(57)【要約】  骨格組織中のビスホスホネートを除去又は排除する方法及び組成物が本明細書に開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格組織中の活性ビスホスホネートを除去又は排除する方法であって、前記骨格組織に１種以上の不活性ビスホスホネートを投与することを含む方法。
【請求項２】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、（ａ）α−ヒドロキシ基を欠く、（ｂ）パラ置換されたピリジル側鎖を有する、又は（ｃ）α−ヒドロキシ基を欠き、且つパラ置換されたピリジル側鎖を有する、分子スキャホールドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記不活性ビスホスホネートが、それに結合された検出可能な標識、例えば、蛍光性化合物を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記不活性ビスホスホネートが蛍光性化合物に連結されたビスホスホネートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光性化合物が、ＲＯＸ、ＦＡＭ、ＡＦ６４７、ＩＣＧ、ＩＣＧアナログ、Ｃｙ５、スルホ−Ｃｙ５、Ｃｙ７、及びＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、５−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ、８００ＣＷ−ＺＯＬ、ＡＦ６４７−ＲＩＳ、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、８００ＣＷ−ＲＩＳ、８００ＣＷ−ＺＯＬ、８００ＣＷ−ＲＩＳＰＣ、ＩＣＧ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−ＺＯＬ、ＩＣＧ−ＲＩＳＰＣ、及びＩＣＧ−ｐ−ｐｙｒＥＢＰからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、ＩＣＧ−Ａ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ｂ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ｃ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ｄ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ａ−ｐ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−Ｂ−ｐ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−Ｃ−ｐ−ＲＩＳ、又はＩＣＧ−Ｄ−ｐ−ＲＩＳである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記活性ビスホスホネートが活性窒素含有ビスホスホネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記活性窒素含有ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートがエチドロネートである場合、投与様式が局所（local）、好ましくは局所(topical)であることを条件として、前記骨格組織中の前記活性ビスホスホネートが、対象においてインビボで除去又は排除される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記対象に局所投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記対象に経口投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記対象の歯肉組織及び／又は口蓋組織に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、口腔内適用により歯牙歯槽の処置の部位に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記歯牙歯槽の処置の前、その間、及び／又はその後に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
有効量の前記１種以上の不活性ビスホスホネートが投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、リポソーム製剤又はナノベシクル製剤、好ましくは変形可能なナノベシクル製剤の形態で投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
対象におけるビスホスホネート系薬剤関連顎骨壊死（ＢＲＯＮＪ）又はビスホスホネート関連症状を治療、低減、予防、又は抑止する方法であって、前記対象に治療上有効な量の１種以上の不活性ビスホスホネートを投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記対象が活性ビスホスホネートにより治療されたか、又は治療されている、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の謝辞
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）により授与された、Ｒ０１ＤＥ０２２５５２、ＳＢＩＲ  １Ｒ４３ＤＥ０２５５２４−０１、及びＳＢＩＲ  ２Ｒ４４ＤＥ０２５５２４−０２で政府支援によりなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ビスホスホネート系薬剤関連顎骨壊死（ＢＲＯＮＪ）を含む骨壊死並びに他の骨格の障害及び症状を治療する方法に関する。
【０００３】
２．関連技術の説明
顎骨壊死（ＯＮＪ）は珍しいが、重度の口腔合併症であり、数か月から数年にかけて消散しない、痛みのある骨露出又は瘻孔形成からなる症状を特徴とする。それは、強力な骨吸収抑制性ビスホスホネート（ＢＰ）薬、特に、ゾレドロネート（ＺＯＬ）、パミドロネート、及びアレンドロネートなどの窒素含有ＢＰ（Ｎ−ＢＰ）により治療された患者に特定されたとき、ビスホスホネート系薬剤関連ＯＮＪ（ＢＲＯＮＪ）と最初に記載され、後に、デノスマブなど他の骨吸収抑制性医薬又は抗血管新生医薬を服用している一部の患者にも見いだされた。場合によっては、壊死性の口内及び顎顔面骨のアブレーション手術が必要となり、患者の生活の質に著しく影響を与えたが、現在の予防法及び治療法は限定されている。臨床報告及び患者の調査は、定型的な抜歯及び義歯装着などの歯科処置が、ＯＮＪになるリスクを顕著に増加させるので、近年、歯科医療専門職及び患者の間に不安及び懸念を起こしていることを示した。
【０００４】
American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons（ＡＡＯＭＳ）により発表された最新版のポジションペーパーは、ＯＮＪを薬剤関連顎骨壊死（ＭＲＯＮＪ）と再定義して、ＢＲＯＮＪに関するその以前のポジションペーパーの範囲を拡大した。ＭＲＯＮＪは、活性ＢＰの他に、可能性のある関連薬剤として、例えば、核内因子κＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）活性化受容体阻害剤（例えば、デノスマブ）及び抗血管新生療法の医薬品の投与から生じるか、又は関連するＯＮＪの包含を反映している。
【０００５】
活性ＢＰの作用機序とデノスマブの作用機序は異なると当業者により考えられている。活性ＢＰの薬理学的機構は、そのピロリン酸塩との類似に基づいている。骨中のカルシウムイオンへの高い親和性のために、活性ＢＰは骨上に蓄積し、破骨細胞を標的とする。骨吸収の間、活性ＢＰは破骨細胞により取り込まれ、メバロン酸経路中の重要な酵素、ファルネシルピロリン酸シンターゼを阻害する。結果として、破骨細胞の活性が減少し、骨喪失の低減をもたらす。対照的に、デノスマブは、前破骨細胞上のＲＡＮＫ受容体に結合するタンパク質であるＲＡＮＫＬを阻害する。デノスマブは、ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫ受容体に結合するのを妨げ、そのため破骨細胞の形成を低下させる。
【０００６】
「休薬日」は、患者のための可能性のある予防措置としてＡＡＯＭＳにより推奨されており、デノスマブ療法を受けている患者に多少の見込みある結果を示した。しかし、活性ＢＰにより治療された患者にとってのその有効性は充分には確立されておらず、それは、部分的に、それらの異なる作用機序及び骨中の活性ＢＰの長い半減期によることがある。投与後、約５０％もの活性ＢＰが骨内に組み込まれ、残りは腎臓により迅速に排泄される。活性ＢＰの全身性代謝はなく、その長い半減期の一因であるが、半減期は、所与のＢＰによって数か月から１０年以上に達しうる。実際に、ＵＳ  ＦＤＡは、「休薬日の開始又は期間に関する決定を導くのに利用可能な根拠のあるデータはない」と発表した。
【０００７】
活性ＢＰはおよそ１５年間販売されてきたので、活性ＢＰにより治療されてきて、活性ＢＰをその骨格系の中に保持している可能性がある患者が大勢いる。したがって、ＢＲＯＮＪは、活性ＢＰにより治療されたか、又は現在治療されている多くの人々に対する医療上の脅威を提示し続ける。
【０００８】
このように、ＢＲＯＮＪ並びに活性ＢＰによる治療により起こるか、又はそれと関連する他の骨及び骨格の問題を治療、予防、及び／又は抑止する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
いくつかの実施形態において、本発明は、骨組織などの骨格組織中の活性ＢＰを除去又は排除する方法であって、骨格組織に１種以上の不活性ＢＰを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、骨組織などの骨格組織中の活性ＢＰは、対象中でインビボで除去又は排除される。いくつかの実施形態において、本発明は、対象のＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状を治療、低減、予防、又は抑止する方法であって、対象に１種以上の不活性ＢＰを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、骨組織などの骨格組織中の活性ＢＰを除去又は排除するための１種以上の不活性ＢＰの使用を対象とする。いくつかの実施形態において、本発明は、ＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状の治療のための、治療上有効な量の１種以上の不活性ＢＰを含む医薬品を対象とする。
【００１０】
本発明の種々の実施形態で使用するのに好適な不活性ＢＰの例には、段落［００４４］〜［００５０］に記載されるもの並びにその薬学的に許容できる塩、溶媒和物、及びプロドラッグがあり、活性ＢＰの例には、［００４３］で記載されるものがある。いくつかの実施形態において、除去又は排除されている活性ＢＰは、活性窒素含有ビスホスホネートである。いくつかの実施形態において、活性窒素含有ビスホスホネートは、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートである。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、低活性ビスホスホネートである。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰはα−ヒドロキシ基を欠き、パラ置換されたピリジル側鎖を有し、且つ／又は蛍光性化合物に共有結合したビスホスホネートを含む。いくつかの実施形態において、除去又は排除されている活性ＢＰは活性窒素含有ビスホスホネートであり、１種以上の不活性ＢＰは低活性ビスホスホネートである。いくつかの実施形態において、活性窒素含有ビスホスホネートは、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートであり、１種以上の不活性ＢＰは低活性ビスホスホネートである。いくつかの実施形態において、活性窒素含有ビスホスホネートは、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートであり、１種以上の不活性ＢＰはα−ヒドロキシ基を欠く。いくつかの実施形態において、活性窒素含有ビスホスホネートは、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートであり、１種以上の不活性ＢＰはパラ置換されたピリジル側鎖を有する。いくつかの実施形態において、活性窒素含有ビスホスホネートは、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートであり、１種以上の不活性ＢＰはα−ヒドロキシ基を欠き、且つ／又はパラ置換されたピリジル側鎖を有する。いくつかの実施形態において、活性窒素含有ビスホスホネートは、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネートであり、１種以上の不活性ＢＰは、蛍光性化合物に共有結合したビスホスホネートを含む。投与様式が全身投与である実施形態において、１種以上の不活性ＢＰはエチドロネートでない。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは以下の構造を有する：
