(57)【要約】本発明は、患者がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を将来発現するかどうかを同定するための予測診断方法に関する。特に本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／測定する／定量する）；そして（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定する（すなわち、検出する）；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。本発明の他の側面は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／測定する／定量する）；その際、第１試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；（ｂ）その被験対象の第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／測定する／定量する）；その際、第２試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして（ｃ）療法の成功を予測する（すなわち、療法の成功の有無を検出する）；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を疾患の発症前に同定するための方法であって、
（ａ）被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；そして
（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定する；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる；
ことを含む方法。
【請求項２】
健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを疾患の発症前に同定する際に使用するための予測バイオマーカーとしてのｍｉＲ−１２２。
【請求項３】
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを、それぞれメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の臨床発現の少なくとも１年前に同定する、請求項１に記載の方法または請求項２の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項４】
方法またはバイオマーカーがメタボリックシンドロームを発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、リスク比が１．８〜４．６である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または請求項２もしくは３の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項５】
方法またはバイオマーカーが２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、リスク比が１．３〜６．４である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または請求項２もしくは３の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項６】
ｍｉＲ−１２２が下記のポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドである：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一でありかつ機能性であるポリヌクレオチド；その機能はｍｉＲ−１２２のターゲット遺伝子の翻訳を抑制する活性を含む；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）によるポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含むもの；
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または請求項２〜５のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項７】
方法またはバイオマーカーがメタボリックシンドロームを発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、健康な基準集団がメタボリックシンドロームを伴っておらず、下記の基準（ｉ）および（ｉｉ）のうちの少なくとも１つを満たす：
（ｉ）下記のものから選択されるいずれかの特徴をもたない：
（ａ）ウェスト周囲：男性≧１０２ｃｍまたは女性≧８８ｃｍ；
（ｂ）空腹時トリグリセリド値≧１５０ｍｇ／ｄｌ、または高トリグリセリドのための薬物治療中である；
（ｃ）ＨＤＬコレステロール：男性＜４０および女性＜５０ｍｇ／ｄｌ、または低いＨＤＬコレステロールのための薬物治療中である；
（ｄ）血圧≧１３０／≧８５ｍｍＨｇ、または抗高血圧症薬治療中であり、高血圧症の病歴をもつ；ならびに
（ｅ）空腹時血糖値≧１００ｍｇ／ｄｌ、または高血糖のための薬物治療中である；あるいは
（ｉｉ）集団健常値の３３パーセンタイルより低いｍｉＲ−１２２レベルをもたない；
請求項１〜４および６のいずれか１項に記載の方法または請求項２〜４および６のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項８】
方法またはバイオマーカーが２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、健康な基準集団が２型糖尿病を伴っておらず、集団健常値の３３パーセンタイルより低いｍｉＲ−１２２レベルをもたない、請求項１〜３、５および６のいずれか１項に記載の方法または請求項２、３、５および６のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項９】
健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量の少なくとも１１０％である被験対象のｍｉＲ−１２２がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法または請求項２〜８のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項１０】
さらに、被験対象が過体重、肥満、中心性肥満、高血圧、低いＨＤＬコレステロールレベルまたは高いトリグリセリドレベルから選択されるリスク因子のうち少なくとも１つを有するかどうかを同定することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法または請求項１〜１０のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項１１】
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有すると同定された被験対象にメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法を施すべきである；ならびに／あるいは
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有すると同定された被験対象にライフスタイル介入を推奨する；
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法または請求項２〜１０のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項１２】
試料が血液、血漿、血清、尿または肝臓組織試料である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ｍｉＲ−１２２の量を定量ＰＣＲにより分析する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法または請求項２〜１２のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【請求項１４】
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法であって、
（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第１試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；
（ｂ）その被験対象の第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第２試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして
（ｃ）療法の成功を予測する；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる；
ことを含む方法。
【請求項１５】
２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための、請求項１４に記載のモニタリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を将来発現するかどうかを同定するための予測診断方法に関する。特に本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／測定する／定量する）；そして（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定する（すなわち、検出する）；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。本発明の他の側面は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法であって、下記を含む方法に関する：（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／測定する／定量する）；その際、第１試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；（ｂ）その被験対象の第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／測定する／定量する）；その際、第２試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして（ｃ）療法の成功を予測する（すなわち、療法の成功の有無を検出する）；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）は肝臓におけるスモールノンコーディングＲＮＡの最大７０％を占め、脂質およびグルコースのホメオスタシス、ならびに肝臓インスリン抵抗性において中心的な役割を果たすと提唱されている(Fernandez-Hernando, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2013, 33: 178-85; Shantikumar, Cardiovascular Research 2012, 93: 583-93)。マウス(Esau, Cell Metab 2006, 3: 87-98; Kruetzfeldt, Nature 2005, 438: 685-9)および非ヒト霊長類(Elmen, Nature 2008, 452: 896-9; Lanford, Science 2010, 327: 198-201)からの証拠は、ｍｉＲ−１２２の阻害が脂肪酸酸化を誘導し、脂質合成を低減し、それによって総コレステロールレベルの低下をもたらすことを示した。ｍｉＲ−１２２は幾つかの疾患の診断に有用な可能性がある幾つかのバイオマーカーのひとつであることが示唆された(WO 2011/110644 A1)。抗−ｍｉＲ−１２２の使用が種々の疾患の療法のために示唆された(WO 2009/109665 A1)。さらに、高脂肪食誘発肥満症ラットにおいてプロアントシアニディディス(proanthocyanididis)が肝臓ｍｉｒＲ−１２２レベルを正常化したことが示された(Baselga-Escudero, Nutrition research 2015, 35: 337-345)。さらに、ｍｉＲ−１２２は非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎(steatohepatitis)およびウイルス性肝炎を含めた種々の肝疾患に応答して増加し、それはおそらく組織損傷を反映しているのであろう(Szabo, Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2013, 10: 542-52; Bandiera, J Hepatol 2015, 62: 448-57)。
【０００３】
実験による証拠はｍｉＲ−１２２が有害な代謝作用をもち、心血管代謝性疾患の発現に関与する可能性があることを示唆しているが、ヒトにおける循環ｍｉＲ−１２２の長期的関連性はほとんど分かっていない。ｍｉＲ−１２２と心血管代謝形質(cardiomatabolic trait)との関係についてのヒト集団における研究は少なく、著しい制限がある。これまでの研究は主要脂質クラスとの相関性に注目していた(Gao, Lipids Health Dis 2012, 11: 55)が、脂質亜種へのブレイクダウンは解決策を加え、ｍｉＲ−１２２による脂質ホメオスタシスの調節の解釈を改善するであろう。また、研究は横断的であり、あるいは追跡期間が短かったが、長期間の前向き研究はｍｉＲ−１２２と疾患発生との時間的関係の確立を可能にし、バイアスの範囲を低減し、より有効な推論をなすことができるであろう。
【０００４】
メタボリックシンドロームは、アテローム硬化性心血管疾患および２型糖尿病のリスクを直接増大させる相互に関連した一群の生理学、生化学、臨床および代謝因子により定義される。メタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の罹患率は、それぞれ約２５％（国際糖尿病連盟（International Diabetes Federation）)および約９％(WHO 2014)である。世界的に糖尿病患者の絶対数は３５年間で５倍増加してほぼ５００００万になった。食事の早期調節およびライフスタイル変更はこれらの疾患の発現および進行に対してかなりの効果をもつので、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病に対する素因を推定するためのバイオマーカーはきわめて重要である。
【０００５】
さらに、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病の発現後、患者の健康状態は適切な療法にかなり依存する。特に、選択した療法に患者が応答するかどうかの早期同定は回復の機会を増大させ、患者が無効な医薬の副作用を不必要に受けるのを防ぐ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2011/110644 A1
【特許文献２】WO 2009/109665 A1
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Fernandez-Hernando, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2013, 33: 178-85
【非特許文献２】Shantikumar, Cardiovascular Research 2012, 93: 583-93
【非特許文献３】Esau, Cell Metab 2006, 3: 87-98
【非特許文献４】Kruetzfeldt, Nature 2005, 438: 685-9
【非特許文献５】Elmen, Nature 2008, 452: 896-9
【非特許文献６】Lanford, Science 2010, 327: 198-201
【非特許文献７】Baselga-Escudero, Nutrition research 2015, 35: 337-345
【非特許文献８】Szabo, Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2013, 10: 542-52
【非特許文献９】Bandiera, J Hepatol 2015, 62: 448-57
【非特許文献１０】Gao, Lipids Health Dis 2012, 11: 55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、本発明の基礎となる技術的課題は、疾患（単数または複数）の発症前に、ライフスタイル介入が疾患（単数または複数）の発生および／または重症度を遅延または阻止できる時点および／または合併症を阻止できる時点で、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を早期診断するための手段および方法；ならびにメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この技術的課題は特許請求の範囲に明記される態様の提供により解決される。
したがって、本発明は、無症候対象においてメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の素因を同定するための診断方法に関する。特に、本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を疾患（単数または複数）の発症前に同定するための方法であって、下記を含む方法に関する：
（ａ）被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；そして
（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定する；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。
【００１０】
