(57)【要約】  出生後幹細胞を含む集団などの哺乳動物出生後細胞集団を、ChgAを上方制御し、かつ出生後幹細胞の分化を促進する複数の小分子で処理して腸内分泌細胞を形成することにより、該細胞集団から腸内分泌細胞(EEC)の集団が得られる。ChgAの上方制御は、得られた細胞集団中のCGAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイにより測定した場合に、少なくとも約1.5%となるようなものである。該出生後細胞を腸内分泌細胞に分化させるために使用され得る小分子としては、Wnt活性化剤、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤、成長因子、HDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤の少なくとも１つが挙げられ得る。また、哺乳動物細胞の集団のインスリン発現は、該集団を、インスリン発現を増加させる複数の小分子で処理することにより増加される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物出生後細胞集団から腸内分泌細胞(EEC)の集団を得るための方法であって、該方法が、
哺乳動物出生後細胞集団を、ChgAを上方制御する複数の小分子で処理して、該出生後細胞集団中の出生後細胞を分化させ、細胞の集団を得、その結果該得られた細胞集団中のChgAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイで測定した場合、少なくとも約1.5%となる工程
を含む、方法。
【請求項２】
該出生後細胞が出生後幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該出生後細胞が多能性子孫細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ChgAを発現する細胞の画分が少なくとも約5%である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ChgAを発現する細胞の画分が少なくとも約10%である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ChgAを発現する細胞の画分が少なくとも約50%である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ChgAを発現する細胞の画分が、約60%〜約100%の範囲内にある、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ChgAの発現レベルが、mRNA ChgA発現アッセイで測定した場合、出生後細胞集団中のChgAを発現する細胞の数の少なくとも10倍である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
得られた集団中のChgAを発現する細胞の数が、出生後細胞集団中のChgAを発現する細胞の数の少なくとも約100倍である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
得られた集団中のChgAを発現する細胞の数が、出生後細胞集団中のChgAを発現する細胞の数の約1000倍〜100000倍の範囲内にある、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
腸内分泌細胞が、GLP-1、GIP、5HT、SST、ガストリン、CCK、SCT、NTS、PYY、ガストリンおよびグレリンの少なくとも1つを発現する腸内分泌細胞型を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該複数の小分子が、Wnt活性化剤、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤、成長因子、HDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せの少なくとも1つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該方法が、
哺乳動物出生後細胞集団と1つ以上の第1の小分子を接触させる第1の段階：および
哺乳動物出生後細胞集団と1つ以上の第2の小分子を接触させる第2の段階
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該1つ以上の第1の小分子が、Notch阻害剤およびWnt活性化剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含み、該1つ以上の第2の小分子が、Notch阻害剤、ならびにEGFR阻害剤およびMEK/ERK阻害剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該1つ以上の第1の小分子が、R-Spondin1およびDAPT、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含み、該1つ以上の第2の小分子が、DAPTおよびPD0325901、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該1つ以上の第2の小分子がWnt阻害剤をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該Wnt阻害剤がWnt-C59を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該1つ以上の第1の小分子または該1つ以上の第2の小分子が、EGFおよびNogginの少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む成長因子をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
該1つ以上の第1の小分子が、HDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、およびCa2+/NeuroD1活性化剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
該1つ以上の第1の小分子が、ツバスタチンA、トラニルシプロミンおよびISX-9の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該1つ以上の第2の小分子が、Tgf-β阻害剤、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
該1つ以上の第2の小分子が、616452、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該1つ以上の第2の小分子が、ヒストンメチル化阻害剤、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
該1つ以上の第2の小分子が、トラニルシプロミン(Trancylpromine)、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該第1の段階が、出生後細胞集団と、Ngn3を上方制御して細胞中のNgn3発現を増加させる1つ以上の第1の小分子を接触させることを含み、該第2の段階が、出生後細胞集団と、Ngn3を下方制御して細胞中のNgn3発現を減少させる1つ以上の第2の小分子を接触させることを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項２６】
該哺乳動物出生後細胞集団の少なくとも約2%が腸内分泌細胞に転換される、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
該哺乳動物出生後細胞集団の少なくとも約70%が腸内分泌細胞に転換される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該哺乳動物出生後細胞集団が、上皮幹細胞、胃幹細胞、腸幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞および神経幹細胞の少なくとも1つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
該哺乳動物出生後細胞集団がLgr5+腸幹細胞を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該哺乳動物出生後細胞集団が細胞のインビトロ集団である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
該哺乳動物出生後細胞集団が細胞培養培地中に分散される、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物出生後細胞集団が細胞のインビボ集団である、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
出生後細胞または腸内分泌細胞を含む哺乳動物細胞の集団のインスリン発現を増加させるための方法であって、該方法が、
インスリン活性アッセイにおいて、活性化されたインスリンGFPレポーターを有する細胞の画分が少なくとも約1%となるように、該哺乳動物細胞集団を、細胞集団中のインスリン発現を増加させる複数の小分子で処理する工程
を含む、方法。
【請求項３４】
該出生後細胞が出生後幹細胞である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該出生後細胞が出生後多能性子孫細胞である、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
活性化されたインスリンGFPレポーターを有する細胞の画分が少なくとも約20%である、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
活性化されたインスリンGFPレポーターを有する細胞の画分が約20%〜約100%の範囲内にある、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該得られた細胞が、mRNAインスリンアッセイにより測定した場合に、Hprt mRNAの発現レベルに対応するベースラインと比較して、少なくとも約1倍〜2倍であるインスリンの発現を有する、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
該複数の小分子が、DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
該複数の小分子が、616452、ISX-9、ならびに5-アザシチジンおよび5-アザ-2'デオキシシチジンの少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該複数の小分子が、Wnt活性化剤、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤、成長因子、HDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
得られた細胞の少なくとも約1%がインスリン産生細胞である、請求項３３記載の方法。
【請求項４３】
得られた細胞の約1%〜約20%がインスリン産生細胞である、請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
該哺乳動物細胞集団が、Lgr5+幹細胞、多能性子孫細胞、および分化した腸内分泌細胞の少なくとも1つを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４５】
該方法が、
該哺乳動物細胞集団と、1つ以上の第1の小分子を接触させる第1の段階；
該哺乳動物細胞集団と、1つ以上の第2の小分子を接触させる第2の段階；および
該哺乳動物細胞集団と、1つ以上の第3の小分子を接触させる第3の段階
を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
第1の段階が、該細胞と、Notch阻害剤、Wnt活性化剤およびDNAメチル化阻害剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含む1つ以上の第1の小分子を接触させることを含み、第2の段階が、該細胞と、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、Tgf-阻害剤、およびNeuroD1活性化剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含む1つ以上の第2の小分子を接触させることを含み、第3の段階が、該細胞と、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤およびTgf-β阻害剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む1つ以上の第3の小分子を接触させることを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該1つ以上の第1の小分子が、 R-Spondin 1、DAPTならびに5-アザシチジンおよび5-アザ-2'デオキシシチジンの少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含み、該1つ以上の第2の小分子が、DAPT、Wnt-C59、616452およびISX-9、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩を含み、該1つ以上の第3の小分子が、DAPT、Wnt-C59、616452およびPD0325901、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
第1の段階が、該細胞と、EGFおよびNogginの少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む成長因子を接触させることをさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
第1の段階が、該細胞と、HDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、およびCa2+流入/Neuro D1活性化剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを接触させることさらにを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
第1の段階が、該細胞と、ツバスタチン、トラニルシプロミン、およびISX-9の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを接触させることを含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
第2の段階が、該細胞と、ヒストンメチル化阻害剤、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを接触させることをさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
第2の段階が、該細胞と、トラニルシプロミン(trancylpromine)、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを接触させることをさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５３】
該哺乳動物細胞集団が、上皮幹細胞、胃幹細胞、腸幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞および神経幹細胞の少なくとも1つを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項５４】
該哺乳動物細胞集団がLgr5+腸幹細胞を含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
該哺乳動物細胞集団が細胞のインビトロ集団である、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
該哺乳動物細胞集団が細胞培養培地中に分散される、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
該哺乳動物細胞集団が細胞のインビボ集団である、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
複数の小分子を用いた処理により出生後幹細胞から由来する腸内分泌細胞を有する細胞集団であって、該腸内分泌細胞の画分が全細胞集団の少なくとも約1%である、細胞集団。
【請求項５９】
該腸内分泌細胞が5-HTまたはGLP-1を発現する、請求項５８記載の細胞集団。
【請求項６０】
該細胞集団が未分類の集団である、請求項５８記載の細胞集団。
【請求項６１】
腸内分泌細胞の画分が少なくとも約5%である、請求項５８記載の細胞集団。
【請求項６２】
腸内分泌細胞の画分が少なくとも約10%である、請求項６１記載の細胞集団。
【請求項６３】
腸内分泌細胞の画分が約20%〜約100%の範囲内にある、請求項６２記載の細胞集団。
【請求項６４】
該細胞が凍結保存される、請求項５８記載の細胞集団。
【請求項６５】
インスリン産生細胞を有する細胞集団であって、該インスリン産生細胞の画分が全細胞集団の少なくとも約0.05%である、細胞集団。
【請求項６６】
インスリン産生細胞の画分が少なくとも約1%である、請求項６５記載の細胞集団。
【請求項６７】
該インスリン産生細胞が出生後幹細胞に由来する、請求項６５記載の細胞集団。
【請求項６８】
哺乳動物出生後細胞の集団を腸内分泌細胞に分化させるためのキットであって、該キットが、
細胞培養培地；
哺乳動物出生後細胞集団；および
得られた細胞集団中のChgAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイで測定した場合、少なくとも約1.5%となるように、ChgAを上方制御して、出生後細胞を分化させる複数の小分子
を含む、キット。
【請求項６９】
該哺乳動物出生後細胞が出生後幹細胞である、請求項６８記載のキット。
【請求項７０】
該出生後細胞が多能性子孫細胞である、請求項６８記載のキット。
【請求項７１】
該キットが、
Notch阻害剤およびWnt活性化剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む小分子の第1の組；ならびに
Notch阻害剤、ならびにEGFR阻害剤およびMEK/ERK阻害剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む小分子の第2の組
を含む、請求項６８記載のキット。
【請求項７２】
哺乳動物出生後細胞および出生後幹細胞から分化した腸内分泌細胞の少なくとも1つを含む哺乳動物細胞の集団からインスリン産生細胞を得るためのキットであって、該キットが、
細胞培養培地；
哺乳動物細胞集団；および
インスリン-GFPプロモーターアッセイにおいて、活性化されたインスリンGFPプロモーターを有する細胞の画分が少なくとも約1%となるように、該細胞集団中のインスリン発現を増加させる複数の小分子
を含む、キット。
【請求項７３】
該哺乳動物出生後細胞が出生後幹細胞である、請求項７２記載のキット。
【請求項７４】
該哺乳動物出生後細胞が多能性子孫細胞である、請求項７２記載のキット。
【請求項７５】
該キットが、
DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤の組合せ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せ
を含む、請求項７２記載のキット。
【請求項７６】
細胞培養培地、哺乳動物細胞集団、および該哺乳動物細胞から腸内分泌細胞を得るための指示書をさらに含む、請求項７２記載のキット。
【請求項７７】
不十分な内分泌細胞または腸内分泌細胞生成物を特徴とする疾患状態の治療を必要とする哺乳動物における、不十分な内分泌細胞または腸内分泌細胞生成物を特徴とする疾患状態を治療する方法であって、該方法が、
哺乳動物の該細胞集団中のChgAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイで測定した場合、少なくとも約1.5%となるように、哺乳動物の細胞集団中の出生後細胞においてChgAを上方制御して、出生後細胞を腸内分泌細胞に分化させる複数の小分子を、該哺乳動物に投与する工程
を含む、方法。
【請求項７８】
該出生後細胞が出生後幹細胞である、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
該出生後細胞が多能性子孫細胞である、請求項７または７７記載の方法。
