(57)【要約】本発明は、切断された相補的なタグ切片を用いた標的核酸配列の検出方法及びその組成物に関し、具体的には、ＰＣＲプライマーに標識相補的配列を連結して、ＰＣＲ反応中に制限酵素によって標識が生成されるようにし、各プライマーに連結する標識相補的配列を長さ及び核酸の組み合わせなどの要素を活用して多様化し、これを用いて標的配列を区分する方法に関する。  本発明によれば、厳格な条件下で、ＣＣＴＦ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｔａｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、プライマーに連結された５’末端の任意の配列と相補的配列であって、ＰＣＲ反応と制限酵素反応が起こらないと形成されず、標的配列にハイブリダイゼーション及び標的配列と相補的なプライマー伸長産物を形成した場合にのみ、切断された一本鎖が形成されるので、これを読み取ることによって、より高い正確性を確保することができる。また、ＣＣＴＦは、様々な分析技法及び分析装置を使用者の意図に合わせて選択して、多数の標的核酸配列を同定するのに活用することができる。例えば、遺伝子検査、サンプル内の生物体の同定、微生物又はウイルスの感染の有無の診断などで迅速かつ正確に結果を確認することができる。
2019514384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列と非相補的なランダム核酸配列を含み、制限酵素認識配列及び標的配列と相補的な核酸配列を順次含む構造を有するプライマー。
【請求項２】
前記制限酵素認識配列は、Ｐｈｏ  Ｉ、ＰｓｐＧＩ、ＢｓｔＮＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐｅＫＩ、ＴｓｐＭＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＹＩ、ＴａｑＩ、ＭｗｏＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限酵素及びＮｉｃｋ制限酵素からなる群から選択された制限酵素に対する認識配列であることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。
【請求項３】
前記プライマーは、切断された相補的なタグ切片以外の切断副産物が反応に関与しないことを目的として、前記プライマー中の制限酵素によって切断される部位に変形されたｄＮＴＰが挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。
【請求項４】
前記切断部位に挿入される変形されたｄＮＴＰは、ホスホロチオエート化された（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ｄＮＴＰ、７−デアザプリン（Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ）を含有したｄＮＴＰ、またはＤＮＡ鋳型中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ｍｅｔｈｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；２’−ＯＭｅＮ）を含むことを特徴とする、請求項３に記載のプライマー。
【請求項５】
前記プライマーは、生成される切断された相補的なタグ切片の長さが５ｍｅｒ以上５０ｍｅｒ以下であることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。
【請求項６】
前記プライマーは、配列番号１、３、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５１、１５３、１５５、１５６、１５９、１６１、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、２０４、２０５、２０７、２１８、２２０及び２２２からなる群から選択された１つ以上のプライマーである、請求項１に記載のプライマー。
【請求項７】
ａ）切断された相補的なタグ切片である標識を生成するための標識の鋳型を含む請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプライマーと標的配列をハイブリダイズさせるステップ；
ｂ）前記ａ）ステップのハイブリダイゼーションにより増幅過程が進行するとき、制限酵素の活性によって前記プライマーから切断された相補的なタグ切片が生成されて反応液に放出及び流入するステップ；及び
ｃ）前記生成された切断された相補的なタグ切片を分析装置によって同定し、標的核酸配列の存在を確認するステップを含む、重合酵素連鎖反応中に増幅された標的配列の種類を区分及び分析するのに使用される標識を形成し、同定する方法。
【請求項８】
前記方法は、切断された相補的なタグ切片の質量を分析して、切断された相補的なタグ切片を同定することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記質量の分析に使用される機器は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、液体クロマトグラフィー質量分析器（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、または高性能液体クロマトグラフィー質量分析器（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記質量の分析に使用される切断された相補的なタグ切片の単位電荷当たりの質量（ｍ／ｚ）は、０超１００００Ｄａ以下の間に存在することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅過程中に質量の分析に使用される切断された相補的なタグ切片の質量を保存するために、重合酵素の特性である３’末端のアデニン追加伸長機能が抑制されているＤＮＡ重合酵素を使用することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記切断された相補的なタグ切片の同定方法として、蛍光及びクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が標識されており、切断された相補的なタグ切片の相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて蛍光シグナルを分析することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、オリゴヌクレオチドと切断された相補的なタグ切片の二本鎖が一本鎖に解離される固有の解離温度を多様化して解離温度及び溶融ピークを分析し、切断された相補的なタグ切片を同定して標的配列の存在を確認することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、２つ以上のターゲットを検出する場合、異なる解離温度を有するようにして、溶融ピークの分析によって２種以上のターゲットを同時に分析するようにする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドの長さは、５個以上から５０個以下の間のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドをブロッキングすることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドにＳｐａｃｅｒ  Ｃ３、Ｐｈｏｓｐｈａｔ、ｄｄＣ、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＥＮＤを付着することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドにクエンチャーを付着することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、性媒介疾患の原因菌を同定する、請求項７乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記性媒介疾患の原因菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２）、及びトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、胃腸管疾患の原因体を同定する、請求項７乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記胃腸管疾患の原因体は、ロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ａ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスＦ４０（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４０）、アデノウイルスＦ４１（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４１）、ノロウイルスＧＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ）、及びノロウイルスＧＩＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法は、ヒト乳頭腫ウイルスを同定する、請求項７乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒト乳頭腫ウイルスは、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、及び８２型からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法は、呼吸器疾患の原因体を同定する、請求項７乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記呼吸器疾患の原因体は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  １）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は、単一塩基多型性（ＳＮＰ）の遺伝子型を分析することができる、請求項７乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記単一塩基多型性は、ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基多型性であるｒｓ６２６５の突然変異型であるＡ／Ａ、野生型であるＧ／Ｇ、または異型接合体であるＡ／Ｇの遺伝子型を分析することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は、オリゴヌクレオチドの蛍光シグナルのＣｔ値を分析して、切断された相補的なタグ切片を同定することを特徴とする、請求項７乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプライマーを有効成分として含む、性媒介疾患診断用組成物。
【請求項３１】
前記性媒介疾患は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２）、及びトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）からなる群から選択された菌によって誘発されることを特徴とする、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプライマーを有効成分として含む胃腸管疾患診断用組成物。
【請求項３３】
前記胃腸管疾患は、ロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ａ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスＦ４０（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４０）、アデノウイルスＦ４１（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４１）、ノロウイルスＧＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ）、及びノロウイルスＧＩＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ）からなる群から選択された菌によって誘発されることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプライマーを有効成分として含むヒト乳頭腫ウイルス診断用組成物。
【請求項３５】
前記ヒト乳頭腫ウイルスの亜型は、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、または８２型を診断する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプライマーを有効成分として含む呼吸器疾患原因体診断用組成物。
【請求項３７】
前記呼吸器疾患は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  １）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択された菌によって誘発されることを特徴とする、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプライマーを有効成分として含む単一塩基変異分析用組成物。
【請求項３９】
前記単一塩基変異は、ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基多型性であるｒｓ６２６５の突然変異型Ａ／Ａ、野生型Ｇ／Ｇ、または異型接合体Ａ／Ｇの遺伝子型を分析することができる、請求項３８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、切断された相補的なタグ切片を用いた標的核酸配列の検出方法及びその組成物に関し、具体的には、標的配列と特異的に反応するプライマーに標識物質を生成できる標識の鋳型を連結することによって、ＰＣＲ反応中に制限酵素の活性によって標識が合成、放出されて反応液に流入するようにして増幅産物を識別する方法に関する。また、一つの標的配列には一つの種類の標識鋳型配列のみを使用し、反応中に生成された標識を様々な分析装置で分析して標識を識別することを特徴とする標識生成及び標識同定方法、並びにその方法に使用される組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）は、低濃度の核酸を検出及び分析する際に非常に有用に活用されている技法の一つである。核酸の検出は、二本のオリゴヌクレオチド配列の相補性及び各ＤＮＡ重合酵素の伸長反応に起因するものであって、これを用いて標的核酸配列を検出することができる。（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：２１，２００１）。
【０００３】
多重ＰＣＲは、多数の標的配列の核酸を同時に増幅できる方法であって、他の方法に比べて比較的迅速かつ簡便であるので、遺伝子検査、サンプル内の生物体の同定、微生物又はウイルスの感染の有無などの診断分野で非常に大きな役割を果たしている。
【０００４】
このような多重ＰＣＲの結果を確認する最も一般的な方法は、ＰＣＲ中に目的とする標的配列の増幅産物の大きさを多様化してプライマーを設計し、ＰＣＲ結果物を電気泳動を介して増幅産物の大きさを分析することで、当該標的配列の増幅の有無を確認するものである。この場合、一度に増幅させることができる遺伝子の個数が実験的に３〜４個に限定されるが、これは、ＰＣＲ反応中に生成できる増幅産物の大きさに応じて増幅効率が変わってしまい、均一な増幅効率を保証できないため、増幅産物の大きさを狭い範囲に限定しなければならないという制約があるためである。このとき、所望の遺伝子増幅産物の大きさが重なり合う場合も発生し、このように大きさに依存して多重ＰＣＲを分析する場合、検出方法の解析に対する限界点が存在するようになる。
【０００５】
ＰＣＲ結果を確認する場合、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）は、迅速な結果の確認を保証し、ＰＣＲ中に蛍光物質を標識して、増幅産物の大きさと関係なく増幅の有無を確認することができる。リアルタイム重合酵素連鎖反応を行って検出する方式は、インターカレーティング方式とプローブ方式とに分けることができる。インターカレーティング方式は、二本鎖の塩基配列の間に蛍光物質が挿入されて蛍光強度を確認する方法を指す。このような方法は、二本鎖を形成する増幅産物を区分することができず、全て同じ波長の蛍光で観察し得るため、標的配列別に増幅産物を識別して１つ以上の増幅物を同時に検出、確認するのに限界を有している。プローブ（Ｐｒｏｂｅ）方式は、標的配列別に指定されているプローブの蛍光値を読み取って増幅産物を検出する方法であって、この方式を用いる場合、使用される機器の分析可能蛍光チャネルの個数に限定して増幅物を検出できるので、蛍光チャネルの個数以上の多重分析に適していない。
【０００６】
したがって、できる限り多くの個数の多重分析が可能なようにＰＣＲ中に標識を挿入しようとする研究が継続的に行われた。
【０００７】
Ｌｕｍｉｎｅｘ社のｘＴＡＧ技術の場合、核酸をなすチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）のランダム配列で構成された一定の塩基配列を設定し、これをｘＴＡＧと命名した。観察しようとする標的配列の増幅時に、末端にｘＴＡＧ配列が位置するようにプライマーにｘＴＡＧの配列を挿入して、ＰＣＲ過程中にｘＴＡＧが増幅産物に挿入されるようにし、ｘＴＡＧと相補的な配列が付着しているビーズと二次的に結合するようにして、２つの塩基配列の相補的な結合を形成するようにし、これを用いてターゲットを感知し、ビーズの蛍光で標的配列を分析する方法である。前記の方法は、ｘＴＡＧが増幅に関与しなくても、増幅後のプライマーが完全に除去されないと、ビーズの相補的ｘＴＡＧと結合して標識を認識する可能性があり、ｘＴＡＧの相補的配列がＰＣＲによって非特異反応を形成、非特異ターゲットを検出する誤りが生じることもあるという問題を有している。（Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ  ｎｏ．７，６４５，８６８及び８，６２４，０１４）
【０００８】
これを解決するために、ＰＣＲ反応中に標識を構築し、標識がＰＣＲ反応に影響を与えず、できる限り多くの個数の多重検出が可能な技法に関する研究が継続的に行われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の問題点を解決し、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、ＰＣＲのような増幅反応を用いた標的配列の増幅及び分析の実行時に、生成産物の長さに依存して結果を判断するときに生じる結果の不確実性を解決し、多重検出する場合、増幅確認の可能な最大個数に対する制約を解決する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的はまた、標識を形成して標的配列の増幅を確認する場合、人為的な配列を標識それ自体として使用することによって引き起こされ得る非特異的増幅による誤りを解決して、正確度を高める方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、標的配列と非相補的なランダム核酸配列を含み、制限酵素認識配列及び標的配列と相補的な核酸配列を順次含む構造を有するプライマーを提供する。
【００１２】
本発明の一具現例において、前記制限酵素認識配列は、Ｐｈｏ  Ｉ、ＰｓｐＧＩ、ＢｓｔＮＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐｅＫＩ、ＴｓｐＭＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＹＩ、ＴａｑＩ、ＭｗｏＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限酵素及びＮｉｃｋ制限酵素からなる群から選択された制限酵素に対する認識配列であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１３】
本発明の他の具現例において、前記プライマーは、切断された相補的なタグ切片以外の切断副産物が反応に関与しないことを目的として、前記プライマーの制限酵素認識配列中の切断部位に変形されたｄＮＴＰが挿入されていることが好ましく、前記切断部位に挿入される変形されたｄＮＴＰは、ホスホロチオエート化された（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ｄＮＴＰ、７−デアザプリン（Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ）を含有したｄＮＴＰ、またはＤＮＡ鋳型中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ｍｅｔｈｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；２’−ＯＭｅＮ）を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００１４】
本発明は、他の具現例において、前記プライマーは、生成される切断された相補的なタグ切片の長さが５ｍｅｒ以上５０ｍｅｒ以下であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１５】
本発明の一実施例において、前記プライマーは、配列番号１、３、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１５１、１５３、１５５、１５６、１５９、１６１、１６３、１６４、１６６、１６８、１７０、２０４、２０５、２０７、２１８、２２０及び２２２からなる群から選択された１つ以上のプライマーであることが好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
