(57)【要約】  本開示は、概して、環化活性を有する組換え酵素の生成、ならびに環状ペプチドならびに直鎖状ペプチド複合体を生成するための酵素の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物細胞または真核生物細胞において、環化活性を有する組換えアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）液胞プロセシング酵素を生成するステップと、
前記ＡＥＰを、前記環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で前記環状ペプチドの直鎖状ポリペプチド前駆体と共にインキュベートするステップと、を含み、
前記ポリペプチド前駆体が、Ｎ末端および／またはＣ末端のＡＥＰプロセシング部位を含む、環状ペプチドの産生方法。
【請求項２】
細胞を含み、該細胞に遺伝子材料を導入するステップであって、
該遺伝子材料は、発現されると、前記組換えＡＥＰおよび前記直鎖状ポリペプチドを含む前記直鎖状ポリペプチド前駆体を生成するステップと、次いで、
前記細胞を、インビボで環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下でインキュベートするステップと、次いで、
前記環状ペプチドを単離するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離された組換えＡＥＰが、インビトロで反応容器において、前記環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、直鎖状ポリペプチド前駆体またはその翻訳後修飾形態もしくは合成修飾形態と共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記直鎖状ポリペプチド前駆体をコードする発現ベクターを、原核生物細胞または真核生物細胞に導入するステップと、
前記ベクターの発現を可能にして、組換え直鎖状ポリペプチド前駆体を産生するステップと、
前記ポリペプチドを前記細胞から単離するステップと、
反応容器において、前記ポリペプチド前駆体を、前記環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、前記ＡＥＰと共にインキュベートするステップと、を含む、請求項１に記載の環状ペプチドの産生方法。
【請求項５】
前記ＡＥＰをコードする発現ベクターを、原核生物細胞または真核生物細胞に導入するステップと、
前記ベクターの発現を可能にして、組換えＡＥＰを産生するステップと、
前記ＡＥＰを前記細胞から単離するステップと、
反応容器において、前記組換えＡＥＰを、前記ポリペプチド前駆体と、または前記環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、共にインキュベートするステップと、を含む、請求項１に記載の環状ペプチドの産生方法。
【請求項６】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体をコードする１つまたは複数の発現ベクターを、原核生物細胞または真核生物細胞に導入するステップと、前記ベクターの発現を可能にして、組換えＡＥＰおよび組換え直鎖状ポリペプチド前駆体を産生するステップと、
環状ペプチドを、前記真核生物細胞または原核生物細胞の適切なコンパートメントまたは発現培地から単離するステップと、を含む、請求項１に記載の環状ペプチドの産生方法。
【請求項７】
少なくとも２つのペプチドを、直鎖状ペプチド複合体を生成するのに十分な時間および条件下でＡＥＰと共にインキュベートするステップを含み、
少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含み、少なくとも１つの他のペプチドがＮ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含む、ペプチド複合体の生成方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド前駆体が、環化される前記ペプチドの複数の反復物の形態か、または環化される複数の異なるポリペプチドの形態である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＥＰが、最適なアライメント後に、配列番号１、２、および／または４のうちのいずれか１つまたは複数に対する少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列、ならびに１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在を含み、
ギャップが、残基の非存在を意味する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現ベクターが、２つ以上の転写セグメントを含むポリヌクレオチドからなる多重遺伝子発現ビヒクルであり、
各セグメントが、前記ＡＥＰまたは直鎖状ポリペプチド前駆体をコードし、
各セグメントが、リンカーペプチドをコードするリンカーセグメントによって直鎖状配列で次のセグメントに接合されており、
前記転写セグメントがすべて、単一のプロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結された同じリーディングフレーム内にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、ウイルス発現ベクターである、請求項６または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、大腸菌である、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、酵母である、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母が、ピキア属、サッカロマイセス属、またはクリベロマイセス属である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記環状ペプチドが、病原体による感染もしくは侵入の治療、または癌、心臓血管疾患、免疫疾患、および疼痛の治療のためのものを含む、抗病原体特性または治療特性を示す、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチド前駆体が、天然に直鎖状である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃ末端のＡＥＰプロセシング部位が、実際の切断部位の前にＰ３〜Ｐ１と、
前記切断部位の後に、前記Ｃ末端に向かってＰ１’〜Ｐ３’と、を含み、
Ｐ３〜Ｐ１およびＰ１〜Ｐ３が、アミノ酸配列：
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７
を有し、
Ｘは、アミノ酸残基であり、
Ｘ２は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は、ＮまたはＤであり、
Ｘ５は、ＧまたはＳであり、
Ｘ６は、ＬまたはＡまたはＩであり、
Ｘ７は、任意選択、または任意のアミノ酸である、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
Ｘ２からＸ７が、アミノ酸配列：
Ｘ２Ｘ３ＮＧＬＸ７
を含み、
Ｘ２、Ｘ３、およびＸ７が、請求項１７に定義される通りである、請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｎ末端プロセシング部位が、特定のＡＥＰプロセシング部位含んでいなくてもよく、またはＰ１”〜Ｐ３”のうちのいずれか１つによって定義されるプロセシング部位を含んでもよく、
Ｐ１”〜Ｐ３”は、
Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１によって定義され、
Ｘは、アミノ酸残基であり、
Ｘ９は、任意選択であり、任意のアミノ酸、またはＧ、Ｑ、Ｋ、Ｖ、もしくはＬであり、
Ｘ１０は、任意選択、または任意のアミノ酸、またはＬ、Ｆ、もしくはＩ、または疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ１１は、任意選択であり、任意のアミノ酸である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘ９からＸ１１が、アミノ酸配列：
ＧＬＸ１１
を含み、
Ｘ１１が、請求項１９に定義されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＥＰプロセシング部位が、配列：
ＧＬＸ１１［Ｘｎ］Ｘ２Ｘ３ＮＧＬＸ７を含む、Ｎ末端およびＣ末端配列を含み、
Ｘ１１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ７が、上記に定義される通りであり、［Ｘｎ］が、非存在（ｎ＝０）、または１〜２０００個のアミノ酸の配列の任意のアミノ酸残基である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
アミド結合の切断を伴う酵素的ペプチド転移のための方法であって、
前記方法は、ポリペプチド前駆体を、アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）と共にインキュベートするステップを含み、
前記アミド結合の切断は、新しいアミド結合の形成と連続している、方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチド前駆体のＣ末端およびＮ末端が、酵素的にライゲートされて、環状ペプチドが産生される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
酵素的にライゲートされる前記ポリペプチド前駆体の前記Ｃ末端およびＮ末端が、追加的なＡＥＰ認識アミノ酸配列を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも２つの別個のポリペプチドのＣ末端およびＮ末端が、ライゲートされて、新しい直鎖状ポリペプチドが産生される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ライゲートされる前記２つの別個のポリペプチドの前記Ｃ末端および前記Ｎ末端が、追加的なＡＥＰ認識アミノ酸配列を含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＥＰが、組換えにより産生される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＥＰが、原核生物細胞または真核生物細胞に導入された発現ベクターにおいてコードされ、前記細胞内で組換え発現され、前記細胞から精製され、環化またはライゲーションに十分な時間および条件下で適切な直鎖状ポリペプチドと共にインキュベートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換え発現されたＡＥＰが、前記細胞から精製されず、粗製抽出物が、環化またはライゲーションに十分な時間および条件下で適切な直鎖状ポリペプチドと共にインキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＥＰが、無細胞系に導入された発現ベクターにおいてコードされる請求項６は、前記系を使用して組換え発現され、前記系から精製され、環化またはライゲーションに十分な時間および条件下で適切な直鎖状ポリペプチドと共にインキュベートされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
組換え発現されたＡＥＰが、前記系から精製されず、粗製抽出物が、環化またはライゲーションに十分な時間および条件下で適切な直鎖状ポリペプチドと共にインキュベートされる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチド前駆体が、細胞において産生される、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチド前駆体が、合成化学反応によって産生される、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチド前駆体が、無細胞発現系において産生される、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＡＥＰが、前記ポリペプチド前駆体と共発現され、環化またはライゲーションがインビボで生じるのに十分な時間および条件下でインキュベートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体が、原核生物細胞または真核生物細胞に導入された発現ベクターにおいてコードされ、前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体の両方が同じ細胞において共発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体が、無細胞系に導入された発現ベクターにおいてコードされ、前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体の両方が同じ系において共発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体が、同じ転写ユニットから発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体が、多重遺伝子発現ビヒクルを使用して連結される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体が、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに由来する別個の転写ユニットから発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記環化またはライゲートされたポリペプチドが、前記発現されたＡＥＰによるインビトロでのプロセシング後に、前記細胞または無細胞系から直接精製される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記環化またはライゲートされたポリペプチド前駆体が、前記細胞または無細胞系内に残存する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチド前駆体が、複数の反復物の形態、または複数の異なるポリペプチドの形態である、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＡＥＰが、最適なアライメント後に、配列番号１、２、および／または４のうちのいずれか１つまたは複数に対する少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を含み、
１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在を含み、
ギャップが、残基の非存在を意味する、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ベクターが、ウイルス発現ベクターである、請求項２８から３０、または３６、または３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、細菌である、請求項２８、３２、または３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、大腸菌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＡＥＰおよび前記ポリペプチド前駆体が、細胞膜周囲腔を標的とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が、酵母である、請求項７、１１、または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵母が、ピキア属、サッカロマイセス属、またはクリベロマイセス属である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＡＥＰおよびポリペプチド前駆体が、液胞を標的とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記環状ペプチドが、抗病原体特性または治療特性を示す、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリペプチド前駆体が、天然の環化基質である、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリペプチド前駆体が、天然に直鎖状である、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記環状ペプチドが、シクロチドの骨格フレームワークに融合されているかまたは埋め込まれた機能性部分を含む、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記環状ペプチドが、病原体による感染または侵入から保護するために、植物またはその根茎もしくは種子に局所適用される、請求項２２から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記病原体が、真菌、細菌、線虫、蠕虫、ウイルス、または原虫生物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項２２から３７のいずれか一項に記載の方法によって生成された前記環状ペプチドを含む、農学的組成物。
【請求項５９】
請求項２２から５７のいずれか一項に記載の方法によって生成された前記環状ペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項６０】
前記環状ペプチドが、病原体による感染または侵入から保護するために、植物またはその根茎もしくは種子に局所適用される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記病原体が、真菌、細菌、線虫、蠕虫、ウイルス、または原虫生物である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１または２１のいずれか一項に記載の方法によって生成された前記環状ペプチドを含む、農学的組成物。
【請求項６３】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって生成された前記環状ペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項６４】
試験されるＡＥＰを、内部消光性蛍光（ＩＱＦ）ペプチドと共にインキュベートするステップと、
前記ペプチドの酵素的切断後に、蛍光ドナー／クエンチャー対の空間的分離による蛍光に起因する経時的な蛍光強度の変化に関してアッセイするステップと、を含み、
蛍光強度の上昇が、環化能力を有するＡＥＰを示す、環化能力を有するＡＥＰの特定方法。
【請求項６５】
前記ＩＱＦペプチドが、Ａｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）［配列番号２１］およびＡｂｚ−ＳＴＲＮＧＡＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）［配列番号２５］からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
蛍光強度が、励起／放出波長３２０／４２０ｎｍで、経時的にモニタリングされる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法によって特定された、環化能力を有するＡＥＰ。
【請求項６８】
前記ＡＥＰのアミノ酸配列を判定するステップと、
前記配列を、最良の適合度で、ＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）のアミノ酸配列とアライメントするステップと、
１８０Ｋ、２１９Ｄ、２７４Ｋ、２８０Ｄ、３５２Ｃ、３５３Ｙ、３５９Ｑ、３６１Ａ、３７９Ｖ、５０６Ｈ、５１９ギャップ、５２０ギャップ、５２１ギャップ、５２５キャップ、５２６ギャップ、５４２Ｅ、および５４４Ｇの残基の５つ以上の残基または残基の非存在に関してスクリーニングするステップと、を含み、
前記ギャップが、残基の非存在を意味し、
前記列挙された残基のうちの５つ以上の残基または残基の非存在が、シクラーゼであるＡＥＰを示す、ＡＥＰが、環化活性を有する可能性が高いかどうかを判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（出願データ）
本出願は、２０１５年９月２５日に出願された「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題されるオーストラリア仮特許出願第２０１５９０３６９１８号と関連し、その優先権を主張する。該出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、環化活性を有する組換え酵素の生成、ならびに環状ペプチドならびに直鎖状ペプチド複合体を生成するための酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において著者で参照される刊行物の書誌に関する詳細は、説明の最後にアルファベット順でまとめられている。
【０００４】
本明細書における任意の先行刊行物（もしくはそれに由来する情報）または公知である任意の事柄への参照は、先行刊行物（もしくはそれに由来する情報）または公知の事柄が、本明細書の属する分野における共通の一般知識の一部を形成するという認識または容認または何らかの形の提案ではなく、そのように解釈されるものではない。
【０００５】
プロテアーゼは、自然界において豊富であり、広範な細胞プロセスに必須である。プロテアーゼは、典型的には、ポリペプチド鎖を加水分解するように機能し、その結果、標的配列の分解または生物学的に活性な形態への成熟のいずれかをもたらす。頻度は低いが、プロテアーゼは、異なるポリペプチドを連結するリガーゼとして作用し、新しいバリアントまたは選択的にスプライシングされたバリアントを産生することができる。この珍しい機能は、レクチンであるコンカナバリンＡの成熟（非特許文献１）、主要組織適合複合体クラスＩ分子によるペプチド提示（非特許文献２）、および細菌タンパク質と細胞壁との結合（非特許文献３）などのプロセスに関して報告されている。この酵素的ペプチド転移は、リボソームにより合成される環状ペプチドの骨格環化にも関連付けられている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
遺伝子によりコードされる環状ペプチドは、植物、真菌、細菌、および動物を含む、様々な生物において特定されている（非特許文献８）。植物の場合、環状ペプチドは、シクロチド（例えば、プロトタイプのシクロチドであるカラタＢ１［ｋＢ１］）（非特許文献９、非特許文献１０）、ＰａｗＳ由来のトリプシン阻害剤（例えば、ヒマワリトリプシン阻害剤（ＳＦＴＩ））［非特許文献１１］、ノッチントリプシン阻害剤（例えば、ナンバンカラスウリトリプシン阻害剤（ＭＣｏＴＩ−ＩＩ））［非特許文献１２］、およびオルビチド（ｏｒｂｉｔｉｄｅ）（例えば、セゲタリン）［非特許文献４］の４つのクラスに分類される。
【０００７】
シクロチドは、アフリカの植物であるオルデンランディア・アフィニス（Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ  ａｆｆｉｎｉｓ）において初めて特定され、農業害虫に対する殺虫活性、殺線虫活性、および殺軟体動物活性を示す（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。他の報告されている活性としては、ニューロテンシンアンタゴニズム（非特許文献１７）、抗ＨＩＶ活性（非特許文献１８）、抗微生物活性（非特許文献１９）、細胞毒性活性（非特許文献２０）、子宮収縮活性（非特許文献２１）、および溶血特性（非特許文献１９）、および防汚特性（非特許文献２２）が挙げられる。シクロチドは、シスチンノットモチーフによって特徴付けられ、これは、骨格環化と一緒に、ひときわ優れた安定性をもたらす。このことにより、薬学的足場としてのシクロチドのフレームワークに大きな関心が生じ、メビウスシクロチドおよびトリプシン阻害剤シクロチドの両方への生物活性配列のグラフトが成功したことにより、可能性が高まった（非特許文献２３）。骨格環化はまた、安定性を増大させ、生物活性直鎖状ペプチドの経口投与経路を促進することができ、この修飾が広範な用途をもたらすであろうことが示唆される（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）。シクロチドの生合成に固有な酵素的環化の機序を解明することは、シクロチドの薬学的可能性および農業的可能性の実現のためだけでなく、無関係な生物活性ペプチドの環化効率を増大させるためにも、重要である。
【０００８】
シクロチドは、前駆体分子から産生されるが、前駆体分子では、シクロチド配列には、典型的に、Ｎ末端およびＣ末端のプロペプチドが隣接している。最初のプロセシング事象は、Ｎ末端のプロペプチドの除去であり、Ｃ末端プロドメインには連結されたままの直鎖状前駆体が生じる（非特許文献９）。最後の成熟ステップは、酵素によるこのＣ末端領域の切断、ならびにそれに続く遊離Ｃ末端およびＮ末端のライゲーションを伴う。しかしながら、現在のところ、天然のシクラーゼは４つしか特定されていない（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献９）。シクラーゼの中で最も特徴付けられているのは、セリンプロテアーゼＰａｔＧであり、これは、細菌シアノバクチンの成熟を担う（非特許文献７）。植物においては、セリンプロテアーゼＰＣＹ１が、報告によると、ナデシコ科由来の環状ペプチドであるセゲタリンの環化を促進する（非特許文献４）。植物由来の環状ペプチドの他の３つのクラスでは、Ｃ末端切断部位のＰ１残基における強力なＡｓｘ配列（ここで、ｘは、Ｎ（アスパラギン）またはＤ（アスパラギン酸）である）の変換により、このプロセスに、液胞プロセシング酵素（ＶＰＥ）またはアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）として知られているシステインプロテアーゼの群が関与することが示唆された（非特許文献９）。
【０００９】
ペプチドリガーゼとして優先的に作用することが示されている数少ないＡＥＰの中で唯一、有効なシクラーゼであることが示されているのはブテラーゼ（ｂｕｔｅｌａｓｅ）１だけである（非特許文献２７、非特許文献５、非特許文献１）。ＡＥＰのこのサブセットの優先的なリガーゼ活性に関する構造的基盤は、わかっていない。
