(57)【要約】【課題】本明細書では、ＣＤ３に結合するドメイン、半減期拡張ドメインおよび、ＰＳＭＡに結合するドメインを含む、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質が提供される。また、その医薬組成物、同様に、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞も提供される。さらに、疾患、疾病、および障害の予防、および／また処置において本開示のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質を使用する方法も提供される。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質であって、前記三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および
（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合される、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２】
第１のドメインは、各々がヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、可変軽鎖と可変重鎖を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３】
第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４】
第１のドメインはヒト化されるか、またはヒトである、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５】
第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１５０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６】
第２のドメインはヒト血清アルブミンと結合する、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項７】
第２のドメインは、ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項８】
第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項９】
第３のドメインは、ＰＳＭＡと特異的に結合する、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１０】
第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１１】
リンカーＬ１とＬ２は各々、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、または、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）から独立して選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１２】
リンカーＬ１とＬ２は、各々独立して（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）である、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１３】
第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で結合される、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１４】
第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で結合される、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１５】
前記三重特異性タンパク質は、約８０ｋＤａ未満である、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１６】
前記三重特異性タンパク質は、約５０−約７５ｋＤａである、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１７】
前記三重特異性タンパク質は、約６０ｋＤａ未満である、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１８】
前記三重特異性タンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項１９】
前記三重特異性タンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２０】
同じＰＳＭＡに対するＩｇＧと比較して、前記三重特異性タンパク質は増加した組織浸透を有する、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２１】
前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の医薬組成物の有効な量の投与を含む、癌の処置を必要とする個体を処置する方法。
【請求項２４】
癌は、前立腺癌または、腎臓癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質であって、前記三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、
（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２６】
第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合される、請求項２５に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２７】
第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項２５または２６に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２８】
第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項２５乃至２７のいずれか１項に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２からなる群から選択される配列を含む、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３０】
前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０−１５２からなる群から選択される配列を含む、請求項２９に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３１】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質であって、前記三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、
（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３２】
第１のドメインは、可変軽鎖と可変重鎖を含み、それぞれヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３３】
第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３４】
第１のドメインはヒト化されるか、またはヒトである、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３５】
第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１５０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３６】
第２のドメインはヒト血清アルブミンと結合する、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３７】
第２のドメインは、ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３８】
第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項３９】
第３のドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４０】
リンカーＬ１とＬ２は各々、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、または、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）から独立して選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４１】
リンカーＬ１とＬ２は、各々独立して（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）である、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４２】
第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で結合される、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４３】
前記三重特異性タンパク質は、約８０ｋＤａ未満である、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４４】
前記三重特異性タンパク質は、約５０−約７５ｋＤａである、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４５】
前記三重特異性タンパク質は、約６０ｋＤａ未満である、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４６】
前記三重特異性タンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４７】
前記三重特異性タンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４８】
同じＰＳＭＡに対するＩｇＧと比較して、前記タンパク質は増加した組織浸透を有する、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項４９】
前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２からなる群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０−１５２からなる群から選択される配列を含む、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５１】
（ｉ）請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項５２】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質であって、前記三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および、
（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５３】
第１のドメインは、各々がヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、可変軽鎖と可変重鎖を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５４】
第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５５】
第１のドメインはヒト化されるか、またはヒトである、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５６】
第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１５０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５７】
第２のドメインはヒト血清アルブミンと結合する、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５８】
第２のドメインは、ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、ペプチド、リガンド、または小分子を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項５９】
第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６０】
第３のドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６１】
リンカーＬ１とＬ２は各々、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、または、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）から独立して選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６２】
リンカーＬ１とＬ２は、各々独立して（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）である、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６３】
第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−Ｌ１−（Ｂ）−Ｌ２−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で結合される、請求項３１に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６４】
前記三重特異性タンパク質は、約８０ｋＤａ未満である、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６５】
前記三重特異性タンパク質は、約５０−約７５ｋＤａである、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６６】
前記三重特異性タンパク質は、約６０ｋＤａ未満である、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６７】
前記三重特異性タンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６８】
前記三重特異性タンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項６９】
同じＰＳＭＡに対するＩｇＧと比較して、前記三重特異性タンパク質は増加した組織浸透を有する、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項７０】
前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２からなる群から選択される配列を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項７１】
前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０−１５２からなる群から選択される配列を含む、請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質。
【請求項７２】
（ｉ）請求項５２に記載の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項７３】
前立腺癌を処置する方法であって、
前記方法は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質の有効な量の投与を含み、
前記三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；
（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、方法。
