(57)【要約】成人幹細胞が、ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の逐次的活性化を介して、ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞を形成するように再プログラミングされる。これらのプルキンエ細胞は、自発的により大きなペースメーカ細胞を取り囲んでこれと結合して洞房体を形成し、これは奇異性電流を生成して、天然の洞結節に類似した方法で心血管組織を拍動させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体再生細胞を誘導された非収縮性心筋細胞タイプへと分化させる方法であって、前記細胞の特異的分化を誘導するために、成体再生細胞の集団をＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の逐次的発現に付すことと、前記細胞を、心臓ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞が形成されるまで培養することを含む前記方法。
【請求項２】
前記再生細胞が成体幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記再生細胞が自己脂肪組織由来幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの前記細胞への逐次トランスフェクションを誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＴＢＸ３＞ＴＢＸ１８＞ＨＣＮ２の逐次的発現を誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記非収縮性心筋細胞が、自己脂肪組織由来の再生細胞から生成される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導段階が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５、及びＨＣＮ２をコードする１以上の発現ベクターを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記誘導段階が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２をコードする１以上の発現ベクターを使用する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記誘導段階が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５、及びＨＣＮ２をコードする１以上のレンチウイルスベクターを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記誘導段階が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２をコードする１以上のレンチウイルス発現ベクターを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記誘導段階が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５、及びＨＣＮ２をコードするｍＲＮＡを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記誘導段階が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２をコードするｍＲＮＡを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
誘導された洞房体が形成されるまで前記ペースメーカ細胞及び前記プルキンエ細胞を増殖させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
医薬的に許容される緩衝液及び／または細胞支持媒体中に、請求項１３に記載の方法により作製された誘導された洞房体を含む組成物。
【請求項１５】
医薬的に許容される緩衝液及び／または細胞支持媒体中に、請求項１に記載の方法により作製された誘導されたペースメーカ細胞を含む組成物。
【請求項１６】
医薬的に許容される緩衝液及び／または細胞支持媒体中に、請求項１に記載の方法により作製された誘導されたプルキンエ細胞を含む組成物。
【請求項１７】
ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の逐次的発現を可能にする発現構築物で形質転換され、従って前記再プログラミングされた細胞を形成する成体再生細胞から形成された、再プログラミングされた細胞の集団を含む組成物であって、前記再プログラミングされた細胞の集団が医薬的に許容可能な液体の賦形剤及び／または細胞支持媒体中にある前記組成物。
【請求項１８】
前記再プログラミングされた細胞の集団が、ＳＨＯＸ２＞（ＴＢＸ３及びＴＢＸ５及びＴＢＸ１８）＞ＨＣＮの逐次的発現により形成される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記再プログラミングされた細胞の集団が、ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ３＞ＴＢＸ５＞ＴＢＸ１８＞ＨＣＮの逐次的発現により形成される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
成体幹細胞を取得することと、
前記成体幹細胞においてＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の逐次的発現を誘導して再プログラミングされた細胞を形成することと、
前記再プログラミングされた細胞を、心臓ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞が形成されるまで増殖させることを含む方法。
【請求項２１】
前記心臓ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞を、それらが結合して誘導される洞房体を形成するまで増殖させることを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記誘導された洞房体を患者の心臓に導入することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記成体幹細胞が、自己脂肪組織由来の成体幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＳＨＯＸ２＞（ＴＢＸ３＞ＴＢＸ５＞ＴＢＸ１８）＞ＨＣＮ２の逐次的発現を誘導することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ３＞ＴＢＸ５＞ＴＢＸ１８＞ＨＣＮ２の逐次的発現を誘導することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞をサイズ選別によって分離することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
２０μｍ未満の細胞をプルキンエ細胞として選別し、また５０μｍを超える細胞をペースメーカ細胞として選別する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分離されたプルキンエ細胞を頻脈性不整脈の治療のために患者に投与することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記成体幹細胞は頻脈性不整脈を有する患者から得られ、また前記分離されたプルキンエ細胞は、前記頻脈性不整脈を治療するために十分な量で前記患者に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
洞不全症候群の治療のために前記分離されたペースメーカ細胞を患者に投与することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記成人幹細胞は洞不全症候群の患者から得られ、また前記分離されたペースメーカ細胞は、前記洞不全症候群を治療するために十分な量で前記患者に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
不整脈を治療する方法であって、
不整脈の心臓を有する患者から成体幹細胞を取得することと、
前記成体幹細胞のプルキンエ細胞及びペースメーカ心筋細胞への分化系列決定（lineage commitment）を、逐次的なエピジェネティック再プログラミングにより誘導することと、
前記プルキンエ細胞もしくは前記ペースメーカ細胞、またはその両者を前記不整脈の心臓に導入することを含む前記方法。
【請求項３３】
前記ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞が、それらのサイズに基づいて相互に分離される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞の両方を一緒に使用して、前記患者の損傷した洞結節を再構成する、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１２月２８日に出願された米国特許出願番号１４／９８０，２７４「成人幹細胞から誘導されたペースメーカ及びプルキンエ細胞」に関し、その全体を、全ての目的で本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、不整脈の治療に使用するための非収縮性で電気的に活性な、誘導された心筋細胞を生成させる方法、並びに洞細胞または洞房結節細胞及びプルキンエ細胞のような、心臓の増強された電気的活動のための細胞の作製及び形成、それによって製造されたプルキンエ細胞及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓（図１Ａ）は、循環系の血管を通して血液を送り出す筋肉臓器である。右心房及び左心房並びに右心室及び左心室で構成される健康な哺乳類の心臓では、心臓弁が逆流を防止するため、血液は心臓を一方向にのみ流れる。心臓は保護嚢、即ち心膜に封入されており、心膜には少量の液体も含まれている。心臓の壁は、心外膜、心筋及び心内膜の３つの層で構成されている。
【０００４】