【００１０】
ブテラーゼ−１は、シクロチドを産生する植物であるクリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｔｅｒｎａｔｅａ）から単離され、オルデンランディア・アフィニス由来のｋＢ１の修飾前駆体を環化することが示されており、この群の酵素のインビトロで環化を媒介する能力が確認されたが（非特許文献５）、ただし、適切な認識配列が、環化されるポリペプチド前駆体の末端に付加されていることが条件である。しかしながら、大腸菌由来の組換えブテラーゼ−１は、不溶性形態でしか発現されず、したがって、環化を媒介することができなかった。環化能力を有するＡＥＰは、１つだけが組換えで産生されているが、これは、非常に効率が悪く、主として、加水分解された基質が産生された（非特許文献２７）。ポリペプチド前駆体から環状ペプチド、ならびに直鎖状ペプチド複合体をより効率的に生成するために使用することができるように、機能性の組換えＡＥＰを生成するための手法を開発することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，６９５，９３７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４０５，７８３号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４１２，０８７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２８７，８６０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２０：８６５−８７０
【非特許文献２】Ｈａｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：２５２−２５６
【非特許文献３】Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０）２８５：７６０−７６３
【非特許文献４】Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８：１２５００−１２５１０
【非特許文献５】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：７３２−７３８
【非特許文献６】Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１−８  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１４．１０．０１５
【非特許文献７】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３１：２１２２−２１２４
【非特許文献８】Ａｒｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｐ  ３０：１０８−１６０
【非特許文献９】Ｇｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５３：５０５−５１５
【非特許文献１０】Ｓａｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２９７２１−２９７２８
【非特許文献１１】Ｍｙｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：２５７−２５９
【非特許文献１２】Ｍｙｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２４：２７６５−２７７８
【非特許文献１３】Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１０６１４−１０６１９
【非特許文献１４】Ｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５６：５２３７−５２４１
【非特許文献１５】Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：５５８１−５５８９
【非特許文献１６】Ｃｏｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐ．１０９：１６３−１６６
【非特許文献１７】Ｗｉｔｈｅｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ  ５７：１６１９−１６２５
【非特許文献１８】Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ  ６３：１７６−１７８
【非特許文献１９】Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：８９１３−８９１８
【非特許文献２０】Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１：３６５−３６９
【非特許文献２１】Ｇｒａｎ（１９７３）Ａｃｔａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｔｏｘｉｃｏｌ．３３：４００−４０８
【非特許文献２２】Ｇｏｒａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６７：１２８７−１２９０
【非特許文献２３】Ｐｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １００：４８０−４９１
【非特許文献２４】Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ａｍ．１０２：１３７６７−１３７７２
【非特許文献２５】Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４９：６５４５−８
【非特許文献２６】Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １４：６１７−６２４
【非特許文献２７】Ｂｅｒｎａｔｈ−Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２：１−１２
【非特許文献２８】Ｃａｍａｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ９：２４７９−２４８４
【非特許文献２９】Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ  ７：  ５３９
【非特許文献３０】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：  ３３８９−３４０２
【非特許文献３１】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．１９９４−１９９８
【非特許文献３２】Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８：７０７−７１８
【非特許文献３３】Ｓａｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．８７２：１０７−１１４
【非特許文献３４】Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．
【非特許文献３５】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献３６】Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７７（３）：３９９−４０２
【非特許文献３７】Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８：  １０８６−１０９６
【非特許文献３８】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２：  １６５８−１６５９
【非特許文献３９】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：  １７５４−１７６０
【非特許文献４０】Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：  １１１
【非特許文献４１】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：  ４０３−４１０
【非特許文献４２】Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １３：  １３３１−１３３９
【非特許文献４３】Ｈｉｒａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １２（４）：８１９−８２９
【非特許文献４４】Ｈｉｒａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４４７（２−３）：２１３−２１６
【非特許文献４５】Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４３（２）：１４３−１５１
【非特許文献４６】Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８４（１４）：９３６１−９３７１
【非特許文献４７】Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３（１０）：６９８１−６９８９
【非特許文献４８】Ｗｕ  ａｎｄ  Ｈａｎｃｏｃｋ（１９９９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈ  ４３：１２７４−１２７６
【非特許文献４９】Ｎｏｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６（２８）：２５１４５−２５１５３
【非特許文献５０】Ｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３１：１２８３−１２９３
【非特許文献５１】Ｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７：１９９６１−１９９７２
【非特許文献５２】Ｒｏｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２：９５３−９５９
【非特許文献５３】Ｈａｔｓｕｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５（５６８５）：  ８５５−８５８
【非特許文献５４】Ｑｕｉｍｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８（１９）：１３８８５−１３８９６
【非特許文献５５】Ｏｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｙｅａｓｔ  １２：３１−４０
【非特許文献５６】Ｖｉｓｗｅｓｗａｒａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（４２）：３６５６８−３６５７９
【非特許文献５７】Ｃａｂｒｅｒａ  ａｎｄ  Ｕｎｇｅｒｍａｎｎ（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４５１：１７７−１９６
【非特許文献５８】Ｗｉｅｄｅｒｈｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：３８０−３９２
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、機能性の組換えアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）の産生、および環状ペプチドまたは直鎖状ペプチド複合体を産生するための効率的な方法におけるＡＥＰの使用を教示する。「環状ペプチド」という用語には、シクロチドが含まれるがこれに限定されない。環状ペプチドは、天然に環状であってもよく、または例えば追加的な安定性、有効性、または有用性を付与するために人工的に環化されていてもよい。直鎖状ペプチド複合体は、２つ以上のペプチドを一緒に直鎖状の配列にライゲートしたものである。「ペプチド」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質を除外するものではない。簡潔さのため、「ペプチド」という用語が、何らかの曖昧さ回避のために使用されるが、本発明は、環状ペプチド、環状ポリペプチド、および環状タンパク質、ならびに直鎖状ペプチド、直鎖状ポリペプチド、または直鎖状タンパク質を包含する。すべてが、「環状ペプチド」または「直鎖状ペプチド」という用語に包含される。
【００１４】
環状ペプチドまたは直鎖状ペプチドは、ヒトおよび非ヒト動物ならびに植物に関連する様々な用途において使用することができる。病原体による感染または侵入の治療のための局所用薬剤の生成などの農業的用途、ならびに癌、心臓血管疾患、感染性疾患、自己免疫疾患、および疼痛の治療などの薬理学的用途が含まれる。治療剤は、局所的に送達されてもよく、または全身的に送達されてもよい。さらに、天然の環状ペプチドの直鎖状形態および天然の直鎖状ペプチドの両方、ならびに非天然のアミノ酸および／または修飾された側鎖もしくは修飾された架橋結合を含む直鎖状ポリペプチド前駆体が、環化を受け得る。天然の直鎖状ペプチドの環化は、とりわけ、長い半減期ならびに／または安定性および／または経口投与される能力の増大をもたらし得る。
【００１５】
環化プロセスは、様々な方式で行われ得、原核生物または真核生物を利用することができ、非天然のアミノ酸残基または他の修飾を含むポリペプチド前駆体に対して作用し得る。本質的には、環化能力を有するアスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）が、直鎖状ポリペプチド前駆体を環化するか、またはポリペプチドおよびタンパク質を含むペプチドを一緒にライゲートするために用いられる。「ポリペプチド」という用語には、「タンパク質」が含まれる。ポリペプチド前駆体には、天然の環状ペプチドの前駆体、ならびに天然には直鎖状であり、変換されて環状ペプチドとなるポリペプチドの前駆体が含まれる。
【００１６】
直鎖状ポリペプチド前駆体は、Ｃ末端のＡＥＰプロセシング部位を含む。Ｃ末端プロセシング部位は、実際の切断部位よりも前にＰ３〜Ｐ１と、切断部位の後、Ｃ末端に向かって、Ｐ１’〜Ｐ３’と、を含むとして定義されるアミノ酸配列であることが一般的であるが、それに限られるものではない。ある実施形態において、Ｐ３〜Ｐ１およびＰ１’〜Ｐ３’は、アミノ酸配列：
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７
を有し、
ここで、Ｘは、アミノ酸残基であり、
Ｘ２は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は、ＮまたはＤであり、
Ｘ５は、ＧまたはＳであり、
Ｘ６は、ＬまたはＡまたはＩであり、
Ｘ７は、任意選択、または任意のアミノ酸である。
【００１７】
ある実施形態において、Ｘ１からＸ６は、アミノ酸配列：
Ｘ２Ｘ３ＮＧＬＸ７
を含み、
ここで、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ７は、上記に定義される通りである。
【００１８】
直鎖状ポリペプチド前駆体のＮ末端は、特定のＡＥＰプロセシング部位含んでいなくてもよく、またはＰ１”〜Ｐ３”のうちのいずれか１つによって定義されるプロセシング部位を含んでもよく、ここで、Ｐ１”〜Ｐ３”は、
Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１によって定義され、
ここで、Ｘは、アミノ酸残基であり、
Ｘ９は、任意選択、任意のアミノ酸、またはＧ、Ｑ、Ｋ、Ｖ、もしくはＬであり、
Ｘ１０は、任意選択、または任意のアミノ酸、またはＬ、Ｆ、もしくはＩ、または疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ１１は、任意選択であり、任意のアミノ酸である。
【００１９】
ある実施形態において、Ｘ９〜Ｘ１１は、アミノ酸配列：
ＧＬＸ１１
を含み、
ここで、Ｘ１１は、上記に定義される通りである。
【００２０】
ある実施形態において、ＡＥＰプロセシング部位は、配列：
ＧＬＸ１１［Ｘｎ］Ｘ２Ｘ３ＮＧＬＸ７を含む、Ｎ末端およびＣ末端配列を含み、
ここで、Ｘ１１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ７は、上記に定義される通りであり、［Ｘｎ］は、非存在（ｎ＝０）、または１〜２０００個のアミノ酸の配列の任意のアミノ酸残基である。
【００２１】
ある実施形態において、Ｃ末端プロセシング部位は、Ｐ４〜Ｐ１およびＰ１’〜Ｐ４’を含み、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ１’〜Ｐ４
’は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含み、ここで、Ｘ２〜Ｘ７は、上記に定義される通りであり、Ｘ１は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、Ｘ８は、任意選択、または任意のアミノ酸である。
【００２２】
原核生物系の場合には、ＡＥＰは、細胞において産生され、環化される直鎖状ポリペプチド前駆体と共にインビトロで使用する前に、単離される。直鎖状ポリペプチド前駆体もまた、細胞において産生され得、次いで、細胞から分離されるかまたはそうでなければ単離され、組換えＡＥＰを使用してインビトロで環化され得る。非天然のアミノ酸を有するポリペプチドまたは翻訳後修飾を有する組換えポリペプチドを含め、合成によって産生されたポリペプチド前駆体もまた、組換えＡＥＰを使用してインビトロで環化することができる。ＡＥＰおよびポリペプチド前駆体はまた、細胞膜周囲腔などであるがこれに限定されない、原核生物細胞のコンパートメントにおいて、共発現されてもよい。いずれの場合においても、結果として得られるペプチドは、細胞から単離される。
【００２３】
酵母（例えば、ピキア属、サッカロマイセス属、またはクリベロマイセス属）などの真核生物を用いる場合、同様のプロトコルが適合される。前駆体ポリペプチドからインビトロでの環状ペプチドの生成、またはＡＥＰおよびポリペプチドの両方が共発現される場合にはインビボでの環状ペプチドの生成を可能にする、ＡＥＰをコードする遺伝子材料が、発現される。いずれの事象においても、結果として得られるペプチドは、真核生物細胞の液胞もしくは他の細胞内コンパートメントから、または反応容器からの、単離および生成を受ける。あるいは、ＡＥＰおよびポリペプチド前駆体は、別個の真核生物細胞において、または同じ細胞内の異なるコンパートメントにおいて、産生され、抽出された後、インビトロで共にインキュベートされ、環状ペプチドが生成される。さらに別の態様において、ＡＥＰまたはポリペプチド前駆体の一方または他方のみが、真核生物細胞において産生され、他方の成分は、異なる供給源から供給され、次いで、これら２つをインビトロでインキュベートして、環状ペプチドが生成される。
【００２４】
念のため再度強調するが、「ペプチド」という用語には、ポリペプチドまたはタンパク質、ならびにペプチドが含まれる。
【００２５】
環状ペプチドの産生方法であって、原核生物細胞または真核生物細胞に、発現されると、環化能力を有する組換えＡＥＰを生成する、遺伝子材料を導入するステップと、ＡＥＰを単離するステップと、ＡＥＰを、非天然のアミノ酸を導入するように任意選択で修飾された直鎖状ポリペプチド前駆体と共にインキュベートするステップを含み、このインキュベーションが、ポリペプチド前駆体から環状ペプチド生成するのに十分な時間および条件下で行われる、方法が、本明細書において実現される。あるいは、環化能力を有するＡＥＰをコードする遺伝子材料は、ある細胞において、細胞の液胞または他の細胞内コンパートメントにおいて環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、直鎖状ポリペプチド前駆体をコードする遺伝子材料と共に、共発現される。このプロセスは、細胞膜周囲腔など、原核生物細胞の膜コンパートメントにおいても起こり得る。加えて、ＡＥＰは、２つ以上のペプチドを複合体するライゲーション反応を触媒することができ、ここで、少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含み、もう一方のペプチドが、Ｎ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含む。真核生物細胞もまた、インビトロでの環状ペプチドの生成に使用するためのＡＥＰおよび／またはポリペプチド前駆体のうちの一方または両方を生成するために使用することができる。環状ペプチドはまた、原核生物細胞においても産生することができる。ある実施形態において、環状ペプチドは、原核生物細胞の細胞膜周囲腔において産生される。上述のように、「ペプチド」への言及は、ポリペプチドまたはタンパク質を含む。「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語の使用により、タンパク質性分子のサイズまたは種類に対する制限は意図されない。
【００２６】
ある実施形態において、直鎖状ペプチドは、ＡＥＰのリガーゼ活性を使用して生成される。この実施形態において、Ｃ末端ＡＥＰ認識配列を含む第１のペプチドは、タグを有する場合も有さない場合もあるＮ末端ＡＥＰ認識配列を含む第２のペプチドおよびＡＥＰと共にインキュベートされる。ＡＥＰは、第１のペプチドと第２のペプチドとの間のライゲーションを触媒して、直鎖状ペプチド複合体を生成する。この複合体が、続いて、環化されて環状ペプチドとなり得るか、または直鎖状ペプチドのまま使用され得る。
【００２７】
ある実施形態において、環状ペプチドまたはペプチド複合体は、生成される方法に関係なく、単離を受けるが、この単離には精製が含まれる。
【００２８】
環状ペプチドの産生方法であって、ペプチド環化活性を有するＡＥＰを、環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で環状ペプチドの直鎖状ポリペプチド前駆体と共にインキュベートするステップを含む、方法が、本明細書において実現される。「環状ペプチド」への言及には、「シクロチド」が含まれる。「共にインキュベートする」は、インビトロで反応容器において、または細胞もしくは細胞のコンパートメントにおいてのいずれかを意味する。複数のペプチドまたは同じペプチドの反復形態も、インビトロまたはインビボで環化され得る。ここでも、「ペプチド」という用語には、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。
【００２９】
したがって、ＡＥＰを、原核生物細胞または真核生物細胞において生成し、インビトロまたはインビボで使用して、直鎖状ポリペプチド前駆体から環状ペプチドを生成することが、本明細書に教示される。ＡＥＰおよび直鎖状ポリペプチド前駆体はまた、原核生物細胞または真核生物細胞において共発現することもできる。あるいは、直鎖状ポリペプチド前駆体は、合成化学反応によって産生してもよい。ある実施形態において、組換えＡＥＰを、原核生物細胞または真核生物細胞において産生し、細胞から単離し、インビトロでポリペプチド前駆体に使用して、環状ペプチドを生成することができる。
【００３０】
一般に、遺伝子材料は、２つのそれぞれの核酸コンストラクトにおいて発現され得る核酸を含む。あるいは、ＡＥＰおよびポリペプチド前駆体のそれぞれをコードする組換え核酸が、単一の核酸コンストラクトにおいて発現される。同じペプチドまたは異なるペプチドの複数の反復形態もまた、インビボまたはインビトロで環化プロセシングを受け得る。それにもかかわらず、前駆体ポリペプチドと共にインビトロで使用することができるか、またはＡＥＰを発現する細胞を、前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子分子のレシピエントとして使用することができる、ペプチド環化能力を有する機能性ＡＥＰの組換え形態の産生が、重要な態様である。
【００３１】
ＡＥＰがシクラーゼであるかどうかの予測を可能にするための一連の法則が、本明細書において実現される。一連の法則は、とりわけ、１７個の予測部位のうちの少なくとも２５％における残基またはギャップの存在または非存在に基づく。これは、５つ以上に等しい。予測部位には、活性優先性ループ（ＡＰＬ）、活性部位およびその近傍の部位、ならびに非活性表面残基が包含される。予測部位を、表２に要約する。したがって、ＡＥＰが、環化活性を有する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、ＡＥＰのアミノ酸配列を判定するステップと、この配列を、最良の適合度で、ＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）のアミノ酸配列とアライメントするステップと、１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在に関してスクリーニングするステップを含み、ここで、ギャップは、残基の非存在を意味し、列挙された残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在は、シクラーゼであるＡＥＰを示す、方法が、本明細書において教示される。さらに、ＡＥＰが、環化活性を有する可能性が低いかどうかを判定する方法であって、ＡＥＰのアミノ酸配列を判定するステップと、この配列を、最良の適合度で、ＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）のアミノ酸配列とアライメントするステップと、残基１３９Ｄ、１６１Ｎ、１８６Ｇ、１９２Ｎ、２４７Ｇ、２４８Ｔ、２５３Ｅ、２５５Ｐ、２６３Ｔ、２９３Ｌ、ＯａＡＥＰ１ｂの残基２９９〜３００にアライメントする残基Ｎ、Ｇ、Ｎ、Ｙ、およびＳ、３１４Ｋ、ならびに３１６Ｋのうちの１３個以上の残基の存在に関してスクリーニングするステップと、を含み、ここで、列挙された残基のうちの１３個以上の存在は、シクラーゼではないＡＥＰを示す、方法が、本明細書において実現される。ＡＥＰは、したがって、オルデンランディア属に由来するものなどであるが、これに限定されない、任意の源に由来し得る。ＡＥＰは、シクラーゼ活性に関して容易に試験することができる。１つのそのような種は、オルデンランディア・アフィニスである。例としては、ＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）、ＯａＡＥＰ１（配列番号２）、ＯａＡＥＰ３（配列番号４）、または環化活性を保持するそれらのバリアント、誘導体、もしくはハイブリッドが挙げられる。ある実施形態において、ＡＥＰは、最適なアライメント後に、配列番号１、配列番号２、または配列番号４のいずれか１つに少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を有し、ここで、ＡＥＰは、１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在を含み、ギャップは、配列番号１と最適にアライメントしたときの残基の非存在を意味する。この定義においてシクラーゼとしては除外される非シクラーゼＡＥＰの例は、ＯａＡＥＰ２（配列番号３）である。ただし、シクラーゼＡＥＰを包含する記述が、ＯａＡＥＰ２（配列番号３）を含まないことを条件とする。
