(57)【要約】本開示の主題は、末梢神経系（ＰＮＳ）および／もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）の再生、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害）の予防および／もしくは処置における薬物発見のための、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から誘導されたシュワン細胞前駆体およびシュワン細胞の使用に関する。本開示の主題は、末梢神経系（ＰＮＳ）の再生のため、中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害を予防および／もしくは処置するために適切な化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。
2019535263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢神経系（ＰＮＳ）の再生のため、中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害を予防および／もしくは処置するために適切な化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を、少なくとも約３０ｍＭのグルコース濃度に曝露するステップであって、前記細胞は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる、ステップ
（ｂ）前記細胞を、グルコース曝露後に試験化合物と接触させるステップ、
（ｃ）前記試験化合物による処理なしの前記細胞の第１のソルビトールレベル、第１のグルコースレベルおよび第１の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｄ）前記試験化合物で処理した前記細胞の第２のソルビトールレベル、第２のグルコースレベルおよび第２の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｅ）以下のうち１つまたは複数を比較するステップ：
（ｉ）前記第２のソルビトールレベルを前記第１のソルビトールレベルと、
（ｉｉ）前記第２のグルコースレベルを前記第１のグルコースレベルと、
（ｉｉｉ）前記第２の細胞生存度を前記第１の細胞生存度と；ならびに
（ｆ）以下のうち１つまたは複数が存在する場合に、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害の予防および／もしくは処置のために適切な試験化合物を同定するステップ：
（ｉ）前記第２のソルビトールレベルが前記第１のソルビトールレベルよりも低い場合、
（ｉｉ）前記第２のグルコースレベルが前記第１のグルコースレベルよりも低い場合、および
（ｉｉｉ）前記第２の細胞生存度が第１の細胞生存度よりも低い場合
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２】
末梢神経系（ＰＮＳ）の再生のため、中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害を予防および／もしくは処置するために適切な化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ａ）１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する細胞の集団を、少なくとも約３０ｍＭのグルコース濃度に曝露するステップであって、前記細胞は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる、ステップ、
（ｂ）前記細胞を、グルコース曝露後に試験化合物と接触させるステップ、
（ｃ）前記試験化合物による処理なしの前記細胞の第１のソルビトールレベル、第１のグルコースレベルおよび第１の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｄ）前記試験化合物で処理した前記細胞の第２のソルビトールレベル、第２のグルコースレベルおよび第２の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｅ）以下のうち１つまたは複数を比較するステップ：
（ｉ）前記第２のソルビトールレベルを前記第１のソルビトールレベルと、
（ｉｉ）前記第２のグルコースレベルを前記第１のグルコースレベルと、
（ｉｉｉ）前記第２の細胞生存度を前記第１の細胞生存度と；ならびに
（ｆ）以下のうち１つまたは複数が存在する場合に、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害の予防および／もしくは処置のために適切な試験化合物を同定するステップ：
（ｉ）前記第２のソルビトールレベルが前記第１のソルビトールレベルよりも低い場合、
（ｉｉ）前記第２のグルコースレベルが前記第１のグルコースレベルよりも低い場合、および
（ｉｉｉ）前記第２の細胞生存度が第１の細胞生存度よりも低い場合
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３】
１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する前記細胞が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップおよび前記細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させるステップ、ならびに前記細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と少なくとも約３日間にわたってさらに接触させるステップを含む方法による幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する前記細胞が、
幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップおよび前記細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させるステップ、
前記細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と少なくとも約３日間にわたってさらに接触させて、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するステップ、ならびに
１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の前記集団を、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件に供するステップ
を含む方法による幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子と約１４日間にわたって接触させるステップを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２０日以内に、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１０日後と約１５日後との間に、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１１日後に、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞を１種または複数のＳＣ分化誘導剤と接触させて、１つまたは複数のＳＣ前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するステップをさらに含む、請求項３から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記細胞を前記１種または複数のＳＣ分化誘導剤と少なくとも約３日間にわたって接触させて、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記細胞を前記１種または複数のＳＣ分化誘導剤と約１４日間にわたって接触させるステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１０日後と約１５日後との間に、前記細胞を前記１種または複数のＳＣ分化誘導剤と最初に接触させるステップを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子および前記１種または複数のＳＣ分化誘導剤と同時に接触させるステップを含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞の前記集団が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２５日後またはそれ以降に、１つまたは複数の前記シュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団へと分化する、請求項３から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞を１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤および前記１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤に同時に接触させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触から約４日以内に、前記細胞を前記１種または複数のＷｎｔ活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２日後に、前記細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記幹細胞を分化させるための前記方法が、前記幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤との最初の接触と同日に、前記細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤がＳＢ４３１５４２である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１種または複数のＷｎｔ活性化因子が、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる、請求項３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種または複数のＷｎｔ活性化因子が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ−１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１種または複数のＷｎｔ活性化因子がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１種または複数のＳＣ分化誘導剤が、ニューレグリン、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、フォルスコリン、ＴＧＦβおよびＦＢＳからなる群から選択される、請求項９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記１種または複数のＳＣ分化誘導剤がＮＲＧ１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子がＦＧＦ２である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーが、ＳＯＸ１０、ＧＡＰ４３、ＢＬＢＰ、ＭＰＺ、Ｄｈｈ、Ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ４９Ｄ、ＴＦＡＰ２、ＣＤＨ１９、ＣＤ４４、ＥＲＢＢ３、ＰＯＵ３Ｆ１、ＧＦＡＰ、ＣＡＬＣＢ、ＧＲＰ１１６、ＴＳＰＹＬ５、ＩＴＰＫＡ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰＬ２、ＬＯＣ１００１２８２５２、ＡＮＧＰＴＬ７、ＬＯＣ７２８９７８、ＺＮＦ５０２、ＳＬＣ１６Ａ６、ＬＰＬ、ＳＬＣ３０Ａ２、およびＳＬＣ１０Ａ４からなる群から選択される、請求項１、３から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト幹細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項３５】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子および前記１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約３日間にわたって接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子および前記１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約１０日間にわたって接触させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子および前記１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約３５日間にわたって接触させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤とさらに接触させることを含む、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を前記１種または複数のＳＣ分化増強剤と少なくとも約３日間にわたって接触させることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を前記１種または複数のＳＣ分化増強剤と約１０日間にわたって接触させることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を前記１種または複数のＳＣ分化増強剤と約３５日間にわたって接触させることを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記集団細胞を、前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子、前記１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤および前記１種または複数のＳＣ分化増強剤と同時に接触させることを含む、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤とさらに接触させることを含む、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記１種または複数のＳＣ分化増強剤が、ニューレグリン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、フォルスコリン、ＬＩＦおよびＣＮＴＦからなる群から選択される、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記１種または複数のＳＣ分化増強剤がｃＡＭＰである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記細胞を３Ｄスフェロイドへと凝集させること；ならびに前記３Ｄスフェロイドを、前記１種または複数のＦＧＦ活性化因子および前記１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む、請求項３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する前記条件が、前記３Ｄスフェロイドを接着培養で培養することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記１つまたは複数のシュワン細胞マーカーが、ＬＲＲＴＭ４、ＣＤＨ１、ＦＡＢＰ７、ＢＤＮＦ、ＵＮＣＢ５、ＳＯＳＴＤＣ１、ＯＬＩＧ１、ＰＬＡＴ、ＫＣＮＪ１０、ＳＨＨ、ＮＴＮ１、ＧＤＮＦ、ＥＲＢＢ３、ＧＡＰ４３、ＳＯＸ１０、Ｓ１００、ＧＦＡＰ、ＰＯＵ３Ｆ１、ＰＭＰ２２、ＭＢＰ、ＡＱＰ４、ＭＰＺ、ＮＧＦＲ、ＮＦＡＴＣ４、ＭＯＧ、ＩＦＮＧ、ＭＡＬ、ＮＴＦ３、ＴＧＦＢ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ９８、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｄ、ＴＹＲＰ１、ＥＮＴＨＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＨＴＲ２Ｂ、ＮＯＶ、ＩＬ８、ＳＬＣ１６Ａ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＬＰ２、Ｓ１００Ａ６、ＡＱＰ９、およびＣＤＨ１９からなる群から選択される、請求項４および３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記グルコース濃度が少なくとも約１０ｍＭである、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記グルコース濃度が約３０ｍＭである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記測定が、前記細胞の前記グルコースへの最初の曝露から少なくとも約１２時間後に実施される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記測定が、前記細胞の前記グルコースへの最初の曝露から約７２時間後に実施される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記シュワン細胞関連障害が、末梢神経障害、神経鞘腫症、シャルコー・マリー・トゥース病およびギラン・バレー症候群からなる群から選択される、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
対象における中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害を予防および／もしくは処置するための、末梢神経系（ＰＮＳ）の再生の方法であって、有効量の化合物またはそれを含む組成物を、前記シュワン細胞関連障害に罹患している対象に投与するステップを含み、前記化合物が、カリウムチャネルブロッカー、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤、シクロペンチアジド、カプトプリル、イスラジピン、コンデルフィン、ニメスリド、トリアムシノロン、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらの包接体およびそれらのプロドラッグ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、方法。
【請求項５７】
前記カリウムチャネルブロッカーがスルホニルウレア化合物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記スルホニルウレア化合物が、トルブタミド、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリシクラミド（トルヘキサミド）、メタヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリボルヌリド、グリクラジド、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリクロピラミド、グリメピリド、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらの包接体およびそれらのプロドラッグからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤が、ブプロピオン、アミネプチン、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標）、Ｃｏｎｃｅｒｔａ（登録商標）、Ｍｅｔａｄａｔｅ（登録商標）、Ｍｅｔｈｙｌｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｉｆｅｎ（登録商標）またはＳｔｉｍｄａｔｅ（登録商標））、アトモキセチン、マプロチリン、デスオキシピプラドロール、デクスメチルフェニデート、ジフェメトレックス、ジフェニルプロリノール、エチルフェニデート、フェンカムファミン、フェンカミン、レフェタミン、メチレンジオキシピロバレロン、メチルフェニデート、ノミフェンシン、Ｏ−２１７２、オキソリニン酸、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、タメトラリン、ＷＹ−４６８２４、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらのプロドラッグおよびそれらの包接体からなる群から選択される、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記シュワン細胞関連障害が、末梢神経障害、神経鞘腫症、シャルコー・マリー・トゥース病およびギラン・バレー症候群からなる群から選択される、請求項５６から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記シュワン細胞関連障害が末梢神経障害である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記末梢神経障害が糖尿病性末梢神経障害である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が、ブプロピオン、その塩、溶媒和物、水和物、包接体またはプロドラッグである、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物が塩酸ブプロピオンである、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物が、ブプロピオン代謝物、その塩、溶媒和物、水和物、包接体またはプロドラッグである、請求項５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ブプロピオン代謝物が、ヒドロキシブプロピオン、スレオ−ヒドロブプロピオンおよびエリスロヒドロブプロピオンからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記カリウムチャネルブロッカーが、トルブタミド、その塩、溶媒和物、水和物、包接体またはプロドラッグである、請求項５６から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項５６から６７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１１月１４日に出願された米国特許出願番号第６２／４２１，８１６号に基づく優先権を主張しており、そしてその内容は、本明細書中にその全体が参考として本明細書によって援用され、そしてその中の各々に基づく優先権が主張される。
【０００２】
序論
本開示の主題は、末梢神経系（ＰＮＳ）および／もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）の再生、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、糖尿病性末梢神経障害）の予防および／もしくは処置における薬物発見のための、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から誘導されたシュワン細胞前駆体およびシュワン細胞の使用に関する。前記薬物発見用の材料および方法によって同定された化合物を使用する、シュワン細胞関連障害の処置の方法がさらに提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
シュワン細胞（ＳＣ）は、末梢神経系（ＰＮＳ）のグリアであり、ＰＮＳ機能にとって重要である。これらは、神経堤（ＮＣ）からシュワン細胞前駆体（ＳＣＰ）中間体を介して発生する。ＳＣは、ＰＮＳの機能的調節、維持および修復において重要な役割を果たし、傷害後に神経修復を促進する優れた能力を示す（Jessenら、２０１５年；Lavdasら、２００８年）。ＳＣ欠損は、広範なヒト障害、例えば、神経鞘腫症、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、および糖尿病性末梢神経障害（ＤＰＮ）を含む種々の他の末梢神経障害に関与する。
【０００４】
真性糖尿病は、糖尿病患者の３０％（Callaghanら、２０１２年）〜６０％（Zochodne、２００７年）が罹患する末梢神経障害の主要原因である。これは、生活の質の低減ならびに罹患率および死亡率の増加を引き起こす主要な健康上の問題を提示する（La  Fontaineら、２０１４年）。米国におけるＤＰＮに関連する医療費は、２００１年には１年間に４６億〜１３７億ドルと推定され、増加し続けている（Gordoisら、２００３年）。ＤＰＮの症状は多様であるが、感覚機能不全および疼痛ならびに自律神経およびＥＮＳの合併症が含まれる。
【０００５】
グルコースレベルを注意深くモニタリングおよび調整することによってさらなる損傷を予防するという主要な目標を追求すること以外、ＤＰＮに対する有効な処置は現在存在しない。対症的処置には、抗うつ薬、抗痙攣薬、ならびに神経障害性疼痛に対処するためのオピオイドの使用が含まれる。
【０００６】
ＤＰＮの病理発生には、末梢神経における細胞毒性および変性をもたらすいくつかの複雑な寄与因子が関与する可能性が高い（SimmonsおよびFeldman、２００２年）。糖尿病における高血糖、低酸素および酸化ストレスは、特に感覚神経においてＳＣの変性をもたらすという証拠がある（Eckersley、２００２年）。究極的症状はニューロンの機能不全から生じるが、感覚ニューロンまたはグリアがＤＰＮの病理発生において重要な役割を果たすかどうかは不明である（Eckersley、２００２年）。細胞型特異的機構を精査することは、疾患表現型への、全身性血管異常を含む非細胞自律的因子の複雑な寄与を考えると、ＤＰＮの現在の動物モデルでは非常に困難である。従って、ＤＰＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によって幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から誘導されたシュワン細胞前駆体およびシュワン細胞が、末梢神経系（ＰＮＳ）および／もしくは中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、糖尿病性末梢神経障害（「ＤＰＮ」））を予防および／もしくは処置するために適切な薬物をスクリーニングするための疾患モデルにおいて使用できるという発見に関する。本開示の主題は、前記材料および方法によって同定された分子を使用してシュワン細胞関連障害を処置する方法にさらに関する。
【０００８】
本開示の主題は、末梢神経系（ＰＮＳ）の再生のため、中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害を予防および／もしくは処置するために適切な化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、
（ａ）１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を、少なくとも約３０ｍＭのグルコース濃度に曝露するステップであって、細胞は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる、ステップ；
（ｂ）細胞を、グルコース曝露後に試験化合物と接触させるステップ；
（ｃ）試験化合物による処理なしの細胞の第１のソルビトールレベル、第１のグルコースレベルおよび第１の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｄ）試験化合物で処理した細胞の第２のソルビトールレベル、第２のグルコースレベルおよび第２の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｅ）以下のうち１つまたは複数を比較するステップ：
