(57)【要約】  本発明は、改変細胞、改変キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）、細胞を架橋するための多特異性結合剤の新規使用、及び治療方法に関する。本発明はまた、変異を適合させた改変細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞にＣＡＬ免疫細胞（例えば、ＣＡＬ−Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ）を標的化する方法であって、
Ａ．架橋剤を提供することであって、剤が
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片である、架橋剤を提供すること；
Ｂ．キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供することであって、前記免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、前記リガンドが
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第２の抗原を含む細胞外部分；及び
ｉｖ．前記薬剤が前記第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供すること；
Ｃ．ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤を標的細胞と組み合わせることであって、標的細胞が前記第１の標的抗原を含み、第１の標的抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．それによって前記架橋剤が前記第１及び第２の抗原に結合して前記標的細胞に前記免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって前記免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する
組み合わせること、
を含む方法。
【請求項２】
抗原特異的架橋剤への標的化結合のためのキメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞であって、
Ａ．前記薬剤が
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片であり；
Ｂ．前記ＣＡＬ−免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、前記リガンドが
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される前記第２の抗原を含む細胞外部分と、
ｉｖ．前記薬剤が前記第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含み；
Ｃ．前記ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤が標的細胞と組み合わされる場合、前記標的細胞が前記第１の標的抗原を含み、前記第１の標的抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．前記架橋剤が前記第１及び第２の抗原に結合して前記標的細胞に前記免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって前記免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する、
キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞。
【請求項３】
前記第２の抗原が、ＣＤ３細胞外ドメイン配列；必要に応じてヒトＣＤ３細胞外ドメイン配列によって提供される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項４】
前記ＣＤ３細胞外ドメインが、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はＣＤεドメインである、請求項３に記載の方法又は細胞。
【請求項５】
前記第２の標的結合部位が、抗体Ｌ２Ｋ−０７、抗体ＯＫＴ３（商標）、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ及びフォラルマブからなる群から選択される抗体の抗ＣＤ３結合部位の可変ドメインを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項６】
前記第１の抗原結合部位が、ブリナツモマブ又は抗体ＨＤ３７のＣＤ１９結合部位；カツマキソマブのＥｐＣＡＭ結合部位；ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位；リンフォムン（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）のＣＤ２０結合部位；エルツマキソマブのＨｅｒ２結合部位；ＡＭＧ２１１（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１）のＣＥＡ結合部位；パソツキシズマブのＰＳＭＡ結合部位；ソリトマブのＥｐＣＡＭ結合部位；ＲＧ７２２１若しくはＲＧ７７１６のＶＥＧＦ又はアンジオポエチン２結合部位；ＲＧ７５９７のＨｅｒ１又はＨｅｒ３結合部位；ＭＭ１１１のＨｅｒ２又はＨｅｒ３結合部位；ＭＭ１４１のＩＧＦ１Ｒ又はＨｅｒ３結合部位；ＭＧＤ００６のＣＤ１２３結合部位；ＭＧＤ００７のｇｐａ３３結合部位；ＴＦ２のＣＥＡ結合部位；ＡＦＭ１３のＣＤ３０結合部位；ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位；及びＬＹ３１６４５３０のＨｅｒ１又はｃＭｅｔ結合部位からなる群から選択される抗体の可変ドメインを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項７】
前記架橋剤が、ブリナツモマブ又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体である（必要に応じて前記標的細胞が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）Ｂ細胞である）、請求項１〜６のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項８】
前記架橋剤が、ＡＭＧ２１１又はそのＣＤ３／ＣＥＡ結合誘導体（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１；必要に応じて前記標的細胞が、消化管癌細胞である）；パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）又はそのＣＤ３／ＰＭＳＡ結合誘導体（必要に応じて前記標的細胞が、前立腺癌細胞である）；ソリトマブ又はそのＣＤ３／ＥｐＣＡＭ結合誘導体（必要に応じて前記標的細胞が、癌細胞である）；又はＡＦＭ１１又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（及び必要に応じて前記標的細胞が、ＡＬＬ細胞又は非ホジキンリンパ腫細胞である）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項９】
前記第１の抗原が、ヒトＣＤ１９（及び必要に応じて前記標的細胞が、白血病細胞又はリンパ腫細胞である）、ＥｐＣＡＭ（及び必要に応じて前記標的細胞が、肺癌細胞、胃腸癌細胞、腺癌、癌幹細胞である）、ＣＤ２０（及び必要に応じて前記標的細胞が、白血病細胞である）、ＭＣＳＰ（及び必要に応じて前記標的細胞が、メラノーマ細胞である）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、シアリルＴｎ、ＣＤ１３３、ＣＤ３３（及び必要に応じて前記標的細胞が、白血病細胞、例えば、ＡＭＬ細胞である）、ＰＭＳＡ、ＷＴ１、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ−１、ＭＵＣ−１６、ＣＤ３０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ＴＡＧ−７２、ムチン、ＣＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＣＤ６６ｅ、ＥｐｈＡ２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、アンジオポエチン、メソテリン、糖脂質Ｆ７７又はテネイシンである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１０】
前記第１の抗原結合部位が、レオプロ（商標）；アブシキシマブ；リツキサン（商標）；リツキシマブ；ゼナパックス（商標）；ダクリズマブ；シミュレクト（商標）；バシリキシマブ；シナジス（商標）；パリビズマブ；レミケード（商標）；インフリキシマブ；ハーセプチン（商標）；トラスツズマブ；マイロターグ（商標）；ゲムツズマブ；キャンパス（商標）；アレムツズマブ；ゼヴァリン（商標）；イブリツモマブ；ヒュミラ（商標）；アダリムマブ；ゾレア（商標）；オマリズマブ；ベクサール（商標）；トシツモマブ；ラプティバ（商標）；エファリズマブ；エルビタックス（商標）；セツキシマブ；アバスチン（商標）；ベバシズマブ；タイサブリ（商標）；ナタリズマブ；アクテムラ（商標）；トシリズマブ；ベクチビックス（商標）；パニツムマブ；ルセンティス（商標）；ラニビズマブ；ソリリス（商標）；エクリズマブ；シムジア（商標）；セルトリズマブ；シンポニ（商標）；ゴリムマブ、イラリス（商標）；カナキヌマブ；ステララ（商標）；ウステキヌマブ；アーゼラ（商標）；オファツムマブ；プロリア（商標）；デノスマブ；ヌマックス（商標）；モタビズマブ；ＡＢＴｈｒａｘ（商標）；ラキシバクマブ；ベンリスタ（商標）；ベリムマブ；ヤーボイ（商標）；イピリムマブ；アドセトリス（商標）；ブレンツキシマブ；ベドチン（商標）；パージェタ（商標）；ペルツズマブ；カドサイラ（商標）；アドトラスツズマブ；ガジバ（Ｇａｚｙｖａ）（商標）及びオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の可変ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項１１】
前記架橋剤と組み合わされる、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記架橋剤が、ＩｇＧのヒト血清半減期より短い、必要に応じて１５日以下のヒト血清半減期を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１３】
前記第１及び第２の抗原結合部位のそれぞれが、ｓｃＦｖ、ナノボディ（商標）、ｄＡｂ、デュオカリン、ＤＡＲｐｉｎ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アドネクチン及びフィノマーからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１４】
前記架橋剤が、ＢｉＴＥ（商標）抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、三重特異性ｓｃＦｖ、ｔａｎｄａｂ（商標）、ｄＡｂナノボディ（例えば、ダイマー又はトリマー）、ｄＡｂ多量体（例えば、ダイマー又はトリマー）、ダイアボディ、テトラボディ又はＤＡＲＴ（商標）であるか又はそれらを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１５】
前記第１の抗原に対する前記第１の結合部位の結合親和性（ＫＤ）が、前記第２の抗原に対する前記第２の結合部位の親和性より少なくとも５倍低い、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１６】
前記第１の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１０ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有し；かつ前記第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定される５０ｎＭ以上の前記第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有し；必要に応じて前記第１の結合部位が、ＳＰＲによって決定される２ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有しかつ前記第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定される６０ｎＭ以上の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１７】
前記標的細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１８】
前記架橋剤が、第３の抗原結合部位を含み、必要に応じて前記第３の抗原が、前記第１の抗原と異なる、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項１９】
前記第３の抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、前記標的細胞に含まれる細胞表面ＴＡＡである、請求項１８に記載の方法又は細胞。
【請求項２０】
前記第１及び／又は第３の抗原が、正常細胞上よりも癌細胞上でより一般的に存在する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項２１】
前記標的細胞が、血液細胞であり；必要に応じて前記標的細胞が、Ｂ細胞又はＴ細胞である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項２２】
前記第１の抗原が、自己免疫疾患の標的であり、かつ前記シグナル伝達が、前記免疫細胞の細胞傷害活性又は増殖を下方制御する、請求項１〜５及び１０〜１８のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項２３】
前記第２の抗原が、免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞又はＮＫ細胞）の細胞外抗原である、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項２４】
前記第２の抗原が、タンパク質抗原であり、かつ前記免疫細胞が、ＣＡＬに含まれる前記第２の抗原のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列（例えば、ＣＤ３細胞外ドメイン配列）を発現する内因性配列である第１のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項２５】
前記細胞外部分が、非自己エピトープを含まない、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項２６】
ａ．前記ＣＡＬの第２の抗原が前記抗原のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；
ｂ．前記細胞のゲノムがＳＮＰ１を含みかつ前記第２の抗原のアミノ酸配列と同一でありＲ１を含むアミノ酸配列をコードする；又は前記第２の抗原のアミノ酸配列の天然に存在する変異体でありＲ１を含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み；かつ
ｃ．Ｓ２が前記細胞の内因性ゲノム配列でありかつＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
請求項１〜２５のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項２７】
ヒトにおいて疾患若しくは病態を治療する又は予防する方法での使用のための請求項２〜２６のいずれか一項に記載の細胞であって、前記方法が、前記ヒトに前記架橋剤及び前記薬剤を投与することを含み、
ａ．前記ＣＡＬの第２の抗原が前記抗原のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；かつ
ｂ．前記ＣＡＬ細胞が、自己移植片又は同種移植片に含まれ、前記方法が、工程（ｃ）においてヒトに前記移植片を投与することを含み、前記ＣＡＬ細胞及び標的細胞が、組み合わされ、前記ヒトのゲノムが、前記投与前に前記ＳＮＰ１を含む、
細胞。
【請求項２８】
前記ＣＡＬの第２の抗原が、
（ｉ）ＣＤ３γ細胞外ドメインでありかつＲ１がＩ５３、Ｎ５３及びＴ５３（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される；
（ｉｉ）ＣＤ３δ細胞外ドメインでありかつＲ１がＮ３８及びＫ３８（位置番号は配列番号３の位置に対応する）からなる群から選択される；又は
（ｉｉｉ）ＣＤ３ε細胞外ドメインでありかつＲ１がＡ１０８、Ｅ１０８及びＶ１０８（位置番号は配列番号５の位置に対応する）からなる群から選択される、
請求項２６又は２７に記載の方法又は細胞。
【請求項２９】
ヒト患者において疾患若しくは病態を治療する又は予防する方法での使用のための請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の細胞であって、前記ＣＡＬ細胞が、自己又は同種移植片に含まれ、前記方法が、ヒトに前記移植片及び架橋剤を投与することを含み、前記ＣＡＬ細胞、架橋剤及び標的細胞が、組み合わされかつ前記疾患若しくは病態が治療又は予防され、前記ヒトが、前記移植片が投与される前に前記ＳＮＰ１を含む、細胞。
【請求項３０】
前記細胞が、ヒトにおいて疾患若しくは病態を治療する又は予防する方法での使用のためであり、前記方法が、前記ヒトに自己移植片及び架橋剤を投与することを含み、前記ＣＡＬ細胞が、前記移植片に含まれ；前記ＣＡＬ細胞、架橋剤及び標的細胞が、組み合わされかつ前記疾患若しくは病態が治療又は予防され；かつ前記ＣＡＬ細胞が、前記ヒト由来の祖先細胞の改変子孫である、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
ａ．前記第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）が前記シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含むヌクレオチド配列（Ｓ３）によって細胞中でコードされ；
ｂ．前記細胞のゲノムがＳＮＰ２を含みかつシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードするヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ２が、（ｉ）ＳＤ１と同一でありＲ２を含む又は（ｉｉ）ＳＤ１の天然に存在する変異体でありＲ２を含み；かつ
ｃ．Ｓ４が前記細胞の内因性ゲノム配列でありかつＳＮＰ２が非同義ＳＮＰである、
請求項１〜３０のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項３２】
ＳＤ１及びＳＤ２のそれぞれが、Ｒ２を含む免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項３１に記載の方法又は細胞。
【請求項３３】
前記シグナル伝達ドメインのＩＴＡＭが、同一である、請求項３２に記載の方法又は細胞。
【請求項３４】
前記細胞内部分が、ヌクレオチド配列（Ｓ５）によって細胞中でコードされるさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＤ３）を含み、Ｓ５が、ＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ３）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ３）を含み；前記細胞のゲノムが、シグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードするヌクレオチド配列（Ｓ６）を含み、ＳＤ４が、（ｉ）ＳＤ３と同一でありＲ３を含む；又は（ｉｉ）ＳＤ３の天然に存在する変異体でありＲ３を含み；かつＳ６が、前記細胞の内因性ゲノム配列であり、かつＳＮＰ３が、非同義ＳＮＰである、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項３５】
前記受容体のＳＤ１及びＳＤ３が、異なる、請求項３４に記載の方法又は細胞。
【請求項３６】
ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれが、Ｒ３を含むＩＴＡＭを含む、請求項３４又は３５に記載の方法又は細胞。
【請求項３７】
ＳＤ３及びＳＤ４のＩＴＡＭが、同一である、請求項３６に記載の方法又は細胞。
【請求項３８】
ＳＤ３及びＳＤ４が、同一である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項３９】
ＳＤ３のそれぞれが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項４０】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインである、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項４１】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、かつ（ａ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存される配列番号１０；（ｂ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存される配列番号１１；及び（ｃ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存される配列番号１２から選択される１、２又は３個のアミノ酸モチーフを含む、請求項４０に記載の方法又は細胞。
【請求項４２】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、モチーフ（ａ）を含み、かつ前記モチーフが、Ａ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７及びＫ８８（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１０と異なる、請求項４１に記載の方法又は細胞。
【請求項４３】
前記変更が、Ａ６１Ｖ、Ａ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｐ６２Ａ、Ａ６３Ｐ、Ｑ６６Ｈ、Ｇ６７Ｓ、Ｎ６９Ｔ、Ｑ７０Ｙ、Ｑ７０Ｌ、Ｑ７０Ｐ、Ｑ７０Ｗ、Ｎ７３Ｙ、Ｒ７９Ｌ、Ｒ７９Ｇ、Ｅ８２Ｋ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｙ、Ｖ８５Ｉ、Ｄ８７Ｇ及びＫ８８Ｒ（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法又は細胞。
【請求項４４】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、モチーフ（ｂ）を含み、かつ前記モチーフが、Ｐ１００、Ｑ１０１、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０８、Ｌ１１０、Ａ１２０、Ａ１２２及びＭ１２８（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１１と異なる、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項４５】
前記変更が、Ｐ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｌ、Ｑ１０１Ｐ、Ｒ１０３Ｋ、Ｋ１０４Ｅ、Ｎ１０５Ｋ、Ｐ１０６Ｒ、Ｅ１０８Ａ、Ｌ１１０Ｑ、Ａ１２０Ｖ、Ａ１２２Ｖ及びＭ１２８Ｔ（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法又は細胞。
【請求項４６】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、モチーフ（ｃ）を含み、かつ前記モチーフが、Ｅ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３６、Ｇ１３７、Ｇ１４０、Ｌ１４５、Ａ１４８、Ｔ１５２、Ａ１５５、Ｌ１５６（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１２と異なる、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項４７】
前記変更が、Ｅ１３１Ｋ、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３３Ｗ、Ｋ１３６Ｎ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１４０Ｄ、Ｌ１４５Ｆ、Ａ１４８Ｄ、Ｔ１５２Ｉ、Ａ１５５Ｔ、Ｌ１５６Ｐ（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法又は細胞。
【請求項４８】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、かつＳ５８、Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３（配列番号７の位置に従って番号付ける位置）からなる群から選択される１個、それより多い又は全てのアミノ酸残基を含む、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項４９】
前記第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、かつｒｓ３６８６５１００１、ｒｓ３７２６５１０４８、ｒｓ７６７１１２６８６、ｒｓ７６５８７７５８０、ｒｓ７５１１４５９５６、ｒｓ７７２８６７１４４、ｒｓ５５８９３５０６、ｒｓ７６１７１０５１０、ｒｓ７７６６０１５４７、ｒｓ７６８６０７３７６、ｒｓ１９３９２２７４１、ｒｓ１９３９２２７４０、ｒｓ１９３９２２７３９、ｒｓ７８０１８８１２６、ｒｓ７７２１２８１７４、ｒｓ７５７９７８２２３、ｒｓ７７９３９７５６２、ｒｓ７４９９２６６５３、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ７５３５７２８６７、ｒｓ３７１７０９７９８、ｒｓ１４５４０７２６７、ｒｓ１４３１８０７２９、ｒｓ１４８５１３４１３、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ７７０３２０２５５、ｒｓ１３９９２６３０１、ｒｓ５６２９７６３６、ｒｓ７６０８９５７５５、ｒｓ１１２８９０５４１、ｒｓ３７０９１０３４０、ｒｓ１４５５０５９０９、ｒｓ７５４９３５００６、ｒｓ７５１５８３９７１、ｒｓ７６６５４１４８１、ｒｓ７６３０７４９６７、ｒｓ７４５８７１２１２、ｒｓ３７２６６５４６１、ｒｓ７６４１８５４９１、ｒｓ７５６３４００３９、ｒｓ７７３５７２４９１、ｒｓ２０１５９４８１５、ｒｓ７８１５１０５１９、ｒｓ１４７５２７５６１、ｒｓ７５１９８１６７７、ｒｓ７６３５３２９３９、ｒｓ７５３２７８２４４、ｒｓ７７１８７３９４９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ７６２７７３７７５、ｒｓ７４８１５８２２０、ｒｓ７７６７０３６８０、ｒｓ５６１２６２９８２、ｒｓ７５８８４６００９、ｒｓ７４６２６２１８３、ｒｓ３７６０４６４４６、ｒｓ２０１９３７４０５及びｒｓ７５２１９８７９５からなる群から選択されるＳＮＰによりコードされる残基を含み；かつ前記免疫細胞のゲノムが、前記選択されたＳＮＰを含む内因性ヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項５０】
前記第１又は第３のシグナル伝達ドメインが、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項５１】
前記ＣＤ２８ドメインが、前記グループの全ての残基を含む、請求項５０に記載の方法又は細胞。
【請求項５２】
前記ＣＤ２８ドメインが、アミノ酸残基Ｙ１９１及びＹ２０９（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）を含む、請求項５０若しくは５１に記載の方法又は細胞。
【請求項５３】
前記ＣＤ２８ドメインが、ＹＭＮＭモチーフ（配列番号１３のＹ１９１−Ｍ１９２−Ｎ１９３−Ｍ１９４に対応する）及び／又はＰＹＡＰモチーフ（配列番号１３のＰ２０８−Ｙ２０９−Ａ２１０−Ｐ２１１に対応する）を含む、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項５４】
前記ＣＡＬ−免疫細胞が、ＣＡＬ−Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、プレＲＥＰ  ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ又はＴＥＭである、請求項１〜５３のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項５５】
前記ＣＡＬ免疫細胞が、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス感染又は癌に罹患しているヒトの細胞の子孫であり、例えば、前記ヒトが、リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）又は非ホジキンリンパ腫に罹患している、請求項１〜５４のいずれかに記載の方法又は細胞。
【請求項５６】
工程（ｃ）が、前記混合細胞を前記架橋剤と組み合わせる前に細胞を共に混合することを含む、請求項１〜１０、１２〜２６、２８及び３１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的細胞及び前記薬剤を前記免疫細胞と組み合わせる前に前記標的細胞及び架橋剤を共に混合することを含む、請求項１〜１０、１２〜２６、２８及び３１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
薬剤の量が、工程（ｃ）後に減少される、請求項１〜１０、１２〜２６、２８及び３１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＡＬ細胞が、リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ又はＢ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）、又は非ホジキンリンパ腫に罹患しているヒトの免疫細胞の子孫である、請求項１〜１０、１２〜２６、２８及び３１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
各自己ＣＡＬ細胞が、ヒトの血液又は腫瘍試料に由来しかつインビトロで活性化され増やされる、請求項１〜１０、１２〜２６、２８及び３１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ヒトが、自己免疫疾患を有し、前記ＣＡＬ細胞が、前記架橋剤コピーによって標的細胞に結合したときにアネルギーであるか、又は低減された増殖及び／若しくは細胞傷害活性を有する、請求項６０に記載の方法又は細胞。
【請求項６２】
前記ＣＡＬが、請求項２〜６１のいずれか一項で定義される通りである、ＣＡＬ−免疫細胞、ＣＡＬ−Ｔ細胞、ＣＡＬ−ＮＫ細胞又はＣＡＬ−ＴＩＬ。
【請求項６３】
前記細胞が、請求項６２に記載のものである、ＣＡＬ−免疫細胞の集団、ＣＡＬ−Ｔ細胞、ＣＡＬ−ＮＫ細胞の集団又はＣＡＬ−ＴＩＬの集団。
【請求項６４】
ヒトにおいて疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減する方法での使用のための請求項６２若しくは６３に記載の細胞又は集団であって、前記方法が、請求項２９又は３０に従う、細胞又は集団。
【請求項６５】
医療用ＩＶ容器、注入装置又は注射器に含まれる請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の細胞又は集団。
【請求項６６】
請求項１〜６５のいずれかに記載のＣＡＬをコードするヌクレオチド配列を含む哺乳動物幹細胞。
【請求項６７】
前記細胞が、多能性又は多分化能性である、請求項６６に記載の細胞。
【請求項６８】
請求項６６又は６７に記載の複数の幹細胞を含む細胞の集団。
【請求項６９】
請求項２９又は３０に記載の方法での使用のための請求項６６又は６７に記載の幹細胞であって、前記方法が、前記架橋剤及び前記幹細胞を前記ヒトに投与することを含み、前記幹細胞が、前記ＣＡＬ−免疫細胞に発展し、前記免疫細胞が、前記ヒトの中で前記標的細胞と組み合わされかつ前記細胞が、前記架橋剤により架橋され、前記疾患若しくは病態が、治療又は予防される、幹細胞。
【請求項７０】
そのゲノムが（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号９を含むＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列；及び配列番号９を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＣＤ２８細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列；及び配列番号１５を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ２８細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号１８を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列；及び配列番号１８を含むＣＡＬ又はＣＡＲの４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列、
の１つ、それより多く又は全部を含むＣＡＬ免疫細胞又はＣＡＲ免疫細胞。
【請求項７１】
疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療する又は予防するためのヒト患者への投与のための自己細胞移植片又は同種細胞移植片であって、複数のＣＡＬ免疫細胞又はＣＡＲ免疫細胞を含み、前記細胞が、ヒトドナーから得られる１以上の祖先細胞の子孫であり、前記移植片の各前記細胞のゲノムが、（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号９を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、前記祖先細胞（複数可）のゲノム（複数可）が、配列番号９を含むＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ２８細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、前記祖先細胞（複数可）のゲノム（複数可）が、配列番号１５を含むＣＤ２８細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列；又は
（ｉｉｉ）配列番号１８を含むＣＡＬ又はＣＡＲの４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、前記祖先細胞（複数可）のゲノム（複数可）が、配列番号１８を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列
の１つ、それより多く又は全部を含む、移植片。
【請求項７２】
前記移植片の各前記細胞が、前記内因性配列（複数可）を含む、請求項７１に記載の移植片。
【請求項７３】
ヒト患者において疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療する又は予防する方法での使用のための、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の細胞又は移植片であって、前記患者の生殖細胞ゲノムが、前記細胞内ドメイン内因性配列（複数可）を含み、必要に応じて前記生殖細胞ゲノムが、それぞれ配列番号９、１５及び１８を含むＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８並びに４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードする、細胞又は移植片。
【請求項７４】
ヒト患者において疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療する又は予防するための、請求項７１、７２又は７３に記載の移植片であって、前記患者が、前記ドナーである、移植片。
【請求項７５】
前記ＣＡＬ又はＣＡＲが、細胞外ＣＤ３（例えば、ＣＤ３デルタ）又はＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメインを含む、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の細胞又は移植片。
【請求項７６】
キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）あって、前記ＣＡＬが、ＣＤ３細胞外ドメイン；オプションのヒンジ；膜貫通ドメイン；及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む（Ｎ末端からＣ末端の方向で）改変ポリペプチドを含み；前記ＣＡＬが免疫細胞膜に含まれかつ前記ＣＡＬが架橋剤と結びつく時に、細胞内シグナル伝達が、前記免疫細胞中で誘発されて免疫細胞の活性を調節する、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）。
【請求項７７】
少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含むＣＡＬポリペプチド複合体であって、
（ｉ）前記第１のポリペプチドがＣＤ３細胞外ドメイン；オプションのヒンジ；及び膜貫通ドメインを含み（Ｎ末端からＣ末端の方向で）；かつ
（ｉｉ）前記第２のポリペプチドが膜貫通ドメイン；及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含み（Ｎ末端からＣ末端の方向で）；
一方又は両方又は前記ポリペプチドが、ＣＤ３ドメインではない細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）を含み；かつ
前記ＣＡＬが免疫細胞膜に含まれかつ前記ＣＡＬが架橋剤と結びつく時に、細胞内シグナル伝達が、前記免疫細胞中で誘発されて免疫細胞の活性を調節する、
ＣＡＬポリペプチド複合体。
【請求項７８】
前記ＣＤ３細胞外ドメインが、ヒトＣＤ３細胞外ドメインである、請求項７６又は７７に記載のＣＡＬ。
【請求項７９】
１以上のさらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含み、それぞれがＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン及びＣＤ１６ドメインからなる群から選択される、請求項７６、７７又は７８に記載のＣＡＬ。
【請求項８０】
キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞であって、前記細胞が、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載のＣＡＬを発現する、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞。
【請求項８１】
請求項７６〜７９のいずれか一項に記載のＣＡＬをコードする核酸。
【請求項８２】
免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ細胞）中で請求項７６〜７９のいずれか一項に記載のＣＡＬを発現することを含む、ＣＡＬを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変免疫細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＬ  Ｔ細胞）を標的細胞に架橋するための多特異性結合剤、改変免疫細胞、改変キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）及び免疫療法、例えば、ヒトの養子ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＬ  Ｔ細胞療法の方法の新規使用に関する。本発明はまた、精密免疫療法を実施するためのヒト変異を適合させたＣＡＲ細胞及びＣＡＬ細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
免疫療法への１つの手法は、腫瘍を認識して攻撃する細胞表面抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、患者自身の（又はドナーの）免疫細胞を改変することを伴う。この手法は、養子細胞移入（ＡＣＴ）と呼ばれ、これまで小規模な臨床試験に制限されてきたが、これらの改変免疫細胞を用いる治療は、進行癌患者においていくつかの顕著な応答を生み出している。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞によって発現された場合に、ＣＡＲの標的化ドメインによって決定される抗原特異性をＴ細胞に付与するＴ細胞シグナル伝達ドメインと融合される抗体由来の標的化ドメインからなる。ＣＡＲは、抗体ベースの標的化ドメインが利用できる限り、Ｔ細胞のエフェクター機能を、細胞表面上で発現した任意のタンパク質及び非タンパク質標的に向かうように潜在的に再指示できる。この戦略は、それにより、抗原のプロセシング及び標的細胞による提示の必要性を回避し、糖のような非古典的Ｔ細胞標的に適用可能である。このＨＬＡ制限の回避は、ＣＡＲ  Ｔ細胞手法が、養子Ｔ細胞療法の適用の可能性を広げる一般的なツールとして使用できることを意味する。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；９０７：６４５−６６．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−９７４−７＿３６，「Ｔ細胞ベース療法用のキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ），Ｃｈｅａｄｌｅ  ＥＪらを参照されたい。
【０００４】
最初のＣＡＲ  Ｔ構築物は、ＰＮＡＳで免疫療法のパイオニアであるＺｅｌｉｇ  Ｅｓｈｈａｒによって１９８９年の論文に記載された。ＣＡＲの構造は現在、異なる細胞タンパク質からの異なるドメインのキメラである膜貫通ポリペプチド鎖を含む。例えば、ＣＡＲは、細胞内部分に結合された（多くの場合、リンカー及び／又はヒンジ領域によって）細胞外部分を有し、ＣＡＲの膜貫通部分は、免疫細胞、通常はＴ細胞の膜中に受容体を埋め込んでいる。細胞外部分は、一般に癌細胞の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である標的抗原を認識する抗体結合部位（通常、マウスｍＡｂに由来するものなどの、ｓｃＦｖの形態である）を含む。このような抗原認識は、ＭＨＣ制限抗原提示を必要とするＴＣＲに依存する必要性を不要にし、その場合、結合親和性は比較的低い可能性がある。ＣＡＲの細胞内部分は典型的には、抗原が細胞外結合部位に結合される場合の細胞内シグナル伝達のためのＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）ドメインを含む。後世代のＣＡＲはまたＴ細胞媒介性応答を強化するさらなるドメインを含み、それは多くの場合、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）又はＣＤ２８細胞内ドメインである。ＣＡＲ結合部位の同族抗原リガンドに遭遇する際に、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達を活性化し、ひいてはＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化して、腫瘍細胞の死滅を高めることができる。
【０００５】
ほとんどのＣＡＲ  Ｔはインビボで増殖し、したがって従来の意味での用量設定が困難であり、多くの場合、改変Ｔ細胞は「永遠に」活性があるように思われる。すなわち、進行中のＢ細胞の形成不全の所見がこれまでのＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ臨床研究のほとんどにおいて見られる。このことは、ＣＡＲ  Ｔ細胞手法に対して深刻な問題を提起する。いくつかの観察されたリスクが、Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｎｏｖ；１８（１００）：２６５−７１，「癌のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法への挑戦（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｔｏ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）−Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ）」，Ｍａｇｅｅ  ＭＳ  ＆  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥで論じられており、それは、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療後の最初の重篤な有害事象が、肺及び肝臓へ転移する結腸直腸癌の患者において生じたことを説明している（Ｍｏｒｇａｎら、２０１０）。この患者は、上皮成長因子受容体２（ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２）を標的とする第３世代のＣＡＲを発現するＴ細胞で治療された。このＣＡＲは、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療のためにＦＤＡに承認された４Ｄ５抗体（トラスツズマブ）由来のｓｃＦｖを含んだ（Ｚｈａｏら、２００９）。患者は、１０１０個のＣＡＲ−Ｔ細胞の単回用量を投与された後、１５分以内に呼吸困難を発症し、５日間にわたって複数回の心停止がそれに続き、最終的に死に至る。治療後四時間の時点での血清分析は、サイトカインであるＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の顕著な増加を明らかにした。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、肺、腹部及び縦隔リンパ節において見出されたが、腫瘍転移では見出されなかった。研究者らは毒性の原因を、肺上皮においてＨＥＲ２が認識される結果、炎症性サイトカインが放出され肺毒性をもたらすこと、かつサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）が多臓器不全を引き起こすことであると結論付けた（Ｍｏｒｇａｎら、２０１０）。保守的な用量漸増戦略後に異なる抗体（ＦＲＰ５）由来の第２世代のＨＥＲ２標的化ＣＡＲを利用する試験が、他の研究者らによって様々なＨＥＲ２＋悪性腫瘍に対して現在行われている（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０１１０９０９５、ＮＣＴ００８８９９５４、及びＮＣＴ００９０２０４４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
別のＣＡＲ  Ｔ細胞の主題は、腫瘍特異的ＩｇＧのＦｃ領域に結合するためにＣＤ１６Ａ（ＦＣγＲＩＩＩＡ）を使用する、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）治療薬である（例えば、ＷＯ２０１５／０５８０１８を参照されたい）。目的は、患者に投与されるＩｇＧを滴定することによって、インビボでＣＡＲ  Ｔ細胞活性のさらなる制御を可能にすることである。ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ１６結合部位は、空いているが、患者の内因性ＩｇＧにも結合でき、これはこの手法の魅力を低減する。この手法はまた、体内での本質的に長いＩｇＧの半減期（ヒトにおけるＩｇＧについては約２０日）を考慮する必要があり、これはＣＡＲ細胞活性の制御を制限し得る。進行中の研究は、このリスクを評価するであろう。活性を制御するためにＩｇＧを使用する際の潜在的な合併症を避けるために、ＣＡＲ−Ｔ細胞手法のような、免疫細胞ベースの療法を制御する別の方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の説明
