(57)【要約】  本発明は、有害な心室リモデリングの予防及び／又は治療に用いるためのカルパイン阻害剤に関する。特に、カルパイン阻害剤は、心筋梗塞に付随する、又は慢性高血圧症に起因する有害な心室リモデリングにおいて使用するためのものである。本発明はまた、これら阻害剤を含む特定の組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有害な心室リモデリングの予防及び／又は治療に使用するためのカルパイン阻害剤又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
有害な心室リモデリングが、冠動脈疾患、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心不整脈、先天性心疾患、心臓弁機能不全、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される病変における持続性心筋ストレスによって引き起こされる、請求項１に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項３】
有害な心室リモデリングが、心筋梗塞、左心室動脈瘤、及び虚血性心筋症からなる群から選択される冠動脈疾患によって引き起こされる、請求項１又は２に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項４】
前記有害な心室リモデリングが心筋梗塞によって引き起こされる、請求項３に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項５】
前記カルパイン阻害剤が長期間使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項６】
前記カルパイン阻害剤が、３〜３０日間、１日を超えて投与されるためのものである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項７】
前記カルパイン阻害剤が、７〜２１日間、１日を超えて投与されるためのものである、請求項６に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項８】
前記有害な心室リモデリングが心筋梗塞によって引き起こされ、前記カルパイン阻害剤が心筋の再灌流発生後に長期間使用されるためのものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項９】
前記カルパイン阻害剤が、３〜３０日間、１日を超えて投与されるためのものである、請求項８に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項１０】
前記カルパイン阻害剤が、７〜２１日間、１日を超えて投与されるためのものである、請求項８又は９に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項１１】
カルパイン阻害剤が経口用である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項１２】
前記カルパイン阻害剤が式（Ｉ）の化合物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのカルパイン阻害剤：
【化１】
2019514942.tif 000004
式中、
Ｒ１が
（１）式（ＩＩｂ）（式中、ｎは２〜５の整数である）で表される基、
【化２】
2019514942.tif 000005
（２）場合により（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルを有するピリジル基で置換された、直鎖若しくは分枝（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、又は
（３）テトラヒドロフラニル基若しくはテトラヒドロピラニル基であり、
Ｒ２は、場合によりフェニルで置換された直鎖又は分枝（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルであり、
Ｒ３は、水素、直鎖若しくは分枝（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルであるか、又はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルからなる群から選択される。
【請求項１３】
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソ−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステル、
及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【請求項１４】
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルである、請求項１３に記載の使用のためのカルパイン阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１６年５月６日に出願された欧州特許出願ＥＰ１６１６８５８１．３の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、心臓病のための医学的アプローチの分野に関する。特に、本発明は、持続性心筋ストレスが生じる心臓病の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
心室リモデリングは、虚血、動脈性高血圧、弁疾患、心筋炎、及び拡張型心筋症等の多くの心臓病に伴う心筋ストレスに対する応答として生じる。この初期代償プロセスは、ストレスが持続すると有害な心室リモデリングに発展する。結果として、心筋細胞肥大、炎症性細胞浸潤、及び心筋の間質マトリックスにおける過剰なコラーゲン沈着があり、機能障害及び慢性心不全を引き起こす。
【０００４】
現在、有害な心室リモデリングのための特定の治療法はないが、いくつかの臨床試験では、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤及びアルドステロン阻害剤が、臨床的心不全症状を伴う確立されたリモデリングにおいて心筋性能を改善することが示されている。
【０００５】
虚血／再灌流及び心臓麻痺モデルにおけるカルパイン媒介障害を減少させるためのカルパイン阻害剤の使用に焦点を当てた文献がある。
【０００６】
そのような文献の例として、Ｙｏｓｈｉｋａｗａらの文献（非特許文献１）が挙げられる。この文献は、心停止によって誘発された心機能不全に対するＳＮＪ−１９４５の投与の効果を開示している。心停止液にＳＮＪ−１９４５を加え、６０分間の再灌流を行った。他のデータの中でも、ミッドレンジ左心室容積（ＥＳＰｍｌＬＶＶ）での収縮終期圧及び収縮期圧容積面積（ＰＶＡ）が詳述されている。著者らは、この阻害剤が左心室機能不全を予防すると結論付けた。しかし、有害な心室リモデリングは異なる病変であるため、有害な心室リモデリングに関する非結論的データは、実験スキーム及びそこで行われる測定で抽出することができる。
【０００７】
ＳＮＪ−１９４５（（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステルとも呼ばれる）及び特定の式の他のα−ケトアミド誘発体は、特許文献１のＰＣＴ出願に開示されている。虚血性疾患、免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、骨粗鬆症、脳組織損傷により引き起こされる疾患、白内障、緑内障、網膜疾患、網膜脈絡膜炎、後眼球合併症又は血管新生を伴う疾患から選択されるカルパイン関連疾患に有用であると提案されている。ＳＮＪ−１９４５の特定の場合、この化合物は、カルパインに関連する特定の疾患としての、ラットモデルの網膜虚血障害において使用され、提案される経口投与計画は、虚血が起こる１５分前及び虚血の解放後１回である。
【０００８】
