(57)【要約】本発明は、二重特異性単鎖抗体コンストラクトとシクロデキストリンとバッファーとを含む新規かつ安定性の医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性単鎖抗体コンストラクトと、β−シクロデキストリンと、バッファーとを含む医薬組成物であって、安定性である、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、エチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン  スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル）−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンリン酸ナトリウム塩、β−シクロデキストリン硫酸ナトリウム塩、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリンヘプタナトリウム塩、カルボキシメチル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記β−シクロデキストリンが、０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．８％〜１．５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記β−シクロデキストリンが、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトが、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記バッファーが、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタメート、アセテート、及びこれらの混合物からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記バッファーが、リン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタメート、アセテート、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物のｐＨが４〜７．５の範囲にある、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種類以上の賦形剤をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
１種類以上の保存剤を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記１種類以上の保存剤が、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン、及びチオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトの前記第１の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＦＬＴ３、またはＢＣＭＡに結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記二重特異性単鎖コンストラクトの前記第１の結合ドメインのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９、１０９、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８３、１８５、及び１８７からなる群から選択され、かつ前記二重特異性単鎖コンストラクトの前記第２の結合ドメインのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１８、２７、３６、４５、５４、６３、７２、８１、１７９、及び９０からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記製剤が保存剤を含まず、前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または１１０でありかつ前記コンストラクトが約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、前記シクロデキストリンが、約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩であり、前記バッファーが約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムであり、かつ前記製剤が、ｐＨ  約６．０の約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
組換えＤＮＡ技術の出現によって、過去３０年間で多くのタンパク質医薬品が開発されてきた。今やタンパク質ベースの医薬品は、（前）臨床開発での治療薬において、また市販品として、最も成長の速いカテゴリーに含まれる。低分子の化学薬物に比べると、タンパク質医薬品は比較的低い濃度で高い特性及び活性を有し、典型的には、様々ながん、自己免疫疾患、及び代謝障害などの影響の大きい疾患の治療に提供される（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０（非特許文献１），Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１９９９  Ａｕｇ  ２０；１８５（２）：１２９−８８（非特許文献２））。
【０００２】
商業規模での精製プロセスの進歩により、現在、組換えタンパク質は最初の製造時に高い純度で得ることができる。しかし、タンパク質は、安定性がわずかなものに過ぎず、化学的にも物理的にも非常に分解されやすい。化学分解とは、共有結合を伴う修飾、例えば脱アミド、酸化、新たなジスルフィド架橋の切断もしくは形成、加水分解、異性化、または脱グリコシルを指す。物理的分解には、タンパク質のアンフォールド、表面への望ましくない吸着、及び凝集が含まれる。これらの物理的及び化学的な不安定性への対処は、タンパク質医薬品の開発において最も難しい課題の１つである（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．  ９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６（非特許文献３），Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０（非特許文献１））。
【０００３】
タンパク質の凝集は、タンパク質の物理的不安定性の主要な現象に相当するものであり、溶媒と疎水性タンパク質残基との間の熱力学的に好ましくない相互作用を最小化するという固有の傾向に起因して生じる。タンパク質の凝集は、リフォールディング、精製、滅菌、出荷、及び保管のプロセス中に日常的に遭遇するため、とりわけ問題が多い。凝集は、タンパク質のネイティブ状態が熱力学的に極めて好ましい（例えば、中性ｐＨ及び３７℃）液体条件下であっても、ストレスの不在下であっても生じ得る（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．  ９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６（非特許文献３），Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０（非特許文献１），Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１９９９  Ａｕｇ  ２０；１８５（２）：１２９−８８（非特許文献２），Ｍａｈｌｅｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４（非特許文献４））。
【０００４】
タンパク質の凝集は治療用タンパク質の生物学的活性を損なう恐れがあるため、問題が多い。その上、タンパク質の凝集は、薬物製品の望ましくない外観をもたらし、また、最終製品から凝集体を除去するために必要とされる精密な精製ステップにより、製品収率を低下させる。また、最近では、凝集したタンパク質の存在によって（それがヒト化タンパク質または完全なヒトタンパク質であっても）、患者は活性タンパク質モノマーに対する免疫応答が発生し、その結果中和抗体及び薬物耐性の形成、または他の有害な副作用がもたらされるというリスクが顕著に増加する恐れがあるといった懸念及びエビデンスも拡大している（Ｍａｈｌｅｒ  Ｊ  Ｐｈａｍ  Ｓｃｉ．  ２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４（非特許文献４））。
【０００５】
文献において、様々な機構によってタンパク質の凝集を最小化するいくつかの試みが報告されている。タンパク質は、その一次構造を修飾して、内部の疎水性を向上させ外部の疎水性を低減することによって安定化させ、よって凝集体形成及び他の化学的変化から保護することができる。しかし、タンパク質の遺伝子操作は、機能性を損ない、かつ／または免疫原性を増加させる可能性がある。別のアプローチは、凝集体の解離（「脱凝集」と呼ばれる）に焦点を絞って、温度、圧力、ｐＨ、及び塩などの様々な機構を使用することによって機能的なネイティブモノマーを回復させる。現状は、タンパク質凝集体は、主に下流処理の研磨ステップで不純物として除去される。しかし、高分子量（ＨＭＷ）のレベルが高い場合においては、顕著な量のＨＭＷ除去によって、実質的な収率損失がもたらされるだけではなく、ロバストな下流プロセス設計が難しいものとなる（Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．  ９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６（非特許文献３））。
【０００６】
生物学及びバイオテクノロジーの応用におけるタンパク質の安定性及び活性の維持は、重大な課題を提起する。治療用タンパク質をいっそう安定化し、製剤、装填、出荷、保管、及び投与中の凝集及び変性を低減することによって機能喪失及び有害な免疫原性反応を防止する、最適化された医薬組成物が当技術分野において必要とされている。このような必要性に応じることが本発明の目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；３２（７）：３７２−８０
【非特許文献２】Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．１９９９  Ａｕｇ  ２０；１８５（２）：１２９−８８
【非特許文献３】Ｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．  ９，Ｓｅｐｔ  ２００３，ｐｐ．１３２５−１３３６
【非特許文献４】Ｍａｈｌｅｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４
【発明の概要】
【０００８】
概要
タンパク質の不安定性、とりわけ、リフォールディング、精製、滅菌、出荷、及び保管の各プロセス中を含めた治療用タンパク質のライフタイム全体にわたって遭遇するタンパク質の凝集は、バイオテクノロジー産業においてますます課題となっている。したがって、本発明の目的は、第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性単鎖抗体コンストラクトと、β−シクロデキストリンと、バッファーとを含む安定性の医薬組成物を提供することである。
【０００９】
β−シクロデキストリンは、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、エチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン  スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル）−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンリン酸ナトリウム塩、β−シクロデキストリン硫酸ナトリウム塩、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリンヘプタナトリウム塩、カルボキシメチル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−シクロデキストリンからなる群から、とりわけ、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンから選択されて存在することができる。それは、０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．８％〜１．５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在することができる。
【００１０】
二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在することができる。その第１の結合ドメインは、ＣＤ３３に結合し得る。詳細には、二重特異性単鎖コンストラクトの第１の結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９、１０９、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、及び１７３からなる群から選択され、二重特異性単鎖コンストラクトの第２の結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１８、２７、３６、４５、５４、６３、７２、８１、１７９、及び９０からなる群から選択される。
【００１１】
バッファーは、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタメート、アセテート、及びこれらの混合物からなる群から、とりわけ、リン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタメート、アセテート、及びこれらの組合せから選択することができる。
【００１２】
当該医薬組成物のｐＨは、４〜７．５の範囲とすることができる。
【００１３】
本明細書で提供する医薬組成物中には１種類以上の賦形剤が存在してもよく、これにはスクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック、及びこれらの組合せが含まれる。
【００１４】
当該組成物は、１種類以上の保存剤、とりわけ、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン、チオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）を含むことができる。これらの保存剤を使用するための構造及び典型的濃度は、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９６（１２），３１５５の表１に記載されている。
【００１５】
また、本明細書では、保存剤を含まない医薬組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または１１０のアミノ酸配列を有し約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する二重特異性単鎖抗体コンストラクトを含み、さらに約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩であるシクロデキストリンと、さらに約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムであるバッファーとを含み、当該製剤が、ｐＨ  約６．０の約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０をさらに含む、医薬組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ポリソルベート２０、８０、またはＨＰ−β−ＣＤを含有するＡＭＧ３３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）調製物におけるサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）による、高分子種及び立体構造異性体の定量化。
【図２】非ストレス（Ａ）、発泡（Ｂ）、及び１０回の凍結／解凍サイクル（Ｃ）というストレス因子の関数下で、ＡＭＧ３３０調製物中の非モノマー種（立体構造異性体、ダイマー、凝集体を含む）の量に及ぼすポリソルベート（ＰＳ）２０、８０、及びＨＰ−β−ＣＤの効果。各種の定量化は、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）によって達成した。タンパク質濃度は、同じアッセイ（Ａ２８０検出）によって対処した。
【図３】０．９％（Ｖ／Ｖ）のベンジルアルコールの存在下でのＡＭＧ１０３の凝集傾向に及ぼすＨＰ−β−ＣＤ及びＳＢＥ−β−ＣＤの濃度依存の効果（３５０ｎｍにおける光学密度により測定；光学密度とは１０ｍｍの経路長を指す）。
【図４】０．９％（Ｖ／Ｖ）のベンジルアルコールの存在下、３７℃、２４時間のインキュベートを行う前（Ａ）及び後（Ｂ）における、ＡＭＧ１０３の内部蛍光放出強度の測定値。
【図５】実験設計研究（２水準４因子要因）に由来する予測モデルであり、ＡＭＧ１０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４）調製物の３５０ｎｍにおける光学密度に及ぼすＨＰ−β−ＣＤ（Ａ）及びＳＢＥ−β−ＣＤ（Ｂ）の濃度増加の効果を説明するものである。
【図６】５ｍｇ／ｍＬのＣＤ３３＿２−ｈＡＬＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５）を含有する種々の製剤におけるサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子種（ＨＭＷＳ）の評価。
【図７】３種類の異なるＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６）製剤（Ｋ６０ＲＴｒＴ（Ａ）、Ｋ６０ＳＢＥＳｕＴ（Ｂ）、及びＫ６０ＲＭＳｕＴ（Ｃ））についての、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された、２５℃及び３７℃における高分子種の形成率。
【図８】３種類の異なるＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ製剤についての、弱カチオン交換超高速液体クロマトグラフィー（ＷＣＸ−ＵＰＬＣ）によって決定された、２５℃及び３７℃における酸性電荷バリアントの形成。
【図９】１２％のＰＥＧ−３３５０の存在下、４０ＣにおけるＡＭＧ３３０の可溶性。ＳＢＥ−β−ＣＤ（Ｃａｐｔｉｓｏｌ）及びアルギナート（Ｐｒｏｔａｎａｌ）の両方が、高濃度で使用した場合に、凝集したＡＭＧ３３０及びモノマーＡＭＧ３３０の可溶性を増加させる。ただし、ＳＢＥ−β−ＣＤはモノマーを優先的に可溶化する。左側の対照（１×ＰＢＳ）はＳＢＥ−β−ＣＤなしでインキュベートし、一方右側の対照（１×ＰＢＳ）はＰＥＧもＳＢＥ−β−ＣＤもなしでインキュベートした。
【図１０】図９に示されるものと同じ実験から得られたデータであり、ＡＭＧ３３０の％モノマー及び％凝集体に及ぼす種々の濃度のＳＢＥ−β−ＣＤ及びアルギナートの効果を実証するものである。約０．１〜１％のＳＢＥ−β−ＣＤは凝集体を減らしモノマー含量を増加させるのに有効である（緑の矢印で示されている）。これに対し、アルギナートデータは凝集体を増加させるという逆の傾向を示している（赤の矢印で示されている）。ＳＢＥ−β−ＣＤは、この場合において過剰濃縮の負の影響を低減することも示された。
【図１１】限外濾過／遠心分離によるバッファー交換及びタンパク質濃縮の後のＡＭＧ３３０の平均ＳＥＣ相対ピーク面積。
【図１２】Ａ：過剰濃縮により達成されＳＥＣメインピーク＋ＨＭＷによって計算されたＡＭＧ３３０の最高濃度の概要。ＳＢＥ−β−ＣＤ製剤（星印で示される）はより高い濃度に到達し、より高い％モノマーを維持した。Ｂ：図１２Ａに示されるものと同じ実験からのデータであり、ＳＢＥ−β−ＣＤの濃度増加の存在下、グリシン及びスクロースありまたはなしで、ＡＭＧ３３０を７〜８ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（星印を参照）。左側の対照は、ＳＢＥ−β−ＣＤなしで濃縮した。右側の対照は、その出発濃度０．４ｍｇ／ｍｌを超えて濃縮しなかった。「２％のグリシン、１％のスクロース」と表示された追加の試料は、ＳＢＥ−β−ＣＤを使用する利点を実証するためにＳＢＥ−β−ＣＤなしで濃縮した。Ｃ：４℃における５日間のインキュベート後のＡＭＧ３３０  ＣＥＸの相対ピーク面積、２回反復試験の平均。全ての試料は、２０ｍＭのクエン酸、０．０１％のＰＳ−８０、ｐＨ６．０を含有する。Ｄ：ＳＥＣ分析後のＡＭＧ３３０の相対メインピーク面積。全ての試料は、２０ｍＭのクエン酸、０．０１％のＰＳ−８０、ｐＨ６．０も含む。
【図１３】ＳＥＣメインピーク＋ＨＭＷから計算したＡＭＧ３３０の濃度。
【図１４】バッファー交換及び濃縮の後のＳＥＣからのＡＭＧ３３０の相対ピーク面積。
【図１５】様々なシクロデキストリンと共にインキュベートした後のＡＭＧ３３０のＳＥＣ総ピーク面積（メインピーク＋ＨＭＷ）。
【図１６】１ｍｇ／ｍＬにおける１３の異なる製剤において、−２０℃、−３０℃、及び−７００℃で最大６週間保管したＡＭＧ３３０。
【図１７】Ａ：０．５％のＳＢＥ−β−ＣＤでは、洗練された凍結乾燥ケークを自力で提供するのに十分でない可能性があるが、より一般的な増量剤、例えばグリシン及びマンニトールと適合性である。これらの凍結乾燥ケークの全てが十分に再構成され、ＳＢＥ−β−ＣＤの存在下、凝集または粒子化はほとんどまたは全くもたらされなかった。Ｂ：ＳＢＥ−β−ＣＤを使用し（青のクロマトグラム、矢印で示されている）α−シクロデキストランを使用しない（ピンクのクロマトグラム、矢印で示されている）場合、再構成後の％凝集体が低減される。いかなるシクロデキストリンもなしの対照製剤（太く黒い線）も高いレベルの凝集体を示しているが、それでもα−シクロデキストランの場合よりは低い。これらの結果は、ＳＢＥ−β−ＣＤを使用する利点を実証するものである。Ｃ：種々の製剤の分析的ＳＥＣ（「前」及び「後」は、凍結乾燥前及び再構成後を表す）。Ｄ：種々の製剤の凍結乾燥後のＭＦＩ分析。
【図１８】過剰濃縮により達成されたＦａｐα  ＢｉＴＥ（登録商標）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７）の最高濃度の概要。ＳＢＥ−β−ＣＤ製剤（星印で示される）はα−シクロデキストランよりも高いタンパク質濃度に到達し、より高い％モノマーを維持した。α−シクロデキストラン製剤は、沈殿のため可溶性のタンパク質のほとんどを失った。
【図１９】ＣＤ３３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト製剤の関数下における、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣによる）高分子種（ＨＭＷＳ）のパーセンテージ含量に関する概要。
【図２０】ＦＬＴ３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト製剤の関数下における、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣによる）高分子種（ＨＭＷＳ）のパーセンテージ含量に関する概要。
【図２１】ＢＣＭＡ−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト製剤の関数下における、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣによる）高分子種（ＨＭＷＳ）のパーセンテージ含量に関する概要。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
現在の治療用バイオテクノロジー製品は高品質であり、また組換えのヒトタンパク質及び抗体は内在性のヒトタンパク質に類似しているものの、タンパク質の不安定性は、依然として重要な懸念事項である。考えられるタンパク質活性の損失及び薬物製品の望ましくない外観のようなタンパク質凝集の品質に関する結果に加えて、可溶性のタンパク質凝集体は顕著な細胞毒性作用を有することが報告されており、重要なことには、可溶性のタンパク質凝集体は、タンパク質製品に対する免疫応答を発生させる潜在的なリスク因子となる。
【００１８】
