(57)【要約】本発明は、全必須アミノ酸を含み、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く、複数のアミノ酸を含むダイエタリー製品；がんの処置におけるその方法と使用；斯かる用途のための層別化方法およびバイオマーカーに関する。
2019507754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全必須アミノ酸を含み、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く、複数のアミノ酸を含むダイエタリー製品。
【請求項２】
少なくとも１２個のアミノ酸を含む、請求項１に記載のダイエタリー製品。
【請求項３】
前記実質的に欠如する非必須アミノ酸の少なくとも１つは、グリシン、セリン、システイン、チロシン、およびアルギニンからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のダイエタリー製品。
【請求項４】
前記少なくとも２つの実質的に欠如する非必須アミノ酸は、以下のアミノ酸：グリシン、セリン、システイン、チロシン、およびアルギニンのうち２つ以上を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載のダイエタリー製品。
【請求項５】
実質的に：
ａ．グリシン、セリン、およびシステイン；
ｂ．グリシン、セリン、およびアルギニン；
ｃ．グリシン、セリン、およびチロシン；
ｄ．グリシン、セリン、アルギニン、およびシステイン；
ｅ．グリシン、セリン、チロシン、およびシステイン；
ｆ．システインおよびアルギニン；
ｇ．システインおよびチロシン；
ｈ．システインおよびグリシン；
ｉ．システイン、チロシン、およびアルギニン；または
ｊ．グリシン、セリン、アルギニン、チロシン、およびシステインを欠く、
請求項１〜４の何れか一項に記載のダイエタリー製品。
【請求項６】
１つもしくは複数の主要栄養素および／または１つもしくは複数の微量栄養素をさらに含む、請求項１〜５の何れか一項に記載のダイエタリー製品。
【請求項７】
２５ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルのメチオニンをさらに含む、請求項１〜６の何れか一項に記載のダイエタリー製品。
【請求項８】
一日平均総タンパク質消費量に基づき、必須アミノ酸の一日推奨摂取量を少なくとも提供するように配合される、請求項１〜７の何れか一項に記載のダイエタリー製品。
【請求項９】
固体または飲料の形態をとる、請求項１〜８の何れか一項に記載のダイエタリー製品。
【請求項１０】
前記成分を水に溶解または分散させ、噴霧乾燥させる、請求項１〜９の何れか一項に記載のダイエタリー製品を調製するプロセス。
【請求項１１】
請求項１〜９の何れか一項に記載のダイエタリー製品または請求項１０に従って生成されたダイエタリー製品と、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される治療薬をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させる、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
治療で使用するための、請求項１〜９の何れか一項に記載のもしくは請求項１０に従って生成されたダイエタリー製品、または請求項１１〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
がんの処置で使用するための、請求項１〜９の何れか一項に記載のもしくは請求項１０に従って生成されたダイエタリー製品、または請求項１１〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記がんは、大腸がん、肝がん、骨肉腫、肺がん、リンパ腫、および乳がんからなる群から選択される、請求項１５に記載する使用するためのダイエタリー製品。
【請求項１７】
前記がんは野生型ＫＲＡＳについて陽性である、請求項１５または１６に記載の使用するためのダイエタリー製品。
【請求項１８】
前記がんはｃＭｙｃ発現の制御が解除されている、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の使用するためのダイエタリー製品。
【請求項１９】
前記がんはＭＴＡＰ発現の下方制御されている、請求項１５〜１８の何れか一項に記載の使用するためのダイエタリー製品。
【請求項２０】
セリンおよび／またはグリシンを実質的に欠く、請求項１５〜１９の何れか一項に記載の使用するためのダイエタリー製品。
【請求項２１】
がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される治療薬と組み合わせて使用される、請求項１５〜２０の何れか一項に記載の使用するためのダイエタリー製品。
【請求項２２】
前記治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させる、請求項２１に記載の使用するためのダイエタリー製品。
【請求項２３】
がんの処置で使用する薬物の製造における、請求項１〜９の何れか一項に記載のもしくは請求項１０に従って生成されたダイエタリー製品、または、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
前記がんは、大腸がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、骨肉腫、および乳がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記がんは野生型ＫＲＡＳについて陽性である、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２６】
前記がんはｃＭｙｃ発現の制御が解除されている、請求項２２〜２４の何れか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ダイエタリー製品は、セリンおよび／またはグリシンを実質的に欠く、請求項２２〜２６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記ダイエタリー製品は、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される治療薬と組み合わせて使用される、請求項２２〜２７の何れか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させる、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
請求項１〜９の何れか一項に記載のもしくは請求項１０に従って生成されたダイエタリー製品、または、請求項１１〜１３の何れか一項の組成物を、治療的に有効な量で投与するステップを含む、対象のがんを処置する方法。
【請求項３１】
前記がんは、大腸がん、肝がん、肺がん、骨肉腫、リンパ腫、および乳がんからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんは野生型ＫＲＡＳについて陽性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんはｃＭｙｃ発現の制御が解除されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんはＭＴＡＰの発現が下方制御されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ダイエタリー製品はセリンおよび／またはグリシンを実質的に欠く、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ダイエタリー製品は、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される治療薬と組み合わせて使用される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３７】
前記治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ダイエタリー製品は、前記対象の唯一の栄養供給源である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記処置は、少なくとも２４時間という期間にわたって、または、治療エンドポイントが観察されるまで与えられる、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記ダイエタリー製品は１日に１〜６回投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも必須アミノ酸の一日の推奨量が、各日の投与レジメンにより満たされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である患者または患者集団を特定するための、ＫＲＡＳまたはＭＴＡＰのバイオマーカーとして使用。
【請求項４３】
前記がん処置は、セリンおよびグリシンを実質的に欠く食餌を含む、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記がん処置は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および／または化学療法薬から選択される治療薬の投与を含む、請求項４２または４３に記載の使用。
【請求項４５】
セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である可能性が低い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してまたは前記所定の参照レベルと比較して高い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する非応答性または非感受性を表す、方法。
【請求項４６】
セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である可能性が高い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す、方法。
【請求項４７】
セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受け得る対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記患者が前記がん処置から恩恵を受け得ることを示す、方法。
【請求項４８】
ｉ）セリンを実質的に欠くおよび／またはｉｉ）システインのレベルが制限された食餌を含むがん処置に対し、応答性または感受性である可能性が高い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＭＴＡＰの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す、方法。
【請求項４９】
ｉ）セリンを実質的に欠くおよび／またはｉｉ）システインレベルが制限された食餌を含むがん処置から恩恵を受け得る対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいて発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＭＴＡＰの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記患者が前記がん処置から恩恵を受け得ることを示す、方法。
【請求項５０】
前記生物学的サンプルはがん細胞またはがん組織である、請求項４５〜４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記対照サンプルは、正常な細胞または組織のサンプルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記正常な細胞または組織のサンプルは、前記がん細胞またはがん組織と同じ細胞タイプまたは組織タイプである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
がんのある対象を処置する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルのＫｒａｓおよび／またはＭＴＡＰの発現または活性のレベルが、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓおよび／またはＭＴＡＰの発現または活性のレベルが、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す場合に、前記対象に前記がん処置を与えるステップとを含む、方法。
【請求項５４】
前記がん処置は、セリンおよびグリシンを実質的に欠く食餌を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記がん処置は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および／または化学療法薬から選択される治療薬の投与を含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象から単離した生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルが、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップは：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み得、
対照サンプルと比較してまたは所定の参照レベルと比較して高い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する対象の非応答性または非感受性を表し、対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の応答性または感受性を表す、請求項５３〜５５の何れか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象から単離した生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルが、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップは：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＭＴＡＰの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み得、
対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の応答性または感受性を表す、請求項５３〜５６の何れか一項に記載の方法。
【請求項５８】
セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定する際に使用するキットであって：
ａ．Ｋｒａｓの発現または活性を求める薬剤と；
ｂ．アッセイ用の試薬とを含むキット。
【請求項５９】
対照サンプルと比較してまたは所定の参照レベルと比較して高い、生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の非応答性または非感受性を表し、前記対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の応答性または感受性を表すという指示書をさらに含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項６０】
ＭＴＡＰの発現または活性を求める薬剤を含む、請求項５８または５９に記載のキット。
【請求項６１】
セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定する際に使用するキットであって：
ａ．ＭＴＡＰの発現または活性を求める薬剤と；
ｂ．アッセイ用試薬とを含む、キット。
【請求項６２】
説明および図に関連して本明細書で実質的に記載される、請求項１に記載のダイエタリー製品。
【請求項６３】
説明および図に関連して本明細書で実質的に記載される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
説明および図に関連して本明細書で実質的に記載される、請求項１５に記載の使用するためのダイエタリー製品、または請求項２３に記載の使用、または請求項２５もしくは請求項５３に記載の処置方法。
【請求項６５】
説明および図に関連して本明細書で実質的に記載される、ＫＲＡＳまたはＭＴＡＰのバイオマーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、がんを処置する食餌療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、がんを処置し、既存のがん療法を改善するように、食餌におけるアミノ酸レベルを変更することに関する。本発明は、また、がんを処置する食餌療法から恩恵を受けるであろう患者を特定するためのバイオマーカーと、該バイオマーカーを使用する方法およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、細胞が無制御に増殖し、細胞増殖の通常の限界を超えて増殖および分裂する疾患である。これらの細胞は、周りの組織に浸潤し、破壊する可能性がある。さらに、がん細胞は転移する可能性があり、その場合、がん細胞は血液またはリンパ系を介して身体の他領域に広がり得る。
【０００３】
がんの処置には、組織を除去する手術、腫瘍サイズを減少させる放射線療法、または薬物もしくは他の医薬品を使用してがんを処置する薬物療法／化学療法が含まれ得る。がんでの生存率は、がんの種類によって異なるが、転移したがんの場合、その率は特に低い。これは主に、薬物療法的／化学療法的処置はしばしば失敗し、がんを完全に根絶することがまれであるからである。正常な非がん細胞は、ある投与量の薬物療法薬／化学療法薬にしか耐性がなく、過度な副作用を予防するために、がんの処置には最適以下の投与量を利用することになる。この問題を複雑にしているのは、がん細胞では正常細胞よりも薬剤の選択性が限られ、がん細胞は、処置期間中に、薬物療法薬／化学療法薬に対し耐性を持つようになる可能性があることである。生存がん細胞は、典型的には、なお、無制御に増殖することが可能であり、がんは残り続ける。これは、研究者らががんを処置する新規の方法を探ることにつながった。
【０００４】
近年では、がん代謝、特に、がん細胞が正常細胞とどのように異なって、典型的に疾患と関連する急速な無制御細胞増殖を呈するかに注意が向けられている。増殖し、新しい細胞を生成し、代謝ストレスに適応することができるように、がんがその代謝を再プログラムすることは明らかである。がんを処置する際、特異的な代謝経路酵素を標的化するか、あるいは、該経路で利用される化学物質および／または代謝物を標的化することが可能である。タンパク質は細胞の重要な成分であり、タンパク質合成経路はがん細胞の増殖にとって鍵である。
【０００５】
タンパク質はアミノ酸から合成され得、哺乳類では、既知の生物学的に活性なアミノ酸が２０個ある。これらは体内で合成されるが（非必須アミノ酸）、合成され得ないものは食餌の必須要素である（必須アミノ酸）。がん細胞は、増殖を支えるのに非必須アミノ酸の利用に大きく依存している。いくつかのがんは、増殖を支えるこれらの非必須アミノ酸をｄｅ  ｎｏｖｏで合成することが可能であるが、他のがんは、外来性アミノ酸の取り込みに依存する（Jason W. Locasale, Nature Reviews Cancer, 2013, 13, 572-583; R. Possemato et al, Nature, 2011 476, 346-350; O. Maddocks et al, Nature, 2013, 493, 542-546; C. Labuschagne et al, Cell Rep. 2014, 22, 7(4), 1248-58）。非必須アミノ酸は、タンパク質合成の他、がん細胞増殖に必要な多くの他のタンパク同化プロセスにも使用される。
【０００６】
がんの外来性アミノ酸への依存には、食餌中のアミノ酸レベルを制限することを通じてがんが入手可能な外来性アミノ酸の量を調節することにより、がんを処置するのに利用できる可能性がある。この、がん細胞の増殖および生存に必要な必須成分の欠乏は、がん増殖を防ぎ、がん細胞死を誘発する効果を有し得る。これは、療法として単独で、または、放射線療法および薬物療法／化学療法などの他のストラテジーと組み合わせて使用することが可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このようなストラテジーは、このような療法から恩恵を受け得る患者および患者集団を特定するため、がんの種類を分類する改善された方法を必要とするだろう。
【０００８】
したがって、代謝標的療法から恩恵を受けるであろう患者および患者集団を特定する改善された方法に対するニーズが残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に従って、全必須アミノ酸を含み、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く、複数のアミノ酸を含むダイエタリー製品を提供する。適切には、このダイエタリー製品は少なくとも９個のアミノ酸を含み得る。
【００１０】
実質的に欠如する非必須アミノ酸の少なくとも１つは、グリシン、セリン、システイン、チロシン、およびアルギニンからなる群から選択され得る。
【００１１】
前記少なくとも２つの実質的に欠如する非必須アミノ酸には、以下のアミノ酸：グリシン、セリン、システイン、チロシン、およびアルギニンのうち２つ以上を含み得る。適切には、本ダイエタリー製品は、実質的に、
ａ．グリシン、セリン、およびシステイン；
ｂ．グリシン、セリン、およびアルギニン；
ｃ．グリシン、セリン、およびチロシン；
ｄ．グリシン、セリン、アルギニン、およびシステイン；
ｅ．グリシン、セリン、チロシン、およびシステイン；
ｆ．システインおよびアルギニン；
ｇ．システインおよびチロシン；
ｈ．システインおよびグリシン；
ｉ．システイン、チロシン、およびアルギニン；または
ｊ．グリシン、セリン、アルギニン、チロシン、およびシステインを欠き得る。
【００１２】
適切には、本ダイエタリー製品は、さらに、１つもしくは複数の主要栄養素および／または１つもしくは複数の微量栄養素を含み得る。
【００１３】
本ダイエタリー製品は、さらに、２５ｍｇ／対象の体重ｋｇ／日未満または２０ｍｇ／ｋｇ／日未満または１８ｍｇ／ｋｇ／日未満または１６ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルのメチオニンを含み得る。
【００１４】
本発明のダイエタリー製品は、一日平均総タンパク質消費量に基づき、必須アミノ酸（任意選択的にメチオニンを除く）の一日推奨摂取量を少なくとも提供するように配合することができる。
【００１５】
本発明のダイエタリー製品は、固体または飲料の形態をとり得る。
【００１６】
本発明は、さらに、成分を水に溶解または分散させ、噴霧乾燥させる、本発明のダイエタリー製品の調製プロセスを提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明のダイエタリー製品または本発明にしたがって生成したダイエタリー製品と、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００１８】
適切には、本発明の医薬組成物は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される治療薬を含み得る。治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させ得る。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、がんの処置で使用するための、本発明のもしくは本発明のプロセスに従って生成したダイエタリー製品か、または本発明の医薬組成物を提供する。
【００２０】
がんは、腸がん、大腸がん、肝がん、肺がん、骨肉腫、リンパ腫、白血病、および乳がんからなる群から選択することができる。
【００２１】
がんは、野生型ＫＲＡＳについて陽性であり得る。
【００２２】
がんは、ｃＭｙｃ発現の制御が解除されている場合がある。
【００２３】
本ダイエタリー製品は、実質的に、セリンおよび／またはグリシンを欠く場合がある。
【００２４】
がんは、ＭＴＡＰ発現の下方制御と関連し得、任意選択的に、ダイエタリー製品のシステインレベルは減少しているか、またはシステインを実質的に欠く場合がある。
【００２５】
適切には、がんの処置で使用する本ダイエタリー製品は、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、化学療法薬、アミノ酸代謝／ターンオーバー／相互変換の阻害剤、非必須アミノ酸生合成阻害剤、アミノ酸輸送阻害剤、アミノ酸分解を促進する酵素もしくは薬物、または、アミノ酸を隔離する物質から選択される治療薬と組み合わせて使用することができる。
【００２６】
治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させ得る。
【００２７】
別の態様において、本発明は、本発明のダイエタリー製品もしくは本発明に従って生成したダイエタリー製品、または、本発明の医薬組成物を、がんの処置で使用する薬物の製造において使用することを提供する。
【００２８】
適切には、がんは、大腸がん、リンパ腫、肝がん、肺がん、骨肉腫、および乳がんからなる群から選択することができる。
【００２９】
がんは、野生型ＫＲＡＳについて陽性であり得、ならびに／または、がんは、ｃＭｙｃ発現の制御が解除されているおよび／もしくはＭＴＡＰの発現が下方制御されている場合がある。
【００３０】
適切には、本発明のダイエタリー製品は、セリン、グリシン、またはセリンおよびグリシンを実質的に欠く場合がある。
【００３１】
適切には、本発明のダイエタリー製品は、システインレベルが減少しているか、またはシステインを実質的に欠く場合がある。
【００３２】
適切には、本ダイエタリー製品は、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される１つまたは複数の治療薬と組み合わせて使用することができる。
【００３３】
治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させ得る。
【００３４】
別の態様では、本発明は、治療的に有効な量の本発明のダイエタリー製品または本発明に従って生成したダイエタリー製品または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、対象のがんを処置する方法に関する。
【００３５】
適切には、がんは、大腸がん、肝がん、骨肉腫、肺がん、リンパ腫、および乳がんからなる群から選択することができる。
【００３６】
がんは、野生型ＫＲＡＳについて陽性であり得、および／または、ｃＭｙｃ発現の制御が解除されている場合がある。
【００３７】
本ダイエタリー製品は、セリンおよび／またはグリシンを実質的に欠き得る。
【００３８】
本ダイエタリー製品は、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される１つまたは複数の治療薬と組み合わせて使用することができる。
【００３９】
治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または、抗酸化防御を低下させ得る。
【００４０】
適切には、本発明の全態様において、本ダイエタリー製品を、対象の唯一の栄養供給源とすることができる。
【００４１】
処置は、少なくとも２４時間という期間にわたって、または、治療エンドポイントが観察されるまで与える。
【００４２】
本ダイエタリー製品は、１日に１〜６回投与してよい。
【００４３】
適切には、少なくとも必須アミノ酸の一日の推奨量を、各日の投与レジメンにより満たすことができる。
【００４４】
本発明は、さらに、セリンおよび／またはグリシンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である患者または患者集団を特定するために、ＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰをバイオマーカーとして使用することを提供する。
【００４５】
適切には、がん処置は、セリンおよびグリシンを実質的に欠く食餌を含み得る。
【００４６】
適切には、がん処置は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および／または化学療法薬から選択される治療薬の投与を含み得る。
【００４７】
別の態様では、本発明は、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である可能性が低い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してまたは前記所定の参照レベルと比較して高い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する非応答性または非感受性を表す、方法を提供する。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である可能性が高い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す、方法を提供する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受け得る対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記患者が前記がん処置から恩恵を受け得ることを示す、方法を提供する。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、ｉ）セリンを実質的に欠くおよび／またはｉｉ）および／またはｉｉ）システインのレベルが制限された食餌を含むがん処置に対し、応答性または感受性である可能性が高い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＭＴＡＰの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す、方法を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、ｉ）セリンを実質的に欠くおよび／またはｉｉ）システインレベルが制限された食餌を含むがん処置から恩恵を受け得る対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＭＴＡＰの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記患者が前記がん処置から恩恵を受け得ることを示す、方法を提供する。適切には、全態様において、生物学的サンプルはがん細胞またはがん組織とすることができる。同様に、全態様において、対照サンプルは正常な細胞または組織のサンプルとすることができる。正常な細胞または組織のサンプルは、がん細胞またはがん組織と同じ細胞タイプまたは組織タイプとすることができる。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、がんのある対象を処置する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルが、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルが、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す場合に、前記対象に前記がん処置を与えるステップとを含む、方法を提供する。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、がんのある対象を処置する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルが、ｉ）セリンを実質的に欠くおよび／またはｉｉ）システインが制限された食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルが、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す場合に、前記対象に前記がん処置を与えるステップとを含む、方法を提供する。
【００５４】
適切には、前記がん処置は、セリンおよびグリシンを実質的に欠く食餌を含み得る。
【００５５】
適切には、前記がん処置は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および／または化学療法薬から選択される治療薬の投与を含み得る。
【００５６】
対象から単離した生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルが、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップは：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み得、
対照サンプルと比較してまたは所定の参照レベルと比較して高い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の非応答性または非感受性を表し、対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の応答性または感受性を表す。
【００５７】
対象から単離した生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルが、ｉ）セリンを実質的に欠く食餌および／またはｉｉ）システインが制限された食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップは：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み得、
対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する前記対象の高い応答性または感受性を表す。
【００５８】
別の態様では、本発明は、セリンおよび／またはグリシンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定する際に使用するキットであって：
ａ．Ｋｒａｓの発現または活性を求める薬剤と；
ｂ．アッセイ用の試薬とを含むキットを提供する。
【００５９】
適切には、キットは、さらに、ＭＴＡＰの発現または活性を求める薬剤を含み得る。
【００６０】
キットは、さらに、対照サンプルと比較してまたは所定の参照レベルと比較して高い、生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、対象ががん処置に対する非応答性または非感受性を表し、対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する対象の応答性または感受性を表すという指示書を含み得る。
【００６１】
別の態様では、本発明は、ｉ）セリンおよび／もしくはグリシンを実質的に欠く；ならびに／またはｉｉ）システインが制限された食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定する際に使用するキットであって：
ａ．ＭＴＡＰの発現または活性を求める薬剤と；
ｂ．アッセイ用試薬とを含む、キットを提供する。
【００６２】
キットは、さらに、対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する対象の応答性または感受性を表すという指示書を含み得る。
【００６３】
本発明の実施形態について、添付の図面を参照して、以下にさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１ａ。ＰＤＡＣ  Ｋｒａｓ  Ｇ１２Ｄ／＋  ｐ５３＋／−：〜６０日齢のマウスに食餌をとらせ、臨床エンドポイントまで（ＰＤＡＣ関連生存期間）利用した。生存期間は、食餌の変更（誕生ではなく）より計算。Ｐ値は、ｍａｎｔｅｌ−ｃｏｘテストを使用して計算。図１ｂ。ＰＤＡＣ  Ｋｒａｓ  Ｇ１２Ｄ／＋  ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋：〜６０日齢のマウスに食餌をとらせ、臨床エンドポイントまで（ＰＤＡＣ関連生存期間）利用した。生存期間は、食餌の変更（誕生ではなく）より計算。Ｐ値は、ｍａｎｔｅｌ−ｃｏｘテストを使用して計算。図１ｃ。マウスの尾静脈に、１００μＬの１００μＭ  １３Ｃ３ １５Ｎ１セリンを注射し、２時間放置した。殺処分組織を凍結させた後、代謝物抽出緩衝液で均質化し、ＬＣＭＳにより定量化した。Ｐ値は、対応のあるＴ検定を使用して計算。図１ｄ。Ｋｒａｓ誘導性細胞株（ｉＫＲＡＳ１、ｉＫＲＡＳ３、およびＡＫ１９６）を、ドキシサイクリンあり（ＫＲＡＳ−オン）で、またはドキシサイクリンなし（ＫＲＡＳ−オフ）で、完全培地において増殖させた。セリン合成経路酵素のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより解析した。エラーバー＝ＳＥＭ。図１ｅ。３つのＫｒａｓ誘導性細胞株（ｉＫＲＡＳ１、ｉＫＲＡＳ３、およびＡＫ１９６）を３日間増殖させ、タンパク質発現をウェスタンブロットにより解析した。ｉＫＲＡＳ１、ｉＫＲＡＳ３、およびＡＫ１９６細胞で平均した、ＳＳＰおよびＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１タンパク質の発現におけるＫｒａｓ−オン／Ｋｒａｓ−オフの相対的変動（ＬｉＣｏｒ赤外線定量化により測定）を示す図であり；定量化バンドはウェスタンブロットで示されたものである。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。図１ｆ。Ｋｒａｓ誘導性細胞株をセリンおよびグリシンを含有するまたは欠く（＋ＳＧ／−ＳＧ）培地において増殖させ、４８時間後および９６時間後にカウントした。エラーバー＝ＳＥＭ。
【図２】図２ａ。ＡＰＣｍｉｎ／ＡＰＣｍｉｎ  ＫＲＡＳオルガノイドを、セリンおよびグリシンありまたはなしで、２４−４８時間増殖させた。図２ｂ。ＡＰＣｍｉｎ／ＡＰＣｍｉｎ  ＫＲＡＳオルガノイドをセリンおよびグリシンなしで５日間増殖させ、次に、セリンおよびグリシンを含有する培地に播種し、さらに２４−７２時間増殖させた。図２ｃ。セリンおよびグリシンありまたはなしで増殖させたＡＰＣｍｉｎ／ＡＰＣｍｉｎ  ＫＲＡＳオルガノイドから抽出したｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲを示す図である。図２ｄ。１３Ｃ６−グルコースの存在下でＡＰＣｍｉｎ／ＡＰＣｍｉｎ  ＫＲＡＳオルガノイドを５時間成長させ、代謝物を抽出し、ＬＣＭＳにより解析した図である。Ｐ値は、独立Ｔ検定を使用して計算。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。
【図３ａ】血清サンプルの質量分析により測定した、２匹の膵臓がんマウスモデルにおける、血清アミノ酸レベルに対するセリン／グリシンフリー食の影響を示す図である。統計的比較は図で詳述する。Ｐｄｘ１ｃｒｅ；ＫＲａｓＧ１２Ｄ／＋；ｐ５３＋／−マウスに６０日齢まで通常の固形飼料を与え、次に、臨床エンドポイントまでセリンおよびグリシンを含有する対照食（Ｃｔｒ）か、またはセリンおよびグリシンを欠くマッチング食（−ＳＧ）に移行させた。末端出血から単離した血清を、ＬＣＭＳにより解析した。代謝物の相対量を示す（ｘ軸＝ピーク面積）。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。Ｐ値は、各アミノ酸についてＴ検定（独立、両側）により計算した。０．０５未満のＰ値を示す。