本発明は、Ｆｃ結合に依存せずかつ、スイッチ半減期を容易に適合させることにより柔軟な調整を提供するスイッチとして多特異性小断片ベースの手法による新規の改変された免疫細胞を使用することによる解決を提供する。この新しい手法の１つの種類は、発明者らが「キメラ抗原リガンド」（ＣＡＬ）と呼ぶ構築物を使用し、これらは、ＣＡＬ  Ｔ細胞及び他の免疫細胞に担持される。
【０００８】
本発明はまた、従来技術とは異なり、比較的短い血清半減期の結合断片手法で利点のある実施形態を提供する。そのため、本発明は、当技術分野の既存のＴ細胞エンゲージャー抗体手法（Ａｍｇｅｎ社のＢｉＴＥ（商標）など）を改良し、ＣＡＲ細胞制御のためのＩｇの使用を改善する。いくつかの他の利点は、以下に説明するように、本発明の手法によって提供される。
【０００９】
本発明はまた、免疫細胞、ＣＡＲ、ＣＡＬ、移植片及び天然のヒト遺伝子型と表現型の変異を適合させることによりヒト及びヒト細胞に合わせられる精密免疫療法の方法を提供する。
【００１０】
この目的のために、本発明は以下の構成を提供する。
【００１１】
第１の構成において：
標的細胞に免疫細胞を標的化する方法であって、
Ａ．架橋剤を提供することであって、剤が
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片である、架橋剤を提供すること；
Ｂ．キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供することであって、免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、リガンドが、
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第２の抗原を含む細胞外部分と、
ｉｖ．薬剤が第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供すること；
Ｃ．ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤を標的細胞と組み合わせることであって、標的細胞が上記第１の標的抗原を含み、第１の標的抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．それによって架橋剤が第１及び第２の抗原に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する
組み合わせること、
を含む方法。
【００１２】
これは、架橋剤がＩｇＧのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する実施形態を可能し、それにより、従来のＣＡＲ−Ｔ手法でこれまで可能であった制御よりも、より細かい制御を可能にしかつＦｃ相互作用（それは患者自身の抗体Ｆｃ領域と容易に区別できないかもしれない）への依存を回避する可能性を可能にする。
【００１３】
第２の構成において：
抗原特異的薬剤への標的化結合のためのキメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞であって、
Ａ．薬剤が、
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片であり；
Ｂ．ＣＡＬ−免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、リガンドが、
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第２の抗原を含む細胞外部分と、
ｉｖ．薬剤が第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含み；
Ｃ．ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤が標的細胞と組み合わされる場合、標的細胞が上記第１の標的抗原を含み、第１の標的抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．架橋剤が第１及び第２の抗原に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する、
キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞。
【００１４】
第３の構成において：
ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法における使用のための、ＣＡＬ免疫細胞又はかかる細胞の複数を含む移植片であって、方法がヒトにＣＡＬ細胞及び上記架橋剤を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及びヒトの標的細胞が組み合わされ、かつ架橋剤によって架橋され、それによってＣＡＬ細胞においてシグナル伝達を上方制御してＣＡＬ細胞の標的細胞の細胞傷害性（例えば、ＡＤＣＣ媒介性死滅活性）を高め、それによってヒトにおける上記疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、ＣＡＬ免疫細胞又はかかる細胞の複数を含む移植片。
【００１５】
第４の構成において：
ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ又は同種移植拒絶反応）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法における使用のための、ＣＡＬ免疫細胞又はかかる細胞の複数を含む移植片であって、方法がヒトにＣＡＬ細胞及び上記架橋剤を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及びヒトの標的細胞が組み合わされ、かつ架橋剤によって架橋され、それによってＣＡＬ細胞においてシグナル伝達を上方制御してＣＡＬ細胞の細胞傷害性（例えば、ＡＤＣＣ媒介性死滅活性）を低減し、それによってヒトにおける上記疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、ＣＡＬ免疫細胞又はかかる細胞の複数を含む移植片。
【００１６】
第５の構成において：
標的細胞に免疫細胞を標的化する方法であって、
Ａ．架橋剤を提供することであって、剤が
ｉ．第１の結合部分；及び
ｉｉ．第２の結合部分
を含む多特異性結合断片である、架橋剤を提供すること；
Ｂ．免疫細胞を提供することであって、免疫細胞が
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第３の結合部分を含む細胞外部分であって、第２及び第３の部分が特異的結合対（ＳＢＰ１）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合する、細胞外部分と、
ｉｖ．第２及び第３の部分が共に結合する場合の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む膜貫通タンパク質を発現する、免疫細胞を提供すること；
Ｃ．免疫細胞及び架橋剤を標的細胞と組み合わせることであって、標的細胞が第４の結合部分を含み、第４の結合部分が細胞外にあり、
ｖ．それによって第１及び第４の部分が特異的結合対（ＳＢＰ２）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し；
ｖｉ．第２及び第３の部分が共に結合しそれによって免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する
組み合わせること、
を含み、かつ
Ｄ．架橋剤の分子量が１２５ｋＤａ以下である、
方法。
【００１７】
これは、Ｉｇの半減期より短い（１５０ｋＤａのサイズを有する）架橋剤の血清半減期を利用するために有益である。
【００１８】
第６の構成において：
抗原特異的薬剤への標的結合のための免疫細胞であって、
Ａ．薬剤が、
ｉ．第１の結合部分；及び
ｉｉ．第２の結合部分
を含む多特異性結合断片であり；
Ｂ．免疫細胞が、
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第３の結合部分を含み、第２及び第３の部分が特異的結合対（ＳＢＰ１）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合する細胞外部分と、
ｉｖ．第２及び第３の部分が共に結合する場合の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む膜貫通タンパク質を発現し；
Ｃ．免疫細胞及び架橋剤を標的細胞（第４の結合部分を含み、第４の部分が細胞外にある標的細胞）と組み合わされる場合、
ｖ．第１及び第４の部分が特異的結合対（ＳＢＰ２）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し；
ｖｉ．第２及び第３の部分が共に結合しそれによって免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節し；かつ
Ｄ．架橋剤の分子量が１２５ｋＤａ以下である、
免疫細胞。
【００１９】
第７の構成において：
改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．１以上のリガンド結合ドメイン又は１以上のリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．改変タンパク質のＳＤ１がＳＤ１のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ１を含み第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、第２のシグナル伝達ドメインが（ｉ）ＳＤ１と同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）天然に存在するＳＤ１の変異体でありＲ１を含み；かつ
Ｆ．Ｓ２が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
ヒト免疫細胞。
【００２０】
改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
を含み；
Ｄ．第１の抗原又は改変タンパク質のリガンドドメインが抗原又はリガンドドメインのアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ１を含み第２の抗原又はリガンドドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、第２の抗原又はリガンドドメインが（ｉ）それぞれ第１の抗原又はリガンドドメインと同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）それぞれ天然に存在する第１の抗原又はリガンドドメインの変異体でありＲ１を含み；かつ
Ｆ．Ｓ２が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
ヒト免疫細胞。
【００２１】
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法はヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は改変膜貫通タンパク質を含み、タンパク質は、
Ａ．１以上のリガンド結合ドメイン又は１以上のリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．改変タンパク質のＳＤ１がＳＤ１のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．ヒトのゲノムが、ＳＮＰ１を含み第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、ＳＤ２が（ｉ）ＳＤ１と同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）天然に存在するＳＤ１の変異体でありＲ１を含み；
Ｆ．Ｓ２がヒトの内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰであり；かつ
Ｇ．ヒトゲノムが免疫細胞の上記投与前にＳ２を含み；かつ
Ｈ．方法がヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、ヒト免疫細胞。
【００２２】
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法はヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は改変膜貫通タンパク質を含み、タンパク質は、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．第１の抗原又は改変タンパク質のリガンドドメインが抗原又はリガンドドメインのアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．ヒトのゲノムが、ＳＮＰ１を含み第２の抗原又はリガンドドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、第２の抗原又はリガンドドメインが（ｉ）それぞれ第１の抗原又はリガンドドメインと同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）それぞれ天然に存在する第１の抗原又はリガンドドメインの変異体でありＲ１を含み；
Ｆ．Ｓ２がヒトの内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰであり；かつ
Ｇ．ヒトゲノムが免疫細胞の上記投与前にＳ２を含み；かつ
Ｈ．方法がヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、ヒト免疫細胞。
【００２３】
第８の構成において：
改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．１以上のリガンド結合ドメイン又は１以上のリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｖ５３、Ｋ５４、Ｆ５５、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｄ６０、Ｙ６４、Ｑ６５、Ｑ６８、Ｌ７１、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｎ７６、Ｌ７７、Ｇ７８、Ｒ８０、Ｅ８１、Ｙ８３、Ｌ８６、Ｒ８９、Ｇ９１、Ｐ９４、Ｅ９５、Ｇ９８、Ｋ９９、Ｒ１０２、Ｑ１０７、Ｇ１０９、Ｙ１１１、Ｎ１１２、Ｅ１１３、Ｌ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｄ１１７、Ｋ１１８、Ｍ１１９、Ｅ１２１、Ａ１２２、Ｙ１２３、Ｓ１２４、Ｅ１２５、Ｉ１２６、Ｇ１２７、Ｇ１３０、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｈ１３８、Ｄ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１４２、Ｑ１４３、Ｇ１４４、Ｓ１４６、Ｔ１４７、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｄ１５１、Ｄ１５４、Ｈ１５７、Ｍ１５８、Ｑ１５９、Ｌ１６１及びＰ１６２（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも５０個のアミノ酸残基を含み；かつ
Ｅ．細胞のゲノムが第２のシグナル伝達ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、第２のドメインが上記選択された残基の少なくとも４０（例えば、４５又は全て）を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン又はＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインである、
ヒト免疫細胞。
【００２４】
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法はヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は改変膜貫通タンパク質を含み、タンパク質は、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｖ５３、Ｋ５４、Ｆ５５、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｄ６０、Ｙ６４、Ｑ６５、Ｑ６８、Ｌ７１、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｎ７６、Ｌ７７、Ｇ７８、Ｒ８０、Ｅ８１、Ｙ８３、Ｌ８６、Ｒ８９、Ｇ９１、Ｐ９４、Ｅ９５、Ｇ９８、Ｋ９９、Ｒ１０２、Ｑ１０７、Ｇ１０９、Ｙ１１１、Ｎ１１２、Ｅ１１３、Ｌ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｄ１１７、Ｋ１１８、Ｍ１１９、Ｅ１２１、Ａ１２２、Ｙ１２３、Ｓ１２４、Ｅ１２５、Ｉ１２６、Ｇ１２７、Ｇ１３０、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｈ１３８、Ｄ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１４２、Ｑ１４３、Ｇ１４４、Ｓ１４６、Ｔ１４７、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｄ１５１、Ｄ１５４、Ｈ１５７、Ｍ１５８、Ｑ１５９、Ｌ１６１及びＰ１６２（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも５０個のアミノ酸残基を含み；かつ
Ｅ．ヒトのゲノムが第２のシグナル伝達ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、第２のドメインが上記選択された残基の少なくとも４０（例えば、４５又は全て）を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン又はＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインであり；
Ｆ．方法がヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、
ヒト免疫細胞。
【００２５】
第９の構成において：
改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．ＳＤ１がＲ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインであり；かつ
Ｅ．細胞のゲノムが第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が上記選択された残基の少なくとも１０（又は１１、１２又は１３）個を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、
ヒト免疫細胞。
【００２６】
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法はヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は改変膜貫通タンパク質を含み、タンパク質は、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．ＳＤ１がＲ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインであり；
Ｅ．ヒトのゲノムが第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が上記選択された残基の少なくとも１０（又は１１、１２又は１３）個を含むＣＤ２８細胞内ドメインであり；かつ
Ｆ．方法がヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、
ヒト免疫細胞。
【００２７】
第１０の構成において：
改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．ＳＤ１がＲ２１５、Ｒ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２２２、Ｐ２２７、Ｍ２２９、Ｖ２３２、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｒ２４４、Ｅ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５２及びＣ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４個又は全部を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインであり；かつ
Ｅ．細胞のゲノムが第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が上記選択された残基の少なくとも８（又は９又は１０）を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインである、
ヒト免疫細胞。
【００２８】
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法はヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞は改変膜貫通タンパク質を含み、タンパク質は、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．ＳＤ１がＲ２１５、Ｒ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２２２、Ｐ２２７、Ｍ２２９、Ｖ２３２、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｒ２４４、Ｅ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５２及びＣ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択される残基の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４個又は全部を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインであり；かつ
Ｅ．ヒトのゲノムが第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が上記選択された残基の少なくとも８（又は９又は１０）を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインであり；
Ｆ．方法がヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減する、
ヒト免疫細胞。
【００２９】
本発明はまた、本発明のＣＡＬ免疫細胞及び／又は架橋剤を含む移植片、細胞集団、キット及び装置を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
その様々な態様において、本発明は、以下の考慮点に基づいている：
・免疫療法を切り替える及び制御するための比較的小さな、多特異性リガンド結合断片の使用（ＣＡＬ細胞免疫及びＣＡＲ免疫細胞への適用で）；
・例えばＦＤＡ又はＥＭＡに承認されたｍＡｂに基づく新しい様式を有効にする、免疫細胞媒介性活性との組み合わせにより既存のｍＡｂ及びＩｇ又は非Ｉｇ抗原結合断片を再び目的とする可能性；
・インビボ及びエクスビボでの免疫エフェクター細胞の新しい種類としてのＣＡＬ細胞の提供；
・当技術分野で見られるような高い毒性レベルの多特異性断片の投与への依存を低減するための、インビボでのＣＡＲ細胞及びＣＡＬ細胞増殖の有用性；
・当技術分野で見られるような多特異性断片の長期（例えば、連続的にポンプで注入する）投与への依存を低減するための、インビボでのＣＡＲ細胞及びＣＡＬ細胞増殖の有用性；
・固形腫瘍に対処するためのｍＡｂとは対照的な、断片のより良い腫瘍浸透の可能性；
・ＩＬ−２などの免疫上方制御因子の低用量の共投与を使用する可能性を含む、固形腫瘍に対処するための断片手法と組み合わせて腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を活用する可能性；並びに
・発明者が「精密免疫療法」と呼ぶものを提供するための、ＣＡＲ及びＣＡＬ結合ドメインにおける天然のヒト多型変異の観察、並びにヒト及びヒト細胞の遺伝子型変異並びに表現型変異への適合。
【００３１】
多特異性断片の有用性
本発明による複数のリガンド結合部位を有する架橋剤の使用は、比較的短い半減期（ヒト血清中で約２０日の平均半減期を有するＩｇＧよりはるかに短い）を有する比較的小さいサイズの２重特異性、３重特異性及び多特異性断片（例えば、当技術分野で周知の抗体ベースの断片）の使用を可能にする。このように、本発明は、本発明の免疫細胞におけるシグナル伝達の変化を誘発するためのスイッチとして作用する架橋剤の迅速な滴定を可能にする。これは、患者に投与されるＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞及びＣＡＲ  ＴＩＬ細胞）又はＣＡＬ細胞（例えば、ＣＡＬ  Ｔ細胞、ＣＡＬ  ＮＫ細胞及びＣＡＬ  ＴＩＬ細胞）などの、免疫療法における免疫細胞の活性を容易に変更し、それによって強力な療法を制御するための便利な方法を可能にする滴定可能な方法を提供する。これは、患者におけるＣＡＲ細胞療法の不要な過活性を回避する方法の当技術分野における懸念に対処するのに役立つ。また、本発明に従って架橋された標的細胞と免疫細胞の間のより密接な接近を可能にするために、架橋剤として比較的小さな断片を使用することが有利であり得る。
【００３２】
ＢｉＴＥ（商標）（Ａｍｇｅｎ）又は他の二重特異性Ｔ細胞結合因子などの既存の二重特異性断片技術を、本発明による架橋剤として容易に使用でき、それによって、本発明を便利にする（特に、薬剤が既にＦＤＡ又はＥＭＡに承認されている場合）。一つの例はブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ社のＢｌｉｎｃｙｔｏ（商標））であり、これはヒトＣＤ１９のｓｃＦｖ結合部位（腫瘍関連抗原、ＴＡＡ）に連結されたヒトＣＤ３δのｓｃＦｖ結合部位を有する。ブリナツモマブは、ＣＤ３結合が腫瘍細胞のＴ細胞死滅を活性化する特定の癌治療のために承認されている。
【００３３】
Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．２０１４；４：６３；オンライン発行２０１４  Ｍａｒ  ３１；ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１４．０００６３；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３９７８２９４；「ブリナツモマブ、急性リンパ芽球性白血病の治療のための二重特異性抗ＣＤ１９／ＣＤ３  ＢｉＴＥ（登録商標）抗体：展望と現在の小児適用（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ，ａ  Ｂｉ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉ−ＣＤ１９／ＣＤ３  ＢｉＴＥＲ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」；Ｌｉｎｄｓｅｙ  Ｍ．Ｈｏｆｆｍａｎ及びＬｉａ  Ｇｏｒｅが参照され、これは、このＢｉＴＥ（商標）の比較的短い半減期（約２時間）及び入院を必要とする、ポンプによる連続注入の薬物投与について記載している。ブリナツモマブによって例示されるように、かかる小さな断片を用いる療法は、薬剤の比較的短い半減期によって妨げられると認識され、リナツモマブの場合これに対処するために、４週間にわたって薬剤を連続してポンプ注入する移植ポンプによって患者に大用量が投与される。これは、医療スタッフによるポンプの設置を必要とし、かつ患者が治療期間中、１日最大２４時間、不都合にポンプとつながれるので不便である。さらに、一般的に、比較的大用量の多特異性断片を投与することの副作用が起こり得る。
【００３４】
当技術分野における長年の姿勢に反して、本発明は代わりに、実際に、比較的短い半減期の２重特異性、３重特異性及び多特異性の断片の手法において有用である。本発明者は、かかる薬剤が、標的細胞を死滅させるために、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬなどのより細かい制御のための容易に制御可能なスイッチとして使用できることに気づいた。特に、一例において、これは、以前に初期のＣＡＲ−Ｔ手法では可能ではなかった、患者におけるＡＤＣＣ様活性などの改変免疫細胞活性のより細かい調整を可能にする。そうすることで、疾患（例えば、癌）のＣＡＲ細胞媒介性及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ（商標））媒介性治療の利点を、以前可能であった方法よりも、より制御された方法で実現できる。利点は、したがって、免疫細胞ベース療法がより容易に調整され、このような画期的な戦略のさらに大きな可能性を開くことができる。また、小さな多特異性断片治療の認知される望ましくない結果が減り、それによって、エンゲージャー薬剤のより低い投薬量の可能性及び、例えば、ブリナツモマブ及び他の小さい多特異性断片手法で現在見られるような長期間にわたる連続的な薬物ポンプへの依存の低減を可能にする。
【００３５】
さらに、ブリナツモマブでのように、標的細胞死滅を促進するために患者における十分に大量の多特異性断片に依存することよりもむしろ、本発明は代わりに、標的細胞の増強された死滅又は調節を提供するために、改変免疫細胞の増殖能力を活用できる。このような理由からも、架橋剤の量は特定の設定で低減され、それによって副作用のリスクとオフターゲットの死滅又は正常細胞の望ましくない調節を低減できる。本発明の低減された量の架橋剤を使用する能力は、低レベルの第１の標的抗原も発現する正常細胞の望ましくない標的化を低減するのに有利であり得る。そのため、標的化のストリンジェンシーが架橋剤のより少ない滴定によってある程度制御できるので、本発明は、第１の抗原が正常細胞よりも標的の（例えば、腫瘍）細胞上でより高レベルで存在する場合に、特に有用であり得る。本発明は、本発明の免疫細胞による細胞媒介性細胞傷害性（例えば、ＡＤＣＣ様活性）の可能性において成り立つので、その活性が連続溶解（連続薬物投与を必要とする）に依存することが示唆されているブリナツモマブなどの断片と共に、代わりにかかる機構への依存を打破することが本発明を用いて可能であり得、その効果は患者における免疫細胞増殖の能力から恩恵を被ることができる。
【００３６】
キメラ抗原リガンド受容体（ＣＡＬ）及びＣＡＬ−免疫細胞
本発明は、ＣＡＬ−免疫細胞及びこれらの使用を提供するために、半減期の短い断片の手法で有用性を見出すだけでなく、抗原リガンド／結合部位のペアを交換することによる特定の構成においても従来の手法から外れることが認められる。先行技術のＣＡＲ−Ｔ及びＣＡＲ−ＮＫ手法は、免疫細胞の「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）の細胞外機能としての抗原結合部位の提供に依存する。対照的に、本発明は、免疫細胞の細胞表面機能としての抗原リガンド自体の提供に依存し、結合部位は代わりに架橋剤上に配置される。これは、既製の多特異性断片（上述したような）を使用することの利点を都合よく提供するだけでなく、有利なことに、免疫細胞のシグナル伝達複合体の細胞外抗原として自己抗原を使用できる（例えば、ＣＤ３細胞外ドメイン又はＴ細胞、ＮＫ細胞又はヒトの他の関連する免疫細胞で通常見出される他のドメインの自己バージョン）。発明者らは、ＣＡＲとそれらを区別するために、これらを「キメラ抗原リガンド」（ＣＡＬ）と呼ぶ。本発明の例示的な免疫細胞は、ＣＡＬ  Ｔ細胞、ＣＡＬ  ＮＫ細胞及びＣＡＬ  ＴＩＬ細胞である。自己抗原を使用する能力は、ＣＡＬ細胞が患者の免疫系によって標的化及び排除されるリスクを低減し、これは自己又は同種細胞移植片について有用性を有する。ＣＡＲ細胞では、受容体の抗原結合部位は免疫原性エピトープを含みそのため、患者自身の免疫系の標的であるかもしれないというリスクがあり、それによって効率を低下させ得る。ＣＡＬの使用は、患者の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面上に天然に存在するタンパク質の種類（例えば、ＣＤ３γ、δ又はε）によって細胞外抗原が提供されることを可能にし、これは患者との適合性に有用であり得る。ＣＡＬ細胞におけるヌクレオチド配列のノックアウトを用いて、ＴＣＲ−ＣＤ３シグナル伝達複合体の１以上の内因性ドメイン又はタンパク質の発現を予防し、それによってシグナル伝達を代わりに本発明のＣＡＬ（又は架橋剤と共にＣＡＲ細胞を使用する本発明の他の構成についてはＣＡＲ細胞）に向けることができる。
【００３７】
架橋剤
本発明の利点はさらにある：改変免疫細胞によって引き起こされる細胞傷害性又は他の制御を調節するために、ＣＡＬへの架橋剤の結合親和性を調整できる。従来のＣＡＲ−Ｔ手法では、結合相互作用は、腫瘍細胞上のその標的抗原へのＣＡＲの細胞外結合部位の比較的高い結合親和性を生成する必要性によって決定される。しかしながら、本発明の手法では、この考慮は、架橋剤の第１の結合部位（本発明の第５及び第６の構成における第１の結合部分）にうつり、したがって、例えば、腫瘍細胞に強く結合する適切な親和性を選択するのは自由である。これは、架橋剤の第２の結合部位（本発明の第５及び第６の構成における第２の結合部分）とＣＡＬに含まれる第２の標的抗原（膜貫通タンパク質に含まれる、本発明の第５及び第６の構成における第３の結合部分）の間の結合相互作用における柔軟性を可能にする。そのため、標的細胞に架橋された時に改変免疫細胞は増殖し、活性化されるので、改変免疫細胞の活性を下げたり上げたりするために、例えば、結合強度（例えば、中程度のＫＤ及び／又は中程度のＫｏｆｆ）を選択できる。したがって、本発明は、当業者が手元の状況に対して半減期と結合親和性の平衡を意図的に保つのを可能にするので、従来のＣＡＲ−Ｔ手法で可能であったよりも、より細かい調節を可能にする。薬剤の２つの結合部位での結合親和性は平衡が保たれ、これは１つの結合部位のみの親和性を選択する（ＣＡＲでのように）よりも細かい調節を可能にする。本発明による断片（有利なモジュラーであり大腸菌及び他のシステムによって容易にかつ安価に生成される、抗体又は非Ｉｇ足場ドメインを含むものなど）の使用は、これが都合の良い通例の当技術分野で十分に開発された結合メンバーのファージ又は酵母ディスプレイなどのレパートリーの選択手法を使用することを可能にするので、結合親和性を調整するための直接的な方法を提供する。本発明はまた、承認され患者に許容されることが示されている、十分に確立された既存のモノクローナル抗体治療薬の結合部位を使用するのに適している。ＣＡＬ結合部位と（又はＣＡＲが特異的に結合するリガンドと）、かかる結合部位（例えば、第１及び第２の、異なる抗体由来の結合部位）の１以上を組み合わせることによって、特異的親和性が手元の治療設定のために意図的に設計された、適切な二重特異性又は三重特異性架橋剤を作製できる。三重特異性（又は高次の多特異性）は、例えば、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の少なくとも２個の異なる細胞表面標的を標的化するのに有用であり、それらの標的は正常細胞上に含まれないか、又は腫瘍細胞上よりも低いレベルで共に存在している。本発明は、したがって、改変免疫細胞と組み合わせたかかる架橋剤、及び本明細書に記載される疾患若しくは病態のリスクを治療又は低減するための使用を提供する。
【００３８】
さらに、嵩高いＩｇＧの共投与に依存するＡＣＴＲ手法とは異なり、本発明は、はるかに小さい結合断片の使用を可能にし、そのため、架橋剤の分子量は、（１５０ｋＤａである）ＩｇＧの分子量よりはるかに小さくなるように選択できる。これは、患者の投薬についてより少ない量の可能性及び架橋剤を生成するための潜在的により低価格の商品も提供する。上述した架橋細胞のより密接な近接及び細菌（例えば、大腸菌）又は酵母（例えば、ピキア）による製造の容易さは、ＩｇＧを使用するＡＣＴＲ手法を上回るさらなる利点である。
【００３９】
例示的な結合断片のサイズを以下の表に示す。本発明の結合剤は、その表に示される、又は任意のかかる断片を含む任意の多特異性結合断片であり得、薬剤は、Ｉｇ未満のサイズを有する。例えば、薬剤の分子量は、１２５、１２０、１１５、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０又は４０ｋＤａ未満である。
【００４０】
【表１】
2019512215.tif 000002
＊断片が発見されたサイズの範囲を示す
【００４１】
参照により本明細書に組み込まれる「多価抗体：デザインが進化を超えるとき（Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｗｈｅｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｕｒｐａｓｓｅｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ａｎｇｅｌ  Ｍ．Ｃｕｅｓｔａら，Ｃｅｌｌ，２８巻，７号，ｐ３５５〜３６２，Ｊｕｌｙ  ２０１０の中の図を参照されたい。
【００４２】
固形腫瘍及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療
一実施形態において、本発明の利点は、小さい多特異性結合断片の腫瘍浸透能力を活用し、それは例えば、固形腫瘍を治療するのに有用である。ｓｃＦｖベースの断片などのかかる断片は、親抗体の結合特異性を保持し、完全長のｍＡｂに比べていくつかの利点を提供する。例えば、これらの断片は、インタクトな抗体と比較して腫瘍により迅速に浸透できる（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．；Ｖｉｎｅｒ，Ｊ．Ｌ．；Ｂｅｅｒｓ，Ｒ．；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．「ファージディスプレイによるＤＮＡ免疫マウスからのメソテリンに特異的な高親和性の安定な単鎖Ｆｖの単離及び抗腫瘍活性を有する組換え免疫毒素の構築（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｔａｂｌｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｏｎａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９８，９５，６６９−６７４；並びにＤｅｃｋｅｒｔ，Ｐ．Ｍ．「抗体ベースの癌療法のための臨床開発中の現在の構築物及び標的（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２００９，１０，１５８−１７５を参照されたい）。最適な腫瘍標的断片は、高い組織浸透、標的保持及び迅速な血液クリアランスを組み合わせたダイアボディ（５５〜６０ｋＤａ）であると主張されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋ．ら，「ヨウ素１２４標識された抗ＨＥＲ２ダイアボディでのＨＥＲ２陽性腫瘍異種移植片の定量的免疫陽電子放射断層撮影（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｏｄｉｎｅ−１２４  ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｄｉａｂｏｄｙ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５，１４７１−１４７８；及びＳｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｇら，「１２４Ｉ標識改変抗ＣＥＡｃｅａミニボディ及びダイアボディは、胸腺欠損マウスにおける異種移植片の高コントラストの抗原特異的小動物ＰＥＴイメージングを可能にする（１２４Ｉ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＥＡｃｅａ  ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｒａｓｔ，ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｍａｌｌ−ａｎｉｍａｌ  ＰＥＴｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｍｉｃｅ）」，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２００３，４４，１９６２−１９６９）。小さいサイズの断片は、癌療法においてなどの、組織浸透に望ましい特性であるが、短い生体内半減期ももたらし、断片への標的分子の暴露を制限する。本発明において、比較的短い半減期は、免疫療法のより微細なスイッチングを可能にするために都合よく使用される。いかなる特定の理論に縛られることなく、癌細胞の部位での本発明の免疫細胞によるインビボでの架橋剤捕捉は、癌の微小環境における薬剤の持続性を延長でき、そのため、一般的に低い全身半減期を補う。同様の理由で、これらの種類の細胞は固形腫瘍に浸潤することが示されているので、いくつかの実施形態において、本発明の免疫細胞のベースとしてＴＩＬを使用することが有用であり、これは捕捉架橋剤と共に、本発明を用いて固形腫瘍を治療するのに有益であり得る。そのため、一実施形態において、本発明の免疫細胞は、患者（例えば、ヒト）における固形腫瘍を治療又は予防するためのＴＩＬである。かかるＴＩＬ（又はかかるＴＩＬを複数を含む移植片）と共に使用するための例示的な薬剤は、２つ又は３つのｓｃＦｖ結合部位を含む二重及び三重特異性抗原結合断片である。さらに以下に説明するように、既存のｍＡｂ固形腫瘍療法の利点を、本発明の架橋剤（例えば、ｓｃＦｖとして提供される）の第１の結合部位（又は第１の結合部分）としてかかるｍＡｂの抗体ＶＨ／ＶＬ結合部位を用いることによって本発明で再活用できる。そのため、本発明は、患者（例えば、ヒト）における固形腫瘍を治療又は予防するために、本発明の架橋剤（一緒に混合される、又は別々にキットに含まれるかのいずれか）と組み合わせた本発明の免疫細胞（例えば、ＣＡＬ−ＴＩＬ又はＣＡＲ−ＴＩＬ）を提供し、薬剤の結合部位は、必要に応じてリンカーによって連結されるｓｃＦｖ結合部位である。
【００４３】
本発明のこれらの態様（又は本明細書の任意の他の態様）の例において、薬剤は、ダイアボディ（例えば、サイズ＝５５〜６５ｋＤａ）、トリアボディ（例えば、サイズ＝８５〜９５ｋＤａ）又はテトラボディ（例えば、サイズ＝１１５〜１２５ｋＤａ）である。ダイアボディは、より良好な腫瘍血液比を有し単量体ｓｃＦｖを上回る（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１３  Ｍａｙ；９７（９）：３８５５−６３．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５３−０１２−４６３２−９電子出版２０１２  Ｄｅｃ  １９、「ピチア・パストリスから分泌されるＣＤ２５特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の生成及び特徴付け（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ２５−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ−Ｆｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）」、Ｗａｎ  Ｌら）。そのため、６０〜１００ｋＤａの組換え抗体は、無傷の抗体と比較して効率的な腫瘍浸透及び高速循環クリアランスを示すことが判明し、したがってインビボ腫瘍標的化に良好に適している。そのため、本明細書の任意の態様の例において、薬剤のサイズは６０〜１００ｋＤａである。
【００４４】
代替例において、ＣＡＬ細胞（複数可）は、ＣＡＬ  Ｔ細胞又はＣＡＬ  ＮＫ細胞又はＣＡＬ  ＴＩＬ、ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＡＲ  ＮＫ細胞の２つ若しくは３つの混合物である。代替例において、ＣＡＲ細胞（複数可）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ  ＮＫ細胞又はＣＡＬ  ＴＩＬ、ＣＡＲ  Ｔ細胞及びＣＡＲ  ＮＫ細胞の２つ若しくは３つの混合物である。
【００４５】
固形腫瘍は、悪性細胞及び内皮構造及び免疫細胞を含む、様々な成分で構成される。癌細胞は、独自の代謝及び免疫学的ニーズを満たすために微小環境を形作ることができる。これと反対に、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、その成長を制御するための試みにおいて、腫瘍中に動員される。診断時のＴＩＬの量が予後と関連していることを示す証拠が蓄積されている。患者からのＴＩＬを、その患者の癌の治療法として使用されるように操作できる。
【００４６】
ＴＩＬを用いる養子細胞療法（ＡＣＴ）は、転移性黒色腫などの癌の治療に有効な戦略である。この技術は、患者の黒色腫生検からのＴＩＬ培養物の生成及び高い抗腫瘍活性を示すリンパ球のインターロイキン−２（ＩＬ−２）含有培地中での急速な増殖を伴う。ＴＩＬは次いで、リンパ球除去後に高用量ＩＬ−２の存在下で同じ患者に再導入される。十年以上前に記載されたにも関わらず、リンパ球除去を使用するＴＩＬでのＡＣＴは、その見かけの有効性を考えると期待されるほど広くは利用されていない。これに関わる要因は、一般的に一過的であるが、重度であり得る高用量のＩＬ−２に関連する毒性である可能性がある。
【００４７】
そのため、一実施形態において、本発明の免疫細胞（例えば、ＣＡＬ免疫細胞又はＣＡＲ免疫細胞）はＴＩＬである。一例において、本発明は、患者（例えば、ヒト）における癌（例えば、固形腫瘍又は黒色腫）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法であって、ＣＡＲ又はＣＡＲ  ＴＩＬ及び本発明の架橋剤並びに必要に応じてＩＬ−２をヒトに投与することを含む方法を提供する。一例において、本方法は、ヒトに自己又は同種ＴＩＬ移植片を投与することを含み、移植片は本発明の複数のＣＡＬ−ＴＩＬ又はＣＡＲ−ＴＩＬを含む。インビボでの細胞増殖及び癌細胞に向けられる細胞傷害性の可能性を有するかかるＴＩＬ療法を用いることによって、本発明は、一実施例で、以前に使用されたものよりも低い用量のＩＬ−２の使用を提供する。そのため、一例において、（トラスツズマブ試験の分野の当業者によって理解されるように）低い又は中間の用量のＩＬ−２がヒトに投与される。一例において、低用量のＩＬ−２は、１日に１００万ＩＵ／ｍ（２）以下である。一例において、ＩＬ−２は、皮下（ＳＣ）に投与される。代替的に又はＩＬ−２投与に加えて、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の１つ、２つ、又は全てが、ヒトに投与される（例えば、低用量として）。例えば、低い及び中間のＩＬ−２用量での前臨床試験：Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．２００９  Ｓｅｐ；１１７（１）：８３−９．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０５４９−００８−０２５１−７．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｄｅｃ  ３，「以前にトラスツズマブが効かなかった転移性乳癌（ＭＢＣ）患者（ＰＴＳ）における低用量インターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせたトラスツズマブの第ＩＩ相試験（ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  （ＩＬ−２）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  （ＰＴＳ）  ｗｉｔｈ  ＭＥＴＡＳＴＡＴＩＣ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  （ＭＢＣ）  ｗｈｏ  ｈａｖｅ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｆａｉｌｅｄ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）」，Ｍａｎｉ  Ａら；及びＪ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．２０１４；２（補遺３）：オンライン発行  ２０１４  Ｎｏｖ  ６．ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５１−１４２６−２−Ｓ３−Ｐ１，ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２８８３７６，「転移性黒色腫に対する腫瘍浸潤リンパ球及び中間用量のＩＬ−２での養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｕｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｄｏｓｅ  ＩＬ−２  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ）」，Ｒｉｋｋｅ  Ａｎｄｅｒｓｅｎらを参照されたい。本発明のＴＩＬベースの方法の実施形態において、本方法は、患者（例えば、ヒト）における癌を治療するか、又はそのリスクを低減し、患者は、患者への本発明の免疫細胞（複数可）の投与前にリンパ球除去を受けている。