また、本発明は、ａ）切断された相補的なタグ切片である標識を生成するための標識の鋳型を含む前記本発明のプライマーと標的配列をハイブリダイズさせるステップ；ｂ）前記ａ）ステップのハイブリダイゼーションにより増幅過程が進行するとき、制限酵素の活性によって前記プライマーから切断された相補的なタグ切片が生成されて反応液に流入するステップ；及びｃ）前記生成された切断された相補的なタグ切片を分析装置によって同定し、標的核酸配列の存在を確認するステップを含む、重合酵素連鎖反応中に増幅された標的配列の種類を区分及び分析するのに使用される標識を形成し、同定する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一具現例において、前記方法は、切断された相補的なタグ切片の質量を分析して、切断された相補的なタグ切片を同定することが好ましく、前記質量の分析に使用される機器は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、液体クロマトグラフィー質量分析器（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、または高性能液体クロマトグラフィー質量分析器（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
本発明の他の具現例において、質量の分析に使用される切断されたタグ切片の単位電荷当たりの質量（ｍ／ｚ）は、０超１００００Ｄａ以下であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の更に他の具現例において、前記増幅過程中に質量の分析に使用される切断された相補的なタグ切片の質量を保存するために、核酸重合酵素の固有の性質である３’末端のアデニン追加伸長効果（Ａテーリング）の機能が抑制されているＤＮＡ重合酵素を使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の更に他の具現例において、前記切断された相補的なタグ切片の同定方法として、蛍光及びクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が標識されており、切断された相補的なタグ切片の相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて蛍光シグナルを分析することが好ましいが、これに限定れない。
【００２１】
本発明の他の具現例において、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドと切断された相補的なタグ切片の二本鎖が一本鎖に解離される固有の解離温度を多様化して解離温度及び溶融ピークを分析し、切断された相補的なタグ切片を同定して標的配列の存在を確認することが好ましいが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の更に他の具現例において、前記オリゴヌクレオチドの長さは、５個以上のオリゴヌクレオチドであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２３】
本発明の更に他の具現例において、前記方法は、オリゴヌクレオチドから塩基配列が伸長することを防止するために、オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドにクエンチャーを付着することが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
本発明の更に他の具現例において、前記方法は、オリゴヌクレオチドの蛍光シグナルのＣｔ（Ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）値を分析することで、切断された相補的なタグ切片を同定することが好ましいが、これに限定されない。
【００２５】
本発明の好ましい実施例において、前記方法は、性媒介疾患の原因菌を同定することが好ましく、前記性媒介疾患の原因菌は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２）、及びトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む性媒介疾患診断用組成物を提供する。
【００２７】
本発明の更に他の実施例において、前記方法は、胃腸管疾患の原因体を同定することが好ましく、前記胃腸管疾患の原因体は、ロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ａ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスＦ４０（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４０）、アデノウイルスＦ４１（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４１）、ノロウイルスＧＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ）、及びノロウイルスＧＩＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ）からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む胃腸管疾患原因体診断用組成物を提供する。
【００２９】
本発明の更に他の好ましい実施例において、前記方法は、ヒト乳頭腫ウイルスを同定することが好ましく、前記ヒト乳頭腫ウイルスの亜型は、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、及び８２型からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。
【００３０】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含むヒト乳頭腫ウイルス診断用組成物を提供する。
【００３１】
本発明の更に他の好ましい実施例において、前記方法は、呼吸器疾患の原因体を同定することが好ましく、前記呼吸器疾患の原因体は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  １）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、及びアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。
【００３２】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含む呼吸器疾患診断用組成物を提供する。
【００３３】
本発明の更に他の好ましい実施例において、前記方法は、単一塩基多型性（ＳＮＰ、Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が好ましく、前記単一塩基変異は、ＢＤＮＦ遺伝子（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ）のｒ６２６５からなる群から選択されたものが好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
また、本発明は、前記本発明のプライマーを有効成分として含むＢＤＮＦ遺伝子のｒｓ６２６５遺伝子分析用組成物を提供する。
【００３５】
以下、本発明を説明する。
本発明者は、増幅反応を行い、結果を解析する場合、より容易かつ迅速で、効率的な方法によって各増幅産物を明確に区分できるようにすることによって、一度に多くの標的を対象として多重増幅反応を行い、結果を解析することができる方法を開発するために鋭意研究努力した。
【００３６】
その結果、標識として使用できる核酸配列を増幅反応中に生成できるように、標識の鋳型となる配列をプライマーに挿入し、制限酵素を用いて標識のみを切断したとき、生成された標識が標的配列を検出するための標識としての役割を果たすことができることを確認し、これを様々な分析法に適用して、多重増幅反応の分析において既存の他の方法に比べて効率的かつ迅速に増幅の有無を識別できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００３７】
本発明は、ＰＣＲ反応中に増幅された標的配列の種類を区分及び分析するのに使用される標識を形成する方法に関する。
【００３８】
特に、本発明では、（１）標識を生成するための標識の鋳型を含むプライマーと標的配列のハイブリダイゼーションステップと、（２）ＰＣＲ反応中に制限酵素を用いて標識の鋳型から標識を生成するステップと、（３）生成された標識を様々な分析装置で分析して標識を識別するステップとを有することを特徴とする。
【００３９】
（１）標識（ＣＣＴＦ−Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｔａｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、以下、ＣＣＴＦ）を生成するための標識の鋳型を含むプライマー（ＣＴＰＯ−Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｔａｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、以下、ＣＴＰＯ）と標的配列をハイブリダイズさせるステップであって；ＣＴＰＯは、標的配列と非相補的な核酸配列を含み（ＣＣＴＦの鋳型）、制限酵素認識配列及び標的配列と相補的な核酸配列を順次含み、３’末端に位置した標的配列と相補的な核酸配列部位が標的配列とハイブリダイズされることによって、ＰＣＲ反応中にプライマーとしての役割を果たす。
【００４０】
（２）増幅過程中に制限酵素の活性によってＣＴＰＯからＣＣＴＦが生成されて放出されるステップであって；前記記述されたＣＴＰＯから伸長した増幅産物には制限酵素認識配列が挿入されるようになり、これを認識した熱安定性制限酵素の活性によってＣＣＴＦが生成されて反応液に流入する。
【００４１】
（３）前記生成されたＣＣＴＦを様々な分析装置によって分析、同定して標的核酸配列の存在を確認するステップであって；生成されたＣＣＴＦの質量を測定してＣＣＴＦの種類を把握、増幅された物質を区分して標的核酸配列の存在を確認するか、または生成されたＣＣＴＦと相補的配列で構成されており、蛍光及びクエンチャーが標識されているオリゴヌクレオチド（ＳＣＯ−Ｓｉｇｎａｌ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、以下、ＳＣＯ）とＣＣＴＦがハイブリダイズして二本鎖を形成し、再び一本鎖に解離される過程で蛍光の発光がなされ、この固有の解離温度を分析してＣＣＴＦの種類を確認し、標的核酸配列の増幅の有無を確認する。
【００４２】
以下、本発明を詳細に説明する。
ステップ（１）において、ＣＴＰＯと標的配列をハイブリダイズさせるに先立ち、ＣＴＰＯの構造は、下記の構造式１のように、ＣＣＴＦの鋳型となる部分と、制限酵素認識配列と、標的と相補的な配列部分とに分けられている。
【００４３】
構造式１
５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’
【００４４】
構造式１のＡ部位は、ＣＣＴＦの鋳型となる部分であって、ランダム配列からなっており、標的配列とのアニーリング後、増幅して、ＣＣＴＦの鋳型の相補的配列、すなわち、ＣＣＴＦ部分を伸長した後、増幅中に制限酵素によってＣＣＴＦ部分が放出される。放出されたＣＣＴＦは、標識として標的配列特異的に分析可能なように、オリゴヌクレオチド５個以上の長さを有するランダム配列であることを特徴とする。ランダム配列は、ＰＣＲ反応中に副産物を生成しない範囲であれば、いかなる配列でも使用することができる。ＣＣＴＦの鋳型として使用されるヌクレオチド配列は、増幅反応中にハイブリダイゼーション反応を起こさない限り、いかなる配列でも構わない。
【００４５】
Ｂは、制限酵素認識配列であって、増幅過程中に使用できる熱安定性を有する制限酵素及びＮｉｃｋ制限酵素の特異的認識配列を意味する。その例として、Ｐｈｏ  Ｉ、ＰｓｐＧＩ、ＢｓｔＮＩ、ＴｆｉＩ、ＡｐｅＫＩ、ＴｓｐＭＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＹＩ、ＴａｑＩ、ＭｗｏＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩなどがある。
【００４６】
そのうち、最も好ましくはＰｓｐＧＩを使用することができ、本発明の実施例で使用した制限酵素はＰｓｐＧＩである。
【００４７】
ＣＣＴＦ以外の切断副産物が反応に存在及び関与しないように、ＣＴＰＯの制限酵素認識配列中の制限酵素によって切断される部位に変形されたｄＮＴＰを挿入させる。その種類としては、ホスホロチオエート化された（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ｄＮＴＰ、７−デアザプリン（Ｄｅａｚａｐｕｒｉｎｅ）を含有したｄＮＴＰ、またはＤＮＡ鋳型中の２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（ｍｅｔｈｙｌ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；２’−ＯＭｅＮ）などがある。従来技術として、論文ＰＮＡＳ  ８９（１９９２）３９２−３９６、及び核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０（１）  １９９１  ５５−６１などは、本発明に応用できる。最も好ましくは、ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｌａｔｅｄ  ｂｏｎｄを認識配列中の切断部位に挿入して、制限酵素によるＣＣＴＦの鋳型の切断を防止することで、ＣＣＴＦを生成できる鋳型を確保し、ＣＣＴＦの鋳型が反応液に流入して生じる副産物を防止することで、反応の効率を増大させることができる。ＣＣＴＦを生成し、その鋳型が反応液に流入することを防止するという点で、従来技術であるＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法（米国特許９２−８１９，３５８）とは異なる発明の効果を示す。
【００４８】
構造式１に示されたＣ部位は、制限酵素認識配列の後から３’末端までを意味し、標的特異的配列で構成され、増幅時に標的特異的に結合してプライマーとしての役割を維持できるようにする。
【００４９】
ステップ（２）において、ＣＴＰＯによる増幅産物が形成され、二本鎖として存在する増幅産物から制限酵素によってＣＣＴＦに切断されて反応液に放出されるときに使用される制限酵素の適正濃度は、使用目的に応じて多様に変更可能である。また、使用される重合酵素の種類に応じて結果において差があり、これもまた、使用目的に応じて多様に変更可能である。例えば、質量の分析を目的としてＣＣＴＦを形成する場合、ＣＣＴＦの質量が、増幅過程と関係なく一定の質量を維持しなければならず、核酸重合酵素の固有の性質を反映しないことが好ましい。したがって、核酸重合酵素の固有の性質である３’末端のアデニン追加伸長効果（Ａテーリング）がない核酸重合酵素を選定して使用しなければならない。核酸重合酵素のうち、Ａテーリングをしない酵素としては、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、Ｂｓｔポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）などがある。
【００５０】
しかし、質量の分析ではなく、他の技法を用いたＣＣＴＦの分析法を適用する場合、Ａテーリング効果による結果に変動がないので、いかなる重合酵素を用いても構わない。
【００５１】
制限酵素の効率を増大させてＣＣＴＦの生成及び反応液への流入を促進して効果を極大化するために、ＰＣＲ過程中に制限酵素の反応時間を延長することができる。反応時間及び反応温度などは、具体的な制限酵素の種類、反応意図に応じて異ならせて適用することができる。
【００５２】
ステップ（３）において、生成されたＣＣＴＦを様々な分析装置によって分析して標的核酸配列を同定するステップであって、生成されたＣＣＴＦの質量を直接分析する場合、ＣＣＴＦの種類を長さ及び配列の組換えによって多様化し、これらの質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、ＬＣ  ＭＳ、ＨＰＬＣ  ＭＳなどの質量分析器を用いて分析すると、生成されたＣＣＴＦの固有の質量を観察することができ、これを用いて、増幅された標的配列の区分及び確認が可能である。好ましくは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって観察し、観察の容易なＣＣＴＦの質量の範囲は１２００Ｄａ以上である。前記の範囲の質量において、様々なＣＣＴＦを形成して増幅産物を観察することができる。
【００５３】
ＣＣＴＦの蛍光シグナルを観察することにより、増幅された標的配列の識別も可能であり、生成されたＣＣＴＦが、固有の解離温度で蛍光シグナルを提供できるように蛍光及びクエンチャーが標識されており、固有の解離温度を有するＣＣＴＦと相補的な配列であるＳＣＯとハイブリダイズして、固有の解離温度で蛍光シグナルを分析し、ＣＣＴＦの生成の有無を確認し、これによって標的核酸配列の存在を同定する方法である。
【００５４】
ＣＣＴＦの放出のためには、上述したように、使用目的による制限酵素の使用濃度を指定し、重合酵素の種類は、質量分析とは異なって、Ａテーリングと関係がない。増幅産物から反応液へ放出されて流入したＣＣＴＦは、反応液に存在していたＳＣＯと反応するようになり、ＳＣＯの構成は、次の通りである。
【００５５】
５’末端方向から３’末端方向にＣＣＴＦとのハイブリダイゼーションが可能なように、ＣＣＴＦの相補的配列が存在し、ＳＣＯの配列は、ＣＣＴＦに依存的にＣＣＴＦの長さ、配列の組換えによって決定される。前記の（１）ステップで標識の種類を多様化するためにＣＣＴＦの長さ及び配列の組換えなどの方法を用いたように、ＣＣＴＦ及びＳＣＯの固有の解離温度を付与するために、長さ及び配列の組み合わせを異ならせてデザインすることができる。このとき、ＳＣＯは、ＣＣＴＦの相補的配列で構成され、配列中に蛍光物質を含有しており、蛍光物質の位置は、クエンチャーと一定の長さ以上離れて存在すれば、どこでも構わない。ＳＣＯの３’末端にはブロッカー（Ｂｌｏｃｋｅｒ）が位置して、ＳＣＯが反応中にプライマーとしての役割を果たすことで、塩基配列が伸長することを防止する。ブロッカーとしては、Ｓｐａｃｅｒ  Ｃ３、Ｐｈｏｓｐｈａｔ、ｄｄＣ、Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ＥＮＤ及びクエンチャーなどを使用することができるが、これに限定されない。特に、ＳＣＯの３’末端にクエンチャーが位置すると、ＳＣＯが反応中にプライマーとしての役割を果たすことで、塩基配列が伸長することを防止すると同時に、ＣＣＴＦとハイブリダイズされて二本鎖を形成する前に、ＦＲＥＴ現象によって蛍光物質の発光を抑制する機能を有するようにする。クエンチャーを塩基配列伸長防止物質として混用して使用することによって、ＳＣＯの製造時に不必要なモディフィケーション（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応を減少させ、製造反応の収率を高めることができ、さらに、製造コストを低減することができる。反応中に含まれているＳＣＯと反応中に生成されるＣＣＴＦとのハイブリダイゼーションを用いて、指定された温度でハイブリダイズされた二本鎖の解離が観察されるかを蛍光で確認して分析することによって、標的配列によるＣＣＴＦの生成の有無を確認し、これを用いて標的配列を同定することができる。前記のＳＣＯの固有の解離温度として指定できる温度の範囲は、〜９５℃であり、それぞれの二本鎖の解離温度の干渉がなければ、蛍光物質毎に固有の解離温度を指定し、個数の上限に制限はない。
【００５６】
ＳＣＯの蛍光物質とクエンチャーの組み合わせは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６１２Ｑ、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０、ＡＴＴＯ  ＭＢ２、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５、Ｐｕｌｓａｒ  ６５０、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、Ｑｕａｓａｒ  ７０５．ＦＡＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＲＯＸ）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｄａｎｓｙｌ、Ｄａｐｏｘｙｌ、Ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ、４’，５’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２’，７’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＤＭ−ＮＥＲＦ、Ｅｏｓｉｎ、Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ、ＨＥＸ、Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００、ＪＯＥ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６１０、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＮＥＤ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００���Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、Ｐｙｒｅｎｅ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ６Ｇ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、２’，４’，５’，７’−Ｔｅｔｒａ−ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｎｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＭＲ）、Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＡＭＲＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ．ＴＥＴ、ＶＩＣ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＢＭＮ−Ｑ４６０、ＤＤＱ−Ｉ、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＭＮ−Ｑ５３０、ＢＭＮ−Ｑ５３５、Ｅｃｌｉｐｓｅ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、ＢＨＱ−１、ＴＱ２、ＩＱ４、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ＴＱ３、ＤＤＱ−ＩＩ、ＢＢＱ−６５０、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、ＱＳＹ−２１、ＢＨＱ−３などがあり得、前記の羅列に限定されず、いかなる蛍光物質とクエンチャーも含むことができる。
