(57)【要約】  本発明は、微小気泡−超音波感受性薬剤複合体と共に、微小気泡−化学療法剤複合体の共投与を含む音響化学療法の方法に関する。本発明はさらに、これらの複合体を含む医薬組成物並びに音響化学療法及び／又は音響化学診断の方法におけるそれらの使用に関する。そのような方法は、特に、癌、例えば、膵臓癌の治療において使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
音響化学療法において使用するための微小気泡−化学療法剤複合体であって、前記音響化学療法が、微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の同時使用または逐次使用を含む、微小気泡−化学療法剤複合体。
【請求項２】
音響化学療法において使用するための微小気泡−化学療法剤複合体であって、前記複合体が、さらに、好ましくは、非共有結合を介して、例えば、ビオチン−アビジン相互作用を介して少なくとも１つの超音波感受性薬剤に付着又は結合している、微小気泡−化学療法剤複合体。
【請求項３】
好ましくは、非共有結合を介して、例えば、ビオチン−アビジン相互作用を介して少なくとも１つの化学療法剤に付着又は結合している微小気泡を含む、請求項１に記載の使用のための複合体。
【請求項４】
前記微小気泡−化学療法剤複合体が、気体、好ましくは酸素を保持するシェルを有する微小気泡を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
【請求項５】
前記微小気泡−超音波感受性薬剤複合体が、気体、好ましくは酸素を保持するシェルを有する微小気泡を含む、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
【請求項６】
前記微小気泡−化学療法剤複合体及び／又は前記微小気泡−超音波感受性薬剤複合体が、０．５〜１００μｍの直径を有する微小気泡を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
【請求項７】
前記微小気泡−化学療法剤複合体及び／又は前記微小気泡−超音波感受性薬剤複合体が、１種以上のポリマー、例えば、ポリエチレングリコールに連結されたリン脂質単層シェルを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
【請求項８】
前記超音波感受性薬剤が、メチレンブルー、トルイジンブルー、ローズベンガルなどのフェノチアジン色素、フォトフリン（登録商標）などのポルフィリン、クロリン、ベンゾクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、ポルフィセン、メロシアニン５４０及びインドシアニングリーンなどのシアニン及びシアニン類似体、ＢＯＤＩＰＹ及びそのハロゲン化誘導体などのアゾジピロメチン（ａｚｏｄｉｐｙｒｏｍｅｔｈｉｎｅ）、アクリジン色素、プルプリン、フェオホルビド、ベルジン、ソラレン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン及びクルクミンから選択され、好ましくは、前記超音波感受性薬剤が、ローズベンガル、メチレンブルー、インドシアニングリーン又はインドシアニングリーンの類似体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
【請求項９】
少なくとも１種類の医薬担体または賦形剤と共に、請求項２及び４〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体（例えば、少なくとも１つの化学療法剤と少なくとも１つの超音波感受性薬剤に非共有結合した微小気泡）を含む医薬組成物。
【請求項１０】
少なくとも１種類の医薬担体または賦形剤と共に、請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体、並びに請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
音響化学療法及び／又は診断方法における使用のための、好ましくは、音響化学療法及び同時画像診断の方法における使用のための、請求項９又は請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、同時に又は経時的に患者の細胞又は組織と接触し、前記細胞又は組織が超音波及び／又は光による照射に供される、請求項１１に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
癌の治療及び／又は診断、好ましくは、深部腫瘍の治療及び／又は診断に使用するための、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌が、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫；癌、例えば、乳癌、肺癌、脳癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、並びに急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、星細胞腫、神経膠腫並びに網膜芽腫からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が膵臓癌である、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
音響化学療法及び／又は音響化学診断の方法における同時使用又は逐次使用のための、請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体、並びに請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含む生成物。
【請求項１７】
以下の成分：必要に応じて、（ｉｉｉ）音響化学療法及び／又は診断の方法における前記成分の使用のための取扱説明書ともに、（ｉ）請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体；並びに別々に（ｉｉ）請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含むキット。
【請求項１８】
例えば、音響化学療法及び／又は診断の方法において、請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体との組み合わせ療法で使用するための医薬の製造における、請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体の使用。
【請求項１９】
例えば、音響化学療法及び／又は診断の方法において、請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−化学療法剤複合体との組み合わせ療法で使用するための医薬の製造における、請求項１及び３〜８のいずれか一項に定義される微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の使用。
【請求項２０】
音響化学療法及び同時画像診断の方法における、請求項１８又は請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記方法が、
（ａ）請求項９又は請求項１０に記載の有効量の医薬組成物を、影響を受けた細胞又は組織に投与すること；並びに
（ｂ）前記細胞又は組織を超音波照射及び／又は光に供すること、
を含む、患者の細胞又は組織の音響化学治療法。
【請求項２２】
請求項１及び３〜８のいずれかに定義される微小気泡−化学療法剤複合体。
【請求項２３】
少なくとも１つの化学療法剤及び少なくとも１つの超音波感受性薬剤に連結し、好ましくは、酸素ガスを含有する微小気泡。
【請求項２４】
前記超音波感受性薬剤がハロゲン化（例えば、臭素化又はヨウ素化）され、好ましくは、前記超音波感受性薬剤がハロゲン化シアニン色素、例えば、ＩＲ７８３のハロゲン化類似体である、微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
【請求項２５】
前記超音波感受性薬剤が、式Ｉ又は式ＩＩ
【化１２】
2019500410.tif 000014
（式Ｉ及び式ＩＩにおいて、各Ｘは、独立して、臭素及びヨウ素原子から選択され、好ましくは、各Ｘはヨウ素である）
の化合物、又はその薬学的に許容される塩である、請求項２４に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
【請求項２６】
前記超音波感受性薬剤が、
【化１３】
2019500410.tif 000015
及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
療法における、例えば、音響化学療法及び／又は診断の方法における使用のための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
【請求項２８】
近赤外イメージング（例えば、ＮＩＲ蛍光イメージング）の方法における使用のための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体。
【請求項２９】
式Ｉの化合物、式ＩＩの化合物
【化１４】
2019500410.tif 000016
（式Ｉ及び式ＩＩにおいて、各Ｘは、独立して、臭素及びヨウ素原子から選択され、好ましくは、各Ｘはヨウ素である）
から選択される化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３０】
【化１５】
2019500410.tif 000017
及びそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
療法における、例えば、音響化学療法及び／又は診断の方法における使用のための、請求項２９又は請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
近赤外イメージング剤として使用するための式Ｉ
【化１６】
2019500410.tif 000018
（各Ｘは、独立して、臭素及びヨウ素原子から選択され、好ましくは、各Ｘはヨウ素である）
の化合物、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３３】
【化１７】
2019500410.tif 000019
又はその薬学的に許容される塩である、請求項３２に記載の使用のための化合物。
【請求項３４】
超音波感受性薬剤及び近赤外イメージング剤の組み合わせとして使用するための、請求項３２又は請求項３３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、音響力学的療法の方法における、及び音響力学的療法の方法に関する改善に関し、特に、過剰増殖細胞及び／又は異常細胞によって特徴付けられる疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は、音響力学的療法と抗癌療法の組み合わせを用いた深部腫瘍の標的治療に関する。
【０００２】
本発明はさらに、特定の新規増感剤、それらの調製方法、並びに光力学療法（ＰＤＴ）及び／又は音響力学的療法（ＳＤＴ）の方法における増感剤としてのそれらの使用に関する。本発明はまた、近赤外（ＮＩＲ）イメージング剤としての、これらの薬剤のうちのいくつかの使用及び画像診断法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
深部腫瘍の従来の治療は、典型的には、大手術、化学療法、放射線療法又はこれらの全ての組み合わせを伴う。全３つの介入は、敗血症を含む様々な合併症をもたらし得る。したがって、そのような患者を治療するために有効性が改善され、より標的化され、低侵襲性の治療方法の開発が非常に求められている。膵臓癌は深部腫瘍の一例である。膵臓癌は、診断された人の２０％未満が根治的外科的治療の対象であることが知られている癌の最も致命的な種類の１つである。膵臓癌は全ての癌の約２％を占め、外科的切除後に全身化学療法を受ける患者の１５〜２１％の生存率は５年である。
【０００４】
癌の治療に使用するための既知の方法には、光線力学療法（ＰＤＴ）が含まれる。ＰＤＴは、患部への光増感剤の適用後に、光の光活性化への暴露が続き、これらを細胞傷害性形態に変換する。これにより、標的組織内の細胞及び周囲の血管系の破壊がもたらされる。
【０００５】
現在ＰＤＴにおける使用が承認されている光増感剤は、可視領域（７００ｎｍ未満）の光を吸収する。しかしながら、この波長の光は、皮膚に浸透する能力が制限されており、わずか数ｍｍの表面の深さしか浸透しない。ＰＤＴは、より深部の標的細胞を治療するために使用することができるが、これは、一般的に、光増感剤の活性化のために、カテーテル指向光ファイバーなどのデバイスの使用を伴う。これは、複雑な手順であるだけでなく、身体の特定の領域へのアクセスを妨げる。それはまた、治療の非侵襲的な性質を損なう。したがって、表在性腫瘍を治療するのに適するが、腫瘍塊などの深部細胞、及び解剖学的にアクセスしにくい病変の治療におけるＰＤＴの使用は制限される。
【０００６】
音響力学療法（ＳＤＴ）は、より最近の概念であり、超音波と超音波感受性薬物（ｓｏｎｏｓｅｎｓｉｔｉｓｉｎｇ ｄｒｕｇ）（超音波感受性薬剤（ｓｏｎｏｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒ）とも呼ばれる）の組み合わせを伴う。ＰＤＴと同様に、音響エネルギーによる超音波感受性薬剤の活性化によって、一重項酸素などの反応性酸素種（ＲＯＳ）が対象となる標的部位に生成される。そのような種は細胞傷害性であり、それにより、標的細胞を死滅させるか、又は少なくともその増殖能を減少させる。多くの公知の光増感剤は、音響エネルギーによって活性化することができ、そのためＳＤＴでの使用に適している。超音波は、数ｃｍの組織を容易に通って伝播するので、ＳＤＴは、組織内の深部に位置する腫瘍を治療することができる手段を提供する。光と同様に、超音波エネルギーはまた、超音波感受性薬剤を活性化させることによって、その効果を標的部位に制限するために、腫瘍塊に焦点を合わせることができる。
【０００７】
ＳＤＴは、ＰＤＴを上回るいくつかの重要な利点を提供する。超音波は、コスト効果的かつ安全な臨床イメージングモダリティとして広く受け入れられており、光とは異なり、使用される超音波周波数に応じて、しっかりと数十センチメートルまでの軟部組織に浸透することに集中することができる。
【０００８】
ＷＯ  ２０１２／１４３７３９において、超音波感受性薬剤は、気体充填微小気泡（ＭＢ）にコンジュゲートされて、ＳＤＴで使用するための微小気泡−超音波感受性薬剤「複合体」を提供する。これらの複合体は、超音波を用いて制御された気泡の破壊によって、部位特異的に活性のある超音波感受性薬剤の効果的な送達を可能にする。標的化超音波感受性薬剤のその後の又は同時の超音波活性化により、標的部位における細胞破壊及び腫瘍組織の退縮をもたらす。微小気泡の使用はまた、所望の標的部位に到達する前に、潜在的な光活性化から超音波感受性薬剤の遮蔽により、有毒な副作用の減少をもたらす。
【０００９】
最近、本発明者らは、前臨床モデルにおける膵臓癌の治療のための微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を用いてＳＤＴの有効性を実証した（ＭｃＥｗａｎら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１５；２０３，５１−６）。これらの研究から、気体酸素で充填し、ローズベンガル増感剤を保有する超音波応答性微小気泡（ＭＢ）の注入が、コアガスとしてＳＦ6を含む同様のＭＢコンジュゲートで処置した腫瘍と比較した場合、ヒト異種移植片ＢｘＰＣ−３腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍成長の統計学的に有意なＳＤＴ媒介性低減をもたらすことが示された。ＭＢのコア中に酸素を取り込む根拠は、酸素がＳＤＴにおけるＲＯＳ生成のための基質であるので、音響力学的事象中に腫瘍微小環境内で発生するＲＯＳの量を高めることであった。膵臓腫瘍は、特に、非常に低酸素であることが知られており、細胞傷害性ＲＯＳの生成については酸素に依存しており、ＰＤＴ／ＳＤＴなどの方法の有効性にさらなる悪影響を与える。
【００１０】
ベンチマーク膵臓癌代謝拮抗治療薬の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びゲムシタビンを、イリノテカン及びオキサリプラチンなどの補完的化学療法剤と組み合わせると、膵臓癌患者の平均生存率を向上させることができることも実証されている（Ｌｅｅら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；５９，２７３−９）。しかしながら、フォルフィリノックス（ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ）として知られるこの組み合わせは、重篤な副作用をもたらし、特に適合する健康な患者にのみ処方される。
【００１１】
したがって、膵臓癌などの深部のアクセス不能な腫瘍の治療のための代替方法、特に、非侵襲性又は微小浸潤性であり、かつ悪影響のない方法の必要性が存在する。このような方法は、例えば、患者の外傷の低減、治療費の削減及び入院に関連する費用の削減の面で、明らかに社会経済的な利益を有する。本発明は、この必要性に取り組むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４３７３９号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ＭｃＥｗａｎら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１５；２０３，５１−６
【非特許文献２】Ｌｅｅら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；５９，２７３−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、異なる機構を介して細胞傷害性効果を発揮する代謝拮抗療法及びＳＤＴとして（前者はチミジル酸シンターゼ阻害を介し、後者は細胞基質の酸化を介して）、単一の治療計画におけるそれらの組み合わせが、有意な患者の利益を提供することができることをこれから提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
具体的には、本発明者らは、音響力学的治療の方法において使用した場合に、超音波感受性薬剤と代謝拮抗薬の両方を送達するための微小気泡の使用がいくつかの利点を与えることを見出した。具体的には、本発明者らが発見したことは、微小気泡を有する複合体（又は複数種の複合体）の形態での超音波感受性薬剤と代謝拮抗薬の両方の送達が、超音波を用いて制御された気泡の破壊によって部位特異的に（例えば、内部腫瘍へ）両方の薬剤の有効な送達を可能にすることである。標的化超音波感受性薬剤の超音波活性化により、標的部位で腫瘍細胞を破壊するＲＯＳが生成する。この作用は、意図した標的部位でその細胞傷害性効果を直接発揮する代謝拮抗薬の作用によって補完される。両方の薬剤の担体として微小気泡を使用することにより、非標的組織によるこれらの非特異的な取り込みは低減されるので、全身送達を上回る有意な利点を提供する。このように、この治療法は、副作用を軽減し、ひいては、重要な患者の利益を提供することが期待される。
【００１６】
さらに、腫瘍微小環境へ酸素だけでなく代謝拮抗薬及び増感剤を送達するために、外部から適用される超音波と組み合わせた酸素添加ＭＢプラットフォームを利用することによって、高度に標的化された療法が、特に、増感剤と代謝拮抗化学療法薬物の治療指数の増加の結果として実現することができることを本発明者らは提案する。腫瘍に酸素を送達する微小気泡の能力は、その治療効果を媒介する酸素に依存するそのような治療をさらに強化することが期待される。
【００１７】
本明細書に記載されるのは、表面にローズベンガル（Ｏ2ＭＢ−ＲＢ）又は５−ＦＵ（Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ）のいずれかが付着した酸素添加脂質安定化ＭＢ（Ｏ2ＭＢ）の調製である。得られるコンジュゲートは、ＭＢ安定性及び超音波媒介酸素放出の点で特徴付けられ、膵臓癌細胞株のパネルにおける代謝拮抗薬／ＳＤＴの組み合わせ治療の超音波媒介細胞傷害性をインビトロで実証する。組み合わせアプローチの治療効果は、マウスにおける前臨床異所性のヒト異種移植片膵臓腫瘍モデルを用いて実証され、５−ＦＵ又はゲムシタビン単独治療を利用する従来の治療アプローチと比較される。ＳＤＴが、免疫応答及び細胞増殖を媒介するシグナル伝達プロセスに重大な影響を与えることを実証する証拠も提供される。
【００１８】
本明細書で提供される結果は、治療効果を媒介するＯ2に依存する療法の有効性を高めるために、膵臓癌における独立型の治療オプションとしての組み合わされたＳＤＴ／代謝拮抗薬療法の可能性だけでなく、Ｏ2を腫瘍微小環境に送達するＯ2添加ＭＢの能力を示す。外部から印加される超音波を用いて増感剤を活性化する可能性と組み合わせて、Ｏ2並びに増感剤／代謝拮抗薬の送達を容易にするためにＭＢを使用すると、従来の単独の代謝拮抗薬物の全身投与と比較して、有効性が改善され、副作用が低減されたより標的化されたアプローチを提供する。
【００１９】
膵臓癌の治療のこの新規なアプローチは、過剰増殖細胞及び／又は異常細胞によって特徴付けられる他の疾患及び病状の治療、特に、他の深部腫瘍の治療にまで及ぶ。したがって、本明細書で説明するように、このアプローチは、他の化学療法薬物を用いて、他のそのような疾患及び病状の治療にまで及ぶより広い用途を有する。