【化１】
2019522642.tif 000002
ここで、Ｘは、Ｈ、ヒドロキシル、アミノ、ハロ、アルキル、又はアリールであり；Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、又は複素環であり；Ｚは、フルオロフォアなど、存在しても存在しなくてもよい検出可能な標識である。いくつかの実施形態において、Ｘは、ヒドロキシル又はＨであり、Ｙは、パラ置換されたピリジル基である。いくつかの実施形態において、Ｚは存在している。いくつかの実施形態において、Ｚは存在していない。
【００１１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、１種以上の不活性ＢＰがエチドロネートでないという条件で、対象に全身投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、活性ＢＰが除去又は排除されるべき部位に局所(locally)投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは対象に経口投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、対象の歯肉組織及び／又は口蓋組織に投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、活性ＢＰが除去又は排除されるべき部位に注射により投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、活性ＢＰが除去又は排除されるべき部位に局所(topically)投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、対象に実施された歯牙歯槽の処置の部位への口腔内適用により投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、歯牙歯槽の処置の前、その間、及び／又はその後に投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、歯牙歯槽の処置の部位の粘膜又はその近くの粘膜に直接注射により投与される。投与されている１種以上の不活性ＢＰがエチドロネートである実施形態において、投与様式は局所(local)投与である。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは医薬組成物として投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、医薬組成物の形態で与えられる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、段落［００６４］から［００６７］で記載される組成物又は製剤である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は変形可能なナノベシクル製剤である。いくつかの実施形態において、医薬組成物はリン脂質系変形可能なナノベシクル製剤である。いくつかの実施形態において、有効量の１種以上の不活性ＢＰが投与される。いくつかの実施形態において、治療上有効な量の１種以上の不活性ＢＰが対象に投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰが投与される対象は、活性ＢＰにより治療された。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰが投与される対象は、活性ＢＰにより治療されている。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰが投与される対象は、活性ＢＰにより治療されることになる。
【００１２】
前記の全般的な説明と以下の詳細な説明はどちらも例示的且つ説明的にすぎず、請求項記載の本発明のさらなる説明を与えるものである。添付図面は、本発明のさらなる理解を与えるために含められ、本明細書に組み込まれその一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を説明し、記載と共に本発明の原理を説明する。
【００１３】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してさらに理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１、パネルＡ〜Ｃは、骨を模したハイドロキシアパタイト表面からの、吸着された蛍光標識ＢＰ（ＦＬ−ＢＰ）の、異なる蛍光標識ＢＰによる排除を表す。合成骨／象牙質（リン酸カルシウム、ＣａＰ）によりコートされた培養ウェルは、ＲＯＸ−ＲＩＳか５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（５０μΜ）のいずれかにより事前処理された。段階希釈された投与量の５−ＦＡＭ−ＲＩＳ又はＲＯＸ−ＲＩＳ（０〜５０μΜ）によりそれぞれ曝露された後、ＣａＰによりコートされたウェルのカルボキシル−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）及びカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）蛍光強度が測定された。パネルＡ：ＣａＰ中のＲＯＸ−ＲＩＳ（各組の最初のバー）は、５μΜ以上の濃度の５−ＦＡＭ−ＲＩＳが曝露されるまで事前吸着された５０μΜレベル近くのままであった。対照的に、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ（各組の第２のバー）は、１μΜほどの低濃度のＲＯＸ−ＲＩＳにより迅速に排除された。パネルＢ：事前吸着されたＦＡＭ−ＲＩＳは、１０μΜ〜５０μΜのＲＯＸ−ＲＩＳにより置換された。パネルＣ：ＦＡＭ及びＲＯＸ蛍光シグナルの定量的測定は、標準化された蛍光性バイオフォトニクス及び独占プログラム（LAS3000、富士フイルム株式会社、東京、日本）により実施された。
【図２Ａ】図２Ａは、種々のＦＬ−ＢＰの合成を図式的に示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々のＦＬ−ＢＰの合成を図式的に示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、種々のＦＬ−ＢＰの合成を図式的に示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、種々のＦＬ−ＢＰの合成を図式的に示す。
【図３】図３は、象牙質表面に吸着された蛍光標識されたリセドロネート（ＲＩＳ）（上段画像中の円内の緑の点並びに下段画像中の半円の下の緑の点及び線）の画像である。表面に付着している破骨細胞（上段画像中の青い円及び下段画像中の半円）が、局所的な吸収窩（白色破線）を形成しながら放出された薬物を摂取するのを見ることができる。上段画像：１μｍ  ｘｙ画像  象牙質表面の８μｍ上；下段画像：同じ破骨細胞のｚｘ画像。
【図４】図４は、ＲＩＳ、２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビスホスホン酸（ｐ−ＰｙｒＥＢＰ）、及び１−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ｐ−ＲＩＳ）の構造を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、いくつかのＦＬ−ＢＰの合成を図式的に示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、いくつかのＦＬ−ＢＰの合成を図式的に示す。
【図６】図６は、いくつかのＦＬ−ＢＰの構造式を示す。
【図７】図７は、ゾレドロネート（ＺＯＬ）、ＲＯＸ−ＲＩＳ、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、及びＡＦ６４７−ＺＯＬのハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）結合親和性を示す棒グラフである。相対保持倍数はＲＩＳに対して標準化された。
【図８Ａ】図８Ａから図８Ｄは、ｐＨ６．８での４種のＦＬ−ＢＰのハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）への結合の吸着等温式（上段のグラフ）を、同じデータのスキャッチャードプロット（下段のグラフ）と共に示し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。図８Ａは、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳの吸着等温式を示す。
【図８Ｂ】図８Ａから図８Ｄは、ｐＨ６．８での４種のＦＬ−ＢＰのハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）への結合の吸着等温式（上段のグラフ）を、同じデータのスキャッチャードプロット（下段のグラフ）と共に示し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。図８Ｂは、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣの吸着等温式を示す。
【図８Ｃ】図８Ａから図８Ｄは、ｐＨ６．８での４種のＦＬ−ＢＰのハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）への結合の吸着等温式（上段のグラフ）を、同じデータのスキャッチャードプロット（下段のグラフ）と共に示し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。図８Ｃは、ＡＦ６４７−ＲＩＳの吸着等温式を示す。
【図８Ｄ】図８Ａから図８Ｄは、ｐＨ６．８での４種のＦＬ−ＢＰのハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）への結合の吸着等温式（上段のグラフ）を、同じデータのスキャッチャードプロット（下段のグラフ）と共に示し、データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。図８Ｄは、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣの吸着等温式を示す。
【図９】図９は、３種の異なるＦＬ−ＢＰ（ＲＯＸ−ＲＩＳ、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、及び５−ＦＡＭ−ＺＯＬ）の発光波長を示す。左から右に、曲線は、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、ＲＯＸ−ＲＩＳ、及びＡＦ６４７−ＺＯＬである。５−ＦＡＭとＡＦ６４７の重なりは極めて小さい。
【図１０】図１０は、マウス上顎骨の代表的な画像である。ＡＦ６４７−ＺＯＬは、５−ＦＡＭ−ＺＯＬにより事前注射されたマウスの上顎骨に口腔内注射された。ＡＦ６４７−ＺＯＬの用量依存的吸着が、注射部位及びその周辺（矢印）に観察された。ＦＡＭ−ＺＯＬシグナルの減少が定性的に観察された（点線）。大腿骨の蛍光画像化は、ＡＦ６４７−ＺＯＬの口腔内注射が、静脈内投与とは違い、遠位の骨格系への全身分布をもたらさないことを示した。
【図１１】図１１は、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ  ＩＶ注射（左のパネル）又はＲＯＸ−ＲＩＳ口腔内注射（中央及び右のパネル）後のマウス上顎骨の蛍光性バイオフォトニク画像を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａから図１２Ｃは、ＡＦ６４７−ＺＯＬ及び５−ＦＡＭ−ＺＯＬの排除及び置換を示す。図１２Ａは頭蓋骨の蛍光画像である。ＡＦ６４７−ＺＯＬ（５０μΜ）は、ＩＶ注射により頭蓋骨に事前吸着された。示された投与量の５−ＦＡＭ−ＺＯＬは、骨膜下空間に直接注射された。
【図１２Ｂ】図１２Ａから図１２Ｃは、ＡＦ６４７−ＺＯＬ及び５−ＦＡＭ−ＺＯＬの排除及び置換を示す。図１２Ｂは、５−ＦＡＭ−ＺＯＬシグナルが注射投与量の増加と共に増加する一方で、ＡＦ６４７−ＺＯＬシグナルが減少したことを示すグラフである。各セットの最初のバーはＡＦ６４７−ＺＯＬのものであり、各セットの第２のバーは５−ＦＡＭ−ＺＯＬのものである。＊、ダネット検定によりビヒクルに対してＰ＜０．０５。
【図１２Ｃ】図１２Ａから図１２Ｃは、ＡＦ６４７−ＺＯＬ及び５−ＦＡＭ−ＺＯＬの排除及び置換を示す。図１２Ｃは、頭蓋骨冷却断面の画像であり、ＡＦ６４７−ＺＯＬの局所的な排除及び５−ＦＡＭ−ＺＯＬによる置換を明らかにした。
【図１３】図１３は、マウス大腿部骨梁構造のマイクロＣＴ評価の結果を示す。５−ＦＡＭ−ＺＯＬの薬理学的機能が、ビタミンＤ欠乏（ＶｉｔＤ（−））ラット（各群でｎ＝３）で調査された。５−ＦＡＭ−ＺＯＬは、異化作用による骨リモデリングを効果的に妨げ、海綿骨構造を増加させた。バーは１．０ｍｍである。＊：ステューデントのｔ検定によりｐ＜０．０５。
【図１４】図１４は、マウス大腿部骨梁構造のマイクロＣＴ評価の結果を示す。ＡＦ６４７−ＺＯＬではなくＺＯＬのＩＶ注射は、骨構造パラメーターを著しく増加させた。
