(57)【要約】標本から得られた細胞の３Ｄ再構成画像を解析することによって、異形成を自動的に検出し、モニターし、及び処置するための方法は、痰標本からの細胞を正常又は異常として分類する生体標本分類器を含む。異常細胞が検出された場合、異常細胞は前癌又は癌として更に分類される。前癌細胞は、腺にできる又は扁平上皮にできるもの（異形成細胞）として更に下位分類される。この情報は、患者治療を規定するために使用されることになるため、細胞が異形成として分類された場合、治療量を達成するために所定の期間にわたって被験者にイロプロストのような癌化学予防薬剤を投与され、悪性細胞だけが見出された場合又は悪性細胞及び前癌細胞が見出された場合、次のステップは、生検及び手術並びに場合によっては癌化学予防薬剤の使用に対する患者のトリアージを含むことになる。【選択図】図１
2019506602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得られた痰標本から得られた疑似投影図に基づく細胞の３Ｄ画像を解析することによって、前癌細胞状態を自動的に検出しモニターするための方法であって、
前記痰標本からの細胞を正常又は異常として識別するために生体標本分類器を動作させることと、
識別された異常細胞を前癌又は癌として更に分類することと、
前癌細胞を、腺にできる前癌細胞、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、又は高度異形成として更に分類することと、
前記細胞が癌として分類されると、疑わしい病変を検証するために生検を実施することと、
癌が見出されると、前記癌病変を取除くために外科手技を施行することと、
前記細胞が腺にできる前癌細胞として分類されると、所定の期間にわたって、前記被験者に癌化学予防薬剤を投与することと、
細胞が軽度、中等度、又は高度異形成として分類されると、所定の期間にわたって、前記被験者に癌化学予防薬剤を投与することと、
前癌細胞と癌細胞の両方が発見されると、任意の疑わしい病変の癌状態を検証することと、
癌が見出されると、前記癌病変を取除くために外科手技を施行することと、
所定の期間にわたって、前記被験者に癌化学予防薬剤を投与することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びその組合せからなる群から選択される薬物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
所定の期間にわたって、前記被験者に前記癌化学予防薬剤を投与することと、
その後、前記被験者から２回目の痰標本を得ることと、
細胞を正常又は異常として識別するために前記生体標本分類器の動作を繰返すことと、
異常細胞が検出されると、前記異常細胞を、腺にできる癌細胞、腺にできる前癌細胞、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、高度異形成、又は癌として更に分類することと、
前記繰返された動作の複数の分類結果を直前の動作からの分類結果と比較することであって、それにより、前記癌化学予防薬剤の有効性を判定することと、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験者から得られた痰標本から得られた細胞の３Ｄ画像からの特徴データを解析することによって、異形成を自動的に検出しモニターするための光トモグラフィーシステムであって、
前記特徴データを受信し、試料適正値を発生するために結合された試料適正分類器と、
前記特徴データを受信し、正常細胞及び異常細胞を検出するために結合された正常／異常細胞分類器と、
前記異常細胞についてのデータを受信し、前記異常細胞を癌細胞及び前癌細胞に更に分類するために、前記正常／異常細胞分類器に結合された異常細胞分類器と、
前癌細胞データを受信し、各前癌細胞を、腺にできる前癌細胞又は異形成として分類するために、前記異常細胞分類器に結合された前癌細胞分類器と、
異形成細胞データを受信し、異形成細胞を、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、又は高度異形成として更に分類するために、前癌細胞分類器に結合された異形成細胞分類器と、
前記異常細胞分類器、前記前癌細胞分類器、及び前記異形成細胞分類器から分類データを受信し、癌細胞、前癌細胞、又は異形成細胞の検出によって示される場合、応答して、所定の期間にわたって前記被験者に癌化学予防薬剤を投与するプロトコルを生成するように適合される処置プロトコル発生器と、
を備える、システム。
【請求項５】
前記癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びその組合せからなる群から選択される薬物を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
被験者から得えられた痰試料から得られた細胞の３Ｄ画像を解析することによって、異形成を自動的に検出しモニターするための方法であって、
前記痰試料内に含まれる細胞について３Ｄ撮像データを提供することと、
前記痰試料について試料適正判定を提供することと、
前記試料適正判定が所定の基準を満した場合、正常／異常の判定を生成するために、正常／異常分類器を動作させることと、
前記判定が異常であった場合、前記細胞を、癌、腺にできる前癌、又は異形成として更に識別することと、
前記細胞が癌として分類された場合、前記細胞が扁平上皮癌又は腺癌であるかどうかを判定することと、
前記細胞が異形成であった場合、所定の期間にわたって前記被験者に癌化学予防薬剤を投与することと、
を含む、方法。
【請求項７】
前記癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びその組合せからなる群から選択される薬物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記異形成細胞を軽度又は中等度〜高度異形成として分類することを更に含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
痰試料から得られた細胞の３Ｄ画像を解析することによって、異形成を自動的に検出しモニターするための方法であって、
前記痰試料内に含まれる細胞について３Ｄ撮像データを提供することと、
前記痰試料について試料適正判定を提供することと、
前記試料適正判定が所定の基準を満たした場合、前記細胞データを、正常及び化生状態、腺にできる前癌細胞、軽度〜中等度異形成若しくは高度異形成、又は、ＣＩＳ及び／又は癌として識別することと、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記細胞データが正常及び化生状態を示した場合、後で、１２〜２４カ月以内に、後続の光トモグラフィー痰試験をスケジュールすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞データが軽度〜中等度異形成を示した場合、後で、６カ月以内に、後続の光トモグラフィー痰試験をスケジュールすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞データが高度異形成を示した場合、後で、３カ月以内に、後続の光トモグラフィー痰試験をスケジュールすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞データが腺にできる前癌状態を示した場合、後で、３カ月以内に、後続の光トモグラフィー痰試験をスケジュールすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記高度異形成の確認が必要とされ、その後、化学予防治療が行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
高度異形成がＣＩＳ及び／又は癌を示した後、６カ月以内にＣＴスキャン及び気管支鏡検査等のフォローアップ診断試験をスケジュールすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が異形成であった場合、所定の期間にわたって前記被験者に癌化学予防薬剤を投与することを更に含む、請求項９、１２、又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びその組合せからなる群から選択される薬物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験者から得られた痰標本から得られた細胞の３Ｄ画像を解析することによって、異形成を自動的に検出し、モニターし、及び処置するための方法であって、前記痰標本からの細胞を正常又は異常として識別するために生体標本分類器を使用することと、異常細胞が検出された場合、前記異常細胞を異形成又は癌として更に分類することと、前記細胞が異形成として分類された場合、治療量を達成するために設計された所定の期間にわたって前記被験者に癌化学予防薬剤を投与することとを含む、方法。
【請求項１９】