（ｉ）第２のソルビトールレベルを第１のソルビトールレベルと、
（ｉｉ）第２のグルコースレベルを第１のグルコースレベルと、
（ｉｉｉ）第２の細胞生存度を第１の細胞生存度と；ならびに
（ｆ）以下のうち１つまたは複数が存在する場合に、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害の予防および／もしくは処置のために適切な試験化合物を同定するステップ：
（ｉ）第２のソルビトールレベルが第１のソルビトールレベルよりも低い場合、
（ｉｉ）第２のグルコースレベルが第１のグルコースレベルよりも低い場合、および
（ｉｉｉ）第２の細胞生存度が第１の細胞生存度よりも低い場合
を含む。
【０００９】
ある特定の実施形態では、この方法は、
（ａ）１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する細胞の集団を、少なくとも約３０ｍＭのグルコース濃度に曝露するステップであって、細胞は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる、ステップ；
（ｂ）細胞を、グルコース曝露後に試験化合物と接触させるステップ；
（ｃ）試験化合物による処理なしの細胞の第１のソルビトールレベル、第１のグルコースレベルおよび第１の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｄ）試験化合物で処理した細胞の第２のソルビトールレベル、第２のグルコースレベルおよび第２の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ；
（ｅ）以下のうち１つまたは複数を比較するステップ：
（ｉ）第２のソルビトールレベルを第１のソルビトールレベルと、
（ｉｉ）第２のグルコースレベルを第１のグルコースレベルと、
（ｉｉｉ）第２の細胞生存度を第１の細胞生存度と；ならびに
（ｆ）以下のうち１つまたは複数が存在する場合に、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害の予防および／もしくは処置のために適切な試験化合物を同定するステップ：
（ｉ）第２のソルビトールレベルが第１のソルビトールレベルよりも低い場合、
（ｉｉ）第２のグルコースレベルが第１のグルコースレベルよりも低い場合、および
（ｉｉｉ）第２の細胞生存度が第１の細胞生存度よりも低い場合
を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞は、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−ノーダル（Nodal）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップおよびこれらの細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させるステップ、ならびにこれらの細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と少なくとも約３日間にわたってさらに接触させるステップを含む方法による幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する細胞は、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップおよびこれらの細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させるステップ、これらの細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と少なくとも約３日間にわたってさらに接触させて、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するステップ、ならびに１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件に供するステップを含む方法による幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と約１４日間にわたって接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２０日以内に、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と最初に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１０日後と約１５日後との間に、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と最初に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１１日後に、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子と最初に接触させるステップを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、この方法は、細胞を１種または複数のＳＣ分化誘導剤と接触させて、１つまたは複数のＳＣ前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、細胞を１種または複数のＳＣ分化誘導剤と少なくとも約３日間にわたって接触させて、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団を産生するステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、細胞を１種または複数のＳＣ分化誘導剤と約１４日間にわたって接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１０日後と約１５日後との間に、細胞を１種または複数のＳＣ分化誘導剤と最初に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＳＣ分化誘導剤と同時に接触させるステップを含む。
【００１４】
ある特定の実施形態では、幹細胞の集団は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２５日後またはそれ以降に、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する分化した細胞の集団へと分化する。
【００１５】
ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞を１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と同時に接触させるステップを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約４日以内に、細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子と最初に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２日後に、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を分化させるための方法は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触と同日に、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と最初に接触させるステップを含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤はＳＢ４３１５４２である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ−１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１である。
【００２０】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＣ分化誘導剤は、ニューレグリン、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、フォルスコリン、ＴＧＦβおよびＦＢＳからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＣ分化誘導剤はＮＲＧ１である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子はＦＧＦ２である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、ＳＯＸ１０、ＧＡＰ４３、ＢＬＢＰ、ＭＰＺ、Ｄｈｈ、Ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ４９Ｄ、ＴＦＡＰ２、ＣＤＨ１９、ＣＤ４４、ＥＲＢＢ３、ＰＯＵ３Ｆ１、ＧＦＡＰ、ＣＡＬＣＢ、ＧＲＰ１１６、ＴＳＰＹＬ５、ＩＴＰＫＡ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰＬ２、ＬＯＣ１００１２８２５２、ＡＮＧＰＴＬ７、ＬＯＣ７２８９７８、ＺＮＦ５０２、ＳＬＣ１６Ａ６、ＬＰＬ、ＳＬＣ３０Ａ２、およびＳＬＣ１０Ａ４からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、表１〜４に列挙される遺伝子から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、表１に列挙される遺伝子から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、ＣＡＬＣＢ、ＧＲＰ１１６、ＴＳＰＹＬ５、ＩＴＰＫＡ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰＬ２、ＬＯＣ１００１２８２５２、ＡＮＧＰＴＬ７、ＬＯＣ７２８９７８およびＺＮＦ５０２からなる群から選択される。
【００２３】
ある特定の実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞からなる群から選択される。
【００２４】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と少なくとも約３日間にわたって接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約１０日間にわたって接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と約３５日間にわたって接触させることを含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤とさらに接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤と少なくとも約３日間にわたって接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤と約１０日間にわたって接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤と約３５日間にわたって接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、集団細胞を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤および１種または複数のＳＣ分化増強剤と同時に接触させることを含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を１種または複数のＳＣ分化増強剤とさらに接触させることを含む。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＣ分化増強剤は、ニューレグリン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、フォルスコリン、ＬＩＦおよびＣＮＴＦからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＣ分化増強剤はｃＡＭＰである。
【００２７】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、細胞を３Ｄスフェロイドへと凝集させること；ならびに３Ｄスフェロイドを、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体細胞のシュワン細胞への成熟化を支持する条件は、３Ｄスフェロイドを接着培養で培養することをさらに含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞マーカーは、ＬＲＲＴＭ４、ＣＤＨ１、ＦＡＢＰ７、ＢＤＮＦ、ＵＮＣＢ５、ＳＯＳＴＤＣ１、ＯＬＩＧ１、ＰＬＡＴ、ＫＣＮＪ１０、ＳＨＨ、ＮＴＮ１、ＧＤＮＦ、ＥＲＢＢ３、ＧＡＰ４３、ＳＯＸ１０、Ｓ１００、ＧＦＡＰ、ＰＯＵ３Ｆ１、ＰＭＰ２２、ＭＢＰ、ＡＱＰ４、ＭＰＺ、ＮＧＦＲ、ＮＦＡＴＣ４、ＭＯＧ、ＩＦＮＧ、ＭＡＬ、ＮＴＦ３、ＴＧＦＢ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ９８、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４９Ｄ、ＴＹＲＰ１、ＥＮＴＨＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＨＴＲ２Ｂ、ＮＯＶ、ＩＬ８、ＳＬＣ１６Ａ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＬＰ２、Ｓ１００Ａ６、ＡＱＰ９、およびＣＤＨ１９からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＣマーカーは、表１〜４に列挙される遺伝子から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＣマーカーは、表２〜４に列挙される遺伝子から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＣマーカーは、ＴＹＲＰ１、ＣＤ４４、ＥＮＴＨＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＨＴＲ２Ｂ、ＮＯＶ、ＩＬ８、ＳＬＣ１６Ａ６およびＣＤＫＮ２Ａからなる群から選択される。
【００２８】
ある特定の実施形態では、グルコース濃度は少なくとも約１０ｍＭである。ある特定の実施形態では、グルコース濃度は約３０ｍＭである。ある特定の実施形態では、測定は、細胞のグルコースへの最初の曝露から少なくとも約１２時間後に実施される。ある特定の実施形態では、測定は、細胞のグルコースへの最初の曝露から約７２時間後に実施される。
【００２９】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞関連障害は、末梢神経障害、神経鞘腫症、シャルコー・マリー・トゥース病およびギラン・バレー症候群からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、シュワン細胞関連障害は末梢神経障害である。ある特定の実施形態では、末梢神経障害は糖尿病性末梢神経障害である。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、対象における中枢神経系（ＣＮＳ）の再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害を予防および／もしくは処置するための、末梢神経系（ＰＮＳ）の再生の方法であって、有効量の化合物またはそれを含む組成物を、シュワン細胞関連障害に罹患している対象に投与するステップを含み、この化合物が、カリウムチャネルブロッカー、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤、シクロペンチアジド、カプトプリル、イスラジピン、コンデルフィン（condelphine）、ニメスリド、トリアムシノロン、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらの包接体およびそれらのプロドラッグ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、方法もまた提供する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、カリウムチャネルブロッカーはスルホニルウレア化合物である。ある特定の実施形態では、スルホニルウレア化合物は、トルブタミド、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリシクラミド（glycyclamide）（トルヘキサミド（tolhexamide））、メタヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリボルヌリド、グリクラジド、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリクロピラミド、グリメピリド、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらの包接体およびそれらのプロドラッグからなる群から選択される。
【００３２】
ある特定の実施形態では、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤は、ブプロピオン、アミネプチン、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標）、Ｃｏｎｃｅｒｔａ（登録商標）、Ｍｅｔａｄａｔｅ（登録商標）、Ｍｅｔｈｙｌｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｉｆｅｎ（登録商標）またはＳｔｉｍｄａｔｅ（登録商標））、アトモキセチン、マプロチリン、デスオキシピプラドロール（desoxypipradrol）、デクスメチルフェニデート、ジフェメトレックス（difemetorex）、ジフェニルプロリノール（diphenylprolinol）、エチルフェニデート、フェンカムファミン（fencamfamine）、フェンカミン（fencamine）、レフェタミン、メチレンジオキシピロバレロン（methylenedioxypyrovalerone）、メチルフェニデート、ノミフェンシン、Ｏ−２１７２、オキソリニン酸、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン（pyrovalerone）、タメトラリン（tametraline）、ＷＹ−４６８２４、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらのプロドラッグおよびそれらの包接体からなる群から選択される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞関連障害は、末梢神経障害、神経鞘腫症、シャルコー・マリー・トゥース病およびギラン・バレー症候群からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、シュワン細胞関連障害は末梢神経障害である。ある特定の実施形態では、末梢神経障害は糖尿病性末梢神経障害である。
【００３４】
ある特定の実施形態では、この化合物は、ブプロピオン、その塩、溶媒和物、水和物、包接体またはプロドラッグである。ある特定の実施形態では、この化合物は塩酸ブプロピオンである。ある特定の実施形態では、この化合物は、ブプロピオン代謝物、またはその塩、溶媒和物、水和物、包接体もしくはプロドラッグである。ある特定の実施形態では、ブプロピオン代謝物は、ヒドロキシブプロピオン（hydroxybupropion）、スレオ−ヒドロブプロピオン（threo-hydrobupropion）およびエリスロヒドロブプロピオン（erythrohydrobupropion）からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、カリウムチャネルブロッカーは、トルブタミド、その塩、溶媒和物、水和物、包接体またはプロドラッグである。
【００３５】
ある特定の実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ＡＢＣＤ】図１Ａ〜１Ｉは、ｈＥＳＣからのＳＣの誘導を示す図である。（１Ａ）シュワン細胞前駆体およびシュワン細胞を誘導するためのプロトコール（１１〜３５日目）の概略図表示。（１Ｂ）分化の１１日目、２５日目および３５日目におけるＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現。（１Ｃ、１Ｄ）シュワン細胞の分化およびミエリン形成（１Ｃ）ならびに神経の相互作用および支持（１Ｄ）に関与するシュワン系列マーカーのパネルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ。ＳＯＸ１０についての、選別されていないおよびＣＤ４９Ｄ選別された分化したＮＣ細胞の免疫蛍光。（１Ｅ）６０日目における、シュワン系列マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＳＣの代表的免疫蛍光イメージ。Ｆ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。（１Ｇ）ＣＮＳ前駆体と比較した、ＣＤ４９ｄ精製されたＮＣ、ＣＤ４９ｄ精製されたＳＣＰ、ヒト初代シュワン細胞、ならびに分化の５０日目および１００日目におけるＣＤ９８精製されたｈＥＳＣ由来ＳＣの主成分分析。（１Ｈ）２５日目のＳＣＰおよび１００日目のＳＣにおいて有意に上方調節された、上位１０（通常の書体）および選択されたさらなる（太字の書体）遺伝子。（１Ｉ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。スケールバー＝Ｂの左および中央のパネルでは１００μｍ、Ｂの右パネルおよびＥでは２５μｍ。
【図１ＥＦ】図１Ａ〜１Ｉは、ｈＥＳＣからのＳＣの誘導を示す図である。（１Ａ）シュワン細胞前駆体およびシュワン細胞を誘導するためのプロトコール（１１〜３５日目）の概略図表示。（１Ｂ）分化の１１日目、２５日目および３５日目におけるＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現。（１Ｃ、１Ｄ）シュワン細胞の分化およびミエリン形成（１Ｃ）ならびに神経の相互作用および支持（１Ｄ）に関与するシュワン系列マーカーのパネルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ。ＳＯＸ１０についての、選別されていないおよびＣＤ４９Ｄ選別された分化したＮＣ細胞の免疫蛍光。（１Ｅ）６０日目における、シュワン系列マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＳＣの代表的免疫蛍光イメージ。Ｆ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。（１Ｇ）ＣＮＳ前駆体と比較した、ＣＤ４９ｄ精製されたＮＣ、ＣＤ４９ｄ精製されたＳＣＰ、ヒト初代シュワン細胞、ならびに分化の５０日目および１００日目におけるＣＤ９８精製されたｈＥＳＣ由来ＳＣの主成分分析。（１Ｈ）２５日目のＳＣＰおよび１００日目のＳＣにおいて有意に上方調節された、上位１０（通常の書体）および選択されたさらなる（太字の書体）遺伝子。（１Ｉ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。スケールバー＝Ｂの左および中央のパネルでは１００μｍ、Ｂの右パネルおよびＥでは２５μｍ。
【図１ＧＨ】図１Ａ〜１Ｉは、ｈＥＳＣからのＳＣの誘導を示す図である。（１Ａ）シュワン細胞前駆体およびシュワン細胞を誘導するためのプロトコール（１１〜３５日目）の概略図表示。（１Ｂ）分化の１１日目、２５日目および３５日目におけるＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現。（１Ｃ、１Ｄ）シュワン細胞の分化およびミエリン形成（１Ｃ）ならびに神経の相互作用および支持（１Ｄ）に関与するシュワン系列マーカーのパネルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ。ＳＯＸ１０についての、選別されていないおよびＣＤ４９Ｄ選別された分化したＮＣ細胞の免疫蛍光。（１Ｅ）６０日目における、シュワン系列マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＳＣの代表的免疫蛍光イメージ。Ｆ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。（１Ｇ）ＣＮＳ前駆体と比較した、ＣＤ４９ｄ精製されたＮＣ、ＣＤ４９ｄ精製されたＳＣＰ、ヒト初代シュワン細胞、ならびに分化の５０日目および１００日目におけるＣＤ９８精製されたｈＥＳＣ由来ＳＣの主成分分析。（１Ｈ）２５日目のＳＣＰおよび１００日目のＳＣにおいて有意に上方調節された、上位１０（通常の書体）および選択されたさらなる（太字の書体）遺伝子。（１Ｉ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。スケールバー＝Ｂの左および中央のパネルでは１００μｍ、Ｂの右パネルおよびＥでは２５μｍ。
【図１Ｉ】図１Ａ〜１Ｉは、ｈＥＳＣからのＳＣの誘導を示す図である。（１Ａ）シュワン細胞前駆体およびシュワン細胞を誘導するためのプロトコール（１１〜３５日目）の概略図表示。（１Ｂ）分化の１１日目、２５日目および３５日目におけるＳＯＸ１０：：ＧＦＰ発現。（１Ｃ、１Ｄ）シュワン細胞の分化およびミエリン形成（１Ｃ）ならびに神経の相互作用および支持（１Ｄ）に関与するシュワン系列マーカーのパネルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ。ＳＯＸ１０についての、選別されていないおよびＣＤ４９Ｄ選別された分化したＮＣ細胞の免疫蛍光。（１Ｅ）６０日目における、シュワン系列マーカーについてのｈＥＳＣ由来ＳＣの代表的免疫蛍光イメージ。Ｆ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。（１Ｇ）ＣＮＳ前駆体と比較した、ＣＤ４９ｄ精製されたＮＣ、ＣＤ４９ｄ精製されたＳＣＰ、ヒト初代シュワン細胞、ならびに分化の５０日目および１００日目におけるＣＤ９８精製されたｈＥＳＣ由来ＳＣの主成分分析。（１Ｈ）２５日目のＳＣＰおよび１００日目のＳＣにおいて有意に上方調節された、上位１０（通常の書体）および選択されたさらなる（太字の書体）遺伝子。（１Ｉ）（１Ｅ）中のマーカーの定量化。スケールバー＝Ｂの左および中央のパネルでは１００μｍ、Ｂの右パネルおよびＥでは２５μｍ。
【００３７】
【図２ＡＢＣＤ】図２Ａ〜２Ｄは、高グルコース曝露に対するｈＥＳＣ−ＳＣの選択的脆弱性を示す図である。（２Ａ）ｈＥＳＣ由来細胞型において糖尿病性神経損傷をモデル化するための実験パラダイムの概略図表示。（２Ｂ）ＬＤＨ活性アッセイを使用する、異なるグルコース濃度への曝露に応答したｈＥＳＣ由来ＳＣおよび感覚ニューロンの細胞死分析。（２Ｃ）未分化ｈＥＳＣならびにｈＥＳＣ由来シュワン細胞および感覚ニューロンにおけるアルドースレダクターゼ（ＡＲ）およびソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）についてのｑＲＴ−ＰＣＲ。（２Ｄ）異なるグルコース濃度への曝露に応答した、ｈＥＳＣ由来ＳＣおよび感覚ニューロンにおける細胞内ソルビトール測定。
【図２Ｅ】記載なし。
【００３８】