よって、前記の診断方法は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症前に、すなわち疾患（単数または複数）の臨床症状の発症前に、同定するために使用できる。たとえば、前記の診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の少なくとも１年前、たとえば少なくとも２年前、少なくとも３年前、少なくとも４年前、または少なくとも５年前に同定できる。たとえば、その診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の１０年前から疾患（単数または複数）の発症の直前（たとえば、１か月前）までに同定できる。好ましくは、その診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の７．５年前から疾患（単数または複数）の発症の直前（たとえば、１か月前）までに同定できる。より好ましくは、その診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の５年前から疾患（単数または複数）の発症の直前（たとえば、１か月前）までに同定できる。“疾患（単数または複数）の発症”は、疾患（単数または複数）の発生、すなわち疾患（単数または複数）、特にメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の臨床発現を意味する。好ましくは、本発明において提供する診断方法で循環ｍｉＲ−１２２の量を分析する。“循環ｍｉＲ−１２２”は、血液により輸送されているｍｉＲ−１２２、すなわち血液、血漿または血清中に存在するｍｉＲ−１２２である。よって、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病は、本発明において提供する診断方法によりメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクが同定された後、１０年以内、好ましくは７．５年以内、より好ましくは５年以内に発生する可能性がある。
【００１１】
以下および付随する例に記載するように、ｍｉＲ−１２２はメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病を発現するリスクを疾患（単数または複数）が発症するかなり前に同定する（すなわち診断する）ためのバイオマーカーであることが意外にも見出されたので、本発明は前記で確認した技術的課題を解決する。付随する実施例で、ｍｉＲ−１２２を８１０人の患者の血清試料において測定し（１９９５年）、５年後（２０００年）に６９５人の患者の血清および血漿試料において再検査した。さらに、この再検査においては患者がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現したかどうかを検査した。それらの結果は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病が発症する５年前の患者における強くかつ安定なｍｉＲ−１２２増加を確実に示す。よって、付随する実施例は、意外にもｍｉＲ−１２２レベルがメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の発現の長期リスクと関連することを立証する。したがって、本発明はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の発現について高い確率（すなわち、高いリスク）をもつ無症候対象を同定するための診断方法に関する。
【００１２】
先行技術において、ｍｉＲ−１２２はメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病を含めた幾つかの疾患との関連で言及されている(Rotllan, Cholesterol 2012: 1-8; Kaur, World Journal of Diabetes, 2011, 2: 158-163; および“Nutritional Intervention in Metabolic Syndrome”, edited by Isaias Dichi, Andrea Name Colado Simao, CRC press, 2016)。しかし、ｍｉＲ−１２２をメタボリックシンドロームまたは２型糖尿病について疾患発症前のバイオマーカーとして用いることは決して示唆されていない。しかし、これらの疾患の発現についてのリスクを疾患の発現前に検出することは、罹患した者が発生の阻止または疾患の重症度の低減のために彼らのライフスタイルを変更できる（たとえば、彼らのウェスト−ヒップ比(weight-to-hip ratio)を低減する）という利点をもつ。
【００１３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉｒ−）は種々の疾患における重要なレギュレーターおよび有望なバイオマーカーとして明らかになりつつある。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の翻訳後レギュレーターとして機能するスモールノンコーディングＲＮＡである。バイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡ（たとえば、ｍｉＲ−１２２）の使用は幾つかの利点をもつ。たとえば、ｍｉＲＮＡは細胞内および細胞外に存在し、体液中できわめて安定である。細胞外安定性のため、ｍｉＲＮＡの分析を複雑な全身性疾患の診断に使用できる。
【００１４】
ｍｉＲ−１２２は、臓器特異性をもちかつ血清および血漿において測定できるごく少数のｍｉＲＮＡのひとつである。よって、ｍｉＲ−１２２はルーティン理学的検査中に血液試料において容易に検出できる高特異性マーカーである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１：ブルーニコ試験(Bruneck Study)における血清ｍｉＲ−１２２レベルと脂質亜種レベルとの横断的相関性（Ａ）、およびマウスにおけるアンタゴｍｉＲ−１２２注射の結果（グループ当たりｎ＝５）：ノーザンブロッティングにより評価した肝臓ｍｉＲ−１２２の低減を含む（Ｂ）、リポタンパク質代謝を調節する他の肝臓ｍｉＲＮＡの発現にアンタゴｍｉＲ−１２２が及ぼす影響：ｍｉＲ−３３の低減を含む（Ｃ）、アンタゴｍｉＲ−１２２処置に際しての血清コレステロール濃度の低減（Ｄ）、ならびにコレステロールおよび脂質の代謝における関与が示唆されている遺伝子の発現（Ｅ）。
【図１−２】図１：ブルーニコ試験(Bruneck Study)における血清ｍｉＲ−１２２レベルと脂質亜種レベルとの横断的相関性（Ａ）、およびマウスにおけるアンタゴｍｉＲ−１２２注射の結果（グループ当たりｎ＝５）：ノーザンブロッティングにより評価した肝臓ｍｉＲ−１２２の低減を含む（Ｂ）、リポタンパク質代謝を調節する他の肝臓ｍｉＲＮＡの発現にアンタゴｍｉＲ−１２２が及ぼす影響：ｍｉＲ−３３の低減を含む（Ｃ）、アンタゴｍｉＲ−１２２処置に際しての血清コレステロール濃度の低減（Ｄ）、ならびにコレステロールおよび脂質の代謝における関与が示唆されている遺伝子の発現（Ｅ）。
【図１−３】図１：ブルーニコ試験(Bruneck Study)における血清ｍｉＲ−１２２レベルと脂質亜種レベルとの横断的相関性（Ａ）、およびマウスにおけるアンタゴｍｉＲ−１２２注射の結果（グループ当たりｎ＝５）：ノーザンブロッティングにより評価した肝臓ｍｉＲ−１２２の低減を含む（Ｂ）、リポタンパク質代謝を調節する他の肝臓ｍｉＲＮＡの発現にアンタゴｍｉＲ−１２２が及ぼす影響：ｍｉＲ−３３の低減を含む（Ｃ）、アンタゴｍｉＲ−１２２処置に際しての血清コレステロール濃度の低減（Ｄ）、ならびにコレステロールおよび脂質の代謝における関与が示唆されている遺伝子の発現（Ｅ）。
【図２】図２：アトルバスタチン(atorvastatin)による処置は、ＡＳＣＯＴ試験の参加者における総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、および血清ｍｉＲ−１２２における一致した低減（Ａ）、マウスにおける血清ｍｉＲ−１２２の低減（Ｂ）、ならびに初代肝細胞からのｍｉＲ−１２２分泌の低減（Ｃ）をもたらした。
【図３】図３：ブルーニコ試験における、血清ｍｉＲ−１２２レベルと、アポリポタンパク質および脂質代謝に関係する他の選択されたタンパク質の循環レベルとの相関性。
【図４】図４：ブルーニコ試験におけるｍｉＲ−１２２と心血管代謝性疾患罹患との関連性。
【図５】図５：循環中の肝臓ｍｉＲ−１２２のためのビヒクルとしてのエクソソーム。
【図６】図６：ブルーニコ試験におけるｍｉＲ−１２２の経時相関性および血清−対−血漿相関性。比較のためにマイクロＲＮＡ値を対数変換した。
【図７】図７：マウス肝臓においてアンタゴｍｉＲ−１２２注射がｍｉＲＮＡ発現に及ぼした結果を定量ＰＣＲにより評価したもの；図１と関連。データは平均（標準偏差）である。アンタゴｍｉＲ−１２２グループにおける相対的ｍｉＲ−１２２量は０．１３％±０．０６％（Ｐ＝６×１０−４）であった。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図８】図８：ブルーニコ試験における血清ｍｉＲ−１２２とタンパク質の循環レベルとの相関性。
【図９】図９：ブルーニコ試験における臨床関連サブグループにわたるｍｉＲ−１２２と心血管代謝性疾患との関連性。年齢、性、社会経済的状態、喫煙、身体活動および、アルコール摂取について調整した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
よって、本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを同定するための方法であって、下記を含む方法に関する：
（ａ）試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／定量する／測定する）；そして
（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを同定する（すなわち、検出する／決定する／評価する）；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較してその試料において増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。
【００１７】
本発明方法において、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクは被験対象（好ましくは、人類）において同定される（すなわち、診断される）。ｍｉＲ−１２２の量を分析する（すなわち、決定する／定量する／測定する）試料はその被験対象から得られる。
【００１８】
したがって、本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するための方法であって、下記を含む方法に関する：
（ａ）被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；そして
（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定する；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。
【００１９】
好ましくは、本明細書に記載した方法においては循環ｍｉＲ−１２２の量を分析する。
前記のように、本発明によれば、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを同定する（すなわち、診断する）ためのバイオマーカーとしてｍｉＲ−１２２、特に循環ｍｉＲ−１２２を使用できる。したがって、本発明は予測バイオマーカーを提供する。より具体的には、本発明はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの同定に使用するための予測バイオマーカーとしてのｍｉＲ−１２２を提供する；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較してその試料において増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。前記に述べたように、ｍｉＲ−１２２はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを疾患（単数または複数）の発症前に診断するために使用できるという利点をもつ。したがって、本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを疾患（単数または複数）の発症前に診断するのに使用するための予測バイオマーカーとしてのｍｉＲ−１２２に関する；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較してその試料において増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。本明細書に記載するバイオマーカーとして用いるｍｉＲ−１２２は好ましくは循環ｍｉＲ−１２２である。
【００２０】
患者がメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の両方の疾患を発症することはきわめて一般的である。通常はメタボリックシンドロームが最初に発現し、その後、同じ対象に２型糖尿病が発現する。しかし、時にはメタボリックシンドロームを伴う患者が既に２型糖尿病の基準を満たしている。逆に、ほとんどすべての２型糖尿病患者がメタボリックシンドロームの基準を満たしている。よって、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーは、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病のいずれかを発現するリスクを同定するために、あるいはメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の両方を発現するリスクを同定するために、使用できる。たとえば、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーは、２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を同定するために使用できる。あるいは、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーは、メタボリックシンドロームを発現するリスクを同定するために使用できる。
【００２１】
本発明において提供する診断方法で、あるいは本明細書に記載するバイオマーカーの使用により、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをこれらの臨床発現のかなり前に、たとえばメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の臨床発現の１０年前からその疾患の臨床発現までに同定できる。メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを、それぞれメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の臨床発現の少なくとも１年前に同定することが好ましい。たとえば、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーを用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の少なくとも１年前、少なくとも２年前、少なくとも３年前、少なくとも４年前、または少なくとも５年前に同定できる。したがって、この診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の１０年前から疾患（単数または複数）の発症の直前（たとえば、１か月前）までに同定できる。好ましくは、その診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の７．５年前から疾患（単数または複数）の発症の直前（たとえば、１か月前）までに同定できる。より好ましくは、その診断方法を用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を、疾患（単数または複数）の発症の５年前から疾患（単数または複数）の発症の直前（たとえば、１か月前）までに同定できる。よって、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病は、本発明において提供する診断方法によりまたは本発明において提供するバイオマーカーを用いてメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクが同定された後、１０年以内、好ましくは７．５年以内、より好ましくは５年以内に発生する可能性がある。
【００２２】
通常、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病のための薬物療法は疾患が診断されるまで開始されないであろう。よって、本発明において提供する診断方法を適用すると、または本明細書に記載するバイオマーカーを適用すると、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病のための薬物療法を受けていない被験対象において、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを同定することができる。
【００２３】
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の表明は標準診断基準に従って行なうことができる。たとえば、下記の５つの特徴のうちの３つが存在すればメタボリックシンドロームを診断することができる(Alberti, Circulation 2009, 120: 1640-5)：（ｉ）ウェスト周囲：男性≧１０２ｃｍまたは女性≧８８ｃｍ；（ｉｉ）空腹時トリグリセリド値≧１５０ｍｇ／ｄｌ、または高トリグリセリドのための薬物治療中である（たとえば、フィブレート類およびニコチン酸類で）；（ｉｉｉ）ＨＤＬコレステロール：男性＜４０および女性＜５０ｍｇ／ｄｌ、または低いＨＤＬコレステロールのための薬物治療中である（たとえば、フィブレート類およびニコチン酸類で）；（ｉｖ）血圧≧１３０／≧８５ｍｍＨｇ、または高血圧症の病歴をもつ患者において抗高血圧症薬治療中である；ならびに（ｖ）空腹時血糖値≧１００ｍｇ／ｄｌ、または高血糖のための薬物治療中である。２型糖尿病は１９９７年米国糖尿病学会基準(1997 American Diabetes Association criteria)、その最近の改定、ＷＨＯ基準その他に従って診断できる。