【００３２】
直鎖状前駆体が、原核生物細胞において産生される場合、コンストラクトにおける最初のＮ末端残基は、メチオニンである必要がある。Ｎ末端メチオニンが環化を妨げる場合には、代替的なアプローチが用いられる。例として、
−一部の大腸菌株によって発現される内因性メチオニンアミノペプチダーゼを利用して、開始メチオニンをインビボで除去し、環化に適したＮ末端を露出させる（非特許文献２８）。
−追加的な残基を無駄なく放出するプロテアーゼ（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子）の認識配列を、ポリペプチド前駆体のＮ末端に付加し、切断後に環化に適したＮ末端を露出させる。
【００３３】
ある実施形態において、環状ペプチドは、薬学的活性を示すなど、多数の活性のうちの１つを有し、抗病原体特性、治療特性、または子宮収縮特性を含む。治療活性の例としては、抗がん活性、プロテアーゼ阻害活性、抗ウイルス活性、または免疫調節活性、ならびに疼痛治療が挙げられる。環状ペプチドはまた、シクロチドの骨格フレームワークまたは他の環状足場に融合されるかまたは埋め込まれた、機能性部分も含み得る（非特許文献２３）。環状ペプチドはまた、植物または植物の種子を、真菌、細菌、線虫、軟体動物、蠕虫、ウイルス、または原虫生物に対してなど、病原体による感染または侵入から保護するために、植物または植物の種子に局所適用するために生成され得る。あるいは、環状ペプチドは、ヒトまたは非ヒト動物の表面、例えば、爪、毛髪、または皮膚に局所適用される。ポリペプチド前駆体は、環状ペプチドを生成するための天然の前駆体であってもよく、または天然には環状とはならない場合があるが、環状ペプチドを生成するように適合される。そのような非天然の環状ペプチドは、例えば、組成物中においてもしくはインビボで使用した場合に、より長い半減期を有し得るか、またはより高い安定性、有効性、もしくは有用性を有し得る。
【００３４】
さらに、ＡＥＰと、ポリペプチド前駆体を受容するように適合された受容器と、ＡＥＰとポリペプチド前駆体とを混合するための手段と、を含む、キットが、本明細書において実現される。ポリペプチド前駆体から環状ペプチドへの変換を促進するための試薬もまた、含まれ得る。あるいは、キットは、ＡＥＰをコードする遺伝子材料を含む真核生物細胞または原核生物細胞を含む。次いで、環化されるポリペプチド前駆体をコードするさらなる遺伝子材料が、その細胞に導入される。例は、ピキア属などの酵母細胞である。
【００３５】
このキットにより、任意のポリペプチド前駆体から環状ペプチドを生成するための有用なビジネスモデルが実現される。
【００３６】
本明細書全体を通じて使用される配列識別子の概要を、表１に提供する。
【表１】
2019500879.tif 000002
2019500879.tif 000003
2019500879.tif 000004
2019500879.tif 000005
【００３７】
一部の図面は、カラーの表示または実体を含む。カラー写真は、要請により特許権者から入手可能であるか、または適切な特許庁から入手可能である。特許庁から入手した場合には、手数料が発生する場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】Ｏａｋ１遺伝子産物の概略図である。Ｏａｋ１遺伝子によってコードされる前駆体タンパク質（配列番号２２によってコードされる配列番号２３）は、タンパク質分解によりプロセシングされて、成熟ｋＢ１が産生される。示されているドメインは、順に、ＥＲシグナルペプチド（ＥＲ  ＳＰ）、Ｎ末端プロペプチド（ＮＴＰＰ）、Ｎ末端リピート（ＮＴＲ）、シクロチドドメイン、Ｃ末端プロペプチド（ＣＴＰＰ）である。破線は、Ｎ末端およびＣ末端のプロセシング部位を示し、太字のアスタリスクは、ｒＯａＡＥＰ１ｂ切断部位を表す。Ｃ末端Ｐ３〜Ｐ１およびＰ１’〜Ｐ３’部位が、示されている。Ｐ１”〜Ｐ３”は、Ｃ末端プロペプチド放出およびそれに続く骨格環化の際に、Ｐ１’〜Ｐ３’残基と置き換わるＮ末端残基を表す。
【図１Ｂ】天然のＣ末端プロ−ヘプタ−ペプチド（ＧＬＰＳＬＡＡ−配列番号１０）を保有する合成カラタＢ１前駆体の概略図である。
【００３９】
【図２Ａ】ＯａＡＥＰ１ｂ、ＯａＡＥＰ３、ＯａＡＥＰ４、およびＯａＡＥＰ５の全長タンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（非特許文献２９）アライメントの図である。
【００４０】
【図２Ｂ】ＯａＡＥＰ１ｂ、ＯａＡＥＰ３、ＯａＡＥＰ４、およびＯａＡＥＰ５の全長タンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（非特許文献２９）アライメントの図である。
【００４１】
【図３】大腸菌における活性ｒＯａＡＥＰ１ｂの発現を示すグラフである。（Ａ）低ｐＨでの活性化前および活性化後の、プールしたｒＯａＡＥＰ１ｂ含有アニオン交換画分を、１：１４で希釈し、野生型の内部消光性蛍光（ｗｔＩＱＦ）ペプチド（１１μＭ）［配列番号２１］に対して、活性を試験した。基質なしの対照からのベースライン蛍光を差し引き、ｔ＝９０分での相対蛍光強度（ＲＦＵ）を報告する。２回の技術的再現からの単一の代表的実験を示す。（Ｂ）活性化されたｒＯａＡＥＰ１ｂを、カチオン交換によって捕捉し、最終的な産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて（ｉ）Ｉｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅでの染色、および（ｉｉ）抗ＡＥＰ１ｂポリクローナルウサギ血清を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【００４２】
【図４】オルデンランディア・アフィニスのゲノムＤＮＡから単離したＯａＡＥＰ１ｂ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の表示である（配列番号１）。予測されるＥＲシグナル配列を灰色で示し、Ｎ末端プロペプチドをイタリックで示し、推定上のシグナルペプチダーゼ切断部位を白抜きの三角形で示し、自己触媒プロセシング部位を黒塗りの三角形で示す。成熟ＯａＡＥＰ１ｂシクラーゼドメインは、下線で示す。触媒活性に重要と考えられるＣｙｓ２１７およびＨｉｓ１７５は、太字で示し、アスタリスクで印を付ける。破線の下線は、成熟酵素の生成のための潜在的なプロセシング部位を示す。
【００４３】
【図５Ａ】プロテアーゼとして優先的に作用する３つのＡＥＰ配列（ＮｔＡＥＰ１ｂ（配列番号５５）、ＰｘＡＥＰ３ａ（配列番号５６）、およびＯａＡＥＰ２（配列番号３））、ならびにシクラーゼとして優先的に作用する２つのＡＥＰ配列（ＰｘＡＥＰ３ｂ（配列番号５７）およびＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）の活性優先性ループ（ＡＰＬ）を含む、配列領域のアライメントを示す。
【図５Ｂ】１７個のシクラーゼ予測残基（または部位）の位置を示すＯａＡＥＰ１ｂ（優先的に、シクラーゼ）およびＯａＡＥＰ２（優先的に、プロテアーゼ）のアライメントを示す。
【００４４】
【図６】ｒＯａＡＥＰ１ｂの存在下におけるＣ末端プロペプチドを含む直鎖状ｋＢ１前駆体（ｋＢ１ｗｔ）の酵素プロセシング産物のＭＡＬＤＩ  ＭＳプロファイルを示すグラフである。Ｐｒｅは直鎖状前駆体であり、Ｃｙｃは環状産物である。＋６Ｄａのピークは、環状産物の還元形態に対応する。
【００４５】
【図７】ｒＯａＡＥＰ１ｂによって媒介される環化の動態を示すグラフである。様々な濃度の基質（ｋＢ１ｗｔ前駆体）を、酵素（１９．７μｇ／ｍＬ全タンパク質）と共に５分間インキュベートした。形成された産物の量は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって前駆体の枯渇をモニタリングすることによって推定した。ミカエリスメンテンのプロットは、３回の技術的再現の平均を示し、エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。このプロットから導出された動態パラメーターを列挙する（±ＳＥＭ）。
【００４６】
【図８Ａ】ｒＯａＡＥＰ１ｂ（１２μｇ／ｍＬ全タンパク質）による、バクテネシンの直鎖状ペプチド誘導体であるＢａｃ２Ａ（ＲＬＡＲＩＶＶＩＲＶＡＲ−配列番号２４）の環化のグラフ図である。ｒＯａＡＥＰ１ｂ（酵素あり）または水（酵素なし）を添加した２２時間後に、産物を、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって分析した。太字の残基は、付加された隣接する酵素認識配列である。アスタリスクは、ｒＯａＡＥＰ１ｂ切断部位である。観察されたモノアイソトピック質量（Ｄａ、［Ｍ＋Ｈ］＋）を列挙する。＋２２Ｄａのピークは、Ｎａ＋付加物を表す可能性が高い。Ｃｙｃは環状産物であり、Ｐｒｅは直鎖状前駆体である。
【図８Ｂ】追加的なＡＥＰ認識残基を有する標的ペプチドの酵素プロセシング産物の、５時間後のＭＡＬＤＩ  ＭＳプロファイルを示すグラフ図である。示されている標的ペプチドは、（Ａ）Ｒ１バリアントＧＬＰＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫＳＴＲＮＧＬ（配列番号８６）、および（Ｂ）Ｂａｃ２ＡバリアントＧＬＰＲＬＡＲＩＶＶＩＲＶＡＲＴＲＮＧＬＰ（配列番号８７）であり、太字の残基は追加的なＡＥＰ残基を示す。使用した酵素は、（ｉ）ｒＯａＡＥＰ１ｂ、（ｉｉ）ｒＯａＡＥＰ３、（ｉｉｉ）ｒＯａＡＥＰ４、および（ｉｖ）ｒＯａＡＥＰ５であり、これらはすべて、最終濃度が１９．７μｇ／ｍＬ全タンパク質であった。酵素なしの対照（ｖ）も、示されている。環化されたバリアントの予測されるモノアイソトピック質量は、Ｒ１バリアントおよびＢａｃ２Ａバリアントについて、それぞれ、３０７４．７および２０４２．３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］  ＋である。観察されたモノアイソトピック質量を、図中に列挙する（Ｄａ、［Ｍ＋Ｈ］＋］）。＋２２Ｄａのピークは、ナトリウム付加物を表す可能性が高い。
【００４７】
【図９】追加的なＡＥＰ認識残基を有するＥｃＡＭＰ１（ＧＬＰＧＳＧＲＧＳＣＲＳＱＣＭＲＲＨＥＤＥＰＷＲＶＱＥＣＶＳＱＣＲＲＲＲＧＧＧＤＴＲＮＧＬＰ（配列番号６０）、太字の残基は、追加的なＡＥＰ認識残基を示す）の酵素プロセシング産物の５時間後のＥＳＩ  ＭＳプロファイルを示すグラフ図である。使用した酵素は、（ｉ）ｒＯａＡＥＰ１ｂ、（ｉｉ）ｒＯａＡＥＰ３、（ｉｉｉ）ｒＯａＡＥＰ４、および（ｉｖ）ｒＯａＡＥＰ５であり、これらはすべて、最終濃度が１９．７μｇ／ｍＬ全タンパク質であった。酵素なしの対照（ｖ）も、示されている。環状ＥｃＡＭＰ１の予測されるモノアイソトピック質量は、４８９２．３Ｄａである。観察されたモノアイソトピック質量を、図中に列挙する（Ｄａ）。
【００４８】
【図１０】細菌において発現される組換えＡＥＰによる、様々な隣接配列を有するＲ１モデルペプチドの環化のグラフである。（Ａ）ＯａＡＥＰ１ｂ（１時間のインキュベーション）、（Ｂ）ＯａＡＥＰ３（５時間のインキュベーション）、（Ｃ）ＯａＡＥＰ４（５時間のインキュベーション）、または（Ｄ）ＯａＡＥＰ５（１時間のインキュベーション）による環化後の環状産物の割合を示す。すべての事例において、酵素は、最終濃度１９．７μｇ／ｍＬの全タンパク質で添加した。−−−は、モデルペプチドＲ１（ＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫ）を表し、Ｒ１ペプチドの追加的な隣接する残基は、示される通りである：ＧＬＰ−−−ＳＴＲＧＬＰ（配列番号２６）、ＧＬ−−−ＮＧＬ（配列番号２７）、ＧＬ−−−ＮＧ（配列番号２８）、−−−ＮＧＬ（配列番号２９）、ＧＬ−−−ＧＨＶ（配列番号６１）、ＧＬ−−−ＮＨＶ（配列番号６２）、ＧＬ−−−ＮＨＬ（配列番号６３）、ＧＬ−−−ＮＧＨ（配列番号６４）、ＧＬ−−−ＮＧＦ（配列番号６５）、ＧＬ−−−ＮＦＬ（配列番号６６）、ＧＬ−−−ＤＧＬ（配列番号６７）、ＬＬ−−−ＮＧＬ（配列番号８９）、ＱＬ−−−ＮＧＬ（配列番号３０）、ＫＬ−−−ＮＧＬ（配列番号３１）、ＧＫ−−−ＮＧＬ（配列番号９０）、ＧＦ−−−ＮＧＬ（配列番号９１）。３回の技術的再現の平均が示されており、エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【００４９】
【図１１】ＡＥＰによって触媒される、標的ペプチドとライゲーションパートナーペプチドとの間のポリペプチドのライゲーションの概略図である。ＡＥＰ切断部位は、三角形によって示される。Ｃ末端標識化のために、ＡＥＰ切断部位を標的ペプチドに組み込み、ライゲーションパートナーペプチドは、ＡＥＰ適合性Ｎ末端を含んでいる。Ｎ末端標識化のために、ＡＥＰ切断部位を、ライゲーションパートナーペプチドに組み込み、標的ペプチドは、ＡＥＰ適合性Ｎ末端を含んでいる。標的ペプチドに付加したＡＥＰ認識残基を、太字で示し、脱離基を下線で示す。
【００５０】
【図１２】示されるように、標的ペプチド（１４０μＭ、ＧＬＰ−ＮａＤ１−ＴＲＮＧＬＰ（配列番号７９））およびライゲーションパートナーペプチド（７００μＭ）の酵素プロセシング産物の、６〜２２時間後のＥＳＩ  ＭＳプロファイルのグラフ図である。使用した酵素は、（Ａ）ｒＯａＡＥＰ１ｂ、（Ｂ）ｒＯａＡＥＰ３、（Ｃ）ｒＯａＡＥＰ４、および（Ｄ）ｒＯａＡＥＰ５であり、これらはすべて、最終濃度が１９．７μｇ／ｍＬの全タンパク質であった。パネル（ｉ）では、ライゲーションパートナーは、ＧＬＰＶＳＧＥ（配列番号１４）であった。パネル（ｉｉ）では、ライゲーションパートナーは、ＰＬＰＶＳＧＥ（配列番号８０）であった。パネル（ｉｉｉ）では、ライゲーションパートナーは添加しなかった。標識化ＮａＤ１産物は、Ｃ末端にライゲーションパートナーペプチドが付加されている。標識化ＮａＤ１の予測されるモノアイソトピック質量は、ライゲーションパートナーがＧＬＰＶＳＧＥの場合は６６４１．３Ｄａであり、ライゲーションパートナーがＰＬＰＶＳＧＥの場合は６６８１．３Ｄａである。観察されたモノアイソトピック質量を、図中に列挙する（Ｄａ）。
【００５１】
【図１３】標的ペプチド（１４０μＭ、Ｒ１バリアントＧＫＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫＮＧＬ（配列番号９０））およびライゲーションパートナーペプチド（７００μＭ、ＧＬＫ−ビオチン）の酵素プロセシング産物の、６時間後のＭＡＬＤＩ  ＭＳプロファイルを示すグラフ図である。使用した酵素は、（Ａ）ｒＯａＡＥＰ１ｂ、（Ｂ）ｒＯａＡＥＰ３、（Ｃ）ｒＯａＡＥＰ４、および（Ｄ）ｒＯａＡＥＰ５であり、これらはすべて、最終濃度が１９．７μｇ／ｍＬの全タンパク質であった。パネル（ｉ）では、ライゲーションパートナーペプチドを添加した。パネル（ｉｉ）では、ライゲーションパートナーペプチドを添加しなかった。ライゲーション産物は、Ｃ末端ビオチンを有する。ビオチン標識化産物の予測平均質量は、３１９２．９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］＋であり、観察された平均質量を、図中に列挙する（Ｄａ、［Ｍ＋Ｈ］＋］）。
【００５２】
【図１４】標的ペプチド（１４０μＭ、Ｒ１バリアントＧＬＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫＧＨＶ（配列番号６１））およびライゲーションパートナーペプチド（７００μＭ、ビオチン−ＴＲＮＧＬ）の酵素プロセシング産物の、６時間後のＭＡＬＤＩ  ＭＳプロファイルを示すグラフ図である。使用した酵素は、（Ａ）ｒＯａＡＥＰ１ｂ、（Ｂ）ｒＯａＡＥＰ３、（Ｃ）ｒＯａＡＥＰ４、および（Ｄ）ｒＯａＡＥＰ５であり、これらはすべて、最終濃度が１９．７μｇ／ｍＬの全タンパク質であった。パネル（ｉ）では、ライゲーションパートナーペプチドを添加した。パネル（ｉｉ）では、ライゲーションパートナーペプチドを添加しなかった。＋２２Ｄａのピークは、ナトリウム付加物である可能性が高い。ライゲーション産物は、Ｎ末端ビオチンを有する。ビオチン標識化産物の予測平均質量は、３４３０．１Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］＋であり、観察された平均質量を、図中に列挙する（Ｄａ、［Ｍ＋Ｈ］＋］）。
【００５３】
【図１５】蛍光基質Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（１００μＭ）に対する組換えオルデンランディア・アフィニスＡＥＰ（約５μｇ／ｍＬの 全タンパク質）およびｒｈｕＬＥＧ（１μｇ／ｍＬの全タンパク質）の経時的な活性のグラフ図である。活性を、励起および放出、それぞれ、３６０および４６０ｎｍの波長を使用して、３７℃で６０分間、１分間隔でトラッキングする。単一の代表的な実験を示す。ＲＦＵは、相対蛍光単位である。
【００５４】
【図１６】プロテアーゼ阻害剤の存在下におけるＩＱＦペプチドＡｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）［配列番号２１］に対するｒＯａＡＥＰ１ｂ活性のグラフ図である。ｒＯａＡＥＰ１ｂ（４．４μｇ／ｍＬの全タンパク質）は、９０分間、ＩＱＦペプチド（１１μＭ）を切断させた。Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ阻害剤またはＡｃ−ＳＴＲＮ−ＣＨＯ阻害剤のいずれかの存在下におけるＩＱＦペプチドに対する酵素活性を、９０分の時点において、阻害剤なしの対照と比較して報告する。
【００５５】
【図１７Ａ】野生型（配列番号２１）およびＬ３１Ａ（配列番号２５）のＩＱＦペプチド基質に対する、植物ＡＥＰおよびヒトＡＥＰの基質特異性のグラフである。５０μＭ  ＩＱＦペプチド基質に対する組換えオルデンランディア・アフィニスＡＥＰ（約１０μｇ／ｍＬの全タンパク質）（１７Ａ）およびｒｈｕＬＥＧ（１．１μｇ／ｍＬの全タンパク質）（１７Ｂ）の初速度が、示されている。アッセイは、３７℃で行った。２回の技術的再現の平均が示されており、エラーバーは、範囲を表す。
【００５６】
【図１７Ｂ】野生型（配列番号２１）およびＬ３１Ａ（配列番号２５）のＩＱＦペプチド基質に対する、植物ＡＥＰおよびヒトＡＥＰの基質特異性のグラフである。５０μＭ  ＩＱＦペプチド基質に対する組換えオルデンランディア・アフィニスＡＥＰ（約１０μｇ／ｍＬの全タンパク質）（１７Ａ）およびｒｈｕＬＥＧ（１．１μｇ／ｍＬの全タンパク質）（１７Ｂ）の初速度が、示されている。アッセイは、３７℃で行った。２回の技術的再現の平均が示されており、エラーバーは、範囲を表す。
【００５７】
【図１８Ａ】短いリンカーによってユビキチン−６ｘＨｉｓに接合されたシクロチドドメインを含む、大腸菌における発現のためのシクロチドコンストラクトの略図である。黒塗りの三角形は、ＡＥＰ切断部位である。
【図１８Ｂ】メチオニン、続いてカラタＢ１  Ｎ末端リピート（ＮＴＲ）、シクロチドドメイン、短いリンカー、およびユビキチン−６ｘＨｉｓを含む、大腸菌における発現のための代替的なシクロチドコンストラクトの略図である。
【００５８】
【図１９Ａ】ユビキチンに融合された標的ペプチドの酵素プロセシング産物のＭＡＬＤＩ  ＭＳプロファイルを示すグラフ図である。標的ペプチドは、（Ａ）ＳＦＴＩ１−Ｉ１０Ｒ−ユビキチン（配列番号７２）（１ｍｇ／ｍＬの全タンパク質）、（Ｂ）ｋＢ１−ユビキチン（配列番号７４）（０．９ｍｇ／ｍＬの全タンパク質）、および（Ｃ）Ｖｃ１．１−ユビキチン（配列番号７６）（０．２４ｍｇ／ｍＬの全タンパク質）である。（ｉ）ｒＯａＡＥＰ１ｂ（１９．７〜９８．５μｇ／ｍＬ）と共に、（ｉｉ）ｒＯａＡＥＰ４（１９．７〜３０μｇ／ｍＬ）と共に、または（ｉｉｉ）酵素なしで、２２時間インキュベートした後に得られた質量が、示されている。Ｃｙｃは、環状産物を表す。＋２２Ｄａのピークは、ナトリウム付加物である可能性が高く、−１６Ｄａのピークは、酸化されたメチオニンである可能性が高く、＋６０Ｄａのピークは、ナトリウム付加物（＋２２Ｄａ）およびカリウム付加物（＋３８Ｄａ）の両方を保有する環状産物である可能性が高いか、または調製物中の不純物に由来し得る。
【図１９Ｂ】２２時間のインキュベーション後の、異なるＡＥＰ（１９．７μｇ／ｍＬの全タンパク質）によるカラタＢ１−ユビキチン融合タンパク質（配列番号７４）（２６０μｇ／ｍＬの全タンパク質）の酵素プロセシングを示すグラフ図である。およそ２μｇの出発材料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗−６ｘＨｉｓマウスモノクローナル抗体でのウェスタンブロッティングによって分析した。
【００５９】
【図２０Ａ】ピキア・パストリスの形質転換のためのコンストラクトの概略図である。コンストラクト１は、要素を単一のコンストラクトに含み、順に、ＥＲシグナル配列、液胞標的化シグナル（Ｖａｃ）、シクロチドドメイン、短いリンカー、およびプロＡＥＰドメインを含む。コンストラクト２は、ＥＲシグナル配列、液胞標的化シグナル、シクロチドドメイン、および短いリンカーを含む。コンストラクト３は、ＥＲシグナル配列、液胞標的化ドメイン、およびプロＡＥＰドメインを含む。コンストラクト２および３は、共形質転換される。黒塗りの三角形は、ＡＥＰ切断部位を示し、白抜きの三角形は、液胞標的化シグナルの切断を表す。
【図２０Ｂ】ピキア・パストリスの形質転換のための代替的なコンストラクトの略図である。コンストラクト４および５は、液胞標的化シグナルとシクロチドドメインとの間にカラタＢ１  Ｎ末端リピート（ＮＴＲ）が付加されていることを除き、それぞれ、コンストラクト１および２（図２０Ａ）と同一である。
【００６０】
【図２１】カラタＢ１およびＡＥＰが、同じ転写ユニットから発現される場合の、ＯａＡＥＰ１ｂの発現を示すグラフである（配列番号７７および７８）。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ＡＥＰ１ｂポリクローナルウサギ血清を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。陰性対照は、同じ条件下で発現および抽出された無関係のタンパク質を示す。Ｔは全タンパク質であり、Ｌは溶解後の全タンパク質であり、Ｓは溶解後の可溶性タンパク質であり、Ｃは溶解後の濃縮可溶性タンパク質であり、＋ｖｅは、陽性対照、活性化前のｒＯａＡＥＰ１ｂである。
【００６１】
【図２２】ｒＯａＡＥＰ１ｂによって触媒される、ｒＯａＡＥＰ１ｂ切断部位および６ｘＨｉｓタグを組み込んだＣ末端隣接配列を有する第１のペプチド（ＮａＤ１）と、ｒＯａＡＥＰ１ｂに適合性のＮ末端を含む第２のペプチドとの間のポリペプチドのライゲーションの概略図である。第１のペプチドの脱離基を下線で示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本明細書全体を通じて、文脈により他の意味とすべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、示された要素もしくは整数もしくは方法ステップ、または要素もしくは整数もしくは方法ステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップの群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。
【００６３】
本明細書において使用されるとき、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の態様を含む。したがって、例えば、「１つの環状ペプチド」への参照は、単一の環状ペプチド、ならびに２つ以上の環状ペプチドを含み、「１つのＡＥＰ」への参照は、単一のＡＥＰ、ならびに２つ以上のＡＥＰを含み、「その開示」への参照は、その開示によって教示される単一の態様および複数の態様を含む。本明細書において教示され、実現される態様は、「本発明」という用語に包含される。すべてのそのような態様は、本発明の範囲内で実現される。
【００６４】
本明細書は、環状ペプチドおよびペプチド複合体を産生する方法を教示する。「環状ペプチド」という用語は、「シクロチド」を包含するが、これに限定されない。環状ペプチドは、骨格環化によって環状となったペプチドである。環状ペプチドは、天然に環状であってもよく、天然には環状でない直鎖状ポリペプチド前駆体に由来してもよい。したがって、環状ペプチドが由来するポリペプチド前駆体は、天然の環化基質であってもよく、または環化に適合された天然の直鎖状ペプチドであってもよい。「ペプチド」という用語には、ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。曖昧さを回避するため、例えば、「環状ペプチド」、「ポリペプチド前駆体」、「複合体ペプチド」などへの言及は、「環状ポリペプチド」もしくは「環状タンパク質」、「前駆体ペプチド」もしくは「前駆体タンパク質」、または「複合体ポリペプチド」もしくは「複合体タンパク質」を除外するものではない。
【００６５】
本方法は、受容器または細胞のいずれかにおける、（ｉ）環化活性を有するＡＥＰと、（ｉｉ）環状ペプチドの直鎖状ポリペプチド前駆体とを共にインキュベートすることを含む。ＡＥＰは、ポリペプチド前駆体のプロセシングを触媒して、切除および環状ペプチドの環化を促進する。受容器において行われる場合、環状ペプチドは、精製される。環化が、細胞において触媒される場合、環状ペプチドは、細胞内の液胞または他のコンパートメントから単離される。「ペプチド複合体」という用語は、２つ以上のペプチドが、一緒にライゲートされたものを意味し、ここで、少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識配列を含み、もう一方のペプチドが、Ｎ末端ＡＥＰ認識配列を含む。
【００６６】
直鎖状ポリペプチド前駆体は、Ｃ末端のＡＥＰプロセシング部位を含む。Ｃ末端プロセシング部位は、実際の切断部位よりも前にＰ３〜Ｐ１と、切断部位の後、Ｃ末端に向かって、Ｐ１’〜Ｐ３’と、を含むとして定義されるアミノ酸配列であることが一般的であるが、それに限られるものではない。ある実施形態において、Ｐ３〜Ｐ１およびＰ１’〜Ｐ３’は、アミノ酸配列：
Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７
を有し、
ここで、Ｘは、アミノ酸残基であり、