腺にできる前癌細胞は、肺胞上皮（２型）、円柱細胞−異型、杯細胞−異型、及び多形錯角化を含む細胞型から選択される、請求項１、３、４、６、９、１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びその組合せからなる群から選択される薬物を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び亜細胞スケールの光トモグラフィーに関する。より詳細には、本発明は、異形成細胞を検出するのに適合された光トモグラフィーシステムによって解析される試料において異形成を判定し、その結果、異形成を低減し、肺癌のリスクを下げるために被験者に癌化学予防薬剤を投与するためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、米国において２番目に流行している癌であり、最も致死率が高い。米国（ＵＳ）において３１００万人を超える患者が、主に、年齢、喫煙歴、ラドン曝露を含む汚染及び他の因子、肺癌の家族歴等に起因して、肺癌の発症の高いリスクにある。毎年約１６００００人の米国人患者が、肺癌で死亡している。執筆時点で、肺癌は、早期段階、主に、ステージＩ及びＩＩで検出された場合にのみ、手術によって治癒させることができる。しかし、肺癌は、その前段階として異形成細胞として現れる前癌状態があることが知られている。こうした前癌状態の検出は、肺癌にかかるリスクを低減することができる予防的処置のきっかけとなる可能性がある。
【０００３】
肺癌に対する闘いの１つの大きな進歩において、２０１４年１月７日に発行されたKeith他に対する「Uses of Prostacyclin Analogs」という名称の米国特許第８，６２３，９１７号が、人間の喫煙経験者において肺癌を発症するリスクを低減する方法を開示している。米国特許第８，６２３，９１７号（Keith特許）は、引用することにより本明細書の一部をなす。Keith特許に教示される方法は、喫煙経験者に対して治療上効果的な量のイロプロストを含むプロスタサイクリン類似体を投与することを含み、それにより、喫煙経験者において肺癌を発症するリスクが、同様のリスク因子を有する対照群に比べて少なくとも１０％だけ減少する。この発明の別の態様は、被験者において前悪性異形成を発症するリスクを低減する方法を提供している。Keith発明は、肺癌予防の領域において重要な開発技術であるが、この治療方法を実施することはかなり困難である。
【０００４】
Keith特許に教示される処置コースを実施することに対する１つの重大な障害は、イロプロスト等の化学予防薬の投与から最も利益を受けると思われる、異形成を有する被験者を識別することである。肺異形成を有する患者は、高まった肺癌のリスクを有する場合があるが、一般に、症状がなく、自分の状態を知らない。現在、患者において異形成を識別する最も信頼性のある技法である気管支鏡検査は、麻酔又は鎮静剤を必要とする。肺の気管支鏡検査は、通常、両肺からの幾つかの生検、すなわち、病理解析が後に続く侵襲的手技を含む。結果として、現在まで、イロプロスト処置から利益を得ることがわかった患者の集団（class）は、喫煙経験者に限定される。その理由は、集団として、喫煙経験者は肺癌の高いリスクにあり、異形成について更に試験しなくても、処置が、集団としての喫煙経験者に利益を与えることが示されているからである。しかし、化学予防薬は、異形成についての診断試験がなければ処方されない。
【０００５】
さらに、或る特定の非喫煙者も、ラドンガス、炭塵、化学物質、及び他の原因物（知られているもの及び知られていないものの両方）に対する曝露等の因子に起因して、許容できないほど高い肺癌の罹患率を有する場合がある。そして、異形成を示さない喫煙経験者は、薬物による処置から全く利益を受けていない場合がある。したがって、異形成細胞を確実に検出する無侵襲試験が、喫煙者であるのか、喫煙経験者であるのか、又は非喫煙者であるのかにかかわらず、肺癌を発症するリスクにある被験者を識別するために、緊急に必要とされている。
【０００６】
別の調査は、肺の化生又は異形成を有する患者の肺癌をカルシトリオールが防止できるかどうかを判定するための、２０１６年４月の時点で継続中の臨床試験である。この臨床試験の目的は、肺癌の高いリスクにある現喫煙者及び喫煙経験者において肺癌を防止することにおけるカルシトリオールの副作用及び最良用量を調査することである。その調査は、国立癌研究所（ＮＣＩ：National Cancer Institute）と連携してロズウェルパーク癌研究所（Roswell Park Cancer Institute）によって行われている。その調査の主要な目的は、肺癌の高いリスクにある患者においてカルシトリオールの安全性を確立し、これらの患者においてカルシトリオールの用量制限毒性を決定することである。
【０００７】
関連する開発技術において、光トモグラフィーを使用する生体細胞の３Ｄ撮像における進歩は、Nelsonによって展開されており、例えば２００３年２月１８日に発行された、「Apparatus and Method for Imaging Small Objects in a Flow Stream Using Optical Tomography」という名称の米国特許第６，５２２，７７５号に開示されており、その全開示は引用することにより本明細書の一部をなす。本分野における更なる主要な開発は、Fauver他による、２０１０年６月１５日に発行された、「Method and Apparatus for Pseudo-projection Formation for Optical Tomography」という名称の米国特許第７，７３８，９４５号（Fauver‘９４５号）及びFauver他による、２０１１年３月１５日に発行された、「Focal Plane Tracking for Optical Microtomography」という名称の米国特許第７，９０７，７６５号（Fauver‘７６５号）において教示されており、Fauver‘９４５号及びFauver‘７６５号の全開示も、同様に引用することにより本明細書の一部をなす。これらの明細書の教示に基づいて、早期肺癌検出技術は、VisionGate, Inc.（アリゾナ州フェニックス所在）によって完全に開発され、商業化されて、従来の形態学的細胞診解析の動作特性の大幅な改善を立証した測定利点を提供した。
【０００８】
こうした光トモグラフィーシステムにおける処理は、標本収集及び調製で始まる。肺疾患における診断用途の場合、患者の痰は、診療所又は家庭で無侵襲的に収集することができる。臨床検査室において、痰は、非診断材料を取除くために処理され、定着され、その後、染色される。染色済み標本は、その後、オプティカルゲルと混合され、懸濁液が、マイクロキャピラリーチューブに注入される。懸濁液内の、細胞等の対象物の画像は、光トモグラフィーシステム内の画像収集光学系に対して細胞が約３６０度回転する間に収集される。結果として得られる画像は、「疑似投影画像（pseudo-projection image）」と呼ばれる、いろいろな視点からの拡張した被写界深度画像のセットを含む。疑似投影画像のセットを、逆投影及びフィルタリング技法を使用して数学的に再構築して、関心の細胞の３Ｄ再構成をもたらすことができる。３つ全ての次元において同寸法の又はほぼ等しい解像度を有することは、３Ｄトモグラフィー細胞撮像における、特に、定量的特徴測定及び画像解析のための３Ｄトモグラフィー細胞撮像における利点である。
【０００９】
３Ｄ再構成済みデジタル画像は、関心の亜細胞構造、分子、又は分子プローブの測定を通した定量化を可能にするために、解析のために利用可能なままである。生体細胞等の対象物は、少なくとも１つの吸収性造影剤又はタグ付け分子プローブで染色又はラベル付けすることができ、このバイオマーカーの測定される量及び構造は、限定はしないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、及び膵臓癌等の種々の癌、及び、異形成である場合の種々のステージを含む、細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらすことができる。
【００１０】
しかし、本明細書の開示が出るまで、異形成のような前癌状態を識別するために光トモグラフィーを使用する確実な方法が全く存在しなかった。異形成細胞を識別する方法及びシステムをここで提供することによって、患者は、イロプロスト等の化学予防薬剤で処置されて、年齢及び発癌性物質に対する曝露に起因して極端に高い肺癌のリスクにある患者に処置を代替的に施行するだけであることに比べて、リスクのある患者のより的を絞ったクラスにおいて肺癌を発症するリスクを下げることができる。
【発明の概要】
【００１１】
この要約は、簡略化した形態で、以下で詳細な説明において更に述べられる概念の選択を導入するものである。この要約は、特許請求される主題の重要な特徴を特定することを意図されず、特許請求される主題の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図されない。
【００１２】