虚血／再灌流のモデルにおけるカルパインの効果及びカルパイン阻害と関連して、Ｉｎｓｅｒｔｅらの文献（非特許文献２）が挙げられる。Ｉｎｓｅｒｔｅらは、虚血及び再灌流によって引き起こされる損傷におけるカルパインの役割について現在までに知られていることを要約している。この文献には、再灌流の開始時（発生時）に投与された場合の心臓保護効果を示すいくつかのカルパイン阻害剤（Ａ−７０５２５３及びＭＤＬ−２８１７０）の使用が記載されている。この文献は、異なる阻害剤が早期再灌流中に投与された場合に急性再灌流傷害を軽減することができることを示している。Ｉｎｓｅｒｔｅらによって言及された全てのアッセイは、カルパイン活性が永久に減少するトランスジェニック動物でのアッセイに関する。これが結果や実質的な効果を隠蔽できることは広く知られている。
【０００９】
Ｉｎｓｅｒｔｅらが言及する１つの参考文献は、非特許文献３である。Ｈｅｒｎａｎｄｏらには、カルパイン阻害剤ＭＤＬ−２８１７０を再灌流の最初の数分間に静脈内で使用すると、梗塞サイズ（危険及び壊死領域）が減少することが開示されている。しかし、これらのデータは、心室リモデリングに関して決定的なものではない。
【００１０】
Ｉｎｓｅｒｔｅらが言及する別の参考文献は、非特許文献４である。この場合、カルパイン阻害剤Ａ−７０５２５３を虚血開始前及び６時間の再灌流中に静脈内投与すると、梗塞サイズが減少するのみならず、他の研究と比較して血行動態及び収縮機能が改善されることが示された。
【００１１】
上記のように、これらのモデルはいずれも、有害な心室リモデリングに関する決定的なデータを教示も提供もしていない。従って、心臓麻痺の場合の影響と同様に、心筋又は他の臓器における虚血プロセスに起因する多くの負の影響が研究されているが、依然として有害な心室リモデリングのための特定の治療が必要である。この有害な心室リモデリングは、一般に、持続型虚血性心筋症（心筋梗塞の場合等）において起こる。また、動脈性高血圧の場合等のストレス条件下で心筋が（長期間又は慢性的に）持続される非虚血性心臓病変において引き起こされるこの有害な心室リモデリングを回避する予防プロトコルも存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００５／０５６５１９号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＳＮＪ−１９４５  ｆｏｒ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｃａｒｄｉｏｐｌｅｇｉｃ  ａｒｒｅｓｔ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ−２０１０，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．６４３−６５１
【非特許文献２】Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｐａｉｎｓ  ｔｏ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ−２０１２，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２３−３１
【非特許文献３】Ｃａｌｐａｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ−２０１０，ｖｏｌ．４９（２），ｐｐ．２１７−２７９
【非特許文献４】Ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｇｌｏｂａｌ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ−２００５，ｖｏｌ．５２８，ｐｐ．１２４−１３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、カルパイン阻害剤が、心筋梗塞（ＭＩ）等に起因して引き起こされる有害な心室リモデリング（ＡＶＲ）に罹患している又は罹患するリスクのある被験体において損傷を引き起こすことなく、且つ、実質的な正の効果を伴って、長期的に（持続的又は慢性的に、とも言う）投与できることを見出した。阻害剤はまた、動脈性高血圧のような持続性心筋ストレスを引き起こす病変に罹患している場合に前記ＡＶＲを予防するのにも有効である。従って、カルパイン阻害剤の外因性投与は、ＡＶＲに罹患しているか又は罹患するリスクのある被験体にとって、この投与が一回ではなく長期間であっても、実質的な利点をもたらすと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明の第１の態様は、有害な心室リモデリング（ＡＶＲ）の予防及び／又は治療に用いるためのカルパイン阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物である。
【００１６】
上に示したように、有害な心室リモデリングは、心筋機能不全を伴う病態であり、ストレスの長期化に起因する心筋細胞肥大、炎症性細胞浸潤、及び筋細胞の間質マトリックスにおける過度のコラーゲン沈着が代償プロセスとして最初に存在することが観察される。
【００１７】
この態様はまた、ＡＶＲの治療又は予防のための医薬を製造するための、上記で定義されたカルパイン阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物の使用として考案することができる。本発明はまた、薬学的有効量のカルパイン阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と一緒に、それを必要とするヒトを含む被験体において投与することを含む、ＡＶＲの治療又は予防方法に関する。
【００１８】
従って、外因性カルパイン阻害剤は、ＡＶＲの予防及び／又は治療に使用するためのものである。
【００１９】
本発明の別の態様は、治療的有効量のカルパイン阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と一緒に含む医薬組成物であって、前記賦形剤は、溶媒中にカルボキシメチルセルロースを含み、前記溶媒に対するカルボキシメチルセルロースの重量百分率は、０．３％（ｗ／ｗ）〜１．５％（ｗ／ｗ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】一過性虚血によって引き起こされる心筋梗塞後（ＭＩ後）モデル（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから得られたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）後の心室リモデリングの治療におけるカルパイン阻害剤（ＳＮＪ−１９４５）の能力を試験するためのアッセイで行われた実験プロトコルを示す。Ｃは対照（非処置）を意味する。急性（Ａｃと略記することもある）は、ＳＮＪ−１９４５が冠動脈閉塞の最後の数分間に腹腔内投与されたことを意味する。慢性（Ｃｈｒと略記することもある）は、再灌流後１日目から開始して１４日間、ＳＮＪ−１９４５を１日１回経口投与した（０．５％カルボキシメチルセルロース中１２０ｍｇ／ＫｇのＳＮＪ−１９４５を含むボーラス）ことを意味する。急性／慢性（Ａｃ＋Ｃｈｒと略記することもある）は、両方のタイプの投与が行われたことを意味する。
【図２】図１に開示された異なるアッセイ群における心エコー検査から分析された様々なパラメータを示す。図２（Ａ）において、対照は黒丸で表し、急性は白丸で表し、慢性は三角で表し、急性＋慢性は四角で表している。再潅流後２１日目の各試験群のデータを図２（Ｂ）に示す。ＬＶＥＤＤ（ｍｍ）は左心室拡張末期径であり、ＬＶＥＳＤ（ｍｍ）は左心室収縮末期径であり、ＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤは、心室リモデリングの評価に使用される主な心エコー検査パラメータである。ＥＦ（パーセント（％））は駆出率であり、心室機能を決定する。ＭＩ前のベースラインで得られた測定値、並びに再灌流後７日目（７ｄ）及び２１日目（２１ｄ）に得られた測定値。（＊ｐ＜０．０５）。