Ｘ２は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は、ＮまたはＤであり、
Ｘ５は、ＧまたはＳであり、
Ｘ６は、ＬまたはＡまたはＩであり、
Ｘ７は、任意選択、または任意のアミノ酸である。
【００６７】
ある実施形態において、Ｘ２〜Ｘ７は、アミノ酸配列：
Ｘ２Ｘ３ＮＧＬＸ７
を含み、
ここで、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ７は、上記に定義される通りである。
【００６８】
直鎖状ポリペプチド前駆体のＮ末端は、特定のＡＥＰプロセシング部位含んでいなくてもよく、またはＰ１”〜Ｐ３”のうちのいずれか１つによって定義されるプロセシング部位を含んでもよく、ここで、Ｐ１”〜Ｐ３”は、
Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１によって定義され、
ここで、Ｘは、アミノ酸残基であり、
Ｘ９は、任意選択、任意のアミノ酸、またはＧ、Ｑ、Ｋ、Ｖ、もしくはＬであり、
Ｘ１０は、任意選択、または任意のアミノ酸、またはＬ、Ｆ、もしくはＩ、または疎水性アミノ酸残基であり、
Ｘ１１は、任意選択であり、任意のアミノ酸である。
【００６９】
ある実施形態において、Ｘ９〜Ｘ１１は、アミノ酸配列：
ＧＬＸ１１
を含み、
ここで、Ｘ１１は、上記に定義される通りである。
【００７０】
ある実施形態において、ＡＥＰプロセシング部位は、配列：
ＧＬＸ１１［Ｘｎ］Ｘ１Ｘ２ＮＧＬＸ６
を含む、Ｎ末端およびＣ末端配列を含み、
ここで、Ｘ１１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ７は、上記に定義される通りであり、［Ｘｎ］は、非存在（ｎ＝０）、または１〜２０００個のアミノ酸の配列の任意のアミノ酸残基である。「１〜２０００個」への言及は、１〜１０００個および１〜５００個を含み、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０８６、１０８７、１０８８、１０８９、１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、１０９７、１０９８、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４１、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４６、１１４７、１１４８、１１４９、１１５０、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５７、１１５８、１１５９、１１６０、１１６１、１１６２、１１６３、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７４、１１７５、１１７６、１１７７、１１７８、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３、１１８４、１１８５、１１８６、１１８７、１１８８、１１８９、１１９０、１１９１、１１９２、１１９３、１１９４、１１９５、１１９６、１１９７、１１９８、１１９９、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１０、１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、１２１５、１２１６
、１２１７、１２１８、１２１９、１２２０、１２２１、１２２２、１２２３、１２２４、１２２５、１２２６、１２２７、１２２８、１２２９、１２３０、１２３１、１２３２、１２３３、１２３４、１２３５、１２３６、１２３７、１２３８、１２３９、１２４０、１２４１、１２４２、１２４３、１２４４、１２４５、１２４６、１２４７、１２４８、１２４９、１２５０、１２５１、１２５２、１２５３、１２５４、１２５５、１２５６、１２５７、１２５８、１２５９、１２６０、１２６１、１２６２、１２６３、１２６４、１２６５、１２６６、１２６７、１２６８、１２６９、１２７０、１２７１、１２７２、１２７３、１２７４、１２７５、１２７６、１２７７、１２７８、１２７９、１２８０、１２８１、１２８２、１２８３、１２８４、１２８５、１２８６、１２８７、１２８８、１２８９、１２９０、１２９１、１２９２、１２９３、１２９４、１２９５、１２９６、１２９７、１２９８、１２９９、１３００、１３０１、１３０２、１３０３、１３０４、１３０５、１３０６、１３０７、１３０８、１３０９、１３１０、１３１１、１３１２、１３１３、１３１４、１３１５、１３１６、１３１７、１３１８、１３１９、１３２０、１３２１、１３２２、１３２３、１３２４、１３２５、１３２６、１３２７、１３２８、１３２９、１３３０、１３３１、１３３２、１３３３、１３３４、１３３５、１３３６、１３３７、１３３８、１３３９、１３４０、１３４１、１３４２、１３４３、１３４４、１３４５、１３４６、１３４７、１３４８、１３４９、１３５０、１３５１、１３５２、１３５３、１３５４、１３５５、１３５６、１３５７、１３５８、１３５９、１３６０、１３６１、１３６２、１３６３、１３６４、１３６５、１３６６、１３６７、１３６８、１３６９、１３７０、１３７１、１３７２、１３７３、１３７４、１３７５、１３７６、１３７７、１３７８、１３７９、１３８０、１３８１、１３８２、１３８３、１３８４、１３８５、１３８６、１３８７、１３８８、１３８９、１３９０、１３９１、１３９２、１３９３、１３９４、１３９５、１３９６、１３９７、１３９８、１３９９、１４００、１４０１、１４０２、１４０３、１４０４、１４０５、１４０６、１４０７、１４０８、１４０９、１４１０、１４１１、１４１２、１４１３、１４１４、１４１５、１４１６、１４１７、１４１８、１４１９、１４２０、１４２１、１４２２、１４２３、１４２４、１４２５、１４２６、１４２７、１４２８、１４２９、１４３０、１４３１、１４３２、１４３３、１４３４、１４３５、１４３６、１４３７、１４３８、１４３９、１４４０、１４４１、１４４２、１４４３、１４４４、１４４５、１４４６、１４４７、１４４８、１４４９、１４５０、１４５１、１４５２、１４５３、１４５４、１４５５、１４５６、１４５７、１４５８、１４５９、１４６０、１４６１、１４６２、１４６３、１４６４、１４６５、１４６６、１４６７、１４６８、１４６９、１４７０、１４７１、１４７２、１４７３、１４７４、１４７５、１４７６、１４７７、１４７８、１４７９、１４８０、１４８１、１４８２、１４８３、１４８４、１４８５、１４８６、１４８７、１４８８、１４８９、１４９０、１４９１、１４９２、１４９３、１４９４、１４９５、１４９６、１４９７、１４９８、１４９９、１５００、１５０１、１５０２、１５０３、１５０４、１５０５、１５０６、１５０７、１５０８、１５０９、１５１０、１５１１、１５１２、１５１３、１５１４、１５１５、１５１６、１５１７、１５１８、１５１９、１５２０、１５２１、１５２２、１５２３、１５２４、１５２５、１５２６、１５２７、１５２８、１５２９、１５３０、１５３１、１５３２、１５３３、１５３４、１５３５、１５３６、１５３７、１５３８、１５３９、１５４０、１５４１、１５４２、１５４３、１５４４、１５４５、１５４６、１５４７、１５４８、１５４９、１５５０、１５５１、１５５２、１５５３、１５５４、１５５５、１５５６、１５５７、１５５８、１５５９、１５６０、１５６１、１５６２、１５６３、１５６４、１５６５、１５６６、１５６７、１５６８、１５６９、１５７０、１５７１、１５７２、１５７３、１５７４、１５７５、１５７６、１５７７、１５７８、１５７９、１５８０、１５８１、１５８２、１５８３、１５８４、１５８５、１５８６、１５８７、１５８８、１５８９、１５９０、１５９１、１５９２、１５９３、１５９４、１５９５、１５９６、１５９７、１５９８、１５９９、１６００、１６０１、１６０２、１６０３、１６０４、１６０５、１６０６、１６０７、１６０８、１６０９、１６１０、１６１１、１６１２、１６１３、１６１４、１６１５、１６１６、１６１７、１６１８、１６１９、１６２０、１６２１、１６２２、１６２３、１６２４、１６２５、１６２６、１６２７、１６２８、１６２９、１６３０、１６３１、１６３２、１６３３、１６３４、１６３５、１６３６、１６３７、１６３８、１６３９、１６４０、１６４１、１６４２、１６４３、１６４４、１６４５、１６４６、１６４７、１６４８、１６４９、１６５０、１６５１、１６５２、１６５３、１６５４、１６５５、１６５６、１６５７、１６５８、１６５９、１６６０、１６６１、１６６２、１６６３、１６６４、１６６５、１６６６、１６６７、１６６８、１６６９、１６７０、１６７１、１６７２、１６７３、１６７４、１６７５、１６７６、１６７７、１６７８、１６７９、１６８０、１６８１、１６８２、１６８３、１６８４、１６８５、１６８６、１６８７、１６８８、１６８９、１６９０、１６９１、１６９２、１６９３、１６９４、１６９５、１６９６、１６９７、１６９８、１６９９、１７００、１７０１、１７０２、１７０３、１７０４、１７０５、１７０６、１７０７、１７０８、１７０９、１７１０、１７１１、１７１２、１７１３、１７１４、１７１５、１７１６、１７１７、１７１８、１７１９、１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、１７３５、１７３６、１７３７、１７３８、１７３９、１７４０、１７４１、１７４２、１７４３、１７４４、１７４５、１７４６、１７４７、１７４８、１７４９、１７５０、１７５１、１７５２、１７５３、１７５４、１７５５、１７５６、１７５７、１７５８、１７５９、１７６０、１７６１、１７６２、１７６３、１７６４、１７６５、１７６６、１７６７、１７６８、１７６９、１７７０、１７７１、１７７２、１７７３、１７７４、１７７５、１７７６、１７７７、１７７８、１７７９、１７８０、１７８１、１７８２、１７８３、１７８４、１７８５、１７８６、１７８７、１７８８、１７８９、１７９０、１７９１、１７９２、１７９３、１７９４、１７９５、１７９６、１７９７、１７９８、１７９９、１８００、１８０１、１８０２、１８０３、１８０４、１８０５、１８０６、１８０７、１８０８、１８０９、１８１０、１８１１、１８１２、１８１３、１８１４、１８１５、１８１６、１８１７、１８１８、１８１９、１８２０、１８２１、１８２２、１８２３、１８２４、１８２５、１８２６、１８２７、１８２８、１８２９、１８３０、１８３１、１８３２、１８３３、１８３４、１８３５、１８３６、１８３７、１８３８、１８３９、１８４０、１８４１、１８４２、１８４３、１８４４、１８４５、１８４６、１８４７、１８４８、１８４９、１８５０、１８５１、１８５２、１８５３、１８５４、１８５５、１８５６、１８５７、１８５８、１８５９、１８６０、１８６１、１８６２、１８６３、１８６４、１８６５、１８６６、１８６７、１８６８、１８６９、１８７０、１８７１、１８７２、１８７３、１８７４、１８７５、１８７６、１８７７、１８７８、１８７９、１８８０、１８８１、１８８２、１８８３、１８８４、１８８５、１８８６、１８８７、１８８８、１８８９、１８９０、１８９１、１８９２、１８９３、１８９４、１８９５、１８９６、１８９７、１８９８、１８９９、１９００、１９０１、１９０２、１９０３、１９０４、１９０５、１９０６、１９０７、１９０８、１９０９、１９１０、１９１１、１９１２、１９１３、１９１４、１９１５、１９１６、１９１７、１９１８、１９１９、１９２０、１９２１、１９２２、１９２３、１９２４、１９２５、１９２６、１９２７、１９２８、１９２９、１９３０、１９３１、１９３２、１９３３、１９３４、１９３５、１９３６、１９３７、１９３８、１９３９、１９４０、１９４１、１９４２、１９４３、１９４４、１９４５、１９４６、１９４７、１９４８、１９４９、１９５０、１９５１、１９５２、１９５３、１９５４、１９５５、１９５６、１９５７、１９５８、１９５９、１９６０、１９６１、１９６２、１９６３、１９６４、１９６５、１９６６、１９６７、１９６８、１９６９、１９７０、１９７１、１９７２、１９７３、１９７４、１９７５、１９７６、１９７７、１９７８、１９７９、１９８０、１９８１、１９８２、１９８３、１９８４、１９８５、１９８６、１９８７、１９８８、１９８９、１９９０、１９９１、１９９２、１９９３、１９９４、１９９５、１９９６、１９９７、１９９８、１９９９および２０００個などであるがこれらに限定されない。
【００７１】
ある実施形態において、Ｃ末端プロセシング部位は、Ｐ４〜Ｐ１およびＰ１’〜Ｐ４’を含み、Ｐ１〜Ｐ４およびＰ１’〜Ｐ４’は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含み、ここで、Ｘ２〜Ｘ７は、上記に定義される通りであり、Ｘ７は、任意選択、または任意のアミノ酸であり、Ｘ８は、任意選択、または任意のアミノ酸である。
【００７２】
本発明は、環化活性を有するＡＥＰと、直鎖状ポリペプチド前駆体とを共にインキュベートすることに関連する様々な態様を含み、これらには以下のものが含まれる。
（ｉ）原核生物細胞または真核生物細胞に、ＡＥＰをコードする遺伝子ベクターを導入し、ＡＥＰが発現され、次いで、ＡＥＰを単離し、インビトロでの環化反応に使用して、直鎖状ポリペプチド前駆体から環状ペプチドを生成すること、
（ｉｉ）原核生物細胞または真核生物細胞に、直鎖状ポリペプチド前駆体をコードする遺伝子ベクターを導入し、直鎖状ポリペプチド前駆体が発現され、これを精製し、任意選択で、非天然のアミノ酸残基を導入するように翻訳後修飾し、次いで、ＡＥＰを使用してインビトロでの環化に供して、環状ペプチドを形成すること（これには、同位体標識したペプチドの産生など、細胞における修飾が含まれる）、ならびに
（ｉｉｉ）原核生物細胞または真核生物細胞に、ＡＥＰおよびポリペプチド前駆体をコードする単一または複数の遺伝子ベクターを導入し、これにより、細胞の液胞または他の細胞内コンパートメントにおける環状ペプチドの産生を可能にすること。
【００７３】
態様（ｉｉ）は、直鎖状ポリペプチド前駆体が合成により産生され、特定の源から単離されるように修正することができる。直鎖状ペプチド複合体は、インビトロまたはインビボにおいて生成することができる。真核生物細胞の場合には、ＡＥＰおよび直鎖状ポリペプチド前駆体を、異なる細胞または同じ細胞の異なる細胞内コンパートメントにおいて産生し、単離した後、インビトロで使用してもよい。態様（ｉｉ）、原核生物細胞での場合、非限定的な実施形態において、環状ペプチドは、細胞膜周囲腔におけるＡＥＰとの共発現によって生成される。ポリペプチド前駆体は、天然の環化基質であってもよく、または通常は直鎖状ペプチドであってもよく、これが環化される。直鎖状ペプチドの環状形態を作製することにより、安定性、有効性、および有用性を向上させることができる。
【００７４】
「共にインキュベートすること」とは、受容器または反応容器中でインビトロで共にインキュベートすること、ならびに細胞内で共にインキュベートすることを意味する。加えて、ＡＥＰはまた、少なくとも２つのペプチドのペプチド複合体の生成を可能にするリガーゼ活性も有し、ここで、少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識配列を含み、少なくとも１つの他のペプチドが、Ｎ末端ＡＥＰ認識配列を含む。
【００７５】
したがって、環状ペプチドの産生方法であって、原核生物細胞または真核生物細胞に、発現されると、環化能力を有するＡＥＰを生成する、遺伝子材料を導入するステップと、ＡＥＰを単離するステップと、次いで、ＡＥＰを、ポリペプチド前駆体から環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、任意選択で非天然のアミノ酸残基もしくは架橋結合を導入するような翻訳後修飾または他の修飾を組み込んだポリペプチド前駆体と共にインキュベートするステップと、を含むか、あるいは原核生物細胞または真核生物細胞において、細胞の液胞または他の細胞内コンパートメントにおいて環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、環化能力を有するＡＥＰおよび直鎖状ポリペプチド前駆体をコードする遺伝子材料を共発現するステップを含む、方法が、本明細書において実現される。加えて、ＡＥＰは、２つ以上のペプチドを複合体するライゲーション反応を触媒することができ、ここで、少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識配列を含み、もう一方のペプチドが、Ｎ末端ＡＥＰ認識配列を含む。細胞はまた、インビトロでの環状ペプチドの生成に使用するためのＡＥＰおよび／またはポリペプチド前駆体のうちの一方または両方を生成するために使用することができる。ある実施形態において、環状ペプチドは、原核生物細胞の細胞膜周囲腔における、環化能力を有するＡＥＰと標的ポリペプチドとの共発現によって産生される。
【００７６】
直鎖状ペプチド複合体を生成する方法であって、少なくとも２つのペプチドが一緒にライゲートしてペプチド複合体を形成するのに十分な時間および条件下で２つ以上のペプチドを共にインキュベートするステップを含み、少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識配列を含み、少なくとも１つの他のペプチドが、Ｎ末端ＡＥＰ認識配列を含む、方法が、本明細書においてさらに実現される。
【００７７】
上述のように、「ペプチド」への言及は、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語の使用により、タンパク質性分子のサイズまたは種類に関する制限は意図されない。
【００７８】
「ベクター」は、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えプラスミドまたはウイルスを指す。送達されるポリヌクレオチドは、ＡＥＰおよび／もしくはポリペプチド前駆体のコーディング配列、または同じかもしくは異なるペプチドの複数の形態を含む。この用語には、主にＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入する機能を果たすベクター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳の機能を果たす発現ベクターが含まれる。上述の機能を、１つを上回って提供するベクターもまた、含まれる。
【００７９】
原核生物細胞または真核生物細胞に関連するベクターとしては、多重遺伝子発現ビヒクルが挙げられる。２つ以上の転写ユニットセグメントを含むポリヌクレオチドからなるビヒクルなどであるが、各セグメントが、ＡＥＰまたは直鎖状ポリペプチド前駆体をコードし、各セグメントが、リンカーペプチドをコードするリンカーセグメントによって直鎖状配列で次のセグメントに接合されており、転写セグメントがすべて、単一のプロモーターに作動可能に連結された同じリーディングフレーム内にある。複数のポリペプチドリピートまたは複数の異なるポリペプチドもまた、生成され得る。ベクターには、タンパク質をコードし、安定な発現を可能にする、修飾されたヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含むウイルス発現ベクターも含まれる。あるいは、それぞれがＡＥＰまたは直鎖状ポリペプチド前駆体をコードする複数のベクターが使用される。
【００８０】
「転写ユニット」は、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの転写を誘導することができる核酸セグメントである。典型的に、転写ユニットは、転写されるポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、転写されるポリヌクレオチドの開始部位または終結部位の上流または下流のいずれかに位置する任意選択の制御配列と、を含む。あるいは、多重遺伝子発現ビヒクルとして、単一のプロモーターおよびターミネーターを使用して、単一の転写ユニットから１つを上回るタンパク質が産生される。転写ユニットには、ＡＥＰもしくはポリペプチド前駆体のいずれか、または両方をコードするユニットが含まれる。
【００８１】
真核生物細胞としては、酵母、糸状菌、および植物細胞が挙げられる。「酵母細胞」としては、ピキア・パストリスなどであるがこれに限定されないピキア種、ならびにサッカロマイセス種またはクリベロマイセス種が挙げられる。他の真核生物細胞としては、非ヒト哺乳動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。原核生物細胞としては、大腸菌または組換えタンパク質の産生に好適な一部の他の原核生物が挙げられる。
【００８２】
「宿主」細胞は、原核生物細胞（例えば、大腸菌）または真核生物細胞（例えば、ピキア種などの酵母細胞）を包含する。
【００８３】
「核酸」配列、「ポリヌクレオチド」配列、および「ヌクレオチド」配列という用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態、またはそれらの類似体を指す。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、遺伝子または遺伝子フラグメントの系統から定義される１つまたは複数の遺伝子座、連鎖分析により定義される１つまたは複数の遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、ＡＥＰ、または環化されるタンパク質の直鎖状前駆体もしくはライゲートされる２つの直鎖状ペプチドを含む直鎖状ポリペプチド前駆体、または選択可能なマーカーをコードする。
【００８４】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に、ＡＥＰまたはポリペプチド前駆体をコードすることができる、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【００８５】
本明細書に使用されるとき、「発現」とは、ポリヌクレオチド転写ユニットが、ｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（「転写産物」とも称される）が、続いて、ＡＥＰもしくはポリペプチド前駆体に翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、集合的に、「遺伝子産物」と称される。
【００８６】
直鎖状ポリペプチド前駆体の文脈において、「直鎖状」配列は、配列内で互いに隣接するアミノ酸残基が、ポリペプチドの一次構造において連続している、ポリペプチドにおけるアミノ酸のＮ末端からＣ末端の方向での順列である。「前駆体」は、ＡＥＰが環状ペプチドを生成するための基質である。直鎖状ペプチド複合体は、少なくとも２つのペプチドのライゲーション後に生成され、ここで、少なくとも１つのペプチドは、Ｃ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含み、少なくとも１つのペプチドは、Ｎ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含む。
【００８７】
「病原体」は、真菌、昆虫、細菌、線虫、蠕虫、軟体動物、ウイルス、および原虫生物から選択される、植物または動物またはヒトの病原体を含む。
【００８８】
環状ペプチドの産生方法であって、ペプチド環化活性を有するＡＥＰと、環状ペプチドの直鎖状ポリペプチド前駆体とを、環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で共にインキュベートするステップを含む、方法が、本明細書において実現される。共にインキュベートすることは、受容器において（インビトロで）、または細胞の液胞もしくは他の細胞内コンパートメントなど、細胞において、起こり得る。共にインキュベートすることが、インビトロにおいて行われる場合、ＡＥＰまたは直鎖状ポリペプチド前駆体は、原核生物細胞または真核生物細胞において産生される。直鎖状ポリペプチド前駆体はまた、細胞において産生し、単離し、非天然のアミノ酸残基もしくは非天然の架橋結合を組み込むか、または同位体標識されるように、任意選択で翻訳後修飾するか合成で生成してもよい。共にインキュベートすることが、細胞において起こる場合、これは、真核生物細胞の液胞もしくは他のコンパートメントにおいて起こり得るか、または原核生物細胞の細胞膜周囲腔において起こり得る。
【００８９】
シクロチド・カラタＢ１（ｏａｋ１）の前駆体遺伝子および他のペプチドと共に発現されると、骨格の環化に有効である、シクロチド産生植物に由来するＡＥＰが、特定されている。ライゲーション能力のあるＡＥＰのアミノ酸配列と、タンパク質分解に有利なＡＥＰのアミノ酸配列とを比較することにより、特異性に寄与する活性優先性ループ（ＡＰＬ）と称される差次的なループ領域が、特定されている。リガーゼ能力のあるＡＥＰにおいて、ＡＰＬは、複数の残基が欠けているか、または疎水性のアミノ酸ストレッチで置き換えられている（図５Ａ）。
【００９０】
シクラーゼ機能と関連するさらなる残基は、実験的に決定されたシクラーゼ配列および非シクラーゼ配列のセットを使用した機械学習（タンパク質配列空間分析）によって特定される。以下の残基は、現時点で判明しているシクラーゼおよび非シクラーゼにおいて、シクラーゼ機能を高度に予測することがわかっている。すべての番号付けは、ＯａＡＥＰ１ｂ（図４、配列番号１）に対して付与されたものである。
１．ＡＰＬ−ＯａＡＥＰ１の２９９〜３００の領域における残基の非存在は、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
２．セット１−以下の活性部位の残基の存在もまた、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
・Ｄ１６１
・Ｃ２４７
・Ｙ２４８
・Ｑ２５３
・Ａ２５５
・Ｖ２６３
３．セット２−以下の活性部位の近傍の残基の存在もまた、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
・Ｋ１８６
・Ｄ１９２
４．セット３−以下の非活性部位の表面残基の存在もまた、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
・Ｋ１３９
・Ｈ２９３
・Ｅ３１４
・Ｇ３１６
【００９１】
全体的には、配列が、以下のいずれかを含む場合に、シクラーゼ活性が高く予測される。
・短縮されたＡＰＬ
・セット１の６つの活性部位残基うちの３つ
・セット２の活性部位の近傍の残基の両方
・セット３の４つの非活性部位残基のうちの３つ
【００９２】
最も予測性が高いのは、ＡＰＬおよびセット１である。これらの基準のうち適合するものが多いほど、シクラーゼとみられる可能性が高い。シクラーゼ活性を予測する残基を、表２に示す。残基の番号付けは、ＯａＡＥＰ１ｂ（図４、配列番号１）に対するものである。シクラーゼ活性を強く予測する残基の特性は、障害傾向（ＤＩＳＯＲＤ）、正味の静電荷（ＣＨＲＧ）、Ｒ基の分子量（ＲＭＷ）、および疎水性親水性指標（ＨＰＡＴＨ）である。
【００９３】
