(57)【要約】  本明細書で提供されるものは、細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）の修飾または変異形態、およびそれを含む組成物に関する。特に、ＣｌｙＡの修飾または変異形態は、低いまたは生理学的イオン強度で、修飾または変異ＣｌｙＡナノポアを通じた、標的の負に荷電した分子またはポリマーの効率的な捕捉および／または移行を可能にする。したがって、ＣｌｙＡの修飾または変異形態および組成物を、例えば、標的の負に荷電した分析物、例えば、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるために使用するための方法も提供される。
2019507583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記ｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含む、修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項２】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアへのデオキシリボ核酸の捕捉を可能にするように前記ｃｉｓ開口部に配置されている、請求項１に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３】
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記デオキシリボ核酸の移行を可能にするように前記中間部に配置されている、請求項２記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４】
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれアルギニンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項５】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列のＳ１１０Ｒ変異に対応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項６】
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列のＤ６４Ｒ変異に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項７】
１２量体ポアである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
【請求項９】
人工膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記人工膜に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
低イオン強度溶液をさらに含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記低イオン強度溶液が、約５０ｍＭから約１Ｍのイオン強度を有する塩溶液である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記イオン強度が約１５０ｍＭである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ＣｌｙＡナノポアを通じてＤＮＡを移行する方法であって、
ａ．低イオン強度溶液に、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと人工膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が前記低イオン強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するように、前記人工膜に存在する、ステップと、
ｂ．前記低イオン強度溶液の前記ｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、
ｃ．前記修飾ＣｌｙＡナノポアにわたり電位を印加して、前記ＤＮＡを、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じて前記ｃｉｓ側から前記ｔｒａｎｓ側へ移行させるステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記イオン強度が約１５０ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡシーケンシングのために使用される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１（野生型ＣｌｙＡのアミノ酸配列に対応）または配列番号２（ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列に対応）に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドであって、前記アミノ酸配列は配列番号１または配列番号２の１０６〜７８の範囲内の位置に第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、配列番号１または配列番号２の４１〜７４の範囲内の位置に第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１または配列番号２の１〜３２位のアミノ酸が正味の負電荷をもたらす、請求項２１に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
【請求項２３】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の１１０位に配置されている、請求項２１または２２に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
【請求項２４】
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２の６４位に配置されている、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
【請求項２５】
前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換がそれぞれ独立してアルギニン、ヒスチジンまたはリジンを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２７】
複数の、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項２８】
１２〜１４個の前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、請求項２７に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項２９】
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、請求項２７または２８に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３０】
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、請求項２９に記載のホモ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３１】
少なくとも１つの、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、１２〜１４個のＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、請求項３１に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３３】
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、請求項３１または３２に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３４】
前記修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記ナノポアを通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記ヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポアの中間部に配置されている、請求項３３に記載のヘテロ多量体修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３５】
第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、前記第１の開口部から前記中間部を通じて前記第２の開口部に延びる内腔とを含む修飾ＣｌｙＡナノポアであって、前記第１の開口部の内腔表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記中間部の内腔表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、前記第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する、修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３６】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換から前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換までの前記内腔内の距離が０．５ｎｍから１０ｎｍの範囲である、請求項３５に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３７】
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項３５または３６に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３８】
配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、前記第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む最大１０個の置換を有するサブユニットポリペプチドを含む、請求項３５または３６に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項３９】
前記第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１１０、１０６、１１４、１２１、１２２、１２９、８５、７８、２６８、２６７、２６５および２５８からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４０】
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸７４、７１、６４、５３、１６１、１５８、４６、４２、４１からなる群から選択されるアミノ酸の置換である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４１】
第１の正に荷電したアミノ酸の置換が、前記第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマーの捕捉を可能にするように、前記第１の開口部に配置されている、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４２】
前記第２の正に荷電したアミノ酸の置換が、ポアの前記内腔を通じた前記負に荷電したポリマーの移行を可能にするように、前記中間部に配置されている、請求項４１に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４３】
前記負に荷電したポリマーが核酸である、請求項４１または４２に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４４】
前記核酸がデオキシリボ核酸である、請求項４３に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４５】
前記デオキシリボ核酸が二本鎖である、請求項４４に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４６】
前記デオキシリボ核酸が一本鎖である、請求項４４に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４７】
１２量体ポアである、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４８】
１３マーのポアである、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア。
【請求項４９】
請求項２７〜４８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアを含む組成物。
【請求項５０】
膜をさらに含み、前記修飾ＣｌｙＡナノポアが前記膜に存在する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む、請求項４９または５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチド結合タンパク質が、前記修飾ＣｌｙＡナノポアに結合している、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
低イオン強度溶液をさらに含む、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記低イオン強度溶液が、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記塩溶液が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む、請求項５２または５３に記載の組成物。
【請求項５６】
標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ａ）約１５０ｍＭから約３００ｍＭの低イオン強度溶液に、請求項２７〜４８のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで前記修飾ＣｌｙＡナノポアは前記膜に存在する、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記低イオン強度溶液に前記標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、
（ｃ）前記ナノポアにわたり電位を印加する間に、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、前記標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップと
を含む、方法。
【請求項５７】
前記１つまたは複数の特徴が、（ｉ）前記標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記標的ポリヌクレオチドの二次構造、ならびに（ｖ）前記標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、およびそれによる前記標的ポリヌクレオチドの特徴付けから選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記標的ポリヌクレオチドに結合し、前記修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、前記ポリヌクレオチド結合タンパク質をステップ（ｂ）の前記低イオン強度溶液に添加するステップをさらに含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記標的ポリヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡである、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記イオン流の測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定を含む、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記低イオン強度溶液が塩化ナトリウムを含む、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１５年１２月８日に出願された米国仮出願第６２／２６４，７０９号の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書では、細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）の修飾または変異形態およびそれを含む組成物が提供される。例えば、標的分析物、例えば標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためにＣｌｙＡの修飾または変異形態および組成物を使用するための方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
膜貫通ポア（例えば、ナノポア）は、低分子または折り畳まれたタンパク質を同定するために、および単分子レベルで化学的または酵素的反応をモニターするために使用されてきた。人工膜に再構成されたナノポアを横切るＤＮＡの電気泳動的移行は、ＤＮＡシーケンシングおよびバイオマーカー認識などの実用的用途のために大きな期待が持たれている。しかしながら、負に荷電したアミノ酸に面する内部表面を有するナノポアを通じた二本鎖または一本鎖ＤＮＡの移行は非効率的である。特に、負の内部表面電荷および溶液のデバイ長に匹敵する半径を有するナノポアにおいて、内側ナノポア壁上の電気二重層（ＥＤＬ）によって生じる表面電位が重なり、ナノポアへのＤＮＡの進入に対して大きな静電障壁をもたらす。結果として、そのようなナノポアを横切るＤＮＡの移行は、大きなナノポア（例えば、１０ｎｍ）を使用してまたは高イオン強度溶液もしくは非対称塩濃度下で小さいナノポア（例えば、約３．５ｎｍ）を使用して観察されたにすぎない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、ある特定のタンパク質ナノポア、例えば細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）ナノポアが、負に荷電した狭いくびれ（または移行を阻害するかもしくはその効率を減少させる領域）を有する一方、そのような負に荷電した狭いくびれを有するタンパク質ナノポアを通じた負に荷電した分子またはポリマー（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ）の低イオン強度溶液での捕捉および移行を、正電荷、例えば、正に荷電したアミノ酸（例えば、アルギニン）をタンパク質ナノポア（例えば、ＣｌｙＡナノポア）の内腔表面内に導入してナノポア内に負に荷電した分子またはポリマー（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ）を捕捉または配向させることによって、上手く達成することができるという、予期されなかった発見に少なくとも部分的に基づく。例えば、正電荷、例えば正に荷電したアミノ酸（例えば、アルギニン）を、負に荷電した狭いくびれを有するタンパク質ナノポア（例えば、ＣｌｙＡナノポア）の内腔表面に、開口部（例えば、負に荷電した分子またはポリマーの進入のための開口部）の近傍および中間部内で導入してもよい。
【０００５】
ある特定の例では、平面脂質二重層における有利な特性のために選択した改変ＣｌｙＡバージョンであるＣｌｙＡ−ＡＳを使用して、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアを作製した。ＣｌｙＡ−ＡＳの内部電荷を再配置して、生理学的イオン強度でのナノポアによるＤＮＡの捕捉を誘導した。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアは、ｃｉｓ開口部、中間部、およびｔｒａｎｓ開口部を含み、ここでｃｉｓ開口部の内部表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、中間部の内部表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、ｔｒａｎｓ開口部は負に帯電したくびれを含む。一部の例では、第１の正に荷電したアミノ酸の置換（例えば、アルギニンによる置換）はｃｉｓ開口部に配置され、修飾ＣｌｙＡナノポアへのＤＮＡの捕捉を可能にしてもよく、および／または第２の正に荷電したアミノ酸の置換（例えば、アルギニンによる置換）は中間部に配置され、修飾ＣｌｙＡナノポアを通じたＤＮＡの移行を可能にしてもよい。例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換は、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列のＳ１１０Ｒ変異に対応してもよく、および／または第２の正に荷電したアミノ酸の置換は、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列のＤ６４Ｒ変異に対応してもよい。
【０００６】
したがって、本開示の一態様は、例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアへの負に荷電したポリマーの捕捉、および／または修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた負に荷電したポリマーの移行を可能にする、修飾ＣｌｙＡナノポアを特色とする。修飾ＣｌｙＡナノポアは、第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、第１の開口部から中間部を通じて第２の開口部に延びる内腔とを含み、ここで第１の開口部の内腔表面は第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）を含み、中間部の内腔表面は第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む。第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する。
【０００７】
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）までの内腔内の距離は、約０．５ｎｍから約１０ｎｍの範囲内で変動しうる。一部の実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第１の開口部表面までの内腔内の距離は、約３ｎｍから約７ｎｍの範囲内で変動しうる。
【０００８】
任意の形態のＣｌｙＡを、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを製造するために使用することができる。例えば、野生型ＣｌｙＡ（ＣｌｙＡ−ＷＴ）およびＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列ならびにそれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。したがって、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、野生型ＣｌｙＡに対応する配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポアは、ＣｌｙＡ−ＡＳに対応する配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む、最大１５個の置換を含みうる。
【０００９】
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマー（例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の捕捉を可能にするように、第１の開口部に配置されてもよい。例えば、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、次の位置：配列番号１または配列番号２のＥ１０６、Ｄ１１４、Ｄ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２９、Ｅ８５、Ｅ７８、Ｄ２６８、Ｄ２６７、Ｄ２６５、Ｅ２５８の１つまたは複数で行われてもよい。
【００１０】
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、ポアの内腔を通じた負に荷電したポリマー（例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の移行を可能にするように、中間部に配置されてもよい。例えば、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、次の位置：配列番号１または配列番号２のＤ７４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ４２、Ｄ４１の１つまたは複数で行われてもよい。
【００１１】
第１と第２の正電荷修飾（例えば、第１と第２の正に荷電した置換）の間の距離は、好ましくは、約０．５ｎｍから約１０ｎｍである。距離は、約３ｎｍから約７ｎｍの間でありうる。
【００１２】
修飾ＣｌｙＡナノポアは、ホモ多量体（例えば、ナノポア内の全てのサブユニットが同じである）またはヘテロ多量体（例えば、少なくとも１つのサブユニットがナノポア内の他のサブユニットと異なる）でありうる。修飾ＣｌｙＡナノポアは、標的ポリマー（例えば、ポリヌクレオチド）が通り抜けるのを可能にするために十分な内腔の大きさの形成を充足する任意の数のサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、１２個以上のサブユニットポリペプチド、例えば、１３個のサブユニットポリペプチドおよび１４個のサブユニットポリペプチドを含んでもよく、ここでサブユニットポリペプチドの少なくとも１つまたは複数は、本明細書に記載される第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む。
【００１３】
第１および第２の正電荷修飾（例えば、第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、ナノポアの全てのサブユニットで行われてもよい。
【００１４】
したがって、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド、ならびに修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも本明細書で提供される。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を含み、ここでアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２の１０６〜７８の範囲内の位置に第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）を含み、配列番号１または配列番号２の４１〜７４の範囲内の位置に第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む。一例では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１もしくは配列番号２の１１０位に配置されうる；および／または第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１もしくは配列番号２の６４位に配置されうる。第１のおよび／または第２の正に荷電したアミノ酸の置換の例としては、限定されないが、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンのうちの１つによる置換が挙げられる。
【００１５】
また、標的ポリマー、例えば標的ポリヌクレオチドなどの標的の負に荷電したポリマーの特徴付けに使用するための組成物も本開示の範囲内に含まれる。組成物は、本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアを含む。組成物は、修飾ＣｌｙＡナノポアが配置される膜（例えば、人工膜）をさらに含んでもよい。組成物は、低イオン強度溶液、例えば、約１００ｍＭから約３００ｍＭまたは約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液をさらに含んでもよい。より一般的には、塩溶液は、約５０ｍＭから約１Ｍのイオン強度を有しうる。一部の実施形態では、組成物は、修飾ＣｌｙＡナノポアに任意選択的に結合することができるポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含んでもよい。