タンパク質の凝集は、発酵、リフォールディング、精製、装填、出荷、保管、または投与を含めたタンパク質のライフタイム全体にわたり生じ得るものであり、様々な環境因子に強く左右される。当技術分野では、治療用タンパク質における安定性の増加及び凝集の低減が極めて必要とされており、最適化された医薬製剤がこれを行う一助となり得る。発明者らは、二重特異性抗体コンストラクト（具体的には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーのＢｉＴＥ（登録商標））が様々な環境ストレス因子に曝露された際に生じる凝集に及ぼす種々のシクロデキストリンの効果について調べた。驚いたことに、発明者らは、当該抗体コンストラクトがシクロデキストリンの存在下で、とりわけβ−シクロデキストリンの存在下で顕著に安定化され得ることを見いだした。
【００１９】
したがって、本発明は、ａ）第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性単鎖抗体コンストラクトと、ｂ）β−シクロデキストリンと、ｃ）バッファーとを含む安定性の医薬組成物を提供する。
【００２０】
安定性
本明細書の範囲内において、「安定性」または「安定化」という用語は、全体的な医薬組成物の安定性、とりわけ活性成分（すなわち、二重特異性単鎖抗体コンストラクト）自身の安定性、具体的には製剤、装填、出荷、保管、及び投与中における安定性に関連する。本発明の医薬組成物及び二重特異性単鎖抗体コンストラクトの文脈における「安定性」または「安定性の」という用語は、詳細には、タンパク質凝集体（ＨＭＷＳ）形成の低減または防止に関連する。具体的には、「安定性」という用語は、本明細書に記載の医薬組成物内に含まれる二重特異性単鎖抗体コンストラクトのコロイド安定性にも関連する。「コロイド安定性」とは、コロイド状粒子（例えば、タンパク質）が長時間（日単位〜年単位）液体中で分散性を保つ能力である。
【００２１】
本明細書で使用する「（タンパク質）凝集体」という用語は、概して、所望の定義された種（例えば、モノマー）ではなく、比較的高分子量のタンパク質種、例えば、「オリゴマー」または「マルチマー」を包含する。当該用語は、本明細書では「高分子種」及び「ＨＭＷＳ」という用語と互換的に使用される。タンパク質凝集体は、概して以下の点で異なり得る：サイズ（小型（２量体）〜大型（顕微鏡で確認可能な粒子またはさらに可視粒子）の集合体であり、直径はナノメートル〜マイクロメートルの範囲）、形態（概ね球状〜繊維状）、タンパク質構造（ナイーブ対非ネイティブ／変性）、分子間結合のタイプ（共有対非共有）、可逆性、及び可溶性。可溶性の凝集体はおよそ１〜１００ｎｍのサイズ範囲を網羅し、タンパク質粒子は顕微鏡で確認可能な（約０．１〜１００．ｍ）範囲及び可視（＞１００．ｍ）範囲を網羅する。前述のタイプのタンパク質凝集体全てが、概して当該用語に包含される。したがって、「（タンパク質）凝集体」という用語は、２つ以上のタンパク質モノマーが物理的に会合したまたは化学的に結合したあらゆる種類の非ネイティブ種を指す。
【００２２】
したがって、「タンパク質凝集」または「非ネイティブ凝集」という用語は、タンパク質分子が２つ以上のタンパク質で構成された複合体に集成されるプロセスを示し、個々のタンパク質はモノマーとして示される。タンパク質凝集に至る経路は複数存在し、タンパク質凝集は、温度、振とう及び攪拌などの機械的ストレス、ポンピング、凍結及び／または解凍、ならびに製剤を含めた多岐にわたる条件によって誘導され得る。
【００２３】
温度
温度の上昇は、タンパク質の酸化及び脱アミドなどの化学反応を加速させ、ひいては凝集を促進し得る。また、高い温度は、タンパク質の立体構造に対し４次元、３次元、及び２次元の構造レベルで直接的に影響を及ぼし、そして凝集を促進し得る温度誘導のアンフォールディングにつながり得る。
【００２４】
凍結及び解凍
タンパク質の変性及び凝集は凍結／解凍中に生じる可能性があるが、それは、新たな氷／溶液界面、容器表面への吸着、タンパク質及び溶質の凍結濃縮、及びバッファー成分の結晶化によるｐＨ変化などの、複雑な物理的及び化学的な変化に起因する。
【００２５】
タンパク質濃度
タンパク質濃度の上昇もタンパク質凝集体の形成を増強し得る。タンパク質濃度が高いと、高分子溶質による高い全体積占有率がその溶液中の各高分子種の挙動に及ぼす作用を説明するために使用される用語の高分子クラウディングが生じる。この排除体積理論によれば、自己集合及びこのような潜在的凝集が好都合となり得る。
【００２６】
保存剤
抗微生物性保存剤、例えば、ベンジルアルコール及びフェノールは、タンパク質液体製剤において貯蔵寿命中の無菌性を保証するためにしばしば必要となり、さらに多用量製剤及びあるいくつかの薬物送達システム、例えば、注射ペン、ミニポンプ、及び局所適用においても必要とされる。多くの保存剤についてタンパク質の凝集を誘発することが報告されているが、根底にある機構についてはよく分かっていない。保存剤が、凝集を起こしやすい折り畳まれていないタンパク質状態に結合し、それを集合させているということが提唱されている。
【００２７】
有利なことには、本発明の医薬組成物は安定性であることが想定されており、すなわち、ストレス、とりわけ熱ストレス、保管、表面誘導ストレス（例えば、凍結／解凍サイクル、発泡）、濃縮（限外濾過及びダイアフィルトレーションによる）、または抗微生物性保存剤などの有機化合物との混合に供された場合であっても、タンパク質凝集体を含まないまたは実質的に含まない状態を保つことが想定されている。好ましくは、当該医薬組成物は、付属の実施例で評価されたＳＢＥ−β−ＣＤまたはＨＰ  β−ＣＤを含む組成物と比べて、同様の、またはいっそう改良された特徴を有し得る。本発明の医薬組成物は、好ましくは、分散したモノマーの二重特異性単鎖抗体コンストラクトの均質な溶液である。
【００２８】
当業者であれば、当該医薬組成物は効果的に活性成分の安定化を提供する（すなわち、二重特異性単鎖抗体コンストラクトのタンパク質凝集体の形成を低減または阻害する）が、場合によってはいくらかの凝集体または立体構造異性体が、ただし当該医薬組成物の全体的な可用性を実質的に損なわない程度に形成される可能性があるということを理解することになる。この文脈において、凝集体を「実質的に含まない」とは、凝集体の量が１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％（ｗ／ｖ）を下回って保たれる、とりわけ、環境ストレス、例えば付属の実施例で評価されているようなストレスに供されてもそのように保たれることを意味する。
【００２９】
可溶性または不溶性のタンパク質凝集体の存在を決定するための方法は、中でも、Ｍａｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９−３４によって概説されている。可溶性のタンパク質凝集体の形成は、付属の実施例に記載されるように、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）によって評価することができる。ＳＥＣは、タンパク質凝集体の検出及び定量化に最もよく使用されている分析方法の１つである。ＳＥＣ分析により、凝集体のサイズ決定及び定量化の両方を行うことができる。ＳＥＱ−ＵＰＬＣにより、約５〜１０００ｋＤａの分子量範囲で高分子の形状及びサイズ（流体力学的半径）に基づいた選択的かつ迅速な分離を行うことができる。
【００３０】
タンパク質溶液は、タンパク光または混濁度と呼ばれる光学的特性を示す。溶液の光学的特性は、存在する粒子が光を散乱し吸収する機能である。タンパク質は天然のコロイドであり、水性製剤の混濁度は、タンパク質濃度、溶解していない粒子の存在、粒子サイズ、及び単位体積当たりの粒子数に依存する。混濁度は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって３４０〜３６０ｎｍの範囲における光学密度として測定することができ、可溶性及び不溶性の凝集体両方の検出に使用することができる。
【００３１】
また、視覚的手段による試料の検査も、依然としてタンパク質凝集体の評価における重要な態様である。可視凝集体が不在であるか存在するかの視覚的評価は、好ましくはＤｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｃｏｄｅｘ  （ＤＡＣ）試験５に従って実施する。
【００３２】
本発明の他の箇所で示されるように、本発明の医薬組成物は、おそらくは当該組成物に含まれるβ−シクロデキストリンの作用によって、二重特異性単鎖抗体コンストラクトのコロイド安定性の増加に好都合であり、よって液−液相分離（ＬＬＰＳ）の低減またはさらに不在を示すことが想定されている。ＬＬＰＳは熱力学的に推進される現象であり、均質なタンパク質溶液が温度低下によってタンパク質不足相（通常は上層）とタンパク質豊富相（通常は下層）とに分離する現象である。典型的には、ＬＬＰＳは、単にこの２つの相を混合し溶液の温度を上げることによって完全に元に戻すことができる。ＬＬＰＳの発生は、短い範囲における引力性のタンパク質間相互作用が原因であり、これはタンパク質間引力の強さの尺度となる。本発明によるβ−シクロデキストリンを含む医薬組成物は、β−シクロデキストリンを含まない医薬組成物よりも高い濃度の二重特異性単鎖抗体コンストラクトをＬＬＰＳタンパク質不足相中に含むことが見いだされた。したがって、本発明の医薬組成物は、対照と比べるとＬＬＰＳの低減またはＬＬＰＳの完全な不在を呈し、よって本発明の二重特異性単鎖抗体コンストラクトのコロイド安定性の増加を促進することが想定されている。ＬＬＰＳは誘導可能であり、異なる相のタンパク質の含量は付属の実施例に記載のようにして調べることができる。
【００３３】
環境ストレスも、とりわけ熱及び／または化学的変性に起因して、立体配座の変化につながる可能性があり、これがひいては凝集に好都合となり得る。驚いたことに、発明者らは、芳香族アミノ酸における自家蛍光の発光強度を測定することによって評価されるように、二重特異性単鎖抗体コンストラクトが立体配座の変化に対しても安定化されることを見いだした。そのため本発明の医薬組成物は、好ましくは、立体構造異性体（すなわち、非ネイティブの異常に折り畳まれたタンパク質種）の形成も低減または阻害する。
【００３４】
抗体コンストラクト
先に説明したように、本発明における安定性の医薬組成物は、第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する、二重特異性単鎖抗体コンストラクトを含む。
【００３５】
「抗体コンストラクト」という用語は、概して、その構造及び／または機能が、ある抗体の、例えば全長または全体の免疫グロブリン分子の抗体の、構造及び／または機能に基づいていることを指す。そのため、抗体コンストラクトはその特異的なターゲットまたは抗原に結合することができる。さらに、本明細書による抗体コンストラクトは、ターゲット結合を可能にする抗体の最小限の構造要件を含む。この最小限の要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）の存在によって定義することができる。本明細書に記載のコンストラクトの基礎となる抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が含まれる。
【００３６】
「抗体コンストラクト」の定義の範囲内には、ラクダ科抗体及び、バイオテクノロジーまたはタンパク質工学の方法またはプロセスによって産生される他の免疫グロブリン抗体を含めた全長または全体の抗体が含まれる。これらの全長抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体とすることができる。また、「抗体コンストラクト」の定義の範囲内には、全長の抗体の断片、例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、（ｓ）ｄＡｂ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または「ｒ  ＩｇＧ」（「半抗体」）も含まれる。また、抗体コンストラクトは、抗体バリアントとも呼ばれる抗体の修飾断片であってもよく、例としては、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖまたはｂｉ（ｓ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ジッパー、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ’ｓ）、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、以下の構造：（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ３）２、（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２、または（ｓｃＦｖ−ＣＨ３−ｓｃＦｖ）２によって例示される「ミニボディ」、トリアボディまたはテトラボディなどのマルチボディ、及びナノボディ、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ  ＶＨ、またはＶＬであり得る唯一つの可変ドメインを含み他のＶ領域またはＶドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合する、単一の可変ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体がある。また、「抗体コンストラクト」という用語は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個々に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体とリンカーとから構成された単一ドメイン抗体コンストラクトも包含する。リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態をとる。同様に、「ｓｃＦｖ−単一ドメインｍＡｂ」とは、上に記載されるような少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、上に記載されるような１つのｓｃＦｖ分子とから構成される、モノクローナル抗体コンストラクトである。ここでもまた、リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態をとる。
【００３７】
さらに、「抗体コンストラクト」という用語の定義には、概して、一価、二価、及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ／ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）のコンストラクトが含まれ、したがって、１つの抗原構造にのみ特異的に結合する単一特異性コンストラクト、さらに、２つ以上の、例えば、２つ、３つまたはそれ以上の抗原構造に別個の結合ドメインを介して特異的に結合する二重特異性及び多特異性／多重特異性コンストラクトが含まれる。その上、「抗体コンストラクト」という用語の定義には、１つのポリペプチド鎖のみからなる分子、さらに、同一でもよく（ホモダイマー、ホモトリマー、またはホモオリゴマー）異なってもよい（ヘテロダイマー、ヘテロトリマー、またはヘテロオリゴマー）２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子が含まれる。本発明の文脈においては、第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性単鎖抗体コンストラクトがとりわけ想定されている。
【００３８】
結合ドメイン
「結合ドメイン」という用語は、ターゲット分子（抗原）における所与のターゲットエピトープまたは所与のターゲット部位に対し、（特異的に）結合／相互作用／認識するドメインを特徴づけるものである。結合ドメインは、好ましくは、ポリペプチドの形態をとる。このようなポリペプチドとしては、タンパク質性部分及び非タンパク質部分（例えば、化学的リンカーまたはグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）が挙げられ得る。タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性の断片、及び通常３０未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、共有結合的ペプチド結合を介して互いに結合した２つ以上のアミノ酸（結果としてアミノ酸の鎖となる）を含む。本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、通常３０アミノ酸超からなる分子の群を説明している。ポリペプチドは、さらにマルチマー、例えば、ダイマー、トリマー、及びより大きいオリゴマーを形成し、すなわち２つ以上のポリペプチドからなる。このようなダイマー、トリマーなどを形成するポリペプチド分子は、同一であっても同一でなくてもよい。したがって、このようなマルチマーについて対応するさらに高次の構造は、ホモダイマーまたはヘテロダイマー、ホモトリマーまたはヘテロトリマーなどと呼ばれる。ヘテロマルチマーの一例は、天然に存在する形態において２つの同一なポリペプチド軽鎖と２つの同一なポリペプチド重鎖とからなる抗体分子である。また、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、天然に修飾されたペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指し、当該修飾は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾によって引き起こされる。本明細書で「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」と呼ばれる場合、これらはペグ化のように化学修飾されていてもよい。このような修飾は当技術分野において周知であり、本明細書で後述される。
【００３９】
第１の結合ドメインの構造及び機能は、好ましくはさらに第２の結合ドメインの構造及び／または機能も、ある抗体の、例えば全長または全体の免疫グロブリン分子の抗体の、構造及び／または機能に基づいている。第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、軽鎖可変（ＶＬ）領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、重鎖可変（ＶＨ）領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）の存在によって特徴づけられる。また第２の結合ドメインは、好ましくは、ターゲット結合を可能にする抗体の最小限の構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含む。
【００４０】
上述のように、結合ドメインは典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことができるが、両方を含む必要はない。例えば、Ｆｄ断片は２つのＶＨ領域を有し、インタクトな抗原結合ドメインの抗原結合機能をある程度保持することが多い。（修飾された）抗原結合抗体断片の例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価の断片、Ｆａｂ断片；（２）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を有する二価の断片、Ｆ（ａｂ’）２断片；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有する、Ｆｄ断片；（４）抗体の１本のアームのＶＬ及びＶＨドメインを有する、Ｆｖ断片；（５）ＶＨドメインを有する、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００４１】
可変領域
「可変」という用語は、配列における可変性を示し特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体の部分または免疫グロブリンドメイン（すなわち、「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を共に対合することで、１つの抗原結合部位が形成される。ＶＨに最も近いＣＨドメインはＣＨ１と呼ばれる。各軽（Ｌ）鎖は、共有結合的ジスルフィド結合によって１つの重（Ｈ）鎖に連結し、一方２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結している。
【００４２】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分散しているわけではなく、重鎖及び軽鎖の可変領域それぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲは、抗体と抗原との特定の相互作用を受け持つほとんどの残基を含有するため、抗体分子の機能的活性に寄与し、抗原特異性における主要な決定因子となる。
【００４３】
ＣＤＲの正確な定義上の境界及び長さは、種々の分類体系及びナンバリングシステムに供される。そのためＣＤＲは、本明細書に記載のナンバリングシステムを含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、コンタクトまたは任意の他の境界定義によって参照することができる。境界の相違はあるものの、これらのシステムのそれぞれは、可変配列内におけるいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。そのため、これらのシステムに従ったＣＤＲ定義は、長さ、及び隣接するフレームワーク領域との境界エリアが異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づいたアプローチ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づいたアプローチ）、及び／またはＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照。抗原結合部位を特徴づけるさらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアが使用するＡｂＭ定義である。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）中のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓを参照。２つの残基同定技法が、同一ではない領域以外の重複する領域を定義する範囲で、これらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかし、いわゆるＫａｂａｔシステムに従ったナンバリングが好ましい。
【００４４】
典型的には、ＣＤＲはループ構造を形成するが、この構造はカノニカル構造に分類することができるものである。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループが採用する主鎖の立体構造を指す。比較的な構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つについては、利用可能な立体構造のレパートリーが限られていることが見いだされた。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴づけることができる。そのため、抗体間で対応するループは、それらのループの大部分でアミノ酸配列の可変性が高いものの、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されているループ構造とそれを取り囲むアミノ酸配列との間には関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さと、そのループ内及び保存されたフレームワーク内（すなわち、ループ外）の主要な位置に存在するアミノ酸残基とによって決定される。そのため、特定のカノニカルクラスへの割当ては、これらの主要なアミノ酸残基の存在に基づいて行うことができる。
【００４５】