被験者から得られる痰標本から得られる細胞の疑似投影画像を解析することによって、異形成を自動的に検出し、モニターし、処置する方法が提供される。生体標本分類器が、痰標本からの細胞を正常又は異常として識別する。異常細胞が検出された場合、異常細胞は異形成又は癌として更に分類される。細胞が異形成として分類された場合、治療量を達成するために設計された所定の期間にわたって被験者に癌化学予防薬剤が投与される。
【００１３】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に述べられるが、本発明は、構成及び内容の両方に関して、図面と併せて行われる以下の詳細な説明から、その他の目的及び特徴と共に、より十分に理解され、認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】痰試料を解析するための肺癌試験の機能概要を概略的に示す図である。
【図２】肺癌試験システムで使用される３Ｄ光トモグラフィー撮像システムの基本システムコンポーネントを概略的に示す図である。
【図３】肺癌リスクを有する前悪性のステージの相関をグラフィカルに示す図である。
【図４】癌症例についての腫瘍組織学に対して異形成細胞が見出された痰試料のパーセンテージのプロットである。
【図５】癌症例について、腫瘍ステージに対する、異形成細胞が見出された痰試料のパーセンテージのプロットである。
【図６】腺異型、中等度／高度異形成、及び癌細胞として識別された細胞３Ｄ再構成の図である。
【図７】異形成細胞分類器についての、感度対１−特異度のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図８】異形成及び癌について痰試料を解析するための細胞分類システムの機能ブロック図を概略的に示す図である。
【図９】癌細胞分類器の一例の機能ブロック図を概略的に示す図である。
【図１０】処置プロトコル発生器の高レベル機能ブロック図を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図面において、同一の参照符号は、同様の要素又はコンポーネントを指す。図面における要素のサイズ及び相対位置は、必ずしも一定比例尺で描かれていない。例えば、種々の要素の形状及び角度は一定比例尺で描かれておらず、これらの要素の一部は、図面の視認性を改善するために任意に拡大され位置決めされる。さらに、描かれる要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関する何らかの情報を伝えることを必ずしも意図しているわけではなく、単に、図面における認識を容易にするために選択されている。
【００１６】
以下の開示は、痰標本から得られる細胞の３Ｄ画像を解析することによって異形成を自動的に検出しモニターする方法を述べる。例示的な実施形態による方法及びシステムの幾つかの特徴は、図において挙げられ述べられる。他の例示的な実施形態による方法及びシステムが、図に示されるものと異なる更なる手順又は特徴を含み得ることが理解されるであろう。例示的な実施形態は、光トモグラフィー細胞撮像システムに関して本明細書で述べられる。しかし、これらの例が、原理を示すためのものであること、及び、本発明がそれに限定されないことが理解されるであろう。
【００１７】
本発明は、光トモグラフィーシステムによって処理される患者の痰を含む標本を使用する早期肺異形成及び癌検出システムを提供し、光トモグラフィーシステムは、アイソメトリックでサブミクロンの解像度の３Ｄ細胞画像を生成し、その画像は、その後、自動化特徴抽出及び分類アルゴリズムによって処理され、痰内の異常細胞を高精度で識別する。異常細胞が、痰内で希少であり、非診断汚染物質が豊富であるため、高感度でかつ非常に高い特異度で細胞検出が可能なシステムだけが、標本適正を保証しながら、効率的に痰内の肺癌検出を達成することができる。
【００１８】
現在開示されている光トモグラフィーシステムについて考えられる多くの用途が存在する。光トモグラフィーシステムは、新生細胞の収率が低い標本、又は、非新生細胞の背景と比較した場合に異常細胞を認識するのが難しい標本において、最も有利である。例としては、早期又は末梢肺癌の場合、異形成細胞、血液中の循環する腫瘍細胞、及び、痰内の新生細胞の検出が挙げられる。
【００１９】
定義
一般に、本明細書で使用するとき、以下の用語は、文脈における使用が別途指示しない限り、以下の意味を有する。
【００２０】
特許請求の範囲又は明細書における用語「備える（comprising）」と共に使用するときの語「１つの（"a" or "an"）」の使用は、別途文脈が指示しない限り、１つ又は２つ以上を意味する。用語「約（about）」は、述べた値プラス若しくはマイナス測定誤差の余裕度、又は、測定方法が全く示されない場合、プラス若しくはマイナス１０％を意味する。特許請求の範囲における用語「又は（or）」の使用は、単に代替物を挙げることが明示的に指示されない限り、又は、代替物が相互に排他的である場合を除いて、「及び／又は（and/or）」を意味するために使用される。用語「備える（comprise）」、「有する（have）」、「含む（include）」、及び「含む（contain）」（並びにそれらの変形）は、オープンエンド連結動詞であり、特許請求の範囲において使用される場合、他の要素の付加を許容する。
【００２１】
本明細書全体を通して、「一例（one example）」若しくは「例示的な実施形態（an example embodiment）」、「一実施形態（one embodiment）」、「実施形態（an embodiment）」、又はこれらの用語の組合せ及び／又は変形に対する参照は、その実施形態に関連して述べられる特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の場所における、「一実施形態において（in one embodiment）」又は「実施形態において（in an embodiment）」という句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の適した方法で組合されてもよい。
【００２２】
「適正（adequacy）」は、標本の内容物を参照し、十分な細胞ペレットが解析されたかどうかを判定するためのターゲット細胞についての限界を規定する。
【００２３】
「カルシトリオール」は、本明細書で使用されるとき、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）の合成（人工）活性形態である。
【００２４】
「キャピラリーチューブ」は、その一般的に受入れられる意味を有し、概して５００ミクロン以下の内径を有する透明なマイクロキャピラリーチューブ及び等価な物品を含むことを意図される。しかしながら、より大きい直径を使用することができる。
【００２５】
「細胞（cell）」は、人間、哺乳類、又は動物の細胞等の生体細胞を意味する。
【００２６】
「Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォーム」は、本明細書において上記で参照したNelson特許及びFauver特許の教示並びにそれらの教示の改良を組込んだ、アリゾナ州フェニックス所在のVisionGate, Inc.によって製造される光トモグラフィーシステムを指す。
【００２７】
「ＣｅｌｌＧａｚｅｒ」Ｃｅｌｌ−ＣＴによってレンダリングされた細胞の２Ｄ及び３Ｄ画像のレビューを促進するソフトウェアベースユーティリティ。細胞レビューの結果は、細胞型の詳細な鑑別診断であり、その鑑別診断は、例えば、ＬｕＣＥＤ試験によって処理された症例の最終結果を判定する。
【００２８】
「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：chimeric antigen receptor）」は、本明細書で使用されるとき、人工Ｔ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体又はキメラ免疫受容体としても知られている）が改変受容体であり、改変受容体が任意の特異度を免疫エフェクター細胞に与えることを意味する。
【００２９】
「ＣＩＳ」は、本明細書で使用されるとき、上皮内新生物としても知られている上皮内癌の一般的に受入れられる意味を有する。
【００３０】
「被写界深度」は、指定された特徴について許容できない画像ブラーが生成されるまで、焦点面をシフトすることができる光軸に沿う長さである。
【００３１】
「富化（enrichment）」は、未処理標本からターゲット細胞を取出すプロセスを指す。そのプロセスは、富化したペレットをもたらし、その細胞は、その後、Ｃｅｌｌ−ＣＴシステム上でより効率的に撮像することができる。
【００３２】
「イロプロスト」は、本明細書で使用されるとき、プロスタサイクリンＰＧＩ２の合成類似体である。
【００３３】
「ＬｕＣＥＤ（商標）試験」は、本明細書において上記で参照したNelson特許及びFauver特許の教示並びにそれらの教示の改良を組込んだ、アリゾナ州フェニックス所在のVisionGate, Inc.によって開発されたＣｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームを使用する早期肺癌検出試験を指す。
【００３４】
