(57)【要約】  本願発明は、改善された薬理学的有効性、インビボ持続時間およびタンパク質安定性を有する、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ変異体タンパク質を免疫グロブリンのＦｃ領域に連結することによって製造されるデュアル機能タンパク質を提供する。本願発明のデュアル機能タンパク質は、改善された薬理学的有効性、インビボ持続時間およびタンパク質安定性を示し、活性成分としてデュアル機能タンパク質を含む医薬組成物は、糖尿病、肥満、脂質異常症、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または心臓血管疾患に対する治療剤として有効的に使用され得る。
2019500013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むデュアル機能タンパク質であって、
ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）−（７）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１にてＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）でのアミノ酸の置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）でのアミノ酸の置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）でのアミノ酸の置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（６）１つ以上の上記変異（１）から（５）と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０にてアミノ酸Ｅでのアミノ酸の置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異、
デュアル機能タンパク質。
【請求項２】
変異によって導入されるＦＧＦ２１変異体タンパク質のアミノ酸残基Ｎがグリコシル化される、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項３】
生物学的に活性なタンパク質が、インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、グルカゴン、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）、オキシントモジュリン、オキシトシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、イリシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５（ＦＮＤＣ５）、アペリン、アディポネクチン、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＣＴＲＰファミリー）、レジスチン、ビスファチン、オメンチン、レチノール結合タンパク質−４（ＲＢＰ−４）、グリセンチン、アンジオポイエチン、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、エキセンディン−４および成長ホルモンからなる群から選択される１つである、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項４】
生物学的に活性なタンパク質が、ＧＬＰ−１、その変異体およびエキセンディン−４から選択される１つである、請求項３に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項５】
ＧＬＰ−１の変異体が、配列番号：４３から４６のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項６】
野生型ＦＧＦ２１タンパク質が、配列番号：１によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項７】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質が、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項８】
デュアル機能タンパク質が、リンカーをさらに含む、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項９】
リンカーが、ＦＧＦ２１変異体タンパク質を免疫グロブリンのＦｃ領域に連結する、請求項８に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１０】
リンカーが、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結される、請求項９に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１１】
リンカーが、１０から３０のアミノ酸残基からなるペプチドである、請求項９に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１２】
リンカーが、配列番号：２から５のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１３】
免疫グロブリンのＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤのＦｃ領域のいずれか１つ、またはそれらの組合せを含むハイブリッドＦｃである、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１４】
ハイブリッドＦｃが、ＩｇＧ４領域およびＩｇＤ領域を含む、請求項１３に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１５】
デュアル機能タンパク質が、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１６】
リンカーが、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質間にさらに連結される、請求項１５に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１７】
リンカーが、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結される、請求項１６に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１８】
リンカーが、１０から３０のアミノ酸残基からなるペプチドである、請求項１６に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項１９】
リンカーが、配列番号：２から５のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項２０】
デュアル機能タンパク質が、配列番号：６５によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項２１】
デュアル機能タンパク質が、配列番号：６６によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項２２】
デュアル機能タンパク質が、配列番号：６７によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のデュアル機能タンパク質。
【請求項２３】
糖尿病、肥満、脂質異常症、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または心臓血管疾患を処置するための、請求項１から２２のいずれかに記載のデュアル機能タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１から２２のいずれかに記載のデュアル機能タンパク質をコードする単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、生物学的に活性なタンパク質および線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質、およびそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、食物によって刺激されるときなどに、腸管におけるＬ細胞によって分泌される３１アミノ酸からなるインクレチンホルモンである。その生物学的効果は、膵臓、脳などのβ−細胞のような標的組織において発現されるＧタンパク質共役受容体であるＧＬＰ−１受容体を介する細胞内シグナル伝達を介して生じる。血液中に分泌されたＧＬＰ−１は、酵素ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）によるＮ−末端でのアミノ酸の開裂による活性の喪失によって引き起こされる、２分未満の非常に短い半減期を有する。ＧＬＰ−１が血糖レベルに基づいて膵臓のβ−細胞においてインスリンの分泌を刺激するため、低血糖を誘導することなく血糖を低下させる強い効果を有する。さらに、ＧＬＰ−１の投与は、食欲抑制に対する効果による食物摂取の低下によって引き起こされることが知られている、種々の動物モデルおよびヒトにおいて体重減少をもたらす。ＧＬＰ−１は、β−細胞の増殖を誘導し、膵臓のβ−細胞において発現されるＧＬＰ−１受容体を介して糖脂質毒性によって引き起こされる細胞死を阻害することによりβ−細胞の生存能力を増強する。グルカゴンの過剰分泌は血糖を増加させ、糖尿病患者において高血糖の原因の１つであることが知られている。加えて、ＧＬＰ−１が、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）タンパク質特異的グルカゴンの分泌を阻害することによって空腹時血糖上昇を阻害するように膵臓のα−細胞に作用することが知られている。
【０００３】
エキセンディン−４は、臨床的に重要なＧＬＰ−１受容体アゴニストである。エキセンディン−４は、３９アミノ酸残基を有するポリペプチドであり、通常、Ｇｉｌａ  Ｍｏｎｓｔｅｒ  ｌｉｚａｒｄの唾液腺において生産される。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と５２％のアミノ酸配列相同性を有し、哺乳動物におけるＧＬＰ−１受容体と相互作用することが知られている（Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682）。エキセンディン−４はインビトロでインスリン生産細胞によるインスリン分泌を刺激することが示されており、インスリン生産細胞によるインスリン放出の誘導は等モル条件下でＧＬＰ−１よりも強い。エキセンディン−４はＧＬＰ−１よりも長い作用持続時間で齧歯動物およびヒトの両方において血糖レベルを減少させるようにインスリン分泌を強く刺激するが、ＧＬＰ−１を欠いている哺乳動物において見慣れないエピトープを有しているため、エキセンディン−４はＧＬＰ−１を欠いている哺乳動物において抗原性を示す。
【０００４】
ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４アナログ（例えば、リラグルチドおよびバイエッタ）がヒトにおいてグルコースコントロールを改善する能力は、臨床的に確認されている。ＧＬＰ−１がアポトーシス阻害および増殖誘導を介してβ−細胞量を増加させることが報告されている。さらに、ＧＬＰ−１が、胃酸分泌および胃内容排出を阻害し、満腹シグナルを増強し、それによって食欲を低下させる腸ホルモンとして作用することも報告されている。かかるＧＬＰ−１の効果は、ＧＬＰ−１アナログが２型糖尿病を有する患者に投与されるときに観察される体重減少を説明することができる。加えて、ＧＬＰ−１は、齧歯動物において虚血後の心臓保護効果を示す。
【０００５】
長時間作用型ＧＬＰ−１アナログを開発するための様々な試みがなされている。臨床的に確認された長時間作用型ＧＬＰ−１アナログは、デュラグルチド（ＷＯ  ２００５／０００８９２）およびアルビグルチド（ＷＯ  ２００３／０５９９３４）を含む。デュラグルチドはＦｃ融合ＧＬＰ−１アナログであり、アルビグルチドはアルブミン融合ＧＬＰ−１アナログであり、それら両方が週１回の投与が可能である薬物動態学プロフィールを有する。両方の薬物は、週１回の投与で血糖を低下させ体重を低下させる優れた効果を有し、また、バイエッタおよびリラグルチドと比較したとき処置に関して大幅に改善された利便性を提供する。
【０００６】
その一方で、肝臓において合成される線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、グルコースおよび脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが知られているホルモンである。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１特異的受容体、すなわちＦＧＦ受容体およびβ−クロトー複合体の両方が発現される、肝臓、脂肪細胞、膵臓のβ細胞、脳の視床下部および筋肉組織において薬理学的作用を示す。種々の糖尿病および代謝疾患の非ヒト霊長類およびマウスモデルにおいて、ＦＧＦ２１がインスリン非依存性において血糖レベルを低下させ、体重を低下させ、血中のトリグリセリドおよび低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）濃度を低下させることができることが報告されている。さらに、インスリン感受性を改善するその効果のために、ＦＧＦ２１は糖尿病および肥満に対する新規な治療剤としての開発のための可能性を有する（ＷＯ２００３／０１１２１３参照）。
【０００７】
したがって、ＦＧＦ２１に基づく新規な抗糖尿病薬を開発するために、いくつかのアミノ酸の置換、挿入および欠失を介して野生型ＦＧＦ２１配列に基づくＦＧＦ２１変異体を構築することによってその生物学的活性およびインビボ安定性を改善させる試みがなされている（ＷＯ２０１０／０６５４３９参照）。しかしながら、ＦＧＦ２１が非常に短い半減期を有するため、生物学的薬剤として直接的に使用されるとき問題があることが証明されている（Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635）。ＦＧＦ２１のインビボ半減期はマウスにおいて１から２時間およびサルにおいて２．５から３時間である。したがって、糖尿病に対する治療剤として現在の形態において使用されるＦＧＦ２１について、毎日の投与が必要である。
【０００８】
ＦＧＦ２１組換えタンパク質のインビボ半減期を増加させる試みにおいて、様々なアプローチが報告されている。かかる１つの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわちポリマー材料をＦＧＦ２１に連結させ、その分子量を増加させ、それにより腎臓排出を阻害し、インビボ保持時間を増加させることである（ＷＯ２０１２／０６６０７５参照）。別のアプローチは、それをヒトアルブミンに結合する脂肪酸と融合させることによって半減期を改善することを試みている（ＷＯ２０１２／０１０５５３参照）。さらなる例は、ヒトＦＧＦ受容体単独でとまたはβ−クロトーとの複合体としてと特異的に結合するアゴニスト抗体の産生を介して、野生型ＦＧＦ２１と同等の薬理学的活性を維持しながら、半減期を増加させることを試みる（ＷＯ２０１２／１７０４３８参照）。別の例において、半減期は、ＩｇＧのＦｃ領域がＦＧＦ２１分子に結合する長時間作用型融合タンパク質を製造することによって改善された（ＷＯ２０１３／１８８１８１参照）。
【０００９】
長時間作用型薬物を作製するために利用できる種々の技術の中で、Ｆｃ融合技術は、インビボ半減期を増加させながら免疫応答または毒性を誘導するような他のアプローチで見られる欠点が少ないため、広範に使用されている。長時間作用型治療薬としてのＦｃ融合ＦＧＦ２１タンパク質の開発について、以下の条件を満たす必要がある。
【００１０】
