(57)【要約】本開示は、微生物の新規株を含む単離微生物、微生物共同体、及びそれらを含む組成物に関する。さらに、本開示は、本明細書に記載する微生物、微生物共同体、及びそれらを含む組成物を、反芻動物の乳及び乳成分の生産及び収量を調節する方法に用いる方法を教示する。特定の態様では、本開示は、反芻動物の乳の望ましい成分を増加させる方法を提供する。さらに、本開示は、第一胃ミクロビオームを調節する方法を提供する。本開示は、とりわけ乳製品生産における用途をもつ、単離された生物学的に純粋な微生物に関する。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物に有効量の組成物を投与することを含む、反芻動物の乳生産を増加させるかまたは乳成分特徴を改善する方法であって、前記組成物は、
ａ）
ｉ．配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製された細菌集団、及び／または
ｉｉ．配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む真菌の精製集団を含む、
精製された微生物集団、及び
ｂ）反芻動物への投与に適した担体を含み、
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、前記組成物を投与されていない反芻動物と比べて、乳生産の増加または乳成分特徴の改善を示す、
前記方法。
【請求項２】
前記反芻動物はウシである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物は周囲条件下で少なくとも１日は安定している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、封入物、錠剤、カプセル、丸薬、飼料添加物、食品成分、食品添加物、食品調製物、食品サプリメント、消耗溶液、消耗スプレー添加物、消耗固体、消耗ゲル、注射、坐剤、ボーラス、水薬、またはそれらの組合せとして製剤されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物はポリマーまたは炭水化物に封入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
投与することには、前記組成物を反芻動物に給餌することが含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
投与することには、前記組成物を反芻動物に注入することが含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記精製された微生物集団は、前記組成物中に少なくとも１０２細胞の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記精製された微生物集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記精製された微生物集団は、配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記精製された微生物集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記精製された微生物集団は、配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製された微生物集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製された微生物集団は、配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択されるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製された微生物集団は、配列番号１〜６０及び２０４５〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌及びＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製された微生物集団は、配列番号２８と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製された微生物集団は、配列番号３２と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記精製された微生物集団は、ＮＲＲＬ  Ｙ−６７２４９で寄託されたＰｉｃｈｉａ真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記精製された微生物集団は、
Ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｍｏｎａｓ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｓｐｈａｅｒａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｒａｌｓｏｎｉａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｓａｌｔｅｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ、Ａｍｉｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｓｈａｒｐｅａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｓｕｇｉｙａｍａｅｌｌａ、Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｉｍａｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｅｍｅｌｌａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ＸｌＶａ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ＸＩａ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ＿ｉｎｃｅｒｔａｅ＿ｓｅｄｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａ＿ｉｎｃｅｒｔａｅ＿ｓｅｄｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ｓｅｎｓｕ＿ｓｔｒｉｃｔｏ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ、Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｓｈａｒｐｅａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓから選択される群のメンバーである生物のみを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、実測乳収量の増加につながる乳生産の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、実測エネルギー補正乳の増加につながる乳生産の増加及び乳成分特徴の改善を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、乳脂肪の増加、乳タンパク質の増加、乳中炭水化物の増加、乳中ビタミンの増加、乳中ミネラルの増加、またはそれらの組合せからなる群より選択される乳成分特徴の改善を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも１％の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも１０％の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも２０％の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物はさらに、改善された飼料利用効率、改善された消化率、ポリサッカライド及びリグニン分解率の増加、第一胃内の脂肪酸濃度の上昇、第一胃内のｐＨバランス、メタン放出量の減少、糞生産の減少、改善された乾物摂取量、改善された窒素利用効率、またはそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの改善された表現型形質を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示し、
前記組成物の投与前に第一胃に存在していた微生物集団は、前記組成物の投与後に数度が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示し、
前記組成物の投与前に第一胃に存在していた微生物集団は、前記組成物の投与後に数度が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示し、
前記組成物の投与前に第一胃に存在していた微生物の第１の集団は、前記組成物の投与後に数度が増加し、
前記組成物の投与前に第一胃に存在していた微生物の第２の集団は、前記組成物の投与後に数度が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
表１及び／または表３から選択される少なくとも１つの微生物株を含む、微生物共同体。
【請求項３２】
少なくとも１つの微生物株を含む微生物共同体であって、前記少なくとも１つの微生物株は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３から選択される配列によりコードされる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列、または配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７から選択されるＩＴＳ配列を含む、前記微生物共同体。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿１８０１、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２６８、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４９を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿３５３を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２３を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｆ＿１５を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８及びＡｓｃｕｓｆ＿１５を含む、請求項３２に記載の微生物共同体。
【請求項４３】
前記共同体は封入されている、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の微生物共同体。
【請求項４４】
（ａ）請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の微生物共同体、及び
（ｂ）許容される担体
を含む、組成物。
【請求項４５】
前記微生物共同体は封入されている、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記封入微生物共同体は、サッカライドポリマー、寒天ポリマー、アガロースポリマー、タンパク質ポリマー、及び脂質ポリマーから選択されるポリマーを含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記許容される担体は、食用飼料等級物質、ミネラル混合物、水、グリコール、モラセス、及びトウモロコシ油からなる群より選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
前記微生物共同体を形成する前記少なくとも１つの微生物株は、前記組成物中、前記組成物１グラムあたり１０２〜１０１５細胞で存在する、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物は家畜飼料と混合される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項５０】
動物に少なくとも１つの改善された形質を与える方法であって、請求項４４の組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記動物は反芻動物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記反芻動物はウシである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与には、前記組成物を前記動物の第一胃に注入することが含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物は少なくとも月１回投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物は少なくとも週１回投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物は少なくとも１日１回投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記投与は動物に給餌するたびに行われる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記投与は肛門投与である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記肛門投与には、前記組成物を含む坐剤を前記動物の直腸に挿入することが含まれる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記投与は経口投与である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記経口投与には、前記組成物を、前記動物の飼料、水、薬、またはワクチンと合わせて投与することが含まれる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記経口投与には、前記動物の体の一部に前記組成物のゲルまたは粘性液を塗ることが含まれ、前記動物は前記組成物を舐めて摂取する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記投与には、前記組成物を前記動物に噴霧することが含まれ、前記動物は前記組成物を摂取する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６４】
前記少なくとも１つの改善された形質は、乳中の脂肪の増加、乳中の炭水化物の増加、乳中のタンパク質の増加、乳中のビタミンの増加、乳中のミネラルの増加、乳体積の増加、改善された飼料利用効率及び消化率、ポリサッカライド及びリグニン分解率の増加、第一胃内の脂肪酸濃度の上昇、第一胃内のｐＨバランス、メタン放出量の減少、糞生産の減少、改善された乾物摂取量、エネルギー補正乳（ＥＣＭ）の重量及び／または体積の増加、ならびに改善された窒素利用効率からなる群より選択され、前記増加または減少は、前記組成物を投与されていない動物との比較により決定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６５】
前記乳中の脂肪の増加は、トリグリセリド、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、コレステロール、糖脂質、及び／または脂肪酸の増加である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記炭水化物の増加は、オリゴサッカライド、ラクトース、グルコース、及び／またはガラクトースの増加である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリサッカライド分解率の増加は、リグニン、セルロース及び／またはヘミセルロースの分解率の増加である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記脂肪酸濃度の上昇は、酢酸、プロピオン酸、及び／または酪酸の増加である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも１つの微生物株は、前記株が単独で出現するとき、または前記株が自然発生する濃度で存在するときには示さない、高い有用性を示す、請求項４４に記載の組成物。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの微生物株は、動物において少なくとも１つの改善された形質を与えることにおいて相乗効果を示す、請求項４４に記載の組成物。
【請求項７１】
反芻動物において望ましい表現型形質を増加させることができる反芻動物飼料サプリメントであって、
（ａ）自然発生しない濃度で存在する、請求項３１〜４２のいずれか１項に記載の微生物共同体、及び
（ｂ）許容される担体
を含む、前記反芻動物飼料サプリメント。
【請求項７２】
前記微生物共同体は封入されている、請求項７１に記載の反芻動物飼料サプリメント。
【請求項７３】
表１及び／または表３の微生物のいずれかから選択される、単離微生物株。
【請求項７４】
（ａ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２０１１として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿７、
（ｂ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００７として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿３２、
（ｃ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２０１２として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿８２、
（ｄ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００９として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿１１９、
（ｅ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００９として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿１８０１、
（ｆ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００３として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２０６、
（ｇ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２０１４として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２３、
（ｈ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００４として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２４、
（ｉ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００２として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿４５、
（ｊ）Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００３として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２０８、
（ｋ）ＮＲＲＬ登録寄託番号Ｂ−６７２４８として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿３１３８、及び
（ｌ）ＮＲＲＬ登録寄託番号Ｙ−６７２４９として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿１５
からなる群より選択される単離微生物株。
【請求項７５】
配列番号１〜６０及び２０４５〜２１０７のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む、単離微生物株。
【請求項７６】
請求項７３〜７５のいずれか１項に記載の単離微生物株の実質的に純粋な培養物。
【請求項７７】
請求項４５の組成物を投与することが含まれる、反芻動物のミクロビオームを調節する方法。
【請求項７８】
前記組成物の前記投与により、前記反芻動物に少なくとも１つの改善された形質が与えられる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも１つの改善された形質は、乳中の脂肪の増加、乳中の炭水化物の増加、乳中のタンパク質の増加、乳中のビタミンの増加、乳中のミネラルの増加、乳体積の増加、改善された飼料利用効率及び消化率、ポリサッカライド及びリグニン分解率の増加、第一胃内の脂肪酸濃度の上昇、第一胃内のｐＨバランス、メタン放出量の減少、糞生産の減少、改善された乾物摂取量、エネルギー補正乳（ＥＣＭ）の重量及び／または体積の増加、ならびに改善された窒素利用効率からなる群より選択され、前記増加または減少は、前記組成物を投与されていない動物との比較により決定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記乳中の脂肪の増加は、トリグリセリド、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、コレステロール、糖脂質、及び／または脂肪酸の増加である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記炭水化物の増加は、オリゴサッカライド、ラクトース、グルコース、及び／またはガラクトースの増加である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポリサッカライド分解率の増加は、リグニン、セルロース及び／またはヘミセルロースの分解率の増加である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記脂肪酸濃度の上昇は、酢酸、プロピオン酸、及び／または酪酸の増加である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記ミクロビオームの調節は、前記ミクロビオームの少なくとも１つの微生物株の割合の増加であり、この増加は、前記少なくとも１つの微生物株を投与されなかった反芻動物に対して測定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８５】
前記ミクロビオームの調節は、前記組成物の投与前に前記ミクロビオームに存在していた微生物株の割合の減少であり、この減少は、前記組成物の投与前の前記反芻動物のミクロビオームに対して測定される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８６】
病原性微生物のコロニー形成に対するウシの耐性を増加させる方法であって、請求項４４に記載の組成物を投与することを含み、前記病原体はウシの胃腸管内でコロニー形成ができない、前記方法。
【請求項８７】
請求項４４に記載の組成物を投与することが含まれる、少なくとも１つの病原性微生物の存在に関してウシを治療する方法。
【請求項８８】
前記組成物の投与後、胃腸管内で前記少なくとも１つの病原性微生物の相対数度が５％未満の相対数度に減少する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
胃腸管内で前記少なくとも１つの病原性微生物の相対数度が１％未満の相対数度に減少する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記少なくとも１つの病原性微生物は胃腸管内で検出不能である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記微生物共同体は、細菌及び／または真菌を、胞子の形態で、栄養細胞の形態で、及び／または溶解物の形態で含む、請求項４４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１月７日に出願された米国特許仮出願第６２／２７６，１４２号、２０１６年１月８日に出願された米国特許仮出願第６２／２７６，５３１号、２０１６年５月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／３３４，８１６号、及び２０１６年１１月１日に出願された米国特許仮出願第６２／４１５，９０８号の優先権を主張し、それらの全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
分野
本開示は、とりわけ乳製品生産における用途をもつ、単離された生物学的に純粋な微生物に関する。本開示の微生物は、単離された生物学的に純粋な状態で利用することができ、また製剤して組成物とすることもできる。さらに、本開示は、本開示の微生物のメンバーを少なくとも２つは含む微生物共同体、ならびに該共同体を利用する方法を提供する。さらに、本開示は、第一胃ミクロビオームを調節する方法を提供する。
【０００３】
配列一覧表に関する陳述
本願に関する配列一覧表を書類の代わりにテキスト形式で提供し、参照により本明細書に援用する。配列一覧表が収められたテキストファイル名は、ＡＳＢＩ＿００２＿０２ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは８９３ｋｂ、作成日は２０１６年１０月３１日であり、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子提出される。
【背景技術】
【０００４】
世界人口は２０５０年までに９０億人を超えると予測されるが、一人当たりの土地や水、その他の利用可能な天然資源の量は、それと同時進行で減少している。中国とインドのＧＤＰ上昇が見込まれるため、平均国内所得も増加すると推定されている。所得の増加に伴い、動物由来タンパク質が豊富な食事に対する要望が高まるため、より少ない資源でより大量の乳汁を生産するという課題が世界の畜産部門に突き付けられることになる。国際連合食糧農業機関の予測では、食糧生産を７０％増加させる必要があるにもかかわらず、利用可能な農作用の土地面積は減少していく。人口増加を支えるためには、資源インプット単位あたりの食料アウトプットを相当増加させなければならないことは明白である。
【０００５】
泌乳反芻動物由来の乳及び乳成分は、主に、多種多様な形態の食品の調製に用いられている。ところが、乳及び乳成分には、糊、布地繊維、プラスチック材料の製造など非食品部門でも多くの代替用途があり、エタノールやメタンの生産にも利用されている。栄養の調節、ホルモン処置、動物の管理法の変更、及び選択的繁殖により、反芻動物の乳の生産及び成分を改良する多くの戦略が存在するが、動物１頭あたりの乳及び乳成分のより高効率な生産が必要とされている。
【０００６】
動物の心身の健康とバランスをとりながら、持続的に乳生産量を増加させ、目的の乳成分を調節するための組成物及び方法を特定することは、人口が増加するなか人々の日々のニーズを満たすための急務となっている。酪農場の家畜の総数を拡大することで世界的に乳生産量を増加させ、さらに所望の乳成分を調節する、というのは世界の多くの地域にとっては経済的に実行不可能であるばかりか、環境的に負の結果を招くことにもなる。
【０００７】
このように、現在の高インプットの農業システム（先進世界のほとんどで用いられている）の規模を単純に拡大することにより、世界的な乳及び乳成分の生産の期待に応える、というのは全く実行不可能である。
【０００８】
したがって、当業界には、乳生産量を増加させ、さらに所望の乳成分の収量を増加させる、改善された方法に対する差し迫った需要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、表１及び／または表３に示す微生物の新規株を含む単離微生物を提供する。
【００１０】
他の態様では、本開示は、表１及び表３で特定する微生物の単離された全微生物培養物を提供する。このような培養物は、微生物を様々な濃度で含み得る。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示は、表１及び／または表３から選択される１つ以上の微生物を用いて、反芻動物における対象とする表現型形質を増加させることを提供する。さらに、本開示は、表１及び／または表３から選択される１つ以上の微生物を用いることにより、第一胃ミクロビオームを調節する方法を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、微生物共同体は、表１及び／または表３から選択される少なくとも２つの微生物株を含む。いくつかの実施形態では、微生物共同体は、表１及び／または表３から選択される少なくとも１つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、少なくとも２つの微生物株を含み、各微生物は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３から選択される配列によりコードされる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列、または配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７から選択されるＩＴＳ配列を含む。追加の実施形態では、微生物共同体は、少なくとも１つの微生物株を含み、各微生物は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３から選択される配列によりコードされる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列、または配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７から選択されるＩＴＳ配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物共同体は、少なくとも２つの微生物株を含み、各微生物は、配列番号１〜３０、配列番号６１〜１９８８、または配列番号２０４５〜２１０３から選択される配列によりコードされる１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列、または配列番号３１〜６０、配列番号１９８９〜２０４４、または配列番号２１０４〜２１０７から選択されるＩＴＳ配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿１８０１、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿１８０１、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２６８、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２６８、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４９を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４９を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿３５３を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿３５３を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２３を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２３を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。一実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８及びＡｓｃｕｓｆ＿１５を含む、少なくとも２つの微生物株を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８及びＡｓｃｕｓｆ＿１５を含む、少なくとも１つの微生物株を含む。一実施形態では、一実施形態では、少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの微生物株は、Ａｓｃｕｓｆ＿１５を含む。
【００１５】
一実施形態では、組成物は、本開示の微生物共同体及び許容される担体を含む。さらなる実施形態では、組成物は、本開示の微生物共同体及び許容される担体を含む。さらなる実施形態では、微生物共同体は封入されている。さらなる実施形態では、封入微生物共同体は、ポリマーを含む。さらなる実施形態では、ポリマーは、サッカライドポリマー、寒天ポリマー、アガロースポリマー、タンパク質ポリマー、糖ポリマー、及び脂質ポリマーから選択され得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、許容される担体は、食用飼料等級物質、ミネラル混合物、水、グリコール、モラセス、及びトウモロコシ油からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、微生物共同体を形成する少なくとも２つの微生物株は、組成物中、該組成物１グラムあたり１０２〜１０１５細胞で存在する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、組成物は家畜飼料と混合されて得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、動物に少なくとも１つの改善された形質を与える方法には、組成物を動物に投与することが含まれる。さらなる実施形態では、動物は反芻動物であり、さらにウシであり得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１日１回投与される。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも月１回投与される。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも週１回投与される。さらなる実施形態では、組成物は、少なくとも１時間に１回投与される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、投与は、組成物を第一胃内に注入することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は肛門投与される。さらなる実施形態では、肛門投与は、直腸に坐剤を挿入することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与される。いくつかの態様では、経口投与には、組成物を、動物の飼料、水、薬、またはワクチンと合わせて投与することが含まれる。いくつかの態様では、経口投与には、動物の体の一部に組成物のゲルまたは粘性液を塗ることが含まれ、動物は組成物を舐めて摂取する。いくつかの実施形態では、投与には、組成物を動物に噴霧することが含まれ、動物は組成物を摂取する。いくつかの実施形態では、投与は、動物に給餌するたびに行う。いくつかの実施形態では、経口投与には、組成物を動物飼料と合わせて投与することが含まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改善された形質は、乳中の脂肪の増加、乳中の炭水化物の増加、乳中のタンパク質の増加、乳中のビタミンの増加、乳中のミネラルの増加、乳体積の増加、改善された飼料利用及び消化効率、ポリサッカライド及びリグニン分解率の増加、第一胃内の脂肪酸濃度の上昇、第一胃内のｐＨバランス、メタン放出量の減少、糞生産の減少、改善された乾物摂取量、エネルギー補正乳（ＥＣＭ）の重量及び／または体積の増加、改善された窒素利用効率、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択され、これらの増加または減少は、該組成物を投与されていない動物との比較により決定される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、乳中の脂肪の増加は、トリグリセリド、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、コレステロール、糖脂質、及び／または脂肪酸の増加である。いくつかの実施形態では、炭水化物の増加は、オリゴサッカライド、ラクトース、グルコース、及び／またはグルコースの増加である。いくつかの実施形態では、ポリサッカライド分解率の増加は、セルロース、リグニン、及び／またはヘミセルロースの分解率の増加である。いくつかの実施形態では、脂肪酸濃度の上昇は、酢酸、プロピオン酸、及び／または酪酸の増加である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または共同体に存在する少なくとも２つの微生物株または少なくとも１つの微生物株は、該株が単独で出現するとき、または該株が自然発生する濃度で存在するときには示さない、高い有用性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で教示する少なくとも２つの微生物株を含む本開示の組成物は、動物において少なくとも１つの改善された形質を与える相乗効果を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で教示する１つ以上の単離微生物を含む本開示の組成物は、それらと最も近い自然発生する対応物と比べて、著しく異なる特徴／特性を示す。つまり、本開示の組成物は、それらと最も近い自然発生する対応物と比べて、著しく異なる機能的及び／または構造的特徴／特性を示す。たとえば、本開示の微生物は、第一胃に自然に存在する微生物と、少なくとも次のような理由により構造的に異なっている：該微生物は、単離され精製することができるので、第一胃環境には見られないこと、該微生物は第一胃内では生じない濃度で存在し得ること、該微生物は第一胃内に発生しない許容される担体と伴わせることができること、該微生物は保存可能に製剤されて第一胃環境の外部で存在することができること、及び、該微生物は第一胃内では生じない濃度で他の微生物と組み合わせることができること。さらに、本開示の微生物は、第一胃に自然に存在する微生物と、少なくとも次のような理由により機能的に異なっている：該微生物は、単離され精製された形で用いられると、第一胃ミクロビオームの調節、乳生産の増加、及び／または乳成分特徴の改善をもたらすことができること、該微生物は、保存性が高く製剤されて第一胃環境の外部で存在することができることであって、その結果として該微生物は反芻動物に投与できるサプリメントとして新たな有用性を獲得するが、該微生物は第一胃内の自然な状態ではそのような有用性を有することはできず、それは、該微生物を製剤して保存可能な状態とし、該微生物が第一胃内での自然な状態ではもたない前述の機能的特徴を有するこの新たな有用性を与えるように人の手が介入しなければ、該微生物は第一胃の外部では生存できなくなるからである。
【００２４】
一実施形態では、本開示は、反芻動物において望ましい表現型形質を増加させることができる反芻動物飼料サプリメントを提供する。特定の実施形態では、反芻動物飼料サプリメントは、自然発生しない濃度の本開示の微生物共同体、及び許容される担体を含む。一態様では、微生物共同体は封入されている。
【００２５】
一実施形態では、単離微生物株は、表１及び／または表３の微生物株のいずれかから選択される。一実施形態では、単離微生物株は、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２０１１として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿７、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００７として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿３２、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２０１２として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿８２、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００９として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿１１９、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００９として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿１８０１、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００３として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２０６、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２０１４として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２３、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００４として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２４、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００２として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿４５、Ｂｉｇｅｌｏｗ登録寄託番号Ｐａｔｅｎｔ２０１６１２００３として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿２０８、ＮＲＲＬ登録寄託番号Ｂ−６７２４８として寄託されたＡｓｃｕｓｂ＿３１３８、及びＮＲＲＬ登録寄託番号Ｙ−６７２４９として寄託されたＡｓｃｕｓｆ＿１５からなる群より選択される。
【００２６】
一実施形態では、本開示の単離微生物株は、配列番号１〜２１０７のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本開示の単離微生物株は、配列番号１〜６０及び２０４５〜２１０７のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性をもつポリヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、単離微生物株の実質的に純粋な培養物は、本開示の株または微生物のいずれかを含む。
【００２８】
一実施形態では、反芻動物のミクロビオームを調節する方法には、本開示の組成物を投与することが含まれる。さらなる実施形態では、組成物の投与により、反芻動物に少なくとも１つの改善された形質が与えられる。一実施形態では、少なくとも１つの改善された形質は、乳中の脂肪の増加、乳中の炭水化物の増加、乳中のタンパク質の増加、乳中のビタミンの増加、乳中のミネラルの増加、乳体積の増加、改善された飼料利用及び消化効率、ポリサッカライド及びリグニン分解率の増加、第一胃内の脂肪酸濃度の上昇、第一胃内のｐＨバランス、メタン放出量の減少、糞生産の減少、改善された乾物摂取量、エネルギー補正乳（ＥＣＭ）の重量及び／または体積の増加、並びに改善された窒素利用効率からなる群より選択され、これらの増加または減少は、該組成物を投与されていない動物との比較により決定される。追加の実施形態では、ミクロビオームの調節は、該組成物の投与前にミクロビオームに存在していた微生物株の割合の減少であり、この減少は、該組成物の投与前の反芻動物のミクロビオームに対して測定される。
【００２９】
一実施形態では、乳中の脂肪を増加させる方法は、トリグリセリド、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、コレステロール、糖脂質、及び／または脂肪酸の増加である。
【００３０】
一実施形態では、炭水化物を増加させる方法は、オリゴサッカライド、ラクトース、グルコース、及び／またはガラクトースの増加である。
【００３１】
一実施形態では、ポリサッカライド分解率を増加させる方法は、リグニン、セルロース、ペクチン及び／またはヘミセルロースの分解率の増加である。
【００３２】
一実施形態では、脂肪酸濃度を上昇させる方法は、酢酸、プロピオン酸、及び／または酪酸の増加である。
【００３３】
一実施形態では、ミクロビオームを調節する方法は、ミクロビオームの少なくとも１つの微生物株の割合の増加であり、この増加は、該少なくとも１つの微生物株を投与されなかった反芻動物に対して測定される。
【００３４】
一実施形態では、ミクロビオームを調節する方法は、組成物の投与前にミクロビオームに存在していた微生物株の割合の減少であり、この減少は、該組成物の投与前の反芻動物のミクロビオームに対して測定される。
【００３５】
一実施形態では、病原性微生物のコロニー形成に対するウシの耐性を増加させる方法には、本開示の組成物を投与することが含まれ、その結果として病原性微生物はウシの胃腸管内でコロニー形成できなくなる。別の実施形態では、少なくとも１つの病原性微生物の存在に関してウシを治療する方法には、本開示の微生物共同体及び許容される担体の投与が含まれる。さらなる実施形態では、微生物共同体または微生物組成物の投与の結果として、胃腸管内で少なくとも１つの病原性微生物の相対数度が５％未満の相対数度に減少する。別の実施形態では、微生物共同体または微生物組成物の投与の結果として、胃腸管内で少なくとも１つの病原性微生物の相対数度が１％未満の相対数度に減少する。別の実施形態では、微生物共同体または微生物組成物の投与の結果として、病原性微生物は胃腸管内で検出不能となる。
【００３６】
一実施形態では、微生物組成物及び／または共同体は、細菌及び／または真菌を胞子として含む。一実施形態では、本開示の微生物組成物及び／または共同体は、細菌及び／または真菌を全細胞として含む。一実施形態では、本開示の微生物組成物及び／または共同体は、細菌及び／または真菌を溶解細胞として含む。本開示による微生物を製剤するいくつかの態様では、微生物を、発酵させ→濾過し→遠心分離し→凍結乾燥または噴霧乾燥し→任意選択によりコーティングする（すなわち「流動層ステップ」）。
【００３７】
特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
本出願の一部の微生物を２０１６年４月２５日１、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＲＳ）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ（登録商標））（所在地  １８１５  Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔ．，Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ  ６１６０４，ＵＳＡ）に寄託した。本出願の一部の微生物を、Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ（所在地  ６０  Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｄｒｉｖｅ，Ｅａｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ，Ｍａｉｎｅ  ０４５４４，ＵＳＡ）に寄託した。
【００３８】
寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約にしたがい寄託した。このブダペスト条約に関するＮＲＲＬ（登録商標）及び／またはＢｉｇｅｌｏｗ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａの受託番号を表３に記載する。本明細書で説明する微生物の受託番号とそれに対応する寄託日を、別途表２５に記載する。
【００３９】
以下の表で表示する株は、少なくとも２０１５年１２月１５日からＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．の研究室に寄託されている。
【００４０】