「ＬｕＣＥＤ（商標）プロセス」は、３Ｄ細胞再構成、異常細胞を見出すための分類、及び病理確認のメカニズムを指す。
【００３５】
「ＬＤＣＴ」は、低線量コンピュータトモグラフィー（ＣＴ）放射線撮影スキャニングを意味する。
【００３６】
「対象物（object）」は、個々の細胞、人間の細胞、哺乳類の細胞、品目、事物、又は他のエンティティを意味する。
【００３７】
「疑似投影図」は、光学系の固有の被写界深度より広い範囲のサンプリングされる容積を表す単一画像を含み、こうして形成される疑似投影画像は、固定視点からの或る範囲の焦点面画像の積算を含む。疑似投影図の概念は、Fauver‘９４５号に教示される。
【００３８】
「標本」は、個々の患者からの単一の試験又は手続きから取得される完全な生成物（例えば、解析用に提出された痰、生検材料又は鼻腔スワブ）を意味する。標本は、１つ以上の対象物で構成されてもよい。標本診断の結果は症例診断の一部になる。
【００３９】
「ＲＯＣ」は、受信者動作特性の一般に受入れられる意味を有する。
【００４０】
「試料」は、アリコート又は標本の全て又は一部を含む、解析の準備ができている完成した細胞調製物を意味する。
【００４１】
「被験者（subject）」は、本明細書で使用するとき、人間の患者を意味する。
【００４２】
「ターゲット細胞（target cell）」は、その特徴付け又は列挙が特に所望される標本からの細胞を指す。例えば、ＬｕＣＥＤ試験において、ターゲット細胞は正常気管支上皮細胞である。標本が適正であると考えられるために、試験中に、最小数のこれらが列挙されなければならない。
【００４３】
画像処理の文脈で使用される「閾値（threshold）」は、或る特徴の任意の測定可能な特性についての決定境界値を含む。閾値は、機器の仕様、許容可能な誤り率、統計量、又は受け入れられるパターン認識原理による他の基準に従って予め決定されてもよい又は設定されてもよい。
【００４４】
「ＴＮＭステージ（TNM stage）」は、肺癌の文脈内で一般に受入れられる意味で本明細書において使用され、例えば国際肺癌学会（ＩＡＳＬＣ：International Association for the Study of Lung Cancer）によるように医師会によって規定された、腫瘍、結節、転移（ＴＮＭ：tumor, node, metastasis）ステージを意味する。
【００４５】
スベラニロヒドロキサム酸としても知られているボリノスタットは、バレット食道において使用されるヒストンデアセチラーゼ（正：histone de-acetylase）（ＨＤＡＣ）阻害剤としてその通常の意味で使用される。
【００４６】
画像処理の文脈で使用される「ボクセル（voxel）」は、３Ｄグリッド上の体素である。
【００４７】
概要
図１を参照すると、痰試料を解析するための肺異形成及び癌試験システムの機能概要が概略的に示される。試験システム５は、痰標本収集１０用の装置及び方法、それに続く、例えばＬｕＣＥＤ（商標）試験等の早期肺癌検出のための試験１２を含む。早期肺癌試験１２は、標本染色及び富化１４、３Ｄ細胞撮像２０、３Ｄ細胞分類２２、及び異常候補細胞の臨床レビュー２５用の装置及び方法を更に含む。
【００４８】
痰収集は、通常、患者の家庭における自発的咳を通して又は診療所における誘発を通して行われる。痰は、例えば、白血球（white cell）及び口腔扁平上皮細胞の大部分を除去することによって汚染物質及び非気管支上皮細胞を除去するために処理される。富化済み標本は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォーム上で処理され、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）プラットフォームは、例えば、上記で参照したNelson及びFauverに開示されるように、アイソメトリックでサブミクロンの解像度を有する真の３Ｄで細胞をデジタル的に撮像する。癌に関連するバイオシグネチャーは、３Ｄ細胞画像上で測定され、癌特性を有する少数の細胞を識別するために使用されるスコアへと結合される。これらの細胞は、任意選択で、その後、VisionGate, Inc.（アリゾナ州フェニックス所在）によって開発されたＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）レビューステーション等のレビューステーションを使用してマニュアルによる細胞学者のレビューのために表示される。レビューステーションは、視覚的表示を提供し、細胞学者が、細胞画像を２Ｄ及び３Ｄで観察して、特異的細胞候補について決定的な正常又は異常状態を確立することを可能にする。３次元（３Ｄ）細胞分類２２は、以下で本明細書において開示される技法を使用して実施されてもよい。
【００４９】
細胞撮像システム２０は、例えば、画像取込み中に生じる動きを補正するために、光学機械デバイスとインタフェースするパーソナルコンピューターによって実行されるコンピューターソフトウェアを通して実装されるプロセスを含む。ほとんどの細胞画像は、十分に再構成される方式でフィルタ補正逆投影から現れる。このアルゴリズムは、不十分に再構成された細胞を識別するため、その細胞は更なる処理から排除することができる。不十分な品質の再構成を検出する方法の一例は、２０１２年４月１０日に発行され、「System and Method for Detecting Poor Quality in 3D Reconstructions」という名称の米国特許第８，１５５，４２０号においてMeyer他によって教示され、その開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【００５０】
肺癌スクリーニグプログラムの開発における早期試みは、人間の眼による疾病検出に対して不充分な感度である（平均、約６０％）が、非常に良好な特異度を有することを示した喀痰細胞診（sputum cytology）（Schreiber and McCrory (2003) Chest 123 (1 Supplement): 115）に基づいた。この経験は、一部の者に、肺癌の検出にとって痰が、価値がないと結論付けさせた。パラフィンブロックに埋め込まれた痰に関わる注意深い解析（Boecking A, Biesterfeld S, Chatelain R, Gien-Gerlach G, Esser E., Diagnosis of bronchial carcinoma on sections of paraffin-embedded sputum. Sensitivity and specificity of an alternative to routine cytology. Acta Cytol. 1992;36(1):37- 47）は、癌患者の８６％以上において標本が異常細胞を実際に含むことを示した。連続する３日にわたる朝の咳による収集が最適結果をもたらした。更なる解析は、異常細胞が、腫瘍組織学的型、サイズ、ステージ、及び場所を含む全ての関連する臨床因子によって層別化された（stratified）痰内に存在することを示した（Neumann T, Meyer M, Patten F, Johnson F, Erozan Y, Frable J, et al. Premalignant and Malignant Cells in Sputum from Lung Cancer Patients. Cancer Cytopathology, 2009; 117(6):473-481.）。これらの標本特性に基づいて、現在開示されている肺癌検出試験は、自発的咳による痰を使用するものである。初期評価は、Ｃｙｔｏｙｔ（Hologic（マサチューセッツ州マールボロ所在））又はよく知られているＳａｃｃｏｍａｎｎｏ法による痰固定を使用して満足のいく結果を示した。標本適正の問題は、痰細胞診にとっても重要である。痰喀出の容積を増加させる試みは、様々な成功を収めた。痰誘発は、粘液の生成を増加させて、総合的な適正試料を達成するのを助けた。
【００５１】
痰富化及び調製の例
異形成の検出に適用される肺癌検出試験の一例において、痰標本は、解析に先立って、処理の３つの段階：１）痰細胞単離及び凍結保存；２）蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ：fluorescence activated cell sorting）による富化；及び３）光トモグラフィー撮像システムの光学コンポーネントにインデックスマッチングされる光学オイル内への富化済み細胞の埋め込みを受ける。
【００５２】
凍結保存及びＦＡＣＳ富化（ＦＡＣＳは１つの例である）