【請求項７４】
前立腺癌を処置する方法であって、
前記方法は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質の有効な量の投与を含み、
前記三重特異性タンパク質は、
（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；
（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；
（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、
ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜相互参照＞
本出願は、２０１６年１１月２３日に出願された米国仮特許出願６２／４２６，０６９と、２０１６年１１月２３日に出願された米国仮特許出願６２／４２６，０７７の利益を主張し、文献は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜配列表＞
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０１７年１１月２７日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７−７０１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという命名をされ、１５０，９１１バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
個々の細胞または特定細胞型の選択的な破壊は、様々な臨床設定においてしばしば望まれることである。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しつつ、健康な細胞と組織を無傷のまま損傷を与えずに残すことが癌治療の主要な目的である。そのような１つの方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃および破壊させるために、腫瘍に対する免疫反応を引き起こすことによるものである。
【発明の概要】
【０００４】
三重特異性抗原結合タンパク質、その医薬組成物、核酸として、そのような三重特異性抗原結合タンパク質を作るための組換え発現ベクターと宿主細胞、および、疾患、障害、または疾病の処置のための使用の方法が本明細書で提供される。本明細書で記載されている、１つの態様では、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質であって、前記三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合される。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、各々がヒトＣＤ３に特異的に結合することができる、可変軽鎖と可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のドメインはヒト化されるか、またはヒトである。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＣＤ３発現細胞上でＣＤ３に対して１５０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態において、第２のドメインはヒト血清アルブミンと結合する。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ｓｃＦｖ、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、ペプチド、リガンド、または小分子を含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む、いくつかの実施形態において、第３のドメインは、ＰＳＭＡに特異的に結合する、ｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、非Ｉｇドメイン、リガンド、ノッチン、または小分子実体を含む。いくつかの実施形態において、第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は各々、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ    ＩＤ  ＮＯ：１５３）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、または、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）から独立して選択され、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は、各々独立して（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）である。いくつかの実施形態において、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨの順序で結合される。いくつかの実施形態において、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で結合される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、約８０ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は約５０〜約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は約６０ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態において、同じＰＳＭＡに対するＩｇＧと比較して、前記三重特異性タンパク質は増加した組織浸透を有する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２からなる群から選択される配列を含む。
【０００８】
他の態様では、（ｉ）上記実施形態のいずれか１つの前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質、および（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【０００９】
さらに上記実施形態のいずれか１つの医薬組成物または、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質の有効な量の投与を含む、癌の処置を必要とする個体を処置する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、癌は、前立腺癌または、腎臓癌である。
【００１０】
１つの実施形態において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質を提供し、前記三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここでは、第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合される。いくつかの実施形態において、第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００１１】
１つの実施形態において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質が提供され、前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記三重特異性タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０−１５２からなる群から選択される配列を含む。
【００１２】
１つの実施形態は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質を提供し、前記三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００１３】
１つの実施形態は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質を提供し、前記三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；および（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００１４】
１つの実施形態は、前立腺癌を処置する方法を提供し、前記方法は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質の有効な量の投与を含み、前記三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第３のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００１５】
１つの実施形態は、前立腺癌を処置する方法を提供し、前記方法は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質の有効な量の投与を含み、前記三重特異性タンパク質は、（ａ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第１のドメイン（Ａ）；（ｂ）半減期拡張ドメインである第２のドメイン（Ｂ）；（ｃ）ＰＳＭＡに特異的に結合する第３のドメイン（Ｃ）を含み、ここで、第１、第２および第３のドメインは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨの順序で、またはリンカーＬ１とＬ２によって、結合され、かつ第１のドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８からなる群から選択される１つまたは複数の配列を含む。
【００１６】
＜引用による組み込み＞
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、また特許出願が引用によって組み込まれるよう具体的且つ個別に示されるかのように、同じ程度まで引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の新規な特徴はとりわけ添付の請求項で説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図１】典型的なＰＭＳＡを標的とする三重特異性タンパク質の略図であり、三重特異性タンパク質は抗ＣＤ３ε単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と抗ＨＳＡ可変重鎖領域を含む不変のコア要素と、ＶＨ、ｓｃＦｖ、非Ｉｇバインダー、またはリガンドであり得るＰＳＭＡに結合する結合ドメインとを有する。
【図２Ａ】Ｔ細胞を誘発してヒト前立腺癌細胞を死滅させるためのＣＤ３に対する異なる親和性を有する例示的なＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）の能力を比較する。図２Ａは、前立腺癌モデルＬＮＣａＰにおける異なるＰＭＳＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子による死滅を示す。
【図２Ｂ】Ｔ細胞を誘発してヒト前立腺癌細胞を死滅させるためのＣＤ３に対する異なる親和性を有する例示的なＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）の能力を比較する。図２Ｂは、前立腺癌モデル２２Ｒｖ１における異なるＰＭＳＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子による死滅を示す。
【図２Ｃ】Ｔ細胞を誘発してヒト前立腺癌細胞を死滅させるためのＣＤ３に対する異なる親和性を有する例示的なＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）の能力を比較する。図２Ｃは、ＬＮＣａＰおよび２２Ｒｖ１前立腺癌モデルにおけるＰＭＳＡを標的とするＴｒｉＴＡＣのＥＣ５０値を示す。
【図３】静脈内投与（１００μｇ／ｋｇ）後３週間にわたるカニクイザルにおけるＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ  Ｃ２３６の血清濃度を示す。
【図４】、静脈内投与（１００μｇ／ｋｇ）後３週間にわたるカニクイザルにおける異なるＣＤ３親和性を有するＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の血清濃度を示す。
【図５Ａ】ＰＳＭＡに対して異なる親和性を有するＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子が、Ｔ細胞を誘発してヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを死滅させる能力を示す。図５Ａは、陽性対照としてＰＳＭＡを標的とするＢｉＴＥを用いて、ヒト血清アルブミンの非存在下で行われた実験を示す。
【図５Ｂ】ＰＳＭＡに対して異なる親和性を有するＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子が、Ｔ細胞を誘発してヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを死滅させる能力を示す。図５Ｂは、陽性対照としてＰＳＭＡを標的とするＢｉＴＥを用いて、ヒト血清アルブミンの存在下で行われた実験を示す。
【図５Ｃ】ＰＳＭＡに対して異なる親和性を有するＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子が、Ｔ細胞を誘発してヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰを死滅させる能力を示す。図５Ｃは、ＬＮＣａＰ前立腺癌モデルにおける陽性対照としてのＰＳＭＡを標的とするＢｉＴＥと共に、ＨＳＡの存在下または非存在下でのＴｒｉＴＡＣを標的とするＰＭＳＡについてのＥＣ５０値を示す。
【図６】マウス異種移植片実験においてＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子がヒト前立腺癌細胞の腫瘍増殖を阻害する能力を実証する。
【図７Ａ】標的タンパク質を発現するかまたは発現しない標的細胞株を用いた細胞死滅アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を示す。図７Ａは、ＬＮＣａＰ、ＫＭＳ１２ＢＭ、およびＯＶＣＡＲ８細胞株におけるＥＧＦＲおよびＰＳＭＡの発現を示す。
【図７Ｂ】標的タンパク質を発現するかまたは発現しない標的細胞株を用いた細胞死滅アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を示す。図７Ｂは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、およびネガティブコントロールＴｒｉＴＡＣによるＬＮＣａＰ腫瘍細胞の死滅を示す。
【図７Ｃ】標的タンパク質を発現するかまたは発現しない標的細胞株を用いた細胞死滅アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を示す。図７Ｃは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、および陰性対照ＴｒｉＴＡＣによるＫＭＳ１２ＢＭ腫瘍細胞の死滅を示す。
【図７Ｄ】標的タンパク質を発現するかまたは発現しない標的細胞株を用いた細胞死滅アッセイにおけるＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を示す。図７Ｄは、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲ、および陰性対照ＴｒｉＴＡＣによるＯＶＣＡＲ８細胞の死滅を示す。
【図８Ａ】３７℃でのプレインキュベーションおよび、凍結／解凍サイクルがＴｒｉＴＡＣ活性に与える影響を示す。図８Ａは、３７℃でのプレインキュベーションまたは凍結／解凍サイクル後のＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ２３５活性を示す。
【図８Ｂ】３７℃でのプレインキュベーションおよび、凍結／解凍サイクルがＴｒｉＴＡＣ活性に与える影響を示す。図８Ｂは、３７℃でのプレインキュベーションまたは凍結／解凍サイクル後のＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３５９活性を示す。
