(57)【要約】組合せプライム：ブースト療法が本明細書に記載されている。組合せプライム：ブースト療法は、哺乳動物において免疫応答を誘導するのに使用するためのものである。組合せは、抗原性タンパク質を発現することが可能であり、哺乳動物において抗原タンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルスと；抗原性タンパク質を発現することが可能であり、哺乳動物において免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスとを含む。抗原性タンパク質は、両方ともに同じ腫瘍関連抗原に基づいているが、同一である必要はない。アデノウイルス、処置方法、及び使用についても記載されている。【選択図】  図９
2019514988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において免疫応答を誘導するのに使用するための組合せプライム：ブースト療法であって、前記組合せが、
抗原性タンパク質を発現することが可能であり、前記哺乳動物において前記抗原性タンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルスと；
抗原性タンパク質を発現することが可能であり、前記哺乳動物において前記免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスと
を含み、
前記アデノウイルスによって発現可能な前記抗原性タンパク質及び前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現可能な前記抗原性タンパク質が、両方ともに同じ腫瘍関連抗原に基づいている、組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２】
前記アデノウイルスによって発現する前記抗原性タンパク質が、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質であり、及び前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現する前記抗原性タンパク質が、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質である、請求項１に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項３】
前記アデノウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインを含むアミノ酸配列を有し、前記タンパク質ドメインがプロテアソーム分解性リンカーによって連結されている、請求項２に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項４】
前記アデノウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質の前記タンパク質ドメインが、ＨＰＶ１６  Ｅ６、次にＨＰＶ１８  Ｅ６、次にＨＰＶ１６  Ｅ７、次にＨＰＶ１８  Ｅ７の順序である、請求項３に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項５】
前記アデノウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質の前記タンパク質ドメインが、ＨＰＶ１６  Ｅ６、次にＨＰＶ１８  Ｅ６、次にＨＰＶ１６  Ｅ７、次にＨＰＶ１８  Ｅ７以外の順序である、請求項３に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項６】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインを含むアミノ酸配列を有し、前記タンパク質ドメインがプロテアソーム分解性リンカーによって連結されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項７】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質の前記タンパク質ドメインが、ＨＰＶ１６  Ｅ６、次にＨＰＶ１８  Ｅ６、次にＨＰＶ１６  Ｅ７、次にＨＰＶ１８  Ｅ７の順序である、請求項６に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項８】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質の前記タンパク質ドメインが、ＨＰＶ１６  Ｅ６、次にＨＰＶ１８  Ｅ６、次にＨＰＶ１６  Ｅ７、次にＨＰＶ１８  Ｅ７以外の順序である、請求項６に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項９】
前記アデノウイルス、前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルス、又は両方によってコードされる前記ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質において、
前記ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質ドメインが、配列番号９に従う配列、又は配列番号９に従う配列の変異体を有し；
前記ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質ドメインが、配列番号１０に従う配列、又は配列番号１０に従う配列の変異体を有し；
前記ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質ドメインが、配列番号１１に従う配列、又は配列番号１１に従う配列の変異体を有し；及び
前記ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインが、配列番号１２に従う配列、又は配列番号１２に従う配列の変異体を有する、請求項３〜８のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１０】
配列番号９のＸａａのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個が独立して、不在又は非システインアミノ酸である、請求項９に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１１】
配列番号１０のＸａａのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個が独立して、不在又は非システインアミノ酸である、請求項９又は１０に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１２】
配列番号１１の９１位及び９４位でのＸａａのうちの少なくとも１個が不在又は非システインアミノ酸である；並びに
配列番号１１の２４位でのＸａａが不在、又は非システインアミノ酸のいずれかであること；
配列番号１１の２５位でのＸａａが不在、又は非チロシンアミノ酸のいずれかであること；及び
配列番号１１の２６位でのＸａａが不在、又は非グルタミン酸アミノ酸のいずれかであること、
のうちの少なくとも１つである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１３】
配列番号１２の９８位及び１０１位でのＸａａのうちの少なくとも１個が不在又は非システインアミノ酸である；並びに
配列番号１２の２７位でのＸａａが不在、又は非システインアミノ酸のいずれかであること；
配列番号１２の２８位でのＸａａが不在、又は非ヒスチジンアミノ酸のいずれかであること；及び
配列番号１２の２９位でのＸａａが不在、又は非グルタミン酸アミノ酸のいずれかであること、
のうちの少なくとも１つである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１４】
配列番号９及び１０のそれぞれにおいてＸａａのうちの５個、６個、７個、又は８個が不在である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１５】
配列番号１１の９１位及び９４位でのＸａａのうちの少なくとも１個が不在である；並びに、配列番号１１の２４位〜２６位でのＸａａが不在である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１６】
配列番号１２の９８位及び１０１位でのＸａａのうちの少なくとも１個が不在である；並びに、配列番号１２の２７位〜２９位でのＸａａが不在である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１７】
前記プロテアソーム分解性リンカーが、配列ＧＧＧＧＧＡＡＹを有するアミノ酸リンカーである、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１８】
前記アデノウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、配列番号１に従うアミノ酸配列、又は配列番号１に従うアミノ酸配列の変異体を有する、請求項２に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１９】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、配列番号１に従うアミノ酸配列、又は配列番号１に従うアミノ酸配列の変異体を有する、請求項２又は１８に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２０】
前記アデノウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質及び前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによってコードされる前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、同じアミノ酸配列を有する、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２１】
前記アデノウイルスが、配列番号３に従うヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２２】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスが配列番号３のヌクレオチド配列の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンを含む、請求項２又は２１に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２３】
Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスゲノムが、配列番号４の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンであるヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２４】
前記アデノウイルスによって発現する前記抗原性タンパク質が、前立腺のヒト６回膜貫通型上皮抗原（ｈｕ−ＳＴＥＡＰ）タンパク質であり、及び前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現する前記抗原性タンパク質が、ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質である、請求項１に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２５】
前記アデノウイルスによって発現する前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質が、配列番号１３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である配列を有する、請求項２４に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２６】
前記アデノウイルスによって発現する前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質が、配列番号１３と同一である配列を有する、請求項２５に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２７】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現する前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質が、配列番号１３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である配列を有する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２８】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現する前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質が、配列番号１３と同一である配列を有する、請求項２７に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項２９】
前記アデノウイルスが、配列番号１４に従うヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項３０】
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスが配列番号１４のヌクレオチド配列の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンを含む、請求項２４に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項３１】
Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスゲノムが、配列番号１５の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンであるヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の組合せプライム：ブースト療法。
【請求項３２】
ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能で、そして哺乳動物において前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルス。
【請求項３３】
前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、任意の順序で、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインを含むアミノ酸配列を有し、前記タンパク質ドメインがプロテアソーム分解性リンカーによって連結されている、請求項３２に記載のアデノウイルス。
【請求項３４】
前記ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質ドメインが、配列番号９に従う配列、又は配列番号９に従う配列の変異体を有し；
前記ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質ドメインが、配列番号１０に従う配列、又は配列番号１０に従う配列の変異体を有し；
前記ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質ドメインが、配列番号１１に従う配列、又は配列番号１１に従う配列の変異体を有し；及び
前記ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインが、配列番号１２に従う配列、又は配列番号１２に従う配列の変異体を有する、請求項３２又は３３に記載のアデノウイルス。
【請求項３５】
配列番号９のＸａａのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個が独立して、不在又は非システインアミノ酸である、請求項３４に記載のアデノウイルス。
【請求項３６】
配列番号１０のＸａａのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個が独立して、不在又は非システインアミノ酸である、請求項３４又は３５に記載のアデノウイルス。
【請求項３７】
配列番号１１の９１位及び９４位でのＸａａのうちの少なくとも１個が不在又は非システインアミノ酸である；並びに
配列番号１１の２４位でのＸａａが不在、又は非システインアミノ酸のいずれかであること；