痰は、粘液溶解薬ジチオトレイトール（ＤＴＴ：dithiothreitol）（Fisher Scientific（マサチューセッツ州ウォルサム所在））によって処理される。１つの例において、長期貯蔵の場合、標本は、４１μｍナイロンネットを通してろ過され、１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：dimethyl sulfoxide）（Fisher Scientific（マサチューセッツ州ウォルサム所在））内で−８０℃に維持された。ろ過後、保存される標本の最大１００μＬのアリコートが、肺癌検出試験解析のために取り出される。最初に、痰細胞は、下流の肺癌検出試験撮像のためにヘマトキシリン（Electron Microscopy Sciences（ペンシルベニア州ハットフィールド所在））で染色された。細胞は、その後、気管支上皮細胞について富化させると共に、汚染性炎症細胞（好中球及びマクロファージ）を枯渇させるために選択される蛍光コンジュゲートを含む抗体カクテルで処理された。抗サイトケラチンＦＩＴＣコンジュゲートカクテル（Cell Signaling（マサチューセッツ州ダンバース所在））は、正常及び悪性の両方の上皮細胞において発現するサイトケラチンをターゲットにする。抗ＣＤ４５−ＡＰＣコンジュゲート（Mylteni（ドイツ、ベルギッシュ  グラッドバッハ（Bergisch Gladbach）所在））は、陰性選択のために炎症細胞をターゲットにする。細胞は、細胞ソーティングに先立って、ＤＡＰＩ（Life Technologies（ニューヨーク州グランドアイランド所在））によっても染色される。ＦＡＣＳ富化の場合、ＤＡＰＩ陽性のマザーゲートが作成されて、ダブレット細胞及びデブリを排除し、それに続いて、高い側方散乱事象を排除した。ダブレット細胞は、主に口腔扁平上皮細胞である。その後、高サイトケラチン（高ＦＩＴＣ）及び低ＣＤ４５（低ＡＰＣ）のドーターゲートが引かれる。このドーターゲート内の細胞の集合は、Ｃｅｌｌ−ＣＴ（商標）光トモグラフィーシステム等の光トモグラフィーシステムを使用する、より効率的でかつ下流の肺癌検出試験解析についてソーティングされた富化済みターゲット上皮細胞であった。
【００５３】
富化済み細胞の埋め込み
ＦＡＣＳ富化（又は富化の任意の他の処理）に続いて、細胞は、エタノール中で脱水され、それに続いて、キシレン中で懸濁される。細胞は、その後、適した容積の光媒体に移送され、そこに埋め込まれる。光媒体は、光トモグラフィーシステムのために、整合する屈折率を有する粘性オイルである。埋め込まれると、細胞は、光トモグラフィーシステム上で撮像するために、使い捨てカートリッジ内に注入される。
【００５４】
ここで、図２を参照すると、肺癌試験システムにおいて使用される３Ｄ光トモグラフィー撮像システムの基本システムコンポーネントが示される。細胞撮像システム２０は、フロー中の細胞を撮像するための、自動化された高解像度３Ｄトモグラフィック顕微鏡及びコンピューティングシステムである。コンデンサーレンズ９２に光学的に結合される照明源９０が含まれ、コンデンサーレンズ９２は、対物レンズ９４と光学的に協働して、キャピラリーチューブ９６内に含まれる対象物１の画像をスキャンする。画像は、振動ミラー１０２によって対象物が占める容積をスキャンすることによって取得され、ビームスプリッター１０４を通して高速度カメラ１０６に伝達される。高速度カメラは、複数の疑似投影画像１１０を生成する。多数のアキシャルチューブ回転位置について疑似投影画像のセットが、各対象物について生成される。
【００５５】
試験システムは任意の１つのコントラスト法に限定されないが、一例において、肺癌検出試験は、伝統的に使用されるヘマトキシリン染色に基づく細胞形態学を特にターゲットにする。肺癌検出試験用途において、光トモグラフィーシステムは、全ての次元において等しい解像度（すなわち、アイソメトリック解像度）を有する３Ｄ細胞画像をコンピューター処理し、測定が向きに無関係であることを可能にする。さらに、従来の顕微鏡法に典型的である焦点面曖昧さ及び視点向き依存性をなくすことは、広範囲の細胞タイプを自動的に認識し、支配的に正常な細胞集団内で希少な異常細胞を明確に識別するための情報コンテンツを提供する。光トモグラフィーシステム出力は、全ての細胞の約０．５％を、ＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）（VisionGate, Inc.（アリゾナ州フェニックス所在））ワークステーション、焦点面及び向き曖昧さのない画像の人間によるレビューを可能にする撮像ソフトウェアを使用して確認される異常候補として識別する。
【００５６】
光トモグラフィーシステム撮像は、小容積液体懸濁液に関して実施される。肺癌検出試験の場合、これらの細胞は、上記で述べた富化済み上皮細胞集団からのものである。光トモグラフィーシステムは密接に一致する対象物を分離することができるため、単一ファイル細胞フローの狭く収束されたコアは、標準的なフローサイトメトリーにおける要件ではあるが、必要でない。
【００５７】
肺癌試験システムの例の動作は、本明細書において上記で参照によって組込まれたNelson及びFauverの参考文献、並びに、２０１２年８月２８日に発行された、「Optical Tomography System with High-Speed Scanner」という名称の、Watson他に対する米国特許第８，２５４，０２３号を含む他の特許に記載され、それらの特許も同様に、引用することにより本明細書の一部をなす。動作中、生体細胞１の染色済み核は、光媒体１１２内で懸濁され、また、例えば、６２μｍ内径を有するキャピラリーチューブ９６内に注入される。キャピラリーシステムは、使い捨てであるように設計されており、したがって、標本間の相互汚染の可能性をなくす。圧力１１４が流体に印加され、流体は、チューブが回転するにつれて３Ｄデータが収集される前に、対象物１を撮像用の所定の位置に移動させる。ミラー１０２が作動されて、対象物を通して焦点面をスイープし、画像が、カメラによって積算されて、それぞれの単一視点からの疑似投影図を作成する。光トモグラフィーシステムに対してキャピラリーチューブ９６をインタフェースするガラスホルダーは示されない。ホルダーは、キャピラリーの外径よりわずかに大きい中央部を通してカットされた穴を有し、ガラスは、両側が平坦であって、対物レンズ及びコンデンサーレンズに対する光学結合を可能にする。輸送媒体内に埋め込まれる細胞がロードされたキャピラリーチューブは、ホルダーを通してねじ込まれる。細胞を保持する輸送媒体、ガラスキャピラリー、キャピラリーホルダー、レンズにインタフェースするオイル、及びレンズそれ自身は、同じ光学指数の材料から作られる。結果として、光線は、光トモグラフィーシステム光学系、キャピラリー、及び細胞を、屈折なしで通過し、一方、細胞は、回転して、キャピラリーが３６０度を回転するにつれて撮影される５００の疑似投影図のセットの取込みを可能にしてもよい。細胞は、流体媒体内に懸濁されるため、疑似投影画像１１０が収集されている間に、少量の移動を生じ易い。
【００５８】
したがって、疑似投影図内の細胞画像は、細胞特徴が再構成中に互いに強化されるように共通センターに登録されなければならない。「Method for Image Processing and Reconstruction of Images for Optical Tomography」という名称の米国特許第７，８３５，５６１号は、疑似投影図についての誤差補正技術を開示している。米国特許第７，８３５，５６１号は引用することにより本明細書の一部をなす。補正済み疑似投影図のセットは、従来のＸ線ＣＴで使用中のアルゴリズムと同様のフィルタ補正逆投影アルゴリズムを使用して処理されて、トモグラフィック３Ｄ細胞再構成をコンピューター処理する。３つの角度位置：０ｇ、９０ｇ、及び１８０ｇで撮影された疑似投影画像１１０が示される。５８５ｎｍ波長の光源９０による照明が提供されて、ヘマトキシリン吸収スペクトルに基づく画像コントラストを最適化する。再構成において、３Ｄピクセル又はボクセルは立方体であり、各寸法が７０ｎｍのサイズである。再構成容積は、画像収集容積が対象物の周りでクロップされるため、サイズが変動する。通常、容積は、側部上で約２００ピクセル〜３００ピクセルである。
【００５９】
ここで図３を参照すると、肺癌リスクを有する前悪性のステージの相関がグラフィカルに示される。チャート３００は、前悪性のステージが、細胞解析の診断範囲にわたって肺癌リスクにどのように相関するかを示す。曲線３０１は、左から右に増加するリスクの相対尺度を示す。第１のステージ３０２は正常上皮の診断を示す。第２のステージ３０４は化生の診断を示す。第３のステージ３０６は軽度異形成の診断を示す。第４のステージ３０８は中等度異形成の診断を示す。第５のステージ３１０は高度異形成の診断を示す。第６のステージ３２０は、手術及び／又は化学療法を必要とする癌の診断を示す。最終ステージ３１２は転移の診断を示す。化学予防の窓３２２は、癌ステージ３２０の前でかつ異形成ステージのうちの任意の異形成ステージ中に存在する。比較のため、幅広線３３２はＬＤＣＴの診断限界を示す。
【００６０】
ここで図４を参照すると、癌症例についての腫瘍ステージに対して、異形成細胞が見出された痰試料のパーセンテージがプロットされる。プロット４００において、ＬｕＣＥＤプロセスを通して見出された異形成細胞を有する癌症例のパーセンテージは組織学によって分類される。バー４０１は、１０の知られている細胞の母集団からの、扁平上皮細胞癌についての異形成細胞の９０％検出を示す。バー４０２は、２１の知られている細胞の母集団からの、腺癌についての異形成細胞の８６％検出を示す。バー４０４は、６の知られている細胞の母集団からの、小細胞癌についての異形成細胞の３３％検出を示す。