【図８Ｃ】３７℃でのプレインキュベーションおよび、凍結／解凍サイクルがＴｒｉＴＡＣ活性に与える影響を示す。図８Ｃは、３７℃でのプレインキュベーションまたは凍結／解凍サイクル後のＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６０活性を示す。
【図８Ｄ】３７℃でのプレインキュベーションおよび、凍結／解凍サイクルがＴｒｉＴＡＣ活性に与える影響を示す。図８Ｄは、３７℃でのプレインキュベーションまたは凍結／解凍サイクル後のＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６１活性を示す。
【図９Ａ】Ｔ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ）（ＴＤＣＣ）における、リダイレクトされた（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞が死滅させることに対する、本開示のＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の活性を示す。図９Ａは、ＬＮＣａＰ細胞の死滅における、カニクイザルドナーＧ３２２由来のカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をリダイレクトするＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の影響を示す。
【図９Ｂ】Ｔ細胞依存性細胞傷害性アッセイ（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ）（ＴＤＣＣ）における、リダイレクトされた（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ）Ｔ細胞が死滅させることに対する、本開示のＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の活性を示す。図９Ｂは、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞の死滅における、カニクイザルドナーＤ１７３由来のカニクイザルＰＢＭＣをリダイレクトするＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の影響を示す。
【図１０】Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の発現に関して、本開示のＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の影響を示す。
【図１１】は、ＰＳＭＡを発現する標的細胞の存在下で本開示のＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子がＴ細胞増殖を刺激する能力を示す。
【図１２Ａ】ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子によってリダイレクトされたＴ細胞がＬｎＣａＰ細胞を死滅させることを示す。図１２Ａは、ＰＳＭＡ  ＰＨ１Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５０）およびＰＳＭＡ  ＰＨ１  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５１）分子による、リダイレクトされたＴ細胞がＬｎＣａＰ細胞を死滅させることを示す。
【図１２Ｂ】ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子によってリダイレクトされたＴ細胞がＬｎＣａＰ細胞を死滅させることを示す。図１２Ｂは、ＰＳＭＡ  Ｚ２  ＴｒｉＴＡＣ（配列番号１５２）による、リダイレクトされたＴ細胞がＬｎＣａＰ細胞を死滅させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする三重特異性タンパク質、その医薬組成物、同様に、そのような三重特異性タンパク質を作るための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書で記載される。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の使用方法も提供される。ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３と同様にＰＳＭＡにも特異的に結合することができ、そしてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するドメインのような半減期延長ドメインを有する。図１は、三重特異性抗原結合タンパク質の１つの非限定的な例を描く。
【００１９】
１つの態様において、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメイン（Ａ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合するドメイン（Ｂ）、およびＰＳＭＡに特異的に結合するドメイン（Ｃ）を含む。三重特異性タンパク質中の３つのドメインは、任意の順序で配置される。したがって、三重特異性タンパク質のドメイン順序は以下のとおり企図される：
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨ、または
Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨ。
【００２０】
いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ａ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｂ）−（Ｃ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。いくつかの実施形態において、三重特異性タンパク質は、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ａ）−（Ｂ）−ＣＯＯＨのドメイン順序を有する。
【００２１】
ＰＳＭＡターゲティング三重特異性タンパク質は、ミドルドメイン（ｍｉｄｄｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）としてＨＳＡ結合ドメインを有し、そのようなドメインの順序は、Ｈ２Ｎ−（Ａ）−（Ｂ）−（Ｃ）−ＣＯＯＨまたは、Ｈ２Ｎ−（Ｃ）−（Ｂ）−（Ａ）−ＣＯＯＨである。中間ドメインとしてのＨＳＡ結合ドメイン、ＣＤ３およびＰＳＭＡ結合ドメインは、それらのそれぞれの標的に結合するためのさらなる適応性を与えられるような実施形態において企図される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、表１０に記載の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２）およびその部分配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載されている配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２）に対して少なくとも７０％−９５％以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載されている配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２）の少なくとも一部を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、表１０の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０−１５２）に記載されているように１つまたは複数のＣＤＲを含む。
【００２３】
本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員することによって、ＰＳＭＡを発現する細胞を特異的に標的とできるように設計されている。これは、単独の抗原に向けられた完全長の抗体を使用し、細胞傷害性Ｔ細胞を直接補充することができないＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）と比較して、有効性を改善する。対照的に、これらの細胞で特異的に発現されたＣＤ３分子を係合することにより、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、非常に特異的なやり方で細胞傷害性Ｔ細胞を、ＰＳＭＡを発現する細胞と架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）することができ、それによって、Ｔ細胞の細胞毒性の可能性を標的細胞へ向けることができる。本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＴＣＲの一部を形成する、表面発現されたＣＤ３タンパク質に結合することによって細胞傷害性Ｔ細胞と係合する。特定の細胞の表面上で発現されたＣＤ３およびＰＳＭＡへの複数のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の同時の結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、特定のＰＳＭＡを発現する細胞のその後の溶解を媒介する。したがって、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は強力で、特異的で、かつ効率的な標的細胞の死滅を表示するように企図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞による標的細胞の死滅を刺激して病原性細胞（例えば、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞）を排除する。そのような実施形態のいくつかでは、細胞は選択的に除去され、それによって、毒性の副作用の可能性が減少する。
【００２４】
本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質はさらに、従来のモノクローナル抗体とより小さな二重特異性の分子を上回る治療上の利点を与える。一般に、組換えタンパク質医薬品の有効性は、タンパク質自体の内因性の薬物動態学に極度に依存する。こうした利点の一つは、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性結合タンパク質が、ＨＳＡに特異的なドメインなどの半減期拡張ドメインを持っていることにより、薬物動態学的消失半減期を延長させたことである。この点で、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、いくつかの実施形態において、約２、３、約５、約７、約１０、または約１４日の延長された血清消失半減期を有する。このことは、消失半減期が比較的非常に短いＢｉＴＥまたはＤＡＲＴの分子などの他の結合タンパク質にとは対照的である。例えば、ＢｉＴＥのＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合分子は、消失半減期が短いため持続点滴（静脈内）による薬物送達を必要とする。ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のより長い内因性の半減時間は、この問題を解決し、それによって、低用量の医薬製剤、定期的な投与の減少、および／または新規な医薬組成物などの治療可能性を増加させる。
【００２５】
さらに本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質はさらに、組織への浸透と組織への分布を向上するための最適なサイズを有する。サイズが大きければ、標的組織中でのタンパク質の浸透または分布が制限されるか妨げられる。本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、組織への浸透と分布を向上可能とする小さなサイズを有することによりこれを回避する。これに応じて、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、いくつかの実施形態において、約５０ｋＤ−約８０ｋＤ、約５０ｋＤ−約７５ｋＤ、約５０ｋＤ−約７０ｋＤ、または約５０ｋＤ−約６５ｋＤのサイズを有する。したがって、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のサイズは、約１５０ｋＤであるＩｇＧ抗体よりも、および、約５５ｋＤであるが半減期が延長されておらず、ゆえに腎臓ですぐに除去されるＢｉＴＥとＤＡＲＴ二重特異性抗体分子よりも、有利である。
【００２６】
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、組織への浸透と分布を向上するための最適なサイズを有する。これらの実施形態において、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質はできるだけ小さくなるように構築され、その一方で、その標的に対する特異性を保持する。これに応じて、これらの実施形態において、本明細書に記載される三重特異性タンパク質は、約２０ｋＤ−約４０ｋＤ、約２５ｋＤ−約３５ｋＤ、−約４０ｋＤ、−約４５ｋＤ、−約５０ｋＤ、−約５５ｋＤ、−約６０ｋＤ、−約６５ｋＤのサイズを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、約５０ｋＤ、４９ｋＤ、４８ｋＤ、４７ｋＤ、４６ｋＤ、４５ｋＤ、４４ｋＤ、４３ｋＤ、４２ｋＤ、４１ｋＤ、４０ｋＤ、約３９ｋＤ、約３８ｋＤ、約３７ｋＤ、約３６ｋＤ、約３５ｋＤ、約３４ｋＤ、約３３ｋＤ、約３２ｋＤ、約３１ｋＤ、約３０ｋＤ、約２９ｋＤ、約２８ｋＤ、約２７ｋＤ、約２６ｋＤ、約２５ｋＤ、約２４ｋＤ、約２３ｋＤ、約２２ｋＤ、約２１ｋＤ、または約２０ｋＤのサイズを有する。小さなサイズに対する典型的な手法は、ドメインの各々について単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントを使用することによる。例えば、特定のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、ＰＳＭＡのために抗ＣＤ３  ｓｄＡｂ、抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂ、およびｓｄＡｂを有する。これは、４０ｋＤ未満で典型的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のサイズを減少させる。したがって、いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のドメインはすべて単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメントである。他の実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＨＳＡおよび／またはＰＳＭＡのための小分子実体（ＳＭＥ）バインダーを含む。ＳＭＥバインダーは、平均して約５００〜２０００Ｄａのサイズの小分子であり、ソルターゼ連結反応または共役などの既知の方法によって、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質にされる。これらの例では、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のドメインの１つは、ソルターゼ認識配列、例えば、ＬＰＥＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５７）である。ソルターゼ認識配列を備えたＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質にＳＭＥバインダーを結合させるために、タンパク質はソルターゼとＳＭＥバインダーでインキュベートされ、それによってソルターゼがＳＭＥバインダーを認識配列に結合させる。既知のＳＭＥバインダーは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するＭＩＰ−１０７２とＭＩＰ−１０９５を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のＰＳＭＡに結合するドメインは、ＰＳＭＡに結合するためのノッチンペプチドを含む。ノッチンはシステインノット足場を備えたジスルフィド安定したペプチドであり、約３．５ｋＤの平均サイズを有する。ノッチンは、ＰＳＭＡのような特定の腫瘍分子への結合について企図されてきた。さらなる実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク��のＰＳＭＡに結合するドメインは、天然のＰＳＭＡリガンドを含む。