【請求項８０】
該複数の小分子が、Wnt活性化剤、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤、成長因子、HDAC(6)阻害剤、ヒストンメチル化(LSD1)阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項７７〜７９いずれか記載の方法。
【請求項８１】
該出生後細胞が、腸幹細胞、胃幹細胞、上皮幹細胞、造血(hematopoetic)幹細胞、乳房幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞および神経幹細胞の少なくとも1つである、請求項７７記載の方法。
【請求項８２】
該疾患状態が、肥満、糖尿病、過敏性腸症候群、感染性腸炎および炎症性腸疾患の少なくとも1つである、請求項７７記載の方法。
【請求項８３】
不十分なインスリン産生を特徴とする疾患状態の治療を必要とする哺乳動物において、不十分なインスリン産生を特徴とする疾患状態を治療する方法であって、該方法が、
インスリン-GFPプロモーターアッセイにおいて、活性化されたインスリンGFPプロモーターを有する細胞の画分が少なくとも約1%となるように、哺乳動物の細胞集団中のインスリン発現を増加させる複数の小分子を、該哺乳動物に投与する工程
を含み、該細胞集団が、出生後細胞または腸内分泌細胞を含む、方法。
【請求項８４】
該出生後細胞が出生後幹細胞である、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
該出生後細胞が出生後多能性子孫細胞である、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
該複数の小分子が、DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
該複数の小分子が、616452、ISX-9、ならびに5-アザシチジンおよび5-アザ-2'デオキシシチジンの少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項８３記載の方法。
【請求項８８】
該疾患状態が、肥満およびI型糖尿病の少なくとも1つである、請求項８３記載の方法。
【請求項８９】
DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せ；ならびに
薬学的に許容され得る賦形剤
を含む、組成物。
【請求項９０】
616452、ISX-9、ならびに5-アザシチジンおよび5-アザ-2'デオキシシチジンの少なくとも1つ、またはそれらの誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩、あるいはそれらの組合せを含む、請求項８９記載の組成物。
【請求項９１】
細胞の集団を得るための方法であって、該方法は、
a) 哺乳動物出生後細胞の集団を提供する工程；
b) 該哺乳動物出生後細胞集団を、ChgAを上方制御する少なくとも1つの小分子で処理して、処理後細胞集団を得る工程
を含む、方法。
【請求項９２】
該処理後細胞集団が腸内分泌細胞を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
該処理後細胞集団がChgA-陽性細胞を含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
該処理後細胞集団が少なくとも約1.5%のChgA-陽性細胞集団を含む、請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
該ChgA-陽性細胞集団をChgA免疫染色(Immunsotaining)アッセイにより測定する、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
該ChgA-陽性細胞集団をChgA免疫染色(Immunsotaining)アッセイにより測定する、請求項９４記載の方法。
【請求項９７】
該哺乳動物出生後細胞集団がインビトロ集団である、請求項１または９１記載の方法。
【請求項９８】
該インビトロ集団が細胞培養培地に分散される細胞を含む、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
該インビトロ集団が類器官を含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
該哺乳動物出生後細胞集団がインビボ集団またはエキソビボ集団である、請求項１または９１記載の方法。
【請求項１０１】
該哺乳動物細胞集団がインビトロ集団である、請求項３３記載の方法。
【請求項１０２】
該インビトロ集団が、細胞培養培地中に分散される細胞を含む、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
該インビトロ集団が類器官を含む、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０４】
該哺乳動物細胞集団がインビボ集団またはエキソビボ集団である、請求項３３記載の方法。
【請求項１０５】
該複数の小分子が、単回投与で哺乳動物に投与される、請求項７７または８３記載の方法。
【請求項１０６】
出生後細胞の腸内分泌細胞への分化が、複数の小分子の投与後にインサイチュで起こる、請求項７７記載の方法。
【請求項１０７】
該複数の小分子が、MAO阻害剤の少なくとも1つ、またはその誘導体もしくは薬学的に許容され得る塩をさらに含む、請求項８０記載の方法。
【請求項１０８】
インスリン発現の増加が、複数の小分子の投与後にインサイチュで起こる、請求項８３記載の方法。
【請求項１０９】
不十分な内分泌細胞または腸内分泌細胞の生成物を特徴とする疾患状態の治療を必要とする哺乳動物において、不十分な内分泌細胞または腸内分泌細胞の生成物を特徴とする疾患状態を治療する方法であって、該方法が、
該哺乳動物に細胞集団を投与する工程を含み、ここで、該細胞集団が、該細胞集団中の出生後細胞においてChgAを上方制御する複数の小分子によりエキソビボで処理されて、出生後細胞が腸内分泌細胞に分化され、その結果、該細胞集団中のChgAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイで測定した場合に、少なくとも約1.5%となるように、方法。
【請求項１１０】
不十分なインスリン産生を特徴とする疾患状態の治療を必要とする哺乳動物において、不十分なインスリン産生を特徴とする疾患状態を治療する方法であって、該方法が、
該哺乳動物に、出生後細胞、腸内分泌細胞、またはそれらの組合せを含む細胞集団を投与する工程を含み、ここで、該細胞集団が、インスリン-GFPプロモーターアッセイにおいて、細胞集団中の活性化されたインスリンGFPプロモーターを有する細胞の画分が少なくとも約1%となるように、該細胞集団中でインスリン発現を増加させる複数の小分子によりエキソビボで処理される、方法。
【請求項１１１】
該複数の小分子が多段階プロセスで投与される、請求項１、３３、７７、８３、９１、１０９および１１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2016年1月8日に出願された米国仮特許出願第62/276,814号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により認められた助成金番号R01 DE013023の下、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
腸内分泌系は、多様なホルモンを使用して、体内での広範な生理学的応答を微妙に調節することにより体が栄養物にどのように応答するかを調整し、そのため胃腸(GI)障害、糖尿病および肥満などの消化および代謝性の疾患において重要な役割を担う。腸内分泌細胞(EEC)は体内で最大の内分泌系を形成する(Grible and Reimann, 2015)。EECは個々に、腸上皮を通って陰窩-絨毛軸(crypt-villus axis)に沿って分散されるが、インビボにおいては少ない割合(約1%)で存在するだけである(Gunawardene et al., 2011)。EECの重要な機能は、管腔内容物、特に栄養物を感知すること、および食物摂取、エネルギー恒常性およびブドウ糖耐性を調節する多様なホルモン(例えばGLP-1)の分泌により応答することである(Furness, 2013)。EECはGLP-1、PYYおよびGLP-2などのホルモンを分泌することにより胃バイパス手術において重要な役割を担うことも示唆される(Mumphrey, 2013)。したがって、EECは、糖尿病および肥満における治療標的である。さらに、増大する証拠(mounting evidence)により、先天性免疫におけるEECの免疫制御機能が示される(Moran, 2008)。EECは、機能的Toll様受容体(TLR)を発現し、共生細菌により産生された代謝物に直接応答する(Bogunovic, 2007)。最近の証拠はまた、EECは、炎症の間に数およびホルモン分泌の変化により免疫細胞機能を直接調整し得ることを示唆する(Worthington, 2015)。EECはまた、代謝性疾患(例えば糖尿病および肥満)、ならびに過敏性腸症候群、感染性腸炎および炎症性腸疾患などの胃腸病状において決定的な役割を果たすと考えられる(Moran, 2008 and Manocha and Kahn, 2012)。したがって、疾患介入の調査および開発のためにEECには大きな利益がある。
【０００４】
しかしながら、腸内分泌細胞の研究は、インビトロでEECを培養する能力の相対的な欠如、ならびに腸上皮におけるEECの散乱分布およびEECの相対的な希少性(1%)により阻害されている。特に、EECの分化および機能を制御するシグナルの知識は、かなりわかっていない。さらに、EECの直接インビトロ研究は、EECが分裂しない最終的に分化した細胞になるために、可能ではない。したがって、消化管上皮におけるEECの散乱分布および希少性(1%)のために、インサイチュでEECの機能および制御を研究することは困難である(Sternini, Anselmi and Rosengut, 2008 and Gunawerdene, Corfe and Staton, 2011)。
【０００５】
したがって、代謝および消化の疾患の調査を可能にするためのインビトロEEC培養のための必要性が残っている。EECの機能を調節し、疾患状態の治療の発見および実行における使用のためなどの特異的EECサブタイプを得る能力のための必要性もある。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本開示の局面は、出生後幹細胞集団などの哺乳動物出生後細胞集団を、ChgAを上方制御し、かつ細胞の分化を促進して腸内分泌細胞を形成する複数の小分子で処理することにより、出生後幹細胞集団などの哺乳動物出生後細胞集団から腸内分泌細胞(EEC)の集団を得ることを含む。ChgAの上方制御は、得られた細胞集団中のCGAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイにより測定した場合に少なくとも約1.5%となるものである。出生後幹細胞を腸内分泌細胞に分化させるために使用され得る小分子としては、Wnt活性化剤、Notch阻害剤、Wnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤、成長因子、HDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つが挙げられ得る。
【０００７】
本開示の局面はまた、哺乳動物細胞の集団を、該細胞がインスリン発現を増加することを誘導する複数の小分子で処理することにより哺乳動物細胞の集団のインスリン発現を増加させるための方法を含む。該インスリン発現のレベルは、インスリン-GFPレポーターを使用したインスリン活性アッセイにおいて、活性化されたインスリンGFPレポーターを有する細胞の画分が少なくとも約1%であるように該細胞集団中で増加され得る。インスリン発現を増加するように処理され得る哺乳動物細胞としては、出生後幹細胞、出生後多能性子孫細胞および腸内分泌細胞などの出生後細胞または腸内分泌細胞が挙げられ得る。細胞においてインスリンの発現を増加させるための処理に使用され得る小分子としては、DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤およびNeuroD1活性化剤が挙げられ得る。
【０００８】
本明細書に記載されるEECおよび/またはインスリン産生細胞により疾患状態を治療するための方法および/または組成物も、本開示の局面に従って含まれる。また、得られたEECおよび/またはインスリン産生細胞に対応する細胞の集団も、該EECおよび/またはインスリン産生細胞の調製における使用のための小分子を含むキットと同様に、本開示の局面に従って含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
前述のものは、添付の図面において示されるように、本発明の例示態様の以下のより具体的な記載から明らかであり、図面中、同様の参照記号は、異なる図面を通じて同じ部分を指す。図面は、必ずしも同じ縮尺ではなく、その代り、本発明の態様の例示に重きが置かれる。
【図１】図1は、Notch阻害剤を使用したISCからの腸内分泌細胞(EEC)の分化の増加を示す。
【図２】図2は、培養された腸幹細胞におけるChgAのmRNA発現を示す。
【図３】図3は、EEC分化を増加させる小分子に対する96ウェルスクリーニングプラットフォームを示す。
【図４】図4は、小分子スクリーニング結果からの陽性ヒットを示す。
【図５】図5は、小分子およびEND条件下で分化した腸幹細胞を使用した陽性ヒットの検証を示す。
【図６】図6は、EEC分化を特異的に増加させるMAPK/ERKまたはEGFR阻害剤を示す。
【図７】図7は、EEC分化の際に小分子ゲフィチニブ(Ge)、AS703026 (As)またはPD0325901 (Pd)がNgn3発現を減少させること、およびR-Spondin 1がNgn3発現を促進することを示す。
【図８】図8は、最適化された分化プロトコルを示す。
【図９】図9は、EEC分化の際の24時間でのNgn3発現を示す。
【図１０】図10は、分化の際の3日目でのEECの重要なマーカーの発現を示す。
【図１１】図11は、EEC分化の際の重要な遺伝子の時間経過試験を示す。
【図１２】図12は、分化の5日後にEECマーカーChgA発現が増加する2工程プロトコルを示す。
【図１３】図13は、分化の5日後にEECマーカーChgAを染色することによりEEC分化が増加する2工程プロトコルを示す。スケールバー：50μm。
【図１４】図14は、さらなる小分子による分化プロトコルの向上を示す。
【図１５】図15は、分化プロトコルの工程1において添加した場合にツバスタチンA(Tu)がEEC分化を増加させることを示す。
【図１６】図16は、分化における両方の工程で添加した場合にトラニルシプロミンがEEC分化を増加させたことを示す。
【図１７】図17は、EGFの除去によりEECの分化がさらに増加したことを示す。
【図１８】図18は、向上した分化プロトコルを示す。
【図１９】図19は、ISCからの高度に効率的なEEC分化を示す。スケールバー：20μm。
【図２０】図20は、ISCから生成される機能的L細胞(GLP-1)を示す。
【図２１】図21は、Wnt-C59およびISX-9ならびにそれらの組合せを含むさらなる因子がEEC分化を増加させることを示す。
【図２２】図22は、複数の条件下での機能的EECマーカーの発現を示す。
【図２３】図23は、ISCからのEEC分化のための分化プロトコルを示す。
【図２４】図24は、5-アザ(5)、616452 (6)およびWnt-C59 (C)の組合せが5日目に、分化した腸幹細胞においてインスリン-GFP発現を誘導することを示す。
【図２５】図25は、インスリン-GFP発現の誘導の5日目における5-アザの用量応答を示す。
【図２６】図26は、インスリン-GFP発現の誘導の5日目における616452の用量応答を示す。
【図２７】図27は、培養5日後にISX-9 (I)がインスリン-GFP発現をさらに増加させたことを示す。
【図２８】図28は、インスリン-GFP発現の誘導の5日目におけるISX-9の用量応答を示す。
【図２９】図29は、培養5日後の複数の条件における細胞のインスリン-GFP発現のFACS分析を示す。
【図３０】図30は、7日目に薬物なしまたは薬物ありで処理した細胞のGFPおよび明視野を示す。
【図３１】図31は遺伝子発現データを示す。
【図３２】図32は、グルコースの低(2mM)および高(20mM)濃度による細胞の処理が異なるレベルのインスリン放出を誘導することを示す。
【図３３】図33は、分化プロトコルのフロー図を示す。
【図３４】図34は、WntおよびNotch経路により調節されたインビボEEC分化のモデルを示す。
【図３５】図35は、NotchおよびEGFR/MEK/ERK阻害ならびにWnt不活性化(R-Spondin1除去(withdraw)による)の組合せが、ChgAに対する免疫染色により決定した場合にISCのEEC方向への特異化(specification)を誘導することを示す。
【図３６】図36は、EGFおよび/またはNogginの該組み合わせからの除去により高レベルのChgA発現が誘導され、一方でWnt経路阻害剤IWP 2 (またはI)またはGSK3β阻害剤CHIR99021 (またはC)の添加によりEECへの分化はさらには増加されなかったことを示す。
【図３７】図37は、複数の分化条件における細胞コロニーの形態を示す。
【図３８】図38は、複数の分化条件における細胞コロニーの形態を示す。Notch、MEK阻害およびWnt不活性化(D.Pd条件)ならびにNotch/MEK/Wnt阻害(D.Pd.C59条件)の条件における死細胞を有するコロニーの顕著な管腔に注意。一方で2工程分化条件(ENRD-END.Pd)はより少ない細胞死を誘導した。
【図３９Ａ】図39は、さらなる小分子がEEC分化を増加させることを示す。図39A、工程1におけるツバスタチンA(Tu)の添加ありまたはなしの複数の条件において分化した細胞についてのGip、Gcg、CckのmRNA発現。
【図３９Ｂ−Ｄ】図39B、工程1、工程2または両方の工程において添加したトラニルシプロミン(Tc)ありまたはなしの複数の条件における細胞分化についてのGip、GcgおよびCckのmRNA発現。図39C、トラニルシプロミンについてのEECマーカー(ChgA、Gcg、Gip、Tph1)の用量依存的誘導。図39D、複数の条件において分化した細胞についての複数のEECマーカー(Gip、Gcg、Cck)のmRNA発現。
【図３９Ｅ】図39E、複数の条件において分化した細胞についてのLyz1のmRNA発現。
【図４０Ａ】図40A〜40Dは、プロトコル最適化によりISCからのEECの高効率分化が生じることを示す。図40A、複数の時点におけるWnt経路阻害剤Wnt-C59 (C59)およびTgf-β経路阻害剤レプソックス(Repsox) (Rep)の添加ありまたはなしでの杯細胞(Muc2)、パーネト細胞(Lyz1)およびEEC (ChgA、Gcg、Gip、Cck、Tph1、Sst、SctおよびPyy)についてのマーカーのmRNA発現。S1、S2は2工程分化プロトコルの工程1および工程2を示す。0時間または12時間は、C59の添加の時点を示す。ENRは、自発的分化のための対照として使用した。
【図４０Ｂ】図40B、2-工程分化プロセスにおける複数の遺伝子の時間経過試験。
【図４０Ｃ】図40C、複数の遺伝子の対応するピークレベル(2日目でSox9、Math1、Ngn3およびNeuroD1、5日目でChgA、図40D参照)と比較した該複数の遺伝子の発現レベル。
【図４０Ｄ】図40A〜40Dは、プロトコル最適化によりISCからのEECの高効率分化が生じることを示す。図40A、複数の時点におけるWnt経路阻害剤Wnt-C59 (C59)およびTgf-β経路阻害剤レプソックス (Rep)の添加ありまたはなしでの杯細胞(Muc2)、パーネト細胞(Lyz1)およびEEC (ChgA、Gcg、Gip、Cck、Tph1、Sst、SctおよびPyy)についてのマーカーのmRNA発現。S1、S2は2工程分化プロトコルの工程1および工程2を示す。0時間または12時間は、C59の添加の時点を示す。ENRは、自発的分化のための対照として使用した。図40B、2-工程分化プロセスにおける複数の遺伝子の時間経過試験。図40C、複数の遺伝子の対応するピークレベル(2日目でSox9、Math1、Ngn3およびNeuroD1、5日目でChgA、図40D参照)と比較した該複数の遺伝子の発現レベル。図40E、分化したEEC細胞の免疫染色。
【図４０Ｅ】図40E、分化したEEC細胞の免疫染色。
【図４１Ａ】図41A〜41Cは、プロトコル最適化によりISCからのEECの高効率分化が生じることを示す。図41A、レプソックスありまたはなしでの条件における複数の遺伝子のmRNA発現。使用した基底条件はENR.D.Tu.Tc-D.Pd.Tc.C59であった。レプソックスは工程2で添加した。
【図４１Ｂ】図41B、示される条件における複数の遺伝子のmRNA発現。
