(57)【要約】本発明は、ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質またはその断片を含む抗ＲＮＡウイルス用組成物、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療用組成物、及び前記組成物を用いたＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療方法に関する。  本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を含む組成物は、ＰＣＢＰ２タンパク質に結合してＭＡＶＳのシグナル伝達経路を活性化させることで抗ＲＮＡウイルス効果を有するため、ＲＮＡ感染疾患の予防または治療用組成物として優れた効果がある。【選択図】図１０９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質またはその断片を含み、前記ＥＰＲＳタンパク質の断片が、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むものである、抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項２】
前記ＥＰＲＳタンパク質の断片が、配列番号６３の１〜１９６番目のアミノ酸配列、１〜２６９番目のアミノ酸配列、１〜４５７番目のアミノ酸配列、１〜５０６番目のアミノ酸配列、１〜６８２番目のアミノ酸配列、１６８〜５０６番目のアミノ酸配列、１６８〜２６９番目のアミノ酸配列、及び１６８〜１９６番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項３】
前記ＲＮＡウイルスが、アマルガウイルス科（Amalgaviridae）、ビルナウイルス科（Birnaviridae）、クリソウイルス科（Chrysoviridae）、シストウイルス科（Cystoviridae）、エンドルナウイルス科（Endornaviridae）、ハイポウイルス科（Hypoviridae）、メガビルナウイルス科（Megabirnaviridae）、パルティティウイルス科（Partitiviridae）、ピコビルナウイルス科（Picobirnaviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、トチウイルス科（Totiviridae）、クアドリウイルス科（Quadriviridae）、アルテリウイルス科（Arteriviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、メソニウイルス科（Mesoniviridae）、ロニウイルス科（Roniviridae）、ジシストロウイルス科（Dicistroviridae）、イフラウイルス科（Iflaviridae）、マルナウイルス科（Marnaviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、セコウイルス科（Secoviridae）、アルファフレキシウイルス科（Alphaflexiviridae）、ベータフレキシウイルス科（Betaflexiviridae）、ガンマフレキシウイルス科（Gammaflexiviridae）、チモウイルス科（Tymoviridae）、ボルナウイルス科（Bornaviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ニヤミウイルス科（Nyamiviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae ）、ルテオウイルス科（Luteoviridae）、トガウイルス科（Togaviridae）、ニューモウイルス科（Pneumoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、デルタウイルス（Deltavirus）、及びオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）ウイルスからなる群から選択される１つ以上のものである、請求項１に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項４】
前記ＥＰＲＳタンパク質またはその断片が、Ｎ-末端、Ｃ-末端、または両末端に細胞透過性ペプチドをさらに含むものである、請求項１に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項５】
前記細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ、アンテナペディア（Antennapedia）、トランスポータン（Transportan）、ＶＰ２２、Ｈｐｈ‐１、Ｒ１１（Ｒ９）、シグナル配列ベースのペプチド、及び両親媒性（Amphipathic）ペプチドからなる群から選択される１つ以上のものである、請求項４に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項６】
前記ＥＰＲＳタンパク質またはその断片が、ＰＣＢＰ２に結合してＭＡＶＳとＰＣＢＰ２の結合を抑制するものである、請求項１に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項７】
前記抗ＲＮＡウイルス用組成物が、薬学組成物、医薬部外品組成物、食品組成物、化粧料組成物または飼料組成物として用いられるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物。
【請求項８】
抗ＲＮＡウイルス活性を有するＥＰＲＳタンパク質またはその断片であって、前記ＥＰＲＳタンパク質の断片が、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むものである、タンパク質またはその断片。
【請求項９】
請求項８に記載のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含む、形質転換体。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗ＲＮＡウイルス用組成物を個体に投与する段階を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質またはその断片を含む抗ＲＮＡウイルス用組成物、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療用組成物、及び前記組成物を用いたＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＲＳ（Aminoacyl-tRNA synthetases）はアミノアシル化を触媒するのに必要不可欠な酵素であって、高性能タンパク質の合成を保障する。ＡＲＳの触媒領域は、３つの系（kingdom）に高いレベルで保存されている。細胞質に存在するＡＲＳは原核生物のホモログ（homologues）にも存在していないばかりか、酵素的コア部分も存在しない独特な構造的特性を有する新しいドメインのスイッチの追加を含めて、高等動物が進化する過程で大きく変化した。特に、前記追加領域は広い範囲の生物学的機能と関連がある。そこで、ＡＲＳは、タンパク質の合成を越えて新たな分類の調節タンパク質として知られている。高等生物において多数のＡＲＳの活性は、ＭＳＣ（multi-tRNA synthetase complex）と呼ばれる細胞質保存システム内に存在することにより調節されることが分かった。前記ＭＳＣは、ほとんどの場合、追加のドメインを介して組み立てられ、ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA syntetase）、及び３つのＡＲＳ相互作用の多機能タンパク質（ＡＩＭＰ１/ｐ４３、ＡＩＭＰ２/ｐ３８、及びＡＩＭＰ３/ｐ３８）を含む８種のｔＲＮＡ合成酵素で構成されている（非特許文献１）。
【０００３】
ストレス条件下で、ＥＰＲＳ、ＭＲＳ（methionyl-tRNA synthetase）、ＫＲＳ（lysyl-tRNA synthetase）、ＡＩＭＰ１、及びＡＩＭＰ２を含むいくつかのＭＳＣの構成要素は、翻訳後の変形過程を経て複合体から放出され、非翻訳過程での炎症、細胞代謝、血管新生及び腫瘍形成のような活性を示すことが分かった（ 非特許文献２）。リン酸化は、細胞内でＡＲＳの非翻訳的機能を決定する重要な調節作用機序である。代表的な例として、唯一の二作用（bifunctional）ｔＲＮＡ合成酵素であるＥＰＲＳがある。ＥＰＲＳは、ＥＲＳ及びＰＲＳが、３つのＷＨＥＰドメインを含むリンカーを介して相互に連結された形態で構成されている。ＭＳＣから放出を誘導しうる特性に照らして、ＥＰＲＳはＭＳＣの外部に存在すると考えられる。ＥＰＲＳのＥＲＳ及びＰＲＳのドメイン間に位置するＳｅｒ８８６及びＳｅｒ９９９残基は、ＩＦＮ‐γで刺激され、連続的にリン酸化され、これにより、ＭＳＣからの放出が促進される。ＥＰＲＳがＭＳＣから放出されると、ＮＳＡＰ１（NS1-associated protein 1）、リン酸化されたリボソームタンパク質Ｌ１３ａ、及びＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）と相互作用して、ＧＡＩＴ（IFN-γ-activated inhibitor of translation）複合体を形成する。前記調節複合体は、セルロプラスミン（ceruloplasmin、Cp）のような炎症タンパク質をコードするｍＲＮＡの特定の３’‐ＵＴＲ（untranslated region）に結合して、これらの翻訳を抑制する。このような特異的機能は、感染の初期に、これに反応して生成される有害な前炎症性分子の発現を調節することにより、慢性炎症を緩和するのに寄与すると考えられる。しかし、ＩＦＮ‐γは、感染後期の後天性免疫反応の間に生成されるものであり、主にＩＬ‐１２によって活性化されたＮＫ（natural killer）細胞またはＴｈ１細胞によって分泌されるという事実に注目する必要がある。
【０００４】
先天性免疫反応は、感染初期に最初のシールドとなる。抗ウイルスのシグナル伝達は、ウイルス感染に反応して進化した核心的な細胞過程である。前記シグナル伝達は、ウイルスＲＮＡを検出する重要な細胞センサーＲＩＧ‐Ｉ（retinoic acid-inducible gene-I）とＭＤＡ５（melanoma differentiation-associated protein 5）を含むＲＩＧ‐Ｉ類似受容体（ＲＬＲ）経路によって主に活性化される。その後、前記センサーは、重要な抗ウイルスのシグナル伝達タンパク質ＭＡＶＳ（mitochondria antiviral signaling protein）と相互作用し、細胞内のリン酸化酵素であるＩＫＫとＴＢＫ１を介して各々転写因子ＮＦ‐ｋＢ及びＩＲＦ３を活性化させる。前記シグナル伝達は、最終的にはＩ型ＩＦＮ及びその他の抗ウイルス分子の誘導を引き起こす（非特許文献３）。このシグナル伝達経路は、タンパク質の複合体ネットワークを介して抗ウイルス反応を調節する陽性及び陰性調節作用機序によって適切に調節される。したがって、ウイルスのＲＮＡによってＲＬＲ経路が活性化され、これにより、ＭＡＶＳによって免疫反応が活性化されるので、ＭＡＶＳの分解を防ぐ場合、ＲＮＡウイルスに対して汎用的な抗ウイルス活性を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Trends Biochem. Sci, 2007, 35: 158-164
【非特許文献２】Trends Biochem. Sci, 2009, 34: 324-331
【非特許文献３】Cell, 2006, 124: 783-801
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ウイルス感染を予防または治療することができる抗ウイルス用組成物を開発するために鋭意努力した結果、ＭＳＣの構成要素の一つであるＥＰＲＳタンパク質またはその断片が感染特異的な変形を介して重要な抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＭＡＶＳの陰性調節者であるＰＣＢＰ２（poly(rC）-binding protein2）からＭＡＶＳを保護し、最終的には、ウイルス感染に対する予防及び治療効果を有することを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質またはその断片を含み、前記ＥＰＲＳタンパク質の断片が、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むものである、抗ＲＮＡウイルス用組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、抗ＲＮＡウイルス活性を有するＥＰＲＳタンパク質またはその断片であって、前記ＥＰＲＳタンパク質の断片は、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むものである、タンパク質またはその断片を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む、形質転換体を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療用薬学組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を個体に投与する段階を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の治療方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用食品組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用飼料組成物を提供することにある。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を投与する段階を含む、ＭＡＶＳタンパク質分解の予防または抑制方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を含む組成物は、ＰＣＢＰ２タンパク質に結合して、すべての抗ＲＮＡウイルス活性において重要な役割をするＭＡＶＳシグナル伝達経路を活性化させることにより、汎用的な抗ＲＮＡウイルス効果を有するため、ＲＮＡ感染疾患の予防または治療用組成物として優れた効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＰＲ８に感染された気管支上皮細胞におけるＭＳＣ遺伝子（１．５倍以上の変化）の上向調節（灰色）、あるいは下向調節（黒）を示した。
【図２】ＥＰＲＳのＩＦＮ‐βプロモーター活性の誘導効果を確認した。選別されたＭＳＣの遺伝子のルシフェラーゼ分析のためにＲＩＧ‐ＩのＮ‐ターミナルドメイン（N-RIG-１）及びＩＦＮ‐βプロモーターを暗号化するプラスミドを２９３Ｔ細胞に形質転換させた。ＣｏｎはＮ‐ＲＩＧ‐Ｉに形質転換しない。
【図３】ウイルスに感染されたさまざまな細胞株におけるＥＰＲＳ発現を確認した。
【図４】ＥＰＲＳ発現を免疫ブロット分析で確認した。ＲＡＷ２４６．７細胞は、非標的対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで形質転換させた。
【図５】蛍光顕微鏡でウイルス複製の分析を行った（蛍光顕微鏡、上段パネル;位相差顕微鏡、下段パネル）。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで形質転換させた。
【図６】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）またはＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．５）に感染された後、２４時間後に蛍光分析及びプラーク分析を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞をｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで形質転換させた。
【図７】ＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させた後、ウイルス力価を確認した。ＲＡＷ２４６．７細胞は、非標的対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで形質転換させた。
【図８】ＰＲ８‐ＧＦＰ、ＶＳＶ‐ＧＦＰ、またはＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させたり、またはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（８０μｇ）を処理した細胞の培養上清液からＩＦＮ‐βのレベルを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞をｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで形質転換させた。
【図９】ＰＲ８‐ＧＦＰ、ＶＳＶ‐ＧＦＰ、またはＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させたり、またはｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（８０μｇ）を処理した細胞の培養上清液からＩＬ‐６のレベルを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞をｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで形質転換させた。
【図１０】ｓｉＣｏｎまたはｓｉＥＰＲＳで３６時間形質転換させた後、ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．０００１）に感染させた２９３Ｔ細胞の蛍光顕微鏡の写真を示した。
【図１１】ｓｉＣｏｎまたはｓｉＥＰＲＳで３６時間形質転換させた後、ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．０００１）に感染させた２９３Ｔ細胞でウイルスの複製を確認した。