【図３】図１に詳述された異なる実験群における、ピクロシリウスレッドで染色された瘢痕領域を示す横断面切断心臓スライスからの代表的な画像、及びＬＶ面積の百分率として表されるその定量を示す。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（ｎ＝９）である。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。略語は図１に示す通りである。
【図４】非虚血性心筋における心筋細胞肥大作用を示す。Ａ）非梗塞領域に対応するヘマトキシリン＆エオシンで染色された代表的な心室断面、及び心筋細胞断面積の定量。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．６３ソフトウェアを用いて４００倍（オリンパスデジタルカメラＣ−１４００Ｌ）で、各心臓（ｎ＝６／群）からの少なくとも５０個のランダムな細胞を測定した。Ｂ）肥大マーカーとして使用されるβ−ミオシン重鎖（β−ＨＭＣ）（ＡＢＣＡＭ）の代表的なウエスタンブロット、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）（ＡＢＣＡＭ）に対するβ−ＨＭＣタンパク質の定量。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。シャム（Ｓｈａｍ）は、非梗塞（非手術）群の参照値に関する。略語は図１に示す通りである。
【図５】図５（Ａ）において、２００倍の倍率（オリンパスデジタルカメラＣ−１４００Ｌ）で得られた非梗塞領域に対応するピクロシリウスレッドで染色された代表的な心室断面及び各心臓（ｎ＝６／群）からの少なくとも６枚のランダムな顕微鏡写真の間質コラーゲン沈着の定量を示す棒グラフ。図５（Ｂ）は、線維芽細胞活性化マーカーとして使用されるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、Ｓｉｇｍａ）の代表的なウエスタンブロットであり、ＧＡＤＰＨ（Ａｂｃａｍ）に対するα−ＳＭＡタンパク質の定量を棒グラフで包含する。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。シャム（Ｓｈａｍ）は、非梗塞（非手術）群の参照値に関する。略語は図１に示す通りである。
【図６】図６（Ａ）は、梗塞領域及び（Ｂ）非梗塞領域（遠隔領域）における、３日間の再灌流後に得られ、単球／マクロファージ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）のＣＤ６８に対して免疫染色された代表的な心室断面及びＣＤ６８＋細胞の定量。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。略語は図１に示す通りである。
【図７】図７（Ａ）は、実施例２に関し、５ｍｇ／ｋｇ／日のイソプロテレノール（ＩＳＯ）を１週間腹腔内摂取したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、イソプロテレノールを摂取していない対照群（ＣＯＮＴＲＯＬ）、及びＳＮＪ−１９４５（経口）とイソプロテレノール（皮下）を７日間連続同時投与された群（ＩＳＯ＋ＳＮＪ）の心臓重量（グラム（ｇ））を示すグラフである。図７（Ｂ）は、心エコー検査によって測定した、ＩＳＯ及びＩＳＯ＋ＳＮＪ群における心室間壁（ＩＶＳＷＴ）及び後壁（ＰＷＴ）の値を示す。
【図８】実施例２に関し、図７におけるようなラットのアッセイ群においてＰＣＲで測定した肥大マーカーの発現レベル（量）を示すグラフである。特に、ベータミオシン重鎖（βＭＩ）及びアルファミオシン重鎖（αＭＨＣ）の比（ＬＨＹ７／ＬＨＹ６とも言う）（図８（Ａ））並びにナトリウム利尿ペプチドＡ（ＡＮＰ）及びＢ（ＢＮＰ）の発現（図８（Ｂ））。Ｃｔｒｏｌは対照である。
【図９】実施例２に関し、図７及び８におけるような３つのアッセイ群に関するものであり、線維化マーカーとしてのコラーゲン１のレベル（図９（Ａ））及び腫瘍成長因子β（ＴＧＦ）のレベル（図９（Ｂ））（全てＰＣＲで測定）を示している。Ｃｔｒｏｌは対照である。
【図１０】ＤＭＳＯ（ビヒクルとしてのジメチルスルホキシド）、５、１０、及び５０μＭの濃度のＳＮＪ−１９４５、並びに選択的ＭＭＰ阻害剤ＯＮＯ−４８１７（（Ｎ−［（１Ｓ，３Ｓ）−１−［（エトキシメトキシ）メチル］−４−（ヒドロキシアミノ）−３−メチル−４−オキソブチル］−４−フェノキシベンズアミド））を用いて３７℃にて一晩インキュベートした２１日間の再灌流後の対照ラットから得た心筋抽出物のゼラチンザイモグラム画像である。また、ＳＮＪ−１９４５の経口強制飼養（１２０ｇ／ｋｇ）からのデータが示されている。ＭＭＰ−２はマトリックスメタロプロテイナーゼ−２を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
「持続性心筋ストレス」に関して、心筋は、特定の原因、特に心筋自体に必ずしも生じる病理ではなく、冠状動脈異常及び他の血管疾患に起因してその正常な機能を損なう状態にあることが理解されるべきである。いずれにしても、それは血液を継続的に駆出するために初期代償状態を持続することに由来する有害なストレスである。一例は、有害な心室リモデリングにつながるストレスであり、筋細胞のいくつかのパラメータが（分子レベル及び細胞レベルで）、虚血による他の筋細胞の喪失などの機能喪失を補うために変更され、そのパラメータが、異なる病態（有害な心室リモデリング）に進展する。
【００２２】
「カルパイン阻害剤の持続的又は長期的使用」という表現は、前記阻害剤が、一回だけではなく慢性的に投与されることを意味する。本発明においては、慢性投与の同義語として使用される。従って、１日を超える特定の期間、特に３〜３０日、より詳細には７〜２１日、更により詳細には７〜１４日である。従って、特に通院医によって指示された計画にしたがった、１日を超える投与のために使用可能であり、特に対象生命の残りの間、毎日投与する計画である可能性がある。
【００２３】
「外因性カルパイン阻害剤」又は「カルパイン阻害剤」（同義語として使用される）は、カルパイン活性を低下させることができる任意の物質として理解されるべきであり、任意の薬学的形態において、外部要素として被験体に与えられる。阻害剤がペプチド性のものである場合、ペプチド又はタンパク質の形態で、あるいは更にはこのペプチド又はタンパク質をコードする発現ベクターの形態で外部投与される。「外因性カルパイン阻害剤」は、遺伝子非ヒト実験動物モデルにおいて生殖系列トランスジェニック改変に起因するタンパク質又はペプチドの構成的発現を含まない。
【００２４】
本明細書で使用される「治療的有効量」という表現は、投与された場合、対処される疾患の１以上の症状の発症を予防するか又はある程度緩和するのに十分な化合物の量を指す。本発明に従って投与される化合物の特定の用量は、勿論、投与される化合物、投与経路、治療される特定の状態、及び同様の考慮事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。
【００２５】
「薬学的に許容される賦形剤又は担体」という表現は、薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを指す。各成分は、医薬組成物の他の成分と適合性があるという意味において、薬学的に許容されなければならない。また、各成分は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又は合理的な利益／リスク比に見合う他の問題又は合併症なしに、ヒト及び動物の組織又は器官との接触での使用にも適していなければならない。
【００２６】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」は、無機酸又は有機酸を含む薬学的に許容される非毒性の酸から形成される任意の塩を包含する。治療目的のために使用される場合、それらが薬学的に許容されなければならないことを除いて、塩に関して制限はない。
【００２７】
カルパイン阻害剤の薬学的に許容される塩の調製は、当該分野で公知の方法によって行うことができる。例えば、それらは、塩基性又は酸性部分を含む親化合物から、従来の化学的方法によって調製することができる。一般に、このような塩は、例えば、これらの化合物の遊離酸又は塩基形態を、化学量論量の適切な薬学的に許容される塩基又は酸と、水若しくは有機溶媒又はそれらの混合物中で反応させることによって調製される。