洞房結節［ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄｅ、ＳＡ節またはＳＡＮと略記されることが多い：また一般には洞結節とも呼ばれ、一般性は低いが洞節（ｓｉｎｕａｔｒｉａｌ  ｎｏｄｅ）とも呼ばれる］は、心臓のペースメーカであり、心拍の開始を担当する。これは、大静脈上部と心房の接合部に位置し、約５ｍｍ×２ｃｍの大きさである。それは自発的に電気刺激を発生させ、これが心臓全体を伝導した後に心臓を収縮させる。電気刺激は自発的に発生するが、刺激の速度（従って心拍数）は心臓の右心房（上室）に位置する洞房結節を支配する神経によって修飾される。
【０００５】
房室（ＡＶ）結節は、心室の収縮を調整する心臓の電気伝導システムの一部である。それは、心房及び心室を電気的に接続する（図１Ｂ）。ＡＶ結節は、心房と心室の間の特殊組織の領域であり、具体的には、心房から心室への正常な電気的刺激を伝導する冠状静脈洞の開口付近の心房中隔の後下領域にある。ＡＶ結節は非常にコンパクトである（約１×３×５ｍｍ）。それはコッホの三角形、即ち、三尖弁の中隔葉、冠状静脈洞、及び心房中隔の膜状部分によって囲まれた三角形の中心に位置する。
【０００６】
ＡＶ結節の遠位部分は、Ｈｉｓ束として知られている。このＨｉｓ束は、心室中隔の２つの枝、左の束の枝及び右の束の枝に分かれる。左の束の枝は左心室を活性化し、右の束の枝は右心室を活性化する。上記２つの束の枝は先細りになって多数のプルキンエ繊維を生成し、これは個々の心筋細胞群を刺激して収縮させる。
【０００７】
奇異性電流（または奇異性チャネル、またはＩｆもしくはＩＫｆ、またはペースメーカ電流）とは、心臓内の特定の電流を指す。１９７０年代後半にプルキンエ線維及び洞房心筋細胞において最初に記載されてから、心臓ペースメーカ「奇異性」電流は広範に特徴付けられ、心臓ペースメーカにおけるその役割が研究されてきた。
【０００８】
上記奇異性電流は、伝導組織の洞房結節、房室結節及びプルキンエ繊維のような自発的に活動する心臓領域において高度に発現される。この奇異性電流は、拡張期の電圧（通常−６０／−７０ｍＶ〜−４０ｍＶ）での過分極時に活性化する混合ナトリウム−カリウム電流である。洞房活動電位の終わりに膜がＩｆ閾値（約−４０／−５０ｍＶ）未満で再分極すると、奇異性電流が活性化されて内向き電流が供給され、これは拡張期脱分極段階（ＤＤ）を開始する原因となる。このメカニズムにより、奇異性電流は洞房心筋細胞の自発的活動の速度、従って心拍数を制御する。
【０００９】
ペースメーカ電流の分子的決定要素は、過分極活性化型の環状ヌクレオチド感受性チャネルファミリー（ＨＣＮ）に属し、その４つのアイソフォーム（ＨＣＮ１−４）が現在までに知られている。それらの配列に基づいて、ＨＣＮチャネルは、電位感受性Ｋ＋（Ｋｖ）イオンチャネル及び環状ヌクレオチド感受性（ＣＮＧ）イオンチャネルのスーパーファミリー構成員として分類される。
【００１０】
簡単に言えば、心拍を制御する電気信号は、以下のように説明することができる。電気的刺激はＳＡ節で開始する。この電気的活動は、心房の壁を通って広がり、それらを収縮させる。これにより血液が心室に送られる。ＡＶ節は、心室に入る前に電気信号を遅くするゲートのように働く。この遅延は、心房に対して、心室が収縮する前にそれが収縮するための時間を与える。この遅延の後、上記刺激は発散し、左と右のＨｉｓ束を経て、心臓の各側のプルキンエ線維、心臓の頂点の心内膜、そして最後に心室心外膜へと伝導する。繊維のこのＨｉｓ−プルキンエネットワークは、心室の筋肉壁に刺激を送り、それらを収縮させる。これは、心臓から肺及び身体へと血液を強制的に送り出す。ＳＡ節は別の刺激を発生させ、上記サイクルが再び開始される。
【００１１】
心臓では多くのことが間違って起こり、不規則な鼓動を生じ得る。洞不全症候群（洞結節疾患または洞結節機能不全としても知られる）は、心臓の天然のペースメーカである洞結節が適切に機能しない一群の心臓リズム問題（不整脈）の名称である。
【００１２】
人工ペースメーカは、心臓の鼓動を調節するために、心筋を脱分極させる電極により供給される電気刺激を用いる医療装置である。人工ペースメーカの主な目的は、心臓の天然のペースメーカが十分に速くないので、または心臓の電気伝導システムにブロックがあるので、適切な心拍数を維持することである。現代のペースメーカは外部からプログラム可能であり、心臓専門医が個々の患者のために最適なペーシングモードを選択することを可能にする。幾つかのものは、ペースメーカ及び除細動器を移植可能な単一の装置に組み合わせたものである。他のものは、心臓の上部（心房）及び下部（心室）の部屋の同期を改善するために、心臓内の異なる位置を刺激する複数の電極を有する。
【００１３】
人工ペースメーカは多くの人命を救ってきたが、それは完全な解決策ではない。特に、それらはホルモン応答性ではなく、機械的及び／または電気的障害の影響を受け、電池交換が必要であり、強い磁場または治療的放射線の状況においては支障をきたす可能性がある。更に、ペースメーカ媒介性頻脈、準最適房室同期（ＳＶ）、及び幾つかの他のタイプのペースメーカ誘導性不整脈と同様に、感染は常に危険である。従って、より自然なペースメーカを開発するための努力が続けられている。
【００１４】
サイレント組織での自発的活動を誘導できる細胞基質として一般的に意図される生物学的ペースメーカは、電子ペースメーカの限界を克服するための潜在的ツールである。人工ペースメーカの代わりに使用するための天然ペースメーカを開発する努力は、一般に２つのアプローチのうちの１つを採用してきた。
【００１５】
１つのアプローチは、鼓動する心筋を、遺伝子操作を介してインサイチューでペースメーカ細胞に変換すること（即ち、直接再プログラミング）である。これに関して、初期の重要な転写因子であるＴＢＸ３は有望な結果をもたらしたが、不完全なペースメーカ特性を有する細胞を導いた。
【００１６】
別のアプローチは、ペースメーカ細胞を形成するようにプログラミングされた胚または誘導された多能性幹細胞（いわゆるＩＰＳ細胞）を使用し、次に、これらの新たにプログラミングされたＡＶ様細胞でＡＶ細胞を置換または補充することである。
【００１７】
ある研究において、Ｊｕｎｇらは、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）におけるＴＢＸ３のアップレギュレーションによって、ペースメーカ細胞を生成しようと試みた。Ｈａｓｈｅｍら（２０１３）は、ＳＨＯＸ２が、胚様体においてペースメーカ遺伝子プログラムを調節することを示した。Ｂａｋｋｅｒら（２０１２）は、最終分化した心筋細胞を、ＴＢＸ３のアップレギュレーションによりペースメーカ細胞へと再プログラミングしようと試みた。別の研究において、Ｋａｐｏｏｒら（２０１３）は、成人の心筋細胞におけるＴＢＸ１８の過剰発現によって、ペースメーカ細胞を生成しようと試みた。Ｈｕら（２０１４）は、Ｔｂｘ１８のアップレギュレーションによって心筋細胞をペースメーカ細胞に変換しようと試みた。
【００１８】
心臓ペースメーカ細胞を生成するためのこれまでの幾つかの試みにもかかわらず、未分化の成人自己幹細胞に由来する臨床適用に利用可能な、正確に機能する生物学的ペースメーカ細胞は今まで存在していない。心臓伝導系のペースメーカ細胞または他の細胞に存在する幾つかの特徴を得るために、胚細胞またはＩＰＳ細胞のような細胞が、特定の遺伝子の操作によって誘導され得ることが以前に示されていただけである。単一の転写因子の単独の発現では、ペースメーカ細胞またはプルキンエ細胞へのそれぞれの完全な調節分化経路のスイッチを入れることはできなかった。ペースメーカ細胞を生成しようとする過去の試みは、天然の心臓ペースメーカ細胞の適切な生理学的機能性及び形態学的特性を模倣することができなかった。
【００１９】
本明細書に記載される研究は、この研究を新規かつより高い状態にするものである：患者自身の組織に由来する成熟した未改変の新鮮な未培養細胞（本明細書では再生細胞とも呼ばれる）を、天然ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞の形態学的及び機能的な構造及び特徴を備えた非収縮性心筋細胞へと誘導することは、これまで達成されていない。
【発明の概要】
【００２０】
誘導されたペースメーカ細胞、プルキンエ細胞及びそれらの連合によって産生された洞房体、並びにその作製及び使用の方法が本明細書に記載される。
【００２１】
レンチウイルスベース及びｍＲＮＡベースのトランスフェクションアプローチの両方を使用して、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２を含む転写因子の組み合わせのそれぞれの事後適用によって、心臓ペースメーカ細胞へと再プログラミングされている。
【００２２】
ＳＨＯＸ２は、収縮性心筋細胞分化経路を阻害するＳＡ結節におけるＮＫＸ２．５の負の調節因子であるが、ペースメーカ分化経路のアップレギュレーションによって、未分化の前駆細胞をそれぞれ非収縮性の心筋細胞ペースメーカ細胞系統へと特異的に誘導する。ＴＢＸ３、ＴＢＸ５及びＴＢＸ１８は、未分化の中胚葉由来幹細胞のペースメーカ細胞系への分化、及びＳＡＮの形成を制御する主要な転写因子である。
【００２３】
組織発生の後期段階における成熟ペースメーカ細胞は、心周期の拡張期の間に膜電位を漸進的に低下させる不安定なフェーズ４電位によって引き起こされる自発的脱分極過程の存在のために、通常の心筋細胞とは異なる。上記低下が臨界閾値に達すると、ナトリウムチャネルが開き、活動電位が誘導される。ペースメーカ細胞の自発的な拡張期脱分極は、特定のタンパク質をコードする過分極活性化型の環状ヌクレオチド感受性（ＨＣＮ）チャネル遺伝子に起因し、これはＩｆまたは奇異性電流と名付けられた内向き電流の存在を提供する。ＨＣＮ２の発現は、ペースメーカ細胞の適切な生理学的機能にとって重要であると考えられているが、他のＨＣＮ遺伝子がＨＣＮ２に取って代わり、または補充できる可能性がある
【００２４】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００２５】
＜ペースメーカ再プログラミング遺伝子＞