【００６１】
ここで図５を参照すると、癌症例についての腫瘍組織学に対して、異形成細胞が見出された痰試料のパーセンテージがプロットされる。プロット５００は、腫瘍ステージによって細分されたＬｕＣＥＤプロセスを通して見出された異形成細胞を有する癌症例のパーセンテージの評価を提供する。バー５０１は、９のステージＩ癌細胞の母集団からの、異形成細胞についての８９％検出率を示す。バー５０２は、６のステージＩＩ癌細胞の母集団からの、異形成細胞についての８３％検出率を示す。バー５０３は、１１のステージＩＩＩ癌細胞の母集団からの、異形成細胞についての７３％検出率を示す。バー５０４は、７のステージＩＶ癌細胞の母集団からの、異形成細胞についての７１％検出率を示す。バー５０５は、２の未知細胞の母集団からの、未知細胞についての５０％検出率を示す。バー５１２は、２の未知細胞の母集団からの、異形成細細胞についての５０％検出率を示す。
【００６２】
ここで図６Ａ〜図６Ｄを参照すると、腺異型、中等度／高度異形成、及び癌細胞として識別された断面３Ｄ細胞画像の図が示される。図は、図示するように５ミクロンに対してスケーリングされる。撮像される各細胞は、例えば、図９を参照して本明細書で論じられる分類スコアを割当てられる。中等度異形成、異型円柱細胞等の最終診断は、ＬｕＣＥＤ（商標）試験によるレビューのために転送される細胞を調べる病理学者によって行われる。
【００６３】
ここで図７を参照すると、異形成細胞分類器についてのＲＯＣ曲線が示される。ＲＯＣ曲線７００は、水平軸７０３上の１−特異度に対する、垂直軸７０１上の異形成細胞への感度のプロットである。ポイント７０７は、異形成細胞分類器が、ほぼ１００％特異度において７５％感度で働く領域を示す。分類器は、中等度〜高度異形成及び幾つかの異型細胞状態からなる異常肺プロセスを示す細胞を含むデータセットを使用して構築された。分類器の訓練は、約１５０の知られている異形成細胞及び約２５０００の知られている正常細胞のセットを使用して実装された。精度は、異形成細胞のほぼ完全な検出を示す単一細胞ＲＯＣ曲線７００によって立証される。分類器精度は、しばしば、ＲＯＣ曲線の下の面積（ＡＲＯＣ：area under the ROC curve）として表される。完全な識別は、ＡＲＯＣが１であるときに生じる。ＬｕＣＥＤ  ＡＲＯＣ値は０．９９１である。単一細胞検出の場合、７５％感度及び１００％特異度を提供する動作ポイントが選択された。細胞分類は、以下のリストに示す症例の検出に関連する。例えば、ＬｕＣＥＤ解析中に１つの異常細胞に遭遇する場合、症例検出確率は、０．７５、すなわち７５％であることになる。ＬｕＣＥＤによって２つの異常細胞に遭遇する場合、症例検出確率は、（１−（１−０．７５）２）＝０．９３７５、すなわち、ほぼ９４％の症例感度であることになる、等である。
１細胞−７５％症例感度、
２細胞−９４％症例感度、及び
３細胞−９８％症例感度。
【００６４】
細胞分類
ここで図８を参照すると、幾つかの細胞分類アルゴリズムが、異形成及び他の状態を検出するためのシステムに含まれる。一例において、分類器は、不十分な再構成を検出する分類器３０、適正分類器９１０、正常／異常細胞分類器３２、染色分類器３６、異常細胞分類器４２、前癌細胞分類器４３、癌細胞分類器４５、及び異形成細胞分類器５０を含む。前癌細胞分類器４３、癌細胞分類器４５、及び異形成細胞分類器５０は、分類データを提供するために処置プロトコル発生器８３６（以下で詳細に論じる）に結合される。細胞診検出システムにおいて使用される分類器は、以下で述べるように訓練される。１つの有用な例において、不十分な再構成を検出する分類器３０は、Meyer他を参照して上記で述べたようなものとすることができる。細胞を正常又は異常と分類する前に、標本適正分類器９１０が適用される。標本適正を判定するための１つのこうした方法は、２０１５年６月３０日に出願された、Meyer（本発明者らの１人）他に対する同時係属中の米国特許出願第１４／７８８，０１５号において詳細に教示される。米国特許出願第１４／７８８，０１５号は引用することにより本明細書の一部をなす。一例において、正常細胞ギャラリー用の分類器３２は、レビューステーションを使用して異常細胞の人間識別のための参照ポイントとして役立つために正常細胞を識別する。正常細胞型は、正常扁平上皮中間細胞、並びに、正常円柱上皮細胞及び正常マクロファージを含む他の正常細胞を含むクラスに細分することができる。
【００６５】
染色分類器３６は、例えば、扁平上皮中間細胞として識別される細胞を処理することによって動作して、細胞が、ＬｕＣＥＤ試験についての正しい染色範囲内にあるかどうかを判定する。扁平上皮中間細胞の核は、一定の倍数性を有し、その総合的な積算グレースケール光学密度値を、標本染色が最適吸収コントラスト用の正しい範囲内にあるかどうかを評価するために使用することができる理想的な特徴にする。平均及びメジアングレースケール値は、それぞれの核についてコンピューター処理され、移動平均が維持されてもよい。平均についての安定値は、検討中の核の個々のグレースケール値についての正規化として使用される場合がある染色である。
【００６６】
異常細胞分類器４２は、本明細書で述べる分類器訓練法を使用して異常特性を有するターゲット細胞を識別するために訓練されることによって生成される。これらのターゲット細胞（通常、処理される全ての細胞の０．５％）は、アリゾナ州フェニックス所在のVisionGate, Inc.によって開発されたＣｅｌｌＧａｚｅｒ（商標）ワークステーション等のレビューステーション２５を使用して病理学者によって検査され続ける。或る特定の実施形態において、ターゲット細胞は、異常扁平上皮細胞、腺癌細胞、気管支肺胞上皮癌細胞、異常神経内分泌細胞、小細胞癌細胞、大細胞癌細胞、肺円柱細胞、腫瘍細胞、新生細胞及び気管支肺胞上皮癌細胞、並びに痰中に見出される他の細胞及び対象物を含む。異常細胞分類器は、癌細胞及び前癌細胞を識別するために動作する。
【００６７】
前癌細胞は、前癌細胞分類器４３によって更に解析される。前癌分類器は、腺にできる前癌細胞（pre-cancerous cells of glandular origin：腺由来の前癌細胞）と扁平上皮にできる前癌細胞（異形成）とを識別する。細胞が異形成であった場合、細胞は、異形成細胞分類器５０に更にルーティングされる。異形成細胞分類器５０は、分類器訓練方法を使用して、所定の特性を有するターゲット細胞を識別するために訓練されることによって生成される。図７を参照して上記で論じたように、異形成分類器は、約１５０の知られている異形成細胞及び約２５０００の知られている正常細胞のセットを使用して訓練された。異形成細胞分類器５０は、細胞を、軽度、中等度、又は高度の異形成を示すものとして更に識別する。
【００６８】
ここで図９を参照すると、異形成及び癌について痰試料を解析するための癌細胞分類器４５の一例の機能ブロック図が概略的に示される。癌細胞分類器は、細胞を、腺癌細胞、小細胞癌細胞、又は扁平上皮癌細胞として更に分類する。
【００６９】
本明細書で開示されるシステム及び方法のよりよい理解を促進するために、システム動作の一例がここで詳細に述べられる。処置オプションは、上記で論じたように痰標本から分類器アルゴリズムによって決定される分類に応じて選択される。
【００７０】
ここで図１０を参照すると、プロトコル発生器の高レベル機能ブロック図が概略的に示される。動作時、異常細胞が、正常／異常細胞分類器３２によって検出された場合、異常細胞は、異常細胞分類器４２によって、前癌８４２又は癌８４０として更に分類される。上述したように、癌８４０として分類された細胞は、腺癌細胞８５４、小細胞癌細胞８５２、又は扁平上皮癌細胞８５０として更に識別される。疑わしい病変を検証するために生検を実施することができる。生検の結果、癌が見出された場合、薬剤化学予防処置８６０と連携して、単数又は複数の癌病変を取除くために外科手技が実施されるべきである。
【００７１】
前癌細胞が検出された場合、前癌細胞分類器４３は、痰試料からの細胞を、腺にできる前癌細胞８４２又は異形成８３８として分類するように動作する。細胞が前癌として分類された場合、癌化学予防薬剤８５６が、所定の期間にわたって被験者に投与される。その後、異形成細胞は、異形成細胞分類器によって、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、又は高度異形成に分類される。細胞が、軽度、中等度、又は高度の異形成として分類された場合、癌化学予防薬剤８５６が、所定の期間にわたって被験者に投与される。前癌細胞と癌細胞の両方が発見された場合、任意の疑わしい病変の癌状態が検証され、癌が見出された場合、外科手技が癌病変を取除くために施行され、癌化学予防薬剤が所定の期間にわたって被験者に投与される。有用な癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び、ボリノスタット、又は他のＨＤＡＣ阻害剤からなる群から選択される薬物を含む。
【００７２】
分類器訓練−入力及び方法