【発明の効果】
【００２０】
発明の詳細な説明
その最も広い態様において、本発明は、音響力学的治療の方法における使用のための微小気泡−化学療法剤複合体を提供する。本明細書で使用する場合、用語「音響力学的療法」は、超音波と超音波感受性薬剤（本明細書では「超音波感受性薬物」とも呼ばれる）の組み合わせを含み、音響エネルギーによる超音波感受性薬剤の活性化が一重項酸素などの活性酸素種の生成をもたらす方法を指すことが意図される。
【００２１】
微小気泡−化学療法剤複合体は、少なくとも１つの化学療法剤に付着するか、又は別の方法で結合している微小気泡を含む。微小気泡が、２以上の化学療法剤に付着している場合、それらは同一でも、又は異なっていてもよい。しかしながら、一般的に、特定の微小気泡に付着した化学療法剤は、同一である。そのような複合体がＳＤＴの方法での使用を意図している限り、それは超音波応答性である。具体的には、複合体の微小気泡成分が、超音波の適用によって破裂し、それよって、所望の標的部位に化学療法剤を放出することができることが意図される。
【００２２】
化学療法剤（又は複数の化学療法剤）は、共有結合又は非共有結合手段を介して、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス力及び／又は水素結合を介して微小気泡に連結されてもよい。一実施形態において、該微小気泡は、化学療法剤に静電的に結合される。別の実施形態において、該微小気泡は共有結合せることができる、すなわち、該化学療法剤は、１以上の共有結合によって微小気泡に付着している。
【００２３】
好ましくは、化学療法剤（又は複数の化学療法剤）と微小気泡との間の相互作用は、ビオチン−アビジン相互作用などの強い非共有結合を含む。この実施形態において、結合対の一方の成分（例えば、化学療法剤）はビオチンで官能化され、他方（例えば、微小気泡）はアビジンで官能化される。アビジンは、ビオチンのための複数の結合部位を含有するので、これは、典型的には、ビオチン−アビジン相互作用を介して微小気泡にも結合される。
【００２４】
例えば、微小気泡は、ビオチンで官能化され、ビオチン化微小気泡を形成することができ、次いで、アビジンと共にインキュベートされる。アビジンが気泡と結合すると、化学療法剤などの任意のさらなるビオチン化部分の結合を可能にする。そのため、微小気泡と化学療法剤との間に生じる結合は、「ビオチン−アビジン−ビオチン」相互作用の形態を取ることができる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「化学療法剤」は、広義には、癌の治療に有用な任意の化学的又は生物学的化合物を包含することが意図される。これは、増殖阻害剤及び他の細胞傷害性剤を含む。用語「成長阻害剤」は、インビトロ又はインビボのいずれかで、細胞、特に、癌細胞の増殖を阻害する化合物を指す。
【００２６】
本発明における使用のために、化学療法剤の適切なクラス及びそれらのクラス内の例としては、以下のものが挙げられる：葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート）；５−フルオロピリミジン（例えば、５−フルオロウラシル又は５−ＦＵ）；シチジン類似体（例えば、ゲムシタビン）；プリン代謝拮抗薬（例えば、メルカプトプリン）；アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド）；非古典的アルキル化剤（例えば、ダカルバジン）；プラチナ類似体（例えば、シスプラチン）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ）；生体内還元剤（例えば、マイトマイシンＣ、バノキサントロン（ＡＱ４Ｎ））；アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ミトキサントロン）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド）；ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン）、タキソール（例えば、パクリタキセル）、及びエポチロンなどの抗微小管剤（例えば、イキサベピロン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド（ｂｉｃｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸シプロテロン）；アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、フォルメスタン）；抗血管新生薬物又は低酸素症標的薬物（天然に存在する、例えば、エンドスタチン又は合成の、例えば、ゲフィチニブ、レナリドマイドのいずれか）；抗血管剤（例えば、コンブレタスタチン（ｃａｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）；チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、バンデタニブ、スニチニブ）；癌遺伝子又はシグナル伝達経路標的剤（例えば、チピファルニブ（ｔｉｐｆａｒｎｉｂ）、ロナファルニブ、ナルトリンドール、ラパマイシン）；ストレスタンパク質標的薬（例えば、ゲルダナマイシン及びその類似体）；オートファジー標的剤（例えば、クロロキン）；プロテアソーム標的剤（例えば、ボルテゾミブ）；テロメラーゼ阻害剤（標的オリゴヌクレオチド又はヌクレオチド）；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、トリコスタチンＡ、バルプロ酸）；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、デシタビン）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ）；エチレンイミン及びメチロールメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミン）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；プリン類似体（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、ドロモスタノロン、プロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；及び抗副腎剤（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）。これらの化合物の任意の薬学的に許容される塩、誘導体又は類似体も使用することができる。
【００２７】
本発明で使用するための増殖阻害剤の例としては、Ｇ１停止及びＭ期停止を誘導する薬剤などの（Ｓ期以外の位置で）細胞周期の進行を阻止する薬剤が挙げられる。古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）；パクリタキセル、ドセタキセル、及びその類似体を含むタキサンファミリーメンバー；並びにイリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ラメラリンＤ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤が含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤には、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−ＦＵ、及びａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤が含まれる。
【００２８】
化学療法剤の選択は、腫瘍の性質、治療すべき患者などの様々な要因に依存するが、当業者によって容易に選択することができる。
【００２９】
特定の一実施形態において、該化学療法剤は代謝拮抗薬である。本発明における使用に特に適している代謝拮抗薬には、抗葉酸、プリン及びピリミジン代謝拮抗薬及び抗生物質が含まれる。膵臓癌の治療に用いることができる代謝拮抗薬の一例としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が挙げられる。
【００３０】
ＳＤＴで使用するために、微小気泡−化学療法複合体は、微小気泡にも連結される少なくとも１つの超音波感受性薬剤（例えば、複数の超音波感受性薬剤）と組み合わせて（本明細書では「微小気泡−超音波感受性薬剤複合体」）使用される。超音波感受性薬剤は、化学療法剤と同じ微小気泡に連結することができるか、或いは、別々の微小気泡に連結することができる。典型的には、２つの薬剤がコンジュゲートされて、微小気泡を分離する。
【００３１】
微小気泡−超音波感受性薬剤複合体は、少なくとも１つの超音波感受性薬剤、好ましくは、複数の超音波感受性薬剤に付着するか、又は別の方法で結合された微小気泡を含む。微小気泡が、２以上の超音波感受性薬剤に付着している場合、それらは同一でも、又は異なっていてもよい。しかしながら、一般的に、超音波感受性薬剤は同一である。そのような複合体がＳＤＴの方法での使用を意図している限り、それは超音波応答性である。具体的には、該複合体の微小気泡成分が超音波の適用によって破裂することにより、所望の標的部位に超音波感受性薬剤を放出することができることが意図される。本明細書に記載されるとおり、音響エネルギーによる超音波感受性薬剤の活性化はまた、細胞傷害性である一重項酸素などの反応性酸素種の生成をもたらす。
【００３２】
超音波感受性薬剤（又は複数の超音波感受性薬剤）は、共有結合又は非共有結合手段を介して、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス力及び／又は水素結合を介して微小気泡に連結されてよい。一実施形態において、該微小気泡は、超音波感受性薬剤に静電結合する。別の実施形態において、該微小気泡は、共有結合することができる、すなわち、超音波感受性薬剤は、１以上の共有結合によって微小気泡に付着する。しかしながら、好ましくは、該相互作用は、上記のようなビオチン−アビジン相互作用などの強い非共有結合を含む。
【００３３】
ビオチン−アビジン相互作用が、微小気泡に超音波感受性薬剤（又は複数の超音波感受性薬剤）を連結するために使用される場合には、結合対の一方の成分（例えば、超音波感受性薬剤）はビオチンで官能化され、他方（例えば、微小気泡）はアビジンで官能化される。典型的には、アビジン分子は、ビオチン−アビジン相互作用を介して微小気泡にも結合される。例えば、微小気泡は、ビオチンで官能化され、ビオチン化微小気泡を形成することができ、次いで、アビジンと共にインキュベートされる。アビジンが気泡と結合すると、超音波感受性薬剤などの任意のさらなるビオチン化部分の結合を可能にする。そのため、微小気泡と超音波感受性薬剤との間に生じる連結は、「ビオチン−アビジン−ビオチン」相互作用の形態を取ることができる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「微小気泡」は、ほぼ球形の形状を有するシェルを含み、気体又は気体の混合物を含む内部空隙を取り囲むマイクロスフェアを指すことが意図される。「シェル」は、微小気泡の内部空隙を取り囲む膜を指す。
【００３５】
微小気泡は、例えば、超音波造影剤として、当技術分野でよく知られている。そのため、それらの組成及びそれらの調製方法は、当業者にはよく知られている。微小気泡の調製のための手順の例としては、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら，Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２９：１７５９−１７６７，２００３；Ｆａｒｏｏｋら，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，６：２７１−２７７，２００９；及びＳｔｒｉｄｅ＆Ｅｄｉｒｉｓｉｎｇｈｅ，Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｐｕｔ．，４７：８８３−８９２，２００９に記載されており、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
微小気泡は、気体を含む内部空隙を取り囲むシェルを含む。一般的に、微小気泡の形状は、本発明の実施に必須ではなく、したがって、限定するものではないが、これらの形状はほぼ球形である。微小気泡のサイズは、例えば、静脈注射によって、投与後に肺系統を通過するのを可能にするようなものであるべきである。微小気泡は、典型的には、約２００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、約０.５〜約１００μｍの範囲である。特に本発明での使用に適しているのは、約１０μｍ未満、より好ましくは１〜８μｍ、特に好ましくは５μｍまで、例えば、約２μｍの直径を有する微小気泡である。微小気泡のシェルは、厚さが変化し、典型的には、約１０〜約２００ｎｍの範囲である。シェルが気体コアを保持する所望の機能を実行するという条件で、正確な厚さは必須ではない。
【００３７】
微小気泡を形成するために使用することができる材料は、生体適合性であるべきであり、適切な材料は当技術分野で周知である。典型的には、微小気泡のシェルは、界面活性剤又はポリマーを含む。使用することができる界面活性剤は、微小気泡を形成し、コア内の気体と外部媒体、例えば、微小気泡を含有する水溶液の間のインタフェースで層を形成することにより維持することができる任意の材料を含む。界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせを使用することができる。適切なものには、脂質、特にリン脂質が含まれる。使用することができる脂質には、レシチン（すなわち、ホスファチジルコリン）、例えば、卵黄レシチン又は大豆レシチンなどの天然レシチン及びジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン若しくはジステアロイルホスファチジルコリンなどの合成レシチン；ホスファチジン酸；ホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；及びそれらの混合物が含まれる。例えば、大豆又は卵黄由来のもの；ホスファチジルセリン；ホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；及びホスファチジン酸などの正味の全体の電荷（例えば、負電荷）を有するリン脂質の使用は、超音波感受性薬剤への微小気泡のイオン結合に有利である。一実施形態において、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）などの長鎖脂質は、微小気泡のシェルを形成するために使用することができる。
【００３８】
適切な脂質は、酸素の保持に関して、微小気泡の安定性を増強するそれらの能力に基づいて選択することができる。この点で使用に適するものは、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）である。
【００３９】
微小気泡のシェル形成に使用するのに適するポリマー材料には、タンパク質、特にアルブミン、特にヒト血清アルブミンが含まれる。使用することができる他の生体適合性ポリマーには、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、シアノアクリレート、ポロキサマー（プルロニック）又はこれらの組み合わせが含まれる。
【００４０】
微小気泡のシェルは、同一若しくは異なる材料の単一又は複数の層を含むことができる。複数の層は、例えば、基本的なシェル材料（例えば、脂質）が１以上のポリマー又は多糖類を保有する場合に形成され得る。このようなポリマーの例としては、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンが挙げられる。微小気泡シェルはまた、ポリ−Ｌ−リジン及びＰＬＧＡなどのポリマー、並びに／又はアルギン酸塩、デキストラン、ジエチルアミノエチル−デキストラン塩酸塩（ＤＥＡＥ）又はキトサンなどの多糖類で被覆することができる。これらのコーティング材料を付着させる方法は、静電的又は共有結合性相互作用を伴い得る。異なるコーティング材料（ポリマー、多糖類、タンパク質など）は、例えば、微小気泡ベースの試薬の循環の強剛性、安定性及び／又は組織浸透能力を高めることによって、微小気泡の正味の表面電荷を操作することによって、おそらく最も重要なのは、微小気泡のペイロード容量を増大することによって、微小気泡の特性を改善するために使用することができる。ペイロード容量の増大を達成する１つの方法は、レイヤー・バイ・レイヤー（ＬＢＬ）アセンブル技術の適用によるものである。これは、超音波感受性薬剤負荷容量を増大させるために予め形成された微小気泡への超音波感受性薬剤の複数層の付着を伴う。ＬＢＬ技術は、Ｂｏｒｄｅｎら、陽イオン性脂質コーティング微小気泡上へのＤＮＡ及びポリリジンの吸着及び多層構成（ＤＮＡ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎd ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｎｔｏ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２３（１８）：９４０１−８，２００７）によって記載されている。
【００４１】
加えて、微小気泡のコーティングは、特に、コーティング材料が超音波感受性薬剤又は化学療法剤用の固定化マトリックスとして（例えば、架橋を介して）機能する場合、ペイロードの安定性を増大させることができる。
【００４２】
単層、二層又は多層構造のいずれかを形成する脂質も使用することができる。これらの例としては、単層又は多層のリポソーム及びミセルが挙げられる。
【００４３】
本明細書に記載の微小気泡シェルのいずれかは、標的部位への気泡の送達を補助するさらなる成分を含むことができる。例えば、これらは、標的細胞又は組織に結合することができるリガンド又は標的化剤を組み込むか、又はこれらに結合するように官能化することができる。適切な標的化剤の例としては、抗体及び抗体断片、細胞接着分子及びそれらの受容体、サイトカイン、増殖因子及び受容体リガンドが挙げられる。そのような薬剤は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、共有結合、分子スペーサー（例えば、ＰＥＧ）の使用及び／又はアビジン−ビオチン複合体法によって微小気泡に付着させることができる。例えば、脂質ベースの微小気泡への脂質−ＰＥＧ−ビオチンコンジュゲートの取り込みに続く、アビジンの添加によって、ビオチン化標的リガンドで微小気泡表面を官能化することができる。ハーセプチンは、目的の標的化のために微小気泡シェルにコンジュゲートさせることができる抗体の例である。
【００４４】
微小気泡のコア内の気体は、生体適合性であるべきである。用語「気体」は、周囲温度及び圧力で気体である物質だけでなく、これらの条件下で液状であるものを包含する。「気体」が周囲温度で液体である場合、これは一般的に、３０℃以上、より好ましくは３５℃以上の温度で気体への相変化を受ける。周囲温度で液体である任意の気体にとって、一般的に、これは、約３０〜３７℃の間の温度で、好ましくは、ほぼ正常体温で、気体への相変化を受けることが好ましい。このように、本明細書での「気体」への言及は、気体及び液体だけでなく、液体蒸気及びそれらの任意の組み合わせ、例えば、気体中の液体蒸気の混合物を包含することを考慮すべきである。
【００４５】
本発明に従って使用するための微小気泡内に組み込むのに適している気体には、空気、窒素、酸素、二酸化炭素、水素；ヘリウム、アルゴン、キセノン又はクリプトンなどの不活性気体；六フッ化硫黄、二硫化デカフルオライド（ｄｉｓｕｌｐｈｕｒ ｄｅｃａｆｌｕｏｒｉｄｅ）などの硫黄フッ化物；アルカン類（例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン）、シクロアルカン類（例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン）、アルケン類（例えば、エチレン、プロペン）などの低分子量炭化水素；並びにアルキン類（例えば、アセチレン又はプロピン）；エーテル類；エステル類；ハロゲン化低分子量炭化水素；及びこれらの混合物が含まれる。
【００４６】
適切なハロゲン化炭化水素の例としては、１以上のフッ素原子を含有するものであり、例えば、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロトリフルオロエチレン、フルオロエチレン、フッ化エチル、１，１−ジフルオロエタン及びパーフルオロカーボンが挙げられる。
【００４７】
適切なフルオロカーボン化合物の例としては、パーフルオロカーボンが挙げられる。パーフルオロカーボンには、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン及びパーフルオロへプタンなどのパーフルオロアルカン類；パーフルオロプロペン、パーフルオロブテンなどのパーフルオロアルケン類；及びパーフルオロシクロブタンなどのパーフルオロシクロアルカン類が含まれる。
【００４８】
過フッ素化気体を含有する微小気泡、特に、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン及びパーフルオロヘキサンなどのパーフルオロカーボンは、血流中の安定性により本発明での使用に適する。
【００４９】