【図１２】ｓｉＣｏｎまたはｓｉＥＰＲＳで３６時間形質転換させた後、ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．０００１）に感染させた２９３Ｔ細胞でＩＦＮ‐βまたはＩＬ‐６の分泌レベルを確認した。
【図１３】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させた細胞におけるＥＰＲＳ発現の免疫ブロット分析を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図１４】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させた細胞の蛍光顕微鏡写真を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図１５】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させた細胞におけるＰＲ８力価を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図１６】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させた細胞におけるＩＦＮ‐βまたはＩＬ‐６の分泌レベルを示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図１７】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ）に感染させた安定的ＥＰＲＳ欠損細胞の蛍光顕微鏡写真を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図１８】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ）に感染させた安定的ＥＰＲＳ欠損細胞におけるＶＳＶ力価を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図１９】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ）に感染させた安定的ＥＰＲＳ欠損細胞におけるＩＦＮ‐βまたはＩＬ‐６の分泌レベルを示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、非標的対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）またはＥＰＲＳｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）を導入した後、ピューロマイシンで選別して使用した。
【図２０】ＩＲＦ３及びＳＴＡＴ１のリン酸化または不活性化、及びＥＰＲＳ及びアクチンの発現を免疫ブロット分析で確認した。ＥＰＲＳに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＥＰＲＳ）または対照群ｓｈＲＮＡ（ｓｈＣｏｎ）を発現するＲＡＷ２６４．７細胞を示された時間にＰＲ８‐ＧＦＰに感染させた。
【図２１】ＥＰＲＳ発現の免疫ブロット分析を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＦＬＡＧタグ空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧ（ＥＰＲＳ）プラスミドで形質転換させた後、ピューロマイシンで選別した。
【図２２】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染された空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳノックイン（knock-in）ＲＡＷ２６４．７細胞に対する蛍光顕微鏡分析を示した。
【図２３】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染された空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳノックイン（knock-in）ＲＡＷ２６４．７細胞に対する蛍光分析及びプラーク分析を示した。
【図２４】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染された空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳノックイン（knock-in）ＲＡＷ２６４．７細胞のＩＦＮ‐βまたはＩＬ‐６の分泌を確認した。
【図２５】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．５）に感染させたＥＰＲＳ過発現細胞の蛍光顕微鏡写真を示した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＦＬＡＧタグ空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧ（ＥＰＲＳ）プラスミドで形質転換させた後、ピューロマイシンで選別した。
【図２６】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．５）に感染させたＥＰＲＳ過発現細胞におけるＶＳＶ力価を確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＦＬＡＧタグ空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧ（ＥＰＲＳ）プラスミドで形質転換させた後、ピューロマイシンで選別した。
【図２７】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=０．５）に感染させたＥＰＲＳ過発現細胞におけるＩＦＮ‐βまたはＩＬ‐６の分泌レベルを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＦＬＡＧタグ空ベクター（Ｃｏｎ）またはＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧ（ＥＰＲＳ）プラスミドで形質転換させた後、ピューロマイシンで選別した。
【図２８】プラーク分析でウイルス力価を確認した。ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウスのＢＭＤＭをＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）及びＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=３）に感染させた。
【図２９】ウイルス感染後、１２または２４時間後の培養上清液でＩＦＮ‐β、及びＩＬ‐６レベルを確認した。ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウスのＢＭＤＭをＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）及びＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=３）に感染させた。
【図３０】ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理後、１２または２４時間後の培養上清液でＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６レベルを確認した。ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウスのＢＭＤＭをｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（４０μｇ）で処理した。
【図３１】ＢＭＤＭにおけるＥＰＲＳ発現を免疫ブロット分析で確認した。ＢＭＤＭは、非標的対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎ）またはｓｉＥＰＲＳで３６時間形質転換させた。
【図３２】感染して１２及び２４時間後にプラーク分析を行い、ウイルス力価を確認した。ＢＭＤＭは、ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=３）またはＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）に感染させた。
【図３３】感染して１２及び２４時間後にＥＬＩＳＡを行い、ＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６レベルを測定した。ＢＭＤＭは、ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=３）またはＶＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）に感染させた。
【図３４】４０μｇＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を処理したＢＭＤＭ培養上清液でＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６レベルを測定した。
【図３５】ＶＳＶ‐ＧＦＰに感染させ、１２時間後にＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス由来のＢＭＤＭでＩＦＮ‐β、ＩＬ‐６、及びその他のＩＦＮ関連の抗ウイルス遺伝子の発現を確認した。
【図３６】ウイルス感染細胞におけるＩＦＮ‐βｍＲＮＡまたはＩＦＮ関連の抗ウイルス遺伝子の発現が誘導されるかどうかを確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ｓｉＣｏｎまたはｓｉＥＰＲＳに３６時間形質転換させた後、ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）で１２時間感染させた。グラフは、示された遺伝子をｇａｐｄｈに対して標準化させて誘導倍数で示した。
【図３７】ＨＳＶ‐ＧＦＰに感染させた後、細胞培養の上清液におけるウイルス力価（プラーク分析で確認）を示した。ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス由来のＢＭＤＭは、ＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=２）に感染させた。
【図３８】ＨＳＶ‐ＧＦＰに感染させた後、細胞培養の上清液におけるＩＦＮ‐βまたはＩＬ‐６の分泌レベルを確認した。ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス由来のＢＭＤＭは、ＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=２）に感染させた。
【図３９】年齢及び性別が同一のＥＰＲＳ+/+（ｎ＝１５）及びＥＰＲＳ+/-（ｎ＝１４）マウスにＶＳＶインディアナを静脈投与（２×１０８ｐｆｕ/ｍｏｕｓｅ）した後、１０日間の生存率を確認した。
【図４０】ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス（ｎ＝６）を感染させ、５日後、脳と脾臓組織でプラーク分析を行い、ウイルスの量を確認した。
【図４１】ＶＳＶ転写体（ｎ＝５）に対してｑＰＣＲを行い、ウイルスの量を確認した。
【図４２】プラーク分析でウイルス量を確認した。ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス（ｎ＝８）をＶＳＶ‐ＧＦＰに感染させ（２×１０８ｐｆｕ/ｍｏｕｓｅ）、１２時間後に回収した血清を分析に使用した。
【図４３】ＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐α及びＩＬ‐６レベルをＥＬＩＳＡで確認した。 ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス（ｎ＝８）をＶＳＶ‐ＧＦＰに感染させ（２×１０８ｐｆｕ/ｍｏｕｓｅ）、１２時間後に回収した血清を分析に使用した。
【図４４】ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウス（ｎ＝４）をＶＳＶインディアナに感染させ、５日後に脳組織切片をＨ＆Ｅ染色し、神経柔組織（parenchyma）を確認した（ｉ-ｉｉｉ）。脳柔組織で反応性ミクログリア細胞（microglial cell）及び単核球細胞によって形成された膠細胞結節（glial nodule）は黒い矢印で示し、血管周囲浸潤は矢印の先で示した。単核球細胞の大量浸潤で側脳室（lateral ventricle、LV）に脳室膜線が破壊されたことが観察された（赤い矢印、iv）。Ｃｏｎは、ウイルスに感染されてない標本である。
【図４５】ＶＳＶインディアナに感染されて３日及び５日後の抗ＶＳＶ‐Ｇ抗体で脳切片（ｎ＝４）を染色した免疫組織分析の結果を示した。核はＤＡＰＩで染色した。ＶＳＶ陽性ＧＦＰシグナルは白い矢印で示した。Ｃｏｎは、ウイルスに感染されてない標本である。
【図４６】Ｕ９３７細胞をＰＲ８‐ＧＦＰに感染させたり（ＭＯＩ=３）またはＩＦＮ‐γで処理（５００ｕｎｉｔ/ｍｌ）した後、抗ＥＰＲＳ抗体で内因性の共同‐ＩＰを行い、抗ＫＲＳ及び抗ＡＩＭＰ３（ＭＳＣ構成要素）、及び抗ＮＳＡＰ１及び抗ＧＡＰＤＨ（ＧＡＩＴ複合体の構成要素）抗体で免疫ブロッティングを行った結果を示した。
【図４７】ウイルス感染がＭＳＣ構成要素のタンパク質からＥＰＲＳの放出を誘導することを確認した。ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させたＲＡＷ２６４．７細胞の溶解物を用いて、抗ＥＰＲＳ抗体でＩＰを行った後、抗ＫＲＳ、抗ＭＲＳ、抗ＡＩＭＰ３、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体で免疫ブロット分析を行った。
【図４８】ウイルス感染がＭＳＣ構成要素のタンパク質からＥＰＲＳの放出を誘導することを確認した。ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染させたＲＡＷ２６４．７細胞の溶解物を用いて、抗ＫＲＳ抗体でＩＰを行った後、抗ＥＰＲＳ、及び抗ＡＩＭＰ３抗体で免疫ブロット分析を行った。
【図４９】内因性ＥＰＲＳ（赤）及びＫＲＳ（緑）をコンフォーカル顕微鏡で確認して、共同位置で検出されるかどうかを確認した。細胞はＰＲ８（ＭＯＩ=５）に６または１２時間感染させたり、ＩＦＮ‐γ（１０００ｕｎｉｔ/ｍｌ）で１２時間処理した。スケールバー、１０μｍ。
【図５０】ＥＰＲＳ及びＫＲＳの共同位置のインデックスを示す。
【図５１】ＰＲ８（ＭＯＩ=５）に６または１２時間感染させたＨｅＬａ細胞における内因性ＥＰＲＳ（赤）及びＫＲＳ（緑）の発現をコンフォーカル顕微鏡で確認した。ＩＦＮ‐γ（１０００ｕｎｉｔ/ｍｌ）を１２時間処理して比較した。スケールバー、１０μｍ（拡大写真は２μｍ）。
【図５２】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）に感染されたり、または感染されていない（−）２９３Ｔ細胞でＳｔｒｅｐ沈降分析で精製したＳｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳをＳｉｌｖｅｒ染色した。ＥＰＲＳタンパク質は*で示した。ＥＶ、Ｓｔｒｅｐタグ空ベクター。
【図５３】非感染（− 、上段パネル）及びＰＲ８感染（ＰＲ８、下段パネル）の条件で収得した２価イオンＥＰＲＳペプチドＥＹＩＰＧＱＰＰＬＳＱＳＳＤＳｐＳ*ＰＴＲ（ＭＨ＋＝２１２５．９３、ｚ＝２＋、配列番号６５）のＭＳ/ＭＳスペクトルを示した。前記ペプチドは、Ｓ８８６のリン酸化位置（*で表示）を含む。切片イオンは質量分析においてペプチド切片化に対する命名法に基づいて表示した。
【図５４】非感染（− 、上段パネル）及び感染（ＰＲ８、下段パネル）の条件下でトリプシン分解を行い、非リン酸化（左）及びリン酸化（右）ＥＰＲＳ由来の２価イオンＥＹＩＰＧＱＰＰＬＳＱＳＳＤＳＳＰＴＲ（ＭＨ＋＝２０４４．９６、ｚ＝２＋、配列番号６６）ペプチドに対するＸＩＣ（Extracted ion chromatogram）を示した。 *は、リン酸化された残基を示し、Ｎ．Ｄ．は検出されないことを示す。
【図５５】非感染（− 、上段パネル）及び感染（ＰＲ８、下段パネル）の条件下でトリプシン分解を行い、非リン酸化ＥＰＲＳ由来の２価イオンＮＱＧＧＧＬＳＳＳＧＡＧＥＧＱＧＰＫ（ＭＨ＋＝１５８６．７２、ｚ＝２＋、配列番号６７）ペプチド（左）及びリン酸化ＥＰＲＳ由来の２価イオンＮＱＧＧＧＬＳＳ*ＳＧＡＧＥＧＱＧＰＫ（配列番号６８）ペプチド（右）のＸＩＣ（Extracted ion chromatogram）を示した。 *は、リン酸化された残基を示し、Ｎ．Ｄ．は検出されないことを示す。
【図５６】３価イオンＥＰＲＳペプチド、ＫＤＰＳＫＮＱＧＧＧＬＳＳＳＧＡＧＥＧＱＧＰＫ [ＭＨ＋＝２１４２．０２、ｚ＝３＋、配列番号６９;非感染条件（−、左パネル）]、及びＫＤＰｐＳ*ＫＮＱＧＧＧＬＳＳＳＧＡＧＥＧＱＧＰＫ [ＭＨ＋＝２２２２．９９、ｚ＝３＋、配列番号７０; ＰＲ８感染条件（ＰＲ８、右側のパネル）]のＭＳ/ＭＳスペクトルを示した。後者は、Ｓｅｒ９９０リン酸化の位置を含む（*印）。
【図５７】非感染（− 、上段パネル）及び感染（ＰＲ８、下段パネル）の条件下でトリプシン分解を行い、非リン酸化（左）及びリン酸化（右）ＥＰＲＳ由来の３価イオンＫＤＰＳＫＮＱＧＧＧＬＳＳＳＧＡＧＥＧＱＧＰＫ（ＭＨ＋＝２１４２．０２、ｚ＝３＋、配列番号６９）ペプチドに対するＸＩＣ（Extracted ion chromatogram）を示した。 *は、リン酸化された残基を示し、Ｎ．Ｄ．は検出されないことを示す。