【００４８】
架橋剤によるトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）＆ＨＥＲ２の標的化
いくつかの研究は、乳癌が免疫原性であるという示唆を支持する。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）におけるアジュバント治験のデータを用いて、ＴＮＢＣにおけるＴＩＬの予後の影響及びＨＥＲ２過剰発現疾患におけるトラスツズマブの利点との関連を調査した。ＴＮＢＣにおいて診断時に存在するＴＩＬ量と予後時に存在するＴＩＬ量の間に正の相関があった。より高いレベルのＴＩＬとトラスツズマブからの利点の増加との間の相互作用もあった。そのため、一例において、第１の抗原はＨＥＲ２である（又はこれは、第５及び第６の構成の第４の結合部分である）。一例において、第１の結合部位（第５及び第６の構成の第１の結合部分）は、トラスツズマブ又はハーセプチン（商標）のＶＨ／ＶＬ結合部位を含み、例えば、結合剤は第１のｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖはＨＥＲ２（第１の抗原、又は第４の結合部分）を結合し、かつＶＨ−リンカー−ＶＬを含み、ＶＨ及びＶＬはトラスツズマブ又はハーセプチン（商標）の可変ドメインである。一例において、本明細書では任意のｓｃＦｖのリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーであり、式中、ｎ＝２又はそれより多い（例えば、３、４、５又は６）。一例において、免疫細胞（例えば、本発明のＣＡＬ細胞若しくはＣＡＲ−ＴＩＬ若しくはＣＡＬ−ＴＩＬ）又は本発明の方法は、ヒトにおける乳癌を治療するか、又はそのリスク低減するためのものである（例えば、トリプルネガティブ乳癌）。一例において、本方法は、ヒトへ細胞移植片を投与することを含み、移植片は自己又は同種であり、かつ本発明の複数のＴＩＬ及び本発明の架橋剤を含み、架橋剤の第１の結合部位（第１の結合部分）はＨＥＲ２を特異的に結合し、例えば、第１の結合部位（第１の結合部分）は、例えば、上記のｓｃＦｖとして提供されるトラスツズマブ又はハーセプチン（商標）のＶＨ／ＶＬ結合部位を含む。
【００４９】
一例において、態様は、ヒトにおける乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）を治療するか、又はそのリスクを低減する方法で使用するための、本発明のＣＡＬ−ＴＩＬ（又はＣＡＬ−Ｔ又はＣＡＬ−ＮＫ）を提供し、第１の抗原はＨＥＲ２であり、必要に応じて架橋剤の第１の結合部位はトラスツズマブ又はハーセプチン（商標）のＶＨ／ＶＬ結合部位を含み、本方法は、ヒトにＣＡＬ細胞及び架橋剤を投与することを含み、乳癌が治療されるか、又は乳癌のリスクが低減される。
【００５０】
一例において、結合剤は、ｓｃＦｖ  抗ＨＥＲ２結合部位を含み、必要に応じてｓｃＦｖはＶＨ−リンカー−ＶＬを含み、ＶＨ及びＶＬはトラスツズマブ又はハーセプチン（商標）の結合部位の可変ドメインである。一例において、結合剤の第２の結合部位は、ヒトＣＤ３細胞外ドメイン又はＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメインを特異的に結合する。
【００５１】
一例において、本発明のＣＡＬ細胞は、本発明の複数のＣＡＬ−ＴＩＬ（又はＣＡＬ−Ｔ、又はＣＡＬ−ＮＫ細胞）を含む移植片に含まれ、移植片は疾患（例えば、癌、自己免疫疾患、ＧｖＨＤの移植拒絶）を治療又は予防するためにヒトに投与されるか、又は細胞若しくは移植はかかる使用のためのものである。
【００５２】
一例において、ヒトは女性、又は男性である。
【００５３】
一例において、患者又はヒトは、本発明の免疫細胞（例えば、ＣＡＬ細胞）の投与前にリンパ球除去を受けている。
【００５４】
ＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するための技術は、当技術分野で周知であり、通常のものであり、これらは、一般的に、本発明のＣＡＬ及びＣＡＬ−細胞の生成に適用できる（例えば、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９  Ｓｅｐ；３２（７）：６８９−７０２，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＣＪＩ．０ｂ０１３ｅ３１８１ａｃ６１３８，「抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体の構築及び前臨床評価（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ１９  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」，Ｊａｍｅｓ  Ｎ．Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら；本発明に適用できる一般的な方法についてはＷＯ  ２０１４０１２００１も参照されたい）。例えば、エレクトロポレーション、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターの使用は、当業者によって知られているように、本発明のＣＡＬ細胞を生成するために、本発明のＣＡＬエレメントをコードするヌクレオチド配列をＴ細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬ又は他の免疫細胞へ導入するために使用できる。患者から単離された細胞（自己細胞試料）又は別のドナーから単離された細胞（同種試料）を、ＣＡＬコード配列を含むように遺伝子改変された祖先細胞を提供するために使用できる。当技術分野で知られているように、細胞の増殖を、プロセスで使用できる。例えば、ＣＡＬ細胞を改変した後、細胞集団を、患者に投与（例えば、注入）される移植片を生成するために、通常の技術を使用して大規模に増やすことができる。患者は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。ＣＡＬエレメントの１以上の（例えば、第２の抗原及び／又は第１のシグナル伝達ドメインの）ヌクレオチド配列は、患者若しくは別のドナーから得られた細胞を用いてクローニング又は配列決定できる。
【００５５】
ドメインの変異及び適合
第５及び第６の構成の実施形態において、第２の結合部分は、リガンド（例えば、抗原）であり、第３の部分はリガンド受容体又は結合部位（例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位で）であり、例えば、免疫細胞はＣＡＲ細胞である。有利な実施例において、第２の結合部分の配列は第２の部分のコード配列中で、ヒトに天然に見られる１以上の非同義ＳＮＰについてＳＮＰ適合される。
【００５６】
ＣＡＬに関する第１〜第４の構成の有利な実施例において、第２の抗原配列は第２の抗原のコード配列中で、ヒトに見られる１以上の非同義ＳＮＰについて（例えば、ヒトＣＤ３細胞外ドメインに天然に見られる１以上のＳＮＰを参照して）ＳＮＰ適合される。
【００５７】
Ｅｎｓｅｍｂｌ及び１０００ゲノムデータベースなどの、ＳＮＰを評価し特定するための適切なデータベースは、当業者に知られている。発現可能な配列中の特定のヌクレオチド位置の変異を参照して、特定のヌクレオチド位置での「非同義ＳＮＰ」が、コードタンパク質配列中で、天然変異が異なるアミノ酸残基の結果をもたらすその位置での一塩基多型であることを当業者は知っている。架橋剤の第２の結合部分（本発明の第５及び第６の構成）又はＣＡＬ細胞外ドメインの第２の抗原（第１〜第４の構成）中の１以上のＳＮＰ変異又は対応するアミノ酸変化の考慮は、本発明の免疫細胞（又はこれが子孫であるその祖先細胞）によってコードされる及び／又は患者のゲノムによってコードされる同等のタンパク質中の天然ＳＮＰ変異を反映するように薬剤又はＣＡＬのこのエレメントを適合させるために有用である。これは、本発明の免疫細胞（又は細胞移植）を受けとる患者のゲノムがそのように適合させたＳＮＰ（複数可）をコードする場合に特に有用であり、その場合、これは、患者の免疫系との架橋剤（第５及び第６の構成での）又はＣＡＬ細胞外部分（第１〜第４の構成での）の適合性を増大させる（かつこれは、そうでなければ有用性を減少させ得る薬剤又はＣＡＬに対する免疫応答を減少させるのに有用であり得る）。有利な実施形態において、患者は、第２の結合部分（第５及び第６の構成）又は第２の抗原（第１〜第４の構成）、すなわち、そのアミノ酸配列が、そのような薬剤の第２の部分又はＣＡＬの第２の抗原のアミノ酸配列と同一であるタンパク質、を発現する。そのため、例えば、第２の結合部分（第５及び第６の構成）又は第２の抗原（第１〜第４の構成）は、ＣＤ３γ、δ又はεドメインであり、本発明による薬剤及び免疫細胞のレシピエントは、それぞれ適合されたＣＤ３γ、δ又はεドメインを発現する。
【００５８】
同様に、本発明の態様は、膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＲ又はＣＡＬ）の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を、改変免疫細胞内で性能を最適化するのを助けるように適合させる。この場合、ＳＮＰ適合は、（ｉ）膜貫通タンパク質の第１の（又は各）シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列（例えば、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターに導入された、非内因性配列）と、（ｉｉ）そのようなシグナル伝達ドメインをコードする細胞の内因性ヌクレオチド配列の間で用いられる。このように適合させることにより、シグナル伝達ドメインは、パフォーマンスを最適化するために、細胞中の内因性シグナル伝達カスケードの他の成分とも適合される。本明細書で使用される「内因性」は、例えば、生物、細胞、組織若しくは系内の、又はそれに由来するか、又はその中で生成される、例えば本発明による若しくは免疫細胞が由来するドナーからの免疫細胞（例えば、ＣＡＲ細胞若しくはＣＡＬ細胞）を有するか、又は投与される患者の非改変細胞に見られる、任意の天然に存在する物質を指す。
【００５９】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインはヒトＣＤ３ζドメインであり、本発明の細胞は、上記ヒトＣＤ３ζドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含むヒト細胞である。一例において、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号２４のアミノ酸配列を含み、その配列は、本発明における使用のために及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。一例において、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１８の核酸配列によってコードされ、その配列は、本発明における使用のために及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６０】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインはヒトＣＤ２８ドメインであり、本発明の細胞は、上記ヒトＣＤ２８ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含むヒト細胞である。
【００６１】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインはヒト４−１ＢＢドメインであり、本発明の細胞は、上記ヒト４−１ＢＢドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含むヒト細胞である。
【００６２】
例えば、第１のシグナル伝達ドメインはヒトＯＸ４０ドメインであり、本発明の細胞は、上記ヒトＯＸ４０ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含むヒト細胞である。
【００６３】
一例において、第２の結合部分（第５及び第６の構成）又は第２の抗原（第１〜第４の構成）がＣＤ３γ、δ又はεドメインであり、かつ第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζドメインである場合、部分／抗原及びドメインは、単一細胞（例えば、ヒト野生型細胞又は患者から単離された細胞）中で共に天然に生じない。別の例において、第２の結合部分又は第２の抗原がＣＤ３γ、δ又はεドメインであり、かつ第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζドメインである場合、膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）は、ＣＤ３ドメインではないさらなるドメインを含み、例えば、さらなるドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０又は４−１ＢＢドメインである。
【００６４】
一例において、第１の細胞内ドメインは、本明細書の配列表に開示されるＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメイン又は４−１ＢＢドメインである。
【００６５】
（Ａ）：一例において、ＣＡＬは、ヒトＣＤ３細胞外ドメイン；オプションのヒンジ（例えば、ヒトＣＤ８αヒンジ）；膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ８α又はＣＤ２８膜貫通ドメイン）；及びヒトＣＤ３ζドメインを含む（Ｎ末端からＣ末端方向に）改変単一ポリペプチドである。一例において、ＣＡＬは、上記ポリペプチドの２以上の複合体である。必要に応じて、ＣＡＬは、（ｉ）膜貫通ドメインとＣＤ３ζドメインの間に、さらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。必要に応じて、ＣＡＬはさらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ３ζドメインがさらなるシグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインの間にある。一例において、さらなるシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン又はＣＤ１６ドメインである。代替例において、単一ポリペプチドの代わりに、ＣＡＬは、上記ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチドの改変複合体を含む。代替例において、ＣＡＲが本発明で使用される場合、ＣＡＲがＣＤ３細胞外ドメインの代わりに抗原結合部位を有することを除いて、ＣＡＲはかかるＣＡＬと同一である。
【００６６】
（Ｂ）：一例において、ＣＡＬは、ヒトＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメイン；オプションのヒンジ（例えば、ヒトＣＤ８αヒンジ）；膜貫通ドメイン（例えば、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン）；及びヒトＣＤ３ζドメインを含む（Ｎ末端からＣ末端方向に）改変単一ポリペプチドである。一例において、ＣＡＬは、上記ポリペプチドの２以上の複合体である。必要に応じて、ＣＡＬは、（ｉ）膜貫通ドメインとＣＤ３ζドメインの間に、さらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。必要に応じて、ＣＡＬはさらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ３ζドメインがさらなるシグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインの間にある。一例において、さらなるシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン又はＣＤ３ドメインである。代替例において、単一ポリペプチドの代わりに、ＣＡＬは、上記ドメインを含む少なくとも２つのポリペプチドの改変複合体を含む。代替例において、ＣＡＲが本発明で使用される場合、ＣＡＲがＣＤ１６細胞外ドメインの代わりに抗原結合部位を有することを除いて、ＣＡＲはかかるＣＡＬと同一である。
【００６７】
（Ｃ）：一実施形態において、ＣＡＬはポリペプチドの２以上の複合体であり、第１の上記ＣＡＬポリペプチドは（Ａ）によるものであり、第２の上記ポリペプチドは（Ｂ）によるＣＡＬポリペプチドである。別の実施形態において、ＣＡＲはポリペプチドの２以上の複合体であり、第１の上記ＣＡＬポリペプチドは（Ａ）によるものであり、第２の上記ポリペプチドは、（Ｂ）によるＣＡＲポリペプチドである。
【００６８】
一例において、ＣＡＬ細胞は、細胞の内因性ヌクレオチド配列からの上記第２の抗原又はその天然に存在する変異体を発現しない。例えば、内因性配列は、例えば、全体的又は部分的にノックアウトされることによるか、又は変異により、細胞内で不活性化されている。例えば、変異は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ゲノム改変の生成物である。内因性の第２の抗原（例えば、ＣＤ３細胞外ドメイン）を発現する可能性を除去することにより、第２の抗原の全ての結合は、そうでなければ架橋剤への結合について競合する可能性があるＣＡＬの誘発に向けられる（かつ内因性ＴＣＲ−ＣＤ３複合体などの、任意の内因性受容体複合体へは向けられない）。
【００６９】
一実施形態において、本発明の免疫細胞（例えば、ＣＡＲ細胞又はＣＡＬ細胞）は、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。当技術分野において公知の任意の免疫抑制剤が使用されてよい。例えば、免疫抑制剤は、シクロスポリン、アザチオプリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸、プレドニゾン、シロリムス、バシリキシマブ、若しくはダクリズマブ、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００７０】
使用できる追加の又は代替的な免疫抑制剤は、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ  ＯＫＴ（商標）３（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（商標）、ＮＥＯＲＡＬ（商標）、ＳＡＮＧＤＹＡ（商標）（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（商標）（ＦＫ５０６、タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（商標）（活性代謝物がミコフェノール酸であるミコフェノール酸モフェチル）、ＩＭＵＲＡＮ（商標）（アザチオプリン）、グルココルチコイド、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニゾン）及びＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（プレドニゾロン）などの副腎皮質ステロイド、ＦＯＬＥＸ（商標）及びＭＥＸＡＴＥ（商標）（メトトレキサート）、ＯＸＳＯＲＡＬＥＮ−ＵＬＴＲＡ（商標）（メトキサレン）、ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）（リツキシマブ）、及びＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）（シロリムス）を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明の免疫細胞は、免疫抑制剤の前か、後か、又は同時に患者に投与できる。例えば、本発明の細胞は、免疫抑制剤を患者に投与した後に投与でき、又は本発明の細胞は、免疫抑制剤を患者に投与する前に投与できる。或いは、又は加えて、本発明の細胞は、免疫抑制剤が患者に投与されると同時に投与される。
【００７２】
本発明の免疫細胞及び／又は免疫抑制剤は、臓器又は組織の移植後に患者に投与できる。或いは、又は加えて、本発明の免疫細胞及び／又は免疫抑制剤は、移植前に患者に投与できる。本発明の免疫細胞及び／又は免疫抑制剤はまた、移植手術中に患者に投与できる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、患者へ免疫細胞を投与する本発明の方法は、免疫抑制療法が開始された後に実施される。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、経時的に、かつ該当する場合は、異なる免疫抑制療法の体制において、移植レシピエントを監視するために複数回実施される。いくつかの実施形態において、移植レシピエントが移植片に耐性を示すと予測される場合、免疫抑制療法は低減される。いくつかの実施形態において、移植レシピエントが移植片に耐性を示すと予測される場合、免疫抑制療法は施されず、例えば、免疫抑制療法は停止される。移植レシピエントが非耐性バイオマーカー特性を示す場合、免疫抑制療法は、再開するか又は標準レベルで継続できる。
【００７４】
臓器又は組織移植は、心臓、心臓弁、肺、腎臓、肝臓、膵臓、小腸、皮膚、血管、骨髄、幹細胞、骨、又は、膵島細胞であり得る。
【００７５】
本発明の免疫細胞は、単独で、又は希釈剤及び／又はＩＬ−２若しくは他のサイトカインなどの他の成分又は細胞集団と組み合わせて医薬組成物としてのいずれかで投与できる。
【００７６】
腫瘍抗原（ＴＡＡ）は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって生成されるタンパク質である。本発明の架橋剤の第１の抗原結合特異性の選択は、治療される癌の特定の種類に依存する。腫瘍抗原は、当技術分野で公知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体及びメソテリンを含む。第１の抗原（本発明の第１〜第４の構成）又は第４の結合部分（第５又は第６の構成）は、これらのＴＡＡのいずれかであってよく、又はこれらのＴＡＡのいずれかの抗原性配列であってよい。
【００７７】
一実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１以上の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として機能できるいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子は、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びＧＰ  １００並びに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異性抗原を含むが、これらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ  ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子のグループに属する。標的抗原のさらに別のグループは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍−胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異性イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に特有である、真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ  １９、ＣＤ２０及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原のための他の候補である。これらの抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）のいくつかは、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として使用されてきたが成功は限られている。第１の抗原又は第４の結合部分は、これらのＴＡＡのいずれであってよく、又はこれらのＴＡＡのいずれかの抗原性配列であってよい。
【００７８】
ＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ＭＡＲＴ−Ｉ／メランＡ（ＭＡＲＴ−１）、ｇＩＯＯ（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原を及びＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ  ５などの腫瘍特異的多系列抗原；ＣＥＡなどの過剰発現した胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどの過剰発現した癌遺伝子及び変異した腫瘍抑制遺伝子；染色体転座から生じた独特の腫瘍抗原；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、１ＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡ及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７などのウイルス抗原。他の大きなタンパク質ベースの抗原は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４（７９１Ｔｇｐ７２）アルファ−フェトプロテイン、ベータＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３／ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｉ、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ  １８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ  １、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０／Ｍａｃ−２結合タンパク質シクロフィリンＣ結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳを含む。
【００７９】
一実施形態において、第１の抗原又は第４の結合部分はヒトＣＤ  １９であり、第１の抗原結合部位又は架橋剤の第１の結合部分は抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶであり、必要に応じて、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶはＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示される配列番号１４によってコードされる。一実施形態において、抗ＣＤ  １９  ｓｃＦＶは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。このパラグラフの配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に見られ、架橋剤での本発明における使用のため、及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８０】
一実施形態において、ＣＡＲ又はＣＡＬ中のドメインの１つと天然に関連付けられる膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避するよう選択され又はアミノ酸置換によって修飾されてよい。
【００８１】
膜貫通ドメインは、天然源又は合成源のいずれかから誘導できる。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明における特定の使用の膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む）。或いは、膜貫通ドメインは合成であり得、その場合には、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性残基を含む。
【００８２】
必要に応じて、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。
【００８３】
必要に応じて、長さが好ましくは２〜１０個のアミノ酸の、短いオリゴ又はポリペプチドリンカーが、膜貫通ドメインと膜貫通タンパク質の細胞内部分（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）との間の結合を形成する。グリシン−セリンダブレットは、特に適切なリンカー（例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー）を提供する。
【００８４】
必要に応じて、膜貫通ドメインは、配列番号１６の核酸配列によってコードされるＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。このパラグラフの配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に見られ、架橋剤として本発明における使用のため及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８５】
いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の核酸配列によってコードされるＣＤ８ヒンジドメインを含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。このパラグラフの配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に見られ、架橋剤として本発明における使用のため及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８６】
細胞内部分又はそうでなければ、本発明の膜貫通タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）は、膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）を発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。そのため、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、かつ特化された機能を実施するように細胞を導くタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用できるが、多くの場合、鎖の全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切り詰められた部分が使用される程度に、そのような切り詰められた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用されてよい。用語「シグナル伝達ドメイン」は、そのため、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切り詰められた部分を含むことを意味する。本発明の膜貫通タンパク質での使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列及び抗原受容体結合後のシグナル伝達を開始するために協調して作用する共受容体、並びにこれらの配列の任意の誘導体若しくは変異体及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。
【００８７】
ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルはＴ細胞の完全な活性化に不十分であること、及び二次又は共刺激シグナルも必要とされることが知られている。そのため、Ｔ細胞活性化は、細胞質シグナル伝達配列の２つの異なるクラス：ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達ドメイン）と抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達ドメイン）、によって媒介されると言うことができる。一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的に又は阻害的にのいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有してよい。
【００８８】
一例において、第１のシグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζドメイン）である。一例において、第１のシグナル伝達ドメインは、二次細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８又は４−１ＢＢドメイン）である。
【００８９】
一例において、第１のシグナル伝達ドメインは、１以上のＩＴＡＭを含む。
【００９０】
本発明において特に有用である一次細胞質シグナル伝達ドメインを含有する適切なＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータは、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤＳ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄから誘導されるものが挙げられる。本発明の膜貫通タンパク質中の細胞質シグナル伝達分子がＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが、特に好ましい。
【００９１】
細胞内部分は、必要に応じて、共刺激分子のドメインを含む（例えば、第１のシグナル伝達ドメイン又はさらなる細胞内ドメインとして）。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体又はそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。そのため、これらの及び他の共刺激要素は、膜貫通タンパク質の細胞内部分に使用するための本発明の範囲内である。
【００９２】
細胞内部分のドメインは、１以上のリンカー、例えば、本明細書に開示される（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーによって互いに連結されてよい。
【００９３】
一実施形態において、細胞内部分は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、細胞内部分は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の実施形態において、細胞内部分は、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメイン並びにＣＤ２８及び４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む。
【００９４】
一実施形態において、細胞内Ｖは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号１７に記載の核酸配列によってコードされ、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号１８に記載の核酸配列によってコードされる。このパラグラフの配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に見られ、架橋剤として本発明における使用のため及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９５】
一実施形態において、細胞内部分は、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。このパラグラフの配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に見られ、架橋剤として本発明における使用のため及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９６】
一実施形態において、細胞内部分は、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインを含み、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。このパラグラフの配列は、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に見られ、架橋剤として本発明における使用のため及び本明細書の１以上の請求項に可能であれば含めるために本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９７】
本発明は、膜貫通タンパク質、例えば、本発明のＣＡＲ又はＣＡＬをコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む核酸ベクターを提供する。本発明は、本発明の膜貫通タンパク質をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む第１の核酸ベクター及び本発明の架橋剤をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含む第２の核酸ベクターを提供する。一実施形態において、本発明（例えば、ヒトなどの、患者における疾患若しくは病態のリスクを治療又は低減するための本明細書に開示される任意の方法）は、膜貫通タンパク質をコードするベクターを患者に投与することを含み、それによってベクターは、膜貫通タンパク質の発現のために患者の１以上の第１の細胞内に導入される。一例において、膜貫通タンパク質は子孫細胞で発現し、細胞は第１の細胞の子孫である。一例において、第１の細胞は、患者の幹細胞（例えば、骨髄細胞、造血幹細胞及び／又はＴメモリー細胞）である。以下に説明するように、当技術分野は既に、適したベクター及び本実施形態を実施するための技術を含み、例えば、ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス又はレトロウイルスである。一例において、膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡは、第１の細胞のゲノムに組み込まれている。これは、膜貫通タンパク質をコードするようにエクスビボで改変するために祖先細胞を採取し、その後に患者に注入する必要性を回避する。代わりに、ベクター投与は必要とされる唯一の工程であり、エクスビボでの操作によって生じる変化のリスクなしに、子孫細胞が患者の第１の細胞にのみ基づくので、得られる子孫細胞の適合性が最大化される。さらに、患者自身のシステム（必要に応じて、免疫細胞の増殖を上方制御するＩＬ−２などの薬剤で刺激される）を、子孫細胞の集団を拡大するために投与できる。架橋剤は、例えば、エクスビボで生成され、患者が子孫細胞を生成した後に患者に投与でき、それによって、本発明の方法の滴定効果を実現できる。
【００９８】
一例において、ベクターは、ヒト細胞、例えば、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬ、幹細胞、骨髄細胞又はその前駆細胞中に導入するための遺伝子治療ベクターである。本発明はまた、膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）又はベクターを含むそのような細胞を提供する。本発明はまた、本発明の膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ）をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含むレトロウイルス、アデノウイルス又はレンチウイルスを含む。配列は、本発明の免疫細胞に含まれる場合に発現可能であり、例えば、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬで発現可能である。
【００９９】
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されるベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが長期的に安定な導入遺伝子組み込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にするので、長期遺伝子移入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ−レトロウイルスに由来するベクターを上回るさらなる利点を有する。それらはまた、低い免疫原性の追加の利点を有する。
【０１００】
本発明の構築物及びベクターは、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫及び遺伝子療法のために使用できる。遺伝子送達のための方法は、当技術分野で知られている。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第番号５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。
【０１０１】
本発明は、膜貫通タンパク質、例えば、本発明のＣＡＬ又はＣＡＲをコードするｍＲＮＡを提供する。当業者は、インビボでのコードタンパク質の発現のために、ヒトなどの生物にｍＲＮＡを送達する技術を知っている。一例において、本発明は、細胞又はその子孫での膜貫通タンパク質の発現のために、第１の免疫細胞又は第１の免疫細胞前駆細胞（例えば、ヒトＴ細胞、ＴＩＬのＮＫ細胞又は造血幹細胞又はＴメモリー幹細胞）中にｍＲＮＡを導入することを含む。必要に応じて、細胞又は子孫生成物は、本明細書に記載の疾患若しくは病態の治療又は予防の方法において患者（例えば、ヒト）に投与される。別の方法では、第１の細胞は、ｍＲＮＡが細胞中に導入される場合、患者、例えば、ヒトに含まれる。
【０１０２】
Ｔ細胞及び他の免疫細胞の供給源は、これらの作製、活性化及び増殖の方法と共に、ＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に開示されている。これらの開示は、本発明の作業での可能な使用について参照される。
【０１０３】
癌
治療され得る癌は、血管形成されない腫瘍、又は実質的に血管形成されない腫瘍、並びに血管形成される腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫など）を含むか、又は固形腫瘍を含んでよい。本発明のＣＡＬで治療される癌の種類は、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及び特定の白血病又はリンパ性悪性疾患、良性及び悪性の腫瘍、並びに悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌も含まれる。
【０１０４】
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液（又は血行性）癌の例としては、急性白血病（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽球、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ球性白血病など）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病及び骨髄異形成が挙げられる。
【０１０５】
固形腫瘍は、嚢胞又は液体領域を通常含有しない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の異なる種類は、それらを形成する細胞の種類（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）にちなんで命名される。肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑液、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、並びにＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られている）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移など）が挙げられる。
【０１０６】
一実施形態において、第１の結合部分又は本発明の架橋剤の第１の抗原結合部位は、特定の癌を治療するために設計される。例えば、それがＣＤ１９に特異的に結合することを用いて、癌及び障害、例えば、プレＢ  ＡＬＬ（小児の徴候）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫又は同種骨髄移植後のサルベージについて治療できる。別の実施形態において、第１の部分又は第１の結合部位は、ＣＤ２２を特異的に結合して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を治療する。
【０１０７】
一実施形態において、癌及び障害は、プレＢ  ＡＬＬ（小児の徴候）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及び同種骨髄移植後のサルベージなどを含むが、これらに限定されず、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及びＲＯＲ１（例えば、ＣＤ１９及び他の標的の１つ）の２又は３つを標的化する架橋剤（又は単一薬剤に含まれる結合部分又は部位）の組み合わせを使用して治療できる。
【０１０８】
一例において、本発明の細胞は、異なる第１及び第２の膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）、例えば、それらの第２の抗原が異なるＣＡＬ（及び必要に応じて、そうでなければ同じであるもの）を含む。同様に、本発明は、例えば、本発明の移植片に含まれる、本発明の免疫細胞の混合物（例えば、ＣＡＬ細胞の混合物）を提供し、混合物は異なる膜貫通タンパク質（例えば、それらの第２の抗原が異なる別々のＣＡＬ）を含む細胞を含む。一例において、本発明の細胞は、異なる第１及び第２の架橋剤、例えば、それらの第１の部分／第１の抗原結合部位の特異性が異なる架橋剤を含む（及び必要に応じて、そうでなければ、同じである架橋剤、例えば、同一の第２の部分／第２の抗原結合部位を含む第１及び第２の架橋剤を含む）。これは、例えば、癌による治療に対する耐性を低下させるのに有用であるか、又は表面が複数の標的抗原を発現する癌細胞などの細胞集団をより効果的に標的化するのに有用であり得る。
【０１０９】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、メソセリンに特異的に結合して、中皮腫、膵臓癌若しくは卵巣癌を治療又は予防する。
【０１１０】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａに特異的に結合して、急性骨髄性白血病を治療又は予防する。
【０１１１】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、トリプルネガティブ乳癌若しくは非小細胞肺癌を治療又は予防する。
【０１１２】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、ＰＳＭＡに特異的に結合して、前立腺癌を治療又は予防する。
【０１１３】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、糖脂質Ｆ７７に特異的に結合して、前立腺癌を治療又は予防する。
【０１１４】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合して、神経膠芽腫を治療又は予防する。
