(57)【要約】  本発明は、亜鉛２＋塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーならびに場合により腫瘍増感剤としてのＮＦ−κＢ阻害剤を含む医薬組成物ならびにそのような組成物を用いて患者における腫瘍を処置するための方法に関する。方法は、療法上有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーの液体剤形または固体剤形を、それを必要とする患者に投与することを含む。開示された組成物を用いて薬物耐性表現型を有する腫瘍を含む広いスペクトルのヒト腫瘍を処置する方法が、提供される。本明細書で開示される医薬組成物に応答する腫瘍は、神経内分泌腫瘍（神経芽細胞腫）、胃腫瘍、子宮腫瘍および肺腫瘍を含む。【選択図】図２
2019534330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者中の腫瘍においてＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を誘導する方法であって、該方法が、剤形中の療法上有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーを、該腫瘍を有する該患者に投与することを含み；
前記のγ−ポリグルタミン酸キャリヤーが、γ−ポリグルタミン酸および／または腫瘍標的化γ−ポリグルタミン酸誘導体および／または電荷修飾γ−ポリグルタミン酸誘導体および／または腫瘍標的化電荷修飾γ−ポリグルタミン酸誘導体を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記の腫瘍が、薬物耐性表現型を有する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記の薬物耐性表現型が、機能不全のｐ５３である方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記の薬物耐性表現型が、ＭＤＲ１の過剰発現である方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、前記の薬物耐性表現型が、ＭＲＰ１の過剰発現である方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記の剤形中における前記のＺｎ（ＩＩ）塩および前記のγ−ポリグルタミン酸キャリヤーが、療法量のＮＦ−κＢ阻害剤との組み合わせで療法量で投与される方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記の剤形が、固体剤形または液体剤形である方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記の剤形が、固体剤形であり、錠剤、ミニ錠剤、硬カプセル、軟カプセル、カプレット、ゼラチンカプセル、経口崩壊性フィルム、顆粒、ペレット、ペーストおよび粉末小袋から選択される方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記の剤形が、液体剤形であり、液体溶液、液体懸濁液、シロップおよび経口スプレーから選択される方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記の投与工程が、経口投与および注射投与から選択される方法。
【請求項１１】
（ｉ）薬学的に許容可能なＺｎ（ＩＩ）塩ならびに（ｉｉ）腫瘍標的化部分および／または電荷修飾部分を含むγ−ポリグルタミン酸キャリヤーを含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物であって、前記の腫瘍標的化部分が、葉酸、５Ｎ，１０Ｎ−ジメチルテトラヒドロフォレートおよびＲＧＤペプチドから選択され、前記の部分のいずれかの組み合わせが、γ−ポリグルタミン酸に共有結合的に連結されている医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の医薬組成物であって、前記の電荷修飾部分が、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸から選択され、前記の部分のいずれかの組み合わせが、γ−ポリグルタミン酸に共有結合的に連結されている医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の医薬組成物であって、さらに（ｉｉｉ）γ−ポリグルタミン酸を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記のＺｎ（ＩＩ）塩の実質的な部分が、Ｚｎ（ＩＩ）イオンのγ−ポリグルタミン酸および／または前記の腫瘍標的化部分および／または前記の電荷修飾部分との結合した複合体である医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、（ｉ）前記のＺｎ（ＩＩ）塩および（ｉｉ）前記のγ−ポリグルタミン酸キャリヤーが、固体混合物中で一緒に混合される医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、さらにＮＦ−κＢ阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、固体剤形として配合される医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記の固体剤形が、さらに胃耐性結合剤および／または胃耐性外部コーティングを含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、液体剤形として配合される医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の医薬組成物であって、前記の液体剤形が、注射に適している医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の医薬組成物であって、前記の液体剤形が、さらに胃耐性材料を含む医薬組成物の懸濁液である医薬組成物。
【請求項２３】
患者において腫瘍を処置するための方法であって、療法上有効量の請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、該腫瘍を有する該患者に投与することを含む方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記の腫瘍が、機能不全のｐ５３、ＭＤＲ１過剰発現およびＭＲＰ１過剰発現から選択される薬物耐性表現型を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンマ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）キャリヤーおよび亜鉛塩ならびに場合によりＮＦ−κＢ阻害剤を含む組成物、その医薬配合物、ならびにその組成物および配合物のいずれかを抗腫瘍剤として患者におけるがんを処置するために用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん薬物に対する先天性および後天性薬物耐性は、がん処置の失敗の主な原因である。耐性に関する一般的な機序は、ｐ５３アポトーシスタンパク質における機能不全および／またはＭＤＲ１もしくはＭＲＰ１遺伝子によりコードされるエネルギー依存性薬物排出ポンプの過剰発現を含む。薬物耐性問題を克服するための１つの殺腫瘍戦略は、機能不全のｐ５３アポトーシス機能を個々に修正することまたは薬物排出ポンプを阻害することである。代わりのアプローチは、ＰＡＲＰ１に媒介されるエネルギー枯渇に誘導される壊死性細胞死機序（“ＰＡＲＰ１媒介性壊死”）を利用することであり、それは、ｐ５３に媒介されるアポトーシス機序を完全に迂回する。
【０００３】
心臓または脳組織の虚血後壊死において最初に観察されるＰＡＲＰ１媒介性壊死は、ＰＡＲＰ１酵素による過剰なＤＮＡ修復活性からの細胞エネルギー（ＮＡＤ＋およびＡＴＰ）の枯渇により引き起こされる。遺伝子損傷に反応したＰＡＲＰ１／ＰＡＲＧの超活性化は、ＮＡＤ＋およびＡＴＰ細胞エネルギー物資の枯渇を誘発し、それは、続いてＭＰＴＰ活性化からのミトコンドリアに開始される壊死を誘発する。この事象のセットが、図１において図説されている。その壊死機序はｐ５３に媒介されるアポトーシスを迂回するため、この機序ががんを標的とするために用いられることできる可能性があることが提唱された（ＮＰＬ３）。しかし、このアイデアを臨床的に有用な療法的処置に変換することは、試みられた方法が毒性すぎることが判明したため、誰も成功しなかった。ＰＡＲＰ１媒介性壊死は、過剰な放射線曝露および／または高度に毒性の化学療法剤、例えばドキソルビシンの投与による実験的腫瘍においてのみ誘導されることができた。ＰＡＲＰ１媒介性壊死を活性化するための毒性薬剤の使用による別の問題は、その薬剤がｐ５３タンパク質も亜臨界（ｓｕｂ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）レベルで活性化し、ｐ５３に誘導されるＰＡＲＰ１酵素の断片化によりＰＡＲＰ１媒介性壊死を有効に無力化することであった。腫瘍内の薬物分布が物理的および構造的制約のために不均一であることを考慮すると、毒性薬剤が同時にがん腫瘍塊の大部分においてＰＡＲＰ１を欠損させ、従ってＰＡＲＰ１媒介性壊死に非感受性の状態にするであろうことが、推測された。
【０００４】
多数の臨床がん症例において解決されるべき問題は、一部のがんは従来の抗がん薬に生得的に耐性であり、他のがんは全身性処置の過程にわたって多剤耐性を発現し、結果として処置の失敗をもたらすことである。放射線および化学療法剤の過剰投与によるＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死の利用を、がんを処置するために用いることができるという理論的示唆は存在したが、この可能性のある結果の実現は、処置において本来備わっている毒性および上記で言及された機序に本来備わっている自己矛盾的性質により困難であった。従って、ＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死の有効な誘導に基づく組成物および／または処置法を見付けるための未だ対処されていない必要性が、残っている。さらに、腫瘍壊死プロセスに干渉することも過度に毒性であることもなくそのような誘導剤を腫瘍組織に特異的に送達することができるキャリヤーおよび標的化システムを含む組成物および／または処置法が、非常に望まれている。多種多様ながんのタイプおよび／または薬物耐性特性に対して必要とされる殺腫瘍用量を低減する、ならびに健康な組織における望ましくない副作用を低減する継続した望みも、存在する。
【０００５】
亜鉛塩類の神経毒性を評価する報告は、単純な亜鉛塩類からの亜鉛イオンの高い濃度（４００μＭまたは２６μｇ／ｍＬ）は、培養された皮質細胞においてＰＡＲＰ／ＰＡＲＧに媒介されるＮＡＤ＋およびＡＴＰ枯渇ならびにそれに続く壊死を誘導することを記載している（ＮＰＬ６）。しかし、その報告は、亜鉛塩類の殺腫瘍活性またはがんに対するそれらの療法的使用を研究しなかった。
【０００６】