【００２７】
本明細書に記載されるＰＳＭＡ三重特異性タンパク質の別の特徴は、それらがドメインの適応性のある（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）結合を備えた単一のポリペプチドの設計であるということである。これにより、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の容易な産生と製造が可能になる。なぜなら、この三重特異性タンパク質はベクターに容易に組み入れられる単一のｃＤＮＡ分子によってコード可能であるからである。さらに、本明細書に記載される三重特異性タンパク質が単量体の単一のポリペプチド鎖であるので、鎖の対形成の問題がなく、二量化のための要件もない。本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、Ｆｃγ免疫グロブリンドメインを備えた二重特異性タンパク質などの他の報告されている分子とは異なり、凝集する傾向が低下していることが企図される。
【００２８】
本明細書に記載される三重特異性タンパク質では、ドメインは内部リンカーＬ１とＬ２によって結合され、ここで、Ｌ１は、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の第１と第２のドメインに結合し、Ｌ２はＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の第２と第３のドメインに結合する。リンカーＬ１とＬ２は最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を有する。いくつかの実施形態において、リンカーＬ１とＬ２は同じ長さとアミノ酸組成物を有する。他の実施形態において、Ｌ１とＬ２は異なる。ある実施形態において、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、内部リンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、内部リンカーはペプチド結合である。ある実施形態において、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は「長い」、つまり、１５、２０、または２５のアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態において、これらの内部リンカーは約３から約１５まで、例えば、８、９、または１０の連続したアミノ酸残基からなる。内部リンカーＬ１とＬ２のアミノ酸組成物に関して、ペプチドは、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質に対して柔軟性を与える特性とともに選択され、結合ドメインに干渉せず、同様にプロテアーゼからの切断に抵抗しない。例えば、グリシンとセリンの残基は一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質中のドメインの結合に適切な内部リンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３），（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４），（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５），（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６），（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、または、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。１つの実施形態において、内部リンカーＬ１および／またはＬ２は、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）、または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）である。
【００２９】
＜ＣＤ３結合ドメイン＞
Ｔ細胞の応答の特異性は、ＴＣＲによって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣのコンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）で表示された）の認識によって媒介される。ＴＣＲの一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、および２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。完全なＴＣＲを含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、ＴＣＲのα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と一緒に結合する。固定された抗ＣＤ３抗体によるなどしてＴ細胞上にＣＤ３をクラスター形成することで、Ｔ細胞受容体の結合に似ているがそのクローンに典型的な特異性とは無関係のＴ細胞活性化を引き起こす。
【００３０】
１つの態様において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ヒトＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを含む。
【００３１】
さらなる実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＴＣＲに特異的に結合するドメインを含む。ある例では、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのα鎖を特異的に結合するドメインを含む。ある例では、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＴＣＲのβ鎖を特異的に結合するドメインを含む。
【００３２】
ある実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。いくつかの例では、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。ある例において、ＣＤ３に関するヒト：カニクイザルのＫＤ比率は５−０．２の間である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含むＣＤ３に結合する任意のドメインであり得る。いくつかの例では、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含めることが、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益なことがある。
【００３４】
したがって、１つの態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはヒト抗体または抗体フラグメント、またはマウスの抗体または抗体フラグメントを含む。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト−ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、および／または、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、例えば１つ以上、例えば、３つすべてのＬＣ  ＣＤＲと１つ以上、例えば、３つすべてのＨＣ  ＣＤＲを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域はヒト軽鎖フレームワーク領域中のヒトまたはヒト以外の軽鎖ＣＤＲを含む。ある例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域はヒト重鎖フレームワーク領域のヒトまたはヒト以外の重鎖ＣＤＲを含む。
【００３７】
ある例において、重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、およびＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
【００３８】
１つの実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用されるように、「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを指し、軽鎖と重鎖の可変領域は、短い適応性のあるポリペプチドリンカーによって連続的に結合され、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、およびｓｃＦｖはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。実施形態において、抗ＣＤ３結合ドメインは以下を含む：本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または３つの修飾（例えば置換）を有するが、せいぜい３０、２０、または１０の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または３つの修飾（例えば置換）を有するが、せいぜい３０、２０、または１０の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５−９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域。１つの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーによって本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域、または重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域。
【００３９】
いくつかの例では、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖｓは既知の方法によって調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、適応性のあるポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨとＶＬの領域を一緒に結合することにより、生成可能である。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を備えるｓｃＦｖリンカー（例えばＳｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。これに応じて、いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＣＤ３結合部位を形成するために、ＶＨまたはＶＬのドメインが他の可変ドメインと分子間で結合することができるような長さである。ある実施形態において、こうしたｓｃＦｖリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、ｓｃＦｖリンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。いくつかの実施形態において、これらのｓｃＦｖリンカーは約３から約１５、例えば８、９、または１０の連続的なアミノ酸残基からなる。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸組成物に関して、柔軟性を与え、可変ドメインに干渉せず、同様に、機能的なＣＤ３結合部位を形成するために２つの可変ドメインを接合する鎖間フォールディングを許可しないペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリンの残基を含むｓｃＦｖリンカーは一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ中のリンカーはグリシンとセリンの残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ３結合とｓｃＦｖの産生収率を改善するファージディスプレー方法によって最適化可能である。ｓｃＦｖ中の可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを結合するのに適切なペプチドｓｃＦｖリンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３），（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４），（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５），（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６），（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。１つの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）、または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）であり得る。リンカー長さの変動は活性を保持または向上し、活性研究で優れた有効性をもたらすこともある。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤのＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤの、ＣＤ３ε、γ、またはδに対する親和性を有する。さらなる実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインはＣＤ３に対する低い親和性（すなわち、約１００ｎＭ以上）を有する。
【００４１】
ＣＤ３に結合するための親和性は、例えば、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質自体、または、アッセイプレート上で被覆される；微生物細胞表面上で表示される；溶液中にあるＣＤ３に結合するそのＣＤ３結合ドメインの能力により、判定され得る。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質タンパク質自体の結合活性、または、ＣＤ３に対する本開示のそのＣＤ３結合ドメインは、ビーズ、基質、細胞などへの、リガンド（例えばＣＤ３）、三重特異性抗原結合タンパク質自体、またそのＣＤ３結合ドメインの固定により、分析され得る。薬剤は、所定の温度で一定の期間インキュベートされた適切な緩衝液と結合パートナーに加えることができる。未結合材料を取り除くために洗浄した後、結合タンパク質は、例えば、ＳＤＳ、高いｐＨの緩衝液などで放出可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析可能である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８）およびその部分配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８）に対して少なくとも７０％−９５％それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８）の少なくとも一部を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、表７に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−８８）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。
【００４３】
ある実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および２２−３３を含む重鎖ＣＤＲ１を有するｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７および３４−４３を含む重鎖ＣＤＲ２を有するｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８および４４−５３を含む重鎖ＣＤＲ３を有するｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および５４−６６を含む軽鎖ＣＤＲ１を有するｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０および６７−７９を含む軽鎖ＣＤＲ２を有するｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および８０−８６を含む軽鎖ＣＤＲ３を有するｓｃＦｖを含む。