表１では、微生物が分類学的に最も近いと予測されたヒット結果が第２列と第５列に挙げられている。第２列は、ＢＬＡＳＴによる分類学的予測でヒットした第１位、第５列はＢＬＡＳＴによる属＋種の分類学的予測でヒットした第１位である。以下の表で表示する株は、少なくとも２０１５年１２月１５日からＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．の研究室に寄託されている。
【表１−１】
2019506856.tif 000003
【表１−２】
2019506856.tif 000004
【表１−３】
2019506856.tif 000005
【表１−４】
2019506856.tif 000006
【表１−５】
2019506856.tif 000007
【表１−６】
2019506856.tif 000008
【表２−１】
2019506856.tif 000009
【表２−２】
2019506856.tif 000010
【表２−３】
2019506856.tif 000011
【表２−４】
2019506856.tif 000012
【表２−５】
2019506856.tif 000013
【表３−１】
2019506856.tif 000014
【表３−２】
2019506856.tif 000015
【表３−３】
2019506856.tif 000016
【表３−４】
2019506856.tif 000017
【表３−５】
2019506856.tif 000018
【表３−６】
2019506856.tif 000019
【表３−７】
2019506856.tif 000020
【表３−８】
2019506856.tif 000021
【表３−９】
2019506856.tif 000022
【表３−１０】
2019506856.tif 000023
【表３−１１】
2019506856.tif 000024
【表３−１２】
2019506856.tif 000025
【表３−１３】
2019506856.tif 000026
【表３−１４】
2019506856.tif 000027
【表３−１５】
2019506856.tif 000028
【表３−１６】
2019506856.tif 000029
【表３−１７】
2019506856.tif 000030
【表３−１８】
2019506856.tif 000031
【表３−１９】
2019506856.tif 000032
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】１つ以上の活性微生物株の絶対数度を決定する方法の一実施形態の全体的なワークフローである。
【図２】試料中の１つ以上または２つ以上の活性微生物株の共出現とともに１つ以上のメタデータ（環境）パラメーターを決定し、この決定された関係のネットワークについてクラスター分析及び群集検出法が用いられる、方法の一実施形態の全体的なワークフローである。
【図３】乳牛にＡｓｃｕｓｂ＿３１３８及びＡｓｃｕｓｆ＿１５を含む組成物を投与したフィールド試験の結果を示す図である。図３Ａは、経時的に生産された乳脂肪の平均ポンド数を示し、図３Ｂは、経時的に生産された乳タンパク質の平均ポンド数を示し、図３Ｃは、経時的に生産されたエネルギー補正乳（ＥＣＭ）の平均ポンド数を示す。図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃそれぞれのデータポイントを縦断する線は、微生物バイオ共同体の投与が終わった日を示す。
【図４】介入期間の試験日による、対照（円）または接種（菱形）のいずれかに割り当てたウシの乳収量（ｋｇ）１日平均（塗りつぶしなし）、及び共変量調節した週の最小二乗平均（中実塗りつぶし）±標準誤差を示す図である。
【図５】介入期間の試験日による、対照（円）または接種（菱形）のいずれかに割り当てたウシの乳粗タンパク質収量（ＣＰ、ｋｇ）１日平均（塗りつぶしなし）及び週の最小二乗平均（中実塗りつぶし）±標準誤差を示す図である。
【図６】介入期間の試験日による、対照（円）または接種（菱形）のいずれかに割り当てたウシの乳脂肪収量（ｋｇ）１日平均（塗りつぶしなし）及び週の最小二乗平均（中実塗りつぶし）±標準誤差を示す図である。
【図７】介入期間の試験日による、対照（円）または接種（菱形）のいずれかに割り当てたウシのエネルギー補正乳収量（ＥＣＭ、ｋｇ）１日平均（塗りつぶしなし）及び週の最小二乗平均（中実塗りつぶし）±標準誤差を示す図である。
【図８】表１の細菌（図８Ａ）及び真菌（図８Ｂ）が共有する類似性パーセント（同一性パーセント）を示す図である。データポイントは、各株について最大類似性パーセントのペアリングを表す。
【図９】第一胃細菌と乳脂肪効率のＭＩＣスコア分布を示す図である。
【図１０】第一胃真菌と乳脂肪効率のＭＩＣスコア分布を示す図である。
【図１１】第一胃細菌と酪農効率のＭＩＣスコア分布を示す図である。
【図１２】第一胃真菌と酪農効率のＭＩＣスコア分布を示す図である。
【図１３】第一胃細菌と乳脂肪効率のＭＩＣスコア分布を、細菌４種とそれらのＭＩＣスコアとともに示す図であり、これらの種は第三者の試験で評価されたものである。ＭＩＣスコアが低いほど、種／株が乳牛の乳脂肪効率を好ましく調節する確率は低くなると考えられる。
【図１４】不溶性炭素源アッセイで用いられた、分解されていない炭素源（０日目）と、分解された炭素源（７日目）の図である。
【図１５】本開示の微生物組成物を投与された乳牛が、本開示の微生物組成物を投与されなかった乳牛に対して、乳１ｍＬ当たり２０万個超の体細胞（ＳＳＣ）を示すウシの頭数の減少を示す図である。
【図１６】食餌がいかに揮発性脂肪酸の生産に影響して、乳生産、体調、成長等を調節するかを例示する表である。Ｍｏｒａｎ，２００５．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｄａｉｒｙ  ｆａｒｍｉｎｇ：ｆｅｅｄｉｎｇ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｈｏｌｄｅｒ  ｄａｉｒｙ  ｆａｒｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍｉｃ  ｔｒｏｐｉｃｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ  ５），Ｌａｎｄｌｉｎｋｓ  Ｐｒｅｓｓ，３１２  ｐｐから再掲。
【図１７】本開示全体で考察するＭＩＣスコアの決定を含む、例示的な微生物の相互作用の分析及び選択システムで用いるプロセス・フローの一例を説明する概略図である。
【図１８】乳牛の乳脂肪生産に影響する第一胃微生物群集の構成員を決定するための、実験の間に生産された乳脂肪ポンド数の非線形性を示す図である。
【図１９】ターゲット株Ａｓｃｕｓ＿７１３の活性フィルターありの絶対細胞数と生産乳脂肪のポンド数（ｌｂｓ）の相関を示す図である。
【図２０】ターゲット株Ａｓｃｕｓ＿７の活性フィルターありの絶対細胞数と、実験の間に生産された乳脂肪のポンド数（ｌｂｓ）とを示す図である。
【図２１】ターゲット株Ａｓｃｕｓ＿３０３８の活性フィルターなしの相対数度と生産乳脂肪のポンド数（ｌｂｓ）の相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
以下の各用語は当業者であれば十分理解していようが、以下の各定義は、本開示の主題の説明を容易にするために示すものである。
【００４３】
「ａ」または「ａｎ」という用語は、あるものの１つ以上を指す場合があり、すなわち、複数を指すことができる。したがって、「ａ」または「ａｎ」、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では交換可能に用いられる。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」への言及は、その要素が１つだけでなくてはならないと文脈で明言しないかぎり、その要素が２つ以上ある可能性を排除するものではない。
【００４４】
本明細書全体で、「一実施形態」、「ある実施形態」、「一態様」、または「ある態様」への言及は、その実施形態に関して説明する特定の特性、構造、または特徴が、少なくとも１つの本開示の実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体で様々な箇所に見られる「一実施形態では」または「ある実施形態では」という表現は、それら全てが必ずしも同一の実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わせることができる。
【００４５】
本明細書では、特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、数値の前にある場合は、その値プラスまたはマイナス１０％以内を指す。
【００４６】
本明細書では「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、広義に理解すべきである。これらの用語は交換可能に用いられ、限定ではないが、原核生物の２ドメインの細菌及び古細菌、真核生物の真菌及び原生生物、ならびにウイルスが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、表１もしくは表３の「微生物」、または参照により本明細書に援用する「微生物」を指す。この特徴付けは、表の予測された分類学的微生物識別子だけでなく、表に挙げる特定された微生物株にも及び得る。
【００４７】
「微生物共同体（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉａ）」またはその複数形「ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ」という用語は、共通の機能を果たすと説明され得る、あるいは対象とする表現型の形質（たとえば反芻動物の乳生産の増加）など識別可能なパラメーターに関与する、つながる、または相関があると説明され得る、個々の微生物種または種の株の微生物群集のサブセットを指す。群集は、微生物の２つ以上の種または微生物種の株を含む場合がある。いくつかの例では、各微生物は群集内で相利共生的に共存する。
【００４８】
「微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）」という用語は、２つ以上の種または株を含む微生物群を意味する。微生物共同体とは違って、微生物群集は、共通の機能を果たさなくてもよく、あるいは、対象とする表現型の形質（たとえば反芻動物の乳生産の増加）など識別可能なパラメーターに関与しなくても、つながらなくても、または相関がなくてもよい。
【００４９】
本明細書では、「単離する」、「単離された」、「単離微生物」等の用語は、１つ以上の微生物が、ある特定の環境（たとえば土壌、水、動物組織）において関連する物質のうち少なくとも１つから単離されていることを意味するものとする。
【００５０】
本開示の微生物には、胞子及び／または栄養細胞が含まれる場合もある。いくつかの実施形態では、本開示の微生物には、生きているが培養できない（ＶＢＮＣ）状態の微生物が含まれる。Ｌｉａｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ（米国公開第２０１５２６７１６３Ａ１号）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本開示の微生物には、生物膜の微生物も含まれる。Ｍｅｒｒｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，４２７，４０８号）を参照されたい。
【００５１】
したがって、「単離微生物」は自然発生するような環境には存在せず、本明細書で説明する様々な技法により、該微生物はその自然な状況から離され、非自然発生的な存在状態に置かれている。したがって、単離株または単離微生物は、たとえば、生物学的に純粋な培養物として、または許容される担体と関連して胞子として（もしくは該株の他の形態で）存在し得る。
【００５２】
本明細書では、「胞子（ｓｐｏｒｅ）」またはその複数形「ｓｐｏｒｅｓ」は、細菌及び真菌により生産される生存及び散布に適した構造体を指す。胞子は一般に休眠構造体と特徴付けられるが、胞子は発芽過程により分化することができる。発芽は、胞子が、代謝活動、増殖、及び生殖が可能な栄養細胞へと分化することである。胞子１つが発芽して、１つの真菌または細菌栄養細胞となる。真菌胞子は、無性生殖の単位であり、真菌生活環における必要な構造体である場合もある。細菌胞子は、栄養細胞の生存または増殖に本来つながり得ないような条件下で生存する構造体である。
【００５３】
本明細書では、「微生物組成物」は、本開示の１つ以上の微生物を含む組成物を指し、微生物組成物は、いくつかの実施形態では、本開示の動物に投与される。
【００５４】
本明細書では、「担体」、「許容される担体」、または「製薬用担体」は、化合物が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような担体は、滅菌した液体、たとえば水や、石油由来、動物由来、植物由来、または合成などの油、たとえば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等であってもよい。水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液が、好ましくは担体として、いくつかの実施形態では注射液として、使用される。あるいは、担体は、限定ではないが、結合剤（圧縮丸薬用）、滑剤、カプセル剤、香料、及び着色料のうちの１種以上など、固体剤形の担体の場合もある。担体は、所期の投与経路及び標準薬務に応じて選択することができる。Ｈａｒｄｅｅ  ａｎｄ  Ｂａｇｇｏ（１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．５０４  ｐｇ．）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１９７０．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１７ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、及びＢｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国公開第２０１１０２８０８４０Ａ１号）を参照されたい。
【００５５】
本開示のある特定の態様では、単離微生物は、単離された生物学的に純粋な培養物として存在する。当業者であれば、特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物とは、該培養物が実質的に他の生命体を（科学的常識の範囲内で）含まず、その微生物のみを含むものと理解しよう。培養物は、該微生物を様々な濃度で含むことができる。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物は、しばしば「純度が低いかまたは不純な物質とは必然的に異なる」ことに留意する。たとえば、Ｉｎ  ｒｅ  Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，４２７  Ｆ．２ｄ  １３９４，（ＣＣＰＡ  １９７０）（精製プロスタグランジンについて記述）、また、Ｉｎ  ｒｅ  Ｂｅｒｇｙ，５９６  Ｆ．２ｄ  ９５２（ＣＣＰＡ  １９７９）（精製微生物についての記述）、また、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ  ＆  Ｃｏ．，１８９  Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（Ｌｅａｒｎｅｄ  Ｈａｎｄの精製アドレナリンについての記述）、ａｆｆ’ｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ，ｒｅｖ’ｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ，１９６  Ｆ．４９６（２ｄ  Ｃｉｒ．１９１２）を参照されたい（これらをすべて参照により本明細書に援用する）。さらに、いくつかの態様では、本開示は、単離された生物学的に純粋な微生物培養物において見られるべき濃度つまり純度限界のある特定の量的尺度を提供する。これらの純度値の存在は、ある特定の実施形態では、本開示の微生物を自然な状態で存在する微生物と区別するさらなる属性である。たとえば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ  Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，２５３  Ｆ．２ｄ  １５６（４ｔｈ  Ｃｉｒ．１９５８）（微生物が生産したビタミンＢ１２の純度限界について記述）を参照されたい（参照により本明細書に援用する）。
【００５６】
本明細書では、「個々の単離物」は、１つ以上の他の微生物からの単離後の、単一の微生物の属、種、または株を優勢的に含む組成物または培養物を意味すると解釈すべきである。この表現は、該微生物が単離または精製されている程度の指標と解釈してはならない。しかし、「個々の単離物」は、実質的に唯一の微生物の属、種、または株を含むことができる。
【００５７】
本明細書では、「ミクロビオーム」は、動物の消化管または胃腸管（該動物が反芻動物の場合は第一胃も含む）に住む微生物の集団、かつ、該微生物の物理的環境を指す（すなわち、ミクロビオームには、生物的要素と物理的要素がある）。ミクロビオームは液体であり、多数の自然に生じる条件及び人工的条件（たとえば、飼料の変化、疾患、抗微生物剤、さらなる微生物の流入等）により調節され得る。本開示の組成物の投与により実現することができる第一胃のミクロビオームの調節は、（ａ）特定の微生物の科、属、種、または機能群の増加または減少（すなわち第一胃ミクロビオームの生物的要素の改変）、及び／または（ｂ）第一胃の揮発性脂肪酸の増加または減少、第一胃ｐＨの上昇または低下、第一胃の健康に重要な任意の他の物理的パラメーターの上昇または低下（すなわち第一胃ミクロビオームの非生物的要素の改変）とすることができる。
【００５８】
本明細書では、「プロバイオティック」は、実質的に純粋な微生物（すなわち、単一の単離物）または所望の微生物の混合物を指し、微生物叢の回復のため哺乳類に投与され得る任意の追加成分も含むことができる。本発明のプロバイオティックまたは微生物接種材料組成物は、胃腸管の環境で微生物が生存できる、すなわち微生物が胃腸環境の低ｐＨに耐えて増殖できるようにする剤とともに投与することができる。いくつかの実施形態では、本組成物（たとえば、微生物組成物）はいくつかの態様ではプロバイオティックである。
【００５９】
本明細書では、「プレバイオティック」は、１つ以上の所望の微生物の数及び／または活性を増加させる剤を指す。本開示の方法で有用であり得るプレバイオティックの非限定的な例としては、フルクトオリゴサッカライド（たとえば、オリゴフルクトース、イヌリン、イヌリンタイプのフルクタン）、ガラクトオリゴサッカライド、アミノ酸、アルコール、及びそれらの混合物が挙げられる。Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｆａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８．Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．４：１−１０）及びＰｏｏｌ−Ｚｏｂｅｌ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ（２００７．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３７：２５８０−２５８４及び補足）を参照されたい。
【００６０】
本明細書では、「増殖培地」という用語は、微生物の増殖を支えるのに好適な、あらゆる培地である。例として、培地は、ガストリン付加寒天、ＬＢ培地、血清、及び組織培養ゲルなど、天然でも人工でもよい。なお、培地は単独で使用しても、１つ以上の他の培地と組み合わせて使用してもよいことを理解されたい。また、外因的栄養素を加えて使用しても、加えずに使用してもよい。
【００６１】
培地は、追加の化合物または成分、たとえば特定の微生物群の相互作用及び／または選択を補助できるような成分により改良または補強することができる。たとえば、抗生物質（たとえばペニシリン）または殺菌剤（たとえば四級アンモニウム塩及び酸化剤）が存在してもよいし、及び／または物理的条件（たとえば塩分、栄養素（たとえば有機ミネラル及び無機ミネラル（たとえばリン、窒素塩、アンモニア、カリウム、及び微量栄養素、たとえばコバルト及びマグネシウム）、ｐＨ、及び／または温度）を改良することができる。
【００６２】
本明細書では、「反芻動物」という用語には、植物系の飼料を特殊な胃（第一胃）内で主として微生物の作用によって発酵させてから消化することで、飼料からの栄養素を摂取できる哺乳類が含まれる。反芻動物としては、牛、ヤギ、羊、キリン、ヤク、鹿、レイヨウ等が挙げられる。
【００６３】
本明細書では、「ウシ科」という用語には、Ｂｏｖｉｄａｅ科のあらゆるメンバーが含まれ、これにはたとえばレイヨウ、羊、ヤギ、及び牛といった有蹄哺乳類が含まれる。
【００６４】
本明細書では、「エネルギー補正乳」または「ＥＣＭ」は、乳体積、乳脂肪、及び乳タンパク質に基づく乳のエネルギー量を表す。ＥＣＭは、乳成分を脂肪３．５％及びタンパク質３．２％に調整するので、動物の成績が均一化され、また、動物の個体レベル及び集団レベルで経時的な生産の比較が可能になる。本開示に関して用いるＥＣＭの計算式は次のとおりである。
ＥＣＭ＝（０．３２７ｘ乳ポンド数）＋（１２．９５ｘ脂肪ポンド数）＋（７．２ｘタンパク質ポンド数）
【００６５】
本明細書では、「改善（改良）された」は、広く、対照群と比べての、または対象とする特徴に関する既知の平均量と比べての、該対象となる特徴の改善を網羅すると考えるべきである。たとえば、本開示の有益な微生物、または共同体の利用に関連する「改善された」乳生産は、本明細書で教示する微生物で処置された有蹄動物が生産する乳と、処置されていない有蹄動物の乳を比較することにより示すことができる。本開示では、「改善された」は必ずしもデータに統計学的有意差があること（すなわちｐ＜０．０５）を要求するものではなく、１つの値（たとえば平均処置値）が別の値（たとえば平均対照値）とは異なることを示す定量可能な差異ならどれでも「改善された」レベルとすることができる。
【００６６】
本明細書では、「阻害し抑制すること」等の用語は、完全な阻害または抑制を要すると解釈してはならない。ただし、実施形態によっては完全な阻害または抑制が望ましい場合もある。
【００６７】
本明細書では、「マーカー」または「特有のマーカー」という用語は、特有の微生物タイプ、微生物株または微生物株の活性の指標である。マーカーは、生体試料において測定することができ、限定ではないが、リボソームＲＮＡ遺伝子など核酸ベースのマーカー、ペプチドベースのマーカー、もしくはタンパク質ベースのマーカー、及び／または代謝物もしくは他の小分子マーカーが含まれる。
【００６８】
本明細書では、「代謝物」という用語は、代謝の中間体または産物である。一実施形態では代謝物は小分子である。代謝物には様々な機能があり、たとえば、酵素の補助因子として酵素に対する燃料、構造的、シグナル伝達、刺激、及び阻害の各効果、防御、及び他の生物との相互作用における機能が挙げられる（たとえば色素、匂い物質、及びフェロモン）。一次代謝物は、正常な増殖、発生、及び生殖に直接関与している。二次代謝物はこうした過程に直接の関与はないが、ふつうは重要な生態学的機能を有する。代謝物の例としては、限定ではないが、抗生物質及び色素、たとえば樹脂及びテルペン等が挙げられる。一次代謝物トリプトファンから生成するアクチノマイシンなど、一次代謝物を前駆体とする抗生物質もある。本明細書では、代謝物には、分子量の小さい疎水性炭水化物、分子量の大きい親水性脂質及び天然化合物複合体が含まれる。
【００６９】
本明細書では、「遺伝子型」という用語は、１個の細胞、細胞培養物、組織、生物、または生物群の遺伝子構成を指す。
【００７０】
本明細書では、「アレル」という用語は、ある遺伝子の１つ以上の代替形態をどれでも意味し、これらアレルはすべて、少なくとも１つの形質または特徴に関する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つのアレルは、１対の相同染色体上の対応する座位を占めている。本開示は複数の実施形態でＱＴＬ、すなわち１つ以上の遺伝子または制御配列を含み得るゲノム領域に関するので、場合によっては、より正確には「アレル」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち染色体セグメントのアレル）を指すが、そのような場合、「アレル」という用語は「ハプロタイプ」という用語を含むと理解すべきである。複数のアレルが類似の表現型を発現する場合、これらのアレルは同一であるとみなされる。配列の違いはあり得るが、表現型に影響しないかぎりは重要ではない。
【００７１】
本明細書では、「座位（ｌｏｃｕｓ）」（複数形はｌｏｃｉ）という用語は、たとえば遺伝子または遺伝子マーカーが見つかる染色体上の特定の場所（単数または複数）または部位を意味する。
【００７２】
本明細書では、「遺伝的に関係のある」という用語は、繁殖時に高い割合で共遺伝するので交雑により分かれ難い２つ以上の形質を指す。
【００７３】
本明細書では、「組換え」または「組換事象」は、染色体の交雑または独立した組合せを指す。「組換え体」という用語は、組換事象の結果として新たな遺伝子構成を有する生物を指す。
【００７４】
本明細書では、「分子マーカー」または「遺伝子マーカー」という用語は、核酸配列特徴の差異を可視化する方法に用いられる指標を指す。そのような指標の例は、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入変異、マイクロサテライトマーカー（ＳＳＲ）、配列特徴的増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、もしくはイソ酵素マーカー、または特定の遺伝子の及び染色体上の位置を定める本明細書で説明するマーカーの組合せである。マーカーにはさらに、１６Ｓ  ｒＲＮＡまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列（小サブユニットｒＲＮＡ遺伝子と大サブユニットｒＲＮＡ遺伝子の間に見られる配列であり、互いに比較すると関係や区別の解明に特に有用であることがわかっている）が含まれる。アレル近傍での分子マーカーのマッピングは、分子生物学的技法の当業者であれば実施できる手順である。
【００７５】
主たるｒＲＮＡサブユニット１６Ｓの一次構造には、異なる速度で進化し、ドメインなどの非常に古い系統と属などのより新しい系統の両方の解析を可能にする、保存領域、可変領域、及び超可変領域の特定の組合せが含まれる。１６Ｓサブユニットの二次構造には、およそ５０ヘリックスが含まれ、残基の約６７％の塩基対となる。これらの高度に保存された二次構造の特徴は、機能的に非常に重要であり、多重配列アラインメント及び系統発生分析で位置相同性の確認に用いることができる。この数十年で、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、最も多く配列決定された分類学的マーカーとなっており、現在の細菌及び古細菌の体系的分類の土台となっている（Ｙａｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．１２：６３５−４５）。
【００７６】
２つの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列同一性が９４．５％以下であれば明白に異なる属の強力な証拠となり、８６．５％以下であれば明白に異なる科の強力な証拠となり、８２％以下であれば明白に異なる目の強力な証拠となり、７８．５％であれば明白に異なる綱の強力な証拠となり、７５％以下であれば明白に異なる門の強力な証拠となる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の比較分析により、分類学的閾値の確立が可能になり、これは培養微生物の分類に便利であるだけでなく、多くの環境配列の分類にも便利である（Ｙａｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ．１２：６３５−４５）。
【００７７】
本明細書では、「形質」という用語は、特徴または表現型を指す。たとえば、本開示のいくつかの実施形態の文脈では、生産乳脂肪の量は、乳中のトリグリセリド、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、コレステロール、糖脂質、及び脂肪酸の量に関する。望ましい形質には、それ以外の乳の特徴も含まれる場合があり、たとえば限定ではないが、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、及び長鎖脂肪酸の優勢、ラクトース、グルコース、ガラクトース、及び他のオリゴサッカライドなどの炭水化物の量、カゼイン及び乳清などのタンパク質の量、ビタミンやミネラル、乳収量／乳体積の量、メタン放出または糞の減少、窒素利用効率の改善、乾物摂取量の改善、飼料効率及び消化率の改善、セルロース、リグニン、及びヘミセルロースの分解率の増加、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸などの脂肪酸の第一胃内濃度の上昇、その他が挙げられる。
【００７８】
形質は、優性的もしくは劣性的に、または部分優性的もしくは不完全優性的に遺伝し得る。形質は一遺伝子性（すなわち１つの座位により決定される）でも、多遺伝子性（すなわち２つ以上の座位により決定される）でもよく、あるいは１つ以上の遺伝子が環境と相互作用して生じる場合もある。
【００７９】
本開示の文脈では、形質は、１つ以上の哺乳類遺伝子が１つ以上の微生物遺伝子と相互作用して生じる場合もある。
【００８０】
本明細書では、「ホモ接合の」という用語は、２つの同一のアレルが特定の座位にあるが、二倍体生物の細胞の相同染色体の対応する対にそれぞれ位置している場合に存在する遺伝子の状態を意味する。それとは逆に「ヘテロ接合の」という用語は、本明細書では、２つの異なるアレルが特定の座位にあるが、二倍体生物の細胞の相同染色体の対応する対にそれぞれ位置している場合に存在する遺伝子の状態を意味する。
【００８１】
本明細書では、「表現型」という用語は、１個の細胞、細胞培養物、生物（たとえば反芻動物）、または生物群の観察可能な特徴を指し、これはその個体の遺伝子構成（すなわち遺伝子型）と環境の相互作用の結果である。
【００８２】
本明細書では、核酸配列またはタンパク質配列を説明する場合の「キメラ」または「組換え」という用語は、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチド、または２つの異種ポリペプチドを結合して１つの巨大分子にする、あるいは、少なくとも１つの天然の核酸またはタンパク質配列の１つ以上の要素を再配置する核酸またはタンパク質配列を指す。たとえば、「組換え」という用語は、たとえば化学合成により、または遺伝子工学の技法を用いての核酸の単離セグメントの操作によって、そうでなければ別々である２つの配列セグメントを人工的に組み合わせたものを指すことができる。
【００８３】
本明細書では、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、自然発生することが知られていない、または自然発生しないヌクレオチド配列である。一般に、そのような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の自然発生するヌクレオチド配列と比較すると、少なくとも１つのヌクレオチドの違いを含んでいる。
【００８４】
本明細書では、「核酸」という用語は、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでも、またはそのアナログでも、あらゆる長さのヌクレオチド重合体を指す。この用語は、分子の一次構造を指すので、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを含む。また、メチル化及び／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基や骨格修飾を含む核酸等の修飾された核酸も含む。「核酸」と「ヌクレオチド配列」という用語は交換可能に用いられる。
【００８５】
本明細書では、「遺伝子」という用語は、生物学的機能と関連のあるあらゆるＤＮＡセグメントを指す。したがって、遺伝子には、限定ではないが、それらの発現に必要なコード配列及び／または制御配列が含まれる。遺伝子にはまた、たとえば他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含まれる。遺伝子は、たとえば、対象とするソースからのクローニング、または既知のもしくは予測された配列情報からの合成など、多様なソースから得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含み得る。
【００８６】
「相同性のある」または「ホモログ」または「オルソログ」という用語は当業界では知られており、本明細書では、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有する関連配列を指し、配列同一性の程度により決定される。「相同性」、「相同性のある」、「実質的に同じ」、及び「実質的に対応がある」という用語は、本明細書では交換可能に用いられる。これらは、核酸断片について、１つ以上のヌクレオチド塩基の変更が、核酸断片が遺伝子発現を媒介する、または特定の表現型を生じる能力に影響しないことを指す。これらの用語はまた、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入など、本開示の核酸断片の修飾も指すが、この修飾により得られた核酸断片の機能特性は、当初の未修飾断片のものと比べて実質的に改変されない。したがって、当業者であれば理解しようが、本開示は、特定の例示的な配列に留まらず、もっと包括的であることを理解されたい。これらの用語は、１つの種、亜種、変種、栽培品種、または株に見られる遺伝子と、別の種、亜種、変種、栽培品種、または株の対応するかもしくは同等の遺伝子の関係を説明する。本開示の目的では、相同配列を比較する。「相同配列」または「ホモログ」または「オルソログ」は、機能的に関係があると思われ、考えられ、または知られている。機能的関係の表示方法は多くあり、限定ではないが、（ａ）配列同一性の程度及び／または（ｂ）同一もしくは類似の生物学的機能などが挙げられ、どれで表示してもよい。好ましくは、（ａ）と（ｂ）の両方で表示される。相同性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７１８，Ｔａｂｌｅ  ７．７１に記載されているような、当業界では容易に入手できるソフトウェアプログラムを使って決定することができる。いくつかのアラインメント・プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、及びＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。別のアラインメント・プログラムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）であり、デフォルトのパラメーターを用いる。
【００８７】
本明細書では、「ヌクレオチドの変更」という用語は、当業界では周知のように、たとえばヌクレオチドの置換、欠失、及び／または挿入を指す。たとえば、変異には、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性は変えない、またはそのタンパク質がどのような構成であるかは変えない、改変が含まれる。
【００８８】
本明細書では、「タンパク質修飾」という用語は、当業界では周知のように、たとえばアミノ酸の置換、アミノ酸の修飾、欠失、及び／または挿入を指す。
【００８９】
本明細書では、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部分」または「断片」という用語は、そのような配列の最小サイズの特徴をもつ部分、またはもっと大きい、最大で全長分子そのものを含む、全長分子の断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子制御エレメントの生物学的活性部分をコードし得る。遺伝子制御エレメントの生物学的活性部分は、その遺伝子制御エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドのうちの１つの一部分を単離し、本明細書で説明するようにして活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの一部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸等々、最大で全長ポリペプチドであってもよい。使用する一部分の長さは、具体的な用途による。ハイブリダイゼーション・プローブとして有用な、核酸の一部分は、１２ヌクレオチドと短い場合もあるが、いくつかの実施形態では２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用な、ポリペプチドの一部分は、４アミノ酸と短い場合もある。全長ポリペプチドの機能を果たす、ポリペプチドの一部分は、一般に４アミノ酸よりも大きくなる。
【００９０】
バリアントのポリヌクレオチドは、変異原性の組換え誘導手順、たとえばＤＮＡシャフリングにより誘導される配列も網羅する。そのようなＤＮＡシャフリングのストラテジーは、当業界では知られている。たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：１０７４７−１０７５１、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４：４５０４−４５０９、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１、ならびに米国特許第５，６０５，７９３号及び同第５，８３７，４５８号を参照されたい。本明細書で開示するポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために、ＰＣＲ反応で用いるオリゴヌクレオチド・プライマーを設計して、ｃＤＮＡまたは対象とする任意の生物から抽出したゲノムＤＮＡからの対応するＤＮＡ配列を増幅することができる。ＰＣＲプライマーの設計及びＰＣＲクローニングの方法は当業界では一般的に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に開示されている。また、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、  Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＩｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，ｅｄｓ．（１９９９）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照されたい。知られているＰＣＲ方法としては、限定ではないが、ペアのプライマー、入れ子式プライマー、単一特異的プライマー、変性プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマー等を用いる方法が挙げられる。
【００９１】
本明細書では、「プライマー」という用語は、増幅ターゲットにアニーリングしてＤＮＡポリメラーゼを付着させることができるオリゴヌクレオチドを指し、それにより、プライマー伸長産物の合成が誘発される条件下に置かれると、すなわちヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤、ならびに好適な温度及びｐＨの存在下では、ＤＮＡ合成の開始点となる。この（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅効率が最大化されるように、一本鎖である。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるのに十分な長さがなくてはならない。プライマーの実際の長さは、温度、及びプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有率）などの多くの要因による。二方向性のプライマー対は、ＰＣＲ増幅などＤＮＡ増幅において当業界で広く使用されているように、一本のフォワードプライマーと一本のリバースプライマーからなる。
【００９２】
「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、たとえば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度等を指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのそのターゲット核酸配列との特異的な結合を最大限にし、非特異的結合を最小限にするように、経験的に最適化される。本明細書ではこれらの用語は、プローブまたはプライマーが、他の配列と比べて検出できるほど高度に（たとえば少なくともバックグラウンドの２倍）ターゲット配列にハイブリダイズするような条件への言及を含む。ストリンジェント条件は配列によって決まり、状況が異なれば変わってくる。配列が長いほど、高温で、特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びｐＨで、特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強度及びｐＨで）相補的ターゲット配列の５０％が、完全にマッチするプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度である。ストリンジェント条件は、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン濃度という塩濃度がふつうであり、一般には約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）で、ｐＨ７．０〜８．３、温度は短いプローブまたはプライマー（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブまたはプライマー（たとえば５０ヌクレオチドよりも長い）では最低約６０℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現することもできる。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーを下げた条件」としては、３７℃で、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳのバッファー液を用い、４０℃で２×ＳＳＣで一回洗うハイブリダイゼーションが挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、３７℃で、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳを用い、６０℃で０．１×ＳＳＣで一回洗うハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーション手順は当業界では周知であり、たとえばＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１で説明されている。いくつかの実施形態では、ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションは、４５℃で、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％など０．５〜２０％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー（ｐＨ７．２）を用い、次いで５５℃〜６５℃で、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含む５×ＳＳＣで一回洗う。
【００９３】
本明細書では、「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近位と遠位の上流要素からなり、後者の要素はエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの天然要素の場合もあれば、プロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるように挿入された異種要素の場合もある。プロモーターは、全体的に天然の遺伝子に由来する場合もあるし、自然界に見られる異種プロモーターに由来する異なる要素で構成されている場合もあるし、合成ＤＮＡセグメントを含む場合もある。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織または細胞種における、あるいは異なる発生段階で、あるいは異なる環境条件に応答して、遺伝子発現を指令することができることを理解しよう。さらに、ほとんどの場合、制御配列の明確な境界は完全には画定されていないので、多少異なるＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性をもち得ることが認識されている。
【００９４】
本明細書では、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下で及び／またはほとんどの発生段階中に活性のあるプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクター内に構成的プロモーターを用いる利点はいくつかあり、たとえば、遺伝子導入細胞または生物の選択に用いるタンパク質の高レベルの生産、レポータータンパク質またはスコラブルマーカーの高レベルの発現（検出及び定量化が容易になる）、制御転写系の一部である転写因子の高レベルの生産、生物における広範な活性を要する化合物の生産、及び、発生のあらゆる段階中に必要となる化合物の生産などである。限定ではなく例示的な構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、オパインプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター等が挙げられる。
【００９５】
本明細書では、「非構成的プロモーター」は、ある特定条件下で、ある特定のタイプの細胞において、及び／またはある特定の発生段階中に、活性のあるプロモーターである。たとえば、組織特異的、組織優先的、細胞タイプに特異的、細胞タイプに優先的な誘導性プロモーター及び発生制御下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生制御下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織において優先的に転写を開始させるプロモーターが挙げられる。
【００９６】
本明細書では、「誘導性」または「抑制性」プロモーターは、化学的または環境性の要因の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、嫌気性条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件などが挙げられる。
【００９７】
本明細書では、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織のみにおいて転写を開始させるプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、いくつかの相互作用するレベルの遺伝子制御の結果である。したがって、当業界では、特定の組織において導入遺伝子を高効率かつ確実に発現させるために、相同性のまたは近縁種からのプロモーターを用いることが好ましい場合もある。このことは、科学文献及び特許文献のどちらにも見られるように、特定組織から大量の組織特異的プロモーターが単離されることの主な理由の一つである。
【００９８】
本明細書では、「機能的に連結されている」という用語は、一方の機能が他方によって制御されるように、核酸配列が単一の核酸断片に結合していることを指す。たとえば、プロモーターが、連結されているコード配列の発現を制御できる場合、該コード配列と機能的に連結されている（すなわち、該コード配列は該プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に、制御配列に機能的に連結されている。別の例では、本開示の相補ＲＮＡ領域は、直接または間接的に、ターゲットｍＲＮＡに５’または３’で、またはターゲットｍＲＮＡ内で、あるいは第１の相補領域はターゲットｍＲＮＡに対し５’に、もう一方は３’に、機能的に連結されていてもよい。
【００９９】