【００２８】
本発明の化合物は、遊離の溶媒和化合物又は溶媒和物（例えば水和物）のいずれかとしての結晶形態であってもよく、両方の形態が本発明の範囲内であることが意図される。溶媒和の方法は、当技術分野において一般的に知られている。
【００２９】
直鎖又は分枝（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルという用語は、１〜６個の炭素原子を有する飽和直鎖又は分枝鎖アルキルを指す。例示的な非限定的な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオペンチル、及びｎ−ヘキシルである。同様に、用語（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルは、メチル、エチル、プロピル、及びイソプロピルを含む１〜３個の炭素原子を有する飽和直鎖又は分枝鎖アルキルを指す。
【００３０】
本発明の第１の態様の特定の実施形態において、有害な心室リモデリングは、虚血性心疾患としても知られている冠動脈疾患（ＣＡＤ）、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症（特に拡張型心筋症）、心不整脈、先天性心疾患、心臓弁機能不全、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される病変（即ち、心臓病）における持続性心筋ストレスによって引き起こされる。
【００３１】
より詳細には、ＡＶＲは、心筋梗塞、左心室動脈瘤、及び虚血性心筋症からなる群から選択されるＣＡＤによって引き起こされる。
【００３２】
更に別の特定実施形態において、カルパイン阻害剤は、梗塞後の有害な心室リモデリング（ＭＩ後ＡＶＲ）の治療に使用するためのものである。即ち、ＡＶＲを引き起こすＣＡＤは、心筋梗塞に伴う持続性心筋ストレスである。
【００３３】
本発明の第１の態様の別の特定実施形態において、カルパイン阻害剤は、持続的又は長期的（一回だけではなく慢性的に投与される）使用のためのものである。即ち、カルパイン阻害剤は、持続的又は長期的使用のためのものであり、これは、有害な心室リモデリングの予防及び／又は治療において慢性的に使用するためのものであることを意味する。特に、３〜３０日間、より詳細には７〜２１日間、更により詳細には７〜１４日間の期間である。慢性投与は、本発明によれば、１日を超えて連続的に又は断続的に投与することを含む。従って、それは１日を超える投与に、特に上記の期間、より具体的には１日１回の投与に使用され、且つ、使用可能である。
【００３４】
場合により上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定実施形態において、カルパイン阻害剤は、持続的又は長期的使用のためのものであり、ＭＩ後ＡＶＲに使用される。ＡＶＲがＭＩ後に起こる場合、特定の投与計画は、心筋梗塞の日（再灌流開始前及び／又は後）に適切な用量でカルパイン阻害剤を２〜１４日間毎日投与することを含む。最も具体的には、再灌流が行われた１日後から２〜１４日間の投与が開始される。
【００３５】
虚血発作が存在する特定の心臓病において、カルパイン阻害剤は、別の特定実施形態では、前記虚血発作中に使用するためのものである。このタイプの投与は、本明細書においては急性投与（急性又は単にＡｃ）と命名されている。より特定の実施形態では、カルパイン阻害剤は、前記虚血発作中、及び、虚血発作が終了し、再灌流が始まった後に使用するためのものである。再灌流後の投与は、特定の実施形態では、持続的に実施され、これは、１日を超えて連続的に又は間欠的にこの阻害剤が投与されることを意味する。
【００３６】
場合により上記又は下記実施形態のいずれかと組み合わせた本発明の第１の態様の別の特定実施形態において、カルパイン阻害剤は、ＡＶＲの予防及び／又は治療における経口使用のためのものである。
【００３７】
これらの阻害剤の経口使用は、特に、有効量のカルパイン阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を、薬学的に許容される賦形剤又は担体と共に含む医薬組成物の形態で達成され、前記賦形剤はカルボキシメチルセルロースを含む。特定の経口組成物は、溶媒、特に水に阻害剤及びカルボキシメチルセルロースを含み、前記溶媒に対するカルボキシメチルセルロースの重量百分率は０．３％（ｗ／ｗ）〜１．５％（ｗ／ｗ）である。より詳細には、前記溶媒に対するカルボキシメチルセルロースの重量百分率は、０．５％（ｗ／ｗ）〜１．０％（ｗ／ｗ）である。より詳細には、０．５％（ｗ／ｗ）である。場合によっては上記又は下記の実施形態のいずれかと組み合わせた別の特定の実施形態では、口腔用組成物中のカルパイン阻害剤は、５０ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／Ｋｇ、より詳細には１２０ｍｇ／Ｋｇ〜１５０ｍｇ／Ｋｇであり、全ての区間は極値を含む。
【００３８】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態において、カルパイン阻害剤は、式（Ｉ）の化合物である：
【化１】
2019514942.tif 000002
【００３９】
式中、
Ｒ１が
（１）式（ＩＩｂ）（式中、ｎは２〜５の整数である）で表される基、
【化２】
2019514942.tif 000003
（２）場合により（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルを有するピリジル基で置換された直鎖若しくは分枝（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、又は
（３）テトラヒドロフラニル基若しくはテトラヒドロピラニル基であり、
Ｒ２は、場合によりフェニルで置換される直鎖又は分枝鎖（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルであり、
Ｒ３は、水素、直鎖若しくは分枝（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルであるか、又はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルからなる群から選択される。
【００４０】
より詳細には、カルパイン阻害剤は、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸８−メトキシ−３，６−ジオキサオクチルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸１１−メトキシ−３，６，９−トリオキサウンデカニルエステル、
（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−３−（シクロプロピルアミノ）−２，３−ジオキソ−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸２−（ピリジン−２−イル）エチルエステル、
及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４１】
より特定の実施形態では、ＡＶＲの予防及び／又は治療に用いるカルパイン阻害剤は、（（１Ｓ）−１−（（（（１Ｓ）−１−ベンジル−２，３−ジオキソ−３−（シクロプロピルアミノ）−プロピル）アミノ）カルボニル）−３−メチルブチル）カルバミン酸５−メトキシ−３−オキサペンチルエステル（ＳＮＪ−１９４５と略記することもある）である。それのＩＵＰＡＣ名は、２−（２−メトキシエトキシ）エチルＮ−［（２Ｓ）−１−［［（２Ｓ）−４−（シクロプロピルアミノ）−３，４−ジオキソ−１−フェニルブタン−２−イル］アミノ］−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル］カルバメートである。
【００４２】
従って、カルパイン阻害剤は、有害な心室リモデリングの予防及び／又は治療における使用のための分子ＳＮＪ−１９４５が水溶性であるために、特に有利な実施態様である。
【００４３】