【図５８】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染されたり、ＩＦＮ‐γを処理したＵ９３７細胞のＥＰＲＳＳｅｒ９９０のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図５９】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に感染されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＰＲＳＳｅｒ９９０のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図６０】ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）に感染された２９３Ｔ細胞におけるＥＰＲＳＳｅｒ９９０のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図６１】ＶＳＶ‐ＧＦＰ（ ＭＯＩ=０．００１）に感染された２９３Ｔ細胞におけるＥＰＲＳＳｅｒ９９０のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図６２】Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）２μｇで形質転換させた細胞におけるＥＰＲＳＳｅｒ９９０のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図６３】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染されたり、ＩＦＮ‐γを処理したＵ９３７細胞におけるＥＰＲＳＳｅｒ８８６のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図６４】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染されたり、ＩＦＮ‐γを処理したＵ９３７細胞におけるＥＰＲＳＳｅｒ９９９のリン酸化を免疫ブロット分析で確認した。
【図６５】ＰＲ８‐ＧＦＰまたはＶＳＶ‐ＧＦＰに感染されたＵ９３７細胞におけるＩＦＮ‐γ分泌レベルを確認した。陽性対照群としてＩＦＮ‐γ（１０００ｕｎｉｔ/ｍｌ）を２４時間処理した細胞を使用した。
【図６６】ＰＲ８‐ＧＦＰまたはＶＳＶ‐ＧＦＰに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＩＦＮ‐γ分泌レベルを確認した。陽性対照群としてＩＦＮ‐γ（１０００ｕｎｉｔ/ｍｌ）を２４時間処理した細胞を使用した。
【図６７】ＰＲ８‐ＧＦＰに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣｐ発現を免疫ブロット分析で確認した。
【図６８】Ｓｅｒ９９０のリン酸化模倣ＥＰＲＳがＭＳＣから放出されることを確認した結果である。２９３Ｔ細胞は、空ベクター（ＥＶ）、Ｓｔｒｅｐ-ＥＰＲＳＷＴ、または３つのリン酸化模倣の形態で形質転換させ、Ｓｔｒｅｐ沈降を行った後、抗ＫＲＳ、抗ＡＩＭＰ３、及び抗ＭＲＳ抗体で免疫ブロット分析を行った。
【図６９】ＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧプラスミド（０、５０、２００、または８００ｎｇ）と一緒にＮ‐ＲＩＧ‐Ｉ、ＭＤＡ５、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）またはＭＡＶＳで形質転換させた２９３Ｔ細胞におけるＩＦＮ‐βプロモーターの活性を確認した。
【図７０】ＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧプラスミド（０、５０、２００、または８００ｎｇ）と一緒にＴＲＡＦ３、ＴＢＫ１、またはＩＲＦ７で形質転換させた２９３Ｔ細胞におけるＩＦＮ‐βプロモーターの活性を確認した。
【図７１】２９３Ｔ細胞をＳｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳプラスミドで形質転換させた後、ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）に６時間感染させ、２４時間後、細胞から分離したＳｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳ複合体をＳｉｌｖｅｒ染色した。*で示したタンパク質は、ＰＣＢＰ２（３８ｋＤａ）を示す。配列は質量分析で究明されたペプチドを示す。
【図７２】ＰＲ８に感染されたＲＡＷ２６４．７細胞を抗ＥＰＲＳ抗体で免疫沈降した後、抗ＰＣＢＰ２抗体で免疫ブロット分析を行い、ＥＰＲＳ及びＰＢＰ２の相互作用を確認した。
【図７３】ＰＲ８に感染されたＵ９３７細胞を抗ＥＰＲＳ抗体で免疫沈降した後、抗ＰＣＢＰ２抗体で免疫ブロット分析を行い、ＥＰＲＳ及びＰＢＰ２の相互作用を確認した。
【図７４】ＰＲ８ウイルス（ＭＯＩ=５）に感染されたＨｅＬａ細胞における内因性ＥＰＲＳ（赤）及びＰＣＢＰ２（緑）の発現をコンフォーカル分析で確認した。スケールバー、１０μｍ。
【図７５】本発明で用いられたＥＰＲＳ及びその断片の模式図を示した。ＰＣＢＰ２にＥＰＲＳが結合するかどうか（＋または−）を示した。ＧＳＴ、ＧＳＴ様ドメイン；Ｌ、リンカー；ＣＤ、触媒ドメイン；ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ結合ドメイン；Ｗ、ＷＨＥＰドメイン。
【図７６】ＥＰＲＳ及びその断片がＰＣＢＰ２と相互作用するかどうかを確認した。２９３Ｔ細胞を空ベクター（ＥＶ）、ＰＣＢＰ２またはＥＰＲＳプラスミドで形質転換させた。
【図７７】ルシフェラーゼのレポーター分析でＩＦＮ‐βプロモーターの活性を確認した。２９３Ｔ細胞をＥＶまたは示されたＥＰＲＳプラスミドと一緒にＮ‐ＲＩＧ‐Ｉ、ＩＦＮ‐βプロモーター、及びＴＫ‐Ｒｅｎｉｌｌａを含む発現プラスミドで形質転換させた。
【図７８】ＥＰＲＳ及びその断片がＰＣＢＰ２と相互作用するかどうかを確認した。２９３Ｔ細胞を空ベクター（ＥＶ）、ＰＣＢＰ２またはＥＰＲＳプラスミドで形質転換させた。
【図７９】ルシフェラーゼのレポーター分析でＩＦＮ‐βプロモーターの活性を確認した。２９３Ｔ細胞をＥＶまたは示されたＥＰＲＳプラスミドと一緒にＮ‐ＲＩＧ‐Ｉ、ＩＦＮ‐βプロモーター、及びＴＫ‐Ｒｅｎｉｌｌａを含む発現プラスミドで形質転換させた。
【図８０】ＥＰＲＳ及びその断片がＰＣＢＰ２と相互作用するかを確認した。２９３Ｔ細胞を空ベクター（ＥＶ）、ＰＣＢＰ２またはＥＰＲＳプラスミドで形質転換させた。
【図８１】ルシフェラーゼのレポーター分析でＩＦＮ‐βプロモーターの活性を確認した。２９３Ｔ細胞をＥＶまたは表示されたＥＰＲＳプラスミドと一緒にＮ‐ＲＩＧ‐Ｉ、ＩＦＮ‐βプロモーター、及びＴＫ‐Ｒｅｎｉｌｌａを含む発現プラスミドで形質転換させた。
【図８２】ＰＣＢＰ２コンストラクトを模式的に示した。ＰＣＢＰ２がＥＰＲＳに結合するかどうかを示した。
【図８３】ＰＣＢＰ２ＫＨ１がＥＰＲＳとの相互作用に核心的であることを確認した。Ｓｔｒｅｐ沈降でＳｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳ及びさまざまな形態のＧＳＴ‐ＰＣＢＰ２を発現する２９３Ｔ細胞の溶解物を沈降させて、抗ＧＳＴ抗体で免疫ブロットを行い、ＰＣＢＰ２との相互作用を確認した。
【図８４】ＥＰＲＳ（ａａ１‐７３２、ａａ１‐１９６及びａａ１‐１６８）及びＰＣＢＰ２ＫＨ１（ａａ１１‐８２）ドメイン間の直接結合するかどうかをインビトロ沈降分析で確認した。黒い矢印は、精製過程でＥＰＲＳから由来したタンパク質の切片を示す。示されたバンドのＮ‐末端配列はＥＰＲＳのＭＲＦＤＤ（ａａ２３４‐２３８）及びＭＶＴＦＩ（ａａ５６５‐５６９）の配列であることが確認された。赤い矢印の先は、ＰＣＢＰ２ＫＨ１ドメインを示す。
【図８５】ＥＰＲＳ及びＰＣＢＰ２の間の相互作用を確認した。精製されたＨｉｓタグＥＰＲＳ（ａａ１‐１９６）をＧＳＴ融合ＰＣＢＰ２ＫＨ１（ａａ１１‐８２）と混合した。Ｈｉｓタグ沈降後、タンパク質を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥを行った後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色した。ＦＴは、ｆｌｏｗ‐ｔｈｒｏｕｇｈ分画を意味する。
【図８６】ＥＰＲＳ及びＰＣＢＰ２の間の相互作用を確認した。精製されたＨｉｓタグＥＰＲＳ（ａａ１‐１８６）をＧＳＴ融合ＰＣＢＰ２ＫＨ１（ａａ１１‐８２）と混合した。Ｈｉｇタグ沈降後、タンパク質を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥを行った後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色した。ＦＴは、ｆｌｏｗ‐ｔｈｒｏｕｇｈ分画を意味する。
【図８７】ＰＣＢＰ２ＫＨ１ドメインとＭＡＶＳの相互作用を確認した。ＭＡＶＳ及びさまざまなＰＣＢＰ２プラスミドで形質転換させた２９３Ｔ細胞の溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で共同ＩＰし、抗ＧＳＴ抗体で免疫ブロット分析を行って、ＰＣＢＰ２との相互作用を確認した。
【図８８】ＰＣＢＰ２ＫＨ１ドメインとＭＡＶＳの相互作用を確認したインビトロ沈降分析を示した。矢印の先は、ＭＡＶＳタンパク質を示す。
【図８９】ＭＡＶＳとＰＣＢＰ２間の相互作用を示した。精製されたＧＳＴ融合ＭＡＶＳ（ａａ４６０‐５４０）をＨｉｓタグＰＣＢＰ２ＫＨ１（ａａ１１‐８２）と混合した。タンパク質の混合物をＮｉ‐ＮＴＡアガロースビーズにロードして、イミダゾール溶出緩衝液で溶出させた。ＦＴは、ｆｌｏｗ‐ｔｈｒｏｕｇｈ分画を意味する。
【図９０】ＭＡＶＳとＰＣＢＰ２間の相互作用を示したものである。精製されたＧＳＴ-融合ＭＡＶＳ（ａａ４６０‐５４０）をＨｉｓタグＰＣＢＰ２リンカー（ａａ 168-279）と混合した。タンパク質の混合物をＮｉ‐ＮＴＡアガロースビーズにロードしてイミダゾール溶出緩衝液で溶出させた。ＦＴは、ｆｌｏｗ‐ｔｈｒｏｕｇｈ分画を意味する。
【図９１】抗ＦＬＡＧまたは抗Ｓｔｒｅｐ抗体でそれぞれＭＡＶＳ（最初のパネル）またはＥＰＲＳ（２番目のパネル）とＰＣＢＰ２との相互作用をＧＳＴ沈降及び免疫ブロット分析により確認した。２９３Ｔ細胞は、ＭＡＶＳ及びＰＣＢＰ２で形質転換させて、ＥＰＲＳの量を多様に処理した。
【図９２】ＰＣＢＰ２とＩＴＣＨ（最初のパネル）またはＥＰＲＳ（２番目のパネル）との相互作用を評価するために、ＧＳＴ沈降分析を行った。
【図９３】ＰＣＢＰ２とＥＰＲＳまたはＭＡＶＳ間の内因性相互作用を確認した。抗ＰＣＢＰ２抗体でＰＲ８に感染されたＲＡＷ２６４．７細胞の溶解物から内因性ＰＣＢＰ２を免疫沈降させ、抗ＥＰＲＳ（最初のパネル）または抗ＭＡＶＳ（２番目のパネル）抗体で免疫ブロットを行った。
【図９４】ＥＰＲＳ、ＰＣＢＰ２、ＩＴＣＨ、及びＵｂをさまざまな組み合わせで発現する２９３Ｔ細胞をＭＧ‐１３２で処理した後、その溶解物から免疫沈降させた外因性ＭＡＶＳを抗Ｋ４８Ｕｂ抗体で免疫ブロット分析を行った。
【図９５】ＥＰＲＳ、ＰＣＢＰ２、ＩＴＣＨ、及びＵｂをさまざまな組み合わせで発現する２９３Ｔ細胞をＭＧ‐１３２で処理した後、その溶解物から免疫沈降させた内因性ＭＡＶＳを抗Ｋ４８Ｕｂ抗体で免疫ブロット分析を行った。
【図９６】ＰＣＢＰ２で形質転換させた２９３Ｔ細胞にさまざまな濃度のＥＰＲＳを処理した後、外因性ＭＡＶＳの発現を確認した。グラフは、アクチンに対して標準化したＭＡＶＳバンドの強度を示す。
【図９７】ＰＣＢＰ２で形質転換させた２９３Ｔ細胞にさまざまな濃度のＥＰＲＳを処理した後、内因性ＭＡＶＳの発現を確認した。グラフは、アクチンに対して標準化したＭＡＶＳバンドの強度を示す。
【図９８】抗Ｕｂ抗体で免疫ブロットを行い、ＭＡＶＳユビキチン化を確認したインビトロ分析を示した。精製されたＭＡＶＳタンパク質をユビキチン、Ｅ１、Ｅ２、及び精製されたＥＰＲＳ、ＰＣＢＰ２、及びＩＴＣＨタンパク質の組み合わせと一緒にインキュベーションした。
【図９９】細胞透過性のＴａｔと融合したＥＰＲＳＬ１（ａａ１６８‐１９６）ドメインがＭＡＶＳユビキチン化を抑制することを確認した。２９３Ｔ細胞をＰＣＢＰ２、ＩＴＣＨ、またはＵｂプラスミドで２９３Ｔ細胞を形質転換させ、さまざまな濃度のＴａｔ‐Ｅｐｅｐ（２０、５０、及び１００μＭ）を処理した後、抗ＭＡＶＳ抗体を用いて、内因性ＭＡＶＳを沈降させた。沈降物は抗Ｋ４８Ｕｂで免疫ブロットした。ＥＰＲＳアミノ酸１６８‐１９６及びＴａｔを融合して合成したペプチド（Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ）配列を示した。
【図１００】ＰＣＢＰ２で形質転換させた２９３Ｔ細胞に、さまざまな濃度のＴａｔ‐Ｅｐｅｐ（２０、５０、及び１００μＭ）を処理し、内因性ＭＡＶＳのレベルを確認した。グラフは、アクチンに対して標準化させたＭＡＶＳタンパク質バンドの強度を示す。
【図１０１】ＶＳＶに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞でＴａｔ‐ＥｐｅｐがＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６の分泌を濃度依存的な方式で促進させることを確認した。Ｃｏｎ、陰性対照群にＰＢＳを処理したＶＳＶ感染ＲＡＷ２６４．７細胞。
【図１０２】ＶＳＶ‐ＧＦＰに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞を１００μＭＴａｔまたはＴａｔ‐Ｅｐｅで処理した代表的な蛍光画像を示した。
【図１０３】ＶＳＶに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞でＴａｔ‐ＥｐｅｐがＶＳＶ力価を用量依存的に減少させることを確認した。Ｃｏｎ、陰性対照群にＰＢＳを処理したＶＳＶ感染ＲＡＷ２６４．７細胞。
【図１０４】ＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に１２時間感染されたＲＡＷ２６４．７細胞でＴａｔ‐Ｅｐｅｐがウイルス複製に有意な効果がないことを確認した。Ｃｏｎは、陰性対照群であり、ＰＢＳを処理したＨＳＶ‐ＧＦＰ感染ＲＡＷ２６４．７細胞である。
【図１０５】ＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に１２時間感染されたＲＡＷ２６４．７細胞でＴａｔ‐ＥｐｅｐがＩＦＮ‐βの分泌に有意な効果がないことを確認した。Ｃｏｎは、陰性対照群であり、ＰＢＳを処理したＨＳＶ‐ＧＦＰ感染ＲＡＷ２６４．７細胞である。
【図１０６】ＨＳＶ‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=１）に１２時間感染されたＲＡＷ２６４．７細胞でＴａｔ‐ＥｐｅｐがＩＬ‐６の分泌に有意な効果がないことを確認した。Ｃｏｎは、陰性対照群であり、ＰＢＳを処理したＨＳＶ‐ＧＦＰ感染ＲＡＷ２６４．７細胞である。
【図１０７】さまざまな濃度のＴａｔ‐Ｅｐｅｐを１２時間処理した後、ＭＴＳ分析でＲＡＷ２６４．７細胞の生存性を測定した。Ｃｏｎは、陽性対照群であり、溶解性界面活性剤（digitonin、30μｇ/ｍｌ）を２９３Ｔ細胞に処理したものである。
【図１０８】Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐを１２または２４時間処理した後、２９３Ｔ細胞の生存性を確認した。Ｃｏｎは、陽性対照群であり、溶解性界面活性剤（digitonin、30μｇ/ｍｌ）を２９３Ｔ細胞に処理したものである。
【図１０９】ＶＳＶインディアナ（２×１０８ｐｆｕ/ｍｏｕｓｅ）を静脈投与し、4日目からＴａｔ‐ｔａｇ（１．０５μＭ/ｋｇ）またはＴａｔ‐Ｅｐｅｐ（０．５３μＭ/ｋｇまたは1１．０５μＭ/ｋｇ）を３日間毎日腹腔注射したマウスの脳組織（ｎ＝７）でウイルス量をプラーク分析で確認した結果である。
【図１１０】ＮｅｗＴａｔ‐ＥｐｅｐのＶＳＶウイルス量の減少効果を確認した。
【図１１１】ＶＳＶ‐ＧＦＰに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞にＴａｔ‐Ｅｐｅｐを処理する時にウイルス増殖が減少することを示し、ＮｅｗＴａｔ‐Ｅｐｅｐはウイルス増殖抑制能力がより強いことを蛍光写真で示した。
【図１１２】Ｔａｔ‐ＥｐｅｐまたはＮｅｗＴａｔ‐Ｅｐｅｐ処理によるＩＦＮ‐βの分泌を確認した。
【図１１３】Ｔａｔ‐ＥｐｅｐまたはＮｅｗＴａｔ‐Ｅｐｅｐ処理によるＩＬ‐６の分泌を確認した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らはＭＳＣ（Multi-tRNA synthetase complex）の構成要素であるＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質またはその断片が抗ＲＮＡウイルス活性を有することを確認した。具体的に、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、汎用的な抗ＲＮＡウイルス活性において重要な役割をするＭＡＶＳを分解するＰＣＢＰ２にＭＡＶＳと競争的に結合することにより、ＭＡＶＳの分解を抑制するところ、前記タンパク質またはその断片を含む組成物を用いてＲＮＡウイルス感染疾患を汎用的かつ効果的に治療することができる。
【００２２】
これを具体的に説明すると次のとおりである。一方、本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本発明で開示されたさまざまな要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。また、下記に記述された具体的な叙述によって、本発明の範囲が制限されると見ることができない。
【００２３】
前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質またはその断片を含む抗ＲＮＡウイルス用組成物である。具体的に、前記ＥＰＲＳタンパク質の断片は、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むものであってもよく、より具体的には、配列番号６３の１〜１９６番目のアミノ酸配列、１〜２６９番目のアミノ酸配列、１〜４５７番目のアミノ酸配列、１〜５０６番目のアミノ酸配列、１〜６８２番目のアミノ酸配列、１６８〜５０６番目のアミノ酸配列、１６８〜２６９番目のアミノ酸配列及び１６８〜１９６番目のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２４】
また、前記ＥＰＲＳの断片は、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上の相同性を有するポリペプチドを含んでもよい。例えば、このような相同性を有しながら前記配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有しても、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００２５】