【００４４】
＜半減期延長ドメイン＞
本明細書では、抗原結合ドメインの半減期を延ばすドメインが考慮される。そのようなドメインは、限定されないがＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、および当該技術分野で既知の他の半減期延長ドメインを含むと企図される。
【００４５】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子質量〜６７ｋＤａ）は、血漿中で最も大量のタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトにおいて約２０日の半減期を有している。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持するように役立ち、膠質の血圧に寄与し、多くの代謝物質および脂肪酸の担体として機能し、そして血漿の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。
【００４６】
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延ばす。例えば、Ｆａｂフラグメントに対するアルブミン結合ドメインの組み換え型融合は、Ｆａｂフラグメントだけの投与と比較すると、マウスとウサギそれぞれへの静脈内投与時に、２５倍および５８倍のインビボの除去、並びに２６倍および３７倍の半減期延長を結果としてもたらした。別の例において、アルブミンとの会合を促進するためにインスリンが脂肪酸でアシル化されると、ウサギまたブタに皮下注射した時に、遅延性の効果が観察された。総じて、このような研究は、アルブミン結合と遅延性作用との連係を実証する。
【００４７】
１つの態様において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン（例えばＨＳＡに特異的に結合するドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体由来のドメインを含むがこれらに限定されない、ＨＳＡに結合する任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、およびラクダ由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ペプチド、リガンド、またＨＳＡには特異的な小分子実体である。特定の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインはペプチドである。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは小分子である。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインはかなり小さく、わずか２５ｋＤ、わずか２０ｋＤ、わずか１５ｋＤ、またはわずか１０ｋＤであることが企図される。特定の例において、ＨＳＡ結合は、ペプチドまた小分子の実体である場合に、５ｋＤ以下である。
【００４８】
ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質自体の変更された薬力学と薬物動態を提供する。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延ばす。半減期延長ドメインはまた、三重特異性抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、および拡散の変化を含む、薬物動態学的特性を変更する。幾つかの実施形態において、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインの無いタンパク質と比較して、組織（腫瘍を含む）の標的化、組織分布、組織浸透、組織内の拡散の改善、および効果の向上を提供する。１つの実施形態において、治療方法は、減少量の三重特異性抗原結合蛋白を効果的且つ効率的に利用して、その結果非腫瘍細胞毒性の減少などの副作用の減少をもたらす。
【００４９】
さらに、半減期延長ドメインの結合親和性は、特定の三重特異性抗原結合蛋白の特異的な消失半減期を標的とするように選択され得る。故に、幾つかの実施形態において、半減期拡張ドメインには高度な結合親和性がある。他の実施形態において、半減期拡張ドメインには中位の結合親和性がある。また他の実施形態において、半減期拡張ドメインには低いまた最低限の（ｍａｒｇｉｎａｌ）結合親和性がある。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭと１００ｎＭの間（中）、および１００ｎＭ超（低）でのＫＤ濃度を含む。上記のように、ＨＳＡに対する結合親和性は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）など既知の方法により判定される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＨＳＡ結合ドメインは、表８に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２）およびその部分配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表８に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２）に対して少なくとも７０％−９５％または、それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表８に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または、それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表８に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２）の少なくとも一部を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表８に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９−１１２）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＨＳＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９６または、９９−１０１を含むＣＤＲ１を有する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＨＳＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９７または、１０２−１０７を含むＣＤＲ１を有する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＨＳＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９８、１０８および、１０９を含むＣＤＲ１を有する単一ドメイン抗体を含む。
【００５２】
＜前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ドメイン＞
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、ＮＡＡＬＡＤａｓｅ活性でのトランスフェリン受容体を持った配列同一性がある前立腺組織で発現された１００ｋＤのＩＩ型膜糖タンパク質である。ＰＳＭＡは前立腺癌において増加した量で発現され、そしてＰＳＭＡの上昇したレベルもまた、これらの患者の血清において検出可能である。ＰＳＭＡの発現は疾患の進行とともに増加し、現在の治療法がない転移性ホルモン難治性疾患において最も高くなる。
【００５３】
記載されたＣＤ３及び半減期拡張ドメインに加えて、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ＰＳＭＡに結合するドメインも含む。本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の設計は、ＰＳＭＡに対する結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体のドメインを含むが、任意のタイプの結合ドメインであり得るという点で、ＰＳＭＡに対する結合ドメインが適応性を有することを可能にする。幾つかの実施形態において、ＰＳＭＡに対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、例えば重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ由来の単一ドメイン抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）である。他の実施形態において、ＰＳＭＡに対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、即ち、抗体模倣体、例えばａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ａｆｆｉｌｉｎｓ、ａｆｆｉｂｏｄｙ分子、ａｆｆｉｍｅｒｓ、ａｆｆｉｔｉｎｓ、ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ、ａｖｉｍｅｒｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ｆｙｎｏｍｅｒｓ、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、及びｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓである。さらなる実施形態において、ＰＳＭＡに対する結合ドメインは、ＰＳＭＡに結合するか、またはそれに会合するリガンド又はペプチドである。またさらなる実施形態において、ＰＳＭＡに対する結合ドメインはノッチンである。またさらなる実施形態において、ＰＳＭＡに対する結合ドメインは小分子実体である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインは以下の式：ｆ１−ｒ１−ｆ２−ｒ２−ｆ３−ｒ３−ｆ４を含む。ここではｒ１、ｒ２および、ｒ３はそれぞれ相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３であり、かつ、ｆ１、ｆ２、ｆ３とｆ４はフレームワーク残基であり、ここでｒ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１４、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１５、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１６または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＬ  １２５を含み，ｒ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１９、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２３または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６であり、かつｒ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６とＸ７は、独立して、グルタミン酸、プロリン、セリン、ヒスチジン、スレオニン、アスパラギン酸、グリシン、リジン、スレオニン、グルタミンとチロシンから選ばれる。いくつかの実施形態において、Ｘ１はプロリンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２はヒスチジンである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はアスパラギン酸である。いくつかの実施形態において、Ｘ４はリジンである。いくつかの実施形態において、Ｘ５はグルタミンである。いくつかの実施形態において、Ｘ６はチロシンである。いくつかの実施形態において、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合タンパク質は、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はアスパラギン酸、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示さる。ここでＸ１は、プロリンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ５は、グルタミンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ６は、グルタミンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ４は、リジンおよび、Ｘ７は、セリンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ２は、ヒスチジン、Ｘ３は、アスパラギン酸、Ｘ４は、リジンおよび、Ｘ７は、セリンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ１は、プロリン、Ｘ２は、ヒスチジン、Ｘ３は、アスパラギン酸および、Ｘ７は、セリンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ２は、ヒスチジン、Ｘ３は、アスパラギン酸、Ｘ５は、グルタミンおよび、Ｘ７は、セリンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ２は、ヒスチジン、Ｘ３は、アスパラギン酸、Ｘ６は、チロシンおよび、Ｘ７は、セリンである。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡ結合ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３を含む。ここで、（ａ）ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６２（ＲＦＭＩＳＸ１ＹＸ２ＭＨ）として示される。（ｂ）ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６３（Ｘ３ＩＮＰＡＸ４Ｘ５ＴＤＹＡＥＸ６ＶＫＧ）として示される。そして（ｃ）ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６４（ＤＸ７ＹＧＹ）として示される。ここでＸ２は、ヒスチジン、Ｘ３は、アスパラギン酸および、Ｘ７は、セリンである。
【００５７】