【図４１Ｃ】図41C、分化した細胞コロニーの形態。矢印は、コロニーから放出された死細胞を示す。
【図４２】図42は、レプソックスおよびFGF10が、段階1で添加された場合に、インスリンmRNA発現を増加したことを示す。
【図４３】図43は、より長い5アザ処理がインスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図４４】図44は、段階2におけるWnt-C59の遅延添加がインスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図４５】図45は、BayK 8644が、段階1で添加された場合に、インスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図４６】図46は、インスリン発現の促進におけるBayK 8644の用量依存的活性を示す。
【図４７】図47は、BayK 8644が、段階1〜3で添加された場合に、インスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図４８】図48は、インスリン発現の促進におけるDAPTの用量依存的活性を示す。
【図４９】図49は、IOX1がインスリンおよびNkx6.1発現を増加させたことを示す。
【図５０】図50は、インスリンおよびNkx6.1発現の促進におけるレプソックスの用量応答を示す。
【図５１】図51は、インスリンおよびNkx6.1発現の促進におけるISX9の用量応答を示す。
【図５２】図52は、インスリンおよびNkx6.1発現の促進におけるWnt-C59の用量応答を示す。
【図５３】図53は、DMH-1が、段階2〜3で添加された場合に、インスリンおよびNkx6.1発現レベルを増加させたことを示す。
【図５４】図54は、デキサメタゾンが、段階2〜3で添加された場合に、インスリンおよびNkx6.1発現レベルを増加させたことを示す。
【図５５】図55は、T3が、段階3で添加された場合に、インスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図５６】図56は、T3およびN-アセチルシステイン(N-Alc)が、段階3で添加された場合に、インスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図５７】図57は、CHIR99021 (CHIR)が、段階3で添加された場合に、インスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図５８】図58は、Exendin-4およびオーロラキナーゼ阻害剤II、ならびにホルスコリンがインスリンmRNA発現を増加させたことを示す。
【図５９】図59は、インスリンmRNA発現の促進においてGC1がT3にとって代わり得ることを示す。
【図６０】図60は、インスリン-GFP発現および胃腸幹細胞から因子の組合せを使用して得られた島様構造の形態を示す。
【図６１】図61は、細胞培養プロセスの図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本願において、そうではないと記載されなければ、「または」の使用は「および/または」を意味する。本願において使用される場合、用語「含む(comprise)」ならびに「含む(comprising)」および「含む(comprises)」などのその用語の変形は、他の添加物、成分、整数または工程を除外することを意図しない。本願において使用される場合、用語「約(about)」および「約(approximately)」は同等のものとして使用される。本願において使用される約(about)/約(approximately)を伴うかまたは伴わない任意の数字は、当業者に理解される任意の通常の変動をカバーすることを意味する。特定の態様において、用語「約(approximately)」または「約(about)」は、そうではないと記載されない限りまたは文脈からそうではないと明らかでない限りは、記載された参照値のいずれかの方向(より多いまたはより少ない)に25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%またはそれ以下以内にある値の範囲をいう(かかる数があり得る値の100%を超える場合を除く)。
【００１１】
「投与」は、被験体に物質を導入することをいう。いくつかの態様において、投与は経口であるかまたは注射による。特定の態様において、「投与されるようにする(causing to be administered)」は、第1の成分がすでに投与された後の第2の成分の投与をいう(例えば異なる時点でおよび/または異なる行為者による)。
【００１２】
「抗体」は、免疫グロブリンポリペプチド、または免疫原結合能力を有するその断片をいう。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「アゴニスト」は、標的遺伝子、タンパク質、または経路それぞれの発現または活性の増加を引き起こす薬剤である。そのため、アゴニストは、標的遺伝子またはタンパク質にこの生理学的な効果を直接または間接的に生じさせるいくつかの様式で、その同族の(cognate)受容体に結合して活性化し得る。アゴニストはまた、経路構成要素の活性を調節することにより、例えば経路の負の制御因子の活性を阻害することにより経路の活性を増加し得る。そのため、「Wntアゴニスト」は、Wnt経路の活性を増加する薬剤として定義され得、該活性は、細胞中の増加したTCF/LEF媒介性の転写により測定され得る。そのため、「Wntアゴニスト」は、Wntファミリータンパク質、細胞内ベータカテニン分解の阻害剤、およびTCF/LEFの活性化剤のいずれかおよび全てを含むFrizzled受容体ファミリーメンバーに結合して活性化する真のWntアゴニストであり得る。「Notchアゴニスト」は、の転写活性を測定することにより決定され得る、Notch経路の活性を増加する薬剤として定義され得る。
【００１４】
「アンタゴニスト」は、受容体に結合して、次いで他の分子による結合を低減または排除する薬剤をいう。
【００１５】
特定の細胞型に関して本明細書で使用する場合、「細胞密度」は、代表的な顕微鏡検査試料中の面積当たりのその細胞型の平均数である。該細胞型としては、限定されないが、Lgr5+細胞、腸内分泌細胞またはインスリン産生細胞が挙げられ得る。該細胞密度は、所定の試料、器官または組織中の所定の細胞型により評価され得る。
【００１６】
「細胞分化」は、細胞が特殊化されて、出生後幹細胞のより特殊化された機能を有する細胞への変換などの特異的な機能を実行するプロセスをいう。一態様において、Lgr5+腸幹細胞は腸内分泌細胞に分化する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「ChgA免疫染色アッセイ」は、免疫染色法により、細胞集団中のChgAを発現する細胞の画分を決定するために使用されるアッセイである。ChgA免疫染色アッセイの一例において、細胞集団が処理される細胞培養培地を除去し、試料をPBSで洗浄する。マトリゲル中で培養された類器官または細胞コロニーは、4% PFAを添加して室温で20分間インキュベートすることにより直接固定される。次いでマトリゲルを機械的に破壊し、細胞を、BSA-被覆Eppendorfチューブに移す。試料をPBSで洗浄し、0.25% Triton X-100で30分間浸透化し、クロモグラニンAに対する一次抗体(例えば、抗クロモグラニンA、sc-13090, Santa Cruz)および適切な二次抗体(例えば、Alexa Fluorコンジュゲート二次抗体、例えばAlexa Fluor 594コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体、A-21207; Life Technologies)で染色する。共焦点顕微鏡検査により画像を取得する。
【００１８】
「CHIR99021」は、化学式C22H18Cl2N8および以下の別名：CT 99021; 6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリルを有する化学組成物である。その化学構造は以下のとおりである：
【化１】
2019506153.tif 000002
【００１９】
「相補的な核酸配列」は、相補的なヌクレオチド塩基対で構成される別の核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列をいう。
【００２０】
特定の細胞型に関して本明細書で使用される場合、「断面細胞密度」は、代表的な顕微鏡検査試料中の組織を通る断面の面積当たりのその細胞型の平均数である。
【００２１】
「減少(decreasing)」および「減少する(decrease)」は、例えば参照のレベルと比較して、少なくとも5%、例えば5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99または100%の減少をいい、例えば参照のレベルと比較して、少なくとも１倍、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍またはそれ以上の減少が挙げられる。
【００２２】
「EGFR阻害剤」は、上皮成長因子受容体を阻害する物質である。EGFR阻害剤の例としては、特に、エルロチニブHCl (OSI-744)、ゲフィチニブ(ZD1839)、ラパチニブ(GW-572016)ジトシレート、アファチニブ(BIBW2992)、ネラチニブ(HKI-272)、カネルチニブ(Canertinib)(CI-1033)、ラパチニブ、AG-490 (チルホスチンB42)、CP-724714、ダコミチニブ(PF299804, PF299)、WZ4002、AZD8931 (サピチニブ(Sapitinib))、CUDC-101、AG-1478 (チルホスチンAG-1478)、PD153035 HCl、ペリチニブ(Pelitinib)(EKB-569)、AC480 (BMS-599626)、AEE788 (NVP-AEE788)、OSI-420、WZ3146 WZ8040、AST-1306、ロシレチニブ(Rociletinib)(CO-1686, AVL-301)、ゲニステイン、バルリチニブ(Varlitinib)、イコチニブ、TAK-285、WHI-P154、PD168393、CNX-2006、チルホスチン9、AG-18、ポジオチニブ(Poziotinib)(HM781-36B)、AZD3759、オシメルチニブ(AZD9291)、アファチニブ(BIBW2992)二マレイン酸塩、エルロチニブ、オルムチニブ(olmutinib)(HM61713, BI 1482694)、CL-387785 (EKI-785)、NSC228155、AZ5104、AG490、AG 494、AG 555、AG 556、AG 825、AG 879、AG 99、AP 24534、AV 412、BIBU 1361、BIBX 1382、BMS 599626、カネルチニブ、CGP 52411、GW 583340、HDS 029、HKI 357、イレッサ、JNJ 28871063、ラベンズスチンA、2,5-ジヒドロキシ桂皮酸メチル、PD 158780、PF 6274484、PKI 166、R 1530、RAF 265およびXL 184が挙げられる。
【００２３】
「排除する」は、検出可能でないレベルまで減少させることを意味する。
【００２４】
「腸内分泌細胞」は、胃腸管および膵臓の特殊化された内分泌細胞である細胞をいい、腸管、胃および膵臓内に見られ得る。
該腸内分泌細胞は、体内の最大の内分泌系を形成し、管腔内容物、特に栄養物を感知し得、食物摂取、エネルギー恒常性およびブドウ糖耐性を調節する多様なホルモン(例えばGLP-1)の分泌により応答し得る。腸内分泌細胞の特定の型は、しばしば、特にGLP-1、5HT、SST、ガストリン、CCK、SCT、NTS、PYY、ガストリンおよびグレリンを発現する細胞などの特定の腸内分泌細胞サブセット内のホルモンの発現に従って分類される。腸内分泌の異なるサブセットは、しばしばK細胞、I細胞、L細胞、G細胞、腸クロム親和細胞、N細胞およびS細胞とも称されるが、該細胞のホルモン発現は、上述の細胞サブタイプを同定するためにますます使用されている。腸内分泌細胞は、本明細書に記載されるmRNA ChgA発現アッセイおよびChgA免疫染色アッセイなどのアッセイにより検出され得るChgAマーカーの発現により同定され得る。
【００２５】
「植え込む」または「植え込み」は、目的の組織の既存の細胞との接触による、インビボでの目的の組織中への幹細胞または前駆細胞の組み込みの過程をいう。
【００２６】
「上皮前駆細胞」は、上皮細胞を生じる細胞系統になるよう限定される能力を有する多能性細胞をいう。
【００２７】
「上皮幹細胞」は、上皮細胞を生じる細胞系統を含む複数の細胞系統になるよう付される(committed)能力を有する多能性細胞をいう。
【００２８】
「断片」は、例えばポリペプチドまたは核酸分子の部分をいう。この部分は、例えば参照核酸分子またはポリペプチドの完全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90もしくは100、200、300、400、500、600、700、800、900もしくは1000のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００２９】
「成長因子」は、細胞成長、増殖または分化を刺激し得る物質をいう。
【００３０】
本明細書において交換可能に使用されるように、「GSK3ベータ」、「GSK3β」および「GSK3B」は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータの頭字語である。
【００３１】
「GSK3ベータ阻害剤」は、GSK3ベータの活性を阻害する物質である。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「HDAC」はヒストンデアセチラーゼの頭字語である。
【００３３】
「HDAC阻害剤」はHDACの活性を阻害する物質である。
【００３４】
「ヒストンメチル化阻害剤」は、ヒストンメチル化を阻害する物質である。
【００３５】
「ハイブリダイズ」は、ストリンジェンシーの適切な条件下で、相補的なヌクレオチド塩基の間で二本鎖分子を形成する対形成(例えば、DNA中アデニン(A)はチミン(T)と塩基対を形成し、同様にグアニン(G)はシトシン(C)と塩基対を形成する)をいう。(例えばWahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507参照)。
【００３６】
「阻害剤」は、例えば標的遺伝子、タンパク質または経路の発現または活性の減少を引き起こす薬剤をいう。例えば、「Wnt阻害剤」は、Wntシグナル伝達経路の活性の減少を引き起こす薬剤をいい、例えば、Wnt受容体阻害剤、Wnt受容体アンタゴニスト、Wnt分泌を阻害するPorcupine阻害剤、もしくはタンキラーゼ阻害剤、またはβカテニン相互作用に干渉する薬物であり得る。「アンタゴニスト」は阻害剤であり得るが、より具体的には、受容体に結合し、次いで他の分子による結合を減少または排除する薬剤である。
【００３７】
「増加(increasing)」および「増加する(increase)」は、例えば参照のレベルと比較して、少なくとも5%、例えば5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100%またはそれ以上の増加をいい、例えば参照標準のレベルと比較して(as compared to the level of a as compared to the level of a reference standard)、少なくとも1倍、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍またはそれ以上の増加を含む。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「インスリン活性アッセイ」は、インスリン遺伝子転写、翻訳またはインスリン放出が細胞集団中で活性化されている程度を決定するために使用されるアッセイである。例示的なインスリン活性アッセイにおいて、初期の細胞は、B6.Cg-Tg (Ins1-EGFP)1Hara/Jマウス(MIT-GFPマウスとも称される、Jackson lab stock no.: 006864)などのインスリン-GFPマウスの腸から単離される。腸陰窩は、腸の近位半分から単離される。約200の陰窩を40μlのマトリゲルに閉じ込め、500μlの陰窩培養培地(培地補助物(1X N2、1X B27、2mM Glutamax、10mM HEPES、1mM N-アセチルシステインおよび100U/mlペニシリン/100μg/mlストレプトマイシン)を有するAdvanced DMEM/F12)を有し、成長因子(50ng/ml EGF、100ng/ml Nogginおよび500ng/ml R-Spondin1)および小分子(5μM CHIR99021および1.25mM VPA)を補充した24ウェルプレート中で培養して、腸幹細胞の富化された集団を得る。次いで細胞を1〜2回継代して、アッセイのための開始細胞集団を作製する。薬剤がインスリン遺伝子転写、翻訳またはインスリン放出を活性化する能力を試験するために、細胞を、適切な培養培地(例えば、前述の陰窩培養培地)、成長因子および/または他の試験される薬剤と共にインキュベートする。陰窩培養培地および評価される薬剤を含む適切な培養培地をそれぞれのウェルに添加して、2日毎に培地を交換して、細胞と共に2〜10日間インキュベートする。インスリン-GFP陽性細胞の画分(すなわち、インスリン-GFPレポーターが活性化される細胞)は、総細胞集団中に存在するGFP+細胞集団の画分を測定するためにフローサイトメーターを使用して定量され得る。また、細胞集団の平均インスリン活性は、適切な参照またはハウスキーピング遺伝子を使用して(例えば、ベースラインとしてHprtのmRNA発現を使用して)標準化した集団のインスリンの平均mRNA発現レベルを測定することにより測定され得る。
【００３９】
「腸幹細胞」は、拘束されて、腸内分泌細胞、腸細胞(enterocyte cell)、杯細胞およびパーネト細胞などの腸細胞(interstinal cell)を生じる細胞系統を含む複数の細胞系統になるよう付される能力を有する腸系統の多能性細胞をいう。
【００４０】
「単離される」は、天然の状態で見られるような通常では物質に付随する成分を様々な程度で含まない該物質をいう。「単離」は、元の供給源または周囲からの分離の程度を示す。
【００４１】
「Lgr5」は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5の頭字語であり、Gタンパク質共役受容体49(GPR49)またはGタンパク質共役受容体67(GPR67)としても知られる。これは、ヒトにおいてLgr5遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「Lgr5+細胞」または「Lgr5-陽性細胞」は、Lgr5を発現する細胞である。本明細書で使用する場合、「Lgr5-細胞」はLgr5+ではない細胞である。
【００４３】
「哺乳動物」は、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、サル、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ウマ、ウシまたはブタを含む任意の哺乳動物をいう。
【００４４】
「多能性子孫細胞」は、すでに幹細胞よりも特異的な細胞をいい、これは、該細胞は特定の型の細胞に分化する傾向を有することを意味するが、依然として複数の、異なるが限定された細胞型に分化する能力を有する細胞をいう。多能性子孫細胞は、幹細胞から分化しているが、まだ「標的」細胞型に分化していない多能性細胞であり得る。
【００４５】
「MEK/ERK阻害剤」は、MEK/ERKシグナル伝達経路を阻害する物質である。MEK阻害剤の例としては、アルクチゲニン(Arctigenin)、BIX 02189、10Z-ヒメニアルジシン、PD 0325901、PD 184352、PD 198306、PD 334581、PD 98059、SL 327、U0126、セルメチニブ(selumetinib)(AZD6244)、トラメチニブ(GSK1120212)、PD184352 (CI-1040)、PD98059、ピマセルチブ(AS-703026)、BIX 02188、TAK-733、AZD8330、ビニメチニブ(Binimetinib)(MEK162、ARRY-162、ARRY-438162)、PD318088、レファメチニブ(Refametinib)(RDEA119、Bay 86-9766)、BI-847325、コビメチニブ(GDC-0973、RG7420)、GDC-0623およびAPS-2-79が挙げられる。ERK阻害剤の例としては、SCH772984、DEL-22379、VX-11e、ERK5-IN-1、XMD8-92、SC1 (プルリポチン(pluripotin))、ウリキセルチニブ(u;ixetinib)(BVD-523、VRT75227、FR 180204、GDC-0994、BIX 02189、TCS ERK 11e、TMCBおよびエイコサペンタエン酸が挙げられる。
