゼに結合したＰＧと混合される。
【０６９７】
実施例１０６：塩素化β−ラクタム前駆体の形成
【化１１６】
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【０６９８】
３−クロロメチル−７−（２−フェニルアセトアミド）−３−セフェム−４−カルボキシレート（１．０４ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（乾燥、４０ｍＬ）に懸濁させ、ｍ−クロル過安息香酸（７７％、１．０９ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）を室温で一度に加えた。混合物を室温で週末にわたって撹拌した。固体を濾別し、ＤＣＭ（３０ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮乾固した。粗生成物をＥｔ２Ｏ（４０ｍＬ）に取り、氷浴中で２時間撹拌した。次いで、固体を濾別し、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）で洗浄した。生成物（８１１ｍｇ、７３％）を白色固体として得た。
【０６９９】
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５４１。
【０７００】
実施例１０７：β−ラクタムインドキシルエーテルの形成
【化１１７】
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【０７０１】
室温で、３−クロロメチル−７−（２−フェニルアセトアミド）−３−セフェム−４−カルボキシレート（４８８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）をアセトン（乾燥、５ｍＬ）に懸濁し、混合物を、室温でアルゴンを流しつつ１０分間撹拌した。次いで、５−ブロモ−４−クロロインドキシル（２３１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を室温で一度に加えた。アルゴン流での撹拌を５分間続けた後、炭酸カリウム（２７８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を室温で一度に加えた。次いで、アルゴンを流しつつ、混合物を室温でさらに１０分間撹拌した。次いで、さらなるアセトン（乾燥、２ｍＬ）を添加した。アルゴン気流で室温でさらに２分間撹拌した後、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で一晩撹拌した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）を加えた。抽出後、全混合物を溝付きフィルターで濾過した。濾過後、有機相と水相を分離し、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮乾固した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、溶出液：ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ）で精製した。生成物を含有する画分を集め、２２８ｍｇの深褐色固体を得た。
【０７０２】
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性）：［Ｍ＋Ｎａ］＋＝７１８。
【０７０３】
実施例１０８：メトキシアニリン誘導体塩
【０７０４】
実施例１０の物質は、直接的なＭＰＯの基質とすることができるが、アルキル化反応生成物とメトキシアニリンと二価アニオンとのイオン対として配合すると、最も迅速な反応をもたらす（図１２参照）。  理想的な質量比は、２：８  アニリン：実施例１０の生成物である。最も効果的な反応は、二価アニオンが硫酸である場合に起こるが、ジスルフォン置換芳香族系およびリン酸も、速度は減少するが使用することができる。ＨＣｌは、限られた反応しか与えない。反応すると、ＭＰＯ酸化生成物の１つは、２つのアニリン要素のダイマーであるように見える（図１３参照）。
【０７０５】