配列番号１１の２５位でのＸａａが不在、又は非チロシンアミノ酸のいずれかであること；及び
配列番号１１の２６位でのＸａａが不在、又は非グルタミン酸アミノ酸のいずれかであること、
のうちの少なくとも１つである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項３８】
配列番号１２の９８位及び１０１位でのＸａａのうちの少なくとも１個が不在又は非システインアミノ酸である；並びに
配列番号１２の２７位でのＸａａが不在、又は非システインアミノ酸のいずれかであること；
配列番号１２の２８位でのＸａａが不在、又は非ヒスチジンアミノ酸のいずれかであること；及び
配列番号１２の２９位でのＸａａが不在、又は非グルタミン酸アミノ酸のいずれかであること、
のうちの少なくとも１つである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
【請求項３９】
前記ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質が、配列番号１に従う配列を有する、請求項３２に記載のアデノウイルス。
【請求項４０】
前記アデノウイルスが、配列番号３に従うヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のアデノウイルス。
【請求項４１】
ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であり、哺乳動物において前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルス。
【請求項４２】
前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質が、配列番号１３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一である配列を有する、請求項４１に記載のアデノウイルス。
【請求項４３】
前記ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質が、配列番号１３と同一である配列を有する、請求項４２に記載のアデノウイルス。
【請求項４４】
哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、前記方法が
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組合せプライム：ブースト療法を前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記アデノウイルスを投与して少なくとも約２４時間後に前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを投与する、方法。
【請求項４５】
前記アデノウイルスを投与して２〜４日後に前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アデノウイルスを投与して約１週間後に前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記アデノウイルスを投与して２週間後に前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記アデノウイルスを投与して２週間より後に前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記哺乳動物がＨＰＶ由来のがんに罹患し、前記組合せプライム：ブースト療法が請求項２〜２３のいずれか一項に記載のものであり、及び、免疫応答を誘導するステップが前記ＨＰＶ由来のがんのサイズの縮小をもたらす、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＰＶ由来のがんが、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８によって引き起こされるがんである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８によって引き起こされる前記ＨＰＶ由来のがんが重複上皮性悪性腫瘍である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記重複上皮性悪性腫瘍が頸がん、頭頸部がん、又は肛門性器がんである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物が、前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、乳がん、精巣がん、頸がん、膀胱がん、卵巣がん、急性リンパ球性白血病、又はユーイング肉腫に罹患し、前記組合せプライム：ブースト療法が請求項２４〜３１のいずれか一項に記載のものであり、及び、免疫応答を誘導するステップが前記がんのサイズの縮小をもたらす、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物が前立腺がんに罹患している、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
哺乳動物において免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスであって、
前記Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスが、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を抗原性タンパク質としてコードし、
前記融合タンパク質が、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインを含むアミノ酸配列を有し、
前記タンパク質ドメインがプロテアソーム分解性リンカーによって連結されており、並びに
前記融合タンパク質が、配列番号１に従う配列を有さない、
Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月９日出願米国特許仮出願第６２，３３３，６８５号及び２０１６年９月３０日出願米国特許仮出願第６２／４０２，６７０号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
［分野］
[0002]本開示は、免疫応答を誘導するための腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、悪性細胞に特異的に感染し、これの中で複製し、これを殺滅し、正常組織は影響を受けない。いくつかのＯＶは、様々な新生物の処置のための臨床評価の高度な段階に達している（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＪ．ら、（２０１２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３０：６５８〜６７０）。一旦承認されれば、そのようなウイルス剤は、標準的ながん治療に取って代わる、又はがん治療と合わせて用いられ、毒性の低下及び治療有効性の改善が可能になり得る。
【０００４】
[0004]水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に加えて（Ｓｔｏｊｄｌ  ＤＦ．ら、（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：８２１〜８２５；Ｓｔｏｊｄｌ  ＤＦ．ら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：２６３〜２７５）、腫瘍溶解活性を呈する他のラブドウイルスが近年記載されている（Ｂｒｕｎ  Ｊ．ら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１４４０〜１４４９；  Ｍａｈｏｎｅｙ  ＤＪ．ら、（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０：４４３〜４５６）。これらの内でも、非ＶＳＶ  Ｍａｒａｂａウイルスが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最も幅広い腫瘍親和性を示した（国際公開第２００９／０１６４３３号）。腫瘍選択性が改善され、正常細胞における毒性が低減された変異型Ｍａｒａｂａウイルスを操作した。弱毒株は、Ｇタンパク質（Ｑ２４２Ｒ）突然変異及びＭタンパク質（Ｌ１２３Ｗ）突然変異の双方を含有する二重変異型株である。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＭＧ１又はＭａｒａｂａ  ＭＧ１と呼ばれるこの弱毒株は、マウスの異種移植及び同系腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示し、治療有効性が弱毒化ＶＳＶ、ＶＳＶΔＭ５１よりも優れていた（国際公開第２０１１／０７０４４０号）。
【０００５】
[0005]過去数年間にわたって蓄積されたデータによって、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍有効性は、腫瘍溶解性ウイルスの直接の腫瘍溶解に左右されると共に、抗腫瘍免疫を刺激する腫瘍溶解性ウイルスの能力にも左右される可能性もあることが明らかにされた（Ｂｒｉｄｌｅ  ＢＷ．ら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８４：４２６９〜４２７５）。この免疫媒介腫瘍制御は、ＯＶ療法の全体的な有効性において重要な役割を果たすと思われる。事実、腫瘍特異的適応免疫系に関与する細胞は、組織をパトロールし、ＯＶによって見落とされた腫瘍細胞を破壊することができる。さらに、それらの記憶区画によって、腫瘍の再発を防ぐことができる。
【０００６】
[0006]ＯＶ誘発抗腫瘍免疫を改善するために種々の戦略が開発されてきた（Ｐｏｌ  Ｊ．ら、（２０１２）Ｖｉｒｕｓ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ４：１〜２１）。一部のグループでは、免疫刺激性サイトカインを発現するＯＶを遺伝子操作してきた。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する単純ヘルペス及びワクチニアウイルスは、がん治療向け臨床評価の第ＩＩＩ相及び第ＩＩＢ相にそれぞれ到達したが、一方、ＩＦＮ−βを発現するＶＳＶは第Ｉ相に入ったばかりである。
【０００７】
[0007]腫瘍溶解性ワクチンとして規定される別の戦略は、ＯＶ由来の腫瘍抗原を発現させることからなる（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＳＪ．ら、（２０１２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３０：６５８〜６７０）。従来から、ＶＳＶはがんワクチンベクターとしても使用可能であることが実証されてきた（Ｂｒｉｄｌｅ  ＢＷら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８４：４２６９〜４２７５）。マウス黒色腫モデルを処置する異種プライム：ブースト設定で適用すると、ＶＳＶ−ヒトドーパクロームトートメラーゼ（ｈＤＣＴ）腫瘍溶解性ワクチンは、ＤＣＴに対する腫瘍特異的免疫の増加を引き起こし、並びに抗ウイルス適応免疫の低下も同時に引き起こした。結果として、治療有効性は劇的に改善され、生存期間中央値及び長期生存の両方が高まった（国際公開第２０１０／１０５３４７号）。ＶＳＶは、腫瘍関連抗原としてｈＤＣＴを使用して有効であることが示されたが、異種プライム：ブースト設定においてどのような腫瘍関連抗原が有効であるか予測する方法はない。
【０００８】
[0008]３つの特定のプライム：ブースト組合せ療法が、ＰＣＴ出願である国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０１１８号に開示されている。当該組合せ療法は、抗原として：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺のヒト６回膜貫通型上皮抗原（human Six-Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate）（ｈｕＳＴＥＡＰ）タンパク質、又はがん／精巣抗原１（Cancer Testis Antigen 1）をコードするレンチウイルスと、同一抗原をコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスとを含む。ＰＣＴ出願である国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０１１８号にはまた、抗原としてＭＡＧＥＡ３をコードするアデノウイルス、及び同一抗原をコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを使用するプライム：ブースト組合せ療法が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0009]以下の概要は、本明細書に記載のうちの１つ又は複数の発明を読者に紹介するものであって、それらのいずれの１つをも規定するものではない。
【００１０】
[0010]本開示の一目的は、従来の抗がんワクチンの少なくとも１つの欠点を回避又は緩和することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[0011]本開示の著者らは、哺乳動物において免疫応答を誘導する組合せプライム：ブースト療法を特定した。「プライム」としてレンチウイルスを使用している、上で考察したＰＣＴ出願である国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０１１８号に開示されたプライム：ブースト組合せ療法とは対照的に、本開示による組合せプライム：ブースト療法は、プライミングウイルスとして抗原を発現する組換えアデノウイルスを使用する。抗原を発現する組換えＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスをブースティングウイルスとして使用する。本開示による例示的な組合せ療法は、抗原としてＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７又はＳＴＥＡＰを使用する。
【００１２】
[0012]本明細書で考察する結果が示すところによれば、組換えアデノウイルスによって、‘１１８  ＰＣＴ出願の組換えレンチウイルスに勝る少なくとも１つの利点が提供される。プライミングウイルスを変更すると有効性が影響を受けるかどうか、又はどのように影響を受けるか、予測する方法がないので、本明細書で考察する結果は予期せぬものであり、予測不可能である。いずれかのプライミングウイルスがプライム：ブースト組合せ療法で免疫応答に有益な効果をもたらすことがもしあるとしても、どのプライミングウイルスによりそうなるのかを予測することはできなかったであろう。
【００１３】
[0013]一態様では、哺乳動物において免疫応答を誘導するのに使用するための組合せプライム：ブースト療法が提供される。組合せプライム：ブースト療法が、（ａ）抗原性タンパク質を発現し、そして（ｂ）哺乳動物において抗原性タンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルスを含む。組合せプライム：ブースト療法はまた、（ａ）抗原性タンパク質を発現し、そして（ｂ）哺乳動物において免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを含む。アデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現される抗原性タンパク質は、同じ腫瘍関連抗原に基づくが、配列において同一である必要はない。
【００１４】
[0014]組合せプライム：ブースト療法の一部の例では、抗原性タンパク質は、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質である。組合せプライム：ブースト療法の他の例では、抗原性タンパク質はｈｕＳＴＥＡＰタンパク質である。
【００１５】
[0015]他の態様では、本開示は、ウイルスの組合せの使用と、ウイルスの組合せを使用する方法とを提供する。本開示の使用及び方法は、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８によって引き起こされるがんなどの、ＨＰＶ由来のがんの処置又は防止；Ｅ６及び／又はＥ７タンパク質に対する免疫応答を高めること：或いは、ＨＰＶ由来のがんの処置又は防止及び免疫応答を高めること、の組合せに関するものとすることができる。
【００１６】
[0016]本開示のその他の態様及び特徴は、添付の図面と併せて特定の実施形態の以下の説明を検討することにより、当業者にとって明らかになるであろう。
【００１７】