第１に、融合によって引き起こされるインビトロ活性の減少を最小限にするべきである。ＦＧＦ２１のＮ−末端およびＣ−末端の両方がＦＧＦ２１の活性に関与する。この点において、ＦＧＦ２１融合タンパク質の活性は融合の位置に依存して大きく変化することが知られている。したがって、変異がＦＧＦ２１に導入されているＦｃ融合ＦＧＦ２１融合タンパク質の活性は、融合の存在／非存在または位置に依存して変化し得る。第２に、ヒトにおいて１週間に１回の間隔での投与を可能にする薬物動態学プロフィールは、融合によるインビボ半減期の増加によって実現されるべきである。第３に、バイオ医薬の投与後に多数の患者において免疫原性が予期され得ることを考慮して、融合リンカーまたは変異による免疫原性リスクを最小限にするべきである。第４に、融合の位置または変異の導入から生じる安定性の問題はないべきである。第５に、望ましくない免疫応答が融合免疫グロブリンのアイソタイプに依存して起こり得るため、かかる応答を防止する解決策が必要である。
【００１１】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域をＦＧＦ２１分子に連結することによって長時間作用型融合タンパク質を開発する試みが既に報告されている（ＷＯ  ２０１３／１８８１８１参照）。Ｆｃが野生型ＦＧＦ２１のＮ−末端に融合されている１つのＦｃ−ＦＧＦ２１構造の場合、野生型ＦＧＦ２１と比較してインビトロ活性において明確な違いは存在しないが、半減期がタンパク質のインビボ分解によって非常に短いことが知られている。この問題に対処するために、タンパク質分解に抵抗するためにＦＧＦ２１の特定の部位位置でいくつかの変異を導入することによってインビボ半減期を改善する試みがなされている。しかしながら、免疫原性リスクが複数の変異の導入で増加し得る。対照的に、ＦｃがＦＧＦ２１分子のＣ−末端に融合されているＦＧＦ２１−Ｆｃ構造の場合、Ｆｃ−ＦＧＦ２１構造と比較してこの部位での融合によって引き起こされる活性の有意な減少が存在することが知られている。
【００１２】
ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の組合せ投与は、体内の作用メカニズムおよび標的組織に依存する単一投与と比較して相乗効果を有し得、顕著な抗糖尿病有効性およびさらなる利点が潜在的に期待される。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の組合せ投与またはＧＬＰ−１／ＦＧＦ２１デュアル機能タンパク質の効果は、既に調査および報告されている（ＷＯ  ２０１０／１４２６６５およびＷＯ  ２０１１／０２０３１９参照）。
【００１３】
ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１を含むデュアル機能タンパク質を開発するために、様々な問題を解決しなければならない。野生型ＧＬＰ−１および野生型ＦＧＦ２１は非常に短いインビボ半減期を有するため、たとえ治療剤として開発されたとしても、それらは少なくとも１日１回投与する必要がある。したがって、患者の利便性を改善するように長時間作用型デュアル機能タンパク質を開発するために、Ｆｃ融合のような長時間作用型技術が必要である。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の２つの標的に対するデュアル機能薬物において、変異の導入は、各薬物の活性およびインビボ安定性を維持するために重要であり、それぞれの変異によって引き起こされる活性、構造または安定性の変化と関連する問題に対処すべきである。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の２つの標的に対する薬効はバランスが取れていなければならず、動物モデルにおいてインビトロ活性、薬物動態学プロフィール、薬理学的有効性ならびにヒトにおいて有効性の臨床評価を考慮する薬物設計が、この目的のために必要である。デュアル機能タンパク質は、人体には存在することができない構造を有し、単一の標的に対する融合タンパク質と比較して構造的に複雑である。加えて、変異またはリンカー操作が２つの標的とバランスをとるために必要であるため、凝集体複合体を形成する可能性が増加し得、これを防止するためのさらなるタンパク質操作が必要となり得る。さらに、起こり得る免疫原性は、新規な変異配列または複合体構造によって増加し得、対処または回避すべきである。
【００１４】
本願発明者らは、ＧＬＰ−１変異体タンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質の安定性、薬物動態学プロフィールおよび薬理学的有効性を改善するために努力し、ＧＬＰ−１変異体タンパク質が免疫グロブリンのＦｃ領域に融合され、新規なＦＧＦ２１変異体タンパク質が融合されるときに、デュアル機能タンパク質の安定性、薬物動態学プロフィールおよび薬理学的有効性が改善され得ることを見いだし、それにより本願発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本願発明の目的は、改善された薬物動態パラメータ、高い安定性、凝集複合体を形成する低い可能性、および低下した起こり得る免疫原性を有する、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質を提供することである。
【００１６】
本願発明の別の目的は、ＦＧＦ２１−関連障害を予防または処置するためのデュアル機能タンパク質を含む医薬組成物を提供することである。
【００１７】
本願発明のさらなる目的は、デュアル機能タンパク質をコードする単離された核酸分子、該核酸分子を含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本願発明は、ＦＧＦ２１変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むデュアル機能タンパク質であって、
ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）−（７）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１にてＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）でのアミノ酸の置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）でのアミノ酸の置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）でのアミノ酸の置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（６）１つ以上の上記変異（１）から（５）と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０にてアミノ酸Ｅでのアミノ酸の置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異、
デュアル機能タンパク質を提供する。
【００１９】
加えて、本願発明は、糖尿病、肥満、脂質異常症、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または心臓血管疾患を処置するためのデュアル機能タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
さらに、本願発明は、デュアル機能タンパク質をコードする単離された核酸分子、核酸分子を含む発現ベクター、および発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ変異体タンパク質を免疫グロブリンのＦｃ領域に連結することによって製造される本願発明のデュアル機能タンパク質は、改善された薬理学的有効性、インビボ持続時間およびタンパク質安定性を有する。加えて、活性成分としてデュアル機能タンパク質を有する医薬組成物は、糖尿病、肥満、脂質異常症、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または心臓血管疾患に対する治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａから１Ｃは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用するＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質（以下、「ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質」）のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入による活性における有意な減少を示さなかった。
【００２３】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用するＦＧＦ２１のＮ−末端をＦｃ領域に連結する種々のリンカーを有するＦＧＦ２１変異体融合タンパク質のインビトロ活性を示すグラフである。わずかな違いがリンカー配列に依存して活性において示されたが、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は活性における有意な減少を示さなかった。
【００２４】
【図３】図３は、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用するＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）およびＤＦＤ１のインビトロ活性を示すグラフである。Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）は他のタンパク質よりも２倍高いインビトロ活性を有したが、ＤＦＤ１およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）は同様の活性を有した。
【００２５】
【図４】図４は、融合タンパク質の安定性に対するＦＧＦ２１のＥＩＲＰ変異の効果を確認するために、ＤＦＤ４の安定性およびＤＦＤ１３の安定性を示す。ＤＦＤ１３が、ＤＦＤ４と比較して初期段階および２週間以上後の時点で、高分子量凝集体（ＨＭＷ％）のより低い割合と関連したことを確認し、ＥＩＲＰ変異の導入がＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の安定性を改善し、それによりＨＭＷ％を有意に低下させることを示した。
【００２６】
【図５】図５は、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の皮下投与後９６時間、時間とともに血液中の各タンパク質の濃度を示す。データは、平均値および標準偏差として示される。
【００２７】
【図６】図６は、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７４またはＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）の単一の皮下注射後のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける血糖レベルを示す。ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４全ては、血糖レベルを連続的に低下させる効果を有した。データは、平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示される。
【００２８】
【図７】図７は、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７４またはＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）の単一の皮下注射後、投与の日から１４日目のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける体重の変化を示すグラフを示す。ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４全ては、ＰＢＳ処置グループと比較して体重を低下させる効果を有した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００２９】
【図８】図８は、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７４またはＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）の単一の皮下注射後、投与の日（１日目）から１６日目のｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける糖化ヘモグロビンレベルの変化を示すグラフを示す。ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４全ては、投与の日の糖化ヘモグロビンレベルと比較して１６日目の糖化ヘモグロビンレベルを低下させた。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３０】
【図９】図９は、ＤＦＤ７２またはＤＦＤ７４の単一の皮下注射後、ＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおける血糖レベルを示す。ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４の両方は、血糖レベルを連続的に低下させる効果を有した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３１】
【図１０】図１０は、ＤＦＤ７２またはＤＦＤ７４の単一の皮下注射後、投与の日から１４日目のＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおける動物体重の変化を示す。ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４の両方は、ＰＢＳ処置グループと比較して、体重を低下させる効果を有した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３２】
【図１１】図１１は、ＤＦＤ７２またはＤＦＤ７４の単一の皮下注射後、１日目および１３日目にＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおける糖化ヘモグロビンレベルの変化を示すグラフを示す。ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４の両方は、ＰＢＳ処置グループと比較して、糖化ヘモグロビンレベルの大きな低下を引き起こしたことを観察した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３３】
【図１２】図１２は、ＤＦＤ１８の単一の投与後、投与の日から１４日目の食餌性肥満マウスモデルにおいて測定される体重の変化を示す。ＤＦＤ１８は、体重低下に対して有意な効果を有した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３４】
【図１３】図１３は、ヒトＧＬＰ−１受容体が過剰発現されるＣＨＯ細胞系を使用するＧＬＰ−１変異体およびＧＬＰ−１のＣ−末端をＦｃ領域に連結するヒンジに依存するデュアル機能タンパク質のインビトロＧＬＰ−１活性を示すグラフである。一般的に、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列（ＤＦＤ２３）を含むデュアル機能タンパク質は、他のＧＬＰ−１変異体配列を含む他のデュアル機能タンパク質よりも２から３倍低い活性を示した。ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列を除いて変異体配列を含むデュアル機能タンパク質間でＧＬＰ−１活性における有意な差異は見られなかった。
【００３５】