そのような基質の主な要件は、それらがヘムと反応しないことである。Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅの代替品として様々なメトキシアニリンを使用することができるが、それら（３，４−ジメトキシアニリン、２，５−ジメトキシアニリン）は、発色団単独で、ヘムや過酸化物と反応する傾向がある。これを避けるためには、アミドを介した失活が必要である。  種々の置換基が実現可能である。アルキルアンカー部分は、直接アルキル化または実施例１０のエポキシ化反応のバリアントのいずれかによって、他の同様の親油性基で置き換えることができる。  同様に、アミド基は、さまざまであってもよい。
【０７０６】
マーカッシュ図を挿入する−ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ
【０７０７】
実施例１０９：紙または不織材料のような固体材料上の基質の調製
【０７０８】
エラスターゼ検出：円形濾紙（６ｍｍ）に、含浸分散混合物（０．２５％（ｗ／ｗ）Ｎｏｎｉｄｅｔ、０．０５Ｍ  ホウ酸バッファーｐＨ８中の２％（ｗ／ｗ）デカノール）を１〜２分間含浸させた。その後、濾紙をガラス板上に置き、５４℃で１〜２時間乾燥させた。乾燥後、実施例１のエラスターゼ−基質ＦｍｏｃＡＡＰＶインドキシルエステル（メタノール中２０ｍｇ／ｍＬ）を、最終的な量である、試験円形（２０ｍｍ２）あたり８０μｇが塗布されるまで、上述の円形に２μＬずつ２回、ピペットで加えた。
【０７０９】
あるいは、エラスターゼ基質ＦｍｏｃＡＡＰＶインドキシルエステル（実施例１）を、メタノール中、４−ジアゾ−３−メトキシジフェニルアミンサルフェートおよび／または２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩と混合し、最終濃度が、１０ｍｇ／ｍＬのＦｍｏｃＡＡＰＶインドキシルエステルであり、５〜１０ｍｇ／ｍＬのそれぞれのジアゾニウム塩（または両方の組み合わせ）とすることができる。混合物を２μＬずつ２回、含浸した試験環上にピペットで移した。
【０７１０】
ＭＰＯ検出：実施例１０８の物質の４０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ：メタノール（１部のＤＭＳＯ、２部のＭｅＯＨ）溶液２μＬをピペットで加え、その後、乾燥工程（４８時間、室温）を行うことによって、円形濾紙（直径６ｍｍ）を含浸させた。これに、水中の１０μｇのグルコースおよび３μＬの０．１％グルコースオキシダーゼ（３μｇ）加える。
【０７１１】
水分接触を示す陽性コントロールは、キトサン中のブロモチモールブルーの調製に基づき、グルタルアルデヒドを含有するｐＨ指示薬である。混合物をレポーター領域にピペットで入れ、乾燥後、暗黄色指標系が得られる。
【０７１２】
あるいは、０．１％ブロモクレゾールパープルのエタノール溶液を使用することができる。そのために１．４μＬを円形濾紙（直径６ｍｍ）上にピペットで移し、５０〜６０℃で１．５時間乾燥させる。
【０７１３】
これらの様々な濾紙をスティック上に置き、ケアポイントにおける体液の同時評価を可能にする。これらをディップスティックと呼ぶ。
【０７１４】
実施例１１０：気道吸引物の臨床評価
【０７１５】
実施例１０９のディップスティックは、適切な貯蔵によって活性状態に維持され、試験のために臨床施設に送達される。これらを、気道吸引液中の感染状態を評価するために使用することができる。これらの物質の感染を検出する能力を試験するために、このスティックを用いて、集中治療処置の一部として挿管された患者の吸引物を評価する。吸引は、定期的なケアの一環として行われる。吸引後、得られた物質をディップスティックと接触させ、最大６分間反応させる。  反応の程度に応じて、バイオマーカー酵素の推定上の濃度を示す様々なカットオフ値を得ることができる。  バックグラウンドレベルを上回る吸入におけるエラスターゼまたはＭＰＯの存在は、潜在的な感染の指標である。これらのデータの有用性を解釈するために、ディップスティックに対する応答を、サンプルについて臨床的に知られていたものと比較した。場合によっては、サンプルは、感染のために治療されている患者から採取されることが知られていた。他の場合には、患者は、気道感染症を有していないと考えられた。  特定の症例では、２日以内に感染をその後発症した患者からサンプルを採取した。これらのサンプルは、採取された時点の臨床診断であったため、「非感染」とみなされた。しかし、今後の研究では、２日以内に感染を発症する患者のサンプルを「感染した」と分類する予定である。