【００２４】
本発明において提供する手段および方法により検出できるメタボリックシンドロームまたは２型糖尿病を発現するリスクは、具体的なリスク比を提示することにより定量できる。これらのリスク比はｍｉＲ−１２２レベルと疾患発現の関連性の強さの尺度である。特に、付随する実施例は、増大したｍｉＲ−１２２レベルは約１．８〜４．６のリスク比でメタボリックシンドロームを発現するリスクの指標となることを示す。より具体的には、付随する実施例は、ｍｉＲ−１２２レベルの上３分の１（すなわち、＞６６パーセンタイル）をｍｉＲ−１２２レベルの下３分の１（すなわち、＜３３パーセンタイル）と比較して、１．８〜４．６がメタボリックシンドロームについてのリスク比の９５％信頼区間であることを示す。よって、メタボリックシンドロームについて、１．８〜４．６の範囲は９５％信頼区間である。これは、増大したｍｉＲ−１２２レベルとメタボリックシンドローム発現の間に“真の”関連性がある−  ９５％信頼度で  −範囲である。よって、本発明は、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関するものであって、その方法またはバイオマーカーはメタボリックシンドロームを発現するリスクをもつ対象を同定するためのものであり、その際、リスク比は１．８〜４．６である。
【００２５】
付随する実施例は、増大したｍｉＲ−１２２レベルが１．３〜６．４のリスク比で２型糖尿病を発現するリスクの指標となることも示す。この範囲１．３〜６．４は、ｍｉＲ−１２２レベルの上３分の１（すなわち、＞６６パーセンタイル）をｍｉＲ−１２２レベルの下３分の１（すなわち、＜３３パーセンタイル）と比較した、２型糖尿病についてのリスク比の９５％信頼区間である。よって、本発明は、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関するものであって、その方法または使用は２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を同定するためのものであり、その際、リスク比は１．３〜６．４である。
【００２６】
本発明に関して、リスク比は好ましくは年齢および性について調整されており、これはそれらが年齢または性がもつ可能性のある何らかの影響について補正されている（すなわち、増大したｍｉＲ−１２２レベルとメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の発現との関連性は年齢および性とは“無関係”である）ことを意味する。
【００２７】
本発明は本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関するものであり、その際、ｍｉＲ−１２２は下記のポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドである：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一でありかつ機能性であるポリヌクレオチド；その機能はｍｉＲ−１２２のターゲット遺伝子（たとえば、マウス遺伝子Ａｃａｃａ、Ａｃｌｙ、Ｆａｓｎ、Ｓｃｄ１、Ｓｒｅｂｆ１）の翻訳を抑制する活性を含む；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）によるポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含むもの。
【００２８】
前記の項目（ｉｉ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％、よりさらに好ましくは少なくとも９９％同一でありかつ機能性であるポリヌクレオチドを表わす；その機能はｍｉＲ−１２２のターゲット遺伝子（たとえば、マウス遺伝子Ａｃａｃａ、Ａｃｌｙ、Ｆａｓｎ、Ｓｃｄ１、Ｓｒｅｂｆ１）の翻訳を抑制する活性を含む。好ましくは、本発明に関して、ｍｉＲ−１２２は前記の（ｉ）または（ｉｉｉ）に記載したポリヌクレオチドである。より好ましくは、ｍｉＲ−１２２は前記の（ｉ）に記載したもの（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド）である。最も好ましくは、ｍｉＲ−１２２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２９】
ｍｉＲ−１２２は、それのターゲットｍＲＮＡの３’側非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合してそれによってそれらの翻訳を抑制することにより、またはｍＲＮＡ分解を誘導することにより、それの生物活性を発揮する(Huntzinger Nat Rev Genet 2011;12(2):99-110)。マウスにおいて、ｍｉＲ−１２２の阻害は未知のメカニズムによるターゲット遺伝子のアップレギュレーションをもたらし、こうして肝臓における脂質代謝を制御する。ｍｉＲ−１２２のターゲット遺伝子には、遺伝子Ａｃａｃａ、Ａｃｌｙ、Ｆａｓｎ、Ｓｃｄ１、Ｓｒｅｂｆ１（マウス遺伝子名）が含まれる(Tsai, J Clin Invest 2012; 122: 2884-97; Esau, Cell Metab 2006; 3: 87-98; Elmen, Nucleic Acids Res 2008; 36: 1153-62)。これらの遺伝子の（すなわち、マウス遺伝子Ａｃａｃａ、Ａｃｌｙ、Ｆａｓｎ、Ｓｃｄ１、Ｓｒｅｂｆ１の）発現分析を用いてｍｉＲ−１２２活性をアッセイすることができた。ｍｉＲ−１２２は、ＨＣＶ  ＲＮＡの５’−ＵＴＲを結合することによりＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製も増大させる(Roberts, Nucleic Acids Res 2011; 39: 7716-29)。ｍｉＲ−１２２の阻害はＨＣＶ  ＲＮＡレベルを低下させる(Janssen, N Engl J Med 2013; 368: 1685-94)。
【００３０】
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを同定するための本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーの使用において、健康な基準集団は好ましくは少なくとも２０の健康な対象（たとえば、２０〜１０００人の健康な人類）からなる。
【００３１】
本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーがメタボリックシンドロームを発現するリスクを同定するためのものであれば、健康な基準集団（それは好ましくは健康な人類からなる）はメタボリックシンドロームを伴わず、かつメタボリックシンドロームを発現するリスクをもたない。よって、本発明の一側面は本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関するものであって、その方法またはバイオマーカーはメタボリックシンドロームを発現するリスクをもつ対象を同定するためのものであり、健康な基準集団はメタボリックシンドロームを伴わず、かつ下記の基準（ｉ）および（ｉｉ）のうち少なくとも１つを満たす：
（ｉ）下記のものから選択されるいずれかの特徴をもたない：
（ａ）ウェスト周囲：男性≧１０２ｃｍまたは女性≧８８ｃｍ；
（ｂ）空腹時トリグリセリド値≧１５０ｍｇ／ｄｌ、または高トリグリセリドのための薬物治療中（たとえば、フィブレート類およびニコチン酸類による薬物治療中）である；
（ｃ）ＨＤＬコレステロール：男性＜４０および女性＜５０ｍｇ／ｄｌ、または低いＨＤＬコレステロールのための薬物治療中（たとえば、フィブレート類およびニコチン酸類による薬物治療中）である；
（ｄ）血圧≧１３０／≧８５ｍｍＨｇ、または抗高血圧症薬治療中であり、高血圧症の病歴をもつ；ならびに
（ｅ）空腹時血糖値≧１００ｍｇ／ｄｌ、または高血糖のための薬物治療中である；
（ｉｉ）集団健常値(population normative value)の３３パーセンタイルより低いｍｉＲ−１２２レベルをもたない；
集団健常値の３３パーセンタイル未満のｍｉＲ−１２２レベルは、集団においてｍｉＲ−１２２の量（すなわち、ｍｉＲ−１２２レベル）を測定してｍｉＲ−１２２分布を同定することにより決定できる。ｍｉＲ−１２２レベル分布を増大順に配置すると３３％の数値がこの数値より下にあり、残り（すなわち、６６％）がそれより上にある。その集団は少なくとも１００人の集団、たとえば１００〜１０００人のランダム集団であってもよい。
【００３２】
本発明に関して、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病を発現するリスクをもたない者は０．６５の中央ｍｉＲ−１２２値（四分位範囲(interquartile range)：０．３４〜１．１２）をもつことが見出された。
【００３３】
本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーが２型糖尿病を発現するリスクを同定するためのものであれば、健康な基準集団（それは、好ましくは健康な人類からなる）は２型糖尿病を伴わず、かつ２型糖尿病を発現するリスクをもたない。よって、本発明の一側面は本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関するものであって、その方法またはバイオマーカーは２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を同定するためのものであり、その際、健康な基準集団は２型糖尿病を伴わず、かつ集団健常値の３３パーセンタイルより低いｍｉＲ−１２２レベルをもたない。たとえば、付随する実施例において、＜０．５００のｍｉＲ−１２２値は集団健常値の３３パーセンタイルより低いことが示された。前記に述べたように、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病を発現するリスクをもたない者は０．６５の中央ｍｉＲ−１２２（四分位範囲：０．３４〜１．１２）をもつ。さらに、またはその代りに、その健康な基準集団は≧１２６ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値を伴わないであろう。
【００３４】
付随する実施例において、ｍｉＲ−１２２の量は平均および四分位範囲として決定された。特に、メタボリックシンドロームを発現するリスクをもつ者は１．０５の中央ｍｉＲ−１２２値（四分位範囲：０．６５〜２．９３）をもつことが示された。同様に、２型糖尿病を発現するリスクをもつ者は０．９４の中央ｍｉＲ−１２２値（四分位範囲：０．５５〜１．６６）をもつ。これに対し、これら２つのいずれの疾患についてもリスクをもたない者は０．６５の中央ｍｉＲ−１２２値（四分位範囲：０．３４〜１．１２）をもつ。これらの数値は定量ポリメラーゼ連鎖反応（相対定量のみが可能）で得られたので無単位である。特に、これらの数値は基準の量に対比した（特に、Ｕ６およびＣｅｌ−ｍｉＲ−３９の量に対比した）ｍｉＲ−１２２量を反映する。よって、１の中央ｍｉＲ−１２２値はｍｉＲ−１２２の量と基準の量が同一であることを意味するであろう。したがって、本発明に関して、ｍｉＲ−１２２の量を分析するためにＵ６および外来Ｃ．エレガンス(C. elegans)スパイク−イン対照（Ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９）を正規化の目的で使用できる。
【００３５】
しかし、ｍｉＲ−１２２の量（すなわち、レベル）の絶対定量も本発明に関して実施できる。たとえば、標準曲線の使用により絶対定量が可能であろう（マイクロＲＮＡ試料への既知濃度の基準のスパイク−イン、標準曲線の作成、患者試料における絶対濃度の推論を伴う）。
【００３６】
用語“四分位範囲”は、２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの間の範囲を表わす。“四分位範囲”は、集団においてｍｉＲ−１２２の量（すなわち、ｍｉＲ−１２２レベル）を測定してｍｉＲ−１２２分布を確認することにより決定できる。ｍｉＲ−１２２レベル分布を増大順に配置すると、２５％の数値が四分位範囲より下にあり、２５％がそれより上にある。その集団は少なくとも１００人の集団、たとえば１００〜１０００人のランダム集団であってもよい。
【００３７】
本発明に関して、メタボリックシンドロームが発現している者においてｍｉＲ−１２２の量が健康な基準集団と比較して１６０％増加している（すなわち、２６０％の数値に）ことが見出された。同様に、２型糖尿病が発現している者においてｍｉＲ−１２２の量が健康な基準集団と比較して２１４％増加している（すなわち、３１４％の数値に）。意外にも、罹患している者は、これらの疾患が発現する５年前に既に増大したｍｉＲ−１２２レベルを示した。特に、メタボリックシンドローム発現の５年前にｍｉＲ−１２２の量は健康な基準集団と比較して既に１０４％増加していた（すなわち、２０４％の数値に）。同様に、２型糖尿病発現の５年前にｍｉＲ−１２２の量は健康な基準集団と比較して既に４９％増加していた（すなわち、１４９％の数値に）。
【００３８】
よって、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーの一側面において、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２量の少なくとも１１０％（好ましくは少なくとも１２０％、より好ましくは少なくとも１２５％、よりさらに好ましくは少なくとも１３０％、よりさらに好ましくは少なくとも１３５％）である被験対象のｍｉＲ−１２２量は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。たとえば、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーがメタボリックシンドロームを発現するリスクを同定するためのものであれば、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２量の少なくとも１１０％（好ましくは少なくとも１２０％、より好ましくは少なくとも１３０％、よりさらに好ましくは少なくとも１４０％、よりさらに好ましくは少なくとも１５０％、よりさらに好ましくは少なくとも１６０％、よりさらに好ましくは少なくとも１７０％、よりさらに好ましくは少なくとも１８０％、またはよりさらに好ましくは少なくとも１９０％）である被験対象のｍｉＲ−１２２量は、メタボリックシンドロームを発現するリスクの指標となる。さらに、またはその代りに、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーが２型糖尿病を発現するリスクを同定するためのものであれば、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２量の少なくとも１１０％（好ましくは少なくとも１２０％、より好ましくは少なくとも１２５％、よりさらに好ましくは少なくとも１３０％、よりさらに好ましくは少なくとも１３５％、またはよりさらに好ましくは少なくとも１４０％）である被験対象のｍｉＲ−１２２量は、２型糖尿病を発現するリスクの指標となる。
【００３９】
本発明において提供する診断方法を用いて、または本発明において提供するバイオマーカーを用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクが予測されれば、その被験対象がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病についての一般的リスク因子をもつかどうかを分析する（すなわち、決定する／測定する）こともできる。よって、本発明の一側面は、さらにその被験対象が下記のものから選択される少なくとも１つのリスク因子をもつかどうかを同定することを含む、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関する：過体重（ＢＭＩ≧２５）、肥満（ＢＭＩ≧３０）、中心性肥満（ウェスト周囲：男性において≧１０２ｃｍ、または女性において≧８８ｃｍ）、高血圧（血圧≧１４０／９０）、低いＨＤＬコレステロール（ＨＤＬコレステロール：男性において＜４０、女性において＜５０ｍｇ／ｄｌ）、および高いトリグリセリドレベル（≧１５０ｍｇ／ｄＬ）。これらの特徴はメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の両疾患についてのリスク因子である。
【００４０】
本発明において提供する診断方法および本明細書に記載するバイオマーカーとしてのｍｉＲ−１２２は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをきわめて初期に、すなわち疾患（単数または複数）が発症するかなり前に検出できるという利点をもつ。よって、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつと同定された患者は、たとえばライフスタイル介入あるいはメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法により、疾患の発生を遅延または阻止する可能性をもつ。よって、本発明のさらなる側面は、本発明において提供する診断方法または本発明において提供するバイオマーカーに関するものであり、その際、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつと同定された被験対象に投与されるべきであり；ならびに／あるいはライフスタイル介入はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつと同定された被験対象に推奨される。メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつと同定された被験対象には、リスクをもつ対象の疾患状態をモニターするための追跡を施すこともできる。
【００４１】
薬物療法は、標準ガイドラインに従ったメタボリックシンドロームまたは２型糖尿病の医薬を含むか、またはそれらからなることができる。たとえば２型糖尿病のための薬物療法は、メトホルミン(metformin)処置を含むか、またはそれらからなることができる。メタボリックシンドロームのための薬物療法は、スタチン(statin)（たとえば、アトルバスタチン(atorvastatin)）処置を含むか、またはそれらからなることができる。よって、メタボリックシンドロームを発現するリスクをもつと同定された被験対象（すなわち、患者）をスタチン（たとえば、アトルバスタチン）で処置することができる。メタボリックシンドロームについてのその薬物療法はアンタゴｍｉＲ−１２２(antagomiR-122)処置であってもよい。