本明細書では、「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換えＤＮＡコンストラクト」という表現は、交換可能に用いられる。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工的な組合せ、たとえば自然界ではその組合せが見られない制御配列及びコード配列を含む。たとえば、キメラコンストラクトは、異なるソース由来の制御配列とコード配列、または同じソース由来だが自然界で見られるものとは違う構成にされている制御配列とコード配列を含むことができる。そのようなコンストラクトは単独で使用してもよいし、ベクターと組み合わせて使用してもよい。ベクターを用いる場合、当業者には周知のように、ベクターの選択は、宿主細胞の形質転換に用いられる方法に依存する。たとえば、プラスミドベクターを用いることができる。当業者であれば、本開示の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞の形質転換、選択、及び繁殖を成功させるためにベクターに存在していなければならない遺伝子要素を熟知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベル及びパターンの発現をもたらす（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）ので、所望の発現レベル及びパターンを示す株を得るためには複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識している。そのようなスクリーニングは、たとえば、ＤＮＡのサザーン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザーン分析、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、または表現型分析により実施することができる。ベクターは、自己複製するかまたは宿主細胞の染色体に組み込まれることが可能な、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等であってもよい。ベクターはまた、自己複製しない、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内でＤＮＡとＲＮＡ両方で構成されているポリヌクレオチド、ポリ−リジンが結合されたＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドが結合されたＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームが結合されたＤＮＡ等であってもよい。本明細書では、「発現」という用語は、機能性の最終産物、たとえば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟体）の生産を指す。
【０１００】
いくつかの実施形態では、細胞または生物は少なくとも１つの異種形質を有する。本明細書では、「異種形質」という用語は、形質転換された宿主細胞または遺伝子導入生物に、外因的ＤＮＡセグメント、異種ポリヌクレオチド、または異種核酸によって与えられる表現型を指す。表現型の様々な変更は本開示の対象であり、たとえば限定ではないが、乳の脂肪酸組成の変更、乳の炭水化物成分の改変、有蹄動物の経済上重要な形質（たとえば、乳、乳脂肪、乳タンパク質等）の収量の増加等が挙げられる。これらの結果は、本開示の方法及び組成物により、生物において異種産物の発現または内因性産物の発現率の増加を提供することによって、実現することができる。
【０１０１】
本明細書では、「ＭＩＣ」という用語は、最大情報係数を意味する。ＭＩＣはノンパラメトリックなネットワーク分析の一種であり、本開示の活性微生物株と、少なくとも１つの測定されたメタデータ（たとえば乳脂肪）間のスコア（ＭＩＣスコア）を特定する。さらに、２０１６年７月２２日出願の米国特許出願第１５／２１７，５７５号（２０１７年１月１０日に米国特許第９，５４０，６７６号として発行）の全体を参照により本明細書に援用する。
【０１０２】
次に、図１７に見られるように、最大情報係数（ＭＩＣ）を、株とメタデータ間で計算し（３０２１ａ）、株間で計算する（３０２１ｂ）。結果をプールして、すべての関係とそれらの対応するＭＩＣスコアのリストを作成する（３０２２）。関係スコアが所与の閾値よりも低い場合（３０２３）、その関係は、関連性なしとみなされる／特定される（３０２３ｂ）。関係が所与の閾値よりも高い場合（３０２３）、その関係は、関連性ありとみなされ／特定され（２０２３ａ）、さらにネットワーク分析に供される（３０２４）。以下のコード断片はそのような分析の一実施形態によるある例示的な方法を示すものである。
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【化１】
2019506856.tif 000033
【０１０３】
ネットワーク分析の出力に基づき、活性株が、該選択株を含む産物（たとえば、アンサンブル、アグリゲート、及び／または他の合成グループ分け）を調整するために選択される（３０２５）。ネットワーク分析の出力はまた、さらなる産物組成試験のための、株の選択についての情報提供にも用いることができる。
【０１０４】
分析及び決定のための閾値の使用については上に記載した。閾値は、実装形態及び用途に依存して以下の通りであることができる：（１）経験的に決定する（たとえば、分布レベルに基づき、低レベルのリードの特定した、または有意な部分を取り除く数値をカットオフとして設定する）、（２）あらゆる非ゼロ値、（３）百分率／百分位数に基づく、（４）正規化第２マーカー（すなわち活性）のリードが正規化第１マーカー（細胞数）のリードよりも大きい株のみ、（５）活性と量または細胞数のｌｏｇ２倍の変化（６）全試料（または試料セット）で正規化第２マーカー（活性）のリードが第２マーカー（活性）の平均リードよりも大きい、及び／または統計的閾値（すなわち有意差検定）に加えてのあらゆる上述の大きさ閾値。以下の実施例では、一実施形態による、ＤＮＡベースの第１マーカー測定値に対するＲＮＡベースの第２マーカー測定値の分布の閾値に関する詳細を提供する。
【０１０５】
本明細書では「保存可能な」は、本開示において製剤される微生物が獲得した機能的属性及び新たな有益性を指し、それにより該微生物は第一胃内の自然な環境の外でも有用／活性状態で存在することができる（すなわち著しく異なる特徴である）。したがって、保存可能なとは、本開示の製剤／組成物により生じる機能的属性であり、製剤され保存可能な組成物となった微生物は第一胃の外の周囲条件下である期間にわたって存在することができることを意味する。ある期間というのは、用いられる具体的な製剤に応じて決定することができるが、一般には、該微生物が周囲条件下で少なくとも２、３日、一般には少なくとも１週間は安定して組成物中に存在するように製剤できることを意味する。したがって、「保存可能な反芻動物用サプリメント」は、本開示の１つ以上の微生物を含む組成物であって、該微生物は組成物中に配合されて該組成物は周囲条件下で少なくとも１週間は安定であるようにされ、つまり、該組成物に含まれる該微生物（たとえば全細胞、胞子、または溶解細胞）は、反芻動物に投与されると、１つ以上の有益な表現型特性（たとえば乳収量の増加、乳成分特徴の改善、第一胃の健康状態の改善、及び／または第一胃ミクロビオームの調節）を与えることができる。
【０１０６】
単離微生物
いくつかの態様では、本開示は、表１及び表３に示す、微生物の新規株を含む単離微生物を提供する。
【０１０７】
他の態様では、本開示は、表１及び表３で特定した微生物の単離全微生物培養物を提供する。これらの培養物は、微生物を様々な濃度で含むことができる。
【０１０８】
いくつかの態様では、本開示は、表１及び表３から選択される１つ以上の微生物を利用して、反芻動物において対象とする表現型形質を増加させることを提供する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本開示は、分類学的にＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇａｃｅａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎａｅｃｅａｅ、Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科に属する単離微生物種を提供する。
【０１１０】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｎｏｘｙｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｂｒｙａｎｔｅｌｌａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｌｄａｎａｅｒｏｃｅｌｌａ、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ、Ｃａｌｏｒａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｍｉｎｉｃｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｒｔｈｒｏｍｉｔｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｃｉｅｌｌａ、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｌｉｎｍｉｎｇｉａ、Ｎａｔｒｏｎｉｎｃｏｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｒａｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｏｅｈｎｇｅｎｉａ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｔｅｐｉｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｔｅｐｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＴｉｎｄａｌｌｉａから選択してもよい。
【０１１１】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の属、たとえばＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｉｕｍ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、Ｇｅｍｍｉｇｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｓｔｉｄｉｏｓｉｐｉｌａ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｎｇｅｎｅｎｓ、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＣａｎｄｉｄａｄｕｓ  Ｓｏｌｅａｆｅｒｒｅａから選択してもよい。
【０１１２】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科の属、たとえばＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎｅｌｌａ、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｄｏｒｅａ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｍａｒｖｉｎｂｒｙａｎｔｉａ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔｏｍａｔｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔａｔｉｆａｃｔｏｒ、及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａから選択してもよい。
【０１１３】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｃｃｉｎｉｃｌａｓｔｉｃｕｍ、及びＳｕｃｃｉｎｉｓｐｉｒａから選択してもよい。
【０１１４】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の属、たとえばＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂｏｔｕｌｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎｉｓｐｏｒａ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｉｎｃｏｌａ、Ｃｒｙｐｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｓｐｏｒａ、及びＤｅｓｕｌｆｉｔｏｓｐｏｒａから選択してもよい。
【０１１５】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の属、たとえばＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｄｙｓｇｏｎｏｍｏｎａｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｍ、Ｐｅｔｒｉｍｏｎａｓ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｖｅｓｔｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｍａｃｅｌｌｉｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、及びＣｏｐｒｏｂａｃｔｅｒから選択してもよい。
【０１１６】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ａｎａｅｒｏｌｉｎａｅｃｅａｅ科の属、たとえばＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａ、Ｂｅｌｌｉｌｉｎｅａ、Ｌｅｐｔｏｌｉｎｅａ、Ｌｅｖｉｌｉｎｅａ、Ｌｏｎｇｉｌｉｎｅａ、Ｏｒｎａｔｉｌｉｎｅａ、及びＰｅｌｏｌｉｎｅａから選択してもよい。
【０１１７】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ａｔｏｐｏｂｉａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｔｏｐｂｉｕｍ及びＯｌｓｅｎｅｌｌａから選択してもよい。
【０１１８】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ａｍｉｎｉｃｅｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｃｉｅｌｌａ、及びＰｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒから選択してもよい。
【０１１９】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａなど、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ科の属から選択してもよい。
【０１２０】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｃｃｉｎａｔｉｍｏｎａｓ、Ｓｕｃｃｉｎｉｍｏｎａｓ、及びＳｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏから選択してもよい。
【０１２１】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ科の属、たとえばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ、及びＳｈａｒｐｅａから選択してもよい。
【０１２２】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｓｃｈｗａｒｔｚｉａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、及びＺｙｍｏｐｈｉｌｕｓから選択してもよい。
【０１２３】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ科の属、たとえばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｉｔｉｎｉｍｏｎａｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｎｄｏｒａｅａ、Ｐａｒａｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｐａｕｃｉｍｏｎａｓ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ、及びＷａｕｔｅｒｓｉａから選択してもよい。
【０１２４】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科の属、たとえばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｖｕｍ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓから選択してもよい。
【０１２５】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ａｎａｅｒｏｌｉｎａｅｃｅａｅ科の属、たとえばＡｅｓｔｕａｒｉｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ａｒａｃｈｎｉａ、Ａｕｒａｔｉｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒｏｏｋｌａｗｎｉａ、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ、Ｇｒａｎｕｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍａｒｉｎｉｌｕｔｅｉｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ、Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ、Ｎａｕｍａｎｎｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｆｅｒａｘ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、及びＴｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓから選択してもよい。
【０１２６】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ科の属、たとえばＰａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、ｈａｌｌｅｌｌａ、Ｘｙｌａｎｉｂａｃｔｅｒ、及びＡｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａから選択してもよい。
【０１２７】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓから選択してもよい。
【０１２８】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科の属、たとえばＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｎｉｃｌｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ（Ａｒｘｉｏｚｙｍａと同じ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｌａｃｈａｎｃｅａ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｎａｋａｓｅｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐａｔｈａｓｐｏｒａ、Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ、Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、及びＺｙｇｏｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａから選択してもよい。
【０１２９】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ科の属、たとえばＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｃｏｃｃｕｓ、Ｆａｅｃａｌｉｔａｌｅａ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｅｌｌａ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ、Ｄｉｅｌｍａ、Ｅｇｇｅｒｔｈｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ａｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｚｎａｋｉａ、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｓｐｈａｅｒａ、及びＣｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓから選択してもよい。
【０１３０】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ科の属、たとえばＢａｒｒｉａ、Ｂｒｉｃｏｏｋｅａ、Ｃａｒｉｎｉｓｐｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｐｌｅａ、Ｅｕｄａｒｌｕｃａ、Ｈａｄｒｏｓｐｏｒａ、Ｉｓｔｈｍｏｓｐｏｒｅｌｌａ、Ｋａｔｕｍｏｔｏａ、Ｌａｕｔｉｔｉａ、Ｍｅｔａｍｅｒｉｓ、Ｍｉｘｔｕｒａ、Ｎｅｏｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｎｏｄｕｌｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｏｐｈｉｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉｓ、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉｏｐｓｉｓ、Ｓｅｔｏｍｅｌａｎｏｍｍａ、Ｓｔａｇｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｔｅｒａｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、及びＷｉｌｍｉａから選択してもよい。
【０１３１】
さらなる実施形態では、単離微生物種は、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ科の属、たとえばＡｍａｒｅｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｐｌｏｓｐｏｒｅｌｌａ、Ａｕｅｒｓｗａｌｄｉｅｌｌａ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｄｉｃｈｏｍｅｒａ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｄｉｓｃｏｃｈｏｒａ、Ｄｏｔｈｉｄｏｔｈｉａ、Ｄｏｔｈｉｏｒｅｌｌａ、Ｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ、Ｇｒａｎｕｌｏｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ、Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｌｅｐｔｏｄｏｔｈｉｏｒｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｄｏｔｈｉｏｒｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｇｕｉｇｎａｒｄｉａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍａ、Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ、Ｎａｔｔｒａｓｓｉａ、Ｎｅｏｄｅｉｇｈｔｏｎｉａ、Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｕｍ、Ｎｅｏｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｏｔｔｈｉａ、Ｐｈａｅｏｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｐｈｏｍａｔｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒａｔａ、Ｓｉｖａｎｅｓａｎｉａ、及びＴｈｙｒｏｓｔｒｏｍａから選択してもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｖｒｙｓｔａａｔｉａ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、及びＰｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ属に属する単離微生物種を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に属する単離微生物種を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、単離微生物種Ｃａｎｄｉｄａ  ｘｙｌｏｐｓｏｃｉ、Ｖｒｙｓｔａａｔｉａ  ａｌｏｅｉｃｏｌａ、及びＰｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ  ｃａｐｉｔａｌｅｎｓｉｓを提供する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示する分類群からの微生物が反芻動物の乳に１つ以上の有益な特性または改善された形質を与えるように用いられる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｖｒｙｓｔａａｔｉａ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、及びＰｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａからなる群より選択される単離微生物種を提供する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｖｒｙｓｔａａｔｉａ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、及びＰｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａからなる群より選択される種の新規の単離微生物株を提供する。これらの分類学的グループの特定の新規株は、表１及び／または表３に見出すことができる。
【０１３６】
さらに、本開示は、表１または表３で特定する微生物の特徴と実質的に同じ特徴をもつ微生物に関する。
【０１３７】
本開示で特定する単離微生物種、及び該種の新規株は、反芻動物が生産する乳に有益な特性または形質を与えることができる。
【０１３８】
たとえば、表１及び表３に記載する単離微生物または該微生物の共同体は、反芻動物の乳中の総乳脂肪を増加させることができる。この増加は、たとえば該微生物の使用が総乳脂肪の調節に及ぼす効果を測定することにより、定量的に測定することができる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、単離微生物株は、遺伝子改変されている、本開示の微生物である。いくつかの実施形態では、この遺伝子改変または組換え微生物は、該微生物で自然発生しないポリヌクレオチド配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、この微生物は、異種ポリヌクレオチドを含み得る。さらなる実施形態では、この異種ポリヌクレオチドは、該微生物に固有の１つ以上のポリヌクレオチドに機能的に連結され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子または選択可能マーカーであり得る。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質ファミリーのいずれか（たとえば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ等）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼから選択することができる。いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アセトラクターゼシンターゼ、ブロモキシニルニトリラーゼ、β−グルクロニダーゼ、ジヒドロゴラートレダクターゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼから選択することができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ接合ポリヌクレオチドは、１つ以上のプロモーターに機能的に連結されてい得る。
【表４−１】
2019506856.tif 000034
【表４−２】
2019506856.tif 000035
【０１４１】
微生物共同体
いくつかの態様では、本開示は、表１及び／または表３で特定される微生物から選択される少なくとも２微生物の組合せを含む微生物共同体を提供する。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本開示の共同体は、２微生物、または３微生物、または４微生物、または５微生物、または６微生物、または７微生物、または８微生物、または９微生物、または１０以上の微生物を含む。共同体のこのような微生物は、異なる微生物種であるか、または１つの微生物種の異なる株である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｖｒｙｓｔａａｔｉａ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、及びＰｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ属に属する単離微生物種を少なくとも２つ含む共同体を提供する。これらの属の種の特定の新規株は、表１及び／または表３に見出すことができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目の種からなる群より選択される単離微生物種を少なくとも２つ含む共同体を提供する。
【０１４５】
特定の態様では、本開示は、表５〜表１１にグループ分けされている種を含む微生物共同体を提供する。表５〜表１１に関して、ＡからＩの文字は、以下のように定めるように、本開示の微生物の非限定的な選択を表す。
【０１４６】
Ａ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｂ＿７、
【０１４７】
Ｂ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、
【０１４８】
Ｃ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｂ＿８２、
【０１４９】
Ｄ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｂ＿１１９、
【０１５０】
Ｅ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｂ＿１８０１、
【０１５１】
Ｆ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｆ＿２３、
【０１５２】
Ｇ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｆ＿２４、
【０１５３】
Ｈ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及び
【０１５４】
Ｉ＝表１で特定される株表示Ａｓｃｕｓｆ＿１５。
【表５】
2019506856.tif 000036
【表６】
2019506856.tif 000037
【表７】
2019506856.tif 000038
【表８】
2019506856.tif 000039
【表９】
2019506856.tif 000040
【表１０】
2019506856.tif 000041
【表１１】
2019506856.tif 000042
【０１５５】
いくつかの実施形態では、微生物共同体は、表５〜表１１のどのメンバー群から選択してもよい。
【０１５６】
単離微生物−原料物質
本開示の微生物は、たとえば、米国内の様々な場所で、ウシの胃腸管から入手した。
【０１５７】
単離微生物−微生物培養法
表１及び表３の微生物を、１６ｓ  ｒＲＮＡ配列については分類ツールＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）を用いて、ＩＴＳ  ｒＲＮＡ配列についてはＵｓｅｒ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ  Ｎｏｒｄｉｃ  ＩＴＳ  Ｅｃｔｏｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ（ＵＮＩＴＥ）データベースを用いて、最も近い分類学的グループとマッチさせた。微生物を最も近い分類群にマッチングする例は、Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２．ＰＬＯＳ  ｏｎｅ．７（３）：ｅ３２４９１），Ｓｃｈｌｏｓｓ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｃｏｔｔ（２０１１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７（１０）：３２１９−３２２６）、及びＫｏｌｊａｌｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５．Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．１６６（３）：１０６３−１０６８）に見出すことができる。
【０１５８】
本開示の微生物の単離、特定、及び培養は、標準的な微生物学の技法により実行することができる。そのような技法の例は、Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）及びＬｅｎｎｅｔｔｅ，Ｅ．Ｈ．（ｅｄ．）Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）で見出すことができ、これらを参照により本明細書に援用する。
【０１５９】
単離は、固体培地（たとえば、栄養寒天プレート）表面に検体を画線することにより実施することができ、それによって、上述の表現型の形質によって特徴付けられる（たとえば、グラム陽性／陰性、好気的／嫌気的に胞子を形成できる、細胞の形態、炭素源の代謝、酸／塩基生産、酵素分泌、代謝性分泌等）単一のコロニーを得、また、汚染された培養物で作業する可能性を減じる。
【０１６０】
たとえば、本開示の微生物について、生物学的試料の継代培養を繰り返し、各継代培養物を固体培地の表面に画線してそれぞれのコロニーまたはコロニー形成ユニットを得ることで、生物学的に純粋な単離物を得ることができる。凍結乾燥細菌を調製し、解凍し、増殖させる方法は広く知られており、たとえば、Ｇｈｅｒｎａ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｒｅｄｄｙ．２００７．Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｐ  １０１９−１０３３．Ｉｎ  Ｃ．Ａ．Ｒｅｄｄｙ，Ｔ．Ｊ．Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ａ．Ｂｒｅｚｎａｋ，Ｇ．Ａ．Ｍａｒｚｌｕｆ，Ｔ．Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，ａｎｄ  Ｌ．Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ，ｅｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１０３３  ｐａｇｅｓであり、参照により本明細書に援用する。したがって、グリセロール含有液中−７０℃で長期間保存された凍結乾燥液剤及び培養物が、本開示の製剤の準備に用いられることが企図される。
【０１６１】
本開示の微生物は、液体培地中、好気性条件あるいは嫌気性条件下で繁殖させることができる。本開示の細菌株を増殖するための培地には、炭素源、窒素源、及び無機塩、ならびにビタミン、アミノ酸、核酸等の特別に必要とされる物質が含まれる。微生物の増殖に使用できる好適な炭素源の例としては、限定ではないが、デンプン、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸、糖、たとえばグルコース、アラビノース、マンノース、グルコサミン、マルトース等；酢酸、フマル酸、アジピン酸、プロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、マロン酸等の有機酸の塩；エタノール及びグリセロール等のアルコール；大豆油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油などの油または脂が挙げられる。添加される炭素源の量は、炭素源の種類によって変わり、一般には培地１リットル当たり１〜１００グラムである。好ましくは、グルコース、デンプン、及び／またはペプトンが主炭素源として０．１〜５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で培地に含まれる。本開示の細菌株の増殖に使用できる好適な窒素源の例としては、限定ではないが、アミノ酸、酵母エキス、トリプトン、ビーフエキス、ペプトン、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、またはそれらの組合せが挙げられる。窒素源の量は、窒素源の種類によって異なり、一般には培地１リットル当たり０．１〜３０グラムである。無機塩、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化第一鉄、硫酸第一マンガン、塩化第一マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムは、単独でも組合せでも用いることができる。無機酸の量は、無機塩の種類によって異なり、一般には培地１リットル当たり０．００１〜１０グラムである。特別に必要とされる物質の例としては、限定ではないが、ビタミン、核酸、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、麦芽エキス、乾燥酵母、及びそれらの組合せが挙げられる。培養は、微生物株の増殖が可能な温度、基本的には２０℃〜４６℃で実施することができる。いくつかの態様では、温度の範囲は３０℃〜３９℃である。最適な増殖のために、いくつかの実施形態では、培地をｐＨ６．０〜７．４に調節することができる。微生物株の培養には、たとえばＤｉｆｃｏ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）が販売するＮｕｔｒｉｅｎｔ  ＢｒｏｔｈまたはＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒなど、市販の培地を用いてもよいことは理解されよう。培養の時間は、用いられる培養培地の種類、及び主炭素源としての糖の濃度により異なり得ることは理解されよう。
【０１６２】
いくつかの態様では、培養は、２４〜９６時間続く。こうして得られた微生物細胞を、当業界で周知の方法により単離する。例としては、限定ではないが、膜濾過法及び遠心分離法が挙げられる。水酸化ナトリウム等でｐＨを調節することができ、培養物を水分含量が４％以下になるまで凍結乾燥機で乾燥することができる。微生物の共培養物は、上述の各株を繁殖することにより得ることができる。いくつかの態様では、微生物の多株培養物は、上述の株のうち２つ以上を繁殖させることにより得ることができる。適合する培養条件を用いることができる場合には微生物株を共培養できることが理解されよう。
【０１６３】
単離微生物−微生物株
微生物は、あらゆる有効な表現型データ及び遺伝子型データをコンセンサス分類に組み込む多相分類学に基づいて、属に区分することができる（Ｖａｎｄａｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ  ｔａｘｏｎｏｍｙ，ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９６，６０：４０７−４３８）。種を定義するための、一般に認められている１つの遺伝子型法は、全体的ゲノム関連性に基づくものであり、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより、標準条件下、ΔＴｍ（相同及び異種ハイブリッド間の溶解温度の差）は５℃以下で、およそ７０％以上の関連性がある株を、同種のメンバーとみなす。したがって、この７０％閾値超を共有する集団を、同種のバリアントとみなすことができる。種を定義するための、一般に認められている別の遺伝子型法は、本開示のマーカー遺伝子を単離し、これらの遺伝子を配列決定し、これらの配列決定した複数の単離物またはバリアントからの遺伝子をアラインメントすることである。それらの微生物は、配列決定した遺伝子の１つ以上が少なくとも９７％の配列同一性を有する場合、同種に属すると解釈される。
【０１６４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列またはＩＴＳ配列は、種や株の区別に用いられることが多く、このような配列のうちの１つが参照配列に対し特定の配列同一性パーセントを下回る場合、このような配列が由来する２生物は、異なる種または株である、と言われる。
【０１６５】
したがって、微生物間で、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列またはＩＴＳ１配列もしくはＩＴＳ２配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性がある場合、同種であるとみなすことができる。
【０１６６】
さらに、微生物株間で、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列、またはＩＴＳ１配列もしくはＩＴＳ２配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性がある場合、それらは１つの種の株とみなすことができる。
【０１６７】
一実施形態では、本開示の微生物株には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、３９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、２０４５、２０４６、２０４７、２０４８、２０４９、２０５０、２０５１、２０５２、２０５３、２０５４、２０５５、２０５６、２０５７、２０５８、２０５９、２０６０、２０６１、２０６２、２０６３、２０６４、２０６５、２０６６、２０６７、２０６８、２０６９、２０７０、２０７１、２０７２、２０７３、２０７４、２０７５、２０７６、２０７７、２０７８、２０７９、２０８０、２０８１、２０８２、２０８３、２０８４、２０８５、２０８６、２０８７、２０８８、２０８９、２０９０、２０９１、２０９２、２０９３、２０９４、２０９５、２０９６、２０９７、２０９８、２０９９、２１００、２１０１、２１０２、２１０３、２１０４、２１０５、２１０６、及び２１０７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むものが含まれる。さらなる実施形態では、本開示の微生物株には、配列番号１〜２１０７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むものが含まれる。
【０１６８】
２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列を参照配列と比較する場合もある。
【０１６９】
培養できない微生物は、表現型が決定されず、特定の種に割り当てられないことが多いが、そのような微生物はその１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列もしくは１８Ｓ  ｒＲＮＡ配列またはＩＴＳ配列が既知の種と基本的な同一性がある場合は、属内でｃａｎｄｉｄａｔｕｓ表示を与えられる場合がある。
【０１７０】
一つの方法として、近縁種の多数の株の配列空間における分布を観察し、他のクラスターとはっきり区別できるクラスターを特定することがある。この方法は、複数のコア（ハウスキーピング）遺伝子の連鎖配列によりクラスター形成パターンを評価することで開発され、多座位配列分析（ＭＬＳＡ）または多座位配列系統発生分析と呼ばれている。ＭＬＳＡは、現行の分類学的方法により非常に近縁の種に割り当てられた多数の株同士のクラスター形成パターンを調査したり、１つの属またはより大きな分類学的グループ内の少数の株同士の関係を調べたり、特定の分類学的問題に取り組んだりするのに成功裏に利用されている。もっと広くは、この方法は、細菌種が存在するかどうかの確認、つまり、巨大集団の類似株がはっきりと区別されるクラスターに一様に当てはまるかどうか、あるいは場合によっては、明瞭なクラスター区切りが観察されない遺伝子連続体があるかどうかの観察に用いることができる。
【０１７１】
より正確に属を決定するために、形態的、生化学的、及び生理学的特徴などの表現型形質を決めて、参照する属の原型と比較する。コロニー形態には、色、形、色素沈着、スライム生産等が含まれ得る。細胞の特性は、形、サイズ、グラム反応、細胞外物質、内生胞子の存在、鞭毛の存在及び場所、運動性、ならびに封入体に関して記述される。生化学的及び生理学的特徴は、異なる範囲の温度、ｐＨ、塩分、及び雰囲気条件での生物の増殖、異なる単独炭素源及び単独窒素源の存在下での増殖を記述する。当業者であれば、本開示の属を定義する表現型形質について当然知識はあろう。
【０１７２】
一実施形態では、本明細書で教示する微生物は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列及びＩＴＳ配列を使って特定した。当業界では、１６Ｓ  ｒＲＮＡは、細菌の特定に便利な種／株特異的符号配列を提供できる超可変領域を含むこと、及びＩＴＳ配列もまた真菌の特定に便利な種／株特異的特徴配列を提供できることが知られている。
【０１７３】
ｒＲＮＡ遺伝子及び／またはＩＴＳ配列を用いる系統発生分析は、同じ属に属する「実質的に類似」種を定めること、及び所与の分類学的種の「実質的に類似」株を定めることにも用いられる。さらに、単離物の生理学的及び／または生化学的特性は、反芻動物における有益な挙動につながり得る、株間の微小および著しい差異の双方を強調するのに用いることができる。
【０１７４】
本開示の組成物は、真菌胞子と細菌胞子、真菌胞子と細菌栄養細胞、真菌栄養細胞と細菌胞子、真菌栄養細胞と細菌栄養細胞の組合せを含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、細菌を胞子の形態のみで含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、細菌を栄養細胞の形態のみで含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、真菌の非存在下で細菌を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、細菌の非存在下で真菌を含む。
【０１７５】
細菌胞子としては、内生胞子及びアキネートを挙げることができる。真菌胞子としては、非射出胞子、射出胞子、自然発生胞子、不動胞子、遊走子、栄養胞子、大胞子、小胞子、減数胞子、厚膜胞子、夏胞子、冬胞子、卵胞子、果胞子、四分胞子、胞子嚢胞子、接合胞子、子嚢胞子、担子胞子、子嚢胞子、及びサビ胞子を挙げることができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、組成物の胞子は、本開示の動物に投与すると発芽する。いくつかの実施形態では、組成物の胞子は、本開示の動物に投与した場合のみ発芽する。