本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はスレオニン、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はスレオニン、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はセリン、Ｘ３はスレオニン、Ｘ４はリジン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はプロリン、Ｘ２はセリン、Ｘ３はスレオニン、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はグリシンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はセリン、Ｘ３はスレオニン、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はグルタミン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はグリシンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はセリン、Ｘ３はスレオニン、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はグリシンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はアスパラギン酸、Ｘ４はリジン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はプロリン、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はアスパラギン酸、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はアスパラギン酸、Ｘ４はグルタミン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はセリンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ１はグルタミン酸、Ｘ２はヒスチジン、Ｘ３はアスパラギン酸、Ｘ４はグリシン、Ｘ５はスレオニン、Ｘ６はチロシンおよび、Ｘ７はセリンである。本開示のＰＳＭＡ結合ドメインは、いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３配列を含み得るものであり、ここで、Ｘ２はヒスチジンおよび、Ｘ７はセリンである。例示的なフレームワーク配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ��：１６５−１６８として開示されている。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＳＭＡ結合ドメインは、表９に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０）および、その部分配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表９に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０）に対して少なくとも７０％−９５％それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表９に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、それ以上の相同性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表９に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０）の少なくとも一部を含む配列を有する。いくつかの実施形態において、ＨＳＡ結合ドメインは、表９に記載される配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３−１４０）の１つ以上を含むポリペプチドを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１４−１１６または、１２５を含むＣＤＲ１を有する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１７−１２３または、１２６を含むＣＤＲ１を有する単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ結合ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２４または、１２７を含むＣＤＲ１を有する単一ドメイン抗体を含む。
【００６０】
＜ＰＳＭＡ三重特異性タンパク質の修飾＞
本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによりコードされたものでないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物と融合され、また（ｉｉｉ）付加的なアミノ酸が、リーダー配列また分泌配列、或いはタンパク質の精製のための配列などのタンパク質に融合される、誘導体またアナログを包含する。
【００６１】
典型的な修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合の架橋の組成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性の加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の付加、およびユビキチン化を含む。
【００６２】
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またカルボキシル末端を含む、本明細書に記載される三重特異性抗原結合タンパク質のあらゆる場所で行われる。ＰＳＭＡ三重特異性タンパク質の修飾に有用な特定の一般的なペプチド修飾は、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、共有結合性修飾によるポリペプチド中のアミノ基またカルボキシル基、或いはその両方の遮断、およびＡＤＰ−リボシル化を含む。
【００６３】
＜ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質をコードするポリヌクレオチド＞
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
【００６４】
ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーにより分離され、或いは他の実施形態においてペプチド結合により直接結合される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を、適切なプロモーター、及び随意に適切な転写ターミネーターに動作可能に結合された１つの遺伝子構築物に組み合わせること、および、例えばＣＨＯ細胞などの細菌又は他の適切な発現系においてそれを発現させることなどによる、既知の方法によって構築される。ＰＳＭＡ結合ドメインが小分子である実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３結合ドメインと半減期延長ドメインをコードする遺伝子を含んでいる。半減期延長ドメインが小分子である実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３とＰＳＭＡに結合するドメインをコードする遺伝子を含んでいる。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導性のプロモーターを含む、任意数の適切な転写および翻訳要素が使用されてもよい。プロモーターは、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を促進するために選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらなる実施形態を表わす、ベクター、好ましくは発現ベクターへと挿入される。この組み換えベクターは、既知の方法に従って構築され得る。特に対象のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ｖｉｒｉｉ（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドを含む。
【００６６】
様々な発現ベクター／宿主系は、記載された三重特異性抗原結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み且つ発現させるために利用され得る。大腸菌における発現のための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＳＫＫ（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１−２７）またはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００６７】
故に、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、いくつかの実施形態において、上述のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞に導入することにより、および、タンパク質ドメインが発現され、分離され、および随意に更に精製される条件下で、前記宿主細胞を培養することにより、生成される。
【００６８】
＜医薬組成物＞
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターまたは、このベクターにより形質転換される宿主細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」は、限定されないが、成分の生物活性の有効性に干渉しないおよび投与される患者に対して毒性ではない担体を含む。適切な薬学的担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含む。そのような担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被験体に投与することができる。好ましくは、組成物は滅菌される。これらの組成物はまた、防腐剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって確かなものとされ得る。
【００６９】
医薬組成物のいくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、ナノ粒子に封入される。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性微粒子、デンドリマー、またナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質はリポソームに結合される。いくつかの例において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、リポソームの表面に抱合される。いくつかの例において、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、リポソームのシェル内に封入される。いくつかの例において、リポソームはカチオン性リポソームである。
【００７０】
本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、薬物として使用のために企図される。投与は、異なる方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、また皮内の投与により達成される。いくつかの実施形態において、投与経路は、治療の種類、および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは、主治医および他の臨床学的因子により決定される。１人の患者のための投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。「有効な量」は、疾患の経過と重症度に影響を及ぼし、それによりそのような病状の減少また寛解を引き起こすのに十分な量の活性成分を指し、既知の方法を用いて決定され得る。
【００７１】
＜治療法＞
また本明細書には、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与を含む、それを必要とする個体の免疫系を刺激する方法および使用も提供される。いくつかの例において、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与は、ＰＳＭＡタンパク質を発現する細胞の方へと細胞毒性を誘導および／また維持する。いくつかの例において、ＰＳＭＡを発現する細胞は癌細胞である。
【００７２】
また本明細書には、本明細書に記載されるＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質を、それを必要とする個体に投与する工程を含む、ＰＳＭＡに関連する疾患、障害、また疾病の処置の方法および使用も提供される。ＰＳＭＡに関連した疾患、障害または疾病は限定されないが、増殖性疾患または腫瘍性疾患が挙げられる。１つの実施形態において、ＰＳＭＡに関連する疾患、障害、また疾病は、前立腺癌である。別の実施形態において、ＰＳＭＡに関連する疾患、障害または、疾病は腎癌である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、前立腺癌は、進行期前立腺癌である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、薬剤耐性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、抗アンドロゲン薬耐性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、転移性のである。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、転移性および、薬剤耐性（例えば、抗アンドロゲン薬耐性）である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、去勢抵抗性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、転移性および、去勢抵抗性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、エンザルタミド耐性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、エンザルタミドおよびアビラテロン耐性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、エンザルタミド、アビラテロンおよびビカルタミド耐性である。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、ドセタキセルである。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、前立腺癌は、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミドおよびドセタキセル耐性である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与は、前立腺癌細胞の成長を阻害する；前立腺癌細胞の遊走を阻害する；前立腺癌細胞の浸潤を阻害する；前立腺癌の症状を改善する；前立腺癌腫瘍のサイズを減少させる；前立腺癌腫瘍の数を減少させる；前立腺癌細胞の数を減少させる；前立腺癌細胞のネクローシス、ピロプトーシス、オンコーシス、アポトーシス、オートファジー、または他の細胞死を誘発する；または、エンザルタミド、アビラテロン、ドセタキセル、ビカルタミドとその任意の組み合わせからなる群から選ばれた化合物の治療効果を向上する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌細胞の成長を阻害することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌細胞の遊走を阻害することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌細胞の浸潤することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌の症状を改善することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌細胞のサイズを減少させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌腫瘍の数を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により、前立腺癌細胞の数を減少させることを含む。ある実施形態において、方法は、本明細書に記載されたＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の投与により前立腺癌細胞のネクローシス、ピロプトーシス、オンコーシス、アポトーシス、オートファジー、または他の細胞死を誘発することを含む。
【００７６】
本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置された（ｔｒｅａｔｅｄ）」とは、望ましくない生理的な疾患、障害、または疾患を遅らせること、または、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、または疾患の程度の減少；疾病、障害、または疾患の状態の安定化（つまり、悪化しないこと）；疾病、障害、または疾患の発症を遅らせること、または進行を遅らせること；疾病、障害、または疾患状態の改善；および、検出可能であれ検出不可能であれ、または疾病、障害、または疾患の亢進であれ改善であれ、緩解（部分的でも全体でも）。処置は過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置はさらに、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態において、「処置」または「処置すること」または「処置された」とは、予防的な処置を指し、例えば、疾患にかかりやすい人（例えば、前立腺癌などの疾患のための遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、または疾患の発症を遅らせるか、またはその重症度を低下させることである。