また、「カノニカル構造」という用語は、例えばＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  上記引用中）によって分類されているように、抗体の直線的配列に対する考慮も含み得る。Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（システム）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基のナンバリングを一貫した方法で行うために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも言及されているように、本発明に適用されている好ましいスキームである。さらなる構造的考慮も、抗体のカノニカル構造を決定するために用いられ得る。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングで十分に反映されない相違は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．のナンバリングシステムによって説明される可能性があり、かつ／または他の技術、例えば結晶学及び二次元もしくは三次元のコンピューターモデリングによって明らかになる可能性がある。したがって、所与の抗体配列は、特に、（例えば、様々なカノニカル構造を１つのライブラリに含めたいという所望に基づいて）適切なシャーシ配列の同定が可能なカノニカルクラスに入れることができる。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔナンバリング及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，上記引用中によって説明される構造的考慮、そして抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するこれらの意味は、文献に記載されている。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、当技術分野において周知である。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照。
【００４６】
軽鎖のＣＤＲ３、及び、とりわけ重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖の可変領域内の抗原結合における最も重要な決定因子を構成し得る。一部の抗体コンストラクトにおいては、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域を構成しているように思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させること、またはどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがってＣＤＲ３は、典型的には、抗体結合部位内の分子多様性をもたらす最大の源である。例えば、Ｈ３は、２アミノ酸残基のように短くても２６アミノ酸より長くてもよい。
【００４７】
フレームワーク及び定常領域
可変ドメインのより保存的な（すなわち、超可変でない）部分は「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれ、三次元空間における６つのＣＤＲが抗原結合表面を形成するための骨格を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、これらは、ループ接続を形成し一部の場合ではβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続されている。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接状態で一緒に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記引用中を参照）。定常ドメインは抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害及び補体活性化などを示す。
【００４８】
結合特異性
二重特異性抗体コンストラクト
先に説明したように、本発明の医薬組成物内に含まれる抗体コンストラクトは、二重特異性単鎖抗体コンストラクトであることがとりわけ想定されている。本明細書で使用する「二重特異性」という用語は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを指し、すなわち、当該抗体コンストラクトは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、このとき、第１の結合ドメインは１つの抗原またはターゲットに結合し、第２の結合ドメインは別の抗原またはターゲットに結合する。したがって、当該用語が包含する抗体コンストラクトは、少なくとも２種類の異なる抗原またはターゲットに対する特異性を備える。したがって、本発明の「二重特異性抗体コンストラクト」という用語は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば、３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト、または３つを超える（例えば、４つ、５つなど）特異性を有するコンストラクトを包含する。抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、当該コンストラクトは天然には存在せず、かつ天然に存在する産物とは著しく異なる。したがって、「二重特異性」抗体コンストラクトとは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、当技術分野において公知の様々な方法によって生成することができ、例えば、２つの異なる精製されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）または抗体フラグメントの化学的結合によって、あるいは２つのハイブリドーマを融合して、特に二重特異性ＩｇＧ分子を生成するクアドローマ細胞株を得ることによって、生成することができる（概説については、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．２０１５  Ｊｕｌ；２０（７）：８３８−４７を参照）。
【００４９】
ターゲット
先に示したように、本発明の医薬組成物は、第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する、二重特異性単鎖抗体コンストラクトを含む。
【００５０】
本発明における「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）向けられる」及び「（特異的に）反応する」という用語は、結合ドメインが、ターゲットタンパク質または抗原に位置するエピトープにおける１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と相互作用する、または特異的に相互作用することを意味する。
【００５１】
「エピトープ」という用語は、抗体もしくは免疫グロブリンのまたは抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体もしくはフラグメントなどの結合ドメインが特異的に結合する、抗原上の部位を指す。「エピトープ」は抗原性であるため、本明細書ではエピトープという用語が「抗原構造」または「抗原性決定基」を指すこともある。したがって、結合ドメインとは「抗原相互作用部位」である。また、当該結合／相互作用は「特異的認識」を定義すると理解されている。「エピトープ」は、連続的なアミノ酸（直鎖状エピトープ）またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非連続的なアミノ酸（立体構造エピトープ）の両方によって形成され得る。典型的には、直鎖状エピトープは、少なくとも３個または少なくとも４個、より通常的には、少なくとも５個または少なくとも６個または少なくとも７個、例えば約８〜約１０個のアミノ酸を一意の配列内に含む。典型的には、立体構造エピトープは、直鎖状エピトープよりも多数のアミノ酸を含む。エピトープの立体構造を決定する方法としては、以下に限定するものではないが、ｘ線結晶解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光分析、及び部位特異的スピンラベル、及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光分析が挙げられる。
【００５２】
結合ドメインとエピトープまたはエピトープクラスターとの間の相互作用は、結合ドメインが、特定のタンパク質または抗原上のエピトープまたはエピトープクラスターに対して認識可能な親和性を示し、概して、非ターゲットタンパク質または抗原との顕著な反応性を示さないことを意味する。「認識可能な親和性」とは、約１０−６Ｍ（ＫＤ）以上の親和性による結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである場合に特異的とみなされる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、自らのターゲットタンパク質または抗原以外のタンパク質または抗原に対しては、本質的または実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインは、それぞれのターゲットタンパク質以外のタンパク質に結合することができない）。
【００５３】
「本質的／実質的に結合しない」または「結合することができない」という用語は、本発明の結合ドメインが、自らのターゲットタンパク質または抗原以外のタンパク質または抗原に結合しないことを意味し、すなわち、自らのそれぞれのターゲットタンパク質または抗原に対する結合を１００％とすると、自らのターゲットタンパク質または抗原以外のタンパク質または抗原に対して、３０％を超える、好ましくは２０％を超える、より好ましくは１０％を超える、特に好ましくは９％、８％、７％、６％または５％を超える反応性を示さないことを意味する。
【００５４】
本明細書で説明されているように、二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、ターゲット細胞の表面抗原に結合可能な第１の結合ドメインと、Ｔ細胞の表面抗原ＣＤ３に結合可能な第２の結合ドメインとを含むことが想定されている。抗体コンストラクト、結合ドメイン、とりわけ（Ｔ細胞の表面にあるヒトＣＤ３に結合する）第２の結合ドメインは、特に以下の形式を有することが想定されている。ＶＨ領域及びＶＬ領域の対は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形式をとる。ＶＨ及びＶＬ領域は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順で配置されている。好ましくは、ＶＨ領域はリンカー配列に対してＮ末端側に位置し、ＶＬ領域はリンカー配列に対してＣ末端側に位置する。
【００５５】
本発明の医薬組成物内に含まれる抗体コンストラクトの第２の結合ドメインは、Ｔ細胞の表面抗原ＣＤ３に結合することができる。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、リンパ球の一タイプであり（リンパ球自身は白血球の一タイプである）、細胞媒介免疫において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞にはいくつかのサブセットが存在し、各々が別々の機能を有する。Ｔ細胞は、細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が存在することにより、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球から区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を担い、２つの異なるタンパク質鎖から構成されている。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）及びベータ（β）鎖からなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と係合すると、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、専用アダプター分子、及び活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的イベントを通じて活性化される。
【００５６】
ＣＤ３受容体複合体はタンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳類の場合、当該複合体はＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合して、Ｔ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成しＴリンパ球において活性化シグナルを産生する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーについて関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、または略してＩＴＡＭとし知られる単一の保存されたモチーフを含有し、これはＴＣＲのシグナリング能力に必須である。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトにおいて第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【００５７】
本発明の医薬組成物内に含まれる二重特異性単鎖抗体コンストラクトの第２の結合ドメインは、ターゲット細胞表面抗原に結合することができる。概して、当該ターゲット細胞の表面抗原は、第２の結合ドメインによって認識され第２の結合ドメインに結合することができる任意の抗原とすることができる。二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、ＣＤ３及びターゲット細胞表面抗原の両方に結合することにより、Ｔ細胞とターゲット細胞との間の連結を形成することが想定されている。したがって、二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、Ｔ細胞をターゲット細胞に向けて動員させ、好ましくは、パーフォリン及びグランザイムのようなアポトーシス促進性のタンパク質の生成により、Ｔ細胞にターゲット細胞への細胞毒性活性を発揮させると考えられている。そのため典型的には、ターゲット細胞は、Ｔ細胞が媒介する細胞毒性のターゲット、よって細胞溶解のターゲットとして意図された細胞となる。例えば、ターゲット細胞は、悪性芽細胞などの腫瘍細胞であり得る。したがって、ターゲット細胞表面抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＦＡＰアルファ、ＭＳＬＮ、ＦＬＴ３、またはＢＣＭＡから選択することができる。とりわけＣＤ３３は、本発明の二重特異性単鎖抗体コンストラクトにおける第１の結合ドメインのターゲットとして想定されている。
【００５８】
本発明における好ましい二重特異性単鎖抗体コンストラクトには、付属の実施例で評価される、ＡＭＧ１０３（ＣＤ１９を認識する第１の結合ドメインを含む）、ＡＭＧ３３０（ＣＤ３３を認識する第１の結合ドメインを含む）、ＣＤ３３特異性ＨＬＥ  ＢｉＴＥ、ＦＬＴ３特異性ＨＬＥ  ＢｉＴＥ、及びＢＣＭＡ特異性ＨＬＥ  ＢｉＴＥが含まれる。
【００５９】
具体的には、二重特異性単鎖コンストラクトの第１の結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９、１０９、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８３、１８５、及び１８７からなる群から選択され、二重特異性単鎖コンストラクトの第２の結合ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、１８、２７、３６、４５、５４、６３、７２、８１、１７９、及び９０からなる群から選択される。
【００６０】
したがって、本発明における好ましい二重特異性単鎖抗体コンストラクトには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８からなる群から選択されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むまたは当該ポリペプチドからなるコンストラクトが含まれる。
【００６１】
ペプチドリンカー
本発明の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも含まなくてもよい。本発明において、「ペプチドリンカー」という用語は、本発明の抗体コンストラクトの１つの（可変及び／または結合）ドメイン及び別の（可変及び／または結合）ドメインを互いに連結させるアミノ酸配列を定義する。このようなペプチドリンカーの本質的な技術的特徴は、当該ペプチドリンカーがいかなる重合活性も備えていないことである。好適なペプチドリンカーに含まれるものとして、米国特許第４，７５１，１８０号及び同第４，９３５，２３３号またはＷＯ８８／０９３４４に記載のペプチドリンカーがある。
【００６２】
リンカーが使用される場合、このリンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立して自らの差別的な結合特異性を保持できることを保証するための十分な長さ及び配列を有することが好ましい。抗体コンストラクトにおける少なくとも２つの結合ドメイン（または２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーに関しては、当該ペプチドリンカーは少数のアミノ酸残基、例えば１２アミノ酸残基以下、例えば１１、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸残基を含むことができる。想定される５アミノ酸未満を有するペプチドリンカーは、４、３、２、または１アミノ酸を含み、Ｇｌｙリッチであってもよく、すなわち、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなっていてもよい。他の有用なペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８）、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ、またはそのポリマー、すなわち、ｘが１以上の整数である（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘによって特徴づけられる。好ましくは、ペプチドリンカーはいかなる二次構造も促進しないことが好ましい。融合し作用可能に連結した二重特異性単鎖コンストラクトを調製し、当該コンストラクトを哺乳類細胞または細菌内で発現させるための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１２）。
【００６３】
誘導体
「抗体コンストラクト」という用語は、誘導体も包含する。「誘導体」という用語は、追加の機能を導入するように共有結合的に修飾された抗体コンストラクトを指す。抗体コンストラクトの共有結合的修飾は、分子の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることにより、翻訳後に導入することができる。抗体コンストラクトの誘導体化は、治療用または診断用の薬剤、標識、分子の血清半減期を延長する基を結びつけるため、あるいは非天然アミノ酸の挿入に使用することができる。一般に適用される化学修飾としては、以下のものが挙げられる。
【００６４】
システイニル残基は、最も一般的にはα−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。また、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル  ２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【００６５】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０におけるジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。これは、この薬剤がヒスチジル側鎖に比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくはｐＨ６．０において０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で実施する。リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤による誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基の誘導体化に好適な他の試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロンヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【００６６】
アルギニル残基は、１つまたはいくつかの従来的な試薬との反応により修飾され、試薬には、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基を誘導体化するには、グアニジン官能基のｐＫａが高いことから、アルカリ性条件下で反応を実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基に加えてアルギニンイプシロン−アミノ基とも反応し得る。
【００６７】
チロシル残基の特異的修飾、特にスペクトル標識のチロシル残基への導入に関しては、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンは、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体の形成に使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイで使用するための標識タンパク質を調製するために１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化するが、上述のクロラミンＴ法が適している。
【００６８】
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、式中、Ｒ及びＲ’は任意選択により異なるアルキル基であり、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【００６９】
二官能性薬剤による誘導体化は、本発明の抗体コンストラクトを様々な方法での使用のために水不溶性の支持マトリックスまたは表面と架橋させるのに有用である。一般的に使用されている架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及び二官能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体をもたらす。代替的に、反応性の水不溶性マトリックス、例えば、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、及び同第４，３３０，４４０号に記載の臭化シアン活性化炭水化物及び反応性基質をタンパク質固定化に用いる。
【００７０】
グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば脱アミドされ、それぞれ、対応するグルタミル及びアスパルチル残基となる。代替的に、これらの残基は穏やかな酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に入る。
【００７１】
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基に対するリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基に対するメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００７２】
グリコシル化及び脱グリコシル
本発明の範囲内に含まれる抗体コンストラクトにおける別のタイプの共有結合的修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンを変更することを含む。当技術分野において公知であるように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、後に論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または不在）、またはタンパク質が生成される宿主細胞もしくは生物のいずれにも依存し得る。特定の発現系については、後に論じる。
【００７３】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型とは、炭水化物部分とアスパラギン残基の側鎖との結合を指す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部分とアスパラギン側鎖との酵素結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって潜在的なグリコシル化部位がもたらされる。Ｏ結合型グリコシル化とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの糖と、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る、ヒドロキシアミノ酸との結合を指す。
