(57)【要約】  本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集構成成分の送達のために有益である脂質ナノ粒子をベースとした組成物および方法を提供する。
2019516351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、
細胞を、
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む方法。
【請求項２】
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸を肝臓細胞に送達することを含む遺伝子編集の方法であって、前記クラス２  Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸は、
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含む少なくとも１つのＬＮＰ組成物として製剤化されている、方法。
【請求項３】
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸を対象のＡｐｏＥ結合性細胞に投与することを含む遺伝子編集の方法であって、前記クラス２  Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸は、
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含む少なくとも１つのＬＮＰ組成物として製剤化されている、方法。
【請求項４】
肝臓細胞を、
ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ；
ガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含むＬＮＰと接触させることを含む遺伝子編集の方法。
【請求項５】
肝臓細胞における遺伝子の発現を変更する方法であって、１つまたは複数のＬＮＰ製剤としてクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸の治療的有効量を対象に投与することを含み、少なくとも１つのＬＮＰ製剤が、
ガイドＲＮＡ核酸またはクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含む、方法。
【請求項６】
遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、
細胞を、
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む方法。
【請求項７】
遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、
細胞を、
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含むＬＮＰと接触させることを含む方法。
【請求項８】
遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、
細胞を、
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ガイドＲＮＡ核酸；
肝臓特異的方法で前記ＲＮＡを送達するための手段
を含む脂質ナノ粒子組成物と接触させることを含む方法。
【請求項９】
遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、
細胞を、
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；
肝臓細胞に前記ＲＮＡを送達するための手段
を含む脂質ナノ粒子と接触させることを含む方法。
【請求項１０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を肝臓細胞に投与する方法であって、
肝臓細胞における遺伝子編集のための、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ；
肝臓細胞に前記ＲＮＡを送達するための生分解性手段
を含むＬＮＰ組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記肝臓細胞が肝細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記肝細胞が一次肝細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記肝臓細胞が幹細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が対象の中にある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍＲＮＡが第１のＬＮＰ組成物に製剤化され、前記ガイドＲＮＡ核酸が第２のＬＮＰ組成物に製剤化されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１および第２のＬＮＰ組成物が同時に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１および第２のＬＮＰ組成物が逐次的に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸が単一のＬＮＰ組成物に製剤化されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの鋳型をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｍＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ９  ｍＲＮＡがヒトコドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ガイドＲＮＡ核酸がガイドＲＮＡをコードする発現カセットである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現カセットが調節エレメントをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ガイドＲＮＡ核酸がガイドＲＮＡである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ガイドＲＮＡが二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ガイドＲＮＡ核酸が改変された残基を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変された残基が、骨格改変、糖改変および塩基改変から選択される改変を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＣＤ脂質がリピドＡである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＣＤ脂質が、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣおよびリピドＤから選択される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヘルパー脂質が、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートから選択される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記中性脂質がＤＳＰＣおよびＤＭＰＥから選択される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記中性脂質がＤＳＰＣである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧおよびＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１から選択される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのＬＮＰがリピドＡ、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのＬＮＰがリピドＢ、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が前記ＣＣＤ脂質を約３０モル％から約６０モル％の範囲内の量で含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が前記ヘルパー脂質を約３０モル％から約６０モル％の範囲内の量で含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が前記中性脂質を約１モル％から約２０モル％の範囲内の量で含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物が前記ステルス脂質を約１モル％から約１０モル％の範囲内の量で含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が前記ＣＣＤ脂質を約４５モル％の量で含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が前記ヘルパー脂質を約４４モル％の量で含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が前記中性脂質を約９モル％の量で含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が前記ステルス脂質を約２モル％の量で含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸が重量で約１０：１から約１：１０の範囲内の比で存在する、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡが重量で約１：１の比で存在する、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＣＣＤ脂質アミン対前記ＲＮＡリン酸の比が約３から約５の範囲内である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣＣＤ脂質アミン対前記ＲＮＡリン酸の比が約４．５である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物の粒径が約５０ｎｍから約１２０ｎｍの範囲内である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物の粒径が約７５ｎｍから約１５０ｎｍの範囲内である、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物の封入効率が約７０％から約１００％の範囲内である、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物の多分散指数が約．００５から約０．５の範囲内である、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物の多分散指数が約０．０２から約０．３５の範囲内である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物の投与が遺伝子編集をもたらす、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子編集が遺伝子ノックアウトをもたらす、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記遺伝子編集が遺伝子補正をもたらす、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記遺伝子編集が持続的応答をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記遺伝子編集が約１日から約１年の応答期間をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記遺伝子編集が少なくとも１週間の応答期間をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記遺伝子編集が少なくとも２週間の応答期間をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記遺伝子編集が少なくとも１カ月の応答期間をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記遺伝子編集が少なくとも４カ月の応答期間をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記遺伝子編集が少なくとも１年の応答期間をもたらす、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ；
ガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含むＬＮＰ組成物。
【請求項６８】
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含むＬＮＰ組成物。
【請求項６９】
肝臓細胞における遺伝子編集のためのＬＮＰ組成物であって、
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；
ＣＣＤ脂質；
ヘルパー脂質；
中性脂質；および
ステルス脂質
を含むＬＮＰ組成物。
【請求項７０】
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ガイドＲＮＡ核酸；
肝臓特異的方法で前記ＲＮＡを送達するための手段
を含むＬＮＰ組成物。
【請求項７１】
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；
肝臓細胞に前記ＲＮＡを送達するための手段
を含むＬＮＰ組成物。
【請求項７２】
肝臓細胞における遺伝子編集のためのＬＮＰ組成物であって、
Ｃａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡ
ｓｇＲＮＡであるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ；
肝臓細胞に前記ＲＮＡを送達するための生分解性手段
を含むＬＮＰ組成物。
【請求項７３】
前記ｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸がＬＮＰに別々に封入されおり、これらのＬＮＰが合わされて前記ＬＮＰ組成物を形成する、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸が前記ＬＮＰ組成物に一緒に封入されている、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
少なくとも１つの鋳型をさらに含む、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記ｍＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡである、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡがヒトコドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ガイドＲＮＡ核酸がガイドＲＮＡをコードする発現カセットである、請求項６７〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記発現カセットが調節エレメントをさらに含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
前記ガイドＲＮＡ核酸がガイドＲＮＡである、請求項６７〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記ガイドＲＮＡがｓｇＲＮＡである、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記ガイドＲＮＡが二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項７３〜８０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記ガイドＲＮＡ核酸が改変された残基を含む、請求項６７〜８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記改変された残基が、骨格改変、糖改変および塩基改変から選択される改変を含む、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ＣＣＤ脂質がリピドＡである、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ＣＣＤ脂質が、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣおよびリピドＤから選択される、請求項６７〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
前記ヘルパー脂質が、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートから選択される、請求項６７〜８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
前記中性脂質がＤＳＰＣおよびＤＭＰＥから選択される、請求項６７〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９０】
前記中性脂質がＤＳＰＣである、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧおよびＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１から選択される、請求項６７〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである、請求項９１に記載の組成物。
【請求項９３】
少なくとも１つのＬＮＰがリピドＡ、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含む、請求項６７〜９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
少なくとも１つのＬＮＰがリピドＢ、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含む、請求項６７〜９３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
前記ＣＣＤ脂質を約３０モル％から約６０モル％の範囲内の量で含む、請求項６７〜９４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
前記ヘルパー脂質を約３０モル％から約６０モル％の範囲内の量で含む、請求項６７〜９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
前記中性脂質を約１モル％から約２０モル％の範囲内の量で含む、請求項６７〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
前記ステルス脂質を約１モル％から約１０モル％の範囲内の量で含む、請求項６７〜９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９９】
前記ＣＣＤ脂質を約４５モル％の量で含む、請求項６７〜９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１００】
前記ヘルパー脂質を約４４モル％の量で含む、請求項６７〜９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記中性脂質を約９モル％の量で含む、請求項６７〜１００のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記ステルス脂質を約２モル％の量で含む、請求項６７〜１０１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸が重量で約１０：１から約１：１０の範囲内の比で存在する、請求項６７〜１０２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよび前記ガイドＲＮＡ核酸が重量で約１：１のモル比で存在する、請求項６７〜１０３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記ＣＣＤ脂質アミン対前記ＲＮＡリン酸の比が約３から約５の範囲内である、請求項６７〜１０４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記ＣＣＤ脂質アミン対前記ＲＮＡリン酸の比が約４．５である、請求項６７〜１０５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記組成物の粒径が約５０ｎｍから約１２０ｎｍの範囲内である、請求項６７〜１０６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記組成物の粒径が約７５ｎｍから約１５０ｎｍの範囲内である、請求項６７〜１０７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記組成物の封入効率が約７０％から約１００％の範囲内である、請求項６７〜１０８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記組成物の多分散指数が約．００５から約０．５の範囲内である、請求項６７〜１０９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記組成物の多分散指数が約．０２から約０．３５の範囲内である、請求項６７〜１１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１２】
肝臓選択的である、請求項６７〜１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１３】
肝細胞選択的である、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
ＡｐｏＥ受容体選択的である、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１５】
請求項１〜５９のいずれかの方法によって作製される、遺伝子操作された肝臓細胞。
【請求項１１６】
請求項６７〜１１４のいずれかの組成物で作製される、遺伝子操作された肝臓細胞。
【請求項１１７】
前記肝臓細胞が一次肝細胞である、請求項１１５または１１６に記載の遺伝子操作された肝臓細胞。
【請求項１１８】
凍結保護物質をさらに含む、請求項６７〜１１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記凍結保護物質が約１％から約１０ｗ／ｖ％の範囲内の量で存在する、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記凍結保護物質が、スクロース、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯおよびエチレングリコールから選択される、請求項１１８または１１９に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記凍結保護物質がスクロースである、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２２】
緩衝液をさらに含む、請求項６７〜１１４または１１８〜１２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液およびそれらの混合物から選択される、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
ＮａＣｌをさらに含む、請求項１２２または１２３に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記凍結保護物質がスクロースであり；
前記スクロースが約１％から約１０ｗ／ｖ％の範囲内の量で存在し；
前記緩衝液が前記トリス緩衝液およびＮａＣｌ緩衝液の混合物であり；
前記ＮａＣｌ緩衝液が約４０ｍＭから約５０ｍＭの範囲内の量で存在し；
前記トリス緩衝液が約４０ｍＭから約６０ｍＭの範囲内の量で存在する、
請求項１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記スクロースが約５ｗ／ｖ％の量で存在し；
前記ＮａＣｌ緩衝液が約４５ｍＭの量で存在し；
前記トリス緩衝液が約５０ｍＭの量で存在する、
請求項１２５に記載の組成物。
【請求項１２７】
約７．３から約７．７の範囲内のｐＨを有する、請求項１２５または１２６に記載の組成物。
【請求項１２８】
約７．３、約７．４、約７．５または約７．６のｐＨを有する、請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１２９】
約７．４から約７．６の範囲内のｐＨを有する、請求項１２７または１２８に記載の組成物。
【請求項１３０】
約７．５のｐＨを有する、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
少なくとも２０％の編集効率を達成することをさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
少なくとも５０％の編集効率を達成することをさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
少なくとも８０％の編集効率を達成することをさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
少なくとも２０％のＤＮＡ改変効率を達成することをさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
少なくとも５０％のＤＮＡ改変効率を達成することをさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
少なくとも８０％のＤＮＡ改変効率を達成することをさらに含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月３０日に出願の米国特許仮出願第６２／３１５，６０２号明細書、２０１６年８月１６日に出願の米国特許仮出願第６２／３７５，７７６号明細書、２０１６年１２月１２日に出願の米国特許仮出願第６２／４３３，２２８号明細書および２０１７年３月７日に出願の米国特許仮出願第６２／４６８，３００号明細書への優先権益を主張する；各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
対象への生物学的活性薬剤（治療関連化合物を含む）の送達は、薬剤が標的の細胞または組織に到達するのが困難であることによってしばしば妨げられる。特に、生細胞への多くの生物学的活性薬剤の輸送は、細胞の膜系によって制限される可能性がある。
【０００３】
細胞に送達するのが特に困難である生物学的活性薬剤の１つのクラスは、タンパク質、核酸ベースの薬物およびその誘導体を含む生物製剤である。ある特定の核酸およびタンパク質は、細胞または血漿中で限られた期間だけ安定で、時には高度に荷電しており、これにより、細胞膜を越える送達が複雑になる可能性がある。したがって、そのような薬剤を安定にし、細胞に送達することができる組成物は、特に興味がある。細胞へのこれらの生物学的活性薬剤の送達を向上させるために、脂質担体、生分解性ポリマーおよび様々なコンジュゲート系を使用することができる。
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞において遺伝子を編集するためのいくつかの構成成分および組成物が今や存在し、遺伝性、ウイルス性、細菌性、自己免疫性、がん、加齢関連および炎症性の疾患を処置するためのおびただしい可能性を提供する。これらの編集テクノロジーのいくつかは、酵素、例えばメガヌクレアーゼ、クラスター化規則的散在性の短いパリンドローム反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（「Ｃａｓ」）のヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）によって形成された二本鎖切断（「ＤＳＢ」）を修復するための細胞機構を利用する。ＤＳＢが細胞で起こるとき、細胞はいくつかの方法の１つによって切断を修復することができる。そのような方法の１つは、ＤＮＡの切断された末端の非相同的末端連結（「ＮＨＥＪ」）を含む。ＮＨＥＪの間、細胞はヌクレオチドを加えるかまたは除去することができ、切断された配列から変更された配列をもたらす。他の状況では、細胞は、相同性誘導修復（「ＨＤＲ」）または相同組換え（「ＨＲ」）機構によってＤＳＢを修復し、ここで、例えばＤＳＢの各末端に相同性を有する内因性または外因性の鋳型が、切断の修復を誘導するために使用される。これらの編集テクノロジーのいくつかは、一本鎖切断または二本鎖切断（「ＤＳＢ」）を修復するための細胞機構を利用する。
【発明の概要】
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集系は、細胞中のリボ核タンパク質複合体として活性である。患者の細胞などの細胞への、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのタンパク質および核酸構成成分の送達ための組成物が必要である。
【０００６】
本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集構成成分の送達のために有益である脂質ナノ粒子をベースとした組成物を本明細書で提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本発明者らは、遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、以下を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と細胞を接触させることを含む方法を本明細書で提供する：クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；ガイドＲＮＡ核酸；ＣＣＤ脂質；ヘルパー脂質；中性脂質；およびステルス脂質。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ核酸、ＣＣＤ脂質、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も提供される。
【０００８】
さらなる実施形態は、遺伝子編集の方法であって、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸を肝臓細胞に送達することを含み、クラス２  Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸は：ＣＣＤ脂質；ヘルパー脂質；中性脂質；およびステルス脂質を含む少なくとも１つのＬＮＰ組成物として製剤化されている、方法を提供する。さらなる実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を肝臓細胞に投与する方法であって、細胞を：クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；ガイドＲＮＡ核酸；ＣＣＤ脂質；ヘルパー脂質；中性脂質；およびステルス脂質を含むＬＮＰと接触させること、を含む方法を提供する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、肝臓細胞における遺伝子の発現を変更する方法であって、１つまたは複数のＬＮＰ製剤としてクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸の治療的有効量を対象に投与することを含み、少なくとも１つのＬＮＰ製剤は：ガイドＲＮＡ核酸またはクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；ＣＣＤ脂質；ヘルパー脂質；中性脂質；およびステルス脂質を含む、方法が提供される。
【００１０】
一部の実施形態では、遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法は、細胞を：クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ；単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードするガイドＲＮＡ核酸；ＣＣＤ脂質；ヘルパー脂質；中性脂質；およびステルス脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と接触させることを含む。
【００１１】
ある特定の態様では、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡは第１のＬＮＰ組成物に製剤化され、ガイドＲＮＡ核酸は第２のＬＮＰ組成物に製剤化されている。他の態様では、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ核酸は、ＬＮＰ組成物に一緒に製剤化されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウス肝細胞（Ｈｅｐａ１．６）への１ウェルにつき１００ｎｇおよび５００ｎｇのｅＧＦＰ  ｍＲＮＡの量で送達された様々なＬＮＰ製剤の送達後のＧＦＰの発現を示す図である。
【図２】用量依存的応答をもたらした、様々な用量の様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおけるｇＬＵＣ発現を示す図である。
【図３】図３Ａは、様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおける第ＶＩＩ因子標的化の編集効率を示す図である。図３Ｂは、様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図４】図４Ａは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが別々に製剤化されている、様々な投与レジメンによる様々なＬＮＰ製剤の送達の後のマウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。図４Ｂは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが別々に製剤化されたＬＮＰ製剤の送達の後の、マウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図５】ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが別々に製剤化された様々なＬＮＰ製剤の投与の後の、細胞における第ＶＩＩ因子またはＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図６】ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが別々に製剤化された様々なＬＮＰ製剤の投与の後の、マウスにおける第ＶＩＩ因子またはＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図７】ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが一緒に製剤化され、様々な濃度で送達される、様々なＬＮＰ製剤の投与の後の、細胞における編集効率を示す図である。
【図８−１】図８Ａは、様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図８−２】図８Ｂは、様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおける第ＶＩＩ因子標的化の編集効率を示す図である。
【図９】様々なＬＮＰ製剤を投与した動物から収集された切除部位ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す図である。
【図１０】ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが一緒に製剤化された様々なＬＮＰ製剤を投与したマウスの、血清中ＴＴＲレベルを示す図である。
【図１１】ｇＲＮＡおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡが一緒に製剤化された様々なＬＮＰ製剤を動物に投与した後のマウスにおける、相対的な第ＶＩＩ因子活性を示す図である。
【図１２−１】図１２Ａは、用量依存的応答をもたらしたＬＮＰ−１６９を様々な用量で投与した後のマウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図１２−２】図１２Ｂは、用量依存的応答をもたらしたＬＮＰ−１６９を様々な用量で投与した後の様々な日のマウスにおける血清中ＴＴＲレベルを示す図である。