【０１１５】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合結合部位は、ＧＤ−２に特異的に結合して、神経芽細胞腫若しくは黒色腫を治療又は予防する。
【０１１６】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ ＴＣＲに特異的に結合して、骨髄腫、肉腫又は黒色腫を治療する。
【０１１７】
一実施形態において、架橋剤の第１の部分／第１の抗原結合部位は、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲに特異的に結合して、骨髄腫、肉腫及び黒色腫を治療する。
【０１１８】
一例において、本方法を用いる上記治療は、疾患若しくは病態又はその症状の進行を低下させる。一例において、本方法を用いる上記治療は、例えば、少なくとも１、２、３、４、又は５年の間、疾患若しくは病態又はその症状の発生率を低下させる。
【０１１９】
一例において、本発明の方法は、標的細胞が死滅又は数が減少している移植片を生成するようにエクスビボで実施され、移植片は、ヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスクを低減するために、患者（例えば、ヒト）に投与（例えば、注入）するためのものである。
【０１２０】
一例において、本方法はインビトロである。別の例において、本方法は、哺乳動物、例えば、ヒト、男性若しくは女性、又は男の子供若しくは女の子供、又はヒト乳児（例えば、１、２、３又は４歳以下）におけるインビボである。一例において、患者は成人のヒト又は小児ヒト患者である。
【０１２１】
特定の実施形態
本発明は、以下の番号付きパラグラフで特定の実施形態を提供する：
１．標的細胞に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ）を標的化する方法であって、
Ａ．架橋剤を提供することであって、剤が
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片である、架橋剤を提供すること；
Ｂ．キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供することであって、免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、リガンドが、
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第２の抗原を含む細胞外部分と、
ｉｖ．薬剤が第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供すること；
Ｃ．ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤を標的細胞と組み合わせることであって、標的細胞が上記第１の標的抗原を含み、第１の標的抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．それによって架橋剤が第１及び第２の抗原に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する
組み合わせること、
を含む方法。
【０１２２】
ＣＡＬは、改変され、すなわち、部分及びドメインの非天然の組み合わせを含む。例えば、リガンドは、ＣＤ３細胞外ドメイン（第２の抗原）、ＣＤ２８又は４−１ＢＢドメイン（第１のシグナル伝達ドメイン）及びＣＤ３ゼータドメインを含む単一ポリペプチドを含む（すなわち、１つのそのようなポリペプチドのみを有する）。この場合、ＣＤ３細胞外ドメイン及びＣＤ２８又は４−１ＢＢドメインは同一の受容体で天然に存在しないので（例えば、天然のＣＤ３受容体複合体では存在しない）、リガンドは、改変されたドメインの組み合わせを含む。したがって、一例において、第２の抗原及び第１のシグナル伝達ドメインは、細胞の受容体に天然には含まれないか、又は本発明の方法の主題である人々又は人に天然には含まれない。例えば、免疫細胞は、上記組み合わせを含む受容体をコードする内因性ヌクレオチド配列（複数可）を含まない。
【０１２３】
抗体又は結合部位に関して本明細書で使用される用語「特異的に結合する」は、ＳＰＲによって決定される１ｍＭ以下の結合親和性で特定の抗原を認識する抗体又は結合部位を意味する。
【０１２４】
標的の結合能、特異性及び親和性（（ＫＤ（ｋｄとも呼ばれる）、Ｋｏｆｆ及び／又はＫｏｎ）は、当技術分野における任意の常法によって、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、決定できる。本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、特定の結合部位／リガンド、受容体／リガンド又は抗体／抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
【０１２５】
一実施形態において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は２５℃で行われる。別の実施形態において、ＳＰＲは３７℃で行われる。
【０１２６】
一実施形態において、ＳＰＲは、約ｐＨ７などの生理的ｐＨで又はｐＨ７．６で（例えば、ｐＨ７．６のＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ−ＥＰとも呼ばれる）を用いて）行われる。
【０１２７】
一実施形態において、ＳＰＲは、生理食塩レベル、例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌで行われる。
【０１２８】
一実施形態において、ＳＰＲは、０．０５体積％以下の界面活性剤レベルで、例えば、０．０５％のＰ２０（ポリソルベート２０；例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０（商標））及び３ｍＭのＥＤＴＡの存在下で行われる。
【０１２９】
一例において、ＳＰＲは、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤（例えば、Ｐ２０）及び３ｍＭのＥＤＴＡの緩衝液中で２５℃又は３７℃で行われる。緩衝液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有してよい。一例において、ＳＰＲは、ＨＢＳ−ＥＰ中で２５℃又は３７℃にて行われる。ＨＢＳ−ＥＰは、Ｔｅｋｎｏｖａ社（カリフォルニア州；カタログ番号Ｈ８０２２）から入手可能である。
【０１３０】
一例において、親和性（例えば、ＶＨ／ＶＬ結合部位を含む薬剤の）は、ビアコア（商標）により又はＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（商標）（バイオラッド（登録商標）を用いるなど、任意の標準的なＳＰＲ装置を用いることによりＳＰＲを用いて決定される。結合データは、標準的な技術を用いて、例えば、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（商標）解析ソフトウェアに固有のモデルを用いて、固有の１：１モデルに適合させることができる。
【０１３１】
第２の抗原（ドメイン又はペプチドであり得る）とＣＡＬの膜貫通ドメインの間、又は第１のシグナル伝達ドメインとＣＡＬの膜貫通ドメインの間に、スペーサ（ドメイン又はペプチド）が必要に応じて存在する。本明細書で使用される用語「スペーサー」は一般に、膜貫通ドメインを第２の抗原又はＣＡＬ中のシグナル伝達ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサーは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含んでよい。
【０１３２】
必要に応じて、架橋剤の各結合部位は、抗体結合部位を、例えば、抗原に対するＶＨ／ＶＬ結合部位を含む。
【０１３３】
上記シグナル伝達は、免疫細胞の活性、例えば、細胞傷害性又は細胞増殖を上方制御又は下方制御できる。
【０１３４】
第５及び第６の構成の例
代替例において、パラグラフ１は、以下の代替条項Ｉ〜ＶＩＩを提供する。したがって、パラグラフ２以降の特徴は、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれかと組み合わせ可能である。そのため、以下の「パラグラフ１」への言及は、代替例において、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれか１つとして読み取ることができる。パラグラフ２以降のいずれか１つの中の「第１の抗原結合部位」は、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれかに記載の「第１の結合部分」として読み取ることができる。パラグラフ２以降のいずれか１つの中の「第２の抗原結合部位」は、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれかに記載の「第２の結合部分」として読み取ることができる。パラグラフ２以降のいずれか１つの中の「第１の抗原」は、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれかに記載の「第４の結合部分」として読み取ることができる。パラグラフ２以降のいずれか１つの中の「第２の抗原」は、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれかに記載の「第３の結合部分」として読み取ることができる。パラグラフ２以降のいずれか１つの中のＣＡＬは、条項Ｉ〜ＶＩＩのいずれかの「膜貫通タンパク質」、「ＣＡＲ」又は「ＣＡＬ」として読み取ることができる。
【０１３５】
Ｉ．標的細胞に免疫細胞を標的化する方法であって、
Ａ．架橋剤を提供することであって、剤が
ｖｉｉ．第１の結合部分；及び
ｖｉｉｉ．第２の結合部分
を含む多特異性結合断片である、架橋剤を提供すること；
Ｂ．免疫細胞を提供することであって、免疫細胞が
ｉｘ．膜貫通ドメインに連結される第３の結合部分を含む細胞外部分であって、第２及び第３の部分が特異的結合対（ＳＢＰ１）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合する、細胞外部分と、
ｘ．第２及び第３の部分が共に結合する場合の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む膜貫通タンパク質を発現する、免疫細胞を提供すること；
Ｃ．免疫細胞及び架橋剤を標的細胞と組み合わせることであって、標的細胞が第４の結合部分を含み、第４の結合部分が細胞外にあり、
ｘｉ．それによって第１及び第４の部分が特異的結合対（ＳＢＰ２）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し；
ｘｉｉ．第２及び第３の部分が共に結合しそれによって免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節し；かつ
ｘｉｉｉ．架橋剤の分子量が１２５ｋＤａ以下である、
組み合わせること
を含む、方法。
【０１３６】
ＩＩ．第１及び第２の結合部分がリガンド結合部位である、条項Ｉに記載の方法。
【０１３７】
ＩＩＩ．第１及び第２の結合部分が、それぞれ第１及び第２の抗原結合部位（例えば、ＶＨ／ＶＬ抗原結合部位）である、条項ＩＩに記載の方法。
【０１３８】
どのように抗体ＶＨドメインが抗体ＶＬドメインと対を形成して抗原を特異的に結合するＶＨ／ＶＬ結合部位を形成するかは周知である。
【０１３９】
ＩＶ．ＳＢＰ１及びＳＢ２の各々が、
（ａ）抗原と抗原結合部位（例えば、抗原及びＶＨ／ＶＬ抗原結合部位；又はスーパー抗原及び抗体可変ドメイン又は定常ドメイン）；並びに
（ｂ）受容体及びリガンド
からなる群から選択される、条項Ｉ〜ＩＩＩのいずれか一項に記載の方法。
【０１４０】
スーパー抗原の例は、プロテインＡ（例えば、黄色ブドウ球菌のプロテインＡのリガンド結合ドメイン）、プロテインＧ及びプロテインＬ（（例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌスのプロテインＬのリガンド結合ドメイン）又はｇｐ１２０のリガンド結合ドメインである。
【０１４１】
一例において、ＳＢ１及び／又はＳＢ２のそれぞれは、成長因子ドメイン−成長因子受容体ペア、又はホルモンドメイン−ホルモン受容体ペアである。受容体は、同族リガンドの結合部位を含むが、そうでなければ完全な受容体である必要はない、すなわち、受容体断片であり得る。
【０１４２】
Ｖ．膜貫通タンパク質がキメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）であり、第３の部分が抗原であり第２部分が抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖ）であり、かつ必要に応じて第１の部分が抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖ）であり第４の部分が抗原である、条項Ｉ〜ＩＶのいずれか一項に記載の方法。
【０１４３】
ＶＩ．膜貫通タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、第３の部分が抗原結合部位であり第２の部分が抗原であり、かつ必要に応じて第１の部分が抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖ）であり第４の部分が抗原である、条項Ｉ〜ＩＶのいずれか一項に記載の方法。
【０１４４】
ＶＩＩ．架橋剤の分子量が１１５ｋＤａ以下、例えば、５５〜１１５ｋＤａ又は６０〜１００ｋＤａである、条項Ｉ〜ＶＩのいずれか一項に記載の方法。
【０１４５】
以下の機能が全ての構成に適用可能である。
【０１４６】
一例において、結合剤は、その分子量が１２５、１２０、１１５、１１０、１００又は５０ｋＤａ以下であるリガンドトラップである。一例において、トラップの第１の結合部分はリガンド結合部位、例えば、リガンド受容体の結合部位を含み、第２の結合部位は抗体Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域）を含み、第３の結合部分はＦｃ受容体の結合部位（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ１６Ａ又はＣＤ１６Ｂ）を含み、第４の結合部分は上記リガンドに含まれる。本発明のこのような結合剤は有利に、上記のような抗体よりも短い半減期を有する。一例において、リガンドは、ヒトＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＮ、ＩＬ−６、ＢＬｙｓ、ＡＰＲＩＬ、アクチビンＡ、ＴＮＦアルファ、ＢＭＰ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ又はＰＧＦである。一例において、第１の結合部分は、ＩＬ−１Ｒドメイン、ｇｐ１３０ドメイン、ＡｃｔＲＩＩＡドメイン、ＡｃｔＲＩＩＢドメイン、Ａｌｋ１ドメイン、ＯＰＧドメイン及びＶＥＧＦＲ１及び／又はＶＥＧＦＲ２ドメインを含む。一例において、第１の結合部分は、ヒトＩＬ−１Ｒ、ｇｐ１３０、ＡｃｔＲＩＩＡドメイン、ＡｃｔＲＩＩＢ、Ａｌｋ１、ＯＰＧ、ＶＥＧＦＲ１、又はＶＥＧＦＲ２のリガンド結合部位を含む。
【０１４７】
一例において、薬剤は、アフリベルセプト、Ｚａｌｔｒａｐ（商標）、又はＥｙｌｅａ（商標）（かつ第４の結合部分はＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ又はＰＧＦである）、ラニビズマブ又はＬｕｃｅｎｔｉｓ（商標）（かつ第４の結合部分はＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ又はＰＧＦである）、エタネルセプト又はＥｎｂｒｅｌ（商標）（かつ第４の結合部分はＴＮＦアルファである）、セルトリズマブ（すなわち、ＰＥＧを除くセルトリズマブペゴル又はＣｉｍｚｉａ（商標）のＦａｂ）（かつ第４の結合部分はＴＮＦアルファである）、アタシセプト（及び第４の結合部分はＢＬｙｓである）、リロナセプト又はＡｒｃａｌｙｓｔ（商標）（かつ第４の結合部分はＩＬ−１である）からなる群から選択されるか、或いは、本発明の架橋剤の第１の結合部分は、上記群から選択される薬剤のリガンド結合部位を含む。
【０１４８】
一例において、各結合部分は、ヒトであるか、又はヒト部分、例えば、ヒトリガンド又はヒト結合部位に由来する。
【０１４９】
２．架橋剤がＩｇＧのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する、条項１に記載の方法。
【０１５０】
必要に応じて、架橋剤は、ＩｇＡのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する。必要に応じて、架橋剤は、ＩｇＭのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する。必要に応じて、架橋剤は、ＩｇＤのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する。必要に応じて、架橋剤は、ＩｇＥのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する。
【０１５１】
３．架橋剤が１５、１０又は５日以下のヒト血清半減期を有する、条項２の方法。
【０１５２】
当業者は、かかる半減期を日常的に決定する方法を知っている。本明細書に開示される断片を含む、多くの従来技術の断片の血清半減期は、当技術分野で知られている。
【０１５３】
４．半減期が１日未満である、条項３に記載の方法。
【０１５４】
５．第１の結合部位がＶＨ／ＶＬ結合部位である、条項１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１５５】
６．第２の結合部位がＶＨ／ＶＬ結合部位である、条項１〜５のいずれかに記載の方法。
【０１５６】
７．第１の抗原に対する第１の結合部位の結合親和性（ＫＤ）が、第２の抗原に対する第２の結合部位の親和性より少なくとも５倍、１０倍又は２０倍低い、条項１〜６のいずれかに記載の方法。
【０１５７】
このように、第１の抗原への結合は、第２の抗原より強力である。これは、架橋剤のスイッチング動作を制御するのに役立ち得る。
【０１５８】
例えば、ブリナツモマブは、Ｂ細胞により唯一発現されるマーカーであるＣＤ１９を介して、悪性Ｂ細胞を高度に特異的（１．６×１０−９Ｍの親和性）に標的にする。また、ブリナツモマブは、ＣＤ３とのより低い親和性相互作用（８．７×１０−８Ｍ）を介してＴ細胞を動員し、活性化する。一例において、架橋剤は、ブリナツモマブであるか、又はブリナツモマブを含む。ブリナツモマブの配列は、以下の配列番号１９に示される。一実施形態において、したがって、薬剤は配列番号１９を含む。
【０１５９】
８．第１の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１０ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有し、第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定される５０ｎＭ以上（例えば、最大１ｍＭ）の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１〜７のいずれかに記載の方法。
【０１６０】
これは、生体内で免疫細胞活性の緩和を助けるために、免疫細胞よりも標的細胞への優先的な結合を生み出すのに有用である。
【０１６１】
天然のＴＣＲペプチド／ＭＨＣ相互作用の結合親和性は、約０．１〜５００μΜのＫＤである。一例において、第２の抗原への第２の結合部位の結合（第１〜第４の構成）／本発明の第３の部分への第２の部分の結合（第５又は第６の構成）についてのＫＤは、１００ｎＭ未満、例えば、５０ｎＭ以上で１００ｎＭ未満のＫＤ、例えば、５０ｎＭ〜９５、９０、８５又は８０ｎＭである。１００ｎＭより低い親和性は、本発明の免疫細胞の表面上の天然のＴＣＲ結合よりむしろ改変膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）への優先的な結合を促進するのに有用である。一例において、免疫細胞は、ＣＡＬ−Ｔ又はＣＡＲ−Ｔ細胞であり、第１の抗原に対する架橋剤の結合親和性は、第２の抗原／第３の部分についての架橋剤の親和性よりも高く、第２の抗原／第３の部分についての親和性は、１００、９０又は８５ｎＭ未満である。そのため、ＴＣＲ及び第２の抗原又は第３の部分が本発明の免疫細胞上で共発現される場合、このように相対的な結合親和性を選択することによって、細胞は、Ｔ細胞の任意の内因性ＴＣＲを介するよりもむしろ本発明の改変膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）に優先的に結合され得る。これは、膜貫通タンパク質を介するシグナル伝達を促進するのに有用である。
【０１６２】
９．第１の結合部位が、ＳＰＲによって決定される２ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有し、第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定される６０ｎＭ以上（例えば、最高１ｍＭ）の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１〜８のいずれかに記載の方法。
【０１６３】
１０．第１の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１００ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１〜９のいずれかに記載の方法。
【０１６４】
１１．第１の結合部位が、ＳＰＲによって決定されるＫｏｆｆ＝１０−３／秒以下の第１の抗原に対する結合解離速度を有する、条項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０１６５】
１２．第２の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１００ｎＭ以下の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０１６６】
１３．第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定されるＫｏｆｆ＝１０−３／秒以下の第２の抗原に対する結合解離速度を有する、条項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【０１６７】
本発明は、架橋剤に関して、以下の任意の実施形態を含む。
【０１６８】
第１の結合部位の動態
（ａ）第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される０．１（又は約０．１）〜１００００（又は約１００００）ｎＭ、必要に応じて、１（又は約１）〜６０００（又は約６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＦＡ（ＦＡ＝該第１の抗原）を特異的に結合し；
（ｂ）第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される１．５×１０−４（又は約１．５×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒、必要に応じて、３×１０−４（又は約３×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒のオフ速度定数（Ｋｄ）でヒトＦＡを特異的に結合し；かつ
（ｃ）第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される２×１０６（又は約２×１０６）〜１×１０４（又は約１×１０４）／Ｍ／秒、必要に応じて、１×１０６（又は約１×１０６）〜２×１０４（又は約２×１０４）／Ｍ／秒のオン速度定数（Ｋａ）でヒトＦＡを特異的に結合し；
必要に応じて、また：
（ｄ）第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される０．１（又は約０．１）〜１００００（又は約１００００）ｎＭ、必要に応じて、１（又は約１）〜６０００（又は約６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＦＡを特異的に結合し；
（ｅ）第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される１．５×１０−４（又は約１．５×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒、必要に応じて、３×１０−４（又は約３×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒のオフ速度定数（Ｋｄ）でカニクイザルＦＡを特異的に結合し；
（ｆ）第１の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される２×１０６（又は約２×１０６）〜１×１０４（又は約１×１０４）／Ｍ／秒、必要に応じて、１×１０６（又は約１×１０６）〜５×１０３（又は約５×１０３）／Ｍ／秒のオン速度定数（Ｋａ）でカニクイザルＦＡを特異的に結合する。
【０１６９】
必要に応じて、第１の結合部位は、（ａ）及び（ｄ）によるＫＤ、（ｂ）及び（ｅ）によるＫｄ、並びに（ｃ）及び（ｆ）によるＫａを有する。
【０１７０】
第２の結合部位の動態
（ａ’）第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される０．１（又は約０．１）〜１００００（又は約１００００）ｎＭ、必要に応じて、１（又は約１）〜６０００（又は約６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＳＡ（ＳＡ＝該第２の抗原）を特異的に結合し；
（ｂ’）第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される１．５×１０−４（又は約１．５×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒、必要に応じて、３×１０−４（又は約３×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒のオフ速度定数（Ｋｄ）でヒトＳＡを特異的に結合し；かつ
（ｃ’）第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される２×１０６（又は約２×１０６）〜１×１０４（又は約１×１０４）／Ｍ／秒、必要に応じて、１×１０６（又は約１×１０６）〜２×１０４（又は約２×１０４）／Ｍ／秒のオン速度定数（Ｋａ）でヒトＳＡを特異的に結合し；
必要に応じて、また：
（ｄ’）第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される０．１（又は約０．１）〜１００００（又は約１００００）ｎＭ、必要に応じて、１（又は約１）〜６０００（又は約６０００）ｎＭの解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＳＡを特異的に結合し；
（ｅ’）第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される１．５×１０−４（又は約１．５×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒、必要に応じて、３×１０−４（又は約３×１０−４）〜０．１（又は約０．１）／秒のオフ速度定数（Ｋｄ）でカニクイザルＳＡを特異的に結合し；
（ｆ’）第２の抗原結合部位は、表面プラズモン共鳴によって決定される２×１０６（又は約２×１０６）〜１×１０４（又は約１×１０４）／Ｍ／秒、必要に応じて、１×１０６（又は約１×１０６）〜５×１０３（又は約５×１０３）／Ｍ／秒のオン速度定数（Ｋａ）でカニクイザルＳＡを特異的に結合する。
【０１７１】
必要に応じて、第２の結合部位は、（ａ’）及び（ｄ’）によるＫＤ、（ｂ’）及び（ｅ’）によるＫｄ、並びに（ｃ’）及び（ｆ’）によるＫａを有する。
【０１７２】
１４．第１及び第２の抗原結合部位のそれぞれが、ｓｃＦｖ、ナノボディ（商標）、ｄＡｂ、デュオカリン、ＤＡＲｐｉｎ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アドネクチン及びフィノマーからなる群から選択される、条項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１７３】
１５．架橋剤のサイズが、１２５ｋＤａ以下である、条項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０１７４】
一例において、サイズは、１１５、１１０、１００、９０、８０、７０又は６０ｋＤａ以下である。
【０１７５】
これは、上述したように、本発明の有用な利点を有するヒト血清半減期を提供するのに有利である。
【０１７６】
１６．架橋剤のサイズが、８０ｋＤａ以下（例えば、５０又は５５ｋＤａ以下）である、条項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０１７７】
１７．架橋剤が、ＢｉＴＥ（商標）抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、三重特異性ｓｃＦｖ、ｔａｎｄａｂ（商標）、ｄＡｂナノボディ（例えば、ダイマー又はトリマー）、ｄＡｂ多量体（例えば、ダイマー又はトリマー）、ダイアボディ、テトラボディ又はＤＡＲＴ（商標）であるか、又はそれらを含む、条項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０１７８】
一例において、架橋剤は、結合部位を提供するために、１つ、２つ又はそれより多いＦａｂを含む。
【０１７９】
抗原結合部位
一例において、抗原結合部位又は各抗原結合部位（又は第５若しくは第６の構成による場合のリガンド結合部分）は、抗体可変ドメイン（例えば、ＶＬ又はＶＨ、抗体単一可変ドメイン（ドメイン抗体又はｄＡｂ）、ラクダＶＨＨ抗体単一可変ドメイン、サメ免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＮＡ  Ｖ）、ナノボディ（商標）又はラクダ化ＶＨ単一可変ドメイン）；Ｔ細胞受容体結合ドメイン；免疫グロブリンスーパーファミリードメイン；無顎類可変リンパ球受容体（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；２０１０  Ａｕｇ  １；１８５（３）：１３６７−７４；「顎のない脊椎動物における代替的な適応免疫（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｊａｗｌｅｓｓ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ）；Ｈｅｒｒｉｎ  ＢＲ＆Ｃｏｏｐｅｒ  Ｍ  Ｄ．）；フィブロネクチンドメイン（例えば、アドネクチン（商標））；ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２；ｓｃ−ダイアボディ；ｓｃＦａｂ；センチリン及びＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ（商標））から選択される足場に由来する抗原結合部位；リポカリンドメイン；プロテインＡのＺドメインなどのプロテインＡ（例えば、アフィボディ（商標）又はＳｐＡ）；Ａドメイン（例えば、アビマー（商標）又はマキシボディ（商標））；熱ショックタンパク質（ＧｒｏＥＩ及びＧｒｏＥＳ由来のエピトープ結合ドメイン）；トランスフェリンドメイン（例えば、トランス体）；アンキリンリピートタンパク質（例えば、ＤＡＲｐｉｎ（商標））；ペプチドアプタマー；Ｃ型レクチンドメイン（例えば、テトラネクチン（商標））；ヒトγ−クリスタリン若しくはヒトユビキチン（アフィリン）；ＰＤＺドメイン；サソリ毒素；及びヒトのプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメインからなる群から選択される。
【０１８０】
抗原結合部位のさらなる供給源は、ＷＯ２００７０２４７１５の４０ページの２３行〜４３ページの２３行に開示される可変ドメイン及び抗体のＶＨ／ＶＬペアである。この特定の開示は、本明細書に明示的に記述されたものとして参照により本明細書に組み込まれて本発明における使用のため及び本明細書の特許請求の範囲内に含めることができるようにエピトープ結合部分の基礎を提供する。「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分から独立した三次構造を有する折り畳まれたタンパク質構造である。一般に、ドメインは、タンパク質の個別の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残部の機能を喪失することなく、追加されるか、除去されるか、又は他のタンパク質に移すことができる。「単一抗体可変ドメイン」は、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインである。単一抗体可変ドメインはしたがって、完全な抗体可変ドメイン及び、例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的でない配列により置換されている改変可変ドメイン、又は切り詰められているか又はＮ末端若しくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、並びに全長ドメインの少なくとも結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
【０１８１】
語句「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、異なるＶ領域又はドメインから独立して抗原又はエピトープを特異的に結合する抗体可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の領域又はドメインが単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない、他の異なる可変領域又は可変ドメインを有する形式（例えば、ホモ又はヘテロ−多量体）で存在してよい（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加の可変ドメインから独立して抗原を結合する）。本明細書で使用される用語「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」は、抗原に結合できる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と同じである。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってよいが、齧歯類（例えば、ＷＯ  ００／２９００４に開示されるような）、テンジクザメ及びラクダ科のＶＨＨ免疫グロブリン単一可変ドメインなどの他の種からの単一抗体可変ドメインも含む。ラクダＶＨＨは、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体を生成する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的な技術に従ってヒト化されてよく、かかるドメインは依然として、本発明による「ドメイン抗体」であると見なされる。本明細書で使用される「ＶＨ」は、ラクダ科ＶＨＨドメインを含む。ＮＡ  Ｖは、テンジクザメを含む軟骨魚類において同定された免疫グロブリン単一可変ドメインの別の種類である。これらのドメインはまた、新規抗原受容体可変領域（Ｖ（ＮＡＲ）又はＮＡＲＶと一般に略記される）としても知られている。さらなる詳細については、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４，６５６−６６５（２００６）及びＵＳ２００５００４３５１９Ａを参照されたい。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、折り畳まれたＩｇ様可変ドメインを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異種配列と置換されて、異なる結合特性を付与できる。異なる結合特異性を有するように改変されたＣＴＬＡ−４分子はまた、Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓとして知られている。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２），３１−４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン（ｂｉｌｉｎ）、レチノイド及び脂質などの疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、異なる標的抗原に結合するように改変できる円錐形構造の開口端にいくつかのループを有する剛性βシート二次構造を有する。アンチカリンは、サイズが１６０〜１８０個のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７−３５０（２０００）、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１及びＵＳ２００７０２２４６３３を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するように改変できる、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ由来の足場である。そのドメインは、約５８個のアミノ酸の三重らせん状の束から���る。ライブラリが、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７，４５５−４６２（２００４）及びＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照されたい。アビマー（商標）は、Ａドメイン足場ファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５個のアミノ酸のネイティブドメインが、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａ−ドメインのファミリーが示す天然変異のシャッフルによって作製される。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６），９０９−９１７（Ｊｕｎｅ  ２００７）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容的な表面ループ中のペプチド配列の挿入により異なる標的抗原に結合するように改変できる。改変トランスフェリン足場の例としては、トランス体が挙げられる。さらなる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４，２４０６６−２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（商標））は、細胞骨格への内在性膜タンパク質の接着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一アンキリンリピートは、２つのα−ヘリックス及びβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの第１のαヘリックス及びβターン中の残基をランダム化することによって、異なる標的抗原に結合するように改変できる。それらの結合界面は、モジュール数を増加させることによって増大できる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３），ＰＮＡＳ  １００（４），１７００−１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５−１０２８（２００７）及びＵＳ２００４０１３２０２８を参照されたい。フィブロネクチンは、抗原に結合するように改変できる足場である。アドネクチン（商標）は、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５のリピート単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。βサンドイッチの一端にある３つのループは、興味のある治療標的をアドネクチンが特異的に認識できるように改変できる。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５−４４４（２００５）、ＵＳ２００８０１３９７９１、ＷＯ２００５０５６７６４及びＵＳ６８１８４１８Ａ１を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入される制限された可変ペプチドループを含有するチオレドキシン（ＴｒｘＡ）、からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，７８３−７９７（２００５）を参照されたい。マイクロボディは、３〜４個のシステイン架橋を含有する、２５〜５０個のアミノ酸長の天然に存在するマイクロタンパク質に由来し、マイクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチ���が挙げられる。マイクロタンパク質は、マイクロタンパク質の全体的な折り畳みに影響を与えずに最大２５個のアミノ酸を含むように改変できるループを有する。改変ノッチンドメインのさらなる詳細については、ＷＯ２００８０９８７９６を参照されたい。他のエピトープ結合部分及びドメインは、異なる標的抗原結合特性を改変するための足場として使用されているタンパク質を含みヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）を含み、ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺ−ドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）は、第７章−治療用抗体のハンドブックからの非抗体足場（２００７、Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ編）及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５：１４−２７（２００６）で概説されている。本発明の架橋剤の抗原結合部位又はリガンド結合部分は、これらの代替タンパク質ドメインのいずれかに由来してよい。
【０１８２】
１８．ＣＡＬが、第２の抗原と膜貫通ドメインの間にヒンジ領域及び／又はリンカーを含む、条項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０１８３】
１９．標的細胞が、ヒト細胞である、条項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【０１８４】
２０．架橋剤が、第３の抗原結合部位を含む、条項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０１８５】
２１．第３の抗原が、第１の抗原とは異なる、条項２０に記載の方法。
【０１８６】
２２．第３の抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、標的細胞に含まれる細胞表面ＴＡＡである、条項２０又は２１に記載の方法。
【０１８７】
２３．第１及び／又は第３の抗原が、正常細胞よりも癌細胞上でより一般的に存在する、条項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【０１８８】
２４．標的細胞が、腫瘍細胞であり、シグナル伝達が、細胞傷害活性（例えば、ＡＤＣＣ）又は免疫細胞の増殖を上方制御する、条項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【０１８９】
２５．シグナル伝達が該細胞傷害性を上方制御して、腫瘍細胞が死滅するか、又は腫瘍細胞の増殖が下方制御される、条項２４に記載の方法。
【０１９０】
２６．標的細胞が、白血病細胞、リンパ腫細胞、腺癌細胞又は癌幹細胞である、条項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【０１９１】
２７．第１の抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、条項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【０１９２】
２８．第１の抗原が、ヒトＣＤ１９（及び必要に応じて、標的細胞が白血病細胞又はリンパ腫細胞である）、ＥｐＣＡＭ（及び必要に応じて、標的細胞が肺癌細胞、胃腸癌細胞、腺癌、癌幹細胞である）、ＣＤ２０（及び必要に応じて、標的細胞が白血病細胞である）、ＭＣＳＰ（及び必要に応じて、標的細胞がメラノーマ細胞である）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、シアリルＴｎ、ＣＤ１３３、ＣＤ３３（及び必要に応じて、標的細胞が白血病細胞、例えば、ＡＭＬ細胞である）、ＰＭＳＡ、ＷＴ１、ＣＤ２２、Ｌ１ＣＡＭ、ＲＯＲ−１、ＭＵＣ−１６、ＣＤ３０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ＴＡＧ−７２、ムチン、ＣＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＣＤ６６ｅ、ＥｐｈＡ２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、アンジオポエチン、メソテリン、糖脂質Ｆ７７又はテネイシンである、条項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【０１９３】
２９．第１の抗原結合部位が、ブリナツモマブ又は抗体ＨＤ３７のＣＤ１９結合部位；カツマキソマブのＥｐＣＡＭ結合部位；ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位；リンフォムン（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）のＣＤ２０結合部位；エルツマキソマブのＨｅｒ２結合部位；ＡＭＧ２１１（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１）のＣＥＡ結合部位；パソツキシズマブのＰＳＭＡ結合部位；ソリトマブのＥｐＣＡＭ結合部位；ＲＧ７２２１若しくはＲＧ７７１６のＶＥＧＦ又はアンジオポエチン２結合部位；ＲＧ７５９７のＨｅｒ１又はＨｅｒ３結合部位；ＭＭ１１１のＨｅｒ２又はＨｅｒ３結合部位；ＭＭ１４１のＩＧＦ１Ｒ又はＨｅｒ３結合部位；ＭＧＤ００６のＣＤ１２３結合部位；ＭＧＤ００７のｇｐａ３３結合部位；ＴＦ２のＣＥＡ結合部位；ＡＦＭ１３のＣＤ３０結合部位；ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位；及びＬＹ３１６４５３０のＨｅｒ１又はｃＭｅｔ結合部位からなる群から選択される抗体の可変ドメインを含む、条項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【０１９４】
３０．架橋剤が、ブリナツモマブ又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（必要に応じて、標的細胞が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）Ｂ細胞である）；ＡＭＧ２１１又はそのＣＤ３／ＣＥＡ結合誘導体（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１；必要に応じて、標的細胞が消化管癌細胞である）；パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）又はそのＣＤ３／ＰＭＳＡ結合誘導体（必要に応じて、標的細胞が前立腺癌細胞である）；ソリトマブ又はそのＣＤ３／ＥｐＣＡＭ結合誘導体（必要に応じて、標的細胞が癌細胞である）；又はＡＦＭ１１又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（及び必要に応じて、標的細胞がＡＬＬ細胞又は非ホジキンリンパ腫細胞である）である、条項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【０１９５】