【図３ｂ】血清サンプルの質量分析により測定した、２匹の膵臓がんマウスモデルにおける、血清アミノ酸レベルに対するセリン／グリシンを有さない食餌の影響を示す図である。統計的比較は図で詳述する。６０日齢のＰｄｘ１ｃｒｅ；ＫＲａｓＧ１２Ｄ／＋；ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋マウスに、臨床エンドポイントまで対照食またはＳＧフリー食（−ＳＧ）を与えた。末端出血から単離した血清を、ＬＣＭＳにより解析した。代謝物の相対量を示す（ｘ軸＝ピーク面積）。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。Ｐ値は、各アミノ酸についてＴ検定（独立、両側）により計算した。０．０５未満のＰ値を示す。
【図４】図４ａ。ＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸がん、ｐ５３ｗｔまたはヌル）から形成された腫瘍の増殖率を示す図である。対照食を与えたマウスでは腫瘍は急速に増殖したが、セリンおよびグリシンフリー食（−ＳＧ）では腫瘍増殖は著しく減弱した。図４ｂ。図４ａで示す実験のマウスの生存率を示す図である。セリンフリー食は、マウスの生存期間を著しく改善した。
【図５】ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１およびＳＷ４８０細胞株を用いた、抗がん剤の増殖阻害効果に対するセリン欠乏の効果を示す図である。かなりの割合の化学療法が、セリンおよびグリシン欠乏と同時に与えた場合に、抗増殖効果の増大を示す。
【図６】マウスの血清サンプル中のアミノ酸レベルに対する、セリンおよびグリシン制限食の効果を示す図である。Ｃ５７Ｂｌ６マウスには、２０個のアミノ酸を全て含有する対照食か、または、セリンとグリシンは欠くが、他の１８個のアミノ酸は全て含有する食餌を与えた。血清サンプルをＬＣＭＳにより解析し、全非必須アミノ酸の相対量を示す。食餌ありで、セリン、グリシン、およびシステインのレベルの低下が見られる。
【図７】多数の細胞株（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＲＫＯ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、およびＭＤＡ  ＭＢ４６８）における、細胞培地からのシステイン取り込みを示す図である。がん細胞株は、外来性システインを貪欲に消費することが示される。
【図８】多数の細胞株（ＨＣＴ１１６、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、ＲＫＯ、およびＵ２ＯＳ）におけるシステイン欠乏の効果を示す図である。基本培地＝セリン、グリシン、システインを除く全アミノ酸を添加。Ｓ＝セリン０．８ｍＭ、Ｇ＝グリシン０．４ｍＭ、Ｃ＝システイン０．４ｍＭ。培地は２４時間ごとに交換する。
【図９】３つの細胞株（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、およびＤＬＤ１）の細胞数に対する、システインと、セリンおよびグリシンとを組み合わせて欠乏させたおよび別々に欠乏させた効果を示す図である。細胞を、異なる濃度のセリン、グリシン、およびシステインを有する（ただし、他のアミノ酸は全て豊富な）培地に播種し、４８時間後にカウントした。
【図１０】セリンおよびシステインの相互依存機序を示す図である。ホモシステインの排出は、２つの方法；１．セリン由来の一炭素が再メチル化に使用されず、セリン由来の一炭素プールが、代わりに、ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）合成に使用されるようにする、２．セリンがシステインを作る必要をなくすことで、セリンプールの枯渇を防ぐ。しかしながら、ホモシステイン排出は、システインがｄｅ  ｎｏｖｏではもはや合成されず、そのため、システインはがん細胞の外側から来なければならないことを意味する。ヌクレオチドおよびグルタチオン（ＧＳＨ）合成のためのタンパク同化の高い需要を満たすため、がん細胞は、外来性のセリンおよびシステインを取り込む必要がある。
【図１１】全身代謝および腫瘍代謝の概要を示す図である。
【図１２】ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞の増殖に対し、セリンおよびグリシンの他に非必須アミノ酸を取り除くことの効果を示す図である。他のアミノ酸を調節することによる、セリンおよびグリシンフリー食の抗がん作用の改善を示す。ａ．セリンおよびグリシン欠乏のみが、増殖率を低減させる。セリンおよびグリシンの除去に加え、ある他の非必須アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン酸、およびアスパラギン）を取り除くことは、２日目で、細胞増殖に対し軽微だがさらなる追加効果を有する。ｂ．セリンおよびグリシンの欠乏のみが、増殖率を低減させる。さらに、チロシン、アルギニン、またはシステインを個別に除去することは、より大きな抗増殖効果を有する。
【図１３】４日間での、ＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖および細胞死（細胞数の％変化により示す）に対する、セリン、グリシン、システイン、アルギニン、およびチロシン欠乏の異なる組み合わせの効果を示す図である。完全培地（対照）における細胞増殖は＋１４００％だった。チロシンのみの欠乏；チロシン、セリン、およびグリシンの欠乏；アルギニンのみの欠乏；ならびにアルギニン、セリン、およびグリシンの欠乏は、全て、増殖阻害をもたらした。システインのみの欠乏；システイン、セリン、およびグリシンの欠乏；セリン、グリシン、システイン、およびアルギンの欠乏は、増殖阻害と細胞死をもたらした。
【図１４】セリン合成経路酵素の発現が、セリン欠乏に対する感受性の決定要因であることを示す図である。セリン合成経路酵素（ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、ＰＳＰＨ）の発現が増加したまたは活性が高まった腫瘍は、セリン欠乏に対する感受性がより低い。セリン合成経路の活性は、遺伝子コピー数の増幅、転写活性化（例えば、発がん性Ｋｒａｓによる）を含むがんにおける多数の機序により、もしくは後成的手段により高められ得、または、他の機序、例えばアロステリック活性化により、高められる可能性もある。
【図１５】完全培地において４８時間培養した４つの細胞株（ＳＷ４８０、ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６、およびＲＫＯ）における、システイン前駆体／ホモシステイン二量体流出の測定値を示す図である。ホモシステインは、システインのｄｅ  ｎｏｖｏ合成の前駆体であるが、ホモシステインはがん細胞から流出し、ホモ二量体、つまりホモシスチンを検出した。
【図１６】セリン欠乏ならびにセリンおよびグリシン欠乏の条件下での、２つの細胞株（ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ）における、システイン前駆体／ホモシステイン二量体流出の測定値を示す図である。ｈｏｍｏＣ−ｃｙｓ＝ホモシステイン＋システイン二量体。ホモシスチン＝ホモシステイン＋ホモシステイン二量体。
【図１７】セリン欠乏ならびにセリンおよびグリシン欠乏の条件下での、２つの細胞株（Ａ５４９およびＭＤＡ  ＭＢ２３１）におけるシステイン前駆体／ホモシステイン二量体流出の測定値を示す図である。ｈｏｍｏＣ−ｃｙｓ＝ホモシステイン＋システイン二量体。ホモシスチン＝ホモシステイン＋ホモシステイン二量体。
【図１８】セリンおよびグリシンフリー食が、ＧＥＭＭのリンパ腫および腸がんに対し、有効な治療介入であることを示す図である。ａ．Ｅμ−Ｍｙｃマウスに〜６０日齢まで通常の固形飼料を与え、次に、臨床エンドポイントまで（リンパ腫関連生存期間）、対照食（セリンおよびグリシン含有）またはセリンおよびグリシンを欠くマッチング食（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし）に移行させた。生存期間は、食餌の変更（誕生ではなく）より計算した。Ｐ値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘテストを使用して計算。ｂ．ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスに、〜８０日齢まで通常の固形飼料を与え、次に、臨床エンドポイントまで（腸腫瘍関連生存期間）、対照食（セリンおよびグリシン含有）またはセリンおよびグリシンを欠くマッチング食（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし）に移行させた。生存期間は、食餌の変更（誕生ではなく）より計算した。Ｐ値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘテストにより計算。ｃ．Ｅμ−Ｍｙｃからの血清およびｄ．ＡＰＣＭｉｎ／＋コホートからの血清をＬＣＭＳにより解析し、（代謝物ピーク面積による）相対的存在量を示す。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ、Ｐ値はＴ検定により計算した（独立、両側、＊＝Ｐ＜０．０００５）。全アミノ酸の相対定量化については図２１を参照されたい。ｅ．ＡＰＣＭｉｎ／＋コホートにおけるセリンおよびグリシンの血清濃度を、血清において希釈された１３Ｃ１５Ｎ−セリンおよびグリシンを用いて、６点検量線を使用して求めた。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。ｆ．７−１０週齢のＬｇｒ５−ｃｒｅＥＲ  ＡＰＣｆｌ／ｆｌマウスを導入し、第１タモキシフェン処置の７週間後に食餌を変更し、臨床エンドポイントまで（腸腫瘍関連生存期間）継続した。生存期間は、第１タモキシフェン処置より計算する。Ｐ値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘテストを使用して計算。
【図１９】抗酸化応答の操作が、食餌誘発性抗がん作用を高めることを示す図である。ａ．〜６０日齢のＥμ−Ｍｙｃマウスに、１００ｍｇ／ｋｇ／日のフェンホルミン（Ｐｈｅｎ．）と共に、対照食かまたはセリンおよびグリシンフリー食（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし）を強制経口投与により与え、臨床エンドポイントまで世話をした。リンパ腫関連生存期間を誕生ではなく食餌の変更より計算した。ｂ．〜８０日齢のＡＰＣＭｉｎ／＋マウスを、対照食またはセリンおよびグリシンフリー食（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし）に移行させ、その４日後に水を飲む際に２００ｍｇ／ｋｇ／日のメトホルミン（Ｍｅｔｆ．）を与えた。腸腫瘍関連生存期間は、誕生ではなく食餌の変更より計算。Ｐ値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘテストを使用して計算。生存曲線の完全比較については図２２ａを参照されたい。ｃ．食餌のみでの腫瘍量データとメトホルミン＋食餌での腫瘍量の比較。死後の腫瘍数カウントを、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの小腸（ＳＩ）において行った。Ｐ値は、Ｔ検定（独立、両側）により計算。腫瘍面積データについては図２２ｃを参照されたい。食餌のみのデータを上記の（ａ）および（ｂ）において複製した。ｄ．ＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰｆｌ／ｆｌマウス由来の腸腫瘍オルガノイドは、２日間で、＋／−ＳＧ、既定濃度の＋／−メトホルミンで増殖させた。オルガノイド直径の相対変化を（’−薬物’に対し）プロットする。データは、４つの独立した実験の平均であり、エラーバー＝ＳＥＭである。Ｐ値はＴ検定（独立、両側、多重比較の補正あり）により計算。ｅ．ＡＰｆｌ／ｆｌオルガノイドを、２日間で＋／−ＳＧ＋／−メトホルミンで増殖させ、次に固定し、脂質過酸化反応生成物マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を免疫染色した。データは、３つの独立した実験の平均であり、エラーバー＝ＳＥＭである。Ｐ値はＴ検定（独立、両側、多重比較の補正あり）により計算。ｆ．Ｅμ−Ｍｙｃマウスを、Ｔｉｇａｒ−／−マウスと交配させ、〜６０日齢のコホートに食餌をとらせ、臨床エンドポイントまで（リンパ腫関連生存期間）利用した。生存期間は、食餌の変更（誕生ではなく）より計算した。Ｐ値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘテストを使用して計算。
【図２０】ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスの腫瘍量に対するセリンおよびグリシンフリー食の効果を示す図である。ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスに、８０日齢までは通常の固形飼料を与え、次に、臨床エンドポイントまで（腸腫瘍関連生存期間）、対照食（セリンおよびグリシン含有）またはセリンおよびグリシンを欠くマッチング食（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし；−ＳＧ）に移行させた。死後腫瘍測定を、食餌変更時（８０日目）または臨床エンドポイントで腸腫瘍において行った。Ｐ値はＴ検定（独立、両側、多重比較の補正あり）により計算。
【図２１】血清アミノ酸に対するセリンおよびグリシンフリー食の効果を示す図である。ａ．Ｅμ−ｍｙｃおよびｂ．ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスに、それぞれ〜６０日齢および〜８０日齢まで通常の固形飼料を与え、次に、臨床エンドポイントまで、セリンおよびグリシンを含有する対照食（Ｃｔｒ）か、または、セリンおよびグリシンを欠くマッチング食（−ＳＧ）に移行させた。末端出血から単離した血清を、ＬＣＭＳにより解析した。代謝物の相対量を示す（ｘ軸＝ピーク面積）。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。Ｐ値はＴ検定（独立）により計算した。
【図２２】メトホルミン処置が、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスにおいて、セリンおよびグリシンフリー食の抗がん作用を高めなかったことを示す図である。〜８０日齢のマウスを、セリンおよびグリシンフリー食（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし）（ａ）または対照食（ｂ）に移行させ、その４日後に水を飲む際に２００ｍｇ／ｋｇ／日のメトホルミン（Ｍｅｔｆ．）を与えた。腸腫瘍関連生存期間は、誕生ではなく食餌の変更より計算。Ｐ値は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘにより計算。ｃ．食餌のみでの腫瘍量データとメトホルミン＋食餌での腫瘍量の比較。死後の腫瘍面積測定を、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスの小腸（ＳＩ）において行った。Ｐ値はＴ検定（独立、両側）により計算した。「食餌のみ」のデータは、図２０より複製している。
【図２３】ｉｎ  ｖｉｖｏでのメトホルミンレベルが全身代謝にほとんど影響せず、該メトホルミンレベルが低すぎてセリンおよびグリシンフリー食の抗がん作用を増強することができなかったことを示す図である。ａ．ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスを、対照食またはセリンおよびグリシンフリー食（−ＳＧ）に移行させ、次に、水を飲む際にメトホルミン２００ｍｇ／ｋｇ／日を与えた。末端出血から単離した血清を、ＬＣＭＳにより解析した。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。ｂ．メトホルミン処置マウスからの組織サンプルをＬＣＭＳにより解析した。ＮＣ＝正常大腸、ＮＳＩ＝正常小腸、ＴＣ＝腫瘍大腸、ＴＳＩ＝腫瘍小腸。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。ｃ．血清と腫瘍（ＳＩまたは大腸）組織サンプルのマッチングが利用可能なマウスについて（Ｃｔｒ食  ｎ＝７、−ＳＧ食  ｎ＝６）、血清対腫瘍でのメトホルミン濃度をプロットする。メトホルミン濃度は、６点検量線を使用し、適切な生物学的マトリックス（組織／血清）を使用して、全サンプルにおいて求めた。ｄ．メトホルミンで処置したＡＰＣｍｉｎ／＋マウスからの血清を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒを使用して、グルコースと乳酸のレベルについて解析した。ｅ．ヒト大腸がん細胞ＤＬＤ１およびＳＷ４８０は切断型ＡＰＣを発現しているが、該細胞を、セリンおよびグリシンなしで（Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし）または低セリンおよびグリシン（１０μＭ）で、メトホルミン濃度を変えながら３日間増殖させ、その後、細胞数をカウントした。データは３重ウェルの平均であり、エラーバー＝ＳＴＤＥＶである。
【図２４】Ｅμ−ｍｙｃ腫瘍組織（腫瘍担持脾臓）についての、不偏メタボローム解析（ＯＰＬＳ−ＤＡ；直交部分的最小二乗判別分析）のＳ−プロットを示す図である（Ｃｔｒ  ｎ＝２０、−ＳＧ  ｎ＝１３）。食餌を理由に最大の減少を示す検出代謝物は、セリンおよびグリシンである。カルニチン関連代謝物およびコリン関連代謝物のレベルの低下も観察された。ホスファチジルコリン（ＰＣ）代謝物およびアラニンおよびスレオニンのレベルの上昇も見られた。ＳＧ欠乏は、解糖系およびＯＸＰＨＯＳ（カルニチンおよびアラニンのレベル変化を説明する可能性がある）、ならびに一炭素代謝（コリン関連代謝物の変化を説明する可能性がある）に影響を与えることが知られている。
【図２５】Ｅｕ−ｍｙｃ腫瘍細胞に対する−ＳＧ食の効果を示す図である。ａ．リンパ腫細胞をＥμ−ｍｙｃマウスから単離し、培養液中で増殖させた。細胞をヌードマウスに皮下注射し（５ｘ１０＾５／側腹部）、腫瘍を形成させた。いったん腫瘍（Ｃｔｒ  ｎ＝４、−ＳＧ  ｎ＝４）が可視化し、測定可能になったら、マウスを対照（Ｃｔｒ）またはセリンおよびグリシンフリー食（−ＳＧ）に移行させた。マウスを殺処分し、腫瘍を単一経時的エンドポイント（食餌制限の６日目）で切除した。平均腫瘍体積（開始時の腫瘍体積のパーセンテージとして示す、エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。ｂ、皮下Ｅμ−ｍｙｃ腫瘍毎に細胞数を評価するため、腫瘍毎に２つの別の細胞カウント（Ｈ＆Ｅ染色横断面を使用）を実行し、平均化し、平均の平均を示す。エラーバー＝ＳＥＭ。Ｐ値はＴ検定（独立、片側）によって計算。ｃ、全皮下Ｅμ−ｍｙｃ腫瘍組織切片（Ｃｔｒ  ｎ＝３、−ＳＧ  ｎ＝４）を、切断カスパーゼ３（ＣＣ３）およびＢｒｄＵについて免疫染色した。全腫瘍の非壊死性領域の画像解析により、腫瘍毎の切断カスパーゼ３陽性細胞％と、腫瘍毎のＢｒｄＵ陽性細胞％の定量的評価が可能だった。データは平均であり、エラーバー＝ＳＴＤＥＶである。ｄ．Ｅμ−ｍｙｃ腫瘍（上記のａ−ｃで記載するような）の横断面をＨ＆Ｅ染色した。各画像のスケールバーは４ｍｍであり、例証的な壊死性領域は矢印でマークする。（＊でマークした）追加の腫瘍組織切片を、食餌変更後に発症した腫瘍との比較のために含める（これらの３つの腫瘍は、食餌変更２日後に測定可能であり、エンドポイント前の食餌を与えた４日間の間存在した）。ｅ．壊死を、（ｄ）に示す切片をＨ＆Ｅ染色した壊死性および非壊死性表面積の画像解析により定量化した。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ、Ｐ値はＴ検定（独立、片側、Ｃｔｒ，Ｎ＝５；−ＳＧ，ｎ＝６）により計算した。ｆ、８０日齢のＡＰＣｍｉｎ／＋マウスに対照食（Ｃｔｒ，ｎ＝３）またはセリンおよびグリシンフリー食（−ＳＧ，ｎ＝３）をとらせた。単一経時的エンドポイント（食餌の１４日目）にマウスを殺処分し、小腸を組織学的解析のために取り出した。組織切片を、切断カスパーゼ３およびＢｒｄＵについて免疫染色した。全小腸の画像解析により、腺腫毎の細胞数、腺腫毎のＣＣ３陽性細胞％、およびＢｒｄＵ陽性細胞％の定量的評価が可能だった。データは、各小腸切片で特定された全腺腫の平均であり、エラーバー＝ＳＥＭであり、Ｐ値はＴ検定（独立、片側）により計算した。全解析（ａ−ｆ）で、０．１未満のＰ値を示す。
【図２６】ＰＤＡＣおよびＥμ−ｍｙｃモデルからの腫瘍組織における、ＳＳＰ酵素の発現を示す図である。対照食またはＳＧフリー食を与えられたＥμーＭｙｃマウスからのＰＤＡＣ腫瘍および腫瘍担持脾臓のタンパク質溶解物を、ウェスタンブロットによりＳＳＰ酵素発現について解析し、Ｌｉ−Ｃｏｒスキャナを使用して定量化した。ＳＳＰ酵素の（対照食に対する）相対発現を示す。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。各組織サンプルは異なるマウスから取り、マウス／腫瘍の数をバーの上に示す。
【図２７】−ＳＧ食がセリンおよびグリシンレベルの低下を招き、Ｅｕ−ｍｙｃ腫瘍においてＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を低下させたが、ＰＤＡＣ腫瘍ではグリシンおよびＧＳＨ／ＧＳＳＧ比を低下させなかったことを示す図である。Ｐｄｘ１ｃｒｅ；ＫＲａｓＧ１２Ｄ／＋；ｐ５３＋／−マウスの膵臓腫瘍およびＥμ−ｍｙｃマウスの腫瘍担持脾臓を、ＬＣＭＳにより、セリン、グリシン、ＧＳＨ（還元型グルタチオン）およびＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）について解析した。Ｐ値は、Ｔ検定、独立、両側により計算。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。
【図２８】Ｋｒａｓを発現している腫瘍オルガノイドは、セリンおよびグリシンの欠乏に対しより抵抗性があったことを示す図である。ＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰｆｌ／ｆｌ、およびＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰｆｌ／ｆｌ；ＫＲａｓＧ１２Ｄ／＋腸腫瘍オルガノイド（遺伝子型毎にｎ＝３マウスに由来する）を、セリンおよびグリシンなしで５日間増殖させ、次に溶解し、完全増殖培地に播種した。オルガノイドの直径を毎日完全（回復）培地において測定した。データは、単一実験で得た、３匹のマウスからのオルガノイドの平均である。エラーバー＝ＳＥＭ。
【図２９】グリシンおよびセリンを欠く食餌が、ｉｎ  ｖｉｖｏですでに形成されていた異種移植腫瘍の増殖を減少させ、腫瘍内のセリンおよびグリシンレベルを低下させることと、そのようなレベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞増殖を遅くすることにつながることを示す図である。ａ．ＨＣＴ１１６細胞を、左右対称に注射し（各側腹部に３ｘ１０＾６）、腫瘍を形成させた。いったん腫瘍が可視化し、カリパスにより測定可能になったら、マウスを対照食（Ｃｔｒ）またはセリンおよびグリシンフリー食（−ＳＧ）に移行させた。腫瘍を週に３回測定し、週平均腫瘍体積をプロットする。エラーバー＝ＳＥＭ。Ｐ値はＴ検定（独立、片側）により計算した、ｂ．ＨＣＴ１１６腫瘍（臨床エンドポイントで採取）を、ＬＣＭＳにより、セリンおよびグリシンの絶対濃度について解析した（各腫瘍の１〜３小片を解析した）。データは平均であり、バーはＳＴＤＥＶである。Ｐ値はＴ検定（独立、片側）により計算した。ｃ．ＨＣＴ１１６細胞を、「ｂ」で表示するセリンおよびグリシン腫瘍内濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた（２４ウェルプレート）。培地は２４時間ごとに取り換え、細胞カウントを規定の日に実行した。データは、独立した実験からの、各条件につき１２複製ウェルの平均であり、エラーバー＝ＳＴＤＥＶである。ｄ．ＨＣＴ１１６細胞を、「ｂ」で表示するセリンおよびグリシン腫瘍内濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた（２４ウェルプレート、各条件につき１２複製ウェル）。培地は２４時間ごとに取り換え、細胞カウントを４日後に実行した。データは、３つの独立した実験の平均であり、エラーバー＝ＳＥＭである。Ｐ値は、Ｔ検定（独立、片側）により計算した。
【図３０】Ｋｒａｓ発現細胞は、微飲作用の増大ではなく、ｄｅ  ｎｏｖｏでのセリンおよびグリシンの合成により、セリンおよびグリシンを得ることを示す図である。ｉＫＲａｓ細胞におけるマクロピノサイトーシスを、ＴＭＲ標識デキストラン取り込みアッセイを使用して評価した。細胞をはじめに＋／−ドキシサイクリンで４８時間増殖させ、次に＋／−ドキシサイクリン、＋／−ＳＧで４０時間播種し（最後の１６時間はＦＢＳなし）、次に、マッチング培地において３０分間ＴＭＲデキストラン／ＦＢＳを与えた。エラーバーおよびラインは、平均およびＳＴＤＥＶを示す。
【図３１】図３１ａ。ダウノルビシンが、セリンおよびグリシンの欠乏を補完することを示す図である。ＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰｆｌ／ｆｌマウスを、２日間、既定濃度の＋／−セリンおよびグリシン、＋／−ダウノルビシンで成長させた。オルガノイド直径の相対変化（’−薬物’に対する）をプロットする。データは３つの独立した実験の平均であり、エラーバー＝ＳＥＭである。ｂ．ＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰＣｆｌ／ｆｌオルガノイドを２日間、＋／−セリンおよびグリシン、＋／−ダウノルビシンで増殖させ、次に固定し、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を染色した。データは３つの独立した実験の平均であり、エラーバー＝ＳＥＭである。Ｐ値はＴ検定（独立、両側、多重比較の補正あり）により計算。
【図３２】ヒトにおけるｄｅ  ｎｏｖｏでのシステイン合成およびポリアミン合成を示す、簡略化した概略図である。代謝物は通常のテキストで示し、酵素は枠内に示す。
【図３３】（ＭＴＡＰ欠損／不活性化の指標である）ＭＴＡ排出が、システイン欠乏に対する感受性の増大と相関することを示す図である。ａ．膵臓がん細胞株を、２４ウェルプレートにおいて、システインを欠くが他の１９個の必須アミノ酸の全ておよび非必須アミノ酸を含有する配合培地（ＲＰＭＩ培地を基とする）において増殖させた。細胞数を、ＣＡＳＹ  ＴＴ細胞カウンターを使用してカウントした。３日後に、細胞培養培地中のメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）レベルを、培地のサンプルを液体クロマトグラフィー−質量分析により解析することにより測定した。ｂ．大腸がんおよび乳がんの細胞株を、２４ウェルプレートにおいて、システインを欠くが他の１９個の必須アミノ酸の全ておよび非必須アミノ酸を含有する配合培地（ＲＰＭＩを基とする）において３日間増殖させた。細胞数を、ＣＡＳＹ  ＴＴ細胞カウンターを使用してカウントした。２４時間後に、細胞培養培地中のメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）レベルを、培地のサンプルを液体クロマトグラフィー−質量分析により解析することにより測定した。Ｒ２＝ＭＳエクセルによりコンピュータ処理した相関係数（Ｌｏｇ傾向線を使用）。
【図３４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＡおよびスペルミジンの合成率はより高く、多量のメチオニンが、これらの細胞においてポリアミン経路に転用されることを示す図である。対照的に、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞では、ポリアミン経路に転用されるメチオニンは少なく、より多くのメチオニンが、システインに変換され得るホモシステイン／シスタチオニンに達する。これは、システイン欠乏時に、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞の生存率がより良好であることを説明するのに役立つ。ＳＷ４８０およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｍ２３１）細胞を、配合培地（炭素１２−メチオニンを欠き、炭素１３で標識したメチオニンを補充し、他の１９個の必須アミノ酸および非必須アミノ酸は全て含有し、ＲＰＭＩを基にする）において２日間増殖させた。細胞溶解物を、液体クロマトグラフィー−質量分析により解析した。最も豊富な同位体異性体を示す。ＭＴＡ＝メチルチオアデノシン、Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｈｃ＝ホモシステイン、ＳＡＭ＝Ｓ−アデノシルメチオニン。Ｍ＋ｘ＝質量プラスｘユニット
【図３５】ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞は、ＭＴＡをメチオニンに再生することが可能であるが、（ＭＴＡを排出する）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＭＴＡをメチオニンに再生することはできないことを示す図である。炭素１３で標識したメチオニンを用いた代謝物追跡は、ＳＷ４８０およびＨＣＴ１１６細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とは異なり、ポリアミン経路で使用されたメチオニンを（ＭＴＡを介して）再生することが可能であることを示し、これは、「ｍ＋１」メチオニンと表示する。ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｍ２３１）細胞を、配合培地（炭素１２メチオニンを欠き、炭素１３で標識したメチオニンを補充し、他の１９個の必須アミノ酸の全ておよび非必須アミノ酸を含有し、ＲＰＭＩ培地を基にする）において２日間増殖させた。細胞溶解物を、液体クロマトグラフィー−質量分析により解析した。主要なメチオニン同位体異性体を示す。
【図３６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｍ２３１）細胞が、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞と比較し、ＭＴＡの排出が著しく、システイン欠乏時でもＭＴＡを排出し続けることを示す図である。ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｍ２３１）細胞を、システインありまたはなしで、炭素１２メチオニンを欠き、炭素１３で標識したメチオニンを補充し、他の１９個の必須アミノ酸の全ておよび非必須アミノ酸を含有する配合培地（ＲＰＭＩ培地を基にする）において、２日間増殖させた。代謝物抽出物を、培地サンプルから調製し（特定の時点で採取）、液体クロマトグラフィー−質量分析により解析した。ＭＴＡ＝メチルチオアデノシン。Ｍ＋ｘ＝質量プラスｘユニットシステイン。システイン欠乏での４８時間目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についてのデータは、その時点まで生細胞が残っていなかったことから、ない。
【図３７】ＭＴＡＰ遺伝子発現をノックアウトすることがＭＴＡ排出の誘発を招くことを示す図である。ＨＣＴ１１６細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とＭＴＡＰ用のターゲティング配列（Ｓｅｑ１および２）で、または、非ターゲティング対照配列（ＮＴＣ）でトランスフェクトした。いくつかのクローンを各配列より単離し、完全培地において４日間増殖させた。タンパク質溶解物をウェスタンブロットによりＭＴＡＰ発現について解析した。培地のサンプルを、液体−クロマトグラフィー質量分析によりＭＴＡ含有量について解析した。
【図３８】ＨＣＴ１１６はホモシステイン（システインの上流前駆体）を排出するが、システイン欠乏時には、ホモシステインを再取込可能であることを示す図である。ＨＣＴ１１６細胞は、システイン欠乏に対しなお感受性であるが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｍ２３１）細胞ほどではない。ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｍ２３１）細胞を、システインありまたはなしで、炭素１２メチオニンを欠き、炭素１３で標識したメチオニンを補充し、他の１９個の必須アミノ酸の全ておよび非必須アミノ酸を含有する配合培地（ＲＰＭＩ培地を基にする）において、２日間増殖させた。代謝物抽出物を培地サンプルから調製し（特定の時点で採取）、液体クロマトグラフィー−質量分析により解析した。ＨＣ＝ホモシステイン。Ｍ＋ｘ＝質量プラスｘユニットシステイン。システイン欠乏での４８時間目のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞についてのデータは、その時点まで生細胞が残っていなかったことから、ない。
【図３９】細胞は、ホモシステインの補充によりシステイン欠乏から救済され得ることを示す図である。これは、酵素ＣＴＨおよびＣＢＳが発現し、活性であり、前駆体の供給が十分である場合に、ｄｅ  ｎｏｖｏでのシステイン合成を実行可能であることを実証する。このデータは、（不完全な／不十分なＣＴＨおよびＣＢＳ酵素発現よりも、またはそれに加えて、）前駆体の不足がシステイン欠乏に対する感受性の一因となるという考えを支持する。大腸がんおよび乳がんの細胞株を、２４ウェルプレートにおいて増殖させた。システインを欠くが、他の１９個の必須アミノ酸の全ておよび非必須アミノ酸を含有する基本培地を（ＲＰＭＩ培地を基に）配合した。この基本培地に、既定の成分：システイン０．４ｍＭ（＋Ｃｙｓ）、ホモシステイン０．２ｍＭおよび０．８ｍＭ（ＨＣ）を補充し、３日間増殖させた。データは３つのセルの平均である。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。
【図４０】ＡＭＤ１（メチオニン由来ＳＡＭをポリアミン合成経路に転用させる酵素）の阻害が、細胞を、システイン欠乏に対する鋭い感受性（つまり、細胞死）から守ることを示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、最初に、２４ウェルプレート中の完全（ＤＭＥＭ）培地に播種した。２４時間後、細胞をＡＭＤ１阻害剤サルドモジド（２０μＭ）で１６時間処理するか、または未処理のままにした（Ｃｔｒ）。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、システインは欠くが、他の１９個のアミノ酸は全て含有する培地を与えた。画像（ａ）は、光学顕微鏡を使用して取り込み、細胞カウント（ｂ）は、ＣＡＳＹ  ＴＴ細胞カウンターを使用して実行した。データは３つのウェルの平均である。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
発明者らは、驚くべきことに、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く食餌は、がんまたは増殖性障害の処置に有用であり得ることを発見した。理論に縛られることは望まないが、腫瘍細胞の増殖および成長に必要なアミノ酸を実質的に除去することにより、アミノ酸を実質的に欠く供給源を提供するという代謝のリモデリングは、資源を転用し、急速な増殖に利用可能なアミノ酸量を減少させることが可能であり、それにより、がん細胞の増殖を遅くさせるか、抑制すらするか、またはがん細胞死を引き起こす。
【００６６】
適切には、本発明は、がんに罹患した対象の通常の食餌を、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く処方食に部分的にまたは完全に置き換えることを伴い得る。このような食餌は、本明細書に記載のダイエタリー製品の供給か、または、同時にもしくは連続的に投与可能な２つ以上の栄養補助食品により、達成される可能性がある。潜在的に、このような食餌は、２つ以上の非必須アミノ酸を実質的に欠いたままであるように、現在利用可能な成分を使用して、適切な食物を選択することにより、さらに補充することができる。
【００６７】
ダイエタリー製品
本発明の第１態様では、全必須アミノ酸を含み、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く、複数のアミノ酸を含むダイエタリー製品を提供する。
【００６８】
「必須アミノ酸」により、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、リシン、スレオニン、ヒスチジン、およびトリプトファンが意味される。
【００６９】
「ダイエタリー製品」は、１つまたは複数の必須アミノ酸またはその塩もしくはエステルを含む組成物であって、食品中で使用され、または食品と組み合わせて使用もしくは消費されて、サプリメントを消費する対象に、所望のレベルのアミノ酸またはその塩もしくはエステルを提供する、組成物を指す。これらの製品中の栄養成分としては：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物性薬品、アミノ酸、ならびに、酵素、臓器組織、腺、および代謝物などの物質が挙げられ得る。一部の実施形態では、本ダイエタリー製品は、食餌の一部として対象が消費する、外来性アミノ酸の唯一の供給源である。適切には、一部の態様において、本ダイエタリー製品は、対象の食餌を実質的にまたは単に置き換えることを目的とし得る。つまり、一部の態様では、本ダイエタリー製品は、対象にとって完全な置き換え食とすることができる。
【００７０】
有利なことに、タンパク質などの通常のアミノ酸供給源の消費を本発明のダイエタリー製品に置き換えると、少なくとも２つの非必須アミノ酸を実質的に欠く食餌が得られるだろう。これは、がん対象にとって治療的に利益を提供し得る。
【００７１】
本明細書で使用する場合、本発明の全態様に従い、用語「対象」は、好適には、ヒト、家畜または畜類、飼育動物またはペット、ならびに、非ヒト霊長類、イヌ、およびマウスを含む、臨床研究のために通常使用される動物を含む哺乳動物を指す。具体的には、本発明の対象はヒトとすることができる。
【００７２】
適切には、本ダイエタリー製品は、少なくとも９個のアミノ酸を含み得る。適切には、本ダイエタリー製品は、少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも１５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個のアミノ酸を含み得る。適切には、本ダイエタリー製品は、例えば、９〜１８個のアミノ酸、または１２−１８個のアミノ酸、または１２−１７個のアミノ酸、または１３−１７個のアミノ酸、または１４−１７個のアミノ酸を含み得る。
【００７３】