【００７７】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、三重特ＰＳＭＡを標的とする異性タンパク質は、特定の疾患、障害、また疾病の処置のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤は、限定されないが、抗体を含む治療薬、小分子（例えば化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線治療薬（γ線、Ｘ線、および／また、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの配向された送達）、遺伝子治療薬（例えばアンチセンス、レトロウイルスの治療など）、および他の免疫療法薬を含む。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、下痢止め、抗催吐薬、鎮痛薬、オピオイド、および／また非ステロイド性抗炎症剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、手術の前、間、または後に投与される。
【００７８】
＜特定の定義＞
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、ＧｏｏｄｍａｎとＧｉｌｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２１−２５（Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｉｌｍａｎ，  ｅｄｓ．，６ｔｈ  ｅｄ．１９８０）に記載されるように、その通常の意味で使用される。簡潔に、この用語は、薬物消失の時間経過の定量的測度を包含することを意味している。薬物濃度は通常、消失プロセスの飽和に必要なものに匹敵しないため、大抵の薬剤の消失は急激的なものである（即ち、一次速度論に従う）。急激なプロセスの速度は、時間の単位当たりの分数変化率を表すその速度定数ｋにより、また、処理の５０％の完了に必要な時間であるその半減期ｔ１／２によって表され得る。これらの２つの定数の単位は、それぞれ時間−１および時間である。一次反応速度定数および反応の半減期は単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、適宜交換され得る。一次消失キネティクスは、薬物の一定の画分が時間単位ごとに消失されることを命令するため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初期分布段階後（即ち、薬物吸収と分布が完了した後）の全ての時間で直線状である。薬物消失の半減期は、そのようなグラフから正確に判定され得る。
【００７９】
本明細書中で使用される、句「前立腺癌」または「進行期前立腺癌」は、疾患の初期段階を超えて進行した前立腺癌のクラスを含む。典型的には、進行期前立腺癌は予後不良と関連しています。進行期前立腺癌のタイプは、限定されないが、転移性前立腺癌、抗アンドロゲン耐性前立腺癌などの薬剤耐性前立腺癌（例えば、エンザルタミド耐性前立腺癌、アビラテロン耐性前立腺癌、ビカルタミド耐性前立腺癌など）、ホルモン抵抗性前立腺癌、去勢耐性前立腺癌、転移性去勢抵抗性前立腺癌、ドセタキセル耐性前立腺癌、ＡＲ−Ｖ７誘導性抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、ＡＲ−Ｖ７誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌）のようなアンドロゲン受容体スプライスバリアント−７（ＡＲ−Ｖ７）誘導性薬物耐性前立腺癌。アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３（ＡＫＲ１Ｃ３）誘導性抗アンドロゲン耐性前立腺癌（例えば、ＡＫＲ１Ｃ３誘導性エンザルタミド耐性前立腺癌）などの薬物耐性前立腺癌（ＡＫＲ１Ｃ３）および、それらの組み合わせを含む。いくつかの例において、進行期前立腺癌は、一般的に、以下の１つ以上の従来の前立腺癌療法による処置に反応しないか、または耐性がある：エンザルタミド、アルビラテロン、ビカルタミドおよび、ドセタキセル。本開示の化合物、組成物、および方法は、本明細書に開示される進行期前立腺癌の任意の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）を含む進行期前立腺癌などの前立腺癌を治療するために提供される。
【実施例】
【００８０】
＜実施例１：三重特異性抗原結合分子の結合および細胞毒性活性を評価する方法＞
＜タンパク質産生＞
【００８１】
三重特異性分子の配列を、リーダー配列が先行し、６ｘヒスチジンタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）が後続する、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ  ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４５２７）を、Ｅｘｐｉ２９３培地中の０．２−８ｘ１ｅ６細胞／ｍｌでＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）において懸濁液中で維持した。精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６３５）プロトコルに従って、Ｅｘｐｉ２９３細胞へトランスフェクトし、トランスフェクション後４−６日間維持した。調整培地を、親和性および脱塩のクロマトグラフィーによって部分的に精製した。続いて、三重特異性タンパク質を、イオン交換によって磨き、または代替的に、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａの遠心濾過ユニット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００のサイズ排除培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、賦形剤を含有している中性緩衝液中に溶解した。フラクションプール（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｐｏｏｌｉｎｇ）および最終的な純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析的なＳＥＣによって評価した。
【００８２】
＜親和性測定＞
【００８３】
すべての結合ドメイン分子の親和性を、Ｏｃｔｅｔの機器を使用して、バイオレイヤー干渉法によって測定した。
【００８４】
ＰＳＭＡ親和性を、ヒトＰＳＭＡ−Ｆｃタンパク質（１００ｎＭ）を抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃバイオセンサー上に１２０秒間充填し、続いて６０秒間のベースラインによって測定し、その後、センサーチップを一連の三重特異性分子中で１８０秒間インキュベートし、続いて５０秒間解離させることによって会合を測定した。ＧＦＲおよびＣＤ３親和性は、ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃタンパク質またはヒトＣＤ３−Ｆｌａｇ−Ｆｃタンパク質（１００ｎＭ）をそれぞれ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃバイオセンサーに１２０秒間充填した後、６０秒間のベースラインによって測定し、その後、センサーチップを一連の三重特異性分子の希釈液中で１８０秒間インキュベートし、続いて３００秒間解離させることによって会合を測定した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性は、ビオチン化アルブミンをストレプトアビジンバイオセンサーに充填し、次いでＣＤ３親和性測定と同じ速度論的パラメータに従って測定することによって測定した。すべての工程を、リン酸緩衝食塩水の０．２５％カゼイン中において３０℃で実行した。
【００８５】
＜細胞毒性アッセイ＞
【００８６】
腫瘍細胞を死滅させるようにＴ細胞に指示する、三重特異性分子を含むＴ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒｓ）の能力を測定するために、ヒトＴ細胞依存性細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイを用いた（Ｎａｚａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．２０：５１９−２７）。このアッセイにおいて、Ｔ細胞および標的癌細胞株の細胞は、３８４ウェルのプレートにおいて１０：１の比率で一緒に混合され、様々な量のＴ細胞エンゲージャーが加えられる。４８時間後、Ｔ細胞は洗浄され、Ｔ細胞によって死滅しなかったプレート標的細胞に結合されたままにされる。残りの生細胞を定量化するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が使用される。場合によっては、標的細胞がルシフェラーゼを発現するように操作される。これらの場合、標的細胞の生存率は、生存率がルシフェラーゼ活性の量に正比例する、ＳＴＥＡＤＹＧＬＯＲ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光ルシフェラーゼアッセイを実施することによって評価される。
【００８７】
＜安定性アッセイ＞
【００８８】
三重特異性結合タンパク質の安定性を、非ヒト霊長類の血清の存在下で、低濃度で評価した。ＴｒｉＴＡＣをカニクイザル血清（ＢｉｏＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＩＶＴ）中で３３μｇ／ｍｌに希釈し、３７℃で２日間インキュベートするか、または５回の凍結／解凍サイクルに供した。処理後、サンプルを細胞毒性（ＴＤＣＣ）アッセイで評価し、それらの残存活性を未処理の原液と比較した。
【００８９】
＜異種移植片アッセイ＞
【００９０】
三重特異性結合タンパク質のインビボ有効性を、異種移植片実験（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｉｃａｎｇ）において評価した。共通ガンマ鎖を欠損したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＮＣＧ，  Ｍｏｄｅｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に、０日目に、健康なヒトのドナーから単離された５ｅ６  ２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞および５ｅ６休止ヒトＴ細胞の混合物を接種した。マウスを３つの群へ無作為化し、ビヒクル、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３２４あるいは０．５ｍｇ／ｋｇのＰＳＭＡ  ＢｉＴＥで処置した。処置は、静脈内のボーラス注入によって１０日間毎日投与された。罹患率および死亡率について動物を毎日調べた。腫瘍容積は、カリパスを用いて週に２回測定した。試験は３０日後に終了した。
【００９１】
＜ＰＫアッセイ＞
【００９２】
この試験の目的は、静脈内注射後の三重特異性結合タンパク質の単回投与薬物動態を評価することであった。１グループあたり２匹の実験的にナイーブなカニクイザル（雄１匹および雌１匹）に、約１分かけてゆっくりとしたＩＶボーラス注射によって化合物を与えた。投与後、ケージサイドの観察を１日１回行い、体重を毎週記録した。投与後２１日まで、血液試料を採取し、薬物動態学的分析のために血清に処理した。
【００９３】
被験物質の濃度は、エレクトロルミネセンス読み出し（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）を用いてサル血清から決定した。分析物を捕捉するために、固定化された組換えＣＤ３を有する９６ウェルプレートを使用した。製造者の説明書に従って、ＭＳＤリーダー上でスルホタグ付き組換えＰＳＭＡを用いて検出を行った。
【００９４】
＜実施例２：三重特異性分子の性質に対するＣＤ３親和性の影響の評価＞
異なるＣＤ３結合ドメインを有するＰＳＭＡを標的とする三重特異性分子を研究して、ＣＤ３親和性を変えることの効果を実証した。例示的なＰＳＭＡを標的とする三重特異性分子を図１に示す。表１は、３つの結合パートナー（ＰＳＭＡ、ＣＤ３、ＨＳＡ）に対する各分子の親和性を列挙する。親和性は、Ｏｃｔｅｔの機器（Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）を用いてバイオレイヤー干渉法により測定した。ＣＤ３親和性の低下は、Ｔ細胞媒介細胞毒性に関して効力の喪失をもたらす（図２Ａ〜Ｃ）。これらの三重特異性分子の薬物動態学的特性をカニクイザルにおいて評価した。ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ２３６のようなＣＤ３との親和性が高い分子は、約９０時間の最終半減期を有する（図３）。Ｔ細胞上のＣＤ３を結合する能力の変化にもかかわらず、図４に示される異なるＣＤ３親和性を有する２つの分子の最終半減期は非常に類似している。しかしながら、減少したＣＤ３親和性はより大きな容積の分布をもたらすように見え、それはＴ細胞による三重特異性分子の減少した隔離と一致する。試験期間中に有害な臨床観察または体重の変化は見られなかった。
【００９５】
【表１】
2019535763.tif 000003
【００９６】
＜実施例３：三重特異性分子の性質に対するＰＳＭＡ親和性の影響の評価＞
ＰＳＭＡ親和性を変化させることの効果を実証するために、異なるＰＳＭＡ結合ドメインを有するＰＳＭＡを標的とする三重特異性分子を研究した。表２は、３つの結合パートナー（ＰＳＭＡ、ＣＤ３、ＨＳＡ）に対する各分子の親和性を列挙する。ＰＳＭＡ親和性の低下は、Ｔ細胞媒介性細胞毒性に関して効力の喪失をもたらす（図５Ａ〜Ｃ）。
【００９７】
【表２】
2019535763.tif 000004
【００９８】
＜実施例４：ＰＳＭＡを標的とする三重特異性分子のインビボ有効性＞
ＰＳＭＡを標的とする三重特異性分子Ｃ３２４の、マウスにおける腫瘍の増殖を阻害するその能力について評価した。この実験のために、ヒトＴ細胞で再構成された免疫不全マウスにＰＳＭＡ発現ヒト前立腺腫瘍細胞（２２Ｒｖ１）を皮下接種し、ＰＳＭＡを標的とするＢｉＴＥあるいはＴｒｉＴＡＣ分子のいずれかを０．５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与で１０日間毎日処置した。腫瘍増殖は３０に測定された。実験の過程で、三重特異性分子はＢｉＴＥ分子に匹敵する有効性で腫瘍増殖を阻害することができた（図６）。
【００９９】
＜実施例５：三重特異性分子の特異性＞
ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子の特異性を評価するために、Ｔ細胞を誘導して腫瘍細胞を殺すその能力を、ＰＳＭＡについて陰性である腫瘍細胞を用いて試験した（図７Ａ）。ＥＧＦＲを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子を陽性対照として、ＧＦＰを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子を陰性対照として使用した。異なるＰＳＭＡ結合ドメインを有する３つ全てのＴｒｉＴＡＣはＰＳＭＡ陽性細胞系ＬＮＣａＰに対して期待される活性を示したが（図７Ｂ）、ＰＳＭＡ陰性腫瘍細胞系ＫＭＳ１２ＢＭおよびＯＶＣＡＲ８ではＥＣ５０に達しなかった（図７Ｃおよび７Ｄ）。ＥＣ５０を表３に要約する。非常に高いＴｒｉＴＡＣ濃度（＞１ｎＭ）では、ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６２およびＣ３６３についていくらかの限られた標的外細胞殺傷が観察される可能性があるが、Ｃ３６４はいずれの試験条件下でも有意な細胞殺害を示さなかった。
【０１００】
【表３】
2019535763.tif 000005
【０１０１】
＜実施例６：ストレステストおよびタンパク質安定性＞