【００５７】
また、ＳＣＯとＣＣＴＦとの反応が、増幅反応及びＣＣＴＦ形成反応と同時に起こるようになり、ＳＣＯの二本鎖の形成割合が標的配列の増幅量と同様の効率で示されることを活用して、固有の解離温度を有するＳＣＯのＣｔグラフを作成することができ、これを用いて、固有解離温度分析方法と異なる方式で標的配列の同定が可能である。
【００５８】
本発明の解決手段として作成された上記の内容は、本発明の実施例により最も好ましい具現例としてより詳細に記述される。
【発明の効果】
【００５９】
本発明は、増幅反応中に制限酵素によって任意の標識（ＣＣＴＦ）が生成及び切断されるので、標識を形成するために添加した人為的な配列（ＣＴＰＯ）が、増幅反応が起こる前に制限酵素認識配列の二本鎖が形成されないため、ランダムに切断される可能性がなく、ＰＣＲ中に標的配列特異的に生成された反応産物によってのみ標識が生成されるので、ＣＣＴＦを形成するのに正確度が高く、ＰＣＲ増幅産物の長さ又は特定の配列の特異度に依存していた既存のＰＣＲ結果分析方法よりも精巧な分析結果を得ることができ、様々な種類の増幅産物を同じ長さに生産しても、特異的に増幅産物の区分及び解析が可能である。また、このように生成されたＣＣＴＦの解析は、塩基配列を活用した分析法にほとんど適用できるので、解析のための装置を汎用的に選択、適用できる。特に、これは、増幅反応を用いた迅速な多重分析が必要な診断などの分野で活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＣＣＴＦの形成の模式図であって、ＰＣＲ反応中に使用されるＣＴＰＯ及びＣＣＴＦの生成過程、ＣＣＴＦの分析のための例示を模式化した代表図である。
【図２】デュアルターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＭＡＬＤＩ分析結果である。標的配列毎にそれぞれ異なるＣＣＴＦを形成できるようにＣＴＰＯをデザインし、増幅反応を経てＭＡＬＤＩで分析した結果、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、ＮＧ）を増幅して切断されたＣＣＴＦ１とマイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）を増幅して切断されたＣＣＴＦ２の質量に該当するピークが観察された。
【図３】性媒介疾患の原因体に対するリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｅａｋ）の分析結果である。クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＣＴ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、ＭＧ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＴＶ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、ＵＵ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、ＣＡ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＧＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １、ＨＳＶ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２、ＨＳＶ２）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ＴＰ）、及び内部対照物質（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）のターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＣＴ：ＦＡＭ  ８０℃、ＮＧ：ＨＥＸ  ７６．５℃、ＭＨ：ＨＥＸ  ６８℃、ＭＧ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６７．５℃、ＴＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１．５℃、ＵＵ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ７７℃、ＵＰ：ＦＡＭ  ７７℃、ＣＡ：ＦＡＭ  ６５℃、ＧＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７８．５℃、ＨＳＶ１：Ｑｕａｓａｒ７０５  ７３．５℃、ＨＳＶ２：Ｑｕａｓａｒ７０５  ７９℃、ＴＰ：Ｑｕａｓａｒ７０５  ６６℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ６３．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｇ）。
【図４】胃腸管疾患の原因体に対するリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｅａｋ）の分析結果である。ロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ａ、ＲＶＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ、ＡｓｔＶ）、アデノウイルスＦ４０（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４０、ＡｄＶ  ４０）、アデノウイルスＦ４１（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４１、ＡｄＶ  ４１）、ノロウイルスＧＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ、ＮｏＶ  ＧＩ）、ノロウイルスＧＩＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ、ＮｏＶ  ＧＩＩ）、及び外部対照物質（Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）のターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＲＶＡ：ＨＥＸ  ７８℃、ＡｓｔＶ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ７８℃、ＡｄＶ  ４０：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６７℃、ＡｄＶ  ４１：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６７℃、ＮｏＶ  ＧＩ：ＦＡＭ  ６８℃、ＮｏＶ  ＧＩＩ：ＦＡＭ  ８４℃、ＥＣ：ＨＥＸ  ６９℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｅ）。
【図５】ヒト乳頭腫ウイルスの検出のためのリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｅａｋ）の分析結果である。１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型、及びＩＣのターゲット別の多重固有解離温度測定を示した結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（１６型：ＨＥＸ  ７６．５℃、１８型：ＦＡＭ  ７８℃、３３型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、３５型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、５１型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、５３型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、５９型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、６８型ａ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、８２型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ６７．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｅ）。
【図６】呼吸器疾患誘発ウイルスの検出のためのリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｅａｋ）の分析結果である。インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ｈ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｈ３）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ、Ｆｌｕ  Ｂ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  １、ＰＩＶ  １）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ３、ＰＩＶ  ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａ、ＲＳＶ  Ａ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ、ＲＳＶ  Ｂ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、ＭＰＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｄＶ）、及び外部対照物質（ＥＣ、Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）のターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ｈ１：ＦＡＭ  ６７．５℃、Ｈ３：ＦＡＭ  ７６．５℃、２００９ｐｄｍ：ＦＡＭ  ８６．５℃、Ｆｌｕ  Ｂ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ８３．５℃、ＰＩＶ  １：Ｑｕａｓａｒ６７０  ６６℃、ＰＩＶ  ３：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７４℃、ＲＳＶ  Ａ：ＨＥＸ  ６３．５℃、ＲＳＶ  Ｂ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ７２℃、ＭＰＶ：ＨＥＸ  ８６℃、ＡＤＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ８５℃、ＥＣ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６８．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｆ）。
【図７】ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基多型性であるｒｓ６２６５の遺伝子型を分析するためのリアルタイム重合酵素連鎖反応の溶融ピーク（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｅａｋ）の分析結果である。突然変異型であるＡ／Ａ、野生型であるＧ／Ｇ、及び異型接合体であるＡ／Ｇのターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ａ／Ａ：７６．５℃、Ａ／Ｇ：７６．５℃と７５℃、Ｇ／Ｇ：７５℃、ＩＣ：６６℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｅ）。
【図８】リアルタイム重合酵素連鎖反応のＣｔグラフの結果である。各原因菌別のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を１００ｐｇ／ｕｌの濃度から１０倍ずつ希釈した淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ））、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ．ｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）の多重リアルタイム重合連鎖反応の実験条件で示されたＳＣＯの蛍光増幅曲線（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅｓ）及び標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅｓ）結果であって、（ａ）グラフは、３つの標的配列が濃度別に同時に存在する場合に描かれる蛍光増幅曲線を示し、（ｂ）グラフは、３つの標的配列がいずれも含まれない場合に描かれる陰性結果である。（ａ）グラフ中のＮＧに該当するグラフを単一蛍光増幅曲線で示して標準曲線を示すと、（ｃ）及び（ｄ）で示すことができ、ＭＧに該当するグラフは（ｅ）及び（ｆ）で示すことができ、ＵＰに該当する曲線は（ｇ）及び（ｈ）で示すことができる。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６２】
実施例１．デュアルターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＭＡＬＤＩ分析
多重標的配列の検出のためのＰＣＲ反応中に形成されたＣＣＴＦを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて質量分析して標的特異的に検出が可能であることを証明するために、本実験を行った。本実施例１では、性媒介疾患の原因体である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、ＮＧ）及びマイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）のＤＮＡを対象として行った。
【００６３】
１．標的鋳型ＤＮＡ及び配列特異的に作製されたプライマー
本実施例において標的とするＮＧ及びＭＨの順方向プライマーはＣＴＰＯであって、発明の詳細な説明に記述された方法に基づいて作製された。順方向プライマーの５’末端は、ＣＣＴＦの鋳型として使用できるように、ＮＧ及びＭＨのＤＮＡと非相補的な配列で構成された任意の塩基配列であり、すぐに連続して制限酵素認識配列が位置するようにした。制限酵素認識配列の後から３’末端までは、ＮＧ及びＭＨのＤＮＡの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。また、順方向プライマーの５’末端はそれぞれ異なる個数のヌクレオチドで構成して、生成されるＣＣＴＦ毎に異なる質量値を有するようにした。これは、ＣＣＴＦが形成されたときに質量で増幅物を区分できるように設計するためである。逆方向プライマーは、ＮＧ及びＭＨのＤＮＡの標的部位と相補的な配列で構成されている。
【００６４】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【００６５】
プライマー１：５’−ＴＧＡＡＣＴＡＴ＊ＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧ−３’（配列番号１）
【００６６】
プライマー２：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＣＣＧＧ−３’（配列番号２）
【００６７】
プライマー３：５’−ＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号３）
【００６８】
プライマー４：５’−ＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’（配列番号４）
【００６９】
増幅物１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１２０２８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２５１４１６−２５１５０６
【００７０】
５’ＴＧＡＡＣＴＡＴ＊ＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴＴＴＣＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号５）
【００７１】
増幅物２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ２４３６９２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：８３５−９４４
【００７２】
５’ＡＴＣＴＡＴＧＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＴ
【００７３】
ＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡ−３’（配列番号６）
【００７４】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。本発明の実施例において、＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。
【００７５】
増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列及び質量は、次の通りである。
【００７６】
ＣＣＴＦ  １：５’−ＣＣＡＧＧＡＴＡＧＴＴＣＡ−３’／４０３８．６Ｄａ（配列番号７）
【００７７】
ＣＣＴＦ  ２：５’−ＣＣＡＧＧＴＡＴＣＡＴＡＧＡＴ−３’／４３５１．８Ｄａ（配列番号８）
【００７８】
２．ＰＣＲ増幅
順方向プライマーとしてプライマー１、プライマー３を、逆方向プライマーとしてプライマー２、プライマー４を投入して、同時にＰＣＲ反応を行い、ＣＣＴＦが形成されたか否かを把握した。それぞれのプライマーを３μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）２Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＳＯ４  ３ｍＭ、ｄＮＴＰ  ４００μＭ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（ＮＥＢ、ＵＳＡ）１Ｕ、及びＮＧ、ＭＨ鋳型ＤＮＡ  １００ｐｇ／ｕｌが含まれた総反応液２０μlを、次の条件でＣ１０００  ＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００７９】
９４℃  １０分、
９４℃  ３０秒、６２℃  ３０秒、７２℃  ３０秒（３５サイクル）、
８５℃  ２．５時間
【００８０】
３．ＰＣＲ反応中に切断された切片の精製及び脱塩
ＰＣＲ反応中に制限酵素で処理されて切断されたＤＮＡ切片を、前記溶液から分離するために、Ｏａｓｉｓ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ１８イオン交換樹脂カラム（Ｃ１８  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いた。前記制限酵素で処理した溶液に０．１５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ、ｐＨ７．６）７０μlを入れて１分間放置する。カラムに１００％アセトニトリル（ＡＣＮ；Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）と０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  １ｍｌを通過させてレジン（Ｒｅｓｉｎ）を活性化させた後、前記制限酵素で処理した溶液と０．１５Ｍ  ＴＥＡＡとの混合液１００μl、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ  ２ｍｌ及び３次蒸留水１ｍｌを順に完全に通過させる。収集プレート（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ）上に前記カラムを位置させ、７０％ＡＣＮ  １００μlを入れて通過させる。溶出液が収集プレートに集められると、前記収集プレートを１２０℃で６０分間乾燥させる。
【００８１】
４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析
ＭＡＬＤＩマトリックス（ＭＡＬＤＩ  ｍａｔｒｉｘ）［２２．８ｍｇのクエン酸アンモニウム、１４８．５ｍｇのヒドロキシピコリン酸（ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、１．１２ｍｌのアセトニトリル、７．８ｍｌのＨ２Ｏ］４μlを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＶ、Ｂｒｕｋｅｒ）のアンカーチッププレート（Ａｎｃｈｏｒ  ｃｈｉｐ  ｐｌａｔｅ）に予め点滴（ｄｏｔｔｉｎｇ）した後、３７℃で３０分間乾燥させる。精製及び脱塩過程を経た収集プレートのサンプルに３次蒸留水を１０μl入れて溶解させた後、乾燥されたＭＡＬＤＩマトリックス上に２μlを点滴し、ＭＡＬＤＩマトリックスを再び３７℃で３０分間乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析する。分析方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器のマニュアルに従う。