【００４２】
よって、本発明の一側面は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法による処置を必要とする対象を疾患（単数または複数）の発生前に処置する方法に関するものであり、その対象はそれぞれメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつと同定されており、その処置方法はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法を対象に施すことを含む。その薬物療法はｍｉＲ−１２２阻害薬、たとえばｍｉＲ−１２２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。たとえば、そのｍｉＲ−１２２阻害薬はアンタゴｍｉＲ−１２２であってもよい。そのような処置を必要とする対象は、本発明の診断方法またはバイオマーカーを用いて、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつと同定されているものとする。
【００４３】
ライフスタイル介入（それはリスクをもつ対象に推奨される）は、たとえば身体活動の増強および／または１日当たり摂取するカロリー量の低減および／または他の標準的な食事推奨事項であってもよい。これらの介入の結果、ウェスト−ヒップ比が低減して、メタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の発現および重症度が抑えられる可能性がある。
【００４４】
本発明において提供する診断方法には、または本明細書に記載するバイオマーカーを用いる際には、ｍｉＲ−１２２の量（すなわち、レベル）を測定するために幾つかの異なる試料を使用できる。本発明の一側面において、その試料は血液、血漿、血清、尿または肝臓組織試料である。好ましくは、試料は血清または血漿である。最も好ましくは、試料は血清である。本発明に関して、ｍｉＲ−１２２の量は定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により分析できる。
【００４５】
より具体的には、ｍｉＲ−１２２の量（すなわち、レベル）は先の記載に従って測定できる(Willeit, Circ Res 2013, 112: 595-600; Zampetaki, Circ Res 2010, 107: 810-7)。要約すると、ｍｉＲＮＡをたとえばｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ、ヒルデン）の使用により抽出することができる。血漿または血清試料については、２５μｌのＲＮＡ溶出液のうち固定体積３μｌを逆転写（ＲＴ）反応のための装入材料として使用できる。細胞または組織からのＲＮＡについては、１００ｎｇの装入材料をＲＴのために使用できる。Ｍｅｇａｐｌｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｏｏｌｓ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｏｌｓ  Ａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１またはＲｏｄｅｎｔ  Ｐｏｏｌ  Ａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ドイツ、ダルムシュタット）を用いてｍｉＲＮＡを逆転写し、Ｍｅｇａｐｌｅｘ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ａ  ｖ２．１）を用いて生成物をさらに増幅することができる。ＲＴおよびＰｒｅＡｍｐの生成物は両方とも−２０℃で保存することができる。Ｔａｑｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  ａｓｓａｙを用いてｍｉＲ−１２２の発現を査定することができる。希釈した予備増幅生成物（０．５μｌ）またはＲＴ生成物（０．４５ｎｇの装入量に対応する）を０．２５μｌのＴａｑｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｓｓａｙ（２０×）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２．５μｌのＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（２×）と混和して、５μｌの最終体積にすることができる。ｑＲＴ−ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴサーモサイクラーにより、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル、実施することができる。すべての試料を二重に試験することができる。相対定量は、ソフトウェアＳＤＳ２．２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施できる。Ｕ６および外来Ｃ．エレガンス  スパイク−イン対照（Ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９）を正規化のために使用できる。
【００４６】
しかし、ｍｉＲ−１２２の量はｍｉＲ−１２２に特異的に結合する結合分子を用いて分析（すなわち、決定）することもできる。ｍｉＲ−１２２に特異的に結合する結合分子は、オリゴヌクレオチド（すなわち、プローブまたはプライマー）であってもよい。そのようなオリゴヌクレオチドの製造は当技術分野で一般に知られている。本発明に関してメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を同定するために用いる結合分子はキットの一部であってもよく、それを用いてメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを疾患（単数または複数）の発症前に診断できる。よって、本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を疾患（単数または複数）の発症前に同定するためのキットの使用に関するものであり、そのキットは本明細書において前記に定めた結合分子を含む。本明細書において提供する本発明の診断方法は、このキットを用いて実現できる。有利には、本発明のキットはさらに、場合により（ａ）反応緩衝液（単数または複数）、保存溶液、洗浄溶液、および／または本明細書に記載するアッセイの実施に必要な残りの試薬もしくは材料を含む。さらに、本発明のキットの部品は、個別にバイアルもしくはボトルに、または組み合わせて容器もしくはマルチコンテナ(multicontainer)ユニット内にパッケージすることができる。これらのバイアル／ボトル／容器またはマルチコンテナは、本明細書に記載する結合分子のほかに保存のための保存剤または緩衝液を含むことができる。さらに、キットは使用のための指示を含むことができる。本発明のキットの製造は好ましくは当業者に既知の標準法に従う。前記に述べたように、本発明において提供するキットはメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を疾患（単数または複数）の発症前に同定するために用いられる。
【００４７】
付随する実施例は、メタボリックシンドロームのための確立された薬物療法（特に、スタチン処置）が循環ｍｉＲ−１２２レベルを低減することを示す。類似のスタチン応答がマウスおよび培養肝細胞においても観察された。よって、付随する実施例は、ｍｉＲ−１２２がｍｉＲ−１２２レベルの増大に付随する疾患の処置の成功の指標となる分子マーカーであることを立証する。したがって、ｍｉＲ−１２２のレベルの測定は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法が療法の成功をもたらすかどうかを同定するために使用できる。よって、本発明は、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法に関するものであり、その方法は下記を含む：
（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第１試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；
（ｂ）被験対象から得た第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第２試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして
（ｃ）療法の成功を予測する；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる。
【００４８】
もちろん、上記のモニタリング方法において第２試料は第１試料後に得られたものである。
本発明には、被験対象のｍｉＲ−１２２の量を基準データと比較するモニタリング方法も含まれる。特に、本発明の一側面はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法に関するものであり、その方法は下記を含む：
（ａ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法を受けたかまたは受ける被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量の量を分析する；
（ｂ）その量を、基準集団のｍｉＲ−１２２の量に対応する基準データと比較する；そして
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて療法の成功を予測する。
基準集団が健康な対象（すなわち、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病を伴わない者）からなるならば、試料の、基準データと同一または類似するｍｉＲ−１２２量は療法の成功の指標となる。同様に、基準集団が罹患した対象（すなわち、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を伴う者）からなり、ただしその疾患のための薬物療法を受けていれば、試料の、基準データと同一または類似するｍｉＲ−１２２量は療法の成功の指標となる。基準集団が罹患した対象（すなわち、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を伴う者）からなるならば、基準データより低い試料のｍｉＲ−１２２量は療法の成功の指標となる。
【００４９】
上記のモニタリング方法において、“同一または類似するｍｉＲ−１２２量”は、被験対象の試料（たとえば、血漿または血清試料）中のｍｉＲ−１２２の量が基準集団のｍｉＲ−１２２の量の６０〜１４０％、好ましくは７０〜１３０％、より好ましくは８０〜１２０％、よりさらに好ましくは９０〜１１０％であることを意味する。
【００５０】
上記のモニタリング方法は、両方（メタボリックシンドロームおよび２型糖尿病）の処置における療法の成功を一緒にモニタリングするために使用できる。上記のモニタリング方法は、これらの疾患のうちのいずれか一方、すなわちメタボリックシンドロームまたは２型糖尿病のいずれかの処置における療法の成功をモニタリングするためにも使用できる。よって、本発明の一側面はメタボリックシンドロームの処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法に関するものであり、その方法は下記を含む：
（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第１試料はメタボリックシンドロームのための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；
（ｂ）被験対象から得た第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第２試料はメタボリックシンドロームのための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして
（ｃ）療法の成功を予測する；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる。
【００５１】
本発明において提供するモニタリング方法を、２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするために使用することが好ましい。よって、本発明の他の側面は２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法に関するものであり、その方法は下記を含む：
（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第１試料は２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；
（ｂ）被験対象から得た第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第２試料は２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして
（ｃ）療法の成功を予測する；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる。
【００５２】
上記モニタリング方法における試料は血清または血漿試料、好ましくは血清試料であってもよい。
本発明において提供するモニタリング方法は、さらなるマーカーの量（すなわち、レベル）を分析することをも含み、その際、変化した（すなわち、減少または増加した）そのマーカーの量は、さらにメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置における療法の成功の指標となる。本発明において提供するモニタリング方法に使用できるさらなるマーカーは、たとえば空腹時血糖値および／またはＨｂＡ１ｃである。特に、工程（ｃ）において第１試料と比較して第２試料における空腹時血糖値および／またはＨｂＡ１ｃの量の減少は療法の成功の指標となる。
【００５３】
本発明の診断方法（すなわち、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクをもつ対象を同定するための方法）に関連して本明細書に開示する定義（特に、ｍｉＲ−１２２の量の分析に関するもの）は、必要な変更を加えて上記のモニタリング方法に適用される。
【００５４】
付随する実施例においては、循環ｍｉＲ−１２２の量を分析した。よって、本発明において提供する診断方法、本発明において提供するバイオマーカー、または本発明において提供するモニタリング方法に関して、そのｍｉＲ−１２２は好ましくは循環ｍｉＲ−１２２である。
【００５５】
よって、本発明は下記の項目に関する：
１．メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を疾患の発症前に同定するための方法であって、
（ａ）被験対象から得た試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；そして
（ｂ）メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定する；その際、健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる
ことを含む方法。
【００５６】
２．健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量と比較して増加したｍｉＲ−１２２の量がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる、メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを疾患の発症前に同定する際に使用するための予測バイオマーカーとしてのｍｉＲ−１２２。
【００５７】
３．メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを、それぞれメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の臨床発現の少なくとも１年前に同定する、項目１に記載の方法または項目２の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００５８】
４．方法またはバイオマーカーがメタボリックシンドロームを発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、リスク比が１．８〜４．６である、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法または項目２もしくは３の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００５９】
５．方法またはバイオマーカーが２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、リスク比が１．３〜６．４である、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法または項目２もしくは３の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６０】
６．ｍｉＲ−１２２が下記のポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドである：
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一でありかつ機能性であるポリヌクレオチド；その機能はｍｉＲ−１２２のターゲット遺伝子の翻訳を抑制する活性を含む；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）によるポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含むもの；
項目１〜５のいずれか１項に記載の方法または項目２〜５のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６１】