[0017]次に、本開示の実施形態について、添付の図面を参照して、単に例示の目的で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現が可能であり、本開示による組合せプライム：ブースト療法において使用可能である、例示的なＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の配列の例示の図である。
【図２】例示的なＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合体のｐ５３との相互作用を例示するグラフの図である。
【図３】例示的なＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合体のｐＲｂとの相互作用を例示するグラフの図である。
【図４Ａ】本開示による組合せプライム：ブースト療法について、及び対照療法について、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値で測定した、Ｅ６又はＥ７エピトープに対する免疫応答の刺激を例示する一セットのグラフの図である。
【図４Ｂ】本開示による組合せプライム：ブースト療法について、及び対照療法について、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値で測定した、Ｅ６又はＥ７エピトープに対する免疫応答の刺激を例示する一セットのグラフの図である。
【図４Ｃ】本開示による組合せプライム：ブースト療法について、及び対照療法について、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値で測定した、Ｅ６又はＥ７エピトープに対する免疫応答の刺激を例示する一セットのグラフの図である。
【図４Ｄ】本開示による組合せプライム：ブースト療法について、及び対照療法について、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値で測定した、Ｅ６又はＥ７エピトープに対する免疫応答の刺激を例示する一セットのグラフの図である。
【図５Ａ】本開示による組合せプライム：ブースト療法後に生じた、これに対してプライム単独後に生じた、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数及びＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数を例示するグラフの図である。
【図５Ｂ】本開示による組合せプライム：ブースト療法後に生じた、これに対してプライム単独後に生じた、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数及びＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数を例示するグラフの図である。
【図６】本開示による組合せプライム：ブースト療法について、及び対照療法について、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値で経時的に測定した、Ｅ７エピトープに対する免疫応答を例示するグラフの図である。
【図７Ａ】循環プール及び脾臓プールにおいて見い出された二重陽性の（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）又は三重陽性の（ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞で測定した、生じたＴ細胞応答の質を例示するグラフの図である。
【図７Ｂ】循環プール及び脾臓プールにおいて見い出された二重陽性の（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）又は三重陽性の（ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞で測定した、生じたＴ細胞応答の質を例示するグラフの図である。
【図７Ｃ】循環プール及び脾臓プールにおいて見い出された二重陽性の（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）又は三重陽性の（ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞で測定した、生じたＴ細胞応答の質を例示するグラフの図である。
【図７Ｄ】循環プール及び脾臓プールにおいて見い出された二重陽性の（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）又は三重陽性の（ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞で測定した、生じたＴ細胞応答の質を例示するグラフの図である。
【図８Ａ】インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値を細胞内染色により測定した、本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法の後の、腫瘍保有マウスにおけるＥ６及びＥ７特異的Ｔ細胞の増殖を例示するグラフの図である。
【図８Ｂ】インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント値を細胞内染色により測定した、本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法の後の、腫瘍保有マウスにおけるＥ６及びＥ７特異的Ｔ細胞の増殖を例示するグラフの図である。
【図９】本開示による組合せプライム：ブースト療法で処置したマウスの、及び対照処置で処置したマウスの、生存率対時間を例示するグラフの図である。
【図１０】処置における様々な時間でのＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇を伴う、本開示による治癒的組合せプライム：ブースト療法で処置したマウスの生存率対時間を例示するグラフの図である。
【図１１Ａ】本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法を使用するブースティングを行って、６２日後及び１１７日後の、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の血液及び脾臓での持続性を例示するグラフの図である。
【図１１Ｂ】本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法を使用するブースティングを行って、６２日後及び１１７日後の、Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の血液及び脾臓での持続性を例示するグラフの図である。
【図１２】実施例７で考察する試験に関する処置概略の例示の図である。
【図１３】腫瘍フリーのマウスをＡｄ−ｈｕＳＴＥＡＰでプライミングした後の特異的ペプチド抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激による応答を例示するグラフの図である。
【図１４】腫瘍フリーのマウスをＡｄ−ｈｕＳＴＥＡＰでプライミングし、続いてＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰでブースティングした後の特異的ペプチド抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激による応答を例示するグラフの図である。
【図１５】実施例８で考察する試験に関する処置概略の例示の図である。
【図１６】ＴｒａｍｐＣ２細胞を移植されたマウスをＡｄ−ｈｕＳＴＥＡＰでプライミングした後の特異的ペプチド抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激による応答を例示するグラフの図である。
【図１７】ＴｒａｍｐＣ２細胞を移植されたマウスをＡｄ−ｈｕＳＴＥＡＰでプライミングし、続いてＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰでブースティングした後の特異的ペプチド抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激による応答を例示するグラフの図である。
【図１８】３つのマウス群における容積でのＴｒａｍｐＣ２腫瘍成長の例示の図である。
【図１９】３つのマウス群におけるマウスの経時的生存の例示の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[0037]本開示は、哺乳動物における免疫応答の誘導において使用するための組合せプライム：ブースト療法を提供する。「異種」プライム：ブースト形式で同じ抗原を使用しながら、非適合ワクチン送達法により、又は「同種」プライム：ブーストで適合ワクチン送達法により、プライム：ブースト免疫化を付与することができる。同種ワクチン接種は、二次応答においてベクター及び導入遺伝子の両方に対する応答のブースティングをもたらすことになるので、ベクター型ワクチンプラットフォームを使用する場合、異種プライム：ブースト法が好ましい。対照的に、第１の及び第２のベクターに対する応答が一次応答であり、それ故、ましてや頑強ではないので、異種系は、二次応答（すなわち、ブーストされた応答）を抗原に合わせている。
【００２０】
[0038]一般に、本開示の組合せプライム：ブースト療法が、（１）抗原性タンパク質を発現することが可能であり、哺乳動物において抗原性タンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルスと；（２）抗原性タンパク質を発現することが可能であり、哺乳動物において免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスとを含む。
【００２１】
[0039]アデノウイルスによって発現される抗原性タンパク質及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現される抗原性タンパク質は、同一であっても異なっていてもよい。異なる場合、これらの抗原性タンパク質は、十分に類似しており、その結果、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現される抗原性タンパク質に対する免疫応答が、プライミングウイルスの非存在下で誘導される免疫応答と比較して高められる。
【００２２】
[0040]本開示による一部の例示的な組合せプライム：ブースト療法では、本療法を使用して、患者の免疫系を活性化させ、その結果、例えば、腫瘍での腫瘍関連抗原に対する抗体及び／又はリンパ球を活性化することによって、正常組織に対する毒性は低減した状態で、腫瘍細胞を死滅させることができる。特定の例では、本療法は、腫瘍溶解活性及び適応細胞免疫をブースティングする能力の両方を提示することができる。
【００２３】
[0041]一態様では、本開示の組合せプライム：ブースト療法は、（１）ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であり、そして哺乳動物においてヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルスと；（２）ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であり、そして哺乳動物において免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスとを含む。アデノウイルスによって発現される抗原性タンパク質及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現される抗原性タンパク質は、同一であっても異なっていてもよい。
【００２４】
[0042]別の態様では、本開示による組合せプライム：ブースト療法は、（１）前立腺のヒト６回膜貫通型上皮抗原（ｈｕＳＴＥＡＰ）タンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であり、そして哺乳動物においてｈｕＳＴＥＡＰタンパク質に対する免疫を生み出すように製剤化されているアデノウイルスと；（２）ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であり、そして哺乳動物において免疫応答を誘導するように製剤化されているＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスとを含む。アデノウイルスによって発現される抗原性タンパク質及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現される抗原性タンパク質は、同一であっても異なっていてもよい。
【００２５】
[0043]本開示の文脈において、用語「プライミングアデノウイルス」及び「ブースティングＭａｒａｂａウイルス」とは、それぞれ、抗原性タンパク質を発現することが可能であるアデノウイルス、及び抗原性タンパク質を発現することが可能であるＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを指すものと理解されたい。用語「Ａｄ−Ｅ６Ｅ７」、「アデノウイルスＥ６Ｅ７」及び「ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質をコードするアデノウイルス」とは全て、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であるアデノウイルスを指すものと理解されたい；並びに用語「ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７」、「Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１  Ｅ６Ｅ７」、及び「ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質をコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルス」とは全て、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を発現することが可能であるＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを指すものと理解されたい。同様に、用語「Ａｄ−ｈｕＳＴＥＡＰ」、「アデノウイルスｈｕＳＴＥＡＰ」、「ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質をコードするアデノウイルス」及び「プライミングアデノウイルス」とは全て、ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を抗原性タンパク質として発現することが可能であるアデノウイルスを指すものと理解されたい；並びに用語「ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ」、「Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１  ｈｕＳＴＥＡＰ」、及び「ｈｕＳＴＥＡＰをコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルス」とは全て、ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を発現することが可能であるＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを指すものと理解されたい。
【００２６】
[0044]ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質は、本開示による療法及び方法において使用することができる抗原性タンパク質の一例である。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７は、ＨＰＶ１６血清型及びＨＰＶ１８血清型両方のＥ６及びＥ７形質転換タンパク質に相応する配列を含み、結果として、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質ドメインを含む融合タンパク質がもたらされる。４つのタンパク質ドメインは、融合タンパク質がプロテアソーム内にあると、分断しているＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質をもたらすプロテアソーム分解性リンカーによって連結されている。融合タンパク質のプロテアソーム分解性リンカーは、同じであっても異なっていてもよい。用語「ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質」、「ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質」及び「治療用Ｅ６Ｅ７構築物」とは全て、「ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質」と同義であると理解されたい。