【００７４】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、（Ｎ結合型グリコシル化部位用の）上述のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって遂行される。当該変更は、（Ｏ結合型グリコシル化部位用の）開始配列に１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加または置換することによって行うこともできる。簡便のため、抗体コンストラクトのアミノ酸配列の変更は、好ましくは、ＤＮＡレベルにおける変化を通じて、とりわけ予め選択された塩基におけるポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって行い、そうすることで所望のアミノ酸につながるコドンが産生される。
【００７５】
抗体コンストラクトにおける炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドとタンパク質との化学的または酵素的なカップリングによるものである。この手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としないという点で有利である。糖は、使用するカップリング様式に応じて、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【００７６】
出発抗体コンストラクト上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に遂行されても酵素的に遂行されてもよい。化学的脱グリコシルは、タンパク質を化合物のトリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物に曝露する必要がある。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖の切断がもたらされるが、ポリペプチドはインタクトのままである。化学的脱グリコシルは、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２、及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって説明されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって説明されるように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼを使用することによって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって説明されるように、化合物ツニカマイシンを使用することによって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成をブロックする。
【００７７】
非タンパク質性ポリマー
本明細書では、抗体コンストラクトの他の修飾も想定されている。例えば、抗体コンストラクトにおける別のタイプの共有結合的修飾は、抗体コンストラクトを様々な非タンパク質性ポリマーに連結することを含み、非タンパク質性ポリマーとしては、以下に限定するものではないが、様々なポリオール、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー、または、ヒドロキシエチルデンプン（例えば、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標））またはポリシアル酸（例えばＰｏｌｙＸｅｎ（登録商標）技術）などの炭水化物のコポリマーが挙げられる。加えて、当該技術分野において公知のように、アミノ酸置換は、例えばＰＥＧなどのポリマーの付加を促進するために、抗体コンストラクト内の様々な位置で行うことができる。
【００７８】
標識
一部の実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの共有結合的修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。標識基は、様々な長さのスペーサーアームを介して抗体コンストラクトに結合して、潜在的な立体障害を低減することができる。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、これらは本発明を実施する際に使用することができる。「標識」または「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を指す。概して、標識は、検出するアッセイに応じて様々なクラスに分類され、例としては以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
ａ）放射性同位元素であり得るかまたは重同位元素であり得る同位体標識、例えば、ラジオアイソトープまたは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）。
ｂ）磁性標識（例えば、磁性粒子）。
ｃ）レドックス活性部分。
ｄ）光学的色素（以下に限定するものではないが、発色団、リン光体、及びフルオロフォアを含む）、例えば、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基、及び「低分子」フルオロフォアであってもまたはタンパク質性フルオロフォアであってもよいフルオロフォア。
ｅ）酵素基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）。
ｆ）ビオチン化基。
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
【００７９】
「蛍光標識」は、自らの固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、以下に限定するものではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー、及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）が挙げられる。フルオロフォアを含む好適な光学的色素は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
【００８０】
また、好適なタンパク質性蛍光標識としては、以下に限定するものではないが、ウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）種、プチロサルクス（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ）種、またはオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ種）のＧＦＰを含む、緑色蛍光タンパク質（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２６０３−２６０７）、及びウミシイタケ属（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）が挙げられる。
【００８１】
ロイシンジッパードメインは、自らが見いだされるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初はいくつかのＤＮＡ結合タンパク質内で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、それ以来様々な異なるタンパク質内で見いだされている。既知のロイシンジッパーに含まれるものとしては、ダイマー化またはトリマー化する天然に存在するペプチド及びその誘導体がある。可溶性のオリゴマータンパク質の生成に好適なロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載され、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーはＨｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載されている。自らに融合した異種タンパク質の安定的なトリマー化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用については、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。１つのアプローチにおいては、ロイシンジッパーペプチドに融合したＣＤＨ１９抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を好適な宿主細胞内で発現させ、形成される可溶性のオリゴマーＣＤＨ１９抗体断片または誘導体を培養物の上清から回収する。
【００８２】
抗体コンストラクトは、例えば、分子の単離に役立つ、または分子の適合した薬物動態プロファイルに関連する、追加のペプチドまたはドメインも含むことができる。抗体コンストラクトの単離に役立つドメインは、ペプチドモチーフまたは二次的に導入された部分から選択することができ、これらはある単離方法（例えば、単離カラム）でキャプチャーすることができる。このような追加のドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びそのバリアント（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）、ならびにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。Ｈｉｓタグドメインは、分子のアミノ酸配列における連続したＨｉｓ残基、好ましくは６つのＨｉｓ残基の繰り返しとして一般的に知られている。抗体コンストラクトにおける血清半減期（すなわち、投与された薬物の５０％が生物学的プロセス、例えば、代謝、排泄などを通じて排除される時間）の延長に有用なドメインまたはペプチドとしては、ヒト体内で好ましい薬物動態プロファイルを用いて他のタンパク質に結合可能なもの、例えば、血清アルブミン（例えば、ＡＢ１５６ペプチド）または免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃドメインまたはそのバリアント）が挙げられる。
【００８３】
二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、本発明の医薬組成物中に約５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で、すなわち、約４．０ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、または０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することが想定されている。好ましくは、二重特異性単鎖抗体コンストラクトは、当該医薬組成物中に０．１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度、好ましくは０．２〜２．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．２５〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００８４】
シクロデキストリン
二重特異性単鎖抗体コンストラクト及びバッファーに加えて、本発明の医薬組成物はさらにβ−シクロデキストリンを含む。概して、「シクロデキストリン」または「ＣＤ」という用語は、少なくとも６つ以上の１→４結合α−Ｄ−グルコピラノシド単位から構成された環状オリゴ糖を指す。シクロデキストリンの単位構造は、内部にエーテル基を有する疎水性の空洞と、１級ヒドロキシル基によって特徴づけられる極性の外側とによって特徴づけられる。多くのシクロデキストリンが当技術分野において公知であり、これには６員（α−シクロデキストリン）、７員（β−シクロデキストリン）、及び８員（γ−シクロデキストリン）のシクロデキストリンが含まれる。７つのα−Ｄ−グルコピラノシド単位を含むβ−シクロデキストリンが、本発明の医薬組成物において特に好ましい成分である。というのも、β−シクロデキストリンが様々なストレス条件下で二重特異性単鎖抗体コンストラクトを有効に安定化可能であるということが示されたからである。
【００８５】
「シクロデキストリン」（とりわけ「β−シクロデキストリン」）という用語は、化学修飾された（β−）シクロデキストリン誘導体も包含する。概して、付属の実施例で実証されるような医薬組成物の有利な特性を低減または消失しない限りにおいて、とりわけ、医薬組成物が安定性を保持する限りにおいて、任意の化学修飾が考えられる。化学修飾されたシクロデキストリン誘導体は、典型的には、グルコース残基の２−、３−、及び６−ヒドロキシル基におけるエーテル化または他の官能基の導入によってもたらされる。したがって、当該用語は、ヒドロキシル基の１つ以上の置換を含むシクロデキストリン、例えば、アルキル化シクロデキストリン及びヒドロキシアルキル化シクロデキストリンを含む。
【００８６】
本発明の目的に関して、「シクロデキストリン」という用語は、その医薬的に許容される塩も含む。本明細書で使用する「医薬的に許容される塩」という用語は、投与に関して安全かつ有効なシクロデキストリンの塩を意味する。医薬的に許容される塩には、アニオンを用いて形成されたもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの、そしてカチオンを用いて形成されたもの、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものが含まれる。当然ながら医薬品で使用される任意の対イオンは安全とみなされるはずであり、出所に応じて様々であるが、医薬的に承認された対イオンのいくつかのリストが存在する。承認された塩形成物は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ（Ｓｔａｈｌ  ＰＨ，Ｗｅｒｍｕｔｈ  ＣＧ，ｅｄｉｔｏｒｓ．２００２．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｚｕｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ／ＶＨＣＡ．）で見いだすことができる。
【００８７】
したがって、本発明の医薬組成物は、β−シクロデキストリン、とりわけ、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、エチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン  スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル）−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンリン酸ナトリウム塩、β−シクロデキストリン硫酸ナトリウム塩、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリンヘプタナトリウム塩、カルボキシメチル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−シクロデキストリンからなる群から選択されるβ−シクロデキストリンを含むことが想定されている。とりわけ、当該β−シクロデキストリンは、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（「ＳＢＥ−β−ＣＤ」）ナトリウム塩、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（「ＨＰ−β−ＣＤ」）とすることができる。
【００８８】
β−シクロデキストリンは、医薬組成物中に０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度、好ましくは０．５％〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．８％〜１．５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在することができる。とりわけ、化学的に修飾されていないβ−シクロデキストリンの濃度は、約１．８％（ｗ／ｖ）以下、例えば、約１．６％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約１．４％（ｗ／ｖ）、約１．３％（ｗ／ｖ）、約１．２％（ｗ／ｖ）、約１．１％（ｗ／ｖ）、約１．０％（ｗ／ｖ）、約０．９％（ｗ／ｖ）、約０．８％（ｗ／ｖ）以下から約０．１％（ｗ／ｖ）に至るまでの濃度であることが想定されている。
【００８９】
バッファー
本発明の医薬組成物はさらにバッファーを含み、バッファーは、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタメート、アセテート、及びこれらの混合物からなる群から、とりわけ、リン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタメート、アセテート、及びこれらの組合せから選択することができる。
【００９０】
好適なバッファー濃度は、約２００ｍＭ以下、例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ｍＭの濃度を包含する。当業者であれば、本明細書に記載の医薬組成物の安定性を提供するために、容易にバッファー濃度を調整することができると考えられる。本発明の医薬組成物において想定されるバッファー濃度は、具体的には約５〜約２００ｍＭ、好ましくは約５〜約１００ｍＭ、より好ましくは約１０〜約５０ｍＭを範囲とする。
【００９１】
ｐＨ
本発明による医薬組成物は、約４〜約７．５の範囲のｐＨ、すなわち、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、または７．５のｐＨを有することができる。好ましくは、ｐＨは約５〜約７．５、より好ましくは約５．５〜約７．５の範囲である。
【００９２】
医薬組成物
本明細書で使用する「医薬組成物」という用語は、必要とする患者への投与に好適な組成物に関する。「対象」または「個体」または「動物」または「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、本発明の医薬組成物の投与が望ましい任意の対象、特に哺乳類の対象を指す。哺乳類の対象には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが含まれ、ヒトが好ましい。本発明の医薬組成物は安定性であり、かつ医薬的に許容されるものであり、すなわち、医薬組成物が投与される対象においていかなる望ましくない局所的または全身的な作用をもたらすことなく、所望の治療効果を引き出すことができる。本発明の医薬的に許容される組成物は、とりわけ無菌であり、かつ／または医薬的に不活性であり得る。具体的には、「医薬的に許容される」という用語は、動物における使用、より特定的にはヒトにおける使用のための、規制機関または他の一般に認識されている薬局方によって承認されていることを意味し得る。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、好ましくは治療有効量の、１つまたは複数の本明細書に記載の二重特異性単鎖抗体コンストラクト、β−シクロデキストリン、及びバッファーを含む。「治療有効量」は、所望の治療効果を引き出す当該コンストラクトの量を意味する。治療効果及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順、例えば、ＥＤ５０（個体群の５０％に治療有効な用量）及びＬＤ５０の判定（個体群の５０％に致死的な用量）によって決定することができる。治療効果と毒性作用との間の用量比は治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表現することができる。大きい治療指数を示す医薬組成物が一般に好ましい。
【００９４】
賦形剤
先述のβ−シクロデキストリン及びバッファーの他に、当該医薬組成物は、任意選択により、１つまたは複数のさらなる賦形剤を、本明細書に記載の有利な特性、とりわけ安定性を低減または消失しない限りにおいて含むことができる。
【００９５】
賦形剤は、多岐にわたる目的、例えば、製剤の物理的、化学的、または生物学的特性の調整、例えば、粘度の調整、及びまたは、さらに有効性を向上させるための、またはこのような製剤をさらに安定化させるための本発明のプロセス、ならびに、例えば製造、出荷、保管、使用前の調製、投与の間及びこれらの後に生じるストレスに起因する分解及び損傷に対するプロセス、のために本明細書で使用され得る。「賦形剤」という用語は、概して、充填剤、結合剤、崩壊罪、コーティング、吸着剤、付着防止剤、滑剤、保存剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味剤、溶媒、共溶媒、バッファー剤、キレート剤、粘性付与剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定剤、及び浸透圧調節剤を含む。
【００９６】
許容される賦形剤は、好ましくは医薬的に許容されるものであり、すなわち、用いる投薬量及び濃度においてレシピエントに対し無毒である。
【００９７】
例示的な賦形剤としては以下のものが挙げられるが、これに限定されない：
●  荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジンアセテート、アルギニン、グルタメート、及び／またはヒスチジンを含む、アミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、２−フェニルアラニン；
●  抗細菌剤及び抗真菌剤などの抗微生物剤を含む、保存剤；
●  抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム；
●  組成物を生理学的ｐＨまたはそれよりわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８または９のｐＨ範囲内に維持するために使用されるバッファー、バッファーシステム、及びバッファー剤；バッファーの例としては、ホウ酸、重炭酸、トリス−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸、コハク酸、ホスフェート、ヒスチジン、及びアセテートがあり；例えば、約ｐＨ７．０〜８．５のトリスバッファー、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファー；
●  非水性溶媒、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステル；
●  生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液を含む、水性担体；
●  ポリエステルなどの生分解性ポリマー；
●  マンニトールまたはグリシンなどの増量剤；
●  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；
●  等張剤及び吸収遅延剤；
●  錯化剤、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；
●  充填剤；
●  単糖、二糖、及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）；炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタ硫酸エステル、ソルビトール、またはキシリトールとすることができる；
●  （低分子量）タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質性担体、例えば、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチン、または好ましくはヒト由来の免疫グロブリン；
●  着色剤及び香味剤；
●  硫黄含有還元剤、例えば、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム；
●  希釈剤；
●  乳化剤；
●  ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；
●  ナトリウムなどの塩形成対イオン；
●  保存剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなど；例としては、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素；
●  Ｚｎ−タンパク質錯体などの金属錯体；
●  溶媒及び共溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）；
●  ポリオール、トレハロース、スクロース、オクタ硫酸、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；及び多価糖アルコールを含む、糖及び糖アルコール；
●  懸濁化剤；