また、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相応する活性を有する場合は、アミノ酸配列の前後の無意味な配列を追加または自然に発生しうる突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（silent mutation）を除くものではない。
【００２６】
本発明において、用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似性（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算するための標準ソフトウェア、具体的にＢＬＡＳＴ２．０を用いたり、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義されている適切な混成化条件は、該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York）で決定されてもよい。
【００２７】
本発明において、用語、「ＲＮＡウイルス」は、ＲＮＡを遺伝物質として用いるすべてのウイルスを意味する。例えば、前記ＲＮＡウイルスは、アマルガウイルス科（Amalgaviridae）、ビルナウイルス科（Birnaviridae）、クリソウイルス科（Chrysoviridae）、シストウイルス科（Cystoviridae）、エンドルナウイルス科（Endornaviridae）、ハイポウイルス科（Hypoviridae）、メガビルナウイルス科（Megabirnaviridae）、パルティティウイルス科（Partitiviridae）、ピコビルナウイルス科（Picobirnaviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、トチウイルス科（Totiviridae）、クアドリウイルス科（Quadriviridae）、アルテリウイルス科（Arteriviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、メソニウイルス科（Mesoniviridae）、ロニウイルス科（Roniviridae）、ジシストロウイルス科（Dicistroviridae）、イフラウイルス科（Iflaviridae）、マルナウイルス科（Marnaviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、セコウイルス科（Secoviridae）、アルファフレキシウイルス科（Alphaflexiviridae）、ベータフレキシウイルス科（Betaflexiviridae）、ガンマフレキシウイルス科（Gammaflexiviridae）、チモウイルス科（Tymoviridae）、ボルナウイルス科（Bornaviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、ニヤミウイルス科（Nyamiviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae ）、ルテオウイルス科（Luteoviridae）、トガウイルス科（Togaviridae）、ニューモウイルス科（Pneumoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、デルタウイルス（Deltavirus）、及びオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）ウイルスであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００２８】
本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、ＰＣＢＰ２に結合してＰＣＢＰ２とＭＡＶＳの間の結合を防ぐことにより、ＭＡＶＳの分解を抑制する効果を有する。したがって、分解されないＭＡＶＳは、そのシグナル伝達経路が活性化され、ウイルス感染に対する先天性免疫反応を活性化させることができる。
【００２９】
本発明において、用語、「ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）タンパク質」は、ＡＲＳ（aminoacyl-tRNA synthetase）の一つであり、ＭＳＣ（multi-tRNA synthetase complex）と呼ばれる細胞質保存システムの一構成要素としてタンパク質合成に関与することが知られている。しかし、ＥＰＲＳの抗ウイルス活性については全く報告されていない。
【００３０】
ＥＰＲＳタンパク質またはこれをコードする遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから取得することができ、例えば、配列番号６３のアミノ酸配列を有するものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００３１】
本発明において、用語、「ＭＡＶＳ（Mitochondrial antiviral-signaling protein）」は、ＲＩＧ‐Ｉ及びＭＤＡ５がＲＮＡウイルスを認識した後に活性化され、さまざまな種類の抗ウイルス性サイトカインを作る重要シグナル伝達のタンパク質をいう。ＭＡＶＳがない場合、ＲＮＡウイルス感染に非常に脆弱になることが知られている。したがって、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、ＭＡＶＳの分解を防ぎ、そのシグナル伝達を活性化させることができるため、ＥＰＲＳタンパク質またはその断片を含む組成物は、すべてのＲＮＡウイルスに対して抗ウイルス活性を誘導することができる。
【００３２】
本発明の具体的な一実施例では、ＥＰＲＳノックダウン細胞でＰＲ８及びＶＳＶ感染によるウイルス複製が増加し（図５及び図６）、ウイルス感染またはウイルス遺伝子の形態を模倣したｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理に対して抗ウイルス性サイトカイン生産が減少することを確認した（図８及び図９）。一方、ＥＰＲＳを過発現させた細胞でＰＲ８及びＶＳＶ感染によるウイルス複製が著しく減少し、ＩＦＮ‐β、及びＩＬ‐６の生産が増加することを確認した（図２２〜図２７）。また、ＥＰＲＳ+/-マウスでは、ウイルス感染の時、ＥＰＲＳ+/+マウスに比べて、ウイルス力価が高く、血清にＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐α及びＩＬ‐６レベルが低いことを確認して（図４０〜図４３）、ＥＰＲＳがＲＮＡウイルスに対する先天性免疫反応を陽性調節しうることを確認した。
【００３３】
本発明の他の具体的な一実施例では、さまざまなサイズのＥＰＲＳ断片を用いて、免疫反応の調節に関与しているＥＰＲＳ領域を確認し、これにより、ＥＰＲＳＬ１領域（配列番号６３の１６８〜１９６番目のアミノ酸）、より具体的には、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列がＥＰＲＳの抗ウイルス活性に必須であることを確認した（図７５〜図８１）。結論として、ＥＰＲＳタンパク質、または前記配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むＥＰＲＳタンパク質の断片は、抗ＲＮＡウイルス活性を有するので、抗ＲＮＡウイルス用組成物として有用に用いられることが分かった。
【００３４】
前記ＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、細胞透過性を高めるためにさらに細胞透過性ペプチド（cell-penetrating peptide）と融合した形態で用いられてもよい。すなわち、前記ＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、Ｎ‐末端、Ｃ‐末端、または両末端に細胞透過性ペプチドをさらに含んでもよい。このとき、ＥＰＲＳタンパク質またはその断片、及び細胞透過性ペプチドの間にリンカーをさらに含んでもよく、これは当業者によって適切に行われてもよい。
【００３５】
本発明において、用語、「細胞透過性ペプチド」は、ナノ粒子、化合物、ＤＮＡ、タンパク質などのさまざまな物質の細胞内摂取/吸収を促進させうる短いペプチドをいう。具体的に、前記細胞透過性ペプチドは、Ｔａｔ、アンテナペディア（Antennapedia）、トランスポータン（Transportan）、ＶＰ２２、Ｈｐｈ‐１、Ｒ１１（Ｒ９）、シグナル配列ベースのペプチド、または両親媒性（Amphipathic）ペプチドであってもよいが、これらに制限されるものではなく、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片の細胞内移動を促進させることができる細胞透過性ペプチドであれば、当業者によって適切に選択されてもよい。さらに、当業者は、用いられる細胞透過性ペプチドの種類に応じてこれを適用するために、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を適切に変形して用いてもよい。すなわち、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、本発明で提示するアミノ酸配列のみに限定されるものではなく、当業者に自明な範囲内で、細胞透過性ペプチドの適用に適切な形態でアミノ酸配列を付加/置換/除去して用いてもよい。
【００３６】
本発明の具体的な一実施例では、ＨＩＶ‐１ Ｔａｔタンパク質変換ドメイン（transduction domain、配列番号６０）とＥＰＲＳＬ１ペプチド（配列番号６３の１６８〜１９６）を融合した融合ペプチド（Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ：配列番号６１）の抗ウイルス活性を調査した結果（図９９〜図１０９）、試験管内及び生体内で前記Ｔａｔ‐ＥｐｅｐがＭＡＶＳ生存性及びI型ＩＦＮの生産を増加させて、ウイルスに感染されたマウスの脳組織におけるウイルス力価を著しく削減させる、優れた抗ＲＮＡウイルス活性を有することを確認した。
【００３７】
本発明の他の具体的な一実施例では、ＨＩＶ‐１ Ｔａｔタンパク質変換ドメイン（transduction domain、配列番号６０）とＥＰＲＳＬ１ペプチド断片（配列番号６３の１６８〜１８６）を融合した融合ペプチド（ＮｅｗＴａｔ‐Ｅｐｅｐ：配列番号６４）が、前記Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐよりも著しくウイルスに感染されたマウスの脳におけるウイルス力価を減少させ、抗ウイルスサイトカインであるＩＦＮ‐β、及びＩＬ‐６の分泌を促進させることを確認した（図１１０〜図１１３）。
【００３８】
また、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、細胞透過性を高めるため、細胞にタンパク質を伝達したり、伝達効率を増進させることができる当業界に公知された試薬と一緒に用いられてもよい。前記試薬は、例えば、Ｃｈａｒｉｏｔ（Active motif, Cat. 30025）などを用いてもよいが、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を細胞に伝達させることができる限り、前記の例に特に制限されるものではない。
【００３９】
本発明の抗ＲＮＡウイルス用組成物は、薬学組成物、医薬部外品組成物、食品組成物、化粧料組成物または飼料組成物として用いられてもよいが、これらに制限されるものではない。
【００４０】
本発明の他の一つの態様は、抗ＲＮＡウイルス活性を有するＥＰＲＳタンパク質またはその断片であって、前記ＥＰＲＳタンパク質の断片は、配列番号６３の１６８〜１８６番目のアミノ酸配列を含むものである、タンパク質またはその断片である。
【００４１】
本発明のもう一つの態様は、前記タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドである。
【００４２】
本発明のもう一つの態様は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００４３】
本発明のもう一つの態様は、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを含む、形質転換体である。
【００４４】
抗ＲＮＡウイルス活性を有するＥＰＲＳタンパク質またはその断片は、前記で説明したとおりである。
【００４５】
前記ポリヌクレオチドは、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を有するものであってもよく、それから翻訳されたポリペプチド（すなわち、タンパク質もしくはその断片）が本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片と相応する効能を示すものであれば、ヌクレオチド配列の５’及び/または３’末端に無意味な配列の付加、あるいは一部の配列の欠失、変形、置換された場合も、本発明の範囲に含まれてもよい。前記ポリヌクレオチドは、公知のプロモーター配列と作動可能に連結された発現カセット、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形態で用いられてもよく、ポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターの製造は、当業者が公知の方法を介して適切に行ってもよい。プロモーター及びベクターの種類は、特に制限されず、目的に応じて当業者が適宜選択してもよい。また、前記ポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターを宿主細胞に形質転換させて形質転換体を製造して用いてもよく、このときの形質転換方法も当業者が公知の方法を制限なく用いてもよい。前記形質転換体は、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を発現させようとする対象体であって、微生物、植物または動物であってもよく、ヒトを除いたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４６】
当業者は、さまざまな目的で前記ＥＰＲＳタンパク質またはその断片を適用/生産するためにこれをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、あるいは前記ベクターを含む形質転換体を製造して用いてもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドあるいは前記ベクターを用いて直接的にＲＮＡウイルス感染疾患に対する治療用途で用いてもよく、これを含んでＥＰＲＳタンパク質もしくはその断片を発現する形質転換体を用いて前記タンパク質またはその断片を生産したり、治療目的で用いてもよいが、これに制限されるものではない。
【００４７】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療用薬学組成物である。
【００４８】
抗ＲＮＡウイルス用組成物については、前記で説明したとおりである。
【００４９】
本発明において、用語、「ＲＮＡウイルス感染疾患」は、ＲＮＡウイルスの感染によって宿主に発生しうるすべての疾患を意味するもので、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を用いて、前記疾患の予防及び/または治療効果を期待することができる。例えば、ＲＮＡウイルス感染疾患は、インフルエンザ（influenza）、急性灰白髄炎（poliomyelitis anterior acuta）、無菌性髄膜炎（aseptic meningitis）、手足口病（hand-foot-mouth disease）、ヘルパンギーナ（herpangina）、急性出血性結膜炎（acute hemorrhagic conjunctivitis）、流行性胸膜炎（epidemic pleurodynia）、心膜炎（pericarditis）、心筋炎（myocarditis）、乳幼児の白色硬性下痢症、風疹（rubella）、先天性風疹症候群（Congenital rubella syndrome）、黄熱病（yellow fever ）、デング熱（Dengue fever）、デング出血熱（Dengue hemorrhagic fever）、日本脳炎（Japanese encephalitis）、単純ヘルペス脳炎（Herpes simplex encephalitis）、流行性耳下腺炎（epidemic parotitis）、麻疹（measles）、狂犬病（rabies）、マールブルグ病（Marburg disease）、エボラ出血熱（Ebola hemorrhagic fever）、腎症候性出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome）、ハンタウイルス肺症候群（HPS）、クリミアコンゴ出血熱（Congo-Crimean hemorrhagic fever）、ＡＩＤＳ（Acquired immunodeficiency disease）、成人Ｔ細胞白血病（Adult T-cell leukemia）、ＨＴＬＶ‐１関連脊髄症（HTLV-1 associated myelopathy）、ＨＴＬＶ‐１ブドウ膜炎（HTLV-1 uveitis ）及びラッサ熱（Lassa fever）からなる群から選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるものではなく、ＲＮＡウイルスによって引き起こされる疾患及び症状は、すべて本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
本発明において、用語、「予防」は、本発明に係る組成物の投与で前記ＲＮＡウイルス感染疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為をいい、「治療」は、本発明に係る組成物の投与で前記ＲＮＡウイルス感染疾患の症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為をいう。
【００５１】
前記ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療は、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片がＰＣＢＰ２タンパク質に結合することにより達成されることであってもよく、さらにＭＡＶＳのシグナル伝達が活性化されることによるものであってもよい。したがって、本発明のＥＰＲＳタンパク質またはその断片を含む組成物は、前述したように、抗ＲＮＡウイルス活性を有するので、ＲＮＡ感染疾患の予防または治療用組成物として有用に用いられる。