ＳＨＯＸ２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ６０９０２）、別名ＳＨＯＲＴ・ＳＴＡＴＵＲＥ・ＨＯＭＥＯＢＯＸ・２またはＳＨＯＴは、ヒト短鎖ホメオボックス遺伝子（ＳＨＯＸ；３１２８６５）及びマウスｏｇｌ２遺伝子に関連する遺伝子として同定された。元の発見者は、ＳＨＯＸ２が、ＳＨＯＸよりもｏｇｌ２に対する相同性の程度がはるかに高いことを示した。その中で、同一のホメオドメインを有し、且つ頭蓋冠に発現されたホメオドメインタンパク質に特徴的なＣ末端１４アミノ酸残基モチーフを共有する２つの異なるアイソフォーム、即ちＳＨＯＴａ及びＳＨＯＴｂが単離された。ＳＨＯＴａとＳＨＯＴｂの間の相違は、Ｎ末端、及びＣ末端の択一的にスプライシングされたエキソン内にあった。段階化されたマウス胚由来切片上でのｏｇｌ２のインサイチューハイブリダイゼーションにより、発生中の洞静脈（大動脈）、女性生殖器、間脳、間葉及び髄脊髄、鼻の莢膜、口蓋、眼瞼及び四肢における高度に制限された転写物が検出された。
【００２６】
ＴＢＸ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９９５９３）、別名Ｔ−ＢＯＸ−５は、９つのエキソン及び４７ｋｂ以上に亘って広がり、このタンパク質の突然変異はホルトオラム症候群、即ち、心臓及び四肢に影響を与える発達障害の原因である。研究者らは、野生型ＴＢＸ５を過剰発現するＰ１９ＣＬ６細胞株が、親株Ｐ１９ＣＬ６細胞よりもより早く鼓動し始め、また心臓特異的遺伝子をより豊富に発現するのに対して、ＨＯＳにおいて軽度の骨格異常を伴う実質的な心臓欠陥を引き起こすＧ８０Ｒ突然変異（６０１６２０．０００４）を発現する細胞株は、鼓動する心筋細胞へと分化しないことを見出した。逆に、心臓異常を伴わない上肢奇形を引き起こすＲ２３７Ｑ突然変異（６０１６２０．０００３）は、野生型ＴＢＸ５と同程度までにＮｐｐａプロモーターを活性化した。アイソフォーム１は、５５８アミノ酸である。
【００２７】
ＴＢＸ５の代わりに、またはそれに加えて、ＴＢＸ３（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ１５１１９）を本明細書に記載の方法で使用することができる。ＴＢＸ３、別名Ｔ−ＢＯＸ−３は、ホルトオラム症候群との関連性を研究する際にＴＢＸ５と共に同定された。Ｔ−ｂｏｘを中断する１つを含んだ、択一的に転写されるＴＢＸ３転写物が存在する。ＴＢＸ３遺伝子の完全なオープンリーディングフレームは、予測された７２３アミノ酸のタンパク質をコードする。ＴＢＸ３に対する他のＴ−ｂｏｘ遺伝子の比較は、ＤＮＡ結合ドメイン外の実質的な相同性領域を示した。
【００２８】
四肢の形成に関与することに加えて、ＴＢＸ３はペースメーカの発生に関与する。遺伝的系統解析、ノックアウト研究、及び外植体アッセイを用いることにより、ＴＢＸ１８（ＯＭＩＭ  ６０４６１３）は、間葉前駆体からマウス洞房結節の大きな頭部構造を確立することが要求されることが見出された。その後、ＴＢＸ３は、ペースメーカ機能のためのペースメーカ遺伝子の発現を誘導した。それはまた、誘導された多能性幹（ｉＰＳ）細胞の質を改善するために使用されてきた。
【００２９】
ＴＢＸ１８（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｏ９５９３５）もまた、本明細書に記載の方法で使用することができる。ＴＢＸ１８またはＴ−ＢＯＸ−１８は、心臓及び冠状血管、尿管及び脊柱を含む様々な組織及び器官の発生過程に関与する転写リプレッサーとして作用する。これは、洞房結節（ＳＡＮ）頭部領域の胚発生のために必要とされる。このファミリーにおいては典型的なように、幾つかのエキソン（８）、少なくとも４つの転写物が存在し、また全長タンパク質は６０７アミノ酸である。
【００３０】
ＨＣＮ２（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＵＬ５１）、別名過分極−活性化型環状ヌクレオチド感受性カリウムチャネル２、及び脳環状ヌクレオチド感受性２；ＢＣＮＧ２は、ペースメーカイオンチャネルの１つであると考えられている。ＨＣＮ２遺伝子は、約２７ｋｂに亘る８個のエキソンを含み、全チャネルと同様に少なくとも６個の膜貫通ドメインを有する８８９個のアミノ酸でかなり大きい。この過分極活性化型イオンチャネルは、ナトリウムイオンよりもカリウムに対して弱い選択性を示し、心臓における本来の（奇異性の）ペースメーカ電流（Ｉｆ）に寄与する。
【００３１】
＜方法の概要＞
一般的に言えば、我々は、非常に初期の多能性幹細胞及び前駆細胞を含んだ、成体の非培養で且つ最初は未修飾の脂肪組織に由来する再生細胞を用いる。鼓動性または頻脈性の両方の心臓不整脈の修復を必要とする、同じ患者からの自己細胞を使用するのが好ましい。
【００３２】
これらの細胞は、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２、またはＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２をコードする逐次的発現ベクターでトランスフェクトされ、各遺伝子が逐次的かつ組織化された様式で転写されて、機能性タンパク質の産生をもたらすようになっている。
【００３３】
脂肪組織由来の幹細胞の使用は、例示的なものに過ぎず、任意の適切な再生細胞調製物を使用することができる。再生細胞調製物には、例えば、骨髄、臍帯組織、臍帯血、胎盤、血液、または毛根もしくは大網脂肪のような身体の任意の他の組織に由来する細胞が含まれ、それによって、本出願に記載の方法でペースメーカ細胞を生成させるよう誘導され得る初期幹細胞を含有する。この可能な細胞のリストは例示に過ぎず、網羅的なものではない。
【００３４】
本発明者らの経験において、上記タンパク質は、特定の順序及び量で連続して上記細胞に導入されるべきである（図２）。一度に全ての遺伝子をトランスフェクトしようとしたところ、大部分の細胞が死滅した。しかしながら、より良い導入システムを用いると、細胞がショックを受けずに生き残る可能性がある。しかし、活性化の順序は、発現レベルと同様に引き続き重要であると予想される。
【００３５】
本明細書で使用したベクターはレンチウイルスベクターであったが、これは単なる例示であり、任意の発現ベクターを使用することができる。或いは、ＲＮＡを使用することができ、または未処理の機能性タンパク質でさえも使用することができる。
【００３６】
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び脂質媒介トランスフェクションを含む様々な方法で、細胞に導入することができる。ＲＮＡはまた、例えば、ＨＩＶ−１−ｔａｔタンパク質を用い、例えばｔａｔ融合を用いて細胞に送達することもできる。ｔａｔは、タンパク質送達に首尾よく用いられてきた。例えば、細胞透過性ペプチドＴＡＴのテトラメチルローダミンで標識された二量体であるｄｆＴＡＴは、高効率で、エンドソームから脱出することによって生きた細胞に浸透する。他の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が知られており、実際に、無処置のタンパク質は、ＣＰＰを融合タンパク質として使用して送達でき、並びに非共有結合のＣＰＰ／タンパク質複合体によって送達することができる。
【００３７】
現時点において、レトロウイルスは遺伝子治療（レトロウイルス及びレンチウイルス）に好ましいものであり、現在では３５０を超える遺伝子治療研究に用いられている。レトロウイルスベクターは、移入された導入遺伝子（複数可）の長期かつ安定した発現に起因して、またクローニング及び製造のための努力が殆ど必要ないため、細胞の遺伝子矯正に特に適している。しかしながら、ペースメーカ細胞の誘導のために等しく使用され得る次世代ベクターが引き続き開発されることが予想される。
【００３８】
更に、ゲノム工学技術の出現（例えば、ＣＲＩＳＰ／ＣＡＳ等）により、将来は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の細胞送達ではなく、ゲノム工学を介して、必要なタンパク質を選択的に活性化することも可能になる可能性がある。選択的でエピジェネティックな変化（例えば、メチル化パターンの変化）も将来は可能であるかもしれないが、現時点では実用的ではない。
【００３９】
多くの異なる成人多能性幹細胞源を本明細書で用いることができるが、本発明の１つの重要な側面は、ヒトにおける洞不全症候群及び他の不整脈を治療するための細胞を作製することにある。幹細胞の好ましい供給源は、不整脈の修復を必要とする同じ患者からの脂肪組織に由来する再生細胞のような自己細胞である。脂肪組織は、非収縮性であるが電気的に特殊な細胞、例えば連合して洞房体を形成するペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞等を形成するために、適切な逐次誘導を受けることが可能な、多数のこれら初期多能性細胞を含有するものとして好ましいものである。脂肪組織は、骨髄源を叩くことに関連した不快感を伴わずに、または拒絶の問題を回避する同種細胞を使用して、患者から容易に入手可能である。将来は、より多くの患者が、例えば臍帯血及び／または臍帯、または胎盤由来の幹細胞等を保存したときに、他のタイプの幹細胞が適合した同種異系移植術において好ましくなる可能性もあるが、現時点では、未だ僅かな患者についてしかこれらの資源は存在しない。
【００４０】
現時点までは、形態学的レベル及び機能的レベルの両方でペースメーカ細胞の特徴を示す誘導された洞房細胞の創製のために、非培養または培養された成体の、即ち非胚性且つ非ｉＰＳの幹細胞を使用することはできなかった。これら細胞の使用は、それらが胚性幹細胞とは異なって自己由来であり、拒絶の問題を排除し、且つ容易に入手可能であるため、胚性幹細胞に対して非常に有利である。更に、誘導された多能性幹（ｉＰＳ）細胞は安全ではない可能性がある：最近、幾つかの報告はこのような細胞はがん細胞に近いことを示した。
【００４１】
同種異系細胞もまた適切であり得るが、ＨＬＡパターンが一致しない場合、免疫調節薬が典型的に必要とされる。しかしながら、このような細胞は今日使用されており、また、より多くのバンクが臍帯血、臍帯組織幹細胞等、及びそれによって生成された幹細胞を収集して貯蔵するようになってきているので、将来は更に適するようになる可能性があり、特に、何百何千もの異なるＨＬＡパターンのライブラリを収集し、凍結保存することができる場合には、適合した同種異系移植の確率が増加する可能性がある。或いは、誘導されたペースメーカ／プルキンエ細胞のライブラリを予め作製することができるので、必要時には、これらの細胞を移植のために容易に利用することができる。
【００４２】
更に、本発明者らは、ヒト野生型遺伝子を用いて本発明を説明したが、他の供給源を、上記種に適したものとして使用してもよい。発現を最適化するためにコドン最適化を行うこともできる。