７．方法またはバイオマーカーがメタボリックシンドロームを発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、健康な基準集団がメタボリックシンドロームを伴っておらず、下記の基準（ｉ）および（ｉｉ）のうちの少なくとも１つを満たす：
（ｉ）下記のものから選択されるいずれかの特徴をもたない：
（ａ）ウェスト周囲：男性≧１０２ｃｍまたは女性≧８８ｃｍ；
（ｂ）空腹時トリグリセリド値≧１５０ｍｇ／ｄｌ、または高トリグリセリドのための薬物治療中である；
（ｃ）ＨＤＬコレステロール：男性＜４０および女性＜５０ｍｇ／ｄｌ、または低いＨＤＬコレステロールのための薬物治療中である；
（ｄ）血圧≧１３０／≧８５ｍｍＨｇ、または抗高血圧症薬治療中であり、高血圧症の病歴をもつ；ならびに
（ｅ）空腹時血糖値≧１００ｍｇ／ｄｌ、または高血糖のための薬物治療中である；あるいは
（ｉｉ）集団健常値の３３パーセンタイルより低いｍｉＲ−１２２レベルをもたない；
項目１〜４および６のいずれか１項に記載の方法または項目２〜４および６のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６２】
８．方法またはバイオマーカーが２型糖尿病を発現するリスクを有する対象を同定するためのものであり、健康な基準集団が２型糖尿病を伴っておらず、集団健常値の３３パーセンタイルより低いｍｉＲ−１２２レベルをもたない、項目１〜３、５および６のいずれか１項に記載の方法または項目２、３、５および６のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６３】
９．健康な基準集団のｍｉＲ−１２２の量の少なくとも１１０％である被験対象のｍｉＲ−１２２がメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクの指標となる、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法または項目２〜８のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６４】
１０．さらに、過体重、肥満、中心性肥満、高血圧、低いＨＤＬコレステロールレベルまたは高いトリグリセリドレベルから選択されるリスク因子のうち少なくとも１つを有するかどうかを同定することを含む、、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法または項目１〜１０のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６５】
１１．メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有すると同定された被験対象にメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法を施すべきである；ならびに／あるいは
メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病を発現するリスクを有すると同定された被験対象にライフスタイル介入を推奨する；
項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法または項目２〜１０のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６６】
１２．試料が血液、血漿、血清、尿または肝臓組織試料である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．ｍｉＲ−１２２の量を定量ＰＣＲにより分析する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法または項目２〜１２のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカー。
【００６７】
１４．メタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための方法であって、
（ａ）被験対象から得た第１試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第１試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する前または途中に得られたものである；
（ｂ）被験対象から得た第２試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する；その際、第２試料はメタボリックシンドロームおよび／または２型糖尿病のための薬物療法で被験対象を処置する途中または後に得られたものである；そして
（ｃ）療法の成功を予測する；その際、第１試料と比較して第２試料におけるｍｉＲ−１２２の量の減少は療法の成功の指標となる；
ことを含む方法。
【００６８】
１５．２型糖尿病の処置に際して療法の成功をモニタリングするための、項目１４に記載のモニタリング方法。
１６．試料が血清または血液の試料である、項目１４または１５に記載のモニタリング方法。
【００６９】
１７．ｍｉＲ−１２２が循環ｍｉＲ−１２２である、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法または項目２〜１３のいずれか１項の記載に従って使用するためのバイオマーカーまたは項目１４〜１６のいずれか１項に記載のモニタリング方法。
【００７０】
本明細書において用語“分析する”は、“決定する”、“定量する”または“測定する”を意味する。たとえば、本発明において用語“試料においてｍｉＲ−１２２の量を分析する”は、“試料においてｍｉＲ−１２２の量を決定、定量、または測定する”ことを意味する。ｍｉＲ−１２２の量は、たとえば定量ＰＣＲを用いて分析する（すなわち、定量する）ことができる。
【００７１】
本発明の目的について、“対象”（または“患者”）は、最も好ましくは人類である。しかし、本発明において提供する診断方法、バイオマーカーまたはモニタリング方法は獣医科用としても適用できる。したがって、それらの対象は動物、たとえばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ類、ウマ、ラクダ、または霊長類であってもよい。好ましくは、対象は哺乳類である。より好ましくは、対象はヒトである。さらに、被験対象は好ましくは中等度に高いＣＶＤリスクをもつ。中等度に高いＣＶＤリスクは、その被験対象が下記のものから選択される少なくとも１つのリスク因子をもつことを意味する：過体重（ＢＭＩ≧２５）、肥満（ＢＭＩ≧３０）、中心性肥満（ウェスト周囲：男性≧１０２ｃｍ、または女性≧８８ｃｍ）、高血圧（血圧≧１４０／９０）、低いＨＤＬコレステロール（ＨＤＬコレステロール：男性＜４０、および女性＜５０ｍｇ／ｄｌ）、および高いトリグリセリドレベル（≧１５０ｍｇ／ｄＬ）。付随する実施例中で概説する実験は白人集団を用いて実施された。したがって、“被験対象”および“基準集団”は白人の可能性がある。
【００７２】
“マイクロＲＮＡ”（“ｍｉｃｒｏＲＮＡ”、“ｍｉｒ−”、“ｍｉＲ−”または“ｍｉＲＮＡ”とも呼ばれる）は、植物、動物、およびある種のウイルス中にみられるスモールノンコーディングＲＮＡ分子（約２２個のヌクレオチドを含む）であり、それはＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の翻訳後調節において機能する。ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡ分子内の相補配列との塩基対合により機能する。その結果、これらのｍＲＮＡ分子は下記のプロセスのうち１以上によってサイレンシングされる：１）ｍＲＮＡ鎖を開裂して２つの断片にする、２）ｍＲＮＡをそれのポリ（Ａ）テイルの短縮によって不安定化する、および３）リボソームによるｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の効率を低下させる。ｍｉＲＮＡは植物および動物の両方において良好に保存されており、重要な進化的に古い遺伝子調節成分であると考えられる。本明細書において用語“ｍｉＲ−”（特に、ｍｉＲ−１２２）は成熟ｍｉＲＮＡを表わす。たとえば、ｍｉＲ−１２２はｐｒｅ−ｍｉＲ−１２２に由来する成熟ｍｉＲＮＡ配列を表わす。ｍｉＲ−１２２の配列を本明細書においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示す。
【００７３】
疾患“メタボリックシンドローム”は、“メタボリックシンドロームＸ”、“心メタボリックシンドローム(cardiometabolic syndrome)”、“シンドロームＸ”、“インスリン抵抗性症候群”、“リーベン症候群(Reaven’s syndrome)”、および“ＣＨＡＯＳ”とも呼ばれる。メタボリックシンドロームは下記の５つの特徴のうち少なくとも３つが集積したものを特徴とする疾患である：腹部肥満、高血圧、脂質異常症（高い血清トリグリセリドレベルおよび低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル）、高い空腹時血漿血糖値、およびインスリン抵抗性。本発明によれば、用語“メタボリックシンドローム”は疾患“メタボリックシンドローム”の他の標準的なすべての定義、たとえば世界保健機構(World Health Organization)（ＷＨＯ）または国際糖尿病連合(International Diabetes Federation)（ＩＤＦ）が提示する定義をも表わす。
【００７４】
糖尿病(diabetes mellitus)（一般に“diabetes”と呼ばれる）は長期間にわたる高い血糖値を伴う一群の代謝性疾患である。高血糖の症状には、頻尿、口渇亢進、および空腹感亢進が含まれる。未処置のまま放置すると、糖尿病は多数の合併症、たとえば糖尿病性ケトアシドーシスおよび非ケトン性高浸透圧性昏睡を引き起こす可能性がある。重篤な長期合併症には心血管疾患、卒中、慢性腎不全、足潰瘍、および眼の障害が含まれる。糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生しないこと、または産生されたインスリンに対して身体の細胞が適正に応答しないことのいずれかによるものである。３つの主なタイプの糖尿病、“１型糖尿病”、“２型糖尿病”および“妊娠糖尿病”がある。２型糖尿病(type-2 diabetes) (type-2 diabetes mellitusとも呼ばれる）はインスリン抵抗性、すなわち細胞がインスリンに適正に応答できない状態から開始する。疾患が進行するのに伴って、インスリン欠乏も発現する可能性がある。時に、“２型糖尿病”は“非インスリン依存性糖尿病”（ＮＩＤＤＭ）または“成人発症型糖尿病”とも呼ばれる。２型糖尿病の現在の標準的定義は空腹時血糖値≧１２６ｍｇ／ｄＬである。しかし、本発明によれば、用語“２型糖尿病”は他のすべての標準的定義の疾患“２型糖尿病”をも表わす。主因は過体重および運動不足である。２０１４年の時点において、世界中で推定３８７００万人が糖尿病を伴っており、２型糖尿病が症例の約９０％を占めている。
【００７５】
本発明に関して、“リスク比”を決定する。リスク因子およびリスク比は当技術分野で一般に知られており、先に記載されたように検証済みの標準法により確認できる(Willeit, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010, 30: 1649-56; Kiechl, N Engl J Med 2002, 347: 185-92)。
【００７６】
用語“リスク比(risk ratio)”（“相対リスク(relative risk)”または“ＲＲ”とも呼ばれる）は当技術分野で一般に知られており、曝露グループにおいてある事象が起きる（たとえば、疾患が発現する）確率と、比較する非曝露グループにおいてその事象が起きる確率との比を表わす。たとえば、メタボリックシンドロームまたは２型糖尿病の発現についてのリスク比は、次式を用いて計算することができる：
【００７７】
【数１】
2019500053.tif 000002
【００７８】
式中：
“ａ”は、増大したｍｉＲ−１２２レベルを伴う者がメタボリックシンドローム／２型糖尿病を発現する確率であり；“ａ＋ｂ＝１００”である；
“ｃ”は、正常な増大していないｍｉＲ−１２２を伴う者がメタボリックシンドローム／２型糖尿病を発現する確率であり；“ｃ＋ｄ＝１００”である。
【００７９】
本発明に関して、メタボリックシンドロームについてのリスク比はロジスティック回帰を用いて計算することができる；糖尿病についてのリスク比はＣｏｘ回帰(Cox regression)を用いて計算することができる。より特別には、ｍｉＲ−１２２値を解析前に対数変換することができる。ｍｉＲ−１２２レベルと他の関係特徴との横断的関連性(cross-sectional association)を、年齢および性について調整したスピアマン相関係数(spearman correlation coefficient)および線形回帰モデルを用いて数量化することができる。前向き解析は、２型糖尿病についての最新の共変量およびメタボリックシンドロームについてのプールしたロジスティック回帰(D’Agostino, Stat Med 1990, 9: 1501-15)によるコックス比例ハザード回帰(Cox proportional hazard regression)を用いる。ハザード比とオッズ比は同じ相対リスク尺度を表わすと推定することができ、まとめてリスク比と記載される。罹患疾患(prevalent disease)を伴う参加者をそれぞれの解析から除外することができる。モデルを、年齢および性に加えて、社会経済的状態（低、中、高）、喫煙（有、無）、身体活動およびアルコール摂取について調整することが好ましい（“多変量モデル”）。潜在的な仲介因子／交絡因子(mediators/confounders)である肥満度指数およびウェスト−ヒップ比について調整するために、さらに感度分析を使用できる。２型糖尿病についての比例ハザード推定(proportional hazarsds assumption)は、シェーンフィールド残基(Schoenfeld residuals)を用いて検定することができる。さらに、年齢（＜６０歳、６０〜７０歳、＞７０歳）、性、スタチン摂取、および肥満症（肥満度指数：＜２５、２５〜３０、＞３０）により規定したグループ間の交互作用について、フォーマルテストにより効果修飾(effect modification)を調べることができる。主成分分析(principal analyses)には、両側有意水準(significance levels of two-sided)Ｐ＜０．０５を使用できる。
【００８０】
本発明に関して、“同一性”、“同一性パーセント”または“Ｘ％同一”は、そのヌクレオチド配列が本明細書に示す配列、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性をもつことを意味し、その際、より高い同一性数値の方がより低いものより好ましい。本発明によれば、２以上の核酸配列に関して、用語“同一性(identity/identities)”または“同一性パーセント(percent identity/identities)”は、比較ウインドウまたは指定した領域にわたって比較して最大一致が得られるようにアラインした際に、当技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いるかまたは手動アラインメントおよび目視検査により測定して、同じであるかまたは明記したパーセントの同じヌクレオチドをもつ、２以上の配列を表わす（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の核酸配列と少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、よりさらに好ましくは９７％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％、またはよりさらに好ましくは少なくとも９９％の同一性をもち、かつ機能性である；その際、機能はｍｉＲ−１２２のターゲット遺伝子の翻訳を抑制する活性（すなわち、能力）を含む）。
【００８１】
好ましくは、記載した同一性は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、最も好ましくは全ヌクレオチドの長さの領域にわたって存在する。たとえば当技術分野で既知のＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム(Thompson, 1994, Nucl Acids Res, 2: 4673-4680)またはＦＡＳＴＤＢ(Brutlag, 1990, Comp App Biosci, 6: 237-245)に基づくアルゴリズムを用いて配列間の同一性を決定する方法が当業者に既知であろう。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズム(Altschul, 1997, Nucl Acids Res 25: 3389-3402; Altschul, 1993, J Mol Evol, 36: 290-300; Altschul, 1990, J Mol Biol 215: 403-410)も当業者が利用できる。たとえば、ＢＬＡＳＴ  ２．０（Basic Local Alignment Search Tool BLASTを表わす）(Altschul, 1997, 前掲; Altschul, 1993, 前掲; Altschul, 1990, 前掲)を用いて局所配列アラインメントを検索できる。上記に述べたＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の両方のアラインメントを作成して配列類似性を決定する。アラインメントの局所性のため、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を決定する際または類似配列を同定する際に特に有用である。ＢＬＡＳＴを用いる同様なコンピューター手法(Altschul, 1997, 前掲; Altschul, 1993, 前掲; Altschul, 1990, 前掲)を用いて、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベース中の同一分子または関連分子を検索することができる。
【００８２】
以下の図面および実施例を参照することにより本発明をさらに記載する。
図面は下記を示す：