免疫細胞に対するピリチオン亜鉛の毒性を評価する報告は、ナノモル濃度のピリチオン亜鉛が、マウス胸腺細胞、マウス脾臓リンパ球、ヒトＲａｍｏｓ  ＢおよびヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を含む様々な白血球由来細胞において亜鉛特異的アポトーシスを誘導することを示した（ＮＰＬ７）。その報告は、壊死性細胞死を妨げる作用を有するカスパーゼ９の活性化により、ピリチオン亜鉛がアポトーシスを誘導することを開示した（ＮＰＬ１１）。まとめると、これらの報告は、研究された免疫細胞において、ナノモル用量のピリチオン亜鉛がアポトーシス性細胞死を誘導し、壊死性細胞死を誘導しないことを示している。
【０００７】
後に、マイクロモル濃度のピリチオン亜鉛（１〜１０μＭ）はアンドロゲン依存性ＬＮＣａＰおよびアンドロゲン非依存性ＰＣ３、ＤＵ１４５前立腺がん細胞株においてＡＴＰ枯渇ならびに最終的にＥＲＫおよびＰＫＣ依存性壊死を誘発することが、実証された（ＮＰＬ２）。しかし、壊死を誘発するためにＮＰＬ２において用いられたピリチオン亜鉛の用量は、ラットにおいて９〜１４日間の食餌性投与（２４０ｐｐｍ）後に進行性後肢虚弱、協調運動障害、筋萎縮を伴う脊柱後弯および陰茎脱の臨床症状を伴う急性神経毒性を引き起こすことが、以前に示された（ＮＰＬ１０）。
【０００８】
従って、ピリチオン亜鉛が前立腺がん細胞株に対して選択的壊死性細胞死を引き起こすことができるという報告は存在したが、それは高い（μＭ）濃度の薬剤を必要とし（ＮＰＬ２）、しかしピリチオン亜鉛は、そのような濃度において重篤かつ永続的な神経毒性を引き起こすことが示されてきたものであり（ＮＰＬ１２）、このことは、ピリチオン亜鉛を抗腫瘍療法剤へと開発する試みを思いとどまらせてきたであろう。さらに、ＮＰＬ２は、多数のがん細胞型に対して広いスペクトルの抗がん活性を実証したものではなく、ＭＤＲ１またはＭＲＰ１多剤耐性遺伝子の過剰発現に由来する薬物耐性の逆転へ向けた有効性を示さず、また、いずれの動物がんモデルにおいても壊死性有効性を示さなかった。
【０００９】
ＮＰＬ５は、インスリン模倣亜鉛（２＋）複合体を開発し、２型糖尿病ＫＫＡｙマウスにおいて亜鉛（ガンマ−ポリグルタミン酸）複合体のインビトロインスリン模倣活性ならびにインビボ抗糖尿病作用を調べた。具体的には、その研究は、ガンマ−ポリグルタミン酸複合体化亜鉛を用いて、ｋｇ体重あたり１０〜２０ｍｇのＺｎを３０日間経口投与することが、ＺｎＳＯ４を用いた処置と比較してＫＫＡｙマウスにおいて高血糖症を正常化し、耐糖能障害、高められたＨｂＡ（１ｃ）レベルおよびメタボリックシンドロームを改善することを示した（ＮＰＬ５）。ＮＰＬ５において、著者らは、亜鉛（ガンマ−ポリグルタミン酸）複合体は２型糖尿病性ＫＫＡｙマウスにおいてそれらの高い血中グルコース低下作用ならびにインスリンのβ細胞分泌における撹乱およびインスリン抵抗性を減弱するそれらの能力により抗糖尿病効力を有すると結論付けたが、彼らは、その複合体のインスリン模倣活性の原因となる作用機序を理解しておらず、彼らは、亜鉛（ガンマ−ポリグルタミン酸）複合体による抗腫瘍活性も薬物不応性のがんのタイプの処置に関するその有効性も一切示唆しなかった。
【００１０】
要約すると、当該技術は、インビボで重要な薬物耐性特性を有するがんを含む広いスペクトルのがんを有効に処置し、さらに重大な毒性の危険を冒さずにそうするという上記で言及された目的を達成するための亜鉛化合物の使用を示唆さえしておらず、当然成功もしていない。従って、毒性の問題を伴わずに多くのがんのタイプ、さらに薬物耐性表現型（例えば機能不全のｐ５３、ＭＤＲ１過剰発現、ＭＲＰ１過剰発現）を有するがんのタイプにわたって作用するがんを処置するための、臨床的に有効かつ安全な亜鉛組成物に関する未解決の必要性が、存在する。その問題を解決するため、我々は、当該分野における体系的な研究を実施し、これらの必要性を満たす亜鉛複合体の配合物を開発し、従って本明細書で記載される我々の発明を完成させた。
【００１１】
引用
【００１２】
【化１】
2019534330.tif 000003
【００１３】
【化２】
2019534330.tif 000004
【発明の概要】
【００１４】
本明細書で開示される組成物、医薬配合物および方法は、亜鉛およびγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）の複合体が様々なヒトおよびマウスがん細胞株において壊死性細胞死を誘導することができるという驚くべき観察に基づいている。
【００１５】
本発明は、ＰＡＲＰ１媒介性壊死性細胞死機序を誘発する亜鉛含有γ−ポリグルタミン酸組成物に関する。理論により限定されることなく、亜鉛は、ＰＡＲＰ１を過剰に活性化するようであり、それは今度は、細胞中のＡＴＰおよびＮＡＤ＋の枯渇につながる。結果として、細胞は、エネルギー源を枯渇させられ、次いで壊死性細胞死経路に入る。
【００１６】
壊死を誘導するこの機序は、ほとんどのがん細胞型に関して同様に利用可能であると予想され、従って亜鉛含有γ−ポリグルタミン酸組成物は、広いスペクトルの殺腫瘍活性を示す。さらに、この機序は、異なる殺腫瘍機序に関連する薬物耐性表現型を有する腫瘍もこのＰＡＲＰ１媒介性機序に反応し得ることを示唆している。
【００１７】
本発明に従う組成物は、（ｉ）有効成分としての亜鉛（ＩＩ）種（同等に、Ｚｎ２＋）ならびに（ｉｉ）未修飾形態および／または修飾形態（ここで、葉酸および／またはＲＧＤ腫瘍標的化ペプチドがγ−ＰＧＡに共有結合している）のキャリヤーとしてのγ−ＰＧＡを含む。組成物は、さらに腫瘍細胞をＺｎ（ＩＩ）およびγ−ＰＧＡの殺腫瘍作用に対して増感させる（それらをより感受性にする）ためのＮＦ−κＢ阻害剤またはＮＦ−κＢシグナル伝達カスケード阻害剤を含むことができる。
【００１８】
組成物は、経口投与のために配合されることができる。ある態様において、胃の強酸性環境中での複合体からの亜鉛イオンの解離を防ぐ、遅らせる、または減じるために胃耐性材料、例えば腸溶結合剤およびコーティングまたは蝋コーティングを含む経口配合物が、提供される。
【００１９】
本発明は、上記で言及された組成物および医薬配合物を調製するための方法ならびにその療法的使用にも関する。
ＰＡＲＰ−１媒介性腫瘍壊死を有効に誘導することができる組成物を提供することは、本発明の１つの目的であり、患者に毒性ではない組成物および配合物を用いてそうすることは、さらなる目的である。
【００２０】
患者において薬物耐性表現型を有する多種多様な腫瘍およびがん細胞を処置することにおける使用のための医薬配合物を提供することは、本発明の別の目的である。
Ｚｎ（ＩＩ）の腫瘍細胞への送達を標的化することができるγ−ＰＧＡキャリヤーを含む組成物を提供することは、本発明の別の目的である。また、低減した用量要求を有する、または健康な組織における望まれない副作用の低減したプロフィールを有する強い殺腫瘍剤を提供することは、本発明の目的である。
【００２１】
患者中の腫瘍においてＰＡＲＰ１媒介性腫瘍壊死を誘導する方法の一態様は、療法上有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーを、腫瘍を有する患者に投与することを含み、ここで前記のγ−ポリグルタミン酸キャリヤーは、γ−ポリグルタミン酸および／または腫瘍標的化γ−ポリグルタミン酸誘導体および／または電荷修飾γ−ポリグルタミン酸誘導体および／または腫瘍標的化電荷修飾γ−ポリグルタミン酸誘導体を含む。方法の別の態様において、療法上有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤー（別途示されない限り、γ−ポリグルタミン酸キャリヤーまたは組成物への言及は、上記で列挙されたような様々なタイプのγ−ポリグルタミン酸の誘導体を含む組成物を含む）が、薬物耐性表現型を有する腫瘍を有する患者に投与される。
【００２２】
方法の別の態様において、療法上有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーは、療法量のＮＦ−κＢ阻害剤および／またはＮＦ−κＢシグナル伝達カスケード阻害剤との組み合わせで投与される。
【００２３】
一態様において、療法量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーは、固体剤形中で、または液体剤形中で一緒に投与される。いくつかの態様において、固体剤形は、錠剤、ミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂ）、硬カプセル、軟カプセル、カプレット、ゼラチンカプセル（ｇｅｌｃａｐｓ）、経口崩壊性フィルム、顆粒、ペレット、ペーストおよび粉末小袋（ｓａｃｈｅｔ）から選択される。いくつかの態様において、液体剤形は、液体溶液、液体懸濁液、シロップおよび経口スプレーから選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、療法量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーは、経口投与または注射投与により一緒に投与される。
本発明の一態様は、（ｉ）薬学的に許容可能なＺｎ（ＩＩ）塩、（ｉｉ）腫瘍標的化部分および／または電荷修飾部分を含有するγ−ポリグルタミン酸を含み、かつ（ｉｉｉ）場合によりさらにγ−ポリグルタミン酸を含む医薬組成物である。
【００２５】
いくつかの態様において、前記の腫瘍標的化部分は、葉酸、ジメチルテトラヒドロフォレート（ＤＭＴＨＦ）およびＲＧＤペプチドから選択され、前記の部分のいずれかの組み合わせが、γ−ポリグルタミン酸に共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、前記の電荷修飾部分は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸から選択され、前記の部分のいずれかの組み合わせが、γ−ポリグルタミン酸に共有結合的に連結されている。
【００２６】
別の態様において、医薬組成物は、さらにγ−ポリグルタミン酸を含む。別の態様において、医薬組成物において、前記のＺｎ（ＩＩ）塩の実質的な部分は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンのγ−ポリグルタミン酸および／または前記の腫瘍標的化部分および／または前記の電荷修飾部分との結合した複合体である。別の態様において、医薬組成物において、Ｚｎ（ＩＩ）塩および（ｉｉ）前記のγ−ポリグルタミン酸ポリマーは、固体混合物中で一緒に混合される。
【００２７】
別の態様において、医薬組成物は、さらにＮＦ−κＢ阻害剤および／またはＮＦ−κＢシグナル伝達カスケード阻害剤を含む。
他の態様において、上記の医薬組成物のいずれかが、固体剤形として配合される。いくつかのさらなる態様において、固体剤形は、さらに胃耐性結合剤および／または胃耐性外部コーティングを含む。他の態様において、上記の医薬組成物のいずれかが、液体剤形として配合される。ある態様において、液体剤形は、注射のために配合される。さらなる態様において、液体剤形は、さらに胃耐性材料を含む医薬組成物の懸濁液である。さらなる態様において、液体剤形は、上記の医薬組成物のいずれかおよび場合により胃耐性材料を含む蝋でコートされた微粒子の懸濁液である。
【００２８】
患者における腫瘍を処置するための方法の一態様は、前記の医薬組成物の態様のいずれか１つに従う療法上有効量の医薬組成物を、腫瘍を有する患者に投与することを含む。方法のさらなる態様において、療法上有効量の前記の医薬組成物は、薬物耐性表現型を有する腫瘍を有する患者に投与される。