【００４３】
本発明は、以下の実施形態の１以上を、それらの任意の組合せ（複数可）において包含するものである。
【表１】
2019506895.tif 000002
【表２】
2019506895.tif 000003
【００４４】
本明細書中で使用するとき、「誘導された洞房体」とは、再プログラミングされた幹細胞からなっており、これはペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞を形成し、次いでこれらが連合して機能的相互接続を形成し、且つ奇異性電流を発生して心臓拍動を誘導できる誘導された洞房体を産生する。ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞の機能的相互接続及び電気生理学的特性は、特にＣＸ３０．２及びＨＣＮ４を含む心臓伝導性細胞に関しては、特異的な細胞膜接合及びイオンチャネルの発現と関連している（図１０、１１）
【００４５】
本明細書で使用するとき、ペースメーカ細胞とは、自発的に脱分極する能力を有する、幾つかの蜘蛛状突出部をもった大きな主に丸い（＞５０μｍ）細胞である（図７、８）。
【００４６】
本明細書中で使用するとき、「プルキンエ細胞」とは、小さな（＜２０μｍ、主細胞体の直径を横切って）細胞であり、この細胞は互いに特異的な鎖を形成し、鎖及びチャネルにおいて自発的にそれ自体を配向させ、またペースメーカ細胞を包囲して、これら細胞との相互接続を形成する（図７、８、９）。
【００４７】
本明細書中で使用するとき、幹細胞において特定の遺伝子の発現を「誘導する」とは、特定の方法論を意味せず、誘導性プロモーターの使用に限定されない。その代わりに、発現ベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡまたはタンパク質の使用、エピジェネティックな変化の誘導などを含む、遺伝子発現を開始する任意の手段を用いることができる。それは列挙された遺伝子／タンパク質の発現を既に示している天然細胞は含まず、ヒトの手によってそのように再プログラミングされた幹細胞のみを含む。
【００４８】
本明細書中で使用するとき、「幹細胞」または「再生細胞」とは、多分化能性及び多能性の幹細胞、並びに本明細書に記載の細胞型に分化するために首尾よく再プログラミングされ得る他の型の細胞を含むものである。これらは、未だ分化していないか、または脱分化されている細胞であり、従って、全ての細胞型または多数の細胞型の何れかを形成する能力を有している。
【００４９】
「成人幹細胞」とは、典型的には、非乳児由来の多能性幹細胞であり、ドナーの特定の年齢を意味しない。体細胞性幹細胞としても知られており、小児並びに成人にも見出すことができる。
【００５０】
本明細書で使用する「自己の」とは、患者または遺伝的に同一の患者に由来する細胞を意味する。「同種異系」とは、同じ種に由来するが、異なる遺伝子型を有する細胞をいう。
【００５１】
用語「ａ」または「ａｎ」の使用は、特許請求の範囲または明細書中の「含む」の用語に関連して使用されるときは、文脈上別段の指示がない限り、１以上を意味する。
【００５２】
「約」の用語は、記載した値プラスまたはマイナス測定誤差の限度、或いは、測定方法が示されていない場合は記載した値プラスまたはマイナス１０％を意味する。
【００５３】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、択一的選択物のみを指すことが明示的に示されない限り、または択一的選択物が相互に排他的である場合を除いて、「及び／または」を意味するために使用される。
【００５４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」（及びそれらの変形）は、非限定的連結動詞であり、請求項で使用されるときには他の要素の追加を可能にする。
【００５５】
「〜からなる」との語句は閉じられており、すべての追加要素を除外している。
【００５６】
「本質的に〜からなる」の語句は、追加の重要な要素を除外するが、本発明の性質を実質的に変えない重要でない要素の包含を可能にする。このタイプの要素は、例えば、緩衝剤、キレート剤、栄養素、使用説明書などが含まれる。
【００５７】
本明細書では以下の略語が使用される。
【表３】
2019506895.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】心臓の解剖図：ＥＫＧトレース（右上）を伴った心臓の断面解剖図。
【図１Ｂ】心臓の電気生理学：心臓の電気システム及び詳細なＥＫＧトレース。
【図２】遺伝子活性化シーケンス：心臓ペースメーカ細胞系統発生の異なる段階に関与する重要遺伝子を表す概略アルゴリズム。
【図３】実験概要：心臓ペースメーカ細胞生成のための実験手順の順序を表す概略図。
【図４】ベクターマップ：ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８、ＨＣＮ２、ＳＨＯＸ２構築物の発現ベクターとして使用される、ＰＮＬ−ＴＲＥＰｉＴＴ−ＥＧＦＰデルタＵ３−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰプラスミド。
【図５】形質転換の前及び後のＡＤＳＣ：ＡＤＳＣの典型的な線維芽様様形態（Ａ）から小ネットワーク形成細胞のコロニー（Ｂ）への、ＡＤＳＣの形態の変化。矢印を参照されたい。ドキシサイクリン感受性スイッチの下で開始から７日後。
【図６】形態の変化：心臓ペースメーカ誘導因子ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２でのトランスフェクション後で、ドキシサイクリンスイッチ制御誘導の開始後１週間以内における、ＡＤＳＣの典型的な線維芽様形態から小型及び大型ネットワーク形成細胞のコロニーへの、ＡＤＳＣの形態学における変化。
【図７】細胞型及びアラインメント：ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２でトランスフェクトされたＡＤＳＣの培養プレート中の２つの異なる細胞型の観察。右矢印−スパイク形状の突起を伴った小さな細胞集団。小さな細胞は、特別な整列した成長パターンを形成し、チャネル様の構造を作り始める。左矢印−特別な蜘蛛形状の形態を有するより大きな細胞。
【図８】大きな細胞の詳細な観察：ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２のドキシサイクリン制御誘導開始後１４日以内の、大きな細胞（＞５０μｍ）の典型的な蜘蛛様形態の出現。
【図９】ネットワーク：ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の誘導後３週間以内に、大きな蜘蛛形状の細胞がお互いに、及び小細胞と共にネットワークを形成し始める。
【図１０】小細胞におけるＤＡＰＩ及びＣＸ３０．２。小さなネットワーク形成細胞におけるＣＸ３０．２（ペースメーカ細胞系統の特異的マーカー）の発現。青色のＤＡＰＩ染色はＤＮＡを発光させ、核を示す。
【図１１】大きな細胞におけるＤＡＰＩ及びＣＸ３０．２。小さな蜘蛛形状の細胞及び大きな蜘蛛形状の細胞の両方におけるＣＸ３０．２の発現。
【図１２】小さな細胞及び大きな細胞の両者における、ＤＡＰＩ及びＨＣＮ４（ペースメーカ細胞系統の特異的マーカー）。
【図１３】ＲＮＡ発現レベル。誘導の開始から２週間後に、ペースメーカ誘導因子の異なる組み合わせでトランスフェクトされたＡＤＳＣにおける、心臓プルキンエ細胞の特異的マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル。
【図１４】ＲＮＡ発現レベルの続き。ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の誘導開始の２週間後の、ペースメーカ誘導因子の異なる組み合わせでトランスフェクトされたＡＤＳＣにおける心臓ペースメーカ細胞の特異的マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル。
【図１５】単一細胞電圧クランプ実験、奇異性電流制御細胞：ＡＤＳＣ（対照２）細胞から記録された代表的な奇異性電流（Ｉｆ）。このＩｆ電流は、−４０ｍＶの保持電位から１０ｍＶずつ増加させて、５００ｍＳの間、−１００ｍＶから−４０ｍＶまでの電圧ステップで誘起された。
【図１６】小さな細胞における奇異性電流：ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５、及びＨＣＮ２でトランスフェクトされた小サイズ画分（＜２０μｍ細胞サイズ）のＡＤＳＣから記録された代表的な奇異性電流（Ｉｆ）。Ｉｆ電流は、−４０ｍＶの保持電位から１０ｍＶずつ増加させて、５００ｍＳの間、−１００ｍＶから−４０ｍＶまでの電圧ステップで誘起された。
【図１７】大きな細胞における奇異性電流。ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５、ＨＣＮ２でトランスフェクトされたＡＤＳＣの大サイズの画分（＞５０μｍ細胞サイズ）から記録された代表的な奇異性電流（Ｉｆ）。このＩｆ電流は、−４０ｍＶの保持電位から１０ｍＶずつ増加させて、５００ｍＳの間、−１００ｍＶから−４０ｍＶまでの電圧ステップで誘起された。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、ペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞または洞房結節（ＳＡＮ）を作製する新規な方法；それによって作製されたペースメーカ細胞、プルキンエ細胞、及びＳＡＮ；並びに、例えばヒト患者のような患者の心臓における損傷したペースメーカ及びプルキンエ繊維を置換または補うために、これらを使用する方法を提供する。上記細胞は、直接またはカテーテルベースの注入によって、必要とされる場所に外科的に送達することができる。例えば、洞結節の修復については、損傷して機能が低下している洞結節に数千個の細胞をカテーテルベースで注入することで、効果的な修復を行うのに十分である。
【００６０】
頻脈性不整脈の修復については、不整脈基質における伝導の速度を加速し、それによって難治性心筋に適合するように循環刺激を加速することによって再導入経路を閉じ、再導入を中断させるために、梗塞の境界領域のような遅い伝導帯の中にプルキンエ細胞が注入される。
【００６１】
好ましくは、上記細胞は、患者由来の任意の利用可能な幹細胞供給源、例えば骨髄由来幹細胞、または脂肪由来もしくは血液、皮膚及び臍帯組織由来の幹細胞を使用して、自己細胞から作製される。