図１：ブルーニコ試験(Bruneck Study)における血清ｍｉＲ−１２２レベルと脂質亜種レベルとの横断的相関性（Ａ）、ならびにマウスにおけるアンタゴｍｉＲ−１２２注射の結果（グループ当たりｎ＝５）：ノーザンブロッティングにより評価した肝臓ｍｉＲ−１２２の低減を含む（Ｂ）、リポタンパク質代謝を調節する他の肝臓ｍｉＲＮＡの発現にアンタゴｍｉＲ−１２２が及ぼす影響：ｍｉＲ−３３の低減を含む（Ｃ）、アンタゴｍｉＲ−１２２処置に際しての血清コレステロール濃度の低減（Ｄ）、ならびにコレステロールおよび脂質の代謝における関与が示唆されている遺伝子の発現（Ｅ）。パネルＡにおいて、数字は質量分析により決定した複合脂質の脂肪酸（ＦＡ）組成を示す（炭素鎖長：二重結合の数）；菱形およびラベルは、多重試験についてのボンフェロニ補正(Bonferroni-correction)後に有意である相関係数を示す。マーカーラベルは炭素鎖長および二重結合数を示す。略号：ＡＣＣ１，アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（細胞質ゾル性）；Ａｃｌｙ，ＡＴＰクエン酸リアーゼ；ＡＬＤＯ，アルドラーゼ；ＡＭＰＫ，５’ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ；ＣＥ，コレステリルエステル；ＣＰＴ１，カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１；ＦＡＳ，脂肪酸シンターゼ；ＨＭＧＣＲ，ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ；ＬＤＬＲ，ＬＤＬ受容体；ＬＰＣ，リゾホスファチジルコリン；ＬＰＥ，リゾホスファチジルエタノールアミン；ＰＣ，ホスファチジルコリン；ＰＥ，ホスファチジルエタノールアミン；ＰＳ，ホスファチジルセリン；ＭＴＴＰ，ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質；ＳＣＤ１，ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１；ＳＭ，スフィンゴミエリン；ＳＲＥＢＰ，ステロール調節エレメント結合タンパク質；およびＴＡＧ，トリアシルグリセロール。＊Ｐ＜０．０５。
【００８３】
図２：アトルバスタチンによる処置は、ＡＳＣＯＴ試験の参加者における総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、および血清ｍｉＲ−１２２における一致した低減（Ａ）、マウスにおける血清ｍｉＲ−１２２の低減（Ｂ）、ならびに初代肝細胞からのｍｉＲ−１２２分泌の低減（Ｃ）をもたらした。
【００８４】
図３：ブルーニコ試験における、血清ｍｉＲ−１２２レベルと、アポリポタンパク質および脂質代謝に関係する他の選択されたタンパク質の循環レベルとの相関性。略号：ＡＦＡＭ，アファミン（アルファ−アルブミン）；ＣＦＡＨ，補体因子Ｈ；ＺＡ２Ｇ，亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質。スピアマン相関係数(Spearman correlation coefficient)を年齢および性について調整した。太字のＰ値は、多重試験についてのボンフェロニ補正後に有意であった（タンパク質の完全パネルを図８に示す）。他のタンパク質は、脂質代謝におけるそれらの役割、およびそれらと循環ｍｉＲ−１２２との強い相関性という理由で選択された。
【００８５】
図４：ブルーニコ試験におけるｍｉＲ−１２２と心血管代謝性疾患発生との関連性。＊多変量モデルは年齢、性、社会経済的状態、喫煙、身体活動および、アルコール摂取について調整された。星印は有意水準を示す：＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００８６】
図５：循環中の肝臓ｍｉＲ−１２２のためのビヒクルとしてのエクソソーム。
図６：ブルーニコ試験におけるｍｉＲ−１２２の経時相関性および血清−対−血漿相関性。比較のためにマイクロＲＮＡ値を対数変換した。
【００８７】
図７：マウス肝臓においてアンタゴｍｉＲ−１２２注射がｍｉＲＮＡ発現に及ぼした結果を定量ＰＣＲにより評価したもの；図１と関連。データは平均（標準偏差）である。アンタゴｍｉＲ−１２２グループにおけるｍｉＲ−１２２相対量は０．１３％±０．０６％（Ｐ＝６×１０−４）であった。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００８８】
図８：ブルーニコ試験における血清ｍｉＲ−１２２とタンパク質の循環レベルとの相関性。スピアマン相関係数を年齢および性についての調整した。太字のタンパク質は、多重試験についてのボンフェロニ補正後に有意であった。略号：Ａ１ＡＧ１，アルファ−１−酸  糖タンパク質１；Ａ１ＡＧ２，アルファ−１−酸  糖タンパク質２；Ａ１ＡＴ，アルファ−１−アンチトリプシン；Ａ１ＢＧ，アルファ−１Ｂ−糖タンパク質；Ａ２ＡＰ，アルファ−２−アンチプラスミン；Ａ２ＧＬ，ロイシンリッチ  アルファ−２−糖タンパク質；Ａ２ＭＧ，アルファ−２−マクログロブリン；ＡＡＣＴ，アルファ−１−アンチキモトリプシン；ＡＦＡＭ，アファミン；ＡＬＢＵ，アルブミン；ＡＭＢＰ，アルファ−１−ミクログロブリン；ＡＮＧＴ，アンギオテンシノーゲン；ＡＮＴ３，アンチトロンビン−ＩＩＩ；ａｐｏ（ａ），アポリポタンパク質（ａ）；ＡＰＯＡ１，アポリポタンパク質Ａ−Ｉ；ＡＰＯＡ２，アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ；ＡＰＯＡ４，アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ；ＡＰＯＢ，アポリポタンパク質Ｂ−１００；ＡＰＯＣ１，アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ；ＡＰＯＣ２，アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ；ＡＰＯＣ３，アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ；ＡＰＯＤ，アポリポタンパク質Ｄ；ＡＰＯＥ，アポリポタンパク質Ｅ；ＡＰＯＨ，アポリポタンパク質Ｈ；ＡＰＯＬ１，アポリポタンパク質Ｌ１；ＡＰＯＭ，アポリポタンパク質Ｍ；Ｃ１ＱＢ，補体Ｃ１ｑサブコンポーネントサブユニットＢ；Ｃ１ＱＣ，補体Ｃ１ｑサブコンポーネントサブユニットＣ；Ｃ１Ｒ，補体Ｃ１ｒサブコンポーネント；Ｃ１Ｓ，補体Ｃ１ｓサブコンポーネント；Ｃ４ＢＰＡ，Ｃ４ｂ結合タンパク質アルファ鎖；ＣＢＧ，コルチコステロイド結合グロブリン；ＣＤ５Ｌ，ＣＤ５抗原様；ＣＥＲＵ，セルロプラスミン；ＣＦＡＢ，補体因子Ｂ；ＣＦＡＨ，補体因子Ｈ；ＣＦＡＩ，補体因子Ｉ；ＣＬＵＳ，クラステリン；ＣＯ２，補体Ｃ２；ＣＯ３，補体Ｃ３；ＣＯ５，補体Ｃ５；ＣＯ６，補体Ｃ６；ＣＯ７，補体Ｃ７；ＣＯ８Ａ，補体Ｃ８  アルファ鎖；ＣＯ９，補体Ｃ９；ＣＰＮ２，カルボキシペプチダーゼＮ  サブユニット２；Ｆ１３Ａ，凝固因子ＸＩＩＩ  Ａ鎖；ＦＢＬＮ１，フィブリン−１；ＦＣＮ３，フィコリン−３；ＦＥＴＵＡ，フェチュインＡ；ＦＩＢＡ，フィブリノーゲン  アルファ鎖；ＦＩＮＣ，フィブロネクチン；ＧＥＬＳ，ゲルソリン；ＧＰＸ３，グルタチオンペルオキシダーゼ３；ＨＢＡ，ヘモグロビンサブユニットアルファ；ＨＢＤ，ヘモグロビンサブユニットデルタ；ＨＥＭＯ，ヘモペキシン；ＨＥＰ２，ヘパリンコファクター２；ＨＰＴ，ハプトグロビン；ＨＰＴＲ，ハプトグロビン関連タンパク質；ＨＲＧ，ヒスチジンリッチ糖タンパク質；ＩＣ１，血漿プロテアーゼＣ１インヒビター；ＩＧＨＡ１，免疫グロブリン  アルファ１；ＩＧＨＡ２，免疫グロブリン  アルファ２；ＩＧＨＧ，免疫グロブリン  ガンマ；ＩＧＨＧ１，免疫グロブリン  ガンマ１；ＩＧＨＧ２，免疫グロブリン  ガンマ２；ＩＧＨＧ３，免疫グロブリン  ガンマ３；ＩＧＨＧ４，免疫グロブリン  ガンマ４；ＩＧＨＭ，免疫グロブリン  ミュー；ＩＧＪ，免疫グロブリンＪ；ＩＴＩＨ１，インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖１；ＩＴＩＨ２，インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖２；ＩＴＩＨ４，インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖４；ＫＬＫＢ１，カリクレイン；ＫＮＧ１，キニノーゲン−１；ＭＢＬ２，マンノース結合タンパク質Ｃ；ＰＥＤＦ，色素上皮由来因子；ＰＧＲＰ２，Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ；ＰＬＦ４，血小板因子４；ＰＬＭＮ，プラスミノーゲン；ＲＥＴ４，レチノール結合タンパク質４；ＳＡＡ４，血清アミロイドＡ−４タンパク質；ＳＥＰＰ１，セレノプロテイン；ＳＨＢＧ，性ホルモン結合グロブリン；ＴＥＴＮ，テトラネクチン；ＴＨＢＧ，チロキシン結合グロブリン；ＴＨＲＢ，プロトロンビン；ＴＲＦＥ，セロトランスフェリン；ＴＴＨＹ，トランスチレチン；ＶＴＤＢ，ビタミンＤ結合タンパク質；ＶＴＮＣ，ビトロネクチン；ＺＡ２Ｇ，亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質。
【００８９】
図９：ブルーニコ試験における臨床関連サブグループにわたるｍｉＲ−１２２と心血管代謝性疾患との関連性。年齢、性、社会経済的状態、喫煙、身体活動および、アルコール摂取について調整した。
【実施例】
【００９０】
実施例により本発明を説明する。
実施例１：材料および方法
ブルーニコ試験
ブルーニコ試験は前向き集団ベース試験である(Stegemann, Circulation 2014, 129: 1821-31; Kiechl, Nat Med 2013, 19: 358-63)。１９９０年に、ブルーニコ住民のランダムサンプルとして年齢４０〜７９歳の１，０００人の個体を動員し、それ以来５年毎に再検査した；すべての調査において参加率は９０％を超えた。今回の試験は１９９５年の調査をベースラインとして用いた。１９９５〜２０１０年（メタボリックシンドロームについては１９９５〜２００５年）に行なわれた臨床エンドポイントについては、その後の評価に参加しなかった者または追跡期間中に死亡したものを含めて、すべての個体に関して完全な医療記録を入手できる（臨床エンドポイントについて１００％の追跡）。下記の５つの特徴のうち３つが存在すればメタボリックシンドロームと診断された(Alberti, Circulation 2009, 120: 1640-5)：（ｉ）ウェスト周囲：男性≧１０２ｃｍまたは女性≧８８ｃｍ；（ｉｉ）空腹時トリグリセリド値≧１５０ｍｇ／ｄｌ、または高トリグリセリドのための薬物治療中である（フィブレート類およびニコチン酸類）；（ｉｉｉ）ＨＤＬコレステロール：男性＜４０および女性＜５０ｍｇ／ｄｌ、または低いＨＤＬコレステロールのための薬物治療中である（フィブレート類およびニコチン酸類）；（ｉｖ）血圧≧１３０／≧８５ｍｍＨｇ、または高血圧症の病歴をもつ患者において抗高血圧症薬治療中である；ならびに（ｖ）空腹時血糖値≧１００ｍｇ／ｄｌ、または高血糖のための薬物治療中である。Ｔ２ＤＭは、１９９７年米国糖尿病学会基準に従って、または参加者がＴ２ＤＭの臨床診断を受けており、抗糖尿病処置を受けていれば、診断された。ＣＶＤは、心筋梗塞、卒中、または血管死として定義された(Willeit, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010, 30: 1649-56)。致命的および非致命的な心筋梗塞は、明確な疾患状態についての世界保健機構基準を満たした場合に確定されたと判断した。虚血性発作および一過性虚血性発作は、脳卒中の全国調査(National Survey of Stroke)に従って分類された。一般開業医およびＢｒｕｎｅｃｋ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの参加者医療記録を精査することにより、疾患の自己報告書を常に確認した。ブルーニコ試験プロトコルはボルツァーノ(Bolzano)およびヴェローナ(Verona)の倫理委員会により承認され、すべての試験参加者が参加前に書面によるインフォームドコンセントを提出した。リスク因子を、先に記載された検証済みの標準法により確認した(Willeit, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010, 30: 1649-56; Kiechl, N Engl J Med 2002, 347: 185-92)。世帯で最高の収入をもつ者の職業状態および教育レベルに関する情報に基づいて、社会経済的状態を３カテゴリー尺度（低、中、高）で定義した。参加者に≧１２年の教育または平均月収≧＄２，０００（課税前の基本給）を伴う職業があれば高い社会経済的状態と推定した。低い社会経済的状態を≦８年の教育または平均月収≦＄１，０００により定義した。身体活動は、検証済みのベックスコア(Baecke Score)を用いて査定された(Baecke, Am J Clin Nutr 1982, 36: 936-42)。ウェスト周囲およびヒップ周囲は、プラスチックテープメジャーを用いて、それぞれ臍および大転子(greater trochanter)の高さで査定された。血液試料は一夜絶食後に採取された。リピドミクスプロファイリングは質量分析により実施され、それにより１３��の別個の脂質種の定量が可能であった(Stegemann, Circulation 2014, 129: 1821-31; Shah, Circulation 2012, 126: 1110-20)。ＨｂＡ１ｃは、高速液体クロマトグラフィー（ＤＣＣＴに整合したアッセイ）を用いて定量された。ホメオスタシスモデル査定によるインスリン抵抗性(insulin resistance by homeostasis model assessment)（ＨＯＭＡ−ＩＲ）の程度は、式：空腹時血漿血糖値ｍｍｏｌ／ｌ  ×  空腹時血清インスリンｍＵ／ｌ  ÷  ２２．５(Bonora, Int J Obes Relat Metab Disord 2003, 27: 1283-9)を用いて推定され、より高いＨＯＭＡ−ＩＲ値はより高いインスリン抵抗性の指標となる。ｍｉＲ−１２２は１９９５年の試験で採取された血清（ｎ＝８１０）ならびに２０００年の試験で採取された血清および血漿（ｎ＝６９５）において測定された。
【００９１】
血漿タンパク質についての多重反応モニタリング(multiple reaction monitoring)（ＭＲＭ）
ＰｌａｓｍａＤｉｖｅキット（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ  ＡＧ）を用いてブルーニコ試験の血漿タンパク質をプロファイリングした。血漿試料を製造業者の指示に従って処理した；唯一の例外：トリプシン消化およびＣ１８クリーンアップの後ではなくその前にペプチド標準品をスパイクした。要約すると、１０μｌの血漿試料を変性させ、還元し、アルキル化した。２０μｇのタンパク質に１００種類の真正な重ペプチド(heavy peptide)標準品をスパイクした。７種類のタンパク質は検出限界未満であった。溶液内消化(in-solution digestion)を一夜実施した。固相をＣ１８スピンカラム（９６ウェルフォーマット，Ｈａｒｖａｒｄ装置）で抽出した後、溶出ペプチドをＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ）により乾燥させ、４０μｌの液体クロマトグラフィー（ＬＣ）溶液に再懸濁した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９５  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＭＳに接続したＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＬＣシステムで試料を分析した。１０μｌの試料を２５ｃｍカラム（ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐ  ２．１×２５０ｍｍ）に直接注入し、勾配３００μｌ／分で２３分間にわたって分離した。Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェア  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１（ＭａｃＣｒｏｓｓ  Ｌａｂ）を用いてデータを解析し、重／軽(heavy/light)（Ｈ／Ｌ）比を用いてタンパク質濃度を計算した。２週間にわたる連続操作に際して、日間の相対標準偏差(relative standard deviation)（ＲＳＤ）は、新生標準ペプチドのピーク面積について調整した場合と調整しなかった場合でそれぞれ＜２０％および＜５％であった。
【００９２】
ＡＳＣＯＴ試験
アングロスカンジナビアンにおける心臓予後試験(Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial)（ＡＳＣＯＴ）試験は、血圧降下処置と脂質低下処置の二重盲検ランダム化２×２要因試験(factorial study)である(Sever, Lancet 2003, 361: 1149-58; Poulter, Lancet 2005, 366: 907-13)。合計１４，４１２人の患者（年齢４０〜７９歳）を、１９９８〜２０００年に、コンピューター作成した最適割当てメカニズムを用いて試験実施に関与するすべての者に隠した状態でＡＳＣＯＴにランダム化した。脂質低下アームにランダム化された患者は低ないし中等度のコレステロールレベル（血清総コレステロール≦６．５ｍｍｏｌ／ｌ）をもち、アトルバスタチン（１０ｍｇ／日）またはプラセボに割り当てられた。ＡＳＣＯＴの高血圧症関連−心血管疾患(hypertention-associated cardiovascular disease)（ＨＡＣＶＤ）サブスタダィーに参加した、Ｔ２ＤＭを伴わない欧州人種のランダム化個体（ｎ＝１５５：７３人は介入グループ、８２人はプラセボグループ）において、血清ｍｉＲ−１２２レベルをベースラインおよびスタチン処置開始の１年（中央値１３［範囲１２〜１６］か月）後に測定した(Stanton, J Hum Hypertens 2001, 15 Suppl 1: S13-8)。
【００９３】
マウスのアンタゴｍｉＲ処理