適切には、少なくとも２つの実質的に欠如するアミノ酸には、以下のアミノ酸：グリシン、セリン、システイン、チロシン、プロリン、およびアルギニンのうち２つ以上が含まれる（または、本質的にそのアミノ酸からなる、またはそのアミノ酸からなる）。あるいは、本ダイエタリー製品は、以下のアミノ酸：グリシン、セリン、システイン、チロシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、およびアスパラギンの、少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個を欠き得る。適切には、本ダイエタリー製品は、７個のアミノ酸を欠き得、この場合、該第ダイエタリー製品は、セリンと、グリシンと、以下のアミノ酸：システイン、チロシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、およびアスパラギンのうち５個を欠く。適切には、本ダイエタリー製品は、システインを実質的に欠くか、または制限レベルのシステインを含み得る。
【００７４】
本文脈では、「本質的にそれから成る」により、本ダイエタリー製品が、本発明のダイエタリー製品に重大な影響を与えるアミノ酸をさらに欠くことはできないことを意味する。「重大な影響」は、以下の：ａ）健常な細胞とは対照的な、がん特異性への有意な影響；ｂ）細胞増殖の抑制に対する有意な影響；ｃ）がん細胞の毒性に対する有意な影響；またはｄ）ａ）−ｃ）の任意の組み合わせの１つとして測定することが可能な、有意な治療効果が意味される。一部の態様では、これは、特定のアミノ酸を有するダイエタリー製品と、特定のアミノ酸を有さないダイエタリー製品を比べ、アミノ酸の欠如が重大な影響を有するか否かを判断することにより測定することができる。
【００７５】
１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖に対するアミノ酸欠乏の影響を測定する方法：
細胞を、多数複製２４ウェル細胞培養プレートの完全培地に、１ウェルにつき１ｘ１０＾４〜１ｘ１０＾５の密度で播種し、一晩付着させた。一晩後、付着細胞は５−２０％コンフルエントであるはずである。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、全アミノ酸を含有する対照培地を含む、特定のアミノ酸／アミノ酸（複数）を含有するまたは欠くように特異的に配合した種々の細胞培養培地を与える。培地は、２４時間ごとに新鮮なマッチング培地と交換する。最初の培地交換後、多数の時点で（例えば、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に）、プレートを細胞カウントのために使用する。各条件につき少なくとも３つのウェル（つまり、三重）を使用し、平均を計算すべきである。細胞は、Ｃａｓｙ  ＴＴ細胞カウンターを使用して、または、細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、Ｏｐｅｒｅｔｔａスキャナでカウントすることにより、カウントする。異なるアミノ酸条件下および異なる時点での細胞数を比較する。培地のアミノ酸組成物の変化を原因とする有意な影響とは、対照培地と比較して、細胞数が５％超変化することであると考える。これは、少なくとも３つの独立実験を適切なＴ検定により比較した場合に、統計的に優位である（Ｐ＜０．０５が有意な影響に該当する）。
【００７６】
２．マウスの異種移植／同種移植／同所性モデルを使用した、がん細胞の増殖／ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖および生存期間に対する、食餌のアミノ酸組成の影響を測定する方法
ヌードマウスの側腹部の皮下に移植した場合に腫瘍を形成する適切ながん細胞株を選択すべきである（例えば、ＨＣＴ１１６）、腫瘍を形成する適切な細胞数（例えば、３ｘ１０＾６）を、マウス側腹部に皮下注射する。両側腹部または単一側腹部に注射したマウスを、一群につき少なくとも１０匹使用すべきである。マウスに注射したのと同日に、マウスを、通常の固形飼料から、特定のアミノ酸／アミノ酸（複数）を欠くように特異的に配合された実験食に移行させるべきである。全アミノ酸を含有する食餌を与える対照群も含めるべきである。腫瘍の長さおよび幅を、死亡まで少なくとも１週間に２回測定し、これを使用して腫瘍体積を計算する。（現地倫理に許可された）所定の最大腫瘍体積に達する臨床エンドポイントまでマウスを生存させてから、間引くべきである。最初のマウスが死亡する前に／最初のマウスを間引く前に、各測定時点での平均腫瘍体積を比較すべきである。腫瘍体積に対する有意な影響を、適切なＴ検定により評価する。Ｐ＜０．０５が有意な影響に該当する。生存期間の有意な変化を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログランク）統計テストを使用して計算する。Ｐ＜０．０５が有意な影響に該当する。
【００７７】
あるいは、マウスに移植細胞を注入後、通常の固形飼料を続け、いったん測定可能な腫瘍が検出されたらはじめて実験食を割り当てる場合でも、上記アッセイを実行することが可能である。この場合、腫瘍体積は、絶対体積か、または、食餌変更時の開始腫瘍体積のパーセンテージとして比較することが可能である。
【００７８】
あるいは、同種移植片モデルまたは同所性モデルを、上記と同じように使用することが可能である。
【００７９】
３．遺伝子改変マウスモデル（ＧＥＭＭ）を使用して、がん細胞増殖／ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖および生存期間に対する食餌のアミノ酸組成の影響を測定する方法
適切なＧＥＭＭを選択すべきであり（例えば、ＡＰＣｍｉｎ／＋またはＥμ−ｍｙｃ）；マウスには食餌変更まで通常の固形飼料を与えるべきである。食餌変更時の年齢は高齢期（発がんイニシエーションが起きたら直ちに）、ただし、臨床エンドポイントを原因とする死（腫瘍関連生存期間）が起きる前とすべきである。例えば、ＡＰＣｍｉｎ／＋マウスでは８０日齢、Ｅμ−ｍｙｃマウスでは６０日齢である。特定の日齢のマウスを、通常の固形飼料から、特定のアミノ酸／アミノ酸（複数）を欠くように特異的に配合した実験食に移行させるべきである。全アミノ酸を含有する食餌を与える対照群も含めるべきである。可能であれば、腫瘍増殖を測定し（例えば、腫瘍測定により、または、例えば、腫瘍内の蛍光タンパク質マーカーからの蛍光シグナルなどのバイオマーカー解析により）、マウスを臨床エンドポイントに到達させるべきである（腫瘍関連生存期間）。この時点での腫瘍量も評価すべきである（例えば、カウント／秤量／腫瘍測定により）。最初のマウスが死亡する／間引く前の各測定時点での平均腫瘍体積を比較すべきである。腫瘍体積に対する有意な影響を適切なＴ検定により評価する。Ｐ＜０．０５が有意な影響に該当する。生存期間の有意な変化を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログ・ランク）統計テストを使用して計算する。Ｐ＜０．０５が有意な影響に該当する。エンドポイント腫瘍量について、腫瘍量に対する有意な影響を適切なＴ検定により評価する。Ｐ＜０．０５が有意な影響に該当する。
【００８０】
あるいは、食餌を若齢期、例えば、１０日齢／２０日齢／４０日齢に変更することも可能であり、上記（３）に記載したのと同じ結果を測定し、比較する。
【００８１】
適切には、本ダイエタリー製品は、実質的に、セリンを欠き得る。がん細胞は、多量の外来性セリンを即時に利用して、急速な増殖を支えることができる。セリンが枯渇した場合、がん細胞は、セリン合成経路を通じて解糖中間体を振り向けることを余儀なくされる。有利なことに、これは増殖の低減および／または細胞生存期間の減少をもたらし得る。
【００８２】
適切には、本ダイエタリー製品は、実質的に、グリシンを欠き得る。これは、セリンがグリシンの合成に利用されることから、グリシンとセリンの両方の血中レベルを低下させ得る。有利なことに、本発明は、セリンとグリシンの両方を実質的に欠く食餌が、特に有効であり得ることを示した。
【００８３】
適切には、本ダイエタリー製品は、実質的に、システインを欠き得る。本発明は、驚くべきことに、多数のがん細胞株（例えば、肺、大腸、および乳房）が外来性システインを貪欲に消費することを示した。驚くべきことに、システインを実質的に欠く食餌は、細胞増殖を抑制し、例えば大腸細胞株において示されるように、がん細胞死を引き起こし得る。適切には、システインを実質的に欠くか、または、システインレベルを制限したダイエタリー製品が、特に、ＭＴＡＰの発現が下方制御されている対象にとって有効であり得る。
【００８４】
適切には、本ダイエタリー製品は、実質的に、チロシンを欠き得る。本発明は、驚くべきことに、チロシンの制限は、単独で、または他の非必須アミノ酸と組み合わせて、がん細胞増殖を低下し得ることを発見した。
【００８５】
適切には、本ダイエタリー製品は、実質的に：
ａ．グリシン、セリン、およびシステイン；
ｂ．グリシン、セリン、およびアルギニン；
ｃ．グリシン、セリン、およびチロシン；
ｄ．グリシン、セリン、アルギニン、およびシステイン；
ｅ．グリシン、セリン、チロシン、およびシステイン；
ｆ．システインおよびアルギニン；
ｇ．システインおよびチロシン；
ｈ．システインおよびグリシン；
ｉ．システイン、チロシン、およびアルギニン；または
ｊ．グリシン、セリン、アルギニン、チロシン、およびシステインを欠く。
【００８６】
有利なことに、本発明は、驚くべきことに、このような組み合わせが、細胞増殖の抑制および／またはがん細胞死の誘発に特に有効であることを示した。
【００８７】
一態様では、本ダイエタリー製品は、実質的に、グリシン、セリン、およびシステインを欠く。本発明は、この組み合わせが、驚くべきことに、例えば、大腸がん（例えば、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯなどにおいて）、肝がん（ＨｅｐＧ２）、骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）、および乳がん（ＭＤＡ  ＭＢ２３１）を含む多数のがん細胞株において、がん細胞増殖の抑制およびがん細胞死の増加に有効であることが示した。
【００８８】
一態様では、本ダイエタリー製品は、実質的に、グリシン、セリン、およびアルギニンを欠く。本発明は、この組み合わせが、驚くべきことに、大腸細胞株（例えば、ＲＫＯおよびＨＣＴ１１６など）において、がん細胞増殖の抑制および／またはがん細胞死の増加に有効であることを示した。
【００８９】
一態様では、本ダイエタリー製品は、実質的に、グリシン、セリン、およびチロシンを欠く。本発明は、この組み合わせが、驚くべきことに、大腸細胞株（例えば、ＲＫＯおよびＨＣＴ１１６など）において、がん細胞増殖の抑制および／またはがん細胞死の増加に有効であることを示した。
【００９０】
一態様では、本ダイエタリー製品は、実質的に、グリシン、セリン、アルギニン、およびシステインを欠く。驚くべきことに、この組み合わせが、大腸細胞株において細胞死を誘発するのに特に有効であることが示された。
【００９１】
一態様では、本ダイエタリー組成物は、実質的に、グリシン、セリン、アルギニン、チロシン、およびシステインを欠き得る。
【００９２】
適切には、全態様において、本ダイエタリー製品は、メチオニン、グルタミン、およびロイシンの任意の１つまたは任意の組み合わせを含み得る。有利なことには、ロイシンとグルタミンである。
【００９３】
本ダイエタリー製品は、さらに、２５ｍｇ／対象の体重ｋｇ／日未満または２０ｍｇ／ｋｇ／日未満または１８ｍｇ／ｋｇ／日未満または１６ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルでのメチオニンを含み得る。
【００９４】
本発明のダイエタリー製品は、本明細書で特に明記しない限り、一日平均総タンパク質消費量に基づき、必須アミノ酸の一日推奨摂取量を少なくとも提供するように配合することができる。
【００９５】
医学研究所による必須アミノ酸の一日推奨摂取量は、一日平均総タンパク質消費量に基づき、ヒスチジン１８ｍｇ／タンパク質消費量ｇ；イソロイシン２５ｍｇ／タンパク質ｇ；ロイシン５５ｍｇ／タンパク質ｇ、リシン５１ｍｇ／タンパク質ｇ、メチオニンとシステインを組み合わせて２５ｍｇ／タンパク質ｇ；フェニルアラニンとチロシンを組み合わせて４７ｍｇ／タンパク質ｇ、スレオニン２７ｍｇ／タンパク質ｇ、トリプトファン７ｍｇ／タンパク質ｇ、およびバリン３２ｍｇ／タンパク質ｇである。チロシンおよびシステインは、非必須アミノ酸である。本発明のダイエタリー製品が、実質的に、チロシンおよび／またはシステインを欠く場合、あるレベルのフェニルアラニンおよびメチオニンを提供するように配合されるダイエタリー製品は、一日平均タンパク質消費量に基づき、少なくとも２５ｍｇ／タンパク質ｇの量のメチオニンおよび少なくとも４７ｍｇ／タンパク質ｇの量のフェニルアラニンを提供するように配合されるように調節されよう。
【００９６】
適切には、システインを「制限し」たダイエタリー製品は、一日平均タンパク質消費量に基づきシステインの一日推奨摂取量未満を提供するように配合された、より少量を提供するものである。例えば、システインを制限したダイエタリー製品は、２０ｍｇ／タンパク質ｇ未満または１５ｍｇ／タンパク質ｇ未満または１０ｍｇ／タンパク質ｇ未満を提供するものであり得る。
【００９７】
適切には、本ダイエタリー製品は、タンパク質摂取量１グラム当たりの総非必須アミノ酸レベルを制限するように配合することができる。例えば、非必須アミノ酸の組み合わせ一日摂取量は、消費タンパク質１グラム当たりの総非必須アミノ酸の一日推奨摂取量と比較し、少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは少なくとも４つまたは少なくとも５つまたは少なくとも６つまたは少なくとも７つの非必須アミノ酸を実質的に欠く食餌と同等とすることができる。
【００９８】
医学研究所は、タンパク質は、例えば、１日につき、成人の体重１キログラム当たり０．８グラムの割合で消費することを推奨している。本ダイエタリー製品は、製品の一日推奨消費量で、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．８グラムのタンパク質を提供するように配合することができる。
【００９９】
適切には、本発明のダイエタリー製品は、上記の推奨レベルを提供するように配合することができる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸を、一日平均総タンパク質消費量に基づき、一日平均摂取量の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、または６倍を提供するように、本ダイエタリー製品に配合することができる。
【０１００】
適切には、本発明のダイエタリー製品中に存在するアミノ酸は、遊離型、プロドラッグ型、塩、またはアミノ酸エステルのアミノ酸とすることができる。１つまたは複数のＮ末端修飾またはＣ末端修飾を有するアミノ酸、ならびに、ホモポリマー型、ホモダイマー型、ヘテロポリマー型、およびヘテロダイマー型も考えることができる。
【０１０１】
適切には、ダイエタリー製品は、１日に１〜８回投与するように配合することができる。好適には、１日１〜４回である。したがって、本ダイエタリー製品は、適切な単位剤形に配合することができる。
【０１０２】
本発明のダイエタリー製品は、さらに、１つまたは複数の主要栄養素および／または微量栄養素を含み得る。
【０１０３】
主要栄養素についてのガイダンスおよび提案される一日推奨量は、Dietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrate, Fiber, Fat, Fatty Acids, cholesterol, protein and amino acids released by the Institute of Medicine September 2002に見つけることができる。
【０１０４】
ダイエタリー製品の追加成分とすることができる主要栄養素の非包括的リストには、炭水化物、繊維、および脂質（例えば、ｎ−６多価不飽和脂肪酸、ｎ−３多価不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、トランス脂肪酸、およびコレステロールなど）が含まれる。
【０１０５】
微量栄養素の非包括的リストには、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２、パントテン酸、ビオチン、コリン、カルシウム、クロミウム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マグネシウム、モリブデン、リン、セレニウム、亜鉛、カリウム、ナトリウム、および塩化物が含まれる。適切には、本ダイエタリー製品は、刊行物"Dietary Reference Intakes: RDA and AI for Vitamins and Elements", NAS. IOM. Food and Nutrition Boardに詳述されているように、これらを許容可能なまたは一日推奨摂取量で提供するように配合することができる。
【０１０６】
食餌は、概して２つ以上の非必須アミノ酸を欠いた形態の不均衡なアミノ酸を含有し、オプションとして、過剰な１つまたは複数の他のアミノ酸が補足される。例えば、実質的なアミノ酸の欠乏は、他のアミノ酸の平均存在量の少なくとも１０分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４５分の１、５０分の１、１００分の１、または１０００分の１とすることができる。タンパク質は少ないが他の栄養素は豊富な食物、例えば、果物、野菜、およびある種のナッツは、栄養士の勧めに従って、食餌のアミノ酸摂取比が意図した比率を保つことを確認しながら、消費することが可能である。この食餌は、単独でまたは抗がん作用を有するような薬物療法と組み合わせて消費することを意図する。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明のダイエタリー製品を、合わさって本発明のダイエタリー製品を提供する、２つ以上の栄養補助食品にわたり配合する。これらの栄養補助食品は、該栄養補助食品により提供される組み合わせ平均食が本発明のダイエタリー製品を提供するように、前記対象に同時にまたは連続して投与することができる。これは、対象の食餌に多様性を加えるのに有利であり得る。
【０１０８】
ダイエタリー製品は、粉末、ゲル、溶液、懸濁液、ペースト、固体、液体、原液、再構成可能な粉末、シェイク、濃縮物、ピル、バー、タブレット、カプセル、またはすぐに使用できる製品の形態で提供することができる。ダイエタリー製品は、また、サプリメントが、タブレット、ピル、カプセル、液体、エアロゾル、注射可能液、または他の医薬的に許容される製剤の形態である場合、医薬組成物とすることが可能であると考えられる。適切には、本ダイエタリー製品は、飲料とすることができる。適切には、本飲料は、１日に２〜６回投与することができる。
【０１０９】
適切には、本ダイエタリー製品は、自然発生の食物とすることはできない。
【０１１０】
適切には、本ダイエタリー製品は、特定のアミノ酸に対し追加の化合物を含み得る。適切には、そのような追加化合物は、実質的に欠如するアミノ酸の、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成を助けることはできない。
【０１１１】
本発明で使用する場合、アミノ酸に関連した「実質的に欠く」は、そのアミノ酸を完全に含まないまたは極めて少ない（例えば、微量）ことを意味する。
【０１１２】
任意選択的に、投与は静脈内経路によるだろう。任意選択的に、非経口的投与が、急速投与でまたは注入により提供され得る。
【０１１３】
適切には、本ダイエタリー製品は：
ａ）チューブ供給経腸栄養製品（例えば、ＮＧチューブを介して投与され得る経鼻胃栄養製品；ＮＪチューブを介して投与され得る経鼻空腸栄養製品；または、ＰＥＧ（胃瘻）チューブ栄養製品など）；
ｂ）（中心動脈投与により、例えば、静脈カテーテルの専用管腔を介して投与され得る）非経口的栄養製品；
ｃ）ＩＶ注入製品とすることができる。
【０１１４】
好適には、投与は、チューブ供給経腸栄養法によるとすることができる。
【０１１５】
ある実施形態では、本発明の食餌またはダイエタリー製品を、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、または治療的エンドポイントが観察されるまで、例えば、腫瘍収縮が観察されるまでの期間にわたり投与する。
【０１１６】
本発明は、さらに、アミノ酸を水に溶解または分散させ、噴霧乾燥させる、本発明のダイエタリー製品の調製プロセスを提供する。
【０１１７】
適切には、アミノ酸は主要栄養素および微量栄養素などの追加成分と混合することができる。ヒトまたは動物の消費に適切な結合剤、乳化剤、または他の成分を、所望により加えることができる。
【０１１８】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明のダイエタリー製品または本発明に従って生成されたダイエタリー製品と、医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【０１１９】
適切な医薬製剤の選択および調製についての従来手順は、例えば、"Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs", M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988に記載されている。
【０１２０】
本発明の組成物は、（例えば、タブレット、トローチ剤、硬カプセル、軟カプセル、水性もしくは油性の懸濁液、乳剤、分散性の散剤もしくは顆粒剤、シロップ剤、またはエリキシル剤として）経口使用に適した形態であり得る。
【０１２１】
本発明の組成物は、当技術分野で周知である従来の医薬賦形剤を使用して、従来の手順により得ることができる。したがって、経口使用を意図した組成物は、例えば、１つまたは複数の着色剤、甘味料、着香料、および／または防腐剤を含有し得る。
【０１２２】
適切には、医薬組成物は、治療的に有効な量の本発明のダイエタリー製品を提供するように配合される。
【０１２３】
病気の治療に使用するための有効量とは、恒温動物、とくにヒトの病気の症状を対症的に和らげるか、または、病気の進行を遅くするのに十分な量である。
【０１２４】
用語「治療的に有効な量」は、投与された場合に、処置する病気、障害、または疾患の１つまたは複数の症状の発症を防ぐか、または、ある程度軽減するのに十分な、化合物または組成物の量を包含する。用語「治療的に有効な量」は、また、研究者、医師、または臨床医により求められている、細胞、組織、臓器、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発するのに十分な、化合物または組成物の量も包含する。任意の個々のケースにおける適切な「有効」量は、慣例となっている実験を使用して、当業者が決定することができる。任意の特定の患者に対する具体的な投与量レベルおよび投与頻度は変化し得、それは、利用する具体的化合物の活性；バイオアベイラビリティ；代謝安定性、該化合物の排出速度および作用の長さ；化合物の投与方法および投与時間；患者の年齢、体重、健康状態、性別および食餌；ならびに処置する特定の病気の重症度を含む、種々の因子に左右されるだろうことが理解されよう。
【０１２５】
用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、病気、障害、もしくは疾患、または、その病気、障害、もしくは疾患に関連する１つまたは複数の症状を緩和するかまたは抑止することを包含し、その病気、障害、または疾患自体の原因を緩和するまたは根絶することも包含する。ある実施形態では、用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、病気、障害、もしくは疾患、またはそれに関連する症状、またはその原因を緩和し、抑止し、または防ぐことを目的に、対象に、化合物、医薬組成物または医薬的剤形を投与することを指す。
【０１２６】
適切には、本発明の医薬組成物は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、化学療法薬、アミノ酸代謝／ターンオーバー／相互変換の阻害剤、非必須アミノ酸生合成阻害剤、アミノ酸輸送阻害剤、アミノ酸分解を促進する酵素もしくは薬物、または、アミノ酸を隔離する物質から選択される治療薬を含み得る。治療薬は、ＯＸＰＨＯＳを阻害し、および／または、活性酸素種を増加させ、および／または抗酸化防御を低下させ得る。
【０１２７】
がんおよび増殖性障害
一態様では、本発明は、薬物で使用するための、本発明のもしくは本発明のプロセスに従って生成したダイエタリー製品か、または、本発明の医薬組成物を提供する。
【０１２８】
例えば、本発明は、がんの処置で使用するための、本発明のもしくは本発明のプロセスに従って生成したダイエタリー製品か、または、本発明の医薬組成物を提供する。
【０１２９】
別の態様において、本発明は、がんの処置で使用する薬物の製造において、本発明もしくは本発明に従って生成したダイエタリー製品か、または、本発明の医薬組成物を使用することを提供する。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明は、治療的に有効な量のダイエタリー製品を対象に投与するステップを含む、対象のがんを処置する方法を提供する。
【０１３１】
全態様で、例示的ながんとしては、限定するわけではないが、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、肛門直腸がん、肛門管がん、虫垂がん、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞がん、皮膚がん（非黒色腫）、胆道がん、肝外胆管がん、肝内胆管がん、膀胱がん、膀胱がん、骨と関節のがん、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳がん、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、神経膠腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚伝導路および視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化器系、神経系のがん、神経系リンパ腫、中枢神経系がん、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、大腸がん、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫、リンパ様新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜がん、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢膀胱がん、胃がん、消化器系カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍神経膠腫、頭部および頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、眼球がん、島細胞腫瘍（膵臓内分泌部）、カポジ肉腫、腎がん、腎がん、腎がん、喉頭部がん、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、唇および口腔がん、肝がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、髄芽腫、黒色腫、眼球内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平上皮性頸部がん、口がん、舌がん、多発性内分泌腺腹、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性障害、鼻咽頭がん、ニューロブラストーマ、口内がん、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣低悪性腫瘍、膵臓がん、島細胞膵臓がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺がん、直腸がん、腎盂および尿管、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟組織腫瘍、子宮がん、子宮肉腫、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚がん（黒色腫）、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟組織腫瘍、扁平上皮細胞がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、睾丸がん、咽喉がん、胸腺腫、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、腎盂および尿管および他の泌尿器の移行上皮がん細胞がん、妊娠性絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮内膜子宮がん、子宮肉腫、子宮体がん、膣がん、外陰部がん、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。一部の実施形態では、がんは、大腸がん、肝がん、骨肉腫、リンパ腫、および乳がん、およびリンパ腫からなる群から選択される。
【０１３２】
がんは、野生型ＫＲＡＳについてポジティブであり得る。
【０１３３】
がんは、ｃＭｙｃの発現の調節が解除されている場合がある。
【０１３４】
がんは、ＭＴＡＰの発現の調節を解除した腫瘍であり得る。腫瘍は、固形腫瘍または血液系悪性腫瘍であり得る。
【０１３５】
例示的な固形腫瘍としては、限定するわけではないが、悪性中皮腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腺癌、扁平上皮がん、神経膠腫、膵臓腫瘍、膵臓がん、乳頭部がん、胆道がん、胆管がん、軟組織肉腫、食道がん、子宮内膜がん、軟骨肉腫、骨肉腫、消化管間質腫瘍および脊索腫、原発性悪性黒色腫、転移性黒色腫、ならびに原発性乳がんが挙げられる。
【０１３６】
例示的な血液系悪性腫瘍としては、限定するわけではないが、びまん性大細胞型リンパ腫、低悪性度リンパ腫、Ｂ系列急性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性白血病、成人Ｔ細胞性白血病、Ｔ細胞由来リンパ腫が挙げられる。リンパ腫は、任意選択的にがん化する場合がある。
【０１３７】
適切には、本発明のダイエタリー製品は、異常なまたはそうでなければ不所望の細胞増殖が衰弱性障害を引き起こし得る疾患または障害を処置するのに有用であり得る。
【０１３８】
本ダイエタリー製品は、実質的にシステインを欠き得る。適切には、システインを実質的に欠く食餌は、肺がん、大腸がん、および乳がんなどの外来性システインを貪欲に消費するがんにおいて、有用であり得る。適切には、システインを実質的に欠く食餌は、ＭＴＡＰの発現が下方制御されたがんにおいて有用であり得る。
【０１３９】
本ダイエタリー製品は、実質的に、セリンおよび／またはグリシンを欠き得る。適切には、セリンおよび；／またはグリシンを実質的に欠く食餌は、肺がん、大腸がん、乳がん、リンパ腫、大腸がん、肝がん、骨肉腫、および乳がんなどの、外来性セリンおよび／またはグリシンを貪欲に消費するがんにおいて、有用であり得る。
【０１４０】
本ダイエタリー製品は、実質的に、アルギニンおよび／またはチロシンを欠き得る。適切には、アルギニンを実質的に欠く食餌は、大腸がんなどのがんにおいて有用であり得る。
【０１４１】
組み合わせ療法
本発明のダイエタリー製品または医薬組成物は、単独で使用して治療効果を提供することができる。適切には、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物は、また、１つまたは複数の追加の化学療法薬および／もしくは放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０１４２】
このような化学療法は、以下のカテゴリーの抗がん剤を１つまたは複数含み得る：
（ｉ）アルキル化剤などの抗増殖／抗腫瘍薬およびそれらの組み合わせ（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ベンダムスチン、メルファラン、クロラムブシル、クロルメチン、ブスルファン、テモゾロミド、ニトロソウレア、イホスファミド、メルファラン、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ロムスチン、ストロプトゾシンおよびダカルバジン）；代謝拮抗薬（例えば、ゲムシタビンおよび抗葉酸剤、例えば、５−フルオロウラシルやテガフールなどのフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、ペメトレキセド、シトシンアラビノシド、フロクスリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン、およびヒドロキシウレア）；抗生物質（例えば、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系薬剤、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン（登録商標）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、および、ミスラマイシン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンやビノレルビンのようなビンカアルカロイドおよびタキソールやタキソテールのようなタキソイドおよびポロキナーゼ阻害剤）；プロテアソーム阻害剤、例えば、カルフィルゾミブおよびボルテゾミブ；インターフェロン療法；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドやテニポシドなどのエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン、および、カンプトテシン）；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（タキソール（商標））、ｎａｂｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ドセタキセル、ミスラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシンＣ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−α）、エトポシド、テニポシド、ＤＮＡ脱メチル化剤（例えば、アザシチジンまたはデシタビン）；ならびにヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、ボリノスタット、ＭＳ−２７５、パノビノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）およびプラシノスタットＳＢ９３９）；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤などの細胞分裂阻害剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および、酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗剤またはＬＨＲＨ作用薬（例えば、ゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、黄体ホルモン剤（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタンとして）、および、フィナステリドなどの５＊−レダクターゼ阻害剤；ならびにナベルベン、ＣＰＴ−ＩＩ、アナストロゾール、レトロゾール、カペシタビン、レロキサファム、シクロホスファミド、イホスファミド、および、ドロロキサフィン；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤、例えば、ダサチニブおよびボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ならびに、メタロプロテアーゼ阻害剤、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤、または、ヘパラナーゼ抗体；
（ｉｖ）成長因子機能阻害剤：例えば、このような阻害剤として、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体、例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（商標））、抗ＥＧＦＲ抗体であるパニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体であるセツキシマブ、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリー阻害剤（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）、アファチニブ、バンデタニブ、オシメルチニブ、およびロシレチニブなどのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）ラパチニブのなどのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤）、およびＣＴＬＡ−４、４−ＩＢＢおよびＰＤ−１などの共刺激分子に対する抗体、または、サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）に対する抗体；肝細胞増殖因子ファミリー阻害剤；インスリン増殖因子ファミリー阻害剤；細胞アポトーシスタンパク質レギュレーターのモジュレーター（例えば、Ｂｃｌ−２阻害剤）；イマチニブおよび／またはニロチニブ（ＡＭＮ１０７）などの血小板由来増殖因子ファミリー阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、ファルネシル転移酵素阻害剤などのＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、ソラフェニブ、ティピファニブおよびロナファーニブ）、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼによる細胞シグナル伝達の阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｐｌｔ３キナーゼ阻害剤、ＣＳＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体、キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤、および、ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤；ＣＣＲ２、ＣＣＲ４またはＣＣＲ６アンタゴニスト；ならびに、国際公開第２００６０４３０９０号、同第２００９０７７７６６号、同第２０１１０９２４６９、または同第２０１５０７５４８３号に記載されているようなＲＡＦキナーゼ阻害剤。
（ｖ）血管内皮増殖因子の機能を阻害する薬剤などの血管新生抑制剤［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ（アバスチン（商標））］；サリドマイド；レナリドマイド；ならびに、例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、バンデタニブ、バタラニブ、スニチニブ、アキシチニブ、および、パゾパニブ；
（ｖｉ）例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常遺伝子を交換するアプローチを含む、遺伝子療法；
