(57)【要約】  本開示は、ある特定のMenaスプライシングアイソフォームを修飾すること及び該アイソフォームの存在をアッセイすることによりチューブリン再構築又はタンパク質チロシンキナーゼ活性が関わる抗がん療法の効力を向上させる及び判定するための処置方法及び組成物を提供する。
2019500591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して耐性の腫瘍を有する患者を同定又は診断するための方法であって、
(a)患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つからのMenaINVの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程
ここで、前記対照に対するMenaINV発現増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す;及び
(b)前記対照と比較してMenaINVの発現増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料から観察又は検出された場合、TKIに対する耐性があると前記患者を同定又は診断する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程(a)の前に、前記患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを検出及び測定する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、
(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、
(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は
(iv)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程
を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
TKI以外の前記化学療法剤が、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤が、Ras阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMena11aの発現レベルを測定する工程を更に含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記血液、組織又は腫瘍におけるMenaINV/Mena11a発現の比を対照と比較する工程であって、前記MenaINV/Mena11aの比の増加がMenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す、工程;及び
前記対照と比較してMenaINV/Mena11aの比の増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程
を更に含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記TKIが、RTKの阻害剤である、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断するための方法であって、
TKIでの処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMenaINVの発現レベルを比較する工程
ここで、
前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、
MenaINV発現の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す;及び
より早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料においてMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、TKIに対する二次耐性がある腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程
を含む方法。
【請求項１２】
前記試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
TKIでの処置レジメンを開始する前の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、及び
MenaINVの前記レベルが、所定の対照レベルと同等であった又はそれより低かった場合、前記患者にTKIの有効量を投与する工程
を更に含む、請求項11から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、
(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、
(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は
(iv)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程
を更に含む、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記TKIが、RTKの阻害剤である、請求項11から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、
TKIの第1の有効量での処置中の異なる時点で得た患者からの少なくとも2つの試料におけるMenaINVのレベルを比較する工程
ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、
対照と比べてMenaINVの発現の増加はTKI耐性がんを示す;及び
MenaINVの発現が対照と比べて増加されなかった場合、前記TKIの第1の有効量を投与する工程、又は
MenaINVの発現が、対照と比べて増加された場合、
(i)前記患者にTKIの第2の有効量、
(ii)前記患者にTKI以外の化学療法剤の有効量、
(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量と組み合わせてTKIの有効量、若しくは
(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は
(v)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを投与する工程
を含む方法。
【請求項１９】
前記比較する工程の前に、
TKIの第1の有効量を投与する工程、
前記試料におけるMenaINVの発現レベルを検出若しくは測定する工程、又は
それらの組合せ
を更に含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記TKIの第2の有効量が、前記TKIの初期有効量より少なくとも約2倍〜約20倍多い、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
TKI以外の前記化学療法剤が、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤である、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤が、Ras阻害剤、Rag阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
TKIの前記第1の有効量を投与する前に採取した血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つにおけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、
MenaINVの発現レベルを所定の対照発現レベルと比較する工程、及び
前記TKIの第1の有効量を投与する前に採取した試料において同等の又はより低いMenaINVレベルが観察又は検出された場合、TKIの前記第1の有効量を受けることに適していると患者を同定又は診断する工程
を更に含む、請求項18から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記TKIが、RTKの阻害剤である、請求項18から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
RTKの前記阻害剤が、EGFR、HGFR、IGFR、HER2、HER3、HER4又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである、請求項10、17又は26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、
患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの1つ又は複数からのMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程
ここで、前記対照に対するMena及び/又はMenaINV発現増加は、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す;及び
前記対照と比較してMena及び/又はMenaINVの発現増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料から観察又は検出された場合、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程
を含む方法。
【請求項２９】
前記試料からの前記Mena、MenaINV又はそれらの組合せの発現レベルを測定する工程を更に含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、
(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、
(iii)微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は
(iv)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを前記患者に投与する工程を更に含む、請求項28から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
微小管結合剤以外の前記化学療法有効剤が、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定される、請求項28から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記微小管結合剤が、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である、請求項28から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記微小管結合剤が、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである、請求項28から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
微小管結合剤に対して二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断するための方法であって、
微小管結合剤での処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程
ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、
より早い時点で得た試料に対してより遅い時点から得た試料におけるMena及び/又はMenaINV発現の増加は、二次Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す;及び
より早い時点で得た試料と比較して、より遅い時点で得られた試料においてMena及び/又はMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程
を含む方法。
【請求項３８】
前記試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
MenaINVの前記発現レベルが、患者の血液試料、組織、腫瘍試料又はそれらの組合せにおいて測定される、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、
(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、
(iii)微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は
(iv)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを前記患者に投与する工程を更に含む、請求項37から41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
微小管結合剤以外の前記化学療法有効剤が、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記微小管結合剤が、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である、請求項37から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記微小管結合剤が、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍を有する患者における、がんを処置するための方法であって、
微小管結合剤の第1の有効量での処置中に得た患者からの試験試料と対照組織試料のMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程
ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、
前記対照試料に対するMena及び/又はMenaINV発現の増加は、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す;及び
次のうちの少なくとも1つ:
(i)前記試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、前記対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加されなかった場合、微小管結合剤の有効量を投与する工程、
(ii)前記試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、前記対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量を前記患者に投与する、又は微小管結合剤の投与を中止する工程、
(iii)前記試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、前記対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路、又はそれらの組合せを阻害するか又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、有効量を投与する工程、又は
(iv)それらの組合せ
を含む方法。
【請求項４７】
工程(i)又は(iii)における前記微小管結合剤の有効量が、前記微小管結合剤の第1の有効量より少なくも5倍、少なくとも10倍又は少なくとも20倍多い、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記微小管結合剤が、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である、請求項46又は47に記載の方法。
【請求項４９】
前記微小管結合剤が、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである、請求項46から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
微小管結合剤以外の前記化学療法有効剤が、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである、請求項46から49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを検出又は測定する工程の少なくとも一方を更に含む、請求項46から50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
MenaINVの発現レベルが、前記患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せにおいて測定される、請求項51に記載の方法。
【請求項５５】
腫瘍を有する患者における、がんを処置するための方法であって、
(i)微小管結合剤の有効量、
(ii)TKIの有効量、
(iii)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、
(iv)Mena阻害剤若しくは修飾物質、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質又はそれらの組合せののうちの少なくとも1つの有効量、又は
(v)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを前記患者に併用投与する工程
を含む方法。
【請求項５６】
前記Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又は前記MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の前記有効量が、前記患者の前記微小管結合剤に対する耐性を予防及び/又は改善するのに有効な量である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又は前記MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の前記有効量が、前記患者に対する前記微小管結合剤又はTKIの抗腫瘍効力を増強するのに有効な量である、請求項55又は56に記載の方法。
【請求項５８】
前記微小管結合剤又はTKIと前記Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又は前記MenaINV阻害剤若しくは修飾物質との併用投与が、前記患者に、逐次的に、別々に又は同時に投与される、請求項55〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記微小管結合剤が、MenaINVの阻害剤と併用投与される、請求項55から58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
腫瘍を有する患者における、がんを処置するための方法であって、
微小管結合剤治療中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程
ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料から選択されるか又はそれらの組合せである;及び
より遅い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを前記患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項６１】
前記発現レベルを比較する工程の前に、前記患者に微小管結合剤の有効量を投与する工程及び前記試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料が、
MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、
MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、
Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、
Menaと特異的に結合する剤、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
前記剤が、
抗体若しくはアプタマー、
核酸、
検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸、又は
それらの組合せ
のうちの少なくとも1つである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定され、MenaINVの阻害剤が前記患者に投与される、請求項61に記載の方法。
【請求項６５】
MenaINV過剰発現腫瘍を有する患者における、がんを処置するための方法であって、
TKI、微小管結合剤、Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの第1の有効量に対して耐性であるMenaINV過剰発現がんを有すると判定された患者を用意する工程、及び
(i)前記患者にTKIの有効量、
(ii)前記患者にTKI若しくは微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、
(iii)Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、
(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、
(v)微小管結合剤の有効量、
(vi)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、又は
(v)それらの組合せ
のうちの少なくとも1つを投与する工程
を含む方法。
【請求項６６】
(i)〜(vi)のいずれにおける前記剤の有効量が、前記第1の有効量より2倍〜10倍多い、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
TKI又は微小管結合剤以外の前記化学療法有効剤が、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである、請求項65又は66に記載の方法。
【請求項６８】
前記腫瘍が、乳腺、乳房、膵臓、前立腺、結腸、脳、肝臓、肺、頭部又は頸部腫瘍である、請求項1から67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
血液、組織又は腫瘍におけるMeancalcを対照と比較する工程であって、Menacalcが、Mena11aの量を減算した全Mena量に相当し、Menacalcの増加又は減少が、Mena関連TKI耐性腫瘍を示す、工程、及び
前記対照と比較してMenacalcの増加又は減少が前記血液試料、前記組織試料又は前記腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程
を更に含む、請求項65から68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記血液、組織又は腫瘍におけるMenaINV/Menatotal発現の比を対照と比較する工程であって、MenaINV/Menatotalの前記比の増加がMenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す、工程;及び
前記対照と比較してMenaINV/Menatotalの比の増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程
を更に含む、請求項65から69のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2015年11月13日に出願した、「METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING AND MODULATING CANCER CELLS」と題する米国特許仮出願第62/255,293号の利益を主張するものであり、この仮出願の全開示は、参照により本明細書に組込まれている。
【０００２】
米国政府による資金提供の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約U54-CA112967の下に米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
参考文献の段落による組み入れ
37 C.F.R.  §  1.52(e)(5)に従って、Patent-In 3.5及びChecker 4.4.0を使用して2016年11月14日に作成した電子ファイル、名称:1515028_108WO2_Sequence_Listing_ST25.txt;size 4.23 KB、に収載されている配列情報は、その全体が参照により本明細書に組込まれている。
【０００４】
細胞骨格要素又は受容体チロシンキナーゼ活性を標的にする抗がん療法の効力を予測、モニタリング及び増強するための方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００５】
がんは、複雑な疾患であり、最も単純に言えば無制御の増殖及び異常な細胞の伸展を特徴とする疾患である。がんは、世界の最も深刻な健康問題の1つであり、米国では心疾患に続く死因の第2位である。特定の型及び病期のがんを有する殆どの患者は、同じ処置を受ける。この手法は最適ではない。何故ならば、一部の処置は、一部の患者にはよく効くが、他の患者にはあまり効かないからである。ゲノムの差及びがん関連遺伝子が発現される方法の差により、処置に対する応答の多くの差が説明される。標的抗がん療法は、より有効ながん処置を開発するための有望な手法の代表である。
【０００６】
受容体チロシンキナーゼ(RTK)、例えば、上皮増殖因子受容体(EGFR、HER2、HER3及びHER4)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR)及びインスリン様増殖因子受容体1(IGFR)は、増殖因子、サイトカイン及びホルモンに対する高親和性受容体であり、それらの活性化により、細胞増殖及び生存をはじめとする重要なプロセスが調節される。RTKの調節異常は、多くのがんの発生及び進行に重要な役割を果すことが証明され、しかるが故に、小分子及び抗体療法薬によるキナーゼシグナル伝達経路の標的化は、非常に有望な研究方法になってきた。幾つかのチロシンキナーゼ阻害剤及び抗体は、既に臨床使用されている。
【０００７】
細胞骨格成分(アクチン、微小管及び中間経フィラメント)は、高度に一体化しており、それらの機能は、正常な細胞ではよく組織化されている。対照的に、細胞骨格要素の変異及び異常発現は、ある部位から別の部位へのがん細胞の移動(転移)に重要な役割を果す。主構成要素がチューブリンである微小管は、細胞分裂を媒介し、細胞内遊走及び輸送、細胞形態維持及び極性に重要な役割を果す、重要な細胞骨格構造である。微小管動態は、抗がん研究の重要な標的であり、タキサン等のチューブリン結合剤(TBA)は、強力な化学療法薬であることが証明されている。
【０００８】
チロシンキナーゼシグナル伝達経路又は微小管動態のどちらかを選択的に標的にする治療の主な制限は、二次的な薬物耐性の発生である。初期応答の後、続いて二次耐性が必ず起こり、その結果、これらの薬物の臨床的有益性が制限される。本発明は、二次的な薬物耐性の早期検出の必要に対処し、RTK阻害剤及びTBAでの治療を改善する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第2012/0028252号
【特許文献２】米国特許出願公開第2015/0044234号
【特許文献３】米国特許第8,603,738号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons社、New York
【非特許文献２】Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons社、New Yorkの10.8.1
【非特許文献３】Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons社、New Yorkの11.2.1
【非特許文献４】Agarwalら、Quantitative assessment of invasive mena isoforms(Menacalc)as an independent prognostic marker in breast cancer、Breast Cancer Research、14:R124(2012)
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【非特許文献６】DNA Cloning、第I及びII巻(D. N. Glover編、1985)
【非特許文献７】Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney、Alan R. Liss社、1987)
【非特許文献８】B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)
【非特許文献９】Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及びWalker編、Academic Press社, London, 1987)
【非特許文献１０】Handbook Of Experimental Immunology、第I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編、1986)
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【非特許文献１２】Philipparら、A Mena invasion isoform potentiates EGF-induced carcinoma cell invasion and metastasis、Dev Cell 15(6):813(2008)
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【非特許文献１５】Chakrabortyら、Listeria comet tails:the actin-based motility machinery at work、Trends Cell Biol. 18(5):220(2008)
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【非特許文献１７】The Cancer Genome Atlas(TCGA)公開データポータル(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)
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【非特許文献２０】Wangら、CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis、Cancer Cell 25(1):21(2014)
【非特許文献２１】Oudin MJら、Characterization of the expression of the pro-metastatic Mena(INV)isoform during breast tumor progression、Clin Exp Metastasis, 2015
【非特許文献２２】Gertler FBら、Mena, a relative of VASP and Drosophila enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics. Cell. 1996;87:227〜39頁
【非特許文献２３】Oudin MJ、Hughes SK、Rohani N、Moufarrej MN、Jones JG、Condeelis JSら、Characterization of the expression of the pro-metastatic Mena(INV)isoform during breast tumor progression、Clin Exp Metastasis、2015年12月17日、オンライン先行発表版
【非特許文献２４】Oudin MJら、Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling enables haptotaxis during metastatic progression、Cancer Discov. 2016
【非特許文献２５】Roussos ET、Balsamo M、Alford SK、Wyckoff JB、Gligorijevic B、Wang Yら、Mena invasive(MenaINV)promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer、J Cell Sci.、2011;124:2120〜31頁、[PubMed:21670198]
【非特許文献２６】Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature; 2012;490:61〜70頁(*TCGAからのデータ。著者名の記載なし。原文[0281], l.2を参照されたい。)
【非特許文献２７】Wang Lら、CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis、Cancer Cell、2014;25:21〜36頁
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【非特許文献３０】Oudinら、Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression、Cancer Discov、2016年5月、6(5):516〜31頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
Menaタンパク質は、腫瘍細胞浸潤及び転移、アクチン重合、接着、及びEGF誘発運動応答にとって重要である、複数のプロセスを介して作用する。高遊走性且つ浸潤性の腫瘍細胞亜集団は、選択的スプライス型のMenaを含有するMena mRNAを産生する。Mena11aと称する1つのそのような選択的スプライス型は、その全体が参照により本明細書に組込まれている、米国特許出願公開第2012/0028252号に記載されている。別の選択的スプライス型であるMenaINVは、TKIに対する二次耐性を予示する。Mena INVのそのような使用は、その全体が参照により本明細書に組込まれている、米国特許出願公開第2015/0044234号の段落[0120]〜[0122]に特に詳細に記載されている。抗体を使用するMena/MenaINVレベルの測定、又はmRNAの検出により、がん患者がタキサンに基づく化学療法に初期応答する可能性が高いかどうかが予測され、そのような測定及び検出がタキサンに対する耐性の獲得についての患者のモニタリングにも有効であることは、驚くべきことであり、意外にもそれを発見した。更に、Mena/MenaINV発現は、タキサン処置に対する耐性を増加させるので、Menaがタキサンに対する耐性を克服するための治療標的になることも発見した。
【００１２】
ある態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して耐性の腫瘍を有する患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、(a)患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つからのMenaINVの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程(ここで、前記対照に対するMenaINV発現増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)及び(b)前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料からのMenaINVの発現増加が、前記対照と比較して観察又は検出された場合、TKIに対して耐性である腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、方法は、工程(a)の前に、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを検出及び測定する工程を更に含む。
【００１４】
ある特定の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００１５】
特定の実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００１６】
別の実施形態では、方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しく修飾物質の有効量、又は(iv)それらの組合せを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程を更に含む。
【００１７】
ある実施形態では、TKI以外の化学療法剤は、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤である。
【００１８】
更なる実施形態では、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤は、Ras阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【００１９】
更に他の実施形態では、方法は、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMena11aの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【００２０】
特定の実施形態では、方法は、血液、組織又は腫瘍におけるMenaINV/Mena11a発現の比を対照と比較する工程(ここで、MenaINV/Mena11aの比の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及び前記対照と比較してMenaINV/Mena11aの比の増加が前記血液試料、組織試料又は腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性の腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を更に含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、TKIは、RTKの阻害剤である。
【００２２】
更なる態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、TKIでの処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMenaINVの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、MenaINV発現の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及びより早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料においてMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、TKIに対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、方法は、試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００２５】
他の実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００２６】
更なる実施形態では、方法は、TKIでの処置レジメンを開始する前の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、及びMenaINVのレベルが、所定の対照レベルと同等であった又はそれより低かった場合、患者にTKIの有効量を投与する工程を更に含む。
【００２７】
特定の実施形態では、方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は(iv)それらの組合せを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程を更に含む。
【００２８】
別の実施形態では、TKIは、RTKの阻害剤である。
【００２９】
別の態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、TKIの第1の有効量での処置中の異なる時点で得た患者からの少なくとも2つの試料におけるMenaINVのレベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、対照と比べてMenaINVの発現レベルの増加はTKI耐性がんを示す)と、MenaINVの発現が対照と比べて増加されなかった場合、TKIの第1の有効量を投与する工程、又はMenaINVの発現が、対照と比べて増加された場合、次のうちの少なくとも1つ:(i)患者にTKIの第2の有効量、(ii)患者にTKI以外の化学療法剤の有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量と組み合わせてTKIの有効量、(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、若しくは(v)それらの組合せを投与する工程とを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、方法は、比較する工程の前に、TKIの第1の有効量を投与する工程、試料におけるMenaINVの発現レベルを検出又は測定する工程、又はそれらの組合せを更に含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、TKIの第2の有効量は、TKIの初期有効量より少なくとも約2倍〜約20倍多い。