【００８２】
前記反応によって生成されたＣＣＴＦを質量分析器で分析した結果は、図２に示される通りである。図２の結果、プライマー１とプライマー２との組み合わせでＰＣＲを行ったときに形成されるＣＣＴＦ１の質量である４０８３Ｄａ、及びプライマー３とプライマー４との組み合わせでＰＣＲを行ったときに形成されるＣＣＴＦ２の質量である４３５１Ｄａのピークが確認できた（ａ）。これによって、ＣＴＰＯによって形成されたＣＣＴＦを用いてＰＣＲ増幅産物を分析できることを立証し、なお、種々のプライマーが混入している反応物でも、標的配列を正確に増幅及び区分するのにＣＣＴＦを活用できることを検証した。
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲを行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを活用した質量分析法によって様々な長さの標識切片を識別することで、既存のＰＣＲ方式よりも精巧に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。
【００８３】
実施例２．多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
ＰＣＲ反応中に生成されたＣＣＴＦは、固有の解離温度で蛍光シグナルを出し得るＳＣＯと結合して固有の解離温度のピークを形成するようになり、これを、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）機器を用いてＰＣＲ過程後に直接観察が可能なようにした。ＰＣＲ反応中にＣＣＴＦが形成されると同時に、反応容器内に共に投入されているＳＣＯのＣＣＴＦ相補的配列部位とハイブリダイズするようになり、二本鎖を形成するようになる。この二本鎖を一本鎖に解離させるときに示されるＳＣＯの固有の解離温度を測定して、ＣＣＴＦの種類をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器によってＰＣＲと同時に区分及び分析することができる。本実施例において使用したＳＣＯは、それぞれ異なる蛍光レポーターを使用し、固有の解離温度を調節してＣＣＴＦの区分が可能なようにした。
【００８４】
本実施例では、性媒介疾患の原因体１２種、胃腸管疾患の原因体５種、ヒト乳頭腫ウイルス亜型９種、呼吸器疾患の原因体１０種、ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基変異ｒｓ６２６５核酸を、リアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いてＣＣＴＦ分析を行った。
【００８５】
１．性媒介疾患の原因体の検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
性媒介疾患の原因体であるクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ＣＴ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、ＭＧ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＴＶ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、ＵＵ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、ＣＡ）、ガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ＧＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス１（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １、ＨＳＶ１）、ヘルペスシンプレックスウイルス２（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ２、ＨＳＶ２）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ＴＰ）及び内部対照物質（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）のＤＮＡのリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。
【００８６】
１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。
【００８７】
また、ＣＣＴＦと相補的結合を形成して二本鎖の鋳型となるＳＣＯは、３’末端の蛍光相殺分子（ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２）を位置させ、蛍光レポーター分子を一定の距離を有するように位置させた。
【００８８】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【００８９】
プライマー５：５’−ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＡＴ−３’（配列番号９）
【００９０】
プライマー６：５’−ＧＴＴＴＴＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号１０）
【００９１】
プライマー７：５’−ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号１１）
【００９２】
プライマー８：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＣＣＧＧＴ−３’（配列番号１２）
【００９３】
プライマー９：５’−ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１３）
【００９４】
プライマー１０：５’−ＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＴＧＴＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１４）
【００９５】
プライマー１１：５’−ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１５）
【００９６】
プライマー１２：５’−ＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１６）
【００９７】
プライマー１３：５’−ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴ−３’（配列番号１７）
【００９８】
プライマー１４：５’−ＧＡＧＣＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（配列番号１８）
【００９９】
プライマー１５：５’−ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡ−３’（配列番号１９）
【０１００】
プライマー１６：５’−ＴＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２０）
【０１０１】
プライマー１７：５’−ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２１）
【０１０２】
プライマー１８：５’−ＴＴＧＴＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＴ−３’（配列番号２２）
【０１０３】
プライマー１９：５’−ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡ＊ＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣ−３’（配列番号２３）
【０１０４】
プライマー２０：５’−ＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号２４）
【０１０５】
プライマー２１：５’−ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号２５）
【０１０６】
プライマー２２：５’−ＣＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＣＣ−３’（配列番号２６）
【０１０７】
プライマー２３：５’−ＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号２７）
【０１０８】
プライマー２４：５’−ＣＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号２８）
【０１０９】
プライマー２５：５’−ＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号２９）
【０１１０】
プライマー２６：５’−ＧＧＡＡＡＣＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号３０）
【０１１１】
プライマー２７：５’−ＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣ−３’（配列番号３１）
【０１１２】
プライマー２８：５’−ＣＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＣＧ−３’（配列番号３２）
【０１１３】
プライマー２９：５’−ＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号３３）
【０１１４】
プライマー３０：５’−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＧＴＧＣ−３’（配列番号３４）
【０１１５】
ＳＣＯ１：ＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＴＡＡＡＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡ［ＢＨＱ１］（配列番号３５）
【０１１６】
ＳＣＯ２：ＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ［ＢＨＱ１］（配列番号３６）
【０１１７】
ＳＣＯ３：ＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＧＡＴＧＴＴＡＡＡ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡ［ＢＨＱ１］（配列番号３７）
【０１１８】
ＳＣＯ４：ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡ［Ｔ（ＣａｌＲｅｄ６１０）］ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧ［ＢＨＱ２］（配列番号３８）
【０１１９】
ＳＣＯ５：ＡＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡ［ＢＨＱ２］（配列番号３９）
【０１２０】
ＳＣＯ６：ＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡ［Ｔ（ＣａｌＲｅｄ６１０）］ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ［ＢＨＱ２］（配列番号４０）
【０１２１】
ＳＣＯ７：ＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡ［ＢＨＱ１］（配列番号４１）
【０１２２】
ＳＣＯ８：ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡ［ＢＨＱ１］（配列番号４２）
【０１２３】
ＳＣＯ９：ＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＴＡＡＣＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡ［ＢＨＱ２］（配列番号４３）
【０１２４】
ＳＣＯ１０：ＡＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ７０５）］ＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡ［ＢＨＱ２］（配列番号４４）
【０１２５】
ＳＣＯ１１：ＴＣＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＴＡＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ７０５）］ＣＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧ［ＢＨＱ２］（配列番号４５）
【０１２６】
ＳＣＯ１２：ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ７０５）］ＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ［ＢＨＱ２］（配列番号４６）
【０１２７】
ＳＣＯ１３：ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＴＡＴＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ６７０）］ＴＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ［ＢＨＱ２］（配列番号４７）
【０１２８】
増幅物３：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５２５５７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１５７−２２７
【０１２９】
ＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＧＴＡＴＧＧＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＴＴＴＣＧＡＣＣＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣ（配列番号４８）
【０１３０】
増幅物４：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５２３６４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３７５−４５９
【０１３１】
ＣＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣ（配列番号４９）
【０１３２】
増幅物５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ２４３６９２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：８３５−９４４
【０１３３】
ＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡ（配列番号５０）
【０１３４】
増幅物６：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０９２５１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３４６２−３６８７
【０１３５】
ＧＣＴＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＴＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴＡＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣＡＧ（配列番号５１）
【０１３６】
増幅物７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＸＭ＿００１５８２９９３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：７０５−７６８
【０１３７】
ＴＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡ＊ＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＴＡＴＧＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＴＣＡＡＣＴＣＣＧＡＣＣＴＴＣＧＴＡＡＧＣＴＣ（配列番号５２）
【０１３８】
増幅物８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０８５７００．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４６７３−４８７３
【０１３９】
ＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＴＣＡＣＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＡＴＴＡ（配列番号５３）
【０１４０】
増幅物９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０８５７３３．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４６７７−４８８６
【０１４１】
ＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＴＧＣＧＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＡＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＣＡＴＣＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＴＣＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号５４）
【０１４２】
増幅物１０：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ９０８１２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１７３６−１８１１
【０１４３】
ＧＣＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴＡＴＡ＊ＣＣＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣ（配列番号５５）
【０１４４】
増幅物１１：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ０８１６７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２７３−４３４
【０１４５】
ＡＣＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＧＴＴＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＧＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＧＧＧＣＧＴＡＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＡＣＡＧＧＡＣＣＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＡＣＧ（配列番号５６）
【０１４６】
増幅物１２：ＤＱ８８９５０２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１２３８６０−１２４００７
【０１４７】
ＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＡ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＣＧＡＣＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＧＴＧＴＧＴＣＧＣＧＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＡＣＡＡＣＧ（配列番号５７）
【０１４８】
増幅物１３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ０１８１００．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５６１−７４６
【０１４９】
ＣＴＣＡＴＡＧＣＴＡＧＧＣＧＣＣＴＧ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＴＣＣＣＣＣＣＧＧＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＧＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＣＣＣＣＣＧＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＣＣＧＣＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＧＧＴＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣ（配列番号５８）
【０１５０】
増幅物１４：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ５７７５７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：９１０−１０６７
