(57)【要約】  本開示は、核酸分子、組成物、及びそれらを具備するキット、ならびに鋳型化アセンブリ産物を作製するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハプロマー・リガンド複合体であって、
標的核酸分子に対し実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む、ハプロマーと、
前記ハプロマーの５’末端または３’末端に連結されたリガンドであって、リガンドパートナー結合部位を含む、前記リガンドと、
を含む、前記ハプロマー・リガンド複合体。
【請求項２】
請求項１に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体とを含む、組成物またはキットであって、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、前記組成物またはキット。
【請求項３】
ボトルハプロマー・リガンド複合体において、
ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーであって、前記ポリヌクレオチドが、
ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第１のステム部分と、
ｉｉ）約１６〜約４０までのヌクレオチド塩基を含み、且つ前記第１のステム部分が連結されている第１の末端を有する、抗標的ループ部分であって、標的核酸分子に対し実質的に相補的である、前記抗標的ループ部分と、
ｉｉｉ）抗標的ループ部分の第２の末端に連結された約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、第２のステム部分であって、前記第１のステム部分に対し実質的に相補的である、前記第２のステム部分と、
ｂ）前記第１のステム部分または前記第２のステム部分のいずれかの末端に連結されたリガンドであって、リガンドパートナー結合部位を含む、前記リガンドと、
を含み、
前記抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、前記第１のステム部分：前記第２のステム部分のＴmよりも大きい、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体。
【請求項４】
請求項３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体と、
ハプロマー・リガンド複合体において、
ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的である約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含む、前記ハプロマー・リガンド複合体と、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のヌクレオチド部分の５’末端または３’末端に連結されているリガンドであって、リガンドパートナー結合部位を含む、前記リガンドと、
を含み、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体において：前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに結合している第１または第２のステム部分のＴmが、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体の第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である、前記組成物またはキット。
【請求項５】
【化１】
2019535281.tif 000085
次式：
（式中、ｍは３〜６）を有するか、
次式：
【化２】
2019535281.tif 000086
（式中、ｍは３〜６）を有するか、
次式：
【化３】
2019535281.tif 000087
（式中、ｎは１〜６）を有するか、
次式：
【化４】
2019535281.tif 000088
（式中、ｘは１〜６）を有するか、
次式：
【化５】
2019535281.tif 000089
（式中、ｘは１〜６）を有するか、または
次式：
【化６】
2019535281.tif 000090
を有する化合物。
【請求項６】
リガンド結合ドメインに融合した目的タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質であって、前記リガンド結合ドメインがＦＫＢＰドメインまたはＦＲＢドメインである、前記融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の第１の融合タンパク質と請求項６に記載の第２の融合タンパク質とを含み、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質及び前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質が二量体化または一体的に折り畳み可能である、組成物またはキット。
【請求項８】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項１に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記標的核酸を、請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第２の融合タンパク質に接触させることとを含み、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、  前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近い部位にて前記標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、
結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項９】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項１に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記標的核酸を、請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第２の融合タンパク質に接触させることとを含み、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近い部位にて前記標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、
前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ
前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、
結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項１０】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項１に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と請求項６に記載の第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第１ハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、前記接触させることと、
標的核酸分子を、請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と請求項６に記載の第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第２ハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、前記接触させることと、
を含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項１１】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項１に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と請求項６に記載の第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第１ハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、前記第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、前記接触させることと、
前記標的核酸分子を、請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と請求項６に記載の第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、前記第２ハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、前記接触させることと、
を含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項１２】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記標的核酸を請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体が、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されている前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、前記接触させることと、
前記ボトルハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
を含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項１３】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記標的核酸を請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体が、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されている前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、前記接触させることと、
前記ボトルハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
を含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項１４】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記標的核酸分子を請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体が、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されている前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、前記接触させることと、
前記ボトルハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
を含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【請求項１５】
タンパク質の指向性アセンブリ方法であって、
標的核酸分子を、請求項３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、
前記標的核酸分子を請求項１に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体が、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されている前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、前記接触させることと、
前記ボトルハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
前記第２のハプロマー・リガンド複合体を請求項６に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、前記第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと前記第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、前記接触させることと、
を含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一部には、核酸分子、組成物、及びそれらを具備するキット、ならびに鋳型化アセンブリ産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬の目標は、ウイルス感染細胞、新生物細胞、自己免疫応答を生起する細胞、及び他の調節不全または機能不全細胞などの、病原性細胞への強力な生物学的療法の介入を提供することにある。病原性細胞を駆除し得る強力な生物学的療法の介入の例としては、毒素、アポトーシス促進剤、及び免疫細胞を病原性細胞の排除に再指向させる免疫療法アプローチが挙げられる。しかしながら、隣接する正常細胞に対し毒物が曝される危険性が高いことから、すなわち患者の全身的な健康上の理由から、こうした創薬は極めて困難となっている。
【０００３】
正常細胞への毒性を軽減しつつ病原性細胞への強力な介入を可能にすることを目的とした方法が、台頭してきた。この方法は、病原性細胞に特異的な分子マーカーに対し治療薬を指し向けることによって治療薬を標的化するというものである。標的治療薬は、限られた症例において臨床結果が並外れたものであることが明らかにされてきたが、標的治療用のアクセス可能マーカーが欠如しているという理由から、現時点では標的治療薬の適用性に限界がある。多くの病原性細胞型に対するタンパク質マーカーを発見することは極めて困難であり、不可能なこともしばしばである。
【０００４】
病原性細胞に特異的な核酸標的を標的化する治療法が開発されてきたのは、つい最近のことである。ｓｉＲＮＡなどの既存の核酸標的療法は、危険な可能性のある遺伝子の発現の下方調節を可能としているが、強力な細胞傷害性または細胞増殖抑制性の介入を生じないため、危険な細胞自体を排除する効率に劣っている。
【０００５】
そのため、既存の生物学的療法の介入の有効性が低く及び／または副作用が深刻となっており、それらに対処する必要性が存在している。本明細書中に記載されているように、タンパク質のアセンブルは、病原性細胞もしくはそれ以外の所望されない細胞または細胞産物を駆除する目的に使用できる核酸分子鋳型を用いた、折り畳みまたは二量体化を介して為され得る。そのような鋳型化アセンブリプロセスを用いることで、対象の細胞型を破壊の標的とすることができる。特に調整され且つ相互に反応性のリガンドを担持する修飾オリゴヌクレオチドの対は、本明細書に記載の鋳型化アセンブリに準じ、所定の機能が備わるタンパク質をアセンブルできる。
【発明の概要】
【０００６】
本開示には、標的核酸分子に対し実質的に相補的なポリヌクレオチドを含むハプロマーと、ハプロマーの５’末端または３’末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドと、を含むハプロマー・リガンド複合体が提供されている。
【０００７】
本開示はまた、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体とを含む、組成物またはキットを提供するものであり、本組成物またはキットにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結されている一方、第２ハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
【０００８】
また、本開示には、ボトルハプロマーを含むボトルハプロマー・リガンド複合体も提供されている。本ボトルハプロマーはポリヌクレオチドを含み、本ポリヌクレオチドは、ａ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第１のステム部分と、ｂ）約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含み、且つその第１の端に第１のステム部分が連結され、標的核酸分子に対し実質的に相補的である抗標的ループ部分と、ｃ）標的ループ部分の第２の端部に連結された約１０〜約２０のヌクレオチド塩基を含み、第１のステム部分に対し実質的に相補的である第２のステム部分と、ｄ）第１のステム部分または第２のステム部分のいずれかの末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドと、を具備する。本ボトルハプロマー・リガンド複合体において、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmは、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい。
【０００９】
また、本開示には、本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体と、第２のハプマー・リガンド複合体と、を具備する組成物またはキットであって、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的である約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含むヌクレオチド部分と、第２のハプマー・リガンド複合体のヌクレオチド部分の５’末端または３’末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドとを含み、この第２のハプロマー・リガンド複合体において、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結された第１または第２のステム部分のＴmが、ボトルハプロマー・リガンド複合体の第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である、組成物またはキットが提供されている。
【００１０】
また、本開示には、次式：
【化１】
2019535281.tif 000002
（式中、ｍは３〜６）を有する化合物も提供されている。
【００１１】
また、本開示には、次式：
【化２】
2019535281.tif 000003
（式中、ｍは３〜６）を有する化合物も提供されている。
【００１２】
また、本開示には、次式：
【化３】
2019535281.tif 000004
（式中、ｎは１〜６）を有する化合物も提供されている。
【００１３】
また、本開示には、次式：
【化４】
2019535281.tif 000005
（式中、ｘは１〜６）を有する化合物も提供されている。
【００１４】
また、本開示には、次式：
【化５】
2019535281.tif 000006
（式中、ｘは１〜６）を有する化合物も提供されている。
【００１５】
また、本開示には、次式：
【化６】
2019535281.tif 000007
（本化合物は、本明細書中では一価ＦＫＢＰリガンド−２（ＭＦＬ２）とも称されている）を有する化合物も提供されている。
【００１６】
また、本開示には、リガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質であって、リガンド結合ドメインが小分子リガンド用のリガンド結合ドメインまたは相互作用性タンパク質ドメインである、融合タンパク質が提供されている。
【００１７】
また、本開示には、本明細書に記載の第１の融合タンパク質と本明細書に記載の第２の融合タンパク質とを具備する、組成物またはキットも提供されており、第１の融合タンパク質の目的タンパク質及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質は一体的に、二量体化可能または折り畳み可能である。
【００１８】
また、本開示には、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の第１の融合タンパク質と、本明細書に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインとが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能である、組成物またはキットが提供されている。
【００１９】
また、本開示には、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の第１の融合タンパク質と、本明細書に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインとが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能である、組成物またはキットが提供されている。
【００２０】
また、本開示には、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分と、本明細書に記載の第１の融合タンパク質と、本明細書に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１のボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能である、組成物またはキットが提供されている。
【００２１】
また、本開示には、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分と、本明細書に記載の第１の融合タンパク質と、本明細書に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１のボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能である、組成物またはキットが提供されている。
【００２２】
また、本開示には、標的核酸分子を本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、第１のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第２の融合タンパク質に接触させることとを含み、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２３】
また、本開示には、標的核酸分子を本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、第１のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第２の融合タンパク質に接触させることとを含み、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２４】
また、本開示には、標的核酸分子を、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と本明細書に記載の第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることと、標的核酸分子を、本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と本明細書に記載の第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２５】
また、本開示には、標的核酸分子を、本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と本明細書に記載の第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることと、標的核酸分子を、本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と本明細書に記載の第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２６】
また、本開示には、標的核酸分子を、本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２７】
また、本開示には、標的核酸分子を、本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２８】
また、本開示には、標的核酸分子を本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸分子を本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を、本明細書に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００２９】
また、本開示には、標的核酸分子を本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸分子を本明細書に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を、本明細書に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法が提供されている。
【００３０】
修飾オリゴヌクレオチド（ハプロマー）と会合したタンパク質フラグメントからの二量体化または折り畳みを介した機能的に活性なタンパク質の鋳型化アセンブリは、２段階プロセスに分割され得る。第１の段階は、ハプロマーをその相補的な対応物に結合することを含む。リガンド媒介の第２段階によって、タンパク質融合物と適切なリガンド結合ドメインとのホモ二量体化またはヘテロ二量体化が可能になる。診断または治療を目的として、標的病理細胞における特異的なタンパク質の活性化に、鋳型媒介二量体化または折り畳みを適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】近接増強反応性を介した代表的なリガンド指向性鋳型アセンブリ（ＬＤ−ＴＡＰＥＲ）の原理について概観を示す。
【図２】ＦＫ５０６、ＦＫＢＰ及びカルシニューリン間、ならびにラパマイシン、ｍＴＯＲ／ＦＲＢ及びカルシニューリン間の、代表的な三元複合体形成を示す。
【図３】ＬＤ−ＴＡＰＥＲの代表的なスコープ及び範囲を示す。
【図４】ＦＫ５０６またはラパマイシンから誘導された化合物により媒介され、ＦＫＢＰまたはＦＲＢドメインとの融合物として発現した、目的タンパク質の代表的な「強制的二量体化」を示す。
【図５】代表的なＬＤ−ＴＡＰＥＲ：小分子媒介物質を介したタンパク質二量体化を示す。
【図６】代表的な修飾一価バージョンの、変異型ＦＫＢＰ結合化合物ＦＫＭ−ＮＨＳを示す。
【図７】代表的な修飾一価バージョンの、変異型ＦＫＢＰ結合化合物ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳを示す。
【図８】代表的な修飾一価バージョンの、変異型ＦＫＢＰ結合化合物ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳを示す。
【図９】ＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した代表的な小分子媒介タンパク質二量体化を示す。
【図１０】別の代表的な、ＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した小分子媒介タンパク質二量体化を示す。
【図１１】別の代表的な、ＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した小分子媒介タンパク質二量体化を示す。
【図１２】別の代表的な、ＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した小分子媒介タンパク質二量体化を示す。
【図１３】小分子リガンドを用いＬＤ−ＴＡＰＥＲを介して小分子媒介タンパク質を二量体化するための、ロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの代表的な構造を示す。
【図１４】代表的なＬＤ−ＴＡＰＥＲ：小型の相互作用性タンパク質ドメインを介したタンパク質二量体化を示す。
【図１５】平行ロイシンジッパーの極性に関する代表的な考慮事項を示す。
【図１６】代表的なＬＤ−ＴＡＰＥＲ：小分子リガンド／リガンド結合ドメイン相互作用を介した分割タンパク質折り畳みを示す。
【図１７】代表的なＬＤ−ＴＡＰＥＲ：小型タンパク質ドメイン相互作用を介した分割タンパク質折り畳み、及び極性効果を示す。
【図１８】ＬＤ−ＴＡＰＥＲのための代表的なヘテロ成分系を示す。
【図１９】ＬＤ−ＴＡＰＥＲ（ロイシンジッパーを用いた特定の実施形態）用の代表的なヘテロ成分系を示す。
【図２０】鋳型化ｉｎ  ｓｉｔｕ結合用ハプロマー・リガンド上にクリック基を付加することによる、代表的なＬＤ−ＴＡＰＥＲリガンドの安定化を示す。
【図２１】変異型ＦＫＢＰ及びオリゴヌクレオチド誘導体化用の、メチルテトラジン（ＭＴＺ）側鎖を有する代表的なクリック修飾一価リガンドを示す。
【図２２】変異型ＦＫＢＰ及びオリゴヌクレオチド誘導体化用の、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）側鎖を有する代表的なクリック修飾一価リガンドを示す。
【図２３】マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質としてのｃ−Ｊｕｎフラグメントの代表的な試験発現、及び融合物をエンテロキナーゼで切断した後に生成される遊離型ｃ−Ｊｕｎ産物のデモンストレーションを示す。
【図２４】逆平行ジッパー配位を用いＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した分割タンパク質折り畳み用の代表的なロックドＴＡＰＥＲ  ｃ−Ｊｕｎオリゴヌクレオチドを示す。
【図２５】ｃ−Ｊｕｎ：ｃ−Ｆｏｓ相互作用を伴うＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した代表的なロックドＴＡＰＥＲ分割タンパク質折り畳みを示す。
【図２６】ＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した分割タンパク質折り畳み用の代表的なロックドＴＡＰＥＲ化合物ＦＫＭ−オリゴヌクレオチドを示す。
【図２７】ＦＫＭ−ＦＫＢＰ結合を伴うＬＤ−ＴＡＰＥＲを介した代表的なロックドＴＡＰＥＲ分割タンパク質折り畳みを示す。
【図２８】Ｃ２２Ｓ及びＣ６１Ｓの各変異の有無に関係なく、１６％トリシンゲル上で試験されたＧａｕｓｓｉａ分割タンパク質ＦＫＢＰ及びＦＲＢ融合タンパク質の発現を示す。ＩＰＴＧを介して誘導された後の発現試料が、図示されている。図中、「直接溶解物」とはゲルローディング前に標準的なＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ緩衝液中に採取され溶解された全細胞試料を指す。「ＩＭＡＣ精製タンパク質」とは、ヘキサヒスチジン親和性磁性ビーズからイミダゾールで溶出した試料を指す。レーン１及びレーン７はＮ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）であり、レーン２及びレーン８はＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメントであり、レーン３及びレーン９はＦＲＢ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメントであり、レーン４及びレーン１０はＮ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント−ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ／Ｃ２２Ｓ）であり、レーン５及びレーン１１はＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ／Ｃ２２Ｓ）−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメントであり、レーン６及びレーン１２はＦＲＢ（Ｃ６１Ｓ）−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメントである。
【図２９−１】（パネル１、２、３及び４）は、追加のＣ２２Ｓ変異またはＦＲＢドメインの有無には関係なく、または追加のＣ６１Ｓ変異の有無には関係なく、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖドメインと融合された分割タンパク質Ｇａｕｓｓｉａフラグメントの二量体化応答を示す。データは、試験開始から４時間後における、二量体化剤の有無に応じたタンパク質の発光応答を示す。図２９−１はＧａｕｓｓｉａ  Ｎ末端−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ融合物（Ａ）、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物（Ｂ）、化合物（Ａ）＋（Ｂ）及び（Ａ）＋（Ｂ）ならびに０．１５μＭのＡＰ２０１８７（ＡＰ）であり、図２９−２はＧａｕｓｓｉａ  Ｎ末端−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ融合物（Ｃ）、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物（Ｄ）、化合物（Ｃ）＋（Ｄ）及び（Ｃ）＋（Ｄ）ならびに０．１５μＭのＡＰ２０１８７（ＡＰ）であり、図２９−３はＧａｕｓｓｉａ  Ｎ末端−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ融合物（Ａ）、ＦＲＢ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物（Ｖ）、（Ａ）＋（Ｖ）及び（Ａ）＋（Ｖ）ならびに０．１５μＭラパマイシン（ＲＡＰ）であり、図２９−４はＧａｕｓｓｉａ  Ｎ末端−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ融合物（ＣＯ，ＦＲＢ−Ｃ６１Ｓ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物（Ｗ）、（Ｃ）＋（Ｗ）及び（Ｃ）＋（Ｗ）ならびに０．１５μＭラパマイシン（ＲＡＰ）である。
【図２９−２】図２９−１の続き。
【図３０】５’または３’チオール修飾オリゴヌクレオチドと一価ＦＫＢＰ−Ｆ３６ＶリガンドＭＦＬ２との間の反応によるＣ共役体形成を示す。修飾オリゴヌクレオチド上の各チオール基は、最も近接した塩基から６Ｃスペーサーで分離されている。３３ｐｍｏｌの非修飾チオオリゴヌクレオチドまたは対応するＭＦＬ２共役体を１５％変性８Ｍ尿素ゲルで試験し、ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色した。
【図３１】アーキテクチャ１において、ＭＦＬ２−オリゴヌクレオチド結合体を介して媒介されるＦＫＢＰ−Ｆ３６ＶまたはＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２ＳとのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ分割タンパク質融合物を用いたＬＤ−ＴＡＰＥＲのデモンストレーションを示す。発光の読みはＹ軸に示されている。時間依存的な陽性シグナルを与える相互に相補的なＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーの調製物は、凡例において矩形で囲繞されている。
【図３２】アーキテクチャ２によるＬＤ−ＴＡＰＥＲのデモンストレーションに使用されるプロセスを示す。
【図３３】（パネル１及び２）は、固相捕捉を介してアーキテクチャ２におけるＭＦＬ２−オリゴヌクレオチド共役体を介して媒介される、ＦＫＢＰ−Ｆ３６ＶまたはＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２ＳとのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ分割タンパク質融合物によるＬＤ−ＴＡＰＥＲのデモンストレーションを示す。パネル１は、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ  Ｇａｕｓｓｉａ融合物である。図中、（Ａ）はＮ末端Ｇａｕｓｓｉａフラグメント−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ融合物であり、（Ｂ）はＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物である。４０７ＭＦＬ２及び４０９ＭＦＬ２はそれぞれ化合物ＭＦＬ２に共役されたオリゴヌクレオチド４０７及び４０９である。４０７ｕ及び４０９ｕは対応する非共役チオ１−オリゴヌクレオチドである。パネル２は、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ  Ｇａｕｓｓｉａ融合物である。図中、（Ａ）はＮ末端Ｇａｕｓｓｉａフラグメント−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ融合物、（Ｂ）はＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物であり、パネル１では４０７ＭＦＬ２、４０９ＭＦＬ２、４０７ｕ及び４０９ｕである。デスチオビオチン化された鋳型とハイブリダイゼーションした後に（図３２を参照）、鋳型及び鋳型結合ハプロマーをストレプトアビジン磁気ビーズ上で単離し、遊離型Ｄ−ビオチンで溶出し、３０分間インキュベーションした後、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性を評価した（Ｙ軸上の発光単位）。
【図３４】溶液相中の鋳型または対照を用い、アーキテクチャ２のＭＦＬ２−オリゴヌクレオチド共役体を介したＦＡＫＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２ＳとのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ分割タンパク質融合物を用いたＬＤ−ＴＡＰＥＲのデモンストレーションを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本明細書に開示されている組成物及び方法の構造、機能、製造、ならびに使用の原理を全般的に理解できるよう、或る特定の例示的な実施形態について説明する。これらの実施形態の１つ以上の実施例は、添付の図面に例証されている。当業者であれば、本明細書中に具体的に説明され添付の図面に例証されている組成物及び方法が非限定的な例示的実施形態であり、本開示の範囲がもっぱら特許請求の範囲によって定義されることを、理解するであろう。或る例示的実施形態に関連して例証または説明されている特徴を、他の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。そのような修正形態及び変形形態は、本開示の範囲内に包含されることを意図したものである。
【００３３】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が本明細書中に用いられている場合、その内容が特に明記されていない限り、複数の指示物が包含される。本開示中に用いられている用語は、当業者に一般に認められている標準的な定義に準拠している。いくつかの用語については、更に詳しい説明が必要とされる場合、以下に更に解説してある。
【００３４】
「抗標的ループ部分」という語句が本明細書中に用いられている場合、標的核酸分子に対する配列特異的な結合を促進するハプロマーの一部分を指す。
【００３５】