表２に記載されている１７個の予測残基のうちの少なくとも２５％、または５つ以上を有するＡＥＰは、シクラーゼとして優先的に作用する可能性が高いと考えられる。予測残基のうちの少なくとも２５％が存在するという要件により、判明しているシクラーゼの１００％を正しく特定すると同時に、その時点で少なくとも８０％、例えば、その時点で少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％の判明している非シクラーゼを除外することが可能である。ある実施形態において、本明細書において確立されている法則により、その時点で非シクラーゼを９４％除外することが可能である。非シクラーゼであるために除外される１つのＡＥＰは、ＯａＡＥＰ２（配列番号３）である。
【００９４】
したがって、ＡＥＰが、環化活性を有する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、ＡＥＰのアミノ酸配列を判定するステップと、この配列を、最良の適合度で、ＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）のアミノ酸配列とアライメントするステップと、１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在に関してスクリーニングするステップを含み、ここで、ギャップは、残基の非存在を意味し、列挙された残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在が、シクラーゼであるＡＥＰを示す、方法が、本明細書において教示される。
【００９５】
ある実施形態において、列挙された部位においてスクリーニングされる５〜１７個の残基またはギャップとしては、５個、６個、７個、８個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、または１７個の残基またはギャップが挙げられる。代替的な表現において、列挙された残基が、列挙された残基またはギャップの少なくとも２５％を有する場合、ＡＥＰは、シクラーゼと考えられる。「少なくとも２５％」とは、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を意味する。
【００９６】
なおもさらなる代替手段において、残基１３９Ｄ、１６１Ｎ、１８６Ｇ、１９２Ｎ、２４７Ｇ、２４８Ｔ、２５３Ｅ、２５５Ｐ、２６３Ｔ、２９３Ｌ、ＯａＡＥＰ１ｂの残基２９９〜３００にアライメントする残基−Ｎ、Ｇ、Ｎ、Ｙ、およびＳ、３１４Ｋ、ならびに３１６Ｋのうちの１３個以上または７５％の存在は、シクラーゼではないＡＥＰを示す。「１３個以上」への言及は、１３個、１４個、１５個、１６個、および１７個を意味する。「少なくとも７５％」への言及は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を意味する。したがって、ＡＥＰが、環化活性を有する可能性が低いかどうかを判定する方法であって、ＡＥＰのアミノ酸配列を判定するステップと、この配列を、最良の適合度で、ＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）のアミノ酸配列とアライメントするステップと、残基１３９Ｄ、１６１Ｎ、１８６Ｇ、１９２Ｎ、２４７Ｇ、２４８Ｔ、２５３Ｅ、２５５Ｐ、２６３Ｔ、２９３Ｌ、ＯａＡＥＰ１ｂの残基２９９〜３００にアライメントする残基Ｎ、Ｇ、Ｎ、Ｙ、およびＳ、３１４Ｋ、ならびに３１６Ｋのうちの１３個以上の存在に関してスクリーニングするステップと、を含み、ここで、列挙された残基のうちの１３個以上の存在は、シクラーゼではないＡＥＰを示す、方法が、本明細書において実現される。
【００９７】
本発明は、上記に定義されるものなど、ペプチド環化活性を有する任意のＡＥＰに及ぶ。オルデンランディア・アフィニスに由来するＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号１）、ＯａＡＥＰ１（配列番号２）、およびＯａＡＥＰ３（配列番号４）などであるがこれらに限定されない、任意の他のＡＥＰが、本明細書に包含される。他のＡＥＰとしては、最適なアライメント後に、配列番号１（ＯａＡＥＰ１ｂ）、配列番号２（ＯａＡＥＰ１）、または配列番号４（ＯａＡＥＰ３）に少なくとも８０％のアミノ酸類似性を有し、ＡＥＰおよびペプチド環化活性を保持する、ＡＥＰが挙げられ、ここで、ＡＥＰは、１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上またはこれらの残基の非存在を含み、ギャップは、配列番号１に最適にアライメントしたときの残基の非存在を意味する。ＡＥＰはまた、ペプチド複合体の生成を促進するリガーゼ活性も有し得る。ＯａＡＥＰ２（配列番号３）は、シクラーゼではないＡＥＰの例である。ただし、シクラーゼＡＥＰを包含する記述が、ＯａＡＥＰ２（配列番号３）を含まないことを条件とする。
【００９８】
原核生物細胞において、コンストラクトにおける最初のＮ末端残基は、メチオニンである必要がある。Ｎ末端メチオニンが環化を妨げる場合には、代替的なアプローチが用いられる。例として、
−原核生物細胞によって発現される内因性メチオニンアミノペプチダーゼを利用して、開始メチオニンをインビボで除去し、環化に適したＮ末端を露出させる（非特許文献２８）。
−追加的な残基を無駄なく放出するプロテアーゼ（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子）の認識配列を、ポリペプチド前駆体のＮ末端に付加し、切断後に環化に適したＮ末端を露出させる。
【００９９】
「少なくとも８０％」への言及には、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が含まれる。
【０１００】
「類似性」という用語は、本明細書に使用されるとき、比較される配列間における、アミノ酸レベルでの厳密な同一性を含む。アミノ酸レベルで非同一性が存在する場合、「類似性」には、それでもなお、構造的、機能的、生化学的、および／または立体配置的なレベルで互いに関連する、アミノ酸が含まれる。特に好ましい実施形態において、アミノ酸配列の比較は、類似性ではなく同一性のレベルで行われる。
【０１０１】
２つ以上のポリペプチド間の配列関係性を説明するために使用される用語には、「基準配列」、「比較ウインドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性の割合」、「配列同一性の割合」、「実質的に類似」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「基準配列」には、少なくとも１０個のアミノ酸残基（例えば、１０個〜１００個のアミノ酸）が含まれる。「比較ウインドウ」は、基準配列と比較される典型的には１０個の連続的なアミノ酸残基の概念上のセグメントを指す。比較ウインドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウをアライメントするのに最適な配列アライメントは、コンピュータによるアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア・パッケージリリース７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるＢＬＡＳＴＰ  ２．２．３２＋、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生成される探索および最良のアライメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最も高い割合の相同性をもたらすもの）によって行うことができる。例えば、非特許文献３０）によって開示されるように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムへの参照もなされ得る。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら（非特許文献３１）の第１９．３部に見出すことができる。
【０１０２】
「配列同一性」および「配列類似性」という用語は、本明細書に使用されるとき、配列が、比較のウインドウにわたって、アミノ酸を基準として、同一であるかまたは機能的もしくは構造的に類似である、程度を指す。したがって、「配列同一性の割合」は、例えば、最適にアライメントされた２つの配列を比較ウインドウにわたって比較し、両方の配列において同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が生じる数を決定して一致する位置の数を得、一致する位置の数を比較のウインドウ内の位置の合計数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、この結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることによって計算される。本発明の目的で、「配列同一性」は、標準的な既定値を使用してＢＬＡＳＴＰ  ２．２．３２＋コンピュータプログラムによって計算される「一致の割合」を意味すると理解されるであろう。同様の内容が、配列類似性に関して適用される。
【０１０３】
ある実施形態において、環状ペプチドの産生方法であって、環化活性を有し、最適なアライメント後に、配列番号１、配列番号２、および配列番号４からなる群から選択される配列に少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を有する（ここで、１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上の残基の存在または残基の非存在があり、ギャップは、残基の非存在を意味する）、ＡＥＰと、環状ペプチドの直鎖状ポリペプチド前駆体とを、環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で共にインキュベートすることを含む、方法が、本明細書において教示される。
【０１０４】
ある実施形態において、ＡＥＰをコードする発現ベクターを原核生物細胞に導入するステップと、ベクターの発現を可能にして、組換えＡＥＰを産生するステップと、ＡＥＰを細胞から単離するステップと、反応容器において、組換えＡＥＰを、環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、ポリペプチド前駆体と共にインキュベートするステップと、を含む、環状ペプチドをインビトロで産生する方法が、本明細書において実現される。
【０１０５】
環状ペプチドをインビトロで産生する方法であって、ペプチド環化活性を有するＡＥＰおよび直鎖状ポリペプチド前駆体のうちの一方または他方をコードする発現ベクターを、原核生物細胞または真核生物細胞に導入するステップと、ベクターの発現を可能にして、細胞もしくは細胞の成分または細胞膜周囲腔において、組換えＡＥＰおよび組換え直鎖状ポリペプチド前駆体を産生するステップと、ポリペプチド前駆体から生成された環状ペプチドを単離するステップと、を含む、方法が、本明細書において教示される。
【０１０６】
環状ペプチドをインビトロで産生する方法であって、ペプチド環化活性を有するＡＥＰをコードする発現ベクターを、原核生物細胞または真核生物細胞に導入するステップと、ＡＥＰを単離するステップと、反応容器において、ＡＥＰを、環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、ポリペプチド前駆体と共にインキュベートするステップと、を含む、方法が、本明細書において実現される。
【０１０７】
ポリペプチド前駆体は、組換え体であってもよく、または合成で産生されてもよい。組換えポリペプチドは、非天然のアミノ酸を導入するように翻訳後修飾されてもよく、または合成形態が、非天然のアミノ酸を組み込んでもよい。
【０１０８】
環状ペプチドをインビボで産生する方法であって、ペプチド環化活性を有するＡＥＰおよびポリペプチド前駆体をコードする発現ベクターの、原核生物細胞または真核生物細胞への導入と、ベクターの発現を可能にして、ＡＥＰおよび直鎖状ポリペプチド前駆体を産生して、環状ペプチドを産生するステップと、を含む、方法が、本明細書において実現される。ある実施形態において、これは、細胞膜周囲腔において起こり得るか、または液胞などの細胞内コンパートメントにおいて起こり得る。
【０１０９】
ある実施形態において、環状ペプチドをインビトロで産生する方法であって、ペプチド環化活性を有するＡＥＰまたは直鎖状ポリペプチド前駆体のうちの一方または他方をコードする発現ベクターを、原核生物細胞または真核生物細胞に導入するステップと、ベクターの発現を可能にして、組換えＡＥＰまたは組換え直鎖状ポリペプチド前駆体を産生するステップと、ＡＥＰまたはポリペプチドを細胞から単離するステップと、反応容器において、組換えＡＥＰを、環状ペプチドを生成するのに十分な時間および条件下で、ポリペプチド前駆体またはその翻訳後修飾形態もしくは合成修飾形態と共にインキュベートするステップと、を含む、方法が、本明細書において教示される。
【０１１０】
ある実施形態において、ＡＥＰは、最適なアライメント後に、配列番号１、２、および／または４のうちのいずれか１つまたは複数に少なくとも８０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１１】
上述のように、「少なくとも８０％」への言及は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を意味する。
【０１１２】
別の実施形態において、直鎖状ペプチドは、ＡＥＰのリガーゼ活性を使用して生成される。この実施形態において、Ｃ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含む第１のペプチドは、タグを有する場合も有さない場合もあるＮ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を有する第２のペプチドおよびＡＥＰと共にインキュベートされる。ＡＥＰは、第１のペプチドと第２のペプチドとの間のライゲーションを触媒して、直鎖状ペプチド複合体を生成する。この複合体が、続いて、環化されて環状ペプチドとなり得るか、または直鎖状ペプチドのまま使用され得る。これは、インビトロで起こる場合もインビボで起こる場合もある。
【０１１３】
ポリペプチド前駆体は、細胞においてポリペプチド前駆体をコードする核酸の発現によって生成される組換え分子であってもよく、または組換え手段に続いて翻訳後修飾（例えば、同位体標識）による産生もしくは合成手段による産生の組合せによって生成される組換え分子であってもよい。翻訳後修飾または合成形態に関しては、非天然のアミノ酸が導入され得る。「細胞」には、原核生物（例えば、大腸菌）細胞または真核生物（例えば、酵母）細胞が含まれる。ＡＥＰおよびポリペプチド前駆体をコードする核酸は、２つの別個の核酸コンストラクトで存在してもよく、または多重遺伝子発現ビヒクルなどの単一のコンストラクトの一部であってもよい。いずれの事例においても、核酸は、ＡＥＰおよび／またはポリペプチド前駆体の直鎖状形態を産生する核酸の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結されており、このポリペプチド前駆体の直鎖状形態が、次いで、インビトロまたは液胞もしくは他の細胞内コンパートメントにおいてインビボでのいずれかで、プロセシングされて環状ペプチドとなる。別の実施形態において、ＡＥＰを産生するように遺伝子修飾された細胞が維持され、これらの細胞は、次いで、ポリペプチド前駆体をコードする任意の所与の核酸の宿主となる。
【０１１４】
細胞において環状ペプチドを産生する方法であって、遺伝子ベクターを細胞に導入するステップを含み、この遺伝子ベクターは、それぞれがペプチド環化活性を有するＡＥＰまたはポリペプチド前駆体のいずれかをコードするポリヌクレオチドセグメントを含み、これらのポリヌクレオチドセグメントは、ポリヌクレオチドリンカーセグメントによって分離されており、ここで、すべてのポリヌクレオチドセグメントは、単一のプロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結された同じリーディングフレーム内にあり、真核生物細胞は、環状ペプチドが生成されるのに十分な時間および条件下で増殖され、この環状ペプチドが、次いで、液胞または他の細胞内コンパートメントから単離される、方法が、本明細書において教示される。
【０１１５】
細胞において環状ペプチドを産生する方法であって、２つの遺伝子ベクターを細胞に導入するステップを含み、これらの遺伝子ベクターは、一方がペプチド環化活性を有するＡＥＰをコードし、他方がポリペプチド前駆体をコードし、それぞれの遺伝子分子が、ＡＥＰまたはポリペプチド前駆体のいずれかをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよびターミネーターを含み、ここで、細胞は、環状ペプチドが生成されるのに十分な時間および条件下で増殖され、環状ペプチドが、次いで、液胞または他の細胞内コンパートメントから単離される、方法が、本明細書においてさらに教示される。
【０１１６】
別の実施形態において、ベクターは、環化される同じポリペプチドの複数の反復形態をコードするか、または環化される複数の異なるポリペプチドの形態をコードする。
【０１１７】
ある実施形態において、ＡＥＰは、最適なアライメント後に、配列番号１、２、および／または４のうちの１つまたは複数に少なくとも８０％の類似性を有するＡＥＰを含み、ここで、１３９Ｋ、１６１Ｄ、１８６Ｋ、１９２Ｄ、２４７Ｃ、２４８Ｙ、２５３Ｑ、２５５Ａ、２６３Ｖ、２９３Ｈ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ、ギャップ（残基２９９〜３００）、３１４Ｅ、および３１６Ｇの残基のうちの５つ以上または残基の非存在があり、ギャップは、残基の非存在を意味する。ここでも、「少なくとも８０％」への言及は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を意味する。ＯａＡＥＰ２（配列番号３）は、シクラーゼではないＡＥＰの例である。真核生物細胞には、ピキア種、サッカロマイセス属、またはクリベロマイセス属などの酵母細胞が含まれる。
【０１１８】
２つ以上のペプチドを含むペプチド複合体を生成する方法であって、少なくとも２つのペプチドをＡＥＰと共にインキュベートするステップを含み、ここで、少なくとも１つのペプチドが、Ｃ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含み、少なくとも１つの他のペプチドが、Ｎ末端ＡＥＰ認識アミノ酸配列を含む。これは、インビトロで起こる場合もインビボで起こる場合もある。
【０１１９】
細胞にベクターを導入し、細胞におけるベクターの存在に関して選択するための技法および薬剤は、周知である。ベクター細胞の選択を可能にする遺伝子マーカー、例えば、カナマイシン、テトラサイクリン、またはアンピシリンなどの抗生物質に対する耐性を保有する遺伝子が、周知である。このマーカーは、対応する耐性遺伝子を保有することになるため、適切な抗生物質を含有する培地において増殖している形質転換が成功した細胞の選択が可能となる。真核生物細胞の形質転換細胞の選択は、ベクターに、必須アミノ酸またはヌクレオチドの合成に関与する酵素をコードするＨＩＳ４またはＵＲＡ３などの栄養要求性マーカーを含めることにより、達成されることが多い。これらのベクターは、次いで、ＨＩＳ４についてはヒスチジン、およびＵＲＡ３についてはウラシルなど、増殖に必要とされる特定のアミノ酸またはヌクレオチドを合成することができない酵母株に形質転換される。ベクターの形質転換が成功した細胞は、特定のアミノ酸またはヌクレオチドが欠如したドロップアウト培地に播種することによって選択されるが、これは、未形質転換細胞は増殖培地に存在していない必須アミノ酸またはヌクレオチドを合成することができないが、一方で、栄養要求性マーカーを有するベクターを保有する細胞は、欠如しているアミノ酸またはヌクレオチドを合成することができるため生き残るためである。他の一般的な栄養要求性マーカーは、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＡＲＧ４、ＡＤＥ２である。
【０１２０】
ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを細胞に導入するための技法は、様々であり、形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、または当該技術分野で公知の他の技法が挙げられる。
【０１２１】
ＡＥＰまたはポリペプチド前駆体をコードする核酸が、作動可能に連結されているベクターの選択は、当該技術分野で周知のように、所望される機能特性、例えば、複製、タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞に直接的に依存し、これらは、組換え核酸分子を構築する分野において固有の制限である。原核生物細胞については、ベクターは、原核生物レプリコン、すなわち、原核生物細胞に導入されると自律的に複製し、組換えＤＮＡ分子を染色体外に維持するように誘導する能力を有するＤＮＡ配列を含むことが望ましい。そのようなレプリコンは、当該技術分野で周知である。真核生物細胞については、例えば、ベクターは、染色体外で維持することができるか（この場合、ベクター配列は、通常、真核生物レプリコンを含む）、またはゲノムＤＮＡに組み込むことができるか（この場合、ベクターは、宿主染色体へのベクターの組換えを促進する配列を含む）のいずれかである。
【０１２２】
原核生物レプリコンを含むベクターには、典型的に、本発明の組換ＤＮＡ分子の挿入のための便宜的な制限部位も含まれる。そのようなベクタープラスミドの典型は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９、ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手可能なｐＰＬ、ｐＫ、およびＫ２２３、ならびにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手可能なｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ｔｍおよびｐＢＳである。本発明のベクターはまた、当該技術分野で公知のラムダファージベクターまたはラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能）であってもよい。別のベクターとしては、例えば、ｐＣＭＵ（非特許文献３２）が挙げられる。他の適切なベクターもまた、公知の方法によって合成することができる。例えば、本明細書において様々な用途で使用されるｐＣＭＵ／ＫｂおよびｐＣＭＵＩＩベクターは、ｐＣＭＵＩＶの修正形である（非特許文献３２）。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１２３】
好適な宿主細胞に導入されると、核酸の発現は、当該技術分野で公知の任意のアッセイを使用して判定することができる。例えば、転写されたポリヌクレオチドの存在は、従来的なハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手順（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（特許文献１）、およびアレイに基づく技術（例えば、特許文献２、特許文献３、および特許文献４を参照されたい）によって検出および／または定量化することができる。ポリヌクレオチドは、ＡＥＰもしくはポリペプチド前駆体をコードするか、または真核生物系の場合においては、ポリヌクレオチドは、両方をコードしてもよい。
【０１２４】
核酸の発現はまた、タンパク質産物を試験することによって判定することもできる。タンパク質分析のための様々な技法が、当該技術分野で利用可能である。これらの技法としては、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射定量測定法、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、およびＰＡＧＥ−ＳＤＳが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、質量分析法が、環状ペプチドに使用される（非特許文献３３）。
【０１２５】
一般に、タンパク質レベルの判定には、（ａ）ポリペプチドを含有する生物学的サンプルを提供するステップ、（ｂ）ＡＥＰまたはポリペプチド前駆体に対して反応性の抗体との間で生じる任意の免疫特異的結合の量を測定するステップが含まれ、ここで、免疫特異的結合の量が、発現されたタンパク質のレベルを示す。ＡＥＰまたは直鎖状ポリペプチド前駆体を特異的に認識し、それに結合する抗体が、免疫アッセイには必要である。これらは、商業的供給業者から購入してもよく、または当該技術分野で周知の方法を使用して生成し、スクリーニングしてもよい。非特許文献３４および非特許文献３５を参照されたい。試験タンパク質のサンプルは、原核生物細胞または真核生物細胞の形質転換体を均質化し、任意選択で、トリトンおよびジギトニンを含む非還元性界面活性剤などの界面活性剤を使用して、試験タンパク質を可溶化することによって、調製することができる。ＡＥＰまたはポリペプチド前駆体が、検出抗体と相互作用することが可能となる結合反応を、溶液中、または細胞ペレットおよび／もしくは単離細胞、例えば、試験タンパク質で固定化されている固体支持体において行なってもよい。複合体の形成は、当該技術分野で公知の多数の技法によって検出することができる。例えば、抗体を、標識と共に供給することができ、未反応抗体を、複合体から除去することができる。残っている標識の量によって、形成された複合体の量を示す。細胞形質転換体由来のサンプルに対する任意のそのようなアッセイを使用して得られた結果を、対照として形質転換していない源から得られたものと比較する。ＢＣＡおよびｎａｎｏｄｒｏｐ手法などの他のタンパク質定量方法を利用してもよい。
【０１２６】
本発明の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞は、ポリヌクレオチドの発現を達成するのに好ましい条件下で増殖される。原核生物細胞の例としては、大腸菌、サルモネラ属、シュードモナス属、およびバチルス属が挙げられる。真核生物細胞の例としては、ピキア属（例えば、ピキア・パストリス）、サッカロマイセス属、またはクリベロマイセス属などの酵母が挙げられる。
【０１２７】
したがって、本発明は、ＡＥＰおよび／またはポリペプチド前駆体をコードする１つまたは２つのベクターを保有する遺伝子修飾細胞を提供する。
【０１２８】