【図１３−１】図１３Ａは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ対ｓｇＲＮＡの比が異なった様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおける、ＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図１３−２】図１３Ｂは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ対ｓｇＲＮＡの比が異なった様々なＬＮＰ製剤の投与の後の、別個の２日におけるマウスでの血清中ＴＴＲレベルを示す図である。
【図１４−１】図１４Ａは、ＬＮＰ−１６９の１つまたは２つの用量での投与の後のマウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図１４−２】図１４Ｂは、ＬＮＰ−１６９の１つまたは２つの用量での投与の９日後のマウスにおける血清中ＴＴＲレベルを示す図である。
【図１５】様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスの脾臓におけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図１６】様々なＬＮＰ製剤の投与の後のマウスにおけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図１７】マウス血清の存在下での様々な濃度のＬＮＰ−１６９の細胞への送達の後の、一次マウス肝細胞におけるＴＴＲ標的化の編集効率を示す図である。
【図１８】ＡｐｏＥの存在量の増加に伴うＡｐｏＥによるＬＮＰ結合の増加を示す図である。
【図１９】ガイドＲＮＡがＤＮＡ発現カセットとして送達された、様々なＬＮＰ製剤の編集効率を示す図である。
【図２０】一次肝細胞培養とｉｎ  ｖｉｖｏのマウス肝臓細胞の間で編集効率が相関することを示す図である。
【図２１】Ｎｅｕｒｏ  ２Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞株対一次マウス肝細胞における編集の特有の修復スペクトルを示す図である。
【図２２】一次マウス肝細胞対ｉｎ  ｖｉｖｏのマウス肝臓細胞における編集の類似の修復スペクトルを示す図である。
【図２３】時間の関数としての、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの血漿中濃度を示す図である。
【図２４】肝臓組織における、時間の関数としてのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの濃度を示す図である。
【図２５】脾臓組織における、時間の関数としてのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの濃度を示す図である。
【図２６−１】図２６Ａは、血漿および組織における、時間の関数としてのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの相対濃度を示す図である。
【図２６−２】図２６Ｂは、血漿および組織における、時間の関数としてのリピドＡの濃度を示す図である。
【図２７】ＬＮＰの投与後の時間の関数としての、血漿中サイトカインレベルの変化を示す図である。
【図２８】ＬＮＰの投与後の経時的なマウス血清中ＴＴＲレベルを示す図である。
【図２９−１】図２９Ａは、ＬＮＰの投与後のマウスにおける経時的なＴＴＲ編集を示す図である。
【図２９−２】図２９Ｂは、ＬＮＰの投与後のマウスにおける経時的なＴＴＲ編集および血清中ＴＴＲレベルを示す図である。
【図３０】異なるｍＲＮＡ調製物を含有するＬＮＰの投与後の、マウス血清中サイトカインレベルを示す図である。
【図３１】異なるｍＲＮＡ調製物を含有するＬＮＰの投与後の、マウス血清中ＴＴＲ濃度レベルを示す図である。
【図３２】異なるｍＲＮＡ調製物を含有するＬＮＰの投与後のマウスにおける経時的なＴＴＲ編集レベルを示す図である。
【図３３】−８０℃または４℃で保存したＬＮＰの投与後の、マウス血清中ＴＴＲ濃度レベルを示す図である。
【図３４】−８０℃または４℃で保存したＬＮＰの投与後の、マウスＴＴＲ編集レベルを示す図である。
【図３５】様々な製剤の投与後の、マウス血清中濃度レベルを示す図である。
【図３６】様々な製剤の投与後の、マウス肝臓ＴＴＲ編集レベルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、細胞への送達およびそれらの使用のための方法のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分（「カーゴ」）の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の実施形態を提供する。ＬＮＰは、（ｉ）ＣＣＤ脂質、（ｉｉ）中性脂質、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質および（ｉｖ）ステルス脂質を含有することができる。ある特定の実施形態では、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。
【００１４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴ
ＬＮＰ製剤を通して送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴは、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子を含み、細胞でのＣａｓヌクレアーゼの発現を可能にする。カーゴは、１つまたは複数のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含有する。カーゴは、修復または組換えのための鋳型核酸をさらに含むことができる。
【００１５】
Ｃａｓヌクレアーゼ
開示される製剤の１つの構成成分は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとも呼ばれる、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。向上した安定性および／または免疫原性のために、ｍＲＮＡを改変することができる。改変は、ｍＲＮＡの中の１つまたは複数のヌクレオシドに加えることができる。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学的改変の例には、プソイドウリジン、１−メチル−プソイドウリジンおよび５−メチルシチジンが含まれる。安定性、発現および免疫原性を向上させるさらなる公知の改変が企図される。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、特定の細胞型、例えば、真核細胞、哺乳動物細胞または、より具体的にはヒト細胞での発現のためにコドンを最適化することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼとして、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはヒトコドン最適化Ｃｐｆヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または、例えば本明細書に記載される同等の方法）を使用して精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーをベースとした方法、例えばＨＰＬＣをベースとした方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載されるもの）を使用して精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）およびＨＰＬＣをベースとした方法の両方を使用して精製される。
【００１６】
Ｃａｓヌクレアーゼのコード配列に加えて、ｍＲＮＡは、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。一部の実施形態では、３’または５’ＵＴＲは、ヒト遺伝子配列に由来することができる。例示的な３’および５’ＵＴＲには、α−およびβ−グロビン、アルブミン、ＨＳＤ１７Ｂ４および真核生物の伸長因子１αが含まれる。さらに、ウイルス由来の５’および３’ＵＴＲを使用することもでき、例には、オルソポックスウイルスおよびサイトメガロウイルスのＵＴＲ配列を含めることができる。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎなどの５’キャップを含む。さらに、このキャップは、ヌクレオチドＮが２’ＯＭｅを含有しないキャップ−０、またはヌクレオチドＮが２’ＯＭｅを含有するキャップ−１、またはヌクレオチドＮおよびＮ＋１が２’ＯＭｅを含有するキャップ−２であってもよい。このキャップは、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）によって組み込まれる、ｍ２７，３’ＯＧ（５’）Ｎの構造であってもよく、また、類似のキャップ−０、キャップ−１およびキャップ−２等の構造を含むこともできる。一部の実施形態では、５’キャップは、核外移行を調節すること；エキソヌクレアーゼによる分解を阻止すること；翻訳を促進すること；および５’近位イントロン切除を促進することができる。キャップのための安定化要素には、ホスホロチオエート連結、ボラノホスフェート改変およびメチレン架橋が含まれる。さらに、キャップは、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅのための結合要素として作用する、非核酸実体を含有することもできる。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールを含む。このテールは、長さが約４０〜約３００ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、テールは、長さが約４０〜約１００ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、テールは、長さが約１００〜約３００ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、テールは、長さが約１００〜約３００ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、テールは、長さが約５０〜約２００ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、テールは、長さが約５０〜約２５０ヌクレオチドであってよい。ある特定の実施形態では、テールは、長さが約１００、１５０または２００ヌクレオチドであってよい。ポリ（Ａ）テールは、ホスホロチオエート連結および核酸塩基改変を含む、エキソヌクレアーゼ分解を阻止するための改変を含有することができる。さらに、ポリ（Ａ）テールは、改変されたまたは非天然の核酸塩基または他の合成部分を含むことができる３’「キャップ」を含有することができる。
【００１７】
本明細書に記載されるｍＲＮＡは、ＲＮＡの細胞内半減期を変更することが可能である少なくとも１つの要素を含むことができる。一部の実施形態では、ＲＮＡの半減期を増加することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡの半減期を減少させることができる。一部の実施形態では、要素は、ＲＮＡの安定性を増加することが可能であってよい。一部の実施形態では、要素は、ＲＮＡの安定性を減少させることが可能であってよい。一部の実施形態では、要素は、ＲＮＡ減衰を促進することができる。一部の実施形態では、要素は、翻訳を活性化することができる。一部の実施形態では、要素は、ＲＮＡの３’ＵＴＲの中にあってもよい。例えば、要素は、ｍＲＮＡ減衰シグナルであってよい。一部の実施形態では、要素は、ポリアデニル化シグナル（ＰＡ）を含むことができる。一部の実施形態では、ＰＡは、ＲＮＡの３’ＵＴＲの中にあってもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡは、それが転写の後に細胞中でより速い分解を受けるように、ＰＡを含まなくてもよい。一部の実施形態では、要素は、少なくとも１つのＡＵに富む要素（ＡＲＥ）を含むことができる。一部の実施形態では、要素は、ＡＲＥを含まない。ＡＲＥには、組織型、細胞型、タイミング、細胞局在化および環境に依存する様式で、ＡＲＥ結合性タンパク質（ＡＲＥ−ＢＰ）が結合することができる。一部の実施形態では、ＡＲＥは、５０〜１５０ヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、ＡＲＥは、配列ＡＵＵＵＡの少なくとも１コピーを含むことができる。一部の実施形態では、ＲＮＡの３’ＵＴＲに少なくとも１つのＡＲＥを加えることができる。一部の実施形態では、要素は、転写物からの発現を増強するために三次構造を形成する、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節要素（ＷＰＲＥ）であってよい。一部の実施形態では、ＲＮＡの３’ＵＴＲにＷＰＲＥを加えることができる。一部の実施形態では、要素は、減衰の速いかまたは遅い転写物に存在する他のＲＮＡ配列モチーフから選択することができる。一部の実施形態では、各要素は、単独で使用することができる。一部の実施形態では、要素は、１つまたは複数の要素と組み合わせて使用することができる。
【００１８】
一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのＣａｓタンパク質を含むことができる。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含むことができる。さらに、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡによって標的配列に誘導することができる。ガイドＲＮＡはＣａｓタンパク質ならびに標的配列と相互作用し、そのため、それは標的配列への結合を誘導する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは標的化切断のための特異性を提供し、Ｃａｓタンパク質は汎用性であり、異なるガイドＲＮＡと対になって異なる標的配列を切断することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを切断することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡを切断することができる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡにニックを入れることができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＤＮＡ結合性ドメインおよび少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合性ドメインに異種であってよい。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を低減または排除するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ配列に結合してその発現または活性をモジュレートするために使用することができる。
【００１９】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、リボ核酸タンパク質複合体を含む、クラス１またはクラス２の系構成成分を含むことができる。例えば、Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)を参照。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、単一タンパク質エフェクターを有する。タイプＩＩ、ＶおよびＶＩのＣａｓタンパク質は、「クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼ」と本明細書で呼ばれる、単一タンパク質のＲＮＡによって誘導されるエンドヌクレアーゼであってよい。クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２およびＣ２ｃ３タンパク質が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質、Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015)、はＣａｓ９に相同的であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照により完全に組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１およびＳ３を参照する。
【００２０】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのもの、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系からのＣａｓ９タンパク質、またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のもの、例えばＣｐｆ１タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのもの、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質などの単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼであってもよい。クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼファミリーのタンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、それらは、本明細書でさらに記載される適当なガイドＲＮＡを設計することによって所望の核酸標的を切断するように誘導することができる。
【００２１】
クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系構成成分は、タイプＩＩＡ、タイプＩＩＢ、タイプＩＩＣ、タイプＶまたはタイプＶＩの系からのものであってよい。Ｃａｓ９およびそのオルソログが包含される。Ｃａｓ９タンパク質または他の構成成分が由来することができる非限定的な例示的な種には、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス属の種（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、ラクトバシラス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、フランキセラ・ノビシダ（Francisella novicida）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、ステレラ・ワズウォルテンシス（Sutterella wadsworthensis）、ガンマ・プロテオバクテリア（Gamma proteobacterium）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、フィブロバクター・スクシノゲン（Fibrobacter succinogene）、ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ノカルディオプシス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチネスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリシクロバシラス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バシラス・シュードミコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バシラス・セレニチレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、デルブリュック乳酸杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ブーフナー乳酸杆菌（Lactobacillus buchneri）、トレポネーマ・デンチコーラ（Treponema denticola）、ミクロシラ・マリーナ（Microscilla marina）、ブルクホルデリアレス（Burkholderiales）細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属の種（Polaromonas sp.）、クロコスフェラ・ワツゥオニ（Crocosphaera watsonii）、シアノテセ属の種（Cyanothece sp.）、アオコ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属の種（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラバチクム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェックス・デゲンシ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシルプトー・ベクシ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンディダツス・デスルホルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラネロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクラム・サーモプロピオニウム（Pelotomaculum thermopropionium）、アシディチオバシラス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバシラス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノサム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属の種（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワツゥオニ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクチス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、テドノバクター・ラセミフェル（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノデュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ネンジュモ属の種（Nostoc sp.）、アースロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アースロスピラ属の種（Arthrospira sp.）、リングビア属の種（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クトノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、ユレモ属の種（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Streptococcus pasteurianus）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、パルビバキュラム・ラバメンチボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）またはアカリオクロリス・マリーナ（Acaryochloris marina）が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）由来であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来であってよい。さらなる実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、野兎病菌（Francisella tularensis）、ラクノスピラセエ科（Lachnospiraceae）細菌、ブチリビブリオ・プロテオクラスティクス（Butyrivibrio proteoclasticus）、ペレグリニバクテリア（Peregrinibacteria）細菌、パルクバクテリア（Parcubacteria）細菌、スミテラ（Smithella）、アシドアミノコッカス属（Acidaminococcus）、カンディダツス・メタノプラズマ・テルミタム（Candidatus Methanoplasma termitum）、ユーバクテリウム・エリゲンス（Eubacterium eligens）、モラクセラ・ボボクリ（Moraxella bovoculi）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Porphyromonas crevioricanis）、プレボテラ・ディジエンス（Prevotella disiens）またはポルフィロモナス・マカケ（Porphyromonas macacae）由来であってよい。ある特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、アシドアミノコッカス属（Acidaminococcus）またはラクノスピラセエ科（Lachnospiraceae）由来であってよい。
【００２２】
一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質などの少なくとも１つのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、１つより多いヌクレアーゼドメインを含むことができる。例えば、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、少なくとも１つのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよび少なくとも１つのＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列にＤＳＢを導入することが可能であってよい。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、ただ１つの機能的ヌクレアーゼドメインを含有するように改変することができる。例えば、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、その核酸切断活性を低減するために、ヌクレアーゼドメインの１つが突然変異しているかまたは完全もしくは部分的に欠失しているように改変することができる。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、機能的ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変することができる。他の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９タンパク質は、機能的ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含有しないように改変することができる。ただ１つのヌクレアーゼドメインが機能的である一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、一本鎖切断（「ニック」）を標的配列に導入することが可能であるニッカーゼであってよい。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインの中の保存されたアミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または変更するために置換される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインの突然変異は、ＤＮＡ切断活性を不活性化することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインの突然変異は、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼの１つのヌクレアーゼドメインを不活性化することができ、ニッカーゼをもたらす。一部の実施形態では、ニッカーゼは、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含むことができる。ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン中の例示的アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ（化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に基づく、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９９ＺＷ２（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＰ１）を参照）を含む。さらなる例示的なアミノ酸置換には、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６ＡおよびＤ１２５５Ａ（フランキセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が含まれる。一部の実施形態では、ニッカーゼは、ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含むことができる。ＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換には、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３ＡおよびＤ９８６Ａ（化膿連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が含まれる。例示的な突然変異はヌクレアーゼドメイン中の保存された触媒性残基を変更し、そのドメインの核溶解活性を変更する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるヌクレアーゼ系は、ニッカーゼ、ならびに標的配列のセンスおよびアンチセンス鎖にそれ��れ相補的である一対のガイドＲＮＡを含むことができる。ガイドＲＮＡは、標的配列の対向する鎖にニックを生成すること（すなわち、二重ニッキング）によってＤＳＢを標的にして、それを導入するようにニッカーゼを誘導することができる。タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部と置き換えられる、キメラのクラス２  Ｃａｓヌクレアーゼを使用することもできる。例えば、ヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼからのドメインで置き換えることができる。ある特定の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を低減または排除するように改変することができる。それは、ＤＮＡ配列に結合してその発現または活性をモジュレートするために使用することができる。
【００２３】
代わりの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成成分であってよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３タンパク質であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものであってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＩＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものであってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＩＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものであってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものであってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タイプＶＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものであってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ切断活性を有することができる。
【００２４】
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、少なくとも１つの異種タンパク質ドメインと融合することができる。少なくとも１つのタンパク質ドメインは、ヌクレアーゼのＮ末端、Ｃ末端、または内部の位置に位置することができる。一部の実施形態では、２つ以上の異種タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼの１つまたは複数の位置にある。
【００２５】
一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、細胞の核へのヌクレアーゼの輸送を促進することができる。例えば、タンパク質ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１〜１０個のＮＬＳ（複数可）と融合することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１〜５個のＮＬＳ（複数可）と融合することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、１つのＮＬＳと融合することができる。１つのＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端にあってよい。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、１つより多いＮＬＳと融合することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、２、３、４または５個のＮＬＳと融合することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、２つのＮＬＳと融合することができる。ある特定の状況では、２つのＮＬＳは同じであってもよく（例えば、２つのＳＶ４０  ＮＬＳ）、または異なってもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、カルボキシ末端で２つのＳＶ４０  ＮＬＳ配列と融合する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは２つのＮＬＳと融合することができ、１つはＮ末端に、１つはＣ末端にある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、３つのＮＬＳと融合することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＮＬＳと融合しなくてもよい。一部の実施形態では、ＮＬＳは一連配列、例えばＳＶ４０  ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶまたはＰＫＫＫＲＲＶであってよい。一部の実施形態では、ＮＬＳは二連配列、例えばヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫであってよい。具体的な実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶのＮＬＳは、ヌクレアーゼのＣ末端にあってよい。
【００２６】