本明細書において、「塩基」という用語は、ワトソン−クリックまたはフーグスティン結合相互作用を介して別の対応する塩基と結合対を形成する、プリンもしくはピリミジン基、または人工類似体を含む分子を指す。塩基は、オリゴマーなどのポリマー中で複数の塩基を一体的に共有結合させるのを促進する基を、更に含有する。例としては、限定されないが、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチド核酸残基、またはモルホリノ残基が挙げられる。
【００３６】
本明細書において、「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」、「結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ）」及び「結合された（ｂｏｕｎｄ）」という用語は、互いに近接した２つの分子間の安定した相互作用を指す。この用語には、（直接結合または中間構造を介した）化学結合などの物理的相互作用のほか、非物理的相互作用、ならびに静電引力、水素結合、及びファンデルワールス／分散力などの引力が包含される。
【００３７】
本明細書において、「生体共役化学」という語句は、穏やかな条件下で共通の官能基を一体的にライゲートし、多残基化合物のモジュール構造を促進する化学合成ストラテジー及び試薬を指す。
【００３８】
本明細書において、「化学連結基」という語句は、或るハプロマーを別のハプロマーに結合する分子、または或る残基を異なる化合物上の別の残基に結合する分子を指す。連結基は、分枝状または非分枝状の共有結合分子鎖から構成され得る。
【００３９】
本明細書において、「投薬量単位形態」という語句は、治療の対象となる被験者用の単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す。
【００４０】
本明細書において、「ハプロマー」という用語は、配列特異的に標的核酸分子鋳型に結合し、核酸鋳型化アセンブリ中にタンパク質形成に関与する、リガンドに連結された核酸分子を指す。また、本明細書には、化学修飾に供されていて、同じ生物学的活性もしくは生物学的活性欠如、及び／またはハプロマーとして作用する能力を維持しているか、あるいはハプロマーと一貫性のある様式にて機能する「誘導体」または「類似体」、例えば、それらの塩、水和物、溶媒和物もしくは他の分子も含まれる。
【００４１】
本明細書において、「非無痕跡型の生体直交型化学」という語句は、選択的反応性残基の構造の一部または全部が産物構造中に保持されている選択的反応性残基を含む反応を指す。
【００４２】
本明細書において、「核酸鋳型化アセンブリ」という語句は、ハプロマーを介してタンパク質の形成を促進できるように、標的核酸分子上のタンパク質を二量体化するかまたは折り畳むことによって、タンパク質が標的核酸分子に結合されたときに近接してアセンブルすることを指す。
【００４３】
本明細書中に用いられている「オリゴマー」及び「オリゴ」という用語は、複数の単位から構成される分子において、その単位の一部または全部が、ワトソン−クリックもしくはフーグスティン塩基対相互作用を形成する機能を有する塩基であり、それにより二本鎖または多重構造における核酸分子への配列特異的結合を可能にしている、分子を指す。例としては、限定されないが、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸オリゴマー及びモルホリノオリゴマーが挙げられる。
【００４４】
本明細書において、「病原性細胞」という語句は、ウイルスに感染した細胞、腫瘍細胞及び微生物に感染した細胞などの罹患状態もしくは異常状態を引き起こし得るまたは促進し得る細胞を指す場合もあれば、あるいはアレルギー、アナフィラキシー、炎症及び自己免疫を含むがこれらに限定されない疾患を誘発または媒介する分子を産生する細胞を指す場合もある。
【００４５】
本明細書において、「医薬的に許容される」という語句は、非生物学的に許容されない物質もしくはそれ以外の様式で許容されない物質において、許容されない生物学的影響を引き起こすことなくまたは許容されない様式で組成物の他の成分と相互作用することなしに、組成物中に組み込むことも患者に投与することも可能な、物質を指す。
【００４６】
本明細書において、「医薬的に許容される塩」という語句は、哺乳動物などの患者に投与する目的に許容される塩基または酸から調製される塩（例えば、所与の投薬レジームで、許容される哺乳動物に対し安全性が確保される塩）を意味する。
【００４７】
本明細書において、「塩」という用語には、医薬的に許容される無機酸及び塩基から誘導される塩が包含される場合もあれば、医薬的に許容される有機酸及び塩基、ならびにそれらの誘導体及び変種から誘導される塩が包含される場合もある。
【００４８】
本明細書において、「試料」という用語は、ハプロマーの投与先となり得る系であって、
核酸鋳型化アセンブリが起こり得る、任意の系を指す。試料の例としては、限定されないが、固定もしくは保存された細胞、生物全体、組織、腫瘍、溶解物、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系が挙げられる。
【００４９】
本明細書において、「対応する反応物のセット」または「対応するハプロマー」という語句は、単一の標的核酸分子上で一緒になって鋳型化アセンブリ反応に関与するハプロマーを指す。
【００５０】
本明細書において、「超抗原」という用語は、特定の可変（Ｖ）領域を発現するＴ細胞の広範なサブセットに結合する抗原を指す。
【００５１】
本明細書において、「標的区画」という語句は、細胞、ウイルス、組織、腫瘍、溶解物、他の生物学的構造、空間領域もしくは試料であって、標的核酸分子（複数可）を含むもの、または非標的区画とは異なる量の標的核酸分子を含むものを指す。
【００５２】
本明細書において、「標的核酸配列」及び「標的核酸分子」という語句は、同義に用いられており、核酸鋳型化アセンブリ用の鋳型として機能することが意図される、一連の単位または核酸を指す。
【００５３】
本明細書において、「鋳型化アセンブリ産物」という語句は、ハプロマーに関連する特定のタンパク質の２つのフラグメントを二量体化するかまたは折り畳むことによって形成されるタンパク質を指す。
【００５４】
本明細書において、「無痕跡型の生体直交型化学」という語句は、アミドのような天然起源の結合が、こうして生成されたリガンド構造から生体直交型残基の一部または全部を除去することによって形成されるハプロマー・リガンドを含む反応を指す。
【００５５】
指定された目的の細胞に特異的な核酸分子は（それらが病理学的腫瘍細胞、異常な免疫細胞、または他の任意の細胞型によって表されるかどうかには無関係に）、分子間相互作用の近接誘導性増強を利用して新規構造（例えばエフェクター構造）を生成するための鋳型として、使用可能である（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１４／１９７５４７号を参照）。そのような鋳型化産物は、様々な方法で細胞死を誘発するように、または細胞活性を調節するように設計することが可能である。細胞型特異的核酸は、特異的転写ｍＲＮＡから、または核酸アプタマーを介して供給することが可能であり、非核酸標的を定義済の鋳型配列を提供する目的に合うように適応させるのに役立ち得る。
【００５６】
上記の診断または治療を目的とする鋳型化アセンブリの元のプロセスにおいて、反応性基は、所定の配列のオリゴヌクレオチドとの結合によって空間的に近接し、標的核酸分子鋳型上で反応性基どうしがそれら自体で近接して共ハイブリダイズする。相互に反応性である基を保持する鋳型指向性の修飾オリゴヌクレオチドは、「ハプロマー」と称される。そのような反応性基どうしを強制的に近接させ、産物形成を多大に増強することで、細胞型特異的な転写産物により、対象の細胞内で所望される分子を産生させ得る。本明細書に記載されているように、特異的リガンドを、直接的に相互作用性官能基に付加する代わりに各ハプロマーオリゴヌクレオチドに付加することによって、ＴＡＰＥＲの一般原理を２段階プロセスに改変することが可能である。ゆえに、（本明細書中で「従来型ＴＡＰＥＲ」と称される）ＴＡＰＥＲの元の構成において、鋳型を機能的に特異的な触媒と見なしても差し支えない場合、本プロセスを単一反応シーケンス内で起こるものとして表すことができる。
【数１】
2019535281.tif 000008
（式１）
式中、Ｈ１及びＨ２はそれぞれ、反応基Ａ及び反応基Ｂを有するハプロマーを表す。特異的な鋳型へのハイブリダイゼーションの際、ＡとＢとの間の近接駆動反応中間体［Ａ：Ｂ］が形成され、急速に産物［Ｐ］が形成される。
【００５７】
リガンド指向性ＴＡＰＥＲ代替物（すなわち、ＬＤ−ＴＡＰＥＲ）において、所望のプロセスは、２つの別個のレベルで起こる。
【数２】
2019535281.tif 000009
（式２．１及び式２．２）
式中、Ｈ１及びＨ２はハプロマーを表し、ＬＩは任意の形態のリガンドを表し、Ｄはタンパク質結合ドメイン、または特定の方法でリガンドに結合し得る任意の他の分子を表す。ここで、（ハプロマー鋳型結合を介して空間的に近接して示されている）２つのリガンド分子に対する２つのＤ分子の初期結合は、熱力学的に可逆的または不可逆的であり得るＤ−Ｄ二量体が形成される前の遷移状態として示されている。ＬＤ−ＴＡＰＥＲの第２段階では、リガンドＬ１−Ｌ１の空間的近接を強制する目的で、鋳型が依然として必要とされる。このことは、２つの修飾ＬＩ分子どうしの間、または修飾ＬＩ分子と修飾Ｌ２分子との間で近接増強共有結合相互作用が起こり、それらの分子が共有結合的に連結され、結果的に、対として安定化されるように設計されている場合を除き、ＬＤ−ＴＡＰＥＲのあらゆる変形実施形態に当てはまる。それらの分子と同族結合ドメインとの相互作用が（本実施形態に必要な前提条件として）リガンド−リガンド共有結合に影響されない限り、ＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセスの後続段階２は、当然ながら鋳型非依存になる。２段階からなるＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセスの般化可能な性質は、図１に概略的に描かれている。図１を参照すると、特異的リガンド（Ｌ１及びＬ２）を付加されたハプロマーが、標的核酸分子鋳型に結合し、結果として、それらのリガンドどうしが互いに空間的に近接している。リガンドと対応するリガンド結合ドメインとの間の相互作用によって、目的のリガンド（Ｒ１及びＲ２）に対する結合ドメインに融合されたタンパク質またはポリペプチド（Ｐ１及びＰ２）が、鋳型化ハプロマー部位へと指向される。Ｐ１及びＰ２セグメントが、強制的に空間的に近接したことで、二量体化またはタンパク質折り畳みが促進された。
【００５８】
（図１に描かれているように）ＬＤ−ＴＡＰＥＲは２段階プロセスであるが、ハプロマー／鋳型ハイブリダイゼーションが第１ステップを含むことは概ね本質的ではない。いくつかの実施形態では、ハプロマー融合タンパク質複合体を形成するに際して、最初に、（付加リガンドを有する）各ハプロマーを、その指定された同族リガンド結合ドメインと共に予備形成することが望ましい場合もある。引き続いて、ハイブリダイゼーションステップを実施すると、結果として、リガンド結合ドメイン自体と融合されたタンパク質フラグメントどうしの間で、所望される分子近接性が実現される。これは、上記の用語を用いて、次式のように表せる。
【数３】
2019535281.tif 000010
（式３．１及び式３．２）
式中、置換基は上記の通りである。
【００５９】
Ｈ１及びＨ２に異なるリガンド（Ｌ１及びＬ２）を付加するかまたはリガンドを２つの別々の結合ドメイン（Ｄ１及びＤ２）を介して結合できる、ＬＤ−ＴＡＰＥＲの様々な態様が可能である。Ｄ１及びＤ２が分割タンパク質ポリペプチドである場合、第２レベルの事象はＤ１とＤ２との間の成熟タンパク質折り畳みから構成され得る。
【００６０】
進化によって、天然小分子リガンドに関する重要且つ極めて有用な例が提供されてきたが、これは、生物工学上の目的に悪用される可能性がある。この点に関して、実験的免疫学及び応用免疫学の両方に対し多大な影響を与えてきたいくつかの天然小分子が注目に値し得る。天然産物免疫抑制剤シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６（それぞれ、真菌及び細菌起源由来）は、Ｔ細胞活性化を遮断することによって、臓器移植に革命をもたらしてきた。これらの化合物は、異なる細胞タンパク質、シクロフィリン及びＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）のそれぞれと結合しながら、複数のシグナル伝達経路のカルシウム応答調節因子であるタンパク質ホスファターゼカルシニューリンの形態で、共通の標的を共有する。一方、シクロフィリン−シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６−ＦＫＢＰ複合体は、カルシニューリンと三元複合体を形成し、ＮＦ  ＡＴファミリーの転写因子を介してＴ細胞活性化における役割を阻害する。別の天然免疫調節分子であるラパマイシンは、ＦＫ５０６分子と同じＦＫＢＰに結合しながら、別個のシグナル経路における役割を有する無関連のタンパク質ＦＲＡＰ／ｍＴＯＲと三元複合体を形成する。
ａ）ＦＫ５０６、カルシニューリン及びＦＫＢＰと、ｂ）ラパマイシン、ＦＫＢＰ及びｍＴＯＲ−ＦＲＢとの間の相互作用は、図２に描かれている。
【００６１】
ＦＫ５０６／ＦＫＢＰの相互作用は、小型サイズのＦＫＢＰ結合ドメイン（約１００アミノ酸残基）によって更に促進され、多くの分野において利用されてきた。この相互作用の潜在的な治療上の有用性を増強し、内因性ＦＫＢＰタンパク質への結合を最小限に抑えることを目的に、ＦＫＢＰの変異型誘導体が誘導されてきた。この変異型誘導体は改変ＦＫ５０６類似体に対し優先的に結合する。ゆえに、Ｆ３６Ｖ  ＦＫＢＰ変異型は、特異的なＦＫ５０６誘導体に対し野生型分子自体よりもはるかに強く結合する。
【００６２】
小分子リガンドは、ＬＤ−ＴＡＰＥＲに用いられるリガンドの一種であるが、使用可能な唯一のタイプのリガンドであるというわけではない。これに関連して適用可能な、比較的小型の、互いに相互作用するタンパク質ドメイン（例えばタンパク質のフラグメント）が存在する。その一例が、ロイシンジッパーである。相互作用性タンパク質ドメインの好適な例が、ｃ−ｊｕｎ及びｃ−ｆｏｓジッパードメインである。これらジッパードメインは一般に、ヘリックス開始セグメント及びヘリックス終了セグメントを含めて５０アミノ酸残基未満のポリペプチドである。ｃ−ｊｕｎはホモ二量体の形成が可能であるのに対し、ｃ−ｆｏｓはホモ二量体の形成が不可能である。ｃ−ｆｏｓ：ｃ−ｊｕｎヘテロ二量体は、ｃ−ｊｕｎ：ｃ−ｊｕｎホモ二量体と比べて有意に安定している。ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーを作製する目的で、そのようなジッパー配列をオリゴヌクレオチドに付加することによって、リガンド結合ドメインとしての相補的ジッパーを有する所望のポリペプチドの融合タンパク質に結合するため、リガンドとして作用するジッパーを各ハプロマーに対し提供する。
【００６３】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲに用いられるリガンドが、小型の化学エンティティであるか、相互作用性タンパク質ドメインであるか、それとも相補的結合要素が存在する他の構造であるかに関係なく、２段階のＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセスを、同じパートナータンパク質フラグメント（ホモ二量体化）または異なるパートナータンパク質フラグメント（ヘテロ二量体化）のいずれかの強制的二量体化に適用できる。ＬＤ−ＴＡＰＥＲのこれらの複数の態様は、図３に要約されている。
【００６４】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセス及びその成分は、下記の汎用表現によって概説することができる。非限定的な例において、小分子リガンドを使用するＬＤ−ＴＡＰＥＲの実施形態は、ＦＫ５０６用のＦＫＢＰ結合ドメインを利用し得る。ＦＫ５０６の二価類似体は、ＦＫＢＰ結合ドメイン、またはそれらの変異型誘導体の二量体化を促進し得ることが、公知である。次いで、そのようなＦＫＢＰドメインが他のタンパク質と融合されている場合、他のタンパク質自体が強制的二量体化事象を経て（図４を参照）、場合によっては目的タンパク質を強力な生物学的活性に向けて活性化し得る。
【００６５】
小分子ＬＤ−ＴＡＰＥＲの目的に対応するように、一価ドメイン結合化合物が使用される。この一価ドメイン結合化合物は、短いオリゴヌクレオチド鎖の５’末端または３’末端に化学的に付加されて、結果として得られるハプロマーの一部を構成する。そのようなハプロマーが相補的な標的核酸分子鋳型にハイブリダイズすると、付加された一価化合物どうしが空間的に近接する（図５を参照）。一価化合物（すなわち、リガンド）を認識し結合するタンパク質リガンド結合ドメインも同様に、結合ドメイン自体に融合された他の任意のタンパク質ドメインと同じく、空間的位置において互いに近接し合う（図５を参照）。目的タンパク質の融合ドメインのそのような二量体化の強化は、機能的な活性化につながり、測定可能な生物学的影響を伴う。
【００６６】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲが小分子リガンドを介して媒介される場合、リガンドの同一性は、他の低分子量規定化合物、天然もしくは人工ペプチド、ペプチド模倣物、または規定の結合パートナーを有する他の分子に対応し得る。小分子ＬＤ−ＴＡＰＥＲは、ハプロマーアーキテクチャといういくつかの別個の鋳型を用いて設計することができる。最も単純なアレンジメントを含むいくつかの実施形態において、ハプロマーどうしは互いに相補的であり、結果として得られる二本鎖によって、リガンド相互作用性タンパク質融合物に対し所望の空間的近接が強制される。この構成は、本明細書ではアーキテクチャ１と呼ばれる（図９を参照）。ハプロマーが互いに相補的ではない場合に、標的核酸分子鋳型上の空間的に隣接した部位にハイブリダイズすると、アーキテクチャ２が達成される（図５及び図１０を参照）。好適な配位が存在する場合、非隣接ハイブリダイゼーション部位は依然としてＬＤ−ＴＡＰＥＲ標的であり得る。ゆえに、ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーがステムループ構造の外側境界にハイブリダイズすると、空間的近接が達成され、アーキテクチャ３が生成される（図１１を参照）。逆に、ハプロマーが互いに対して適切な部位とアニールした場合、ステムループの内側領域が潜在的に標的化される可能性があり、それゆえ、アーキテクチャ４が生成される（図１２を参照）。
【００６７】
いくつかの実施形態において、「ロックドＴＡＰＥＲ」と呼ばれるＴＡＰＥＲの変形形態は、ＬＤ−ＴＡＰＥＲに容易に適用可能である。ロックドＬＤ−ＴＡＰＥＲの場合、第１のボトルハプロマー及び第２のハプロマーは、上記の実施形態における他のＬＤ−ＴＡＰＥＲアーキテクチャと類似の方法で、所定のリガンドと共役している。ロックドＴＡＰＥＲプロセスの性質上、第１のボトルハプロマーの抗標的ループ部分に対しハイブリダイゼーションが生じた状況において、特異的な標的の存在下にある場合を除き、第２のハプロマー・ポリペプチド共役体のハイブリダイゼーション部位はアクセス不可となる。引き続いて、第２のハプロマー・ポリペプチド共役体のハイブリダイゼーション部位をアクセス可能にし、次いで、近接促進リガンド媒介二量体化を行う（図１３を参照）。
【００６８】
ロックドＴＡＰＥＲ系内で、ポリペプチド共役体を担持する２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション媒介により空間的に近接しているときは（図１３を参照）、標的核酸分子鋳型に相補的なアーキテクチャ２〜４とは異なって、２つの誘導体化オリゴヌクレオチドが互いに相補的となることから、アセンブリ片の構造がアーキテクチャ１に対応する（図９を参照）。にもかかわらず、ロックドＴＡＰＥＲの第１のボトルハプロマーの抗標的ループ部分を、標的核酸分子鋳型にハイブリダイズして第２のハプロマーの認識部位を露出させる必要があることから、標的核酸分子自体に対する抗標的ループ部分の結合は、異なるアーキテクチャを介して起こり得る。ゆえに、図９のロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイゼーションはアーキテクチャ２に対応するが（図５を参照）、アーキテクチャ３及び４による標的ハイブリダイゼーション（それぞれ図６及び図７を参照）も同様に可能である。したがって、ロックドＴＡＰＥＲは、ＴＡＰＥＲアセンブリが常にアーキテクチャ１に対し一定であるという独特の特徴を有するが、標的ハイブリダイゼーションは可変アーキテクチャを想定し得る。言い換えれば、標的ハイブリダイゼーション及びアセンブリ指向性ハイブリダイゼーションは、従来型ＴＡＰＥＲでは合致するものであるのに対し、ロックドＴＡＰＥＲでは区別され且つ分離される場合がある。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＬＤ−ＴＡＰＥＲに対するリガンドは、従来的意味では小分子というより寧ろ小型の相互作用性タンパク質ドメインである。それらの例としては、限定されないが、相互作用性ロイシンジッパーモチーフを挙げることができ、これらのロイシンジッパーモチーフは、それ自体がｃ−ｊｕｎ：ｃ−ｆｏｓ；ｍａｄ：ｍａｘ；及びｃ−ｍｙｃ：ｍａｘなどの平行ジッパー、またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｅｒｙ−ｔＲＮＡシンテターゼからのものなどの逆平行ジッパーから構成され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、小型の相互作用性タンパク質ドメインは、リガンドとして使用され、十分に特徴付けられたｃ−ｊｕｎ：ｃ−ｆｏｓジッパー対は、図１４に描かれているように使用される。目的の標的核酸分子鋳型に対し相補的なオリゴヌクレオチドセグメントから構成されるハプロマーは、ｃ−ｊｕｎドメインと共役させ、次いで鋳型とハイブリダイズさせてもよい。引き続いて、ｃ−ｆｏｓドメインと融合された目的タンパク質フラグメントを加え、目的タンパク質フラグメントを複合体形成し、強制的に二量体化させる。上記の式２．１及び式２．２で般化された２段階ストラテジーに対応する図１４の描写では、初期二本鎖は、ｃ−ｊｕｎホモ二量体の形成によって更に安定化させることが可能である。但し、ｃ−ｊｕｎ：ｃ−ｆｏｓヘテロ二量体は有意に安性が高いため、ｆｏｓ融合タンパク質の導入によって、所望のヘテロ二量体複合体が優先的に形成される結果になる（ｃ−ｆｏｓ自体はホモ二量体を形成できない）。この実施形態の代替バージョンでは、ｃ−ｊｕｎ共役タグを有するハプロマーを、目的のｆｏｓ融合タンパク質と予備アセンブリした後、目的の鋳型を含む標的の系に追加する。この代替のアレンジメントは、上記の式３．１及び式３．２で般化された２段階ストラテジーに対応する。
【００７１】
小型の相互作用性タンパク質ドメインをリガンドとして使用する実施形態では、小型ドメインタグの共役の極性を考慮に入れる必要がある。これは、ロイシンジッパーの互作用が平行な配向で起こる、ｆｏｓ−ｊｕｎヘテロ二量体化を使用する特定の実施形態で例示できる。
ハプロマーによってｃ−Ｊｕｎタグが付加されたため、ハイブリダイゼーション後にｃ−Ｊｕｎヘリックスが平行な配向になった場合（図１５を参照）、後続のｃ−ｆｏｓ融合タンパク質との複合体が形成される際には、融合物が幾分平行に指し向けられる。その逆の状況では、目的タンパク質セグメント間の二量体化が不利になる場合もある（図１５を参照）。但し、ＬＤ−ＴＡＰＥＲの他の或る用途については（なかでも注目すべきことに、下記のような、分割タンパク質フラグメントのアセンブリについては）、逆平行の配向が有益となる可能性もある。この理由から、５’または３’オリゴヌクレオチド末端を、それらのＮ末端またはＣ末端のいずれかによって小型タンパク質タグと共役させるためのストラテジーが存在するならば有利である。
【００７２】
小型の相互作用性タンパク質ドメインをリガンドとして使用する実施形態において、ｃ−ｊｕｎ及びｃ−ｆｏｓは有意な利点を有する。両方の事例において、それらのαヘリックスジッパーは、比較的短いポリペプチドによって完全に画定され、どちらも内部システイン残基を有さない。これらの配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ内の発現系を介して容易に産生することが可能であり、十分に短いため、完全な合成が実現可能となっている。これは、チオール媒介のオリゴヌクレオチドとの共役を容易なアプローチに変えることから、ｃ−Ｊｕｎセグメントにとって有用である。ｃ−ｊｕｎタグに関しては、Ｎ末端共役体を作製するために本明細書中で使用される配列は４７量体である。
この配列には、Ｎ末端システインが示されている。ボールド体の配列は螺旋状の境界を表す。
【化７】
2019535281.tif 000011
ｃ−ｊｕｎタグに関しては、Ｃ末端共役体を作製するために本明細書中で使用される配列は４９量体である。
この配列には、Ｃ末端システインが示されている。ボールド体の配列は螺旋状の境界を表す。
【化８】
2019535281.tif 000012
目的タンパク質フラグメントとの融合物として作製されるｆｏｓジッパーの配列は、４１量体であり、ここでボールド体の配列は螺旋状の境界を示す。
【化９】
2019535281.tif 000013
ｃ−Ｆｏｓ配列と目的タンパク質フラグメントとの間には、追加の伸長セリン−グリシン連結基を挿入することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体を形成できないが依然としてｃ−Ｆｏｓとヘテロ二量体化できる、ｃ−Ｊｕｎの変異型が使用される。そのようなＮ末端システイン残基を有する修飾配列としては、限定されないが、
【化１０】
2019535281.tif 000014
が挙げられる。
配列中、ボールド体の残基は野生型からの変化を表し、二重下線付きの配列は螺旋状の境界を表す。そのようなＣ末端システイン残基を有する修飾配列としては、限定されないが、
【化１１】
2019535281.tif 000015
が挙げられる。
配列中、ボールド体の残基は野生型からの変化を表し、二重下線付きの配列は螺旋状の境界を表す。
【００７４】
いくつかの実施形態において、小分子リガンドまたは小相互作用性ドメインリガンドのいずれかを使用したＬＤ−ＴＡＰＥＲのいくつかの実施形態において、この用途は分割タンパク質フラグメントのアセンブリを目的としたものであり得る。他のＬＤ−ＴＡＰＥＲの実施形態において、リガンド結合ドメインと融合されたタンパク質フラグメントは自己秩序で安定な構造に自己折り畳みされるが、但し、このことは、分割タンパク質アセンブリに適用されたＬＤ−ＴＡＰＥＲには当てはまらない。後者のＬＤ−ＴＡＰＥＲにおいて、リガンド結合ドメインに付加されたタンパク質配列の、成熟した折り畳みが達成されるのは、適正な配向で空間的に近接して配置されている場合だけに限られる。
【００７５】
小分子リガンドを利用する分割タンパク質再折り畳み用のＬＤ−ＴＡＰＥＲのいくつかの実施形態において、分割タンパク質ポリペプチドは、ＦＫＢＰ  ＦＫ５０６結合ドメインとの融合物として別々に発現する。
Ｎ末端分割タンパク質フラグメントはＣ末端ＦＫＢＰセグメントと共に発現する一方、Ｃ末端分割タンパク質フラグメントはＮ末端ＦＫＢＰセグメントと共に発現する（図１６を参照）。ＦＫＢＰドメインが一価ＦＫＢＰ結合剤を担持する鋳型化ハプロマー共役体に結合すると（図６〜図８を参照）、成熟ポリペプチドの近接有効の折り畳みが誘発される（鋳型アーキテクチャ２に関して描いた図１６）。各ハプロマー・リガンドに結合するＦＫＢＰドメインどうしは、同じ（平行）配向にあるので、分割タンパク質フラグメントは空間的に近位にあるＦＫＢＰ対の反対側に配置される（図１６を参照）。但し、ＦＫＢＰドメインと分割タンパク質ポリペプチドとを分離しているセリン−グリシン連結基が、十分に長い場合には、分割タンパク質の再折り畳みが依然として起こる可能性がある。
【００７６】
同様の原理は、小型の相互作用性タンパク質ドメインをリガンドとして利用する分割タンパク質再折り畳み用のＬＤ−ＴＡＰＥＲの実施形態にも適用されている。ｃ−Ｊｕｎ：ｃ−Ｆｏｓ相互作用を用いたいくつかの実施形態において、Ｎ末端分割タンパク質フラグメントは、ｃ−ＦｏｓとのＣ末端融合物として発現し、Ｃ末端分割タンパク質フラグメントは、ｃ−Ｆｏｓを有するＮ末端として発現する（図１７を参照）。これらの実施形態では、ｃ−Ｊｕｎで標識されたハプロマーの逆平行アレンジメントを容易に達成できる。これは、ｃ−Ｊｕｎ対の同じ側にタンパク質フラグメントを並置して配置するのに有利である。にもかかわらず、小分子リガンドによって媒介される分割タンパク質ＬＤ−ＴＡＰＥＲ（図１６を参照）に関して、用いられたセリン−グリシン連結基が十分な長さである場合には、平行ｃ−Ｊｕｎタグを依然として使用できる（図１７を参照）。ＬＤ−ＴＡＰＥＲの分割タンパク質実施形態の描写には、ハプロマー鋳型アーキテクチャ２（図１０を参照）が用いられているが、アーキテクチャ３及び４（図１１及び図１２を参照）も同様に適用可能である。これに関連して、アーキテクチャ１（図９を参照）は、ロックドＴＡＰＥＲ（図１３を参照）に対応しており、またＬＤ−ＴＡＰＥＲの分割タンパク質実施形態に対し極めて適合性がある。
【００７７】
上記の実施形態では（図５及び図９〜図１７に示すように）、両方のハプロマーは共通のリガンドタグを有し、目的タンパク質またはポリペプチドフラグメントは、共通のリガンド結合ドメインで標識されている。このアレンジメントは、ホモ二量体化を特徴とする系には十分に適しているが、その性質が２段階プロセスであるため、ヘテロ二量体化には理想的ではない。（上記の式２．１及び式２．２と同様）第１段階をハプロマー鋳型結合であると仮定すると、ハプロマーＨＡ及びＨＢを有する鋳型上でタンパク質ヘテロダイマーＡ−Ｂをアセンブルすべき場合に、モノリガンド／結合ドメイン系が用いられているときには、タンパク質セグメントＡ及びＢを３つの可能な方法で分類することが可能であり、そのうちの１つだけが適正なＡ−Ｂである。
【数４】
2019535281.tif 000016
式４．１、式４．２（簡潔さを期して、Ａ及びＢの最終的な関連状態のみを示す）。
【００７８】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲの分割タンパク質の適用は、２つの別々の結合ドメイン−ポリペプチド共役体を含むので（図１６及び図１７を参照）、この事例では、ヘテロ二量体化特性もまた適用される。ヘテロ成分に関するモノリガンド／結合ドメイン系の使用（上記Ａ及びＢに関して）は排除されないが、式４．１及び式４．２の２段階手順が使用された場合、活性の損失が極めて有意になる可能性がある。にもかかわらず、いくつかの実施形態において、この特徴は、核酸分子鋳型への曝露の前に、ハプロマー／リガンド結合ドメイン融合複合体を調製することによって克服できる。ハプロマー融合タンパク質複合体を予備アセンブリすることで、どのリガンド結合ドメイン融合タンパク質に対し、特異的なハプロマーとパートナーを形成させるかの制御を可能にする。そのような手段によって、定義されたハプロマー配列は、式３．１及び式３．２と類似の様式で、目的の特異的リガンド結合ドメイン複合体を担持する。
【数５】
2019535281.tif 000017
式５．１、式５．２（簡潔さを期して、Ａ及びＢの最終的な関連状態のみを示す）。
【００７９】
にもかかわらず、ＬＤ−ＴＡＰＥＲのいくつかの実施形態では、ハプロマー及びタンパク質融合ドメインの予備アセンブリを必要とせずに、十分効率的にヘテロ成分系を使用できることが有利な場合がある。これは、各々が異なる特異的なパートナーリガンド結合ドメインを有する２つの異なるリガンドを使用することによって達成できる。そのようなアレンジメントは、上記と同じ記号で表すことができる（ＬA及びＬBは、結合特異性が異なる２つの別個のリガンドを表し、Ａ及びＢは、対応するリガンド結合エンティティを表す）。
【数６】
2019535281.tif 000018
式６．１、式６．２（簡潔さを期して、Ａ及びＢの最終的な関連状態のみを示す）。
ヘテロ成分ＬＤ−ＴＡＰＥＲのいくつかの実施形態において、ロイシンジッパー相互作用の特異性が使用される。それらの例としては、限定されないが、ｃ−Ｊｕｎ：ｃ−Ｆｏｓ、及びｃ−Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロ二量体形成が挙げられる（図１９を参照）。ゆえに、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｍｙｃジッパーとの末端共役体を用いてハプロマーを調製することができ、目的タンパク質ドメイン（または分割タンパク質ポリペプチドフラグメント）は、ｃ−Ｆｏｓ及びＭａｘとの融合物として発現させることができる。鋳型化ｊｕｎ／ｍｙｃハプロマーは、後続の二量体化（予備折り畳み済み単量体ドメイン）または折り畳み（分割タンパク質ポリペプチドフラグメント）が確実に行われるように、２つの目的ドメインの強制近接を指示する（図１９を参照）。
【００８０】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲのいくつかの実施形態では、所望のハプロマー鋳型化が行われた後に、小分子一価リガンドを結合対として安定化することが有益な場合がある。多くの事例において、小分子ＬＤ−ＴＡＰＥＲを介したポリペプチド折り畳みの強制的二量体化は不可逆的であるかまたは逆転速度がゆっくりである。にもかかわらず、一価リガンドを二価性に鋳型媒介変換すると、従来の二価化学二量体化剤単独の場合と同様、後続の二量体化を鋳型非依存性にすることが可能になる。図２０に概略的に図示するように、生体直交型クリック基に対応する側鎖を一価リガンド化合物に具備させることによって、ハプロマー小分子リガンドの架橋が達成される。ｉｎ  ｓｉｔｕ鋳型化クリック反応に続いて、初期に一価であったリガンドは、後続の適切なリガンド結合ドメインとの相互作用に備えて、実際に、安定な二価の種に変換される（図２０を参照）。
【００８１】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲのいくつかの実施形態には、重要な生物学的機能を遂行する予備折り畳みタンパク質のホモ二量体化またはヘテロ二量体化が関与する。そのようなタンパク質は、天然構築物である場合もあればまたは人工構築物である場合もある。これらには、限定されないが、ｉＣａｓｐ９融合タンパク質（変異型ＫＢＰ配列と融合された修飾カスパーゼ−９配列を有する人工構築物）、プロアポトーシスタンパク質、または二量体転写因子が包含される。ＬＤ−ＴＡＰＥＲにより媒介される強制的二量体化の効果は、様々な実施形態において、アポトーシスアッセイ、レポーター遺伝子の活性化、または特異的蛍光の発生を基準に評価可能である。
【００８２】
ＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセス及びその成分は、より具体的な下記の実施形態によって概説できる。
【００８３】
本開示には、標的核酸分子に対し実質的に相補的なポリヌクレオチドを含むハプロマーと、ハプロマーの５’末端または３’末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドと、を含むハプロマー・リガンド複合体が提供されている。いくつかの実施形態において、ハプロマーのポリヌクレオチドは、約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、ハプロマーのポリヌクレオチドは、約８〜約１５ヌクレオチド塩基を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、一対のハプロマー・リガンド複合体は縦列方向に動作する。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
【００８５】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的である。
【００８６】
本明細書に記載のいずれかの実施形態において、ハプロマー・リガンド複合体は、（標的核酸分子に結合したときに）空間的に近接していることから、リガンド、ひいてはそのリガンド結合ドメインの各々が適切に相互作用して目的タンパク質のフラグメントの各々の折り畳みまたは二量体化を誘導できるようになっている。ゆえに、任意のハプロマー・リガンド対に対して、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体と第２のハプロマー・リガンド複合体との間のギャップＮが０である（すなわち、ハプロマー・リガンド複合体が直ちに並置され）、ギャップ（Ｎ＞０）の漸増によって活性が徐々に低減する。ゆえに、いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体との間には、０個のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体との間には、６個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体との間には、５個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体との間には、４個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体との間には、３個未満のヌクレオチドが存在する。いくつかの実施形態において、標的核酸分子に結合する第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体との間には、２個未満のヌクレオチドが存在する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、両方のリガンドは小分子リガンドであるか、または相互作用性タンパク質ドメインである。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含み、第１のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基が、第２のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基と反応可能である。
【００８８】
また、本開示は、ａ）ポリヌクレオチドを含むボトルハプロマーを含むボトルハプロマーであって、本ポリヌクレオチドは、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第１のステム部分と、ｉｉ）約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含み、且つその第１の端に第１のステム部分が連結され、標的核酸分子に対し実質的に相補的である抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分の第２の端部に連結された約１０〜約２０のヌクレオチド塩基を含み、第１のステム部分に対し実質的に相補的である第２のステム部分と、ｂ）第１のステム部分または第２のステム部分のいずれかの末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドとを含む、本ボトルハプロマー・リガンド複合体を提供する。本ボトルハプロマー・リガンド複合体において、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmは、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい。
【００８９】
いくつかの実施形態において、第１のステム部分は、約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、第１のステム部分は、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、抗標的ループ部分は、約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、抗標的ループ部分は、約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含む。抗標的ループ部分の第１の端部には、第１のステム部分が連結されている。抗標的ループ部分は、標的核酸分子に対し実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、リガンドは、第２のステム部分に連結されている。
【００９１】