本発明は、さらに、環状ペプチドを産生するためのビジネスモデルを企図する。一実施形態において、ビジネスモデルは、環化活性を有する異種ＡＥＰをコードする原核生物細胞、または所望される直鎖状ポリペプチド前駆体をコードするベクターを導入および発現する際に使用するための原核生物細胞を含む。いずれの事例においても、組換え手段または合成手段によって産生されるポリペプチド前駆体、およびＡＥＰは、反応容器において、環状ペプチドがポリペプチド前駆体から生成されるのに十分な時間および条件下で、共にインキュベートされる。別の実施形態において、原核生物細胞または真核生物細胞は、同じコンストラクトもしくは別個のコンストラクトのいずれかにおけるＡＥＰおよびポリペプチド前駆体をコードするベクターの形質転換のために選択されるか、または真核生物細胞は、ＡＥＰをコードするベクターを既に含み、ポリペプチド前駆体をコードする選択されたベクターのレシピエントとして使用される。細胞は、次いで、環状ペプチドが形成されるのに十分な時間および条件下でインキュベートされ、環状ペプチドを、真核生物細胞の液胞から単離することができる。真核生物細胞は、インビトロで使用されるＡＥＰおよび／またはポリペプチド前駆体を生成するために使用され得る。さらなる実施形態において、ビジネスモデルは、直鎖状ペプチド複合体の生成に拡張される。
【０１２９】
環状ペプチドは、抗病原体、治療的もしくは他の薬学的に有用な特性、および／または殺虫活性、殺軟体動物活性、もしくは殺線虫活性を含む、広範な有用な特性のうちのいずれかを有し得る。治療活性の例としては、抗がん活性、プロテアーゼ阻害活性、抗ウイルス活性、または免疫調節活性、ならびに疼痛治療が挙げられる。環状ペプチドはまた、機能性を組み込むためのフレームワークでもあり得る。通常の直鎖状ポリペプチドもまた、環化を受け得る。これにより、安定性、有効性、および有用性が向上し得る。あるいは、ポリペプチド前駆体は、天然の環化基質である。
【０１３０】
本明細書に企図されるように、非天然のアミノ酸が、ポリペプチド前駆体に導入され得る。非天然のアミノ酸には、修飾された側鎖を有するアミノ酸が含まれる。
【０１３１】
本発明により企図される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応後にＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化；メチルアセトイミデート（ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）によるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸によるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール−５−リン酸によるリシンのピリドキシル化後にＮａＢＨ４による還元といった、アミノ基の修飾が挙げられる。
【０１３２】
アルギニン残基のグアニジン基を、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬を用いて、複素環縮合産物を形成することによって修飾してもよい。
【０１３３】
カルボキシル基を、Ｏ−アシルイソ尿素の形成によるカルボジイミド活性化後、続いて、例えば対応するアミドに誘導体化することによって、修飾してもよい。
【０１３４】
スルフヒドリル基を、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；過ギ酸のシステイン酸への酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロ水銀安息香酸、４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、および他の水銀剤を使用した水銀誘導体の形成；アルカリｐＨにおけるシアン酸によるカルバモイル化といった方法によって修飾してもよい。
【０１３５】
トリプトファン残基を、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニル（ｓｕｌｐｈｅｎｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）によるインドール環のアルキル化によって、修飾してもよい。一方で、チロシン残基は、テトラニトロメタンによりニトロ化して、３−ニトロチロシン誘導体を形成することによって変換してもよい。
【０１３６】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカーボネートによるＮ−カルベトキシル化（Ｎ−ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｌａｔｉｏｎ）により達成することができる。
【０１３７】
ペプチド合成中に組み込む非天然のアミノ酸および誘導体の例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
架橋剤を使用して、例えば、（ＣＨ２）ｎスペーサー基（ｎ＝１からｎ＝６）を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤、ならびに通常はＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分およびマレイミドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基に特異的な反応部分を含有する、ヘテロ二官能性試薬を使用して、３次元立体配置を安定させることができる。加えて、ペプチドは、例えば、ＣおよびＮ−メチルアミノ酸の組み込み、アミノ酸のＣ原子とＣ原子との間の二重結合の導入によって、立体配置を制限することができる。
【０１３９】
ポリペプチド前駆体はまた、細胞によって、またはインビトロ合成中に、同位体標識してもよい。
【０１４０】
環状ペプチドもしくは直鎖状ペプチド複合体または薬学的に許容されるそれらの塩を含む、薬学的製剤が、本明細書においてさらに実現される。そのような製剤は、ヒト対象および非ヒト動物対象の治療における用途を有する。
【０１４１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明のペプチドの生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的作用を付与しない塩を指す。
【０１４２】
本発明の薬学的組成物は、局所治療が所望されるか全身治療が所望されるかに応じて、また治療される場所に応じて、いくつかの手段で投与され得る。投与は、局所（眼、ならびに膣および直腸送達を含む粘膜へのものを含む）、肺内、例えば、ネブライザーによるものを含む、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹送によるもの、気管内、鼻腔内、表皮、および経皮）、経口、または非経口によるものであり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内への注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、髄腔内もしくは脳室内への投与が挙げられる。局所投与のための薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点眼剤、坐剤、スプレー、液体、および粉末を挙げることができる。従来的な薬学的担体、水溶液、粉末、または油性基剤、増粘剤などが、必要とされる場合があるか、または望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。
【０１４３】
便宜上、単位投薬形態で提示され得る本発明の薬学的製剤は、製薬業界で周知の従来的な技法に従って調製され得る。そのような技法には、活性成分を、薬学的担体または賦形剤と混合するステップが含まれる。一般に、製剤は、活性成分を、液体担体もしくは微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ密に混合し、次いで、必要に応じて、製品を成形することによって、調製される。
【０１４４】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸剤などであるがこれらに限定されない、多数の可能性のある投薬形態のうちのいずれかに製剤化され得る。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁液として製剤化されてもよい。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有してもよい。懸濁液はまた、安定剤も含有し得る。
【０１４５】
本発明の薬学的組成物としては、溶液、エマルジョン、泡沫体、およびリポソーム含有製剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物および製剤は、１つまたは複数の透過促進剤、担体、賦形剤、または他の活性成分もしくは不活性成分を含み得る。
【０１４６】
エマルジョンは、典型的に、１つの液体が、直径０．１μｍを上回る液滴の形態で、別の液体中に分散した、不均質系である。エマルジョンは、分散相に加えて、追加的な成分、ならびに水相中、油相中の溶液としてまたはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬物を含有し得る。マイクロエマルジョンが、本発明の実施形態として含まれる。
【０１４７】
本発明の薬学的製剤および組成物はまた、界面活性剤も含み得る。薬物製品、製剤、およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、当該技術分野において周知である。
【０１４８】
一実施形態において、本発明は、爪真菌症を治療するためなど、環状ペプチドの効率的な送達を達成するために、様々な透過促進剤を利用する。細胞膜全体にわたる非親油性ペプチドの拡散を補助することに加えて、透過促進剤は、ケラチンの透過性も増強させる。透過促進剤は、５つの広範なカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの１つに属するとして分類され得る。透過促進剤およびそれらの使用については、特許文献５にさらに説明されており、この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
当業者であれば、製剤が、その意図される使用に応じて、すなわち、投与経路に応じて慣例的に設計されることを認識しているものと予想される。
【０１５０】
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末もしくは顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ剤、錠剤、またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が、望ましい場合がある。
【０１５１】
治療用組成物の製剤化およびそれに続く組成物の投与（投薬）は、当業者の技能の範囲内であると考えられる。投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存し、治療過程は、数日間から数カ月間、または治癒が達成されるかもしくは疾患状態の縮小が達成されるまで、継続される。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者であれば、最適な投薬量、投薬方法、および反復率を容易に判定することができる。
【０１５２】
最適な投薬量は、個々の環状ペプチドまたは直鎖状ペプチドの相対強度に応じて多様であり得、一般に、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０の値に基づいて計算することができる。一般に、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日ごと、１週間ごと、１カ月ごと、または１年ごとに１回もしくは複数回、またはさらには２〜２０年に１回、提供され得る。当業者であれば、体液または組織におけるペプチドの測定された存在時間および濃度に基づいて、投薬の反復率を容易に推測することができる。治療の成功後に、疾患状態の再発を予防するために、患者が維持療法を受けることが望ましい場合があり、その場合、ペプチドは、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、１日１回または複数回から２０年に１回、投与される。
【０１５３】
非経口、髄腔内、または脳室内への投与のための組成物および製剤としては、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤、例えば、透過促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体もしくは賦形剤も含有し得る、滅菌水溶液を挙げることができる。
【０１５４】
環状ペプチドまたは直鎖状ペプチド複合体はまた、植物または種子への局所適用のための農学的に許容される組成物に製剤化されてもよい。農学的に許容される担体が、本方法を実施するための本明細書に開示されるペプチドを製剤化するために使用される。全身投与および表面投与に好適な投薬量の決定は、本明細書において実現され、当業者の技能の範囲内である。適切な担体の選択および好適な製造実践により、溶液として製剤化されたものなどの組成物は、植物の、地面より上の部分および／もしくは根茎を含む表面に投与することができるか、または種子の表面に適用されるコーティングとして投与することができる。
【０１５５】
本明細書に開示される系における使用に好適な農学的に有用な組成物には、活性成分が、意図される目的を達成するのに有効な量で含有された、組成物が含まれる。有効量の判定は、特に、本明細書に提供される開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５６】
活性成分に加えて、植物病原体に対抗して使用するためのこれらの組成物は、活性化合物をプロセシングして、田畑、温室、または研究室環境において使用することができる調製物にするのを促進する賦形剤および補助剤を含む、好適な農学的に許容される担体を含有し得る。
【０１５７】
抗病原体製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。加えて、環状ペプチドの懸濁液は、適切な油性懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。任意選択として、懸濁液はまた、好適な安定剤、または高濃度の溶液の調製を可能にするために、化合物の可溶性を増大させる薬剤を含有してもよい。さらなる成分としては、とりわけ、増粘剤、ゲル、湿潤剤、紫外線保護剤を挙げることができる。
【０１５８】
表面適用のための調製物は、活性なペプチドを、固形賦形剤と合わせ、任意選択で、結果として得られた混合物を粉砕し、所望される場合は好適な補助剤を添加した後に、顆粒混合物をプロセシングして、保護される植物への直接適用のため、または植物に噴霧する前に溶解するための粉末を得ることによって、得ることができる。好適な賦形剤は、特に、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの糖類、セルロースまたはデンプン調製物、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望される場合、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩といった、崩壊剤を添加してもよい。
【実施例】
【０１５９】
本明細書に開示される態様を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【０１６０】
材料および方法
ペプチド基質および阻害剤
２つの内部消光性蛍光（ＩＱＦ）ペプチド（Ａｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）（配列番号２１）およびＡｂｚ−ＳＴＲＮＧＡＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）（配列番号２５）、ここで、Ａｂｚは、ｏ−アミノ安息香酸であり、Ｙ［３ＮＯ２］は、３−ニトロチロシンである）を、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍによって、９０％を上回る純度で合成し、２５％（体積／体積）のアセトニトリル：水に可溶化した。蛍光性ペプチド基質Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｚは、カルボキシベンジルであり、ＭＣＡは、７−アミド−４−メチルクマリンである）を、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手し、ＤＭＳＯ中に可溶化した。阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯおよびＡｃ−ＳＴＲＮ−ＣＨＯ（Ａｃは、アセチルであり、ＣＨＯは、アルデヒドである）を、それぞれ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＭｉｍｏｔｏｐｅｓによって合成した。シクロチド・カラタＢ１の直鎖状前駆体を、化学的に合成し、既述のようにフォールディングした（非特許文献３６）。この前駆体を、超純水中に可溶化し、末端遊離酸またはアミンを有するように合成した。図１は、直鎖状シクロチドポリペプチド前駆体の図を示す。Ｂａｃ２Ａ、ＥｃＡＭＰ１、およびＲ１、ならびにその誘導体を、ＡＥＰ認識残基を付加して、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔまたはＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍによって、８５％を上回る純度で、末端遊離酸またはアミンを有するように合成し、超純水中に可溶化したが、１つのＲ１誘導体（ＬＬＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫＮＧＬ、配列番号８９）は除き、このＲ１誘導体は、２５％ＤＭＳＯ中に可溶化した。ライゲーションパートナーペプチド（ＧＬＫ−ビオチン；ビオチン−ＴＲＮＧＬ；ＧＬＰＶＳＧＥ、配列番号１４；ＰＬＰＶＳＧＥ、配列番号８０）を、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍによって、８５％を上回る純度で、末端遊離酸またはアミンを有するように合成し、超純水中に可溶化した。
【０１６１】
環化アッセイ
直鎖状標的ペプチド（別途記載されない限り、２８０μＭ）を、活性緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］、０．５μＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩［ＴＣＥＰ］、ｐＨ５）中で、ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、またはｒＯａＡＥＰ５（全タンパク質濃度は、図の説明に示される通り）と共にインキュベートした。反応を、室温で最大２２時間進行させ、適宜、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって分析した。
【０１６２】
分子間ライゲーションアッセイ
標的ペプチド（１４０μＭ）を、活性緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ５）中で、ライゲーションパートナーペプチド（７００μＭ）および組換えＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、またはｒＯａＡＥＰ５、合計タンパク質１９．７μｇ／ｍＬ）と共に、インキュベートした。反応を、室温で最大２２時間進行させ、適宜、ＭＡＬＤＩ  ＭＳまたはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法によって分析した。
【０１６３】
ＡＥＰに媒介される直鎖状ペプチドのプロセシングをトラッキングするためのＭＳ
直鎖状標的ペプチドの環化または分子間ライゲーションを、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ  ＭＳによってモニタリングした。いずれの事例においても、反応混合物（５〜５０μＬ）を、Ｃ１８  ｚｉｐ  ｔｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して脱塩し、４μＬの５０〜７５％体積／体積のアセトニトリル、０．１％体積／体積のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶出した。
【０１６４】
ＭＡＬＤＩ  ＭＳについては、９５％体積／体積のアセトニトリル、０．１％体積／体積のＴＦＡ中に調製した飽和ＭＡＬＤＩマトリックス溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、ＣＨＣＡ、Ｂｒｕｋｅｒ）を、１：２２で希釈して、最終的なマトリックス溶液が、９０％体積／体積のアセトニトリル、０．１％体積／体積のＴＦＡ、および１ｍＭ  ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４を含むようにした。溶出したサンプルを、１：４でＭＡＬＤＩマトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩプレートにスポッティングし、正のリフレクターモードでＵｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ）によって分析した。データを、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓプログラム（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して分析した。
【０１６５】
ＥＳＩ  ＭＳについては、９６μｌの７５％体積／体積のアセトニトリル、０１％体積／体積のＴＦＡを、脱塩したサンプルに添加した。サンプルを、次いで、ＭｉｃｒｏＴＯＦ  Ｑ（Ｂｒｕｋｅｒ）に注射し、データを、正のイオン化モードで収集した。ライゲーションまたは環化された産物の質量を、Ｃｏｍｐａｓｓ  ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓプログラム（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して、電荷のデコンボリューションによって判定した。
【０１６６】
ＩＱＦおよび蛍光ペプチドに対するプロテアーゼ活性のアッセイ
内部消光性蛍光ペプチドおよび他の蛍光ペプチドの両方に対する組換えＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、またはｒＯａＡＥＰ５）の活性をアッセイするために、基質および酵素を、適宜、活性緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ５）中に希釈した。同じ基質に対する組換えヒトレグマイン（ｒｈｕＬＥＧ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）の活性をアッセイするために、酵素を、まず、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４（４μＬ緩衝液／１μＬ酵素）において、３７℃で２時間インキュベートすることによって活性化した。基質および活性化されたｒｈｕＬＥＧを、必要に応じて、５０ｍＭ酢酸、０．１％体積／体積トリトンＸ１００、０．５μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ５．５または５０ｍＭ  ＭＥＳ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５において、希釈した。希釈した酵素および基質を、１００〜２００μＬの合計アッセイ量で、黒色の平底マイクロタイタープレートに添加した。経時的な蛍光強度の変化を、励起／放出波長３２０／４２０ｎｍ（ＩＱＦペプチド）または３６０／４６０ｎｍ（他の蛍光ペプチド）を使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）においてモニタリングした。
【０１６７】
阻害アッセイ
野生型ＩＱＦペプチドであるＡｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）に対する酵素活性への、阻害剤の影響を調査するために、ｒＯａＡＥＰ１ｂ（４．４μｇ／ｍＬの全タンパク質）を、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（５００μＭ）またはＡｃ−ＳＴＲＮ−ＣＨＯ（４０９μＭ）と共に４０分間インキュベートした後、基質（１１μＭ）に添加した。次いで、野生型ＩＱＦペプチドに対する酵素活性を、上述のように評価した。
【０１６８】
抗体
ニュージーランドホワイトウサギに、大腸菌において組換え産生したオルデンランディア・アフィニスＡＥＰ１ｂの変性不活性形態（残基Ｄ４７〜Ｐ４７４）で免疫付与を行うことによって、ポリクローナル抗ＡＥＰ１ｂウサギ血清を生成した。ウサギに、５０％（体積／体積）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）において１５０μｇの抗原を、４週間おきに３回の用量を与えた。血清を、最後の用量の２週間後に得た。
【０１６９】
オルデンランディア・アフィニスのトランスクリプトーム
全ＲＮＡを、オルデンランディア・アフィニスの根茎、葉、および苗の組織から、フェノール抽出方法を使用して抽出した。植物材料を、液体窒素中で凍結させ、微細な粉末に粉砕し、この粉末を、次いで、緩衝液（０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノール）中に再懸濁し、１：１のフェノール：クロロホルムで２回抽出し、イソプロパノールの添加によって沈殿させた。ペレットを、０．５ｍｌの水中に溶解させ、ＲＮＡを、４Ｍの塩化リチウムの添加によって４℃で一晩沈殿させた。抽出した各組織のＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩｘプラットフォームを使用して、ＧｅｎｅＷｏｒｋｓによって分析した。合計で、６９３０万個の７５ｂｐの対合末端の読取りが生成された。読み取り値を、ｐｈｒｅｄの信頼性値Ｑ３７でフィルタリングし、４１〜６７の範囲のｋ−ｍｅｒでＯａｓｅｓ（非特許文献３７）を使用してアセンブルしてコンティグにした。アセンブリを、ｃｄ−ｈｉｔ−ｅｓｔ（非特許文献３８）を使用して統合し、２７０，０００個のコンティグを得た。シーケンシングの深度に関する統計情報を、ＢＷＡ（非特許文献３９）を使用して各組織の読取り値をコンティグでアライメントすることによって、作製した。１つのＡＥＰを含む、オルデンランディア・アフィニスのＥＳＴライブラリーからこれまでに特定されているすべての配列が、コンティグ間で存在していた（非特許文献４０）。このＡＥＰ配列のホモログを、最大Ｅ値１ｅ−２０を使用して、コンティグライブラリーにおいてＢＬＡＳＴ（非特許文献４１）を使用して検索し、３７１個の推定上のＡＥＰ転写産物が得られた。これらの配列を、次いで、ｃｄ−ｈｉｔ（非特許文献３８）を使用して、少なくとも９０％の配列同一性を共有する１３個の群にクラスター化することができた。特定されたコーディング配列は、ＯａＡＥＰ４−１７（配列番号３９または５４）であった。