●  界面活性剤または湿潤剤、例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール；界面活性剤は洗浄剤、好ましくは分子量が＞１．２ＫＤの洗浄剤、及び／またはポリエーテル、好ましくは分子量が＞３ＫＤのポリエーテルとすることができる；好ましい洗浄剤の非限定的な例としてはＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ８５があり、好ましいポリエーテルの非限定的な例としてはＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、及びＰＥＧ５０００がある；
●  スクロースまたはソルビトールなどの安定増強剤；
●  浸透圧増強剤、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール；
●  塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含む、非経口送達ビヒクル；
●  液体及び栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）を含む、静脈内送達ビヒクル。
【００９８】
当該医薬組成物における種々の賦形剤（例えば、上に挙げたもの）が種々の効果を有し得るものであり、例えば、アミノ酸がバッファー、安定剤、及び／または抗酸化剤として作用し、マンニトールが増量剤及び／または浸透圧増強剤として作用し、塩化ナトリウムが送達ビヒクル及び／または浸透圧増強剤として作用し得る等ということは、当業者には明らかである。
【００９９】
ポリオールは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質を物理的及び化学的な分解プロセスから守る有用な安定剤であり、また製剤の浸透圧調整にも有用である。ポリオールには、糖類、例えば、マンニトール、スクロース、及びソルビトール、ならびに多価アルコール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、さらに、本明細書で論じる目的のため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質も含まれる。マンニトールは、凍結乾燥製剤におけるケークの構造安定性を保証するために一般的に使用されている。マンニトールは、ケークの構造安定性を保証する。マンニトールは概して、凍結保護剤、例えばスクロースと共に使用する。ソルビトール及びスクロースは、浸透圧を調整するための薬剤、また、輸送中の凍結・解凍ストレスから保護するための、または製造プロセス中のバルク調製物を保護するための安定剤として、一般的に使用されている。ＰＥＧはタンパク質の安定化に有用であり、また凍結保護剤としても有用である。
【０１００】
界面活性剤は通常、表面吸着の防止、最小化、または低減のために使用されている。タンパク質分子は、表面への吸着、そして気体−液体、固体−液体、及び液体−液体界面における変性及び結果的な凝集に対して感受性であり得る。これらの効果は、概してタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、概してタンパク質濃度に反比例し、典型的には物理的攪拌、例えば出荷及び製品の取り扱いの間に発生する物理的攪拌によって悪化する。一般に使用されている界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。また、界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般的に使用されている。この観点における界面活性剤の使用は、特定のタンパク質に向けられたものである。というのも、任意の所与の界面活性剤は、典型的には一部のタンパク質を安定化させ他のタンパク質を不安定化させるからである。
【０１０１】
ポリソルベートは酸化的分解を受けやすく、追加する際に、タンパク質残基側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量の過酸化物を含有することが多い。そのため、ポリソルベートは慎重に使用するべきであり、使用する場合は最低有効濃度で用いるべきである。
【０１０２】
抗酸化剤は、周囲の酸素及び温度を適正なレベルに維持し、光への曝露を回避することにより、医薬組成物におけるタンパク質の有害な酸化を、ある程度まで、防止することができる。抗酸化賦形剤も、タンパク質の酸化的分解の防止に使用することができる。この観点において有用な抗酸化剤に含まれるものとしては、還元剤、酸素／フリーラジカルスカベンジャー、及びキレート剤がある。治療用タンパク質製剤で使用するための抗酸化剤は、好ましくは水溶性であり、製品の貯蔵寿命全体においてその活性を維持する。ＥＤＴＡは有用な例である。
【０１０３】
金属イオンはタンパク質補因子として作用することができ、タンパク質の配位錯体の形成を可能にする。金属イオンは、タンパク質を分解する一部のプロセスを阻害することもできる。しかし、金属イオンは、物理的及び化学的プロセスへの触媒作用も及ぼす。マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用することができる。Ｃａ＋２イオン（１００ｍＭまで）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加させることができる。しかし、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮアーゼを不安定化させる可能性がある。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は第ＶＩＩＩ因子を安定化させ、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２は第ＶＩＩＩ因子を不安定化させ、Ａｌ＋３イオンは第ＶＩＩＩ因子の凝集を増加させる可能性がある。
【０１０４】
保存剤の主要な機能は微生物成長の阻害であり、薬物製品の貯蔵寿命または使用期間全体にわたって製品の無菌性を保証し、とりわけ多用量製剤に対して必要とされるものである。一般的に使用される保存剤としては、ベンジルアルコール、フェノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬に対しては長年にわたって使用されてきたが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は困難なものであり得る。保存剤は、タンパク質に対する不安定化作用（凝集）をほとんど常に有し、このことがタンパク質製剤における使用を制約する主な要因となっている。これまで、ほとんどのタンパク質薬物は単回専用に製剤化されてきた。しかし、多用量製剤が可能な場合、患者の利便性を可能にするという追加の利点、及び市場性の増大がもたらされる。好例がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の多用量製剤であり、保存製剤の開発によって、利便性のより高い多回使用ペン型注射器提示の商品化がもたらされた。
【０１０５】
予想され得るように、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。フリーズドライ製品は、保存剤なしで凍結乾燥し、使用時に保存剤を含有する希釈剤で再構成することができる。このことは保存剤がタンパク質と接触する時間を短縮し、関連する安定性リスクを顕著に最小化する。液体製剤については、保存剤の有効性及び安定性を製品の貯蔵寿命（約１８〜２４ヵ月）全体にわたって維持するべきである。留意すべき重要な点は、保存剤の有効性が、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において示されるべきであるという点である。
【０１０６】
塩は、例えば、医薬組成物のイオン強度及び／または等張性を調整し、かつ／または抗体コンストラクトもしくは他の成分の可溶性及び／もしくは物理的安定性をさらに向上させるために、本発明に従って使用することができる。周知であるように、イオンは、タンパク質の表面における荷電残基に結合することにより、またタンパク質内の荷電極性基を保護し、静電相互作用、引力性及び反発性の相互作用の強さを低減することにより、タンパク質のネイティブ状態を安定化させることができる。また、イオンは、とりわけタンパク質における変性したペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することにより、タンパク質の変性状態を安定化させることもできる。さらに、タンパク質内の荷電極性基とのイオン相互作用は、分子間の静電相互作用を低減し、よって、タンパク質の凝集及び不溶性を防止または低減することもできる。イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は異なる。イオン及びイオンがタンパク質に及ぼす効果についての複数のカテゴリー別ランキングが開発されており、これらは本発明による医薬組成物の製剤で使用することができる。一例にホフマイスター系列があり、これは、イオン性溶質及び極性の非イオン性溶質を、それらが溶媒中のタンパク質の立体構造安定性に及ぼす効果によってランク付けしている。安定化作用のある溶質は「コスモトロピック」と呼ばれる。不安定化作用のある溶質は「カオトロピック」と呼ばれる。一般的に、コスモトロピック物質は、溶媒からタンパク質を沈殿させる（「塩析」する）ために高濃度（例えば、＞１モルの硫酸アンモニウム）で使用する。一般的に、カオトロピック物質は、タンパク質を変性及び／または可溶化する（「塩溶」する）ために使用する。イオンが「塩溶」及び「塩析」する相対的有効性によって、ホフマイスター系列におけるイオンの位置が定義される。
【０１０７】
遊離アミノ酸は、増量剤、安定剤、及び抗酸化剤、さらに他の標準的な使用として、医薬組成物中で使用することができる。リジン、プロリン、セリン、及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化させるために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥において正しいケーク構造及び特性を保証するのに有用である。アルギニンは、液体製剤及び凍結乾燥製剤の両方において、タンパク質凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、抗酸化剤として有用である。
【０１０８】
医薬組成物の製剤化に特に有用な賦形剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック、及びこれらの組合せが挙げられる。当該賦形剤は、医薬組成物が本明細書で例示される所望の特性を示し、とりわけ含まれている二重特異性単鎖抗体コンストラクトの安定性を促進する限りにおいて、種々の濃度で医薬組成物中に存在することができる。例えば、スクロースは、医薬組成物中に２％（ｗ／ｖ）から１２％（ｗ／ｖ）の間の濃度で、すなわち、１２％（ｗ／ｖ）、１１％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、または２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することができる。好ましいスクロース濃度は、４％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間、より好ましくは６％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）の間の範囲である。ポリソルベート８０は、医薬組成物中に０．００１％（ｗ／ｖ）から０．５％（ｗ／ｖ）の間の濃度で、すなわち、０．５％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００８％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）、０．００２％（ｗ／ｖ）、または０．００１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することができる。好ましいポリソルベート８０濃度は、０．００２％（ｗ／ｖ）から０．５％（ｗ／ｖ）の間、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）から０．０２％（ｗ／ｖ）の間の範囲である。
【０１０９】
本明細書で提供する医薬組成物は、とりわけ１つ以上の保存剤を含むことができる。
【０１１０】
医薬組成物の製剤化に有用な保存剤としては、概して、抗微生物剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤）、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられ、例としては、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素がある。抗微生物性保存剤は、微生物の増殖を低減することにより薬の貯蔵寿命を延長するために使用される物質である。本発明の医薬組成物の製剤化に特に有用な保存剤としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン、チオメロサールが挙げられる。これらの保存剤を使用するための構造及び典型的濃度は、Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９６（１２），３１５５の表１に記載されている。
【０１１１】
前述の保存剤は、種々の濃度で医薬組成物中に存在することができる。例えば、ベンジルアルコールは０．２から１．１％（ｖ／ｖ）の間の範囲の濃度、クロロブタノールは０．３〜０．５％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度、フェノールは０．０７から０．５％（ｖ／ｖ）の間の範囲の濃度、メタ−クレゾールは０．１７から０−３２％（ｖ／ｖ）の間の範囲の濃度、またはチオメロサールは０．００３から０．０１％（ｖ／ｖ）の間の範囲の濃度で存在することができる。メチルパラベンの好ましい濃度は０．０５から０．５％（ｖ／ｖ）の範囲であり、フェノキシエタノールについては０．１から３％（ｖ／ｖ）の範囲であり、プロピルパラベンについては０．０５から０．５％（ｖ／ｖ）の範囲である。
【０１１２】
ただし、医薬組成物がいかなる保存剤も含まない場合も考えられる。詳細には、本明細書ではとりわけ、保存剤を含まない医薬組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または１１０に示されるアミノ酸配列を有する約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の二重特異性単鎖抗体コンストラクトと、約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩と、約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムと、さらに、ｐＨ  約６．０の約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０とを含む、医薬組成物を提供する。
【０１１３】
形態
本発明の医薬組成物は様々な形態で、例えば、固体、液体、凍結、気体、または凍結乾燥の形態で製剤化することができ、とりわけ本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、タブレット、溶液、エアロゾル、顆粒、ピル、懸濁液、エマルジョン、カプセル、シロップ、液体、エリクシール、抽出物、チンキ、または流エキスの形態をとり得る。
【０１１４】
概して、本発明の医薬組成物に関しては、とりわけ、意図される投与経路、送達形式、及び所望の投薬量に応じて、様々な保管形態及び／または剤形が考えられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（２０１２）を参照）。当業者であれば、このような特定の剤形の選択が、例えば、本発明の抗体コンストラクトにおける物理的状態、安定性、インビボの放出率、及びインビボのクリアランス率に影響を及ぼし得るということを認識するであろう。
【０１１５】
例えば、医薬組成物における主なビヒクルまたは担体は、事実上水性であっても非水性であってもよい。好適なビヒクルまたは担体は、注射用水、生理的食塩水、または人工脊髄液とすることができ、場合によっては非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を追加する。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。
【０１１６】
非経口投与が企図される場合、本発明の治療用組成物は、医薬的に許容されるビヒクル中に所望の抗体コンストラクトを含む、パイロジェンフリーで非経口的に許容される溶液の形態で提供することができる。非経口注入に特に好適なビヒクルは無菌蒸留水であり、抗体コンストラクトはこの無菌蒸留水中で、適正に保存された状態で無菌の等張性溶液として製剤化される。調製は、デポー注入によって送達することができる製品の制御放出または持続放出を提供し得る薬剤、例えば、注入可能なミクロスフェア、生物侵食性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームと共に、所望の分子を製剤化することを伴い得る。循環中の持続期間を増進する効果のあるヒアルロン酸も使用することができる。植え込み式の薬物送達デバイスを使用して所望の抗体コンストラクトを導入してもよい。
【０１１７】
持続性または制御性の送達／放出の製剤も、本明細書で想定されている。様々な他の持続性または制御性の送達手段、例えば、リポソーム担体、生物侵食性の微粒子または多孔性ビーズ、及びデポー注入も、当業者にとって公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載されている国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照。持続放出調製物としては、造形品の形態の半透性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルが挙げられ得る。持続放出マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願公報番号ＥＰ０５８４８１に開示）、Ｌ−グルタミン酸及びガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，上記参照）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公報番号ＥＰ１３３，９８８）が挙げられ得る。持続放出組成物としてはリポソームも挙げることができ、これは当技術分野において公知であるいくつかの方法のいずれかによって調製することができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公報番号ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６及びＥＰ１４３，９４９を参照。また、抗体コンストラクトは、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれについて、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）のマイクロカプセル）、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入することもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（２０１２）に開示されている。
【０１１８】
インビボ投与用に使用する医薬組成物は、典型的には無菌調製物として提供される。滅菌は、無菌濾過膜を通じての濾過によって遂行することができる。組成物を凍結乾燥させる場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前または後のいずれかで行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液中で保管することができる。概して、非経口の組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静注用溶液バッグまたはバイアルに入れる。
【０１１９】
本明細書で開示される抗体コンストラクトは、免疫リポソームとして製剤化することもできる。「リポソーム」とは、様々なタイプの脂質、リン脂質、及び／または界面活性剤から構成された小さな小胞であり、哺乳類への薬物送達に有用である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と同様に二分子膜構成で配置されている。抗体コンストラクトを含有するリポソームは、当技術分野において公知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；ならびにＷＯ９７／３８７３１に記載の方法によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって産生することができる。リポソームは規定孔径のフィルターから押し出し、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体コンストラクトのＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のように、ジスルフィド交換反応によってリポソームに結合させることができる。任意選択により、化学療法剤をリポソーム内に含有させる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）  １４８４（１９８９）を参照。
【０１２０】
さらなる活性剤
本発明の組成物は、本明細書で定義する二重特異性単鎖抗体コンストラクトに加えて、当該組成物の意図される使用に応じて、さらに生物活性剤を含み得ることが想定されている。このような薬剤は、とりわけ腫瘍及び／または悪性細胞に作用する薬物であり得るが、医薬組成物の意図される使用に応じて他の活性剤も考えられ、これには、胃腸系に作用する薬剤、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症反応を調節する薬物、循環系に作用する薬物、及び／またはサイトカインなどの、当技術分野において公知の薬剤が含まれる。また、本発明の医薬組成物は、併用療法、すなわち、別の抗がん剤と組み合わせて適用されることも想定されている。
【０１２１】
保管
医薬組成物は、ひとたび製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として無菌バイアル内で保管することができる。このような製剤は、すぐに使用可能な形態でも、投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）でも保管することができる。例えば、凍結乾燥組成物は、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤中で再構成することができる。
【０１２２】
投与経路
本発明の医薬組成物は、概して、任意の好適な投与経路による送達用に製剤化することができる。本発明の文脈における投与経路としては、以下に限定するものではないが、局所経路（例えば、皮膚上、吸入、経鼻、点眼、耳介／耳、膣、粘膜）；経腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇の下、頬側、直腸）；及び非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）が挙げられる。
【０１２３】