いくつかの実施形態において、抗標的ループ部分は、内部ヒンジ領域を更に含む場合があり、このヒンジ領域は、標的核酸分子に対し相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、約１ヌクレオチド〜約６ヌクレオチド、約１ヌクレオチド〜約５ヌクレオチド、約１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチド、約１ヌクレオチド〜約３ヌクレオチド、または１ヌクレオチドもしくは２ヌクレオチドを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、第２のステム部分は、約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む。いくつかの実施形態において、第２のステム部分は、約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む。第２のステム部分は、抗標的ループ部分の第２の端部に連結されている。第１のステム部分は、第２のステム部分に対し実質的に相補的である。いくつかの実施形態において、リガンドは、第２のステム部分に連結されている。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマーは、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：６）、または５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：７）を含む。
【００９４】
本明細書に記載のボトルハプロマーのポリヌクレオチドに関しては、特定のポリヌクレオチドまたはその一部の長さは、そのポリヌクレオチドまたはその一部と、別の核酸分子またはその一部との相互作用を介して形成される二重鎖のＴmよりも重大度が低い。例えば、抗標的ループ部分と標的核酸分子（例えば、抗標的ループ部分：標的核酸分子）との相互作用によって形成される二本鎖のＴmは、第２のステム部分を有する第１のステム部分（例えば、第１のステム部分：第２のステム部分）の相互作用によって形成される二本鎖のＴmよりも大きい。いくつかの実施形態では、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃である。いくつかの実施形態において、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子Ｔmから減算した残余が、約１０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態において、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約４０℃〜約５０℃である。いくつかの実施形態において、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約６０℃〜約８０℃である。
【００９５】
加えて、上記のＴm情報を本明細書に記載の特定の長さの核酸分子に翻訳する際にはまた、各核酸分子のＧＣ含有量に依存する場合もある。例えば、好適なＨＰＶモデル標的核酸分子は、長さが３０塩基（Ｔmが７０℃）である一方、ＥＢＶモデル標的核酸分子の場合、その％ＧＣが高いことから、長さが２１塩基のみ（Ｔmが６９℃）に限られる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体は、第２のハプロマー・リガンド複合体に対し縦列方向に動作する。いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体は、本明細書に記載のいずれかのボトルハプロマー・リガンド複合体、及び第２のハプロマー・リガンド複合体は、本明細書に記載のいずれかのハプロマー・リガンド複合体である。いくつかの実施形態において、第２のハプロマー・リガンド複合体は、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的である約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含むヌクレオチド部分と、第２のハプマー・リガンド複合体のヌクレオチド部分の５’末端または３’末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドとを含み、この第２のハプロマー・リガンド複合体において、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結された第１または第２のステム部分のＴmが、ボトルハプロマー・リガンド複合体の第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である、組成物またはキットが提供されている。
【００９７】
いくつかの実施形態において、第２のハプロマー・リガンド複合体を、第１のステム部分または第２のステム部分のいずれかリガンドに連結されている方のステム部分（例えば、リガンドに連結されている第２のハプロマー・リガンド複合体：第１または第２のステム部分）と相互作用させて形成された二重鎖のＴmは、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である。いくつかの実施形態において、第２のハプロマー・リガンド複合体、及びリガンドに連結されている第１または第２のステム部分によって形成された二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余は、約０℃〜約２０℃である。いくつかの実施形態において、リガンドに連結されている第２のハプロマー・リガンド複合体及び第１または第２のステム部分によって形成された二重鎖のＴmを、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余は、約５°Ｃ〜約１０℃である。いくつかの実施形態において、第２のハプロマー・リガンド複合体、及びリガンドに連結されている第１または第２のステム部分によって形成された二重鎖Ｔmは、約３０℃〜約４０℃である。
【００９８】
この構造的アレンジメントは、標的核酸分子鋳型の非存在下で、ロックド第１のボトルハプロマーがその相補的な第２のハプロマーに有意にハイブリダイズしないように設計されているので、そのような条件下では鋳型指向性産物のアセンブリが促進されない。他方、特異的な標的核酸分子鋳型が存在する場合、ボトルハプロマーの抗標的ループ領域と標的核酸分子自体との間に安定性に優れるハイブリッドが形成されて、ボトルハプロマー・リガンド複合体が「アンロック」される。いったんこのアンロックが起こると、リガンドに連結されているボトルハプロマーの第１のステム部分が、利用可能な第２のハプロマー・リガンド複合体に自在にハイブリダイズし、結果として、両方のリガンド間に近接する。
【００９９】
本明細書に記載の任意のハプロマーポリヌクレオチド、またはその任意の部分において、ヌクレオチド塩基が、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせもしくは混合物からなる群から選択される。
【０１００】
本明細書に記載の任意のハプロマーポリヌクレオチドのいずれについても、別の核酸分子との相補性は１００％であり得る。いくつかの実施形態において、或る特定の核酸分子は、別の核酸分子に対し実質的に相補的であり得る。本明細書中に「実質的に相補的」という語句が用いられている場合、１〜１０個のミスマッチ塩基位置、１〜９個のミスマッチ塩基位置、１〜８個のミスマッチ塩基位置、１〜７個のミスマッチ塩基位置、１〜６個のミスマッチ塩基位置、１〜５個のミスマッチ塩基位置、１〜４個のミスマッチ塩基位置、１〜３個のミスマッチ塩基位置、及び１または２個のミスマッチ塩基位置を意味する。いくつかの実施形態では、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、ミスマッチ塩基位置を介して１０％を超えて低下するのを回避することが所望される。ボトルハプロマーステムは、第２のハプロマーに関して設計されており、その構造は、第２のハプロマー二本鎖の形成よりも幾分かは安定性が高まるように意図的に整列されている。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、リガンドに連結されていないボトルハプロマー・リガンド複合体の部分は、オーバーハングしてステム構造の一部を形成しない追加のヌクレオチド塩基を有し得る。いくつかの実施形態において、第２のハプロマー・リガンド複合体の端部は、リガンドに連結されていない場合、オーバーハングしてボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し構造の相補的部分を形成しない追加のヌクレオチド塩基を有し得る。加えて、いくつかの実施形態では、リガンドに連結されているステムの部分はまた、第１のステム部分と塩基対合していないヌクレオチド塩基を有し得る。ハイブリダイズしていない「アーム」を介して、そのようにステムが伸長すると、２つのリガンドがより大きな空間距離に配置するため、それらの相互反応性が低下する傾向がある。したがって、少数のヌクレオチド塩基（１０未満または５未満）では、反応性の強化が依然として生起される可能性が高いが、非塩基対合セグメントの長さが増加するにつれてこの反応性は低減する傾向がある。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、付加されたヌクレオチド塩基が無限の長さになり得るのは、１）ロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの他の領域のいずれに対しても有意な相同性を有さず、それゆえ交差ハイブリダイズして干渉する傾向がない場合、または２）系の他の任意の機能に対し非特異的に干渉しない場合である。例えば、長い付加配列は治療との関連において使用されるロックドＴＡＰＥＲオリゴヌクレオチドの形質転換効率を低下させる可能性がある。また、付加配列は、他の細胞転写物との擬似ハイブリダイゼーションが回避されるように設計されている必要がある。付加された非相同配列は、２０〜３０ヌクレオチド塩基のものが、好適とされる。付加された核酸配列は、当該技術分野において遍く用いられるプライマー配列を含有し得る。そのような例としては、限定されないが、Ｍ１３、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、ＶＦ２、ＶＲ、それらの修飾バージョン、それらの相補配列、及びそれらの逆配列を挙げることができ、また、それ以外に、カスタムプライマー配列も挙げられる。そのようなプライマー配列も使用可能であり、考え得る用途としては、例えば、ロックドＴＡＰＥＲに対する化学的にライゲートされたオリゴヌクレオチドの空間的誘発（ＣＬＯＳＥ）ストラテジーが挙げられる（その全体が本明細書において参照により援用されているＰＣＴ公報ＷＯ２０１６／８９９５８号を参照）。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、両方のリガンドは小分子リガンドであるか、または相互作用性タンパク質ドメインである。いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、あるいはボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
【０１０５】
本明細書に記載のいずれかのボトルハプロマー、またはその任意の部分は、第１のステム部分と抗標的ループ部分との間、抗標的ループ部分と第２のステム部分との間、第２のステム部分とリガンドとの間、第１のステム部分とリガンドとの間、または第２のハプロマーとそのリガンドとの間、のうちのいずれか１つ以上の間に連結基を更に含む場合がある。
いくつかの実施形態において、連結基は、アルキル基、アルケニル基、アミド、エステル、チオエステル、ケトン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン、ウレタン、アゾール、イミン、ハロアルキル及びカルバメート、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、第２のハプロマー・リガンド複合体は、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：８）、または５’−ＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：９）を含む。
【０１０７】
本明細書に記載のいずれかの実施形態において、リガンドは、小分子リガンドまたは相互作用性タンパク質ドメインである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子リガンドである。
いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、約２５００ダルトン未満である。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、小分子、約２０アミノ酸残基未満のペプチド、天然もしくは人工的に修飾されたペプチド、ペプチド模倣物、グリカン、有機酵素補因子、または人工的に誘導された小分子リガンドである。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、ＦＫＢＰを標的とするように設計された化合物から誘導される。いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、ＦＫＭ一価リガンドである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、変異型バージョンのＦＫＢＰを標的とするように設計された化合物から誘導される（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１０３４３７−１０４３２）。そのような修飾の１つが、ＦＫＭ−ＮＨＳである。このＦＫＭ−ＮＨＳは、付加されたアミド、３−炭素スペーサー及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でエステル化されたカルボン酸基を有する修飾一価変異型ＦＫＢＰ結合残基を含み（図６を参照）、これは、例えばアミノ標識オリゴヌクレオチドへのカップリングに使用できる。ＦＫＭ−ＮＨＳのスペーサー残基は、長さが４個、５個または６個の炭素原子を含み得るが、これらに限定されるものではない。また、溶解度を上昇させる目的で、ＦＫＭ−ＮＨＳを修飾することもできる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、小分子リガンドはＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳである。このＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳを、例えばアミノ標識オリゴヌクレオチドにカップリングする目的で使用してもよいし、溶解度を増強させる目的で追加のスルホ基と共に使用してもよい（図７を参照）。ＮＨＳ残基はスルホ基を担持する。ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳのスペーサー残基は、長さが４個、５個または６個の炭素原子を含み得るが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、小分子リガンドは、ＦＫＭ−ＮＨＳの別の溶解度増強のための修飾を含み、ここで、スペーサーアームはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の短いセグメントに変換されてＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳを提供する（図８を参照）。このＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨを、例えば、アミノ標識オリゴヌクレオチドにカップリングする目的で、ＳＰＥＧスペーサーと併用することで、溶解度を増強させることが可能である。ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳのスペーサーアームは、これらに限定されないが、１、２、４、５、または６コピーの単量体エチレングリコールが含まれ得る。ＦＫＭ−ＮＨＳ及びその全ての誘導体は、５’末端または３’末端のいずれかにおいて、アミノ標識オリゴヌクレオチドに対し容易且つ直接的に結合できる。加えて、ＰＥＧ鎖に反応基を付加する部位は、変動し得る。ゆえに、ＰＥＧ鎖中の炭素原子が番号付けされている場合、これらの部位のいずれかに反応基が位置し得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ＦＫＭ一価リガンドは、ＦＫＭ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳ、または一価ＦＫＢＰリガンド−２（ＭＦＬ２）であって、ＦＫＭ−ＮＨＳは
【化１２】
2019535281.tif 000019
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳは
【化１３】
2019535281.tif 000020
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳは
【化１４】
2019535281.tif 000021
（式中、ｎは１〜６）であり、ＭＦＬ２は
【化１５】
2019535281.tif 000022
である。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、リガンドは、相互作用性タンパク質ドメインである。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、１００アミノ酸残基未満を含む。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、ロイシンジッパードメインである。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、ｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ＮＺドメインは、そのアミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインは、そのアミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインのＮ末端は、ハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインは、アミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＣＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１２）を含む。いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインのＣ末端は、ハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインは、アミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）、またはＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ｃ−Ｆｏｓドメインは、アミノ酸配列ＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：３）またはＳＧＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１３）を含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、２つのハプロマー・リガンド複合体は縦列方向に動作するか、またはボトルハプロマー・リガンド複合体は第２のハプロマー・リガンド複合体に対し縦列方向に動作し、両方のリガンドは、小分子リガンドまたは相互作用性タンパク質ドメインのいずれである。いくつかの実施形態において、両方の相互作用性タンパク質ドメインは、ロイシンジッパードメインである。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、あるいは第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端は、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインのＣ末端は、第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のいずれかまたは両方のポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に連結されている。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインまたはｃ−ｍｙｃドメインであり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインまたはｃ−ｍｙｃドメインである。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体または第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインであり、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｍｙｃドメインである。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインであり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインである。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体に連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインであり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインである。いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの一方のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｊｕｎドメインであり、且つボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のポリヌクレオチドに連結されているリガンドはｃ−ｍｙｃドメインである。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体は、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：６）を含み
且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：８）を含むか；またはボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体は、ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：７）を含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：９）を含む。
【０１２４】
本明細書に記載の実施形態において鋳型として機能する標的核酸分子は、ハプロマーのポリヌクレオチドまたはボトルハプロマーの抗標的ループ部分とハイブリダイズ可能な任意の所望の核酸配列から構成され得る。アクセス可能な配列を有する任意の一本鎖核酸分子は、潜在的に標的化可能である。これらには、限定されないが、細胞性ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムもしくはオルガネラＤＮＡ、エピソームもしくはプラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、短い及び長い非コードＲＮＡ、ならびに鋳型化の目的に使用される任意の人工核酸配列、または他の任意の生物学的もしくは人工の核酸配列が包含される。人工配列の例としては、限定されないが、アプタマー及び高分子−核酸共役体が挙げられる。また、ロックドＴＡＰＥＲをはじめとする任意の形態のＴＡＰＥＲに関する非核酸細胞産物を標的化可能な配列に変換するように設計されている、アプタマー鋳型も挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子ハイブリダイゼーション部位が可能な限り短く維持されるのは、１）複雑なトランスクリプトームまたは他の複雑な標的内で特異性を維持する場合、及び２）本明細書に記載されているロックドＴＡＰＥＲ設計ガイドラインを維持する場合である。
【０１２５】
核酸分子を含有する試料の任意の細胞、ウイルス、組織、空間領域、溶解物、または他の副成分によって、標的核酸分子が提供される場合もある。標的核酸分子を含む標的区画の例としては、限定されないが、病原性細胞、がん細胞、ウイルスを挙げることができるほか、ウイルスまたは他の病原体に感染した宿主細胞、あるいは自己免疫に寄与する免疫系の細胞（例えば、適応免疫系もしくは先天的免疫系の細胞、移植拒絶反応、またはアレルギー反応の細胞）も挙げることができる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、ウイルス中、またはウイルスに感染した細胞中に存在し得る反面、健全な細胞中には存在し得ない。ウイルスの例としては、限定されないが、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または逆転写ウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、腫瘍細胞中またはがん性細胞中に存在し得る反面、健全な細胞中には存在し得ない。がんの例としては、これらに限定されないが、ヒトパピローマウイルス、エプスタインバーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのがんウイルスによって引き起こされるがんが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、感染性病原体中もしくは微生物中、または感染性病原体もしくは微生物に感染した細胞中に存在し得る反面、健全な細胞中には存在し得ない。感染性病原体または微生物の例としては、限定されないが、ウイルス、細菌、真菌、原生生物、プリオン、または真核生物の寄生虫が挙げられる。
【０１２６】
標的核酸分子は、がん遺伝子、突然変異遺伝子、がんウイルス遺伝子、ウイルス核酸配列、微生物核酸配列、差次的に発現された遺伝子、及びそれらの核酸遺伝子産物などの遺伝子のフラグメント、部分または一部でもあり得る。
【０１２７】
がん特異的な標的核酸の例としては、限定されないが、変異型がん遺伝子、例えば変異型ｒａｓ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＢＬ１、ＰＤＧＦＢ、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４もしくはＳＲＣ遺伝子、変異型がん抑制遺伝子、例えば、ＴＰ５３、ＴＰ６３、  ＴＰ７３、  ＭＤＭ１、  ＭＤＭ２、  ＡＴＭ、  ＲＢ１、  ＲＢＬ１、ＲＢＬ２、  ＰＴＥＮ、  ＡＰＣ、  ＤＣＣ、ＷＴ１、ＩＲＦ１、ＣＤＫ２ＡＰ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＴＲＩＭ３、ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２遺伝子、及び変異または遺伝的に改変し得ないが、投与時に試料の健全な細胞では発現されないがん細胞において発現される、がん胎児性抗原などの遺伝子が挙げられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子が、非標的区画と比較して、標的区画において差次的な量または濃度で存在し得る。例としては、限定されないが、健全な細胞とは異なるレベルでがん細胞中に発現する遺伝子、例えばｍｙｃ、テロメラーゼ、ＨＥＲ２、またはサイクリン依存性キナーゼが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、標的区画と非標的区画との間に、少なくとも１．５Ｘ倍に差次的に発現する遺伝子であり得る。それらのいくつかの例としては、限定されないが、標的ＲＮＡ分子が免疫グロブリンイプシロン重鎖配列を含む、Ｉ型アレルギー反応の媒介に関連する遺伝子；Ｔ細胞サブセットで発現される遺伝子、例えば、プロインスリン由来ペプチドのような特異的な主要組織適合性（ＭＨＣ）タンパク質及び糖尿病誘発性ＣＤ８＋から誘導されたαまたはβ可変領域配列を含むクローン特異的ｍＲＮＡとの関連において自己抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；ならびにＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、ＩＦＮ−γ、ＯＳＭ及びＬＩＦが挙げられるがこれらに限定されない、炎症反応の悪化によってその産生が有害事象を生ずる恐れのあるサイトカインが挙げられる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、標的区画及び非標的区画の許容可能なサブグループ中に存在するが、非標的区画の異種または別個のサブグループ中には存在しない。例としては、限定されないが、がん細胞内で発現する遺伝子（但し、がん精巣抗原、サバイビン、前立腺特異抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、αフェトプロテイン及び他のがん胎児性タンパク質などの健全な細胞のクラスのみ）が挙げられる。また、組織及び臓器の多くは、他の点では深刻な病気に直面しても健全な生活に不可欠でない。例えば、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１及びｇｐ１００のようなメラニン形成細胞抗原は、多くの悪性黒色腫ならびに正常なメラニン形成細胞上に発現される。これらの抗原を標的とする治療法は、腫瘍と正常なメラニン細胞の両方を破壊し、白斑を生ずるだけでなく、腫瘍を大幅に減少させる。同様に、これらの組織の腫瘍が発生し、これらの臓器内の正常組織の破壊が治療の結果として許容範囲内となり得る場合、精巣、卵巣及び子宮などの生殖器官を外科的に除去し得ると共に、乳房及び前立腺などの関連する器官を標的化し得る。更にそのうえ、チロキシン及びインスリンなどのホルモンを産生する細胞によっては、関連タンパク質で置換可能なものもあり、これらの起源の腫瘍の存在下で、存在し得る正常細胞を潜在的に標的化することが可能となる。
【０１３０】
また、標的核酸分子は、以前に同定されなかった新規な配列も含み得る。いくつかの実施形態では、次世代配列決定、全トランスクリプトーム（ＲＮＡ配列）または全ゲノム配列決定、マイクロアレイプロファイリング、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）などの配列分析によって１つもしくは複数の試料を評価し、試料の遺伝子構成を特定できる。標的核酸分子は、標的区画中に存在するものとして同定できるが、非標的区画中には存在しないか、または非標的区画と比較して差次的な量もしくは濃度で標的区画中に存在する。これらの方法で同定された配列は、標的核酸分子としての役目を果たし得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、リガンドは小分子リガンドであり、この小分子リガンドは生体直交型残基を更に含む場合がある。いくつかの実施形態において、２つのハプロマー・リガンド複合体は縦列方向に動作し、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含む。第１のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基は、第２のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基と反応可能である。いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体は第２のハプロマー・リガンド複合体に対し縦列方向に動作し、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含む。ボトルハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基は、第２のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基と反応可能である。
【０１３２】
生体直交型残基は、アジドとアルキンとの間の「クリック」反応、アジドとホスフィンとの間の無痕跡型もしくは非無痕跡型シュタウディンガー反応、及びチオエステルとチオールとの間の天然化学ライゲーション反応を経る可能性のある基を含む。追加的に、生体直交型残基は、アジド、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、及びそれらの誘導体のいずれかであり得る。１セットの対応するハプロマーのメンバーの生体直交型残基は、それらが互いに反応するように選択される。
【０１３３】
本明細書中に開示されている方法及び組成物と共に複数の生体直交型残基を使用できる。いくつかの例としては、限定されないが、アジド−アルキン「クリックケミストリー」が挙げられる。
典型的な条件下ではアジドもアルキンも一般的な生体分子と反応しないので、クリックケミストリーは、高度な選択性を呈する。Ｒ−Ｎ3型のアジド及びＲ−Ｃ＝ＣＨ型の末端アルキンまたはＲ−Ｃ＝Ｃ−Ｒ型の内部アルキンは、互いに容易に反応して１，２，３−トリアゾールの形のフイスゲン環状付加産物を生成する。
【化１６】
2019535281.tif 000023
【０１３４】
アジド系ハプロマーは部分構造Ｒ−Ｎ3を有する。
式中、Ｒは化学連結基、核酸認識残基（例えば核酸分子の他の部分に対し相補的なオリゴヌクレオチドの部分）、またはリガンドである。アジド及びアジド誘導体は、市販の試薬から容易に調製できる。
【０１３５】
また、アジドを、リガンドの合成中にリガンド中に導入することも可能である。いくつかの実施形態では、標準的なペプチド合成法を用いたリガンドの合成中に、市販のアジド誘導体化標準アミノ酸またはアミノ酸類似体を組み込むことによって、アジド基をペプチドリガンドに導入する。アミノ酸は、α−アミノ基を置換するアジドで誘導体化され、以下の形態の構造を与え得る。
【化１７】
2019535281.tif 000024
式中、Ｒは標準アミノ酸または非標準アミノ酸類似体の側鎖である。
【０１３６】
市販の製品は、アミノ酸側鎖としてアジド官能性を導入でき、その結果、次の形態の構造を生ずる。
【化１８】
2019535281.tif 000025
式中、Ａは、標準アミノ酸または非標準アミノ酸類似体の側鎖中の任意の原子及びその置換基である。
【０１３７】
また、ジアゾトランスファー法により、ペプチドリガンド上のアミン基をアジドに変換することにより合成した後に、アジドをペプチドリガンドに導入することも可能である。また、生体共役化学を使用して、市販の誘導体化アジドを化学連結基、核酸認識残基、または好適な反応基を含むリガンドに結合することも可能である。
【０１３８】
アジドの組み込みと同様の方法で、標準アルキンをハプロマーに組み込むことができる。アルキン官能化ヌクレオチド類似体は市販されており、これにより、核酸認識残基の合成時に、アルキン基を直接的に組み込むことが可能になる。同様に、アルキン誘導体化アミノ酸類似体を、標準的なペプチド合成方法でリガンドに組み込むこともできる。追加的に、生体共役化学的アプローチに適合する多様な官能化アルキンを使用して、好適な官能基または側鎖を介して他の残基へのアルキンの組み込みを促進できる。
【０１３９】
アジド活性化アルキン「クリックケミストリー」
標準的なアジド−アルキン化学反応は、典型的には銅（Ｉ）のような触媒を必要とする。触媒濃度の銅（Ｉ）は多くの生物学的系に有毒であることから、標準的なアジド−アルキン化学反応は、生細胞における用途が限られている。活性化アルキンに基づく銅を含まないクリックケミストリー系は、有毒な触媒を回避する。
【０１４０】
活性化アルキンは多くの場合、シクロオクチンの形態を取り、その際、シクロオクチル基への組み込みによって、アルキンに環歪みが導入される。
【化１９】
2019535281.tif 000026
【０１４１】
ヘテロ原子または置換基は、シクロオクチル環の様々な位置に導入することができ、これによって、アルキンの反応性が改変することも、あるいは化合物中に他の代替の化学的性質が付与することも可能となる。また、環上の様々な位置は、シクロオクチンを核酸鋳型化アセンブリ残基または連結基に連結するための結合点としての役目を果たし得る。環上のこれらの位置またはその置換基は、任意選択的に、補助基で更に誘導体化できる。
【０１４２】
標準的な生体共役化学プロトコルと併用するのに適したいくつかの誘導体化バージョンを含む、複数のシクロオクチンが市販されている。市販のシクロオクチン誘導体化ヌクレオチドは、核酸認識残基合成中のリガンドが好都合に取り込まれるのを促進する一助となり得る。
【化２０】
2019535281.tif 000027
【０１４３】
シクロオクチンアジドに基づく生体直交型化学は、下記の一般構造の鋳型化アセンブリ産物を生成し得る。
【化２１】
2019535281.tif 000028
【０１４４】
別の実施例は、以下の通りである。
【化２２】
2019535281.tif 000029
【０１４５】
アジド−ホスフィンスタイディンガー化学
また、アジドとホスフィンまたは亜リン酸エステルとの急速な反応に基づくＮ2の損失を伴う、シュタウディンガー還元も、生体直交型反応を表す。シュタウディンガー反応において反応物どうしの間に共有結合を形成するシュタウディンガーライゲーションは、核酸鋳型化アセンブリでの使用に適する。これらの反応で形成される産物の化学構造における多様な選択肢が、非無痕跡型形態及び無痕跡型形態のシュタウディンガーライゲーションの両方によって実現されている。
【０１４６】
非無痕跡型シュタウディンガーライゲーション
標準シュタウディンガーライゲーションは、アジドとトリフェニルホスフィンのようなフェニル置換ホスフィンとの間の非無痕跡型反応である。
この非無痕跡型反応において、メチルエステルなどのホスフィン上の求電子性トラップ置換基は、反応のアザ−イリド中間体に対し再整列して、ホスフィンオキシドを介して連結されたライゲーション産物を生成する。ハプロマーＡ及びＢによって形成されるシュタウディンガーライゲーション産物の例は、以下の構造を有し得る。
【化２３】
2019535281.tif 000030
【０１４７】
また、求電子トラップを担持するフェニル置換ホスフィンも、容易に合成できる。誘導体化バージョンは、市販されており、ハプロマーへの組み込みに適している。
【化２４】
2019535281.tif 000031
【０１４８】
無痕跡型シュタウディンガーライゲーション
いくつかの実施形態において、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションが可能なホスフィンは、リガンド用の生体直交型残基として利用され得る。無痕跡型反応において、ホスフィンは、アザ−イリド中間体の転位中に脱離基として機能し、典型的には天然アミド結合の形態でライゲーションを生ずる。無痕跡型シュタウディンガーライゲーションが可能な化合物は、チオエステル誘導体化ホスフィンまたはエステル誘導体化ホスフィンの形態を取るのが、一般的である。
無痕跡型シュタウディンガーライゲーション用の例示的なエステル誘導体化ホスフィンは以下の通り：
【化２５】
2019535281.tif 000032
である。
【０１４９】
無痕跡型シュタウディンガーライゲーション用の例示的なチオエステル誘導体化ホスフィンは以下の通り：
【化２６】
2019535281.tif 000033
【０１５０】
上記構造中のＲ基への置換基として、化学連結基または補助基を任意に付加することが可能であり、それにより、核酸認識残基または反応物に対し追加的な官能性を導入するための結合点が提供される。
【０１５１】
無痕跡型ホスフィノフェノールシュタウディンガーライゲーション