３１．第１の抗原結合部位が、レオプロ（商標）；アブシキシマブ；リツキサン（商標）；リツキシマブ；ゼナパックス（商標）；ダクリズマブ；シミュレクト（商標）；バシリキシマブ；シナジス（商標）；パリビズマブ；レミケード（商標）；インフリキシマブ；ハーセプチン（商標）；トラスツズマブ；マイロターグ（商標）；ゲムツズマブ；キャンパス（商標）；アレムツズマブ；ゼヴァリン（商標）；イブリツモマブ；ヒュミラ（商標）；アダリムマブ；ゾレア（商標）；オマリズマブ；ベクサール（商標）；トシツモマブ；ラプティバ（商標）；エファリズマブ；エルビタックス（商標）；セツキシマブ；アバスチン（商標）；ベバシズマブ；タイサブリ（商標）；ナタリズマブ；アクテムラ（商標）；トシリズマブ；ベクチビックス（商標）；パニツムマブ；ルセンティス（商標）；ラニビズマブ；ソリリス（商標）；エクリズマブ；シムジア（商標）；セルトリズマブ；シンポニ（商標）；ゴリムマブ、イラリス（商標）；カナキヌマブ；ステララ（商標）；ウステキヌマブ；アーゼラ（商標）；オファツムマブ；プロリア（商標）；デノスマブ；ヌマックス（商標）；モタビズマブ；ＡＢＴｈｒａｘ（商標）；ラキシバクマブ；ベンリスタ（商標）；ベリムマブ；ヤーボイ（商標）；イピリムマブ；アドセトリス（商標）；ブレンツキシマブ；ベドチン（商標）；パージェタ（商標）；ペルツズマブ；カドサイラ（商標）；アドトラスツズマブ；ガジバ（Ｇａｚｙｖａ）（商標）及びオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の可変ドメインを含む、条項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【０１９６】
３２．標的細胞が、血液細胞である、条項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【０１９７】
代替例として、標的細胞は、ヒト若しくは動物の幹細胞又は骨髄細胞である。
【０１９８】
３３．標的細胞が、Ｂ細胞又はＴ細胞である、条項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【０１９９】
３４．第１の抗原が自己免疫疾患の標的であり、シグナル伝達が細胞傷害活性又は免疫細胞の増殖を下方制御する、条項１〜２１及び３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【０２００】
本明細書で使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答に起因する疾患として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切で過度な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、とりわけ、アディソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、ジストロフィー表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
３５．第２の抗原が、免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞又はＮＫ細胞）の細胞外抗原である、条項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【０２０２】
一例において、抗原は、本発明の細胞の種類と同じである細胞型に含まれ、例えば、本発明のＣＡＬ細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬであり、第２の抗原は、それぞれＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬの細胞表面抗原である。
【０２０３】
３６．第２の抗原がタンパク質抗原であり、免疫細胞が、ＣＡＬに含まれる第２の抗原のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列（例えば、ＣＤ３細胞外ドメイン配列）を発現する内因性配列である第１のヌクレオチド配列を含む、条項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【０２０４】
そのため、第２の抗原は、自己であり、架橋剤によって認識される。ヒト患者がこの細胞を受け取る場合、患者が第２の抗原も発現するならば、これは、ヒトによるＣＡＬ細胞の免疫拒絶のリスクを低減する。
【０２０５】
一例において、第２の抗原は、合成タンパク質配列によって提供される。
【０２０６】
３７．第２の抗原が、ヒトＣＤ３又はヒトＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメイン配列によって提供される、条項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【０２０７】
一例において、第２結合部位は、タンダブ（商標）のＡＦＭ１２又はＡＦＭ１３のＣＤ１６Ａ結合部位の可変ドメインを含む。
【０２０８】
一例において、ＣＡＬ細胞は、内因性ヌクレオチド配列から上記第２の抗原を発現しない、例えば、この配列は、細胞ゲノム中でノックアウト又は不活性化される。一例において、第２の抗原は、ＣＤ３又はＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメイン配列によって提供され、ＣＡＬ−Ｔ細胞の内因性ゲノムは、ＴＣＲシグナル伝達を非機能にする改変を含む。例えば、内因性の対応するＣＤ３又はＣＤ１６Ａ細胞外ドメインのエクソン配列は、ノックアウト又は不活性化されている。一例において、ＣＤ３細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はＣＤεドメインである。当業者は、例えば、相同組換え及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼ切断を使用することによる、細胞ゲノム中の配列を正確にノックアウトする又は改変するための通常の方法を知っている。
【０２０９】
３８．ＣＤ３細胞外ドメインが、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はＣＤεドメインである、条項３７のいずれかに記載の方法。
【０２１０】
必要に応じて、ＣＤ３細胞外ドメインはＣＤ３γドメインである。必要に応じて、ＣＤ３細胞外ドメインはＣＤ３δドメインである。必要に応じて、ＣＤ３細胞外ドメインはＣＤ３εドメインである。
【０２１１】
３９．第２の標的結合部位が、抗体Ｌ２Ｋ−０７、抗体ＯＫＴ３（商標）、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ及びフォラルマブからなる群から選択される抗体の抗ＣＤ３結合部位の可変ドメインを含む、条項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【０２１２】
４０．細胞外部分が非自己エピトープを含まない、条項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【０２１３】
これは、レシピエント患者が細胞外部分のドメインも発現する場合、拒絶反応のリスクを減らすことができる。一例において、「自己」は、患者、例えば、免疫細胞及び本発明の架橋剤のヒトレシピエントの発現型、並びに／又は免疫細胞が由来する祖先細胞の発現型（例えば、該患者から得られる祖先細胞）によって決定される。
【０２１４】
４１．Ａ．ＣＡＬの第２の抗原が、抗原のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；
Ｂ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ１を含みかつ第２の抗原のアミノ酸配列と同一でありかつＲ１を含むアミノ酸配列をコードする；又は第２の抗原のアミノ酸配列の天然に存在する変異体でありかつＲ１を含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、かつ
Ｃ．Ｓ２が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
条項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【０２１５】
これは、本明細書でさらに説明するように、細胞と本発明の改変膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ）との間の適合性の増加された機会に適合する利点を提供する。
【０２１６】
一例において、変異体のアミノ酸配列は、第２の抗原の配列と少なくとも８０、９０又は９５％同一である。
【０２１７】
用語「非同義」のＳＮＰは、上で説明されている。
【０２１８】
４２．Ａ．ＣＡＬの第２の抗原が、抗原のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；かつ
Ｂ．ＣＡＬ細胞が同種移植片に含まれ、方法が工程（ｃ）においてヒトに移植片を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及び標的細胞が組み合わされ、ヒトゲノムが上記投与前に上記ＳＮＰ１を含む、条項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【０２１９】
これは、本明細書で説明するような適合する利点を提供する。
【０２２０】
本明細書で使用する「移植片」は、個体に導入される細胞、組織、又は臓器を指す。移植材料の供給源は、培養細胞、別の個体由来の細胞、又は同じ個体からの細胞（例えば、細胞がインビトロで培養された後の）であり得る。
【０２２１】
４３．ＣＡＬの第２の抗原がＣＤ３γ細胞外ドメインであり、Ｒ１がＩ５３、Ｎ５３及びＴ５３（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される、条項４１又は４２に記載の方法。
【０２２２】
４４．第２の抗原がＩ５３を含む、条項４３に記載の方法。
【０２２３】
本発明者は、この位置がヒトにおける天然の変異を示し、Ｉ５３変異体がＥｎｓｅｍｂｌによって示されるように、最も一般的な変異であることを見出した。そのため、本発明者は、この実施形態が本発明のＣＡＬ細胞を受け取るほとんどの患者に適合される実施形態を提供することに気づいた。
【０２２４】
４５．ＣＡＬの第２の抗原がＣＤ３δ細胞外ドメインであり、Ｒ１がＮ３８及びＫ３８（位置番号は配列番号３の位置に対応する）からなる群から選択される、条項４１又は４２に記載の方法。
【０２２５】
４６．第２の抗原がＮ３８を含む、条項４５に記載の方法。
【０２２６】
本発明者は、この位置がヒトにおける天然の変異を示し、Ｎ３８変異体がＥｎｓｅｍｂｌによって示されるように、最も一般的な変異であることを見出した。そのため、本発明者は、この実施形態が本発明のＣＡＬ細胞を受け取るほとんどの患者に適合される実施形態を提供することに気づいた。
【０２２７】
４７．ＣＡＬの第２の抗原がＣＤ３ε細胞外ドメインであり、Ａ１０８、Ｅ１０８及びＶ１０８（位置番号は配列番号５の位置に対応する）からなる群から選択される、条項４１又は４２に記載の方法。
【０２２８】
４８．第２の抗原がＡ１０８を含む、条項４７に記載の方法。
【０２２９】
本発明者は、この位置がヒトにおける天然の変異を示し、Ａ１０８変異体がＥｎｓｅｍｂｌによって示されるように、最も一般的な変異であることを見出した。そのため、本発明者は、この実施形態が本発明のＣＡＬ細胞を受け取るほとんどの患者に適合される実施形態を提供することに気づいた。
【０２３０】
４９．ＣＡＬ細胞が同種移植片に含まれ、方法が工程（ｃ）においてヒトに移植片を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及び標的細胞が組み合わされ、ヒトが移植片投与前に上記ＳＮＰ１を含む、条項４２〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【０２３１】
５０．ＣＡＬ細胞が、ヒトからの祖先細胞の改変子孫であり、方法が工程（ｃ）においてヒトに改変ＣＡＬ細胞を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及び標的細胞が組み合わされる、条項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【０２３２】
５１．Ａ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）が、シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含む第３のヌクレオチド配列（Ｓ３）によって細胞中でコードされており；
Ｂ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ２を含みシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする第４のヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ２がＳＤ１と同一でありＲ２を含むか又は（ｉｉ）ＳＤ１の天然に存在する変異体でありＲ２を含み；かつ
Ｃ．Ｓ４が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ２が非同義ＳＮＰである、
条項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【０２３３】
５２．ＳＤ１及びＳＤ２のそれぞれが、Ｒ２を含む免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、条項５１に記載の方法。
【０２３４】
細胞のシグナル伝達におけるＩＴＡＭの重要性を考慮すると、本発明のこの態様は、細胞の内因性シグナル伝達機構で機能するための天然の状況と適合するようにＩＴＡＭ中のＳＮＰを適合する。
【０２３５】
５３．シグナル伝達ドメインのＩＴＡＭが同一である、条項５２に記載の方法。
【０２３６】
５４．細胞内部分が、第５のヌクレオチド配列（Ｓ５）によって細胞中でコードされるさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＤ３）を含み、Ｓ５がＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ３）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ３）を含み、細胞のゲノムがシグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードする第６のヌクレオチド配列（Ｓ６）を含み、ＳＤ４がＳＤ３と同一でありＲ３を含むか又はＳＤ３の天然に存在する変異体でありＲ３を含み、Ｓ６が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ３が非同義ＳＮＰである、条項１〜５３のいずれかに記載の方法。
【０２３７】
５５．受容体のＳＤ１及びＳＤ３が異なる、条項５４に記載の方法。
【０２３８】
５６．ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれが、Ｒ３を含むＩＴＡＭを含む、条項５４又は５５に記載の方法。
【０２３９】
５７．ＳＤ３及びＳＤ４のＩＴＡＭが同一である、条項５６に記載の方法。
【０２４０】
５８．ＳＤ３及びＳＤ４が同一である、条項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【０２４１】
５９．ＳＤ３がヒトである、条項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【０２４２】
６０．ＳＤ３のそれぞれが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η、（ＣＤ３イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインである、条項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【０２４３】
ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。その別名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−１ＢＢであり、リンパ球活性化（ＩＬＡ）によって誘導される。これは現在、共刺激免疫チェックポイント分子として免疫学者に関心をもたれている。
【０２４４】
６１．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン（第２の抗原がＣＤ３ドメインではない）、ＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメイン（第２の抗原がＣＤ３ドメインではない）、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６のドメイン（第２の抗原がＣＤ１６ドメインではない）、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインである、条項１〜６０のいずれかに記載の方法。
【０２４５】
本明細書の任意の態様において、第１のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される。
【０２４６】
６２．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、（ａ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１０；（ｂ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１１；及び（ｃ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１２から選択される１、２又は３個のアミノ酸モチーフを含む、条項６１に記載の方法。
【０２４７】
６３．第１のシグナル伝達ドメインがモチーフ（ａ）を含み、モチーフがＡ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７及びＫ８８（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１０と異なる、条項６２に記載の方法。
【０２４８】
これは、ＣＤ３ゼータ配列中の天然のヒトゲノム多型の発明者の分析と、これらの位置が天然変異体であるので、変更について許容されることを発明者が気づいたことに基づいている。同様の分析を用いて、本発明者は、以下の条項及び実施例のように他の可能な変異及び適合する態様も考案した。
【０２４９】
６４．変更が、Ａ６１Ｖ、Ａ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｐ６２Ａ、Ａ６３Ｐ、Ｑ６６Ｈ、Ｇ６７Ｓ、Ｎ６９Ｔ、Ｑ７０Ｙ、Ｑ７０Ｌ、Ｑ７０Ｐ、Ｑ７０Ｗ、Ｎ７３Ｙ、Ｒ７９Ｌ、Ｒ７９Ｇ、Ｅ８２Ｋ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｙ、Ｖ８５Ｉ、Ｄ８７Ｇ及びＫ８８Ｒ（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される、条項６３に記載の方法。
【０２５０】
本発明者は、これらが天然に存在する変異である（そのため、ヒトにおいて許容される）ことを見出した。
【０２５１】
６５．第１のシグナル伝達ドメインがモチーフ（ｂ）を含み、モチーフがＰ１００、Ｑ１０１、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０８、Ｌ１１０、Ａ１２０、Ａ１２２及びＭ１２８（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１１と異なる、条項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【０２５２】
６６．変更が、Ｐ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｌ、Ｑ１０１Ｐ、Ｒ１０３Ｋ、Ｋ１０４Ｅ、Ｎ１０５Ｋ、Ｐ１０６Ｒ、Ｅ１０８Ａ、Ｌ１１０Ｑ、Ａ１２０Ｖ、Ａ１２２Ｖ及びＭ１２８Ｔ（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される、条項６５に記載の方法。
【０２５３】
６７．第１のシグナル伝達ドメインがモチーフ（ｃ）を含み、モチーフがＥ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３６、Ｇ１３７、Ｇ１４０、Ｌ１４５、Ａ１４８、Ｔ１５２、Ａ１５５、Ｌ１５６（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１２と異なる、条項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【０２５４】
６８．変更が、Ｅ１３１Ｋ、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３３Ｗ、Ｋ１３６Ｎ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１４０Ｄ、Ｌ１４５Ｆ、Ａ１４８Ｄ、Ｔ１５２Ｉ、Ａ１５５Ｔ、Ｌ１５６Ｐ（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される、条項６７に記載の方法。
【０２５５】
６９．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｓ５８、Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３（配列番号７の位置に従って番号を付けた位置）からなる群から選択される１個、それより多い又は全てのアミノ酸残基を含む、条項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【０２５６】
本発明者は、かかる残基が細胞内経路におけるシグナル伝達及び認識に関与しており、そのため、これらの残基の保存は、本発明の膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ）を用いる良好なシグナル伝達に有用であることに気づいた。
【０２５７】
７０．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、ｒｓ３６８６５１００１、ｒｓ３７２６５１０４８、ｒｓ７６７１１２６８６、ｒｓ７６５８７７５８０、ｒｓ７５１１４５９５６、ｒｓ７７２８６７１４４、ｒｓ５５８９３５０６、ｒｓ７６１７１０５１０、ｒｓ７７６６０１５４７、ｒｓ７６８６０７３７６、ｒｓ１９３９２２７４１、ｒｓ１９３９２２７４０、ｒｓ１９３９２２７３９、ｒｓ７８０１８８１２６、ｒｓ７７２１２８１７４、ｒｓ７５７９７８２２３、ｒｓ７７９３９７５６２、ｒｓ７４９９２６６５３、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ７５３５７２８６７、ｒｓ３７１７０９７９８、ｒｓ１４５４０７２６７、ｒｓ１４３１８０７２９、ｒｓ１４８５１３４１３、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ７７０３２０２５５、ｒｓ１３９９２６３０１、ｒｓ５６２９７６３６、ｒｓ７６０８９５７５５、ｒｓ１１２８９０５４１、ｒｓ３７０９１０３４０、ｒｓ１４５５０５９０９、ｒｓ７５４９３５００６、ｒｓ７５１５８３９７１、ｒｓ７６６５４１４８１、ｒｓ７６３０７４９６７、ｒｓ７４５８７１２１２、ｒｓ３７２６６５４６１、ｒｓ７６４１８５４９１、ｒｓ７５６３４００３９、ｒｓ７７３５７２４９１、ｒｓ２０１５９４８１５、ｒｓ７８１５１０５１９、ｒｓ１４７５２７５６１、ｒｓ７５１９８１６７７、ｒｓ７６３５３２９３９、ｒｓ７５３２７８２４４、ｒｓ７７１８７３９４９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ７６２７７３７７５、ｒｓ７４８１５８２２０、ｒｓ７７６７０３６８０、ｒｓ５６１２６２９８２、ｒｓ７５８８４６００９、ｒｓ７４６２６２１８３、ｒｓ３７６０４６４４６、ｒｓ２０１９３７４０５及びｒｓ７５２１９８７９５からなる群から選択されるＳＮＰによりコードされる残基を含み、かつ免疫細胞のゲノムが、上記選択されたＳＮＰを含む内因性ヌクレオチド配列を含む、条項６１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【０２５８】
本発明者は、これらのＳＮＰが、変更について許容される、天然に存在するＣＤ３ゼータ及びＣＤ３イータ中の位置での残基をコードすることに気づいた。これは、本明細書で説明するような適合する利点を提供するために、例えば細胞の内因性ゲノムがＳＮＰも含む場合に、有用である。
【０２５９】
７１．第１又は第３のシグナル伝達ドメインが、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、条項１〜７０のいずれかに記載の方法。
【０２６０】
本発明者は、これらが、ＣＤ２８細胞内ドメイン中の天然に存在する変異であり、そのため、本発明の適合する態様に従って適合するための基礎を形成することに気づいた。これは、本明細書で説明されるような適合する利点を提供するために、例えば細胞の内因性ゲノムが選択された残基もコードする場合に、有用である。
【０２６１】
７２．ＣＤ２８ドメインが上記グループの全ての残基を含む、条項７１に記載の方法。
【０２６２】
７３．ＣＤ２８ドメインが、アミノ酸残基Ｙ１９１及びＹ２０９（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）を含む、条項７１又は７２に記載の方法。
【０２６３】
実施例でさらに記載するように、本発明者は、これらの位置が細胞内シグナル伝達に重要である保存されたＣＤ２８細胞内モチーフ（ＹＭＮＭ及びＰＹＡＰ）に見られることに気づいた。
【０２６４】
７４．ＣＤ２８ドメインが、ＹＭＮＭモチーフ（配列番号１３のＹ１９１−Ｍ１９２−Ｎ１９３−Ｍ１９４に対応する）及び／又はＰＹＡＰモチーフ（配列番号１３のＰ２０８−Ｙ２０９−Ａ２１０−Ｐ２１１に対応する）を含む、条項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【０２６５】
７５．ＣＡＬ−免疫細胞が、ＣＡＬ−Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、プレＲＥＰ  ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ又はＴＥＭである、条項１〜７４に記載の方法。
【０２６６】
全体的なメモリーＴ細胞集団内で、いくつかの別個の亜集団は、説明されており、ケモカイン受容体ＣＣＲ７及びＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の発現差異によって認識され得る。ナイーブ細胞のようなメモリーＴＳＣＭ幹細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋及びＩＬ−７Ｒα＋であるが、それらはまた、大量のＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、及びＬＦＡ−１を発現し、かつメモリー細胞に特有の数多くの機能的特質を示す。中枢メモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ−セレクチン及びＣＣＲ７を発現し、それらはＩＬ−２を分泌するが、ＩＦＮγ又はＩＬ−４を分泌しない。エフェクターメモリーＴＥＭ細胞は、しかしながら、Ｌ−セレクチン又はＣＣＲ７を発現しないが、ＩＦＮγ及びＩＬ−４のようなエフェクターサイトカインを生成する。ＴＳＣＭなどのメモリーＴ細胞は、ヒトにおいて改変免疫細胞の持続的な集団を確立するのに特に有用であり得る。
【０２６７】
任意の幹細胞は、本明細書では、一例において、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ又はＴＥＭ細胞、例えば、ヒトＴＳＣＭ、ＴＣＭ又はＴＥＭ細胞であり得る。
【０２６８】
７６．ＣＡＬ免疫細胞が、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス感染又は癌を患うヒトの細胞の子孫であり、例えば、ヒトが、リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）又は非ホジキンリンパ腫に罹患している、条項１〜７５のいずれかに記載の方法。
【０２６９】
７７．ＣＡＬ免疫細胞がシグナル伝達を高めるために改変されており、シグナル伝達がＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ４０のシグナル伝達から選択される、条項１〜７６のいずれかに記載の方法。
【０２７０】
７８．工程（ｃ）が、混合細胞を架橋剤と組み合わせる前に、細胞を共に混合することを含む、条項１〜７７のいずれかに記載の方法。
【０２７１】
７９．標的細胞及び薬剤を免疫細胞と組み合わせる前に、標的細胞と架橋剤を共に混合することを含む、条項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【０２７２】
８０．方法が複数の上記標的細胞、複数の上記ＣＡＬ−免疫細胞及び複数コピーの上記架橋剤を用いて実施され、工程（Ｃ）において標的細胞、ＣＡＬ細胞及び薬剤コピーが組み合わされ、かつ上記免疫細胞の活性がそれによって調節される、条項１〜７９のいずれかに記載の方法。
【０２７３】
８１．薬剤の量が工程（ｃ）後に減少される、条項８０に記載の方法。
【０２７４】
８２．より多くの上記薬剤が工程（ｃ）後に組み合わされる、条項８０に記載の方法。
【０２７５】
８３．ヒト又は動物において実施される、条項８０又は８２のいずれか一項に記載の方法。
【０２７６】
８４．インビトロで標的細胞及びＣＡＬ細胞を用いて実施される、条項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【０２７７】
８５．標的細胞を含むヒトにおける疾患若しくは病態を治療するか、又はそのリスク低減するための方法であって、工程（ｃ）が架橋剤コピー及びＣＡＬ細胞（又はその祖先細胞）をヒトに同時に又は連続して投与することを含み、架橋剤が第１及び第２の抗原に結合して標的細胞にＣＡＬ細胞を標的化し、それによってＣＡＬ細胞中の細胞内シグナル伝達を誘発してＣＡＬ細胞活性を調節し、それによって疾患又は病態が治療されるか疾患又は病態のリスクが低減される、条項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【０２７８】
８６．疾患若しくは病態が、ヒトにおける癌、炎症性疾患、自己免疫疾患又はウイルス感染である、条項８５に記載の方法。
【０２７９】
８７．標的細胞（例えば、腫瘍細胞）が死滅する、条項８５又は８６に記載の方法。
【０２８０】
８８．各標的細胞が腫瘍細胞であり、方法がヒトにおける癌を治療するか癌のリスクを低減する、又は癌の進行を治療するか癌の進行のリスクを低減する、条項８６又は８７に記載の方法。
【０２８１】
８９．ヒトが癌を有する、条項８５〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【０２８２】
一例において、癌は血液の癌である。一例において、ヒトは、Ｂ細胞起源の癌を有する。一例において、ヒトは、Ｔ細胞起源の癌を有する。
【０２８３】
例えば、癌は、肺癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病及びリンパ腫である。本発明での使用に好ましい癌標的は、特に急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含む、Ｂ細胞起源の癌である。
【０２８４】
９０．癌が、Ｔ細胞又はＢ細胞起源の癌、例えば、リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）、又は非ホジキンリンパ腫である、条項８９に記載の方法。
【０２８５】
９１．ＣＡＬ細胞が上記ヒト免疫細胞の子孫であり、例えば、ヒトがリンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ又はＢ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）、又は非ホジキンリンパ腫である、条項８５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【０２８６】
９２．各上記細胞が、上記ヒトの自己細胞（例えば、Ｔ細胞）であるか、又はそのような自己細胞の子孫である、条項８５〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【０２８７】
本明細書で使用される用語「自己」は、それが後でその個体に再導入される、同一の個体に由来する任意の物質を指すことを意味する。
【０２８８】
「同種」は、同じ種の異なる動物に由来する移植組織を指す。
【０２８９】
９３．各ＣＡＬ細胞が、ヒトの血液又は腫瘍試料に由来し、かつステップ（ｃ）前にインビトロで活性化され増やされる、条項９２に記載の方法。
【０２９０】
本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されているＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、サイトカイン生成の誘導、及び検出可能なエフェクター機能と関連付けられ得る。用語「活性化されたＴ細胞」は、とりわけ、細胞分裂を受けているＴ細胞を指す。
【０２９１】
９４．ヒトが自己免疫疾患を有し、ＣＡＬ細胞が架橋剤コピーによって標的細胞に結合される時アネルギーであるか増殖及び／若しくは細胞傷害活性を低減し、それによってＣＡＬ細胞が上記自己免疫疾患を上方制御する上記ヒトの内因性免疫細胞と競合する、条項８０に記載の方法。
【０２９２】
９５．投与が、患者の血液へのＣＡＬ細胞の注入による、条項８５〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【０２９３】
９６．工程（ｃ）において標的細胞と組み合わされる増殖した免疫細胞集団を生成するためにＣＡＬ−免疫細胞を増殖させることを含む、条項８５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【０２９４】
９７．工程（ｃ）において標的細胞（複数可）と組み合わされる活性化免疫細胞集団を生成するように改変免疫細胞（複数可）を活性化することを含む、条項８５〜９６のいずれかに記載の方法。
【０２９５】
９８．抗原特異的薬剤への標的化結合のためのキメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞であって、
Ａ．薬剤が、
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片であり；
Ｂ．ＣＡＬ−免疫細胞が、膜貫通リガンドを含み、リガンドが、
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第２の抗原を含む細胞外部分と、
ｉｖ．薬剤が第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分、
の改変された組み合わせを含み；
Ｃ．ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤が標的細胞と組み合わされる時に、標的細胞が上記第１の標的抗原を含み、第１の抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．架橋剤が第１及び第２の抗原に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって免疫細胞中の細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する、
キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞。
【０２９６】
方法１〜９７の特徴は、必要な変更を加えて、条項９８以降の特徴に適用できる。
【０２９７】
代替例において、条項９８は、以下の代替条項ＶＩＩＩ〜ＸＶを提供する。したがって、以下の条項９９以降の特徴は、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれかと組み合わせ可能である。以下の「条項９８」への言及は、代替例において、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれか一項として読み取ることができる。条項９９以降のいずれか一項に記載の「第１の抗原結合部位」は、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれかに列挙されるような「第１の結合部分」として読み取ることができる。条項９９以降のいずれか一項に記載の「第２の抗原結合部位」は、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれかに列挙されるような「第２の結合部分」として読み取ることができる。条項９９以降のいずれか一項に記載の「第１の抗原」は、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれかに列挙されるような「第４の結合部分」として読み取ることができる。条項９９以降のいずれか一項に記載の「第２の抗原」は、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれかに列挙されるような「第３の結合部分」として読み取ることができる。かつ条項９９以降のいずれか一項に記載のＣＡＬは、条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれかに記載の「膜貫通タンパク質」、「ＣＡＲ」又は「ＣＡＬ」として読み取ることができる。
【０２９８】
ＶＩＩＩ．抗原特異的薬剤への標的化結合のための免疫細胞であって、
Ａ．薬剤が、
ｉ．第１の結合部分；及び
ｉｉ．第２の結合部分、
を含む多特異性結合断片であり；
Ｂ．免疫細胞が、
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される第３の結合部分を含み、第２及び第３の部分が特異的結合対（ＳＢＰ１）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合している細胞外部分と、
ｉｖ．第２及び第３の部分が共に結合する場合の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む膜貫通タンパク質を発現し；
Ｃ．免疫細胞及び架橋剤が標的細胞と組み合わされる時に、標的細胞が第４の結合部分を含み、第４の結合部分が細胞外であり、
ｖ．第１及び第４の部分が特異的結合対（ＳＢＰ２）を形成し、一方の部分が他方の部分に特異的に結合して標的細胞に免疫細胞を標的化し；
ｖｉ．第２及び第３の部分が共に結合しそれによって免疫細胞中の細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節し；かつ
Ｄ．架橋剤の分子量が１２５ｋＤａ以下である、
免疫細胞。
【０２９９】
ＩＸ．架橋薬と組み合わせた、条項ＶＩＩＩの免疫細胞。
【０３００】
Ｘ．第１及び第２の結合部分がリガンド結合部位である、条項ＶＩＩＩ〜ＩＸの免疫細胞。
【０３０１】
ＸＩ．第１及び第２の結合部分が、それぞれ第１及び第２の抗原結合部位（例えば、ＶＨ／ＶＬ抗原結合部位）である、条項Ｘに記載の免疫細胞。
【０３０２】
ＸＩＩ．ＳＢＰ１及びＳＢ２のそれぞれが、
（ａ）抗原及び抗原結合部位（例えば、抗原及びＶＨ／ＶＬの抗原結合部位、又はスーパー抗原及び抗体可変ドメイン）；並びに
（ｂ）受容体及びリガンド
からなる群から選択される、条項ＶＩＩＩ〜ＸＩのいずれか一項に記載の免疫細胞。
【０３０３】
ＸＩＩＩ．貫通タンパク質がキメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）であり、第３の部分が抗原であり第２の部分が抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖ）であり、かつ必要に応じて第１の部分が抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖ）であり第４の部分が抗原である、条項ＶＩＩＩ〜ＸＩＩのいずれか一項に記載の免疫細胞。
【０３０４】
ＸＩＶ．膜貫通タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、第３の部分が抗原結合部位であり第２の部分が抗原であり、かつ必要に応じて第１の部分が抗原結合部位（例えば、ｓｃＦｖ）であり第４の部分が抗原である、条項ＶＩＩＩ〜ＸＩＩのいずれか一項に記載の免疫細胞。
【０３０５】
ＸＶ．架橋剤の分子量が１１５ｋＤａ以下、例えば、５５〜１１５ｋＤａ、又は６０〜１００ｋＤａである、条項ＶＩＩＩ〜ＸＩＶのいずれか一項に記載の免疫細胞。
【０３０６】
一般的に適用可能な特徴：
９９．ＣＡＬが、第２の抗原と膜貫通ドメインの間にヒンジ領域及び／又はリンカーを含む、条項９８のＣＡＬ細胞。
【０３０７】
１００．ヒンジ領域がＣＤ８αヒンジ領域である、条項９９のＣＡＬ細胞。
【０３０８】
一例において、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ドメインである。一例において、第２の抗原及び／又は第１のシグナル伝達ドメインはヒトである。必要に応じて、膜貫通ドメイン及び／又はヒンジはヒトである。
【０３０９】
１０１．シグナル伝達が、ＣＡＬ細胞傷害性を上方制御する、条項９８〜１００のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１０】
１０２．シグナル伝達が、ＣＡＬ細胞のＡＤＣＣ活性を上方制御する、条項９８〜１０１のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１１】
１０３．第１の抗原が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、条項９８〜１０２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１２】
１０４．第１の抗原が、ヒトＣＤ１９（及び必要に応じて、標的細胞が白血病細胞又はリンパ腫細胞である）、ＥｐＣＡＭ（及び必要に応じて、標的細胞が肺癌細胞、胃腸癌細胞、腺癌、癌幹細胞である）、ＣＤ２０（及び必要に応じて、標的細胞が白血病細胞である）、ＭＣＳＰ（及び必要に応じて、標的細胞がメラノーマ細胞である）、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、シアリルＴｎ、ＣＤ１３３、ＣＤ３３（及び必要に応じて、標的細胞が白血病細胞、例えば、ＡＭＬ細胞である）、ＰＭＳＡ、ＣＤ３０、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ｇｐＡ３３、ＴＡＧ−７２、ムチン、ＣＩＸ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、ｃＭＥＴ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＣＤ６６ｅ、ＥｐｈＡ２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、アンジオポエチン又はテネイシンである、条項９８〜１０３のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１３】
１０５．第１の抗原結合部位が、ブリナツモマブ又は抗体ＨＤ３７のＣＤ１９結合部位；カツマキソマブのＥｐＣＡＭ結合部位；ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位；リンフォムン（Ｌｙｍｐｈｏｍｕｎ）のＣＤ２０結合部位；エルツマキソマブのＨｅｒ２結合部位；ＡＭＧ２１１（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１）のＣＥＡ結合部位；パソツキシズマブのＰＳＭＡ結合部位；ソリトマブのＥｐＣＡＭ結合部位；ＲＧ７２２１若しくはＲＧ７７１６のＶＥＧＦ又はアンジオポエチン２結合部位；ＲＧ７５９７のＨｅｒ１又はＨｅｒ３結合部位；ＭＭ１１１のＨｅｒ２又はＨｅｒ３結合部位；ＭＭ１４１のＩＧＦ１Ｒ又はＨｅｒ３結合部位；ＭＧＤ００６のＣＤ１２３結合部位；ＭＧＤ００７のｇｐａ３３結合部位；ＴＦ２のＣＥＡ結合部位；ＡＦＭ１３のＣＤ３０結合部位；ＡＦＭ１１のＣＤ１９結合部位；及びＬＹ３１６４５３０のＨｅｒ１又はｃＭｅｔ結合部位からなる群から選択される抗体の可変ドメインを含む、条項９８〜１０４のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１４】
１０６．架橋剤が、ブリナツモマブ又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（必要に応じて、標的細胞が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）Ｂ細胞である）；ＡＭＧ２１１又はそのＣＤ３／ＣＥＡ結合誘導体（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１；必要に応じて、標的細胞が消化管癌細胞である）；パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）又はそのＣＤ３／ＰＭＳＡ結合誘導体（必要に応じて、標的細胞が前立腺癌細胞である）；ソリトマブ又はそのＣＤ３／ＥｐＣＡＭ結合誘導体（必要に応じて、標的細胞が癌細胞である）；又はＡＦＭ１１又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（及び必要に応じて、標的細胞がＡＬＬ細胞又は非ホジキンリンパ腫細胞である）である、条項９８〜１０５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１５】
１０７．第１の抗原結合部位が、レオプロ（商標）；アブシキシマブ；リツキサン（商標）；リツキシマブ；ゼナパックス（商標）；ダクリズマブ；シミュレクト（商標）；バシリキシマブ；シナジス（商標）；パリビズマブ；レミケード（商標）；インフリキシマブ；ハーセプチン（商標）；トラスツズマブ；マイロターグ（商標）；ゲムツズマブ；キャンパス（商標）；アレムツズマブ；ゼヴァリン（商標）；イブリツモマブ；ヒュミラ（商標）；アダリムマブ；ゾレア（商標）；オマリズマブ；ベクサール（商標）；トシツモマブ；ラプティバ（商標）；エファリズマブ；エルビタックス（商標）；セツキシマブ；アバスチン（商標）；ベバシズマブ；タイサブリ（商標）；ナタリズマブ；アクテムラ（商標）；トシリズマブ；ベクチビックス（商標）；パニツムマブ；ルセンティス（商標）；ラニビズマブ；ソリリス（商標）；エクリズマブ；シムジア（商標）；セルトリズマブ；シンポニ（商標）；ゴリムマブ、イラリス（商標）；カナキヌマブ；ステララ（商標）；ウステキヌマブ；アーゼラ（商標）；オファツムマブ；プロリア（商標）；デノスマブ；ヌマックス（商標）；モタビズマブ；ＡＢＴｈｒａｘ（商標）；ラキシバクマブ；ベンリスタ（商標）；ベリムマブ；ヤーボイ（商標）；イピリムマブ；アドセトリス（商標）；ブレンツキシマブ；ベドチン（商標）；パージェタ（商標）；ペルツズマブ；カドサイラ（商標）；アドトラスツズマブ；ガジバ（Ｇａｚｙｖａ）（商標）及びオビヌツズマブからなる群から選択される抗体の抗原結合部位の可変ドメインを含む、条項９８〜１０６のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１６】
１０８．第１の抗原が自己免疫疾患標的であり、シグナル伝達が免疫細胞の細胞傷害活性又は増殖を下方制御する、条項９８〜１０２のいずれか一項記載のＣＡＬ細胞。
【０３１７】
１０９．第２の抗原が免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞又はＮＫ細胞）の細胞外抗原である、条項９８〜１０８のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３１８】
１１０．第２の抗原がタンパク質抗原であり、免疫細胞が、ＣＡＬに含まれる第２の抗原のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を発現する内因性配列（例えば、ＣＤ３細胞外ドメイン配列）である第１のヌクレオチド配列を含む、条項９８〜１０９のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞）。
【０３１９】
１１１．第２の抗原が、ヒトＣＤ３又はヒトＣＤ１６の細胞外ドメイン配列によって提供される、条項９８〜１１０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２０】
１１２．ＣＤ３細胞外ドメインが、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はＣＤεドメインである、条項１１１に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２１】