【０１７７】
微生物組成物
いくつかの実施形態では、本開示の微生物は微生物組成物中に混合される。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、穀類（オオムギ、トウモロコシ、オートムギ等）、デンプン（タピオカ等）、脂肪種子残渣、及び野菜廃棄物などの反芻動物用飼料を含む。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、ビタミン、ミネラル、微量元素、乳化剤、芳香剤、結合剤、着色料、匂い物質、増粘剤等を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は固体である。固体組成物を用いる場合、限定ではないが、シリカ、タルク、カオリン、石灰石、白亜、粘土、苦灰石、珪藻土などの粘土鉱物、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、穀物の粗挽粉、樹皮の粗挽粉、木材の粗挽粉、及び堅果の殻の粗挽粉などの植物由来の産物などの、１つ以上の担体物質を含むことが望ましい場合がある。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は液体である。さらなる実施形態では、液体は、水またはアルコールを含み得る溶媒、及び他の動物に安全な溶媒を含む。いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、動物に安全なポリマー、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ポリビニルアルコール等の結合剤を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、シリカ、粘土、種子や海藻の天然エキス、セルロース合成誘導体、グアーガム、ローカストビーンガム、アルギン酸エステル、及びメチルセルロースなどの増粘剤を含む。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、加工デンプン、ポリビニルアルコール、キサンタンガム等の沈降防止剤を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、ニトロソ；ニトロ；アゾ、たとえばモノアゾ、ビスアゾ、及びポリアゾ；アクリジン、アントラキノン、アジン、ジフェニルメタン、インダミン、インドフェノール、メチン、オキサジン、フタロシアニン、チアジン、チアゾール、トリアリールメタン、キサンテンとして分類される有機発色団を含む。いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、鉄、マンガン、ホウ素、銅、コバルト、モリブデン、及び亜鉛の各塩などの微量栄養素を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、動物に安全な抗ウイルス剤または殺線虫剤を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、サッカライド（たとえば、モノサッカライド、ジサッカライド、トリサッカライド、ポリサッカライド、オリゴサッカライド等）、高分子サッカライド、脂質、高分子脂質、リポポリサッカライド、タンパク質、高分子タンパク質、リポタンパク質、核酸、核酸ポリマー、シリカ、無機塩、及びそれらの組合せを含む。さらなる実施形態では、微生物組成物は、寒天、アガロース、ゲルライト、ゲランガム等のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、プラスチックカプセル、乳剤（たとえば、水と油）、膜、及び人工膜を含む。いくつかの実施形態では、乳剤または結合ポリマー溶液（ｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が、本開示の微生物組成物を含む場合がある。Ｈａｒｅｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ（米国特許第８，４６０，７２６Ｂ２号）を参照されたい。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、固体として（たとえば分散凍結乾燥胞子）または液体として（貯蔵培地に散在する微生物）存在する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、１つ以上の保存料を含む。保存料は、液体製剤であっても気体製剤であってもよい。保存料は、モノサッカライド、ジサッカライド、トリサッカライド、ポリサッカライド、酢酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸カルシウム、エリスロビン酸、イソアスコルビン酸、エリソルビン酸、硝酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、イソアスコルビン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、窒素、安息香酸、ソルビン酸カルシウム、ラウロイルアルギニンエチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、メチルパラベン、酢酸カリウム、安息香酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、二酢酸カリウム、乳酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、プロピルパラベン、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、二酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルのナトリウム塩、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルのナトリウム塩、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、亜硫酸、プロピオン酸カルシウム、二炭酸ジメチル、ナタマイシン、ソルビン酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、二酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシルアニソール（ＢＨＡ）、クエン酸、モノグリセリド及び／またはジグリセリドのクエン酸エステル、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン塩酸塩、ユウソウボク樹脂、グアヤク樹脂、レシチン、クエン酸レシチン、クエン酸モノグリセリド、クエン酸モノイソプロピル、没食子酸プロピル、ピロ亜硫酸ナトリウム、酒石酸、三級ブチルヒドロキノン、塩化第一錫、チオジプロピオン酸、チオジプロピオン酸ジラウリル、チオジプロピオン酸ジステアリル、エトキシキン、二酸化硫黄、ギ酸、またはトコフェロールのうちの１つ以上から選択することができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、細菌及び／または真菌細胞を、胞子形態で、栄養細胞形態で、及び／または溶解細胞形態で含む。一実施形態では、溶解細胞体は、マイコトキシン結合剤として、たとえば死細胞に結合するマイコトキシンとして作用する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、冷蔵庫（３５〜４０°Ｆ）内で、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、または６０日の期間は保存可能である。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、冷蔵庫（３５〜４０°Ｆ）内で、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間は保存可能である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、室温（６８〜７２°Ｆ）または５０〜７７°Ｆで、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、または６０日の期間は保存可能である。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、室温（６８〜７２°Ｆ）または５０〜７７°Ｆで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間は保存可能である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、−２３〜３５°Ｆで、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、または６０日の期間は保存可能である。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、−２３〜３５°Ｆで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間は保存可能である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、７７〜１００°Ｆで、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、または６０日の期間は保存可能である。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、７７〜１００°Ｆで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間は保存可能である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、１０１〜２１３°Ｆで、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、または６０日の期間は保存可能である。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、１０１〜２１３°Ｆで、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、５３週間、５４週間、５５週間、５６週間、５７週間、５８週間、５９週間、または６０週間の期間は保存可能である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、冷蔵温度（３５〜４０°Ｆ）で、室温（６８〜７２°Ｆ）で、５０〜７７°Ｆで、−２３〜３５°Ｆで、７０〜１００°Ｆで、または１０１〜２１３°Ｆで、約１〜１００週間、約１〜９５週間、約１〜９０週間、約１〜８５週間、約１〜８０週間、約１〜７５週間、約１〜７０週間、約１〜６５週間、約１〜６０週間、約１〜５５週間、約１〜５０週間、約１〜４５週間、約１〜４０週間、約１〜３５週間、約１〜３０週間、約１〜２５週間、約１〜２０週間、約１〜１５週間、約１〜１０週間、約１〜５週間、約５〜１００週間、約５〜９５週間、約５〜９０週間、約５〜８５週間、約５〜８０週間、約５〜７５週間、約５〜７０週間、約５〜６５週間、約５〜６０週間、約５〜５５週間、約５〜５０週間、約５〜４５週間、約５〜４０週間、約５〜３５週間、約５〜３０週間、約５〜２５週間、約５〜２０週間、約５〜１５週間、約５〜１０週間、約１０〜１００週間、約１０〜９５週間、約１０〜９０週間、約１０〜８５週間、約１０〜８０週間、約１０〜７５週間、約１０〜７０週間、約１０〜６５週間、約１０〜６０週間、約１０〜５５週間、約１０〜５０週間、約１０〜４５週間、約１０〜４０週間、約１０〜３５週間、約１０〜３０週間、約１０〜２５週間、約１０〜２０週間、約１０〜１５週間、約１５〜１００週間、約１５〜９５週間、約１５〜９０週間、約１５〜８５週間、約１５〜８０週間、約１５〜７５週間、約１５〜７０週間、約１５〜６５週間、約１５〜６０週間、約１５〜５５週間、約１５〜５０週間、約１５〜４５週間、約１５〜４０週間、約１５〜３５週間、約１５〜３０週間、約１５〜２５週間、約１５〜２０週間、約２０〜１００週間、約２０〜９５週間、約２０〜９０週間、約２０〜８５週間、約２０〜８０週間、約２０〜７５週間、約２０〜７０週間、約２０〜６５週間、約２０〜６０週間、約２０〜５５週間、約２０〜５０週間、約２０〜４５週間、約２０〜４０週間、約２０〜３５週間、約２０〜３０週間、約２０〜２５週間、約２５〜１００週間、約２５〜９５週間、約２５〜９０週間、約２５〜８５週間、約２５〜８０週間、約２５〜７５週間、約２５〜７０週間、約２５〜６５週間、約２５〜６０週間、約２５〜５５週間、約２５〜５０週間、約２５〜４５週間、約２５〜４０週間、約２５〜３５週間、約２５〜３０週間、約３０〜１００週間、約３０〜９５週間、約３０〜９０週間、約３０〜８５週間、約３０〜８０週間、約３０〜７５週間、約３０〜７０週間、約３０〜６５週間、約３０〜６０週間、約３０〜５５週間、約３０〜５０週間、約３０〜４５週間、約３０〜４０週間、約３０〜３５週間、約３５〜１００週間、約３５〜９５週間、約３５〜９０週間、約３５〜８５週間、約３５〜８０週間、約３５〜７５週間、約３５〜７０週間、約３５〜６５週間、約３５〜６０週間、約３５〜５５週間、約３５〜５０週間、約３５〜４５週間、約３５〜４０週間、約４０〜１００週間、約４０〜９５週間、約４０〜９０週間、約４０〜８５週間、約４０〜８０週間、約４０〜７５週間、約４０〜７０週間、約４０〜６５週間、約４０〜６０週間、約４０〜５５週間、約４０〜５０週間、約４０〜４５週間、約４５〜１００週間、約４５〜９５週間、約４５〜９０週間、約４５〜８５週間、約４５〜８０週間、約４５〜７５週間、約４５〜７０週間、約４５〜６５週間、約４５〜６０週間、約４５〜５５週間、約４５〜５０週間、約５０〜１００週間、約５０〜９５週間、約５０〜９０週間、約５０〜８５週間、約５０〜８０週間、約５０〜７５週間、約５０〜７０週間、約５０〜６５週間、約５０〜６０週間、約５０〜５５週間、約５５〜１００週間、約５５〜９５週間、約５５〜９０週間、約５５〜８５週間、約５５〜８０週間、約５５〜７５週間、約５５〜７０週間、約５５〜６５週間、約５５〜６０週間、約６０〜１００週間、約６０〜９５週間、約６０〜９０週間、約６０〜８５週間、約６０〜８０週間、約６０〜７５週間、約６０〜７０週間、約６０〜６５週間、約６５〜１００週間、約６５〜９５週間、約６５〜９０週間、約６５〜８５週間、約６５〜８０週間、約６５〜７５週間、約６５〜７０週間、約７０〜１００週間、約７０〜９５週間、約７０〜９０週間、約７０〜８５週間、約７０〜８０週間、約７０〜７５週間、約７５〜１００週間、約７５〜９５週間、約７５〜９０週間、約７５〜８５週間、約７５〜８０週間、約８０〜１００週間、約８０〜９５週間、約８０〜９０週間、約８０〜８５週間、約８５〜１００週間、約８５〜９５週間、約８５〜９０週間、約９０〜１００週間、約９０〜９５週間、または９５〜１００週間の期間は保存可能である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、冷蔵温度（３５〜４０°Ｆ）で、室温（６８〜７２°Ｆ）で、５０〜７７°Ｆで、−２３〜３５°Ｆで、７０〜１００°Ｆで、または１０１〜２１３°Ｆで、１〜１００週間、１〜９５週間、１〜９０週間、１〜８５週間、１〜８０週間、１〜７５週間、１〜７０週間、１〜６５週間、１〜６０週間、１〜５５週間、１〜５０週間、１〜４５週間、１〜４０週間、１〜３５週間、１〜３０週間、１〜２５週間、１〜２０週間、１〜１５週間、１〜１０週間、１〜５週間、５〜１００週間、５〜９５週間、５〜９０週間、５〜８５週間、５〜８０週間、５〜７５週間、５〜７０週間、５〜６５週間、５〜６０週間、５〜５５週間、５〜５０週間、５〜４５週間、５〜４０週間、５〜３５週間、５〜３０週間、５〜２５週間、５〜２０週間、５〜１５週間、５〜１０週間、１０〜１００週間、１０〜９５週間、１０〜９０週間、１０〜８５週間、１０〜８０週間、１０〜７５週間、１０〜７０週間、１０〜６５週間、１０〜６０週間、１０〜５５週間、１０〜５０週間、１０〜４５週間、１０〜４０週間、１０〜３５週間、１０〜３０週間、１０〜２５週間、１０〜２０週間、１０〜１５週間、１５〜１００週間、１５〜９５週間、１５〜９０週間、１５〜８５週間、１５〜８０週間、１５〜７５週間、１５〜７０週間、１５〜６５週間、１５〜６０週間、１５〜５５週間、１５〜５０週間、１５〜４５週間、１５〜４０週間、１５〜３５週間、１５〜３０週間、１５〜２５週間、１５〜２０週間、２０〜１００週間、２０〜９５週間、２０〜９０週間、２０〜８５週間、２０〜８０週間、２０〜７５週間、２０〜７０週間、２０〜６５週間、２０〜６０週間、２０〜５５週間、２０〜５０週間、２０〜４５週間、２０〜４０週間、２０〜３５週間、２０〜３０週間、２０〜２５週間、２５〜１００週間、２５〜９５週間、２５〜９０週間、２５〜８５週間、２５〜８０週間、２５〜７５週間、２５〜７０週間、２５〜６５週間、２５〜６０週間、２５〜５５週間、２５〜５０週間、２５〜４５週間、２５〜４０週間、２５〜３５週間、２５〜３０週間、３０〜１００週間、３０〜９５週間、３０〜９０週間、３０〜８５週間、３０〜８０週間、３０〜７５週間、３０〜７０週間、３０〜６５週間、３０〜６０週間、３０〜５５週間、３０〜５０週間、３０〜４５週間、３０〜４０週間、３０〜３５週間、３５〜１００週間、３５〜９５週間、３５〜９０週間、３５〜８５週間、３５〜８０週間、３５〜７５週間、３５〜７０週間、３５〜６５週間、３５〜６０週間、３５〜５５週間、３５〜５０週間、３５〜４５週間、３５〜４０週間、４０〜１００週間、４０〜９５週間、４０〜９０週間、４０〜８５週間、４０〜８０週間、４０〜７５週間、４０〜７０週間、４０〜６５週間、４０〜６０週間、４０〜５５週間、４０〜５０週間、４０〜４５週間、４５〜１００週間、４５〜９５週間、４５〜９０週間、４５〜８５週間、４５〜８０週間、４５〜７５週間、４５〜７０週間、４５〜６５週間、４５〜６０週間、４５〜５５週間、４５〜５０週間、５０〜１００週間、５０〜９５週間、５０〜９０週間、５０〜８５週間、５０〜８０週間、５０〜７５週間、５０〜７０週間、５０〜６５週間、５０〜６０週間、５０〜５５週間、５５〜１００週間、５５〜９５週間、５５〜９０週間、５５〜８５週間、５５〜８０週間、５５〜７５週間、５５〜７０週間、５５〜６５週間、５５〜６０週間、６０〜１００週間、６０〜９５週間、６０〜９０週間、６０〜８５週間、６０〜８０週間、６０〜７５週間、６０〜７０週間、６０〜６５週間、６５〜１００週間、６５〜９５週間、６５〜９０週間、６５〜８５週間、６５〜８０週間、６５〜７５週間、６５〜７０週間、７０〜１００週間、７０〜９５週間、７０〜９０週間、７０〜８５週間、７０〜８０週間、７０〜７５週間、７５〜１００週間、７５〜９５週間、７５〜９０週間、７５〜８５週間、７５〜８０週間、８０〜１００週間、８０〜９５週間、８０〜９０週間、８０〜８５週間、８５〜１００週間、８５〜９５週間、８５〜９０週間、９０〜１００週間、９０〜９５週間、または９５〜１００週間の期間は保存可能である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、冷蔵温度（３５〜４０°Ｆ）で、室温（６８〜７２°Ｆ）で、５０〜７７°Ｆで、−２３〜３５°Ｆで、７０〜１００°Ｆで、または１０１〜２１３°Ｆで、約１〜３６か月、約１〜３４か月、約１〜３２か月、約１〜３０か月、約１〜２８か月、約１〜２６か月、約１〜２４か月、約１〜２２か月、約１〜２０か月、約１〜１８か月、約１〜１６か月、約１〜１４か月、約１〜１２か月、約１〜１０か月、約１〜８か月、約１〜６か月、約１  １  ４か月、約１〜２か月、約４〜３６か月、約４〜３４か月、約４〜３２か月、約４〜３０か月、約４〜２８か月、約４〜２６か月、約４〜２４か月、約４〜２２か月、約４〜２０か月、約４〜１８か月、約４〜１６か月、約４〜１４か月、約４〜１２か月、約４〜１０か月、約４〜８か月、約４〜６か月、約６〜３６か月、約６〜３４か月、約６〜３２か月、約６〜３０か月、約６〜２８か月、約６〜２６か月、約６〜２４か月、約６〜２２か月、約６〜２０か月、約６〜１８か月、約６〜１６か月、約６〜１４か月、約６〜１２か月、約６〜１０か月、約６〜８か月、約８〜３６か月、約８〜３４か月、約８〜３２か月、約８〜３０か月、約８〜２８か月、約８〜２６か月、約８〜２４か月、約８〜２２か月、約８〜２０か月、約８〜１８か月、約８〜１６か月、約８〜１４か月、約８〜１２か月、約８〜１０か月、約１０〜３６か月、約１０〜３４か月、約１０〜３２か月、約１０〜３０か月、約１０〜２８か月、約１０〜２６か月、約１０〜２４か月、約１０〜２２か月、約１０〜２０か月、約１０〜１８か月、約１０〜１６か月、約１０〜１４か月、約１０〜１２か月、約１２〜３６か月、約１２〜３４か月、約１２〜３２か月、約１２〜３０か月、約１２〜２８か月、約１２〜２６か月、約１２〜２４か月、約１２〜２２か月、約１２〜２０か月、約１２〜１８か月、約１２〜１６か月、約１２〜１４か月、約１４〜３６か月、約１４〜３４か月、約１４〜３２か月、約１４〜３０か月、約１４〜２８か月、約１４〜２６か月、約１４〜２４か月、約１４〜２２か月、約１４〜２０か月、約１４〜１８か月、約１４〜１６か月、約１６〜３６か月、約１６〜３４か月、約１６〜３２か月、約１６〜３０か月、約１６〜２８か月、約１６〜２６か月、約１６〜２４か月、約１６〜２２か月、約１６〜２０か月、約１６〜１８か月、約１８〜３６か月、約１８〜３４か月、約１８〜３２か月、約１８〜３０か月、約１８〜２８か月、約１８〜２６か月、約１８〜２４か月、約１８〜２２か月、約１８〜２０か月、約２０〜３６か月、約２０〜３４か月、約２０〜３２か月、約２０〜３０か月、約２０〜２８か月、約２０〜２６か月、約２０〜２４か月、約２０〜２２か月、約２２〜３６か月、約２２〜３４か月、約２２〜３２か月、約２２〜３０か月、約２２〜２８か月、約２２〜２６か月、約２２〜２４か月、約２４〜３６か月、約２４〜３４か月、約２４〜３２か月、約２４〜３０か月、約２４〜２８か月、約２４〜２６か月、約２６〜３６か月、約２６〜３４か月、約２６〜３２か月、約２６〜３０か月、約２６〜２８か月、約２８〜３６か月、約２８〜３４か月、約２８〜３２か月、約２８〜３０か月、約３０〜３６か月��約３０〜３４か月、約３０〜３２か月、約３２〜３６か月、約３２〜３４か月、または約３４〜３６か月の期間は保存可能である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、冷蔵温度（３５〜４０°Ｆ）で、室温（６８〜７２°Ｆ）で、５０〜７７°Ｆで、−２３〜３５°Ｆで、７０〜１００°Ｆで、または１０１〜２１３°Ｆで、１〜３６  １〜３４  １〜３２  １〜３０  １〜２８  １〜２６  １〜２４  １〜２２  １〜２０  １〜１８  １〜１６  １〜１４  １〜１２  １〜１０  １〜８  １〜６  １  １  ４  １〜２  ４〜３６  ４〜３４  ４〜３２  ４〜３０  ４〜２８  ４〜２６  ４〜２４  ４〜２２  ４〜２０  ４〜１８  ４〜１６  ４〜１４  ４〜１２  ４〜１０  ４〜８  ４〜６  ６〜３６  ６〜３４  ６〜３２  ６〜３０  ６〜２８  ６〜２６  ６〜２４  ６〜２２  ６〜２０  ６〜１８  ６〜１６  ６〜１４  ６〜１２  ６〜１０  ６〜８  ８〜３６  ８〜３４  ８〜３２  ８〜３０  ８〜２８  ８〜２６  ８〜２４  ８〜２２  ８〜２０  ８〜１８  ８〜１６  ８〜１４  ８〜１２  ８〜１０  １０〜３６  １０〜３４  １０〜３２  １０〜３０  １０〜２８  １０〜２６  １０〜２４  １０〜２２  １０〜２０  １０〜１８  １０〜１６  １０〜１４  １０〜１２  １２〜３６  １２〜３４  １２〜３２  １２〜３０  １２〜２８  １２〜２６  １２〜２４  １２〜２２  １２〜２０  １２〜１８  １２〜１６  １２〜１４  １４〜３６  １４〜３４  １４〜３２  １４〜３０  １４〜２８  １４〜２６  １４〜２４  １４〜２２  １４〜２０  １４〜１８  １４〜１６  １６〜３６  １６〜３４  １６〜３２  １６〜３０  １６〜２８  １６〜２６  １６〜２４  １６〜２２  １６〜２０  １６〜１８  １８〜３６  １８〜３４  １８〜３２  １８〜３０  １８〜２８  １８〜２６  １８〜２４  １８〜２２  １８〜２０  ２０〜３６  ２０〜３４  ２０〜３２  ２０〜３０  ２０〜２８  ２０〜２６  ２０〜２４  ２０〜２２  ２２〜３６  ２２〜３４  ２２〜３２  ２２〜３０  ２２〜２８  ２２〜２６  ２２〜２４  ２４〜３６  ２４〜３４  ２４〜３２  ２４〜３０  ２４〜２８  ２４〜２６  ２６〜３６  ２６〜３４  ２６〜３２  ２６〜３０  ２６〜２８  ２８〜３６  ２８〜３４  ２８〜３２  ２８〜３０  ３０〜３６  ３０〜３４  ３０〜３２  ３２〜３６  ３２〜３４、または約３４〜３６の期間は保存可能である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、本開示のあらゆる温度及び／または温度範囲、ならびに期間範囲で、相対湿度は少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％で、保存可能である。
【０１９８】
封入組成物
いくつかの実施形態では、本開示の微生物または微生物組成物は、封入組成物に封入されている。封入組成物は、有蹄動物の胃腸管に入るまで微生物を外部ストレッサーから保護する。封入組成物はさらに、有酸素環境が嫌気性微生物に及ぼす酸化ストレスを最小限化するなど、微生物にとって有益であり得る環境を作る。微生物の封入組成物、及び微生物を封入する方法については、Ｋａｌｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，１０４，６６２Ａ号）、Ｆｏｒｄ（同第５，７３３，５６８Ａ号）、及びＭｏｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｉｌｓｓｏｎ（同第４，６４７，５３６Ａ号）を参照されたい。
【０１９９】
一実施形態では、封入組成物は、複数の液体コアが固体のシェル材に封入されているマイクロカプセルを含む。本開示の目的では、「複数」のコアは、２つ以上とする。
【０２００】
便利な易融性シェル材の第１のカテゴリーは、通常は固体である脂肪であり、これには既に好適な硬さをもつ脂肪、及び、本開示の目的に使えるように融点が十分に高くなるまで水素添加されている動物性または植物性油脂が含まれる。所望の処理温度及び保存温度、ならびに選択される具体的な材料によって、特定の脂肪は、通常は固体の材料であっても、通常は液体の材料であってもよい。本明細書では、「通常は固体」及び「通常は液体」という用語は、得られたマイクロカプセルを保存する所望の温度での材料の状態を指す。厳密に言えば、脂肪や水素添加油は融点をもたないので、本明細書では「融点」という用語は、易融性材料が十分に柔らかくなる、または液体がうまく乳化し噴霧冷却される最低温度を説明するものであり、したがって、シェル材がコリンコアを放出させないよう十分な完全性を有する最高温度に概ね匹敵する。本明細書では「融点」は、明白な融点をもたない他の材料についても同様に定められる。
【０２０１】
本明細書で有用な油脂の具体的な例（その一部は硬化を要する）は、動物性油脂、たとえば牛脂、羊脂、子羊脂、ラードすなわち豚脂、魚油、及び鯨油；植物油、たとえばカノーラ油、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、オリーブ油、大豆油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ココナツ油、ヤシ油、亜麻仁油、桐油、及びひまし油；脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド；遊離脂肪酸、たとえばステアリン酸、パルミチン酸、及びオレイン酸；ならびにそれらの混合物である。上述の油脂の列挙は網羅的であることを意図しておらず、単なる例示である。
【０２０２】
脂肪酸の具体的な例としては、リノレイン酸、γ−リノレイン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、バクセン酸、ネルボン酸、ミード酸、エルカ酸、ゴンド酸、エライジン酸、オレイン酸、パリトレイン酸、ステアリンドン酸、エイコサペンタン酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラッセル酸、トリトリアコンタン酸、ゲダ酸、セロプラスチック酸、ヘキサトリアコンチル酸、ヘプタトリアコンタン酸、及びオクタトリアコンタン酸が挙げられる。
【０２０３】
封入シェル材として有用な易融性材料の別のカテゴリーは、蝋である。本明細書での使用が意図される代表的な蝋は、動物性蝋、たとえば蜜蝋、ラノリン、シェルワックス、及びイボタ蝋；植物性蝋、たとえばカルナウバ蝋、キャンデリラ蝋、ヤマモモ蝋、及びサトウキビ蝋；鉱蝋、たとえばパラフィン、微結晶性石油、臭蝋、地蝋、及びモンタン蝋；合成蝋、たとえば低分子量ポリオレフィン（たとえばＣＡＲＢＯＷＡＸ）、及びポリオールエーテルエステル（たとえばソルビトール）；フィッシャー・トロプシュ法による合成蝋；及びそれらの混合物である。ＣＡＲＢＯＷＡＸやソルビトールなどの水溶性蝋は、水溶性コアの場合には、本明細書では企図されない。
【０２０４】
本明細書で有用な、さらなる他の易融性化合物は、易融性の天然樹脂、たとえばロジン、バルサム、セラック、及びそれらの混合物である。
【０２０５】
本開示による易融性材料には様々な補助物質が組み込まれることが企図される。たとえば、抗酸化剤、光安定剤、色素及びレーキ、香料、精油、固化防止剤、充填剤、ｐＨ安定剤、糖（モノサッカライド、ジサッカライド、トリサッカライド、及びポリサッカライド）等を、本開示のための有用性が減じない量だけ、易融性材料に組み込むことができる。
【０２０６】
本明細書で企図するコア材は、マイクロカプセルの重量の約０．１％〜約５０％、約１％〜約３５％、または約５％〜約３０％を構成する。いくつかの実施形態では、本明細書で企図するコア材は、マイクロカプセルの重量の約３０％以下を構成する。いくつかの実施形態では、本明細書で企図するコア材は、マイクロカプセルの重量の約５％を構成する。コア材は、マイクロカプセルの企図される保存温度で、液体または固体である。
【０２０７】
コアには、製薬業界では周知の他の添加物が含まれ得、たとえば、食用糖、たとえばスクロース、グルコース、マルトース、フルクトース、ラクトース、セロビオース、モノサッカライド、ジサッカライド、トリサッカライド、ポリサッカライド、及びそれらの混合物；人工甘味料、たとえばアスパルテーム、サッカリン、シクラマート塩、及びそれらの混合物；食用酸、たとえば酢酸（酢）、クエン酸、アスコルビン酸、酒石酸、及びそれらの混合物；食用デンプン、たとえばコーンスターチ；加水分解植物性タンパク質；水溶性ビタミン、たとえばビタミンＣ；水溶性医薬；水溶性栄養剤、たとえば硫酸第一鉄；香料；塩；グルタミン酸ナトリウム；抗微生物剤、たとえばソルビン酸；抗真菌剤、たとえばソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸ナトリウム、及び安息香酸；食品等級の色素及び染料；及びそれらの混合物が挙げられる。他の有用であり得る補助コア材は、当業者には明白となる。
【０２０８】
安定した乳剤を作る補助として乳化剤を用いる場合がある。代表的な乳化剤としては、モノステアリン酸グリセリル、ポリソルベートエステル、エトキシル化モノグリセリド及びジグリセリド、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【０２０９】
加工しやすさのため、また特に、適切に安定した乳剤が首尾よくできるように、乳剤が形成する温度でコア材とシェル材は似たような粘度をもつべきである。具体的には、センチポワズまたは同様の単位で表される、いずれも乳剤の温度で測定したときのシェル粘度対コア粘度の比は、約２２：１〜約１：１となるべきで、望ましくは約８：１〜約１：１、好ましくは約３：１〜約１：１である。理想は１：１の比であるが、前述の範囲内の粘度比であれば有用である。
【０２１０】
封入組成物は、上述のマイクロカプセル組成物に限定されない。いくつかの実施形態では、封入組成物は、天然でも人工でもよい有毒作用のない粘着性ポリマー中に微生物組成物を封入する。いくつかの実施形態では、封入組成物は、糖基マトリクス、ゼラチンマトリクス、ポリマーマトリクス、シリカマトリクス、デンプンマトリクス、発泡マトリクス等から選択されるマトリクスの場合がある。いくつかの実施形態では、封入組成物は、酢酸ポリビニル；酢酸ポリビニル共重合体；エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）共重合体；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコール共重合体；エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；ポリビニルピロリドン；デンプン、加工デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギナート、及びキトサンなどのポリサッカライド；モノサッカライド；脂肪；油などの脂肪酸；ゼラチン及びゼインなどのタンパク質；アラビアゴム；セラック；塩化ビニリデン及び塩化ビニリデン共重合体；リグノスルホン酸カルシウム；アクリル共重合体；ポリビニルアクリラート；ポリエチレンオキシド；アクリルアミドポリマー及び共重合体；ポリヒドロキシエチルアクリラート、メチルアクリルアミドモノマー；及びポリクロロプレンから選択することができる。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本開示の封入シェルの厚さは、最大で１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍ、２６０μｍ、２７０μｍ、２８０μｍ、２９０μｍ、３００μｍ、３１０μｍ、３２０μｍ、３３０μｍ、３４０μｍ、３５０μｍ、３６０μｍ、３７０μｍ、３８０μｍ、３９０μｍ、４００μｍ、４１０μｍ、４２０μｍ、４３０μｍ、４４０μｍ、４５０μｍ、４６０μｍ、４７０μｍ、４８０μｍ、４９０μｍ、５００μｍ、５１０μｍ、５２０μｍ、５３０μｍ、５４０μｍ、５５０μｍ、５６０μｍ、５７０μｍ、５８０μｍ、５９０μｍ、６００μｍ、６１０μｍ、６２０μｍ、６３０μｍ、６４０μｍ、６５０μｍ、６６０μｍ、６７０μｍ、６８０μｍ、６９０μｍ、７００μｍ、７１０μｍ、７２０μｍ、７３０μｍ、７４０μｍ、７５０μｍ、７６０μｍ、７７０μｍ、７８０μｍ、７９０μｍ、８００μｍ、８１０μｍ、８２０μｍ、８３０μｍ、８４０μｍ、８５０μｍ、８６０μｍ、８７０μｍ、８８０μｍ、８９０μｍ、９００μｍ、９１０μｍ、９２０μｍ、９３０μｍ、９４０μｍ、９５０μｍ、９６０μｍ、９７０μｍ、９８０μｍ、９９０μｍ、１０００μｍ、１０１０μｍ、１０２０μｍ、１０３０μｍ、１０４０μｍ、１０５０μｍ、１０６０μｍ、１０７０μｍ、１０８０μｍ、１０９０μｍ、１１００μｍ、１１１０μｍ、１１２０μｍ、１１３０μｍ、１１４０μｍ、１１５０μｍ、１１６０μｍ、１１７０μｍ、１１８０μｍ、１１９０μｍ、１２００μｍ、１２１０μｍ、１２２０μｍ、１２３０μｍ、１２４０μｍ、１２５０μｍ、１２６０μｍ、１２７０μｍ、１２８０μｍ、１２９０μｍ、１３００μｍ、１３１０μｍ、１３２０μｍ、１３３０μｍ、１３４０μｍ、１３５０μｍ、１３６０μｍ、１３７０μｍ、１３８０μｍ、１３９０μｍ、１４００μｍ、１４１０μｍ、１４２０μｍ、１４３０μｍ、１４４０μｍ、１４５０μｍ、１４６０μｍ、１４７０μｍ、１４８０μｍ、１４９０μｍ、１５００μｍ、１５１０μｍ、１５２０μｍ、１５３０μｍ、１５４０μｍ、１５５０μｍ、１５６０μｍ、１５７０μｍ、１５８０μｍ、１５９０μｍ、１６００μｍ、１６１０μｍ、１６２０μｍ、１６３０μｍ、１６４０μｍ、１６５０μｍ、１６６０μｍ、１６７０μｍ、１６８０μｍ、１６９０μｍ、１７００μｍ、１７１０μｍ、１７２０μｍ、１７３０μｍ、１７４０μｍ、１７５０μｍ、１７６０μｍ、１７７０μｍ、１７８０μｍ、１７９０μｍ、１８００μｍ、１８１０μｍ、１８２０μｍ、１８３０μｍ、１８４０μｍ、１８５０μｍ、１８６０μｍ、１８７０μｍ、１８８０μｍ、１８９０μｍ、１９００μｍ、１９１０μｍ、１９２０μｍ、１９３０μｍ、１９４０μｍ、１９５０μｍ、１９６０μｍ、１９７０μｍ、１９８０μｍ、１９９０μｍ、２０００μｍ、２０１０μｍ、２０２０μｍ、２０３０μｍ、２０４０μｍ、２０５０μｍ、２０６０μｍ、２０７０μｍ、２０８０μｍ、２０９０μｍ、２１００μｍ、２１１０μｍ、２１２０μｍ、２１３０μｍ、２１４０μｍ、２１５０μｍ、２１６０μｍ、２１７０μｍ、２１８０μｍ、２１９０μｍ、２２００μｍ、２２１０μｍ、２２２０μｍ、２２３０μｍ、２２４０μｍ、２２５０μｍ、２２６０μｍ、２２７０μｍ、２２８０μｍ、２２９０μｍ、２３００μｍ、２３１０μｍ、２３２０μｍ、２３３０μｍ、２３４０μｍ、２３５０μｍ、２３６０μｍ、２３７０μｍ、２３８０μｍ、２３９０μｍ、２４００μｍ、２４１０μｍ、２４２０μｍ、２４３０μｍ、２４４０μｍ、２４５０μｍ、２４６０μｍ、２４７０μｍ、２４８０μｍ、２４９０μｍ、２５００μｍ、２５１０μｍ、２５２０μｍ、２５３０μｍ、２５４０μｍ、２５５０μｍ、２５６０μｍ、２５７０μｍ、２５８０μｍ、２５９０μｍ、２６００μｍ、２６１０μｍ、２６２０μｍ、２６３０μｍ、２６４０μｍ、２６５０μｍ、２６６０μｍ、２６７０μｍ、２６８０μｍ、２６９０μｍ、２７００μｍ、２７１０μｍ、２７２０μｍ、２７３０μｍ、２７４０μｍ、２７５０μｍ、２７６０μｍ、２７７０μｍ、２７８０μｍ、２７９０μｍ、２８００μｍ、２８１０μｍ、２８２０μｍ、２８３０μｍ、２８４０μｍ、２８５０μｍ、２８６０μｍ、２８７０μｍ、２８８０μｍ、２８９０μｍ、２９００μｍ、２９１０μｍ、２９２０μｍ、２９３０μｍ、２９４０μｍ、２９５０μｍ、２９６０μｍ、２９７０μｍ、２９８０μｍ、２９９０μｍ、または３０００μｍであることができる。
【０２１２】
動物飼料
いくつかの実施形態では、本開示の組成物を動物飼料と混合する。いくつかの実施形態では、動物飼料は、ペレット、カプセル、顆粒、粉末、液体、または半液体など、様々な形態で存在し得る。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、飼料工場（たとえばＣａｒｇｈｉｌｌまたはＷｅｓｔｅｒｎ  Ｍｉｌｌｉｎ）で、独立したプレミックスとして単独で、及び／またはＭＯＮＥＮＳＩＮやビタミン等の他の飼料添加物と一緒に、プレミックスに混入される。一実施形態では、本開示の組成物は、飼料工場で飼料に混入される。別の実施形態では、本開示の組成物は飼料自体に混入される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本開示の飼料には、水、１種または複数種のプレミックス、飼葉、まぐさ、豆類（たとえば、全粒、粗挽き、または粉砕）、穀類（たとえば、全粒、粗挽き、または粉砕）、豆類または穀類ベースの油、豆類または穀類ベースの粗挽き粉、豆類または穀類ベースの半乾飼料または貯蔵飼料、豆類または穀類ベースのシロップ、脂肪酸、糖アルコール（たとえば、多価アルコール）、市販の調合飼料、及びそれらの混合物を補充することができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、飼葉には、乾草、半乾草、及び貯蔵牧草が含まれる。いくつかの実施形態では、乾草には、干し草（たとえば、スーダングラス、オーチャードグラス等）、アルファルファ乾草、クローバー乾草が含まれる。いくつかの実施形態では、半乾草には、牧草の半乾草、モロコシ半乾草、及びアルファルファ半乾草が含まれる。いくつかの実施形態では、貯蔵牧草には、トウモロコシ、オートムギ、コムギ、アルファルファ、クローバー等が含まれる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、１種または複数種のプレミックスが、飼料に用いられる。プレミックスには、ビタミン、ミネラル、アミノ酸などの微小成分；化学保存料；抗生物質及び他の医薬などの医薬組成物；発酵製品、及び他の成分が含まれ得る。いくつかの実施形態では、プレミックスは飼料に混ぜ込まれる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、飼料は、大豆かす、テンサイかす、モラセス、高タンパク大豆粉、トウモロコシ挽粉、穂をとったトウモロコシ、ふすま入り粗挽きコムギ、醸造かす、綿実かす、第一胃迂回タンパク質、第一胃迂回脂肪、及び獣脂などの濃厚飼料を含む場合がある。本組成物及び本方法で使用できる動物飼料及び動物飼料サプリメントについては、Ｌｕｈｍａｎ（米国公報第２０１５０２１６８１７Ａ１号）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第３，４８４，２４３号）及びＰｏｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｈｍａｎ（米国特許第９，１７９，６９４Ｂ２号）を参照されたい。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、飼料は複合物であり、基本的な栄養面の必要性を満たすことができる混合組成物中、飼料自体、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、及び他の必要成分を含む。複合飼料はさらに、プレミックスを含む場合がある。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、動物飼料、プレミックス、及び／または複合飼料と混合してもよい。反芻動物に与える前に、動物飼料の個々の成分を微生物組成物と混合してもよい。本開示の微生物組成物を、プレミックスに加えるかもしくはかける、飼料に加えるかもしくはかける、及び／または複合飼料に加えるかもしくはかけることができる。
【０２２０】
微生物組成物の投与