無痕跡型ホスフィノフェノール上の求電子性トラップエステルの配向は、非無痕跡型タウディンガーフェニルホスフィン化合物とは対照的に、フェニル基に対して逆さまになっている。これにより、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションがアジドとの反応で起こり、ホスフィンオキシドを含まずに産物中に天然アミド結合を生成することが可能になる。
【化２７】
2019535281.tif 000034
【０１５２】
第三級アミンのような好適な親水性基がフェニルホスフィンに付加されている場合には、有機共溶媒を含まない水性媒体中で、無痕跡型シュタウディンガーライゲーションを行うことができる。Ｗｅｉｓｂｒｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｘには、水溶性ホスフィノフェノールの調製に関する記載がある。この水溶性ホスフィノフェノールには、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などのカルボジイミド、及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）などのエステル活性化剤を用い、穏やかなステグリッヒエステル化を介して、カルボン酸含有の所望のリガンド（ペプチドのＣ末端など）を充填できる。このアプローチによって促進されるハプロマーの合成形態は以下の通り：
【化２８】
2019535281.tif 000035
である（Ｓｙｎｌｅｔｔ，２０１０，５，７８７−７８９）。
水溶性ホスフィノフェノール系の無痕跡型ハプロマー構造
【０１５３】
無痕跡型ホスフィノメタンチオールシュタウディンガーライゲーション
ホスフィノメタンチオールは、無痕跡型シュタウディンガーライゲーション反応を媒介するためのホスフィノフェノールに対する代替物の代表例である。無痕跡型シュタウディンガー反応の媒介におけるホスフィノフェノール類と比べ、ホスフィノメタンチオールは、概ね有利な反応速度論を有する。米国特許出願公開第２０１０／００４８８６６号及びＴａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９，１１４２１−３０には、以下の形態の水溶性ホスフィノメタンチオールの調製について記載されている。
【化２９】
2019535281.tif 000036
【０１５４】
これらの化合物に、活性化エステル形態にてペプチドまたは他のペイロードを充填することによって、無痕跡型の生体直交型反応基としての使用に適したチオエステルを形成することが可能である。
【化３０】
2019535281.tif 000037
水溶性ホスフィノメタンチオール無痕跡型シュタウディンガーの生体直交型化学に基づくハプロマー構造
【０１５５】
天然化学ライゲーション
天然化学ライゲーションは、チオエステルと、チオール及びアミンを有する化合物との間の反応に基づく生体直交型アプローチである。下記から分かるように、古典的な天然化学ライゲーションは、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドと、Ｎ末端システインを有する別のペプチドと、の間におけるものである。
【化３１】
2019535281.tif 000038
【０１５６】
天然化学ライゲーションを利用して、無痕跡型反応を仲介して、内部システイン残基、または他のチオール残基含有のペプチドもしくはペプチド模倣物が製造される場合がある。
【０１５７】
標準的なアミノ酸合成法により、Ｎ末端システインを取り込むことが可能である。末端チオエステルの生成を可能にする方法としては、当該技術分野において公知のいくつかの方法、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような薬剤を用いた活性化エステルとチオールとの縮合、または「セーフティ−キャッチ」支持樹脂を用いたペプチド合成中の導入が挙げられる。
【０１５８】
その他の選択的反応性残基
任意の好適な生体直交型反応化学は、複雑な生物学的環境において高度に選択的な方法で反応を効率的に媒介するものである限り、ハプロマー・リガンド複合体の合成に利用できる。好適とされ得る代替の生体直交型化学で、最近開発されたものの例としては、限定されないが、テトラジン類と、ノルボルネン及びトランス−シクロオクテンのような種々のアルケン類との間の反応であり、この反応によって水性媒体中での生体直交型反応が効率的に媒介される。
【０１５９】
上記構造には、任意選択的に、化学連結基または補助基を置換基として付加することが可能である。これにより、核酸認識残基もしくはリガンド用の結合点、または反応物に対し追加的な官能性を導入するための結合点が提供される。
【０１６０】
実施例及び図に描かれているリガンドを含む構成は、逆さまにもできる。換言すれば、第２のハプロマー・リガンド複合体の５’末端にリガンドが連結されている限り、ボトルハプロマー・リガンド複合体の３’末端にリガンドを連結させることができる。下掲の例に、５’に連結されたリガンドを有するボトルハプロマー・リガンド複合体、及び３’に連結されたリガンドを有する第２のハプロマー・リガンド複合体を示す。同様に、この系では、生体直交型残基を入れ替えることができる。例えば、５’−ヘキシニルを有するボトルハプロマー・リガンド複合体、及び３’−アジドを有する第２のハプロマー・リガンド複合体を用いる代わりに、アジド、及び第２のハプロマー・リガンド複合体であるヘキシニル基を、ボトルハプロマー・リガンド複合体に具備させてもよい。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、生体直交型残基は、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーの生体直交型残基はヘキシニルであり、且つ第２のハプロマーの生体直交型残基はアジドである。いくつかの実施形態において、第１のハプロマーの生体直交型残基はアジドであり、且つ第２のハプロマーの生体直交型残基はヘキシニルである。
【０１６２】
例えば、いくつかの実施形態には、クリック基側鎖を有する化合物のＦＫＭ−ＮＨＳシリーズ（図６〜図８）の修飾が用いられている。いくつかの実施形態において、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳは、ＰＥＧ鎖のＣ２位置において、メチルテトラジン基（ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳ）（図２１を参照）、またはトランス−シクロオクテン基（ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳ）（図２２を参照）で修飾されている。これらの化合物を標準のＮＨＳ化学によりアミノ標識オリゴヌクレオチドに付加し、クリック修飾リガンドハプロマーを形成した場合（図２０参照）、鋳型形成よって空間的に近接して配置した後に生体直交型的な様式にて互いに反応させることができる。ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳは、以下の通り：
【化３２】
2019535281.tif 000039
（式中、ｘは１〜６）であり、且つＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳが
【化３３】
2019535281.tif 000040
（式中、ｘは１〜６）である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体または第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの１つのリガンドは、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳというＦＫＭ一価リガンドであり、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体または第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のリガンドは、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳというＦＫＭ一価リガンドである。いくつかの実施形態において、ボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの一方のリガンドは、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳというＦＫＭ一価リガンドであり、且つボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のリガンドは、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳというＦＫＭ一価リガンドである。
【０１６４】
また、本開示において提供されている化合物は、次式：
【化３４】
2019535281.tif 000041
（式中、ｍは３〜６）を有する。
【０１６５】
また、本開示において提供されている化合物は、次式：
【化３５】
2019535281.tif 000042
（式中、ｍは３〜６）を有する。
【０１６６】
また、本開示において提供されている化合物は、次式：
【化３６】
2019535281.tif 000043
（式中、ｎは１〜６）を有する。
【０１６７】
また、本開示において提供されている化合物は、次式：
【化３７】
2019535281.tif 000044
（式中、ｘは１〜６）を有する。
【０１６８】
また、本開示において提供されている化合物は、次式：
【化３８】
2019535281.tif 000045
（式中、ｘは１〜６）を有する。
【０１６９】
また、本開示において提供されている化合物は、次式：
【化３９】
2019535281.tif 000046
を有する。
【０１７０】
本化合物は、ＭＦＬ２である。
【０１７１】
また、本開示には、リガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質であって、リガンド結合ドメインが小分子リガンド用のリガンド結合ドメインまたは相互作用性タンパク質ドメインである、融合タンパク質が提供されている。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、ＦＫＢＰドメインまたはＦＲＢドメインである。いくつかの実施形態において、ＦＫＢＰドメインは、変異型ＦＫＢＰドメインである。いくつかの実施形態において、変異型ＦＫＢＰドメインは、Ｆ３６Ｖ  ＦＫＢＰ変異型ドメインであり、この変異型ドメインは、アミノ酸配列ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列ＩＤ番号：１４）、またはＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列ＩＤ番号：１５）を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、リガンド結合ドメインは、相互作用性タンパク質ドメインである。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、１００アミノ酸残基未満を含む。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、ロイシンジッパードメインである。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、ｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のＮ末端に融合されている。いくつかの実施形態において、相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のＣ末端に融合されている。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ＮＺドメインは、アミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインは、アミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインは、アミノ酸配列
ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１６）を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ｃ−ｊｕｎドメインは、アミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）またはＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ｃ−Ｆｏｓドメインは、アミノ酸配列ＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：３）またはＳＧＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１３）を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、目的タンパク質とリガンド結合ドメインとの間に連結基を含む。いくつかの実施形態において、連結基は、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ連結基、ポリアスパラギン連結基、またはアミノ酸配列ＡＧＳＳＡＡＧＳＧＳ（配列ＩＤ番号：１７）を含む連結基である。いくつかの実施形態において、ポリアスパラギン連結基は、約８〜約１６個のアスパラギン残基を含む。いくつかの実施形態において、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ連結基は、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：１８）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：１９）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２０）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２１）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２３）、ＳＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：２４）、ＳＧＳＧ（配列ＩＤ番号：２５）、ＳＧＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：２６）、またはＳＧＳＧＧ（配列ＩＤ番号：２７）を含む。
【０１８０】
目的タンパク質は、そのフラグメントが各々のリガンド結合ドメインに対するそれぞれの融合を介して一緒になって、一体的に折り畳み可能または二量体化可能とされる、任意の所望のタンパク質であり得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質が、標的区画内（例えば細胞内）、標的区画の表面（例えば細胞表面）、標的区画の近傍（例えば、エフェクター構造が細胞から活発に輸送された場合、細胞から漏出された場合、細胞死の際に放出もしくは拡散された場合、または試料の離れた領域に運搬された場合、応答が誘発される。いくつかの実施形態では、鋳型化アセンブリ産物に標的化基を組み込むことによって、目的タンパク質をその活性部位に標的化できる。標的化基の例としては、限定されないが、小胞体輸送シグナル、ゴルジ体輸送シグナル、核輸送シグナル、ミトコンドリア輸送シグナル、ユビキチン化モチーフ、他のプロテオソーム標的化モチーフ、またはグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーモチーフが挙げられる。標的化基は、合成中にハプロマー残基、化学連結基、または補助基に組み込むことによって導入することも可能であるし、あるいはライゲーション反応中に生成することも可能である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質を、標的区画の表面上に提示できる。いくつかの実施形態では、目的タンパク質を、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合したリガンドとしての細胞の表面上に提示できる。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、目的タンパク質を、内因性ペプチド、及びそれらの類似体、あるいは抗体などの薬剤の標的となる完全合成構造であり得る。標的核酸分子の利用可能性が、目的の活性タンパク質の産生を制限してしまう可能性があることから、低レベルで存在するときに活性を発揮する目的タンパク質を有することが所望される場合がある。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、細胞傷害性、殺微生物性、または殺ウイルス性のエフェクター構造との直接的な相互作用によって、標的細胞の殺傷または増殖阻害が誘導される場合がある。当該技術分野において、公知の多数の有毒分子を生成できる。いくつかの実施形態において、目的タンパク質は有毒なペプチドである。有毒ペプチドの例としては、限定されないが、蜂メリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、ＮＫ−リシンが挙げられる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、目的プロアポトーシスタンパク質によって、標的細胞の殺傷または増殖阻害が誘導される場合がある。例えば、目的タンパク質としては、限定されないが、プロアポトーシスペプチド、例えば、プリオンタンパク質フラグメント１０６〜１２６（ＰｒＰ  １０６〜１２６）、カスパーゼカスケードに関連するＢａｘから誘導された最小ポロペプチド（Ｂａｘ１０６〜１３４など）及びプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ；配列ＩＤ番号：２８）が挙げられる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、凝固カスケードタンパク質の様々な成分の活性化、タンパク質の活性化、血小板の活性化及び／または凝集、あるいは内皮損傷を誘発するという点で血栓形成性であり得る。このために、病原性細胞を含む領域を選択的に血栓化して腫瘍もしくは他の病原性細胞への血液供給を制限してしまう恐れのある、生物学的に活性なプロセスに至る可能性がある。また、それらの種類の目的タンパク質は、凝固を誘導することも、凝固を防止することも、あるいは標的病原細胞内及び周囲の血小板が活性化されて凝集するのを防止することもできる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、免疫系に関連する分子、経路、または細胞の活性化によって、標的細胞もしくはウイルスの殺傷または増殖阻害を媒介し得る。目的タンパク質は、先天性免疫系、適応免疫系、及び／またはその両方に関与し得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、自然免疫系の刺激によって、細胞もしくはウイルスの殺傷または増殖阻害を媒介し得る。いくつかの実施形態では、目的タンパク質に、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、及びそれらの合成類似体が包含される。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、生来の免疫系には、補体系を活性化させる目的タンパク質が関与し得る。補体活性化エフェクター構造の非限定的な例は、補体タンパク質Ｃ３のＣ３ａフラグメントであり得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の天然または合成リガンドであり得る。そのような目的タンパク質の例としては、ＴＬＲアゴニストであることが公知である熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）のペプチドフラグメントが挙げられる。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、無痕跡型の生体直交型化学を用い、ＮＯＤ２受容体のムラミルジペプチドアゴニストを製造し、炎症反応を活性化することが可能になる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、適応免疫系の分子または細胞の活性化によって、細胞もしくはウイルスの殺傷または増殖阻害を媒介し得る。適応免疫系に特有な、分子または細胞は、極めて多様な構造を認識するようにエンジニアリングを施すことが可能であり、それにより、目的タンパク質が本質的に活性であるかまたは内因性タンパク質に結合しなければならないという制約が取り除かれる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、抗体または抗体フラグメント（限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖを含む）に対するリガンドであり得る。無痕跡型の生体直交型アプローチを使用すれば、既存の抗体を介して結合されるペプチドまたは他のエピトープを産生することも可能であるし、あるいは作製された目的タンパク質を認識するための抗体を開発することも可能である。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、細胞傷害性タンパク質、殺菌性タンパク質、殺ウイルス性タンパク質、プロアポトーシスタンパク質、血栓形成性タンパク質、補体活性化タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質のフラグメント、またはその抗体もしくはそのフラグメントであり、第１のフラグメント及び第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれる。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、細胞傷害性タンパク質は、ハチメリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、またはＮＫ−リシンである。いくつかの実施形態において、プロアポトーシスタンパク質は、プリオンタンパク質、カスパーゼカスケードと会合したＢａｘ由来最小ポロペプチド、またはプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ）（配列ＩＤ番号：２８）である。いくつかの実施形態において、先天性免疫系刺激タンパク質は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）である。いくつかの実施形態において、補体活性化タンパク質は、補体タンパク質Ｃ３のＣ３ａフラグメントである。いくつかの実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）タンパク質は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）である。いくつかの実施形態において、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質はムラミルジペプチドアゴニストである。いくつかの実施形態において、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）のフラグメント、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチン、βラクタマーゼまたは単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼであり、目的タンパク質の或るフラグメントが、その目的タンパク質の他のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）のフラグメントは、ＭＲＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（配列ＩＤ番号：２９）、またはＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列ＩＤ番号：３０）を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのフラグメントは、ＭＡＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＣＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧ（配列ＩＤ番号：３１）またはＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列ＩＤ番号：３２）を含み、配列中、一方のフラグメントが他方のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のフラグメントは、そのアミノ酸１〜１０５または１０６〜１８６を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０２００】
いくつかの実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンのフラグメントは、そのアミノ酸１〜３４（ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥ；配列ＩＤ番号：３３）または３５〜７６（ＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ；配列ＩＤ番号：３４）を含み、配列中、一方のフラグメントが他方のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、βラクタマーゼのフラグメントは、そのアミノ酸２５〜１９７もしくは１９８〜２８６を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼのフラグメントが、そのアミノ酸１〜２６５または２６６〜３７６を含み、一方のフラグメントが他方のフラグメントと一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれるようになっている。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、一般的なタンパク質分解分析（例えばＬＤ−ＴＡＰＥＲ）用の、目的タンパク質がどこで分断されるかに関する既存の情報が存在しない可能性がある。そのような事例において、タンパク質の三次元結晶構造の検査によって、タンパク質の機能に直接関係する領域から離れた表面ループ内及びターン内に、いくつかの候補標的が提供される場合がある。予測された標的部位における切断によって生じたフラグメントは、好適な相互作用性ロイシンジッパーを有する融合タンパク質として別個に発現することでスクリーニング可能となり、この場合、分割タンパク質が正常に標的化されれば、融合タンパク質が混合された際にタンパク質の活性が回復する。経験的に好適な開裂部位にフラグ付けするためのより迅速なアッセイ溶解度アッセイ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１８，３９９−４０９を参照）、または好ましい円順列アッセイ（Ｍａｓｓｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，１６，９２１−９２６を参照）が利用可能である。それらのアッセイは、構造的情報がなくても適用可能であるが、利用可能な場合には構造的知識によりガイドし、効率化できる。円順列アッセイ用に、最初に、２つのコピーの間に位置するセリン−グリシン連結基（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ；配列ＩＤ番号：２１など）を用いて、目的のコード配列の縦列インフレーム連続二量体を生成する。次いで、好適なプライマーを用いた増幅によって、発現用に、二量体から円順列コード配列ブロックを作製する。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントは、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている。いくつかの実施形態において、第１の融合タンパク質は、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含み、且つ第２の融合タンパク質は、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、第１の融合タンパク質は、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含み、且つ第２の融合タンパク質は、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、第１の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のフラグメントのＮ末端に融合され、且つ第２の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のフラグメントのＮ末端に融合され、あるいは第１の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のフラグメントのＣ末端に融合され、且つ第２の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のフラグメントのＣ末端に融合され、あるいは第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方の相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のフラグメントのＮ末端に融合され、且つ第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の他方の相互作用性タンパク質ドメインは、目的タンパク質のフラグメントのＣ末端に融合される。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の両方は、目的タンパク質とリガンド結合ドメインとの間に連結基を含む。いくつかの実施形態において、各連結基は、独立に、本明細書に記載のＳｅｒ／Ｇｌｙ連結基、ポリアスパラギン連結基、またはアミノ酸配列ＡＧＳＳＡＡＧＳＧＳ（配列ＩＤ番号：１７）を含む連結基である。
【０２０７】
また、本開示には、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び本明細書に記載の融合タンパク質のうちのいずれか１つ以上を具備する、組成物またはキットが提供されている。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、本明細書に記載の小分子リガンドを含む第１のハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の小分子リガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体と、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質と、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質とを具備し、ｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、ｉｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、ｉｉｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｉｖ）第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｖ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｖｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つｖｉｉ）第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントは、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第１のハプロマー・リガンド複合体と、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドから構成される第２のハプロマー・リガンド複合体と、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質と、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質とを具備し、ｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、ｉｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、ｉｉｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｉｖ）第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｖ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｖｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｖｉｉ）第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントは、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、小分子リガンドを含む本明細書に記載の第１のボトルハプロマー・リガンド複合体と、本明細書に記載の小分子リガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体であって、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、第２のハプロマー・リガンド複合体と、小分子リガンドのリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質と、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質とを含み、ｉ）第１のボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｉｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｉｉｉ）第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントは、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、本組成物またはキットは、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドから構成される本明細書に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドから構成される第２のハプロマー・リガンド複合体であって、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、第２のハプロマー・リガンド複合体と、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質と、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質とを具備し、ｉ）第１のボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｉｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つｉｉｉ）第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントは、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている。
【０２１２】