【００１６】
本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアおよび組成物は、様々なバイオセンサーまたは分析物検出用途、限定されないがポリヌクレオチドシーケンシングのために使用することができる。分析物は、タンパク質でありうる。一態様では、低イオン強度でＤＮＡを移行する方法が本明細書に記載される。方法は、（ａ）低イオン強度溶液に、本明細書に記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアと膜（例えば、人工膜）とを供給するステップであり、ここで修飾ＣｌｙＡナノポアは、修飾ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ開口部が低イオン強度溶液のｃｉｓ側に存在し、修飾ＣｌｙＡナノポアのｔｒａｎｓ開口部が低イオン強度溶液のｔｒａｎｓ側に存在するように、膜に存在する、ステップと、（ｂ）低イオン強度溶液のｃｉｓ側にＤＮＡを供給するステップと、（ｃ）ＤＮＡが、修飾ＣｌｙＡナノポアを通じてｃｉｓ側からｔｒａｎｓ側へ移行するように、修飾ＣｌｙＡナノポアにわたり電位を印加するステップとを含む。一例では、低イオン強度溶液は、約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有する塩溶液（例えば、塩化ナトリウム溶液）でありうる。そのような方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を特徴付けるために使用することができる。
【００１７】
したがって、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法も本明細書に提供される。方法は、（ａ）低イオン強度溶液（例えば、約１５０ｍＭから約３００ｍＭの）に、本明細書に記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアと膜とを供給するステップであり、ここで修飾ＣｌｙＡナノポアは膜に存在する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の低イオン強度溶液に標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、（ｃ）ナノポアにわたり電位を印加する間に、修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップとを含む。本明細書に記載の方法を使用して決定することができる標的ポリヌクレオチドの特徴の非限定的な例としては、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、およびそれによる標的ポリヌクレオチドの特徴付け、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００１８】
本明細書に記載のいずれかの態様では、標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡでありうる。
【００１９】
本明細書に記載のいずれかの態様では、方法は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合し、修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質を低イオン強度溶液に添加するステップをさらに含むことができる。
【００２０】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、下記の詳細な説明で示される。本開示の他の特色または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明、さらに添付の特許請求の範囲から明らかである。
【００２１】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本開示のある特定の態様は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することによって、より良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＤＮＡ移行のためのＣｌｙＡナノポアの改変を示す図である。パネルＡ）大腸菌（E. coli）ＣｌｙＡ構造（ＰＤＢ：２ＷＣＤ、９０％配列同一性）からホモロジーモデリングによって構築した脂質二重層に埋め込まれたＣｌｙＡ−ＡＳおよびＣｌｙＡ−ＲＲナノポアの断面。内側ポア内腔は、表面描写で示され、「真空内（in vacuo）」静電に従って影を付している（濃い影は負の領域を示し、薄い影は正の領域を示す。Ｐｙｍｏｌ）。試験したアミノ酸置換は、ＣｌｙＡ−ＡＳに示している（左）。ＣｌｙＡ−ＲＲポアは、１１０位および６４位にプロテオマーごとに２個の追加のアルギニン残基を含有する（右）。パネルＢ）ＣｌｙＡ−ＡＳおよびＣｌｙＡ−ＲＲについての電流対電圧の関係。生理学的イオン強度で＋７０ｍＶでのＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じたパネルＣ）ｓｓＤＮＡ（１ａ、１μＭ）および（パネルＤ）ｄｓＤＮＡ（１、１７０ｎＭ）移行。下の電流トレースは、ＤＮＡ移行イベントの規模を示す。電流信号は、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用して１０ｋＨｚで取得した。緩衝液は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５であり、温度は２２℃であった。
【図２】１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液におけるＤＮＡロタキサン形成を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡロタキサンは、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）で複合体化したハイブリッドｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡスレッド１ａ／１ｃ（１．０μＭ）をｃｉｓコンパートメントへ添加することによって＋５０ｍＶで形成された。１ａ／１ｃは３１塩基一本鎖オーバーハングを５’に含有し、これを使用して、１ａ／１ｃのｓｓＤＮＡオーバーハングに相補的なビオチン化ｓｓＤＮＡ分子である１ｄ（１．０μＭ）とハイブリダイズさせた。したがって、ナノポア／ＤＮＡロタキサンは、１ａ／１ｃがナノポアを移行する場合にのみ形成される。ＤＮＡがＣｌｙＡの内腔を占めたとき、開口ポア電流は、正に印加された電位（ＩＲＥＳ＋５０＝８４±７、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）で減少し、負に印加された電位（ＩＲＥＳ−５０＝１．１１±０．０６、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）で増加した。パネルＢ）ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡハイブリッドロタキサンは、＋５０ｍＶで、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）で複合体化した５’ビオチン化ｓｓＤＮＡスレッド２ａ（１．０μＭ、黒線）を、ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアのｃｉｓコンパートメントへ添加することによって形成された。２ａの３’端と相補的であり、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）と複合体化した第２の５’ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子２ｂ（１．０μＭ）をｔｒａｎｓコンパートメントへ添加した。ロタキサン形成時に、−５０ｍＶへの印加電位の逆転により、電流増加が誘導され（ＩＲＥＳ−５０＝１．１６±０．０３、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）、ハイブリッドｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡが構築されていることが示された。右側の電流トレースは、ロタキサン構成における遊離ＣｌｙＡ−ＲＲおよびＣｌｙＡ−ＲＲについての電圧関係（ＩＶ曲線）を示す。図２のパネルＡおよびＢにおける黒線および灰色線は、２つのロタキサンのＤＮＡ構成を示す。使用した緩衝液は、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５であり、温度は２２℃であった。ＤＮＡ配列を表３に示す。
【図３】ＤＮＡ移行および通過のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡ（丸）およびｓｓＤＮＡ（三角）についての移行頻度のデバイ強度依存性。ｄｓＤＮＡ移行イベントの頻度は直線回帰（Ｒ２＝０．９８）に良くフィットしたが、ｓｓＤＮＡの頻度は直線回帰（Ｒ２＝０．７８）よりも単一指数回帰（Ｒ２＝０．９９）に良くフィットした。パネルＢ）ｄｓＤＮＡ（三角）およびニュートラアビジン：ｄｓＤＮＡ複合体（丸）封鎖の残留電流の、溶液デバイ長に対する依存性。線は直線回帰を表す。パネルＣ）ｓｓＤＮＡについてであること以外、パネルＢと同じ。パネルＤ）ＤＮＡ通過のイオン強度依存性。＋７０ｍＶの印加電位下で、ＣｌｙＡ−ＲＲのｃｉｓ側へのｓｓＤＮＡの最初の添加（１ａ、１μＭ）は、ＣｌｙＡ−ＲＲ開口ポア電流への高速電流封鎖を誘導した。その後のニュートラアビジンの添加（１．２μＭ、ｃｉｓ）は、１５０および３００ｍＭのＮａＣｌ溶液における長く続く電流封鎖を誘導し、これはおそらくｓｓＤＮＡの通過による。これは１Ｍの（またはより高い）ＮａＣｌ溶液では観察されず、封鎖は一過性のままであった。相補的（complimentary）ｓｓＤＮＡ（１ａ、１μＭ、ｃｉｓ）のさらなる添加は、全てのイオン強度でｄｓＤＮＡの通過による永続性封鎖を誘導した。それぞれの永続性ＤＮＡ捕捉イベントの後、電位を手動で−７０ｍＶへ逆転することによって開口ポアが再生した。開口ポア電流レベルを上回るおよび下回るスパイクは、電位逆転後の容量過渡を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録し、表７に示す。１５０ｍＭのＮａＣｌで、追加のデジタル２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを電流トレースに適用した。
【図４】ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じた一方向性ＤＮＡ移行を示す図である。パネルＡ）１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液では、ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアのｃｉｓおよびｔｒａｎｓ側の両方への３μＭのｄｓＤＮＡ１の添加は、正に印加された電位下でのみ一過性の電流封鎖（灰色の垂直線）を誘導した。パネルＢ）１．０ＭのＮａＣｌ溶液では、ＤＮＡ封鎖は、両方の印加電位下で観察される。ＤＮＡ誘導封鎖は、灰色の垂直線として示す。印加電位は、２１秒間で＋７０から−７０ｍＶへ（パネルＡ）または＋１００から−１００ｍＶへ（パネルＢ）自動的に変化した。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは２ｋＨｚ（パネルＡ）および１０ｋＨｚ（パネルＢ）ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ、パネルＡ）および５０ｋＨｚ（パネルＢ）のサンプリングレートを使用して記録した。
【図５】ＣｌｙＡナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の機構を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡ移行。（１）ｄｓＤＮＡは、最初にナノポアのｃｉｓ入り口で電荷と相互作用する。（２）ｄｓＤＮＡは、ナノポア内部に入り込み、そこで第２の改変電荷と相互作用する。両方の電荷が、負荷電ｔｒａｎｓ型くびれを通じた移行を生じさせるために、ＤＮＡを整列させるために重要である。その後、（３）ｄｓＤＮＡは移行することができ、その後、（４）ポアを出ることができる。パネルＢ）（１）ｃｉｓ入り口での追加的電荷は、ナノポアの内部へのＤＮＡの効率的な捕捉を媒介する。（２）ｓｓＤＮＡはおそらくコイル構造としてｃｉｓ内腔に入る。（３）ｔｒａｎｓ型くびれを移行するために、ｓｓＤＮＡは解け、その後、ナノポアの外で再コイル化する必要がある。（４）ＤＮＡはナノポアを出る。ＤＮＡ分子およびナノポアは所定の縮尺で描かれている。Ｒｇは、ｓｓＤＮＡの回転半径を示す。実験条件下で、ｄｓＤＮＡは剛性ロッドであり、ｓｓＤＮＡは約６ｎｍの回転半径を有するコイル構造である。
【図６】０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中のＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ側からのＤＮＡ移行を示す図である。示された各変異体（パネルＡ〜Ｇ）について、次のことが報告される：１μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）のｃｉｓコンパートメントへの添加前および後の正のＶＧ印加電位下でのＩＶ関係（２１秒および１０ｍＶ電圧ステップにおける＋１００から−１００ｍＶへの電圧ランプ）および代表的電流トレース（表５）。またその後に１．２μＭのニュートラアビジン（モノマー）および１μＭの相補的ｓｓＤＮＡ（１ｂ、表１）をｃｉｓ溶液に添加した後の様々な電流トレースも示している。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
【図７】ｓｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ〜Ｆは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。（左側）様々なＮａＣｌ濃度で＋７０ｍＶ下で１μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）のポアのｃｉｓ側への添加前および後のＣｌｙＡ−ＲＲナノポアの開口ポア電流を示す代表的電流トレース。右側のヒストグラムは、個々のｓｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（ｔＯＦＦ、左のヒストグラム）およびイベント間時間（inter-event time）（ｔＯＮ、右のヒストグラム）を表す。個々のｔｏｆｆおよびイベント間時間ｔｏｎイベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデータ獲得閾値を使用して、独立的に収集した。平均ＤＮＡ移行滞留時間ｔＯＦＦは、累積ヒストグラムから単一指数フィットにより計算した。イベント間時間ｔＯＮは、対数ビン（底１０）を使用してヒストグラムから指数対数確率フィッティングにより計算した。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。
【図８】ｄｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ〜Ｅは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。電流トレースは、＋７０ｍＶ下および示されたＮａＣｌ濃度でポアのｃｉｓ側への１７０ｎＭのｄｓＤＮＡ（１、表３）の添加前（左）および後（右）のＣｌｙＡ−ＲＲナノポアの開口ポア電流を示す。右側のヒストグラムは、個々のｓｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（ｔＯＦＦ、左のヒストグラム）およびイベント間時間（ｔＯＮ、右のヒストグラム）を表す。個々のｔＯＦＦおよびイベント間時間ｔＯＮイベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデータ獲得閾値を使用して、独立的に収集した。平均ＤＮＡ移行滞留時間τｏｆｆを累積ヒストグラムから単一指数フィットにより計算した。イベント間時間τｏｎを、対数ビン（底１０）を使用してヒストグラムから指数対数確率フィッティングにより計算した。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。
【図９】１ＭのＮａＣｌでのｔｒａｎｓ側からのＤＮＡロタキサンの形成を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡロタキサンを、−７０ｍＶの印加電位下で、ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）と複合体化したハイブリッドｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡスレッドＴ１ｄ（１ａおよび１ｃ、１．０μＭ、表３、電流トレースの上の黒線として表示）を、ｔｒａｎｓナノポアコンパートメントに添加することにより形成した。Ｔ１ｄのオーバーハングに相補的な３’ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子、１ｄ（１．０μＭ、表３、電流トレースの上の灰色線に相当）をｃｉｓコンパートメントに添加した。ナノポア／ＤＮＡロタキサンは、Ｔ１ｄがナノポアを通じて移行されて１とハイブリダイズした場合にのみ形成されるので、この実験により、ｃｉｓからｔｒａｎｓへのＣｌｙＡを通じたＤＮＡの移行が証明される。−７０ｍＶで通過したＤＮＡの封鎖ポア電流は６４±２．０、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）であった。ロタキサン形成後、＋７０ｍＶへの印加電位の逆転は、封鎖ポア電流（ＩＲＥＳ＋７０＝７３±０．５、平均±Ｓ．Ｄ．、Ｎ＝３）を示し、ｄｓＤＮＡがナノポアを占有していることを示している。パネルＢ）ロタキサン構成におけるＣｌｙＡ−ＲＲおよびＣｌｙＡ−ＲＲについてのＩＶ関係。
【図１０】０．１５ＭのＮａＣｌ溶液中でのｔｒａｎｓ側からのＤＮＡの移行を観察するためのポア改変を示す図である。パネルＡ〜Ｉに示した各変異体について、次のことが報告される：１μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）のｔｒａｎｓコンパートメントへの添加前および後の正のＶＧ印加電位下でのＩＶ関係（２１秒および１０ｍＶ電圧ステップで＋１００から−１００ｍＶへの電圧ランプ）および代表的電流トレース。またその後に１．２μＭのニュートラアビジン（モノマー）および１μＭの相補的ｓｓＤＮＡ（１ｂ、表１）をｔｒａｎｓ溶液に添加した後の様々な電流トレースも示している。ＤＮＡのｔｒａｎｓチャンバーへの添加後にＣｌｙＡ−３Ｒ−Ｅ７Ｓは電流封鎖を示したが、ロタキサンを形成することはできず、封鎖がＤＮＡの移行によるものではないことが示唆された。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
【図１１】ＤＮＡ移行のためのＣｌｙＡナノポアの改変を示す図である。パネルＡ）ＶＭＤおよびＮＡＭＤを使用して大腸菌（Escherichia coli）ＣｌｙＡ構造（ＰＤＢ：２ＷＣＤ、９０％配列同一性）からホモロジーモデリングによって構築された脂質二重層に埋め込まれたＣｌｙＡ−ＡＳ（左）およびＣｌｙＡ−ＲＲ（右）ナノポアの断面。内側ポア内腔は、ＰｙＭＯＬ（バージョン１．８、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）によって計算される溶媒が接近可能な表面積を使用して示し、アダプティブポアソンボルツマンソルバ（adaptive Poisson-Boltzmann solver、ＡＰＢＳ）によって計算される１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中の静電電位に従って影を付している。影を付した領域は負および正の電位（−２から＋２ｋＢＴ／ｅまたは−５１．４から＋５１．４ｍＶの範囲）に対応する。パネルＢ）１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度でのＣｌｙＡ−ＡＳおよびＣｌｙＡ−ＲＲナノポアの中心の静電電位。
【図１２】１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液における＋５０ｍＶでのＤＮＡロタキサン形成を示す図である。パネルＡ）１ａ／１ｃ（１．０μＭ、黒線）および１ｄ（１．０μＭ、灰色線）を、それぞれｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンパートメントに添加することによってｄｓＤＮＡロタキサンを形成した。ニュートラアビジン（ＮＡ、０．３μＭ、四量体）も両方の溶液に添加した。パネルＢ）ｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡハイブリッドロタキサンは、５’−ビオチン化ｓｓＤＮＡスレッド２ａ（１．０μＭ、黒線）のｃｉｓコンパートメントへの添加および２ａの３’端に相補的な５’−ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（２ｂ、１．０μＭ、灰色線）のｔｒａｎｓコンパートメントへの添加によって形成された。ＮＡ（０．３μＭ、四量体）は両側に存在した。電流トレースの右側のグラフは、ロタキサン構成におけるＣｌｙＡ−ＲＲおよびＣｌｙＡ−ＲＲについての電圧関係（Ｉ−Ｖ曲線）を示す。実験は、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する緩衝液中で、２２℃で実施した。ＤＮＡ配列を表３に示す。
【図１３】＋７０ｍＶ下でのＤＮＡ移行および通過のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ〜Ｂ）１μＭのＤＮＡあたりのｄｓＤＮＡ（パネルＡ）およびｓｓＤＮＡ（パネルＢ）移行の頻度の、デバイ長依存性。（パネルＡ）の点線は、拡散律速プロセスに対する移行頻度の理論的予測を示す。（パネルＢ）の線は、障壁律速プロセスを示す指数的回帰である。
【図１４】ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の機構を示す図である。パネルＡ）ｄｓＤＮＡ移行は、拡散律速である。（ｉ）実験条件下、剛性ロッドであるｄｓＤＮＡは、電場線によって整列され、規定の方向でナノポアに入る。（ｉｉ）ｄｓＤＮＡはナノポア内に入り込み、ここで第２の改変された電荷の層と相互作用する。その後、（ｉｉｉ）ｄｓＤＮＡはくびれを移行することができ、（ｉｖ）ポアを出ることができる。ナノポアのｃｉｓ側入口における電荷は最初の捕捉を援助する。パネルＢ）ｓｓＤＮＡ移行は反応律速である。（ｉ）ｓｓＤＮＡは、ナノポアの半径の約２倍である回転半径（Ｒｇ≒６ｎｍ）を有するコイル構造を有する。（ｉｉ）ｓｓＤＮＡはまだポア内にいないが、入口を捜し求めている。（ｉｉｉ）ｓｓＤＮＡの一端は、ｃｉｓ内腔の入口を見つけ、解け始める。ナノポアに入るためにはエントロピーエネルギー障壁があるので、移行イベントを成功させるために数回の試みがなされうる。（ｉｖ）くびれを移行するために、ｓｓＤＮＡは完全に解ける必要がある。（ｖ）ＤＮＡはナノポアを出て、その後、再コイル化する。ｃｉｓ側入口での追加的電荷は、ナノポア内部のＤＮＡの効率的な捕捉をおそらく媒介する。ＤＮＡ分子およびナノポアは所定の縮尺で描かれている。
【図１５】ＤＮＡ通過のイオン強度依存性を示す図である。ｓｓＤＮＡ（１ａ、１．０μＭ）を、ＣｌｙＡ−ＲＲのｃｉｓ側に最初に添加し、次いでニュートラアビジン（ＮＡ、０．３μＭ、ｃｉｓ）、最後に相補的ｓｓＤＮＡ（１ｂ、１μＭ、ｃｉｓ）を添加した。１５０および５００ｍＭのＮａＣｌ溶液では、ｓｓＤＮＡ：ＮＡ複合体は、長く続く電流封鎖を誘導し、これはおそらくｓｓＤＮＡの通過による。１．０Ｍ（またはより高い）のＮａＣｌ溶液では、ｓｓＤＮＡ：ＮＡ封鎖は一過性であり、ｓｓＤＮＡがポアを完全に通過できなかったことを示唆した。ｄｓＤＮＡ：ＮＡ複合体は、全てのイオン強度で永続性封鎖を誘導した。開口ポア電流レベルを上回るおよび下回るスパイクは、ＤＮＡからナノポアを自由にするために使用した手動の電位逆転後の容量過渡を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。
【図１６】ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じたｓｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ〜Ｆは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。電流トレースは、＋７０ｍＶ下で様々なＮａＣｌ濃度でポアのｃｉｓ側への１．０μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（１ａ、表３）の添加前または後のＣｌｙＡ−ＲＲの開口ポア電流を示す。トレースの右側のヒストグラムは、ｄｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（左のヒストグラム、従来のビニング単一指数フィット）およびイベント間時間（右のヒストグラム、対数の底１０、指数対数確率フィット）を表す。散乱プロットは、電流対滞留時間を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。
【図１７】ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡ移行のイオン強度依存性を示す図である。パネルＡ〜Ｅは、様々な塩濃度またはイオン強度についてのデータを示す。電流トレースは、＋７０ｍＶ下で様々なＮａＣｌ濃度でのポアのｃｉｓ側への１４０〜１７０ｎＭのビオチン化ｄｓＤＮＡ（１、表３）の添加前または後のＣｌｙＡ−ＲＲの開口ポア電流を示す。トレースの右側のヒストグラムは、ｄｓＤＮＡ移行イベントの滞留時間（左のヒストグラム、従来のビニング単一指数フィット）およびイベント間時間（右のヒストグラム、対数の底１０、指数対数確率フィット）を表す。散乱プロットは、電流対滞留時間を表す。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、５０ｋＨｚサンプリングレートを使用して記録した。追加の２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを使用して、データを０．１５ＭのＮａＣｌ溶液で収集した。
【図１８】１ｋＨｚでフィルタリングしたＤＮＡ移行頻度のイオン強度依存性を示す図である。１ｋＨｚのデジタルＧａｕｓｓｉａｎフィルター（Ｃｌａｍｐｆｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してフィルタリングした電流トレースから決定される、（パネルＡ）ｄｓＤＮＡおよび（パネルＢ）ｓｓＤＮＡについてのイベント頻度の塩依存性。線は、直線的（パネルＡ）および指数的（パネルＢ）回帰フィットを示す。
【図１９】ナノポア近傍のｓｓＤＮＡに作用するエントロピーおよび電気泳動力を示す図である。ｓｓＤＮＡはコイル形状を有し、障壁横断を介してポアによって捕捉されると予測される（反応律速プロセス）。障壁は、電気泳動引力の上面に作用するポアの周辺におけるエントロピー起源の反発力に由来する。これらの２つの寄与についての自由エネルギーは細線で示され、一方で太線は２つの合計である（式（１５））。図の上部は、反応座標γａおよびγｂによって特徴付けられるｓｓＤＮＡの２つの特徴的構成をそれぞれ示す。構成（ｂ）は低いエントロピーを有し、障壁の頂部に近い状態に相当する。
【図２０】ＣｌｙＡの構造を示す図であり、ｃｉｓ部はＡとして示され、中間部はＢとして示され、ｔｒａｎｓ部はＣとして示される。負に荷電したアミノ酸ＤおよびＥは、（極性、非荷電アミノ酸ＳおよびＱと共に）図の左側に示される。極性非荷電アミノ酸または負に荷電したアミノ酸の１つまたは複数の置換がＡで行われてもよく、負に荷電したアミノ酸の１つまたは複数の置換がＢで行われてもよい。いくつかの負に荷電したアミノ酸を含有する領域Ｃは、中性または正に荷電したアミノ酸の置換がなく、そのままでありうる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