マウスにアンタゴｍｉＲ−１２２および対照アンタゴｍｉＲ類（６５ｍｇ／ｋｇ）を、先の記載に従って３日連続して腹腔内注射した(Zampetaki, Circ Res 2014, 115: 857-66)。アンタゴｍｉＲ類はＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓから下記の配列をもつものを購入した：アンタゴｍｉＲ−１２２  −  Ｃ＊Ａ＊ＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃｈｏｌ＊−Ｔ；対照  −  Ａ＊Ａ＊ＧＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＵＧＡＡ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃｈｏｌ−Ｔ。マウスを７日目にと殺した。肝臓および血清試料を分析用に採集した。
【００９４】
ノーザンブロット分析
ｍｉＲＮＡ発現を先の記載に従ってノーザンブロット分析により査定した(Suarez, Circ Res 2007, 100: 1164-73)。要約すると、総ＲＮＡ（５μｇ）を１５％アクリルアミドＴＢＥ  ８Ｍウレアゲル上で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋  ナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上へブロットした。成熟ｍｉＲ−１２２に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ−３’）を［α−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で末端標識して、高特異的活性プローブを作成した。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プロトコルに従ってハイブリダイゼーションを実施した。特異的放射性標識プローブとの一夜のメンブレンハイブリダイゼーションの後、メンブレンを４２℃で３０分間、４×ＳＳＣ／０．５％  ＳＤＳ中において１回洗浄し、オートラジオグラフィーを施した。同等な装填が得られるように制御するために、ブロットを５Ｓ  ｒＲＮＡについて再検査した：５’−ＣＡＧＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＴＴＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＡＣＧＡＧＡＴ−３’。
【００９５】
ＲＮＡ単離および定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡは、肝臓および肝細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いて単離された。ｍＲＮＡ定量のために、ｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡを合成した。ｉＱ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）をｉＣｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を三重に実施した。ｍＲＮＡレベルをハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨまたは１８Ｓに対して正規化した（表２のプライマー配列を参照）。ｍｉＲＮＡ定量のために、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを逆転写した。マウスｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ１４８ａおよびｍｉＲ−３３ａに対して特異的なプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、数値をＳＮＯＲＤ６８（Ｑｉａｇｅｎ）に対して正規化した。マウス組織について、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ）を用いて、ＨＦＤを給餌した野生型マウスからの総肝臓ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ中に単離した。前記に従って１μｇの総ＲＮＡを逆転写し、遺伝子／ｍｉＲＮＡ発現を査定した。
【００９６】
マウスにおける総およびＨＤＬコレステロールの測定
脂質分析のために、１２時間の一夜絶食後に眼窩後静脈穿刺により血液試料を採集した。遠心により血漿を分離し、４℃で保存した。Ｔ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｎｄ  ＨＤＬ−Ｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて各試料中の総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールを酵素測定した。
【００９７】
マウスのスタチン処理
６週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｐｉｅｔｒｏ  ａｌ  Ｎａｔｉｓｏｎｅ，イタリア）から購入し、２２℃において１２時間の明／暗サイクルで特別な無病原体条件下に固形試料と水を任意に摂取できる状態で収容した。マウスに１日１回、２０ｍｇ／ｋｇのアトルバスタチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ドイツ、タウフキルヘン）を５日間、腹腔内注射した。５日目にマウスをと殺した。心臓穿刺により血清を採集した。肝臓に氷冷リン酸緩衝化生理食塩水を潅流し、さらなる処理まで左下葉からの組織検体を瞬間凍結するか、またはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ、ヒルデン）に入れておいた。
【００９８】
初代肝細胞のスタチン処理
インビトロ実験のために、初代マウス肝細胞を先の記載に従って単離した(Moschen, Hepatology 2011, 54: 675-86)。要約すると、マウスを麻酔処理し、腹部を切開し、肝臓、大静脈、および門脈を準備した。肝臓を腹部大静脈から肝静脈を経て（肝静脈の近くの大静脈をマイクロクランプで咬合した）門脈まで、ペリスタルティックポンプ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて逆行潅流した。肝臓をまず、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡを補足した肝臓潅流媒体１を用いて７ｍｌ／分の流速で１０分間潅流した。その後、３０μｇ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，ドイツ、マンハイム）を含有する肝臓潅流媒体２を３．５ｍｌ／分の流速でさらに１０分間用いた。肝臓を慎重に摘出し、Ｌ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ，カリフォルニア州カールスバッド）を入れたペトリ皿に移した。被膜を切開し、得られた細胞懸濁液を１００μｍの細胞ストレーナー(cell strainer)に通した。３０×ｇで３分間の低速遠心により肝細胞を沈降させた。等密度パーコール(Percoll)遠心の後、純度および生存率は＞９０％であった。１．３×１０５／ｃｍ２の肝細胞を、コラーゲンコートした６ウェルプレート上の１０％  ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したウイリアムＥ培地(William’s E medium)に播種した。細胞を一夜静置した後、肝細胞を０．１、１０および２５μＭのアトルバスタチンに２４時間曝露した。上清を採集し、緩衝液ＲＬＴ中で細胞を溶解した。両方ともさらなる仕上げ処理まで−８０℃で保存した。
【００９９】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍｉＲＮＡ−１２２測定
ｍｉＲ−１２２を先の記載に従って測定した(Willeit, Circ Res 2013, 112: 595-600; Zampetaki, Circ Res 2010, 107: 810-7)。要約すると、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ、ヒルデン）を用いてｍｉＲＮＡを抽出した。血漿、血清、または細胞培養上清について、２５μｌのＲＮＡ溶出液のうち固定体積３μｌを逆転写（ＲＴ）反応のための装入材料として用いた。細胞または組織からのＲＮＡについては、１００ｎｇの装入材料をＲＴのために用いた。Ｍｅｇａｐｌｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｐｏｏｌｓ（Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｏｌｓ  Ａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１またはＲｏｄｅｎｔ  Ｐｏｏｌ  Ａ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ドイツ、ダルムシュタット）を用いてｍｉＲＮＡを逆転写し、Ｍｅｇａｐｌｅｘ  ＰｒｅＡｍｐ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ａ  ｖ２．１）を用いて生成物をさらに増幅した。ＲＴおよびＰｒｅＡｍｐ両方の生成物を−２０℃で保存した。Ｔａｑｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  ａｓｓａｙを用いて個々のｍｉＲＮＡの発現を査定した。希釈した増幅前生成物（０．５μｌ）またはＲＴ生成物（０．４５ｎｇの装入量に相当する）を０．２５μｌのＴａｑｍａｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｓｓａｙ（２０×）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２．５μｌのＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（２×）と混和して、５μｌの最終体積にした。ｑＲＴ−ＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴサーモサイクラーにより、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル、実施した。すべての試料を二重に試験した。実験室技術者に参加者の疾患状態が分からないようにした。ソフトウェアＳＤＳ２．２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて相対定量を実施した。Ｕ６および外来Ｃ．エレガンス  スパイク−イン対照（Ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９）を正規化の目的で用いた。
【０１００】
ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析
高性能ｃＤＮＡ  ＲＴキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて総ＲＮＡを逆転写した。ＲＴ生成物（６．７５ｎｇの装入ＲＮＡに相当する）、０．２５μｌのＴａｑｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙおよび２．５μｌのＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ（２×）を５μｌの総体積で混和した。サイクリング条件はｍｉＲＮＡ分析と同一であった。ＧＡＰＤＨを正規化対照として用いた。
【０１０１】
統計
予め特定した解析計画に従って統計解析を実施した。ｍｉＲ−１２２値を解析のために対数変換した。スピアマン相関係数ならびに年齢および性について調整した線形回帰モデルを用いて、ｍｉＲ−１２２レベルと他の参加者特徴との横断的関連性を定量した。前向き解析には、ＣＶＤおよびＴ２ＤＭについての更新した共変量によるコックス比例ハザード回帰、およびメタボリックシンドロームについてのプールしたロジスティック回帰(D’Agostino, Stat Med 1990, 9: 1501-15)を用いた。両方法とも、１９９５年および２０００年の試験で得られたｍｉＲ−１２２の反復測定値を十分に利用した。ハザード比とオッズ比は同じ尺度の相対リスクを表わすと推定して、リスク比（ＲＲ）としてまとめて記載する。罹患疾患を伴う参加者をそれぞれの解析から除外した。モデルを年齢および性に加えて、社会経済的状態（低、中、高）、喫煙（有、無）、身体活動およびアルコール摂取について調整した（“多変量モデル”）。感度分析をさらに潜在的な仲介因子／交絡因子である肥満度指数およびウェスト−ヒップ比について調整した。シェーンフィールド残基を用いてＣＶＤおよびＴ２ＤＭについての比例ハザード推定を検定し、集合させた。年齢（＜６０歳、６０〜７０歳、＞７０歳）、性、スタチン摂取、および肥満症（肥満度指数：＜２５、２５〜３０、＞３０）により規定したグループ間の交互作用について、フォーマルテストにより効果修飾(effect modification)を調べた。主成分分析には、両側有意水準Ｐ＜０．０５を用いた。探索的解析には、偽陽性結果のリスクを制限するために、ボンフェローニ補正したＰ値を用いた（すなわち、脂質亜種の解析には０．０００３７；タンパク質には０．０００５４；交互作用検定には０．００４２）。Ｓｔａｔａソフトウェア，ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．１を用いて解析を実施した。試験方法および所見をＳＴＲＯＢＥガイドラインに従ってレポートした。
【０１０２】
試験の承認
ブルーニコ試験プロトコルはボルツァーノの地域倫理委員会により承認された(‘Comitato etico del comprensorio sanitario di Bolzano’;承認番号28−2010)。ＡＳＣＯＴ試験プロトコルは英国の中央および地域倫理委員会審査委員会ならびにアイルランドおよびノルディックカントリーの国立倫理委員会および国策機関により承認された。動物実験はオーストリア関係当局により承認され(A. R. Moschenに対して許可 No BMWF-66.011/0040-II/10b/2009)、英国関係当局により承認された(Q. Xuに対して許可 No. PPL70/7266)。書面によるインフォームドコンセントをブルーニコおよびＡＳＣＯＴ参加者から試験参加前に受け取った。
【０１０３】
実施例２：循環マイクロＲＮＡ−１２２はメタボリックシンドロームおよび２型糖尿病の発生と関連する
実施例のまとめ
前向き集団ベースのブルーニコ試験において、循環ｍｉＲ−１２２とインスリン抵抗性、肥満症、メタボリックシンドローム、糖尿病、および有害な脂質プロフィールとの関連性を調べた。質量スペクトルを用いて、１３５の脂質亜種および９３の血漿タンパク質を定量した。ｍｉＲ−１２２は、アファミン、亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質、補体因子Ｈ、ならびに幾つかのアポリポタンパク質、特にａｐｏＢ、ａｐｏＣ２、ａｐｏＣ３およびａｐｏＥのレベルと密接に関係していた。アングロスカンジナビアンにおける心臓予後試験（ＡＳＣＯＴ，ｎ＝１５５）において、アトルバスタチン処置は循環ｍｉＲ−１２２レベルを低減した。類似のスタチン応答がマウスおよび培養肝細胞にみられた。ブルーニコ試験において、最大１５年間の追跡（１９９５−２０１０）にわたって心血管代謝性疾患の発生を記録した（臨床事象についての追跡率：１００％）。１−ＳＤ高いｌｏｇ  ｍｉＲ−１２２当たりの、年齢、性、社会経済的状態、喫煙、身体活動および、アルコール摂取について調整したリスク比は下記のとおりであった：１．６０（１．３０〜１．９６；Ｐ＜０．００１）：メタボリックシンドロームについて、１．３７（１．０３〜１．８２；Ｐ＝０．０２１）：２型糖尿病について、および１．１０（０．９０〜１．３３；Ｐ＝０．３３０）：心血管疾患について。
【０１０４】
結論：循環ｍｉＲ−１２２レベルは、一般集団において肝代謝ならびにメタボリックシンドロームおよび糖尿病の発生のリスクと強く関連する。
詳細な結果
ブルーニコ試験におけるｍｉＲ−１２２の相関性
ブルーニコ試験の参加者８２６人中の８１０人においてｍｉＲ−１２２の定量に成功した；彼らのベースライン特徴を表１にまとめる。試験参加者の平均年齢は６３歳（ＳＤ，１１）であり、半数は女性であった。５年離して行なったｍｉＲ−１２２の反復測定の解析で、個人内相関性(within-person correlation)は０．２４（９５％信頼区間：０．１７〜０．３１；図６）であった。血漿中と血清中のｍｉＲ−１２２レベルの相関係数は０．８６（０．８４〜０．８８；図６）であった。年齢および性につき調整した解析において、ｍｉＲ−１２２レベルは肝酵素のレベル、インスリン感受性、脂肪症(adiposity)、主要脂質（トリグリセリド、ＬＤＬ−およびＨＤＬ−Ｃ）、ならびにＴ２ＤＭおよびメタボリックシンドロームの有病率と関連していた（表１）。彼らの健康なカウンターパートと比較して、循環ｍｉＲ−１２２はＴ２ＤＭを伴う参加者において２１４％高く（７０〜４８１％）、メタボリックシンドロームを伴う参加者において１６０％高かった（７６〜２８５％）。
【０１０５】
特に、ｍｉＲ−１２２の量を平均および四分位範囲として決定した。メタボリックシンドロームを発現するリスクを伴う者は中央ｍｉＲ−１２２値１．０５（四分位範囲：０．６５〜２．９３）をもつことが示された。同様に、２型糖尿病を発現するリスクを伴う者は中央ｍｉＲ−１２２値０．９４（四分位範囲：０．５５〜１．６６）をもつ。これに対し、これら２疾患のいずれに対するリスクも伴わない者は中央ｍｉＲ−１２２値０．６５（四分位範囲：０．３４〜１．１２）をもつ。
【０１０６】
さらに、メタボリックシンドロームが発現した者において健康な基準集団と比較してｍｉＲ−１２２の量が１６０％増加する（すなわち、２６０％の数値になる）ことが見出された。同様に、２型糖尿病が発現した者において健康な基準集団と比較してｍｉＲ−１２２の量が２１４％増加する（すなわち、３１４％の数値になる）。意外にも、罹患した者はこれらの疾患が発現する５年前に既に増大したｍｉＲ−１２２レベルを示した。特に、メタボリックシンドロームが発現する５年前に、ｍｉＲ−１２２の量は健康な基準集団と比較して既に１０４％増加していた（すなわち、２０４％の数値になっていた）。同様に、２型糖尿病が発現する５年前に、ｍｉＲ−１２２レベルは健康な基準集団と比較して既に４９％増加していた（すなわち、１４９％の数値になっていた）。
【０１０７】