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、経口経路で反芻動物に投与される。いくつかの実施形態では、微生物組成物は、胃腸管への直接注入経路で投与される。さらなる実施形態では、直接注入による投与で、微生物組成物は第一胃に直接送達される。いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、動物に肛門経由で投与される。さらなる実施形態では、肛門投与は坐剤挿入という形をとる。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、全部でまたは少なくとも１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１１ｍｌ、１２ｍｌ、１３ｍｌ、１４ｍｌ、１５ｍｌ、１６ｍｌ、１７ｍｌ、１８ｍｌ、１９ｍｌ、２０ｍｌ、２１ｍｌ、２２ｍｌ、２３ｍｌ、２４ｍｌ、２５ｍｌ、２６ｍｌ、２７ｍｌ、２８ｍｌ、２９ｍｌ、３０ｍｌ、３１ｍｌ、３２ｍｌ、３３ｍｌ、３４ｍｌ、３５ｍｌ、３６ｍｌ、３７ｍｌ、３８ｍｌ、３９ｍｌ、４０ｍｌ、４１ｍ、４２ｍｌ、４３ｍｌ、４４ｍｌ、４５ｍｌ、４６ｍｌ、４７ｍｌ、４８ｍｌ、４９ｍｌ、５０ｍｌ、６０ｍｌ、７０ｍｌ、８０ｍｌ、９０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌ、５００ｍｌ、６００ｍｌ、７００ｍｌ、８００ｍｌ、９００ｍｌ、または１，０００ｍｌを含む用量で投与される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、全部でまたは少なくとも１０１８、１０１７、１０１６、１０１５、１０１４、１０１３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、または１０２の微生物細胞を含む用量で投与される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は飼料と混合され、飼料と一緒に微生物組成物が摂取されることにより、投与されることになる。いくつかの実施形態では、微生物組成物の用量は、組成物１グラムまたは１ミリリットル当たりに存在する微生物細胞の総数が１０２〜１０１２、１０３〜１０１２、１０４〜１０１２、１０５〜１０１２、１０６〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２、１０９〜１０１２、１０１０〜１０１２、１０１１〜１０１２、１０２〜１０１１、１０３〜１０１１、１０４〜１０１１、１０５〜１０１１、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０８〜１０１１、１０９〜１０１１、１０１０〜１０１１、１０２〜１０１０、１０３〜１０１０、１０４〜１０１０、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０２〜１０９、１０３〜１０９、１０４〜１０９、１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０２〜１０８、１０３〜１０８、１０４〜１０８、１０５〜１０８、１０６〜１０８、１０７〜１０８、１０２〜１０７、１０３〜１０７、１０４〜１０７、１０５〜１０７、１０６〜１０７、１０２〜１０６、１０３〜１０６、１０４〜１０６、１０５〜１０６、１０２〜１０５、１０３〜１０５、１０４〜１０５、１０２〜１０４、１０３〜１０４、１０２〜１０３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、または１０２となるように、投与される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、微生物組成物の投与用量に含まれる微生物細胞の総数は、１０２〜１０１８、１０３〜１０１８、１０４〜１０１８、１０５〜１０１８、１０６〜１０１８、１０７〜１０１８、１０８〜１０１８、１０９〜１０１８、１０１０〜１０１８、１０１１〜１０１８、１０１２〜１０１８、１０１３〜１０１８、１０１４〜１０１８、１０１５〜１０１８、１０１６〜１０１８、１０１７〜１０１８、１０２〜１０１２、１０３〜１０１２、１０４〜１０１２、１０５〜１０１２、１０６〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２、１０９〜１０１２、１０１０〜１０１２、１０１１〜１０１２、１０２〜１０１１、１０３〜１０１１、１０４〜１０１１、１０５〜１０１１、１０６〜１０１１、１０７〜１０１１、１０８〜１０１１、１０９〜１０１１、１０１０〜１０１１、１０２〜１０１０、１０３〜１０１０、１０４〜１０１０、１０５〜１０１０、１０６〜１０１０、１０７〜１０１０、１０８〜１０１０、１０９〜１０１０、１０２〜１０９、１０３〜１０９、１０４〜１０９、１０５〜１０９、１０６〜１０９、１０７〜１０９、１０８〜１０９、１０２〜１０８、１０３〜１０８、１０４〜１０８、１０５〜１０８、１０６〜１０８、１０７〜１０８、１０２〜１０７、１０３〜１０７、１０４〜１０７、１０５〜１０７、１０６〜１０７、１０２〜１０６、１０３〜１０６、１０４〜１０６、１０５〜１０６、１０２〜１０５、１０３〜１０５、１０４〜１０５、１０２〜１０４、１０３〜１０４、１０２〜１０３、１０１８、１０１７、１０１６、１０１５、１０１４、１０１３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、または１０２である。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、１日１回以上投与される。いくつかの態様では、組成物は、動物の飼料と一緒に給餌のたびに投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、１日に１〜１０回、１〜９回、１〜８回、１〜７回、１〜６回、１〜５回、１〜４回、１〜３回、１〜２回、２〜１０回、２〜９回、２〜８回、２〜７回、２〜６回、２〜５回、２〜４回、２〜３回、３〜１０回、３〜９回、３〜８回、３〜７回、３〜６回、３〜５回、３〜４回、４〜１０回、４〜９回、４〜８回、４〜７回、４〜６回、４〜５回、５〜１０回、５〜９回、５〜８回、５〜７回、５〜６回、６〜１０回、６〜９回、６〜８回、６〜７回、７〜１０回、７〜９回、７〜８回、８〜１０回、８〜９回、９〜１０回、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回投与される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、１週間に１〜１０回、１〜９回、１〜８回、１〜７回、１〜６回、１〜５回、１〜４回、１〜３回、１〜２回、２〜１０回、２〜９回、２〜８回、２〜７回、２〜６回、２〜５回、２〜４回、２〜３回、３〜１０回、３〜９回、３〜８回、３〜７回、３〜６回、３〜５回、３〜４回、４〜１０回、４〜９回、４〜８回、４〜７回、４〜６回、４〜５回、５〜１０回、５〜９回、５〜８回、５〜７回、５〜６回、６〜１０回、６〜９回、６〜８回、６〜７回、７〜１０回、７〜９回、７〜８回、８〜１０回、８〜９回、９〜１０回、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回投与される。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、１月に１〜１０回、１〜９回、１〜８回、１〜７回、１〜６回、１〜５回、１〜４回、１〜３回、１〜２回、２〜１０回、２〜９回、２〜８回、２〜７回、２〜６回、２〜５回、２〜４回、２〜３回、３〜１０回、３〜９回、３〜８回、３〜７回、３〜６回、３〜５回、３〜４回、４〜１０回、４〜９回、４〜８回、４〜７回、４〜６回、４〜５回、５〜１０回、５〜９回、５〜８回、５〜７回、５〜６回、６〜１０回、６〜９回、６〜８回、６〜７回、７〜１０回、７〜９回、７〜８回、８〜１０回、８〜９回、９〜１０回、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回投与される。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、微生物組成物は、１年に１〜１０回、１〜９回、１〜８回、１〜７回、１〜６回、１〜５回、１〜４回、１〜３回、１〜２回、２〜１０回、２〜９回、２〜８回、２〜７回、２〜６回、２〜５回、２〜４回、２〜３回、３〜１０回、３〜９回、３〜８回、３〜７回、３〜６回、３〜５回、３〜４回、４〜１０回、４〜９回、４〜８回、４〜７回、４〜６回、４〜５回、５〜１０回、５〜９回、５〜８回、５〜７回、５〜６回、６〜１０回、６〜９回、６〜８回、６〜７回、７〜１０回、７〜９回、７〜８回、８〜１０回、８〜９回、９〜１０回、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９、または１０回投与される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、飼料は、正確に安全に効率よくコーティングを塗布するように特別に設計され製造された治療剤塗布装置を用いて、混合、噴霧、またはそれらの組合せの一般的な方法により、本開示の微生物及び／または微生物組成物の１つ以上の層を均一にコーティングすることができる。そのような装置は、ロータリー・コーター、ドラム・コーター、流動層法、噴流層、ロータリー・ミスト、またはそれらの組合せなど、様々な種類のコーティング技術を用いる。本開示の液状処置剤などの液状処置剤は、回転「アトマイザー」ディスクでもスプレーノズルでも塗布することができ、飼料をスプレーパターンのなかで移動させながら微生物組成物を飼料表面に均等に散布する。いくつかの態様では、次いで飼料をさらなる時間にわたり混合しまたは転がして、さらに治療剤を散布し乾燥する。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本開示の飼料コーティングの最高厚さは、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍ、２６０μｍ、２７０μｍ、２８０μｍ、２９０μｍ、３００μｍ、３１０μｍ、３２０μｍ、３３０μｍ、３４０μｍ、３５０μｍ、３６０μｍ、３７０μｍ、３８０μｍ、３９０μｍ、４００μｍ、４１０μｍ、４２０μｍ、４３０μｍ、４４０μｍ、４５０μｍ、４６０μｍ、４７０μｍ、４８０μｍ、４９０μｍ、５００μｍ、５１０μｍ、５２０μｍ、５３０μｍ、５４０μｍ、５５０μｍ、５６０μｍ、５７０μｍ、５８０μｍ、５９０μｍ、６００μｍ、６１０μｍ、６２０μｍ、６３０μｍ、６４０μｍ、６５０μｍ、６６０μｍ、６７０μｍ、６８０μｍ、６９０μｍ、７００μｍ、７１０μｍ、７２０μｍ、７３０μｍ、７４０μｍ、７５０μｍ、７６０μｍ、７７０μｍ、７８０μｍ、７９０μｍ、８００μｍ、８１０μｍ、８２０μｍ、８３０μｍ、８４０μｍ、８５０μｍ、８６０μｍ、８７０μｍ、８８０μｍ、８９０μｍ、９００μｍ、９１０μｍ、９２０μｍ、９３０μｍ、９４０μｍ、９５０μｍ、９６０μｍ、９７０μｍ、９８０μｍ、９９０μｍ、１０００μｍ、１０１０μｍ、１０２０μｍ、１０３０μｍ、１０４０μｍ、１０５０μｍ、１０６０μｍ、１０７０μｍ、１０８０μｍ、１０９０μｍ、１１００μｍ、１１１０μｍ、１１２０μｍ、１１３０μｍ、１１４０μｍ、１１５０μｍ、１１６０μｍ、１１７０μｍ、１１８０μｍ、１１９０μｍ、１２００μｍ、１２１０μｍ、１２２０μｍ、１２３０μｍ、１２４０μｍ、１２５０μｍ、１２６０μｍ、１２７０μｍ、１２８０μｍ、１２９０μｍ、１３００μｍ、１３１０μｍ、１３２０μｍ、１３３０μｍ、１３４０μｍ、１３５０μｍ、１３６０μｍ、１３７０μｍ、１３８０μｍ、１３９０μｍ、１４００μｍ、１４１０μｍ、１４２０μｍ、１４３０μｍ、１４４０μｍ、１４５０μｍ、１４６０μｍ、１４７０μｍ、１４８０μｍ、１４９０μｍ、１５００μｍ、１５１０μｍ、１５２０μｍ、１５３０μｍ、１５４０μｍ、１５５０μｍ、１５６０μｍ、１５７０μｍ、１５８０μｍ、１５９０μｍ、１６００μｍ、１６１０μｍ、１６２０μｍ、１６３０μｍ、１６４０μｍ、１６５０μｍ、１６６０μｍ、１６７０μｍ、１６８０μｍ、１６９０μｍ、１７００μｍ、１７１０μｍ、１７２０μｍ、１７３０μｍ、１７４０μｍ、１７５０μｍ、１７６０μｍ、１７７０μｍ、１７８０μｍ、１７９０μｍ、１８００μｍ、１８１０μｍ、１８２０μｍ、１８３０μｍ、１８４０μｍ、１８５０μｍ、１８６０μｍ、１８７０μｍ、１８８０μｍ、１８９０μｍ、１９００μｍ、１９１０μｍ、１９２０μｍ、１９３０μｍ、１９４０μｍ、１９５０μｍ、１９６０μｍ、１９７０μｍ、１９８０μｍ、１９９０μｍ、２０００μｍ、２０１０μｍ、２０２０μｍ、２０３０μｍ、２０４０μｍ、２０５０μｍ、２０６０μｍ、２０７０μｍ、２０８０μｍ、２０９０μｍ、２１００μｍ、２１１０μｍ、２１２０μｍ、２１３０μｍ、２１４０μｍ、２１５０μｍ、２１６０μｍ、２１７０μｍ、２１８０μｍ、２１９０μｍ、２２００μｍ、２２１０μｍ、２２２０μｍ、２２３０μｍ、２２４０μｍ、２２５０μｍ、２２６０μｍ、２２７０μｍ、２２８０μｍ、２２９０μｍ、２３００μｍ、２３１０μｍ、２３２０μｍ、２３３０μｍ、２３４０μｍ、２３５０μｍ、２３６０μｍ、２３７０μｍ、２３８０μｍ、２３９０μｍ、２４００μｍ、２４１０μｍ、２４２０μｍ、２４３０μｍ、２４４０μｍ、２４５０μｍ、２４６０μｍ、２４７０μｍ、２４８０μｍ、２４９０μｍ、２５００μｍ、２５１０μｍ、２５２０μｍ、２５３０μｍ、２５４０μｍ、２５５０μｍ、２５６０μｍ、２５７０μｍ、２５８０μｍ、２５９０μｍ、２６００μｍ、２６１０μｍ、２６２０μｍ、２６３０μｍ、２６４０μｍ、２６５０μｍ、２６６０μｍ、２６７０μｍ、２６８０μｍ、２６９０μｍ、２７００μｍ、２７１０μｍ、２７２０μｍ、２７３０μｍ、２７４０μｍ、２７５０μｍ、２７６０μｍ、２７７０μｍ、２７８０μｍ、２７９０μｍ、２８００μｍ、２８１０μｍ、２８２０μｍ、２８３０μｍ、２８４０μｍ、２８５０μｍ、２８６０μｍ、２８７０μｍ、２８８０μｍ、２８９０μｍ、２９００μｍ、２９１０μｍ、２９２０μｍ、２９３０μｍ、２９４０μｍ、２９５０μｍ、２９６０μｍ、２９７０μｍ、２９８０μｍ、２９９０μｍ、または３０００μｍである。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、微生物細胞は、任意の数の組成物に自由にコーティングすることができ、あるいは、液体または固体組成物として製剤してから組成物にコーティングすることもできる。たとえば、微生物を含む固体組成物は、固体担体と胞子浮遊液とを、該固体担体に該胞子または細胞浮遊液が染み込むまで混合することにより、調製することができる。次いでこの混合物を乾燥して、所望の粒子を得ることができる。
【０２３２】
いくつかの他の実施形態では、本開示の固体または液体微生物組成物はさらに、たとえば活性炭素、ミネラル、ビタミン、及び製品の品質を向上させることができるその他の剤、またはそれらの組合せなど、機能性剤を含むことが企図される。
【０２３３】
当業界で知られているコーティング方法及び該方法を用いる組成物は、本開示の実施形態のいずれかを加えて改良することで、特に有用になり得る。そのようなコーティング方法及びコーティングを塗布する装置は、たとえば米国特許第８，０９７，２４５号及び同第７，９９８，５０２号、ならびにＰＣＴ公報ＷＯ２００８／０７６９７５、ＷＯ２０１０／１３８５２２、ＷＯ２０１１／０９４４６９、ＷＯ２０１０／１１１３４７、及びＷＯ２０１０／１１１５６５に記載されており、これらをすべて参照により本明細書に援用する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物または微生物共同体は、１つ以上の該微生物または共同体が互いに接触すると、本明細書で説明する形質の１つ以上に相乗効果を示す。本教示の方法により得られる相乗効果は、たとえばＣｏｌｂｙの式（すなわち、（Ｅ）＝Ｘ＋Ｙ−（Ｘ＊Ｙ／１００））により定量化することができる。Ｃｏｌｂｙ，Ｒ．Ｓ．，“Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，”  １９６７．Ｗｅｅｄｓ．Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２０−２２を参照されたい（その内容を参照により本明細書に援用する）。したがって、「相乗的」とは、相加量よりも増加した結果／パラメーター／効果を反映することを意図する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物または微生物共同体は、ボーラス投与することができる。一実施形態では、ボーラス（たとえば、組成物を含むカプセル）をボーラスガンに挿入し、このボーラスガンを動物の頬側口腔及び／または食道に挿入し、次いで該ボーラスを動物の消化管へと放出／注入する。一実施形態では、ボーラスガン／アプリケーターは、ＢＯＶＩＫＡＬＣボーラスガン／アプリケーターである。別の実施形態では、ボーラスガン／アプリケーターは、ＱＵＡＤＲＩＣＡＬガン／アプリケーターである。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物または微生物共同体は、水薬として投与することができる。一実施形態では、水薬は経口水薬である。水薬の投与には、微生物または微生物共同体を含む液体を動物の消化管へと放出／注入する水薬キット／アプリケーター／シリンジの使用が含まれる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物または微生物共同体は、徐放式に投与することができる。組成物は、化学組成物としてコーティングされる場合もあるし、微生物または微生物共同体を一度に放出するのではなく時間をかけて放出する機械的デバイスまたはカプセルに収容される場合もある。一実施形態では、微生物または微生物共同体は、徐放カプセルで、動物に投与される。一実施形態では、組成物は、化学組成物としてコーティングされる場合もあるし、摂取後何時間か経つと微生物または微生物共同体を一度に放出する機械的デバイスまたはカプセルに収容される場合もある。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、微生物または微生物共同体は、１〜５時間、１〜１０時間、１〜１５時間、１〜２０時間、１〜２４時間、１〜２５時間、１〜３０時間、１〜３５時間、１〜４０時間、１〜４５時間、１〜５０時間、１〜５５時間、１〜６０時間、１〜６５時間、１〜７０時間、１〜７５時間、１〜８０時間、１〜８５時間、１〜９０時間、１〜９５時間、または１〜１００時間の徐放式に投与される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、微生物または微生物共同体は、１〜２日、１〜３日、１〜４日、１〜５日、１〜６日、１〜７日、１〜８日、１〜９日、１〜１０日、１〜１１日、１〜１２日、１〜１３日、１〜１４日、１〜１５日、１〜１６日、１〜１７日、１〜１８日、１〜１９日、１〜２０日、１〜２１日、１〜２２日、１〜２３日、１〜２４日、１〜２５日、１〜２６日、１〜２７日、１〜２８日、１〜２９日、または１〜３０日の徐放式に投与される。
【０２４０】
微生物
本明細書では、「微生物」という用語は、広義に解釈すべきである。この用語には、限定ではないが、原核生物の２ドメインの細菌及び古細菌、ならびに真核生物の真菌、原生生物、及びウイルスが含まれる。
【０２４１】
例として、微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ属、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ属、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｖｒｙｓｔａａｔｉａ属、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、及びＰｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ属の種を含み得る。微生物はさらに、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ科に属する種、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目に属する種を含み得る。いくつかの実施形態では、微生物は、本明細書で開示するあらゆる属の種を含み得る。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、微生物は培養できない。このことは、微生物が、当業者に知られている方法で培養できると判明していないかまたは培養が難しい、という意味にとるべきである。
【０２４３】
一実施形態では、微生物は、動物（たとえば、哺乳類、爬虫類、鳥類等）、土壌（たとえば、根圏）、空気、水（たとえば、海水、淡水、廃水スラッジ）、底泥、油、植物（たとえば、根、葉、茎）、農産物、及び非常に厳しい環境（たとえば、酸性鉱山排水または熱水系）から得られる。さらなる実施形態では、微生物は、海洋、河川、または湖沼などの、海水または淡水環境から得られる。さらなる実施形態では、微生物は、水域の表面部または水域のあらゆる深部から採取され得る（たとえば深海試料）。
【０２４４】
本開示の微生物は、実質的に純粋なまたは混合の培養物として単離することができる。これらは濃縮されていても、希釈されていても、または原料物質に見られる自然の濃度で提供してもよい。たとえば、塩水底泥由来の微生物は、該底泥を真水中に懸濁し該底泥を沈殿させることによって、本開示で使用できるように単離することができる。大部分の微生物を含む水は、適当な時間をかけて澄ませた後にデカントすることで除去することができ、有蹄動物の胃腸管に投与されるか、あるいは濾過または遠心分離により濃縮されるか、適当な濃度にまで希釈されてから、大部分の塩を除去して、有蹄動物の胃腸管に投与される。さらなる例として、石化したまたは毒性の供給源由来の微生物も同様に処理し、有蹄動物への投与用に微生物を回収して、動物に害を及ぼす可能性を最小限化する。
【０２４５】
別の実施形態では、微生物は、未加工のまま用いられ、該微生物が天然に生息している原料物質から単離されていない。たとえば、微生物は、それが生息している原料物質、たとえば、大便、反芻食塊、または他の胃腸管内に見られる組成物と組み合せて提供される。この実施形態では、原料物質は、１つ以上の微生物種を含む場合がある。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、微生物の混合集団が本開示の方法で用いられる。
【０２４７】
微生物が原料物質（たとえば、その微生物が天然に生息している物質）から単離される本開示の実施形態では、当業者であれば容易にわかるようないくつかの標準的な技法のいずれか１つまたは組合せを用いることができる。しかし、一例として、これらは一般に、単一微生物の固体培養物または液体培養物が実質的に純粋な形態で得られるような方法を用い、普通は、固体微生物増殖培地の表面の物理的分離、または液体微生物増殖培地への容積希釈単離による。これらの方法には、乾燥物質、懸濁液、適切な固体ゲル増殖培地上の薄層中に物質が散在しているスラリーまたはホモジネートからの単離、あるいは物質を滅菌培地へと系列希釈し液体もしくは固体培養培地に接種することが含まれ得る。
【０２４８】
必須ではないが、一実施形態では、微生物を含んでいる物質は、単離処理を行う前に、物質中の全微生物を増殖させるために前処理される場合がある。次にこの濃縮材料から、上述のようにして微生物を単離することができる。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、本明細書で既に述べたように、微生物は未加工のまま使用する場合があり、動物または培地から単離する必要はない。たとえば、有蹄動物の乳増産の利益があると特定された微生物を含む反芻食塊、大便、または増殖培地を得て、方法の次のラウンドで微生物の未加工供給源として、または方法の最後で微生物の未加工供給源として用いることができる。たとえば、新鮮な大便を入手して、任意選択により処理することができる。
【０２５０】
ミクロビオームの変化と微生物の数度
いくつかの実施形態では、第一胃ミクロビオームなどの反芻動物のミクロビオームは、様々な代謝能力をもつ多様な微生物の集積を含む。ミクロビオームは、食餌、動物の代謝の変化、品種など様々な要因に影響される。ほとんどのウシの食餌は植物系であり、食餌に含まれる特定の高分子成分を分解できる微生物の胃腸微生物群集を増強する複合ポリサッカライドが豊富である。一次分解の最終産物には微生物連鎖が保持されており、これら微生物は最終的に様々な有機酸を水素及び二酸化炭素と一緒に生産する。ミクロビオームは複合的で相互連鎖的な性質なので、食餌の変化、したがって一次分解の基質の変化は、第一胃微生物の代謝にカスケード的効果を与え、有機酸プロファイルと生産メタンレベルの両方が変化し得、したがって動物の生産及び／または動物が生産する産物の質及び量に影響を及ぼし得る。Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．７８（２）：２５６−２６５．）を参照されたい。
【０２５１】
いくつかの態様では、本開示は、反芻動物のミクロビオームを調節するかまたは変化させるための、本明細書に記載する微生物組成物の投与に関する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ミクロビオームは、１つ以上の微生物の胃腸管への投与により変化する。さらなる実施形態では、１つ以上の微生物は、表１または表３から選択される微生物である。いくつかの実施形態では、ミクロビオームの変化または調節は、本開示の１つ以上の微生物の投与前には存在していた特定の微生物の減少または消失を含む。いくつかの実施形態では、ミクロビオームの変化または調節は、本開示の１つ以上の微生物の投与前に存在していた微生物の増加を含む。いくつかの実施形態では、ミクロビオームの変化または調節は、本開示の１つ以上の微生物の投与前には存在していなかった１つ以上の微生物の獲得を含む。さらなる実施形態では、１つ以上の微生物の獲得は、投与された微生物共同体には特に含まれていなかった微生物である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物の投与の結果、投与された微生物がミクロビオーム内に少なくとも１〜１０日、１〜９日、１〜８日、１〜７日、１〜６日、１〜５日、１〜４日、１〜３日、１〜２日、２〜１０日、２〜９日、２〜８日、２〜７日、２〜６日、２〜５日、２〜４日、２〜３日、３〜１０日、３〜９日、３〜８日、３〜７日、３〜６日、３〜５日、３〜４日、４〜１０日、４〜９日、４〜８日、４〜７日、４〜６日、４〜５日、５〜１０日、５〜９日、５〜８日、５〜７日、５〜６日、６〜１０日、６〜９日、６〜８日、６〜７日、７〜１０日、７〜９日、７〜８日、８〜１０日、８〜９日、９〜１０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日の期間は存在するように、ミクロビオームの調節が維持される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物の投与の結果、投与された微生物がミクロビオーム内に少なくとも１〜１０週間、１〜９週間、１〜８週間、１〜７週間、１〜６週間、１〜５週間、１〜４週間、１〜３週間、１〜２週間、２〜１０週間、２〜９週間、２〜８週間、２〜７週間、２〜６週間、２〜５週間、２〜４週間、２〜３週間、３〜１０週間、３〜９週間、３〜８週間、３〜７週間、３〜６週間、３〜５週間、３〜４週間、４〜１０週間、４〜９週間、４〜８週間、４〜７週間、４〜６週間、４〜５週間、５〜１０週間、５〜９週間、５〜８週間、５〜７週間、５〜６週間、６〜１０週間、６〜９週間、６〜８週間、６〜７週間、７〜１０週間、７〜９週間、７〜８週間、８〜１０週間、８〜９週間、９〜１０週間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、または１０週間の期間は存在するように、ミクロビオームの調節が維持される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物の投与の結果、投与された微生物がミクロビオーム内に少なくとも１〜１０か月、１〜９か月、１〜８か月、１〜７か月、１〜６か月、１〜５か月、１〜４か月、１〜３か月、１〜２か月、２〜１０か月、２〜９か月、２〜８か月、２〜７か月、２〜６か月、２〜５か月、２〜４か月、２〜３か月、３〜１０か月、３〜９か月、３〜８か月、３〜７か月、３〜６か月、３〜５か月、３〜４か月、４〜１０か月、４〜９か月、４〜８か月、４〜７か月、４〜６か月、４〜５か月、５〜１０か月、５〜９か月、５〜８か月、５〜７か月、５〜６か月、６〜１０か月、６〜９か月、６〜８か月、６〜７か月、７〜１０か月、７〜９か月、７〜８か月、８〜１０か月、８〜９か月、９〜１０か月、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、または１２か月の期間は存在するように、ミクロビオームの調節が維持される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、投与された微生物の存在は、胃腸管から試料採取し、投与された微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列もしくは１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列、またはＩＴＳ  ｒＤＮＡ配列をプライマーを用いて増幅することにより検出される。いくつかの実施形態では、投与された微生物は、表１または表３から選択される１つ以上の微生物であり、対応するｒＤＮＡ配列は、配列番号１〜６０、配列番号２０４５〜２１０７、及び表３で特定する配列番号の配列から選択される。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、反芻動物のミクロビオームは、胃腸試料から回収されたポリヌクレオチドの増幅により測定され、ここで該ポリヌクレオチドは微生物ｒＤＮＡの１６Ｓ  ｒＤＮＡ断片もしくは１８Ｓ  ｒＤＮＡ断片、またはＩＴＳ  ｒＤＮＡ断片であり得る。一実施形態では、ミクロビオームは、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）によりフィンガープリントされ、この方法では、増幅されたｒＤＮＡ断片が変性する場所により分別され、ゲル中に特有のバンドパターンを形成し、これを同一の反芻動物の経時的なミクロビオームの比較、または複数の反芻動物のミクロビオームの比較に用いることができる。別の実施形態では、ミクロビオームは、末端制限酵素断片長多型法（Ｔ−ＲＦＬＰ）によりフィンガープリントされ、この方法では、標識されたＰＣＲ断片が制限酵素により切断され、次いでサイズにより分別される。さらなる実施形態では、Ｔ−ＲＦＬＰ法で収集したデータをノンメトリック多次元尺度法（ｎＭＤＳ）順位付けにより評価し、ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ統計法でミクロビオームの差を特定し、したがってミクロビオームの変化の特定及び測定が可能になる。Ｓｈａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７（９）：２９９２−３００１）、Ｐｅｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３．ＰＬＯＳ  ｏｎｅ．８（１２）：ｅ８３４２４）、及びＭｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｃｏｌ．７８（２）：２５６−２６５．）も参照されたい。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物の投与の結果、ミクロビオームの調節または変化がもたらされ、さらにその結果、所望の表現型または改善された形質がもたらされる。
【０２５９】
本明細書で提供する方法によると、試料を処理して、該試料中の１つ以上の微生物タイプの存在を検出する（図１の１００１、図２の２００１）。該試料中の１つ以上の微生物生物タイプの絶対数を決定する（図１の１００２、図２の２００２）。１つ以上の生物タイプの存在及び少なくとも１つの生物タイプの絶対数の決定は、同時にまたは順次行うことができる。たとえば、細菌（すなわち、第１の微生物タイプ）と真菌（すなわち、第２の微生物タイプ）とを含む微生物群集を含む試料の場合、一実施形態のユーザーは、該試料中の片方または両方の生物タイプの存在を検出する（図１の１００１、図２の２００１）。ユーザーは、さらなる実施形態では、試料中の少なくとも１つの生物タイプの絶対数、この例の場合でいえば、試料中の細菌、真菌、またはそれらの組合せの数を決定する（図１の１００２、図２の２００２）。
【０２６０】
一実施形態では、試料、またはその一部分をフローサイトメトリー（ＦＣ）分析に供して１つ以上の微生物タイプの存在及び／または数を検出する（図１の１００１、１００２、図２の２００１、２００２）。あるフローサイトメーターの実施形態では、個々の微生物細胞が、少なくとも約３００＊ｓ−１、または少なくとも約５００＊ｓ−１、または少なくとも約１０００＊ｓ−１の速度で照射ゾーンを通過する。とはいえ、当業者であれば、この速度は使用する機器のタイプによって変わり得ることを認識しよう。ゲート設定された検出器が、光散乱の程度を表すパルスの大きさを電子測定する。これらのパルスの大きさは、各「ビン」または「チャンネル」へと電子選別され、ある特定の定量的特性（たとえば、細胞染色特性、直径、細胞膜）をもつ細胞の数対チャンネル数のヒストグラムの表示が可能になる。そのような分析により、本明細書で説明する実施形態ではたとえば細菌、真菌、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス、ビロイド等の「微生物タイプ」のビンである各「ビン」内の細胞数を決定することが可能になる。
【０２６１】
一実施形態では、試料を、１つ以上の蛍光色素で染色して（ここで蛍光色素は特定の微生物タイプに特異的である）、フローサイトメーターによる検出、または蛍光を利用する何らかの他の検出及び定量化の方法、たとえば蛍光顕微鏡法を可能にする。この方法は、試料中の所与の生物タイプの細胞数及び／または細胞容積の定量化を提供することができる。さらなる実施形態では、本明細書で説明するように、フローサイトメトリーを利用して、生物タイプの特有第１マーカー及び／または特有第２マーカー、たとえば酵素発現、細胞表面タンパク質の発現等の存在及び量を決定する。たとえば光散乱と、細胞膜染色による蛍光（と、タンパク質染色またはＤＮＡ染色による蛍光）などの２つか３つの変数のヒストグラムまたは等高線図も作製することができ、したがって、集団全体における細胞の対象とする様々な特性の分布について所見を得ることができる。そのような多重パラメーターのフローサイトメトリックデータのいくつかの表示法が広く使用されており、本明細書で説明する方法で用いることもできる。
【０２６２】
試料を処理して１つ以上の微生物タイプの存在及び数を検出する一実施形態では、顕微鏡法アッセイが用いられる（図１の１００１、１００２）。一実施形態では、顕微鏡法は光学顕微鏡法であり、可視光とレンズ系を用いて小さな試料の像を拡大する。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラにより、デジタル画像を撮影することもできる。他の顕微鏡法としては、限定ではないが、走査型電子顕微鏡法及び透過型電子顕微鏡法が挙げられる。微生物タイプは本明細書で提供する態様にしたがい可視化され定量化される。
【０２６３】
１つ以上の微生物タイプの存在及び数を検出するための別の実施形態では、試料またはその一部分が蛍光顕微鏡法に供される。試料中の細胞を異なる蛍光色素で直接染色して、落射蛍光顕微鏡ならびに上述のフローサイトメトリーにより細胞総数を定量化することができる。微生物を定量化するのに有用な色素としては、限定ではないが、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、４，６−ジ−アミノ−２フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、及び５−シアノ−２，３ジトリルテトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）が挙げられる。生存細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細菌生存率キット（Ｂａｃ−Ｌｉｇｈｔ（商標））などの生存率染色法により推定することができ、該キットは２種の核酸染料を含み、緑色蛍光ＳＹＴＯ  ９（商標）色素はすべての膜に浸透し、赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素は膜が傷ついた細胞に浸透する。したがって、膜が損傷している細胞は赤色に染まるが、無傷の膜は緑色に染まる。蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は、落射蛍光顕微鏡法を発展させて特定の生物の高速の検出及び計数を可能にする。ＦＩＳＨは、試料中の生物のＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブ（通常は１５〜２５塩基対）を用い、落射蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）を用いて細胞の可視化を可能にする。触媒レポーター沈着蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ）は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、調査対象の微生物から得られたシグナルの強度を増幅することにより、ＦＩＳＨ方法に改良を加えたものである。ＦＩＳＨを他の技法と組み合わせて、微生物群集を特徴付けることができる。１つの組合せ技法は、高親和性ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ＦＩＳＨであり、プローブは細胞外高分子物質（ＥＰＳ）マトリックスを貫通する強化された能力をもつ。別の例は、細胞生存率キットとＦＩＳＨを組み合わせたＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ−ＦＩＳＨであり、飲料水の給水施設における殺菌効率を評価するのに用いられている。
【０２６４】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、微生物タイプの存在及び少なくとも１つの微生物タイプの絶対数を決定するために、ラマン顕微分光法に供する（図１の１００１〜１００２、図２の２００１〜２００２）。ラマン顕微分光法は、非破壊的な標識無しの技術であり、単細胞ラマンスペクトル（ＳＣＲＳ）の検出及び測定ができる。一般的なＳＣＲＳは、単細胞の内在性生化学的「フィンガープリント」を提供する。ＳＣＲＳには、核酸、タンパク質、炭水化物、及び脂質などの生体分子の豊富な情報が含まれ、それによって種々の細胞種、生理学的変化、及び細胞表現型の特徴付けが可能になる。ラマン顕微鏡法は、種々の細胞バイオマーカーの化学結合によるレーザー光の散乱を検査する。ＳＣＲＳは、１個の単細胞の全生体分子のスペクトルの総体であり、細胞の表現型プロファイルを示すものである。細胞表現型は、遺伝子発現の結果として、普通は遺伝子型を反映する。したがって、同一の増殖条件下で、異なる微生物タイプはそれらの遺伝子型の違いに応じて個別のＳＣＲＳを生じるので、ラマンスペクトルにより特定することができる。
【０２６５】
さらに別の実施形態では、試料またはその一部分を、微生物タイプの存在及び少なくとも１つの微生物タイプの数を決定するために、遠心分離に供する（図１の１００１〜１００２、図２の２００１〜２００２）。この方法では、遠心分離機が発生させる遠心力により異種混合物を沈殿させる。混合物中のより高密度の成分は遠心分離機の軸線から離れていき、混合物中のより低密度の成分は軸線に向けて移動する。遠心分離は、試料を細胞質と膜と細胞外部分とに分画させることができる。また、対象とする生物学的分子の局在情報を決定するのにも用いることができる。さらに、遠心分離は、全微生物群集のＤＮＡを分画するのに用いることができる。異なる原核生物群はＤＮＡのグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が異なるので、Ｇ＋Ｃ含量に基づく密度勾配遠心分離は、生物のタイプ、及び各タイプに関連する細胞の数を区別する方法である。この技法は、群集全体のＤＮＡの分画プロファイルを作成し、Ｇ＋Ｃ含量の関数としてのＤＮＡ数度を示す。全群集ＤＮＡは、高度に精製された画分へと物理的に分けられ、それぞれの画分は異なるＧ＋Ｃ含量を表すものであり、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）／増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）などのさらなる分子技法により分析して（本明細書の記述を参照されたい）全微生物群集の多様性及び１つ以上の微生物タイプの存在／量を評価することができる。
【０２６６】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、微生物タイプの存在及び少なくとも１つの微生物タイプの数を決定するために、染色に供する（図１の１００１〜１００２、図２の２００１〜２００２）。染料及び色素は、生物学的組織、細胞、または細胞内小器官を可視化するために用いることができる。染色は、顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはゲル電気泳動法と一緒に用いて、異なる微生物タイプに特有の細胞または生物学的分子を可視化またはマーキングすることができる。インビボ染色は、生組織を染める方法であり、一方インビトロ染色は、生体内状況から取り出された細胞または構造物を染色するものである。本明細書で説明する方法で使用する特定の染色法の例としては、限定ではないが、細菌のグラム状態を決定するグラム染色、内生胞子の存在を特定する内生胞子染色、チール・ネールゼン染色、組織薄片を検査するヘマトキシリン及びエオシン染色、様々な体分泌物からの細胞試料を検査するパパニコロウ染色、炭水化物の過ヨウ素酸シッフ染色、３色染色プロトコルを用いて細胞を周囲の結合組織と区別するマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ）、血液または骨髄試料を検査するロマノフスキー染色（またはライト染色、ジェンナー染色、メイ・グリュンワルド染色、リーシュマン染色、及びギムザ染色などの一般的な変形）、タンパク質及びＤＮＡを明らかにする銀染色、脂質のＳｕｄａｎ染色、ならびに真の内生胞子を検出するコンクリン染色が挙げられる。一般的な生物学的染料としては、細胞周期決定用のアクリジンオレンジ、酸ムチン用のビスマルクブラウン、グリコーゲン用のカーマイン、核用のカーマインアルム、タンパク質用のクーマシーブルー、ニューロン細胞質の酸性成分用のクレシルバイオレット、細胞壁用のクリスタルバイオレット、核用のＤＡＰＩ、細胞質物質、細胞膜、何らかの細胞外構造物、及び赤血球用のエオシン、ＤＮＡ用の臭化エチジウム、コラーゲン、平滑筋、またはミトコンドリア用のフクシン酸（ａｃｉｄ  ｆｕｃｈｓｉｎｅ）、核用のヘマトキシリン、ＤＮＡ用のヘキスト染料、デンプン用のヨード、Ｇｉｍｅｎｅｚ染色法での細菌用及び胞子用のマラカイトグリーン、クロマチン用のメチルグリーン、動物細胞用のメチレンブルー、ニッスル物質用のニュートラルレッド；核用のナイルブルー、親油性物質用のナイルレッド、脂質用の四酸化オスミウム、蛍光顕微鏡法で用いられるローダミン、核用のサフラニンが挙げられる。染料は、透過型電子顕微鏡法でもコントラストを上げるために用いられ、リンタングステン酸、四酸化オスミウム、四酸化ルテニウム、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カドミウム、カルボヒドラジド、塩化第二鉄、ヘキサミン、三塩化インジウム、硝酸ランタン、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛（ＩＩ）、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、銀プロテイナート、塩化金酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、及び硫酸バナジルが挙げられる。
【０２６７】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、微生物タイプの存在及び少なくとも１つの微生物タイプの数を決定するために、質量分析法（ＭＳ）に供する（図１の１００１〜１００２、図２の２００１〜２００２）。以下で説明するが、ＭＳは、試料中の１つ以上の特有のマーカーの存在及び発現の検出にも用いられる場合がある（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。ＭＳはたとえば、微生物タイプに特有のタンパク質及び／またはペプチドマーカーの存在及び量の検出に用いられるので、試料中の各微生物タイプの数の評価を提供する。定量化は、安定同位体標識しても無標識でもよい。ペプチドの新規の配列決定も、直接ＭＳ／ＭＳスペクトルから、または配列タグ化（データベースとマッチングさせることができる短いタグの生成）からなされ得る。ＭＳはまた、タンパク質の翻訳後修飾を明らかにし、代謝物を特定することもできる。ＭＳは、クロマトグラフィー法または他の分離法（たとえばガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、イオン移動度）と一緒に用いて、質量分解度及び決定能を高めることができる。
【０２６８】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、微生物タイプの存在及び少なくとも１つの微生物タイプの数を決定するために、脂質分析に供する（図１の１００１〜１００２、図２の２００１〜２００２）。脂肪酸は、細胞バイオマスの比較的一定の割合を占め、微生物細胞には特徴的な脂肪酸が存在し、群集内の微生物タイプの区別を可能にする。一実施形態では、脂肪酸は、鹸化の後誘導体化してそれぞれの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得ることにより抽出され、それらを次いでガスクロマトグラフィーにより分析する。一実施形態のＦＡＭＥプロファイルは、次に、参照ＦＡＭＥデータベースと比較されて、多変量統計分析により脂肪酸及び対応する微生物特徴が特定される。
【０２６９】
本明細書で提供する方法の態様では、試料またはその一部分（たとえば、試料アリコート）中の特有の第１マーカーの数ならびに各特有の第１マーカーの数度を測定する（図１の１００３、図２の２００３）。特有のマーカーは、微生物株のマーカーである。当業者であれば、調査され測定される特有のマーカーによっては、試料全部を分析する必要がないことを理解しよう。たとえば、特有のマーカーが細菌株に特有である場合は、その試料の真菌部分を分析する必要はない。上述のように、いくつかの実施形態では、試料中の１つ以上の生物タイプの絶対数度を測定することは、たとえばフローサイトメトリーにより、この試料を生物タイプによって分けることを含む。
【０２７０】
本明細書では、生物株に特有の任意のマーカーを用いることができる。たとえば、マーカーとしては、限定ではないが、小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ／１８Ｓ  ｒＤＮＡ）、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（２３Ｓ／２５Ｓ／２８Ｓ  ｒＤＮＡ）、介在５．８Ｓ遺伝子、チトクロムｃオキシダーゼ、ベータチューブリン、伸長因子、ＲＮＡポリメラーゼ、及び内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を挙げることができる。
【０２７１】
リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、特に小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子、すなわち、真核生物の場合は１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１８Ｓ  ｒＤＮＡ）、原核生物の場合は１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）は、微生物群集における生物タイプ及び株の評価の主たるターゲットとされている。しかし、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子２８Ｓ  ｒＤＮＡもまた、ターゲットとされている。ｒＤＮＡが分類学的特定に好適なのは、（ｉ）あらゆる既知の生物に偏在している、（ｉｉ）保存領域と可変領域の両方をもつ、（ｉｉｉ）比較に用いることができる急速に拡大している配列データベースがある、という理由からである。試料の群集分析では、保存領域は対応するユニバーサルＰＣＲ及び／または配列決定用プライマーのアニーリング部位となり、可変領域は系統区別に用いることができる。さらに、細胞中のｒＤＮＡの複製数が豊富であることは、環境試料からの検出を容易にする。
【０２７２】
１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡの間にある内部転写スペーサー（ＩＴＳ）もまた、ターゲットとされている。ＩＴＳは、転写はされるが、リボソームの構築前に切り出される。ＩＴＳ領域は、２つの超可変スペーサーＩＴＳ１とＩＴＳ２、及び介在５．８Ｓ遺伝子で構成される。このｒＤＮＡオペロンは、複数の複製がゲノムにおいて生じる。ＩＴＳ領域はリボソーム成分をコードしないので、超可変である。
【０２７３】
一実施形態では、特有のＲＮＡマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、またはリボソームＲＮＡマーカーであることができる。
【０２７４】
タンパク質をコードする機能性遺伝子も、本明細書で特有の第１マーカーとして用いることができる。そのようなマーカーとしては、限定ではないが、リコンビナーゼＡ遺伝子ファミリー（細菌ＲｅｃＡ、古細菌ＲａｄＡ及びＲａｄＢ、真核生物Ｒａｄ５１及びＲａｄ５７、ファージＵｖｓＸ）、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ＲｐｏＢ）遺伝子（転写開始及び伸長を担う）、シャペロニンが挙げられる。候補マーカー遺伝子も細菌と古細菌について特定されている：リボソームタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ｒｐｓＪ）、リボソームタンパク質Ｌ１（ｒｐｌＡ）、翻訳伸長因子ＥＦ−２、翻訳開始因子ＩＦ−２、メタロエンドペプチターゼ、リボソームタンパク質Ｌ２２、ｆｆｈシグナル認識粒子タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ４／Ｌ１ｅ（ｒｐｌＤ）、リボソームタンパク質Ｌ２（ｒｐｌＢ）、リボソームタンパク質Ｓ９（ｒｐｓＩ）、リボソームタンパク質Ｌ３（ｒｐｌＣ）、フェニルアラニルｔＲＮＡシンセターゼベータサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１４ｂ／Ｌ２３ｅ（ｒｐｌＮ）、リボソームタンパク質Ｓ５、リボソームタンパク質Ｓ１９（ｒｐｓＳ）、リボソームタンパク質Ｓ７、リボソームタンパク質Ｌ１６／Ｌ１０Ｅ（ｒｐｌＰ）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ｒｐｓＭ）、フェニルアラニルｔＲＮＡシンセターゼαサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５／Ｌ２３、リボソームタンパク質Ｌ６（ｒｐｌＦ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ｒｐｌＫ）、リボソームタンパク質Ｌ５（ｒｐｌＥ）、リボソームタンパク質Ｓ１２／Ｓ２３、リボソームタンパク質Ｌ２９、リボソームタンパク質Ｓ３（ｒｐｓＣ）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ｒｐｓＫ）、リボソームタンパク質Ｌ１０、リボソームタンパク質Ｓ８、ｔＲＮＡプソイドウリジンシンターゼＢ、リボソームタンパク質Ｌ１８Ｐ／Ｌ５Ｅ、リボソームタンパク質Ｓ１５Ｐ／Ｓ１３ｅ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、リボソームタンパク質Ｓ１７、リボソームタンパク質Ｌ１３（ｒｐｌＭ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロ−リガーゼ（ｒｐｓＥ）、リボヌクレアーゼＨＩＩ、及びリボソームタンパク質Ｌ２４。細菌の他の候補マーカー遺伝子としては、転写伸長タンパク質ＮｕｓＡ（ｎｕｓＡ）、ｒｐｏＢ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットベータ（ｒｐｏＢ）、ＧＴＰ結合性タンパク質ＥｎｇＡ、ｒｐｏＣ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットベータ’、ｐｒｉＡプライモソーム構築タンパク質、転写修復カップリング因子、ＣＴＰシンターゼ（ｐｙｒＧ）、ｓｅｃＹ前タンパク質トランスロカーゼサブユニットＳｅｃＹ、ＧＴＰ結合性タンパク質Ｏｂｇ／ＣｇｔＡ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｒｐｓＦ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６、ｐｏＡ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットアルファ、ペプチド鎖終結因子１、ｒｐｌＩ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ９、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔｓｆ伸長因子Ｔｓ（ｔｓｆ）、ｒｐｌＱ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１７、ｔＲＮＡ（グアニン−Ｎ（１）−）−メチルトランスフェラーゼ（ｒｐｌＳ）、ｒｐｌＹ高可能性��ｐｒｏｂａｂｌｅ）５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２５、ＤＮＡ修復タンパク質ＲａｄＡ、グルコース阻害分裂（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）タンパク質Ａ、リボソーム結合性因子Ａ、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＬ、ｓｍｐＢ  ＳｓｒＡ結合性タンパク質（ｓｍｐＢ）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−メチルトランスフェラーゼＭｒａＷ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニン−−Ｄ−グルタマートリガーゼ、ｒｐｌＳ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１９、ｒｐｌＴ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２０（ｒｐｌＴ）、ｒｕｖＡホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼ、ｒｕｖＢホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼＢ、ｓｅｒＳセリルｔＲＮＡシンセターゼ、ｒｐｌＵ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２１、ｒｐｓＲ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１８、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ、ｒｐｓＴ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２０、ＤＮＡ修復タンパク質ＲｅｃＮ、ｆｒｒリボソームリサイクリング因子（ｆｒｒ）、組換タンパク質ＲｅｃＲ、未知機能タンパク質ＵＰＦ００５４、ｍｉａＡ  ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼ、ＧＴＰ結合性タンパク質ＹｃｈＦ、染色体複製イニシエータータンパク質ＤｎａＡ、デホスホ−ＣｏＡキナーゼ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ加工タンパク質ＲｉｍＭ、ＡＴＰ−ｃｏｎｅドメインタンパク質、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスファートシンターゼ、脂肪酸／リン脂質合成タンパク質ＰｌｓＸ、ｔＲＮＡ（Ｉｌｅ）ライシジンシンセターゼ、ｄｎａＧ  ＤＮＡプライマーゼ（ｄｎａＧ）、ｒｕｖＣホリデイジャンクションリゾルバーゼ、ｒｐｓＰ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１６、リコンビナーゼＡ  ｒｅｃＡ、リボフラビン生合成タンパク質ＲｉｂＦ、グリシルｔＲＮＡシンセターゼベータサブユニット、ｔｒｍＵ  ｔＲＮＡ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジラート）−メチルトランスフェラーゼ、ｒｐｍＩ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３５、ｈｅｍＥウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ、Ｒｏｄ形状決定タンパク質、ｒｐｍＡ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７（ｒｐｍＡ）、ペプチジルｔＲＮＡヒドロラーゼ、翻訳開始因子ＩＦ−３（ｉｎｆＣ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−トリペプチドシンセターゼ、ｒｐｍＦ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２、ｒｐＩＬ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（ｒｐＩＬ）、ｌｅｕＳロイシルｔＲＮＡシンセターゼ、ｌｉｇＡ  ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ、細胞分裂タンパク質ＦｔｓＡ、ＧＴＰ結合性タンパク質ＴｙｐＡ、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ、ＡＴＰ結合性サブユニットＣｌｐＸ、ＤＮＡ複製及び修復タンパク質ＲｅｃＦ、ならびにＵＤＰ−Ｎ−アセチレノールピルボイルグルコサミンレダクターゼが挙げられる。