また、本開示はまた、本明細書に記載の任意のハプロマー・リガンド複合体を本明細書に記載の融合タンパク質と組み合わせて使用して、二量体化されたタンパク質または折り畳まれたタンパク質を製造する方法を提供する。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、小分子リガンドを含む第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｂ）標的核酸を、小分子リガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｃ）第１のハプロマー・リガンド複合体を、小分子リガンドに対するリガンド結合ドメインを含む第１の融合タンパク質に接触させることと、ｄ）第２のハプロマー・リガンド複合体を、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインを含む第２の融合タンパク質に接触させることとを含み、ｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、ｉｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、ｉｉｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｉｖ）第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｖ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つｖｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｂ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｃ）第１のハプロマー・リガンド複合体を、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質に接触させることと、ｄ）第２のハプロマー・リガンド複合体を、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、ｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、ｉｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、ｉｉｉ）第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｉｖ）第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、ｖ）第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、ｖｉ）第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに対し相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、第２のハプロマー・リガンド複合体がポリヌクレオチドの標的核酸分子に結合する部分に空間的に近接して、標的核酸分子に結合する。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ステムループ構造に隣接する核酸標的５’の部分に対し相補的であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ステムループ構造に隣接する核酸標的３’の部分に対し相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、核酸標的のステムループ構造のループ構造の５’部分に対し相補的であり、このループ構造の５’部分がステムループ構造のステム領域に隣接していて、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、核酸標的のステムループ構造のループ構造の３’部分に対し相補的であり、このループ構造の３’部分はステムループ構造のステム領域に隣接している。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、小分子リガンドを含む第１のハプロマー・リガンド複合体と小分子リガンドに対するリガンド結合ドメインを含む第１の融合タンパク質との相互作用によって複合体と接触させることとにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることと、ｂ）標的核酸分子を、小分子リガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体と小分子リガンド用のリガンド結合ドメインを含む第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることとにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることとを含み、結果として、前記第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと前記第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第１のハプロマー・リガンド複合体と相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることと、ｂ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体と相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに対し相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、第２のハプロマー・リガンド複合体がポリヌクレオチドの標的核酸分子に結合する部分に空間的に近接して、標的核酸分子に結合する。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ステムループ構造に隣接する核酸標的５’の部分に対し相補的であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ステムループ構造に隣接する核酸標的３’の部分に対し相補的である。いくつかの実施形態において、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、核酸標的のステムループ構造のループ構造の５’部分に対し相補的であり、このループ構造の５’部分がステムループ構造のステム領域に隣接していて、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、核酸標的のステムループ構造のループ構造の３’部分に対し相補的であり、このループ構造の３’部分はステムループ構造のステム領域に隣接している。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、小分子リガンドを含む本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｂ）標的核酸を、小分子リガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ｃ）ボトルハプロマー・リガンド複合体を、小分子リガンドに対するリガンド結合ドメインを含む第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、ｄ）第２のハプロマー・リガンド複合体を、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインを含む第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含むボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｂ）標的核酸を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ｃ）ボトルハプロマー・リガンド複合体を、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、ｄ）第２のハプロマー・リガンド複合体を、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、小分子リガンドを含む本明細書に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｂ）標的核酸を、小分子リガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ｃ）ボトルハプロマー・リガンド複合体を、小分子リガンドに対するリガンド結合ドメインを含む第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、ｄ）第２のハプロマー・リガンド複合体を、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインを含む第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、本方法は、ａ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含むボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、ｂ）標的核酸分子を、相互作用性タンパク質ドメインであるリガンドを含む第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ｃ）ボトルハプロマー・リガンド複合体を、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、ｄ）第２のハプロマー・リガンド複合体を、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている。
【０２２３】
また、本開示には、本明細書に記載のハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質のいずれかを使用して、細胞または細胞標的分子を調節する方法も提供されている。哺乳動物またはヒトに対し対応するハプロマー・リガンド複合体のセットとその対応する融合タンパク質との併用投与は、治療が試みられる疾患、障害または症状の性質に応じて異なる場合がある。いくつかの実施形態では、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を、好適な容器またはチャンバ内の試料に分取する場合もある。いくつかの実施形態では、既にハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を含有する容器に、試料を分取する場合もある。いくつかの実施形態では、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される場合もあればまたはｉｎ  ｓｉｔｕで使用される場合もある。いくつかの実施形態においてヒトに必要とされるのは、そのような治療である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、鋳型化アセンブリ用にハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合がある。そのような治療を促進する目的で、調製されたハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を、任意選択的に好適な送達剤を組み込み、ｅｘ  ｖｉｖｏ法では哺乳動物もしくはヒトまたはその試料と接触させて、任意の好適な緩衝液または製剤中で投与してもよい。ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質の濃縮形態は、その対応物であるハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質とは別個に取り扱ってもよい。高濃度での産物生成反応は、標的核酸分子鋳型の非存在下で起こり得るからである。表１に、様々なハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質から構成される体操性（送達剤なし）ハプロマーの最大許容濃度に関するガイドラインを示す。ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質をその閾値を超える濃度で接触させた場合、非鋳型化バックグラウンド反応が起こり得る。
【０２２５】
【表１】
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【０２２６】
他のハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質の閾値濃度は、開示されている鋳型化アセンブリ診断評価アッセイを利用して経験的に算定できる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、最初に１つのハプロマー・リガンド複合体を投与し、次いで時間遅延が観察された後、対応するハプロマー・リガンド複合体を投与して、１セットの対応するハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を投与することによって、非鋳型反応の可能性を低減し得る。この時間遅延は、系内のハプロマー・リガンド複合体の持続性に応じて、１分〜数日の範囲に及ぶ場合がある。
【０２２８】
カチオン性脂質、ポリエチレンイミン、デキストラン系トランスフェクタントなどのトランスフェクション試薬、または当該技術分野において公知の他のものなどの特定の送達剤は、ハプロマー・リガンド複合体の縮合を引き起こし得る。これらの状況下では、ハプロマー・リガンド複合体を、対応する反応性ハプロマー・リガンド複合体とは別に調製し、別々に試料に投与することもできるし、また、追加の送達剤を添加することなく、ハプロマー・リガンド複合体を適当な緩衝液中に溶解し、裸で投与しても差し支えない。
【０２２９】
また、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質は、好適な送達剤と共に製剤化した後に投与することも可能である。好適な送達剤は、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質の安定性、生物学的利用能、生体内分布、細胞透過性もしくは他の望ましい薬理学的特性、またはこれらの特性の組み合わせを増強できる。当該技術分野において公知の送達剤の例としては、限定されないが、ポリカチオントランスフェクション試薬、ポリエチレンイミン及びその誘導体、ＤＥＡＥ−デキストラン、その他のトランスフェクション試薬、塩、イオン、緩衝剤、可溶化剤、各種ウイルスベクター、リポソーム、標的リポソーム、ナノ粒子、キャリアポリマー、エンドソーム破壊剤、透過処理剤、脂質、ステロイド、界面活性剤、分散剤、安定化剤、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２３０】
また、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質に補助基を共有結合することによって、標的コンパートメントに対するハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質の送達を増強できる。送達を増強し得る補助基としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの化合物の安定性及び生体内分布を増強することが公知である化合物類、ハプロマーの細胞透過性を高める化合物類、例えば、当該分野において公知のコレステロール誘導体類、当該分野において公知のエンドソーム破壊剤類、ポリカチオン（例えば、ポリアルギニン、ポリリジン）などの細胞透過性ペプチド類、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質であるトランスポーターから誘導されたペプチド類、アンテナペディアタンパク質（ペネトラチン）から誘導されるペプチド類を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０２３１】
また、エフェクタータンパク質産物誘発剤、例えば、抗体もしくは他のエフェクタータンパク質産物検出分子またはエフェクタータンパク質産物検出細胞を投与することを、含めてもよい。この投与を、鋳型化アセンブリ手順の一部とすることもできる。本剤は、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質の投与前、投与中、または投与後に、薬剤に適した任意の方法で、投与することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質産物誘発剤の投与後にハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を投与することによって、エフェクタータンパク質が形成されて薬剤結合に利用可能になると直ちに、それらのエフェクタータンパク質によって活性の誘発が促進される。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、複数セットの対応するハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を並行して投与し得る。これらのセットの反応物は、単一の標的核酸上の複数のハイブリダイゼーション部位に結合するか、または異なる標的核酸に結合するか、またはそれらの組み合わせであり得る。種々のセットのハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質は同じタンパク質構造を生成し、それにより、その生成を促進することでそのタンパク質構造で生成される活性のレベルを上昇させ、あるいは種々のセットのハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体及び融合タンパク質によって異なるタンパク質構造を生成し、それにより、試料中に多価活性、またはそれらの組み合わせを生じ得る。複数セットのハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を並行して投与するときには同じ生体直交型反応性基（あるいは、種々のセットのハプロマー・リガンド複合体に対し異なる生体直交型化学を用いたときには互いに反応しない基）を有する種々のセットのハプロマー・リガンド複合体からのリガンド）は、互いに反応性ではないという理由から、高濃度の場合でさえ、併用投与して差し支えない。例えば、アジド−アルキン生体直交型反応系が対応するハプロマー・リガンド複合体の各セットに使用される場合、全てのアジド含有ハプロマー・リガンド複合体を処方して併用投与することができ、試料中のアジドを十分に希釈した後に、全てのアルキン含有ハプロマー・リガンド複合体を処方して併用投与することができる。
【０２３３】
本明細書に記載の方法によるエフェクタータンパク質の産生は、免疫応答の誘導、プログラム細胞死、アポトーシス、壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、がん遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の修飾、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害、ならびにこれらの生物学的活性の組み合わせなどの活性をもたらし得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、投与される組成物は、２セット以上の対応するハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプマー・リガンド複合体、及び２つ以上の標的核酸分子を標的化する融合タンパク質を含み得る。２つ以上の標的核酸分子が、同じ遺伝子転写物内に見出される場合もあれば、あるいは代替的に異なる別々の転写物上に見出される場合もある。同じ細胞転写物内の異なる核酸標的分子を認識する２セット以上の対応するハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質は独立に、同じまたは異なるタンパク質を産生し得る。
【０２３５】
また、標的核酸分子が多量の場合は、鋳型化アセンブリによって産生される活性タンパク質の量が制限されてしまう可能性がある。いくつかの実施形態では、標的区画当たり少なくとも平均５コピーの標的核酸分子が存在する。投与される組成物の投薬量及び濃度に関して、標的核酸分子の利用可能性が考慮される場合がある。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質、またはそれらのうちの１セット以上を含む組成物を病原性細胞に送達する方法が開示されている。本方法には、治療上有効量の１セットまたは複数セットの対応するハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質組成物を病原性細胞に投与することを、含める場合もある。また、いくつかの実施形態では、標的核酸分子の存在または非存在を検出した後、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質組成物を投与することを本方法に含める場合もある。
【０２３７】
医薬組成物は、以下の経路：経口、局所、全身（例えば、経皮、鼻腔内、または坐剤）、または非経口（例えば、筋肉内、皮下、または静脈内注射）のうちの１つを介して投与できる。本組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、エアロゾル剤、または任意の他の適切な組成物の形態を取る場合もあれば、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて少なくとも１つの化合物を含む場合もある。好適な賦形剤は当業者に周知であり、且つ本組成物の処方方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａなどの標準的な参考文献に見出すことができる。特に注射用溶液に好適な液体担体には、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、及びグリコールが含まれる。
【０２３８】
注射用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含み得る。あらゆる場合において、本組成物は無菌である必要があると共に、容易な注射可能性が存在する程度に流動的である必要がある。本組成物は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならないと共に、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。好適な流動性を維持する手段としては、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用が挙げられる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって達成できる。多くの事例では、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール類、及び塩化ナトリウムを含める場合がある。組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって、注射用組成物の持続的吸収を実現できる。
【０２３９】
滅菌注射用溶液は、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を含有する組成物を、上に列挙されている成分の１つまたは組み合わせと共に好適な量で、適切な溶媒中に組み込むことによって調製できる。概して、分散液は、基本分散媒と上に列挙されているものからの他の所要成分とを含有する滅菌ビヒクル中に、組成物を組み込むことによって調製される。
上記のように、ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質を含有する組成物が好適に保護されている場合、本組成物を経口投与用に、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に処方できる。組成物及び他の成分を、硬殻もしくは軟殻ゼラチンカプセルに封入することも、錠剤に圧縮することも、あるいは被験者の食事に直接組み込むこともできる。経口治療投与用に、本組成物を賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用してもよい。本組成物及び調製物の割合は、当然のことながら、変動する場合もある。そのような治療上有用な組成物中のハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質の量は、好適な投薬量が得られるように適合されている。
【０２４０】
投薬の容易さ及び投与量の均一性を期して、組成物を投薬単位形態で処方することが有利な場合もある。各投薬単位形態は、所定量のハプロマー・リガンド複合体と、ボトルハプロマー・リガンド複合体と、融合タンパク質とを含み、これらは、医薬担体に関連する活性エフェクター産物の量が求められるように計算されている。新規な投薬単位形態の仕様は、標的化の対象となる鋳型化アセンブリ組成物の独特の特徴、及び達成すべき特定の療法効果に依存する。投薬量は、通常の用量、及び成分の投与様式を参照することによって決定される。
【０２４１】
ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質組成物は、本組成物中に担体を組み込み、許容されない生物学的効果を引き起こすことなしに、または組成物の他の成分と許容されない方法で相互作用することなしに、担体を患者に投与できるような、医薬的に許容される担体を含み得る。そのような医薬的に許容される担体は典型的に、毒物学的試験及び製造試験の必要基準を満たし、米国食品医薬品局によって好適な不活性成分として同定された材料を具備する。
【０２４２】
ハプロマー・リガンド複合体、ボトルハプロマー・リガンド複合体、及び融合タンパク質は、医薬的に許容される塩として調製できる。そのような塩は、例えば、哺乳動物などの患者に投与する目的に許容される塩基または酸から調製される塩（例えば、所与の投薬レジームで、許容される哺乳動物に対し安全性が確保される塩）であり得る。但し、了解されるように、本明細書中で扱われている塩は、必ずしも医薬的に許容される塩（例えば、患者への投与にはふさわしくないハプロマーの塩）でなくてもよい。医薬的に許容される塩は、医薬的に許容される無機または有機塩基から、及び医薬的に許容される無機または有機酸から誘導できる。加えて、アミンのような塩基性残基と、カルボン酸のような酸性残基と、の両方がハプロマーに含有される場合、双性イオンが形成される可能性があり、この双性イオンは、本明細書中に用いられている「塩」という用語に組み込まれる。医薬的に許容される無機塩基から誘導される塩には、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛の塩などが包含される場合がある。医薬的に許容される有機塩基から誘導される塩としては、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ、Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペラジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのような、置換アミン、環式アミン、天然起源のアミン及びそれらに類するものを含めた一級、二級、及び三級アミンの塩を挙げることができる。医薬的に許容される無機酸から誘導される塩としては、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸またはヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸及び硫酸の塩を挙げることができる。医薬的に許容される有機酸から誘導される塩としては、脂肪族ヒドロキシル酸の塩（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸及び酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸及びトリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチシン酸、馬尿酸及びトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸及び３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸及びコハク酸）、グルコロン酸、マンデル酸、粘液酸、ニコチン酸、オロト酸、パモ酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、エジシル酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸などを挙げることができる。
【０２４３】
本明細書に記載のプロセスによって（二量体化または折り畳みを介して）生成されるエフェクタータンパク質は、所望される作用を駆動するトリガーである。所望されるタンパク質活性のいくつか例としては、限定されないが、免疫応答の誘導、プログラム細胞死、アポトーシス、非特異的壊死またはプログラム壊死、溶解、増殖阻害、ウイルス感染の阻害、ウイルス複製の阻害、がん遺伝子発現の阻害、遺伝子発現の修飾、微生物感染の阻害、及び微生物複製の阻害、ならびにこれらの生物学的活性の組み合わせを挙げることができる。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質は、病原性細胞の部位で免疫応答を誘導するための抗体に対するリガンドとして、または治療有効量を担持する抗体などの抗体指向性治療を病原性細胞の部位に局在化させるための抗体に対するリガンドとして機能し得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質は、標的遺伝子の発現を調節し得る。いくつかの実施形態において、産生されたタンパク質は、酵素活性、遺伝子／タンパク質発現、分子シグナル伝達、及び分子間相互作用を制御し得る。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、二量体化ドメインであるＦＫＢＰまたはＦＲＢの使用を含む、これらのドメインは、目的タンパク質フラグメントとの融合タンパク質として発現したときにそのパフォーマンスを向上させるための特定の方法で改変された。特に、ＦＫＢＰ及びＦＲＢの両方が単一システイン残基を有することが観察された。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼならびに免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖を含むがこれらに限定されない目的タンパク質フラグメントの多くはそれ自体、いくつかの場合においてジスルフィド結合の形成及び折り畳みにとって構造的に重要な複数のシステインを有する。ＦＫＢＰ及びＦＲＢの両方に存在していたのは単一のシステインだけであったので、ジスルフィド結合が二量体化ドメイン自体の折り畳みに不可欠であるということは事実ではあり得なかった。したがって、ＦＫＢＰ及びＦＲＢシステインは、構造的に不正な内部クロスジスルフィド結合を形成することによって、所望される融合タンパク質折り畳み成熟を潜在的に妨害する可能性があると見なされた。言い換えれば、これらのドメインの安定性及びリガンド結合活性と変更とに適合性があることを前提とした場合、ＦＫＢＰ及びＦＲＢシステインを代替アミノ酸残基で保存的置換すれば有益であり得る。それゆえ、いくつかの実施形態では、Ｆ３６Ｖ変異型だけでなくＦＫＢＰの変異型も同様に、システインからセリンへの変異（Ｃ２２Ｓ）を含んでいた。他の或る実施形態では、システインからアラニンへの突然変異（Ｃ２２Ａ）またはシステインからバリンへの突然変異（Ｃ２２Ｖ）もまた、使用される場合がある。いくつかの態様では、ＦＲＢの変異型は類似の様式にて、システインからセリンへの変異（Ｃ６１Ｓ）と共に用いられ、あるいは他の或る態様では、システインからアラニンへの変異（Ｃ６１Ａ）またはシステインからバリンへの変異（Ｃ６１Ｖ）と共に用いられる。
【０２４５】
あらゆる事例において、所望のコード配列変化がプライマーのうちの１つによって指定された、コード配列の２つの重複ブロックを増幅することにより、突然変異誘発が標準的な様式で為された。後続のＰＣＲラウンドで、配列決定により確証された配列ブロックどうしを適正に融合することが可能となった。
【０２４６】
以下のような代表的な実施形態が提示されている。
実施形態１
標的核酸分子に対し実質的に相補的なポリヌクレオチドを含むハプロマーと、ハプロマーの５’末端または３’末端に連結され、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドと、を含む、ハプロマー・リガンド複合体。
【０２４７】
実施形態２
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２４８】
実施形態３
リガンドが小分子リガンドまたは相互作用性タンパク質ドメインである、実施形態１または実施形態２に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２４９】
実施形態４
小分子リガンドが約２５００ダルトン未満である、実施形態３に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５０】
実施形態５
小分子リガンドが、小分子、約２０アミノ酸残基未満のペプチド、天然もしくは人工的に修飾されたペプチド、ペプチド模倣物、グリカン、有機酵素補因子、または人工的に誘導された小分子リガンド、実施形態４に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５１】
実施形態６
小分子リガンドがＦＫＭ一価リガンドである、実施形態３に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５２】
実施形態７
ＦＫＭ一価リガンドがＦＫＭ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳ、またはＭＦＬ２であり、ＦＫＭ−ＮＨＳが
【化４０】
2019535281.tif 000048
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳが
【化４１】
2019535281.tif 000049
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳが
【化４２】
2019535281.tif 000050
（式中、ｘは１〜６）であり、且つＭＦＬ２が
【化４３】
2019535281.tif 000051
である、実施形態６に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５３】
実施形態８
リガンドは生体直交型残基を更に含む、実施形態１〜７のいずれか一項に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５４】
実施形態９
生体直交型残基が、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体である、実施形態８に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２５５】
実施形態１０
リガンドがＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳ及びＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳから選択されるＦＫＭ一価リガンドであり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳが
【化４４】
2019535281.tif 000052
（式中、ｘは１〜６）であり、且つＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳが
【化４５】
2019535281.tif 000053
（式中、ｘは１〜６）である、実施形態８に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５６】
実施形態１１
相互作用性タンパク質ドメインは、１００アミノ酸残基未満を含む、実施形態３に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５７】
実施形態１２
相互作用性タンパク質ドメインがロイシンジッパードメインである、実施形態１１に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５８】
実施形態１３
相互作用性タンパク質ドメインが、ｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである、実施形態１２に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２５９】
実施形態１４
ＮＺドメインが、そのアミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインが、そのアミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む、実施形態１３に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２６０】
実施形態１５
ｃ−ｊｕｎドメインのＮ末端がハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結されている、実施形態１２に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２６１】
実施形態１６
ｃ−ｊｕｎドメインが、そのアミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＬＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＣＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１２）を含む、実施形態１５に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２６２】
実施形態１７
ｃ−ｊｕｎドメインのＣ末端が、ハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結されている、実施形態１２に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２６３】
実施形態１８
ｃ−ｊｕｎドメインが、そのアミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）、またはＳＧＡＳＬＥＲ１ＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む、実施形態１７に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０２６４】
実施形態１９
第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態１の第１のハプロマー・リガンド複合体及び実施形態１の第２のハプロマー・リガンド複合体を含む、組成物またはキット。
【０２６５】
実施形態２０
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに対し実質的に相補的である、実施形態１９に記載の組成物またはキット。
【０２６６】
実施形態２１
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的である、実施形態１９に記載の組成物またはキット。
【０２６７】
実施形態２２
第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２６８】
実施形態２３  両方のリガンドは小分子リガンドであるか、または両方のリガンドが相互作用性タンパク質ドメインである、実施形態１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２６９】
実施形態２４
両方の小分子リガンドが約２５００ダルトン未満である、実施形態２３に記載の組成物またはキット。
【０２７０】
実施形態２５
両方の小分子リガンドが小分子、約２０アミノ酸残基未満のペプチド、天然もしくは人工的に修飾されたペプチド、ペプチド模倣物、グリカン、有機酵素補因子、または人工的に誘導された小分子リガンドである、実施形態２４に記載の組成物またはキット。
【０２７１】
実施形態２６
両方の小分子リガンドがＦＫＭ一価リガンドである、実施形態２３に記載の組成物またはキット。
【０２７２】
実施形態２７
各ＦＫＭ一価リガンドが独立にＦＫＭ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳ、またはＭＦＬ２であり、ＦＫＭ−ＮＨＳが
【化４６】
2019535281.tif 000054
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳが
【化４７】
2019535281.tif 000055
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳが
【化４８】
2019535281.tif 000056
（式中、ｎは１〜６）であり、ＭＦＬ２が
【化４９】
2019535281.tif 000057
である、実施形態２６に記載の組成物またはキット。
【０２７３】
実施形態２８
第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが生体直交型残基を更に含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが生体直交型残基を更に含み、第１のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基が、第２のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基と反応可能である、実施形態１９〜２７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２７４】
実施形態２９
反応性の生体直交型残基が、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、実施形態２８に記載の組成物またはキット。
【０２７５】
実施形態３０
第１のハプロマー・リガンド複合体または第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの一方のリガンドがＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳであり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳが ＭＴＺ−ＮＨＳというＦＫＭ一価リガンドであり、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体または第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のリガンドがＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳであり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳが
【化５０】
2019535281.tif 000058
（式中、ｘは１〜６）であり、且つＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳが
【化５１】
2019535281.tif 000059
（式中、ｘは１〜６）である、実施形態２８に記載の組成物またはキット。
【０２７６】
実施形態３１