【図３ＡＢＣＤ】図３Ａ〜３Ｆは、塩酸ブプロピオンが糖毒性に対してｈＥＳＣ−ＳＣを保護することを示す図である。（３Ａ、３Ｅ）高グルコース処理したｈＥＳＣ−ＳＣの生存度を増強する化合物の同定のためのハイスループット薬物スクリーニングの概略図表示。（３Ｂ）高グルコースで処置した生存ｈＥＳＣ−ＳＣの総数および１２８０のスクリーニングされた化合物を示す一次スクリーニングデータ。（３Ｃ）細胞死に対する効果についての、選択されたヒット化合物「塩酸ブプロピオン」の用量応答分析。（３Ｄ）ソルビトールレベルに対する効果についての、選択されたヒット化合物「塩酸ブプロピオン」の用量応答分析。（３Ｆ）一次ヒット化合物のリスト（Ｚ−スコア＞３）。ｐ値は、ｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｆは、塩酸ブプロピオンが糖毒性に対してｈＥＳＣ−ＳＣを保護することを示す図である。（３Ａ、３Ｅ）高グルコース処理したｈＥＳＣ−ＳＣの生存度を増強する化合物の同定のためのハイスループット薬物スクリーニングの概略図表示。（３Ｂ）高グルコースで処置した生存ｈＥＳＣ−ＳＣの総数および１２８０のスクリーニングされた化合物を示す一次スクリーニングデータ。（３Ｃ）細胞死に対する効果についての、選択されたヒット化合物「塩酸ブプロピオン」の用量応答分析。（３Ｄ）ソルビトールレベルに対する効果についての、選択されたヒット化合物「塩酸ブプロピオン」の用量応答分析。（３Ｆ）一次ヒット化合物のリスト（Ｚ−スコア＞３）。ｐ値は、ｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｆは、塩酸ブプロピオンが糖毒性に対してｈＥＳＣ−ＳＣを保護することを示す図である。（３Ａ、３Ｅ）高グルコース処理したｈＥＳＣ−ＳＣの生存度を増強する化合物の同定のためのハイスループット薬物スクリーニングの概略図表示。（３Ｂ）高グルコースで処置した生存ｈＥＳＣ−ＳＣの総数および１２８０のスクリーニングされた化合物を示す一次スクリーニングデータ。（３Ｃ）細胞死に対する効果についての、選択されたヒット化合物「塩酸ブプロピオン」の用量応答分析。（３Ｄ）ソルビトールレベルに対する効果についての、選択されたヒット化合物「塩酸ブプロピオン」の用量応答分析。（３Ｆ）一次ヒット化合物のリスト（Ｚ−スコア＞３）。ｐ値は、ｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である。
【００３９】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、グルコース代謝およびポリオール経路に対するブプロピオンの影響を示す図である。塩酸ブプロピオンは、解糖フラックス（glycolytic  flux）を増加させることによってソルビトールレベルを低減させる。（４Ａ〜４Ｃ）塩酸ブプロピオンに応答した細胞内グルコースレベル（４Ａ）、グルコース再取り込み（４Ｂ）およびピルベート（４Ｃ）の測定。（４Ｄ）ＳＣにおけるグルコース代謝に対するブプロピオンの影響のモデルの概略図表示。ｐ値は、ｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である。
【００４０】
【図５ＡＢＣ】図５Ａ〜５Ｇは、ブプロピオン処置がマウスにおいて糖尿病性神経損傷を予防することを示す図である。（５Ａ）マウスにおける糖尿病のモデル化およびブプロピオン処置の概略図表示。（５Ｂ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスにおける血中グルコースレベル。（５Ｃ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスにおける後肢引っ込めの潜時を測定する熱感度試験。（５Ｄ、５Ｅ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスの坐骨神経におけるＴＵＮＥＬ染色および定量化。（５Ｆ、５Ｇ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスの坐骨神経における損傷ミエリン構造の透過電子顕微鏡および定量化。ｐ値は、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００である。スケールバー＝Ｄでは１００μｍ、Ｆでは５μｍ。ＢＰ、塩酸ブプロピオン。
【図５ＤＥＦＧ】図５Ａ〜５Ｇは、ブプロピオン処置がマウスにおいて糖尿病性神経損傷を予防することを示す図である。（５Ａ）マウスにおける糖尿病のモデル化およびブプロピオン処置の概略図表示。（５Ｂ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスにおける血中グルコースレベル。（５Ｃ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスにおける後肢引っ込めの潜時を測定する熱感度試験。（５Ｄ、５Ｅ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスの坐骨神経におけるＴＵＮＥＬ染色および定量化。（５Ｆ、５Ｇ）正常マウスならびにＳＴＺおよびブプロピオンで処置したマウスの坐骨神経における損傷ミエリン構造の透過電子顕微鏡および定量化。ｐ値は、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００である。スケールバー＝Ｄでは１００μｍ、Ｆでは５μｍ。ＢＰ、塩酸ブプロピオン。
【００４１】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ｈＥＳＣ由来ＳＣＰおよびＳＣ系列の特徴付けを示す図である。（６Ａ）ｈＥＳＣ由来ＮＣ（１１日目）およびＳＣＰ（２５日目）におけるＳＯＸ１０：：ＧＦＰのフローサイトメトリー分析。（６Ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の間の異なる時点におけるｈＥＳＣ由来ＳＣにおけるＧＦＡＰのフローサイトメトリー分析。
【００４２】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜７Ｃは、抗体スクリーニングがヒトＳＣについての新規表面マーカーを同定することを示す図である。（７Ａ）抗体スクリーニングパラダイムの概略図表示。（７Ｂ）一次スクリーニングは、ｈＥＳＣ−ＳＣについての新規表面マーカーを同定する。（７Ｃ）ＳＣ分化の異なる段階における表面マーカー発現の免疫細胞化学およびフローサイトメトリーベースの検証。
【図７Ｃ−１】図７Ａ〜７Ｃは、抗体スクリーニングがヒトＳＣについての新規表面マーカーを同定することを示す図である。（７Ａ）抗体スクリーニングパラダイムの概略図表示。（７Ｂ）一次スクリーニングは、ｈＥＳＣ−ＳＣについての新規表面マーカーを同定する。（７Ｃ）ＳＣ分化の異なる段階における表面マーカー発現の免疫細胞化学およびフローサイトメトリーベースの検証。
【図７Ｃ−２】図７Ａ〜７Ｃは、抗体スクリーニングがヒトＳＣについての新規表面マーカーを同定することを示す図である。（７Ａ）抗体スクリーニングパラダイムの概略図表示。（７Ｂ）一次スクリーニングは、ｈＥＳＣ−ＳＣについての新規表面マーカーを同定する。（７Ｃ）ＳＣ分化の異なる段階における表面マーカー発現の免疫細胞化学およびフローサイトメトリーベースの検証。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本開示の主題は、シュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、糖尿病性末梢神経障害）を予防および／または処置する際の薬物発見のための幹細胞由来シュワン細胞前駆体および／またはシュワン細胞の使用に関する。本開示の主題は、シュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、糖尿病性末梢神経障害）を予防および／または処置するための、かかる薬物発見方法からスクリーニングされた化合物およびかかる化合物の医薬組成物の使用にも関する。
【００４４】
限定ではなく開示の明確さを目的として、詳細な説明は以下のサブセクションに分割される：
１．定義
２．幹細胞を分化させる方法
３．治療的化合物をスクリーニングする方法
４．処置の方法
５．キット
【００４５】
１．定義
本明細書で使用される用語は一般に、本発明の文脈内で、各用語が使用される具体的な文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。ある特定の用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれらをどのように作製および使用するかを記述するにあたり実務者にさらなるガイダンスを提供するために、以下または本明細書の他の箇所で議論される。
【００４６】
用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定され、その値がどのように測定または決定されるか、即ち、測定系の限界に一部依存する、特定の値について許容される誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当該分野における実務に従い、３標準偏差以内または３標準偏差よりも大きいことを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大で２０％、例えば、最大で１０％、最大で５％または最大で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１オーダー以内、例えば、５分の１〜５倍以内または２分の１〜２倍以内を意味し得る。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関して、用語「シグナル伝達」とは、膜受容体タンパク質へのリガンド結合または一部の他の刺激によって活性化されるまたは他の方法で影響されるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例には、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＳＭＡＤ、ベータ−カテニン（catnin）を含むウイングレス（Ｗｎｔ）複合タンパク質、ＮＯＴＣＨ、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３Ｐ）タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質について、リガンド−受容体相互作用は、細胞の応答と直接関連するわけではない。リガンド活性化された受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの究極的な生理学的影響が生じる前に、細胞の内側の他のタンパク質と最初に相互作用し得る。しばしば、いくつかの相互作用性細胞タンパク質の鎖の挙動は、受容体の活性化または阻害後に変更される。受容体活性化によって誘導される細胞変化のセット全体は、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「シグナル」とは、細胞の構造および機能における変化を制御する内部および外部の因子を指す。これらは、性質が化学的または物理的であり得る。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「リガンド」とは、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、ＴＧＦβ、アクチビン、ノーダル、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。
【００５０】
「阻害剤」とは、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能を妨害する（例えば、低減、減少、抑制、排除または遮断する）化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマーまたは抗体）を指す。阻害剤は、一例として、ＳＭＡＤシグナル伝達に直接接触すること、ＳＭＡＤ  ｍＲＮＡに接触すること、ＳＭＡＤのコンフォメーション変化を引き起こすこと、ＳＭＡＤタンパク質レベルを減少させること、またはＳＭＡＤとシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されるものが含まれる）との相互作用を妨害すること、およびＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現に影響を与えることを介して、指定されたタンパク質（シグナル伝達分子、指定されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、指定された関連する分子、例えば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、本明細書に記載されるシグナル伝達分子が含まれるがこれらに限定されない）の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子であり得る。阻害剤には、上流シグナル伝達分子（例えば、細胞外ドメイン内）を妨害することによって、ＳＭＡＤの生物活性を間接的に調節する分子も含まれ、シグナル伝達分子および効果の例には、骨形態形成タンパク質を隔離し、ＡＬＫ受容体１、２、３および６の活性化を阻害し、それによって下流ＳＭＡＤ活性化を防止するノギンが含まれる。同様に、コーディン、ケルベロス、フォリスタチンも同様に、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を隔離する。膜貫通タンパク質であるバンビ（Bambi）もまた、細胞外ＴＧＦｂシグナル伝達分子を隔離する偽受容体として作用する。アクチビン、ノーダル、ＴＧＦｂおよびＢＭＰを遮断する抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を中和するためなどの使用について企図される。阻害剤は、指定された分子の阻害を次に引き起こす、指定されたシグナル伝達分子から上流の分子に結合しそれに影響を与えることによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を除外または低減させる様式で活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（そのタンパク質の活性部位への化合物の結合を妨害する様式でタンパク質コンフォメーションを変化させる様式でタンパク質に結合する）の観点から記載される。阻害剤は、シグナル伝達標的を実際に接触させることによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語「シュワン細胞前駆体」とは、本明細書に開示されるシュワン細胞前駆体マーカーが含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞を指す。適切な成熟化条件下で、シュワン細胞前駆体はシュワン細胞になり得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「シュワン細胞」とは、本明細書に開示されるシュワン細胞マーカーが含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する細胞を指す。シュワン細胞は、ミエリン形成性シュワン細胞または非ミエリン形成性シュワン細胞であり得る。ある特定の実施形態では、シュワン細胞は、末梢神経系においてニューロンの軸索を維持および再生することが可能である（例えば、健康な軸索の維持）。ある特定の実施形態では、シュワン細胞は、ミエリン鞘を形成することが可能である。ある特定の実施形態では、シュワン細胞は、Ｒｅｍａｋバンドル（Remak  bundle）を形成することが可能である。
【００５３】
「活性化因子」とは、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達またはＦＧＦシグナル伝達を増加させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、またはその活性化を増強する化合物を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「誘導体」とは、類似のコア構造を有する化学化合物を指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」または「細胞集団」とは、少なくとも２つの細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団、例えば、ＳＣ前駆体の集団、ＳＣの集団、または未分化幹細胞の集団であり得る。あるいは、集団は、１つよりも多い細胞型、例えば、混合細胞集団、例えば、ＳＣ前駆体およびＳＣの混合集団を含み得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」とは、培養物中で不確定の期間にわたって分裂し、特殊化された細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞とは、ヒト由来の幹細胞を指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」とは、着床前段階の胚から誘導され、培養物中で長期間にわたって分化せずに分裂することが可能であり、３つの主な胚葉の細胞および組織へと発生することが公知の、原始的（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞とは、ヒト由来の胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」とは、胚盤胞段階までおよび胚盤胞段階を含む初期段階のヒト胚から誘導され、培養物中で長期間にわたって分化せずに分裂することが可能であり、３つの主な胚葉の細胞および組織へと発生することが公知の、多能性幹細胞（「ＰＳＣ」）の１つの型を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞系」とは、最大で数日間、数ヶ月〜数年間にわたって分化せずに増殖することを可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「全能性」とは、身体の全ての細胞型＋胎盤などの胚外組織を構成する全ての細胞型を生じる能力を指す。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「多分化能性」とは、身体の１つよりも多い細胞型へと発生する能力を指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「多能性」とは、内胚葉、中胚葉および外胚葉を含む生物の３つの発生的胚葉へと発生する能力を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、体細胞、例えば、ＣＩ４、Ｃ７２などの中へのある特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるTakahashiおよびYamanaka  Cell  １２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年）を参照のこと）の導入によって形成される、胚性幹細胞と類似の多能性幹細胞の１つの型を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「体細胞」とは、配偶子（卵または精子）以外の身体中の任意の細胞を指し、「成体」細胞と呼ばれる場合がある。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「体性（成体）幹細胞」とは、自己再生（実験室中で）および分化の両方について限定的な能力を有する、多くの臓器および分化した組織において見出される比較的稀な未分化細胞を指す。かかる細胞は、その分化能が異なっているが、起源の臓器中の細胞型に通常は限定される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「ニューロン」とは、神経系の主要な機能的単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体およびその突起、即ち軸索、および１つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって、他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「増殖」とは、細胞数の増加を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「未分化」とは、特殊化された細胞型へと未だ発生していない細胞を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「分化」とは、特殊化されていない胚性細胞が、心臓、肝臓または筋肉細胞などの特殊化された細胞の特色を獲得するプロセスを指す。分化は、細胞表面中に包埋されたタンパク質が関与するシグナル伝達経路を通常は介した、細胞の遺伝子と細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「方向付けられた分化」とは、特定の（例えば、所望の）細胞型、例えばＳＣ前駆体への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、幹細胞に関して、用語「方向付けられた分化」とは、多能性状態から、より成熟したまたは特殊化された細胞運命（例えば、ＳＣ前駆体、ＳＣなど）への幹細胞の移行を促進するための、小分子、増殖因子タンパク質および他の成長条件の使用を指す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、細胞に関して、用語「分化を誘導する」とは、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）へと変化させることを指す。従って、「幹細胞において分化を誘導する」とは、幹細胞とは異なる特徴、例えば、遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子分析によって決定される、遺伝子発現における変化）および／または表現型（例えば、ＳＣ前駆体マーカー（単数または複数）およびＳＣマーカー（単数または複数）などのタンパク質の発現における変化）を有する子孫細胞へと分裂するように幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を誘導することを指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「細胞培養」とは、研究または医学的処置のための人工培地中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「培養培地」とは、培養容器、例えば、ペトリプレート、マルチウェルプレートなどの中の細胞を覆う液体を指し、細胞に栄養を与え細胞を支持する栄養素を含む。培養培地は、細胞において所望の変化を生じさせるために添加される増殖因子もまた含み得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、細胞を化合物（例えば、１種または複数の阻害剤、活性化因子および／または誘導剤）と「接触させる」という用語は、それが細胞に触れるのを可能にする位置に化合物を配置することを指す。接触させることは、任意の適切な方法を使用して達成され得る。例えば、接触させることは、細胞の管に化合物を添加することによって達成され得る。接触させることは、細胞を含む培養培地に化合物を添加することによっても達成され得る。化合物（例えば、本明細書に開示される阻害剤、活性化因子および誘導剤）の各々は、細胞を含む培養培地に、溶液（例えば、濃縮溶液）として添加され得る。あるいはまたはさらに、化合物（例えば、本明細書に開示される阻害剤、活性化因子および誘導剤）ならびに細胞は、製剤化された細胞培養培地中に存在し得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、人工的環境、および人工的環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境には、試験管および細胞培養物が例示されるがこれらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、天然の環境（例えば、動物または細胞）、および天然の環境内で生じるプロセスまたは反応、例えば、胚発生、細胞分化、神経管形成などを指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関して、用語「発現する」とは、アッセイ、例えば、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどを使用して観察され得る、ｍＲＮＡまたはタンパク質を作製することを指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「マーカー」または「細胞マーカー」とは、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞についてのマーカーは、１つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーとは、指定された群のマーカーがある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定できるような、マーカーの「パターン」を指し得る。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「〜から誘導される」または「〜から樹立される」または「〜から分化させた」は、本明細書に開示される任意の細胞に関して用いられる場合、任意の操作、例えば、限定なしに、単細胞単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養、例えば、タンパク質、化学物質、照射、ウイルスによる感染、ＤＮＡ配列による、例えば、モルフォゲンなどによるトランスフェクション、培養された親細胞中に含まれる任意の細胞の選択（例えば、連続培養による）を使用する処理および／または変異誘発を使用して、細胞系、組織（例えば、解離された胚）または体液中の親細胞から得られた（例えば、単離された、精製されたなどの）細胞を指す。誘導された細胞は、増殖因子、サイトカイン、サイトカイン処理の選択された経過に対する応答、接着性、接着性の欠如、選別手順などによって、混合集団から選択され得る。
【００８０】
本明細書の「個体」または「対象」は、脊椎動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜、スポーツ動物（sport  animal）、げっ歯類およびペットが含まれるがこれらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例には、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；ならびに非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサルが含まれる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」とは、細胞、組織または臓器の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」とは、処置されている個体または細胞の疾患過程を変更することを試みた臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程の間に実施され得る。処置の治療効果には、限定なしに、疾患の出現または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減殺、転移の予防、疾患進行の速度の減少、疾患状態の軽快または緩和、および寛解または改善された予後が含まれる。疾患または障害の進行を予防することによって、処置は、罹患したもしくは診断された対象、または障害を有すると疑われる対象における障害に起因する悪化を予防できるが、処置は、障害のリスクがある対象または障害を有すると疑われる対象における障害または障害の症状の開始もまた予防し得る。
【００８３】
２．幹細胞をシュワン細胞へと分化させる方法
シュワン細胞は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られ得る。ある特定の実施形態では、幹細胞はヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系列特異的分化が可能な任意の他の細胞が含まれる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、またはげっ歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど由来の幹細胞が含まれるがこれらに限定されない非ヒト幹細胞である。