【００３２】
他の実施形態では、TKI以外の化学療法剤は、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤である。
【００３３】
更なる実施形態では、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤は、Ras阻害剤、Rag阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【００３４】
更なる実施形態では、方法は、TKIの第1の有効量を投与する前に採取した血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つにおけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、MenaINVの発現レベルを所定の対照発現レベルと比較する工程、及びTKIの第1の有効量を投与する前に採取した試料において同等の又はより低いMenaINVレベルが観察又は検出された場合、TKIの第1の有効量を受けることに適していると患者を同定又は診断する工程を更に含む。
【００３５】
特定の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００３６】
ある実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００３７】
ある特定の実施形態では、TKIは、RTKの阻害剤である。
【００３８】
他の実施形態では、RTKの阻害剤は、EGFR、HGFR、IGFR、HER2、HER3、HER4、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【００３９】
更に別の態様では、本開示は、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定するための方法を提供する。この方法は、患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料、又はそれらの組合せのうちの1つ又は複数からのMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程であって、前記対照に対するMena及び/又はMenaINV発現増加が、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す工程、及び前記対照と比較してMena及び/又はMenaINVの発現増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料から観察又は検出された場合、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、方法は、単数の試料又は複数の試料からのMena、MenaINV又はそれらの組合せの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００４２】
他の実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００４３】
更なる実施形態では、方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)微量管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は(iv)それらの組合せを、患者に投与する工程を更に含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【００４５】
更なる実施形態では、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定される。
【００４６】
別の実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【００４７】
特定の実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【００４８】
更に別のもう1つの態様では、本開示は、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有する患者を同定するための方法を提供する。この方法は、微小管結合剤での処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せであり、より早い時点で得た試料に対してより遅い時点から得た試料におけるMena及び/又はMenaINV発現の増加は、二次Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)、及びより早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料においてMena及び/又はMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、方法は、試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【００５０】
他の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００５１】
ある特定の実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００５２】
特定の実施形態では、MenaINVの発現レベルは、患者の血液試料、組織、腫瘍試料又はそれらの組合せにおいて測定される。
【００５３】
更に他の実施形態では、方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)微量管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は(iv)それらの組合せを、患者に投与する工程を更に含む。
【００５４】
ある実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【００５５】
更なる実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【００５６】
ある特定の実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【００５７】
尚、更なる態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、微小管結合剤の第1の有効量での処置中に得た患者からの得た試験組織試料と対照組織試料のMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せであり、対照試料に対するMena及び/又はMenaINV発現の増加は、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)と、次のうちの少なくとも1つ:(i)前記試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、前記対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加されなかった場合、微小管結合剤の有効量を投与する工程、(ii)前記試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、前記対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量を患者に投与する、若しくは微小管結合剤の投与を中止する工程、(iii)前記試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、前記対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路、又はそれらの組合せを阻害するか又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、有効量を投与する工程、又は(iv)それらの組合せ、とを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、工程(i)又は(iii)における微小管結合剤の有効量は、微小管結合剤の第1の有効量より少なくも5倍、少なくとも10倍又は少なくとも20倍多い。
【００５９】
ある特定の他の実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【００６０】
他の実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【００６１】
特定の実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【００６２】
更なる実施形態では、方法は、試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを検出する工程又は測定する工程の少なくとも一方を更に含む。
【００６３】
更に別の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００６４】
ある実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００６５】
ある特定の実施形態では、MenaINVの発現レベルは、患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せにおいて測定される。
【００６６】
更に別の態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、次のうちの1つ:(i)微小管結合剤の有効量、(ii)TKIの有効量、(iii)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、(iv)Mena阻害剤若しくは修飾物質、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質又はそれらの組合せの有効量、又は(v)それらの組合せを、患者に併用投与する工程を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量は、患者の微小管結合剤に対する耐性を予防/改善するのに有効な量である。
【００６８】
ある特定の実施形態では、Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量は、患者に対する微小管結合剤又はTKIの抗腫瘍効力を増強するのに有効な量である。
【００６９】
更なる実施形態では、微小管結合剤又はTKIとMena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質との併用投与は、患者に、逐次的に、別々に又は同時に投与される。
【００７０】
他の実施形態では、微小管結合剤は、MenaINVの阻害剤と併用投与される。
【００７１】
ある態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、微小管結合剤治療中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料から選択されるか又はそれらの組合せである)、及び遅い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００７２】
一部の実施形態では、この方法は、発現レベルを比較する工程の前に患者に微小管結合剤の有効量を投与する工程、及び試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【００７３】
他の実施形態では、試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイされる。
【００７４】
ある特定の実施形態では、前記剤は、次のうちの少なくとも1つである:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【００７５】
更なる実施形態では、MenaINVの発現レベルが患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料において測定され、MenaINVの阻害剤が患者に投与される。
【００７６】
更なる態様では、本開示は、MenaINV過剰発現腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、TKI、微小管結合剤、Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの第1の有効量に対して耐性であるMenaINV過剰発現がんを有すると判定された患者を用意する工程、及び次のうちの少なくとも1つ:(i)患者にTKIの有効量、(ii)患者にTKI若しくは微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(iii)Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(v)微小管結合剤の有効量、(vi)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、又は(vii)それらの組合せを投与する工程を含む。
【００７７】
一部の実施形態では、(i)〜(vi)のいずれにおける剤の有効量は、第1の有効量より2倍〜10倍多い。
【００７８】
ある特定の実施形態では、TKI又は微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【００７９】
他の実施形態では、腫瘍は、乳腺、乳房、膵臓、前立腺、結腸、脳、肝臓、肺、頭部又は頸部腫瘍である。
【００８０】
有用な前記一般領域は、単なる例として与えるものであり、本開示及び添付の特許請求の範囲に記載の範囲を限定するためのものではない。本開示の組成物、方法及びプロセスに関連する目的及び利点は、本特許請求の範囲、説明及び実施例に照らせば当業者には理解されるであろう。例えば、本開示の様々な態様及び実施形態を非常に多数の組合せで用いることができ、そのような組合せの全てが本開示によって明確に企図されている。これらの追加の利点、目的及び実施形態は、本開示の範囲内に明確に含まれる。本発明の背景を説明するために及び特定の場合には実施に関して更なる詳細を提供するために本明細書で使用される公表文献及び他の資料は、参照により組込まれている。
【００８１】
添付の図面は、本明細書に組込まれ、本明細書の一部を構成するものであり、本発明の幾つかの実施形態となり、この説明と合わせて、本発明の原理を解釈するのに役立つ。これらの図面は、本発明の実施形態の例証を目的としたものに過ぎず、本発明を制限するものと見なすべきではない。本発明の更なる目的、特徴及び利点は、本発明の例証となる実施形態を示す添付の図面と共に用いられる後続の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】MDA-MB 231乳がん細胞におけるMena又はMenaINVの発現がタキソール処置に対する応答を低下させることを示す図である。96ウェルプレートにおいてGFP、GFP-Mena又はGFP-MenaINVを発現するMDA MB 231細胞の細胞生存率を評価した。グラフは、Prestoblueを使用して決定した、タキソール(A)、ドキソルビシン(B)、又はシスプラチン(C)での72時間の処置後の生存細胞の割合を示す。生存率が未処置細胞に対する割合として表されている。非線形(シグモイド)回帰分析を使用して用量反応プロットからIC50値を算出した。(A)各々2回ずつ行った3つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。ウェルチ補正を用いて対応のないt検定により決定された統計値。ここで、*** p<0.001、** p<0.01、* p<0.05。(D)抗Mena及び抗チューブリン抗体でプローブした、乳がん細胞株のパネルから調製した溶解物の代表ウェスタンブロット。(E)細胞生存率を次の細胞株に関して評価した:MDA-MB 175IIV及びT47D(ルミナルA)、MDA MB 453(HER2+)、MDA-MB 436、BT-549、LM2、SUM159、MDA-MB 231及びBT 20(TNBC)。グラフは、各細胞株についての用量反応曲線を示し、データは、各々2回ずつ行った3つの独立した実験についての平均値として提示されたものである。(F)ウェスタンブロットにより得たMenaタンパク質発現と、本明細書では(1E)における用量反応曲線から算出されるその有効面積の逆数と定義されるタキソール効力(すなわち、生存細胞の割合低下により判断されるタキソールに対する感受性)との線形回帰。各データ点は、Menaタンパク質発現についての三重反復実験の平均値、及びタキソール効力についての各々2回ずつ行った3つの独立した実験の平均値を表す。
【図２】Mena又はMenaINV発現が、タキソール治療及びドキソルビシン治療により誘導される腫瘍増殖阻害を阻害することを示す図である。腫瘍をNOD SCIDマウスの乳房脂肪体体内への231-GFP、231-Mena又は231-MenaINV細胞の注射により発生させた。腫瘍が直径1cmに達したら、マウスを5日毎にタキソール(合計3用量)又はドキソルビシン(合計2用量)のどちらかで処置した。腫瘍体積を処置前及び処置後に測定し、それを使用して、GFP(対照)又はGFPタグ付きMena/MenaINVを発現する腫瘍についてのタキソール(A)又はドキソルビシン(B)での処置後の腫瘍体積の相対変化を算出した。Mena又はMenaINVの発現は、化学療法処置に依存する腫瘍増殖停止を阻害した。ビヒクル又はタキソールで処置された腫瘍内の、GFP、Mena又はMenaINVを発現するMDA-MB-231細胞に関する、Ki67陽性(C, D)及び切断カスパーゼ2陽性(E, F)の代表画像及び定量。各群における少なくとも4匹のマウスの平均値±SEMとして提示されたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、*** p<0.001、** p<0.01、* p<0.05。
【図３】MenaINVを発現する原発性同所性異種移植腫瘍からの骨及び肺への転移がタキソール治療による影響を受けないことを判定する図である。(A)注射の12週間後に対照腫瘍を担持するマウス又はMena若しくはMenaINVを発現しているマウスから採取された培養骨髄におけるコロニーの数に対応する播種性腫瘍細胞の数。(B)注射の12週間後に対照腫瘍を担持するマウス又はMena若しくはMenaINVを発現しているマウスの肺における転移の数。1群当たりマウス3匹についての平均値±SEMとして提示されたデータ。
【図４】タキソールで処置された細胞及び腫瘍が高いMenaタンパク質発現レベルを示すことを示す図である。(A)Taxol(10mg/kg、図3と同じレジメン)で又はビヒクルで処置されたマウスにおけるMDA-MB-231 GFP対照異種移植腫瘍からのFFPE切片であって、DAPI(青色)と共に、内因性発現pan-Mena(緑色)及びMenaINV(赤色)について染色された切片の代表画像。スケールバー=200μm。(B)ビヒクル又はタキソールで処置された腫瘍におけるMena及びMenaINV蛍光シグナル強度の平均値。3匹の異なるマウスからの、1腫瘍当たり10視野についての平均値±SEMとして提示されたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、* p<0.05。
【図５】EGFR及びMET阻害剤に対する応答と遺伝子発現の相関についてのPCA分析プロットを示す図である。Y軸は、EGFR阻害剤に対する感受性(陽性数)又は耐性(陰性数)とのCCLEにおける細胞株にわたっての相対的なmRNAレベルの相関を示し、その一方でX軸は、MET阻害剤に対する感受性又は耐性との相関を示す。各々の応答型と最も高度に相関した遺伝子が示されている。全てのヒト遺伝子のうち、Mena(青色で示されている)は、mRNA発現レベルとEGFR阻害剤及びMET阻害剤両方に対する耐性に関して最大の相関を示す。これらのデータは、遺伝子発現のマイクロアレイ評価に基づくものであり、したがって、個々のMena mRNAアイソフォームの発現を区別することができないことに留意されたい。
【図６】MenaINV mRNAレベルにより乳がん患者における転帰が予測されることを示す図である。1060の乳がんTCGAコホートからの生RNAseqデータを、構成的Mena配列の存在量を決定するために、及びINVエクソンの存在量について(MenaINVレベルを測定するために)、分析した。Mena発現に基づく患者の上位及び下位四分の一は、生存率(左側)の差がないことを示す。MenaINV発現により、患者の上位四分の一は、MenaINVの3つ併せた下位の四分一(右のパネル)と比較して有意に低下した生存率を示す。
【図７】10年を超えて(> 10yr)経過観察しているTCGA乳がん患者における生存率分析の図である。MenaINV mRNAレベルにより、>10yrである乳がん患者における転帰が予測される(左側パネル)が、Menaレベルによっては予測されない(右側パネル)。
【図８】4つ全てのMenaINV四分位に関する、>10yr経過観察しているTCGA乳がん患者における生存率分析の図である。MenaINV mRNAレベルの各四分位の患者により、>10yr経過観察している乳がん患者の転帰が予測される。
【図９】MenaINVによるリンパ節転移陰性患者における生存率分析の図である。MenaINVにより、>5yr経過観察している者はもちろん、全TCGA乳がんコホート内のリンパ節転移陰性乳がん患者に関しても、生存率が予測される。
【図１０】乳がん患者における疾患再発及び全生存率とMenaINVタンパク質レベルを相関させる図である。アイソフォーム特異的抗MenaINV抗体を使用して、300の患者TMAを染色した。MenaINVレベルを定量し、平均した(患者1名につき2〜3ポイント)。(A)は、MenaINVによる患者の最も下の四分位が、3つのより上側の四分位の各々と比較して生存率が増加したことを示す。(B)は、MenaINV発現の各四分位における疾患が再発した患者の割合を示す。(C)は、MenaINVレベルが、再発した患者におけるほうが有意に高いことを示す。(D)フィブロネクチン(FN)及び核(DAPI)についての染色を伴う、各四分位におけるMenINVの代表画像。
【図１１】Mena11a発現が上皮組織及び上皮様がん細胞株に限定されることを実証する図である。(A)Menaドメイン及び相互作用パートナー。EVH1ドメインは、「(F/L)PXΦP」コンセンサスモチーフ(ここでのXは任意の残基であり、Φは疎水性残基である)を有する結合部位を含有するタンパク質及びTesを有する結合部位を含有するタンパク質(前記モチーフのないタンパク質)と相互作用する。プロリンリッチ領域は、プロフィリンに対する並びにSH3及びWWドメインを含有するタンパク質に対する高親和性結合部位を有し、EVH2ドメインは、G-アクチン結合部位(GAB)、F-アクチン結合部位(FAB)、及び四量体化を媒介するC末端コイルドコイル(CC)を含有する。Menaは、腫瘍進行に関与する、選択的スプライシングを受けた幾つかのエクソンを有し、α5インテグリンと直接相互作用する「LERERリピート」の次にINVエクソンを含み、FABとCCの間に11aエクソンを含む。(B)ヒト乳がん細胞株(MCF7、T47D、SKBR3、BT474、MDA-MB-231)のパネルにおける及びMTLn3細胞における内因性Mena11a及びpan-Mena発現のウェスタンブロット分析。(C)マウスE15.5真皮、(D)マウスE15.5肺上皮、(E)成体マウス上皮、(F)成体マウス気管支肺胞上皮、(G)成人ヒト結腸、(H)MMTV-PyMT Mena-/-マウスからの原発性乳房腫瘍切片における、Mena11a及びpan-Menaの免疫蛍光。(C)〜(H):DNAをHoechst染色で可視化した。3つの独立した実験を代表する画像。スケールバー、20μm。
【図１２】Mena11a発現が、がん患者により良好な予後をもたらすことを示す図である。(A)腺腫ステージと(B)早期癌ステージ両方のMMTV-PyMTトランスジェニックマウスからの原発性乳房腫瘍におけるpan-Mena及びMena11aの免疫蛍光。Hoechst染色で可視化されたDNA。スケールバー、20μm。画像は、3つの独立した実験の代表である。(C)COAD患者コホートにおける転移ステージとMenaCalc間の関連。MO=遠隔転移の証拠なし、M1=遠隔転移の証拠。患者n=453。エラーバー:95%CI。ウィルコクソンの順位和検定 ***p<0.005。図11も参照されたい。(D)COADコホートにおけるMenaCalc、Mena及びMena11aと相関関係がある上位50遺伝子のGOターム濃縮カテゴリー。
【図１３】Mena11a発現が結合部の完全性を維持することを示す図である。(A)〜(E):MCF7細胞。(A)内在性ZO-1及びMena11a局在化を示す免疫蛍光。スケールバー、10μm。(B)内在性E-カドヘリン及びMena11a局在化を示す免疫蛍光。スケールバー、10μm。(C)ウェスタンブロット分析。抗Mena11a及び抗pan-Mena抗体でプローブした膜。負荷対照アルファチューブリン。(D)濃度測定により判定した、Mena11a:アルファチューブリンの相対比の定量分析。発現の倍率変化は、適切な対照に対するものである。エラーバー:SEM。結果は、三重反復実験の代表である。(E)(左側パネル)2つの異なるshRNAs(sh-1、sh-2)及び対照shRNAs(sh-1C)を使用して、アイソフォーム特異的にMena11aがノックダウンされたMCF7細胞におけるE-カドヘリン局在化を示す、3D-SIM画像。ファロイジンで標識することにより可視化されたF-アクチン。挿入図:倍率7倍。スケールバー、10μm。(F)(右側パネル)結合部のE-カドヘリンの定量。a.u.=任意単位。分析した細胞>30個。エラーバー:SEM。結果は、三重反復実験の代表である。一元配置ANOVA *p<0.05。n.s.、有意でない。
【図１４】Mena11a発現が細胞間結合部完全性を維持することを示す図である。(A)結合部形成を刺激するために培養培地にCaCl2を添加した3時間後にE-カドヘリンについて免疫染色された、EGFP-Mena11aを安定的に発現するマウス表皮ケラチノサイトの免疫蛍光。ファロイジンで標識することにより可視化されたF-アクチン。挿入図:倍率7倍。この挿入図は、接着結合部へのMena11a局在化を明示している。スケールバー、10μm。(B)Mena11a及びpan-Mena抗体を使用する、MCF7細胞におけるMena11a特異的な安定的ノックダウンの免疫蛍光。青色の空間充填GFPは、Mena11aノックダウンプラスミドを含有する細胞を示す。スケールバー、10μm。挿入図:倍率3倍。Mena11aダウンレギュレーションは、Menaタンパク質レベル及び接着点への局在化に影響を与えない。(C)2つの異なるshRNAs(sh-1、sh-2)及び対照shRNAs(sh-1C)を使用する、アイソフォーム特異的にMena11aがノックダウンされたMCF7細胞におけるZO-1の3D-SIM画像。ファロイジンで標識することにより可視化されたF-アクチン。挿入図:倍率7倍。スケールバー、10μm。
【図１５】Mena11aダウンレギュレーションが泳動、形態及び膜突出に影響を与えることを示す図である。(A)、(E):2つの異なるshRNAs(それぞれ、sh-1、sh-2)及び対照shRNAs(sh-1C、sh-2C)を使用する、安定的にアイソフォーム特異的にMena11aがノックダウンされた(A)T47D及び(E)SKBr3細胞からの溶解物のウェスタンブロット分析。抗pan-Mena及び抗Mena11a抗体でプローブした膜。アルファチューブリンを負荷対照として使用した。(B)、(F):(B)T47D及び(F)SKBr3対照細胞並びにMena11a特異的ノックダウン細胞において濃度測定により判定した相対Mena11a:アルファチューブリン比の定量的分析。発現の倍率変化は、適切な対照に対するものである。エラーバー:SEM、結果は三重反復実験の代表である。(C)、(D)、(I)、(J):T47D対照(sh-1C、sh-2C)細胞及びMena11a特異的ノックダウン(sh-1、sh-2)細胞を使用する、創傷治癒アッセイ。(C)完全培地中、0及び48時間後の細胞のDIC画像。スケールバー、50μm。(D)完全培地中、48時間後の細胞のギャップ閉鎖パーセント。(G)、(H):SKBr3対照(sh-1C、sh-2C)細胞及びMena11a特異的ノックダウン(sh-1、sh-2)細胞を使用する、創傷治癒アッセイ。(K)、(L):100ng/mlのニューレグリン1で刺激された、MCF7対照細胞及びMena11a特異的ノックダウン細胞。(D)、(H)、(J)、(L)における定量的結果は、三重反復実験の代表であり、エラーバーは、SEMを表す。対応のないt検定、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.005。(G)完全培地中、0及び24時間後の細胞のDIC画像。スケールバー、50μm。(H)完全培地中、24時間後の細胞のギャップ閉鎖パーセント。(I)細胞の形態。24時間後のギャップの自由縁のDIC画像。スケールバー、50μm。挿入図は、倍率9倍である。(J)細胞の形態計測分析。24時間後のギャップの自由縁のDIC画像。真円度の箱ひげ図;分析した細胞>470個。(K)膜突出動態;分析した細胞>22個。(L)刺激後t=7分の時点での対照及びMena11a特異的ノックダウン細胞の膜突出;分析した細胞>22個。
【図１６】Mena11aホモ四量体がMVD7細胞の糸状仮足の先端を標的にし、糸状仮足形成を減少させることを示す図である。(A)GFP、Mena又はMena11aを発現するMVD7細胞並びにMCF7細胞からの溶解物のウェスタンブロット。膜を抗pan-Mena及びGFP抗体でプローブした。アルファチューブリンが負荷対照として使用されている。(B)伸展アッセイ(20μg/mlのラミニン上に播種されたMVD7細胞)の免疫蛍光。示されている3つの伸展表現型は、滑らかな辺縁(左側パネル)、波打つ辺縁(中央パネル)及び糸状仮足のもの(右側パネル)である。ファロイジンで標識することにより可視化されたF-アクチン。スケールバー、10μm。(C)EGFP-Mena(左側パネル)及びEGFP-Mena11a(右側パネル)を発現する伸展MVD7細胞の免疫蛍光。ファスシン抗体が糸状仮足マーカーとして使用されている。スケールバー、10μm。EGFP-Mena MVD7細胞についての倍率10倍の挿入図は、糸状仮足の先端へのMenaの局在化を示す。EGFP-Mena11a MVD7細胞についての倍率11倍の挿入図は、糸状仮足の先端へのMena11aの局在化を示す。(D)糸状仮足表現型を有する、GFP、Mena及びMena11aを発現する伸展MVD7細胞のパーセント。結果は、>930個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。エラーバーはSEMを示す。一元配置ANOVA *p<0.05、**p<0.01。n.s.:有意でない。
【図１７】Mena11aの発現が、Arp2/3存在量を減少させ、最先端でのF-アクチン構築を変化させ、リステリア属(Listeria)尾部伸長を低減させることを示す図である。(A)MVD7 EGFP-Mena細胞におけるEGFP-Mena(上段)及びMVD7 EGFP-Mena11a細胞におけるEGFP-Mena11a(下段)の3D-SIM画像。ファロイジン染色は、F-アクチンを示す。スケールバー、10μm。赤色の矢じり:Mena及びMena11aが葉状仮足の最先端に正しく局在している。(B)100ng/ml PDGF-BBで5分間刺激した、GFP、Mena及びMena11aを発現するMVD7細胞におけるアクチン細胞骨格の白金レプリカEM。スケールバー、250nm。(C)100ng/ml PDGF-BBで180秒間刺激した、GFP、Mena及びMena11aを発現するMVD7細胞における内在性p34Arcの3D-SIM画像。ファロイジン染色により可視化されたF-アクチン。スケールバー、10μm。挿入図は、倍率28倍である。(D)細胞辺縁からの距離の関数としてプロットされた、p34Arcの正規化画素強度(平均値±SEM)。結果は、>30個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。(E)、(G)、(H):エラーバー:SEM。結果は、三重反復実験の代表である。一元配置ANOVA ***p<0.005。n.s.、有意でない。(E)最先端から最初の0.65μmのp34Arc蛍光強度和の定量。a.u.=任意単位。分析した細胞>30個。(F)〜(H):リステリア属に感染した、GFP、Mena及びMena11aを発現するMVD7細胞。(F)F-アクチン及びDNAを可視化するためにそれぞれファロイジン及びHoechstで染色された細胞。スケールバー、10μm。挿入図は、倍率9倍である。(G)リステリア属により誘導されたF-アクチン尾部形成のパーセント;分析した細菌>540個。(H)>540個の細胞におけるリステリア属のF-アクチン尾部長。
【図１８】Mena11a発現は葉状仮足の動態を変調させるが、EGFR活性化及び最先端へのラメリポディン動員は影響を受けないことを示す図である。(A)GFP(対照)、Mena、Mena11a及びMena11a S>Aを安定的に発現するMTLn3細胞のウェスタンブロット分析。膜を抗pan-Mena及び抗GFP抗体でプローブした。アルファチューブリンが負荷対照として使用されている。(B)0.5nM EGF刺激後の、GFP、Mena又はMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞の膜突出動態。エラーバーはSEMを示す。(C)0.5nM EGF刺激後、t=180秒の時点での、GFP、Mena又はMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞の膜突出。箱の中心線は中央値を示し、上は第3四分位値を示し、下は第1四分位値を示す。ひげは、90及び10パーセンタイルを表す。エラーバーはSEMを表す。>90個の細胞を分析した三重反復実験からの結果。一元配置ANOVA **p<0.01。(D)5nM EGFで刺激中の、GFP及びMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞についての個々の突出事象の速度の箱ひげ図。箱の中心線は中央値を示し、上は第3四分位値を示し、下は第1四分位値を示す。ひげは、10及び90パーセンタイルを表す。MTLn3-GFP細胞についてのデータは、112の突出事象に由来し、MTLn3 EGFP-Mena11aについてのデータは、90の突出事象に由来する。n.s.:有意でない。(E)〜(F)(上のパネル):GFP、Mena及びMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞のウェスタンブロット分析。細胞を4時間飢餓させ、その後、0、0.5、1、2、3及び5分間、5nM EGFで刺激した。膜を(E)抗EGFR pY1068及び(F)抗EGFR pY1173でプローブした。負荷対照として使用したGAPDH。(下のパネル):濃度測定により決定される(E)EGFR pY1068/GAPDHの相対比及び(F)EGFR pY1173/GAPDHの相対比の濃度測定。倍率増加は、ベースライン(EGF刺激なし)に対するものである。パネルE〜F:Mena11a発現は、EGFR活性化状態に有意な影響を与えない。(G)5nM EGFで180秒間刺激した後の、GFP、Mena11aを安定的に発現するMTLn3細胞における内在性ラメリポディン(Lpd)の免疫蛍光。ファロイジンで標識することにより可視化されたF-アクチン。スケールバー、10μm。(H)GFP、Mena及びMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞の最先端から最初の0.65μmのラメリポディン(Lpd)蛍光強度和の定量。a.u.=任意単位。エラーバー:SEM。結果は、>30個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。一元配置ANOVA。n.s.:有意でない。(I)細胞辺縁からの距離の関数としてプロットされた、Lpdの正規化画素強度(平均値±SEM)。結果は、30個超の細胞を分析した三重反復実験の代表である。パネルG〜Iは、Mena11a発現が、突出している葉状仮足の最先端へのLpd動員に有意な影響を与えないことを示す。
【図１９】Mena11a発現が膜突出及びArp2/3の最先端への動員を減弱することを実証する図である。(A)〜(C)、(F)〜(H):5nM EGFで刺激された、GFP、Mena及びMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞。(A)刺激中の膜突出のDIC画像。白色の矢じり:葉状仮足の突出。突出はMena細胞では明らかであるが、Mena11a細胞では減弱される。(B)EGF刺激後の細胞の膜突出動態。エラーバー:SEM。(C)t=180秒後の膜突出。エラーバー:SEM。結果は、>90個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。一元配置ANOVA **p<0.01、***p<0.005。(D)300秒間刺激したMTLn3 GFP及びMTLn3 GFP-Mena11a細胞のタイムラプス動画からのキモグラフ。キモグラフは、葉状仮足の活動を明示する;辺縁の上昇する輪郭は突出を表し、その一方で下降するものは引っ込みを表す。(E)刺激中の個々の突出時間(左側)及び突出持続時間(右側)を定量する箱ひげ図。MTLn3 GFP細胞についてのデータは、112の突出事象からのものであり、MTLn3 GFP-Mena11a細胞についてのデータは、90の突出事象からのものである。対応のないt検定 ***p<0.005。(F)180秒間の刺激後の内在性p34Arcの免疫蛍光。ファロイジンで標識することによりF-アクチンが可視化されている。スケールバー、10μm。挿入図(倍率33倍)は、p34Arcの最先端を示す。(G)細胞辺縁からの距離の関数としてプロットされた、p34Arcの正規化画素強度(平均値±SEM)。結果は、>50個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。(H)細胞の最先端から最初の0.65μmのp34Arc蛍光強度和の定量。a.u.、任意単位。エラーバー:SEM。結果は、>50個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。一元配置ANOVA *p<0.05、**p<0.01、***p<0.005。
【図２０】Mena11a発現が最先端のF-アクチン反矢じり端へのG-アクチンの組込みを減少させることを示す図である。全ての実験は、GFP、Mena及びMena11aを安定的に発現するMTLn3細胞を用いて行った。(A)、(D)、(G):(A)60秒間の0.5nM EGF、(D)60秒間の5nM EGF、及び(G)180秒間の5nM EGFでの刺激後の反矢じり端組込み。ローダミン・G-アクチン及びファロイジンで標識することでそれぞれ可視化された反矢じり端及びF-アクチン。スケールバー、10μm。倍率(A)27倍、(D)31倍及び(G)25倍の挿入図は、最先端における反矢じり端分布を示す。(B)、(E)、(H):(B)60秒間の0.5nM EGF、(E)60秒間の5nM EGF、及び(H)180秒間の5nM EGFでの刺激後の、最先端における反矢じり端の相対数の定量。エラーバー:SEM。結果は、(B)及び(E)については>30個の細胞、(H)については>50個の細胞を分析した三重反復実験の代表である。一元配置ANOVA **p<0.01、***p<0.005。n.s.有意でない。(C)、(F)、(I):(C)60秒間の0.5nM EGF、(F)60秒間の5nM EGF、及び(I)180秒間の5nM EGFでの刺激後の、細胞辺縁からの距離の関数としてプロットされた、反矢じり端の相対数の正規化画素強度(平均値±SEM)。
【図２１】Mena11aセリンリン酸化部位の特徴を明らかにする図である。(A)60秒間の5nM EGF刺激後のMTLn3溶解物からのEGFP-Mena11aの免疫沈降(IP)/タンデム質量分析(MS/MS)戦略。(B)リン酸化ペプチドSPVISRRDsPRKのMS/MSスペクトル(ピークの詳細が拡大表示されている)。-H3PO4で標識されたイオンは、リン酸のニュートラルロスを示す。「b」及び「y」イオン系列は、それぞれ、ペプチドのN末端及びC末端を含有する断片イオンを表す。(C)リン酸化ペプチドのMS/MSスペクトル。-H3PO4で標識されたイオンは、リン酸のニュートラルロスを示す。(D)Mena11a及びMena11a S>A変異体を安定的に発現するMTLn3細胞であって、300秒間、5nM EGFで刺激されたMTLn3細胞の、タイムラプスDIC動画からのキモグラフ。キモグラフは、葉状仮足の活動を明示する;辺縁の上昇する輪郭は突出事象を表し、辺縁の下降する輪郭は引っ込み事象を表す。(E)5nM EGFで刺激されているときにMena11a及びMena11a S>A変異体を安定的に発現するMTLn3細胞についての個々の突出事象の時間、持続性及び速度の箱ひげ図。箱の中心線は中央値を示し、上は第3四分位値を示し、下は第1四分位値を示す。ひげは、10及び90パーセンタイルを表す。90の突出事象からのデータ;対応のないt検定 ***p<0.005、n.s.:有意でない。