両方の相互作用性タンパク質ドメインがそれぞれ１００アミノ酸残基未満を含む、実施形態２３に記載の組成物またはキット。
【０２７７】
実施形態３２
両方の相互作用性タンパク質ドメインがロイシンジッパードメインである、実施形態３１に記載の組成物またはキット。
【０２７８】
実施形態３３
各相互作用性タンパク質ドメインが独立にｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである、実施形態３２に記載の組成物またはキット。
【０２７９】
実施形態３４
第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態３３に記載の組成物またはキット。
【０２８０】
実施形態３５
第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態３３に記載の組成物またはキット。
【０２８１】
実施形態３６
第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、あるいは第１のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端は、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態３３に記載の組成物またはキット。
【０２８２】
実施形態３７
ＮＺドメインが、そのアミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインが、そのアミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む、実施形態３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２８３】
実施形態３８
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインであり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインである、実施形態３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２８４】
実施形態３９
ｃ−ｊｕｎドメインが、アミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、ＡまたはＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１６）を含む、実施形態３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２８５】
実施形態４０
ｃ−ｊｕｎドメインのＣ末端が、第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のいずれかまたは両方のポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に連結されている、実施形態３５または実施形態３６に記載の組成物またはキット。
【０２８６】
実施形態４１
ｃ−ｊｕｎドメインが、アミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）、またはＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む、実施形態４０に記載の組成物またはキット。
【０２８７】
実施形態４２
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインまたはｃ−ｍｙｃドメインであり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインまたはｃ−ｍｙｃドメインである、実施形態３３〜３６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０２８８】
実施形態４３
第１のハプロマー・リガンド複合体または第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインであり、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｍｙｃドメインである、実施形態４２に記載の組成物またはキット。
【０２８９】
実施形態４４
ａ）本ポリヌクレオチドが、ｉ）約１０〜約２０ヌクレオチド塩基を含む第１のステム部分と、ｉｉ）約１６〜約４０ヌクレオチド塩基を含み、且つその第１の端に第１のステム部分が結合し、標的核酸分子に対し実質的に相補的である抗標的ループ部分と、ｉｉｉ）抗標的ループ部分の第２の端部に連結された約１０〜約２０のヌクレオチド塩基を含み、第１のステム部分に対し実質的に相補的である第２のステム部分と、を具備するボトルハプロマーと、ｂ）第１のステム部分または第２のステム部分のいずれかの末端に連結し、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドと、を具備するボトルハプロマー・リガンド複合体であって、抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが、第１のステム部分：第２のステム部分のＴmよりも大きい、ボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９０】
実施形態４５
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約４０℃である、実施形態４４に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９１】
実施形態４６
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmが、約４０℃〜約５０°Ｃである、実施形態４４または実施形態４５に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９２】
実施形態４７
抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmが約６０℃〜約８０°Ｃである、実施形態４４〜４６のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９３】
実施形態４８
第１のステム部分：第２のステム部分のＴmを抗標的ループ部分：標的核酸分子のＴmから減算した残余が、約１０℃〜約２０℃である、実施形態４４〜４７に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９４】
実施形態４９
第１のステム部分が約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、実施形態４４〜４８のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９５】
実施形態５０
抗標的ループ部分が約１８〜約３５ヌクレオチド塩基を含む、実施形態４４〜４９のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９６】
実施形態５１
第２のステム部分が約１２〜約１８ヌクレオチド塩基を含む、実施形態４４〜５０のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９７】
実施形態５２
第１のステム部分、抗標的ループ部分、及び第２のステム部分のうちのいずれか１つ以上のヌクレオチド塩基が、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態４４〜５１のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９８】
実施形態５３
第１のステム部分と抗標的ループ部分との間、抗標的ループ部分と第２のステム部分との間、及び第２のステム部分と反応性エフェクター残基との間、のうちのいずれか１つ以上の間の連結基を更に含む、実施形態４４〜５２のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０２９９】
実施形態５４
連結基がアルキル基、アルケニル基、アミド、エステル、チオエステル、ケトン、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エチレングリコール、シクロアルキル基、ベンジル基、複素環基、マレイミジル基、ヒドラゾン、ウレタン、アゾール、イミン、ハロアルキル及びカルバメート、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態５３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３００】
実施形態５５
抗標的ループ部分が、内部ヒンジ領域を更に含み、このヒンジ領域が、標的核酸分子に対し相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含む、実施形態４４〜５４のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０１】
実施形態５６
ヒンジ領域が約１ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドを含む、実施形態５５に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０２】
実施形態５７
ヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：６）、または５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：７）を含む、実施形態４４〜５６のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０３】
実施形態５８
リガンドが小分子リガンドまたは相互作用性タンパク質ドメインである、実施形態４４〜５７のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０４】
実施形態５９
小分子リガンドが約２５００ダルトン未満である、実施形態５８に記載のハプロマー・リガンド複合体。
【０３０５】
実施形態６０
小分子リガンドが、小分子、約２０アミノ酸残基未満のペプチド、天然もしくは人工的に修飾されたペプチド、ペプチド模倣物、グリカン、有機酵素補因子、または人工的に誘導された小分子リガンド、実施形態５９に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０６】
実施形態６１
小分子リガンドがＦＫＭ一価リガンドである、実施形態５８に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０７】
実施形態６２
ＦＫＭ一価リガンドが、ＦＫＭ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳ、ＭＦＬ２であって、
ＦＫＭ−ＮＨＳが
【化５２】
2019535281.tif 000060
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳが
【化５３】
2019535281.tif 000061
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳが
【化５４】
2019535281.tif 000062
（式中、ｎは１〜６）であり、且つＭＦＬ２が
【化５５】
2019535281.tif 000063
である、実施形態６１に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０８】
実施形態６３
リガンドが生体直交型残基を更に含む、実施形態４４〜６２のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３０９】
実施形態６４
生体直交型残基が、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体である、実施形態６３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１０】
実施形態６５
リガンドがＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳ及びＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳから選択されるＦＫＭ一価リガンドであり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳが
【化５６】
2019535281.tif 000064
（式中、ｘは１〜６）であり、且つＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳが
【化５７】
2019535281.tif 000065
（式中、ｘは１〜６）である、実施形態６３に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１１】
実施形態６６
相互作用性タンパク質ドメインが１００アミノ酸残基未満を含む、実施形態５８に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１２】
実施形態６７
相互作用性タンパク質ドメインがロイシンジッパードメインである、実施形態６６に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１３】
実施形態６８
相互作用性タンパク質ドメインがｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである、実施形態６７に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１４】
実施形態６９
ＮＺドメインが、そのアミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインが、そのアミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む、実施形態６８に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１５】
実施形態７０
ｃ−ｊｕｎドメインのＮ末端がボトルハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結されている、実施形態６７に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１６】
実施形態７１
ｃ−ｊｕｎドメインが、そのアミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＣＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１２）を含む、実施形態７０に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１７】
実施形態７２
ｃ−ｊｕｎドメインのＣ末端が、ボトルハプロマーのポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結されている、実施形態６７に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１８】
実施形態７３
ｃ−ｊｕｎドメインが、そのアミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）、またはＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む、実施形態７２に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体。
【０３１９】
実施形態７４
実施形態４４〜７３のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体と、第２のハプマー・リガンド複合体と、を具備する組成物またはキットであって、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的である約６〜約２０ヌクレオチド塩基を含むヌクレオチド部分と、第２のハプマー・リガンド複合体のヌクレオチド部分の５’末端または３’末端に連結し、リガンドパートナー結合部位を含むリガンドとを含み、この第２のハプロマー・リガンド複合体において、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結された第１または第２のステム部分のＴmが、ボトルハプロマー・リガンド複合体の第１のステム部分：第２のステム部分のＴmに等しいかそれ未満である、組成物またはキット。
【０３２０】
実施形態７５
第２のハプロマー・リガンドＣ複合体と、リガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体の第１または第２のステム部分とによって形成される二重鎖のＴmを、ボトルハプロマー・リガンド複合体の第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約０℃〜約２０℃である、実施形態７４に記載の組成物またはキット。
【０３２１】
実施形態７６
リガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体の第２のハプロマー・リガンド複合体及び第１または第２のステム部分によって形成される二重鎖のＴmが約３０℃〜約４０℃である、実施形態７４または実施形態７５に記載の組成物またはキット。
【０３２２】
実施形態７７
リガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体の第２のハプロマー・リガンド複合体及び第１または第２のステム部分によって形成される二重鎖のＴmをボトルハプロマー・リガンド複合体の第１のステム部分：第２のステム部分のＴmから減算した残余が約５°Ｃ〜約１０℃である、実施形態７４〜７６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３２３】
実施形態７８
第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが約８〜約１５ヌクレオチド塩基を含む、実施形態７４〜７７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３２４】
実施形態７９
ボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、２−Ｏ−アルキル化ＲＮＡヌクレオチド、ハロゲン化ヌクレオチド、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸類似体（モルホリノ）、シュードウリジンヌクレオチド、キサンチンヌクレオチド、ヒポキサンチンヌクレオチド、２−デオキシイノシンヌクレオチド、Ｌ−リボースを有するＤＮＡ類似体（Ｌ−ＤＮＡ）、Ｘｅｎｏ核酸（ＸＮＡ）類似体、もしくは塩基対形成が可能な他の核酸類似体、骨格が改変された人工核酸類似体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態７４〜７８のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３２５】
実施形態８０
両方のリガンドは小分子リガンドであるか、または両方のリガンドが相互作用性タンパク質ドメインである、実施形態７４〜７９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３２６】
実施形態８１
両方の小分子リガンドが約２５００ダルトン未満である、実施形態８０に記載の組成物またはキット。
【０３２７】
実施形態８２
両方の小分子リガンドが小分子、約２０アミノ酸残基未満のペプチド、天然もしくは人工的に修飾されたペプチド、ペプチド模倣物、グリカン、有機酵素補因子、または人工的に誘導された小分子リガンドである、実施形態８１に記載の組成物またはキット。
【０３２８】
実施形態８３
両方の小分子リガンドがＦＫＭ一価リガンドである、実施形態８０に記載の組成物またはキット。
【０３２９】
実施形態８４
各ＦＫＭ一価リガンドが独立にＦＫＭ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳ、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳ、またはＭＦＬ２であり、ＦＫＭ−ＮＨＳが
【化５８】
2019535281.tif 000066
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−スルホ−ＮＨＳが
【化５９】
2019535281.tif 000067
（式中、ｍは３〜６）であり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＮＨＳが
【化６０】
2019535281.tif 000068
（式中、ｎは１〜６）であり、且つＭＦＬ２が
【化６１】
2019535281.tif 000069
である、実施形態８３に記載の組成物またはキット。
【０３３０】
実施形態８５
ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドは生体直交型残基を更に含み、ボトルハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基が、第２のハプロマー・リガンド複合体の生体直交型残基と反応可能である、実施形態７４〜８４のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３３１】
実施形態８６
反応性の生体直交型残基が、アジド、アルキン、シクロオクチン、ニトロン、ノルボルネン、オキサノルボルナジエン、ホスフィン、ジアルキルホスフィン、トリアルキルホスフィン、ホスフィノチオール、ホスフィノフェノール、シクロオクテン、ニトリルオキシド、チオエステル、テトラジン、イソニトリル、テトラゾールもしくはクアドリシクラン、またはそれらの任意の誘導体から選択される、実施形態８５に記載の組成物またはキット。
【０３３２】
実施形態８７
ボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの一方のリガンドは、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳであるＦＫＭ一価リガンドであり、且つボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のリガンドは、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳであるＦＫＭ一価リガンドであり、ＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＭＴＺ−ＮＨＳが
【化６２】
2019535281.tif 000070
（式中、ｘは１〜６）であり、且つＦＫＭ−ＰＥＧ３−ＴＣＯ−ＮＨＳが
【化６３】
2019535281.tif 000071
（式中、ｘは１〜６）である、実施形態８５に記載の組成物またはキット。
【０３３３】
実施形態８８
両方の相互作用性タンパク質ドメインがそれぞれ１００アミノ酸残基未満を含む、実施形態８０に記載の組成物またはキット。
【０３３４】
実施形態８９
両方の相互作用性タンパク質ドメインがロイシンジッパードメインである、実施形態８８に記載の組成物またはキット。
【０３３５】
実施形態９０
各相互作用性タンパク質ドメインが独立にｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである、実施形態８９に記載の組成物またはキット。
【０３３６】
実施形態９１
ボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態９０に記載の組成物またはキット。
【０３３７】
実施形態９２
ボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態９０に記載の組成物またはキット。
【０３３８】
実施形態９３
ボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、あるいはボトルハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＮ末端が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体の相互作用性タンパク質ドメインのＣ末端が、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結されている、実施形態９０に記載の組成物またはキット。
【０３３９】
実施形態９４
ＮＺドメインがアミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインがアミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む、実施形態９０〜９３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３４０】
実施形態９５
ボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体に連結されているリガンドが、ｃ−ｊｕｎドメインであり、且つ、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインである、実施形態９０〜９３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３４１】
実施形態９６
ｃ−ｊｕｎドメインは、アミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１２）を含む、実施形態９０〜９３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３４２】
実施形態９７
ｃ−ｊｕｎドメインのＣ末端が、ボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のいずれかまたは両方のポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に連結されている、実施形態９２または実施形態９３に記載の組成物またはキット。
【０３４３】
実施形態９８
ｃ−ｊｕｎドメインが、アミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）またはＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む、実施形態９７に記載の組成物またはキット。
【０３４４】
実施形態９９
ボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体に連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインまたはｃ−ｍｙｃドメインであり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインまたはｃ−ｍｙｃドメインである、実施形態９０〜９３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３４５】
実施形態１００
ボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの一方のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｊｕｎドメインであり、且つボトルハプロマー・リガンド複合体及び第２のハプロマー・リガンド複合体のうちの他方のポリヌクレオチドに連結されているリガンドがｃ−ｍｙｃドメインである、実施形態９９に記載の組成物またはキット。
【０３４６】
実施形態１０１
ボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体がヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：６）を含み、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：８）を含むか、またはボトルハプロマーのポリヌクレオチド−リガンド複合体がヌクレオチド配列５’−ＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：７）を含み、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：９）を含む、実施形態７４〜１００のいずれか一項に記載のキット。
【０３４７】
実施形態１０２
次式：
【化６４】
2019535281.tif 000072
（式中、ｍは３〜６）を有する化合物。
【０３４８】
実施形態１０３
次式：
【化６５】
2019535281.tif 000073
（式中、ｍは３〜６）を有する化合物。
【０３４９】
実施形態１０４
次式：
【化６６】
2019535281.tif 000074
（式中、ｎは１〜６）を有する化合物。
【０３５０】
実施形態１０５
次式：
【化６７】
2019535281.tif 000075
（式中、ｘは１〜６）を有する化合物。
【０３５１】
実施形態１０６
次式：
【化６８】
2019535281.tif 000076
（式中、ｘは１〜６）を有する化合物。
【０３５２】
実施形態１０６Ｂ
次式：
【化６９】
2019535281.tif 000077
を有する化合物。
【０３５３】
実施形態１０７
リガンド結合ドメインが、小分子リガンド用のリガンド結合ドメインまたは相互作用性タンパク質ドメインである、リガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質。
【０３５４】
実施形態１０８
リガンド結合ドメインが小分子リガンド用のリガンド結合ドメインである、実施形態１０７に記載の融合タンパク質。
【０３５５】
実施形態１０９
リガンド結合ドメインがＦＫＢＰドメインまたはＦＲＢドメインである、実施形態１０８に記載の融合タンパク質。
【０３５６】
実施形態１１０
ＦＫＢＰドメインが変異型ＦＫＢＰドメインである、実施形態１０９に記載の融合タンパク質。
【０３５７】
実施形態１１０Ｂ
ＦＫＢＰドメインがＣ２２Ｓ、Ｃ２２Ａ、またはＣ２２Ｖ置換を含むか、またはＦＲＢドメインがＣ６１Ｓ、Ｃ６１Ａ、またはＣ６１Ｖ置換を含む、実施形態１０８に記載の融合タンパク質。
【０３５８】
実施形態１１１
変異型ＦＫＢＰドメインがＦ３６ＶＦＫＢＰ変異型ドメインであり、この変異型ドメインが、アミノ酸配列ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列ＩＤ番号：１４）またはＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列ＩＤ番号：１５）を含む、実施形態１１０に記載の融合タンパク質。
【０３５９】
実施形態１１２
リガンド結合ドメインが相互作用性タンパク質ドメインである、実施形態１０７に記載の融合タンパク質。
【０３６０】
実施形態１１３
相互作用性タンパク質ドメインが１００アミノ酸残基未満を含む、実施形態１１２に記載の融合タンパク質。
【０３６１】
実施形態１１４
相互作用性タンパク質ドメインがロイシンジッパードメインである、実施形態１１２に記載の融合タンパク質。
【０３６２】
実施形態１１５
相互作用性タンパク質ドメインがｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメイン、ｃ−ｍａｘドメイン、ＮＺドメイン、またはＣＺドメインである、実施形態１１４に記載の融合タンパク質。
【０３６３】
実施形態１１６
相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＮ末端に融合されている、実施形態１１５に記載の融合タンパク質。
【０３６４】
実施形態１１７
相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＣ末端に融合されている、実施形態１１５に記載の融合タンパク質。
【０３６５】
実施形態１１８
ＮＺドメインが、アミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインが、アミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む、実施形態１１５〜１１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３６６】
実施形態１１９
ｃ−ｊｕｎドメインが、アミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１２）を含む、実施形態１１５〜１１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３６７】
実施形態１２０
ｃ−ｊｕｎドメインが、アミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）、ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む、実施形態１１５〜１１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３６８】
実施形態１２１
ｃ−Ｆｏｓドメインが、アミノ酸配列ＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：３）またはＳＧＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１３）を含む、実施形態１１５〜１１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３６９】
実施形態１２２
融合タンパク質が、目的タンパク質とリガンド結合ドメインとの間に連結基を含む、実施形態１０７〜１２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３７０】
実施形態１２３
連結基がＳｅｒ／Ｇｌｙ連結基、ポリアスパラギン連結基、またはアミノ酸配列ＡＧＳＳＡＡＧＳＧＳ（配列ＩＤ番号：１７）を含む連結基である、実施形態１２２に記載の融合タンパク質。
【０３７１】
実施形態１２４
ポリアスパラギン連結基が約８〜約１６個のアスパラギン残基を含む、実施形態１２３に記載の融合タンパク質。
【０３７２】
実施形態１２５
Ｓｅｒ／Ｇｌｙ連結基が、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：１８）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：１９）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２０）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２１）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２３）、ＳＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：２４）、ＳＧＳＧ（配列ＩＤ番号：２５）、ＳＧＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：２６）、またはＳＧＳＧＧ（配列ＩＤ番号：２７）を含む、実施形態１２３に記載の融合タンパク質。
【０３７３】
実施形態１２６
目的タンパク質が、細胞傷害性タンパク質、殺菌性タンパク質、殺ウイルス性タンパク質、プロアポトーシスタンパク質、血栓形成性タンパク質、補体活性化タンパク質、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質のフラグメント、またはその抗体もしくはそのフラグメントである、実施形態１０７〜１２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３７４】
実施形態１２７
細胞傷害性タンパク質がハチメリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、またはＮＫ−リシンであり、プロアポトーシスタンパク質がプリオンタンパク質、カスパーゼカスケードに関連するＢａｘ由来最小ポロペプチド、またはプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ2（配列ＩＤ番号：２８））であり、先天性免疫系刺激タンパク質が。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）であり、補体活性化タンパク質が補体タンパク質Ｃ３のＣ３ａフラグメントであり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）タンパク質が熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）であり、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質がムラミルジペプチドアゴニストであり、且つ抗体フラグメントがＦａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである、実施形態１２６に記載の融合タンパク質。
【０３７５】
実施形態１２８
目的タンパク質は、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチン、βラクタマーゼ、または単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼのフラグメントである、実施形態１０７〜１２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【０３７６】
実施形態１２９
スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）のフラグメントが、ＭＲＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（配列ＩＤ番号：２９）またはＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列ＩＤ番号：３０）を含み、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのフラグメントが、ＭＡＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＣＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧ（配列ＩＤ番号：３１）またはＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列ＩＤ番号：３２）を含み、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のフラグメントが、そのアミノ酸１〜１０５または１０６〜１８６を含み、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンのフラグメントが、そのアミノ酸１〜３４（ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥ；配列ＩＤ番号：３３）または３５〜７６（ＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ；配列ＩＤ番号：３４）を含み、βラクタマーゼのフラグメントが、そのアミノ酸２５〜１９７または１９８〜２８６を含み、且つ単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼのフラグメントが、そのアミノ酸１〜２６５または２６６〜３７６を含む、実施形態１２８に記載の融合タンパク質。
【０３７７】
実施形態１３０
実施形態１０７に記載の第１の融合タンパク質と実施形態１０７に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１の融合タンパク質の目的タンパク質及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質が二量体化可能または一体的に折り畳み可能である、組成物またはキット。