【０１７０】
ＯａＡＥＰクローニング
オルデンランディア・アフィニスのトランスクリプトームアセンブリからの全長ＡＥＰ転写産物を使用して、プライマーのセットを設計した。開始コドンにおける各全長転写産物の５’領域内の単一ヌクレオチド位置における可変性のため、全配列を増幅するように、単一のフォワードディジェネレートプライマー（ＯａＡＥＰｄｅｇｅｎ−Ｆ、５’−ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＣＹＣ  ＧＣＣ  ＧＧ−３’−配列番号６）を手作業で設計した。プライマー３を活用して設計した３つのリバースプライマーにより、ＡＥＰ配列の増幅が成功した（ＯａＡＥＰ１−Ｒ、５’−ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＧＣ−３’−配列番号７；ＯａＡＥＰ２−Ｒ、５’−ＴＴＡ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＧＧ−３’−配列番号８；ＯａＡＥＰ３−Ｒ、５’−ＴＴＡ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  Ｇ−３’−配列番号９）。
【０１７１】
発現されたＯａＡＥＰをクローニングするために、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、オルデンランディア・アフィニスの葉および芽から全ＲＮＡを抽出し、製造業者の指示書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および上述のプライマーを、推奨される反応条件下で使用して、結果として得られたｃＤＮＡから、標的配列を増幅させた。ゲル抽出したＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＡと共に、提供された緩衝液中でインキュベートすることにより、ｄＡテールを付加した。プロセシングした産物を、ｐＣＲ８−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングし、大腸菌に形質転換した。ＡＥＰインサートに関してＰＣＲで陽性であったクローンから精製したＤＮＡを、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙでのサンガーシーケンシングのために送った。コーディング配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに受託されている（受託コード：ＯａＡＥＰ１（ＫＲ２５９３７７）、ＯａＡＥＰ２（ＫＲ２５９３７８）、ＯａＡＥＰ３（ＫＲ２５９３７９）。
【０１７２】
異なるアプローチでは、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを製造業者の指示書に従って使用して、ゲノムＤＮＡを、オルデンランディア・アフィニスの葉組織から抽出した。このＤＮＡからのＰＣＲ増幅では、ＯａＡＥＰ１ヌクレオチド配列を特異的に標的とするプライマーを使用した。ゲル抽出した産物を、上述のようにｄＡテールを付加し、ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングし、大腸菌に形質転換した。ＰＣＲ陽性クローンからのＤＮＡを、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙでのシーケンシングのために送った。この方法を使用して特定されたＡＥＰ配列（ＯａＡＥＰ１ｂ）を、続いて、組換えタンパク質として発現させた。
【０１７３】
シクラーゼ活性の予測
シクロチド・カラタＢ１（ｏａｋ１）の前駆体遺伝子、および他のペプチドと共に発現されると、骨格環化を達成する、ＡＥＰを、シクロチド産生植物から特定する。ライゲーション能力のあるＡＥＰのアミノ酸配列と、タンパク質分解に有利なＡＥＰのアミノ酸配列とを比較することにより、特異性に寄与する活性優先性ループ（ＡＰＬ）と称される差のあるループ領域が、特定される。リガーゼ能力のあるＡＥＰにおいて、ＡＰＬは、複数の残基が欠けているか、または疎水性のアミノ酸ストレッチで置き換えられている（図５Ａ）。
【０１７４】
シクラーゼ機能と関連するさらなる残基は、実験的に決定されたシクラーゼ配列および非シクラーゼ配列のセットを使用した機械学習（タンパク質配列空間分析）によって特定される。以下の残基は、現時点で判明しているシクラーゼおよび非シクラーゼにおいて、シクラーゼ機能を高度に予測することがわかっている（図５Ｂ）。すべての番号付けは、ＯａＡＥＰ１ｂ（図４、配列番号１）に対して付与されている。
１．ＡＰＬ−ＯａＡＥＰ１の２９９〜３００の領域における残基の非存在は、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
２．セット１−以下の活性部位の残基の存在もまた、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
・Ｄ１６１
・Ｃ２４７
・Ｙ２４８
・Ｑ２５３
・Ａ２５５
・Ｖ２６３
３．セット２−以下の活性部位の近傍の残基の存在もまた、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
・Ｋ１８６
・Ｄ１９２
４．セット３−以下の非活性部位の表面残基の存在もまた、シクラーゼ活性の可能性が高いことを予測する。
・Ｋ１３９
・Ｈ２９３
・Ｅ３１４
・Ｇ３１６
【０１７５】
全体的には、配列が、以下のいずれかを含む場合に、シクラーゼ活性が高く予測される。
・短縮されたＡＰＬ
・セット１の６つの活性部位残基うちの３つ
・セット２の活性部位の近傍の残基の両方
・セット３の４つの非活性部位残基のうちの３つ
【０１７６】
最も予測性が高いのは、ＡＰＬおよびセット１である。これらの基準のうち適合するものが多いほど、シクラーゼとみられる可能性が高い。シクラーゼ活性を予測する残基を、表２に示す。残基の番号付けは、ＯａＡＥＰ１ｂ（図４、配列番号１）に対するものである。シクラーゼ活性を強く予測する残基の特性は、障害傾向（ＤＩＳＯＲＤ）、正味の静電荷（ＣＨＲＧ）、Ｒ基の分子量（ＲＭＷ）、および疎水性親水性指標（ＨＰＡＴＨ）である。
【０１７７】
表２に記載されている１７個の予測残基のうちの少なくとも２５％（または５つ以上）を有するＡＥＰは、シクラーゼとして優先的に作用する可能性が高いと考えられる。予測残基の少なくとも２５％が存在するという要件により、判明しているシクラーゼの１００％を正しく特定すると同時に、少なくとも８０％、例えば、９４％の判明している非シクラーゼを除外することが可能となる。
【０１７８】
この方法を使用してシクラーゼであることが予測されるＡＥＰの例としては、ＯａＡＥＰ４（８８％）、ＯａＡＥＰ５（７０％）が挙げられ、いずれの配列も、トランスクリプトーム分析から導出され、シクラーゼであることが試験され、示されている（例えば、実施例４）。シクラーゼであることが予測される他の配列としては、シサー・アリティナム（配列番号９２）、メディカゴ・トランカツラ（配列番号９３）、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（配列番号９４）、ゴシピウム・ライモンジ（Ｇｏｓｓｉｐｉｕｍ  ｒａｉｍｏｎｄｉｉ）（配列番号９５、およびケノポジウム・キノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）（配列番号９６）（実施例１０）に由来するＡＥＰが挙げられる。
【表２】
2019500879.tif 000006
【０１７９】
実施例１
大腸菌における組換えオルデンランディア・アフィニスＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ）の発現および活性化
推定上のシグナル伝達ドメイン（ＯａＡＥＰ１ｂ残基Ａ２７〜Ｐ４７８、ＯａＡＥＰ３残基Ｒ２８〜Ａ４９１、ＯａＡＥＰ４残基Ａ２８〜Ａ４９１、またはＯａＡＥＰ５残基Ｅ２７〜Ｌ４８５）を有さない全長オルデンランディア・アフィニスＡＥＰをコードするＤＮＡを、ｐＨＵＥベクターに挿入して（非特許文献４２）、６ｘＨｉｓ−ユビキチン−ＯａＡＥＰ融合タンパク質コンストラクトを得た（配列番号２０は、ｒＯａＡＥＰ１ｂコンストラクトについて記載し、ＯａＡＥＰ１ｂを含む領域は、他のコンストラクトではＯａＡＥＰ３、ＯａＡＥＰ４、またはＯａＡＥＰ５と置き換えられる）。残基の番号付けは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（非特許文献２９）を使用して生成された多重アライメントによって決定される通りである（図２）。ＤＮＡを、次いで、Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ大腸菌細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）に導入した。形質転換した細胞を、ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（３．５％トリプトン［重量／体積］、２％酵母抽出物［重量／体積］、１％グルコース［重量／体積］、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＯＨ）において３０℃で中対数期まで増殖させた。温度を、次いで、１６℃まで下げ、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．４ｍＭ、Ｂｉｏ  Ｖｅｃｔｒａ）で、およそ２０時間、発現を誘導した。細胞を、遠心分離によって採取し、非変性溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７）中に再懸濁した。合計５回の凍結／解凍サイクルおよびリゾチーム（鶏卵の卵白、Ｒｏｃｈｅ、０．４ｍｇ／ｍＬ）の添加によって、溶解を促進した。ＤＮａｓｅ（ウシ膵臓、Ｒｏｃｈｅ、４０μｇ／ｍＬ）およびＭｇＣｌ２（０．４Ｍ）もまた、添加した。細胞残屑を、遠心分離によって除去し、溶解物を、必要となるまで−８０℃で保管した。
【０１８０】
発現された組換えＡＥＰを含有する溶解物を、０．１μＭのガラス繊維フィルタ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して濾過した後、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ビス−トリス、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）中に１：８で希釈し、直列に接続された２つの５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１．６〜３．１ｍＬ未希釈溶解物／ｍＬ樹脂）に充填した。結合したタンパク質を、連続塩勾配（０−３０％の緩衝液Ｂ［２０ｍＭ  ビス−トリス、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７］、１５カラム体積［ｃｖ］）で溶出し、ＡＥＰ陽性の画分を、ウェスタンブロッティング（抗ＡＥＰ１ｂウサギ血清［１：２０００］、ペルオキシダーゼ複合体抗ウサギＩｇＧ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１：５０００］）によって特定した。
【０１８１】
ＡＥＰは、通常、酵素前駆体として産生され、この前駆体が、低ｐＨにおいて自己プロセシングして、それらの成熟した活性形態となる（非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５）。すべてのＡＥＰを自己活性化するために、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、０．５ｍＭ）を添加し、ｐＨを、氷酢酸によって４．５に調節し、タンパク質プールを３７℃で５時間インキュベートした。図３Ａは、ｋＢ１における天然のＣ末端プロセシング部位を表すＩＱＦペプチド（Ａｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２））に対するｒＯａＡＥＰ１ｂの活性が、この活性化ステップの後に劇的に増大したことを示す。ｐＨ４．５でのタンパク質沈殿により、汚染タンパク質の大部分を遠心分離によって除去することが可能となった。残りのタンパク質を、濾過し（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、緩衝液Ａ２（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４）中に１：８で希釈した後、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で捕捉した。結合したタンパク質を、塩勾配（０−１００％の緩衝液Ｂ２［５０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４］、１０ｃｖ）で溶出し、ＩＱＦペプチド（Ａｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２））に対する活性を有する画分をプールし、後続の活性アッセイにおいて使用した。図３Ｂは、ｒＯａＡＥＰ１ｂの活性化後に、約３２ｋＤａの優勢なバンドが、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩｎｓｔａｎｔ  ｂｌｕｅでの染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）によって明らかとなり、これが、ｒＯａＡＥＰ１ｂであることがウェスタンブロッティングによって確認されたことを示す。実験的に判定されたｒＯａＡＥＰ１ｂの自己プロセシング部位を、図４に示す。各調製物中の全タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイによって、製造業者の指示書に従って推測した。
【０１８２】
実施例２
インビトロでのシクロチド・カラタＢ１（ｋＢ１）の環化
活性化された成熟ｒＯａＡＥＰ１ｂの、天然のＣ末端プロ−ヘプタ−ペプチド（ＧＬＰＳＬＡＡ）を有する合成ｋＢ１前駆体（図１Ｂ）を環化する能力を、材料および方法に記載されている環化アッセイに続いてＭＡＬＤＩ  ＭＳを使用して、試験した。ｋＢ１前駆体と共にインキュベートすると、活性酵素が、成熟した環状ｋＢ１の予測質量と一致する２８９１．２Ｄａ（モノアイソトピック、［Ｍ＋Ｈ］  ＋）のペプチドを産生した（図６）。この産物は、天然のｋＢ１と同一であることを、ＨＰＬＣ共溶出ならびに１次元および２次元のＮＭＲ実験によって確認した。
【０１８３】
野生型ｋＢ１前駆体（図１、配列番号１１）に対するｒＯａＡＥＰ１ｂの活性の動態を判定するために、基質を、室温において、合計体積２０〜１６０ｌの活性緩衝液中７５〜２５０Ｍの範囲の濃度で、アッセイした。動態アッセイに添加した酵素調製物の全タンパク質濃度は、１９．７ｇ／ｍＬであった。反応を、５分後に、０．１％ＴＦＡで停止させ、体積を８００ｌに調節した。７００ｌの量を、逆相Ｃ１８分析カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１８、５ｍ、４．６×１５０ｍｍ）に充填し、ペプチドをＨＰＬＣ（１９分間で線形勾配１２−６０％のアセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、１ｍｌ／分）によって分離した。溶出されたピークの同一性を、ＭＡＬＤＩ  ＭＳを使用して確認した。前駆体ペプチドに対応する曲線下面積を、標準曲線との比較によって定量化し、これを形成された産物のモルに変換することによって初速度を計算した。ミカエリスメンテンの式および曲線当てはめプログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して、動態パラメーターを推定した。調製物中に残っている不純物および活性部位滴定に適した阻害剤の欠如に起因して、活性酵素の濃度を正確に判定することは不可能であった。しかしながら、３２ｋＤａの質量、および全タンパク質濃度が活性酵素を反映するという仮定に基づいて、保存的回転率（ｋｃａｔ）を推定した。野生型ｋＢ１前駆体およびｒＯａＡＥＰ１ｂのプロセシングの動態パラメーター（±標準誤差）は、ミカエリスメンテンのプロットから判定すると、ｋｃａｔが０．５３（±０．１）ｓ−１、Ｋｍが２１２（±７６）Ｍ、ｋｃａｔ／Ｋｍが２，５００Ｍ−１ｓ−１であった（図７）。異なる調製物における活性酵素の純度および割合の相違は、これらのパラメーターが、バッチごとの変動を受けることを意味する。
【０１８４】
実施例３
インビトロでの非シクロチドペプチドＲ１、Ｂａｃ２Ａ、およびＥｃＡＭＰ１の環化
活性化されたＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、およびｒＯａＡＥＰ５）の、構造的にシクロチドに無関係なペプチド基質を環化する能力を、材料および方法において記載されている環化アッセイにおいて試験した。抗マラリアペプチドＲ１（非特許文献４６、非特許文献４７）、Ｂａｃ２Ａ、ウシペプチドであるバクテネシンの直鎖状誘導体（非特許文献４８）、および抗真菌ペプチドＥｃＡＭＰ１（非特許文献４９）を、追加的なＡＥＰ認識残基を有するように産生し、基質として使用した。環状産物に対応する質量の出現は、いずれの事例においても、直鎖状前駆体ペプチドが、Ｎ末端およびＣ末端のＡＥＰ認識配列の付加後に効率的に環化されたことを示した（図８および９）。
【０１８５】
実施例４
インビトロでの環化の配列要件
インビトロでの環化の配列要件を調査するために、Ｒ１を、モデルペプチドとして使用した。このモデルペプチドに付加する認識残基を、順に減らして、ＡＥＰに媒介される環化の最小要件を判定した。さらに、Ｎ末端およびＣ末端認識残基を、代替的なアミノ酸と置換して、特定のクラスの残基が、これらの組換えＡＥＰによる環化に好ましかったかどうかを判定した。次いで、活性化されたＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、およびｒＯａＡＥＰ５）の、様々な隣接配列を有するＲ１ペプチドを環化する能力を、材料および方法において記載されている環化アッセイにおいて試験した（図１０、表３）。
【０１８６】
付加する認識残基を順に減らすことにより、試験した４つすべての酵素が、Ｃ末端Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕモチーフのみの付加後に、Ｒ１ペプチドを環化することができることが明らかとなった（しかしながら、一部の直鎖状産物も、この前駆体から産生された）。Ａｓｎ残基のＣ末端側で切断した後には、１つの残基（Ａｓｎ）のみが、環化ペプチドに残された。しかしながら、Ｎ末端Ｇｌｙ−Ｌｅｕモチーフ、ならびにＣ末端Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕモチーフを用いることで、全体的により効率的な環化が達成された。続いて、隣接する残基の変異を、この形式内で行った。
【０１８７】
Ｎ末端において、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、およびＬｙｓはすべて、Ｐ１”Ｇｌｙの代わりに許容されたが、一部の事例においては、これにより、環状産物の収率が減少した。モデルペプチドＲ１の第１の残基として提示される場合には、Ｖａｌも許容された。Ｐ２”位置では、正電荷を有するＬｙｓは、Ｌｅｕの代わりとして寛容度は不十分であったが、環状産物の産生は依然として可能であった。同じ位置において、芳香族Ｐｈｅは、一般に、十分に許容されたが、ここでも、一部の事例では、これにより試験した時点での環状産物の収率が減少した。Ｎ末端に付加された任意のアミノ酸と、最大でＡｓｎまでの（Ａｓｎ含む）Ｃ末端に付加された任意のアミノ酸とが一緒に、環状産物に保持される。したがって、追加的なＮ末端残基が機能に影響を及ぼす一部の標的ペプチドについては、非天然の残基の導入を最小限に抑えるために、全体的な収率を低減することが許容され得る。
【０１８８】
Ｃ末端では、ほとんどの置換が、試験した条件下で環状産物の収率の低減をもたらした。Ｐ１’位置において、ＨｉｓおよびＰｈｅが許容可能であったが、収率は、概して、試験した条件下で低減された。Ｐ２’の位置では、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、およびＰｈｅが、許容可能であったが、これにより、一部の事例で収率が低減された。この位置で許容可能であった他の残基は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒである。Ｐ１残基のＣ末端側の残基は、最終的な産物に組み込まれない。したがって、この領域に最適とは言えない残基を含めることの利点はほとんどない。試験した４つすべての酵素は、Ｐ１’位置にＡｓｎまたはＡｓｐのいずれかを示す基質を環化することができたが、優先性は酵素によって異なった。この残基は、最終的なペプチドに組み込まれるため、この位置にＡｓｎを選択するかＡｓｐを選択するかは、基質に依存する可能性が高く、これは、どの酵素を使用に選択するかに影響を及ぼし得る。
【０１８９】
天然のＲ１ペプチドまたはＮ末端Ｇｌｙ−Ｌｅｕモチーフを有する修飾されたＲ１のいずれのプロセシングも観察されず、Ｃ末端のＡｓｎのみが、ｒＯａＡＥＰ１ｂによって観察された。ｒＯａＡＥＰ１ｂによってプロセシングされた表３に提示されるＲ１誘導体の環状性質を、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製造業者の指示書に従う）での消化によって確認した。この二次消化により、骨格が環化されたペプチドの直鎖化と一致して、単一の直鎖状産物（２つの直鎖状ペプチドとは対照的に）が産生された。
【表３】
2019500879.tif 000007
【０１９０】
実施例５
ポリペプチドのライゲーション
組換え産生されたＡＥＰの、分子間のライゲーション（ならびに骨格が環化されたペプチドを産生するために必要な分子内ライゲーション）を行う能力を調査するために、標的ペプチドを、ライゲーションパートナーペプチドならびに活性酵素と共にインキュベートした（図１１）。新しい直鎖状ペプチドの出現をトラッキングした。標識したペプチドと標的ポリペプチドとのライゲーションにより、様々な部分（例えば、蛍光標識、ビオチン、親和性タグ、エピトープタグ、可溶性タグ）の一般的な標的化タンパク質標識戦略が提供される。この戦略は、合成ペプチド化学または他の方法が適切なライゲーションパートナーを産生する能力によってのみ制限される。このアプローチはまた、単一の組換えタンパク質として産生するのが困難な可能性のある複数のドメインのライゲーションも可能にすることができる。
【０１９１】
ＡＥＰ認識残基を、植物ディフェンシンＮａＤ１（非特許文献５０）のＮ末端およびＣ末端に付加して、修飾されたディフェンシン（ＧＬＰ−ＮａＤ１−ＴＲＮＧＬＰ、配列番号７９）を産生した。これを、ピキア・パストリスにおいて組換え発現させ、非特許文献５１に記載されるものに類似の方法を使用して精製した。ＡＥＰに媒介される修飾されたＮａＤ１（１４０μＭ）のプロセシングを、材料および方法の節に記載されている環化アッセイを使用して試験すると、ＥＳＩ−ＭＳでは直鎖状産物のみが明らかであり、骨格環化の兆候はなかった（図１２）。ＮａＤ１のジスルフィド結合構造が、環化に最適とは言えないと考えられる。しかしながら、修飾されたＮａＤ１を、材料および方法に記載されているライゲーションアッセイを使用して、ライゲーションパートナーペプチド（ＧＬＰＶＳＧＥ、配列番号１４、またはＰＬＰＶＳＧＥ、配列番号８０）、ならびに活性な組換えＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、およびｒＯａＡＥＰ５）と共にインキュベートした場合、新しい直鎖状ペプチドが、ＥＳＩ−ＭＳを使用して検出された（図１２）。
【０１９２】
組換えＡＥＰの分子間リガーゼ活性を、他のペプチドの組合せを使用してさらに探索した。骨格環化にとっては良くない基質であった修飾されたＲ１ペプチド（ＧＫＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫＮＧＬ、配列番号８３）を、Ｃ末端標識化の標的ペプチドとして使用した。Ｒ１誘導体を、ビオチン標識したライゲーションパートナー（ＧＬＫ−ビオチン、配列番号１０２）および組換えＡＥＰと共にインキュベートした。ＡＥＰに媒介されるプロセシングにより、Ｃ末端にビオチンを組み込んだ新しい直鎖状ペプチドが作製されたことが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより示された（図１３）。
【０１９３】
必要とされるＡｓｘ残基を含んでいないため、それ自体はＡＥＰの基質ではなかった修飾されたＲ１ペプチド（ＧＬＶＦＡＥＦＬＰＬＦＳＫＦＧＳＲＭＨＩＬＫＧＨＶ、配列番号６１）を、Ｎ末端標識化の標的ペプチドとして使用した。Ｒ１誘導体を、ビオチン標識したライゲーションパートナーペプチド（ビオチン−ＴＲＮＧＬ、配列番号１０４）および組換えＡＥＰと共にインキュベートした。ＡＥＰに媒介されるプロセシングにより、Ｎ末端にビオチンを組み込んだ新しい直鎖状ペプチドが作製されたことが、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより示された（図１４）。
【０１９４】
実施例６
基質特異性による環化ＡＥＰの特定
ＡＥＰ活性は、従来的に、蛍光基質Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ（Ｚは、カルボキシベンジルであり、ＭＣＡは、７−アミド−４−メチルクマリンである）の切断をモニタリングすることによってトラッキングされている［非特許文献１０、非特許文献５２］。ＡｓｎのＣ末端側での切断により、フルオロフォアが遊離され、これが、次いで、蛍光を発して、基質の切断が報告される。しかしながら、ブテラーゼ−１（非特許文献５）もｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、もしくはｒＯａＡＥＰ５（図１５）も、この基質に対する検出可能活性を有していなかった。さらに、２つのＡＥＰ活性部位阻害剤は、高濃度ではｒＯａＡＥＰ１ｂに対する有効性が限られていた（図１６）。それらの阻害剤は、ＡＥＰ活性を特定するために慣例的に使用されているＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（非特許文献５３）、およびＣ末端ｋＢ１切断部位のＰ１〜Ｐ４残基を表すＡｃ−ＳＴＲＮ−ＣＨＯである。ＡＥＰ活性を特定するこれらの従来的な経路は、したがって、環化能力を有するＡＥＰの特定には有効でない可能性が高いであろう。