【００８４】
二重ＳＭＡＤ阻害の使用は、１つの型の神経系列への幹細胞（例えば、ｈＰＳＣ）の分化を誘導するために使用され得る。例えば、その全体が参照によって組み込まれるChambers（２００９年）。さらに、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の連続的阻害とその後のＷｎｔシグナル伝達の活性化によって、神経堤系列細胞（例えば、侵害受容器）へと分化させ得る。例えば、全て、その全体が参照によって組み込まれる、Chambers（２０１２年）；Mica（２０１３年）；ＷＯ２０１１／１４９７６２；Fattahi（２０１６年）；および２０１５年１２月２３日出願の米国特許仮出願番号６２／３８７，４６８号。
【００８５】
ある特定の実施形態では、ＳＣへの幹細胞の分化は、３つの相を含む：１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞（神経堤系列細胞）への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化、ＳＣ前駆体への神経堤系列細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化、およびＳＣへのＳＣ前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化または成熟化。Chambers（２０１２年）；Mica（２０１３年）；ＷＯ２０１１／１４９７６２；２０１５年１２月２３日出願の米国特許仮出願番号６２／３８７，４６８号；およびFattahi（２０１６年）に開示されるものが含まれるがこれらに限定されない、神経堤系列細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のための任意の適切な方法が、第１の相において使用され得る。ある特定の実施形態では、幹細胞の集団を神経堤系列細胞の集団へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、神経堤系列細胞の集団をＳＣ前駆体の集団へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、ＳＣ前駆体の集団をＳＣの集団へとｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに誘導する。
【００８６】
神経堤系列マーカーの非限定的な例には、ＳＯＸ１０、ｐ７５、ＨＮＫ１、ＣＤ４９Ｄ、ＥＲＢＢ３、ＴＦＡＰ２、ＳＮＡＩＬおよびＳＬＵＧが含まれる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、神経堤系列細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害およびＷｎｔシグナル伝達の活性化によって、幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる。ある特定の実施形態では、この方法は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の集団を、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させるステップを含む。
【００８８】
ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣ分化を誘導することによって、神経堤系列細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる。ある特定の実施形態では、この方法は、神経堤系列細胞（例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害およびＷｎｔシグナル伝達の活性化によって幹細胞から誘導された神経堤系列細胞）の集団を、１種または複数のＷｎｔ活性化因子および１種または複数のＦＧＦ活性化因子と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、神経堤系列細胞（例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害およびＷｎｔシグナル伝達の活性化によって幹細胞から誘導された神経堤系列細胞）の集団を、１種または複数のＳＣ分化誘導剤と接触させるステップを含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、ＳＣは、ＳＣ分化を増強することによって、ＳＣ前駆体からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる。ある特定の実施形態では、この方法は、ＳＣ前駆体（例えば、ＳＣ分化を誘導することによって神経堤系列細胞から誘導されたＳＣ前駆体細胞）の集団を、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、１種または複数のＳＣ分化誘導剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、ＳＣ前駆体（例えば、ＳＣ分化を誘導することによって神経堤系列細胞から誘導されたＳＣ前駆体細胞）の集団を、１種または複数のＳＣ分化増強剤と接触させるステップを含む。
【００９０】
１．神経堤系列細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導する方法は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の集団を、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ノーダルおよびアクチビンを含むリガンドを中和し、または受容体および下流のエフェクターを遮断することを介して、そのシグナル経路を遮断する。ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Chambers（２００９年）およびChambers（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤はＳＢ４３１５４２である。
【００９１】
「ＳＢ４３１５４２」とは、ＣＡＳ番号３０１８３６−４１−９、Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３の分子式、および４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドの名称を有する分子を指す。例えば、以下の構造：
【化１】
2019535263.tif 000003
を参照のこと。
【００９２】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導する方法は、幹細胞を、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤（「ＳＭＡＤ阻害剤」）と接触させるステップをさらに含む。ＳＭＡＤ阻害剤の非限定的な例は、その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Chambers（２００９年）およびChambers（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤はＬＤＮ１９３１８９である。
【００９３】
「ＬＤＮ１９３１８９」とは、Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６の化学式を有し、以下の式
【化２】
2019535263.tif 000004
を有する小分子ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンを指す。
【００９４】
ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することが可能である。ＬＤＮ１９３１８９は、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３およびＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の高度に強力な小分子阻害剤でもあり、ＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのＩ型ＴＧＦβ受容体のメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物シグナルの伝達、ならびに引き続いてＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化の阻害を生じる（参照によって本明細書に組み込まれる、Yuら（２００８年）Nat  Med  １４巻：１３６３〜１３６９頁；Cunyら（２００８年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.  １８巻：４３８８〜４３９２頁）。
【００９５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞の分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導する方法は、細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触させるステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、リガンドに関して、用語「ＷＮＴ」または「ウイングレス」とは、ＷＮＴ受容体、例えば、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリー中の受容体と相互作用することが可能な一群の分泌タンパク質（即ち、ヒトではＩｎｔ１（組み込み１））を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関して、用語「ＷＮＴ」または「ウイングレス」とは、β−カテニンで媒介されるまたは媒介されない、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体、例えば、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成されるシグナル経路を指す。ある特定の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路は、β−カテニン、例えば、ＷＮＴ／β−カテニンによる媒介を含む。
【００９６】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。従って、Ｗｎｔ活性化因子は、ＧＳＫ３β阻害剤であり得る。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することが可能である。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Cadiganら、J  Cell  Sci.  ２００６年；１１９巻：３９５〜４０２頁；Kikuchiら、Cell  Signaling.  ２００７年；１９巻：６５９〜６７１頁を参照のこと。本明細書で使用される場合、用語「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤」とは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指す。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるDobleら、J  Cell  Sci.  ２００３年；１１６巻：１１７５〜１１８６頁を参照のこと。
【００９７】
Ｗｎｔ活性化因子またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例は、その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Chambers（２０１２年）およびCalderら、J  Neurosci.  ２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁に開示されている。ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子はＣＨＩＲ９９０２１である。
【００９８】
「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」としても公知）とは、以下の式
【化３】
2019535263.tif 000005
を有する、ＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。
【００９９】
ＣＨＩＲ９９０２１は高度に選択的であり、関連するキナーゼおよび関連しないキナーゼのパネルに対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭ、げっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値である。
【０１００】
１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のために、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、または少なくとも約３０日間にわたって接触され得る。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、最大で約３日間、最大で約４日間、最大で約５日間、最大で約６日間、最大で約７日間、最大で約８日間、最大で約９日間、最大で約１０日間、最大で約１１日間、最大で約１２日間、最大で約１３日間、最大で約１４日間、最大で約１５日間、最大で約１６日間、最大で約１７日間、最大で約１８日間、最大で約１９日間、最大で約２０日間、最大で約２１日間、最大で約２２日間、最大で約２３日間、最大で約２４日間、最大で約２５日間、最大で約２６日間、最大で約２７日間、最大で約２８日間、最大で約２９日間、または最大で約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約４日間と約３０日間との間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間と約２６日間との間、約４日間と約２５日間との間、約４日間と約２４日間との間、約４日間と約２０日間との間、約４日間と約１５日間との間、約４日間と約１０日間との間、約５日間と約１５日間との間、約５日間と約１０日間との間、約１０日間と約１５日間との間、約１５日間と約２０日間との間、約１０日間と約２０日間との間、約２０日間と約２５日間との間、または約２５日間と約３０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、１０日間と約１５日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１０日間にわたって接触される。ある特定の実施形���では、幹細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間にわたって接触される。
【０１０１】
１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のために、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、または少なくとも約３０日間にわたって接触され得る。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、最大で約３日間、最大で約４日間、最大で約５日間、最大で約６日間、最大で約７日間、最大で約８日間、最大で約９日間、最大で約１０日間、最大で約１１日間、最大で約１２日間、最大で約１３日間、最大で約１４日間、最大で約１５日間、最大で約１６日間、最大で約１７日間、最大で約１８日間、最大で約１９日間、最大で約２０日間、最大で約２１日間、最大で約２２日間、最大で約２３日間、最大で約２４日間、最大で約２５日間、最大で約２６日間、最大で約２７日間、最大で約２８日間、最大で約２９日間、または最大で約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約４日間と約３０日間との間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間と約２６日間との間、約４日間と約２５日間との間、約４日間と約２４日間との間、約４日間と約２０日間との間、約４日間と約１５日間との間、約４日間と約１０日間との間、約５日間と約１５日間との間、約５日間と約１０日間との間、約１０日間と約１５日間との間、約１５日間と約２０日間との間、約１０日間と約２０日間との間、約２０日間と約２５日間との間、または約２５日間と約３０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、１０日間と約１５日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、約１１日間にわたって接触される。
【０１０２】
さらに、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間にわたって接触され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、最大で約４日間、最大で約５日間、最大で約６日間、最大で約７日間、最大で約８日間、最大で約９日間、最大で約１０日間、最大で約１１日間、最大で約１２日間、最大で約１３日間、最大で約１４日間、最大で約１５日間、最大で約１６日間、最大で約１７日間、最大で約１８日間、最大で約１９日間、最大で約２０日間、最大で約２１日間、最大で約２２日間、最大で約２３日間、最大で約２４日間、最大で約２５日間、最大で約２６日間、最大で約２７日間、最大で約２８日間、最大で約２９日間、または最大で約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間と約３０日間との間、約４日間〜約２７日間の間、約４日間と約２６日間との間、約４日間と約２５日間との間、約４日間と約２４日間との間、約４日間と約２０日間との間、約４日間と約１５日間との間、約４日間と約１０日間との間、約５日間と約１５日間との間、約５日間と約１０日間との間、約１０日間と約１５日間との間、約１５日間と約２０日間との間、約１０日間と約２０日間との間、約２０日間と約２５日間との間、または約２５日間と約３０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、５日間と約１５日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１１日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約１０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、約９日間にわたって接触される。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１ｎＭ〜約３００ｎＭ、約５ｎＭ〜約２５０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約８０ｎＭ〜約１２０ｎＭ、約９０ｎＭ〜約１１０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約１５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、または約２５０ｎＭ〜約３００ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約８０ｎＭ〜約１２０ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１００ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、上記濃度のいずれか１つのＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１００ｎＭの濃度のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日接触される。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約５μＭ〜１５μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１０μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、上記濃度のいずれか１つのＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、約１０μＭの濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、毎日接触される。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、約１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、約３μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、上記濃度のいずれか１つのＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、約３μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触される。
【０１０６】
２．シュワン細胞前駆体への神経堤系列細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化
ある特定の実施形態では、神経堤系列細胞は、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、例えば、幹細胞の集団を１種または複数のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達および任意選択で１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させ、それらの細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子とさらに接触させた後の、分化した細胞）を、本明細書に記載される１種または複数のＷｎｔ活性化因子、およびＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子（「ＦＧＦ活性化因子」）と接触させて、ＳＣ前駆体、例えば、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するステップを含む方法によって、シュワン細胞前駆体へと分化させる。ある特定の実施形態では、この方法は、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、例えば、幹細胞の集団を１種または複数のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達および任意選択で１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させ、それらの細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子とさらに接触させた後の、分化した細胞）を、シュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子（「ＳＣ分化誘導剤」）と接触させて、ＳＣ前駆体、例えば、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞の集団を産生するステップを含む。
【０１０７】
ＳＣ分化誘導剤の非限定的な例には、ニューレグリン、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、フォルスコリン、ＴＧＦβおよびＦＢＳが含まれる。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＣ分化誘導剤はニューレグリン１（ＮＲＧ１）である。
【０１０８】
ＦＧＦシグナル伝達の活性化因子の非限定的な例には、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、それらの誘導体、およびそれらの混合物が含まれる。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子はＦＧＦ２である。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子および１種または複数のＦＧＦ活性化因子、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と同時に接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のＳＣ分化誘導剤と同時に接触される。例えば、１種または複数のＷｎｔ活性化因子および１種または複数のＦＧＦ活性化因子、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤は全て、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）を含む細胞培養培地中に存在する。ある特定の実施形態では、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤は、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、例えば、幹細胞の集団を１種または複数のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達および任意選択で１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させ、それらの細胞を１種または複数のＷｎｔ活性化因子とさらに接触させた後の、分化した細胞）を含む細胞培養培地に、毎日（または１日おきに、もしくは２日毎に）一緒に添加される。
【０１１０】