【００２７】
[0045]本開示によるヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質の一例は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有する。配列番号１において、プロテアソーム分解性リンカーは、配列ＧＧＧＧＧＡＡＹ（配列番号２）を有する。その他のプロテアソーム分解性リンカーを代替的に使用することも可能である。
【００２８】
[0046]配列番号１に従うＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質を生じるために、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスゲノムは、配列番号３のヌクレオチド配列の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンを含むことができる。特定の例では、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスゲノムは、配列番号４の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンであるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２９】
[0047]配列番号１に従うＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質を生じるために、アデノウイルスは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むことができる。導入遺伝子は、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）ＩＥプロモーターなどのプロモーターをさらに含み、ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７コード領域に先行することができる。導入遺伝子は、プロモーターと組み合わせて、ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７コード領域の後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列をコードする領域をさらに含むことができることが好ましい。
【００３０】
[0048]ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質はプロテアソーム内で互いに分断されているので（融合タンパク質中にプロテアソーム分解性リンカーが存在するため）、本開示によるヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質は、タンパク質ドメインが、配列番号１におけるのとは異なる順序で再構成され、なおＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質を提供する、配列を有することができる。
【００３１】
[0049]仮に、配列番号１のＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７ドメインの配列がそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに相応しているとしたら、本開示によるヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質は、４つのドメインが、例えば：ＡＢＤＣ、ＡＣＢＤ、ＡＣＤＢ、ＡＤＢＣ、ＡＤＣＢ、ＢＡＣＤ、ＢＡＣＤ、ＢＡＤＣ、ＣＡＢＤ、ＣＡＤＢ、ＤＡＣＢ、ＤＣＡＢ、ＤＣＢＡ等、その他の可能性のある２３の入替のうちのいずれかで再構成された、配列を有することができるであろう。配列番号１のかかる再構成に関する４つの特定の例が配列番号５〜８に示されているが、本開示はまたその他の１９の入替も企図していること、並びに、かかる入替の配列は配列番号１及び５〜８に開示のタンパク質ドメイン及びリンカーから容易に導き出せることを理解されたい。
【００３２】
[0050]本開示によるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質は、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質の野生型配列から形成することができるが、野生型配列を改変してジンクフィンガーの形成を防止することが望ましい。仮に、アデノウイルスＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７で形質導入された細胞が、ジンクフィンガーを形成できないＥ６及びＥ７タンパク質を産生する融合タンパク質をコードするＥ６Ｅ７導入遺伝子での組込み事象を受けていたなら、産生されたタンパク質は、ｐ５３又は網膜芽細胞腫の機能を妨げることができず、それにより、ｄｅ  ｎｏｖｏの新生物が形成する可能性が減少するであろう。
【００３３】
[0051]好ましい例では、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質のうちの１つ又は複数の配列を改変して、１つ又は複数のＣＸＸＣモチーフがジンクフィンガーを形成する能力を阻害することができる。野生型ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質のうちの１つ又は複数の配列を、追加的又は代替的に改変して、ＬＸＣＸＥ配列モチーフが網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質に結合する能力を阻害することができる。ジンクフィンガーの形成の防止は、例えば、ＣＸＸＣモチーフのシステインのうちの一方又は両方を欠失させることによって行うことができる。Ｒｂタンパク質への結合の防止は、例えば、ＣＸＥアミノ酸を欠失させるなどの、ＬＸＣＸＥ配列モチーフのアミノ酸のうちの１つ又は複数を欠失させることによって、行うことができる。アミノ酸を欠失させることの代替法では、ＣＸＸＣ又はＬＸＣＸＥモチーフのいずれかのアミノ酸のうちの１つ又は複数をアラニンなどの他のアミノ酸で置き換えることにより、結合を防止することができる。タンパク質配列の４つ全てを改変して、分断されたＥ６及びＥ７タンパク質がジンクフィンガーを形成すること及び／又はＲｂタンパク質に結合することを防止することが好ましい。
【００３４】
[0052]ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質において使用することができるＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質の配列は、配列番号９〜１２に示されている。
【００３５】
配列番号９及び１０では、各Ｘａａは、独立して、不在、システイン、又は非システインアミノ酸である。特定された可変部分Ｘａａの残基がシステインである場合、配列はそれぞれＨＰＶ１６  Ｅ６及びＨＰＶ１８  Ｅ６の野生型配列に相応する。
【００３６】
配列番号１１では、２４位でのＸａａは、不在、システイン、又は非システインアミノ酸のいずれかであり；２５位でのＸａａは不在、チロシン、又は非チロシンアミノ酸のいずれかであり；２６位でのＸａａは不在、グルタミン酸又は非グルタミン酸アミノ酸のいずれかであり；並びに９１位及び９４位でのＸａａは、独立して、不在、システイン、又は非システインアミノ酸である。２４位〜２６位でのＸａａがシステイン−チロシン−グルタミン酸であり、９１位及び９４位でのＸａａがシステインである場合、配列番号１１の配列は、ＨＰＶ１６  Ｅ７の野生型配列に相応する。
【００３７】
配列番号１２では、２７位でのＸａａは、不在、システイン、又は非システインアミノ酸のいずれかであり；２８位でのＸａａは、不在、ヒスチジン、又は非ヒスチジンアミノ酸のいずれかであり；２９位でのＸａａは不在、グルタミン酸又は非グルタミン酸アミノ酸のいずれかであり；並びに、９８位及び１０１位でのＸａａは、独立して、不在、システイン、又は非システインアミノ酸である。位置２７位〜２９位でのＸａａがシステイン−ヒスチジン−グルタミン酸であり、位置９８位及び１０１位でのＸａａがシステインである場合、配列番号１２の配列は、ＨＰＶ１８  Ｅ７の野生型配列に相応する。
【００３８】
[0053]本開示によるヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質は、任意の順序で、配列番号９、１０、１１及び１２に従う配列を有する４つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質として規定することができ、ここで、タンパク質ドメインは、プロテアソーム分解性リンカーによって連結されており、このリンカーは同じであっても異なっていてもよい。
【００３９】
[0054]配列番号９、１０、１１及び１２のそれぞれにおいて少なくとも１つのＸａａは不在であることが好ましい。プロテアソーム内で生じる分断されたタンパク質におけるジンクフィンガー形成を減少させるのに十分なＸａａが不在であることがより好ましい。一部の好ましい例では、配列番号９及び１０の両方の第１のＣＸＸＣモチーフにおいてＸａａは不在である。
【００４０】
[0055]プロテアソーム分解性リンカーは、配列：ＧＧＧＧＧＡＡＹを有するアミノ酸リンカーであることが好ましい。
【００４１】
[0056]上の規定は：
タンパク質ドメインが、配列番号９、次に配列番号１０、次に配列番号１１、次に配列番号１２の順序に構成されている；
タンパク質ドメインが、配列ＧＧＧＧＧＡＡＹを有するリンカーによって互いに連結されている；
配列番号９の７０位、７３位、１１０位及び１１３位でのＸａａが不在である；
配列番号１０の６５位、６８位、１０５位及び１０８位でのＸａａが不在である；
配列番号１１の２４位〜２６位及び９１位でのＸａａが不在である；並びに、
配列番号１２の２７位〜２９位及び９８位でのＸａａが不在である
場合、配列番号１に相応することを理解されたい。
【００４２】
[0057]ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質に関して上で考察した可変部分の全て（例えば：タンパク質ドメインの順序、プロテアソーム分解性リンカーの配列、プロテアソーム分解性リンカーが同じであるか異なるかどうか、及び野生型配列がジンクフィンガーの形成を防止するように改変されているかどうか）を、単独で、又は組み合わせて使用して、本開示によるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質と考えられるタンパク質配列を生み出すことができることを、理解されたい。
【００４３】
[0058]本開示による療法及び方法において使用することができる抗原性タンパク質の別の例は、前立腺の６回膜貫通型上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）タンパク質である。ヒトＳＴＥＡＰ（ｈｕＳＴＥＡＰ）は、前立腺がんにおいて過剰発現され、膵臓、結腸、乳房、精巣、頚部、膀胱、卵巣を含めて多数のがん細胞株、急性虚血性白血病及びユーイング肉腫において上方制御されている（Ｈｕｂｅｒｔ  ＲＳら、（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９６：１４５２３〜１４５２８）。
【００４４】
[0059]ＳＴＥＡＰ遺伝子は、親水性のアミノ末端ドメイン及びカルボキシル末端ドメインが隣接している６つの潜在的膜貫通領域を有するタンパク質をコードする。ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質は、プライミングアデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスの両方において抗原性タンパク質として、本開示の著者らによって使用された。本開示において、著者らは、アミノ酸３４１個のタンパク質（配列番号１３）を生じる、ヒト及びマウスにおける発現向けのコドン最適化配列について試験した。配列番号１３のタンパク質を発現するネガティブセンスＲＮＡウイルスは、配列番号１４のポリヌクレオチドの逆相補鎖及びＲＮＡバージョンを含むことができる。配列番号１３のタンパク質を発現するＤＮＡウイルスは、配列番号１４である配列を含むことができる。
【００４５】
[0060]ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子との間に挿入された前立腺のヒト６回膜貫通型上皮抗原導入遺伝子を含有するように、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１を操作した（Ｂｒｕｎ  Ｊ．ら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８：１４４０〜１４４９）。導入遺伝子配列を、哺乳類細胞における発現向けにコドン最適化した。ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を含有する、結果として得られるＭａｒａｂａ  ＭＧ１は、「Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ」又は「ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ」と指定する。クローニングを容易にするために改変Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１骨格を使用した。Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ゲノム骨格のＬ遺伝子にサイレント突然変異を導入して、ＭｌｕＩ部位のうちの１つを除去した。第２のＭｌｕＩ部位を、ＧとＬとの間のクローニング領域にてＢｓｉＷＩ部位に置き換えた。シャトルプラスミドｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦの使用が避けられるので、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ゲノム骨格に対するこれらの改変によって、Ｂｒｕｎらの論文に記載のものよりも直接的なクローニング系が可能になった。ｈｕＳＴＥＡＰ導入遺伝子配列を、そのＭｌｕＩ及びＢｓｉＷＩ部位で（ＧとＬとの間のクローニング領域で）改変Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ゲノム骨格に連結反応させた。次いで、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰをレスキューし（Ｂｒｕｎ  Ｊ．ら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１４４０〜１４４９に先に記載されているように）、１回プラーク精製し、オプティプレップ（ｏｐｔｉ−ｐｒｅｐ）精製に付した。Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰは、配列番号１５の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンであるゲノム配列を有する。
【００４６】
[0061]本開示による例示的なプライミングウイルスは、ｈｕＳＴＥＡＰ又はマウスＳＴＥＡＰ（ｍｕＳＴＥＡＰ）を発現する、Ｅ１／Ｅ３欠失を有するアデノウイルス５型である。腫瘍フリーのマウスにおいて、Ａｄ−ｈｕＳＴＥＡＰを使用する腫瘍フリーの動物でのｈｕＳＴＥＡＰ免疫化によって、抗ＳＴＥＡＰ免疫応答を生じることに成功した。応答はヒトペプチドに対してより強い反応性を有したが、一方では、マウスＳＴＥＡＰタンパク質中に存在するエピトープに対する免疫応答がブーストされた、という証拠があった。Ａｄ：ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰによる処置によって、抗ＳＴＥＡＰ免疫応答を生じることができ、腫瘍成長を有意に損ない、生存の有意な改善がもたらされた。
【００４７】
[0062]アデノウイルス、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルス、又はその両方は、分離されたウイルスとして投与向けに製剤化することができる。アデノウイルスは、例えば、１０％グリセロールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０に製剤化することができる。Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは、例えば、およそｐＨ７．５で１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び４％スクロースに製剤化することができる。