一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼの細胞内半減期を改変することが可能であってよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの半減期を増加することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの半減期を低減することができる。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼの安定性を増加することが可能であってよい。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ヌクレアーゼの安定性を低減することが可能であってよい。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用することができる。一部の実施形態では、タンパク質分解は、タンパク質分解酵素、例えばプロテアソーム、リソソームプロテアーゼまたはカルパインプロテアーゼが媒介することができる。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含むことができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の追加によって改変することができる。一部の実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例には、小さいユビキチン様モディファイヤー（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連モディファイヤー１（ＵＲＭ１）、神経細胞前駆体細胞によって発現される発達下方制御タンパク質８（ＮＥＤＤ８、出芽酵母（S. cerevisiae）のＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、自己貪食−８（ＡＴＧ８）および−１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜固定ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折畳みモディファイヤー１（ＵＦＭ１）、ならびにユビキチン様タンパク質５（ＵＢＬ５）が含まれる。
【００２７】
一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、マーカードメインであってよい。マーカードメインの非限定的な例には、蛍光性タンパク質、精製タグ、エピトープタグおよびリポーター遺伝子配列が含まれる。一部の実施形態では、マーカードメインは、蛍光性タンパク質であってよい。適する蛍光性タンパク質の非限定的な例には、緑色蛍光性タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、モノマーＡｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光性タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光性タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光性タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光性タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ色蛍光性タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の適する蛍光性タンパク質が含まれる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであってよい。非限定的な例示的なタグには、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、キチン結合性タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリＨｉｓおよびカルモジュリンが含まれる。非限定的な例示的なリポーター遺伝子には、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたは蛍光性タンパク質が含まれる。
【００２８】
さらなる実施形態では、タンパク質ドメインは、特異的オルガネラ、細胞型、組織または器官をヌクレアーゼの標的にすることができる。一部の実施形態では、タンパク質ドメインは、ミトコンドリアをヌクレアーゼの標的にすることができる。
【００２９】
さらなる実施形態では、タンパク質ドメインは、エフェクタードメインであってよい。ヌクレアーゼがその標的配列に誘導されるとき、例えばＣａｓ９タンパク質がガイドＲＮＡによって標的配列に誘導されるとき、エフェクタードメインは標的配列を改変するかまたは影響することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合性ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、後成的改変ドメイン、転写活性化ドメイン、メチル化ドメインまたは転写リプレッサードメインから選択することができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ改変ドメインは、メチル化ドメイン、例えば脱メチル化またはメチルトランスフェラーゼドメインである。ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、塩基編集ドメインなどのＤＮＡ改変ドメインである。特定の実施形態では、ＤＮＡ改変ドメインは、デアミナーゼドメインなどの、特異的改変をＤＮＡに導入する核酸編集ドメインである。国際出願番号国際公開第２０１５／０８９４０６号パンフレット；米国特許出願公開第２０１６／０３０４８４６号明細書を参照。国際出願番号国際公開第２０１５／０８９４０６号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１６／０３０４８４６号明細書に記載される核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、およびＣａｓ９変異体は、ここに参照により組み込まれる。
【００３０】
ガイドＲＮＡ
本開示の一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のためのカーゴは、少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは標的核酸分子の上の標的配列にクラス２  Ｃａｓヌクレアーゼを誘導することができ、ここで、ガイドＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、Ｃａｓヌクレアーゼはそれを切断またはモジュレートする。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、クラス２ヌクレアーゼに結合し、それによる切断の特異性を提供する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であってよい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体などの、タイプＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であってよい。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質であってよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質による切断を標的化する。
【００３１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系のためのガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｃｒ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）を含む。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的核酸分子の上の標的配列に相補性であり、それとハイブリダイズする標的化配列を含むことができる。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部に相補性であり、それとハイブリダイズするフラッグポールを含むこともできる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、細菌のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される天然に存在するｃｒＲＮＡの構造に対応することができ、ここで、標的化配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のスペーサーとして作用し、フラッグポールは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の上のスペーサーに隣接する反復配列の一部に対応する。
【００３２】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列を通して、目的の任意の配列を標的にすることができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的核酸分子の上の標的配列の間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％であってよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子の上の標的配列は、１００％補足性であってよい。他の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子の上の標的配列は、少なくとも１つのミスマッチを含むことができる。例えば、ガイドＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子の上の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のミスマッチを含むことができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子の上の標的配列は、１〜６個のミスマッチを含むことができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子の上の標的配列は、５個または６個のミスマッチを含むことができる。
【００３３】
標的化配列の長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および構成成分に依存してもよい。例えば、異なる細菌種からの異なるＣａｓタンパク質は、様々な最適な標的化配列長を有する。したがって、標的化配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個、または５０個より多いヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、標的化配列は、１８〜２４ヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、標的化配列は、１９〜２１ヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、標的化配列は、２０ヌクレオチドの長さを含むことができる。
【００３４】
フラッグポールは、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の形成を促進するのに十分な相補性をｔｒａｃｒ  ＲＮＡと有する、任意の配列を含むことができる。一部の実施形態では、フラッグポールは、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｔｒａｃｒ  ＲＮＡに相補性である天然に存在するｃｒＲＮＡの配列（「タグ」または「ハンドル」とも呼ばれる）の全体または一部を含むことができる。一部の実施形態では、フラッグポールは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの反復配列の全体または一部を含むことができる。一部の実施形態では、フラッグポールは、トランケーションまたは改変されたタグまたはハンドル配列を含むことができる。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡと２つの配列のうちの短い方の長さに沿ってｔｒａｃｒ  ＲＮＡとハイブリダイズするフラッグポールの部分の間の相補性の程度は、約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上であってよいが、１００％より低い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡとハイブリダイズするフラッグポールの部分は、２つの配列のうちの短い方の長さに沿って１００％相補性でなく、その理由は、ｔｒａｃｒの上の１つまたは複数の隆起構造の存在および／またはｔｒａｃｒとフラッグポールの間の揺らぎ塩基対形成のためである。フラッグポールの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはｔｒａｃｒ  ＲＮＡに依存してもよい。例えば、フラッグポールは１０〜５０ヌクレオチド、または５０を超えるヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、フラッグポールは、１５〜４０ヌクレオチドの長さを含むことができる。他の実施形態では、フラッグポールは、２０〜３０ヌクレオチドの長さを含むことができる。さらに他の実施形態では、フラッグポールは、２２ヌクレオチドの長さを含むことができる。例えば二重のガイドＲＮＡが使用される場合、フラッグポールの長さは上限を有さなくてもよい。
【００３５】
一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの野生型ｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列の全体または一部を含むことができる。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、野生型ｔｒａｃｒ  ＲＮＡのトランケーションまたは改変された変異体を含むことができる。ｔｒａｃｒ  ＲＮＡの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存してもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００より多いヌクレオチドの長さを含むことができる。ある特定の実施形態では、ｔｒａｃｒは少なくとも２６ヌクレオチドの長さである。さらなる実施形態では、ｔｒａｃｒは少なくとも４０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡはある特定の二次構造、例えば、１つまたは複数のヘアピンもしくはステム−ループ構造、または１つまたは複数の隆起構造を含むことができる。
【００３６】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは２つのＲＮＡ分子を含むことができ、「二重ガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」と本明細書で呼ばれる。一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子、およびｔｒａｃｒ  ＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子を含むことができる。第１および第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡの上のフラッグポールとｔｒａｃｒ  ＲＮＡの間の塩基対形成を通してＲＮＡ二重鎖を形成することができる。
【００３７】
さらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは単一のＲＮＡ分子を含むことができ、「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と本明細書で呼ばれる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡに共有結合しているｃｒＲＮＡを含むことができる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、リンカーを通して共有結合することができる。一部の実施形態では、単一分子ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの上のフラッグポールとｔｒａｃｒ  ＲＮＡの間の塩基対形成を通してステム−ループ構造を含むことができる。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介することが可能な「Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ」である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質によるＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介することが可能な「Ｃｐｆ１  ｓｇＲＮＡ」である。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と活性複合体を形成して、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質と活性複合体を形成して、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡを含む。Zetsche 2015を参照する。
【００３８】
本発明のある特定の実施形態は、本明細書に記載されるガイドＲＮＡをコードする核酸、例えば、発現カセットも提供する。「ガイドＲＮＡ核酸」は、本明細書において、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）、および１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸であるガイドＲＮＡ発現カセットを指すために使用される。
【００３９】
一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ分子であってよい。一部の実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの反復配列の全体または一部が隣接した標的化配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒ  ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、２つの別個の核酸によってコードされてもよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、単一の核酸によってコードされてもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、単一の核酸の対向する鎖によってコードされてもよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、単一の核酸の同じ鎖によってコードされてもよい。一部の実施形態では、発現カセットは、ｓｇＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、発現カセットは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、発現カセットは、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。
【００４０】
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または調節制御配列、例えばプロモーター、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲに作動可能に連結することができる。一例では、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３またはｔＲＮＡキメラであってよい。Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9；Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628を参照。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）が認識することができる。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの非限定的な例には、Ｕ６およびＨ１プロモーターも含まれる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに作動可能に連結することができる。一部の実施形態では、発現カセットは、改変された核酸である。ある特定の実施形態では、発現カセットは、改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、発現カセットの組込みを安定化および阻止するために、発現カセットは、５’末端の改変、例えば改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、各鎖の上に５’末端改変を有する二本鎖ＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、５’末端改変として反転したジデオキシ−Ｔまたは反転した無塩基のヌクレオシドもしくはヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、発現カセットは、ビオチン、デスチオビオテン−ＴＥＧ、ジゴキシゲニン、ならびに、例えばＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒを含む蛍光性マーカーなどの標識を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、１つより多いガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系で使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が１つより多い標的配列を切断するように、各ガイドＲＮＡは異なる標的化配列を含有することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の中に、活性または安定性などの同じまたは異なる特性を有することができる。１つより多いガイドＲＮＡを使用する場合、各ガイドＲＮＡは同じまたは異なる発現カセットにコードされてもよい。１つより多いガイドＲＮＡの発現を促進するために使用されるプロモーターは、同じであっても異なってもよい。
【００４２】
化学改変されたＲＮＡ
ガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡに、改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが存在してもよい。１つまたは複数の改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｍＲＮＡをコードするガイドＲＮＡまたはＣａｓヌクレアーゼは、正規のＡ、Ｇ、ＣおよびＵ残基の代わりまたはそれに加えて使用される、１つまたは複数の天然に存在しないおよび／または天然に存在する構成成分または構成の存在を記載するために、「改変された」ＲＮＡと呼ばれる。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡは、「改変された」とここで呼ばれる、非正規のヌクレオシドまたはヌクレオチドで合成される。改変されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含むことができる：（ｉ）非連結リン酸酸素の１つまたは両方および／またはホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素の１つまたは複数の変更、例えば交換（例示的な骨格改変）；（ｉｉ）リボース糖の構成成分、例えば、リボース糖の上の２’ヒドロキシルの変更、例えば交換（例示的な糖改変）；（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーによるリン酸部分の大幅な交換（例示的な骨格改変）；（ｉｖ）非正規核酸塩基によるものを含む、天然に存在する核酸塩基の改変または交換（例示的な塩基改変）；（ｖ）リボース−リン酸骨格の交換または改変（例示的な骨格改変）；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは交換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’キャップ改変は、糖および／または骨格の改変を含むことができる）；ならびに（ｖｉｉ）糖の改変または交換（例示的な糖改変）。
【００４３】
２、３、４またはそれより多くの改変を有することができるヌクレオシドおよびヌクレオチド（一括して「残基」）を含む改変されたＲＮＡを提供するために、上記の改変を組み合わせることができる。例えば、改変された残基は、改変された糖および改変された核酸塩基を有することができる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのあらゆる塩基が改変される、例えば、全ての塩基はホスホロチオエート基などの改変されたリン酸基を有する。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡ分子のリン酸基の全てまたは実質的に全ては、ホスホロチオエート基で置き換えられる。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端にまたはその近くに少なくとも１つの改変された残基を含む。一部の実施形態では、改変されたＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端にまたはその近くに少なくとも１つの改変された残基を含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、改変された残基をガイドＲＮＡに組み込むことができる。ある特定の実施形態では、改変された残基をｍＲＮＡに組み込むことができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１、２、３またはそれより多くの改変された残基を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および３’末端の各々に、１、２、３またはそれより多くの改変された残基を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５、１０、１５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれより多い改変された残基を含む。一部の実施形態では、改変されたガイドＲＮＡまたはｍＲＮＡの位置のうちの少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％）は、改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
【００４５】
未改変の核酸は、例えば細胞性ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸ホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡは、例えばヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つまたは複数の改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡは、例えばヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つまたは複数の改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有することができる。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方で、本明細書に記載される改変されたＲＮＡ分子は細胞の集団に導入されるとき自然免疫応答の低減を示すことができる。用語「自然免疫応答」は、一本鎖核酸を含む外因性核酸への細胞性応答を含み、それは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導を含む。
【００４６】
骨格改変の一部の実施形態では、改変された残基のリン酸基は、酸素の１つまたは複数を異なる置換基で置き換えることによって改変することができる。さらに、改変された残基、例えば改変された核酸に存在する改変された残基は、本明細書に記載される改変されたリン酸基による未改変のリン酸部分の大幅な交換を含むことができる。一部の実施形態では、リン酸骨格の骨格改変は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布の荷電リンカーをもたらす変更を含むことができる。
【００４７】
改変されたリン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが含まれる。未改変のリン酸基中のリン原子は、アキラル性である。しかし、上記の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの交換は、リン原子をキラルにすることができる。立体原性リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）を有することができる。骨格は、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）による架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の交換によって改変することもできる。交換は、連結酸素のいずれかで、または連結酸素の両方で起こることができる。
【００４８】
リン酸基は、ある特定の骨格改変における非リン含有コネクタによって置き換えることができる。一部の実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることができる部分の例には、限定されずに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノを含めることができる。
【００４９】
リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物によって置き換えられている、核酸を模倣することができる足場を構築することもできる。そのような改変は、骨格および糖改変を含むことができる。一部の実施形態では、核酸塩基は代用骨格によって連結することができる。例には、限定されずに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物を含めることができる。
【００５０】
改変されたヌクレオシドおよび改変されたヌクレオチドは、糖基への１つまたは複数の改変、すなわち糖改変を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で改変すること、例えば、置き換えることができる。一部の実施形態では、ヒドロキシルを脱プロトン化して２’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできないので、２’ヒドロキシル基への改変は、核酸の安定性を強化することができる。
【００５１】
２’ヒドロキシル基改変の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲを含めることができ、ここで、Ｒは、例えばＨ、または任意選択で置換されたアルキルであってよく、ｎは、０から２０までの整数（例えば、０から４、０から８、０から１０、０から１６、１から４、１から８、１から１０、１から１６、１から２０、２から４、２から８、２から１０、２から１６、２から２０、４から８、４から１０、４から１６および４から２０）であってよい。一部の実施形態では、２’ヒドロキシル基改変は、２’−Ｏ−Ｍｅであってよい。一部の実施形態では、２’ヒドロキシル基改変は、２’−フルオロ改変であってよく、それは２’ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える。一部の実施形態では、２’ヒドロキシル基改変は、「ロック」核酸（ＬＮＡ）を含むことができ、ここで、２’ヒドロキシルは、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に接続することができ、例示的な架橋には、メチレン、プロピレン、エーテルまたはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであってよい）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミンまたはポリアミノであってよい）を含めることができる。一部の実施形態では、２’ヒドロキシル基改変は、リボース環がＣ２’−Ｃ３’結合を欠いている「未ロック」核酸（ＵＮＡ）を含むことができる。一部の実施形態では、２’ヒドロキシル基改変は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含むことができる。
【００５２】
「デオキシ」２’改変は、水素（すなわち、例えば部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分にあるデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロまたはヨード）；アミノ（アミノは、例えば、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸であってよい）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（アミノは、例えば、本明細書に記載されるものであってよい）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびに、例えば本明細書に記載されるアミノにより任意選択で置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含むことができる。
【００５３】
糖改変は、糖基を含むことができ、それは、リボースの対応する炭素のそれと反対の立体化学的配置を有する１つまたは複数の炭素を含有することもできる。したがって、改変された核酸は、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。改変された核酸は、無塩基糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、構成成分糖原子の１つまたは複数においてさらに改変されてもよい。改変された核酸は、Ｌ形の１つまたは複数の糖、例えばＬ−ヌクレオシドを含むこともできる。
【００５４】
改変された核酸に組み込むことができる、本明細書に記載される改変されたヌクレオシドおよび改変されたヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる改変された塩基を含むことができる。核酸塩基の例には、限定されずに、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。これらの核酸塩基は改変するかまたは全面的に置き換えて、改変された核酸に組み込むことができる改変された残基を提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン類似体またはピリミジン類似体から独立して選択することができる。一部の実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在するおよび合成の誘導体を含むことができる。
【００５５】
二重ガイドＲＮＡを用いる実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒ  ＲＮＡの各々は、改変を含むことができる。そのような改変は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒ  ＲＮＡの一方または両方の末端にあってもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態では、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端の１つまたは複数の残基が化学改変されてもよいか、または、全体のｓｇＲＮＡが化学改変されてもよい。ある特定の実施形態は、５’末端の改変を含む。ある特定の実施形態は、３’末端の改変を含む。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハング中のヌクレオチドの１つまたは複数、または全ては、デオキシヌクレオチドである。改変されたｍＲＮＡは、５’末端および／または３’末端の改変を含むことができる。
【００５６】
鋳型核酸
本明細書に開示される製剤は、鋳型核酸を含むことができる。Ｃａｓヌクレアーゼのための標的部位において、またはその近くで核酸配列を変更または挿入するために、鋳型を使用することができる。
【００５７】