上述した細胞検出分類器の作成及び最適化は、そのプロセスが、参照又はグラウンドトゥルースに従って細胞を正確に診断することを目指すため、一般に、「分類器訓練（classifier training）」と呼ばれる。精度に対して２つの主要な態様が存在する：第１は特異度であり（正常細胞は分類器によって正常と呼ばれる）、第２は感度である（異常細胞は分類器によって異常であると呼ばれる）。アルゴリズム訓練法は、適用的ブースト式ロジスティック回帰（Adaptively Boosted Logistic Regression）及びランダムフォレスト（Random Forest）を含む。当業者は、テンプレート法、適応的処理等のような分類器のために他の古典的な訓練技法をどのように適用するかをよく知っているであろう。
【００７３】
分類器を訓練するために使用される方法は、データが入力として使用される場合、著しく良好な成果を保証する。主に、分類器精度は、分類器訓練プロセスに対する入力が、細胞の臨床的に重要な態様を正確に記述し、光トモグラフィーシステム結果に影響を及ぼす可能性がある環境因子に対して頑健であるときに保証される：
１．図６Ａ〜図６Ｄを参照して上記で示したように、光トモグラフィーシステムによって生成される３次元細胞画像は、高い解像度を有し、正しい分類をサポートするクリティカルな特徴の的確な測定を可能にする。
２．分類において有用である幾つかの特徴は、３Ｄ画像においてのみ出現する。その結果、３Ｄ特徴セットは、細胞をより多く記述するだけでなく、３次元撮像に基づく分類を、２Ｄ撮像に対してより正確にする。
３．３次元画像区画化アルゴリズムは、背景から全細胞を、また、細胞から核を分離するために開発された。これらの区画化アルゴリズムの精度は、区画化済みトレースを、人間が導出する細胞又は核エンベロープトレースと比較することによって確認された。
４．特徴測定は、細胞、細胞核、細胞質、及び細胞核小体の種々の態様を記述する。試験システムの一例において、５９４の特徴が、各３Ｄ細胞画像についてコンピューター処理され、その特徴は、対象物の形状、容積、クロマチンの分布、及び、他のより微妙な形態要素を表す。これらの特徴のコンピューター処理は、細胞の向きに無関係であると確認された。
５．分類器訓練についての診断的真理（病理学の至適基準）は、２人の細胞検査技師及び１人の細胞病理学者によって提供される階層的細胞診断に基づく。
【００７４】
分類器訓練−統計的考察
第２に、本明細書の発明者らによって実施される１つの試験において、分類器訓練プロセスの精度は、３つの態様を包含した厳密なプロセスを通して保証された：
１．分類器を訓練するために使用されたデータベースは、２項分布９５％信頼区間が、許容可能な限度内で性能推定の変動を維持することを保証するのに十分な材料を含むように形成された。
２．過剰訓練（over-training：過学習）は、訓練プロセスの考えられる１つの落とし穴であり、そこでは、多過ぎる情報が分類器内に含まれる可能性があるため、結果は、訓練において使用されるデータに過剰に専用化される可能性がある。この状況は、分類器性能について過剰に楽観的な推定を生成する。過剰訓練のリスクは、訓練データの一部を取得するとともにこれを試験データとして使用することを伴う交差検証によって軽減することができる。分類器において使用することができる情報量の限界は、訓練データに基づく性能推定が試験データによる推定を超える場合に達せられる。
３．最後に、過剰訓練に対する更なる保証として、分類器は、訓練プロセスの一部でなかった細胞の第２のセットによるデータに対して試験された。
【００７５】
異常細胞分類器訓練概要
以下の考察は、異常細胞分類器４２についての訓練を左右するパラメーターを規定するために使用された：
１．痰試料中の異常細胞が十分でなく、痰中の非診断要素が十分であるため、分類器は、高い感度及び非常に高い特異度で動作しなければならない。表１において後で述べるように、高い症例検出感度は、単一細胞分類器感度が７５％であり、標本が２つ以上の異常細胞を含むときに維持される。
２．ワークロードを保証することは、妥当な限界内で維持され、特異度についての目標は９９％に設定された。
３．下限２項分布９５％信頼限界（２１）についての区間は、感度について７０％超に、及び、特異度について９８．５％超に維持された。
【００７６】
最後に、高い検出率が、各陽性症例について所望される。単一細胞検出の感度は、表１に示す異常症例の検出につながる。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
表１の示唆は、肺癌検出試験にとって重要である。この表に示す結果は、異常細胞が、肺癌検出試験によって解析される群内にある場合、異常細胞が確信をもって検出されるため、症例は高感度で識別されることになることを示す。これは、肺癌検出試験解析における異常細胞存在の問題を、癌検出率を決定する残りの因子として残す。
【００７９】
標本適正
痰が、患者ごとの非常に変動性のある標本であるため、肺癌検出試験によって解析される細胞が疾病検出について十分な肺サンプリングを含むかどうかを評価するプロセスが必要とされる。古典的な痰適正は、豊富な肺胞マクロファージの存在に基づいて評価される。しかし、これらの細胞タイプは、肺癌検出試験の細胞富化プロセスを通して保存されない。さらに、痰中のマクロファージの存在と異常細胞の存在との間の関係についての従来の評価は、この適正判定法において信頼を与えなかった。その結果、肺癌検出試験適正は、化生細胞及び円柱細胞を含む正常気管支上皮細胞等の参照細胞の列挙に基づく。肺癌検出試験は、これらの細胞を自動的に列挙するため、適正についての別個のマニュアル解析は必要とされない。上記で述べたように、肺癌検出試験標本処理は、痰中の非診断要素を取除く。この処理は、富化済み細胞ペレット内で細胞内容物をランダム化する効果を有する。これは、癌患者からの標本の肺癌検出試験解析中に異常細胞に遭遇する可能性が、試料中の異常細胞の数と正常細胞の数との比及び肺癌検出試験によって処理される正常細胞の数に主に依存することを意味する。この比は、病変サイズ、咳の動態等を含む多くの因子に依存する。症例検出は、その後、異常細胞も同様に処理されるように十分な正常気管支上皮細胞を処理することに主に依存することになる。
【００８０】
分類器開発及び特徴
一般に、特徴は、３Ｄトモグラムの種々の態様の数値表現を提供するためにコンピューター処理される。コンピューター処理される特徴は、対象物のエキスパート診断と共に使用されて、対象物タイプを区別することができる分類器を開発する。例えば、Ｍ個の３Ｄトモグラムを有するデータセットは、第１のタイプ、タイプ１の対象物についてコンピューター処理されてもよく、Ｎ個の３Ｄトモグラムを有するデータセットは、第２のタイプ、タイプ２の対象物についてコンピューター処理されてもよく、第１及び第２のタイプの対象物は、正常細胞及び異常細胞等である。ここで、「Ｍ」及び「Ｎ」はタイプ１及びタイプ２の値の数をそれぞれ表す。データセットは、好ましくは、光トモグラフィーシステムによって生成される。光トモグラフィーシステムは、例えば、細胞等の対象物の３Ｄ画像を含む３Ｄトモグラムを提供する。細胞は、通常、核小体等の細胞小器官を有する核等の他の特徴を含む。対象物タイプは、様々なタイプの細胞、細胞小器官、選択された疾病状態を示す細胞、プローブ、正常細胞、又は対象の他の特徴を含んでもよい。ｘの３Ｄ画像特徴のセットは、全てのＭ＋Ｎの対象物についての３Ｄトモグラムに基づいてコンピューター処理される。次に、対象物タイプを最もよく弁別するｙの３Ｄ画像特徴の洗練された特徴セットが見出される。ここで、「ｘ」及び「ｙ」は、各段階における３Ｄ画像特徴の数を表す。ｙの３Ｄ画像特徴の洗練された３Ｄ画像特徴セットが使用されて、その出力が対象物タイプに相関する分類器を構築する。１つの例示的な実施形態において、段階１０２において、３Ｄトモグラムのセットが組立てられ、組立てられたセットは、３Ｄ生物学的対象物タイプを区別するためにエキスパートによって使用されることになる実質的に全ての重要なマーカーを表す。３Ｄトモグラムの代表的なセットを組立てて、３Ｄ画像特徴セットは、重要なマーカーを特徴付ける各対象物についてコンピューター処理されてもよい。
【００８１】
特徴
細胞等の生物学的対象物のトモグラムは、複数の観測可能でかつ測定可能な特性を示し、その特性の一部は、分類用の特徴として使用されてもよい。以下の表２は、特徴、すなわち分類目的を果たすために使用される重要なマーカーの概要を提供する。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
更なる説明として、１つの有用な例において、３Ｄ生物学的対象物内で発生するボイドは、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。ボイドに関連する別の特性は、対象物内のボイドの数を含んでもよい。ボイドに関連する別の特性は、ボイドの容積又はボイドの数を含む。更に別の特性は、ボイドの表面積又はボイドの数を含む。核間ボイドの形状及び場所も同様に、有用な特徴特性として使用されてもよい。さらに、特徴特性の組合せも同様に、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００８４】