【００４８】
[0063]本開示による組合せプライム：ブースト療法では、２つのウイルスは、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質又はｈｕＳＴＥＡＰタンパク質などの、同一の配列を有さない抗原性タンパク質を発現することが可能であり得る。例えば、アデノウイルスは、ＡＢＣＤの順序で４つのタンパク質ドメインを有するＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質を発現することが可能であり得るが、一方、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは、ＢＡＤＣの順序で４つのタンパク質ドメインを有するＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質を発現することが可能であり得る。別の例では、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスによって発現される融合タンパク質の４つのタンパク質ドメインを連結しているプロテアソーム分解性リンカーとは異なるプロテアソーム分解性リンカーによって、４つのタンパク質ドメインが連結されている、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質をアデノウイルスが発現することが可能であり得る。さらに別の例では、アデノウイルスは、配列番号１３に従うｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を発現することが可能であり得るが、一方、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは、配列番号１３と９０％同一であるタンパク質などの、配列番号１３の変異体であるｈｕＳＴＥＡＰタンパク質を発現することが可能であり得る。
【００４９】
[0064]用語「変異体」とは、参照タンパク質の配列と少なくとも７０％同一であるタンパク質を指すものと理解されたい。変異体は少なくとも８０％同一となることが好ましい。変異体は少なくとも９０％同一となるのがより好ましい。変異体は少なくとも９５％同一となるのがさらにより好ましい。配列番号１などの特定の配列の融合タンパク質の文脈では、融合タンパク質の変異体とは、タンパク質ドメインのそれぞれは、参照タンパク質の中の、タンパク質ドメインのそれぞれが相応しているドメインの配列と少なくとも７０％同一である、タンパク質を指すと理解されるであろう。変異体は少なくとも８０％同一となることが好ましい。変異体は少なくとも９０％同一となるのがより好ましい。変異体は少なくとも９５％同一となるのがさらにより好ましい。変異体がより高い配列同一性を有することで、エピトープは参照タンパク質に同様の３次元様式で提示される可能性が高まった。したがって、２つのウイルスが同一の配列を有するタンパク質を生じない組合せのさらに別の例では、アデノウイルスは、配列番号１に従うタンパク質を発現することが可能であり得るが、一方、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは配列番号１の変異体であるタンパク質を、例えば、４つのタンパク質ドメインのそれぞれは、配列番号１の中の、４つのタンパク質ドメインのそれぞれが相応しているタンパク質ドメインの配列と少なくとも９０％同一である、融合タンパク質を、発現することが可能であり得る。
【００５０】
[0065]本開示の文脈において、「ウイルスによって発現されるタンパク質」の考察及びこれへの参照全ては、ウイルスがそれ自身タンパク質を発現する能力を有さないので、ウイルスに感染した細胞によって発現されるタンパク質を、より正確に意味することを理解されたい。同様に、「タンパク質を発現するウイルス」又は「タンパク質を発現することが可能なウイルス」の考察及びこれへの参照全ては、ウイルスに感染した細胞によって発現されるタンパク質に必要な遺伝情報を含むウイルスを（すなわち、タンパク質を「コードする」）、より正確に意味する。
【００５１】
[0066]本開示の文脈において、「組合せプライム：ブースト療法」とは、本明細書で考察するアデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスをプライム：ブースト処置として投与することになる治療を指すものと理解されたい。アデノウイルスが最初に投与され、そして哺乳動物において免疫応答が生じた後のみＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスが投与されることになるので、アデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは一緒に物理的に提供又はパッケージされる必要はない。一部の例では、プライミングアデノウイルスの複数のパッケージの形態で、及びブースティングＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスの別個の複数のパッケージの形態で、病院又は医院などの医療機関に、本発明の組合せが提供される。アデノウイルスのパッケージ及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスのパッケージは、異なるときに提供することができる。その他の例では、プライミングアデノウイルス及びブースティングＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスの両方を含むパッケージの形態で、病院又は医院などの医療機関に本発明の組合せが提供される。
【００５２】
[0067]組合せプライム：ブースト療法は、第１のウイルスを投与することによって哺乳動物において生じた腫瘍関連抗原性タンパク質に対するプライム免疫応答を高める、シクロホスファミド（ＣＰＡ）などの、免疫賦活化合物をさらに含むことができる。シクロホスファミドは、腫瘍関連抗原性タンパク質に対する免疫応答の増強をもたらすことができる化学療法剤である。相乗的マウスメラノーマ腫瘍モデルでは、プライミングベクターに先立ち投与されたＣＰＡは生存を有意に高めたが、一方、ブースティングベクターに先立ち投与されたＣＰＡは生存を有意に高めることはなかった。
【００５３】
[0068]本明細書で開示の治療アプローチでは、（１）アデノウイルスワクチンと、（２）腫瘍溶解性ウイルスワクチンとしてＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスとを組み合わせるが、両方とも、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質又はｈｕＳＴＥＡＰなどの抗原性タンパク質を発現する。本開示の腫瘍溶解性ワクチンによるブースティングによって、腫瘍溶解性ウイルスによる腫瘍減量術と、アデノウイルスワクチンによってプライミングされている動物における腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の数の大幅な増加との両方をもたらすことができる。逆説的に、この方法論は、腫瘍フリーの動物と比較して、腫瘍保有動物においてより大きな抗腫瘍応答を現に生じる。その理由は、腫瘍溶解ウイルスの複製が腫瘍保有動物において増幅され、これによって、腫瘍フリーの動物における腫瘍溶解性ウイルスの複製及び抗原特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の関連する数と比較した場合に、抗原特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の対応した数の増加がもたらされるからである。
【００５４】
[0069]ＨＰＶ遺伝子の発現産物は、ペプチドに処理され、次いで、ペプチドが細胞表面上で発現する。このことによって、特異的ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解をもたらすことができる。外来抗原に対するＴ細胞応答は、細胞溶解性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球の両方を含む。ＣＤ８＋細胞傷害性又は細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、活性化されると、ＨＬＡクラスＩ分子によって提示される適切な抗原を提示する細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、サイトカインを分泌して、マクロファージと、その表面にＨＬＡクラスＩＩ分子によって適切な抗原を提示する抗原産生Ｂ細胞とを刺激するＴ細胞である。
【００５５】
[0070]用語「哺乳動物」とは、ヒト並びに非ヒト哺乳動物を指す。用語「がん」とは、抗原性タンパク質として、Ｅ６及びＥ７タンパク質又はｈｕＳＴＥＡＰタンパク質などの、プライムウイルス及びブーストウイルスによってコードされるタンパク質を発現する任意のがんを包含するように本明細書では使用される。そのようながんの例には、限定されないが、頸がん、頭頸部がん及びその他の肛門性器がん；前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、乳がん、精巣がん、頸がん、膀胱がん、卵巣がん、などの重複上皮性悪性腫瘍、急性リンパ球性白血病並びにユーイング肉腫が含まれる。
【００５６】
[0071]アデノウイルス、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルス、又はその両方を、静脈内、筋肉内、腹腔内又は鼻腔内に哺乳動物に独立して投与することができる。ウイルスの投与後、免疫応答は、免疫応答間隔以内に、例えば約４日以内に、哺乳動物によって生じ、数ヶ月、数年又は潜在的に生涯の間延長する。
【００５７】
[0072]抗原性タンパク質に対する免疫応答を確立するために、アデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスを使用するワクチン接種は、十分に確立された技法を使用して行うことができる。免疫応答を生じるのに必要とされるウイルスの量は、例えば、処置される哺乳動物、例えば種、年齢、サイズ等を含めて、いくつかの要因によって変化するであろうことは、当業者であれば理解するであろう。これに関して、例えば、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質をコードするアデノウイルスベクターの少なくとも約１０７ＰＦＵのマウスへの筋肉内投与は、免疫応答を生じるのに十分である。相応する量が、免疫応答を生じるのにヒトへの投与にとって十分であろう。
【００５８】
[0073]抗原性タンパク質をコードするアデノウイルスの投与によって免疫応答が哺乳動物において一旦生じると、抗原性タンパク質をコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは、適切な免疫応答間隔以内で腫瘍溶解性ウイルス療法に適した量で投与される。適切な免疫応答間隔は、例えば、少なくとも約２４時間、少なくとも約２〜４日以上が好ましく、例えば少なくとも約１週間、又は少なくとも約２週間とすることができる。当業者であれば理解するように、腫瘍溶解性ウイルス療法に適したＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスの量は、処置する哺乳類によって変化するであろう。例えば、マウスにＩＶ投与された、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質をコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスの１０８ＰＦＵは、腫瘍溶解療法には十分である。相応する量が、ヒトにおける使用に十分であろう。
【００５９】
[0074]ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質をコードするＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスは、標準組換え技術を使用して、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質をコードする導入遺伝子の逆相補鎖をＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスに組み込むことによって調製することができる。例えば、導入遺伝子の逆相補鎖はＭａｒａｍａ  ＭＧ１ウイルスのゲノムに組み込むことができ、又は代替的に、導入遺伝子を組み込んでいるプラスミドを使用してウイルスに組み込むこともできる。タンパク質をコードする導入遺伝子は、コドン最適化導入遺伝子とすることができる。
【００６０】
[0075]本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法は、マウスにおいて、平均容積２５０ｍｍ３を有する進行性巨大皮下腫瘍の大部分を治癒することが可能であることが例に示されている。例示的な組合せプライム：ブースト療法は、マウスにおいてＥ７特異的Ｔ細胞を５０００万個を超えて産生することが可能な状態で、マウスにおいて腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することが示されている。理論に束縛されることを望むものではないが、本開示の著者らは、抗原性タンパク質としてＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を使用する本開示による組合せプライム：ブースト療法は、ヒトにおいて使用してＨＰＶ陽性腫瘍を処置することができると考えている。
【００６１】
[0076]本明細書で使用するＴＣ１腫瘍モデルは、直接腫瘍溶解を受けないようであるが、本開示の著者らは、ＨＰＶ陽性ヒト腫瘍は、ＭＧ１  Ｍａｒａｂａで選択的に感染し及び死滅することになると考えている。Ｉ型ＩＦＮが存在しない場合、Ｍａｒａｂａはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＣ１細胞を溶解することができる。しかし、ＴＣ１細胞をＩＦＮβにより前処理すると、ＴＣ１細胞がウイルスの腫瘍溶解から保護される。Ｉ型ＩＦＮによって結果として生じる保護は、定着ＴＣ１腫瘍を保有するマウスが非特異的導入遺伝子をコードするＭＧ１  Ｍａｒａｂａで処置される場合、有効性が欠如する理由を説明する。Ｅ６及びＥ７の両方が、ヒト細胞のゲノムに組み込まれた場合、Ｉ型ＩＦＮ１６に対する細胞応答を阻害する（高悪性度ＨＰＶ悪性腫瘍の場合のように）。Ｇ−欠失ＶＳＶアッセイからのデータによって（下で考察するアッセイ、データは示さず）、ヒト上皮細胞株においてこの効果が再現されている。ＴＣ１細胞株におけるＥ６及びＥ７の発現を確認することで、ウイルスの腫瘍溶解に対する感受性の欠如は、Ｅ６及びＥ７はマウス組織においてＩ型ＩＦＮカスケードと相互作用できないことによって説明可能であり、したがって、このような効果は、その宿主であるヒト生物体へのＨＰＶの適応に特異的である。理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の著者らは、ＨＰＶ陽性ヒト腫瘍が感受性であることによって、本開示による組合せプライム：ブースト療法の効力がさらに増強され得ると考えている。
【００６２】
[0077]Ｍａｒａｂａウイルスは、ラブドウイルスファミリーのメンバーであるので、完全に核の外側で進行するウイルスのライフサイクルではＤＮＡは決して生産されないという事実からして、挿入変異誘発のリスクはもたらさない。宿主ゲノムへのアデノウイルス組み込みの頻度は低い。仮に、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７で形質導入された細胞が、ジンクフィンガー形成を防止する、上で考察した任意選択の突然変異を有するタンパク質をコードするＥ６Ｅ７導入遺伝子での組込み事象を受けていたなら、産生されたタンパク質は、ｐ５３又は網膜芽細胞腫の機能を妨げることができず、それにより、ｄｅ  ｎｏｖｏの新生物が形成する可能性が減少するであろう。
【００６３】
[0078]ＨＰＶ  １６及びＨＰＶ  １８由来のＥ６及びＥ７の完全長配列を含むことにより、ＨＰＶ関連がんを有する患者は、本開示による組合せプライム：ブースト療法による処置に適格とすることができる。組合せプライム：ブースト療法は、多数の潜在性エピトープに対する応答を誘発することができるかもしれない。
【００６４】
[0079]感染性疾患の処置におけるワクチンベースの療法の有効性は、多数のサイトカインを産生することができる防御性Ｔ細胞の能力に関連すると考えられる。例示的な組合せプライム：ブースト療法は、サイトカイン産生に関するＴ細胞のパターンによって規定される、Ｔ細胞の多数の様々な集団を誘導することが本明細書に示されている。一部の例では、サイトカイン陽性Ｔ細胞は、Ｅ７ペプチドの存在下で脱顆粒することができる。Ａｄ−Ｅ６Ｅ７単独の投与によって多機能性Ｔ細胞を誘導することができること、しかし、多機能性Ｔ細胞の数は、ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７でブーストした場合に増加すること、が本開示に例示されている。本開示による組合せプライム：ブースト療法を使用して多機能性Ｔ細胞を生じることができ、このことは、治療用ワクチンにとって有益であると考えられる。