【図２２】Mena11aにおけるセリンリン酸化部位がその機能を調節することを実証する図である。(A)種にわたってのMena11aタンパク質配列のアラインメント。青色:11a挿入配列内の保存されたセリン3。(B)〜(I):5nM EGFでの刺激された、Mena11a及びMena11a S>A変異体を安定的に発現する、MTLn3細胞。(B)刺激中の膜突出のDIC画像。矢じりは、Mena11a細胞における膜突出減弱、Mena11a S>A変異細胞における葉状仮足突出を示す。(C)(上):>195個の細胞の膜突出動態。(下):刺激後t=180秒の時点でのもの。対応のないt検定**p<0.01。(D)60秒間刺激後の細胞内への反矢じり端組込み。ローダミン・G-アクチン及びファロイジンで標識することでそれぞれ可視化された反矢じり端及びF-アクチン。スケールバー、10μm。倍率38倍の挿入図は、最先端における反矢じり端分布を示す。(E)60秒間刺激後の>20個の細胞における最先端の反矢じり端の相対数の定量。対応のないt検定、n.s.有意でない。(F)60秒間刺激後の細胞についての細胞辺縁からの距離の関数としてプロットされた反矢じり端の相対数の正規化画素強度(平均値±SEM)。(G)180秒間刺激後の細胞における内在性p34Arcの免疫蛍光。F-アクチンがファロイジン染色で可視化されている。スケールバー、10μm。倍率48倍の挿入図は、最先端へのp34Arcの局在化を示す。(H)>40個の細胞の最先端から最初の0.65μmのp34Arc蛍光強度和の定量。a.u.=任意単位。対応のないt検定、n.s.、有意でない。(I)>40個の細胞を分析して、細胞辺縁からの距離の関数としてプロットされた、p34Arcの正規化画素強度(平均値±SEM)。(C)、(E)、(F)、(H)、(I):三重反復実験での結果。エラーバーはSEMを表す。
【図２３】MenaINV mRNAの核酸配列(配列番号1)の図である。非コード配列は小文字で示されており、コード配列は大文字であり、INV特異的配列には下線付きである。
【図２４】INVエクソンの核酸配列(配列番号2)の図である。
【図２５】INVエクソンによりコードされているタンパク質配列(配列番号3)の図である。
【図２６】表1:COADコホートにおけるMenaCalc、Mena及びMena11aと相関関係がある上位50遺伝子のGSEAの図である。
【図２７】表2:COADコホートにおけるENAH(Mena)、Mena11a及びMenaCalcと相関関係がある上位50遺伝子の図である。
【図２８】乳がんの際のMena発現及びパクリタキセル耐性を検査する図である。TCGA乳がんコホート(患者1060名からのデータ)における、並びにサブタイプHER2+、ER+/HER2-又はTNBC毎の、Mena(A)及びMenaINV(B)レベルのRPKM。(C)MenaINV発現を腫瘍コンパートメントにおける任意単位での蛍光強度により測定した、300の患者腫瘍マイクロアレイにより測定されたMenaINV発現。(D)抗Mena及び抗チューブリン抗体でプローブした乳がん細胞株MDA-MB 175IIV及びT47D(ルミナルA)、MDA-MB 453(HER2+)、MDA-MB 436、BT-549、LM2、SUM159、MDA-MB 231及びBT-20(TNBC)のパネルから調製した溶解物についての図29Aからの全ウェスタンブロット画像。分析しなかった細胞株からの溶解物を含有する2レーン(3及び4)は、ブロットから外した。(E)shCtrl又はshMenaを安定的に発現するT47D細胞におけるMena発現についてのウェスタンブロット。ドキソルビシン(F)又はシスプラチン(G)での72時間の処置後、231-対照、231-Mena又は231-MenaINV細胞の細胞生存率を、Prestoblueアッセイを使用して測定した。生存率が未処置細胞に対する割合として表されている。各々2回ずつ行った3つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。ウェルチ補正を用いて対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図２９】MENAアイソフォームの発現がパクリタキセル耐性に関連していることを実証する図である。(A)抗MENA及び抗チューブリン抗体(n=3)でプローブした乳がん細胞株MDA-MB 175IIV及びT47D(ルミナルA、四角)、MDA-MB 453(HER2+、三角)、MDA-MB 436、BT-549、LM2、SUM159、MDA-MB 231及びBT-20(TNBC、丸)のパネルから調製した溶解物についての代表ウェスタンブロット。MENA発現レベルを、80kDaバンドの強度を測定することにより評価した。(B)72時間の時点での細胞生存率を(A)の場合と同じ細胞株について評価したものであり、n=3にわたっての平均用量反応を示す。(C)MENAタンパク質発現(A)とパクリタキセル効力(ここでは(B)(n=3)における用量反応曲線下面積の逆数と定義した)との線形相関。(D)Prestoblueアッセイを使用して決定された、パクリタキセルでの72時間の処置後のShCtrl又はShMENAを発現するT47D細胞の細胞生存率。(E)Prestoblueアッセイを使用して判定して、パクリタキセルでの72時間の処置後の231-対照、231-MENA又は231-MENAINV 細胞の細胞生存率を評価した。生存率が未処置細胞に対する割合として表されている。各々2回ずつ行った3つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。ウェルチ補正を用いて対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３０】MENA又はMENAINVの発現が、in vivoで腫瘍増殖に対するパクリタキセルの効果を弱めることを例証する図である。(A) NOD SCIDマウスの乳房脂肪体内への231-対照、231-MENA又は231-MENAINV細胞の注射により腫瘍を発生させた。腫瘍が直径1cmに達したら、マウスを5日毎に10mg/kg IPでの3用量のパクリタキセルで処置した。腫瘍体積を処置前及び後に測定した。(B)異なるGEPタグ付きMENAアイソフォームを発現する腫瘍についてのパクリタキセルでの処置後の腫瘍体積の相対変化。各群における少なくとも9匹のマウスの平均値±SEMとして提示されたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。(C)ビヒクル又はパクリタキセルで処置され、増殖マーカーKi67について染色された(緑色)、231-対照、231-MENA及び231-MENAINVからの腫瘍切片の代表画像。スケールバーは100μmである。(D)パクリタキセルで処置された及び処置されていない、231-対照、231-MENA及び231-MENAINV腫瘍におけるKi67染色強度の定量。(E)ビヒクル又はパクリタキセルで処置され、アポトーシスマーカー切断カスパーゼ3(CC3)について染色された(緑色)、231-対照、231-MENA及び231-MENAINVからの腫瘍切片の代表画像。スケールバーは100μmである。(F)パクリタキセルで処置された及び処置されていない、231-対照、231-MENA又は231-MENAINV腫瘍におけるCC3染色強度の定量。各群における3匹のマウスの腫瘍1つにつき少なくとも5視野に関する平均値±SEMとして提示されたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３１】パクリタキセル処置がin vitroで細胞速度を低下させることを実証する図である。(A)コラーゲン(0.1mg/ml)が塗布されたガラス底の皿の上に播種され、異なる濃度のパクリタキセルで処置された、対照、Mena及びMenaINV細胞の速度。2つの独立した実験において追跡した少なくとも50個の細胞についての平均値±SEMとして提示されたデータ。ウェルチ補正を用いて対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３２】パクリタキセル処置が、マウスにおけるMENAINVにより駆動される腫瘍細胞の運動性及び播種に影響を与えないことを実証する図である。(A)MENA、MENAINV又は対照を発現する腫瘍におけるマルチフォトン生体内イメージングによる運動性細胞の定量。パクリタキセル又はビヒクルで処置されたマウスにおける腫瘍増殖。1条件につき少なくとも3匹のマウスからプールされたデータであって、マウス1匹につき少なくとも2視野に関する平均値±SEMとして提示されたデータ。(B)注射の12週間後に231-対照、231-MENA又は231-MENAINV腫瘍を担持するマウスから採取された培養骨髄におけるコロニーの数に対応する播種性腫瘍細胞の数。(C)ビヒクル又はパクリタキセルで処置された、対照、231-MENA又は231-MENAINV腫瘍を担持するマウスからのH&E染色された肺の代表画像。スケールバーは100μmである。(D)注射の12週間後の対照、231-MENA又は231-MENAINV腫瘍を担持するマウスの肺における転移の数。1群当たり少なくとも3匹のマウスについての平均値±SEMとして提示されたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３３】パクリタキセル処置がin vitro及びin vivoでの高いMENA発現を選定することを実証する図である。(A)100nMのパクリタキセルで又はビヒクルとしてのDMSOで72時間処置され、抗MENA及び抗GAPDH抗体でプローブされた、複数の乳がん細胞株から調製された、全細胞溶解物の代表ウェスタンブロット。画像は全てが同じブロットからのものとは限らない。(B)DMSOでの処置後に対する100nMのパクリタキセルでの処置後の内因性MENAレベルの定量。3つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。(C)ドキソルビシンで72時間処置された231-対照、231-MENA又は231-MENAINV細胞のGFP発現レベルのFACS分析。数字は、231-対照細胞に対するGFPシグナルの倍率変化を示す。(D)パクリタキセルで処置されたマウスにおいて増殖した231-対照腫瘍からのFFPE切片であって、MENA(緑色)、MENAINV(赤色)及びDAPI(青色)について染色された切片の代表画像。スケールバー=200μm。MENA(E)及びMENAINV(F)蛍光シグナル強度の平均値。3匹の異なるマウスからの、1腫瘍当たり10視野についての平均値±SEMとして提示されたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、*p<0.05。
【図３４】Menaアイソフォームにより駆動されるタキサン耐性が薬物排出、FAシグナル伝達に起因しないことを実証する図である。(A)MDR1阻害剤HM30181と共に又はなしでパクリタキセルにより72時間の間処置された231-対照又は231-MenaINV細胞の生存細胞の割合。各々2回ずつ行った3つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。(B)100nMのタキソールでの72時間の処置後の、231-対照、231-Mena、231-MenaINV、231-MenaΔLERER又は231-MenaINVΔLERERの生存細胞の割合。各々2回ずつ行った2つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。ウェルチ補正を用いて対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３５】Menaアイソフォームにより駆動されるタキサン耐性が細胞周期の進行に影響を与えることを実証する図である。16時間の間、10nM又は100nMのパクリタキセルで処置された、231-対照(A)、231-Mena(B)及び231-MenaINV(C)細胞の細胞周期分析。2つの独立した実験についての平均値±SEMとして提示されたデータ。成功した細胞分裂前、中又は後の、ビヒクル又は10nMパクリタキセルで処置された231-対照(D)、231-Mena(E)及び231-MenaINV(F)の代表透過光画像。スケールバーは、2μmである。(G)ビヒクル又は10nMパクリタキセルで処置された細胞が、細胞分裂中、母細胞が丸くなるときから娘細胞が接着するときまでに費やした時間の定量。(H)ビヒクル又は10nMパクリタキセルで処置された231-対照、231-Mena、231-MenaINV細胞についての、2個の生存娘細胞をもたらす成功した細胞分裂のパーセントの定量。3つの独立した実験からプールされた平均値±SEMとして提示されたデータ。ウェルチ補正を用いて対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３６】Mena発現がMT長を変化させることを実証する図である。パクリタキセル(10nM)で24時間処置され、チューブリン(赤色)及びDAPI(青色)について免疫染色された、231-対照(A)及び231-MenaINV(B)細胞の代表画像。スケールバーは、4μmであり、挿入図については0.5μmである。(C)ビヒクル(0.01%DMSO)又は10nMパクリタキセルで24時間処置された231-対照、231-Mena又は231-MenaINV細胞におけるMT長の定量。1実験当たり少なくとも5個の細胞を分析した3つの別々の実験からプールされたデータ。平均±SEMとして提示されたデータ。一元配置ANOVAにより決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３７】MENA発現がパクリタキセル処置中にMT動態を変化させることを実証する図である。パクリタキセル(10nM)で24時間処置され、Glu-チューブリン(赤色)及びチロシン化又はTyr-チューブリン(緑色)について免疫染色された、231-対照(A)及び231-MENAINV(B)細胞の代表画像。スケールバーは、1μmであり、挿入図については0.25μmである。(C)ビヒクル(0.01%DMSO)又は10nMパクリタキセルで24時間処置された231-対照、231-MENA又は231-MENAINV細胞におけるTyr-MTに対するGlu-MTの比の定量。平均±SEMとして提示されたデータ。1実験当たり少なくとも8個の細胞を分析した3つの別々の実験からプールされたデータ。一元配置ANOVAにより決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３８】MENAアイソフォームがMAPKシグナル伝達を増加させることによりパクリタキセルに対する耐性を付与することを実証する図である。(A)ビヒクル(0.01%DMSO)又は10若しくは100nMパクリタキセルで72時間処置された231-対照、MENA又はMENAINV細胞におけるpERK Y204についての代表ウェスタンブロット。負荷対照は、GAPDHである。(B)Aに示されているウェスタンブロットの、GAPHに対するpERKについての定量。4つの実験(1実験当たり2回の技術的反復)からプールされたデータ。231-対照(C)、231-MENA(D)及び231-MENAINV(E)細胞を様々な濃度のMEKi PD0329501及びパクリタキセルで72時間処置し、その後、細胞数を測定した(各プレートについての最大細胞数に対する割合として、数値及びヒートマップとして示した)。(F)ビヒクル(0.01% DMSO)、10nMパクリタキセル、0.1μM PD0329501を単独で又は組み合わせて用いて72時間処置された231-MENAINV細胞のpERK Y204についての代表ウェスタンブロット。負荷対照は、GAPDHである。(G)ビヒクル(0.01% DMSO)、10nMパクリタキセル、0.1μM PD0329501を単独で又は組み合わせて用いて24時間処置され、脱チロシン化又はGlu-チューブリン(赤色)及びチロシン化又はTyr-チューブリン(緑色)について免疫染色された、231-MENAINV細胞の代表画像。スケールバーは、1μmであり、挿入図については0.25μmである。(H)ビヒクル(0.01%DMSO)又は10nMパクリタキセルで24時間処置された231-MENAINV細胞におけるTyr-MTに対するGlu-MTの比の定量。1実験当たり少なくとも8個の細胞を分析した3つの別々の実験からプールされたデータ。平均±SEMとして提示されたデータ。一元配置ANOVAにより決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図３９】パクリタキセルに対するMenaにより駆動される耐性にはAktシグナル伝達が関与しないことを実証する図である。(A)10又は100nMパクリタキセルで72時間処置された231-対照、231-Mena及び231-MenaINVから得られた溶解物の、全ERKについて免疫染色された代表ウェスタンブロット。(B)GAPHに対するERKについてのウェスタンブロットの定量。(C)10又は100nMパクリタキセルで72時間処置された231-対照、231-Mena及び231-MenaINVから得られた溶解物の、pAkt473について免疫染色された代表ウェスタンブロット。(D)GAPHに対するpAkt473についてのウェスタンブロットの定量。(E)10又は100nMパクリタキセルで72時間処置された231-対照、231-Mena及び231-MenaINVから得られた溶解物の、全Aktについて免疫染色された代表ウェスタンブロット。(F)GAPHに対する全Aktについてのウェスタンブロットの定量。少なくとも3つの実験(1実験当たり2回の技術的反復)からプールされたデータ。対応のないt検定により決定された統計値。ここで、***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05。
【図４０】MenaINV及びフィブロネクチンの高発現が、ヒト腫瘍及び再発の点で転帰不良に関連することを実証する図である。示されている通りの(Q1は最高発現を有し、Q4は最低発現を有した)、Mena(41A)又はMenaINV(41B)mRNAレベルの四分位毎にビニングされた乳がん患者の生存率のカプラン・マイヤー曲線(リンパ節転移陰性患者サブグループに関して同様の結果が図40Eに示されている)。データは、128の乳がん症例と>10年の経過観察BRCA TCGAデータセット(図40A〜40Dにおける患者1060名のコホート全体からのデータ)からのものである。ログランクマンテル・コックス検定により算出された有意性、ログランク検定により算出されたハザード比、傾向についてのログランク検定により算出されたpTrend(方法を参照されたい)。(41C)乳がん患者(10年経過観察している患者)におけるMena又はMenaINVと死亡までの時間との関係を評価するために行ったコックス回帰。(41D)乳がん患者(10年経過観察している患者)におけるMena又はMenaINVと生存率との関係を評価するために行ったロジック回帰。(40F、40G、40H)Mena及びMenaINV発現は両方とも、FN及びα5と有意に相関している、すなわち、自分の疾患に屈した患者において有意に相関している。(41E)Mena(赤色)及びMenaINV(緑色)について染色されたPyMT-MMTV腫瘍の代表画像。スケールバー=20μm。(41F)MenaINV(緑色)及びインテグリンα5(赤色)について染色されたPyMT-MMTVの代表画像。Eと同じスケール。(41G)野生型PyMT腫瘍FN(赤色)、MenaINV(緑色)及び核(DAPI染色)からの代表画像。スケールバー=100μm。(41H)MenaINVとコラーゲンFN強度間の相関。各ドットが個々の領域を表す、4匹のPyMTマウスからの50超の領域からのデータ。(41I)高レベルのMenaINV(緑色)及びFN(赤色)を有する組織マイクロアレイからの腫瘍スポットの代表画像。(41J)全患者コホートにおけるFN染色とMenaINV染色間の相関(同様に、(40I)は、TMAによるより高いMenaINVレベルが転帰不良と有意に相関することを実証する)。(41K)再発した又はしていない患者を比較する、乳がん患者300名におけるMenaINV発現。データは、平均+/-SEMを示す。(40K、40K)MenaINV発現の平均4.6倍増加は、再発した患者数の2倍増加と相関した。(41L)低いMenaINVに対して高いMenaINV、低いFNに対して高いFN、又は低いMenaINV+FNに対して高いMenaINV+FNを有する患者における、月数での無再発時間中央値及び対応するp値を示す表。ログランクマンテル・コックス検定により算出された有意性。データは、平均値±SEM、一元配置ANOVAによる有意性、*p<0.5、**p<0.01、***p<0.005を示す。
【図４１】上記図40の説明の欄参照。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
Menaタンパク質は、腫瘍細胞浸潤及び転移、アクチン重合、接着及びEGF誘発運動応答にとって重要である、複数のプロセスを介して作用する。高遊走性且つ浸潤性の腫瘍細胞亜集団は、選択的スプライス型のMena、例えば、Mena11a及びMenaINVを含有するmRNAを産生する。抗体を使用するMena/MenaINVレベルの測定、又はmRNAの検出により、がん患者がタキサンに基づく化学療法に初期応答する可能性が高いかどうかが予測され、そのような測定及び検出がタキサンに対する耐性の獲得についての患者のモニタリングにも有効であることは、驚くべきことであり、意外にもそれを発見した。更に、Mena/MenaINV発現は、タキサン処置に対する耐性を増加させるので、Menaがタキサンに対する耐性を克服するための治療標的になることも発見した。
【００８４】
本開示の全ての実施形態を示すとは限らないが、これから下文にて本開示をより十分に説明することにする。例示的な実施形態を参照して本開示を説明してきたが、本開示の範囲を逸脱することなく様々な変更を加えることができ、そのような実施形態の要素の代わりに均等物を使用することができることは、当業者には理解されるであろう。加えて、本開示の本質的範囲を逸脱することなく、本開示の教示に方法を適応させるために多くの修飾を加えることができる。
【００８５】
本発明を説明するために、以下の用語が使用される。用語が本明細書で具体的に定義されない場合、その用語には当技術分野において認知されている意味が与えられ、当業者は、その用語が本発明の説明において使用される文脈に応じて、その用語に当技術分野において認知されている意味を当てはめることになる。
【００８６】
本明細書で及び添付の特許請求の範囲で使用される場合の冠詞「a」及び「an」は、文脈による別段の指示がない限り、その冠詞の文法上の目的語の1つ又は1つより多く(すなわち少なくとも1つ)を指すために本願では使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素又は1つより多くの要素を意味する。
【００８７】
本願において本明細書で及び特許請求範囲で使用される「及び/又は」という句は、そのように結合されている要素の「どちらか又は両方」、すなわち、連言的に存在する場合もあり、選言的に存在する場合もある要素を意味すると解されたい。「及び/又は」を用いて列挙されている複数の用語は、同じように、すなわち、そのように結合されている要素の「1つ又は複数」と解釈されたい。「及び/又は」という節により具体的に特定される要素以外に、それらの具体的に特定される要素と関係があるか無関係であるかを問わず、他の要素が任意選択的に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「A及び/又はB」への言及は、「含む」等の非限定的な言葉と共に使用される場合、一実施形態ではAのみ(任意選択的にB以外の要素を含む)、別の実施形態ではBのみ(任意選択的にA以外の要素を含む)、更に別の実施形態ではAとBの両方(任意選択的に他の要素を含む)、等を意味することができる。
【００８８】
本願において本明細書で及び特許請求の範囲で使用される「又は」は、上文にて定義の「及び/又は」と同じ意味を有すると解されたい。例えば、リスト内の品目を分ける場合、「又は」又は「及び/又は」は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、少なくとも1つの品目の包含、しかし多数の要素又は要素のリストのうちの1つより多くの品目及び任意選択的に追加の未収載品目も含むことと解釈されるものとする。「のうちの1つのみ」若しくは「のうちのまさに1つ」等の、それとは逆のことが明らかに示される、又は特許請求の範囲で使用される場合の、only(のみ、専ら等)という用語は、多数の要素又は要素のリストのうちのまさに1つの要素の包含を意味することになる。一般に、本願で使用される「又は」という用語は、「どちらか」、「のうちの1つ」、「のうちの1つのみ」又は「のうちのまさに1つ」等の排他性の用語が先行する場合、排他的選択肢(すなわち、「両方ではなく、一方又は他方」)を示すと専ら解釈されるものとする。
【００８９】
本明細書における上文ではもちろん特許請求の範囲においても、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(conatining)」、「含む(involving)」、「保持する(holding)」、「で構成されている(composed of)」等のような全ての移行句は、非限定的であると、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味すると、解釈されるものとする。「からなる」及び「から本質的になる」という移行句のみは、10  米国特許庁米国特許審査便覧第2111章03に記載の通り、それぞれ、制限的又は半制限的移行句であるものとする。
【００９０】
1つ又は複数の要素のリストに関して本願において本明細書で及び特許請求の範囲で使用される「少なくとも1つ」という句は、要素リスト中の要素のいずれか1つ又は複数から選択されるが、要素リスト中に具体的に収載されている各々の及びあらゆる要素のうちの少なくとも1つを必ずしも含まず、要素リスト中の要素の任意の組合せを除外しない、少なくとも1つの要素を意味すると解されたい。この定義はまた、具体的に特定される要素以外の要素が、それらの具体的に特定される要素と関係があるか無関係であるかを問わず「少なくとも1つ」という句が指す要素のリストの中に任意選択的に存在しうることを許すものである。したがって、非限定的な例として、「A及びBのうちの少なくとも1つ」(又は同等に「A又はBのうちの少なくとも1つ」、又は同等に「A及び/又はBのうちの少なくとも1つ」)は、一実施形態では、Bが存在しない少なくとも1つのAであって、1つより多くのAを任意選択的に含む(及びB以外の要素を任意選択的に含む)A、別の実施形態では、Aが存在しない少なくとも1つのBであって、1つより多くのBを任意選択的に含む(及びA以外の要素を任意選択的に含む)B、更に別の実施形態では、少なくとも1つのAであって、1つより多くAを任意選択的に含むA、及び少なくとも1つのBであって、1つより多くBを任意選択的に含む(及び他の要素を任意選択的に含む)B、等を意味することができる。相反する明らかな指示がない限り、1つより多くの工程又は行為を含む本願における特許請求の範囲に記載のいずれの方法においても、方法の工程又は行為の順序は、その方法の工程又は行為が列挙されている順序に必ずしも限定されないことも、理解されたい。
【００９１】
本願において使用される「抗体」という用語は、全抗体を包含し、且つ全抗体の断片であって、Mena、MenaINV及び/又はMena11aと特異的に結合する断片を包含する。抗体断片は、F(ab')2及びFab'断片並びに一本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。F(ab')2は、結晶性断片(Fc)領域が欠失しており結合領域が保存されている、抗体分子の抗原結合断片である。Fab'は、結合領域の1/2のみを有する、F(ab')2分子の1/2である。抗体という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を包含することを更に意図したものである。抗体は、当業者に周知の技術により産生させることができる。ポリクローナル抗体は、例えば、Mena、MenaINV及び/又はMena11aによりコードされている精製ポリペプチドでマウス、ウサギ又はラットを免疫することにより産生させることができる。次いで、免疫されたマウスから脾臓を除去し、脾細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成することによりモノクローナル抗体を産生させることができ、そのハイブリドーマを培養で増殖させると、そのハイブリドーマがモノクローナル抗体を産生することになる。抗体は、例えば、IgA、IgD、IgE、IgG又はIgM抗体のいずれであってもよい。IgA抗体は、例えば、IgA1又はIgA2抗体でありうる。IgG抗体は、例えば、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3又はIgG4抗体でありうる。これらの抗体サブタイプのいずれかの組合せを使用することもできる。使用されることになる抗体のタイプを選択する上での1つの考慮事項は、抗体のサイズである。例えば、IgGのサイズは、IgMのものより小さく、したがって、IgGのほうが大量に組織に浸透することができる。抗体は、ヒト抗体であってもよく、又は非ヒト抗体、例えば、ウサギ抗体、ヤギ抗体若しくはマウス抗体であってもよい。抗体は、標準的な遺伝子組換え技術を使用して「ヒト化」することができる。
【００９２】
ある態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して耐性の腫瘍を有する患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、(a)患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つからのMenaINVの発現レベルを対照における発現レベルと比較する工程(ここで前記対照に対するMenaINV発現増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及び(b)前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料からのMenaINVの発現増加が、前記対照と比較して観察又は検出された場合、TKIに対して耐性であるMenaINV関連腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を含む。
【００９３】
この方法は、工程(a)の前に、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを検出及び測定する工程を更に含みうる。MenaINV発現、Mena発現及びMena11a発現は、当技術分野において公知の又は公知になる任意の方法により、それぞれ検出することができる。例えば、MenaINV、Mena及び/又はMena11aタンパク質レベル又はmRNAレベルのどちらかをアッセイすることにより発現レベルを決定することができることは、当業者には理解されるであろう。
【００９４】
ある実施形態では、MenaINVは、アミノ酸配列AQSKVTATQDSTNLRCIFC(配列番号3)を含む。ある実施形態では、MenaINVは、配列gcccagagcaaggttactgctacccaggac agcactaatttgcgatgtat tttctgt(配列番号2)を含む核酸によりコードされている。ある実施形態では、MenaINVは、ヒトMenaINVである。別の実施形態では、MenaINVは、配列番号1を含むmRNAとして発現される。関連実施形態では、MenaINVは、配列番号1を含むmRNAから転写される。ある実施形態では、MenaINVは、ヒトMenaINVである。
【００９５】
ある実施形態では、Mena11aは、配列RDSPRKNQIV FDNRSYDSLHR(配列番号4)を含む。ある実施形態では、Mena11aは、配列cgggattctccaaggaaaaatcagattgt ttttgacaacaggtcctatgatt cattacacag(配列番号5)を含む核酸によりコードされている。参照により本明細書に組込まれている米国特許出願公開第2012/0028252号に記載されている、Mena11a。ある実施形態では、Mena11aは、ヒトMena11aである。
【００９６】
一部の実施形態では、Mena、MenaINV又はMena11aの発現の変化は、正常組織におけるそれらのレベルと比べての又は上皮内(非転移性)癌におけるそれらのレベルと比べての発現の変化を意味する。MenaINV、Mena11a又はMenaの発現を、転移性腫瘍では発現が変化しないタンパク質の発現に対して正規化することができる。対照として使用することができるだろうタンパク質の例としては、Menaの140K及び80Kアイソフォーム並びにVASPを含む、転移性細胞においてそれらの発現が変化しないEna/VASPファミリーのものが挙げられる。対照として使用することができるだろうタンパク質又は遺伝子の他の例としては、限定ではないがN-WASP、Rac1、Pak1、並びにPKCアルファ及びベータを含む、発現が比較的変化しないものとして収載されているものが挙げられる。好ましい対照は、Mena及びVASPの80K及び140Kアイソフォームを含む。
【００９７】
MenaINV又はMena11aの発現をin vitro又はin vivoで検出することができる。発現を核酸レベルで及び/又はタンパク質レベルで検出することができる。発現をIn vitroで検出する場合、生検及び吸引をはじめとする標準的な手順を使用して、対象から血液、腫瘍、組織又は細胞の試料を除去することができる。対象から除去される細胞は、免疫細胞蛍光測定法(FACS分析)を使用して分析することができる。MenaINV又はMena11aの発現は、限定ではないが免疫学的技術、例えば、ウェスタンブロット法、ハイブリダイゼーション分析、蛍光イメージング技術及び/又は放射線検出を含む、公知の技術から容易に決定される検出方法によって検出することができる。
【００９８】
血液、組織、細胞又は腫瘍試料は、Mena、MenaINV又はMena11aと特異的に結合する剤を使用してアッセイすることができる。Mena、MenaINV又はMena11aと特異的に結合する剤は、例えば、抗体、ペプチド又はアプタマーでありうる。アプタマーは、タンパク質等の特定の標的分子と結合する一本鎖オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体である。したがって、アプタマーは、抗体に類似しているオリゴヌクレオチドである。しかし、アプタマーは、抗体より小さい。それらの結合は、アプタマーオリゴヌクレオチドにより形成される二次構造に大いに依存する。RNA及び一本鎖DNA(又は類似体)アプタマー両方を使用することができる。事実上任意の特定の標的と結合するアプタマーを、SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment:指数関数的増加によるリガンドの系統的展開を表す)と呼ばれる反復プロセスを使用して、選択することができる。
【００９９】
Mena、MenaINV又はMena11aと特異的に結合する剤を、検出可能なマーカーで標識してもよい。当技術分野において公知のペルオキシダーゼ、化学発光性及び/又は放射性標識を含む、様々な標識化技術の1つを使用して、標識化を果すことができる。検出可能なマーカーは、例えば、非放射性又は蛍光性マーカー、例えばビオチン、フルオレセイン(FITC)、アクリジン、コレステロール、又はカルボキシ-X-ローダミンであってもよく、これらは、当技術分野では容易に分かる蛍光及び他のイメージング技術を使用して検出することができる。或いは、検出可能なマーカーは、例えば放射性同位体をはじめとする、放射性マーカーであってもよい。放射性同位体は、例えば35S、32P、33P、14C又は3H等の、検出可能な放射線を放射するいずれの同位体であってもよい。放射性同位体により放射される放射能を、当技術分野において周知の技術により検出することができる。例えば、放射性同位体からのガンマ線放射を、ガンマ線イメージング技術、特にシンチグラフィー技術を使用して検出することができる。
【０１００】
対象におけるMena、MenaINV又はMena11aの発現は、Mena、MenaINV又はMena11aをコードする核酸と特異的にハイブリダイズする1つ又は複数の核酸プローブを使用する、対象からの血液、腫瘍、組織又は細胞試料から抽出された核酸のハイブリダイゼーション分析により、検出することができる。核酸プローブは、DNAあってもよく、又はRNAであってもよく、長さに約8ヌクレオチドからMenaINV又はMena11aの全長までの幅があってもよい。ハイブリダイゼーション技術は当技術分野において周知である。例えば、Sambrook and Russell(2001)を参照されたい。プローブは、当業者に公知の様々な技術により調製することができ、そのような技術には、限定ではないが、Mena核酸の制限酵素消化;及びApplied Biosystems社Model 392 DNA/RNA合成装置等の市販のオリゴヌクレオチド合成装置を使用する、配列がMena核酸のヌクレオチド配列の選択された部分に対応するオリゴヌクレオチドの自動合成が含まれる。Mena、MenaINV又はMena11aをコードする核酸の異なる領域又は重複領域に対応する2つ以上の核酸プローブの組合せを使用して、Mena、MenaINV又はMena11aの発現について診断試料をアッセイしてもよい。
【０１０１】
核酸プローブを1つ又は複数の検出可能なマーカーで標識してもよい。核酸プローブの標識化は、当技術分野において公知の多数の方法(例えば、ニック翻訳、末端標識法、フィルイン末端標識法、ポリヌクレオチドキナーゼ交換反応、ランダムプライミング、又はSP6ポリメラーゼ)を、様々な標識(例えば、放射性標識、例えば35S、32P、33P、14C若しくは3H、非放射性標識、例えばビオチン、フルオレセイン(FITC)、アクリジン、コレステロール、若しくはカルボキシ-X-ローダミン(ROX))、又は本開示の至る所で論じられている他の検出可能なマーカーのうちの1つと共に使用して、果すことができる。
【０１０２】
Mena、MenaINV又はMena11aをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするPCRプライマーを使用して試料をアッセイすることができる。試料をMenaINV、Mena11a、又はMenaINVとMena11aの両方についてアッセイすることができる。
【０１０３】
例えば、本明細書に記載の任意の実施形態又は態様の発現レベルは、当技術分野において公知の任意の好適な方法によりタンパク質レベルをアッセイすることによって決定することができる。抗体(又はその断片)及び抗原が関わるアッセイは、「イムノアッセイ」として公知であり、これを本開示において用いて発現レベル(例えば、Mena、MenaINV及び/又はMena11aの発現レベル)を決定することができる。使用することができるイムノアッセイとしては、ほんの数例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法等の技術を使用する、競合及び非競合アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは、当技術分野において常例的且つ周知であり(例えば、その全体が参照により本明細書に組込まれている、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons社、New Yorkを参照されたい)、過度の実験を伴わずにそのようなアッセイを行うことができる。更に、マルチプレックスイムノアッセイが公知であり(例えば、ProcartaPlex(登録商標)、Luminex(登録商標)、プロテインチップ等)、それらを用いてタンパク質発現を調査してもよい。
【０１０４】
ウェスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料を調製すること、前記タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル中での電気泳動(例えば、抗原の分子量に依存して8% 20% SDS-PAGE)、前記ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDF又はナイロン等の膜に前記タンパク質試料を転写すること、ブロッキング溶液(例えば、3% BSA又は脱脂乳を含有するPBS)中で前記膜をブロッキングすること、洗浄緩衝液(例えば、PBS-Tween 20)中で前記膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体(例えば、目的の抗体)で前記膜をブロッキングすること、前記膜を洗浄緩衝液中洗浄すること、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼ)又は放射性分子(例えば、32P若しくは125I)に結合された二次抗体(前記一次抗体、例えば抗ヒト抗体、を認識する)で前記膜をブロッキングすること、前記膜を洗浄緩衝液中で洗浄すること、及び前記抗原の存在について検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように及びバックグラウンドノイズを低減させるように変更することができるパラメータについての知識が豊富であるであろう。ウェスタンブロットプロトコールに関する更なる論述については、例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons社、New Yorkの10.8.1を参照されたく、前記参考文献は、参照により本明細書に組込まれている。ELISAは、抗原を用意すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに前記抗原を塗布すること、酵素基質(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)等の検出可能な化合物に結合された目的の抗体を前記ウェルに添加して暫くの間インキュベートすること、及び前記抗原の存在を検出することを概して含む。ELISAの場合、目的の抗体を検出可能な化合物に結合させる必要がなく、その代わりに、検出可能な化合物に結合された二次抗体(目的の抗体を認識する)をウェルに添加してもよい。更に、ウェルに抗原を塗布する代わりに、抗体をウェルに塗布してもよい。この場合、塗布されたウェルに目的の抗原を添加した後、検出可能な化合物に結合された二次抗体を添加してもよい。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように変更することができるパラメータ及び当技術分野において公知のELISAの他の変形形態についての知識が豊富であるであろう。ELISAに関する更なる論述については、例えば、Ausubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley & Sons社、New Yorkの11.2.1を参照されたく、前記参考文献は、参照により本明細書に組込まれている。