【図１４】図１４は、ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４のＧＬＰ−１活性およびＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１活性を示すグラフを示す。３つのデュアル機能タンパク質（ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４）およびＦＧＦ２１を含まないＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体（ＤＦＤ５９）のインビトロＧＬＰ−１活性を、ヒトＧＬＰ−１受容体が過剰発現されるＣＨＯ細胞系を使用して測定した。３つのデュアル機能タンパク質は同様のＥＣ５０値を示し、Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体（ＤＦＤ５９）はデュアル機能タンパク質よりも約２倍高い活性を示した。ＦＧＦ２１変異体に依存するデュアル機能タンパク質のインビトロ活性をヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して測定した。ＦＧＦ２１部分のインビトロ活性が３つのデュアル機能タンパク質と同様であったことを確認した。
【００３６】
【図１５】図１５は、デュアル機能タンパク質の皮下投与後２４０時間の血液中のタンパク質の濃度  対  時間を示す。データは、平均値および標準偏差として示される。
【００３７】
【図１６】図１６は、ＤＦＤ１１４またはＤＦＤ５９の単一の皮下注射およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せの単一の皮下注射後のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける血糖レベルを示す。デュアル機能タンパク質で処置されるグループは、単一機能タンパク質で処置されるよりも血糖レベルを低下させるより強い効果を示した。データは、平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示される。
【００３８】
【図１７】図１７は、ＤＦＤ１１４またはＤＦＤ５９の単一の皮下注射およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せの単一の皮下注射後、投与の日から１４日目のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける体重の変化を示すグラフを示す。デュアル機能タンパク質で処置されるグループは、単一機能タンパク質で処置されるよりも体重を低下させるより強い効果を示した。データは、平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示される。
【００３９】
【図１８】図１８は、ＤＦＤ１１４またはＤＦＤ５９の単一の皮下注射およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せの単一の皮下注射後、投与の日（１日目）および１６日目にｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける糖化ヘモグロビンレベルの変化を示すグラフを示す。デュアル機能タンパク質で処置されるグループは、単一機能タンパク質またはそれらの組合せで処置されるよりも糖化ヘモグロビンレベルを低下させるより強い効果を示した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【００４０】
【図１９】図１９は、ＤＦＤ１１４、ＤＦＤ５９、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の単一の皮下注射およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せの単一の皮下注射後のＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおける血糖レベルを示す。デュアル機能タンパク質で処置されるグループは、単一機能タンパク質で処置されるよりも血糖レベルを低下させるより強い効果を示した。データは、平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示される。
【００４１】
【図２０】図２０は、ＤＦＤ５９、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ１１４の単一の皮下注射およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せの単一の皮下注射後、投与の日から１４日目のＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおける体重の変化を示す。デュアル機能タンパク質で処置されるグループは、単一機能タンパク質で処置されるよりも体重を低下させるより強い効果を示した。データは、平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として示される。
【００４２】
【図２１】図２１は、ＤＦＤ５９、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ１１４の単一の皮下注射およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せの単一の皮下注射後、投与の日（１日目）および１６日目のＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおける糖化ヘモグロビンレベルの変化を示す。デュアル機能タンパク質で処置されるグループは、単一機能タンパク質またはそれらの組合せで処置されるよりも糖化ヘモグロビンレベルを低下させるより強い効果を示した。データは、平均値および平均の標準誤差として示される。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下に、本願発明をより詳細に記載する。
【００４４】
１つの局面において、本願発明は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含むデュアル機能タンパク質であって、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）−（７）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１にてＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）でのアミノ酸の置換（以下、「ＥＩＲＰ」）；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）でのアミノ酸の置換（以下、「ＴＧＬＥＡＶ））；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）でのアミノ酸の置換（以下、「ＴＧＬＥＡＮ」）；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（６）１つ以上の上記変異（１）から（５）と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０にてアミノ酸Ｅでのアミノ酸の置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異、
デュアル機能タンパク質を提供する。
【００４５】
グルコースおよび脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが知られているホルモンである野生型ＦＧＦ２１タンパク質は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ブタ、サルなど、好ましくはヒト由来のものであり得る。さらに好ましくは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質は、配列番号：１によって示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトＦＧＦ２１タンパク質であり得る。
【００４６】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質に含まれる変異は、好ましくは、ＥＩＲＰ、ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つ；ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つおよびＥＩＲＰの変異の組合せ；ＥＩＲＰ、ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つおよびＡ１８０Ｅの変異の組合せ；またはＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つ、ＥＩＲＰの変異およびＡ１８０Ｅの変異の組合せであり得る。さらに、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、Ｎ−末端またはＣ−末端での１から１０のアミノ酸が野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して欠失されている構造を有し得る。さらに好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を含み、Ｎ−末端またはＣ−末端での１から１０のアミノ酸が野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して欠失されている構造をさらに有してもよい。
【００４７】
デュアル機能タンパク質において、変異によって導入されるＦＧＦ２１変異体タンパク質のアミノ酸残基Ｎはグリコシル化され得る。
【００４８】
生物学的に活性なタンパク質は、インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、グルカゴン、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）、オキシントモジュリン、オキシトシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、イリシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５（ＦＮＤＣ５）、アペリン、アディポネクチン、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＣＴＲＰファミリー）、レジスチン、ビスファチン、オメンチン、レチノール結合タンパク質−４（ＲＢＰ−４）、グリセンチン、アンジオポイエチン、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、エキセンディン−４および成長ホルモンからなる群から選択される１つであり得る。好ましくは、生物学的に活性なタンパク質は、ＧＬＰ−１、その変異体およびエキセンディン−４から選択される１つであり得る。
【００４９】
ＧＬＰ−１タンパク質は、食物によって刺激されるなどによって、腸管におけるＬ細胞によって分泌される３１アミノ酸からなるインクレチンホルモンである。例えば、ＧＬＰ−１タンパク質は。配列番号：４２のアミノ酸配列によって示され得る。
【００５０】
ＧＬＰ−１の変異体は、例えば、配列番号：４３から４６のいずれかのアミノ酸配列によって示され得る。
【００５１】
本願明細書において使用される「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ」なる用語は、免疫グロブリンの重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域および軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含まないタンパク質を示す。さらに、本願明細書において使用される「Ｆｃ領域変異体」なる用語は、Ｆｃ領域のアミノ酸の一部を置換することによって、または様々な型のＦｃ領域を組み合わせることによって調製されるものを示す。
【００５２】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、抗体を構成する完全Ｆｃ領域、そのフラグメントまたはＦｃ領域変異体であり得る。さらに、Ｆｃ領域は、単量体または多量体の形態の分子を含み、重鎖定常領域のヒンジ領域をさらに含み得る。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジ領域での開裂を防止するように修飾され得る。さらに、Ｆｃのヒンジ配列は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を低下させるためにいくつかのアミノ酸配列において置換を有し得る。加えて、Ｆｃヒンジ配列のアミノ酸配列の一部は、Ｆａｂ領域の再配列を阻害するために置換され得る。ＦｃのＣ−末端でのリジン残基は除去され得る。
【００５３】
好ましくは、免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤのＦｃ領域のいずれか１つ；またはそれらの組合せであるハイブリッドＦｃであり得る。さらに、ハイブリッドＦｃはＩｇＧ４領域およびＩｇＤ領域を含み得る。さらに、ハイブリッドＦｃ領域は、ＩｇＤのＦｃのヒンジ配列の一部およびＣＨ２、およびＩｇＧ４のＦｃのＣＨ２およびＣＨ３配列を含み得る。
【００５４】
加えて、本願発明のＦｃフラグメントは、野生型グリコシル化鎖、野生型よりも多いグリコシル化鎖、野生型よりも少ないグリコシル化鎖または脱グリコシル化鎖の形態においてであり得る。グリコシル化鎖の増加、減少または除去は、当分野で知られている慣用の方法、例えば化学方法、酵素方法および微生物を使用する遺伝子操作方法によって行われ得る。
【００５５】
好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号：２４から２６、４７および４８から選択されるアミノ酸配列によって示され得る。
【００５６】
デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含み得る。さらに、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＦＧＦ２１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域および生物学的に活性なタンパク質を含み得る。好ましくは、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含み得る。
【００５７】
さらに、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含み得る。さらに、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＦＧＦ２１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＬＰ−１変異体タンパク質を含み得る。好ましくは、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含み得る。
【００５８】
さらに、デュアル機能タンパク質はリンカーをさらに含み得る。
【００５９】
デュアル機能タンパク質は、ＦＧＦ２１変異体タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ−末端またはＣ−末端に直接的に連結される、またはＦＧＦ２１変異体タンパク質がリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結される形態であり得る。
【００６０】
そのような場合、リンカーは、ＦｃフラグメントのＮ−末端、Ｃ−末端または遊離基に連結され得、また、ＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端または遊離基に連結され得る。リンカーがペプチドリンカーであるとき、連結は任意の領域において起こり得る。例えば、リンカーは、免疫グロブリンＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結され、免疫グロブリンＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質の融合タンパク質を形成し得る。