１１３．第２の標的結合部位が、抗体Ｌ２Ｋ−０７、抗体ＯＫＴ３（商標）、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビシリズマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ及びフォラルマブからなる群から選択される抗体の抗ＣＤ３結合部位の可変ドメインを含む、条項９８〜１１２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２２】
１１４．細胞外部分が、非自己エピトープを含まない、条項９８〜１１３のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２３】
１１５．ａ．ＣＡＬの第２の抗原が、抗原のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；
ｂ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ１を含みかつ第２の抗原のアミノ酸配列と同一でありかつＲ１を含むアミノ酸配列をコードする；又は第２の抗原のアミノ酸配列の天然に存在する変異体でありかつＲ１を含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み；かつ
ｃ．Ｓ２が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
条項９８〜１１４のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２４】
１１６．ＣＡＬ細胞が、ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療する又はそのリスクを低減する方法における使用のためのものであり、本方法が、ヒトにＣＡＬ細胞及び上記架橋剤を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及びヒトの標的細胞が組み合わされ架橋剤によって架橋され、それによってＣＡＬ細胞中のシグナル伝達を上方制御してＣＡＬ細胞の標的細胞細胞傷害性（例えば、ＡＤＣＣ媒介性死滅活性）を高め、それによってヒトにおける上記疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減する、条項９８〜１１５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２５】
本明細書の方法において、有効量のＣＡＬ細胞及び架橋剤が投与される。本明細書で使用される「有効量」は、治療的又は予防的利点を提供する量を意味する。
【０３２６】
本発明の方法の実施形態において、本方法は、患者（例えば、ヒト）における癌を治療するか又はそのリスクを低減し、患者は、患者への本発明の免疫細胞の投与前にリンパ球除去を受けている。
【０３２７】
１１７．ＣＡＬ細胞が、ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、自己免疫疾患、ＧｖＨＤ又は同種移植拒絶反応）を治療する又はそのリスクを低減する方法における使用のためのものであり、方法が、ヒトにＣＡＬ細胞及び上記架橋剤を投与することを含み、ＣＡＬ細胞及びヒトの標的細胞が組み合わされ架橋剤によって架橋され、それによってＣＡＬ細胞中のシグナル伝達を上方制御してＣＡＬ細胞の細胞傷害性（例えば、ＡＤＣＣ媒介性死滅活性）を低減し、それによってヒトにおける上記疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減する、条項９８〜１１５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２８】
１１８．上記架橋が、ヒトにおいてＣＡＬ細胞アネルギーを誘発する、条項１１７に記載のＣＡＬ細胞。
【０３２９】
１１９．移植片が、ヒトの内因性の疾患若しくは病態を媒介する免疫細胞と競合して（例えば、Ｔ細胞活性によって媒介される）上記疾患若しくは病態を治療する又は低減するためのものである、条項１１７又は１１８に記載の複数のＣＡＬ−細胞を含む移植片（例えば、同種移植片）。
【０３３０】
例えば、ＣＡＬ細胞は、組織損傷の部位での疾患媒介性内因性免疫細胞の有病率又は他の疾患活性を効果的に「希釈する」。このように上記疾患媒介性内因性免疫細胞の局所濃度を減少させることによって、Ｔ細胞などの内因性免疫細胞の望ましくない活性（例えば、自己免疫、ＧｖＨＤ又は拒否活性）が、ヒトにおいて抑えられ得る。この場合、一実施形態において、ＣＡＬ細胞（例えば、ＣＡＬ−Ｔ細胞）はアネルギーになり、それによってそのようなアネルギー性細胞は、内因性のＴ細胞の活性を「希釈し」、そのためヒトにおいて疾患若しくは病態を抑えるか、又は疾患若しくは病態のリスクを低減する。
【０３３１】
別の例において、本発明の免疫細胞は、疾患若しくは病態を治療又は予防するために、患者の標的細胞（例えば、Ｔ細胞）を死滅させるように活性化されるようになる。
【０３３２】
本明細書で使用される疾患を「治療する」という用語は、対象が経験する疾患若しくは病態の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又はその重症度を軽減することを意味する。
【０３３３】
１２０．ヒトのゲノムが上記投与前に上記ＳＮＰ１を含む、条項１１５に従属する場合の、条項１１６〜１１９のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３３４】
このように、細胞又は移植片は、レシピエントのヒトとの適合性を高めるために、細胞外部分で適合される。
【０３３５】
１２１．標的細胞がヒト細胞である、条項９８〜１２０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３３６】
１２２．標的細胞が腫瘍細胞であり、シグナル伝達が免疫細胞の細胞傷害活性（例えば、ＡＤＣＣ）又は増殖を上方制御する、条項９８〜１２１のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３３７】
１２３．標的細胞が、白血病細胞、リンパ腫細胞、腺癌細胞又は癌幹細胞である、条項９８〜１２２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３３８】
１２４．標的細胞が血液細胞である、条項９８〜１２３のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３３９】
１２５．標的細胞がＢ細胞又はＴ細胞である、条項９８〜１２３のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３４０】
１２６．ＣＡＬの第２の抗原がＣＤ３γ細胞外ドメインであり、Ｒ１がＩ１１、Ｍ１１、Ａ２２、Ｔ２２、Ｉ５３、Ｎ５３、Ｔ５３、Ｖ１３１、Ｆ１３１、Ｒ１６６、Ｇ１６６、Ｙ１７１及びＨ１７１（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される、条項１１５又は条項１１５に従属する場合の条項１１６〜１２５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３４１】
上記の態様と同様に、本発明者は、このような位置がヒトにおいて天然に生じるＣＤ３γ変異について許容されることに気づき、そのため、本発明者は、これらを本発明に従って適合するための候補位置として特定した。
【０３４２】
１２７．第２の抗原が、Ｉ１１、Ａ２２、Ｉ５３、Ｎ５３、Ｖ１３１、Ｒ１６６及びＹ１７１を含む、条項１２６に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３４３】
本発明者は、これらの変異がヒトにおいて最も一般的であり（Ｅｎｓｅｍｂｌによって示されるように）、そのためこの特徴がほとんどのヒト及びほとんどのヒト細胞と適合する可能性があることに気づいた。
【０３４４】
１２８．ＣＡＬの第２の抗原がＣＤ３δ細胞外ドメインであり、Ｒ１がＱ１８、Ｋ１８、Ｎ３８及びＫ３８（位置番号は配列番号３の位置に対応する）からなる群から選択される、条項１１５又は条項１１５に従属する場合の条項１１６〜１２５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３４５】
上記の態様と同様に、本発明者は、このような位置がヒトにおいて天然に生じるＣＤ３δ変異について許容されることに気づき、そのため、本発明者は、これらを本発明に従って適合するための候補位置として特定した。
【０３４６】
１２９．第２の抗原がＱ１８及びＮ３８を含む、条項１２８に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３４７】
本発明者は、これらの変異がヒトにおいて最も一般的であり（Ｅｎｓｅｍｂｌによって示されるように）、そのため、この特徴がほとんどのヒト及びほとんどのヒト細胞と適合する可能性があることに気づいた。
【０３４８】
１３０．ＣＡＬの第２の抗原がＣＤ３ε細胞外ドメインであり、Ｒ１がＤ７１、Ｎ７１、Ｈ７１、Ｙ７１、Ａ１０８、Ｅ１０８、Ｖ１０８、Ａ１５７及びＶ１５７（位置番号は配列番号５の位置に対応する）からなる群から選択される、条項１１５又は条項１１５に従属する場合の条項１１６〜１２５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３４９】
上記の態様と同様に、本発明者は、このような位置がヒトにおいて天然に生じるＣＤ３ε変異に許容されることに気づき、そのため、本発明者は、これらを本発明に従って適合するための候補位置として特定した。
【０３５０】
１３１．第２の抗原が、Ｄ７１、Ａ１０８及びＡ１５７を含む、条項１３０に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５１】
本発明者は、これらの変異がヒトにおいて最も一般的であり（Ｅｎｓｅｍｂｌによって示されるように）、そのため、この特徴がほとんどのヒト及びほとんどのヒト細胞と適合する可能性があることに気づいた。
【０３５２】
１３２．各ＣＡＬ細胞がヒトの祖先細胞の改変子孫であり、方法が改変ＣＡＬ細胞又は移植片片をヒトに投与することを含み、ＣＡＬ細胞（複数可）及び標的細胞が組み合わされる、条項１１６〜１３１のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５３】
１３３．ａ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）が、シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含む第３のヌクレオチド配列（Ｓ３）によって各ＣＡＬ細胞中でコードされ；
ｂ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ２を含みかつシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする第４のヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ２が、ＳＤ１と同一でありＲ２を含む又は（ｉｉ）ＳＤ１の天然に存在する変異体でありＲ２を含み；かつ
ｃ．Ｓ４が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ２が非同義ＳＮＰである、
条項９８〜１３２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５４】
１３４．ＳＤ１及びＳＤ２のそれぞれが、Ｒ２を含む免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、条項１３３に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５５】
１３５．シグナル伝達ドメインのＩＴＡＭが同一である、条項１３４に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５６】
１３６．細胞内部分が、第５のヌクレオチド配列（Ｓ５）によって細胞中でコードされるさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＤ３）を含み、Ｓ５がＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ３）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ３）を含み、細胞のゲノムがシグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードする第６のヌクレオチド配列（Ｓ６）を含み、ＳＤ４がＳＤ３と同一でありＲ３を含むか；又はＳＤ３の天然に存在する変異体でありＲ３を含み、Ｓ６が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ３が非同義ＳＮＰである、条項９８〜１３５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５７】
１３７．受容体のＳＤ１及びＳＤ３が異なる、条項１３６に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５８】
１３８．ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれが、Ｒ３を含むＩＴＡＭを含む、条項１３６若しくは１３７に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３５９】
１３９．ＳＤ３及びＳＤ４のＩＴＡＭが同一である、条項１３８に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６０】
１４０．ＳＤ３及びＳＤ４が同一である、条項１３６〜１３９のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６１】
１４１．ＳＤ３がヒトである、条項１３６〜１４０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６２】
１４２．ＳＤ３のそれぞれが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインである、条項１３６〜１４１のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６３】
１４３．第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン（第２の抗原がＣＤ３ドメインではない）、ＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメイン（第２の抗原がＣＤ３ドメインではない）、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン（第２の抗原がＣＤ１６のドメインではない）、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインである、条項９８〜１４２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６４】
１４４．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、（ａ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１０；（ｂ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１１；及び（ｃ）必要に応じて、最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１２から選択される１、２又は３個のアミノ酸モチーフを含む、条項１４３に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６５】
１４５．第１のシグナル伝達ドメインが、モチーフ（ａ）を含み、モチーフが、Ａ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７及びＫ８８からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１０と異なる、条項１４４に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６６】
変更が、Ａ６１Ｖ、Ａ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｐ６２Ａ、Ａ６３Ｐ、Ｑ６６Ｈ、Ｇ６７Ｓ、Ｎ６９Ｔ、Ｑ７０Ｙ、Ｑ７０Ｌ、Ｑ７０Ｐ、Ｑ７０Ｗ、Ｎ７３Ｙ、Ｒ７９Ｌ、Ｒ７９Ｇ、Ｅ８２Ｋ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｙ、Ｖ８５Ｉ、Ｄ８７Ｇ及びＫ８８Ｒからなる群から選択される、条項１４５に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６７】
第１のシグナル伝達ドメインが、モチーフ（ｂ）を含み、モチーフが、Ｐ１００、Ｑ１０１、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０８、Ｌ１１０、Ａ１２０、Ａ１２２及びＭ１２８からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１２と異なる、条項１４４〜１４６のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６８】
１４８．変更が、Ｐ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｌ、Ｑ１０１Ｐ、Ｒ１０３Ｋ、Ｋ１０４Ｅ、Ｎ１０５Ｋ、Ｐ１０６Ｒ、Ｅ１０８Ａ、Ｌ１１０Ｑ、Ａ１２０Ｖ、Ａ１２２Ｖ及びＭ１２８Ｔからなる群から選択される、条項１４７に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３６９】
１４９．第１のシグナル伝達ドメインが、モチーフ（ｃ）を含み、モチーフが、Ｅ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３６、Ｇ１３７、Ｇ１４０、Ｌ１４５、Ａ１４８、Ｔ１５２、Ａ１５５、Ｌ１５６からなる群から選択される残基での最大５個の変更によって配列番号１３と異なる、条項１４４〜１４８のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７０】
１５０．変更が、Ｅ１３１Ｋ、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３３Ｗ、Ｋ１３６Ｎ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１４０Ｄ、Ｌ１４５Ｆ、Ａ１４８Ｄ、Ｔ１５２Ｉ、Ａ１５５Ｔ、Ｌ１５６Ｐからなる群から選択される、条項１４９に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７１】
１５１．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｓ５８、Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３（位置番号は配列番号７の位置に対応する）からなる群から選択される１個、それより多い又は全てのアミノ酸残基を含む、条項９８〜１５０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７２】
１５２．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、ｒｓ３６８６５１００１、ｒｓ３７２６５１０４８、ｒｓ７６７１１２６８６、ｒｓ７６５８７７５８０、ｒｓ７５１１４５９５６、ｒｓ７７２８６７１４４、ｒｓ５５８９３５０６、ｒｓ７６１７１０５１０、ｒｓ７７６６０１５４７、ｒｓ７６８６０７３７６、ｒｓ１９３９２２７４１、ｒｓ１９３９２２７４０、ｒｓ１９３９２２７３９、ｒｓ７８０１８８１２６、ｒｓ７７２１２８１７４、ｒｓ７５７９７８２２３、ｒｓ７７９３９７５６２、ｒｓ７４９９２６６５３、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ７５３５７２８６７、ｒｓ３７１７０９７９８、ｒｓ１４５４０７２６７、ｒｓ１４３１８０７２９、ｒｓ１４８５１３４１３、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ７７０３２０２５５、ｒｓ１３９９２６３０１、ｒｓ５６２９７６３６、ｒｓ７６０８９５７５５、ｒｓ１１２８９０５４１、ｒｓ３７０９１０３４０、ｒｓ１４５５０５９０９、ｒｓ７５４９３５００６、ｒｓ７５１５８３９７１、ｒｓ７６６５４１４８１、ｒｓ７６３０７４９６７、ｒｓ７４５８７１２１２、ｒｓ３７２６６５４６１、ｒｓ７６４１８５４９１、ｒｓ７５６３４００３９、ｒｓ７７３５７２４９１、ｒｓ２０１５９４８１５、ｒｓ７８１５１０５１９、ｒｓ１４７５２７５６１、ｒｓ７５１９８１６７７、ｒｓ７６３５３２９３９、ｒｓ７５３２７８２４４、ｒｓ７７１８７３９４９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ７６２７７３７７５、  ｒｓ７４８１５８２２０、ｒｓ７７６７０３６８０、ｒｓ５６１２６２９８２、ｒｓ７５８８４６００９、ｒｓ７４６２６２１８３、ｒｓ３７６０４６４４６、ｒｓ２０１９３７４０５及びｒｓ７５２１９８７９５からなる群から選択されるＳＮＰによりコードされる残基を含み、かつ免疫細胞のゲノムが、上記選択されたＳＮＰを含む内因性ヌクレオチド配列を含む、条項９８〜１５１のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７３】
１５３．第１又は第３のシグナル伝達ドメインが、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８からなる群から選択される少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、条項９８〜１５２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７４】
１５４．ＣＤ２８ドメインが上記グループの全ての残基を含む、条項１５３に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７５】
１５５．ＣＤ２８ドメインが、アミノ酸残基Ｙ１９１及びＹ２０９（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）を含む、条項１５３若しくは１５４に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７６】
１５６．ＣＤ２８ドメインが、ＹＭＮＭモチーフ（配列番号：全長ＣＤ２８配列のＹ１９１−Ｍ１９２−Ｎ１９３−Ｍ１９４に対応する）及び／又はＰＹＡＰモチーフ（配列番号１３のＰ２０８−Ｙ２０９−Ａ２１０−Ｐ２１１に対応する）を含む、条項１５３〜１５５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７７】
１５７．各ＣＡＬ−免疫細胞が、ＣＡＬ−Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、プレＲＥＰ  ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ又はＴＥＭである、条項９８〜１５６のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７８】
１５８．各ＣＡＬ免疫細胞が、自己免疫疾患、炎症性疾患、ウイルス感染又は癌を患うヒトの細胞の子孫であり、例えば、ヒトが、リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）又は非ホジキンリンパ腫に罹患している、条項９８〜１５７のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３７９】
一実施形態において、ヒトは、少なくとも１つの化学療法剤に耐性である。
【０３８０】
一実施形態において、慢性リンパ性白血病は、難治ＣＤ１９＋白血病及びリンパ腫である。
【０３８１】
本発明はまた、癌と診断されたヒトにおいて遺伝子改変されたＴ細胞の持続集団を生成する方法を含む。一実施形態において、本方法は、本発明のＴ細胞（例えば、ＣＡＬ  Ｔ細胞）をヒトに投与することを含み、遺伝子改変されたＴ細胞の持続集団は、投与後少なくとも１ヶ月間、ヒトにおいて持続する。一実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞の持続集団は、メモリーＴ細胞を含む。一実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞の持続集団は、投与後少なくとも３ヶ月間、ヒトにおいて持続する。別の実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞の持続集団は、投与後少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、２年、又は３年間、ヒトにおいて持続する。
【０３８２】
一実施形態において、慢性リンパ性白血病が治療される。本発明はまた、癌と診断されたヒトにおいて改変Ｔ細胞又はＮＫ細胞の集団を増殖させる方法を提供する。
【０３８３】
必要に応じて、自己リンパ球注入が治療で使用される。自己ＰＢＭＣは治療を必要とする患者から採取され、Ｔ細胞は、本発明の膜貫通タンパク質を発現するように改変され、当技術分野で公知の方法を用いて活性化及び増殖され、次いで架橋剤の投与と同時に、又は連続して患者へ注入により戻される。
【０３８４】
１５９．各ＣＡＬ−免疫細胞がシグナル伝達を高めるために改変されており、シグナル伝達がＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ４０シグナル伝達から選択される、条項９８〜１５８のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３８５】
１６０．各ＣＡＬ細胞が、ヒト（例えば、癌患者）の血液又は腫瘍試料に由来し、細胞が活性化細胞である、条項９８〜１５９のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３８６】
１６１．架橋剤と組み合わされる、条項９８〜１６０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３８７】
１６２．架橋剤が、ＩｇＧのヒト血清半減期より短いヒト血清半減期を有する、条項１６１に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３８８】
１６３．架橋剤が、５日以下のヒト血清半減期を有する、条項１６１若しくは１６２に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３８９】
１６４．半減期が１日未満である、条項１６３に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９０】
１６５．第１の結合部位が、抗体のＶＨ／ＶＬ結合部位である、条項１６１〜１６４のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９１】
１６６．第２の結合部位が、抗体のＶＨ／ＶＬ結合部位である、条項１６１〜１６５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９２】
１６７．第１の抗原に対する第１の結合部位の結合親和性（ＫＤ）が、第２の抗原に対する第２の結合部位の親和性よりも少なくとも５倍、１０倍又は２０倍低い、条項１６１〜１６６のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９３】
１６８．第１の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１０ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有し、第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定される５０ｎＭ以上（例えば、最大１ｍＭ）の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１６１〜１６７のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９４】
１６９．第１の結合部位が、ＳＰＲによって決定される２ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有し、第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定される６０ｎＭ以上（例えば、最高１ｍＭ）の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１６１〜１６８のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９５】
１７０．第１の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１００ｎＭ以下の第１の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１６１〜１６９のいずれかに記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９６】
１７１．第１の結合部位が、ＳＰＲによって決定されるＫｏｆｆ＝１０−３／秒以下の第１の抗原に対する結合解離速度を有する、条項１６１〜１７０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９７】
１７２．第２の結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１００ｎＭ以下の第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）を有する、条項１６１〜１７２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９８】
１７３．第１の抗原に対する第１の結合部位の結合親和性（ＫＤ）が第２の抗原に対する第２の結合部位の親和性（ＫＤ）よりも高く、第２の抗原に対する親和性が１００ｎＭ未満である、条項１６１〜１７２のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０３９９】
１７４．第２の結合部位が、ＳＰＲによって決定されるＫｏｆｆ＝１０−３／秒以下の第１の抗原に対する結合解離速度を有する、条項１６１〜１７３のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４００】
１７５．第１及び第２の抗原結合部位のそれぞれが、ｓｃＦｖ、ナノボディ（商標）、ｄＡｂ、デュオカリン、ＤＡＲｐｉｎ、アビマー、アドネクチン及びフィノマーからなる群から選択される、条項１６１〜１７４のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０１】
１７６．架橋剤のサイズが１００ｋＤａ以下である、条項１６１〜１７５のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０２】
１７７．架橋剤のサイズが、８０ｋＤａ以下（例えば、５０又は５５ｋＤａ以下）である、条項１６１〜１７６のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０３】
１７８．架橋剤が、ＢｉＴＥ（商標）抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、三重特異性ｓｃＦｖ、ｔａｎｄａｂ（商標）、ｄＡｂナノボディ（例えば、ダイマー又はトリマー）、ｄＡｂ多量体（例えば、ダイマー又はトリマー）、ダイアボディ、テトラボディ又はＤＡＲＴ（商標）であるか、又はそれらを含む、条項１６１〜１７７のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０４】
１７９．架橋剤が、第３の抗原結合部位を含む、条項１６１〜１７８のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０５】
１８０．第３の抗原が第１の抗原とは異なる、条項１７９に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０６】
１８１．第３の抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、標的細胞に含まれる細胞表面ＴＡＡである、条項１７９若しくは１８０に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０７】
１８２．第１及び／又は第３の抗原が、正常細胞よりも癌細胞上でより一般的に存在する、条項１６１〜１８０のいずれか一項に記載のＣＡＬ細胞又は移植片。
【０４０８】
１８３．ＣＡＬが条項９８〜１８２のいずれか一項に定義される通りである、ＣＡＬ−免疫細胞、ＣＡＬ−Ｔ細胞、ＣＡＬ−ＮＫ細胞又はＣＡＬ−ＴＩＬ。
【０４０９】
ＣＡＲが条項９８〜１８２のいずれか一項に（条項ＶＩＩＩ〜ＸＶのいずれか一項を参照して）定義される通りである、ＣＡＲ−免疫細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞又はＣＡＲ−ＴＩＬ。
【０４１０】
１８４．細胞が条項１８３に記載される、ＣＡＬ−免疫細胞の集団、ＣＡＬ−Ｔ細胞、ＣＡＬ−ＮＫ細胞の集団又はＣＡＬ−ＴＩＬの集団。
【０４１１】
細胞が条項１８３に記載される、ＣＡＲ−免疫細胞の集団、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫ細胞の集団又はＣＡＲ−ＴＩＬの集団。
【０４１２】
１８５．方法が条項１１６〜１２０のいずれか一項に従う、ヒトの疾患若しくは病態を治療する又はそのリスク低減する方法における使用のための条項１８３又は１８４の細胞又は集団。
【０４１３】
１８６．医療用ＩＶ容器、注入装置又は注射器に含まれる条項９８〜１８５のいずれか一項に記載の細胞又は集団。
【０４１４】
１８７．条項１〜１８６のいずれかに記載される改変膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む哺乳動物幹細胞。
【０４１５】
１８８．改変タンパク質がＣＡＬである、条項１８７に記載の細胞。
【０４１６】
１８９．改変タンパク質がＣＡＲである、条項１８７に記載の細胞。
【０４１７】
１９０．細胞が多能性又は多分化能性である、条項１８７〜１８９のいずれか一項に記載の細胞。
【０４１８】
幹細胞はヒトへと発展できない。一実施形態において、幹細胞は、ヒト胚又は受精卵へと発展できない。
【０４１９】
１９１．細胞が骨髄幹細胞である、条項１８７〜１９０のいずれか一項に記載の細胞。
【０４２０】
１９２．細胞が造血幹細胞である、条項１８７〜１９１のいずれか一項に記載の細胞。
【０４２１】
１９３．細胞が非ヒト幹細胞である、条項１８７〜１９２のいずれか一項に記載の細胞。
【０４２２】
１９４．細胞がエクスビボにある、条項１８７〜１９３のいずれか一項に記載の細胞。
【０４２３】
１９５．条項１８７〜１９４のいずれか一項に記載の複数の幹細胞を含む細胞の集団。
【０４２４】
１９６．工程（ｃ）がヒトに架橋剤と条項１８７〜１９４のいずれか一項に記載の幹細胞を投与することを含み、幹細胞が改変膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）を発現する上記免疫細胞に発達し、免疫細胞がヒトにおいて標的細胞と組み合わされる、条項１〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【０４２５】
１９７．方法が条項１９５の集団を投与することを含み、上記幹細胞が改変膜貫通タンパク質を発現する複数の免疫細胞に発達し、免疫細胞がヒトにおいて標的細胞と組み合わされる、条項１９６に記載の方法。
【０４２６】
１９８．ヒトにおける疾患若しくは病態、例えば、癌又は自己免疫疾患若しくは病態を治療するか又はそのリスクを低減するための、条項１９６又は１９７の方法での使用のための、条項１８７〜１９５のいずれか一項に記載の細胞又は集団。
【０４２７】
精密免疫療法：ドメイン変異＆さらなる適合の態様
個々のヒトは配列が異なり、最近、何人か、例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒは彼らのゲノムを配列決定させたことが認められている。個人のゲノム配列の比較は、ゲノムのコード部分と非コード部分の両方で、それらの配列の違いを明らかにした。ヒトでのこれらの変異のいくつかは、重要であり、個人間の発現型の違いに寄与する。極端な場合において、これらは遺伝性疾患をもたらす。１０００ゲノムプロジェクトは、ヒトゲノム中の配列をカタログ化することを目的とし、当技術分野で認められている多様なヒト民族集団の個人から非常に大規模にサンプリングしたゲノムの配列決定を伴う。
【０４２８】
本発明に適用できる、様々な疾患状態を有する細胞内シグナル伝達タンパク質の多型に関する証拠が集まりつつある。例えば、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．２０１５  Ｍａｒ；１６（２）：１４２−５０．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｇｅｎｅ．２０１４．７３．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｊａｎ  ８，「大規模な多民族研究におけるＳＬＥとＣＤ２４７（ＣＤ３ζ）の遺伝的関連（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２４７  （ＣＤ３ζ）  ｗｉｔｈ  ＳＬＥ  ｉｎ  ａ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｕｌｔｉｅｔｈｎｉｃ  ｓｔｕｄｙ）」，Ｍａｒｔｉｎｓ  Ｍら；Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）．２０１３  Ｓｅｐ；５２（９）：１５５１−５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ／ｋｅｔ１１９．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｍａｒ  ２２，「全身性エリテマトーデス患者で観察されるＣＤ２４７変異体及び一塩基多型（ＣＤ２４７  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ  ＆  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ；「ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０及びＣＤ８６遺伝子における多型は多発性硬化症のリスク及びその発症年齢に影響を与え得る（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ＣＤ２８，ＣＴＬＡ−４，ＣＤ８０  ａｎｄ  ＣＤ８６  ｇｅｎｅｓ  ｍａｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｇｅ  ｏｆ  ｏｎｓｅｔ）」，Ｗａｇｎｅｒ  Ｍら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  Ｎｏｖ  １５；２８８：７９−８６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｎｅｕｒｏｉｍ．２０１５．０９．００４．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｓｅｐ  １８；「ポーランド人集団の前向き研究におけるＣＴＬＡ−４及びＣＤ２８遺伝子の多型及び腎細胞癌の感受性（ＣＴＬＡ−４  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｇｅｎｅｓ’  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ）」，Ｔｕｐｉｋｏｗｓｋｉ  Ｋら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１５  Ｎｏｖ；８６（５）：３５３−６１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｔａｎ．１２６７１．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｓｅｐ  ２５；及び「非小細胞肺癌とＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、及びＩＣＯＳ遺伝子多型の関連（ＣＴＬＡ−４，ＣＤ２８，ａｎｄ  ＩＣＯＳ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）」，Ｋａｒａｂｏｎ  Ｌ，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  Ｏｃｔ；７２（１０）：９４７−５４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｈｕｍｉｍｍ．２０１１．０５．０１０．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｍａｙ  ２４が参照される。
【０４２９】
ヒト遺伝子変異解析及び合理的に設計された配列選択の適用により、本発明は、ＣＡＲ及びＣＡＬのタンパク質成分におけるヒト変異に基づく改良されたヒト患者の治療を提供する。重要なことに、本発明は、個々のヒト患者の遺伝子型又は発現型を扱うテーラード薬を可能にする。
【０４３０】
多数の天然に存在するゲノムヒト配列についての発明者の分析は、多様なヒト集団間に有意な変異があることを明らかにし、個々のヒト患者と標的に取り組むテーラード薬手法との間の相関の能力を提供する。本発明により、これらの知見の技術的な適用は、そのため、ヒトでのより良い治療及び予防に貢献し、個別化された医薬及び治療法を可能にすることにより患者に利点を提供する。これは、より良い処方、より少ない薬の廃棄及び患者における薬効の機会の改善の利点を提供する。
【０４３１】
これにより、本発明者は、疾患及び病態の治療並びに／又は予防のためにヒト患者に投与するためのＣＡＲ及びＣＡＬタンパク質ドメインの選択を導くという点で、本発明にとって重要な産業用途及び医療用途があることに気づいた。このように、患者は、患者の遺伝的又は発現型の構造によって決定される、かれらのニーズに合わせた免疫療法を受ける。これと同調して、本発明は、そのような治療に関連する患者の遺伝子型解析及び／又は発現型解析を提供し、それによって患者への薬物の適切な適合を可能にする。これは、医学的効果の機会を増加させ、患者に適合しない薬物を用いる劣った治療（例えば、乏しい有効性及び／又は副作用）の可能性を低減し、かつ医薬の誤処方及び廃棄を回避する。
【０４３２】
上述し、実施例１でさらに説明するように、本発明の実施形態は、レシピエント細胞又はヒト患者の内因性（すなわち、天然に存在する）遺伝子型を有する膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）を改変するために使用される配列の適合を提供する。この態様において、本発明者は、ヒト集団において見出され、レシピエントヒト細胞及び患者のゲノムに見出される天然変異を反映するように改変タンパク質ドメイン（複数可）を適合した。これは、ヒトにおける天然の耐容性アミノ酸変異（及び対応する非同義ＳＮＰ）が、細胞内シグナル伝達機構の他の構成要素と効率的に動作するように共進化してきたという認識に部分的に基づく。すぐ上の出版物によって示されるように、シグナル伝達タンパク質の変異は、おそらく部分的には劣ったシグナル伝達によって、望ましくない影響をもたらし得る。本発明は、本発明で使用される内因性タンパク質及びヒト細胞及び患者の遺伝子型をより密接に反映するように改変タンパク質を適合させることを目指す。
【０４３３】
細胞内シグナル伝達機構との適合と同様に、別の態様において本発明は、改変膜貫通タンパク質の細胞外部分が、免疫細胞の表面でレシピエント患者の免疫系に暴露されることを実現する。そのため、本発明の適合実施形態はまた、膜貫通タンパク質の細胞外部分をレシピエントヒト患者に対しできるだけ「自己」と見えるようにすることの望ましさを実現する。そのため、態様において、細胞外部分（例えば、ＣＡＬの第２の抗原又はヒンジ内）の１以上の多型は、患者で天然に見られる多型に適合される。実施例において、本発明者は、そのような共通の多型と適合するヒト細胞集団及び患者に有用であるべき共通の個々の多型又は多型群を特定した。
【０４３４】
この延長として、本発明は、本発明の膜貫通タンパク質のドメインについて「ユニバーサルフレームワーク」を特定する。これは、ヒト集団における変異について天然に許容される特定のドメイン中の残基群の特定に基づいている。本発明は、それぞれがヒトにおいて最も一般的な多型を表すそのような変異の集合を特定し、そのため発明者らは、それらがそのような細胞及び患者における多くの天然多型と適合するので、多くのヒト細胞及びヒト患者で使用できる「ユニバーサルＣＡＲ」及び「ユニバーサルＣＡＬ」を生成することにおいて有用であると信じている。
【０４３５】
そのため、本発明は、ゲノム及び発現型の適合を用いる本発明のこの実施形態の以下の具体的な態様を提供する。
【０４３６】
１．改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．１以上のリガンド結合ドメイン又は１以上のリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．改変タンパク質のＳＤ１が、ＳＤ１のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ１を含みかつ第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、第２のシグナル伝達ドメインが、（ｉ）ＳＤ１と同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）天然に存在するＳＤ１の変異体でありＲ１を含み；かつ
Ｆ．Ｓ２が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
ヒト免疫細胞。
【０４３７】
追加的又は代替的に、条項１は、以下を提供する：
改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
を含み；
Ｄ．第１の抗原又は改変タンパク質のリガンドドメインが、抗原又はリガンドドメインのアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．細胞のゲノムが、ＳＮＰ１を含みかつ第２の抗原又はリガンドドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、第２の抗原又はリガンドドメインが、（ｉ）それぞれ第１の抗原又はリガンドドメインと同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）それぞれ天然に存在する第１の抗原又はリガンドドメインの変異体でありＲ１を含み；かつ
Ｆ．Ｓ２が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
ヒト免疫細胞。
【０４３８】
追加的又は代替的に、条項１は、以下を提供する：
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療する又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法が、ヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が改変膜貫通タンパク質を含み、
タンパク質が、
Ａ．１以上のリガンド結合ドメイン又は１以上のリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．改変タンパク質のＳＤ１が、ＳＤ１のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．ヒトのゲノムが、ＳＮＰ１を含みかつ第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、ＳＤ２が、（ｉ）ＳＤ１と同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）天然に存在するＳＤ１の変異体でありＲ１を含み；
Ｆ．Ｓ２がヒトの内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰであり；かつ
Ｇ．ヒトゲノムが、免疫細胞の上記投与前にＳ２を含み；かつ
Ｈ．上記方法が、ヒトにおける疾患若しくは病態のリスクを処置する、
ヒト免疫細胞。
【０４３９】
追加的又は代替的に、条項１は、以下を提供する：