【図１５】図１５は、マウスＯＮＪモデルが好適なＢＲＯＮＪモデルであることを示す画像である。抜歯創の治癒はＺＯＬ−注射マウスにおいて遅れた（矢じり）。口腔内の上皮過形成（矢印）は壊死性の歯槽骨の露出（下段右のパネル中、赤点線、実質的に水平）をもたらした。
【図１６Ａ】図１６Ａから図１６Ｃは、ＢＲＯＮＪマウスモデルでのＢＲＯＮＪの予防又は抑止を表す。図１６Ａは、ＺＯＬ  ＩＶ注射とそれに続く抜歯を含むマウスモデル試験を図式的に示す。ＡＦ６４７−ＺＯＬは、口腔内注射又はＩＶ注射により抜歯の１日前に適用された。
【図１６Ｂ】図１６Ａから図１６Ｃは、ＢＲＯＮＪマウスモデルでのＢＲＯＮＪの予防又は抑止を表す。図１６Ｂは、ＺＯＬ−処置マウス（ＢＲＯＮＪ対照：ｎ−４）の抜歯部位での種々の程度の顎骨露出（矢印）を有するマウス上顎骨並びに口腔粘膜炎症及び腫脹（白い点線、左及び右のパネル）の画像である。ＡＦ６４７−ＺＯＬ口腔内注射群（ｎ＝４）（中央のパネル）では、全マウスが、慢性炎症も腫脹もなく優れた抜歯創傷治癒を示した。ＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＩＶ注射群（ｎ＝４）（右のパネル）は、ＢＲＯＮＪ様病変の弱まりを示した。
【図１６Ｃ】図１６Ａから図１６Ｃは、ＢＲＯＮＪマウスモデルでのＢＲＯＮＪの予防又は抑止を表す。図１６Ｃは、ＡＦ６４７−ＺＯＬシグナルがＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＩＶ注射後に明らかに大腿骨に観察できることを示す、マウス大腿骨の標準化された蛍光性バイオフォトニクス画像を表す。対照的に、口腔内注射は大腿骨に検出可能な蛍光シグナルをもたらさなかった。
【図１７】図１７は、メチレンヒドロキシルビスホスホネート（ＭＨＤＰ）、エチレンヒドロキシルビスホスホネート（ＥＨＤＰ）、メチレンビスホスホネート（ＭＢＰ）、クロドロネート、チルドロネート、２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビスホスホン酸（ｐ−ＰｙｒＥＢＰ）、及び１−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビス（ホスホン酸）（ｐ−ＲＩＳ）を含む、いくつかのアルキリデンビスホスホネートの構造式を示す。
【図１８Ａ１】図１８Ａ１から図１８Ａ４は、活性ＢＰの排除に使用できる近赤外線ＦＬ−ＢＰ（ＩＣＧ−ＢＰ）の合成のためのＩＣＧアナログの調製を図式的に表す。図１８Ａ１は、全般的な図面及び合成経路Ａを示す。
【図１８Ａ２】図１８Ａ１から図１８Ａ４は、活性ＢＰの排除に使用できる近赤外線ＦＬ−ＢＰ（ＩＣＧ−ＢＰ）の合成のためのＩＣＧアナログの調製を図式的に表す。図１８Ａ２は、合成経路Ｂを示す。
【図１８Ａ３】図１８Ａ１から図１８Ａ４は、活性ＢＰの排除に使用できる近赤外線ＦＬ−ＢＰ（ＩＣＧ−ＢＰ）の合成のためのＩＣＧアナログの調製を図式的に表す。図１８Ａ３は、合成経路Ｃを示す。
【図１８Ａ４】図１８Ａ１から図１８Ａ４は、活性ＢＰの排除に使用できる近赤外線ＦＬ−ＢＰ（ＩＣＧ−ＢＰ）の合成のためのＩＣＧアナログの調製を図式的に表す。図１８Ａ４は、合成経路Ｄを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、いくつかのそのようなＩＣＧ−ＢＰの構造を表す。
【図１９Ａ】図１９Ａから図１９Ｃは、特定のアルキリデンビスホスホネートがマウスモデルにおいてインビボで活性ＢＰの排除に使用できる証拠を表す。図１９Ａは、塩水（０．９％ＮａＣｌ）ビヒクル群としてベースラインレベルのままであったＭＨＤＰの骨吸収抑制効果の欠如を示す、マウス大腿部骨梁構造のマイクロＣＴ評価の結果を示す。ゾレドロネート（ＺＯＬ）は、海綿骨中の骨量を組織体積で割ったもの（ＢＶ／ＴＶ）の増加及び連結密度（ＣｏｎｎＤ）の減少により示される通り、著しい骨吸収抑制効果を示した。
【図１９Ｂ】図１９Ａから図１９Ｃは、特定のアルキリデンビスホスホネートがマウスモデルにおいてインビボで活性ＢＰの排除に使用できる証拠を表す。図１９Ｂは、ＭＨＤＰを使用してＣ５７Ｂｌ６マウスを処置する実験のプロトコルを略記する。マウスへのＺＯＬ  ＩＶ注射によりＯＮＪ様病変を発生させ、それに続いて上顎第１大臼歯を抜歯した。抜歯の１日前に、１群のマウスは２μｇＭＨＤＰの口腔内注射を受け、別の群は１００μｇＭＨＤＰのＩＶ注射を受けた。
【図１９Ｃ】図１９Ａから図１９Ｃは、特定のアルキリデンビスホスホネートがマウスモデルにおいてインビボで活性ＢＰの排除に使用できる証拠を表す。図１９Ｃは、マウス上顎骨の画像を表す。左のパネルは、ＭＨＤＰ処置のないＺＯＬを注射されたマウスが、ＯＮＪ様病変：口腔粘膜の大規模な炎症及び顎骨の露出を起こしたことを示す。ＭＨＤＰの口腔内注射（中央のパネル）及びＩＶ注射（右のパネル）は、ＯＮＪ様病変の発生を防いだ。
【図２０】図２０は、抜歯部位のマウス上顎骨の代表的な組織構造を示す。ＺＯＬを注射されたマウスは、上顎大臼歯抜歯の２週間後に、両側に口腔内上皮過形成（矢印）がある創傷の露出（Ｅｘｐ）により強調されるＯＮＪ様病変の発生を表した。抜歯窩（黒色点線）は骨の創傷治癒を示さず、口蓋骨（赤色点線）の表面は生きておらず（骨壊死）、局所的な激しい炎症反応（矢じり）と接続していた。１回のＡＦ６４７−ＺＯＬ又はＭＨＤＰの口腔内注射により処置されたＺＯＬ−マウスは、ＯＮＪ様病変を起こさなかった。抜歯窩（黒色点線）は再生骨で満たされ、口腔粘膜炎症ははるかに弱かった。上顎骨の骨壊死は全く観察されなかった。
【図２１】図２１、パネルＡ及びＢは、不活性ＢＰの口腔内注射によるマウスのＯＮＪ予防を示す。パネルＡは、実験予定表の略図である。ＺＯＬ（５００μｇ／ｋｇ）のＩＶ注射により処置されたマウスは、上顎第１大臼歯抜歯の１日前に、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、ＭＨＤＰ、又はＥＴＩ（エチドロネート）の口腔内注射を受けた。ＯＮＪの発生が、抜歯後１４日に評価された。パネルＢは、疾患対照マウス（ＺＯＬ−ＮａＣｌ）が抜歯部位でＯＮＪ様病変を起こしたことを示すが、これは、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、ＭＨＤＰ、又はＥＴＩの口腔内注射により予防されるようであった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
薬剤関連顎骨壊死（ＭＲＯＮＪ）は、口腔内の部分的に壊死した顎骨の消散しない露出又はそこへの瘻孔交通を臨床的に特徴とし、歯牙歯槽の処置と関連することが多い。骨吸収抑制薬剤及び抗血管新生薬剤のうち、骨吸収抑制性ビスホスホネートによる治療は、ＭＲＯＮＪの報告される臨床例と顕著に関連する。骨吸収抑制性ビスホスホネートの反復投与は、顎骨壊死（ＯＮＪ）と関連することが多い、骨中の高蓄積レベルの骨吸収抑制性ビスホスホネートをもたらす。そのため、活性ＢＰにより治療されたか、又は治療されている対象のＯＮＪは、一般的にビスホスホネート系薬剤関連顎骨壊死（ＢＲＯＮＪ）と称される。
【００１６】
本明細書では、「活性ビスホスホネート（活性ＢＰ）」は、強力な骨吸収抑制活性を示し、骨吸収抑制療法に使用されるビスホスホネートを指す。本明細書では、「ビスホスホネート」は、全般的に、炭素に共有結合している２つのホスホネート基を有する化合物を指す。活性ビスホスホネートは、「活性窒素含有ビスホスホネート（活性Ｎ−ＢＰ）」を含むが、これは、ヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）のＴｈｒ２０１及びＬｙｓ２００のカルボニルと水素結合を形成する窒素を含む化学構造を有するビスホスホネートを指す。活性Ｎ−ＢＰの例には、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、及びゾレドロネートがある。
【００１７】
本明細書では、「不活性ビスホスホネート（不活性ＢＰ）」は、骨吸収抑制療法に使用されてきたか、且つ／又は使用されている活性ＢＰと比べて、骨吸収抑制剤として完全に不活性であるか、又は骨吸収抑制剤として部分的に不活性であるビスホスホネートを指す。部分的に不活性なＢＰは、本明細書で「低活性ビスホスホネート（低活性ＢＰ）」と称される。言い換えると、不活性ＢＰは低活性ＢＰを含む。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰはα−ヒドロキシ基を欠く化学構造を有する。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰはパラ置換されたピリジル側鎖を有する化学構造を有する。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、α−ヒドロキシ基を欠き、パラ置換されたピリジル側鎖を有する。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは以下の構造を有する：
【化２】
2019522642.tif 000003
式中、Ｘは、Ｈ、ヒドロキシル、アミノ、ハロ、アルキル、又はアリールであり；Ｙは、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、アリール、又は複素環であり；Ｚは存在しても存在しなくてもよい、フルオロフォアなどの検出可能な標識である。いくつかの実施形態において、Ｘはヒドロキシル又はＨであり、Ｙはパラ置換されたピリジル基である。いくつかの実施形態において、Ｚは存在する。いくつかの実施形態において、Ｚは存在しない。
【００１８】
不活性ＢＰは、本発明によると、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）への結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、活性ＢＰの結合親和性よりも高いハイドロキシアパタイトへの結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、活性ＢＰのハイドロキシアパタイトへの結合を競合阻害する。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、ハイドロキシアパタイトに投与されると、ハイドロキシアパタイトに結合している活性ＢＰを排除する。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、活性Ｎ−ＢＰと同じか、又は実質的に類似の骨親和性を示し、抗破骨細胞活性をほとんど又は全く示さない。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、活性Ｎ−ＢＰより高い骨親和性を示し、活性Ｎ−ＢＰの抗破骨細胞活性をほとんど又は全く示さない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、不活性ＢＰが、排除又は置換されている活性Ｎ−ＢＰより低い程度にヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）を阻害する限り、不活性ＢＰはその化学構造内に窒素を含み得る。いくつかの実施形態において、窒素とヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）のＴｈｒ２０１との間及びＬｙｓ２００のカルボニルとの間に形成される水素結合の強度が、排除又は置換されている活性Ｎ−ＢＰとＦＰＰＳのＴｈｒ２０１及びＬｙｓ２００のカルボニルとの間に形成される水素結合の強度より低い限り、不活性ＢＰは、その化学構造内に窒素を含み得る。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、窒素が、ヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）のＴｈｒ２０１及びＬｙｓ２００のカルボニルと水素結合を結合しない限り、その化学構造内に窒素を含み得る。当技術分野の酵素結合活性アッセイ及びタンパク質モデリング法を利用して、ヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）のＴｈｒ２０１及びＬｙｓ２００のカルボニルと水素結合を形成する窒素を有さないビスホスホネートをスクリーニングできる。例えば、Ebetino, et al. (2011) Bone 49(1):20-33; 及びKavanagh, et al. (2006) PNAS, 103(20):7829-7834を参照されたい。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、Dunford, et al. (2008) J Medicinal Chemistry 51(7):2187-2195中の手順により測定されて、４．１ｎＭ超、好ましくは１０ｎＭ以上、より好ましくは１００ｎＭ以上、さらにより好ましくは５００ｎＭ以上、最も好ましくは１０００ｎＭ以上のヒトファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）の阻害性ＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、Sun, et al. (2016) Bioconjugate Chem 27(2):329-340中の手順により測定されて、１００μΜ未満の濃度でタンパク質のプレニル化を阻害しない。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、Schenk又は成長過程ラットモデル（Seitsema, et al. (1989) Drugs Exptl. Clin. Res. XV(9):389-396）などの骨代謝のインビボモデルにおいて、活性ＢＰの濃度未満の濃度で骨吸収を阻害しない。不活性ＢＰの例には、２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビスホスホン酸（ｐ−ＰｙｒＥＢＰ）、１−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビスホスホン酸（ｐ−ＲＩＳ）、メチレンビスホスホネート（ＭＢＰ）、メチレンヒドロキシルビスホスホネート（ＭＨＤＰ）、エチドロネート（ＥＨＤＰ）、クロドロネート、イスクロドロネート（isclodronate）、チルドロネート、２−ヒドロキシ−２−ホスホノ−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸（３−ＰＥＨＰＣ）、及び２−ヒドロキシ−３−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）−２−ホスホノプロパン酸（３−ＩＰＥＨＰＣ）がある。