【００４６】
「mRNA ChgA発現アッセイ」は、細胞集団中の相対的なChgA mRNA発現レベルを決定するために使用されるアッセイをいう。例えば、該アッセイは、出生後幹細胞の試験されない集団と比較して、試験される薬剤での処理後の分化した細胞集団のChgA mRNA発現レベルを決定し得る。mRNA ChgA発現アッセイの例において、細胞を回収して、RNA抽出キット(例えばRNeasy Miniキット, Qiagen)を使用して、該細胞からRNAを抽出する。次いでChgA発現レベルを、1工程qPCRキット(例えばQuantiTech Probe PCRキット, Qiagen)、ならびにChgAプライマーおよびプローブ(例えば、市販のマウスChgA用Taqmanプローブ, Life Technologies)を使用して定量的リアルタイムPCRにより評価する。
【００４７】
「mRNAインスリン発現アッセイ」は、細胞集団の相対的インスリンmRNA発現レベルを決定するために使用されるアッセイをいう。例えば、該アッセイは、細胞の処理されない集団と比較して、細胞内のインスリンの発現を増加するように処理された細胞集団中で発現されたインスリンmRNAレベルを決定し得る。例示的mRNAインスリン発現アッセイにおいて、細胞を回収して、RNA抽出キット(例えばRNeasy Miniキット, Qiagen)を使用して該細胞からRNAを抽出する。次いで、1工程qPCRキット(例えば、QuantiTech Probe PCRキット, Qiagen)、ならびにIns1またはIns2プライマーおよびプローブ(例えば、マウスIns1およびIns2用の市販のTaqManプローブ, Life Technologies)を使用して、定量的リアルタイムPCRによりインスリン発現レベルを評価する。相対的インスリンmRNA発現は、ベースラインまたは他のマーカー、例えばHprt mRNA発現レベルまたは他のベースラインマーカーに対して決定され得る。
【００４８】
「NeuroD1活性化剤」は、NeuroD1を活性化する物質である。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「非ヒト哺乳動物」は、ヒトではない任意の哺乳動物をいう。
【００５０】
「Notch阻害剤」は、Notchシグナル伝達経路の阻害剤をいう。
【００５１】
「Ngn3」は、内分泌前駆細胞中で発現され、腸内分泌分化に関連するタンパク質であるニューロゲニン-3をいう。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「Ngn3アッセイ」は、分化プロトコルに供される細胞などの細胞中のNgn3の発現の程度を決定するために使用されるアッセイである。例示的Ngn3アッセイにおいて、RNAを、分化プロトコルに従って培養された細胞から単離して、市販のプライマーおよびプローブ(例えばTaqmanプローブ)を使用して定量的リアルタイムPCRを行い、細胞中のNgn3発現の程度を決定する。
【００５３】
本明細書の関連のある文脈で使用する場合、用語、細胞の「数」は、0、1またはそれ以上の細胞であり得る。
【００５４】
「類器官」または「上皮類器官」は、器官または器官の一部に類似し、その特定の器官に関連する細胞型を有する細胞のクラスター(cluster)または凝集物をいう。
【００５５】
細胞の「集団」は、1より多い任意の数の細胞をいい、さらには少なくとも1X103細胞、少なくとも1X104細胞、少なくとも1X105細胞、少なくとも1X106細胞、少なくとも1X107細胞、少なくとも1X108細胞、少なくとも1X109細胞、または少なくとも1X1010細胞をいう。
【００５６】
「出生後細胞」は、非胚性細胞をいう。出生後細胞としては、出生後幹細胞、出生後前駆細胞および出生後多能性子孫細胞、ならびにこれらの細胞から分化した1つ以上の細胞、例えば腸内分泌細胞(EEC)の少なくとも1つが挙げられ得る。
【００５７】
「出生後幹細胞」は、自己複製する能力複数の細胞系統に分化する能力を有する非胚性幹細胞をいう。出生後幹細胞は、成体幹細胞または体細胞性幹細胞とも称され得る。出生後幹細胞としては、腸幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞および神経幹細胞が挙げられ得る。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「前駆細胞」は、特定の細胞の型に分化する傾向を有する、幹細胞と同様の細胞をいうが、すでに幹細胞よりも特異的であり、その「標的」細胞に分化するように強制される。
【００５９】
「参照」は、標準または対照条件(例えば試験剤または試験剤の組合せで処理されない)を意味する。
【００６０】
用語「試料」は、得られる、提供されるおよび/または分析に供される体積または質量をいう。いくつかの態様において、試料は、組織試料、細胞試料、液体試料等であるかまたはそれらを含む。いくつかの態様において、試料は被験体(例えばヒトまたは動物被験体)から得られる(またはそれらである)。いくつかの態様において、組織試料は、脳、毛髪(毛根を含む)、頬スワブ、血液、唾液、精液、筋肉、または任意の内部臓器由来のもの、またはこれらのいずれか1つと関連のある癌、前癌もしくは腫瘍の細胞であるかあるいはそれらを含む。限定されないが、液体は、尿、血液、腹水、胸膜液、脊髄液等であり得る。体組織としては限定されないが、脳、皮膚、筋肉、子宮内膜、子宮、および頸部の組織、またはこれらのいずれか1つに関連する癌、前癌もしくは腫瘍の細胞が挙げられ得る。
【００６１】
「自己複製(Self-renewal)」は、幹細胞が分裂して、母細胞のものとは区別できない発生能力を有する1つ(非対称的分裂)または2つ(対照的分裂)の娘細胞を生成する過程をいう。自己複製は、増殖および未分化状態の維持の両方を含む。
【００６２】
本明細書で言及する場合、「小分子」は、生物学的経路の調節に関与し得、かつ非核酸である有機化合物をいい、典型的には非ペプチド性で非オリゴマーであり、1500ダルトン未満の分子量を有し得る。
【００６３】
「幹細胞」は、自己複製する能力および複数の細胞系統に分化する能力を有する多能性細胞をいう。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「幹細胞マーカー」は、幹細胞中で特異的に発現される遺伝子産物(例えばタンパク質、RNA等)として定義され得る。幹細胞マーカーの1つの型は、幹細胞同一性の維持を直接および特異的に支持する遺伝子産物である。例としてはLgr5およびSox2が挙げられる。さらなる幹細胞マーカーは、文献中に記載されたアッセイを用いて同定され得る。遺伝子が幹細胞同一性の維持に必要であるかどうかを決定するために、機能獲得型(gain-of-function)および機能欠損型(loss-of-function)の試験を使用し得る。機能獲得型試験において、特定の遺伝子産物(幹細胞マーカー)の過剰発現は幹細胞同一性の維持を補助する。一方で、機能欠損型試験において、幹細胞マーカーの除去により、幹細胞同一性の消失が引き起こされるか、または幹細胞の分化が誘導された。別の型の幹細胞マーカーは、幹細胞のみで発現されるが、幹細胞の同一性を維持するための特定の機能を必ずしも有さない遺伝子である。この種類のマーカーは、分類された幹細胞と非幹細胞の遺伝子発現のサインをマイクロアレイおよびqPCRなどのアッセイにより比較することにより同定され得る。この種類の幹細胞マーカーは、文献中に見られ得る(例えばLiu Q. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2015 Mar;60:99-111. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582750)。あり得る幹細胞マーカーとしてはCcdc121、Gdf10、Opcml、Phex等が挙げられる。所定の細胞または細胞集団中のLgr5またはSox2などの幹細胞マーカーの発現は、qPCR、免疫組織化学、ウエスタンブロットおよびRNAハイブリダイゼーションなどのアッセイを使用して測定され得る。幹細胞マーカーの発現はまた、所定の幹細胞マーカー、例えばLgr5-GFPまたはSox2-GFPの発現を示し得るレポーターを発現するトランスジェニック細胞を使用して測定され得る。次いでフローサイトメトリー分析を使用してレポーター発現の活性を測定し得る。蛍光顕微鏡検査を使用しても、レポーターの発現を直接視覚化することができる。幹細胞マーカーの発現はさらに、包括的な遺伝子発現プロフィール分析のためののマイクロアレイ分析を使用して決定され得る。所定の細胞集団または精製された細胞集団の遺伝子発現プロフィールを、幹細胞の遺伝子発現プロフィールと比較して、2つの細胞集団間の類似性を決定し得る。幹細胞機能は、コロニー形成アッセイまたはスフィア(sphere)形成アッセイ、自己複製アッセイおよび分化アッセイにより測定し得る。コロニー(またはスフィア)形成アッセイにおいて、適切な培養培地中で培養した場合、幹細胞は、細胞培養表面(例えば細胞培養皿)上でコロニーを形成し得るかもしくは細胞培養基質(例えばマトリゲル)中に埋め込まれ得るべきであるか、または懸濁液中で培養した場合はスフィアを形成し得るべきである。コロニー/スフィア形成アッセイにおいて、単一の幹細胞を適切な細胞培養培地中に低細胞密度で播種し、所定の期間(7〜10日)増殖させる。次いで、形成されたコロニーを、計数し、起源細胞の幹細胞性の指標として幹細胞マーカー発現についてスコア化する。次いで、任意に、形成されるコロニーを採取して継代し、その自己複製および分化の能力を試験する。自己複製アッセイにおいて、適切な培養培地中で培養した場合、細胞は、少なくとも1回(例えば1、2、3、4、5、10、20等)の細胞分裂にわたり幹細胞マーカー(例えばLgr5)発現を維持するべきである。
【００６５】
「被験体」としてはヒトおよび哺乳動物(例えばマウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌおよびウマ)が挙げられる。多くの態様において、被験体は哺乳動物、特に霊長類、とりわけヒトである。いくつかの態様において、被験体は、例えば畜牛、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ等の家畜；例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ等の家禽；ならびにイヌおよびネコなどの飼いならされた動物、特にペットである。いくつかの態様において(例えば、特に研究の文脈で)、被験体哺乳動物は、例えばげっ歯類(例えばマウス、ラット、ハムスター)、ウサギ、霊長類または例えば同系交配のブタ等のブタである。
【００６６】
「相乗作用(synergy)」または「相乗効果(synergistic effect)」は、別々に得られる効果のそれぞれの合計より高い、相加効果より高い効果である。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「Tgfベータ阻害剤」(Tgf-β阻害剤)は、Tgfベータ経路の活性を低減する物質である。Tgfベータ阻害剤の例はTgfベータ受容体阻害剤であり得、限定されないが、Alk4、Alk7およびAlk5/Tgfベータ-RIが挙げられ得る。
【００６８】
「組織」は、一緒になって特定の機能を実行する同じ起源由来の同様の細胞の集合である。
【００６９】
本明細書において細胞集団に関して使用する場合、「処理すること」は、集団に物質を送達して結果に影響を及ぼすことを意味する。インビトロ集団の場合、該物質は、直接的に(または間接的にも)集団に送達され得る。インビボ集団の場合、該物質は、宿主被験体への投与により送達され得る。
【００７０】
「バルプロ酸」(VPA)は、化学式C8H16O2および以下の別名2-プロピルペンタン酸を有する。バルプロ酸のナトリウム塩はまたVPAの代わりに使用され得、用語「VPA」は、本明細書においてVPAまたはその薬学的に許容され得る塩、例えばナトリウム塩をいうために交換可能に使用される。その化学構造は以下のとおりである：
【化２】
2019506153.tif 000003
【００７１】
物質または組成物に関して本明細書で使用される場合、「Wnt活性化」は、Wntシグナル伝達経路の活性化である。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「Wnt活性化剤」は、Wntシグナル伝達経路を活性化する物質をいう。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「Wnt阻害剤」は、Wntシグナル伝達経路を阻害する物質をいい、例えばWnt受容体阻害剤、Wnt受容体アンタゴニスト、Wnt分泌を阻害するPorcupine阻害剤、もしくはタンキラーゼ阻害剤、またはβカテニン相互作用に干渉する薬物であり得る。Wnt阻害剤の例としては、Wnt-C59、IWP-2、IWR-1-endo、AZ6102、FH535、WIKI4、ICG-001、XAV-939、PRI-724、LGK-974、YA1797K、KY02111、Cardionogen 1およびIWP 12等が挙げられる。
【００７４】
句「薬学的に許容され得る」は、本明細書において、正常な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を有することなく、妥当な利益/リスク比と釣り合ったヒトおよび動物の組織との接触における使用に適するｓれらの化合物、物質、組成物および/または剤型をいうように使用される。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤」としては、限定されることなく、ヒトまたは家庭動物における使用に許容され得るような、米国食品医薬品局により承認された任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤(glidant)、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素/着色剤、矯味矯臭増加剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定化剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられる。薬学的に許容され得る担体の例としては、限定されないが、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；アルギン酸；発熱原非含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、リン酸緩衝溶液；ならびに医薬製剤中に使用される任意の他の適合性の物質が挙げられる。
【００７６】
「薬学的に許容され得る塩」としては、酸付加塩および塩基付加塩の両方が挙げられる。
【００７７】
「薬学的に許容され得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的有効性および特性を維持し、生物学的に望ましくないかまたは他の望ましくないものではなく、限定されないが、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、ならびに限定されないが、例えば、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、ショウノウ-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、サイクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、ガラクタール酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、2-オキソ-グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソブチル酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸等の有機酸と形成されるそれらの塩をいう。
【００７８】
「薬学的に許容され得る塩基付加塩」は、遊離酸の生物学的有効性および特性を維持し、生物学的に望ましくないかまたは他の望ましくないものではないそれらの塩をいう。これらの塩は、無機塩基または有機塩基の遊離酸への付加により調製される。無機塩基に由来する塩としては、限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩等が挙げられる。例えば、無機塩としては、限定されないが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩が挙げられる。有機塩基に由来する塩としては、限定されないが、第1級、第2級および第3級のアミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばアンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール(deaonl)、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン(hydrabamine)、コリン、ベタイン、ベネタミン(benethamine)、ベンザチン(benzathine)、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩が挙げられる。特定の態様で使用される有機塩基の例としては、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンならびにカフェインが挙げられる。
【００７９】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤および矯味矯臭剤および香料剤、保存剤および酸化防止剤も該組成物(例えば、医薬組成物)中に存在し得る。
【００８０】
薬学的に許容され得る酸化防止剤の例としては、(1) 例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性酸化防止剤；(2) 例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェロール等の油溶性酸化防止剤；および(3) 例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が挙げられる。
【００８１】
詳細な説明
本開示の例示態様の記載を以下に示す。
【００８２】
本開示は、出生後細胞集団の腸内分泌細胞(EEC)への分化を引き起こす経路および機構を活性化および/または非活性化し得る複数の小分子で処理することにより、出生後幹細胞集団などの哺乳動物出生後細胞集団から腸内分泌細胞(EEC)を形成する方法に関する。小分子により影響を受ける経路および機構としては、限定されないが、Wntシグナル伝達経路、Notchシグナル伝達経路、EGFR経路、MEK/ERFシグナル伝達経路、成長因子により影響を受ける機構、ヒストンメチル化経路、Tgf-βシグナル伝達経路およびNeuroD1経路が挙げられ得る。特に、本開示の局面は、出生後幹細胞などの出生後細胞のEECへの分化を促進し得る小分子の組合せ、および特定のEEC細胞型への分化のシグナルを出す小分子の組合せを提供する。
【００８３】
本開示はまた、哺乳動物細胞の集団を、該細胞において増加したインスリン発現をもたらす経路および機構を活性化および/または非活性化し得る複数の小分子で処理することにより、該集団におけるインスリン発現を増加させるための方法に関する。小分子で処理される細胞は、出生後細胞(例えば出生後幹細胞または多能性子孫細胞)または上述の方法により出生後幹細胞などの出生後細胞から分化されたEECなどの腸内分泌細胞のいずれかであり得る。インスリン産生を増加するための小分子により影響を受ける経路および機構としては、限定されないが、上述のEEC分化について記載されたシグナル伝達経路、例えばWntおよびNotchシグナル伝達経路など、および特にDNAメチル化経路、Tgf-βシグナル伝達経路およびNeuroD1経路を阻害および/または活性化するように作用する小分子を含むシグナル伝達経路のいずれかが挙げられ得る。特に、本開示の局面は、細胞においてインスリン発現を促進する小分子の組合せ、および処理された集団中の細胞をインスリン産生細胞になるように誘導する小分子の組合せを提供する。
【００８４】