パーフルオロカーボンを含有する微小気泡、特に、パーフルオロアルカン、及びリン脂質を含有するシェルは、本発明で使用することができ、例えば、Ｎｏｍｉｋｏｕ ＆ ＭｃＨａｌｅ，ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２９６：１３３−１４３，２０１０に記載されている。そのような微小気泡の一例としては、Ｓｏｎｉｄｅｌ ＳＤＭ２０２（Ｓｏｎｉｄｅｌ社から入手可能）が挙げられる。パーフルオロカーボンは、気体又は液状のいずれかで存在し得る。例えば、Ｒａｐｏｐｏｒｔら、Ｂｕｂｂｌｅ Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：３１−３９，２００９に記載されているように、液体コアを含有するものは、超音波への曝露の際に、後で気体の微小気泡に変換することができるナノエマルジョンから調製することができる。
【００５０】
特に、本発明での使用に好ましいのは、酸素を運ぶ微小気泡である。酸素は、ＳＤＴの重要な基質であり、多くの癌が低酸素状態であるので、酸素ガスで気泡のコアを充填すると、音響力学的効果及び生成される一重項酸素の量が増す。
【００５１】
微小気泡が化学療法剤と超音波感受性薬剤の両方に添加される場合、気泡は、好ましくは、酸素を運ぶ（例えば、それは酸素ガスを含有する）。異なる微小気泡が本明細書に記載の併用療法で使用される場合、微小気泡の少なくとも一種が酸素を取り込むことが好ましい。例えば、超音波感受性薬剤にコンジュゲートされた微小気泡が酸素酸素を含むことができ、かつ／又は化学療法剤を担持する微小気泡が酸素を含むことができる。好ましい実施形態において、使用される全ての微小気泡は、酸素（例えば、Ｏ2ガス）を運ぶ、すなわち、これらは「Ｏ2付加」されている。
【００５２】
本発明において使用することができる超音波感受性薬剤には、標的細胞又は組織を超音波に過敏にさせる化合物が含まれる。場合によって、超音波感受性薬剤は、音響エネルギー（例えば、超音波）を、細胞傷害性をもたらすＲＯＳに変換することが可能であり得る。他のものは、細胞膜の完全性を損なうことにより、標的細胞又は組織を超音波に過敏にさせることができる。多くの既知の超音波感受性薬剤が光力学活性化を促進することができること、かつ細胞又は組織を光に対して過敏にさせるために使用することができることは周知である。
【００５３】
本発明の一実施形態において、超音波感受性薬剤は、イメージング剤として、例えば、ＮＩＲ剤として同時に機能することができる。そのような増感剤は、インビボでのコンジュゲートのトラッキングを可能にするイメージング潜在力の点で利点を提供する。
【００５４】
本発明で超音波感受性薬剤として使用するのに適する化合物の例としては、フェノチアジン色素（例えば、メチレンブルー、トルイジンブルー）、ローズベンガル、ポルフィリン（例えば、フォトフリン（登録商標））、クロリン、ベンゾクロリン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、ポルフィセン、シアニン（例えば、メロシアニン５４０及びインドシアニングリーン）、アゾジピロメチン（ａｚｏｄｉｐｙｒｏｍｅｔｈｉｎｅ）（例えば、ＢＯＤＩＰＹ及びそのハロゲン化誘導体）、アクリジン色素、プルプリン、フェオホルビド、ベルジン、ソラレン、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン及びクルクミンが挙げられる。これらの薬剤の任意の既知の類似体又は誘導体も使用することができる。適切な誘導体には、薬学的に許容される塩が含まれる。
【００５５】
本発明で超音波感受性薬剤として使用するのに好ましいのは、メチレンブルー、ローズベンガル、インドシアニングリーン（ＩＣＧ、カルジオグリーンとしても知られている）、並びにそれらの任意の類似体及び誘導体である。ＩＣＧは、以下の構造を有する：
【００５６】
【化１】
2019500410.tif 000002
【００５７】
本明細書に記載の超音波感受性薬剤の任意の公知の類似体も、本発明において使用することができる。特に適するのは、シアニン系色素の構造類似体、例えば、ＩＣＧの構造類似体及びそれらの薬学的に許容される塩である。これらの例としては、シアニン色素ＩＲ８２０及びＩＲ７８３が挙げられ、共に市販されている。
【００５８】
【化２】
2019500410.tif 000003
【００５９】
近赤外（ＮＩＲ）吸収蛍光色素ＩＣＧは、医療用イメージングにおける使用がＦＤＡ承認されている。ＩＣＧは、ＮＩＲ領域（７５０〜９００ｎｍ）で強く吸収し、ヒト組織のより深部で光によって活性化され得る利点を有する（８００ｎｍでの光の透過は、６００ｎｍよりも４倍高い）。しかしながら、ＩＣＧ、ＩＲ８２０及びＩＲ７８３などのシアニン色素の一重項酸素生成（ＳＯＧ）効果は、ローズベンガルなどの他の公知の増感剤と比較した場合には比較的不良である。これは、微小気泡上へのより多くのシアニン分子の濃縮によって克服することができる。
【００６０】
その構造中にハロゲン原子（例えば、ヨウ素及び臭素）を取り込むことによりシアニン色素のＲＯＳ生成能を改善する他の試みが行われてきた。例えば、米国特許公開第２０１３／０２３１６０４号（その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる）において、シアニン系色素及びそのような色素の類似体は、それぞれのベンズアゾール若しくはナフタゾール環のベンゼン又はナフタレン部分上に３個のヨウ素原子を導入することによって改変され得ることが提案されている。本明細書に開示するポリメチン色素（特に、シアニン）のいずれかは、本発明において超音波感受性薬剤として使用することができる。
【００６１】
米国特許公開第２０１３／０２３１６０４号に記載の研究開発において、本発明者らは、ベンザゾール環のそれぞれに１又は２個のハロゲン原子（例えば、ヨウ素又は臭素、好ましくはヨウ素）を担持する特定のシアニン色素の構造類似体（例えば、ＩＲ７８３）を調製し、これらが、ＲＯＳ発生能を強化し、ひいては、ＩＣＧと比較して超音波活性化時に癌細胞（例えば、膵臓癌細胞）に対してより細胞傷害性となることを発見した。理論に束縛されるものではないが、ハロゲン原子の存在は、「重原子効果」として知られているものにより、励起一重項状態から励起三重項状態への項間交差（ＩＳＣ）を増加させると考えられている。三重項励起状態は、その後、分子状酸素又は他の基質と係合し、ＲＯＳを生成することができる。ＲＯＳ生成能の向上したこのようなレベルは、米国特許公開第２０１３／０２３１６０４号の教示に照らして予測され得なかったハロゲン原子（例えば、ヨウ素）と、ＩＲ７８３中のより少ない（すなわち、合計２又は４のいずれかの）水素原子を置換することによって達成することができる。
【００６２】
さらに、以下でより詳細に説明するように、本発明者らは、驚くべきことに、ＩＲ７８３が合計２個のハロゲン原子（すなわち、ベンザゾール環のそれぞれにただ１つのハロゲン原子、例えば、ヨウ素、）と置換されている場合に、該化合物は高度に蛍光のままであるので、ＮＩＲイメージング剤として使用することができることを見出した。ＩＳＣの増加は、典型的には、蛍光を発する化合物の能力を低下させるので、この発見は予想外である。ＩＲ７８３のこれらの特定の類似体のＮＩＲイメージングとしての潜在力と増感剤としての潜在力の組み合わせは、これらの化合物が「テラノスティック」潜在力、すなわち、治療薬及び診断薬の両方として機能する能力を有することを意味する。
【００６３】
本明細書に開示されるＩＲ７８３のハロゲン化（例えば、ヨウ化）類似体は、新規化学物質であり、本発明のさらなる態様を表す。したがって、さらなる態様から考えると、本発明は、式Ｉ又は式ＩＩ：
【００６４】
【化３】
2019500410.tif 000004
【００６５】
（式Ｉ及び式ＩＩにおいて、各Ｘは、独立して、臭素及びヨウ素原子から選択され、好ましくは、各Ｘはヨウ素である）の化合物又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【００６６】
そのような化合物の適切な塩及びそれらの調製方法は、当業者が容易に選択することができる。該化合物は、例えば、その適切な薬学的に許容される塩に無機又は有機塩基を用いて変換することができる。この目的のために適切であり得る塩基には、アルカリ及びアルカリ土類金属水酸化物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化セシウム、アンモニア及びジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、シクロヘキシルアミン及びジシクロヘキシルアミンなどの有機アミン類が含まれる。塩形成の手順は、当技術分野の従来のものである。
【００６７】
式Ｉ及びＩＩの好ましい化合物は、以下のもの：
【００６８】
【化４】
2019500410.tif 000005
【００６９】
及びそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【００７０】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に、式Ｉ、ＩＩ、Ｉａ若しくはＩＩａの化合物又はその薬学的に許容される塩のいずれかを含有する医薬組成物は、本発明のさらなる態様を表す。
【００７１】
これらの新規化合物は、当業者に公知の方法によって調製することができ、本明細書で提供される実施例によって例示される。このような化合物の調製方法はまた、本発明の一部を形成する。
【００７２】
したがって、さらなる態様から考えると、本発明は、式Ｉ又はＩＩの化合物の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）式ＩＩＩの化合物：
【００７３】
【化５】
2019500410.tif 000006
【００７４】
と、式ＩＶ又はＶの化合物：
【００７５】
【化６】
2019500410.tif 000007
【００７６】
（式ＩＶにおいて、Ｘは臭素又はヨウ素原子であり、式Ｖにおいて、各Ｘは独立して、臭素及びヨウ素原子から選択される）
を反応させる工程；及び
（ｂ）必要に応じて、生じた化合物をその薬学的に許容される塩に変換する工程、
を含む方法を提供する。
【００７７】
本発明はさらに、医薬として、例えば、治療薬、診断薬又はセラノスティック薬（すなわち、治療及び診断の両方の機能を有するもの）として、式Ｉ、ＩＩ、Ｉａ及びＩＩａの化合物、及びその薬学的に許容される塩のいずれかの使用を提供する。特に、これらは、ＰＤＴ及び／又はＳＤＴの方法、又はインビボイメージング（例えば、ＮＩＲイメージング）の方法、特に、腫瘍塊などの深部に位置する細胞の治療及び／又は診断のイメージング方法において使用することができる。ＰＤＴの方法において使用される場合、近ＩＲ領域、例えば、７００〜９００ｎｍ、より特には、７５０〜８５０ｎｍの波長を有する活性化光を使用することができる。ＮＩＲ光活性化又は超音波活性化の際に、これらの化合物は、ＲＯＳ生成能を増強し、ＩＣＧよりも癌細胞（例えば、膵臓癌及び子宮頸癌の細胞）に対してより毒性である。
【００７８】
ＮＩＲイメージング剤としての、好ましくは、ＰＤＴ及び／又はＳＤＴにおける組み合わせた増感剤及びＮＩＲイメージング剤としての式Ｉ又はＩａの化合物又はその薬学的に許容される塩の使用は、本発明の好ましい実施形態を表す。
【００７９】
本明細書に記載のハロゲン化増感剤、特に、式Ｉ、ＩＩ、Ｉａ、ＩＩａの化合物、及びそれらの薬学的に許容される塩のいずれかを保有する微小気泡、並びにそのような微小気泡の調製方法も、本発明の一部を形成する。そのような微小気泡−増感剤複合体は、微小気泡への超音波感受性薬剤の付着に関して、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて生成することができる。好ましくは、そのような方法は、ハロゲン化増感剤のビオチン化の工程及びそれをビオチン−アビジン官能化微小気泡に連結する工程を含む。
【００８０】
微小気泡の形成の方法は当技術分野で知られている。そのような方法は、選択されたシェル材料の存在下で水性媒体中での気体の懸濁液の形成を含む。微小気泡を形成するために使用される技術は、超音波処理、高速混合（機械的撹拌）、同軸電気流体力学噴霧及びＴ−接合を用いるマイクロ流体処理を含む（例えば、Ｓｔｒｉｄｅ ＆ Ｅｄｉｒｉｓｉｎｇｈｅ，Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｐｕｔ．，４７：８８３−８９２，２００９参照されたい）。
【００８１】
超音波処理は、広く使用され、一般的に好ましい。この技術は、超音波送信用プローブを用いて行うことができる。より具体的には、微小気泡シェル成分の水性懸濁液は、関連する微小気泡の成分の気体、例えば、酸素の存在下で超音波処理される。
【００８２】
微小気泡を形成するために使用され得る他の方法は、ナノエマルジョン中のナノ液滴コアの蒸発を含む（例えば、Ｒａｐｏｐｏｒｔら、前出を参照されたい）。そのようなナノ液滴のコアは、典型的には、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（Ｌ−ラクチド）又はポリ（エチレンオキシド）−コ−カプロラクトンなどの生分解性両親媒性ブロック共重合体の壁によって包まれている有機パーフルオロ化合物により形成される。或いは、ナノエマルジョンは、例えば、シェル材料としてアルブミンを使用して、サイジング膜を通す押出によって調製することができる。液滴から気泡への遷移は、熱、超音波及びファインゲージ針を介する注入を含む物理的並びに／又は機械的手段により誘導することができる。そのような微小気泡は、患者への投与の時点で（例えば、ファインゲージ針を用いる投与の工程中に）又は所望の標的細胞又は組織にインビボで（例えば、ナノエマルジョンを超音波に供することによって）形成することができる。
【００８３】
患者への投与の工程中又は投与後（すなわち、インビボ）のいずれかで、本明細書に定義される所望の微小気泡複合体（又は複数の複合体）を形成することが可能なナノエマルジョンの投与は、本発明の範囲内である。生じた微小気泡が酸素ガスを含有することが望ましい場合、これは、位相シフトナノエマルジョンの液体のパーフルオロカーボンコア中に溶解された形態で提供することができる。
【００８４】
本明細書に記載の微小気泡複合体は、当技術分野で公知の方法及び手順を用いて調製することができる。微小気泡に化学療法剤及び／又は超音波感受性薬剤を共有結合するために使用することできる方法は、公知の化学的カップリング技術を含む。使用される正確な方法は、微小気泡の正確な性質、化学療法剤及び超音波感受性薬剤、具体的には、任意のペンダント官能基の性質に依存する。必要であれば、複合体の成分の１つ又は両方（すなわち、微小気泡及び／又は超音波感受性薬剤、又は微小気泡及び／又は化学療法剤）は、例えば、分子をカップリングするために使用することができる反応性官能基を含むように官能化することができる。適切な反応性基には、酸、ヒドロキシ、カルボニル基、酸ハロゲン化物、チオール及び／又は第一級アミンが含まれる。そのような官能基を導入する方法は、当技術分野で周知である。
【００８５】
１以上の化学療法剤及び／又は超音波感受性薬剤に微小気泡を共有結合するために使用することができる方法の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ａ）カルボジイミド系カップリング方法。これらは、カルボン酸又はアミン官能基のいずれかを有する部分にアミン又はカルボン酸官能基のいずれかを含有する微小気泡をカップリングするために使用することができる。そのような方法は、エステル又はアミド結合の形成をもたらす；ｂ）「クリック（ＣＬＩＣＫ）」反応（すなわち、１，３−双極子環状付加反応）。これは、アセチレン又はアジド官能基のいずれかを有する部分と、アジド又はアセチレン官能化微小気泡を反応させるために使用することができる；ｃ）シッフ塩基形成（すなわち、イミン結合形成）。この反応は、アミン又はアルデヒド官能基を含有する部分にアルデヒド又はアミン官能化微小気泡を結合するために使用することができる；並びにｄ）マイケル付加反応。
【００８６】
ビオチン−アビジン連結を介する１以上の化学療法剤及び／又は超音波感受性薬剤への微小気泡の連結は、当業者に公知の方法によって行うことができる。そのような方法では、両方の部分は、典型的には、ビオチン化され、その後、アビジンを用いて２つの間の連結を形成する。ビオチン−アビジン相互作用を介して結合させた微小気泡−化学療法剤コンジュゲートを生成する方法の例を実施例２のスキーム１に提供する。
【００８７】
予め形成された微小気泡への化学療法剤及び／又は超音波感受性薬剤のカップリングに代わるものとして、これらの部分は、代替的に（例えば、上述の方法のいずれかを使用して）脂質に連結することができ、その脂質は、続いて、調製中に微小気泡の脂質シェルに組み込まれ得る。
【００８８】
荷電超音波感受性薬剤及び／又は荷電化学療法剤は、荷電微小気泡に静電気的に連結することができる。例えば、陰イオン性の泡は、陽イオン性超音波感受性薬剤又は陽イオン性化学療法剤に連結することができ、かつ逆もまた同じである。荷電超音波感受性薬剤の一例としては、陰イオン性微小気泡に静電気的に付着することができるメチレンブルーが挙げられる。
【００８９】
微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の調製の方法の例はＷＯ  ２０１２／１４３７３９に開示されており、その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる。一例として、添付の図２は、（ａ）ローズベンガル誘導体の調製の模式図（「ＲＢＩ」と表記する）及び（ｂ）微小気泡へのＲＢＩの共有カップリングの模式図を示す。ＷＯ  ２０１２／１４３７３９に開示された方法のいずれかは、本明細書に記載の微小気泡−化学療法剤複合体の調製と同様にして適用することができる。
【００９０】
本明細書に記載の微小気泡−化学療法剤複合体は、それ自体新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。一実施形態において、これらの複合体はまた、本明細書に記載の１以上の超音波感受性薬剤に連結することができる。例えば、本明細書に記載の技術のいずれかを用いて、微小気泡へ少なくとも１つの化学療法剤を連結する工程を含む、微小気泡−化学療法剤複合体の調製方法は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００９１】
本明細書に記載の微小気泡複合体は、これらを音響力学的療法の方法に有用にさせる特性を有する。
【００９２】
該複合体は、音響力学的療法に応答する体内の細胞若しくは組織の障害又は異常の治療に適している。これらには、癌性増殖又は腫瘍などの悪性及び前悪性の癌状態、並びにその転移；肉腫及び癌腫などの腫瘍、特に固形腫瘍が含まれる。本発明は、腫瘍、特に、皮膚の表面の下に位置するものの治療に適している。
【００９３】
本発明を用いて治療され得る腫瘍の例としては、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫；癌、例えば、乳癌、肺癌、脳癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、子宮癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌；ホジキン及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍；急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病；星細胞腫、神経膠腫及び網膜芽が挙げられる。膵臓癌の治療は、本発明の好ましい態様を形成する。
【００９４】
一態様において、本明細書に記載の複合体は、音響力学的療法の方法、及び同時に、インビボイメージング方法（画像診断などの方法）において使用することができる。そのような方法において、イメージングを用いて、対象となる標的部位での複合体（又は複数の複合体）のペイロード堆積及び／又は蓄積を監視することができる。上記のように、本発明のこの態様は、イメージング潜在力を有する増感剤、例えば、ＮＩＲイメージング剤として同時に機能する増感剤を選択することによって実現することができる。或いは、ＮＩＲイメージング剤などの公知のイメージング剤はまた、本発明における使用のために提案された微小気泡の少なくとも１つにコンジュゲートすることができる。単一の微小気泡が使用される場合、ひいては、これは、化学療法剤、超音波感受性薬剤及びＮＩＲイメージング剤を保有することができる。異なる微小気泡が、化学療法剤及び超音波感受性薬剤を保有するために使用される場合、ＮＩＲイメージング剤は、微小気泡の一方又は両方の種類に（例えば、ビオチン−アビジン相互作用などの非共有結合を介して）コンジュゲートすることができる。微小気泡のこれらの種類のそれぞれは新しく、これらは本発明のさらなる態様を形成する。
【００９５】
インビボで特定の部位に化学療法剤及び超音波感受性薬剤を標的化する手段を提供することに加えて、本明細書に記載の方法はさらに、エクスビボで利用することができる。例えば、白血病の治療の自家骨髄移植において、患者の骨髄を、癌細胞への微小気泡複合体（又は複数の複合体）の分子標的によってエクスビボで治療することができる。次いで、これらの混合物は、超音波で処理されて、癌細胞を破壊することができ、次いで、処理された骨髄を用いて、放射線治療後の患者において造血を再確立することができる。或いは、本発明の方法は、従来の移植のために、摘出した臓器から不要な組織を除去するためにエクスビボで行うことができる。外科的切除した組織は標的化され、治療した組織の再移植前に病変が破壊される。
【００９６】