【００２９】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な本発明および特許請求の範囲の記載から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＰＡＲＰ１媒介性壊死の模式的要約である。
【図２】図２は、ＺｎＰＧＡ組成物の一態様で処置されたヒトがん株のインビトロフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図３】図３は、ＬＬ２マウス肺がん同種移植片をＺｎＰＧＡ組成物の態様で処置した結果を示す。
【図４】図４は、マウスにおけるＨ４６０ヒト肺がんの皮下異種移植片をＺｎＰＧＡ組成物の一態様で処置した結果を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＨｅＬａ細胞およびＭＣＦ７細胞をそれぞれＺｎ（ＩＩ）／γ−ＰＧＡ組成物で処置した結果を示す。
【図６】図６は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ７細胞およびＡ５４９細胞をＺｎ（ＩＩ）／γ−ＰＧＡ組成物で処置した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書で記載される組成物、配合物および方法において用いられる構成要素は、医薬的使用に関して、または食品における使用に関して、またはヒトの消費のための製品における使用に関して規制当局により認められているグレードのものである。ある場合において、構成要素は、医薬グレードまたは医学グレードの化合物または物質である。
【００３２】
本明細書で用いられる略語の意味は、以下の通りである：“ｋＤａ”は、キロダルトンを意味し；“重量％”は、重量によるパーセントを意味する。
亜鉛は、亜鉛（ＩＩ）塩（同等にＺｎ２＋塩）として提供され、ここで、対イオン（陰イオン）は、あらゆる適切な無機または有機陰イオンであることができる。適切な陰イオンは、毒性ではない陰イオンを含む人体に許容される陰イオンである。一般に、亜鉛塩は、式Ｚｎ２＋Ｘ２−もしくはＺｎ２＋（Ｘ−）２またはさらにはＺｎ２＋（Ｘ−）（Ｙ−）により表されることができ、式中、ＸおよびＹは、適切な陰イオンである。陰イオンは、認可された医薬の構成要素である陰イオンの群から選択されることができる。ある態様において、亜鉛（ＩＩ）塩は、薬学的に許容可能な亜鉛塩であり、前記の亜鉛（ＩＩ）塩は、医薬組成物における使用に関して認可されている亜鉛（ＩＩ）塩類の群から選択される。陰イオンは、ＦＤＡに認可された医薬製品の構成要素である陰イオンの群から選択されることができる。ある態様において、亜鉛（ＩＩ）塩は、薬学的に許容可能な亜鉛塩である。他の態様において、陰イオンは、認可された食品添加剤または栄養補給剤の構成要素である陰イオンの群から選択されることができる。亜鉛塩類の例は、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酢酸亜鉛、ピコリン酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、アミノ酸−亜鉛キレート類、例えばグリシン亜鉛または当該技術で既知である、および使用されている他のアミノ酸を含む。２種類以上の異なる亜鉛塩類が、組成物または配合物のいずれかにおいてＺｎ（ＩＩ）を提供するためにあらゆる割合で一緒に用いられることができる。
【００３３】
ある態様において、組成物または配合物においてγ−ポリグルタミン酸化合物に対して複合体化したＺｎ（ＩＩ）が、提供される。典型的には、Ｚｎ（ＩＩ）およびγ−ＰＧＡの複合体化した形態（“ＺｎＰＧＡ”）が、提供され、ＺｎＰＧＡは、精製され、遊離のＺｎ（ＩＩ）イオンならびにＺｎ陽イオンに対する元の対イオンは、そのプロセスにおいて実質的に除去される。
【００３４】
単一の固体剤形中に含まれる亜鉛の量は、一般に約１〜約１００ｍｇの亜鉛（亜鉛（ＩＩ）イオン）の範囲である。従って、配合された組成物中で用いられる亜鉛塩（類）の特定の量は、塩の量が対イオンの重量を説明しなければならないため、より高いであろう。亜鉛（ＩＩ）のみを考慮すると、剤形中で提供される量は、約１００ｍｇまで、約７５ｍｇまで、約５０ｍｇまで、約２５ｍｇまで、約１０ｍｇまでの亜鉛、または約５ｍｇまでであることができる。固体剤形中で提供される亜鉛（ＩＩ）の量は、一般に少なくとも約１ｍｇである。比較として、一般に入手可能な補給剤は、例えば２０、２５、３０、５０、７５およびさらには１００ｍｇの亜鉛を提供する。この範囲における亜鉛のあらゆる量またはさらに高い量が、提供される量が生理的に過剰なレベルの亜鉛の吸収を引き起こさない限り、許容可能である。しかし、考慮され得ることは、過剰なレベルおよびそれ由来のリスクが、腫瘍を処置することにより得られる療法的利益に対して釣り合いが取られるべきであることである。ほとんどの成人における亜鉛の許容可能な上限摂取レベルは、約４０ｍｇ／日である（子供に関してはそれはより低い）が、経口摂取される固体剤形中の亜鉛の全てが吸収されることはなさそうであり；その一部は吸収されずに体を通過するであろうことは、認識されるべきである。吸収される亜鉛の量は配合によっても異なると考えられるため、個々の配合物中の亜鉛含有量の上限は、配合物により提供される取り込みのレベルを確かめるための当該技術で既知の方法により試験されることができ、次いで配合物を投与することにより得られる処置におけるあらゆる療法的利益を考慮して、所与の剤形または配合物に関して投与される量を適宜調節することができる。
【００３５】
液体剤形中の組成物または配合物中で提供される亜鉛の濃度は、一般に約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの亜鉛（亜鉛（ＩＩ）イオン）の範囲である。これは、約０．０００１重量％〜約１０重量％の亜鉛の範囲に相当する。Ｚｎ（ＩＩ）の濃度は、少なくとも約１０ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、もしくは少なくとも約１ｇ／Ｌ、もしくは少なくとも約１０ｇ／Ｌであることができ、またはＺｎ（ＩＩ）の濃度に関する範囲は、これらの典型的な濃度のいずれか２つの範囲内に入ることができる。一態様において、濃度は、約１００ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの範囲であることができる。剤形中で提供される液体の量は、総投与量を決定するであろう。例えば、１００ｍＬの量の液体は、典型的な範囲に関して約１０ｍｇ〜約５０ｍｇのＺｎ（ＩＩ）を提供するであろう。別の態様において、濃度は、約１０００ｍｇ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬ）であることができ、従って１ミリリットルあたり約１ｍｇを提供することができる。固体剤形中の亜鉛の投与量に関する開示は、液体投与量として提供するＺｎ（ＩＩ）溶液の量に関する手引きとして用いられることができる。実施例４において開示されるように、マウスが、Ｚｎ（ＩＩ）の１６０μｇ／ｍＬ溶液（１６０ｍｇ／Ｌと等しい）で処置され、１６ｍｇ／日／ｋｇ体重のＺｎ（ＩＩ）の生理学的に関連する用量を与えられた。
【００３６】
亜鉛は、液体中で懸濁された固体の一部として提供されることもできる。提供される亜鉛（ＩＩ）の量および懸濁液の体積は、上記で固体および液体剤形に関して述べられた手引きに従う。
【００３７】
ガンマ−ポリグルタミン酸（あるいはγ−ポリグルタミン酸またはγ−ＰＧＡ）は、グルタミン酸（アミノ酸）のポリマーであり、ここで、ポリマーの主鎖は、アミノ基およびアミノ酸側鎖中の（γ−炭素における）カルボキシル基を連結するペプチド結合により形成される。γ−ＰＧＡは、グルタミン酸のＬ異性体、Ｄ異性体またはＤＬラセミ体から形成されることができる。これらの形態のいずれも、用いられることができ、２種類以上の異なる形態が、あらゆる割合で一緒に用いられることができる。γ−ＰＧＡの様々な異性体形態は、合成によることができ、または天然源に由来することができる。γ−ＰＧＡは、例えば日本の納豆中および昆布中に存在する。生物は通常はＬ異性体からのみポリ（アミノ酸）を生成するが、γ−ＰＧＡを生成する特定の細菌性酵素は、どちらかの異性体または両方の異性体からポリマーを生成することができる。
【００３８】
様々な大きさおよび様々なポリマー分散度のγ−ＰＧＡが、用いられることができる。γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、一般に少なくとも約１ｋＤａかつ最大で約１０００ｋＤａである。ある態様において、γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、少なくとも約１ｋＤａ、または少なくとも約５ｋＤａ、または少なくとも約１０ｋＤａ、または少なくとも約２０ｋＤａ、または少なくとも約３０ｋＤａ、または少なくとも約３５ｋＤａ、または少なくとも約４０ｋＤａ、または少なくとも約５０ｋＤａである。ある態様において、γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、最大で約７００ｋＤａ、または最大で約５００ｋＤａ、または最大で約３００ｋＤａ、または最大で約２００ｋＤａ、または最大で約１００ｋＤａである。許容可能なポリマー分子量範囲は、上記で示されたポリマー分子量の値のいずれから選択されることもできる。一態様において、ポリマー分子量は、約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａの範囲である。別の態様において、ポリマー分子量は、約５ｋＤａ〜約３００ｋＤａの範囲である。一態様において、ポリマー分子量は、約５０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である。一態様において、ポリマー分子量は、約１００ｋＤａである。一態様において、ポリマー分子量は、約５０ｋＤａ（ｋＤＡ）である。組成物または配合物は、γ−ＰＧＡの１以上のポリマー分子量形態を含むことができる。
【００３９】
ポリマー分子量は、典型的には例えばゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による測定に基づく数平均分子量（Ｍｎ）として与えられる。上記のポリマー質量は、Ｍｎとして言及され；他の測定技法が、例えば質量（重量）平均分子量（Ｍｗ）を決定するために用いられることができ、あらゆる所与のポリマーに関する明細は、様々なポリマー質量表現の間で変換されることができる。
【００４０】
固体剤形中に含まれるγ−ＰＧＡの量は、一般に約１０重量％〜約４０重量％の範囲である。ある態様において、量は、約２０重量％または約３０重量％である。用いられる量は、一般に亜鉛およびポリグルタミン酸単量体単位の間の所望のモル比、亜鉛塩の質量（対イオンの重量を説明する）ならびに許容可能な配合された剤形を提供するために必要とされる賦形剤の量に基づく。例えば、用いられるγ−ＰＧＡおよび亜鉛塩の量が大きいほど、所与の剤形全体の大きさに関して添加されることができる賦形剤の量は少ない。当業者は、有効成分の量対安定な剤形を得るために必要とされる賦形剤の量およびタイプの釣り合いを容易にとることができる。亜鉛およびγ−ＰＧＡの間の所望の比率は、剤形あたりの亜鉛のミリグラム対γ−ＰＧＡの重量％の比率として表されることもできる。典型的な比率は、５ｍｇ：１０重量％；５ｍｇ：２０重量％；５ｍｇ：４０重量％；３０ｍｇ：１０重量％；３０ｍｇ：２０重量％；３０ｍｇ：４０重量％；もしくはさらには１００ｍｇ：１０重量％；１００ｍｇ：２０重量％；１００ｍｇ：４０重量％；またはこれらの典型的な比率により示される範囲内のあらゆる他の値のセットもしくは本明細書においてそれぞれの成分に関して引用される値から明らかである値のセットを含む。