【００６５】
[0080]本明細書で考察する実験によって例示されるように、本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法は、特異的な抗腫瘍細胞傷害性Ｔ細胞を生み出すことができ、そしてそのようなＣＤ８＋  Ｔ細胞が枯渇すると、有効性が喪失する。
【００６６】
[0081]理論に束縛されることを望むものではないが、本開示の著者らは、かなり大きな特異的免疫応答を生じることができる組合せプライム：ブースト療法が、おそらく進行した疾患を目の前にして、好ましい臨床結果をもたらすことになる、と考えている。本開示の著者らはまた、このような組合せプライム：ブースト療法によって、かかる応答が欠如した患者において特異的Ｅ６及び／又はＥ７応答を誘導するのに有用であり得ると、及び、このような組合せプライム：ブースト療法での処置によって患者の予後を改善することができると、考えている。進行性ＴＣ１腫瘍を治癒したマウスにおいて、本明細書で試験した例示的な組合せプライム：ブースト療法によって、時間と共にセントラルメモリー（central memory）Ｔ細胞が相対的に増殖する状態で、反応性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は顕著で永続性のある持続性を示す。セントラルメモリーＴ細胞の欠如は、治療用がんワクチン接種の失敗の１つの潜在的原因と考えられる。本明細書で考察する結果が示すところによれば、本開示による例示的な組合せプライム：ブースト療法によって、マウスにおいて、進行性ＨＰＶ陽性腫瘍のモデルを処置することが可能である。
［材料及び方法］
【００６７】
[0082]マウス
[0083]６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、特定の無菌条件に収容した。全ての動物試験は、ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物研究倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ）によって承認されたものであり、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）のガイドラインに準拠した。
【００６８】
[0084]組換えウイルス
[0085]コドン最適化導入遺伝子を、変異型弱毒化Ｅ６Ｅ７及びＷＴ  Ｅ６Ｅ７（ＧｅｎｓＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の配列をコードするように特異的に製造した。Ａｄ  ＢＨＧ及びＡｄ  Ｅ６Ｅ７は、ヒト血清型５複製欠陥性（Ｅ１／Ｅ３欠失）アデノウイルスである。Ａｄ  ＢＨＧは導入遺伝子を含有せず、ＡｄＥ６Ｅ７は弱毒化治療用Ｅ６Ｅ７構築物をコードする導入遺伝子を含有する。ＧＦＰ又はＥ６Ｅ７導入遺伝子を、Ｍａｒａｂａウイルスの弱毒化ＭＧ１株のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子との間に挿入して、それぞれＭＧ１  ＧＦＰ及びＭＧ１  Ｅ６Ｅ７を産生した。
【００６９】
[0086]細胞培養
[0087]ＨＰＶ  １６由来のＥ６及びＥ７を発現するマウスＴＣ１細胞を、ウシ胎仔血清１０％、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／ｌ、Ｌ−グルタミン  ２ｍｍｏｌ／ｌ及びＧ４１８（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ  Ｌｏｉｓ、ＭＯ）４００μｇ／ｍｌを含有するＲＰＭＩ中で増殖させた。Ｖｅｒｏ、Ｌ９２９及びＡ５４９細胞を、ウシ胎仔血清８％及びＬ−グルタミン  ２ｍｍｏｌ／ｌを含有するαＭＥＭ中で全て培養した。ＳａＯＳ２細胞を、ウシ胎仔血清１０％及びＬ−グルタミン  ２ｍｍｏｌ／ｌを含有するＤＭＥＭ中で培養した。Ｐａｎｃ０２細胞を、ウシ胎仔血清１０％及びＬ−グルタミン  ２ｍｍｏｌ／ｌを含有するＲＰＭＩ中で培養した。
【００７０】
[0088]ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染
[0089]コンフルエントなＴＣ１細胞を含有する６枚のウェルプレート（１ウェルあたりおよそ１．５×１０６）を、低下感染多重度（１０〜０．００１並びに非感染対照ウェル）にて２００μｌの培養培地中で４５分間感染させ、感染後に、新鮮な培地を加え、感染後４８時間で、細胞をメタノールで固定し、生存率のために２０％エタノール中の０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ  Ｓｔ  Ｌｏｉｓ、ＭＯ）で染色した。
【００７１】
[0090]インターフェロンβ応答試験
[0091]ＩＦＮβ応答性Ｌ９２９及びＩＦＮβ耐性Ｐａｎｃ０２細胞株を、９６ウェルプレート中のＴＣ１細胞と一緒に播種し、コンフルエンスに至ったら、マウスＩＦＮβの希釈系列で一晩処理した。翌日、細胞を、ＧＦＰを発現する野生型ＶＳＶ  １ウェルあたり５×１０５ＰＦＵで感染させた。Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を使用して、感染の２４時間後に蛍光を検出した。
【００７２】
[0092]ヒト上皮腫瘍細胞における先天性抗ウイルス応答に対するＥ６及びＥ７の効果を決定するためのＧ欠失ＶＳＶアッセイ
【００７３】
[0093]Ａ５４９ヒト肺腺がん細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＶＳＶ糖タンパク質をコードするプラスミド（ＰＳＧ５−Ｇ）と組み合わせて目的のプラスミドを、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、同時トランスフェクトした。その後、細胞を、ＧＦＰを発現するＧ欠失ＶＳＶで感染させ、上清を回収した。任意のレスキューウイルス子孫を含有する上清を採取し、連続希釈液を使用して９６ウェルプレートのコンフルエントＶｅｒｏ細胞に感染させ、これを蛍光に対して画像化した。ＰＳＧ５−Ｇを首尾良くトランスフェクトされ、そして目的のトランスフェクトプラスミドによる抗ウイルス状態の阻害を有する細胞のみが、蛍光によって検出されるウイルス子孫を産生することができる。
【００７４】
[0094]一過性トランスフェクション
[0095]播種したＡ５４９細胞は６枚のウェルプレートにあり、８０％コンフルエントとなったとき、リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ＨＰＶ  １６及び１８由来の野生型Ｅ６Ｅ７  ２μｇ、弱毒化Ｅ６Ｅ７導入遺伝子又はｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）中のＧＦＰをトランスフェクトした。ＳａＯＳ２細胞に、ｐｃＤＮＡ３中のＨＡタグ化網膜芽細胞腫（Ｊｏｅ  Ｍｙｍｒｙｋからの寄贈）、ＧＦＰ、及びＷＴ  Ｅ６Ｅ７、弱毒化Ｅ６Ｅ７又は空のｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのうちの１つを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４〜４８時間後に、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ）プロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を補充した放射免疫沈降アッセイバッファ１００μｌ中で細胞を溶解させた。
【００７５】
[0096]ウエスタンブロット及び抗体
[0097]ポリアクリルアミドゲル上に１レーン当たりに等量（２０又は３０μｇ）のタンパク質溶解物をロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、０．４５μｍのニトロセルロース膜に転写した。膜を、室温で４０分間、ＰＢＳ中５％無脂肪ミルク又はオデッセイブロッキングバッファ（Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＬＩ  ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）のいずれかでブロックした。ｐ５３（クローン  ＤＯ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、ＨＡ（クローン  Ｆ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、Ｅ７（クローン  ８Ｅ２、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）、β−アクチン（クローン  １３Ｅ５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）及びＧＦＰ（クローン  Ｄ５．１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）に対する抗体で膜をプローブした。次いで、膜を二次ＩＲＤｙｅ（ＬＩ  ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）抗体でプローブした。膜をスキャンし、ＬＩ  ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ  ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して蛍光を定量化した。
【００７６】
[0098]マウスのワクチン接種
[0099]アデノウイルスを、注射用０．９％ＮａＣｌ（Ｈｏｓｐｉｒａ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）１００μｌの２×１０８ＰＦＵ用量でガス全身麻酔下で投与したが、用量は二分割し、５０μｌを両方の後肢の半膜様筋に注射した。ＴＣ１腫瘍の直接腫瘍溶解については、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１  ＧＦＰを、４８時間離れて与えた３用量で、０．９％ＮａＣｌ  ２００μｌ中の５×１０８ＰＦＵ用量で静脈内に注射した。ブーストとして使用する場合、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１  ＧＦＰ又はＥ６Ｅ７を、アデノウイルスワクチン接種の９日後に、単回用量として０．９％ＮａＣｌ  ２００μｌ中の１×１０９ＰＦＵの用量で投与した。
【００７７】
[00100]腫瘍チャレンジ
[00101]マウスに、ガス全身麻酔下で皮下に１×１０６個のＴＣ１細胞を移植した。腫瘍の最長軸（長さ）及びこれに対する直交軸（幅）を２〜３日毎に測定し、以下の式を使用して腫瘍容積を計算した：
[00102]容積＝４／３π（０．５長さ×０．５幅２）
【００７８】
[00103]腫瘍保有マウスの処置を、移植マウスにおいて２５０ｍｍ３の平均腫瘍容積に至ったときに開始した。腫瘍が１５００ｍｍ３の容積まで増殖した場合、又はマウスが腫瘍移植前に記録された重さに対してその体重の２０％を失った場合、マウスは終点に至った。
【００７９】
[00104]ペプチド
[00105]ＨＰＶ血清型１６由来の既知の免疫優性ペプチドを、Ｂｉｏｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）によって合成した。使用したＨ−２Ｋｂ結合Ｅ６ペプチドの配列はＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ（配列番号１６）であり、使用したＨ−２Ｄｂ結合Ｅ７ペプチドの配列は、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号１７）であった。
【００８０】
[00106]細胞内サイトカイン染色及び抗体
[00107]血液試料をアデノウイルスワクチン接種の８日後及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１処置の５日後に取得し、Ｍａｒａｂａの５日後に脾臓も回収した。末梢血単核細胞及び脾臓細胞を、ペプチド２μｇ／ｍｌ及び抗ＣＤ１０７ａ（クローン  １Ｄ４Ｂ、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を含む完全ＲＰＭＩ（ウシ胎仔血清１０％及びＬ−グルタミン  ２ｍｍｏｌ／ｌを含有する）中でインキュベートした。インキュベーションを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で湿度９５％にて計５時間行い、ブレフェルジンＡ（ゴルジプラグ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）１μｇ／ｍｌを最後の４時間に添加した。次いで、細胞を抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン  ２．４Ｇ２、Ｍｏｕｓｅ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と共にインキュベートした。ＣＤ８ａ（クローン  ５３−６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＣＤ４（クローン  ＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対する抗体でＴ細胞表面染色を行った。続いて、細胞を固定し、透過処理した（サイトフィックス／サイトパーム（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ）、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）。次いで、ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＴＮＦα（クローンＭＰ６−ＸＴ２２、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）及びＩＬ−２（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に対する抗体を使用して細胞内サイトカイン染色を行った。データは、ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡサイトメーター（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｍａｃソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で解析した。
【００８１】
[00108]Ｔ細胞カウント
[00109]ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＣＤ４（クローンＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に対する抗体で染色された全血５０μｌに、既知量の蛍光ビーズ（１２３カウント  ｅビーズ（１２３ｃｏｕｎｔ  ｅＢｅａｄｓ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加し、及び固定すると共に溶解させた（１ステップフィックス／ライゼソリューション（１−ｓｔｅｐ  Ｆｉｘ／Ｌｙｓｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。２回の洗浄ステップの後、細胞及びビーズをＦＡＣＳに再懸濁させ、絶対細胞数を計算した。脾臓細胞の計数については、脾臓全体を処理し、完全ＲＰＭＩに再懸濁させ、次いで、再懸濁脾臓細胞５０μｌを末梢血に関して分析した。各マウスのグラム表示の体重を７０倍してμｌ表示で総血液量を計算し、したがって、それによって、Ｔ細胞の総循環カウントが可能となった。
【００８２】
[00110]Ｔ細胞メモリー表現型及び抗体
[00111]ＰＢＭＧ及び脾臓細胞を、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、マウスＢＤ  Ｆｃ  ブロック（Ｍｏｕｓｅ  ＢＤ  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ）、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を、ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＭＥＬ−１４、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＣＤ１２７（クローンＳＢ／１９９、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、及びＨＰＶ  Ｈ−２Ｄｂ  Ｅ７四量体ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）に対する抗体で染色した。