一部の実施形態では、鋳型は相同組換えにおいて使用することができる。一部の実施形態では、相同組換えは、標的核酸分子への鋳型配列または鋳型配列の一部の組込みをもたらすことができる。一部の実施形態では、単一の鋳型を提供することができる。他の実施形態では、相同組換えが２つ以上の標的部位で起こるように、２つ以上の鋳型を提供することができる。例えば、細胞中の単一の遺伝子または細胞中の２つの異なる遺伝子を修復するために、異なる鋳型を提供することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの鋳型の複数のコピーが細胞に提供される。一部の実施形態では、独立したコピー数または独立した量で異なる鋳型を提供することができる。
【００５８】
他の実施形態では、鋳型は、核酸の切断部位におけるＤＮＡ鎖侵入を含む、相同性誘導修復において使用することができる。一部の実施形態では、相同性誘導修復は、編集された標的核酸分子への鋳型配列の組入れをもたらすことができる。一部の実施形態では、単一の鋳型を提供することができる。他の実施形態では、相同性誘導修復によって、異なる配列を有する２つ以上の鋳型を２つ以上の部位において使用することができる。例えば、細胞中の単一の遺伝子または細胞中の２つの異なる遺伝子を修復するために、異なる鋳型を提供することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの鋳型の複数のコピーが細胞に提供される。一部の実施形態では、独立したコピー数または独立した量で異なる鋳型を提供することができる。
【００５９】
さらに他の実施形態では、非相同的末端連結によって媒介される遺伝子編集において鋳型を使用することができる。一部の実施形態では、鋳型配列は、切断部位の近くの核酸配列と類似性を有しない。一部の実施形態では、鋳型または鋳型配列の一部が組み込まれる。一部の実施形態では、単一の鋳型を提供することができる。他の実施形態では、非相同的末端連結によって、異なる配列を有する２つ以上の鋳型を２つ以上の部位に挿入することができる。例えば、細胞に単一の鋳型を、または細胞に２つの異なる鋳型を挿入するために、異なる鋳型を提供することができる。一部の実施形態では、独立したコピー数で異なる鋳型を提供することができる。一部の実施形態では、鋳型は、隣接した逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、鋳型配列は、標的細胞の内因性配列に対応することができる。本明細書で用いるように、用語「内因性配列」は、細胞に固有の配列を指す。用語「外因性配列」は、細胞に固有でない配列、または細胞のゲノム中のその固有の位置が異なる位置にある配列を指す。一部の実施形態では、内因性配列は、細胞のゲノム配列であってよい。一部の実施形態では、内因性配列は、染色体のまたは染色体外の配列であってよい。一部の実施形態では、内因性配列は、細胞のプラスミド配列であってよい。一部の実施形態では、鋳型配列は、切断部位のまたはその近くの細胞中の内因性配列の一部と実質的に同一であってよいが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含むことができる。一部の実施形態では、切断された標的核酸分子の鋳型による修復は、標的核酸分子の１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含む突然変異をもたらすことができる。一部の実施形態では、突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の、１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらすことができる。一部の実施形態では、突然変異は、標的遺伝子から発現されるＲＮＡ中の、１つまたは複数のヌクレオチド変化をもたらすことができる。一部の実施形態では、突然変異は、標的遺伝子の発現レベルを変更することができる。一部の実施形態では、突然変異は、標的遺伝子の発現の増加または減少をもたらすことができる。一部の実施形態では、突然変異は、遺伝子ノックダウンをもたらすことができる。一部の実施形態では、突然変異は、遺伝子ノックアウトをもたらすことができる。一部の実施形態では、突然変異は、遺伝子機能の回復をもたらすことができる。一部の実施形態では、切断された標的核酸分子の鋳型による修復は、標的遺伝子のエクソン配列、イントロン配列、調節配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位または非コード配列に変化をもたらすことができる。
【００６１】
他の実施形態では、鋳型配列は、外因性配列を含むことができる。一部の実施形態では、外因性配列は、外因性プロモーター配列に作動可能に連結されるタンパク質またはＲＮＡコード配列を含むことができ、そのため、標的核酸分子への外因性配列の組込みにより、組み込まれた配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡを細胞が発現することが可能である。他の実施形態では、標的核酸分子への外因性配列の組込みにより、組み込まれた配列の発現は、内因性のプロモーター配列によって調節することができる。一部の実施形態では、外因性配列は、染色体のまたは染色体外の配列であってよい。一部の実施形態では、外因性配列は、タンパク質またはタンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を提供することができる。さらに他の実施形態では、外因性配列は、エクソン配列、イントロン配列、調節配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位または非コード配列を含むことができる。一部の実施形態では、外因性配列の組込みは、遺伝子機能の回復をもたらすことができる。一部の実施形態では、外因性配列の組込みは、遺伝子ノックインをもたらすことができる。一部の実施形態では、外因性配列の組込みは、遺伝子ノックアウトをもたらすことができる。
【００６２】
鋳型は、任意の適する長さであってよい。一部の実施形態では、鋳型は、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００またはそれより多くのヌクレオチドの長さを含むことができる。鋳型は、一本鎖核酸であってよい。鋳型は、二本鎖または部分的に二本鎖の核酸であってよい。ある特定の実施形態では、一本鎖の鋳型は、長さが２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５または２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、鋳型は、標的配列を含む標的核酸分子の一部に相補性であるヌクレオチド配列（すなわち、「相同性の腕」）を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型は、標的核酸分子の上の切断部位の上流または下流に位置する配列に相補性である、相同性の腕を含むことができる。一部の実施形態では、鋳型は、切断部位の上流および下流に位置する配列にそれぞれ相補性である、第１の相同性の腕および第２の相同性の腕（第１および第２のヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含むことができる。鋳型が２つの相同性の腕を含む場合、各腕は同じ長さまたは異なる長さであってもよく、相同性の腕の間の配列は、相同性の腕の間の標的配列に実質的に類似するかもしくは同一であってよく、または、それは完全に無関係であってもよい。一部の実施形態では、鋳型の上の第１のヌクレオチド配列と切断部位の上流の配列の間、および鋳型の上の第２のヌクレオチド配列と切断部位の下流の配列の間の相補性の程度は、鋳型と標的核酸分子の間で相同組換え、例えば高忠実度相同組換えを許すことができる。一部の実施形態では、相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％であってよい。一部の実施形態では、相補性の程度は、約９５％、９７％、９８％、９９％または１００％であってよい。一部の実施形態では、相補性の程度は、少なくとも９８％、９９％または１００％であってよい。一部の実施形態では、相補性の程度は、１００％であってよい。
【００６３】
一部の実施形態では、鋳型は、隣接した逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含む。一部の実施形態では、鋳型は、プラスミド、ミニサークル、ナノサークルまたはＰＣＲ生成物として供給される。
【００６４】
核酸の精製
一部の実施形態では、核酸は精製される。一部の実施形態では、核酸は、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または、例えば本明細書に記載される同等の方法）を使用して精製される。一部の実施形態では、核酸は、クロマトグラフィーをベースとした方法、例えばＨＰＬＣをベースとした方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載されるもの）を使用して精製される。一部の実施形態では、核酸は、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）およびＨＰＬＣをベースとした方法の両方を使用して精製される。
【００６５】
標的配列
一部の実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、標的核酸分子の上の標的配列に誘導し、それを切断することができる。例えば、標的配列は、Ｃａｓヌクレアーゼが認識して、切断することができる。一部の実施形態では、クラス２  Ｃａｓヌクレアーゼは、標的核酸分子の標的配列にガイドＲＮＡが誘導することができ、ここで、ガイドＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質がそれを切断する。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはそのコグネイトＰＡＭを含む標的配列とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質がそれを切断する。一部の実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの標的化配列に相補性であってよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの標的化配列とガイドＲＮＡにハイブリダイズする対応標的配列の一部の間の相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％であってよい。一部の実施形態では、標的の相同性領域は、コグネイトＰＡＭ配列に隣接している。一部の実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの標的化配列に１００％相補性である配列を含むことができる。他の実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの標的化配列と比較して、少なくとも１つのミスマッチ、欠失または挿入を含むことができる。例えば、標的配列およびガイドＲＮＡの標的化配列は、任意選択でＰＡＭに隣接した標的配列の一部において、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のミスマッチを含有することができる。一部の実施形態では、標的配列およびガイドＲＮＡの標的化配列は、１〜９個のミスマッチを含有することができる。一部の実施形態では、標的配列およびガイドＲＮＡの標的化配列は、３〜６個のミスマッチを含有することができる。一部の実施形態では、標的配列およびガイドＲＮＡの標的化配列は、５または６個のミスマッチを含有することができる。
【００６６】
標的配列の長さは、使用するヌクレアーゼ系に依存してもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のためのガイドＲＮＡの標的化配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個、または５０個より多いヌクレオチドの長さを含むことができ、標的配列は対応する長さであり、任意選択でＰＡＭ配列に隣接している。一部の実施形態では、標的配列は、１５〜２４ヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、標的配列は、１７〜２１ヌクレオチドの長さを含むことができる。一部の実施形態では、標的配列は、２０ヌクレオチドの長さを含むことができる。ニッカーゼが使用される場合は、標的配列は、ＤＮＡ分子の対向する鎖を切断する一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含むことができる。一部の実施形態では、標的配列は、ＤＮＡ分子の同じ鎖を切断する一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含むことができる。一部の実施形態では、標的配列は、１つまたは複数のＣａｓヌクレアーゼによって認識される標的配列の部分を含むことができる。
【００６７】
標的核酸分子は、細胞にとって内因性または外因性である任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよい。一部の実施形態では、標的核酸分子は、細胞からのまたは細胞中の、エピソームＤＮＡ、プラスミド、ゲノムＤＮＡ、ウイルスゲノム、ミトコンドリアＤＮＡまたは染色体であってよい。一部の実施形態では、標的核酸分子の標的配列は、細胞からのまたは細胞中のゲノム配列であってよい。他の実施形態では、細胞は、哺乳動物の細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、齧歯動物の細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、ヒトの細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、肝臓細胞であってよい。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒトの肝臓細胞であってよい。一部の実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞はヒト肝細胞である。一部の実施形態では、肝臓細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、ヒト肝細胞は、肝臓の洞様内皮細胞（ＬＳＥＣ）であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、クッパー細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、肝臓の星状細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、腫瘍細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ結合性受容体を含む。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、肝臓の幹細胞であってよい。例えば、Wang, et al. Nature, 2015；Font-Burgada, et al. Cell, 2015, 162:766-799を参照する。
【００６８】
さらなる実施形態では、標的配列は、ウイルスの配列であってよい。さらなる実施形態では、標的配列は、病原体の配列であってよい。さらに他の実施形態では、標的配列は、合成された配列であってよい。さらなる実施形態では、標的配列は、染色体の配列であってよい。ある特定の実施形態では、標的配列は、転座接合部、例えば、がんと関連した転座を含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、ヒト染色体などの真核生物の染色体の上にあり得る。ある特定の実施形態では、標的配列は、肝臓細胞で発現されるという点で、肝臓特異的配列である。
【００６９】
一部の実施形態では、標的配列は、遺伝子のコード配列、遺伝子のイントロン配列、調節配列、遺伝子の転写制御配列、遺伝子の翻訳制御配列、スプライシング部位または遺伝子の間の非コード配列に位置することができる。一部の実施形態では、遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であってよい。他の実施形態では、遺伝子は、非コードＲＮＡ遺伝子であってよい。一部の実施形態では、標的配列は、疾患関連遺伝子の全体または一部を含むことができる。ある特定の場合には、遺伝子は肝臓で発現される。
【００７０】
一部の実施形態では、標的配列は、足場部位または遺伝子座制御領域などの、クロマチン組織の態様を制御するゲノム中の非遺伝子機能部位に位置することができる。
【００７１】
クラス２  ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼを含む実施形態では、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）に隣接することができる。一部の実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端に隣接するか、またはそれから１、２、３または４ヌクレオチド以内であってもよい。ＰＡＭの長さおよび配列は、使用されるＣａｓタンパク質に依存することができる。例えば、ＰＡＭは、その各々の関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる、Ran et al., Nature, 520: 186-191 (2015)の図１およびZetsche 2015の図Ｓ５に開示されるものを含む、特異的Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログのためのコンセンサスまたは特定のＰＡＭ配列から選択することができる。一部の実施形態では、ＰＡＭは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドであってよい。非限定的な例示的なＰＡＭ配列には、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、ＴＴＮおよびＮＮＮＮＧＡＴＴ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドと規定され、ＷはＡまたはＴと規定される）が含まれる。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧであってよい。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧＮＧであってよい。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＮであってよい。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＮＮＡＡＡＡＷであってよい。
【００７２】
脂質製剤
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓカーゴのためのＬＮＰ製剤の様々な実施形態が、本明細書に開示される。そのようなＬＮＰ製剤は、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質に加えて、ＣＣＤ脂質を含むことができる。「脂質ナノ粒子」は、分子間力によって物理的に互いに関係する複数の（すなわち、１つより多い）脂質分子を含む粒子を意味する。ＬＮＰは、例えば、マイクロスフェア（一部の実施形態では実質的に球状であり、より特定の実施形態では、水性のコアを含むことができる、例えばＲＮＡ分子の相当部分を含む、単層および多層の小胞、例えば、「リポソーム」−ラメラ相脂質二重層を含む）、乳剤中の分散相、ミセルまたは懸濁液中の内相であってよい。乳剤、ミセルおよび懸濁液は、ローカルなおよび／または局所の送達のために適する組成物であってよい。
【００７３】
本明細書で提供されるＬＮＰ組成物は、肝臓細胞（例えば、肝細胞）によって優先的に取り込まれる。さらに、ＬＮＰ組成物は、それらが治療的有効用量でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞傷害性レベルまで蓄積しないという点で、生分解性である。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、治療的用量レベルにおいて、相当な有害効果につながる自然免疫応答を引き起こさない。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＬＮＰ組成物は、治療的用量レベルで毒性を引き起こさない。ＬＮＰ組成物は、血液中のアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）などのアポリポタンパク質に特異的に結合する。アポリポタンパク質は、脂質輸送の調節における鍵である、血漿中を循環するタンパク質である。ＡｐｏＥは、リポタンパク質の取り込みの間に肝臓で細胞表面硫酸ヘパリンプロテオグリカンと相互作用する、アポリポタンパク質の１つのクラスを表す。（例えば、Scherphof and Kamps, The role of hepatocytes in the clearance of liposomes from the blood circulation. Prog Lipid Res. 2001 May;40(3):149-66を参照）。
【００７４】
ＣＣＤ脂質
生物学的活性薬剤の送達のための脂質組成物は、肝臓細胞または器官を優先的に標的にするように調整することができる。ある特定の実施形態では、脂質組成物は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）結合性細胞、例えばＡｐｏＥ受容体を発現する細胞を優先的に標的にする。肝臓細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ構成成分の送達のための脂質組成物は、ＣＣＤ脂質を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、ＣＣＤ脂質はリピドＡであり、それは（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであり、別名、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる。リピドＡは、以下のように表すことができる：
【００７６】
【化１】
2019516351.tif 000003
【００７７】
リピドＡは、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（例えば、８４〜８６頁）により合成することができる。
【００７８】
一部の実施形態では、ＣＣＤ脂質はリピドＢであり、それは（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）であり、別名、（（５−（（ジメチルアミノ）メチル）−１，３−フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン−８，１−ジイル）ビス（デカノエート）とも呼ばれる。リピドＢは、以下のように表すことができる：
【００７９】
【化２】
2019516351.tif 000004
【００８０】
リピドＢは、国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット（例えば、１０７〜０９頁）により合成することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、ＣＣＤ脂質はリピドＣであり、それは２−（（４−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン−１，３−ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）−ビス（オクタデカ−９，１２−ジエノエート）である。リピドＣは、以下のように表すことができる：
【００８２】
【化３】
2019516351.tif 000005
【００８３】
一部の実施形態では、ＣＣＤ脂質はリピドＤであり、それは、３−（（（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）−１３−（オクタノイルオキシ）トリデシル３−オクチルウンデカノエートである。
【００８４】
リピドＤは、以下のように表すことができる：
【００８５】
【化４】
2019516351.tif 000006
【００８６】
リピドＣおよびリピドＤは、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレットにより合成することができる。
【００８７】
ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤの同等物であってもよい。ある特定の実施形態では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡの同等物またはリピドＢの同等物である。
【００８８】
本明細書に記載されるＬＮＰで使用するのに適するＣＣＤ脂質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生分解性である。ＣＣＤ脂質は、低毒性である（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ以上の量において動物モデルで耐容性を示し、有害作用もない）。ある特定の実施形態では、ＣＣＤ脂質を含むＬＮＰには、ＣＣＤ脂質の少なくとも７５％が８、１０、１２、２４もしくは４８時間以内に、または３、４、５、６、７もしくは１０日以内に血漿から消去されるものが含まれる。ある特定の実施形態では、ＣＣＤ脂質を含むＬＮＰには、ｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡの少なくとも５０％が８、１０、１２、２４もしくは４８時間以内に、または３、４、５、６、７もしくは１０日以内に血漿から消去されるものが含まれる。ある特定の実施形態では、ＣＣＤ脂質を含むＬＮＰには、例えば、脂質（例えばＣＣＤ脂質）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質成分を測定することによって、ＬＮＰの少なくとも５０％が８、１０、１２、２４もしくは４８時間以内に、または３、４、５、６、７もしくは１０日以内に血漿から消去されるものが含まれる。ある特定の実施形態では、脂質封入対ＬＮＰの遊離脂質、ＲＮＡまたはタンパク質成分が測定される。
【００８９】
脂質クリアランスは、文献に記載されている通りに測定することができる。Maier, M.A., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier")を参照。例えば、Ｍａｉｅｒでは、ルシフェラーゼ標的化ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を、側方の尾静脈を通した静脈内ボーラス注射によって０．３ｍｇ／ｋｇで６〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＩ／６マウスに投与した。投与の０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、９６および１６８時間後に、血液、肝臓および脾臓試料を収集した。血漿を得るために組織収集および血液試料を処理する前に、マウスを食塩水で潅流した。全ての試料は、ＬＣ−ＭＳによって処理し、分析した。さらに、ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ製剤の投与の後に毒性を評価するための手順を、Ｍａｉｅｒは記載する。例えば、ルシフェラーゼ標的化ｓｉＲＮＡを、５ｍＬ／ｋｇの投与量で単一の静脈内ボーラス注射によって、０、１、３、５および１０ｍｇ／ｋｇで雄ＳＤラット（５動物／群）に投与した。２４時間後に、意識のある動物の頸静脈から約１ｍＬの血液を得、血清を単離した。投与の７２時間後に、全ての動物を検死のために安楽死させた。臨床徴候、体重、血清化学、器官重量および組織病理学の評価を実行した。ＭａｉｅｒはｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ製剤の評価方法を記載するが、これらの方法は、本開示の製剤の投与のクリアランス、薬物動態および毒性を評価するために適用することができる。
【００９０】
ＣＣＤ脂質は、クリアランス速度の上昇につながる。一部の実施形態では、クリアランス速度は、脂質クリアランス速度、例えばＣＣＤ脂質が血液、血清または血漿から消去される速度である。一部の実施形態では、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度、例えばｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡが血液、血清または血漿から消去される速度である。一部の実施形態では、クリアランス速度は、ＬＮＰが血液、血清または血漿から消去される速度である。一部の実施形態では、クリアランス速度は、ＬＮＰが肝臓組織または脾臓組織などの組織から消去される速度である。ある特定の実施形態では、クリアランス速度の高い速度は、相当な有害作用のない安全性プロファイルにつながる。ＣＣＤ脂質は、循環および組織中のＬＮＰ蓄積を低減する。一部の実施形態では、循環および組織中のＬＮＰ蓄積の低減は、相当な有害作用のない安全性プロファイルにつながる。
【００９１】
本開示のＣＣＤ脂質は、それらがその中にある媒体のｐＨによってイオン化可能である。例えば、わずかに酸性の媒体中では、ＣＣＤ脂質はプロトン化が可能であり、したがって、陽電荷を有する。反対に、わずかに塩基性の媒体中では、例えばｐＨが概ね７．３５である血液中では、ＣＣＤ脂質はプロトン化することができず、したがって、無電荷である。一部の実施形態では、本開示のＣＣＤ脂質は、少なくとも約９のｐＨでプロトン化することができる。一部の実施形態では、本開示のＣＣＤ脂質は、少なくとも約９のｐＨでプロトン化することができる。一部の実施形態では、本開示のＣＣＤ脂質は、少なくとも約１０のｐＨでプロトン化することができる。
【００９２】
電荷を持つためのＣＣＤ脂質の能力は、その固有のｐＫａに関係している。例えば、本開示のＣＣＤ脂質の各々は、約５．８から約６．２の範囲内のｐＫａを独立して有することができる。約５．１から約７．４の範囲内のｐＫａを有するカチオン性脂質が肝臓へのカーゴの送達のために有効であることが見出されたので、これは有利である可能性がある。さらに、約５．３から約６．４の範囲内のｐＫａを有するカチオン性脂質は、腫瘍への送達のために有効であることが見出された。例えば、国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレットを参照。
【００９３】
さらなる脂質
本開示の脂質組成物での使用に適する「中性脂質」には、例えば、様々な中性、非荷電または双性イオン性の脂質が含まれる。本開示で使用するのに適する中性リン脂質の例には、限定されずに、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびその組合せが含まれる。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択することができる。別の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であってよい。中性脂質は、ＬＮＰの処理を安定化し、向上させる働きをする。
【００９４】
「ヘルパー脂質」は、トランスフェクション（例えば、生物学的活性薬剤を含むナノ粒子のトランスフェクション）を増強する脂質である。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強する機構は、粒子安定性を増強することを含む。ある特定の実施形態では、ヘルパー脂質は、膜融合誘導を強化する。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロールおよびアルキルレゾルシノールを含む。本開示で使用するのに適するヘルパー脂質には、限定されずに、コレステロール、５−ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートが含まれる。一実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールであってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールヘミスクシネートであってよい。
【００９５】
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏに（例えば、血液中に）存在することができる時間の長さを変更する脂質である。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒径を制御することによって、製剤工程で支援することができる。本明細書で用いられるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態学的特性をモジュレートすることができる。本開示の脂質組成物での使用に適するステルス脂質には、限定されずに、脂質部分に連結した親水性の頭基を有するステルス脂質が含まれる。本開示の脂質組成物での使用に適するステルス脂質、およびそのような脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, pg. 55-71およびHoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52に見出すことができる。さらなる適するＰＥＧ脂質は、例えば、国際公開第２００６／００７７１２号パンフレットに開示される。
【００９６】
一実施形態では、ステルス脂質の親水性頭基は、ＰＥＧ（時にはポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］に基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含む。
【００９７】
ステルス脂質は、脂質部分を含むことができる。一部の実施形態では、ステルス脂質の脂質部分は、約Ｃ４から約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有する、ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含む、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドに由来することができ、ここで、鎖は１つまたは複数の官能基、例えばアミドまたはエステルを含むことができる。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換されたアルキル基をさらに含むことができる。
【００９８】
別途指示がない限り、本明細書で用いる用語「ＰＥＧ」は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態では、ＰＥＧは、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換された線状または分枝状のポリマーである。一実施形態では、ＰＥＧは未置換である。一実施形態では、ＰＥＧは、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシまたはアリール基によって置換される。一実施形態では、この用語は、ＰＥＧ−ポリウレタンまたはＰＥＧ−ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含む（例えば、J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)を参照）；別の実施形態では、この用語はＰＥＧコポリマーを含まない。一実施形態では、ＰＥＧは、約１３０から約５０，０００、下位実施形態では約１５０から約３０，０００、下位実施形態では約１５０から約２０，０００、下位実施形態では約１５０から約１５，０００、下位実施形態では約１５０から約１０，０００、下位実施形態では約１５０から約６，０００、下位実施形態では約１５０から約５，０００、下位実施形態では約１５０から約４，０００、下位実施形態では約１５０から約３，０００、下位実施形態では約３００から約３，０００、下位実施形態では約１，０００から約３，０００、下位実施形態では約１，５００から約２，５００の分子量を有する。
【００９９】
ある特定の実施形態では、ＰＥＧ（例えば、ステルス脂質などの、脂質にコンジュゲートした）は、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、「ＰＥＧ２０００」とも呼ばれる「ＰＥＧ−２Ｋ」である。ＰＥＧ−２Ｋは、本明細書で以下の式（Ｉ）によって表され、式中、ｎは４５であり、数平均重合度が約４５サブユニットを含むことを意味する
【０１００】
【化５】
2019516351.tif 000007