【００４１】
液体剤形中に含まれるγ−ＰＧＡの量は、一般に約０．０１重量％〜約１０重量％の範囲である。ある態様において、量は、約０．１重量％〜約１重量％である。
用いられる量は、一般に亜鉛およびポリグルタミン酸単量体単位の間の所望のモル比、γ−ＰＧＡキャリヤーの性質（すなわちそれが未修飾であるか、または腫瘍標的化部分および／もしくは電荷修飾部分で修飾されているか）、ならびにγ−ＰＧＡキャリヤーとのＺｎ（ＩＩ）複合体の形成の程度に基づく。例えば、実施例１および２において説明されるように、ＺｎＰＧＡ複合体は、おおよそ１重量％のγ−ＰＧＡをおおよそ４００μｇ／ｍＬ（ｍｇ／Ｌ）の複合体化した亜鉛と共に含む溶液として得られた。理論により束縛されることなく、液体剤形を調製する際、溶液中での亜鉛塩のγ−ＰＧＡキャリヤーとの組み合わせは、一般に結果として亜鉛イオンおよびγ−ＰＧＡキャリヤーの複合体の形成をもたらすと考えられ、従って形成された複合体を単離または精製する別個の工程は必要ではない可能性があることは、理解されるべきである。他の典型的な比率は、液体剤形中に含まれるγ−ＰＧＡの量との組み合わせにおいて、液体剤形中の組成物または配合物として提供される亜鉛の濃度に関する上記の開示に基づく範囲を含む。
【００４２】
有効量のＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸キャリヤーを有する適切な固体または液体組成物および配合物に到達するため、γ−ＰＧＡキャリヤーおよび亜鉛の相対量およびそれぞれの濃度は、当業者により本開示に従って容易に調節されることができる。本明細書で開示される組成物において、γ−ＰＧＡ構成要素は、γ−ＰＧＡとしてまたはγ−ＰＧＡキャリヤーとして言及されることができる。特筆されたように、γ−ＰＧＡの誘導体も、意図されており、修飾γ−ＰＧＡまたはγ−ＰＧＡコンジュゲート等として多様に言及されることができる。
【００４３】
γ−ＰＧＡは、腫瘍標的化部分を含むことができる。そのような部分は、葉酸、Ｎ５，Ｎ１０−ジメチルテトラヒドロフォレート（ＤＭＴＨＦ）およびＲＧＤペプチドから選択されることができる。前記の部分のいずれかまたは全部が、γ−ポリグルタミン酸に共有結合的に連結されてγ−ＰＧＡのフォレートコンジュゲートおよび／またはＤＭＴＨＦコンジュゲートおよび／またはＲＧＤペプチドコンジュゲートを形成していることができる。葉酸受容体タンパク質は、多くのヒト腫瘍において頻繁に発現している。
【００４４】
フォレート類は、天然に葉酸受容体に関する高い親和性を有し、さらに、結合すると、フォレートおよび取り付けられたコンジュゲートは、エンドサイトーシスにより細胞中に輸送されることができる。この方式で、葉酸で修飾されたＺｎＰＧＡは、腫瘍細胞を標的としてそこで蓄積し、亜鉛（ＩＩ）を腫瘍細胞の内部へと送達することができる。ＤＭＴＨＦも、葉酸受容体に関して高い親和性を有することが知られている。ＤＭＴＨＦの調製が、ＮＰＬ１３において記載されている。さらに、葉酸受容体（ＦＲ）の２つの主なイソ型であるＦＲ−αおよびＦＲ−βが存在し、ＤＭＴＨＦは、ＦＲ−βと比較してＦＲ−αに関してより高い親和性を有することが、示されている（ＮＰＬ１２）。ＦＲ−αは多くの悪性細胞型において過剰発現されており、一方でＦＲ−βは炎症性疾患と関係するマクロファージにおいて過剰発現されているため、これは、腫瘍細胞を標的化するために有益である。従って、ＤＭＴＨＦのγ−ＰＧＡへのコンジュゲーションは、腫瘍細胞により発現されている葉酸受容体に選択的に結合することができるコンジュゲートを提供する。同様に、ＲＧＤペプチドは、α（Ｖ）β（３）インテグリン類に強く結合することが知られており、それは、腫瘍性内皮細胞上ならびに一部の腫瘍細胞上で発現されている。従って、ＲＧＤコンジュゲートは、抗腫瘍剤をその部位に標的化および送達するための戦略である。本発明において意図されているように、γ−ＰＧＡは、これらの腫瘍標的化剤のいずれか１種類または２種類または全部でコンジュゲートされる（すなわち修飾される）ことができ、２種類以上が存在する場合、これらの薬剤の相対的な比率は、特に限定されない。例えば、γ−ＰＧＡキャリヤーは、γ−ＰＧＡの（ａ）葉酸、（ｂ）ＤＭＴＨＦ、（ｃ）ＲＧＤ、（ｄ）葉酸およびＤＭＴＨＦ、（ｅ）葉酸およびＲＧＤ、（ｆ）ＤＭＴＨＦおよびＲＧＤ、または（ｇ）葉酸、ＤＭＴＨＦおよびＲＧＤとのコンジュゲートを含むことができる。他の類似の腫瘍標的化部分も、本発明の範囲内である。
【００４５】
γ−ＰＧＡは、それぞれのグルタミン酸単位のα炭素において遊離のカルボン酸基を有し、それは、葉酸との、ＤＭＴＨＦとの、そしてＲＧＤペプチドとのコンジュゲートを形成するために用いられることができる。葉酸は、環外アミン基を有し、それは、グルタミン酸のα炭素のカルボン酸基と結合して２つを連結させるアミド結合を形成することができる。葉酸中の環外アミン基と同じ環外アミン基が、ＤＭＴＨＦにおいてアミド結合形成のために利用可能である。ＲＧＤコンジュゲートも、当該技術で周知であり、やはり同様に例えばＲＧＤ中の遊離のαアミノ基を介してα炭素カルボン酸基に共有結合的に連結されることができる。あるいは、どの部分も、例えばポリエチレングリコールアミンのようなスペーサー基を介してγ−ＰＧＡにコンジュゲートされることができる。γ−ＰＧＡへのコンジュゲーション反応の例が、葉酸およびクエン酸のコンジュゲーションを含め、（２０１４年１０月２日に公開された）国際公開第２０１４／１５５１４２号において見付けられることができる。
【００４６】
γ−ＰＧＡは、電荷修飾部分を含むことができる。そのような部分は、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ''，Ｎ'''−四酢酸（ＤＯＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）から選択されることができる。前記の部分のいずれかの組み合わせが、γ−ポリグルタミン酸に、やはりα炭素のカルボン酸において共有結合的に連結されることができる。クエン酸は、γ−ＰＧＡのα炭素のカルボン酸基に、エステル結合を形成することによりコンジュゲートされることができる。（例えば、国際公開第２０１４／１５５１４２号を参照。）ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡおよびＤＴＰＡは、例えばこれらの部分のアミンをγ−ＰＧＡのα炭素のカルボン酸基に連結するためのスペーサー基を用いてγ−ＰＧＡに連結されることができる。数多くの選択肢が、当業者に利用可能である。電荷修飾部分は、Ｚｎ（ＩＩ）イオンをキレートするための部位として用いられることができ、電荷修飾も、ＺｎＰＧＡ複合体の輸送および可溶性に影響を及ぼすと考えられ、従って、キャリヤーおよびＺｎＰＧＡ複合体の医薬的作用を調整するために用いられることができる。
【００４７】
γ−ＰＧＡは、両方のタイプの部分の利益および機能性がγ−ＰＧＡキャリヤーに付与されることができるように、腫瘍標的化および電荷修飾部分の両方を含むことができる。腫瘍標的化および電荷修飾部分のいずれかの組み合わせが、γ−ＰＧＡにコンジュゲートされることができ、部分の相対的比率は、特に制限されない。
【００４８】
本発明に従う組成物および配合物は、ＮＦ−κＢ阻害剤を含むこともできる。本明細書で用いられる際、ＮＦ−κＢ阻害剤は、直接的な阻害剤ならびにシグナル伝達カスケードを阻害することができる化合物、またはＮＦ−κＢの作用を抑制してそれにより腫瘍細胞の増殖もしくは生存を制限するあらゆる化合物を含む。本明細書で定義されるようなＮＦ−κＢ阻害剤として用いられることができる典型的な化合物は、ピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）（ＮＰＬ４）、テルミサルタン（ＮＰＬ９）、オルメサルタン（ＮＰＬ１）、バルサルタン（ＮＰＬ８）、ジスルフィラム（ＮＰＬ４）またはそれらの薬学的に許容可能な塩類を含む。これらの阻害剤は、それらが腫瘍細胞の生存度を制限し、それによりそれらを他の殺腫瘍剤、例えば主題発明の組成物および配合物の作用に対して増感させるため、増感剤とも呼ばれ得る。実施例４は、ＰＤＴＣおよび本発明の一態様に従う配合物の同時投与の殺腫瘍作用を示す。
【００４９】
液体配合物
亜鉛（ＩＩ）およびγ−ＰＧＡキャリヤー成分は、液体として配合されることができる。適切な液体配合物は、液体溶液、液体懸濁液、シロップおよび経口スプレーを含む。液体溶液は、経口摂取される、または注射により例えば静脈内、皮内、筋内、髄腔内もしくは皮下もしくは直接腫瘍中もしくは腫瘍付近に投与されることができ、一方で液体懸濁液、シロップおよびスプレーは、一般に経口投与に適している。
【００５０】
液体剤形を調製する方法
液体剤形を調製するための方法は、所望の量の（ｉ）亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤーならびに／または（ｉｉ）ＺｎＰＧＡ複合体を、適切な賦形剤と共に一緒に混合することを含む。一部の態様は、さらに配合物中に胃耐性結合剤および／またはコーティングを含む。
【００５１】
液体溶液配合物は、適切なキャリヤー、希釈剤、緩衝剤、保存剤または投与の形態に関して適切に選択された他の賦形剤を用いて調製されることができる。例えば、静脈内配合物は、適切なｐＨにおいて緩衝され、等張剤を用いて調製されることができる。
【００５２】
注射または経口送達に適した液体配合物の一態様は、亜鉛（ＩＩ）塩、γ−ＰＧＡキャリヤー（上記のような未修飾のγ−ＰＧＡおよび／またはあらゆる形態の修飾されたγ−ＰＧＡ）および水を含む。さらなる態様において、液体配合物は、さらに緩衝剤および／または塩、例えば塩化ナトリウムを含むことができる。緩衝剤が含まれる場合、好ましい緩衝ｐＨは、約ｐＨ４〜約ｐＨ９の範囲である。注射された際、好ましくは、溶液は、それがその中に注射されるべき溶液と等張であり、適切なｐＨを有する。一態様において、硫酸亜鉛七水和物、γ−ＰＧＡおよび塩化ナトリウムが、水中で組み合わせられ、ここで、亜鉛（ＩＩ）の濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、γ−ＰＧＡの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬである。γ−ＰＧＡのポリマー分子量は、上記の範囲のいずれかから選択されることができる。一態様において、それは、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲であり、他の態様において、それは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲である。あらゆる態様において、γ−ＰＧＡの１以上のポリマー分子量形態が、含まれることができる。
【００５３】
ある態様において、亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤーは、ＺｎＰＧＡ複合体として調製されることができる。一般に、ＺｎＰＧＡ複合体を形成するため、亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤーは、例えば実施例１および２において記載されているように組み合わせられ、精製される。得られたＺｎＰＧＡ複合体の溶液は、希釈され、または実質的に乾燥させられ、液体剤形を調製するための手順における使用のためにより濃縮された形態で再構成されることができる。ＺｎＰＧＡ複合体は、注射用溶液として、または液体懸濁液、シロップもしくはスプレーとして配合されることができる。