本明細書に記載される方法のいずれかで使用するために、微小気泡複合体は、一般的に、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に医薬組成物中に提供される。そのような組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００９７】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、当技術分野で周知の技術を用いて製剤化することができる。投与経路は、使用目的に依存する。典型的には、これらは、全身投与され、ひいては、非経口投与、例えば、皮内、皮下、腹腔内又は静脈内注射に適合した形態で提供することができる。好適な薬学的形態は、１種以上の不活性担体又は賦形剤と共に活性微小気泡複合体を含有する懸濁液及び溶液を含む。適切な担体には、生理食塩水、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水及びそれらの混合物が含まれる。
【００９８】
該組成物は、さらに、乳化剤、懸濁剤、分散剤、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、防腐剤などの他の薬剤を含むことができる。該組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌することができる。
【００９９】
該複合体を含有する溶液は、例えば、粘度調整剤、乳化剤、可溶化剤などの薬剤を添加することによって安定化させることができる。
【０１００】
好ましくは、本発明で使用するための組成物は、水又は生理食塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中の複合体（又は複数の複合体）の水性懸濁液形態で使用される。該複合体は、使用の時点で再構成するため、例えば、水、生理食塩水又はＰＢＳで再構成するための凍結乾燥粉末形態で供給することができる。
【０１０１】
本明細書に記載の方法は、添加された微小気泡を含有する治療有効量の組成物の投与を伴う。次いで、微小気泡複合体は、活性化の前に身体の所望の部分又は標的領域に分配が可能になる。身体に投与されると、標的領域は、所望の治療効果を達成するための周波数及び強度で超音波に曝露される。増感剤添加微小気泡については、典型的な活性化手順は添付の図１に模式的に示されている。これは、微小気泡（ＭＢ）が最初に集束超音波により破壊されることによって、後に所望の標的組織（例えば、腫瘍）に浸透することができる超音波感受性薬剤（ＳＳ）を放出する二段階プロセスを示す。標的細胞内の超音波感受性薬剤のその後の超音波活性化により一重項酸素が生成され、それが、タンパク質、脂質、アミノ酸及びヌクレオチドなどの様々な細胞成分を酸化することによって標的細胞を破壊することができる。超音波感受性薬剤の活性化は、典型的には、その送達の後（すなわち、超音波感受性薬剤を放出する微小気泡のバースト後）に起こることが予想されるが、それにもかかわらず、複合体の送達及び超音波感受性薬剤の活性化は同時であり得る。
【０１０２】
本明細書に記載の組成物の有効用量は、該複合体の性質、投与様式、治療される病状、患者などに依存し、それに応じて調整することができる。
【０１０３】
使用することができる超音波の周波数及び強度は、標的部位での微小気泡の選択的破壊を達成する必要性に基づいて選択することができ、例えば、微小気泡の共振周波数に一致させることができる。超音波周波数は、典型的には、２０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、好ましくは０.１〜２ＭＨｚの範囲である。超音波は、異なる周波数の組合せの単一周波数のいずれかとして送達することができる。超音波の強度（すなわち、電力密度）は、約０.１Ｗ／ｃｍ2〜約１ｋＷ／ｃｍ2、好ましくは、約１〜約５０Ｗ／ｃｍ2の範囲であり得る。処理時間は、典型的には、１ミリ秒〜２０分の範囲であり、これは選択された強度に依存し、すなわち、低い超音波強度については、処理時間が延長され、より高い超音波強度については、処理時間はより短くなる。超音波は、連続モード又はパルスモードで適用することができ、集束するか、又は柱状ビームとして送達され得る。
【０１０４】
音響エネルギー（例えば、超音波）を生成することが可能な任意の放射線源は、本明細書に記載する方法で使用することができる。該源は、標的部位にエネルギーを導くことができなければならず、例えば、身体の表面から標的組織にエネルギーを導くことができるプローブ又は装置を含むことができる。
【０１０５】
キャビテーション（又は微小気泡破壊）を達成するのに必要な超音波の周波数及び／又は強度並びに超音波感受性薬剤の活性化を引き起こすのに必要なそれらが異なる場合には、超音波パラメータ（周波数／強度）のこれらの異なるセットは、同時に又は２（又は複数）の工程手順で適用することができる。
【０１０６】
本発明のさらなる態様は、患者の細胞又は組織の音響力学的治療方法に関し、本方法は、
（ａ）本明細書に記載の有効量の組成物を、影響を受けた細胞又は組織に投与すること；及び
（ｂ）前記細胞又は組織を超音波に供すること、
を含む。
【０１０７】
使用される超音波感受性薬剤は、光にも応答するものである場合に、超音波活性化は光活性化を伴い得る。例えば、超音波感受性薬剤としてＮＩＲ色素を使用する場合、光熱活性化も追加的に使用することができる。
【０１０８】
異なる微小気泡が、化学療法剤及び超音波感受性薬剤を運ぶために使用される場合、これらは、一般的に、単一の医薬製剤、例えば、水性溶液中で共投与されることが想定される。しかしながら、別の実施形態において、これらは、別々の製剤に（例えば、同時に又は連続して）別々に投与することができる。
【０１０９】
このように、さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の微小気泡−化学療法剤複合体、並びに音響力学的療法及び／又は画像診断の方法で同時又は逐次使用するための本明細書に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含む生成物を提供する。
【０１１０】
さらに別の態様において、本発明は、必要に応じて、音響力学的療法及び／又は画像診断の方法における（ｉ）及び（ｉｉ）の使用説明書と共に、（ｉ）本明細書に記載の微小気泡−化学療法剤複合体；及び別々に（ｉｉ）本明細書に記載の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体を含むキットを提供する。使用される場合、該キットの活性成分（すなわち、（ｉ）及び（ｉｉ））は、同時に、別々に又は逐次的に投与することができる。該キットの一実施形態において、成分（ｉ）及び／又は（ｉｉ）は、例えば、凍結乾燥粉末として、乾燥形態で提供することができる。この場合、該キットはまた、活性物質の粉末形態の再構成のための無菌の、生理学的に許容される液体、例えば、生理食塩水又はＰＢＳを含有する容器を含むことができる。
【０１１１】
本発明による様々な方法及び使用は、主に、「すぐに使える」微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の投与の文脈で本明細書に記載されているが、代替実施形態において、該複合体の前駆体を投与することができる。本明細書で使用する用語「前駆体」は、インビボでそれに変換され、ひいては、本質的にそれと同等である微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の前駆体を指すことが意図される。したがって、例えば、用語「前駆体」は、インビボで又は投与中のいずれかに、所望の微小気泡−超音波感受性薬剤複合体に変換することが可能なナノエマルジョン又はナノ液滴製剤を包含する。一実施形態において、そのような前駆体は、標的組織（例えば、腫瘍組織）に蓄積する際、所望の複合体に変換することが可能である。標的組織又は細胞への分配後に、液滴から気泡への遷移は、超音波を含む方法によって開始することができる。或いは、複合体の前駆体を投与する工程は、それ自体、本発明に係る微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の形成を誘導することができる。例えば、該前駆体が、ナノエマルジョンの形態をとる場合、液滴から気泡への遷移は、ファインゲージ針を通して注射によって誘導され得る。標的細胞又は組織、例えば、腫瘍内への適切なナノエマルジョンの直接注射は、本発明の好ましい態様を形成する。
【０１１２】
理解されるとおり、本明細書に記載の組成物、方法又は使用のいずれにおいても、本発明に係る微小気泡−超音波感受性薬剤複合体への言及は、本明細書で定義される適切な「前駆体」で置換することができる。
【０１１３】
本発明に係る微小気泡−超音波感受性薬剤前駆体として使用するためのナノエマルジョン又はナノ液滴製剤は、当技術分野で公知の方法及び手順の適切な変形、例えば、Ｒｂｐｏｐｏｒｔら（上述）によって開示されたものによって生成することができる。そのような製剤において、液体パーフルオロカーボン（例えば、パーフルオロアルカン）によって形成することができるナノエマルジョン液滴のコアは、適切なポリマー、タンパク質又は脂質シェル材料（例えば、微小気泡−超音波感受性薬剤複合体に関連して本明細書に記載のポリマーのいずれか）の壁によって包まれている。超音波感受性薬剤へのナノ液滴のシェルの連結は、従来の方法を使用して達成され、予め形成された微小気泡に超音波感受性薬剤を付着するための上記のもののいずれかを含むことができる。使用される正確な方法は、シェル材料及び超音波感受性薬剤の正確な性質、具体的には、任意のペンダント官能基の性質に依存する。必要に応じて、シェル及び／又は超音波感受性薬剤のいずれかは、例えば、部分をカップリングするのに使用することができる反応性官能基を含むように官能化することができる。適切な反応性基には、酸、ヒドロキシ、カルボニル、酸ハロゲン化物、チオール及び／又は第一級アミンが含まれる。一実施形態において、該シェルは、ビオチンで官能基化し、次いで、アビジンに結合して、ビオチン化超音波感受性薬剤の結合を容易にすることができる。形成された微小気泡が酸素ガスを含有することが望ましい場合、パーフルオロカーボンは液体の形態で酸素の担体として作用することができる。複合体の形成に続いて、パーフルオロカーボン液は酸素で飽和され、その後、気化して酸素ガスを形成する。
【０１１４】
微小気泡−超音波感受性薬剤複合体に関して上述したのと同様に、微小気泡−化学療法剤複合体の前駆体もまた、本発明において使用することができる。同様に、これらは、投与中又は意図された標的部位のいずれかで、所望の複合体を形成することができるナノエマルジョンの形態をとることができる。
【０１１５】
これから、本発明を以下の非限定的な実施例及び添付の図面を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】微小気泡−超音波感受性薬剤複合体の超音波活性化超音波感作の模式図である。
【図２】（ａ）ローズベンガル誘導体（「ＲＢ１」と表記する）の調製の模式図及び（ｂ）微小気泡へのＲＢ１の共有カップリングの模式図を示す。
【図３】ＰＢＳでの希釈（１：１０）後にＯ2ＭＢの４０倍対物レンズで撮影した顕微鏡写真を示す。スケールバーは２０μｍである。（ｂ）３０枚の光学顕微鏡像の分析から得られた遠心分離後のＯ2ＭＢのサイズ分布（グラフの左側の白いボックスは、画像解析ソフトウェアによって検出されたＭＢを示すが、システムの光学分解能の４５０ｎｍ未満である）。
【図４】３７℃で、ＤＢＰＣ又はＤＳＰＣのいずれかから調製したＭＢのＰＢＳ分散液のインキュベーション後に残っている％ＭＢのプロットである。エラーバーは、ｎ＝４の場合の±標準誤差を表す。*ｐ＜０.０５及び**ｐ＜０.０１。
【図５】Ｏ2ＭＢ又はＰＦＢＭＢのいずれかを含有する脱気したＰＢＳ溶液についての溶存酸素の増加率（％）のプロットである。矢印は、超音波適用の時刻を示す。
【図６】（左から右へ）（ｉ）未処理、（ｉｉ）ゲムシタビン、（ｉｉｉ）５−ＦＵ、（ｉｖ）Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ＋ＵＳ、（ｖ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ＋ＵＳ、（ｖｉ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物−ＵＳ及び（ｖｉｉ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳで処理した（ａ）ＢｘＰｃ−３、（ｂ）ＭＩＡ ＰａＣａ−２及び（ｃ）ＰＡＮＣ−１細胞の細胞生存率のプロットである。[ＲＢ］、[５−ＦＵ]及び[ゲムシタビン]を、それぞれ５μΜ、１００μΜ及び１００μΜで一定に保った。超音波処理を、１ＭＨｚの周波数、３.０Ｗｃｍ-2の超音波パワー密度及び５０％のデューティ・サイクル、パルス周波数＝１００Ｈｚで３０秒間施した。エラーバーは、ｎ＝４の場合の±標準誤差を表す。*ｐ＜０.０５及び**ｐ＜０.０１及び***ｐ＜０.００１。
【図７】ＰＦＢＭＢ−ＲＢ／ＰＦＢＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳ（左）又は（ｉｉ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳ（右）で処理したＢｘＰｃ−３（黒）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（灰色）及び（ｃ）ＰＡＮＣ−１（白）細胞の細胞生存率のプロットである。濃度及びＵＳパラメータは図６のとおりである。エラーバーは、ｎ＝４の場合の±標準誤差を表す。**ｐ＜０.０１。
【図８】（ｉ）未処置（白菱形）、（ｉｉ）超音波のみ（黒菱形）、（ｉｉｉ）ゲムシタビン（白三角）、（ｉｖ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物−ＵＳ（白丸）、（ｖ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ＋ＵＳ（黒四角）、（ｖｉ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳ（黒丸）で処置したマウスの（ａ）腫瘍容積の変化率（％）及び（ｂ）平均体重のプロットである。図の簡便さのために、５ＦＵのみ、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ−ＵＳ、Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ＋ＵＳ、Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ−ＵＳについては示さない。ＲＢ、５−ＦＵ及びゲムシタビンの濃度は、それぞれの場合で、それぞれ０．１８４ｍｇ／ｋｇ（９０．８μＭ）、０．１１５ｍｇ／ｋｇ（４４０μＭ）及び０.２６４ｍｇ／ｋｇ（４４０μＭ）で一定に保った。超音波処理を、１ＭＨｚの周波数、３.０Ｗｃｍ-2の超音波パワー密度及び５０％のデューティ・サイクル、パルス周波数＝１００Ｈｚで３０秒間施した。エラーバーは、ｎ＝４の場合の±標準誤差を表す。（ｉ）と比較した（ｉｖ）については*ｐ＜０.０５及び**ｐ＜０.０１及び***ｐ＜０.００１並びに（ｖ）と比較した（ｖｉ）についてはΔｐ＜０.０５及びΔΔｐ＜０.０１及びΔΔΔｐ＜０.００１。
【図９】ＩＰゲムシタビン（０、３及び８日目に１２０ｍｇ／ｋｇ）（黒四角）又はビヒクルのみ（黒菱形）で処置したマウスの腫瘍体積の変化率（％）のプロットである。エラーバーは、ｎ＝４の場合の±標準誤差を表す。
【図１０】（ａ）免疫組織化学を用いたＢｃｌ３及びＢｃｌ２タンパク質発現を示す。内部画像は全区間であり、主画像は、２０倍の倍率で選択した領域である。（ｂ）Ｂｃｌ３及びＢｃｌ２の発現についての組織学スコアである。
【図１１】（ａ）Ｂｃｌ３の定量的ＲＴ−ＰＣＲ  ｍＲＮＡ発現、（ｂ）（ｉ）未処置（黒）、（ｉｉ）Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ＋ＵＳ（灰色）及び（ｉｉｉ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳ（白）のＢｃｌ３遺伝子発現プロファイルのプロットを示す。エラーバーは、ｎ＝３の場合の±標準誤差を表す。***ｐ＜０.００１。
【図１２】（ａ）ＩＶ注射中に腫瘍に超音波を適用する場合（＋ＵＳ）と適用しない場合（−ＵＳ）での、ＭＢ−９コンジュゲートの静脈内投与の前（ｔ＝０）、５分後（ｔ＝５）及び３０分後（ｔ＝３０）の異所性ＢｘＰＣ−３腫瘍を有するヌードマウスの代表的な蛍光画像、（ｂ）ＩＶ注射中に腫瘍に超音波を適用する場合（ＵＳ）と適用しない場合（対照）での、ＭＢ−９コンジュゲートの静脈内投与後５分及び３０分の時点で記録した腫瘍の蛍光の増加率（％）のプロットを示す。強度の増加を、処置前の腫瘍に対して測定した。エラーバーは、ｎ＝３の場合の±ＳＥＭを表す。（ｃ）Ｏ2ＭＢ又はＰＦＢＭＢのＩＶ懸濁液で処置したマウスのＨｉｆ１αタンパク質発現を示す（ローディング対照ＧＢＰＤＨと比較した）濃度測定データ。エラーバーは、ｎ＝３の場合の±ＳＥＭを表す。*ｐ＜０.０５及び**ｐ＜０.０１及び***ｐ＜０.００１。
【図１３】（ｉ）ビヒクルのみ（白丸）、又は（ｉｉ）処置間で１分間の遅れ、３×３分間、７８０ｎｍの光照射で、ＰＢＳ：ＤＭＳＯ（９８：２）中のＩ2−ＩＲ７８３（１００μＬ、１ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍内注射（白四角）で処置した異所性ヒト膵臓ＢｘＰＣ３腫瘍を有するマウスについての時間に対する腫瘍成長率（％）のプロットを示す。治療群のマウスに、８日目に１００μＬのＯ2ＭＢ（１×１０8 ＭＢ／ｍＬ）を含む第２の処置を行った。
【図１４】（ａ）ＵＶ−Ｖｉｓスペクトル及び（ｂ）ＩＣＧ（・・・・・・）、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ（実線）及びＩ４−ＩＲＣＹＤＹＥ（-----）の蛍光スペクトルを示す。
【図１５】ＩＣＧ、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ及びとＩ４−ＩＲＣＹＤＹＥについての、４１０ｎｍでのＳＯＳＧ強度の増加のプロットを示す。増加したＳＯＳＧ強度は、一重項酸素の生成を示す。
【図１６】１分間、７８０ｎｍ（２００ｍＷ）の光を当てる場合（白棒）及び当てない場合（黒棒）での、（ａ）ＩＣＧ、（ｂ）Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ及び（Ｃ）Ｉ４−ＩＲＣＹＤＹＥで処置したＭｉａ Ｐａｃａ（上のグラフ）及びＢｘＰＣ３細胞（下のグラフ）の細胞生存率のプロットを示す。
【図１７】ＳＤＴ及び５ＦＵ処理を組み合わせた時に明らかな相乗効果があるかどうかを決定するために、ローズベンガル（ＲＢ）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）及びＲＢ／５ＦＵ組み合わせ処理±超音波を用いたＭｉａ Ｐａｃａ２細胞の処理を示す。この細胞を、３時間、サブ致死用量である３μΜのＲＢ及び５０μΜの５ＦＵのいずれか（又は両方）とインキュベートすることで、相乗効果が明らかであるかを特定できた。超音波暴露は、３.０Ｗｃｍ-2、１ＭＨｚ、５０％のデューティ・サイクル、１００Ｈｚのパルス反復周波数で３０秒間であった。細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを用いて、処理後２４時間測定した。
【図１８】ドキソルビシン（Ｄｏｘ−Ｏ2ＭＢ）及びローズベンガル（ＲＢＯ2ＭＢ）を表面に付着させた酸素添加微小気泡の模式図を示す。
【図１９】（ｉ）ビヒクルのみ、（ｉｉ）ＤｏｘＯ2 ＭＢ＋ＵＳ、（ｉｉｉ）ＲＢＯ2ＭＢ＋ＵＳ又は（ｉｖ）ＤｏｘＯ2 ＭＢ／ＲＢＯ2ＭＢの組み合わせ＋ＵＳで処理したヒト異種移植片ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍の時間に対する腫瘍体積変化率（％）のプロットを示す。グループ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）についてはＲＢ及びＤＯＸそれぞれ３００μΜ及び４７５μΜ、並びにグループ（ｉｖ）についてはＲＢ及びＤＯＸそれぞれ１５０μΜ及び２３７.５μΜを含有するＭＢの用量を反映する１００μＬの腫瘍内注射を０日及び１４日目に施した。超音波暴露は、３Ｗ／ｃｍ2、１ＭＨｚ、５０％のデューティ・サイクル、１００Ｈｚのパルス反復で３．５分間であった。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
実施例
試薬及び器具：
ローズベンガルナトリウム塩、２−ブロモエチルアミン、ＮＨＳ−ビオチン、ＭＴＴ、アビジン、ＦＩＴＣアビジン、クロロ酢酸、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ν，Ν’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びエタノールを、可能な限り最高級でＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（ＵＫ）から購入した。ビオチン、５−フルオロウラシル、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート及び２−アミノエタノールを、Ｔｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＵＫ社から購入した。１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[アミノ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００））及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−ビオチンを、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）から購入した。ドキソルビシンをＸＢＢＣ（中国）から購入した。酸素ガスをＢＯＣ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｇａｓｅｓ ＵＫから購入し、パーフルオロブタン（ＰＦＢ）ガスをＡｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＧｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫから購入した。