【００２０】
いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、それに結合している蛍光性化合物などの検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態において、不活性ＢＰは、ＲＯＸ、ＦＡＭ、ＡＦ６４７、ＩＣＧ、Ｃｙ５、スルホ−Ｃｙ５、Ｃｙ７、及びＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷなどの蛍光性化合物に共有結合しているビスホスホネート（活性ＢＰでも不活性ＢＰでもよい）を含む。蛍光性化合物が連結されている不活性ＢＰの例には、図２Ａ〜図２Ｄの化合物７ａ１〜７ｆ２、図５Ａのものなどの蛍光性ｐ−ＰｙｒＥＢＰコンジュゲート、図５Ｂのものなどの蛍光性ｐ−ＲＩＳコンジュゲート、図１８Ａ１〜図１８Ａ４に従って合成されるＩＧＣ化合物、及び図１８Ｂに記載されるＩＧＣ化合物がある。いくつかの実施形態において、蛍光性化合物が連結されている不活性ＢＰは、５−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ、８００ＣＷ−ＺＯＬ、ＡＦ６４７−ＲＩＳ、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、８００ＣＷ−ＲＩＳ、８００ＣＷ−ＺＯＬ、８００ＣＷ−ＲＩＳＰＣ、ＩＣＧ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−ＺＯＬ、ＩＣＧ−ＲＩＳＰＣ、及びＩＣＧ−ｐ−ｐｙｒＥＢＰである。
【００２１】
不活性ＢＰは、骨吸収抑制療法において使用されてきたか、且つ／又は使用されている活性ＢＰと比べて、骨吸収抑制剤として完全に不活性であるか、又は骨吸収抑制剤として部分的に不活性であるビスホスホネートの薬学的に許容できる溶媒和物、塩、及びプロドラッグも含む。「薬学的に許容できる溶媒和物」は、所与の化合物の生物学的活性、例えば骨吸収抑制活性（又はその欠如）を保持している、明示された化合物の溶媒和物形態を指す。溶媒和物の例には、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸、エタノールアミン、又はアセトンと組み合わされた本発明の化合物がある。有機化学の当業者は、多くの有機化合物が、それらがその中で反応する溶媒又はそれらがそこから沈殿若しくは結晶化する溶媒と錯体を形成し得ることを認識するであろう。これらの錯体は、「溶媒和物」として知られている。例えば、水との錯体は「水和物」として知られている。多くの有機化合物が２つ以上の結晶形で存在し得る。例えば、結晶形は、溶媒和物によって様々になり得る。そのため、不活性ＢＰ及びその溶媒和物の全結晶形が本発明の範囲内にある。
【００２２】
用語「薬学的に許容できる塩」は、薬理学的に許容でき、本発明の化合物により治療されている対象にとって実質的に非毒性である塩形態を指す。薬学的に許容できる塩には、好適な非毒性の有機若しくは無機酸又は無機塩基から形成される従来の酸付加塩又は塩基付加塩がある。例示的な酸付加塩には、塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸などの無機酸から誘導されたもの並びにｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタン−ジスルホン酸、イセチオン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、酢酸、フェニル酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、グルタミン酸、サリチル酸、スルファニル酸、及びフマル酸などの有機酸から誘導されたものがある。例示的な塩基付加塩には、水酸化アンモニウム（例えば、テトラメチルアンモニウムヒドロキシドなどの四級アンモニウムヒドロキシド）から誘導されるもの、アルカリ又はアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、又はマグネシウム）水酸化物などの無機塩基から誘導されるもの、及び塩基性のアミノ酸などの非毒性の有機塩基から誘導されるものがある。
【００２３】
「薬学的に許容できるプロドラッグ」は、生理的条件下、又は加溶媒分解により、明示された化合物又はそのような化合物の薬学的に許容できる塩に転化し得る化合物である。「薬学的に活性な代謝物」は、明示された化合物又はその塩の体内での代謝により生じる薬理活性のある生成物を指す。ある化合物のプロドラッグ及び活性代謝物は、当技術分野に公知である技法を利用して特定できる。例えば、Bertolini, G. et al., (1997) J. Med. Chem. 40:2011-2016; Shan, D. et al., J. Pharm. Sci., 86(7):765-767; Bagshawe K., (1995) Drug Dev. Res. 34:220-230; Bodor, N., (1984) Advances in Drug Res. 13:224-331;Bundgaard, H., Design of Prodrugs (Elsevier Press, 1985) 及び Larsen, I. K., Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen et al., eds., Harwood Academic Publishers, 1991)を参照されたい。
【００２４】
本明細書に開示される通り、骨などの骨格組織中の以前に吸着された活性ＢＰは、新たに投与された不活性ＢＰにより排除又は除去され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１種以上の不活性ＢＰを骨格組織に投与することによる、骨格組織中のビスホスホネートを除去又は排除する方法を対象とする。いくつかの実施形態において、本発明は、ＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状を治療、抑止、又は減少させる方法であって、それを必要とする対象に１種以上の不活性ＢＰを投与することによる方法を対象とする。本明細書では、「ビスホスホネート関連症状」は、痛みのある骨露出及び瘻孔形成、異常な骨折など、活性ＢＰによる治療により起こるか、又はそれと関連する症状を含む。活性Ｎ−ＢＰにより治療されてきた対象の異常な骨折の例には、非定型大腿骨骨折及び股関節骨折がある。例えば、 Paziana, et al. (2011) Bone 43:103-110を参照されたい。
【００２５】
局所投与された不活性ＢＰは、かなりの濃度で全身に分布することなく投与部位で骨に結合することが可能である。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、局所投与され、例えば、活性ＢＰが排除若しくは除去されるべき部位での骨組織への注射、例えば外科手術の間に露出される骨組織の部位での局所投与、又は１種以上の不活性ＢＰの全身分布を減少させ、抑止し、若しくは防ぐ、例えば、リポソーム若しくはナノベシクルなどの薬物送達粒子上若しくはその中の医薬製剤の形態での治療すべき骨組織の部位に隣接する組織中の適用（例えば、注射）である。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、ナノベシクルの形態で送達される。いくつかの実施形態において、ナノベシクルは変形可能でないナノベシクルである。いくつかの実施形態において、ナノベシクルは変形可能なナノベシクルである。例えば、国際公開第２０１７／０８７６８５号及びSubbiah, et al. (2017) J Drug Delivery, Article ID 4759839を参照されたい。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、活性ＢＰにより治療されてきたか、又は治療されている人のＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状が起こりそうな部位で、ＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状の発生を防ぐための予防的措置として、対象に局所投与される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、治療すべき対象は、休薬日の候補でない対象である。いくつかの実施形態において、治療すべき対象は、骨粗鬆症又は骨に関連する癌若しくは転移（例えば、骨転移性の悪性腫瘍又は多発性骨髄腫）を患い、活性ＢＰにより治療されている対象である。いくつかの実施形態において、対象が休薬日の候補でなく、活性Ｎ−ＢＰにより治療されている結果としてＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状を起こす危険性がある場合、１種以上の不活性ＢＰが、活性Ｎ−ＢＰが除去又は排除されるべき部位に局所適用され得る。
【００２７】
エチドロネートが不活性ＢＰとして対象に投与されている実施形態において、エチドロネートは、活性Ｎ−ＢＰが排除又は除去されるべき部位に局所投与される。いくつかの実施形態において、エチドロネートは、ＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状の発生を防ぐための予防的措置として局所投与される。
【００２８】
ＢＲＯＮＪ予防／治療法：不活性ＢＰによる活性ＢＰの排除に基づく、ＢＲＯＮＪの第１の予防処置及び／又は治療処置が本明細書に開示される。本明細書に開示される通り、１種以上の不活性ＢＰの投与は「競合平衡」に基づく活性ＢＰの排除をもたらしそうである。骨へのＢＰ吸着の文脈において、「ＢＰ排除」は、以前に吸着されたＢＰのその後に投与されたＢＰによる排除を指す。ＢＰ排除は、インビトロ（図１）及びインビボ（図１０、図１２Ａ〜図１２Ｃ）で示された。本明細書に開示される通り、ＢＰ排除はＢＲＯＮＪの予防法として使用できる。例えば、事前吸着された活性ＢＰは、例えば、静脈内若しくは経口投与により全身投与されるか、又は所与の治療部位への局所投与による（例えば、顎への直接口腔内注射又は口腔粘膜への局所適用）１種以上の不活性ＢＰにより効果的に排除され得る。
【００２９】
口腔内アプローチ：抜歯などの歯牙歯槽の処置の部位への１種以上の不活性ＢＰの局所投与は、骨中に存在する１種以上の活性ＢＰを排除し、それによりＢＲＯＮＪを治療することも、ＢＲＯＮＪを起こす危険性を低下させることもできる。重要なことは、抜歯などの歯牙歯槽の処置の部位への１種以上の不活性ＢＰの口腔内適用は、その部位に存在する１種以上の活性ＢＰを排除し、それにより、対象内の他の組織中及び／又は他の部位での活性ＢＰの治療活性に著しく干渉せずに、対象がＢＲＯＮＪを起こす危険性を低下させることができる。そのため、いくつかの実施形態において、事前吸着された活性ＢＰは、１種以上の不活性ＢＰの顎への口腔内注射により効果的に排除又は除去され得る。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、治療すべき部位に適用される液剤、ゲル剤、又はペースト剤の形態で投与され得る。本発明による治療方法の例として、対象は、例えば抜歯などの歯牙歯槽の処置の部位へ口腔内適用により有効量の１種以上の不活性ＢＰを投与されて、ＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状を治療又は抑止することも、対象がＢＲＯＮＪ及び／又はビスホスホネート関連症状を起こす危険性を低下させることもできる。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、歯牙歯槽の処置の前、その間、及び／又はその後に、対象の歯肉／口蓋組織に適用される。
【００３０】