同様に、３Ｄ生物学的対象物内で発生する陥入は、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。陥入に関連する別の特性は、対象物内の陥入の数を含んでもよい。陥入に関連する別の特性は、陥入の容積又は陥入の数を含む。更に別の特性は、陥入のサイズ又は陥入の数を含む。核陥入の場所も同様に、有用な特徴特性を含む。さらに、特徴特性の組合せも同様に、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００８５】
３Ｄ生物学的対象物内で発生する陥入は、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。陥入ボイドの容積、表面積、形状、陥入に接続されるボイドの場所、及び陥入特徴の組合せも同様に、有利には、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。
【００８６】
３Ｄ生物学的対象物内で発生する核小体は、計算済み又は選択済み閾値との比較を含む、測定基準に基づく有用な分類特徴であることがここでわかった。核小体又はクロマチン凝縮である可能性がある対象物の容積、表面積、形状、場所、又は上記特性の組合せも同様に、有利には、本明細書において上記で述べた分類器を構築するために使用されてもよい。３Ｄ生物学的対象物内で発生する核テキスチャ特徴は、有用な分類特徴であることがここでわかった。種々のサイズに作られた構造要素を使用して、ブラーレジデュー技法が使用されて、核内の種々のサイズに作られた特徴を分離する。ブラーレジデュー技法は、通常、フィルタを使用して画像をブラー処理し、マーキング操作を適用することによって、結果として得られるブラーレジデューを測定することを必要とする。全体の３Ｄ容積は、その後、離散的コンポーネントの数、容積ヒストグラム、平均容積及び分散、並びに形状ヒストグラムであるとしてコンピューター処理される。
【００８７】
核小体と、陥入と、ボイドと、核エンベロープとの間の空間的関係を記述する距離メトリックは、有用な分類特徴であることがここでわかった。例えば、３つの核小体が見出される場合、平均及び分散の、また、最小及び最大の核小体間距離が見出される場合がある。同様に、核小体のクラスタについての平均座標と対象物全体についての質量中心との間の距離も見出される場合がある。同様の計算は、核小体及び核の質量中心を上記エンティティのうちの任意のエンティティに置き換えることによって形成されてもよい。
【００８８】
高速フーリエ変換（ＦＦＴ：Fast Fourier Transform）特徴は、有用な分類特徴であることがここでわかった。ＦＦＴ特徴は、３Ｄトモグラムの高速フーリエ変換によって形成される。ＦＦＴ特徴は、ＦＦＴ分類の顕著な、また平均的な特性を特徴付ける。
【００８９】
例示的な方法
異形成細胞及びその処置施行を決定するための方法及びシステムの詳細な説明を提供したが、システム構造及び使用の幾つかの詳細な例を提供することが本発明の理解にとって役立つと考えられる。
【００９０】
一例において、被験者から得られた痰標本から得られた疑似投影図に基づく細胞の３Ｄ画像を解析することによって、前癌細胞状態を自動的に検出しモニターするための方法は、痰標本からの細胞を正常又は異常として識別するために生体標本分類器を動作させることを含む。異常細胞が検出された場合、異常細胞は前癌又は癌として更に分類される。前癌細胞が検出された場合、生体標本分類器は、痰試料からの細胞を、腺にできる前癌細胞、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、又は高度異形成として分類する。細胞が癌として分類された場合、疑わしい病変を検証するために生検が実施される。癌が見出された場合、外科手技により癌病変を取除く。細胞が前癌として分類された場合、癌化学予防薬剤が所定の期間にわたって被験者に投与される。細胞が軽度、中等度、又は高度異形成として分類された場合、癌化学予防薬剤が所定の期間にわたって被験者に投与される。前癌細胞と癌細胞の両方が発見された場合、任意の疑わしい病変の癌状態が検証され、癌が見出された場合、外科手技により癌病変を取除き、癌化学予防薬剤が所定の期間にわたって被験者に投与される。
【００９１】
別の例において、癌化学予防薬剤は、プロスタサイクリン類似体、イロプロスト、Ｔ細胞用のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ボリノスタット、ＨＤＡＣ阻害剤、コレカルシフェロール、カルシトリオール、及びその組合せからなる群から選択される薬物を含む。
【００９２】
別の例において、処置は、所定の期間にわたって被験者に癌化学予防薬剤を投与し、その後、被験者から２回目の痰標本を得て、細胞を正常又は異常として分類するために生体標本分類器の動作を繰返すことを要求する。異常細胞が検出された場合、異常細胞は、腺にできる癌細胞、腺にできる前癌細胞、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、高度異形成、又は癌として更に分類され、繰返された動作の複数の分類結果は、直前の動作からの分類結果と比較されて、化学予防薬剤の有効性を判定する。
【００９３】
別の例において、被験者から得られた痰標本から得られた細胞の３Ｄ画像からの特徴データを解析することによって、異形成を自動的に検出しモニターするための光トモグラフィーシステムは、特徴データを受信し、試料適正値を発生するために結合された試料適正分類器を含む。正常／異常細胞分類器は、特徴データを受信し、正常細胞及び異常細胞を検出するために結合される。異常細胞分類器は、異常細胞についてのデータを受信し、異常細胞を癌細胞及び前癌細胞に更に分類するために、正常／異常細胞分類器に結合される。前癌細胞分類器は、前癌細胞データを受信し、各前癌細胞を、腺にできる前癌細胞又は異形成として識別するために、異常細胞分類器に結合される。異形成細胞分類器は、異形成細胞データを受信し、異形成細胞を、軽度〜中等度異形成、中等度〜高度異形成、又は高度異形成として更に分類するために、前癌細胞分類器に結合される。処置プロトコル発生器は、異常細胞分類器、前癌細胞分類器、及び異形成細胞分類器から分類データを受信し、癌細胞、前癌細胞、又は異形成細胞の検出によって示される場合、応答して、所定の期間にわたって被験者に癌化学予防薬剤を投与するプロトコルを生成するように適合される。
【００９４】
別の例において、被験者から得られた痰試料から得られた細胞の３Ｄ画像を解析することによって、異形成を自動的に検出しモニターするための方法は、痰試料内に含まれる細胞について３Ｄ撮像データを提供することと、痰試料について試料適正判定を提供することと、試料適正判定が所定の基準を満たした場合、正常／異常の判定を生成するために、正常／異常分類器を動作させることと、判定が異常であった場合、細胞を、癌、腺にできる前癌、又は異形成として更に識別し、腫瘍を取除くために手術を実施することと、細胞が癌として分類された場合、細胞が扁平上皮癌又は腺癌であるかどうかを判定することと、細胞が異形成であった場合、所定の期間にわたって被験者に癌化学予防薬剤を投与することと、判定が癌及び異形成であった場合、腫瘍を取除くために手術を実施し、更に所定の期間にわたって被験者に癌化学予防薬剤を投与することとを含む。
【００９５】
別の例において、痰試料から得られた細胞の疑似投影画像を解析することによって、異形成を自動的に検出しモニターするための方法は、痰試料内に含まれる細胞について３Ｄ撮像データを提供することを含む。試料適正判定が痰試料について行われ、試料適正判定が所定の基準を満たした場合、細胞データは、正常及び化生状態、腺にできる前癌細胞、軽度〜中等度異形成若しくは高度異形成、又は、ＣＩＳ及び／又は癌として識別される。後続の光トモグラフィー痰試験は、細胞データが正常及び化生状態を示した場合、後で、１２〜２４カ月以内に、また、細胞データが軽度〜中等度異形成を示した場合、後で、６カ月以内にスケジュールされる。後続の光トモグラフィー痰試験は、細胞データが高度異形成を示した場合、後で、３カ月以内にスケジュールされ、高度異形成の確認が必要とされ、その後、化学予防治療が行われる。ＣＴスキャン及び気管支鏡等のフォローアップ診断試験は、高度異形成がＣＩＳ及び／又は癌を示した後、６カ月以内にスケジュールされる。癌化学予防薬剤は、細胞が異形成であった場合、所定の期間にわたって被験者に投与される。
【００９６】
本発明は、特許法に適合し、本発明の新規な原理を適用するために必要とされる情報を当業者に提供し、必要とされる例示的でかつ専用のこうしたコンポーネントを構築し使用するために、本明細書でかなり詳細に述べられた。しかし、本発明が異なる機器及びデバイスによって実施されてもよいこと、及び、機器の詳細及び動作手順の両方について、種々の修正が、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく達成されてもよいことが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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