本明細書に記載の医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下または静脈内の送達に特に有用であり、例えば、ボーラス注射などの注射によって、または継続的注入などの注入によって行う。医薬組成物は、医療デバイスを用いて投与することができる。医薬組成物の投与用の医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号；同第４，４３９，１９６号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４８７，６０３号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；及び同第５，３９９，１６３号に記載されている。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、中断なしに投与することもできる。非限定的な例として、中断なしの、または実質的に中断なしの、すなわち継続的な投与は、患者に装着させる小型ポンプシステムによって実現することができ、当該システムによって抗体コンストラクトの患者体内への流入が計量される。医薬組成物は、当該ポンプシステムを使用することによって投与することができる。このようなポンプシステムは当技術分野において広く知られており、一般的には注入対象の治療剤を含有するカートリッジの定期的交換が必要である。このようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、このこと以外で中断は生じない患者体内への治療剤の流入が一時的に中断され得る。このような場合も、カートリッジ交換前の投与フェーズとカートリッジ交換後の投与フェーズは、依然として本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内とみなされ、これらが一緒になってこのような治療剤の「中断なしの投与」を構成するものと思われる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物の継続的なまたは中断なしの投与は、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内投与または皮下投与とすることができ、当該デバイスまたはシステムは、流体をリザーバーから推進するための流体推進機構及び推進機構を作動させるための作動機構を含む。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に貫入し好適な組成物を患者体内に送達するための針またはカニューレを含むことができる。当該ポンプシステムは、静脈、動脈または血管とは無関係に、ポンプシステム及び患者の皮膚が直接接触できるように、患者の皮膚に直接固定または取り付けることができる。ポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間〜数日間取り付けることができる。ポンプシステムは、小容量のリザーバーを有する小型サイズのものとすることができる。非限定的な例として、投与する好適な医薬組成物用のリザーバーの容量は、０．１から５０ｍｌの間とすることができる。
【０１２６】
また、継続的投与は、皮膚に装着し一定間隔で交換するパッチによって経皮的に達成することもできる。当業者は、この目的に好適な薬物送達用のパッチシステムを認識している。経皮投与は、第１の使用済みパッチの交換を、新たな第２のパッチの配置と同時に達成することができ有利であるため、例えば、第１の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面に、そして第１の使用済みパッチを除去する直前に新たな第２のパッチを配置するため、中断なしの投与に特に適用可能であることに注目されたい。流れの中断または動力電池破損の問題は生じない。
【０１２７】
当業者であれば、本発明の医薬組成物が、概して前述の賦形剤または追加の活性剤のいずれかを含むことができ、あるいは、本発明の医薬組成物が、安定性でありかつ好ましくは付属の実施例で評価されているβ−シクロデキストリンを含む医薬組成物と同じ有利な特性を示す限りにおいて、任意の好適な形態で提供され得ることを容易に理解することになる。当業者であれば、安定性である医薬組成物、すなわち好ましくは凝集体及び／または内部に含まれる二重特異性単鎖抗体コンストラクトの立体構造異性体を実質的に含まない医薬組成物を提供するように、様々な成分を調整することができる。
【０１２８】
本明細書で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「（１つの）試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」に対する参照は、１つ以上のこのような種々の試薬を含み、「当該方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する参照は、本明細書に記載の方法のために改変され得るまたは本明細書に記載の方法と置換され得る当業者に公知の等価なステップ及び方法に対する参照を含む。
【０１２９】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のあらゆる要素を指すと理解すべきである。当業者は、本明細書に記載の特定の態様に対する多くの等価物を認識することになり、または単なる通例的実験を用いてこれらを確認することができる。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図されている。
【０１３０】
「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「及び」、「または」、そして「当該用語によって接続される要素の全てまたは任意の他の組合せ」という意味を含む。
【０１３１】
本明細書で使用する「約」または「およそ」という用語は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。ただし、当該用語は具体的な数字も含み、例えば約２０は２０を含む。
【０１３２】
「〜未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）」または「〜より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）」という用語は、具体的な数字を含む。例えば、２０未満は、未満またはそれに等しいことを意味する。同様に、〜を超える（ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ）、または〜より大きいはそれぞれ、〜を超えるまたはそれに等しい、〜より大きいまたはそれに等しいことを意味する。
【０１３３】
本明細書及びその次の特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、述べられる整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を含むことを意味し、ただし任意の他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または本明細書で使用する場合は時として「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語とも置き換えることができる。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項の要素で特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用する場合、「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的な影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。
【０１３５】
本明細書では各場合において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。
【０１３６】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、及び物質等に限定されず、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０１３７】
本明細書の本文全体において引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書等を含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれる資料が本明細書と相反または矛盾する程度まで、本明細書はいかなるこのような資料よりも優先される。
【０１３８】
以下の実施例から本発明及びその利点をより良好に理解することができるが、本実施例は例示目的で提供するに過ぎない。本実施例は、いかなる形においても本発明の範囲を制限するようには意図されていない。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：ＡＭＧ３３０及びＨＰ−β−ＣＤを含む製剤に及ぼす温度誘導ストレスの作用
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに由来するＡＭＧ３３０タンパク質プール（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）を、１００ｍＭのトリス塩基、５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム、４％（ｗ／ｖ）のトレハロース二水和物、ｐＨ５．２から構成された製剤塩基バッファーに透析した。透析のエンドポイントをオスモル濃度測定によって検証した。透析したバルクを限外濾過及び遠心分離によって濃縮して０．９６ｍｇ／ｍＬの濃度にし、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターによって無菌濾過を行った。予備製剤化したバルクを３つの等しいサイズの体積分画に分割した。これらを、５Ｍの水酸化ナトリウムを用いてそれぞれｐＨ５．２、５．６、及び６．０に調整し、０．２μｍのＰＶＤＦフィルターで再び濾過した。ｐＨ調整後、予備製剤化したバルクに、１％（ｗ／Ｖ）のポリソルベート２０、１％（ｗ／Ｖ）のポリソルベート８０、または４％（ｗ／Ｖ）のＨＰ−β−ＣＤのいずれかを含有する所要体積のストック溶液を添加した。最終製剤におけるポリソルベート２０、ポリソルベート８０、及びＨＰ−β−ＣＤの濃度を図１に示す。上述のように構成された塩基バッファーを用いて、各製剤の濃度を０．４ｍｇ／ｍＬに調整した。全ての賦形剤を公定グレードで適用した。最終製剤をポリプロピレン反応チューブ内に１５０μＬ充填し、３０℃の制御されたキャビネット内で７２時間インキュベートした。立体構造異性体及び高分子種（ＨＭＷＳ）の含量を、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）を用いて決定した。ＳＥ−ＵＰＬＣは、Ａｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ  １５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて実施した。カラム温度を２５℃に設定した。均一濃度法を０．４ｍＬ／分の流量で適用することにより、サイズバリアントの分離を達成した。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８で構成されていた。実行時間は合計６．０分である。分析するまで、試料をオートサンプラー内で８℃に保持した。注入体積は７．５μＬとした。キャリーオーバーを回避するため、４０％のＡＣＮを用いた中間注入を各試料の後に実施した。検出は、蛍光（Ｅｘ２８０ｎｍ、Ｅｍ３２５ｎｍ）に基づいた。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いてピーク積分を実施した。モノマー及びサイズバリアントの相対的ＡＵＣが報告された。熱ストレス（３０℃）中における非モノマータンパク質種（立体構造異性体及び高分子種を含む）の形成は、ＨＰ−β−ＣＤの存在下で阻害される可能性があることが示されたと考えられる（図１）。これに対し、ポリソルベート２０または８０を含有する製剤は、経時的に非モノマー種の形成を示した。
【０１４０】
実施例２：ＡＭＧ３３０及びＨＰ−β−ＣＤを含む製剤に及ぼす表面誘導ストレスの作用
ＨＰ−β−ＣＤが表面誘導ストレス条件に対しＡＭＧ３３０を安定化させるかどうかを評価するため、さらなる実験を実施した。３５ｍＭのトリス塩酸塩、１７．５ｍＭのリン酸ナトリウムリン酸水素、１００ｍＭのＬ−アルギニン塩酸塩、及び１．４％（ｗ／Ｖ）のトレハロース二水和物、ｐＨ６．０において製剤化したＡＭＧ３３０原薬に、ポリソルベート２０、８０、またはＨＰ−β−ＣＤのいずれかを、図２に示す種々の濃度（ｘ軸）で追加した。全ての賦形剤を公定グレードで適用した。製剤を、予備洗浄し予備滅菌したＩ型ガラスバイアルに１．０ｍＬ充填した。滅菌したブチルゴムストッパーでバイアルに栓をし、アルミニウムキャップで密封した。製剤に、（１）１０回の連続した凍結／解凍サイクル及び（２）発泡でストレスをかけた。凍結及び解凍は、Ｅｐｓｉｌｏｎ  ２−６Ｄパイロット凍結乾燥器（Ｃｈｒｉｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。凍結及び解凍の目標温度を、それぞれ−５０℃及び２０℃に設定した。０．３Ｋ／ｍｉｎの凍結率及び解凍率を使用した。各温度は、１時間等温プラトーに従った。発泡は、２１Ｇの注射針を用いて、それぞれの溶液に１分間当たり８０ｍＬで１時間にわたり窒素を注入することによって達成した。無菌フィルターを装備した第２の注射針を用いて、バイアルをベントした。−７０℃で保管した試料を非ストレス対照として使用した。試料をＳＥ−ＵＰＬＣ及びＤｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｃｏｄｅｘ（ＤＡＣ）試験５による目視検査によって分析した。実施例１に記載のようにしてＳＥ−ＵＰＬＣを実施した。タンパク質濃度の評価のため、２８０ｎｍにおける吸収により追加的に検出を実施した。
【０１４１】
非ストレス対照試料においては、ＨＰ−β−ＣＤを含む製剤と比べると、ポリソルベート２０または８０を含有する製剤中で立体構造異性体、ダイマー、及び凝集体を含めた非モノマー種がより豊富であることが明らかになった。発泡及び凍結／解凍によってストレスをかけた場合、ポリソルベートを含有する製剤中で非モノマー種が増加した（図２）。ＨＰ−β−ＣＤの使用によって、非モノマー種の形成が低減された。界面活性剤の不在下では８０％を超えるタンパク質損失が観察されたが、一方ポリソルベート及びＨＰ−β−ＣＤを使用した場合には、定量的なタンパク質の回復がもたらされた。界面活性剤を含まない製剤とは対照的に、ＨＰ−β−ＣＤを含有する製剤は、可視のサイズ範囲においてタンパク質凝集体を事実上含まなかった（表１）。
【０１４２】
（表１）ＰｈＥｕｒ  ２．９．２０による可視粒子の評価。検査結果評点はＤｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｃｏｄｅｘ  （ＤＡＣ）試験５による割当て。
2019506406.tif 000002
１  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｃｏｄｅｘ（ＤＡＣ）試験５による公定要件：検査結果＜４．５
【０１４３】
実施例３：ＡＭＧ１０３及びＨＰ−β−ＣＤまたはＳＢＥ−β−ＣＤを含む製剤に及ぼすベンジルアルコールの効果
ベンジルアルコールの存在下でのＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトの安定性に及ぼすＨＰ−β−ＣＤ及びＳＢＥ−β−ＣＤの効果について、０．６ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ１０３（ブリナツモマブ）を含有する製剤で調べた。そのため、ＡＭＧ１０３を２０ｍＭのヒスチジン、２％（ｗ／ｖ）のトレハロース二水和物、０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中で製剤化した。この製剤に、種々の濃度のＨＰ−β−ＣＤ（０．５及び１．０％  ｗ／Ｖ）またはＳＢＥ−β−ＣＤ（０．５、１．０、及び２．０％  ｗ／Ｖ）のいずれかを追加した。シクロデキストリンを含まない製剤が対照としての役目を果たした。全ての製剤におけるＡＭＧ１０３の濃度を０．６ｍｇ／ｍＬに調整した。全ての賦形剤を公定グレードで適用した。全ての製剤に０．９％（Ｖ／Ｖ）のベンジルアルコールを添加し、ポリプロピレン反応チューブに０．５ｍＬ充填した。インキュベートを３７℃で２４時間実施した。タンパク質凝集の尺度としての３５０ｎｍにおける光学密度を決定するために、ＵＶ吸収によって試料を分析し、潜在的な立体構造の変化を検出するために、内部蛍光放出強度の測定によって試料を分析した。ＵＶ吸収は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）上で透明なハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて実施した。各ウェルに１００μＬの試料溶液を充填した。試料の測定を三重反復で実施した。ＵＶ吸収を３５０ｎｍで記録した。内部蛍光放出強度を、同じプレートにおいて下から分析した。励起を２７８ｎｍで実現した。放出強度を３００〜５００ｎｍにおいて１ｎｍずつ増加させて記録した。励起及び放出のスリットを、それぞれ１０及び５ｎｍに設定した。ＵＶ測定及び蛍光測定のいずれを行う間も、プレートに温度制御（２５℃）を行った。
【０１４４】
３５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）からは、ＨＰ−β−ＣＤまたはＳＢＥ−β−ＣＤの存在下でのＡＭＧ１０３の凝集傾向の低減が示された。この効果は、シクロデキストリン濃度を増加させた場合により著明であった（図３）。ベンジルアルコールの存在下でのＡＭＧ１０３の凝集は、内部蛍光が実証するところのトリプトファン残基の局所環境の変化につながる。異なるβ−ＣＤの濃度を増加させることでこれらの変化が最小限に抑えられた（図４）。
【０１４５】
実施例４：種々の濃度のＡＭＧ１０３及びβ−ＣＤを含む製剤に及ぼすベンジルアルコールの効果
ＡＭＧ１０３（ブリナツモマブ）の凝集傾向に及ぼす、濃度を増加させたＨＰ−β−ＣＤ及びＳＢＥ−β−ＣＤの効果を、２水準４因子要因実験設計によって対処した。ＡＭＧ１０３を実施例２に記載のようにして製剤化した。ただし、その濃度を０．２から０．６ｍｇ／ｍＬの間に変動させた（表２）。
【０１４６】
（表２）ベンジルアルコールの存在下でのＡＭＧ１０３の凝集傾向に及ぼすＳＢＥ−β−ＣＤ及びＨＰ−β−ＣＤの効果を評価するための２水準４因子要因実験設計
2019506406.tif 000003
【０１４７】
全ての試料を透明なハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に直接入れ、３７℃で９６時間インキュベートした。プレートを接着性のホイルで覆って蒸発損失を回避した。ここでも、３５０ｎｍにおける光学密度をＡＭＧ１０３の凝集の尺度として用いた（実施例３を参照）。分析データの評価を、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ（登録商標）ソフトウェアを用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。予測正常値を生の残差に対しプロットすることにより、測定値の正規分布を図式的に検証した。分析データの回帰に基づき、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ（登録商標）によって予測モデル（図５）を生成した。これにより、純粋な因子効果に加えて因子間の線形相互作用も考慮された。所与の濃度のＡＭＧ１０３及びベンジルアルコールでは、ＡＭＧ１０３の凝集は、ＨＰ−β−ＣＤまたはＳＢＥ−β−ＣＤのいずれかの含有量増加によって低減される可能性がある（図５）。
【０１４８】
実施例５：二重特異性抗体コンストラクト及びβ−ＣＤを含む製剤に及ぼす保管誘導ストレスの作用
２０ｍＭのリン酸カリウム中およそ１ｍｇ／ｍＬのＣＤ３３＿２−ｈＡＬＢ、１５０ｍＭのＬ−アルギニン塩酸塩、及び６％（ｗ／Ｖ）のトレハロース二水和物、ｐＨ６．０を含有する予備製剤化した薬物物質を、２０ｍＭのクエン酸、６％（ｗ／Ｖ）のスクロース、ｐＨ５．０中と、２０ｍＭのリン酸カリウム、６％（ｗ／Ｖ）のスクロース、ｐＨ６．０中とでそれぞれ透析した。透析のエンドポイントをオスモル濃度測定値によって決定した。透析はＳｌｉｄｅ  Ａ  Ｌｙｚｅｒ（登録商標）デバイスを用いて実施した。透析後、クエン酸緩衝材料をＶｉｖａＳｐｉｎ（登録商標）ユニットで７ｍｇ／ｍＬ超に直接濃縮した。およそ２０００ｇで５分間、２〜８℃で遠心分離を行った。リン酸カリウム緩衝材料を同様に処理した。ただし、遠心分離ステップの前に、材料を２つの同じサイズの体積画分に分割した。一方の画分をｐＨ７．０に調整した。第２の画分のｐＨはｐＨ６．０で維持した。０．２μｍのＰＶＤＦフィルターによる無菌濾過後、適用可能な場合においてポリソルベート８０及びＳＢＥ−β−ＣＤのストック溶液を添加することにより、濃縮物を最終的に製剤化した。ＣＤ３３＿２−ｈＡＬＢの目標濃度は５．０ｍｇ／ｍＬとした。最終的に製剤化されたバルクを、予備洗浄し予備滅菌したＩ型ガラスバイアルに充填した。滅菌したブチルゴムストッパーでバイアルに栓をし、アルミニウムキャップで密封した。充填体積は合計１．０ｍＬとした。製剤に関する概要を表３に示す。３７℃に温度制御したキャビネット内でバイアルを６日間保管した。実施例１に記載の方法を用いて、ＳＥ−ＵＰＬＣにより高分子種を定量化した。タンパク質の注入量は合計３μｇとした。
【０１４９】
（表３）ＣＤ３３＿２−ｈＡＬＢ製剤に関する概要
2019506406.tif 000004
【０１５０】
ＳＢＥ−β−ＣＤを含有する製剤（Ｆ２、Ｆ４、Ｆ６）は、インキュベート後、シクロデキストリンを含まない調製物に比べて、より低量の高分子種（ＨＭＷＳ）を示した。この効果は、ｐＨ５よりもｐＨ６及び７においてより著明であった（図６）。
【０１５１】
実施例６：二重特異性抗体コンストラクト及びβ−ＣＤを含む製剤に及ぼす限外濾過及びダイアフィルトレーションの効果
精製したＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６）を限外濾過（ＵＦ）によって段階的に濃縮した。最初に、再生セルロース膜及び０．１１ｍ２の表面を装備したカセットを用いて７倍濃縮を実施した。５０ｃｍ２の表面を有するより小さい膜を用いてさらに７倍濃縮を行った。両方の膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は１０ｋＤａとした。限外濾過及びダイアフィルトレーションのステップに関しては、膜間圧力を１．４バールに制限した。濃縮プールを２つの部分に分割した。第１の部分は、２０ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＬ−アルギニン塩酸塩、６％（ｗ／Ｖ）のトレハロース二水和物、ｐＨ６．０から構成されたバッファー内へダイアフィルトレーションした。第２の部分は、２０ｍＭのリン酸カリウム、２％（ｗ／Ｖ）のスクロース、ｐＨ６．０から構成されたバッファー内へダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした材料に濃縮したストック溶液を添加することによって、表４に収載された最終製剤を調整した。全ての賦形剤を公定グレードで適用した。目標ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ濃度は１．０ｍｇ／ｍＬとした。
【０１５２】
（表４）ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ製剤に関する概要
2019506406.tif 000005
【０１５３】
最後に、ＭＳＬＮ−ｈＡＬＢ原薬を０．２μｍのＰＶＤＦフィルターによって無菌濾過し、予備洗浄し予備滅菌したＩ型ガラスバイアルに充填した。滅菌したブチルゴムストッパーでバイアルに栓をし、アルミニウムキャップで密封した。充填体積は合計１．０ｍＬとした。バイアルを、２５℃及び３７℃にそれぞれ温度制御したキャビネット内で最大２週間保管した。実施例１に記載の方法を用いて、ＳＥ−ＵＰＬＣにより高分子種を定量化した。タンパク質の注入量は合計３μｇとした。弱カチオン交換超高速液体クロマトグラフィー（ＷＣＸ−ＵＰＬＣ）を用いて、酸性電荷バリアントを決定した。ＷＣＸ−ＵＰＬＣは、ＵＰＬＣ  ＨクラスＡｑｕｉｔｙ（ａｔｅｒｓ）上でＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ  Ｈｉ  Ｒｅｓ  ＣＭ  ７μｍ  ４．６×１００ｍｍカラムを用いて実施した。カラム温度を３０℃に設定した。クロマトグラフィー分離を達成するため、以下のグラジエント（表５）を適用した。
【０１５４】
（表５）ＷＣＸ−ＵＰＬＣグラジエントに関する概要
2019506406.tif 000006
【０１５５】
溶離剤Ａは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５から構成されていた。溶離剤Ｂは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．５から構成されていた。タンパク質の注入量は合計３μｇとした。流量は０．６５ｍＬ／分とした。注入の前に、試料をオートサンプラー内に８℃で保持した。タンパク質検出は、内部蛍光強度の測定に依存した。２８０ｎｍで励起を実施し、３３０ｎｍで発光を得た。酸性電荷バリアントを相対的な曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて定量化した。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いて積分を実施した。
【０１５６】
ＳＢＥ−β−ＣＤを含む製剤について、最も低い高分子種（ＨＭＷＳ）形成率が観察された（図７Ｂ）。また、ＳＢＥ−β−ＣＤ含有製剤については化学的安定性も最も著明であり、これは酸性電荷バリアントの最も低い画分によって示された（図８）。