【０３７８】
実施形態１３１
第１の融合タンパク質が、小分子リガンドのリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質を含み、第２の融合タンパク質が、小分子リガンドのリガンド結合ドメインに融合された目的タンパク質を含む、実施形態１３０に記載の組成物またはキット。
【０３７９】
実施形態１３２
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の両方のリガンド結合ドメインが、ＦＫＢＰドメインまたはＦＲＢドメインである、実施形態１３１に記載の組成物またはキット。
【０３８０】
実施形態１３３
ＦＫＢＰドメインが変異型ＦＫＢＰドメインである、実施形態１３２に記載の組成物またはキット。
【０３８１】
実施形態１３３Ｂ
ＦＫＢＰドメインがＣ２２Ｓ、Ｃ２２Ａ、またはＣ２２Ｖ置換を含むか、またはＦＲＢドメインがＣ６１Ｓ、Ｃ６１Ａ、またはＣ６１Ｖ置換を含む、実施形態１３２に記載の融合タンパク質。
【０３８２】
実施形態１３４
変異型ＦＫＢＰドメインがＦ３６ＶＦＫＢＰ変異型ドメインを含み、この変異型ドメインが、アミノ酸配列ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列ＩＤ番号：１４）またはＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列ＩＤ番号：１５）を含む、実施形態１３３に記載の組成物またはキット。
【０３８３】
実施形態１３５
第１の融合タンパク質が、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質を含み、第２の融合タンパク質が、相互作用性タンパク質ドメインに融合された目的タンパク質を含む、実施形態１３０に記載の組成物またはキット。
【０３８４】
実施形態１３６
両方の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインが１００アミノ酸残基未満を含む、実施形態１３５に記載の組成物またはキット。
【０３８５】
実施形態１３７
両方の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインがロイシンジッパードメインである、実施形態１３５に記載の組成物またはキット。
【０３８６】
実施形態１３８
第１の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメイン及び第２の融合タンパク質が独立にＮＺドメイン、ＣＺドメイン、ｃ−ｊｕｎドメイン、ｃ−ｆｏｓドメイン、ｃ−ｍｙｃドメインまたはｃ−ｍａｘドメインである、実施形態１１４に記載の組成物またはキット。
【０３８７】
実施形態１３９
第１の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＮ末端に融合され、且つ第２の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＮ末端に融合され、第１の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＣ末端に融合され、且つ第２の融合タンパク質の相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＣ末端に融合され、あるいは第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の一方の相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＮ末端に融合され、且つ第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の他方の相互作用性タンパク質ドメインが目的タンパク質のＣ末端に融合される、実施形態１３５〜１３８のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３８８】
実施形態１４０
ＮＺドメインが、そのアミノ酸配列ＡＬＫＫＥＬＱＡＮＫＫＥＬＡＱＬＫＷＥＬＱＡＬＫＫＥＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１０）を含み、且つＣＺドメインが、そのアミノ酸配列ＥＱＬＥＫＫＬＱＡＬＥＫＫＬＡＱＬＥＷＫＮＱＡＬＥＫＫＬＡＱ（配列ＩＤ番号：１１）を含む、実施形態１３５〜１３９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３８９】
実施形態１４１
ｃ−ｊｕｎドメインが、そのアミノ酸配列ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１）、ＣＳＧＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：４）、またはＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１６）を含む、実施形態１３５〜１３９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３９０】
実施形態１４２
ｃ−ｊｕｎドメインが、そのアミノ酸配列ＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＴＬＫＡＱＮＳＥＬＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：２）またはＳＧＡＳＬＥＲＩＡＲＬＥＥＫＶＫＳＦＫＡＱＮＳＥＮＡＳＴＡＮＭＬＲＥＱＶＡＱＬＫＱＫＧＡＰＳＧＧＣ（配列ＩＤ番号：５）を含む、実施形態１３５〜１３９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３９１】
実施形態１４３
ｃ−Ｆｏｓドメインが、そのアミノ酸配列ＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：３）またはＳＧＡＳＲＥＬＴＤＴＬＱＡＥＴＤＱＬＥＤＥＫＳＡＬＱＴＥＩＡＮＬＬＫＥＫＥＫＬＥＧＡＰ（配列ＩＤ番号：１３）を含む、実施形態１３５〜１３９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３９２】
実施形態１４４
第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の両方が目的タンパク質とリガンド結合ドメインとの間に連結基を含む、実施形態１３０〜１４３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３９３】
実施形態１４５
各連結基が独立にＳｅｒ／Ｇｌｙ連結基、ポリアスパラギン連結基、またはアミノ酸配列ＡＧＳＳＡＡＧＳＧＳ（配列ＩＤ番号：１７）を含む連結基である、実施形態１４４に記載の組成物またはキット。
【０３９４】
実施形態１４６
各ポリ−アスパラギン連結基が独立に約８〜約１６個のアスパラギン残基を含む、実施形態１４５に記載の組成物またはキット。
【０３９５】
実施形態１４７
各Ｓｅｒ／Ｇｌｙ連結基が独立に、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：１８）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：１９）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２０）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２１）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列ＩＤ番号：２３）、ＳＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：２４）、ＳＧＳＧ（配列ＩＤ番号：２５）、ＳＧＧＧＧＳ（配列ＩＤ番号：２６）、またはＳＧＳＧＧ（配列ＩＤ番号：２７）を具備する、実施形態１４５に記載の組成物またはキット。
【０３９６】
実施形態１４８
第１の融合タンパク質の目的タンパク質が細胞傷害性タンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が細胞傷害性タンパク質の第２のフラグメントであり、細胞傷害性タンパク質の第１のフラグメント及び細胞傷害性タンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質が殺菌タンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が殺菌タンパク質の第２のフラグメントであり、殺菌タンパク質の第１のフラグメント及び殺菌タンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質が殺ウイルス性タンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が殺ウイルス性タンパク質の第２のフラグメントであり、殺ウイルス性タンパク質の第１のフラグメント及び殺ウイルス性タンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がプロアポトーシスタンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がプロアポトーシスタンパク質の第２のフラグメントであり、プロアポトーシスタンパク質の第１のフラグメント及びプロアポトーシスタンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質が血栓形成タンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が血栓形成タンパク質の第２のフラグメントであり、血栓形成タンパク質の第１のフラグメント及び血栓形成タンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質が補体活性化タンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が補体活性化タンパク質の第２のフラグメントであり、補体活性化タンパク質の第１のフラグメント及び補体活性化タンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がＴｏｌｌ様受容体タンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がＴｏｌｌ様受容体タンパク質の第２のフラグメントであり、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質の第１のフラグメント及びＴｏｌｌ様受容体タンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質の第２のフラグメントであり、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質の第１のフラグメント及びＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質の第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、あるいは第１の融合タンパク質の目的タンパク質が抗体またはそのフラグメントの第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が抗体またはそのフラグメントの第２のフラグメントであり、抗体またはそのフラグメントの第１のフラグメント及び抗体またはそのフラグメントの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれる、実施形態１３０〜１４７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３９７】
実施形態１４９
細胞傷害性タンパク質がハチメリチン、コノトキシン、カテリシジン、ディフェンシン、プロテグリン、またはＮＫ−リシンであり、プロアポトーシスタンパク質がプリオンタンパク質、カスパーゼカスケードに関連するＢａｘ由来最小ポロペプチド、またはプロアポトーシスペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ2（配列ＩＤ番号：２８））であり、先天性免疫系刺激タンパク質が。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）であり、補体活性化タンパク質が補体タンパク質Ｃ３のＣ３ａフラグメントであり、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）タンパク質が熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）であり、ＮＯＤ２受容体アゴニストタンパク質がムラミルジペプチドアゴニストであり、且つ抗体フラグメントがＦａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである、実施形態１４８に記載の組成物またはキット。
【０３９８】
実施形態１５０
第１の融合タンパク質の目的タンパク質が、第１のスーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がｓｆＧＦＰの第２のフラグメントであり、ｓｆＧＦＰの第１のフラグメント及びｓｆＧＦＰの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの第２のフラグメントであり、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの第１のフラグメント及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がネズミジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がＤＨＦＲの第２のフラグメントであり、ＤＨＦＲの第１のフラグメント及びＤＨＦＲの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンの第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンの第２のフラグメントであり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンの第１のフラグメント及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、第１の融合タンパク質の目的タンパク質がβラクタマーゼの第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質がβラクタマーゼの第２のフラグメントであり、βラクタマーゼの第１のフラグメント及びβラクタマーゼの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれ、あるいは第１の融合タンパク質の目的タンパク質が単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼの第１のフラグメントであり、且つ第２の融合タンパク質の目的タンパク質が単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼの第２のフラグメントであり、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼの第１のフラグメント及び単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼの第２のフラグメントが一体的に、二量体化されるかまたは折り畳まれる、実施形態１３０〜１４７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【０３９９】
実施形態１５１
ｓｆＧＦＰの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントが、そのアミノ酸配列ＭＲＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＲＧＥＧＥＧＤＡＴＮＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＳＦＫＤＤＧＴＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＦＮＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱ（配列ＩＤ番号：２９）を含み、且つｓｆＧＦＰのそれ以外の第１のフラグメントまたは第２のフラグメントは、アミノ酸配列ＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＶＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＶＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＨＧＭＤＥＬＹＫ（配列ＩＤ番号：３０）を含み、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントが、そのアミノ酸配列ＭＡＳＫＶＹＤＰＥＱＲＫＲＭＩＴＧＰＱＷＷＡＲＣＫＱＭＮＶＬＤＳＦＩＮＹＹＤＳＥＫＨＡＥＮＡＶＩＦＬＨＧＮＡＡＳＳＹＬＷＲＨＶＶＰＨＩＥＰＶＡＲＣＩＩＰＤＬＩＧＭＧＫＳＧＫＳＧＮＧＳＹＲＬＬＤＨＹＫＹＬＴＡＷＦＥＬＬＮＬＰＫＫＩＩＦＶＧＨＤＷＧＡＣＬＡＦＨＹＳＹＥＨＱＤＫＩＫＡＩＶＨＡＥＳＶＶＤＶＩＥＳＷＤＥＷＰＤＩＥＥＤＩＡＬＩＫＳＥＥＧＥＫＭＶＬＥＮＮＦＦＶＥＴＭＬＰＳＫＩＭＲＫＬＥＰＥＥＦＡＡＹＬＥＰＦＫＥＫＧＥＶＲＲＰＴＬＳＷＰＲＥＩＰＬＶＫＧＧ（配列ＩＤ番号：３１）を含み、且つＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントのうちの他方が、アミノ酸配列ＫＰＤＶＶＱＩＶＲＮＹＮＡＹＬＲＡＳＤＤＬＰＫＭＦＩＥＳＤＰＧＦＦＳＮＡＩＶＥＧＡＫＫＦＰＮＴＥＦＶＫＶＫＧＬＨＦＳＱＥＤＡＰＤＥＭＧＫＹＩＫＳＦＶＥＲＶＬＫＮＥＱ（配列ＩＤ番号：３２）を含み、ＤＨＦＲの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントは、そのアミノ酸１〜１０５を含み、且つＤＨＦＲのそれ以外の第１のフラグメントまたは第２のフラグメントが、そのアミノ酸１０６〜１８６を含み、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントが、そのアミノ酸配列ＭＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥ（配列ＩＤ番号：３３）を含み、且つＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅユビキチンの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントのうちの他方が、そのアミノ酸配列ＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列ＩＤ番号：３４）を含み、β−ラクタマーゼの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントが、そのアミノ酸２５〜１９７を含み、且つβ−ラクタマーゼの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントのうちの他方が、そのアミノ酸１９８〜２８６を含み、且つ単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントが、そのアミノ酸１〜２６５を含み、且つ単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼの第１のフラグメントまたは第２のフラグメントのうちの他方が、そのアミノ酸２６６〜３７６を含む、実施形態１５０に記載の組成物またはキット。
【０４００】
実施形態１５２
実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質と、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインとが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドと第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている、組成物またはキット。
【０４０１】
実施形態１５３
実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質と、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質と、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている、組成物またはキット。
【０４０２】
実施形態１５４
実施形態４４〜６５のいずれか一項に記載の第１のボトルハプロマー・リガンド複合体、実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体であって、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、第２のハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質と、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質とを具備し、第１のボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている、組成物またはキット。
【０４０３】
実施形態１５５
実施形態４４〜５７または６６〜７３のいずれか一項に記載の第１のボトルハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体であって、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、第２のハプロマー・リガンド複合体と、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質と、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質と、を具備し、第１のボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメント及び第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントが、一体的に折り畳み可能または二量体化可能になっている、組成物またはキット。
【０４０４】
実施形態１５６
標的核酸分子を、実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、第１のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、を含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４０５】
実施形態１５７
標的核酸分子を、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、第１のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質に接触させることとを含み、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに空間的に近接した部位にて標的核酸分子に対し実質的に相補的であり、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能であり、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４０６】
実施形態１５８
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに対し相補的である、実施形態１５６または実施形態１５７に記載の方法。
【０４０７】
実施形態１５９
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの標的核酸分子への結合部に空間的に近接して標的核酸分子に結合する、実施形態１５６または実施形態１５７に記載の方法。
【０４０８】
実施形態１６０
第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接する核酸標的５’の部分に対し相補的であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接する核酸標的３’の部分に対し相補的である、実施形態１５６または実施形態１５７に記載の方法。
【０４０９】
実施形態１６１
第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、核酸標的のステムループ構造のループ構造の５’部分に対し相補的であり、このループ構造の５’部分がステムループ構造のステム領域に隣接していて、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、核酸標的のステムループ構造のループ構造の３’部分対し相補的であり、このループ構造の３’部分がステムループ構造のステム領域に隣接している、実施形態１５６または実施形態１５７に記載の方法。
【０４１０】
実施形態１６２
標的核酸分子を、実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体と接触させることにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることと、標的核酸分子を、実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体と接触させることとを含み、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用し、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化される、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４１１】
実施形態１６３
標的核酸分子を、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第１のハプロマー・リガンド複合体と実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体と接触させることにおいて、第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることと、標的核酸分子を、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体と実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質との相互作用によって形成された複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインと相互作用する、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４１２】
実施形態１６４
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドに対し相補的である、実施形態１６２または実施形態１６３に記載の方法。
【０４１３】
実施形態１６５
第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの標的核酸分子への結合部に空間的に近接して標的核酸分子に結合する、実施形態１６２または実施形態１６３に記載の方法。
【０４１４】
実施形態１６６
第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接する核酸標的５’の部分に対し相補的であり、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、ステムループ構造に隣接する核酸標的３’の部分に対し相補的である、実施形態１６２または実施形態１６３に記載の方法。
【０４１５】
実施形態１６７
第１のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが、第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの３’末端に連結され、且つ第１のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、核酸標的のステムループ構造のループ構造の５’部分に対し相補的であり、このループ構造の５’部分がステムループ構造のステム領域に隣接していて、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンドが第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドの５’末端に連結され、且つ第２のハプロマー・リガンド複合体のポリヌクレオチドが、核酸標的のステムループ構造のループ構造の３’部分対し相補的であり、このループ構造の３’部分がステムループ構造のステム領域に隣接している、実施形態１６２または実施形態１６３に記載の方法。
【０４１６】
実施形態１６８
標的核酸分子を、実施形態４４〜５７または５８〜６５のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を、実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４１７】
実施形態１６９
標的核酸分子を、実施形態４４〜５７または６６〜７３のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸を、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４１８】
実施形態１７０
標的核酸分子を実施形態４４〜６５のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸分子を実施形態１、２、または３〜１０のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質に接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７〜１１１または１２２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４１９】
実施形態１７１
標的核酸分子を、実施形態４４〜５７または６６〜７３のいずれか一項に記載のボトルハプロマー・リガンド複合体に接触させることと、標的核酸分子を、実施形態１、２、または１１〜１８のいずれか一項に記載の第２のハプロマー・リガンド複合体に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体が、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンドに連結されているボトルハプロマー・リガンド複合体のステム部分に対し実質的に相補的なヌクレオチド部分を含む、接触させることと、ボトルハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第１の融合タンパク質に接触させることにおいて、ボトルハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第１の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることと、第２のハプロマー・リガンド複合体を、実施形態１０７または１１２〜１２９のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質に接触させることにおいて、第２のハプロマー・リガンド複合体のリガンド及び第２の融合タンパク質のリガンド結合ドメインが相互作用可能である、接触させることとを含み、結果として、第１の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントと第２の融合タンパク質の目的タンパク質のフラグメントとが折り畳みまたは二量体化されるようになっている、タンパク質の指向性アセンブリ方法。
【０４２０】
本明細書中に開示されている主題をより効率的に理解できるように、以下に実施例を提供する。これらの実施例は、もっぱら例証のみを目的としたものであり、請求される主題をいかなる方法によっても限定するものとして解釈すべきではないことを理解する必要がある。
【実施例】
【０４２１】
実施例１：マルトース結合タンパク質系を介したｃ−Ｊｕｎロイシンジッパードメインの発現、及び特異的オリゴヌクレオチドとの共役による、ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーの形成
小型タンパク質相互作用性ドメインＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーを形成するための、オリゴヌクレオチドとの共役用のｃ−Ｊｕｎフラグメントは、エンテロキナーゼとのＭＢＰ融合タンパク質から放出される前に、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）系内で融合タンパク質として発現した。
【０４２２】
（上記のようなＮ末端システインまたはＣ末端システインのいずれかを有する）各ｃ−Ｊｕｎセグメント用のコード配列に、発現後にエンテロキナーゼ認識シグナル（ＤＤＤＤＫのコドン；配列ＩＤ番号：３５）が具備され、結果として、マルトース結合担体タンパク質からＣ末端ＭＢＰフラグメントを開裂することが可能であった。アセンブルされた配列をｐＭＡＬｃ５ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のＸｍｎＩ部位とＳｂｆＩ部位との間にクローニングし、候補クローンの構造を配列決定により確証した。検証されたクローンを株ＮＥＢ−ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換し、液体培養物（５０ｍｌ）中で短期間の増殖条件下、３７℃で１．５時間増殖させてから、更に２時間３００μＭのＩＰＴＧで誘導させた。試料（「直接溶解物」；２００μｌ）を採取し、１．５ｍｌ×チューブに１０００×ｇでペレット化し、２００μｌの１×ＰＢＳで１回洗浄して、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。残りの５０ｍｌの増殖物を（Ｓｏｒｖａｌｌベンチトップ遠心分離機で１０分／３０００ｒｐｍ）ペレット化し、氷冷マルトース結合タンパク質系カラム緩衝液（ＭＣ緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴ）１．５ｍｌ中に２．０ｍｌエッペンドルフチューブに再懸濁して、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３８４０）もまた含有する。次いで、細胞懸濁液を超音波処理した（各超音波処理ラウンドの間に冷却しながら、６×５秒パルス、５設定、Ｂｒａｎｓｏｎ  ４５０  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した（ベンチトップ微量溶液）、上清を新しいチューブに移した。
【０４２３】
マルトース結合タンパク質との融合物として発現されたポリペプチドを、アミロース磁気ビーズ（Ａ−ＭＢ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）上でアフィニティ精製した。Ａ−ＭＢの好適な試料（通常、上清１ｍｌ当たり２５０μｌの元のスラリーと等量）を、１ｍｌの冷ＭＣ緩衝液で２回洗浄し（磁気分離を用いてＡ−ＭＢを牽引させ）、元のボリューム中に再懸濁させた。誘導されたプラスミド培養物から超音波処理済の上清を、４℃でＡ−ＭＢと１時間混合させ、チューブを頻回にわたって反転させ、ビーズを再懸濁させる。次に上清を磁気的に除去し、ビーズを０．５ｍｌの冷ＭＣ緩衝液で４回洗浄して、同じ緩衝液１５０μｌ／元のビーズ２５０μｌ中に再懸濁させた。
【０４２４】
結合タンパク質を、最終濃度１０ｍＭのマルトースで溶出させた。マルトース含有のＭＣ緩衝液に２ｍＭ塩化カルシウムを加え、溶出及びエンテロキナーゼ処理を同時に行った。３時間の溶出／消化の後、上清を磁気的に分離し、ペレットを７５μｌのＭＣ緩衝液で処理して、可溶性相を最初の上清と合わせた。次いで、この産物の一部をアガロースアフィニティ処理に供してエンテロキナーゼ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を除去し、非結合フロースルーを保持した。次いで、この産物の一部をアガロースアフィニティ処理に供してエンテロキナーゼ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を除去し、非結合フロースルーを保持した。最初に試料をＴＧＸ  ａｎｙ−ｋＤゲル（ＢｉｏＲａｄ）で分析してから、ＳＹＰＲＯ−Ｒｕｂｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。可溶性タンパク質としての両方のｃ−Ｊｕｎ  ＭＢＰ融合物の発現が、極めて高度なレベルで起こった（図２３のレーン１及びレーン２を参照）。この発現レベルは、使用されたＡ−ＭＢの量で保持可能な最大量をかなり超過していた（図２３のレーン１及びレーン２、対レーン３及びレーン４を参照）。Ｃ末端システインｃ−Ｊｕｎフラグメントの事例では、共溶出された融合タンパク質のエンテロキナーゼの開裂が完了し（図２３のレーン６を参照）、Ｎ末端システイン融合の完成率は約８０％であった（図２３のレーン５を参照）。エンテロキナーゼ除去後の産物回収率は、７５％程度であった（図２３のレーン７及びレーン８、対レーン５及びレーン６を参照）。両方の事例において、エンテロキナーゼの開裂によって予期されたＭＢＰ開裂帯域が生じたが、用いられた条件下で、小さなｃ−Ｊｕｎ帯域は明視化されなかった。引き続いて、開裂された産物の試料を１６％トリス−トリシンゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で泳動させ、フラミンゴ染色（ＢｉｏＲａｄ）で染色した。その後、Ｎ末端及びＣ末端システインｃ−Ｊｕｎフラグメント（それぞれ）に対して予期された０ｋＤ及び５ｋＤの帯域を明視化できた（図２３のレーン９〜レーン１２を参照）。
【０４２５】
両方のｃ−Ｊｕｎフラグメントは内部システインが欠落していることから、二官能性マレイミド試薬を介したチオール標識オリゴヌクレオチドとの共役に容易に適合する。ビス−マレイミド連結基を用いた共役プロセスは、２段階で行われる。最初に、５’末端または３’末端ジスルフィド修飾を有するオリゴヌクレオチドを、２５℃にて１００倍モル過剰のＴＣＥＰで少なくとも４時間処理した後、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に脱塩し、ＴＣＥＰ及び低分子量の生成物を除去する。次いで、結果として得られた−ＳＨオリゴヌクレオチドを、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）中、モル過剰（５００倍）の１，８−ビス（マレイミド）ジエチレングリコール（ＢＭＰ２、Ｓｉｇｍａ）で２５℃にて４時間処理する。次いで、調製物をもう一度脱塩し、過剰のＢＭＰ２を除去する。修飾オリゴヌクレオチドの試料を、８Ｍ尿素ゲル上で泳動させ、元の−ＳＳ−オリゴヌクレオチド及び対応する誘導−ＳＨオリゴヌクレオチドと比較してプロセスの成功を調べる。
【０４２６】
第２の段階では、ＢＭＰ２誘導体化オリゴヌクレオチドを用い、Ｎ末端及びＣ末端システイン残基をｃ−Ｊｕｎフラグメントに架橋させる。処理前に、開裂されたフラグメント−ＭＢＰ調製物を１０倍モル過剰のＴＣＥＰで処理し、システイン−ＳＨ基が確実に還元された後、１００ｍＭ塩化ナトリウム含有のリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）中で脱塩する。
【０４２７】