【０１０５】
加えて、本明細書に記載の任意の態様又は実施形態の発現レベルを、当技術分野において公知の任意の好適な方法によりmRNAレベルをアッセイすることによって決定することができる。例えば、mRNA発現を逆転写酵素PCR又は遺伝子発現アレイによってアッセイしてもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載の任意の実施形態又は態様の試料は、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、アッセイすることができる。前記剤は、抗体(若しくはその抗原結合断片)又はアプタマー又は核酸(例えば、プローブ)のうちの1つ又は複数であってもよい。前記剤を検出可能なマーカーで標識してもよい。例えば、前記剤は、検出可能なマーカーで標識された抗体(若しくはその抗原結合断片)、検出可能なマーカーで標識されたアプタマー、若しくは検出可能なマーカーで標識された核酸、又はそれらの組合せであってもよい。例示的な検出可能なマーカーとしては、蛍光検出可能な剤、検出可能な酵素、及び/又は放射性核種(例えば、111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P若しくは35S)が挙げられる。例えば、蛍光検出可能な剤は、次のうちの少なくとも1つでありうる:フルオレセイン、フルオレセインチオイソシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン等。また、ドメイン抗体構築物を検出可能な酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等で誘導体化してもよい。検出可能なマーカーが、検出可能な酵素である場合、酵素が検出可能な反応生成物を生成するために使用する更なる試薬を添加することにより、そのマーカーを検出することができる。他の実施形態では、当業者には理解されるであろうように、酵素、アプタマー及び/又は核酸をビオチンで標識し、アビジン又はストレプトアビジン結合の直接測定により検出することができる。
【０１０６】
本明細書に記載の任意の実施形態又は態様のMena、MenaINV又はMena11a mRNAにハイブリダイズする核酸は、Mena、MenaINV又はMena11a mRNAとの少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は少なくとも99%の同一性を有しうる。ハイブリダイズする核酸(例えば、プローブ)は、長さが約10核酸〜約30核酸(例えば、長さが約10〜約25、約10〜約20、約10〜約15、約15〜約30、約15〜約25、約15〜約20、約20〜約30、約20〜約25、又は約25〜約30核酸)である。
【０１０７】
方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は(iv)それらの組合せを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程を更に含みうる。したがって、TKIに対して耐性である患者には、TKIの標準処置量より多い(例えば、少なくとも10倍多い、少なくとも12倍多い、少なくとも14倍多い、少なくとも16倍多い、又は少なくとも20倍多い)TKIの用量を与えることができるだろう。TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者は、MenaINV阻害剤又は修飾物質の有効量であって、前記患者がTKIの標準処置量に反応する結果となる有効量を摂取することができる。これらの処置の任意の組合せも用いることができることは理解されるはずである。
【０１０８】
本明細書に記載のいずれの態様又は実施形態においても、Mena阻害剤若しくは修飾物質、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質、及び/又はMena11a阻害剤若しくは修飾物質は、DNA、RNA及び/又はタンパク質レベルで介在する。例えば、Mean、MenaINV及び/又はMena11aの存在又は活性は、MenaINVの発現を特異的に阻害するアンチセンス分子、リボザイム又はRNA干渉(RNAi)分子を腫瘍に加えることによって、低下させることができる。アンチセンス分子、リボザイム又はRNAi分子は、当技術分野において公知であるように核酸(例えば、DNA又はRNA)又は核酸模倣体(例えば、ホスホロチオネート模倣体)からなりうる。これらの組成物で組織を処置するための方法も、当技術分野において公知である。組織の細胞へのアンチセンス分子、リボザイム又はRNAi分子の浸透を増進する賦形剤を好ましくは含む医薬組成物で、アンチセンス分子、リボザイム又はRNAi分子をがん性腫瘍組織に直接加えることができる。がん性組織にトランスフェクトされるベクターから、アンチセンス分子、リボザイム又はRNAi分子を発現させることができる。そのようなベクターは、当技術分野において公知である。
【０１０９】
ある実施形態では、Mena阻害剤若しくは修飾物質、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質、及び/又はMena11a阻害剤若しくは修飾物質は、RNAi剤であり、例えば、siRNA剤又はshRNA剤によるものである。本明細書に記載の方法又は組成物において使用される場合のsiRNA(低分子量干渉RNA)剤は、哺乳動物Mena、MenaINV及び/又はMena11aをコードするmRNA配列に相補的である部分を含み、該siRNA剤は、哺乳動物Mena、MenaINV及び/又はMena11aの発現を阻害するのに有効である。ある実施形態では、siRNA剤は、二本鎖部分(二重鎖)を含む。ある実施形態では、siRNA剤は、長さが20〜25ヌクレオチドである。ある実施形態では、siRNAは、19〜21のコアRNA二重鎖を含み、どちらか一方又は両方の鎖上に独立して1つ又は2つのヌクレオチド3'オーバーハングを有する。siRNAは、5'リン酸化されていることもあり、又はされていないこともあり、並びに効力及び/又はヌクレアーゼ分解に対する耐性を向上させるために当技術分野において公知の修飾法のいずれかで修飾されていることもある。ある実施形態では、siRNA剤が1つ又は複数の細胞にトランスフェクトされるようにsiRNA剤を投与することができる。
【０１１０】
一実施形態では、本開示のsiRNA剤は、二本鎖RNAの一方の鎖が、哺乳動物(例えば、ヒト)Mena、MenaINV及び/又はMena11aをコードする遺伝子のRNA転写物の部分に80、85、90、95又は100%相補的である、二本鎖RNAを含む。別の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、RNAの一方の鎖が、哺乳動物Mena、MenaINV及び/又はMena11aをコードする遺伝子のRNA転写物の連続した18〜25ヌクレオチド部分と同じ配列を有する部分を含む、二本鎖RNAを含む。更に別の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、RNAの両方の鎖が非ヌクレオチドリンカーにより連結されている、二本鎖RNAを含む。或いは、本開示のsiRNA剤は、RNAの両方の鎖が、ループ又はステムループ構造等の、ヌクレオチドリンカーにより連結されている、二本鎖RNAを含む。
【０１１１】
一実施形態では、本開示のsiRNA剤の一本鎖成分は、長さが14〜50ヌクレオチドである。別の実施形態では、本開示のsiRNA剤の一本鎖成分は、長さが14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28ヌクレオチドである。更に別の実施形態では、本開示のsiRNA剤の一本鎖成分は、長さが21ヌクレオチドである。更に別の実施形態では、本開示のsiRNA剤の一本鎖成分は、長さが22ヌクレオチドである。更に別の実施形態では、本開示のsiRNA剤の一本鎖成分は、長さが23ヌクレオチドである。一実施形態では、本開示のsiRNA剤は、長さが28〜56ヌクレオチドである。別の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、長さが40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51又は52ヌクレオチドである。更に別の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、長さが46ヌクレオチドである。
【０１１２】
一部の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、少なくとも1つの2'-糖修飾を含む。ある特定の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、少なくとも1つの核酸塩基修飾を含む。別の実施形態では、本開示のsiRNA剤は、少なくとも1つのリン酸骨格修飾を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、Mena、MenaINV及び/又はMena11aのRNAi阻害は、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)によりもたらされる。本開示のshRNA剤は、担体及び/又はベクターでの形質導入により細胞に導入することができる。更なる実施形態では、担体は、リポフェクション試薬である。別の実施形態では、担体は、ナノ粒子試薬である。ある実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。更なる実施形態では、ベクターは、プロモーターを含む。更に別の実施形態では、プロモーターはU6又はH1プロモーターである。更なる実施形態では、ベクターによりコードされる本開示のshRNA剤は、標的遺伝子に相補的な19〜29ヌクレオチドの範囲の第1のヌクレオチド配列、又はmRNA(例えば、Mena、MenaINV及び/又はMena11aをコードするmRNA)である。更に他の実施形態では、ベクターによりコードされるshRNA剤は、4〜15ヌクレオチドの短いスペーサー(ハイブリダイズしないループ)、及び第1のヌクレオチド配列の逆相補配列である19〜29ヌクレオチド配列も含む。特定の実施形態では、shRNAの細胞内プロセシングの結果として生じるsiRNA剤は、1又は2ヌクレオチドのオーバーハングを有する。ある特定の実施形態では、shRNAオーバーハングの細胞内プロセシングの結果として生じるsiRNA剤は、2つの3'オーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハングは、UUである。
【０１１４】
本明細書に記載の任意の実施形態又は態様のTKI以外の化学療法剤は、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤(例えば、Ras阻害剤[例えば、trans-ファルネシルチオサリチル酸]、Raf阻害剤[例えば、SB590885、PLX4720、XL281、RAF265、エンコラフェニブ、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、若しくはそれらの組合せ]、MEK阻害剤[例えば、コビメチニブ、CI-1040、PD035901、ビニメチニブ(MEK162)、セルメチニブ、トラメチニブ(GSK1120212)、若しくはそれらの組合せ]、ERK阻害剤[例えば、SCH772984(Merck/Schering- Plough社)、TX11e(Vertex社)、若しくはそれらの組合せ]、又はそれらの組合せ)であってもよい。
【０１１５】
本明細書に記載の任意の実施形態又は態様のTKIは、RTKの阻害剤であってもよい。例えば、RTKは、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子受容体(HGFR)、インスリン様増殖因子受容体(IGFR)、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)、ヒト上皮増殖因子受容体3(HER3)、ヒト上皮増殖因子受容体4(HER4)又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つでありうる。
【０１１６】
例えば、TKIは、特定のイムノリガンド、抗体、キナーゼ阻害剤、例えば、アファチニブ(Gilotrif(登録商標)、Boehringer Ingelheim社)、セツキシマブ(Erbitux(登録商標))、エルロチニブ(Tarceva(登録商標))、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標))、ラパチニブ(Tykerb(登録商標))、パニツムマブ(Vectibix(登録商標))、ロシレチニブ(CO-1686)、AZD9291、又はこれらの組合せ(しかしそれらに限定されない)のうちの少なくとも1つを含む、EGFR阻害剤であってもよい。TKIは、特定のイムノリガンド、抗体、キナーゼ阻害剤、例えば、チバンチニブ(ARQ197、ArQule社)、リロツムマブ(AMG 102、Amgen社)、オナルツズマブ(Genetech/Roche社)、(MetMAb)、フィクラツズマブ(AV-299)、AMG 337、又はこれらの組合せ(しかしそれらに限定されない)のうちの少なくとも1つを含む、HGFR(MET)阻害剤であってもよい。TKIは、特定のイムノリガンド、抗体、キナーゼ阻害剤、例えば、チロホスチン(AG538、AG1024)、ピロロ(2,3-d)-ピリミジン誘導体(NVP-AEW541)、フィギツムマブ、又はこれらの組合せ(しかしそれらに限定されない)のうちの少なくとも1つを含む、HGFR(MET)阻害剤であってもよい。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、患者は、乳腺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、頭部腫瘍又は頸部腫瘍を有する。他の実施形態では、腫瘍は、乳房腫瘍(例えば、HER-2陽性又は三種陰性腫瘍である、乳房腫瘍)である。
【０１１８】
方法は、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMena11aの発現レベルを測定する工程を更に含みうる。MenaINV及びMena11aの発現レベルを決定する場合、方法は、血液、組織又は腫瘍におけるMenaINV/Mena11a発現の比を対照と比較する工程(ここで、MenaINV/Mena11aの比の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及び前記対照と比較してMenaINV/Mena11aの比の増加が前記血液試料、前記組織試料又は前記腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性であるMenaINV関連腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を更に含みうる。
【０１１９】
更なる態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、TKIでの処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMenaINVの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、MenaINV発現の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及びより早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料においてMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、TKIに対する二次耐性がある腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を含む。
【０１２０】
方法は、試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含みうる。例えば、上文にてより詳細に説明したように、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、試料をアッセイしてもよい。前記剤は、次のうちの少なくとも1つでありうる:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せ。
【０１２１】
方法は、TKIでの処置レジメンを開始する前の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、及びMenaINVのレベルが、所定の対照レベルと同等であった又はそれより低かった場合、患者にTKIの有効量を投与する工程を更に含みうる。
【０１２２】
方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は(iv)それらの組合せを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程を更に含みうる。
【０１２３】
TKIは、RTKの阻害剤であってもよい。
【０１２４】
別の態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、TKIの第1の有効量での処置中の異なる時点で得た患者からの少なくとも2つの試料におけるMenaINVのレベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、対照と比べてMenaINVの発現の増加はTKI耐性がんを示す)と、MenaINVの発現が対照と比べて増加されなかった場合、前記TKIの第1の有効量を投与する工程、又はMenaINVの発現が、対照と比べて増加された場合、(i)患者にTKIの第2の有効量、(ii)患者にTKI以外の化学療法剤の有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量と組み合わせてTKIの有効量、若しくは(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量又は(v)それらの組合せのうちの少なくとも1つを投与する工程とを含む。
【０１２５】
方法は、比較する工程の前に、TKIの第1の有効量を投与する工程、試料におけるMenaINVの発現レベルを検出若しくは測定する工程、又はそれらの組合せを更に含みうる。
【０１２６】
TKIの第2の有効量は、TKIの初期有効量より少なくとも約2倍〜約20倍多い。例えば、TKIの第2の有効量は、TKIの初期有効量より少なくとも約4倍、少なくとも約6倍、少なくとも約8倍、少なくとも約10倍、少なくとも約12倍、少なくとも約14倍、少なくとも約16倍、少なくとも約18倍、又は少なくとも約20倍多いことがある。
【０１２７】
TKI以外の化学療法剤は、本開示の至る所で説明されている通りでありうる。
【０１２８】
方法は、TKIの第1の有効量を投与する前に採取した血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つにおけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、MenaINVの発現レベルを所定の対照発現レベルと比較する工程、及びTKIの第1の有効量を投与する前に採取した試料において同等の又はより低いMenaINVレベルが観察又は検出された場合、TKIの第1の有効量を受けることに適していると患者を同定又は診断する工程を更に含みうる。
【０１２９】
試料は、本開示の至る所で説明されているようにアッセイすることができる。例えば、次のうちの少なくとも1つ:MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤、MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤、Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤、Menaと特異的に結合する剤、又はそれらの組合せを使用して、試料をアッセイしてもよい。前記剤は、次のうちの少なくとも1つでありうる:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せとしうる。
【０１３０】
更に別の態様では、本開示は、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定するための方法を提供する。この方法は、患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの1つ又は複数からのMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程であって、対照に対するMena及び/又はMenaINV発現増加が、MenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す、工程及び、前記対照と比較して前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料からMena及び/又はMenaINVの発現増加が観察又は検出された場合、微小管結合剤に対して耐性であるMena関連又はMenaINV関連腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を含む。
【０１３１】
別の実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【０１３２】
特定の実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０１３３】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態の微小管結合剤は、微小管安定化剤、例えば、限定ではないが、タキサン系薬剤ドセタキセル(TAXOTERE)、パクリタキセル(TAXOL)、カバジタキセル(JEVTANA)、ミラタキセル(MAC-321、TL-139)、ラロタキセル(XRP9881)、オルタタキセル(IDN-5109、BAY 59-8862)、テセタキセル、DJ-927、BMS-275183、TPI 287(ARC-100)、Nab-パクリタキセル(ABRAXANE)、Nab-ドセタキセル(ABI-008)、NKTR-105及びそれらのプロドラッグ、エポチロン系薬剤(イクサベピロン(IXEMPRA)、パツピロン、サゴピロン、KOS 1584(エポチロンD))、ディスコデルモリド、エリュテロビン類、サルコジクチン類、シクロストレプチン、ジクチオスタチン、ラウリマライド、ラジニラム、ペロルシドA、並びにポリイソプレニルベンゾフェノン類であってもよい。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態の微小管結合剤は、微小管不安定化剤、例えば、限定ではないが、ビンカアルカロイド系薬剤(ビンクリスチン(Oncovin)、ビンブラスチン(Vblastin)及びビノレルビン(Navebine)、ビンデシン、ビンフルニン)、ドラスタチン系薬剤(ソブリドチン(TZT-1027)、ロミデプシン(ISTODAX)、ブレンツキシマブベドチン(SGN 35))、エリブリン(E7389、NSC 707389)、スポンギスタチン、リゾキシン、メイタンシノイド系薬剤(Mertansine免疫複合体類(BT-062、IMGN388、BIIB015))、及びタシドチンであってもよい。他の不安定化剤としては、コルヒチン部位結合剤、例えばコルヒチン及びその類似体、ポドフィロトキシン、コンブレタスタチン系薬剤(フォスブレタブリン(CA4リン酸塩)、ベルブリン、クリノブリン、オムブラブリン)、CI-980、2-メトキシエストラジオール(PANZEM)、フェニラヒスチン(ジケトピペラジン)、ステガナシン類、並びにクラシン類を挙げることができる。好ましい実施形態では、微小管結合剤は、タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル又はカバジタキセルである。
【０１３４】
方法は、単数の試料又は複数の試料からのMena、MenaINV又はそれらの組合せの発現レベルを測定する工程を更に含みうる。
【０１３５】
試料は、本開示の至る所で説明されているようにアッセイすることができる。
【０１３６】
方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は(iv)それらの組合せを、患者に投与する工程を更に含みうる。
【０１３７】
本明細書に記載の任意の態様又は実施形態における微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤、又はそれらの組合せでありうる。
【０１３８】
更なる実施形態では、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定される。
【０１３９】
更に別のもう1つの態様では、本開示は、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有する患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、微小管結合剤での処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せであり、より早い時点で得た試料に対してより遅い時点から得た試料におけるMena及び/又はMenaINV発現の増加は、二次Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)、及びより早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料においてMena及び/又はMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、微小管結合剤に対する二次耐性があるMena関連又はMenaINV関連腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を含む。方法は、本願の至る所で論じているような、試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含みうる。特定の実施形態では、MenaINVの発現レベルは、患者の血液試料、組織、腫瘍試料又はそれらの組合せにおいて測定される。
【０１４０】
方法は、次のうちの少なくとも1つ:(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は(iv)それらの組合せを、患者に投与する工程を更に含みうる。
【０１４１】
ある実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【０１４２】
更なる実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０１４４】
尚、更なる態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、微小管結合剤での第1の有効量での処置中に得た患者からの試験組織試料と対照組織試料のMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、前記対照試料に対するMena及び/又はMenaINV発現の増加は、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)と、次のうちの少なくとも1つ:(i)試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加されなかった場合、微小管結合剤の有効量を投与する工程、(ii)試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量を患者に投与する、若しくは微小管結合剤の投与を中止する工程、(iii)試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路、又はそれらの組合せを阻害するか又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、有効量を投与する工程、又は(iv)それらの組合せとを更に含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、工程(i)又は(iii)における微小管結合剤の有効量は、微小管結合剤の第1の有効量より少なくとも約4倍、少なくとも約6倍、少なくとも約8倍、少なくとも約10倍、少なくとも約12倍、少なくとも約14倍、少なくとも約16倍、少なくとも約18倍、又は少なくとも約20倍多い。
【０１４６】
微小管結合剤は、微小管の動態を抑制することもあり、組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉することもあり、又は両方であることもある。微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つでありうる。
【０１４７】
方法は、試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを検出又は測定する工程を更に含みうる。例えば、MenaINVの発現レベルを患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せにおいて測定することができる。
【０１４８】
更に別の態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、次のうちの1つ:(i)微小管結合剤の有効量、(ii)TKIの有効量、(iii)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、(iv)Mena阻害剤若しくは修飾物質、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質又はそれらの組合せののうちの少なくとも1つの有効量、又は(v)それらの組合せを、患者に併用投与する工程を含む。
【０１４９】
一部の実施形態では、Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量は、患者の微小管結合剤に対する耐性を予防及び/若しくは改善するのに有効な量、又は患者に対する微小管結合剤若しくはTKIの抗腫瘍効力を増強するのに有効な量である。
【０１５０】
微小管結合剤又はTKIとMena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質との併用投与は、患者に逐次的に投与してもよく、別々に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。
【０１５１】
他の実施形態では、微小管結合剤は、MenaINVの阻害剤と併用投与される。
【０１５２】
ある態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、微小管結合剤治療中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料における、Mena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料から選択されるか又はそれらの組合せである)、及びより遅い点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【０１５３】
この方法は、発現レベルを比較する工程の前に患者に微小管結合剤の有効量を投与する工程と試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程とを更に含みうる。
【０１５４】
試料は、本明細書に記載の通りアッセイすることができる。
【０１５５】
更なる実施形態では、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料においてMenaINVのレベルが測定され、MenaINVの阻害剤が患者に投与される。
【０１５６】
更なる態様では、本開示は、MenaINV過剰発現腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、TKI、微小管結合剤、Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの第1の有効量に対して耐性であるMenaINV過剰発現がんを有すると判定された患者を用意する工程と、次のうちの少なくとも1つ:(i)患者にTKIの有効量、(ii)患者にTKI若しくは微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(iii)Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(v)微小管結合剤の有効量、(vi)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、又は(vii)それらの組合せを、投与する工程とを含む。
【０１５７】
(i)〜(vi)のいずれにおける剤の有効量も、第1の有効量より約2倍〜約10倍多い。例えば、(i)〜(vi)のいずれにおける剤の有効量も、第1の有効量より、約2倍〜約8倍、約2倍〜約6倍、約2倍〜約4倍、約4倍〜約10倍、約4倍〜約8倍、約4倍〜約6倍、約6倍〜約10倍、約6倍〜約8倍、又は約8倍〜約10倍多い。
【０１５８】
本明細書に記載の態様又は実施形態のいずれにおいても、腫瘍は、固形腫瘍、例えば、乳腺腫瘍、乳房腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、肝臓腫瘍、肺腫瘍、頭部腫瘍、頸部腫瘍、又はそれらの組合せでありうる。
【０１５９】
本明細書に記載のいずれの態様又は実施形態も、血液試料、組織試料、細胞試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを得ることを更に含みうる。本明細書に記載のいずれの態様又は実施形態も、本開示の至る所で説明されている、Mena、MenaINV、Mena11a又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを測定することも、更に含みうる。
【０１６０】
一実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定するための及び任意選択的に処置するための方法であって、(a)患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、及び(b)前記血液、組織及び/又は腫瘍からのMenaINVのレベルを対照における発現レベルと比較する工程を含み、前記対照と比較して前記血液、組織又は腫瘍からのMenaINVの発現増加が、TKIに対して耐性である腫瘍を有する患者を示す、方法が提供される。関連実施形態では、この方法は、(c)その後、患者にTKI以外の化学療法剤の有効量を投与する工程、及び/又は標準的処置より10倍多いTKIの有効量を投与する工程を更に含む。他の関連実施形態では、Mena11aの発現レベルも工程(a)で患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料において測定され、工程(b)で対照発現レベルと比較され、対照と比較して血液、組織又は腫瘍からのMenaINV/Mena11a比の増加は、TKIに対して耐性である腫瘍を有する患者を示す。
【０１６１】
チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対する二次耐性がある腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、TKIでの処置中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程を含み、より早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料におけるMenaINVのレベルの増加が、TKIに対する二次耐性がある腫瘍を有する患者を示す、方法も提供される。関連実施形態では、この方法は、TKIでの処置を開始する前の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、及びMenaINVのレベルが、所定の対照レベルと同等であった又はそれより低かった場合、患者にTKIの有効量を投与する工程を更に含む。
【０１６２】
固形腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、(a)第1の投与期間にわたってTKIの第1の有効量を投与する工程、(b)前記第1の投与期間中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、(c)前記少なくとも2つの試料におけるMenaINVのレベルを比較する工程、及び(d)より遅い時点で得た試料におけるMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMenaINVのレベルと比較して増加された場合、患者に対してTKIの第2の有効量を投与する及び/又はTKIの投与を中止する及び/又はTKI以外の化学療法剤を投与する工程を含む方法も提供される。好ましい実施形態では、TKIの第2の有効量は、TKIの第1の有効量より少なくとも約5倍、少なくとも10倍又は少なくとも20倍多い。一部の実施形態では、血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルは、工程(a)において第1のTKIの有効量の投与前に所定の対照発現レベルと比較され、対照と比較して前記試料におけるMenaINVの同等又はより低いレベルにより、TKIの第1の有効量を受けることに適している患者が同定される。
【０１６３】
他の態様では、疾患の処置のために、チューブリンを標的にする治療に対する耐性若しくは該治療の効力低下、及び/又は微小管動態を抑制する作用機序を予測するための、がん患者のスクリーニング方法が提供される。同様に、微小管の動態を抑制する及び/又は組織化アクチンネットワークの幾何形状に干渉する微小管結合剤での、改善された患者処置方法。
【０１６４】
一実施形態では、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、(a)患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程、及び(b)前記血液、組織及び/又は腫瘍からのMena及び/又はMenaINVのレベルを対照における発現レベルと比較する工程を含み、前記対照と比較して前記血液、組織又は腫瘍からのMena及び/又はMenaINVの発現増加が、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を示す、方法が提供される。関連実施形態では、この方法は、(c)患者に微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量を投与する工程、及び/又は標準的処置より5倍多い微小管結合剤の有効量を投与する工程を更に含む。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定される。
【０１６５】
微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、微小管結合剤での処置中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を含み、より早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルの増加が、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有する患者を示す、方法も提供される。関連実施形態では、この方法は、微小管結合剤の有効量を患者に投与する工程を更に含む。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定される。
【０１６６】