【００６１】
さらに、本願発明のデュアル機能タンパク質は、生物学的に活性なタンパク質が融合タンパク質の免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ−末端に連結される形態であり得る。
【００６２】
リンカーおよびＦｃが別々に発現され、次に連結されるとき、リンカーは当分野で知られている架橋剤であり得る。架橋剤の例は、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸およびジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むイミドエステル、および二機能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを含み得るが、これらに限定されない。
【００６３】
さらに、リンカーはペプチドであり得る。好ましくは、リンカーは１０から３０のアミノ酸残基からなるペプチドであり得る。
【００６４】
さらに、アラニンが、リンカーの末端にさらに結合され得る。好ましくは、リンカーは、配列番号：２から５のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【００６５】
デュアル機能タンパク質は、１つ以上のＦＧＦ２１変異体タンパク質が互いに連結したＦＧＦ２１変異体タンパク質の二量体または多量体が免疫グロブリンＦｃ領域に連結される形態であり得る。さらに、デュアル機能タンパク質は、２つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域が連結される二量体または多量体の形態であって、免疫グロブリンＦｃ領域が連結されるＦＧＦ２１変異体タンパク質を有する、形態であり得る。
【００６６】
さらに、デュアル機能タンパク質は、好ましくは配列番号：５８から６７のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。さらに好ましくは、デュアル機能タンパク質は、配列番号：６５、６６または６７によって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【００６７】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異をさらに含み得る。免疫原性は、当分野で知られている慣用の方法により予測され得る。例えば、タンパク質の起こり得る免疫原性は、例えばｉＴｏｐｅＴＭおよびＴＣＥＤＴＭ方法を使用することによってスクリーニングされ得る。
【００６８】
さらに、免疫原性を最小限にするための変異は、当分野で知られている慣用の方法により設計され得る。例えば、免疫原性が起こり得る免疫原性を評価するためにＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ分析を実施することによって観察されるとき、免疫原性を誘導するアミノ酸配列はＴ細胞エピトープマッピングを介して同定され得、最小限にされる免疫原性を有する変異体はコンピューター内予測を介して設計され得る。
【００６９】
別の局面において、本願発明は、ＦＧＦ２１−関連障害を処置するためのデュアル機能タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００７０】
本願明細書において使用される「ＦＧＦ２１−関連障害」なる用語は、肥満、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、膵炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、高血糖、メタボリック・シンドローム、急性心筋梗塞、高血圧、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、卒中、心不全、冠動脈心臓疾患、腎臓疾患、糖尿病性合併症、ニューロパシー、胃不全まひ、インスリン受容体における重篤な不活性化変異と関連する障害、および他の代謝障害を含み得る。好ましくは、ＦＧＦ２１−関連障害は、糖尿病、肥満、脂質異常症、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または心臓血管疾患であり得る。
【００７１】
さらに、医薬組成物は医薬担体をさらに含み得る。医薬担体は、患者に抗体を送達するために適当な非毒性物質であればあらゆる担体であり得る。例えば、蒸留水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性な固体が担体として含まれ得る。薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた医薬組成物に含まれ得る。これらの製剤において、デュアル機能タンパク質の濃度は大きく変化し得る。
【００７２】
具体的には、医薬組成物は、組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明性、色、等張性、香気、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着または透過性を変更、維持または保存するための製剤物質を含み得る。適当な製剤物質の例は、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、抗微生物剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール）、安定性向上剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、増殖(growth)向上剤（例えば、アルキル金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバントを含み得るがこれらに限定されない。
【００７３】
別の局面において、本願発明は、ＦＧＦ２１−関連障害を予防または処置するための方法であって、デュアル機能タンパク質をかかる予防または処置を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。この方法は、特に、有効量の本願発明のデュアル機能タンパク質をＦＧＦ２１−関連障害である糖尿病、肥満、脂質異常症、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎または心臓血管疾患の症状を有する哺乳動物に投与することを含む。
【００７４】
本願発明の医薬組成物は任意の経路を介して投与され得る。本願発明の組成物は、任意の適当な手段を介して直接的に（例えば、局所的に、注射、移植または局所投与により組織領域に投与することにより）または全身的に（例えば、経口または非経口投与により）動物に提供され得る。本願発明の組成物が静脈内、皮下、眼内、腹腔内、筋肉内、口腔、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、髄腔内、嚢内、関節包内、鼻腔内、またはエアロゾル投与を介して非経腸的に提供されるとき、組成物は、好ましくは水性であるか、または生理学的に適用できる体液懸濁液または溶液の一部を含み得る。したがって、担体またはビヒクルは、生理学的に適用可能であるため、組成物に加えられてもよく、患者に送達されてもよい。したがって、生理学的に適当な塩水は一般的に、製剤のための体液のような担体として含まれ得る。
【００７５】
さらに、投与頻度は、使用される製剤におけるデュアル機能タンパク質の薬物動態パラメータに依存して変化し得る。一般的に、所望の効果をなし遂げるための投与用量に達するまで、医師は組成物を投与するであろう。したがって、組成物は、単位用量として、時間間隔で少なくとも２つの用量として（同じ量の標的デュアル機能タンパク質を含んでも、含まなくてもよい）投与され得、または移植装置またはカテーテルを介して連続的な注射により投与され得る。適当な投与用量の追加の正確さは、当業者により日常的に行われ得、当業者により日常的に行われる業の範囲に対応する。
【００７６】
さらに、ヒトにおいてデュアル機能タンパク質の好ましい単位用量は、０．０１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、さらに好ましくは１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。これは最適な量であるが、単位用量は、処置される疾患または副作用の存在／非存在に依存して変化し得る。それにもかかわらず、最適な投与用量は、慣用の実験を実施することによって決定され得る。デュアル機能タンパク質の投与は、周期的ボーラス注射、外部リザーバー（例えば静脈内バッグ）、または内部供給源（例えば生体適合インプラント）からの連続的な静脈内、皮下または腹腔内投与により行われ得る。
【００７７】
加えて、本願発明のデュアル機能タンパク質は、他の生物学的に活性な分子と共に対象レシピエントに投与され得る。デュアル機能タンパク質および他の分子、投与形態、および最適な用量の最適な組合せは、当分野でよく知られている慣用の実験によって決定され得る。
【００７８】
さらに別の局面において、本願発明は、デュアル機能タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００７９】
本願明細書において使用される「単離された核酸分子」なる用語は、総核酸が供給源細胞から単離されるとき天然に見いだされる少なくとも約５０％のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質から単離される；天然に連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結される；または大型ポリヌクレオチド配列の一部であり、天然に生じない、本願発明の核酸分子を示す。好ましくは、本願発明の単離された核酸分子において、他の汚染核酸、または天然環境において見いだされ、ポリペプチドの生産、または処置、診断、予防または研究における核酸の使用を阻害する他の汚染物質は実質的に存在しない。
【００８０】
そのような場合、デュアル機能タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コドン重複のために互いに異なる配列を有し得る。さらに、単離された核酸がデュアル機能タンパク質を生産することができる限り、所望の目的によって、単離された核酸は適当に修飾され得る、またはヌクレオチドは単離された核酸のＮ−末端またはＣ−末端に加えられ得る。
【００８１】
単離された核酸は、例えば配列番号：７１から８０のいずれか１つによって示されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００８２】
さらに別の局面において、本願発明は、単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００８３】
本願明細書において使用される「発現ベクター」なる用語は、宿主細胞の形質転換のために適当であり、挿入される異種核酸配列の発現を指向またはコントロールする核酸配列を含むベクターを示す。発現ベクターは、直鎖核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、およびそれらのアナログを含む。ウイルスベクターの例は、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本願明細書において使用される「異種核酸配列の発現」または標的タンパク質の「発現」なる用語は、挿入されるＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物、抗体または抗体フラグメントの生産を示す。
【００８５】
有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）またはその変異体であり得る。有用な発現ベクターは、哺乳動物細胞において標的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、および転写後ＲＮＡ安定性のレベルを増強するためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含み得る。本願発明の典型的な態様において、発現ベクターは、ＲｃＣＭＶの修飾ベクターであるｐＡＤ１５である。
【００８６】
さらに別の局面において、本願発明は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００８７】
本願明細書において使用される「宿主細胞」なる用語は、組換え発現ベクターが導入され得る原核細胞または真核細胞を示す。本願明細書において使用される「形質転換」または「トランスフェクト」なる用語は、当分野で知られている種々の技術による細胞への核酸（例えばベクター）の導入を示す。
【００８８】
適当な宿主細胞は、本願発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトされ得、標的タンパク質の発現および／または分泌のために使用され得る。本願発明において使用され得る適当な宿主細胞の例は、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＡＰ細胞（ヒト羊水由来細胞）、およびＣＯＳ細胞を含む。
【００８９】
以下、本願発明の典型的な態様は例を基準にして詳細に記載される。しかしながら、本願発明の例は多数の様々な形態において修飾することができ、本願発明の範囲はここに記載の例に限定されるべきでない。
【００９０】
本願発明の様式
調製例１．ＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質の調製および精製
【００９１】
調製例１−１．ＦＧＦ２１変異体タンパク質の発現のための発現ベクターの調製
【００９２】
Ｆｃ−ＦＧＦ２１構造におけるＦＧＦ２１の安定性、活性および薬物動態学プロフィールを改善するために、ＦＧＦ２１の変異試験を行った。
【００９３】
具体的には、変異体タンパク質は、ＦＧＦ２１タンパク質の３次元構造分析に基づいてタンパク質活性に有意に作用することが予期された、ＬＬＬＥ領域（ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１でのアミノ酸）およびＧＰＳＱＧ領域（ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４でのアミノ酸）、およびＡ１８０部位について設計された。
【００９４】
ＦＧＦ２１タンパク質に導入される各変異の位置、配列情報、標的および予期される効果は以下の表１に列挙される（表１において、Ｎはグリコシル化アスパラギン（Ｎ）を示す）。さらに、表１に記載されている変異を含むＦＧＦ２１変異体タンパク質は以下の表２に列挙される。
【００９５】
【表１】
2019500013.tif 000003
【００９６】
【表２】
2019500013.tif 000004
【００９７】
発現ベクターを、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において３つの構成要素：融合担体、リンカーおよびＦＧＦ２１変異体のアミノ酸を発現するように調製した。各ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の物質コード、ＦＧＦ２１に導入される変異の配列、融合担体の配列およびリンカー配列は以下の表３に列挙される（表３において、Ｎはグリコシル化アスパラギン（Ｎ）を示す）。
【００９８】
【表３】
2019500013.tif 000005
【００９９】
ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を生産するために、ＦＧＦ２１変異体タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を、各タンパク質のアミノ酸配列に基づいてＢｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｒｅａ）と相談することによって合成した。ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素配列をＦＧＦ２１変異体タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に加え、タンパク質翻訳のための開始コドンおよび細胞の外側に発現されたタンパク質を分泌することができるリーダー配列（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＨＡ）を５’末端で制限酵素配列の次に挿入した。終止コドンを、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列の次に挿入した。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩの２つの制限酵素を使用することによってｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターにクローニングした。ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ−由来複製起点、ＳＶ４０−由来複製起点およびアンピシリン−耐性遺伝子を含む単純な構造を有するｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターを、ＣＥＶＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１００】
ＤＦＤ６（大腸菌）およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）の融合タンパク質の場合において、それぞれの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、大腸菌における発現のためのｐＥＴ３０ａ発現ベクターに挿入した。
【０１０１】
調製例１−２．ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡの構築
発現のために使用される大量のプラスミドＤＮＡを得るために、大腸菌を、調製例１−１において構築された発現ベクターのそれぞれで形質転換した。細胞壁が弱められた大腸菌細胞を熱ショックを介してそれぞれの発現ベクターで形質転換し、形質転換体をＬＢプレート上に置き、コロニーを得た。このように得られたコロニーをＬＢ培地に播種し、３７℃で１６時間培養し、それぞれの発現ベクターを含む各大腸菌培養物を１００ｍＬの容量において得た。このように得られた大腸菌を遠心分離して培養培地を除去し、次にＰ１、Ｐ２、Ｐ３溶液（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：１２９６３）を加え、細胞壁を破砕し、それによりタンパク質およびＤＮＡが分離されたＤＮＡ懸濁液を得た。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製カラムを使用することによって、このように得られたＤＮＡ懸濁液からプラスミドＤＮＡを精製した。溶出したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動を介して同定し、濃度および純度をナノドロップ(nanodrop)装置（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）を使用することによって測定した。このように得られたＤＮＡを発現のために使用した。
【０１０２】
調製例１−３．ＣＡＰ−Ｔ細胞における融合タンパク質の発現
ヒト細胞系を調製例１−２において得られた各プラスミドＤＮＡ型でトランスフェクトした。ＰＥＩ溶液（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．：１０１−１０Ｎ）を使用することによって、各プラスミドＤＮＡ型をＰＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養されたＣＡＰ−Ｔ細胞（ＣＥＶＥＣ）に形質導入した。ＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合溶液をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって細胞懸濁液と混合し、３７℃で５時間培養し、ＰＥＭ培地を加えた。３７℃で５−７日間培養後、培養物を遠心分離して細胞を除去し、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む上清を得た。
【０１０３】
調製例１−４．大腸菌におけるＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の発現および精製
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をＤＦＤ６（大腸菌）およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質を発現する各プラスミドＤＮＡで形質転換した。各融合タンパク質を発現する形質転換された大腸菌を２０ｍｌのＬＢ培地に播種し、震盪しながら３７℃で１５時間培養し、次に培養培地の一部を１００ｍｌのＬＢ培地に播種し、震盪しながら３７℃で１６時間培養した。培養完了したら、培養物を遠心分離して大腸菌ペレットを得て、次に細胞を高圧細胞破壊器を使用して破壊し、封入体を得た。
【０１０４】
得られた封入体を洗浄および溶離、次にタンパク質リフォールディング処理により精製した。具体的には、得られた封入体を０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファー溶液（ｐＨ８．０）で２−３回洗浄し、細菌タンパク質を取り出し、次に８Ｍ  ウレア、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む８Ｍ  ウレアバッファーに再懸濁した。８Ｍ  ウレアバッファー中のタンパク質が完全に変性されたため、タンパク質リフォールディング処理を以下のように行った。
【０１０５】
まず、８Ｍ  ウレアバッファーを２０ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ９．０）で徐々に希釈してウレアを除去し、２Ｍの濃度から、ＣｕＳＯ４を８０μＭの濃度に加え、安定なタンパク質フォールディングを誘導した。リフォールディング処理を完了したタンパク質をＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）に懸濁し、懸濁液を０．２２μｍフィルターで濾過し不純物を除去し、次にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷した。カラムを１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にタンパク質を１００ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ３．０）を使用して溶出し、ＤＦＤ６（大腸菌）融合タンパク質を調製した。
【０１０６】
ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質の場合、リフォールディング処理を完了したタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、懸濁液を０．２２μｍフィルターで濾過し不純物を除去し、次に陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）  ＨＱ  ５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に負荷した。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って投与し、ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質を溶出させた。陰イオン交換樹脂によって得られたＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質を１Ｍの濃度に硫酸アンモニウムと混合し、次に疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（Ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。具体的には、カラムを１Ｍ  硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って投与し、溶出された画分を１０％  Ｔｒｉｓ−グリシンゲル電気泳動を介して分析した。ゲルを穏やかに振盪しながらクマシーブリリアントブルーＲで染色し、高純度でＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む画分を回収し、次に最終バッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を使用して４℃で一晩透析した。透析完了したら、４℃で３０，０００ＭＷカットオフ遠心分離フィルターを使用することによって、得られたタンパク質貯蔵溶液を３，０００ｒｐｍで濃縮した。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の濃度をＢＣＡ定量分析を介して測定した。
【０１０７】
調製例１−５．ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で平衡化した。調製例１−３において得られた各ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む培養上清を０．２μｍフィルターで濾過し、次にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷した。カラムを１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にタンパク質を１００ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ３．０）を使用して溶出した。アフィニティークロマトグラフィーによって得られた融合タンパク質を陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）  ＨＱ  ５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製した。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質がカラムから溶出される前に、陰イオン交換樹脂カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）で平衡化した。具体的には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って分配し、溶出された画分を分析した。各溶出した画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用して分析し、高純度でＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む画分を回収した。調製例１−４に記載されている方法にしたがって、濃度および定量分析を行った。
【０１０８】
実験例１．融合タンパク質のインビトロ活性
実験例１−１．タンパク質活性に対するＦＧＦ２１変異の効果
調製例１において調製された融合タンパク質ＤＦＤ４、ＤＦＤ５、ＤＦＤ６、ＤＦＤ６（大腸菌）、ＤＦＤ７、ＤＦＤ９、ＤＦＤ１３、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７３およびＤＦＤ７４のインビトロ活性を測定した。
【０１０９】
具体的には、融合タンパク質のインビトロＦＧＦ２１活性を、ＦＧＦ２１の共受容体であるヒトβ−クロトーを過剰発現するように修飾されたＨＥＫ２９３細胞系（Ｙｕｈａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を使用して評価した。活性の評価のために、調製例１−４および１−５において調製された融合タンパク質を含む濃縮物を３μＭの濃度で３倍連続希釈に付した。血清欠乏状態において５時間培養された後に、ヒトβ−クロトーを過剰発現する細胞系を希釈された融合タンパク質で２０分間処理し、次に室温で３０分間６０ｒｐｍで撹拌しながら細胞溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ／Ｃａｔ＃  ６４ＥＲＫＰＥＧ）を加えることによって溶解した。細胞溶解物溶液を細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびリン酸化ＥＲＫを検出することができる抗体（Ｃｉｓｂｉｏ／Ｃａｔ＃  ６４ＥＲＫＰＥＧ）と混合し、混合物を室温で２時間維持した。蛍光を蛍光検出器（ＴＥＣＡＮ／ＧＥＮｉｏｓＰｒｏ）を使用して検出した。融合タンパク質の活性を、ＥＣ５０値を比較することによって測定した。
【０１１０】
図１Ａから１Ｃに示されるとおり、変異配列を野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入することによって調製された融合タンパク質のインビトロ活性が阻害されず、各融合タンパク質の活性が互いに同様であることを確認した。大腸菌において発現されたＤＦＤ６（大腸菌）サンプルおよび動物細胞において発現されたＤＦＤ６サンプルを介して、Ｎ−グリコシル化変異を野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入することによって調製された融合タンパク質のインビトロ活性が阻害されなかったことも確認した。
【０１１１】
実験例１−２．タンパク質活性に対するリンカー配列の効果
調製例１において調製された融合タンパク質ＤＦＤ１、ＤＦＤ３、ＤＦＤ４およびＤＦＤ１３のインビトロ活性を測定した。
【０１１２】
具体的には、融合タンパク質のＦＧＦ２１活性を、実験例１−１に記載されている方法にしたがって調製例１−５において調製された融合タンパク質を含む濃縮物を使用することによって測定した。結果は図２Ａおよび２Ｂに示される。
【０１１３】
わずかな違いが図２Ａおよび２Ｂに示されるとおりリンカー配列に依存して活性において示されたが、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質が活性において有意な減少を示さなかったことを確認した。
【０１１４】
実験例１−３．ＤＦＤ１、ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）およびＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）についての実験結果
調製例１において調製された融合タンパク質ＤＦＤ１およびコントロールタンパク質ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）およびＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）のインビトロ活性を測定した。
【０１１５】
具体的には、融合タンパク質のＦＧＦ２１活性を、実験例１−１に記載されている方法にしたがって、調製例１−５において調製された融合タンパク質およびコントロールタンパク質を含む濃縮物を使用することによって測定した。結果は図３に示される。
【０１１６】
図３に示されるとおり、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）は他のタンパク質よりも２倍高いインビトロ活性を有したが、ＤＦＤ１およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）は同様のインビトロ活性を有したことを確認した。
【０１１７】
実験例２．融合タンパク質の安定性の評価
実験例２−１．安定性を評価するための実験方法
サンプル調製の初期段階でタンパク質凝集体の量を測定するために、高分子量凝集体（％ＨＭＷ）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）方法を使用して定量した。結果は図４に示される。