【０２７５】
本明細書で説明する方法によると、リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ）も特有の第１マーカーとして用いることができる。ＰＬＦＡは微生物の増殖中に速やかに合成され、貯蔵分子には見られず、細胞死の際に速やかに分解するので、現在生存している群集の正確な個体数調査ができる。全ての細胞は脂肪酸（ＦＡ）を含み、これを抽出しエステル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を形成することができる。ＦＡＭＥをガスクロマトグラフィー質量分析法で分析すると、結果のプロファイルは試料中の微生物の「フィンガープリント」を構成する。細菌ドメイン及び真核生物ドメインの生物の膜の化学的組成は、エステルタイプの結合によりグリセロールに結合した脂肪酸で構成されている（リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ））。これに対し、古細菌の膜脂質は、長い分枝炭化水素で構成され、これらがエーテルタイプの結合によりグリセロールに結合している（リン脂質エーテル脂質（ＰＬＥＬ））。これは、最も広く用いられている、これらの３つのドメインを識別する非遺伝子的判断基準のひとつである。この文脈では、異なるアシル鎖を特徴とする微生物細胞膜由来のリン脂質は、そのような脂質構造の多様性は特定の微生物分類群に結び付けることができるので、優れた特徴分子である。
【０２７６】
本明細書で提供するように、生物株が活性かどうかを決定するために、第１マーカーと同じでも異なっていてもよい、１つ以上の特有の第２マーカーの発現レベルを測定する（図１の１００４、図２の２００４）。特有の第１特有のマーカーについては上に記載する。特有の第２マーカーは、微生物活性のマーカーである。たとえば、一実施形態では、上述の第１マーカーのいずれのｍＲＮＡまたはタンパク質発現も、本発明の目的では特有の第２マーカーとみなされる。
【０２７７】
一実施形態では、第２マーカーの発現レベルが閾値レベル（たとえば対照レベル）を上回るかまたは閾値レベルである場合、微生物は活性とみなされる（図１の１００５、図２の２００５）。活性は、一実施形態では、第２マーカーの発現レベルが、閾値レベル（いくつかの実施形態では対照レベルである）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％改変された場合に判定される。
【０２７８】
第２の特有のマーカーは、一実施形態では、タンパク質、ＲＮＡ、または代謝物のレベルで測定される。特有の第２マーカーは、第１の特有のマーカーと同じであるか、異なる。
【０２７９】
上述のように、本明細書で説明する方法にしたがって、ある数の特有の第１マーカーと特有の第２マーカーとを検出することができる。さらに、特有の第１マーカーの検出及び定量化は、当業者に知られている方法にしたがい実行される（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。
【０２８０】
一実施形態では核酸（たとえば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）配列決定（シーケンシング）を用いて、特有の第１マーカー及び／または特有の第２マーカーの絶対数度を決定する。シーケンシングのプラットフォームとしては、限定ではないが、サンガーシーケンシング法、及びＲｏｃｈｅ／４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＮａｎｏｐｏｒｅから入手可能なハイスループット・シーケンシング法が挙げられる。シーケンシングは、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のアンプリコンのシーケンシグでも、全メタゲノム／トランスクリプトームのショットガン式シーケンシングでもよい。
【０２８１】
従来のサンガーシーケンシング法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐｐ．５４６３−５４６７  その内容を参照により本明細書に援用する）は、インビトロのＤＮＡ複製中にＤＮＡポリメラーゼにより鎖停止ジデオキシヌクレオチドが選択的に取り込まれることに依存するもので、本明細書で説明する方法で用いることができる。
【０２８２】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、核酸抽出、好適なプライマーを用いての対象とするＤＮＡ（たとえばｒＲＮＡ遺伝子）の増幅、及びシーケンシングベクターを用いてのクローンライブラリー構築に供する。次に、選択されたクローンをサンガーシーケンシング法により配列決定し、対象とするＤＮＡのヌクレオチド配列を読み出し、試料中の特有微生物株の数の計算が可能になる。
【０２８３】
Ｒｏｃｈｅ／４５４Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの４５４パイロシーケンシングでは長いリードが得られ、本明細書で説明する方法で利用することができる（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３７，ｐｐ．３７６−３８０；米国特許第６，２７４，３２０号；同第６，２５８，５６８号；同第６，２１０，８９１号  これらすべての内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する）。配列決定される核酸（たとえば、アンプリコン、または噴霧ゲノム／メタゲノムＤＮＡ）には、ＰＣＲまたはライゲーションにより、両端に特異的アダプターが付加される。アダプターがついたＤＮＡを微小ビーズに固定し（理想的には、ビーズ１個に対しＤＮＡ断片１つ）、油中水乳剤に懸濁する。次に、乳剤ＰＣＲステップを実行して各ＤＮＡ断片の複数の複製を作り、その結果として、各ビーズが同一ＤＮＡ断片の多数のクローン化複製を含んでいる一式のビーズを得る。次いで各ビーズを光ファイバーチップのウェルに入れるが、該ウェルは合成時解読反応に必要な酵素も含んでいる。塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴなど）を加えると、ピロリン酸の放出が誘発されて光を発するので、これを記録して、各ウェルのＤＮＡ断片の配列を推定する。１回のランで、約１００万のリードが最大１，０００塩基のリード長で得られる。対合末端のシーケンシングを実行でき、それぞれ所与のＤＮＡ断片の一つの末端から始まる対のリードが得られる。分子バーコードを生成し、多重増幅反応でアダプター配列と対象とする配列の間に配置することで、各配列を試料に生物情報学的に割り当てることができる。
【０２８４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａシーケンシングで生産されるリード長の平均は、約２５塩基対（ｂｐ）から約３００ｂｐである（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６：３７３−３８２；Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，ｐ．６３；Ｆａｄｒｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ２，ｐ．６；Ｃａｐｏｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＩＳＭＥ  Ｊ，６，ｐ．１６２１−１６２４；Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｗｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９）。このシーケンシング技術も合成時解読であるが、リバーシブル・ダイ・ターミネーター、及びオリゴのフィールドを結合させたフローセルを用いる。配列決定されるＤＮＡ断片は、両末端に特異的アダプターを有し、該断片の末端にハイブリダイズする特異的オリゴヌクレオチドが充填されたフローセルに流される。すると、各断片は、同一断片のクラスターを作るように複製される。次にリバーシブル・ダイ・ターミネーター・ヌクレオチドをフローセルに流し、結合する時間を与える。過剰ヌクレオチドを洗い流し、フローセルを撮像し、リバーシブル・ターミネーターを除去して、このプロセスを繰り返し、後続のサイクルでヌクレオチドを加え続けることができる。それぞれ３００塩基長の対合末端のリードを得ることができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームは、１回のランで、各リードが１２５塩基の、対合末端の４０億の断片を生産できる。試料の多重増幅にバーコードを用いることもできるが、指標プライマーが用いられる。
【０２８５】
ＳＯＬｉＤ（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）法は、「ライゲーション時解読」の方法であり、第１マーカー及び／または第２マーカーの存在及び数度を検出するために本明細書で説明する方法とともに用いることができる（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）（Ｐｅｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＳＯＬｉＤＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ２−Ｂａｓｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７；Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｕｓｉｎｇ  ＳＯＬｉＤ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＳＯＬｉＤ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４（Ｓｕｐｐｌ  ５）：Ｓ１６；Ｍａｒｄｉｓ（２００８）Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，９：３８７−４０２；これらすべての内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する）。配列を決定する試料からＤＮＡ断片のライブラリーを調製して、クローンビーズ集団の調製に用いるが、ここで各磁気ビーズ表面には１種の断片だけが存在することになる。磁気ビーズに結合する断片は、ユニバーサルＰ１アダプター配列を有するので、各断片の開始配列は既知かつ同一である。プライマーは、ライブラリー鋳型内のＰ１アダプター配列にハイブリダイズする。４つ一組の蛍光標識二塩基プローブが、シーケンシングプライマーへのライゲーションについて競合する。二塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応の第１と第２の塩基を全て調べることで得られる。ライゲーション、検出、及び切断の複数のサイクルを実行し、サイクル数が最終的なリード長を決める。ＳＯＬｉＤプラットフォームは、１回のランで、最大３０億のリードを、７５塩基のリード長で、生産できる。対合末端シーケンシングが可能であり、本明細書で用いることができるが、対の第２のリード長はわずか３５塩基である。試料の多重増幅は、別途指標ランがある、Ｉｌｌｕｍｉｎａで使用するものと類似したシステムにより、可能である。
【０２８６】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、４５４シーケンシングと同様に、第１マーカー及び／または第２マーカーの存在及び数度を検出するための本明細書で説明する方法で用いることができる（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。これは、ＤＮＡ断片が結合したビーズを含むマイクロウェルのプレートを用いる。しかし、他のどのシステムとも異なるのは、塩基の取り込みの検出の仕方である。伸長ＤＮＡ鎖に塩基が加えられると、プロトンが放出され、それによって周囲のｐＨが僅かに変化する。ｐＨに敏感なマイクロ検出器をプレートのウェルと対応させて、このような変化が生じると記録させる。異なる塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を順次ウェルに流すことで、各ウェルの配列を推定できる。Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームは、１回のランで、２００塩基のリード長を有する最高５０００万のリードを生産できる。Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅプラットフォームは、リード長が４００塩基とより長い。二方向のシーケンシングが可能である。多重増幅は、標準のインライン分子バーコードシーケンシングにより可能である。
【０２８７】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）ＳＭＲＴシーケンシングは、１分子リアルタイムのシーケンシング方法を用い、一実施形態では、第１マーカー及び／または第２マーカーの存在及び数度を検出するための本明細書で説明する方法とともに用いられる（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。ＰａｃＢｉｏシーケンシングシステムには増幅ステップが含まれないことが、他の主要な次世代シーケンシングシステムとの違いである。一実施形態では、シーケンシングは多数のゼロモード導波路（ＺＭＷ）検出器を含むチップ上で実行される。ＤＮＡポリメラーゼをＺＭＷ検出器に結合させ、リン酸結合色素で標識したヌクレオチドの取り込みをＤＮＡ鎖合成と同時に撮像する。ＰａｃＢｉｏシステムは、１回のランで、非常に長いリード長（平均約４，６００塩基）及び大量のリード数（約４７，０００）を生産する。一般的な「対合末端」法はＰａｃＢｉｏでは用いないが、それは一般にリードが十分に長いので断片をＣＣＳにより複数回カバーでき、各端から独立して配列決定する必要がないからである。ＰａｃＢｉｏによる多重増幅は、独立したリードを含まず、標準的な「インライン」のバーコード化モデルを踏襲する。
【０２８８】
第１の特有のマーカーがＩＴＳゲノム領域である一実施形態では、自動リボソーム遺伝子間スペーサー分析（ＡＲＩＳＡ）が、一実施形態で、試料中の微生物株の数及び識別を決定するのに用いられる（図１の１００３、図２の２００３）（Ｒａｎｊａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５，ｐｐ．１１１１−１１２０、その内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する）。ＩＴＳ領域は、長さもヌクレオチド配列も大きく異なる。蛍光標識されたフォワードプライマー及び自動ＤＮＡシーケンサーを用いることで、高分離能及び高収率が可能になる。各試料で内部標準を用いることで、一般的な断片を正確にサイズ決めできる。
【０２８９】
別の実施形態では、ＰＣＲ増幅ｒＤＮＡ断片の断片長多型（ＲＦＬＰ）、別名増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）を用いて、試料中の特有の第１マーカー及びその数度を特徴付ける（図１の１００３、図２の２００３）（Ｍａｓｓｏｌ−Ｄｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｍａｎｕａｌ．３．３．２，ｐｐ．１−１８、その内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する）。ｒＤＮＡ断片を、汎用プライマーを用いてＰＣＲで作成し、制限酵素で切断し、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル中に電気泳動させ、臭化エチジウムまたは硝酸銀で染色する。
【０２９０】
特有の第１マーカーの存在及び数度を検出するのに用いられる１つのフィンガープリント法は、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）である（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６２，ｐｐ．３１１２−３１２０；Ｓｃｈｅｉｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６，ｐｐ．１０３−１１７；Ｓｃｈｗｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｔｅｂｂｅ（１９９８）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，ｐｐ．４８７０−４８７６、これらすべての内容を参照により本明細書に援用する）。この技法では、ＤＮＡ断片、たとえば１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を変性させ、非変性ゲル上で直接電気泳動させる。分離は、一本鎖ＤＮＡのサイズ及び折畳み高次構造の差（電気泳動の移動性に影響する）に基づく。電気泳動中のＤＮＡ鎖の再アニーリングは、いくつかの手段によって防止することができ、ＰＣＲで１つのリン酸化プライマーを用い、次いでリン酸化鎖をラムダエキソヌクレアーゼで特異的に切断すること、及びビオチン化プライマーを用いて変性後に１つの一本鎖を磁気分離すること、が挙げられる。所与の共同体における優勢な集団の識別を評価するために、一実施形態では、バンドを切除し配列決定するか、またはＳＳＣＰパターンを特異的プローブとハイブリダイズさせる。電気泳動条件、たとえばゲルマトリクス、温度、及びグリセロールのゲル添加などは、分離に影響し得る。
【０２９１】
シーケンシングに基づく方法に加えて、第２マーカーの発現（たとえば、遺伝子、タンパク質発現）を定量化する他の方法も、１つ以上の第２マーカーの発現レベルを決定するために、本明細書で提供する方法で用いることができる（図１の１００４、図２の２００４）。たとえば、定量ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、線形増幅法、たとえば核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）はすべて本明細書で説明する方法で用いることができ、当業者に知られている方法にしたがって実行することができる。
【０２９２】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、第１マーカー及び／または第２マーカーの存在及び数度を検出するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供する（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。特定の微生物株の活性は、転写リボソーム及び／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ）を相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写してからＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行って測定する。
【０２９３】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、ＰＣＲベースのフィンガープリント法に供して、第１マーカー及び／または第２マーカーの存在及び数度を検出する（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。ＰＣＲ産物は、ヌクレオチド組成に基づく電気泳動により分離することができる。異なるＤＮＡ分子間の配列の違いは融解挙動に影響するので、配列が異なる分子はゲル中の異なる位置で移動を停止する。したがって、電気泳動プロファイルは、異なるバンドまたはピークの位置及び相対強度により定めることができ、多様性指標の計算用に数値データに変換することができる。また、バンドをゲルから切り出した後に配列決定して、群集メンバーの系統所属性を明らかにすることができる。電気泳動法としては、限定ではないが、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）または増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ）、末端制限酵素断片長多型分析（Ｔ−ＲＦＬＰ）、自動リボソーム遺伝子間スペーサー分析（ＡＲＩＳＡ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリント法（ＤＡＦ）、及びＢｂ−ＰＥＧ電気泳動が挙げられる。
【０２９４】
別の実施形態では、試料またはその一部分を、マイクロアレイまたは微小流体などのチップベースのプラットフォームに供して、特有の第１マーカーの数度、及び／または特有の第２マーカーの存在／数度を決定する（図１の１００３〜１００４、図２の２００３〜２００４）。ＰＣＲ産物は、試料中の全ＤＮＡから増幅し、マイクロアレイに固定した既知の分子プローブに直接ハイブリダイズさせる。蛍光標識されたＰＣＲアンプリコンがプローブにハイブリダイズした後、共焦点レーザー走査型顕微鏡法により陽性シグナルをスコア化する。マイクロアレイ法では、複製により試料の高速評価が可能であり、このことは微生物群集の分析において大きな利点である。一般に、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションシグナルの強度は、ターゲット生物の数度と正比例する。ユニバーサル高密度１６Ｓマイクロアレイ（ＰｈｙｌｏＣｈｉｐ）は、いくつかの培養微生物種及び「候補門」をターゲットとする１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のプローブ約３０，０００を含む。これらのプローブは、１２１の境界画定された原核生物目の全部をターゲットとし、また、８，７４１の細菌分類群及び古細菌分類群の同時検出を可能にする。微生物群集のプロファイリングに用いられる別のマイクロアレイは、機能性遺伝子Ａｒｒａｙ（ＦＧＡ）である。ＰｈｙｌｏＣｈｉｐとは異なり、ＦＧＡは主として特定の細菌の代謝群を検出するように設計されている。したがって、ＦＧＡは群集構造を明らかにするだけでなく、インサイツの群集代謝可能性も解明する。ＦＧＡは、既知の生物学的機能をもつ遺伝子由来のプローブを含むので、微生物群集の組成をエコシステムの機能と結び付けるのに有用である。ＧｅｏＣｈｉｐと呼ばれるＦＧＡは、様々な生物地球科学的、生態学的、及び環境的プロセス、たとえばアンモニア酸化、メタン酸化、及び窒素固定など関与しているあらゆる既知の代謝遺伝子に由来する２４，０００を上回るプローブを含む。
【０２９５】
一実施形態では、タンパク質発現アッセイが、１つ以上の第２マーカーの発現レベルを決定するために、本明細書で説明する方法とともに用いられる（図１の１００４、図２の２００４）。たとえば、一実施形態では、質量分析法または免疫アッセイ、たとえば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて１つ以上の特有の第２マーカーの発現レベルを定量化し、ここで１つ以上の特有の第２マーカーはタンパク質である。
【０２９６】
一実施形態では、試料またはその一部分を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに供して、第２特有のマーカーのレベルを決定する（図１の１００４、図２の２００４）。チミジンの合成ヌクレオシドアナログであるＢｒｄＵは、複製細胞の新たに合成されたＤＮＡに取り込まれることができる。次にＢＲｄＵに特異的な抗体を用いて塩基アナログを検出することができる。したがって、ＢｒｄＵの取り込みは、ＤＮＡを積極的に複製している細胞を特定するものであり、本明細書で説明する方法の一実施形態による、微生物活性の測定である。ＢｒｄＵの取り込みをＦＩＳＨと組み合わせて、ターゲット細胞の識別及び活性を提供することができる。
【０２９７】
一実施形態では、試料またはその一部分を、ＦＩＳＨと組み合わせたマイクロオートラジオグラフィー（ＭＡＲ）に供して、第２特有のマーカーのレベルを決定する（図１の１００４、図２の２００４）。ＭＡＲ−ＦＩＳＨは、放射性基質の細胞内取り込み、オートラジオグラフィーによる活性細胞の検出、及びＦＩＳＨによる細胞の特定に基づく。１細胞解像度での活性細胞の検出及び特定は、顕微鏡で行う。ＭＡＲ−ＦＩＳＨは、全細胞、プローブターゲット細胞、及び所与の放射標識物質を取り込んだ細胞の割合についての情報を提供する。この方法は、ターゲット微生物のインサイツの機能の評価を提供するとともに、微生物のインビボの生理を調べる有効な方法である。細胞特異的基質吸収の定量化用に開発された、ＭＡＲ−ＦＩＳＨと併用される技法が、定量ＭＡＲ（ＱＭＡＲ）として知られている。
【０２９８】
一実施形態では、試料またはその一部分を、ＦＩＳＨと組み合わせた安定同位体ラマン分光法（ラマン−ＦＩＳＨ）に供して、第２特有のマーカーのレベルを決定する（図１の１００４、図２の２００４）。この技法は、安定同位体プロービング、ラマン分光法とＦＩＳＨを組み合わせて、代謝プロセスを特定の生物と結び付ける。細胞に取り込まれた安定同位体の割合が光散乱に影響し、その結果、タンパク質及びｍＲＮＡ成分などの標識した細胞成分の測定可能なピークシフトが生じる。ラマン分光法は、細胞が、限定ではないが、油（たとえばアルカン）、脂質（たとえばトリアシルグリセロール（ＴＡＧ））、特定のタンパク質（たとえばヘムタンパク質、金属タンパク質）、チトクロム（たとえばＰ４５０、チトクロムｃ）、クロロフィル、発色団（たとえば集光性カロテノイド及びロドプシンの色素）、有機ポリマー（たとえばポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリヒドロキシブチラート（ＰＨＢ））、ホパノイド、ステロイド、デンプン、硫化物、硫酸、及び二次代謝物（たとえばビタミンＢ１２）などの化合物を合成するかどうかを特定するのに用いることができる。
【０２９９】
一実施形態では、試料またはその一部分を、ＤＮＡ／ＲＮＡ安定同位体プロービング（ＳＩＰ）に供して、第２特有のマーカーのレベルを決定する（図１の１００４、図２の２００４）。ＳＩＰは、特定の代謝経路と関連のある微生物多様性の決定を可能にし、炭素化合物や窒素化合物の利用に関する微生物の調査に広く用いられている。対象とする基質を安定同位体（１３Ｃまたは１５Ｎなど）で標識し、試料に加える。該基質を代謝できる微生物だけがその細胞内に該基質を取り込む。次に、密度勾配遠心分離法により１３Ｃ−ＤＮＡ及び１５Ｎ−ＤＮＡを単離して、メタゲノム分析に用いることができる。ＲＮＡベースのＳＩＰは、ＳＩＰ試験で用いられる応答性に優れたバイオマーカーとなり得るが、それはＲＮＡ自体が細胞活性を反映するからである。
【０３００】
一実施形態では、試料またはその一部分を同位体アレイに供して、第２特有のマーカーのレベルを決定する（図１の１００４、図２の２００４）。同位体アレイは、活性微生物群集の機能及び系統の高スループット式のスクリーニングを可能にする。この技法は、基質吸収プロファイルをモニタリングするＳＩＰと、活性微生物群集の分類学的識別を決定するマイクロアレイ技術の組合せを用いる。試料を１４Ｃ標識基質と一緒にインキュベートし、該基質は増殖の過程で微生物バイオマスに取り込まれる。該１４Ｃ標識ｒＲＮＡは非標識ｒＲＮＡから分離され、次に蛍光色素で標識される。蛍光標識ｒＲＮＡを系統マイクロアレイにハイブリダイズさせてから、放射性シグナル及び蛍光シグナルについてスキャンする。このように、この技法は、微生物群集の組成と、複合的な微生物群集の代謝活性微生物による特定の基質の消費とを同時に調査することを可能にする。
【０３０１】
一実施形態では、試料またはその一部分をメタボロミクスアッセイに供して、第２特有のマーカーのレベルを決定する（図１の１００４、図２の２００４）。メタボロミクスは、生物学的細胞、組織、器官、または生物における細胞プロセスの最終産物つまり代謝物全ての総体であるメタボロームを調査する。この方法は、特定の代謝物プロファイルと種々の微生物の関連付けを可能にするので、微生物の存在及び／または微生物が介在するプロセスをモニターするのに用いることができる。微生物活性と関連のある細胞内及び細胞外代謝物のプロファイルは、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）などの技法により得ることができる。メタボローム試料の混成物は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及びキャピラリー電気泳動などの技法により分離することができる。代謝物の検出は、質量分析法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、イオンモビリティ質量分析、電気化学的検出（ＨＰＬＣに連結）及び（薄層クロマトグラフィーと組み合わせた）放射標識により実施することができる。
【０３０２】
本明細書に記載する実施形態によると、試料中の１つ以上の活性微生物株の存在及びそれぞれの数が決定される（図１の１００６、図２の２００６）。たとえば、第１マーカーの数及び存在についてのアッセイから得られた株識別の情報を分析して、特有の微生物株の出現数を表す特有の第１マーカーの出現数がいくつあるかを（たとえば、シーケンシングアッセイの配列リードの数を数えることにより）決定する。この値を、一実施形態では、第１マーカーの全配列リードのパーセンテージとして示して、特定の微生物タイプの特有微生物株のパーセンテージを与えることができる。さらなる実施形態では、このパーセンテージを微生物タイプの数（ステップ１００２または２００２で求めたもの。図１及び図２を参照されたい）で乗じて、試料中及び所与の体積における１つ以上の微生物株の絶対数度を与える。
【０３０３】
１つ以上の微生物株は、上述のように、第２特有のマーカーの発現レベルが、閾値レベルであるか、または閾値を上回る場合、たとえば、対照レベルを少なくとも約５％上回る、少なくとも約１０％上回る、少なくとも約２０％上回る、または少なくとも約３０％上回る場合に、活性があるとみなされる。
【０３０４】
本発明の別の態様では、１つ以上の微生物株の絶対数度を決定するための方法は、複数の試料で決定される（図２の特に２００７を参照されたい）。微生物株が活性と分類されるためには、試料のうちの１つにおいて活性であればよい。試料は、同じ供給源から複数の時点で採取したものでも、異なる環境供給源（たとえば異なる動物）から採取したものでもよい。
【０３０５】
一実施形態では、複数の試料の絶対数度の値を用いて、１つ以上の活性微生物株を環境パラメーターと関連付ける（図２の２００８）。一実施形態では、環境パラメーターは、第２の活性微生物株の存在である。１つ以上の活性微生物株を環境パラメーターと関連付けることは、一実施形態では、相関またはネットワーク分析により株とパラメーターの共出現を決定することによって実行することができる。
【０３０６】
一実施形態では、１つ以上の活性微生物株と環境パラメーターの共出現を決定することは、ネットワーク（共通または類似の環境パラメーターを共有する２つ以上の試料の総体）内の複数または単数の株と環境パラメーターの関連性を測定する、ネットワーク及び／またはクラスター分析法を含む。別の実施形態では、ネットワーク及び／またはクラスター分析法は、試料中の２つ以上の活性微生物株の共出現を決定するのに用いることができる（図２の２００８）。別の実施形態では、ネットワーク分析には、変数間の関連性を確立する相互情報量を含むノンパラメトリック法が含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、リンケージ分析、モジュラリティー分析、頑強性測定、媒介性（ｂｅｔｗｅｅｎｎｅｓｓ）測定、関連性測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組合せが含まれる（図２の２００９）。別の実施形態では、クラスター分析法には、関連性モデル、サブスペースモデル、分布モデル、密度モデル、もしくは重心（ｃｅｎｔｒｏｉｄ）モデルの構築、及び／またはＬｏｕｖａｉｎ、Ｂｒｏｎ−Ｋｅｒｂｏｓｃｈ、Ｇｉｒｖａｎ−Ｎｅｗｍａｎ、Ｃｌａｕｓｅｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ、Ｐｏｎｓ−Ｌａｔａｐｙ、及びＷａｋｉｔａ−Ｔｓｕｒｕｍｉアルゴリズムなどの群集検出アルゴリズムの使用が含まれる（図２の２０１０）。
【０３０７】
一実施形態では、クラスター分析法は、モジュラリティー最適化に基づくヒューリスティック法である。さらなる実施形態では、クラスター分析法は、Ｌｏｕｖａｉｎ法である。たとえば、Ｂｌｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｆａｓｔ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２００８，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８で説明している方法を参照されたい（その内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する）。
【０３０８】
別の実施形態では、ネットワーク分析には、リンク・マイニング及び予測、集団分類（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、リンクベースのクラスタリング、関係類似性、またはそれらの組合せによるネットワーク予測モデリングが含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、微分方程式ベースの集団のモデリングが含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングが含まれる。
【０３０９】
一実施形態では、試料中の１つ以上の活性微生物株を環境パラメーターと関連付けること（たとえば、共出現の決定）には、環境パラメーターと微生物株の関連を示すリンケージを集めたマトリックスを作成することが含まれる
【０３１０】
一実施形態では、ステップ２００７で得た複数の試料データ（たとえば、２つ以上の時点で収集され得る２つ以上の試料のデータであり、ここで各時点は個々の試料に対応している）をまとめる。さらなる実施形態では、各試料の１つ以上の微生物株それぞれの細胞の数を、関連付けマトリックス（いくつかの実施形態では、数度マトリックスの場合がある）に保存する。一実施形態では、関連付けマトリックスを用いて、関連（たとえば数度）データで重みづけしたルール・マイニング法により、特定の時点の試料中の活性微生物株間の関連を特定する。一実施形態ではフィルターを用いて重要ではないルールを除去する。
【０３１１】
一実施形態では、１つ以上の、または２つ以上の活性微生物株の絶対数度を、１つ以上の環境パラメーターと、たとえば共出現の決定により、関連付ける（図２の２００８）。環境パラメーターは、分析する試料（複数可）に応じてユーザーが選択するものであり、本明細書で説明する方法により制限されない。環境パラメーターは、たとえば、ｐＨ、温度、試料中のタンパク質の量など、試料自体のパラメーターであってもよい。あるいは、環境パラメーターは、微生物群集の識別の変化に影響するパラメーターである（すなわち、微生物群集の「識別」が、群集中の微生物株のタイプ及び／または特定の微生物株の数により特徴付けられる場合）か、または、微生物群集の識別の変化により影響されるパラメーターである。たとえば、一実施形態の環境パラメーターは、動物の食物摂取量、または泌乳反芻動物が生産する乳（または乳のタンパク質または脂肪成分）の量である。一実施形態では、環境パラメーターは、同じ試料中に存在する、微生物群集の第２の微生物株の存在、活性、及び／または数度である。
【０３１２】
本明細書で説明するいくつかの実施形態では、環境パラメーターはメタデータ・パラメーターと呼ばれる。
【０３１３】
メタデータ・パラメーターの他の例としては、限定ではないが、試料が採取された宿主の遺伝子情報（たとえば、ＤＮＡ変異の情報）、試料のｐＨ、試料の温度、特定のタンパク質またはｍＲＮＡの発現、周囲環境／エコシステムの栄養条件（たとえば、１つ以上の栄養素のレベル及び／または識別）、病気に対する感受性または耐性、病気の発生または悪化、毒素に対する試料の感受性または耐性、異物化合物（医薬）の有効性、天然物の生合成、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０３１４】
たとえば、一実施形態によると、微生物株数の変化は、図２の方法（すなわち２００１〜２００７）にしたがい、複数の試料で計算される。１つ以上の活性株（たとえば、ステップ２００６にしたがい、当初活性であると特定された１つ以上の株）の経時的な株数の変化がまとめられ、変化の方向性が記録される（すなわち、負の値は減少を指し、正の値は増加を指す）。経時的な細胞数は、ネットワークとして表され、微生物株はノードを表し、数度で重みづけしたルールはエッジを表す。マルコフ鎖及び乱歩を用いてノード間の関連性を決定し、クラスターを画定する。一実施形態のクラスターは、所望のメタデータと関連のあるクラスターを特定するために、メタデータを用いてフィルタリングされる（図２の２００８）。
【０３１５】
さらなる実施形態では、微生物株を、経時的な細胞数の変化とターゲットクラスターに存在する株を統合して重要性により順位付けし、細胞数の変化が最大のものを最高位とする。
【０３１６】
ネットワーク及び／またはクラスター分析法が、一実施形態ではネットワーク（共通または類似の環境パラメーターを共有する２つ以上の試料の総体）内の１つ以上の株の関連性の測定に用いられる。一実施形態では、ネットワーク分析には、リンケージ分析、モジュラリティー分析、頑強性測定、媒介性測定、関連性測定、推移性測定、中心性測定またはそれらの組合せが含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、リンク・マイニング及び予測、ソーシャル・ネットワーク・セオリー、集団分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似性、またはそれらの組合せによるネットワーク予測モデリングが含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、微分方程式ベースの集団のモデリングが含まれる。さらに別の実施形態では、ネットワーク分析にはＬｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングが含まれる。
【０３１７】
クラスター分析法には、関連性モデル、サブスペースモデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルの構築が含まれる。
【０３１８】
ネットワーク及びクラスターベースの分析は、たとえば図２の方法ステップ２００８を実行するために、モジュールにより実行することができる。本明細書では、モジュールは、たとえば、あらゆる組立体、命令、及び／または機能的に接続された電気的コンポーネント・セットであり得、たとえば、メモリー、プロセッサー、電気トレース、光学式コネクター、ソフトウェア（ハードウェア内で実行）等を含み得る。
【０３１９】
ウシの病原体耐性及びクリアランス
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で説明する１つ以上の微生物組成物をウシに投与して、胃腸管の病原性微生物を排除することに関する。いくつかの実施形態では、本開示はさらに、本明細書で説明する微生物組成物を投与して、病原性微生物の胃腸管におけるコロニー形成を予防することに関する。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する微生物組成物の投与により、さらに、ウシの外皮及び気道から病原体が排除され、及び／または外皮及び気道での病原体コロニー形成が予防される。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する微生物組成物の投与により、リーキーガット／腸からの浸出、炎症、及び／または肝疾患発生が軽減する。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物は、ウシの胃腸管に、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、または０．０１％未満の相対数度で存在する１つ以上の微生物を含む。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、本開示の微生物組成物の投与後、該１つ以上の微生物は、ウシの胃腸管に、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相対数度で存在する。
【０３２２】
ウシの病原性微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｉｎｓｉｄｉｏｓａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの病原性株を含み得る。いくつかの実施形態では、病原性微生物は、ウイルス病原体を含む。いくつかの実施形態では、病原性微生物は、ウシとヒト両方にとって病原性である。いくつかの実施形態では、病原性微生物は、ウシかヒトのいずれかにとって病原性である。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物をウシに投与すると、胃腸ミクロビオームの構成が調節されて、該投与された微生物が胃腸管に存在する病原性微生物を打ち負かす。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を病原性微生物をもつウシに投与すると、該病原体が打ち負かされ、該病原体はウシから排除される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を投与する結果、宿主の免疫が刺激され、病原性微生物の排除の助けとなる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を投与すると、病原性微生物をウシから減じるかまたは排除する静菌成分及び／または殺菌成分を生産する微生物が導入される（米国特許第８，３４５，０１０号）。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の本開示の組成物の投与後にウシを微生物生着菌または病原性微生物で攻撃すると、該微生物生着菌または病原性微生物は、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、または０．０１％を上回る相対数度にまで増殖することを阻止される。さらなる実施形態では、１つ以上の本開示の組成物の投与後にウシを微生物生着菌または病原性微生物で攻撃すると、ウシにおける該微生物生着菌または病原性微生物によるコロニー形成が阻止される。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、微生物生着菌または病原性微生物の排除は、１つ以上の本開示の組成物の投与後２５日未満で、２４日未満で、２３日未満で、２２日未満で、２１日未満で、２０日未満で、１９日未満で、１８日未満で、１７日未満で、１６日未満で、１５日未満で、１４日未満で、１３日未満で、１２日未満で、１１日未満で、１０日未満で、９日未満で、８日未満で、７日未満で、６日未満で、５日未満で、４日未満で、３日未満で、または２日未満で生じる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、微生物生着菌または病原性微生物の排除は、１つ以上の本開示の組成物の投与後１〜３０日以内に、１〜２５日以内に、１〜２０日以内に、１〜１５日以内に、１〜１０日以内に、１〜５日以内に、５〜３０日以内に、５〜２５日以内に、５〜２０日以内に、５〜１５日以内に、５〜１０日以内に、１０〜３０日以内に、１０〜２５日以内に、１０〜２０日以内に、１０〜１５日以内に、１５〜３０日以内に、１５〜２５日以内に、１５〜２０日以内に、２０〜３０日以内に、２０〜２５日以内に、または２５〜３０日以内に生じる。
【０３２７】
改善される形質
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で説明する微生物組成物を反芻動物に投与して、乳生産、乳量、乳質、反芻動物の消化化学、ならびに飼料利用及び消化の効率の側面の調節により１つ以上の形質を改善することに関する。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産する乳脂肪の量を改善することが望ましく、乳脂肪としては、トリグリセリド、トリアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、リン脂質、コレステロール、糖脂質、及び遊離脂肪酸が挙げられる。さらなる実施形態では、遊離脂肪酸は、短鎖脂肪酸（すなわち、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０）、中鎖脂肪酸（すなわち、Ｃ１０：０、Ｃ１０：１、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１４：１、及びＣ１５：０）、及び長鎖脂肪酸（すなわち、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１７：０、Ｃ１７：１、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、及びＣ２０：０）を含む。さらなる実施形態では、乳脂肪効率の増加を得ることが望ましいが、これは生産乳脂肪の全重量を摂取飼料の重量で除して測定される。生産乳脂肪の重量は、測定した脂肪率に生産乳の重量を乗じて計算される。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産する乳中の炭水化物の量の改善が望ましく、炭水化物としてはラクトース、グルコース、ガラクトース、及びオリゴサッカライドが挙げられる。Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９２：２９９１−３００１）は、ウシの乳中に見られ得る数々のオリゴサッカライドを開示している。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産する乳中のタンパク質の量の改善が望ましく、ここでタンパク質にはカゼイン及び乳清が含まれる。いくつかの実施形態では、対象とするタンパク質は、乳中に生産されるタンパク質のみである。他の実施形態では、対象とするタンパク質は、乳中にのみ生産されるタンパク質でなくてもよい。乳清タンパク質としては、免疫グロブリン、血清アルブミン、ベータラクトグロブリン、及びアルファラクトグロブリンが挙げられる。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産するビタミンの量の改善が望ましい。乳中に見られるビタミンとしては、脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、及びＫ、ならびに乳の水相中に見られるビタミンＢが挙げられる。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産するミネラルの量の改善が望ましい。乳中に見られるミネラルとしては、鉄、亜鉛、銅、コバルト、マグネシウム、マンガン、モリブデン、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩素、及びクエン酸が挙げられる。乳中には、微量のアルミニウム、ヒ素、ホウ素、臭素、カドミウム、クロム、フッ素、ヨウ素、鉛、ニッケル、セレン、ケイ素、銀、ストロンチウム、及びバナジウムが見出され得る。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産する乳収量及び乳体積の改善が望ましい。いくつかの実施形態では、乳収量及び乳体積の増加が単なる溶質量の増加に伴うものでなければ、さらに望ましい。