膜貫通ポア（例えば、タンパク質ナノポアまたは固体ナノポア）はバイオポリマーを検出または特徴付けるためのセンサーとして有用であるが、低イオン強度（例えば、約１５０ｍＭから約３００ｍＭ）である特定のナノポアを通じた、バイオポリマー、例えば、ポリヌクレオチドの移行は難題である場合があった。特に負の内部表面電荷を有する部分と、負に荷電したバイオポリマーの大きさと匹敵する半径（例えばｄｓＤＮＡのＢフォームについて約２．２ｎｍおよびｓｓＤＮＡについて約１ｎｍ）を有するナノポアは、低イオン強度での負に荷電したバイオポリマーのナノポアへの進入に対して大きな静電障壁を生じうる。したがって、ナノポアにわたる負に荷電したバイオポリマー、例えばポリヌクレオチドのより効率的な捕捉および／または移行を可能にする膜貫通ナノポアを設計する必要がある。そのナノポアは、ポリヌクレオチドマッピングまたはシーケンシングなどの実用的用途のために有用でありうる。
【００２４】
本開示は、正電荷を膜貫通ナノポア、例えば細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）の内腔表面へ、ある特定の位置で導入して、負に荷電した狭いくびれ（例えば、約３．３ｎｍの寸法を有する）を通じたＤＮＡ移行のエントロピーおよび静電障壁を克服することができるという、予期されなかった発見に少なくとも部分的に基づく。例えば、ＣｌｙＡナノポアの広い方の入口（ｃｉｓ側）および中間部での正電荷（例えばアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸）の導入が、負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれ自体に何らの修飾が存在しない場合でも、狭く負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれを通じた有効な電気泳動駆動スライディングのためにＤＮＡ（例えば、二本鎖または一本鎖）を「把持（grab）」し、配向させるために十分であることが発見された。さらに、そのような修飾が、例えば５０ｍＭ程度の低イオン強度でのＤＮＡ移行を可能にすることが発見された。原理的に、修飾は、本明細書に記載のいずれかの態様の方法を、５０ｍＭより低いイオン強度でさえも実施することを可能にする。しかしながら、低いイオン強度は対応して低いイオン電流を生じさせる可能性があるため、いくつかの状況では、望ましくない場合がある。そのような修飾なしでは、ナノポアを通じた一本鎖または二本鎖ＤＮＡの移行は、２．０Ｍを超えるイオン強度でのみ観察された。
【００２５】
したがって、一部の態様では、本開示は、（例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアを形成するための）修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびそれを含むナノポアを提供する。本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアは、ポリヌクレオチドの特徴付けなどの様々な実用的用途のために使用することができる。したがって、二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを特徴付けるための方法および組成物も本明細書に記載される。本明細書に記載の方法および組成物は、生理学的イオン強度（例えば５０ｍＭ〜３００ｍＭ）または低イオン強度（例えば、２Ｍ未満、または１Ｍ未満）での二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドの効率的な移行を提供する。
【００２６】
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび方法は、ポリヌクレオチドの一方向の移行を可能にする、つまりポリヌクレオチドがナノポアにｔｒａｎｓからｃｉｓ方向へ入るおよび通過することができない。これにより、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）のｃｉｓからｔｒａｎｓ方向へのフィルタリングが可能になる。
【００２７】
またＣｌｙＡナノポアのナノポア構造と同様のナノポア構造（例えば、ｃｉｓ開口部でより大きな直径（例えば、５〜７ｎｍ）を有し、ｔｒａｎｓ開口部で負に荷電したより狭いくびれ（例えば、直径３〜４ｎｍ）を有する円筒形の内腔）を有する他のナノ構造も、低イオン強度溶液でＤＮＡ移行を可能にする同様の修飾ストラテジーをとりうると考えられる。
【００２８】
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド
本開示の一態様は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを提供する。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、その配列が参照ＣｌｙＡアミノ酸配列とは異なっているポリペプチドである。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列は、（ｉ）ｃｉｓ開口部形成アミノ酸配列、（ｉｉ）中間部形成アミノ酸配列、および（ｉｉｉ）ｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列を含む。ｃｉｓ開口部形成アミノ酸配列は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して、膜にナノポアを形成するときの、ナノポアのｃｉｓ開口部の部位を形成するアミノ酸配列の一部である。中間部形成アミノ酸配列は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して膜にナノポアを形成するときのナノポアの中間部の部位を形成するアミノ酸配列の部分である。ｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドが他のサブユニットポリペプチドと相互作用して、膜にナノポアを形成するときのナノポアのｔｒａｎｓ開口部の部位を形成するアミノ酸配列の部分である。ＣｌｙＡナノポアのｃｉｓ部分、中間部およびｔｒａｎｓ部分に対応するＣｌｙＡアミノ酸配列の部分を同定する方法は、当技術分野で公知であり、実施例にも記載されている。例えば、部分が膜に埋め込まれたナノポアは、例えば、Humphrey et al., "VMD: Visual Molecular Dynamics" J. Mol. Graphics (1996) 14: 33-38に記載のＶＭＤ、および例えばPhillips et al., "Scalable Molecular Dynamics with NAMD" J. Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802に記載のＮＡＭＤを使用して、公知のＣｌｙＡ構造からホモロジーモデリングによって構築することができる。例えば、図１Ａを参照。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「参照ＣｌｙＡアミノ酸配列」は、ＣｌｙＡナノポアサブユニットの公知のアミノ酸配列を指す。ＣｌｙＡナノポアサブユニットの様々な形態は、当技術分野で公知であり、例えば、限定されないが、ＣｌｙＡ野生型（ＣｌｙＡ−ＷＴ）、ＣｌｙＡ−ＳＳ、ＣｌｙＡ−ＣＳおよびＣｌｙＡ−ＡＳが挙げられる。例えば、ＣｌｙＡ−ＳＳ、ＣｌｙＡ−ＣＳおよびＣｌｙＡ−ＡＳにおけるＣｌｙＡ−ＷＴに対する様々な変異ならびにそれらの作製方法を記載するSoskine et al. "Tuning the size and properties of ClyA nanopores assisted by directed evolution" J Am Chem Soc. (2013) 135: 13456-13463を参照。国際公開第２０１６／１６６２３２号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１５３６２５号パンフレットに記載の任意のＣｌｙＡアミノ酸配列を、参照ＣｌｙＡアミノ酸配列として使用することもできる。一実施形態では、参照ＣｌｙＡアミノ酸配列は、配列番号１に示すＣｌｙＡ−ＷＴのアミノ酸配列である。一実施形態では、参照アミノ酸は、配列番号１に示すＣｌｙＡ−ＷＴのアミノ酸配列（amino sequence）と比較して、以下の変異：Ｃ８７Ａ、Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６Ｙ、Ｉ２０３Ｖ、Ｃ２８５Ｓ、Ｋ２９４Ｒを含有する、配列番号２に示すＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列である。一部の実施形態では、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列は、ＣｌｙＡ−ＷＴのアミノ酸配列と比較して、さらにＨ３０７Ｙを含むことができる。
【００３０】
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、参照ＣｌｙＡアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を含む。当技術分野の標準的方法を使用してホモロジーを決定してもよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、例えばデフォルト設定で使用されるホモロジーを計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300、Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ホモロジーを計算するまたは配列を並べる（例えば、（通常、デフォルト設定での）等価な残基または対応する配列を同定する）ために使用することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。
【００３１】
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列は、ｃｉｓ開口部形成アミノ酸配列内の位置に（ｉ）第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）、および中間部形成アミノ酸配列内の位置に（ｉｉ）第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む。第１および第２の正電荷修飾（例えば、第１および第２の正に荷電した置換）は、参照ＣｌｙＡアミノ酸配列と比較して、ナノポアを通じた負に荷電したポリマー（例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡなどのポリヌクレオチド）の捕捉および／または移行のより高い頻度を提供するように選択される。
【００３２】
一実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列の１１０位でありうる。一部の実施形態では、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、以下の位置：配列番号１または配列番号２のＥ１０６、Ｄ１１４、Ｄ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２９、Ｅ８５、Ｅ７８、Ｄ２６８、Ｄ２６７、Ｄ２６５、Ｅ２５８の１つまたは複数で行われてもよい。一部の実施形態では、ＣｌｙＡアミノ酸配列（例えば、配列番号１または２に示す）は、そのＮ末端にさらなるアミノ酸「ＭＩ」を含むように修飾または改変されていてもよい。
【００３３】
一実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列の６４位でありうる。一部の実施形態では、正電荷（例えば、正に荷電したアミノ酸）による置換は、以下の位置：配列番号１または配列番号２のＤ７４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ４２、Ｄ４１の１つまたは複数で行われてもよい。
【００３４】
用語「正に荷電したアミノ酸の置換」は、本明細書で使用されるとき、参照アミノ酸の、例えばｐＨ７．０〜８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０〜２５℃で検出される正味の正電荷を増加させるまたは正味の負電荷を減少させる参照アミノ酸への修飾を指す。例えば、正に荷電したアミノ酸の置換には、限定されないが、（ｉ）負に荷電したアミノ酸を、それほど負に荷電していないアミノ酸、中性アミノ酸もしくは正に荷電したアミノ酸で置き換えること、（ｉｉ）中性アミノ酸を正に荷電したアミノ酸で置き換えること、または（ｉｉｉ）正に荷電したアミノ酸をより正に荷電したアミノ酸で置き換えることを含むことができる。一部の実施形態では、正に荷電したアミノ酸の置換は、負に荷電したアミノ酸の欠失または正に荷電したアミノ酸の付加を含みうる。一部の実施形態では、正に荷電したアミノ酸の置換は、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸の、それらの負電荷を中和する１つまたは複数の化学修飾を含みうる。例えば、１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸をカルボジイミドと反応させてもよい。
【００３５】
正に荷電したアミノ酸は、溶液のｐＨより高い等電点（ｐＩ）を有し、したがって溶液中でアミノ酸が正味の正電荷を保有する、アミノ酸である。例えば、ｐＨ７．０〜８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０〜２５℃で検出される正に荷電したアミノ酸の例としては、限定されないが、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）が挙げられる。負に荷電したアミノ酸は、溶液のｐＨより低いｐＩを有し、したがって溶液中でアミノ酸が正味の負電荷を保有する、アミノ酸である。ｐＨ７．０〜８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０〜２５℃で検出される負に荷電したアミノ酸の例としては、限定されないが、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）が挙げられる。中性アミノ酸は、溶液のｐＨと同じ等電点（ｐＩ）を有し、したがって溶液中でアミノ酸が正味の電荷を保有しない、アミノ酸である。アミノ酸のｐＩ値は、当技術分野で公知である。目的のアミノ酸のｐＩ値を溶液のｐＨと比較することにより、当業者は、溶液中に存在するアミノ酸が正に荷電したアミノ酸であるか、中性アミノ酸であるか、または負に荷電したアミノ酸であるかを容易に決定することができる。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸または合成アミノ酸でありうる。
【００３６】
一部の実施形態では、例えばｐＨ７．０〜８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温、例えば２０〜２５℃で検出される第１および／または第２の正に荷電したアミノ酸の置換には、限定されないが、参照アミノ酸をアルギニン、ヒスチジンおよびリジンのうちの１つで置換することが含まれる。
【００３７】
一部の実施形態では、第１の正に荷電したアミノ酸の置換はＳ１１０Ｒであり、ここで１１０位は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸１１０に対応する。
【００３８】
一部の実施形態では、第２の正に荷電したアミノ酸の置換はＤ６４Ｒであり、ここで６４位は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸６４に対応する。
【００３９】
本明細書に記載の第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換に加えて、アミノ酸の置換、例えば、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または３０個の置換を参照ＣｌｙＡアミノ酸配列に行いうる。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖体積を有する他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と、類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有しうる。代替的に、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は当技術分野で周知であり、下記表Ａに定義される２０種の主要なアミノ酸の特性に従って選択しうる。これは、アミノ酸が同様の極性を有する場合、表Ａに示すアミノ酸側鎖のハイドロパシースケールを参照することによって決定することもできる。
【００４０】
【表１】
2019507583.tif 000003
【００４１】
【表２】
2019507583.tif 000004
【００４２】
配列番号１または２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基が、上記のポリペプチドからさらに欠失してもよい。最大１、２、３、４、５、１０、２０または３０個の残基が欠失してもよく、またはそれ以上が欠失してもよい。
【００４３】
１つまたは複数のアミノ酸が、代替的にまたは付加的に上記のポリペプチドに付加されてもよい。配列番号１もしくは２のアミノ酸配列またはそのポリペプチドバリアントもしくはそのフラグメントのアミノ末端またはカルボキシ末端に伸長が与えられてもよい。伸長は非常に短く、例えば１から１０アミノ酸の長さであってもよい。代替的に、伸長はより長く、例えば最大５０または１００アミノ酸であってもよい。キャリアタンパク質は、アミノ酸配列、例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列に融合されていてもよい。他の融合タンパク質は、以下により詳細に説明されている。
【００４４】
アミノ酸を（例えば、置換、付加または欠失により）修飾するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、参照アミノ酸は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する位置で、参照アミノ酸についてのコドンを標的アミノ酸についてのコドンで置き換えることによって、標的アミノ酸で置換してもよい。次いでポリヌクレオチドは、以下で説明されるように発現されうる。アミノ酸が非天然アミノ酸である場合、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを発現するために使用されるＩＶＴＴ系に、合成アミノアシル−ｔＲＮＡを含めることによって導入してもよい。代替的に、特定のアミノ酸の合成（つまり非天然）アナログの存在下で特定のアミノ酸に対して栄養要求性である大腸菌（E. coli）で、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを発現することによって導入してもよい。また、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドが部分ペプチド合成を使用して製造される場合、ネイキッドライゲーション（naked ligation）によって製造してもよい。
【００４５】
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、例えば、ｐＨ７．０〜８．０（例えば、ｐＨ８．０）および室温（例えば、２０〜２５℃）で検出される正味の負電荷を保有してもよく、これは参照ＣｌｙＡアミノ酸配列の対応するｔｒａｎｓ開口部形成部分の正味の負電荷と（例えば、１０％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内またはそれ未満で）匹敵する。例えば、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、例えば、配列番号１または配列番号２に示す参照ＣｌｙＡアミノ酸配列の対応するｔｒａｎｓ開口部形成部分と、少なくとも約９５％以上（例えば、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または最大１００％など）同一でありうる。一実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのｔｒａｎｓ開口部形成アミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の対応するｔｒａｎｓ開口部形成部分と１００％同一である。
【００４６】
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを使用して、本明細書に記載されるホモ多量体ナノポアまたはヘテロ多量体ナノポアを形成してもよい。したがって、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、他のサブユニットポリペプチドを有するナノポアを形成する能力を保持する。修飾モノマーのナノポア形成能力を評価するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを、他の適切なサブユニットと共に両親媒性層に挿入して、オリゴマー化してポアを形成する能力を調べてもよい。サブユニットを、膜、例えば両親媒性層に挿入するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、サブユニットが膜に拡散し、膜に結合することにより挿入され、機能的な状態に構築されるように、サブユニットは、トリブロックコポリマー膜を含有する溶液中に精製された形態で懸濁されてもよい。代替的に、サブユニットは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に記載の「ピックアンドプレース（pick and place）」方法を使用して、膜に直接挿入されてもよい。
【００４７】
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ナノポア形成に干渉しない限り、非特異的修飾を含有してもよい。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野で公知であり、アミノ酸の側鎖に対してなされてもよい。そのような修飾としては、例えば、アルデヒドとの反応とその後のＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデートを用いたアミド化、または無水酢酸を用いたアシル化が挙げられる。
【００４８】
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、当技術分野で公知の標準的方法を使用して製造されうる。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、合成的にまたは組換え手段によって作製されうる。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポアおよび修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを製造するための適切な方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０（国際公開第２０１０／００４２７３号パンフレットとして公開）、ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）またはＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開）で説明されている。
【００４９】
本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸を使用して製造されうる。例えば、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含みうる。このことは、そのようなタンパク質またはペプチドの製造について当技術分野において一般的である。
【００５０】
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、化学的に修飾されてもよい。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、任意の方法でおよび任意の部位で化学的に修飾されうる。例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、染料または蛍光体の結合によって化学的に修飾されてもよい。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、１つもしくは複数のシステイン（システイン結合）への分子の結合、１つもしくは複数のリジンへの分子の結合、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の結合、エピトープの酵素修飾または末端の修飾によって化学的に修飾されてもよい。そのような修飾を実施するための適切な方法は、当技術分野で周知である。
【００５１】
一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むナノポアと標的ヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列との間の相互作用を促進する分子アダプターで化学的に修飾されていてもよい。アダプターの存在は、ナノポアおよびヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列のホスト−ゲスト化学を改善し、それによって修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドから形成されたポアのシーケンシング能力を改善する。ホスト−ゲスト化学の原理は、当技術分野で周知である。アダプターは、ナノポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列との相互作用を向上させるナノポアの物理的または化学的特性に影響を与える。アダプターは、ポアのバレルもしくはチャネルの電荷を変化させ、またはヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列と特異的に相互作用もしくは結合し、それによってポアとの相互作用を促進することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、分子アダプターは、環状分子、シクロデキストリン、ハイブリダイゼーションが可能な種、ＤＮＡ結合剤もしくはインターカレータ（interchelator）、ペプチドもしくはペプチドアナログ、合成ポリマー、芳香族平面分子、正に荷電した小分子また水素結合可能な小分子でありうる。
【００５３】
一部の実施形態では、分子アダプターは、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドに共有結合的に結合していてもよい。アダプターは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ナノポアに共有結合的に結合することができる。アダプターは、通常、化学結合を介して結合する。分子アダプターがシステイン結合を介して結合する場合、１つまたは複数のシステインが、置換によって修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドに導入されてもよい。
【００５４】
他の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えば、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびポリメラーゼに結合または連結されてもよい。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ヘリカーゼ、例えばＤＮＡヘリカーゼに結合または連結されてもよい。ナノポアシーケンシングの使用に適したヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびポリメラーゼの例は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、ヘリカーゼ、例えば、ＤＮＡヘリカーゼ、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットに記載）、ＲｅｃＤヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットに記載）、ＸＰＤヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１／０９８５６１号パンフレットに記載）またはＤｄａヘリカーゼ（例えば、国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレットに記載）に結合または連結されうる。これは標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法に使用しうるモジュール型シーケンシングシステムを形成する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、以下で説明される。移行の速度制御は、システムに添加されるポリヌクレオチド結合タンパク質の種類および／または燃料（ＡＴＰ）の量によって決定されうる。例えば、二本鎖ＤＮＡ分析物の移行の速度は、ＦｔｓＫなどの二本鎖ＤＮＡトランスロカーゼによって制御することができる。システムに添加された燃料（ＡＴＰ）に依存して、標的ポリヌクレオチドの移行速度は、約３０Ｂ／秒〜１０００Ｂ／秒の間でありうる。