【０１１８】
具体的には、ＴｏｓｏＨａａｓモデルＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムをＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法のために使用した。カラムを、１ｍＬ／分の流速でバッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を流すことによって平衡化した。調製例１−５において調製されたＤＦＤ４およびＤＦＤ１３タンパク質貯蔵溶液を、４℃で３０，０００ＭＷカットオフ遠心分離フィルターを使用して３，０００ｒｐｍで２０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の標的濃度に濃縮した。ＢＣＡ定量分析によるそれぞれのサンプルの濃度の測定後、サンプルを２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にバッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で希釈した。ＤＦＤ４およびＤＦＤ１３の最初の％ＨＭＷを測定するために、２０ｍｇ／ｍＬのサンプルを１ｍｇ／ｍＬの最終濃度にバッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で希釈し、１００μＬの容量におけるそれぞれのサンプルをＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムにより分析した。
【０１１９】
それぞれのサンプルの安定性評価について、サンプルの％ＨＭＷを、２週間５℃、２５℃および３７℃で保存しながら４日目、８日目および１４日目にＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法を使用して測定した。
【０１２０】
図４に示されるとおり、ＤＦＤ１３がＤＦＤ４と比較して初期段階および最大２週の時点で高分子量凝集体（ＨＭＷ％）のより少ない量を有したことを確認し、ＥＩＲＰ変異の導入がＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の安定性を改善し、それによりＨＭＷ％を有意に低下させることを示した。
【０１２１】
実験例２−２．安定性結果
ＦＧＦ２１の元の配列ＬＬＬＥ（９８−１０１）に導入されたＥＩＲＰ変異の安定性に対する効果を調査するために、ＤＦＤ４（配列番号：２９）およびＤＦＤ１３（配列番号：３５）の安定性を実験例２−１に記載されている方法にしたがって測定した。ＤＦＤ４およびＤＦＤ１３のゼロ時サンプル（初期段階；０日）および４、８および１４日保存サンプルに対する分析結果は、以下の表４において要約されている（表４において、Ｎ．Ｄ．は「検出されない」を意味する）。
【０１２２】
【表４】
2019500013.tif 000006
【０１２３】
表４に示されるとおり、初期段階（０日）での％ＨＭＷの量はＤＦＤ４に対して０．９１％およびＤＦＤ１３に対して０．５６％であった。２週間後、２５℃での保存条件下で、％ＨＭＷの量はＤＦＤ４に対して８．８３％に増加したが、ＤＦＤ１３において観察されなかった。ＤＦＤ１３がＤＦＤ４と比較して初期段階および２週でより小さい％ＨＭＷ率を有することが示され、これはＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の％ＨＭＷ率がＥＩＲＰ変異の導入によって有意に減少したことを示した。
【０１２４】
実験例３．融合タンパク質の薬物動態学評価
実験例３−１．薬物動態学評価のための実験方法
Ｏｒｉｅｎｔ  ＢＩＯ（Ｋｏｒｅａ）から購入された６週齢オスＩＣＲマウスを薬物処置の１日前に体重に対して同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝３／血液サンプリング時）に区分化し、１ｍｇ／ｋｇ（ＲＧＥに対して２ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれのサンプルで１回皮下に投与した。次に、血液サンプルをそれぞれ、注射後１、４、８、１２、２４、４８、７２および９６時に回収した。血液中の無傷な全長ＦＧＦ２１タンパク質の濃度を、ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端への免疫反応を有するＩｎｔａｃｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ２１  ＥＬＩＳＡキット（Ｆ１２３１−Ｋ０１、Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して測定した。マウスへの各融合タンパク質の皮下注射後９６時間までに回収された血液中のサンプルの濃度を測定し、それぞれのサンプルの薬物動態パラメータを計算した。
【０１２５】
実験例３−２．薬物動態学活性の評価
マウスにおける融合タンパク質の皮下投与後の血液中の各タンパク質の濃度  対  時間を示すグラフに基づいて（図５）、薬物動態パラメータを計算した。データは以下の表５に示される。
【０１２６】
【表５】
2019500013.tif 000007
【０１２７】
各融合タンパク質の薬物動態学プロフィールは、薬物暴露の程度を示す曲線下面積（ＡＵＣ）の値に基づいて比較および評価した。
【０１２８】
表５に示されるとおり、ＤＦＤ４とＤＦＤ１３とを、およびＤＦＤ６とＤＦＤ７３とを比較すると、ＥＩＲＰ配列の導入がＡＵＣ値において約１０から２０％増加を引き起こしたことを決定した。ＤＦＤ９とＤＦＤ４とを比較すると、ＴＧＬＥＡＶの導入はＡＵＣ値において約６倍の増加を引き起こした。
【０１２９】
さらに、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異を、インビボでタンパク質分解されることが知られているＦＧＦ２１のＣ−末端にＮ−グリコシル化を導入することによって半減期を延長させるように設計する。Ｎ−グリコシル化の導入によるＡＵＣの増加を、変異体と各コントロール物質とを比較することによって確認した。Ｎ−グリコシル化の導入によるＡＵＣにおける改善の効果を確認するために、グリコシル化を有さない大腸菌によって生産されるＤＦＤ６（大腸菌）に対するＡＵＣ値を、ヒト細胞系によって生産されるＤＦＤ６と比較した。ヒト細胞系によって生産されるＤＦＤ６は、大腸菌によって生産されるＤＦＤ６（大腸菌）と比較してＡＵＣ値において３倍またはそれ以上の増加を示し、これはグリコシル化による薬物動態学プロフィールの改善を証明した。
【０１３０】
Ａ１８０Ｅは、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃによって所有されるＷＯ  ２００９／１４９１７１に記載されている変異である。Ａ１８０Ｅの変異がＴＧＬＥＡＶまたはＧ１７０Ｎのそれぞれの変異を含む変異体ＤＦＤ１３またはＤＦＤ７３にさらに導入されたとき、得られる変異体ＤＦＤ１８またはＤＦＤ７４のそれぞれが、ＡＵＣ値において約２から３倍のさらなる増加を示した。
【０１３１】
要約すれば、薬物動態パラメータが、野生型ＦＧＦ２１融合タンパク質であるＤＦＤ９と比較して、種々の変異およびそれらの組合せの導入によって改善されたことを確認した。最も改善されたＡＵＣ値を示す融合タンパク質はＥＩＲＰ、Ｇ１７０ＮおよびＡ１８０Ｅの変異を含むＤＦＤ７４であり、これはＤＦＤ９と比較してＡＵＣ値において約４５倍の改善を示した。さらに、２ｍｇ／ｋｇ体重の用量でのＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）を考慮して、ＤＦＤ７４はＲＧＥと比較して薬物暴露のより高い程度を有し得る。変異による薬物動態学における改善の総括的な効果は、以下の表６において要約される。
【０１３２】
【表６】
2019500013.tif 000008
【０１３３】
実験例４．ｏｂ／ｏｂマウスにおける融合タンパク質の活性評価
実験例４−１．ｏｂ／ｏｂマウスにおける活性を評価するための実験方法
レプチンの遺伝的欠乏によって高血糖、インスリン抵抗性、過食、脂肪肝および肥満を示すと特徴付けられたｏｂ／ｏｂマウスは、２型糖尿病の試験のために広範に使用される。オスｏｂ／ｏｂマウス（Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）をＲａｏｎｂｉｏ（Ｋｏｒｅａ）から購入した。これらのマウスは到着時に５から６週齢、および適応の３週間後に薬物処置時に８から９週齢であった。マウスを、薬物処置の１日前（０日目）に体重および尾部の血糖レベルに対して同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝８／グループ）に区分化し、サンプルをこれらのそれぞれの用量のそれぞれにしたがって１回皮下に投与した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）をビヒクル処置として投与し、血中のグルコース濃度をグルコースメーターＧｌｕｃｏＤｒ（Ａｌｌ  Ｍｅｄｉｃｕｓ、Ｋｏｒｅａ）を使用して測定した。非空腹時グルコースレベルおよび体重を、投与後１４日目まで毎日測定した。糖化ヘモグロビンレベルもまた、投与前および試験後に各グループにおいて測定した。糖化ヘモグロビンレベルを、ＤＣＡ  ２０００  ＨｂＡ１ｃキット（Ｓｉｅｍｅｎｓ、５０３５Ｃ）を使用して計算した。
【０１３４】
実験例４−２．ｏｂ／ｏｂマウスにおける活性の評価
オスｏｂ／ｏｂマウスにおける非空腹時血糖レベルおよび体重の変化を、３０または１００ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１８およびＤＦＤ７２、または１０、３０または１００ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ７４の単一の皮下注射後に観察した。
【０１３５】
ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４の全てが用量依存的に血糖レベルを低下させる効果を有したことを確認した。１００ｎｍｏｌ／ｋｇの高用量で３つの薬剤を比較すると、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４は、ＤＦＤ１８よりも血糖レベルを低下させる改善された効果を示した（図６）。加えて、試験においてコントロール物質として使用されたＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）は、同じ用量レベル（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）でのＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４と比較して、血糖レベルを低下させることにおいてあまり有効でなかった。
【０１３６】
体重低下の効果について、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの高用量で３つの薬剤を比較すると、ＤＦＤ７２が、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて最も有効であり、体重において約６％の低下を引き起こし、ＤＦＤ１８が、次に有効であり、ＤＦＤ７４が続いた（図７）。
【０１３７】
試験終了後、血糖の平均値を示す糖化ヘモグロビンレベルを測定し、平均血糖の変化を各試験グループにおいて分析した。コントロールタンパク質Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）で処置されたコントロールグループを除いて処置グループの全てが投与前および試験後間の違いにおいて負の値を示し、これは血糖を低下させることにおいてコントロール物質と比較して試験タンパク質の有効性を確認した（図８）。
【０１３８】
実験例５．ＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおいて融合タンパク質の活性評価
実験例５−１．ＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおいて活性を評価するための実験方法
血糖および体重を低下させるＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の効果を、別の糖尿病モデルであるＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルと比較し、評価した。（８週間またはそれ以上６０ｋｃａｌ％の高脂肪食をＣ５７ＢＬ／６マウスに与えることによって誘導される）慣用の食餌誘導性肥満マウスモデルは、インスリン抵抗性を引き起こすが、弱い高血糖性および糖尿病特徴を有する。慣用の食餌誘導性肥満マウスモデルにおける欠点を補い得るＨＦＤ／ＳＴＺマウスは、膵臓において機能障害のβ細胞を生産することができ、高脂肪食（ＨＦＤ）および低レベルのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与の結果としてインスリン分泌を減少させ、したがって２型糖尿病の薬理学的試験のために有用である。
【０１３９】
具体的には、ＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルを誘導するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ）に４週間６０ｋｃａｌ％の高脂肪食を与え、次に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ、８５８８２）を３日間毎日腹腔内に投与し、膵臓のβ細胞において機能障害を誘導した。さらなる２週間高脂肪食を与えた後、２００ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上の非空腹時血糖レベルを有するマウスを試験のために使用した。マウスを、薬物処置の１日前（０日目）に体重および尾部の血糖レベルの同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝６／グループ）に区分化し、サンプルをこれらのそれぞれの用量のそれぞれにしたがって１回皮下に投与した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）をビヒクル処置として投与し、血中のグルコース濃度をグルコースメーターＧｌｕｃｏＤｒ（Ａｌｌ  Ｍｅｄｉｃｕｓ、Ｋｏｒｅａ）を使用して測定した。非空腹時グルコースレベルおよび体重を、投与後１４日目まで毎日測定した。糖化ヘモグロビンレベルもまた、投与前および試験後に各グループにおいて測定した。糖化ヘモグロビンレベルを、ＤＣＡ  ２０００  ＨｂＡ１ｃキット（Ｓｉｅｍｅｎｓ、５０３５Ｃ）を使用して計算した。
【０１４０】
実験例５−２．ＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおける活性の評価
オスＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおける非空腹時血糖レベルおよび体重の変化を、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ７２またはＤＦＤ７４の単一の皮下注射後に観察した。
【０１４１】
非空腹時血糖レベルの変化について、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４が血糖レベルを低下させる同様の効果を有し、血糖低下効果を投与後１０日目まで維持し、次に１０日後に薬剤の代謝で失ったことを確認した（図９）。ＤＦＤ７２は、投与の１０日後の非空腹時血糖レベルの変化に関して、ＤＦＤ７４よりもより長期な効果を示した。
【０１４２】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質の投与による体重低下の効果に関して、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４の両方は体重を約５％低下させる同様の効果を有し、効果は投与の１０日後に消失したことを確認した（図１０）。