固形腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、(a)第1の投与期間にわたって微小管結合剤の第1の有効量を投与する工程、(b)前記第1の投与期間中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程、(c)前記試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルを対照試料と比較する工程、及び(d)より遅い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、患者に対して微小管結合剤の第2の有効量を投与する及び/又は微小管結合剤の投与を中止する及び/又は微小管結合剤以外の化学療法剤を投与する工程を含む方法も提供される。好ましい実施形態では、微小管結合剤の第2の有効量は、微小管結合剤の第1の有効量より少なくも5倍、少なくとも10倍又は少なくとも20倍多い。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定される。
【０１６７】
患者におけるがんを処置するための方法であって、微小管結合剤とMena及び/又はMenaINVの阻害剤とを患者に併用投与する工程を含み、Mena及び/又はMenaINVの前記阻害剤が、前記患者における微小管結合剤に対する耐性を予防及び/又は改善するのに有効な量で投与される、方法も提供される。関連実施形態では、Mena及び/又はMenaINVの阻害剤は、患者に対する微小管結合剤の抗腫瘍効力を増強するのに有効な量で投与される。微小管結合剤とMena及び/又はMenaINVの阻害剤を、患者に逐次的に投与してもよく、別々に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。好ましい実施形態では、微小管結合剤は、MenaINVの阻害剤と併用投与される。
【０１６８】
関連実施形態では、Mena及び/又はMenaINVの発現レベルは、微小管結合剤での治療を開始する前の患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料において測定され、前記治療では、微小管結合剤とMena及び/若しくはMenaINVの阻害剤が同時に投与され、並びに/又は前記試料におけるMena及び/若しくはMenaINVのレベルが対照試料におけるレベルと比較して増加された場合、Mena及び/若しくはMenaINVの阻害剤の投与が微小管結合剤の投与に先行する。そのような場合、Mena及び/又はMenaINVの阻害剤は、患者における微小管結合剤の耐性を改善するのに有効な量で投与される。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定され、MenaINVの阻害剤が患者に投与される。
【０１６９】
他の関連実施形態では、Mena及び/又はMenaINVの発現レベルは、微小管結合剤での治療を開始する前の患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料において測定され、前記治療では、微小管結合剤とMena及び/若しくはMenaINVの阻害剤が同時に投与され、並びに/又は前記試料におけるMena及び/若しくはMenaINVのレベルが対照試料におけるレベルと比較して同等であった又は増加された場合、Mena及び/若しくはMenaINVの阻害剤の投与が微小管結合剤の投与に先行する。そのような場合、Men及び/又はMenaINVの阻害剤は、患者における微小管結合剤の耐性を予防するのに有効な量で投与される。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定され、MenaINVの阻害剤が患者に投与される。
【０１７０】
他の関連実施形態では、Men及び/又はMenaINVの発現レベルは、微小管結合剤での治療を開始する前の患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料において測定され、前記治療では、前記試料におけるMena及び/若しくはMenaINVのレベルが対照試料におけるレベルと比較して同等であった又は低下された場合、前記微小管結合剤治療が、最初はMena及び/若しくはMenaINVの阻害剤非存在下で開始される。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定され、MenaINVの阻害剤が患者に投与される。
【０１７１】
更に他の関連実施形態では、腫瘍を有する患者におけるがんを処置する方法であって、(a)微小管結合剤の有効量を患者に投与する工程、(b)微小管結合剤治療中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程、(c)前記試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルを対照試料と比較する工程、及び(D)より遅い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、Mena及び/又はMenaINVの阻害剤を患者に投与する工程を含む方法が提供される。好ましい実施形態では、患者の血液、組織及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルが測定され、MenaINVの阻害剤が患者に投与される。
【０１７２】
更に別の実施形態では、転移の阻害剤を同定する方法であって、ある量のMena及び/又はある量のMenaINVを含む複数のタキサン耐性がん細胞を接触させる工程、及び薬剤の存在下及び非存在下で生存細胞の特定の割合をもたらすタキサンの濃度を定量する工程を含み、前記濃度の低下により転移の阻害剤が同定される、方法が提供される。一部の実施形態では、生存細胞の特定の割合は、0.5、0.6、0.7、又は0.8である。好ましい実施形態では、タキサンは、パクリタキセルである。
【０１７３】
関連実施形態では、タキサンに対するタキサン耐性細胞の増感剤を同定する方法であって、ある量のMena及び/又はある量のMenaINVを含む複数のタキサン耐性がん細胞を接触させる工程、及び薬剤の存在下及び非存在下で生存細胞の特定の割合をもたらすタキサンの濃度を定量する工程を含み、前記濃度の低下により増感剤が同定される、方法が提供される。一部の実施形態では、生存細胞の特定の割合は、0.5、0.6、0.7、又は0.8である。好ましい実施形態では、タキサンは、パクリタキセルである。
【０１７４】
本明細書に記載の方法のいずれにおいても、Mena11aの発現レベルも血液、組織及び/又は腫瘍試料において測定することができ、試料におけるMenaINV/Mena11aの比を決定し、対照発現レベルと比較することができる。或いは、Agarwalら、Quantitative assessment of invasive mena isoforms(Menacalc)as an independent prognostic marker in breast cancer、Breast Cancer Research、14:R124(2012)に記載されている方法により、全Mena発現を血液、組織及び/又は腫瘍試料において測定し、Mena11aの発現レベルから減算して「Menacalc」を決定することができ、前記参考文献の全内容は、参照により本明細書に組込まれている。
【０１７５】
TKIに対して耐性である(又は二次耐性がある)腫瘍を有する患者を同定するための方法では、対照と比較して(若しくはより早い時点で得た試料と比較して)MenaINV/Mena11a比増加、又は対照と比較して(若しくはより早い時点で得た試料と比較して)Menacalcの増加は、TKIに対して耐性である腫瘍を有する患者を示す。固形腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法では、試料におけるMenaINV/Mena11aの比が、より早い時点で得た試料と比較して増加された場合、又はMenacalcが、より早い時点で得た試料と比較して増加された場合、TKIの第2の有効量が投与され、及び/又はTKI以外の化学療法剤が投与され、及び/又はTKIでの処置が中止される。
【０１７６】
微小管結合剤に対して耐性である(又は二次耐性がある)腫瘍を有する患者を同定するための方法では、対照と比較して試料におけるMenaINV/Mena11a比増加、又は対照と比較して(若しくはより早い時点で得た試料と比較して)Menacalcの増加は、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を示す。固形腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法では、試料におけるMenaINV/Mena11aの比が、より早い時点で得た試料と比較して増加された場合、又はMenacalcが、より早い時点で得た試料と比較して増加された場合、微小管結合剤の第2の有効量が投与され、及び/又は微小管結合剤以外の化学療法剤が投与され、及び/又は微小管結合剤での処置が中止される。微小管結合剤とMenaINVの阻害剤とを患者に併用投与する工程を含む、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法では、試料におけるMenaINV/Mena11aの比又はMenacalcが測定されることもある。
【０１７７】
本発明の実施は、当該技術分野における技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の従来技術を利用することになる。そのような技術は、文献に記載されている。例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Sambrook、Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press社:1989)、DNA Cloning、第I及びII巻(D. N. Glover編、1985)、Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney、Alan R. Liss社、1987)、B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及びWalker編、Academic Press社, London, 1987)、Handbook Of Experimental Immunology、第I〜IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編、1986)を参照されたい。
【実施例】
【０１７８】
実施例1〜15の材料及び方法
具体的な細胞株及び細胞培養手順は、ヒト細胞株(MCF7、T47D、SkBr3、BT474、MDA-MB-231)及びHEK293を含み、これらをATCCから得て、10%ウシ胎仔血清(FBS、Hyclone)、L-グルタミン及び抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン;Invitrogen社)を補充したDMEM中で維持した。MTLn3細胞は、5%FBS、L-グルタミン及び抗生物質(ペニシリン/ストレプトマイシン;Invitrogen社)を補充したアルファ-MEM中で維持した。接着性単層培養物を、5%CO2及び95%空気中、37℃でインキュベートした。MVD7、Ena/VASP欠損マウス胎仔由来線維芽細胞を、Wyckoffにより記載されたように単離し(Wyckoffら、A paracrine loop between tumor cells and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors、Cancer Res 64(19):7022(2004))、15%FBSとペニシリン/ストレプトマイシンとL-グルタミン及び50U/mL  組換えマウスIFN-γとを含有する高グルコースダルベッコ変性イーグル培地(Invitrogen社)]中、32℃で培養した。マウス初代ケラチノサイトを単離するために、新生児Swiss Websterマウスからの皮膚を一晩、4℃で、2U/ml  ディスパーゼI及びII(Roche社)と共にインキュベートした。翌日、表皮を真皮から分離し、0.25%トリプシン(Gibco社)中、37℃で10〜20分間インキュベートし、45μm  セルストレーナーに通してケラチノサイトの単個細胞浮遊液を得た。4%キレート化FBSと0.05mM CaCl2と0.4μg/ml  ヒドロコルチゾン(Sigma Aldrich社)と5μg/ml  ウシインスリン(Sigma Aldrich社)と10ng/ml  組換えヒト上皮増殖因子(Invitrogen社)と10〜9M  コレラ毒素(ICN)と2×10〜9M 3,3',5-トリヨード-L-サイロニン(T3)(Sigma Aldrich社)と100U/ml  ペニシリンと100μg/ml  ストレプトマイシンと2mM L-グルタミンと0,1gr/l MgSO4とを補充した、カルシウム不含S-MEM(Invitrogen社)中で細胞を維持した。カルシウムスイッチ実験のために、培養培地中のカルシウム濃度を1.8mMに上昇させた。市販のキット(MycoAlert、Lonza社)を使用することにより、細胞株をマイコプラズマ汚染について定期的に検査した。
【０１７９】
標準的技術を使用して、マウス幹細胞ウイルス-EGFPをパッケージしているレトロウイルスベクターにEGFP-Menaスプライスアイソフォームをサブクローニングした。変異誘発ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー(Stratagene社)を使用してEGFP-Mena11aS>A変異体を生成し、シークエンシングにより確認した。
【０１８０】
Mena11aノックダウン手順に利用したshRNAは、EcoRI/XhoI部位を有するPCRプライマーにより増幅したshRNAを含む、97-merオリゴ(Invitrogen社)に基づくものであり、それをpMSCV-miR30-MLS-GFPベクター(MIT、コッホ研究所(Koch Institute)のMichael Hemannからの寄贈品)にクローニングした。オリゴ配列は、次の通りである:
sh-1(配列番号6)
TGCTGTTGACAGTGAGCGCATGATTCATTACACAGACCAATAGTGAAGCCACAGATGTATTGGTCTGTGTAATGAATCATATGCCTACTGCCTCGGA
sh-1C(配列番号7)
TGCTGTTGACAGTGAGCGAATGATTCCTTAAACAGCCCAATAGTGAAGCCACAGATGTATTGGGCTGTTTAAGGAATCATGTGCCTACTGCCTCGGA
sh-2(配列番号8)
TGCTGTTGACAGTGAGCGCAACAGGTCCTATGATTCATTATAGTGAAGCCACAGATGTATAATGAATCATAGGACCTGTTATGCCTACTGCCTCGGA
sh-2C(配列番号9)
TGCTGTTGACAGTGAGCGAAACAGGTCATAGGATTAATTATAGTGAAGCCACAGATGTATAATTAATCCTATGACCTGTTCTGCCTACTGCCTCGGA
【０１８１】
レトロウイルスパッケージング、感染及び蛍光活性化細胞選別は、Wyckoffにより記載されたように行った。簡単に言うと、レトロウイルスプラスミドを、pCL-Ecoヘルパープラスミド(齧歯類細胞用)、又はVSV-g及びGAG-Pol cDNAを含有するプラスミド(ヒト細胞用)と共に、HEK293 Phoenix細胞に一過性にトランスフェクトし、48時間後に上清を回収した。MVD7、MTLn3、MCF7、T47D、SKBr3及びマウス初代ケラチノサイトを8mg/mL  ポリブレン(Invitrogen社)の存在下で24時間、ウイルスに感染させ、集密度90%になるまで培養し、トリプシン処理し、PBS/5%FCS中で蛍光活性化細胞選別(FACS)に付した。EGFP-Menaアイソフォームを発現するMVD7及びMTLn3細胞を、マウス胎仔由来線維芽細胞におけるMenaの内因性発現と同様の発現レベルに、又はPhilipparら、A Mena invasion isoform potentiates EGF-induced carcinoma cell invasion and metastasis、Dev Cell 15(6):813(2008)による記載の通りに、FACS選別した。
【０１８２】
細胞処置のための抗体、蛍光プローブ及び増殖因子は、以下のものを含んだ:ウサギポリクローナル抗Mena11a、マウスモノクローナル抗pan-Mena及びウサギポリクローナル抗ラメリポディン(Lpd)抗体を標準的方法により研究室内で生成した。市販の抗体は、ウサギポリクローナル抗ZO-1(Sigma社、希釈度1:250)、マウスモノクローナル抗E-カドヘリン(BD社、希釈度1:1000)、ウサギポリクローナル抗p34Arc(Millipore社、希釈度1:100)、ニワトリIgY抗GFP(Aves labs社、希釈度1:500)、ウサギポリクローナル抗GFP(BD biosciences社、希釈度1:5000)、マウスモノクローナル抗GFP(Clontech社、希釈度1:10000)、マウスモノクローナル抗ビメンチン(Thermo Scientific社、クローンV9、希釈度1:250)、ニワトリIgY抗ビメンチン(IHC用、Millipore社、希釈度1:500)、マウスモノクローナル抗CD68(Dako社、クローンPG-M1、希釈度1:300)、マウスモノクローナル抗CD31(Dako社、クローンJC70A、希釈度1:300)、マウスモノクローナル抗ファスシン(Dako社、希釈度1:50)、マウスモノクローナル抗チューブリン(BD biosciences社、希釈度1:5000)、ウサギポリクローナル抗GAPDH(Cell Signaling Technology社、希釈度1:1000)、ウサギポリクローナル抗EGFR pY1068(Cell Signaling Technology社、希釈度1:1000)、ウサギモノクローナル抗EGFR pY1173(Epitomics社、希釈度1:1000)である。CR405-ファロイジンを購入し(Biotium社)、1:50希釈した。ファロイジン、Alexa488ファロイジン、Alexa594ファロイジン(1:250希釈物を使用した)及びHoechst 33342(10μg/mlを使用した)は、Invitrogen社からのものであった。マウス組換え上皮増殖因子(EGF)は、Invitrogen社からのものであった。ニューレグリン1(NRG-1  β1)及び血小板由来増殖因子-BB(PDGF-BB)は、Peprotech社からのものであった。増殖因子の濃度は、示す通りである。
【０１８３】
ウェスタンブロッティングのために、プロテアーゼ阻害剤(Completeタブレット、Roche社)とホスファターゼ阻害剤(1mM  オルトバナジン酸ナトリウム、50mM  フッ化ナトリウム、40mM  ベータ-グリセロリン酸、15mM  ピロリン酸ナトリウム)とを含有するNP-40緩衝液(1%NP-40、150mM NaCl、及び50mM Tris、pH8.0)中で細胞を溶解した。タンパク質抽出物を8% SDS-PAGEゲル上で泳動させ、PVDF膜(Millipore社)に転写し、1時間、室温でTBST中5%ミルクでブロッキングし、示す通りの抗体でプローブした。マウス及びウサギ親和性精製HRP結合二次抗体(1:5000希釈したもの)は、Jackson Immunoresearchから購入した。PVDF膜をECL試薬(GE社)で現像した。
【０１８４】
図12、図16及び図18のウェスタンブロットについては、タンパク質抽出物を8%SDS-PAGEゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜(Biorad社)に転写し、1時間、室温で、Licorブロッキング緩衝液でブロッキングし、Licorブロッキング緩衝液で希釈した、図及び説明文に示されている抗体でプローブした。マウス及びウサギ親和性精製680及び800蛍光結合二次抗体(1:10000希釈したもの)は、Licor社からのものであった。Licor Odyssey赤外イメージングシステム(Licor社)を使用することにより膜をスキャンした。
【０１８５】
膜突出アッセイは、ある期間にわたって全細胞免疫の変化を継続的に測定することを含んだ。典型的には、0.35%BSAを補充したL15培地(Gibco社)中で4時間、MTLn3細胞を飢餓させた。刺激のために、37℃での0.5nM又は5nMどちらかのEGEFのバス適用で細胞を処置した。EGFを加えた後、10秒間隔で5分間、DICタイムラプス動画を記録した。MVD7細胞並びにMCF7 sh11a対照及びノックダウン細胞については、細胞を上記の通り飢餓させたが、それぞれ、100ng/mlのPDGF-BB又は100ng/mlのNRG-1で、37℃で刺激した。PDGF-BB又はNRG-1を加えた後、10秒間隔で10分間、DICタイムラプス動画を記録した。MTLn3及びMCF7細胞については、細胞トレーシングにより面積倍率変化を定量し、ImageJソフトウェアを使用して細胞面積を測定した。各細胞の免疫測定値を時間=0に標準化し、平均し、EGF又はNRG-1刺激後の時間に対してプロットした。
【０１８６】
顕微鏡法は、微分干渉(DIC)顕微鏡観察を含んだ。生存細胞イメージング実験のために、細胞をガラス底の皿(MatTek社)の上に播種し、1M HClで5分間処置し、その後、70%エタノール及びPBSで洗浄した。Nikon TE300顕微鏡に取り付けたORCA-ERカメラ(浜松ホトニクス株式会社)で、10X DIC/0.30NA又は40X DIC/1.3NA Nikon対物レンズのどちらかを使用して、細胞をイメージングした。タイムラプス中、この顕微鏡に適しているSolent Incubatorチャンバー(Solent社)を用いてMTLn3細胞を37℃に保った。Metamorphイメージングソフトウェア(Molecular Devices社)及びImageJを用いて、全ての画像を収集し、測定し、編集した。
【０１８７】
MTLn3細胞のDICタイムラプスシーケンス動画は5分の長さであり、40X DIC油浸対物レンズで3秒ごとにフレームを撮影した。Metamorph又はImageJを使用して、キモグラスを生成し、分析した。個々の突出に沿って配向された1画素幅の線領域に沿ってキモグラフを生成した。定量分析のために、キモグラフに個々の突出事象の始点から終点への直線を引き勾配を使用して速度を算出した。x軸(時間)に沿った線の投影を使用して突出の持続を算出した。突出時間は、イメージング時間を通して、膜が突出している総時間である。
【０１８８】
デコンボリューション広視野蛍光顕微鏡観察を使用する蛍光プローブの分析は、100μg/ml  ラット尾部I型コラーゲン(BD bioscience社)又は10μg/ml  ウシ血漿フィブロネクチン(MVD7細胞用)(Sigma社)を塗布したガラスカバースリップ上に播種し、細胞骨格緩衝液(10mM MES、pH 8.0、3mM MgCl2、138mM KCl、2mM EGTA、pH6.1、0.32M  スクロース)中の4%パラホルムアルデヒド中で20分間、室温で固定し、PBS中の0.2%Triton X-100中で透過処理し、PBS中の10% BSAで1時間ブロッキングし、抗体(図及び説明文に示されているもの)と共に1時間、37℃でインキュベートし、PBSで3回洗浄し、蛍光標識二次抗体、ファロイジン又はHoechstと共にインキュベートし、F-アクチン又はDNAをそれぞれ可視化した細胞を使用した。Mena及びMena11aの細胞間結合部を可視化するために(図13A及び図13B)、氷上で2分間、0.2%Triton X-100を含有する細胞骨格緩衝液中で細胞を透過処理し、氷上で20分間、細胞骨格緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド中で固定した。
【０１８９】
白金レプリカ電子顕微鏡観察は、Di Modugnoら、The cooperation between human Mena(hMena)overexpression and HER2 signaling in breast cancer、PLoS One 5(12):e15852(2010)による記載の通りに行った。MVD7細胞をカバースリップ上で培養し、10μM  ファロイジンと0.2%グルタルアルデヒドと浸透圧緩衝液としての4.2%スクロースとを含有するPEM緩衝液(100mM PIPES、pH6.8、1mM EGTA、1mM MgCl2)中の1%Triton X-100を用いて直ちに抽出した。1μM  ファロイジンと1%スクロースとを含有するPEMでカバースリップを洗浄し、0.1M  カコジル酸Na緩衝液(pH7.3)、2%グルタルアルデヒド、1%スクロース中で固定し、電子顕微鏡観察用に処理した。TEM JEOL 200CXを使用して画像をフィルムに収めた。
【０１９０】
胎仔E10.5腸、皮膚及び気管支肺胞上皮をSwiss Websterマウスから得た。腫瘍は、FVB遺伝背景のMMTV-PyMTマウス(マサチューセッツ工科大学(Massachusetts Institute of Technology)に所在するコッホ研究所のRichard Hynes研究室、及びアルベルト・アインシュタイン医学校(Albert Einstein College of Medicine)のJohn Condeelis研究室から入手可能)から得た。異なる胎齢及び成体年齢でマウスを屠殺し、直ちに解剖した。MMTV-PyMTマウスは、4カ月の時点で屠殺した。組織を3.7%緩衝ホルマリン中で固定し、処理し、パラフィンに包埋した。
【０１９１】
組織染色のために、5μm切片をキシレンで脱パラフィンし、段階希釈系列のアルコールで処置し、PBSで脱水し、10mM  クエン酸緩衝液(pH6.0)中での熱誘導抗原賦活化に付した。切片を0.5% Tween-20中で2時間、室温で10%正常ロバ又はヤギ血清と共にプレインキュベートし、1%ロバ又はヤギ血清及び0.5%Tween-20緩衝液中で一晩、4℃で一次抗体と共にインキュベートし、PBSで3回洗浄し、蛍光標識二次抗体(AlexaFluor、Molecular Probes社)中で2時間、室温でインキュベートし、DNAを標識するためにHoechst中でインキュベートした。
【０１９２】
Deltavision顕微鏡を使用し、SoftWoRx acquisitionソフトウェア(Applied Precision社)を使用して、又はNikon Ti倒立顕微鏡を使用し、NIS Elements取得ソフトウェア(株式会社ニコン)、40X及び60X 1.4 NAプランアポクロマート対物レンズ(オリンパス株式会社)若しくは40X 1.15NAプランアポクロマート対物レンズ(株式会社ニコン)、及びカメラ(それぞれ、CoolSNAP HQ、Photometrics社;又はZyla4.2 sCMOS、Andor社)を使用して、z系列の細胞及び組織をイメージングした。Deltavision顕微鏡で撮影した画像は、Deltavision SoftWoRxソフトウェア及び対物レンズに固有の点像分布関数を使用してデコンボリューションした。
【０１９３】
3次元構造照明顕微鏡観察については、405nm、488nm、594nmレーザー及び3台のPhotometrics Cascade II、EMCCDカメラを装備した、OMX-3D超解像度顕微鏡(Applied Precision/GE社)で細胞をイメージングした。1.512液浸油を使用して、0.125μmのzステップで100X、NA 1.4の油浸対物レンズを用いて、画像を取得した。全ての画像を同じ照明設定(100ミリ秒間、強度19%で405nmレーザー、150ミリ秒間、強度1%で488nmレーザー、及び100ミリ秒間、強度50%で594nmレーザー)で取得し、その後、OMX softWoRxソフトウェア(Applied Precision社)で処理した。8 x 0.125マイクロメートルのz切片のスタックの最大投射画像を.tiffとして保存した。
【０１９４】
細胞辺縁に沿って抗体又はローダミン標識反矢じり端からの蛍光強度を輪郭線に基づいたImageJ macroで定量した。本発明者らは、膜に沿ってシグナルの分布を測定し、細胞辺縁からの距離(平均値±SEM)、及び細胞辺縁から最初の0.65μmにおける強度の和の関数としてプロットした。上皮単層の遊離縁の細胞を手動で追跡することにより、及び真円度プラグイン内蔵ImageJを使用することにより、真円度測定を行った。この分析では、真円度値1は完全な円を示すが、値が0に近づくにつれて、伸長した細胞形状を示す。定量的イメージングのために、本発明者らは、同じ実験で分析した全ての細胞株について同じハードウェア構成及び露光時間を使用した。上皮単層の遊離縁における細胞の手動追跡を真円度プラグイン内蔵ImageJと共に使用して、真円度の程度を導出した。抽出した画素強度を、分析のためにMicrosoft Excelに、及びグラフ作成のためにGraph-Pad Prismにエクスポートした。
【０１９５】
接点での蛍光強度の定量分析は、変更を加えて、Leerberg等(Leerbergら、Tension-Sensitive Actin Assembly Supports Contractility at the Epithelial Zonula Adherens. Curr Biol:1-11(2014))に記載されているように行った。ImageJのラインスキャン機能を使用して、長さ4μmの線(20画素を平均)を、無作為に選択された接点に配置した。ImageJのプロットプロファイル機能を使用して、この線に沿った蛍光強度プロファイルの数値を得た。強度プロファイルの各々から一定の値を減算することにより、各々の独立したプロファイルのベースラインを補正した。3つの個々の実験から最低30の接点を測定した。データをPrism 5にインポートし、オフセット変数を用いてガウス関数に当てはめた。ピーク値及びそれらのSEを線形回帰により得た。
【０１９６】
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)によるMVD7細胞の感染は、Chakrabortyら、Listeria comet tails:the actin-based motility machinery at work、Trends Cell Biol. 18(5):220(2008)に従って行った。簡単に言うと、リステリア菌10403S株(Listeria 10403S)を使用して、200:1(細菌:細胞)のMOIを使用し、1 O.D.=細菌109個/mlと考えて、MVD7細胞を感染させた。37℃での細菌侵入のための1時間のインキュベーション時間の後、細胞をPBSで洗浄し、10mg/mlのゲンタマイシンを含有する培地を5時間にわたって添加して、細胞外リステリア菌を殺滅して、F-アクチン尾部の成長を可能にした。5時間後、細胞をPBSで洗浄し、細胞骨格緩衝液中4%パラホルムアルデヒドで固定し(20分)、ファロイジン及びHoechstで染色して、F-アクチン及びDNAをそれぞれ可視化した。上記のデコンボリューション顕微鏡をで画像を撮影した。F-アクチン尾部長をImageJでの手動追跡により定量した。
【０１９７】
標準的技術を使用して、G-アクチンをウサギ筋肉アセトンパウダーから抽出し、Superdex-200ゲル濾過カラムでゲル濾過した。ゲル濾過したG-アクチンをF-アクチン緩衝液(1mM ATP、5mM MgCl2、50mM KCl、50mM Tris/HCl、pH8.0)中で重合してF-アクチンにし、ローダミン-X  スクシンイミジルエステル(Invitrogen社)を製造業者の説示に従って用いて標識した。F-アクチンをG-アクチン緩衝液(0.2mM ATP、0.5mM DTT、0.2mM CaCl2、2mM Tris/HCl、pH8.0)中で解重合してG-アクチンにし、PD-10カラム(GE Healthcare社)に通して遊離ローダミンを除去した。
【０１９８】
反矢じり端アッセイは、多少の変更を加えて、Furmanら、Ena/VASP is required for endothelial barrier function in vivo、J Cell Biol 179(4):761(2007)により記載されたように行った。0.35%BSAを補充したL15培地中で4時間、MTLn3細胞を飢餓させた。刺激のために、37℃での0.5nM又は5nM EGFのバス適用で細胞を処置し、60又は180秒後、0.5mM  ローダミン結合G-アクチンの存在下で0.125mg/ml  サポニン(Sigma社)を用いて透過処理した。1分の標識化後、細胞骨格緩衝液中の0.5%グルタルアルデヒド中で試料を固定し、細胞骨格緩衝液中の0.5%Triton X-100を用いて透過処理し、PBS中の100mM  水素化ホウ素Na中で失活させ、CF405-ファロイジン(Biotium社)の存在下でブロッキングした。デコンボリューション顕微鏡で画像を撮影した。辺縁に沿ったファロイジン強度に対する反矢じり端強度の比を、Supplemental Experimental Proceduresに記載の通りに定量した。
【０１９９】
15cm皿で培養し、0.35%BSAを補充したL15培地(Gibco社)中で4時間飢餓させ、5nM EGFで刺激し、直後に、350μlの氷冷RIPA緩衝液(0.1%SDS、1%NP40、150mM NaCl、50mM TRIS(pH8.0)、0.5%  デオキシコール酸Na、ホスファターゼ阻害剤(PhosStop、Roche社)、及びComplete miniプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット(Roche社))中で凝固させたMTLn3細胞の、免疫沈降/タンデム質量分析。凝固し、不溶化した材料を10,000rpmで15分間、4℃で遠心分離した。上清を除去し、プロテインAプラスアガロースビーズ(Pierce社)で予備清澄化し、GFPに対するウサギポリクローナル抗体(BD Biosciences社)及びウサギIgG対照抗体で免疫沈降させた。抗体-抗原混合物をプロテインAセファロースビース(Pierce社)と混合し、よく洗浄した。結合タンパク質をLaemmli試料緩衝液に可溶化し、濃度勾配4〜15%のポリアクリルアミドゲル(BioRad)上で泳動させた後、クマシーブルーで染色した。ゲルからバンドを切り出し、Taplin Biological Mass Spectrometry Facility(ハーバード大学医学大学院)に送って、HPLC-MS/MSを使用して翻訳後修飾を同定した。MS分析は、Swanson Biotechnology Proteomics Core(マサチューセッツ工科大学、コッホ統合がん研究所(Koch Institute for Integrative Cancer Research))が標準的な方法によって行った。
【０２００】
The Cancer Genome Atlas(TCGA)公開データポータル(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)から、1098名の乳がん患者(BRCA)及び461名の結腸直腸腺癌患者(COAD)についてのエクソンレベル遺伝子発現データ(RNAseqV2)及び臨床データを入手した。MenaCalcは、次の式を用いて算出した:MenaCalc=平均RPKM構成的エクソン(hg19 225695653:225695719及び225688694:225688772)-RPKM選択的エクソン11a(hg19 225692693:225692755)。COADコホートにおけるMenaCalc、Mena及びMena11aと転移との関連性をR 2.15.3でのロジスティック回帰により評価した。本発明者らは、先ず、転移の病理学的病期の指定のない対象を除外した。試験全体にわたって係数を比較するために、本発明者らは、平均値ゼロ及び標準偏差1のMenaCalc、Mena及びMena11a RPKM値を標準化した。転移を従属変数(遠隔転移の証拠なしの場合M0、遠隔転移を有する証拠がある場合M1)として選択することにより、ロジスティック回帰を行った。このモデルに当てはめられる唯一の独立変数が、それぞれ、MenaCalc又はMena又は11aであった。P値、及び独立変数に対応する係数を使用して、関連性のレベルを判断した。Mena、Mena11a、及びMenaCalcと有意な相関関係がある上位50遺伝子を、Enrichr分析ツール(Chenら、Enrichr:interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool、BMC Bioinformatics 14:128(2013)、http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)とMsigDbを使用するGSEAソフトウェア(Subramanianら、Gene set enrichment analysis:A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles、PNAS USA 102:15545(2005)、http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)とを使用するGO分析に付した。
【０２０１】
(実施例1:MDA-MB-231細胞におけるMena又はMenaINV発現増加は、タキソールでの処置に対する耐性をin vitroで駆動するが、ドキソルビシン又はシスプラチンに対してはしない)
化学療法への乳がん細胞の応答に対するMenaアイソフォーム(Mena又はMenaINV)発現上昇の効果を、in vitroで低い内因性レベルのMena及び検出不能レベルのMenaINVを発現する三種陰性乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)を使用して、分析した(図1D)。GFP、GFPタグ付きMena、又はMenaINVを安定的に発現するMDA-MB-231集団をレトロウイルス感染、続いてのFACにより生成して、均一で同等のレベルの各構築物を発現する細胞集団を作出した。GFP-MenaINV、GFP-Mena又はGFP  を発現する、得られたMDA-MB-231集団を96ウェルプレートに播種し、0.1nM〜100μMの範囲の濃度のドキソルビシン又はタキソールで又は1nM〜100nMの範囲の濃度のシスプラチンで72時間処置し、このとき、Prestoblue染色を使用して細胞生存率を測定した。GFP-Menaを発現する生存MDA-MB-231細胞又はMDA-MB-231 GFP-MenaINV細胞の割合は、100nM、1μm又は10μMのタキソールでの72時間の処置後に生存MDA-MB-231 GFP(対照)細胞の割合より少なくとも65%高く(図1A)、同様の結果が24時間後に観察された(データを示さない)。しかし、GFP-Mena発現も、GFP-MenaINV発現も、様々な濃度のドキソルビシン又はシスプラチンでの72時間の処置後、生存MDA-MB-231細胞の割合に対してGFP対照と異なる影響を及ぼさなかった(図1B、図1C)。
【０２０２】
(実施例2:乳がん細胞株におけるMenaの内因レベルは、タキソール処置に対するそれらの耐性と相関する)
初期実験は、単一の細胞株における異所性発現に頼ったものであり、本発明者らは、内因性Mena発現レベルが異なる乳がん細胞株のパネルをタキソールに対する感受性について調査した。ルミナルA(MDA-MB 175IIV及びT47D)、HER2陽性(MDA-MD 453)及びTNBC(SUM 159、BT-20、MDA-MB 436、LM2、BT-549、MDA-MB 231)を含む、共通のサブタイプからの9種のヒト乳がん細胞株にわたって、内因性Menaタンパク質発現レベルを、抗pan Mena抗体を用いるウェスタンブロットによりアッセイした(図1D;註記:MenaINVは培養中のこれらの乳がん細胞株のいずれにしても検出可能なレベルで発現されないので、分析はMenaに限定される)。タキソールの効力(様々なタキソール濃度での72時間の処置後の精細胞の割合)を測定し(図1E)、タキソールの効力と内因性Mena発現レベルとの非常に有意な反相関が観察された。本質的に、低いzMenaは、タキソール処置細胞において低い耐性/生存率低下と相関し、その一方で高い内因性Menaは、タキソール処置細胞において高い耐性/生存率と相関した(図1F)。
【０２０３】
(実施例3:Mena又はMenaINV発現は、処置された動物の腫瘍に対するタキソール効力を阻害する)
NOD-SCIDマウスの乳房脂肪体へのGFPを発現するMDA-MB-231細胞(対照)、GFP-Menaを発現するMDA-MB-231細胞(Mena)又はGFP-MenaINVを発現するMDA-MB-231細胞(MenaINV)の注射により、異種移植腫瘍を有するマウスを生じさせた。原発性腫瘍が直径1cmに達したら、3用量のタキソール(10mg/kg)又は2用量のドキソルビシン(5mg/kg)でマウスを処置した。腫瘍サイズを処置前及び後に測定した。タキソール又はドキソルビシンのいずれかでの処置は、ビヒクルで処置したマウスと比較して対照腫瘍の増殖を有意に減少させたが、Mena又はMenaINV腫瘍の増殖は、タキソール処置による影響を受けなかった(図2A)。これらのin vivo知見は、in vitroデータで得られた結果と一致し、腫瘍増殖により判断してMen/MenaINVがタキソールに対する耐性を促進することを示す。in vitro実験は、ドキソルビシンへの細胞感受性に対する異所性Mena又はMenaINV発現の効果を明らかにすることができなかったが、Mena又はMenaINVを発現する腫瘍は、in vivoで対照と比較してドキソルビシンへの応答減少を示した(図2B)。これは、Menaレベル増加が、ドキソルビシン処置の抗増殖効果から腫瘍を保護しうることを示す。
【０２０４】
Mena/MenaINVレベル増加のin vivoでのタキソール処置(生存細胞の割合増加)及びin vitroでのタキソール処置(抗腫瘍増殖効果に対する耐性)に対する効果は、増殖増加、アポトーシス減少、又は両方に起因する可能性があった。増殖及び細胞死に対するMena/MenaINVの効果を評価するために、腫瘍切片をKi67(増殖マーカー)及び切断カスパーゼ3(アポトーシスマーカー)に対する抗体で染色した。予想通り、タキソール処置は、MDA-MB-231対照腫瘍における増殖(Ki67陽性)細胞数を有意に減少させた(図2C、図2D)。対照とは異なり、タキソール処置は、Mena発現及びMenaINV発現MDA-MB-231細胞を使用して発生させた腫瘍の増殖を減少させることができなかった(図2C、図2D)。3タイプ全ての腫瘍において、タキソールでの処置は、切断カスパーゼ3レベルにより判断して、同様の、有意なアポトーシス応答を誘導した(図2E、図2F)。総合して、これらのデータは、異種移植腫瘍におけるMena/MenaINV発現MDA-MB-231細胞の増殖が、異種移植片における対照MDA-MB-231細胞の増殖を停止させるタキソール処置に対して非感受性であることを示す。したがって、Mena/MenaINV発現上昇は、タキソール処置の抗増殖効果を阻害することにより、処置動物における腫瘍増殖継続を可能にする。