【００５２】
本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常に用いられる適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、経口または非経口のさまざまな剤形であってもよく、具体的に、非経口剤形であってもよいが、これに制限されるものではない。製剤化する場合は、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製されてもよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれてもよく、これらの固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤してもよい。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も用いられてもよい。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられてもよい。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられてもよい。
【００５３】
また、本発明の薬学組成物は、これに制限されないが、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか１つの剤形を有してもよい。
【００５４】
前記本発明の薬学組成物は薬学的に有効な量で投与する。
【００５５】
本発明において、用語、「投与」は、ある適切な方法で対象に本発明の薬学組成物を導入することをいい、投与経路は目的組織に到達することができる限り、経口または非経口の多様な経路を介して投与されてもよく、具体的に、非経口で投与されてもよいが、これに制限されるものではない。
【００５６】
前記薬学組成物は、目的または必要に応じて当業界で用いられる通常の方法、投与経路、投与量に応じて適宜個体に投与されてもよい。投与経路の例としては、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内に投与されてもよく、非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。また、当業界に公知された方法に応じて適切な投与量及び投与回数が選択されてもよく、実際に投与される本発明の薬学組成物の量及び投与回数は、治療しようとする症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食餌、個体の年齢及び体重、及び疾患の重症度のようなさまざまな因子によって適切に決定されてもよい。
【００５７】
本発明において、用語、「薬学的に有効な量」は、医学的用途に適用可能な合理的な恩恵/リスク比であり、血管透過性の増加を抑制または緩和するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の組成物は、個別治療薬で投与するか、他の治療薬と併用して投与されてもよく、従来の治療薬とは順次的または同時に投与されてもよい。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用のない最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されてもよい。
【００５８】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を個体に投与する段階を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療方法である。
【００５９】
抗ＲＮＡウイルス用組成物及びＲＮＡウイルス感染疾患の予防または治療は、前記説明したとおりである。
【００６０】
本発明において、用語、「個体」は、本発明のＲＮＡウイルス感染疾患が発症したり、発症しうるヒトを含むすべての動物を意味する。また、ヒト以外の動物を意味してもよいが、これに制限されるものではない。本発明の抗ＲＮＡウイルス用組成物を個体に投与することにより、ＲＮＡウイルス感染疾患を予防または治療することができる。
【００６１】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
【００６２】
抗ＲＮＡウイルス用組成物、ＲＮＡウイルス感染疾患及び予防については、前記説明したとおりである。
【００６３】
本発明の用語、「改善」は、本発明の組成物の投与により、ＲＮＡウイルス感染疾患が好転または有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００６４】
本発明の用語、「医薬部外品」は、ヒトや動物の疾病を治療、軽減、処置または予防する目的で用いられる繊維、ゴム製品、またはこれと類似したもの、人体に対する作用が弱いか、人体に直接作用することなく、器具または機械ではないものとこれに類似したもの、感染予防のために殺菌、殺虫及びこれらに類似する用途に用いられる製剤のいずれかに該当する物品であって、ヒトや動物の疾病を診断、治療、軽減、処置または予防する目的で使用する物品のうち器具、機械または装置がないもの及びヒトや動物の構造と機能に薬理学的影響を与える目的で使用する物品のうち器具、機械または装置がないものを除いた物品を意味し、具体的に、皮膚外用剤または個人衛生用品であってもよいが、これに制限されない。
【００６５】
本発明の抗ＲＮＡウイルス用組成物をＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善の目的で医薬部外品組成物に添加する場合、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物をそのまま添加したり、他の医薬部外品の成分と一緒に用いてもよく、通常の方法に応じて適宜使用してもよい。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適切に決定してもよい。
【００６６】
前記皮膚外用剤は、特にこれに制限されないが、例えば、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤またはゲルの形態で製造されて用いられてもよい。前記個人衛生用品には特にこれに制限されないが、具体的には、石鹸、化粧品、ウェットティッシュ、ティッシュペーパー、シャンプー、スキンクリーム、顔クリーム、歯磨き粉、口紅、日焼け止めローション、または洗浄ゲルであってもよい。また、本発明の医薬部外品組成物の別の例として、消毒清潔剤、シャワーフォーム、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドソープ、または軟膏剤がある。
【００６７】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００６８】
抗ＲＮＡウイルス用組成物、ＲＮＡウイルス感染疾患、予防、改善については、前記説明したとおりである。
【００６９】
本発明の用語、「食品」は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味での食品のすべてを含む。
【００７０】
前記健康機能（性）食品（health functional food）は、特定保健用食品（food for special health use、FoSHU）と同じ用語であり、栄養供給のほか、生体調節機能が効率的に示されるよう加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで、「機能（性）」は、人体の構造及び機能に対して栄養素を調整したり、生理学的作用のような保健の用途に有用な効果を得ることを意味する。前記健康食品（health food）は、一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（health supplement food）は、健康補助の目的の食品を意味する。場合によっては、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は、混用されてもよい。
【００７１】
具体的に、前記健康機能食品は本発明の抗ＲＮＡウイルス用組成物を飲料、お茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品素材に添加したり、カプセル化、粉末化、懸濁液などで製造した食品であり、これを摂取する場合、健康上の特定効果をもたらすことを意味するが、一般医薬品とは異なり、食品を原料として薬の長期服用時に発生しうる副作用がないという長点がある。
【００７２】
本発明の食品は、当業界で一般的に使用される方法によって製造されてもよく、当業界で一般的に添加する原料及び成分を添加して製造してもよい。また、前記食品組成物は、食品として認められる剤形であれば、さまざまな形態の剤形で制限なく製造されてもよい。
【００７３】
また、前記食品組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含んでもよいが、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野で一般的に用いられる担体であれば、いかなるものでも用いてもよい。
【００７４】
また、前記食品組成物は、食品組成物に通常用いられて、香り、味、視覚などを向上させうる追加の成分を含んでもよい。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（niacin）、ビオチン（biotin）、葉酸（folate）、パントテン酸（panthotenic acid）などを含んでもよい。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）などのミネラル；及びリジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含んでもよい。
【００７５】
また、前記食品組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜室酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ‐酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（food additives）を含んでもよい。前記添加物は、食品の種類に応じて選別して適切な量で用いてもよい。
【００７６】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００７７】
抗ＲＮＡウイルス用組成物、ＲＮＡウイルス感染疾患、予防、改善については、前記説明したとおりである。
【００７８】
前記化粧料組成物の剤形は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、香水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、日焼け止めクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチまたはスプレーであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７９】
前記化粧料組成物は、一般的な皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよく、通常の成分として、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、無機塩類、色素、酸化防止剤、殺菌剤、防腐剤、香料などを適切に配合してもよいが、これに制限されるものではない。
【００８０】
前記化粧品学的に許容可能な担体は、前記化粧料組成物の剤形に応じてさまざまである。
【００８１】
前記剤形は、軟膏、ペースト、クリーム、またはゲルの場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが用いられてもよいが、これに制限されるものではない。これらは単独で用いても、２種以上混合して用いてもよい。
【００８２】
前記剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミドパウダーなどが用いられてもよく、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロ炭化水素、プロパン/ブタンまたはジメチルエーテルのような推進剤を含んでもよいが、これに制限されるものではない。これらは単独で用いても、２種以上混合して用いてもよい。
【００８３】
前記剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または油濁化剤などが用いられてもよく、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１,３‐ブチルグリコールオイルなどが用いられてもよく、特に、綿実油、ピーナッツ油、コーン胚種オイル、オリーブオイル、ヒマシ油、及びごま油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルが用いられてもよいが、これに制限されるものではない。これらは単独で用いても、２種以上混合して用いてもよい。
【００８４】
前記剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが用いられてもよいが、これに制限されるものではない。これらは単独で用いたり、２種以上混合して用いてもよい。
【００８５】
本発明の剤形が石鹸である場合には、担体成分として、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオン酸、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物油、グリセロール、糖などが用いられてもよいが、これに制限されるものではない。これらは単独で用いたり、２種以上混合して用いてもよい。
【００８６】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を含む、ＲＮＡウイルス感染疾患の予防または改善用飼料組成物を提供する。
【００８７】
抗ＲＮＡウイルス用組成物、ＲＮＡウイルス感染疾患、予防、改善については、前記説明したとおりである。
【００８８】
本発明の用語、「飼料」は、動物が食べて、摂取し、消化させるための、またはこれに適した任意の天然または人工規定食、一食などまたは前記一食の成分として前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を有効成分として含む飼料は、当業界の公知のさまざまな形態の飼料に製造可能であり、好ましくは濃厚飼料、粗飼料及び/または特殊飼料が含まれてもよい。
【００８９】
本発明のもう一つの態様は、前記抗ＲＮＡウイルス用組成物を投与する段階を含む、ＭＡＶＳタンパク質分解の予防または抑制方法を提供する。
【００９０】
抗ＲＮＡウイルス用組成物は、前記説明したとおりである。
【００９１】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１：細胞培養及び形質転換ｓｔｒ
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ及びＲＡＷ２６４．７細胞は１０%ＦＢＳ（Fetal bovine serum、Gibco-BRL）及び１％ペニシリン‐Ｓｔｒｅｐマイシン（Gibco-BRL）を含有するＤＭＥＭ培地で培養し、Ｕ９３７細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン‐Ｓｔｒｅｐマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco-BRL）で培養した。前記細胞は、すべてＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から分譲された。
【００９３】
ＢＭＤＭ（Bone marrow derived macrophage）は５〜６週齢のマウスから分離し、赤血球はＡＣＫ（ammonium-chloride-potassium）溶解バッファー（Gibco-BRL）で溶解させた。次に収得したＢＭＤＭは、１０％ＦＢＳ、１０％Ｌ９２９細胞‐ＣＭ（conditioned medium）及びＧＭ‐ＣＳＦ（R＆D Systems）を含有するＤＭＥＭで培養した。培地は２日ごとに新しい完全培地に交換し、培養７日目の細胞を実験に使用した。
【００９４】
安定的なＥＰＲＳノックダウンＲＡＷ２６４．７細胞株は、ｓｈＲＮＡ（kindly provided by Dr. Jae U. Jung, University of Southern California）を処理して少なくとも２週間の間に２μｇ/ｍｌのピューロマイシンで選別して製作した。
【００９５】
ｐＩＲＥＳまたはｐＩＲＥＳ‐ＥＰＲＳ‐ＦＬＡＧを安定的に発現するＲＡＷ２６４．７細胞株は、対応するＤＮＡコンストラクトで形質転換させて製作し、１μg/ｍｌのピューロマイシンを含有するＤＭＥＭで培養した。
【００９６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｘ‐ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡ形質転換試薬（Roche）を用いてＤＮＡプラスミドコンストラクトで形質転換させた。Ｕ９３７、ＲＡＷ２６４．７及びＢＭＤＭ細胞はｎｕｃｌｅｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ（Lonza, Cologne AG, Germany）で形質転換させ、すぐにＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（Gibco-BRL）で６時間培養した後、２４時間、１０％ＦＢＳを含有する完全培地で培養した。
【００９７】
実施例２：マウス及びウイルス感染