【０７１６】
計５２例の患者を１１７サンプルによって評価した。データは、各バイオマーカーに対する反応の程度および感染を示すために使用されるカットオフ値にしたがって集計することができる。これらのデータを以下のデータセットにまとめている。
【０７１７】
１１７の患者サンプル全てにおけるエラスターゼ応答の分析。
【表４】
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【０７１８】
両方のバイオマーカーを使用する５２人の患者の分析
【表５】
2019512556.tif 000131
【０７１９】
これらのデータは、バイオマーカーが反応時間および使用されたカットオフと共に報告されるバイオマーカー応答の分析である。従って、ＨＮＥ６  ２，３は、反応が６分間観察されたことを意味し、図１０Ｂの例の第４スポットにおける反応の程度は、陽性サンプルの存在を示すために使用される。より高いカットオフをＭＰＯ（３，４）に用いることで、この知見が裏付けられる。
【０７２０】
しかし、感染が進行するにつれて多数の患者がサンプリングされ、「感染していない」と分類された。この現象の例を以下に示す。以下のグラフでは、臨床感染が診断された日をＴ０と示す。Ｔ−１およびＴ−２は、感染が臨床的に診断される前のサンプリング日である。
【表６】
2019512556.tif 000132
【０７２１】
これらのデータは、ＩＣＵスタッフに臨床的に明らかになる前に、バイオマーカーの応答が差し迫った感染を示す可能性があることを示唆している。これらのデータはまた、発色基質が、その感染状態と一致する気道吸引液中の異常なレベルの酵素マーカーを有用に示すことができることを示唆している。
【０７２２】
実施例１１１：負圧創傷治療液の臨床評価
【０７２３】
創傷治癒は、創傷領域に高減圧を適用することによって媒介され得る。これは、創傷を通して体液から漿液を採取し、それによって成長因子、免疫細胞および栄養素をもたらすことを含め、多くの効果を有する場合がある。また、顆粒化する組織を増殖させることを促進または刺激することもある。この処理から現れる流体は、創傷床の状態の指標である。感染バイオマーカーの存在を評価することにより、包帯または高減圧スポンジを除去することなく、創傷が良好な状態にあるかどうかを示すことができる。
【０７２４】
この手法の妥当性を評価するために、このような高減圧後に得られた流体からサンプルを採取し、ディップスティックの応答を試験した。この結果は、実施例１１０で作成された創傷と観察結果について知られているものと一致する。すなわち、感染が診断されたか、または感染が疑われる場合には、明確なバイオマーカー応答が存在する（図１０Ａ参照）。
【０７２５】
例１１２：医療機器に使用される配管内の指標物質の配置
【０７２６】
前の２つの例では、流体を供給源から採取し、バイオマーカー応答を評価するためにディップスティックシステムを用いて分析した。しかしながら、マーカーを含む材料を医用機器内のｉｎ  ｓｉｔｕに置くことも可能である。これらの材料は、監視システムの一形態と考えることができる。この用途では、材料は滅菌に適している必要があり、適切な時間スケールで反応する必要がある。例えば、創傷の高減圧治療や人工呼吸器などの多くの用途では、潜在的な状態の変化を示すのは２４時間で十分である。この目的のために、ディップスティックの迅速な反応は必要ではない。
【０７２７】
その形態も異なる。図９では、種々の形態が示されている。図９Ｂには、実施例１０９に記載の円形濾紙を収容することができる形態が示されている。しかしながら、その態様は、チューブおよび円筒形ホルダーが、反応性基質の担体または固体支持体である紙または不織布材料、他の不活性材料のポリオレフィンまたはセルロースを保持するために変換されてもよいという点で、より単純でってもよい（図９Ａ、ＣおよびＤを参照）。
【０７２８】
この概念を試験するために、実施例１０９に記載の物質で処理した、保持紙または不織布材料、ポリオレフィンまたはセルロースを、若干の変更をして調製した。特に、エラスターゼ基質は、ジアゾニウム塩で印刷または塗布されなかった。これは、この設定では迅速な反応が必要ないためである。インドキシルの発色団への変換は、通常、酸化によるものであり、ジアゾニウム塩は、酸素の必要なく、直接的な反応を起こす。モニタリング設定では、反応時間は重要ではない。同様に、ＭＰＯについては酸素が重要であり、これが制限されている場合、反応速度は制限される。