【００５４】
亜鉛塩類およびγ−ＰＧＡ組成物は、本発明の方法における使用のための液体懸濁液として配合されることができる。例えば、まず、Ｚｎ（ＩＩ）塩およびγ−ＰＧＡキャリヤー（γ−ＰＧＡの未修飾形態および／またはあらゆる修飾された形態を含む）の混合物を含む顆粒化された組成物が、顆粒化された固体中に含まれる胃耐性結合剤を用いて調製される。（固体配合物を調製する方法に関する下記の論考を参照。）γ−ＰＧＡキャリヤーは、約５ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、または約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの範囲の平均分子量を有するγ−ＰＧＡから調製されることができる。次いで、顆粒化された固体は、摂取に適した酸性液体中で懸濁される。溶液のｐＨは、顆粒化された固体が胃耐性結合剤の結果として安定なままであるように、約ｐＨ６未満であることができる。一態様において、液体懸濁液配合物は、顆粒化された固体が十分に懸濁されたままであり容器から効率的に摂取されることができるように、増粘剤または粘度増進剤も含有する。
【００５５】
液体懸濁液の別の態様において、顆粒化された固体は、まずＺｎＰＧＡ複合体を調製することにより調製され、ここで、Ｚｎ（ＩＩ）が、γ−ＰＧＡキャリヤーと複合体化される。そのような調製の例が、例えば実施例１および２において提供されている。その後、ＺｎＰＧＡは、胃耐性結合剤および他の適切な賦形剤を用いて顆粒化されることができる。次いで、この顆粒化された混合物は、すぐ上で記載されたように液体懸濁液として調製されることができる。
【００５６】
液体配合物の別の態様は、亜鉛塩およびγ−ＰＧＡ複合体の粒子、例えばマイクロスフェア、微粒子、顆粒または他の適切な固体形態を形成し、その粒子を蝋の薄層でコートすることを含む。好ましい態様において、粒子は、さらに胃耐性結合剤を含む。コートされた粒子は、液体懸濁液配合物として配合される。粒子上の蝋コーティングは、粒子の物理的完全性を促進し、透過性を低減するが、コーティングは、それでもなお亜鉛およびγ−ＰＧＡ複合体の腸への送達を可能にする。
【００５７】
コーティングに適した顆粒は、前記の方法のいずれかに従って調製されることができる。亜鉛塩、γ−ＰＧＡおよび胃耐性結合剤のマイクロスフェアまたは微粒子は、数多くの当該技術で既知の方法のいずれかにより調製されることができ、それは、分散した相の単一エマルジョン（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）法、二重エマルジョン（ｄｏｕｂｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）法、重合、界面重合、相分離およびコアセルベーション、噴霧乾燥、噴霧凝結、溶媒抽出、凍結乾燥を含む。そのようなマイクロスフェアまたは微粒子の寸法は、数１０ミクロン〜数１０００ミクロンの範囲であることができる。例として、マイクロスフェア粒子を調製するための１つの方法は、亜鉛塩およびγ−ＰＧＡを含む微細に分割された（例えば粉末化された）固体混合物を懸濁媒体、例えばパラフィン油中で撹拌し、ポリマー性胃耐性結合剤の溶液をその撹拌された懸濁液に添加することを含む。マイクロスフェアが形成されたら、非溶媒、例えばクロロホルムが、マイクロスフェアを沈殿させるために添加され、それが収集され、乾燥させられ、続いて蝋でコートされる。
【００５８】
蝋コーティングは、生体適合性かつ非免疫原性であり、薬物の捕捉および腸管への送達に適していることが、認識されている。粒子（マイクロスフェア、微粒子、顆粒等）は、当該技術で既知の方法に従って蝋、例えばカルナウバ蝋、蜜蝋、セトステアリルアルコール、鯨蝋および他の蝋でコートされることができる。例えば、粒子は、蝋を白色パラフィン油中で溶解させ、その溶液を４５℃未満まで冷却し、次いで粒子を機械的に撹拌された蝋／パラフィン油溶液に、その粒子がコートされるまで添加することにより、カルナウバ蝋でコートされることができる。撹拌速度および時間ならびに蝋溶液の温度は、蝋コーティングの厚さを修正するために調節されることができる。
【００５９】
蝋でコートされた亜鉛塩およびγ−ＰＧＡ粒子は、投与のために液体懸濁液として配合される。コートされた亜鉛／γ−ＰＧＡ粒子は、最終的な配合された懸濁液中に約５重量％〜３０重量％で存在する。典型的には、液体懸濁液配合物は、懸濁ポリマー、粘性剤および緩衝剤を含む。配合物は、さらに甘味料、香味料および／または保存剤の１以上も含んでよい。
【００６０】
懸濁ポリマーは、キサンタンガム、カルボマー、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムから選択されることができ、それは、単独でまたはあらゆる組み合わせで用いられることができる。当該技術で既知の他の類似の薬剤も、用いられることができる。合計で、懸濁ポリマー構成要素は、最終配合物中に約０．０２重量％〜約５重量％で存在する。
【００６１】
粘性剤は、グリセリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、グアーガムおよびローカストビーンガムから選択されることができ、それは、単独で、またはあらゆる組み合わせで用いられることができる。当該技術で既知の他の類似の薬剤も、用いられることができる。合計で、粘性剤構成要素は、最終配合物中に約０．０５重量％〜約５０重量％で存在する。
【００６２】
緩衝剤は、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、乳酸緩衝剤およびクエン酸緩衝剤または所定の範囲の緩衝能力を有する他の薬学的に許容可能な緩衝剤から選択されることができる。緩衝剤は、約６以下のｐＨを有するように調節される。ある態様において、ｐＨは、約３〜約６である。ある態様において、ｐＨは、４．５〜５であり、他の態様において、ｐＨは、４〜５であり、さらに他の態様において、ｐＨは、３〜５である。
【００６３】
甘味料は、スクロース、転化スクロース、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、アスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースから選択されることができ、それは、単独で、またはあらゆる組み合わせで用いられることができる。当該技術で既知の他の類似の薬剤も、用いられることができる。合計で、甘味料構成要素は、最終配合物中に約５重量％〜約４０重量％で存在することができる。
【００６４】
香味料は、あらゆる薬学的に許容可能な香味料または当該技術で既知の食品もしくは補給剤中で用いられているあらゆる薬剤から選択されることができ、業界の慣習と一致する量で最終配合物中に添加されることができる。
【００６５】
保存剤は、安息香酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸カリウムおよびクエン酸から選択されることができ、それは、単独で、またはあらゆる組み合わせで用いられることができ、業界の慣習と一致する量で最終配合物中に添加されることができる。当該技術で既知の他の類似の薬剤も、用いられることができる。
【００６６】
一部の態様に従う液体剤形を調製するための配合物および方法が、下記で実施例１０において提供されている。
液体懸濁液配合物に関するこれらの態様のいずれにおいても、γ−ＰＧＡキャリヤーは、一般に約０．０１重量％〜約１０重量％の濃度で存在し、ある態様において、その量は、約０．１重量％または約１重量％である。Ｚｎ（ＩＩ）は、一般に約０．００１重量％〜約１０重量％の濃度で存在する。
【００６７】
液体投与配合物は、ＮＦ−κＢ阻害剤を含むように調製されることもできる。そのようなＮＦ−κＢ阻害剤を配合物中に含まない態様において、ＮＦ−κＢ阻害剤は、あらゆる他の適切な配合物および投与の形態を用いて同時投与されることができる。
【００６８】
固体配合物
亜鉛塩およびγ−ＰＧＡキャリヤーは、経口投与のための経口固体剤形、例えば錠剤、硬カプセル、軟カプセルまたは関連する形態、例えばミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）、カプレット、ゼラチンカプセル、経口崩壊性フィルム等の中に配合されることができる。剤形は、さらに胃耐性結合剤および／または胃耐性コーティングを含むように配合される。
【００６９】
亜鉛塩およびγ−ＰＧＡキャリヤーは、医薬製品中での使用に適した、そして特定の剤形、例えば錠剤またはカプセル等を作製するのに適した賦形剤と組み合わせられる。典型的な賦形剤は、増量剤、結合剤、崩壊剤、滑剤、潤滑剤ならびに緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、香味料、甘味料、着色剤等を含む。添加されるべき賦形剤の量およびタイプは、様々な目的、例えば剤形の向上した完全性、向上した生物学的利用能、安定性、製造、コーティング、外観および／またはコンプライアンスに関して選択されることができる。一部の賦形剤は、１より多くの目的に役立つ可能性があり、かつ／または１より多くの向上した特徴を提供することができる。
【００７０】
増量剤は、水溶性または水に不溶性であることができ、それぞれのタイプの１以上が、組み合わせられることができる。水溶性増量剤の例は、限定ではなく、当該技術で既知であるように、糖類、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、デキストロース、ガラクトース等、および糖アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール等を含む。水に不溶性の増量剤の例は、限定ではなく、当該技術で既知であるように、蝋、長鎖脂肪酸、タルク、カオリン、二酸化ケイ素、二酸化チタン、アルミナ、デンプン、粉末状セルロース、微結晶性セルロース等を含む。
【００７１】
結合剤は、限定ではなく、当該技術で既知であるように、セルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、酢酸フタル酸セルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドンならびにデンプン類、加工デンプン類、例えば部分的に加水分解されたデンプン、例えばマルトデキストリン、糖質、ゼラチン、天然または合成ガム等を含む。
【００７２】
上記のように、ある態様において、胃耐性材料は、胃耐性結合剤として、および／または胃耐性外部コーティングとして含まれる。胃耐性結合剤または外部コーティングを構成する材料は、剤形からの亜鉛塩およびγ−ＰＧＡの放出を、それが胃を通過して腸に入るまで遅らせる機能を果たす。胃耐性結合剤またはコーティングが用いられる場合、それは、他の（非胃耐性）結合剤またはコーティングとの組み合わせで用いられることができる。
【００７３】
一般に、胃耐性材料は、胃の酸性環境（ｐＨ約３）中では認識できるほどに溶解または膨潤しないが、腸の中性〜わずかにアルカリ性の環境（ｐＨ７〜９）中では内容物が放出されるように十分に溶解または膨潤するであろうマトリックスまたはポリマーまたは他の障壁である。腸溶コーティングおよび腸溶結合剤は、胃耐性材料の例である。