【０３３４】
いくつかの実施形態は、エネルギー補正乳（ＥＣＭ）の改善が望ましい。さらなる実施形態では、計算されるＥＣＭ出力が増加するようなＥＣＭ量の改善が望ましい。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは次のように計算される。ＥＣＭ＝（０．３２７ｘ乳ポンド）＋（１２．９５ｘ脂肪ポンド）＋（７．２ｘタンパク質ポンド）
【０３３５】
いくつかの実施形態では、動物飼料効率及び消化率の改善が望ましい。いくつかの実施形態では、動物飼料由来のリグノセルロース成分の分解率の上昇が望ましい。リグノセルロース成分としては、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースが挙げられる。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、反芻動物の第一胃内の脂肪酸濃度の上昇が望ましい。脂肪酸としては、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、第一胃内のｐＨバランスを維持して、有益な微生物共同体の溶解を防止することが望ましい。いくつかの実施形態では、第一胃内のｐＨバランスを維持して有益な微生物共同体の減少を防止することが望ましい。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、反芻動物が生産するメタン及び糞の量を減少させることが望ましい。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、乾物摂取量の改善が望ましい。いくつかの実施形態では、反芻動物が摂取する飼料及び乾物の窒素利用効率を改善することが望ましい。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、本開示の改善された形質は、本明細書で説明する微生物組成物を投与した結果である。本微生物組成物が反芻動物のミクロビオームを調節し、その結果、第一胃の液体及び固体の基質が、本開示の微生物組成物を投与されていない反芻動物の第一胃よりも効率よく完全に小成分及び代謝物に分解されるように、第一胃の生化学が変化するものと考えられる。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、効率の上昇及び第一胃の基質の分解率の増加の結果、本開示の形質が改善される。
【０３４１】
作用機構：反芻動物の消化率の改善
第一胃は、反芻動物において飼料成分を消化するための特別な胃である。多様な微生物集団が第一胃内に生息しており、それらの主な機能は繊維質及び非繊維質の炭水化物成分を利用可能なエネルギー源及びタンパク質源に変換することである（図１６）。なかでもセルロースは、植物バイオマスの最大４０％を占め、哺乳類には消化できないと考えられている。ヘミセルロース、ペクチン、及びリグニンなど他の構造性炭水化物とも密接な関係がある。第一胃内のセルロース分解性微生物は、強力な酵素活性を利用して、これらの分子を単糖及び揮発性脂肪酸に分解する。この酵素活性は飼料からのエネルギー抽出に重要であり、より高効率な分解は最終的により多くのエネルギーを動物に与える。飼料の非繊維質部分に見られる可溶性糖はまた、発酵して、ガスや、酪酸エステル（ｂｕｔｙｒａｔｅ）、プロピオン酸エステル（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、及び酢酸エステル（ａｃｅｔａｔｅ）などの揮発性脂肪酸になる。飼料の繊維質及び非繊維質両方の成分の消化で生じる揮発性脂肪酸は、最終的に、反芻動物の主なエネルギー源となる。
【０３４２】
個々の脂肪酸が、それらが生産の様々な側面に与える影響を特定するために、反芻動物で試験されている。
【０３４３】
酢酸エステル：構造性炭水化物は分解されると大量の酢酸エステルを生産する。酢酸エステルを直接第一胃に注入すると、乳収量ならびに生産乳脂肪量が改善することがわかった。酢酸エステルは、末梢血中の酸の少なくとも９０％を占めており、乳腺組織によってエネルギー源として直接利用される可能性がある。Ｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂａｌｃｈ．１９６１．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１５：３６１−３６９を参照されたい。
【０３４４】
プロピオン酸エステル：プロピオン酸エステルは乳タンパク質生産を増加させるが、乳収量を減少させることがわかっている。Ｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂａｌｃｈ．１９６１．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１５：３６１−３６９を参照されたい。
【０３４５】
酪酸エステル：酪酸エステルを直接乳牛の第一胃に注入すると、乳収量が変わらずに乳脂肪生産が増加する。Ｈｕｈｔａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７６：１１１４−１１２４を参照されたい。
【０３４６】
ネットワーク分析
ネットワーク及び／またはクラスター分析法は、一実施形態では、ネットワーク（共通または類似の環境パラメーターを共有する２つ以上の試料の総体）内の１つ以上の株の関連性を測定するのに用いられる。一実施形態では、ネットワーク分析には、リンケージ分析、モジュラリティー分析、頑強性測定、介在性測定、関連性測定、推移性測定、中心性測定またはそれらの組合せが含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、リンク・マイニング及び予測、ソーシャル・ネットワーク・セオリー、集団分類、リンクベースのクラスタリング、関係類似性、またはそれらの組合せによるネットワークの予測モデリングが含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、関連性を構築するため、相互情報量、最大情報係数（ＭＩＣ）の計算、または他の変数間ノンパラメトリック方法が含まれる。別の実施形態では、ネットワーク分析には、微分方程式ベースの集団のモデリングが含まれる。さらに別の実施形態では、ネットワーク分析にはＬｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングが含まれる。
【０３４７】
環境パラメーターは、たとえば、ｐＨ、温度、試料中のタンパク質の量など、試料自体のパラメーターであってもよい。あるいは、環境パラメーターは、微生物群集の識別の変化に影響するパラメーターである（すなわち、微生物群集の「識別」が、群集中の微生物株のタイプ及び／または特定の微生物株の数により特徴付けられる場合）か、または、微生物群集の識別の変化により影響されるパラメーターである。たとえば、一実施形態の環境パラメーターは、動物の食物摂取量、または泌乳反芻動物が生産する乳（または乳のタンパク質または脂肪成分）の量である。一実施形態では、環境パラメーターは、同じ試料中に存在する、微生物群集の第２の微生物株の存在、活性、及び／または数度である。いくつかの実施形態では、環境パラメーターは、メタデータ・パラメーターと呼ばれる。
【０３４８】
メタデータ・パラメーターの他の例としては、限定ではないが、試料が採取された宿主の遺伝子情報（たとえば、ＤＮＡ変異の情報）、試料のｐＨ、試料の温度、特定のタンパク質またはｍＲＮＡの発現、周囲環境／エコシステムの栄養条件（たとえば、１つ以上の栄養素のレベル及び／または識別）、病気に対する感受性または耐性、病気の発生または悪化、毒素に対する試料の感受性または耐性、異物化合物（医薬）の有効性、天然物の生合成、またはそれらの組合せが挙げられる。
【実施例】
【０３４９】
実施例Ｉ  ウシの乳脂肪及び乳タンパク質、ならびにエネルギー補正乳（ＥＣＭ）の全体的増加
実施例Ｉの方法は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびにＥＣＭ計算値の増加を目的とする。
【０３５０】
本開示の単離微生物、共同体、及びそれらを含む組成物の利用に基づく本明細書に示す方法は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量の増加を示す。このような増加は、ホルモン剤をさらに追加する必要なく実現された。
【０３５１】
この実施例では、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８（配列番号２８、ＮＲＲＬ  Ｙ−６７２４８として寄託）とＡｓｃｕｓｆ＿１５（配列番号３２、ＮＲＲＬ  Ｙ６７２４９として寄託）の２つの単離微生物を含む微生物共同体を、泌乳中期のホルスタイン牛に５週間にわたって投与した。
【０３５２】
ウシを無作為に８頭ずつ２群に割り当て、片方の群を対照群として微生物共同体を含まない緩衝液を与えた。２つめの群の実験群は、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８（配列番号２８）及びＡｓｃｕｓｆ＿１５（配列番号３２）を含む微生物共同体を１日１回、５週間にわたり投与した。ウシは１頭ずつ囲いに収容し、飼料と水を自由に摂らせた。餌は、高乳収量用の餌であった。ウシに随意に飼料を食べさせて、１日の終わりに飼料を重量測定し、前日残した飼料の重量を測定して廃棄した。重量測定には、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）の秤ＰＳ−２０００を用いた。
【０３５３】
ウシに、第一胃内まで延在するようにカニューレを挿入した。カニューレ挿入後、ウシにはさらに、対照用量または実験用量を投与する前に少なくとも１０日間の回復期間を与えた。
【０３５４】
各投与は、２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水からなり、各投与は生理食塩水に浮遊させたおよそ１０９個の細胞からなった。対照群は２０ｍｌの生理食塩水を１日１回受け、実験群は本明細書で説明する共同体の微生物細胞１０９個をさらに含む２０ｍｌの生理食塩水を受けた。
【０３５５】
全てのウシの第一胃の試料採取を０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目に行ったが、ここで０日目とは微生物の投与前の日であった。なお、実験群及び対照群の投与は、その日に第一胃の試料採取をしてから実施したことに留意されたい。第一胃の毎日の試料採取は、０日目から開始して、Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを、収集した第一胃の液体中に挿入して記録した。第一胃の試料採取には、第一胃の中央、背側、腹側、前側、後側の領域からカニューレを通しての粒子と液体の両方の試料採取が含まれ、５つの試料を全部、１．５ｍｌの停止液（９５％エタノール、５％フェノール）が入った１５ｍｌのコニカルバイアルに集めた。大便試料も試料採取日に毎回収集し、大便は触診用手袋を使って直腸から収集した。ウシは、試料採取時に毎回体重測定した。
【０３５６】
大便試料は２オンスのバイアルに入れ、凍結保存し、分析して中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）の見かけ消化率、デンプンの見かけ消化率、及びタンパク質の見かけ消化率の各値を決定した。第一胃の試料採取は、第一胃の液体部分と粒子部分の両方の試料採取からなり、それぞれ１５ｍｌのコニカルチューブに保存した。細胞を１０％停止液（５％フェノール／９５％エタノール混合物）で固定し、４℃で保存して、氷上Ａｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送った。
【０３５７】
乳収量は朝晩に１回ずつ１日２回、測定した。乳組成（脂肪分％、及びタンパク質％等）を朝晩に１回ずつ１日２回、測定した。乳試料はさらに、Ｔｕｌａｒｅ  Ｄａｉｒｙ  Ｈｅｒｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＤＨＩＡ）（Ｔｕｌａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、近赤外線分光法により、タンパク質、脂肪、固体、乳中尿素窒素（ＭＵＮ）の分析、及び体細胞数（ＳＣＣ）について分析した。個々のウシの飼料摂取量及び第一胃ｐＨは１日１回決定された。
【０３５８】
完全混合飼料（ＴＭＲ）の試料を順応期間の最終日に収集し、引き続き週１回収集した。試料採取はクオータリング法で実施し、ここで試料は真空の密封袋に保存されてＣｕｍｂｅｒｌａｎｄ  Ｖａｌｌｅｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，ＭＤ）に送られ、ＮＩＲ１パッケージで分析された。
【０３５９】
バッファー及び／または微生物バイオ共同体の投与の最終日は３５日目だが、他の測定及び試料採取はすべて、上述のようにして、４６日目まで継続した。
【表１２】
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【０３６０】
表１２は、Ａｓｃｕｓ微生物共同体の毎日の投与が、経産ホルスタイン牛（泌乳中６０〜１２０日）の成績に与える影響を明らかにしている。対照処置と接種処置では明白な違いが観察された。接種群では、ＦＣＭ／ＤＭＩと第一胃ｐＨを除く全てのパラメーターで増加があった。ウシがまだ処置に順応中だった、介入期間の初期の週値も計算に含まれる。
【０３６１】
図４〜図７は、経時的な１日の乳収量、１日の乳粗タンパク質収量、１日の乳脂肪収量、及び１日のエネルギー補正乳収量について、微生物共同体が乳牛に及ぼす著しい効果を示す。微生物が第一胃でコロニー形成するのが観察された初めの順応期間の後、接種処置群の生産特徴が増加し、対照群と分かれた。
【０３６２】
図３Ａは、微生物共同体を投与されたウシが、緩衝液のみを投与されたウシに対し、乳脂肪の平均生産の２０．９％の増加を示したことを示している。図３Ｂは、微生物共同体を投与されたウシが、緩衝液のみを投与されたウシに対し、乳タンパク質の平均生産の２０．７％の増加を示したことを示している。図３Ｃは、微生物共同体を投与されたウシが、エネルギー補正乳の平均生産の１９．４％の増加を示したことを示している。図３Ａ〜図３Ｃで見られる増加は、データポイントを縦断する線が示すように、共同体の投与が終わった後は、あまり明瞭ではなくなった。
【０３６３】
図１４は、微生物共同体が乳中の体細胞数に及ぼす影響をはっきりと特定している。微生物共同体を受ける実験群のウシでは、乳１ｍｌ当たり２０万個超の体細胞をもつ頭数の減少が示された。酪農分野では、ＳＣＣは乳品質の強力な指標となる。乳中に見られる体細胞の大半は白血球、つまり通常は病原体に対する免疫応答により特定の組織／液体に増数して蓄積する免疫細胞である。一般に、ＳＣＣ値が低いほど、乳品質は高くなる。Ｄｏｓｏｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．８６（３）：８２８−８３４。
【０３６４】
実施例ＩＩ  ウシの総乳脂肪及び乳タンパク質の増加
本開示のある特定の実施形態では、本方法は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量の増加を目的とする。
【０３６５】
本開示の単離微生物、共同体、及びそれらを含む組成物の利用に基づく本明細書に示す方法は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量を増加させる可能性がある。このような増加は、ホルモン剤をさらに追加する必要なく実現することができる。
【０３６６】
この実施例では、表１の単離微生物を含む７つの微生物共同体を、泌乳中期のホルスタイン牛に６週間にわたって投与する。それらの共同体は以下のとおりである。
【０３６７】
共同体１−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４、
【０３６８】
共同体２−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿１８０１、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４、
【０３６９】
共同体３−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２６８、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４、
【０３７０】
共同体４−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿２３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４、
【０３７１】
共同体５−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４９、
【０３７２】
共同体６−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿３５３、及び
【０３７３】
共同体７−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２３。
【０３７４】
共同体８−Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、Ａｓｃｕｓｂ＿１８０１、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿１５。
【０３７５】
共同体９−Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、Ａｓｃｕｓｂ＿２６８、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿１５。
【０３７６】
共同体１０−Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、Ａｓｃｕｓｂ＿２３２、Ａｓｃｕｓｆ＿２３、及びＡｓｃｕｓｆ＿１５。
【０３７７】
共同体１１−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、Ａｓｃｕｓｆ＿１５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２４９。
【０３７８】
共同体１２−Ａｓｃｕｓｂ＿７、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、Ａｓｃｕｓｆ＿４５、及びＡｓｃｕｓｆ＿１５。
【０３７９】
共同体１３−Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８、Ａｓｃｕｓｂ＿３２、Ａｓｃｕｓｆ＿１５、及びＡｓｃｕｓｆ＿２３。
【０３８０】
共同体１４−Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８及びＡｓｃｕｓｆ＿１５。
【０３８１】
xxxx
ウシを無作為に８頭ずつ１５群に割り当て、１つの群を対照群として微生物共同体を含まない緩衝液を与える。残りの７群は実験群であり、それぞれ１３の微生物バイオ共同体のうちの１つを１日１回、６週間にわたり投与される。ウシは、相互汚染を避けるために１頭ずつ囲いに収容し、飼料と水を自由に摂らせる。餌は、高乳収量用の餌である。ウシに１日２回給餌し、給餌のたびに飼料の重量を測定し、前日残した飼料の重量を測定して廃棄する。重量測定には、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）の秤ＰＳ−２０００を用いる。
【０３８２】
ウシに、第一胃内まで延在するようにカニューレを挿入する。カニューレ挿入後、ウシにはさらに、対照用量または実験用量を投与する前に少なくとも１０日間の回復期間を与える。
【０３８３】
各投与は、５ｍｌの中性緩衝生理食塩水からなり、各投与は生理食塩水に浮遊させたおよそ１０９個の細胞からなる。対照群は５ｍｌの生理食塩水を１日１回受け、実験群は本明細書で説明する共同体の微生物細胞１０９個をさらに含む５ｍｌの生理食塩水を受ける。
【０３８４】
全てのウシの第一胃の試料採取を０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目に行うが、ここで０日目とは微生物の投与前の日である。なお、実験群及び対照群の投与は、その日に第一胃の試料採取をしてから実施することに留意されたい。第一胃の毎日の試料採取は、０日目から開始して、Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを、収集した第一胃の液体中に挿入して記録する。第一胃の試料採取には、第一胃の中央、背側、腹側、前側、後側の領域からカニューレを通しての粒子と液体の両方の試料採取が含まれ、５つの試料を全部、１．５ｍｌの停止液（９５％エタノール、５％フェノール）が入った１５ｍｌのコニカルバイアルに集める。大便試料も試料採取日に毎回収集し、大便は触診用手袋を使って直腸から収集する。ウシは、試料採取時に毎回体重測定する。
【０３８５】
大便試料は２オンスのバイアルに入れ、凍結保存し、分析してＮＤＦの見かけ消化率、デンプンの見かけ消化率、及びタンパク質の見かけ消化率の各値を決定する。第一胃の試料採取は、第一胃の液体部分と粒子部分の両方の試料採取からなり、それぞれ１５ｍｌのコニカルチューブに保存する。細胞を１０％停止液（５％フェノール／９５％エタノール混合物）で固定し、４℃で保存して、氷上Ａｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送る。
【０３８６】
乳収量は朝晩に１回ずつ１日２回、測定する。乳組成（脂肪分％、及びタンパク質％等）を朝晩に１回ずつ１日２回、測定する。乳試料はさらに、Ｔｕｌａｒｅ  Ｄａｉｒｙ  Ｈｅｒｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＤＨＩＡ）（Ｔｕｌａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、近赤外線分光法により、タンパク質、脂肪、固体、乳中尿素窒素（ＭＵＮ）の分析、及び体細胞数（ＳＣＣ）について分析する。個々のウシの飼料摂取量及び第一胃ｐＨは１日１回決定する。
【０３８７】
完全混合飼料（ＴＭＲ）の試料を順応期間の最終日に収集し、引き続き週１回収集する。試料採取はクオータリング法で実施し、ここで試料は真空の密封袋に保存されてＣｕｍｂｅｒｌａｎｄ  Ｖａｌｌｅｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，ＭＤ）に送られ、ＮＩＲ１パッケージで分析される。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、実験群のウシそれぞれの乳中の脂肪パーセントとタンパク質パーセントは、対照群のウシの乳中の脂肪パーセントとタンパク質パーセントよりも、統計的に有意な増加を示すと期待される。他の実施形態では、増加は統計的に有意であることは期待されないものの、定量可能であることが期待される。
【０３８９】
実施例ＩＩＩ  反芻動物のミクロビオームの変化
本開示のある特定の実施形態では、本方法は、１つ以上の微生物を反芻動物の胃腸管に投与することにより、反芻動物のミクロビオームを調節することを目的とする。
【０３９０】
本開示の単離微生物、共同体、及びそれらを含む組成物の利用に基づく本明細書に示す方法は、反芻動物のミクロビオームを調節する可能性がある。反芻動物の胃腸ミクロビオームの調節は、本開示の望ましい形質の増加をもたらし得る。
【０３９１】
この実施例では、表５の微生物共同体が、ホルスタイン牛に、６週間にわたって投与される。
【０３９２】
ウシを無作為に８頭ずつ３７群に割り当て、１つの群を対照群として微生物共同体を含まない緩衝液を与える。残りの３６群は実験群であり、それぞれ３６の微生物バイオ共同体のうちの１つを１日１回、６週間にわたり投与される。ウシは、相互汚染を避けるために１頭ずつ囲いに収容し、飼料と水を自由に摂らせる。餌は、高乳収量用の餌である。ウシに１日２回給餌し、給餌のたびに飼料の重量を測定し、前日残した飼料の重量を測定して廃棄する。重量測定には、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）の秤ＰＳ−２０００を用いる。
【０３９３】
ウシに、第一胃内まで延在するようにカニューレを挿入する。カニューレ挿入後、ウシにはさらに、対照用量または実験用量を投与する前に少なくとも１０日間の回復期間を与える。
【０３９４】
各投与は、５ｍｌの中性緩衝生理食塩水からなり、各投与は生理食塩水に浮遊させたおよそ１０９個の細胞からなる。対照群は５ｍｌの生理食塩水を１日１回受け、実験群は本明細書で説明する共同体の微生物細胞１０９個をさらに含む５ｍｌの生理食塩水を受ける。
【０３９５】
全てのウシの第一胃の試料採取を０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目に行うが、ここで０日目とは微生物の投与前の日である。なお、実験群及び対照群の投与は、その日に第一胃の試料採取をしてから実施することに留意されたい。第一胃の毎日の試料採取は、０日目から開始して、Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを、収集した第一胃の液体中に挿入して記録する。第一胃の試料採取には、第一胃の中央、背側、腹側、前側、後側の領域からカニューレを通しての粒子と液体の両方の試料採取が含まれ、５つの試料を全部、１．５ｍｌの停止液（９５％エタノール、５％フェノール）が入った１５ｍｌのコニカルバイアルに集める。大便試料も試料採取日に毎回収集し、大便は触診用手袋を使って直腸から収集する。ウシは、試料採取時に毎回体重測定する。
【０３９６】
大便試料は２オンスのバイアルに入れ、凍結保存し、分析してＮＤＦの見かけ消化率、デンプンの見かけ消化率、及びタンパク質の見かけ消化率の各値を決定する。第一胃の試料採取は、第一胃の液体部分と粒子部分の両方の試料採取からなり、それぞれ１５ｍｌのコニカルチューブに保存する。細胞を１０％停止液（５％フェノール／９５％エタノール混合物）で固定し、４℃で保存して、氷上Ａｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送る。
【０３９７】
第一胃の液体及び粒子部分の試料、ならびに大便試料はそれぞれ、ｎＭＤＳ順位付け及びＰＥＲＭＡＮＯＶＡ統計法と組み合わせたＴ−ＲＦＬＰ方法により、ミクロビオームのフィンガープリントについて評価される。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、実験群のウシそれぞれの第一胃及び大便のミクロビオームは、対照群のウシのミクロビオームならびに０日目ミクロビオーム試料よりも有意なミクロビオーム変化を示すことが期待され、該変化は、実験群投与で投与された微生物の割合の有意な増加である。他の実施形態では、増加は統計的に有意であることは期待されないものの、定量可能であることが期待される。
【０３９９】
実施例ＩＶ  微生物の絶対数度に対する生産乳脂肪
乳牛の乳脂肪生産に影響する第一胃微生物群集の構成員を決定する。
【０４００】
第一胃にカニューレ挿入された泌乳中の８頭のホルスタイン牛を個別の繋留房に収容して実験に用いた。ウシに毎日２回給餌し、１日２回搾乳し、常に新鮮な水を自由に飲ませた。１頭のウシ（ウシ４２０１）を、実験前の中絶を原因とする合併症による最初の食餌性低乳脂肪症の後、試験から除いた。
【０４０１】
実験計画及び処置：実験は、２群、１実験期間のクロスオーバーデザインを用いた。実験期間は３８日続き、内訳は共変量／休薬期間が１０日と、データ収集及び試料採取が２８日であった。データ収集期間は、食餌性低乳脂肪症（ＭＦＤ）１０日間と回復１８日間からなった。第１の実験期間の後、第２の期間を開始する前に、全てのウシに１０日間の休薬期間をとらせた。
【０４０２】
食餌性ＭＦＤは、低線維性（２９％ＮＤＦ）、高デンプン分解性（７０％分解可能）の、多価不飽和脂肪酸レベルの高い（ＰＵＦＡ、３．７％）完全混合飼料（ＴＭＲ）により誘発した。回復段階は、デンプン分解性が異なる２種類の餌を含んだ。４頭のウシを高繊維性（３７％ＮＤＦ）、低ＰＵＦＡ（２．６％）、高デンプン分解性（７０％分解可能）の回復食に無作為に割り当てた。残り４頭のウシには高繊維性（３７％ＮＤＦ）、低ＰＵＦＡ（２．６％）であるが低デンプン分解性（３５％）の回復食を与えた。
【０４０３】
１０日間の共変量と１０日間の休薬期間中、ウシに高繊維性、低ＰＵＦＡ、低デンプン分解性の餌を与えた。
【０４０４】
試料及び測定：乳収量、乾物摂取量、及び飼料効率を毎日各動物について、共変量、休薬、及び試料収集の期間を通じて測定した。ＴＭＲ試料を栄養組成について測定した。収集期間中、乳試料を３日おきに収集して分析した。試料は、乳成分濃度（乳脂肪、乳タンパク質、ラクトース、乳尿素窒素、体細胞数、及び固体）及び脂肪酸組成について分析した。
【０４０５】
第一胃試料を、収集期間中、３日おきに収集して微生物群集組成及び活性について分析した。第一胃は、食餌性ＭＦＤの０日目、７日目、及び１０日目に、給餌後０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、及び２２時間と密に試料採取を行った。同様に、第一胃は、試料収集期間の１６日目及び２８日目の給餌後０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、及び２２時間と密に試料採取を行った。第一胃内容物は、ｐＨ、酢酸エステル濃度、酪酸エステル濃度、プロピオン酸エステル濃度、イソ酸濃度、ならびに長鎖及びＣＬＡ異性体濃度について分析した。第一胃試料採取には、第一胃の中央、背側、腹側、前側、後側の領域からカニューレを通しての粒子と液体の両方の試料採取が含まれ、５つの試料を全部、１５ｍｌのコニカルバイアルに集めた。
【０４０６】
第一胃試料の調製及びシーケンシング：収集後、第一胃試料を４，０００ｒｐｍでスイング・バケット遠心分離機により４℃で２０分間遠心分離した。上清をデカントし、各第一胃内容物試料（１〜２ｍｇ）のアリコートを、０．１ｍｍガラスビーズを予め充填した滅菌１．７ｍＬチューブに加えた。第２のアリコートを収集し、細胞計数のため空の滅菌１．７ｍＬチューブに保存した。
【０４０７】
空のチューブ内の第一胃試料を染色し、フローサイトメーターにかけて、各試料中の各微生物タイプの細胞数を定量化した。ガラスビーズと合わせた第一胃飼料は、ビーズ式破砕によりホモジナイズさせて、微生物を溶解した。ＤＮＡ及びＲＮＡを各試料から抽出して精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシーケンシング用に調製した。試料は対合末端化学により配列決定し、ライブラリーの各末端の３００塩基が配列決定された。
【０４０８】
シーケンシングのリードの処理及びデータ分析：シーケンシングのリードをクオリティ・トリミングし処理して、マーカー遺伝子１６Ｓ  ｒＤＮＡ、またはＩＴＳ１及び／もしくはＩＴＳ２に基づき第一胃内に存在する細菌種を特定した。数のデータセットと活性のデータセットをシーケンシングのリードと統合して、第一胃微生物群集内の活性微生物種の絶対細胞数を決定した。生産乳ポンド数などの、経時的なウシの生産特徴を、相互情報量を用いて、実験の間の各試料中の活性微生物の分布と結び付けた。
【０４０９】
数データ、活性データ、ならびに数及び活性が、最終出力に及ぼす影響を決定するためのテストケースを、シーケンシング分析から適切なデータセットを除外することによって、実施した。ＭＩＣではなく線形相関を用いることがターゲット選択に及ぼす影響を評価するために、全微生物の相対数度及び活性微生物の絶対数度と比較しての、生産乳脂肪ポンド数のピアソン係数も計算した。
【０４１０】
結果
本出願で用いられるＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの技術の一構成要素は、相互情報量を利用して、動物の胃腸管に生息する天然の微生物株の、動物の特定の形質に対する重要性を順位付けする。最大情報係数（ＭＩＣ）スコアを全微生物と動物の所望の形質について計算する。１が微生物株と動物の形質との強い関係を表し、０が無関係を表す、０から１のスケールで、関係をスコア付けした。このスコアに基づくカットオフにより、特定の形質の改善について有用な微生物と非有用な微生物とを定める。図９及び図１０は、乳牛の乳脂肪効率との関係を共有する第一胃微生物株のＭＩＣスコア分布を示す。曲線が指数的から線形に移行する点（細菌では約０．４５〜０．５、真菌では約０．３）は、乳脂肪効率に関する有用な微生物と非有用な微生物間のカットオフ点を表す。図１１及び図１２は、酪農効率との関係を共有する第一胃微生物株のＭＩＣスコア分布を示す。曲線が指数的から線形に移行するポイント（細菌では約０．４５〜０．５、真菌では約０．２５）は、有用な微生物と非有用な微生物間のカットオフ点を表す。
【０４１１】
乳脂肪ポンド数と各活性微生物の絶対数度間のＭＩＣを計算した。微生物をＭＩＣスコアにより順位付けし、最も高いＭＩＣスコアを有する微生物を、生産乳ポンド数と最も関係のあるターゲット種に選んだ。本開示の微生物のＭＩＣスコアを表１に記載する。ＭＩＣスコアが高いほど、微生物が、ウシが生産する乳脂肪の重量増加をもたらす能力が高い。
【０４１２】
実施例Ｖ  他のグループの発表済みの研究のＭＩＣスコアの比較分析
Ａｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの技術を用いて、現在入手が可能な微生物飼料添加物の性能を予測した。
【０４１３】
酪農成績が向上すると謳う直接給餌用の微生物製品が一般的に市販されている。こうした製品のなかには、天然の第一胃微生物（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）の微生物株、または天然の第一胃微生物と９７％以上の配列類似性をもつ微生物株を含むものがある。発明者らは、こうした製品で用いられる微生物種を特定し、それらのＭＩＣスコアを乳脂肪効率に対し計算した（図１３）。図１３の曲線から明らかであるように、入手でき検定したすべての株が、有用株と非有用株を定めるのに用いられた上述の閾値を下回った。カットオフ点に最も近い種／株Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉは、ある研究では好ましい効果を示している。
【０４１４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ：ＭＩＣ  ０．２８４０２
ＭＩＣ計算値は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍは乳脂肪効率との関連性が低いと予測しており、当業界はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを接種しても乳脂肪生産は増加しないことを開示しており、少なくとも１つの研究が、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのいくつかの株は乳脂肪低下の原因となる分子を生じることを開示している。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０３（４）：１１４０−１１４６及びＭｏｈａｍｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９５（１）：３２８−３３９を参照されたい。
【０４１５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ：ＭＩＣ  ０．３００４８
ＭＩＣ計算値は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは乳脂肪効率との関連性が低いと予測しており、当業界はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを乳牛／仔牛に投与しても乳収量／乳成分収量の様々な側面に対し効果がなかったことを開示している。Ｈｉｇｇｉｎｂｏｔｈａｍ  ａｎｄ  Ｂａｔｈ．１９９３．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７６（２）：６１５−６２０、Ａｂｕ−Ｔａｒｂｏｕｓｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．５７（１−２）：３９−４９；ＭｃＧｉｌｌｉａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｔａｌｌｉｎｇｓ．１９９８．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．８１（５）：１３５３−１３５７、及びＲａｅｔｈ−Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９０（４）：１８０２−１８０９を参照されたいが、Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．９４（９）：４６１６−４６２２も参照されたい（乳収量及び乳タンパク質収量の増加を開示している）。Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．は、乳及び乳タンパク質の収量の増加を開示してはいるが、この一研究の対照は、増加の原因としてＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの存在を適切に切り離しているようには見えない。先行技術の主論はＢｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．の知見と一致しない。
【０４１６】
Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ：ＭＩＣ  ０．３２５４８
ＭＩＣ計算値は、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉは乳脂肪効率との関連性が低いと予測しており、当業界はＭｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉは乳脂肪効率に関し好ましい効果がないことを示す確固たる証拠を提供しているが、複数の参考文献が、乳脂肪効率について負の効果があることを示している。Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．９２（５）：９７６−９８２；Ｈａｇｇ．２００８．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｏｒｉａ．１−７２；Ｈａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｓ．Ａｆｒｉｃａｎ．Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉ．４０（２）：１０１−１１２；Ｚｅｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．７９（１）：１６−２５、Ａｉｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９４（６）：２８４０−２８４９；Ｍｏｈａｍｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９５（１）：３２８−３３９、及びＣａｃｉｔｅ  ａｎｄ  Ｗｅｉｍｅｒ．２０１６．Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉ．Ｐｏｓｔｅｒ  Ａｂｓｔｒａｃｔ．９４（ｓｕｐ．５）：７８４を参照されたい。
【０４１７】
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉ：ＭＩＣ  ０．４０１６１
ＭＩＣ計算値は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｒｙａｎｔｉｉは乳脂肪効率と高い関連性はないと予測しており、当業界はＰ．ｂｒｙａｎｔｉｉを亜急性酸血症の攻撃中、泌乳中期の乳牛に投与しても、乳収量に特に効果がないことの証拠を提供しているが、この微生物を泌乳初期の乳牛に投与すると、乳脂肪濃度の改善が得られる。それぞれ、Ｃｈｉｑｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９５（１０）：５９８５−５９９５と、Ｃｈｉｑｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８．９１（９）：３５３６−３５４３を参照されたい。
【０４１８】
実施例ＶＩ  微生物組成物の投与後の第一胃微生物組成の変化
この実施例の方法は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびにエネルギー補正乳（ＥＣＭ）計算値の増加を目的とする。
【０４１９】
本開示の単離微生物、共同体、及びそれらを含む組成物の利用に基づく本明細書に示す方法は、泌乳反芻動物が生産する乳脂肪及び乳タンパク質の総量の増加を示す。このような増加は、ホルモン剤をさらに追加する必要なく実現された。
【０４２０】
この実施例では、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８（配列番号２８）とＡｓｃｕｓｆ＿１５（配列番号３２）の２つの単離微生物を含む微生物共同体を、泌乳中期のホルスタイン牛に５週間にわたって投与した。
【０４２１】
ウシを無作為に８頭ずつ２群に割り当て、片方の群を対照群として微生物共同体を含まない緩衝液を与えた。２つめの群は実験群であり、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８（配列番号２８）及びＡｓｃｕｓｆ＿１５（配列番号３２）を含む微生物共同体を１日１回、５週間にわたり投与した。ウシは１頭ずつ囲いに収容し、飼料と水を自由に摂らせた。餌は、高乳収量用の餌であった。ウシに随意に飼料を食べさせて、１日の終わりに飼料を重量測定し、前日残した飼料の重量を測定して廃棄した。重量測定には、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）の秤ＰＳ−２０００を用いた。
【０４２２】
ウシに、第一胃内まで延在するようにカニューレを挿入した。カニューレ挿入後、ウシにはさらに、対照用量または実験用量を投与する前に少なくとも１０日間の回復期間を与えた。
【０４２３】
各投与は、２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水からなり、各投与は生理食塩水に浮遊させたおよそ１０９個の細胞からなった。対照群は２０ｍｌの生理食塩水を１日１回受け、実験群は本明細書で説明する共同体の微生物細胞１０９個をさらに含む２０ｍｌの生理食塩水を受けた。
【０４２４】
全てのウシの第一胃の試料採取を０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目に行ったが、ここで０日目とは微生物の投与前の日であった。なお、実験群及び対照群の投与は、その日に第一胃の試料採取をしてから実施したことに留意されたい。第一胃の毎日の試料採取は、０日目から開始して、Ｈａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを、収集した第一胃の液体中に挿入して記録した。第一胃の試料採取には、第一胃の中央、背側、腹側、前側、後側の領域からカニューレを通しての粒子と液体の両方の試料採取が含まれ、５つの試料を全部、１．５ｍｌの停止液（９５％エタノール、５％フェノール）が入った１５ｍｌのコニカルバイアルに集め、４℃で保存して、氷上Ａｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送った。
【０４２５】
各第一胃試料の一部分を染色し、フローサイトメーターにかけて、各試料中の各微生物タイプの細胞数を定量化した。同じ第一胃試料の別の部分を、ビーズ式破砕によりホモジナイズさせて微生物を溶解した。ＤＮＡ及びＲＮＡを各試料から抽出して精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシーケンシング用に調製した。試料は対合末端化学により配列決定し、ライブラリーの各末端端の３００塩基が配列決定された。シーケンシングのリードを用いて、実験の間対照群及び実験群の各動物の第一胃に存在する各活性微生物メンバーの細胞数を定量化した。
【０４２６】
動物にもよるが、毎日の投与の約３〜５日後に、Ａｓｃｕｓｂ＿３１３８もＡｓｃｕｓｆ＿１５も第一胃内でコロニー形成し、活性であった。このコロニー形成は、実験群で観察されたが、対照群では観察されなかった。第一胃は動的な環境であり、累積的な第一胃微生物集団の化学作用が高度に絡み合っている。人工的に加えたＡｓｃｕｓｂ＿３１３８及びＡｓｃｕｆ＿１５が、群集の全体構造に影響を与える可能性がある。この可能な影響を評価するため、実験の間の全微生物群集を分析して、微生物群集集団におけるより高レベルの分類学的変化を特定した。
【０４２７】
真菌集団では、実験動物でＡｓｃｕｓｆ＿１５の細胞数がより多かったこと以外は、経時的な明確に異なるな傾向は観察されなかった。一方、細菌集団は、より予測可能に変化した。動物全頭での経時的な高レベルの傾向を評価するために、微生物集団の組成パーセントを計算し比較した。表１３を参照されたい。群集の１％超を構成する属だけを分析した。Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓなどの既知の繊維分解性細菌を含む属の組成パーセントは、対照動物と比べて実験動物で増加が見られた。揮発性脂肪酸生産性の属、たとえばクロストリジウム・クラスターＸＩＶａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａも、実験動物においてより高い数度で見られた。最大の変化はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ属で観察された。この属のメンバーは、第一胃内でセロビオース、ペクチン、及び様々な他の構造性炭水化物の消化に関与していることがわかっている。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．はさらに、植物のリグニンを有益な抗酸化剤に変換することにも関与している（Ｓｃｈｏｇｏｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ．９（４）：ｅ８７９４９（１０  ｐ．））。
【０４２８】
第一胃内の経時的な量的変化をより直接的に測定するために、細胞数データをシーケンシング・データと統合して、細胞レベルで集団中の全体の変化を特定した。細胞数の変化倍数は、実験群の各属の細胞の平均数を、対照群の各属の細胞の平均数で除すことにより決定された。表１３を参照されたい。細胞数の分析は、以前の分析では閾値を下回った多くの属を捕え、Ｐｒｏｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ、Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａ、Ｅｕｂａｃｔｅｉｒｕ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏはすべて、実験動物で、平均して少なくとも１０倍高いことが見出された。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ｓｅｎｓｕ＿ｓｔｒｉｃｔｏ、及びＰｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏは、実験動物で、約１．５倍高いことが見出された。