【０１１８】
ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  ５００  ＭＨｚ分光計で記録した。ＥＳＩ−ＭＳの特徴付けは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を利用するＬＣＱＴＭ四重極イオントラップ質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて達成した。光学顕微鏡画像は、光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ５００光学顕微鏡）で撮影した。溶存酸素を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｉｏｎ Ｓｔａｒ Ａ２１６ベンチトップ溶存酸素計を用いて測定した。エラーを±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表し、統計比較を対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った。
【０１１９】
実施例１−Ｏ2添加微小気泡（Ｏ2ＭＢ）の調製
ＤＳＰＣ  ＭＢを、ＭｃＥｗａｎら（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１５；２０３，５１−６）に記載されるように調製した。しかしながら、ＭＢの物理的安定性及びＯ2保持に対するそれらの安定性の両方を改善するために、発明者らは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）の代わりに、長鎖脂質ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）を利用し、これは、ＭＢ表面の拡散を低減し、ひいては安定性を向上させることが以前の研究で示されている。
【０１２０】
ＤＢＰＣ  ＭＢの調製については、ＤＢＰＣ（４.０ｍｇ、４.４３μｍｏｌ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）（１.３５ｍｇ、０.４８１μｍｏｌ）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−ビオチン（１.４５ｍｇ、０.４８１μｍｏｌ）を、８２：９：９のモル比で、クロロホルムに溶解し、ガラスバイアルに入れた。全てのクロロホルムが蒸発するまで、溶液を４０℃で加熱した。ＰＢＳ（ｐＨ７.４±０.１）（５ｍｌ）を乾燥脂質フィルムに添加し、内容物を３０分間絶えず磁気撹拌しながら、脂質相転移温度を超えて（＞７０℃）加熱する。次いで、懸濁液をＭｉｃｒｏｓｏｎ超音波細胞破壊器で１.５分間超音波処理（１００ワット、パワー設定４で２２.５ｋＨｚ）し、ヘッドスペースをパーフルオロブタン（ＰＦＢ）の気体で充填し、気体／液体界面を２０秒間超音波処理（パワー１９）すると、ＰＦＢＭＢが生成した。ＭＢ懸濁液を、約１０分間氷浴中で冷却した。次いで、アビジンの水溶液（５０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、冷却したＭＢ懸濁液に添加し、さらに１０分間撹拌した。次いで、この懸濁液を遠心分離し（３００ＲＰＭ、１０分）、得られたＭＢ「ケーキ」を１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７.４±０.１）に濃縮した。これを、２つの凍結乾燥バイアルに分けた。次いで、ＰＦＢＭＢについては、バイアルを圧着した（金属キャップで密封した）。酸素充填ＭＢを作成するために、バイアルのヘッドスペース及びＭＢ懸濁液を２分間酸素ガスの正圧下で分散し、次いで、バイアルを圧着した。上記のように調製した後、ＭＢ試料を従来の光学顕微鏡下で画像化し、それらのサイズ分布及び濃度を決定した。１０μＬの試料を、各懸濁液から取り出し、９０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７.４±０.１）で希釈し、その後、血球計算器（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｌｉｎｅ，Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ，ＵＳＡ）で検査した。Ｌｅｉｃａ ＤＭ５００光学顕微鏡で４０倍の対物レンズを用いて画像を取得した。次いで、ＭＢのサイズ分布及び濃度を、Ｍａｔｌａｂ（２０１０Ｂ，Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、目的が書き込まれた画像解析ソフトウェアを用いて取得した。
【０１２１】
これらのＭＢは、光学顕微鏡画像分析によって決定した場合に、約１×１０９ＭＢ／ｍＬの濃度で、１〜２μｍｍの平均直径を有していた（図３）。ＤＢＰＣの包含がＭＢ安定性に与える効果を決定するために、発明者らは、３７℃でＤＢＰＣ又はＤＳＰＣで調製したＭＢのＰＢＳ分散液をインキュベートし、様々な時間間隔で残りの生存ＭＢ数を計数した。結果を図４に示し、ＤＳＰＣを用いて調製したものと比較して、ＤＢＰＣから調製したＭＢの安定性の有意な改善を明らかにしている。実際、３時間のインキュベーション後、ＤＢＰＣ  ＭＢの８０％が残ったが、ＤＳＰＣ  ＭＢの数は５４％に減少した。これらの結果は、脂質のアシル鎖長が増加すると、微小気泡の機械的柔軟性と表面拡散の両方を低減することを示した以前の研究のものと一致している。
【０１２２】
実施例２−ビオチン化ローズベンガル及びビオチン化５−ＦＵの調製
【０１２３】
【化７】
2019500410.tif 000008
【０１２４】
ビオチン官能化ローズベンガル（６）を、ＭｃＥｗａｎら（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１５；２０３，５１−６）に記載されているように調製した。ビオチン官能化５−ＦＵ（５）を、以下に概説する手順に従うスキーム１ａに従って合成した。
【０１２５】
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ[３，４−ｄ]イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（２）の調製：
無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１）（ＫａｎｇらのＪｒ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９，２３（１１），１７１９−１７２６）に記載のビオチンとジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネートとの反応によって調製した）の氷冷溶液（３.７５ｇ、１１ミリモル）に、２−アミノエタノール（１.０ｍｌ、１６.４ミリモル）を加え、混合物を３０分間、２５℃で撹拌した。反応を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ６０、ＨＦ ２５４、２０：８０メタノール−ジクロロメタン  ｖ／ｖ）により監視した。ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒf＝０.７６）は、アルコール生成物（Ｒf＝０.４７）の同時形成と共に、１５分以内に消費された。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をＤＭＦと共蒸発させ、過剰量の２−アミノエタノールを除去した。白色残留物を水から再結晶し、明黄色の固体（１.７ｇ、３８％）として２を得た。分析試料を、２回目の再結晶から得て、融点は１９２−１９５℃であった。
【０１２６】
1ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）４．４９−４．４７（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ），４．３１−４．３０（ｍ，１Ｈ，−ＣＨ），３．５３−３．５１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．２３−３．１８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ及びＣＨ2），２．８５−２.６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．１５（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ2），１．６２−１．４６（Ｍ，４Ｈ，ＣＨ2Ｘ２），１．３２−１．２６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）。
13Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）１７７．０９（Ｃ＝Ｏ），６１．９８（ＣＨ2），６０．１９（ＣＨ），５９．９１（ＣＨ），５５．２４（ＣＨ），４１．２９（ＣＨ2），３９．６１（ＣＨ2），３５．４２（ＣＨ2），２７．７７（ＣＨ2），２７．５６（ＣＨ2），２５．０２（ＣＨ2）。
ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ+）：Ｃ12Ｈ21Ｎ3Ｏ3Ｓの実測値２８８．７０、計算値＝２８７．１３。
【０１２７】
５−フルオロウラシル−１−カルボン酸（４）の調製：
水１００ｍＬ中の５−フルオロウラシル（３）（５ｇ、３８.４ミリモル）、水酸化カリウム（９.０７ｇ、１６１.６ミリモル）及びクロロ酢酸（３.６３ｇ、３８.４ミリモル）の混合物を、７０℃で２時間還流した。室温まで冷却した後、溶液のｐＨを濃塩酸の添加により５.５に調整した。次いで、反応混合物を１８時間、冷蔵庫（５℃）で保管し、得られた白色結晶を濾過により単離し、冷水で洗浄し、５２.５％の収率で４を生成した。融点は２００℃を超える。
【０１２８】
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ），４．２９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2）
13Ｃ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：１７３．５８（Ｃ＝Ｏ），１５９．９７（Ｃ＝Ｏ），１５０．８０（Ｃ＝Ｏ），１４１．２０（Ｃ），１３１．７４（ＣＨ），５１．４８（ＣＨ2）。
ＥＳＭＳ （Ｍ−Ｈ+）：Ｃ6Ｈ5Ｏ4Ｎ2Ｆの実測値１８７．１０、計算値＝１８８．１１。
【０１２９】
２−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ[３，４−ｄ]）イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エチル２−（５−フルオロ−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）アセテート（５）の調製：
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ[３，４−ｄ]イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（２）（０．５ｇ、１.７ミリモル）、５−フルオロウラシル−１−カルボン酸（４）（０．４ｇ、２.１ミリモル）、ＤＭＡＰ（０．０２３ｇ、０．１７ミリモル）及びＨＯＢＴ（０．０２３ｇ、０．１７ミリモル）を、Ｎ2雰囲気下で、１００ｍＬの２口丸底フラスコ中の２０ｍＬの無水ＤＭＦに加えた。混合物を４０℃に加熱し、均一な溶液が得られるまで撹拌した。次いで、ＤＣＣ（０．４ｇ、１.９ミリモル）を反応混合物に加え、１２時間室温で撹拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、内容物を２０分間撹拌した。得られた白色半固体生成物を濾過により除去し、減圧下で過剰のジエチルエーテルを除去した後、粗生成物を、移動相としてアセトニトリル／水（８０:２０ ｖ／ｖ）を使用して分取ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム）により精製した。生成物５を、白色半固体（０．２４ｇ、収率３０％）として所望の画分の凍結乾燥後に得た。
【０１３０】
1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：７．６７（Ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ），４．５０−４．４７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．３１−４．２９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），３．５４（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2），３．２２−３．１９（Ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．８９−２．８６（Ｍ，１Ｈ，ＣＨ），２．６７−２．６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．１７−２．１４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．６１−１．４７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2Ｘ２），１．４７−１．２８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）。
【０１３１】
13Ｃ  ＮＭＲ １２５ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：１７７．１２（Ｃ＝Ｏ），１７３．７４（Ｃ＝Ｏ），１６５．３３（Ｃ＝Ｏ），１６０．０１（Ｃ＝Ｏ），１５９．８１（Ｃ＝Ｏ），１４１．１４（Ｃ），１３１．７１（ＣＨ），６２．００（ＣＨ2），６０．２２（ＣＨ），５９．９４（ＣＨ），５５．２６（ＣＨ），５１．５３（ＣＨ2），４１．３１（ＣＨ2），３９．６４（ＣＨ2），３５．４５（ＣＨ2），２７．７９（ＣＨ２），２７．５８（ＣＨ2），２５．１４（ＣＨ2）。
ＥＳＭＳ （Ｍ−Ｈ+）：Ｃ18Ｈ24ＦＮ5Ｏ6Ｓの実測値４５６．２０、計算値＝４５７．４８。
【０１３２】
実施例３−Ｏ2ＭＢ−ローズベンガル及びＯ2ＭＢ−５ＦＵコンジュゲートの調製
５（９１.２ｍＭ）及び６（０．６１ｍＭ）の飽和溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７.４±０．１）中の０．５％ＤＭＳＯ液で調製した。次いで、これらのストック溶液の０．３ｍＬのアリコートを、アビジン官能化ＰＦＢＭＢ（１×１０9  ＭＢ／ｍＬ）の２つの１ｍＬ懸濁液に別々に添加し、内容物を１５分間、ボルテックスで混合した。次いで、懸濁液を５分間で、遠心分離（９００ｒｐｍ）し、溶液の上部に浮遊した乳状懸濁液としてＭＢコンジュゲートを単離した。溶液を除去し、さらに、５又は６のいずれかを含有するストック溶液０．３ｍＬと交換し、混合／遠心分離の工程を繰り返した。次いで、ＭＢ懸濁液を、ＰＢＳ（５ｍＬ）で洗浄し、５分間遠心分離（９００ｒｐｍ）し、ＭＢを清浄な遠心管に移した。この洗浄手順を再度繰り返し、単離したＰＦＢＭＢ−ＲＢ及びＰＦＢＭＢ−５ＦＵコンジュゲートをガラスバイアルに入れた。次いで、ＰＦＢＭＢ−ＲＢ及びＰＦＢＭＢ−５ＦＵコンジュゲートに、酸素ガスを２分間噴霧し、得られたＯ2ＭＢ−ＲＢ及びＯ2ＭＢ−５ＦＵコンジュゲートを１：３.２５の比率で混合し、９０．８μＭのＲＢ及び４４０μＭの５−ＦＵで、６.８×１０7ＭＢ／ｍＬを含有する最終懸濁液を生成した。
【０１３３】
このＯ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物を、本明細書に記載のインビトロ及びインビボ実験で直接使用した。
【０１３４】
実施例４−Ｏ2ＭＢ−ＩＲ８２０コンジュゲートの調製
【０１３５】
【化８】
2019500410.tif 000009
【０１３６】
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−（（４−アミノフェニル）チオ）−３−（（Ｅ）−２−（１，１−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−２−（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）ビニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−３−イウム（８）の合成：
化合物７を、文献の手順に従って調製した（Ｊａｍｅｓら、腫瘍の近赤外蛍光イメージングのための潜在的プローブとしてのポリメチン色素の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｔｈｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ）：パート−１．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１３，３（９），６９２−７０２）。４−アミノチオフェノール（０．６３ｇ、５ミリモル）をＮ2雰囲気下で無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解した。７（０．６ｇ、０．７ミリモル）をこの溶液に添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。この反応を、ＴＬＣ（移動相として２５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用して、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ６０、ＨＦ ２５４）によって監視した。ＤＭＦを減圧下で除去し、残渣をＤＭＦ（５ｍＬ）に再溶解し、Ｅｔ2Ｏ（１５ｍＬ）で沈殿させた。固体生成物を濾過し、Ｅｔ2Ｏ（３０ｍＬ）で洗浄し、溶出剤としてＭｅＯＨ／ＤＣＭ（１：３）を用いるカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、６０〜１２０メッシュ）によって精製した。生成物（２３０ｍｇ、４.８％）を赤褐色の半固体として単離した。この化合物は、安定せず、次の工程で直ちに使用した。
【０１３７】
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ4）：８．９６−８．９３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），８．８１−８．７８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），８．０９−８．０７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．９０−７．８９（ｍ，６Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．５７−７．５１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．３８（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ2），７．３８−７．２８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），６．３４−６．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ Ｘ ２），４．２３（ｂｒｓ，４Ｈ，ＣＨ Ｘ ２，ＣＨ2），２．８７−２．８０（ｍ，８Ｈ，ＣＨ2 Ｘ４），１．９８−１．９１（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ2 Ｘ５），１．７０（ｓ，１２Ｈ，ＣＨ3 Ｘ４）。
【０１３８】
13Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄｍｓｏ−ｄ6）：１７３．４，１７０．２，１５０．１，１４８．４，１４３．７，１４４．６，１４２．７，１３４．３，１３３．９，１３２．４，１２８．０，１２６．１，１２６．２，１２５．５，１２５．７，１１７．５，１１５．４，１０４.７，６１．８，５９．３，４９．４，４８．９，４６．８，３０．２，２８．６，２６．８，２６．９，２５．２，２１．０。
ＥＳＭＳ：Ｃ52Ｈ58Ｎ3Ｏ6Ｓ3Ｎａ2+の計算値＝９６１．１、実測値９６０．３。
【０１３９】