１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、または少なくとも約２０日間にわたって接触され得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、少なくとも約１０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、最大で約１５日間、最大で約１６日間、最大で約１７日間、最大で約１８日間、最大で約１９日間、最大で約２０日間、最大で約２１日間、最大で約２２日間、最大で約２３日間、最大で約２４日間、最大で約２５日間、最大で約２６日間、最大で約２７日間、最大で約２８日間、最大で約２９日間、または最大で約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、約３日間と約５日間との間、約５日間と約１０日間との間、約１０日間と約１５日間との間、約１５日間と約２０日間との間、約２０日間と約２５日間との間、または約２５日間と約３０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、約１０日間と約１５日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、または約３０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、約１４日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子、１種または複数のＦＧＦ活性化因子、および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と、約１５日間にわたって接触される。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞の集団を産生するために、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と接触され、神経堤系列細胞集団は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子とさらに接触される。従って、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３１日間、少なくとも約３２日間、少なくとも約３３日間、少なくとも約３４日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約３６日間、少なくとも約３７日間、少なくとも約３８日間、少なくとも約３９日間、または少なくとも約４０日間にわたって接触され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で最大で約１５日間、最大で約１６日間、最大で約１７日間、最大で約１８日間、最大で約１９日間、最大で約２０日間、最大で約２１日間、最大で約２２日間、最大で約２３日間、最大で約２４日間、最大で約２５日間、最大で約２６日間、最大で約２７日間、最大で約２８日間、最大で約２９日間、最大で約３０日間、最大で約３１日間、最大で約３２日間、最大で約３３日間、最大で約３４日間、最大で約３５日間、最大で約３６日間、最大で約３７日間、最大で約３８日間、最大で約３９日間、最大で約４０日間、最大で約４１日間、最大で約４２日間、最大で約４３日間、最大で約４４日間、最大で約４５日間、最大で約４６日間、最大で約４７日間、最大で約４８日間、最大で約４９日間、最大で約５０日間、最大で約５１日間、最大で約５２日間、最大で約５３日間、最大で約５４日間、最大で約５５日間、最大で約５６日間、最大で約５７日間、最大で約５８日間、最大で約５９日間、または最大で約６０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、約１４日間と約２０日間との間、約２０日間と約２５日間との間、約２５日間と約３０日間との間、約３０日間と約３５日間との間、約３５日間と約４０日間との間、約４０日間と約４５日間との間、約４５日間と約５０日間との間、約５０日間と約５５日間との間、または約５５日間と約６０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で２０日間と約３０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、合計で２０日間と約２５日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で２５日間と約３０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、合計で約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約２２日間、約２３日間、約２４日間、約２５日間、約２６日間、約２７日間、約２８日間、約２９日間、約３０日間、約３１日間、約３２日間、約３３日間、約３４日間、約３５日間、約３６日間、約３７日間、約３８日間、約３９日間、約４０日間、約４１日間、約４２日間、約４３日間、約４４日間、約４５日間、約４６日間、約４７日間、約４８日間、約４９日間、約５０日間、約５１日間、約５２日間、約５３日間、約５４日間、約５５日間、約５６日間、約５７日間、約５８日間、約５９日間または約６０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で約２６日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、合計で約２５日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で約２４日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種または複数のＷｎｔ活性化因子と、合計で約２３日間にわたって接触される。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１ｎＭ〜１００ｎＭ、約１ｎＭ〜２０ｎＭ、約１ｎＭ〜１５ｎＭ、約１ｎＭ〜１０ｎＭ、約１ｎＭ〜５ｎＭ、約５ｎＭ〜１０ｎＭ、約５ｎＭ〜１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜４０ｎＭ、約４０ｎＭ〜５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜６０ｎＭ、約６０ｎＭ〜７０ｎＭ、約７０ｎＭ〜８０ｎＭ、約８０ｎＭ〜９０ｎＭ、または約９０ｎＭ〜１００ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約５ｎＭ〜１５ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１０ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、上記濃度のいずれか１つのＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１０ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、上記濃度のいずれか１つのシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と、毎日接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と、毎日接触される。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１μＭ〜１００μＭ、約１μＭ〜２０μＭ、約１μＭ〜１５μＭ、約１μＭ〜１０μＭ、約１μＭ〜５μＭ、約５μＭ〜１０μＭ、約５μＭ〜１５μＭ、約１５μＭ〜２０μＭ、約２０μＭ〜３０μＭ、約３０μＭ〜４０μＭ、約４０μＭ〜５０μＭ、約５０μＭ〜６０μＭ、約６０μＭ〜７０μＭ、約７０μＭ〜８０μＭ、約８０μＭ〜９０μＭ、または約９０μＭ〜１００μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、ＳＣ前駆体を産生するために、約３μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、上記濃度のいずれか１つのＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞）は、約３μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触される。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞を少なくとも約５０％含む細胞集団は、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させ、細胞のこの集団は、１種のＷｎｔ活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、例えば、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１）、１種のＦＧＦ活性化因子（例えば、ＦＧＦ２、例えば、１０ｎＭ  ＦＧＦ２）および１種のＳＣ分化誘導剤（例えば、ＮＲＧ１、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ１）と、約１５日間（例えば、約１４日間または約１５日間）にわたって接触される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させ、この細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種の阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、例えば、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２）および任意選択で１種のＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９、例えば、１００ｎＭ  ＬＤＮ１９３１８９）と約１０日間（例えば、約１０日間または約１１日間）にわたって；１種のＷｎｔ活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、例えば、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１）と約２３日間（例えば、約２３日間または約２４日間）にわたって；ならびに１種のＦＧＦ活性化因子（例えば、ＦＧＦ２、例えば、１０ｎＭ  ＦＧＦ２）および１種のＳＣ分化誘導剤（例えば、ＮＲＧ１、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ１）と約１５日間（例えば、約１４または１５日間）にわたって接触される。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、細胞は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子には曝露されない。ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子の非限定的な例には、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、Ｃ２５ＩＩ、スムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト（例えば、プルモルファミン（purmorphamine））、それらの誘導体、およびそれらの混合物が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＨＨには曝露されない。
【０１１８】
３．シュワン細胞へのシュワン細胞前駆体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導
シュワン細胞前駆体は、シュワン細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに誘導され得る。分化したＳＣ前駆体は、ＳＣ前駆体のシュワン細胞の集団への成熟化を支持する条件に供され得る。シュワン細胞は、ミエリン形成性シュワン細胞または非ミエリン形成性シュワン細胞であり得る。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体（ＳＣ前駆体）は、ＳＣの集団を産生するために、本明細書に記載される１種または複数のＦＧＦ活性化因子、本明細書に記載される１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤と接触される。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体（ＳＣ前駆体）は、シュワン細胞分化を増強する１種または複数の分子（「ＳＣ分化増強剤」と呼ばれる）と接触される。ＳＣ分化増強剤の非限定的な例には、ニューレグリン、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、フォルスコリン、ＬＩＦおよびＣＮＴＦが含まれる。ある特定の実施形態では、ニューレグリンはＮＲＧ１である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＳＣ分化増強剤はｃＡＭＰである。ある特定の実施形態では、シュワン細胞前駆体（ＳＣ前駆体）は、ＳＣの集団を産生するために、１種のＦＧＦ活性化因子および２種のシュワン細胞分化誘導剤と接触される。ある特定の実施形態では、２種のシュワン細胞分化誘導剤は、ｃＡＭＰおよびＮＲＧ１である。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、細胞培養培地中の１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と接触される。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｉｂｃｏ製、２５０３０−１６４）、Ｎ２（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、０７１５６）およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１７５０４０４４）を補充したＮＢ培地である。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、約１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ〜９０ｎｇ／ｍｌ、または約９０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、約１５ｎｇ／ｍｌ〜２５ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、上記濃度のいずれか１つのシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度のシュワン細胞分化を誘導する１種または複数の分子と、毎日接触される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、または少なくとも約１５日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、約３日間と約４０日間との間、約３日間と約３５日間との間、約３日間と約３０日間との間、約３日間と約２５日間との間、約３日間と約２０日間との間、約３日間と約１５日間との間、約１０日間と約４０日間との間、約１０日間と約２０日間との間、約２０日間と約４０日間との間、約２０日間と約３０日間との間、または約３０日間と約４０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、約３日間と約１５日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、約３０日間と約４０日間との間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、約１０日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、約１１日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と、約３５日間にわたって接触される。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、約１ｎＭ〜１００ｎＭ、約１ｎＭ〜２０ｎＭ、約１ｎＭ〜１５ｎＭ、約１ｎＭ〜１０ｎＭ、約１ｎＭ〜５ｎＭ、約５ｎＭ〜１０ｎＭ、約５ｎＭ〜１５ｎＭ、約１５ｎＭ〜２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜４０ｎＭ、約４０ｎＭ〜５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜６０ｎＭ、約６０ｎＭ〜７０ｎＭ、約７０ｎＭ〜８０ｎＭ、約８０ｎＭ〜９０ｎＭ、または約９０ｎＭ〜１００ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣ前駆体を産生するために、約５ｎＭ〜１５ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＣを産生するために、約１０ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、上記濃度のいずれか１つのＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日、１日おきに、または２日毎に接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、約１０ｎＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、毎日接触される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体からＳＣへの成熟化を支持する条件は、分化したＳＣ前駆体細胞を３Ｄスフェロイドへと凝集させること、ならびに前記３Ｄスフェロイドを、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および１種または複数のシュワン細胞分化誘導剤、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤とさらに接触させることを含む。ある特定の実施形態では、培養培地は、懸濁培養培地である。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞を少なくとも約５０％含む細胞集団は、１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する細胞へと分化させ、細胞のこの集団は、１種のＦＧＦ活性化因子（例えば、ＦＧＦ２、例えば、１０ｎＭ  ＦＧＦ２）、２種のＳＣ分化誘導剤（例えば、ＮＲＧ１（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ  ＮＲＧ１）およびｃＡＭＰ（例えば、１００ｍＭ  ｃＡＭＰ））と、少なくとも約１０日間にわたって接触される。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、細胞は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化因子には曝露されない。ＳＨＨシグナル伝達の活性化因子の非限定的な例には、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、Ｃ２５ＩＩ、スムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト（例えば、プルモルファミン）、それらの誘導体、およびそれらの混合物が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＨＨには曝露されない。
【０１２７】
４．細胞培養培地
ある特定の実施形態では、上記阻害剤、活性化因子、誘導剤および増強剤は、細胞、例えば、幹細胞、１つもしくは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞、１つもしくは複数のＳＣ前駆体マーカーを発現する細胞、１つもしくは複数のＳＣマーカーを発現する細胞、またはそれらの組合せを含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」）培地、Ｎ２培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地（例えば、Ｎ２およびＢ−２７（登録商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを補充したＮＢ培地）が含まれるがこれらに限定されない。ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、Ｅ８／Ｅ６培地およびＮＢ培地は、市販されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のための培地は、ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、およびそれらの組合せからなる群から選択される培地である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のための培地は、Ｅ８／Ｅ６培地である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＣ前駆体マーカーを発現する細胞への、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導のための培地は、ＮＢ培地である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＣマーカーを発現する細胞への、１つまたは複数のＳＣ前駆体マーカーを発現する細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導のための培地は、ＮＢ培地である。
【０１２８】
ＫＳＲ培地は、培養物中で未分化ｈＥＳＣ細胞を成長させ維持するために最適化された、規定された無血清製剤である。ＫＳＲ培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭおよびβ−メルカプトエタノール（13-mercaptoethanol）を含む。ある特定の実施形態では、１リットルのＫＳＲ培地は、８２０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ、１５０ｍＬのＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１０ｍＬの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ  ＭＥＭ、および５５μＭのβ−メルカプトエタノールを含み得る。
【０１２９】
Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大増殖を支持するフィーダーフリーかつゼノフリーの培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞初期化を支持することが証明されている。さらに、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣの培養のためのカスタム培地の製剤化のための基礎として使用され得る。一例のＥ８／Ｅ６培地は、その全体が参照によって組み込まれるChenら、Nat  Methods.  ２０１１年５月；８巻（５号）：４２４〜９頁に記載されている。一例のＥ８／Ｅ６培地は、その全体が参照によって組み込まれるＷＯ１５／０７７６４８に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン、インスリン、ＮａＨＣＯ３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が活性なＢＭＰもＷｎｔ成分も含まないという点で、ＫＳＲ培地とは異なる。従って、ある特定の実施形態では、幹細胞を培養するためにＥ８／Ｅ６培地が使用される場合、１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＢＭＰを阻害するもの）がＥ８／Ｅ６培地に添加される必要はない。
【０１３０】
Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、培養物中での未分化神経幹および前駆細胞の拡大増殖のために使用される、化学的に規定された動物フリーのサプリメントである。Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地との使用のために意図される。Ｎ２培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｎ２培地は、グルコース、炭酸水素ナトリウム、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリンおよびインスリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む。ある特定の実施形態では、１リットルのＮ２培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２粉末、１．５５ｇのグルコース、２．００ｇの炭酸水素ナトリウム、プトレシン（１００ｍＬの蒸留水中に溶解された１．６１ｇの１００ｕＬアリコート）、プロゲステロン（１００ｍＬの１００％エタノール中に溶解された０．０３２ｇの２０ｕＬアリコート）、亜セレン酸ナトリウム（蒸留水中０．５ｍＭ溶液の６０ｕＬアリコート）、１００ｍｇのトランスフェリン、および１０ｍＬの５ｍＭ  ＮａＯＨ中２５ｍｇのインスリンと共に、９８５ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏを含む。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触の約１、約２、約３、約４、または約５、約６、約７、または約８日後から、幹細胞とＳＣ分化誘導剤およびＦＧＦ活性化因子との接触まで、漸増量のＮ２培地で漸進的に置き換えられるＫＳＲ培地中で最初に培養される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触後４日目〜１０日目に、漸増量のＮ２培地で漸進的に置き換えられるＫＳＲ培地中で最初に培養される。
【０１３２】