【０１４３】
試験終了後、血糖の平均値を示す糖化ヘモグロビンレベルを測定し、平均血糖の変化を各試験グループにおいて分析した。ビヒクルグループは糖化ヘモグロビンレベルにおいて０．２５の増加を有したが、ＤＦＤ７４で処置されたグループは０．１の増加を有し、ＤＦＤ７２で処置されたグループは０．２７の減少を有した（図１１）。
【０１４４】
実験例６．食餌性肥満マウスにおける融合タンパク質の活性
実験例６−１．食餌性肥満マウスにおける活性を評価するための実験方法
ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質であるＤＦＤ１８の体重低下効果を食餌性肥満マウスにおいて評価した。食餌性肥満モデルについて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスはＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．から購入され、６０ｋｃａｌ％脂肪を含む高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ）を８から１２週間与えた。マウスを、薬物処置の１日前（０日目）に体重の同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝８／グループ）に区分化し、次に３０ｎｍｏｌ／ｋｇのサンプルを１回皮下に投与した。体重の変化をビヒクル（ＰＢＳ）で処置されるグループと比較した。
【０１４５】
実験例６−２．食餌性肥満マウスにおけるタンパク質活性
３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１８の単一の投与後の食餌性肥満マウスモデルにおける時間とともにの体重の変化について、体重低下効果が投与後１０日目まで続き、最大体重低下（約１８％）が投与後１１日目であり、これは１４日目まで維持されたことを確認した（図１２）。
【０１４６】
調製例２．デュアル機能タンパク質の調製および精製
調製例２−１．デュアル機能タンパク質の発現のための発現ベクターの調製
インビトロ活性、薬物動態学プロフィールおよび薬理学的有効性に対するＧＬＰ−１変異体タンパク質の配列およびそれに融合されたＦｃヒンジの配列の効果を同定するために、Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体タンパク質についての様々な配列を設計した。ＧＬＰ−１変異体タンパク質の配列は以下の表７に列挙され、Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体の配列は表８に列挙される。
【０１４７】
【表７】
2019500013.tif 000009
【０１４８】
【表８】
2019500013.tif 000010
【０１４９】
表８において、ＨｙＦｃ５は配列番号：４７を示し、ＨｙＦｃ４０は配列番号：４８を示す。
【０１５０】
インビトロ活性、薬物動態学プロフィールおよび薬理学的有効性に対するＧＬＰ−１変異体タンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質の配列、ＧＬＰ−１変異体に融合されるＦｃヒンジの配列、ＦＧＦ２１変異体タンパク質およびＦｃ間に連結されるリンカーの配列の効果を調査するために、デュアル機能タンパク質について様々な配列を設計した。ＧＬＰ−１変異体タンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質の配列は以下の表９に列挙される。各デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域、リンカーおよびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む。
【０１５１】
【表９】
2019500013.tif 000011
【０１５２】
具体的には、デュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を、各タンパク質のアミノ酸配列に基づいてＢｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｒｅａ）と相談した後に合成した。ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素配列をデュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に加え、タンパク質翻訳のための開始コドンおよび細胞の外側に発現されたタンパク質を分泌することができるリーダー配列（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＨＡ）を５’末端で制限酵素配列の次に挿入した。終止コドンを、デュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列の次に挿入した。デュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩの２つの制限酵素を使用することによってｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターにクローニングした。ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ−由来複製起点、ＳＶ４０−由来複製起点およびアンピシリン−耐性遺伝子を含む単純な構造を有するｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターを、ＣＥＶＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１５３】
調製例２−２．Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体およびデュアル機能タンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡの構築
発現のために使用される大量のプラスミドＤＮＡを得るために、大腸菌を、調製例２−１において構築された発現ベクターのそれぞれで形質転換した。熱ショックを介して弱められた細胞壁を有する大腸菌細胞をそれぞれの発現ベクターで形質転換し、形質転換体をＬＢプレート上に置き、コロニーを得た。このように得られたコロニーをＬＢ培地に播種し、３７℃で１６時間培養し、それぞれの発現ベクターを含む各大腸菌培養物を１００ｍＬの容量において得た。このように得られた大腸菌を遠心分離して培養培地を除去し、次にＰ１、Ｐ２、Ｐ３溶液（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：１２９６３）を加え、細胞壁を破砕し、それによりタンパク質およびＤＮＡが分離されたＤＮＡ懸濁液を得た。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製カラムを使用することによって、このように得られたＤＮＡ懸濁液からプラスミドＤＮＡを精製した。溶出したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって同定し、濃度および純度をナノドロップ(nanodrop)装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）を使用して測定した。このように得られたＤＮＡを発現のために使用した。
【０１５４】
調製例２−３．ＣＡＰ−Ｔ細胞におけるＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体およびデュアル機能タンパク質の発現
ヒト細胞系を調製例２−２において得られた各プラスミドＤＮＡで形質転換した。ＰＥＩ溶液（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．：１０１−１０Ｎ）を使用することによって、各プラスミドＤＮＡ型をＰＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養されたＣＡＰ−Ｔ細胞（ＣＥＶＥＣ）に形質導入した。ＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合溶液をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞懸濁液と混合し、３７℃で５時間培養し、ＰＥＭ培地を加えた。３７℃で５−７日間培養後、培養物を遠心分離して細胞を除去し、各タンパク質を含む上清を得た。
【０１５５】
調製例２−４．Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体およびデュアル機能タンパク質の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で平衡化した。調製例２−３において得られたＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体およびデュアル機能タンパク質のそれぞれを含む培養上清を０．２μｍフィルターで濾過し、次にＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷した。カラムを１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にタンパク質を１００ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ３．０）を使用して溶出した。アフィニティークロマトグラフィーによって得られたタンパク質を陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）  ＨＱ  ５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製した。アフィニティークロマトグラフィーから溶出したタンパク質が負荷される前に、陰イオン交換樹脂カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）で平衡化した。
【０１５６】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って分配し、溶出された画分を分析した。各溶出した画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用することによって分析し、高純度でＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体およびデュアル機能タンパク質を含む画分を回収し、最終バッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を使用して４℃で一晩透析した。透析完了したら、４℃で３０，０００ＭＷカットオフ遠心分離フィルターを使用して、得られたタンパク質貯蔵溶液を３，０００ｒｐｍで濃縮した。各タンパク質の濃度をＢＣＡ定量分析を介して測定した。
【０１５７】
実験例７．デュアル機能タンパク質のインビトロ活性
実験例７−１．ＤＦＤ２３、ＤＦＤ２４、ＤＦＤ２５、ＤＦＤ２６、ＤＦＤ２７、ＤＦＤ２８およびＤＦＤ２９の活性
デュアル機能タンパク質ＤＦＤ２３、ＤＦＤ２４、ＤＦＤ２５、ＤＦＤ２６、ＤＦＤ２７、ＤＦＤ２８およびＤＦＤ２９のインビトロＧＬＰ−１活性を測定した。具体的には、ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、ＨＴＳ１６３Ｃ２）を購入し、デュアル機能タンパク質のＧＬＰ−１活性を評価するために使用した。活性の評価のために、融合タンパク質を含むサンプル（調製例２−４において調製されたタンパク質貯蔵溶液；以下「サンプル」）を２５ｎＭの濃度で４倍連続希釈に付した。ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系を３０分間処理した後、生産された細胞内ｃＡＭＰを測定した（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＡＭ４ＰＥＢ）。各タンパク質の活性を、ＥＣ５０値を比較することによって測定した。
【０１５８】
図１３に示されるとおり、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列を含むデュアル機能タンパク質は、他のＧＬＰ−１変異体配列を含むデュアル機能タンパク質よりも約２〜３倍低い活性を示した。ＧＬＰ−１活性において有意な差異は、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列を除いて変異配列を含むデュアル機能タンパク質間で観察されなかった。
【０１５９】
実験例７−２．ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４の活性
調製例２において調製されたデュアル機能タンパク質ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４およびＤＦＤ５９（Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体）のインビトロＧＬＰ−１活性を測定した。具体的には、ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、ＨＴＳ１６３Ｃ２）を購入し、デュアル機能タンパク質のＧＬＰ−１活性を評価するために使用した。活性の評価のために、融合タンパク質のそれぞれを含むサンプルを２５ｎＭの濃度で４倍連続希釈に付した。ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系を３０分間処理した後、生産された細胞内ｃＡＭＰを測定した（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＡＭ４ＰＥＢ）。
【０１６０】
図１４に示されるとおり、各タンパク質の活性を、ＥＣ５０値を比較することによって評価した。３つのデュアル機能タンパク質は同様のＥＣ５０値を示し、（ＦＧＦ２１変異体を含まない）ＤＦＤ５９はデュアル機能タンパク質よりも約２倍高い活性を示した。
【０１６１】
次に、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４におけるＦＧＦ２１部分のインビトロ活性を測定した。具体的には、デュアル機能タンパク質におけるＦＧＦ２１部分のインビトロ活性を、ヒトβ−クロトー（ＦＧＦ２１の共受容体）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞系を使用して評価した。活性の評価のために、デュアル機能タンパク質のそれぞれを含むサンプルを３μＭの濃度で３倍連続希釈に付した。血清欠乏状態において５時間培養された後に、ヒトβ−クロトーを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞系を２０分間処理し、室温で３０分間６０ｒｐｍで撹拌しながら細胞溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ／Ｃａｔ＃  ６４ＥＲＫＰＥＧ）を加えることによって細胞を溶解した。細胞溶解物溶液をＥＲＫおよびリン酸化ＥＲＫを検出することができる抗体と混合し、混合物を室温で２時間維持した。蛍光を蛍光検出器（ＴＥＣＡＮ／ＧＥＮｉｏｓＰｒｏ）を使用して検出した。活性を、ＥＣ５０値を比較することによって測定した。
【０１６２】
デュアル機能タンパク質ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１部分のインビトロ活性が図１４に示されるとおり同様であったことを確認した。
【０１６３】
実験例８．デュアル機能タンパク質の薬物動態学評価
実験例８−１．薬物動態学評価のための実験方法