【００６２】
＜レンチウイルスベースの再プログラミング＞
心臓ペースメーカ細胞に分化するようにＡＤＳＣを誘導するために、レンチウイルスベクター系を適用することにより、上記ＡＤＳＣに、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５、ＴＢＸ３、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２を含む心臓ペースメーカ誘導因子の異なる組合せを逐次的にトランスフェクトする。レンチウイルスベクターは、例えばドキシサイクリンスイッチのようなスイッチの制御下にある。
【００６３】
心臓ペースメーカ誘導因子の発現は、上記細胞に対して２４時間間隔で連続的に適用されたレンチウイルスベクターにより達成された（図３）。細胞を、５％ウマ血清、２ｍＭのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸を添加したα−ＭＥＭ中で培養した。培養物を毎日４００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンで３日間処理し、次いで上記添加物を含むα−ＭＥＭ中で２週間維持した。トランスフェクション後の細胞の形態学的変化を調べるために、細胞の顕微鏡観察を毎日行った。ドキシサイクリン誘導の開始後１４日目に、種々の実験群からＲＮＡサンプルを採取した。
【表４】
2019506895.tif 000005
【００６４】
ヒトＡＤＳＣ（ｈＡＤＳＣ）は、ＩＮＧＥＥＲＯＮ（登録商標）（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手した。３０〜４０歳のドナーからの脂肪組織を、治験審査委員会によって承認された組織取得プロトコルの下でのインフォームド・コンセントで得た。このＡＤＳＣは、選択的脂肪形成術を受けているドナーから獲得した脂肪吸引物から調製した。以前に記載されたようにして、ｈＡＳＤＣを単離した。
【００６５】
簡単に言うと、脂肪組織を細かく切り、３９℃で３０分間、トランスポーズＲＴ［（ＴｒａｎｓｐｏｓｅＲＴ（商標））処理装置［ＩＮＧＥＮＥＲＯＮ（登録商標）］のリンゲル溶液中で脂肪組織１グラム当たり１単位濃度のマトラーゼ［Ｍａｔｒａｓｅ：ＩＮＧＥＮＥＲＯＮ（登録商標）］と共にインキュベートした。その後、処理した組織を１００μｍフィルターで濾過し、４５０ｇで１０分間遠心分離した。脂肪細胞及び破片を含む上清を捨て、ペレット化した細胞をハンクス平衡塩類溶液［ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）］で２回洗浄し、最後に増殖培地中に懸濁させた。このプロセスは、インゲネロン・トランスポーズＲＴ［ＩｎＧｅｎｅｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｅ  ＲＴ（商標）］システム［ＩＮＧＥＮＥＲＯＮ（登録商標）］の使用説明書により詳細に記載されている。増殖培地は、アルファ修飾のイーグル（Ｅａｇｌｅ）培地［ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）］、２０％ＦＢＳ［アトランタバイオロジカルズ（商標）］、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを伴う１００単位／ｍＬのペニシリン［ＣＥＬＬＧＲＯ（商標）］を含んでいた。
【００６６】
接着細胞はｈＡＤＳＣと称され、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中において３７℃にて培養フラスコ内で増殖させた後、毎日洗浄して赤血球及び非付着細胞を除去した。８０％コンフルエントに達したときに、トリプシン溶液０．２５％を適用して細胞を剥離し、新しい細胞培養フラスコ中に３０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。
【００６７】
ＡＤＳＣを心臓ペースメーカ細胞に分化させるために、レンチウイルスベクター系（表１）を用いて、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８及びＨＣＮ２を含む心臓ペースメーカ誘導因子の異なる組合せをＡＤＳＣにトランスフェクトした。本明細書で使用するレンチウイルスベクターは、パッキングベクターｐｓＰＡＸ２及びエンベロープベクターｐＭＤＳ２．Ｇ［ＡＤＤＧＥＮＥ（商標）］（Ｉｓｌａｓ、２０１２）を含んでいる。加えて、ドキシサイクリン制御トランスアクチベーター（ｒｔＴＡ２）を、上記系の転写誘導スイッチとして使用した。プラスミドＰＮＬ−ＴＲＥＰｉＴＴ−ＥＧＦＰデルタＵ３−ＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（図４）が、全ての単一遺伝子のためのバックボーンベクターとして用いられた。市販の細胞株２９３ＦＴを、ウイルスパッケージングに使用した。この２９３ＦＴ細胞株は、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換されたヒト胎児腎細胞に由来する、急速に増殖する高度にトランスフェクション可能なクローン単離物であり、サーモフィッシャーサイエンティフィック［ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）］から入手可能である。
【００６８】
手短に言うと、ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤｓ２．Ｇベクター、及びＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８、ＨＣＮ２を含む興味の対象である全ての単一遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、ウイルス粒子を産生させた。約８０％コンフルエントなＡＤＳＣの増殖状態への再プログラミングは、所定の実験群（表１参照）に従って、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ３、ＴＢＸ５、ＴＢＸ１８、ＨＣＮ２ベクターを含むウイルス粒子の異なる組み合わせでの感染によって達成された。４遺伝子及び５遺伝子の組み合わせもまた、良好な予備的結果を示す。
【００６９】
トランスフェクトされた細胞は、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウマ血清、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン酸を添加したα−ＭＥＭ［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）］により、大組織培養プレート中で培養された
【００７０】
ＰＣＲを用いたトランスフェクションの７２時間後に、各遺伝子構築物の安定な組込み及びｍＲＮＡ発現を確認した。
【００７１】
トランスフェクション後の細胞に起こる変化を調べるために、細胞の繊細な顕微鏡観察を毎日行った。ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の逐次的トランスフェクションの三つの組合せに属する代表的なデータを本明細書に示す。
【００７２】
ドキシサイクリン誘導処置後の第２週から出発して、異なる実験群からの遺伝子的にプログラミングされたペースメーカ細胞は、線維芽細胞様形態を変換するように開始して、幾つかの大きなスパイク形状の突起を有する特定のネットワーク形成細胞型を含む新しいコロニーを形成した。ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の逐次的トランスフェクションを図５、６に示す。
【００７３】
種々の実験群における分化期間中に、特定の大きな蜘蛛形状の細胞型及び長いスパイク状の突起を有する小さな紡錘形細胞を含む、２つの異なるタイプの細胞が徐々に出現した。図７，８は、ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２三つの逐次的連続トランスフェクションにおける２つの細胞型の外観を示す。その後、紡錘体形状及び蜘蛛形状の両方の細胞集団は互いに、高度に相互接続されたネットワークを形成し始めた（図９）。加えて、小さなスパイク形状の細胞は、特定の高度に整列した成長パターンを形成し始めた（心臓の自然伝導系におけるプルキンエ細胞ネットワークに対応する可能性が高い、図７における直線状の溝形成を参照されたい）。
【００７４】
胎児ＳＡＮからのペースメーカ細胞の単離に関する以前の研究結果によれば、蜘蛛形状の形態は、ペースメーカ細胞の典型的な形態として定義されている。従って、我々の秩序だったトランスフェクション実験は、ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の三つの逐次的トランスフェクションが、天然のペースメーカ細胞に非常によく似た形態を有する細胞を作ったことを示した。
【００７５】
本明細書には示されていないが、ペースメーカ誘導因子の種々の組み合わせでトランスフェクトされたＡＤＳＣの異なる群において、同様の観察がなされた。しかし、個々のＳＨＯＸ２及びＨＣＮ２、またはこれらの二つの組み合わせでトランスフェクトされた群と比較して、ＴＢＸ転写因子（特にＴＢＸ５）でトランスフェクトされたＡＤＳＣ群では、心臓伝導細胞の典型的な形態に向けたより強固な形態学的変化が観察された。ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の３種の組み合わせでトランスフェクトされたＡＤＳＣ群において最も強固な形態学的変化が観察されたので、これらの結果を本明細書の一部に示す。ｑＰＣＲアッセイによる心臓伝導系の分子マーカーの発現においてもまた、同様の結果が観察された（図１３，１４）。
【００７６】
心臓伝導系開発の主な分子レギュレーターを同定することに関する以前のインビボ研究の結果は、Ｔ−ボックスタンパク質を、心臓伝導系形態形成のための、並びに心臓伝導性細胞の電気生理学的機能性に寄与するイオンチャネルタンパク質をコードする遺伝子のアップレギュレーションのための必須因子として同定した。
【００７７】
Ｈｏｏｇａａｒｓら（２００７）は、ＴＢＸ３が洞房結節遺伝子プログラムを制御し、心房にペースメーカ機能を課すことを示した。他の研究の結果は、ＴＢＸ５が、心臓伝導細胞の成熟及び機能に必要な発生ネットワークを制御する重要な転写因子であることを示している。