【００７４】
胃耐性材料の例は、酢酸フタル酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、酢酸トリメリット酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース−フタレート、以下から選択される２以上の単量体のコポリマー：（ｉ）アクリル酸エステル、（ｉｉ）アクリル酸メチルエステル、ならびに（ｉｉｉ）メタクリル酸、ポリビニルアセテートフタレート、酢酸コハク酸ヒプロメロース、フタル酸ヒプロメロース、アルギン酸ナトリウム、シェラックおよびゼインを含む。
【００７５】
数多くのグレードおよび薬局方収載の標準が、胃耐性材料に関して存在し、それらは、亜鉛およびγ−ＰＧＡを腸に送達する機能を提供するための適切な材料を選択するための有用な手引きを提供する。外部コーティングにおけるコーティングの厚さおよびポリマー組成または結合剤およびポリマー組成物の量を制御することにより、放出点は、より早くもしくはより遅く、または腸の特定のおおよその領域内で起こるように調節されることができる。達成されることができる制御の程度の例は、様々な薬局方収載の標準を満たすＣｏｒｅｌ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｈｅｍ（インド）から商品名Ａｃｒｙｃｏａｔ（登録商標）の下で入手可能なメタクリル酸コポリマーの系列（ｌｉｎｅ）、例えば：ＵＳＰ／ＮＦメタクリル酸コポリマー、タイプＡ−ＮＦ（４〜５％で用いられ、典型的には剤形の内容物を空腸に送達する）；ＵＳＰ／ＮＦメタクリル酸コポリマー、タイプＣ−ＮＦ（４〜５％で用いられ、典型的には剤形の内容物を十二指腸に送達する）；およびＵＳＰ／ＮＦメタクリル酸コポリマー、タイプＢ−ＮＦ（１０〜２０％で用いられ、典型的には剤形の内容物を結腸に送達する）において見付けられることができる。後者（タイプＢ−ＮＦ）は、送達をｐＨ依存性ポリマーにより達成しているが、ｐＨ非依存性ポリマーも、結腸または腸への送達のために用いられることができる。
【００７６】
崩壊剤は、限定ではなく、当該技術で既知であるように、カルメロース、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、アルギネート類、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、部分アルファ化デンプン等を含む。
【００７７】
滑剤は、限定ではなく、当該技術で既知であるように、シリカ類、シリケート類、タルク、リン酸カルシウム等を含む。
潤滑剤は、限定ではなく、当該技術で既知であるように、アルカリ金属またはアルカリ土類金属ステアリン酸塩類、オレエート類、ベンゾエート類、アセテート類、塩化物等を含む。
【００７８】
他のタイプの賦形剤、例えば緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、香味料、甘味料、着色剤が、周知であり、当業者は、そのような構成要素を容易に選択して配合物に適用することができる。
【００７９】
固体投与配合物は、ＮＦ−κＢ阻害剤を含むように調製されることもできる。固体配合物中にそのようなＮＦ−κＢ阻害剤を含まない態様において、ＮＦ−κＢ阻害剤は、あらゆる他の適切な配合物および投与の形態を用いて同時投与されることができる。
【００８０】
腸中での吸収を受け入れられる他のタイプの有効成分、例えばビタミン類、鉱質、栄養素および他の栄養または食事補給剤も、別途記載されない限り、本発明の範囲から逸脱することなく本明細書で記載される液体または固体組成物および配合物に添加されることができる。
【００８１】
本明細書で記載される組成物および配合物は、あるいは、亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤーならびに胃耐性外部コーティングおよび／または胃耐性結合剤を、それが本明細書と矛盾しない限り、含む、それで構成される、または本質的にそれで構成されることができる。組成物および配合物は、先行技術の組成物中に存在する、または他の点では（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）開示される発明に必要ではないあらゆる構成要素（単数または複数）、例えば有効成分および／または賦形剤を欠いている、または実質的に含まないこともできる。
【００８２】
固体剤形を調製する方法
亜鉛塩類およびγ−ＰＧＡならびに選択された賦形剤は、個々に、または組み合わせで大きさを決められる、塊を除去される（ｄｅｃｌｕｍｐｅｄ）、または粉末化されることができる。様々な構成要素は、乾燥混合により組み合わせられる、または湿式もしくは乾式顆粒化、噴霧、押し出し、圧延もしくは流動床顆粒化もしくは当該技術で既知の他のそのような技法により顆粒化されることができ、その後、場合により製粉されることができる。
【００８３】
ある態様において、亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤー（上記のような未修飾のγ−ＰＧＡおよび／または修飾されたγ−ＰＧＡのあらゆる形態）が、ＺｎＰＧＡ複合体として調製されることができる。一般に、亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤーは、例えば実施例１および２において記載されるように組み合わせられ、精製される。便宜上、得られたＺｎＰＧＡ複合体の溶液は、実質的に乾燥させられ、固体剤形を調製するための手順において乾燥した、または実質的に乾燥した粉末として用いられることができる。
【００８４】
固体剤形を調製するための方法は、所望の量の（ｉ）亜鉛塩（類）およびγ−ＰＧＡキャリヤーならびに／または（ｉｉ）ＺｎＰＧＡ複合体、ならびに賦形剤を一緒に混合することを含み、それは、１種類以上の増量剤および／または１種類以上の結合剤および／または１種類以上の崩壊剤および／または１種類以上の潤滑剤および／または１種類以上の滑剤を含む。上記のように、ある態様において、前記の１種類以上の結合剤は、胃耐性結合剤であることができ、それは、他の（非胃耐性）結合剤との組み合わせで用いられることができる。顆粒化工程が含まれる場合、賦形剤のいずれも、顆粒化工程の前、間または後に、全て、または部分的に添加されることができる。ある態様において、潤滑剤の一部または全部が、顆粒化工程の後に混合される。これらの態様の一部において、滑剤も、顆粒化工程の後に混合される。
【００８５】
顆粒化工程が、構成要素のブレンドをそれらが顆粒化される際に湿らせるために溶媒、例えば水または有機溶媒または水性有機溶液の使用を含む場合、結果として得られる製品は、通常は残留する溶媒を除去するために乾燥させられる。有機溶媒の例は、当該技術で既知であるように、エタノールおよびイソプロパノール等を含む。好ましくは、有機溶媒の実質的に全部が、乾燥工程において除去される。水が顆粒化工程において用いられる溶媒の一部である場合、好ましくは、１０重量％より多くない、または５重量％より多くない、または２重量％より多くない水が、乾燥後に残されて次の工程へと進む。
【００８６】
混合または顆粒された固体は、固体を圧縮、締固めまたは成型を用いて錠剤化することにより錠剤へと形成されることができる。その後、ある態様において、錠剤は、上記のように胃耐性コーティングでコートされる。一般に、胃耐性物質および場合により他の賦形剤（例えば可塑剤、乳化剤）が、水性または有機溶媒中に溶解または分散させられ、次いで噴霧コーティング、流動床コーティング、パンコーティング等を含む当該技術で既知の数多くの方法のいずれかを用いて適用される。ある態様において、錠剤は、外観、機械的安定性、化学的安定性等の目的のためにコートされるが、そのコーティング中には胃耐性材料は含まれない。
【００８７】
あるいは、混合または顆粒化された固体は、カプセルまたはカプレット中に充填されて内部に封入されることができる。カプセルという用語は、軟カプセル、硬カプセル、ゼラチンカプセル（ｇｅｌｃａｐｓ）、植物性カプセルを含み、ワンピースまたはツーピースカプセルであることができる。腸溶コーティングカプセルが、利用可能であり（例えば腸溶カプセル薬物送達技術）、またはカプセルは、充填、封入され、次いで上記で言及された方法により物質の溶液もしくは分散物を場合により他の賦形剤と共に用いて胃耐性コーティングでコートされることができる。他の態様において、混合または顆粒化された固体は、胃耐性結合剤材料を含み、そのような固体は、腸溶コーティングを有するかまたは有しないカプセル中に装填されることができる。
【００８８】
錠剤またはカプセル両方の大きさおよび形状は、特に制限されない。亜鉛塩類およびγ−ＰＧＡの所望の投与量は、過度に大きくない錠剤またはカプセル中に配合されることができることが、予想される。
【００８９】
本発明の態様に従う錠剤剤形を調製するための典型的な方法が、下記で実施例１１および１２において提供される。
投薬および投与
本明細書で記載される剤形は、対象において所望の生物学的応答を達成するために療法上有効量の亜鉛を提供するために投与されることができる。療法上有効量は、Ｚｎ、γ−ＰＧＡ、γ−ＰＧＡに対するあらゆる修飾、あらゆるＺｎＰＧＡ複合体の形態、ＮＦ−κＢ阻害剤の存在もしくは非存在、および／または剤形の送達効率等の組み合わせられた作用により処置を必要とする患者に送達される亜鉛の量が所望の生物学的応答を達成するであろうことを意味する。
【００９０】
所望の生物学的応答は、対象、例えば哺乳類における、例えばヒト（患者とも呼ばれ得る）における腫瘍もしくはがんの発病もしくは発症の予防、腫瘍もしくはがんの進行の部分的もしくは完全な予防、遅延もしくは阻害、または腫瘍もしくはがんの再発の予防、遅延もしくは阻害を含む。
【００９１】
ＰＡＲＰ１媒介性壊死を受け入れられる全ての腫瘍型は、本明細書で開示される処置の方法に従って処置されることができる適応症であることが意図されている。実施例４、５および６は、開示された組成物および医薬配合物の態様を用いる開示された方法の態様に従う処置の有効性を実証する。結果は、インビボでのマウスがん細胞における、およびヒトがん細胞における、ならびにヒト対象における有効な処置を実証している。
【００９２】
療法上有効量の達成は、配合物の特徴に依存すると考えられ、いずれもそれぞれの個体の性別、年齢、体調および遺伝子構成により異なるであろう。例えば遺伝的原因または吸収障害もしくは重度の食事制限の他の原因により不十分な亜鉛を有する個体は、一般的に十分なレベルの亜鉛を有する個体と比較して療法的作用に関して異なる量を必要とし得る。
【００９３】
対象は、一般に１日あたり約１ｍｇ〜約３００ｍｇの量の亜鉛を投与される。例えば、１日あたり約２５ｍｇ、または５０ｍｇ、または７５ｍｇ、または１００ｍｇ、または１５０ｍｇ、または２００ｍｇの亜鉛。複数の剤形が、その日に一緒に、または別々に摂取されることができる。経口剤形は、一般に食事時間にかかわらず投与されることができる。処置は、一般に所望の療法的作用が達成されるまで継続する。腫瘍が退縮する、または阻害されている場合、その再発を予防する、遅らせる、または阻害する目的で、本明細書で記載される組成物および配合物の低い投与量レベルが、本発明の一態様に従う処置として継続される、または予防的処置として用いられることもできる。
【実施例】
【００９４】
実施例１：未結合の過剰な亜鉛を除去するためのリン酸沈殿法を用いたｐＨ７．０におけるＺｎＰＧＡの調製および特性付け。