蛍光標識されたビスホスホネート（ＦＬ−ＢＰ）：不活性ＢＰは、ＲＩＳ又はＺＯＬ及び関連アナログなどの活性ＢＰの、検出可能な標識、例えば、蛍光性化合物との連結により生成することができる。好適な蛍光性化合物の例には、フルオレセイン及びその誘導体（カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、カルボキシル−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Alexa Fluor 647（ＡＦ６４７）、ローダミンＲｅｄ−Ｘ（ＲｈＲ−Ｘ）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ（８００ＣＷ）、スルホ−Ｃｙ５、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、及びそのアナログを含む、図１８Ａ１〜図１８Ａ４の合成方法に利用されたもの及び図１８Ｂに描かれているものを含む）がある。好適なＦＬ−ＢＰの例は、図２Ａ〜図２Ｄ、図５Ａ、図５Ｂ、図６、図１８Ａ１〜図１８Ａ４、及び図１８Ｂに開示されている。ＦＬ−ＢＰを使用して、骨塩表面上に吸着されたビスホスホネートの破骨細胞組み込みの直接的な可視化（図３）を含む、ビスホスホネートの局在化及び相互作用をインビボでモニターできる。ＦＬ−ＢＰは、不活性ＢＰでありＩＣＧ−ＢＰを含むが、本明細書に開示される通り、骨格組織中の活性ＢＰを除去又は排除するのに使用され得る。
【００３１】
異なる骨塩結合親和性、骨吸収抑制活性（不活性から部分的に活性まで）、及び／又は機能を有する１種以上の不活性ＢＰが利用され得る。例えば、一連の異なるＦＬ−ＢＰを使用して、対象、例えば、動物モデルにおいて吸着された程度及び量を特性化することも、そのような治療をモニターすることもできる。
【００３２】
ＲＩＳ又はＺＯＬなどの現代のＢＰの特徴は、その骨吸収抑制効果が、主として２つのホスホネート基によるその貪欲な骨親和性とは異なり、その窒素含有置換基の構造に依存することである。いくつかの実施形態において、本発明による不活性ＢＰは、Ｎ含有ビスホスホネートに基づくスキャホールド、例えば、リセドロネート（ＲＩＳ）及びゾレドロネート（ＺＯＬ）を有し、Ｎ含有ビスホスホネートと同じ又は実質的に類似の骨親和性を示すが、抗破骨細胞活性はほとんど又は全く示さない。いくつかの実施形態において、本発明による不活性ＢＰは、α−ヒドロキシ基、パラ置換されたピリジル基（図４）、又は両方を欠くスキャホールドを有するが、それは、対応する活性ＢＰと比べて骨親和性に対する著しい影響なしに、骨吸収抑制活性を劇的に減少させる。いくつかの実施形態において、本発明による不活性ＢＰは蛍光性化合物に連結した活性ＢＰを含み、蛍光性化合物への連結は、ビスホスホネートを骨吸収抑制剤として不活性にするか、又は活性を低減している。これらの蛍光標識されたビスホスホネート（ＦＬ−ＢＰ）は、ハイドロキシアパタイトの表面に強く吸着されることが可能であるが、対応する非連結のビスホスホネートの骨吸収抑制活性を実質的に又は完全に欠いている。
【００３３】
いくつかの実施形態において、治療すべき対象は動物モデルである。いくつかの実施形態において、治療すべき対象はヒトである。いくつかの実施形態において、治療すべき対象はＢＲＯＮＪを起こす危険性がある。いくつかの実施形態において、治療すべき対象は１種以上の活性ＢＰにより治療されてきた。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明は、１種以上の不活性ＢＰを対象の骨に投与することを含む、対象の骨中の事前吸着された活性ＢＰ薬物を排除することを対象とする。
【００３５】
いくつかの実施形態において、対象に投与される１種以上の不活性ＢＰの量は、治療上有効な量又は有効量である。本明細書では、「有効量」は、プラセボと比べて観察可能な差異をもたらす投与量である。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰの有効量は、骨などの組織に投与されると、その組織中の活性ＢＰの５０％超を排除するものである。「治療上有効な量」は、対象に投与されると、対照と比べて、（ｉ）特定の疾患、病態、若しくは障害を治療若しくは抑止する、（ｉｉ）特定の疾患、病態、若しくは障害の１種以上の症状を弱め、改善し、若しくは無くす、且つ／又は（ｉｉｉ）特定の疾患、病態、若しくは障害の１種以上の症状の発症を抑止若しくは遅延する、１種以上の本発明の化合物の量を指す。１種以上の本発明の化合物の治療上有効な量は、所与の化合物、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害の種類、疾患又は障害の程度、及び治療されている対象の正体などの因子によって変わるであろうが、それにもかかわらず当業者により容易に決定され得る。例えば、１種以上の不活性ＢＰの「治療上有効な量」は、陰性対照と比べて、ＢＲＯＮＪの徴候又は症状を治療、抑止、予防、又は減少させるものである。治療上有効な量は動物モデルから決定され得る。例えば、ヒトの治療上有効な量は、動物モデルにおいて治療上有効であるとわかった量に基づいて公式化され得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、治療上有効な量の１種以上の不活性ＢＰは、歯牙歯槽の処置、抜歯、インプラント処置、歯周病の確定などの事象の前、その間、又はその後に、対象のキログラム体重あたり約５〜２０、約１０〜１５、又は約１１〜１２ミリグラムの単回投与として投与される。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、事象の間又はその直後に投与される。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全般的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に治療するために要する用量に影響し得ることを認識するであろう。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明は、１種以上の不活性ＢＰを含む、１種以上の不活性ＢＰから基本的になる、又は１種以上の不活性ＢＰからなる組成物を対象とする。医薬組成物を含む本発明の組成物は、１種以上の不活性ＢＰ及び薬学的に許容できる担体を含む。本明細書では、用語「医薬組成物」と「医薬製剤」は互換的に使用されて、対象における薬学的使用に好適な組成物を指す。医薬組成物は、一般的に、活性薬剤、例えば、１種以上の不活性ＢＰ及び薬学的に許容できる担体、例えば、緩衝剤、補助剤、希釈剤などを含む。
【００３８】
対象に投与すべき１種以上の不活性ＢＰは、医薬製剤として提供され得る。医薬製剤は、所望の投与様式に適切な単位剤形で調製され得る。本発明の医薬製剤は、経口、直腸、鼻腔内、局所（頬側及び舌下を含む）、膣内、粘膜、及び非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）を含むあらゆる好適な経路により投与され得る。投与経路が、受容者の状態及び年齢、治療すべき病態の性質、並びに本発明の所与の化合物により変わり得ることが認識されるであろう。いくつかの実施形態において、投与経路は経口である。いくつかの実施形態において、投与経路は粘膜である。いくつかの実施形態において、１種以上の不活性ＢＰは、対象の口腔粘膜に送達される。いくつかの実施形態において、本発明による医薬製剤は１種以上の不活性ＢＰの水溶液である。いくつかの実施形態において、本発明による医薬製剤は、１種以上の不活性ＢＰを含む、例えば親油性ゲル中の懸濁液である。いくつかの実施形態において、本発明による医薬製剤は、リポソーム又はナノベシクル中にカプセル化された１種以上の不活性ＢＰを含むリポソーム又はナノベシクル調製物である。いくつかの実施形態において、ナノベシクルは変形可能でないナノベシクルである。いくつかの実施形態において、ナノベシクルは変形可能なナノベシクルである。例えば、国際公開第２０１７／０８７６８５号及びSubbiah, et al. (2017) J Drug Delivery, Article ID 4759839を参照されたい。いくつかの実施形態において、本発明による医薬製剤は、１種以上の不活性ＢＰを含む経口的粘膜ゲル製剤である。いくつかの実施形態において、本発明による医薬製剤は、１種以上の不活性ＢＰを含む口腔歯粘膜接着プロニオソームゲル製剤である。
【００３９】
医薬製剤に使用される不活性ＢＰの実際の用量が、使用されている特定の化合物、処方される特定の組成物、投与様式、並びに治療されている特定の部位、対象、及び疾患によって、様々であることが認識されるであろう。所与の組の状態に対する最適な用量は、所与の化合物の実験データを考慮して用量決定試験を利用して当業者により確認され得る。プロドラッグの投与は、完全に活性のある形態の重量レベルと化学的に等しい重量レベルで投薬され得る。
【００４０】
本発明による医薬組成物及び製剤は、治療上有効な量の１種以上の不活性ＢＰ及び薬学的に許容できる担体を含む。本明細書では、「薬学的に許容できるビヒクル」と「薬学的に許容できる担体」は互換的に使用され、薬務行政と適合し、薬務行政のための該当する規格と法規、例えば、米国薬局方（United States Pharmacopeia）及び国民医薬品集（National Formulary）（ＵＳＰ−ＮＦ）本に述べられている薬局方基準に合致するありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、賦形剤、希釈剤などを指し、それらを含む。そのため、例えば、滅菌されていない水は、少なくとも静脈内投与用には、薬学的に許容できる担体としては除外される。薬学的に許容できるビヒクルは当技術分野に公知であるものを含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy. 20thed. (2000) Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MDを参照されたい。利用される薬学的に許容できる担体は、固体でも液体でもよい。例示的な固体担体は、ラクトース、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。例示的な液体担体は、シロップ、落花生油、オリーブ油、医薬品グレードの水などである。同様に、担体又は希釈剤は、単独又は蝋、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレートなどと組み合わせたステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなど、当技術分野に公知である時間遅延又は時間放出材料を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる担体はリポソームである。いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる担体は、変形可能でも、変形可能でなくてもよいナノベシクルである。いくつかの実施形態において、薬学的に許容できる担体はプロニオソームである。
【００４１】
不活性ＢＰの毒性及び治療効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的である投与量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である投与量）を決定するための細胞培養又は実験動物における標準的な薬学手順により決定され得る。毒性効果と治療効果の間の投与量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０により表され得る。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され得るものの、感染していない細胞に対する潜在的な損傷を最低限にして副作用を減少させるために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計するように配慮すべきである。
【００４２】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のためのある範囲の用量を公式化するために使用され得る。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんど又は全くない、ＥＤ５０を含むある範囲の血中濃度内にある。用量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で変わり得る。本発明の方法で使用される化合物では、治療上有効な投与量は、最初は細胞培養アッセイから推定され得る。投与量は動物モデルにおいて公式化されて、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲が達成され得る。そのような情報を利用して、ヒトにおける有用な投与量がより正確に決定され得る。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【実施例】
【００４３】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するが、本発明を限定しないものとする。
【００４４】
動物
マウス顎骨壊死（ＯＮＪ）モデル
ＯＮＪのＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスモデルを使用する。この試験での一貫した組織源は、抜歯のある又はないマウスの上顎骨、並びに大腿骨、下顎骨、及びＬ４／Ｌ５木材骨（lumber bones）である。マウスの創傷治癒を試験するための抜歯動物モデルは、発明者らの研究所及び他の研究所で充分に確立された。全身性ビスホスホネート治療はＩＶ注射により達成され、提案されるＦＬ−ＢＰの局所適用は、マウス上顎の歯肉／口蓋組織への口腔内注射により達成される。マウスを上顎大臼歯抜歯に付す。麻酔及びバイタルサイン確認の後、動物を、口を開けたままにしながら、イソフルラン管類を支持するベッドに配置する。眼科用軟膏（刺激のない、例えば、ラクリューブ）を適用する。上顎大臼歯部分を０．１２％クロルヘキシジングルコン酸塩溶液（ペリデックス、オーラルリンス）で拭く。抜歯後の不快を最低限にするために、頸管粘膜の注意深い熟考（reflection）の後、オートクレーブ処理された歯科用探針を抜歯用エレベーターとして使用する。オートクレーブ処理された綿棒を、初期の血液凝固が確立されるまで抜歯窩上に配置する。次いで、上顎第１大臼歯を、残りの未処置の側が咀嚼に使用できるように、一方だけ抜く。発明者らの以前の実験では、手順全体は約５〜１５分かかる。
【００４５】
ＯＮＪは口腔内に起こる。歯科処置（通常抜歯）が、ビスホスホネート関連ＯＮＪの発症の引き金として指摘されてきた。口腔内創傷治癒の適切な代替モデルがないため、動物を使用して提案された研究を実施することが必要である。他のモデルを使用すれば、創傷治癒の生物学及び分子機構を研究することは不可能であろう。将来の創傷治癒治療のヒト患者への外挿は、動物の使用なしでは不可能であろう。マウスは、その創傷治癒過程がヒトに類似しているために、且つ発明者らの仮説に直接関連する遺伝子操作された血統をすぐに利用可能であるために使用される。この試験に必要とされる動物の推定数は、創傷治癒に対するビスホスホネート治療の総合的な試験が達成されるであろうという考慮に基づいている。
【００４６】
獣医学的手当は、UCLA Medical CenterのDepartment of Laboratory Animal Medicineのおかげで提供される。動物対象を手術の後に診察する；獣医学的診察が、感染などの合併症のために得られる。呼吸器の疾患若しくは窮迫、又は腸の疾患の徴候を示す動物は使用しない。ＵＣＬＡは、完全認証されたAmerican Association of Accreditation of Laboratory Animal Care(ＡＡＡＬＡＣ)である。
【００４７】
動物のいずれの苦痛、不快、又は疼痛も防ぐために、処置は、イソフルラン吸入（１〜２％）を利用して全身麻酔下で実施する。生存手術後に、動物を水循環式ヒーティングパッド上に配置する。動物を、心血管機能及び呼吸器機能に関してモニターし、動物が伏臥位をとるまで連続的に付き添う。処置後の不快を防ぐために、鎮痛剤を投与する。これらの変異体マウスの飼畜に特別な処理は何も考えられていないが、起こりうるあらゆる感染をモニターする。
【００４８】
動物を、実験完了時に安楽死させる。安楽死は１００％二酸化炭素吸入により完了する。方法は、Panel of Euthanasia of the American Veterinary Medical Associationの勧告と一致している。
【００４９】
実施例１
種々の骨塩結合親和性を有するＦＬ−ＢＰの合成及び特性化
低い又は検出不能な生物学的活性を有するが高い骨塩親和性を有する、蛍光性化合物が連結しているビスホスホネート（ＦＬ−ＢＰ）を合成した。異なるフルオロフォアを、「Magic linker」技術（例えば、米国特許第８，４３１，７１４号参照）を利用して、ビスホスホネートに連結した。結合親和性／薬理活性のインビトロ特性化を実施した。
【００５０】
実験１−１：ＦＬ−ＢＰの合成
ＦＬ−ＢＰを、「Magic linker」技術（例えば、米国特許第８，４３１，７１４号参照）を利用して、図５Ａに図式的に示される通り、ＢＰ化合物、例えば、ＲＩＳ、ＺＯＬ、及び他の関連アナログ（例えば、図４）をフルオロフォアに連結した。コンジュゲート、ＦＬ−ＢＰは、収率５０〜７７％（＞純度９８％）で得られ、ＵＶ−ＶＩＳ、蛍光発光、１Ｈ  ＮＭＲ、３１Ｐ  ＮＭＲ、及びＨＲＭＳにより特性化した。図６は、合成した３種のＦＬ−ＢＰの構造式を示す。いくつかの実施形態において、本発明により使用されるＢＰは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，４３１，７１４号に記載されるものである。低活性ＢＰの１例は、１−ヒドロキシ−２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビスホスホン酸（ｐ−ＲＩＳ）であり；不活性ＢＰの別の例は、２−（ピリジン−４−イル）エタン−１，１−ジイルビスホスホン酸（ｐ−ＰｙｒＥＢＰ）である。
【００５１】
実験１−２：ＦＬ−ＢＰのインビトロ特性化
Ａ）骨塩結合親和性アッセイ
ハイドロキシアパタイトアッセイは、ＦＬ−ＢＰが一般的に、ＢＰ成分の親和性及び程度は低いが連結したフルオロフォアの親和性を反映する、骨塩への著しい親和性を保持することを示す。ハイドロキシアパタイト（Macro-Prep（登録商標）セラミックハイドロキシアパタイトＩＩ型２０μΜ）を、Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CAから得た。正確に秤量したハイドロキシアパタイト粉末（１．４〜１．６ｍｇ）を、適切な体積のアッセイバッファー（０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）Tween20、１０μΜ  ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．４）を含む４ｍＬ透明バイアル中で３時間懸濁させた。次いで、ハイドロキシアパタイトを、増加する量のＦＡＭ−ＢＰ及びＲＯＸ−ＢＰ（０、２５、５０、１００、２００、及び３００μＭ）と共にインキュベートした。試料を、３７℃で３時間、適切な体積のアッセイバッファー（０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）Tween20、１０μΜ  ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．４）中で穏やかに振盪した。平衡期間の後に、バイアルを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、固体と上清を分けた。０．３ｍＬの上清を回収し、平衡溶液濃度を、Shimadzu ＵＶ−ＶＩＳ分光計を使用して測定する。較正系列のために、ＦＬ−ＢＰプローブ標準を、ストック溶液から同じ等温緩衝液とともに段階希釈により調製して０〜４００μΜの範囲を与えた。較正曲線を、標的ＦＬ−ＢＰの標準溶液を使用して作成した。蛍光発光を使用して、結合パラメーターを計算することもできる。対照として、非特異的結合を、ハイドロキシアパタイトのない状態で、類似の手順で測定した。結合パラメーター（Ｋｄ及びＢｍａｘは、それぞれ、平衡解離定数及び最大結合部位数を表す）を、PRISMプログラム（Graphpad, USA）を使用して計算した。各化合物の結合パラメーターを５つの独立した実験で測定した。平衡解離定数（Ｋｄ）が約１００μΜより高い（親ＢＰのＫｄの約１０倍）化合物をさらなる調査から除いた。２標本ｔ検定を利用して、プローブの結合パラメーターを評価した。各群の試料サイズ（ｎ＝５）は、検出力８０％及び片側第一種過誤０．０５でこの仮説に対して効果量１．７２を検出することができた。
【００５２】
ハイドロキシアパタイトアッセイは、ＦＬ−ＢＰが全般的に相当な骨塩親和性を保持していることを確認するものである。フルオロフォア成分は、親和性に対して多少の影響を及ぼす：５−ＦＡＭ−ＺＯＬ及びＡＦ６４７−ＺＯＬはわずかな減少を示したが、ＲＯＸ−ＲＩＳは増大を示した（図７）。このように、ビスホスホネートの骨親和性は、異なるフルオロフォアに連結した場合、実質的に保持されている。
【００５３】
ラングミュア吸着等温式に基づく方法を利用して、代表的な蛍光性ＢＰプローブの結合親和性測定を測定した；結果は、ハイドロキシアパタイトカラムアッセイから得た結果と良好に一致する（図８Ａ〜図８Ｄ）。
【００５４】
Ｂ）生物学的活性インビトロアッセイ
インビトロ活性アッセイを、骨髄マクロファージを使用し、それをＭ−ＣＳＦと共にウシ骨スライス上で２日間培養して、破骨細胞前駆体（ＯＣＰ）を富化し、次いでＲＡＮＫＬによりさらに３日間処理して、多核破骨細胞を発生させ単離することにより実施した。骨スライスにＦＬ−ＢＰを事前吸着させ、段階希釈された多数のＯＣＰをそれらの上で培養した。吸収窩面積を測定した。それとは別に、破骨細胞を回収し、総タンパク試料を調製した。Ｒａｐ１ａのプレニル化を、ウェスタンブロットにより調査した。各実験群（ｎ＝５）を、プロトタイプ実験で対照（ｎ＝５）と比較する。実験１−２−Ｂは、実験１−２−Ａと同じ検出力計算を有する。
【００５５】
予備的な試験において、蛍光性ＺＯＬアナログの細胞生存率に対する影響を決定するために、Ｊ７７４．２マウスマクロファージを２×１０５細胞／ｍｌで９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。次いで、インキュベーション期間の最後に、細胞を、１０、１００、又は５００μΜの蛍光性ＺＯＬアナログ、ＺＯＬ、又はビヒクルにより４８時間処理し、培地を除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、アラマーブルー試薬を含む培地を加え、細胞をさらに３時間インキュベートする。ウェスタンブロット及び細胞生存率アッセイは、ＦＡＭコンジュゲートの著しい生物学的効果を示した。これらの結果は、５−フルオレセイン−ＺＯＬコンジュゲート（及び類似のＲＩＳコンジュゲート）が観察可能な抗プレニル化及び親ＢＰ薬物の骨吸収抑制性を保持していることを表す。
【００５６】
代替手法
インビトロ系及びアッセイのほとんどが蛍光性ＢＰプローブに関して充分に確立されているが、ハイドロキシアパタイトカラムアッセイを結合親和性アッセイに使用できる。象牙質ディスクも、ウシ骨スライスの代わりに使用できる。方法は、ｐ−ＲＩＳなどＢＰ分子の構造に適切な修飾を含む他のＦＬ−ＢＰを生じさせて、所望の親和性を得るのに適用できる。
【００５７】
実施例２
顎骨への局所吸着のためのＦＬ−ＢＰの口腔内適用及び事前吸着されたＦＬ−ＢＰのＩＶ注射による競合的排除
この実験は、インビボのＢＰ排除を実証するために実施した。尾静脈（tail vain）注射による全身投与から生じたマウス中の事前吸着されたＦＬ−ＢＰを、異なるフルオロフォアを有するＦＬ−ＢＰを使用する上顎の歯肉／口蓋組織への局所適用により曝露させる。局所適用は、ａ）歯肉／口蓋組織への注射；ｂ）口内洗浄；及びｃ）経粘膜送達のための局所適用、を含み得る。ＦＬ−ＢＰは顎骨の骨膜空間に適用できる。口腔内注射の投与量及び時点を、定量的な蛍光画像化分析により確立して、最大の排除効率が達成される。可能性のある遠位の毒性効果も考察した。大腿骨、下顎骨、及びＬ４／Ｌ５木材骨を調査した。
【００５８】
実験２−１
この実験は、口腔内注射プロトコルを確立し、注射量と上顎骨吸着蛍光シグナルの間の関係を決定するものである。合計で３０匹の雌性Ｂ６マウスを５群（ｎ＝６）に分ける。各群で、２５μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液中の０、１、５、１０、又は５０μΜのＲＯＸ−ＢＰの単回の口腔内注射を歯肉／口蓋組織に実施した。口腔内注射の１週間後に、頭蓋骨（上顎注射部位を含む）、下顎骨、大腿骨、及びＬ４／Ｌ５木材骨を収集し、軟部組織を除いた。ＰＢＳ中に保存した骨検体を標準化された蛍光性バイオフォトニクスにより評価し、シグナルを独占プログラム（LAS3000、富士フイルム株式会社）を使用して定量化した。
【００５９】
実験結果
図９に示される通り、ＲＯＸとＦＡＭは、最適以下の蛍光シグナル分離が生じる重複する発光スペクトルを有する（データ示さず）。したがって、ＡＦ６４７−ＺＯＬを、ＦＡＭ−ＺＯＬの排除を試験するための候補ＦＬ−ＢＰとして選択したが、逆も同様である。元のＢＰと排除する標識されたＢＰからの相補的な蛍光シグナルを使用すると、元のＢＰローディング及び排除するＢＰローディングに対するその応答をモニターできた。
【００６０】
マウス口腔内注射プロトコルを、３３ゲージニードルのついたハミルトンシリンジを使用して確立した。手術用顕微鏡下で、２μｌの溶液を、マウス上顎の左第１大臼歯の口蓋歯肉に注射した。緩徐注射の後、ニードルを組織内に３分間残し、次いで静かに除いた。
【００６１】
この方法を用いて、２μｌの０μΜ、０．５μΜ、又は５．０μΜ  ＡＦ６４７−ＺＯＬを、１００μｌの５０μΜ  ＦＡＭ−ＺＯＬの後眼窩ＩＶ注射の６日後に、マウスの上顎口腔粘膜に、マウスに注射した。マウス組織を口腔内注射の１日後に収集し、上顎骨を、４６０ｎｍの励起波長及び５１５ｎｍフィルターを使用して得られた標準化された蛍光性バイオフォトニクス画像に付した（LAS3000、富士フイルム株式会社）。
【００６２】
図１０に示される通り、この方法は、一貫して首尾よくＦＬ−ＢＰをマウス上顎口腔粘膜組織に送達した。ＡＦ６４７−ＺＯＬ口腔内注射は、用量依存的ＡＦ６４７シグナルを、口蓋骨の注射部位及びその周囲に生じさせた。さらに、事前吸着されたＦＡＭ−ＺＯＬがＡＦ６４７−ＺＯＬにより除去された徴候があった。しかし、この排除の定量的な評価は、大部分はマウス上顎の複雑な解剖学的構造による、いくらかの問題を提示した。
【００６３】
実験２−２
この実験は、口腔内注射部位での仮定されたＢＰ排除を調査するものである。合計で３０匹の雌性マウスを５群（ｎ＝６）に分けた。全群は、２００μｌの３５０μΜ  ＦＡＭ−ＢＰの単回ＩＶ注射を受けた。１週間後、各群のマウスは、２５μｌの０、１、５、１０、又は５０μΜ  ＲＯＸ−ＢＰの歯肉／口蓋組織への口腔内注射を受けた。口腔内注射の１週間後にマウスを安楽死させ、頭蓋骨、下顎骨、大腿骨、及びＬ４／Ｌ５木材骨を収集した。骨検体を、２色蛍光性バイオフォトニクスに関して評価し、各シグナルを定量化した。