【００７８】
ゲノムワイドアソシエート研究（ＧＷＡＳ）の結果は、ＴＢＸ５及びイオンチャネルを含むヒト心臓伝導系の発生プロセスに関連する多数の遺伝子座を同定した。イオンチャネルの発現は、系の電気生理学的機能にとって重要である。Ａｒｎｏｌｄら（２０１２）は、ＴＢＸ５の欠損が、急速伝導の喪失、不整脈及び突然死を含む心臓伝導系において重度の機能不全を生じることを見出した。
【００７９】
更に、ゲノムワイドアソシエート研究（ＧＷＡＳ）の結果に基づいて、ＴＢＸ５及びＳＣＮ５Ａ（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ１４５２４）（別名ＮＡＶ１．５、高速伝導系の重要なメディエータ）との間の分子リンクが同定された。この研究の結果は、ＳＣＮ５Ａの下流にあるＴＢＸ５応答性エンハンサーを同定したが、これは心室伝導系の系統明細にとって十分である（Ａｒｎｏｌｄｓ，２０１２）。
【００８０】
より小さい細胞は、紡錘状の形態及び長い細胞突起によって決定されるように、プルキンエ細胞に対応している：トランスフェクションの２週間後、これらの小さな紡錘状細胞は、個々の細胞の相互の密着結合による多細胞鎖及びネットワークの形成を含めて、特に高度に整列した成長パターンを示した。これらの細胞は、単細胞パッチ凝集アッセイにおいて、中程度のレベルの奇異性電流を示した。種々の心臓細胞型の単離及び特徴付けに関する以前のインビボ研究の結果によれば、この特定の鎖及びネットワーク形成成長パターンは、プルキンエ細胞の典型的な特徴として定義されている。同様の形態学的性質が、ＥＳＣにおけるＴＢＸ３の過剰発現による心臓結節細胞のインビトロ産生についての以前の試みにおいて報告された。加えて、我々の知見と一致して、種々のタイプの心臓伝導性細胞の特徴付けに関する以前の研究の結果もまた、ペースメーカ細胞と比較して、心臓プルキンエ細胞におけるより低レベルの電気生理学的活性を明らかにした。
【００８１】
２つの細胞型が連合して相互接続されたネットワークが形成され、ここでは１つのペースメーカ細胞が囲まれ、幾つかのプルキンエ細胞に接続されてネットワークを形成する。このプルキンエ細胞は、ペースメーカ細胞によって誘導された最初の自発的脱分極の増幅器、及び伝導体として作用する目的を有する。これらの相互接続されたネットワークの形成は、細胞の電気生理学的機能に必須のＣＸ３０．２及びＨＣＮ４を含む、心臓導電性細胞の特異的膜接合及びイオンチャネルの発現と密接に関連している。過分極活性化型環状ヌクレオチド感受性ナトリウムチャネルのメンバーであるＨＣＮ４は、特定のペースメーカ電流Ｉｆのために必要とされる。ＣＸ３０．２は、細胞−細胞接合部、及び自発的に脱分極する心筋細胞間のネットワーク形成を担当する。
【００８２】
＜ＲＮＡに基づく再プログラミング＞
プログラミングされたペースメーカ非収縮性心筋細胞を誘導する別の成功した方法は、ｍＲＮＡベースのトランスフェクション法を使用している。この方法論は、全ての異なる誘導因子については未だ完全には完了していないが、我々の現在の結果は、その方法が同等に実行可能で効果的であることを示唆している。
【００８３】
簡単に言えば、特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、コーディングＤＮＡの配列を増幅させる。次いで、このＰＣＲ産物を精製し、生成したＤＮＡの品質を決定する。インビトロ転写（ＩＶＴ）プロセスを使用して、上記ＤＮＡ産物からｍＲＮＡを生成させる。続いて、この生成物を精製し、ホスファターゼで処理して５’−三リン酸を除去する。生成したｍＲＮＡの更なる精製及び品質管理の後、トランスフェクション実験が行われる。
【００８４】
ＩＶＴのＤＮＡ鋳型を得るために、ＰＣＲを用いて、全てのＴＢＸ１８、ＴＢＸ３及びＨＣＮ２プラスミドを増幅する。それにより、１２０個のチミジン（Ｔ）のポリＴテールが、Ｔ１２０伸長部を有する逆方向プライマーを使用することによって挿入物に加えられる。こうして、ＩＶＴの後、生成したｍＲＮＡは、規定された長さを有するポリＡテールを得る。１００μＬのＰＣＲ反応が、ＨＯＴＳＴＡＲ（商標）ＨＩＦＩＤＥＬＩＴＹ・ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ・ＫＩＴ［ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、ドイツ］を使用し、また０．７μＭの各順方向及び逆方向プライマー、１×Ｑ溶液、１×ＨＯＳＴＡＲ（商標）ＨＩＦＩＤＥＬＩＴＹ・ＰＣＲ緩衝液、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、２．５ＵのＨＯＴＳＴＡＲ（商標）ＨＩＦＩＤＥＬＩＴＹ・ＤＮＡポリメラーゼを含めて行われるであろう。
【００８５】
増幅は、例えば以下の循環プロトコルを用いて実施される：即ち、９５℃で５分間の初期活性化ステップ、続いて９５℃で４５秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長、最後に７２℃で１０分間の伸長を２５サイクルである。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（商標）ＰＣＲ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ［ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、ドイツ］を用いて製造業者の指示に従って精製し、２０μＬのヌクレアーゼフリーの水を用いてＤＮＡを溶出する。ＤＮＡの品質及び純度は、１％アガロースゲル電気泳動によって評価することができる。
【００８６】
ＰＣＲの後、遺伝子情報は、例えば、ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｔ７キット［ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）、ドイツ］を用いて、インビトロでＤＮＡからｍＲＮＡに転写される。次いで、このｍＲＮＡ転写物を使用して、細胞内でのタンパク質発現が誘導されるであろう。最初に、７．５ｍＭのＡＴＰ、１．８７５ｍＭのＧＴＰ［両者ともＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｔ７キットから］、７．５ｍＭのＭｅ−ＣＴＰ、７．５ｍＭの擬−ＵＴＰ（両者ともＴＲＩＬＩＮＫ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＴＭ、ＣＡから）、及び２．５ｍＭの３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧのＲＮＡキャップ構造アナログ［ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）、ドイツ］を含有する、２３μＬのＮＴＰ／キャップ構造類似体混合物を調製し、完全に混合する。
【００８７】
次いで、４０μＬのこのＩＶＴ反応混合物は、４０ＵのＲＩＢＯＬＯＣＫ（商標）ＲＮａｓｅ阻害剤（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１μｇのＰＣＲ産物、１×反応緩衝液及び１×Ｔ７・ＲＮＡポリメラーゼ酵素混合物を加えることによって組立てられるであろう。このＩＶＴ反応混合物は、サーモミキサーにおいて３７℃で３時間インキュベートされるであろう。鋳型ＤＮＡを除去するために、１μＬのＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ［ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｔ７キットから］をＩＶＴ反応混合物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、この反応混合物をＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉ・Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、製造業者の指示に従って精製する。この改変されたｍＲＮＡは、４０μＬのヌクレアーゼフリーの水で２回スピンカラム膜から溶出されるであろう。
【００８８】
生成されたｍＲＮＡは、ＲＩＧ−１によって認識されて免疫活性化を導き得る５’三リン酸を除去するために、アンタルクチックホスファターゼ［Ａｎｔａｒｃｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）］で処理されるであろう。更に、このホスファターゼ処理は、自己ライゲーション反応における再環化を防止する。この目的のために、９μＬの１０×アンタルクチックホスファターゼ反応緩衝液を、７９μＬの精製ｍＲＮＡ溶液に添加する。続いて、２μＬのアンタルクチックホスファターゼ（５Ｕ／μＬ）を反応混合物に添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。
【００８９】
この処理されたｍＲＮＡは、例えばＲＮｅａｓｙ・Ｍｉｎｉ・Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の指示に従って使用して、精製することができる。この改変されたｍＲＮＡは、５０μＬのヌクレアーゼフリーの水で２回スピンカラム膜から溶出されるであろう。濃度は、ＳＣＡＮＤＲＯＰ分光光度計（ＡＮＡＬＹＴＩＣ  ＪＥＮＡ、ドイツ）を用いて測定されるであろう。ｍＲＮＡの濃度は、ヌクレアーゼフリーの水を加えることによって１００ｎｇ／μＬに調整されるであろう。合成された修飾ｍＲＮＡの品質及び純度は、１％アガロースゲル電気泳動によって決定されるであろう。修飾されたｍＲＮＡはアリコートに分けられ、−８０℃で保存され、トランスフェクションに使用されるであろう。
【００９０】
ＡＤＳＣは、１０％ＦＢＳ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡラボラトリーズ、オーストリア）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＡ  ＬＡＢ．）を添加したα−ＭＥＭ培地で培養されるであろう。細胞は、５％ＣＯ２で３７℃に保たれ、また培地は３日毎に交換されるであろう。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ［０．０４％／０．０３％、ＰＲＯＭＯＣＥＬＬ（商標）、ドイツ］を用いて継代されるであろう。トランスフェクション実験を実施するために、２４ウェルプレートのウェル当たり１．５×１０５個の細胞がプレーティングされるであろう。この細胞は、細胞インキュベーター中において３７℃で一晩インキュベートされるであろう。翌日、トランスフェクション実験を行うことができる。