４つのＰＳＭＡを標的とする三重特異性分子を、低濃度（３３．３μｇ／ｍｌ）のカニクイザル血清中で４８時間インキュベートするか、またはカニクイザル血清中で５回の凍結融解サイクルに供した。処理後、ＴｒｉＴＡＣ分子の生物活性を細胞殺傷アッセイで評価し、ストレスを受けていないサンプルと比較した（「陽性対照」、図８Ａ〜Ｄ）。全ての分子はそれらの殺細胞活性の大部分を維持していた。ＴｒｉＴＡＣ  Ｃ３６２は最も耐ストレス性があり、ここでテストされた条件下で活性を失うことはないようであった。
【０１０２】
＜実施例７：異種移植片腫瘍モデル＞
先の実施例のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質は、異種移植片モデルにおいて評価される。
【０１０３】
オスの免疫不全ＮＣＧマウスに、５ｘ１０６  ２２Ｒｖ１細胞をそれらの右後側腹部に皮下接種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達すると、動物を３つの処置群へと割り当てる。グループ２および３（それぞれ８匹の動物）に１．５×１０７個の活性化ヒトＴ細胞を腹腔内注射する。３日後、グループ３の動物は、引き続いて合計９回の５０μｇの実施例１のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ｑｄ×９ｄ）の静脈内投与量で処置される。グループ１および２をビヒクルのみで処置する。体重および腫瘍体積を３０日間測定する。
【０１０４】
ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質で処置したマウスにおける腫瘍増殖は、それぞれのビヒクル処置した対照群における腫瘍増殖と比較して有意に減少した増殖を有することが期待される。
【０１０５】
＜実施例８：前立腺癌患者への実施例１のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の投与のための概念実証臨床試験プロトコル＞
これは、前立腺癌の処置としての実施例１のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質を研究するための第Ｉ／ＩＩ相臨床試験である。
【０１０６】
試験目的：
【０１０７】
第１：先の実施例のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の最大耐量
【０１０８】
第２：先の実施例のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質のインビトロ反応が臨床反応と関連するかどうかを決定すること
【０１０９】
第Ｉ相
【０１１０】
最大耐量（ＭＴＤ）は、試験の第Ｉ相セクションで決定される。
１．１  最大耐量（ＭＴＤ）は、試験の第Ｉ相セクションで決定される。
１．２  適格基準を満たす患者は、先の実施例のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質に対する試験に参加する。
１．３  目的は、参加者に重篤なまたは管理不能な副作用なしに安全に投与することができる先の実施例のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の最高用量を同定することである。与えられる用量は、以前に試験に登録された参加者の数およびその用量がどれほど良好に耐容されたかに依存するだろう。すべての参加者が同じ用量を受けるわけではない。
【０１１１】
第ＩＩ相
【０１１２】
２．１  続く第ＩＩ相のセクションでは、先の実施例のＰＳＭＡを標的とする三重特異性タンパク質の療法による療法が少なくとも２０％の奏効率をもたらすかどうかを決定する目的で、ＭＴＤで処置される。
第ＩＩ相の主な結果−−−先の実施例の三重特異性タンパク質を標的とするＰＳＭＡの治療により、少なくとも２０％の患者が臨床反応（爆発的な反応、わずかな反応、部分奏効、または完全奏効）を達成するかどうかを決定する。
【０１１３】
適格性：
２００１年から２００７年までの現在の世界保健機関分類に従って、組織学的に確認された新たに診断された侵襲性の前立腺癌
疾患のあらゆる段階。
ドセタキセルとプレドニゾンによる処置（＋／−手術）。
年齢≧１８歳
カルノフスキーパフォーマンスステータス≧５０％またはＥＣＯＧパフォーマンスステータス０−２
平均余命≧６週
【０１１４】
＜実施例９：ＰＳＭＡ発現細胞株および異なるドナー由来のＴ細胞のパネルを用いたリダイレクトＴ細胞殺傷アッセイにおける例示的なＰＳＭＡ抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）の活性＞
この試験は、例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の活性が、ＬＮＣａＰ細胞または単一細胞ドナーに限定されないことを実証するために行われた。
【０１１５】
４体の異なるドナー由来のＴ細胞とヒトＰＳＭＡ発現前立腺癌細胞株ＶＣａＰ、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡＰＣａ２ｂ、および２２Ｒｖ１を使用して、リダイレクトＴ細胞殺傷アッセイを行った。１つの例外を除いて、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、表４に示されるように、０．２から１．５ｐＭのＥＣ５０値を有するすべてのドナーからのＴ細胞を使用してこれらの癌細胞株を直接殺すことができた。前立腺癌細胞株２２  Ｒｖ１およびドナー２４では、殺傷はほとんどまたは全く観察されなかった（図示さず）。ドナー２４はまた、ＭＤＡＰＣａ２ｂ細胞系の約５０％の死滅のみをもたらしたが、他の３体のドナーからのＴ細胞はこの細胞系のほぼ完全な死滅をもたらした（データは示さず）。対照アッセイは、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質による殺傷がＰＳＭＡ特異的であることを実証した。ＰＳＭＡを発現する細胞を、ＰＳＭＡの代わりに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を標的とする対照三重特異性タンパク質で処理した場合に、殺傷は観察されなかった（データは示さず）。同様に、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、表４に示される、ＰＳＭＡ発現を欠く細胞株、ＮＣＩ−１５６３およびＨＣＴ１１６とは不活性であった。
【０１１６】
【表４】
2019535763.tif 000006
【０１１７】
＜実施例１０：リダイレクトＴ細胞殺傷アッセイにおける例示的ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）によるサイトカイン発現の刺激＞
この試験は、活性化Ｔ細胞によるアッセイ培地へのサイトカインの分泌を測定することによって、リダイレクトＴ細胞殺傷アッセイ中の例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質によるＴ細胞の活性化を実証するために行われた。
【０１１８】
実施例９に上記したように、リダイレクトＴ細胞殺傷アッセイから集めた調整培地をサイトカインＴＮＦαおよびＩＦＮγの発現について分析した。サイトカインはＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。ＰＳＭＡ抗原結合タンパク質の滴定を４体の異なるドナーおよび４つのＰＳＭＡ発現細胞株、ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＭＤＡＰＣａ２ｂ、および２２Ｒｖ１からのＴ細胞に加えると、ＴＮＦαレベルが上昇した。調整培地中のＴＮＦα発現とＩＦＮγ発現レベルについての結果をそれぞれ表５および６に示す。ＰＳＭＡ抗原結合タンパク質が誘導するこれらのサイトカインの発現についてのＥＣ５０値は、３から１５ｐＭの範囲であった。ＧＦＰを標的とする対照三重特異性タンパク質では、サイトカインレベルの増加は観察されなかった。同様に、ＰＳＭＡ発現を欠く２つの細胞株、ＨＣＴ１１６およびＮＣＩ−Ｈ１５６３を用いてアッセイを実施した場合、ＰＳＭＡ  ＨＴＳ  ＴｒｉＴＡＣもまたＴＮＦαまたはＩＦＮγ発現を増加させなかった。
【０１１９】
【表５】
2019535763.tif 000007
【０１２０】
【表６】
2019535763.tif 000008
【０１２１】
＜実施例１１：カニクイザルのＴ細胞を用いたリダイレクトＴ細胞殺傷アッセイ（ＴＤＣＣ）における例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ）の活性＞
この研究は、カニクイザル由来のＴ細胞がＰＳＭＡ発現細胞株を殺すように指示する例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の能力を試験するために行われた。
【０１２２】
カニクイザルからの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いてＴＤＣＣアッセイを設定した。カニクイザル（Ｃｙｎｏ）ＰＢＭＣをＬＮＣａＰ細胞に１０：１の比率で添加した。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、１１ｐＭのＥＣ５０値を有するカニクイザルＰＢＭＣによるＬＮＣａＰの殺傷をリダイレクトすることが観察された。結果を図９Ａに示す。これらの結果を確認するために、第二の細胞株ＭＤＡＰＣａ２ｂを使用し、そして第二のカニクイザルドナー由来のＰＢＭＣを試験した。標的細胞のリダイレクトされた死滅は、２．２ｐＭのＥＣ５０値で観察された。結果を図９Ｂに示す。殺傷は、ＧＦＰを標的とする陰性対照三特異性タンパク質では観察されなかったので、ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質の抗ＰＭＳＡアームに特異的であった。これらのデータは、ＰＳＭＡ抗原結合三重特異性タンパク質が、カニクイザルＴ細胞にヒトＰＳＭＡを発現する標的細胞を殺すように指示できることを実証している。
【０１２３】
＜実施例１２：例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）を用いたリダイレクトＴ細胞殺傷アッセイにおけるＴ細胞活性化のマーカーの発現＞
この試験は、例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質がＴ細胞に標的細胞を殺すように指示したときにＴ細胞が活性化されたかどうかを評価するために行われた。
【０１２４】
上記の実施例に記載されているリダイレクトＴ細胞殺傷アッセイの条件を用いてアッセイを設定した。Ｔ細胞活性化は、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞の表面上のＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を測定することによって評価した。ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質を精製ヒトＴ細胞と前立腺癌細胞株ＶＣａＰの１０：１混合物に添加した。図１０に示すように、漸増量のＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質を添加すると、ＣＤ６９発現およびＣＤ２５発現の増加が観察された。ＥＣ５０値は、ＣＤ６９では０．３ｐＭ、ＣＤ２５では０．２ｐＭであった。ＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質をこれらのアッセイに陰性対照として含めたが、図１０にも示されるように、ＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質では、ＣＤ６９またはＣＤ２５の発現の増加はほとんどまたは全く観察されない。
【０１２５】
＜実施例１３：ＰＳＭＡ発現標的細胞の存在下での例示的ＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子）によるＴ細胞増殖の刺激＞
この試験は、例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質がＴ細胞を、標的細胞を殺すようにそれらをリダイレクトするときにＴ細胞を活性化することができることを実証するためのさらなる方法として使用された。
【０１２６】
Ｔ細胞増殖アッセイは、上記のように、ＬＮＣａＰ標的細胞を使用するＴ細胞リダイレクト殺傷アッセイの条件を使用して、そして７２時間で存在するＴ細胞の数を測定することによって設定した。例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質は、０．５ｐＭのＥＣ５０値で増殖を刺激した。陰性対照として、ＧＦＰを標的とする三重特異性タンパク質をアッセイに含めたところ、このタンパク質では増殖の増加は観察されなかった。Ｔ細胞増殖アッセイの結果を図１１に示す。
【０１２７】
＜実施例１４：３つの例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質（ＰＳＭＡを標的とするＴｒｉＴＡＣ分子ＰＨ１Ｔ、ＰＨ、およびＺ２）によるＬＮＣａＰ細胞のリダイレクトＴ細胞殺傷＞
この試験は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５０、１５１、および１５２に記載の配列を有する３つの例示的なＰＳＭＡ三重特異性抗原結合タンパク質が、Ｔ細胞を、ＬＮＣａＰ細胞株を殺すようにリダイレクトする能力を試験するために行われた。
【０１２８】
上の実施例に記載されるように設定されたＴＤＣＣアッセイにおいて、ＰＳＭＡ  ＰＨ１Ｔ  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５０）およびＰＳＭＡ  ＰＨ１  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５１）タンパク質は、図１２Ａに示されるように、それぞれ２５および２０ｐＭのＥＣ５０値で殺傷を指示し、図１２Ｂに示すように、ＰＳＭＡ  Ｚ２  ＴｒｉＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５２）タンパク質は０．８ｐＭのＥＣ５０値で殺傷を指示した。
【０１２９】
【表７−１】
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【０１３０】
【表７−２】
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【０１３１】
【表７−３】
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【０１３２】
【表７−４】
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【０１３３】
【表７−５】
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【０１３４】
【表８−１】
2019535763.tif 000014
【０１３５】
【表８−２】
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【０１３６】
【表９−１】
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【０１３７】
【表９−２】
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【０１３８】
【表１０−１】
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【０１３９】
【表１０−２】
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【０１４０】
【表１０−３】
2019535763.tif 000020
【０１４１】
【表１０−４】
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【０１４２】
【表１１】
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【０１４３】
【表１２】
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【０１４４】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されてきたが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されるかもしれないことを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法、および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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