より詳細には、ＳＮＪ−１９４５は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症（特に拡張型心筋症）、心不整脈、先天性心疾患、心内膜炎、心臓弁機能不全、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される心臓病における持続性心筋ストレスによって引き起こされるＡＶＲの予防及び／又は治療で使用するためのものである。
【００４４】
より特定の実施形態では、ＳＮＪ−１９４５は、梗塞後の有害な心室リモデリング（ＭＩ後ＡＶＲ）の治療に使用するためのものである。即ち、ＡＶＲを引き起こす冠動脈疾患は、心筋梗塞に伴う持続性心筋ストレスである。更に別の特定実施形態では、上記の使用のためのＳＮＪ−１９４５は、持続的又は長期的使用のためのものであり、これは、有害な心室リモデリングの予防及び／又は治療において慢性的に使用することを意味する。特に、３〜３０日、より詳細には７〜２１日、更により詳細には７〜１４日間、持続的又は長期的に使用するためのものである。従って、それは１日を超える投与に、特に上記の期間、より具体的には１日１回の投与に使用され、且つ、使用可能である。より詳細には、ＳＮＪ−１９４５は、梗塞後の有害な心室リモデリング（ＭＩ後ＡＶＲ）の治療において持続的又は長期的に使用するためのものであり、心筋梗塞の日（再灌流開始前及び／又は再開後）に適切な用量で２〜１４日間少なくとも１日１回持続的又は長期投与される。
【００４５】
虚血発作が存在する特定の心臓病において、ＳＮＪ−１９４５は、別の特定の実施形態において、前記虚血発作中に使用される。このタイプの投与は、本明細書では急性投与（図では急性又は単純にＡｃ）と命名されている。より特定の実施形態では、ＳＮＪ−１９４５は、虚血発作中及び虚血発作が終了し、再灌流が開始した後に使用するためのものである。再灌流後の投与は、継続的に投与されることを意味する持続型方法で行われる特定の実施形態である。又は断続的に１日を超えて継続する。
【００４６】
水溶性であるために、ＳＮＪ−１９４５は、任意の原因のＡＶＲの予防及び／又は治療における使用のために、注射されるか、又は経口投与されるように処方され得る。
【００４７】
明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及びその変形語は、他の技術的特徴、添加物、構成要素、又は工程を排除することを意図しない。更に、この「含む」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」の場合を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、説明を検討することにより当業者に明らかになるか、又は本発明の実施によって習得されるであろう。以下の実施例及び図面は例示として提供され、本発明を限定するものではない。更に、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態及び好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。
【実施例】
【００４８】
実施例１：心筋梗塞によって引き起こされる有害な心室リモデリングの予防及び／又は治療における使用のためのＳＮＪ−１９４５
【００４９】
インビボ心筋梗塞
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０−３００ｇ）に、アトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を前投与し、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）で麻酔し、機械的に換気した（Ｉｎｓｐｉｒａ  ＡＳＶ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）。
【００５０】
１〜２％イソフルランで麻酔を維持し、体温を３６〜３７℃に加熱パッドで制御した。心臓を、第４肋間腔を通して露出させ、左心耳から１ｍｍ遠位に６／０絹縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｅｎｄｏ−ｓｕｒｇｉｃａｌ、米国オハイオ州）を用いて左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を結紮した。３０分間の閉塞後、縫合糸を緩めて再灌流を開始し、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ／６時間、皮下）を４８時間与えた。虚血中にＳＴが上昇しなかった又は再灌流時にＳＴが回復しなかったマウスを、更なる評価から除外した。
【００５１】
梗塞後リモデリング及び心臓機能に対するＳＮＪ−１９４５の効果を、２１日間再灌流した４８匹のマウスにおいて分析した（ｎ＝１２／群）。異なる実験群を図１に示す。急性群では、再灌流を開始する５分前にＳＮＪ−１９４５（１２０ｍｇ／ｋｇ＋０．５％カルボキシメチルセルロース）を腹腔内投与した。慢性群では、ＳＮＰ−１９４５（１２０ｍｇ／ｋｇ＋０．５％カルボキシメチルセルロース）を、２４時間の再灌流後に開始して１４日間にわたって経口投与した。薬物の遅延投与は、カルパイン阻害が、再灌流の急性期に起こる細胞死を減少させるだけでなく、そのプロセスの原因となる機構の直接調節によって心筋リモデリングを変化させるかどうかを決定することを可能にする。最後の群では、ＳＮＪ−１９４５の急性及び慢性投与を組み合わせた（Ａｃ＋Ｃｈｒ）。ＳＮＪ−１９４５の有効用量は、Ｔｒａｇｅｒ  Ｎ（Ｔｒａｇｅｒら，「多発性硬化症のネズミモデルにおける免疫調節及び神経変性に対する新規経口投与カルパイン阻害剤ＳＮＪ−１９４５の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＳＮＪ−１９４５  ｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ−２０１４，ｖｏｌ．ｎｏ．１３０（２），ｐｐ．２６８−２７９）及び本発明者らの研究室からの用量依存性データに関する未公表の研究に基づいて予め決定しておいた。
【００５２】
心エコー分析
ラットは、ベースライン（手術前）並びに手術後７日目及び２１日目に経胸腔式心エコー検査を受けた。心エコー検査は、（Ｐｏｎｃｅｌａｓ，Ｉｎｓｅｒｔｅら，２０１５，「高脂肪食により誘発された肥満は、Ｂ６Ｄ２Ｆ１成体マウスの梗塞後心筋リモデリング及び機能不全を軽減する（Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｂ６Ｄ２Ｆ１  ｍｉｃｅ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｒａｄｉｏｌｏｇｙ−２０１５，ｖｏｌ．，ｎｏ．８４，ｐｐ．１５４−１６１）に先に記載されたように、ｉ１２Ｌ−ＲＳ  １２ＭＨｚトランスデューサ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＶｉｖｉｄポータブル超音波システムを用いて行った。Ｍモード記録では、左心室収縮期（ＬＶＥＳｄ）及び拡張期（ＬＶＥＤｓ）内径、心室中隔膜厚（ＩＶＳ）、並びに後壁厚（ＬＶＰＷ）を測定した。左心室駆出率（ＬＶＥＦ）を標準的な処方に従って計算した。
【００５３】
組織学及び免疫組織化学
２１日間の再灌流後、心臓を迅速に摘出し、秤量し、緩衝化４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋して組織学的評価を行った。乳頭筋レベルでの切片を４μｍで切断し、ピクロシリウスレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州）で染色して、瘢痕及び間質線維化領域を可視化した。ＩｍａｇｅＰｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、米国メリーランド州）を使用してデジタル化画像を評価し、瘢痕領域を、先に記載したように（Ｐｏｎｃｅｌａｓ、Ｉｎｓｅｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５、前掲）左心室面積に対する線維化面積の百分率として表した。間質性コラーゲン沈着の分析は、各心臓（ｎ＝６／群）からの６枚のランダムな顕微鏡写真を２００倍で撮影した後胸部非梗塞心筋で評価した。