【０７２９】
この形式では、流体の通過により、支持材料が濡れ、基質が変換される。変換された基質は、縞模様として見える。一定期間内の縞模様の存在は、流体の供給源が感染した可能性があるという事実の指標となる。このようなカラー指標は、体液と接触するバキュームラインに配置することができる。それはまた、吸引ラインまたは人工呼吸機器内に配置されてもよい。
【０７３０】
実施例１１３：バイオマーカーの電子的モニタリング
【０７３１】
発色基質は、機器を使用せずに、バイオマーカー応答の解釈を可能にする手段である。しかし、特定の状況では、オンラインモニタリングまたは定量によって電子的評価が必要となることがある。この目的のために採用可能な様々な態様がある。
【０７３２】
カラーセンシングは、反射光の色、従って試薬の変化速度を読み取るためにセンサを配置することができる１つの手段である。しかしながら、センサを用いた色測定は、サンプル色に対して背景色が限られているか、またはコントラストが高い流体に依存している。カラーセンシングを達成するために、電子ボードはディップスティックまたはチップシステム上の試薬の反対側に配置される。ボードは、光源（例えば、赤色、緑色および青色の小さなＬＥＤ）と検出チップとを含む。サンプル中の活性を推定するために経時的なシグナル変化を記録する。
【０７３３】
他の態様は、電流測定による検知である。これは、インドキシル（リゾチーム、エラスターゼ）または過酸化物（ＭＰＯ）のような酸化還元活性生成物を生成または消費する基質に関連する。基板の酸化は、適切な電極によって測定され得る電流を生じさせる。酵素によって放出される酸化還元活性剤の例としては、本明細書中で何度も言及されているインドキシルだけでなく、図１１に示すようなフェロセンも含まれる。
【０７３４】
実施例１１４：指標基質の溶解性
【０７３５】
酵素基質が紙のような固相に付着したままである能力は、それらの機能にとって重要である。乾燥した基質がどの程度まで水相に再溶解するかを試験するために、適切な溶媒（アセトン、メタノール、ＤＭＳＯなど。実施例１０９も参照）を用いて基質を固相に適用し、室温で４８時間まで乾燥させる。その後、紙または不織布材料を、回転によって穏やかに撹拌しつつ、５０ｍＬの水または人工創傷液（塩化カリウム、尿素を含むリン酸緩衝化生理食塩水中の２％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．２）で２分間インキュベートし、その後、液を連続して変え（例えば、５０ｍＬを４回交換）、再び洗浄する。基質の溶解または消失は、多くの方法によって推定される。これには、溶解溶液のＬＣＭＳＭＳ分析、またはＬＣＵＶまたはＬＣＭＳＭＳによる酵素反応または直接分析による固相上の材料の残留物分析が含まれる。ＬＣＭＳの方法は、以下の通りである。
【０７３６】
ＨＰＬＣグレードのメタノール、アセトニトリル、水ＤＭＳＯおよびＴＨＦを、ストックを調製するために、また、移動相として使用した。定量は、ＡＢＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００質量分析計を検出器として使用するＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０シリーズＨＰＬＣシステムで行った。使用したカラムは、４５℃で操作した、ＲｅｐｒｏＳｉｌ  Ｐｕｒ  Ｐｈｅｎｙｌ  ３μｍ６０×２ｍｍであった。移動相は、水＋０．１％ギ酸およびアセトニトリルであった。クロマトグラフィー操作は、流速５００μｌ／分の勾配であった。注入量は５μｌであった。検出された親／フラグメント種は、実施例１の生成物については６９４／５６１であり、実施例１０の生成物については４８５／４６７であり、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅについては２７３／２５８であった。
【表７】
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【０７３７】