本明細書に開示される幹細胞の集団を培養するために使用される細胞培養培地は、細胞と接触される阻害剤（単数または複数）、活性化因子（単数または複数）、誘導剤（単数または複数）および増強剤（単数または複数）を決定するだけでなく（例えば、ＫＳＲ培地については、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤が必要とされる；Ｅ８／Ｅ６培地については、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤のみが必要とされる）、阻害剤（単数または複数）、活性化因子（単数または複数）、誘導剤（単数または複数）および増強剤（単数または複数）を細胞培養培地に添加する順序も決定する。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、細胞と１種または複数のＷｎｔ活性化因子との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約４日以内（例えば、同時に（同日に）、または約１日後と約４日後との間、例えば、約１日後、約２日後、約３日後もしくは約４日後）である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のための細胞培養培地は、ＫＳＲ培地であり、細胞と１種または複数のＷｎｔ活性化因子との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２日後である。ある特定の実施形態では、幹細胞と１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤との最初の接触は、例えば、ＳＭＡＤ阻害剤（単数または複数）およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（単数または複数）を、幹細胞を含む細胞培養培地に同日に最初に添加することによって、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触と同日である。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の神経堤系列マーカーを発現する細胞への幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化のための細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地であり、細胞と１種または複数のＷｎｔ活性化因子との最初の接触は、例えば、Ｗｎｔ活性化因子（単数または複数）およびＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（単数または複数）を、幹細胞を含む細胞培養培地に同日に最初に添加することによって、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触と同日である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤がＥ８／Ｅ６培地に添加される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間の培養後に、培地から取り出される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、約３日間の培養後に培地から取り出される。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、約０．５ｎｇ／ｍＬと約２０ｎｇ／ｍＬとの間、または約１ｎｇ／ｍｌと約１５ｎｇ／ｍｌとの間、または約２ｎｇ／ｍｌと約１０ｎｇ／ｍｌとの間、または約３ｎｇ／ｍｌと約５ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で、培養培地中に存在する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性剤は、約５ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地中に存在する。ＢＭＰ活性剤の非限定的な例には、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、それらの誘導体、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤の細胞との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約２０日以内である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤の細胞との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日後である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤の細胞との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約５日後と約２０日後との間（例えば、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、約１１日後、約１２日後、約１３日後、約１４日後、約１５日後、約１６日後、約１７日後、約１８日後、約１９日後、または約２０日後）である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤の細胞との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１０日後である。ある特定の実施形態では、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤の細胞との最初の接触は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との最初の接触から約１１日後である。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔ活性化因子（単数または複数）、ＦＧＦ活性化因子（単数または複数）および任意選択でＳＣ分化誘導剤（単数または複数）は、ＳＣ前駆体を産生するために、Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）を補充したＮＢ培地に、（毎日、１日おきに、または２日毎に）添加される。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ＳＣ分化誘導剤（単数または複数）、ＦＧＦ活性化因子（単数または複数）および任意選択でＳＣ分化増強剤（単数または複数）は、ＳＣ前駆体を産生するために、Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（例えば、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）を補充したＮＢ培地に、（毎日、１日おきに、または２日毎に）添加される。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（単数または複数）、ＳＭＡＤ阻害剤（単数または複数）、Ｗｎｔ活性化因子（単数または複数）、ＳＣ分化誘導剤（単数または複数）、ＦＧＦ活性化因子（単数または複数）、および任意選択でＳＣ分化増強剤（単数または複数）は、幹細胞を含む細胞培養培地に、毎日（または１日おきに、もしくは２日毎に）添加される。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤との最初の接触は、０日目であり、細胞と１種または複数のＷｎｔ活性化因子との最初の接触は、２日目であり、細胞と１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤との最初の接触は、１１日目であり、細胞と１種または複数のＳＣ分化誘導剤および１種または複数のＦＧＦ活性化因子、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤との最初の接触は、２５日目である。ある特定の実施形態では、０日目〜１０日目についての細胞培養培地は、ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、またはそれらの混合物である。ある特定の実施形態では、０日目〜３日目についての細胞培養培地は、ＫＳＲ培地である。ある特定の実施形態では、４日目〜１０日目についての細胞培養培地は、ＫＳＲ培地およびＮ２培地の組合せである。ある特定の実施形態では、１０日目についての細胞培養培地は、Ｎ２培地である。ある特定の実施形態では、１１日目およびそれ以降についての細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン、Ｎ２およびＢ２７を補充したＮＢ培地である。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および１種または複数のＷｎｔ活性化因子との最初の接触は、０日目であり、細胞と１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤との最初の接触は、１１日目（または１日おきに、もしくは２日毎に）であり、細胞と１種または複数のＳＣ分化誘導剤および１種または複数のＦＧＦ活性化因子、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤との最初の接触は、２５日目である。ある特定の実施形態では、０日目〜１０日目についての細胞培養培地は、Ｅ８／Ｅ６培地、Ｎ２培地、またはそれらの混合物である。ある特定の実施形態では、１１日目およびそれ以降についての細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン、Ｎ２およびＢ２７を補充したＮＢ培地である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤および１種または複数のＳＭＡＤ阻害剤と約１０日間にわたって；１種または複数のＷｎｔ活性化因子と約２３日間にわたって；および１種または複数のＦＧＦ活性化因子と約１４日間にわたって、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と約１４日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＳＣ分化誘導剤、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と少なくとも８日間（例えば、１０日間または３５日間）にわたって接触される。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、細胞は、ＳＣ前駆体を産生するために、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と約１０日間にわたって；Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と約２５日間にわたって；およびＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と約１４日間にわたって、ならびに任意選択で１種または複数のＳＣ分化誘導剤と約１４日間にわたって接触される。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、ＳＣを産生するために、１種または複数のＳＣ分化誘導剤、１種または複数のＦＧＦ活性化因子および任意選択で１種または複数のＳＣ分化増強剤と少なくとも８日間（例えば、１０日間または３５日間）にわたって接触される。
【０１４４】
シュワン細胞（ＳＣ）前駆体（例えば、１つまたは複数の初期シュワン細胞マーカーを発現する細胞）は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（単数または複数）との最初の接触から約３５日未満、約３４日未満、約３３日未満、約３２日未満、約３１日未満、約３０日未満、約２９日未満、約２８日未満、約２７日未満、約２６日未満、約２５日未満、約２４日未満、約２３日未満、約２２日未満、約２１日未満、または約２０日未満で、幹細胞から分化し得る。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（単数または複数）との最初の接触から約２５日後またはそれ以降に、幹細胞から分化する。
【０１４５】
５．マーカーおよびレポーター
分化したＳＣ前駆体は、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーを発現する。シュワン細胞前駆体マーカーの非限定的な例には、ＳＯＸ１０、ＧＡＰ４３、ＢＬＢＰ、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）、Ｄｈｈ、Ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ４９Ｄ、ＴＦＡＰ２、ＣＤＨ１９、ＣＤ４４、ＥＲＢＢ３、ＰＯＵ３Ｆ１、およびグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＣＡＬＣＢ、ＧＲＰ１１６、ＴＳＰＹＬ５、ＩＴＰＫＡ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰＬ２、ＬＯＣ１００１２８２５２、ＡＮＧＰＴＬ７、ＬＯＣ７２８９７８、ＺＮＦ５０２、ＳＬＣ１６Ａ６、ＬＰＬ、ＳＬＣ３０Ａ２、ＳＬＣ１０Ａ４、ならびに表１〜４に列挙される遺伝子が含まれる。
【０１４６】
ＳＣは、１つまたは複数のシュワン細胞マーカーを発現する。シュワン細胞マーカーの非限定的な例には、ロイシンリッチリピート膜貫通ニューロン４（ＬＲＲＴＭ４）、カドヘリン１（ＣＤＨ１）、脂肪酸結合タンパク質７（ＦＡＢＰ７）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＵＮＣＢ５、スクレロスチンドメイン含有１（ＳＯＳＴＤＣ１）、オリゴデンドロサイト転写因子１（ＯＬＩＧ１）、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＴ）、カリウム内向き整流性チャネルサブファミリーＪメンバー１０（ＫＣＮＪ１０）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ネトリン１（ＮＴＮ１）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ｅｒｂ−ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥＲＢＢ３）、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）、ＳＯＸ１０、Ｓ１００、ＧＦＡＰ、ＰＯＵ３Ｆ１、ＰＭＰ２２、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、アクアポリン４（ＡＱＰ４）、ＮＧＦＲ、ＮＦＡＴＣ４、ＭＯＧ、ＩＦＮＧ、ＭＡＬ、ＮＴＦ３、ＴＧＦＢ１、ＭＰＺ、ＣＤ９、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９Ｅ、ＣＤ４４、ＣＤ９８、およびＣＤ８１、ＴＹＲＰ１、ＥＮＴＨＤ１、ＮＴ５Ｅ、ＨＴＲ２Ｂ、ＮＯＶ、ＩＬ８、ＳＬＣ１６Ａ６、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＬＰ２、Ｓ１００Ａ６、ＡＱＰ９、ＣＤＨ１９、ならびに表１〜４に列挙される遺伝子が含まれる。
【０１４７】
分化したＳＣ前駆体およびさらに成熟したＳＣは、１つまたは複数のレポーターをさらに発現し得る。レポーターの非限定的な例には、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ））、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、酵素（例えば、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼ）；および抗原性分子が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」とは、容易に検出可能なまたは容易にアッセイ可能なタンパク質、例えば、有色タンパク質、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ、または酵素、例えばベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）をコードする核酸を含む遺伝子構築物を指す。
【０１４８】
分化したＳＣ前駆体およびさらに成熟したＳＣは、例えば、細胞培養培地中での分化後に精製され得る。本明細書で使用される場合、用語「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」および「単離」とは、試料からの、少なくとも１つの夾雑物の量における低減を指す。例えば、所望の細胞型は、望ましくない細胞型の量における対応する低減により、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、および少なくとも約９０％＞精製される。用語「精製する」とは、試料からのある特定の細胞（例えば、望ましくない細胞）の除去を指し得る。望ましくない細胞の除去または選択は、試料中の所望のＳＣ前駆体またはＳＣのパーセントにおける増加を生じる。ある特定の実施形態では、ＳＣ前駆体は、混合細胞集団を、少なくとも１つのシュワン細胞前駆体マーカーを発現する細胞へと選別することによって精製される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、ＳＯＸ１０、ＧＡＰ４３、ＢＬＢＰ、ＭＰＺ、Ｄｈｈ、Ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ４９Ｄ、ＴＦＡＰ２、ＣＤＨ１９、ＣＤ４４、ＥＲＢＢ３、ＰＯＵ３Ｆ１、ＧＦＡＰ、ＣＡＬＣＢ、ＧＲＰ１１６、ＴＳＰＹＬ５、ＩＴＰＫＡ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰＬ２、ＬＯＣ１００１２８２５２、ＡＮＧＰＴＬ７、ＬＯＣ７２８９７８、ＺＮＦ５０２、ＳＬＣ１６Ａ６、ＬＰＬ、ＳＬＣ３０Ａ２、およびＳＬＣ１０Ａ４からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、表１〜４に列挙される遺伝子から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、表１に列挙される遺伝子から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のシュワン細胞前駆体マーカーは、ＣＡＬＣＢ、ＧＲＰ１１６、ＴＳＰＹＬ５、ＩＴＰＫＡ、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰＬ２、ＬＯＣ１００１２８２５２、ＡＮＧＰＴＬ７、ＬＯＣ７２８９７８およびＺＮＦ５０２からなる群から選択される。
【０１４９】
本開示の主題は、本明細書に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって産生されるＳＣ前駆体およびＳＣの集団、ならびにかかる細胞を含む組成物もまた提供する。
【０１５０】
３．治療的化合物をスクリーニングする方法
幹細胞由来ＳＣ前駆体または成熟したＳＣは、神経障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）に寄与する細胞型特異的機構を決定するためのアプローチであり得る。このアプローチでは、ｈＥＳＣから誘導された個々の細胞型は、糖尿病において生じるような高グルコース濃度に曝露され得る。従って、これらの処置の代謝的および機能的結果は、各々の潜在的な寄与する細胞型において評価され得る。
【０１５１】
本明細書に開示される幹細胞由来ＳＣ前駆体または成熟したＳＣは、シュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）をモデル化するために使用され得、シュワン細胞関連障害における疾患関連欠損を克服できる候補化合物についてスクリーニングするためのプラットフォームとして機能し得る。シュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を軽減する候補化合物の能力は、シュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を引き起こす高グルコース毒性によって引き起こされる生理学的または細胞性欠損をレスキューする候補化合物の能力をアッセイすることによって決定され得る。ＳＴＺ処置した糖尿病マウスにおける神経障害関連の組織学的および挙動上の欠陥をレスキューすることにおけるブプロピオンの本発明者らによる同定は、薬物発見における本明細書に開示される幹細胞由来ＳＣ前駆体または成熟したＳＣの使用についての概念実証を示す。実施例１を参照のこと。
【０１５２】
本開示の主題は、ＰＮＳおよび／またはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷を予防および／または処置もしくは修復するため、ならびに／あるいはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を予防および／または処置するために適切な化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、本明細書に開示されるＳＣ前駆体または成熟したＳＣにおいて高血糖誘導性の細胞毒性（例えば、高グルコース誘導性の毒性）をレスキューすること、例えば、高グルコース曝露後のかかる細胞において、グルコースレベルを低減させること、ソルビトールレベルを低減させること、および／または細胞生存度を低減させることが可能な化合物を同定するステップを含む。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）本明細書に開示される幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られたＳＣ前駆体および／または成熟したＳＣの集団を、少なくとも約１０ｍＭのグルコース濃度に曝露するステップ、ならびに（ｂ）細胞集団を、グルコース曝露後に試験化合物と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、（ｃ）前記試験化合物による処理なしの細胞集団の第１のソルビトールレベル、第１のグルコースレベルおよび第１の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ、ならびに（ｄ）前記試験化合物で処理した細胞集団の第２のソルビトールレベル、第２のグルコースレベルおよび第２の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップを含む。さらに、この方法は、（ｅ）（ｉ）第２のソルビトールレベルを第１のソルビトールレベルと、（ｉｉ）第２のグルコースレベルを第１のグルコースレベルと、および／または（ｉｉｉ）第２の細胞生存度を第１の細胞生存度と比較するステップを含む。
【０１５４】
この方法は、（ｆ）（ｉ）第２のソルビトールレベルが第１のソルビトールレベルよりも低い場合、（ｉｉ）第２のグルコースレベルが第１のグルコースレベルよりも低い場合、および／または（ｉｉｉ）第２の細胞生存度が第１の細胞生存度よりも低い場合に、ＰＮＳおよび／またはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷を予防および／または処置もしくは修復するため、ならびに／あるいはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を予防および／または処置するために適切な試験化合物を同定するステップをさらに含む。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、グルコース濃度は、少なくとも約１０ｍＭ、例えば、１０ｍＭと１００ｍＭとの間である。ある特定の実施形態では、グルコース濃度は約３０ｍＭである。ある特定の実施形態では、測定（第１および第２のソルビトールレベル、グルコースレベルおよび細胞生存度の測定を含む）は、最初のグルコース曝露の少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間（１日）後、約４８時間（２日）後、約７２時間（３日）後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、または約１０日後に実施される。ある特定の実施形態では、測定（第１および第２のソルビトールレベル、グルコースレベルおよび細胞生存度の測定を含む）は、最初のグルコース曝露の少なくとも約７２時間（３日）後に実施される。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるスクリーニング方法によって同定される化合物には、カリウムチャネルブロッカー、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤、シクロペンチアジド、カプトプリル、イスラジピン、コンデルフィン、ニメスリドおよびトリアムシノロンが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、カリウムチャネルブロッカーはスルホニルウレア化合物である。スルホニルウレアの非限定的な例には、トルブタミド、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリシクラミド（トルヘキサミド）、メタヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリボルヌリド、グリクラジド、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリクロピラミド、グリメピリド、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらの包接体およびそれらのプロドラッグが含まれる。ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤の非限定的な例には、ブプロピオン、アミネプチン、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標）、Ｃｏｎｃｅｒｔａ（登録商標）、Ｍｅｔａｄａｔｅ（登録商標）、Ｍｅｔｈｙｌｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｉｆｅｎ（登録商標）またはＳｔｉｍｄａｔｅ（登録商標））、アトモキセチン、マプロチリン、デスオキシピプラドロール、デクスメチルフェニデート、ジフェメトレックス、ジフェニルプロリノール、エチルフェニデート、フェンカムファミン、フェンカミン、レフェタミン、メチレンジオキシピロバレロン、メチルフェニデート、ノミフェンシン、Ｏ−２１７２、オキソリニン酸、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、タメトラリン、ＷＹ−４６８２４、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらのプロドラッグおよびそれらの包接体が含まれる。
【０１５７】
４．治療的化合物による処置の方法
本明細書に開示される薬物発見の方法で同定される化合物、またはかかる化合物を含む組成物（例えば、薬学的に許容される担体および／またはさらなる薬理学的に活性な成分をさらに含む医薬組成物）は、限定としてではなく例えば、例えば末梢神経系（ＰＮＳ）において神経再生を促進するため、ミエリン損傷を予防もしくは低減もしくは修復するため、および／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、糖尿病性末梢神経障害であるがこれに限定されない）を予防および／もしくは処置するために、治療的に使用され得る。
【０１５８】
上で同定した治療のために適切な化合物の非限定的な例には、カリウムチャネルブロッカー、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤、シクロペンチアジド、カプトプリル、イスラジピン、コンデルフィン、ニメスリドおよびトリアムシノロンが含まれる。ある特定の実施形態では、カリウムチャネルブロッカーはスルホニルウレア化合物である。スルホニルウレアの非限定的な例には、トルブタミド、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリシクラミド（トルヘキサミド）、メタヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリボルヌリド、グリクラジド、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリクロピラミド、グリメピリド、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらの包接体およびそれらのプロドラッグが含まれる。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、塩は、薬学的に許容される塩、例えば、薬学的に許容される非毒性の無機または有機の酸または塩基から調製された塩である。薬理学的に許容されるアニオンを含む塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、イソチオン酸塩（isothionate）、乳酸塩、リンゴ酸塩、ムチン酸塩、ゲンチジン酸塩、イソニコチン酸塩、糖酸塩、酒石酸塩、酒石酸水素塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、グリコール酸塩、グルクロン酸塩、マレイン酸塩、フロ酸塩、グルタミン酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、アントラニル酸塩、サリチル酸塩、フェニル酢酸塩、マンデル酸塩、エンボン酸塩（パモ酸塩）、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、パントテン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ステアリン酸塩、スルファニル酸塩、アルギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびガラクツロン酸塩が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、アニオンは、臭化水素酸塩、塩酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、マレイン酸塩、硫酸塩および酸性リン酸塩である。ある特定の実施形態では、アニオンは、塩酸塩およびマレイン酸塩である。
【０１６０】