【００６４】
予備的な試験において、雌性Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ（Ｂ６）マウス（８週齢）は、２００μｌの３５０μΜ  ５−ＦＡＭ−ＺＯＬ（5-FAM-ZOL, #BV111001, BioVinc LLC, Culver City, CA）の尾静脈を経る単回のＩＶ注射又は２５μｌの５０μΜ  ＲＯＸ−ＲＩＳ（5(6)-ROX-RIS, #BV150101, BioVinc LLC, CA）の、上顎左第１大臼歯の歯肉／口蓋組織への単回口腔内注射（図１１中白色矢印）を受けた。１週間後、５−ＦＡＭ−ＺＯＬのＩＶ注射の３週間後又はＲＯＸ−ＲＩＳの口腔内注射の２日後、マウスを安楽死させた。頭蓋骨（上顎骨を含む）を収集し、標準化された蛍光性バイオフォトニクス画像を、４６０ｎｍの励起波長及び５１５ｎｍフィルターを使用して得た（LAS3000、富士フイルム株式会社）。比較的均一な強い緑色蛍光シグナルが、ＦＡＭ−ＺＯＬのＩＶ注射後に、上顎骨及び頬骨弓全体に検出された。対照的に、ＲＯＸ−ＲＩＳの口腔内注射部位周辺の口蓋骨は、局所的な赤色蛍光シグナルを示した（図１１）。
【００６５】
実験結果
マウスを、１００μｌの５０μΜ  ＡＦ６４７−ＺＯＬ後眼窩ＩＶ注射により事前処置した。６日後、マウスは、１０μｌの０μΜ、１μΜ、１０μΜ、又は５０μΜ  ＦＡＭ−ＺＯＬによる骨膜下注射を頭蓋骨に受けた。頭蓋骨を収集し、軟部組織を除いた。ＡＦ６４７及びＦＡＭの蛍光シグナルを、標準化された蛍光性バイオフォトニクスにより測定した。次いで、頭蓋骨を低温切片のために準備した。断面は、テープ法により作成し、共焦点レーザー走査型顕微鏡法により評価した。
【００６６】
骨膜下に注射されたＦＡＭ−ＺＯＬのＦＡＭシグナルは、注射部位の頭蓋骨上で用量依存的増加を示した。図１２Ａに示される通り、対応する部位でのＡＦ６４７シグナルは、ＦＡＭ−ＺＯＬの投与量増加と共に段階的減少を示した。図１２Ｂに示される通り、１０μΜ及び５０μΜで統計的有意性に到達した。
【００６７】
頭蓋骨冷却断面は、図１２Ｃに示される通り、外部及び内部骨表面並びに柱表面でのＡＦ６４７−ＺＯＬ標識を明らかにした。ＦＡＭ−ＺＯＬ骨膜下注射を受けた頭蓋骨検体において、ＦＡＭ−ＺＯＬシグナルが主として外部骨表面に観察され、時折骨髄空間に観察された。外部骨表面上のＡＦ６４７−ＺＯＬシグナルは、内部骨表面と比べて釣り合いがとれないほど減少した（図１２Ｃ）。
【００６８】
代替手法
望まれる場合、上記試験のデータを使用して検出力分析を実施し、動物の数を調整できる。提案された蛍光性バイオフォトニクス画像化方法に加えて、脱灰されていない骨の低温切片を使用できるが、それは、骨中の吸着されたＦＬ−ＢＰの深さを与え得る。或いは、骨片をサンプリングし、インビトロで脱灰して、吸着されたＦＬ−ＢＰを放出させることができる。放出されたＦＬ−ＢＰは、２色プレートリーダー又はＨＰＬＣにより定量化され得る。
【００６９】
実施例３
インビボのＢＲＯＮＪの予防のためのＢＰ排除療法
この試験は、ＢＲＯＮＪの発生の予防における提案されたＢＰ排除の有効性を調査するものである。抜歯前の不活性及び／又は低活性ＦＬ−ＢＰの口腔内投与を、確立されたＺＯＬ誘導性マウスＢＲＯＮＪモデルに適用した。仮定された疾患修飾は、ＢＲＯＮＪの罹患率、並びに組織構造的口腔粘膜異常及び骨壊死発生により決定した。この試験は、提案されるＢＰ排除療法の概念実証を確立するものである。
【００７０】
実験３−１
この試験は、ＺＯＬと比較したＦＬ−ＢＰのインビボの骨吸収抑制機能を決定するものである。雌性Ｂ６マウスに、５０μΜ  ＺＯＬ（ｎ＝６）、５０μΜ  ＦＬ−ＢＰ（ｎ＝６）、又は０．９％ＮａＣｌビヒクル溶液（対照：ｎ＝６）を尾静脈を経て注射した。３週間後、マウスを安楽死させ、大腿骨及びＬ４／Ｌ５を収集した。１０％緩衝ホルマリンに固定した後、骨試料をマイクロＣＴ分析に付した。骨吸収抑制機能を、海綿骨三次元モルフォメトリー（例えば、ＢＶ／ＴＶ、Ｔｂ．Ｎ、Ｔｂ．Ｔｈ、ＴｂＳｐ）により定量的に立証した。BioVincにより開発された５−ＦＡＭ−ＺＯＬは、図１３に示される通り薬理学的機能を示した。薬理学的ＢＰ機能が極めて低いか、又は全くないＦＬ−ＢＰを使用する。本明細書では、薬理学的ＢＰ機能が極めて低いか、又は全くない化合物は、タンパク質抗プレニル化アッセイにより測定される骨吸収抑制活性をほとんど又は全く示さない化合物を意味する（Kashemirov (2008) Bioconjugate Chem. 19(12):2308-2310; Sun (2016) Bioconjugate Chem. 27(2):329-340参照）。
【００７１】
実験結果
マウスに、０．９％ＮａＣｌ（ビヒクル溶液）、ＺＯＬ（１８４μΜ×１００μｌ＝５．０μｇ／動物）又はＡＦ６４７−ＺＯＬ（１８４μΜ×１００μｌ＝２２．０μｇ／動物）をＩＶ注射し、注射の２週間後に大腿骨を収集した。マイクロＣＴデータを比較した。
【００７２】
ＺＯＬ注射は、大腿部海綿骨の体積（ＢＶ／ＴＶ）及び連結密度をほぼ２倍にした。対照的に、図１４に示されている通り、ＡＦ６４７−ＺＯＬは、骨構造パラメーターのいずれも変化させなかった。この試験は、ＡＦ６４７−ＺＯＬが、ＺＯＬの骨吸収抑制性薬理学的作用を有さないことを示唆した。
【００７３】
実験３−２
雌性Ｂ６マウスを、尾静脈を経る２００μｌの３５０μΜ  ＺＯＬ  ＩＶ注射により処置した。マウスのＺＯＬ投与量は、癌患者のヒト投与量の代謝スケーリングにより計算した。１週間後、口腔内注射ＦＬ−ＢＰを、歯肉／口蓋組織の上顎第１大臼歯部分に実施した。この実験に使用したＦＬ−ＢＰは、ＺＯＬに等しい骨親和性を有するが、著しく低下したＢＰ機能を有していた。口腔内注射の１週間後、上顎左第１大臼歯を抜歯した。各群のマウスを、２週目（各群でｎ＝６）及び４週目（各群でｎ＝６）で安楽死させた。抜歯部位を含む上顎骨組織、下顎骨、大腿骨、及びＬ４／Ｌ５木材骨を収集した。全骨試料を１０％緩衝ホルマリンに固定化し、マイクロＣＴにより分析した。１０％ＥＤＴＡによる脱灰後、パラフィン切片を組織病理学的調査に使用した。サイトケラチン１４免疫組織構造を有する切片を、上皮の異常及び破骨細胞のＴＲＡＰに関して調査した。
【００７４】
予備試験において、雌性Ｂ６マウスに、５００μｇ／Ｋｇ  ＺＯＬ（２００μｌの３５０μΜ  ＺＯＬに等しい）を、尾静脈を経て注射し、１週間後、上顎左第１大臼歯を抜歯した。ビヒクル溶液を注射された対照マウスの抜歯創は２〜４週で閉じたが、ＺＯＬを注射されたマウスの１００％及び５０％は、それぞれ抜歯の２週及び４週で口腔内開放創を示した（図１５）。
【００７５】
実験結果
マウスは、ＺＯＬ（４４０μｇ／Ｋｇ；２９４μΜ×１００μＬ＝８．０μｇ／動物）のボーラスＩＶ注射を、後眼窩静脈叢から受けた。図１６Ａに示される通り、１１日後、マウスは、ＡＦ６４７−ＺＯＬ口腔内注射（２５０μΜ×２μＬ＝０．５９μｇ／動物）又はＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＩＶ注射（５００μΜ×１００μＬ＝５９．２μｇ／動物）を受け、次いでＡＦ６４７−ＺＯＬ注射の１日後、マウスを、左上顎第１大臼歯の抜歯に付し、口腔内創傷治癒を抜歯後２週で評価した。遠位の骨におけるＡＦ６４７−ＺＯＬシグナルを大腿骨で評価した。
【００７６】
図１６Ｂは、ＺＯＬを注射された疾患対照マウスが、ＢＲＯＮＪ様病変の発生と一致して、歯肉腫脹及び顎骨露出を伴う遅れた創傷治癒を示したことを示す。抜歯１日前のＡＦ６４７−ＺＯＬの口腔内注射は、口腔粘膜炎症／腫脹を起こさず、この群の全個体（ｎ＝４）にＢＲＯＮＪの完全な予防をもたらした。対照的に、ＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＩＶ注射を受けたマウスの一部は、口腔粘膜炎症／腫脹の徴候を示したが、顎骨露出ははるかに弱かった（図１６Ｂ）。大腿骨の評価は、図１６Ｃに示される通り、ＩＶ注射によりＡＦ６４７−ＺＯＬを受け取ったマウスでは明確なＡＦ６４７−ＺＯＬシグナルを表したが、口腔内注射によりＡＦ６４７−ＺＯＬを受け取ったマウスではそうでなかった。結果は、口腔内適用及び顎骨中の局所的ＢＰ排除が有利であることを示した。
【００７７】
代替手法
ヒトＯＮＪ症例を、非治癒性の口腔内創傷の８週後に決定する。マウスはより速い代謝及び加速された創傷治癒を示すので、この試験は抜歯創を４週間観察できる。この時間までに、対照マウスは完全な創傷治癒を示す。しかし、ＦＬ−ＢＰ治療介入の効果は、より長期間モニターする必要があり得る。
【００７８】
ＡＦ６４７−ＺＯＬによる実験の結果は、１）平衡に基づくＢＰ排除がインビボで起こり、ＢＲＯＮＪを予防、抑止、及び／又は治療するための不活性ＢＰの治療的使用を支持すること、２）ＡＦ６４７などの蛍光性化合物をＢＰに連結することができ、連結した場合、ＢＰの骨吸収抑制活性は最低限まで減少するが、骨塩結合効率は保持されていること、並びに、３）不活性ＢＰの口腔内適用が、ＢＲＯＮＪの予防、抑止、又は治療に有効であることを示す。
【００７９】
実施例４
アルキルビスホスホネート
メチレンヒドロキシルビスホスホネート（ＭＨＤＰ又はＭＨＢＰ）、エチレンヒドロキシルビスホスホネート（ＥＨＤＰ）、メチレンビスホスホネート（ＭＢＰ）、クロドロネートなどのアルキルビスホスホネート（図１７）は、顎及び他の骨格部位におけるＮ−ＢＰの有害作用を予防、低減、又は抑止するのに充分な量でＮ−ＢＰを排除し得る。アルキルＢＰは、それに連結された蛍光性化合物を有することができ、その一部を図１８に示す。
【００８０】
図１９Ａに示される結果は、ＭＨＤＰの骨吸収抑制活性の欠如を証明し、それによりそのようなアルキルＢＰが、ＢＲＯＮＪ並びに活性ＢＰにより起こされる他の骨及び骨格の問題を治療、抑止、低減、又は予防できることを示す。ウェスタンブロット分析はこれらの結果を確認し、ＭＨＤＰ及びＥＴＩ（エチドロネート）ではなくＺＯＬが、Ｊ７７４マクロファージ中で１０μΜ及び１００μΜ投与量で、Ｒａｐ１  Ａプレニル化を阻害した（非プレニル化Ｒａｐ１  Ａ（ｕＲａｐ１  Ａ）を蓄積）ことを示した。したがって、図１９Ｂに図式的に示されている通り、マウス上顎をＺＯＬにより処置し、次いで、２μｇのＭＨＤＰを抜歯すべき大臼歯の部位に口腔内注射するか、又は１００μｇのＭＨＤＰをＩＶ注射し、処置されたマウス上顎の大臼歯抜歯の部位を対照と比べた。図１９Ｃに示される通り、ＭＨＤＰの口腔内注射及びＩＶ注射は、未処置の対照と比べて、ＯＮＪ様病変の発生を予防した。
【００８１】
実施例５
近赤外線ＦＬ−ＢＰ
近赤外線（ＮＩＲ）ＦＬ−ＢＰを、新規のセラノスティック剤（図１８）：具体的には、インドシアニングリーン−ＢＰ（ＩＣＧ−ＢＰ）コンジュゲート：ｐ−ＰｙｒＥＢＰ又はｐ−ＲＩＳ（図４）に結合したフルオロフォアＩＣＧとして合成した。強力な骨吸収抑制性Ｎ−ＢＰのＲＩＳ又はＺＯＬとは異なり、ｐ−ＰｙｒＥＢＰ及びｐ−ＲＩＳのＢＰスキャホールドは、α−ヒドロキシ基を欠くか、且つ／又はそのピリジル側鎖がパラ置換されており、それが、骨親和性にはわずかな影響しか与えずに、骨吸収抑制活性を極めて低いレベルに減少させる。そのため、設計は、ＦＬ−ＢＰコンジュゲートが、親Ｎ−ＢＰの生物学的活性を示さないようにしながら、ハイドロキシアパタイトの表面に極めて強く吸着されることを可能にする。
【００８２】
ＩＣＧは、ヒトの使用のために臨床的に認可された唯一のＮＩＲ蛍光染料であり、８００ｎｍ付近で吸収し、ＮＩＲ領域で（６００〜１２００ｎｍ）高い蛍光強度で蛍光を発し、心臓、肝臓、肺、血液循環、及びリンパ節を含む画像化試験に広く使用されてきた。画像化システム（Xiralite X4, Mivenion GmbH, Berlin, Germany）は米国内での使用に関して最近認可され、手持ち式の装置（例えば、KaVo DIAGNOcam）が、ＮＩＲ波長光を使用して歯の中のカリエスを特定するために現在使用されつつあり、それはここでのＩＣＧ−ＢＰに容易に適用可能である。そのため、この新規組成物は、骨中の骨吸収抑制作用なしに、ＢＰの容易な可視化を可能にする。
【００８３】
しかし、ＩＣＧは、連結を可能にする独自の官能基を全く有さない。そのため、カルボキシル部分を、ＢＰとの連結が３つの別な部位で可能であるように分子中に導入した。これらのスキャホールドは、フルオロフォアコアに対する最低限の作用を持つように設計されて、ＩＣＧフルオロフォアの光学的性質を保存する（図１８）。
【００８４】
これらの新規ＩＣＧ−ＢＰを使用して、安全な歯科処置が、癌関連の骨疾患における高用量Ｎ−ＢＰを含む、骨粗鬆症のＢＰ療法を受けているあらゆる患者に実施できる。理想的には、製品は、歯科医が費用のかからない手持ち式のライトを使用して、顎骨部位で有効な投薬を目視で確認し、次いで歯科処置を開始することを可能にする一方で、ＦＬ−ＢＰの全身性吸着を最低限にし得る。ＮＩＲ蛍光性コンジュゲートの使用は、重なり合う筋膜及び組織を通して顎顔面骨の可視化を可能にし、年齢、性別、民族性などの個々の特許(patent)の特性によって異なる顎骨代謝回転レベルによることがあるなどのコンジュゲート取込みの患者変動をモニターできるので（個別化医療又は精密医療）、重要な発明である。これは、セラノスティック剤の充填量を直接観察する能力により、処置の結果における歯科医の自信を高めながら、使いやすさを改善し、費用対効果を増加させる。
【００８５】
参照文献
参照により本明細書に全体として組み込まれる、全体にわたって引用された参照文献の他に、以下の参照文献も、参照により本明細書に全体として組み込まれる。