【００８３】
[00112]枯渇抗体
[00113]４８時間離れて与えた２用量の抗ＣＤ８ａ（２．４３クローン）クローン又は抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）クローンを使用して、Ｔ細胞を選択的に枯渇させた。マウスに０．９％ＮａＣｌ  ３００μｌ中の抗体２００μｇを腹腔内注射した。ＣＤ８ａ及びＣＤ４に対して染色した末梢血試料から、枯渇についてフローサイトメトリー的に評価した。
【００８４】
[00114]統計解析
[00115]Ｍａｃ用グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）バージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してデータを図形表示及び解析した。トランスフェクション及び免疫応答データを平均及び表示されている平均の標準誤差と共に縦棒グラフとしてプロットした。２つの群を比較する場合は対応のないＴ検定を使用し、ＡＮＯＶＡ検定を使用して３つ以上の群を比較した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を使用して生存率をプロットし、ログランク検定を使用して生存期間中央値を比較した。統計的有意性は、ｐ≦０．０５（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）と規定した。
【実施例】
【００８５】
[00116]説明を明瞭にするために、以下の例においてウイルスによってコードされるＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７融合タンパク質は、配列番号１に従う配列を有する。それは「弱毒化治療用Ｅ６Ｅ７構築物」と呼ぶことができる。
【００８６】
[00117]実施例１：弱毒化Ｅ６Ｅ７導入遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｐ５３又は網膜芽細胞腫を分解しない
[00118]本開示によるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の一例を設計し、アデノウイルス及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ウイルスにクローニングした。例示的な融合タンパク質は、ＨＰＶの１６血清型及び１８血清型のＥ６形質転換タンパク質及びＥ７形質転換タンパク質に基づいた。４つのタンパク質ドメインのそれぞれの間にＧＧＧＧＧＡＡＹリンカーを含めて、プロテアソーム分解を促進し、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質を生じさせた。ＨＰＶ１６  Ｅ６及びＨＰＶ１８  Ｅ６ドメインの両方において、ｐ５３の分解を媒介するジンクフィンガーを形成するように機能する４つのＣＸＸＣモチーフのうちの２つに対して欠失型突然変異を行った。突然変異導入遺伝子のＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７ドメインの両方において、カルボキシ末端ＣＸＸＣモチーフのうちの１つに欠失を適用し、並びに、ＨＰＶ誘発がんにおいて網膜芽腫の機能不全の原因となるＬＸＣＸＥ配列に欠失を適用した。例示的な突然変異導入遺伝子は、配列番号１に従う配列を有し、図１に例示してあり、図で、第１の及び第２のタンパク質ドメインがそれぞれＨＰＶ１６  Ｅ６及びＨＰＶ１８  Ｅ６に相応し、第３の及び第４のタンパク質ドメインがそれぞれＨＰＶ１６  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７に相応し、ＧＧＧＧＧＡＡＹリンカーは強調表示されていない。
【００８７】
[00119]野生型ｐ５３を含有するＡ５４９細胞に、Ｅ６Ｅ７導入遺伝子の野生型配列、突然変異Ｅ６Ｅ７導入遺伝子、又は無関係な対照プラスミド（ＧＦＰ）を含有する発現ベクターをトランスフェクトし、続いて、ｐ５３のレベルをウエスタンブロットによって定量化した。野生型導入遺伝子配列でｐ５３の分解が認められた。しかし、この活性は、コントロール（ＧＦＰ）プラスミドに比較して、上で考察した、治療用導入遺伝子に導入された突然変異によって阻害された。ｐ５３レベルに関連する実験のウエスタンブロットデータは図２に要約されており、図２が示すところによれば、野生型Ｅ６Ｅ７導入遺伝子が発現するとｐ５３の分解がもたらされるが、一方、変異型Ｅ６Ｅ７ではｐ５３タンパク質レベルはインタクトのままである。
【００８８】
[00120]平行セットの実験では、ＧＦＰをコードするプラスミドと一緒にＨＡ−タグ化網膜芽細胞腫（ｐＲｂ）をコードする発現プラスミド、並びに次の３つ：ＷＴ  Ｅ６Ｅ７導入遺伝子、突然変異治療用導入遺伝子、又は対照プラスミドをコードする発現ベクターのうちの１つを、網膜芽腫−ヌル細胞株ＳａＯＳ２に、同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、ウエスタンブロットを使用してＨＡタグ化網膜芽細胞腫のレベルを定量化した。ＷＴ  Ｅ６Ｅ７トランスフェクト細胞溶解物では有意な減少が観察されたが、これに対して、対照プラスミド及び変異型Ｅ６Ｅ７の発現は定常状態のｐＲｂレベルに影響を及ぼさなかった。ウエスタンブロットデータを例示する標準化グラフを図３に示す。
【００８９】
[00121]要約すると、野生型配列における特定のアミノ酸の欠失によって、それぞれｐ５３腫瘍抑制タンパク質及び網膜芽細胞腫腫瘍抑制タンパク質とのＥ６及びＥ７タンパク質の相互作用と関連して、Ｅ６及びＥ７タンパク質の形質転換活性が防止され、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した場合、ワクチンベクターの発がん性が低下する。
【００９０】
[00122]実施例２：ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を発現するアデノウイルスプライミングベクター及びＭａｒａｂａ  ＭＧ１ワクチンベクターの構築及び免疫試験：
[00123]本開示による例示的な方法において、腫瘍溶解性ワクチン接種戦略を試験した。例示的な方法では、治療用Ｅ６Ｅ７（Ａｄ−Ｅ６Ｅ７）導入遺伝子をコードするアデノウイルスプライム、続いて、同じ導入遺伝子をコードするＭＧ１  Ｍａｒａｂａウイルスブースト（ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７）を使用した。ウイルスをマウスに投与し、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用して免疫応答を定量化した。比較のために、シャムプライム（Ａｄ−ＢＨＧ）群及びシャムブースト（ＭＧ１−ＧＦＰ）群も分析した。
【００９１】
[00124]材料及び方法のセクションで上述のように、Ａｄ−ＢＨＧ及びＡｄ−Ｅ６Ｅ７は、ヒト血清型５複製欠陥性（Ｅ１／Ｅ３欠損）アデノウイルスである。Ａｄ  ＢＨＧは導入遺伝子を含有せず、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７は弱毒化治療用Ｅ６Ｅ７構築物をコードする導入遺伝子を含有する。ＧＦＰ又はＥ６Ｅ７導入遺伝子を、Ｍａｒａｂａウイルスの弱毒化ＭＧ１株のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子の間に挿入して、それぞれＭＧ１−ＧＦＰ及びＭＧ１−Ｅ６Ｅ７を産生した。
【００９２】
[00125]末梢血単核細胞を、既知のＥ６（ＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ）及びＥ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）Ｃ５７ＢＬ／６  ＣＤ８＋エピトープで再刺激した。Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライムの後の血液試料によって、ＣＤ８＋  Ｔ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の産生によりＥ６及びＥ７エピトープの両方に対して特異的応答が生じることが明らかとなった。Ｅ６エピトープによる刺激でＣＤ８＋  Ｔ細胞の約１％がＩＦＮγを分泌し、Ｅ７エピトープによる刺激でＣＤ８＋  Ｔ細胞の約１０％がＩＦＮγを分泌した。シャムプライム後には応答はまったく見られなかった。シャムプライムに続いてＭＧ１  Ｅ６Ｅ７を投与した後に小さな応答が見られた（Ｅ６及びＥ７ペプチドに対するＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の平均頻度は、それぞれ、０．０４２％及び０．２１％）。しかし、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライムに続いてＭＧ１  Ｅ６Ｅ７を投与されたマウスは、ＩＦＮγ＋Ｔ細胞頻度の有意な増加を示した。ここでも、このＥ７ペプチドでの再刺激に続いてＩＦＮγ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の平均頻度は６８．８７％であり、Ｅ７エピトープは、優性であると思えた。これらのデータを図４Ａ〜図４Ｄにまとめる。
【００９３】
[00126]Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブーストに比較して、ＡｄＥ６Ｅ７単独で生じた免疫応答の真の大きさを比較するために、マウスの部分集団を時間ブースティング後に殺処分し、Ｅ７ペプチドで再刺激後ＩＣＳを再度行い、細胞数をフローサイトメトリー的に計数するために特異的に設計された蛍光マイクロ粒子ビーズを使用して末梢血及び脾臓ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数を定量化した。
【００９４】
[00127]図５Ａ〜５Ｂに例示するように、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブーストによって、ＡｄＥ６Ｅ７単独に比較して、合計の及びＥ７特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞集団の著しく高度に有意な増殖が誘導された。Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブーストによって、総数６．５×１０７個のＣＤ８＋  Ｔ細胞が生じた。Ｅ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の脾臓プールと循環プールとを合わせると、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブースト後に、平均絶対数４．１×１０７個が生じた（ｎ＝１０、範囲＝２．４〜５．１×１０７）。腫瘍抗原として例示的なＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７融合タンパク質を使用する組合せプライム：ブースト療法によれば、エフェクター細胞の広範囲にわたる増殖を伴って、Ｅ６及びＥ７エピトープに対する特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を生み出すことができた。
【００９５】
[00128]応答反応速度論もまた、例示的な組合せプライム：ブースト療法について測定した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ピーク時に全末梢ＣＤ８＋  Ｔ細胞のうち５０％を超えて応答する。後の時点では、Ｅ７において既知の単一のＣ５７／Ｂ６エピトープに対して測定して、末梢ＣＤ８＋  Ｔ細胞のうち２０％超が導入遺伝子に応答した。このデータを図６に例示する。
【００９６】
[00129]比較例３：ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質を発現するレンチウイルスプライミングベクター及び腫瘍溶解性ワクチンベクターの構築及び免疫試験：
[00130]ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を発現するレンチウイルスを、比較プライミングウイルスとして試験した。
【００９７】
[00131]ＨＰＶ導入遺伝子は、ＨＰＶ血清型１６の完全長野生型Ｅ６（ｇｉ／４９２７７２０／ｇｂ／ＡＡＤ３３２５２．１／ＡＦ１２５６７３＿１  Ｅ６ヒトパピローマウイルス１６型）及びＥ７（ｇｉ／４９２７７２１／ｇｂ／ＡＡＤ３３２５３．１／ＡＦ１２５６７３＿２  Ｅ７ヒトパピローマウイルス１６型）配列、並びにＨＰＶ血清型１８の完全長野生型Ｅ６（ｇｉ／１３７７５８／ｓｐ／Ｐ０６４６３．１／ＶＥ６＿ＨＰＶ１８  ＲｅｃＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ６）及びＥ７（ｇｉ／１３７７９２／ｓｐ／Ｐ０６７８８．２／ＶＥ７＿ＨＰＶ１８  ＲｅｃＮａｍｅ：Ｆｕｌｌ＝Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ７）配列の融合物であり、Ｒｂ又はｐ５３結合に必要なジンクフィンガーを除去するために（タンパク質の発がん性の除去）４つのヌクレオチド配列全てにおいて欠失を有する。結果として得られる融合タンパク質は、フレキシブルなグリシンリンカー＋ＡＡＹ配列（各抗原が、抗原提示のために通常生み出されるペプチドにタンパク質分解的に分解されることを確実にする、プロテアソーム切断部位として働く）を有する。このコドン最適化融合ヌクレオチド配列によって、アミノ酸５２７個のＨＰＶ１６／１８  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質（配列番号１）が生じる。
【００９８】
[00132]ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を発現するレンチウイルスは、ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターを使用して作製した。ＥｃｏＲＩ制限部位（フォワードプライマーＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＧＡＡＣＴＧＣ、配列番号１８）及びＢａｍＨＩ制限部位（リバースプライマーＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣ、配列番号１９）を含有するプライマーを使用して、改変ＨＰＶ導入遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＨＰＶ導入遺伝子のＰＣＲ産物をアガロースゲル精製した。ｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位で切断してｅＧＦＰを除去し、アガロースゲル精製し、ＣＩＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  １８００９−０１９）を使用する脱リン酸化に共した。次いで、切断ベクターをさらなるアガロースゲル精製に供した。次いで、ＨＰＶ導入遺伝子のＰＣＲ産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ベクターに連結反応させた。連結反応の反応物をコンピテント細胞を使用する形質転換に供し、陽性コロニーからのプラスミドＤＮＡをミニプレップ増幅に供した。次いで、改変ＨＰＶ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクターをマキシプレップ増幅に供した。３種のプラスミド：改変ＨＰＶ導入遺伝子を発現するｐＤＹ．ＥＧ．ＷＳレンチウイルスベクター、パッケージングｐＣＭＶ−８．８４プラスミド、及びエンベロープｐＭＤ２Ｇプラスミド、のそれぞれ６．４μｇをトランスフェクトした後に、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を発現するレンチウイルスを２９３Ｔ細胞上でレスキューした。ウイルス上清をプールし、０．４５μＭフィルターを通して濾過し、５０，０００×ｇ、１６℃で１２０分間遠心分離した。ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を発現するレンチウイルスをＰＢＳに再懸濁し、−８０℃で保存した。
【００９９】