Ｃ５７ＢＬ／６ＥＰＲＳｔｍ１ｂヘテロ接合ノックアウトマウスは、ＴｏｒｏｎｔｏＣｅｎｔｅｒｆｏｒＰｈｅｎｏｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ontario, Canada）から分譲されて、水と飼料を自由に提供して２２±２℃で１２時間、明/暗サイクルの特異病原菌がない施設で飼育した。マウスの子は次のプライマーを用いてＰＣＲで遺伝子型を確認した。
【００９８】
Ａ：５’‐ＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣ‐３’（配列番号1）及びＢ：５’‐ＧＧＴＡＧＡＡＧＴＧＣＴＡＡＧＴＡＧＧＡＴＧＡＧＧ‐３’（配列番号２）（２１８ｂｐＷＴバンドに特異的）；Ｃ：５’‐ＣＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＴＣＴＧＧＴＧＴＣ‐３’（配列番号３）及びＤ：５’‐ＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＧＣＣ‐３’（配列番号４）（４６２ｂｐ変異バンドに特異的）
【００９９】
すべてのマウスはＣＯ２で窒息させて犠牲をさせた。すべての動物実験は、韓国生命工学研究院の実験動物運営委員会で承認され、実験動物の管理と使用に関する指針（米国国立衛生研究所から発刊）に基づいて実行した。
【０１００】
ウイルス感染実験のために、６〜７週齢のマウスの尾にＶＳＶ-Ｉｎｄｉａｎａ（２×１０８ｐｆｕ／マウス）またはＶＳＶ‐ＧＦＰ（２×１０８ｐｆｕ／マウス）を静脈内注射して感染させた。
【０１０１】
実施例３：試薬及び抗体
免疫ブロッティング及び免疫蛍光実験では、次の１次抗体を使用した：抗ＥＰＲＳ（ａｂ３１５３１）、抗ＭＲＳ（ａｂ５０７９３）、抗ＫＲＳ（ａｂ１８６１９６）、抗ＰＣＢＰ２（ａｂ１１０２００）、抗Ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ（ａｂ１３５６４９）、及び抗ＶＳＶ‐Ｇ（ａｂ１８７４）（Abcam）；抗ＭＡＶＳ（human-specific; 3993, rodent-specific; 4983）、抗Ｌ１３ａ（２７６５）、抗ＩＲＦ３（４３０２）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＩＲＦ３（４９４７）、抗ＳＴＡＴ１（９１７２）、抗ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＳＴＡＴ１（７６４９）、及び抗Ａｃｔｉｎ‐ＨＲＰ（１２６２０）（Cell Signaling Technology）；抗ＮＳＡＰ１（ＡＶ４０６４１）、抗ＧＡＰＤＨ（Ｇ９５４５）、及び抗ＦＬＡＧ（Ｆ３１６５）（Sigma）;抗Ｕｂ（ｓｃ‐８０１７）、抗ＧＦＰ（ｓｃ‐９９９６）、及び抗ＧＳＴ（ｓｃ‐４５９）（Santa Cruz Biotechnology）；抗ＡＩＭＰ３（NMS-01-0002, Neomics, Seoul, Korea）；抗Ｖ５‐ＨＲＰ（４６‐０７０８、Invitrogen）；抗Ｋ４８‐ｌｉｎｋｅｄｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎｃｈａｉｎｓ（０５‐１３０７、Millipore）；抗Ｓｔｒｅｐ‐ＨＲＰ（2-1509-001, IBA, Germany）。
【０１０２】
Ｓｅｒ９９０に対するａｆｆｉｎｉｔｙ‐ｐｕｒｉｆｉｅｄラビットポリクローナルリン酸特異的抗体は、９８３ＤＧＱＲＫＤＰ（ｐ）ＳＫＮＱＧＧＧ９９６ペプチド（配列番号５）（AbClon, Seoul, Korea）を用いて生産した。リン酸特異的Ｓｅｒ８８６及びＳｅｒ９９９抗体はＤｒ. ＰａｕｌＬ. Ｆｏｘ（Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, CLV, USA）から提供された。ヤギ抗マウス（７０７６）または抗ウサギ（７０７４）ＩｇＧ‐ＨＲＰ（Cell Signaling Technology）を免疫ブロッティングの２次抗体として用いた。Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウスＩｇＧ（Ａ１１０５９, Invitrogen）及びＡｌｅｘａ５９４結合抗ラビットＩｇＧ（A11037, Invitrogen）は、免疫蛍光実験に２次抗体として用いた。その他の試薬及び材料としてＭＧ１３２（Sigma）、ピューロマイシン（Gibco-BRL）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（InvivoGen）、ＩＦＮ‐γ（R＆D Systems）、ジギトニン（digitonin、Sigma）、ｐｒｏｔｅｉｎＡ／ＧＰＬＵＳ‐ａｇａｒｏｓｅ（ｓｃ‐２００３、Santa Cruz Biotechnology）、ＧｌｕＴａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ（１７‐５１３２‐０１、GE Healthcare）、抗ＦＬＡＧＭ２ａｆｆｉｎｉｔｙｇｅｌ（Ａ２２２０、Sigma）、Ｓｔｒｅｐ‐ＴａｃｔｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ（2-1201 -002、IBA）、Ｎｉ‐ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ（３０２３０、Qiagen）、ＧＦＰ‐ｔｒａｐ（ｇｔａ‐２０、ChromoTek、Germany）、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１０/３００ＧＬｃｏｌｕｍｎ（GE Healthcare）を用いた。
【０１０３】
実施例４：プラスミドの製作
ＥＰＲＳコンストラクトは、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ、ＨｉｓまたはＧＦＰタグを貼り付けて製作した。具体的に、各ドメインを保有するＥＰＲＳ断片をＰＣＲで増幅させた後ＧＦＰ、Ｓｔｒｅｐ、Ｈｉｓ、またはＦＬＡＧタグを含むベクターでサブクローニングした。ＥＰＲＳのｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ変異体（Ｓ８８６Ｄ、Ｓ９９０Ｄ、Ｓ９９９Ｄ、Ｓ８８６Ｄ／Ｓ９９０Ｄ及びＳ８８６Ｄ/ Ｓ９９９Ｄ）はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅｓｉｔｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ（Stratagene、Amsterdam、Netherlands）を用いてＰＣＲを介して製作した。位置特異的な突然変異のためのＰＣＲプライマーは、表１に示した。
【０１０４】
【表１−１】
2019535803.tif 000003
【０１０５】
【表１−２】
2019535803.tif 000004
【０１０６】
【表１−３】
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【０１０７】
【表１−４】
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【０１０８】
【表１−５】
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【０１０９】
【表１−６】
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【０１１０】
ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ、ＨｉｓまたはＧＳＴがタグ付けされた全長及び断片ＰＣＢＰ２も製作した。ＭＡＶＳは、ＦＬＡＧ、ＧＳＴあるいはＳｔｒｅｐタグを含むベクターにクローニングした。ルシフェラーゼレポーター分析に用いられたこのベクターはＤｒ.ＪａｅＵ. Ｊｕｎｇ（University of Southern California）から提供された。
【０１１１】
実施例５：ＲＮＡ‐Ｓｅｑ解析
初代NHBE（normal human bronchial epithelial）細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、従来知られている方法で分化させた。断層のＮＨＢＥ細胞をＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス（ＭＯＩ=１）で８時間もしくは２４時間、感染させた。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＲＮＡ抽出ミニキット（Qiagen）を用いて感染した細胞から分離し、分離されたＲＮＡの質（quality）はアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１１２】
シーケンスライブラリは、ＴｒｕＳｅｑＲＮＡｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｋｉｔｖ２（Illumina）を用いて製造した。具体的に、ｐｏｌｙ‐T ｏｌｉｇｏ‐ａｔｔａｃｈｅｄ磁石ビーズを用いて総ＲＮＡに分離したｍＲＮＡを切片化してｃＤＮＡに転換させた。前記ｃＤＮＡにアダプターを連結し、これをＰＣＲで増幅した。Ｐａｉｒｅｄ‐ｅｎｄシーケンス（１０１×２）は、Ｈｉｓｅｑ２０００（Illumina）を用いて実施した。各条件で繰り返して配列を分析した。人間の標準遺伝体配列のデータはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａＳａｎｔａＣｒｕｚＧｅｎｏｍｅＢｒｏｗｓｅｒＧａｔｅｗａｙ（assembly ID：hg19）から得た。標準遺伝体インデックスはＳＡＭｔｏｏｌｓ（v. 0.1.19）及びＢｏｗｔｉｅ２‐ｂｕｉｌｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＢｏｗｔｉｅ２（v. 2.1.0）を用いて樹立した。Ｔｏｐｈａｔ２（v. 2.0）を用いて標準遺伝体をマッピングして読み出した。４６，８９５個のＲｅｆＳｅｑ（ＵＣＳＣｈｇ１９）遺伝子モデルの各遺伝子に対するｒｐｋｍ（reads per kilobase per million mapped reads）数は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（v. 2.2.1）を用いて計算し、ヒートマップ（heat map）は、Ｍｅｖ（v. 4.9.0）を用いて構築した。統計分析及びグラフの構築は、Ｒ（v. 3.1.0）とＰＹＴＨＯＮ（v. 2.7.6）を用いて行った。本発明で記述したＲＮＡ‐ｓｅｑデータは、ＮＣＢＩのＧＥＯ（Gene Expression Omnibus）にａｃｃｅｓｓｉｏｎｃｏｄｅＧＳＥ７５６９９として登録された。
【０１１３】
実施例６：ルシフェラーゼ分析
ルシフェラーゼレポータープラスミド、レニラ（renilla）ルシフェラーゼ内部対照群ベクター（phRL-TK; Promega）及び各プラスミドを含有する混合物でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換させた。ルミノメーター（luminometer、Promega）と二重ルシフェラーゼレポーター分析システム（Promega）を用いて、形質転換して２４時間後にレポーター遺伝子分析を実施した。データは、レニラルシフェラーゼ活性に対する相対的なホタルルシフェラーゼ活性を標準化して示した。レポーター及びレニラプラスミドのみを発現する細胞のプロモーター活性を対照群（Ｃｏｎ）として測定した。
【０１１４】
実施例７：ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）
ＴｒａｎｓＩＴ‐ＴＫＯｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（Mirus）を用いて製造プロトコルに基づいてｄｕｐｌｅｘｓｉＲＮＡで細胞を形質転換させた。ＥＰＲＳ特異的ｓｉＲＮＡ配列は前記表1に示した。非標的ｓｉＲＮＡを対照群として用い、細胞はウイルスに露出させる前の３６時間から４８時間の間にｓｉＲＮＡもしくは対照群を添加した条件で培養した。
【０１１５】
実施例８：ウイルスの複製の分析
１％ＦＢＳを含有する培地で細胞を２時間ウイルスに感染させた。次に、完全培地に培地を交替して超過したウイルスを除去した。ウイルス力価は標準プラーク分析（standard plaque assay）を用いてＭＤＣＫ細胞（ＰＲ８‐ＧＦＰ）もしくはＶｅｒｏ細胞（ＶＳＶ‐ＧＦＰ、ＨＳＶ‐ＧＦＰ）で確認した。マウス組織に存在するウイルスを滴定するとき、凍結‐解凍組織抽出物の均質物を用いてプラークカウントを行った。ＧｌｏＭａｘ(R)Ｍｕｌｔｉ‐ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＭｕｌｔｉｍｏｄｅＲｅａｄｅｒ（Promega）の蛍光モジュールを用いてＧＦＰがタグ付けされたウイルスの複製を測定した。Ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｆｉｔｔｅｄ ｗｉｔｈａ２０×１．４ ＮＡ Ｐｌａｎ‐Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓを用いて写真を撮った。
【０１１６】
実施例９：ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡで感染した細胞培養の上清液、あるいはマウスの血清からサイトカインレベルを測定した。次のＥＬＩＳＡキットをメーカーの指示に従って使用した：マウスまたはヒトＩＬ‐６（BD Biosciences）、ＩＦＮ‐α及びＩＦＮ‐β（PBL interferon source）、及びＩＦＮ‐γ（KOMA、Korea）。
【０１１７】
実施例１０：定量的リアルタイム（ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ）ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ‐Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて細胞及びマウス組織から抽出した。ｃＤＮＡはＥｎｚｙｎｏｍｉｘ ｋｉｔ（Enzynomix）を用いて合成し、定量的ＰＣＲは、遺伝子特異的プライマーセット（Bioneer、Daejeon、Korea）及びＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Roche）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲは、メーカーの指示に基づいてＲｏｔｏｒ‐Ｇｅｎｅ Ｑｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Qiagen）を用いて実施した。データはｇａｐｄｈ発現に対して標準化し、相対的な発現は、ｄｅｌｔａ‐ｄｅｌｔａＣＴ方法で計算した。用いられたプライマー配列は、前記表１にまとめた。
【０１１８】
実施例１１：免疫ブロッティング分析及び免疫沈降分析
免疫ブロッティング分析のために、細胞をｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ及びｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Roche）を含有するＲＩＰＡバッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ‐４０、及び１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解させた。総細胞溶解物（５０〜１００μg）を用い、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥを行った後、それぞれの抗体で免疫ブロッティングを実施した。
リン酸化されたタンパク質を検出するために、４℃でｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌを含むＰｈｏｓｐｈｏｓａｆｅ抽出バッファー（Millipore）で細胞溶解物を製造した。
免疫沈降反応のために、細胞溶解物をｐｒｏｔｅｉｎＡビーズと一緒に４℃で１時間インキュベーションして前洗浄した。前記前洗浄された細胞溶解物をそれぞれの抗体と一緒に４℃で一晩インキュベーションした後、３０μｌのｐｒｏｔｅｉｎＡ／ＧＰＬＵＳアガロースビーズと一緒に４℃で３〜４時間インキュベーションした。その後、免疫沈降物を回収し、免疫ブロッティング分析の前に溶解バッファーで５回洗浄した。
【０１１９】
実施例１２：タンパク質の精製及びサイズ排除クロマトグラフィー
Ｈｉｓ（hexahistidine）‐ｔａｇｇｅｄ ＥＰＲＳ（ａａ１‐７３２、ａａ１‐１９６、及びａａ１‐１６８）、Ｈｉｓ‐ｔａｇｇｅｄ ＰＣＢＰ２（ａａ１１‐８２及びａａ１６８‐２７９）、ＧＳＴ‐ｆｕｓｅｄ ＰＣＢＰ２（ａａ１１‐８２）、またはＧＳＴ‐ｆｕｓｅｄ ＭＡＶＳ（ａａ４６０‐５４０）タンパク質を発現するプラスミドを大腸菌ＢＬ２１‐ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）‐ＲＩＰＬ細胞に形質転換させ、１８℃で１８時間、０．５ｍＭのＩＰＴＧで処理して発現を誘導した。その後、前記細胞をバッファーＡ（５０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び１５０ｍＭＮａＣｌ）に懸濁させ、氷の上でソニケーション（sonication）で溶解させた。次に、細胞溶解物を４℃で１時間、２５，０００ｇで遠心分離した。ＨｉgタグＥＰＲＳドメインまたはＰＣＢＰ２ドメインが含まれている上清液をＮｉ‐ＮＴＡアガロースカラムにロードし、バッファーＡで洗浄した後、２５０ｍＭのイミダゾールで溶出させた。ＧＳＴが融合したＰＣＢＰ２またはＭＡＶＳドメインを含む上清液はＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムにロードし、バッファーＡで洗浄した後、１０ｍＭの還元されたグルタチオンで溶出させた。次に、精製されたタンパク質をバッファーＡで透析し、使用前まで−８０℃で保管した。４℃でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０/３００ ＧＬカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、精製されたＥＰＲＳ（ａａ１‐７３２）を調査した。分子量基準としては、アルコール脱水素酵素（１５０ｋＤａ）及びアルブミン（６６ｋＤａ）を用いた。溶出されたすべてのタンパク質は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色した。