【０１５１】
ＧＣＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＣＣＣＴＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＧＴＴＧＣＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴＡＣＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＴＴＧ（配列番号５９）
【０１５２】
増幅物１５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００１０３５５５１．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２１４−３６９
【０１５３】
ＣＴＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＧＧＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＡＣＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＧＴＴＡＣＡＡＣＧＣＡＴＣＴＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡ（配列番号６０）
【０１５４】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。
【０１５５】
ＣＣＴＦ３：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号６１）
【０１５６】
ＣＣＴＦ４：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号６２）
【０１５７】
ＣＣＴＦ５：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号６３）
【０１５８】
ＣＣＴＦ６：５’−ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣ−３’（配列番号６４）
【０１５９】
ＣＣＴＦ７：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣＡＣＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号６５）
【０１６０】
ＣＣＴＦ８：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡ−３’（配列番号６６）
【０１６１】
ＣＣＴＦ９：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号６７）
【０１６２】
ＣＣＴＦ１０：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣ−３’（配列番号６８）
【０１６３】
ＣＣＴＦ１１：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＡＣＧＴ−３’（配列番号６９）
【０１６４】
ＣＣＴＦ１２：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡ−３’（配列番号７０）
【０１６５】
ＣＣＴＦ１３：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＴＡＧＣＴＡＴＧＡＧ−３’（配列番号７１）
【０１６６】
ＣＣＴＦ１４：５’−ＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＧＡＡＧＣ−３’（配列番号７２）
【０１６７】
ＣＣＴＦ１５：５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＡＧ−３’（配列番号７３）
【０１６８】
２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
【０１６９】
それぞれプライマー５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０とＳＣＯ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）５Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ｈ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及びＣＴ、ＮＧ、ＭＨ、ＭＧ、ＴＶ、ＵＵ、ＵＰ、ＣＡ、ＧＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＴＰ及びＩＣのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  １００ｐｇ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。
【０１７０】
９５℃  １５分、
【０１７１】
９５℃  ３０秒、６３℃  １分（５０サイクル）、
【０１７２】
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．６を用いた。
【０１７３】
図３の（ａ）は、ＣＴ、ＮＧ、ＭＨ、ＭＧ、ＴＶ、ＵＵ、ＵＰ、ＣＡ、ＧＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＴＰ、ＩＣの原因菌別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＣＴ：ＦＡＭ  ８０℃、ＮＧ：ＨＥＸ  ７６．５℃、ＭＨ：ＨＥＸ  ６８℃、ＭＧ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６７．５℃、ＴＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１．５℃、ＵＵ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ７７℃、ＵＰ：ＦＡＭ  ７７℃、ＣＡ：ＦＡＭ  ６５℃、ＧＶ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７８．５℃、ＨＳＶ１：Ｑｕａｓａｒ７０５  ７３．５℃、ＨＳＶ２：Ｑｕａｓａｒ７０５  ７９℃、ＴＰ：Ｑｕａｓａｒ７０５  ６６℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ６３．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）（ｆ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されなかった（ｇ）。
【０１７４】
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行うと同時に、ＳＣＯの蛍光をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を活用して分析することによって、既存のＰＣＲ方式よりも迅速かつ簡単に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。
【０１７５】
２．胃腸管疾患の原因体の検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
【０１７６】
胃腸管疾患の原因体であるロタウイルスＡ（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ａ、ＲＶＡ）、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ、ＡｓｔＶ）、アデノウイルスＦ４０（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４０、ＡｄＶ  ４０）、アデノウイルスＦ４１（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｆ４１、ＡｄＶ  ４１）、ノロウイルスＧＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ、ＮｏＶ  ＧＩ）、ノロウイルスＧＩＩ（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ、ＮｏＶ  ＧＩＩ）及び外部対照物質（Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＥＣ）のＤＮＡのリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。
【０１７７】
１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー
【０１７８】
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。
【０１７９】
また、ＣＣＴＦと相補的結合を形成して二本鎖の鋳型となるＳＣＯは、３’末端の蛍光相殺分子（ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２）を位置させ、蛍光レポーター分子を一定の距離を有するように位置させた。
【０１８０】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【０１８１】
プライマー３１：５’−ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡＲＣＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣ−３’（配列番号７４）
【０１８２】
プライマー３２：５’−ＡＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡＡＴＹＴＧＹＴＣＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号７５）
【０１８３】
プライマー３３：５’−ＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣ＊ＣＣＡＧＧＡＲＧＡＴＹＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＴＡＹＡＴＧＧ−３’（配列番号７６）
【０１８４】
プライマー３４：５’−ＴＴＴＧＣＧＴＧＣＹＴＣＴＴＣＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号７７）
【０１８５】
プライマー３５：５’−ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣ−３’（配列番号７８）
【０１８６】
プライマー３７：５’−ＣＡＴＴＧＣＧＴＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＴＧ−３’（配列番号７９）
【０１８７】
プライマー３８：５’−ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号８０）
【０１８８】
プライマー３９：５’−ＡＴＧＴＴＡＡＣＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＣ−３（配列番号８１）
【０１８９】
プライマー４０：５’−ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴＹＣＴＧＣＣＣＧＡ−３（配列番号８２）
【０１９０】
プライマー４１：５’−ＲＧＣＧＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣ−３（配列番号８３）
【０１９１】
プライマー４２：５’−ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＲＴＴＴＴＧＴＧ−３（配列番号８４）
【０１９２】
プライマー４３：５’−ＧＣＧＴＣＡＹＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＹＴＣＡ−３（配列番号８５）
【０１９３】
プライマー４４：５’−ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＣＧ−３（配列番号８６）
【０１９４】
プライマー４５：５’−ＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧ−３（配列番号８７）
【０１９５】
ＳＣＯ１４：ＴＣＧＧＣＣＧＡＴＣＧＴＣＣＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＧＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣ  ＴＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号８８）
【０１９６】
ＳＣＯ１５：ＴＣＡＣＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＴＧＡＧＣＴＡＣＧ［Ｔ（Ｃａｌｒｅｄ６１０］ＡＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣ［ＢＨＱ２］（配列番号８９）
【０１９７】
ＳＣＯ１６：ＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧ［Ｔ（Ｃａｌｒｅｄ６１０）］ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧ  ＡＴ［ＢＨＱ２］（配列番号９０）
【０１９８】
ＳＣＯ１７：ＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧ［Ｔ（Ｃａｌｒｅｄ６１０）］ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧ  ＡＴ［ＢＨＱ２］（配列番号９１）
【０１９９】
ＳＣＯ１８：ＡＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号９２）
【０２００】
ＳＣＯ１９：ＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号９３）
【０２０１】
ＳＣＯ２０：ＴＡＧＴＴＡＴＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣ［ＢＨＱ１］（配列番号９４）
【０２０２】
増幅物１６：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ６９４９４２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１９−９９
【０２０３】
ＧＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡＲＣＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＧＡＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＲＣＡＲＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴ（配列番号９５）
【０２０４】
増幅物１７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０００２８７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２２３２−２３２１
【０２０５】
ＴＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣ＊ＣＣＡＧＧＡＲＧＡＴＹＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＴＡＴＡＹＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＣＧＴＧＴＧＡＡＧＡＲＧＣＡＣＧＣＡＡＡ（配列番号９６）
【０２０６】
増幅物１８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＭ２７４９２３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１２１−１７９
【０２０７】
ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＧ（配列番号９７）
【０２０８】
増幅物１９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ３３０１２２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１４０７−１６９１
【０２０９】
ＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴ＊ＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＣＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＴＡＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＡＡＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡＣＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＴＡＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＧＴＴＡＣＧＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＣＡＴ（配列番号９８）
【０２１０】
増幅物２０：ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＮ８５４５６４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５３２５−５３７８
【０２１１】
ＴＡＧＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧ＊ＣＣＡＧＧＧＡＧＡＴＣＧＣＲＡＴＣＴＹＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＣＹ（配列番号９９）
【０２１２】
増幅物２１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ２０２７９８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５０６０−５１０７
【０２１３】
ＡＴＣＴＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＲＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＲＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＲＴＧＡＣＧＣ（配列番号１００）
【０２１４】
増幅物２２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ２０４９４０．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１７０７−１８７８
【０２１５】
ＣＡＴＡＧＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＧＡＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧ（配列番号１０１）
【０２１６】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。
【０２１７】
ＣＣＴＦ１６：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧ−３’（配列番号１０２）
【０２１８】
ＣＣＴＦ１７：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１０３）
【０２１９】
ＣＣＴＦ１８：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＡＴＴＡＧＣＧＴＧＡＧＴ−３’（配列番号１０４）
【０２２０】
ＣＣＴＦ１９：５’−ＣＣＴＧＧＣＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＣ−３’（配列番号１０５）
【０２２１】
ＣＣＴＦ２０：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣＡＣＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号１０６）
【０２２２】
ＣＣＴＦ２１：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡ−３’（配列番号１０７）
【０２２３】
ＣＣＴＦ２２：５’−ＣＣＴＧＧＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１０８）
【０２２４】
ＣＣＴＦ２３：５’−ＣＣＴＧＧＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＣ−３’（配列番号１０９）
【０２２５】
ＣＣＴＦ２４：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＣＧＧＣＡＣＧＴ−３’（配列番号１１０）
【０２２６】
ＣＣＴＦ２５：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡ−３’（配列番号１１１）
【０２２７】
ＣＣＴＦ２６：５’−ＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＴＡＧＣＴＡＴＧＡＧ−３’（配列番号１１２）
【０２２８】
ＣＣＴＦ２７：５’−ＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１１３）