。しかし、例えば、数平均重合度が約２３サブユニット（ｎ＝２３）および／または６８サブユニット（ｎ＝６８）を含む、当技術分野で公知である他のＰＥＧ実施形態を使用することができる。一部の実施形態では、ｎは約３０から約６０の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｎは約３５から約５５の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｎは約４０から約５０の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｎは約４２から約４８の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｎは４５であってよい。一部の実施形態では、Ｒは、Ｈ、置換されたアルキルおよび未置換のアルキルから選択することができる。一部の実施形態では、Ｒは、未置換のアルキルであってよい。一部の実施形態では、Ｒは、メチルであってよい。
【０１０１】
本明細書に記載される実施形態のいずれでも、ステルス脂質は、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（ＮＯＦ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎからのカタログ＃ＧＭ−０２０）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（ＮＯＦ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎからのカタログ＃ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡからのカタログ＃８８０１５０Ｐ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡからのカタログ＃８８０１２０Ｃ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ；ＧＳ−０２０、ＮＯＦ  Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）および１，２−ジステアリルオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択することができる。一実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってよい。一部の実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧであってよい。一実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥであってよい。一実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡであってよい。一実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡであってよい。一実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１であってよい。一部の実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−Ｃ１４であってよい。一部の実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−Ｃ１６であってよい。一部の実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−Ｃ１８であってよい。
【０１０２】
ＬＮＰ製剤
ＬＮＰは、（ｉ）封入のためおよびエンドソーム逃避のためにＣＣＤ脂質を、（ｉｉ）安定化のために中性脂質を、（ｉｉｉ）同じく安定化のためにヘルパー脂質を、ならびに（ｉｖ）ステルス脂質を含有することができる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、例えばリピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤを含むことができる。一部の態様では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡである。一部の態様では、ＣＣＤ脂質は、リピドＢである。様々な実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、中性脂質、ヘルパー脂質およびステルス脂質を含む。ある特定の実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。具体的な実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質を含むことができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびステルス脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＰＥＧを含むステルス脂質を含む。ある特定の実施形態では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤから選択される。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡまたはリピドＢ、コレステロール、ＤＳＰＣおよびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧから選択されるＣＣＤ脂質を含む。
【０１０４】
一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質およびＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むことができる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび少なくとも１つの他の脂質成分を含むことができる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む一部の組成物では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質、中性脂質またはステルス脂質から選択される少なくとも１つの他の脂質成分を含む。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むある特定の組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質およびＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むことができる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む具体的な組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤから選択される。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むさらなる組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤから選択され、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。一部の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＡである。一部の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＢである。一部の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＣである。一部の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＤである。
【０１０５】
一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質およびクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むことができる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡおよび少なくとも１つの他の脂質成分を含むことができる。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む一部の組成物では、ＬＮＰは、ヘルパー脂質、中性脂質またはステルス脂質から選択される少なくとも１つの他の脂質成分を含む。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むある特定の組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質およびクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むことができる。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む具体的な組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤから選択される。クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むさらなる組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤから選択され、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。一部の実施形態では、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＡである。一部の実施形態では、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＢである。一部の実施形態では、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＣである。一部の実施形態では、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む組成物中のＣＣＤ脂質は、リピドＤである。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ガイドＲＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ガイドＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質を含むことができる。ガイドＲＮＡを含むある特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。ガイドＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。ガイドＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤ；ヘルパー脂質；中性脂質；ステルス脂質；およびガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡを含むある特定の組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡである。ガイドＲＮＡを含むある特定の組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＢである。ガイドＲＮＡを含むある特定の組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＣである。ガイドＲＮＡを含むある特定の組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＤである。ガイドＲＮＡを含むさらなる組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約２５：１から約１：２５の範囲内の、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約１０：１から約１：１０の範囲内の、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。本明細書で測定されるように、比は重量による。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約５：１から約１：５の範囲内の、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約１：１のクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約１：１から約１：５の、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約１０：１のクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約１：１０のクラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ核酸の比を含む。比は、約２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０または１：２５であってよい。
【０１０８】
一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ｓｇＲＮＡを含むことができる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡを含むことができる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、Ｃｐｆ１  ｓｇＲＮＡを含むことができる。ｓｇＲＮＡを含む一部の組成物では、ＬＮＰは、ＣＣＤ脂質、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質を含む。ｓｇＲＮＡを含むある特定の組成物では、ヘルパー脂質は、コレステロールである。ｓｇＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質は、ＤＳＰＣである。ｓｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質およびｓｇＲＮＡを含むことができる。ｓｇＲＮＡを含む具体的な組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤである。ｓｇＲＮＡを含むさらなる組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびｓｇＲＮＡであってよいガイドＲＮＡを含む。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質を含むことができる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むある特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含む一部の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣＣＤ脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むことができる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含む具体的な組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを含むさらなる組成物では、ＣＣＤ脂質は、リピドＡ、リピドＢ、リピドＣまたはリピドＤであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０１１０】
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物は、鋳型核酸を含むことができる。鋳型核酸は、クラス２  ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと一緒に共製剤化することができる。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ガイドＲＮＡと一緒に共製剤化することができる。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの両方と一緒に共製剤化することができる。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡと別々に製剤化することができる。そのような製剤では、所望の修復機構によって、鋳型核酸は一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。鋳型は、標的ＤＮＡに、または標的ＤＮＡに隣接した配列に相同性である領域を有することができる。
【０１１１】
本開示の実施形態は、製剤中の構成成分脂質のそれぞれのモル比により記載される脂質組成物も提供する。一実施形態では、ＣＣＤ脂質のモル％は、約３０モル％から約６０モル％であってよい。一実施形態では、ＣＣＤ脂質のモル％は、約３５モル％から約５５モル％であってよい。一実施形態では、ＣＣＤ脂質のモル％は、約４０モル％から約５０モル％であってよい。一実施形態では、ＣＣＤ脂質のモル％は、約４２モル％から約４７モル％であってよい。一実施形態では、ＣＣＤ脂質のモル％は、約４５％であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰバッチのＣＣＤ脂質モル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％または±２．５％になる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は、１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
【０１１２】
一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約３０モル％から約６０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約３５モル％から約５５モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約４０モル％から約５０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約４１モル％から約４６モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は、約４４モル％であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰバッチのヘルパーモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％または±２．５％になる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は、１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
【０１１３】
一実施形態では、中性脂質のモル％は、約１モル％から約２０モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質のモル％は、約５モル％から約１５モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質のモル％は、約７モル％から約１２モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質のモル％は、約９モル％であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰバッチの中性脂質モル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％または±２．５％になる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は、１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
【０１１４】
一実施形態では、ステルス脂質のモル％は、約１モル％から約１０モル％であってよい。一実施形態では、ステルス脂質のモル％は、約１モル％から約５モル％であってよい。一実施形態では、ステルス脂質のモル％は、約１モル％から約３モル％であってよい。一実施形態では、ステルス脂質のモル％は、約２モル％であってよい。一実施形態では、ステルス脂質のモル％は、約１モル％であってよい。一部の実施形態では、ＬＮＰバッチのステルス脂質モル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％または±２．５％になる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は、１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
【０１１５】
本開示の実施形態は、ＣＣＤ脂質の正電荷のアミン基（Ｎ）と封入される核酸の負電荷のリン酸基（Ｐ）の間の比によって記載される脂質組成物も提供する。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約０．５から約１００であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約１から約５０であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約１から約２５であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約１から約１０であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約１から約７であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約３から約５であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約４から約５であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約４であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約４．５であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約５であってよい。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＬＮＰは、水性ＲＮＡ溶液を有機溶媒ベースの脂質溶液、例えば１００％エタノールと混合することによって形成される。適する溶液または溶媒には、水、ＰＢＳ、トリス緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールが含まれる、または含有されていてもよい。例えばＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための、薬学的に許容される緩衝液を使用することができる。ある特定の実施形態では、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持するために使用される。さらなる実施形態では、組成物は、約７．３から約７．７の範囲内、または約７．４から約７．６の範囲内のｐＨを有する。さらなる実施形態では、組成物は、約７．３、７．４、７．５、７．６または７．７のｐＨを有する。組成物のｐＨは、マイクロｐＨプローブで測定することができる。ある特定の実施形態では、凍結保護物質が組成物に含まれる。凍結保護物質の非限定的な例には、スクロース、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯおよびエチレングリコールが含まれる。例示的な組成物は、最高１０％の凍結保護物質、例えばスクロースを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％の凍結保護物質を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％のスクロースを含むことができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、緩衝液を含むことができる。一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液およびそれらの混合物を含むことができる。ある特定の例示的な実施形態では、緩衝液はＮａＣｌを含む。ＮａＣｌの例示的な量は、約４０ｍＭから約５０ｍＭの範囲内にあってよい。一部の実施形態では、ＮａＣｌの量は、約４５ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝液は、トリス緩衝液である。トリスの例示的な量は、約４０ｍＭから約６０ｍＭの範囲内にあってよい。一部の実施形態では、トリスの量は、約５０ｍＭである。一部の実施形態では、緩衝液は、ＮａＣｌおよびトリスを含む。ＬＮＰ組成物のある特定の例示的な実施形態は、トリス緩衝液中に５％のスクロースおよび４５ｍＭのＮａＣｌを含有する。他の例示的な実施形態では、組成物は、約５ｗ／ｖ％の量のスクロース、約４５ｍＭのＮａＣｌおよび約５０ｍＭのトリスを含有する。全体の製剤のオスモル濃度が維持されるように、塩、緩衝液および凍結保護物質の量を変更することができる。例えば、最終オスモル濃度は、４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持することができる。さらなる実施形態では、オスモル濃度は、３５０から２５０ｍＯｓｍ／Ｌの間である。ある特定の実施形態は、３００±２０ｍＯｓｍ／Ｌの最終オスモル濃度を有する。
【０１１７】
一部の実施形態では、微流動混合、Ｔ混合または交差混合が使用される。ある特定の態様では、流速、接合部サイズ、接合部幾何構造、接合部形状、チューブ直径、溶液および／またはＲＮＡおよび脂質濃度を変更することができる。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物は、例えば透析またはクロマトグラフィーを通して、濃縮することまたは精製することができる。ＬＮＰは、例えば、懸濁液、乳剤または凍結乾燥粉末として保存することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は２〜８℃で保存され、ある特定の態様では、ＬＮＰ組成物は室温で保存される。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば−２０℃または−８０℃で冷凍保存される。他の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約０℃から約−８０℃の範囲内の温度で保存される。冷凍ＬＮＰ組成物は、使用時に例えば氷上で、室温で、または２５℃で解凍することができる
【０１１８】
本開示のＬＮＰの多分散指数（「ｐｄｉ」）およびサイズを特徴付けるために、動的光散乱（「ＤＬＳ」）を使用することができる。ＤＬＳは、試料を光源にさらすことから生じる、光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から判定されるＰＤＩは、集団における粒径（平均粒径あたり）の分布を表し、完全に均一な集団はゼロのＰＤＩを有する。一部の実施形態では、ｐｄｉは、約０．００５から約０．７５の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｐｄｉは、約０．０１から約０．５の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｐｄｉは、約０．０２から約０．４の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｐｄｉは、約０．０３から約０．３５の範囲内であってよい。一部の実施形態では、ｐｄｉは、約０．１から約０．３５の範囲内であってよい。
【０１１９】
本明細書に開示されるＬＮＰは、約１から約２５０ｎｍのサイズを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１０から約２００ｎｍのサイズを有する。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、約２０から約１５０ｎｍのサイズを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０から約１５０ｎｍのサイズを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０から約１００ｎｍのサイズを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０から約１２０ｎｍのサイズを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７５から約１５０ｎｍのサイズを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約３０から約２００ｎｍのサイズを有する。特記しない限り、本明細書で言及される全てのサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒで動的光散乱によって測定した、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。計数率が概ね２００〜４００ｋｃｔであるように、ナノ粒子試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈する。データは、強度測定の加重平均として提示される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０％から約１００％の範囲内の平均封入効率で形成される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０％から約７０％の範囲内の平均封入効率で形成される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０％から約９０％の範囲内の平均封入効率で形成される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約９０％から約１００％の範囲内の平均封入効率で形成される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７５％から約９５％の範囲内の平均封入効率で形成される。
【０１２０】
細胞を工学操作する方法；工学操作された細胞
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方での遺伝子編集を通して細胞を工学操作する方法において使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、細胞を本明細書に記載されるＬＮＰ組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、齧歯動物の細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、ヒトの細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、肝臓細胞であってよい。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒトの肝臓細胞であってよい。一部の実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞は、ヒトの肝細胞である。一部の実施形態では、肝臓細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、ヒト肝臓細胞は、肝臓の洞様内皮細胞（ＬＳＥＣ）であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、クッパー細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、肝臓の星状細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、腫瘍細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、肝臓の幹細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞は、ＡｐｏＥ結合性受容体を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、工学操作された細胞、例えば、前段落の細胞型のいずれか１つに由来する工学操作された細胞が提供される。そのような工学操作された細胞は、本明細書に記載される方法によって生成される。一部の実施形態では、工学操作された細胞は、対象の中の組織または器官、例えば肝臓の中に存在する。
【０１２２】
本明細書に記載される方法および細胞の一部では、細胞は、標的配列中の改変、例えばヌクレオチドの挿入または欠失（「インデル」）または置換を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１、２、３、４または５個またはそれより多くのヌクレオチドの挿入を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１または２個のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、改変は、標的配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個またはそれより多くのヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１または２個のヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列においてフレームシフト突然変異をもたらすインデルを含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個またはそれより多くのヌクレオチドの置換を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１または２個のヌクレオチドの置換を含む。一部の実施形態では、改変は、鋳型核酸、例えば本明細書に記載される鋳型核酸のいずれかの組込みからもたらされる、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換の１つまたは複数を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、工学操作された細胞を含む細胞の集団、例えば、本明細書に記載される方法によって工学操作された細胞を含む細胞の集団が提供される。一部の実施形態では、集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された工学操作された細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、対象の中の組織または器官、例えば肝臓の中に存在する。一部の実施形態では、集団の中の細胞の、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、またはそれより多くが工学操作される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、インデルの検出によって規定される、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の編集効率（または「パーセント編集」）をもたらす。他の実施形態では、本明細書に開示される方法は、挿入、欠失、置換または他によるかを問わず、配列中の変化の検出によって規定される、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のＤＮＡ改変効率をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、約５％から約１００％、約１０％から約５０％、約２０から約１００％、約２０から約８０％、約４０から約１００％または約４０から約８０％の間の、編集効率レベルまたはＤＮＡ改変効率レベルをもたらす。
【０１２４】
本明細書に記載される方法および細胞の一部では、集団の中の細胞は、改変、例えば標的配列におけるインデルまたは置換を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１、２、３、４または５個またはそれより多くのヌクレオチドの挿入を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１または２個のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、改変は、標的配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個またはそれより多くのヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１または２個のヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列においてフレームシフト突然変異をもたらすインデルを含む。一部の実施形態では、集団中の工学操作された細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％またはそれより多くは、フレームシフト突然変異を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５個またはそれより多くのヌクレオチドの置換を含む。一部の実施形態では、改変は、標的配列中の１または２個のヌクレオチドの置換を含む。一部の実施形態では、改変は、鋳型核酸、例えば本明細書に記載される鋳型核酸のいずれかの組込みからもたらされる、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換の１つまたは複数を含む。