【００５５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドに共有結合的に結合させることができる。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドに共有結合的に結合させることができる。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチド結合タンパク質は、化学的に融合または遺伝的に融合されてもよい。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびポリヌクレオチド結合タンパク質は、全構築物が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、遺伝的に融合される。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのポリヌクレオチド結合タンパク質への遺伝的融合は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（国際公開第２０１０／００４２６５号パンフレットとして公開）で説明されている。
【００５６】
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは、分子アダプターおよびポリヌクレオチド結合タンパク質で化学的に修飾されてもよい。
【００５７】
本明細書に記載のいずれかのタンパク質、例えば本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびナノポアは、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、またはポリペプチドが天然にそのような配列を含有していない細胞からそれらのタンパク質の分泌を促進するためのシグナル配列を付加することによって修飾してそれらの同定または精製が支援されてもよい。遺伝子タグを導入するための代替手段は、タンパク質の天然または改変された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、タンパク質の外側の改変されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモシジンヘテロオリゴマー（Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505）を分離するための方法として実証されている。
【００５８】
本明細書に記載のいずれかのタンパク質、例えば、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドおよびナノポアは、検出可能な標識で標識されてもよい。検出可能な標識は、タンパク質を検出することを可能にする任意の適切な標識でありうる。適切な標識としては、限定されないが、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドが挙げられる。
【００５９】
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む、本明細書に記載のいずれかのタンパク質は、当技術分野で公知の標準的方法を使用して製造することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して、誘導および複製することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を使用して、細菌宿主細胞で発現することができる。タンパク質は、組換え発現ベクターからポリペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕ発現により細胞で産生することができる。発現ベクターは、任意選択的に、ポリペプチドの発現を制御する誘導型プロモーターを保有する。これらの方法は、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
【００６０】
タンパク質は、タンパク質産生生物からまたは組換え発現後に任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製後、大規模に製造しうる。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムとしては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが挙げられる。
【００６１】
修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本明細書において、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド配列も提供される。
【００６２】
ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して、誘導および複製することができる。野生型ＣｌｙＡをコードする染色体ＤＮＡは、ポア産生生物、例えばチフス菌（Salmonella typhi）から抽出してもよい。ポアサブユニットをコードする遺伝子は、特定のプライマーを含むＰＣＲを使用して増幅してもよい。増幅された配列は、次いで、部位特異的変異誘発を受けうる。部位特異的突然変異誘発の適切な方法は、当技術分野で公知であり、例えば、連鎖反応の組合せが挙げられる。修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドは、周知の技術、例えば、Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載の技術を使用して作製しうる。
【００６３】
得られたポリヌクレオチド配列を、次いで、組換え複製ベクター、例えばクローニングベクターに組み込んでもよい。ベクターを使用して、適合する宿主細胞でポリヌクレオチドを複製してもよい。そのように、ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、ベクターを適合する宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製することができる。ベクターは宿主細胞から回収されうる。ポリヌクレオチドをクローニングするための適切な宿主細胞は、当技術分野で公知である。
【００６４】
本開示の別の態様には、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドまたは構築物を製造する方法が含まれる。方法は、適切な宿主細胞で修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのいずれかの実施形態をコードするポリヌクレオチドを発現するステップを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくはベクターの一部であり、好ましくはプロモーターに作動可能に連結されている。
【００６５】
修飾ＣｌｙＡナノポア
本開示の一態様は、例えば、修飾ＣｌｙＡナノポアへの負に荷電したポリマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチド）の捕捉および／または修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた負に荷電したポリマーの移行を可能にする修飾ＣｌｙＡナノポアを特色とする。修飾ＣｌｙＡナノポアは、第１の開口部と、中間部と、第２の開口部と、第１の開口部から中間部を通じて第２の開口部に延びる内腔とを含み、ここで第１の開口部の内腔表面は第１の正に荷電したアミノ酸の置換を含み、中間部の内腔表面は第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む。第２の開口部の内腔表面は負に帯電したくびれを画定する。第１の正に荷電したアミノ酸の置換および第２の荷電アミノ酸の置換は、上記の「修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド」の項目に詳細に記載されている。
【００６６】
説明の目的のためのみに、図１（パネルＡ）に、本明細書に記載の一実施形態による修飾ＣｌｙＡナノポアを示す。修飾ＣｌｙＡナノポアは、第１の開口部１０２、中間部１０４、および第２の開口部１０６を含む。内腔１０８は、第１の開口部１０２から中間部１０４を通じて第２の開口部１０６に延び、約１３ｎｍから約１５ｎｍの全長を有する。第１の開口部１０２および中間部１０４は、約５ｎｍから約７ｎｍの直径を有する。第２の開口部１０６の内腔表面は負に帯電したくびれ１１２を画定し、ここで最も狭い断面は約３ｎｍから約４ｎｍの直径を有する。修飾ＣｌｙＡナノポアの第２の開口部１０６（約３ｎｍから約５ｎｍの長さ）は、修飾ＣｌｙＡナノポアの存在する溶液が２つの側に分かれ、第１の開口部１０２が溶液の１つの側に存在し、負に帯電したくびれ１１２が溶液の別の側に存在するように、膜（例えば、二重層）１１０に挿入される。標的ポリマー（例えば、標的ポリヌクレオチド）が第１の開口部１０２と同じ側に添加されるとき、第１の開口部１０２はｃｉｓ開口部であり、第２の開口部１０６はｔｒａｎｓ開口部である。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「内腔表面」は、溶液に曝露される内腔の内部表面を指す。
【００６８】
本明細書で相互に交換可能に使用されるとき、用語「負に帯電したくびれ」または「負に荷電したくびれ」は、正味の負の表面電荷を有するくびれを指す。例えば、負に帯電したくびれを画定する第２の開口部の内腔表面は、図１（パネルＡ）に示すような正味の負の表面電荷を有する。
【００６９】
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）までの内腔内の距離は、約０．５ｎｍから約１０ｎｍ、または約３ｎｍから約７ｎｍの範囲内で変動しうる。一部の実施形態では、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）から第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）までの内腔内の距離は、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、または約９ｎｍでありうる。
【００７０】
任意の形態のＣｌｙＡを、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアを製造するために使用することができる。例えば、上記のように、ＣｌｙＡの様々な形態、例えば、限定されないが、野生型ＣｌｙＡ（ＣｌｙＡ−ＷＴ）およびＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列ならびにそれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。したがって、一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、本明細書に記載される参照ＣｌｙＡアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、野生型ＣｌｙＡに対応する配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポアは、ＣｌｙＡ−ＡＳのアミノ酸配列に対応する配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上など）同一であるアミノ酸配列を有するサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列と比較して、第１および第２の正電荷修飾（例えば、第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換）を含む、最大１５個の置換（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の置換）を含みうる。
【００７１】
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、第１の開口部に曝露された溶液内の負に荷電したポリマー（例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））の捕捉を可能にするように、第１の開口部に配置されてもよい。例えば、第１の正電荷修飾（例えば、第１の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列のＥ１０６、Ｓ１１０、Ｄ１１４、Ｄ１２１、Ｄ１２２、Ｅ１２９、Ｅ８５、Ｅ７８、Ｄ２６８、Ｄ２６７、Ｄ２６５、Ｅ２５８位またはその組合せに配置されてもよい。
【００７２】
本明細書に記載のいずれかの修飾ＣｌｙＡナノポアでは、第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、負に荷電したポリマー（例えば、限定されないが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の、ポアの内腔を通じた移行を可能にするように、中間部に配置されてもよい。例えば、第２の正電荷修飾（例えば、第２の正に荷電したアミノ酸の置換）は、配列番号１または配列番号２に示すアミノ酸配列のＤ７４、Ｄ７１、Ｄ６４、Ｅ５３、Ｅ１６１、Ｄ１５８、Ｅ４６、Ｅ４２、Ｄ４１位またはその組合せに配置されてもよい。
【００７３】
修飾ＣｌｙＡナノポアは、ホモ多量体（例えば、ナノポア内の全てのサブユニットが同じである）またはヘテロ多量体（例えば、少なくとも１つのサブユニットがナノポア内の他のサブユニットと異なる）でありうる。修飾ＣｌｙＡナノポアは、標的ポリマー（例えば、ポリヌクレオチド）が通り抜けるのを可能にするために十分な内腔の大きさの形成を充足する任意の数のサブユニットポリペプチドを含みうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、１２個以上のサブユニットポリペプチド、例えば、１３個のサブユニットポリペプチドおよび１４個のサブユニットポリペプチドを含む可能性があり、ここでサブユニットポリペプチドの少なくとも１つまたは複数は、本明細書に記載される第１および第２の正に荷電したアミノ酸の置換を含む。
【００７４】
修飾ＣｌｙＡナノポアは、例えば、ナノポアにおける滞留時間およびポアを流れる電流に基づいて、一本鎖ポリヌクレオチドから二本鎖ポリヌクレオチドを区別するために使用することができる。さらに、修飾ＣｌｙＡナノポアは、ポリヌクレオチド配列を特徴付けるために、例えばシーケンシングのために、使用することができる。修飾ＣｌｙＡナノポアは、修飾塩基を区別するために、例えば、メチル化ヌクレオチドと非メチル化ヌクレオチドとを区別するために使用することもできる。
【００７５】
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアは、本明細書に記載の第１および第２の正に荷電した置換なしのＣｌｙＡナノポアと比較して、低イオン強度溶液でのナノポアを通じたポリヌクレオチドの捕捉および／または移行の頻度がより高い。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、用語「低イオン強度溶液」は、２Ｍ未満、例えば１Ｍ未満、９００ｍＭ未満、８００ｍＭ未満、７００ｍＭ未満、６００ｍＭ未満、５００ｍＭ未満、４００ｍＭ未満、３００ｍＭ未満、２００ｍＭ未満、１５０ｍＭ未満、またはより低いイオン強度を有する溶液を指す。一部の実施形態では、より低いイオン強度溶液は、少なくとも約５０ｍＭ、少なくとも約１００ｍＭ、少なくとも約１５０ｍＭ、少なくとも約２００ｍＭ、少なくとも約３００ｍＭ、少なくとも約４００ｍＭ、少なくとも約５００ｍＭ、少なくとも約６００ｍＭ、少なくとも約７００ｍＭ、少なくとも約８００ｍＭ、少なくとも約９００ｍＭ、少なくとも約１Ｍまたはより高いイオン強度を有する。上記の参照範囲の組合せも包含される。例えば、低イオン強度溶液は、約１００ｍＭから約６００ｍＭ、または約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有しうる。任意の塩を使用して、適切なイオン強度を有する溶液を得ることができる。一部の実施形態では、アルカリ塩（例えば、限定されないが、塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）を低イオン強度溶液で使用することができる。
【００７７】
修飾ＣｌｙＡナノポアは、一定の範囲の条件下で異なるヌクレオチドを識別することができる。特に、ポアは、シーケンシングなどの核酸の特徴付けに有利な条件下で、ヌクレオチド同士を識別することができる。修飾ＣｌｙＡナノポアが異なるヌクレオチドを識別することができる程度は、印加電位、塩濃度、緩衝液、温度、ならびに尿素、ベタイン、およびＤＴＴなどの添加剤の存在を変えることによって制御できる。これにより、特にシーケンシングのときのポアの機能の微調整が可能になる。これについては以下により詳細に説明する。また修飾ＣｌｙＡナノポアは、ヌクレオチドごとではなく１つまたは複数のモノマーとの相互作用からポリヌクレオチドポリマーを同定するために使用することもできる。
【００７８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される修飾ＣｌｙＡナノポアは、核酸−タンパク質相互作用を特徴付けるために使用することができる。一部の実施形態では、ナノポアは、異なるセンシングモードを使用して、例えば、核酸に従って結合部位の位置をスキャンおよびマッピングすることによって、ならびに／またはタンパク質と核酸との間の相互作用の強度を探査することによって、タンパク質−核酸を調べることができる。一部の実施形態では、核酸の天然電荷が、核酸−タンパク質複合体に電気泳動力を印加するために利用されてもよい。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ−タンパク質相互作用が、タンパク質ナノポアを通じた単一ＤＮＡ分子の電圧駆動通過を使用して評価されうる。このような実施形態では、個々のＤＮＡタンパク質複合体（例えば、ＤＮＡ−エキソヌクレアーゼＩ複合体、ＤＮＡ−ヘリカーゼ複合体、ＤＮＡ−クランプ複合体）に印加された電気的な力は、２つの分子を引き離すことができ、一方で同時に、イオン電流変化を使用して、複合体の解離速度を評価することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される修飾ＣｌｙＡナノポアは、核酸および他の核酸結合タンパク質、例えば、転写因子、酵素、ＤＮＡパッケージングタンパク質などが関与する核酸−タンパク質相互作用の検出および特徴付けのために使用することができる。
【００７９】
修飾ＣｌｙＡナノポアは、単離されてもよく、実質的に単離されてもよく、精製されてもよく、または実質的に精製されてもよい。修飾ＣｌｙＡナノポアは、任意の他の成分、例えば、脂質または他のポアから完全に遊離されていれば、単離または精製されうる。ポアは、その使用目的を妨げないキャリアまたは希釈剤と混合される場合、実質的に単離される。例えば、ポアは、他の成分、例えば、トリブロックコポリマー、脂質または他のポアを１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満しか含まない形態で存在する場合、実質的に単離または実質的に精製されている。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポアの１つまたは複数は膜に存在しうる。適切な膜は、以下に説明される。
【００８０】
修飾ＣｌｙＡナノポアは、個々のまたは単一のポアとして存在しうる。代替的に、修飾ＣｌｙＡナノポアは、２つ以上のポアの同種または異種集団で存在しうる。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアは、マイクロウェルのアレイに配置されてもよく、ここで各マイクロウェルは、膜にある少なくとも１つのナノポアを含有している。
【００８１】
ホモ多量体ＣｌｙＡナノポア
同一の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むホモ多量体ナノポアも本明細書で提供される。ホモ多量体ナノポアは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのいずれかの実施形態を含みうる。ホモ多量体ナノポアは、ポリヌクレオチドを特徴付けるために、例えばシーケンシングのために、および／または一本鎖ポリヌクレオチド対二本鎖ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出するために使用することができる。本明細書に記載のホモ多量体ナノポアは、上記に説明した利点のいずれかを有しうる。
【００８２】
ホモ多量体ポアは、任意の数の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含有しうる。ポアは、通常、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、または少なくとも１４個の同一の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチド、例えば、１２、１３または１４個の同一の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含む。
【００８３】
ポアを作製するための方法は、以下により詳細に説明される。
【００８４】
ヘテロ多量体ＣｌｙＡナノポア
少なくとも１つの修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含むヘテロ多量体ナノポアも本明細書で提供される。ヘテロ多量体ナノポアは、ポリヌクレオチドを特徴付けるために、例えばシーケンシングのために、および／または一本鎖ポリヌクレオチド対二本鎖ポリヌクレオチドの存在もしくは非存在を検出するために、使用することができる。ヘテロ多量体ナノポアは、当技術分野で公知の方法（例えば、Protein Sci. 2002 Jul; 11(7):1813-24）を使用して作製することができる。
【００８５】
ヘテロ多量体ポアは、ポアを形成するために十分なサブユニットポリペプチドを含有する。サブユニットポリペプチドは、任意の種類でありうる。ポアは、通常、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、または少なくとも１４個のサブユニットポリペプチド、例えば、１２、１３または１４個のサブユニットポリペプチドを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、サブユニットポリペプチドの全て（例えば、１２、１３、または１４個のサブユニットポリペプチド）が、修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドであり、それらの少なくとも１つが他と異なっている。一部の実施形態では、ポアは、１２または１３個の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含み、それらの少なくとも１つが他と異なっている。それらは全てが互いに異なっていてもよい。
【００８７】
一部の実施形態では、サブユニットポリペプチドの少なくとも１つが、本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドではない。この実施形態では、残りのモノマーは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドのいずれか１つでありうる。したがって、ポアは、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドを含みうる。ナノポアを形成する修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドは同じでも異なってもよい。
【００８８】
ポアを作製するための方法は、以下により詳細に説明される。
【００８９】
ポリヌクレオチドの特徴付け
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。方法は、（ａ）約５０ｍＭから約１Ｍの低イオン強度溶液に、本明細書に記載のいずれかの実施形態による修飾ＣｌｙＡナノポアと、膜とを供給するステップであり、ここで修飾ＣｌｙＡナノポアは膜に存在する、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の低イオン強度溶液に標的ポリヌクレオチドを添加するステップと、（ｃ）ナノポアにわたり電位を印加する間に、修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標となる、ステップとを含む。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、低イオン強度溶液のｃｉｓ側に添加される。
【００９０】
一部の実施形態では、低イオン強度溶液は、約５０ｍＭから約３００ｍＭ、または約１５０ｍＭから約３００ｍＭのイオン強度を有しうる。
【００９１】
標的ポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドまたは目的のポリヌクレオチドと称される場合もある。
【００９２】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、例えば核酸は、２つ以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含みうる。ヌクレオチドは、天然のものであっても人工的なものであってもよい。ポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてもよい。ポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷していてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含みうる。そのような二量体は、通常、紫外線による損傷と関連しており、皮膚の黒色腫の主因である。ポリヌクレオチドにおける１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば、標識またはタグで修飾されていてもよい。適切な標識は、以下に記載されている。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含んでもよい。
【００９３】
ヌクレオチドは、通常、核酸塩基、糖、および少なくとも１つのリン酸基を含有している。核酸塩基と糖とでヌクレオシドが形成される。
【００９４】
核酸塩基は、通常、複素環である。核酸塩基には、限定されないが、プリンとピリミジンとが含まれ、より詳細には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が含まれる。
【００９５】
糖は、通常、五炭糖である。ヌクレオチド糖には、限定されないが、リボースおよびデオキシリボースが含まれる。糖は、好ましくは、デオキシリボースである。
【００９６】
ポリヌクレオチドには、好ましくは、以下のヌクレオシド：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）およびデオキシシチジン（ｄＣ）が含まれる。
【００９７】
ヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、通常、一リン酸、二リン酸または三リン酸を含有する。ヌクレオチドが、３つを超えるリン酸、例えば、４または５つのリン酸を含む場合がある。リン酸は、ヌクレオチドの５’側または３’側に結合しうる。ヌクレオチドとしては、限定されないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）およびデオキシメチルシチジン一リン酸が挙げられる。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【００９８】
ヌクレオチドは、脱塩基性（つまり、核酸塩基を欠く）であってもよい。ヌクレオチドは、また、核酸塩基および糖を欠いてもよい。
【００９９】
ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドは任意の様式で互いに結合していてもよい。ヌクレオチドは、通常、核酸と同様に糖およびリン酸基によって結合している。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体と同様に、核酸塩基を介して接続されてもよい。