【００５４】
平均心筋細胞の断面積を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片で測定した。各心臓（ｎ＝６／群）からの少なくとも５０のランダムな細胞を４００倍で測定した。
【００５５】
非梗塞心筋におけるマクロファージ浸潤を、３日間再灌流した心臓（ｎ＝４／群）の免疫組織化学によって分析した。
【００５６】
心筋切片をＨ２Ｏ２／メタノール、レバミゾール（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、及びアビジン／ビオチンブロッキング（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に曝露して内在性ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、及びビオチンをそれぞれ中和した。
【００５７】
切片を、単球／マクロファージに対するＣＤ６８（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）でプローブし、２％正常ブロッキング血清中のビオチン化二次抗体（１：２００、ＡＢＣペルオキシダーゼ標準染色キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてインキュベートし、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ）を用いて可視化した。各心臓（ｎ＝６／群）の梗塞領域から６枚及び非梗塞領域から６枚のランダムな顕微鏡写真を２００倍で撮影した。
【００５８】
治療プロトコルを知らない研究者が、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．６３ソフトウェアを使用して上記の分析を行った。
【００５９】
ウエスタンブロット
心臓サンプルを、トリス塩酸：５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＴＴ：１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＦ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｎａ３ＶＯ４：２ｍｍｏｌ／Ｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液（ｐＨ７．３）中で均質化し、１５０００ｇで１５分間遠心分離した。上清からのサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、５％ＰｈｏｓｐｈｏＢｌｏｃｋｅｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）でブロックしたニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。使用した一次抗体は、カルパイン−１（Ａｂｃａｍ）、カルパイン−２（Ａｂｃａｍ）、カルパスタチン（Ａｂｃａｍ）、α−フォドリン（Ｅｎｚｏ）、β−ＭＨＣ（Ａｂｃａｍ）、α−ＳＭＣ（Ｓｉｇｍａ）、及びＧＡＰＤＨ（Ｇｅｎｅｔｅｘ）に対するものであった。バンドを化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｉｅｒｃｅ）によって検出し、電荷結合素子システム（Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ−３０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）及び画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて定量した。
【００６０】
統計分析
ＳＰＳＳ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓを使用してデータ分析を実施した。群間の平均は、一方向ＡＮＯＶＡ又は独立ｔ検定によって比較した。有意差が認められた場合には、最小有意差二乗検定を事後検定として適用した。反復測定ＡＮＯＶＡ及びダネットの事後検定を用いて、心エコー検査における時間差を比較した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。全ての場合において、正常性の仮定は、シャピロ−ウィルク検定を用いた統計的分析の前にＳＰＳＳで検査された。Ｐ＞０．０５であるとき、データ分布は正常であると考えられた。全ての結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。
【００６１】
結果
急性期又は慢性期におけるＳＮＪ−１９４５の投与は、心臓リモデリング及び心室機能不全を軽減する
【００６２】
虚血及び２１日間の再灌流プロトコルに供された４８匹のマウスから、３８匹がこの研究に含まれた。死亡率は１２．５％であり、群間の生存率に差はなかった（手術中：４匹及び再灌流から１２時間及び２４時間：２匹）。４匹の動物は、虚血中ＳＴの明確な確認がないために除外した。
【００６３】
ベースライン心エコー検査では、群間の差は認められなかった。心筋梗塞は、ＬＶＥＤＤ及びＬＶＥＳＤの進行性増加及びＥＦの減少をもたらした（図２）。これらの変化は経時的に観察され、再灌流の第１週に急速に起こり、その後徐々に変化し続けた。ＬＶＰＷ及びＩＶＳの有意な変化は報告されなかった。再灌流１週目に測定すると、再灌流の急性期（急性群及びＡｃ＋Ｃｈｒ群）にＳＮＪ−１９４５を摂取した群では、対照マウス及び再灌流２１日目の慢性群と比較して、ＬＶ拡張及び機能障害が有意に軽減した。実験終了時、急性治療期と慢性治療期の間で、心エコー検査のパラメータに有意差は認められなかった。図２（Ｂ）では、各パラメータの値は、各群とも２１日目が棒で示されている。
【００６４】
２１日間の再灌流後にピクロシリウスレッドで染色されたＬＶの面積として定義される瘢痕サイズは、３４．６±４．２％であった。再灌流時及び２４時間の再灌流後に開始した経口投与時におけるＳＮＪ−１９４５の腹腔内投与は、急性群において２９．１％（Ｐ＝０．００２）、慢性群で２２．７％（Ｐ＝０．０３６）、Ａｃ＋Ｃｈｒ群では３３．７％（Ｐ＝０．００３）瘢痕面積を減衰させた（図３）。図３には、ピクロシリウスレッドで染色されたＬＶの領域が、各群の横断面切断心臓スライスにおける黒い陰影として示されている。各群の面積百分率の平均値の他に、各個々の値がスライスの下のグラフに表示されている。
【００６５】
ＳＮＪ−１９４５の急性及び慢性投与の組み合わせは、ＬＶ拡張のより効果的な軽減、駆出率の増加、及び瘢痕面積の縮小傾向を示すものの、個々の処置に関して統計的に有意な改善をもたらさなかった。
【００６６】
ＳＮＪ−１９４５の慢性経口投与は、心筋細胞肥大を制限する
【００６７】
肥大を示す非虚血心筋における心筋細胞の断面積は、シャム手術群に対する対照群で増加した。ＳＮＪ−１９４５によるカルパインの慢性的であって急性ではない阻害は、心筋細胞肥大を有意に減少させた（慢性群ではＰ＝０．０４１、Ａｃ＋Ｃｈｒ群ではＰ＝０．０２１）（図４（Ａ））。図４（Ａ）では、非梗塞領域に対応するヘマトキシリン＆エオシンで染色された心室断面、及び心筋細胞断面積の定量（単位：μｍ２）が棒グラフで示されている。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ｊ  １．６３ソフトウェアを用いて４００倍（オリンパスデジタルカメラＣ−１４００Ｌ）で、各心臓（ｎ＝６／群）からの少なくとも５０個のランダムな細胞を測定した。更に、β−ＭＨＣタンパク質レベルは、対照群において増加し（肥大表現型の更なる証拠となる）、ＳＮＪ−１９４５で慢性的に処置された群においてのみ軽減した（慢性群ではＰ＝０．０３６、Ａｃ＋Ｃｈｒ群ではＰ＝０．０１９）（図４（Ｂ））。
【００６８】