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−３−（（Ｅ）−２−（１，１−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−２−（３Ｈ）−イリデン）エチリデン）−２−（（４−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ[３，４−ｄ]イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）フェニル）チオ）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）ビニル）−１，１−ジメチル−３−（４−スルホブチル）−１Ｈ−ベンゾ[ｅ]インドール−３−イウム（９）の合成：
化合物８（１００ｍｇ、０．１ミリモル）を、無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の１（４０.９ｍｇ、０．１２ミリモル）の撹拌溶液に添加し、そこへ触媒量のトリエチルアミンを添加した。溶液を室温で５時間撹拌した。反応混合物をエーテル（１００ｍｌ）に加え、内容物を３０分間攪拌した。沈殿物を濾過により回収し、溶出剤としてＭｅＯＨ：ＤＣＭ（１：４）を用いて分取ＴＬＣにより精製し、生成物を緑色の粉末として単離した。収率＝２１ｍｇ、１８.４％。
【０１４０】
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ4）：８．７７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），８．２１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），８．０３−７.９９（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．７３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．６０−７．５７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．４７−７．４４（Ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．２０−７．１７（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．１６（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ），６．８９−６．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），６．５８（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ），６．４２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．３６（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ Ｘ ２），４．２９−４．２７（ｍ，６Ｈ，ＣＨ Ｘ ２，ＮＣＨ2），４．１０（ｂｒｓ，２Ｈ，−ＣＨ2），３．１４−３．０６（ｍ，３Ｈ，ＣＨ，ＣＨ2），２．８０−２.７４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ２），２．５７−２．４８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ２），２.１９−２．１６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．８８−１．５９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．７６（ｓ，１２Ｈ，ＣＨ3 Ｘ ４），１．５９−１．５７（Ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．４８−１．２８（Ｍ，１２Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ６）。
【０１４１】
13Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ｄｍｓｏ−ｄ６）：１７７．５，１７４．３，１６９．９，１６６．２，１５２．５，１５０．２，１４８．０，１４５．３，１４４．８，１４０．７，１３４．８，１３２．６，１３１．３，１３０．０，１２８．５，１２６．３，１２４．７，１２０．１，１１６．８，１１４．８，１０２．５，６４．０，６２．３，６０．１，５４．９，５０．１，４８．６，４８．１，４２．２，３６．７，３２．８，３０．２，２８．４，２８.３，２６．９，２６．０，２４．５，２２．８。
ＥＳＭＳ：Ｃ62Ｈ72Ｎ5Ｏ8Ｓ4+の計算値＝１１４２．４（プロトン化形態，Ｍ+）、実測値１１４３．４。
【０１４２】
Ｏ2ＭＢ−ＩＲ８２０コンジュゲートの調製
ビオチン官能化ＩＲ-８２０（９）を、５−ＦＵ及びローズベンガルについて上で説明した手順に従って、Ｏ2ＭＢの表面に付着させた。[ＭＢ]＝２.６×１０8；[９]＝２８０μΜ。
【０１４３】
実施例５−Ｏ2ＭＢからの超音波媒介Ｏ2放出
実施例１で調製した０．５ｍＬのＯ2ＭＢ懸濁液（１×１０8）を、脱気したＰＢＳ液（ｐＨ７.４±０．１）（４.５ｍＬ）に加えた。この溶液の溶存酸素レベルを、溶存酸素計を用いて、２分間隔で２０分間にわたって測定した。超音波を、１ＭＨｚの周波数、３．０Ｗｃｍ-2の超音波パワー密度及び５０％のデューティサイクル（パルス周波数＝１００Ｈｚ）を使用して、４.５分後に１分間適用した。ＰＦＢＭＢを用いた対照実験も、同じ手順に従って実施した。
【０１４４】
Ｏ2ＭＢが、インビボでの酸素送達のための担体として成功する場合、ＭＢが標的部位で超音波に暴露されるまで、ＭＢのコアと血液との間の気体交換が最小化されることが重要である。市販のＭＢの半減期は、男性での０．９７分から女性での１.２３分の範囲である。したがって、酸素拡散勾配が存在し得る状況で、少なくともこの時間の間、Ｏ2ＭＢがそれらの酸素を保持することができることが重要である。そのようなシナリオをシミュレートする試みにおいて、Ｏ2ＭＢ（０．５ｍＬ、１×１０8）をガラスバイアル中の脱気した４.５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７.４±０．１）に添加し、内容物を３７℃で定期的に撹拌した。Ｏ2ＭＢは、ＰＢＳ溶液の上部に浮遊した時に、オープンバイアルのヘッドスペース内の空気と直接接触する。ＰＢＳ溶液中の溶存Ｏ2の量を、溶存酸素計を用いて測定し、超音波処理前に４.５分間、及び超音波処理後に１４.５分間測定した。対照として、ＰＦＢＭＢを用いた実験も行った。結果を図５に示し、溶存酸素が４０％超増加する照射後５分の時点で、超音波を外部から印加することによって破壊されるまで、Ｏ2ＭＢが効果的にＯ2を保持することを示す。対照的に、ＰＦＢＭＢ対照実験中の溶存酸素は、超音波への暴露後１分の時点で約２０％増加し、次いで、超音波への曝露後５分の時点でわずか５％に減少した。発明者らは、対照調製物中の溶存Ｏ2のこの初期増加が、測定チャンバー内の流体の超音波媒介攪拌によるものであると考える。それにもかかわらず、結果から、Ｏ2ＭＢが効果的に酸素を保持し、超音波への暴露がこのシステムにおいて、比較的長時間持続される溶存酸素の増加をもたらすことが示唆される。発明者らは、保持と超音波媒介放出の両方のこの時間枠が、微小気泡の標的化を可能にするのに十分な時間及び特定の解剖学的部位へのそれらの気体のペイロードを容易にし、ＳＤＴ中の強化されたＲＯＳ生成を支持するのに十分である組織微小環境中の溶存酸素の増加を提供すると考える。
【０１４５】
実施例６−インビトロ細胞傷害性実験
ヒト原発膵臓腺癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１は、ダルベッコ改変イーグル培地中で維持するが、ＢｘＰＣ−３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持し、これらの全てに、加湿した５％ＣＯ2の雰囲気中、３７℃で１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を補充した。これらの細胞株を、ウェルあたり５×１０3細胞の濃度で９６ウェルプレートのウェルに播種し、加湿した５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で２１時間インキュベートし、その後、３時間、３７℃の低酸素（Ｏ2／ＣＯ2／Ｎ2、０．１：５：９４.９ ｖ／ｖ／ｖ）チャンバーに移した（これは、腫瘍部位で見出される低酸素状態を模倣することを意図している）。次いで、培地を各ウェルから除去し、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ（５０μＬ、５μΜのＲＢ）及びＯ2ＭＢ−５ＦＵ（５０μＬ、１００μΜの５ＦＵ）コンジュゲートで置換した。次いで、個々のウェルを、Ｓｏｎｉｄｅｌ ＳＰ１００ ｓｏｎｏｐｏｒａｔｏｒ（３０秒、周波数＝１ＭＨｚ、超音波パワー密度＝３.０Ｗｃｍ-2、デューティ・サイクル＝５０％、パルス繰り返し周波数＝１００Ｈｚ）を用いて送達する超音波で処理した。細胞を、処理液を除去する前に、さらに３時間低酸素環境で維持し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な培地（ウェル当たり２００μＬ）を加えた。次いで、ＭＴＴアッセイ（ＭｃＨａｌｅら，ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １９８８；４１，３１５−２１）を用いて細胞生存率を決定する前に、プレートをさらに２１時間、正常酸素条件（すなわち、３７℃で、加湿した５％ＣＯ2雰囲気）でインキュベートした。ビヒクルのみ、ゲムシタビン（膵臓癌治療で使用するための承認薬）、５−ＦＵ、Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ＋ＵＳ、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ＋ＵＳ及びＯ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物−ＵＳについて、同様の手順を繰り返した。全ての実験で、ＲＢ、５ＦＵ及びゲムシタビンの量は、それぞれ５μΜ、１００μΜ及び１００μΜを使用した。全てのグループも、同じ量のＲＢ又は５−ＦＵが付着したＰＦＢＭＢコンジュゲートを用いて繰り返した。
【０１４６】
図６に示す結果は、組み合わせたＳＤＴ／代謝拮抗療法（すなわち、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳ）で処理した細胞の全３つ細胞株において、代謝拮抗薬単独療法（すなわち、５−ＦＵ又はゲムシタビン）のいずれかで処理した細胞の生存率と比較して、生存率の統計的に有意な減少が観察されたことを明らかにしている。実際、ＳＤＴ処置単独（すなわち、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ＋ＵＳ）で処理した細胞のそれに比べて、生存率の統計的に有意な減少がまた、併用療法で処理した細胞について観察された。そのような低酸素条件下で観察されたＳＤＴ効果がＯ2ＭＢの使用により大いに増強されることは、超音波処理を行うＯ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵと超音波処理を行うＰＦＢＭＢコンジュゲートの他の点では同一の混合物との間の細胞傷害性の差を比較することによって確認された（図７）。実際に、２０％を超える細胞生存率の統計的に有意（ｐ＜０．０１）な減少が、ＰＦＢＭＢコンジュゲートと比較してＯ2ＭＢコンジュゲートで処理した全３の細胞株について観察された。まとめると、図６及び図７に示す結果は、ＳＤＴを代謝拮抗薬療法と組み合わせた場合、特に、Ｏ2ＭＢが追加のＯ2を提供して、ＳＤＴ効果を向上させることできる低酸素環境で得られる利益をはっきりと強調する。
【０１４７】
実施例７−インビボ細胞傷害性実験
ＢｘＰｃ−３細胞を、上記のように１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。細胞（１×１０6）を、１００μＬのマトリゲル（登録商標）に再懸濁し、雌のＢａｌｂ／ｃ  ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨａｎ（登録商標）Ｈｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）マウスの後部背部に移植した。腫瘍形成は、移植後約２週間で生じ、キャリパーを使用して、腫瘍測定を１日おきに行った。腫瘍が、腫瘍体積の式＝４πＲ3／３を用いる幾何平均直径から計算して２１８ｍｍ3の平均体積に達したら、動物を無作為に１０のグループ（ｎ＝４）に分けた。麻酔の誘導（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌの腹腔内注射）後に、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ（ＭＢ＝１.６×１０7、[ＲＢ]＝９０．８μΜ）及びＯ2ＭＢ−５ＦＵ（ＭＢ＝５.２×１０7、[５ＦＵ]＝４４０μΜ）を含有するＰＢＳの１００μＬ混合物を各腫瘍に直接注射した。腫瘍内注射は、プラットフォームの薬物動態学的挙動に起因する実験的変動を排除するために、投与の経路として選択した。次いで、必要であれば、１ＭＨｚの超音波周波数、３.５Ｗｃｍ-2の超音波パワー密度（ＩSATP；空間平均時間ピーク）及び１００Ｈｚのパルス反復周波数で３０％のデューティ・サイクルを用いて、３.５分間超音波で腫瘍を処置した。追加の処置グループに、（ｉ）薬物なし、（ｉｉ）Ｏ2ＭＢ−ＲＢコンジュゲート単独±超音波処理；及び（ｉｉｉ）Ｏ2ＭＢ−５ＦＵコンジュゲート単独±超音波処理を含めた。ゲムシタビン（４４０μΜ）及び５−ＦＵ（４４０μΜ）単独処置も行った。処置後、動物を麻酔から回復させ、腫瘍体積及び体重を９日間毎日記録した。腫瘍体積の増加率（％）を、各グループについての処置前測定値を用いて計算した。
【０１４８】
腫瘍体積を、９日間毎日測定し、各グループの腫瘍体積の変化率（％）を時間の関数としてプロットした。解釈を容易にするために、１０グループ中６グループの結果のみを図８ａに示す。これらの結果から、ゲムシタビン又は５−ＦＵ単独処置のいずれかと比較して、ＳＤＴ／代謝拮抗薬の組み合わせ療法で処置したマウスの腫瘍体積の劇的な減少が明らかになる。実際、処置後９日目に、ゲムシタビン又は５−ＦＵのみで処置したマウスの腫瘍は、それぞれ１２５.１及び１２３.３％増え、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳで処置した腫瘍は、同じ期間内に元の出発体積をわずか２９.１％上回って増えた。加えて、ＳＤＴ単独（すなわち、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ＋ＵＳ）処置に対して、ＳＤＴ／５−ＦＵ組み合わせ療法（すなわち、Ｏ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳ）で処置した腫瘍の腫瘍体積の統計学的に有意な減少もあり、腫瘍は、処置後９日目に、平均３０．２％小さくなった。各グループの動物の平均体重（図８ｂ）の分析から、実験の過程での目立った減少は示されず、処置が任意の急性の悪影響をもたらさなかったことが示唆された。
【０１４９】
これらの実験では、ゲムシタビンを、使用した５ＦＵの量（４４０μΜ）との直接モル比較を提供するために、０．２６４ｍｇ／ｋｇの濃度で腫瘍内注射として投与した。この量は腫瘍に直接送達されたにもかかわらず、マウスで使用されるゲムシタビンの正常な全身用量（１２０ｍｇ／ｋｇ）よりも著しく少ない。
【０１５０】
全身ゲムシタビン療法に対するＳＤＴ／５ＦＵ組み合わせ療法の有効性を比較するために、発明者らは、０、３及び８日目に腹腔内（ＩＰ）注射により投与されるゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ）で、異所性ＢｘＰＣ−３腫瘍を有するマウスを処置した。腫瘍体積を、以前のように毎日測定し、未処置の動物対照と比較した。これらの結果（図９）は、対照グループの腫瘍体積が約１００％増加する一方で、腫瘍体積はゲムシタビン処置グループで３８％増加し、処置中のどの時点でも、腫瘍体積は出発腫瘍体積より減少しなかったことを実証する。対照的に、単独処置では、ＳＤＴ／５ＦＵ療法（図８）について、腫瘍体積は、最初の治療の体積より減少し、処置後６日までそのままであったが、ゲムシタビングループの腫瘍は６日目に腫瘍体積の２０％増加を示した。そのような劇的な応答は、増感剤／５−ＦＵの比較的低い量を使用して達成することができ、単独処置後に、非常に有望であり、そのような薬剤の標的化送達が、副作用の少ない、強化された治療的利益を提供できることを示唆している。
【０１５１】
実施例８−腫瘍担持マウスへのＩＶ投与後のＯ2ＭＢ−９コンジュゲートのインビボＮＩＲ蛍光イメージング
無胸腺ヌードマウスを麻酔し（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌの腹腔内注射）、Ｏ2ＭＢ−９コンジュゲート（１００μＬ）を、尾静脈注射により投与した。処置グループにおいて、ＩＶ注射中に、及びＩＶ注射後に３分間、超音波（上記２．１０の条件）を腫瘍に適用したが、対照グループ（各グループにおいてｎ＝３）の腫瘍には超音波を適用しなかった。投与後（ｔ＝５分及びｔ＝１０分）、ＩＣＧフィルターセット（励起：７０５〜７８０ｎｍ；発光：８１０〜８８５ｎｍ）を使用して蛍光モードで、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ（登録商標）ルミナイメージングシステムのチャンバー内に動物を入れた。データをキャプチャし、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアパッケージのバージョン２.６０を用いて分析した。定量的データを、腫瘍の周囲の対象となる領域を描画し、Ｏ2ＭＢ−９投与後ｔ＝５及びｔ＝１０分の時点での蛍光シグナル（光子／秒）を、投与前に取得した蛍光シグナルと比較することによって取得した。
【０１５２】
実施例９−免疫組織化学及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析
発明者らはまた、５−ＦＵの単独処置と比較した場合の、分子レベルでのＳＤＴ／５−ＦＵ組み合わせ処置の効果をプロービングすることに興味を持った。これを行うために、対照グループ（すなわち、無処置）、Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ＋ＵＳグループ（すなわち、５−ＦＵ）、及びＯ2ＭＢ−ＲＢ／Ｏ2ＭＢ−５ＦＵ混合物＋ＵＳグループ（すなわち、併用処置）の腫瘍を、監視期間の終了時に採取し、免疫組織化学及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
【０１５３】
Ｏ2ＭＢのＩＶ投与後の腫瘍におけるＨＩＦ１α発現：
無胸腺ヌードマウスを麻酔（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌの腹腔内注射）し、ＰＦＢＭＢ又はＯ2ＭＢ（１００μＬ）のいずれかを尾静脈注射により投与した（各グループｎ＝３）。ＩＶ注射中に、及びＩＶ注射後に３分間、超音波（上記の２．１０の条件）を腫瘍に適用し、腫瘍を３０分後に摘出した。ＨＩＦ−１αタンパク質発現のウェスタンブロット分析のために、総タンパク質を、尿素緩衝液を用いて抽出した。これらの研究で用いられる一次マウス抗体は、抗ＨＩＦ１α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，１：５００）、及び抗ＧＢＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ，１：１０００）であった。タンパク質試料を、４〜１２％のＴｒｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。非特異的結合のブロッキングを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する１×トリス緩衝生理食塩水で希釈した５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン中で行った。次いで、膜を適切な二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（原液の１：１００００）中でインキュベートした。二次抗体を、ドイツのハイデルベルクのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。デンシトメトリーを、ハウスキーピング基準としてＧＡＰＤＨを用いて、ＨＩＦ１αのタンパク質発現を定量するために行った。
【０１５４】
免疫応答特徴付け：