【０１００】
ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でありうる。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は好ましくは二本鎖である。
【０１０１】
ポリヌクレオチドは、核酸、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）でありうる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの一本鎖とハイブリダイズされたＲＮＡの一本鎖を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーであってもよい。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン繰り返し単位で構成されている。ＧＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって連結されたグリコール繰り返し単位で構成されている。ＴＮＡ骨格は、ホスホジエステル結合によって一緒に連結された繰り返しのトレオース糖で構成されている。ＬＮＡは、リボース部分の２’酸素と４’炭素を接続する追加のブリッジを有する、上記に説明したリボヌクレオチドから形成される。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは、最も好ましくは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【０１０３】
ポリヌクレオチドは任意の長さであってよい。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さでありうる。ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対、５０００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さ、または１０００００以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド対の長さでありうる。
【０１０４】
任意の数のポリヌクレオチドを調べることができる。例えば、本明細書に記載の方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００個またはより多くのポリヌクレオチドの特徴付けに関しうる。２個以上のポリヌクレオチドが特徴付けられる場合、それらは異なるポリヌクレオチドであってもよく、または同じポリヌクレオチドの２つの特徴付けであってもよい。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、天然のものであっても人工的なものであってもよい。例えば、方法は、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を確認するために使用されてもよい。方法は、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０１０６】
ポリヌクレオチドは、タンパク質または分析物などの結合された種を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ハイブリダイズされたプローブを含んでもよい。
【０１０７】
試料
各分析物は、通常、任意の適切な試料中に存在する。方法は、分析物を含有することが既知のまたは分析物を含有する疑いのある２つ以上の試料に対して実施してもよい。代替的に、方法は、試料中の存在が既知のまたは予測される２つ以上の分析物の同一性を確認するために、２つ以上の試料に対して実施されてもよい。一部の実施形態では、方法は、一本鎖ポリヌクレオチドから二本鎖ポリヌクレオチドを区別するために、試料に対して実施してもよい。
【０１０８】
第１の試料および／または第２の試料は、生物学的試料であってもよい。本明細書に記載の方法は、任意の生物または微生物から取得されたまたは抽出された少なくとも１つの試料を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施してもよい。第１の試料および／または第２の試料は、非生物学的試料であってもよい。非生物学的試料は、流体試料であってもよい。非生物学的試料の例としては、外科的流体、飲料水、海水または河川水などの水、および臨床検査のための試薬が挙げられる。
【０１０９】
第１の試料および／または第２の試料は、通常、本明細書に記載の方法で使用される前に、例えば遠心分離によって、または不要な分子もしくは赤血球などの細胞を取り除く濾過膜に通して処理される。第１の試料および／または第２の試料は、取得してすぐに測定されてもよい。第１の試料および／または第２の試料は、また、通常、アッセイ前に保存、好ましくは−７０℃未満で保存されてもよい。
【０１１０】
特徴付け
方法は、ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つ、または５つ以上の特徴を測定することを含んでもよい。１つまたは複数の特徴は、好ましくは（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せ、例えば、｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝、｛ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝または｛ｉ，ｉｉ，ｉｉｉ，ｉｖ，ｖ｝が、本明細書に記載の方法に従って測定されうる。上記の組合せのいずれかを含め、（ｉ）から（ｖ）の様々な組合せが、第１のポリヌクレオチドに対して、第２のポリヌクレオチドと比較して測定されてもよい。
【０１１１】
（ｉ）について、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数またはポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を決定することによって測定されうる。
【０１１２】
（ｉｉ）について、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定されうる。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列測定と組み合わせて、またはポリヌクレオチドの配列測定なしに、測定されうる。前者は直接的であり、ポリヌクレオチドを配列決定し、それにより同定する。後者は、いくつかの方法で行われうる。例えば、ポリヌクレオチドの特定のモチーフの存在を（ポリヌクレオチドの残りの配列の測定なしに）測定しうる。代替的に、方法における特定の電気的および／または光学的信号の測定は、特定の出所に由来するものとしてポリヌクレオチドを同定しうる。
【０１１３】
（ｉｉｉ）について、ポリヌクレオチドの配列は前記のように決定することができる。適切なシーケンシング方法、特に電気的測定を使用する方法は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72および国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットに記載されている。
【０１１４】
（ｉｖ）について、二次構造は、種々の方法で測定されうる。例えば、方法が電気的測定を含む場合、二次構造は、滞留時間の変化またはポアを流れる電流の変化を使用して測定しうる。これにより、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの領域を区別することができる。
【０１１５】
（ｖ）について、任意の修飾の存在または非存在を測定してもよい。方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質を用いて、または１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーを用いて修飾されているか否かを決定するステップを含む。特定の修飾は、以下に記載の方法を使用して測定されうる、ポアとの特定の相互作用をもたらす。例えば、メチルシトシンは、各ヌクレオチドとの相互作用の間にポアを通じて流れる電流に基づいてシトシンから区別することができる。
【０１１６】
標的ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのいずれか１つと接触される。ポアは、通常、膜に存在する。適切な膜は以下に説明される。方法は、ポアが膜に存在する膜／ポア系を調べるために適切な任意の装置を使用して実施することができる。方法は、膜貫通ポアの検知に適切な任意の装置を使用して実施されうる。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバーと、チャンバーを２つの部分に分ける障壁とを含む。障壁は、通常、ポアを含有する膜が形成されるアパーチャを有する。代替的に、障壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０１１７】
方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２（国際公開第２００８／１０２１２０号パンフレット）に記載の装置を使用して実施してもよい。
【０１１８】
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これには、限定されないが、電気的測定および光学的測定が含まれる。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定（Ivanov AP et al., Nano Lett. 2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際公開第２００５／１２４８８８号パンフレット）が挙げられる。光学的測定を電気的測定と組み合わせてもよい（Soni GV et al., Rev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301）。測定は、膜貫通電流測定、例えばポアを流れるイオン電流の測定でありうる。代替的に、測定は、チャネルを流れるイオン流を示す蛍光測定、例えば、Heron et al, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (5), 1652-1653によって開示される測定またはＦＥＴを使用する膜間電圧の測定でありうる。
【０１１９】
電気的測定は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72および国際公開第２０００／２８３１２号パンフレットに記載される標準的な単一チャネル記録装置を使用して行ってもよい。代替的に、電気的測定は、例えば国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットに記載されるマルチチャネルシステムを使用して行ってもよい。
【０１２０】
方法は、膜にわたり印加された電位を用いて実施することができる。印加電位は、電圧電位でありうる。代替的に、印加電位は、化学電位でありうる。この例は、両親媒性層などの膜を横切る塩勾配を使用している。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。一部の例では、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときのポアを通過する電流を使用して、ポリヌクレオチドの配列を評価または決定する。これは、ストランドシーケンシングとして記載される場合がある。
【０１２１】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときの、ポアを通過する電流を測定することを含みうる。したがって方法で使用される装置は、電位を印加することができ、膜およびポアを横切る電気信号を測定することができる電流回路も含んでもよい。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施しうる。方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を含む。
【０１２２】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときの、ポアを通過する電流を測定することを含んでもよい。膜貫通タンパク質ポアを通ってイオン電流を測定するための適切な条件は、当技術分野で公知であり、実施例に開示されている。方法は、通常、膜およびポアにわたり印加された電圧を用いて実施される。使用電圧は、通常、＋５Ｖから−５Ｖ、例えば、＋４Ｖから−４Ｖ、＋３Ｖから−３Ｖまたは＋２Ｖから−２Ｖである。使用電圧は、通常、−６００ｍＶから＋６００ｍＶまたは−４００ｍＶから＋４００ｍＶである。使用電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲にある。使用電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶの範囲であり、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶの範囲である。印加電位の増加によって、ポアによる異なるヌクレオチドの識別を向上させることができる。
【０１２３】
方法は、通常、任意の電荷キャリア、例えばアルカリ金属塩などの金属塩、ハロゲン化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩の存在下で実施される。電荷キャリアは、イオン液体または有機塩、例えば、テトラメチルアンモニウムクロリド、トリメチルフェニルアンモニウムクロリド、フェニルトリメチルアンモニウムクロリド、または１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドを含んでもよい。上記に説明した例示的な装置では、塩はチャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が通常、使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が好ましい。電荷キャリアは、膜を横切って非対称であってもよい。例えば、電荷キャリアの種類および／または濃度は、膜の各側で異なってもよい。
【０１２４】
塩濃度は、飽和状態であってもよい。塩濃度は、３Ｍ以下であってもよく、通常０．１から２．５Ｍ、０．３から１．９Ｍ、０．５から１．８Ｍ、０．７から１．７Ｍ、０．９から１．６Ｍまたは１Ｍから１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭから１Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍの塩濃度を使用して実施される。高塩濃度は高いシグナルノイズ比をもたらし、通常電流変動のバックグラウンドに対して同定されるヌクレオチドの存在を電流が示すことを可能にする。本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアはポリヌクレオチドを高塩溶液で特徴付けるために使用することができる一方、修飾ＣｌｙＡナノポアは、上記のように、低イオン強度溶液においてでさえ、ナノポアを通じたポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）の効率的な捕捉および／または移行を可能にすることができる。
【０１２５】
方法は、通常、緩衝液の存在下で実施される。上記に説明した例示的な装置では、緩衝液はチャンバー内の水溶液中に存在する。任意の緩衝液が、本明細書に記載の方法で使用されうる。通常、緩衝液は、リン酸緩衝液である。他の適切な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、通常、４．０から１２．０、４．５から１０．０、５．０から９．０、５．５から８．８、６．０から８．７、７．０から８．８または７．５から８．５のｐＨで実施される。使用ｐＨは、好ましくは、約７．５または８．０である。
【０１２６】
方法は、０℃から１００℃、１５℃から９５℃、１６℃から９０℃、１７℃から８５℃、１８℃から８０℃、１９℃から７０℃、または２０℃から６０℃で実施されうる。方法は、通常、室温で実施される。方法は、任意選択的に、酵素機能を支える温度、例えば約３７℃で実施される。
【０１２７】
ポリヌクレオチド結合タンパク質
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法は、ポリヌクレオチド結合タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合し、修飾ＣｌｙＡナノポアを通じた標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質を低イオン強度溶液に添加するステップを含むことができる。
【０１２８】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合することができ、ポアを通じたその移動を制御することができる任意のタンパク質でありうる。ポリヌクレオチド結合タンパク質の例としては、限定されないが、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレオーゼ、ＤＮＡクランプなどが挙げられる。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアと任意の順序で接触させることができる。ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼ、およびポアと接触するとき、ポリヌクレオチドは最初にタンパク質と複合体を形成することが好ましい。ポアにわたり電圧が印加されるとき、ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は、次いでポアと複合体を形成し、ポアを通じたポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０１２９】
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法の任意のステップが、通常、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチドアナログおよびポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を容易にする酵素補因子の存在下で実施される。
【０１３０】
ヘリカーゼおよび分子ブレーキ
一実施形態では、方法は、
（ａ）ポリヌクレオチドに、ポリヌクレオチドに結合する１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキとを供給するステップと、
（ｂ）１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキとが一緒になり、両方ともポリヌクレオチドのポアを通じた移動を制御するように、膜に存在する修飾ＣｌｙＡナノポアを含む低イオン強度溶液に、ポリヌクレオチドを添加し、ポアにわたり電位を印加するステップと、
（ｃ）ナノポアにわたり電位を印加する間、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときの修飾ＣｌｙＡナノポアを流れるイオン流を測定するステップであり、ここでイオン流の測定は、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特徴の指標であり、それによってポリヌクレオチドが特徴付けられる、ステップとを含む。この種の方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３７に詳細に説明されている。
【０１３１】
膜
本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアは、膜に存在しうる。ポリヌクレオチドを特徴付ける方法では、ポリヌクレオチドは、通常、膜にある修飾ＣｌｙＡナノポアと接触する。任意の膜が使用されうる。適切な膜は、当技術分野で周知である。膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、親水性および親油性特性の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成されたものでも天然に存在するものであってもよい。単層を形成する非天然両親媒性物質および両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えば、ブロックコポリマー（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）が挙げられる。ブロックコポリマーは、一緒に重合化される２つ以上のモノマーサブユニットが単一のポリマー鎖を生成するポリマー材料である。ブロックコポリマーは、通常、各モノマーサブユニットが寄与する特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されるポリマーが有しない固有の特性を有しうる。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットの１つが疎水性または親油性である一方、他のサブユニットが水溶性媒体にいるとき親水性であるように、改変されていてもよい。この場合に、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を有することができ、生体膜を模倣する構造を形成しうる。ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）でありうるが、また、両親媒性物質（amphipiles）のように挙動する、より複雑な構成を形成するために、２つを超えるモノマーサブユニットから構築されてもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロックコポリマーでありうる。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
【０１３２】
古細菌二極性テトラエーテル脂質は、脂質が単層膜を形成するように構築されている天然脂質である。これらの脂質は、一般的に、過酷な生物学的環境で生き残る好極限性細菌、好熱菌、好塩菌、および好酸菌で見出される。それらの安定性は最終的二重層の融合性質から誘導されると考えられる。直接的には、親水性−疎水性−親水性の一般的なモチーフを有するトリブロックポリマーを作製することによって、これらの生物学的実体を模倣するブロックコポリマー材料を構築する。この材料は、脂質二重層と同様に挙動し、小胞から積層膜に至る一定範囲の相挙動を包含する単量体膜を形成しうる。これらのトリブロックコポリマーから形成された膜は、生体脂質膜を上回るいくつかの利点を有する。トリブロックコポリマーは合成されるため、的確な構築を慎重に制御して、膜を形成し、ポアおよび他のタンパク質を相互作用するための正確な鎖長および特性をもたらすことができる。
【０１３３】
またブロックコポリマーは、脂質副材料として分類されないサブユニットから構築されてもよく、例えば疎水性ポリマーは、シロキサンまたは他の非炭化水素系モノマーから作製されてもよい。またブロックコポリマーの親水性サブセクションは、低タンパク質結合特性を有することができ、これにより、未処理の生物学的試料に曝露されたとき、非常に耐性がある膜を作製することが可能である。また、この頭部基ユニットは、非古典的脂質頭部基から誘導されてもよい。
【０１３４】
またトリブロックコポリマー膜は、生物学的な脂質膜と比較して機械的および環境的安定性が向上しており、例えば操作温度またはｐＨ範囲が非常に高い。ブロックコポリマーの合成的性質は、広範囲の用途のためのポリマーベース膜をカスタマイズするためのプラットフォームを提供する。
【０１３５】
膜は、最も好ましくは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６またはＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７に開示されている膜の１つである。
【０１３６】
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドの結合を促進するために化学的に修飾または官能化されていてもよい。
【０１３７】
両親媒性層は、単層または二重層でありうる。両親媒性層は、通常、平面状である。両親媒性層は、湾曲していてもよい。両親媒性層は、支持されていてもよい。
【０１３８】
両親媒性膜は、通常、本来的に移動性であり、脂質拡散率が約１０−８ｃｍ  ｓ−１の二次元流体として本質的に作用する。これは、ポアおよび結合ポリヌクレオチドが、通常、両親媒性膜内を移動することができることを意味する。
【０１３９】
膜は、脂質二重層でありうる。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、一定範囲の実験的研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のために使用することができる。代替的に、脂質二重層は、一定範囲の物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使用されうる。脂質二重層は、任意の脂質二重層でありうる。適切な脂質二重層としては、限定されないが、平面脂質二重層、支持二重層、またはリポソームが挙げられる。脂質二重層は、好ましくは、平面脂質二重層である。適切な脂質二重層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３（国際公開第２００８／１０２１２１号パンフレットとして公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開）に開示されている。
【０１４０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのいずれか一つを含む膜に結合することができる。方法は、ポリヌクレオチドを、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのいずれか一つを含む膜に結合させるステップを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを使用して膜に結合されている。ポリヌクレオチドは、任意の公知の方法を使用して膜に結合されてもよい。
【０１４１】
二本鎖ポリヌクレオチドシーケンシング
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖でありうる。ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、方法は、接触ステップの前に、ポリヌクレオチドの一端にヘアピンアダプターを連結するステップをさらに含んでもよい。次いでポリヌクレオチドの二本鎖は、ポリヌクレオチドが本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアと接触するまたは相互作用するときまたはその前に分離されてもよい。二本鎖は、ポアを通じたポリヌクレオチドの移動が、ポリヌクレオチド結合タンパク質、例えばヘリカーゼまたは分子ブレーキによって制御されるときに分離されてもよい。このことは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１７８６（国際公開第２０１３／０１４４５１号パンフレットとして公開）に記載されている。このように二本鎖構築物の両方の鎖を結びつけ、調べることは、特徴付けの効率および精度を向上させる。
【０１４２】
ラウンドザコーナーシーケンシング（Round the corner sequencing）
好ましい実施形態では、標的二本鎖ポリヌクレオチドは一端にヘアピンループアダプターを有し、方法は、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通じて移動するように、ポリヌクレオチドと本明細書に記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアとを接触させるステップと、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアに対して移動するとき１つまたは複数の測定を行うステップであり、ここで測定は、ポリヌクレオチドの鎖の１つまたは複数の特徴の指標であり、それによって標的二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付ける、ステップとを含む。上記に説明した実施形態のいずれかは、同様に、本実施形態に適用される。
【０１４３】
リーダー配列