（ｖｉｉ）例えば、アレムツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（登録商標））およびオファツムマブなどの抗体療法を含む免疫療法；インターフェロンαなどのインターフェロン、ＩＬ−２（アルデスロイキン）などのインターロイキン；インターロイキン阻害剤、例えばＩＲＡＫ４阻害剤；ＨＰＶワクチン、例えば、ガーダシル、サーバリックス、オンコファージおよびシプロイセルＴ（プロベンジ（登録商標））などの予防ワクチンおよび治療ワクチンを含む癌ワクチン；ｇｐ１００；樹状細胞ベースのワクチン（例えば、Ａｄ．ｐ５３ＤＣなど）；ｔｏｌｌ様受容体モジュレーター、例えばＴＬＲ−７またはＴＬＲ−９アゴニスト；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬ４−Ａモジュレーター（例えば、ニボルマブ）、抗体、およびワクチン；他のＩＤＯ阻害剤（例えば、インドキシモドなど）；抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えば、ＭＫ−３４７５およびニボルマブなど）；抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体（例えば、ＭＥＤＩ−４７３６およびＲＧ−７４４６など）；抗ＰＤＬ２モノクローナル抗体；ならびに抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、イピリムマブなど）；そして
（ｖｉｉｉ）細胞障害性剤、例えば、フルダラビン（フルダラ）、クラドリビン、ペントスタチン（ニペント（商標））；
（ｉｘ）標的療法、例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばイデラリシブおよびペリホシン；アポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）アンタゴニスト（ＩＡＰアンタゴニスト）としても知られるＳＭＡＣ（第２ミトコンドリア由来カスパーゼアクチベーター）類似体。これらの薬剤は、ＩＡＰ、例えば、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、およびｃＩＡＰ２を抑制することにより細胞アポトーシス経路を再構築するように作用する。特定のＳＭＡＣ類似体には、Ｂｉｒｉｎａｐａｎｔ（ＴＬＲ３２７１１、TetraLogic Pharmaceuticals）、ＬＣＬ１６１（Novartis）、ＡＥＧ４０７３０（Aegera Therapeutics）、ＳＭ−１６４（ミシガン大学）、ＬＢＷ２４２（Novartis）、ＭＬ１０１（Sanford-Burnham Medical Research Institute）、ＡＴ−４０６（Ascenta Therapeutics／ミシガン大学）、ＧＤＣ−０９１７（Genentech）、ＡＥＧ３５１５６（Aegera Therapeutic）、およびＨＧＳ１０２９（HUMAN Genome Sciences）；ならびに、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）を標的にする薬剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）、およびＭＬＮ９７０８が含まれる；そして
（ｘｉｉ）キメラ抗原受容体、抗がんワクチン、およびアルギナーゼ阻害剤。
【０１４３】
適切には、本発明の組成物は、アミノ酸を欠乏させる１つまたは複数の治療用酵素と組み合わせて使用することができる。このような治療用酵素は、本発明の組成物と相関し得る。例えば、アルギニンを実質的に欠く組成物に対しては、アルギナーゼなどの治療用酵素を使用することができる。
【０１４４】
さらに、またはあるいは、本発明の組成物は、アミノ酸のｄｅ  ｎｏｖｏ合成の阻害に関与する１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用することができる。このような化合物は、本発明の組成物と相関し得る。例えば、セリンを実質的に欠く組成物では、セリンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を阻害する化合物、例えばＰＨＧＤＨ阻害剤、ＰＳＡＴ１阻害剤、およびＰＳＰＨ阻害剤などを使用することができる。
【０１４５】
本方法で使用する治療薬は、単剤または薬剤の組み合わせとすることが可能である。好適な組み合わせには、異なる作用機序を有する薬剤が含まれるだろう。
【０１４６】
つまり、用語「組み合わせ」を使用する場合、これは、同時の、別個の、または連続の投与を指すことを理解されたい。本発明の一態様では、「組み合わせ」は、同時投与を指す。本発明の別の態様では、「組み合わせ」は、別個の投与を指す。本発明のさらなる態様では、「組み合わせ」は、連続投与を指す。投与が連続または別個である場合、第２成分を投与する際の遅れは、その組み合わせの薬効を失うものであってはならない。
【０１４７】
用語「〜と組み合わせて投与される」および文法上の同等物等は、本明細書で使用する場合、単一患者に選択した治療薬の投与を包含することを意味し、薬剤を同じもしくは異なる投与経路により、または、同じもしくは異なる時刻に投与する処置レジメンを含むことを意図する。一部の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、他の薬剤と共投与されよう。これらの用語は、２つ以上の薬剤を動物に投与し、その結果、両薬剤および／またはその代謝物が、同時にその動物内に存在することを包含する。これらの用語には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時間での投与、および／または、両薬剤が存在する組成物での投与が含まれる。
【０１４８】
本明細書に開示する薬剤は、皮内、皮下、経口、動脈内、または静脈内を含む、任意の経路により投与することができる。
【０１４９】
組み合わせ処置を使用する一部の実施形態では、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物の量と、他の医薬的に活性な薬剤の量は、組み合わせた場合、患者の標的障害を処置するのに治療的に有効である。この文脈では、組み合わせ量は、該量が、組み合わせた場合に、障害の症状もしくは他の有害な影響を減少させるもしくは完全に緩和する；障害を治癒させる；障害の進行を反転させる、完全に停止させる、もしくは遅くする；または、障害が悪化するリスクを低減させるのに十分である場合、「治療的に有効な量」である。典型的には、このような量は当業者により、例えば、本発明の化合物について本明細書で記載した投薬量範囲と、他の医薬的に活性な化合物の承認されたまたはそうでなければ掲載された投薬量範囲で開始して、求めることができる。
【０１５０】
本発明のさらなる態様に従い、がんの共同処置で使用するための、上記で定義した本発明のダイエタリー製品または医薬組成物および上記で定義した追加の抗がん剤を提供する。
【０１５１】
本発明のさらなる態様に従い、治療的に有効な量の本発明のダイエタリー製品または医薬組成物を、上記で定義した追加の抗がん剤と同時に、連続して、または別個に対象に投与するステップを含む、がんに罹患したヒトまたは動物対象の処置方法を提供する。
【０１５２】
本発明のさらなる態様に従い、がんの処置において、上記で定義した追加の抗がん剤と同時に、連続して、または別個に使用する、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物を提供する。
【０１５３】
本発明のダイエタリー製品または医薬組成物は、また、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。適切な放射線療法処置としては、例えば、Ｘ線療法、陽子線療法、または電子ビーム療法が挙げられる。放射線療法には、また、放射性核種剤、例えば１３１Ｉ、３２Ｐ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、１５３Ｓｍ、または２２３Ｒａの使用が包含され得る。このような放射性核種療法は周知であり、商業的に利用可能である。
【０１５４】
本発明のさらなる態様に従い、放射線療法と共同でがん処置に使用するための、本発明のダイエタリー製品もしくは医薬組成物、または上記で定義したその医薬的に許容される塩を提供する。
【０１５５】
本発明のさらなる態様に従い、放射線療法と同時に、連続して、または別個に、治療的に有効な量の本発明のダイエタリー製品もしくは医薬組成物、または、その医薬的に許容される塩を対象に投与するステップを含む、がんに罹患したヒトまたは動物対象の処置法を提供する。
【０１５６】
適切には、本発明は、驚くべきことに、少なくとも１つの化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、少なくとも１つのアミノ酸を実質的に欠く食餌の組み合わせは、単なる相加を超え得ることを発見した。
【０１５７】
適切には、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物の相乗的組み合わせを提供し得る。
【０１５８】
一実施形態では、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物を、ＨＤＡＣ阻害剤、ＭＴＯＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびプロテアソーム阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の種類の化学療法薬と組み合わせることができる。
【０１５９】
ＨＤＡＣ阻害剤
適切には、化学療法薬は、１つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤とすることができる。ＨＤＡＣの阻害剤は転写を調節し、細胞増殖の抑止、分化、およびアポトーシスを誘発する。ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）は、また、放射性薬および化学療法薬を含む、がんの処置で使用される治療薬の細胞毒性効果を高める。
【０１６０】
用語「ＨＤＡＣ」は、タンパク質からアセチル基を、例えば、ヒストンのＮ末端のリシン残基のε−アミノ基を除去する酵素ファミリーを指す。ＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、およびＨＤＡＣ１１を含むヒトＨＤＡＣとすることが可能である。ＨＤＡＣは、また、原生動物供給源または真菌供給源にも由来し得る。
【０１６１】
ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣＩ）は、典型的には、アセチルリシンの構造に類似した３つの構造エレメントを含有する。これら３つの構造エレメントは、活性部位において亜鉛のキレート化を担う亜鉛結合基（Ｍ）と、活性部位を外側の酵素表面に結合させる疎水性チャネルに結合するリンカー領域（Ｌ）と、外側の酵素表面で残基と相互作用するキャッピング基（Ｃａｐ）である。
【０１６２】
ＨＤＡＣ阻害剤の例としては：ＳＡＨＡ、ロミデプシン、バルプロ酸、ＰＣＩ−２４７８１、ＩＴＦ−２３５７、ＭＳ２７５、パノビノスタット、ベリノスタット、ボリノスタット、ＭＧＣＤ０１０３、およびＥＶＰ−０３３４が挙げられる。
【０１６３】
本発明は、驚くべきことに、ロミデプシンおよびボリノスタットなどのＨＤＡＣ阻害剤が、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物と相乗して機能し得ることを発見した。
【０１６４】
適切には、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物は、ＨＤＡＣ阻害剤が処置に有用である任意の適応症に対し、ＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用することができる。ＨＤＡＣ阻害剤は承認されているか、または、臨床治験が少なくとも以下の：例えば、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、腎がん、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、白血病、急性骨髄性白血病、黒色腫、非小細胞肺がん、固形腫瘍、前立腺がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および中皮腫において進行中である。好適には、ＨＤＡＣ阻害剤はロミデプシンおよび／またはボリノスタットである。
【０１６５】
ｍＴＯＲ阻害剤
適切には、化学療法薬は、１つまたは複数の哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤とすることができる。句「ｍＴＯＲ阻害剤」には、本明細書で使用する場合、限定するわけではないが、ｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーの活性を標的にする／阻害する化合物、タンパク質、または抗体が含まれる。ｍＴＯＲ活性の阻害剤としては、例えば、以下の式のラパマイシン：
【化１】
2019507754.tif 000003
および、例えば、
４０−Ｏ−置換ラパマイシン誘導体、例えば
４０−Ｏ−アルキル−ラパマイシン誘導体、例えば４０−Ｏ−ヒドロキシアルキル−ラパマイシン誘導体など、例えば、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）−エチル−ラパマイシン（エベロリムス）など、
３２−デオキソ−ラパマイシン誘導体および３２−ヒドロキシ−ラパマイシン誘導体、例えば、３２−デオキソラパマイシンなど、
１６−Ｏ−置換ラパマイシン誘導体、例えば１６−ｐｅｎｔ−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパマイシン、１６−ｐｅｎｔ−２−イニルオキシ−３２（ＳまたはＲ）−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ｐｅｎｔ−２−イニルオキシ−３２（ＳまたはＲ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンなど、
位置４０において酸素基がアシル化されたラパマイシン誘導体、例えば、４０−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシ−メチル）−２−メチルプロパノエート］−ラパマイシン（ＣＣｌ７７９としても知られる）、位置４０においてヘテロシクリルで置換されたラパマイシン誘導体、例えば、４０−ｅｐｉ−（テトラゾリル）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８としても知られる）、
例えば、国際公開第９８０２４４１号または第０１１４３８７号に開示されるようないわゆるラパログ、例えば、４０−Ｏ−ホスホ含有ラパマイシン誘導体など、例えば、ＡＰ２３５７３を含む４０−Ｏ−ジメチルホスフィニル−ラパマイシン、ならびに、
４０−Ｏ−アルコキシ−アルキル−ラパマイシン誘導体、例えば、４０−Ｏ−（２−エトキシ）−エチル−ラパマイシン（エベロリムス）を含む、バイオリムス（ｂｉｏｌｉｍｕｓ  Ａ９）の名で開示される化合物、およびＴＡＦＡ−９３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５、またはＡＰ２３８４１の名で開示される化合物などが挙げられる。
【０１６６】
本発明は、驚くべきことに、テムシロリムスおよびエベロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤が、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物と相乗して機能し得ることを発見した。
【０１６７】
適切には、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物は、ｍＴＯＲ阻害剤が処置に有用である任意の適応症に対し、ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用することができる。ｍＴＯＲ阻害剤は承認されているか、または、臨床治験が、少なくとも以下の：例えば、リンパ性白血病、大腸がんおよび乳がん、悪性黒色腫および上衣芽腫；米国皮膚がん、中枢神経系腫瘍；腎細胞がん、マントル細胞リンパ腫、乳房および膵内分泌において進行中である。好適には、ｍＴＯＲ阻害剤は、テムシロリムスおよび／またはエベロリムスである。
【０１６８】
チロシンキナーゼ阻害剤
適切には、化学療法薬は、１つまたは複数のチロシンキナーゼ阻害剤とすることができる。チロシンキナーゼは、細胞シグナル伝達において機能する。細胞の増殖、分化、移入、代謝、およびプログラム死は、チロシンキナーゼが介在する細胞応答の例である。種々のチロシンキナーゼ阻害剤は、がんの処置に有用であることが知られており、一実施形態では、任意の既知のチロシンキナーゼ阻害剤を使用することができる。このような阻害剤には、商業的に利用可能な阻害剤および開発中の阻害剤が含まれ得る。
【０１６９】
小分子阻害剤、例えば、クルクミン、二フッ素化クルクミン（ＤＣＦ）、［３−｛５−［４−（シクロペンチルオキシ）−２−ヒドロキシベンゾイル］−２−［（３−ヒドロキシ−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−イル）メトキシ］フェニル｝プロピオン酸］（Ｔ５２２４，Roche）、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、ジヒドログアイヤレチン酸（ＤＨＧＡ）、［（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｅ）−３−メチル−７−（４−メチルフェニル）−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６，８−ノナテトラエン酸（ＳＲ１  １３０２，Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、（ＥＪ−２−ベンジリデン−３−（シクロヘキシルアミノ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（ＢＣＩ）、ＴＰＩ−２、ＴＰＩ−３、トリプトリド、ラパチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、およびベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）が包含される。一実施形態では、組成物で使用するｃ−Ｆｏｓ阻害剤は、クルクミン、二フッ素化クルクミン（ＤＦＣ）、［３−｛５−［４−（シクロペンチルオキシ）−２−ヒドロキシベンゾイル］−２−［（３−ヒドロキシ−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−イル）メトキシ］フェニル｝プロピオン酸］（Ｔ５２２４，Roche）、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）、ジヒドログアイヤレチン酸（ＤＨＧＡ）、および［（Ｅ，Ｅ，Ｚ，Ｅ）−３−メチル−７−（４−メチルフェニル）−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６，８−ノナテトラエン酸（ＳＲ１  １３０２，Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。一実施形態では、Ｄｕｓｐ−１阻害剤は、ＮＳＣ  １５０１  １７としても知られる（ＥＪ−２−ベンジリデン−３−（シクロヘキシルアミノ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン−１−オン（ＢＣＩ）、ＴＰＩ−２、ＴＰＩ−３、およびトリプトリドである。一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、およびベムラフェニブである。
【０１７０】
本発明に従って化学療法薬として使用することができるチロシンキナーゼ阻害剤のさらなる例としては：アファチニブ（Ｇｉｏｔｒｉｆ（登録商標））、アキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ（登録商標））、ボスチニブ（Ｂｏｓｕｌｉｆ（登録商標））、クリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標））、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、イマチイブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ラパチニブ（Ｔｙｖｅｒｂ（登録商標））、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））、パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））、レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ（登録商標））、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、およびスニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））が挙げられる。
【０１７１】
本発明は、驚くべきことに、ダサチニブおよびレゴラフェニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤が、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物と相乗して機能し得ることを発見した。
【０１７２】
適切には、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤が処置に有用である任意の適応症に対し、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用することができる。チロシン阻害剤は承認されているか、または、臨床治験が少なくとも以下の：例えば、非小細胞肺がん、腎がん、軟組織肉腫、甲状腺がん、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肺がん、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肉腫、慢性好酸球性白血病、腸がん、肝がん、および膵臓がんにおいて進行中である。好適には、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブおよび／またはレゴラフェニブである。
【０１７３】
適切には、ダサチニブおよび／またはレゴラフェニブを使用した場合に処置されるがんは、大腸がん、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、腸がん、またはＧＩＳＴである。
【０１７４】
プロテアソーム阻害剤
適切には、化学療法薬は、１つまたは複数のプロテアソーム阻害剤とすることができる。プロテアソーム阻害剤は、ユビキチンプロテアソームシステム（ＵＰＳ）の阻害剤を指す。ＵＰＳは、非リソソームタンパク質分解経路である。ユビキチンのタンパク質表面に対する結合は、ユビキチンが、Ｅ１結合酵素によって活性化されるマルチステッププロセスであり、ユビキチンコンジュガーゼ（Ｅ２）およびＥ３ユビキチンリガーゼにより仲介されて伝達される。このような阻害剤には、商業的に利用可能な阻害剤および開発中の阻害剤が含まれる。
【０１７５】
例としては：ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）およびその類似体（例えば、ボロン酸誘導体、ベンジルマロン系誘導体、アミノ酸系誘導体、およびボロン酸エステル）、サリノスポラミドＡ（ＮＰＩ−００５２）、ＰＲ−１７１、Ｅ１−結合酵素阻害剤、ＰＯＳＨ阻害剤、ＭＤＭ２−ｐ５３阻害剤、および脱ユビキチン化酵素阻害剤が挙げられる。
【０１７６】
本発明は、驚くべきことに、カルフィルゾミブなどのプロテアソーム阻害剤が、本発明のダイエタリー製品または医薬組成と相乗して機能し得ることを発見した。
【０１７７】
適切には、本発明のダイエタリー製品または医薬組成は、プロテアソーム阻害剤が処置に有用である任意の適応症に対し、プロテアソーム阻害剤と組み合わせて使用することができる。開示のプロテアソーム阻害剤で処置することが可能な固形腫瘍の非限定的例としては、膵臓がん；膀胱がん；大腸がん；転移性乳がんを含む乳がん；アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性の前立腺がんを含む前立腺がん；例えば転移性腎細胞がんを含む腎がん；肝細胞がん；例えば非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）、および肺腺がんを含む肺がん；例えば、上皮性進行がんまたは原発性腹膜がんを含む卵巣がん；子宮頸がん；胃がん；食道がん；例えば、頭頸部の扁平上皮がんを含む頭頸部がん；黒色腫；転移性神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌がん；例えば、神経膠腫、退形成乏突起膠腫、成人多形膠芽腫、および成人退形成性星細胞腫を含む脳腫瘍；骨がん：ならびに軟組織肉腫が挙げられる。
【０１７８】
開示のプロテアソーム阻害剤で処置可能な血液系腫瘍の非限定的例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；移行期ＣＭＬおよびＣＭＬの急性転化期（ＣＭＬ−ＢＰ）を含む慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；ホジキン病（ＨＤ）；濾胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫（ＭＭ）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；不応性貧血（ＲＡ）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、（芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）および移行期のＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−Ｔ）を包含する骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；ならびに骨髄増殖性症候群が挙げられる。
【０１７９】
好適には、プロテアソーム阻害剤は、カルフィルゾミブである。
【０１８０】
適切には、カルフィルゾミブを使用した場合に処置されるがんは、多発性骨髄腫またはＴ細胞リンパ腫である。
【０１８１】
ＥＧＦＲ阻害剤
適切には、化学療法薬は、１つまたは複数の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤とすることができる。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１またはＨＥＲ−１としても知られる）阻害剤は、細胞外タンパク質リガンドのＥＧＦファミリーのメンバーの細胞表面受容体阻害剤を指す。ＥＧＦＲは、正常細胞の増殖、アポトーシス、および他の細胞機能の制御において重要な役割を果たす。ＥＧＦＲの変異は、受容体の連続的なまたは異常な活性化を招き、未制御の細胞分裂を引き起こし得、これはいくつかの種類のがんの原因となり得る。
【０１８２】
一態様では、用語「ＥＧＦＲ」は、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ−３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ−４）、ならびにＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）を指す。
【０１８３】
本発明は、驚くべきことに、セツキシマブなどのＥＧＦＲ阻害剤が、本発明のダイエタリー製品または医薬組成と相乗して機能し得ることを発見した。
【０１８４】
適切には、本発明のダイエタリー製品または医薬組成は、ＥＧＦＲ阻害剤が処置に有用である任意の適応症に対して、ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせて使用することができる。開示のＥＧＦＲ阻害剤で処置することが可能な固形腫瘍の非限定的例としては、非小細胞肺がん、膵臓がん、乳がん、結腸がん、および上皮成長因子受容体の上方制御により引き起こされるいくつかの他のがんが挙げられる。
【０１８５】
ＥＧＦＲ阻害剤の例としては：セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、およびオシメルチニブが挙げられる。
【０１８６】
好適には、プロテアソーム阻害剤はセツキシマブである。
【０１８７】
対象の他の化学療法薬
一態様では、本発明のダイエタリー製品または医薬組成を、タモキシフェンクエン酸塩、メトホルミン、エルロチニブ塩酸塩、ダサチニブ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、ダウノルビシン塩酸塩、ボリノスタット、カボザンチニブ、イデラリシブ、ビノレルビン酒石酸塩、テムシロリムス、ヒドロキシウレア、メルファラン塩酸塩、バルルビシン、エベロリムス、アミフォスチン、トレチノイン、フルダラビンリン酸エステル、ダカルバジン、ベムラフェニブ、セリチニブ、酸酸化ヒ素、テモゾロミド、デクスラゾキサン、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、エキセメスタン、ロミデプシン、ボスチニブ、カペシタビン、レナリドマイド、アロプリノール、ストレプトゾシン、アルトレタミン、シスプラチン、ドキソルビシン塩酸塩、ニロチニブ、イミキモド、カルフィルゾミブ、バンデタニブ、ビスモデギブ、フルオロウラシル、オラパリブ、ミトタン、アナストロゾール、エピルビシン塩酸塩、ラロキシフェン、ラパチニブ、パゾパニブ塩酸塩、フルベストラント、ウラシルマスタード、アファチニブ、イホスファミド、エトポシド、トリエチレンメラミン、ポナチニブ、およびその類似体からなる群から選択される１つまたは複数の化学療法薬と組み合わせることができる。
【０１８８】
有利なことに、本発明は、これらの化学療法薬が、セリンおよびグリシンが制限された食餌と組み合わせた場合、相加を超え得ること（つまり、相乗効果）を示した。
【０１８９】
従って、一態様において、本発明は、がんの処置で使用するための、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物と１つまたは複数の化学療法薬の相乗的組み合わせを提供する。相乗的組み合わせをもたらす任意の投与量の化学療法薬を使用することができる。
【０１９０】
適切には、化学療法薬は、ダウノルビシンとすることができる。本発明のダイエタリー製品または医薬組成物とダウノルビシンの組み合わせを、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、およびカポジ肉腫の処置に使用することができる。
【０１９１】
一態様では、各化学療法薬の投与量（または化学療法薬の総組み合わせ投与量）は、一日当たり少なくとも０．１ｇ／患者の体重Ｋｇ、好適には一日当たり少なくとも０．２ｇ／Ｋｇ、または一日当たり０．３ｇ／Ｋｇ、または一日当たり０．４ｇ／Ｋｇ、または一日当たり０．５ｇ／Ｋｇと同等とすることができる。適切には、化学療法薬（または、組み合わせた化学療法薬の組み合わせ）の投与量は、一日当たり少なくとも１ｇ／Ｋｇ、好適には一日当たり少なくとも２ｇ／Ｋｇと同等とすることができる。
【０１９２】
例えば、対象がヒトである場合、メトホルミンでは、その投与量は、一日当たり少なくとも１ｇ、好適には一日当たり２ｇと同等、または非ヒトの場合と同等の投与量とすることができる。
【０１９３】
さらに、別の態様では、本発明は、ａ）本発明のダイエタリー製品とｂ）化学療法薬の相乗効果的な組み合わせを投与するステップを含む、対象のがんを処置する方法を提供する。適切には、相乗的組み合わせの構成要素は、同時にまたは連続して投与することができる。
【０１９４】
適切には、本発明の全態様に従い、化学療法薬は、ａ）ＯＸＰＨＯＳを阻害し；ｂ）活性酸素種（ＲＯＳ）を増加させ；ｃ）抗酸化防御を低下させ；ｄ）ａ）−ｃ）の任意の組み合わせを提供し得る。
【０１９５】
適切には、化学療法薬はＯＸＰＨＯＳを阻害し得る。例えば、化学療法薬は、ビグアナイドとすることができる。理論に縛られることは望まないが、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物（特に、少なくともセリンを実質的に欠いたダイエタリー製品または医薬組成物）は、ビグアナイドの抗腫瘍作用を改善すると考えられる。
【０１９６】
適切には、化学療法薬はＲＯＳレベルを高め得る。理論に縛られることは望まないが、本発明のダイエタリー製品または医薬組成物（特に、少なくともセリンを実質的に欠いたダイエタリー製品または医薬組成物）は、ＲＯＳレベルを高める化合物と組み合わせて使用する場合、効果が高まると考えられる。がん細胞は、ＲＯＳレベルの上昇に対処するため、多量の外来性セリンを利用して急速な増殖を支える。理論に縛られることは望まないが、外来性セリンが枯渇した場合、がん細胞は、セリン合成経路を通じて解糖中間体を振り向けることを余儀なくされ、代謝のリモデリングが増殖の低減および細胞生存期間の縮小をもたらし得ると考えられる。
【０１９７】
ＫＲＡＳ
本発明者らは、驚くべきことに、がん細胞／組織におけるＫｒａｓの発現または活性のレベルが、セリン（および／またはグリシン）を実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する患者の応答性または感受性の可能性を表すことを特定した。Ｋｒａｓの発現または活性のレベルを使用して、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性であろう対象のがん細胞、例えば腫瘍を特定することが可能である。また、バイオマーカーを使用して、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性の可能性が高い、またはその可能性が低い対象を特定することも可能である。また、バイオマーカーを使用して、患者のがんのための処置の選択を助けることも可能である。これに関し、本発明は、バイオマーカーおよびその使用を、バイオマーカーの使用を含む方法およびキットと併せて提供する。
【０１９８】
一態様において、本発明は、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である患者集団を特定するために、ＫＲＡＳをバイオマーカーとして使用することを提供する。用語「バイオマーカー」または「マーカー」は、ある表現型状況の対象から採取したサンプルに、別の表現型状況と比較し特異的に存在する、有機生体分子を指す。バイオマーカーは、異なる群のバイオマーカーの発現レベルの平均値または中央値における差が統計的に有意であると計算される場合、異なる表現型状況間で特異的に存在する。バイオマーカーは、単独でまたは組み合わせて、対象が一表現型状況または別の表現型状況に属する相対的リスクの尺度を提供する。本発明では、バイオマーカーは、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性の可能性を予測するためのマーカーである。一部の実施形態では、バイオマーカーは、本明細書に開示の遺伝子（例えば、核酸）である。他の一部の実施形態では、バイオマーカーは遺伝子産物（例えば、タンパク質）である。
【０１９９】
本明細書で使用する場合、用語「ＫＲＡＳ」は、カーステンラット肉腫ウイルスより単離された形質転換遺伝子のヒト細胞相同体を指す。ＫＲＡＳ遺伝子は、がん遺伝子として知られる遺伝子クラスに属する。変異した場合、がん遺伝子には、正常細胞をがん性にさせる潜在能力がある。ＫＲＡＳ遺伝子は、がん遺伝子のＲａｓファミリー中にあり、Ｒａｓファミリーには他の２つの遺伝子：ＨＲＡＳおよびＮＲＡＳが含まれる。これらの３つの遺伝子から生成されるタンパク質がＧＴＰアーゼである。これらのタンパク質は、細胞分裂、細胞分化、および細胞の自己破壊（アポトーシス）において重要な役割を果たす。
【０２００】
ＫＲＡＳは、分子量約２１ｋＤａおよびＧＴＰ加水分解活性を有するタンパク質のＲＡＳファミリーに属する。ＫＲＡＳは細胞膜の内側に見つけられ、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの細胞外成長因子の受容体への結合に応答して、シグナルを細胞に送る役割を持つ。活性化変異がＫＲＡＳに見つけることができ、該変異は、ヒトのがんの約２０％に見られる。
【０２０１】
本明細書で使用する場合、用語「ＫＲＡＳ」は、ポリペプチドと核酸分子の両方を指すために使用する。
【０２０２】
好適には、ＫＲＡＳはヒトＫＲＡＳのポリペプチドまたは核酸分子である。
【０２０３】
本明細書で使用する場合、用語「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）および例えばヌクレオチド類似体の使用により生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体が含まれる。核酸分子は、一本鎖とすることも二本鎖とすることも可能であるが、好適には二本鎖ＤＮＡである。
【０２０４】
ヒトＫＲＡＳの核酸配列情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３下で見つけることが可能である。特異的な一実施形態では、本発明のＫＲＡＳ遺伝子は、ＫＥＡＳ核酸（例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３）もしくはその連続断片、または、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３の核酸配列もしくはその連続断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【０２０５】
本明細書で使用する場合、用語「野生型」ＫＲＡＳは、変異を含まない、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３下で見つけられるＫＲＡＳ核酸またはＫＲＡＳポリペプチドと比較し変異を含まないＫＲＡＳポリペプチドまたはＫＲＡＳ核酸を指す。本明細書で提供するヒトＫＲＡＳ配列以外の、哺乳類または非哺乳類種のＫＲＡＳの核酸配列は、当技術分野で既知の方法を使用して、例えば、核酸シーケンシングにより、またはハイブリダイゼーションアッセイを使用して、または手動のもしくは用語「ハイブリダイゼーション」の定義と関連して本明細書の下記で言及するようなコンピュータプログラムを使用することによるアライメントおよび相同性の程度を使用することにより、当業者によって特定され得る。
【０２０６】