【０２０５】
(実施例4:タキソール処置は、MenaINV発現異種移植片の転移を低減させることができない）
転移に対するタキソール処置の帰結を調査するために、本発明者らは、対照、Mena又はMenaINV腫瘍を担持するマウスからの肺における転移数及び培養骨髄におけるコロニー数を12週間計数した。MenaINV腫瘍からの骨髄における転移数(図3A)又は肺における転移数(図3B)は、タキソール処置による影響を受けなかった。予想通り、同所移植されたMenaINV発現MDA-MB-231細胞からなる異種移植腫瘍を有するビヒクル処置動物は、骨と肺の両方において相当高い転移負荷を示し、同様の転移レベルがタキソール処置動物において観察された。したがって、タキソール処置は、MenaINV発現に関連する転移表現型増加を低減させることができない。
【０２０６】
(実施例5:タキソール処置は、in vitro及びin vivoでMenaタンパク質発現増加を誘導する)
高いMena又はMenaINV発現レベルはタキソールに対する低い応答と相関するので、本発明者らは、タキソール処置がMena発現に影響を与えると仮定した。本発明者らは分析した(図4B)。薬物での72時間の処置後、Menaの発現レベルは、ビヒクル処置細胞より70%高かった。GFP発現のFACS分析は、タキソール処置が、より高いMenaINV-GFP発現細胞を選定することを明らかにした(図4A)。対照腫瘍からの組織切片の免疫組織化学分析により、ビヒクルと比較してタキソール処置マウスからの腫瘍における全体的なMenaとMenaINVアイソフォーム両方の発現レベルの増加が確証された(図4A、図4B)。
【０２０７】
(実施例6:Mena発現レベルは、EGFR及びHGFRの阻害剤に対する耐性と相関し、MenaINVの発現は、EGFR及びHGFRによるシグナル伝達増加、並びにEGFR及びHGFR阻害剤に対する耐性上昇を駆動する)
以前に、本発明者らは、MenaINVの発現が腫瘍細胞運動性増加及びEGF刺激に対する浸潤反応を誘導するという表明を報告した。更に、マウス乳がんモデル腫瘍からEGFが入っているマイクロニードルに採取した侵襲性腫瘍細胞亜集団におけるMena及びMenaINV mRNAレベルは、化学浸潤により増加される。これは、米国特許第8,603,738号に記載されており、前記特許文献の内容は、それら全体が参照により組込まれている。EGF刺激への生物物理学的応答に対するMenaアイソフォームの効果を、同じく参照により組込まれている、公開されている米国特許出願公開第2015/0044234号に記載されているように更に調査し、1)MenaINV発現が、EGFR、HGFR(MET)及びIGFR受容体チロシンキナーゼによるリガンド誘発応答を増加させること、2)MenaINV依存性シグナル伝達増加が、リガンド刺激に反応して上昇したRTK活性化のために生じること、3)MenaINV発現が、EGFR及びHGFRに対する標的阻害剤の、これらのRTKによるリガンド誘導シグナル伝達を遮断するために必要とされる濃度を上昇させること、4)機序的には、5'イノシトールホスファターゼSHIP2とチロシンホスファターゼPTP1Bの両方と会合しているMenaを含有するタンパク質複合体が、リガンド刺激時に迅速に活性化EGFRに動員され、その結果、PTP1B媒介脱リン酸化及びEGFRシグナル伝達減弱が生じることになることを発見した。MenaINVは、EGFRへのPTP1Bのこのリガンド依存性動員を遮断し、これにより、受容体によるシグナル伝達を増加させ、EGFRへの結果として生じる下流の生物物理学的応答の大きさを増大させる。これらの観察と一致して、PTP1Bの薬理学的阻害は、EGFにより誘発される運動性及び浸潤に対するMenaINV発現の効果と同様の効果を示す。
【０２０８】
(実施例7:特定のRTK阻害剤に対する耐性と遺伝子発現の相関の分析は、いずれの遺伝子についてもEGFR阻害とHGFR阻害の両方に対する耐性と唯一最も高度に相関するのが、Mena発現であることを示す)
Broad CCLEデータベースを検索して、その発現が特定のRTK阻害剤と相関関係がある遺伝子を同定した。これらのデータの主成分分析(PCA)は、Mena発現レベルが、EGFRとHGFRの両方の標的阻害剤での(独立してアッセイした各々の阻害剤での)処置に対する癌細胞株の耐性と、より高度な相関があることを示す。PCA分析は、図5にプロットされている。
【０２０９】
(実施例8:MenaINV mRNA及びタンパク質発現により生存乳がん患者が予測される)
MenaINVの強制発現は、異種移植腫瘍モデルにおいて転移を駆動することは公知であり、qPCRにより検出されるそのMenaINV mRNAレベルは、効率的に血管侵入する腫瘍細胞である侵襲性、EGF陽性腫瘍細胞において、及びTMEM(EGFR/HER2-乳がん患者における転移の尤度に関連する、腫瘍細胞、マクロファージ及び内皮細胞を含有する構造)の数が多い患者において、比較的高い。しかし、ヒト乳がん患者におけるMenaINV mRNA又はタンパク質のレベルと臨床転帰との関係は、調査されていない。ここで、本発明者らは、RNAseq及び臨床データが入手可能であるTCGAコホートにおける1060名の乳がん患者の分析を報告する。RNAseqデータが最初に分析されたときINVエクソンにアノテーションが付与されなかったので、許可されたアクセスによりNCIから生データを得、個々のリードを各試料における全てのMenaエクソンにマッピングした。本発明者らは、全TCGA乳がん患者における全般的Mena mRNAレベル(構成的に含まれているエクソンのレベルにより判断した)が高い患者(上位1/4)と低い患者(下位3/4)間に生存率の差がないことを見いだした(図6)。しかし、MenaINV mRNAのレベルが(INV配列リードの存在量により評価して)高い(上位1/4の)患者は、MenaINV発現の下位3/4の患者より悪化した(図6)。同様の結果が、少なくとも10年経過観察している患者において見られ(図7、8)、リンパ節転移陰性疾患を有する患者においても見られた(図9)。
【０２１０】
MenaINVに対して特異的な新たに開発した抗体(図10)を使用して、本発明者らは、次に、患者300名の以前に特徴づけられた組織マイクロアレイ(TMA)(Wangら、CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis、Cancer Cell 25(1):21(2014))において内因性MenaINVと生存率との関係を調査した。TMAのイメージング及び画像分析は、Mark Gustavsonの助力を得てMetaStat社において彼らの設備及びソフトウェアを用いて行った。より高いMenaINVレベルは、転帰不良と有意に相関していた(図10A;図10Dは各四分位からの代表画像を示す)。加えて、局所部位又は遠位部位のいずれかにおいて疾患が再発した患者は、有意に高いMenaINVレベルを有した(図10C)。MenaINV発現の平均4.6倍増加は、再発した患者数の2倍増加と相関した(図10B)。MenaINV発現の更なる増加は、再発の更なる増加と相関しなかった。これは、MenaINVタンパク質発現の小さな増加であっても再発に影響を与えうることを示唆している。
【０２１１】
(実施例9:Mena11aは、アクチン細胞骨格の構築及び運動性に対するMenaの効果を修飾する)
米国特許第8,603,738号(この特許文献の内容は、それら全体が本明細書に組込まれている)に記載されているように、Mena11aのレベル(アイソフォーム特異的抗Mena11a抗体での染色による)より低い全てのMenaアイソフォームのレベル(抗panMena免疫染色による)を表すMenaCalcを評価するための多重定量的免疫蛍光アプローチ(MQIF)は、MenaCalcが乳がん患者の生存率と有意に相関していることを示した。
【０２１２】
Mena11aタンパク質の一般的機能性を理解するために、本発明者らは、マウス胎仔組織における並びに成体マウス及び成人ヒト組織における発生中のその分布を調べた。Mena11aが、一部の上皮がん細胞株において濃縮されていることは公知であり、上皮様乳がん細胞においてロバストに発現され、間葉様乳がん細胞では、仮にあったとしても、低レベルで発現され(図11B)、Mena11aの異所性発現が粘着性、上皮様形態を有する原発性乳房腫瘍の形成を促進することは公知である。しかし、正常な胎児組織及び成体組織両方におけるMena11a発現は、以前に調査されていない。全てのMenaアイソフォーム(「pan-Mena」)を認識する抗体又はMena11aを排他的に認識する抗体を使用して、本発明者らは、Mena11aが正常組織においてpan-Menaと比較して異なって分布することを見いだした。発生過程のマウスE15.5真皮及びE15.5肺では、Mena11aは、表皮(図11C)及び肺上皮(図11D)の細胞にそれぞれ局在したが、周囲のpan-Mena発現間葉系には含まれず、その発現は、マウス表皮(図11E)、マウス気管支肺胞上皮(図11F)及びヒト結腸上皮(図11G)を含む、成体マウス及び成人ヒト上皮組織内に留まった。したがって、本発明者らは、Mena11aはin vivoでは正常上皮構造に濃縮されると結論づけた。
【０２１３】
幾つかの上皮ヒトがんが、上昇したレベルのMenaタンパク質を発現することは公知である。Mena11aタンパク質の発現は、原発性異種移植マウス乳房腫瘍及び臨床試料において調査されている。しかし、腫瘍進行中のMena11aタンパク質発現及び分布は、まだ報告されていない。したがって、本発明者らは、浸潤性乳がんのMMTV-PyMTマウス乳房腫瘍モデルを使用してMena11a発現を調査した。本発明者らは、抗体を用いてMMTV-PyMT組織をpan-Mena及びMena11aについて染色し(図11F)、これにより、本発明者らは、腫瘍進行中の全Menaに対するMena11aタンパク質の相対分布を詳しく調査することができた。腺腫及び早期癌(それぞれ、図12A及び図12B)において、pan-Mena及びMena11aは、多様な発現を有した:Mena11a及びpan-Menaは、上皮に濃縮されていたが、Mena11aは、pan-Mena陽性間質細胞には濃縮されていなかった。
【０２１４】
組織マイクロアレイの多重定量的免疫蛍光(MQIF)を使用して、臨床試料におけるpan-Menaタンパク質発現とMena11aタンパク質発現の両方を調査した。この方法を使用して前の研究では、全てのMenaアイソフォームとMena11aタンパク質レベル間の差を測定する測定基準であるMenaCalcの高い値は、3つの独立した乳がん患者コホートにおける全生存率低下に関連しているが、Mena又はMena11aのどちらか単独でのタンパク質発現レベルは関連していないことを立証した。臨床試料からのRNAseqトランスクリプトームデータを使用してMenaCalcと等価の代替測定基準を開発することができるかどうかを調査するために、本発明者らは、公表されているTCGAデータポータルからエクソンレベル遺伝子発現データを入手し、Menaを構成的に含むエクソンをコードするmRNAの存在量、Mena11a、又はMenaCalcのmRNAに基づくバージョンが全生存率に関連しているかどうかを判定した。本発明者らは、MenaCalcにはこのTCGA乳がんコホート(BRCA)における全生存率との相関性がないことを見いだし、これは、10年より長く経過観察している患者の限られた数(生存n=55、死亡n=73)による可能性が高かった。
【０２１５】
MenaCalcのmRNAに基づくバージョンは、米国国立がん研究所(National Cancer Institute)の「The Cancer Genome Atlas」(TCGA)公開データポータル(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)から入手した、1098名の乳がん患者(BRCA)及び461名の結腸直小腺癌患者(COAD)についてのエクソンレベル遺伝子発現データ(RNAseqV2)及び臨床データに基づく。ManaCalcは、次の式を用いて算出した:MenaCalc =  平均RPKM構成的エクソン(hg19 225695653:225695719及び225688694:225688772)-RPKM選択的エクソン11a(hg19 225692693:225692755)。COADコホートにおけるMenaCalc、Mena及びMena11aと転移との関連性をR 2.15.3でのロジスティック回帰により評価した。本発明者らは、先ず、転移の病理学的病期の指定のない対象を除外した。試験全体にわたって係数を比較するために、本発明者らは、平均値ゼロ及び標準偏差1のMenaCalc、Mena及びMena11a RPKM値を標準化した。転移を従属変数(遠隔転移の証拠なしの場合M0、遠隔転移を有する証拠がある場合M1)として選択することにより、ロジスティック回帰を行った。このモデルに当てはめられる唯一の独立変数が、それぞれ、MenaCalc又はMena又はMena11aであった。P値、及び独立変数に対応する係数を使用して、関連性のレベルを判断した。Mena、Mena11a、及びMenaCalcと有意な相関関係がある上位50遺伝子を、上記の通りのEnrichr分析ツール及びGSEAソフトウェアを使用するGO分析に付した。
【０２１６】
Mena11aは、正常ヒト結腸上皮において発現され(図11G)、Menaは、結腸直腸腺癌においてアップレギュレートされるので、本発明者らは、MenaCalcレベルが、全生存率と相関するのか、又はTCGA結腸腺腫(COAD)コホートに関するアノテーションを付与した臨床病理学的特徴と相関するのかを調査した。MenaCalcは、全生存率を予測しなかった(この場合もやはり、比較的短い経過観察期間及びコホート内の少ない患者数、>1年の経過観察、生存n=110、死亡n=33のためである可能性が高い)が、遠隔転移の証拠がある(M1)患者は、平均して、遠隔転移の証拠のない(M0)患者と比較して有意に高いMenaCalc値を有した(図12C)。ロジスティック回帰分析により、COADコホートにおいて、MenaCalc(係数=0.349、p=0.003)は、転移に有意に関連するが、単独でのMena(係数=0.176、p=0.168)も、単独でのMena11a(係数=-0.033、p=0.808)も、関連しないことが立証された。これらのデータは、MenaCalcが少なくとも一部の癌において悪性憎悪と関連しているという考えを支持する。
【０２１７】
驚くべきことに、その発現レベルがMena、Mena11a又はMenaCalcのレベルと相関する遺伝子についての遺伝子オントロジー(GO)及び遺伝子セット濃縮解析(GSEA)は、異なる機能アノテーションセットが、MenaCalcでは濃縮されるが、Mena又はMena11a相関遺伝子リストでは濃縮されないことを示した(図12D)(表1)。COADコホートにおけるMenaCalcと相関関係がある上記50遺伝子(表2)は、EMTに関連している遺伝子セット(表1)において濃縮され、細胞l-基質接着(GO:0031589)及び細胞-マトリックス接着(GO:0007160)等のGOタームを伴い(図12D)が、単独のMena及びMena11aと相関する遺伝子(表2)は、がん浸潤及び転移に直接関与する重要な生物学的プロセスにおいて濃縮されず、関連してもいなかった。これらの知見は、11aエクソンを欠くMenaアイソフォームの存在量を表すMenaCalcは、全Menaレベル又はMena11aレベルのどちらかより転移促進性表現型とより大きく関連するという考えと一致し、これは、Menaレベル又はMena11aレベルではなくMenaCalcが、複数の乳がん患者コホートの適切な検出力を有する分析で臨床転帰不良と関連づけられた理由を知る上での可能性のある手がかりとなる。
【０２１８】
(実施例10:Mena11aは、F-アクチン構造を調節することにより細胞間結合部位を維持する)
Mena11aは上皮において濃縮され、本発明者らは、Mena11aが、in vivoでは細胞間接点を優先的に標的にし(図11及び図12)、培養ヒト乳がんMCF7細胞ではタイトジャンクションにZO-1と(図13A)及び接着結合部位にE-カドヘリンと(図13B)共局在する。初代マウスケラチノサイトでのカルシウムスイッチ実験は、Mena11aが、カルシウムの再付加時に形成する新生E-カドヘリン陽性接着結合部位に動員されることを示す(図14A)。
【０２１９】
前の研究ではマウス乳房腫瘍におけるMena11aの異所性発現が、接着性細胞間接触と関連していることを立証したが、これらの過剰発現アッセイでは、1)更なる内因性Menaアイソフォームが、使用した細胞株において共発現され、Mena11aとの混合四量体を形成しうるため、及び2)内因性発現したMena11aが、これらの実験においてなお発現されたため、Mena11aの特異的要件に取り組まなかった。11a配列がMenaとは異なる特異的機能を有するMena11aをもたらすかどうかを評価するために、本発明者らは、63塩基の11a挿入を目的とするshRNA(sh-1、sh-2、本明細書では以降、Mena11a-KD)及び対の対照shRNA(sh-1C、sh-2C、本明細書では以降、対照-KD)を設計した。MCF7細胞では、Mena11a shRNAは、Mena11aを効率的にダウンレギュレートしたが、11a挿入を欠くMenaのタンパク質レベルに影響を与えなかった(図13C〜図13D及び図14B)。対照実験では、MDA-MB-231ヒト三種陰性乳がん細胞(内因性Mena11aを発現しない、図11B)をMena11a shRNAに感染させたとき、Menaレベルは不変であり、これによりそれらの特異性が確証された。
【０２２０】
細胞間接点でのMena11aアイソフォーム特異的機能を調査するために、本発明者らは、F-アクチン、タイトジャンクション(図14C)又は接着結合部位(図13E)をそれぞれ可視化するためにファロイジン、ZO-1又はE-カドヘリンで染色したMCF7 Mena11a-KD細胞及び対照-KD細胞の単層を、超解像度三次元構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を使用してイメージングした。Mena11a-KD細胞は、蛍光強度定量により示される通り、接着結合部位でのE-カドヘリン蓄積低減を有した(図13E)。F-アクチンの周縁帯は、通常、上皮層内のタイトジャンクション及び接着結合部位に隣接して存在し、この構造は正常に見えた。しかし、Mena11a-KD細胞では、F-アクチンは、actin appeared to be disorganized at both the tight  タイトジャンクション(図14C)と接着結合部位(図13E)の両方において無秩序であるように見えた。総合して、これらのデータは、Mena11aアイソフォームが、細胞間接点の構造の調節に、他のMenaアイソフォーム(その発現は、Mena11aのアイソフォーム特異的欠乏による影響を受けない)又はEna/VASPファミリーメンバーとは異なる役割を担うことを示す。
【０２２１】
(実施例11:Mena11a特異的欠乏は、細胞遊走及び膜突出を増進させる)
以前に、異所性発現を用いるアッセイでがん細胞運動性に対するMena11aの効果を評価した。がん細胞運動性に対する内因性発現Mena11aの役割を研究するために、本発明者らは、Mena11aタンパク質レベルの>80%低下を有するT47D及びSKBr3ヒト乳がん細胞を含む、Mena11a-KD細胞(図15A〜図15B、図15E〜図15F)を、創傷閉鎖アッセイに使用した。SKBr3対照-KD細胞の単層においてギャップを露出させた24時間後に初期無細胞領域のおおよそ52%が塞がれた(sh-1C:49.03%±4.2;sh-2C:55.24%±1.8)が、SKBr3 Mena11a-KD細胞のほうが有意に大きい面積を塞いだ(sh-1:74.76%±4.8;sh-2:77.84%±3.6)(図15G〜図15H)。これは、Mena11a欠乏細胞が泳動増進を示したことを示す。T47D細胞は、同様の結果を生じさせたが(図15C〜図15D)、対照T47D細胞の完全閉鎖にはSKBr3細胞でより長い時間がかかった。T47D対照-KD細胞は、48時間後に無細胞領域のおおよそ45%を塞いだ(sh-1C:50.41%±3.7;sh-2C:40.38%±4.2)が、T47D Mena11a-KD細胞はそのおおよそ74%を塞いだ(sh-1:78.39%±4.8;sh-2:70.20%±8.8)(図15C〜図15D)。したがって、MenaとMena11aの両方を正常に発現する細胞からのMena11aアイソフォームの欠乏は、細胞泳動率を上昇させた。
【０２２２】
泳動の変化と一致して、本発明者らは、T47D Mena11a-KD細胞の形態が、特に単層の自由縁において、対照-KD細胞とは異なることを観察した(図15I)。対照-KD細胞の真円度(完全円形=1、減少する値は伸長増加を示す;「方法」を参照されたい)は、典型的な敷石上皮形態を有する細胞について予想される通り、約0.66(sh-1C:0.683;sh-2C:0.640)であったが、Mena11a-KD細胞の真円度は、それより有意に低い約0.56(sh-1:0.614;sh-2:0.509)であり、これは、それらがより伸長された形態を有することを示していた(sh-1C対sh-1 p<0.005;sh-2C対sh-2 p<0.005)(図3J)。
【０２２３】
増殖因子により誘発される膜突出は、乳がん細胞の3D泳動と相関しており、且つ癌細胞の播種及び転移と相関している。MCF7細胞は、膜突出によるニューレグリン1(NRG-1)処置に応答した。したがって、本発明者らは、タイムラプス顕微鏡観察を使用して、Mena11aがMCF7細胞におけるNRG-1により誘発される突出に影響を与えるかどうかを判定した。対照-KD細胞と比較して、Mena11a-KD MCF7細胞は、細胞面積の倍率変化により測定して膜突出の有意な増加を示した(図15K〜図15L)。総合して、これらのデータは、内因性Mena11aが、細胞運動性を低下させ、上皮乳がん細胞における増殖因子により誘発される葉状仮足突出を減弱することを示す。Mena11aのこれらの効果は、乳がん細胞運動性及び葉状仮足突出を増加させるMenaの効果とは異なる。
【０２２４】
(実施例12:アクチン細胞骨格構築に対するMena11aの効果)
細胞間結合部及び膜突出におけるMena11aアイソフォーム特異的表現型は、Mena11aがMenaと比較してアクチン細胞骨格再構築に対して異なる影響を与えることができる可能性を提起する。本発明者らは、培養細胞におけるEna/VASP機能を研究するために使用される確立されたモデルにおいてアクチン細胞骨格構築へのMena11aの寄与を詳しく調査した。EVLの検出可能な発現を欠くMena/VASPダブルノックアウトマウスに由来する胎仔由来線維芽細胞(MVD7細胞)を使用して、同等レベルのGFP、GFP-Mena、又はGFPMena11aを発現する細胞株(本明細書では以降、GFP、Mena及びMena11a細胞)のパネルを生成した(図16A)。Ena/VASP「欠損」バックグラウンド細胞株におけるMena又はMena11aの個々の発現は、その細胞において内因性に又は外因性に発現されるMenaアイソフォームのヘテロ四量体から生じる可能性のある結果の解釈を簡単にする。3D-SIMイメージングは、Mena及びMena11aタンパク質が最先端に及びMVD7細胞の接着点に局在することを明示した(図17A)。したがって、Mena11aは、Mena又は他のEna/VASPタンパク質とは無関係に、細胞内の共通Ena/VASP局在部位に標的化される。
【０２２５】
MVD7細胞のアクチンネットワーク構造を制御することへのEna/VASPタンパク質の関与が分かっていたことから、本発明者らは、アクチンネットワークがMena11を発現する細胞において組織化する方法を、Menaを発現する細胞におけるもの又は全てのMenaアイソフォームを欠くものと比較した。本発明者らは、白金レプリカ電子顕微鏡を使用して、葉状仮足突出を誘導するために100ng/ml PDGF-BBで180秒間刺激したGFP、Mena及びMena11a MVD7細胞株の葉状仮足におけるアクチンフィラメントネットワークの超分子構造形成を調査した。GFP対照細胞と比較して、アクチンネットワーク密度は、Mena発現により著しく変化したようには見えなかったが、Mena11a発現細胞の葉状仮足ではかなり減少するように見えた(図17B)。
【０２２６】
葉状仮足最先端におけるアクチンネットワーク密度は、分岐F-アクチンネットワークの核になる複合体であるArp2/3に依存するため、本発明者らは、Mena11a発現が葉状仮足内のArp2/3存在量に影響を与えうると判断した。GFP、Mena及びMena11aを発現するMVD7細胞を100ng/mlのPDFG-BBで180秒間刺激し、3D-SIMによりイメージングした。Mena11a細胞は、葉状仮足最先端において、GFP細胞及びMena細胞両方と比較して有意に低下したArp2/3複合体レベルを示した(図17C)。葉状仮足端部から0.6μm以内のArp2/3分布及び密度を定量するために使用した、輪郭線に基づいた分析は、Mena11aの発現が、Mena発現細胞と全てのEna/VASPタンパク質を欠く細胞の両方と比較して、Arp2/3存在量を有意に低減させることを示した(図17D〜図17E)。したがって、Mena11a発現は、Arp2/3媒介アクチン重合に対して、VASP及びEVLはもちろん他のMenaアイソフォームとも無関係の、異なる阻害効果を発揮する。
【０２２７】
がん細胞及び線維芽細胞においてアクチン重合を制御する複雑なシグナル伝達ネットワークのため、本発明者らは、そのアクチン重合駆動細胞内運動を支持するために宿主細胞タンパク質の限定セットを動員するリステリア・モノサイトゲネスに関連してMena11a機能を研究することを選択した。Mena、及び他のEna/VASPタンパク質は、リステリア属表面タンパク質ActAに直接結合して、F-アクチン尾部の形成及び伸長を増進させる。Ena/VASPは、リステリア属の運動性にとって必須ではないが、リステリア属の細胞内アクチン重合集団を調節して、速度を上昇させ、細菌の移動の時間的及び空間的持続を調節し、それによって、in vivoでの細胞間伝播及び毒性に寄与する。リステリア属F-アクチン尾部長は、アクチン重合速度及び細菌細胞内速度と相関している。尾部形成は、ActA活性化Arp2/3媒介アクチン核形成により開始される。Mena11aが、リステリア属F-アクチン尾部の形成及び長さに影響を与えるかどうかを判定するために、本発明者らは、GFP、Mena及びMena11a MVD7細胞をリステリア属と共に5時間インキュベートし、細胞を固定し、ファロイジンで染色してF-アクチン尾部を可視化した。以前の報告と一致して、リステリア属に感染したMVD7細胞において発現されるMenaは、その細菌とF-アクチンの間の界面に局在し、尾部減少表現型をレスキューし、F-アクチン尾部長を増加させる(図17F〜図17H)。Mena11aはまた、細菌とF-アクチン尾部の間の界面に局在し、F-アクチン尾部形成頻度を増加させたが、Ena/VASP発現(GFP MVD7細胞における発現)の非存在下で観察される長さを超えてF-アクチン尾部長を増加させることはできなかった(図17F〜図17H)。このデータは、おそらくArp2/3媒介アクチン核形成及び重合に対する効果のため、Mena11aが効率的なリステリア属細胞内運動を支持することができないことを示唆している。
【０２２８】
本発明者らは、Ena/VASPを必要とするもう1つのF-アクチン重合依存性プロセスである糸状仮足形成を支持するMena11aの能力を評価した。MVD7細胞は、3つの形態学的に異なる伸展モード:滑らかな辺縁、波打った辺縁、及び糸状仮足の伸展モード、によってラミニン上で伸展しており、MVD7細胞におけるEna/VASPの発現は、糸状仮足表現型で伸展する細胞の百分率を増加させる(図16B)。本発明者らは、MVD7細胞がラミニン上で伸展したとき、MenaとMena11aの両方が糸状仮足先端に局在することを見いだした(図16C)。Mena発現は、糸状仮足表現型で伸展する細胞の百分率を増加させたが、糸状仮足での細胞伸展の百分率が対照細胞におけるものと同様であった(図16D)ので、Mena11a発現は、効率的な糸状仮足形成を支持しなかった。糸状仮足形成の欠如は、収斂伸長モデルによれば糸状仮足形成の一因となる、Mena11aに起因して変化したArp2/3媒介樹状アクチンネットワークの結果でありうる。
【０２２９】
要するに、Mena11a発現は、葉状仮足、糸状仮足及びリステリア属F-アクチン尾部等の、突出構造の基礎をなすアクチンネットワークにおけるArp2/3レベル低下と相関していることを発見した。
【０２３０】
(実施例13:Mena11aの発現は、がん細胞膜突出を減弱する)
葉状仮足における及びin vivoでの腫瘍細胞挙動に対するMena11a発現の効果は、MTLn3哺乳動物癌細胞における葉状仮足挙動の調節におけるMena11aの役割を調査することを本発明者らに促した。MTLn3細胞は、キャッピングされたF-アクチンフィラメントのコフィリン媒介切断により生じたフリーの反矢じり端でのアクチン組織化によって駆動される機序を使用してそれらの膜を伸長することにより、EGFのバス適用に応答する。MTLn3細胞において、Mena及びMenaINV発現は、EGFのバス適用中の膜突出を促進する。EGF誘発膜突出中のMena11aの寄与を試験するために、本発明者らは、MTLn3細胞において異なるGFP-Menaアイソフォーム及びGFP対照を(同じタンパク質レベルで)異所性発現させた(図18A)。細胞を血清飢餓させ、異なる濃度のEGFで刺激し、膜突出をタイムラプス顕微鏡観察によりイメージングした(図19A)。0.5nM EGF(EGF受容体(EGFR))で、Menaの発現は、予想通り、膜突出を促進したが、Mena11aの発現には効果がなかった(図18B〜図18C)。EGF濃度を5nM(MTLn3における最大膜伸長に最適な、飽和用量)に上昇させると、GFP細胞と比較して膜突出を増加させるMenaの能力は除去された(図19A〜図19C)が、Mena11a発現には膜突出に対して強い負の効果があり(図19A〜図19C)、細胞は、扁平葉状仮足を伸長することができず、不成功に終わった幾つかの突出を示した(図19A)。同様の結果が、100ng/mlのPDGF-BBで突出するように刺激したMena11a-MVD7細胞においても観察された。膜突出の動態パラメータを定量するために、本発明者らは、GFP及びMena11a葉状仮足からのキモグラフを比較した(図19D)。EGF刺激中、Mena11a発現は、突出期間及び突出の持続を減少させた(図19E)が、その速度は低下させなかった(図18D)。
【０２３１】
増殖因子刺激中の増殖因子誘発突出に対するMena11aの負の効果は、アクチン細胞骨格に対する直接効果に起因することもあり、又はEGFR活性か及び下流のシグナル伝達に起因することもあった。EGF刺激後の様々な時点での3つのMTLn3細胞株からの細胞溶解物のウェスタンブロットに対するEGFRのpY-1068又はpY-1173に対する(EGFがEGFRに結合した後、迅速にリン酸化する)リン酸化型特異的抗体の使用(図18E〜図18F)は、EGFRリン酸化の動態の統計的に有意な差を明示しなかった(図18E〜図18F)。本発明者らは、癌細胞におけるEGF誘発膜突出に対するMena11aの阻害効果がアクチン細胞骨格再構築の調節に主として由来すると結論づけた。
【０２３２】
乳癌細胞における急性的EGF誘発膜状仮足伸長は、コフィリンによって生じるアクチンフィラメント反矢じり端形成、及び新たに形成された末端付近のF-アクチン枝のArp2/3依存性核形成に依存する。本発明者らは、5nM EGF刺激の180秒後にMTLn3細胞を固定し、Arp2/3が葉状仮足の最先端に動員されることを確認した(図19F):対照GFP及びMena細胞株では、Arp2/3は、縁部から0.5μm以内に蓄積したが、Mena11a細胞では最先端におけるArp2/3の存在量が有意に低かった(図19G〜図19H)。Mena11a細胞における膜へのアクチン調節タンパク質の標的化の一般的欠陥を排除するために、本発明者らは、F-アクチンに直接結合し、葉状仮足動態、細胞遊動、及びWAVE複合体の調節に関与する、Ena/VASP結合タンパク質である、ラメリポディン(Lpd)について、EGF刺激MTLn3細胞株を染色した。異なる株間で葉状仮足最先端におけるLpd局在化の差は観察されなかった(図18G〜図18I)。これは、最先端におけるArp2/3存在量のMena11a依存性低減が、アクチン調節機構の広範な欠陥の結果である可能性が低いことを示唆している。
【０２３３】
(実施例14:Mena11aは、コフィリン媒介及びArp2/3媒介反矢じり端形成に影響を与える)
アクチンフィラメントのフリーの反矢じり端の生成は、癌細胞におけるEGF刺激膜突出と直接相関する。MTLn3細胞のEGF刺激は、葉状仮足末端部のフリーの反矢じり端の数を増加させ、これは、刺激の60秒後にコフィリンが果す活性により及び180秒後にArp2/3により時間的に調節される。EGFで刺激すると、Menaは、30秒以内に(約60秒後に開始するArp2/3蓄積に先行して)、新生葉状仮足に動員され、EGF刺激の60秒後に反矢じり端形成を速促進する。Mena11a発現細胞においてEGFに反応して低減される葉状仮足突出が、最先端でのフリーのF-アクチン反矢じり端の形成減少の結果として生じたのかどうかを判定するために、本発明者らは、異なるEGF濃度での刺激後にフリーの反矢じり端の相対数を測定した。0.5nM EGFでの刺激の60秒後、Menaは、対照EGF細胞に対するフリーの反矢じり端の組込みを増加させたが、Mena11aは、させなかった(図20A〜図20C)。逆に、Mena11a発現は、5nM EGF処置の60秒後(図20D〜図20F)及び180秒後(図20G〜図20I)、最先端へのG-アクチン組込みを、対照GFP又はMena発現MTLn3細胞のもの未満に低減させた。したがって、Mena11aは、癌細胞の葉状仮足内において、コフィリン依存性のF-アクチンのフリーの反矢じり端の存在量(60秒の時点で)とAr2/3依存性のF-アクチンのフリーの反矢じり端の存在量(180秒の時点で)の両方を低減させた。
【０２３４】
(実施例15:Mena11aにおけるリン酸化部位はその活性を調節する)
Mena11a挿入配列は、幾つかの推定的リン酸化部位を保有する。二次元ゲル電気泳動は、ヒト乳がん細胞の24時間のEGFでの刺激が、Mena11aゲルバンドをより高い酸性pHへとシフトさせた。それ故、本発明者らは、Mena11a特異的リン酸化が、アクチン重合を調節するその能力の一因になりうると判断した。本発明者らは、抗GFP抗体を使用して、5nM EGFで60秒間刺激したGFP-Mena11a発現MTLn3細胞からGFP-Mena11aを免疫沈降させた(図21A)。質量分析により、11a配列の21アミノ酸(青色で示されている、図21B)の中の固有のリン酸化部位(本明細書では以降、セリン3)を同定した(図21C)。異なる脊椎動物種からのMena11aタンパク質のアラインメントは、このセリン及び周囲残基の100%保存を示した(図22A)。Mena11a機能へのリン酸化の寄与を研究するために、本発明者らは、11a配列のセリン3のリン酸化不可能なMena11a変異体(Mena11aS>A)を生成した。Mena11aS>Aを発現するMTLn3細胞(図18A)を5nM EGFで刺激し、葉状仮足の挙動をタイムラプス顕微鏡観察により調査した。5nM EGFでの刺激後、Menaを発現する細胞は、Mena11aを発現する細胞と比べて膜突出の明らかな増加を示した(図20D〜図20I)。驚くべきことに、Mena11aS>A発現は、面積増加と形態の両方の点からMena11aよりMenaに似ている膜突出を誘導した。Mena11aS>A葉状仮足は、平板として突出したが、Mena11a細胞は、不成功に終わった突出を提示した(図22B〜図22C)。キモグラフは、Mena11a MTLn3細胞と比較して、Mena11aS>A細胞の膜が突出している総時間の増加及び単一突出事象(突出持続)時間の増加を示した(図21D〜図21E)が、突出速度の有意な変化は示さなかった。Mena11aS>A発現は、アクチンのフリーの反矢じり端の数を、Menaが5nM EGFでしたように増加させた(図22D〜図22F)が、0.5nM EGFでは増加させなかった(データを示さない)。Mena11aS>A MTLn3細胞はまた、Mena細胞がしたように、葉状仮足最先端にArp2/3を蓄積した(図22G〜図22I)が、Mena11a細胞は、しなかった(図21F〜図21H)。したがって、Mena11aS>Aは、葉状仮足突出及びF-アクチンのフリーの反矢じり端形成に関してMena機能とある程度似た機能を示し、これは、Mena11a特異的な機能にはリン酸化が必要であることを明示している。
【０２３５】
実施例16〜23の材料及び方法
抗体。抗MENA及び抗MENAINV抗体は、研究室において生成し、以前に記載した(Oudin MJら、Characterization of the expression of the pro-metastatic Mena(INV)isoform during breast tumor progression、Clin Exp Metastasis、2015(これは、www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26680363から入手可能);及びGertler FBら、Mena, a relative of VASP and Drosophila enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics. Cell. 1996;87:227〜39頁)、抗チューブリン(Sigma社、DM1A)、抗チューブリン・脱チロシン化型又はGlu-チューブリン(Millipore社、AB3201)、抗チューブリン・チロシン化型(Millipore社、ABT171)、抗pERK Y204(Santa Cruz社、sc7383)、抗GAPDH(Sigma社、G9545)、抗Ki67(BD Biosciences社)、切断カスパーゼ3(BD Biosciences社)、抗pAkt473(CST社)、α5(IF用:BD Biosciences社、#555651、IP用:Millipore社、AB1928、及びWB用:Santa Cruz Biotechnology社、sc-166681)、αv(BD Biosciences社、611012)、α6(Abcam社、ab10566)、α2(Abcam社、ab133557)、β1(BD Biosciences社、610467)、FAK(BD Biosciences社、610087)、pFAK Y397(Invitrogen社、44-625G)、切断カスパーゼ3(CST社、9661)、Ki67(CST社、9027)、FN(BD Biosciences社)、p53(CST社、クローン1C12)、RCP(Sigma社)であった。MenaINVウサギモノクローナル抗体の説明については(26)を参照されたい。INVエクソンによりコードされている配列を含有するペプチドで動物を免疫した。ウェスタンブロットアッセイにより、及び野生型又はMena欠損マウスからのFFPE腫瘍切片を免疫染色することにより、MenaINV特異性についてクローンをスクリーニングした(図40)(Oudin MJ、Hughes SK、Rohani N、Moufarrej MN、Jones JG、Condeelis JSら、Characterization of the expression of the pro-metastatic Mena(INV)isoform during breast tumor progression、Clin Exp Metastasis、2015年12月17日、オンライン先行発表版)。シレンギチド(Selleck Chemicals社)、P1D6  α5遮断抗体(DSHB社)、FAKi(Santa Cruz社)、原繊維形成阻害用の70kD断片及びその対照ペプチド(ロチェスター大学(University of Rochester)のDr. Sottileからの寄贈品)、FN 7-11、ROHからのプラスミドから精製したもの)。
【０２３６】
薬物。ドキソルビシン、シスプラチン及びパクリタキセル(Sigma社)、ドセタキセル。In vitro実験については、1%のDMSOを含有する細胞培養培地で薬物を希釈した。ビヒクル対照は、1%のDMSO(薬物なし)、PD0325901 MEK阻害剤(LC Labs社)、MDR1阻害剤HM30181(100nM)(Weissleder Lab(MGH)からの寄贈品)(31)を含有する培養培地で処置した細胞に対応するものであった。
【０２３７】