【０１５７】
実施例７：ＳＢＥ−β−ＣＤ及びアルギナートを用いたＡＭＧ３３０のＬＬＰＳ
ＬＬＰＳ：液−液相分離（ＬＬＰＳ）は、コロイド粒子（例えば、タンパク質）間の正味引力によって引き起こされるため、この引力の強さの尺度となる。タンパク質間に引力が存在すると、ＬＬＰＳは、温度が十分に低い場合にタンパク質豊富相及びタンパク質不足相の共存をもたらす。ＬＬＰＳの場合、共存する相は真の熱力学的平衡状態にあり、また完全に可逆性であり、共存する相の濃度は温度にのみ依存し、当初のタンパク質濃度には依存しない。ＬＬＰＳは、ＰＥＧの添加によって誘導され得る。タンパク質間に強い引力が存在するほど、ＬＬＰＳが生じるのに必要なＰＥＧ濃度は低くなり、このことはひいてはこれらのタンパク質が容易に凝集することを示す。所与の温度及びＰＥＧ濃度において、タンパク質のコロイド安定性を増加させる賦形剤は、タンパク質不足相におけるタンパク質濃度を高める結果をもたらす。このタンパク質濃度の増加は、クロマトグラフィーによって賦形剤なしの対照と比較して測定することができる。製剤開発においては、ＬＬＰＳを観察し、タンパク質分子間の引力を評価することが望ましい。
【０１５８】
本実験の目的は、ＬＬＰＳを使用して、ＡＭＧ３３０のコロイド安定性に及ぼすＳＢＥ−β−ＣＤ及びアルギナートの効果を評価することである。
【０１５９】
（表６）溶液の組成及び調製
2019506406.tif 000007
【０１６０】
（表７）試料の組成及び調製
2019506406.tif 000008
【０１６１】
上の表６及び７で言及されるように、種々の溶液／試料組成及び調製物を調製した。試料を調製し（最終ＡＭＧ３３０濃度０．１２ｍｇ／ｍｌ）、４０℃で３日間インキュベートした。次に試料を２０秒間微量遠心し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、８０ｕＬの上清を取り出し、Ａｇｉｌｅｎｔクロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）における分析的ＣＥＸ（ＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０カラム、２ｍｍ  ＩＤ）によって分析した。
【０１６２】
分析的ＣＥＸ：７０μＬの試料をＣＥＸカラムに注入し、２０ｍＭのクエン酸、０．００５％のアジ化ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化し、２０ｍＭのクエン酸、１Ｍの塩化ナトリウム、０．００５％のアジ化ナトリウムｐＨ６．０で溶離し、３０分のグラジエント時間（合計運転時間：４５分／注入）、５００ｍＭの塩化ナトリウムの最高濃度、０．２ｍＬ／分の流量で行った。運転中、オートサンプラーの温度を４０Ｃに維持した。クロマトグラムから、試料のピーク面積を計算した（図９及び１０）。
【０１６３】
実施例８：４種類の異なる製剤（ＳＢＥ−β−ＣＤを含む）の存在下での限外濾過遠心分離によるＡＭＧ３３０のバッファー交換及びタンパク質濃縮
（表８）溶液の組成及び調製（体積、ｍＬ）
2019506406.tif 000009
【０１６４】
（表９）試料の組成及び調製
2019506406.tif 000010
【０１６５】
初期タンパク質濃度は０．４ｍｇ／ｍｌとした。２ｍＬの０．４ｍｇ／ｍｌのＡＭＧ３３０をＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  １５ｍｌ遠心フィルター、ＭＷＣＯ  １０，０００に入れた。１０ｍＬの適切なバッファーを各チューブに添加し、穏やかにタンパク質と混合し、遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を２０００ｒｐｍ、４℃で３時間行った。次に残余分を穏やかに混合し、チューブを２５００ｒｐｍ、２５℃で１．５時間遠心分離した。２００〜２５０μＬの残余分体積の次に１０ｍＬの適切なバッファーを各々に添加し、残余分と共に穏やかに混合し、次に２５００ｒｐｍ、２５℃で３０分間遠心分離して最終体積を２００〜２５０μＬにした。４種類の異なる製剤における最終タンパク質濃度は、２．９〜３．７ｍｇ／ｍｌの範囲であった。
【０１６６】
分析的ＳＥＣ：試料の分析を、Ａｇｉｌｅｎｔクロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）における分析的ＳＥＣ（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ，７．８ｍｍ  ＩＤ，ＰＡ，ＵＳＡ）により、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のランニングバッファーを用いて、０．５ｍＬ／分の流量（合計運転時間：３５分／注入）で行った。運転中、オートサンプラーの温度を４℃に維持した。
【０１６７】
ＳＢＥ−β−ＣＤを含有する製剤において凝集体の相対量が最も低いことから、ＳＢＥ−β−ＣＤの存在は、限外濾過によるタンパク質濃縮中にＨＭＷが形成されることに対する顕著な保護をＡＭＧ３３０にもたらしているように思われる。アルギニン、グルタメート、スクロース、マンニトール、及びＰＳ−８０を含有する製剤は最も高い量のＨＭＷを有し、トリス、ホスフェート、アルギニン、トレハロース、及びＰＥＧ４０００を含有する製剤が次に続いた（図１１）。ＣＥＸ分析も同様の効果を示した（データは示さず）。
【０１６８】
実施例９：ＳＢＥ−β−ＣＤを含むＡＭＧ３３０の小規模製剤研究（ＬＬＰＳ、ＦＴ、ＵＦＣ）
本実験の目的は、１４の異なる製剤において様々なストレスを与えた後のＡＭＧ３３０の安定性を評価することである。具体的には、ＬＬＰＳ、２０回の凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）サイクル、及び限外濾過／遠心分離（ＵＦＣ）による濃縮の後にＡＭＧ３３０を評価した。実施例８に示されるようにＳＢＥ−β−ＣＤはＡＭＧ３３０の凝集に対する保護をもたらしており、本実験でさらにＳＢＥ−β−ＣＤの評価を行う。ＵＦＣについては（図１２のＡ、Ｂ）、５種類の製剤のみについて調べた。ＬＬＰＳ及びＦ／Ｔの研究については（図１２のＣ、Ｄ）、１４種類の製剤について調べた。ＬＬＰＳ試料は分析的ＣＥＸによって分析し、ＵＦＣ及びＦ／Ｔ試料は分析的ＳＥＣ及びＣＥＸの両方によって分析した。
【０１６９】
材料及び方法：
（表１０）ストック溶液調製
2019506406.tif 000011
【０１７０】
限外濾過／遠心分離（ＵＦＣ）：
（表１１）ＵＦＣ用の試料の組成・調製（体積、μＬ）
2019506406.tif 000012
【０１７１】
各試料について、４ｍＬの０．４ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ３３０をＭＷＣＯ  １０，０００のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍｌ遠心フィルターチューブに入れた。８ｍＬの適切なバッファーを各チューブに添加し、穏やかにタンパク質と混合し、遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を２０００ｒｐｍ（４０００ｒｃｆ）、２０℃で行って、残余分体積を２００〜２５０ｕＬにした。このプロセスをさらに２回繰り返し、合計３濃縮ステップとした。次に残余分をピペッターで穏やかに混合し、フィルターチューブから取り出し、エッペンドルフチューブに入れ、最高速度で２分間、微量遠心した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）。この後に、上清のタンパク質濃度を測定し、２０μＬの注入により分析的ＳＥＣで分析した（詳細は実施例８と同じ）。各試料を２つずつ調製した。
【０１７２】
ＬＬＰＳ：
以下の表に概説されているように試料を調製し、４℃で５日間インキュベートした。全ての試料の最終体積を２４０μＬとした。インキュベート後、試料を２０秒間微量遠心し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、次に２００μＬの上清を分析的ＣＥＸ用に取り出した（詳細は実施例７と同じ）が、例外としてオートサンプラーの温度を２５℃に維持した。
【０１７３】
（表１２）ＬＬＰＳ用の試料の組成・調製
2019506406.tif 000013
【０１７４】
ＳＢＥ−β−ＣＤの濃度を増加させた結果、モノマーの回収が増加した一方で、凝集体のレベルは低いまま維持された。ＳＢＥ−β−ＣＤは、スクロース、マンニトール、及びスクロースと組み合わせた場合に、特にグリシン及びスクロースと組み合わせた場合に、さらに良好に働く。グリシン単体ではかなり働きが悪く、スクロースと組み合わせた場合でも良好に働かなかったため、このことは特に印象的である。
【０１７５】
凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）：
（表１３）Ｆ／Ｔ用の試料の組成・調製
2019506406.tif 000014
【０１７６】
上に作表したように試料を調製した。２０Ｆ／Ｔサイクルを実施し、試料は、各凍結の間は−７０℃または−３０℃で少なくとも１時間保管し、解凍の間は室温でせいぜい１時間保管した。各試料の最終体積は２４０μＬとした。アリコートを分析的ＳＥＣ用に取り出し（実施例８と同じ）、０サイクル及び２０サイクルの後分析した。
【０１７７】
ＳＢＥ−β−ＣＤの存在は、他の製剤と比較して、Ｆ／Ｔの間の凝集を低減し相対的なモノマーレベルを増加する方向で利益をもたらしているように思われる。ＳＢＥ−β−ＣＤを他の賦形剤と組み合わせて使用した製剤も良好に働き、とりわけグリシン及びスクロースとの組合せで良好だった。
【０１７８】
実施例１０：ＳＢＥ−β−ＣＤ及び２−ヒドロキシプロピルベータ−シクロデキストリンの比較
ＳＢＥ−β−ＣＤは、以前のＵＦＣ実験において、タンパク質濃縮中の凝集に対する顕著な保護をＡＭＧ３３０にもたらすことが示されている。この実験では、ＵＦＣによるタンパク質濃縮中のＡＭＧ３３０の効果を、ＳＢＥ−β−ＣＤまたは別のシクロデキストリンである２−ヒドロキシプロピルベータ−シクロデキストリン（２−ＨＰ−β−ＣＤ）のいずれかの存在下で比較した。
【０１７９】
材料及び方法：
２０ｍＬの０．４ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ３３０を、ＭＷＣＯ  １０，０００のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心フィルターチューブで約１０ｍＬに濃縮した。チューブの残余分を合わせ、次にタンパク質の濃度をＳｏｌｏＶＰＥ（吸光係数２．３１９ｍＬ／（ｍｇ＊ｃｍ）を使用）によって測定し、０．８３ｍｇ／ｍＬであることが分かった。次に、このタンパク質をＵＦＣ試料の調製に使用した。
【０１８０】
全ての試料は、１０ｍＭのリン酸カリウム、８％のスクロース、０．０１％のポリソルベート−８０、ｐＨ６．０を含有した。
【０１８１】
５つの製剤化条件について試験した：１）バッファーのみを含む対照、２）１％のＳＢＥ−β−ＣＤを添加、３）２％のＳＢＥ−β−ＣＤを添加、４）１％の２−ＨＰ−β−ＣＤを添加、及び５）２％の２−ＨＰ−β−ＣＤを添加。５つのバッファー溶液のそれぞれにつき５０ｍＬを調製した。各製剤につき２つの重複試料を試験した。
【０１８２】
各試料について、０．８７５ｍＬのＡＭＧ３３０をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４ｍＬ遠心フィルターチューブ  ＭＷＣＯ  １０，０００に入れた。３．１２５ｍＬの適切なバッファーを各チューブに添加し、穏やかにタンパク質と混合し、遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４０００ｒｃｆ、２５Ｃで行い、残余分体積を約１００ｕＬにした。４ｍＬの追加バッファーを添加し、試料を再び約１００ｕＬに濃縮した。次に残余分をピペッターで穏やかに混合し、４５ｕＬをフィルターチューブから取り出し、エッペンドルフチューブに入れ、微量遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を最大速度で２分間行った。上清を分析的ＳＥＣによって分析した（実施例８と同じ）。濃縮していないＡＭＧ３３０（０．４ｍｇ／ｍＬ）も比較の目的で分析した。
【０１８３】
本実験では、１及び２％のＳＢＥ−β−ＣＤまたは２−ＨＰ−β−ＣＤの存在下で、ＡＭＧ３３０を最大約１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＳＢＥ−β−ＣＤを含有する製剤は星印で示されている。左側の対照（０．４ｍｇ／ｍＬと表示）は、その出発濃度０．４ｍｇ／ｍＬを超えて濃縮しなかった。左から２番目（図４ａ及び４ｂで対照と表示）は、いかなるシクロデキストリンもなしで濃縮した試料である。ＳＢＥ−β−ＣＤと２−ＨＰ−β−ＣＤの製剤間での比較からは、ＳＢＥ−β−ＣＤを使用する利点が実証された。図１３は到達した最高濃度を示し、図１４は、これらの濃縮溶液の組成を％凝集体及び％モノマーの観点で明らかにしている。
【０１８４】
実施例１１：ＡＭＧ３３０を可溶性の非凝集形態で維持する能力についての４種類の異なるシクロデキストリンの効果の比較。
以前の実験において、ＳＢＥ−β−ＣＤはＡＭＧ３３０の凝集を低減することが示されている。本実験の目的は、他のシクロデキストリンをＳＢＥ−β−ＣＤと比較して評価することである。４種類の異なるシクロデキストリンと共に４℃及び２５℃でインキュベートした１〜４日後に、ＡＭＧ３３０における凝集のレベルを測定した。
【０１８５】
材料及び方法：
全ての試料は、約２ｍｇ／ｍＬのＡＭＧ３３０、２０ｍＭのクエン酸、及び０．０１％のポリソルベート−８０、ｐＨ６．０も含有した。試料を調製し、エッペンドルフチューブ内で保管した（表１４）。チューブをプラスチックで包み、インキュベートの間、光から保護した。４℃及び２５℃におけるインキュベートから１日及び４日後にアリコートを採取した（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，（Ｎｅｗｉｎｇｔｏｎ，ＮＨ）  Ｈａａｋｅ  Ａ２８）。アリコートを短時間微量遠心し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、上清を分析的ＳＥＣによって分析した。
【０１８６】
（表１４）溶液の組成及び調製
2019506406.tif 000015
【０１８７】
（表１５）試料の組成及び調製
2019506406.tif 000016
【０１８８】
ＳＢＥ−β−ＣＤを含む４種類の異なるシクロデキストリンに対し、ＡＭＧ３３０を可溶性で非凝集の形態に維持する能力を試験した。約２ｍｇ／ｍｌのタンパク質を４℃及び２５℃で４日間、さらなる濃縮なしでインキュベートした。全ての試料は、２０ｍＭのクエン酸及び０．０１％のポリソルベート−８０、ｐＨ６．０も含有した。
【０１８９】
４日間の終わりに４℃において、０．５％ＳＢＥ−β−ＣＤ製剤はＳＥＣによればより大きな総ピーク面積を有しており、これは可溶性のタンパク質濃度が高くなっていることを示すものだった。他の製剤は、様々な程度において沈殿及び凝集していた。この結果は、ＳＢＥ−β−ＣＤが、両方の温度（４℃及び２５℃）において、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンよりも有効なＡＭＧ３３０の安定剤及び可溶化剤であったことを実証するものであり、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンは２５℃の場合のみ良好であるように思われた（図１５）。
【０１９０】
実施例１２：１ｍｇ／ｍＬの１３種類の異なる製剤において−２０℃、−３０℃、及び−７０°Ｃで最大６週間保管したＡＭＧ３３０。
本実験の目的は、安定性の凍結及び凍結乾燥したＡＭＧ３３０の製剤を開発することである。ＳＢＥ−β−ＣＤ及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をｓ製剤用賦形剤として評価した。ポリカーボネートのカーボイを使用して原薬（ＤＳ）の凍結保管をシミュレートすることになる。
【０１９１】
材料及び方法：
ＡＭＧ３３０について０．４ｍｇ／ｍＬの出発濃度で、デルタ圧力を約２３ｐｓｉに設定した２つの強制的なμＳｃａｌｅ  ＴＦＦシステムを用いて、ＵＦ／ＤＦバッファー交換（表１６に収載のバッファー）を行った。４つのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ３  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １０ｋＤ  ０．１１ｍ２カセット及び２つの強制的なチュービングアセンブリーを使用した。交換後、材料を１．２ｍｇ／ｍＬに過剰濃縮し、無菌のＮａｌｇｅｎｅ容器に収集した。
【０１９２】
（表１６）製剤の組成
2019506406.tif 000017
【０１９３】
製剤バッファー、ＰＥＧ、及び界面活性剤のストックを新たに調製し、添加して最終製剤化材料を生成した。本実験用に、試料を３０ｍＬのＰＣカーボイ（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に１５ｍＬの体積で充填した。充填の前に、全ての試料を無菌フードでｓｔｅｒｉｖｅｘフィルターユニット（０．２２μｍ）を用いて濾過した。ＰＣカーボイ中の最終タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬとする。
【０１９４】
静的実験のために、ｔ＝０及びｔ＝６週間において試料を分析的ＳＥＣによって測定した（実施例８と同じ）。
【０１９５】
結果：
様々な温度でインキュベートしたＡＭＧ３３０製剤にはＳＢＥ−β−ＣＤが含まれた。保管６週間後の結果からは、ＰＥＧ−４０００の使用に基づいたＳＢＥ−β−ＣＤなしの製剤とは対照的に、全てのＳＢＥ−β−ＣＤ含有製剤が安定性であることが示された。
【０１９６】
ＳＢＥ−β−ＣＤベースの製剤とＰＥＧベースの製剤との間の比較からは、ＳＢＥ−β−ＣＤを使用する利点が実証される。ＰＥＧベースの製剤は、−２０℃で保管した後、重度に凝集し粒子化した（図１６）。
【０１９７】
実施例１３：ＡＭＧ３３０の凍結乾燥した製剤用の賦形剤としての２つのシクロデキストラン（ＳＢＥ−β−ＣＤ及びα−シクロデキストリン）の評価。
本実験は、プラットフォーム凍結乾燥製剤をＢｉＴＥ（登録商標）分子用に開発することができるかを決定するために行った。ＡＭＧ３３０  ＢｉＴＥ（登録商標）をモデルタンパク質として使用した。２種類のシクロデキストリン（ＳＢＥ−β−ＣＤ及びα−シクロデキストラン）を製剤用賦形剤として評価した。
【０１９８】
材料及び方法：
ＡＭＧ３３０原薬の濃度は０．４ｍｇ／ｍＬとする。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（３０Ｋ  ＮＭＷＬ、１５ｍＬ）を用いて、ＡＭＧ３３０をそれぞれのバッファーにバッファー交換した（表１７に収載）。
１．３０ｍＬのＡＭＧ３３０  ＤＳを製剤１つ当たり２つ（２×１５ｍＬ）のＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ試料容器に分取。
２．４．４ｍＬの対応する製剤バッファーを各Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濾液収集器に添加（ＤＳの過剰濃縮防止のため）。
３．１５００×ｇ、２５℃で２０分間遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）（遠心分離して平衡状態にする）；各試料容器内に残っている約５ｍＬのタンパク質、１．２ｍｇ／ｍＬ目標値まで３倍濃縮。
４．各濾液収集器に濾液をデカントし、４．４ｍＬの新たな製剤バッファーで置き換え、各試料容器に１０ｍＬの新たな製剤バッファーを添加。
５．ステップ３に従って遠心分離。
６．ステップ４〜５をさらに４回繰り返す（合計で５回のバッファー交換；約２４３倍の合計希釈）。
７．バッファー交換した材料を４℃で一晩保管。
【０１９９】
（表１７）凍結乾燥用の製剤成分
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【０２００】
製剤バッファー及び界面活性剤のストックを添加して最終製剤化材料を生成した。５ｃｃのガラスバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ  １Ａ型）に試料を２ｍＬの体積で充填し、製剤１つ当たり合計４バイアルにした。充填の前に、全ての試料を無菌フードでＳｔｅｒｉｖｅｘフィルターユニット（０．２２μｍ）を用いて濾過した。充填後、凍結乾燥用のゴムストッパーでバイアルにゆるく栓をした（図１７Ａ）。
【０２０１】
改変された保存的凍結乾燥サイクル（−１７℃のアニーリング温度、６６時間の総サイクル時間）を用いて、製剤１つ当たり３つのバイアルを凍結乾燥した。製剤１つ当たり残りの１つのバイアルをｔ＝０（凍結乾燥前）分析用に確保した。再構成の前に、凍結乾燥ケークの構造的完全性及び洗練性について目視検査した。凍結乾燥した試料を１．９６ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再構成し、さらなる分析のために完全に溶解するまで穏やかにかき回した。凍結乾燥前の試料及び構成後の試料を、分析的ＳＥＣ及びマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）によって分析した。
【０２０２】
ＳＥＣ結果により、ＳＢＥ−β−ＣＤ含有製剤は、α−シクロデキストランを含む製剤または全くシクロデキストランを含まない製剤よりも低いレベルのＨＭＷ種を凍結乾燥前及び凍結乾燥後に産生することが明らかになった。他の製剤用賦形剤（スクロース、グリシン、マンニトール）は、顕著にはＨＭＷ種のレベルに影響を及ぼさないように思われた（図１７Ｂ、Ｃ）。
【０２０３】
ＭＦＩにより、凍結乾燥後、ほとんどの製剤について顕微鏡で確認可能な粒子（大部分は１〜２μｍの範囲）が中程度に増加することが明らかになった。α−シクロデキストラン製剤の１つであるＣ６０ＡｃＬについて、劇的な増加が観察された。２つのＳＢＥ−β−ＣＤ（ｃａｐｔｉｓｏｌ）含有製剤であるＣ６０ＣｐＴ及びＣ６０ＣｐＭＳｕＴは、凍結乾燥後、最も少ない数の顕微鏡で確認可能な粒子を含有した（図１７Ｄ）。
【０２０４】
実施例１４：ＳＢＥ−β−ＣＤ及びα−シクロデキストランを含むＦａｐアルファＢｉＴＥ（登録商標）の小規模製剤研究（ＵＦＣ、ＬＬＰＳ、及びＦ／Ｔ）。
本実験の目的は、様々な製剤において様々なストレスを与えた後のＦａｐアルファＢｉＴＥ（登録商標）の安定性を評価することである。具体的には、ＬＬＰＳ、２０回の凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）サイクル、及び限外濾過／遠心分離（ＵＦＣ）による濃縮の後にＦＡＰアルファＢｉＴＥ（登録商標）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７）を評価した。同様の製剤を用いた以前の研究の結果により、ＳＢＥ−β−ＣＤはＡＭＧ３３０  ＢｉＴＥ（登録商標）の安定性に正の効果を有することが示されており、本研究ではＳＢＥ−β−ＣＤがＦＡＰ  ＢｉＴＥ（登録商標）に及ぼす効果について調べた。
【０２０５】
材料及び方法：
３０ｍＬのバッファーを試験対象の各製剤用に調製した。
【０２０６】
（表１８）試料の組成及び調製。対照（ＦＲＭ１）は、１０ｍＭのリン酸カリウム、１６１ｍＭのアルギニンｐＨ７．６＋４％トレハロース中２．６５ｍｇ／ｍＬで製剤化されている。
2019506406.tif 000019
【０２０７】
各試料について、３７５μＬの２．６５ｍｇ／ｍＬのＦＡＰアルファＢｉＴＥ（登録商標）（１０ｍＭのリン酸カリウム、１６１ｍＭのアルギニンｐＨ７．６＋４％トレハロース中で製剤化）をＭＷＣＯ  １０，０００のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４ｍＬ遠心フィルターチューブに入れた。３．５ｍＬの適切なバッファーを各チューブに添加し、穏やかにタンパク質と混合し、遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４０００ｒｃｆ、２５Ｃで行って、残余分体積を約５０ｕＬにした。バッファー添加及び遠心分離のステップをさらに２回繰り返し、合計３回の濃縮ステップになるようにした。次に残余分をピペッターで穏やかに混合し、フィルターチューブから取り出し、エッペンドルフチューブに入れ、微量遠心（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を最高速度で２分間行った。次に上清をＳＥＣによって分析した。各試料を２つずつ調製した。濃縮していないＦＡＰアルファＢｉＴＥ（登録商標）（２．６５ｍｇ／ｍＬ）も比較の目的で分析した。
【０２０８】
ＳＢＥ−β−ＣＤの存在は、タンパク質濃縮中のＨＭＷ種形成を抑制することにより、相対的なＳＥＣメインピークを増加させているように思われた。α−シクロデキストランの存在は、非常に低いタンパク質の回収及び高い相対的レベルのＨＭＷ種をもたらした。