薬理学的に許容されるカチオンを含む塩には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、および特に、カルシウム、マグネシウム、ナトリウムまたはカリウム塩が含まれるがこれらに限定されない。適切な有機塩基には、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（meglumaine）（Ｎ−メチルグルカミン）、リシンおよびプロカインが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、この化合物は、ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）再取り込み阻害剤である。ノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤は、それぞれノルエピネフリン輸送体およびドーパミン輸送体作用を遮断することによって、神経伝達物質ノルエピネフリンおよびドーパミンに対する再取り込み阻害剤として作用する薬剤である。例示的なＮＤＲＩには、ブプロピオン、アミネプチン、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標）、Ｃｏｎｃｅｒｔａ（登録商標）、Ｍｅｔａｄａｔｅ（登録商標）、Ｍｅｔｈｙｌｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｉｆｅｎ（登録商標）またはＳｔｉｍｄａｔｅ（登録商標））、アトモキセチン、マプロチリン、デスオキシピプラドロール、デクスメチルフェニデート、ジフェメトレックス、ジフェニルプロリノール、エチルフェニデート、フェンカムファミン、フェンカミン、レフェタミン、メチレンジオキシピロバレロン、メチルフェニデート、ノミフェンシン、Ｏ−２１７２、オキソリニン酸、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、タメトラリン、ＷＹ−４６８２４、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらのプロドラッグおよびそれらの包接体が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、この化合物は、ブプロピオンまたはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、包接体もしくはプロドラッグである。「ブプロピオン」はＮＤＲＩであり、カリウムチャネルを妨害する機能もまた有する。これは、抗うつ薬として、ならびに禁煙のために承認されている。ブプロピオンの商標名は、Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ、ＥｌｏｎｔｒｉｌおよびＺｙｂａｎである。そのＩＵＰＡＣ名は、３−クロロ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−β−ケト−α−メチルフェネチルアミンであり、Ｃ１３Ｈ１８ＣｌＮＯの化学式を有し、以下の式：
【化４】
2019535263.tif 000006
を有する。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、この化合物は塩酸ブプロピオンである。これは、ブプロピオンの塩酸塩であり、単環式のアミノケトン抗うつ薬である。そのＩＵＰＡＣ名は、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（３−クロロフェニル）プロパン−１−オン；塩酸塩であり、Ｃ１３Ｈ１９Ｃｌ２ＮＯの化学式を有し、以下の式：
【化５】
2019535263.tif 000007
を有する。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、この化合物は、ブプロピオン代謝物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、包接体もしくはプロドラッグである。ブプロピオン代謝物には、２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシ−３，５，５−トリメチル−モルホリノール（morpholinol）（ヒドロキシブプロピオンとしても公知）、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（３−クロロフェニル）−プロパン−１−オール（ジヒドロブプロピオン（dihydrobupropion）としても公知）、および１−（３−クロロフェニル）−２−［（１，１−ジメチルエタノール）アミノ］−１−プロパノンのラセミ形態および光学的に純粋な形態が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「光学的に純粋なブプロピオン代謝物」には、光学的に純粋な：（Ｒ，Ｒ）−２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシ−３，５，５−トリメチル−モルホリノール（（Ｒ，Ｒ）−ヒドロキシブプロピオンとも呼ばれる）；（Ｓ，Ｓ）−２−（３−クロロフェニル）−２−ヒドロキシ−３，５，５−トリメチル−モルホリノール（（Ｓ，Ｓ）−ヒドロキシブプロピオンとも呼ばれる）；（Ｒ，Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（３−クロロフェニル）−プロパン−１−オール（（Ｒ，Ｒ）−ジヒドロブプロピオンとも呼ばれる）；（Ｓ，Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（３−クロロフェニル）−プロパン−１−オール（（Ｓ，Ｒ）−ジヒドロブプロピオンとも呼ばれる）；（Ｓ，Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（３−クロロフェニル）−プロパン−１−オール（（Ｓ，Ｓ）−ジヒドロブプロピオンとも呼ばれる）；（Ｒ，Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−（３−クロロフェニル）−プロパン−１−オール（（Ｒ，Ｓ）−ジヒドロブプロピオンとも呼ばれる）；（Ｒ）−１−（３−クロロフェニル）−２−［（１，１−ジメチル−エタノール）アミノ］−１−プロパノン；および（Ｓ）−１−（３−クロロフェニル）−２−［（１，１−ジメチルエタノール）アミノ］−１−プロパノン；ヒドロキシブプロピオン、スレオ−ヒドロブプロピオン；ならびにエリスロヒドロブプロピオンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、この化合物はカリウムチャネルブロッカーである。カリウムチャネルブロッカーは、カリウムチャネルを介した伝導を妨害し、細胞膜を介したカリウム流出を阻害する薬剤である。カリウムチャネルの遮断は、活動電位の持続時間を延長させ得る。例示的なカリウムチャネルブロッカーには、アミオダロン、ドフェチリド、ソタロール、イブチリド、アジミリド、ブレチリウム、クロフィリウム、Ｅ−４０３１、ニフェカラント、テジサミル、およびセマチリド（sematilide）、テトラエチルアンモニウムＣｌ（ＴＥＡ）、プロカイン、４−アミノピリジン（４ＡＰ）、キニジン、アパミン、トルブタミド、およびグリベンクラミドが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、カリウムチャネルブロッカーは、トルブタミド、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、包接体もしくはプロドラッグである。トルブタミドは、スルホニルウレア血糖降下剤である。そのＩＵＰＡＣ名は、１−ブチル−３−（４−メチルフェニル）スルホニルウレアであり、Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ３Ｓの化学式を有し、以下の式：
【化６】
2019535263.tif 000008
を有する。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、この化合物は、シクロペンチアジド、カプトプリル（captoprio）、イスラジピン、コンデルフィン、ニメスリド、トリアムシノロン、およびそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、包接体またはプロドラッグからなる群から選択される。
【０１６８】
限局性注射、正所性(orthotropic)（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射または非経口投与を介して、これらの化合物またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含む処置の方法が、本明細書に開示される。
【０１６９】
本明細書に開示される化合物は、選択されたｐＨへと緩衝され得る無菌液体調製物、例えば、等張水性溶液、懸濁物、乳濁物、分散物、または粘性組成物として簡便に提供され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するために、いくらかより簡便である。他方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘性範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る担体を含み得る。無菌の注射可能な溶液は、本開示の主題の組成物、例えば、本明細書に開示される化合物を含む組成物を、所望に応じて種々の量の他の成分と共に、必要な量の適切な溶媒中に取り込むことによって調製され得る。かかる組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば、無菌水、生理学的食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物中にあり得る。これらの組成物は、凍結乾燥もされ得る。これらの組成物は、所望の投与経路および調製物に依存して、補助物質、例えば、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加物または粘性増強添加物、防腐剤、調味剤、顔料などを含み得る。参照によって本明細書に組み込まれる「REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCE」、第１７版、１９８５年などの標準的な教科書が、過度の実験なしに適切な調製物を調製するために参考にされ得る。
【０１７０】
抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する種々の添加物が添加され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にされ得る。注射可能な医薬品形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩アルミニウム（alum  inurn  monostearate）およびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤または添加物は、本明細書に開示される化合物またはそれを含む医薬組成物と適合性でなければならない。
【０１７１】
当業者は、医薬組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本明細書に開示される化合物の有効性に影響を与えないことを認識する。これは、化学および医薬品の原理における当業者にとって問題にはならず、または問題は、標準的な教科書を参照して、もしくは単純な実験によって（過度の実験を伴わずに）、本開示および本明細書で引用された文書から、容易に回避され得る。
【０１７２】
「有効量」（または「治療有効量」）は、処置の際に有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１つまたは複数の用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量は、シュワン細胞関連障害（例えば、ＤＰＮ）を緩和、軽快、安定化、反転するもしくはその進行を緩徐化する、またはシュワン細胞関連障害（例えば、ＤＰＮ）の病理学的結果を他の方法で低減させるのに十分な量である。有効量は一般に、ケースバイケースで医師によって決定され、当業者の技術範囲内である。典型的には、いくつかの因子が、有効量を達成するための適切な投薬量を決定する場合に考慮される。これらの因子には、対象の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重症度、ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が含まれる。
【０１７３】
本開示の主題は、かかる処置を必要とする対象における糖尿病性末梢神経障害を処置する方法であって、有効量のノルエピネフリン−ドーパミン再取り込み阻害剤（ＮＤＲＩ）（例えば、ブプロピオン、アミネプチン、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標）、Ｃｏｎｃｅｒｔａ（登録商標）、Ｍｅｔａｄａｔｅ（登録商標）、Ｍｅｔｈｙｌｉｎ（登録商標）、Ｒｕｂｉｆｅｎ（登録商標）またはＳｔｉｍｄａｔｅ（登録商標））、アトモキセチン、マプロチリン、デスオキシピプラドロール、デクスメチルフェニデート、ジフェメトレックス、ジフェニルプロリノール、エチルフェニデート、フェンカムファミン、フェンカミン、レフェタミン、メチレンジオキシピロバレロン、メチルフェニデート、ノミフェンシン、Ｏ−２１７２、オキソリニン酸、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、タメトラリン、ＷＹ−４６８２４、それらの塩、それらの溶媒和物、それらの水和物、それらのプロドラッグおよびそれらの包接体からなる群から選択されるもの）を対象に投与して、糖尿病性神経障害の１つまたは複数の徴候または症状を低減させるステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＮＤＲＩは、ブプロピオンまたはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、包接体もしくはプロドラッグである。例えば、限定ではなく、糖尿病性末梢神経障害の症状および／または徴候には、１つまたは複数の四肢におけるしびれ、ピリピリ感および／または灼熱感；１つまたは複数の四肢における疼痛および／または温度の知覚の低減；１つまたは複数の四肢における感覚過敏；１つまたは複数の四肢における反射の低減；１つまたは複数の四肢における筋力低下；１つまたは複数の四肢の潰瘍化および／または感染が含まれる。
【０１７４】
５．キット
本開示の主題は、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を処置および／もしくは予防するために適切な化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、このキットは、本明細書に開示される分化方法による幹細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から得られるＳＣ前駆体および／または成熟したＳＣの集団の有効量を含む。ある特定の実施形態では、このキットは、細胞を含む無菌コンテナを含む；かかるコンテナは、箱、アンプル、瓶、バイアル、管、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野で公知の他の適切なコンテナ形態であり得る。かかるコンテナは、プラスチック、ガラス、ラミネート加工紙、金属箔、または医薬を保持するのに適切な他の材料で作製され得る。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、このキットは、高グルコース誘導性の毒性からＳＣ前駆体および／または成熟したＳＣをレスキューすることが可能な化合物を同定するための使用説明書をさらに含む。ある特定の実施形態では、使用説明書は、（ａ）ＳＣ前駆体および／または成熟したＳＣを、少なくとも約１０ｍＭのグルコース濃度に曝露するステップ、ならびに（ｂ）細胞集団を、グルコース曝露後に試験化合物と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、使用説明書は、（ｃ）前記試験化合物による処理なしの細胞の第１のソルビトールレベル、第１のグルコースレベルおよび第１の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップ、ならびに（ｄ）前記試験化合物で処理した細胞の第２のソルビトールレベル、第２のグルコースレベルおよび第２の細胞生存度のうち１つまたは複数を測定するステップを含む。さらに、使用説明書は、（ｅ）（ｉ）第２のソルビトールレベルを第１のソルビトールレベルと、（ｉｉ）第２のグルコースレベルを第１のグルコースレベルと、および／または（ｉｉｉ）第２の細胞生存度を第１の細胞生存度と比較するステップを含む。
【０１７６】
使用説明書は、（ｆ）（ｉ）第２のソルビトールレベルが第１のソルビトールレベルよりも低い場合、（ｉｉ）第２のグルコースレベルが第１のグルコースレベルよりも低い場合、および／または（ｉｉｉ）第２の細胞生存度が第１の細胞生存度よりも低い場合に、ＰＮＳおよび／またはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷を予防および／または処置もしくは修復するため、ならびに／あるいはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を予防および／または処置するために適切な試験化合物を同定するステップをさらに含む。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、グルコース濃度は、少なくとも約１０ｍＭ、例えば、１０ｍＭと１００ｍＭとの間である。ある特定の実施形態では、グルコース濃度は約３０ｍＭである。ある特定の実施形態では、測定（第１および第２のソルビトールレベル、グルコースレベルおよび細胞生存度の測定を含む）は、最初のグルコース曝露の少なくとも約１２時間後、少なくとも約２４時間（１日）後、約４８時間（２日）後、約７２時間（３日）後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、または約１０日後に実施される。ある特定の実施形態では、測定（第１および第２のソルビトールレベル、グルコースレベルおよび細胞生存度の測定を含む）は、最初のグルコース曝露の少なくとも約７２時間（３日）後に実施される。
【０１７８】
さらに、本開示の主題は、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を処置および／もしくは予防するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、このキットは、本明細書に開示されるスクリーニング方法によって同定される化合物の有効量を含む。ある特定の実施形態では、このキットは、治療的組成物を含む無菌コンテナを含む；かかるコンテナは、箱、アンプル、瓶、バイアル、管、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野で公知の他の適切なコンテナ形態であり得る。かかるコンテナは、プラスチック、ガラス、ラミネート加工紙、金属箔、または医薬を保持するのに適切な他の材料で作製され得る。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、このキットは、同定された化合物またはそれを含む組成物を、対象、例えば、例えば、シュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）に罹患している対象に投与するための使用説明書を含む。使用説明書は、ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）を処置および／もしくは予防するための化合物または組成物の使用についての情報を含み得る。ある特定の実施形態では、使用説明書は、以下のうち少なくとも１つを含む：化合物の説明；ＰＮＳおよび／もしくはＣＮＳの再生のため、ミエリン損傷の予防および／もしくは修復のため、ならびに／またはシュワン細胞関連障害（例えば、末梢神経障害、例えば、ＤＰＮ）もしくはその症状を処置および／もしくは予防するための投薬スケジュールおよび投与；事前注意；警告；適応症；禁忌（counter-indication）；過量投薬情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに／あるいは参考文献。使用説明書は、コンテナ上に直接（存在する場合）、またはコンテナに貼られた標識として、またはコンテナ中にもしくはコンテナと同梱された別々のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして印刷され得る。
【実施例】
【０１８０】
本開示の主題は、限定ではなく本開示の主題の例示として提供される以下の実施例を参照してより良く理解される。
【０１８１】
（実施例１）
概要
シュワン細胞前駆体およびシュワン細胞を、ヒト幹細胞（例えば、ｈＰＳＣ）から誘導した。本発明者らは、高血糖誘導性の細胞毒性およびポリオール経路の活性化に対するヒトＳＣの選択的脆弱性を明らかにする、ＤＰＮのｈＥＳＣベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを樹立した。本発明者らはさらに、このモデルを使用してハイスループット薬物スクリーニングを実施し、ブプロピオンをＤＰＮの処置のための化合物として同定した。ブプロピオンは、ＳＣにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで高グルコース誘導性の細胞毒性に対抗でき、ＳＴＺ処置した糖尿病マウスにおける神経障害関連の組織学的および挙動上の欠陥をレスキューする。
【０１８２】
方法および材料
未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養
ｈＥＳＣ系統Ｈ９（ＷＡ−０９）および誘導体（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ；ＳＹＮ：：ＣｈＲ２−ＹＦＰ；ＳＹＮ：：ＹＦＰ；ＰＨＯＸ２Ｂ：ＧＦＰ；ＥＦ１：：ＲＦＰ  ＥＤＮＲＢ−／−）ならびに２つの独立したｈｉＰＳＣ系統（健康および家族性自律神経異常症、センダイベースのＯＭＳＫ（Ｃｙｔｏｔｕｎｅ））を、ｈＥＳＣを含むＫＳＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０８２８−０２８）培地中のマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）上で維持した（Chambersら、２００９年）。細胞を、１ヶ月間隔でマイコプラズマ試験に供し、ＳＴＲを、この研究の開始時にプロファイルして、細胞の種類を確認した。
【０１８３】
ｈＥＳＣからの神経堤誘導ならびにシュワン細胞の誘導および拡大増殖
ｈＥＳＣを、１０ｎＭ  ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）を含むｈＥＳＣ培地中で、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５４２３４）コーティングしたディッシュ上にプレートした（１０５細胞／ｃｍ２）。分化を、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ、ＭＩ）を含むｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ＋１５％ＫＳＲ、Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２５０３０−０８１）、ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１１４０−０５０））中で開始させた。ＫＳＲ培地を、以前に記載されたように（Chambersら、２００９年）、４日目〜１０日目に、漸増量のＮ２培地で漸進的に置き換えた。頭蓋ＮＣ（ＣＮＣ）誘導のために、細胞を、２日目〜１１日目に、ＬＤＮおよびＳＢに加えて３ｕＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）で処理する。ＣＮＳ前駆体対照細胞は、以前に記載されたように（Chambersら、２００９年）、０日目〜１１日目のＬＤＮおよびＳＢによる処理によって生成した。この実施例を通じて、０日目は、培地を、ｈＥＳＣ培地からＬＤＮおよびＳＢ含有培地に切り替える日である。本文および図面中の分化の日数は、多能性段階（０日目）以降の日数を指す。
【０１８４】
１１日目に、ＮＣ細胞を、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ６ウェル培養プレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４７１）中で３Ｄスフェロイド（５００万細胞／ウェル）へと凝集させ、ＣＨＩＲ（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４２３）およびＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）およびＮＲＧ１（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ３７８−ＳＭ−０２５）を含むＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で培養した。１４日間の懸濁培養後、スフェロイドを、ＮＲＧ１（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  ３７８−ＳＭ−０２５）、ＦＧＦ２（１０ｎＭ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３−ＦＢ−００１ＭＧ／ＣＦ）およびｃＡＭＰ（１００ｍＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ０２６０）を含むＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−１６４）、Ｎ２（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７１５６）およびＢ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０４０４４）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地中で、ポリオルニチン／ラミニン／フィブロネクチン（ＰＯ／ＬＭ／ＦＮ）コーティングしたディッシュ（以前に記載されたように調製する）上にプレートする（Lee  Gら、２００７年）。ＳＣ前駆体は、プレートしたスフェロイドの外に遊走し、１０日以内にＳＣへと分化する。長期拡大増殖のために、細胞を、ＰＯ／ＬＭ／ＦＮコーティングしたディッシュ上でシュワン細胞培地（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ、１７０１）中で培養した。細胞を、免疫染色のために固定し、または分化の２５日目、３５日目、５０日目、６０日目および１００日目に、遺伝子発現分析のために収集した。
【０１８５】
ＦＡＣＳおよび免疫蛍光（ＩＦ）分析
ＩＦのために、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ−ＵＳＢ、１９９４３）で２０分間固定し、次いで、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２０９）および０．３％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８７８７）を使用して、ブロッキングおよび透過処理した。次いで、細胞を、一次抗体溶液中で４℃（セルシウス）で一晩インキュベートし、フルオロフォアコンジュゲートした二次抗体でＲＴで１時間染色し、次いで、染色された細胞を、ＤＡＰＩ（１ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｄ９５４２−５ＭＧ）と共にインキュベートし、数回洗浄し、その後イメージングした。フローサイトメトリー分析のために、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＴ１０４）を用いて解離させ、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５４７２２）溶液を使用して固定および透過処理し、次いで、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５４７２３）を製造業者の使用説明書に従って使用して、洗浄、ブロッキングおよび透過処理する。次いで、細胞を、一次（４℃で一晩）および二次（室温で３０分間）抗体で染色し、フローサイトメーター（ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析する。一次抗体および希釈のリストは表５に提供される。