出生後幹細胞などの出生後細胞をEECに分化させることにおいて、細胞の分化により分化マーカーChgAの発現を上方制御するような複数の小分子が提供される。ChgAの発現は、小分子により処理された細胞集団中でChgAを発現する細胞の画分が、ChgA免疫染色アッセイにおいて測定された場合に、少なくとも約1.5%となるように上方制御される。ChgA免疫染色アッセイにより測定した際のChgAを発現する細胞の画分は、さらに少なくとも約10%、さらに少なくとも約50%であり得、例えば細胞の画分は、約60%〜約100%の範囲にある。一態様において、ChgAを発現する細胞の画分は、約1.5%〜約100%の範囲にあり得る。さらに、mRNA ChgA発現アッセイで測定すると、分化した細胞集団中のChgA mRNA発現は、初期の出生後細胞集団中のChgA mRNA発現の少なくとも約10倍であり得る。ChgA mRNA発現は、初期の出生後細胞集団中のChgA mRNA発現の少なくとも100倍でさえあり得、初期の出生後細胞集団中のChgA mRNA発現の約1000倍〜1,000,000倍の範囲でさえあり得る。一態様において、ChgA mRNA発現は、初期の出生後細胞集団中のChgAを発現する細胞の数の約10〜約1,000,000倍の範囲であり得る。
【００８５】
小分子を使用したEECを形成するための細胞の分化は、腸内分泌細胞の高度に純粋な集団を提供し得、有意な数の出生後幹細胞などの出生後細胞は腸内分泌細胞に変換される。腸EECは、粘膜に、主に、そのより深い側半分(deeper half)に限定され、典型的に上皮細胞集団全体のわずかに少数、例えば1%未満のみを構成するために、出生後幹細胞を大量にEECに変換するこの能力は重要である。対照的に、本明細書に記載される小分子での処理は、EECについてのChgAマーカーを発現する細胞の割合が、全細胞集団の中少なくとも2%、および該細胞集団のさらに90%〜100%ほど高く、例えば全細胞集団の約60%〜約90%、およびさらに全細胞集団の約70%〜約80%となるように、出生後細胞を腸内分泌細胞に変換する。本明細書に開示されるように、約80%のEECを有する最終細胞集団が達成される(例えば、図40参照)。一態様において、得られた細胞集団中ChgAを発現する細胞の割合は、初期の出生後細胞集団と比較して増加し、少なくとも0.1%〜少なくとも1%のChgA発現細胞の画分の増加であり、さらに少なくとも約5%の増加、例えば少なくとも約10%の増加、およびさらに少なくとも約50%、例えば少なくとも約100%の増加である。
【００８６】
小分子により処理される出生後細胞としては、非胚性幹細胞である出生後幹細胞、例えば自己増殖する能力および複数の細胞系統に分化する能力を有する成体幹細胞が挙げられ、多能性子孫細胞および/または前駆細胞も挙げられ得る。出生後幹細胞としては、しばしば保存されたシグナル伝達および発生の経路を有する腸幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、乳房幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞および神経幹細胞が挙げられ得る。一態様において、出生後幹細胞は腸幹細胞であり、マーカーLgr5により同定され得る。Lgr5は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質連結受容体5であり、Gタンパク質連結受容体49(GPR49)またはGタンパク質連結受容体67(GPR67)としても公知であり、ヒトにおいて、Lgr5遺伝子にコードされる。細胞を小分子で処理してインスリン発現を増加させる場合、処理される細胞は、これらの出生後幹細胞および/またはさらに特異化された細胞、例えば多能性子孫細胞および/または前駆細胞および/または腸内分泌細胞のいずれかであり得る。
【００８７】
細胞の集団の複数の小分子での処理は、細胞のインスリン発現の有意な増加を提供するためにも実施され得る。一態様において、インスリン発現は、インスリン活性アッセイで測定した場合に、処理された細胞において活性化されたインスリンGFPレポーターを有する細胞の画分が少なくとも約1%、およびさらに少なくとも約20%となるように小分子での処理により増加され得る。一態様において、活性化されたインスリンGFPレポーターを有する細胞の画分は、約20%〜約100%の範囲である。異なる種類の測定によると、複数の小分子での処理は、mRNAインスリン発現アッセイにより決定した場合、初期細胞集団と比較してインスリン発現を、ベースラインレベルよりも実質的に大きいレベルまで増加することができ得る。例えば、Hprt mRNA(qPCRにおける発現レベルについての参照遺伝子として)との比較において、mRNAインスリン発現アッセイは、Hprt mRNAレベルを使用した標準と比較して(島細胞のインスリンレベルは典型的にHprtレベルの約100倍である)少なくとも約1倍およびさらに少なくとも約2倍の範囲にあるmRNAインスリン発現レベルを提供し得るので、細胞はインスリン発現細胞に成功裡に変換されていることが示される。本明細書の図31に示されるように、qPCRにおいて幹細胞試料について任意の対照Ct値を設定した場合(インスリンmRNAが幹細胞試料において設定したCt値以上で検出可能でない場合)、幹細胞における発現と比較して、2X107倍のインスリン発現の増加が達成され得る。さらに、mRNAインスリン発現アッセイにより測定した場合のインスリンmRNA発現レベルは、島細胞におけるインスリンmRNAレベルと比較すると、少なくとも約0.01%、例えば少なくとも約0.1%、さらに少なくとも約1%、少なくとも約10%まで、さらに島と比較すると100%または200%のインスリンmRNA活性を提供すると考えられる。一態様によると、細胞集団を複数の小分子による処理に供することは生じる細胞集団を提供し得、ここで得られる細胞の少なくとも約1%がインスリン産生細胞であり、得られた細胞集団中のインスリン産生細胞の数が全細胞集団の約1%〜約20%の範囲になりさえし得る。
【００８８】
複数の小分子でのEECの集団の処理はまた、例えばL細胞、K細胞、I細胞、G細胞、EC細胞、N細胞およびS細胞を含むサブセット集団を生成するように実施され得る。
【００８９】
小分子により処理される哺乳動物細胞の集団は、インビトロ集団、例えば細胞培養培地に分散される細胞の集団であり得る。細胞のインビトロ集団はまた、器官または器官の一部に類似する細胞クラスターまたは凝集物であり、かつその特定の器官に関連する細胞型を有する類器官の形態であり得る(Sato, 2009)。代替的に、小分子により処理される哺乳動物細胞の集団は、インビボ集団、例えば疾患状態を治療するためのヒトまたは他の哺乳動物のインビボ処理であり得る。別の代替において、小分子により処理される哺乳動物細胞の集団は、エキソビボ集団、例えばヒトまたは他の哺乳動物(例えば、治療の必要があるヒトまたは他の哺乳動物)から得られる(例えば、単離される、由来する)細胞の集団であり得る。出生後幹細胞などの出生後細胞からのEECの分化のための一態様について提唱される機構を図34に提供する。なんら特定の理論に制限されることなく、現在では、WntおよびNotch経路ならびに任意に他の経路を制御することにより、EECは、幹細胞から特異化され得ると考えられる。特に、示されるような機構において、Notch経路を阻害しながらWnt経路を活性化し、次いでNotchおよびWntの経路の両方を阻害してEECを形成することが提供される。他の機構および/または経路はまた、下記のように、EECに向かう経路(杯細胞、腸細胞、パーネト細胞等とはまた食異なる)に沿った分化をさらに特異化するために活性化および/または阻害され得、他の機構および/または経路はまた、特定の型のEECおよび/またはEEC機能をさらに特異化するために使用され得る。例えば、図34はWnt阻害を示すが、いくつかの態様においては、Wnt阻害剤の添加を必要とせずにEECへの分化を提供することが可能であり得る。また、図34は、EECを得るための2段階の方法を示すが、特定態様はまた、処理のただ1つの段階、またはさらにEECを達成するための処理の3以上の段階を提供し得る。特異化され得る特定の型のEECとしては、特に、GLP-1、5HT、SST、ガストリン、CCK、SCT、NTS、PYYおよびグレリンを発現する細胞が挙げられ得る。
【００９０】
本明細書に記載のような哺乳動物細胞のインスリン産生を増加させる方法の態様において、哺乳動物細胞の処理は、出生後幹細胞からEECなどの、図34に示されるものと同様の経路に沿った分化を生じ得、ここで得られた細胞は、増加されたインスリン産生を提供する細胞であり、および/または該処理は、EEC自体に対して実施されこれらの細胞を増加したインスリン産生を有する細胞に変換し得る。すなわち、細胞のインスリン産生を増加させるための処理は、出生後幹細胞のEECへの分化と同時、該分化の前または後に実施され得るか、または幹細胞とEECの間の分化段階において細胞に対して、出生後幹細胞またはEEC自体に対して同様に実施され得る。したがって、インスリン産生を増加させるための処理は、出生後幹細胞(例えば、Lgr5+細胞)、前駆細胞および分化した腸内分泌細胞の少なくとも1つを含む哺乳動物細胞集団に対して実施され得る。
【００９１】
図34はまた、EEC、腸細胞、杯細胞、パーネト細胞および幹細胞などの異なる型の腸細胞ならびに腸の陰窩に見られるようなかかる細胞の一般的な構成を示す。この図は、上述のように、腸内分泌(EEC)細胞は典型的に、かかる陰窩に局在し、全細胞の少ない割合(<1%)でそこに存在するのみであることを示すので、細胞のEEC集団を得るためのインビトロ方法の非存在下では疾患治療のための機構を試験することが困難であった。
【００９２】
上述のように、一態様において、出生後細胞集団(例えば出生後幹細胞集団)を処理してEECへの分化を達成するためおよび/または細胞集団を処理してそのインスリン発現を増加させるために提供される複数の小分子としては、Wnt経路を活性化および/または阻害するように作用する小分子が挙げられる。Wntシグナル伝達経路は、Wntタンパク質リガンドのFrizzledファミリー受容体への結合により活性化されるシグナルの伝達経路(signal transduction pathway)である。処理の一部として提供され得るWnt活性化剤としては、例えばCHIR99021、LY2090314、NP031112 (チデグルシブ)、リチウム、A1070722、SKL2001およびWntシグナル伝達経路を活性化し得る他の薬剤の少なくとも1つなどのR-Spondin 1、Wnt3a、Gsk阻害剤の少なくとも1つが挙げられ得る。一態様において、複数の小分子の一部として提供されるWnt活性化剤は、R-Spondinファミリーに属するタンパク質であるR-Spondin 1であり得る。処理の一部として提供され得るWnt阻害剤としては、例えば、Wnt-C59、Dkkファミリータンパク質(例えばDkk-1、Dkk2、Dkk3およびDkk4の少なくとも1つ)、sFRP(例えばsFRP-1およびsFRP-2の少なくとも1つ)、OMP-18R5などのWnt受容体に対する抗体、LGK974、CWP232291、PRI-724、IQR-1、IWP2、IWP-L6、ICG-001、WIKI4、Ky02111、FH535、XAV939、NSC668036、FJ9、3289-8625などの他の小分子Wnt阻害剤、および他のものの少なくとも1つが挙げられ得る(Kahn, 2014)。一態様において、処理のための複数の小分子の一部として提供されるWnt阻害剤はWnt-C59であり得、以下の化学構造：
【化３】
2019506153.tif 000004
を有する。Wnt活性化剤および/またはWnt阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。
【００９３】
Wnt活性化剤として適切であり得るWntアゴニストのさらなる例は以下の表に見られ得る。
【００９４】
【表１−１】
2019506153.tif 000005
【表１−２】
2019506153.tif 000006
【００９５】
一態様において、出生後細胞集団を処理してEECへの分化を達成するため、および/または細胞集団を処理してそのインスリン発現を増加させるために提供される複数の小分子としては、Notch経路を阻害するように作用する小分子が挙げられる。処理の一部として提供され得るNotch阻害剤としては、例えば、DAPT；LY411575；MDL-28170；RO4929097；L-685458 ((5S)-(t-ブトキシカルボニルアミノ)-6-フェニル-(4R)ヒドロキシ-(2R)ベンジルヘキサノイル)-L-leu-L-phe-アミド)；BMS-708163(アバガセスタット(Avagacestat))；BMS-299897 (2-[(1R)-1-[[(4-クロロフェニル)スルホニル](2,5-ジフルオロフェニル)アミノ]エチル-5-フルオロベンゼンブタン酸)；M -0752；YO-01027; MDL28170 (Sigma)；LY41 1575 (N-2((2S)-2-(3,5-ジフルオロフェニル)-2-ヒドロキシエタノイル)-N1-((7S)-5-メチル-6-オキソ-6,7-ジヒドロ-5H-ジベンゾ[b,d]アゼピン-7-イル)-1-アラニンアミド)；ELN-46719 (LY41 1575の2-ヒドロキシ-吉草酸アミドアナログ；PF-03084014 ((S)-2-((S)-5,7-ジフルオロ-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン-3-イルアミノ)-N-(1-(2-メチル-1-(ネオペンチルアミノ)プロパン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)；コンパウンドE (Compound E) ((2S)-2-[[(3,5-ジフルオロ(Difluro)フェニル)アセチル]アミノ]-N-[(3S)-1-メチル-2-オキソ-5-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-1,4-ベンゾジアゼピン-3-イル]プロパンアミド; およびセマガセスタット(Semagacestat)(LY450139；(2S)-2-ヒドロキシ-3-メチル-N-((1S)-1-メチル-2-[[(1S)-3-メチル-2-オキソ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1H-3-ベンゾアゼピン-1-イル]アミノ]-2-オキソエチル)ブタンアミド)の少なくとも1つが挙げられ得る。一態様において、複数の小分子の一部として提供され得るNotch阻害剤は、N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステルとしても知られるDAPTであり得る。Notch阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。
【００９６】
処理のために提供される複数の小分子としてはまた、MEK/ERK経路を阻害するように作用する小分子が挙げられ得る。該小分子としては、コアRas-Raf-MEK-ERKシグナル伝達カスケードの阻害剤、ならびにこのコアのシグナル伝達カスケードの上流または下流のタンパク質の阻害剤、例えばEGF受容体(EGFR)阻害剤が挙げられ得る。処理のために提供されるMEK/ERK阻害剤としては、例えば、PD0325901、AZD8330 (ARRY-424704)、レファメチニブ(Refametinib)(BAY 86-9766、RDEA119)、コビメチニブ(GDC-0973、XL-518、RG7421)、E6201、MEK162 (ARRY-438162)、ピマセルチブ(Pimasertib)(AS703026、MSC1936369B)、RO4987655 (CH4987655)、RO5126766 (CH5126766)、セルメチニブ(AZD6244、ARRY-142,886)、TAK-733、トラメチニブ(GSK1120212)、およびGDC-0623、WX-554の少なくとも1つが挙げられ得(Zhao and Adjei, 2014)、また、および/または代替的には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、アファチニブ、ネラチニブ、AZ5104、アファチニブ、PD 153035、CL-387785、AST-1306、PD 168393、カネルチニブなどのEGFR阻害剤、および他のEGFR阻害剤、ならびにRasおよびRaf阻害剤が挙げられ得る。一態様において、複数の小分子の一部として提供されるMEK/ERK阻害剤は、N-[(2R)-2,3-ジヒドロキシプロポキシル]-3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-ベンズアミドとしても知られるPD0325901であり得る。MEK/ERK阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。
【００９７】
処理のために提供される複数の小分子としてはまた、上皮成長因子(EGF)およびNogginの少なくとも1つなどの種々の成長因子に対応する小分子が挙げられ得る。一態様において、処理のための小分子の一部として提供される成長因子としてはEGFおよび/またはNogginが挙げられる。該成長因子の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。別の態様において、複数の小分子としては、HDAC阻害剤(ヒストンデアセチラーゼ阻害剤)が挙げられ得る。処理のための複数の小分子の一部として提供され得るHDAC阻害剤としては、特に、ツバスタチンA(Tubastatin A)、ACY1215、バルプロ酸、SAHA、トリコスタチンA、SHBA、CBHA、LAQ-824、PDX-101、LBH-589、ITF2357、PCI-24781、コンパウンド7 (ChemieTek)、JNK-24681585(キシノスタット) SB939(プラシノスタット)、4SC-201(レスミノスタット)、テフィノスタット(Tefinostat)(CHR-2845)、CHR-3996、CG200745、デプシペプチド(ロミデプシン)、酪酸塩、MS-275、MGCD0103およびCI994が挙げられ得る。一態様において、処理のために提供されるHDAC阻害剤は、N-ヒドロキシ-4-(2-メチル-1,2,3,4-テトラヒドロ-ピリド[4,3-b]インドール-5-イルメチル)ベンズアミド塩酸塩とも称されるツバスタチンAであり得る。HDAC阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。
【００９８】
HDAC阻害剤のさらなる例は以下の表に見られ得る。
【００９９】
【表２−１】
2019506153.tif 000007
【表２−２】
2019506153.tif 000008
【表２−３】
2019506153.tif 000009
【表２−４】
2019506153.tif 000010
【０１００】
処理のための複数の小分子の一部として提供され得るヒストンメチル化阻害剤(例えば、ヒストンデメチラーゼ(HDM)阻害剤)としては、特に、トラニルシプロミン(Tranylcypromine)、GSK-2879552、GSK-LSD1、SP-2509、GSK J4、2,4-ピリジンジカルボン酸、ML324、IOX 1、OG-L002、CBB1007、GSK J1、GSK J2、およびGSK J5の少なくとも1つが挙げられ得る。一態様において、処理のために提供されるヒストンメチル化阻害剤はトラニルシプロミンであり得る。ある態様において、処理のために提供されるヒストンメチル化阻害剤は、リジン特異的ヒストンデメチラーゼ(LSD1)であり得る。ヒストンメチル化阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。ヒストンメチル化阻害剤の例としては：JmjC-ドメインデメチラーゼ：Jmjd2、Jmjd2C、Jmjd3；リジン特異的デメチラーゼ：トラニルシプロミン(LSD1)、RN 1 (LSD 1)、GSK2879552 (LSD1)、CBB1003 (LSD1)、OG-L002 (LSD1)、CBB1007 (LSD1)、2,4-ピリジンジカルボン酸(LSD)、SP2509 (LSD1)、ORY-1001 (RG-6016)、GSK LSD1 (LSD1)などのLSD1阻害剤；Jmjd：ダミノジッド(Jmjd)、GSK J1 (Jmjd3/UTX)、GSK J4 (Jmjd3)、IOX 1 (Jmjd)、JIB 04 (Jmjd)、NSC 636819 (KDM4A/KDM4B)、TC-E 5002 (KDM2/7)、パルギリン、ML324 (Jmjd2)が挙げられる。
【０１０１】
処理のための複数の小分子の一部として提供され得るTgf-β阻害剤としては、616452 (レプソックス)、LY-364947、SB-505124、A-83-01、SB-431542、TGF-βRIキナーゼ阻害剤VII、SB-525334、TGF-βRIキナーゼ阻害剤IX、GW788388、LY2109761、ガルニセルチブ(LY2157299)、EW-7197、ピルフェニドン、K02288、D 4476、R 268712、A77-01、およびSM16、ならびにTgf-β受容体に対する抗体の少なくとも1つが挙げられ得る。一態様において、処理のために提供されるTgf-β阻害剤は、レプソックスとも称され、化学式2-[3-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-1,5ナフチリジンを有する616452であり得る。ヒストンメチル化阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。