【０２２９】
ＣＣＴＦ２８：５’−ＣＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１１４）
【０２３０】
２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５とＳＣＯ１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）１Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ＤＴＴ  ０．１ｍＭ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １Ｕ、ＳｕｐｅｒｉｏｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）１Ｕ、及びＲＶＡ、ＡｓｔＶ、ＡｄＶ４０、ＡｄＶ４１、ＮｏＶ  ＧＩ、ＮｏＶ  ＧＩＩ及びＥＣ（ＭＳ２  ｐｈａｇｅ）のｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  １×１０＾４ｐｇ／ｒｘｎの核酸を添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。
【０２３１】
５５℃  ２０分、９５℃  １０分
９５℃  ３０秒、６３℃  １分（５０サイクル）、
逆転写反応温度５５℃で２０分間１回、及び変性温度９５℃で１０分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．６を用いた。
【０２３２】
図４は、ＲＶＡ、ＡｓｔＶ、ＡｄＶ４０、ＡｄＶ４１、ＮｏＶ  ＧＩ、ＮｏＶ  ＧＩＩの原因菌別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（ＲＶＡ：ＨＥＸ  ７８℃、ＡｓｔＶ：ＣａｌＲｅｄ６１０  ７８℃、ＡｄＶ４０：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６７℃、ＡｄＶ４１：ＣａｌＲｅｄ６１０  ６７℃、ＮｏＶ  ＧＩ：ＦＡＭ  ６８℃、ＮｏＶ  ＧＩＩ：ＦＡＭ  ８４℃、ＥＣ：ＨＥＸ  ６９℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｅ）。
【０２３３】
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行うと同時に、ＳＣＯの蛍光をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を活用して分析することによって、既存のＰＣＲ方式よりも迅速かつ簡単に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。
【０２３４】
３．ヒト乳頭腫ウイルスの検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ：Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）の亜型である１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型及び内部対照物質（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）のＤＮＡを用いて、リアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。
【０２３５】
１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。
【０２３６】
また、ＣＣＴＦと相補的結合を形成して二本鎖の鋳型となるＳＣＯは、３’末端の蛍光相殺分子（ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２）を位置させ、蛍光レポーター分子を一定の距離を有するように位置させた。
【０２３７】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【０２３８】
プライマー４６：５’−ＣＴＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧ−３’（配列番号１１５）
【０２３９】
プライマー４７：５’−ＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号１１６）
【０２４０】
プライマー４８：５’−ＡＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１１７）
【０２４１】
プライマー４９：５’−ＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＴＡＡＴ−３’（配列番号１１８）
【０２４２】
プライマー５０：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号１１９）
【０２４３】
プライマー５１：５’−ＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＣＡＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１２０）
【０２４４】
プライマー５２：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＣＡＡ−３’（配列番号１２１）
【０２４５】
プライマー５３：５’−ＣＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＡＴＧ−３’（配列番号１２２）
【０２４６】
プライマー５４：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧ−３’（配列番号１２３）
【０２４７】
プライマー５５：５’−ＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１２４）
【０２４８】
プライマー５６：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号１２５）
【０２４９】
プライマー５７：５’−ＴＧＣＡＧＴＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＧＴＧＴＡＧＴＡ−３’（配列番号１２６）
【０２５０】
プライマー５８：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＣＣＧＴＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１２７）
【０２５１】
プライマー５９：５’−ＧＣＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡ−３’（配列番号１２８）
【０２５２】
プライマー６０：５’−ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＴＣＧＧＡＡ−３’（配列番号１２９）
【０２５３】
プライマー６１：５’−ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＴ−３’（配列番号１３０）
【０２５４】
プライマー６２：５’−ＡＴＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＴ＊ＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１３１）
【０２５５】
プライマー６３：５’−ＧＧＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＴＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３’（配列番号１３２）
【０２５６】
ＳＣＯ２１：ＧＡＧＡＣＧＴＴＴＡＡＧＴＣＣＧＣＧＡＣＣＧＣＴＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡ［ＢＨＱ１］（配列番号１３３）
【０２５７】
ＳＣＯ２２：ＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ［ＢＨＱ１］（配列番号１３４）
【０２５８】
ＳＣＯ２３：ＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣ［Ｔ（Ｑｕｓａｒ６７０）］ＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ［ＢＨＱ２］（配列番号１３５）
【０２５９】
ＳＣＯ２４：ＡＡＡＣＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＧＴＡＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１３６）
【０２６０】
増幅物２３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＬＣ１９３８２１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４８０−５７１
【０２６１】
ＣＴＣＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＡ＊ＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧ（配列番号１３７）
【０２６２】
増幅物２４：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ４７０２０９．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５３８−７４７
【０２６３】
ＡＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＧＣＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＣＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＴＡＡＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧ（配列番号１３８）
【０２６４】
増幅物２５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８８９４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５３５−８６０
【０２６５】
ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＣＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＴＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＴＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡ（配列番号１３９）
【０２６６】
増幅物２６：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ７４１１７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１７−５０９
【０２６７】
ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＣＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＡＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴＡＴＡＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＡＴＡＡＣＡＴＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＧ（配列番号１４０）
【０２６８】
増幅物２７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８９０５．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：５１２−８１２
【０２６９】
ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧＴＡＡＣＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＡＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＡＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＣＧＣＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣ（配列番号１４１）
【０２７０】
増幅物２８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８９０６．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３３７４−３５５８
【０２７１】
ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＧＴＣＣＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＡＣＧＧＧＧＡＣＴＣＧＴＣＡＣＴＧＣＡ（配列番号１４２）
【０２７２】
増幅物２９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ２９８９２２．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２２６−３６６
【０２７３】
ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＧＴＴＡＡＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＣＡＡＣＧＡＣＣＡＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＧＣ（配列番号１４３）
【０２７４】
増幅物３０：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＣ４７０２７１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３３８９−３５４１
【０２７５】
ＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＡＣＧＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＣＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＴＧＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＧＴＧＡＣ（配列番号１４４）
【０２７６】
増幅物３１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ４５０７７８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４３１−６８１
【０２７７】
ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＧ（配列番号１４５）
【０２７８】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。
【０２７９】
ＣＣＴＦ２９：５’−ＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＣＧＣＴＡＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１４６）
【０２８０】
ＣＣＴＦ３０：５’−ＣＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１４７）
【０２８１】
ＣＣＴＦ３１：５’−ＡＧＣＧＴＡＡＧＴＧＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１４８）
【０２８２】
ＣＣＴＦ３２：５’−ＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１４９）
【０２８３】
２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３とＳＣＯ２１、２２、２３、２４にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）５Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ｈ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及びＨＰＶ１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型及びＩＣのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  １００ｐｇ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡを添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。
【０２８４】
９５℃  １５分、
９５℃  ３０秒、６３℃  １分（５０サイクル）、
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．６を用いた。
【０２８５】
図５は、１６型、１８型、３３型、３５型、５１型、５３型、５９型、６８ａ型、８２型、ＩＣのターゲット別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（１６型：ＨＥＸ  ７６．５℃、１８型：ＦＡＭ  ７８℃、３３型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、３５型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、５１型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、５３型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、５９型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、６８型ａ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、８２型：Ｑｕａｓａｒ６７０  ７１℃、ＩＣ：Ｑｕａｓａｒ６７０  ６７．５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｅ）。
【０２８６】
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行うと同時に、ＳＣＯの蛍光をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を活用して分析することによって、既存のＰＣＲ方式よりも迅速かつ簡単に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。
【０２８７】
４．呼吸器疾患の原因体の検出のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
呼吸器疾患の原因体であるインフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ／Ｈ３Ｎ２（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ）、インフルエンザＢ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ、Ｆｌｕ  Ｂ）、パラインフルエンザ１（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  １、ＰＩＶ１）、パラインフルエンザ３（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ３、ＰＩＶ３）、呼吸器合胞体ウイルスＡ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａ、ＲＳＶ  Ａ）、呼吸器合胞体ウイルスＢ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  Ｂ、ＲＳＶ  Ｂ）、ヒトメタニューモウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、ＭＰＶ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｄＶ）及び外部対照物質（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＥＣ）の核酸のリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。
【０２８８】
１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー
【０２８９】
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。
【０２９０】
また、ＣＣＴＦと相補的結合を形成して二本鎖の鋳型となるＳＣＯは、３’末端の蛍光相殺分子（ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２）を位置させ、蛍光レポーター分子を一定の距離を有するように位置させた。
【０２９１】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【０２９２】
プライマー６４：５’−ＴＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１５０）
【０２９３】