フラグメントを、同じ緩衝液中で大モル過剰のＢＭＰ２誘導体化オリゴヌクレオチドと共に２５℃で４時間インキュベートし、反応を促進させる。次いで、過剰のオリゴヌクレオチド（未反応マレイミド基を有する）をスルフヒドリル磁性ビーズ（Ｂｉｏｃｌｏｎｅ）で処理して除去する。次いで、ポリペプチド共役体をＰＢＳＭに対して透析し、５０％グリセロール中に−２０℃で保存する。
【０４２８】
実施例２：分割タンパク質ＬＤ−ＴＡＰＥＲのためのｃ−Ｆｏｓポリペプチド融合を伴うｃ−Ｊｕｎハプロマーの使用（仮想例）
標的鋳型へのハプロマーのハイブリダイゼーション後に、ｃ−Ｊｕｎジッパーフラグメントを用いて、ＬＤ−ＴＡＰＥＲ（５’及び３’ｃ−Ｊｕｎタグを有するハプロマーを構築することにより；実施例１を参照）を実施する場合、第２段階では、相補的ｃ−Ｆｏｓジッパーとの融合タンパク質を使用する。ゆえに、小型相互作用性タンパク質ドメインを有する分割タンパク質技術をＬＤ−ＴＡＰＥＲに適用するのに好適なタンパク質フラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端のｃ−Ｆｏｓ融合として表す。スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼフラグメントが用いられる。
【０４２９】
ロックドＴＡＰＥＲ（図１３を参照）は、小分子リガンド（図２４を参照）の代わりに、ｃ−Ｊｕｎタグと共に使用される。チオール−マレイミド化学により、第１のボトルハプロマーの５’末端はＮ末端システインを有するｃ−Ｊｕｎフラグメントと共役し、第２のハプロマーの３’末端はＣ末端システインを有するｃ−Ｊｕｎフラグメントと共役する（上記の配列）。このアレンジメントの場合、ジッパーは、特異的な鋳型の存在下、最初の第１のボトルハプロマー抗標的ループ部分の「アンロック」後に、逆平行な配向で整列される（図２４を参照）。
【０４３０】
Ｆｏｓ融合タンパク質配列は、以下の通り（ｃ−Ｆｏｓ配列は、螺旋境界シグナルを含めてボールド体である。二重下線セグメントはセリン−グリシン連結基を示す）。
【化７０】
2019535281.tif 000078
【０４３１】
発現の目的に合わせて、あらゆるタンパク質コドンが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２用に最適化されている。全てのタンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合物として発現し（実施例１を参照）、エンテロキナーゼでの処理によってＭＢＰ担体から放出される。
【０４３２】
最初の実験的アプローチ「Ａ」では、実験プロセスを実施する目的で、ｃ−Ｊｕｎの第１のボトルハプロマーを、（その抗標的ループ部分に対し相補的である）特異的な標的鋳型と共にインキュベートすることによって、この第１のハプロマーを「アンロック」すると共に、第２のハプロマーについてはハイブリダイゼーション部位を露出させる。第２のハプロマーとの二重鎖が形成された後、ｓｆＧＦＰとＲｅｎｉｌｌａＮ末端及びＣ末端フラグメントとのｃ−Ｆｏｓ融合物の調製物（上記の通り）を加える。これにより、ＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセスの第２段階が進行し、ｃ−Ｆｏｓ：ｃ−Ｊｕｎジッパーが対合し、結果として、ポリペプチドの分割タンパク質の対が並置され、成熟折り畳みが可能になる（図２５を参照）。ハプロマーｃ−Ｊｕｎタグの逆平行な配向（図２４を参照）によって、ポリペプチドの配置及び配向が促進されている（図２５を参照）。
【０４３３】
ｓｆＧＦＰシグナルは、フルオレセインの場合と同じ最大発光での蛍光であり、蛍光読み取り機能付き分光光度計（Ｔｅｃａｎ）でモニターされる。精製Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）をセレンテラジン基質及び陽性対照として用い、この酵素用の市販キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの酵素活性を評価する。標準照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で発光を定量化する。
【０４３４】
用量反応実験デザインでは、等モル量のｓｆＧＦＰのＮ末端及びＣ末端のｍＦＫＢＰ融合物を、上記のような特異的な標的鋳型の存在下、第１段階のＦＫＭハプロマーと「アンロック」混合する。Ｎ末端及びＣ末端のＦｏｓ融合物とハプロマーとの比率は、１：１〜１０：１の範囲内である。類似の実験が、ＲｅｎｉｌｌａのＮ末端及びＣ末端の融合により確立されている。２５°Ｃで１６時間インキュベートした後、ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方に対し、適宜にレポーターシグナルをアッセイする。
【０４３５】
分割タンパク質折り畳み用のホモリガンドＬＤ−ＴＡＰＥＲは効率上限界を有することから、（式４．１、式４．２で示されるように）ハプロマー／鋳型ハイブリダイゼーションを第１ステップとして行う場合には、式５．１及び式５．２に準じて、実験的アプローチ「Ａ」だけでなく第２（「Ｂ」）プロトコルもまた続行することになる。ここで、ｃ−Ｊｕｎを有するロック付きＴＡＰＥＲの第１のボトルハプロマー（図２４参照）を前と同様に鋳型にハイブリダイズさせるが、次いでＮ末端ｓｆＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｃ末端のＦｏｓ融合物で処理する。別の反応で、第２のハプロマーを、Ｃ末端ｓｆＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａＮ末端の融合物で処理する。２５℃で２時間後、予備アセンブル済のｃ−Ｊｕｎハプロマー／鋳型／ｃ−Ｆｏｓ−ポリペプチドをそれぞれ等モル量で混合する。２５°Ｃで１６時間インキュベートした後、ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方に対し、適宜にレポーターシグナルのアッセイを行う。
【０４３６】
実験デザイン「Ａ」と「Ｂ」の両方に対し、全てのＬＤ−ＴＡＰＥＲ成分の２段階アセンブリ完了後に、同等な経時的実験もまた実施する。これは、プロトコル「Ａ」では、両方のＪｕｎハプロマーに対し初期ハイブリダイゼーションを行い、続いて分割タンパク質Ｆｏｓポリペプチドを加えることに対応する一方、プロトコル「Ｂ」では、特異的な分割タンパク質Ｆｏｓポリペプチドを有するＪｕｎハプロマーを別々に予備アセンブルし、続いて２つのハプロマー複合体を化合することに対応する。アレンジメント毎に、１５分間、３０分間、４５分間及び６０分間、ならびに１時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び１６時間の一連の時点で、アッセイ可能な試料を採取した。
【０４３７】
鋳型媒介ＬＤ−ＴＡＰＥＲアセンブリの特異性は、第２のハプロマーと同じ配列に対応し、但し付加タグが欠落したブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することによって、実証することが可能である。アセンブリ反応は、そのようなオリゴヌクレオチドをモル過剰に用いることによって効果的に阻害されるのに対し、アセンブリプロセスは、スクランブルド配列を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドを過剰に用いても影響されない。
【０４３８】
実施例３：分割タンパク質ＬＤ−ＴＡＰＥＲのためのＬＤ−ＴＡＰＥＲ内変異型ＦＫＢＰ結合一価化合物とオリゴヌクレオチド共役体の使用（仮想例）
本実施例では、変異型ＦＫＢＰ結合一価化合物を用いたアミノ標識オリゴヌクレオチドの誘導体化、及び小分子リガンド指向性分割タンパク質折り畳み用のＬＤ−ＴＡＰＥＲにおけるアミノ標識オリゴヌクレオチドの適用について説明する。ＦＫＭ−ＮＨＳ（図６を参照）のような化合物を１０ｍＭになるまでＤＭＳＯ中に可溶化させ、１００倍モル過剰にてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、ハプロマーとして用いられるオリゴヌクレオチドと共にインキュベートして、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端を市販アミノリンカーで修飾する。２５°Ｃで２時間後、過剰の未反応化合物を脱塩カラムにより除去し、その後、結果として得られたＦＫＭハプロマーを（１０／１.０）ＴＥ緩衝液中に貯蔵する。オリゴヌクレオチド：ＦＫＭ付加物が正常に形成されたかどうかは、未処理の親オリゴヌクレオチドと比較して１５％の８Ｍ尿素ゲル上での産物の移動度を試験することにより、確証される。
【０４３９】
小分子リガンドとしてＦＫＭを有するハプロマーの場合、分割タンパク質研究に適合している。本実施例では、図１３に示すようなロックドＴＡＰＥＲが使用される。ポリペプチド分割タンパク質標的は、ＦＫＢＰ−１ＡのＦ３６Ｖ変異型との融合タンパク質として提供される。小分子リガンドを用いた分割タンパク質技術をＬＤ−ＴＡＰＥＲに対し適用するため、好適なタンパク質フラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端変異型ＦＫＢＰ（Ｆ３６Ｖ）融合物として発現する。スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼフラグメントが用いられる。ハプロマー構築用に、ロックドＴＡＰＥＲ（図１３を参照）を、小分子リガンドとして機能するＦＫＭ（図２６を参照）と共に使用し、上記のようにしてハプロマーオリゴヌクレオチドに結合させる。
【０４４０】
変異型ＦＫＢＰ（ｍＦＫＢＰ）融合タンパク質配列は以下の通りである（ＦＫＢＰ配列は小文字で、Ｆ３６Ｖ突然変異以外は、ボールド体である。二重下線セグメントはセリン−グリシン連結基を示す）。
【化７１】
2019535281.tif 000079
【０４４１】
発現の目的に合わせて、あらゆるタンパク質コドンが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２用に最適化されている。全てのタンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合物として発現し（実施例１を参照）、エンテロキナーゼでの処理によってＭＢＰ担体から放出される。
【０４４２】
最初の実験的アプローチ「Ａ」では、実験プロセスを実施する目的で、ＦＫＭ第１のボトルハプロマーを、（そのループ領域に対し相補的である）特異的な標的鋳型と共にインキュベートすることによって、この第１のハプロマーを「アンロック」すると共に、第２のハプロマーについてはハイブリダイゼーション部位を露出させる。第２のＦＫＭハプロマーとの二本鎖が形成された後（図２６を参照）、ｓｆＧＦＰとＲｅｎｉｌｌａのＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントとのｍＦＫＢＰ融合調製物（上記）を加える。これにより、ＬＤ−ＴＡＰＥＲプロセスの第２段階が進行し、ＦＫＭ−ｍＦＫＢＰが結合し、結果として、ポリペプチドの分割タンパク質の対が並置され、成熟折り畳みが可能になる（図２７を参照）。
【０４４３】
ｓｆＧＦＰシグナルは、フルオレセインの場合と同じ最大発光での蛍光であり、蛍光読み取り機能付き分光光度計（Ｔｅｃａｎ）でモニターされる。精製Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）をセレンテラジン基質及び陽性対照として用い、この酵素用の市販キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの酵素活性を評価する。標準照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で発光を定量化する。
【０４４４】
用量反応実験デザインでは、等モル量のｓｆＧＦＰのＮ末端及びＣ末端のＦｏｓ融合物を、上記のような特異的な標的鋳型の存在下、第１段階のハプロマーと「アンロック」混合する。Ｎ末端及びＣ末端のｍＦＫＢＰ融合物とＦＫＭハプロマーとの比率は、１：１〜１０：１の範囲内である。類似の実験は、ＲｅｎｉｌｌａのＮ末端及びＣ末端におけるＦＫＢＰ融合物を用いて確立されている。２５°Ｃで１６時間インキュベートした後、ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方に対し、適宜にレポーターシグナルのアッセイを行う。
【０４４５】
分割タンパク質折り畳み用のホモリガンドＬＤ−ＴＡＰＥＲは効率上限界を有することから、（式４．１、式４．２で示されるように）ハプロマー／鋳型ハイブリダイゼーションを第１ステップとして行う場合には、式５．１及び式５．２に準じて、実験的アプローチ「Ａ」だけでなく第２（「Ｂ」）プロトコルもまた続行することになる。ここで、そのＦＫＭタグを有するロック付きＴＡＰＥＲの第１のボトルハプロマー（図２６を参照）を前と同様に鋳型にハイブリダイズさせるが、次いでＮ末端ｓｆＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｃ末端のｍＦＫＢＰ融合物で処理する。別の反応で、第２のＦＫＭ−ハプロマーを、Ｃ末端ｓｆＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａＮ末端ｍＦＫＢＰ融合物で処理する。２５℃で２時間経過後に、予備アセンブルされたＦＫＭハプロマー／鋳型／ｍＦＫＢＰポリペプチドをそれぞれ、等モル量で混合する。２５°Ｃで１６時間インキュベートした後、ｓｆＧＦＰ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの両方に対し、適宜にレポーターシグナルのアッセイを行う。インキュベーション時間中に、成熟タンパク質折り畳みが可能になる。ｍＦＫＢＰドメインがその同族のＦＫＭ一価リガンドに結合する配向に適応する目的で、長いセリン−グリシン連結基が用いられていることに注意すべきである（図２７を参照）。
【０４４６】
実験デザイン「Ａ」と「Ｂ」の両方に対し、全てのＬＤ−ＴＡＰＥＲ成分の２段階アセンブリ完了後に、同等な経時的実験もまた実施する。これは、プロトコル「Ａ」では、両方のＦＫＭハプロマーに対し初期ハイブリダイゼーションを行い、続いて分割タンパク質ｍＦＫＢＰポリペプチドを加えることに対応する一方、プロトコル「Ｂ」では、特異的な分割タンパク質ｍＦＫＢＰポリペプチドを有するＦＫＭハプロマーを別々に予備アセンブルし、続いて２つのハプロマー複合体を化合することに対応する。アレンジメント毎に、１５分間、３０分間、４５分間及び６０分間、ならびに１時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び１６時間の一連の時点で、アッセイ可能な試料を採取した。
【０４４７】
鋳型媒介ＬＤ−ＴＡＰＥＲアセンブリの特異性は、第２のハプロマーと同じ配列に対応し、但し付加タグが欠落したブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することによって、実証することが可能である。アセンブリ反応は、そのようなオリゴヌクレオチドをモル過剰に用いることによって効果的に阻害されるのに対し、アセンブリプロセスは、スクランブルド配列を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドを過剰に用いても影響されない。
【０４４８】
実施例４：Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ分割タンパク質アッセイでの、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ二量体化ドメインのシステイン変異型による応答の改善
本実施例では、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを用いたタンパク質分割アッセイにおける、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ二量体化ドメインのシステイン変異型Ｃ２２Ｓ及びＣ６１Ｓの各々の用途について説明する。この事例では、ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ）を使用してＮ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント−ＦＫＢＰ、及びＦＫＢＰ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント融合物を二量体化することによって、Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質のアセンブリが著しく加速した。同様に、ヘテロ二量体化剤ラパマイシン（Ｓｉｇｍａ）を使用してＮ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント−ＦＫＢＰ及びＦＲＢ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント融合物を二量体化した結果、それに付随してＧａｕｓｓｉａアセンブリ速度が上昇した。ＦＫＢＰドメインに関しては、上記のように、付加的なＦ３６Ｖの突然変異という状況下にてＣ２２Ｓシステインの突然変異が導入された。
【０４４９】
タンパク質配列は、システイン変異の有無に関係なく、標準的な方法でＥ．ｃｏｌｉ内で発現した。このように、それらの精製は、固相固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）ビーズ（ＩＭＡＣ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、ヘキシチジンアフィニティタグを用いて達成することが可能である。このような方法で精製されたタンパク質を、１６％トリシンゲル上で可視化した（図２８）。
【０４５０】
Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント−ＦＫＢＰ単一Ｆ３６Ｖ変異型融合タンパク質の配列は、以下の通り：
【化７２】
2019535281.tif 000080
配列中、Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント、セリン−グリシン連結基セグメント、Ｃ末端ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｖ変異型及びヘキサヒスチジンタグは、（その順番に）ハイフンで画定されている。変異型バリン残基（Ｆ３６Ｖ）はボールド体である。
【０４５１】
Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント−ＦＫＢＰ  Ｃ２２Ｓ／Ｆ３６Ｖ二重変異型融合タンパク質の配列も同様に、以下の通り：
【化７３】
2019535281.tif 000081
配列中、変異型バリン（Ｆ３６Ｖ）残基はボールド体であり、変異型セリン（Ｃ２２Ｓ）残基は下線付きである。
【０４５２】
ＦＫＢＰ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント単一ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｖ変異型融合タンパク質の配列は、以下の通り：
【化７４】
2019535281.tif 000082
配列中、ヘキサヒスチジンタグ、短いセリン−グリシン連結基、Ｎ末端ＦＫＢＰセグメント、より長いセリン−グリシン連結基セグメントは、（その順番に）ハイフンで画定されている。変異型ＦＫＢＰバリン残基（Ｆ３６Ｖ）はボールド体である。
【０４５３】
ＦＫＢＰ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント二重ＦＫＢＰ  Ｃ２２Ｓ／Ｆ３６Ｖ変異型融合タンパク質も同様に、以下の通り：
【化７５】
2019535281.tif 000083
配列中、ＦＫＢＰ変異型バリン（Ｆ３６Ｖ）残基はボールド体であり、変異型セリン（Ｃ２２Ｓ）残基は下線付きである。
【０４５４】
野生型ＦＲＢ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント変異型Ｃ６１Ｓ変異型融合タンパク質の配列は、以下の通り：
ＭＨＨＨＨＨＨ−ＧＧＳＧ−ＥＭＷＨＥＧＬＥＥＡＳＲＬＹＦＧＥＲＮＶＫＧＭＦＥＶＬＥＰＬＨＡＭＭＥＲＧＰＱＴＬＫＥＴＳＦＮＱＡＹＧＲＤＬＭＥＡＱＥＷＣＲＫＹＭＫＳＧＮＶＫＤＬＴＱＡＷＤＬＹＹＨＶＦＲＲＩＳＫＱ−ＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧ−ＧＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＭＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤ（配列ＩＤ番号：５１）。配列中、ヘキサヒスチジンタグ、短いセリン−グリシン連結基、Ｎ末端ＦＲＢセグメント、より長いセリン−グリシン連結基セグメントは、（その順番に）ハイフンで画定されている。
【０４５５】
Ｃ６１Ｓ変異型ＦＲＢ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質フラグメント融合タンパク質の配列も同様に、以下の通り：
【化７６】
2019535281.tif 000084
配列中、変異型セリン（Ｃ６１Ｓ）残基は下線付きである。
【０４５６】
イミダゾールを用いてＩＭＡＣ磁気ビーズからタンパク質を発現、溶出させた後、（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬で）アッセイし、１６％トリシンゲル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）上で可視化した。
【０４５７】
タンパク質フラグメント（単一または対合混合物）の最終濃度０．３μＭとし、適切な場合にはＡＰ２０１８７またはラパマイシンを用いまたは用いずに（両方とも最終０．１５μＭ）、アッセイの設定を２０μｌ容量とした。適当な時点で、試料２μｌを採取し、５ｍＭ臭化ナトリウムとＰＢＳ５０μｌ中に溶解させたセレンテラジン（最終２．５μＭ）とを試験管中に入れて、Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターで発光アッセイを行った。代表的なデータを図２９に示す。Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ融合物及びＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ−末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント融合物の共インキュベート調製物は、ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７の存在下で応答の増強を呈した（図２９のパネル１）。一方、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ二重変異を含む対応する融合物を使用したことによって、同等な応答の増強が見られた（図２９のパネル２）。Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ融合物及び野生型ＦＲＢ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａセグメント融合物の共インキュベート調製物は、ヘテロ二量体化ラパマイシンによる顕著な増強を示した（図２９のパネル３）。これは、ＦＲＢ  Ｃ６１Ｓ突然変異と組み合わせて、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ二重突然変異との関連において更に促進された（図２９のパネル４）。この関連における二量体化剤の有効性、ならびにＦＫＢＰ及びＦＲＢシステイン−セリン変異の機能性の両方が、結果から実証された。
【０４５８】
実施例５：ＭＦＬ２一価ＦＫＢＰリガンドを用いたオリゴヌクレオチド共役体形成の実証
本実施例では、ＭＦＬ２（Ｆ３６Ｖ変異型ＦＫＢＰ用の一価リガンド）を用いたチオール標識オリゴヌクレオチドの誘導体化について、具体的に説明する。ＭＦＬ２を１００ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に可溶化させた。共役用に調製するため、５’末端または３’末端がジスルフィド残基で修飾された５ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチド（ＩＤＴＣｏｒｐ．）を、５０μｌのＰＢＳ中、１ｍＭトリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）で１２〜１６時間処理し、ジスルフィドを還元して遊離チオール基を生成した。この後、ＭｉｃｒｏＢｉｏｓｐｉｎ  Ｐ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で還元オリゴヌクレオチドを１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）に脱塩した後、直ちに共役に用いた。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０／１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、４ｎｍｏｌの還元チオール−オリゴヌクレオチド、２ｍＭのＴＣＥＰ、及び４００ｎｍｏｌのＭＦＬ２を用い（いずれも最終濃度５０％ＤＭＳＯ）を有する１００μｌ容量にて、共役反応を行った。１００倍モル過剰のＭＦＬ２を用い、ＭＦＬ２マレイミド残基と関連オリゴヌクレオチド上のチオール基との間の反応を完了に向かって進行させた。指示されたＤＭＳＯ濃度は、疎水性ＭＦＬ２分子の溶解度を所望の濃度に維持するために必要とされる濃度であった。室温で１２〜１６時間反応を進行させてから、緩衝液を、ＰＢＳで平衡化されたＭｉｃｒｏ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ｐ６カラムに通し、２回連続して交換することにより、遊離ＭＦＬ２を調製物から除去した。共役体調製物を、変性１５％尿素ゲル上の対応する非修飾チオール−オリゴヌクレオチドと比較した。使用された条件下で共役反応が本質的に完了に向かって進行することは、明らかであった（図３０）。
【０４５９】
本実施例において生成された共役体は、以下の通り：
＃４０７−ＭＦＬ２（３’共役）ＧＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣ−ＭＦＬ２（配列ＩＤ番号：４４）、＃４０８−ＭＦＬ２（３’共役）ＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡ−ＭＦＬ２（配列ＩＤ番号：４５）、＃４０９−ＭＦＬ２（５’共役）ＭＦＬ２−ＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＣ（配列ＩＤ番号：４６）。
【０４６０】
実施例６：分割タンパク質ＬＤ−ＴＡＰＥＲのためのＬＤ−ＴＡＰＥＲ内変異型ＦＫＢＰ結合一価化合物とのオリゴヌクレオチド共役体の使用
本実施例では、アーキテクチャ１と、このアーキテクチャ１をアーキテクチャ２で実証するための２つのアプローチとの両方を用いて、ＬＤ−ＴＡＰＥＲを実証する。
【０４６１】
アーキテクチャ１
この事例では、５’（＃４０９）または３’（＃４０８）チオール修飾を有する互いに相補的なオリゴヌクレオチドを化合物ＭＦＬ２と反応させ（実施例５）、ＰＢＳで平衡化されたＭｉｃｒｏ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  Ｐ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に２回通過させて脱塩処理し、緩衝液をＰＢＳに交換した。結果として得られた共役体を、対応する非共役オリゴを対照として用いて、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ二重変異型ドメインと融合した精製Ｇａｕｓｓｉａ分割タンパク質セグメント（図２８）と共に室温で１時間インキュベートした。Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａ−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ溶解物（この実施例ではコード（Ｃ））を、このように共役体＃４０８−ＭＦＬ２（実施例５）と共に、または対照＃４０８単独でインキュベートした一方、ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ−Ｃ−末端Ｇａｕｓｓｉａ融合物（この実施例におけるコード（Ｄ））を共役体＃４０９−ＭＦＬ２（実施例５）と共に、または対照＃４０９単独でインキュベートした。各調製物（最終１５μｌのＰＢＳ）には、タンパク質フラグメント６０ｐｍｏｌと共役体３０ｐｍｏｌ、またはオリゴヌクレオチド単独が含有されていた。ＦＫＢＰドメインタンパク質融合物とＭＦＬ２共役体との相互作用による産物は、ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーの特定のクラスを構成する。この後、これらのプレインキュベーションの試料５μｌを単独で、または容量を最終２０μｌに調整された適切な混合物として使用した。適当な時点で、試料２μｌを採取し、５ｍＭ臭化ナトリウムとＰＢＳ５０μｌ中に溶解させたセレンテラジン（最終２．５μＭ）とを試験管中に入れて、Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターで発光アッセイを行った。３つの時点に関するデータを、図３１に示す。互いに相補的なＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマー（Ｃ）−＃４０８ＭＦＬ２及び（Ｄ）−＃４０９ＭＦＬ２を一緒に共インキュベートした場合に、発光が経時的に著しく増加したことが観察された。但し、そのような効果は、非共役オリゴ単独との同等の共インキュベーションにおいても、単独の任意のハプロマーにおいても見られなかった（図３１）。
【０４６２】
アーキテクチャ２−固相捕捉
このストラテジーでは、５’デスチオビオチン修飾を有する鋳型鎖を使用した。Ｇａｕｓｓｉａ−ＦＫＢＰＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマー（Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ−ＦＫＢＰフラグメントとＭＦＬ２修飾オリゴヌクレオチドとの複合体）は、この鋳型上に相互に空間的に近接してハイブリダイズすることができ、Ｇａｕｓｓｉａタンパク質折り畳みアセンブリ及び完全な活性生成を可能にする。このプロセスは図３２に示されており、アーキテクチャ２（図１０）に対応している。また、対照の非修飾オリゴヌクレオチドを同じ鋳型にハイブリダイズさせることも可能であるが、同じ方法でＧａｕｓｓｉａフラグメントの並置を空間的に強制することは不可能である。この手順は、自発的Ｇａｕｓｓｉａ自己アセンブリからのバックグラウンド発光を実質的に低減させるという利点を有する。ハイブリダイゼーションステップの後に、鋳型及び共ハイブリダイズされた全ての分子をストレプトアビジン磁気ビーズに結合させてから、他の溶液成分を全て洗い流す。この後、遊離Ｄ−ビオチンによって磁気ビーズからの溶出が行われる。この遊離Ｄ−ビオチンは、結合親和性がはるかに高いことから、ストレプトアビジン結合デスチオビオチンで標識された鋳型複合体を置換する。次いで、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを各溶出調製物に対して実施する。
【０４６３】
具体的には、１２０ｐｍｏｌの精製Ｇａｕｓｓｉａタンパク質−ＦＫＢＰ融合フラグメントを、６０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド−ＭＦＬ２複合体（図３０）または対応する非修飾チオール−オリゴヌクレオチドと共に、容積１８μｌのＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートした。この後、これら７．５μｌのプレインキュベーション反応物類を単独でまたは組み合わせて、２５μｌのＰＢＳの最終反応物に添加した。本実施例において用いられた調製物は、以下の通りである。
Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａフラグメント−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ（コード＝（Ａ））
ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａフラグメント（コード＝（Ｂ））
Ｎ末端Ｇａｕｓｓｉａフラグメント−ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ（コード＝（Ｃ））
ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ−Ｃ末端Ｇａｕｓｓｉａフラグメント（コード＝（Ｄ））
上記のコード、及び実施例５のオリゴヌクレオチドに関する説明によれば、ＬＤハプロマー調製物は以下の通りである。
（Ａ）−＃４０７−ＭＦＬ２
（Ｂ）−＃４０９−ＭＦＬ２
（Ｃ）−＃４０７−ＭＦＬ２
（Ｄ）−＃４０９−ＭＦＬ２
対照調製物に使用されたＧａｕｓｓｉａ−ＦＫＢＰ融合フラグメントは、対応する非共役オリゴヌクレオチドと共にインキュベートされたものと同じである。
【０４６４】
適切なタンパク質フラグメント／共役体／対照オリゴヌクレオチド調製物を、５’デスチオビオチン残基を有する２５ｐｍｏｌの鋳型オリゴヌクレオチド（＃２３０）の存在下、室温で３０分間インキュベートした。デスチオビオチン−ＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＡ
ＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡ（配列ＩＤ番号：５３）。
【０４６５】
この後、２５μｌ（１００μｇ）の親水性ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、１ｍｌのＰＢＳ中で２回予備洗浄してから、元の容量のＰＢＳ中に再懸濁させたもの）を各チューブに加え、室温で更に１時間インキュベートした。次に、ビーズを上清から磁気的に分離させ、０．５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した。各チューブ中の磁気ビーズペレットを５０μｌのＰＢＳに再懸濁させ、遊離Ｄ−ビオチンを１０ｍＭになるまで加え、室温で３０分間インキュベーションした。次いで、上清を磁気分離により採取し、実施例６と同様、各試料２μｌに対しＧａｕｓｓｉａシフェラーゼ活性に関するアッセイを行った。結果を図３３に示す。ここで、Ｆ３６Ｖ及びＦ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ形態のＦＫＢＰの両方に対し、Ｎ末端及びＣ末端Ｇａｕｓｓｉａオリゴ−ＭＦＬ２共役複合体（ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマー）でのみ、発光示度の著増が達成された。ＭＦＬ２修飾オリゴヌクレオチドを、対応する非修飾オリゴヌクレオチドで置換した場合、そのような応答は見られなかった（図３３）。ゆえに、このデータは、アーキテクチャ２鋳型用の系においてＬＤ−ＴＡＰＥＲを介して媒介されるＧａｕｓｓｉａフラグメントの鋳型化アセンブリと一致している。
アーキテクチャ２−溶液相
【０４６６】
また、溶液中のアーキテクチャ２鋳型用の系を介して媒介されるＬＤ−ＴＡＰＥＲの有用性も調査した。ＦＫＢＰ−Ｆ３６Ｖ−Ｃ２２Ｓ二重変異型ドメインと融合されたＧａｕｓｓｉａフラグメントに対して、上記アーキテクチャ２−固相捕捉の実施例と同じ方法で、予備インキュベーションの設定を行った。
【０４６７】
この事例において、最初の予備インキュベーション後に、ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーまたはＭＦＬ２−オリゴヌクレオチド共役体を非修飾チオール−オリゴヌクレオチドと交換した対照の組み合わせを、特異的な鋳型、または鋳型と同じ長さ及び塩基組成を有するスクランブルドオリゴヌクレオチドのいずれかと単に混合した。特異的な鋳型は、５’−デスチオビオチン修飾を除き、上記の鋳型オリゴヌクレオチド＃２３０と同一であった。スクランブルド対照オリゴは、以下の通り：
ＧＡＣＴＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴ（配列ＩＤ番号：５４）であった。次いで、実施例６と同じ様式で、これらの調製物の試料（２μｌ）に対し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ活性に関するアッセイを一定の時間間隔で行った。開始後２時間の結果（図３４）から明らかなように、スクランブルド対照よりも特異的な鋳型に対し発光シグナルの実質的な上昇（約２．５倍の上昇）が観察された。前述したように、これは、ＬＤ−ＴＡＰＥＲハプロマーによるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの鋳型媒介アセンブリと一致する。鋳型化プロセスの性質は、デスチオビオチン残基が存在しないことを除いて、図３２中に描かれているものと一致する。
【０４６８】
本明細書中に記載されている主題以外の、記載されている主題に対する様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。また、そのような修正形態も、添付の特許請求の範囲内に包含されることを意図したものである。本出願中に引用されている各参考文献（限定されるものではないが、ジャーナル記事、米国及び米国以外の特許、特許出願公開、国際特許出願公開、遺伝子バンク受託番号などを含む）は、その全体が本明細書において参照により援用されている。
【図１】
2019535281.tif 000091
【図２】
2019535281.tif 000092
【図３】
2019535281.tif 000093
【図４】
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【図５】
2019535281.tif 000095
【図６】
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【図７】
2019535281.tif 000097
【図８】
2019535281.tif 000098
【図９】
2019535281.tif 000099
【図１０】
2019535281.tif 000100
【図１１】
2019535281.tif 000101
【図１２】
2019535281.tif 000102
【図１３】
2019535281.tif 000103
【図１４】
2019535281.tif 000104
【図１５】
2019535281.tif 000105
【図１６】
2019535281.tif 000106
【図１７】
2019535281.tif 000107
【図１８】
2019535281.tif 000108
【図１９】
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【図２０】
2019535281.tif 000110
【図２１】
2019535281.tif 000111
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2019535281.tif 000115
【図２６】
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【図２７】
2019535281.tif 000117
【図２８】
2019535281.tif 000118
【図２９−１】
2019535281.tif 000119
【図２９−２】
2019535281.tif 000120
【図３０】
2019535281.tif 000121
【図３１】
2019535281.tif 000122
【図３２】
2019535281.tif 000123
【図３３】
2019535281.tif 000124
【図３４】
2019535281.tif 000125
【配列表】
2019535281000001.app
【国際調査報告】
2019535281.tif 000126
2019535281.tif 000127
2019535281.tif 000128