【０１０２】
Tgf-β阻害剤のさらなる例は以下の表に見られ得る。
【０１０３】
【表３−１】
2019506153.tif 000011
【表３−２】
2019506153.tif 000012
【表３−３】
2019506153.tif 000013
【表３−４】
2019506153.tif 000014
【表３−５】
2019506153.tif 000015
【０１０４】
処理のための複数の小分子の一部として提供され得るNeuroD1活性化剤としては、ISX-9および他のイソオキサゾール分子が挙げられ得る(Schneider, 2008)。一態様において、処理のために提供されるNeuroD1活性化剤は、化学式N-シクロプロピル-5-(2-チエニル)-3-イソオキサゾールカルボキサミドを有するISX-9であり得る。Neuro D1活性化剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。
【０１０５】
処理のために提供される複数の小分子としては、1つ以上のモノアミンオキシダーゼ(MAO)阻害剤も挙げられ得る。MAO阻害剤の例としては、特に、メシル酸サフィナミド、メシル酸ラサギリン、トラニルシプロミン、モクロベミド(Ro 111163)、イサチン、8-(3-クロロスチリル)カフェイン、塩酸ビフェメラン、(R)-(-)-デプレニル塩酸塩、ハルマン、塩酸ラザベミド、メシル酸ピルリンドール、RN 1二塩酸塩、およびメシル酸テトリンドールが挙げられる。
【０１０６】
処理のために提供される複数の小分子はまた、1つ以上のBMP受容体(ALK2を含む)阻害剤が挙げられ得る。BMP受容体(ALK2を含む)阻害剤の例としては、DMH-1、DMH2、ドルソモルフィン(Dorspmrphin)、K 02288、LDN 193189およびML 347が挙げられる。
【０１０７】
インスリン発現を増加させるための細胞の処理において、細胞のインスリン発現を増加させることに有効であることが示されている複数の小分子は、DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つを含む複数の小分子である。一態様において、全ての3つの小分子は、細胞集団におけるインスリン産生を増加させるための処理の一部として一緒に提供される。Tgf-β阻害剤およびNeuroD1活性化剤は、上述のもの、および/またはそれらの誘導体および/または薬学的に許容され得るその塩のいずれかであり得、特に616452およびISX-9に対応し得る。616452 (レプソックス)の構造は以下のとおりである：
【化４】
2019506153.tif 000016
【０１０８】
DNAメチル化阻害剤は、特に、5-アザシチジン、5-アザ-2-デオキシシチジン、RG 108、SGI 1027、ナナオマイシンA、ゼブラリン、ロメグアトリブ、SGI-110、およびナナオマイシンの少なくとも1つを含み得る。DNAメチル化阻害剤の例は、それぞれが参照により本明細書に具体的に援用される米国特許第8,207,142号、カナダ国特許第2,454,147号およびWO 2012/087889に記載される。一態様において、DNAメチル化阻害剤は5-アザシチジンを含む。DNAメチル化阻害剤の誘導体および/または薬学的に許容され得る塩も提供され得る。DNAメチル化阻害剤(例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)阻害剤)のさらなる例としては：DNAアナログ5-アザシチジン、ゼブラリン、デシタビン；DNMT阻害剤：カフェー酸プラム(Caffeic acid purum)、クロロゲン酸、(-)-没食子酸エピガロカテキン(EGCG)、ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン、プサムマプリン(Psammaplin)A、RG108、フィセチン、ロメグアトリブ、SGI 1027、5-ヨードツベルシジン、6-チオグアニン、MG98、DC-05、およびDC-517が挙げられる。
【０１０９】
以下の表1は、分子、本明細書記載に他に使用されるそれらの略語、および本明細書に記載されるインビトロ実験に使用される場合のそれぞれの試薬の終濃度の例のリストを表す。
【０１１０】
【表４】
2019506153.tif 000017
【０１１１】
一態様によると、複数の小分子を使用して実施される処理は、いくつかの段階、例えば第1および第2の段階、またはさらにそれより多くの段階で実施され得る。処理に使用される段階の数は、実施される分化および/またはインスリン発現を増加する方法に従って、ならびに使用されている小分子の種類および活性化および/または阻害される経路に関して選択され得る。例えば、出生後幹細胞などの出生後細胞をEECに分化させるための処理の方法において、第1の段階は、出生後細胞集団と、Ngn3を上方制御する1つ以上の第1の小分子を接触させるために実施され得、第2の段階において、出生後細胞集団を、Ngn3を下方制御して細胞中のNgn3発現を減少させる1つ以上の第2の小分子と接触させ得る。本態様による第1および第2の段階は、出生後幹細胞などの出生後細胞のEECの形成に向かう分化を促進させ得る。インスリンを増加させる方法の態様において、第1〜第3の段階は、細胞を処理してインスリンを上方制御し、かつ発現を増加させるために実施され得る。
【０１１２】
一局面によると、出生後幹細胞などの出生後細胞をEECに分化させるための処理は、第1の段階および第2の段階を含み得、第1の段階は、該細胞と、Notch阻害剤およびWnt活性化剤を含む第1の小分子を接触させることを含み、第2の段階は、該細胞と、Notch阻害剤ならびにEGFR阻害剤およびMEK/ERK阻害剤の少なくとも1つを含む第2の小分子を接触させることを含む。例えば、第1の段階は、R-Spondin1およびDAPTを提供し得、第2の段階はDAPTおよびPD0325901を提供し得る。第2の段階はまた、任意に、Wnt-C59などのWnt阻害剤を含み得る。第1および第2の段階はまた、EGFおよび/またはNogginなどの1つ以上の成長因子を含み得る。
【０１１３】
さらに別の局面によると、第1の段階はさらに、該細胞と、ツバスタチンA、トラニルシプロミンおよびISX-9の少なくとも1つなどのHDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つを接触させることを含む。第2の段階はさらに、該細胞と、616452などのTgf-β阻害剤を接触させることおよび/または該細胞と、トラニルシプロミンなどのヒストンメチル化阻害剤を接触させることを含み得る。
【０１１４】
一態様において、細胞集団中のインスリン発現を増加させるための処理は第1、第2および第3の段階を含み得、第1の段階は、該細胞と、Notch阻害剤、Wnt活性化剤およびDNAメチル化阻害剤を含む第1の小分子を接触させることを含み、第2の段階は、該細胞と、Notch阻害剤、任意にWnt阻害剤、Tgf-β阻害剤およびNeuroD1活性化剤を含む第2の小分子を接触させることを含み、第3の段階は、該細胞と、Notch阻害剤、任意にWnt阻害剤、MEK/ERK阻害剤およびTgf-β阻害剤を含む第3の小分子を接触させることを含む。例えば、第1の段階は、R-Spondin1、DAPT、ならびに5-アザシチジンおよび5-アザ-2-デオキシシチジンの少なくとも1つを提供し得るが、第2の段階は、DAPT、Wnt-C59、616452およびISX-9を提供し得、第3の段階は、DAPT、Wnt-C59、6116452、およびPD0325901を提供し得る。第1、第2および/または第3の段階はまた、EGFおよび/またはNogginなどの1つ以上の成長因子を含み得る。
【０１１５】
さらに別の局面によると、第1の段階は、該細胞と、ツバスタチンA、トラニルシプロミンおよびISX-9の少なくとも1つなどのHDAC阻害剤、ヒストンメチル化阻害剤、およびNeuroD1活性化剤の少なくとも1つを接触させることをさらに含む。第2の段階は、該細胞と、トラニルシプロミンなどのヒストンメチル化阻害剤を接触させることをさらに含み得る。
【０１１６】
本明細書に記載されるように、小分子は、出生後幹細胞などの出生後細胞のEECへの分化および/またはインスリンの増加した発現を提供するために、異なる組み合わせ、および処理の異なる段階で提供され得る。処理のための小分子の組合せのいくつかの態様は以下に記載される。
【０１１７】
一局面によると、分化の方法は、出生後幹細胞などの哺乳動物出生後細胞を、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、MEK/ERK阻害剤(例えば、PD0325901)および1つ以上の成長因子(例えば、EGFおよびNoggin)を含む複数の小分子により処理することを含み得る。該処理は、単一の相で実行され得る。
【０１１８】
別の局面によると、分化の方法は、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt活性化剤(例えば、R-Spondin1)、および1つ以上の成長因子(例えば、EGFおよびNoggin)を含む小分子の第1の組を用いる第1の段階、ならびにNotch阻害剤(例えば、DAPT)、MEK/ERK阻害剤(例えば、PD0325901)、および1つ以上の成長因子(例えば、EGFおよびNoggin)を用いる第2の段階を含み得る。
【０１１９】
別の局面によると、分化の方法は、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt活性化剤(例えば、R-Spondin1)、および1つ以上の成長因子(例えば、EGFおよびNoggin)、HDAC阻害剤(例えば、ツバスタチンA)およびヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)を含む小分子の第1の組を用いる第1の段階、ならびにNotch阻害剤(例えば、DAPT)、MEK/ERK阻害剤(例えば、PD0325901)、およびヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)を用いる第2の段階を含み得る。
【０１２０】
別の局面によると、分化の方法は、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt活性化剤(例えば、R-Spondin1)、および1つ以上の成長因子(例えば、EGFおよびNoggin)、HDAC阻害剤(例えば、ツバスタチンA)およびヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)を含む小分子の第1の組を用いる第1の段階、ならびにNotch阻害剤(例えば、DAPT)、MEK/ERK阻害剤(例えば、PD0325901)、ヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)、およびWnt阻害剤(例えば、WNT-C59)を用いる第2の段階を含み得る。
【０１２１】
別の局面によると、分化の方法は、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt活性化剤(例えば、R-Spondin1)、および1つ以上の成長因子(例えば、EGFおよびNoggin)、HDAC阻害剤(例えば、ツバスタチンA)、ヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)、およびNeuroD1活性化剤(例えば、ISX9)を含む小分子の第1の組を用いる第1の段階、ならびにNotch阻害剤(例えば、DAPT)、MEK/ERK阻害剤(例えば、PD0325901)、ヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)、Wnt阻害剤(例えば、WNT-C59)、およびTgf-β阻害剤(例えば、616452)を用いる第2の段階を含み得る。
【０１２２】
一態様において、細胞集団内のインスリンを増加させるための方法は、該細胞と、DNAメチル化阻害剤(例えば、5-アザシチジンおよび/または5-アザ2-デオキシシチジン)、Tgf-β阻害剤(例えば、616452)、およびNeuroD1活性化剤(例えば、ISX-9)を含む小分子を接触させることを含み得る。該細胞集団は、単一の段階で該分子と接触され得るか、または複数の段階で該分子の1つ以上と接触され得る。
【０１２３】
さらに別の局面において、細胞集団においてインスリンを増加させるための方法は、第1の段階において、該細胞と、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt活性化剤(例えば、R-Spondin1)、およびDNAメチル化阻害剤(例えば、5-アザシチジンおよび/または5-アザ2-デオキシシチジン)を接触させること、第2の段階において、該細胞と、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt阻害剤(例えば、Wnt-C59)、Tgf-β阻害剤(例えば、616452)、およびNeuroD1活性化剤(例えば、ISX-9)を接触させること、ならびに第3の段階において、該細胞と、Notch阻害剤(例えば、DAPT)、Wnt阻害剤(例えば、Wnt-C59)、Tgf-β阻害剤(例えば、616452)、およびMEK/ERK阻害剤(例えば、PD0325901)を接触させることを含む3段階プロセスを含む。第1の段階においてEGFおよびNogginなどの成長因子も提供され得、第1および第2の段階においてヒストンメチル化阻害剤(例えば、トラニルシプロミン)が提供され得る。第1の段階においてHDAC阻害剤(例えば、ツバスタチンA)および/またはNeuroD1活性化剤(例えば、ISX-9)も提供され得る。
【０１２４】
出生後幹細胞などの出生後細胞の処理を実施して細胞を腸内分泌細胞に分化させることにより、比較的高いEECの含量を有する細胞集団が得られ得る。一局面によると、出生後幹細胞などの出生後細胞由来の腸内分泌細胞を有する細胞集団は、複数の小分子による処理により提供され得、ここで画分、腸内分泌細胞は、総細胞集団の少なくとも約1%である。別の局面において、細胞集団中の腸内分泌細胞の画分は、全細胞集団の少なくとも約10%、例えば20%〜100%であり得る。細胞集団の細胞はまた、さらなるインビトロまたはインビボ適用における使用のために凍結保存され得る。該細胞集団は未分類であり、これは該細胞集団は細胞の該密度を達成するためにろ過または他に分類されていないことを意味する。一局面によると、分化した細胞は、本明細書に含まれる実施例に示されるように、5-HTおよび/またはGLP-1を発現し得ることがある。
【０１２５】
また、本明細書に記載されるインスリン産生を増加させる方法は、インスリン産生細胞の比較的高い画分、例えば全細胞集団の少なくとも約0.05%およびさらに全細胞集団の少なくとも約1%であるインスリン産生細胞の画分を有する細胞集団を生じ得る。
【０１２６】
本明細書に記載される細胞を処理するための方法は、該処理方法について標的化される細胞集団および複数の小分子と共に、マトリゲルなどの細胞培養培地を提供するキットの使用により実施され得る。該キットはまた、該キットを使用するための指示書、および該処理方法の実行を容易にするための他の用具を含み得る。一態様において、キットは、細胞培養培地、出生後幹細胞などの哺乳動物出生後細胞、およびChgAを上方制御し、かつ該出生後細胞を分化させる複数の小分子を含む。別の態様において、キットは、細胞培養培地、哺乳動物細胞、および細胞中のインスリン産生を増加させる複数の小分子を含む。
【０１２７】
本開示の局面はさらに、本明細書に記載される処理方法を使用する、ヒトなどの哺乳動物における疾患状態の治療に関する。一局面によると、肥満、糖尿病、過敏性腸症候群、感染性腸炎および炎症性腸疾患の少なくとも1つなどの、不十分な内分泌または腸内分泌細胞産物を特徴とする疾患状態が治療される。別の局面において、肥満およびI型糖尿病の少なくとも1つなどの、不十分なインスリン産生を特徴とする疾患状態が治療される。該疾患状態の治療は、上述の小分子および/または小分子組合せのいずれかに対応する複数の小分子を、かかる治療を必要とする哺乳動物に投与することを経由して達成される。ある態様において、複数の小分子における小分子の全てが、かかる治療を必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)に同時に(例えば、単一投与工程で)投与(例えば、送達)される。別の態様において、複数の小分子における小分子は、かかる治療を必要とする哺乳動物(例えば、ヒト)に複数の投与(例えば、多工程プロセスの一部として)において投与(例えば、送達)される。
【０１２８】
いくつかの態様において、複数の分子は、インビボで被験体の上皮に送達され、それによりインサイチュでの細胞分化が誘導される。特定の態様において、該複数は、複数の組織(例えば、胃、小腸、結腸、口腔粘膜)に送達される。
【０１２９】
さらに別の局面によると、薬学的に許容され得る賦形剤と共に複数の小分子を提供することにより、複数の小分子を含む医薬組成物が調製され得る。一態様において、該小分子は、該小分子が(例えば経口的に)投与された場合に、標的領域に到達するまで小分子の分解が阻害されるように、保護製剤を提供し得る医薬組成物の一部として調製され得る。例えば、該製剤は、該複数の小分子が胃を通過して治療が生じ得る腸まで到達し得るような保護コーティングを提供し得る。かかる製剤は、ポロキサマーなどのポリマー材料を含み得、また身体の標的領域での該小分子の放出を提供するために、オイドラギットなどのpH感受性ポリマーを含み得る。該製剤はまた、例えば小分子の放出の開始を調節するように、または標的領域での小分子の放出の持続時間を調節するように、1つ以上の小分子の放出が調節されるようなものであり得る。また、該製剤は、スクラルファートなどの胃または腸を被覆し得る他の化合物を含み得る。医薬組成物は、例えば丸薬、ゲルキャップ、液剤等により経口的に投与され得るが、デバイス(例えば、ステント)を介した、ならびに坐剤、浣腸および/またはパッチによる他の投与方法が含まれ得る。別の態様において、本明細書に記載の方法により得られた細胞集団は、注入、注射におる、移植物上、担体物質中または担体物質上などの細胞療法により投与され得、免疫隔離(例えば、同種異系移植)であり得る物質またはデバイスと組み合わされ得る。
【０１３０】
一態様において、不十分なインスリン産生を特徴とする疾患状態の治療のための医薬組成物は、DNAメチル化阻害剤、Tgf-β阻害剤、およびNeuroD1活性化剤、および/またはそれらの誘導体および/または薬学的に許容され得る塩を、薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含み得る。例えば、該組成物は、616452、ISX-9、ならびに5-アザシチジンおよび5-アザ-2'デオキシシチジンの少なくとも1つ、および/またはそれらの誘導体および/または薬学的に許容され得る塩を、薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含み得る。該組成物製剤は、該製剤が、治療されている哺乳動物における疾患状態の治療に有効である治療有効量の小分子組合せを提供するように、さらに工夫される。
【０１３１】
別の局面において、本発明は、移植を必要とする被験体(例えば、ヒト)への移植のための細胞の集団を調製する方法に関する。この局面の一態様において、該方法は、a) (例えば、被験体由来の組織から)Lgr5+細胞を含む細胞の集団を単離する工程；b) wnt活性化、notch阻害、Tgfβ阻害、および後成的制御(例えば、LSD1阻害および/またはHDAC阻害)、またはそれらの任意の組合せから選択される1つ以上のプロセスを標的化する1つ以上の分子により該細胞を処理する工程；ならびにc) wnt阻害、EGFR阻害、MEK阻害、ERK阻害、後成的制御(例えば、LSD1阻害)、モノアミンオキシダーゼ(MAO)阻害、およびnotch阻害、またはそれらの任意の組合せから選択される1つ以上のプロセスを標的化する1つ以上の分子により細胞を処理する工程を含む。工程b)およびc)のそれぞれについて、該細胞は、種々の時間の間、例えば、約4、8、24、48、96または192時間等あるいはそれら以上該分子で処理され得る。一般的に、工程b)およびc)に使用される分子(1つまたは複数)は、それらのIC50値の約10、25、50、100、500または1000%あるいはそれら以上で使用される。工程b)およびc)において細胞を処理するために複数の分子を使用する場合、該分子は、同時に(例えば、一工程で)または別々に(例えば、連続的に)投与され得る。
【０１３２】
別の態様において、移植のために細胞の集団を調製する方法は、前駆細胞(例えばTA細胞(transit amplifying cell))の集団を、先の段落の工程b)および/またはc)に従って処理する工程を含む。この態様によると、該方法は、工程b)およびc)の両方を含み得るか、または該方法は工程b)なしで工程c)を含み得る。分子をインビボ集団に投与する場合、該方法は、工程b)およびc)の両方、または工程c)なしで工程b)、または工程b)なしで工程c)を含み得る。