【０１８６】
表面マーカースクリーニング
特異的表面抗原についてのスクリーニングを、分化の８０日目にｈＥＳＣ−ＳＣに対して、ＢＤ  Ｌｙｏｐｌａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｙ（登録商標）（ＢＤ、５６０７４７）を使用して実施した。細胞を、９６ウェルプレート中にプレートし（１０，０００細胞／ウェル）、製造業者の使用説明書に従って、一次および二次抗体で染色した。染色された細胞を、プレート全体イメージングおよび定量化のために固定した。総ＧＦＡＰのうちの二重陽性細胞のパーセンテージを、各抗体について定量化した。上位ヒット（＞６０％二重陽性）を、フローサイトメトリーをさらに使用して検証した。
【０１８７】
遺伝子発現分析
ＲＮＡ配列決定のために、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０６）を使用して抽出した。ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのために、総ＲＮＡ試料を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１８０６４−０１４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（Ｑｉａｇｅｎ、２０４１４８）を使用して設定した。各データポイントは、３つの独立した生物学的反復を示す。ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りを、ＴｏｐＨａｔ  ｖ２．０を使用して、ヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。ＴｏｐＨａｔを、カバー範囲検索に対する例外を伴って、デフォルトパラメーターで実行した。次いで、アラインメントを、ＨＴＳｅｑを使用して定量化し、差示的遺伝子発現を、頭蓋神経堤試料に対して標準化したＤＥＳｅｑを使用して計算した。
【０１８８】
生存度アッセイ
ＳＣの生存度をモニタリングするために、細胞を、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６細胞毒性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を使用してＬＤＨ活性についてアッセイした。簡潔に述べると、細胞を、３０，０００細胞／ｃｍ２で９６ウェルプレート中にプレートした。上清および細胞溶解物を、２４時間後に収集し、プレートリーダー（４９０ｎｍ吸光度）を使用してＬＤＨ活性についてアッセイする。生存度を、溶解物のＬＤＨシグナルを総ＬＤＨシグナル（溶解物＋上清から）で除算することによって計算した。細胞を、アッセイの間、ＰＯ／ＬＭ／ＦＮコーティングしたディッシュ上でシュワン細胞培地（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ、１７０１）中で培養した。
【０１８９】
代謝物測定
高グルコース、低グルコースならびに薬物処理したＳＣおよび感覚ニューロンを、製造業者の使用説明書に従って、ソルビトール（ａｂｃａｍ、ａｂ１１８９６８）、グルコース（ａｂｃａｍ、ａｂ６５３３３）、ピルベート（ａｂｃａｍ、ａｂ６５３４２）および２ＤＧ取り込み（ａｂｃａｍ、ａｂ１３６９５５）測定のための生化学的アッセイに供した。データを、細胞数に従って標準化し、３〜６回の生物学的反復について平均した。
【０１９０】
グルコース媒介性ＳＣ細胞毒性を反転させる薬物についてのハイコンテンツスクリーニングアッセイ
化学化合物スクリーニングを、Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（登録商標）を使用して実施した。ＲＦＰ標識したｈＥＳＣ−ＳＣを、３８４ウェルプレート中にプレートし（１，０００／ウェル）、化合物の添加直前に３０ｍＭグルコースで処理した。化合物を１μＭ濃度で添加した。７２時間後、プレートをＤＡＰＩで１０分間処理し、２回洗浄し、プレート全体イメージングのために固定した。生存細胞の数を、ＤＡＰＩ陰性ＲＦＰ陽性細胞の数を計数することによって、各ウェルについて定量化した。死細胞のパーセンテージを、ＤＡＰＩ陽性細胞の数を総ＲＦＰ陽性細胞によって除算することによって、各ウェルについて計算した。
【０１９１】
選択されたヒット化合物（塩酸ブプロピオン、Ｓｉｇｍａ、Ｂ１０２）の検証のために、細胞を、用量応答分析のために種々の濃度の化合物で処理した。最大無毒性用量（最適なソルビトール低減および生存度に基づいて０．７μＭ）を追跡実験に使用した。
【０１９２】
糖尿病マウスの薬物処置
全ての手順を、ＮＩＨガイドラインに従って実施し、これは、地域の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。３〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６マウスを、ストレプトゾトシン（１８０ｍｇ／ｋｇ、ｓｉｇｍａ、８５８８２）の一用量ＩＰ注射で処置して、膵ベータ細胞死を誘導した。血中グルコースレベルを、標準的なグルコメーター（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｌｉｔｅ）を使用して、尾の先端から血液を一滴採血することによって、処置の１週間後に開始して１週間間隔で測定した。ＢＰ処置を、ストレプトゾトシン処置の１週間後に開始した。ＢＰを、約３００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与される固形飼料１グラム当たり１．６３ｍｇで、標準的な固形飼料と混合した。用量は、平均一日食物摂取（５．５グラム／日）および初期体重（３０グラム）に基づいて計算した。
【０１９３】
マウス熱感度試験
温痛覚を、ホットプレート試験を使用して査定した。ホットプレート（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ  ３５１００）は、金属表面（５５℃）と、マウスを収容する透明プレキシガラスシリンダーとからなった。対象を、一定温度のホットプレート上に配置し、後肢の舐め／震えまたはジャンプのいずれかによって査定される不快感を示すのに必要な潜時を決定する。典型的なベースライン潜時は５〜１０秒であり、最大潜時は３０秒である。不快挙動を示さない動物はいずれも、最大潜時である３０秒後に除去して、組織損傷を回避する。
【０１９４】
統計分析
データは、平均±ＳＥＭとして示され、少なくとも３回の独立した実験から導出した。反復（ｎ）に関するデータは、図の説明中に与えられる。統計分析を、スチューデントｔ検定（２つの群を比較する）、またはダネット検定（複数の群を対照に対して比較する）を用いるＡＮＯＶＡを使用して実施した。正規性について検定するために、十分な数の反復を有するデータについて、生データの分布を、正規分布で近似した（コルモゴロフ−スミルノフ正規性検定）。生存度分析を、ログランク（マンテル−コックス）検定を使用して実施した。一次ヒットについてのＺ−スコアを、Ｚ＝（ｘ−μ）／σとして計算した。Ｘは、移動スコア値であり、全てのヒット化合物について３である。μは、平均移動スコア値であり、σは、全ての化合物およびＤＭＳＯ対照についての標準偏差である。
【０１９５】
結果
ｈＥＳＣからのＳＣ系列の誘導および前向き単離
ＤＰＮにおける感覚神経損傷の細胞型特異的機構を精査するために、ヒト感覚ニューロンおよびＳＣをｈＰＳＣから生成した。ｈＥＳＣからの感覚ニューロンの誘導のための方法は、Caiら、２０１６年；Chambersら、２０１２年に記載されているが、ＳＣの誘導は、依然として理解が進んでいない。従って、ＤＰＮのｈＥＳＣモデルを樹立することを目指した第１のステップとして、ｈＥＳＣをＳＣへと分化させるための有効な戦略を樹立した。
【０１９６】
より最近の研究は、ｈＰＳＣからのＳＣ様細胞の誘導について報告したが、ＳＯＸ１０などの重要な系列マーカーの発現を示さず、機能的ミエリン形成を実証できなかった（Liuら、２０１２年；Zieglerら、２０１１年）。胚発生の間に、ＳＣは、段階的プロセスでＳＯＸ１０＋ＮＣ細胞から生じると考えられた。マウスおよびニワトリ胚における研究に基づくと、ＮＣは、発達中の神経においてニューロンの束と関連するＳＣ前駆体を最初に生じる。関連するニューロンは、ＮＲＧ１を発現し、それらのＥＲＢＢ３受容体を活性化することによって、ＳＣ前駆体の生存およびさらなる分化を促進する（NewbernおよびBirchmeier、２０１０年）。マウス発生のＥ１３．５までに、ＳＣ前駆体は、ＳＯＸ１０の発現を維持しつつ、ＧＦＡＰ、Ｓ１００およびＰＯＵ３Ｆ１などの系列マーカーを上方調節する未熟なＳＣを生じる。ミエリン形成性運命および非ミエリン形成性運命へのＳＣの最終分化は、誕生後まで継続する（Jessenら、２０１５年）。
【０１９７】
初期のｈＥＳＣベースのＮＣ分化プロトコールは、ｐ７５＋および／またはＨＮＫ１＋ＮＣ前駆体の前向き単離と組み合わせた、神経上皮系列からの推定ＮＣ細胞の離脱（delamination）に依存する（Bajpaiら、２０１０年；Leeら、２００７年）。これらのプロトコールは種々のＮＣ由来系列を生じるが、ＳＯＸ１０発現のレベルは一般に低い。対照的に、ＷＮＴシグナル伝達の活性化因子へのタイミングをとった曝露に基づく、より方向付けられたＮＣの誘導プロトコールは、分化の１１日目までに、細胞の大部分においてＳＯＸ１０のロバストな誘導を示す（Fattahiら、２０１６年；Menendezら、２０１１年；Micaら、２０１３年）。さらなる培養により、これらのｈＥＳＣ由来ＮＣ細胞は、ＳＯＸ１０＋メラニン細胞へと方向付けられ得るが（Micaら、２０１３年）、ＳＯＸ１０−の間充織およびニューロン前駆体もまた生じる（Micaら、２０１３年）。ＳＯＸ１０発現は、発生を通じてＳＣ系列において保持される重要なマーカーであるので、グリア運命に向けてそれらを指示する前に、培養物中でＳＯＸ１０＋前駆体を維持するための条件を樹立することに最初に焦点を当てた。ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＷＮＴ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ＮＲＧおよびエンドセリン３シグナル伝達のモジュレーターの存在下で、２Ｄまたは３ＤのＮＣ培養物中のＳＯＸ１０＋細胞のパーセンテージを決定した。ＦＧＦ２およびＮＲＧ１処理に加えた、３Ｄ凝集ステップとＣＨＩＲ９９０２１によるＷｎｔシグナル伝達の活性化との組合せは、ＳＯＸ１０発現の維持（図６Ａ）ならびに２５日目までのＳ１００および他の初期ＳＣマーカーの誘導（図１Ａ〜１Ｃ）を生じた。この段階で、さらに１０日間にわたるＦＧＦ２、ＮＲＧ１およびｃＡＭＰによる２５日目培養物前駆体の処理は、ＧＦＡＰ、ＰＯＵ３Ｆ１、ＰＭＰ２２、ＭＢＰ、ＡＱＰ４、ＭＰＺなどのいくつかのＳＣマーカーのロバストな誘導、ならびにとりわけＧＤＮＦ、ＥＲＢＢ３およびＧＡＰ４３が含まれる、ニューロンの相互作用および支持に関与する遺伝子の上方調節を促進する（図１Ａ〜１Ｄ）。より長期の培養は、ＧＦＡＰ＋細胞の富化を生じ、Ｓ１００、ＭＢＰおよびＧＦＡＰの発現（図１Ｅ、１Ｆおよび１Ｉ）に基づいて、６０〜９０日目までにＳＣのほぼ均質な集団を生じた（図６Ｂ）。これらのｈＥＳＣ由来集団は、Ｓ１００、ＭＢＰおよびＧＦＡＰを発現するＳＣの高いパーセンテージを維持したまま、さらに数週間にわたって増殖できる（図１Ｅ、１Ｆおよび１Ｉ）。
【０１９８】
分化の間のｈＥＳＣ−ＳＣの前向き単離を可能にするために、ＧＦＡＰ＋ＳＣを特異的にマークする表面抗原について、２４２の抗体のライブラリーをスクリーニングした（図７Ａ）。ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ８１およびＣＤ９８は、ＧＦＡＰ＋細胞集団を標識すると決定された（図７Ｂ）。さらなる検証により、ＣＤ９８は、６０日目のＳＣにおいて特異的に発現されるが、初期ＳＯＸ１０＋ＮＣ系列を標識することが以前に示されたマーカーであるＣＤ４９Ｄ（Fattahiら、２０１６年）を発現する１１日目のＮＣまたは２５日目のＳＣＰ細胞では発現されない（図７Ｃ）唯一のマーカーであることが明らかになった。精製された細胞のＲＮＡ配列決定により、２５日目のｈＥＳＣ由来ＳＣＰは、初期ＮＣ細胞と密接に関連するが、５０日目、および特に１００日目のＳＣは、初代成体ヒトＳＣと密接に整合する遺伝子発現パターンを示すことが実証された（図１Ｇ）。遺伝子発現データにより、２５日目および１００日目の細胞を１１日目のＮＣと比較することによって、新規候補ＳＣＰおよびＳＣマーカーもまた得られた（図１Ｈ）。各系列についての上位２００の富化された転写物のリストは、表１〜４に提供される。
【０１９９】
ｈＥＳＣ−ＳＣは、糖毒性に対して選択的に脆弱性である
上記知見は、機能的ＳＣを誘導するための効率的なプロトコールを樹立した。ＤＰＮを媒介する特異的な細胞型を同定するために、ｈＥＳＣ由来ＳＣならびに感覚ニューロンに対する糖尿病の影響を、糖尿病において生じるような高グルコース曝露に対するそれらの応答を評価することによって調査した（図２Ａ）。細胞型特異的な脆弱性を査定するために、ｈＥＳＣ由来感覚ニューロンおよびＳＣの培養物を、様々なグルコース濃度で処理した。感覚ニューロンは、４５ｍＭまでのグルコースレベルでは毒性を示さなかった。しかし、ｈＰＳＣ由来ＳＣは、わずかに増加したグルコースレベルに対して感受性であった（図２Ｂ、２Ｅ）。
【０２００】
糖尿病における上昇したレベルのグルコースは、ある特定の細胞型においてポリオール経路を活性化し得る（Oates、２００２年）。ポリオール（polypol）経路は、それぞれアルドースレダクターゼ（ＡＲ）およびソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によって触媒される２つの酵素ステップを介して、過剰なグルコースをソルビトールへと代謝し、引き続いて、フルクトースへと代謝する。ポリオール経路およびソルビトールが媒介する浸透圧ストレスおよび酸化ストレスは、ラットにおけるグルコース誘導性の水晶体白内障に関する研究における高グルコースによる組織損傷の潜在的な媒介因子であり得る（Van  Heyningen、１９５９年）。ソルビトール蓄積は、動物モデルにおける糖尿病誘導性の末梢神経損傷にも関与する（Mizisin、２０１４年；Oates、２００２年）。ｈＥＳＣ−ＳＣに対するグルコースの毒性効果を考慮して、それらが、高グルコース曝露に応答してソルビトールの増加を示すかどうかを査定したところ、それらの選択的脆弱性についての潜在的機構が示唆できた。以前の報告（Maekawaら、２００１年；MizisinおよびPowell、１９９３年）と一致して、感覚ニューロンと比較して、ｈＥＳＣ由来ＳＣにおいて、ＡＲのＳＤＨに対する増加した比が観察された（図２Ｃ）。これは、感覚ニューロンではなくＳＣが、高グルコースに曝露された場合に増加したレベルのソルビトールを示したという観察によって、さらに支持された（図２Ｄ）。
【０２０１】
ハイコンテンツスクリーニングは、ｈＥＳＣ−ＳＣにおいて糖毒性に対抗する薬物を同定する
これらのデータは、ＤＰＮに対する提示された新規治療機会を低減させる、高グルコースに対するＳＣの脆弱性を実証した。ｈＥＳＣ−ＳＣにおいてこの細胞損傷を再現する能力は、この毒性に対抗できる薬物についてのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のためのプラットフォームを提供した。従って、３０ｍＭグルコースの存在下でのｈＰＳＣ由来ＳＣの生存度を測定するＨＴＳシステムを樹立した（図３Ａおよび３Ｅ）。本発明者らは、承認された薬物（ＦＤＡ、ＥＭＡまたは他の規制機関）の１，２８０の小分子を含むＰｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリーをスクリーニングした。高グルコース処理したｈＥＳＣ−ＳＣの生存度を増強するのに最も強力な化合物は、Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ（登録商標）として市販される抗うつ薬ブプロピオン（ＢＰ）であった（図３Ｂ）。検証研究により、ＳＣ生存度をレスキューすることおよびソルビトールレベルを減少させることにおいて、ＢＰについて、２６３ｎＭのＩＣ５０（図３Ｃ、３Ｄ）、および０．７μＭにおける最大効果で用量応答が示され、この０．７μＭ用量を全てのさらなる研究のために使用した。２μＭを上回るＢＰレベルは、漸進的な用量依存的毒性を誘導した。本発明者らは、ＢＰが細胞内グルコースレベルをモジュレートすることによって作用するのかどうかを次に調査した。ソルビトールのレベルに対するＢＰの影響を考慮して、本発明者は、ＢＰ処理がＳＣにおいてグルコースのレベルを変化させるかどうかを調査した。ＢＰは、グルコース取り込みに影響を与えることなく、ｈＥＳＣ−Ｓｃにおける細胞内グルコースレベルを低減させた（図４Ａ、４Ｂ）。従って、ＢＰは、解糖フラックスを増加させ、ソルビトール産生が起きにくくなるようにバランスをシフトさせることによって、グルコースレベルを低下させるという仮説を立てた。この仮説は、ＢＰで処理したｈＥＳＣ−ＳＣにおける、解糖最終産物であるピルベートのレベルの増加によって支持された（図４Ｃ）。合わせて考えると、これらの研究は、ｈＥＳＣ−ＳＣにおける高グルコースの曝露が、ＢＰによる処理によって正常化され得る細胞内グルコースおよびソルビトールの上昇をもたらすことを実証している（図４Ｄ）。
【０２０２】
ブプロピオンは、ＤＰＮのマウスモデルにおいて疾患表現型をレスキューする
高グルコース処理したｈＥＳＣ−ＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存度をレスキューすることにおけるＢＰの顕著な能力を考慮して、ＤＰＮのマウスモデルにおけるＢＰ処置の治療効果を研究した。野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスを、１型糖尿病のマウスモデルとして、ベータ細胞死、損なわれたインスリン産生および高血糖をもたらす膵ベータ細胞特異的毒素ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処置した（WuおよびHuan、２００８年）。この方法は、げっ歯類において１型糖尿病をモデル化するために広く使用されている（Akbarzadehら、２００７年；WuおよびHuan、２００１年）。ＤＰＮ患者および動物モデルでは、感覚神経損傷は、四肢における感覚消失をもたらす場合が多い。ＳＴＺ処置したマウスにおけるＤＰＮ表現型に対するＢＰ処置の影響を、機能的読み出しとして温感試験を使用し、坐骨神経の組織学的分析によって評価して、構造的損傷を査定した（図５Ａ）。ＳＴＺ処置したマウスは、非糖尿病対照動物と比較して、ＢＰ処置とは無関係に、血中グルコースのレベルにおける有意な増加を示し（図５Ｂ）、このことは、ＢＰ処置がグルコースレベルに影響しないことを示している。ＢＰで処置しなかった糖尿病マウスは、ＳＴＺ処置の７週間後および８週間後に、熱刺激に対する遅延した応答を示した。ＢＰ処置した糖尿病マウスは、正常な非糖尿病動物のものと匹敵する有意に改善された応答時間を示した（図５Ｃ）。組織学的分析により、ＳＴＺマウスの坐骨神経におけるＴＵＮＥＬ＋アポトーシス細胞のパーセンテージにおける増加が明らかになった。ＢＰ処置した動物は、未処置群の動物よりも有意に少ないアポトーシス細胞を示した（図５Ｄ、５Ｅ）。次に、末梢ミエリンに対するＳＴＺおよびＢＰ処置の影響を、透過型電子顕微鏡を使用して評価した。大きいパーセンテージの深く損傷したミエリンが、ＳＴＺ処置した動物の坐骨神経において観察されたが、このパーセンテージは、ＢＰで処置したＳＴＺマウスにおいて有意に低減された（図５Ｆ〜５Ｇ）。これらの研究は、ＤＰＮのＳＴＺモデルにおけるＢＰのロバストな治療効果を実証している。
【０２０３】
考察
ＳＣは、末梢神経の発生、機能および修復において重要な役割を果たす。しかし、それらの発生および機能は、初代組織から実行可能な数でそれらを得ることにおける限界に起因して、ヒトではあまり理解されていない。他の研究者が、Ｐ７５＋／ＨＮＫ１＋ＮＣ前駆体の長期維持後のｈＰＳＣ由来のシュワン様細胞を以前に報告しているが（Leeら、２００７年）、これらの研究は、低い誘導効率、および数ヶ月間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、長引く分化、限定的なＳＣ成熟化、およびミエリン形成データの欠如という限界を有する（Leeら、２００７年；Liuら、２０１２年；Zieglerら、２０１１年）。他の研究者によるヒトＳＣを誘導するための試みもまた、低い収量、限定的な表現型の特徴付け、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏミエリン形成の欠如を生じた（Liら、２０１５年；Micaら、２０１３年）。ヒトＳＣの十分特徴付けられた純粋な集団の生成のための高度に効率的なアプローチを樹立したが、これは、将来の徹底的な発生研究、および疾患モデル化などの橋渡し適用、ならびに細胞治療のためのお膳立てとなる。
【０２０４】
本発明者らのｈＥＳＣベースのプラットフォームの重要な特色は、得られたＳＣの拡張性および純度、ならびにＳＣ特性を喪失することなしに延長された期間にわたって細胞を培養する能力である。対照的に、初代ＳＣは、延長された培養の際にそれらの特性を迅速に喪失する傾向があり、線維芽細胞様細胞によるシュワン細胞培養物の夾雑が増加していくことになる。この新規分化テクノロジーを使用してここで到達可能な重要な発生上の疑問には、多分化能性ＮＣ幹細胞から傾倒したＳＣへの移行を制御する機構、ならびにメラニン細胞および副交感ニューロンの両方が初期ＳＣ系列から誘導できることを示唆するマウスにおける最近のデータを考慮したヒトＳＣ可塑性の研究が含まれる（Adameykoら、２００９年；Espinosa-Medinaら、２０１４年）。傾倒したＳＣの前向き単離のための表面マーカーとしてのＣＤ９８の同定は、かかる研究のための強力なツールを提示する。ＰＮＳ病理のモデル化は特に関心の対象となり得る。培養ｈＥＳＣ由来シュワン細胞の驚くべき特色は、シュワン細胞であることを確認するだけでなく、多能性由来細胞が成体シュワン細胞の発現パターンと整合することを示唆する、それらの遺伝子発現パターンである。これは、胎児段階のマーカーを発現するニューロンなどの、ほとんどの他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導されたｈＰＳＣ系列とは対照的である（Studerら、２０１５年）。
【０２０５】
ミエリン形成性ＳＣを生成する能力は、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病などの遺伝性ミエリン形成障害のモデル化を可能にする。ＣＭＴをモデル化するための現在の試みは、実際の疾患表現型をとらえておらず、ＳＣ前駆体における初期分子事象を規定することに限定されている。ＣＭＴは、ＰＮＳの最も一般的な遺伝性障害であるが、末梢神経障害の大部分は、糖尿病によって生じ、最も頻度が高い症例である（全ての糖尿病患者の１５〜６０％が罹患する（MartynおよびHughes、１９９７年））。
【０２０６】
本発明者らは、糖尿病関連高血糖に対するＳＣの選択的脆弱性を明らかにしたｈＥＳＣベースのＤＰＮモデルを提示する。データのほとんどは、高グルコース曝露に応答して得られたが、本発明者らは、非常にわずかなレベルの、グルコースの増加においてでさえ、ＳＣ生存度における減少を観察した。グルコース媒介性のシュワン細胞毒性に対抗するＢＰの能力は、細胞内グルコースおよびスクロースレベルにおける減少と相関したが、酸素消費における増加を示唆するピルベートレベルにおける増加とも相関した。興味深いことに、ＢＰは、患者において体重増加ではなく中程度の体重減少と一般に関連する唯一の抗うつ薬のようであり、従って、グルコース代謝におけるＢＰ媒介性の変化は、そのような全身効果と関連する可能性がある。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究により、ＢＰ処置が、ＤＰＮ関連の挙動上の欠陥および神経損傷をレスキューできることが実証された。ＢＰは、神経障害性疼痛に罹患している患者の処置においていくらかの利益を示したことから（Semenchukら、２００１年）、別の適応症に対するこの薬物の効果もまたＳＣ脆弱性に対するその効果によって媒介され得るかどうかという疑問を生じる。ＢＰに加えて、本発明者らは、シュワン細胞脆弱性をレスキューすることが可能ないくつかのさらなる化合物を同定した。これらの化合物が共通の機構を介して作用するのか別個の機構を介して作用するのか、およびそれらが、ＳＴＺマウスにおいてＢＰと匹敵するｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すかどうかを決定することに興味がもたれる。
【０２０７】
この研究は、他の後天的末梢神経障害のモデル化における進歩をもたらし得る。医原性神経障害は、シスプラチンなどの化学療法薬による処置後にがん患者において一般に観察される（QuasthoffおよびHartung；Thompsonら、１９８４年）。ｈＰＳＣ由来系列を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験とＨＴＳとの組合せは、これらの化学療法剤の細胞型特異的副作用を反転させる潜在的薬物の同定のためのプラットフォームとして機能し得る。
【０２０８】
結論として、この研究は、健康および疾患におけるそれらの生物学を探索し、ＤＰＮに対する新規治療を開発するためにヒトＳＣ系列を入手するための有効な枠組みを提示する。ｈＰＳＣの方向付けられた分化は、基礎研究および橋渡し研究において広い意義を有する、ヒトＳＣの大規模誘導のための有効なアプローチを提示する。この枠組みは、ＰＮＳの生物学および疾患におけるグリアの役割の徹底的な研究のための新たな可能性を提供し、将来的な末梢神経障害に対する新規治療剤の開発に寄与する。この研究は、ＤＰＮの病理発生におけるＳＣ欠損をさらに示し、ＤＰＮ関連損傷をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで処置できるＦＤＡ承認された薬物としてＢＰを提示する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−５】
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【表４−１】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表５】
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【０２０９】
７．参考文献
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【図１ＡＢＣＤ】
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【図１ＥＦ】
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【図１ＧＨ】
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【図１Ｉ】
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【図２ＡＢＣＤ】
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【図２Ｅ】
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【図３ＡＢＣＤ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
2019535263.tif 000041
【図５ＡＢＣ】
2019535263.tif 000042
【図５ＤＥＦＧ】
2019535263.tif 000043
【図６】
2019535263.tif 000044
【図７ＡＢ】
2019535263.tif 000045
【図７Ｃ−１】
2019535263.tif 000046
【図７Ｃ−２】
2019535263.tif 000047
【国際調査報告】
2019535263.tif 000048
2019535263.tif 000049
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