ｍｉＲ−１２２レベルはトリグリセリドと正の関連性をもち、肥満度指数およびウェスト−ヒップ比とはより弱い関連性をもち、ＨＤＬ−コレステロールとは逆の関連性をもっていた。
【０１０８】
【表１−１】
2019500053.tif 000003
【０１０９】
【表１−２】
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【０１１０】
ｍｉＲ−１２２とリピドームプロフィール
ｍｉＲ−１２２は、ブルーニコ試験で測定した１３５の脂質亜種のうち、肝臓デノボ−リポジェネシスに由来する可能性のある飽和およびモノ不飽和脂肪酸を含む脂質亜種との特異的関連性を示した（図１Ａ）。一般集団におけるこの所見は、マウスへのアンタゴｍｉＲ−１２２注射を用いた実験により立証されたように、肝代謝の調節におけるｍｉＲ−１２２の役割により支持される。本発明者らはｍｉＲ−１２２発現のほぼ完全な阻害を達成した（図１Ｂおよび図８）。興味深いことに、ｍｉＲ−３３、すなわち脂質代謝に関与する多数の遺伝子の発現を制御するｍｉＲＮＡの肝臓発現が、アンタゴｍｉＲ−１２２で処理したマウスにおいて減弱した。ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−１４８ａを含めた脂質代謝と関連する他のｍｉＲＮＡの発現は、両グループのマウスにおいて類似していた（図１Ｃ）。先のレポート(Esau, Cell Metab 2006, 3: 87-98; Kruetzfeldt, Nature 2005, 438: 685-9; Elmen, Nature 2008, 452: 896-9; Lanford, Science 2010, 327: 198-201)と一致して、アンタゴｍｉＲ−１２２による処理の結果、コレステロールレベルが低下した（図１Ｄ）。さらに、本発明者らは、脂質代謝、特にデノボ−リポジェネシスおよびリポタンパク質アセンブリーに関与することが示唆されているある範囲の遺伝子（ＡＣＣ１、ＣＴＰ１、ＦＡＳ、ＳＣＤ１、ＭＴＴＰ、ＳＲＥＢＰ１；図１Ｅ）のダウンレギュレーションを観察した。
【０１１１】
ｍｉＲ−１２２とプロテオームプロフィール
ブルーニコ試験におけるリピドミクス測定を４桁を超える多数の血漿タンパク質のＭＳによる査定によって補足した。このタンパク質パネルは、脂質代謝に対するｍｉＲ−１２２の作用がどのようにして心血管代謝リスクを仲介できるかの洞察を得るために、広範なアポリポタンパク質、補体および凝固因子をカバーしている。ｍｉＲ−１２２は、アファミン（年齢および性につき調整した相関係数：＋０．４２  Ｐ＝４×１０−３０）および亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質（−０．２８；Ｐ＝１０−１３）と最も強く関連していた（図３）。アポリポタンパク質に注目した解析により、ＡＰＯＢ、ＡＰＯＣ２、ＡＰＯＣ３およびＡＰＯＥとの有意の正の相関性、ならびにＡＰＯＡ４およびＡＰＯＤとの有意の逆相関性が明らかになった（図３）。すべてのタンパク質についての相関性を図８に提示する。
【０１１２】
スタチン類がｍｉＲ−１２２レベルに及ぼす影響
肝臓脂質代謝と循環ｍｉＲ−１２２レベルの相互作用をさらに査定するために、ＡＳＣＯＴ試験の高血圧症関連−心血管疾患（ＨＡＣＶＤ）サブスタディーからの試料を用いた。アトルバスタチンによる処理は、総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の濃度、および血清ｍｉＲ−１２２レベルの低下をもたらした（図２Ａ）（すべてＰ＜０．００１）が、同じ試料において定量した他のｍｉＲＮＡのレベルは低下させなかった（データを示していない）。類似の影響が、アトルバスタチンで処理したマウスの血清、ならびに１０および２５μＭのアトルバスタチンと共にインキュベートした初代肝細胞の培地において観察された（図２Ｂおよび２Ｃ）。
【０１１３】
ブルーニコ試験におけるｍｉＲ−１２２および心血管代謝性疾患の発生
ブルーニコ試験において、本発明者らは１３６のメタボリックシンドローム発生事象、
５７のＴ２ＤＭ事象、および１０８のＣＶＤ事象を記録した。上３分の１と下３分の１のｍｉＲ−１２２レベルを比較した年齢および性につき調整したリスク比は下記のとおりであった：２．８５（１．７８〜４．５６；Ｐ＜０．００１）：メタボリックシンドロームについて，２．９２（１．３４〜６．３５；Ｐ＝０．００７）：Ｔ２ＤＭについて，および１．２５（０．７８〜２．００；Ｐ＝０．３４７）：ＣＶＤについて（図４）。１−ＳＤ高いｌｏｇ  ｍｉＲ−１２２当たりのリスク比は下記のとおりであった：１．６０（１．３０〜１．９６；Ｐ＜０．００１）：メタボリックシンドロームについて，１．３７（１．０３〜１．８２；Ｐ＝０．０２１）：Ｔ２ＤＭについて，および１．１０（０．９０〜１．３３；Ｐ＝０．３３０）：ＣＶＤについて（図４）。社会経済的状態、喫煙、身体活動およびアルコール摂取についてさらに調整した際にリスク比は実質的に同一のままであったが、肥満度指数およびウェスト−ヒップ比ならびにｌｎ  ＨＯＭＡ−ＩＲについてさらに調整した際には若干減弱した（図４）。本発明者らは女性と男性、スタチン摂取、および脂肪症の臨床カテゴリーにつき概して類似の結果を観察したが、おそらく＜６０歳の参加者においてはより高齢の彼らのカウンターパートと比較してＣＶＤ発生とのより強い関連性がみられるであろう（Ｐ＝０．００６）（図９）。
【０１１４】
考察
この試験において、本発明者らはｍｉＲ−１２２関連の代謝シグネチャーを同定するための集団ベースの試験に多次元‘オミックス法（リピドミクスおよびプロテオミクス）を用いる。メカニズム状況を提示するための実験追跡と組み合わせた、＞３０００のヒト血液試料におけるｍｉＲＮＡ測定に基づく多数の重要な全く新しい結果をレポートする。第１に、循環ｍｉＲ−１２２レベルは心血管代謝性疾患に罹患している者において増大しており、肝臓デノボ−リポジェネシスにより産生される可能性がある脂質種と強く相関する。前向き設定で、血清ｍｉＲ−１２２レベルの増大はメタボリックシンドロームおよびＴ２ＤＭの発現に先立って起きるが、ＣＶＤについてはそうではない。第２に、血清ｍｉＲ−１２２レベルは一般集団において主要脂質（トリグリセリド、ＬＤＬ−およびＨＤＬ−Ｃ）と正の相関性をもち、スタチン療法（アトルバスタチン１０ｍｇ）によるコレステロール低減に伴って実質的に低下する。本発明者らはこの所見を、アトルバスタチン攻撃したヒト肝細胞の上清およびアトルバスタチン処理した野生型マウスの血清においてｍｉＲ−１２２の低減を立証するインビトロおよびインビボ実験によってさらに確証し、肝臓における脂質代謝に関与する酵素に対するｍｉＲ−１２２の作用を確認した。全体として、本発明者らは循環ｍｉＲ−１２２が肝臓における脂質およびグルコース代謝のマーカーであることについての強い証拠を提示する。
【０１１５】
循環ｍｉＲ−１２２のシステム全体的関係
主に肝臓に発現するｍｉＲ−１２２(Lagos-Quintana, Curr Biol 2002, 12: 735-9)は、コレステロールおよび脂肪酸の代謝に関連する種々の遺伝子の発現を調節することが示唆されている(Rottiers, Nat Rev Mol Cell Biol 2012, 13: 239-50)。マウスにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンタゴｍｉＲを用いたｍｉＲ−１２２の阻害は、血漿コレステロールレベルの顕著な低下をもたらし、肝臓脂質合成を停止させ、肝臓脂肪酸酸化を増大させた(Esau, Cell Metab 2006, 3: 87-98; Kruetzfeldt, Nature 2005, 438: 685-9)。非ヒト霊長類における２つの試験によって類似のコレステロール低減がレポートされている(Elmen, Nature 2008, 452: 896-9; Lanford, Science 2010, 327: 198-201)。これらのレポートと一致して、本発明者らの試験は、アンタゴｍｉＲ−１２２を用いたｍｉＲ−１２２の選択的阻害（ｍｉＲ−３３との若干の相互干渉を伴う）が脂質代謝における関与を示唆されている酵素のダウンレギュレーションをもたらすことを示した。さらに、ブルーニコ試験において、循環中の高い循環ｍｉＲ−１２２レベルは一般に有害な脂質プロフィールと関連していた；これはＣＶＤ(Stegemann, Circulation 2014, 129: 1821-31)およびＴ２ＤＭ発症(Rhee, J Clin Invest 2011, 121: 1402-11)に関係していることを本発明者らおよび他の者が以前に示した（コレステリルエステルおよびトリアシルグリセロールとの強い正の相関性、リゾホスファチジルコリンとの強い逆相関性）。ｍｉＲ−１２２と短い炭素鎖長をもつ飽和およびモノ不飽和脂肪酸を含む脂質との正の相関性、ならびに超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）（ａｐｏＢ１００、ａｐｏＣ１、ａｐｏＣ２、ａｐｏＥ）上にみられるアポリポタンパク質との正の相関性は、ｍｉＲ−１２２と肝臓デノボ−リポジェネシスまたはＶＬＤＬ分泌との関連性を支持する。これは、ｍｉＲ−１２２ノックアウトマウスが発現するミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）、すなわちリポタンパク質のバイオジェネシスを調節する必須酵素がより少ないという概念によってさらに確証される(Wen, J Clin Invest 2012, 122: 2773-6)。これに対し、循環ｍｉＲ−１２２は血漿ＡｐｏＤ（主にＨＤＬに存在する）およびａｐｏＡ４（ＨＤＬおよびカイロミクロンの主成分）との逆相関性を示した。さらに、本発明者らによる血漿タンパク質の網羅的査定は、以前にメタボリックシンドロームおよびそれのすべての構成要素の罹患および発生と関連づけられていたアファミンとの正の相関性(Kronenberg, Circ Cardiovasc Genet 2014, 7: 822-9)、マロンジアルデヒドエピトープを結合して酸化的ストレスから保護するタンパク質である補体因子Ｈとの正の相関性(Weismann, Nature 2011, 478: 76-81)、ならびに脂肪細胞において脂質分解およびより高いインスリン感受性をもたらすアディポカインである亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質との逆相関性(Garrido-Sanchez, PLoS One 2012, 7: e33264; Yang, Diabetes Care 2013, 36: 1074-82)を回復した。
【０１１６】
新規バイオマーカーとしての循環ｍｉＲ−１２２
ｍｉＲ−１２２および心血管代謝状態について得られる疫学的証拠は少ない。Gaoら(Gao, Lipids Health Dis 2012, 11: 55)は、高脂血症を伴う患者においてｍｉＲ−１２２がより高く、総コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ−Ｃ、および冠動脈疾患の存在と正の相関性をもつことをレポートした。外科処置誘発性の体重減少はｍｉＲ−１２２の顕著な低減を生じた(Ortega, Clin Chem 2013, 59: 781-92)。今回の試験で、本発明者らが  −初めて−  ｍｉＲ−１２２のベースラインレベルはメタボリックシンドロームの発現と関連し、より弱くではあるがＴ２ＤＭと関連することを示す。これに対し、ｍｉＲ−１２２とＣＶＤ発生には関連性がなかった；ただし、リスク比推定値の信頼区間が広く、心血管系に対する有害な代謝状態の長期予後を完全に捕らえるためにはより長い追跡時間が必要であった可能性はある。さらに、６０歳より若い個体においてｍｉＲ−１２２とＣＶＤの間の正の関連性を方向づけるシグナルがサブグループ解析によって解明された。明らかに、心血管代謝リスクの強い決定因子である脂肪症の程度によって関連性が変動することはなかった(Wuertz, PLoS Med 2014, 11: e1001765; Fall, PLoS Med 2013, 10: e1001474)。
【０１１７】
スタチン処置は肝臓からのリポタンパク質とｍｉＲ−１２２両方の放出を低減した。ｍｉＲ−１２２はＶＬＤＬおよびＨＤＬを含めたリポタンパク質には存在しない（表３）か、またはきわめて低いレベルで、すなわちＬＤＬに存在するにすぎない(Vickers, Nat Cell Biol 2011, 13: 423-33)ので、スタチン類が循環ｍｉＲ−１２２レベルに及ぼす顕著な作用を血漿リポタンパク質に対する作用によって説明することはできない。そうではなく、それはｍｉＲ−１２２が多量に局在していた肝エクソソームの分泌低減（図５）によって起きる可能性が最も大きい(Huang, BMC Genomics 2013, 14: 319; Gallo, PLoS One 2012, 7: e30679)。循環ｍｉＲ−１２２はエクソソーム枯渇した血清中には検出できない(Gallo, PLoS One 2012, 7: e30679)。スタチン類は、コレステロール合成を阻害することによりタンパク質のプレニル化(prenylation)をも調節する(Wang, Dev Cell 2008, 15: 261-71)。この翻訳後修飾はタンパク質、特に、エクソソーム分泌の種々の段階を制御するＲａｂ２７タンパク質の、膜局在化を促進する(Jae, FEBS Lett 2015, 589: 3182-8; Ostrowski, Nat Cell Biol 2010, 12: 19-30)。スタチン類は、Ｒａｂタンパク質プレニル化および肝エクソソーム分泌を阻害することにより循環ｍｉＲ−１２２レベルを低減する可能性がある。後者はスタチン薬物療法の有益な多面的効果の新規部分を構成している可能性がある。
【０１１８】
臨床実施におけるｍｉＲ−１２２のトランスレーショナルな潜在能力
ｍｉＲ−１２２は、代謝作用のほかに、非アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、およびウイルス性肝炎、ならびに肝疾患を含めた、種々の肝疾患と関連づけられている(Laterza, Biomark Med 2013, 7: 205-10; Zhang, Clin Chem 2010, 56: 1830-38)。ｍｉＲ−１２２は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製、翻訳およびパッケージングを容易にし、それによりウイルスの慢性感染を促進する(Lanford, Science 2010, 327: 198-201; Rottiers, Nat Rev Mol Cell Biol 2012, 13: 239-50)。この特定の状態について、ｍｉＲ−１２２をターゲティングするアンチセンスベースの薬物が開発中である(Baek, Arch Pharm Res 2014, 37: 299-305; Lindow, J Cell Biol 2012, 199: 407-12)。慢性Ｃ型肝炎遺伝子型１感染症を伴う３６人の患者における最近の第２ａ相試験において、アンチセンスオリゴヌクレオチド‘ミラビルセン(miravirsen)’による処置がＣ型肝炎ウイルスＲＮＡレベルを用量依存性様式で低下させた(Janssen, N Engl J Med 2013, 368: 1685-94)。他の２つの進行中の第２相臨床試験には、ペグインターフェロンαおよびリバビリン(ribavirin)による処置に応答しなかった患者が含まれていた（ＮＣＴ０１８７２９３６，ＮＣＴ０２０３１１３３）。ｍｉＲ−１２２の療法用阻害薬を入手できれば、心血管代謝仲介による形質および疾患にｍｉＲ−１２２介入が及ぼす効果を患者において試験する機会が得られる（進行中の試験における二次エンドポイントとして、または一次エンドポイントとして）。
【０１１９】
長所と限界
本発明者らの試験には幾つかの長所と限界があった。前向きブルーニココホートは、１００％の追跡ならびに臨床エンドポイントおよび潜在交絡因子の高度の確認で、きわめて良好に解明されている。独立した関連性の同定を補助するために、本発明者らは、喫煙、社会的階級、身体活動および脂肪症尺度を含めた大パネルの潜在交絡因子について調整した。本発明者らの統計モデルにはｍｉＲ−１２２の反復測定を採用した；それは、ｍｉＲ−１２２の個体内変動性が高かったことを考慮すると（５年にわたる相関係数：０．２４）特に重要である。糖尿病患者において低減する血小板関連ｍｉＲＮＡ(Willeit, Circ Res 2013, 112: 595-600; Elgheznawy, Circ Res 2015; 117: 157-65)と対照的に、ｍｉＲ−１２２レベルはメタボリックシンドロームおよびＴ２ＤＭとの正の関連性を示し、血清および血漿中において相関性が高かった。本発明者の試験の潜在的限界は、ブルーニコ試験集団がすべて白人だったことである。ＡＳＣＯＴ試験は、中等度に高いＣＶＤリスクをもつ高血圧症の個体を伴っており、ある程度の選抜集団であった。最後に、ｍｉＲ−１２２は血清および血漿中において測定された。肝臓における発現データはより直接的な尺度であろうが、明らかにこれは集団試験には適さない。
【０１２０】
結論
高い循環ｍｉＲ−１２２レベルは、肝臓デノボ−リポジェネシスおよび有害な代謝プロフィールに由来する可能性がある飽和およびモノ不飽和脂肪酸を含有する複雑な脂質と相関しており、アトルバスタチンによるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害はｍｉＲ−１２２放出を低減し、一般集団において循環ｍｉＲ−１２２レベルは将来のメタボリックシンドロームおよびＴ２ＤＭの発現と関連する。
【０１２１】
【表２】
2019500053.tif 000005
【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
本発明は下記のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について述べる：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１：成熟ヒトｍｉＲ−１２２のヌクレオチド配列
５’  ｕｇｇａｇｕｇｕｇａｃａａｕｇｇｕｇｕｕｕｇ  ３’
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２：シード配列ヒトｍｉＲ−１２２のヌクレオチド配列
５’  ｇｇａｇｕｇｕ  ３’
【図１−１】
2019500053.tif 000007
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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