既知の核酸配列／プロモータのオルソログの特徴についてのハイブリダイゼーションアッセイが当技術分野で周知であり；例えば、Sambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001)：Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)を参照されたい。用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」は、本明細書で使用する場合、ストリンジェントなまたは非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを指し得る。さらに特定しない場合、その条件は、好適には非ストリンジェントである。前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook (2001) loc. cit.; Ausubel (1989) loc. cit., or Higgins and Hames (Eds.) “Nucleic acid hybridization, a practical approach” IRL Press Oxford, Washington D.C., (1985)に記載されている従来のプロトコルに従って定めることができる。条件設定は当業者内で周知であり、当技術分野で記載されているプロトコルに従って決定することが可能である。したがって、特異的にハイブリダイズした配列のみの検出には、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、例えば、０．１×ＳＳＣ、６５℃で０．１％ＳＤＳ、または２×ＳＳＣ、６０℃、０．１％ＳＤＳという高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件などが必要だろう。相同性のまたは必ずしも相補的ではない配列の検出のための低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、６×ＳＳＣ、６５℃で１％ＳＤＳに設定され得る。周知のように、プローブの長さおよび決定する核酸の組成が、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメータを構成する。
【０２０７】
本明細書で使用する場合、用語「相同性」および「同一性」は、区別なく使用する。配列間の配列相同性または配列同一性の計算は、以下のように実行する。
【０２０８】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一率を求めるために、配列を最適比較のために整列させる（例えば、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に、最適アライメントのためにギャップを導入し、非相同性配列は比較のために無視することが可能である）。好適な実施形態では、比較のために整列させる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、より好適には少なくとも５０％、さらにより好適には少なくとも６０％、さらにより好適には少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列における位置が、第２配列の対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、その位置における分子は同一である（本明細書で使用する場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一率は、２つの配列の最適整列のために導入する必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一な位置の数の関数である。
【０２０９】
２つの配列間の配列比較および同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することが可能である。好適な実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www. gcg. comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けと、１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定する。さらなる別の好適な実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www. gcg. comで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスと、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付けと、１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用して決定する。特に好適なパラメータセット（および専門家が、分子が本発明の配列同一性または相同性の限界内にあるか否かを決定するために、どのパラメータを適用すべきかについて確信がない場合に使用されるべきもの）は、ギャップペナルティが１２、ギャップ伸長ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスである。
【０２１０】
あるいは、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているMeyers et al. (1989) CABIOS 4:11-17)のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長さペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、決定することが可能である。
【０２１１】
本明細書で使用する場合、用語「連続断片」は、参照する配列と同じ順で生じている、核酸またはアミノ酸の非中断配列を指す。特に想定されるのは、参照配列の長さの少なくとも２５％、５０％、７０％、７５％、８０％、または９０％の長さの連続断片、および、典型的に少なくとも２５核酸または少なくとも８アミノ酸を有する連続断片である。
【０２１２】
一実施形態では、核酸断片は、ＫＲＡＳのドメイン、領域、または機能部位に相当する配列を含むか、または該配列からなる。あるいは、ＫＲＡＳの核酸断片は、ＫＲＡＳポリペプチドのエピトープ担持領域をコードする。
【０２１３】
代わりの実施形態では、ＫＲＡＳは、限定するわけではないが、ヒトＫＲＡＳ（NP_004976.2、NP_203524.1など）、マウスＫＲＡＳ（NP_067259.4等）、ゼブラフィッシュＫＲＡＳ（NP_001003744.1等）、カエルＫＲＡＳ（NP_001095209.1）、ウシＫＲＡＳ（NP_001103471.1）ニワトリＫＲＡＳ（NP_001243091.1）、サルＫＲＡＳ（NP_001248441.1）、NP_001028153.1、NP_113703.1、およびNP_001008034.1、またはそのバリアントもしくは変異体からなる群から選択され得る。
【０２１４】
ヒトＫＲＡＳのポリペプチド配列情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３下で見つけることが可能である。特定の一実施形態では、本発明のＫＲＡＳポリペプチドは、ＫＲＡＳ（例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３）もしくはその連続断片、または、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３もしくはその連続断片のポリペプチド配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【０２１５】
ＫＲＡＳポリペプチドは、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３のＫＲＡＳポリペプチド配列の対立遺伝子バリアントであり得る。ＫＲＡＳポリペプチドは、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３のＫＲＡＳポリペプチド配列のＫＲＡＳポリペプチドのエピトープ担持領域であり得る。ＫＲＡＳポリペプチドは、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３のＫＲＡＳポリペプチド配列の断片、例えば、生物学的に活性な断片であり得る。
【０２１６】
本明細書で使用する場合、ＫＲＡＳポリペプチドの「生物学的に活性な断片」には、ＫＲＡＳポリペプチドのアミノ酸配列、例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３のポリペプチド配列と十分に相同的なまたは該アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれ、該ペプチドに含まれるアミノ酸は、全長ＫＲＡＳポリペプチドよりも少なく、ＫＲＡＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ呈する。例えば、ＫＲＡＳポリペプチドの生物学的に活性な断片は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１３３７０３のＫＲＡＳポリペプチド配列のＫＲＡＳポリペプチドの、１０、２５、５０、１００、２００、またはそれ以上の連続アミノ酸を含む、または該アミノ酸からなるポリペプチドであり得る。
【０２１７】
ＫＲＡＳの活性決定の文脈では、本明細書で使用する用語「活性」には、例えば、タンパク質レベルでの酵素活性を求めることおよび／または発現レベル（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を求めることが含まれる。本明細書で定義する活性を求める方法は、当技術分野で周知であり、本明細書でも以下に記載する。
【０２１８】
一実施形態において、ＫＲＡＳは変異ＫＲＡＳ、例えば、活性化ＫＲＡＳ変異体である。本明細書で使用する用語「活性化変異体」は、遺伝子、特にＫＲＡＳ遺伝子における変異を指し、これは、野生型と比較し、対応する遺伝子産物、つまりタンパク質、特に、ＫＲＡＳタンパク質の活性を高める。タンパク質、特にＫＲＡＳタンパク質の（高められた）活性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書でも以下に記載する。ＫＲＡＳ遺伝子の変異は、当技術分野で既知の方法により検出することが可能である。このような方法は、例えば、（Papadopoulos et al., 2006; Shendure et al., 2004）に記載されている。
【０２１９】
本発明は、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である可能性が低い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してまたは前記所定の参照レベルと比較して高い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する非応答性または非感受性を表す、方法を提供する。
【０２２０】
本発明は、また、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である可能性が高い対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す、方法を提供する。
【０２２１】
本発明は、また、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に恩恵を受け得る対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＫｒａｓの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルにおけるＫｒａｓの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＫｒａｓの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記患者が前記がん処置から恩恵を受け得ることを示す、方法を提供する。
【０２２２】
ＭＴＡＰ
本発明者らは、驚くべきことに、がん細胞／組織におけるメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）の発現または活性のレベルが、ｉ）システインおよび／またはｉｉ）セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する患者の応答性または感受性の可能性を表すことを特定した。ＭＴＡＰの発現または活性のレベルを使用して、システインおよび／またはシステインを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性であろう対象のがん細胞、例えば腫瘍を特定することが可能である。また、バイオマーカーを使用して、患者のがんのための処置の選択を助けることも可能である。これに関し、本発明は、バイオマーカーおよびその使用を、バイオマーカーの使用を含む方法およびキットと併せて提供する。
【０２２３】
さらなる態様において、本発明は、システインおよび／またはセリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対し応答性または感受性である患者集団を特定するために、ＭＴＡＰをバイオマーカーとして使用することを提供する。
【０２２４】
本発明は、また、システインを実質的に欠く食餌を含むがん処置に恩恵を受け得る対象を特定する方法であって：
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰの発現または活性のレベルを求めるステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現または活性のレベルを、対照サンプルか、またはＭＴＡＰの発現もしくは活性の所定の参照レベルと比較するステップとを含み、
前記対照サンプルと比較してもしくは前記所定の参照レベルと比較して低い、前記生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、前記対照サンプルもしくは前記所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記患者が前記がん処置から恩恵を受け得ることを示す、方法を提供する。
【０２２５】
本明細書で使用する場合、用語「ＭＴＡＰ」は、Ｓ−メチル−５’−チオアドノシン（ＭＴＡ）のアデニンおよび５−メチルチオリボース−１−ホスフェートへの可逆性リン酸化を触媒する、Ｓ−メチルー５’チオアデノシンホスホリラーゼを指す。この酵素は、ポリアミン代謝において主要な役割を果たし、アデノシンおよびメチオニンの両方の再生にとって重要である。ＭＴＡＰは、多くのがんにおいて欠乏していることが知られているが、これは、しばしば、ＭＴＡＰ遺伝子と腫瘍抑制遺伝子ｐ１６の共欠損を原因とする。
【０２２６】
本明細書で使用する場合、用語「ＭＴＡＰ」は、ポリペプチドおよび核酸分子の両方を指すために使用する。
【０２２７】
好適には、ＭＴＡＰはヒトのＭＴＡＰポリペプチドまたは核酸分子である。
【０２２８】
ヒトＭＴＡＰ遺伝子の核酸配列情報は、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ００００００９９８１０下で見つけることが可能である。特異的な一実施形態では、本発明のＭＴＡＰ遺伝子は、ＭＴＡＰ核酸（Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ００００００９９８１０）もしくはその連続断片、または、Ｅｎｓｅｍｂｌアクセッション番号ＥＮＳＧ００００００９９８１０の核酸配列もしくはその連続断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは少なくとも９９％同一な配列を含む。
【０２２９】
本明細書で提供するヒトＭＴＡＰ配列以外の哺乳類または非哺乳類種のＭＴＡＰの核酸配列は、当技術分野で既知の方法を使用し、例えば、核酸シーケンシングにより、またはハイブリダイゼーションアッセイを使用して、または手動のもしくは用語「ハイブリダイゼーション」の定義と関連して本明細書の下記で言及するようなコンピュータプログラムを使用することによるアライメントと相同性の程度を使用することにより、当業者によって特定され得る。
【０２３０】
一実施形態において、核酸断片は、ＭＴＡＰのドメイン、領域、または機能部位に相当する配列を含むか、または該配列からなる。あるいは、ＭＴＡＰの核酸断片は、ＭＴＡＰポリペプチドのエピトープ担持領域をコードする。
【０２３１】
代わりの実施形態では、ＭＴＡＰは、ヒトＭＴＡＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列か、またはそのバリアントもしくは変異体とすることができる。
【０２３２】
ヒトＭＴＡＰのポリペプチド配列情報は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３１２６下で見つけることが可能である。特定の一実施形態では、本発明のＭＴＡＰポリペプチドは、ヒトＭＴＡＰもしくはその連続断片か、または、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３１２６（例えば、Ｑ１３１２６−１）のポリペプチド配列もしくはその連続断片と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
【０２３３】
ＭＴＡＰポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３１２６のＭＴＡＰポリペプチド配列の対立遺伝子バリアントであり得る。ＭＴＡＰポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３１２６のＭＴＡＰポリペプチド配列のエピトープ担持領域であり得る。ＭＴＡＰポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３１２６のＭＴＡＰポリペプチド配列の断片、例えば、生物学的に活性な断片であり得る。
【０２３４】
本明細書で使用する場合、ＭＴＡＰポリペプチドの「生物学的に活性な断片」には、ＭＴＡＰポリペプチドのアミノ酸配列、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１３１２６のポリペプチド配列と十分に相同的なまたは該アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれ、該ペプチドに含まれるアミノ酸は、全長ＭＴＡＰポリペプチドよりも少なく、ＭＴＡＰポリペプチドの活性を少なくとも１つ呈する。例えば、ＭＴＡＰポリペプチドの生物学的に活性な断片は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３１２６（例えば、Ｑ１３１２６−１）のＭＴＡＰポリペプチド配列のＭＴＡＰポリペプチドの、１０、２５、５０、１００、２００、またはそれ以上の連続アミノ酸を含む、または該アミノ酸からなるポリペプチドであり得る。
【０２３５】
ＭＴＡＰの活性を決定する文脈では、本明細書で使用する用語「活性」には、例えば、タンパク質レベルでの酵素活性を求めることおよび／または発現レベル（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を求めることが含まれる。本明細書で定義する活性を求める方法は、当技術分野で周知であり、本明細書でも以下に記載する。
【０２３６】
本明細書で使用する場合、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置が、該処置の後でまたは該処置に続き、がんもしくは腫瘍の増殖を緩やかにする、がんもしくは腫瘍の増殖を防ぐ、または、がんもしくは腫瘍の１つもしくは複数の症状、例えば、腫瘍負荷を減少させる場合、対象は、該処置に対し「応答性」または「感受性」である。そのため、好適な実施形態では、処置により腫瘍負荷が処置中または処置後に減少した場合に、対象は応答性である。一部の実施形態では、腫瘍またはがんが、寛解に入るかまたは根絶された場合に、対象は処置に対し応答性である。
【０２３７】
本明細書で使用する場合、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置が、該処置の後でまたは該処置に続き、がんもしくは腫瘍の増殖を緩やかにしない、がんもしくは腫瘍の増殖を防がない、または、がんもしくは腫瘍の１つもしくは複数の症状、例えば、腫瘍負荷を減少させない場合、対象は、該処置に対し「非応答性」または「非感受性」である。そのため、好適な実施形態では、処置中または処置後に腫瘍負荷が増加した場合に、対象は非応答性である。一部の実施形態では、腫瘍もしくはがんが拡張する、広がる、もしくは転移する場合、または、１つもしくは複数のがんの症状が処置中もしくは処置後に悪化する場合、対象は処置に対し非応答性である。
【０２３８】
本発明の開示方法は、典型的には、対象から得た生物学的サンプルにおいてＫＲＡＳまたはＭＴＡＰの発現レベルを検出するステップを含む。本明細書で使用する場合、用語「生物学的サンプル」および「対象から単離したサンプル」は、区別なく使用して、対象から単離した組織、細胞、および生物学的流体、ならびに、対象内に存在する組織、細胞、および流体を指す。
【０２３９】
好適な実施形態では、対象は、がんのある対象であり、より好適には、サンプルは、がん細胞またはがん組織のサンプルである。生物学的サンプルは、単一がん細胞を含み得るが、好適には、多数のがん細胞を含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、生物学的サンプルは、腫瘍から得たがん細胞を含む。一部の実施形態では、生物学的サンプルは、腫瘍から得てはいないがん細胞を含む。例えば、一部の実施形態では、がん細胞は循環がん細胞である。生物学的サンプルは、他の成分またはがん細胞ではない細胞を含み得る。例えば、サンプルは、非がん性細胞、組織等を含み得る。好適な実施形態では、生物学的サンプルは、正常な組織から単離したまたは分離したがん細胞を含む。他の実施形態では、生物学的サンプルは、がん組織またはがん臓器から得る。
【０２４１】
生物学的サンプルは、当技術分野で既知である種々の方法を使用して対象から得ることが可能である。一部の実施形態では、サンプルは組織バイオプシー、例えばパンチバイオプシーである。サンプルは、利用する検出方法に従って、取り扱うべきである。一部の実施形態では、組織起源または細胞起源の生物学的サンプルを、カオトロピック剤、界面活性剤、還元剤、緩衝液、および塩の１つまたは複数を任意選択的に含有する溶解緩衝液に溶解することが可能である。ｍＲＮＡレベルについて解析する生物学的サンプルを取り扱う条件は、タンパク質レベルについて解析する生物学的サンプルを取り扱う条件とは異なり得、そのような条件は当技術分野で既知である。サンプルが、凝固因子を含む血液サンプル（例えば、全血サンプル）である場合、調製物には、抗凝固剤が含まれ得る。
【０２４２】
サンプルは、サンプルを解析する前に濃縮するかまたは適切な希釈剤で希釈することが可能である。サンプルを凍結する、加工しないでおく、固定（例えばホルマリン固定）する、遠心分離する、および／または包埋（例えばパラフィン包埋）すること等が可能である。サンプル中のマーカー量を評価する前に、細胞サンプルに、周知である種々の収集後調製保存技術（例えば、核酸および／またはタンパク質の抽出、固定、保存、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等）を施すことが可能である。同様に、バイオプシーにも、収集後調製保存技術、例えば固定を施してよい。
【０２４３】
本発明の方法でアッセイし処理することが可能ながんの種類としては、限定するわけではないが、以下の：大腸がん、肝がん、骨肉腫、リンパ腫、および乳がんが挙げられる。
【０２４４】
本発明の文脈では、ＫＲＡＳ／ＭＴＡＰの発現は、任意の適切な方法により測定される、ＫＲＡＳ／ＭＴＡＰ遺伝子またはタンパク質の、遺伝子またはタンパク質の発現レベルを意味する。
【０２４５】
典型的には、特定の遺伝子の発現レベルは、細胞もしくは組織においてＫＲＡＳ／ＭＴＡＰ遺伝子より転写されたｍＲＮＡのレベルを測定することにより転写レベルに反映されるか、または、細胞もしくは組織におけるタンパク質レベルを測定することにより、翻訳レベルに反映される。本方法は、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイとすることが可能である。
【０２４６】
本発明に従って、サンプル中のＫＲＡＳまたはＭＴＡＰの発現レベルを検出する方法を提供する。ＫＲＡＳまたはＭＴＡＰの発現レベルは、サンプル中のＫＲＡＳまたはＭＴＡＰのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することにより求めることができる。サンプル中のｍＲＮＡを測定する方法としては、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、次世代シーケンシングを使用したトランスクリプトーム解析、アレイハイブリダイゼーション解析、デジタルＰＣＲ、ノーザン解析、ドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびＲＮａｓｅプロテクションアッセイが挙げられる。
【０２４７】
定量的リアルタイムＰＣＲが、細胞または組織のサンプルの特定のｍＲＮＡレベルを求めるのに特に適切であり、この場合、ｍＲＮＡはまずｃＤＮＡに逆転写され、次に、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲにより増幅される。このｑＲＴ−ＰＣＲ法は、当技術分野で周知である。次世代シーケンシングまたはマイクロアレイも、ｍＲＮＡレベルの検出に使用することができる。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、細胞または組織のサンプル、例えば、ＦＦＰＥ組織サンプル中のＫＲＡＳのｍＲＮＡレベルをｉｎ  ｓｉｔｕで検出することもできる。
【０２４８】
一部の実施形態では、ＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰの発現を、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲなど）使用して求めることができる。このようなＰＣＲアッセイは、当技術分野で周知である。例えば、一部の実施形態では、生物学的サンプルにおいて、ＫＲＡＳ／ＭＴＡＰ由来のｍＲＮＡを検出する方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して逆転写によりサンプルからｃＤＮＡを生成するステップと；そのように生成したｃＤＮＡを増幅するステップと；前記増幅ｃＤＮＡの存在を検出するステップとを含む。さらに、このような方法は、生物学的サンプル中のｍＲＮＡレベルを決定することを可能にする（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることにより）、１つまたは複数のステップを含むことが可能である。任意選択的に、増幅したｃＤＮＡの配列を決定することが可能である。ノーザンブロット解析は、当技術分野で周知の従来技術であり、例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, third edition, Cold Spring Harbor Press, NY (2000) 11803-2500に記載されている。
【０２４９】
一部の実施形態では、ＫＲＡＳ／ＭＴＡＰ遺伝子は、例えば、プローブまたはプライマーにより検出することが可能である。用語「プローブ」は、本明細書で使用する場合、精製制限酵素消化物中て天然に生じたものであれ、合成的に生成されたものであれ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸、つまりＲＮＡもしくはＤＮＡを指し、これは、該プローブに相補的な配列を有する核酸にアニールするまたは特異的にハイブリダイズすることが可能である。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブの正確な長さは、温度、プローブの供給源、方法の用途を含む多くの因子に左右されよう。例えば、診断的用途では、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、１５−２５、またはそれ以上のヌクレオチドを含有する。ただし、より少ないヌクレオチドを含有する場合もある。
【０２５０】
一部の実施形態では、生物学的サンプルは、少量の細胞を含有するか、または単細胞である。少量細胞（例えば、１０００〜１０細胞）および単細胞において、ｃＤＮＡを増幅し、ｍＲＮＡ発現を解析する方法は、当技術分野において周知である。このような方法としては、例えば、セミランダムプライムＰＣＲおよびｐｈｉ２９に基づくｃＤＮＡ増幅ステップが挙げられる。
【０２５１】
（特異的な）ｍＲＮＡを結合させるこれらのおよび他の適切な方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook and Russell (2001, loc. cit.)に記載されている。当業者は、検出シグナルの強度と決定すべき遺伝子産物の量の間の相関関係、好適には直線的相関を利用することにより、成分、特に前記遺伝子産物の量を求めることが可能である。
【０２５２】
細胞または組織のサンプルにおけるＫＲＡＳ／ＭＴＡＰタンパク質発現を検出するために、細胞または組織のサンプルにおけるタンパク質レベルを測定する任意の既知の方法を、本発明で使用することができる。
【０２５３】
サンプル中のＫＲＡＳ／ＭＴＡＰタンパク質発現を測定する方法としては、例えば、イムノアッセイ、リガンド結合アッセイ、質量分析法、または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。いくつかの方法には、ＫＲＡＳ／ＭＴＡＰタンパク質と特異的に免疫応答性である抗体を、サンプル中のＫＲＡＳ／ＭＴＡＰタンパク質と免疫反応させる条件下で、細胞または組織のサンプルを接触させ、結合抗体量を測定する、イムノアッセイが含まれる。例示的なイムノアッセイとしては、限定するわけではないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降アッセイ、ウェスタンブロット、蛍光イムノアッセイ、および免疫組織化学、フローサイトメトリー、タンパク質アッセイ、マルチプレックスビーズアレイ、磁気捕捉、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ならびに光褪色後蛍光回復／位置測定（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）が挙げられる。他の好適な実施形態では、細胞または組織のサンプルにおけるＫＲＡＳの有無は、ＩＨＣにより決定する。
【０２５４】
いくつかのイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡは、２つの異なるバイオマーカー特異的な抗体またはリガンド（例えば、捕捉リガンドまたは抗体と検出リガンドまたは抗体）を必要とし得ることが理解されよう。ある実施形態では、ＫＲＡＳを表面においてリガンドまたは抗体で捕捉し、タンパク質バイオマーカーを酵素で標識する。一例では、検出抗体をビオチンまたはストレプトアビジンに結合させて、ビオチンまたはストレプトアビジンを含有する、ビオチン−ストレプトアビジンと酵素との結合を生成する。酵素基質を着色分子に変換することによりシグナルを生成し、光センサで吸光度を測定することにより溶液の色の強さを定量化する。考えられるアッセイは、タンパク質バイオマーカーの存在を示す観察可能な色変化を生成する発色性のレポーターおよび基質を利用し得る。蛍光発生性で、電気化学発光性の、リアルタイムＰＣＲリポーターも、定量化可能なシグナルを作成すると考えられる。
【０２５５】
いくつかのアッセイは、抗体をサンプルと接触させる前に、１つまたは複数の抗体を固体支持体に固定して、複合体の洗浄および後続の単離を容易にすることを任意選択的に含む。固体支持体の例としては、マイクロタイタープレート、スティック、ビーズ、またはマイクロビーズなどの形をしたガラスまたはプラスチックが挙げられる。抗体も、プローブ、基質、またはＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイに付着させることが可能である。
【０２５６】
フローサイトメトリーは、粒子を流体の流れに懸濁させ、それらを電子検出装置のそばを通過させることにより、タンパク質バイオマーカーをカウントし、選別し、検出する際に利用することができる、レーザーに基づく技法である。フローサイトメーターには、色を基準に異なる粒子を識別する機能がある。異なる色素を有する粒子の別個の着色、２つ以上の異なる波長での放射は、粒子を識別することを可能にする。マルチプレックス解析、例えばＦＬＯＷＭＥＴＲＩＸ（商標）は、Fulton, et al., Clinical Chemistry, 43(9):1749-1756 (1997)で論じられており、これは、同じサンプルを有する単一チューブにおいて、同時に多数の別個のアッセイを実行することを可能にする。
【０２５７】
別の好適な実施形態では、本発明のＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰの発現を、質量分析法により検出する。多次元的ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を、質量分析法と組み合わせて、ＫＲＡＳを分離することが可能である。また、患者のがんのＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰの遺伝子またはポリペプチドの有無または発現レベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することも可能である。一部の実施形態では、発現を、患者から単離した遺伝物質を含有する生物学的サンプルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出する。一部の他の実施形態では、マーカー遺伝子の発現を、例えば、「量子ドット」標識またはＣＴスキャンなどの技法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うことが可能である。
【０２５８】
ＫＲＡＳの活性は、発現のレベルを測定することによって求めることができるだけでなく、例えば、ＫＲＡＳのＧＴＰアーゼ活性を測定することにより、または、例えばＫＲＡＳの場合はｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔまたはｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋのレベルを求めることによって下流のシグナリング経路メンバーの活性を測定することによっても、求めることができる。前記タンパク質の活性を求める手段および方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈより推定することができる（Spektrum Akademischer Verlag, 1998）。細胞Ｒａｓ−ＧＴＰを検出するＫＲＡＳ活性化アッセイキットは、例えば、Jena BioscienceのＲａｓ活性化キットおよびCell Biolabs社のＫ−Ｒａｓ活性化アッセイキットなど、当技術分野で周知である。
【０２５９】
ＭＴＡＰの活性は、発現レベルを測定することによって求めることができるだけでなく、例えば、メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）の細胞流出を測定することによっても求めることができる。
【０２６０】
適切には、ＭＴＡは、本発明に従って、バイオマーカーとして使用することができる。一実施形態では、ＭＴＡＰに関する方法および用途は、ＭＴＡで代替することができ、本実施形態では、ＭＴＡと、ｉ）セリンを実質的に欠くおよび／またはｉｉ）システインが制限された食餌を用いた処置に対する「応答性」または「感受性」の間の相関性が、逆転する。ＭＴＡ流出の亢進は、そのような処置に対する応答性または感受性を表す。
【０２６１】
用語「活性」は、本明細書で使用する場合、タンパク質（例えば、ＫＲＡＳ）の活性を指し、一方、用語発現レベルは、タンパク質レベル（例えば、ウェスタンブロット等により求められる）または転写レベル（例えば、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ等により求めることができる、スプライスされた、スプライスされていない、または部分的にスプライスされたｍＲＮＡ）での発現を指す。
【０２６２】
本明細書で使用する場合、用語「上昇」は、本明細書で記載する方法によって検出されるバイオマーカーレベル（例えば、発現または活性）が、対照から得られる同じバイオマーカーのレベルまたは参照レベルと比較して、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上上昇することを指し得る。ある実施形態では、用語上昇はバイオマーカーレベルの上昇を指し、その上昇レベルは、対照でのバイオマーカーレベルまたは参照レベルと比較し、０．１倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上である。
【０２６３】
本明細書で使用する場合、用語「低下」は、本明細書に記載の方法によって検出されるバイオマーカーレベル（例えば、発現または活性）が、対照から得られる同じバイオマーカーのレベルまたは参照レベルと比較して、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上低下することを指し得る。ある実施形態では、用語低下はバイオマーカーレベルの低下を指し、その低下レベルは、対照でのバイオマーカーレベルまたは参照レベルと比較し、０．１倍、０．５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上である。
【０２６４】
本明細書で使用する場合、句または「実質的に同じ」は、当業者が、２つの値の差が、前記値によって測定される生物学的特徴の文脈内では、ほとんどまたは全く、生物学的および／または統計的に重要ではないと考えるような、２つの数値（例えば、テスト生物学的サンプルにおけるＫＲＡＳの発現または活性に関するある数値と、対照サンプルにおけるＫＲＡＳの発現または活性に関するもう一方の数値）の間で類似度が十分に高いことを示す。前記２つの値の差は、参照／比較値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、および／または約１０％未満である。
【０２６５】
本明細書に開示する方法は、対象から単離したサンプルにおいて検出されるバイオマーカー（例えば、ＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰ）のレベルを、対照レベルまたは所与の参照レベルと比較するステップを含む。
【０２６６】
本明細書で使用する場合、「対照」は、正常なレベルのバイオマーカー発現を有するサンプル、例えば、がんのないもしくはがんの疑いがない健康な対象からのサンプルか、または、ＫＲＡＳの場合、ＫＲＡＳ変異のないもしくはＫＲＡＳ変異の疑いがないサンプルを指す。好適には、対照サンプルは、正常な（例えば、非疾患の）細胞または組織のサンプルである。好適には、バイオマーカーがＫＲＡＳにおいて測定される場合、対照サンプルは野生型ＫＲＡＳについてポジティブである。対照サンプルは、対象から単離したサンプルと同じ組織または細胞タイプとすることができる。
【０２６７】
本明細書で使用する場合、用語「参照レベル」は、本明細書で記載する方法によって検出される、同じバイオマーカーの対照サンプルで得られるレベルと同じであるバイオマーカーレベル（つまり、ＫＲＡＳレベル）を指す。あるいは、参照レベルには、参照データベースに由来するバイオマーカー（例えば、ＫＲＡＳ）の発現レベルが含まれ得、該参照レベルを使用して、所定のカットオフ値、つまり、症状もしくは疾患またはその欠如を統計的に予測する診断スコアを生成することもできるし、該参照レベルを、標準集団サンプルに基づいた所定の参照レベルとすることも、あるいは、対象の発現レベルの基準線に基づく、つまり、臓器移植前の所定の参照レベルとすることもできる。好適には、対象から単離した生物学的サンプルは、参照値を得るために使用したのと同じテストプラットフォーム（例えば、ＲＴ−ＰＣＴによるｍＲＮＡ解析、イムノアッセイによるタンパク質解析等）を使用して、アッセイする。