【０１２０】
実施例１３：試験管内プルダウン（ｐｕｌｌ‐ｄｏｗｎ）の分析
精製されたＨｉgタグＥＰＲＳドメイン（１０μＭ）及びＧＳＴ融合ＰＣＢＰ２ドメイン（２０μＭ）を結合バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、及び３００ｍＭＮａＣｌ）で混合させた。次に、精製されたＧＳＴ融合ＭＡＶＳ（１０μＭ）はＨｉgタグＰＣＢＰ２ドメイン（５μＭ）と結合バッファーで混合させた。その後、前記タンパク質の混合物を４℃で１時間５０μｌのＮｉ‐ＮＴＡアガロースビーズと一緒にインキュベーションした。洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した後、結合されたタンパク質を溶出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール）で溶出させた。標本は４‐１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルにロードし、タンパク質のバンドはクマシブルー（Coomassie Blue）染色で確認した。
【０１２１】
実施例１４：組織分析
脳試料は４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに封入して、４μｍ厚さの切片に切断した。切片はキシレンで脱パラフィン化させた後、Ｈ＆Ｅで染色した。
【０１２２】
ＶＳＶを検出するために、脳切片をキシレンで脱パラフィン化させてクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）でマイクロ波を加え、抗原を回収した。ＶＳＶ‐Ｇ抗体（ラビット、１：２００）で染色して後、切片をＡｌｅｘａ４８８結合抗ラビットＩｇＧ（１：２５０）とインキュベーションした後、ＤＡＰＩ染色を行った。
【０１２３】
蛍光画像は、Ｎｉｋｏｎ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（C2plus, Tokyo, Japan）でキャプチャし、ＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Nikon）を用いて作業した。
【０１２４】
実施例１５：コンフォーカル顕微鏡
ＨｅＬａ細胞は、８ウェルプレート（Labtek）に接種した。ウイルスを感染させた後、感染された細胞を室温で２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定させた。 ＭＳＣ複合体の鮮明な画像を得るために、氷の上で１０分間、２５μg/ｍｌのジギトニンと一緒に細胞をインキュベーションした。−２０℃で２０分間、１００％ＭｅＯＨで透過処理した後、室温で１時間２％ＢＳＡを含有したＰＢＳで細胞をブロッキングさせた。次に、細胞をＰＢＳ‐Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄し、４℃で適切な１次抗体と一緒に一晩インキュベーションした。次に、３回洗浄し、適切な２次抗体と室温で１時間インキュベーションした。次に、細胞を室温で１０分間ＤＡＰＩで染色し、ＰＢＳ‐Ｔで３回洗浄した後、マウント溶液で封入した。画像は Ｎｉｋｏｎ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（C2plus）にＮＩＳ‐Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを用いて分析した。ピアソン相関係数に基づいたＣｏ‐ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ指数はソフトウェアツールで計算した。
【０１２５】
実施例１６：ＥＰＲＳのリン酸化位置及び相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）を究明するための質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４時間Ｓｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳプラスミドで形質転換させ、６時間ＰＲ８‐ＧＦＰ（ＭＯＩ=５）に感染させた。感染された細胞はタンパク質分解酵素阻害剤及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche）を含む溶解バッファー（２０ ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％‐ＮＰ４０、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で回収し、４℃でＳｔｒｅｐ‐Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｒｅｓｉｎ（IBA）で一晩インキュベーションした。次に、レジンを溶解バッファーで５回洗浄し、結合されたタンパク質を溶出バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２．５ｍＭデスチオビオチン（desthiobiotin）で溶出させた。最後に、溶出された画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐４（１０Ｋ ＭＷＣＯ）遠心分離装置（Millipore）で濃縮した。前記試料はＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びＳｉｌｖｅｒ染色で分析した。次に、染色されたタンパク質のバンドを切ってゲル上でトリプシンで分解した。前記トリプシン分解ペプチドを回収してＥｋｓｉｇｅｎｔ ＭＤＬＣシステムに結合されたｒｅｖeｒｓｅｄ-ｐｈａｓｅ Ｍａｇｉｃ １８ａｑ（５μＭ、２００A、Michrom BioResourecs）カラム（１５ cm×７５μＭ、packed in-house）にロードした。前記ペプチドを、４０分間５‐４０％アセトニトリル含有酸性水（０．１％ギ酸）で直線勾配し、３００ｎＬ/分の流速で溶出させた。 ＨＰＬＣシステムは、ＬＴＱ ＸＬ‐Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Thermo Scientific）に結合させた。
【０１２６】
前駆体選別及びペプチド荷電量を確認するために、１００，０００の解像度でＳｕｒｖｅｙ ｆｕｌｌ-ｓｃａｎ ＭＳ ｓｐｅｃｔｒａ（３００‐２，０００ｍ/ｚ）を獲得した。イオン化パラメータのソースは以下の通りである：噴霧電圧（spray voltage）、１．９ ｋＶ；キャピラリー温度（capillary temperature）、２５０℃。
【０１２７】
ＭＳ１のスキャンで２以上の電荷状態で最も強いイオンのＭＳ/ＭＳｓｐｅｃｔｒａは、以下のオプションを用いて得た：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｄｔｈ、２．０ｍ/ｚ；ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｙ、３５％；ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｄｕｒａｔｉｏｎ、３０ s。生データは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４（Thermo Scientific）のＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズム及びＭＡＳＣＯＴサーチエンジン（v. 2.3.01; Matrix Science）を用いて求めた。ヒトＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２０１３．０７公開）は次のパラメータを用いて求めた。全体トリプシン分解ペプチドの切断特異性（full tryptic peptide cleavage specificity）、２つの誤った切断（two missed cleavages）、ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌシステインの固定された変形（＋５７．０２１Ｄａ）、酸化されたメチオニンのさまざまな変形（＋１５．９９５Ｄａ）、及びリン酸化されたセリン、スレオニン、及びチロシン（＋７９．９７９９Ｄａ）。
【０１２８】
実施例１７：生体内及び試験管内ユビキチン化の分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＭＡＶＳ-ＦＬＡＧ、ＩＴＣＨ-Ｖ５、ＧＳＴ-ＰＣＢＰ２及びＳｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳプラスミドのさまざまな組み合わせで形質転換した。２４時間後、細胞を１０μＭＭＧ‐１３２で６時間処理してＲＩＰＡバッファーで溶解した後、４℃で６時間ａｎｔｉ‐ＦＬＡＧ親和性ゲルで免疫沈降反応を実施した。内因的ＭＡＶＳのユビキチン化を見るために、細胞溶解物をａｎｔｉ‐ＭＡＶＳ抗体と一緒に一晩インキュベーションし、４℃で３時間ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ/Ｇ ＰＬＵＳアガロースビーズとインキュベーションさせた。次に、免疫複合体を溶解バッファーで５回洗浄し、１０分間ＳＤＳサンプルバッファーで加熱した。ユビキチン化は、ａｎｔｉ‐Ｕｂあるいはａｎｔｉ‐Ｋ４８抗体を用いて分析した。試験管内ユビキチン分析のために、Ｓｔｒｅｐ-ＭＡＶＳ、Ｓｔｒｅｐ-ＰＣＢＰ２及びＳｔｒｅｐ‐ＥＰＲＳタンパク質を各プラスミドで形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔの溶解物で沈殿させた。ＩＴＣＨ‐Ｖ５タンパク質はａｎｔｉ‐Ｖ５抗体と溶解物をインキュベーションして準備し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ/Ｇ ＰＬＵＳアガロースビーズと一緒にインキュベーションした。精製されたタンパク質は、Ｍｇ２＋‐ＡＴＰを含有する反応バッファーでＵｂｉｑｕｉｔｉｎ、Ｅ１及びＵｂｃＨ５ｂのＥ２（Boston Biochem）と一緒に３７℃で１時間インキュベーションした。この反応は、1 ｍＭ ＤＴＴを含有するＳＤＳサンプルバッファーを添加して１０分間加熱することで終結し、ユビキチン化はａｎｔｉ‐Ｕｂ抗体で感知した。
【０１２９】
実施例１８：ペプチドの設計及び合成
ＥＰＲＳＬ１（ａａ１６８‐１９６）を細胞透過性ＨＩＶ‐１ ＴＡＴペプチド（ａａ４７‐５７、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号６０）と融合させた。融合ペプチドは、（Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ）を合成した後、逆相ＨＰＬＣ（AbClon）で９３％以上の精製をした。Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ配列はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ‐ＧＧ‐ＤＶＳＴＴＫＡＲＶＡＰＥＫＫＱＤＶＧＫＦＶＥＬＰＧＡＥＭＧ（配列番号６１）である。ＴＡＴ潜伏ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（配列番号６０）は、コントロールペプチドとして用い、凍結乾燥されたペプチドは−８０℃で乾燥剤と保管して使用前にＰＢＳで溶解させた。
【０１３０】
実施例１９：細胞毒性の分析
ＨＥＫ２９３ＴあるいはＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレート（１０，０００ ｐｅｒ ｗｅｌｌ）に接種し、０‐２４時間Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ（２０‐２００μＭ）を処理した。次に、ＭＴＳ [３‐（４,５-ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ‐２‐ｙｌ）‐５‐（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）‐２‐（４‐ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）‐２Ｈ‐ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ]（Promega）を用いて比色分析法で細胞毒性を確認した。ＭＴＳ ２０μlを３７℃で１時間、各ウェルに添加した。Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（BioTek）を用いて光学密度４９０ｎｍで測定し、６３０ｎｍのバックグラウンド吸光度を各サンプルｒｅａｄｉｎｇから差し引いた。
【０１３１】
実施例２０：設計されたペプチドを用いた動物実験
Ｃ５７ＢＬ/６マウス（雌、７週齢）をゴアテック（平沢、韓国）から購入し、ＶＳＶインディアナ（２×１０８ｐｆｕ/マウス）を静脈内投与して感染させた。２４時間後、Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ（２.５ｍｇ/ｋｇ[０．５３μＭ/ｋｇまたは５ｍｇ/ｋｇ [１．０５μＭ/ｋｇ]）を３日間毎日マウスに腹腔内投与した。Ｔａｔ ＰＴＤペプチド（１．６５ｍｇ/ｋｇ [１．０５μＭ/ｋｇ]）を対照群として用いた。４日目に、マウスから脳組織を回収した。回収した標本をＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ機器（Qiagen）を用いてすぐに均質化させ、前述した方法でウイルス力価を測定した。
【０１３２】
実施例２１：統計分析
統計分析は、Ｐｒｉｓｍ（Version 6.0, GraphPad Software）を用いて行った。データは、スチューデントのt検定 （Student's unpaired t-test） 、 ログランク検定（log-ＲＮＡk test）またはノンパラメトリック Ｍａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（non-parametric Mann-Whitney test） を適切に利用して分析した。データの標準化は、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ‐Ｓｍｉｒｎｏｖ ｔｅｓｔを用いて評価した。データは言及しない限り、平均値±ＳＤで示し、すべての実験は少なくとも３回繰り返した。分析に基づいて* <０．０５、** <０．０１、または*** <０．００１のＰ値を有意とした。
【０１３３】
実験例1：ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）の抗ウイルス能の確認
ＡＲＳ（Aminoacyl-tRNA synthetases）は、複数の非翻訳細胞プロセスで重要な役割をするが、ウイルス感染においてこれらの役割はほとんど報告されてない。したがって、本発明者らは、インフルエンザＡウイルスに感染されたヒト気管支上皮細胞でＭＳＣ（Multi-tRNA synthetase complex）の構成要素をコードする遺伝子の発現パターンを調査するために、ＲＮＡシーケンスを用いて、グローバル転写体分析を実施した。これにより、前記遺伝子の非均一的な発現及び一時的な変動を観察し、これはウイルス感染に反応したときに、前記遺伝子が任意の役割をするということを示唆する（図１）。
【０１３４】
次に、本発明者らは、抗ウイルス反応を誘発する可能性があるＭＳＣタンパク質を調査し、ＥＰＲＳ（glutamyl-prolyl-tRNA synthetase）が相当な水準でＩＦＮ‐βプロモーター活性を誘導することを確認した（図２）。さらに、ウイルスが感染されたさまざまな細胞株でＥＰＲＳ ｍＲＮＡ発現が徐々に誘導されることを確認した（図３）。また、ＲＡＷ２６４．７細胞株でｓｉＲＮＡを用いてＥＰＲＳをノックダウンさせた場合（図４）、ＲＮＡウイルス（ＰＲ８インフルエンザＡウイルス及び水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus、ＶＳＶ）の複製が増加されたが（図５及び図６）、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）（ＤＮＡウイルス）は複製に影響を受けないことを確認した（図７）。ＥＰＲＳノックダウン細胞は、ウイルス感染または合成ｄｓＲＮＡｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理について、抗ウイルス性サイトカイン（ＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６）の生産が大幅に減少した（図８及び図９）。ただし、ＨＳＶはサイトカイン誘導を大きく変化させなかった（図８及び図９）。ＥＰＲＳノックダウンＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（図１０〜図１２）及びｓｈＲＮＡを用いて安定的にＥＰＲＳをノックダウンさせたＲＡＷ２６４．７細胞株（図１３〜図１９）でもこれと同等の結果を確認した。さらに、ＥＰＲＳノックダウン細胞でＩＦＮ関連シグナル伝達分子であるＩＲＦ３及びＳＴＡＴ１の活性化が著しく減少した（図２０）。一方、ＥＰＲＳを安定的に過発現させたＲＡＷ２６４．７細胞（図２１）では、ＰＲ８（図２２〜図２４）またはＶＳＶ（図２５〜図２７）感染によりウイルスの複製が大幅に減少し、ＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６生産は増加した。
【０１３５】
総合すると、前記データは、ＥＰＲＳが特にＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス先天性免疫反応を陽性調節することを実証するものである。
【０１３６】
実験例２：ウイルス感染のＥＰＲＳに対する生体内防御反応の確認