図４（Ｂ）には、肥大マーカーとして用いられるβ−ＨＭＣのウエスタンブロット（ＡＢＣＡＭ）が示され、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）に対するβ−ＨＭＣタンパク質の定量（ＡＢＣＡＭ）が棒グラフで示されている。両方の処置を併用した場合、有意な相加効果は認められなかった。
【００６９】
ＳＮＪ−１９４５の慢性経口投与は、間質性コラーゲン沈着を軽減する。
【００７０】
心筋梗塞は、全ての群の非梗塞領域における間質性コラーゲン沈着を増加させた。急性処置ではなくＳＮＪ−１９４５による慢性経口投与は、間質性コラーゲン量を減少させた（慢性群ではＰ＝０．０２９、急性群ではＰ＝０．１０９）。再灌流の急性及び慢性期においてＳＮＪ−１９４５を投与すると、間質線維化の更なる減少は認められなかった（Ｐ＝０．０１６）（図５（Ａ））。これらの結果に沿って、慢性処置を受けた心臓において、線維芽細胞活性化マーカーであるα−ＳＭＡのレベルが低下した（慢性群ではＰ＝０．０１２、Ａｃ＋Ｃｈｒ群ではＰ＝０．００９）（図５（Ｂ））。
【００７１】
カルパイン阻害は炎症細胞の浸潤を軽減する。
【００７２】
炎症細胞浸潤を、再灌流した心臓の下位群において３日間測定した（ｎ＝４／群）。我々のグループ及び他者からの以前の結果（Ｃｈｒｉｓｔｉａら，「再灌流心筋梗塞のマウスモデルにおける心筋炎症、修復、及びリモデリングの系統的特徴付け（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｅｄ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｖｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−２０１３，ｖｏｌ．ｎｏ．６１（８），ｐｐ．５５５−５７０）は、この再灌流の日に、炎症誘発性Ｍ１集団に対応するマクロファージの浸潤が最大であり、２１日後には無視できることを示している。図６に示す結果は、急性及び慢性カルパイン阻害の両方が、虚血領域（急性急性群ではＰ＝０．００２、慢性群ではＰ＝０．０２８）及び非虚血領域（急性群ではＰ＝０．０４６、慢性群ではＰ＝０．００１）での単球／マクロファージの浸潤を軽減することを実証しており、急性及び慢性治療を併用した場合に有意な相加効果は認められなかった（Ｐ＜０．００１）。図６（Ａ）には、３日間の再灌流後に得られ、単球／マクロファージ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）のＣＤ６８に対して免疫染色された心室断面が示されている。陰影領域（円内）は、抗体による染色（カラー画像ではオレンジグリーン）に対応する。
【００７３】
梗塞領域におけるＣＤ６８＋細胞の定量（ｍｍ２での陽性細胞の面積として）は、各群について棒グラフで描写されている。図６（Ｂ）では、非梗塞領域（遠隔領域）について（Ａ）と同じパラメータが示されている。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５。
【００７４】
結論：
本研究は、梗塞後の心筋リモデリング及び機能不全を制限する戦略として、再灌流中のカルパインの薬理学的阻害を裏付ける証拠を提供する。結果は、再灌流時のカルパイン阻害の心臓保護効果に加えて、カルパイン阻害剤ＳＮＪ−１９４５の長期経口遅延投与は、非梗塞心筋における心筋細胞の肥大、コラーゲン沈着及び炎症細胞の浸潤を調節することによって心室リモデリング及び機能不全を軽減することを実証している。
【００７５】
実施例２．非虚血性起源のリモデリングに対するＳＮＪ−１９４５の効果：イソプロテレノールにより誘発される心筋肥大及び線維化に対する効果
【００７６】
イソプロテレノールの慢性投与は、心筋リモデリングの研究における最も一般的な小動物モデルである。心筋梗塞以外の原因であるＡＶＲにおけるカルパイン阻害の効果を研究するために、イソプロテレノールによって心筋肥大及び線維化を誘発した。
【００７７】
カルパイン阻害剤ＳＮＪ−１９４５を、５ｍｇ／ｋｇ／日のイソプロテレノール（ＩＳＯ）を１週間腹腔内摂取した雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに１日１回経口同時投与した。アッセイ群は以下の通りであった：
【００７８】
イソプロテレノール群（ＩＳＯ）：イソプロテレノールを７日間連続して１日１回の皮下注射として投与する。
【００７９】
ＳＮＪ−１９４５処置群（ＳＮＪ＋ＩＳＯ）：ＳＮＪ−１９４５（経口）及びイソプロテレノール（皮下）を７日間連続で同時投与する。
【００８０】
心臓を取得して、カルパイン阻害剤を摂取していないビヒクル処置ラット及びＩＳＯ処置ラットと比較した。
【００８１】
図７には、イソプロテレノールによって誘発され、心エコー検査によって測定された心臓重量（図７（Ａ））、心室間壁（ＩＶＳＷＴ）、及び後壁（ＰＷＴ）の厚さ（図７（Ｂ））の個々の値及び平均値が示されている。
【００８２】
この図７（Ａ及びＢ）に示すように、ＳＮＪ−１９４５は、イソプロテレノールによって誘発され、心エコー検査によって測定された心臓重量（Ａ）、並びに心室間壁（ＩＶＳＷＴ）及び後壁（ＰＷＴ）の厚さ（Ｂ）の増大を低減する。心エコー検査は、（Ｐｏｎｃｅｌａｓ，Ｉｎｓｅｒｔｅら，２０１５，「高脂肪食により誘発された肥満は、Ｂ６Ｄ２Ｆ１成体マウスの梗塞後心筋リモデリング及び機能不全を軽減する（Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  Ｂ６Ｄ２Ｆ１  ｍｉｃｅ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｒａｄｉｏｌｏｇｙ−２０１５，ｖｏｌ．，ｎｏ．８４，ｐｐ．１５４−１６１）に先に記載されたように、ｉ１２Ｌ−ＲＳ  １２ＭＨｚトランスデューサ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＶｉｖｉｄポータブル超音波システムを用いて行った。
【００８３】
図８に、ＰＣＲで測定した肥大マーカーの発現レベル（量）を示す。特に、ＬＨＹ７／ＬＨＹ６比（図８（Ａ））、並びに図８（Ｂ）のナトリウム利尿ペプチドＡ（ＡＮＰ）及びＢ（ＢＮＰ）の発現は、３つのアッセイ群のものである。
【００８４】
更に、図９では、３つのアッセイ群について、線維化マーカーとしてのコラーゲン１レベル（図９（Ａ））及び腫瘍成長因子β（ＴＧＦ）（図９（Ｂ））レベル（全てＰＣＲで測定）が示されている。
【００８５】
ＰＣＲのために、「ＴＲＩｓｕｒｅ」（商標）試薬（ＢＩＯＬＩＮＥ、ＵＫ）を使用して、３つのアッセイ群の心臓サンプルの虚血性領域及び非虚血性領域から、製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて行った。増幅プログラムは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、そして９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルから構成され、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）において行った。ＡＮＰ、ＢＮＰ、コラーゲン１、Ｍｙｈ６、Ｍｙｈ７、及びＴＧＦ−β１のために使用されるプライマーは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入し、以下の遺伝子発現アッセイ（Ｒｎ００５６１６６１＿ｍ１、Ｒｎ０４２１９５５８＿ｇ１、Ｒｎ０１４６３８４８＿ｍ１、Ｒｎ００６９１７２１＿ｇ１、Ｒｎ０１４８８７７７＿ｇ１及びＲｎ００５７２０１０＿ｍ１、各々２０１７年３月１日のＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログから検索可能なアッセイについての言及；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｇｅｎｏｍｅ−ｄａｔａｂａｓｅ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／）。
【００８６】