【０１２５】
処置の方法
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子編集のために使用することができる。一実施形態では、それを必要とする対象に、本明細書に記載される１つまたは複数のＬＮＰ組成物を投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載される組成物の治療的有効量は、それを必要とする対象の細胞と接触させることができる。一実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ組成物と細胞を接触させることによって、遺伝子操作された細胞を生成することができる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本方法は、肝臓障害に関連した細胞にＬＮＰ組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は、肝臓障害を処置することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、肝臓細胞をＬＮＰ組成物と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、肝細胞をＬＮＰ組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＡｐｏＥ結合性細胞をＬＮＰ組成物と接触させることを含む。
【０１２７】
一実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよび鋳型を含むＬＮＰ組成物を、ＡｐｏＥ結合性細胞などの細胞に投与することができる。ある特定の場合には、ＣａｓヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を、ＡｐｏＥ結合性細胞などの細胞に投与することができる。一実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよび鋳型を含むＬＮＰ組成物を、肝臓細胞に投与することができる。ある特定の場合には、ＣａｓヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を、肝臓細胞に投与することができる。一部の場合には、肝臓細胞は対象にある。ある特定の実施形態では、対象は、ＬＮＰ組成物の単回投与を受けることができる。他の例では、対象は、ＬＮＰ組成物の複数回投与を受けることができる。１用量より多く投与される場合、用量は、約１、２、３、４、５、６、７、１４、２１もしくは２８日離れて；約２、３、４、５もしくは６カ月離れて；または約１、２、３、４もしくは５年離れて投与することができる。
【０１２８】
一実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物は、肝臓細胞（肝細胞とも呼ばれる）に投与し、続いてｇＲＮＡおよび任意選択で鋳型を含む組成物を投与することができる。一実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物は、肝臓細胞に投与し、続いて鋳型を含む組成物をその細胞に投与することができる。一実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物は、肝臓細胞に投与し、続いてｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物、次に鋳型を含むＬＮＰ組成物をその細胞に順次投与することができる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物が、ｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物の前に投与される実施形態では、投与は、約４、６、８、１２もしくは２４時間；または２、３、４、５、６もしくは７日離すことができる。
【０１２９】
一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、遺伝子ノックアウトをもたらす遺伝子を編集するために使用することができる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、遺伝子補正をもたらす遺伝子を編集するために使用することができる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、遺伝子挿入をもたらす細胞を編集するために使用することができる。
【０１３０】
一実施形態では、ＬＮＰ組成物の投与は、持続的な応答をもたらす遺伝子編集をもたらすことができる。例えば、投与は、１日、１カ月、１年またはそれより長い応答期間をもたらすことができる。本明細書で用いるように、「応答期間」は、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物を使用して細胞を編集した後、結果として生じる改変がＬＮＰ組成物の投与から一定期間なお存在することを意味する。改変は、標的タンパク質のレベルを測定することによって検出することができる。改変は、標的ＤＮＡを検出することによって検出することができる。一部の実施形態では、応答期間は、少なくとも１週間であってよい。他の実施形態では、応答期間は、少なくとも２週間であってよい。一実施形態では、応答期間は、少なくとも１カ月であってよい。一部の実施形態では、応答期間は、少なくとも２カ月であってよい。一実施形態では、応答期間は、少なくとも４カ月であってよい。一実施形態では、応答期間は、少なくとも６カ月であってよい。ある特定の実施形態では、応答期間は、約２６週間であってよい。一部の実施形態では、応答期間は、少なくとも１年であってよい。一部の実施形態では、応答期間は、少なくとも５年であってよい。一部の実施形態では、応答期間は、少なくとも１０年であってよい。標的タンパク質のレベルを測定することによって、または標的ＤＮＡの検出によって、持続的応答は少なくとも６カ月後にも検出可能である。
【０１３１】
ＬＮＰ組成物は、非経口的に投与することができる。ＬＮＰ組成物は、血流、組織、筋肉または内部器官に直接的に投与することができる。投与は、例えば、注射または注入に全身性であってよい。投与は、局所であってよい。投与のために適する手段には、静脈内、動脈内、クモ膜下、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、網膜下、硝子体内、前房内、筋肉内、関節滑液嚢内および皮下が含まれる。投与に適するデバイスには、針（顕微針を含む）注射器、無針注射器および注入技術が含まれる。
【０１３２】
ＬＮＰ組成物は、必然的ではないが一般的に、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と合わせた製剤として投与される。用語「賦形剤」には、本開示の化合物（複数可）以外の任意の成分、他の脂質成分（複数可）および生物学的活性薬剤が含まれる。賦形剤は、製剤に対して機能的（例えば、薬物放出速度の制御）および／または非機能的（例えば、プロセス助剤または希釈剤）特性を付与することができる。賦形剤の選択は、特定の投与様式、溶解性および安定性に及ぼす賦形剤の影響、ならびに剤形の性質などの因子に大きく依存する。
【０１３３】
非経口製剤は、一般的に水性または油性の溶液または懸濁液である。製剤が水性である場合、糖（限定されずに、グルコース、マンニトール、ソルビトール等を含む）、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは３から９のｐＨ）などの賦形剤であるが、一部の適用のために、それらはより好適には無菌の非水性溶液と一緒に、または無菌の無発熱物質の水（ＷＦＩ）などの適するビヒクルと共に使用される乾燥形として製剤化することができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、遺伝子編集の方法は、第ＶＩＩ因子標的遺伝子を改変する。ある特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子を改変するために、ＬＮＰ組成物は肝臓細胞に投与される。第ＶＩＩ因子欠乏などの肝臓障害を処置するために、ＬＮＰ組成物を使用することができる。本方法は、異常な第ＶＩＩ因子活性をモジュレートすることができる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、血友病または制御不能な血液凝固を処置または予防するために投与することができる。例えば、Lapecorella, M. and Mariani, G. Factor VII deficiency: defining the clinical picture and optimizing therapeutic options. Haemophilia (2008), 14, 1170-1175を参照する。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、血液が凝塊を形成する傾向の増大を有する状態である血栓形成傾向を処置または予防するために投与することができる。
【０１３５】
組織への損傷が起こるとき、第ＶＩＩ因子酵素前駆体と組織因子の間で等モル複合体が形成され、第ＶＩＩ因子配列の１５２位で切断が生じ、活性化第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子の形成につながる。第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体は、凝固につながる。第ＶＩＩ因子関連の障害の処置方法には、第ＶＩＩａ因子凝固を増加させる方法、血液凝固を向上させる方法または血液凝固プロファイルを向上させる方法が含まれる。ある特定の実施形態では、これらの方法では、第ＶＩＩ因子欠乏の対象にＬＮＰ組成物を投与する。一部の実施形態では、これらの方法では、第ＶＩＩ因子欠乏のために、例えば組換え第ＶＩＩａ因子で以前に処置された対象にＬＮＰ組成物を投与する。
【０１３６】
一部の実施形態では、遺伝子編集の方法は、ＴＴＲ標的遺伝子を改変する。ある特定の実施形態では、アミロイド症などの肝臓におけるＴＴＲ発現に関連した障害を処置するために、ＬＮＰ組成物を使用することができる。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、トランスチレチン型のアミロイド症を含むアミロイド症を処置または予防するために投与することができる。例えば、Patel, K. and Hawkins, P. Cardiac amyloidosis: where are we today? J. Intern. Med. (2008), 278, 126-144を参照する。
【０１３７】
ＴＴＲ関連の障害は、アミロイド沈着物の蓄積につながることがある。したがって、ＴＴＲ関連の障害を処置または予防する方法には、ＴＴＲレベルを低減する方法、ＴＴＲ生成を低減する方法、アミロイド沈着物を低減する方法、遺伝性トランスチレチン型アミロイド症を処置する方法、非遺伝性トランスチレチン型アミロイド症を処置する方法、または心臓ならびに自律神経および末梢神経におけるアミロイド沈着物に影響を与える方法が含まれる。一部の実施形態では、ＴＴＲ関連の障害を処置または予防する方法は、アミロイド沈着を診断された対象にＬＮＰ組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、これらの方法では、ＴＴＲ生成の低減を必要とする対象にＬＮＰ組成物を投与する。
【０１３８】
一部の実施形態では、遺伝子編集の方法は、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＫＬＫＢ１、ＫＮＧ１、ＦＸＩＩ、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、Ｇ６ＰＣ、ＧＯ／ＨＡＯ１、ＡＧＸＴ、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＯＴＣ、ＬＩＰＡ、ＡＢＣＢ１１、ＧＡＬＴ、ＡＴＰ７ＢおよびＰＡＨから選択される遺伝子を標的にする。一部の実施形態では、遺伝子編集の方法は、アルファ１抗トリプシン欠乏、血友病Ａ、血友病Ｂ、ＨＡＥ、１型シトルリン血、アルギノコハク酸性尿、メープルシロップ尿症、糖原病、原発性過シュウ酸尿症１型、プロピオン酸アカデミア、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏、コレステリルエステル保存病、進行性の家族性肝内性胆汁うっ滞、ガラクトース血、ウイルソン病およびフェニルケトン尿症から選択される疾患に侵されている対象を処置するために使用することができる。
【０１３９】
請求項および／または明細書で用語「含む」と一緒に使用されるとき、単語「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、「１つ」を意味することがあるが、各々は、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多い」の意味にも一致する。「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。用語「含んでいる（including）」および「含有している（containing）」、ならびに他の形、例えば、「含む（includes）」、「含んでいた（included）」、「含有する（contains）」および「含有した（contained）」の使用は、非限定的である。本出願で与えられる全ての範囲は、特に明記しない限り端点を包含する。
【実施例】
【０１４０】
[実施例１]
材料および方法。
脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤
約４．５のＣＣＤ脂質アミン対ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子構成成分を１００％エタノールに以下のモル比で溶解した：４５モル％（１２．７ｍＭ）のＣＣＤ脂質（例えば、リピドＡまたはリピドＢ）；４４モル％（１２．４ｍＭ）のヘルパー脂質（例えば、コレステロール）；９モル％（２．５３ｍＭ）の中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）；および２モル％（．５６３ｍＭ）のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１）。ＲＮＡカーゴは５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５に溶解し、概ね０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度をもたらした。
【０１４１】
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）ベンチトップ機器を製造業者のプロトコルに従って使用して、脂質およびＲＮＡ溶液を微流動混合することによってＬＮＰを形成した。差別的流速を使用した混合の間、水性対有機溶媒の２：１の比を維持した。混合の後、ＬＮＰを収集し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、概ね１：１）に希釈し、次に、１０ｋＤａのＳｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、軽く撹拌しながら４℃で一晩、残りの緩衝液をＰＢＳ（試料量の１００倍過剰）に交換した。結果として生じた混合物を、次に０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過した。結果として生じた濾液は、２〜８℃で保存した。封入効率、多分散指数および平均粒径を判定するために、単離したＬＮＰを下記のように特徴付けた。
【０１４２】
ヌクレアーゼｍＲＮＡおよび単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）
線状化プラスミドＤＮＡ鋳型およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、Ｎ１−メチル偽性Ｕを含有するキャップされたおよびポリアデニル化されたＣａｓ９  ｍＲＮＡを生成した。以下の条件でＸｂａＩと３７℃で２時間インキュベートすることによって、Ｔ７プロモーターおよび１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有するプラスミドＤＮＡを線状化した：２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）および１×反応緩衝液。反応を６５℃で２０分間加熱することによって、ＸｂａＩを不活性化した。線状化プラスミドはシリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して酵素および緩衝塩から精製し、線形化を確認するためにアガロースゲルによって分析した。Ｃａｓ９の改変ｍＲＮＡを生成するＩＶＴ反応を、以下の条件において３７℃で４時間インキュベートした：５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド；ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＮ１−メチル偽性ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々の２ｍＭ；１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機の大腸菌（E. coli）ピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；ならびに１×反応緩衝液。４時間のインキュベーションの後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．０１Ｕ／μＬの最終濃度まで加え、反応をさらなる３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従ってＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキットを使用して、酵素およびヌクレオチドからＣａｓ９  ｍＲＮＡを精製した。代わりに、例えば実施例１５に示すように、沈殿プロトコルを通してｍＲＮＡを精製し、その後、一部の場合にはＨＰＬＣに基づく精製が続いた。簡潔には、ＤＮアーゼ消化の後、７．５ＭのＬｉＣｌ溶液の０．２１倍の量を加えて混合することによってｍＲＮＡを沈殿させ、沈殿したｍＲＮＡは遠心分離によってペレットにした。上清を除去したならば、ｍＲＮＡを水で復元した。酢酸アンモニウムおよびエタノールを使用して、ｍＲＮＡを再び沈殿させた。２倍量の１００％ＥｔＯＨと一緒に、５Ｍの酢酸アンモニウムを２Ｍの最終濃度のためにｍＲＮＡ溶液に加えた。溶液を混合し、−２０℃で１５分間インキュベートした。沈殿したｍＲＮＡを遠心分離によって再びペレットにし、上清を除去し、ｍＲＮＡを水で復元した。最終段階として、酢酸ナトリウムおよびエタノールを使用して、ｍＲＮＡを沈殿させた。１／１０量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を、２倍量の１００％ＥｔＯＨと一緒に溶液に加えた。溶液を混合し、−２０℃で１５分間インキュベートした。沈殿したｍＲＮＡを遠心分離によって再びペレットにし、上清を除去し、ペレットを７０％の冷エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。ｍＲＮＡを、水で復元した。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡのために、ＬｉＣｌ沈殿および復元の後に、ｍＲＮＡをＲＰ−ＩＰ  ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 e142を参照）。プールするために選択された分画を合わせ、上記の酢酸ナトリウム／エタノール沈殿によって脱塩した（deslated）。
【０１４３】
全ての方法のために、２６０ｎｍで吸光度を測定することによって転写物濃度を判定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物はＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）による毛細管電気泳動によって分析した。
【０１４４】
類似の方法でｓｇＲＮＡを生成するためにも、ＩＶＴを使用した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列だけで構成された最上部オリゴならびにｓｇＲＮＡ鋳型および相補性配列を含有する最下部の鎖をプロモーター部位にアニーリングすることによって、ｓｇＲＮＡのためのＤＮＡ鋳型を生成した。アニールされた鋳型は、以下の条件においてＩＶＴ反応で直接的に使用した：１２５ｎＭの鋳型；ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの各々の７．５ｍＭ；５Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機の大腸菌（E. coli）ピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；ならびに１×反応緩衝液。反応を３７℃で８時間インキュベートし、その後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を０．０１Ｕ／μＬの最終濃度まで加え、反応をさらなる３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキットによって、ｓｇＲＮＡ転写物を精製した。２６０ｎｍでの吸光度によって転写物濃度を判定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物はＰＡＧＥによって分析した。
【０１４５】
製剤分析
ＬＮＰ製剤を、平均粒径、多分散（ｐｄｉ）、全ＲＮＡ含有量およびＲＮＡの封入効率のために分析した。平均粒径および多分散は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＤＬＳ機器を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ＤＬＳによる測定の前に、ＬＮＰ試料をＰＢＳで３０倍に希釈した。平均粒径の強度に基づく測定であるＺ平均直径を、ｐｄｉと一緒に報告した。
【０１４６】
全ＲＮＡ濃度および封入効率を判定するために、蛍光に基づくアッセイを使用した。
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ１１４９１）の線形範囲の中に入るように、ＬＮＰを１×ＴＥ緩衝液で７５倍に希釈した。希釈したＬＮＰの５０μｌを、５０μｌの１×ＴＥ緩衝液または０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１×ＴＥ緩衝液と２反復でさらに混合した。ＴｒｉｔｏｎがＬＮＰを完全に破壊し、全ＲＮＡを曝露させてＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素と相互作用させることを可能にするために、試料を３７℃で１０分の間インキュベートした。ＬＮＰを作製するために使用された出発ＲＮＡ溶液を利用し、上記と同じステップに従うことによって、標準曲線のための試料を調製した。希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（１００μＬ、１×ＴＥ緩衝液に１００倍、製造業者の説明書による）を試料の各々に次に加え、光の非存在下において室温で１０分の間インキュベートした。試料を読み取るためにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、励起、オートカットオフおよび放射波長はそれぞれ４８８ｎｍ、５１５ｎｍおよび５２５ｎｍに設定した。封入効率（％ＥＥ）は、以下の式を使用して計算した：
【０１４７】
【数１】
2019516351.tif 000008
ここで、蛍光＠５２５ｎｍ−トリトンはトリトンなしの試料のための平均蛍光読取りであり、蛍光＠５２５ｎｍ＋トリトンはトリトンのある試料のための平均蛍光読取りである。全ＲＮＡ濃度は、トリトン値のある試料のための線形標準曲線および平均蛍光読取りを使用して判定した。
【０１４８】
ＤＮＡをベースとしたカーゴ構成成分の封入効率を判定するために、同じ手順を使用することができる。一本鎖ＤＮＡのためにＯｌｉｇｒｅｅｎ色素を使用することができ、二本鎖ＤＮＡのためにＰｉｃｏｇｒｅｅｎ色素を使用することができる。
【０１４９】
様々なＬＮＰ組成物のための、平均粒径、多分散および％ＥＥの値は、下の表１で報告される。
【０１５０】
【表１−１】
2019516351.tif 000009
【０１５１】
【表１−２】
2019516351.tif 000010
【０１５２】
【表１−３】
2019516351.tif 000011
【０１５３】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断の後の非相同的末端連結（ＮＨＥＪ）を通して生成された挿入、欠失および置換などのゲノムＤＮＡにおける突然変異事象を検出するために、Ｔ７Ｅ１アッセイを一部の実施例において使用した（例えば、Cho et al., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013; 31, 230-232を参照）。
【０１５４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的であるゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲによって増幅し、９５℃で１０分間変性させ、その後、０．５℃／秒の速度で温度を９５℃から２５℃に降下させることによって再アニールした。ヘテロ二本鎖を形成するＤＮＡの組合せは、増幅された領域における突然変異の存在を示した。再アニールされたヘテロ二本鎖は、次に３７℃で２５分またはそれより長くバクテリオファージレゾルバーゼＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して二本鎖切断を生成し、ここで、Ｔ７Ｅ１ヌクレアーゼはミスマッチを認識した。結果として生じたＤＮＡ断片は、断片アナライザーを使用して分析し、編集効率の近似値を判定するために数量化した。編集効率の定量的分析のために、本明細書に記載される通りに次世代配列決定を使用した。
【０１５５】
的確な切断効率のための次世代配列決定（「ＮＧＳ」）および分析
ゲノム中の標的位置で編集効率を定量的に判定するために、深部配列決定を利用して遺伝子編集によって導入された挿入および欠失の存在を確認した。
【０１５６】
標的部位（例えば、ＴＴＲ、ＦＶＩＩ）の周囲でＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。プライマー配列は、下に提供する。配列決定のために必要な化学を加えるために、製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってさらなるＰＣＲを実行した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器でアンプリコンを配列決定した。低品質のスコアを有するものを排除した後に、読み取りデータをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）と整列させた。読み取りデータを含む生じたファイルを参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、ここで、標的の目的領域に重なった読み取りデータを選択して、野生型読み取りデータの数に対する挿入、置換または欠失を含む読み取りデータの数を計算した。
【０１５７】
編集百分率（例えば、「編集効率」または「パーセント編集」）は、挿入または欠失を有する配列読み取りデータの総数割る野生型を含む配列読み取りデータの総数と規定される。
【０１５８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＬＮＰ送達
マウス細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ＡおよびＨｅｐａ１．６）を１０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ培地で培養し、本明細書に記載される溶解および分析（例えば、リポーター発現、Ｔ７Ｅ１アッセイ、ＮＧＳ）の１８〜２４時間前のＬＮＰによるトランスフェクションの２４時間前に、１５，０００細胞／ウェルの密度で平板培養した。コラーゲンコート９６ウェルプレートを使用して、肝細胞平板培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウス一次肝細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１ウェルにつき細胞数１５，０００で培養した。５時間後に、平板培養培地を除去し、ＬＮＰおよび３％マウス血清を含有する肝細胞維持培地（３７℃で５分間プレインキュベートした）と交換した。本明細書に記載される溶解および分析（例えば、Ｔ７Ｅ１アッセイ、ＮＧＳ）の前に、細胞に４２〜４８時間トランスフェクトした。細胞株および一次肝細胞両方のために、ＬＮＰを希釈し、１ウェルにつき１００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび概ね３０ｎＭのガイドＲＮＡから出発して細胞に加え、１ウェルにつき０．１ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび０．０３ｎＭのガイドＲＮＡまでの段階希釈を片対数により実行した。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＮＰ送達
６〜１０週齢のＣＤ−１雌マウスを、各研究で使用した。群平均体重に基づいて投与溶液を調製するために、動物を計量し、体重によってグループ分けした。１動物につき０．２ｍＬの量（体重１キログラムにつき概ね１０ｍＬ）で、ＬＮＰを側方の尾静脈を通して投与した。有害作用について投与の概ね６時間後に動物を観察した。投与の２４時間後に体重を測定し、イソフルラン麻酔下で心臓の穿刺を通した放血によって動物を様々な時点で安楽死させた。血清分離管または本明細書に記載される血漿のための緩衝クエン酸ナトリウムを含有する管に、血液を収集した。ｉｎ  ｖｉｖｏ編集を含む研究のために、ＤＮＡ抽出および分析のために、肝臓組織を各動物からの中央の小葉から、または３つの独立した小葉（例えば、右中央、左中央および左側葉）から収集した。一部の研究のために、脾臓組織も収集した。
【０１６０】
ゲノムＤＮＡ単離
溶解緩衝液（組織１０ｍｇにつき概ね２００μＬ）で組織をホモジナイズし、ＤＮＡを沈殿させることを含む製造業者のプロトコルに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡキット（カタログＫ１８２０−０２）を使用して、１０ｍｇの組織からゲノムＤＮＡを抽出した。本明細書に記載される通り、ＰＣＲおよび以降のＮＧＳ分析のために、全てのＤＮＡ試料を１００ｎｇ／μＬ濃度に正規化した。
【０１６１】
トランスチレチン（ＴＴＲ）ＥＬＩＳＡ分析
血液を収集し、血清を示すように単離した。全ＴＴＲ血清レベルは、マウスプレアルブミン（トランスチレチン）ＥＬＩＳＡキット（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、カタログＯＫＩＡ００１１１）を使用して判定した。キット試薬および標準は、製造業者のプロトコルに従って調製した。マウス血清を、１×アッセイ希釈剤で１０，０００倍の最終希釈まで希釈した。２回の逐次的な５０倍希釈を実行して２，５００倍希釈をもたらすことによって、これは実行された。１０，０００倍の全体の試料希釈のために、最終の４倍希釈ステップを実行した。捕捉抗体をプレコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、標準曲線希釈溶液（各々１００μＬ）および希釈血清試料の両方を加えた。洗浄の前に、プレートを室温で３０分の間インキュベートした。酵素抗体コンジュゲート（１ウェルにつき１００μＬ）を、２０分のインキュベーションのために加えた。未結合の抗体コンジュゲートを除去し、プレートを再び洗浄してから発色性基質溶液を加えた。プレートを１０分の間インキュベートしてから、１００μＬの停止溶液、例えば硫酸（概ね０．３Ｍ）を加えた。４５０ｎｍの吸光度で、プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーで読み取った。標準曲線から４つのパラメータロジスティック曲線あてはめを使用して、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアバージョン６．４．２によって血清ＴＴＲレベルを計算した。最終血清値を、アッセイ希釈のために調整した。
【０１６２】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）活性アッセイ
示した通りに、血液を血漿のために収集した。ＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩアッセイキット（Ａｎａｒｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログＡ２２１３０４）を使用して、血漿中の第ＶＩＩ因子活性レベルを測定した。キット試薬は、製造業者のプロトコルに従って調製した。２回の逐次的な５０倍希釈を実行して２，５００倍希釈をもたらすことによって、キットの試料希釈緩衝液で血漿を１０，０００倍に希釈した。１０，０００倍の全体の試料希釈のために、最終の４倍希釈ステップを実行した。希釈した試料（３０μＬ）を、キット試薬１（３０μＬ）に加えた。次に、キット試薬２（６０μＬ）をプレートに加え、その後それを３７℃で７分の間インキュベートした。キット試薬３（６０μＬ）を次にプレートに加え、プレートを３７℃でさらなる５分の間インキュベートした後、酢酸（２０ｖ／ｖ％水溶液、６０μＬ）を加えて酵素反応を停止した。４０５ｎＭで、プレートをＳｏｆｔＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーで読み取った。対照動物の血漿から作成した較正曲線に基づいてＦＶＩＩ活性の相対値を計算し、ビヒクル対照のパーセントとして報告した。
【０１６３】
[実施例２]
ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ封入ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達。
ｅＧＦＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ、カタログＬ−６１０１）をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを、実施例１に記載されている通りに調製した。各ＬＮＰ調製物の構成成分には、ＣＣＤ脂質（４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１（２モル％）が含まれる。ＬＮＰ−００２、−００６、−００７、−０１０および−０１１は、リピドＡをＣＣＤ脂質として含み、ＬＮＰ−０１２および−０１３は、リピドＢをＣＣＤ脂質として含む。ＬＮＰ−００２、−０１０および−０１２はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含み、ＬＮＰ−００６、−００７、−０１１および−０１３はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１を含む。平均粒径、多分散および封入効率を含むＬＮＰの詳細は、表１に提供される。実施例１に記載のようにＬＮＰはマウス肝細胞株（Ｈｅｐａ１．６）に送達され、送達されたｅＧＦＰ  ｍＲＮＡの総量は、各ＬＮＰについて１ウェルにつき１００ｎｇまたは５００ｎｇであった。細胞をＬＮＰと一緒に概ね１８時間インキュベートし、ｅＧＦＰ発現はＣｙｔｏＦＬＥＸ細胞アナライザー（Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。
【０１６４】