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療する又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法が、ヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が改変膜貫通タンパク質を含み、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．第１の抗原又は改変タンパク質のリガンドドメインが、抗原又はリガンドドメインのアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む第１のヌクレオチド配列（Ｓ１）によって細胞中でコードされ；
Ｅ．ヒトのゲノムが、ＳＮＰ１を含みかつ第２の抗原又はリガンドドメインをコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み、第２の抗原又はリガンドドメインが、（ｉ）それぞれ第１の抗原又はリガンドドメインと同一でありＲ１を含む又は（ｉｉ）それぞれ天然に存在する第１の抗原又はリガンドドメインの変異体でありＲ１を含み；
Ｆ．Ｓ２がヒトの内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ１が非同義ＳＮＰであり；かつ
Ｇ．ヒトゲノムが、免疫細胞の上記投与前にＳ２を含み；かつ
Ｈ．上記方法が、ヒトにおける疾患若しくは病態のリスクを処置する、
ヒト免疫細胞。
【０４４０】
一例において、Ｓ１はＳ２に少なくとも８０、９０又は９５％同一である。
【０４４１】
一例において、細胞外部分は、抗原結合ドメインを含む。一例において、膜貫通タンパク質は、ＣＡＲ、例えば、本明細書に開示される任意のＣＡＲである。
【０４４２】
一例において、細胞外部分は、抗原又はリガンド（例えば、受容体リガンド）を含む。一例において、膜貫通タンパク質は、ＣＡＬ、例えば、本明細書に開示される任意のＣＡＬである。
【０４４３】
一例において、免疫細胞は、疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示される）を治療する又はそのリスクを低減する方法で使用され、本方法が、ヒト患者に免疫細胞を投与することを含み、患者のゲノムが上記投与前にＳ２及び／又はＳＮＰ１を含み、疾患若しくは病態がヒトにおいて治療又は防止される。一例において、本発明の免疫細胞は、このような方法で使用するためのものである。
【０４４４】
本発明の膜貫通タンパク質は、本明細書で「改変」されるので、このことは、それらがヒト又はヒト細胞、又はそれらが導入される細胞若しくは哺乳動物中で天然に見出されないことを意味する。
【０４４５】
２．各上記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ドメイン、ＣＤ４０Ｌドメイン及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインである、態様１に記載の細胞。
【０４４６】
３．上記第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｖ５３、Ｋ５４、Ｆ５５、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｄ６０、Ｙ６４、Ｑ６５、Ｑ６８、Ｌ７１、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｎ７６、Ｌ７７、Ｇ７８、Ｒ８０、Ｅ８１、Ｙ８３、Ｌ８６、Ｒ８９、Ｇ９１、Ｐ９４、Ｅ９５、Ｇ９８、Ｋ９９、Ｒ１０２、Ｑ１０７、Ｇ１０９、Ｙ１１１、Ｎ１１２、Ｅ１１３、Ｌ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｄ１１７、Ｋ１１８、Ｍ１１９、Ｅ１２１、Ａ１２２、Ｙ１２３、Ｓ１２４、Ｅ１２５、Ｉ１２６、Ｇ１２７、Ｇ１３０、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｈ１３８、Ｄ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１４２、Ｑ１４３、Ｇ１４４、Ｓ１４６、Ｔ１４７、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｄ１５１、Ｄ１５４、Ｈ１５７、Ｍ１５８、Ｑ１５９、Ｌ１６１及びＰ１６２（位置番号は配列番号７の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも５０個のアミノ酸残基を含む、態様１〜２のいずれかに記載の細胞。
【０４４７】
４．第１のシグナル伝達ドメインが、上記グループの全ての残基を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメインである、態様３に記載の細胞。
【０４４８】
５．第１のシグナル伝達ドメインが、アミノ酸残基Ｙ６４、Ｙ７２及びＹ８３；Ｙ６４及びＹ７２；Ｙ７２及びＹ８３；Ｙ１１１及びＹ１２３；Ｙ１４２及びＹ１５３；Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３；又はＹ６４、Ｙ７２、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３；又はＹ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２、及びＹ１５３（位置番号は配列番号７の位置に対応する）を含む、態様３又は４に記載の細胞。
【０４４９】
６．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、配列番号９を含む、態様１〜５のいずれかに記載の細胞。
【０４５０】
これは、本発明に係るユニバーサルフレームワークである（上記及びさらに実施例１で説明される）。
【０４５１】
７．改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．１以上のリガンド結合ドメイン又は１以上のリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｖ５３、Ｋ５４、Ｆ５５、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｄ６０、Ｙ６４、Ｑ６５、Ｑ６８、Ｌ７１、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｎ７６、Ｌ７７、Ｇ７８、Ｒ８０、Ｅ８１、Ｙ８３、Ｌ８６、Ｒ８９、Ｇ９１、Ｐ９４、Ｅ９５、Ｇ９８、Ｋ９９、Ｒ１０２、Ｑ１０７、Ｇ１０９、Ｙ１１１、Ｎ１１２、Ｅ１１３、Ｌ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｄ１１７、Ｋ１１８、Ｍ１１９、Ｅ１２１、Ａ１２２、Ｙ１２３、Ｓ１２４、Ｅ１２５、Ｉ１２６、Ｇ１２７、Ｇ１３０、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｈ１３８、Ｄ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１４２、Ｑ１４３、Ｇ１４４、Ｓ１４６、Ｔ１４７、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｄ１５１、Ｄ１５４、Ｈ１５７、Ｍ１５８、Ｑ１５９、Ｌ１６１及びＰ１６２（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも５０個のアミノ酸残基を含み；
Ｅ．細胞のゲノムが、第２のシグナル伝達ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、第２のドメインが、上記選択された残基の少なくとも４０（例えば、４５又は全て）を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン又はＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインである、
ヒト免疫細胞。
【０４５２】
これは、ヒト集団における変異について天然に許容されるＣＤ３ζ及びＣＤ３ηドメイン中の残基のグループを本発明者が特定したことに基づく。本発明は、それぞれがヒトにおいて最も一般的な多型を表すそのような変異の集合を特定し、そのため発明者らは、それらがそのような細胞及び患者における多くの天然多型と適合するので、多くのヒト細胞及びヒト患者で使用できると信じている。
【０４５３】
追加的又は代替的に、態様７は以下を提供する：
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療する又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法が、ヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が改変膜貫通タンパク質を含み、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．第１のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｖ５３、Ｋ５４、Ｆ５５、Ｒ５７、Ｓ５８、Ｄ６０、Ｙ６４、Ｑ６５、Ｑ６８、Ｌ７１、Ｅ７４、Ｌ７５、Ｎ７６、Ｌ７７、Ｇ７８、Ｒ８０、Ｅ８１、Ｙ８３、Ｌ８６、Ｒ８９、Ｇ９１、Ｐ９４、Ｅ９５、Ｇ９８、Ｋ９９、Ｒ１０２、Ｑ１０７、Ｇ１０９、Ｙ１１１、Ｎ１１２、Ｅ１１３、Ｌ１１４、Ｑ１１５、Ｋ１１６、Ｄ１１７、Ｋ１１８、Ｍ１１９、Ｅ１２１、Ａ１２２、Ｙ１２３、Ｓ１２４、Ｅ１２５、Ｉ１２６、Ｇ１２７、Ｇ１３０、Ｒ１３４、Ｇ１３５、Ｈ１３８、Ｄ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１４２、Ｑ１４３、Ｇ１４４、Ｓ１４６、Ｔ１４７、Ｔ１４９、Ｋ１５０、Ｄ１５１、Ｄ１５４、Ｈ１５７、Ｍ１５８、Ｑ１５９、Ｌ１６１及びＰ１６２（位置番号は配列番号１の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも５０個のアミノ酸残基を含み；
Ｅ．ヒトのゲノムが、第２のシグナル伝達ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、第２のドメインが、上記選択された残基の少なくとも４０（例えば、４５又は全て）を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン又はＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインであり；
Ｆ．方法が、ヒトにおける疾患若しくは病態のリスクを処置する、
ヒト免疫細胞。
【０４５４】
８．第１のシグナル伝達ドメインが、アミノ酸残基Ｙ６４、Ｙ７２及びＹ８３；Ｙ６４及びＹ７２；Ｙ７２及びＹ８３；Ｙ１１１及びＹ１２３；Ｙ１４２及びＹ１５３；Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３；又はＹ６４、Ｙ７２、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３；又はＹ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２、及びＹ１５３（位置番号は配列番号７の位置に対応する）を含む、態様７に記載の細胞。
【０４５５】
９．第１のシグナル伝達ドメインが、配列番号９を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメインであり、第２ドメインが、配列番号９を含むＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメインである、態様７又は８に記載の細胞。
【０４５６】
１０．第１及び第２のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメインであり、必要に応じて各ドメインが上記少なくとも５０個の選択された残基を含む、条項７〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【０４５７】
１１．第１及び第２のシグナル伝達ドメインの各々が、Ｒ１を含む免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、条項１〜１０のいずれかに記載の細胞。
【０４５８】
１２．シグナル伝達ドメインのＩＴＡＭが同一である、態様１１に記載の細胞。
【０４５９】
１３．第１及び第２のシグナル伝達ドメインが同一である、態様１〜１２のいずれかに記載の細胞。
【０４６０】
１４．１のシグナル伝達ドメインがヒトである、態様１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【０４６１】
１５．細胞内部分が、第３のヌクレオチド配列（Ｓ３）によって細胞中でコードされるさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（第３のシグナル伝達ドメイン、ＳＤ３）を含み、Ｓ３が、ＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含み、細胞のゲノムが、第４のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードする第４のヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ４が、（ｉｉｉ）ＳＤ３と同一でありＲ２を含む又は（ｉｖ）ＳＤ３の変異体でありＲ３を含み、Ｓ４が細胞の内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ２が非同義ＳＮＰである、態様１〜１４のいずれかに記載の細胞。
【０４６２】
追加の又は代替的な態様において、細胞内部分が、第３のヌクレオチド配列（Ｓ３）によってヒトゲノム中でコードされるさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（第３のシグナル伝達ドメイン、ＳＤ３）を含み、Ｓ３が、ＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含み、ヒトのゲノムが、第４のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードする第４のヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ４が、（ｉｉｉ）ＳＤ３と同一でありＲ２を含む又は（ｉｖ）ＳＤ３の変異体でありＲ３を含み、Ｓ４がヒトの内因性ゲノム配列であり、ＳＮＰ２が非同義ＳＮＰである。
【０４６３】
１６．ＳＤ１及びＳＤ３ドメインが異なる、態様１５に記載の細胞。
【０４６４】
１７．ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれがＲ２を含むＩＴＡＭを含む、態様１５又は１６に記載の細胞。
【０４６５】
１８．ＳＤ３及びＳＤ４のＩＴＡＭが同一である、態様１７に記載の細胞。
【０４６６】
１９．ＳＤ３及びＳＤ４が同一である、態様１５〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【０４６７】
２０．ＳＤ３がヒトである、態様１５〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
【０４６８】
２１．ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインである、態様１５〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【０４６９】
２２．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、第３のドメインが、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン又は４−１ＢＢドメインである、態様１５〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【０４７０】
２３．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、膜貫通タンパク質のＣ末端ドメインである、態様１〜２２のいずれかに記載の細胞。
【０４７１】
２４．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、（ａ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１０；（ｂ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１１；及び（ｃ）必要に応じて最大１０、９、８、７、６又は５（例えば、最大５）個のアミノ酸の相違を有するが、チロシンは保存されている配列番号１２から選択される１、２又は３個のアミノ酸モチーフを含む、態様１〜２３のいずれかに記載の細胞。
【０４７２】
２５．ＳＤ１がモチーフ（ａ）を含み、モチーフが、Ａ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７及びＫ８８からなる群から選択される最大５個の残基の変更によって配列番号１０と異なる、態様２４に記載の細胞。
【０４７３】
２６．変更が、Ａ６１Ｖ、Ａ６１Ｐ、Ｐ６２Ｓ、Ｐ６２Ａ、Ａ６３Ｐ、Ｑ６６Ｈ、Ｇ６７Ｓ、Ｎ６９Ｔ、Ｑ７０Ｙ、Ｑ７０Ｌ、Ｑ７０Ｐ、Ｑ７０Ｗ、Ｎ７３Ｙ、Ｒ７９Ｌ、Ｒ７９Ｇ、Ｅ８２Ｋ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｙ、Ｖ８５Ｉ、Ｄ８７Ｇ及びＫ８８Ｒからなる群から選択される、態様２５に記載の細胞。
【０４７４】
２７．ＳＤ１がモチーフ（ｂ）を含み、モチーフが、Ｐ１００、Ｑ１０１、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０８、Ｌ１１０、Ａ１２０、Ａ１２２及びＭ１２８からなる群から選択される最大５個の残基の変更によって配列番号１１と異なる、態様２４〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【０４７５】
２８．変更が、Ｐ１００Ｌ、Ｑ１０１Ｌ、Ｑ１０１Ｐ、Ｒ１０３Ｋ、Ｋ１０４Ｅ、Ｎ１０５Ｋ、Ｐ１０６Ｒ、Ｅ１０８Ａ、Ｌ１１０Ｑ、Ａ１２０Ｖ、Ａ１２２Ｖ及びＭ１２８Ｔからなる群から選択される、態様２７に記載の細胞。
【０４７６】
２９．ＳＤ１がモチーフ（ｃ）を含み、モチーフが、Ｅ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３６、Ｇ１３７、Ｇ１４０、Ｌ１４５、Ａ１４８、Ｔ１５２、Ａ１５５、Ｌ１５６からなる群から選択される最大５個の残基の変更によって配列番号１２と異なる、態様２４〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
【０４７７】
３０．変更が、Ｅ１３１Ｋ、Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３３Ｑ、Ｒ１３３Ｗ、Ｋ１３６Ｎ、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１４０Ｄ、Ｌ１４５Ｆ、Ａ１４８Ｄ、Ｔ１５２Ｉ、Ａ１５５Ｔ、Ｌ１５６Ｐからなる群から選択される、態様２９に記載の細胞。
【０４７８】
３１．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、第１のシグナル伝達ドメインが、複数（例えば、３個）のＩＴＡＭを含み、第２のシグナル伝達ドメインが、同じ対応するＩＴＡＭを含む、態様１〜３０のいずれかに記載の細胞。
【０４７９】
３２．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｓ５８、Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３（位置番号は配列番号７の位置に対応する）からなる群から選択される１個、それより多い又は全てのアミノ酸残基を含む、態様１〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【０４８０】
３３．ＳＤ１が、Ｃ７２及びＮ１５３の１つ又は両方を含む、態様３２に記載の細胞。
【０４８１】
３４．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３Η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｒ５２、Ｓ５６、Ａ５９、Ａ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｙ７２、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７、Ｋ８８、Ｒ９０、Ｒ９２、Ｄ９３、Ｍ９６、Ｇ９７、Ｐ１００、Ｑ１０１、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０８、Ｌ１１０、Ａ１２０、Ａ１２２、Ｍ１２８、Ｋ１２９、Ｅ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３６、Ｇ１３７、Ｇ１４０、Ｌ１４５、Ａ１４８、Ｔ１５２、Ｙ１５３、Ａ１５５、Ｌ１５６、Ａ１６０、Ｐ１６３及びＲ１６４（位置番号は配列番号７の位置に対応する）からなる群から選択される残基（上記Ｒ１）を含む、態様１〜３３のいずれかに記載の細胞。
【０４８２】
３５．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｙ７２又はＹ１５３（位置番号は配列番号７の位置に対応する）である残基（上記Ｒ１）を含む、態様１〜３４のいずれかに記載の細胞。
【０４８３】
３６．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、ｒｓ３６８６５１００１、ｒｓ３７２６５１０４８、ｒｓ７６７１１２６８６、ｒｓ７６５８７７５８０、ｒｓ７５１１４５９５６、ｒｓ７７２８６７１４４、ｒｓ５５８９３５０６、ｒｓ７６１７１０５１０、ｒｓ７７６６０１５４７、ｒｓ７６８６０７３７６、ｒｓ１９３９２２７４１、ｒｓ１９３９２２７４０、ｒｓ１９３９２２７３９、ｒｓ７８０１８８１２６、ｒｓ７７２１２８１７４、ｒｓ７５７９７８２２３、ｒｓ７７９３９７５６２、ｒｓ７４９９２６６５３、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ１８１７４６２０５、ｒｓ７５３５７２８６７、ｒｓ３７１７０９７９８、ｒｓ１４５４０７２６７、ｒｓ１４３１８０７２９、ｒｓ１４８５１３４１３、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ３６７６９０３３３、ｒｓ１４４９６３５７０、ｒｓ７７０３２０２５５、ｒｓ１３９９２６３０１、ｒｓ５６２９７６３６、ｒｓ７６０８９５７５５、ｒｓ１１２８９０５４１、ｒｓ３７０９１０３４０、ｒｓ１４５５０５９０９、ｒｓ７５４９３５００６、ｒｓ７５１５８３９７１、ｒｓ７６６５４１４８１、ｒｓ７６３０７４９６７、ｒｓ７４５８７１２１２、ｒｓ３７２６６５４６１、ｒｓ７６４１８５４９１、ｒｓ７５６３４００３９、ｒｓ７７３５７２４９１、ｒｓ２０１５９４８１５、ｒｓ７８１５１０５１９、ｒｓ１４７５２７５６１、ｒｓ７５１９８１６７７、ｒｓ７６３５３２９３９、ｒｓ７５３２７８２４４、ｒｓ７７１８７３９４９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ１８６００４１７９、ｒｓ７６２７７３７７５、ｒｓ７４８１５８２２０、ｒｓ７７６７０３６８０、ｒｓ５６１２６２９８２、ｒｓ７５８８４６００９、ｒｓ７４６２６２１８３、ｒｓ３７６０４６４４６、ｒｓ２０１９３７４０５及びｒｓ７５２１９８７９５からなる群から選択されるＳＮＰ（ＳＮＰ１）によりコードされる残基（上記Ｒ１）を含む、態様１〜３５のいずれかに記載の細胞。
【０４８４】
３７．ＳＤ１が、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン及びＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメインから選択されるＣＤ３細胞内ドメインであり、Ｒ５２、Ｓ５６、Ａ５９、Ａ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｙ７２、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７、Ｋ８８、Ｒ９０、Ｒ９２、Ｄ９３、Ｍ９６、Ｇ９７、Ｐ１００、Ｑ１０１、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０８、Ｌ１１０、Ａ１２０、Ａ１２２、Ｍ１２８、Ｋ１２９、Ｅ１３１、Ｒ１３２、Ｒ１３３、Ｋ１３６、Ｇ１３７、Ｇ１４０、Ｌ１４５、Ａ１４８、Ｔ１５２、Ｙ１５３、Ａ１５５、Ｌ１５６、Ａ１６０、Ｐ１６３及びＲ１６４（位置番号は配列番号７の位置に対応する）からなる群から選択される残基（上記Ｒ１）を含み、必要に応じてＳＤ２が、上記選択された残基（Ｒ１）も含む、態様１〜３６のいずれかに記載の細胞。
【０４８５】
３８．ＳＤ１又はＳＤ３が、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、態様１〜３６のいずれかに記載の細胞。
【０４８６】
３９．ＣＤ２８ドメインが、上記グループの全ての残基を含む、態様３８に記載の細胞。
【０４８７】
４０．ＣＤ２８ドメインが、アミノ酸残基Ｙ１９１及びＹ２０９（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）を含む、態様３８又は３９に記載の細胞。
【０４８８】
４１．ＣＤ２８ドメインが、ＹＭＮＭモチーフ（配列番号１３のＹ１９１−Ｍ１９２−Ｎ１９３−Ｍ１９４に対応する）及び／又はＰＹＡＰモチーフ（配列番号１３のＰ２０８−Ｙ２０９−Ａ２１０−Ｐ２１１に対応する）を含む、態様３８〜４０のいずれか一項に記載の細胞。
【０４８９】
４２．ＣＤドメインが、配列番号１５を含む、態様１〜４１のいずれかに記載の細胞。
【０４９０】
４３．改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．ＳＤ１が、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインであり；かつ
Ｅ．細胞のゲノムが、第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が、上記選択された残基の少なくとも１０（又は１１、１２又は１３）個を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、
ヒト免疫細胞。
【０４９１】
追加的又は代替的に、態様７は、以下を提供する：
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療する又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法が、ヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が、改変膜貫通タンパク質を含み、
タンパク質は、
Ａ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｂ．膜貫通部分；及び
Ｃ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｄ．ＳＤ１が、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｋ１８２、Ｒ１８３、Ｓ１８４、Ｒ１８５、Ｌ１８６、Ｄ１９０、Ｙ１９１、Ｎ１９３、Ｐ１９６、Ｐ１９９、Ｔ２０２、Ｋ２０４、Ｑ２０７、Ｆ２１５、Ａ２１７及びＹ２１８（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される少なくとも１３、１４、１５、１６、１７又は１８個のアミノ酸残基を含むＣＤ２８細胞内ドメインであり；
Ｅ．ヒトのゲノムが、第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が、上記選択された残基の少なくとも１０（又は１１、１２又は１３）個を含むＣＤ２８細胞内ドメインであり、かつ
Ｆ．方法が、ヒトにおける疾患又は病態のリスクを処置する、ヒト免疫細胞。
【０４９２】
４４．ＳＤ１が、アミノ酸残基Ｙ１９１及びＹ２０９（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）を含む、態様４３に記載の細胞。
【０４９３】
４５．ＳＤ１が配列番号１５を含み、第２のドメインが配列番号１５を含むＣＤ２８ドメインである、態様４３又は４４に記載の細胞。
【０４９４】
４６．ＳＤ１及びＳＤ２の各ドメインが、上記少なくとも１３個の選択された残基を含む、態様４３、４４又は４５のいずれ一項に記載の細胞。
【０４９５】
４７．細胞内部分が、第３のヌクレオチド配列（Ｓ３）によって細胞中でコードされるさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（第３のシグナル伝達ドメイン、ＳＤ３）を含み、Ｓ３が、ＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含み、細胞又はヒトのゲノムが、第４のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードする第４のヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ４が、（ｉｉｉ）ＳＤ３と同一でありＲ２を含む又は（ｉｖ）ＳＤ３の変異体でありＲ２を含み、ＳＤ４が、それぞれ細胞又はヒトの内因性ゲノム配列である、態様４３〜４６のいずれか一項に記載の細胞。
【０４９６】
４８．ＳＤ１及びＳＤ３ドメインが異なる、態様４７に記載の細胞。
【０４９７】
４９．ＳＤ３及びＳＤ４が同一である、態様４７又は４８に記載の細胞。
【０４９８】
５０．ＳＤ３がヒトである、態様４７〜４９のいずれか一項に記載の細胞。
【０４９９】
５１．ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン及び４−１ＢＢドメインからなる群から選択される細胞内ドメインである、態様４７〜５０のいずれか一項に記載の細胞。
【０５００】
５２．ＳＤ１が、受容体のＣ末端ドメイン又は受容体の最もＮ末端の細胞内ドメインである、態様４７〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【０５０１】
５３．ＳＤ１又はＳＤ３ドメインが、Ｌ１８７、Ｈ１８８、Ｓ１８９、Ｍ１９２、Ｍ１９４、Ｔ１９５、Ｒ１９７、Ｒ１９８、Ｇ２００、Ｐ２０１、Ｒ２０３、Ｈ２０５、Ｙ２０６、Ｐ２０８、Ｙ２０９、Ａ２１０、Ｐ２１１、Ｐ２１２、Ｒ２１３、Ｄ２１４、Ａ２１６、Ｒ２１９、及びＳ２２０（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）からなる群から選択される残基（上記Ｒ１又はＲ２）を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、態様１〜５２のいずれかに記載の細胞。
【０５０２】
５４．ＳＤ１又はＳＤ３が、Ｍ１９２、Ｍ１９４、Ｐ２０８、Ｙ２０９、Ａ２１０又はＰ２１１（位置番号は配列番号１３の位置に対応する）である残基（上記Ｒ１又はＲ２）を含むＣＤ２８細胞内ドメインである、態様１〜５３のいずれかに記載の細胞。
【０５０３】
５５．ＳＤ１又はＳＤ３が、ＣＤ２８細胞内ドメインであり、ｒｓ１３９８８１８８１、ｒｓ１３９８８１８８１、ｒｓ７５１９４５３２３、ｒｓ７５３３９６３５７、ｒｓ７５４４５３８１０、ｒｓ２００２２１７５９、ｒｓ５６２９６９９３３、ｒｓ７６５５１５３１４、ｒｓ１４５７６１３３５、ｒｓ１９９６４７２７２、ｒｓ２００７５１８２９、ｒｓ２０１５４７３３２、ｒｓ２００６４２７２３、ｒｓ３６７９０８４７５、ｒｓ１９９５４９６３６、ｒｓ１９９５４９６３６、ｒｓ７４９６８８８８１、ｒｓ７６９０９８３８３、ｒｓ５７２７３８９９０、ｒｓ２００６０６７７０、ｒｓ３７１８５０１１０、ｒｓ２０１７７３４１１、ｒｓ７６２１４４２２２、ｒｓ７７０６１０９１５、ｒｓ１９９７７７６７４、ｒｓ２０１９０９７４０、ｒｓ２０００１６３１０、ｒｓ２００９３６７３７、ｒｓ２０１５９８５９６及びｒｓ７６２７４７３５７からなる群から選択されるＳＮＰ（ＳＮＰ１又はＳＮＰ２）によりコードされる残基（上記Ｒ１又はＲ２）を含む、態様１〜５４のいずれか一項に記載の細胞。
【０５０４】
５６．ＳＤ３及びＳＤ４が、ヒト４−１ＢＢドメインであり、Ｒ２が、Ｒ２１５、Ｑ２１５、Ｗ２１５、Ｒ２１７、Ｇ２１７、Ｋ２１８、Ｎ２１８、Ｙ２２２、Ｃ２２２、Ｐ２２７、Ｓ２２７、Ｍ２２９、１２２９、Ｖ２３２、Ａ２３２、Ｑ２３６、Ｈ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｙ２４１、Ｒ２４４、Ｑ２４４、Ｅ２４７、Ｇ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５０、Ｇ２５２、Ｅ２５２、Ｖ２５２、Ｒ２５２、Ｃ２５３及びＳ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択される、態様１５及び／又は４７に従属する態様１〜５５のいずれかに記載の細胞。
【０５０５】
５７．ＳＤ３が、Ｒ２１５、Ｒ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２２２、Ｐ２２７、Ｍ２２９、Ｖ２３２、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｒ２４４、Ｅ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５２及びＣ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択される残基の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４又は全てを含む、態様５６に記載の細胞。
【０５０６】
５８．ＳＤ３及びＳＤ４が、ヒト４−１ＢＢドメインであり、ＳＤ３が、Ｑ２３６及びＤ２３９（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）を含む、態様１５及び／又は４７に従属する態様１〜５７のいずれかに記載の細胞。
【０５０７】
これらは、実施例１で説明したように、保存されるＴＲＡＦ結合残基である。
【０５０８】
５９．ＳＤ３が、配列番号１８を含む、態様１５及び／又は４７に従属する態様１〜５８のいずれか一項に記載の細胞。
【０５０９】
これは、保存された、天然に存在する残基及びＴＲＡＦ結合モチーフを保持する、本発明のユニバーサル４−１ＢＢフレームワークである。
【０５１０】
６０．改変膜貫通タンパク質を含むヒト免疫細胞であって、
タンパク質が、
Ｆ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｇ．膜貫通部分；及び
Ｈ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｉ．ＳＤ１が、Ｒ２１５、Ｒ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２２２、Ｐ２２７、Ｍ２２９、Ｖ２３２、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｒ２４４、Ｅ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５２及びＣ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択される残基の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４又は全てを含む４−１ＢＢ細胞内ドメインであり；かつ
Ｊ．細胞のゲノムが、第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が、上記選択された残基の少なくとも８（又は９又は１０）を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインである、
ヒト免疫細胞。
【０５１１】
追加的又は代替的に、態様７は以下を提供する：
疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示されるような、例えば、癌若しくは自己免疫疾患）を治療する又はそのリスクを低減する方法で使用される用途のためのヒト免疫細胞であって、方法が、ヒト患者へ免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が改変膜貫通タンパク質を含み、
タンパク質は、
Ｇ．第１の抗原又はリガンドドメインを含む細胞外部分；
Ｈ．膜貫通部分；及び
Ｉ．第１のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ１）を含む細胞内部分；
を含み；
Ｊ．ＳＤ１が、Ｒ２１５、Ｒ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２２２、Ｐ２２７、Ｍ２２９、Ｖ２３２、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｒ２４４、Ｅ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５２及びＣ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択される残基のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４個又は全部を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインであり；かつ
Ｋ．ヒトのゲノムが、第２のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ２）をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、ＳＤ２が、上記選択された残基の少なくとも８（又は９又は１０）を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインであり、
Ｌ．方法が、ヒトにおける疾患又は病態のリスクを処置する、
ヒト免疫細胞。
【０５１２】
６１．ＳＤ１が、アミノ酸残基Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｅ２４７及びＥ２５０（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）を含む、態様６０に記載の細胞。
【０５１３】
６２．ＳＤ１が配列番号１８を含み、第２のドメインが配列番号１８を含む４−１ＢＢドメインである、態様６０又は６１に記載の細胞。
【０５１４】
６３．ＳＤ１及びＳＤ２の各ドメインが、上記少なくとも１３個の選択された残基を含む、態様６０、６１又は６２のいずれか一項に記載の細胞。
【０５１５】
６４．細胞内部分が、第３のヌクレオチド配列（Ｓ３）によって細胞中でコードされるさらなるシグナル伝達ドメイン（第３のシグナル伝達ドメイン、ＳＤ３）を含み、Ｓ３が、ＳＤ３のアミノ酸残基（Ｒ２）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ２）を含み、細胞又はヒトのゲノムが、第４のシグナル伝達ドメイン（ＳＤ４）をコードする第４のヌクレオチド配列（Ｓ４）を含み、ＳＤ４が、（ｉｉｉ）ＳＤ３と同一でありＲ２を含む又は（ｉｖ）ＳＤ３の変異体でありＲ２を含み、ＳＤ４が、それぞれ細胞又はヒトの内因性ゲノム配列である、態様６０〜６３のいずれか一項に記載の細胞。
【０５１６】
６５．ＳＤ１及びＳＤ３ドメインが異なる、態様６４に記載の細胞。
【０５１７】
６６．ＳＤ３及びＳＤ４が同一である、態様６４又は６５に記載の細胞。
【０５１８】
６７．ＳＤ３がヒトである、態様６４〜６６のいずれか一項に記載の細胞。
【０５１９】
６８．ＳＤ３及びＳＤ４のそれぞれが、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）ドメイン、ＣＤ３η（ＣＤ３−イータ）ドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン、ＣＤ１６ドメイン、ＣＤ２７ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン及びＣＤ２８ドメインからなる群から選択される細胞内ドメインである、態様６４〜６７のいずれか一項に記載の細胞。
【０５２０】
６９．ＳＤ１が、受容体のＣ末端ドメイン又は受容体の最もＮ末端の細胞内ドメインである、態様６０〜６８のいずれか一項に記載の細胞。
【０５２１】
７０．ＳＤ１又はＳＤ３ドメインが、Ｒ２１５、Ｒ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２２２、Ｐ２２７、Ｍ２２９、Ｖ２３２、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｃ２４１、Ｒ２４４、Ｅ２４７、Ｅ２５０、Ｇ２５２及びＣ２５３（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）からなる群から選択される残基（上記Ｒ１又はＲ２）を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインである、態様１〜６９のいずれかに記載の細胞。
【０５２２】
７１．ＳＤ１又はＳＤ３が、Ｑ２３６、Ｄ２３９、Ｅ２４７又はＥ２５０（位置番号は配列番号１６の位置に対応する）である残基（上記Ｒ１又はＲ２）を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインである、態様１〜７０のいずれかに記載の細胞。
【０５２３】
７２．ＳＤ１又はＳＤ３が、４−１ＢＢ細胞内ドメインであり、ｒｓ７５３０１６２４２、ｒｓ１４３５２４９５０、ｒｓ７８０８１２４７６、ｒｓ７５５９２７７３５、ｒｓＬ４４９０８１０４、ｒｓ５３３８８３４３３、ｒｓ３６７５８４８０４、ｒｓＬ４１４９８４５７、ｒｓ７５１５４２９５５、ｒｓ７６４０１７９１２、ｒｓ７５２１９１４１６、ｒｓ５５４９０９０１９、ｒｓ７５９１８４５４８、ｒｓ７７６８７８２６０、ｒｓＬＬ３３１０００１、ｒｓＬＬ３３１０００１、ｒｓ７６１０８８６９１及びｒｓ７７２６９１７１８からなる群から選択されるＳＮＰ（ＳＮＰ１又はＳＮＰ２）によってコードされる残基（上記Ｒ１又はＲ２）を含む、態様１〜７１のいずれか一項に記載の細胞。
【０５２４】
７３．細胞外部分が、抗体ＶＨドメインを含む抗原結合部位を含み、ＶＨドメインが、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントとのヒトＶＨ遺伝子セグメントの組換えに由来し、ＶＨ遺伝子セグメントが、細胞又はヒトのゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ３）を含む、態様１〜７２のいずれかに記載の細胞。
【０５２５】
７４．細胞外部分が、抗体ＶＬドメインを含む抗原結合部位を含み、ＶＬドメインが、ヒトＶＬ遺伝子セグメントとＪＬ遺伝子セグメントの組換えに由来し、ＶＬ遺伝子セグメントが、細胞又はヒトのゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ４）を含む、態様１〜７３のいずれかに記載の細胞。
【０５２６】
７５．細胞外部分が、ＴＣＲ  Ｖαドメインを含む抗原結合部位を含み、Ｖαドメインが、Ｊα遺伝子セグメントとのヒトＶα遺伝子セグメントの組換えに由来し、Ｖα遺伝子セグメントが、細胞又はヒトのゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ５）を含む、態様１〜７３のいずれか一項に記載の細胞。
【０５２７】
７６．細胞外部分が、ＴＣＲ  Ｖβドメインを含む抗原結合部位を含み、Ｖβドメインが、Ｄβ及びＪβ遺伝子セグメントとのヒトＶβ遺伝子セグメントの組換えに由来し、Ｖβ遺伝子セグメントが、細胞又はヒトのゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ６）を含む、態様１〜７３及び７４のいずれか一項に記載の細胞。
【０５２８】
７７．細胞外部分が、Ｃα遺伝子セグメント配列によってコードされるＴＣＲ  Ｃα配列を含み、Ｃα遺伝子セグメントが、細胞又はヒトのゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ７）を含み、ＳＮＰ７がＣα細胞外アミノ酸残基（Ｒ３）をコードしＲ３が細胞外部分のＣα配列に含まれる、態様１〜７６のいずれかに記載の細胞。
【０５２９】
７８．細胞外部分が、Ｃβ遺伝子セグメント配列によってコードされるＴＣＲ  Ｃβ配列を含み、Ｃβ遺伝子セグメントが、細胞又はヒトのゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ８）を含み、ＳＮＰ８がＣβ細胞外アミノ酸残基（Ｒ４）をコードしＲ４が細胞外部分のＣβ配列に含まれる、態様１〜７７のいずれかに記載の細胞。
【０５３０】
７９．細胞が、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、活性化Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、例えば、プレＲＥＰ  ＴＩＬ）、幹細胞、メモリー幹細胞、骨髄細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、メモリーＴ細胞、ＴＳＣＭ、ＴＣＭ又はＴＥＭである、態様１〜７８のいずれかに記載の細胞。
【０５３１】
８０．細胞が、シグナル伝達の向上のために改変されており、シグナル伝達が、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ４０シグナル伝達から選択される、態様１〜７９のいずれかに記載の細胞。
【０５３２】
８１．態様１〜８０のいずれかに記載の複数の細胞を含む免疫細胞の集団。
【０５３３】
８２．ヒトにおける癌、炎症性疾患、自己免疫疾患又はウイルス感染を治療するための、態様１〜８１のいずれかに記載の細胞又は集団。
【０５３４】
一実施形態において、癌、疾患又は病態は、本明細書に開示される任意の癌、疾患若しくは病態である。
【０５３５】
８３．癌が、Ｔ細胞又はＢ細胞起源の癌、例えば、リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ（例えば、Ｔ−ＡＬＬ）、ＣＬＬ（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病）又は非ホジキンリンパ腫である、態様８２に記載の細胞又は集団。
【０５３６】
８４．各上記細胞が、上記ヒトの自己細胞（例えば、Ｔ細胞）であるか、又はそのような自己細胞の子孫である、態様８２若しくは８９に記載の細胞又は集団。
【０５３７】
８５．各自己細胞が、ヒトの血液又は腫瘍試料に由来し、インビトロで活性化され増やされる、態様８４に記載の細胞又は集団。
【０５３８】
８６．態様１〜８５のいずれかに記載の細胞の生成方法であって、
ｉ．ヒト免疫細胞（例えば、メモリーＴ細胞、ＮＫ細胞、骨髄細胞、幹細胞又はＴＩＬ）を取得すること；
ｉｉ．上記改変膜貫通タンパク質をコードする発現可能なヌクレオチド配列を取得することであって、タンパク質が細胞のゲノムに含まれるＳＮＰ（ＳＮＰ１）によってコードされる上記残基（Ｒ１）を含む、取得すること；かつ
ｉｉｉ．受容体の発現のために細胞にヌクレオチド配列を導入すること、
を含む方法。
【０５３９】
８７．工程（ｉｉｉ）によって生成される細胞を培養、分化及び／又は活性化することをさらに含み、それによって受容体を発現する細胞の集団を生成する、態様８６に記載の方法。
【０５４０】
８８．工程（ｉ）の細胞が、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患又はウイルス感染に罹患しているヒトから得られる、態様８６又は８７に記載の方法。
【０５４１】
８９．ヒトにおける癌、炎症性疾患、自己免疫疾患又はウイルス感染を治療する方法であって、態様１〜８８のいずれかに記載の、又は態様８７又は８８に記載の方法によって生成される細胞若しくは集団をヒトに投与することを含み、細胞死滅が達成され、癌、疾患若しくは病態が治療される、方法。
【０５４２】
一例において、ヒトにおける癌、疾患若しくは感染の重症度又は進行が、低減される。
【０５４３】
９０．投与細胞が、ヒトから得られ態様８６、８７又は８８に記載の方法の工程（ｉ）で使用された細胞の子孫である、態様８９に記載の方法。
【０５４４】
９１．ヒトにおける癌、炎症性疾患、自己免疫疾患若しくはウイルス感染を治療する又はそのリスク若しくは進行を低減するために、態様８９又は９０に記載の方法において使用するための、態様１〜９０のいずれかに記載の細胞又は集団。
【０５４５】
９２．態様１〜８５及び９１のいずれか一項に記載の細胞又は集団を含む医療用Ｖバッグ又は注射装置。
【０５４６】