ＩＳＯ処置の７日目に、カルパイン−１及びカルパイン−２は過剰発現し、カルパイン活性の増加と相関した（データは示していない）。ＳＮＰ−１９４５の経口同時投与は、カルパイン活性化を軽減し、図７（Ａ及びＢ）から推論できるように、心エコー検査で測定される心臓重量、中隔及び左心室後壁の厚さ、並びに心筋細胞横断面積を減少させた。ＳＮＪ−１９４５の投与は、図８（Ａ及びＢ）から推論できるように、β−ＭＨＣ／α−ＭＨＣ比並びにＡＮＰ及びＢＮＰ  ｍＲＮＡレベルを低下させた。更に、ＳＮＪ−１９４５はまた、図９（Ａ及びＢ）から導かれるように、心室内コラーゲン沈着及びＩＳＯによって誘発されるコラーゲン１及びＴＧＦの発現を有意に減少させた。
【００８７】
これらの全てのデータから、ＳＮＪ−１９４５の慢性経口投与は、イソプロテレノール誘発同心性心肥大及び線維化を軽減すると結論付けることができる。薬理学的カルパイン阻害は経口療法で可能であり、非虚血性起源の有害な心室リモデリングを制限する有効な戦略となる。結果は、ＳＮＪ−１９４５の慢性（１日を超える）経口投与が、イソプロテレノール誘発心肥大及び線維化を予防し、非虚血性起源の有害な心室リモデリングを制限する有効な戦略としての薬理学的カルパイン阻害の使用を拡張することを実証する。
【００８８】
実施例３  ＳＮＪ１９４５の用量依存性及び阻害特異性
【００８９】
虚血／再灌流に付した単離ラット心臓で行った研究は、ＳＮＰ−１９４５による灌流が、カルパイン阻害を反映するカルパイン特異的α−フォドリン分解産物の用量依存的減少を生じることを示した（データは示さず）。これらのデータ及びＳＮＪ−１９４５の薬物動態パラメータによれば、ラットは３０、６０、又は１２０ｍｇ／ｋｇの用量で経口的に（強制飼養により）薬物を摂取した。これらの実験条件において、６０分間の再灌流後に測定されたα−フォドリンのタンパク質分解は、１２０ｍｇ／ｋｇのＳＮＪ−１９４５で処置したラットにおいて有意に減少した。ＳＮＪ−１９４５の作用がマトリクス金属プロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）に対するその阻害作用の結果である可能性を捨てるために、ＭＭＰ−２のゼラチン分解活性を、異なる濃度のＳＮＪ−１９４５を用いてインキュベートしたサンプルにおいてザイモグラフィーで測定した。
【００９０】
ＭＭＰ−２の活性は、ゼラチンザイモグラフィーによって評価した。簡潔には、２１日間再灌流したラットから取得した心筋調製物（対照群）を、１．５ｍｇ／ｍｌのゼラチンと共重合した１０％ポリアクリルアミドゲル上に流した。２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した後、ゲルを細片に切断し、５、１０、及び５０μＭの濃度のＳＮＪ−１９４５、ビヒクル対照としてのＤＭＳＯ、又は選択的ＭＭＰ阻害剤ＯＮＯ−４８１７（Ｎ−［（１Ｓ，３Ｓ）−１−［（エトキシメトキシ）メチル］−４−（ヒドロキシアミノ）−３−メチル−４−オキソブチル］−４−フェノキシベンズアミド）を含むザイモグラフィー緩衝液（５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）中で一晩別個にインキュベートした。経口強制飼養によりＳＮＪ−１９４５を摂取し、２１日間再灌流した動物（慢性群）から調製されたサンプル中のＭＭＰ−２活性（０μＭの％として）を更に調べた。０．２５％クーマシーブリリアントブルーＧ、４０％メタノール中でゲルを染色し、脱色後にゼラチン分解活性を定量した。
【００９１】
得られた結果を図１０に示す。この結果は、ＳＮＰ−１９４５が試験濃度ではＭＭＰ−２活性を阻害しないことを実証しており、これはカルパイン阻害がその主要な作用機序であることが裏付けられた。図１０は、ＤＭＳＯ（ビヒクル）、５、１０、及び５０μＭの濃度のＳＮＪ−１９４５及び選択的ＭＭＰ阻害剤ＯＮＯ−４８１７を用いて、３７℃で一晩インキュベートした２１日間の再灌流の対照ラットから得た心筋抽出物のゼラチンザイモグラムを示す。右のザイモグラムは、１４日間にわたって経口投与されたＳＮＪ−１９４５を摂取したラットからの心筋抽出物に対応した。結果は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍである（ｎ＝３／群）。
【００９２】
ＳＮＪ−１９４５は、水溶性及びバイオアベイラビリティを増加させるように特定的に設計され、アミノ及びチオール基と非特異的に反応しにくい第３世代のカルパイン阻害剤であり、ロイペプチン、カルペプチン、及びＳＪＡ６０１７等の他のペプチジル阻害剤とは対照的である。種々の細胞経路におけるカルパイン及びＭＭＰ−２の基質及び作用が重複することが示唆され、広く使用されているいくつかのカルパイン阻害剤もまたＭＭＰ−２を阻害することが実証されているが、ここでの結果は、ＳＮＪ−１９４５で得られた効果が、ＭＭＰ−２に対する阻害作用の結果である可能性を排除する。
【００９３】
本願で引用された参照文献
−Yoshikawa et al., “Cardioprotective effects of a novel calpain inhibitor SNJ-1945 for reperfusion injury after cardioplegic arrest”, Am J Physiol Heart Circ Physiol - 2010, vol 298, pp.: 643-651.
−Inserte et al., “Contribution of calpains to myocardial ischaemia/reperfusion injury”, Cardiovascular Research - 2012, vol 96, pp.: 23-31.
−Hernando et al., “Calpain translocation and activation as a pharmacological targets during myocardial ischemia/reperfusion”, J Mol Cell Cardiol - 2010, vol 49(2), pp.: 271-279.
−Khalil et al., “Calpain inhibition reduces infarct size and improves global hemodynamics and left ventricular contractility in a porcine myocardial ischemia/reperfusion model”, Eur J Pharmacol - 2005, vol 528, pp.: 124-131.
−WO2005056519.
−Trager et al., “Effects of a novel orally administered calpain inhibitor SNJ-1945 on immunomodulation and neurodegeneration in a murine model of multiple sclerosis”, J.Neurochem- 2014, vol. no. 130(2), pp.: 268-279.
−Poncelas, Inserte et al. 2015, “Obesity induced by high fat diet attenuates postinfarct myocardial remodeling and dysfunction in adult B6D2F1 mice”, Journal of Molecular and Cellular Cradiology-2015, vol. no.84, pp.: 154-161.
−Christia et al., “Systematic Characterization of Myocardial Inflammation, Repair, and Remodeling in a Mouse Model of Reperfused Myocardial Infarction”, Journal of Hystochemistry& Cytochemistry-2013, vol. no. 61(8), pp.: 555-570.
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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