【００９１】
本発明の異なるｍＲＮＡでのＡＤＳＣのトランスフェクションは、ＬＩＰＯＦＥＣＴ  ＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨ（登録商標））を用いて行う。リポプレックスの形成に必要なＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００の必要量を決定するために、１、２、４、６μＬの異なる量のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００を使用して細胞をトランスフェクションした。２４ウェルプレートの１つのウェルのトランスフェクションのために、２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ・Ｉ還元血清培地を、製造業者の指示に従って、２．５μｇの興味ある各ｍＲＮＡ及びそれぞれの量のリポフェクタミン［Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００］を含有するように調製した。
【００９２】
ピペット操作により成分を穏やかに混合する。次いで、トランスフェクション混合物を室温で２０分間インキュベートして、トランスフェクションのためのリポプレックスを生成させる。細胞を２５０μＬのＤＰＢＳ／ウェルで洗浄し、トランスフェクション混合物をウェルにピペットで加える。３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を１ｍＬの完全細胞培地で置き換える。細胞を細胞インキュベーター中で２４時間培養し、フローサイトメトリーを用いて分析する。
【００９３】
タンパク質発現誘導のためのｍＲＮＡの必要量を決定するために、最初に、異なる量の各ｅＧＦＰ−ｍＲＮＡ（０、０．５、１、１．５、２、２．５μｇ）を用いて細胞のトランスフェクションを行う。２４ウェルプレートの１ウェルのトランスフェクションのために、２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ還元血清培地は、それぞれの量のｍＲＮＡ及び１μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００を用いて調製されるであろう。
【００９４】
上記成分を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートする。細胞を５００μＬのＤＰＢＳ／ウェルで洗浄し、上記トランスフェクション混合物を添加する。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。その後、トランスフェクション混合物を吸引し、１ｍＬの完全細胞培養培地を上記細胞に添加する。細胞をインキュベーター内で２４時間インキュベートする。
【００９５】
フローサイトメトリーを用いて、細胞におけるｅＧＦＰ発現を確認する。ｅＧＦＰによるタンパク質発現の誘導に必要なｍＲＮＡの量を決定した後、同じ濃度を、本発明によるそれぞれのｍＲＮＡに適用する。
【００９６】
＜免疫組織化学＞
誘導されたペースメーカ細胞の更なる特徴付けのために、ＣＸ３０．２及びＨＣＮ４を含む心臓ペースメーカ細胞系統の主要なマーカー遺伝子に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）的染色を、ドキシサイクリンにトリガーされた誘導開始の２週間後に行った。
【００９７】
ＩＨＣ染色を、ＣＸ３０．２及びＨＣＮ４を含む、非収縮性心筋細胞のそれぞれ２つの主要なマーカー遺伝子について実施した。ＳＨＯＸ２＞ＴＢＸ５＞ＨＣＮ２の三つ組で逐次的に形質転換された細胞におけるＩＨＣ染色の結果は、紡錘体状及び蜘蛛状の細胞集団の両方において、ＣＸ３０．２及びＨＣＮ４の発現を明らかにした（図１０、１１、１２）。ＨＣＮ４は、Ｉｆ、即ち特定のペースメーカ電流について必要とされる過分極活性化型環状ヌクレオチド感受性ナトリウムチャネルのメンバーである。ＣＸ３０．２は、細胞−細胞接合、及びそれぞれの非収縮性心筋細胞間のネットワーク形成を担当する。
【００９８】
同様の免疫表現型が、ペースメーカ誘導因子の他の組み合わせをトランスフェクトされたＡＤＳＣの異なる群においても観察された。しかし、ＳＨＯＸ２及びＨＣＮ２で個別にまたは二つの組み合わせでトランスフェクトされた群と比較して、ＴＢＸ転写因子（特にＴＢＸ５）をトランスフェクトされたＡＤＳＣ群では、トランスフェクトされたＡＤＳＣの形態学的特性及び免疫表現型において、自発的に脱分極する非収縮性心筋細胞へと向かう、より強固な変化が観察された。トランスフェクトされたＡＤＳＣの、洞房結節細胞への形態学的性質及び免疫表現型における最も強固な変化は、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の三つの組み合わせによって観察された。ＴＢＸ３及びＴＢＸ１８は、ＴＢＸ５に加えて、またはＴＢＸ５の代わりに使用することも可能であり、またＨＣＮ４はＨＣＮ２に加えて、またはＨＣＮ２の代わりに使用することができる。
【００９９】
＜主要遺伝子の発現レベル＞
ペースメーカ及びプルキンエ細胞を含む種々のタイプの心臓伝導細胞系統に向けたＡＤＳＣの分化に対する、心臓ペースメーカ誘導因子の種々の組み合わせの効果を評価するために、両方の細胞系統の特異的マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを分析した。
【０１００】
この目的のために、ＨＣＮ１、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４、ＳＣＮ３Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＹ７２）、ＣＸ３０．２（適切にはＧＪＣ３、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ８ＮＦＫ１としても知られる）を含む心臓ペースメーカ細胞の下流後期マーカーのパネル、並びにＩＲＸ３（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ７８４１５）、ＩＲＸ５（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ７８４１１）、ＳＥＭＡ３Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ６ＰＩ５１）、ＳＣＮＩ０Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９Ｙ５Ｙ９）、ＳＨＨ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ１５４６５）を含むプルキンエ細胞の特異的マーカー遺伝子のパネルについてのｍＲＮＡ発現が、混合細胞型集団にｑＰＣＲ分析を適用して決定された（例えば、細胞は最初にペースメーカ細胞及びプルキンエ細胞に分離されなかったが、この実験は計画されている）。
【０１０１】
簡単に言えば、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮＥＡＳＹ（商標）キットを使用して総ＲＮＡを単離し、スーパースクリプトＩＩＩ［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）］を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ・Ｇｒｅｅｎ［ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）］を検出器として用い、ＡＢＩプリズム７０００システム検出配列（ＳＤＳ）及びソフトウェア［ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標）］を用いて行った。
【０１０２】
心臓ペースメーカマーカー（表３及び図１２）及びプルキンエ細胞（表２及び図１３）の特異的マーカー遺伝子のパネルについて、ｍＲＮＡ発現レベルを分析した。ｑＰＣＲ分析の結果に基づいて、心臓プルキンエ細胞のマーカー遺伝子の発現は、ペースメーカ誘導因子の異なる組み合わせをトランスフェクトされた全ての異なる実験群において観察することができる。しかし、ＨＣＮ１、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４、ＳＣＮ３Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ９ＮＹ７２）、ＣＸ３０．２（ＧＪＣ３、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ８ＮＦＫ１）を含む下流心臓ペースメーカマーカー遺伝子のアップレギュレーションに対して、心臓誘導因子の様々な組み合わせが種々の役割を果たす。
【０１０３】
例えば、ＨＣＮ３Ｂ、ＨＣＮ３及びＣＸ３０．２の最も高いｍＲＮＡ発現レベルは、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の３種の組み合わせをトランスフェクトされたＡＤＳＣにおいて観察されたが、ＨＣＮ１のｍＲＮＡ発現はＴＢＸ１８のアップレギュレーションとより相関していた。この研究の結果によれば、ＨＣＮ４のｍＲＮＡ発現は、ＳＨＯＸ２のアップレギュレーションと高度に相関している。加えて、ＨＣＮ４の中程度の発現レベルが、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の３つの組み合わせでトランスフェクトされたＡＤＳＣにおいて観察された。全て総合すると、ｑＰＣＲの結果に基づけば、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の三つの組合せによるＡＤＳＣのトランスフェクションは、心臓伝導性細胞の異なるマーカー遺伝子の最も一貫したアップレギュレーションを導く。トランスフェクトされたＡＤＳＣの遺伝子発現パターンにおいて自発的に脱分極する非収縮性心筋細胞への最も強固な変化が、ＳＨＯＸ２及びＨＣＮ２で個別に、またはそれらの二つの組み合わせでトランスフェクトされた群に比較して、ＴＢＸ転写因子（特にＴＢＸ５）をトランスフェクトされたＡＤＳＣ群において観察されたと結論することができる。トランスフェクトされたＡＤＳＣの遺伝子発現パターンにおいて、自発的に脱分極する非収縮性心筋細胞に向けた最も強固で一貫した変化は、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の三つの組み合わせによって観察された。