【０２６８】
あるいは、予測は、バイオマーカー（例えば、ＫＲＡＳ）の正規化発現レベルに基づくものとすることができる。サンプル中のバイオマーカー（例えば、ＫＲＡＳ）の絶対発現レベルを、その発現と、マーカーではない参照核酸、例えば、恒常的に発現しているｍＲＮＡなどのｍＲＮＡの発現とを比較することによって修正することにより、発現レベルは正規化される。この正規化は、あるサンプルと別のサンプルにおける、または、異なる供給源からのサンプル間での発現レベルの比較を可能にする。この正規化発現は、次に、任意選択的に、参照レベルまたは対照と比較することが可能である。
【０２６９】
一態様において、本発明は、がんのある対象を処置する方法であって、
ａ）前記対象から単離した生物学的サンプルにおけるＫｒａｓの発現または活性のレベルが、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置に対する応答性または感受性を表すか否かを決定するステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルが、前記がん処置に対する応答性または感受性を表す場合に、前記対象に前記がん処置を与えるステップとを含む、方法を提供する。
【０２７０】
ある実施形態において、セリンを実質的に欠く食餌は、ダイエタリー製品を含むか、またはダイエタリー製品から成る。本明細書で使用する場合、用語「ダイエタリー製品」は、１つまたは複数の必須アミノ酸またはその塩もしくはエステルを含む組成物であって、食品中で使用されるか、または食品と組み合わせて使用もしくは消費されて、サプリメントを消費する対象に、所望のレベルのアミノ酸またはその塩もしくはエステルを提供する、組成物を指す。これらの製品中の栄養成分としては：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物性薬品、アミノ酸、ならびに、酵素、臓器組織、腺、および代謝物などの物質が挙げられる。
【０２７１】
ダイエタリー製品は、粉末、ゲル、溶液、懸濁液、ペースト、固体、液体、原液、再構成可能な粉末、シェイク、濃縮物、ピル、バー、タブレット、カプセル、またはすぐに使用できる製品の形態で提供することができる。ダイエタリー製品は、また、サプリメントが、タブレット、ピル、カプセル、液体、エアロゾル、注射可能液、または他の医薬的に許容される製剤の形態である場合、医薬組成物とすることが可能であると考えられる。
【０２７２】
本明細書で使用する場合、「実質的に欠く」は、セリンを完全に含まないまたは極めて少ないことを意味する。種々の実施形態では、食餌またはダイエタリー製品は、実質的にセリンを欠く。
【０２７３】
一実施形態では、前記がん処置は、セリンおよびグリシンを実質的に欠く食餌を含む。
【０２７４】
一部の実施形態では、前記がん処置は、化学療法レジメンまたは放射線療法レジメン中に、がん患者に投与する、セリンを実質的に欠く食餌を含む。好適には、前記がん処置は、さらに、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬から選択される治療薬の投与を含む。
【０２７５】
本明細書で使用する場合、がん細胞増殖阻害剤、放射線療法薬、および化学療法薬、ならびに／または放射線療法。
【０２７６】
このような、化学療法は、以下のカテゴリーの抗がん剤の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）アルキル化剤などの抗増殖／抗腫瘍薬およびそれらの組み合わせ（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ベンダムスチン、メルファラン、クロラムブシル、クロルメチン、ブスルファン、テモゾロミド、ニトロソウレア、イホスファミド、メルファラン、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ロムスチン、ストロプトゾシンおよびダカルバジン）；代謝拮抗薬（例えば、ゲムシタビンおよび抗葉酸剤、例えば、５−フルオロウラシルやテガフールなどのフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキセート、ペメトレキセド、シトシンアラビノシド、フロクスリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン、およびヒドロキシウレア）；抗生物質（例えば、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系薬剤、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン（登録商標）、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、および、ミスラマイシン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンやビノレルビンのようなビンカアルカロイドおよびタキソールやタキソテールのようなタキソイドおよびポロキナーゼ阻害剤）；プロテアソーム阻害剤、例えば、カルフィルゾミブおよびボルテゾミブ；インターフェロン療法；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドやテニポシドなどのエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロン、および、カンプトテシン）；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（タキソール（商標））、ｎａｂｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ドセタキセル、ミスラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシンＣ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−α）、エトポシド、テニポシド、ＤＮＡ脱メチル化剤（例えば、アザシチジンまたはデシタビン）；ならびにヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、ボリノスタット、ＭＳ−２７５、パノビノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）およびプラシノスタットＳＢ９３９）；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤などの細胞分裂阻害剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、および、酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨ拮抗剤またはＬＨＲＨ作用薬（例えば、ゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、黄体ホルモン剤（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタンとして）、および、フィナステリドなどの５＊−レダクターゼ阻害剤；ならびにナベルベン、ＣＰＴ−ＩＩ、アナストロゾール、レトロゾール、カペシタビン、レロキサファム、シクロホスファミド、イホスファミド、および、ドロロキサフィン；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤、例えば、ダサチニブおよびボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、ならびに、メタロプロテアーゼ阻害剤、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能の阻害剤、または、ヘパラナーゼ抗体；
（ｉｖ）成長因子機能阻害剤：例えば、このような阻害剤として、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体、例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン（商標））、抗ＥＧＦＲ抗体であるパニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体であるセツキシマブ、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリー阻害剤（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）、アファチニブ、バンデタニブ、オシメルチニブ、およびロシレチニブなどのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤）ラパチニブのなどのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤）、およびＣＴＬＡ−４、４−ＩＢＢおよびＰＤ−１などの共刺激分子に対する抗体、または、サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）に対する抗体；肝細胞増殖因子ファミリー阻害剤；インスリン増殖因子ファミリー阻害剤；細胞アポトーシスタンパク質レギュレーターのモジュレーター（例えば、Ｂｃｌ−２阻害剤）；イマチニブおよび／またはニロチニブ（ＡＭＮ１０７）などの血小板由来増殖因子ファミリー阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、ファルネシル転移酵素阻害剤などのＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤、ソラフェニブ、ティピファニブおよびロナファーニブなど）、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼによる細胞シグナル伝達の阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｐｌｔ３キナーゼ阻害剤、ＣＳＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体、キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤、および、ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤；ＣＣＲ２、ＣＣＲ４またはＣＣＲ６アンタゴニスト；ならびに、国際公開第２００６０４３０９０号、同第２００９０７７７６６号、同第２０１１０９２４６９、または同第２０１５０７５４８３号に記載されているようなＲＡＦキナーゼ阻害剤。
（ｖ）血管内皮増殖因子の機能を阻害する薬剤などの血管新生抑制剤［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ（アバスチン（商標））］；サリドマイド；レナリドマイド；ならびに、例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、バンデタニブ、バタラニブ、スニチニブ、アキシチニブ、および、パゾパニブ；
（ｖｉ）例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常遺伝子を交換するアプローチを含む、遺伝子療法；
（ｖｉｉ）例えば、アレムツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン（ゼヴァリン（登録商標））およびオファツムマブなどの抗体療法を含む免疫療法；インターフェロンαなどのインターフェロン、ＩＬ−２（アルデスロイキン）などのインターロイキン；インターロイキン阻害剤、例えばＩＲＡＫ４阻害剤；ＨＰＶワクチン、例えば、ガーダシル、サーバリックス、オンコファージおよびシプロイセルＴ（プロベンジ（登録商標））などの予防ワクチンおよび治療ワクチンを含む癌ワクチン；ｇｐ１００；樹状細胞ベースのワクチン（例えば、Ａｄ．ｐ５３ＤＣなど）；ｔｏｌｌ様受容体モジュレーター、例えばＴＬＲ−７またはＴＬＲ−９アゴニスト；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬ４−Ａモジュレーター（例えば、ニボルマブ）、抗体、およびワクチン；他のＩＤＯ阻害剤（例えば、インドキシモドなど）；抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（例えば、ＭＫ−３４７５およびニボルマブなど）；抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体（例えば、ＭＥＤＩ−４７３６およびＲＧ−７４４６など）；抗ＰＤＬ２モノクローナル抗体；ならびに抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、イピリムマブなど）；そして
（ｖｉｉｉ）細胞障害性剤、例えば、フルダラビン（フルダラ）、クラドリビン、ペントスタチン（ニペント（商標））；
（ｉｘ）標的療法、例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばイデラリシブおよびペリホシン；アポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）アンタゴニスト（ＩＡＰアンタゴニスト）としても知られるＳＭＡＣ（第２ミトコンドリア由来カスパーゼアクチベーター）類似体。これらの薬剤は、ＩＡＰ、例えば、ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、およびｃＩＡＰ２を抑制することにより細胞アポトーシス経路を再構築するように作用する。特定のＳＭＡＣ類似体には、Ｂｉｒｉｎａｐａｎｔ（ＴＬＲ３２７１１、TetraLogic Pharmaceuticals）、ＬＣＬ１６１（Novartis）、ＡＥＧ４０７３０（Aegera Therapeutics）、ＳＭ−１６４（ミシガン大学）、ＬＢＷ２４２（Novartis）、ＭＬ１０１（Sanford-Burnham Medical Research Institute）、ＡＴ−４０６（Ascenta Therapeutics／ミシガン大学）、ＧＤＣ−０９１７（Genentech）、ＡＥＧ３５１５６（Aegera Therapeutic）、およびＨＧＳ１０２９（HUMAN Genome Sciences）；ならびに、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）を標的にする薬剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）、およびＭＬＮ９７０８が含まれる；そして
（ｘｉｉ）キメラ抗原受容体、抗がんワクチン、およびアルギナーゼ阻害剤。
【０２７７】
本方法で使用する治療薬は、単剤または薬剤の組み合わせとすることが可能である。好適な組み合わせには、異なる作用機序を有する薬剤が含まれるだろう。
【０２７８】
用語「〜と組み合わせて投与される」および文法上の同等物等は、本明細書で使用する場合、単一患者に選択した治療薬を投与することを包含することを意味し、薬剤を同じもしくは異なる投与経路により、または、同じもしくは異なる時刻に投与する処置レジメンを含むことを意図する。一部の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、他の薬剤と共投与されよう。これらの用語は、２つ以上の薬剤を動物に投与し、その結果、両薬剤および／またはそれらの代謝物が、同時にその動物内に存在することを包含する。これらの用語には、別個の組成物での同時投与、別個の組成物での異なる時刻での投与、および／または、両薬剤が存在する組成物での投与が含まれる。したがって、一部の実施形態では、本発明の化合物と他の薬剤を、単一組成物において投与する。
【０２７９】
本明細書に開示する薬剤は、皮内、皮下、経口、動脈内、または静脈内を含む、任意の経路により投与することができる。好適には、投与は静脈内経路によるだろう。好適には、非経口的投与が、急速投与でまたは注入により提供され得る。
【０２８０】
本発明に従って投与する治療薬の濃度は、投与する化合物の投与量、利用する化合物の薬物動態学的特徴、および投与経路を含むいくつかの要因に応じて変動しよう。薬剤は、単回投与か複数回投与で投与することができる。処置は、患者の健康全般、ならびに選択した化合物の配合および投与経路を含むいくつかの因子に応じて、毎日またはより頻繁に投与することができる。
【０２８１】
好適には、前記がん処置は、さらに、治療的に有効な量の前記治療薬を投与することを含む。用語「治療的に有効な量」は、本明細書で使用する場合、特定の疾患または病気を処置または予防するのに十分な、投与する少なくとも１つの薬剤または化合物の量を指す。結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因の減少および／もしくは軽減、または、生物システムの任意の他の所望の変化であり得る。例えば、治療用途での「有効量」とは、疾患の臨床的に著しい低減を提供するのに必要な、本明細書で開示する化合物を含む組成物の量である。任意の個々のケースにおける適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技法を使用して決定することが可能である。
【０２８２】
ある実施形態では、食餌を、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、または治療的エンドポイントが観察されるまで、例えば、腫瘍収縮が観察されるまでの期間にわたり投与する。
【０２８３】
セリンを実質的に欠く食餌がダイエタリー製品を含むか、またはダイエタリー製品から成る場合、ダイエタリー製品を毎日１〜１０回投与する。
【０２８４】
本発明は、また、サンプルにおけるＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰの存在を検出するためのキットを含む。本発明のキットは、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定するのに特に使用される。例えば、キットは、生物学的サンプルにおいてＫＲＡＳポリペプチドまたは核酸の発現または活性を検出することが可能な化合物または薬剤を含み得る。キットは、生物学的サンプルにおいてＭＴＡＰポリペプチドまたは核酸の発現または活性を検出することが可能な化合物または薬剤を含み得る。化合物または薬剤は、適切な容器にパッケージ化することが可能である。キットは、さらに、ＫＲＡＳおよび／またはＭＴＡＰのタンパク質または核酸分子を検出するキットを使用するための指示書を含み得る。
【０２８５】
一態様では、本発明は、セリンを実質的に欠く食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定する際に使用するキットであって：
ａ．Ｋｒａｓの発現または活性を求める薬剤と；
ｂ．アッセイ用試薬とを含む、キットを提供する。
【０２８６】
キットは、さらに、ＭＴＡＰの発現または活性を求める薬剤を含み得る。
【０２８７】
別の態様では、本発明は、ｉ）セリンを実質的に欠く；および／またはｉｉ）システインが制限された食餌を含むがん処置から恩恵を受ける対象を特定する際に使用するキットであって：
ａ．ＭＴＡＰの発現または活性を求める薬剤と；
ｂ．アッセイ用試薬とを含む、キットを提供する。
【０２８８】
本発明のキットでは、薬剤は、抗体または核酸分子とすることができる。
【０２８９】
抗体に基づくキットでは、キットは：（１）本発明のポリペプチドマーカー（例えば、ＫＲＡＳまたはＭＴＡＰ）に特異的に結合する（例えば、固体支持体に付着した）第１抗体と；任意選択的に、（２）ポリペプチドマーカーまたは第１抗体の何れかに結合し、検出可能薬剤に結合する、第２の異なる抗体とを含み得る。
【０２９０】
オリゴヌクレオチドに基づくキットでは、キットは：（１）バイオマーカー（例えば、ＫＲＡＳもしくはＭＴＡＰ）核酸分子にハイブリダイズする、ヌクレオチドプローブ、例えば、検出可能に標識したプライマーか、または（２）バイオマーカー核酸分子を増幅するプライマー対を含み得る。
【０２９１】
キットは、また、検出可能薬剤（例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な要素を含み得る。キットは、また、アッセイし、含有されるテストサンプルと比較することが可能な、対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含有し得る。
【０２９２】
キットは、また、使用指示書を含み得る。
【０２９３】
一実施形態において、キットがＫＲＡＳの発現または活性を求める場合、キットは、対照サンプルと比較してまたは所定の参照レベルと比較して高い、生物学的サンプルのＫｒａｓの発現または活性のレベルは、前記がん処置に対する対象の非応答性または非感受性を表し、対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、生物学的サンプルのＫｒａｓの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＫｒａｓの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する対象の応答性または感受性を表すという指示書を含む。
【０２９４】
一実施形態では、キットがＭＴＡＰの発現または活性を求める場合、キットは、対照サンプルと比較してもしくは所定の参照レベルと比較して低い、生物学的サンプルのＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベル、または、対照サンプルもしくは所定の参照レベルと実質的に同じであるＭＴＡＰの発現もしくは活性のレベルは、前記がん処置に対する対象の応答性または感受性を表すという指示書を含む。
【実施例】
【０２９５】
実施例１（図１、２、３、４、１８、１９、２０、２１、２２、および２３）
方法
細胞株および細胞培養
ＤＬＤ１およびＳＷ４８０細胞を、ＡＴＣＣより得て、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ１０を使用して認証した。ｉＫＲＡＳ細胞（ｉＫＲＡＳ１、ｉＫＲＡＳ３、ＡＫ１９６）が、親切なことにRon DePinho (Ying et al., Cell, 2012)，(The University of Texas MD Anderson Cancer Center)より供給された。細胞培養培地を、ＧＩＢＣＯより購入した。製品番号を括弧内に示す。ＳＷ４８０およびｉＫＲＡＳ（ＤＭＥＭ−２１９６９）とＤＬＤ１（ＲＰＭＩ−１６４０−３１８７０）を、最終濃度が２ｍＭのＬ−グルタミンと共に、１０％ＦＢＳ（１０２７０）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびアムホテリシンを補充した規定の培地において維持した。保存ｉＫＲＡＳ細胞を、ドキシサイクリン２ｕｇ／ｍｌ（ＫＲＡＳ−オン）の存在下と、ドキシサイクリンを有する／有さない（ＫＲＡＳ−オン／オフ）培地中で、実験用に増殖させた。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２加湿インキュベーターに維持した。培養細胞を、Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ検出キット（Lonza）を使用して、マイコプラズマについて慣例的にテストした。
【０２９６】
増殖アッセイ
ｉＫＲａｓ細胞を、２４ウェルプレートの完全ＤＭＥＭ培地＋ドキシサイクリン２ｕｇ／ｍｌに播種し、一晩付着させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、セリンおよびグリシンを有するまたは有さない、ドキシサイクリン２ｕｇ／ｍｌを有するまたは有さないアッセイ培地を与えた。３重ウェルを、「時刻＝０」プレートを使用して、４８時間目と９６時間目に（Ｃａｓｙ  ＴＴ細胞カウンター，Innovatis，Roche Applied Scienceを使用して）カウントして、培地変更時からの相対的細胞数を計算した。示すデータは、３つの独立した実験によるものである。
【０２９７】
メトホルミンｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＤＬＤ１およびＳＷ４８０細胞を２４ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、セリンおよびグリシンを有するまたは有さない、既定投与量のドキシサイクリンを有するまたは有さないアッセイ培地を与え、３日間増殖させた。代表的なウェルを、光学顕微鏡を使用して撮影し、Ｃａｓｙ  ＴＴ細胞カウンターを使用してカウントした（図１９ｄ）。投与量−応答実験（図２３ｅ）では、細胞を、セリンおよびグリシンを有さないアッセイ培地か、または低セリンおよびグリシン（１０ｕＭ）を有するアッセイ培地の何れかに同じように播種し、３重ウェルを３日後にカウントした。
【０２９８】
オルガノイド培養 
ＡＤＦ＝２ｍＭのグルタミン、１％のぺニシリン／ストレプトマイシン溶液、０．１％のＡｌｂｕＭＡＸ  Ｉ  ＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（全てGibco/Life Technologies）を有する、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ  Ｆ／１２。腺腫をマウスの小腸から取り出し、切って小片にし、氷冷ＰＢＳで５回洗浄した。小片を５ｍＭのＥＤＴＡにおいて、１０分間４℃で、ローラ上でインキュベートした。陰窩を氷冷ＰＢＳ２回洗浄してＥＤＴＡを除去し、１０ｘトリプシン中で３７℃で３０分間インキュベートした。陰窩を多く含む上清を収集し、メカニカルピペッティングにより、５ｍＬのＡＤＦで５回、ざっと洗浄した。陰窩を、５分間の１２００ｒｐｍの遠心分離によりペレット化した。陰窩を成長因子低減マトリゲル（BD Biosciences）に再懸濁し、１２ウェルプレートの各ウェルに２０μＬを蒔いた。マトリゲルを３７℃のインキュベーターにおいて３０分間凝固させてから、０．０５μｇ／ｍｌのＥＧＦおよび０．１μｇ／ｍｌのノギン（１ウェルにつき全体積１ｍｌ）を補充した適切なＡＤＦを加えた。陰窩を、氷冷ＰＢＳ中に収集することにより分割し、３分間６００ｒｐｍで沈降させた。上清を吸引し、ペレットを、メカニカルピペッティングを使用して、１００μＬの氷冷ＰＢＳで分離させた。５ｍＬのＰＢＳをチューブに加え、３分間６００ｒｐｍで沈降させ、上清からデブリがなくなるまで繰り返した。最終陰窩ペレットを増殖因子低減マトリゲルで再懸濁し、前と同じように蒔いた。セリン／グリシン欠乏では、無アミノ酸のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ  Ｆ／１２（Gibco/Life Technologies）を使用して、セリンおよびグリシンを有しまたは有さず、他のアミノ酸は全て含有する、オルガノイド用アッセイ培地を構築した。
【０２９９】
食餌
離乳後、マウスに「通常の固形飼料」（Rat and Mouse Breeder and Grower, 801730, Special Diet Services, SDS, UK）と水を自由に与えた。通常の固形飼料では、食餌のアミノ酸は、原材料（小麦、小麦食、大麦、外皮を除去し取り出しきつね色に焼いた大豆、とうもろこし、および魚粉）に含有される全タンパク質と、補足として加えた少量の精製リシンに由来する。Baker Purified Amino Acid Diet（Hirakawa et al., Nutr. Res. 1984）に基づき、TestDiet（登録商標）（Richmond，IN）の実験食を２セット使用した：「食餌１−対照」は、全必須アミノ酸に加え、セリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、シスチン、およびチロシンを含有し、「食餌１−セリンなし、グリシンなし」は、食餌１−対照と同じだが、ただし、セリンとグリシンを含まず、同じ総アミノ酸含有量を達成するために他のアミノ酸レベルを比例して増やした。これらの「食餌１」製剤は、これまでにも使用された（Maddocks et al, Nature, 2013、および以下の「異種移植」より下を参照されたい）。「食餌２−対照」は、全必須アミノ酸に加え、セリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、シスチン、チロシン、アラニン、プロリン、グルタミン酸、およびアスパラギンを含有し；「食餌２−Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし／食餌２−ＳＧフリー」は、食餌２−対照と同じだが、ただし、セリンとグリシンを含まず、同じ総アミノ酸含有量を達成するために他のアミノ酸レベルを比例して増やした。「食餌２」製剤を、Ｅμ−Ｍｙｃ−Ｔｉｇａｒ−／−コホートに使用した（図１９ｆ）。他の全てのコホートには、すでに発表した「食餌１」製剤を与えた。
【０３００】
マウス
全ての動物研究を、Animals (Scientific Procedures) Act 1986とEU Directive 2010に準拠して実行し、該動物研究は、施設内倫理審査プロセス（University of Glasgow）により承認された。ハツカネズミコホートを、環境エンリッチメントを積極的に行った柵付きの設備に収容した。Ｅμ−Ｍｙｃ１１、ＡｐｃＭｉｎ／＋、Ｌｇｒ５ｃｒｅＥＲ；Ａｐｃｆｌ／ｆｌおよびＰｄｘ１ｃｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｆｌ／＋またはＴｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋マウス／モデルについては、これまでに説明されている。オスとメスの混合集団を、各遺伝子型として使用した。マウスの数（または、個々のマウスからのサンプル数）を、各図／図の凡例に示す。Ｅμ−Ｍｙｃ、およびＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、少なくとも２０世代のＣ５７ＢＬ／６Ｊだった。Ｅμ−Ｍｙｃ；Ｔｉｇａｒｆｌ／ｆｌマウスは、少なくとも５０％Ｃ５７ＢＬ／６Ｊだった。マウスに以下の時刻で適切な食餌をとらせた：純血Ｅμ−Ｍｙｃは生後６０日目、Ｅμ−Ｍｙｃ；Ｔｉｇａｒｆｌ／ｆｌは生後５５日目、ＡｐｃＭｉｎ／＋は生後８０日目、Ｌｇｒ５ｃｒｅＥＲ；Ａｐｃｆｌ／ｆｌは注入後７日目、Ｐｄｘ１ｃｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｆｌ／＋またはＴｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋は、生後６０日目。Ｌｇｒ５ｃｒｅＥＲによる組換えを、注射の間の休息日を用いて、１２０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンを２回腹腔内注射することで誘発した。フェンホルミン実験では、Ｅμ−Ｍｙｃマウスに１００ｍｇ／マウス体重ｋｇを強制経口投与し、これを食餌変更と同日に開始した。メトホルミン実験では、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに飲料水中で２００ｍｇ／ｋｇ／日を与え、これを食餌変更の４日後に開始した。全てのマウスを臨床エンドポイントまで世話をした。腫瘍数と腫瘍領域（幅×長さ）のスコア付けを容易にするため、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの腸をメタカン（メタノール、クロロホルム、酢酸の比率が４：２：１）に固定した。
【０３０１】
マウス研究でのサンプルサイズは、生存期間における潜在的差をＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログ・ランク）解析によりテストした、これらのモデルを用いた以前の実験より推定した。最初の実験群（例えば、食餌のみを与えたＥμ−ＭｙｃおよびＡＰＣＭｉｎ／＋）からのデータを集めた後、後続の群のサイズを小さくして、使用する動物数を最小化した（例えば、フェンホルミンおよびメトホルミン処置群。全ての実験において、研究への登録時点で明白な表現型を持つマウスのみ除外した（つまり、登録しなかった）：例えば、Ｅμ−Ｍｙｃコホートでのリンパ節腫大または胸腺の肥大の兆候、ＡＰＣＭｉｎ／＋コホートでの貧血症状。腫瘍に無関係の疾病により死んだ動物は、打ち切り例として含めた。マウスを乱塊法に従って実験群に割り振った：マウスは繁殖により入手可能になることから、マウスを性別に基づき塊に分け、次に処置にランダムに割り当てた。潜在的な変動原因である性別を取り除くため、オス／メス比率を似た程度に維持するように注意した。研究者の実験群へのマウスの割り当ておよびエンドポイントデータの収集は、盲検化しなかった。
【０３０２】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）
サンプルを、メタノール、アセトニトリル、およびＨ２Ｏ（５０：３０：２０）からなる冷却した（−２０℃）溶解溶媒（ＬＳ）において調製した。１０μＬの血清サンプルを４９０μＬのＬＳに加え、ボルテックスし、沈殿タンパク質を遠心分離により除去した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、次に各ウェルに２５０μＬのＬＳを加え、４０℃で１０分間振とうすることによりオルガノイド抽出物を調製し、ＬＳをウェルから除去し、次にタンパク質を遠心分離により除去した。組織サンプルを急速凍結し、−８０℃で保存した。溶解前に、凍結サンプルを秤量し、次に、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Bertin Technologies）を使用して１ｍＬの冷ＬＳに均質化した。遠心分離により溶解物からタンパク質を除去し、溶解物濃度を、均質化後に、重量に基づき、ＬＳを用いて標準化した。抽出物をＡｃｃｅｌａ６００ＬＣシステムおよびＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Thermo Scientific）からなるＬＣＭＳプラットフォームにおいて解析した。ＳｅＱｕａｎｔ  ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）（Merck）を使用して、代謝物を、Ａ＝炭酸アンモニウム２０ｍＭ（ｐＨ９．４に調節）およびＢ＝アセトニトリルを混ぜた移動相で分離した。２０％のＡで開始し、２分後に直線的に増加させ、１７分で８０％にする勾配プログラムを使用し、その後、洗浄と平衡化ステップを続けた。本方法の全実行時間は２５分だった。ＬＣストリームを脱溶媒し、ＨＥＳＩプローブにおいてイオン化した。Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を、極性を切り替えながら、５００００の分解能で、７５−１０００ｍ／ｚの質量範囲において、フルスキャンモードで操作した。代謝物の特定および定量化のために、生データをＬＣｑｕａｎ（Thermo Scientific）およびＭＺＭｉｎｅ２．１０により解析した。
【０３０３】
ウェスタンブロット
細胞に対しウェスタンブロットを前述のように実行し（Maddocks et al, Nature, 2013; Labuschagne et al., Cell. Rep., 2014; Maddocks et al, Mol. Cell, 2016）、手短に、全細胞タンパク質溶解物を、完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム（両方ともSigma）を補充したＲＩＰＡ緩衝液において調製した。組織サンプルを、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Qiagen）を使用して、プロテアーゼとホスファターゼの阻害剤カクテル（Pierce/Thermo Scientific）を補充したＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。溶解物を遠心分離により除去し、プレキャストした４−１２％の‘ＮｕＰＡＧＥ’または‘Ｂｏｌｔ’ゲル（Invitrogen，Life Technologies）を使用して分離し、ニトロセルロース膜に移した。Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線スキャナおよびソフトウェア（Li-Cor Biosciences）を使用して、タンパク質を検出し、定量化した。関連する種に対する第２抗体は、結合したＩＲＤｙｅ６８０およびＩＲＤｙｅ８００（Li-Cor Biosciences）だった。使用した一次抗体は：ＰＨＧＤＨ（Sigma Life Science，HPA021241）、ＰＳＡＴ１（Novus Biologicals，NBP1-32920）、ＰＳＰＨ（Santa Cruz，sc-98683）、アクチンＩ−１９−Ｒ（Santa-Cruz，sc-1616-R）、ｐＥＲＫ［Phospho-p44/p42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204)］（Cell Signalling Technology9101）、ＡＭＰＫａ１（R&D Systems，AF3197）、およびホスホ−ＡＭＰＫＴ１７２（Cell Signalling Technology2535）だった。
【０３０４】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙキットを、ＤＮＡを除去するＤＮａｓｅ（両方ともQiagen）と共に使用して、ＲＮＡを抽出した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Applied Biosystems）と共に使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲを前述のように実行した（Maddocks et al, Nature, 2013）。プライマー（５´−３´）：ＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧに対しマウスＰＨＧＤＨ；マウスＰＨＧＤＨ  Ｒｅｖ  ＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴ；ＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＣＧＣＡＴＴＧＧに対しマウスＰＳＡＴ１；マウスＰＳＡＴ１  Ｒｅｖ  ＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＧＡＡＴＧ；ＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧに対しマウスＰＳＰＨ；マウスＰＳＰＨ  Ｒｅｖ  ＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣ。マウスＡｃｔｉｎＢはPrimer Design（HK-SY-mo-900 ACTB）より購入。配列はＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎにより合成し、精製。
【０３０５】
統計