【０１３３】
さらなる態様において、移植のために細胞の集団を調製する方法は、d)被験体に処理された細胞の集団を送達する工程をさらに含む。
【０１３４】
いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞集団は、種々の目的(例えば、EECおよびそれらのサブセット集団の効率の増強のため、EECおよびそれらのサブセットの集団の大きさおよび機能をインビボで調節するため、インクレチン発現、例えばGLP-1および/またはGLP-2発現、インスリン発現およびセロトニン発現を調節するため、毒性試験のため)のための化合物のスクリーニングのために使用される。
【実施例】
【０１３５】
実施例
実施例1
マウス
Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2, B6.129マウスおよびインスリン-GFP(Ins-GFP, B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J)マウスをJackson Labsから入手し、陰窩細胞単離には6〜12週齢のマウスを使用した。動物実験の手順は、MITでの動物管理委員会(Committee on Animal Care (CAC))により承認された。
【０１３６】
実施例2
陰窩単離
以前に記載されたように陰窩を単離した(Yin et al., Nature Methods, 2014)。小腸の前半分を採取し、長手方向に開いて冷PBSで洗浄して管腔内容物を除去した。次いで、ハサミで組織を2mm〜4mmの断片に切断して、10mLピペットを使用した上下のピペッティングにより、冷PBSでさらに5〜10回洗浄した。組織断片を、PBS中2mM EDTAと、氷上で30分間インキュベートした。EDTAの除去後、組織断片をPBSで洗浄して陰窩を放出させた。次いで陰窩を回収し、洗浄して細胞培養に使用した。放出された陰窩を回収して70μmセルストレイナーに通した。単離した陰窩をマトリゲルに埋め込み、24ウェルプレート中ウェルの中心で培養(plate)した。
【０１３７】
実施例3
細胞培養
単離された陰窩または単一細胞を前記のように培養した。200〜300個の陰窩を40μlのマトリゲルと混合して、24ウェルプレート中ウェルの中心で培養した。マトリゲルの重合後、成長因子(EGF、Noggin、R-Spondin 1)および小分子(CHIR99021およびVPA)を含む500μlの陰窩培養培地(N2、B27、Glutamax、HEPESおよびN-アセチルシステインを有するAdvanced DMEM/F12)を提供した。細胞分化実験のために、細胞培養培地を、表2に記載の成長因子および小分子を含む培地に変えて、下記の分化プロトコルを続けた。培地は使用した分化条件に応じて1〜2日毎に変えた。
【０１３８】
【表５】
2019506153.tif 000018
【０１３９】
実施例4
免疫染色
分化した細胞コロニーを緩やかにピペッティングして1.5mlタンパク質Lobind Eppendorfチューブに回収した。細胞培養培地を除去して試料をPBSで洗浄した。マトリゲル中で培養した類器官または細胞コロニーを、4% PFAを直接添加して固定し、室温で10〜30分間インキュベートした。次いで、マトリゲルを機械的に破壊して、細胞をBSA被覆Eppendorfチューブに移した。試料をPBSで洗浄して、0.25% Triton X-100で30分間浸透化させ、一次抗体および二次抗体で染色した。使用した抗体を表3に挙げる。共焦点顕微鏡検査(Zeiss LSM 710)または倒立顕微鏡(EVOS; Advanced Microscopy Group)により画像を取得した。
【０１４０】
【表６】
2019506153.tif 000019
【０１４１】
実施例5
RNA抽出およびqPCR
類器官または分化した細胞を採取して、製造業者の指示書に従ってRNeasy Micro Kit (Qiagen)を使用し、RNAを抽出した。市販のプライマーおよびTaqManプローブ(Life Technologies)を使用して、QuantiTect Probe PCRキット(Qiagen)により定量的リアルタイムPCRを行なった。
【０１４２】
実施例6
GLP-1分泌/放出アッセイ
細胞を1.5ml Eppendorfチューブに回収して基本アッセイ培地(10mM HEPES、0.1%脂肪酸非含有BSA を補充したHBSS、グルコースなし、pH7.4)で洗浄した。細胞を基本培地中2時間、300rpmのサーモミキサー中でインキュベートした。次いで細胞を洗浄して、1mg/mlジプロチンA (Sigma-Aldrich)を含む50μlの基本培地中で1時間インキュベートして、上清を回収した。次いで細胞を1mg/mlジプロチンAおよび10mMグルコースを含む50μlの基本培地中で1時間インキュベートして、上清を回収した。24ウェルプレート由来の類器官を1.5mlタンパク質Lobind Eppendorfチューブ(チューブ当たり1ウェル)に回収して、基本培地(10mmol/L HEPES、0.1%脂肪酸非含有BSAを補充したハンクス平衡塩溶液(Life Technologies)、グルコースなし、PH7.4)中で2時間、1分間当たり300回転の、サーモミキサー中でインキュベートした。次いで類器官を洗浄して、1mg/mlジプロチンA (Sigma-Aldrich)を含む100μlの基本溶液中で一時間インキュベートし、上清を回収して類器官をさらに、1mg/mlジプロチンAおよび10mMグルコースを含む100μlの基本溶液中で一時間インキュベートした。次いで細胞および類器官をCelLytic Mバッファ(Sigma-Aldrich)に溶解した。上清中のGLP-1濃度はELISA (Multi-Species GLP-1 total ELISA, Millipore)により決定した。細胞溶解物中のDNA含量は、PicoGreen Kitを使用して定量し、GLP-1含量を標準化するために使用した。
【０１４３】
実施例7
インスリン放出アッセイ
細胞を1.5ml Eppendorfチューブに回収し、0.25% BSAを補充してグルコースを含まないクレブス・リンゲルバッファ(KRB)で洗浄した。次いで細胞を、2mMまたは20mMのいずれかのグルコースを含むKRBと、37℃で1時間インキュベートした。上清を回収し、HTRFインスリンアッセイ(Cisbio)を使用してインスリンを測定した。
【０１４４】
実施例8
Notch阻害剤はISCからの腸内分泌細胞(EEC)分化を増加させる(図1)
腸幹細胞を、類器官を形成するように3Dマトリゲル中で培養し得、ここで幹細胞は自発的に分化してEECを含む全腸上皮細胞型を生成する。図1に示すように、小分子γセクレターゼインヒビター(DAPT)によるNotch阻害により、EEC分化が増加し、約5%〜10%の幹細胞がEECになる。ここで図1は、類器官培養条件(ENR)下またはNotch阻害剤DAPT (ENRD)条件の存在下でのEECマーカーChgAの免疫染色である。DAPIは核染色のために使用した。
【０１４５】
実施例9
EEC分化のためのスクリーニング系(図2)
分化効率をさらに増加させるために、幹細胞増殖および分化系において使用したような成長因子とWnt/Notch調節因子の複数の組合せを試験して、最高の分化効率を有する基本的な組合せを同定した。図2に示すように、EGF、NogginおよびDAPT(END)の組合せであるが、R-spondin1または他のWnt活性化剤/阻害剤を含まない組合せは、高レベルのChgA拡大を誘導した。図2において、成長因子EGF (E)、Noggin (N)、R-spoindin 1 (R)、ならびにWnt活性化剤CHIR99021 (C)、VPAおよびWnt阻害剤 IWP-2 (I)、またはNotch阻害剤DAPT (D)の分化組合せを含む複数の条件下で培養した腸幹細胞についてChgAのmRNA発現を測定した。
【０１４６】
結論において、小分子スクリーニングのための基本条件としてEND条件を使用した。
【０１４７】
実施例10
EEC分化を増加させる小分子に対する96ウェルスクリーニングプラットフォーム(図3)
図3に示すように、小分子ライブラリーをスクリーニングするためのEEC分化の指標としてのChgA発現に対するqPCRと共に96ウェルスクリーニング系をさらに使用し、図3では、Lgr5腸幹細胞を増殖させ、96ウェルプレートに継代した。次いで細胞をEGF、NogginおよびDAPT (END)、ならびに小分子と共に培養した。分化の2〜3日後、細胞を溶解して、qRT-PCRによりChgA発現を測定した。
【０１４８】
実施例11
陽性スクリーニングヒット(図4)
例示的なスクリーニング結果を図4に示すように記録した。EGFR阻害剤 ゲフィチニブおよびMEK/ERK経路阻害剤AS703026はChgA発現を増加させた。
【０１４９】
実施例12
陽性ヒットの検証(図5)
24ウェルプレート培養および分化系を使用して小分子をさらに検証した。EGFR阻害剤(例えば、ゲフィチニブ)またはMEK/ERK阻害剤(例えば、AS703026およびPD0325901)は、ChgA発現の促進において同様の活性を有し、杯細胞マーカー(Muc2)およびパーネト細胞マーカー(Lyz1)の発現は同様には増加せず、図5に示されるようなEECの方向への特異的な誘導が示唆された。図5において、腸幹細胞は、小分子を添加したEND条件下で分化した。杯細胞(Muc2)、腸内分泌細胞(ChgA)およびパーネト細胞(Lyz1)を含む分泌細胞系統のマーカーの発現を測定した。
【０１５０】
ChgAに対する免疫染色によりEEC生成も確認した(図35)。この条件において、NotchおよびEGFR/MEK/ERK阻害およびWnt不活性化(R-Spondin1除去による)の組合せを使用して、ISCのEEC方向への特異化を誘導した。該組合せからEGFおよび/またはNogginをさらに除去することにより、より高レベルのChgA発現が誘導されたが(図36)、より高い細胞アポトーシスレベルがこれらの条件において観察された(図37)。Wnt経路阻害剤IWP 2 (またはI)またはGSK3β阻害剤CHIR99021 (またはC)の添加は、EECへの分化をさらには増加させなかった(図36)。
【０１５１】
実施例13
MAPK/ERKまたはEGFR阻害剤はEEC分化を特異的に増加させる(図6)
腸幹細胞を複数の条件下で培養し、小分子AS703026 (As)、ゲフィチニブ(Ge)およびPD0325901 (Pd)は特異的に、腸内分泌細胞マーカーChgAの発現を増加させた。
【０１５２】
実施例14
小分子(例えば、As、GeおよびPd)はEEC分化の際にNgn3発現を減少させ、R-Spondin1はNgn3発現を促進させる(図7)
分泌細胞分化の際に、Ngn3は、EECの特異化に必須であることが示された。Ngn3陽性分泌前駆細胞がEECに分化するという以前の推測があった(Genes Dev. 2002)。腸幹細胞のインビトロ分化の間のNgn3発現レベルの調査により、驚くべきことに、図7に示すように、R-spondin1の除去によりNgn3発現の強い減少が誘導され、一方でゲフィチニブ(Ge)、AS703026 (As)またはPD0325901 (Pd)の添加によりNgn3発現がさらに減少され、これは、R-Spondin 1の存在下では有意ではないということが明らかになった。図7において、腸幹細胞を複数の条件下で2日間培養してNgn3のmRNAレベルを測定した。
【０１５３】
実施例15
最適化された分化プロトコル(図8)
Wntシグナル伝達(R-Spondin1の供給下)はEECの初期の特異化を助長(encourage)してNgn3発現を促進するが、その後、EECの成熟の間に、Ngn3発現は続いて下方制御される。これはEEC特異化の間のNgn3の一過的な(transit)発現と一致する(Genes Dev. 2002)。したがって、Ngn3発現およびその後のEEC分化の増加を目的とする2工程分化プロトコルを試験した。、図8に示すように、R-Spondin 1およびNotch阻害剤DAPTによる初期(第1)誘導工程を、Ngn3の上方制御を可能にするように追加して、その後Wnt活性化なしで小分子(例えば、Pd)を用いる第2の工程によりEECを最終的に分化させた。図8において、R-spondin1の存在を有する初期工程を、工程1にけるNgn3発現を増加させるために分化プロトコルに追加した。
【０１５４】
実施例16
EEC分化の間の24時間でのNgn3発現(図9)
複数の条件下で24時間後にNgn3発現を測定した。図9に示されるように、R-spondin1およびNotch阻害剤DAPTの存在下でNgn3発現は大きく誘導された。図9においてR-Spondin 1およびNotch阻害剤DAPTの組合せはNgn3発現を増加させた。
【０１５５】
実施例17
分化の間の3日目のEECの重要なマーカーの発現(図10)
図10に示されるように、さらに2日間、培養培地をWntアゴニストまたはR-Spondin 1なしおよびPdありの条件に切り替えることにより、R-spondin1ありまたはPdなしの条件と比較して、Ngn3発現レベルが減少し、ChgA発現が上方制御されることが示された。図10において、2工程分化プロトコルにより、3日目にNgn3発現が減少され、ChgA発現が増加された。さらに図10に示されるように、後期EECマーカーNeuroD1も増加された。
【０１５６】
実施例18
EEC分化の間の重要な遺伝子の時間経過試験(図11、12および13)
EECマーカー発現の時間経過試験により、2工程分化プロトコルは、第1の工程においてNgn3レベルを効率的に増加させ、第2の工程の間にNgn3レベルを減少させChgAレベルを増加させることが示唆された。Ngn3およびChgAと比較して、NeuroD1は中間の変化の傾向を示し、Ngn3後であるが、ChgA前にNeuroD1が発現したことが示唆された。図11に示されるように、該2工程プロトコルは、処理の5日後に、最高のChgA発現を誘導し、図12(2工程プロトコルは分化の5日後にEECマーカーChgA発現を増加させた)および図13(2工程プロトコルは分化の5日後にEECマーカーChgAを染色することによりEEC分化を増加させた)に示されるように、直接Wnt、NotchおよびMEK/ERK不活性化(D.PdまたはD.Pd.C59 条件)よりも少ない細胞アポトーシスを伴って(図38)、ISCからのEEC分化を効率的に誘導した。
【０１５７】
実施例19
さらなる小分子による分化プロトコルのさらなる向上(図14)
EECの分化の促進のための第1の工程の間のNgn3レベルを増加させる努力において、Ngn3発現を増加させる因子を、ENRD条件下でのさらなるスクリーニングにより同定した。80より多くの小分子および成長因子をスクリーニングし、図14に示されるように、ツバスタチンAおよびトラニルシプロミンがNgn3発現を増加させることが見出された。図14において、分化の2日後、トラニルシプロミン(Tranyl)は、Ngn3およびChgAレベルの両方を増加させ、一方でツバスタチンAはNgn3レベルを増加させたが、ChgAレベルを減少させた。しかしながら、トラニルシプロミンもChgA発現を増加させたが、ツバスタチンAはChgA発現を減少させたことに注意(これも図14に示される)。
【０１５８】
実施例20
分化プロトコルの工程1において添加された場合ツバスタチンA (Tu)はEEC分化を増加させる(図15)
ツバスタチンAを工程1において適用したが、トラニルシプロミンは分化の間に両方の工程に適用した。これらの条件下、杯細胞(Muc2)、腸内分泌細胞(ChgA)、パーネト細胞(Lyz1)およびK細胞(Gip)を含む細胞についてマーカーのmRNA発現の図15に示され、杯細胞(Muc2)、腸内分泌細胞(ChgA)、パーネト細胞(Lyz1)、K細胞(Gip)、L細胞(Gcg)およびI細胞(Cck)を含む複数の細胞型のマーカーのmRNA発現の図16に示され、かつ図39A〜39Cに示されるように、両方の化合物は、2工程分化プロトコルの5日後にEECマーカーChgA発現を増加させ、K細胞(Gip)、L細胞(Gcg)およびI細胞(Cck)についてのマーカーの発現も増加された。
【０１５９】
図16においてさらに示されるように、トラニルシプロミンの添加も杯細胞(Muc2)およびパーネト細胞(Lyz1)マーカーの発現を有意に減少させ、EEC分化の特異的な誘導が示唆されることは注意するに値する。
【０１６０】
実施例21
EGFの除去はEECの分化をさらに増加させた(図17)
また、Pd/AsがEGF経路の下流標的の1つであるMEK/ERK経路を標的化するので、分化におけるEGFの効果を試験した。図17および図39Dに示されるように、培地からのEGFの除去により、EECマーカー(すなわちChgA、Gip、GcgおよびCCK)発現がさらに増加された。図17において、腸幹細胞は、5日間の複数の条件において分化して、ChgA、Gip、GcgおよびCckなどの腸内分泌細胞についてのマーカーはqPCRにより測定したが、細胞生存の促進におけるEGFの役割(例えば、PI3K)のためのようであるが、両方の工程においてEGFを除去した場合、分化した細胞コロニーの管腔においてより多くの死細胞が存在する傾向があった。そのため、分化プロセスの第1の工程においてEGFは維持された。工程2におけるNogginの効果は重要ではなかったので、これは組成物から除去した。
【０１６１】
実施例22
向上した分化プロトコル(図18)
腸幹細胞から生成されたEECを特徴づけるために、図18において同定されて示される条件を使用して、該細胞を分化させた。
【０１６２】
実施例23
ISCからの非常に効率的なEEC分化(図19)
EECについてのマーカーに対して免疫蛍光染色を行った。腸類器官培養(ENR条件)において、ごくわずかな細胞だけがEECに分化し、これは、図19の上部パネルに示されるように類器官内のChgA+またはGLP-1+細胞の数で示され、ここで、ISCは、ENRCV条件下で拡大され、示されるような条件においてさらに分化した。腸内分泌細胞(例えば、ChgA)またはEECの複数のサブタイプについてのマーカーに対する免疫染色も行った。核染色についてDAPIを使用した。これらの所見は以前の報告(Diabetes, 2014)と一致した。制御された分化条件下で、細胞のほとんどは5日間の分化プロトコルの後にEECに変化し、EECサブタイプの生成も上昇された(図19参照)。興味深いことに、ほとんどのEECは、セロトニン分泌細胞であるようであり、これは強力な5-HT染色により示される(図19参照)。分化したL細胞からのGLP-1放出をさらに試験した。他のEECサブタイプも、GLP-1、GIPおよびSSTなどのマーカーの陽性染色により同定されるように、より高い頻度で存在した。分化プロトコルは、類器官からのGLP-1分泌を有意に増加させ、10mMのグルコース刺激は、図20に示されるように、GLP-1分泌の5倍の増加を誘導し(ISCから生成される機能的L細胞(GLP-1))、ここで、示される条件で培養した細胞においてGLP-1の分泌を測定し、これらのEECは成熟して機能的であることが示唆された(図40C)。
【０１６３】
EEC分化において、誘導の第1の工程においてWntシグナル伝達活性が必要であるが、EEC特異化の第2の工程においては必要ではない。本明細書に記載される2工程分化プロトコルにおいて、Wnt活性化を伴う第1の工程はNgn3発現を増加させたが、これは、工程2においてさらにWntリガンドを分泌してWnt経路を活性化し得るパーネト細胞分化も誘導した。これは、初期のWnt不活性化工程がそもそもパーネト細胞の生成を妨げた(図39E)END.Pd条件と比較して、より高いレベルのパーネト細胞マーカーLyz1発現と一致する。したがって、工程2において小分子阻害剤(Wnt-C59またはC59)によるWntシグナル伝達の阻害を試験した。C59はパーネト細胞マーカーLyz1発現を効果的に減少させ、C59が工程2においてパーネト細胞分化を防いだことを示唆した。そして、C59はさらにChgA発現を増加させ、より高いレベルのEEC分化を示した(図40A)。工程2におけるC59の12〜24時間遅らせた添加は、工程1におけるより高いレベルのNgn3誘導のために、ChgA発現の可能性をさらに増加させる(図40A)。同様に、Tgf-β阻害剤(レプソックス、Rep)の添加は、ChgA発現を大きく促進させ、杯細胞マーカーMuc2発現を大きく減少させた(図40A, 図41A)。Repはまた、ENR条件における発現レベルに対して120x (Tph1)、300x (Sct)、430x (Cck)、800x (Gip)、15,000xまで(Pyy)の範囲で、成熟EECマーカー(Gcg、Gip、Cck、Tph1、Sst、Sct、Pyy)の発現を大きく増加させた。工程1においてレプソックスを添加することは、両方の工程における添加と同等なレベルのChgAを誘導することに十分であるが、成熟EECマーカーの発現は大きく低減されることが見出され(図41B)、Tgf-β阻害はEEC特異化およびさらなる成熟の両方を誘導することが示唆された。興味深いことに、レプソックスの添加は、コロニーによる管腔からのアポトーシス細胞の排出(図41C)および高純度のEEC細胞コロニーの形成を誘導する。