【０２０９】
ＦａｐアルファのＬＬＰＳ結果：Ｆａｐ  α  ＢｉＴＥ（登録商標）及びＳＢＥ−β−ＣＤによるＬＬＰＳ結果は、ＡＭＧ３３０によるＬＬＰＳ結果に匹敵するものである。α−シクロデキストランは、当該分子のコロイド安定性にいかなる正の作用も負の作用も示さなかった（図１８）。
【０２１０】
実施例１５：ＣＤ３３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクトの製剤研究
プロテインＡ及びカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いてＣＤ３３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクトを精製した。１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を含有する透析カセットを用いて、ＣＥＸ溶離液を１０ｍＭのＬ−グルタミン酸バッファー、ｐＨ４．２に透析した。透析を２〜８℃で実施した。透析したプール材料の濃度は合計２．３ｍｇ／ｍＬとなった。１０ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を含有する濃縮器チューブを用いて、材料を限外濾過遠心分離（ＵＦＣ）によってさらに濃縮した。濃縮した材料を、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾過後の濃度は合計２．７ｍｇ／ｍＬとなった。濃縮したストック溶液を添加することにより、材料を表１９に収載の製剤に完全に製剤化した。最終タンパク質濃度は合計１．０ｍｇ／ｍＬとなる。
【０２１１】
（表１９）試験した製剤に関する概要；ＨＰＢＣＤ：ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；ＰＳ８０；ポリソルベート８０。
2019506406.tif 000020
【０２１２】
製剤を１．０ｍＬに充填した２Ｒ  Ｉ型ガラスバイアルをブチルゴムストッパー及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。バイアルを−２０℃及び−７０℃で保管した。試料を指定の時間点で引き出した。サンプリング後、バイアルを周囲温度で解凍し、高分子種のパーセンテージ含量を定量化するため、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）によって分析した。ＳＥ−ＵＰＬＣは、Ａｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ  １５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて実施した。カラム温度を２５℃に設定した。均一濃度法を０．４ｍＬ／分の流量で適用することにより、サイズバリアントの分離を達成した。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８で構成されていた。実行時間は合計６．０分である。分析するまで、試料をオートサンプラー内で８℃に保持した。総量３μｇのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを回避するため、４０％のＡＣＮを用いた中間注入を各試料の後に実施した。検出は、蛍光（励起２８０ｎｍ、放出３２５ｎｍ）に基づいた。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いてピーク積分を実施した。ＨＭＷＳの相対曲線下面積を報告した（図１８）。
【０２１３】
製剤化したＣＤ３３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクトの−７０℃以下での保管はＨＭＷＳの形成を阻害した。しかし、ＨＰＢＣＤを含有しない製剤については、−２０℃での保管中にＨＭＷＳが顕著に増加した。これに対し、ＨＰＢＣＤの存在下では、ＨＰＢＣＤの濃度とは無関係に（６または１２％）、タンパク質の−２０℃におけるＨＭＷＳ形成が防止された。マンニトールの存在は、−２０℃における安定性に有害な影響を及ぼし、これはＨＭＷＳの増加によって示された。
【０２１４】
実施例１６：ＦＬＴ３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクトについての製剤研究
プロテインＡ及びＣＥＸクロマトグラフィーを用いて、２種類の異なるＦＬＴ３−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト（ＦＬ１−ｓｃＦｃ及びＦＬ２−ｓｃＦｃ）を精製した。ＣＥＸ後、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、４％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ４．２から構成されたバッファーで全てのコンストラクトにダイアフィルトレーションを行った。使用した膜のＭＷＣＯは１０ｋＤａであった。ダイアフィルトレーションプール（１．７ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度）を、７．６ｍｇ／ｍＬの濃度が達成されるまで限外濾過（１０ｋＤａのＭＷＣＯ）によって濃縮した。次に材料を０．２μｍのフィルターで濾過し、賦形剤のストック溶液を添加することにより完全に製剤化した。製剤の概要を表２０に示す。
【０２１５】
（表２０）試験した製剤に関する概要；全製剤についてｐＨを４．２に調整した；ＨＰＢＣＤ：ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；ＰＳ８０；ポリソルベート８０。
2019506406.tif 000021
【０２１６】
両方の製剤を１．３ｍＬに充填した２Ｒ  Ｉ型ガラスバイアルをブチルゴムストッパー及びアルミニウムのフリップオフシールで閉じた。バイアルを−２０℃で保管した。試料を指定の時間点で引き出した。サンプリング後、バイアルを周囲温度で解凍し、高分子種のパーセンテージ含量を定量化するため、サイズ排除超高速クロマトグラフィー（ＳＥ−ＵＰＬＣ）によって分析した。ＳＥ−ＵＰＬＣは、Ａｑｕｉｔｙ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）上で、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ  １５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて実施した。カラム温度を２５℃に設定した。均一濃度法を０．４ｍＬ／分の流量で適用することにより、サイズバリアントの分離を達成した。移動相は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８で構成されていた。実行時間は合計６．０分である。分析するまで、試料をオートサンプラー内で８℃に保持した。総量３μｇのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを回避するため、４０％のＡＣＮを用いた中間注入を各試料の後に実施した。検出は、蛍光（励起２８０ｎｍ、放出３２５ｎｍ）に基づいた。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）ソフトウェアを用いてピーク積分を実施した。ＨＭＷＳの相対曲線下面積を報告した（図１９）。
【０２１７】
実施例１７：ＢＣＭＡ−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクトについての製剤研究
２種類のＢＣＭＡ−ｓｃＦｃ  ＢｉＴＥ抗体コンストラクト（ＢＣ１−ｓｃＦｃ及びＢＣ２−ｓｃＦｃ）を、実施例１６に記載のように精製し、製剤化し、保管し、分析した。製剤の概要を表２１に示す。
【０２１８】
（表２１）試験した製剤に関する概要；全製剤についてｐＨを４．２に調整した；ＨＰＢＣＤ：ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン；ＰＳ８０；ポリソルベート８０。
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【０２１９】
図２０は、両方の抗体コンストラクト製剤の関数下でのパーセンテージＨＭＷＳ含量を示している。ＨＭＷＳのパーセンテージ含量は、ＨＰＢＣＤを含まない製剤において４週間後に１．６％（ＢＣ１−ｓｃＦｃ）、１．９％（ＢＣ−ｓｃＦｃ）とそれぞれ増加した。これに対し、６％のＨＰＢＣＤを含有する製剤ではＨＭＷＳ形成が阻害された。
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2019506406.tif 000037
【図１】
2019506406.tif 000038
【図２Ａ】
2019506406.tif 000039
【図２Ｂ】
2019506406.tif 000040
【図２Ｃ】
2019506406.tif 000041
【図３】
2019506406.tif 000042
【図４】
2019506406.tif 000043
【図５】
2019506406.tif 000044
【図６】
2019506406.tif 000045
【図７Ａ】
2019506406.tif 000046
【図７Ｂ】
2019506406.tif 000047
【図７Ｃ】
2019506406.tif 000048
【図８】
2019506406.tif 000049
【図９】
2019506406.tif 000050
【図１０】
2019506406.tif 000051
【図１１】
2019506406.tif 000052
【図１２Ａ】
2019506406.tif 000053
【図１２Ｂ】
2019506406.tif 000054
【図１２Ｃ】
2019506406.tif 000055
【図１２Ｄ】
2019506406.tif 000056
【図１３】
2019506406.tif 000057
【図１４】
2019506406.tif 000058
【図１５】
2019506406.tif 000059
【図１６】
2019506406.tif 000060
【図１７Ａ】
2019506406.tif 000061
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2019506406.tif 000064
【図１８】
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【図１９】
2019506406.tif 000066
【図２０】
2019506406.tif 000067
【図２１】
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【配列表】
2019506406000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月27日(2018.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合し、第２の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ３に結合する二重特異性単鎖抗体コンストラクトと、β−シクロデキストリンと、バッファーとを含む医薬組成物であって、安定性である、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、エチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン、スクシニル−（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル）−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンリン酸ナトリウム塩、β−シクロデキストリン硫酸ナトリウム塩、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（６−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリン五ナトリウム塩、カルボキシメチル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、６−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記β−シクロデキストリンが、０．１％〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．８％〜１．５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記β−シクロデキストリンが、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトが、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２５〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記バッファーが、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタミン酸塩、酢酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記バッファーが、リン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタミン酸塩、酢酸塩、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物のｐＨが４〜７．５の範囲にある、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、プルロニック、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上の賦形剤をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
１種以上の保存剤を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記１種以上の保存剤が、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン、及びチオメルサールからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトの前記第１の結合ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＦＬＴ３、またはＢＣＭＡに結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記二重特異性単鎖コンストラクトの前記第１の結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号９９、１０９、１１９、１２８、１３７、１４６、１５５、１６４、１７３、１８３、１８５、及び１８７からなる群から選択され、前記二重特異性単鎖コンストラクトの前記第２の結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号９、１８、２７、３６、４５、５４、６３、７２、８１、１７９、及び９０からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記製剤が保存剤を含まず、前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトのアミノ酸配列が配列番号１００または１１０であり、前記コンストラクトが約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度であり、前記シクロデキストリンが、約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩であり、前記バッファーが約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムであり、前記製剤が約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を約６．０のｐＨでさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトの前記第１の結合ドメインのアミノ酸配列が配列番号１７４である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記シクロデキストリンが、約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩であり、前記バッファーが約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムであり、前記製剤が、約２％の濃度のマンニトール、約２％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース、及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０を約６．０のｐＨでさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、本明細書では、保存剤を含まない医薬組成物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または１１０のアミノ酸配列を有し約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する二重特異性単鎖抗体コンストラクトを含み、さらに約１％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩であるシクロデキストリンと、さらに約１０ｍＭの濃度のリン酸カリウムであるバッファーとを含み、当該製剤が、ｐＨ  約６．０の約８％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０をさらに含む、医薬組成物も提供される。
[本発明1001]
第1の結合ドメインを介してターゲット細胞表面抗原に結合しかつ第2の結合ドメインを介してＴ細胞表面抗原ＣＤ3に結合する二重特異性単鎖抗体コンストラクトと、β−シクロデキストリンと、バッファーとを含む医薬組成物であって、安定性である、前記医薬組成物。
[本発明1002]
前記β−シクロデキストリンが、β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、エチル−β−シクロデキストリン、ブチル−β−シクロデキストリン  スクシニル−（2−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（2，3，6−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（2，3，6−トリ−Ｏ−ベンゾイル）−β−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンリン酸ナトリウム塩、β−シクロデキストリン硫酸ナトリウム塩、トリアセチル−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（6−Ｏ−スルホ）−β−シクロデキストリンヘプタナトリウム塩、カルボキシメチル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、6−Ｏ−ｐ−トルエンスルホニル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記β−シクロデキストリンが、0．1％〜20％（ｗ／ｖ）、好ましくは0．5％〜2％（ｗ／ｖ）、より好ましくは0．8％〜1．5％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、本発明1001または1002の組成物。
[本発明1004]
前記β−シクロデキストリンが、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンからなる群から選択される、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1005]
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトが、0．1〜5ｍｇ／ｍｌ、好ましくは0．2〜2．5ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは0．25〜1．0ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1006]
前記バッファーが、リン酸カリウム、酢酸／酢酸ナトリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸／コハク酸ナトリウム、酒石酸／酒石酸ナトリウム、ヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、グリシン、トリス、グルタメート、アセテート、及びこれらの混合物からなる群から選択される、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1007]
前記バッファーが、リン酸カリウム、クエン酸／クエン酸ナトリウム、コハク酸、ヒスチジン、グルタメート、アセテート、及びこれらの混合物からなる群から選択される、本発明1006の組成物。
[本発明1008]
前記組成物のｐＨが4〜7．5の範囲にある、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1009]
スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、アルギニン、リジン、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポロキサマー188、プルロニック、及びこれらの組合せからなる群から選択される1種類以上の賦形剤をさらに含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1010]
1種類以上の保存剤を含む、前記本発明のいずれかの組成物。
[本発明1011]
前記1種類以上の保存剤が、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、フェノキシエタノール、プロピルパラベン、及びチオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）からなる群から選択される、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトの前記第1の結合ドメインが、ＣＤ19、ＣＤ33、ＭＳＬＮ、ＦＬＴ3、またはＢＣＭＡに結合する、本発明1001〜1010のいずれかの組成物。
[本発明1013]
前記二重特異性単鎖コンストラクトの前記第1の結合ドメインのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：99、109、119、128、137、146、155、164、173、183、185、及び187からなる群から選択され、かつ前記二重特異性単鎖コンストラクトの前記第2の結合ドメインのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：9、18、27、36、45、54、63、72、81、179、及び90からなる群から選択される、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
前記製剤が保存剤を含まず、前記二重特異性単鎖抗体コンストラクトのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：100または110でありかつ前記コンストラクトが約0．5ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、前記シクロデキストリンが、約1％（ｗ／ｖ）の濃度のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンナトリウム塩であり、前記バッファーが約10ｍＭの濃度のリン酸カリウムであり、かつ前記製剤が、ｐＨ  約6．0の約8％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及び約0．01％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート80をさらに含む、本発明1013の組成物。
【国際調査報告】
2019506406.tif 000069
2019506406.tif 000070
2019506406.tif 000071
2019506406.tif 000072
2019506406.tif 000073