生存期間データについての統計的比較を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログ・ランク）検定を使用し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ６）ソフトウェアを用いて計算した。Ｔ検定を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ｅｘｃｅｌ（ｖ１４．６．１）またはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ７）の何れかを使用して実行した。ｔｙｐｅ１／対応あり（サンプルを同じ動物から採取）およびｔｙｐｅ−２／独立（サンプルを異なる動物から採取）のＴ検定を使用した。潜在的差異の方向が予測されない場合は、両側／２両側Ｔ検定を使用した（例えば、血清サンプル中の全アミノ酸レベルで、図２１）。既存のデータにより、サンプル間の差の方向における予測が支持される場合、片側／片側Ｔ検定を使用した（例えば、ｄｅ  ｎｏｖｏセリン合成、図２ｄ）。提示するデータが個々のデータ点の平均であり、エラーバーがＳＴＤＥＶである場合もあるし、データが平均の平均であり、エラーバーがＳＥＭである場合もある。各例において、Ｔ検定またはエラーバーの該当する種類を、図の凡例において特定する。Ｔ検定を多重比較と共に行った場合、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ７）ソフトウェアを使用するＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を使用して、Ｐ値を修正した。
【０３０６】
異種移植
３ｘ１０６のＨＣＴ１１６細胞の左右対称な皮下注射を、８週ＣＤ−１−Ｆｏｘｎ１ｎｕメスマウス（Charles River）において行った；右側腹部にｐ５３＋／＋、左にｐ５３−／−（１ｅｘ）。注射の直後に、マウスに、以下のような配合の、対照食（ｎ＝１０）（アミノ酸混合物の一部としてセリンおよびグリシンを含有する）か、またはセリンおよびグリシンが欠乏した食餌（ｎ＝１０）（Test Diet、International Product Supplies）をとらせた：
対照食の成分：スクロース（２５．９％）、コーンスターチ（４１．８％）、コーン油（５．０％）、Ｂａｋｅｒアミノ酸ビタミン混合物（０．２％）、Ｂａｋｅｒアミノ酸ミネラル混合物（１０．０％）、重炭酸ナトリウム（１．０％）、ＤＬ−αトコフェリル酢酸（０．００４％）、エトキシキン（防腐剤、０．０１９％）、塩化コリン（０．１％）、アミノ酸プレミックス（１６．０％）。アミノ酸プレミックス：Ｌ−アルギニン−ＨＣＬ（１．６０％）、Ｌ−シスチン（０．６４％）、Ｌ−グルタミン（１．６０％）、グリシン（１．３３％）、Ｌ−ヒスチジン−ＨＣＬ（０．９６％）、Ｌ−イソロイシン（１．０７％）、Ｌ−ロイシン（１．６０％）、Ｌ−リシン−ＨＣＬ（１．８７％）、Ｌ−メチオニン（０．８０％）、Ｌ−フェニルアラニン（１．０７％）、Ｌ−セリン（１．３３％）、Ｌ−トレオニン（１．０７％）、Ｌ−トリプトファン（０．２７％）、Ｌ−チロシン（０．５３％）、Ｌ−バリン（１．０７％）。セリンおよびグリシンフリー食は、対照食と基本的な配合は同じであるが、アミノ酸混合物はセリンとグリシンを欠く。セリンおよびグリシンフリー食の成分：スクロース（２５．９％）、コーンスターチ（４１．８％）、コーン油（５．０％）、Ｂａｋｅｒアミノ酸ビタミン混合物（０．２％）、Ｂａｋｅｒアミノ酸ミネラル混合物（１０．０％）、重炭酸ナトリウム（１．０％）、ＤＬ−αトコフェリル酢酸（０．００４％）、エトキシキン（防腐剤、０．０１９％）、塩化コリン（０．１％）、アミノ酸プレミックス（１６．０％）。アミノ酸プレミックス：Ｌ−アルギニン−ＨＣＬ（１．６０％）、Ｌ−シスチン（０．６４％）、Ｌ−グルタミン（１．６０％）、Ｌ−ヒスチジン−ＨＣＬ（０．８０％）、Ｌ−イソロイシン（１．２８％）、Ｌ−ロイシン（１．９２％）、Ｌ−リシン−ＨＣＬ（２．２４％）、Ｌ−メチオニン（０．９６％）、Ｌ−フェニルアラニン（１．２８％）、Ｌ−トレオニン（１．２８％）、Ｌ−トリプトファン（０．３２％）、Ｌ−チロシン（０．６４％）、Ｌ−バリン（１．２８％）。
【０３０７】
食餌のカロリー値は等しく、総アミノ酸含有量も等しい。動物を無菌ＩＶＣケージに収容し、週に３回監視し、腫瘍が所定のサイズ（体積＝（長さｘ幅２）／２）または潰瘍化という臨床エンドポイントに到達した際に、人道的に殺処分した。全ての動物実験は、倫理審査プロセス（University of Glasgow）により承認され、１９８６年のUK Animals (Scientific Procedures) Act (PPL60/4181)とEU Directive2010に準拠して実行した。
【０３０８】
結果
ＫＲａｓの活性化およびｐ５３の損失（ＫｒａｓＧ１２Ｄｐ５３＋／−）または変異（ＫｒａｓＧ１２Ｄｐ５３Ｒ１７２Ｈ）により生じた膵臓がんの２匹のマウスモデルをテストした。驚くべきことに、何れのモデルにおいても、セリン／グリシンフリー食に応答した生存期間の著しい変化は観察されなかったが（図１ａおよびｂ）、ただし、血清のセリンおよびグリシンレベルは明白に減少した（図３ａおよびｂ）。１３Ｃ−１５Ｎ−標識セリンの静脈注射は、セリンの取り込みが、膵臓の正常組織および腫瘍組織において同等である一方、ＡＰＣｍｉｎモデルの腸腫瘍は、正常組織に比べ、（セリンおよびセリンに由来するグリシンの標識により測定されるように）著しく多くのセリンを取り込む（図１ｃ）ことを明らかにした。これらの結果は、ＡＰＣｍｉｎ腫瘍が外来性セリンを多く必要とすること、ひいてはＡＰＣｍｉｎ腫瘍の食餌性セリン制限に対する感受性と一致する。しかしながら、膵臓腫瘍は、外来性セリンに対する依存性が低いようで、これは、食餌に対する膵臓腫瘍の抵抗性を説明する。
【０３０９】
リンパ腫／腸腫瘍モデルと、膵臓モデルの間の明白な違いは、後者において、活性化Ｋｒａｓが存在することである。活性化Ｒａｓは、マクロピノサイトーシス、つまり、細胞の遊離循環セリンレベルへの依存度を低くすることが可能な機序を通して、細胞外タンパク質へアクセスする細胞の機能を高めることが示されている。しかしながら、ＳＳＰ経路酵素の過剰発現も細胞外セリンへの依存を取り除き得るから、本研究者らは、ｄｅ  ｎｏｖｏセリン合成を行うこれらの細胞の機能に対するＫＲａｓＧ１２Ｄ発現の影響も調べることにした。本研究者らは、ドキシサイクリン誘導性ＫｒａｓＧ１２Ｄを有する膵臓細胞を使用して、ＫＲａｓＧ１２Ｄの下方制御後に、ＲＮＡとタンパク質レベルの両方で、ＳＳＰ酵素発現が一貫して減少することを発見した（図１ｄおよびｅ）。ＫｒａｓＧ１２Ｄを発現している細胞は、セリンおよびグリシンの欠乏に対し完全に抵抗性があった。ＫｒａｓＧ１２Ｄの不活性化は、完全培地において、これらの細胞の増殖速度を遅くし、重要なことに、ＫｒａｓＧ１２Ｄを有さない細胞は、セリン欠乏に対する感受性を取り戻し、セリンおよびグリシンフリー培地において、増殖のさらなる低下を示した（図１ｆ）。
【０３１０】
本研究者らは、また、オルガノイド培養モデルを使用し、ＫｒａｓＧ１２Ｄ発現が、セリン感受性腸腫瘍細胞に抵抗性を与え得るか否かをテストした。ＡＰＣｍｉｎ腸オルガノイドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで球として成長させたが、当社のｉｎ  ｖｉｖｏ研究と一致して、これらのオルガノイドの成長はセリンおよびグリシン除去により妨げられた（図２ａ）。対照的に、ＡＰＣｍｉｎ／ＫｒａｓＧ１２Ｄオルガノイドがセリン欠乏により受ける影響はずっと少なかった（図２ａ）。さらに、セリンおよびグリシンフリー条件での５日間の成長により、ＡＰＣｍｉｎオルガノイドが完全培地に再播種後に回復する機能はひどく損なわれた一方、ＫｒａｓＧ１２Ｄ発現オルガノイドは急速に回復した（図２ｂおよび図２８）。これらの表現型の変化は、ＫｒａｓＧ１２Ｄ発現腸細胞におけるＳＳＰ酵素のより高い基礎発現によりもたらされたものである（図２ｃ）。ＳＳＰは、解糖中間体を利用してセリンを作成するため、これらの細胞におけるＳＳＰ活性をテストするため、当研究者らは、１３Ｃ−標識グルコースを含有する培地においてオルガノイドを成長させ、標識したグルコースとセリン（グルコースから合成される）のレベルを測定した（図２ｄ）。標識グルコースレベルは、ＡＰＣｍｉｎとＡＰＣｍｉｎ  ＫｒａｓＧ１２Ｄ細胞で同等で、これらの細胞においてグルコースを取り込む機能が等しいことが示された一方、標識セリンのレベルはＫｒａｓＧ１２Ｄ発現細胞で著しく高く、ＫｒａｓＧ１２Ｄ発現細胞においてセリン合成速度が速いことが支持された（図２ｄ）。
【０３１１】
ＰＤＡＣ用ＧＥＭモデルにおける血清アミノ酸の解析により、食餌が、両モデルにおいてセリンおよびグリシンの全身レベルを著しく減少させることが示されたが（図３ａおよびｂ）、他のアミノ酸レベルは変わらなかったか、または軽微な／一貫性のない変化を示した。このセリンおよびグリシンの全身的な減少にも関わらず、ＰＤＡＣ腫瘍は、上記のｄｅ  ｎｏｖｏセリン合成を上方制御するその機能により、セリン／グリシン欠乏に対し抵抗性があった（図１および２）。対照的に、異種移植したヒト大腸がん細胞株（ＨＣＴ１１６）から形成されたヌードマウスの腫瘍は、食餌性セリン／グリシン欠乏に対し、感受性であった。異種移植モデルにおいて、セリン／グリシンフリー食は、腫瘍体積の著しい減少を引き起こし（図４ａ）、マウスの生存期間を著しく延ばした（図４ｂ）。
【０３１２】
異種移植モデルでなされた観察が自発性腫瘍にもいえるか否かを評価するため、リンパ腫（Ｅμ−Ｍｙｃ発現に基づいて）および腸腫瘍（不完全なＡＰＣ発現に基づいて）用に作られたモデルを使用した。マウスを、生後６０−８０日後に、通常の固形飼料食から実験食に移行させ、その後、前癌性病変が発症し（生後数日後のＡＰＣＭｉｎ／＋マウスに腺腫イニシエーションが起き、Ｅμ−Ｍｙｃマウスは、生後２８−４２日内に新生物発生前病変を発症する）、（予防ではなく）治療介入を再現した。両遺伝子型において、セリンおよびグリシンフリー食は著しく生存期間を延ばした（図１８ａおよびｂ）。ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの腫瘍領域は、臨床エンドポイント時のセリン／グリシンフリー食マウスの腫瘍サイズに、小さいが有意な腫瘍サイズの縮小傾向が見られるが、臨床エンドポイント時のセリン／グリシンフリー食マウスの腫瘍数には有意な差はないことを示した（図２０）。
【０３１３】
血清サンプルの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）解析は、食餌が、セリンおよびグリシンレベルの著しい低下を再現性よく引き起こすが、他のアミノ酸への影響は最小限であるかまたは一貫性がないことを示した（図１８ｃおよびｄ、図２１ａおよびｂ）。これらの変化は、対照食での約１５０μＭからセリンおよびグリシンフリー食での６５μＭという、血清のセリンおよびグリシンの減少につながった（図１８ｅ）。さらに、誘発性腸腫瘍モデル（Ｌｇｒ５−ｃｒｅＥＲ  ＡＰＣｆｌ／ｆｌ）を使用して、食餌の生存効果をさらに検証した；この場合、腫瘍誘発が開始された１週間後にマウスを食餌に移行させた。またも食餌は、対照食（精製アミノ酸を含有する）または通常の固形飼料（アミノ酸供給源として総タンパク質を含有する）と比較し、生存期間の著しい延長をもたらした（図１８ｆ）。
【０３１４】
セリン欠乏は、ｄｅ  ｎｏｖｏセリン合成を活性化し、解糖中間体をエネルギー生成から転用する。細胞はＯＸＰＨＯＳを増加させることにより応答してＡＴＰレベルを維持し、ＯＸＰＨＯＳを抑制することは、セリン欠乏の抗増殖効果を高め得る。これらの知見が自発性腫瘍モデルにもいえるか否かをテストするため、Ｅμ−Ｍｙｃマウスにおいて、セリンおよびグリシン欠乏を、ビグアナイドフェンホルミン（複合体Ｉ阻害剤）と組み合わせた。最大投与量のフェンホルミン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）は、通常食のマウスには耐えられたが、セリンおよびグリシン欠乏食を与えたマウスでは著しい毒性（排便障害に似た症状）を誘発した。これは、本研究者らに本研究への補充を減らすことを強いたが、すでに補充し、毒性に屈しなかったマウス（７／１４）に、さらなる有害作用はなかった。これらのマウスを、フェンホルミンを有する食餌で維持し、該マウスは、セリンおよびグリシンフリー食のみの動物と比較し、生存期間の改善傾向を示した。しかしながら、初期の毒性のために、残存したマウスが少なすぎて、この効果を統計的に有意にすることはなかった（図１９ａ）。これらの結果はこれまでの研究と整合性があり、腫瘍同種移植系におけるセリン欠乏とビグアナイド処置の共同作用を示す。
【０３１５】
ビグアナイド処置とセリン欠乏の潜在的相乗効果をさらに調査するため、本研究者らは、より毒性が低く、抗糖尿病薬として診療所で広く使用され、抗がん剤として治験されているメトホルミンに目を向けた。経口メトホルミンの全身アベイラビリティは概して貧弱であるが、一部の組織（腸を含む）は、メトホルミンの取り込みを促進するＯＣＴ１トランスポーターを発現し、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスを生存可能モデルにする。以前の研究に導かれて、ヒト一日投与量の１ｇ／日と同等である（体表面積計算による）、マウスにおけるメトホルミン投与量（２００ｍｇ／ｋｇ／日）を選択した。０．５−１ｇ／日の投与量が大腸がんにおける多数のメトホルミン臨床治験に使用されており、つまり、当研究者らは、臨床的に適切な投与量を選んだが、フェンホルミンで見られた毒性を避けるために、準最大投与量を選んだ。しかしながら、セリン欠乏の有益な効果は持続するものの、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの生存期間に対するメトホルミンの有意な影響を検出することができなかった（図１９ｂならびに図２２およびｂ）。興味深いことに、メトホルミンは、実際に、両食餌群に存在する腫瘍数を増加させ（セリンおよびグリシンフリー食群では統計的に有意）（図１９ｃ）、平均腫瘍領域に実質的な変化はなかった（図２２ｃ）。この結果は、ＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰＣｆｌ／ｆｌマウスに由来する腸腫瘍オルガノイドにおける、セリン欠乏と共同するメトホルミン（１０００ｕＭ）の能力を考えると驚くべきであるが（図１９ｄ）、腫瘍−オルガノイドデータも、低投与量メトホルミンがセリンおよびグリシン欠乏に拮抗し、腫瘍細胞を欠乏から守ることを示した（図１９ｄ）。メトホルミンのこれらの投与量依存的効果（セリンおよびグリシン欠乏の影響から保護するまたは該影響を増強することの何れかに対する）は、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルに対するメトホルミンの影響に関連している可能性が高く、ＲＯＳレベルは低投与量メトホルミンでは低下し、高投与量メトホルミンでは増大する（図１９ｅ）。
【０３１６】
なぜメトホルミン処置がセリン／グリシン欠乏マウスで有効でないように見えたかを調べるため、血清および組織を質量分析計により解析した。メトホルミン処置マウスからの血清および組織の解析（図２３ａ、２３ｂ、および２３ｃ）により、メトホルミンレベルが比較的低く、その範囲では、セリンおよびグリシン欠乏の抗増殖効果を（増強するのではなく）弱めると予測されることが示された。血清グルコースおよび乳酸の解析により、これらの低レベルのメトホルミンは、全身代謝への影響が最小限であることが示された（図２３ｄ）。これらの濃度では、メトホルミンは、セリン／グリシン欠乏ＡＰＣ欠損オルガノイドとの相乗効果がなく（上で検討したように、図１９ｄ）、ＡＰＣ切断型大腸細胞株では、２０μＭで細胞数の増加傾向を示した（図２３ｅ）。メトホルミンには、チオレドキシンの上方制御を含む古くから知られた抗酸化特性があり、本研究者らは、抗酸化物質が、セリンおよびグリシン欠乏時にＲＯＳから守ることにより、細胞の生存期間を改善することを示した。したがって、本研究は、臨床的に適切な投与量および組織透過性にもかかわらず、メトホルミンレベルが腫瘍増殖を阻害するには低すぎたことを示唆する。これは、高投与量とはいえ、メトホルミンで、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの腫瘍領域の中程度の減少を示す（腫瘍数の変化はない）これまでの研究とは対照的である。
【０３１７】
これまで、セリンの枯渇が培養細胞をＲＯＳに対しより感受性にすることを示した。そのため、ＲＯＳレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで上昇させることがセリン枯渇食の抗腫瘍効果を高めるか否かを直接的にテストするため、Ｔｉｇａｒ欠失マウスを使用した。ＴＩＧＡＲタンパク質は、ＲＯＳを制限することにより腫瘍形成を支えることが示されている。この混合株バックグラウンドにおいて、Ｅμ−Ｍｙｃの発現は、純Ｂｌ６  Ｅμ−Ｍｙｃよりも速く、マウスをリンパ腫で死に至らせたが（図１８ａに示す）、予想通り、Ｔｉｇａｒ欠失後は生存期間が延びることを発見した（図１９ｆ）。重要なことに、Ｔｉｇａｒ欠失とセリンおよびグリシンフリー食の組み合わせには効果の改善が見られ、生存期間の著しい全体的な延長をもたらした（図１９ｆ）。これらのデータは、腫瘍ＲＯＳレベルを上昇させることが、セリンおよびグリシンフリー食と組み合わせた場合に生存期間の改善をもたらすだろうという概念を支持する。多くの化学療法薬および放射線療法がＲＯＳを誘発するため、この食餌を標準的な抗がん処置と組み合わせる優れた可能性が存在する。
【０３１８】
実施例２（図５および表１）
方法
ＨＣＴ１１６（１ウェルにつき６０００細胞）、ＤＬＤ１（１ウェルにつき６０００細胞）、およびＳＥ４８０（１ウェルにつき１００００細胞）の細胞を、９６ウェルプレートにおいて、セリンおよびグリシンを含有するまたは欠く（ただし、他のアミノ酸は全て含有する）培地の何れかに播種した。６時間後、既定の薬物を規定の投与量（０．１−１０ｕＭの範囲）でプレートに加え、細胞をさらに４８時間インキュベートした。この時間後、細胞をホルマリン（４％）溶液に固定し、ＤＡＰＩ核染料で染色した。細胞カウントをＯｐｅｒｅｔｔａシステムを使用して行った。結果を図５に示す。
【０３１９】
ヒト細胞株ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、およびＳＷ４８０を、９６ウェルプレートに、セリン、グリシン、およびシステインを１００ｕＭで含有し、他のアミノ酸が全て存在する完全培地か、または、他のアミノ酸が全て存在する、低セリン、グリシン、システイン（１７−２３ｕＭ）培地の何れかに播種した。６時間後、既定の化学療法薬をウェルに加え（０．０１、０．１および１ｕＭの投与量で）、細胞をさらに４８時間インキュベートした。この時間の後、細胞をホルマリン固定し、自動化（Ｏｐｅｒｅｔｔａ）プレートリーダーでの細胞カウントのために、蛍光核染料で染色した。細胞数データを使用して、相乗スコアを導きだして、どの薬物が、低セリン／グリシン／システインと組み合わせて与えた場合に相乗的であるか（つまり、相加効果より大きいか）を計算した（以下参照）。結果を表１に示す。
【０３２０】
図５に示すデータは、（多数の薬物クラスからの）多数の抗がん化学療法薬が、セリンおよびグリシン欠乏と組み合わさった場合、ヒトがん細胞において抗増殖活性を高めたことを実証する。そのため、このデータは、がん患者においてセリンおよびグリシンフリー食と従来の化学療法を組み合わせることにより、化学療法の抗腫瘍活性が高められるおよび／または化学療法をより低い投与量で使用することが可能になることを示唆する。
【０３２１】
表１は、特定の薬物と培地中のセリン、グリシン、およびシステインの減少との組み合わせの、３つの大腸細胞株での平均相乗スコアを示す。
【０３２２】
【表１−１】
2019507754.tif 000004
【表１−２】
2019507754.tif 000005
【０３２３】
表１に示すデータは、（セリンおよびグリシンフリー食またはセリン、グリシン、およびシステインフリー食をとった場合にｉｎ  ｖｉｖｏで起きるような）低濃度のセリン、グリシン、およびシステインにさらされたヒトがん細胞が、多数の化学療法薬の抗増殖作用に対し、より感受性であることを示す。表１に上げた化学療法薬では、低セリン、グリシン、およびシステインと組み合わせた場合に抗増殖活性に対し相乗効果がある；つまり、アミノ酸制限と組み合わせた各薬剤の抗増殖作用は、単独で与えた薬剤の抗増殖作用とアミノ酸制限のみの効果の和よりも大きい。そのため、このデータは、がん患者においてセリンおよびグリシン／セリン、グリシン、およびシステインフリー食と従来の化学療法を組み合わせることが、化学療法の抗腫瘍活性を高めるおよび／または化学療法をより低い投与量で使用することを可能にすることを示唆する。
【０３２４】
実施例３（図６、７、１０、および１１）
方法
Ｃ５７Ｂｌ６マウス（１食餌群につきｎ＝３）に、対照食（上記の「食餌２−対照」を参照）か、セリンおよびグリシンを欠く食餌（上記の「食餌２−Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし」）を６週間与えた。末端血清サンプルを上記のようにＬＣＭＳにより解析した。全非必須アミノ酸の相対量を示す。＊Ｐ＜０．０５独立ｔ検定。結果を図６に示す。
【０３２５】
細胞培養：ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞は、Bert Vogelstein教授の寄贈品だった。ＳＷ４８０、Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＭＣＦ７細胞は、ＡＴＣＣより得た。細胞培養生成物は、特に明記しない限りＧｉｂｃｏより得た；カタログ番号は括弧内に示す。細胞を、３７℃の空気中で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において増殖させた。保存細胞は１０％のウシ胎児血清（FBS;10270）およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したマッコイ５Ａ培地（２６６００）か、または、１０％ＦＢＳ（G10270）、２ｍＭのＬ−グルタミン、およびペニシリンーストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（21969）に維持した。欠乏実験のため、セリンおよびグリシンを欠く「アッセイ培地」を、透析したＦＢＳ（HyClone, Thermo Scientific）、２ｍＭのＬ−グルタミン、Ｄ−グルコース（Sigma-Aldrich；最終濃度１７ｍＭ）、ＭＥＭビタミン（11120）、およびペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（21090）を用いて配合した。
【０３２６】
取り込み／流出アッセイ：規定の細胞を、６ウェルプレートの完全培地に（アッセイの終わりまでに〜９０％コンフルエントとなる適切な播種濃度で）播種し、４８時間増殖させた（培地は２４時間後に新しくした）。アッセイの開始時に、細胞をＰＢＳで洗浄し、セリンおよびグリシンの両方（０．４ｍＭ）を補充したアッセイ培地を１ウェルにつき１．５ｍＬ与えた。規定の時点で、１０μＬの培地を除去し、４９０μＬの氷冷メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（５０：３０：２０）に加えた。これらのサンプルを以下に記載するように、ＬＣ−ＭＳ用に調製した。
【０３２７】
液体クロマトグラフィー−質量分析：サンプルを４℃で１０分間振とうし、次に１５分間１６０００×ｇで遠心分離し、上清を収集し、ＬＣ−ＭＳにより解析した。解析物を、ＳｅＱｕａｎｔ  ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣカラム（２．１×１５０ｍｍ，５μｍ）（Merck）を有する親水性相互作用液体クロマトグラフィーを使用して分離し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＥｘａｃｔｉｖｅをＡｃｃｅｌａ  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒとＡｃｃｅｌａ  ６００ｐｕｍｐ（Thermo Scientific）と併せて使用する高分解能精密質量質量分析で検出した。溶出緩衝液は、緩衝液Ａではアセトニトリルで、緩衝液Ｂでは、Ｈ２Ｏ中の２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＣＯ３および０．１％ＮＨ４ＯＨだった。直線勾配を、１００μＬ／分の流速で、８０％緩衝液Ａから開始し、２０分後に２０％緩衝液Ａで終わり、その後、洗浄（２０％緩衝液Ａ）および再平衡化（８０％緩衝液Ａ）ステップが続くようにプログラムした。質量分析計にエレクトロスプレー−イオン化プローブを装着し、フルスキャンおよび４．５ｋＶの正の電圧と３．５ｋＶの負の電圧の極性スイッチモードで操作した。セリンおよびグリシンのレベルを、細胞溶解物および培地に打った５点検定曲線を使用して定量化した。代謝物特定およびデータ解析を、ＬＣＱＵＡＮソフトウェア（Thermo Scientific）を使用して実行した。結果を図７に示す。
【０３２８】
結果
図７に示すデータは、セリンおよびグリシンを食餌から除去することは、また、食餌性システイン／シスチンが存在する場合でも、ｉｎ  ｖｉｖｏでシステイン／シスチンレベルの枯渇をもたらし得ることを実証する。この効果は、セリンがｄｅ  ｎｏｖｏシステイン合成に使用されることにより生じる可能性が高い（図１０および１１参照）。このデータは、また、メチオニン（ｉｎ  ｖｉｖｏのシステインの前駆体でもある必須アミノ酸）の食餌性制限が、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全身のシステインレベルをさらに枯渇させ得ることを示唆する。図７に示すデータは、多数の形態のがんのがん細胞株が、貪欲に外来性システイン／シスチンを消費することを示し、これは、がん細胞が増殖するために外来性システインを必要とし、ｄｅ  ｎｏｖｏシステイン合成に欠陥があり得ることを示す（図１０および１１参照）。
【０３２９】
実施例４（図８、９、１２、および１３）
方法
規定の細胞を２４ウェルプレートに、１ウェルにつき２ｘ１０＾４〜１ｘ１０＾５で播種し、一晩付着させた。次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、実験増殖培地を加えた。培地は、セリン、グリシン、システイン、および他のアミノ酸を全て含有し、完全（＋ＳＧＣ）であるか、または、セリンおよびグリシンのみを欠くか（−ＳＧ）、または、システインのみを欠いた（−Ｃ）。別の「時刻０」カウントプレートを使用して、開始細胞数を記録した。培地を２４時間ごとに変え、プレートを２日後および４日後にカウントした。相対的細胞数を、「時刻０」時の細胞数との比較により計算した。カウントでは、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁し、ＣＡＳＹ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ  Ｃｅｌｌカウンター（Innovatis，Roche Applied Science）を用いてカウントした。データは３重ウェルの平均であり、エラーバーは標準偏差である。結果を図８に示す。
【０３３０】
規定の細胞を２４ウェルプレートの、既定の濃度（５００ｕＭ〜０．１６ｕＭの範囲）のセリン、グリシン、およびシステインを有する（ただし、他のアミノ酸は全て豊富である）培地に（１ウェルにつき２ｘ１０＾４〜１ｘ１０＾５で）播種し、４８時間後にカウントした。カウントでは、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁し、ＣＡＳＹ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ  Ｃｅｌｌカウンター（Innovatis，Roche Applied Science）を用いてカウントした。結果を図９に示す。
【０３３１】
規定の細胞を２４ウェルプレートに、１ウェルにつき２ｘ１０＾４〜１ｘ１０＾５で播種し、一晩付着させた。次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、実験増殖培地を加えた。培地は、全アミノ酸を有し完全であるか（＋全ＡＡ）、セリンおよびグリシンのみを欠くか、（−Ｓｅｒ  Ｇｌｙ）、セリン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、プロリン、およびグルタミン酸を欠くか（−Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ）、またはセリン、グリシン、およびチロシンを欠くか（−Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ）、またはセリン、グリシン、およびシステインを欠くか（−Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ）、またはセリン、グリシン、およびアルギニンを欠いた（−Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ）。別の「時刻０」カウントプレートを使用して、開始細胞数を記録した。培地を２４時間ごとに変え、プレートを２日後および３日後にカウントした。相対的細胞数を、「時刻０」時の細胞数との比較により計算した。カウントでは、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁し、ＣＡＳＹ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ  Ｃｅｌｌカウンター（Innovatis，Roche Applied Science）を用いてカウントした。データは３重ウェルの平均であり、エラーバーは標準偏差である。結果を図１２に示す。
【０３３２】
ＨＣＴ１１６細胞を、２４ウェルプレートに１ウェルにつき４ｘ１０＾４で播種し、一晩付着させた。次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、実験増殖培地を加えた。培地は、２０個のアミノ酸を全て有し完全であるか、既定の個々のアミノ酸（チロシン／アルギニン／システイン）を欠くか、または、既定のアミノ酸の組み合わせ（チロシン／アルギニン／システイン／セリン／グリシン）を欠いた。別の「時刻０」カウントプレートを使用して、開始細胞数を記録した。培地を２４時間ごとに変え、プレートを４日後にカウントした。細胞数の変化を、「時刻０」時の細胞数との比較により計算し、パーセンテージとして計算した（時刻０＝１００％）。例えば、完全培地の細胞では、４日後の細胞数は、時刻０に対し１４００％だった。時刻０からの負の％変化をした細胞は、細胞死を経験したもので、ｘ軸を下回って現れる。カウントでは、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁し、ＣＡＳＹ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ  Ｃｅｌｌカウンター（Innovatis，Roche Applied Science）を用いてカウントした。データは３重ウェルの平均であり、エラーバーは標準偏差である。結果を図１３に示す。
【０３３３】
結果
図８および９のデータは、外来性システインの除去が多タイプのがんからのがん細胞の増殖を阻害し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシステイン枯渇は、がん細胞の増殖を阻害するのに非常に効果的で、セリンおよびグリシン欠乏のみよりも、高い増殖阻害を達成することを示す。図１２は、除去した（つまり、細胞に欠乏している）外来性非必須アミノ酸の特定の組み合わせが、がん細胞において増殖が阻害される程度を決定することを示す。セリンおよびグリシンのみを除去することの抗増殖効果は、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、およびグルタミン酸を除去することにより最小限に高められる。一方、セリンおよびグリシンと組み合わせて、チロシン、アルギニン、システインを個別にさらに除去すると、増殖に対しより劇的な影響を及ぼす。図１３は、さらに、システインまたは非必須アミノ酸の特異的組み合わせががん細胞から除去された場合に、細胞毒性効果（つまり、単なる抗増殖活性を上回る）が達成され得、細胞毒性効果は、多数の非必須アミノ酸が除去された場合に最大になることを示す。
【０３３４】
実施例５（図１４）
方法
セリン合成経路酵素（ＰＨＧＤＨ、ＰＳＡＴ１、およびＰＳＰＨ）の発現を、セリンおよびグリシンありまたはなしで４８時間増殖させた規定のがん細胞株（左上パネル）において、（上記のように）ウェスタンブロットにより求めた。規定の細胞を、２４ウェルプレートに１ウェルにつき４ｘ１０＾４〜１ｘ１０＾５で播種し、一晩付着させた。次に細胞をＰＢＳで１回洗浄し、セリンおよびグリシンを含有するかまたは欠く増殖培地を加えた（両培地とも全必須アミノ酸と、システイン、アルギニン、グルタミン、およびチロシンは含有した）。別の「時刻０」カウントプレートを使用して、開始細胞数を記録した。培地を２４時間ごとに変え、プレートを２日後および４日後にカウントした。相対的細胞数を、「時刻０」時の細胞数との比較により計算した。カウントでは、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡに再懸濁し、ＣＡＳＹ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ  Ｃｅｌｌカウンター（Innovatis，Roche Applied Science）を用いてカウントした。データは３重ウェルの平均であり、エラーバーは平均の標準誤差である。結果を図１４に示す。
【０３３５】
結果
図１４のデータは、がん細胞の、ｄｅ  ｎｏｖｏセリン合成を請け負う酵素の発現レベルは様々で、これらのタンパク質の発現は、セリンおよびグリシン欠乏に対する細胞の感受性に影響を与えることを示す。つまり、高レベルのセリン合成酵素を発現している細胞は、セリンおよびグリシン欠乏の抗増殖効果に対し抵抗性があるが、低発現の細胞は感受性である。
【０３３６】
実施例６（図１５、１６、１７）
方法
規定の細胞を、６ウェルプレートの完全培地に（アッセイの終わりまでに〜９０％コンフルエントとなる適切な播種濃度で）播種し、４８時間増殖させた（培地は２４時間後に新しくした）。アッセイの開始時に、細胞をＰＢＳで洗浄し、セリンおよびグリシンの両方（０．４ｍＭ）またはセリンのみ（０．４ｍＭ）を補充したアッセイ培地（全必須アミノ酸、グルタミン、アルギニン、チロシン、およびシステインを含有する）を１ウェルにつき１．５ｍＬ与えた。規定の時点で、１０μＬの培地を除去し、４９０μＬの氷冷メタノール／アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（５０：３０：２０）に加えた。これらのサンプルを以下に記載するように、ＬＣ−ＭＳ用に調製し、ＬＣ−ＭＳにより解析した。結果を図１６および１７に示す。
【０３３７】
結果
図１５、１６、および１７のデータは、がん細胞が、システインのｄｅ  ｎｏｖｏ合成の前駆体の総流出（つまり放出）を示すことを示す。ホモシステインは、メチオニンに由来し、哺乳類細胞でのシステインのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に必須である（図１０および１１も参照されたい）。ホモシステインは、種々の形態でこれらのがん細胞から失われ−システインを作れないこと、そのため、システイン欠乏に対し感受性であることに潜在的に寄与する−、ホモシステインは、不変分子（ホモシステイン）としてまたはホモ二量体（ホモシスチン）および（システインを有する）ヘテロ二量体として質量分析法により検出することが可能である。
【０３３８】
実施例７（図２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１）
細胞株および細胞培養
ＨＣＴ１１６細胞をＡＴＣＣより得て、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ１０を使用して認証した。ｉＫＲＡＳ細胞（ｉＫＲＡＳ１、ｉＫＲＡＳ３、ＡＫ１９６）が、親切なことにRonald DePinho教授より供給された（Ying et al., Cell, 2012），（The University of Texas MD Anderson Cancer Center）。細胞培養培地はＧＩＢＣＯから購入した。製品番号を括弧内に示す。ｉＫＲＡＳ（DMEM-21969）およびＨＣＴ１１６細胞（RPMI-1640-31870）を、最終濃度が２ｍＭのＬ−グルタミンと共に、１０％ＦＢＳ（10270）、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびアンホテリシンを補充した規定の培地において維持した。保存ｉＫＲＡＳ細胞を、ドキシサイクリン２μｇ／ｍｌ（ＫＲＡＳ−オン）の存在下と、ドキシサイクリンを有する／有さない（ＫＲＡＳ−オン／オフ）培地中で、実験用に増殖させた。細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２加湿インキュベーターに維持した。培養細胞を、Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ検出キット（Lonza）を使用して、マイコプラズマについて慣例的にテストした。
【０３３９】
増殖アッセイ
ＨＣＴ１１６細胞（１ウェルにつき２．５ｘ１０＾４）を、２４ウェルプレートの完全ＲＰＭＩ培地に播種し、一晩付着させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、種々の濃度のセリンおよびグリシン２を補充した修正ＭＥＭ培地を与えた。培地は２４時間ごとに新しい培地と交換した。ウェルを、「時刻＝０」プレートを使用して、既定の時点で（Ｃａｓｙ  ＴＴ細胞カウンター，Innovatis，Roche Applied Scienceを使用して）カウントして、培地変更時刻からの相対的細胞数を計算した。
【０３４０】
腫瘍オルガノイド培養
ＡＤＦ＝２ｍＭのグルタミン、１％のぺニシン／ストレプトマイシン溶液、０．１％のＡｌｂｕＭＡＸ  Ｉ  ＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（全てGibco/Life Technologies）を有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２。腺腫様小腸組織を切除し、切って小片にし、氷冷ＰＢＳで５回洗浄した。小片を５ｍＭのＥＤＴＡにおいて、１０分間４℃で、ローラ上でインキュベートした。陰窩を氷冷ＰＢＳで２回洗浄してＥＤＴＡを除去し、１０ｘトリプシン中で３７℃で３０分間インキュベートした。陰窩を多く含む上清を収集し、メカニカルピペッティングにより、５ｍＬのＡＤＦで５回、ざっと洗浄した。陰窩を、５分間の１２００ｒｐｍの遠心分離によりペレット化した。陰窩を成長因子低減マトリゲル（BD Biosciences）に再懸濁し、１２ウェルプレートの各ウェルに２０μＬを蒔いた。マトリゲルを３７℃のインキュベーターにおいて３０分間凝固させてから、０．０５μｇ／ｍｌのＥＧＦおよび０．１μｇ／ｍｌのノギン（１ウェルにつき全体積１ｍｌ）を補充した適切なＡＤＦを加えた。陰窩を、氷冷ＰＢＳ中に収集することにより分割し、３分間６００ｒｐｍで沈降させた。上清を吸引し、ペレットを、メカニカルピペッティングを使用して、１００μＬの氷冷ＰＢＳで分離させた。５ｍＬのＰＢＳをチューブに加え、３分間６００ｒｐｍで沈降させ、上清からデブリがなくなるまで繰り返した。最終陰窩ペレットを増殖因子低減マトリゲルで再懸濁し、前と同じように蒔いた。ＳＧ欠乏向けに、無アミノ酸のＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ  Ｆ／１２（Gibco/Life Technologies）を使用して、セリンおよびグリシン（０．２ｍＭ）を有しまたは有さず、他のアミノ酸は全て含有する、オルガノイド用アッセイ培地を構築した。ＬＣＭＳ解析用に、オルガノイドを１２ウェルプレートの完全培地において３日間成長させた。培地を吸引し、オルガノイドをＰＢＳで洗浄した。培地を、１５ｍＭ  １３Ｃ６−グルコース（cK-Gas/Cambridge同位体）を補充したグルコースフリーＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Gibco/Life Technologies）と交換した。５時間後、培地を吸引し、オルガノイドを手短にＰＢＳで洗浄し、代謝物を以下に記載するように抽出した。