それぞれの検体についてＤＭＳＯ：メタノールの１：３混合物およびＤＭＳＯ：メタノールの１：１混合物のそれぞれについて、メタノール中の化合物ごとに１０ｍｇ／ｍｌのストック標準溶液を調製した。このストックをＴＨＦ中に１：１００で溶解し、０．１〜１００００ｎｇ／ｍＬの較正範囲のためにさらに１：１０の希釈物をＴＨＦ中で調製した。
【０７３８】
酵素反応によるアッセイは、実施例１０９に従い、基質をすすぎ、乾燥させた後に、他の必要な試薬を材料に添加する。必要な補助試薬（バッファー、活性化剤）を添加したら、過剰量の酵素を添加する。次いで、反応物を未洗浄サンプルと比較する。理想的な基質または基質調製物は、反応性を実質的に失うことなく、５０ｍＬの水の２回以上の変更に耐える。
【０７３９】
この実験システムは、濾紙上で乾燥させたときの基材の「耐水性」を規定する。したがって、耐水性１は、５０ｍＬの人工創傷液を１回交換した後でも、依然としてシグナルが見えることを意味する。耐水性２は、５０ｍＬの人工創傷液を２回交換した後でも、依然としてシグナルが見えることを意味する。
【０７４０】
実施例１１５：プロテアーゼ基質
【０７４１】
カテプシンの基質は、ペプチドインドキシルカップリングのための従前の実施例の方法を用いて調製することができる。配列の変異は、酵素選択性を変化させるために使用される。
【０７４２】
実施例１１６：プロテアーゼ基質の調製
【０７４３】
本明細書に記載されるようなペプチド基質は、ジペプチドをカップリングすることによって最も効率的に調製することができる。保護された形態のジペプチドＡＡおよびＰＶの調製は、その後の直接的なカップリングによって所望のＡＡＰＶ生成物を形成することを可能にする。
【０７４４】
実施例１１７：ウイルスプロテアーゼ基質の調製
【０７４５】
特定の場合に、病原体は、細菌ではなくウイルスである。上気道では、感染症の大部分は性質上ウイルス性である。特定の場合に、ウイルス感染は、細菌の重複感染を引き起こすことなく解決される。しかしながら、ウイルス感染の状況では、細菌も促進されることが一般的である。これは、ウイルスが感染の間に免疫系をしばしば抑制し、その後、より良好に分配する（粘液、咳、くしゃみ）ために、炎症反応を促進するからである。
【０７４６】
ウイルスは、自己コード化プロテアーゼまたは宿主プロテアーゼを使用する。自身のプロテアーゼをコードするウイルス型は、３Ｃプロテアーゼの類似体を使用する。
【０７４７】
３Ｃプロテアーゼのコンセンサス認識モチーフは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＧｌｎｏｎモチーフまたはＬＥＶＬＦＱｕ−Ｖａである。したがって、ウイルスシグナルの存在について粘液サンプルを評価する１つの手段は、ウイルスプロテアーゼのための発色基質を使用することである。このような例の１つは、Ｃ末端がインドキシルにエステル化されたペプチドＬＥＶＬＦＱ−インドキシルである。
【０７４８】
これとは対照的に、多くのウイルス型は、自身のタンパク質分解機能をコードしないが、宿主機能を使用するようになる。共通するのは、ウイルスによるフリンプロテアーゼの使用である。コンセンサスフリン開裂部位（−ＲＲＲＲ−または−ＲＲＫＲまたはＲＬＧＲまたはＬＬＧＲまたはＬＬＡＲ）は、非常に基本的である。発色性フリン基質は、ポリアルギニンから簡便に作成することはできず、その代わり、リシン置換が用いられる。発色基質の一例は、ＬＬＡＲ−インドキシルまたはＬＬＡＬ−インドキシルである。  あるいは、アルギニンは、アルギニンに利用可能な保護基の立体的に最も厄介でないトシル基によって保護されたままである。
【０７４９】
開示された技術の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が単なる例示として提供されることは、当業者には明らかであろう。ここで、開示された技術から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換が当業者に思い浮かぶであろう。本明細書に記載された開示された技術の実施形態に対する様々な代替が、開示された技術の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、開示された技術の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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