接触ステップの前に、好ましくは、方法は、ポア内を優先的に通過するリーダー配列を、ポリヌクレオチドに結合させるステップを含む。リーダー配列は、本明細書に記載のいずれの方法も促進させる。リーダー配列は、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポアのいずれか１つを優先的に通過し、それによってナノポアを通じたポリヌクレオチドの移動を促進させるように設計される。またリーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを上記に説明した１つまたは複数のアンカーに連結させてもよい。
【０１４４】
修飾ポリヌクレオチド
特徴付けの前に、標的ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと、ポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドの集団とを、ポリメラーゼが標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で接触させることによって修飾されてもよく、ここでポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するとき、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチド種を異なるヌクレオチド種と置き換える。次いで修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに結合された１つまたは複数のヘリカーゼおよびポリヌクレオチドに結合された１つまたは複数の分子ブレーキを含んでもよい。この種の修飾は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０４８３に記載されている。本明細書に説明のいずれかのポリメラーゼが使用されうる。
【０１４５】
鋳型ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼが鋳型ポリヌクレオチドを鋳型として使用して修飾ポリヌクレオチドを形成する条件下で、ポリメラーゼと接触される。そのような条件は当技術分野で公知である。例えば、ポリヌクレオチドは、通常、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）の緩衝液など市販のポリメラーゼ緩衝液でポリメラーゼと接触する。プライマーまたは３’ヘアピンは、通常、ポリメラーゼ伸長のための核形成点として使用される。
【０１４６】
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシーケンシングは、通常、ｋ個（ここで、ｋは正の整数である）のヌクレオチドからなるポリマー単位（つまり、「ｋマー」）を分析することを含む。このことは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３（国際公開第２０１３／０４１８７８号パンフレットとして公開）で説明されている。異なるｋマーについて電流測定値間に明確な区別があることが望ましいが、これらの測定値の一部が重複することが一般的である。特に、ｋマーにおけるポリマー単位の高い数、つまりｋが高値の場合では、異なるｋマーによって生じる測定値を解明することが困難になり、ポリヌクレオチドについての情報の導出、例えばポリヌクレオチドの基礎となる配列の推定に不利益をもたらす可能性がある。
【０１４７】
標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチド種を修飾ポリヌクレオチドの異なるヌクレオチド種と置き換えることによって、修飾ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとは異なるｋマーを含有する。修飾ポリヌクレオチドの異なるｋマーは、標的ポリヌクレオチドのｋマーとは異なる電流測定値を生じることができ、したがって、修飾ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドとは異なる情報を提供する。修飾ポリヌクレオチドからの追加情報は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けることをより容易にすることができる。一部の例では、修飾ポリヌクレオチド自体が、特徴付けが容易でありうる。例えば、修飾ポリヌクレオチドは、電流測定値間の分離増加もしくは明確な分離を有するｋマーまたはノイズを減少させるｋマーを含むように設計してもよい。
【０１４８】
好ましくは、ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチドを形成するとき、標的ポリヌクレオチドの２つ以上のヌクレオチド種を異なるヌクレオチド種と置き換える。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドの２つ以上のヌクレオチド種のそれぞれを別個のヌクレオチド種と置き換えうる。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドの２つ以上のヌクレオチド種のそれぞれを同じヌクレオチド種と置き換えうる。
【０１４９】
標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、修飾体における異なるヌクレオチド種は、通常、アデニン、グアニン、チミン、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基および／またはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジンもしくはデオキシメチルシチジンと異なるヌクレオシドを含む。標的ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、修飾ポリヌクレオチドにおける異なるヌクレオチド種は、通常、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基および／またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンもしくはメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。異なるヌクレオチド種は、上記に説明した普遍的ヌクレオチドのいずれであってもよい。
【０１５０】
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド種を、１つまたは複数のヌクレオチド種に存在しない化学基または原子を含む異なるヌクレオチド種と置き換えることができる。化学基は、プロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基またはプロパルギルアミン基でありうる。
【０１５１】
ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド種を、１つまたは複数のヌクレオチド種に存在する化学基または原子を欠く異なるヌクレオチド種と置き換えることができる。ポリメラーゼは、１つまたは複数のヌクレオチド種を、負への帯電が変化した異なるヌクレオチド種と置き換えることができる。負への帯電が変化した異なるヌクレオチド種は、好ましくはハロゲン原子を含む。
【０１５２】
方法は、好ましくは、修飾ポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の異なるヌクレオチド種から核酸塩基を選択的に除去するステップをさらに含む。
【０１５３】
他の特徴付けの方法
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼがヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み入れるときに放出される標識された種を検出することによって特徴付けられる。ポリメラーゼはポリヌクレオチドを鋳型として使用する。標識された種はそれぞれ各ヌクレオチドに対して特異的である。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の修飾ＣｌｙＡナノポア、ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドと、ポリメラーゼによってヌクレオチドがポリヌクレオチドに添加されたときにリン酸標識された種が順次放出されるように接触され、ここでリン酸種はそれぞれのヌクレオチドに対して特異的な標識を含有する。ポリメラーゼは、上記に説明したポリメラーゼのいずれであってもよい。リン酸標識された種は、ポアを使用して検出され、それによってポリヌクレオチドが特徴付けされる。この種の方法は、欧州出願番号１３１８７１４９．３（欧州特許出願公開第２６８２４６０号明細書として公開）に開示されている。上記に説明した実施形態のいずれも、本方法に同様に適用される。
【０１５４】
キット
本開示の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載のいずれか１つの修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜の成分を含む。膜は、好ましくは成分から形成されている。ポアは、好ましくは膜に存在する。キットは、両親媒性層またはトリブロックコポリマー膜などの上記に開示した膜のいずれかの成分を含みうる。
【０１５５】
キットは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含んでもよい。
【０１５６】
キットは、ポリヌクレオチドを膜に結合するための１つまたは複数のアンカーをさらに含んでもよい。
【０１５７】
キットは、さらに、上述の実施形態のいずれかを実施することを可能にする１つまたは複数の他の試薬または機器を含んでもよい。そのような試薬または機器としては、以下の１つまたは複数が挙げられる：適切な緩衝液（水溶液）、対象から試料を取得するための手段（例えば、針を含む容器または機器）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料により試薬が再懸濁されるように、乾燥状態でキットに存在してもよい。またキットは、任意選択的に、キットを本明細書に記載のいずれか１つの方法で使用することを可能にする指示書、または方法を使用することができる生物についての詳細を含んでもよい。
【０１５８】
装置
本明細書に記載の別の態様は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置も提供する。装置は、複数の本明細書に記載される修飾ＣｌｙＡナノポアと、複数の膜とを含む。一部の実施形態では、複数の修飾ＣｌｙＡナノポアは、複数の膜に存在する。一部の実施形態では、修飾ＣｌｙＡナノポアの数と膜の数は等しい。一実施形態では、単一の修飾ＣｌｙＡナノポアが、それぞれの膜に存在する。
【０１５９】
装置は、さらに、本明細書に記載されるいずれかの方法を実施するための指示書を含んでもよい。装置は、ポリヌクレオチド分析のための任意の従来の装置、例えばアレイまたはチップを含んでもよい。例えば、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法を参照して上記に説明した実施形態のいずれも、本明細書に記載の装置に同様に適用可能である。装置は、本明細書に記載のキットに存在するいずれかの特色をさらに含んでもよい。
【０１６０】
一部の実施形態では、装置は、例えば、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための、本明細書に記載のいずれかの方法を実施するように設定される。
【０１６１】
一実施形態では、装置は、（ａ）複数の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜を支持することができ、ナノポアおよび膜を使用するポリヌクレオチドの特徴付けの実施を操作可能であるセンサーデバイス、ならびに（ｂ）特徴付けを実施するための材料の送達のための少なくとも１つのポートを含む。
【０１６２】
代替的に、装置は、（ａ）複数の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜を支持することができ、ナノポアおよび膜を使用するポリヌクレオチドの特徴付けの実施を操作可能であるセンサーデバイス、ならびに（ｂ）特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバを含んでもよい。
【０１６３】
別の実施形態では、装置は、（ａ）膜および複数の修飾ＣｌｙＡナノポアおよび膜を支持することができ、ポアおよび膜を使用するポリヌクレオチドの特徴付けの実施を操作可能であるセンサーデバイス、（ｂ）特徴付けを実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバ、（ｃ）少なくとも１つのリザーバからセンサーデバイスへ材料を制御可能に供給するように構成された流体システム、ならびに（ｄ）各試料を受けとるための１つまたは複数の容器を含んでもよく、流体システムは、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスへ試料を選択的に供給するように構成されている。
【０１６４】
装置は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開）、ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９（国際公開第２０１０／１２２２９３号パンフレットとして公開）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６（国際公開第２０１１／０６７５５９号パンフレットとして公開）または国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９（国際公開第００／２８３１２号パンフレットとして公開）に記載の装置のいずれかであってもよい。
【０１６５】
さらなる労作を要せずに、当業者は、上記の記載に基づいて、十分に本開示を利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示にすぎず、いかなる方法においても本開示の残部を限定するものではないと解釈される。本明細書で引用された全ての刊行物は、本明細書で言及される目的や主題を参照して組み込まれられる。
【実施例】
【０１６６】
＜実施例１＞
生理学的イオン強度でのＤＮＡ移行を可能にするナノポアの正確なナノスケール改変
生物学における重要なプロセスの多くには、ナノメートルスケールのポアを通じたバイオポリマーの移行が関与しており、例えば、核ポアを横切る核酸輸送、膜チャネルを通じたタンパク質移行、および標的細胞へのウイルスＤＮＡの注入などがある。さらに隔離膜に埋め込まれた生物学的および人工的ナノポアは、このプロセスを調査するための有用なツールを提供し、迅速なＤＮＡまたはタンパク質シーケンシング、単一分子ＤＮＡシーケンシングおよび分析、ならびにバイオマーカーセンシングにおける適用を見出しうる。ナノポアを横切るＤＮＡ移行の機構が、特に調査されてきた。いくつかのポータルバクテリオファージタンパク質の結晶構造は、ＤＮＡ詰め込みおよび注入の間に、ｄｓＤＮＡが、正電荷の環で飾られた強い負の表面を有する狭いナノポア（約３．５ｎｍ）を横切って移行することを明らかにした。ナノポアの負に帯電した内側表面は、負に荷電したＤＮＡのスライディングを容易にすることが提唱されており、一方で正電荷の役割は、このプロセスを促進することと考えられている。この実施例では、生理学的イオン強度で、ポータルタンパク質と同じ折り畳み、大きさおよび全体的内部電荷を有するＣｌｙＡナノポアを横切るＤＮＡの電気泳動的移行が、正電荷の２つの環がナノポアの広い入り口および中間部で改変されている場合にのみ観察することができることが見出される。驚いたことに、ナノポアの強い負に帯電した３．３ｎｍの内部くびれは、修飾を必要としなかった。この知見は、正電荷の改変が、狭いくびれを通じたＤＮＡ移行のためのエントロピーおよび静電障壁克服のために、ＤＮＡを整列させるために重要であることを示す。理論に制限されることは望まないが、負電荷密度を有する狭いナノポアを通じて移行するために、ＤＮＡ分子は配向される必要がある。
【０１６７】
脂質膜に再構成された生物学的ナノポアを流れるイオン電流は、低分子または折り畳まれたタンパク質を同定し、単分子レベルでの化学的または酵素的反応をモニターするために使用されてきた。人工膜に再構成されたナノポアを横切るＤＮＡの電気泳動的移行は、ＤＮＡシーケンシングおよびバイオマーカー認識などの実用的用途のために大きな期待が持たれる。それ自体膜タンパク質ではないφ２９のポータルタンパク質は、黒い脂質二重層に挿入されることが見出され、そのようなナノポアは１．０／０．５ｍＭのＮａＣｌでｄｓＤＮＡを電気泳動的に移行した。しかしながら、膜挿入を可能にするナノポアの正確な疎水性修飾は分からなかった。実際、φ２９ナノポアは、時に脂質膜から放出され、したがって実用的用途には制限が課される。ｄｓＤＮＡは、グラフェンまたは二硫化モリブデンの二重層などの原子層材料を除いて大抵が負の内部表面電荷を有する固体膜上に調製した人工ナノポアを通って移行することが示されている。溶液のデバイ長に匹敵する半径を有するそのようなナノポアにおいて、内側ナノポア壁上の電気二重層（ＥＤＬ）によって生じる表面電位が重なり、ＤＮＡのナノポアへの進入に対して大きな静電障壁をもたらす。結果として、固体ナノポアを横切るＤＮＡの移行は、生理学的イオン強度で大きなナノポア（１０ｎｍ）を使用してまたは３４０ｎＭの塩もしくは非対称塩濃度下で小さいナノポア（約３．５ｎｍ）を使用する。さらにＤＮＡの大きさに匹敵する直径（ｄｓＤＮＡのＢ形態について約２．２ｎｍおよびｓｓＤＮＡについて約１ｎｍ）を有する固体ナノポアを横切るＤＮＡの移行は、生理学的イオン強度でまだ観察されていない。
【０１６８】
約３．３ｎｍの内部くびれを有する１２量体タンパク質であるＣｌｙＡナノポア（図１、パネルＡ）は、折り畳まれたタンパク質を調査するためのツールとして使用されてきた。ナノポアを横切るｄｓＤＮＡ移行が２．５ＭのＮａＣｌ溶液で観察されたが、ポアの強力な負の内側（図１、パネルＡ）により、より低いイオン強度でのＤＮＡ移行は防止された。この実施例では、ＣｌｙＡナノポアが改変され、生理学的イオン強度でのＤＮＡの移行が可能となった。これは、分子とＤＮＡとの間の静電相互作用が重要である多くの用途で有用であり、例えば、ナノポアを横切るＤＮＡの移行を制御したりまたはＤＮＡ−タンパク質相互作用を研究したりするのに酵素が使用される、ＤＮＡシーケンシングまたはマッピングにおいて有用である。ＤＮＡ移行は、正電荷の２つの環がナノポアのより広いｃｉｓ側に添加された後に観察され、一方、ナノポアのｔｒａｎｓ側入口をよりくびれさせる修飾は、ＤＮＡ移行の効率を改善しなかった。さらに、修飾はナノポアのイオン選択性を変化させず、φ２９ポータルタンパク質の電荷分布を反映していた。さらに、改変されたポアは、ナノポアの広い側からのみＤＮＡの移行を可能にした。興味深いことに、ＤＮＡ上をスライディングする多くのタンパク質が、改変されたＣｌｙＡナノポアと類似の表面電荷を示し、正および負電荷の改変が、ナノスケールの両端を横切るＤＮＡ移行を改善するための全体的機構を提供しうることが示される。この実施例は、ナノポアの形状および内部表面電荷の正確な改変が、ＤＮＡと同様の直径を有するナノスケールポアを横切るＤＮＡの移行およびスライディングのために重要であることを示す。
【０１６９】
結果
ＤＮＡを捕捉するためのＣｌｙＡナノポアの改変
ＣｌｙＡ−ＡＳ（図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）は、平面脂質二重層におけるその有利な特性のために選択された、チフス菌（Salmonella typhi）由来の細胞溶解素Ａの改変バージョンであり、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの移行が、２．０Ｍを超えるＮａＣｌイオン強度でのみ観察される。おそらく、低イオン強度ではナノポア内部の強い負の静電電位（図１１、パネルＢ）がＤＮＡ進入および移行を防止し、一方で高イオン強度ではナノポア表面の電荷が効果的に遮蔽される。生理学的イオン強度でのナノポアによるＤＮＡの捕捉を誘導するために、ＣｌｙＡ−ＡＳナノポアの内部電荷を修飾した（表１および２ならびに図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）。ＣｌｙＡバリアントは、時折、開口ポアコンダクタンス（ゲーティング）の一時的な減少を示した。ゲーティングの測定値として、典型的ナノポアを３０秒のタイムスパンで開口のままとする印加電圧として定義されるゲーティング電圧（ＶＧ）（表１）を使用した。修飾ナノポアを通じたＤＮＡの移行は、１μＭの９０量体３’−ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（図１、パネルＡ；表３）、次いで等モル濃度のその相補鎖（図１、パネルＢ；表３）、そして最後にニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）を添加することによって、ＶＧで試験した。
【０１７０】
アルギニン残基の形態での正電荷の単一環をＣｌｙＡ−ＡＳのｃｉｓ側入口（Ｓ１１０Ｒ、ＣｌｙＡ−Ｒ、図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）に導入し、次いでナノポアの３つの部分：ｃｉｓ側入口、中間部およびｔｒａｎｓ型くびれを修飾した（図１、パネルＡ；図１１、パネルＡ）。ＣｌｙＡ−Ｒのｃｉｓ開口部での陽性残基を用いた中性残基の置換は、１５０ｍＭのＮａＣｌでＤＮＡ移行を示さなかった（表１、表２）。ｃｉｓ開口部での追加的正電荷は、平面脂質二重層へのチャネル挿入なし（ＣｌｙＡ−Ｒ−Ｅ１０６ＲおよびＣｌｙＡ−Ｒ−Ｄ１１４Ｒ）、または１５０ｍＭのＮａＣｌでのＤＮＡ移行なし（ＣｌｙＡ−Ｒ−Ｄ１２２ＲおよびＣｌｙＡ−Ｒ−Ｄ１２９Ｒ）のいずれかを示した。ＣｌｙＡ−Ｒナノポアの中間部のアルギニン環は、６４位の負に荷電したグルタミン酸残基がアルギニンで置き換えられたとき（Ｄ６４Ｒ、ＣｌｙＡ−ＲＲ）、ｓｓＤＮＡ（図１、パネルＣ）およびｄｓＤＮＡ（図１、パネルＤ）の移行を誘導したが、近い位置の中性側鎖がアルギニンで置換されたとき（Ｑ５６Ｒ）は誘導しなかった。アルギニンでの近い位置での中性側鎖の置換（Ｑ５６Ｒ）、膜貫通領域における負に荷電した残基の除去（ＣｌｙＡ−Ｒ−Ｅ１１Ｓ）または正に荷電した残基の付加（ＣｌｙＡ−Ｒ−Ｑ８Ｋ）のいずれも、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液でＤＮＡ移行イベントを誘導しなかった（図６）。驚いたことに、ＣｌｙＡ−Ｒの中間部およびｔｒａｎｓ側入口の両方における中性残基の正に荷電した残基での置換（ＣｌｙＡ−Ｒ−Ｑ５６Ｒ−Ｑ８Ｋ）もＤＮＡ移行イベントを誘導しなかった（図６）。ＣｌｙＡ−Ｒ−Ｄ１２９Ｒを除いて、試験した全ての変異はゲーティング電圧を減少させた（表１）。ＣｌｙＡ−ＲＲは、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかをナノポアのｃｉｓ側に添加した後、ＤＮＡ誘導電流イベントを示した唯一のＣｌｙＡ変異体であった（＋７０ｍＶ、図１Ｃ〜Ｄおよび６）。ＣｌｙＡ−ＲＲのみがＤＮＡ移行を可能にしたという観察にもかかわらず、ＣｌｙＡ−ＲＲ、ＣｌｙＡ−ＲおよびＣｌｙＡ−ＡＳは全て同じイオン選択性を示し（それぞれＰＮａ＋／ＰＣｌ−＝１．９±０．７、２．０±１．６、１．９±０．９、表４）、ナノポアのイオン選択性は、ナノポアの膜貫通領域の電荷分布によって支配され、ナノポアを通じた増強電気浸透流によって誘導されないことが示された。
【０１７１】
より一般的には、領域Ａ（図２０に示される）における第１のアミノ酸の置換は、少なくともデルタ１のさらなる正電荷（つまり、正に荷電したアミノ酸による中性アミノ酸の置換）を有することができ、領域Ｂにおける置換は、少なくともデルタ２のさらなる正電荷（つまり、正に荷電したアミノ酸による負に荷電したアミノ酸の置換）を有することができる。
【０１７２】
２つの追加のアルギニン環によって生じる静電電位の変化へのさらなる洞察を得るために、ＣｌｙＡ−ＡＳおよびＣｌｙＡ−ＲＲの全原子ホモロジーモデルを、ＶＭＤ（Humphrey et al. J. Mol. Graphics (1996) 14: 33-38）およびＮＡＭＤ（Phillips et al., J. Comput. Chem. (2005) 26: 1781-1802）を使用し、大腸菌（E. coli）ＣｌｙＡ結晶構造から開始して構築した。例えば、Baker et al., PNAS (2001) 98: 10037-10041、Dolinsky et al., Nucleic Acids Res. (2004) 32: W665-W667およびDolinsky et al., Nucleic Acid Res. (2007) 35: W522-W525に記載されているアダプティブポアソンボルツマンソルバ（ＡＰＢＳ）を使用して、１５０ｍＭのＮａＣｌにおける両方のポアの電位分布を計算した（図１１、パネルＢ）。ＣｌｙＡ−ＡＳでは、ポアの中心での電位は、ｃｉｓ側入口から中間部を通じてｔｒａｎｓ側入口へ、負への帯電を増加するように動くことが分かった（それぞれ平均で−２．６、−４．８および−１５．２ｍＶ）。ＣｌｙＡ−ＲＲの場合には、電位の上昇を、ポアのｃｉｓ側入口および中間部の両方で観察することができた（それぞれ平均で−０．３および−１．１ｍＶ）。ｔｒａｎｓ型くびれの電位は、平均−１７．３ｍＶへさらに低下するように見えた。これらの値は外部バイアスが印加されない場合で計算されていることに留意されたい。
【０１７３】
表１：改変されたＣｌｙＡナノポアバリアントの電気的特性。ナノポアの活性を、約０．１ｎｇのオリゴマータンパク質をｃｉｓチャンバーに添加することによって試験した。負の活性は、チャネル挿入が観察されなかったことを示す。ＶＧは、ゲーティング電圧であり、３０秒のタイムスパン内でゲーティングイベントが観察されなかった最も高い印加電圧を表す。ＤＮＡ移行は、ｄｓＤＮＡロタキサンを形成できたことを示す。各データ点は少なくとも３回の実験の平均であり、誤差は標準偏差である。実験は、０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液中で実施した。
【０１７４】
【表３】
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【０１７５】
ＤＮＡ移行のプルーフとしてのＤＮＡロタキサン
ロタキサンは、２つのストッパーによりロックされたスレッドを取り囲む大環状環によって形成されたダンベル形状分子である。この実施例では、２つのナノポア／ＤＮＡロタキサンを１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中で形成し、ナノポアを通じたｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの移行を立証した。第１のロタキサンは、１００マーの５’−ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子を、ｃｉｓコンパートメントに添加する最初のスレッド（２ａ、表３）として使用して形成した。第２のロタキサンは、３１塩基の３’ビオチンオーバーハングで延長した３’−ビオチン化５９塩基対ｄｓＤＮＡ分子（１ａ／１ｃ、表３）を使用して形成した。ナノポアの反対側に、２ａまたは１ａ／１ｃのオーバーハングにハイブリダイズするように設計されたそれぞれ別のビオチン化ｓｓＤＮＡ分子２ｂ（５０マー、５’−ビオチン化）または１ｄ（３１マー、３’−ビオチン化）を添加することによって、ロタキサンをロックした。ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ溶液の両方が、ビオチンと複合体化してナノポアを横切るＤＮＡ鎖の全移行を防止するニュートラアビジン（ＮＡ、０．３μＭ）を含有していた。
【０１７６】
１５０ｍＭのＮａＣｌおよび＋５０ｍＶでは、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡの両方がナノポアを通過したが（それぞれＩＲＥＳ＋５０  ９２±０．０２、および０．８４±０．０７、Ｎ＝３）、印加電位が−５０ｍＶに逆転したときポアから排出された（図２、パネルＡ〜Ｂ）。その後のＤＮＡ：ニュートラアビジンストッパーのｔｒａｎｓ溶液への添加は、両方の電位で永続性封鎖を誘導し、ＤＮＡロタキサンの構築を示し、両方のスレッドがナノポアに移行されたことを示した。負の印加電位で、両方のロタキサンについて、封鎖イオン電流は、開口ポア電流より高かった（ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡスレッドについてそれぞれＩＲＥＳ−５０＝１．１６±０．０３および１．１１±０．０６、Ｎ＝３の独立したナノポア実験、図２、パネルＡ〜Ｂ；図１２、パネルＡ〜Ｂ）。この効果は、以前に低イオン強度での１０ｎｍの固体ナノポアを通じたＤＮＡの移行について観察され、ＤＮＡ封鎖ポア内部の対イオン蓄積によって説明された。対照的に、正の印加電位で、開口ポア電流は封鎖電流より高く（図１、パネルＣ〜Ｄおよび図２、パネルＡ〜Ｂ；図１２、パネルＡ〜Ｂ）、この構成において、ニュートラアビジンがナノポアの内腔と相互作用している可能性があり、ＤＮＡ上の対イオンの蓄積はナノポアのｃｉｓ側とｔｒａｎｓ側とで異なっていることが示された。