プライマー６５：５’−ＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴ＊ＣＣＡＧＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡ  Ｃ−３’（配列番号１５１）
【０２９４】
プライマー６６：５’−ＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣ−３’（配列番号１５２）
【０２９５】
プライマー６７：５’−ＣＣＧＴＧＧＣＧＣＧＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡ＊ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣＡＡＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１５３）
【０２９６】
プライマー６８：５’−ＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号１５４）
【０２９７】
プライマー６９：５’−ＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１５５）
【０２９８】
プライマー７０：５’−ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴ＊ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣ−３’（配列番号１５６）
【０２９９】
プライマー７１：５’−ＧＣＧＡＴＡＧＣＴＡＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＧＧＴＣ−３’（配列番号１５７）
【０３００】
プライマー７２：５’−ＧＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣ−３’（配列番号１５８）
【０３０１】
プライマー７３：５’−ＣＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧ＊ＣＣＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＧＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号１５９）
【０３０２】
プライマー７４：５’−ＣＣＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１６０）
【０３０３】
プライマー７５：５’−ＡＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１６１）
【０３０４】
プライマー７６：５’−ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＧＡＡＧ−３’（配列番号１６２）
【０３０５】
プライマー７７：５’−ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣ＊ＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＡＴＣＲＴＣＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１６３）
【０３０６】
プライマー７８：５’−ＧＴＧＴＣＡＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＴ＊ＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＣＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＧＣＴＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号１６４）
【０３０７】
プライマー７９：５’−ＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１６５）
【０３０８】
プライマー８０：５’−ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＣＧＴ＊ＣＣＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号１６６）
【０３０９】
プライマー８１：５’−ＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧ−３’（配列番号１６７）
【０３１０】
プライマー８２：５’−ＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣ＊ＣＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣ−３’（配列番号１６８）
【０３１１】
プライマー８３：ＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧ（配列番号１６９）
【０３１２】
プライマー８４：５’−ＡＴＧＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧ＊ＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１７０）
【０３１３】
ＳＣＯ３３：ＣＴＴＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＴＧＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１７１）
【０３１４】
ＳＣＯ３４：ＣＴＡＡＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＡＴＣＧＡＡＴ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＧＴＧＧＣＧＣＧＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡ［ＢＨＱ１］（配列番号１７２）
【０３１５】
ＳＣＯ３５：ＣＧＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣ［Ｔ（Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＧ［ＢＨＱ２］（配列番号１７３）
【０３１６】
ＳＣＯ３６：ＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡ［Ｔ（Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴ［ＢＨＱ２］（配列番号１７４）
【０３１７】
ＳＣＯ３７：ＣＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）］ＣＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧ［ＢＨＱ２］（配列番号１７５）
【０３１８】
ＳＣＯ３８：ＣＴＡＡＴＣＧＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）］ＡＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧ［ＢＨＱ２］（配列番号１７６）
【０３１９】
ＳＣＯ３９：ＴＣＡＴＡＧＡＣＡＴＴＴＡ［Ｔ（Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０）］ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣ［ＢＨＱ１］（配列番号１７７）
【０３２０】
ＳＣＯ４０：ＴＡＣＧＡＡＴＣＴＧＡＣＣＴＡＧＴＡＡＧＡ［Ｔ（Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０）］ＧＴＧＴＣＡＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１７８）
【０３２１】
ＳＣＯ４１：ＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡ［Ｔ（Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０）］ＣＣＣＡＧＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＣＧＴ［ＢＨＱ１］（配列番号１７９）
【０３２２】
ＳＣＯ４２：ＴＣＧＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）］  ＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＡＣ［ＢＨＱ２］（配列番号１８０）
【０３２３】
ＳＣＯ４３：ＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＣＧＴＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＴＧＣＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧ［ＢＨＱ１］（配列番号１８１）
【０３２４】
増幅物３２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＵ５５８７８７．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４２８−６２１
【０３２５】
ＴＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＴＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＴＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＡＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣ＊ＣＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣ（配列番号１８２）
【０３２６】
増幅物３３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＹ２２１９３４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１１−２９６
【０３２７】
ＧＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＣＧＧＡＡＣＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＣＴＡＡＴＧＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＡＧＧＴＧＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＡＣＴＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＧＡＴ＊ＣＣＴＧＧＴＣＧＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧ（配列番号１８３）
【０３２８】
増幅物３４：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＹ２２１７５０．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１２９１−１５０１
【０３２９】
ＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＧＡＡＣＴＴＧＣＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＡＣＡＴＡ＊ＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴ（配列番号１８４）
【０３３０】
増幅物３５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＦ７１９７４３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１８１６−１９５０
【０３３１】
ＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＴＴ＊ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＴＴＴＡＣＡＧＣＡＡＴＴＧＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＡＣＣＴＴＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣＧＡＣＣＣＧＴＣＧＴＡＣＣＴＴＡＧＣＴＡＴＣＧＣ（配列番号１８５）
【０３３２】
増幅物３６：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＸ６３９４９８．１ｚ／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４０３５−４２５３
【０３３３】
ＧＴＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＴＴＡＣＣＧＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＡ＊ＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＣＧ（配列番号１８６）
【０３３４】
増幅物３７：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＹ３６９８７６．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１３１０−１４６３
【０３３５】
ＣＣＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＴＣＡＴＣＴＡＴＡＡＴＣＣＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡ＊ＣＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴ（配列番号１８７）
【０３３６】
増幅物３８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＸ８９４８００．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１３７８−１１５２９
【０３３７】
ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＧＡＡＧＴＴＴＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＡＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＧＡＹＧＡＴＡＧＡＴＴＧＡＡ＊ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡ（配列番号１８８）
【０３３８】
増幅物３９：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＹ２４９６８３．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１１４６５−１１５７７
【０３３９】
ＧＧＴＧＧＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＡＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＡＴＣＴ＊ＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣ（配列番号１８９）
【０３４０】
増幅物４０：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ６２７３９１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３６３１−３９３３
【０３４１】
ＴＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＴＴＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧ＊ＣＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＧ（配列番号１９０）
【０３４２】
増幅物４１：ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ９６３０８１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１８４３７−１８５９８
【０３４３】
ＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＣＣＧＴＧＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧ＊ＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡ（配列番号１９１）
【０３４４】
増幅物４２：ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＹ２２１６２４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：９８８−１２５２
【０３４５】
ＧＣＣＣＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴＡＴＣＧＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＴＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＡＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＴＡＧＣＧＧＧＡＧＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＴＡＡＣＡＧＧＧＣＴ＊ＣＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴ（配列番号１９２）
【０３４６】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。
【０３４７】
ＣＣＴＦ３３：５’−ＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＧＧＧＧＣ−３’（配列番号１９３）
【０３４８】
ＣＣＴＦ３４：５’−ＴＣＧＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＣＡＣＧＧ−３’（配列番号１９４）
【０３４９】
ＣＣＴＦ３５：５’−ＣＧＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＴ−３’（配列番号１９５）
【０３５０】
ＣＣＴＦ３６：５’−ＡＡＴＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣＴＣＴＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１９６）
【０３５１】
ＣＣＴＦ３７：５’−ＣＣＧＣＴＴＧＣＧＣＡＴＧＴＡＡＧＡＣＧ−３’（配列番号１９７）
【０３５２】
ＣＣＴＦ３８：５’−ＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴ−３’（配列番号１９８）
【０３５３】
ＣＣＴＦ３９：５’−ＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡ−３’（配列番号１９９）
【０３５４】
ＣＣＴＦ４０：５’−ＡＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２００）
【０３５５】
ＣＣＴＦ４１：５’−ＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＴＴＣＴＧＧＧ−３’（配列番号２０１）
【０３５６】
ＣＣＴＦ４２：５’−ＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号２０２）
【０３５７】
ＣＣＴＦ４３：５’−ＣＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号２０３）
【０３５８】
２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４とＳＣＯ３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）１Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ＤＴＴ  ０．１ｍＭ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １Ｕ、ＳｕｐｅｒｉｏｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）１Ｕ、及びＦｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ、ｈＭＰＶ、ＡＤＶ及びＭＳ２  ｐｈａｇｅのｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  １×１０＾４ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅ核酸を添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。
【０３５９】
５５℃  ２０分、９５℃  １０分
９５℃  ３０秒、６３℃  １分（５０サイクル）、
逆転写反応温度５５℃で２０分間１回、及び変性温度９５℃で１０分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．６を用いた。
【０３６０】