図１に示すように、ｅＧＦＰ発現は、各製剤で観察された。リピドＡを含むＬＮＰ製剤（ＬＮＰ−００２、−００６、−００７、−０１０および−０１１）は、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを首尾よく送達した。リピドＢを含むＬＮＰ製剤（ＬＮＰ−０１２および−０１３）も、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを送達した。ＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧステルス脂質を含むＬＮＰは、これらの実験で両方ともｍＲＮＡを効果的に送達し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＮＰを使用することによるマウス肝細胞株へのｍＲＮＡの送達を実証している。
【０１６５】
[実施例３]
ｇＬＵＣ  ｍＲＮＡ封入ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ送達。
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ｇＬＵＣ）（ＴｒｉＬｉｎｋ、カタログＬ−６１２３）をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを実施例１に記載されている通りに調製し、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物へのｍＲＮＡの送達について試験した。各ＬＮＰ調製物の構成成分には、ＣＣＤ脂質（４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれる。ＬＮＰ−０１４はリピドＡを含み、ＬＮＰ−０１５はリピドＢを含んでいた。平均粒径、多分散および封入効率などのこれらの製剤の詳細は、表１に提供される。０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのｇＬＵＣ  ｍＲＮＡ用量が、各ＬＮＰ製剤と送達された。動物を２４時間後に安楽死させ、実施例１に記載されている通りに血液採取および血清の単離を実行した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼフラッシュアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１６１５８）を製造業者のプロトコルに従って使用して、血清ルシフェラーゼ発現を測定した。
【０１６６】
図２に示すように、ＰＢＳ対照と比較してｇＬＵＣ発現の用量依存性の増加が各動物（各群につきｎ＝５）で観察された。ルシフェラーゼ活性によって測定したとき、リピドＡまたはリピドＢを含むＬＮＰは、ｍＲＮＡの有効なｉｎ  ｖｉｖｏ送達および発現を示した。
【０１６７】
[実施例４]
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ（ｍＲＮＡ−ＬＮＰ）と二重ガイドＲＮＡ封入ＬＮＰ（ｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ）を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ送達および編集。
肝臓でのｉｎ  ｖｉｖｏ編集のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＲＮＡ構成成分（例えば、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ）を送達するためのＬＮＰを、ＣＤ−１マウスで試験した。これらの実験において、ｄｇＲＮＡおよびｍＲＮＡは別々に製剤化した。
【０１６８】
実施例１に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび化学改変ｄｇＲＮＡ（ＴＴＲまたはＦＶＩＩを標的にする）でＬＮＰを別々に製剤化した。この実施例で使用されたｄｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、二重ガイドを構成するｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を有する。各ＬＮＰ調製物（ＬＮＰ−０９３、−０９４、−０９５、−０９６および−０９７）の構成成分には、ＣＣＤ脂質（リピドＡ）（４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれる。平均粒径、多分散および封入効率を含むこれらの製剤の詳細は、表１に提供される。２つの異なる投与レジメンが用いられた：（１）ｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤（ＬＮＰ−０９７）およびｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤（ＬＮＰ−０９３、−０９４、−０９５または−０９６）を等しい部（ＲＮＡの重量による）で一緒に合わせ、合わせた製剤を２日連続投与する（各日に、各ＲＮＡ構成成分製剤の１ｍｇ／ｋｇで投与する、合計２ｍｇ／ｋｇ）；または、（２）ｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−０９３、−０９４、−０９５および−０９６）を投与する４時間前にｍＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−０９７）を２日連続で投与する（各製剤は、１ｍｇ／ｋｇで投与した）。動物は、各群の最初の投与の５日後に安楽死させた。対照群との比較（ＰＢＳを受けた動物）に加えて、各実験群は内部配列決定対照を有し、実施例１に記載の通り、ＮＧＳ分析のためのＰＣＲ反応を各動物（各群でｎ＝３）の両方の標的のために実行した。肝臓からのゲノムＤＮＡを単離し、実施例１に記載の通りにＮＧＳにより分析した。
【０１６９】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、共投与（Ａ１（ＬＮＰ−０９３／−０９７）またはＡ２（ＬＮＰ−０９４／−０９７））または前投与（Ａ３（ＬＮＰ−０９３／−０９７））投与レジメンを使用して、ＦＶＩＩを標的にしたＬＮＰを受けた動物の肝臓において、ｉｎ  ｖｉｖｏ編集（概ね１．８％編集〜２．８％編集）が観察された。ＴＴＲを標的にしたＬＮＰを受けた動物は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共投与された（Ｂ１（ＬＮＰ−０９５／ＬＮＰ−０９７）またはＢ２（ＬＮＰ−０９６／−０９７））ｄｇＲＮＡを受けた、または前投与された（Ｂ３（ＬＮＰ−０９５／−０９７）またはＢ４（ＬＮＰ−０９６／−０９７））ときの動物の肝臓において、概ね２％〜４．５％の編集を示した。実施例１に記載の通り、血清および血漿分析を全ての動物について実行したが、いずれの動物も、ＴＴＲの全体の血清レベルまたは血漿中のＦＶＩＩ活性のいずれにおいても統計的有意差（ＰＢＳを投与した動物と比較して）を示さなかった（示さず）。
【０１７０】
[実施例５]
ｄｇＲＮＡ−ＬＮＰおよびＩＶＴ  ｓｇＲＮＡ−ＬＮＰを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ送達および編集。
化学改変ｄｇＲＮＡを含むＬＮＰおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰの効力を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰによる共投与との関連で試験した。
【０１７１】
ＬＮＰ−１１５、−１１６、−１１７、−１２０、−１２１および−１２３を実施例１に従って製剤化した。具体的な製剤についての詳細は表１に提供される。実施例１に記載の手順を用いて、この実施例の製剤をＮｅｕｒｏ２Ａ細胞への送達について試験した。
【０１７２】
ＬＮＰ−１２１（ｇＲＮＡ）およびＬＮＰ−１２０（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ）を互いに混合し、それぞれ１ウェルにつき１５２ｎＭ、７６ｎＭおよび３８ｎＭのｇＲＮＡ濃度に加えて５７０ｎｇ、２８５ｎｇおよび１４２ｎｇのｍＲＮＡを投与した；ＬＮＰ−１２３（ｇＲＮＡ）およびＬＮＰ−１２０を互いに混合し、それぞれ１ウェルにつき１５６ｎＭ、７８ｎＭおよび３９ｎＭのｇＲＮＡ濃度に加えて５２８ｎｇ、２６４ｎｇおよび１３２ｎｇのｍＲＮＡを投与した；ならびに、ＬＮＰ−１１６（ｇＲＮＡ）をＬＮＰ−１２０（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ）と混合し、それぞれ１ウェルにつき１２４ｎＭ、６２ｎＭおよび３１ｎＭのｇＲＮＡ濃度に加えて４６０ｎｇ、２２９ｎｇおよび１１４ｎｇのｍＲＮＡを投与した。ＬＮＰ−１２１は、１９８ｎＭ、９９ｎＭおよび４９．５ｎＭのｇＲＮＡ濃度で投与し；ＬＮＰ−１２３は、１８９ｎＭ、９４．５ｎＭおよび４７ｎＭのｇＲＮＡ濃度で投与し；ＬＮＰ−１１６は、１２４ｎＭ、６２ｎＭおよび３１ｎＭのｇＲＮＡ濃度で投与し、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１ウェルにつき１００ｎｇ）は、製造業者の説明書に従ってＬＦ２Ｋによって実験に加えた。ＩＶＴ  ｓｇＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−１２３）をＬＮＰ（ＬＮＰ−１２０）またはＬＦ２Ｋを使用してＣａｓ９  ｍＲＮＡと、ならびに化学改変ｄｇＲＮＡとｇＲＮＡ（ＬＮＰ−１２１）の試験濃度で共投与することを含む試料で、編集が観察された。
【０１７３】
この実施例の製剤を、次にｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。実施例１に記載されているように、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰとｇＲＮＡ−ＬＮＰのうちの１つとの混合物を２日連続で動物に投与し（動物は、各製剤の１ｍｇ／ｋｇを各日に投与された）、１つの製剤は１日だけ投与された（各群でｎ＝５）。最初の投与から６日後（または、単回の投与だけを受けた群では７日後）に動物を安楽死させ、肝臓組織を採取して実施例１に記載の通りＮＧＳによって分析した。
【０１７４】
図４Ａに示すように、単回および２回の投与は、送達のために有効だった。単一の日に１回の投与を受けた群（ＬＮＰ−１２１およびＬＮＰ−１２０；図４ＡのＣ）と、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰを化学改変ｄｇＲＮＡ−ＬＮＰと共投与したときに連続した日に２回の投与を受けた群（ＬＮＰ−１１６およびＬＮＰ−１２０、図４ＡのＡ；ＬＮＰ−１２１およびＬＮＰ−１２０、図４ＢのＢ）との間に統計的差はない。未改変のＩＶＴ  ｓｇＲＮＡ−ＬＮＰと共投与されたＣａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−１２３およびＬＮＰ−１２０、図４ＢのＤ）を受けた動物は、この実施例で使用されたｄｇＲＮＡ−ＬＮＰと比較して相対的に低いレベルの編集を呈した（図４Ｂ）。これらの実験は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰと共投与されるとき、改変ｄｇＲＮＡまたはＩＶＴ  ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ編集を可能にすることを立証する。この実験でＩＶＴ  ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰを使用したときに観察されたｉｎ  ｖｉｖｏ編集のレベルは、単離されたＩＶＴ  ｓｇＲＮＡ中の不純物によって影響を受ける可能性がある。
【０１７５】
[実施例６]
改変ｄｇＲＮＡ−ＬＮＰまたは改変ｓｇＲＮＡ−ＬＮＰを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ送達および編集。
化学改変されたｄｇＲＮＡを含むＬＮＰおよび化学改変されたｓｇＲＮＡを含むＬＮＰは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰとの共投与によっても試験した。
【０１７６】
実施例１に記載の通り、ＬＮＰは、化学改変されたｄｇＲＮＡ（ＴＴＲまたはＦＶＩＩを標的化）、化学改変されたｓｇＲＮＡ（ＴＴＲまたはＦＶＩＩを標的化）およびＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡで製剤化した。この実施例のｄｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、二重ガイドを構成するｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を有する。この実施例のｓｇＲＮＡも化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドで、およびその間に２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結を有する。各ＬＮＰ調製物の構成成分には、ＣＣＤ脂質（リピドＡ、４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれる。ＬＮＰ−１３６、−１３７、−１３８、−１３９および−１４０が、これらの実験で使用された。平均粒径、多分散および封入効率を含む詳細は、表１に提供される。
【０１７７】
実施例１に記載の通り、この実施例の製剤をＮｅｕｒｏ２Ａ細胞への送達について試験した。各製剤を細胞培地に直接的に加えることによって、細胞にガイドＬＮＰおよびＣａｓ９  ｍＲＮＡ  ＬＮＰをコトランスフェクトして、表２に掲載の濃度をもたらし、実施例１に記載のＴ７Ｅ１アッセイを使用して、パーセント編集を判定した。図５で、ラベルは表２に記載の製剤を表す。
【０１７８】
【表２】
2019516351.tif 000012
【０１７９】
試験したｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤と比較したときの、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰとコトランスフェクトした化学改変されたｓｇＲＮＡ−ＬＮＰを使用したときの、編集の大きな増加を両標的について測定した（図５）。ＦＶＩＩおよびＴＴＲを標的にしたとき、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰとコトランスフェクトした化学改変されたｓｇＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−１３８および−１３９、図５）は、細胞でそれぞれ概ね３５〜５０％および６５〜７０％の編集をもたらした。
【０１８０】
この実施例の製剤を、次にｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。実施例１に記載されているように、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−１４０）と試験したｇＲＮＡ−ＬＮＰ（ＬＮＰ−１３６、−１３７、−１３８および−１３９）の１つとの混合物を動物に投与し、各構成成分製剤は２日連続で１ｍｇ／ｋｇ／日で投与した（合計２ｍｇ／ｋｇ／日）（各群でｎ＝５）。最初の投与から６日後に動物を安楽死させ、肝臓組織を採取して実施例１に記載の通りＮＧＳによって分析した。
【０１８１】
図６で、Ａ１およびＡ２は、製剤ＬＮＰ−１３６およびＬＮＰ−１４０の混合物の投与を表し；Ｂ１およびＢ２は、製剤ＬＮＰ−１３９およびＬＮＰ−１４０の混合物の投与を表し；Ｃ１およびＣ２は、製剤ＬＮＰ−１３７およびＬＮＰ−１４０の混合物の投与を表し；Ｄ１およびＤ２は、製剤ＬＮＰ−１３８およびＬＮＰ−１４０の混合物の投与を表す。図６に示すように、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰと共投与した化学改変されたｓｇＲＮＡ−ＬＮＰを使用したときの、ｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤の使用がもたらした編集の量（概ね２％編集〜５％編集）と比較したときの編集の増加（概ね１０％編集〜３２％編集）を両標的について測定した。ＴＴＲを標的にするｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を受けた動物は、２つの肝生検にわたって５％未満の編集をもたらしたが、ｓｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は２０％以上の平均パーセント編集をもたらした（１動物で３０％以上のピーク）。同様に、ＦＶＩＩを標的にするｄｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を受けた動物は、２つの肝生検にわたって３％未満の編集を示したが、ｓｇＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は概ね１０％の平均パーセント編集をもたらした（１動物で１２％以上のピーク）。
【０１８２】
これらの結果は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方）で別々に製剤化されたＬＮＰは、一緒に共投与されるときにｉｎ  ｖｉｖｏ編集を達成し、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰがｇＲＮＡ−ＬＮＰの前に投与されるときにＬＮＰはｉｎ  ｖｉｖｏ編集を達成することを立証した。
【０１８３】
[実施例７]
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共製剤化したｓｇＲＮＡを含むＬＮＰを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ送達および編集。
ＬＮＰ組成物に一緒に封入したＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの送達のために製剤化したＬＮＰも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分を効果的に送達する。
【０１８４】
実施例１に記載されるように、ＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に化学改変ｓｇＲＮＡ（ＴＴＲまたはＦＶＩＩを標的にする）でＬＮＰを製剤化した。ＲＮＡ構成成分の重量によるｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡの比は、概ね１：１であった。この実施例のｓｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドで、およびその間に２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結を有する。各ＬＮＰ調製物の構成成分には、ＣＣＤ脂質（リピドＡ、４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれる。ＬＮＰ−１５２、−１５３、−１５４および−１５５をこれらの実験で使用し、平均粒径、多分散および封入効率を含むこれらの製剤の詳細は、表１に提供される。
【０１８５】
実施例１に記載の通りに、この実施例の製剤をＮｅｕｒｏ２Ａ細胞への送達について試験した。細胞に製剤をトランスフェクトし、パーセント編集は実施例１に記載の通りにＮＧＳを使用して判定した。
【０１８６】
図７で、ＡはＬＮＰ−１５２の投与を表し；Ｂは、ＬＮＰ−１５３の投与を表し；Ｃは、ＬＮＰ−１５４の投与を表し；Ｄは、ＬＮＰ−１５５の投与を表し；Ｅは、ＬＮＰ−１５２およびＬＮＰ−１５３の組合せの投与を表す。各製剤は、３００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび９３ｎＭのｇＲＮＡ；１００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび３１ｎＭのｇＲＮＡ；３０ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび１０ｎＭのｇＲＮＡ；ならびに１０ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび３ｎＭのｇＲＮＡで投与された。図７に示すように、各ＬＮＰ製剤の投与は強健な編集効率をもたらし、一部の製剤は８０％を超える細胞の編集をもたらした（ＬＮＰ−１５３および−１５５）。ＦＶＩＩを標的にするＬＮＰ製剤のうちの２つ（ＬＮＰ−１５２およびＬＮＰ−１５３）の組合せで細胞を処理し、それも効率的な編集（概ね７０〜９０％編集）、ならびに送達した２つのｓｇＲＮＡの間に存在するＦＶＩＩ遺伝子の一部の切除をもたらした（図７、データ示さず）。
【０１８７】
この実施例の製剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏでも試験した。実施例１に記載されているように、動物に投与した（各群でｎ＝４）。ＦＶＩＩを標的にするＬＮＰを受けた処置群は単回投与（２ｍｇ／ｋｇ）を受け、処置群の１つは２ｍｇ／ｋｇ（例えば、ＬＮＰ−１５２およびＬＮＰ−１５３の各々の１ｍｇ／ｋｇ）の単回の組合せ投与（ＬＮＰ−１５２およびＬＮＰ−１５３）を受けた。ＴＴＲを標的にするＬＮＰを受けた処置群は２回の投与（各々２ｍｇ／ｋｇ）を受け、２回目の投与は初回の投与の４日後に送達された（すなわち、１日目に投与１、５日目に投与２）。最初の投与から８日後に全ての群の動物を安楽死させ、血液および肝臓組織を採取して実施例１に記載の通りに分析した。各製剤を、４動物に投与した。
【０１８８】
図８Ａ、８Ｂおよび９で、ＡはＬＮＰ−１５２の投与を表し；Ｂは、ＬＮＰ−１５３の投与を表し；Ｃは、ＬＮＰ−１５２およびＬＮＰ−１５３の組合せの投与を表す。各製剤を、４動物で試験した。図８Ａおよび８Ｂに示すように、試験した各ＬＮＰ製剤は、強健なｉｎ  ｖｉｖｏ編集効率をもたらした。ＴＴＲ配列を標的にするＬＮＰ製剤で処置した動物については、一部の動物の各生検からの肝臓細胞の５０％より多くは標的部位でインデルを示し、各処置群の全平均（全動物の全ての生検にわたる）は４５．２±６．４％（ＬＮＰ−１５４）および５１．１±３．７％（ＬＮＰ−１５５）であった（図８Ａ）。
【０１８９】
ＦＶＩＩ配列を標的にするＬＮＰで処置した動物は、百分率編集の範囲を肝生検で示し、最大の観察された編集では、ＦＶＩＩ配列を標的にする両方のＬＮＰ製剤を受けた１動物で、肝臓細胞の７０％より多くが生検試料から編集された（例えば、標的部位（複数可）で、またはそれらの間で、インデルまたは切除事象を有する）。各処置群（ＬＮＰ−１５２、ＬＮＰ−１５３およびＬＮＰ−１５２とＬＮＰ−１５３）の全体の平均（全動物の全ての生検にわたる）は、それぞれ、１６．９±６．５％、３８．６±１３．２％および５０．７±１５．０％であった（図８Ｂ）。両方のＦＶＩＩ標的化ＬＮＰを受けた動物については、各ｓｇＲＮＡの標的部位の間の介在ゲノムＤＮＡの切除は、標的部位の一方または両方でのインデルがそうであるように、ＰＣＲによって検出された（図９）。
【０１９０】
図１０および１１で、Ａは、ＬＮＰ−１５２の投与を表し；Ｂは、ＬＮＰ−１５３の投与を表し；Ｃは、ＬＮＰ−１５４の投与を表し；Ｄは、ＬＮＰ−１５５の投与を表し；Ｅは、ＬＮＰ−１５２およびＬＮＰ−１５３の組合せの投与を表す。ＬＮＰ製剤をこの実施例で投与したときに観察された強健なｉｎ  ｖｉｖｏ編集は、表現型変化をももたらした。図１０に示すように、ＴＴＲ配列を標的にしたＬＮＰで処置した動物において血清中ＴＴＲレベルの大きな低下（最高概ね７５％）が観察された（しかし、対照またはＦＶＩＩを標的にしたＬＮＰで処置した動物では観察されなかった）。同様に、ＦＶＩＩを標的にしたＬＮＰで処置した動物において血漿中ＦＶＩＩ活性の低減したレベルが観察された（しかし、対照またはＴＴＲを標的にしたＬＮＰで処置した動物では観察されなかった）（図１１）。
【０１９１】
[実施例８]
製剤パラメータの変異。
１つの製剤としてＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを一緒に送達するために製剤化されたＬＮＰを、（１）ある範囲の用量にわたって；（２）変化させたｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比で；（３）１回投与対２回投与による効力について；および（４）ＬＮＰが脾臓によって取り込まれるかまたは脾臓における編集をもたらすかどうかについて試験した。
【０１９２】
実施例１に記載されるように、ＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共に化学改変ｓｇＲＮＡ（ＴＴＲを標的にする）でＬＮＰを製剤化した。ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡの試験した比（ＲＮＡ構成成分の重量による）は、概ね１：１（ＬＮＰ−１６９）、概ね１０：１（ＬＮＰ−１７０）または概ね１：１０（ＬＮＰ−１７１）であった。この実施例で使用したｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドで、およびその間に２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結をそれぞれ含む。各ＬＮＰ調製物の構成成分には、リピドＡ（４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれた。ＬＮＰ−１６９、−１７０およびＬＮＰ−１７１が、これらの実験で使用された。平均粒径、多分散および封入効率を含む詳細は、表１に提供される。
【０１９３】
用量応答研究
この研究で、実施例１に記載の通り１日目にＬＮＰ−１６９を０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇの用量で動物に投与した（各群でｎ＝５）。５日目および９日目に、ＴＴＲの血清レベル分析のために血液を採取した。実施例１に記載の通り、ＮＧＳ分析のために９日目に検死で肝臓および脾臓を採取した。
【０１９４】
図１２Ａに示すように、３用量全ての投与は肝臓においてかなりの編集効率をもたらし、観察された線形用量応答は０．９４４１のｒ２値を有していた。最高用量群（２ｍｇ／ｋｇ）では、１動物の肝臓細胞のほぼ６０％がＴＴＲ標的部位で編集され、この群は肝臓細胞の平均約５０％が編集されていた。投与の５日後および９日後に測定したとき、最高用量を投与された各動物は血清中ＴＴＲレベルの統計的に有意な低減も示し、血清中ＴＴＲレベルの平均低減は７５％であった（ＰＢＳを投与した動物と比較して；図１２Ｂ）。
【０１９５】
ｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比を変更する
１日目に、実施例１に記載されているように、１：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ比のＬＮＰ−１６９（すなわち、１ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ、１ｍｇ／ｋｇのｇＲＮＡ、合計２ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ用量）、１０：１の比のＬＮＰ−１７０（すなわち、１．８ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ、０．１８ｍｇ／ｋｇのｇＲＮＡ、合計１．９８ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ用量）、または、１：１０の比のＬＮＰ−１７１（すなわち、０．１８ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡ、１．８ｍｇ／ｋｇのｇＲＮＡ、合計１．９８ｍｇ／ｋｇのＲＮＡ用量）、を動物に投与した（各群につきｎ＝５）。（注：１：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ比の用量を受けた群およびデータは、上のこの実施例の用量応答研究に記載されるのと同じ群およびデータである。）５日目および９日目に血液を採取し、血清中ＴＴＲレベルを測定した。実施例１に記載の通り、ＮＧＳ分析のために９日目に検死で肝臓および脾臓を採取した。
【０１９６】
図１３Ａに示すように、ＬＮＰ−１６９（１：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ比）の投与は、１動物でＴＴＲ標的部位におけるほぼ６０％の編集をもたらし、この群は平均約５０％の編集を有していた。１：１０および１０：１のＬＮＰ製剤を受けた動物も編集を実証し、この実験において、ＬＮＰ−１７１を受けた群の平均パーセント編集は概ね３２％の編集を示し、ＬＮＰ−１７０を受けた群は概ね１７％の編集を示した。さらに、図１３Ｂに示すように、５日目に、血清中ＴＴＲレベルの統計的に有意な低減が各処置群で検出された（ＰＢＳ対照と比較して）。９日目まで、１：１のｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡおよび１：１０のｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡを受けた群は、血清中ＴＴＲレベルの統計的に有意な低減を保持した。
【０１９７】
１回投与対２回投与
この研究では、１群の動物は、１日目にＬＮＰ−１６９の単回投与（２ｍｇ／ｋｇ）を受けたが、別の群は実施例１に記載されているようにＬＮＰ−１６９の２回の投与（各々２ｍｇ／ｋｇ）を受け、最初の投与は１日目におよび２回目の投与は５日目に投与された（両群でｎ＝５）。（注：ＬＮＰ−１６９の単回投与を受けた群およびデータは、上のこの実施例の用量応答およびｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ比研究に記載されるのと同じ群およびデータである。）５日目に（２回目の投与を受けた群のためには２回目の用量の投与の前に）および実施例１に記載の通りに再び９日目の検死で、血液をＴＴＲ血清中レベルのために両群から採取した。
【０１９８】
図１４Ａに示すように、ＬＮＰ−１６９の単回投与を受けた群で、ＴＴＲ標的部位のほぼ６０％の編集が１動物で観察され、この群は平均約５０％の編集を有していた。ＬＮＰ−１６９の２回の投与を受けた動物で類似の平均数がより低い標準偏差で達成され、この群はＴＴＲ標的部位の編集が平均で概ね５５％であった。図１４Ｂに示すように、両群は血清中ＴＴＲレベルの有意な低減を示した。
【０１９９】
脾臓による取り込みおよびそこにおける編集の評価
ＬＮＰが脾臓に誘導されてそれによって取り込まれ、それによって遺伝子編集をもたらすかどうか判定するために、上記の研究（この実施例の中の）の各動物から脾臓を検死で採取した。ゲノムＤＮＡを脾臓組織から抽出し、実施例１に記載の通りにＮＧＳ分析に付した。
【０２００】
図１５で、Ａは、２回の投与のために２ｍｇ／ｋｇで投与されたＬＮＰ−１６９を表し；Ｂは、単回投与としての０．１ｍｇ／ｋｇの１：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比を有するＬＮＰ−１６９を表し；Ｃは、単回投与としての０．５ｍｇ／ｋｇの１：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比を有するＬＮＰ−１６９を表し；Ｄは、単回投与としての２ｍｇ／ｋｇの１：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比を有するＬＮＰ−１６９を表し；Ｅは、単回投与としての２ｍｇ／ｋｇの１０：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比を有するＬＮＰ−１７０を表し；Ｆは、単回投与としての２ｍｇ／ｋｇの１：１０のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの比を有するＬＮＰ−１７１を表す。図１５に示すように、それらの肝臓と比較してこれらの動物の脾臓において、有意により少ない編集（細胞の概ね２％未満）が観察された。これらの研究において、肝臓において概ね５０％の編集が観察された（例えば、ＬＮＰ−１６９を受けた群において）。これらの結果は、本明細書で提供されるＬＮＰが、脾臓と対照的にほとんど肝臓を標的にすることを示す。
【０２０１】
[実施例９]
（１）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ−ＬＮＰと共投与される改変されたｄｇＲＮＡ−ＬＮＰと、（２）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび改変されたｄｇＲＮＡを１つの製剤に一緒に含むＬＮＰの間のｉｎ  ｖｉｖｏ比較研究。
別々のＬＮＰとしての、または１つの製剤中に一緒の、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび改変されたｄｇＲＮＡの送達のために製剤化されたＬＮＰは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分を効果的に送達する。
【０２０２】
実施例１に記載の通りに、化学改変されたｄｇＲＮＡ（ＴＴＲを標的化）と一緒に（ＬＮＰ−１７４、−１７５）、または別々に（ＬＮＰ−１７２、−１７３）ＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡでＬＮＰを製剤化した。この実施例でｄｇＲＮＡを構成するｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの両方は、各ＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結を含んでいた。各ＬＮＰ調製物の構成成分には、ＣＣＤ脂質（リピドＡ、４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれる。ＬＮＰ−１７２、−１７３、−１７４および−１７５が、これらの実験で使用された。ＬＮＰ−１７５でｄｇＲＮＡを構成するｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡがＬＮＰで製剤化される前にお互いに先ずプレアニールされたことを除いて、ＬＮＰ−１７４およびＬＮＰ−１７５の組成物は同一であった。これは、前述のように、先ずｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを９５℃で１０分の間一緒にインキュベートし、その後、室温に冷却して製剤化に進行することによって達成された。平均粒径、多分散および封入効率を含むＬＮＰに関する他の詳細は、表１に提供される。
【０２０３】
実施例１に記載の通りに、各ＬＮＰを２ｍｇ／ｋｇで動物に投与した（各群でｎ＝５）。投与の８日後の検死で肝臓を採取し、実施例１に記載の通りに、ゲノムＤＮＡを単離してＮＧＳ分析に付した。
【０２０４】
図１６で、Ａは、ｄｇＲＮＡスプリット製剤（ＬＮＰ−１７２およびＬＮＰ−１７３）の投与を表し；Ｂは、ｄｇＲＮＡ共製剤（ＬＮＰ−１７４）の投与を表し；Ｃは、ｄｇＲＮＡがプレアニールされた製剤（ＬＮＰ−１７５）の投与を表す。図１６に示すように、各群からの肝臓で編集が検出された（概ね４〜６％の編集）。Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｄｇＲＮＡで一緒に共製剤化されたＬＮＰを受けた動物、ならびに別々に製剤化されたＬＮＰからｍＲＮＡおよびｄｇＲＮＡを受けた動物は、編集を示した。ｄｇＲＮＡで製剤化された（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと一緒にまたは別々に）ＬＮＰを使用して測定した編集効率は、ｓｇＲＮＡで製剤化されたＬＮＰを使用して検出したものより実質的に低い（例えば、実施例６〜８を参照）。
【０２０５】
[実施例１０]
ＬＮＰのＡｐｏＥ結合および一次肝細胞のトランスフェクション。
実施例８で実証されるように、本明細書で提供されるＬＮＰは、肝臓によって効果的に取り込まれるが、脾臓によってわずかに取り込まれるだけである。この実施例は、一次肝細胞におけるＡｐｏＥ媒介取り込みに関するデータを提供し、ＬＮＰがＡｐｏＥに結合することを実証したＬＮＰ−ＡｐｏＥ結合を試験するためのアッセイを提供する。
【０２０６】
一次肝細胞へのＬＮＰの送達
他のタンパク質に加えて、血清は培地にＡｐｏＥの供与源を提供し、したがって、ＬＮＰが一次肝細胞への取り込みのために血清（例えば、ＡｐｏＥの供与源として）を必要とするかどうかについて試験した。これは、血清の存在の有る無しで、ＬＮＰを一次肝細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで加えることによって達成された。
【０２０７】
実施例１に記載の通りに、ＬＮＰをマウス一次肝細胞に送達した。血清の非存在下では、試験したいかなるＬＮＰについても、Ｔ７Ｅ１アッセイによって編集は検出されなかった（データ示さず）。しかし、トランスフェクションの前にＬＮＰを３％のマウス血清とインキュベートしたとき、ＬＮＰは肝細胞によって取り込まれて編集をもたらした。代表的データセットを、図１７に示す。この実験では、ＬＮＰ−１６９（ＴＴＲを標的化）を３％のマウス血清にプレインキュベートし、次に様々な濃度でマウス一次肝細胞に加えた。図１７のラベルは表３に規定され、投与されたＬＮＰ−１６９の濃度を記載する。図１７に示すように、ＮＧＳによって測定したとき、血清の追加は、ＴＴＲ標的部位で編集の用量依存的増加をもたらした。これらの結果は、血清中に存在するＡｐｏＥが肝細胞におけるＬＮＰ取り込みを媒介することを示唆する。
【０２０８】
【表３】