【０１７７】
ＤＮＡ捕捉／通過および移行は、溶液のイオン強度に依存する
イベント間時間τｏｎの逆数である捕捉率ｋｏｎ（表７、＋７０ｍＶ、１μＭのＤＮＡ）は、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの両方が、溶液のデバイ長（λＤ）と共に増加した（図３、パネルＢ〜Ｃ；図１３、パネルＡ〜Ｂ）。しかしながら、ｄｓＤＮＡ捕捉率はλＤと共に直線的に増加し（図１３、パネルＡ）、一方でｓｓＤＮＡ捕捉率はλＤと共に指数的に増加した（図１３、パネルＢ）。したがって、これにより、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡについて異なる捕捉機構が示される。ｃｉｓ側に添加されたｄｓＤＮＡ移行の頻度は溶液のデバイ長と共に直線的に増加し（＋７０ｍＶ、図３Ａ、７および８）、ＤＮＡとナノポアとの間の静電相互作用がＤＮＡ進入および移行のために重要であることが示された。固体ナノポアを用いて以前に報告されているようにＤＮＡ封鎖ナノポアの残留電流は、溶液のイオン強度が減少するにつれて増加した（例えば、２．５ＭのＮａＣｌで０．７８±０．０９から１５０ｍＭのＮａＣｌで０．９２±０．０２へ）。興味深いことに、ＤＮＡ封鎖のＩＲＥＳと溶液のデバイ長との間の直線関係が明らかになった（図３、パネルＢ〜Ｃ）。ニュートラアビジンと複合体化したｄｓＤＮＡでは、残留電流が、遊離のＤＮＡ移行の間より約１０％低く、ニュートラアビジンが、おそらくはナノポア内腔との相互作用によって、封鎖の全体的なイオン電流に寄与していることが示された。
【０１７８】
ｓｓＤＮＡ移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に、直線的（Ｒ２＝０．７８）ではなく指数的（Ｒ２＝０．９９）に増加し（図３、パネルＣ）、ＣｌｙＡ内腔における改変された正電荷とＤＮＡとの間の相互作用以外のさらなる因子が、ナノポア進入および／または移行のために重要な役割を果たしていることが示された。１５０ｍＭのＮａＣｌでは、ニュートラアビジンと複合体化したｓｓＤＮＡ分子がＣｌｙＡ−ＲＲナノポアに対して永続性封鎖を示したが、一方で、１Ｍ以上のＮａＣｌでは、封鎖は一過性であった（図３、パネルＤ；図１０）。これらのデータについて考えられる説明は、高イオン強度において、ｓｓＤＮＡがｃｉｓ側からポアに入ってｃｉｓ側から出るということである。イオン強度≧１Ｍで、ニュートラアビジンの存在および非存在下でｓｓＤＮＡについてのＩＲＥＳ値は同じであり（図３、パネルＣ；図１０）、これらの条件下でｓｓＤＮＡが完全にナノポアを通過しておらず、ニュートラアビジンがＣｌｙＡの内腔と相互作用することを妨げている可能性があることが示された。
【０１７９】
ＤＮＡのＣｌｙＡナノポアへの一方向性進入
１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液および負の印加電位下（最大−１００ｍＶ）では、１μＭのｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのＣｌｙＡ−ＲＲのｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンパートメントへの添加はＤＮＡ封鎖を誘導せず、ＤＮＡがナノポアのｔｒａｎｓ入り口からナノポアに入ることができないことが示された（図４、パネルＡ）。正の印加バイアス下では、電流封鎖が約＋５０ｍＶよりも高い電位で現れ、ナノポアのｃｉｓ側からのｓｓＤＮＡの移行について電圧閾値が存在することが示唆された。しかしながら、ｔｒａｎｓコンパートメントからのＤＮＡの進入（図４、パネルＢ）および移行（図９）が１ＭのＮａＣｌ溶液で観察され、１５０ｍＭのＮａＣｌでのｔｒａｎｓコンパートメントからの移行を防止するエネルギー障壁が、本質的に静電的であることを示した。
【０１８０】
生理学的イオン強度下でのｔｒａｎｓコンパートメントからのＤＮＡの進入を観察するために、ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアの膜貫通領域の変化を再モデル化した（表５および図１０）。ナノポアの膜貫通領域における負に荷電した残基の置換は、負に印加した電位下で１μＭのｄｓＤＮＡ１をｔｒａｎｓチャンバーに添加したとき電流封鎖を誘導しないことが分かり（図１０）、これらの条件下でＣｌｙＡ−ＲＲナノポアのｃｉｓおよびｔｒａｎｓ側からのＤＮＡの移行に対しての比較的大きな非対称障壁が示された。
【０１８１】
考察
正確なナノポア改変は、生理学的イオン強度でのＤＮＡ移行を支援する
この実施例では、ＣｌｙＡナノポアを、生理学的イオン強度でＤＮＡの電気泳動的移行が可能となるように改変した。ＤＮＡ移行は、２組の正電荷をＣｌｙＡナノポアの入口および中間部に導入したときに観察された（図１１、パネルＡ）。驚いたことに、ＤＮＡ移行について最も高いエントロピーおよび静電障壁を示すナノポアのｔｒａｎｓ側入口（図１１、パネルＡ〜Ｂ）では、修飾を必要としなかった。さらに、ＣｌｙＡのｔｒａｎｓ側入口の電荷への広範囲の再モデル化（表１〜２）にもかかわらず、ＤＮＡ移行は、ナノポアの広い方のｃｉｓ側入口から開始したときにのみ観察することができた。さらに、ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じたｄｓＤＮＡ移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に増加し（図１３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡとＣｌｙＡ−ＲＲのｃｉｓ側入口との好ましい静電相互作用が、ＤＮＡとナノポアくびれとの好ましくない静電反発力を上回ることを示した。ｄｓＤＮＡの剛性が、試験したイオン強度の範囲にわたって顕著に変化していないことに留意されたい。さらに、イオン強度が低下するときの電気浸透流の増加は、電気浸透流がＤＮＡ進入および移行と対向するものであることから、ＤＮＡ移行の頻度増加を説明することはできない。したがって、これらのデータは、ナノポアのｃｉｓ内腔が、ナノポアのくびれを通じたＤＮＡの移行を開始するために重要であることを示す。
【０１８２】
ナノポアを通って移行するＤＮＡ分子は、電気的駆動力を受け、さらにＤＮＡの移行に対向するナノポア内部の電気浸透流（ＥＯＦ）から生じる流体力学的粘性抵抗力を受ける。ＣｌｙＡおよびほとんどの固体ナノポアは、通常、電気二重層（ＥＤＬ）と呼ばれる、表面と直接接触する陽イオンの層によって、静電的に均衡した負の表面電荷を有する。印加された電場下では、ＥＤＬにおけるイオンの移動は対イオンの優先的移行を誘導し、次いでＥＯＦを生じ、ナノポアをイオン選択的にする（例えば、ＣｌｙＡ−ＡＳ  ＰＮａ／Ｐｋ＝１．９、表２）。電解質による遮蔽により、ＥＤＬ力は、拡散層にわたって指数的様式で減衰する。デバイ長および表面電位によるその強度によって、この力には一定の範囲が与えられる。狭いナノポアでは、特に低塩濃度の状況では、拡散層を含むＥＤＬの厚さはナノポアの大きさに匹敵する可能性があり、重複したＥＤＬを生じうる。このレジーム下では、そのようなナノポアに接近するＤＮＡ分子（直径２．２ｎｍ）は、負の表面電荷を有するナノポアに対してＤＮＡのナノポアへの進入に対向する強い表面電位を受ける。
【０１８３】
ＣｌｙＡナノポアを通じたｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の機構
ＣｌｙＡは、円筒形のｃｉｓ内腔（５．５ｎｍの直径および１０ｎｍの長さ）とそれに続く、より小さな負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれ（３．３ｎｍの直径および３．０ｎｍの長さ、図１）によって近似することができ、このくびれは、ＤＮＡ移行のための主な電気泳動およびエントロピー障壁に対向すると予測される。驚いたことに、ＣｌｙＡナノポアを通じたＤＮＡの移行が、一組の正電荷をナノポア（ＣｌｙＡ−ＲＲ）のｃｉｓ内腔に添加したときに観察されたが、ナノポアのくびれは何ら修飾を必要としなかった。ＣｌｙＡのｔｒａｎｓ入り口への広範囲の修飾（表２）にもかかわらず、ＤＮＡ移行は、ナノポアの広い方のｃｉｓ側から開始したときにのみ観察される場合があり、ナノポアのｃｉｓ内腔がナノポアを通じたＤＮＡの移行を開始するために重要であることが示唆された。ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じた二本鎖ＤＮＡの移行の頻度は、溶液のデバイ長と共に直線的に増加し（図３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡとＣｌｙＡ−ＲＲにおける改変電荷との静電相互作用は、移行プロセスに対向するのではなく、むしろ好ましいことが示された。生理学的イオン強度でのｔｒａｎｓ型くびれを通じたｄｓＤＮＡの移行が、ｄｓＤＮＡ鎖がナノポアのｃｉｓ内腔によって予め整列されたときに達成されるというモデルが提唱される（図５、パネルＡ）。この概念では、ｄｓＤＮＡは、最初にｃｉｓ側入口で電荷と相互作用し、次いでポアの内腔に入り、内腔でナノポアの中間部のアルギニン残基とさらに相互作用する（図１、パネルＡ）。これらの静電相互作用は、ＤＮＡのリン酸基を「把持」し、ＤＮＡがｃｉｓ溶液へ戻って出ていくのを防止する。この構成において、ｄｓＤＮＡは、電気泳動力が最も強いｔｒａｎｓ型くびれに入るように整列され、これによりナノポアを横切るＤＮＡの円滑な移行が可能となる（図５、パネルＡ）。
【０１８４】
ｓｓＤＮＡ封鎖のデバイ長依存性が、ｄｓＤＮＡについて観察されるような直線関数ではなく、単一指数関数に良くフィットすることが観察され（図３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡと比較して、ｓｓＤＮＡの移行には、さらなる因子が影響を与えていることが示唆された。この実験では、ＤＮＡが完全に引き延ばされたときの全長であるＤＮＡ輪郭長はｄｓＤＮＡの持続長（約５０ｎｍ）よりも小さく、ｄｓＤＮＡ分子が剛性ロッドとして移行することが示される（図５、パネルＡ）。対照的に、ｓｓＤＮＡは、ポリマーコイルにおけるその重心からの任意の点の平均２乗距離である回転半径が約６ｎｍであるコイル構造（持続長約１．５ｎｍ）を有する。回転半径は、ナノポアのｃｉｓ入り口の直径と同様であるので（図５、パネルＢ）、ｓｓＤＮＡは、おそらく部分的にコイル構造（図５、パネルＢ）としてナノポアのｃｉｓ側に入る。ｓｓＤＮＡがｃｉｓリザーバからｔｒａｎｓ側へ移動するとき、次いでナノポアのｔｒａｎｓ型くびれを通じて航行するためには、コイルが徐々に解かれなければならず、その後、反対側で再コイル化されなければならない（図５、パネルＢ）。高イオン強度で、印加電位に対してナノポアからの固定化ｓｓＤＮＡのｃｉｓ側排出を促進する、移行時のＤＮＡのコンフォメーション変化に関連する、解け、再コイル化するエントロピー力は（図３、パネルＤ）、溶液のイオン強度の減少と共に低下し、溶液のイオン強度が減少するときＤＮＡ移行の効率を増強させる。ＤＮＡ封鎖ナノポア内部のイオン濃度およびデバイ長は不明であることに留意されたい。それにもかかわらず、両方がナノポア電流と相関し、同様にバルク電解質の濃度に関連する（図３、パネルＢおよびＣ）。
【０１８５】
ＤＮＡ移行の機構：ｄｓＤＮＡ捕捉は拡散律速であり、ｓｓＤＮＡ捕捉は反応律速である
異なる塩濃度でのＤＮＡ移行実験は、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡについて２つの異なる捕捉機構を示した（それぞれ図１３、パネルＡ〜Ｂ、および図１４、パネルＡ〜Ｂ）。ｄｓＤＮＡの挙動は、拡散律速捕捉プロセスと一致する。これは、この実験で使用するｄｓＤＮＡがその持続長（１５０ｂｐ）より短く、剛性の一様な荷電ロッドとして挙動することによる。捕捉半径内（０．５ｎｍのλＤについてナノポア中心から約５０ｎｍ）では、電場がＤＮＡをポアに向かって引きつけ、一端がポア入口に当たるように電場線に沿って整列させる（図１４、パネルＡ、ｉ）。ポア内に入ると、改変された電荷がＤＮＡと相互作用し、ｃｉｓ溶液へと引き戻されるのを防止する（図１４、パネルＡ、ｉｉ〜ｉｖ）。したがって、ＤＮＡ捕捉の動力学は、電気泳動に由来する単純な誘引電位での拡散粒子の動力学と近似されうる。この場合、ｄｓＤＮＡの電気泳動移動度は、溶液のデバイ長と比例し、対応するドリフト拡散式は、下記でさらに詳細に記載されるように、正確に解明することができる。ＣｌｙＡナノポアの幾何学的形状を、円筒の長さｌ＝１３ｎｍおよび捕捉直径ｄ＝６ｎｍ（図１１、パネルＡ）で近似することで、捕捉頻度を、以下：
ｋｏｎ〜１４λＤ（ｓ  ｎｍ  μＭ）−１
によって推定することができる。これは、λＤについての実験データ（高塩濃度、図１３、パネルＡ）と非常に良く一致する。何らフィッティングパラメータが使用されていないので、これは顕著なことである。ただし、ＣｌｙＡの幾何学的形状は完全な円筒から著しく逸脱しているため、ポアのパラメータの選択は、ある程度任意であることから、この比較にはいくらか注意が必要である。低塩濃度（０．１５ＭのＮａＣｌ、λＤ＝０．８ｎｍ）では、捕捉率は、上記式によって予測されるよりも高い（図１３、パネルＡ）。同様に、モデルで考慮されていないＣｌｙＡ−ＲＲ入口での正電荷は、低塩濃度で捕捉を促進する一方、高塩濃度ではこれらの電荷がより有効に遮蔽される。
【０１８６】
ｓｓＤＮＡについて、ｋｏｎとλＤとの関係は指数的であり、障壁横断（反応律速プロセス）と一致する。溶液では、ｓｓＤＮＡは、ＤＮＡがナノポアに近づくとき、コイル状のコンフォメーションをとりながら電気泳動力によってナノポアの方へ引っ張られる（図１４、パネルＢ、ｉ）。しかしながら、ポアの入口周辺では、鎖の一端がポアの入口に向き（図１４、パネルＢ、ｉｉ）、ｓｓＤＮＡが解かれる（図１４、パネルＢ、ｉｉｉ、ｉｖ）場合にのみ、移行イベントが上手く起こりうる。このエントロピー起源の追加的な反発力は、実際上、移行の前に横断しなければならないエネルギー障壁を生じさせる。そのような障壁によって制限される移行に関する理論が議論されてきており、一般的な理論では、捕捉率は、
【０１８７】
【数１】
2019507583.tif 000006
で与えられる。ここでΔＦｂは障壁の高さであり、ωは障壁横断のための特有の試行率（attempt rate）である。指数因子は、横断イベントの成功確率を与える。モデル入力から、ΔＦｂの推定を達成しうる。移行の成功確率が、電気泳動移動度に比例し、同様にλＤに比例する項を含むことが示された。これによりλＤに対するｋｏｎの指数的依存性が説明される（図１３、パネルＢ）。ｋｏｎはイベント間時間の逆数から取得されるが、測定された電流封鎖の全てが必ずしも移行イベントを説明するものでないことに留意されたい。これらの封鎖の一部はＤＮＡ鎖の進入とその後のｃｉｓ側への引き戻しによるものでありうる（図１４、パネルＢ、ｉｉｉからｉ）。それにもかかわらず、ロタキサンの形成は、少なくとも一部の分子が上手く移行されることを示している。いずれの場合においても、ｋｏｎのλＤに対する指数的依存性をもたらす引数は有効である。
【０１８８】
生物学的意義
興味深いことに、ＣｌｙＡナノポアを通じたＤＮＡの移行を可能にする修飾は、生物学的機能がＤＮＡに沿ってスライディングすることであるタンパク質においても観察される。バクテリオファージでは、ＤＮＡは、整列し、同様の寸法、化学量論、内部表面電荷、およびＣｌｙＡと同様の内部構造サイズを有するポータルタンパク質にＤＮＡを押し込むタンパク質に詰め込むことによって、前駆型キャプシドに転送される。負の内部表面電荷が、ポータルタンパク質を横切るＤＮＡの平滑な移行のために重要であるようであり、その理由は、負の内部表面電荷が、ＤＮＡを包囲し、ＤＮＡに沿ってスライディングする、β−クランプタンパク質などの他のタンパク質で観察されるからである。またポータルタンパク質およびβ−クランプタンパク質は正に荷電した環を有し、この環は、移行するＤＮＡの負荷電リン酸骨格との相互作用によって、ゲノムＤＮＡパッケージングに直接的な役割を果たすことが提唱されている。ＣｌｙＡナノポアを通じたＤＮＡの電気泳動的移行が、正電荷残基の２つの環がナノポアのｃｉｓ入り口および中間部に導入され、狭い負に帯電したくびれを通じた移行のためにＤＮＡを整列させるときに観察することができた。そのような相互作用がない場合、つまりｔｒａｎｓ側からの通過では、ＤＮＡ移行は観察できなかった。したがって、本明細書に提示される結果は、接続タンパク質における正電荷のそのような環がキャプシドを出て感染細胞へ入るＤＮＡの排出を開始するために重要でありうることを示す。
【０１８９】
この実施例では、改変されたＣｌｙＡ１２量体ナノポアＣｌｙＡ−ＲＲが、正電荷の２つの環が導入されると、生理学的イオン強度でｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡを移行することが提示される。ＣｌｙＡ−ＲＲは、単一分子レベルでタンパク質−ＤＮＡ相互作用を研究するために使用することができ、酵素がナノポアを通じた核酸の移行を制御するＤＮＡマッピングおよびシーケンシング用途で使用することができる。ナノポアの広い方の入口（ｃｉｓ側）での誘引的相互作用となる正電荷の環の導入が、狭く負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれを通じたＤＮＡ移行を誘導するために重要であることが分かった。驚くべきことに、くびれ自体は修飾を必要としなかった。これらの結果は、ナノポアの入口および中間での誘引的相互作用が、狭く負に荷電したｔｒａｎｓ型くびれを通じた電気泳動駆動スライディングを有効にするためのＤＮＡの「把持」および配向のために重要であることを示す。興味深いことに、ＣｌｙＡ−ＲＲの電荷分布は、ウイルスのポータルタンパク質に反映されており、生物学的ナノポアの正確な改変が、ウイルスキャプシド内外でのＤＮＡの効率的な詰め込みおよび排出のために重要であることが示される。さらに、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ移行の頻度の、それぞれ直線的および指数的イオン強度依存性は、ｄｓＤＮＡ捕捉が拡散律速プロセスに従い、一方でｓｓＤＮＡ捕捉が反応律速プロセスに従う、予想される機構を示す。さらにｓｓＤＮＡは、コイル構造としてナノポアに入り、ナノポアのくびれを通じて移行するために解かれる必要があることも示された。これらの知見は、固体ナノポアの改変に役立てるために使用することができる。例えば、好ましい表面電荷と、ナノポア上方に配置されるＤＮＡの回転半径と類似の直径とを有するナノスケールチャンバーは、特に低イオン強度でのＤＮＡの移行に有利であるはずである。さらに、ＤＮＡ移行を可能にするＣｌｙＡナノポアへの修飾は、ウイルスポータルタンパク質に反映されていることが分かり、生物学的ナノポアの正確な改変が、ウイルスキャプシド内外でのＤＮＡの効率的な詰め込みおよび排出のために重要であることが示された。
【０１９０】
例示的材料および方法
ＤＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。ニュートラアビジンはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから取得し、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから取得した。β−ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）は、ＧＬＹＣＯＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨから購入した。酵素はＦｅｒｍｅｎｔａｓから購入し、全ての他の材料は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａから購入した。
【０１９１】
タンパク質精製。ＣｌｙＡ−ＡＳ遺伝子への単一点突然変異は、Soskine et al., J. Am. Chem. Soc. (2013) 135: 13456-13463およびMiyazaki et al., Methods Enzymol. (2011) 498: 399-406に記載される「メガプライマー」方法を使用して実施した。ＣｌｙＡは、ｐＴ７プラスミドを使用して、Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現させた。モノマーは、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、Waduge et al., ACS Nano (2015) 9: 7352-7359に記載される０．５％β−ドデシルマルトシド（ＧＬＹＣＯＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）の存在下でオリゴマー化した。モノマー（Ｃ末端オリゴヒスチジンタグ含有）を大腸菌（E. coli）ＢＬ２１細胞で発現させ、可溶性画分をＮｉ−ＮＴＡアフィニティー緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．２％ＤＤＭおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して精製し、４℃で保存した。
【０１９２】
ＤＮＡ調製。ｄｓＤＮＡ１は、１ａおよび１ｂを等モル濃度で最初に混合することによって調製した（表３）。混合物を９５℃に至らせ、温度を一定の間隔で段階的に下げた。ＤＮＡを、過剰のｓｓＤＮＡから、アガロースビーズに単量体アビジンを固定化したビオチン結合カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いでｄｓＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、カラムから溶出した。溶出画分を濃縮し、ＰＣＲ  ｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してさらに精製した。典型的に０．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度が取得された。１ａ／１ｃデュプレックスは、１について説明したようにアニーリングしたが、精製はしなかった。
【０１９３】
イオン透過性。非対称条件下のＩ−Ｖ曲線（表６）を、対称条件下のｃｉｓチャンバーにＣｌｙＡを添加することによって（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ溶液の両方で１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）収集した。次いで電極の均衡を取り、５ＭのＮａＣｌストック溶液のアリコートをｃｉｓコンパートメントに添加することによってｃｉｓにおける電解質濃度を１Ｍへ増加させた。ｃｉｓ溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ）と同じ緩衝液を使用して、ｃｉｓ側への添加と同じ体積を添加することによって、ｔｒａｎｓチャンバーの体積を調節した。
【０１９４】
透過率（ＰＮａ＋／ＰＣｌ−、表４）は、Ｉ−Ｖ曲線から外挿した測定逆電位（Ｖｒ）値を使用して、ゴールドマン・ホジキン・カッツ（Goldman-Hodgkin-Katz）の式（下記）を使用して計算した。
【０１９５】
【数２】
2019507583.tif 000007
Ｒは、普遍気体定数（８．３１４ＪＫ−１ｍｏｌ−１）であり、Ｔは、ケルビン温度であり、Ｆはファラデー定数（９６４８５Ｃｍｏｌ−１）であり、ＰＮａ＋およびＰＣｌ−はイオンＮａ＋またはＣｌ−についての相対的膜透過性であり、ａＮａ＋およびａＣｌ−はそれぞれの活性である。ｃｉｓチャンバーは接地した。２．５ＭのＮａＣｌを含有する２．５％アガロースブリッジを備えたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用して全ての実験を実施した。
【０１９６】
電気的記録。イオン電流は、ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から形成した平面二重層から記録することによって測定した。電流は、寒天ブリッジ（２．５ＭのＮａＣｌ緩衝液中の３％ｗ／ｖ低融点アガロース）に沈めたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて、Ho et al., Sci. Adv. (2015) 1, e1500905およびMaglia et al., Methods Enzymol. (2010) 475: 591-623に記載されているように、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して測定した。単一チャネルを、電流対印加電圧関係を測定することによって特徴付けした（Ｉ−Ｖ曲線、電位は−１００から＋１００ｍＶの１０ｍＶステップで、２１秒で印加した、図６、１０および表５）。０．１５ＭのＮａＣｌで、イオン電流は、２ｋＨｚのローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１０ｋＨｚサンプリングレートを使用して記録した。より高い塩濃度で、イオン電流を５０ｋＨｚでサンプリングし、ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを１０ｋＨｚに設定した。０．３および０．５ＭでのＮａＣｌ電流トレースは、４ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌデジタルフィルターで取得後フィルタリングした（図１６、１７）。異なるフィルタリング頻度を用いることは、検出されたイベントの総数に影響を与える。例えば、５０ｋＨｚでサンプリングしたトレースへ２ｋＨｚのデジタルＧａｕｓｓｉａｎフィルターを適用し、一方で１０ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌフィルターを適用することにより、イベント間時間が約５０％増加する（２２１から３１１ｍｓへ、０．１７μＭのｄｓＤＮＡ、１ＭのＮａＣｌ、０．１２ｍｓの平均滞留時間）。したがって、ＤＮＡ捕捉頻度のデバイ長依存性に対する過剰なフィルタリングの効果を試験するために、図１３、パネルＡに記載されたデータを、全ての電流トレースに対して１ｋＨｚのＧａｕｓｓｉａｎフィルターを適用した後にプロットした（図１８）。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ封鎖がそれぞれ指数および直線回帰に良好にフィットすることが分かった（図１８）。
【０１９７】
データ分析。電流封鎖イベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデータ収集閾値を使用して、個々に収集した。得られた開口および封鎖ポア電流は、全点ヒストグラムへのＧａｕｓｓｉａｎフィッティングから計算した。残留電流は、封鎖ポア電流値を、開口ポア電流値で割ることによって計算した。ＤＮＡ移行滞留時間（τｏｆｆ）値は、ＤＮＡ封鎖滞留時間のイベントヒストグラムから単一指数フィットにより計算し、一方で（τｏｎ）値は、イベント間時間の対数ヒストグラムから指数対数確率フィットを使用して計算した（図１３、表７および図１６、１７）。誤差は、少なくとも３回の独立したナノポア実験の平均値からの標準偏差を示し、その回数はＮで示している。
【０１９８】
本明細書に記載の一実施形態による修飾ＣｌｙＡナノポアサブユニットポリペプチドの調製に関する追加情報
ＣｌｙＡ−ＡＳ遺伝子への単一点突然変異を、「メガプライマー」方法を使用して実施した。典型的に、２つのＰＣＲサイクルを実施して、新たなＤＮＡ構築物を調製した。第１のＰＣＲ反応では、プラスミドＤＮＡは、２つのプライマーで増幅した：フォワードプライマーは、塩基置換を保有する２０〜３０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、リバースプライマーはＴ７プロモーターまたはＴ７ターミネーターのいずれかであった。膜貫通領域での変異について、リバースプライマーは、タンパク質配列の中間のストレッチに相補的な２５マーのオリゴであった（表３）。メガプライマー（２００〜３００ｂｐ）を含有するＰＣＲ産物をアガロースゲル（２％アガロース／ＴＡＥおよびクリスタルバイオレット）に装填し、メガプライマーを切り出し、ＰＣＲ  ｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。５μＬの精製されたメガプライマーを、２％アガロース／ＴＡＥゲルに装填して純度を確認し、５〜１０μＬのメガプライマーを、第２のＰＣＲ反応のために使用した。次いで第２のＰＣＲ産物を、最初にＤｐｎＩ（１〜２時間、３７℃、高速消化ＤｐｎＩ、Ｆｅｒｍｅｎｔｈａｓ）で消化してＣｌｙＡ−ＡＳ鋳型ＤＮＡを除去し、次いで約１μＬを、エレクトロコンピテント細胞Ｅ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（製造元）を用いての形質転換のために使用した。
【０１９９】
ＤＮＡ調製に関する追加情報