【０３４１】
オルガノイドの画像化
オルガノイドを、メトホルミン／ダウノルビシン（両方ともSigmaより）を有するまたは有さない規定の培地に播種し、２日間成長させた。サイズ定量化（ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実行）用の画像を、光学顕微鏡を使用して撮り、次にオルガノイドを４％パラホルムアルデヒドに固定した。ＲＯＳ損傷を、オルガノイドを、抗マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）（Abcam，ab6463）を用いて免疫染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４第２抗体（Thermo Fisher Scientific）を用いて評価した。画像をＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００反転共焦点レーザー走査型顕微鏡に取り込み、ＭＤＡ染色をＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。
【０３４２】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）
サンプルをメタノール、アセトニトリル、およびＨ２Ｏ（５０：３０：２０）からなる冷却した（−２０℃）溶解溶媒（ＬＳ）において調製した。１０μＬの血清サンプル（末端血液から単離し、−８０℃で保存）を４９０μＬのＬＳに加え、ボルテックスし、沈殿タンパク質を遠心分離（４０℃で１０分間１５０００ｒｐｍ）により除去した。手短にウェルを過剰なＰＢＳで洗浄し、次に、１ウェルにつき２５０μＬのＬＳを加え、ロッキングシェーカー上に４℃で１０分間置き、ＬＳをウェルから（オルガノイド／マトリゲルの機械的破砕なしに）除去し、次にボルテックスし、遠心分離により除去することにより、オルガノイド抽出物を調製した。組織サンプルを急速凍結し、−８０℃で保存した。溶解前に、凍結サンプルを秤量した。次に、組織をＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Bertin Technologies）またはＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Quiagen）を使用して１ｍＬの冷ＬＳに均質化した。遠心分離により溶解物からタンパク質を除去し、溶解物濃度を、均質化後に、元の組織重量に基づき、ＬＳを用いて１０ｍｇ／ｍＬに標準化した。
【０３４３】
抽出物をＡｃｃｅｌａ６００ＬＣシステムおよびＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Thermo Scientific）からなるＬＣＭＳプラットフォームにおいて解析した。ＭＳ検出の前に２つのＬＣ方法を代謝物分離に適用した。方法１は、ＳｅＱｕａｎｔ  ＺＩＣ−ｐＨＩＬＩＣカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）（Merck）を、Ａ＝炭酸アンモニウム２０ｍＭ（ｐＨ９．４に調節）およびＢ＝アセトニトリルを混ぜた移動相と共に利用した。２０％のＡで開始し、２分後に直線的に増加させ、１７分で８０％にする勾配プログラムを使用し、その後、洗浄と平衡化ステップを続けた。方法１の総実行時間は２５分だった。方法２は、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）（Merck）を、Ａ＝０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を有する水およびＢ＝０．１％ギ酸を有するアセトニトリルを混ぜた移動相と共に利用した。２０％のＡで開始し、直線的に増加させ、３０分で８０％にする勾配プログラムを使用し、その後、洗浄と再平衡化ステップを続けた。方法２の全実行時間は４６分だった。ＬＣストリームを脱溶媒し、ＨＥＳＩプローブにおいてイオン化した。Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を、極性を切り替えながら、５００００の分解能で、７５−１０００ｍ／ｚの質量範囲において、フルスキャンモードで操作した。セリンおよびグリシンのＬＣＭＳ定量化を、解析サンプルに合う適切なマトリックスに希釈した１３Ｃ−１５Ｎ−標識アミノ酸（Sigma）を使用する６点標準曲線を用いて達成した。代謝物の特定および定量化のために、生データをＬＣｑｕａｎ（Thermo Scientific）およびＭＺＭｉｎｅ２．１０により解析した。
【０３４４】
無作為メタボロミクス
ＬＣＭＳの生データを、ＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄを使用してｍｚＭＬファイルに変換し、ピーク抽出およびサンプルアライメントのためにＭＺＭｉｎｅ２．１０にインポートした。生成した．ＣＳＶファイルを、代謝物特定およびバックグラウンドシグナルの除去のために、社内マクロ（Microsoft Excel 2010）にインポートした。詳細な手順および設定パラメータは、これまでに説明されている（Zhang et al., PLoS One, 2013）。多変量解析にはＳＩＭＣＡ１４（Umetrics）を使用した。最も影響力のある代謝物を標的するために、Ｓ−プロットをＯＰＬＳ−ＤＡ（直交部分的最小二乗判別分析）モデルで生成した。
【０３４５】
食餌
離乳後、マウスに「通常の固形飼料」（Rat and Mouse Breeder and Grower，801730，Special Diet Services，SDS，UK）と水を自由に与えた。通常の固形飼料では、食餌のアミノ酸は、原材料（小麦、小麦食、大麦、外皮を除去し取り出しきつね色に焼いた大豆、とうもろこし、および魚粉）に含有される全タンパク質と、補足として加えた少量の精製リシンに由来する。Baker Purified Amino Acid Diet（Hirakawa et al., Nutr. Res. 1984）に基づき、TestDiet（Richmond，IN）の実験食を２セット使用した：「食餌１−対照」は、全必須アミノ酸に加え、セリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、シスチン、およびチロシンを含有し、「食餌１−ＳＧフリー」は、食餌１−対照と同じだが、ただし、セリンとグリシンを含まず、同じ総アミノ酸含有量を達成するために他のアミノ酸レベルを比例して増やした。これらの「食餌１」製剤は、これまでにも使用された（Maddocks et al., Nature, 2013）。「食餌２−対照」は、全必須アミノ酸に加え、セリン、グリシン、グルタミン、アルギニン、シスチン、およびチロシンを含有し；「食餌２−Ｓｅｒなし、Ｇｌｙなし／食餌２−ＳＧフリー」は、食餌２−対照と同じだが、ただし、セリンとグリシンを含まず、同じ総アミノ酸含有量を達成するために他のアミノ酸レベルを比例して増やした。「食餌２」製剤を、Ｅμ−Ｍｙｃ；Ｔｉｇａｒ−／−コホートに使用した（図２ｆ）。他の全てのコホートには、すでに発表した「食餌１」製剤を与えた。
【０３４６】
マウス−ＧＥＭモデル
全ての動物研究を、Animals (Scientific Procedures) Act 1986とEU Directive 2010（PPLs 60/4181, PPL70/8645 & 70/8646）に準拠して実行し、該動物研究は、施設内倫理審査プロセス（University of Glasgow）により承認された。ハツカネズミコホートを、環境エンリッチメントを積極的に行った柵付きの設備に収容した。Ｅμ−Ｍｙｃ（Adams et al., Nature 1985）、ＡｐｃＭｉｎ／＋（Moser et al., Science, 1990; Su et al., Science, 1992）、Ｌｇｒ5ｃｒｅＥＲ；Ａｐｃｆｌ／ｆｌ（Barker et al., Nature, 1990）、およびＰｄｘ１ｃｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ｆｌ／＋、またはＰｄｘ１ｃｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋（Hingorani et al., Cancer Cell, 2005; Morten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010）マウス／モデルについては、これまでに説明されている。オスとメスの混合集団を、各遺伝子型として使用した。マウスの数（または、個々のマウスからのサンプル数）を、各図／図の凡例に示す。Ｅμ−Ｍｙｃ、およびＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは、少なくとも２０世代のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ１６）だった。Ｅμ−Ｍｙｃ；Ｔｉｇａｒ−／−マウスは混合株だが、少なくとも５０％のＣ５７ＢＬ／６Ｊだった。膵臓（ＰＤＡＣ）コホートは混合株バックグランド上にあったが、全コホートは同腹対照を含んだ。マウスに、以下の時点で適切な食餌をとらせた。Ｅμ−Ｍｙｃ（Ｂｌ６）は生後６０日目、Ｅμ−Ｍｙｃ；Ｔｉｇａｒ−／−は生後５５日目、ＡｐｃＭｉｎ／＋生後８０日目、Ｌｇｒ５ｃｒｅＥＲ；Ａｐｃｆｌ／ｆｌは注入後７日目、Ｐｄｘ１ｃｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３ｆｌ／＋またはＰｄｘ１ｃｒｅ；ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋は生後６０日目。Ｌｇｒ５ｃｒｅＥＲによる組換えを、注射の間の休息日を用いて、１２０ｍｇ／ｋｇタモキシフェンの２回の腹腔内注射で誘発した。フェンホルミン実験では、Ｅμ−Ｍｙｃマウスに１００ｍｇ／マウス体重ｋｇを強制経口投与し、これを食餌変更と同日に開始した。メトホルミン実験では、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに飲料水中で２００ｍｇ／ｋｇ／日を与え、これを食餌変更の４日後に開始した。６−８週齢のＶｉｌｌｉｎｃｒｅＥＲ；ＡＰＣｆｌ／＋；ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋マウス［Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  Ｎ１０］に実験食をとらせ、２週間食餌を続け、次に、タモキシフェン（８０ｍｇ／ｋｇ）の単一ＩＰ注入で誘発した。腫瘍数と腫瘍領域（幅×長さ）のスコア付けを容易にするため、腸をメタカン（メタノール、クロロホルム、酢酸の比率が４：２：１）に固定した。ＢｒｄＵおよびカスパーゼの染色に使用したｎ＝６のＡＰＣＭｉｎ／＋マウスは別にして、他の全てのＧＥＭマウスを人道的な臨床ポイントまで世話をした。
【０３４７】
マウス研究でのサンプルサイズは、生存期間における潜在的差をＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログ・ランク）解析によりテストした、これらのモデルを用いた以前の実験より推定した。最初の実験群（例えば、食餌のみを与えたＥμ−ＭｙｃおよびＡＰＣＭｉｎ／＋、図１８ａおよび１８ｂ）からのデータを集めた後、後続の群のサイズを小さくして、使用する動物数を最小化した（例えば、フェンホルミンおよびメトホルミン処置群。図１９ａおよび１９ｂ）。全ての実験において、研究への登録時点で明白な表現型を持つマウスは除外した（つまり、登録しなかった）：例えば、Ｅμ−Ｍｙｃコホートでのリンパ節腫大または胸腺の肥大の兆候、ＡＰＣＭｉｎ／＋コホートでの貧血症状。腫瘍に無関係の疾病により死んだ動物は、打ち切り例として含めた。マウスを乱塊法に従って実験群に割り振った：マウスは繁殖により入手可能になることから、マウスを性別に基づき塊に分け、次に処置アームにランダムに割り当てた。潜在的な変動原因である性別を取り除くため、オス／メス比率を似た程度に維持するように注意した。研究者の実験群へのマウスの割り当ておよびエンドポイントデータの収集は、盲検化しなかった。
【０３４８】
マウス−異種移植／同種移植
ＨＣＴ１１６細胞を両側皮下注射（１側腹部につき３×１０＾６細胞）によりＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ（ＣＤ１−ヌード）メスマウス（Charles River, UK）に移植した。マウスを通常の固形飼料で維持し、目に見える測定可能な腫瘍が形成されるまで、毎日監視した。腫瘍担持マウスに対照（ｎ＝８マウス）またはＳＧフリー食（ｎ＝８マウス）をとらせ、腫瘍をカリパーで週に３回測定し、食餌変化後に発症した反対側の側腹部の腫瘍は、解析から除外した。食餌の最初の５週間の間の平均腫瘍体積をプロットした。腫瘍体積は式；体積＝（長さ×幅２）／２を使用して計算した。
【０３４９】
Ｅμ−Ｍｙｃリンパ腫細胞を、混合バックグランドＥμ−Ｍｙｃマウスの腫瘍担持リンパ節からＦＡＣＳにより単離した。これらの細胞を、最初に、照射したマウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を有する細胞培養において増やし、該細胞が独立して増殖できるようになるまで継代培養した。培養培地は１０％ＦＢＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびアンホテリシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Gibco/Life Technologies）だった。細胞を両側皮下注射（１側腹部につき５×１０＾５細胞）によりＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕメスマウス（Charles River, UK）に移植した。マウスを通常の固形飼料で維持し、目に見える測定可能な腫瘍が形成されるまで、毎日監視した。腫瘍担持マウスに対照またはＳＧフリー食をとらせ、腫瘍をカリパーで２／３日毎に測定した。コホートの最初のマウスが臨床エンドポイント（許容される最大腫瘍体積）に到達したら、コホートの全マウスを殺し、腫瘍を取り出した（これは、摂食６日後に起きた）。腫瘍をホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、組織学のために切片を切り取った。
【０３５０】
ＢｒｄＵおよびカスパーゼ染色ならびに壊死定量化
殺処分の２時間前に、マウスにＢｒｄＵ（RPN201, Amersham/GE Heathcare）を含有する２５０μＬの細胞増殖標識試薬を注射した。使用抗体：切断カスパーゼ３  ＡＳＰ−１７５（Cell Signaling Technology, 9661）、抗ＢｒｄＵ（BD Biosciences, 347580）、およびＥｎＶｉｓｉｏｎ抗ウサギ（Dako, K4003）。組織切片は、ヘマトキシリンＺ（CellPath）で対比染色した。染色スライドをＬｅｉｃａ  ＳＣＮ４００Ｆスキャナを使用してスキャンし、ＨＡＬＯ画像解析ソフトウェア（Indica Labs）を使用して解析した。Ｅμ−Ｍｙｃ腫瘍では、細胞数およびＢｒｄＵとカスパーゼの染色を、除外する壊死領域を有する全腫瘍で定量化した。ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスでは、全小腸の単一横断面を解析し、腺腫を手動で特定し、各腺腫における細胞数、カスパーゼおよびＢｒｄＵの染色を定量化し、マウスごとに平均化した。壊死をＨ＆Ｅ染色した全腫瘍横断面を使用して定量化し、壊死領域をＨＡＬＯソフトウェアを使用して手動で区別し、非壊死表面積に対する全壊死表面積を計算した。
【０３５１】
グルコースおよび乳酸の定量化
マウスコホートの（末端血液サンプルからの）血清を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Agilent Technologies）を製造業者の指示に従って使用して、グルコースと乳酸のレベルについて解析した。
【０３５２】
マクロピノサイトーシスアッセイ
マクロピノサイトーシス解析は、これまでに記載されたプロトコルに基づいた（Commisso et al., Nature, 2013）。最初に、ｉＫＲＡＳ細胞をドキシサイクリンあり（ＫＲａｓ−オン）またはなし（ＫＲａｓ−オフ）で４８時間増殖させた。次に、細胞を培地＋／−ドキシサイクリンおよび＋／−ＳＧ中のガラス製のカバーガラスに播種した。２４時間後、培地をＦＢＳを欠いたマッチング培地と交換し、さらに１６時間放置した。最後に、培地を、１０％ＦＢＳおよびテトラメチルローダミン標識デキストラン（TMR-dextran, Thermo Fisher Scientific）粒子（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するマッチング培地と交換した。デキストランを用いた３０分後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドに固定した。細胞をＤＡＰＩおよびｇｒｅｅｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  （Thermo Scientific）で対比染色し、Ｖｅｃｔａｓｈｅｉｌｄ  Ｈａｒｄｓｅｔ（Vector Laboratories）に乗せた。画像をＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００反転共焦点レーザー走査型顕微鏡に取り込み、デキストラン取り込みをＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉ画像解析ソフトウェアを使用して定量化した。
【０３５３】
ウェスタンブロット
細胞に対しウェスタンブロットを前述のように実行し（Maddocks et al, Nature, 2013; Labuschagne et al., Cell. Rep., 2014; Maddocks et al, Mol. Cell, 2016）、簡潔に言えば、全細胞タンパク質溶解物を、完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）、オルトバナジン酸ナトリウム、およびフッ化ナトリウム（両方ともSigma）を補充したＲＩＰＡ緩衝液において調製した。組織サンプルを、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Qiagen）を使用して、プロテアーゼとホスファターゼの阻害剤カクテル（Pierce/Thermo Scientific）を補充したＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。溶解物を遠心分離により除去し、プレキャストした４−１２％の‘ＮｕＰＡＧＥ’または‘Ｂｏｌｔ’ゲル（Invitrogen, Life Technologies）を使用して分離し、ニトロセルロース膜に移した。Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線スキャナおよびソフトウェア（Li-Cor Biosciences）を使用して、タンパク質を検出し、定量化した。関連する種に対する第２抗体は、結合したＩＲＤｙｅ６８０およびＩＲＤｙｅ８００（Li-Cor Biosciences）とした。使用した一次抗体は：ＰＨＧＤＨ（Sigma Life Science，HPA021241）、ＰＳＡＴ１（Novus Biologicals，NBP1-32,920）、ＰＳＰＨ（Santa Cruz，sc-98683）、アクチンＩ−１９−Ｒ（Santa-Cruz，sc-1616-R）、ｐＥＲＫ［Phospho-p44/p42 MAPK (Erk1/2)(Thr202/Tyr204)］（Cell Signalling Technology9101）、ＡＭＰＫａ１（R&D Systems，AF3197）、およびホスホ−ＡＭＰＫＴ１７２（Cell Signalling Technology2535）だった。
【０３５４】
統計
生存期間データについての統計的比較を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ログ・ランク）検定を使用し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ６）ソフトウェアを用いて計算した。Ｔ検定を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ｅｘｃｅｌ（ｖ１４．６．１）またはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ７）の何れかを使用して実行した。ｔｙｐｅ１／対応あり（サンプルを同じ動物から採取）およびｔｙｐｅ−２／独立（サンプルを異なる動物から採取）のＴ検定を使用した。潜在的差異の方向が予測されない場合は、両側／２両側Ｔ検定を使用した（例えば、血清サンプル中の全アミノ酸レベルで、図１Ｃ／拡張データ図２ａ）。既存のデータにより、サンプル間の差の方向における予測が支持される場合、片側／片側Ｔ検定を使用した（例えば、ｄｅ  ｎｏｖｏセリン合成、図４ｃ）。提示するデータが個々のデータ点の平均であり、エラーバーがＳＴＤＥＶである場合もあるし、データが平均の平均であり、エラーバーがＳＥＭである場合もある。各例において、Ｔ検定またはエラーバーの該当する種類を、図の凡例において特定する。Ｔ検定を多重比較と共に行った場合、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ７）ソフトウェアを使用するＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を使用して、Ｐ値を修正した。
【０３５５】
結果
無作為メタボロミクスは、−ＳＧ食をとらせたＥμ−Ｍｙｃ腫瘍組織（腫瘍担持脾臓）において最も減少した代謝物は、セリンおよびグリシンであることを示し、これにより、食餌が特異的にセリンおよびグリシンの腫瘍レベルを下げたことが実証された（図２４）。
【０３５６】
ｉｎ−ｖｉｖｏでのＥμ−ｍｙｃ腫瘍細胞に対する−ＳＧ食の効果は、一部の腫瘍ではアポトーシスが増加し（切断カスパーゼ３（ＣＣ３）の増加により示される）、他の腫瘍では壊死が増加し、両効果とも、腫瘍増殖の阻害または遅延を引き起こすことを示した（図２５）。
【０３５７】
対照および−ＳＧ食で成長させた場合の、ＰＤＡＣおよびＥｕ−ｍｙｃモデルからの腫瘍組織におけるＳＳＰ酵素の発現も解析した。これらの結果は、ＫｒａｓがＳＳＰをｉｎ  ｖｉｖｏで制御することを示唆する（図２６）。さらに、Ｋｒａｓを発現する組織−オルガノイド（３Ｄ細胞培養）は、セリンおよびグリシンの欠乏に最も抵抗性があることが観測され、これもＫｒａｓがＳＳＰを制御することを示す（図２８）。
【０３５８】
さらに、−ＳＧ食は、Ｅμ−ｍｙｃ腫瘍（−ＳＧ食に対し感受性である）において、セリンおよびグリシンレベルの低下と、ＧＳＨ／ＧＳＳＨ比の低下を引き起こした。しかし、ＰＤＡＣ腫瘍（Ｋｒａｓ変異を抱え、食餌に対し抵抗性がある）では、−ＳＧ食は、グリシンレベルもＧＳＨ／ＧＳＳＧ比も低下させなかった（図２７）。
【０３５９】
−ＳＧ食は、ｉｎ  ｖｉｖｏですでに形成されていた異種移植ＨＣＴ１１６腫瘍の増殖を低減させ（図２９ａ）、腫瘍内のセリンおよびグリシンのレベルを低下させた（図２９ｂ）。より低いセリンおよびグリシンの腫瘍レベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞増殖を遅くすることにつながった（図２９ｃおよび２９ｄ）。
【０３６０】
図３０のデータは、（ｉＫＲＡＳ１  ｉＫＲＡＳ３およびＡＫ１９６細胞株における）Ｋｒａｓの、セリンおよびグリシンを得る機能は、微飲作用（栄養スカベンジングの一形態）の高まりによって説明することはできないことを示し、該データは、さらに、Ｋｒａｓ発現細胞は、ｄｅ  ｎｏｖｏセリンおよびグリシン合成により、追加のセリンおよびグリシンを得たという考えを支持する。マクロピノサイトーシスは、細胞が、細胞外分子（例えば、タンパク質など。これはアミノ酸に分解され得る）を貪食することにより細胞外栄養を捕え、使用することを可能にする。培養細胞において、マクロピノサイトーシスの上方制御は、標識デキストランの取り込みの増加およびデキストラン染色された％（細胞）領域の増加に相当する。３つのＫｒａｓ誘導性細胞株の全てにおいて、標識デキストランの取り込みがセリンおよびグリシンの欠乏時に増加したわけではなく、これは、セリンおよびグリシン欠乏がマクロピノサイトーシスの増大をもたらさなかったことを示す。
【０３６１】
図３１ａおよび３１ｂに示すデータは、ダウノルビシン（従来の抗がん剤）が、セリンおよびグリシン欠乏と共に機能して、腫瘍オルガノイドにおける活性酸素種を増加させ、腫瘍オルガノイド増殖を低減させたことを示す。
【０３６２】
実施例７（図３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０） 
方法
細胞株および細胞培養
ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｐａｎｃ１０．０５、ＣＦＰＡＣ−１、ＳＷ１９９０、ＢｘＰＣ−３、ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は、元来ＡＴＣＣから得たもので、その後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ１０を使用して認証した。乳がん細胞および大腸がん細胞を、最終濃度が２ｍＭのＬ−グルタミンと共に、１０％ＦＢＳ（10270）、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびアンホテリシンを補充したＤＭＥＭ（Gibco-21969）において増殖させた。膵臓がん細胞株を、最終濃度が２ｍＭのＬ−グルタミンおよびインスリン−トランスフェリンセレニウム溶液（Gibco）１：５００と共に、１０％ＦＢＳ（10270）、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびアンホテリシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Gibco-31870）培地において、増殖させた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに維持した。培養細胞を、Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ検出キット（Lonza）を使用して、マイコプラズマについて慣例的にテストした。
【０３６３】
ＭＴＡＰおよび非標的対照を除去するために使用するガイドＲＮＡ
【表２】
2019507754.tif 000006
ｇＲＮＡ配列を、足場ＲＮＡと共に使用して、Ran et al (2013)に従ってｓｇＲＮＡを作成した。
【０３６４】
増殖アッセイ
細胞（４ｘ１０＾４−１ｘ１０＾５）を、２４ウェルプレートの完全ＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ培地に播種し、一晩付着させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、既定のアミノ酸／代謝物／薬物を補充したアッセイ培地を与えた。アッセイ培地は、ＲＰＭＩ−１６４０培地を基に配合したがアミノ酸は欠いており、アミノ酸はアッセイに応じて個別に加えた。アッセイ培地には、追加のビタミンＢ６（２０ｕＭ）、システイン合成のための補因子も補充した。細胞を、「時刻＝０」プレートを使用して、既定の時点で（Ｃａｓｙ  ＴＴ細胞カウンター，Innovatis，Roche Applied Scienceを使用して）カウントして、培地変更時刻からの相対的細胞数を計算した。
【０３６５】
顕微鏡
画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎソフトウェアを備えるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍデジタルカメラに連結したＺｅｉｓｓ光学顕微鏡を２０ｘ拡大率で使用して取り込んだ。
【０３６６】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）
細胞を、既定のアミノ酸／代謝物を補充したアッセイ培地において増殖させた。均一標識炭素−１３メチオニンを、Cambridge Isotopes/CKGasより購入した。細胞抽出物および培地サンプルを、メタノール、アセトニトリル、およびＨ２Ｏ（５０：３０：２０）からなる冷却した（−２０℃）溶解溶媒（ＬＳ）において調製した。溶解物を、溶解前に複製ウェルをカウントすることにより、細胞数に基づいて等化した。ＬＳを細胞／培地サンプルに加えた後、タンパク質を沈殿させ、遠心分離により除去した。抽出物をＡｃｃｅｌａ６００ＬＣシステムおよびＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Thermo Scientific）からなるＬＣＭＳプラットフォームにおいて解析した。クロマトグラフィーは、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）（Merck）を、Ａ＝０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を有する水およびＢ＝０．１％ギ酸を有するアセトニトリルを混ぜた移動相と共に利用した。２０％のＡで開始し、直線的に増加させ、３０分で８０％にする勾配プログラムを使用し、その後、洗浄と再平衡化ステップを続けた。方法２の全実行時間は４６分だった。ＬＣストリームを脱溶媒し、ＨＥＳＩプローブにおいてイオン化した。Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を、極性を切り替えながら、５００００の分解能で、７５−１０００ｍ／ｚの質量範囲において、フルスキャンモードで操作した。代謝物の特定および定量化のために、生データをＬＣｑｕａｎ（Thermo Scientific）およびＭＺＭｉｎｅ２．１０により解析した。
【０３６７】
ウェスタンブロット
全細胞タンパク質溶解物を、プロテアーゼとホスフェートの阻害剤カクテル（Pierce/Thermo Scientific）を補充したＲＩＰＡ緩衝液において調製した。溶解物を遠心分離により除去し、プレキャストした４−１２％の‘Ｂｏｌｔ’ゲル（Invitrogen, Life Technologies）を使用して分離し、ニトロセルロース膜に移した。Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外線スキャナおよびソフトウェア（Li-Cor Biosciences）を使用して、タンパク質を検出し、定量化した。関連する種に対する第２抗体は、結合したＩＲＤｙｅ６８０およびＩＲＤｙｅ８００（Li-Cor Biosciences）とした。使用した一次抗体は：ウサギ抗ＭＴＡＰ（Abcam）だった。
【０３６８】
データ提示
データを、標準偏差を示すエラーバーと共に、平均としてプロットする。
【０３６９】
システイン合成の概要（図３２）
システイン合成は、必須アミノ酸メチオニンで始まり、メチオニンは、多数の酵素ステップによりシステインに変換される。ポリアミンは細胞成長および増殖に重要な分子であり、ポリアミン合成は、がんにおいて上方制御されることが分かっている。ポリアミン合成は、メチオニンに由来する代謝物のｄｃＳＡＭを必要とし、ｄｃＳＡＭは、ポリアミン（スペルミンおよびスペルミジン）合成時にＭＴＡに変換される。ＭＴＡは、酵素メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）を伴う多ステップの酵素経路によりメチオニンに再生され得る。ＭＴＡＰが存在する場合、ポリアミン合成において生成されたＭＴＡの再生は、効率的なメチオニン利用をもたらす。しかしながら、ＭＴＡＰが除去されると（がんでは頻繁に起きる）、ＭＴＡはメチオニンに再生されなくなり、細胞から流出する。これは、一定のメチオニン供給がＭＴＡに変換され、細胞から排出されることを意味する。このポリアミン合成へのメチオニンの一定の転換は、メチオニンを、システイン合成などの他の目的に利用することを妨げ得る。
【０３７０】
結果
本研究者らは、テストした全てのがん細胞株が、システイン欠乏に対し、ある程度感受性であることを発見した。注目すべきことに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などのある細胞株が、システイン欠乏に対し極度に感受性であり、システイン欠乏は劇的な細胞死を引き起こすことを発見した（図３３、４０）。しばしば、栄養欠乏（アミノ酸欠乏などの）は、増殖を遅くするが、急性細胞死を必ずしも誘発するわけではなく、本研究者らは、なぜある細胞株が非常に感受性であるかを調べた。
【０３７１】
システイン欠乏ががん細胞にとって有害であり得、この感受性は、システイン合成のための遺伝子の不活性化（例えば、ＣＢＳのための遺伝子のメチル化）による可能性があることがこれまでに報告されているが、本研究者らの結果は、驚くべきことに、ＣＢＳの上流の代謝前駆体（ホモシステイン）を有する補充細胞が、システイン欠乏からの著しい脱出を達成することを示す（図３９）。これは、システイン合成のための酵素が存在し、活性であるものの、システイン合成のための上流の前駆体（ホモシステインなど）の供給に問題があることを示唆する。
【０３７２】
ｄｅ  ｎｏｖｏシステイン合成のための酵素、特にＣＢＳおよびＣＴＨの発現が、システイン欠乏に対する感受性を決定し得ることが示唆されてきたが、本研究者らは、驚くべきことに、システイン欠乏に対し最も敏感に感受性である細胞は、メチオニン由来代謝物のＭＴＡを排出するものであることを発見した（図３３、３４、３６、３２）。ＭＴＡ排出は、システイン欠乏に対する鋭い感受性と密接に相関している（図３３、３９、３６）。ＭＴＡ排出は、酵素ＭＴＡＰをコードする遺伝子の不活性化または欠失により引き起こされる（図３７）。ＭＴＡＰは、ＭＴＡをメチオニンに再生するように機能し、それにより、効率的なメチオニン代謝を提供する（図３４、３５）。ＭＴＡの非存在下では、多量のメチオニンがポリアミン経路に転用され、システイン合成経路には転用されない（図３４）。ＡＭＤ１（メチオニン由来ＳＡＭをポリアミン合成経路に転用する酵素）の阻害が、細胞をシステイン欠乏に対する鋭い感受性（つまり、細胞死）から守ることができるということは、この発見と整合性がある（図４０）。
【０３７３】
食餌を使用してがんを処置する文脈では；本研究者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に基づくと、大部分のがん細胞株はシステイン欠乏に対し感受性であるが、サブセットは特に感受性である（図３３）。本研究者らの研究は、ＭＴＡＰ発現の減少が、システイン欠乏に対する鋭い感受性と強く相関していることを示す（図３３）。ＭＴＡＰが減少した細胞は、システイン合成の上流で代謝前駆体の転用を示す（図３４）。ＭＴＡＰは、一般に、がん／腫瘍細胞において除去／不活性化される（Bertino et al. 2011）。本研究者らの研究は、ＭＴＡＰ発現を欠く腫瘍が、特に、システイン欠乏に対し感受性であることを示唆する。
【０３７４】
本明細書の説明および請求項全体で、単語「含む」および「含有する」およびそれらの変形物は、「限定するわけではないが〜を含む」ことを意味し、他の分子、添加物、成分、整数、またはステップを除外することを意図しない（かつ、除外しない）。本明細書の説明および請求項全体で、単数形の語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数形を包含する。特に、不確定の物を使用する場合、本明細書は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一性と同様に複数性を意図していると理解されたい。
【０３７５】
本発明の特定の態様、実施形態、または例に関連して記載する特徴、整数、特徴、化合物、化学的部分、または基は、矛盾する場合を除き、本明細書に記載する任意の他の態様、実施形態、または例にも適用可能であることを理解されたい。本明細書（任意の添付の請求項、要約、および図面を含む）に開示する特徴の全て、ならびに／または、そのように開示する任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが、互いに排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、任意の前記実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の請求項、要約、および図面を含む）に開示する特徴の任意の新規な一つもしくは任意の新規な組み合わせへも拡張されるか、または、同じく開示した任意の方法もしくはプロセスのステップの、任意の新規な一つもしくは任意の新規な組み合わせへも拡張される。
【０３７６】
読者の注意は、本明細書と連携して本明細書と同時に又は本明細書の前に出願された、そして本明細書と共に公的な検閲に解放された全ての文献及び文書に向けられるものであり、そのような論文および文書の内容は全て引用によりここに組み入れられるものとする。
【０３７７】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019507754.tif 000015
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019507754.tif 000020
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2019507754.tif 000024
【図１７】
2019507754.tif 000025
【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１ａ】
2019507754.tif 000030
【図２１ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
2019507754.tif 000033
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2019507754.tif 000036
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2019507754.tif 000040
【図３１】
2019507754.tif 000041
【図３２】
2019507754.tif 000042
【図３３】
2019507754.tif 000043
【図３４】
2019507754.tif 000044
【図３５】
2019507754.tif 000045
【図３６】
2019507754.tif 000046
【図３７】
2019507754.tif 000047
【図３８】
2019507754.tif 000048
【図３９】
2019507754.tif 000049
【図４０】
2019507754.tif 000050
【国際調査報告】
2019507754.tif 000051
2019507754.tif 000052
2019507754.tif 000053
2019507754.tif 000054
2019507754.tif 000055
2019507754.tif 000056
2019507754.tif 000057
2019507754.tif 000058