1. Ruggiero SL, Mehrotra B, Rosenberg TJ, Engroff SL. Osteonecrosis of the jaws associated with the use of bisphosphonates:a review of 63 cases. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery:Official Journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 2004;62(5):527-34. Epub 2004/05/04. PubMed PMID:15122554.
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【００８６】
本明細書に使用される全科学技術用語は、特記されない限り、当技術分野で通常使用される意味を有する。
【００８７】
本明細書では、用語「対象」と「患者」は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ニワトリ、並びに他の獣医学的対象及び試験動物などを含む。
【００８８】
単数の使用は、具体的に他に記載されない限り、複数を含み得る。本明細書及び添付される特許請求の範囲において使用される通り、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「前記（the）」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含み得る。本明細書では、「及び／又は」は、「及び」又は「又は」を意味する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、「Ａ、Ｂ、又はＡとＢの両方」を意味し、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」は、「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はこれらの組み合わせ」を意味し、前記「これらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのあらゆる部分集合、例えば、１メンバーの部分集合（例えば、Ａ又はＢ又はＣ又はＤ）、２メンバーの部分集合（例えば、Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；など）、又は３メンバーの部分集合（例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ；又はＡ、Ｂ、及びＤ；など）、又は全４メンバー（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）を意味する。
【００８９】
句「〜を含む、〜から基本的になる、又は〜からなる」は、過度なページ費用及び翻訳費用を避けるための手段であり、いくつかの実施形態において、問題となっている所与のものが何かを含み、いくつかの実施形態において、問題となっている所与のものが何かからなることを意味する。例えば、「いくつかの実施形態において、組成物はＡを含み、Ａから基本的になり、又はＡからなる」という文は、以下の２つの別の文として書かれたかのように解釈されるものとする：「いくつかの実施形態において、組成物はＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物はＡから基本的になる。いくつかの実施形態において、組成物はＡからなる」。同様に、一連の代替物を列挙する文は、一連の文が、所与の各代替物が１つの文中で単独に与えられたように与えられるかのように解釈されるものとする。例えば、「いくつかの実施形態において、組成物は、Ａ、Ｂ、又はＣを含む」という文は、以下の３つの別の文として書かれているかのように解釈されるものとする：「いくつかの実施形態において、組成物はＡを含む。いくつかの実施形態において、組成物はＢを含む。いくつかの実施形態において、組成物はＣを含む」。本明細書では、１種以上の不活性ＢＰを含む組成物の文脈での句「から基本的になる」は、組成物が活性ＢＰを全く含まないが、他の有効成分、例えば、鎮痛剤、抗菌剤などを含み得ることを意味する。
【００９０】
本発明の開示を理解又は完成するのに必要である程度に、本明細書に言及される全刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれが個別にそのように組み込まれるのと同じ程度に、参照により明白に本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本発明の例示的な実施形態をこのように説明してきたが、本開示が例示なものに過ぎず、種々の他の変更、改変、及び改良が本発明の範囲内でなされ得ることを当業者は留意すべきである。したがって、本発明は、本明細書に説明される具体的な実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲にのみ限定される。
【図１】
2019522642.tif 000004
【図２Ａ】
2019522642.tif 000005
【図２Ｂ】
2019522642.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
2019522642.tif 000010
【図５Ａ】
2019522642.tif 000011
【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ１】
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【図１８Ａ２】
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【図１８Ａ３】
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【図１８Ａ４】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
2019522642.tif 000040
【図２１】
2019522642.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月31日(2019.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格組織中の活性ビスホスホネートの除去又は排除に使用するための１種以上の不活性ビスホスホネートであって、前記１種以上の不活性ビスホスホネートが前記骨格組織に投与される、前記１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項２】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、（ａ）α−ヒドロキシ基を欠く、（ｂ）パラ置換されたピリジル側鎖を有する、又は（ｃ）α−ヒドロキシ基を欠き、且つパラ置換されたピリジル側鎖を有する、分子スキャホールドを有する、請求項１に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項３】
前記不活性ビスホスホネートが、それに結合された検出可能な標識、例えば、ＲＯＸ、ＦＡＭ、ＡＦ６４７、ＩＣＧ、ＩＣＧアナログ、Ｃｙ５、スルホ−Ｃｙ５、Ｃｙ７、又はＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ等の蛍光性化合物を有する、請求項１に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項４】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、５−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳ、５（６）−ＦＡＭ−ＲＩＳＰＣ、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳ、５（６）−ＲｈＲ−ｄＲＩＳ、５（６）−ＲｈＲ−ＲＩＳＰＣ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳＰＣ、５−ＦＡＭ−ＲＩＳ、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、６−ＦＡＭ−ＲＩＳ、８００ＣＷ−ＺＯＬ、ＡＦ６４７−ＲＩＳ、ＡＦ６４７−ＲＩＳＰＣ、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、８００ＣＷ−ＲＩＳ、８００ＣＷ−ＺＯＬ、８００ＣＷ−ＲＩＳＰＣ、ＩＣＧ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−ＺＯＬ、ＩＣＧ−ＲＩＳＰＣ、及びＩＣＧ−ｐ−ｐｙｒＥＢＰからなる群から選択される、請求項１に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項５】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、５（６）−ＲＯＸ−ＲＩＳ、５−ＦＡＭ−ＺＯＬ、ＡＦ６４７−ＺＯＬ、ＩＣＧ−Ａ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ｂ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ｃ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ｄ−ｐ−ＰｙｒＥＢＰ、ＩＣＧ−Ａ−ｐ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−Ｂ−ｐ−ＲＩＳ、ＩＣＧ−Ｃ−ｐ−ＲＩＳ、又はＩＣＧ−Ｄ−ｐ−ＲＩＳである、請求項１に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項６】
前記活性ビスホスホネートが、アレンドロネート、イバンドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、リセドロネート、又はゾレドロネート等の活性窒素含有ビスホスホネートである、請求項１に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項７】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートがエチドロネートである場合、投与様式が局所（local）、好ましくは局所(topical)であることを条件として、前記骨格組織中の前記活性ビスホスホネートが、対象においてインビボで除去又は排除される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項８】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記対象に局所投与又は経口投与される、請求項７に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項９】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記対象の歯肉組織及び／又は口蓋組織に投与される、請求項７に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項１０】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、口腔内適用により歯牙歯槽の処置の部位に投与される、請求項７に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項１１】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、前記歯牙歯槽の処置の前、その間、及び／又はその後に投与される、請求項１０に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項１２】
有効量の前記１種以上の不活性ビスホスホネートが投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項１３】
前記１種以上の不活性ビスホスホネートが、リポソーム製剤又はナノベシクル製剤、好ましくは変形可能なナノベシクル製剤の形態で投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の１種以上の不活性ビスホスホネート。
【請求項１４】
対象におけるビスホスホネート系薬剤関連顎骨壊死（ＢＲＯＮＪ）又はビスホスホネート関連症状を治療、低減、予防、又は抑止するための１種以上の不活性ビスホスホネートを含む組成物であって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の治療上有効な量の１種以上の不活性ビスホスホネートを含む組成物。
【請求項１５】
前記対象が活性ビスホスホネートにより治療されたか、又は治療されている、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
2019522642.tif 000042
2019522642.tif 000043