細胞培養。MDA-MB-231細胞は、短鎖タンデムリピートプロファイリングにより細胞株が本物であることを証明するATCCから2012年6月に購入した。本発明者らの研究所ではこれらの細胞株が本物であることを再度確認せず、10%FBSを含有するDMEM(Hyclone)でこれらの細胞を培養した。細胞株生成及びFACSは、以前に記載された通りに行った(32)。細胞株は、内因性MENAと比べて8〜10倍過剰発現を示し、細胞株に231-対照、231-MENA及び231-MENAINV  という表示を付ける(Oudin MJら、Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling enables haptotaxis during metastatic progression、Cancer Discov. 2016(これは、www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26811325から入手可能である))。SUM159細胞は、ハーバード大学医学大学院のJoan Bruggeの研究室から入手し(2011年1月)、本発明者らの研究室では本物であることを再度確認しなかった。SUM159細胞をATCCプロトコールに従って培養した。T47D細胞は、短鎖タンデムリピートプロファイリングにより細胞株が本物であることを証明するATCCから購入した。それらの細胞を製造者のプロトコールに従って培養し、本発明者らの研究室では本物であることを再度確認しなかった。レトロウイルスベクターを使用して、安定したノックダウン細胞株(T47D)を生成して、全ての公知Mena mRNAアイソフォーム間で共有されている配列を標的にする、mir30に基づくshRNA配列「CAGAAGACAATCGCCCTTTAA」を発現させた。検出される全ての分子の発現がT47D-ShMena細胞株において有意に低減されることが示した、全ての公知Menaタンパク質アイソフォームにおいて共有されているエピトープを認識する抗Menaモノクローナルを使用して検出されたウェスタンブロット分析(Gertler FBら、Mena, a relative of VASP and Drosophila enabled, is implicated in the control of microfilament dynamics. Cell. 1996;87:227〜39頁.)に準拠して、特定のMENAアイソフォームの発現分析を行わなかった。MDA-MB 175IIV、MDA-MB 453、MDA-MB 436、BT-549、LM2及びBT-20は、Dr Michael Yaffe研究室(コッホ研究所、MIT)により2015年4月に寄贈されたものであり、それらを製造者のプロトコールに従って培養し、本発明者らの研究室は、それらが本物であることを再度確認しなかった。
【０２３８】
細胞生存率アッセイ。細胞生存率アッセイは、96ウェルプレートで行った。細胞5,000個をウェル毎に播種し、24時間後に薬物で処置した。72時間後、PrestoBlue Cell Viability Reagent(Life Technologies社)を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞生存率をアッセイした。蛍光を測定し、ビヒクルに曝露した細胞に対して正規化した。Matlabを使用して用量反応プロットから活性面積を算出した。全ての測定を3回ずつ繰り返した。
【０２３９】
異種移植腫瘍生成及びin vivo化学治療処置。全ての動物実験は、MIT Division of Comparative Medicineにより承認された。異なるMENAアイソフォームを発現する200万個のMDA-MB-231細胞(PBSと20%コラーゲンI中)を、6週齢NOD-SCIDマウス(Taconic社)の第四右乳房脂肪体に注射した。腫瘍が直径1cmに達したら、マウスをPBS中1%DMSO、3%PEG(MW400)、1%Tween 80中の10mg/kgのパクリタキセルのいずれかの3用量で腹腔内注射により5日毎に処置した。並行して、マウスをビヒクル対照としてPBS中1%DMSO、3%PEG(MW400)、1%Tween 80のみで処置した。最後の注射の翌日、腫瘍を測定し、マウスを生体内イメージングに使用し、その後、屠殺した。それらの腫瘍及び胚を10%ホルマリンで一晩固定し、PBSを使用してそれらの骨髄を採取し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM中で培養した。採取の1ヶ月後に培養骨髄中の腫瘍細胞コロニーの数を計数した。光学顕微鏡法により可視化したH&E染色切片から各肺葉内の転移数を計数し、情報を知らされていない人2名が前記転移数を計数した。核種用群は、3〜5匹のマウスを含んだ。
【０２４０】
生体内イメージング。生体内マルチフォトンイメージングは、25X 1.05NA  水浸対物レンズと補正レンズを使用して、以前に記載したように行った(Oudin MJら、Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling enables haptotaxis during metastatic progression、Cancer Discov. 2016(これは、www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26811325から入手可能))。皮弁手術で腫瘍を露出させた後、30分の動画を撮った。ImageJを使用して、10本の30分タイムラプス動画において、各視野内の運動性細胞の数を計数した。運動性細胞は、核の何らかの置換及び細胞突出活動を示す細胞である。1腫瘍群当たりマウス2〜4匹からの、マウス1匹につき4〜10視野をイメージングしたデータをプールした。
【０２４１】
ウェスタンブロット。プロテアーゼMini-完全プロテアーゼ阻害剤(Roche社)及びホスファターゼ阻害剤カクテル(PhosSTOP、Roche社)を含有する25mM Tris、150mM NaCl、10%グリセロール、1%NP40及び0.5M EDTA中、4℃で20分間、細胞を溶解した。タンパク質溶解物をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、Odyssey Blocking Buffer(LiCor社)でブロッキングした。膜を一次抗体と共に一晩、4℃でインキュベートし、Licor二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。タンパク質レベル強度をImageJで測定した。
【０２４２】
実施例16〜22についての免疫組織化学的検査。NOD/SCIDマウスからの切除した腫瘍を10%緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。組織切片(5μm厚)を脱パラフィンし、その後、Citra Plus溶液(Biogenex社)を使用して抗原賦活化した。3%H2O2での処置後、切片を血清でブロックし、一次抗体と共に一晩4℃でインキュベートし、蛍光標識二次抗体と共に室温で2時間インキュベートした。抗MENA(1:500)、ビオチン化抗MENAINV(1:500)、抗CC3(1:200)、抗Ki67(1:200)及びDAPIを使用して、切片を染色した。二次抗体上の蛍光色素は、AlexaFluor 488、594又は647(Jackson Immunoresearch社)を含んだ。切片をFluoromount封入剤で封入し、室温でイメージングした。Softworx acquisition、Olympus 40X 1.3 NAプランアポ対物レンズ及びPhotometrics CoolSNAP HQカメラを使用して、DeltaVision顕微鏡でz系列の画像を撮影した。1腫瘍群当たり少なくとも3つの腫瘍に関して、腫瘍毎に少なくとも10視野を取得した。
【０２４３】
実施例23についての免疫組織化学的検査。腫瘍からの組織切片の固定、処理及び染色は、以前に記載された通りに行った(Roussos ET、Balsamo M、Alford SK、Wyckoff JB、Gligorijevic B、Wang Yら、Mena invasive(MenaINV)promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer、J Cell Sci.、2011;124:2120〜31頁、[PubMed:21670198])。NOD/SCIDマウスからの切除した腫瘍を10%緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。組織切片(5μm厚)を脱パラフィンし、その後、Citra Plus溶液(Biogenex社)を使用して抗原賦活化した。内在性ペルオキシダーゼ不活性化後、切片を一次抗体と共に一晩4℃でインキュベートし、蛍光標識二次抗体と共に室温で2時間インキュベートした。次の抗体を使用して切片を染色した:抗Mena(1:500)、抗Ki67(BD Biosciences社)、切断カスパーゼ3(BD Biosciences社)。二次抗体上の蛍光色素は、AlexaFluor 594、AlexaFluor488及びAlexaFluor 647(Jackson Immunoresearch社)を含んだ。切片をFluoromount封入剤で封入し、室温でイメージングした。Softworx acquisition、Olympus 40X 1.3 NAプランアポ対物レンズ及びPhotometrics CoolSNAP HQカメラを使用して、Applied precision DeltaVision顕微鏡でz系列の画像を撮影した。Deltavision Softworxソフトウェア及び対物レンズに固有の点像分布関数を使用して、画像をデコンボリューションした。1腫瘍群当たり少なくとも3つの腫瘍に関して、腫瘍毎に少なくとも4画像を取得した。
【０２４４】
ヒト乳がん発現分析。TCGA(Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature;2012;490:61〜70頁)からのデータ取得(図28A、図28B)は、(Oudin MJら、Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling enables haptotaxis during metastatic progression、Cancer Discov. 2016(これは、www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26811325から入手可能))で説明した。(Wang Lら、CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis、Cancer Cell、2014;25:21〜36頁)から得た患者試料から、免疫組織化学的検査により測定したMENAINVタンパク質レベルについてのデータも、Oudin MJら、Cancer Discov. 2016にある。
【０２４５】
in vivoイメージング。PBSで希釈した0.1mg/mLのコラーゲンをガラス底の皿に1時間、37℃で塗布した。異なるMENAアイソフォームを発現する細胞を1、10若しくは100nMのパクリタキセル又はビヒクルで処置し、直ちに前記ガラス底の皿に播種した。30分後、20X対物レンズ及びAndor/NeoZylaカメラを用いてNikon回転ディスク上で16時間、10分毎に1画像を取得しながら、一晩、細胞をイメージングした。ImageJ及びManual Trackingプラグインを使用して、個々の細胞を手動で追跡した。IBIDI社により開発された走化性ツールを使用して、データを分析した。細胞分裂に費やされる時間を分析するために、母細胞が最初に丸くなったときから娘細胞が基質上で伸展したときまでの間の時間を測定した。2個の娘細胞をもたらした細胞分裂の数を計数することにより、成功した細胞分裂の百分率を定量した。3つの独立した実験において追跡した少なくとも50個の細胞からのデータをプールした。
【０２４６】
細胞周期分析。231-対照、231-MENA及び231-MENAINV細胞を、10nM若しくは100nMのパクリタキセル、又はビヒクルで処置した。16時間の処置後、細胞をトリプシン処理し、冷PBS中で洗浄し、1000rpmで3分間、遠心分離し、1mLの氷冷PBSに再懸濁させ、-20℃で4mLのエタノールを添加することにより固定し、4℃で1時間インキュベートした。固定後、細胞を氷冷PBSで洗浄し、22,000rpmで20分間、遠心分離した。50μg/mlのヨウ化プロピジウム及び1mg/mlのリボヌクレアーゼAを使用して30分間、37℃でDNAを染色した。DNA含有量をFACSCaliburサイトメーター(Becton-Dickinson社California)で測定した。細胞凝集物を排除するためにFL2-A及びFL2-Wチャネルに適切なゲートを設けてModfitソフトウェア(Verity Software House社)を使用してデータを分析した。1試料当たり25,000事象を分析した。
【０２４７】
免疫蛍光。PBSで希釈した0.1mg/mLのコラーゲン、及び50μg/mL FNを、ガラス底の皿(Mattek社)に1時間、37℃で塗布した。細胞を1時間にわたって播種し、次いで単独での又はMEKiとの組合せでのパクリタキセルで24時間処置した。0.1%グルタルアルデヒドを含有するPHEM緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド中で20分間、細胞を固定し、次いで水素化ホウ素ナトリウムで5分間、失活させた。TBS-0.1%Triton-X 100中の2%BSAで30分間、細胞をブロッキングし、一次抗体と共に、次いで二次抗体と共に、それぞれ1時間、室温でインキュベートした。Softworx acquisition、Olympus 60X 1.4 NAプランアポ対物レンズ及びPhotometrics CoolSNAP HQカメラを使用して、Applied Precision DeltaVision顕微鏡でz系列の画像を撮影した。Deltavision Softworxソフトウェア及び対物レンズに固有の点像分布関数を使用して、画像をデコンボリューションした。画像をImageJで分析し、そこでTyr-又はGlu-MTの全細胞レベルを測定した。少なくとも3つの独立した実験からのデータをプールする。
【０２４８】
MT長画像分析。MT画像を、(1)本物のフィラメントを選択するフィラメント再構成アルゴリズム及び(2)MTネットワーク組織の特性を数量化する事後解析で処理した。フィラメント再構築のために、簡単に言うと、MT画像を先ず多重スケールスティーラブルフィルタによりフィルタリングして、曲線の特徴を強調した。フィルタリングされた画像から、可能性のあるフィラメント断片の中心性を検出し、高信頼度セットと低信頼度セットに分けた。反復グラフマッチングを使用して、低信頼度フィラメント断片の一部を高信頼度断片に関連づけた。再構成の結果は、整列した画素鎖及び局所フィラメント配向によって各々が表されたフィラメントのネットワークである。同定された各フィラメント毎にMt長を画素数として算出し、それをマイクロメートルに変換した。全体としては、少なくとも2つの実験からの1条件につき少なくとも2000のMTを分析した。
【０２４９】
組織マイクロアレイ。TMAを生成するために使用した患者コホート及び関連データは、発表されている(32)。TMAを免疫蛍光により染色し、Vectra自動スライドスキャナー及び20X対物レンズでイメージングした。この対物レンズでの視野は、コアスポットの90%をカバーする。各患者は、TMA上に3つのコアを有した。全てをイメージングしたが、一部は、組織の欠如又は折り重なった組織のため除去しなければならなかった。Informソフトウェアを使用して腫瘍コンパートメントの蛍光強度を分析した。MenaINV及びFN強度の計量は、任意単位での計量である。
【０２５０】
MenaINV TCGAデータ取得。fastqでのRNAseqデータをTCGAから得た。各試料について、BWAバージョン0.7.10を使用して、可能性のある全てのENAHアイソフォームの収集物を収録しているフルデータセットからENAH(Mena)由来のリードを抽出した。次いで、正しく対になったENAHリードをSamtoolsバージョン0.1.19で抽出した。次いで、目的の全てのENAHバリアンドを含むUSCS公知遺伝子アノテーションから導出された編集済みGTFファイルでガイドされるtophat2バージョン2.0.12を使用するhg19とのアラインメントにより、ENAHアイソフォームを定量した。Bedtoolsバージョン2.20.1及びカスタムpythonスクリプトを使用して、各ENAHエクソンと重複しているリードを計数した。次いで、エクソン当たりの得られた数を、アラインメントされた総数の分母として公表されている前処理されたTCGAデータ中のエクソンレベル数の合計を使用して1KbのmRNA当たりの100万リード当たりの数として計算することにより、RNA負荷量に対して正規化した。
【０２５１】
生存/再発データ分析。Mena/MenaINV発現レベル(mRNA TCGA又はタンパク質からの)及び生存(死亡までの時間)又は転移(再発までの時間)をログランクマンテル・コックス検定により評価した。各試料において、Mena又はMenaINV発現に従って患者を四分位にビニングした(Q1は、最高発現レベルであり、Q4は、最低である)。各四分位(95%信頼区画値を有する)についてのハザード比を算出した。このログランク検定により生成されたp値は、曲線の差が有意に異なるかどうかを評価するものである。本発明者らは、Menaアイソフォームの様々な発現レベルを有する患者を表す曲線間の差を更に評価するために傾向についてログランク検定を行った。
【０２５２】
死亡までの時間に対するMenaINV及びMenaのハザード効果を、TCGA BRCAデータをベースにしてR 2.15.3を使用してコックス回帰により調査した。変数全体にわたって比較するために、本発明者らは、先ず、平均値ゼロ及び標準偏差1にMena及びMenaINV RPKM値を標準化した。次いで、唯一の独立変数としての標準化されたMenaINV値又は標準化されたMena RPKM値に基づいてコックス回帰を行って、TCGA研究におけるBRCA患者の死亡までの時間に対する効果を予測した。TCGA BRCA対象のMena/MenaINV発現レベルと生存状態との関連性を、R 2.15.3を使用してロジスティック回帰により評価した。試験全体にわたって係数を比較するために、本発明者らは、先ず、INV及びMena値を、平均値ゼロ及び標準偏差1になるように標準化した。生存状態を従属変数(死亡の場合1、及び生存している場合0)として選択することにより、ロジスティック回帰を行った。このモデルに当てはめられる唯一の独立変数が、それぞれ、INV又はMenaであった。P値、及び独立変数に対応する係数を使用して、関連性の有意性、及び関連性の強さを判断した。
【０２５３】
(実施例16:MENA及びMENAINVは、in vitroでのパクリタキセル処置中の生存率増加に関連している)
内因性MENA及びMENAINV発現レベルがパクリタキセル耐性と関連しているかどうかを調査した。MENA及びMENAINVは、TCGA試料からのmRNAによって測定して全ての主要乳がんサブタイプにおいて広範に発現され、及び免疫組織化学的検査によりタンパク質レベルでは(図28A、図28B、図28C)、Her2+乳がんを有する患者における方がわずかに高度な発現があると判定された。ルミナルA(MDA-MB 175IIV及びT47D)、HER2陽性(MDA-MD 453)及びTNBC(SUM 159、BT-20、MDA-MB 436、LM2、BT-549、MDA-MB 231)を含む、幾つかのヒト乳がんタイプからの細胞株にわたって、パクリタキセルの効力を測定し、内因性MENAタンパク質発現を測定した(図29A、図29B、図28D)。カノニカル80kDa MENAアイソフォームに加えて、使用した細胞株の一部は、T47D細胞を含む上皮様細胞株において発現されること及びBT-549及びMDA-MB-231細胞を含む間葉様細胞株には存在しないことが公知である他のMENAアイソフォーム、例えばMENA11aを、内因性発現する。本発明者らが使用した条件下では、MENA11aは、80kDa MENAと共泳動し、それ故、全てのMENAアイソフォームを認識することが公知である抗体で検出される、測定される80kDa MENAの強度は、両方のアイソフォームを発現する細胞株における80kDa MENA+MENA11aの合計量を表す。細胞生存率によって測定されるパクリタキセル効力と内因性MENA発現レベルとの間には有意な逆相関があった(図29C)。内因性発現されたMENAがパクリタキセル耐性を促進することを確認するために、通常はMENA及びMENA11aを発現するT47D細胞においてMENAをノックダウンさせた(図28E)。これらの実験に使用したshRNAが、全ての公知MENAアイソフォームに共通の配列を標的にすることによって、MENAばかりでなくMENA11aも欠乏させることに留意しなければならない。T47D細胞における全MENAアイソフォームレベル(>75%)を低下させると、細胞はパクリタキセルに対してより高い感受性になる(図29D)。
【０２５４】
MENA及びMENAINVの役割を独立して研究するために、本発明者らは、低レベルのMENAを内因性発現し、他の培養乳がん細胞株と同様、in vitroで微量レベルのMENAINVしか発現しない、三種陰性乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)を使用した。内因性MenaINV発現は、in vivo腫瘍微小環境の中で侵襲性腫瘍細胞によって高度にアップレギュレートされるので、GFP(231-対照)、GFPタグ付きMENA(231-MENA)又はMENAINV(231-MENAINV)を、in vivoで観察されるロバストな発現に匹敵するように、この細胞株において同等のレベルで安定的に過剰発現させた。生存231-MENA又は231-MENAINV細胞の割合は、様々な用量のパクリタキセルでの72時間の処置後、生存231-対照細胞の割合より少なくとも65%高かった(図29E)。応答の特異性を調査するために、2つの他の一般に使用される化学療法薬であるドキソルビシン及びシスプラチンを試験し、MENA発現とMENAINV発現の両方が、異なる濃度のどちらの薬物に対する応答にも影響を与えないことを見いだした(図28F、図28G)。これらの実験により、高いパクリタキセル濃度の存在下の生存細胞は、低いMENA発現で減少され、MENA又はMENAINVの異所性発現によって増加されることが明らかになった。これらのデータは、転移進行中に腫瘍細胞において観察されるMENAアイソフォームレベル増加がパクリタキセル耐性の一因となりうることを示唆している。
【０２５５】
(実施例17:MENAアイソフォーム発現はパクリタキセル処置中のin vivoでの腫瘍増殖増加に関連している)
MENA関連パクリタキセル耐性がin vivoでも観察することができるかどうかを調査した。MENAアイソフォームを発現するMDA-MB-231細胞をNOD-SCIDマウスの乳房脂肪体に注射することにより、異種移植腫瘍を生成した。腫瘍が直径1cmに達したら、マウスをパクリタキセルで処置した(図30A)。パクリタキセルでの処置は、ビヒクルで処置したマウスと比較して231-対照腫瘍の増殖を有意に減少させた(図30B)。しかし、231-MENA又は231-MENAINV腫瘍の増殖は、パクリタキセル処置による影響を受けず(図30B)、それにより、MENA及びMENAINVがin vivoで薬物耐性を促進することが実証された。
【０２５６】
パクリタキセルで処置した231-MENA及び231-MENAINV腫瘍のサイズ増加は、増殖レベル上昇、細胞死レベル低下、又は両方に起因する可能性があった。しかるが故に、Ki67及びCC3に対して陽性の細胞の強度をそれぞれ免疫染色によって定量することにより、増殖及びアポトーシスを調査した。パクリタキセル処置は、231-対照細胞におけるKi67染色の量を減少させたが、231-MENA及び231-MENAINV腫瘍におけるKi67陽性細胞の数を減少させることはできなかった(図30C、図30D)。対照的に、処置は、全ての腫瘍においてCC3陽性細胞により示されるような細胞死の増加をもたらした(図30E、図30F)。これらのデータは、腫瘍担持動物のパクリタキセル処置中にMENA又はMENAINV発現腫瘍細胞が増殖し続けるが、対照腫瘍と同様のアポトーシス率を示すことを示す。
【０２５７】
(実施例18:パクリタキセル処置は、in vitroで細胞速度を低下させるが、マウスにおけるMENAINV駆動腫瘍細胞運動性及び播種に影響を与えない)
MENA及びMENAINVは、腫瘍進行中に細胞運動性及び転移の増加を駆動する。したがって、MENAアイソフォーム発現が、パクリタキセル処置後に細胞遊走及び播種に影響を及ぼすかどうかを調査した。in vitroでは、パクリタキセル処置は、3つのMENAアイソフォーム発現細胞株の速度を低下させた(図31)。しかし、使用した薬物のあらゆる濃度で、231-MENAINVは、MENAを発現する細胞又は対照細胞より高い速度を維持した。マルチフォトン生体内イメージングを使用して、in vivoで、パクリタキセル処置が231-対照腫瘍内の運動性の細胞の数を有意に低減させることを見いだした。対照的に、231-MENA及び231-MENAINV腫瘍細胞は、処置による影響を受けなかった(図32A)。転移負荷に対するタキソール処置の効果を調査するために、231-対照、231-MENA又は231-MENAINV腫瘍を担持するマウスからの培養骨髄におけるコロニー数及び肺における転移数を12週間計数した。231-MENA又は231-MENAINV腫瘍からの骨髄コロニー数(図32B)も、肺転移数(図32C、図32D)も、パクリタキセル処置による影響を受けなかった。これらのデータは、MENAアイソフォームを発現するもの等の高転移性細胞が、転移性疾患に関連したパクリタキセル処置による影響を受けないことを示唆している。
【０２５８】
(実施例19:パクリタキセル処置は、in vitro及びin vivoで高いMENA発現を選定する)
これまでの実施例は、MENA又はMENAINV発現レベル増加がパクリタキセルに対する応答低下に関連していることを示す。in vitro及びin vivoでパクリタキセル処置の効果及び細胞集団におけるMENA発現レベルを調査した。先ず、100nMのパクリタキセル又はビヒクル対照に曝露した5つの乳がん細胞株においてウェスタンブロットにより内因性MENA発現を分析した(図33A)。パクリタキセル処置の72時間後、一部の細胞株(MDA-MB-231及びMDA-MB-175VII)は、MENA発現増加を示した(図33B)。不均一なレベルのGFP、GFP-MENA又はGFP-MENAINVのいずれかを発現するMDA-MB-231細胞集団を使用して、同様の分析を行った。FACS分析は、ドセタキセル(パクリタキセルに密接に関連しているタキサン)での処置が、より高レベルのGFP-MENA又はGFP-MENAINVを発現する細胞を選定するが、より高レベルのGFPを発現する細胞を選定しないことを明示した(図33C)。最後に、パクリタキセル又はビヒクル対照のどちらかで処置した動物から採取した231-対照腫瘍からの組織切片の定量的免疫蛍光分析は、ビヒクルと比較してパクリタキセル処置マウスからの腫瘍における、pan-MENA抗体により検出される全MENAレベル、及び抗MENAINVアイソフォーム特異的抗体により検出されるMENAINVレベルの有意な増加を明示した(図33D、図33E、図33F)。総合して、これらのデータは、in vitro及びin vivo両方で、パクリタキセル処置は、腫瘍細胞について、より高レベルのMENA及びMENAINVを発現する細胞を選定することを示す。
【０２５９】
(実施例20:MENAアイソフォームにより駆動される耐性には薬物排出又は焦点接着シグナル伝達が関与しないが、細胞分裂に影響を与える)
MENA及びMENAINVがパクリタキセルに対する耐性を増加させる機序を次に調査した。MDR1ポンプによりパクリタキセル排出は、最も頻繁に且つ最もよく説明されるパクリタキセル耐性機序である。第3世代MDR1阻害剤であるHM30181と100nMのパクリタキセルとの併用処置は、生存231-対照細胞の割合には無視できる程度の影響しか与えず、231-MENAINV細胞ではパクリタキセルの効力を増加させなかった(図34A)。接着点シグナル伝達は、パクリタキセルに対する耐性を促進すると報告されており、本発明者らは、MENAが、MENAにおけるLERERリピートドメインとα5インテグリンの細胞質側末端との直接___により接着点シグナル伝達を調節することを以前に報告した。MENAとα5間の相互作用がパクリタキセルに対する耐性増加に必要であるかどうかを判定するために、MENA又はMENAINVのα5結合欠損バージョン(LERERリピートドメインを欠いている)を発現する細胞をアッセイし、これらの変異型バージョンが、パクリタキセルに対する耐性を増加させる点で野生型バージョンと同様に効果的であることを見いだした(図34B)。これらのデータは、薬物排出も、MENA-α5相互作用も、パクリタキセルに対するMENAアイソフォームにより駆動される耐性を媒介しないことを示す。
【０２６０】
パクリタキセル誘導細胞死における重要なステップの1つは、細胞周期のG2/M期における細胞停止である。10nM又は100nMのパクリタキセルで16時間処置した231-対照、231-MENA及び231-MENAINV細胞を用いて細胞周期分析を行い(図35A、図35B、図35C)、本発明者らは、3つの細胞株全てにわたってG2/M期において細胞の同様の用量依存性増加を発見した。それ故、MENA又はMENAINV発現は、フローサイトメトリーにより懸濁液中の細胞で測定して、G2/Mにおけるパクリタキセル誘導停止を損なわせない。細胞分裂表現型をより詳細に研究するためにタイムラプス顕微鏡観察を行い、コラーゲンに付着した状態時のMENAアイソフォームを発現する細胞をイメージングした(図35D、図35E、図35F)。パクリタキセルでの処置は、231-対照細胞が細胞分裂中に丸くなるのに費やす時間を4倍増加させたが、231-MENA及び231-MENAINVは、細胞分裂時に費やす時間の2倍増加しか示さなかった(図35G)。更に、パクリタキセル処置は、231-対照細胞において、1個の細胞が2個の生存娘細胞に分裂する成功分裂の数の40%減少をもたらした(図35H)。対照的に、パクリタキセル処置231-MENA及び231-MENAINV細胞では細胞分裂の90%より多くが成功した(図35H)。総合して、これらのデータは、MENAアイソフォーム発現が、パクリタキセルでの処置中により効果的且つ成功裏に細胞分裂を経て進行する能力を付与することを示唆している。
【０２６１】
(実施例21:MENAの発現は、パクリタキセル処置中の動的MTの安定したMTに対する比率増加に関連している)
パクリタキセルは、MTの安定性を増加させることによって細胞死を促進し、MT動態増加に至らせる経路がタキサンに対する耐性を促進することは公知である。それ故、パクリタキセル処置中のMENAアイソフォーム発現細胞におけるMT構造及び動態を調査した。ベースラインで、231-MENA及び231-MENAINV細胞は、231-対照と比べて長いMTを含有した(図36A、図36B、図36C)。パクリタキセル処置は、231-対照細胞においても、231-MENA細胞においても、MT長に対して影響を与えなかったが、231-MENAINV細胞では小さいが有意な増加を誘発した(図36C)。MTの翻訳後修飾は、それらの動態を調節することができ、そのような修飾を検出する抗体を使用して、MT集団の相対動態を推測することができ、詳細には、MTチロシン化は、動的MT状態を増加させるが、MTの脱チロシン化は、安定性増加に関連している。安定したMT(Glu-MT)の動的MT(Tyr-MT)に対する相対存在量を、個々の細胞において抗Glu-MT及び抗Tyr-MT抗体での免疫蛍光によって測定した(図37A、図37B)。231-対照細胞において、パクリタキセルでの処置は、安定したMTの動的MTに対する相対比の有意な増加をもたらした。しかし、231-MENA及び231-MENAINV細胞両方において、安定したMTの動的MTに対する相対比の変化がなかった(図37C)。総合すると、これらのデータは、MENAアイソフォームがMT長に影響を与えることができること、及びMENAアイソフォーム発現が、パクリタキセル処置中に動的MTを維持することを明示する。
【０２６２】
(実施例22:MENAは、MAPKシグナル伝達を増加させることによりパクリタキセルに対する耐性を駆動する)
MAPKシグナル伝達カスケードは、MTと相互作用することが公知の重要な経路の1つである。両方のERK1/2がMTと相互作用し、パクリタキセルによるMT安定化がERKのリン酸化を増加させ、そして次に、ERK経路活性化がMT動態を増加させる。231-対照、231-MENA及び231-MENAINV細胞株におけるERKリン酸化のレベルを72時間のパクリタキセル処置後に測定した。231-MENA及び231-MENAINV細胞は、パクリタキセル処置後、231-対照細胞と比べて高レベルのpERK Y204を有するが、同じ条件で全ERKレベルは変わらないことを発見した(図38A、図38B、図39A、図39B)。対照的に、パクリタキセルでの処置は、3つの細胞株全てにおいて、全Aktレベルを有意に変化させることなく同等にpAkt473レベルを低下させた(図39C、図39D、図39E、図39F)。次に、MEK阻害剤(MEKi)がMENAアイソフォーム発現細胞のパクリタキセルに対する感受性を高めることができるかどうかを調査した。全ての細胞株に関して、増殖アッセイにおいて、両方の薬物を同時に用いる処置が各々の薬物単独で用いる処置より多い細胞死増加をもたらす、パクリタキセルとMEKi PD0325901の間の有意な相加効果を判定された(図38C、図38D、図38E)。しかし、231-MENA及び231-MENAINV細胞では、高い細胞死レベルを得るために231-対照細胞と比較して高い濃度の各薬物が必要であった。MEKi処置は、231-MENAINV細胞においてパクリタキセルにより誘導されるERKリン酸化を阻害した(図38F)。最後に、MT動態に対するパクリタキセル及びMEKi処置の効果を231-MENAINV細胞において調査し、両方の薬物を同時に用いる処置は、動的MTに対して安定したMTの増加を誘導したが、どちらかの薬物を単独で用いる処置には効果がなかった(図38G、図38H)。総合して、これらのデータは、MENAアイソフォームが、MT動態持続及びERKシグナル伝達増加によってパクリタキセルに対する耐性を駆動することを示唆している。
【０２６３】
(実施例23:Menaアイソフォーム発現は、FN及びインテグリンα5発現レベル、並びにヒト乳がん患者の転帰と相関する)
本発明者らの以前の研究は、MenaINVの強制発現が、異種移植腫瘍モデルにおいて転移を駆動すること、及びqPCRにより検出されるMenaINV mRNAレベルが、効率的に血管侵入する細胞において、及びTMEM(EG+/Her2-乳がん患者における転移の尤度に関連する、腫瘍細胞、マクロファージ及び内皮細胞を含有する構造)の数が多い患者において比較的高いことを立証した。しかし、ヒト乳がん患者におけるMenaINV mRNA又はタンパク質のレベルと臨床転帰との関係は、調査されていない。先ず、RNAseq及び臨床データが入手可能なTCGAコホートにおける乳がん患者1060名を分析した。RNAseqデータを最初に分析したとき、INVエクソンにアノテーションが付与されていなかったので、生配列データを入手し、各試料におけるリードを全てのMenaエクソンにマッピングした。Mena発現に従って四分位に患者を分けることでは、全TCGA乳がん患者コホート(図40A)における又は>10yr経過観察している患者のサブセット(図41A)におけるMenaレベル(構成的に含まれているエクソンのレベルによって判断した)と全生存率とのいかなる有意な相関関係も明らかにすることができなかった。しかし、MenaINV mRNAのレベルが(INVエクソン配列リードの存在量により評価して)高い(上位1/4の)患者は、MenaINV発現の下側四分位の各々における患者と比較して有意に低減された生存率を示した(図40B、図41B)。同様の結果が、リンパ節転移陰性患者サブグループにおいて認められた(図40E)。更に、コックス回帰とロジスティック回帰の両方が、MenaINVは、10年経過観察している患者における転帰不良についての、Mena単独よりかなり強い予測因子であることを明示し(図40C、図40D、図41C及び図41D);MenaINV発現レベルとMena発現レベルを組み合わせたモデルは、MenaINVのものを超えて予測力を高めることができなかった。次に、このデータセットにおいてMenaINVレベルがFN及びα5発現とどのように相関するのかを調査した。全般的Mena及びMenaINV発現は両方とも、FNと有意に相関し、より低い程度にα5と相関した(図40F)。詳細には、>10yr経過観察している患者に関して、生存している患者の中には存在しない、自分の疾患に屈した患者において、MenaとMenaINVとFN又はα5との非常に有意な相関関係が観察された(図40G及び図40H)。
【０２６４】
MenaINVに特異的な新たに開発した抗体を使用して、内因性MenaINV、α5及びFNタンパク質間の関係を、乳がんのMMTV-PyMT自然発症マウスモデル(Lin EY、Jones JG、Li P、Zhu L、Whitney KD、Muller WJら、Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases、Am J Pathol.、2003;163:2113〜26頁、[PubMed:14578209])において及び患者300名の以前に特徴づけられた組織マイクロアレイ(TMA)(Wang L、Zhao Z、Meyer M、Saha S、Yu M、Guo Aら、CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis、Cancer Cell、2014;25:21〜36頁、[PubMed:24434208])において免疫染色を使用して調査した。MenaとMenaINVの両方がPyMT腫瘍において発現され(図41E)、α5β1も発現する細胞においてそれらを検出することができる(図41F)。このモデルにおいて、MenaINV発現及び分布は、FNのものと有意に相関した(図41G及び図41H)。本発明者らは、TMAにおいてFNレベルとMenaINVレベルの間にも有意な相関関係を見いだした(図41I及び図41J)。同様に、TMAによって表された患者において、より高いMenaINVレベルは、転帰不良と有意に相関していた(図40I)。加えて、局所部位又は遠位部位のいずれかにおいて疾患が再発した患者は、有意に高いMenaINVレベルを有した(図41K)。ロジスティック回帰は、MenaINV発現MenaINVが、再発の有意な予測因子であることを示した(係数0.377、p=0.0186)。MenaINV発現の平均4.6倍増加は、再発した患者数の2倍増加と相関した(図40J及び図40K)。MenaINV発現の更なる増加は、再発の更なる増加と相関しなかった。これは、MenaINVタンパク質発現の小さな増加であっても再発に影響を与えうることを示唆している。MenaINV又はFNどちらか単独でのmRNAレベルは、疾患再発までの時間と相関しなかったが、高レベルのMenaINV及びFN両方を有する患者は、再発までの時間の統計的に有意な減少を示した(図41L)。総合して、これらのデータは、MenaINV RNA及びタンパク質レベルが、腫瘍再発と相関することの初めての証拠であり、乳がん患者における内因性MenaINV発現とα5発現とFN発現との関連性を支持する。
【０２６５】
実施例16〜23の論考。
幾つかのMENAアイソフォーム、特にMENAINVを、高いMENAINVレベルが乳がん患者における再発増加及び転帰不良に関連する、転移性乳がんの重要な駆動因子として同定した。パクリタキセル処置中に動的MTを維持することによりパクリタキセルに対する耐性を駆動することにおけるMENA及びMENAINVについての更なる予想外の役割も、ここで立証した。MENA及びMENAINV発現が、パクリタキセル処置中にMT動態を維持し、その結果、MAPKシグナル伝達増加をもたらすことを発見した。タキサンは、依然として転移性乳がんの標準治療であるが、本データは、このクラスの薬物が、ある特定の高浸潤性の転移性がんの標的化に有効でない可能性があることを明示する。
【０２６６】
培養乳がん細胞株における内因性MENA発現レベルとパクリタキセルに対する感受性との間に逆相関が認められた。低い内因性MENAレベルを有する培養MDA-MB-231細胞におけるMENA又はMENAINVの異所性発現は、パクリタキセルに対する感受性を低下させた。逆に、高レベルのMENA及びMENA11aを内因性発現するT47Dでは、全てのMENAアイソフォームの欠乏がパクリタキセルに対する感受性を上昇させた。総合して、これらのデータは、MENA発現がパクリタキセルに対する耐性を促進することを示す。MENAばかりでなくMENA11aも、T47Dにおいて、及び現在分析中の他の細胞株の一部において発現されるので、MENA11aは、パクリタキセル耐性の一因となりうる可能性がある。しかし、これに関連して、化学療法に対する耐性におけるMENA11aの役割は未だ不明であるが、MENA11a発現がHER-2過剰発現乳がん細胞においてPI3K阻害剤に対する耐性の一因となることに注目することは興味深い。
【０２６７】
一見、in vitroで培養した場合、低レベルの内因性MENAを発現し、微量レベルのMENAINVしか発現しない侵襲性乳がん細胞株、例えば、MDA-MB-231及びBT549は、逆説的と思われるかもしれない。結果は、培養乳がん細胞を免疫不全マウスに移植して同所性腫瘍を作成した場合、侵襲性腫瘍細胞亜集団においてMENA及びMENAINV発現が有意にアップレギュレートされることを示す。したがって、腫瘍微小環境における増殖は、腫瘍進行中にMENA及びMENAINVの存在量を増加させる遺伝子発現及び選択的スプライシングの変化であって、自然発症マウス乳癌及びヒト乳腺腫瘍において観察されるものと同様の変化を、異種移植細胞において誘発する可能性が高い。この研究の目的は、MENAアイソフォーム発現が、侵襲性の、ことによると転移性の、疾患を有する乳がん患者にどのように影響を与えるのかを判定/調査することであったので、in vivoでの腫瘍細胞におけるMENAアイソフォーム発現の研究から得た知識に基づいて実験を設計した。in vitroでの分析のためにMENAアイソフォーム発現に対する腫瘍微小環境の効果を模倣するために、本発明者らは、侵襲性、転移性乳がんを有する患者において発現される2つのアイソフォームであるMENA及びMENAINVを発現するようにMDA-MB-231細胞を操作した。実験は、転移性腫瘍において発現されるMENAアイソフォームが、パクリタキセルに対する耐性を付与すること、また逆に、パクリタキセル処置が、腫瘍におけるMENA及びMENAINV発現を増加させる結果となることを実証するものであった。パクリタキセル処置が、上昇したMENAINVを有する腫瘍において転移負荷を低減させることへの有効性が低いことが実証されたので、タキサンに基づく治療は、一部の症例では、発現(MENAINV発現)上昇を誘発することがあり、そしてまたそれが、転移を誘発もし、処置の効力を低下させもする。この可能性を調査するための研究は進行中である。