Ｏｒｉｅｎｔ  ＢＩＯ（Ｋｏｒｅａ）から購入された６週齢オスＩＣＲマウスを薬物処置の１日前に体重の同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝３／血液サンプリング時）に区分化し、１ｍｇ／ｋｇの容量でそれぞれのサンプルで１回皮下に投与した。血液サンプルをそれぞれ、注射後１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１４４、１９２および２４０時に回収した。血液中の各デュアル機能タンパク質の濃度を、ＦＧＦ２１部分およびＧＬＰ−１−Ｆｃ部分に基づいて、別々に測定した。血液中のデュアル機能タンパク質の無傷な全長ＦＧＦ２１部分の濃度を、ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端への免疫反応を有するＩｎｔａｃｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ２１  ＥＬＩＳＡキット（Ｆ１２３１−Ｋ０１、Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して測定した。さらに、血液中のデュアル機能タンパク質の活性なＧＬＰ−１−Ｆｃ部分の濃度を、ＥＬＩＳＡ分析を介して決定されるとき、ＧＬＰ−１およびＦｃのＮ−末端への免疫反応を有する抗体を使用して測定した。マウスへの各タンパク質の単一の皮下注射後２４０時間までに回収された血液サンプル中の各タンパク質のＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１−Ｆｃ部分の濃度を測定し、各タンパク質の薬物動態パラメータを計算した。
【０１６４】
実験例８−２．薬物動態学活性結果
マウスにおける各タンパク質の単回皮下投与後の時間とともにの血液中の各活性な物質の濃度に基づいて（図１５）、デュアル機能タンパク質のＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１−Ｆｃ部分に対する薬物動態パラメータを計算した。データは以下の表１０に示される。
【０１６５】
【表１０】
2019500013.tif 000012
【０１６６】
各デュアル機能タンパク質の薬物動態学プロフィールは、薬物暴露の程度を示す曲線下面積（ＡＵＣ）の値に基づいて比較および評価した。
【０１６７】
表１０に示されるとおり、ＦＧＦ２１部分の薬物動態パラメータについて、ＤＦＤ１１４は薬物暴露（ＡＵＣ）および半減期の最も高い程度を示したが、ＤＦＤ１１２は次に高いＡＵＣ値を示し、ＤＦＤ６９が続いた。ＤＦＤ１１４は、ＤＦＤ６９と比較してＡＵＣ値において約２倍またはそれ以上の増加を示した。ＧＬＰ−１−Ｆｃ部分の薬物動態学について、同じＧＬＰ−１変異体配列を含む４つのタンパク質（ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４）は同様のＡＵＣ値を示した。
【０１６８】
実験例９．ｄｂ／ｄｂマウスにおける活性評価
実験例９−１．ｄｂ／ｄｂマウスにおける活性を評価するための方法
レプチン受容体の遺伝的欠乏によって高血糖、インスリン抵抗性、過食、脂肪肝および肥満を有し、ｏｂ／ｏｂマウスよりもより深刻な高血糖および肥満を示すと特徴付けられたｄｂ／ｄｂマウスは、２型糖尿病の試験のために広範に使用される。オスｄｂ／ｄｂマウス（Ｈａｒｌａｎ、ＵＳＡ）をＲａｏｎｂｉｏ（Ｋｏｒｅａ）から購入した。これらのマウスは到着時に５から６週齢、および適応の３週間後に薬物処置時に８から９週齢であった。マウスを、薬物処置の１日前（０日目）に体重および尾部の血糖レベルの同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝６／グループ）に区分化し、サンプルをこれらのそれぞれの用量のそれぞれにしたがって１回皮下に投与した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）をビヒクル処置として投与し、血中のグルコース濃度をグルコースメーターＧｌｕｃｏＤｒ（Ａｌｌ  Ｍｅｄｉｃｕｓ、Ｋｏｒｅａ）を使用して測定した。非空腹時グルコースレベルおよび体重を、投与後１４日目まで毎日測定した。糖化ヘモグロビンレベルもまた、投与前および試験後に各グループにおいて測定した。糖化ヘモグロビンレベルを、ＤＣＡ  ２０００  ＨｂＡ１ｃキット（Ｓｉｅｍｅｎｓ、５０３５Ｃ）を使用して計算した。
【０１６９】
実験例９−２．ｄｂ／ｄｂマウスにおける活性の評価
オスｄｂ／ｄｂマウスにおける非空腹時血糖レベルおよび体重の変化を、デュアル機能タンパク質ＤＦＤ１１４の効果をＦｃ−ＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１−Ｆｃ単一機能タンパク質の組合せ投与と比較するために、１０または３０ｎｍｏｌ／ｋｇのデュアル機能タンパク質ＤＦＤ１１４の単一の皮下注射、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの長時間作用型ＧＬＰ−１−Ｆｃ単一機能タンパク質ＤＦＤ５９の単一の皮下注射、および３０ｎｍｏｌ／ｋｇの（それぞれＧＬＰ−１−ＦｃおよびＦｃ−ＦＧＦ２１単一機能タンパク質である）ＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せ投与後に観察した。
【０１７０】
長時間作用型ＧＬＰ−１−Ｆｃタンパク質ＤＦＤ５９は投与後１日目まで血糖レベルにおける鋭い低下を引き起こしたが、血糖の低下は２日後に減少し、血糖レベルは４日後のビヒクル−処置グループと同様であった。その一方で、ＤＦＤ１１４で処置されるグループは投与後３日目まで血糖低下について優れた効果を示し、血糖レベルを低下させる効果は３０ｎｍｏｌ／ｋｇよりも１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量での投与から４日後により迅速に消失され、血糖低下効果の期間において用量依存的差異を示した。各タンパク質の組合せ投与で処置されるグループは、他のグループと比較して血糖レベルを低下させることに対して最も持続した効果を示し、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の組合せが血糖レベルをコントロールすることについて優れた効果を有したことを示した（図１６）。
【０１７１】
体重低下の効果に関して、ＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せで処置されるグループは体重の低下について最も良い効果を示し、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１４で処置されるグループはまた体重の低下について顕著な効果を示した（図１７）。
【０１７２】
試験終了後、血糖の平均値を示す糖化ヘモグロビンレベルを測定し、平均血糖の変化を各試験グループにおいて分析した。図１８に示されるとおり、ビヒクルで処置されるグループは投与前のグループと比較して試験終了後に糖化ヘモグロビンレベルの増加を示し、ＤＦＤ５９で処置されるグループは同様の増加を示した。３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１４で処置されるグループは糖化ヘモグロビンレベルにおいて最も良い減少を示し、組合せ投与を受けるグループは次に高い有効性を示し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１４で処置されるグループが続いた。各処置されるグループにおいて糖化ヘモグロビンレベルにおける減少に基づいて比較することによってタンパク質を評価するとき、デュアル機能タンパク質ＤＦＤ１１４がＧＬＰ−１−ＦｃまたはＦｃ−ＦＧＦ２１単一機能タンパク質単独よりも血糖レベルを低下させることについてより強い効果を示したことを確認した。
【０１７３】
実験例１０．ＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおける融合タンパク質の活性
実験例１０−１．ＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおける活性を評価するための実験方法
血糖および体重を低下させることについてデュアル機能タンパク質の効果を、別の糖尿病モデルであるＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルにおいて比較および評価した。
【０１７４】
（８週間またはそれ以上６０ｋｃａｌ％の高脂肪食をＣ５７ＢＬ／６マウスに与えることによって誘導される）慣用の食餌誘導性肥満マウスモデルは、インスリン抵抗性を引き起こすが、弱い高血糖性および糖尿病特徴を有する。慣用の食餌誘導性肥満マウスモデルの欠点を補い得るＨＦＤ／ＳＴＺマウスは、膵臓の機能障害のβ細胞を生産することができ、高脂肪食（ＨＦＤ）および低レベルのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与の後のインスリン分泌を減少させ、２型糖尿病の薬理学的試験のために使用される。ＨＦＤ／ＳＴＺマウスモデルを誘導するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに４週間６０ｋｃａｌ％の高脂肪食を与え、次に５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ、８５８８２）を３日間毎日腹腔内に投与し、膵臓のβ細胞の機能障害を誘導した。さらなる２週間高脂肪食を与えた後、２００ｍｇ／ｄＬまたはそれ以上の非空腹時血糖レベルを有するマウスを試験のために選択した。マウスを、薬物処置の１日前（０日目）に体重および尾部の血糖レベルの同様の平均値を有するためにグループ（ｎ＝６／グループ）に区分化し、サンプルをこれらのそれぞれの用量のそれぞれにしたがって１回皮下に投与した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）をビヒクル処置として投与し、血中のグルコース濃度をグルコースメーターＧｌｕｃｏＤｒ（Ａｌｌ  Ｍｅｄｉｃｕｓ、Ｋｏｒｅａ）を使用して測定した。非空腹時グルコースレベルおよび体重を、投与後１４日目まで毎日測定した。糖化ヘモグロビンレベルもまた、投与前および試験後に各グループにおいて測定した。糖化ヘモグロビンレベルを、ＤＣＡ  ２０００  ＨｂＡ１ｃキット（Ｓｉｅｍｅｎｓ、５０３５Ｃ）を使用して計算した。
【０１７５】
実験例１０−２．ＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおける活性
オスＨＦＤ／ＳＴＺマウスにおける時間とともにの非空腹時血糖レベルおよび体重の変化を、３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１０ｎｍｏｌ／ｋｇのデュアル機能タンパク質ＤＦＤ１１４、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体ＤＦＤ５９、または１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦｃ−融合ＦＧＦ２１変異体ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４のそれぞれの単一の皮下注射後に観察した。ＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４もまた、単一機能タンパク質の組合せ投与の効果をデュアル機能タンパク質と比較するために、それぞれ１０ｎｍｏｌ／ｋｇで１回皮下に注射した。
【０１７６】
図１９に示されるとおり、４日目までの血糖レベルの変化に関して、ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４（長時間作用型ＦＧＦ２１単一機能タンパク質）投与は血糖のより遅い低下を引き起こしたが、ＤＦＤ１１４（ＧＬＰ−１を含む長時間作用型タンパク質）、ＤＦＤ５９およびＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せ投与は投与の１日目から血糖のより迅速な低下を示した。ｄｂ／ｄｂマウスにおける結果と同様に、ＤＦＤ５９は早期に血糖における鋭い低下を示したが、血糖の低下は４日後によりゆっくり消失された。ＤＦＤ１１４は３ｎｍｏｌ／ｋｇの低用量で同様のパターンを示した。１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１４、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７４および組合せ投与で処置されるグループにおいて、同様の非空腹時血糖プロフィールが観察された。
【０１７７】
体重低下の効果について、ＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せ投与で処置されるグループは、体重低下について最も良い効果を示し（７から８％）、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１４で処置されるグループはまた体重の低下について顕著な効果を示した（約６％）（図２０）。ＤＦＤ５９で処置されるグループは投与後１日目に５％の体重低下を示したが、効果は２日後に消失し、７日後にビヒクルグループと同様となった。長時間作用型ＦＧＦ２１単一機能タンパク質ＤＦＤ７２およびＤＦＤ７４のそれぞれで処置されるグループは投与後７日目まで４から５％の体重のより遅い低下を示し、効果は１０日後に消失した。
【０１７８】
試験終了後、血糖の平均値を示す糖化ヘモグロビンレベルを測定し、平均血糖の変化を各試験グループにおいて分析した（図２１）。ビヒクルグループは投与前と比較して試験終了後に糖化ヘモグロビンレベルの増加を有し、ＤＦＤ５９で処置されるグループは同様の増加を示した。対照的に、ＤＦＤ１１４で処置されるグループは用量依存的に糖化ヘモグロビンレベルにおける低下を示し、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１４で処置されるグループは糖化ヘモグロビンレベルの低下に関して最も良い効果を有した（−０．４２％）。ＤＦＤ５９およびＤＦＤ７４の組合せ投与で処置されるグループはＤＦＤ１１４と同様の糖化ヘモグロビンレベルの低下を示した（−０．３８％）。長時間作用型ＦＧＦ２１単一機能タンパク質について、ＤＦＤ７２がＤＦＤ７４よりも優れていたことを観察した。各グループにおいて糖化ヘモグロビンの低下したレベルに基づいてタンパク質を比較して、デュアル機能タンパク質ＤＦＤ１１４がＧＬＰ−１−ＦｃおよびＦｃ−ＦＧＦ２１単一機能タンパク質の両方よりも優れていたことを確認した。
【０１７９】
実験例１１．免疫原性の予測および評価
実験例１１−１．免疫原性に対する予測方法および結果
デュアル機能タンパク質の起こり得る免疫原性を予測するために、免疫原性のコンピューター内での分析を各タンパク質に対して行った。
【０１８０】
具体的に、デュアル機能タンパク質の起こり得る免疫原性をｉＴｏｐｅＴＭおよびＴＣＥＤＴＭ方法を使用することによって迅速にスクリーニングした（Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools, BioDrugs, 2010）。２つの方法にしたがって、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩＩ結合分析のみに依存するコンピューター内での分析方法と比較してより正確に予測され得る。
【０１８１】
実験例１１−２．免疫原性に対するエキソビボ評価方法および結果
デュアル機能タンパク質の起こり得る免疫原性を評価するために、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ分析（Increased brain bio-distribution and chemical stability and decreased immunogenicity of an engineered variant of GDNF, Exp Neurol, 2015）を行った。免疫原性が検出されるとき、免疫原性を誘導するアミノ酸配列がＴ細胞エピトープマッピングを介して同定され得、最小限にされた免疫原性を有する脱免疫化変異体が免疫原性を再評価するためにコンピューター内予測を介して設計および調製され得る。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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