図６は、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ、ｈＭＰＶ、ＡＤＶ、ＥＣ（Ｍｓ２  ｐｈａｇｅ）の原因菌別の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１：６７．５℃、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ３Ｎ２：７６．５℃、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ：８６．５℃、Ｆｌｕ  Ｂ：８３．５℃、ＰＩＶ１：６６℃、ＰＩＶ３：７４℃、ＲＳＶ  Ａ：６３．５℃、ＲＳＶ  Ｂ：７２℃、ｈＭＰＶ：８６℃、ＡＤＶ：８５℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）（ｅ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｆ）。
【０３６１】
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行うと同時に、ＳＣＯの蛍光をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を活用して分析することによって、既存のＰＣＲ方式よりも迅速かつ簡単に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。
【０３６２】
５．ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基変異の遺伝子型の分析のための多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦの固有の解離温度のピーク分析
【０３６３】
ＢＤＮＦ遺伝子の単一塩基変異であるｒｓ６２６５の遺伝子型を分析するために、リアルタイム重合酵素連鎖反応機器を用いたＣＣＴＦ分析を行った。
【０３６４】
１）標的配列鋳型ＤＮＡの配列特異的に作製されたプライマー
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＴＰＯであって、上述した実施例１と同じ原理で作製された。ＣＴＰＯの５’末端は、１９〜２０ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成されており、ＣＣＴＦを形成できるように標的配列のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置し、その後から３’末端までは、それぞれの標的部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、それぞれの増幅しようとする標的部位と相補的な配列で構成されている。
【０３６５】
また、ＣＣＴＦと相補的結合を形成して二本鎖の鋳型となるＳＣＯは、３’末端の蛍光相殺分子（ＢＨＱ−１又はＢＨＱ−２）を位置させ、蛍光レポーター分子を一定の距離を有するように位置させた。
【０３６６】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【０３６７】
プライマー８５：５’−ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＣ−３’（配列番号２０４）
【０３６８】
プライマー８６：５’−ＣＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＡＴ＊ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＴ−３’（配列番号２０５）
【０３６９】
プライマー８７：５’−ＧＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＡ−３’（配列番号２０６）
【０３７０】
プライマー８８：５’−ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧ−３’（配列番号２０７）
【０３７１】
プライマー８９：５’−ＣＣＧＡＧＣＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号２０８）
【０３７２】
ＳＣＯ４４：ＧＴＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡＡＴＧＧＣ［Ｔ（ＨＥＸ）］ＡＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧ［ＢＨＱ１］（配列番号２０９）
【０３７３】
ＳＣＯ４５：ＧＡＴＡＣＧＧＡＧＧＴＣＣＧＡＡＧＧＣＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＧＣＧＣＣＧＧＡ［ＢＨＱ１］（配列番号２１０）
【０３７４】
ＳＣＯ４６：ＡＴＴＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＡＴＴ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＴＡＴＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ［ＢＨＱ１］（配列番号２１１）
【０３７５】
増幅物４３：ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＴ＿００９２３７．１９／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２７５９８３４０−２７５９８４５１
【０３７６】
ＡＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＴＡＧ＊ＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＣ（配列番号２１２）
【０３７７】
増幅物４４：ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＴ＿００９２３７．１９／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：２７５９８３３８−２７５９８４５１
【０３７８】
ＣＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＡＡＧＴＣＣＧＣＴＡＴ＊ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＧＧＴＣ（配列番号２１３）
【０３７９】
増幅物４５：ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ４５０７７８．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４３１−６８１
【０３８０】
ＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＴＡ＊ＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣＧＧ（配列番号２１４）
【０３８１】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。
【０３８２】
ＣＣＴＦ４４：５’−ＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＣＧＴ−３’（配列番号２１５）
【０３８３】
ＣＣＴＦ４５：５’−ＡＴＡＧＣＧＧＡＣＴＴＡＧＣＧＴＡＣＣＣＧＧ−３’（配列番号２１６）
【０３８４】
ＣＣＴＦ４６：５’−ＴＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２１７）
【０３８５】
２）ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
それぞれプライマー８５、８６、８７、８８、８９とＳＣＯ４４、４５、４６にそれぞれ０．１５μＭ、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）５Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ｈ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及びＦｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ３Ｎ２、Ｆｌｕ  Ａ／Ｈ１Ｎ１／２００９ｐｄｍ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＰＩＶ１、ＰＩＶ３、ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ、ｈＭＰＶ、ＡＤＶ及びＭＳ２  ｐｈａｇｅのｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  １×１０＾４ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎのｔｅｍｐｌａｔｅ核酸を添加して総反応液２０μlでＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、次のＰＣＲ反応を行った。
【０３８６】
９５℃  １５分、
９５℃  ３０秒、６５℃  １分（５０サイクル）、
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６５℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。反応後、同一機器内で反応混合物を５０℃に冷却し、５０℃で３０秒間維持した後、５０℃から９５℃にゆっくり加熱することによって、固有解離温度分析曲線を得た。データの分析はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．６を用いた。
【０３８７】
図７の（ａ）は、ｒｓ６２６５の突然変異型Ａ／Ａ、野生型Ｇ／Ｇ、及び異型接合体Ａ／Ｇの遺伝子型と内部対照物質（ＩＣ）の多重固有解離温度測定結果であって、それぞれのＳＣＯが有する固有の解離温度（Ａ／Ａ：７６．５℃、Ａ／Ｇ：７６．５℃と７５℃、Ｇ／Ｇ：７５℃、ＩＣ：６６℃）でピークが観察され（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）、同じ組成において標的配列が投入されなかった場合には、ＣＣＴＦを可視化するＳＣＯのピークが観察されないことを確認した（ｅ）。
【０３８８】
したがって、ＣＣＴＦの標識化技法を用いてＰＣＲを行うと同時に、ＳＣＯの蛍光をリアルタイム重合酵素連鎖反応機器を活用して分析することによって、既存のＰＣＲ方式よりも迅速かつ簡単に標的核酸配列の検出が可能であることを証明した。
【０３８９】
実施例３．多重ターゲットＰＣＲでのＣＣＴＦの形成及びＣＣＴＦのＣｔグラフの分析
ＳＣＯを活用してリアルタイム重合酵素連鎖反応機器によりＣＣＴＦの生成有無を確認できることを実施例２で証明している。前記の方法において使用されるＳＣＯは、ＰＣＲ増幅過程中の標的配列が生成される反応中に同時に形成されて、リアルタイム蛍光分析が可能であるので、生成されるＣＣＴＦの同定が可能である。これに基づいて、本実施例では、多重標的配列を有するＰＣＲの場合、ＣＣＴＦの形成をＳＣＯで分析するとき、標準曲線の形成が可能であることを証明しようとした。
【０３９０】
本実施例を行うために、性媒介感染症（ＳＴＩ）の原因菌である淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、ＮＧ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ．ｈｏｍｉｎｉｓ、ＭＨ）、ウレアプラズマ・パルバム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ．ｐａｒｖｕｍ、ＵＰ）を選別した。
【０３９１】
１．標的鋳型ＤＮＡの特異的プライマーの作製
本実施例で使用した順方向プライマーはＣＰＴＯであって、前記の発明の詳細な説明に記述された方法に基づいて作製された。順方向プライマーの５’末端は、１９ｍｅｒ又は２１ｍｅｒのヌクレオチド配列で構成され、ＣＣＴＦを形成できるように各原因菌別のＤＮＡと非相補的な配列で構成される。その後に制限酵素認識配列が位置するようになる。制限酵素認識配列の後から３’末端までは、各原因菌別のＤＮＡのターゲット部位と相補的な配列で構成されているので、プライマーとしての役割を果たす。逆方向プライマーは、各原因菌別のＤＮＡのターゲット部位と相補的な配列で構成されている。
【０３９２】
また、ＣＣＴＦと二量体を形成するＳＣＯは、二重標識を有するようにデザインし、各原因菌別にそれぞれデザインした。ＳＣＯは、３’末端のクエンチャー（ＢＨＱ１又はＢＨＱ２）分子及びレポーター（各ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）分子を一定の距離を有するようにしてデザインし、配列は、分析しようとするＣＣＴＦの配列と相補的である。
【０３９３】
プライマー情報、及び増幅されて生成される標的配列情報は、次の通りである。
【０３９４】
プライマー９０：５’−ＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣ−３’（配列番号２１８）
【０３９５】
プライマー９１：５’−ＧＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＣＣＧＧＴ−３’（配列番号２１９）
【０３９６】
プライマー９２：５’−ＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号２２０）
【０３９７】
プライマー９３：５’−ＣＣＣＣＴＴＴＧＣＡＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号２２１）
【０３９８】
プライマー９４：５’−ＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号２２２）
【０３９９】
プライマー９５：５’−ＧＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＴＡＡＡ−３’（配列番号２２３）
【０４００】
ＳＣＯ４７：ＴＣ［Ｔ（ＨＥＸ）［ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ［ＢＨＱ］（配列番号２２４）
【０４０１】
ＳＣＯ４８：ＴＧ［Ｔ（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ［ＢＨＱ２］（配列番号２２５）
【０４０２】
ＳＣＯ４９：ＴＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ［ＢＨＱ］（配列番号２２６）
【０４０３】
増幅物４６：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５２３６４．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：３７５−４５９
【０４０４】
ＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＴＡＡ＊ＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＧＧＴＣＡＡＡＣＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣ（配列番号２２７）
【０４０５】
増幅物４７：ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ３１４３１．１／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：１４５５−１５３５
【０４０６】
ＧＣＴＣＧＣＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡ＊ＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号２２８）
【０４０７】
増幅物４８：ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０８５７３３．２／Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ）：４１６−５０２
【０４０８】
ＡＧＴＣＧＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＧ＊ＣＣＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＣＧＡＴＣＣＡＡＴＴ［Ｔ／ｃ］ＡＣＡＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣ（配列番号２２９）
【０４０９】
前記プライマー配列中の太い斜体は制限酵素認識配列を意味し、下線は、これにより生成されるＣＣＴＦの相補的な配列である。＊で表示された部分は、ＰｓｐＧＩ制限酵素が切断する部位をブロッキングするために認識配列中のＣにｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄＣＴＰが挿入されたという標識である。ＳＣＯにおける括弧は、蛍光相殺分子と蛍光レポーターが位置した塩基配列の位置を意味する。プライマー及びＳＣＯ中のＮＧに該当するプライマーは、実施例２で使用したものと同一である。増幅物から生成されるＣＣＴＦの配列は、次の通りである。
【０４１０】
ＣＣＴＦ４７：５’−ＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２３０）
【０４１１】
ＣＣＴＦ４８：５’−ＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＣＧＡＧＣ−３’（配列番号２３１）
【０４１２】
ＣＣＴＦ４９：５’−ＣＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＴＡＡＴＣＧＡＣＴ−３’（配列番号２３２）
【０４１３】
２．ＰＣＲ増幅及びＳＣＯの固有の解離温度の測定
前記のプライマーの設計で言及したそれぞれの標的配列の特異的な順方向プライマー３種及び逆方向プライマー３種、ＳＣＯ３種を、それぞれ０．１５ｕＭになるように投入し、ＰｓｐＧＩ（ＮＥＢ、ＵＳＡ）２Ｕ、ＰＣＲバッファ（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、１ｘ）、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、ｈ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）１．６Ｕ、及び各原因菌別の既存の定量方法で証明された１００ｐｇ／μｌのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを１０倍ずつ希釈した鋳型ＤＮＡが含まれた総反応液２０μlを、次の条件でＣＦＸ９６リアルタイム重合酵素連鎖反応（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）機器を用いて行った。
【０４１４】
９５℃  １５分、
９５℃  ３０秒、６３℃  １分（５０サイクル）、
変性温度９５℃で１５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度６３℃で１分のサイクルを５０回繰り返して行った。また、アニーリング段階で蛍光シグナルを収集し、データの分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  １．６を用いた。Ｃｔ（Ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）は、知られた数字のＤＮＡ濃度の対数増幅器で始め、菌株に対する標準曲線を作成した。
【０４１５】
図８の（ａ）に示されたように、予想していたＳＣＯの蛍光増幅曲線を、鋳型の濃度に応じてそれぞれ異なるグラフとして観察することができた。また、鋳型ＤＮＡを投入しない場合、いかなるピークも観察されなかった（ｂ）。各原因菌別のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを１００ｐｇの濃度から１０倍ずつ希釈したＮＧ（実線）、ＭＧ（点線）、ＵＰ（円形）の多重リアルタイム重合連鎖反応の実験条件で現れたＳＣＯの蛍光増幅曲線（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅｓ）及び標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）を示した結果であって、グラフ（ａ）は、３つの標的配列が濃度別に同時に存在する場合に描かれる蛍光増幅曲線を示し、グラフ（ｂ）は、３つの標的配列が全て含まれない場合に描かれる陰性結果である。グラフ（ａ）中のＮＧに該当するグラフを単一の蛍光増幅曲線で示して標準曲線を示すと、（ｃ）及び（ｄ）で示すことができ、ＭＧに該当するグラフは（ｅ）及び（ｆ）で示すことができ、ＵＰに該当する曲線は（ｇ）及び（ｈ）で示すことができる。
【０４１６】
標準曲線の線形回帰分析において回帰係数（Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）（ｒ２）は、それぞれ、ＮＧ０．９９８２、ＭＧ０．９９９、ＵＰ０．９９９２と示された。Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌｏｔの傾きは、ＮＧ−３．８５、ＭＧ−３．８９、ＵＰ−３．６６であった。それぞれの増幅効率（Ｅ＝１０［−１／ｓｌｏｐｅ］−１）は、それぞれＮＧ８１．８％、ＭＧ８０．７％、ＵＰ８７．６％と示され、８０〜１２０％の間の適正範囲内に羅列されることが確認できた。
【０４１７】
本実施例により、各原因菌別の互いに異なるＣＣＴＦをリアルタイム重合酵素連鎖反応機器で読み取るに当たって、ＳＣＯのリアルタイム蛍光の程度を測定することによって、生成されるＣＣＴＦの相対量を把握し、これを用いて標識形成方法でＣｔ値を確認することによって、標的配列の同定が可能であることを証明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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