【０１０４】
一般に、ＳＨＯＸ２、ＴＢＸ５及びＨＣＮ２の三つの組み合わせは、プルキンエ細胞及びペースメーカ細胞を含む心臓伝導系の両方の細胞タイプの生成のために、効果的に適用できると結論することができる。
【表５】
2019506895.tif 000006
【表６】
2019506895.tif 000007
【０１０５】
＜パッチクランプアッセイ＞
遺伝的にプログラミングされたペースメーカ細胞の機能性を更に検証するために、我々は単一細胞パッチクランプ実験を行って、細胞により生成された電流を測定した（Ｗｈｉｔｅ、２００５）。
【０１０６】
全細胞電圧クランプ実験は、標準的なパッチクランプ法を用いて行った。記録電極は、フラミング−ブラウン（Ｆｌａｍｉｎｇ−Ｂｒｏｗｎ）微小電極プラー［Ｐ−９７、ＳＵＴＴＥＲ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（商標）、ＣＡ］を使用して、１．５ｍｍの薄壁ホウケイ酸ガラス［Ｎｏ．７０５２、ＧＡＲＮＥＲ  ＧＬＡＳＳ（商標）、ＣＡ］から作製し、使用前に熱研磨した。ピペットの各々は、内部溶液で満たされたとき２〜５ＭΩの先端抵抗を有する。記録は、アクソクランプ（Ａｘｏｃｌａｍｐ）２Ｂパッチクランプ増幅器［ＡＸＯＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（商標）；ＣＡ］を用いて行った。データを２ｋＨｚでフィルターにかけ、クランペックス（Ｃｌａｍｐｅｘ）８ソフトウェア［ＡＸＯＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（商標）］を用いてデータを取得した。
【０１０７】
パッチピペットをホウケイ酸ガラスから引き上げ、熱研磨した。それらは、細胞間溶液で満たされたときには２〜５ＭΩの抵抗を有した。
【０１０８】
電流クランプ記録のために、細胞間溶液は、１０ｍＭのＮａＣｌ、１３０ｍＭのアスパラギン酸カリウム、０．０４ｍＭのＣａＣｌ２、３ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有していた。ｐＨを、ＫＯＨで７．２に調整した。細胞外（浴）溶液は、ｐＨ７．４において、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、及び５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有していた。
【０１０９】
奇異性電流（Ｉｆ）密度は、４０ｍＶの保持電位から１０ｍＶ刻みで、５００ｍＳの間、−１００ｍＶ〜４０ｍＶの電圧ステップで測定された。心臓ペースメーカ細胞の重要な特性が、内向きの奇異性電流（Ｉｆ）の発現だからである。この研究の結果によれば、小さな紡錘形細胞集団及び大きな蜘蛛形状の細胞集団の両方が、ＨＣＮチャネルサブタイプの典型的な電流である強固なＩｆ電流を示した（図１５、１６、１７）。
【０１１０】
本発明は、レンチウイルスベクターに関して例示される。しかし、これは単なる例示に過ぎず、本発明は、ＡＤＳＣのような幹細胞において必要な遺伝子を活性化するための任意の手段を含むように、広く適用することができる。以下の実施例は例示のみを意図しており、添付の特許請求の範囲を過度に制限するものではない。
【０１１１】
以下の参考文献は、全ての目的で、その全体が組み込まれる。
【０１１２】
Ａｒｎｏｌｄｓ，  Ｄ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＢＸ５  ｄｒｉｖｅｓ  ＳＳＮ５Ａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２０１２．  １２２（７）：  ｐ．２５０９−１８．
【０１１３】
Ａｖｃｉ−Ａｄａｌｉ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｇ，  ２０１４．  ８（１）：  ｐ．８．
【０１１４】
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【０１１７】
Ｄｉｅｇｏ  Ｓ．  Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ，  Ｄ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＣＥＬＬ  ２０１５．  １６１（３）：  ６７４−６９０．
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Ｈａｓｈｅｍ，  Ｓ．Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＨＯＸ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，  ２０１３．  ２２（２１）：  ｐ．２９１５−２６．
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【０１２１】
Ｈｏｏｇａａｒｓ，  Ｗ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＢＸ３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  ｉｍｐｏｓｅｓ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｔｒｉａ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  ２００７．  ２１（９）：  ｐ．１０９８−１１２．
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Ｈｕ，  Ｙ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈｅａｒｔ  ｂｌｏｃｋ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  ２０１４．  ６（２４５）：  ｐ．２４５ｒａ９４．
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Ｉｓｌａｓ，  Ｊ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＥＴＳ２  ａｎｄ  ＭＥＳＰ１  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ，  ２０１２．  １０９（３２）：  ｐ．１３０１６−２１．
【０１２４】
Ｊｕｎｇ，  Ｊ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｎｕｓ−ｎｏｄａｌ  ｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ２０１４．  ２（５）：  ｐ．５９２−６０５．
【０１２５】
Ｋａｐｏｏｒ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＢＸ１８．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１３．  ３１（１）：  ｐ．５４−６２．
【０１２６】
Ｓｔａｎｋｏｖｉｃｏｖａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅａｒｔ．  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  ２００３．  ２２（３）：  ｐ．３２９−４０．
【０１２７】
Ｗｈｉｔｅ，  Ｓ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｗ．Ｃ．  Ｃｌａｙｃｏｍｂ，  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｍ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｚｅｄ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ２００５．  ２８８（２）：  ｐ．Ｈ６７０−９．
【０１２８】
本明細書での全てのＵｎｉＰｒｏｔ引用は、それにリンクされた配列を含めて、それらの全体を、全ての目的で本明細書に参照により組み込まれる。
【図１Ａ】
2019506895.tif 000008
【図１Ｂ】
2019506895.tif 000009
【図２】
2019506895.tif 000010
【図３】
2019506895.tif 000011
【図４】
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【図５】
2019506895.tif 000013
【図６】
2019506895.tif 000014
【図７】
2019506895.tif 000015
【図８】
2019506895.tif 000016
【図９】
2019506895.tif 000017
【図１０】
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【図１１】
2019506895.tif 000019
【図１２】
2019506895.tif 000020
【図１３】
2019506895.tif 000021
【図１４】
2019506895.tif 000022
【図１５】
2019506895.tif 000023
【図１６】
2019506895.tif 000024
【図１７】
2019506895.tif 000025
【配列表】
2019506895000001.app
【国際調査報告】
2019506895.tif 000026
2019506895.tif 000027
2019506895.tif 000028