2019516351.tif 000013
【０２０９】
ＡｐｏＥ結合アッセイ
ＬＮＰをＡｐｏＥで最も一般的な形態である組換えＡｐｏＥ３とインキュベートし、次に、ＨＰＬＣの上の塩勾配を使用してヘパリン親和性カラムで分離した。ＨＰＬＣランにおいて、ＡｐｏＥ３に結合したＬＮＰおよび未結合のＬＮＰに対応した２つのピーク群があった。ＡｐｏＥ３に結合せず、ヘパリンカラム中を自由に流れた遊離のＬＮＰは未結合である。結合していたのは、ヘパリンカラムに結合し塩勾配において溶出したＬＮＰ／ＡｐｏＥ３複合体に相当する、より長い滞留時間を有するピークであった。結合を計算するために、ＡｐｏＥ３に結合したＬＮＰに対応するピーク面積を、両方のピークの面積の合計によって割り算することによって結合ピーク面積の百分率を計算した。
【０２１０】
実施例１に記載されるように、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび化学改変ｓｇＲＮＡでＬＮＰを製剤化した。この実施例で使用したｓｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、それぞれｓｇＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドで、およびその間に２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結を有していた。各ＬＮＰ調製物（ＬＮＰ−１６９およびＬＮＰ−１７１）の構成成分には、リピドＡ（４５モル％）、コレステロール（４４モル％）、ＤＳＰＣ（９モル％）およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ（２モル％）が含まれる。平均粒径、多分散および封入効率を含むこれらの製剤の詳細は、表１に提供される。保存用ＡｐｏＥ３（組換えヒトアポリポタンパク質Ｅ３、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１４４−ＡＥ−５００）溶液を０．５ｍｇ／ｍＬで用いて、ＡｐｏＥ３を２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬおよび３００μｇ／ｍＬでＬＮＰ試料に加えた。試料は、室温で一晩インキュベートした。
【０２１１】
２つの緩衝液を調製した（各々５００ｍＬ）；緩衝液Ａは、ｐＨ８．０に調整した２０ｍＭのトリス緩衝液であり、緩衝液Ｂは、１ＭのＮａＣｌを有するｐＨ８．０に調整した２０ｍＭのトリス緩衝液である。ＨＰＬＣ分析のための勾配および流量は、下記のようである。
【０２１２】
【表４】
2019516351.tif 000014
【０２１３】
試料を一晩インキュベートした後に、各試料をＨＰＬＣによって分析し、結合したピークのパーセント面積を前述の通りに計算した。
【０２１４】
図１８に示すように、ＡｐｏＥ３の量の増加に伴って、例えばＡｐｏＥ３に結合した結果として、より多くのＬＮＰ（両ＬＮＰ−１６９（破線によって表される）および−１７１（実線によって表される））がヘパリンカラムに結合した。これらの結果は、ＬＮＰがＡｐｏＥ３に結合することを示す。
【０２１５】
[実施例１１]
ＤＮＡ発現カセットから発現されたｓｇＲＮＡとＬＮＰを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ送達および編集。
この実施例は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを担持させたＬＮＰを使用した遺伝子編集を実証する。
【０２１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＬＮＰ送達
マウスＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡとして連結したＵ６プロモーターを含有するＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅によって、ｓｇＲＮＡをコードするアンプリコンを調製した。ゲノムＤＮＡへのＤＮＡアンプリコンの組込みを阻止するために、各プライマーは、５’末端に反転したジデオキシＴヌクレオチドを含有した。フェノール／クロロホルム抽出と続くエタノール沈殿によって、ＰＣＲ生成物を精製した。ＤＮＡペレットを乾燥させて、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。
【０２１７】
実施例１に記載の通りに、ＬＮＰをＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（「ｍＲＮＡ−ＬＮＰ」またはＬＮＰ−１７８）またはｓｇＲＮＡ発現カセット（「ＤＮＡ−ＬＮＰ」またはＬＮＰ−１７６）で製剤化した。ＩＶＴ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ発現カセットは、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で別々に製剤化もした（それぞれ、「ｍＲＮＡ  ＬＦ２Ｋ」または「ＤＮＡ  ＬＦ２Ｋ」）。以下のレジメンによって各ウェルの中の細胞培地に直接的に加えて希釈することによって、製剤をマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に適用した（１００ｎｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび１００ｎｇのｓｇＲＮＡ発現カセット）：
・Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ発現カセットの共送達；
・Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの２時間前に投与したｓｇＲＮＡ発現カセット；および
・ｓｇＲＮＡ発現カセットの２時間前に投与したＣａｓ９  ｍＲＮＡ。
【０２１８】
トランスフェクションの後の４８時間細胞をインキュベートし、細胞溶解物は実施例１に記載の通りにＴ７Ｅ１分析によって分析した。図１９に示すように、ｍＲＮＡおよびＤＮＡ構成成分の両方をＬＮＰに製剤化したとき、１つの構成成分または他をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００で製剤化したときと比較して、より高い百分率のＴＴＲ編集が観察された。
【０２１９】
[実施例１２]
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ対ｉｎ  ｖｉｖｏ編集。
実施例１に記載の通りに、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび異なるマウスＴＴＲ配列を標的にする化学改変ｓｇＲＮＡを製剤化して、マウスに投与した（２ｍｇ／ｋｇ）。マウス一次肝細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトするために、同じＬＮＰ調製物を使用した。この実施例のｓｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、それぞれｓｇＲＮＡの５’および３’末端の両方における３つの末端ヌクレオチドで、およびその間に２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結を有する。
【０２２０】
【表５−１】
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【０２２１】
【表５−２】
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【０２２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のために、７ポイント片対数用量応答を実行した（１００ｎｇ／ウェルから開始）。トランスフェクションの４８時間後に、ゲノムＤＮＡを収集し、編集パーセントをＮＧＳによって測定した。図２０はこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験の編集百分率を示し、編集効率が培養およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける一次肝細胞の間で相関することを実証している。
【０２２３】
ＮＧＳは全体の編集効率に加えて特異的配列決定結果を提供するので、配列特異的編集パターンをＮｅｕｒｏ２Ａ細胞と比較した。図２１は、マウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをトランスフェクトされた）とマウス一次肝細胞（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含有するＬＮＰをトランスフェクトされた）の間で、挿入および欠失パターンが有意に異なることを実証する代表的データを示す。マウス一次肝細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されたもの（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含有するＬＮＰをトランスフェクトされた）と非常に類似の編集パターンを与えた（図２２）。図２２に示すように、マウス一次肝細胞で測定された編集の５３．２％は欠失（主に１ｂｐの欠失）であり、１６．８％は挿入（主に１ｂｐの挿入）であって、合計で７０％の編集であった。合計７０％の編集のうち、編集の６４．５％はフレームシフト突然変異をもたらし、それは測定された全編集の約９２％を占める（示さず）。同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウス肝臓細胞へのＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡのＬＮＰに基づく送達から観察された編集百分率および編集タイプのための、代表的データを示す：マウス肝臓細胞でｉｎ  ｖｉｖｏで測定された編集の４６．６％は欠失（再び、主に１ｂｐの欠失）であり、１２．９％は挿入（再び、主に１ｂｐの挿入）であって、合計で５９．５％の編集であった。合計５９．５％の編集のうち、編集の５７．４％はフレームシフト突然変異をもたらし、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定された編集の約９６％を占める（示さず）。
【０２２４】
[実施例１３]
ＬＮＰによって送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分の薬物動態。
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびマウスＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡを含有するＬＮＰ−２９４を、実施例１に記載の通りに製剤化した。ｍＲＮＡ対ガイドＲＮＡの比は、ＨＰＬＣによって確認した。実施例１に記載の通りに各ＬＮＰを２ｍｇ／ｋｇで動物に投与し（各群でｎ＝３）、以下の時点で解体した：５分、１５分、３０分、６０分、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、７２時間および７日。検死時に、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡのレベルのｑＰＣＲ分析のために、血漿、肝臓および脾臓を採取した。図２３はこれらの構成成分の血漿中濃度を示し、図２４は肝臓中の濃度を示し、図２５は脾臓中の濃度を示す。血漿中濃度のために、以下の薬物動態学的パラメータを計算した：
【０２２５】
【表６】
2019516351.tif 000017
【０２２６】
図２６Ａは、血漿および組織におけるｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９  ｍＲＮＡの相対比を示す。
【０２２７】
処置マウスにおけるサイトカイン誘導も、測定した。この分析のために、血清サイトカイン測定のために尾静脈ニックによって概ね５０〜１００μＬの血液を採取した。室温で概ね２時間血液を凝固させ、１０００×ｇで１０分間遠心分離してから血清を採取した。採取試料でのサイトカイン分析のために、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−アルファおよびＭＣＰ−１を測定するＬｕｍｉｎｅｘベースの磁気ビーズ多重アッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｕｓ、カタログ番号Ｅｘｐ０４０−０００００−８０１）を使用した。キット試薬および標準は、製造業者のプロトコルの指示通りに調製した。提供された試料希釈剤を用いてマウス血清を４倍に希釈し、５０μＬを、希釈された抗体コート磁気ビーズの５０μＬを含有するウェルに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートし、その後洗浄した。希釈したビオチン抗体（５０μＬ）をビーズに加え、室温で１時間インキュベートした。ビーズを再び洗浄した後、希釈したストレプトアビジン−ＰＥの５０μＬを各ウェルに加え、続いて３０分間インキュベートした。ビーズを再び洗浄し、次に１００μＬの洗浄緩衝液に懸濁し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ２００機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で読み取った。Ｂｉｏｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒバージョン６．１分析パッケージを使用してデータを分析し、５パラメータロジスティック曲線あてはめを使用して標準曲線からサイトカイン濃度を計算した。図２７は、処置マウスの経時的血漿中サイトカインレベルを示す。図２７に示すように、サイトカインの各々は、処置の２〜４時間後に測定可能な増加を有し、１２〜２４時間までに各々ベースラインに戻った。
【０２２８】
３つの異なるガイド配列を実施例１に従って別々に製剤化し、リピドＡの薬物動態学的プロファイルを判定するためにマウス（ｎ＝３）に注射した。マウスの肝臓および血漿におけるリピドＡのレベルは、ＬＣ／ＭＳによって測定した。図２６Ｂは、リピドＡの血漿および肝臓濃度を経時的に示す。肝臓におけるＴｍａｘは投与から３０分以内に達成されたが、血漿および肝臓におけるＴ１／２はＬＮＰ投与から概ね５〜６時間以内に達成された。
【０２２９】
[実施例１４]
ｉｎ  ｖｉｖｏ編集の応答の期間
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびマウスＴＴＲ配列を標的にする化学改変ｓｇＲＮＡを、実施例１に記載の通りに製剤化した。
【０２３０】
【表７】
2019516351.tif 000018
【０２３１】
ＬＮＰを、実施例１に記載の通りにマウス（３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与）に投与した。マウスのコホートを投与の１、２、４、９、１３および１６週後に血清中ＴＴＲレベルについて、ならびに投与の１、２、９および１６週後に肝臓ＴＴＲ編集について測定した。肝臓ＴＴＲ編集を測定するために、ＤＮＡ抽出および分析のための特定のコホートの各動物からの中葉から肝臓組織試料を採取した。ビーズをベースとした抽出キット、ＭａｇＭＡＸ−９６  ＤＮＡ多試料キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４４１３０２０）を製造業者のプロトコルに従って使用して、１０ｍｇの組織からゲノムＤＮＡを抽出し、それは、溶解緩衝液（組織１０ｍｇにつき概ね４００μＬ）で組織をホモジナイズし、ＤＮＡを沈殿させることを含む。ＰＣＲおよび以降のＮＧＳ分析のために、全てのＤＮＡ試料を１００ｎｇ／μＬ濃度に正規化した。
【０２３２】
この実施例のｓｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、下に表すように２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結を有する（ｍ＝２’−ＯＭｅ；＊＝ホスホロチオエート）：
【０２３３】
ｓｇ２８２：
【０２３４】
【化６】
2019516351.tif 000019
【０２３５】
図２８はマウス血清中ＴＴＲレベルを経時的に示し、図２９ＡはＮＧＳによって測定したときの対応する編集百分率を示す。図２９Ｂは、投与から１６週後までの経時的マウス血清中ＴＴＲレベルおよびＮＧＳによって測定したときの対応する編集百分率を示す。
【０２３６】
[実施例１５]
ｍＲＮＡ調製物を使用した製剤
実施例１に記載の通りに、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、沈殿だけおよびＨＰＬＣ精製プロトコルの両方を使用して調製した。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡを使用してＬＮＰを製剤化し（ＬＮＰ４９２）、沈殿だけで処理したｍＲＮＡを使用して製剤化したＬＮＰ（ＬＮＰ４９０、ＬＮＰ４９４）と比較した。ＬＮＰ４９４のＣａｓ９  ｍＲＮＡカーゴは、沈殿だけのｍＲＮＡの異なる合成ロットを使用して調製した。
【０２３７】
【表８】
2019516351.tif 000020
【０２３８】
実施例１のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＬＮＰ送達に記載の通りに、マウスに各製剤の０．５または１ｍｇ／ｋｇを投与した。この実施例で使用したｓｇＲＮＡは、実施例１４に記載のようにｓｇ２８２であった。
【０２３９】
図３０は、投与から４時間後のマウス血清中のサイトカイン活性を示す。図３１はマウス血清中ＴＴＲ濃度レベルを示し、図３２はマウス肝臓のＴＴＲ編集レベルを示す。
【０２４０】
【表９】
2019516351.tif 000021
【０２４１】
[実施例１６]
凍結製剤
約４．５のリピドＡ対ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子構成成分を１００％エタノールに以下のモル比で溶解した：４５モル％（１２．７ｍＭ）のリピドＡ；４４モル％（１２．４ｍＭ）のコレステロール；９モル％（２．５３ｍＭ）のＤＳＰＣ；および２モル％（０．５６３ｍＭ）のＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ。ＲＮＡカーゴは５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５に溶解し、概ね０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度をもたらした。この研究のために、実施例１４に記載されるｓｇ２８２を使用した。
【０２４２】
【表１０】
2019516351.tif 000022
【０２４３】
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）ベンチトップ機器を製造業者のプロトコルに従って使用して、脂質およびＲＮＡ溶液を微流動混合することによってＬＮＰ（ＬＮＰ４９３、ＬＮＰ４９６）を形成した。差別的流速を使用した混合の間、水性対有機溶媒の２：１の比を維持した。混合の後、ＬＮＰを採取し、５０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．５に希釈した。製剤化したＬＮＰを、０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過した。結果として生じた濾液を、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス緩衝液で調製した１０ｗ／ｖ％スクロース９０ｍＭ  ＮａＣｌと１：１で混合した。５ｗ／ｖ％スクロース、４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス緩衝液の最終ＬＮＰ製剤は、投与の日まで１．５日の間４℃および−８０℃で保存した。
【０２４４】
０．５および１ｍｇ／ｋｇ（投与の１時間前に凍結製剤を２５℃で解凍した）で、ＬＮＰをマウスに投与した。図３３はマウス血清中ＴＴＲ濃度レベルを示し、図３４は投与後のマウス肝臓のＴＴＲ編集レベルを示す。
【０２４５】
【表１１】
2019516351.tif 000023
【０２４６】
この実施例のｓｇＲＮＡは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、下に表すように２’−Ｏ−メチル改変およびホスホロチオエート連結を有する（ｍ＝２’−ＯＭｅ；＊＝ホスホロチオエート）：
ｓｇ３９６：
【０２４７】
【化７】
2019516351.tif 000024
【０２４８】
[実施例１７]
代わりのＬＮＰ製剤化プロセス
約４．５のリピドＡ対ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比で、ＬＮＰを製剤化した。脂質ナノ粒子構成成分を１００％エタノールに以下のモル比で溶解した：４５モル％（１２．７ｍＭ）のリピドＡ；４４モル％（１２．４ｍＭ）のコレステロール；９モル％（２．５３ｍＭ）のＤＳＰＣ；および２モル％（０．５６３ｍＭ）のＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ。酢酸緩衝液（最終濃度２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）またはクエン酸緩衝液（最終濃度２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５）にＲＮＡカーゴを溶解し、概ね０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴの濃度をもたらした。この研究のために、実施例１４に記載されるｓｇ２８２を使用した。
【０２４９】
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）ベンチトップ機器を製造業者のプロトコルに従って使用して、またはクロスフロー混合を使用して、脂質およびＲＮＡ溶液を微流動混合することによってＬＮＰを形成した。ＬＮＰ５６３およびＬＮＰ５６４は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ調製物を使用して調製し、ここでは、水相で８ｍＬ／分および有機相で４ｍＬ／分である差別的流速を使用した混合の間、水性対有機溶媒の２：１の比を維持した。混合の後、ＬＮＰを採取し、５０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．５に１：１で希釈した。ＬＮＰを５０ｍＭトリスｐＨ７．５で一晩透析し、その翌日、０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過した。結果として生じた濾液を濃縮し、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス緩衝液で調製した１０ｗ／ｖ％スクロース９０ｍＭのＮａＣｌと１：１で混合した。５ｗ／ｖ％スクロース、４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス緩衝液の最終ＬＮＰ製剤は、投与の日まで１．５日の間４℃および−８０℃で保存した。
【０２５０】
【表１２】
2019516351.tif 000025
【０２５１】
ＬＮＰ５６１およびＬＮＰ５６２は、クロスフロー技術を使用して調製し、シリンジポンプを２シリンジのＲＮＡと０．４５ｍｇ／ｍＬで使用し、１シリンジは脂質含有有機相であり、１シリンジは水であった。これらを可変管長により４０ｍＬ／分で混合し、水相および有機相を０．５ｍｍピーククロスを通して押し出し、このアウトプットは水の管に接続された１ｍｍティーに導入した。ＬＮＰは室温で１時間インキュベートし、次に水で１：１に希釈した。簡潔には、シリンジポンプによってＬＮＰおよび水を１ｍｍティーに２５ｍＬ／分で導入した。
【０２５２】
精製および濃縮のために、接線流濾過を使用した。この手順のためには、通常、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＶｉｖａｆｌｏｗ５０カートリッジを５００ｍＬの水でプライミングし、次に、Ｐａｌｌ  Ｍｉｎｉｍａｔｅシステムを６０ｍＬ／分の供給速度で使用してＬＮＰを導入する。およそ１．７ｍＬ／分の一定流速を維持するように、濾過液のラインを締める。ＬＮＰが濃縮されると、１５倍の量のＰＢＳまたは５％スクロース、４５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリスを８０ｍＬ／分の供給速度で真空下において導入する。１．９ｍＬ／分の流速を維持するように、濾過液のラインを締める。限外濾過が完了すると、ＬＮＰを濃縮し、無菌の無ＤＮアーゼＲＮアーゼ収集管に採取し、投与の日まで、ＰＢＳ製剤のために４℃で、またはＴＳＳ（すなわち、トリス、スクロースおよび塩）製剤のために４℃もしくは−８０℃で保存する。
【０２５３】
１．０および２ｍｇ／ｋｇ（投与の１時間前に凍結製剤を２５℃で解凍した）で、ＬＮＰをマウスに投与した。図３５はマウス血清中ＴＴＲ濃度レベルを示し、図３６は異なる製剤を投与した後のマウス肝臓のＴＴＲ編集レベルを示す。
【０２５４】
【表１３】
2019516351.tif 000026
【０２５５】
[実施例１８]
より高等な種へのＬＮＰの送達。
実施例１４に記載されるものと同様に製剤を調製した。ある特定の実験では、ｓｇ２８２におけるのと同じ化学的改変でｓｇＲＮＡを改変したが、ラットＴＴＲ配列に特異的な標的化配列であった。ラット肝臓において効率的な編集が、観察された。２ｍｇ／ｋｇ（全カーゴ）投与および５ｍｇ／ｋｇ（全カーゴ）投与は、実験で良好な耐容性を示した。ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを含有する類似の製剤も、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの用量で非ヒト霊長類に良好な耐容性を示した。
【０２５６】
配列
上の実施例に記載される配列を以下のように掲載する（５’から３’までのポリヌクレオチド配列）：
【０２５７】
Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（太字のＣａｓ９コード配列；下線付き太字のＨＡタグ；下線付きの２×ＮＬＳ）：
【０２５８】
【化８−１】
2019516351.tif 000027
【０２５９】
【化８−２】
2019516351.tif 000028
【０２６０】
【化８−３】
2019516351.tif 000029
【０２６１】
【化８−４】
2019516351.tif 000030
【０２６２】
表１１で参照され、実施例１７で使用される「Ｃａｓ９  １×ＮＬＳ、ＨＡタグなし」：
【０２６３】
【化９−１】
2019516351.tif 000031
【０２６４】
【化９−２】
2019516351.tif 000032
【０２６５】
【化９−３】
2019516351.tif 000033
【０２６６】
【化９−４】
2019516351.tif 000034
【０２６７】
ｔｒ００１（ｔｒＲＮＡ）：
【０２６８】
【化１０】
2019516351.tif 000035
【０２６９】
ｃｒ００２（ＦＶＩＩを標的にするｃｒＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２７０】
【化１１】
2019516351.tif 000036
【０２７１】
ｓｇ００１（ＦＶＩＩを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２７２】
【化１２】
2019516351.tif 000037
【０２７３】
ｃｒ００３（ＴＴＲを標的にするｃｒＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２７４】
【化１３】
2019516351.tif 000038
【０２７５】
ｓｇ００６（ＩＶＴによって作製されたＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２７６】
【化１４】
2019516351.tif 000039
【０２７７】
ｓｇ００３（ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２７８】
【化１５】
2019516351.tif 000040
【０２７９】
ｓｇ００７（ＦＶＩＩを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２８０】
【化１６】
2019516351.tif 000041
【０２８１】
ｓｇ００２（ＦＶＩＩを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２８２】
【化１７】
2019516351.tif 000042
【０２８３】
ｓｇ００４（ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２８４】
【化１８】
2019516351.tif 000043
【０２８５】
ｓｇ００５（ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２８６】
【化１９】
2019516351.tif 000044
＊＝ホスホロチオエート連結
ｍ＝２’ＯＭｅ
【０２８７】
ｔｒ００２（ｔｒＲＮＡ）：
【０２８８】
【化２０】
2019516351.tif 000045
【０２８９】
ｃｒ００４（ＦＶＩＩを標的にするｃｒＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２９０】
【化２１】
2019516351.tif 000046
【０２９１】
ｃｒ００５（ＴＴＲを標的にするｃｒＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２９２】
【化２２】
2019516351.tif 000047
【０２９３】
ｓｇ００８（ＦＶＩＩを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２９４】
【化２３】
2019516351.tif 000048
【０２９５】
ｓｇ００９（ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２９６】
【化２４】
2019516351.tif 000049
【０２９７】
ｓｇ０１０（ＦＶＩＩを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０２９８】
【化２５】
2019516351.tif 000050
【０２９９】
ｓｇ００２（ＦＶＩＩを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０３００】
【化２６】
2019516351.tif 000051
【０３０１】
ｓｇ０１１（ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０３０２】
【化２７】
2019516351.tif 000052
【０３０３】
ｓｇ０１２（ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡ；下線付きの標的化配列）：
【０３０４】
【化２８】
2019516351.tif 000053
【０３０５】
ｅｃ００１（発現カセット−ＴＴＲを標的にするｓｇＲＮＡを発現するためのアンプリコン；太字のＵ６プロモーター、下線付きの標的化配列；構築物は、各５’末端に反転したジデオキシＴを含有する）：
【０３０６】
【化２９】
2019516351.tif 000054
【０３０７】
ｃｒ００１の標的であるＦＶＩＩ標的部位のＮＧＳ分析のためのプライマー対：
フォワード：
【０３０８】
【化３０】
2019516351.tif 000055
リバース：
【０３０９】
【化３１】
2019516351.tif 000056
【０３１０】
ｃｒ００２およびｓｇ００１の標的であるＦＶＩＩ標的部位のＮＧＳ分析のためのプライマー対：
フォワード：
【０３１１】
【化３２】
2019516351.tif 000057
リバース：
【０３１２】
【化３３】
2019516351.tif 000058
【０３１３】
ｓｇ００２の標的であるＦＶＩＩ標的部位のＮＧＳ分析のためのプライマー対：
【０３１４】
【化３４】
2019516351.tif 000059
リバース：
【０３１５】
【化３５】
2019516351.tif 000060
【０３１６】
ｃｒ００３およびｓｇ００３の標的であるＴＴＲ標的部位のＮＧＳ分析のためのプライマー対：
フォワード：
【０３１７】
【化３６】
2019516351.tif 000061
リバース：
【０３１８】
【化３７】
2019516351.tif 000062
【０３１９】
ｓｇ００４の標的であるＴＴＲ標的部位のＮＧＳ分析のためのプライマー対：
フォワード：
【０３２０】
【化３８】
2019516351.tif 000063
リバース：
【０３２１】
【化３９】
2019516351.tif 000064
【０３２２】
ｓｇ００５の標的であるＴＴＲ標的部位のＮＧＳ分析のためのプライマー対：
フォワード：
【０３２３】
【化４０】
2019516351.tif 000065
リバース：
【０３２４】
【化４１】
2019516351.tif 000066
【０３２５】
ｓｇ００４発現カセットのＰＣＲ増幅のためのプライマー対：
／５ＩｎｖｄｄＴ／＝反転したジデオキシＴ
フォワード：
／５ＩｎｖｄｄＴ／ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧ
リバース：
／５ＩｎｖｄｄＴ／ＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣ
【０３２６】
【表１４−１】
2019516351.tif 000067
【０３２７】
【表１４−２】
2019516351.tif 000068
【０３２８】
【表１４−３】
2019516351.tif 000069
【０３２９】
【表１４−４】
2019516351.tif 000070
【０３３０】
【表１４−５】
2019516351.tif 000071
【０３３１】
【表１５−１】
2019516351.tif 000072
【０３３２】
【表１５−２】
2019516351.tif 000073
【０３３３】
【表１５−３】
2019516351.tif 000074
【０３３４】
【表１５−４】
2019516351.tif 000075
【図１】
2019516351.tif 000076
【図２】
2019516351.tif 000077
【図３】
2019516351.tif 000078
【図４】
2019516351.tif 000079
【図５】
2019516351.tif 000080
【図６】
2019516351.tif 000081
【図７】
2019516351.tif 000082
【図８−１】
2019516351.tif 000083
【図８−２】
2019516351.tif 000084
【図９】
2019516351.tif 000085
【図１０】
2019516351.tif 000086
【図１１】
2019516351.tif 000087
【図１２−１】
2019516351.tif 000088
【図１２−２】
2019516351.tif 000089
【図１３−１】
2019516351.tif 000090
【図１３−２】
2019516351.tif 000091
【図１４−１】
2019516351.tif 000092
【図１４−２】
2019516351.tif 000093
【図１５】
2019516351.tif 000094
【図１６】
2019516351.tif 000095
【図１７】
2019516351.tif 000096
【図１８】
2019516351.tif 000097
【図１９】
2019516351.tif 000098
【図２０】
2019516351.tif 000099
【図２１】
2019516351.tif 000100
【図２２】
2019516351.tif 000101
【図２３】
2019516351.tif 000102
【図２４】
2019516351.tif 000103
【図２５】
2019516351.tif 000104
【図２６−１】
2019516351.tif 000105
【図２６−２】
2019516351.tif 000106
【図２７】
2019516351.tif 000107
【図２８】
2019516351.tif 000108
【図２９−１】
2019516351.tif 000109
【図２９−２】
2019516351.tif 000110
【図３０】
2019516351.tif 000111
【図３１】
2019516351.tif 000112
【図３２】
2019516351.tif 000113
【図３３】
2019516351.tif 000114
【図３４】
2019516351.tif 000115
【図３５】
2019516351.tif 000116
【図３６】
2019516351.tif 000117
【国際調査報告】
2019516351.tif 000118
2019516351.tif 000119
2019516351.tif 000120
2019516351.tif 000121