【０１９５】
Ｐ１〜Ｐ４、ならびにＰ１’〜Ｐ４’残基を組み込んだＩＱＦペプチドは、しかしながら、組換えオルデンランディア・アフィニスＡＥＰによって効果的に標的とされる。これらのペプチドは、蛍光ドナー／クエンチャー対を含有し、蛍光が、酵素切断後にこの対の空間的分離によって観察される。一般的な基質（Ｚ−ＡＡＮ−ＭＣＡ）に対する対応する活性を有さない、このようなＩＱＦレポーターペプチドに対する活性により、環化活性を有する可能性の高いＡＥＰファミリーのメンバーの迅速な特定が可能となり得る。ＩＱＦペプチド形式において、ｒＯａＡＥＰ１ｂは、Ｐ２’位置のＬｅｕなど、嵩高い疎水性残基に対する優先性を示したが、これは、ヒドロラーゼとして優先的に機能するＡＥＰであるヒトレグマイン（ｒｈｕＬＥＧ）とは共通していなかった（図１７Ａおよび１７Ｂ）。このようなＰ２’の特異性はまた、環化能力の予測および／または環化される基質に異なる配列要件を有するＡＥＰの選択に使用することもできる。
【０１９６】
実施例７
細菌により発現されるポリペプチドのインビトロでの環化
環化のための標的ペプチドをコードするＤＮＡ、短いリンカー（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）、およびＣ末端ユビキチン−６ｘＨｉｓを、ｐＨＵＥベクター（非特許文献４２）（ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ）またはｐＥＴ２３ａ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ）のいずれかに挿入して、標的ペプチド−リンカー−ユビキチン−６ｘＨｉｓの融合タンパク質コンストラクトを得た（図１８Ａ）。リンカーのコーディング領域は、標的ペプチドドメインと他の標的配列との置換を容易にするための制限部位を含んでいる。ｐＨＵＥの事例では、挿入されるＤＮＡ配列は、元のベクター配列が確実に再構築されるように、開始Ｍｅｔコドンの前にヌクレオチドを含んでいた。標的ペプチドに天然に存在していない場合、適切なＮ末端およびＣ末端ＡＥＰ認識配列を、導入した。すべての標的ペプチドの最初の残基は、Ｍｅｔである必要があったため、付加されたＮ末端認識配列は、Ｍｅｔ−Ｌｅｕであった。Ｃ末端認識配列は、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏであった。任意選択で、標的ペプチドは、開始Ｍｅｔ、続いてカラタＢ１  Ｎ末端リピート（ＮＴＲ）（図１８Ｂ）、または他の切断可能ドメインが先行する。
【０１９７】
ユビキチンを有する融合タンパク質として産生された標的ペプチドは、シクロチドｋＢ１（配列番号７４）、修飾ヒマワリトリプシン阻害剤ＳＦＴＩ−１  Ｉ１０Ｒ（非特許文献５４）（配列番号７２）、およびコノトキシンＶｃ１．１（非特許文献２５）（配列番号７６）であった。これらのコンストラクトを、Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ大腸菌細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）に導入し、２ＹＴ（１６％［重量／体積］トリプトン、１０％［重量／体積］酵母、５％［重量／体積］塩化ナトリウム）において、３０℃で中対数期まで増殖させた。次いで、温度を、１６℃まで下げ、ＩＰＴＧ（０．４ｍＭ、Ｂｉｏ  Ｖｅｃｔｒａ）で、およそ２０時間、発現を誘導した。細胞を、遠心分離によって採取し、非変性溶解緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１〜１０ｍＭイミダゾール）中に再懸濁した。最大５回の凍結／解凍サイクルおよびリゾチーム（鶏卵の卵白、Ｒｏｃｈｅ、０．４〜１ｍｇ／ｍＬ）の添加によって、溶解を促進した。ＤＮａｓｅ（ウシ膵臓、Ｒｏｃｈｅ、５μｇ／ｍＬ）およびＭｇＣｌ２（５ｍＭ）もまた、添加した。細胞残屑を、遠心分離によって除去した。次いで、溶解物を、０．１μＭのガラス繊維フィルタ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して濾過し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡｇｅｎ）に移して、６ｘＨｉｓタグタンパク質を捕捉した。結合したタンパク質を、溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で溶出し、全タンパク質濃度を、製造業者の指示書に従ってＢＣＡアッセイによって推定した。次いで、融合タンパク質を、酵素アッセイにおいて使用した。任意選択で、溶出したタンパク質は、まず、水または適切な緩衝液に緩衝液交換した後、ＡＥＰプロセシングをアッセイする。任意選択で、溶出したタンパク質は、まず、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中に１：１０で希釈し、第２の樹脂（Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能アニオン交換樹脂、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによりさらに精製される。結合したタンパク質を、連続塩勾配（０−１００％の２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）によって回収し、場合によっては、超純水または適切な緩衝液中に緩衝液交換し、濃縮する。
【０１９８】
ＡＥＰ（ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、ｒＯａＡＥＰ４、ｒＯａＡＥＰ５）の、ユビキチンタグを放出し、標的ペプチドを環化する能力を、材料および方法において記載されている環化アッセイ、続いてＭＡＬＤＩ  ＭＳを使用して、調査した（図１９Ａ、表４）。
推定された基質および酵素の濃度は、図面の説明に示される通りである。必要であれば、
３．３％体積／体積の氷酢酸も、反応ミックスに添加して、アッセイが、確実に酸性ｐＨで行われるようにした。融合タンパク質と共にインキュベートすると、試験したすべての組換えＡＥＰが、ユビキチンを放出し、環化されたｋＢ１（配列番号  ７３）、ＳＦＴＩ−１  Ｉ１０Ｒ（配列番号７１）、およびＶｃ１．１（配列番号  ７５）を単一のステップで産生した。酵素によりプロセシングされた融合タンパク質の割合を推定するために、経時的な前駆体タンパク質の消失を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティング（抗６ｘＨｉｓモノクローナルマウス抗体［Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、０．５μｇ／ｍＬ］、ペルオキシダーゼ複合体抗−マウスＩｇＧ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：１００００］を使用してトラッキングした（図１９Ｂ）。これにより、ｒＯａＡＥＰ１ｂ、ｒＯａＡＥＰ３、およびｒＯａＡＥＰ５については、前駆体の大部分が酵素によりプロセシングされていたことが示された。この実験では、前駆体タンパク質のごく一部が、ｒＯａＡＥＰ４によってプロセシングされた。
【０１９９】
任意選択で、放出されたユビキチンおよびプロセシングされていない融合タンパク質を環化産物から分離するために、混合物を、次いで、非変性溶解緩衝液中に１：５で希釈して、再度Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡｇｅｎ）を通す。プロセシングされた環状産物は、もはや６ｘＨｉｓタグを含んでおらず、したがって、結合していない画分で存在する。この産物を、次いで、超純水中に透析して、濃縮し、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＨＰＬＣ、またはＮＭＲによって分析して、その環状構造を確認する。
【表４】
2019500879.tif 000008
【０２００】
実施例８
酵母により発現されるポリペプチドのインビボでの環化
環状ペプチドをインビボで産生することができるかどうかを調査するために、カラタＢ１（成熟シクロチドドメインＧｌｙ１−Ａｓｎ２９、Ｃ末端テールＧｌｙ３０−Ｐｒｏ３２）および／またはＯａＡＥＰ１ｂ（Ａｌａ２４−Ｐｒｏ４７４）をコードするＤＮＡを、同じかまたは異なる転写ユニットのいずれかからの共発現のために、ピキア・パストリスに導入した（図２０Ａ）。
【０２０１】
同じ転写ユニットからのカラタＢ１およびＯａＡＥＰ１ｂの共発現については、ＥＲシグナル配列をコードするＤＮＡを、ピキア・パストリスカルボキシペプチダーゼＹ（残基Ｍｅｔ１−Ｖａｌ１０７）（非特許文献５５）、カラタＢ１、およびＯａＡＥＰ１ｂに由来する液胞標的化配列（ＶＴＲ）と共に、ｐＰＩＣ９に挿入した（図２０Ａ、コンストラクト１）。ｐＰＩＣ９分泌シグナルを、液胞標的化シグナルで置き換えた。任意選択で、ＮＴＲが、ＶＴＲとシクロチドドメインとの間に含まれるか（図２０Ｂ、コンストラクト４）、ピキア・パストリスカルボキシペプチダーゼＹ配列の残基Ｍｅｔ１−Ｌｙｓ１０８が、上述のコンストラクトに含まれる。リンカー領域（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−配列番号１８）を、カラタＢ１とＯａＡＥＰ１ｂとの間に含めて、シクロチドドメインとＡＥＰドメインとの間の立体障害をタンパク質レベルで低減させ、シクロチドドメインと、他の標的ペプチドをコードするＤＮＡ配列との容易な置換のための制限部位を導入した。代替的なリンカーは、ＭＧＥＶリンカー（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−配列番号１７）または拡張配列（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］２−５）を組み込み得る。外来ＤＮＡを、次いで、ＧＳ１１５ピキア・パストリス細胞に導入した。カラタＢ１およびＯａＡＥＰ１ｂをコードするベクターを、次いで、ＳａｌＩでの制限消化によって直鎖化し、ＧＳ１１５細胞に導入し、ここで、これをｈｉｓ４遺伝子座でゲノムに組み込んだ。
【０２０２】
カラタＢ１およびＯａＡＥＰ１ｂを、別個の転写ユニットからも発現させた（図２０Ａ、コンストラクト２および３）。ＥＲシグナル配列および液胞標的化配列（ピキア・パストリスカルボキシペプチダーゼＹ、残基Ｍｅｔ１−Ｖａｌ１０７）、ならびにカラタＢ１（短いＣ末端テール［Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ］を含む）（図２０Ａ、コンストラクト２）をコードするＤＮＡを、ｐＰＩＣＺαに挿入した（結果として、α接合因子分泌シグナルがクローニングされ、ＥＲシグナル配列および液胞標的化配列と置き換わった）。ベクターを、次いで、ＳａｃＩにより直鎖化し、ＧＳ１１５細胞に導入し、ここで、これを５’ＡＯＸ１遺伝子座でゲノムに組み込んだ。任意選択で、シクロチドドメインは、液胞標的化配列のＣ末端側に挿入されたＮＴＲが先行する（図２０Ｂ、コンストラクト５）。ＥＲシグナル配列および液胞標的化配列（ピキア・パストリスカルボキシペプチダーゼＹ、残基Ｍｅｔ１−Ｖａｌ１０７）ならびにＯａＡＥＰ１ｂ（図２０Ａ、コンストラクト３）をコードするＤＮＡを、ｐＰＩＣ９に挿入した（結果として、アルファ接合因子分泌シグナルがクローニングされ、ＥＲシグナル配列および液胞標的化配列と置き換わった）。ベクターを、次いで、ＳａｌＩでの制限消化によって直鎖化し、カラタＢ１コンストラクトを既に保有しているＧＳ１１５細胞に導入した。ＯａＡＥＰ１ｂコンストラクトを、ｈｉｓ４遺伝子座でゲノムに組み込んだ。
【０２０３】
適切なコンストラクトを保有するＧＳ１１５細胞を、５ｍＬ最小グリセロール緩衝培地（ＢＭＧ；１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６、０．３４％重量／体積の酵母窒素原礎培地、４×１０−５％重量／体積のビオチン、１％体積／体積のグリセロール）において、振動させながら、３０℃で４８時間増殖させた。次いで、このスターター培養物を使用して、４０ｍＬのＢＭＧを接種し、振動させながら３０℃で一晩増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、２００ｍＬのメタノール緩衝培地（ＢＭＭ；１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６、０．３４％重量／体積の酵母窒素原礎培地、４×１０−５％重量／体積のビオチン、１％体積／体積のメタノール）中に再懸濁して、組換えタンパク質の発現を誘導した。培養物を、振動させながら３０℃で７２時間インキュベートし、メタノールを、２４時間ごとに０．５％まで添加した。７２時間後に、細胞を遠心分離によって採取し、破砕緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）（非特許文献５６）中に、等量のガラスビーズと共に再懸濁した。細胞を、ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ（ＡＸＴ）を使用して激しい撹拌によって破壊し、可溶性材料を、遠心分離によって採取した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウェスタンブロッティング（抗ＡＥＰ１ｂウサギ血清［１：２０００］；ペルオキシダーゼ複合体抗ウサギＩｇＧ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１：５０００］によって分析した（図２１）。抗体反応性によって判断すると、ＯａＡＥＰ１ｂの発現は明らかであるが、しかしながら、不鮮明なパターンおよび予測されたものよりも高い見かけの分子量により、タンパク質が修飾されており、グリコシル化しているかまたは凝集している可能性があることが示唆される。
【０２０４】
液胞標的化シグナルを追加して、発現されたタンパク質のピキア・パストリスの液胞への輸送および標的ペプチドのインビボでの環化を促進する。環状標的ペプチドを、次いで、細胞から直接精製する。これは、液胞画分の単離によって補助することができる。これは、これまでに説明されているように実行される（非特許文献５７）。体積は、ＯＤ６００での１Ｌ培養物に関するものであり、必要に応じて増減される。解凍した細胞を、３３．３ｍＬの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．４、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）中に再懸濁し、３０℃で１０分間インキュベートする。細胞を、次いで、遠心分離によって採取し、６．７ｍＬのスフェロプラスト緩衝液（０．１８×ＹＰＤ［０．１８％重量／体積の酵母抽出物、０．３６％重量／体積のバクトペプトン、０．３６％重量／体積のデキストロース、ｐＨ５．５］、２４０ｍＭソルビトール、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５）中に再懸濁する。さらに、リチカーゼ（Ｓｉｇｍａ、製造業者の指示書に従う）と合わせたスフェロプラスト緩衝液３．３ｍＬを、次いで、添加し、細胞を、３０℃で２０分間インキュベートする。細胞を、遠心分離によって採取し、１．６７ｍＬの１５％  Ｆｉｃｏｌｌ（ＰＳ緩衝液中の重量／体積［１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ６．８、２００ｍＭソルビトール］）中に再懸濁する。デキストラン溶液（１０ｍｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−デキストラン、１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ６．８、２００ｍＭソルビトール）を、０．４ｍｇ／ｍＬまで添加し、細胞を、氷上でインキュベートし（５分間）、３０℃でインキュベートし（１．５分間）、再び氷上でインキュベートする（５分間）。細胞溶解物を、遠心チューブに移し、３ｍＬの８％重量／体積Ｆｉｃｏｌｌ（ＰＳ緩衝液中）、４％重量／体積Ｆｉｃｏｌｌ（ＰＳ緩衝液中）、およびＰＳ緩衝液を順に重ねる。溶解物を、４℃で９０分間、１１０，０００×ｇで遠心分離し、液胞を０〜４％重量／体積Ｆｉｃｏｌｌ界面から収集する。
【０２０５】
単離した液胞を、４倍量の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌを添加することによって（撹拌しながら４℃で３０分間）、浸透圧溶解させる（非特許文献５８）。溶解した液胞を、０．２２μｍのフィルタに通して濾過し、さらに、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８で１：４に希釈し、Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能アニオン交換樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させる。結合したカラタＢ１を、連続塩勾配（０−１００％の２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）によって回収し、超純水に緩衝液交換し、濃縮する。さらなる精製については、サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ１８逆相カラム（４．６×２５０ｍｍ、３００Å）に充填し、緩衝液Ａ（０．０５％体積／体積ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）中５−５５％の線形勾配の緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％体積／体積Ｈ２Ｏ、０．０５％体積／体積ＴＦＡ）を使用して、６０分間にわたって分離させる。カラタＢ１を含有する画分を凍結乾燥させ、超純水中に再懸濁させ、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＨＰＬＣ、またはＮＭＲによって分析して、その環状構造を確認する。
【０２０６】
環化されたタンパク質は、通常、直鎖状タンパク質よりも安定であるため、粗製抽出物を、さらに、細胞破壊後１時間、７０℃に加熱し、４０００ｇで２０分間遠心分離して、環化されていない細胞タンパク質の大半を変性および除去してもよい。環化されたタンパク質が、次いで、液胞抽出物に関して後述のように、浄化された抽出物から精製される。
【０２０７】
実施例９
ポリペプチドのライゲーション
ＡＥＰ切断部位および６ｘＨｉｓタグを組み込むＣ末端隣接配列を有する植物ディフェンシンＮａＤ１（非特許文献５０）（ＮａＤ１−ＳＴＲＮＧＬＰＨＨＨＨＨＨ−配列番号１２、２８０μＭ）を、ライゲーションパートナー（ＧＬＰＶＳＧＥＫ−配列番号１３−フルオレセインイソチオシアネート［ＦＩＴＣ］またはＧＬＰＶＳＧＥ；−配列番号１４、５．６ｍＭ）およびｒＯａＡＥＰ１ｂ（１２μｇ／ｍＬの全タンパク質）と共に、活性緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５μＭ  ＴＣＥＰ、ｐＨ５）中において、室温で２２時間インキュベートする（図２２）。ライゲーション産物の出現（ＮａＤ１−ＳＴＲＮＧＬＰＶＳＧＥＫ−ＦＩＴＣ  −  配列番号１６またはＮａＤ１−ＳＴＲＮＧＬＰＶＳＧＥ−  配列番号１５）を、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによってトラッキングする。プロセシングされていないＮａＤ１をライゲーション産物から分離するために、混合物を、非変性溶解緩衝液（トリトンＸ１００不含）中に１：５で希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡｇｅｎ）に移す。ライゲーション産物は、６ｘＨｉｓタグを含まず、したがって、結合していない画分で存在する。この産物を、次いで、超純水中に透析し（分子量３Ｄａでカットオフして、脱離基も確実に除去されるようにする）、濃縮し、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによって分析して、正しいライゲーション産物が生成されたことを確認する。標識した短いペプチドと大きなポリペプチドとのライゲーションにより、様々な部分（例えば、他の蛍光標識、親和性タグ）の一般的な標的化タンパク質標識戦略が提供される。この戦略は、合成ペプチド化学反応が適切なライゲーションパートナーを産生する能力によってのみ制限される、
【０２０８】
実施例１０
大腸菌における他の組換えＡＥＰの発現および活性化
シサー・アリティナム（配列番号９２）、メディカゴ・トランカツラ（配列番号９３）、ホルデウム・ウルガレ（配列番号９４）、ゴシピウム・ライモンジ（配列番号９５）、およびケノポジウム・キノア（配列番号９６）に由来するＡＥＰを、大腸菌において組換え発現させる。推定上のシグナル伝達ドメイン（ＣａＡＥＰ残基Ｑ５６〜Ｐ４６０、ＭｔＡＥＰ残基Ｅ５４〜Ｎ４９７、ＨｖＡＥＰ残基Ｇ６０〜Ｙ５０８、ＧｒＡＥＰ残基Ｑ３１〜Ｈ５００、ＣｑＡＥＰ残基Ｒ３３〜Ｖ５９９）を有さないこれらの全長ＡＥＰをコードするＤＮＡを、ｐＨＵＥベクターに挿入して（非特許文献４２）、６ｘＨｉｓ−ユビキチン−ＡＥＰ融合タンパク質コンストラクトを得る。残基の番号付けは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（非特許文献２９）を使用して生成された５つの配列の多重アライメントによって決定される通りである。ＤＮＡを、次いで、Ｔ７  Ｓｈｕｆｆｌｅ大腸菌細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）に導入する。形質転換した細胞を、ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（３．５％トリプトン［重量／体積］、２％酵母抽出物［重量／体積］、１％グルコース［重量／体積］、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＯＨ）において３０℃で中対数期まで増殖させる。温度を、次いで、１６℃まで下げ、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．４ｍＭ、Ｂｉｏ  Ｖｅｃｔｒａ）で、およそ２０時間、発現を誘導する。細胞を、遠心分離によって採取し、非変性溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７）中に再懸濁する。合計５回の凍結／解凍サイクルおよびリゾチーム（鶏卵の卵白、Ｒｏｃｈｅ、０．４ｍｇ／ｍＬ）の添加によって、溶解を促進する。ＤＮａｓｅ（ウシ膵臓、Ｒｏｃｈｅ、４０μｇ／ｍＬ）およびＭｇＣｌ２（０．４Ｍ）もまた、添加する。細胞残屑を、遠心分離によって除去し、溶解物を、必要となるまで−８０℃で保管する。
【０２０９】
発現された組換えＡＥＰを含有する溶解物を、０．１μＭのガラス繊維フィルタ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通して濾過した後、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ビス−トリス、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）中に１：８で希釈し、直列に接続された２つの５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１．６〜３．１ｍＬ未希釈溶解物／ｍＬ樹脂）に充填する。結合したタンパク質を、連続塩勾配（０−３０％の緩衝液Ｂ［２０ｍＭ  ビス−トリス、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７］、１５カラム体積［ｃｖ］）で溶出し、ＡＥＰ陽性の画分を、ウェスタンブロッティング（抗ＡＥＰ１ｂウサギ血清［１：２０００］、ペルオキシダーゼ複合体抗ウサギＩｇＧ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１：５０００］）によって特定する。
【０２１０】
ＡＥＰは、通常、酵素前駆体として産生され、この前駆体が、低ｐＨにおいて自己プロセシングして、それらの成熟した活性形態となる（非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５）。すべてのＡＥＰを自己活性化するために、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、０．５ｍＭ）を添加し、ｐＨを、氷酢酸によって４．５に調節し、タンパク質プールを３７℃で５時間インキュベートする。ｐＨ４．５でのタンパク質沈殿により、汚染タンパク質の大部分を遠心分離によって除去することが可能となる。残りのタンパク質を、濾過し（０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、緩衝液Ａ２（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ４）中に１：８で希釈した後、１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で捕捉する。結合したタンパク質を、塩勾配（０−１００％の緩衝液Ｂ２［５０ｍＭ酢酸、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４］、１０ｃｖ）で溶出し、ＩＱＦペプチド（適宜、Ａｂｚ−ＳＴＲＮＧＬＰＳ−Ｙ（３ＮＯ２）または他の標的配列または蛍光ペプチド）に対する活性を有する画分をプールし、後続の活性アッセイにおいて使用する。各調製物中の全タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイによって、製造業者の指示書に従って推測する。酵素は、材料および方法に記載されているように、環化およびライゲーションアッセイに使用する。
【０２１１】
当業者であれば、本明細書に記載される態様の態様が、具体的に記載されたもの以外の変化および修正を受ける可能性を認識しているものと予想される。これらの態様が、そのような変化形および修正形を含むことを理解されたい。これらの態様はまた、個別または集合的に、本明細書に参照されるか、または示されるステップ、特徴、組成物、および化合物のすべて、ならびにステップまたは特徴の任意の２つ以上のあらゆる組合せを含む。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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