処置を施した組織における免疫応答を特徴付けるために、Ｂｃｌ３及びＢｃｌ２タンパク質発現を、監視期間の終了時に採取した組織試料における免疫組織化学を用いて調べた。Ｂｃｌ２及びＢｃｌ３タンパク質の免疫組織化学（ＩＨＣ）評価を、パラフィン包埋切片にて行った。パラフィン包埋組織試料を、Ｌｅｉｃａ ＲＭ２２３５ ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）を用いて４μｍの厚さに切断し、コーティングしたスライドガラス上で調べた。Ｂｃｌ２（クローン：ＢＣＬ−２／１００／Ｄ５）及びＢｃｌ３（クローン：１Ｅ８）のＩＨＣ分析物を、それぞれ１：２００及び１：１５０に希釈した。両方の抗体は、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手したマウス抗ヒトであった。免疫染色を、ボンドエピトープ回収溶液（Ｂｏｎｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２（ｐＨ９.０のＥＤＴＡベース）と共に、オンボード熱誘導抗原回収（ｏｎ ｂｏａｒｄ ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を用いる自動化Ｂｏｎｄ−Ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）を用いて３０分間行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、５分間、０．３％過酸化水素を用いてブロックした。組織学的標本を室温で１５分間、一次抗体とインキュベートし、スライドを室温で８分間、ウサギ抗マウスとインキュベートした。次いで、スライドを、室温で８分間、ヤギ抗ウサギポリマー試薬とインキュベートした。反応を、ボンドポリマーレファイン検出キット（ｂｏｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｒｅｆｉｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）、その後、色原体として３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドを用いて１０分間発色した。免疫組織強度及び比例スコアを、オールレッドら（免疫組織化学的分析による乳癌の予後因子及び予測因子（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）．１９９８，１１（２）：１５５−６８）に従って行った。免疫組織化学研究を行うために、Ｂｃｌ３発現を転写レベルで確認した。Ｂｃｌ３のｍＲＮＡ発現を、表１に記載のプライマーを用いて遺伝子特異的ｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１５５】
【表１】
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【０１５６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ及び分析を、以前に公開されたプロトコル（Ｈａｍｏｕｄｉら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１０，２４巻，８番，ｐｐ．１４８７−１４９７；及びＢｉら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２０１２，９７，９２６−９３０）に従って実施した。簡単に説明すると、ＲＮＡをＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を用いて顕微解剖スライドから抽出した。ｃＤＮＡ合成は、２つのハウスキーピング遺伝子；１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びβアクチンを含む遺伝子の各々のリバースプライマーを用いて、スーパースクリプトＩＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｉｉｉ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ）合成キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を用いて行った。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＣＦＸ９６装置（ＢｉｏＲａｄ、ＵＫ）上でＳＹＢＲグリーンキットを用いて行った。ｑＲＴ−ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった：９５℃で３分間、９５℃で１０秒、６０℃で４５秒の４０サイクル。分析のために、１８ＳのｒＲＮＡ及びβアクチンの幾何平均を、単一のハウスキーピング値として取得した。グループ間の統計的比較を、ボンフェローニ事後解析と双方向ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【０１５７】
結果：
免疫組織化学の結果は、タンパク質レベルで、治療グループと対照グループの両方の間に、Ｂｃｌ３及びＢｃｌ２の調節解除があったことを明らかにした。分析のこのレベルで、Ｂｃｌ３の強度及び割合は、対照及び５ＦＵのグループにおいて高かったが、併用処置グループでは減少した。同様に、Ｂｃｌ２タンパク質発現は、対照グループで最も高く、５ＦＵグループで減少し、併用処置グループで検出されなかった（図１０）。ｍＲＮＡレベルで、同様のパターンがＢｃｌ３について観察され（図１１ａ及び１１ｂ）、ΔΔＣｔは、５ＦＵと組み合わせ処置グループのそれぞれについて、対照グループに比べて約５倍及び７倍の有意な減少を示した（ｐ＜０．００１）。Ｂｃｌ３は、ＮＦ−κβ経路の重要なメンバーであり、生存、増殖、炎症及び免疫応答を含む多くの細胞経路の調節に関与している。Ｂｃｌ３の発現及び活性化は、組織及び刺激の種類に依存して、高まった細胞増殖又は生存に関連している。その転写リプレッサー機能は、免疫応答の調節並びに免疫細胞の発達及び活性化に関与することが示されている（Ｗｅｓｓｅｌｌｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：４９９９５−５０００３、及びＫｕｗａｔａら、Ｂｌｏｏｄ ２００３；１０２：４１２３−４１２９）。Ｂｃｌ３発現が調節解除されたという事実は、免疫応答並びに生存及び増殖細胞シグナル伝達の変化を示唆している。これは、重要な抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ２が、対照において高く、その発現は併用処置後に著しく減少したという事実によって確認された。実際、Ｂｃｌ２発現は、原発膵臓腫瘍の大部分において上方制御されることが知られており（Ｃａｍｐａｎｉら、Ｐａｔｈｏｌ．２００１，１９４（４），４４４−４５０）、その発現を下方制御するためにＢｃｌ２特異的ｓｉＲＮＡを用いることは、インビトロ及びインビボで膵臓腫瘍成長に対する抗増殖及びアポトーシス促進効果を有することが実証されている（Ｏｃｋｅｒら，Ｇｕｔ，２００５，５４（９），１２９８−１３０８）。より最近には、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌異種移植モデルを用いて抗腫瘍活性を示すＧ−四重鎖結合化合物（ＭＭ４１）が、タンパク質レベルでの解析後に、Ｂｃｌ２レベルを４０％低下させたことが示されている（Ｏｈｎｍａｃｈｔら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５，１６（５）：１１３８５）。まとめると、これらの結果は、ＳＤＴ／５−ＦＵ組み合わせ処置の結果として、細胞シグナル伝達経路に顕著な効果を示し、従来の化学療法ベースのレジメンと共に使用した場合に、ＳＤＴが膵臓癌患者にとって重要な治療上の利益を提供できることを示唆している。
【０１５８】
実施例１０−ＮＩＲイメージング
臨床橋渡しに適するために、ＭＢ懸濁液を静脈内投与する必要があり、ＭＢを適切な超音波条件を用いて腫瘍部位で破壊した。そのような方法は、増感剤／化学療法剤の局在化を高め、腫瘍部位での腫瘍ｐＯ2を増やす必要がある。そのようなアプローチの実現可能性を試験するために、ビオチン官能化赤外線吸収シアニン色素（９）をＲＢ及び５−ＦＵ（スキーム２）の代わりとして用いた。実施例４を参照されたい。９のＵＶ−Ｖｉｓ及び蛍光スペクトルは、この化合物をインビボイメージングに最適にさせるＮＩＲ領域に吸光度（７５０ｎｍ）及び発光極大（８１８ｎｍ）を明らかにする。
【０１５９】
実施例４に記載したように、色素（９）はＲＢ及び５−ＦＵのために使用したのと同じ手順に従って、ＭＢ表面上に装填した。次いで、Ｏ2ＭＢ−９コンジュゲートを、異所性Ｂｘ−ＰＣ３腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスの尾静脈を介して静脈内投与した。超音波を、ＩＶ投与中及びＩＶ投与後３分間、腫瘍に直接適用した。超音波を行わない対照実験は、比較目的のために使用した。ＩＶＩＳ全身イメージングシステムを用いて投与前、投与後５及び３０分にマウスを画像化した。代表的な画像（図１２ａ）は、超音波処置グループのマウスの処置後３０分の時点で強い腫瘍蛍光を明らかにし、対照グループのマウスは無視できる程度の腫瘍の蛍光を示し、ほとんどの放射は、肝臓領域から観察された。腫瘍蛍光の強度を処置前の値（図１２ｂ）と比較して測定したところ、超音波処置グループについて、処置後３０分の時点で、対照グループに対して統計的に有意な（ｐ＜０．０１）７倍増強が観察された。さらに、Ｏ2ＭＢ又はＰＦＢＭＢのいずれかを、尾静脈注射により腫瘍を有する動物に投与し、続いて超音波処理した場合に、外科的に切除した腫瘍からのタンパク質抽出物は、Ｏ2ＭＢで処置した腫瘍においてＨｉｆ−１αの有意な減少を明らかにした（図１２ｃ）。これらの結果から、Ｏ2ＭＢ−９コンジュゲートの投与中及び投与直後の腫瘍への超音波の適用が、腫瘍血管におけるＭＢの刺激依存性破壊を促進し、ひいては、標的化の方法でＯ2と付着ペイロードの両方の放出を促進することが示唆される。最終結果は、Ｈｉｆ１αタンパク質の発現低下によって証明される腫瘍ｐＯ2の増加、及び（９）の増強した蛍光によって証明される腫瘍におけるより高濃度の薬物である。
【０１６０】
実施例１１−モノヨードＩＣＧ合成（Ｉ2−ＩＲ７８３又は「Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ」）
【０１６１】
【化９】
2019500410.tif 000011
【０１６２】
（４−ヨードフェニル）ヒドラジン（１）の合成：
２０ｇ（９１．３ミリモル）の４−ヨードアニリンを１５ｍＬの濃塩酸と１５ｍＬの水の溶液と共に撹拌した。混合物を約−１０℃に冷却し、水４５ｍＬ中１２．６ｇ（１８２．６ミリモル）のＮａＮＯ2を連続的に撹拌しながら滴加した。懸濁液をさらに３０分間撹拌し、その後、ＳｎＣｌ2．２Ｈ2Ｏ（６７．９９ｇ，４０ｍｌの濃ＨＣｌ中３０１．３ミリモル）の氷冷溶液を、−１０℃で温度を維持しながら滴加した。反応混合物をこの温度で１．５時間、５℃で一晩撹拌した。得られた淡褐色の沈殿物を濾過し、水で３回洗浄した。次いで、このようにして得られたこの固体塊を、水（１００ｍｌ）中のＮａＯＨの飽和溶液で攪拌し、エーテル（２００ｍｌ）で抽出した。エーテル層をＮａＯＨ、Ｎａ2Ｓ2Ｏ3及び水の水溶液で洗浄した。ＭｇＳＯ4（無水）で乾燥した後、エーテル層を乾燥状態まで蒸発させ、褐色粉末として（４−ヨードフェニル）ヒドラジンを１７．９４ｇ得た。融点＝１０４〜１０６℃。
【０１６３】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：７．４８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），６．６２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），５．１８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），３．５５（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ2）。
ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  Ｃ6Ｈ7ＩＮ2の実測値＝２３５．００、計測値＝２３４．０４。
【０１６４】
５−ヨード−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（２）の合成：
１２．６８ｇ（５４．１ミリモル）の（４−ヨードフェニル）ヒドラジン（１）及び８ｇ（９２．８ミリモル）の３−メチル−２−ブタノンを、２０時間、１００ｍｌの氷酢酸中で還流した。酢酸を蒸発させ、残渣をエーテルに溶解した。不溶性沈殿物を濾別し、エーテル溶液をＮａＯＨの水溶液で洗浄し、その後、Ｎａ2Ｓ2Ｏ3及び水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、エーテルを減圧下で除去し、赤色ガム状液体として１０．５ｇの５−ヨード−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（２）を得た。
【０１６５】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：７．６０（ｄｄ，Ｊ＝４．５，８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），２．２５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），１．２０（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3 Ｘ２）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１５３．４（Ｃ），１４８．１（Ｃ），１３９．３（Ｃ），１３６．６（ＣＨ），１３０．６（ＣＨ），１２１．８（ＣＨ），８９．９（Ｃ），５４．０（Ｃ），２３．０（ＣＨ3），２２．９（ＣＨ3），１５．３（ＣＨ3）。
ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  Ｃ11Ｈ12ＩＮの実測値＝２８６．１、計算値＝２８５．１２。
【０１６６】
５−ヨード−２，３，３−トリメチル−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−１−イウム（３）の合成：
トルエン（７０ｍｌ）、５−ヨード−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（２）（１２ｇ、４２．１ミリモル）及び１，４−ブタンスルトン（８．６ｇ、６３．１ミリモル）を１８時間加熱還流した。反応混合物を室温まで冷却させた。得られた褐色の結晶を濾過し、アセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄した。濾過した生成物をＭｅＯＨ及びジエチルエーテルの溶液から再結晶させた。結晶を収集し、真空乾燥させ、８ｇの５−ヨード−２，３，３−トリメチル−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−１−イウム（３）を得た。
【０１６７】
1Ｈ ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ6）：８．２７（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．９５（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．８２（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），４．４２（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ2），２.７９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．４７（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ2），１．９０（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ2），１．６９（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ2），１．４９（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3 Ｘ ２）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１７６．２，１４８．４，１３９．９，１３６．７，１３２.５，１２６．８，９６．８，４９．８，４６．８，４２．６，２６．８，２５．６，１０.５。
ＥＳＭＳ（Ｍ＋Ｈ）  Ｃ15Ｈ21ＩＮＯ3Ｓ+の実測値＝４２２．１０、計算値＝４２２．３０。
【０１６８】
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−クロロ−３−（（Ｅ）−２−（５−ヨード−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）ビニル）−５−ヨード−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−１−イウム（５）の合成：
無水ＥｔＯＨ（１０ｍｌ）中の３（０．２ｇ、０．４７ミリモル）、（Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，７５１−７５６に記載の方法に従って調製した）４（０．１５３ｇ、０．４７ミリモル）及び無水酢酸ナトリウム（０．０７７ｇ、０．９３ミリモル）の溶液を、Ｎ2雰囲気下で４時間加熱還流した。ＥｔＯＨを減圧下で除去し、残渣を、溶出剤として２５％ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ3混合物を用いるカラムクロマトグラフィー（シリカ６０−１２０メッシュ）によって精製した。生成物（０．１５２ｇ、収率３３％）を緑色がかった粉末として単離した。
【０１６９】
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）：８．２６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），８．０３−７．９８（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．６８−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），７．６３−７．４９（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），６．３９−６．３６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ Ｘ ２），４．３４−４．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ Ｘ ２），３．３３−３．３４（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ２），２．９２−２．９０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．８９−２．８０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．０８−１．９６（ｍ，２６Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ７，ＣＨ3 Ｘ ４）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１７４．７，１７３．９，１５０．１，１４９．６，１４８.０，１４６．７，１４５．９，１３０．８，１３４．８，１３２．６，１３０．１，１２９.８，１２８．３，１２６．４，１２４．７，１２０．７，１１６．１，１１４．９，１０４．６，１０２．８，９８．６，６２．１，６０．１，５０．４，２９．１，４８．７，３０．５，２８．４，２８．５，２６．３，２６．２，４．６。
ＥＳＭＳ（Ｍ−Ｈ+）  Ｃ38Ｈ46ＣｌＩ2Ｎ2Ｏ6Ｓ2+の実測値＝９７７．２、計算値＝９７９．０６。
【０１７０】
実施例１２−ジヨード−ＩＲ−８２０合成（Ｉ4―ＩＲ７８３又は「I４−ＩＲＣＹＤＹＥ」）
【０１７１】
【化１０】
2019500410.tif 000012
【０１７２】
３，５−ジヨードニトロベンゼン（２）の合成：
０℃に冷却した濃Ｈ2ＳＯ4（９６％、１５ｍＬ）溶液に、少量ずつ２，６−ジヨード−４−ニトロアニリン１（３．９ｇ、１０ミリモル）を加えた。この溶液をこの温度で２０分間撹拌し、ＮａＮＯ2（１．５ｇ、２２ミリモル）を加えた。撹拌を２時間、０℃で続けた。次いで、粘性溶液を氷（１００ｇ）に注ぎ、任意の固体物質を濾別した。黄色の濾液を、ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）中のＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ（１６０ｍｇ，１ミリモル）の還流溶液に注意深く注ぎ、２時間撹拌して、ジアゾニウム塩を減少させた。室温に冷却後、固体の３，５−ジヨードニトロベンゼン（２）を分離した。生成物を濾別し、中性になるまで水で洗浄した。生成物を、ＥｔＯＨから再結晶し、２．４８ｇの微細褐色針（収率６６％）を得た。
【０１７３】
1Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）  δ＝８．４３（ｔ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ  Ｘ２），８．２９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ）；
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ＝９４．１，１３１．７，１４８．４，１５１．０。