本発明者らは、ＥＰＲＳの同型欠損（homozygous deletion）マウスは、離乳前段階（pre-weaning stage）で死ぬため、異形ＥＰＲＳ+/-マウスを用いて、抗ウイルス免疫反応でのＥＰＲＳの生理学的役割を調査した。ＰＲ８またはＶＳＶに感染された野生型（ＷＴ、ＥＰＲＳ+/+）及びＥＰＲＳ+/-マウスから分離されたＢＭＤＭ（bone marrow-derived macrophage）を調査したとき、ＥＰＲＳ+/-ＢＭＤＭでのウイルス力価はＷＴ ＢＭＤＭよりもはるかに高かった（図２８）。これと共に、ウイルス感染（図２９）及びｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理（図３０）に対し、ＥＰＲＳ+/- ＢＭＤＭでＩＦＮ‐β及びＩＬ‐６の生産レベルはＥＰＲＳ+/＋細胞に比べて著しく低いことを確認した。ｓｉＲＮＡで形質転換したＥＰＲＳ欠乏ＢＭＤＭを用いた場合にも同様の結果を確認した（図３１〜図３４）。さらに、ＩＦＮ‐βのレベル、抗ウイルス性ＩＦＮ関連遺伝子の発現、及び炎症関連遺伝子の発現も、ＶＳＶに感染されたＥＰＲＳ+/+細胞より、ＶＳＶに感染されたＥＰＲＳ+/- ＢＭＤＭで顕著に減少した（図３５）。ＥＰＲＳノックダウンＲＡＷ２６４．７細胞のＰＲ８感染に対する抗ウイルス性遺伝子の誘導も対照群細胞に比べて大幅に減少した（図３６）。対照的に、ＨＳＶに感染されたＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/- ＢＭＤＭの間では、ウイルス複製またはサイトカインの分泌に有意な差はなかった（図３７及び図３８）。
【０１３７】
次に、ＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウスにＶＳＶインディアナ菌株を静脈投与し、それらの生存を毎日観察した。ＥＰＲＳ+/-マウスは、４３％（６/１４）が感染６日以内に死亡したが、ＥＰＲＳ+/+マウスは、わずか７％（１/１５）のみ死ぬことを確認した（図３９）。マウス組織におけるウイルス量を確認するために、ウイルス感染の５日目にマウスの脳と脾臓を回収して分析した。ＥＰＲＳ+/-マウスの脳及び脾臓におけるウイルス力価はＥＰＲＳ+/+マウスに比べて大幅に高かったが（図４０及び図４１）、これはＥＰＲＳ+/-マウスがＶＳＶ感染にさらに感受性を有することを意味する。
【０１３８】
次に、免疫反応におけるＥＰＲＳの機能的重要性をさらに確認するために、組換えＶＳＶ‐ＧＦＰをＥＰＲＳ+/+及びＥＰＲＳ+/-マウスに静脈投与し、感染１２時間後の血清標本でウイルス量及び抗ウイルス性サイトカインレベルを測定した。その結果、ウイルス血症（viremia）は高く（図４２）、血清中のＩＦＮ‐β、ＩＦＮ‐α、及びＩＬ‐６レベルは低いことを確認した（図４３）。
【０１３９】
最後に、感染０〜５日目に脳組織標本を収集し、ＶＳＶによって誘導された組織学的特徴を調べた。Ｈ＆Ｅ（hematoxylin-eosin）で染色されたＥＰＲＳ+/-マウスの脳切片では、ＥＰＲＳ+/+マウスに比べて炎症性細胞の浸透が著しく多く観察（特に、側脳室領域の周辺）された（図４４）。さらに、脳組織切片を抗ＶＳＶ‐Ｇ抗体で染色した免疫組織化学分析で、炎症の周辺位置で感染されたウイルスの存在を確認し、ＥＰＲＳ+/+マウスに比べてＥＰＲＳ+/-マウスからのウイルス除去はゆっくり進行された（図４５）。
【０１４０】
総合すると、前記結果は、ＥＰＲＳがウイルス感染に対してマウス細胞内先天性免疫反応に関連していることを証明するものである。
【０１４１】
実験例３：抗ウイルス活性に対するＥＰＲＳの感染 - 特異的変形
従来の研究結果では、リン酸化などの翻訳後の変形過程がＭＳＣからＡＲＳを放出させ、その後の下流有効分子との相互作用及び非正規（non-canonical）機能の活性に重要な役割をすることが報告された。例えば、ＥＰＲＳのＳｅｒ８８６及びＳｅｒ９９９のＩＦＮ‐γ依存的な順次的リン酸化は、ＭＳＣからＥＰＲＳを放出させ、ＧＡＩＴ複合体の形成を誘導する。ウイルス感染に対するＥＰＲＳの機能を評価するために、本発明者らはＩＦＮ‐γ活性と関連してＥＰＲＳの研究に主に使用される細胞株であるヒトのマクロファージ類似Ｕ９３７細胞をＰＲ８ウイルスに感染させた。その結果、ウイルス感染によってＫＲＳ及びＡＩＭＰ３とＥＰＲＳの相互作用が著しく減少したことを確認したが、これはＭＳＣからＥＰＲＳが分離されたことを意味するものである（図４６）。ＥＰＲＳのＳｅｒ８８６のリン酸化を介してＥＰＲＳに直接結合する前駆ＧＡＩＴ複合体の構成要素であるＮＳＡＰ１に対する抗体を用いた免疫ブロット分析では、２４時間後にＥＰＲＳがＮＳＡＰ１に弱く結合することを確認した。しかし、ＥＰＲＳは機能的複合体の形成のためにＥＰＲＳＳｅｒ９９９位置のリン酸化に必要なＧＡＩＴ複合体の構成成分であるＧＡＰＤＨには結合しなかった（図４６）。
【０１４２】
次に、ＰＲ８に感染されたＲＡＷ２６４．７マクロファージ溶解物を抗ＥＰＲＳまたは抗ＫＲＳ抗体と共同免疫沈降（ｃｏ‐ＩＰ）させ、ウイルスによってＭＳＣからＥＰＲＳの放出が誘発されるかどうかを確認した（図４７及び図４８）。コンフォーカル顕微鏡の分析もＥＰＲＳがＫＲＳと同じ位置に存在することを示したが、ウイルス感染によって同じ位置に存在するシグナルが減少することを確認した（図４９〜図５１）。前記結果は、ＥＰＲＳ活性と関連する明確なウイルス特異的作用の機序が存在することを意味する。
【０１４３】
ＥＰＲＳ活性の作用機序及びその抗ウイルス反応での役割を解明するために、本発明者らは次のように質量分析ベースのタンパク質分析アプローチを用いて、ＳｔｒｅｐタグＥＰＲＳを異所性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞における特異的な翻訳後の変異を確認しようとした（図５２）。非感染及び感染細胞の両方でＳｅｒ８８６のリン酸化が検出されたのに対し、Ｓｅｒ９９９（ＩＦＮ‐γ刺激に対してリン酸化された）では、すべての条件で変形されないことを確認した（図５３〜図５５）。予想とは異なり、ウイルス感染はＥＰＲＳのＳｅｒ９９０のリン酸化を誘導した（図５６及び図５７）。前記結果を確認するために、抗原としてリン酸ペプチド９８３ＤＧＱＲＫＤＰ（ｐ）ＳＫＮＱＧＧＧ９９６（配列番号６２）を用いて、この位置に対するラビット多クローン抗体を製造した。ＥＰＲＳＳｅｒ９９０位置のリン酸化は、Ｕ９３７細胞にＰＲ８が感染された後に徐々に増加した（図５８）。一方、ＩＦＮ‐γ処理は、Ｓｅｒ９９０のリン酸化を誘導しなかった（図５８）。他のウイルスまたは合成ＲＮＡを処理した細胞でも同様の結果を観察することができた（図５９〜図６２）。
【０１４４】
また、本発明者らは非感染細胞で、ＩＦＮ‐γで刺激した後に観察されたものよりは弱く増加するが、ＰＲ８感染によって増加するＳｅｒ８８６のリン酸化が低レベルで検出されることを確認した（図６３）。ウイルス感染は、Ｓｅｒ９９９のリン酸化を誘導しないが、ＩＦＮ‐γ刺激は明らかにＳｅｒ９９９のリン酸化を誘導した（図６４）。さらに、ウイルス感染は、ＩＦＮ‐γの分泌またはＧＡＩＴ複合体の標的であるＣｐの発現抑制に影響を与えなかった（図６５〜図６７）。異所性に発現されたＥＰＲＳのリン酸化模倣（phosphomimetics）を活用した従来の研究結果では、Ｓｅｒ８８６及びＳｅｒ９９９のリン酸化がＭＳＣからＥＰＲＳの放出を誘導すると報告されている。特に、ＳｔｒｅｐタグＥＰＲＳモノリン酸化模倣、Ｓ９９０ＤはＭＳＣの構成要素であるＫＲＳ、ＡＩＭＰ３及びＭＲＳとの相互作用が欠如され、ＭＳＣから誘導性により放出された（図６８）。
【０１４５】
総合すると、前記結果は、ウイルスによって誘導されるＥＰＲＳ Ｓｅｒ９９０のリン酸化がＭＳＣからＥＰＲＳの放出を誘導して、ＩＦＮ‐γによって活性化されるＧＡＩＴ翻訳沈黙経路での役割とは区別される機能を果たすことを意味する。
【０１４６】
実験例４：ＥＰＲＳ及びＰＣＢＰ２の相互作用の確認
ウイルスが細胞内に入ると、細胞内のセンサーであるＲＩＧ‐Ｉが活性化される。次に、ＲＩＧ‐ＩはＭＡＶＳと相互作用してＩ型ＩＦＮの生産で終わるシグナル伝達カスケードを誘発することになる。前記シグナル伝達カスケードを分析した結果、ＥＰＲＳは容量依存的方式でＲＩＧ‐Ｉ‐、ＭＤＡ５‐、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）‐ 、及びＭＡＶＳ媒介ＩＦＮ‐βプロモーターの活性を増加させることを確認した（図６９ ）。しかし、ＴＲＡＦ３、ＴＢＫ１、またはＩＲＦ７の存在下ではＩＦＮ‐βプロモーターの有意な活性は観察されなかった（図７０）。前記結果は、ＥＰＲＳがＩ型ＩＦＮ経路の陽性調節者として、ＭＡＶＳの下流及びＴＲＦ３シグナル伝達軸の上流に作用することを意味する。
【０１４７】
ウイルスに感染される間、ＭＡＶＳのシグナル伝達を調節するＥＰＲＳ相互作用分子を究明するために、ＰＲ８に感染された細胞から分離されたＳｔｒｅｐＥＰＲＳに特異的な複合体を用いて、タンパク質の分析を行った（図７１）。その結果、ＭＳＣタンパク質は存在したが、ＧＡＩＴタンパク質（ＮＳＡＰ、ＧＡＰＤＨ及びＬ１３ａ）は存在しなかった。特に、ＥＰＲＳは、ウイルス感染時にＭＡＶＳのユビキチン化及び分解を誘発することが知られているＰＣＢＰ２と相互作用した。内因的共同ＩＰ分析を通じ、ＲＡＷ２６４．７及びＵ９３７細胞におけるウイルスで誘導されたＥＰＲＳ及びＰＣＢＰ２の相互作用を確認し、前記２つのタンパク質の相互作用は時間に応じて増加した（図７２及び図７３）。さらに、既存の研究結果からも報告されているように、ＰＣＢＰ２はウイルス感染時に核から細胞質に移動して、ＥＰＲＳと同じ位置に存在することを確認した（図７４）。
【０１４８】
次に、ＰＣＢＰ２と相互作用するＥＰＲＳ領域を究明するために、さまざまなＥＰＲＳドメインを含むプラスミドコンストラクトを製造した（図７５）。ＥＰＲＳの全長アミノ酸配列は、配列番号６３で示される１５１２個の配列である。その次に共同ＩＰを実行して、各ＥＰＲＳ領域及びＰＣＢＰ２の相互作用を確認した。その結果、ＧＳＴ様ドメイン及びリンカー領域Ｌ１（ａａ１‐１９６）を含有するＥＰＲＳのＮ‐末端領域がＰＣＢＰ２との相互作用に決定的であり、前記領域は全長ＥＰＲＳによって誘導されるものと同様のレベルでＩＦＮ‐βプロモーターの活性を誘導することを確認した。しかし、ＧＳＴ様ドメイン単独（ａａ１‐１６８）としては、抗ウイルス活性を誘導しなかった（図７５〜図７９）。前記結果は、ＧＳＴ様ドメイン及びＥＲＳ間のＬ１領域（ａａ１６８‐１９６）がＰＣＢＰ２との相互作用及び抗ウイルス反応に必須であるということを意味する。本発明者らは、Ｌ１欠損変異がＰＣＢＰ２と相互作用せず、ＩＦＮ‐βを誘導する能力が減少することを確認して、Ｌ１領域（ａａ１６８−１９６）及びＬ１領域を含む断片（ａａ １６８‐２６９）が抗ウイルス効果を有することを確認した（図８０及び図８１）。
【０１４９】
一方、本発明者らは、ＰＣＢＰ２のリンカー領域ではなく、Ｎ‐末端のＫＨ１ドメイン（ａａ１-８１）がＥＰＲＳ結合に十分であることを確認した（図８２及び図８３）。試験管内沈降分析を通じ、ＰＣＢＰ２ＫＨ１はＥＰＲＳのＧＳＴ及びＬ１領域と特異的に相互作用し、ＧＳＴ様領域単独（ａａ１-１６８）としては、相互作用しないことを確認した（図８４〜図８６）。総合すると、前記のデータは、Ｓｅｒ９９０のリン酸化に誘導されたＭＳＣからのＥＰＲＳの放出は、そのＰＣＢＰ２との相互作用を促進し、これにより、ＭＡＶＳのシグナル伝達を調節することできることを示唆する。
【０１５０】
実験例５：ＭＡＶＳのＰＣＢＰ２媒介ユビキチン化に対するＥＰＲＳの保護効果の確認
ＰＣＢＰ２は、ウイルス感染によって誘導されてＭＡＶＳと相互作用することにより、プロテアソーム分解でＭＡＶＳユビキチン化を引き起こすことが報告された。したがって、本発明者らは、ＥＰＲＳがＰＣＢＰ２媒介ユビキチン化を防いでＭＡＶＳを保護するという仮説を立てた。そこで、ＰＣＢＰ２とＭＡＶＳの相互作用を再評価し、ＭＡＶＳがＥＰＲＳに結合するドメインであるＰＣＢＰ２ ＫＨ１ドメインと特異的に相互作用することを確認した（図８７〜図９０）。ＥＰＲＳとＭＡＶＳが同じＫＨ１ドメインを標的とすることは、ＥＰＲＳがＭＡＶＳと競争的に作用してＭＡＶＳとＰＣＢＰ２との相互作用を防ぐことができるということを示唆する。
【０１５１】
実際に、ＰＣＢＰ２とＭＡＶＳの相互作用は、ＥＰＲＳ存在下に顕著に減少した（図９１）。しかし、ＥＰＲＳはＰＣＢＰ２がＩＴＣＨ Ｅ３リガーゼ（ligase）に結合することを妨げはしなかったが（図９２）、これはＥＰＲＳはＭＡＶＳがＰＣＢＰ２ ＫＨ１に結合することを特異的に競争的に作用することを意味する。前記結果は、ＰＲ８感染後にＭＡＶＳに結合するＰＣＢＰ２が徐々に減少するが、ＭＡＶＳとＥＰＲＳの相互作用は著しく増加することを示す内因性相互作用の分析を介して確認されたものである。これらの結果は、ウイルスに感染した細胞でＥＰＲＳはＰＣＢＰ２がＭＡＶＳに内因的に結合するのに妨害する役割をすることを意味する（図９３）。
【０１５２】
ＰＣＢＰ２はＩＴＣＨＥ３リガーゼを引き込んでＭＡＶＳのユビキチン（Ｕｂ） 媒介分解を促進させる。したがって、本発明者らは、２９３Ｔ細胞で外因的に発現されるＭＡＶＳ‐ＦＬＡＧがＩＴＣＨによってユビキチン化され、ＰＣＢＰ２の添加により前記反応が著しく増加することを確認した（図９４）。しかし、ＥＰＲＳは容量依存的にＰＣＢＰ２媒介ＭＡＶＳのユビキチン化を抑制した（図９４）。同様に、ＰＣＢＰ２によって内因的ＭＡＶＳのユビキチン化は著しく向上したが、ＥＰＲＳの存在下では大幅に減少することを確認した（図９５）。前記ユビキチン化分析の結果と同様に、外因性（図９６）及び内因性（図９７）ＭＡＶＳは、ＰＣＢＰ２によって分解されたが、ＥＰＲＳの添加により回復されることを確認した。
【０１５３】
最後に、精製されたＥＰＲＳを再構成された無細胞（cell-free）システムに添加した結果、ＰＣＢＰ２誘導ＭＡＶＳのユビキチン化が著しく減少することを確認した（図９８）。したがって、ＥＰＲＳはＭＡＶＳのＰＣＢＰ２媒介の陰性調節を特異的に防ぎ、強力な抗ウイルス免疫反応を維持させることができる。
【０１５４】
実験例６：ＥＰＲＳ由来ペプチドの抗ウイルス活性
実験例６‐１：Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐの試験管内及び生体内の抗ウイルス活性
今まで、本発明者らは、抗ウイルス免疫反応でＥＰＲＳがＭＡＶＳのＰＣＢＰ２媒介分解を抑制し、特にＥＰＲＳ Ｌ１領域（ａａ１６８‐１９６）がＰＣＢＰ２の相互作用に必須であり、抗ウイルスＩ型ＩＦＮのシグナル伝達を向上させる役割をすることを確認した。そこで、次に、本発明者らはＨＩＶ‐１ Ｔａｔタンパク質変換ドメイン（transduction domain）とＥＰＲＳ Ｌ１ペプチドを融合した細胞透過性ペプチド（以下、「Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ」と命名、配列番号６１）を製造し、その抗ウイルス活性を調べた。Ｔａｔ‐ＥｐｅｐはＰＣＢＰ２媒介の内因性ＭＡＶＳユビキチン化を抑制させ（図９９）、ＭＡＶＳの細胞内レベルを回復させた（図１００）。Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐは、また、ウイルス感染細胞でＩＦＮ‐β、及びＩＬ‐６の産生を増加させ（図１０１）、ＲＡＷ２６４．７細胞で容量依存的にＶＳＶ複製を減少させた（図１０２及び図１０３）。しかし、Ｔａｔ‐ＥｐｅｐはＨＳＶに感染されたＲＡＷ２６４．７細胞で抗ウイルス活性を示さなかったが（図１０４〜図１０６）、これはＴａｔ‐ＥｐｅｐがＲＮＡウイルス感染に特異的であることを意味する。Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐは、テストした濃度の範囲でＲＡＷ２６４．７または２９３Ｔ細胞の生存性に影響を及ぼさなかったが、これはウイルス力価の減少がペプチド媒介の細胞毒性によるものではないことを意味する（図１０７及び図１０８）。前記結果は、Ｔａｔ‐ＥｐｅｐがＭＡＶＳ生存性及びＩ型ＩＦＮの生産を増加させる抗ＲＮＡウイルス製剤として優れた効果があることを示唆する。
【０１５５】
生体内でＴａｔ‐Ｅｐｅｐの抗ウイルス効果をより調査するために、本発明者らは、マウスのＶＳＶインディアナ菌株を静脈投与した。投与後、ＴａｔまたはＴａｔ‐Ｅｐｅｐをマウス腹腔内に３日間毎日投与した。その結果、Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐを処理したマウスは、Ｔａｔタグを処理したマウスに比べて脳組織におけるウイルス力価が著しく減少した（図１０９）。前記データは、Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐが抗ＲＮＡウイルス製剤として優れた効果があることをさらに実証する。
【０１５６】
実験例６‐２：Ｎｅｗ Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐの試験管内及び生体内の抗ウイルス活性
本発明者らは、前記Ｔａｔ‐ＥｐｅｐのＥＰＲＳ Ｌ１ペプチド部分を２１マー（ａａ１６６‐１８６）にさらに限定して新規ペプチド（以下、「Ｎｅｗ Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ」と命名）を製造した。Ｎｅｗ Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ‐ＧＧ‐ＫＷＤＶＳＴＴＫＡＲＶＡＰＥＫＫＱＤＶＧＫ（配列番号６４）のアミノ酸配列を有する。これに対し、実施例６‐１と同様の方法でＶＳＶを静脈内投与したマウスに処理（ＴＡＴ対照群：１００μｇ、７匹；Ｎｅｗ Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐ：２００μｇ、３匹）した結果、Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐの場合と同様に、マウスの脳でＶＳＶウイルスの力価を減少させることを確認した（図１１０）。さらに、Ｎｅｗ Ｔａｔ‐ＥｐｅｐをＶＳＶ‐ＧＡＰウイルスに感染したＲＡＷ２６４．７細胞に処理したとき、抗ウイルスのサイトカインであるＩＦＮ‐β、及びＩＬ‐６の分泌をＴａｔ‐Ｅｐｅｐに比べて２〜３倍以上促進させることを確認した（図１１１〜図１１３）。前記結果を通じ、Ｎｅｗ Ｔａｔ‐Ｅｐｅｐも抗ＲＮＡウイルス製剤として優れた効果があることが分かった。
【０１５７】
これにより、ＥＰＲＳ Ｌ１（ａａ１６８‐１９６）でａａ１８７‐１９６の部分がない、ａａ１６８‐１８６の断片だけでも優れた抗ＲＮＡウイルス活性を有することが分かった。
【０１５８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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