ＺｎＰＧＡを調製するため、５５ｍｇのγ−ＰＧＡ（５０，０００Ｄａの分子量）を、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する５ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０中で室温で溶解させ、次いで氷上に置きながら１０分間超音波処理した。次いで、０．５ｍＬの２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０を溶液に添加して遊離の亜鉛イオンを沈殿させ、混合物を０．２μｍシリンジ滅菌フィルターを通して濾過した。亜鉛含有量を、ＩＣＰ−ＭＳを用いて、そして４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイにより測定した。最終的なストックＺｎＰＧＡは、１％（重量／体積）ＰＧＡおよび４００μｇ／ｍＬの結合した亜鉛イオンを含有していた。ストックＺｎＰＧＡ溶液は、それぞれの投与の日に新しく調製された。
【００９５】
実施例２：未結合の過剰な亜鉛を除去するために透析法を用いたｐＨ７．０におけるＺｎＰＧＡの調製および特性付け。
ＺｎＰＧＡを調製するため、５５ｍｇのγ−ＰＧＡ（５０，０００Ｄａの分子量）を、１０ｍＭ  ＺｎＳＯ４を含有する５ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０中で室温で溶解させ、次いで氷上に置きながら１０分間超音波処理した。次いで、溶液を氷上で１Ｌの１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ７．０に対して２時間、連続的に３回、６時間にわたって合計３体積に関して透析した。回収された溶液を、０．２μｍシリンジ滅菌フィルターを通して濾過した。亜鉛含有量を、ＩＣＰ−ＭＳを用いて、そして４−（２−ピリジルアゾ）−レゾルシノールアッセイにより測定した。最終的なストックＺｎＰＧＡは、０．９％（重量／体積）ＰＧＡおよび３８０μｇ／ｍＬの結合した亜鉛イオンを含有していた。ストックＺｎＰＧＡ溶液は、それぞれの投与の日に新しく調製された。
【００９６】
実施例３：異なる薬物耐性遺伝子型を有するヒトがん細胞におけるＺｎＰＧＡに誘導される細胞死のインビトロフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）。
ＺｎＰＧＡにより誘導される細胞死の方式（アポトーシスまたは壊死のどちらであるか）が、異なる薬物耐性遺伝子型を有する３種類のヒトがん細胞株：Ｈ４６０肺がん（ＷＴ  ｐ５３アポトーシス遺伝子、報告された薬物耐性を有しない）、Ｔ９８Ｇ神経芽細胞腫（変異したｐ５３および多剤耐性タンパク質１“ＭＲＰ１”発現）、およびＭＥＳ−ＳＡ  Ｄｘ５肉腫（ＷＴ  ｐ５３およびＰ糖タンパク質“ＰｇＰ”、多剤耐性タンパク質発現）において試験された。簡潔には、それぞれの細胞株が、ＡＴＣＣが提案する方法および培地（ＲＰＭＩ−１６４０、Ｆ−１２Ｋ、マッコイ５Ａ、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ等）（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補われた）に従って、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃および５％ＣＯ２において９６ウェルプレートをウェルあたり２００μＬの培地体積で用いて対数増殖後期における１０，０００単層付着状態へと調製された。９６ウェルプレート上の調製された細胞が、異なる濃度のＺｎＰＧＡで２４時間処理された後、細胞状態のＦＡＣＳ特性付けが行われた。
【００９７】
簡潔には、９６ウェルプレートのそれぞれのウェル中の細胞が、微量遠心チューブ中に回収され、１００μＬの冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中で洗浄された。次に、それぞれの試料が、遠心分離され、冷１００μＬ結合緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で再懸濁された。染色のため、５μＬのＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ  ４８８（登録商標）アネキシンＶ（アネキシンＶ：カタログ番号＃Ａ１３２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５μＬの結合緩衝液中１００μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が、それぞれに染色のために室温で１５分間添加された。インキュベーションの終了時に、試料は、それぞれの試料に４００μＬの結合緩衝液を添加した後即時のＦＡＣＳの読み取りまで氷上に置かれた。ＦＡＣＳは、１００μＬ／分の流速において４８８ｎｍの励起波長ならびに５３０ｎｍおよび５７５ｎｍにおける吸収シグナルの読みで実施された。
【００９８】
結果が、図２において示されており、それは、処理された細胞とのアネキシンＶおよびＰＩの結合に関するインビトロ細胞状態象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）分析を示している。データは、ＺｎＰＧＡが３種類の異なる薬物耐性遺伝子型を有する３つの細胞株全てにおいて２４時間の曝露後に用量依存的に、かつ一貫して壊死性細胞死を誘導することを実証した。図２において、上のパネルは、非耐性Ｈ４６０ヒト肺がん細胞（ＷＴ  ｐ５３を発現しており、薬物耐性タンパク質を発現していない）の処理からの結果を示しており、中央のパネルは、多剤耐性ＭＥＳ−ＳＡ  Ｄｘ５ヒト肉腫（ＷＴ  ｐ５３およびＰｇＰ多剤耐性タンパク質を発現している）の結果を示しており、下のパネルは、多剤耐性Ｔ９８Ｇヒト神経芽細胞腫（変異したｐ５３およびＭＲＰ１多剤耐性タンパク質を発現している）の結果を示している。ＺｎＰＧＡの用量は、図中のそれぞれの横列にわたって増大している。
【００９９】
実施例４：免疫応答性Ｃ５７ＢＬ同種移植モデルの肺におけるＬＬ２マウス肺がんに対する経口補給されたＺｎＰＧＡのインビボ増殖阻害作用
マウスルイス肺がん（ＬＬ２）細胞の単分散懸濁液が、そのインビトロ培養物のトリプシン処理により得られ、冷ＰＢＳ中で２×１０５細胞／ｍＬで調製された。０．５ｍＬのＬＬ２細胞の懸濁液が、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスの尾静脈を通して注射され、注射されたマウスは、肺腫瘍の増殖の観察のために１６日後に屠殺された。経口薬物処置が、腫瘍注射の次の日に、示された用量での飲み水中への希釈により開始された。動物は、がん注射の１６日後に屠殺され、それらの肺が、ＬＬ２腫瘍の増殖に関して観察された。
【０１００】
図３は、１５日間の処置にわたるＺｎＰＧＡを介した飲み水中の１６０μｇ／ｍＬの亜鉛の用量が目に見えて密で堅い（ｖｉｓｉｂｌｙ  ｓｏｌｉｄ）ＬＬ２腫瘍の増殖の顕著な低減をもたらしたことを示している。さらに、ＺｎＰＧＡ溶液へのＮＦ−κＢ阻害剤ＰＤＴＣの補給は、マウス肺がんの同所性同種移植モデルにおけるＬＬ２腫瘍増殖を事実上排除し、これは、ＮＦ−κＢ阻害剤ＰＤＴＣおよびＺｎＰＧＡの間のそれらの抗腫瘍作用における特定の相乗作用を示唆している。
【０１０１】
実施例５：免疫不全性胸腺欠損Ｎｕ／Ｎｕメスマウスの皮下異種移植モデルにおけるＨ４６０ヒト肺がんに対する経口補給されたＺｎＰＧＡのインビボ増殖阻害作用。
Ｈ４６０の単個細胞懸濁液が、その対数増殖期におけるインビトロ培養物のトリプシン処理により調製され、無血清冷ＲＰＭＩ−１６０４０培地中で１０７細胞／ｍＬで調製された。ヒト腫瘍の免疫不全性胸腺欠損Ｎｕ／Ｎｕメスマウスに対する皮下異種移植片が、マウスの右脇腹付近の皮膚中に０．１ｍＬのＨ４６０細胞懸濁液を皮下注射することにより作り出された。経口薬物処置が、腫瘍注射の次の日に開始された。３つの対象の１つの群は、飲み水において生理食塩水を与えられ、３つの対象の第２の群は、シスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）を週１回腹腔内に与えられ、そして３つの対象の第３の群は、飲み水を介してＺｎＰＧＡ（１６０μｇ／ｍＬ亜鉛）を与えられた。注射の１４日後に開始し、触知できる腫瘍塊の長い寸法および短い寸法（それぞれ長さおよび幅）が、デジタルノギスを用いて２日ごとに測定された。実験は、２８日間継続した。腫瘍体積は、式：Ｖ＝長さ×幅２×１／２により得られた。
【０１０２】
図４は、実験の結果を示す。それぞれ実施例３および４のインビトロおよびＣ５７ＢＬマウスにおける同種移植同所性ＬＬ２肺がんモデル試験の結果と一致して、ＺｎＰＧＡを介した飲み水中の１６０μｇ／ｍＬ亜鉛の投与は、皮下異種移植されたＨ４６０ヒト肺がんの増殖に対して顕著な阻害作用をもたらした。重要なことだが、経口補給されたＺｎＰＧＡの腫瘍抑制作用は、腹腔内注射されたシスプラチンの作用と類似しているかそれよりも良好であった。
【０１０３】
前記の発明は、詳細に、かつ例および説明として記載されてきたが、当業者は、本明細書に開示され、特許請求の範囲により包含される組成物および方法の範囲を理解するであろう。
【０１０４】
実施例６：顆粒化されたＺｎ（ＩＩ）塩およびγ−ポリグルタミン酸の混合物を与えられている患者の臨床観察。
顆粒化された硫酸亜鉛およびγ−ポリグルタミン酸混合物から作製された補給剤グレードの腸溶コート錠剤配合物の経口投与（ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、（１）以前に２回のがんの履歴を有する女性患者における第三薬物不応性早期胃がんの臨床的退縮、および（２）以前の処置または疾患の履歴を有しない男性患者における第一原発性早期胃がんの臨床的退縮をもたらした（ｌｅａｄ）。
【０１０５】
実施例７：液体配合物。
例えば注射に適した液体配合物の典型的な態様の組成物は、亜鉛（ＩＩ）塩、γ−ＰＧＡ、塩化ナトリウムおよび水を含む。組成物は、硫酸亜鉛七水和物、γ−ＰＧＡ（カリウム塩、≦１００ｋＤａ）、塩化ナトリウムを組み合わせて水を所定の体積まで追加することにより調製され、ここで、それぞれの構成要素の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ亜鉛（ＩＩ）、１０ｍｇ／ｍＬ  γ−ＰＧＡおよび６．５ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウムである。結果として得られるおおよそ２７６ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度およびｐＨ５．６８の組成物は、ヒト患者における注射に適している。
【０１０６】
実施例８：Ｚｎ（ＩＩ）濃度およびγ−ＰＧＡポリマーの大きさが異なるＺｎ（ＩＩ）／γ−ＰＧＡ溶液を用いた処置におけるインビトロ細胞生存アッセイ。