ＥＳＭＳ［Ｍ＋Ｈ+］：Ｃ6Ｈ3Ｉ2ＮＯ2Ｎａの計算値３９７．８、実測値３９８．９ｍ／ｚ。
【０１７４】
３，５−ジヨードアニリン（３）の合成：
アルゴン雰囲気下で無水ＥｔＯＨ（７５ｍＬ）中２（７．１５ｇ、１９ミリモル）の懸濁液に、ＳｎＣl2・２Ｈ2Ｏ（２１．６ｇ、９６ミリモル）を加えた。この混合物を沸騰させ、ＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中のＮａＢＨ4（３６１ｍｇ、９．５ミリモル）溶液を滴加した。反応混合物を４５分間、還流で撹拌した。反応物を０℃に冷却した後、水（６０ｍＬ）を加え、混合物をＮａＯＨ（Ｈ2Ｏ中２．５Ｍ）で中和した。アニリン誘導体を、ジエチルエーテルで抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、アニリン３（５．８６ｇ、粗収率８９％）を得た。
【０１７５】
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） δ＝７．３９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），６．９７（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ Ｘ ２），３．６６（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ2）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ＝１４８．５，１３４．８，１２２．９，９５．１。
ＥＳＭＳ［Ｍ＋Ｈ+］：Ｃ6Ｈ5Ｉ2Ｎの計算値３４４．８、実測値３４５．５ｍ／ｚ。
【０１７６】
３，５−ジヨードフェニルヒドラジン（４）の合成：
この化合物を米国特許公開第２０１３／０２３１６０４号に記載の手順にしたがって合成した。
【０１７７】
４，６−ジヨード−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（５）の合成：
この化合物を米国特許公開第２０１３／０２３１６０４号に記載の手順にしたがって合成した。
【０１７８】
４，６−ジヨード−２，３，３−トリメチル−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−１−イウム（６）の合成：
トルエン（１０ｍｌ）、４，６−ジヨード−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（５）（２．１ｇ、５．１ミリモル）及び１，４−ブタンスルトン（３．５ｇ、２５．７ミリモル）を還流下で１８時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却させた。得られた褐色の結晶を濾過し、アセトン（３×１０ｍｌ）で洗浄した。濾過した生成物をＭｅＯＨ及びジエチルエーテルの溶液から再結晶させた。結晶を収集し、真空乾燥させ、１．９ｇの４，６−ジヨード−２，３，３−トリメチル−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−１−イウム（６）を得た。
【０１７９】
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）：８．４２（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），８．３６（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−ＣＨ），４．５１−４．４８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．８８−２．８５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．０９−２．００（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．９９−１．８２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），１．７３（ｓ，６Ｈ，ＣＨ3 Ｘ ２），１．１６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）。
ＥＳＭＳ［Ｍ−Ｈ＋］：Ｃ15Ｈ20Ｉ2ＮＯ3Ｓ+の計算値５４７．９、実測値５４６．１ｍ／ｚ。
【０１８０】
２−（（Ｅ）−２−（（Ｅ）−２−クロロ−３−（（Ｅ）−２−（４，６−ジヨード−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）インドリン−２−イリデン）エチリデン）シクロヘキサ−１−エン−１−イル）ビニル）−４，６−ジヨード−３，３−ジメチル−１−（４−スルホブチル）−３Ｈ−インドール−１−イウム（８）の合成：
無水ＥｔＯＨ（１０ｍｌ）中８（０．８４ｇ、１．５ミリモル）、（Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，７５１−７５６に記載の方法に従って調製した）７（０．２５ｇ、０．７ミリモル）及び無水酢酸ナトリウム（０．１３ｇ、１．５ミリモル）の溶液に、Ｎ2雰囲気下で、４時間加熱還流した。ＥｔＯＨを減圧下で除去し、残渣を、溶出剤として２５％ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ3混合物を用いるカラムクロマトグラフィー（シリカ６０−１２０メッシュ）によって精製した。生成物（０．１５３ｇ、収率８％）を褐色粉末として単離した。
【０１８１】
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）：８．５９（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ Ｘ ２），８．２９（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ Ｘ ２），６．７７−６．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ Ｘ ２），５．３０（ｂｒｓ，２Ｈ，ＣＨ Ｘ ２），４．８２−４．７２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ２），３.３９（ｂｒｓ，４Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ２），２．６０−２．４７（ｍ，１４Ｈ，ＣＨ2 Ｘ ７），２．２３（ｓ，１２Ｈ，ＣＨ３ Ｘ ４）。
13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：１７０．２，１６９．９，１５８．９，１５０．１，１４９.７，１４８．６，１４６．８，１４４．９，１４０．８，１３９．３，１３４．２，１３２.１，１２６．７，１２４．３，１０４．０，１００．４，９６．７，９６．２，９４．５，６４．１，５９．５，５０．５，４８．７，４８．１，３０．３，２８．７，２８．２，２６．３，２６．１，２４．３。
ＥＳＭＳ［Ｍ−Ｈ+］：Ｃ38Ｈ44ＣＩ4Ｎ2Ｏ6Ｓ2Ｎａ+の計算値１２５３．８５、実測値１２５２．８１ｍ／ｚ。
【０１８２】
実施例１３−ヒト異種移植異所性ＢｘＰＣ−３膵臓癌腫瘍を有するマウスにおけるＩ2−ＩＲ７８３のインビボＰＤＴ効果
ＢｘＰＣ−３細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６０培地中で維持した。細胞を、空気中５％ＣＯ2下、３７℃で培養した。ＢｘＰＣ−３細胞（１×１０6）を、１００μｌのマトリゲルに再懸濁し、雄性ＳＣＩＤマウスの後背部に移植した。腫瘍形成は、移植後約２週間で生じ、キャリパーを使用して、毎日腫瘍を測定した。腫瘍が、腫瘍体積の式＝４πＲ3／３を用いて幾何平均直径から計算された平均体積２６７ｍｍ3に達したら、動物を無作為に２つのグループ（ｎ＝２）に分けた。麻酔（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌの腹腔内注射）の誘導後、各腫瘍内に直接注入されるＰＢＳ：ＤＭＳＯ（９８：２）ビヒクル中のＩ2−ＩＲ７８３（１ｍｇ／ｋｇ）の１００μｌアリコートを処置グループに与え、処置間で１分間の遅れで、３×３分間、７８０ｎｍの光照射（１００ｍＷ）で処置した。第２グループ（対照）にビヒクルのみを与えた。処置後、動物を麻酔から回復させ、腫瘍体積を示した時間に監視した。腫瘍体積の増加率（％）を、各グループの前処理測定を用いて計算した。８日目に、処置グループに、上記の第２の処置を施すだけでなく、光照射前に、１００μｌのＯ2ＭＢ（１×１０8  ＭＢ／ｍＬ）を腫瘍内注射した。結果を図１３に示す。
【０１８３】
実施例１４−ＩＲ７８３（「Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ」及び「Ｉ４−ＩＲＣＹＤＹＥ」）のＩ２及びＩ４類似体の蛍光
図１４は、（ａ）ＵＶ／Ｖｉｓ及び（ｂ）カルジオグリーンと比較したＩ２−ＩＲＣＹＤＹＥ及びＩ４−ＩＲＣＹＤＹＥの蛍光発光スペクトルを示す。新規化合物は、明らかにカルジオグリーンと同様の吸収プロファイルを示す。しかしながら、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥの蛍光発光はカルジオグリーンと同様のままであるが、Ｉ４−ＩＲＣＹＤＹＥからの発光はかなりクエンチする。これは、追加のヨウ素原子によって増加したＩＳＣに起因している。
【０１８４】
実施例１５−一重項酸素生成及びＩＲ７８３のＩ２及びＩ４の類似体（「Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ」及び「Ｉ４−ＩＲＣＹＤＹＥ」）のインビトロ細胞傷害性
図１５は、７８０ｎｍで励起した時に、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ及びＩ４−ＩＲＣＹＤＹＥの両方がカルジオグリーンよりも一重項酸素を生成することを示す。
【０１８５】
図１６は、７８０ｎｍの照射にさらされた時に、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ及びＩ４−ＩＲＣＹＤＹＥの両方が、カルジオグリーンよりも２つの異なる膵臓癌細胞株（Ｍｉａ Ｐａｃａ及びＢｘＰＣ−３）に対して有意により高い細胞傷害性であることを示す。７８０ｎｍで励起した時に、該化合物はまた、カルジオグリーンよりも子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）により毒性があることが判明した。異所性ＢｘＰＣ−３膵臓腫瘍を用いたマウスにおけるインビボ実験でも、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥは尾静脈投与後１８時間の時点で腫瘍内に局在することが示されている。
【０１８６】
これらの結果は、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥ及びＩ４−ＩＲＣＹＤＹＥの両方が有効なＮＩＲ活性化増感剤であること、Ｉ２−ＩＲＣＹＤＹＥはまた、高いＮＩＲ蛍光を与えるイメージング剤としての可能性を有することを証明する。これは、固形腫瘍、例えば、膵臓腫瘍の画像誘導ＰＤＴ及び／又はＳＤＴの可能性を提供する。
【０１８７】
実施例１６−ローズベンガル及び５−ＦＵを用いたヒト膵臓癌ＭｉａＰａＣａ−２細胞の代謝拮抗／音響力学的組み合わせ療法
手順：
ヒト原発膵臓腺癌細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ−２を、ダルベッコ改変イーグル培地中で維持し、３７℃で、加湿した５％ＣＯ2雰囲気で１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を補充した。細胞を、ウェル当たり４×１０3細胞の濃度で９６ウェルプレートのウェルに播種し、加湿した５％ＣＯ2雰囲気で、３７℃で２１時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、ウェルは、ローズベンガル（３μΜ）、５−フルオロウラシル（５０μΜ）又はＲＢ（３μΜ）と５−ＦＵ（５０μΜ）の両方の組合せのいずれかで３時間処理した。次いで、薬物溶液を除去し、新鮮な培地を添加し、Ｓｏｎｉｄｅｌ ＳＰ１００ ｓｏｎｏｐｏｒａｔｏｒ（３０秒、周波数＝１ＭＨｚ、超音波パワー密度＝３０Ｗｃｍ-2、デューティ・サイクル＝５０％、パルス繰り返し周波数＝１００Ｈｚ）を用いて送達される超音波で処理したウェルを選択した。次いで、細胞を２４時間インキュベートし、その後に、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを用いて決定した。
【０１８８】
結果：
結果を図１７に示す。結果は、ＳＤＴ処置（すなわち、ＲＢ＋ＵＳ）がＲＢ単独（ＲＢ−ＵＳ）と比較して細胞生存率を１１．１％低下させることを実証する。５ＦＵ処理＋超音波は、５ＦＵ単独処理よりも細胞生存率を５．９％低下させた。組み合わせたＳＤＴ／５ＦＵ＋超音波（コンボ＋ＵＳ）での処理は、ＲＢ／５ＦＵ−超音波での処理と比較して２１．９％低下させた。驚くべきことに、この差は、両方の処理による影響を加えることによって予想されるものよりも大きく（１７％）、両方の技術を組み合わせることによって相乗効果があることを示す（ｎ＝６）。
【０１８９】
この実験に活性剤を含めた。しかしながら、これらは、微小気泡破壊の際に、効果的に遊離される種である。このように、結果は、本明細書に記載の微小気泡技術を用いて活性剤が送達される状況にまで及ぶことが期待される。
【０１９０】
実施例１７−酸素添加微小気泡ローズベンガル及びドキソルビシンコンジュゲートを用いたヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍のアントラサイクリン／音響力学的組み合わせ療法
ビオチン−ローズベンガル及びビオチン−ドキソルビシンの合成：
ビオチン−ローズベンガルの合成については上記の実施例２に記載した。ビオチン−ドキソルビシン（ビオチン−Ｄｏｘ）をスキーム３に従って調製した。
【０１９１】
【化１１】
2019500410.tif 000013
【０１９２】
スキーム３：ビオチン−Ｄｏｘの調製のための合成スキーム
ＤＭＦ（１０ｍｌ）中のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．１４ｇ、０．４１ミリモル）の氷冷溶液に、窒素雰囲気下でドキソルビシン（０．３ｇ、０．４１ミリモル）を添加した。３０分間撹拌後、トリエチルアミン（０．５ｍｌ、２ミリモル）をこの反応混合物に加え、室温でさらに１２時間撹拌した。反応をＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ６０、ＨＦ ２５４、２０：８０メタノール−ジクロロメタン  ｖ／ｖ）により監視した。反応完了後、過剰のジエチルエーテル（１００ｍｌ）を反応混合物に加えた。このようにして得られた赤色固体を濾過し、ジエチルエーテル（５０ｍｌ×３）で３回洗浄した。次いで、この赤色固体を溶出液としてメタノール−ジクロロメタン（２０：８０、ｖ／ｖ）を用いてＰＴＬＣ精製に供し、０．２５ｇ（収率＝７８％）のビオチン化ドキソルビシンを得た。分析試料を、エタノールからのこの生成物の再結晶から得た。
【０１９３】
1Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4）δ：８．５４（ｂｒｓ,１Ｈ,ＮＨ）,７．８２−７．７６（ｍ,２Ｈ,芳香族）,７．４７（ｄ,Ｊ＝７．５Ｈｚ,１Ｈ,芳香族）,５．３９（ｂｒｓ,１Ｈ,ＮＨ）,５．０５（ｂｒｓ,２Ｈ,ＮＨ,ＯＨ）,４．７１（ｓ,２Ｈ,−ＣＨ2−ＯＨ）,４．６７（ｂｒｓ,２Ｈ,ＯＨ Ｘ ２）,４．３６−４．３３（ｍ,１Ｈ,ＣＨ）,４．２５−４．２２（ｍ,１Ｈ,ＣＨ）,４．１６−４.１３（ｍ,１Ｈ,ＣＨ）,３．９９（ｓ,３Ｈ,ＯＣＨ3）,３．６０−３．５８（ｍ,１Ｈ,ＣＨ）,３．５５（ｂｒｓ,２Ｈ,ＯＨ Ｘ２）,３．３０−２．５（ｍ,４Ｈ,ＣＨ2 Ｘ１,ＣＨ Ｘ ２）,２．１８−２．１４（ｍ,３Ｈ,ＣＨ2 Ｘ １,ＣＨ）,２．００−１．９６（ｍ,１Ｈ,ＣＨ）,１．６３−１．５０（ｍ,４Ｈ,ＣＨ2 Ｘ ２）,１．４２−１．２６（ｍ,１１Ｈ,ＣＨ3 Ｘ １,ＣＨ2 Ｘ ４）. 
ＥＳＭＳ ［Ｍ−Ｈ］：Ｃ37Ｈ43Ｉ2Ｎ3Ｏ13Ｓの計算値＝７６９．２５、実測値＝７６７．９ｍ／ｚ。
【０１９４】
酸素添加微小気泡ローズベンガル（ＲＢＯ2ＭＢ）及びドキソルビシン（ＤｏｘＯ2ＭＢ）のコンジュゲートの調製：
ビオチン−ＲＢ（２．５ｍｇ／ｍＬ）及びビオチン−ＤＯＸ（２．５ｍｇ／ｍＬ）を含有する溶液を、ＰＢＳ中の０．５％ＤＭＳＯ液（ｐＨ７．４±０．１）で調製した。次いで、これらの原液の２ｍＬのアリコートを、アビジン官能化ＰＦＢＭＢ（１×１０9 ＭＢ／ｍＬ）の２つの２ｍＬの懸濁液に別々に添加し、内容物を１５分間混合した。次いで、懸濁液を５分間遠心分離（９００ｒｐｍ）し、ＭＢコンジュゲートを溶液の上部に浮遊している乳状懸濁液として単離した。溶液を除去し、さらにビオチン−ＲＢ又はビオチン−Ｄｏｘのいずれかを含有する２ｍＬの原液と交換し、混合／遠心分離工程を繰り返した。次いで、ＭＢ懸濁液を、ＰＢＳ（５ｍＬ）で洗浄し、５分間、遠心分離（９００ｒｐｍ）し、ＭＢを清浄な遠心管に移した。この洗浄手順を再度繰り返し、単離したＰＦＢＭＢ−ＲＢ及びＰＦＢＭＢ−Ｄｏｘコンジュゲートをガラスバイアルに入れた。次いで、ＰＦＢＭＢ−ＲＢ及びＰＦＢＭＢ−Ｄｏｘコンジュゲートに、酸素ガスを２分間噴霧し、得られたＲＢＯ2ＭＢ及びＤｏｘＯ2ＭＢ（図１８参照）を動物実験に直接使用した。
【０１９５】
ＳＣＩＤマウスの乳癌腫瘍を用いたヒト異種移植片ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の処置：
本研究で用いた全ての動物を、英国の動物（科学的処置）法１９８６の下でライセンス化された手順に従って人道的に処置した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、上記の１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。細胞（１×１０6）を１００μＬのマトリゲル（登録商標）に再懸濁し、雌Ｂａｌｂ／ｃ  ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨａｎ（登録商標）Ｈｓｄ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ）マウスの後部背部に移植した。腫瘍形成は、移植後約２週間で生じ、キャリパーを使用して一日おきに腫瘍を測定した。腫瘍体積の式＝４πＲ3／３を用いて幾何平均直径から計算された平均体積１００ｍｍ3に腫瘍が達したら、動物を無作為に３つのグループ（ｎ＝３）に分けた。麻酔（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌの腹腔内注射）の誘導後、グループ１に１００μＬのＲＢＯ2ＭＢ（３００μΜのＲＢ）を与え、グループ２に１００μＬのＤｏｘＯ2ＭＢ（４７５μΜ）を与え、グループ３にＲＢＯ2ＭＢ（１５０μΜのＲＢ）及びＤｏｘＯ2ＭＢ（２３７．５μΜ）を１００μＬ与えた。プラットフォームの薬物動態学的挙動に起因する実験的変動を排除するために、腫瘍内注射を投与経路として選択した。次いで、腫瘍を１ＭＨｚの超音波周波数、３．５Ｗｃｍ-2の超音波パワー密度（ＩSATP；空間平均時間ピーク）で、１００Ｈｚのパルス繰り返し周波数で３０％のデューティ・サイクルを用いて３．５分間超音波で処置した。処置を１４日目に繰り返した。処置後、動物を麻酔から回復させ、９日間毎日、腫瘍体積及び体重を記録した。腫瘍体積の増加率（％）を、各グループの処置前測定値を用いて計算した。
【０１９６】
結果：
結果を図１９に示す。結果は、ＤｏｘＯ2ＭＢ／ＲＢＯ2ＭＢ＋ＵＳ組み合わせ治療が、ドキソルビシン及びローズベンガルの半分濃度を用いるＲＢＯ2ＭＢ＋ＵＳよりも効果的で、ＤｏｘＯ2ＭＢ＋ＵＳと同じくらい効果的であったことを示す。結果は、このプラットフォームを用いて、乳癌を治療することができることを実証する。
【図１】
2019500410.tif 000020
【図２】
2019500410.tif 000021
【図３】
2019500410.tif 000022
【図４】
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【図５】
2019500410.tif 000024
【図６】
2019500410.tif 000025
【図７】
2019500410.tif 000026
【図８】
2019500410.tif 000027
【図９】
2019500410.tif 000028
【図１０】
2019500410.tif 000029
【図１１】
2019500410.tif 000030
【図１２】
2019500410.tif 000031
【図１３】
2019500410.tif 000032
【図１４】
2019500410.tif 000033
【図１５】
2019500410.tif 000034
【図１６】
2019500410.tif 000035
【図１７】
2019500410.tif 000036
【図１８】
2019500410.tif 000037
【図１９】
2019500410.tif 000038
【配列表】
2019500410000001.app
【国際調査報告】
2019500410.tif 000039
2019500410.tif 000040
2019500410.tif 000041
2019500410.tif 000042
2019500410.tif 000043