【０１６４】
最適化された分化を使用して(図40B)、分化プロセスの間の重要な分化遺伝子の発現の変化を試験した(図40C)。幹細胞遺伝子Lgr5は、パーネト細胞分化またはNotch下方制御における増加のためのようであるが、2日目にわずかに上方制御された(Tian et al., 2015)。Sox9発現はISCおよびEEC分化の制御に関与し(Formeister et al., 2009)、部分的にNgn3発現の誘導により、膵臓内分泌細胞分化において重要な役割を果たす。Sox9は最初に上方制御され、次いで2日目から下方制御され始め、Lgr5と同様の発現パターンを示すことが見出された。Sox9発現は、Lgr5と比較して比較的高レベルで維持され、EECにおけるその発現と一致した(Formeister et al., 2009)。活性化されたNotchシグナル伝達の下流遺伝子であるHes1の発現は下方制御された。Math1/Atoh1、Ngn3およびNeuroD1などの複数のNotch標的遺伝子の発現は同様に制御され、これは、初期の上方制御段階およびその後の下方制御段階を含んだ。そして、ChgAの発現は連続的に増加され、徐々に増加されるEEC分化と一致した。興味深いことに、これらの遺伝子がピークレベルに達する(Sox9、Math1、Ngn3、NeuroD1について2日目およびChgAについて5日目)上方制御速度は異なり、Sox9、Math1、Ngn3、NeuroD1およびChgAの順であった(図40D)。このことは、これらの遺伝子の天然の遺伝子制御プロセスを反映するようである。
【０１６５】
本発明者らの培養において生成される異なるEECサブタイプを同定するために免疫蛍光染色を行った。高頻度の複数のEECサブタイプがコロニー内に存在することが見出され(図40E)、これはGIP、GLP1、セロトニン、CCK、SCTおよびSSTについての陽性染色により同定された。興味深いことに、分化したEECコロニーにおいてChgA陽性細胞の2つの集団が見出され、ChgAが高度に発現される集団がセロトニン発現細胞と共局在し、ChgA低集団がGLP-1、GIP、CCK、SSTおよびSCT発現細胞と共局在した(図40E)。
【０１６６】
実施例24
さらなる因子がEEC分化を増加させる(図21)
図21に示されるように、EEC分化をさらに増加させ得るさらなる分子を同定した。図21において、Wnt-C59およびISX-9ならびにそれらの組合せを含む小分子は、分化した細胞のChgA発現をさらに増加させた。対照：前記分化条件。
【０１６７】
実施例25
複数の条件下での機能的EECマーカーの発現(図22)
参照遺伝子Hprtに対する相対的な発現を示す図22のように、Tgf-β阻害剤616452は、特にGip、Gcg、Cck、Pyyなどの機能的EECマーカーの発現を大きく増加させることが見出されたが、ISX9はそれらの発現を減少させた。このように、ISCからのEEC分化についての分化プロトコルを示す図23のように、後の段階で616452を含みISX9を除去するように分化プロトコルを調整した。
【０１６８】
実施例26
ChgA陽性EEC細胞のインスリン産生細胞への変換
5-Aza (5)、616452 (6)およびWnt-C59 (C)の組合せは5日目で分化した腸幹細胞においてインスリン-GFP発現を誘導する(図24)
EECおよびインスリン産生ベータ細胞は多くの類似性を共有するので、最近のデータは、さらなる小分子によりEECがインスリン産生細胞に変換され得ることを示す。インスリン-GFPトランスジェニックマウスから単離されたインスリン-GFP細胞を使用して、インスリン産生を誘導し得る小分子を同定した。ISCからのEECの分化の際に、インスリン-GFP陽性細胞は、Tgf-β阻害剤616452の存在下で培養した場合、約1%の細胞がGFP陽性になることが観察された。24ウェルプレートの1ウェル中のGFP+細胞割合およびGFP+細胞数の定量のFACS分析を示す図24のように、Wnt阻害剤Wnt-C59およびDNAメチル化阻害剤5-Aza (5-アザシチジン)のさらなる添加はその後、インスリン-GFP+細胞の割合を増加させた。顕著なことに、56Cの組合せ(5-Aza、616452、Wnt-C59)は、最高数のGFP+細胞を生じる(図24参照)。
【０１６９】
実施例27
インスリン-GFP発現の誘導における5日目の5-Azaの用量応答およびインスリン-GFP発現の誘導における5日目の616452の用量応答(図25)
小分子5-Azaおよび616452も培養中に細胞死を誘導したので、5-Aza(図25参照)および616452(図26参照)の最適濃度を決定した。これにより、今後の実験において0.5〜1μMの5-Azaおよび5μMの616452を使用した。
【０１７０】
実施例28
培養の5日後にISX-9 (I)はインスリン-GFP発現をさらに増加させた(図27)
該組み合わせにおけるISX9 (I)の添加も、GFP+細胞数をさらに増加させることが見出され(図27参照)、図28に示されるように10μMの濃度を使用した。図28において、インスリン-GFP発現の5日目の誘導におけるISX-9についての用量応答データを示す。
【０１７１】
実施例29
複数の条件での培養の5日後における細胞のインスリン-GFP発現のFACS分析(図29)
転換の2つの工程においてWntシグナル伝達も試験した。CHIR99021を添加することによる工程1におけるWnt活性化の増加はGFP発現を増加させなかったが、R-Spondin1およびWnt-C59の組合せは、図29に示されるように、該系におけるGFP+細胞の最高数を生じる。図29において、N：なし、CHIR：CHIR99201、およびC59：Wnt-C59である。
【０１７２】
実施例30
薬物なしまたは有りで処理した細胞の7日目のGFPおよび明視野(図30)
実施例29と同様の条件下、分化の7日後、図30に示されるように20%までの細胞がインスリン-GFPを発現した。図30において、対照は、EEC分化条件で培養した細胞である。(1日目ENR.D.Tu.Tyおよび2日目からD.Pd.Ty.C59)。添加した薬物は5-Aza、616452およびISX9を含み、Pdは2日目に変えて4日目に添加し、スケールバー：200μmである。
【０１７３】
実施例31
プロセスにおける遺伝子発現(図31)
図31に示されるように、細胞は、Pdx1、Ngn3、Mafa、NeuroD1、Nkx6.1およびNkx2.2などのインスリン発現に重要である主要な転写因子の発現を示し、インスリンmRNA発現を大きく増加させた。図31において、対照条件は、ENR.D.Tu.Ty.5Aza.616452.ISX9であり、2日目から5Azaを除去し、薬物処理について細胞は最初にENR.D.Tu.Ty.5Aza.616452.ISX9で培養し、2日目にD.Ty.616452.ISX9.C59条件に変更し、4日目にPd0325901を添加し、0日目に全ての細胞をENR.CV条件下で培養した。
【０１７４】
実施例32
低(2mM)および高(20mM)濃度のグルコースによる細胞の処理により異なるレベルのインスリン放出が誘導される(図32)
分化した細胞からのインスリンの放出を試験した。図32に示されるように、グルコースによる細胞の処理により、用量依存的なインスリン放出が誘導され、これらの細胞は機能的かつグルコースに応答性であることが示唆された。
【０１７５】
実施例33
分化プロトコルのフロー図(図33)
青色および緑色の因子は重要な因子を表す。橙色は補助的な因子を示す。図33に示されるように、分化の際の重要な事象およびそれぞれの段階の重要なマーカーも列挙する。
【０１７６】
実施例34
WntおよびNotch経路により制御されるインビボEEC分化のモデル(図34)
Notch経路の活性は、トランス活性化またはシス阻害により調節される。Notch経路は隣接する細胞(すなわち、パーネト細胞、EECおよび杯細胞などの分泌細胞、または分泌細胞前駆体)上のNotch受容体とNotchリガンド(DLL)の結合により活性化される。これらの細胞との接触を失うことにより、Notch不活性化がもたらされ、これはシス阻害によりさらに増強される。Wnt経路は、粘膜固有層中の細胞または陰窩の基部に位置するパーネト細胞由来のWntリガンド勾配により活性化される。陰窩を基部に残すことにより、Wnt不活性化がもたらされる。Notch不活性化もWntシグナル伝達経路の抑制解除をもたらし、一方でWnt経路の減弱化はNotch阻害と関連する表現型を救出する。(Tian et al., Cell Reports, 2015)。EEC分化について、Notch不活性化はAtoh1発現を誘導し、さらにWnt経路が(適度に)活性化される場合にNgn3上方制御を誘導した(すなわち、WntがNotch不活性化の前に非活性化される場合、Ngn3ではなくAtoh1が誘導され、杯細胞分化がもたらされる)。Wnt不活性化の際にNgn3陽性細胞はさらにEECに分化する。そして、Notch不活性化の際の連続的に(強力な)Wnt活性化によりパーネト細胞の運命がもたらされる。図34に示されるように、5-Aza、Tgf-b阻害剤、ISX-9または他の薬物などの小分子薬物は、幹細胞、前駆細胞または分化した腸内分泌細胞を含む複数の細胞型に対して作用し得、これらの細胞におけるインスリン発現を誘導し得る。
【０１７７】
実施例35
高効率腸内分泌細胞分化の一時的に組み合わされた化学制御。
上述の試験において、EECの特異化において重要な役割を果たすいくつかのシグナル伝達経路を同定した。Notch経路は、吸収性または分泌性の分化を決定することが示されており、その不活性化は、杯細胞、パーネト細胞、刷子細胞(tufts cell)および腸内分泌細胞を含む分泌細胞の特異化に必要である。分化の道筋をさらに下ると、Wnt経路は杯細胞およびパーネト細胞の運命決定において重要な役割を果たし、その活性化はパーネト細胞の運命を誘導し、その不活性化は杯細胞の運命を誘導する。EEC分化におけるWntの役割はあまり明らかにはなっていない。本明細書に記載されるように、Wnt活性化はEECの特異化のためのNgn3発現に重要であり、その後のWnt不活性化はEECのさらなる分化および複数のEECサブタイプの成熟を補助する(図34)。
【０１７８】
インビボにおける腸幹細胞の分化は動的なプロセスであり、ここで細胞は、分化の間に上方へと移動する(パーネト細胞を除く)。陰窩-絨毛軸に沿ったシグナル伝達勾配は、分化/移動プロセスの間の幹細胞および前駆細胞を分化させるための運命決定に影響を及ぼす。幹細胞/前駆細胞の特異化は陰窩基部上で開始され、ここで細胞膜に結合した(パーネト細胞による分泌される)Wntリガンドは、細胞分裂により希釈され、R-Spondin/Lgrシグナル伝達モジュールは、幹細胞がニッチ細胞-パーネト細胞と接触したままである場合、Wnt活性化を長くする(Farin et al, 2016, Nature)。この機構は、Notch不活性化の際のNgn3発現の誘導を可能にする。そのため、Wnt/Notch不活性化の配列およびレベルは、分泌前駆体の運命決定において役割を果たすようである。そして、分泌前駆細胞の位置は、相応じて細胞による選択を補助する。例えば、低レベルのWnt活性化の存在下でのNotchのより早期の不活性化は、(例えば、+4位置での)Ngn3の誘導のためにEEC運命に有利であり得、Notchシグナル伝達の不活性化前のWntシグナル伝達のより早期の不活性化は、(例えば、+4を超える位置で)低レベルのNgn3誘導のために杯細胞分化を促進し得、一方で強力なWntシグナル伝達の活性化およびNotch不活性化は、(例えば陰窩において)パーネト細胞運命に有利である。そのため、腸幹細胞からのEECおよび他の腸上皮細胞型の分化は、空間的および時間的に正確に制御されるプロセスである。
【０１７９】
WntおよびNotch経路はEECを含む幹細胞の分化において助けとなる役割を果たし、他のシグナル伝達経路も分化プロセスに関与する。本明細書に記載されるように、EGFR/MEK/ERKシグナル伝達カスケードの阻害は、EEC分化のレベルを増加して、Tgf-βの阻害もEEC特異化および成熟を大きく促進した。後成的な制御もHDACおよびヒストン脱メチル化などの分化プロセスに参加する。これらの経路の特異的な組合せは、ISCおよび前駆体の運命を制御する。
【０１８０】
実施例36
胃腸幹細胞のインスリン産生細胞への変換のためのプロトコルに基づいて、具体的に段階1として0〜1日目、段階2として1〜3日目、段階3として3〜5日目がある、3段階プロセスを開発した。段階3後、細胞は、Ins-EGFP発現およびインスリンmRNA発現についてのqPCRにより示されるように有意なレベルのインスリン発現を示す。任意に、細胞は、段階4として1〜2週間さらに培養され得る。それぞれの段階について、小分子(および/または成長因子)の特定の組合せの組を添加した。目的は、新規の小分子(または成長因子)をスクリーニングおよび試験することにより、それぞれの段階についてのインスリン発現、具体的にはインスリンmRNA発現を増加するためのリプログラミングプロトコルを最適化することであった。
【０１８１】
レプソックス(616452)を以前は段階2〜3で添加した。段階1からレプソックス(616452)を添加し始めた場合(すなわち、段階1〜3で添加)、インスリンmRNA (Ins2)は、レプソックスを段階2〜3で添加した場合と比較して増加されたことが見出された。FGF10(段階1で添加)と組み合わせた場合、図42に示されるように、インスリン発現はさらに増加された。
【０１８２】
5Aza (5-アザ-2'-デオキシシチジン)の処理時間を段階1のみから段階1および段階2に延長した場合、インスリンmRNA発現がわずかに増加されたことが見出された(図43)。
【０１８３】
段階2において、Wnt-C59の添加を12時間遅らせた場合、インスリンmRNA発現が増加された。この遅延されたWnt阻害は、細胞におけるNgn3発現のより高いレベルを可能にし得(Ngn3発現はWnt活性を必要とするので)、さらにインスリンmRNA発現を増加させる(図44)。
【０１８４】
L型Ca2+チャンネル活性化剤である別の小分子BayK 8644は、図45に示されるように、段階1で添加された場合にインスリンmRNA発現を増加させた。
【０１８５】
BayK 8644は、2μMで使用された場合に最高の(highested)活性を示した(図46)。
【０１８６】
BayK 8644処理は、段階1〜3で添加された場合に最高の活性を示した(図47)。
【０１８７】
DAPTの最適濃度は5μMであった(図48)。
【０１８８】
Nkx6.1はインスリン発現および島機能のための重要な転写因子である。Nkx6.1発現およびインスリン発現を増加させる能力についてさらなる因子を試験した。
【０１８９】
ヒストンデメチラーゼJMJD阻害剤であるIOX1は、5〜10μMで使用された場合に、インスリンおよびNkx6.1発現を増加させた(図49)。
【０１９０】
インスリンおよびNkx6.1発現の促進における最適濃度を同定するためにレプソックスおよびISX9の効果も試験した。インスリンおよびNkx6.1発現の促進においてレプソックスの最適用量は10〜15μMであり、ISX9の最適用量は10〜20μMであることが見出された(図50〜51)。
【０１９１】
Wnt-C59について、最適用量は5μMであった(図52)。
【０１９２】
また、骨形成因子(BMP)ALK2受容体阻害剤DMH-1は、段階2〜3で添加された場合に、Nkx6.1およびインスリンの発現を増加させることが見出された(図53)。
【０１９３】
また、デキサメタゾンも、段階2〜3で添加された場合に、Nkx6.1およびインスリン発現を増加させた(図54)。
【０１９４】
ビタミンCは、段階2〜3で添加された場合に、有利な効果を有した。
【０１９５】
さらなる小分子(成長因子)の段階3においてインスリン発現を促進する能力をさらに試験した。
【０１９６】
小分子T3(トリヨードサイロニン)を段階3で添加した場合、該分子はインスリンmRNA発現を大きく増加させた。しかし、図55に示されるように、ビタミンC (pVc)はかかる効果を示さなかった。
【０１９７】
同様に、図56に示されるように、N-アセチルシステイン (2mM)を含むさらなる分子も、インスリンmRNA発現を増加させ、T3と組み合わせると、インスリン発現をさらに増加させた。
【０１９８】
図57に示されるように、段階3においてWnt-C59をCHIR99021 (CHIR)に切り替えることにより、インスリンmRNAは大きく増加されることも見出された。CHIRとT3を組み合わせた場合、インスリンmRNAはさらに増加された。
【０１９９】
図58に示されるように、インスリンmRNA発現を増加させるために、Exendin-4 (Ex4)およびオーロラキナーゼ阻害剤II(AKi)を含むさらなる小分子または因子を同定した。ホルスコリン (50〜100μM)は、段階3で添加された場合に細胞生存を向上させることも見出された。
【０２００】
また、T3と入れ替えるために甲状腺ホルモンベータ受容体アゴニストGC-1を使用して、インスリンmRNA発現の促進において同様の効果が示された(図59)。
【０２０１】
これらの同定された因子の組合せを使用することにより、インスリン発現およびインスリン-GFP発現は、腸幹細胞から5日のうちに誘導された。図60に示されるように、該細胞の連続的な培養によりインスリン発現レベルがさらに増加され、島様細胞コロニーがもたらされた。
【０２０２】
島様インスリン発現細胞コロニーの培養を継続することについて、ホルスコリンの添加が細胞生存を増加させることが見出された。図61に示されるように、DAPT、PD0325901、BayK8644、DMH-1を含む因子は大きな影響なく除去され得た。
【０２０３】
EEC分化のためのさらなるデータ。
【０２０４】
本明細書に記載される観察に基づいて、EEC分化のための改変されたフロー図を以下に記載されるように開発した(図61)。
【０２０５】
主な違い：
1. 1日目の代わりに0日目からレプソックス(616452)を添加し始める。
2. ISX-9を任意のものに変更して、EEC-V6.docxに記載されるプロトコルには使用しなかった。
3. レプソックスはEEC-V6.docxに記載されるようにEEC分化を大きく増加させるので、これを必須の因子に変更した。
4. Wnt-C59は0日目から36時間の時点で添加した。
【０２０６】
前述の記載より、本明細書に記載される開示を種々の使用および条件に適合させるために、本明細書に記載される開示に対して変形および改変がなされ得ることが明らかである。方法および材料は、本開示における使用のために本明細書に記載され、当該技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用し得る。材料、方法および例は、例示のみのものであり、限定を意図するものではない。かかる態様も以下の特許請求の範囲の範囲内にある。本明細書中の変数の任意の定義における要素の列挙の記載は、任意の単一要素または列挙される要素の組合せ(または下位の組合せ)としてのかかる変数の定義を含む。本明細書中の態様の記載は、任意の単一の態様または任意の他の態様もしくはそれらの一部との組合せとしてのかかる態様を含む。本明細書において引用される全ての特許、公開された出願および参照文献の教示は、それらの全体において参照により援用される。本発明は、その例示態様に関して具体的に示され記載されているが、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが当業者に理解されよう。
【０２０７】
参照文献および均等物による援用
本明細書に引用される全ての特許、公開された出願および参照文献の教示は、それらの全体において参照により援用される。
【０２０８】
本発明は、その例示態様に関して具体的に示され、記載されているが、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが当業者には理解されよう。
【０２０９】
参照文献
【表７】
2019506153.tif 000020
【表８】
2019506153.tif 000021
【図１】
2019506153.tif 000022
【図２】
2019506153.tif 000023
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019506153.tif 000029
【図９】
2019506153.tif 000030
【図１０】
2019506153.tif 000031
【図１１】
2019506153.tif 000032
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ−Ｄ】
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【図３９Ｅ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【国際調査報告】
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