【表１３】
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【表１４】
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【０４２９】
実施例ＶＩＩ  第一胃微生物の揮発性脂肪酸生産及び炭素源利用についての分析
Ａ．揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の生産
株が揮発性脂肪酸を生産する能力を評価するため、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて消費培地での酢酸エステル、酪酸エステル、及びプロピオン酸エステルの濃度を測定した。アッセイでは第一胃の条件を可能なかぎり模倣してＭ２ＧＳＣ培地を用いた。
【０４３０】
純粋培養物は、（嫌気性寒天プレートから）所望の株それぞれの単一のコロニーをＭ２ＧＳＣ培地に接種した。培地ブランク（対照）も調製した。培養物及び培地ブランクを、３７℃で、有意な増殖が見えるようになるまでインキュベートした。光学密度（ＯＤ６００）を各培養物について決定し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングにより株ＩＤを確認した。培養物のアリコートを滅菌濾過により洗浄済みのガラス製１５ｍｌ試料バイアル内に移し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣアッセイはミシガン州立大学で実施した。増殖を示した集積培養物は染色もし、細胞数を数えて、各集積培養物中、個々の株が増殖したことを確認した。株は複数の集積培養物中に出現することが多かったので、株の増殖量が最大の集積培養物（すなわち、その株の細胞数の増加が最大）を表１５で報告する。
【０４３１】
第一胃に存在する代謝物及び微生物の生活様式は極めて複雑なので、第一胃微生物の多くは一種増殖することができない。これらの生物の望ましい特徴についてアッセイするために、第一胃環境の特定の特徴を模倣する様々な条件下で集積培養物を構築した。希釈した第一胃液（１／１００希釈）をＭ２ＧＳＣまたはＭ２培地に接種し、キシロース（４ｇ／Ｌ）、マンニトール（４ｇ／Ｌ）、グリセロール（４ｇ／Ｌ）、キシラン（２ｇ／Ｌ）、セロビオース（２ｇ／Ｌ）、アラビノース（４ｇ／Ｌ）、マンノース（４ｇ／Ｌ）、ラミノース（２ｇ／Ｌ）、マルトース（２ｇ／Ｌ）、マルトース（２ｇ／Ｌ）、及びモラセスなどの様々な炭素源を補給した。第一胃液はレシピから除外されることもあった。アミノ酸、揮発性脂肪酸、及び抗生物質などの添加物も、集積培養物によって異なった。培地ブランク（対照）も調製した。培養物及び培地ブランクを、３７℃で、顕著な増殖が見えるようになるまでインキュベートした。光学密度（ＯＤ６００）を各培養物について決定し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングにより株ＩＤを確認した。培養物のアリコートを滅菌濾過により洗浄済みのガラス製１５ｍｌ試料バイアル内に移し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣアッセイはミシガン州立大学で実施した。増殖を示した集積培養物は染色もし、細胞数を数えて、各集積培養物中、個々の株が増殖したことを確認した。株は複数の集積培養物中に出現することが多かったので、株の増殖量が最大の集積培養物（すなわち、その株の細胞数の増加が最大）を表１５で報告する。
【０４３２】
滅菌濾過した培養試料だけでなく培地ブランクについても、純粋株と集積培養実験の両方について、酢酸エステル、酪酸エステル、及びプロピオン酸エステルの濃度を定量化した。ＨＰＬＣパラメーターは、Ｂｉｏｒａｄ  ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈカラム、６０℃、移動相０．５ｍｌ／分、０．００３２５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、５００ｐｓｉ、３５Ｃ  ＲＩ検出器、ランタイム４５分、及び注入量５μＬであった。純粋培養物と集積培養物の両方の酢酸エステル、酪酸エステル、及びプロピオン酸エステルの濃度を表１５で報告する。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【０４３３】
Ｂ．可溶性炭素源アッセイ
株が様々な炭素源を分解する能力を評価するために、光学密度（ＯＤ６００）を用いて、複数の炭素源での経時的な株の増殖を測定した。
【０４３４】
純粋単離物は、（嫌気性寒天プレートから）所望の株それぞれの単一のコロニーをＭ２ＧＳＣ培地に接種した。培地ブランク（対照）も調製した。株を嫌気性炭素源アッセイに接種し、該アッセイは２ｍＬ滅菌９６ウェルプレートに設定し、各ウェルにＲＡＭＭ塩、ビタミン、ミネラル、システイン、及び１つの炭素源が含まれた。炭素源として、グルコース、キシラン、乳酸、キシロース、マンノース、グリセロール、ペクチン、モラセス、及びセロビオースが含まれた。細胞は、各ウェルが０．０１のＯＤ６００から開始するように接種した。光学密度は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４ハイブリッド・プレート・リーダーで、６００ｎｍで読み取った。全ウェルが静止相になってから、株のＩＤをＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングで確認した。
【０４３５】
上述の揮発性脂肪酸アッセイと同様に、集積培養物を炭素源分解アッセイでも用いた。希釈した第一胃液（１／１００希釈）をＭ２ＧＳＣまたはＭ２培地に接種し、キシロース（４ｇ／Ｌ）、マンニトール（４ｇ／Ｌ）、グリセロール（４ｇ／Ｌ）、キシラン（２ｇ／Ｌ）、セロビオース（２ｇ／Ｌ）、アラビノース（４ｇ／Ｌ）、マンノース（４ｇ／Ｌ）、ラミノース（２ｇ／Ｌ）、マルトース（２ｇ／Ｌ）、マルトース（２ｇ／Ｌ）、及びモラセスなどの様々な炭素源を補給した。第一胃液はレシピから除外されることもあった。アミノ酸、揮発性脂肪酸、及び抗生物質などの添加物も、集積培養物によって異なった。培地ブランク（対照）も調製した。培養物及び培地ブランクを、３７℃で、顕著な増殖が見えるようになるまでインキュベートした。光学密度（ＯＤ６００）を各培養物について決定し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングにより株ＩＤを確認した。増殖を示した集積培養物は染色もし、細胞数を数えて、各集積培養物中、個々の株が増殖したことを確認した。
【０４３６】
Ｃ．不溶性炭素源アッセイ
株が様々な不溶性炭素源を分解する能力を評価するために、株の分解能力を目視により質的に判定した。
【０４３７】
純粋培養物は、（嫌気性寒天プレートから）所望の株それぞれの単一のコロニーを、セルロースペーパー、デンプン、または草を単一炭素源として含むＬｏｗｅ半合成培地を収容する嫌気性Ｈｕｎｇａｔｅチューブに接種した（Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８５．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３１：２２２５−２２２９）。１／１００希釈の第一胃液を用いた集積培養物も、同じ培地条件で設定した。培養物を、不溶性炭素源の分解について目視でチェックした（図１４を参照されたい）。株のＩＤをＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングで確認した。増殖を示した集積培養物は染色もし、細胞数を数えて、各集積培養物中、個々の株が増殖したことを確認した。
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１７】
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【表１８】
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【０４３８】
培地は全て嫌気性水（ＤＩ  Ｈ２Ｏを１５分沸騰させた後、Ｎ２を送りながらウォーターバスで室温まで冷却）を用いて調製した。培地は全て２Ｍ  ＨＣｌでｐＨ６．８に調節した。次に、培地１０ｍＬを１５ｍＬ  ｈｕｎｇａｔｅチューブに分注してから、チューブに８０％Ｎ２、２０％ＣＯ２を３分間送った。
【表１９】
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【０４３９】
（オートクレーブ）滅菌後、２ｍＬの２５０Ｘ改変Ｗｏｌｆｅビタミン・ミックス、１０ｍＬの５０Ｘ改変Ｗｏｌｆｅミネラル・ミックス、５ｍＬの１００ｍＭシステインを加えた。
【０４４０】
実施例ＶＩＩＩ  生産乳ポンド数と関係のある微生物株の最大情報係数（ＭＩＣ）スコアの決定
実験計画及び材料及び方法
目的：乳牛の乳脂肪生産に影響する第一胃微生物群集の構成員の決定
【０４４１】
動物：第一胃にカニューレ挿入された泌乳中の８頭のホルスタイン牛を個別の繋留房に収容して実験に用いた。ウシに毎日２回給餌し、１日２回搾乳し、常に新鮮な水を自由に飲ませた。１頭のウシ（ウシ１）を、実験前の中絶を原因とする合併症による最初の食餌性低乳脂肪症の後、試験から除いた。
【０４４２】
実験計画及び処置：実験は、２群、１実験期間のクロスオーバーデザインを用いた。実験期間は３８日続き、内訳は共変量／休薬期間が１０日と、データ収集及び試料採取が２８日であった。データ収集期間は、食餌性低乳脂肪症（ＭＦＤ）１０日間と回復１８日間からなった。第１の実験期間の後、第２の期間を開始する前に、全てのウシに１０日間の休薬期間をとらせた。
【０４４３】
食餌性ＭＦＤは、低線維性（２９％ＮＤＦ）、高デンプン分解性（７０％分解可能）の、多価不飽和脂肪酸レベルの高い（ＰＵＦＡ、３．７％）完全混合飼料（ＴＭＲ）により誘発した。回復段階は、デンプン分解性が異なる２種類の餌を含んだ。４頭のウシを高繊維性（３７％ＮＤＦ）、低ＰＵＦＡ（２．６％）、高デンプン分解性（７０％分解可能）の回復食に無作為に割り当てた。残り４頭のウシには高繊維性（３７％ＮＤＦ）、低ＰＵＦＡ（２．６％）であるが低デンプン分解性（３５％）の回復食を与えた。
【０４４４】
１０日間の共変量と１０日間の休薬期間中、ウシに高繊維性、低ＰＵＦＡ、低デンプン分解性の餌を与えた。
【０４４５】
試料及び測定：乳収量、乾物摂取量、及び飼料効率を毎日各動物について、共変量、休薬、及び試料収集の期間を通じて測定した。ＴＭＲ試料を栄養組成について測定した。収集期間中、乳試料を３日おきに収集して分析した。試料は、乳成分濃度（乳脂肪、乳タンパク質、ラクトース、乳尿素窒素、体細胞数、及び固体）及び脂肪酸組成について分析した。
【０４４６】
第一胃試料を、収集期間中、３日おきに収集して微生物群集組成及び活性について分析した。第一胃は、食餌性ＭＦＤの０日目、７日目、及び１０日目に、給餌後０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、及び２２時間と密に試料採取を行った。同様に、第一胃は、回復期間の１６日目及び２８日目の給餌後０時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、及び２２時間と密に試料採取を行った。第一胃内容物は、ｐＨ、酢酸エステル濃度、酪酸エステル濃度、プロピオン酸エステル濃度、イソ酸濃度、ならびに長鎖及びＣＬＡ異性体濃度について分析された。
【０４４７】
第一胃試料の調製及びシーケンシング：収集後、第一胃試料を４，０００ｒｐｍでスイング・バケット遠心分離機により４℃で２０分間遠心分離した。上清をデカントし、各第一胃内容物試料（１〜２ｍｇ）のアリコートを、０．１ｍｍガラスビーズを予め充填した滅菌１．７ｍＬチューブに加えた。第２のアリコートを収集し、細胞計数のため空の滅菌１．７ｍＬチューブに保存した。
【０４４８】
ガラスビーズと一緒の第一胃試料（第１アリコート）をビーズ式破砕によりホモジナイズさせて微生物を溶解した。ＤＮＡ及びＲＮＡを各試料から抽出して精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシーケンシング用に調製した。試料は対合末端化学より配列決定し、ライブラリーの各末端の３００塩基が配列決定された。空のチューブに入れた第一胃試料（第２アリコート）を染色しフローサイトメーターにかけて、各試料中の各微生物タイプの細胞数を定量化した。
【０４４９】
シーケンシングのリードの処理及びデータ分析：シーケンシングのリードをクオリティ・トリミングし処理して、マーカー遺伝子に基づき第一胃内に存在する細菌種を特定した。数のデータセットと活性のデータセットをシーケンシングのリードと統合して、第一胃微生物群集内の活性微生物種の絶対細胞数を決定した。生産乳ポンド数などの、経時的なウシの生産特徴を、相互情報量を用いて、実験の間の各試料中の活性微生物の分布と結び付けた。生産乳脂肪ポンド数と各活性微生物の絶対細胞数間の最大情報係数（ＭＩＣ）スコアを計算した。微生物をＭＩＣスコアにより順位付けし、最も高いＭＩＣスコアを有する微生物を、生産乳ポンド数と最も関係のあるターゲット種に選んだ。
【０４５０】
数データ、活性データ、ならびに数及び活性が、最終出力に及ぼす影響を決定するためのテストケースを、シーケンシング分析から適切なデータセットを除外することによって、実施した。ＭＩＣではなく線形相関を用いることがターゲット選択に及ぼす影響を評価するために、全微生物の相対数度及び活性微生物の絶対細胞数と比較しての、生産乳脂肪ポンド数のピアソン係数も計算した。
【０４５１】
結果と考察
相対数度と絶対細胞数
上位１５ターゲット種を、細胞数データを含むデータセットについて（絶対細胞数、表２１）、また、ＭＩＣスコアに基づいて、細胞数データを含まないデータセット（相対数度、表２０）について特定した。細胞数データが最終的なターゲット選択に及ぼす影響を切り離すために、活性データはこの分析では用いなかった。結局、２つのデータセット間で上位８ターゲットが同じであった。残りの７株のうち、５株が異なる順位で両リストに登場した。これら５株は、順位は異なっていたが、各株のＭＩＣスコア計算値は、２つのリストで同一であった。絶対細胞数リストには登場するが、相対数度リストには登場しない２株、すなわちａｓｃｕｓ＿１１１とａｓｃｕｓ＿２８８は、それぞれ相対数度リストでは９１位と１６位であった。相対数度リストには登場するが、絶対細胞数リストには登場しない２株、すなわちａｓｃｕｓ＿１０２とａｓｃｕｓ＿２５２は、それぞれ絶対細胞数リストでは５０位と１９位であった。これらの４株は、各リストで異なるＭＩＣスコアを有しており、順位の変動と、それに伴うリスト内の他の株への影響を説明するものである。
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２１−１】
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【表２１−２】
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【０４５２】
細胞数データの統合は、各株に割り当てたＭＩＣスコアに必ずしも影響したわけではない。このことは、微生物集団が３８日間の実験の間中第一胃内で日々変化したものの、それは常に１０７〜１０８細胞／ｍＬの範囲内であったためかもしれない。集団数のもっと大きな変化は最終ＭＩＣスコアにもっと強力に影響したであろうことは、疑う余地がない。
【０４５３】
不活性種と活性種
活性データに基づき株をフィルタリングする影響を評価するために、ターゲット種を、活性データとともに（表２２）、及び活性データ無しで（表２０）相対数度を用いたデータセット、ならびに活性データとともに（表２３）、及び活性データ無して（表２１）絶対細胞数を用いたデータセットから、特定した。
【０４５４】
相対数度の場合、ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、ａｓｃｕｓ＿３４１、及びａｓｃｕｓ＿２５２が、活性データを適用する前はターゲット株とみなされていた。これらの８株（当初の上位１５ターゲットの５３％）は、活性データ統合後は、上位１５位に入らなかった。同様の傾向が絶対細胞数の場合にも観察された。ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、及びａｓｃｕｓ＿３４１（当初の上位１５ターゲットの４６％）は、活性データ統合後は、上位１５位に入らなかった。
【０４５５】
ターゲットの順位及び選択に対し、活性データセットは、細胞数データセットよりも相当大きい影響を与えた。これらのデータセットを統合すると、試料が不活性と判明した場合、基本的に「０」に変更されて、分析の一部とはみなされなくなる。このため、統合後は試料内のポイント分布が相当変わるかまたは歪曲され、したがって最終ＭＩＣスコアに大きく影響し、ひいてはターゲット微生物の順位にも影響することになる。
【表２２−１】
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【表２２−２】
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【表２３−１】
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【表２３−２】
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【０４５６】
相対数度及び不活性と、絶対細胞数及び活性
最終的に、本明細書で定める方法は、細胞数データと活性データの両方を使って、関係のあるメタデータ特徴と強い関連のある微生物を特定する。両方法により選択した上位１５ターゲット（表２３、表２０）のうち、両リストに見られるのは７株だけである。８株（５３％）は、絶対細胞数リストと活性リストでそれぞれ特有であった。両リストの上位３ターゲットは、株も順位も一致していた。ところが、３株のうち２株は両リストで同じＭＩＣスコアをもたず、順位が変わるほどではないが、活性データセットの統合が影響したことを示唆している。
【０４５７】
線形相関法対ノンパラメトリック法
生産乳脂肪ポンド数と各試料中の活性微生物の絶対細胞数間のピアソン係数とＭＩＣスコアを計算した（表２４）。乳脂肪生産と最も関係のあるターゲット株を選択するために、株をＭＩＣ（表２４ａ）またはピアソン係数（表２４ｂ）により順位付けした。各例のＭＩＣスコアとピアソン係数の両方を報告する。６株が両リストに記載されており、９つ（６０％）の特有株がＭＩＣ法により特定されたことを意味している。両リストの株の順位は一致せず、各方法により特定された上位３ターゲット株もそれぞれ特有であった。
【０４５８】
ピアソン係数と同じく、ＭＩＣスコアも０から１の範囲で報告し、１は２つの変数間に非常に強い関係があることを示唆する。ここで、上位１５ターゲットは、０．９７〜０．７４の範囲のＭＩＣスコアを示した。しかし、相関テストケースのピアソン係数は、０．５３〜０．４５の範囲であり、相互情報量テストケースよりもかなり低かった。この違いは、各分析法固有の差によるものであり得る。相関が直線を中心としたポイントの分散を測定する線形の評価であるのに対し、相互情報量は確率分布を用い、２つの分布の類似性を測定する。実験の間、生産乳脂肪ポンド数は非線形的に変化した（図１８）。この特定の関数については、相関よりも相互情報量によって表し概算するほうがよいかもしれない。このことを調査するために、相関と相互情報量により特定した第１位のターゲット株、それぞれＡｓｃｕｓ＿７１３（図１９）とＡｓｃｕｓ＿７（図２０）をプロットして、株と乳脂肪の関係を各方法がいかに良好に予測したかを決定した。２つの変数が強い相関を示す場合、互いに対しプロットすると、点がまったくまたはほとんど分散しない、直線で表される。図１９では、点が広く散っていることからわかるように、Ａｓｃｕｓ＿７１３は乳脂肪との相関性が弱い。前に述べたが、相互情報量は、２つの点の分布がいかに類似しているかを測定する。Ａｓｃｕｓ＿７を乳脂肪とプロットすると（図２０）、２つのポイント分布が非常に似ているのが明白である。
【０４５９】
本方法全般と従来の方法
微生物群集を分析する従来の方法は、活性情報は組み込まず、相対数度データの使用に依存するものであり、結局は微生物種とメタデータの単純な相関をとるだけである（たとえば、米国特許第９，２０６，６８０号を参照されたい。この内容をあらゆる目的で参照により本明細書に援用する）。本明細書では、各データセットの組込みが、最終的なターゲットリストにいかに増分的に影響するかを示した。本明細書で説明する方法を全て用いると、従来の方法と比べて全く異なるターゲットセットが選択された（表２４ａ及び表２４ｃ）。従来の方法で選択された第１位ターゲット株Ａｓｃｕｓ＿３０３８を乳脂肪に対してプロットして相関の強さを視覚化した（図２１）。前述の例と同じく、Ａｓｃｕｓ＿３０３８も乳脂肪との相関性が弱いことが示された。
表２４：相互情報量または相関による上位１５ターゲット株
【表２４Ａ−１】
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【表２４Ａ−２】
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【表２４Ｂ−１】
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【表２４Ｂ−２】
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【表２４Ｂ−３】
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【表２４Ｃ−１】
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【表２４Ｃ−２】
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【０４６０】
番号付けされた本開示の実施形態
本開示が意図する主題は、以下の番号付けされた実施形態に示される。
【０４６１】
１．反芻動物の乳生産の増加または乳成分特徴の改善ができる保存可能な反芻動物用サプリメントであって、
ａ）配列番号３２と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団、及び
ｂ）反芻動物への投与に適した保存可能な担体を含み、
前記ａ）の精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団は、前記サプリメントを投与されていない反芻動物と比べて、前記サプリメントを投与された反芻動物の乳生産を増加させるかまたは乳成分特徴を改善するのに有効な量で前記サプリメント中に存在する、前記保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６２】
２．前記精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団は、配列番号３２と少なくとも約９９％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６３】
３．前記精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団は、配列番号３２を含むＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６４】
４．前記精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団は、ＮＲＲＬ  Ｙ−６７２４９で寄託された真菌を含む、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６５】
５．さらに、
ｉ．配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製された細菌集団、及び／または
ｉｉ．配列番号３１、３３〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む真菌の精製集団を含む、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６６】
６．前記精製された細菌集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６７】
７．前記精製された真菌集団は、配列番号３１、３３〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６８】
８．前記精製された細菌集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４６９】
９．前記精製された真菌集団は、配列番号３１、３３〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択されるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７０】
１０．前記精製された細菌集団は、配列番号２８と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７１】
１１．前記精製された細菌集団は、配列番号２８と少なくとも約９９％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７２】
１２．前記精製された細菌集団は、配列番号２８を含む１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７３】
１３．前記精製された細菌集団は、ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２４８で寄託された細菌を含む、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７４】
１４．精製された細菌集団ｉ）と精製された真菌集団ｉｉ）の両方が前記サプリメント中に存在している、請求項５に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７５】
１５．ウシに投与されるように製剤されている、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７６】
１６．周囲条件下で少なくとも１週間は安定している、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７７】
１７．封入物、錠剤、カプセル、丸薬、飼料添加物、フード成分、食品添加物、食品調製物、食品サプリメント、消耗溶液、消耗スプレー添加物、消耗固体、消耗ゲル、注射、坐剤、ボーラス、水薬、またはそれらの組合せとして製剤される、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７８】
１８．前記精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団は、前記反芻動物用サプリメント中に、少なくとも１０２細胞の濃度で存在する、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４７９】
１９．前記サプリメントを投与された前記反芻動物は、実測乳収量の増加につながる乳生産の増加を示す、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４８０】
２０．前記サプリメントを投与された前記反芻動物は、実測エネルギー補正乳の増加につながる乳生産の増加及び乳成分特徴の改善を示す、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４８１】
２１．前記サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪の増加、乳タンパク質の増加、乳中炭水化物の増加、乳中ビタミンの増加、乳中ミネラルの増加、またはそれらの組合せからなる群より選択される乳成分特徴の改善を示す、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４８２】
２２．前記サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも１％の増加を示す、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４８３】
２３．前記サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも１０％の増加を示す、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４８４】
２４．前記サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも２０％の増加を示す、請求項１に記載の保存可能な反芻動物用サプリメント。
【０４８５】
２５．反芻動物への投与に適した、反芻動物の乳生産の増加または乳成分特徴の改善ができる組成物であって、
ａ）ＮＲＲＬ  Ｙ−６７２４９で寄託された精製された真菌集団、及び
ｂ）反芻動物への投与に適した担体を含み、
前記ａ）の精製された真菌集団は、前記組成物を投与されていない反芻動物と比べて、前記組成物を投与された反芻動物の乳生産を増加させるかまたは乳成分特徴を改善するのに有効な量で前記組成物中に存在している、前記組成物。
【０４８６】
２６．反芻動物への投与に適した、反芻動物の乳生産の増加または乳成分特徴の改善ができる組成物であって、
ａ）ＮＲＲＬ  Ｙ−６７２４９で寄託された精製された真菌集団、
ｂ）ＮＲＲＬ  Ｂ−６７２４８で寄託された精製された細菌集団、及び
ｃ）反芻動物への投与に適した担体を含み、
前記ａ）の精製された真菌集団及び前記ｂ）の精製された細菌集団は、前記組成物を投与されていない反芻動物と比べて、前記組成物を投与された反芻動物の乳生産を増加させるかまたは乳成分特徴を改善するのに有効な量で前記組成物中に存在している、前記組成物。
【０４８７】
上述の組成物は、第一胃内に自然に存在している細菌または真菌のどの個体ももっていない、著しく異なる特徴及び／または特性を有する。上述の組成物がもつ著しく異なる特徴及び／または特性は、構造的、機能的、またはその両方であり得る。たとえば、組成物は、本明細書で教示するように、反芻動物に投与されると乳生産の増加または乳成分特徴の改善が可能という、著しく異なる機能的特性をもつ。さらに、組成物は、保存可能であるという、著しく異なる機能的特性をもつ。
【０４８８】
番号付けされた本開示の実施形態
本開示が意図する主題は、以下の番号付けされた実施形態に示される。
【０４８９】
１．反芻動物の第一胃ミクロビオームを調節することができる組成物であって、
ａ）配列番号３２と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団、及び
ｂ）反芻動物への投与に適した担体を含み、
前記ａ）の精製されたＰｉｃｈｉａ真菌集団は、前記組成物を投与された反芻動物の第一胃のミクロビオームを変化させるのに有効な量で、前記組成物中に存在している、前記組成物。
【０４９０】
２．前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物集団は、前記組成物の投与後に数度が増加する、請求項１に記載の組成物。
【０４９１】
３．前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物集団は、前記組成物の投与後に数度が減少する、請求項１に記載の組成物。
【０４９２】
４．前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物の第１の集団は、前記組成物の投与後に数度が増加し、前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物の第２の集団は、前記組成物の投与後に数度が減少する、請求項１に記載の組成物。
【０４９３】
５．前記組成物を投与された前記反芻動物の第一胃ミクロビオームは、繊維分解性の属、揮発性脂肪酸生産性の属、構造性炭水化物消化性の属、またはそれらの組合せの存在の増加を含むように変化する、請求項１に記載の組成物。
【０４９４】
６．前記組成物を投与された前記反芻動物の第一胃ミクロビオームは、本開示、ならびに実施例６、及び表１３または表１４に示されるデータにしたがい変化する、請求項１に記載の組成物。
【０４９５】
７．反芻動物の第一胃ミクロビオームを調節する方法であって、反芻動物に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物は、
ａ）
ｉ．配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む精製された細菌集団、及び／または
ｉｉ．配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む真菌の精製集団を含む、
精製された微生物集団、及び
ｂ）反芻動物への投与に適した担体を含み、
前記有効量の前記組成物を投与された前記反芻動物は、第一胃のミクロビオーム内の変化を示す、前記方法。
【０４９６】
８．前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物集団は、前記組成物の投与後に数度が増加する、請求項７に記載の方法。
【０４９７】
９．前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物集団は、前記組成物の投与後に数度が減少する、請求項７に記載の方法。
【０４９８】
１０．前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物の第１の集団は、前記組成物の投与後に数度が増加し、前記組成物の投与前に前記反芻動物の第一胃に存在していた微生物の第２の集団は、前記組成物の投与後に数度が減少する、請求項７に記載の方法。
【０４９９】
１１．前記組成物を投与された前記反芻動物の第一胃ミクロビオームは、繊維分解性の属、揮発性脂肪酸生産性の属、構造性炭水化物消化性の属、またはそれらの組合せの存在の増加を含むように変化する、請求項７に記載の方法。
【０５００】
１２．前記組成物を投与された前記反芻動物の第一胃ミクロビオームは、本開示、ならびに実施例６、及び表１３または表１４に示されるデータにしたがい変化する、請求項７に記載の方法。
【０５０１】
上述の組成物は、第一胃内に自然に存在している細菌または真菌のどの個体ももっていない、著しく異なる特徴及び／または特性を有する。上述の組成物がもつ著しく異なる特徴及び／または特性は、構造的、機能的、またはその両方であり得る。たとえば、組成物は、本明細書で教示するように、反芻動物に投与されると第一胃ミクロビオームの調節が可能という、著しく異なる機能的特性をもつ。
【０５０２】
番号付けされた本開示の実施形態
本開示が意図する主題は、以下の番号付けされた実施形態に示される。
【０５０３】
１．反芻動物の乳生産を増加させるかまたは乳成分特徴を改善する方法であって、
ａ）有効量の保存可能な反芻動物用サプリメントを反芻動物に投与することを含み、前記サプリメントは、
ｉ．配列番号１〜６０及び２０４５〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌及び／またはＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む精製された微生物集団であって、前記細菌は少なくとも約０．４のＭＩＣスコアを有し、前記真菌は少なくとも約０．２のＭＩＣスコアを有する、前記微生物集団、及び
ｉｉ．反芻動物への投与に適した保存可能な担体を含み、
前記細菌または真菌の少なくとも一方は、炭素源を酢酸エステル、酪酸エステル、プロピオン酸エステル、またはそれらの組合せからなる群より選択される揮発性脂肪酸に変換することができ、
前記細菌または真菌の少なくとも一方は、可溶性または不溶性炭素源を分解することができ、
前記有効量の前記保存可能な反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、前記反芻動物用サプリメントを投与されていない反芻動物と比べて、乳生産の増加または乳成分特徴の改善を示す、前記方法。
【０５０４】
２．前記反芻動物はウシである、請求項１に記載の方法。
【０５０５】
３．前記反芻動物用サプリメントは、周囲条件下で少なくとも１週間は安定している、請求項１に記載の方法。
【０５０６】
４．前記反芻動物用サプリメントは、封入物、錠剤、カプセル、丸薬、飼料添加物、食品成分、食品添加物、食品調製物、食品サプリメント、消耗溶液、消耗スプレー添加物、消耗固体、消耗ゲル、注射、坐剤、ボーラス、水薬、またはそれらの組合せとして製剤される、請求項１に記載の方法。
【０５０７】
５．前記反芻動物用サプリメントはポリマーまたは炭水化物に封入されている、請求項１に記載の方法。
【０５０８】
６．投与することには、前記反芻動物用サプリメントを反芻動物に給餌することが含まれる、請求項１に記載の方法。
【０５０９】
７．投与することには、前記反芻動物用サプリメントを反芻動物に注入することが含まれる、請求項１に記載の方法。
【０５１０】
８．前記精製された微生物集団は、前記反芻動物用サプリメント中に少なくとも１０２細胞の濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【０５１１】
９．前記精製された微生物集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１２】
１０．前記精製された微生物集団は、配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１３】
１１．前記精製された微生物集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１４】
１２．前記精製された微生物集団は、配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９９％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１５】
１３．前記精製された微生物集団は、配列番号１〜３０及び２０４５〜２１０３からなる群より選択される１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１６】
１４．前記精製された微生物集団は、配列番号３１〜６０及び２１０４〜２１０７からなる群より選択されるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１７】
１５．前記精製された微生物集団は、配列番号１〜６０及び２０４５〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌及びＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１８】
１６．前記精製された微生物集団は、配列番号２８と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５１９】
１７．前記精製された微生物集団は、配列番号３２と少なくとも約９７％同一であるＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５２０】
１８．前記精製された微生物集団は、ＮＲＲＬ  Ｙ−６７２４９で寄託されたＰｉｃｈｉａ真菌を含む、請求項１に記載の方法。
【０５２１】
１９．前記精製された微生物集団は、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｉｍｏｎａｓ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｔｅｎｉｓｐｈａｅｒａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｒａｌｓｏｎｉａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｓａｌｔｅｌｌａ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ、Ａｍｉｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ、Ｓｈａｒｐｅａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｓｕｇｉｙａｍａｅｌｌａ、Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ、Ｓｉｎｉｍａｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｅｍｅｌｌａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ＸｌＶａ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ＸＩａ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ＿ｉｎｃｅｒｔａｅ＿ｓｅｄｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａ＿ｉｎｃｅｒｔａｅ＿ｓｅｄｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ＿ｓｅｎｓｕ＿ｓｔｒｉｃｔｏ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ、Ｈｏｗａｒｄｅｌｌａ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ、Ｓｈａｒｐｅａ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ、Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｌｌａｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓから選択される群のメンバーである生物のみを含む、請求項１に記載の方法。
【０５２２】
２０．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、実測乳収量の増加につながる乳生産の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２３】
２１．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、実測エネルギー補正乳の増加につながる乳生産の増加及び乳成分特徴の改善を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２４】
２２．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪の増加、乳タンパク質の増加、乳中炭水化物の増加、乳中ビタミンの増加、乳中ミネラルの増加、またはそれらの組合せからなる群より選択される乳成分特徴の改善を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２５】
２３．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも１％の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２６】
２４．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも１０％の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２７】
２５．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、乳脂肪、乳タンパク質、エネルギー補正乳、またはそれらの組合せの平均生産の少なくとも２０％の増加を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２８】
２６．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、さらに、改善された飼料利用効率、改善された消化率、ポリサッカライド及びリグニン分解率の増加、第一胃内の脂肪酸濃度の上昇、第一胃内のｐＨバランス、メタン放出量の減少、糞生産の減少、改善された乾物摂取量、改善された窒素利用効率、またはそれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１つの改善された表現型形質を示す、請求項１に記載の方法。
【０５２９】
２７．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示す、請求項１に記載の方法。
【０５３０】
２８．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示し、
前記反芻動物用サプリメントの投与前に第一胃に存在していた微生物集団は、前記反芻動物用サプリメントの投与後に数度が増加する、請求項１に記載の方法。
【０５３１】
２９．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示し、
前記反芻動物用サプリメントの投与前に第一胃に存在していた微生物集団は、前記反芻動物用サプリメントの投与後に数度が減少する、請求項１に記載の方法。
【０５３２】
３０．前記有効量の反芻動物用サプリメントを投与された前記反芻動物は、さらに、第一胃のミクロビオームの変化を示し、
前記反芻動物用サプリメントの投与前に第一胃に存在していた微生物の第１の集団は、前記反芻動物用サプリメントの投与後に数度が増加し、
前記反芻動物用サプリメントの投与前に第一胃に存在していた微生物の第２の集団は、前記反芻動物用サプリメントの投与後に数度が減少する、請求項１に記載の方法。
【０５３３】
記載した方法で用いられる上述の組成物は、第一胃内に自然に存在している細菌または真菌のどの個体ももっていない、著しく異なる特徴及び／または特性を有する。記載した方法で用いられる上述の組成物がもつ著しく異なる特徴及び／または特性は、構造的、機能的、またはその両方であり得る。たとえば、記載した方法で用いられる組成物は、本明細書で教示するように、反芻動物に投与されると乳生産の増加または乳成分特徴の改善が可能という、著しく異なる機能的特性をもつ。さらに、記載した方法で用いられる組成物は、保存可能という、著しく異なる機能的特性をもつ。
【０５３４】
諸態様で、上述の微生物種、つまり、配列番号１〜６０及び２０４５〜２１０７からなる群より選択される核酸配列と少なくとも約９７％同一である１６Ｓ核酸配列を有する細菌及び／またはＩＴＳ核酸配列を有する真菌を含む精製された微生物集団は、本開示でそのメンバーが様々な物理的及び機能的属性により特徴づけられる微生物クラスに属することを説明しているように、マーカッシュ群のメンバーであり、そのような属性には、ａ）炭素源を酢酸エステル、酪酸エステル、プロピオン酸エステル、またはそれらの組合せなどの揮発性脂肪酸に変換できること、ｂ）可溶性または不溶性炭素源を分解できること、ｃ）該微生物を投与された反芻動物に、乳生産の増加または乳成分特徴の改善を与えられること、ｄ）該微生物を投与された反芻動物の第一胃のミクロビオームを調節できること、ｅ）保存可能な組成物へと製剤可能であること、及び／またはｆ）細菌ならば少なくとも約０．４のＭＩＣスコアをもち、真菌ならば少なくとも約０．２のＭＩＣスコアをもつこと、のどれでも含むことができる。したがって、マーカッシュ群のメンバーは、少なくとも１つの共通する特性をもち、それが、謳われる関係においてそれらの機能の要因である。
【表２５】
2019506856.tif 000073
【０５３５】
参照による援用
本明細書で引用した参照文献、論文、発行物、特許、特許公報、及び特許出願は全て、あらゆる目的でそれらの全体を参照により本明細書に援用する。
【０５３６】
しかし、本明細書で引用したいかなる参照文献、論文、発行物、特許、特許公報、及び特許出願についての言及も、それらが有効な先行文献の一部であるとか、世界のどこかの国での公な一般知識であることを認めたり、またはそうであると何らかの示唆をしたりするものではないし、そのように解釈すべきでもない。
【図１】
2019506856.tif 000074
【図２】
2019506856.tif 000075
【図３】
2019506856.tif 000076
【図４】
2019506856.tif 000077
【図５】
2019506856.tif 000078
【図６】
2019506856.tif 000079
【図７】
2019506856.tif 000080
【図８】
2019506856.tif 000081
【図９】
2019506856.tif 000082
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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