【０２６８】
本発明者らは、FAとMTの間の確立された関連性、並びにFAにおけるMENAの公知存在量及びαインテグリンサブユニットとのその直接相互作用を考慮して、接着点(FA)シグナル伝達の調節におけるMENAの役割が、MENA/MENAINVが促進するタキサンに対する耐性に重要でありうるという仮説を最初に立てた。しかし、α5との相互作用にはタキサン耐性のMENA依存性増加が必要とされないことを発見した(図31)。パクリタキセル処置後、MENA発現細胞は、パクリタキセル処置細胞において動的MT集団の存在量の増加を示した(図37)。したがって、MENAが、MTに、MT結合タンパク質との会合により影響を及ぼすのか、MT動態を調節するシグナル伝達経路に対する効果によって影響を及ぼすのか、又は両方であるのかを理解することは、興味深いことであろう。
【０２６９】
興味深いことに、対照条件下で、本発明者らのデータは、MENA又はMENAINV発現がMT長を増加させたことを示し、これは、MT挙動の調節へのMENAの関与を裏づける(図35)。これらの知見と一致して、唯一のショウジョウバエMENAオルソログであるEnabled(Ena)の、ショウジョウバエS2細胞におけるsiRNA欠乏は、MT動態の有意な変化を誘導した。これは、MT動態の調節におけるMENAの役割が進化的に保存される可能性があることを示唆している。しかし、対照条件下で、チロシン化の変化は、全細胞レベルで検出されなかった。これは、全細胞免疫蛍光には微妙な差を検出できるほどの感受性がないことに起因しうる(図37)。しかし、一部のアクチン調節タンパク質がMT動態を調節できることは明らかである。例えば、アクチン各形成・伸張因子であるフォルミンもまた、MT構築及び安定性の正の調節因子として作用することができる。例えば、足場を伴うフォルミンmDia1及びINF2の活性化形態とMT結合タンパク質IQGAP1とを含有する複合体は、MTとの直接相互作用によってMTの安定化を増大させることができ、MT調節因子もまたフォルミン依存性アクチン動態に影響を与えうる。興味深いことに、ショウジョウバエの遺伝子スクリーニングにより、MT+TIP追跡タンパク質CLASPの異所性発現に関連する表現型の量感受性修飾因子としてEnaが同定された。したがって、ライブイメージングと連関しているMT先端タンパク質の蛍光レポーターを使用する、アクチンに基づく細胞運動性機構とMT調節の間の相互作用に焦点を合わせた将来の研究は、転移性がん細胞によるタキサン耐性の獲得についての更なる洞察をもたらす可能性がある。
【０２７０】
MENAアイソフォームによって駆動されるパクリタキセル耐性は、持続的MT動態をもたらし、そしてまたそのことが、ERKシグナル伝達の増加を少なくともin vitroでもたらす(図38)。MT動態の崩壊は、ERKリン酸化の原因になりえ、MAPK活性化は、MT安定化を阻害しうる。したがって、フィードバック機序は、MAPK経路活性とMT動態のバランスをとるように作用しうる。本データは、パクリタキセルとMEKiを、どちらかの薬物を個々に用いるのではなく、併用する処置が、MENAINV細胞におけるMT安定性増加をもたらすことを示し、MENAINVがMAPKシグナル伝達とMT動態とのバランスを変える可能性を提起する(図38)。乳がんコホートにおいて、IHCにより評価したときのMENA発現は、pERK及びpAkt染色と相関し、Her-2のステータスに関係なく、MENA陽性腫瘍ではpERK及びpAkt陽性数が高かった。MCF7 Her2過剰発現株における全てのアイソフォームの欠乏は、ERKシグナル伝達を減少させ、細胞増殖に対するEGF/NRG1により媒介される効果を阻害した。これらのデータは、ERKシグナル伝達の調節におけるMENAの潜在的役割と一致する。或いは、G2/M停止の差が存在しない場合であっても、パクリタキセル処置に応答して、Akt経路等のバイパスシグナル伝達経路による活性化がインテグリンの下流で起こる。興味深いことに、MENAアイソフォームが誘導したAktリン酸化レベルに差がなく(図39)、このリン酸化レベルは、パクリタキセル処置中に3つの細胞株すべてにおいて有意に低下した。この知見は、パクリタキセル処置中に、MENAアイソフォーム発現が、相対的にAktシグナル伝達に対してより感受性が高いアポトーシスではなく、相対的にMAPKシグナル伝達に対してより感受性が高い増殖を選択的に増加させることを示す本in vivoデータとも一致する。最後に、本データは、タキサンとMEKiでの併用処置により、MENAアイソフォームによって駆動される耐性が回避されることを明示する(図38)。MEKiがin vitro及びin vivoでパクリタキセルによって駆動される細胞死を増進することは、以前に幾つかのグループによって証明されている。タキサンとMEK阻害剤トラメチニブの試験する、黒色腫及び非小細胞肺がん等の進行固形腫瘍に関する複数の治験が、現在進行中である。
【０２７１】
本データは、タキサンに対する高転移性がんの応答と腫瘍における高転移性細胞集団に対するタキサンの効果との興味深い関係を明示し、これは、重要な臨床的意味を持つ可能性がある。第一に、パクリタキセル処置後のほうが、MENA及びMENAINVタンパク質発現が、in vitroでも、異種移植腫瘍においても高かった。これは、残留生存細胞が、上昇したMENA及びMENAINVレベルの選択を受けることを示唆している(図33)。第二に、MENAINVにより駆動される腫瘍細胞運動性及び転移がパクリタキセル処置による影響を受けないことを発見した(図32)。パクリタキセルは、乳腺腫瘍再燃及び転移を予防するために補助療法として広く使用されている。本データは、パクリタキセルが、高レベルのMENAINVを発現する原発性腫瘍を有する患者の処置への有効性が低い可能性があることを明示する。ここでは三種陰性乳がんに焦点を当てているが、ER+乳がんにおけるMENAレベルの低下もパクリタキセルに対する感受性を変えた(図29)。これは、この機序が他のサブタイプにおいて重要であることを示唆する。現在、患者におけるタキサンに対する応答を予測するバイオマーカーはない。乳がんにおける転移の可能性を予測するための及び患者処置の指針になるようなバイオマーカーとして、MENAアイソフォームを開発している。本発明者らは、MENAINVアイソフォーム特異的抗体を最近開発し、それを使用して、転移性腫瘍が、非転移性原発性腫瘍より高度にMENAINVを発現すること、及び高いMENAINVタンパク質レベルが、乳がん患者コホートにおいて転帰不良及び再発と有意に関連することを立証した。
【０２７２】
本データは、MENAINVとα5とFNとの関係がヒト乳がんに果たす役割も裏づける。このことは、その全体が参照により組み込まれている、Oudinら、Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression、Cancer Discov、2016年5月、6(5):516〜31頁において示した。アイソフォーム特異的抗体及び入手可能なTCGAデータのバイオインフォマティック解析を使用して、本発明者らは、MenaINV及びFNの高い発現レベルが2つのヒト乳がんコホートにおいて再発増加及び転帰不良と関連していることを見いだした。しかるが故に、MenaINV及びFN発現を診断及び予後マーカーとして使用することができる。
【０２７３】
ある態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対して耐性の腫瘍を有する患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、(a)患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つからのMenaINVの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程(ここで、前記対照に対するMenaINV発現増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及び(b)前記対照と比較してMenaINVの発現増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料から観察又は検出された場合、TKIに対する耐性があると患者を同定又は診断する工程を含む。
【０２７４】
本開示のいずれ態様又は実施形態においても、方法は、工程(a)の前に、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを検出及び測定する工程を更に含みうる。
【０２７５】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる。
【０２７６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は、抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０２７７】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は:(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しく修飾物質の有効量、又は(iv)それらの組合せのうちの少なくとも1つを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程を更に含む。
【０２７８】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、TKI以外の化学療法剤は、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤である。
【０２７９】
本開示のいずれか態様又は実施形態では、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤は、Ras阻害剤、Raf阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０２８０】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMena11aレベルを測定する工程を更に含む。
【０２８１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、血液、組織又は腫瘍におけるMenaINV/Mena11a発現の比を対照と比較する工程(ここで、MenaINV/Mena11aの比の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)及び対照と比較してMenaINV/Mena11aの比の増加が血液試料、組織試料又は腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性の腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を更に含む。
【０２８２】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、TKIは、RTKの阻害剤である。
【０２８３】
別の態様では、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)に対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、TKIでの処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMenaINVの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、MenaINV発現の増加は、MenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す)、及びより早い時点で得た試料と比較してより遅い時点で得た試料においてMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、TKIに対する二次耐性がある腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を含む。
【０２８４】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【０２８５】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを使用してアッセイすされ。
【０２８６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は、抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０２８７】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、TKIでの処置レジメンを開始する前の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、及びMenaINVのレベルが、所定の対照レベルと同等であった又はそれ未満であった場合、患者にTKIの有効量を投与する工程を更に含む。
【０２８８】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、(i)TKI以外の化学療法剤の有効量、(ii)TKIの標準処置量より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しく修飾物質の有効量、又は(iv)それらの組合せのうちの少なくとも1つを、TKIに対して耐性の腫瘍を有する患者に投与する工程を更に含む。
【０２８９】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、TKIは、RTKの阻害剤である。
【０２９０】
更なる態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、TKIの第1の有効量での処置中の異なる時点で得た患者からの少なくとも2つの試料におけるMenaINVのレベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織、及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、対照と比べてMenaINVの発現レベルの増加はTKI耐性がんを示す)工程と、MenaINVの発現が対照と比べて増加されなかった場合、前記TKIの第1の有効量を投与する工程、又はMenaINVの発現が、対照と比べて増加された場合:(i)患者にTKIの第2の有効量、(ii)患者にTKI以外の化学療法剤の有効量、(iii)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量と組み合わせてTKIの有効量、(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、又は(v)それらの組合せのうちの少なくとも1つを投与する工程とを含む。
【０２９１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、比較する工程の前に、TKIの第1の有効量を投与する工程、試料におけるMenaINVの発現レベルを検出若しくは測定する工程、又はそれらの組合せを更に含む。
【０２９２】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、TKIの第2の有効量は、TKIの初期有効量より少なくとも約2倍〜約20倍多い。
【０２９３】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、TKI以外の化学療法剤は、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤である。
【０２９４】
本開示のいずれか態様又は実施形態では、Ras-Raf-MEK-ERK経路の阻害剤は、Ras阻害剤、Rag阻害剤、MEK阻害剤、ERK阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０２９５】
本開示のいずれか態様又は実施形態では、方法は、TKIの第1の有効量を投与する前に採取した血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つにおけるMenaINVの発現レベルを測定する工程、MenaINVの発現レベルを所定の対照発現レベルと比較する工程、及びTKIの第1の有効量を投与する前に採取した試料において同等の又はより低いMenaINVレベルが観察又は検出された場合、TKIの第1の有効量を受けることに適していると患者を同定又は診断する工程を更に含む。
【０２９６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる。
【０２９７】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は:抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０２９８】
本開示のいずれか態様又は実施形態では、TKIは、RTKの阻害剤である。
【０２９９】
本開示のいずれか態様又は実施形態では、RTKの阻害剤は、EGFR、HGFR、IGFR、HER2、HER3、HER4、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３００】
更なる態様では、本開示は、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有する患者を同定するための方法であって、患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料、腫瘍試料又はそれらの組合せのうちの1つ又は複数からのMena、MenaINV又はそれらの組合せの発現レベルのうちの少なくとも1つを、対照における発現レベルと比較する工程(ここで、前記対照に対するMena及び/又はMenaINV発現増加は、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)、及び前記対照と比較してMena及び/又はMenaINVの発現増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料から観察又は検出された場合、微小管結合剤に対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を含む方法を提供する。
【０３０１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、単数の試料又は複数の試料からのMena、MenaINV、又はそれらの組合せの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【０３０２】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの1つを使用してアッセイされる。
【０３０３】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は、抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３０４】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は(iv)それらの組合せのうちの少なくとも1つを、患者に投与する工程を更に含む。
【０３０５】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【０３０６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定する。
【０３０７】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、構築するアクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【０３０８】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３０９】
更に別の態様では、本開示は、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断するための方法を提供する。この方法は、微小管結合剤での処置レジメン中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料におけるMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、より早い時点で得た試料に対してより遅い時点から得た試料におけるMena及び/又はMenaINV発現の増加は、二次Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)、及びより早い時点で得た試料と比較して、より遅い時点で得られた試料においてMena及び/又はMenaINVのレベルの増加が観察又は検出された場合、微小管結合剤に対する二次耐性がある腫瘍を有すると患者を同定又は診断する工程を含む。
【０３１０】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程を更に含む。
【０３１１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる。
【０３１２】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は、抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３１３】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、患者の血液試料、組織、腫瘍試料又はそれらの組合せにおけるMenaINVの発現レベルを測定する。
【０３１４】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、(i)微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(ii)標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路又はそれらの組合せを阻害又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、標準有効量、又は(iv)それらの組合せのうち少なくとも1つを、患者に投与する工程を更に含む。
【０３１５】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【０３１６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、構築するアクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【０３１７】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３１８】
更なる態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法を提供する。この方法は、微小管結合剤での第1の有効量での処置中に得た患者からの試験試料と対照組織試料のMena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料からなる群から選択されるか又はそれらの組合せであり、前記対照試料に対するMena及び/又はMenaINV発現の増加は、Mena関連及び/又はMenaINV関連微小管結合剤耐性腫瘍を示す)と、次のうちの少なくとも1つ:(i)対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが増加されなかった場合、微小管結合剤の有効量を投与する工程、(ii)対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが増加された場合、微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量を患者に投与する、若しくは微小管結合剤の投与を中止する工程、(iii)対照試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して試験試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが増加された場合、微小管結合剤の、及びMena若しくは関連経路、MenaINV若しくは関連経路、又はそれらの組合せを阻害するか又はダウンレギュレートする1つ又は複数の剤の、有効量を投与する工程、又は(iv)それらの組合せを含む。
【０３１９】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、工程(i)又は(iii)における微小管結合剤の有効量は、微小管結合剤の第1の有効量より少なくも5倍、少なくとも10倍又は少なくとも20倍多い。
【０３２０】
本開示のいずれか態様又は実施形態では、微小管結合剤は、微小管の動態を抑制するか、構築するアクチンネットワークの幾何形状に干渉するか、又は両方である。
【０３２１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤は、微小管不安定化剤、コルヒチン部位結合剤、タキサン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３２２】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【０３２３】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを検出する工程又は測定する工程の少なくとも一方を更に含む。
【０３２４】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる。
【０３２５】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は、抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３２６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料又はそれらの組合せにおけるMenaINVの発現レベルを測定する。
【０３２７】
更に別の態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、次のうちの1つ:(i)微小管結合剤の有効量、(ii)TKIの有効量、(iii)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、(iv)Mena阻害剤若しくは修飾物質、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質又はこれらの組合せののうちの少なくとも1つの有効量;又は(v)それらの組合せを、患者に併用投与する工程を含む方法を提供する。
【０３２８】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量は、患者の微小管結合剤に対する耐性を予防及び/又は改善するのに有効な量である。
【０３２９】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、Mena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量は、患者に対する微小管結合剤又はTKIの抗腫瘍効力を増強するのに有効な量である。
【０３３０】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤又はTKIとMena阻害剤若しくは修飾物質及び/又はMenaINV阻害剤若しくは修飾物質との併用投与を、患者に、逐次的に、別々に又は同時に投与する。
【０３３１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、微小管結合剤をMenaINVの阻害剤と併用投与する。
【０３３２】
更なる態様では、本開示は、腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、微小管結合剤治療中の異なる時点で得た患者の少なくとも2つの試料における、Mena、MenaINV又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを比較する工程(ここで、前記試料は、血液試料、組織試料及び腫瘍試料から選択されるか又はそれらの組合せである)、及びより遅い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルが、より早い時点で得た試料におけるMena及び/又はMenaINVのレベルと比較して増加された場合、Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【０３３３】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、発現レベルを比較する工程の前に患者に微小管結合剤の有効量を投与する工程と試料におけるMena及び/又はMenaINVの発現レベルを測定する工程とを更に含む。
【０３３４】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、試料は、MenaINV(配列番号3)と特異的に結合する剤;MenaINV mRNA(配列番号1)と特異的にハイブリダイズする剤;Mena mRNAと特異的にハイブリダイズする剤;Menaと特異的に結合する剤;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを使用してアッセイされる。
【０３３５】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、前記剤は、抗体若しくはアプタマー;核酸;検出可能なマーカーで標識された抗体、アプタマー若しくは核酸;又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つである。
【０３３６】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、患者の血液試料、組織試料及び/又は腫瘍試料におけるMenaINVの発現レベルを測定し、患者にMenaINVの阻害剤を投与する。
【０３３７】
ある態様では、本開示は、MenaINV過剰発現腫瘍を有する患者におけるがんを処置するための方法であって、TKI、微小管結合剤、Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの第1の有効量に対して耐性であるMenaINV過剰発現がんを有すると判定された患者を用意する工程、及び:(i)患者にTKIの有効量、(ii)患者にTKI若しくは微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(iii)Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(iv)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(v)微小管結合剤の有効量、(vi)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、又は(v)それらの組合せのうちの少なくとも1つを投与する工程を含む方法を提供する。
【０３３８】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、(i)〜(vi)のいずれにおける剤の有効量も、第1の有効量より2倍〜10倍多い。
【０３３９】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、TKI又は微小管結合剤以外の化学療法有効剤は、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍薬(例えば、ドキソルビシン)、抗腫瘍性アルキル化剤(例えば、シスプラチン)、又はそれらの組合せである。
【０３４０】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、腫瘍は、乳腺、乳房、膵臓、前立腺、結腸、脳、肝臓、肺、頭部又は頸部腫瘍である。
【０３４１】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、血液、組織又は腫瘍におけるMeancalcを対照と比較する工程であって、Menacalcが、Mena11aの量を減算した全Mena量に相当し、Menacalcの増加又は減少がMena関連TKI耐性腫瘍を示す、工程、及び前記対照と比較してMenacalcの増加又は減少が前記血液試料、前記組織試料又は前記腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を更に含む。
【０３４２】
本開示のいずれかの態様又は実施形態では、方法は、前記血液、組織又は腫瘍におけるMenaINV/Menatotal発現の比を対照と比較する工程であって、MenaINV/Menatotalの前記比の増加がMenaINV関連TKI耐性腫瘍を示す、工程、及び前記対照と比較してMenaINV/Menatotalの比の増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料において観察又は検出された場合、TKIに対して耐性である腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を更に含む。
【０３４３】
再発の高い尤度を有すると患者を同定又は診断するための方法であって、患者の血液試料、組織試料、腫瘍試料、又はそれらの組合せのうちの1つ又は複数からのMenaINV、フィブロネクチン又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つの発現レベルを、対照における発現レベルと比較する工程(ここで、前記対照に対するMenaINV及び/又はフィブロネクチン発現増加は、再発の高い尤度を有するがんを示す)、及び前記対照と比較してMenaINV及び/又はフィブロネクチンの発現増加が前記血液試料、前記組織試料及び/又は前記腫瘍試料から観察又は検出された場合、再発を有する可能性が高い腫瘍を有すると前記患者を同定又は診断する工程を含む方法。
【０３４４】
本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、MenaINV発現増加は、対照より少なくとも2倍多い。
【０３４５】
本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、MenaINV発現増加は、対照より少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10倍以上多い。本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、MenaINV発現増加は、対照より少なくとも4倍多い。本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、MenaINV発現増加は、対照より少なくとも4.5倍多い。
【０３４６】
本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、フィブロネクチン発現増加は、対照より少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13倍以上多い。本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、フィブロネクチン発現増加は、対照より少なくとも7.5倍多い。本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、フィブロネクチン発現増加は、対照より少なくとも10倍多い。本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、フィブロネクチン発現増加は、対照より少なくとも12.5倍多い。
【０３４７】
本明細書に記載の実施形態又は態様のいずれかにおいて、方法は、(i)患者にTKIの標準的処置より少なくとも10倍多いTKIの有効量、(ii)微小管結合剤の標準的処置より少なくとも5倍多い微小管結合剤の有効量、(iii)患者にTKI若しくは微小管結合剤以外の化学療法剤の有効量、(iv)Mena阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(v)MenaINV阻害剤若しくは修飾物質の有効量、(vi)Ras-Raf-MEK-MAPK経路の阻害剤の有効量、又は(vii)それらの組合せのうち少なくとも1つを投与する工程を更に含む。
【０３４８】
他の実施形態
上記説明から、本明細書に記載の本発明に、それを様々な使用及び条件に適応させるために、様々な変更及び修飾を加えることができることは、理解されるであろう。そのような実施形態もまた、後続の特許請求の範囲に記載の範囲内である。
【０３４９】
本明細書における変数のいずれの定義における要素のリストの記述も、任意の単一要素としての又は収載要素の組合せ(若しくは部分的組合せ)としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の記述は、任意の単一実施形態としての、又は任意の他の実施形態若しくはそれらの部分との組合せでの、その実施形態を含む。
【０３５０】
本明細書中で言及する全ての特許及び公表文献は、各々の独立した特許及び公表文献が参照により組み込まれていると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【０３５１】
［参考文献］
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【図１Ａ】
2019500591.tif 000008
【図１Ｂ】
2019500591.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１３Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１５Ａ】
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【図１６Ａ】
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【図１７Ａ】
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【図１８Ｉ】
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【図１９Ａ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２８Ａ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３５Ｈ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３８Ｇ】
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【図３８Ｈ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図３９Ｆ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４０Ｇ】
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【図４０Ｈ】
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【図４０Ｉ】
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【図４０Ｊ】
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【図４０Ｋ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４１Ｅ】
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【図４１Ｆ】
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【図４１Ｇ】
2019500591.tif 000205
【図４１Ｈ】
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【図４１Ｉ】
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【図４１Ｊ】
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【図４１Ｋ】
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【図４１Ｌ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019500591.tif 000211
2019500591.tif 000212
2019500591.tif 000213
2019500591.tif 000214