９３．態様１〜９２のいずれかに記載の改変膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む哺乳動物幹細胞。
【０５４７】
９４．改変タンパク質がＣＡＬである、態様９３に記載の細胞。
【０５４８】
９５．改変タンパク質がＣＡＲである、態様９３に記載の細胞。
【０５４９】
９６．細胞が、多能性又は多分化能性である、態様９３〜９５のいずれか一項に記載の細胞。
【０５５０】
幹細胞は、ヒトへと発展できない。一実施形態において、幹細胞は、ヒト胚又は受精卵に発展できない。
【０５５１】
９７．細胞が骨髄幹細胞である、態様９３〜９６のいずれか一項に記載の細胞。
【０５５２】
９８．細胞が造血幹細胞である、態様９３〜９７のいずれか一項に記載の細胞。
【０５５３】
９９．細胞が非ヒト幹細胞である、態様９３〜９８のいずれか一項に記載の細胞。
【０５５４】
１００．細胞がエクスビボにある、態様９３〜９９のいずれか一項に記載の細胞。
【０５５５】
１０１．態様９３〜１００のいずれか一項に記載の複数の幹細胞を含む細胞の集団。
【０５５６】
１０２．方法が、ヒトにおける疾患若しくは病態を治療又は予防するためのヒトへの免疫細胞及び架橋剤を含む、態様１〜１０１のいずれかに記載の方法。
【０５５７】
１０３．態様９３〜１００のいずれか一項に記載の幹細胞をヒトに投与することを含み、幹細胞が、改変膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＬ又はＣＡＲ）を発現する上記免疫細胞に発展し、免疫細胞が、ヒトにおいて標的細胞と組み合わされ、改変免疫細胞が活性化され標的細胞が死滅する、態様１０２に記載の方法。
【０５５８】
１０４．方法が条項１０１の集団を投与することを含み、上記幹細胞が改変膜貫通タンパク質を発現する複数の免疫細胞に発展し、免疫細胞がヒトにおいて標的細胞と組み合わされ改変免疫細胞が活性化され標的細胞が死滅し、それによって疾患若しくは病態が治療又は予防される、態様１０３に記載の方法。
【０５５９】
１０５．ヒトにおける疾患若しくは病態、例えば、癌又は自己免疫疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減するための態様１０３又は１０４に記載の方法における使用のための、態様９３〜１０１のいずれか一項に記載の細胞又は集団。
【０５６０】
実施例に記載されるように、本発明者は、ユニバーサル細胞内シグナル伝達ドメインフレームワーク：配列番号９、１５及び１８を設計した。この目的のために、本発明はまた、以下の態様を提供する：
１．そのゲノムが、（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号９を含むＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列；及び配列番号９を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＣＤ２８細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列；及び配列番号１５を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ２８細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列；並びに／又は
（ｉｉｉ）配列番号１８を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列；及び配列番号１８を含むＣＡＬ又はＣＡＲの４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列、
の１つ、それより多く又は全部を含むＣＡＬ免疫細胞又はＣＡＲ免疫細胞。
【０５６１】
２．疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療又は予防するためにヒト患者に投与するための自己又は同種細胞移植片であって、複数のＣＡＬ免疫細胞又はＣＡＲ免疫細胞を含み、細胞がヒトドナーから得られる１以上の祖先細胞の子孫であり、移植片の各上記細胞のゲノムが（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）配列番号９を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって；祖先細胞（複数可）のゲノム（複数可）が、配列番号９を含むＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、配列；
（ｉｉ）配列番号１５を含むＣＡＬ又はＣＡＲのＣＤ２８細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって；祖先細胞（複数可）のゲノム（複数可）が、配列番号１５を含むＣＤ２８細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、配列；又は
（ｉｉｉ）配列番号１８を含むＣＡＬ又はＣＡＲの４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって；祖先細胞（複数可）のゲノム（複数可）が、配列番号１８を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードする内因性ヌクレオチド配列を含む、配列、
の１つ、それより多く又は全部を含む、自己又は同種細胞移植片。
【０５６２】
３．移植片の各上記細胞が上記内因性配列（複数可）を含む、態様２に記載の移植片。
【０５６３】
一例において、ＣＡＬ又はＣＡＲは配列番号９を含み、上記移植片は配列番号９をコードする内因性ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン配列を含み、かつ／又はＣＡＬ又はＣＡＲは配列番号１５を含み、上記移植片は配列番号１５をコードする内因性ＣＤ２８細胞内ドメイン配列を含み、かつ／又はＣＡＬ又はＣＡＲは配列番号１８を含み、上記移植片は配列番号１８をコードする内因性４−１ＢＢ細胞内ドメイン配列を含む。
【０５６４】
代替例において、そのような内因性配列の１以上が、上記移植片細胞又は免疫細胞（複数可）においてノックアウトされ得る（すなわち、機能又は発現しないようにされ得る）。しかしながら、細胞は、ドナーにおいて配列番号９、１５及び１８の１以上を含むＣＡＲ又はＣＡＬの細胞内ドメインと共に機能するシグナル伝達機構をなお発現する。このようなノックアウトは内因性シグナル伝達ドメインではなく、細胞のＣＡＲ又はＣＡＬにシグナル伝達を集中するために使用され得る。
【０５６５】
４．ヒト患者において疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療又は予防する方法において使用するための、患者の生殖細胞ゲノムが上記細胞内ドメイン内因性配列（複数可）を含み、必要に応じて生殖細胞ゲノムが、それぞれ配列番号９、１５及び１８を含むＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８及び４−１ＢＢ細胞内ドメインをコードする、態様１〜３のいずれか一項に記載の細胞又は移植片。
【０５６６】
一例において、ＣＡＬ又はＣＡＲは配列番号９を含み、上記生殖細胞ゲノムは配列番号９をコードする内因性ＣＤ３ゼータ細胞内ドメイン配列を含み、かつ／又はＣＡＬ若しくはＣＡＲは配列番号１５を含み、上記生殖系列ゲノムは配列番号１５をコードする内因性ＣＤ２８細胞内ドメイン配列を含み、かつ／又はＣＡＬ若しくはＣＡＲは配列番号１８を含み、上記生殖系列ゲノムは配列番号１８をコードする内因性４−１ＢＢ細胞内ドメイン配列を含む。
【０５６７】
５．上記ドナーであるヒト患者における疾患若しくは病態（例えば、癌）を治療又は予防するための、態様２、３又は４に記載の移植片。
【０５６８】
６．ＣＡＬ又はＣＡＲが、細胞外ＣＤ３（例えば、ＣＤ３デルタ）又はＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメインを含む、態様１〜５のいずれか一項に記載の細胞又は移植片。必要に応じて、ＣＤ３細胞外ドメインは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はＣＤεドメインである。
【０５６９】
本発明はまた、以下の概念を提供する：
１．ＣＡＬが、ＣＤ３細胞外ドメイン（例えば、ＣＤ３δ又はＣＤ３ε細胞外ドメイン）；オプションのヒンジ（例えば、ＣＤ８αヒンジ）；膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８α又はＣＤ２８膜貫通ドメイン）；及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを（Ｎ末端からＣ末端の方向で）含む改変ポリペプチドを含み、ＣＡＬが免疫細胞膜に含まれＣＡＬが架橋剤と結びつく時に、細胞内シグナル伝達が免疫細胞内で誘発されて免疫細胞の活性を調節する、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）。
【０５７０】
必要に応じて、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ドメインではない。
【０５７１】
一例において、ＣＡＬはヒトＣＤ３δ細胞外ドメインを含む。一例において、ＣＡＬは、ヒトＣＤ８αヒンジを含む。一例において、ＣＡＬは、ヒトＣＤ８α又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。一例において、ＣＡＬはヒトＣＤ３ζドメインを含む。ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインも含む改変ポリペプチド中のＣＤ３細胞外ドメインの提供は、非天然の構成である。
【０５７２】
必要に応じて、上記各ＣＤ３ドメインは、例えば、本明細書に記載の１以上のＣＤ３ドメインＳＮＰを含む、本明細書に記載の任意のＣＤ３ドメインに従ってよい。
【０５７３】
代替例において、概念１は以下を提供する：
少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含むＣＡＬポリペプチド複合体であって、
（ｉ）第１のポリペプチドが、ＣＤ３細胞外ドメイン（例えば、ＣＤ３δ又はＣＤ３ε細胞外ドメイン）；オプションのヒンジ（例えば、ＣＤ８αヒンジ）及び膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ８α又はＣＤ２８膜貫通ドメイン）を含み（Ｎ末端からＣ末端の方向で）；かつ
（ｉｉ）第２のポリペプチドが、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ８α又はＣＤ２８膜貫通ドメイン）；及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含み（Ｎ末端からＣ末端の方向で）；一方又は両方又は上記ポリペプチドが、ＣＤ３ドメインではない細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）を含み、ＣＡＬが免疫細胞膜に含まれＣＡＬが架橋剤と結びつく時に、細胞内シグナル伝達が免疫細胞内で誘発されて免疫細胞の活性を調節する、
ＣＡＬポリペプチド複合体。
【０５７４】
一例において、ＣＡＬは、（ａ）ＣＤ３δ、ＣＤ３ε又はＣＤ３γ鎖、及び（ｂ）ＣＤ３ζ鎖を含み、一方又は両方又は上記鎖は、ＣＤ３ドメインではない細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。例えば、一方又は両方の鎖は、それぞれＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン及びＣＤ１６ドメインからなる群から選択される１以上の細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれを含み、例えば、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達４−１ＢＢドメインを含む。一例において、ＣＡＬは、ＣＤ３δ鎖（例えば、１つの上記鎖）を含み、必要に応じてＣＡＬはまたＣＤ３ε鎖（例えば、２つの上記鎖）を含み、かつ／又はＣＡＬはＣＤ３γ鎖（例えば、１つの上記鎖）を含み、必要に応じてＣＡＬは、ＣＤ３ζ鎖（例えば、２つの上記鎖）を含む。一例において、（ａ）の鎖は、ヒト細胞外ＣＤ３ドメイン（例えば、ＣＤ３δドメイン）を含む。一例において、ＣＡＬは、１つのＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、１つのＣＤ３γ鎖及び２つのＣＤ３ζ鎖の複合体を含み、上記鎖（例えば、両方のＣＤ３ζ鎖）の少なくとも１つは、ＣＤ３ドメインではないそれぞれの上記細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。ＣＡＬは、例えば、ＣＤ３γ、δ、ε及びζ鎖の複合体を含む、天然に存在するＣＤ３鎖複合体を含んでもよいが、その１以上の鎖（例えば、その１以上のζ鎖又はδ鎖（複数可））は、上記非ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ又はＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０５７５】
一態様において、本発明は、ＣＤ３ドメインではない１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、それぞれが４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む改変ＣＤ３ζ鎖を提供する。例えば、各非ＣＤ３ドメインは、ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦｃεＲＩγドメイン、ＣＤ６４ドメイン及びＣＤ１６ドメインからなる群から選択され、例えば、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達４−１ＢＢドメインを含む。必要に応じて、ＣＤ３ζ鎖は、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３δ又はＣＤ３ε）細胞外ドメイン又はＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６Ａ）細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、ヒトのドメインであり得る。
【０５７６】
一例において、全てのＣＤ３鎖又はドメインはヒトであり、例えば、同一のヒトゲノム（例えば、患者又はＣＡＬの将来のレシピエントのゲノム）に由来し、例えば、ヒトのドナー細胞又は組織（例えば、骨髄又は造血幹細胞試料）に由来する。
【０５７７】
一例において、本発明のＣＡＬは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ細胞）膜に含まれる。
【０５７８】
２．ＣＤ３細胞外ドメインがヒトＣＤ３細胞外ドメインである、概念１のＣＡＬ。
【０５７９】
３．ＣＤ２７ドメイン、ＣＤ２８ドメイン、ＩＣＯＳドメイン、ＯＸ４０ドメイン、ＣＤ４０ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＦＣεＲＩγドメイン、ＣＤ６４及びＣＤ１６ドメインからなる群からそれぞれ選択される、１以上のさらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含み、例えば、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達４−１ＢＢドメインを含む、概念１又は２のＣＡＬ。
【０５８０】
一例において、改変ポリペプチドはＮ末端からＣ末端の方向で、上記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン及び上記さらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８）の１以上を含む。
【０５８１】
一例において、改変ポリペプチドはＮ末端からＣ末端の方向で、上記さらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８）の１以上並びに上記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０５８２】
一例において、改変ポリペプチドはＮ末端からＣ末端の方向で、上記さらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８）、上記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン及び上記さらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ２８）の１以上を含む。
【０５８３】
４．細胞が概念１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＬを発現する、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞（例えば、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ細胞）。
【０５８４】
５．概念１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＬをコードする核酸。
【０５８５】
６．ＣＡＬを生成する方法であって、細胞（例えば、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ細胞）中で概念１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＬを発現させることを含む、方法。
【０５８６】
本発明の特定の態様において、架橋剤は、第１の標的抗原（例えば、癌細胞上で発現したＴＡＡ、例えば、ＣＤ１９）を結合でき、かつ架橋剤が投与され得るヒト又は患者の細胞によって天然に表面発現される第２の標的抗原も結合できる、多特異性薬剤である。この場合、例えば、細胞が免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬ細胞）である場合、架橋剤は、本発明のＣＡＬ免疫細胞に結合していない時に、ヒト又は上記患者の野生型の（すなわち、内因性の）免疫細胞に結合できる。例えば、架橋剤は、ＣＤ３細胞外ドメイン（例えば、ＣＤ３δ細胞外ドメイン）を結合でき、架橋剤は本発明のＣＡＬ−免疫細胞の細胞外ドメイン（第２の標的抗原）に結合した時に細胞内シグナル伝達を誘発でき、或いは患者の内因性Ｔ細胞に結合した時に架橋剤は内因性Ｔ細胞において細胞内シグナル伝達を誘発できる。例えば、架橋剤はＢｉＴＥ（商標）であり得る。例えば、架橋剤はブリナツモマブ又はカツマキソマブである。本発明のこれらの態様において、したがって本発明は都合よく、ＣＡＬ免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が投与された患者において免疫細胞のシグナル伝達を誘発する２つの方法を含む。
【０５８７】
実施例
実施例１：ドメイン変異の分析
Ｅｎｓｅｍｂｌからの情報に基づいて、ヒトの免疫細胞タンパク質及びドメイン中の天然に存在する変異の分析を行った。これは、改変タンパク質（例えば、ＣＡＲ又はＣＡＬ）とヒト細胞、レシピエント又はドナーとの間で適合する目的のＳＮＰ及びアミノ酸変異を支援する情報を提供した。本発明によるこのような適合の利点は、上でより詳細に議論される。本発明者は、本発明において有用性を有する、以下の非同義ＳＮＰ変異を特定した。
【０５８８】
（ａ）ヒトＣＤ３変異
【表２】
2019512215.tif 000003
＊転写産物ＥＮＳＴ０００００５３２９１７の生成物を参照。
【０５８９】
【表３】
2019512215.tif 000004
＊転写産物ＥＮＳＴ０００００３００６９２の生成物を参照。
【０５９０】
【表４】
2019512215.tif 000005
＊転写産物ＥＮＳＴ０００００３６１７６３の生成物を参照。
【０５９１】
【表５】
2019512215.tif 000006
2019512215.tif 000007
2019512215.tif 000008
【０５９２】
参照により本明細書に組み込まれる以下のアミノ酸及びヌクレオチド配列を参照した位置。
【表６】
2019512215.tif 000009
【０５９３】
【表７】
2019512215.tif 000010
＊その配列が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物ＩＤ  ＥＮＳＴ０００００３９２１２２及びＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２０９６３によって特定されるタンパク質を参照。
【０５９４】
以下の位置：
（化１）
Ｓ５８、Ｙ６４、Ｙ７２、Ｙ８３、Ｙ１１１、Ｙ１２３、Ｙ１４２及びＹ１５３
は、Ｔ細胞受容体誘発後にリン酸化される。太字＝ＩＴＡＭ残基：本発明の好ましい実施形態において、改変タンパク質、ＣＡＲ又はＣＡＬのＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、少なくともＹ７２及びＹ１５２、及び好ましくは全６つのチロシンを含む。
【０５９５】
ＩＴＡＭ（それぞれ２９個のアミノ酸）
位置６１〜８９（配列番号７を参照した位置）
ＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲ
位置１００〜１２８
ＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭ
位置１３１〜１５９
ＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱ
【０５９６】
Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物番号ＥＮＳＴ０００００３９２１２２のタンパク質生成物における位置番号を参照：
本発明者は、本発明によるこれらの１以上の可能性のある適合のために、以下の変異位置を特定した（配列番号７における位置に従う番号づけ）。
（化２）
Ｒ５２、Ｓ５６、Ａ５９、Ａ６１、Ｐ６２、Ａ６３、Ｑ６６、Ｇ６７、Ｎ６９、Ｑ７０、Ｙ７２、Ｎ７３、Ｒ７９、Ｅ８２、Ｄ８４、Ｖ８５、Ｄ８７、Ｋ８８、Ｒ９０、Ｒ９２、Ｄ９３、Ｍ９６、Ｇ９７、Ｐ１００、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｋ１０４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｌ１０９、Ａ１１９、Ａ１２１、Ｍ１２７、Ｋ１２８、Ｅ１３０、Ｒ１３１、Ｒ１３２、Ｋ１３５、Ｇ１３６、Ｇ１３９、Ｌ１４４、Ａ１４７、Ｔ１５１、Ｙ１５２、Ａ１５４、Ｌ１５５、Ａ１５９、Ｐ１６２、及びＲ１６３。
【０５９７】
これに基づき、本発明者は、ユニバーサルヒトＣＤ３ゼータ細胞内ドメインのフレームワークを特定し、特定の位置が、ほとんどのヒト患者及びヒト細胞とのユニバーサルな適合性のために一定であり、かつＩＴＡＭのチロシンが、細胞内シグナル伝達カスケードにおける使用のために保持されている。この点において、本発明のユニバーサルＣＤ３ゼータフレームワーク細胞内ドメインを示す（Ｘ＝任意のアミノ酸）、配列番号９を参照されたい。本発明は、そのため、配列番号９を含む細胞内ＣＤ３ゼータドメインを含む改変タンパク質であるＣＡＲ又はＣＡＬを提供する。一例において、改変タンパク質であるＣＡＲ又はＣＡＬは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬにより発現される。一例において、本発明は、ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示される）を治療するか又はそのリスクを低減する方法を提供し、方法は、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ細胞又はＣＡＬ細胞）をヒトに投与することを含み、ヒトは、配列番号９をコードするＣＤ３ゼータ細胞内ドメインヌクレオチド配列を含む。そのため、タンパク質（例えば、ＣＡＲ又はＣＡＬ）は、患者との適合性のために適合される。
【０５９８】
（ｂ）ヒトＣＤ２８変異
ＣＤ２８（分化クラスター２８；Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１０７４７）は、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要とされる共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞上で発現されるタンパク質の１つである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えて、ＣＤ２８を介するＴ細胞の刺激は、様々なインターロイキン（特に、ＩＬ−６）の生成のための強力なシグナルを提供できる。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質に対する受容体である。
【０５９９】
トポロジー：
膜貫通＝位置１５３〜１７９；
細胞内ドメイン＝位置１８０〜２２０
（配列番号１３を参照して番号を付けた位置）。
【０６００】
ＣＤ２８は、その効果的なシグナル伝達に重要ないくつかの残基を有する細胞内ドメインを所有する。チロシン１７０から始まるＹＭＮＭモチーフは特に、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質、特にＰＩ３Ｋ、Ｇｒｂ２及びＧａｄの動員に重要である。Ｙ１７０残基は、ｍＴＯＲを介するＢｃｌ−ｘＬの誘導及びＰＫＣθを介するＩＬ−２転写の増強に重要であるが、増殖には影響を及ぼさず、ＩＬ−２生成にわずかな減少をもたらす。（ＹＭＮＭの一部として）Ｎ１７２残基は、Ｇｒｂ２及びＧａｄの結合に重要であり、ＮＦ−κΒ転位ではなく、ＩＬ−２  ｍＲＮＡ安定性を誘導できるように思われる。ＮＦ−κΒの誘導は、分子内のＹＭＮＭと２個のプロリンリッチモチーフの両方へのＧａｄの結合にはるかに依存するように思われる。しかしながら、ＰＩ３Ｋに結合できないがＧｒｂ２及びＧａｄに結合できる、モチーフの最後のアミノ酸Ｍ１７３の変異は、ほとんどＮＦ−κΒ又はＩＬ−２を与えず、それらのＧｒｂ２及びＧａｄがＰＩ３Ｋの喪失を補うことができないことを示唆する。ＩＬ−２転写は、２つの段階；転写を可能にするＹ１７０依存性、ＰＩ３Ｋ依存性の初期段階と、免疫シナプスの形成に依存するＰＩ３Ｋ非依存性第２相、を有するように思われ、これがＩＬ−２ｍＲＮＡ安定性の増強をもたらす。両方とも、ＩＬ−２の完全な生成に必要とされる。
【０６０１】
ＣＤ２８はまた、ＳＨ３含有タンパク質に結合できる２つのプロリンリッチモチーフを含有する。Ｉｔｋ及びＴｅｃは、Ｙ１７０  ＹＭＮＭのすぐ後に続くこれらの２つのモチーフのＮ末端に結合でき、ＬｃｋはＣ末端を結合する。ＩｔｋとＬｃｋの両方は、チロシン残基をリン酸化でき、これは次いでＳＨ２含有タンパク質がＣＤ２８に結合するのを可能にする。ＣＤ２８へのＴｅｃの結合はＩＬ−２生成を増強し、そのＳＨ３及びＰＨドメインのＣＤ２８及びＰＩＰ３それぞれへの結合に依存する。ＣＤ２８中のＣ末端プロリンリッチモチーフは、フィラミンＡを経由して免疫シナプスにＬｃｋ及び脂質ラフトをもたらすのに重要である。Ｃ末端モチーフ内の２つのプロリンの変異は、増殖及びＩＬ−２生成を減少させるが、Ｂｃｌ−ｘＬを正常に誘導する。ＰＹＡＰモチーフ（成熟ヒトＣＤ２８中のＹ１９１）内のチロシンのリン酸化は、ｓｒｃキナーゼのＬｃｋのＳＨ２ドメインに対して高い親和性結合部位を形成し、これは次に、セリンキナーゼＰＫＣ−θに結合する。
【０６０２】
この基礎及び天然ＳＮＰ非同義変異分析において、本発明者はユニバーサルなヒトＣＤ２８細胞内ドメインフレームワークを特定し、ここで特定の位置が、ほとんどのヒト患者及びヒト細胞とのユニバーサルな適合性のために一定であり、保存されたＹＭＮＭ及びＰＹＡＰチロシンが、細胞内シグナル伝達カスケードでの使用のために保持される。この点で、本発明のユニバーサルＣＤ２８フレームワーク細胞内ドメインを示す、配列番号１５（Ｘ＝任意のアミノ酸）を参照されたい。本発明は、そのため、配列番号１５を含む細胞内ＣＤ２８ドメインを含む改変タンパク質（例えば、ＣＡＲ又はＣＡＬ）を提供する。一例において、タンパク質（例えば、ＣＡＲ又はＣＡＬ）は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬにより発現される。一例において、本発明は、ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示される）を治療する又はそのリスクを低減する方法を提供し、方法は、ヒトに免疫細胞（例えば、ＣＡＲ細胞又はＣＡＬ細胞）を投与することを含み、ヒトは、配列番号１５をコードするＣＤ２８細胞内ドメインのヌクレオチド配列を含む。そのため、タンパク質ＣＡＲ又はＣＡＬは、患者との適合性のために適合される。
【０６０３】
表６：選択されたヒトＣＤ２８変異
膜貫通変異
【表８】
2019512215.tif 000011
細胞内ドメイン変異
【表９】
2019512215.tif 000012
2019512215.tif 000013
＊ＹＭＮＭモチーフの一部
＊＊ＰＹＡＰモチーフの一部
【０６０４】
（ｃ）ヒト４−１ＢＢ変異
ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。その代替名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−１ＢＢであり、リンパ球活性化（ＩＬＡ）によって誘導される。ＣＤ１３７は現在、共刺激免疫チェックポイント分子として免疫学者が関心をもっている。ＣＤ１３７の最もよく特徴付けられる活性は、活性化Ｔ細胞に対する共刺激活性である。ＣＤ１３７の架橋は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２の分泌、生存及び細胞溶解活性を増強する。さらに、それはマウスの腫瘍を除去するために免疫活性を高めることができる。
【０６０５】
Ｅｎｓｅｍｂｌ転写物：ＥＮＳＴ０００００６１５２３０
トポロジー：膜貫通：１８７〜２１３
細胞内ドメイン：２１４〜２５５
（配列番号１６に対する位置番号）
【０６０６】
表７：選択されたヒト４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）変異
細胞内ドメイン変異
【表１０】
2019512215.tif 000014
＊ＴＲＡＦ２結合部位
【０６０７】
参照するのは、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ．２００１  Ｄｅｃ  ３１；１２（３）：３０４−１２；「新規ロイシンリッチリピートタンパク質（ＬＲＲ−１）：４−１ＢＢ媒介性シグナル伝達の潜在的な関与」（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＬＲＲ−１）：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ４−１ＢＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」；Ｊａｎｇ  ＬＫらであり、これは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである４−１ＢＢが、ＭＨＣに結合した抗原とのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体の結合時に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上で誘導されることを説明する。４−１ＢＢは、Ｔ細胞活性化の間に共刺激シグナルを伝達するのに重要な役割を果たしている。しかしながら、４−１ＢＢ媒介性シグナル伝達経路が研究された。著者らは、４−１ＢＢと結合する細胞内シグナル伝達分子を特定するために、酵母ツーハイブリッド法を行った。ＬＲＲ−１と名付けられた新規ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）含有タンパク質は、４−１ＢＢの細胞質ドメインと特異的に相互作用することが見出された。ＬＲＲ−１の過剰発現は、４−１ＢＢ又はＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）２により誘導されるＮＦ−κＢの活性化を抑制した。加えて、ＬＲＲ−１によって下方制御されるＪＮＫ１活性が、４−１ＢＢによって誘導された。これらの結果は、ＬＲＲ−１が、ＮＦ−カッパＢ及びＪＮＫ１の活性化をもたらす４−１ＢＢ媒介性シグナル伝達カスケードを負に調節することを示すと、著者らは結論付けている。
【０６０８】
参照するのはまた、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｊａｎ；１８（１）：５５８−５６５；「４−１ＢＢ及びＯｘ４０は、ＴＮＦ受容体関連因子を結合し核因子κΒを活性化する、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−神経成長因子受容体サブファミリーのメンバーである（４−１ＢＢ  ａｎｄ  Ｏｘ４０  Ａｒｅ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＴＮＦ）−Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄ  ＴＮＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  κＢ）」；Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｒｃｈ  ＆  Ｃｒａｉｇ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎであり、これは、４−１ＢＢ及びＯＸ４０の細胞質末端中のＴＲＡＦ結合ドメインが種間で保存されていることを説明する。（Ａ）４−１ＢＢ及びＯｘ４０の細胞質ドメインのタンパク質配列のアラインメント。いずれかの受容体とのＴＲＡＦ分子の相互作用に重要であることが示されるアミノ酸残基が研究された。この報告では、著者は、ＴＮＦ−ＮＧＦ受容体ファミリーの２つのメンバーである４−１ＢＢ及びＯＸ４０が、細胞質シグナル伝達カスケードを誘発するためにＴＲＡＦ分子を使用できることを実証する。この報告は、ＴＮＦ−ＮＧＦ受容体ファミリーの２つのメンバーである４−１ＢＢ及びＯｘ４０の細胞質ドメインが、細胞内アダプター分子のＴＲＡＦファミリーのタンパク質に結合する能力について説明する。トランスフェクトされた細胞中の４−１ＢＢ及びＯｘ４０の細胞質ドメインの多量体化は、ＴＲＡＦ依存的に転写因子ＮＦ−κΒを活性化できる。興味深いことに、個々のＴＲＡＦタンパク質の発現増加は、ＮＦ−κΒの活性化を誘導するこれらの受容体の能力に正又は負のいずれかの影響を与えることができる。これらのデータは、個々のＴＲＡＦタンパク質の差次的な結合親和性と相対存在量の両方が、受容体架橋に対する細胞応答に影響を及ぼし得ることを示唆する。これらの結果は、ＴＮＦ−ＮＧＦ受容体ファミリーのメンバーが活性化Ｔ細胞上で架橋された時に観察された可変的な影響について、可能性のある説明を提供する。
【０６０９】
本発明者はしたがって、改変タンパク質（例えば、ＣＡＲ及びＣＡＬ）ドメインがキメラ受容体を有するヒト免疫細胞の細胞内機構との使用のために適合するように、改変タンパク質（例えば、ＣＡＲ及びＣＡＬ）の実施形態で使用される４−１ＢＢ細胞内ドメイン中でＴＲＡＦ結合部位が保存される望ましさ並びに本発明による適合の望ましさに気づいた。本発明はそのため、これを含む本発明の改変膜貫通タンパク質（ＣＡＲ若しくはＣＡＬ）又は免疫細胞を提供し、タンパク質は、Ｑ２３６及びＥ２４７を含む細胞内４−１ＢＢドメイン（例えば、位置の番号付けは配列番号１６を参照するＱ２３６−Ｅ２３７−Ｅ２３８−Ｄ２３９及び２４７Ｅ−２４８Ｅ−２４９Ｅ−２５０Ｅを含む）を含む。
【０６１０】
ＳＮＰ及び変異解析に基づいて、本発明者はユニバーサルなヒト４−１ＢＢ細胞内ドメインフレームワークを特定し、ここで特定の位置がほとんどのヒト患者及びヒト細胞とのユニバーサルな適合性のために一定であり、かつＴＲＡＦ結合残基が細胞内シグナル伝達カスケードにおける使用のために保持される。この点で、本発明のユニバーサル４−１ＢＢフレームワーク細胞内ドメイン（Ｘ＝任意のアミノ酸）を示す、配列番号１８を参照されたい。本発明はそのため、配列番号１８を含む細胞内４−１ＢＢドメインを含む改変タンパク質ＣＡＲ又ＣＡＬを提供する。
【０６１１】
一例において、改変タンパク質ＣＡＲ又はＣＡＬは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＴＩＬにより発現される。一例において、本発明は、ヒトにおける疾患若しくは病態（例えば、本明細書に開示される）を治療する又はそのリスクを低減する方法を提供し、方法は、ヒトに免疫細胞、ＣＡＲ細胞又はＣＡＬ細胞を投与することを含み、ヒトは、Ｑ２３６及びＥ２４７を含む（例えば、位置の番号付けは配列番号１６を参照するＱ２３６−Ｅ２３７−Ｅ２３８−Ｄ２３９及び２４７Ｅ−２４８Ｅ−２４９Ｅ−２５０Ｅを含む）又は配列番号１６を含む４−１ＢＢ細胞内ドメインヌクレオチド配列を含む。そのため、タンパク質ＣＡＲ又はＣＡＬは、ヒト細胞又は患者との適合性のために適合される。
【０６１２】
実施例２：ブリナツモマブによるＣＤ３δ−ＣＡＬ  Ｔ細胞調節
ＷＯ２０１５／０５８０１８の実施例に開示される方法は、免疫細胞中にＣＡＬをコードする導入遺伝子（その特許出願に開示されているＣＡＲをコードする導入遺伝子の代わりに）を挿入するように容易に適合できる。
【０６１３】
ＣＡＬ導入遺伝子は、本明細書の配列番号４のヒトＣＤ３δ細胞外ドメイン、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ細胞内ドメイン及びＣＤ３ζドメインをコードする（Ｎ末端からＣ末端の方向で）ヌクレオチド配列を含む。適切には、ＣＡＬ配列は、ＣＤ１６配列の代わりにＣＤ３δドメイン配列を有する、ＷＯ２０１５／０５８０１８のＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζ又はＣＤ１６Ｖ−ΒΒ−ζ構築物の改変であり得る。導入遺伝子は、Ｂ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）に罹患しているヒトのドナーから得られた細胞中に挿入され、改変Ｔ細胞集団は、エクスビボで発展され増殖される。ＣＡＬ及び導入遺伝子は、細胞外及び細胞内のＣＡＬ  ＣＤ３並びに４−１ＢＢドメインに適合したアミノ酸多型である。必要に応じて、内因性ＣＤ３δ及び／又はＣＤ３ζ遺伝子が、例えば、遺伝子のＣａｓ９標的化不活性化を用いて、改変細胞内でノックアウトされる。さらに内因性ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲ発現について不活化され得る。
【０６１４】
１つの試験で、改変ＣＡＬ−Ｔ細胞はドナー中に注入により戻され、その後、架橋剤としてのブリナツモマブの投与が続く。ＣＤ１９＋Ｂ細胞へのＣＡＬ細胞の架橋は、インビボで活性化ＣＡＬ−Ｔ細胞による癌細胞の死滅をもたらし、それによってドナーにおいてＡＬＬを治療する。
【０６１５】
別の試験では、ＣＡＬ−Ｔ細胞は、ドナー中への注入前にブリナツモマブとプレインキュベートされる。
【０６１６】
ドナーは監視されブリナツモマブ滴定されてＣＡＬ−Ｔ細胞の活性を調節する。
【０６１７】
【表１１】
2019512215.tif 000015
2019512215.tif 000016
2019512215.tif 000017
【配列表】
2019512215000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月21日(2018.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的架橋剤への標的化結合のためのキメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞であって、
Ａ．前記薬剤が
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片であり；
Ｂ．前記ＣＡＬ−免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、前記リガンドが
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される前記第２の抗原を含む細胞外部分と、
ｉｖ．前記薬剤が前記第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含み；
Ｃ．前記ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤が標的細胞と組み合わされる場合、前記標的細胞が前記第１の標的抗原を含み、前記第１の抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．前記架橋剤が前記第１及び第２の抗原に結合して前記標的細胞に前記免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって前記免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する、
キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞。
【請求項２】
前記架橋剤の各結合部位は、抗体結合部位を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
（ａ）前記架橋剤の各結合部位は、抗体結合部位を含み、前記抗体結合部位は連結されたｓｃＦｖであるか、又は、
（ｂ）各結合部位は、ｓｃＦｖ、ナノボディ（商標）、ｄＡｂ、デュオカリン、ＤＡＲｐｉｎ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アドネクチン及びフィノマーからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
（ａ）は、２つ又は３つのｓｃＦｖ結合部位をそれぞれ含む二重又は三重特異性抗原結合断片であるか、又は、
（ｂ）は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、三重特異性ｓｃＦｖ、ｔａｎｄａｂ（商標）、ｄＡｂ、ナノボディ（例えば、ナノボディダイマー又はトリマー）、ｄＡｂ多量体（例えば、ｄＡｂダイマー又はトリマー）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はＤｕａｌ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ抗体（ＤＡＲＴ（商標））であるか又はそれらを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記架橋剤が、ブリナツモマブ又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（必要に応じて前記標的細胞が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）Ｂ細胞である）、ＡＭＧ２１１又はそのＣＤ３／ＣＥＡ結合誘導体（ＭＥＤＩ−５６５、ＭＴ１１１；必要に応じて前記標的細胞が、消化管癌細胞である）；パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）又はそのＣＤ３／ＰＭＳＡ結合誘導体（必要に応じて前記標的細胞が、前立腺癌細胞である）；ソリトマブ又はそのＣＤ３／ＥｐＣＡＭ結合誘導体（必要に応じて前記標的細胞が、癌細胞である）；又はＡＦＭ１１又はそのＣＤ３／ＣＤ１９結合誘導体（及び必要に応じて前記標的細胞が、ＡＬＬ細胞又は非ホジキンリンパ腫細胞である）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記第１の抗原に対する前記第１の結合部位の結合親和性（ＫＤ）が、前記第２の抗原に対する前記第２の結合部位の結合親和性より少なくとも５倍低い、及び／又は前記第２の結合部位の前記第２の抗原に対する結合親和性（ＫＤ）が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定される１００ｎＭ未満である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記第２の抗原が、免疫細胞の細胞外抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は細胞。
【請求項８】
前記第２の抗原が、ＣＤ３細胞外ドメイン配列；必要に応じてヒトＣＤ３細胞外ドメイン配列によって提供される、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
（ａ）前記ＣＡＬの第２の抗原が前記抗原のアミノ酸残基（Ｒ１）をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；
（ｂ）前記細胞のゲノムがＳＮＰ１を含みかつ前記第２の抗原のアミノ酸配列と同一でありＲ１を含むアミノ酸配列をコードする；又は前記第２の抗原のアミノ酸配列の天然に存在する変異体でありＲ１を含むアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列（Ｓ２）を含み；かつ
ｃ．Ｓ２が前記細胞の内因性ゲノム配列でありかつＳＮＰ１が非同義ＳＮＰである、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
ヒトにおいて疾患若しくは病態を治療する又は予防する方法での使用のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞であって、前記方法が、前記ヒトに前記架橋剤及び前記薬剤を投与することを含み、
（ａ）前記ＣＡＬの第２の抗原が前記抗原のアミノ酸残基をコードするヒト一塩基多型（ＳＮＰ１）を含む非内因性ヌクレオチド（Ｓ１）配列によって細胞中でコードされ；かつ
（ｂ）前記ＣＡＬ細胞が、自己移植片又は同種移植片に含まれ、前記方法が、工程（ｃ）においてヒトに前記移植片を投与することを含み、前記ＣＡＬ細胞及び標的細胞が、組み合わされ、前記ヒトのゲノムが、前記投与前に前記ＳＮＰ１を含む、細胞。
【請求項１１】
前記架橋剤と組み合わされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記架橋剤の分子量は、１２５ｋＤａ未満、または６０〜１００ｋＤａである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
ヒトにおける疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減する方法において使用のための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞であって、前記方法は、ヒトに前記ＣＡＬ細胞及び前記架橋剤を投与することを含み、ここで前記ＣＡＬ細胞及びヒトの標的細胞が組み合わされ架橋剤によって架橋され、それによってＣＡＬ細胞中のシグナル伝達を上方制御してＣＡＬ細胞の標的細胞傷害性を高め、それによってヒトにおける前記疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減する、細胞。
【請求項１４】
標的細胞に免疫細胞を標的化する方法であって、
Ａ．架橋剤を提供することであって、前記剤が
ｉ．第１の標的抗原を特異的に結合する第１の抗原結合部位；及び
ｉｉ．第２の標的抗原を特異的に結合する第２の抗原結合部位
を含む多特異性抗原結合断片である、架橋剤を提供すること；
Ｂ．キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供することであって、前記免疫細胞が膜貫通リガンドを含み、前記リガンドが
ｉｉｉ．膜貫通ドメインに連結される前記第２の抗原を含む細胞外部分；及び
ｉｖ．前記薬剤が前記第２の抗原に結合する時の細胞内シグナル伝達のための第１のシグナル伝達ドメインを含む細胞内部分
の改変された組み合わせを含む、キメラ抗原リガンド（ＣＡＬ）−免疫細胞を提供すること；
Ｃ．ＣＡＬ−免疫細胞及び架橋剤を標的細胞と組み合わせることであって、標的細胞が前記第１の標的抗原を含み、前記第１の抗原が細胞外抗原であり、
ｖ．それによって前記架橋剤が前記第１及び第２の抗原に結合して前記標的細胞に前記免疫細胞を標的化し、
ｖｉ．それによって前記免疫細胞における細胞内シグナル伝達を誘発して免疫細胞活性を調節する
組み合わせること、
を含み、
前記方法は、標的細胞が死滅又は数が減少している移植片を生成するように（ｉ）インビトロ又は（ｉｉ）エクスビボで実施され、前記移植片は、ヒトにおける疾患若しくは病態を治療する又はそのリスクを低減するために患者に投与される、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019512215000001.app
【国際調査報告】
2019512215.tif 000018
2019512215.tif 000019
2019512215.tif 000020