Ａ．Ｚｎ／γ−ＰＧＡ溶液の調製。γ−ＰＧＡ、カリウム塩（Ｘｉ’ａｎ  Ｌｙｐｈａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、西安、中国）、分子量≦１００ｋＤａが、調達され、試料が、ｐＨ３緩衝水溶液中で３５３Ｋで１、２、６、１２および９６時間加熱することにより様々な大きさに断片化されて、γ−ＰＧＡのますます小さい断片を生成した。断片化されたポリマーに関する平均分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）は、それぞれ５０．１ｋＤａ、２８．２ｋＤａ、１５．９ｋＤａ、７．９ｋＤａおよび２．５ｋＤａであることが報告された。Peng, M., Liu, W., Chen, Q., and Hansen. E.W. (2010). Degradation rate of γ-polyglutamic acid probed by 1H-NMR spectral analysis and by PFGSTE NMR - internal consistency. Int’l J. Research and Reviews in Applied Sciences 3, 233-241。Ｚｎ／γ−ＰＧＡ溶液は、３通りのＺｎ（ＩＩ）の濃度において、断片化されていないポリマーおよび以下のような５種類の断片的されたポリマーのそれぞれを用いて調製された。γ−ＰＧＡは、水中で溶解され、トリス・ＨＣｌが、添加され、溶液が、ｐＨ７．０において緩衝され、次いでＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏが、添加されて、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの亜鉛（ｉｉ）濃度を有する溶液を生成し、ここで、亜鉛：グルタミン酸単量体の比率は、１：８であった。これらの溶液が、次に記載されるＭＭＴ細胞生存アッセイにおいて用いられた。
【０１０７】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ。ＨｅＬａおよびＭＣＦ７細胞に関するＺｎ／γ−ＰＧＡの細胞生存度への作用が、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイを用いて決定された。簡潔には、４×１０４細胞／ウェルの密度の培養された細胞（下記参照）が、９６ウェルプレート中に分配された。様々な濃度のＺｎ／γ−ＰＧＡ（それぞれが３通りのＺｎ（ＩＩ）の濃度での６通りのγ−ＰＧＡポリマーの大きさ）が、添加され（それぞれの条件は、４通り（Ｎ＝４）で行われた）、２４時間のインキュベーション後、ウェルの内容物は、細胞を収集するために遠心分離され、培地が除去された。ＭＴＴ溶液（１５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ使用液）が、それぞれのウェルに添加され、結晶ホルマザン顕色を可能にするために３時間インキュベートされ、細胞および結晶ホルマザンを収集するために遠心分離された。形成された結晶ホルマザンを２００μＬ  ＤＭＳＯ中で溶解させ、５４０ｎｍにおける光学吸光度を測定することにより、細胞生存度が決定された。
【０１０８】
Ｃ．細胞培養。ＨｅＬａおよびＭＣＦ７細胞は、９６ウェル細胞培養プレート中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質を含有する２００μＬのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および（ＲＰＭＩ）中で、３７℃において９５％空気および５．０％ＣＯ２の加湿された雰囲気下で２４時間培養された。
【０１０９】
Ｄ．アッセイの結果。アッセイの結果が、ＨｅＬａ細胞およびＭＣＦ７細胞に関してそれぞれ図５Ａおよび５Ｂにおいて示されている。その結果から、Ｚｎ／γ−ＰＧＡが細胞毒性であり、増大するＺｎ（ＩＩ）濃度および低下するγ−ＰＧＡポリマーの大きさに伴って作用が増大することは、明らかである。
【０１１０】
実施例９：４種類の細胞型に関するＺｎ（ＩＩ）／γ−ＰＧＡ溶液、変動するＺｎ（ＩＩ）濃度、１００ｋＤａ  γ−ＰＧＡポリマーを用いた処置におけるインビトロ細胞生存アッセイ。
【０１１１】
Ａ．Ｚｎ／γ−ＰＧＡ溶液の調製。Ｚｎ／γ−ＰＧＡ溶液が、実施例８において記載されたように、γ−ＰＧＡ、カリウム塩（Ｘｉ’ａｎ  Ｌｙｐｈａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、西安、中国）、多分散性、分子量４５ｋＤａを用いて調製され、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍＬの亜鉛（ｉｉ）濃度を有する溶液が、調製され、ここで、亜鉛：グルタミン酸単量体の比率は、１：８であった。
【０１１２】
Ｂ．ＭＴＴアッセイ。ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、ＭＣＦ７およびＡ５４９細胞の細胞生存度に対するＺｎ／γ−ＰＧＡの作用が、実施例８において記載されたようにＭＴＴアッセイを用いて決定された。
【０１１３】
Ｃ．細胞培養。細胞培養条件は、実施例８において記載された条件と同じであった。
Ｄ．アッセイの結果。アッセイの結果が、図６において示されている。その結果から、Ｚｎ／γ−ＰＧＡが細胞毒性であり、４５ｋＤａ  γ−ＰＧＡポリマーに関する増大するＺｎ（ＩＩ）濃度に伴って作用が増大することは、明らかである。
【０１１４】
実施例１０：γ−ポリグルタミン酸−亜鉛液体組成物。
一態様に従って本発明を実施するために有用な組成物が、表１において示されている。組成物は、１００ｇあたり０．６８ｍｇのＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）を蝋でコートされた粒子を含む液体懸濁液配合物として提供する。配合物を調製するための方法は、表に従う。この組成物は、単に主題発明に有用な多くの組成物の１つを説明するだけのものである。
【０１１５】
【表１】
2019534330.tif 000005
【０１１６】
Ａ．コートされたＺｎＰＧＡマイクロスフェア（ｃＺＰＭ）の調製。１０ｇのスクロース（５％ｗ／ｖ）、４５ｍｇのγ−ＰＧＡおよび１９．７９ｍｇの硫酸亜鉛七水和物（元素のＺｎとして４．５ｍｇ）を含有する２００ｍＬの水が、調製され、凍結乾燥された。次いで、結果として得られた粉末が、５％までのコーンスターチを含有する微細に分割されたスクロースと１：４の比率で摩砕処理され、Ｎｏ．５０米国標準ステンレス鋼篩（４８メッシュ）を押し通された。次いで、この粉末が、４００ｍＬビーカー中で２００ｍＬの白色パラフィン油中で懸濁された。その混合物が、高トルク撹拌機（Ｔｙｐｅ  ＲＸＲ１，Ｃａｆｒａｍｏ，オンタリオ州ワイアトン）に取り付けられた４４ｍｍポリエチレン三枚刃パドルによる２６０ｒｐｍでの撹拌により分散させられた。その懸濁液に、２０ｍＬのアセトン−９５％エタノール（９：１）中１０％（ｗ／ｖ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース−フタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）が、添加された。撹拌が、５分間継続され、それによりマイクロスフェアが形成され、次いで７５ｍＬのクロロホルムが、添加された。懸濁媒体が、デカントされ、マイクロスフェアが、７５ｍＬのクロロホルム中で短時間再懸濁され、周囲温度で風乾された。乾燥したら、マイクロスフェアは、カルナウバ蝋でコートされた。具体的には、１ｇのカルナウバ蝋が、２００ｍＬの白色パラフィン油中で７０℃において溶解され、４５℃未満まで冷却された。この冷却された蝋−パラフィン溶液に、調製されたマイクロスフェアが、添加され、一定の撹拌により１５分間懸濁された。次いで、蝋溶液がデカントされ、マイクロスフェアが、過剰な蝋溶液を吸収するために濾紙上で収集され、コートされたＺｎＰＧＡマイクロスフェア（ｃＺＰＭ）が得られた。
【０１１７】
Ｂ．コートされたＺｎＰＧＡマイクロスフェア（ｃＺＰＭ）の液体懸濁液溶液の調製。以下の構成要素：０．３ｇのキサンタンガム（例えば懸濁ポリマーとして）；０．３ｇのグアーガム（例えば粘性剤として）；１０ｇのキシリトール（例えば甘味料として）；０．５ｇのクエン酸緩衝剤（例えば緩衝剤として）；０．１ｇのリモネン（例えば香味料として）；０．０２５ｇのソルビン酸カリウム（例えば保存剤として）が、７８．７ｍＬの水中で溶解された。水溶液のｐＨが、ｐＨ４．５に調節され、次いで１０ｇのｃＺＰＭが、水溶液中で懸濁され、ｃＺＰＭの液体懸濁液が得られた。
【０１１８】
実施例１１：γ−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
一態様に従って本発明を実施するために有用な組成物が、表２において示されている。組成物は、錠剤あたり２５ｍｇのＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）を提供する。錠剤を調製するための方法は、表に従う。この組成物は、単に主題発明に有用な多くの組成物の１つを説明するだけのものである。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
表２において示されている組成物を用いるコートされた錠剤は、湿式顆粒化技法を用いて調製されることができる。まず、硫酸亜鉛およびγ−ポリグルタミン酸が、乾燥状態で一緒に混合される。微結晶性セルロース、デンプンおよび二酸化ケイ素が、さらに添加され、乾燥構成要素が、全てさらに一緒に混合される。混合された構成要素は、造粒機に移され、適切な量の水性エタノールが、添加され、顆粒化が、実施される。得られた顆粒化された混合物が、５０〜７０℃で乾燥させられ、約５％未満の含水率を有する顆粒化された組成物が、生成される。ステアリン酸マグネシウムが、顆粒化された組成物に添加され、それと共に混合される。得られた混合物が、圧縮されて錠剤になる。最後に、錠剤は、当業者に既知であるような標準的な技法を用いて酢酸フタル酸セルロースでコートされる。
【０１２１】
実施例１２：γ−ポリグルタミン酸−亜鉛組成物。
一態様に従って本発明を実施するために有用な組成物が、表３において示されている。組成物は、錠剤あたり３０ｍｇのＺｎ（Ｚｎ２＋イオン）を提供する。錠剤を調製するための方法は、表に従う。この組成物は、単に主題発明に有用な多くの組成物の１つを説明するだけのものである。
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
表３において示されている組成物を有するコートされた錠剤は、以下のように調製されることができる。まず、硫酸亜鉛、γ−ポリグルタミン酸、微結晶性セルロース、ＨＰＭＣ−Ｐ（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、マルトデキストリンおよびカルボキシメチルセルロース−カルシウムが、乾燥状態で一緒に混合された。混合された構成要素は、造粒機に移され、適切な量の７０％水性エタノールが、添加され、湿式造粒が、実施された。得られた顆粒化された混合物は、約６０℃までにおいて乾燥させられ、約３％未満のＬＯＤ（乾燥減量）を有する顆粒化された組成物が、得られた。シリカ（例えばアエロジル（登録商標））およびステアリン酸マグネシウムが、顆粒化された組成物に添加され、それと共に混合された。得られた混合物が、圧縮されて錠剤になった。その錠剤は、当業者に既知であるような標準的な技法を用いて、まずＨＰＭＣ−Ｐのイソプロピルアルコール溶液を用いてコートされ、次いで第２工程においてＨＰＭＣの水溶液を用いてコートされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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