ｄｓＤＮＡ１を、１ａ、３’−ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（表３）を２０％過剰の相補的ｓｓＤＮＡ１ｂ（表３）とインキュベートすることにより形成した。温度を１分間９５℃にし、次いで室温まで段階的に下げた。７０℃の推定アニーリング温度付近では、温度を２１℃へ２℃ステップで下げた。各ステップは１分間継続した。次いで、ＤＮＡを、過剰のｓｓＤＮＡから、アガロースビーズに単量体アビジンを固定化したビオチン結合カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いでｄｓＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ビオチンブロッキング／溶出緩衝液で溶出した。溶出画分を濃縮し、ＰＣＲ  ｑｕｉｃｋ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してさらに精製した。典型的に、０．２μｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度が取得された。ｄｓＤＮＡの大きさおよび純度を、ＴＡＥ緩衝液中の２％アガロースゲルを使用して検査し、分光学的に定量した。精製ｄｓＤＮＡを、１ｍＭのＥＤＴＡの存在下、−２０℃で保存した。１ａ：１ｃを、３’−ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（１ａ、表３）を等モル濃度の１ｃとインキュベートすることによって形成した。温度を１分間９５℃にし、次いで、室温まで段階的に下げた。７０℃の推定アニーリング温度付近では、温度を２℃ステップで下げ、各ステップは、１分間維持した。
【０２００】
電気的記録およびデータ分析に関する追加情報
人工平面脂質二重層を上記のように調製した。特に明記しない場合、信号は、１０ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌフィルターで処理した後、５０ｋＨｚのサンプリングレートで収集した。脂質二重層は、１〜２μｌのペンタン中の１，２−ジフィタノイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの１０％溶液でＴｅｆｌｏｎフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、ＵＫ）の小さな開口部（約１００μｍ）を前処理することによって形成した。電位は、寒天ブリッジ（２．５ＭのＮａＣｌ緩衝液中の３％ｗ／ｖ低融点アガロース）に沈めたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用して印加した。印加電位は、装置のｔｒａｎｓコンパートメントに接続された作用電極の電位を指す。ＣｌｙＡナノポア溶液（０．０１〜０．１ｎｇ／ｍＬ）を、接地電極に接続されたｃｉｓコンパートメントに添加した。単一ポアの挿入後、過剰のタンパク質を数サイクルの灌流によって除去した。電気的記録は０．１５〜２．５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で、２２℃で実施した。０．１５ＭのＮａＣｌ中で、２ｋＨｚのローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１０ｋＨｚサンプリングレートを使用してデータを記録した。より高い塩濃度で、データを５０ｋＨｚでサンプリングし、一方、ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを１０ｋＨｚに設定した。０．３および０．５ＭでのＮａＣｌ電流トレースを、４ｋＨｚのＢｅｓｓｅｌデジタルフィルターで取得後フィルタリングした。電流封鎖イベントは、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ）の「単一チャネル検索」関数を使用し、０．０５ｍｓのデータ収集閾値を使用して個々に収集した。ＩＯおよびＩＢ値は、それぞれ開口および封鎖ポア電流の全点ヒストグラムへのＧａｕｓｓｉａｎフィッティングから計算した。ＤＮＡ移行滞留時間τｏｆｆを、封鎖ポア電流イベント（ｔｏｆｆ）のイベントヒストグラムから単一指数標準フィットにより計算した。イベント間時間τｏｎは、封鎖ポア電流イベント間のイベント間時間（ｔｏｎ）の対数ヒストグラムから指数対数確率フィットを使用して計算した。誤差は、少なくとも３回の独立した繰り返しの平均値からの標準偏差を示し、その回数は「ｎ」で示している。
【０２０１】
ｃｉｓチャンバーから挿入したポアは、正の印加電位でより高いコンダクタンスを示し、挿入チャネルの配向の評価を補助した。単一チャネルを、電流対印加電圧関係を測定することによって特徴付けした（Ｉ−Ｖ曲線、電位は２１秒で−１００から＋１００ｍＶの１０ｍＶステップで印加した）。ポア整流は、＋１００ｍＶおよび−１００ｍＶでの開口ポア電流の比（Ｉ０＋１００ｍＶ／Ｉ０−１００ｍＶ）から取得した。ナノポアのゲーティングの傾向は、所与の印加電位での開口ポア電流での連続測定によって評価した。次いでＶＭＡＸが、３０秒のタイムスパン内でゲーティングイベントが観察されなかった印加電位によって与えられた。イオン電流の自発的可逆ゲーティングが、ＶＭＡＸより高い印加電圧で観察された。ポアを通じたＤＮＡ進入および移行は、ＶＭＡＸと同等の印加電位下で、ｃｉｓチャンバーに、１μＭの３’端ビオチン化ｓｓＤＮＡ１ａを添加し、次いで相補的ｓｓＤＮＡ１ｂを添加し（表３）、その後ニュートラアビジン（１．２μＭ、モノマー）を添加することによって試験した。
【０２０２】
イオン透過性に関する追加情報
ＣｌｙＡナノポアについての透過率は、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｔｒａｎｓ、１ＭのＮａＣｌ  ｃｉｓの非対称塩条件での逆電位の測定によって計算した。タンパク質ナノポアをｃｉｓチャンバーに添加し、単一チャネルを対称条件（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ溶液の両方で１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で最初に特徴付けした。電極の均衡を取った後、ｃｉｓにおける電解質濃度を、５ＭのＮａＣｌストック溶液のアリコートをｃｉｓコンパートメントに添加することによって１Ｍへ増加させた。ｃｉｓ溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ）と同じ緩衝液を使用して、ｃｉｓ側への添加と同じ体積を添加することによって、ｔｒａｎｓチャンバーの体積を調節した。ゼロ電流を取得するために使用する電位である逆電位（Ｖｒ、表３）は、電流−電圧（ＩＶ）曲線（表６）によって取得した。イオン選択性（ＰＮａ＋／ＰＣｌ）は、ゴールドマン・ホジキン・カッツ（ＧＨＫ）式を使用してＶｒから計算した。両方のＧＨＫ式により、ＣｌｙＡナノポアについて観察されたＶｒの正の値は、ポアを通じた陽イオンの優先的移動を示し、ポアが陽性選択的チャネルであることを示す。ｃｉｓチャンバーを接地し、２．５ＭのＮａＣｌを含有する２．５％アガロースブリッジを備えたＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用して全ての実験を実施した。
【０２０３】
【数３】
2019507583.tif 000008
ここでＶｒは膜電位であり、Ｒは普遍気体定数（８．３１４Ｊ．Ｋ−１．ｍｏｌ−１）であり、Ｔはケルビン温度であり、Ｆはファラデー定数（９６４８５Ｃ．ｍｏｌ−１）であり、ＰｘはＮａ＋およびＣｌ−についての相対的膜透過性であり、［ａＸ］ｃｉｓはｃｉｓコンパートメントにおけるＮａ＋およびＣｌ−の活性であり、［ａＸ］ｔｒａｎｓは、ｔｒａｎｓコンパートメントにおけるＮａ＋およびＣｌ−の濃度であり、ａｘはＮａ＋およびＣｌ−の活性である（J.F. Zemaitis, Handbook of aqueous electrolyte thermodynamics: theory and application, 1986、Ludwig Molecular Microbiology 1999、Li-Qun Gu PNAS 2000、Petr G. Merzlyak Biophysics 2005）。
【０２０４】
詳細は、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの捕捉率を記述する、それぞれ式（１）および（２）の導出に関して提示している。
【０２０５】
ｄｓＤＮＡ捕捉
アプローチは、ＧｒｏｓｂｅｒｇおよびＲａｂｉｎによって開発されたアプローチに関する。ＣｌｙＡナノポア膜は、直径ｄの円筒孔を有する厚さｌの平面誘電体表面として記載する。ＣｌｙＡポアについての特徴的距離は、ｌ＝１３ｎｍおよびｄ＝６ｎｍである。ΔＶを使用して膜のｃｉｓ側とｔｒａｎｓ側間の電位差を表すと、ｃｉｓ側の電位は
【０２０６】
【数４】
2019507583.tif 000009
によって与えられると示すことができ、これは１ｒに従って／ｃｉｓ側のポアから遠くなるにつれて減衰する（慣例により、ｃｉｓ側の電極での電位はゼロに設定した）。座標の原点（γ＝０ｎｍ）は、ポアの中央（図１９）である。
【０２０７】
ｄｓＤＮＡは、拡散定数Ｄと電気泳動移動度μによって特徴付けられる電気泳動ドリフトとを有する拡散運動を行う荷電点粒子として近似される。結果として生じるｄｓＤＮＡ濃度ｃ（γ，ｔ）についての半径座標でのドリフト拡散式は、
【０２０８】
【数５】
2019507583.tif 000010
によって与えられる。ここで電気泳動電流の前がマイナス記号であるのは、ＤＮＡが負に荷電しているためである。この慣例で、移動度係数の正のμ＞０に維持され、したがって印加電場によるドリフト速度はν＝−μＥである。アインシュタインの関係式はこの系について保たれないため（つまり、Ｄ≠μｋＢＴ）、単純にＤとμを関連付けることができないことに留意されたい。
【０２０９】
式（２）の定常解（∂ｃ∂ｔ／＝０）は、
【０２１０】
【数６】
2019507583.tif 000011
である。ここで、境界条件は、ｃ（Ｒ）→ｃ０極限およびｃ（Ｒ）＝０であり、Ｒはポアの大きさの桁数の微小距離である。距離γ＊は、
【０２１１】
【数７】
2019507583.tif 000012
と定義される。これにより、電気泳動電位（１）は、
【０２１２】
【数８】
2019507583.tif 000013
のように書き換えることができる。解（３）と前述の関係式から、ラジアル粒子電流密度が取得される：
【０２１３】
【数９】
2019507583.tif 000014
さらに速度が、半径γの半球殻（ｃｉｓ側の利用可能な表面を占める）にわたって電流密度を積分することから得られる：
【０２１４】
【数１０】
2019507583.tif 000015
ここで近似γ＊≫Ｒであり、妥当性を後で検査した。最終結果は、外部電位の非存在下における拡散粒子についてのスモルコフスキー拡散律速反応速度と形式的に似ている。ここでγ＊は、ｄｓＤＮＡがポアによって不可逆的に捕捉される距離と解釈することができる。この捕捉半径は、印加電位が高くなるほど、または電気泳動移動度（４）が増加するほど、長くなる。
【０２１５】
（４）と（７）とを組み合わせると、
【０２１６】
【数１１】
2019507583.tif 000016
が得られる。γ＊はＤに反比例するので、前の式からＤが相殺されることに留意されたい。
【０２１７】
さらに発展させるために、μを推定した。長さＬを有するｄｓＤＮＡ分子の総電荷は、Ｑ＝−２αｅＬａであり、ここでａ＝０．３４ｎｍは２塩基間の距離であり、α＜１は、全てのリン酸基がイオン化されているわけではないという事実を反映する数値係数である。ＤＮＡを表面積Ａの円筒として近似すると、抵抗力は（ηＡλＤ／）νと推定され、ここでη＝１０−３ｋｇ  ｍ−１秒−２は水の粘度であり、λＤはデバイ長である。定義ν＝−μＥを使用して、次式が得られる：
【０２１８】
【数１２】
2019507583.tif 000017
ここでｂ＝２ｎｍは二重らせん直径である。ζ電位の計算に基づいて、この式の別の導出が、ＧｒｏｓｂｅｒｇおよびＲａｂｉｎによって与えられる。ここで式（７）および（９）を組み合わせ、実験に関連する数値（ΔＶ＝＋７０ｍＶ、ｃ０＝１μＭ）を使用し、α＝１、つまり完全イオン化と設定すると、
【０２１９】
【数１３】
2019507583.tif 000018
が得られる。これは、上述の式（１）である。
【０２２０】
最後に捕捉半径γ＊を計算した。この目的のため拡散係数はストークスの法則を使用して見積もられる。
【０２２１】
【数１４】
2019507583.tif 000019
ここでＲＨは流体力学的半径である。ｄｓＤＮＡを半径１ｎｍおよび長さ３４ｎｍ（１００ｂｐ）の円筒とみなすと、Hansen et al.（J. Chem. Phys. (2004) 121: 9111-9115）による式を使用してＲＨ≒６ｎｍと推定された。（１１）と（４）とを組み合わせると：
【０２２２】
【数１５】
2019507583.tif 000020
であり、ここでλＤ＝０．５ｎｍであり、ｋＢＴ≒２５ｍｅＶである。捕捉半径は、デバイ長より２桁大きく、ポア半径より非常に大きく、したがって式（７）で使用される近似は正当化される。
【０２２３】
ｓｓＤＮＡ捕捉
ｓｓＤＮＡ捕捉の議論は、障壁律速プロセスについてRowghanian et al.（Phys. Rev. E (2013) 87: 042723）により発展されたアプローチによって鼓舞される。今回のケースは、拡散律速の場合よりはるかに複雑であり、理論はほとんど確立されていない。モデルは、ポア入口からの一端の距離である単一の「反応」座標γを使用するドリフト拡散式に基づく。ポアから十分に遠いため、ｓｓＤＮＡは、式（１）によって記載される誘引的電気泳動力のみを受ける。距離≦Ｒｇ（ここでＲｇは回転平衡半径である）のポアの周辺では、エントロピー起源の追加的な反発力が存在する：ｓｓＤＮＡコイルは、端部がポア入口に近づくように強制されるとき、配置エントロピーを減少させる。鎖が十分に長い場合、エントロピー反発が静電引力を上回り、障壁を生じる（図１９）。
【０２２４】
エントロピー電位をＵ（γ）で示すと、以下のラジアル電流密度：
【０２２５】
【数１６】
2019507583.tif 000021
が示され、ここでμは電気泳動移動度であり、一方、μ〜は、概念的非電気力に関連する移動度であり、この場合、エントロピー反発である。μはアインシュタインの関係式を満たしていないが（Ｄ≠μｋＢＴ）、概念的移動度μ〜はこの関係式を充足する（μ〜＝Ｄ／ｋＢＴ）。式（１３）における粒子電流は、
【０２２６】
【数１７】
2019507583.tif 000022
と書き換えることができ、ここで、
【０２２７】
【数１８】
2019507583.tif 000023
である。
【０２２８】
したがって問題は電位Ｆｂにおける粒子の拡散運動にある。アインシュタインの関係式に従わないため、この電位は、電気泳動移動度μおよびμ〜からη−１の溶媒粘度ηとしての動力学的パラメータも含んでいる。電位は、距離Ｒｇに最小限近接し、障壁高さを画定するポア入口に最大限近接する：ΔＦｂ≡Ｆｂｍａｘ−Ｆｂｍｉｎ。クラマース（Kramers）理論によると、捕捉率ｋｏｎは指数的に障壁高さに依存する：
【０２２９】
【数１９】
2019507583.tif 000024
【０２３０】
障壁は、印加電圧Δを増加させることによって低下させることができ、したがってポアへの静電引力を高めることができる。式（１５）は、ｓｓＤＮＡの電気泳動移動度μを増加させることによって、同様の効果を得ることができることを示唆する。μを修飾するための１つの明白な方法は、デバイ長を修飾するとき溶液のイオン強度の変化を通じたものである。式（９）に示すように、電気泳動移動度は、λＤに比例する。塩濃度はｓｓＤＮＡの持続長に対しても効果を有し、したがって障壁Ｕ（γ）に対するエントロピーの寄与に対しても効果を有するが、この効果は弱いと予測されることに留意されたい。障壁高さに対する塩濃度の変化の主な効果は、λＤの直線項を含むと予測される：
ΔＦｂ＝ａ−ｂλＤ  （１７）
ここでａ、ｂ＞０であり、（１５）と一緒になって、実験で観察されたλＤに対するｋｏｎの指数的成長を説明する。
【０２３１】
表２．ｔｒａｎｓ側からのＤＮＡ移行を改変するポア。各データ点は少なくとも３回の実験の平均であり、誤差は標準偏差である。実験は、０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５溶液中で実施した。ナノポアの活性を、０．０１〜０．１ｎｇのオリゴマータンパク質をｔｒａｎｓチャンバーに添加することによって試験した。負の活性は、チャネル挿入が観察されなかったことを示す。ＶＧは、ゲーティングイベントが３０秒以内に観察されなかった最大印加電圧を表す。ＤＮＡ捕捉は、ニュートラアビジンと複合体化したビオチン化ｄｓＤＮＡの添加により、一過性の電流封鎖のみが観察されたことを示す。ＤＮＡ移行は、ｄｓＤＮＡロタキサンを形成することができたことを示す。
【０２３２】
【表４】
2019507583.tif 000025
【０２３３】
表３：この実験で使用したＤＮＡ分子。１は、１ａを２０％過剰の１ｂとインキュベートすることによって形成し、方法に記載されるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。１＊は、１ａを２０％過剰の１ｂとインキュベートすることによって形成し、さらなる精製は行わなかった。２つのＤＮＡ鎖の相補的配列を斜体で示す。接尾辞ｂｉｏはビオチン部分を示している。
【０２３４】
【表５】
2019507583.tif 000026
【０２３５】
表４：選択されたＣｌｙＡナノポアのイオン選択性。ＣｌｙＡバリアントナノポアについての透過率（ＰＮａ＋／ＰＣｌ−）および逆電位（Ｖｒ）は、平均±標準偏差として報告される。４つ以上の単一チャネルをバリアントごとに測定した。使用した緩衝液は１５ｍＭのＴＲＩＳ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５であり、ｃｉｓチャンバーでは１ＭのＮａＣｌ、ｔｒａｎｓチャンバーでは１５０ｍＭであった。
【０２３６】
【表６】
2019507583.tif 000027
【０２３７】
表５：ＣｌｙＡ変異体についてのＩＶ曲線。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。各データ点は少なくとも３回の実験の平均であり、誤差は標準偏差である。
【０２３８】
【表７−１】
2019507583.tif 000028
【０２３９】
【表７−２】
2019507583.tif 000029
【０２４０】
【表８−１】
2019507583.tif 000030
【０２４１】
【表８−２】
2019507583.tif 000031
【０２４２】
表６：非対称塩濃度下でのＣｌｙＡバリアントのＩＶ曲線。４つ以上の単一チャネルをバリアントごとに測定した。各データは、平均±標準偏差として報告する。使用した緩衝液は１５ｍＭのＴＲＩＳ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５であり、同時にｃｉｓチャンバーは１ＭのＮａＣｌを含有し、ｔｒａｎｓチャンバーは１５０ｍＭを含有した。電気的記録は０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、２ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、１００μｓ（１０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
【０２４３】
【表９−１】
2019507583.tif 000032
【０２４４】
【表９−２】
2019507583.tif 000033
【０２４５】
表７：ＣｌｙＡ−ＲＲナノポアを通じたｓｓＤＮＡ（１ａ）およびｄｓＤＮＡ（１）の移行。３つ以上の単一チャネルを、条件ごとに測定した。データは、平均±標準偏差として報告する。電気的記録は１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚローパスＢｅｓｓｅｌフィルターを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
【０２４６】
【表１０】
2019507583.tif 000034
【０２４７】
配列表
【０２４８】
【表１１】
2019507583.tif 000035
【０２４９】
他の実施形態
本明細書に開示された特色の全ては、任意の組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特色は、同じ、同等または類似の目的を果たす代替の特色によって置き換えられてもよい。したがって、特に断らない限り、開示される各特色は、同等または類似の特色の一般的な系列の一例としてのみ開示される。上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を、本開示の精神および範囲から逸脱することなく容易に確認することができ、種々の用途および条件に適合させるために、本開示の種々の変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内である。
【０２５０】
均等論
いくつかの本発明の実施形態を本明細書に記載および例示してきたが、当業者は、機能を実施するならびに／あるいは結果および／または本明細書に記載の１つもしくは複数の効果を得るために種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載した本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般的に、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示を意図していること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の用途に依存することを、容易に理解する。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または通例にすぎない実験を使用して確認することができる。したがって、前述の実施形態が単に一例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態が、具体的に説明した以外の方法で実施され請求されうることが理解される。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法に向けられている。さらに、そのような特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組合せが、そのような特色、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０２５１】
本明細書で定義され、使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義および／または定義された用語の通常の意味より優先すると理解されるものとする。
【０２５２】
本明細書で開示されている全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に対する参考として組み込まれ、一部の場合には、文献全体を包含しうる。
【０２５３】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対のことが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるものとする。
【０２５４】
句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、そのように結合される要素の「いずれかまたは両方」を意味し、つまり、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるものとする。「および／または」で列挙される複数の要素は、同じ様式で解釈されるものとし、つまり要素の「１つまたは複数」が同様に結合する。「および／または」の節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、それらの具体的に特定された要素に関連するまたは関連しないかどうかにかかわらず、任意選択的に存在しうる。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用されるとき、一実施形態では、Ａのみ（任意選択的にＢ以外の要素も含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択的にＡ以外の要素も含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
【０２５５】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、「または」は、上記で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解されるものとする。例えば、リスト中の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈され、つまり、要素のいくつかまたはリストの少なくとも１つを含むだけでなく、２つ以上も含み、任意選択的に、列挙されていない追加的項目も含むと解釈されるものとする。逆のことを明確に示す用語、例えば「の１つのみ」もしくは「まさに１つの」または特許請求の範囲で使用される「からなる」のみが、要素のいくつかまたはリストのまさに１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用されるとき、用語「または」は、排他性の用語、例えば、「いずれか」「１つの」「１つのみの」または「まさに１つの」が先行するとき、排他的選択肢（つまり「一方または他方であるが両方でない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用されるとき、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有する。
【０２５６】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、１つまたは複数の要素のリストを参照する句「少なくとも１つ」は、要素のリスト内の任意の１つまたは複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されたそれぞれおよび各要素の必ずしも少なくとも１つを含むものではなく、要素のリスト内の要素の任意の組合せを排除するものではないと理解されるものとする。またこの定義は、句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、それらの具体的に特定された要素に関連するまたは関連しないかどうかにかかわらず、任意選択的に存在しうることを許可する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」は）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、Ａを含むがＢは存在しない（および任意選択的にＢ以外の要素を含む）ことを指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、Ｂを含むがＡは存在しない（および任意選択的にＡ以外の要素を含む）ことを指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、Ａ、および少なくとも１つの、任意選択的に１つを超える、Ｂ（および任意選択的に他の要素を含む）などを指すことができる。
【０２５７】
逆のことを明記しない限り、１つを超えるステップまたは行為を含む、本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙された順序に必ずしも限定されないことも理解されるものとする。
【符号の説明】
【０２５８】
１０２  第１の開口部
１０４  中間部
１０６  第２の開口部
１０８  内腔
１１０  膜
１１２  負に帯電したくびれ
【図１】
2019507583.tif 000036
【図２】
2019507583.tif 000037
【図３】
2019507583.tif 000038
【図４】
2019507583.tif 000039
【図５】
2019507583.tif 000040
【図６】
2019507583.tif 000041
【図７】
2019507583.tif 000042
【図８】
2019507583.tif 000043
【図９】
2019507583.tif 000044
【図１０】
2019507583.tif 000045
【図１１】
2019507583.tif 000046
【図１２】
2019507583.tif 000047
【図１３】
2019507583.tif 000048
【図１４】
2019507583.tif 000049
【図１５】
2019507583.tif 000050
【図１６】
2019507583.tif 000051
【図１７】
2019507583.tif 000052
【図１８】
2019507583.tif 000053
【図１９】
2019507583.tif 000054
【図２０】
2019507583.tif 000055
【配列表】
2019507583000001.app
【国際調査報告】
2019507583.tif 000056
2019507583.tif 000057
2019507583.tif 000058
2019507583.tif 000059