[00133]ＭａｒａｂａウイルスのＭＧ１二重変異体のＧウイルス遺伝子とＬウイルス遺伝子との間に挿入されたパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合導入遺伝子を含有するように、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１を操作した（Ｂｒｕｎ  Ｊ．ら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１４４０〜１４４９）。導入遺伝子配列（配列番号２）を、哺乳動物細胞における発現向けにコドン最適化した。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を含有する、結果として得られるＭａｒａｂａ  ＭＧ１は、一般的に「Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７」と指定する。クローニングを容易にするために改変Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１骨格を使用した。Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ゲノム骨格のＬ遺伝子にサイレント突然変異を導入して、ＭｌｕＩ部位のうちの１つを除去した。第２のＭｌｕＩ部位を、ＧとＬとの間のクローニング領域にてＢｓｉＷＩ部位に置き換えた。シャトルプラスミドｐＭＲＢ−ＭＧ１／ｐＮＦの使用が避けられるので、Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ゲノム骨格に対するこれらの改変によって、Ｂｒｕｎらの論文に記載のものよりも直接的なクローニング系が可能になった。ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合導入遺伝子配列を、そのＭｌｕＩ部位及びＢｓｉＷＩ部位（ＧとＬとの間のクローニング領域で）で改変Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１ゲノム骨格に連結反応させた。次いで、Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７をレスキューし（Ｂｒｕｎら、（２０１０）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：１４４０〜１４４９に先に記載されているように）、１回プラーク精製し、オプティプレップ精製に供した。本例で使用したＭａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７は、配列番号４の逆相補鎖及びＲＮＡバージョンであるゲノム配列を有する。
【０１００】
[00134]一般に、０日目にプライミングベクター（レンチウイルス−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７＋アジュバントとしてのポリｌ：Ｃ）の投与によって、及び１４日目に１ｅ９  ＰＦＵのブースティングベクター（Ｍａｒａｂａ−ＭＧ１−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７）の投与によって、動物を免疫した。対照である非免疫原性導入遺伝子の挿入としてＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７導入遺伝子の代わりにＧＦＰをコードするウイルスベクターで対照動物をプライム：ブーストした。プライム応答の分析を、１４日目に及びブースト応答の分析を１９日目に行った。各レンチウイルスＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７調製物を、アジュバントとしてポリＩ：Ｃ  ２５０μｇをプライミングウイルスに添加して、作製し、次いで、各ウイルスについて５匹の動物の間で分割した。マウスをイソフルランで麻酔し、レンチウイルス−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７／ポリＩ：Ｃ  ３０ｕＬを各後足のパッドに注射した。残りのウイルスは、左鼠径リンパ節の近くに皮下注射した。プライムの１４日後、血液を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。次いで、マウスをＭＧ１−ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７  １×１０９ＰＦＵによって静脈内でブーストした。ブースト後５日目に、血液を採取し、免疫応答をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１０１】
[00135]免疫分析を以下のように行った：ヘパリン処理毛細管を使用して眼窩後出血を介して血液を採取し、血液をヘパリンへと採取した。次いで、ＡＣＫ溶解バッファを使用して赤血球細胞を溶解させ、結果として得られるＰＢＭＣを腫瘍抗原に対する免疫応答について分析した。ＰＢＭＣを、ペプチドの非存在下でインキュベートするか、又はゴルジプラグを刺激へと１時間添加しながらペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）２μｇ／ｍＬで合計５時間刺激するか、いずれかとした。刺激後、ＰＢＭＣをＣＤ４、ＣＤ８及びＩＦＮγについて染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ及びＦｌｏｗＪｏで分析した。ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）後に、フローサイトメトリーによって応答するＴ細胞を検出した。非刺激ＰＢＭＣよりの値を、バックグラウンドと考え、刺激ＰＢＭＣより得た値から差し引いた。データは、平均＋／−ＳＥＭを表す。表２において、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ペプチドは、免疫応答の存在を示すＣＤ８細胞におけるＩＦＮ−γ産生を刺激することができたことが実証されている。
2019514988.tif 000003
【０１０２】
[00136]実施例４．腫瘍溶解性ワクチン接種は多機能性Ｔ細胞を生じる
[00137]生じたＴ細胞応答の質をさらに評価するために、Ｅ７ペプチドによる再刺激後のＡｄ−Ｅ６Ｅ７プライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブーストでワクチン接種したマウスの血液及び脾臓組織について多機能性Ｔ細胞分析を行った。比較のために、ＡｄＥ６Ｅ７単独を受けた一群のマウスを使用した。
【０１０３】
[00138]ＡｄＥ６Ｅ７単独又はその後のＭＧ１−Ｅ６Ｅ７によるいずれかのワクチン接種によって、循環プール及び脾臓プールで見い出される、二重陽性（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）及び三重陽性（ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２）ＣＤ８＋  Ｔ細胞を生じることができた。これらのデータを図７Ａ〜図７Ｄに例示する。
【０１０４】
[00139]図７Ａ〜図７Ｄのデータによって例示されるように、循環の並びに脾臓の、二重陽性及び三重陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞を計数した場合、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブーストレジメンを受けたマウスは、両場所において２つの集団のうち有意に高かった。脱顆粒マーカー、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）もまた、多機能分析に含めたが、Ｅ７ペプチドに応答してなんらかのサイトカインを産生した事実上全ての細胞が、このマーカーに対して陽性であった。ＡｄＥ６Ｅ７によるワクチン接種は、Ｅ７ペプチドに応答して複数のエフェクターサイトカインを分泌することが可能なＣＤ８＋  Ｔ細胞を生み出し、少数ではあるが、かかるマウスがＭＧ１  Ｅ６Ｅ７ブーストを受けた場合、劇的で有意な増殖がこれらの集団において見られた。
【０１０５】
[00140]実施例５．腫瘍溶解性Ｅ６Ｅ７ワクチン接種は、ＨＰＶ陽性がん腫の進行性モデルを保有するマウスをＣＤ８＋依存性様式で治療する
[00141]Ｃ５７ＢＬ／６細胞株ＴＣ１を、ＨＰＶ誘発性がんのマウスモデルとして取得し、Ｅ６及びＥ７抗原の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。皮下移植後、マウスの腫瘍が進行性容積（２５０ｍｍ３）に至ったときにＡｄ−Ｅ６Ｅ７プライムをマウスに与えた。腫瘍保有動物における細胞内染色によって、Ｅ６及びＥ７ペプチドの両方に対する特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が明らかになった。さらに、Ｅ７特異的Ｔ細胞の有意な増殖が、他の全ての群と比較して、ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７でブーストした後に記録された。これらのデータを図８Ａ及び図８Ｂに示す。
【０１０６】
[00142]同じ処理療法及び対照療法を受けた腫瘍フリーのマウスは同様の結果を提示した（データは示さず）。
【０１０７】
[00143]自発性免疫は、未処理の動物では認められなかった。エンドポイント容積（１５００ｍｍ３）に至るか、又はマウスが悪液質のためにボディマスの２０％を失うかいずれかのときにマウスを殺処分した。
【０１０８】
[00144]全ての未処置マウスは腫瘍進行に屈した、一方、シャムＡｄ−ＢＨＧプライム：ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブースト；又はＡｄ−Ｅ６−Ｅ７プライム：シャムＭＧ１−ＧＦＰブーストのいずれかでの処置は、腫瘍進行を遅延させたが、まれに治癒的であった。しかし、Ａｄ−Ｅ６Ｅ７プライムでの、その後ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブーストによる、進行性ＴＣ１腫瘍を保有するマウスの処置は、７５％のマウス（ｎ＝１２）において永続性のある治癒という結果になった。生存率対時間を図９に例示する。
【０１０９】
[00145]治癒レジメンで処置したマウスでは、ブースティングの２日前及び続いてブーストの４０日後（「ＣＤ８」）のＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇は、腫瘍制御の喪失という結果になり、後の時点のみでＣＤ８＋細胞が枯渇した場合（「ＣＤ８後期」）、又はブースティングに先立つ２日前にＣＤ４＋細胞が枯渇した場合（「ＣＤ４」）には、こういった影響は見られなかった。対照には、組合せプライム：ブースト療法では処置されなかったマウスが含まれ、例示的な組合せプライム：ブースト療法で処置されたマウスは、処置レジメン中にＣＤ８又はＣＤ４細胞が枯渇しなかった。生存率対時間を図１０に例示する。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇は、方法のセクションで上で考察したように、抗ＣＤ８ａ（２．４３クローン）クローン又は抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）クローンを使用して行われた。
【０１１０】
[00146]プライムとしてのＡｄ−Ｅ６Ｅ７及びブーストとしてのＭＧ１−Ｅ６Ｅ７を使用する例示的な組合せプライム：ブースト療法によって、進行性の測定可能な疾患を有するＨＰＶのマウスモデルにおいてＥ６及びＥ７抗原に対する特異的免疫を生じることができ、ＣＤ８＋依存性様式で永続性のある治癒がもたらされる。
【０１１１】
[00147]実施例６．治癒マウスは、メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の優位で長時間持続する抗原特異的免疫を有している
[00148]進行性ＴＣ１腫瘍から治癒した実施例５由来のマウスの部分集団については、さらに免疫分析を行ってＣＤ８＋  Ｔ細胞のメモリー表現型を評価した。治癒マウス由来の循環及び脾臓Ｔ細胞を、Ｅ７特異的四量体（Ｈ−２Ｄ（ｂ）上のＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）で標識し、ＭＧ１−Ｅ６Ｅ７ブースティングの６２日後及び１１７日後にＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７について染色を行った。
【０１１２】
[00149]免疫分析によって、血液及び脾臓において長期の両時点でＥ７特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の有意な持続性が明らかになった。特定の細胞の大部分は、エフェクターメモリー表現型のものであり、図１１Ａ及び図１１Ｂに例示のように、血液と脾臓の間で分布していた。
【０１１３】
[00150]セントラルメモリーＴ細胞の相対的な割合は、ブースティングと分析との間の間隔と相まって上昇した（ブーストして１１７日後で血液中１１．８％及び脾臓中１８．８％に比較してブーストして６２日後で血液中５．１％及び脾臓中９．４％）。データを表５に示す。
2019514988.tif 000004
【０１１４】
[00151]腫瘍溶解性Ｅ６Ｅ７ワクチン接種によって、進行性ＴＣ１腫瘍から治癒したマウスにおいて長時間持続するＣＤ８＋免疫メモリーが生じる。
【０１１５】
[00152]実施例７．腫瘍フリーマウスにおける特異的免疫応答の誘発の評価
[00153]雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに総用量２ｅ８  ＰＦＵでｉ．ｍ．でＡｄ−ｈｕＳＴＥＡＰを投与した（１ｅ８  ＰＦＵ  ５０μＬを各肢にｉ．ｍ．で与えた）。ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰを、図１２に例示の処置概略に従って用量１ｅ９  ＰＦＵでｉ．ｖ．投与した。
【０１１６】
[00154]免疫分析を、１３日目（ブースト前）及び１９日目（ピークブースト）に行った。免疫分析を、ｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激によってＰＢＭＣに関して完了し、サイトカインのパネルについて染色して、ＳＴＥＡＰ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の量を評価した。表１に列記の全ペプチドを個々に使用して、Ｔ細胞がどのペプチドに応答しているか、及びペプチドはヒト導入遺伝子特異的であるかどうか又はマウス配列と交差反応することができるかどうかを判定した。
2019514988.tif 000005
【０１１７】
[00155]Ａｄ−ｈｕＳＴＥＡＰ免疫化は、免疫応答をプライミングすることができた。最も大きな応答は、ｈｕ３２７−３３５ペプチドの再刺激において観察された。ｍｕ３２７再刺激、並びに保存された１８６〜１９３及び５〜１３の再刺激においても免疫応答が観察された。これらのデータを図１３に例示する。ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰに続いて、保存された５〜１３ペプチドを除く全てのペプチドで、免疫応答のブーストが観察された。プライム免疫分析と同様に、ｈｕ３２７−３３５再刺激は最大の抗ＳＴＥＡＰ応答をもたらした。これらのデータを図１４に例示する。
【０１１８】
[00156]実施例８．ＴｒａｍｐＣ２前立腺がんモデルにおける免疫誘導及び有効性
[00157]雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、左脇腹にＴｒａｍｐＣ２細胞２．５ｅ６をｓ．ｑ．移植し、腫瘍を３３日間増殖させた。マウスを表２に示す３群のうちの１つに割り当てた。この実験では雄マウスを使用したので、マウスをケージで交換できない。最適な腫瘍容積開始点（平均及び分散）を得るために、２つのケージを１つの群に組み合わせて、所望の平均腫瘍容積を得た。
2019514988.tif 000006
【０１１９】
[00158]Ａｄ−ｈｕＳＴＥＡＰを、総用量２ｅ８  ＰＦＵでｉ．ｍ．で投与した（１ｅ８  ＰＦＵ  ５０μＬを各後肢にｉ．ｍ．で与えた）。ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰを用量１ｅ９でｉ．ｖ．投与した。処置概略を図１５に例示する。
【０１２０】
[00159]免疫分析を８日目（プライム分析）及び１４日目（ピークブースト）に行った。免疫分析を、ｅｘ  ｖｉｖｏペプチド再刺激によってＰＢＭＣに関して完了し、サイトカインのパネルについて染色して、ＳＴＥＡＰ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の量を評価した。マウス特異的ペプチド（１８６〜１９３、ｍｕ３２７〜３３５、５〜１３、表１参照）のプールを使用してＰＢＭＣの再刺激を行った。
【０１２１】
[00160]全てのマウスについて生存を記録した。腫瘍容積が１５００ｍｍ３に至った場合マウスはエンドポイントにあると考えた。腫瘍容積を計算するために、次式を利用した：容積＝（４／３）＊３．１４１５９＊（Ｌ／２）＊（（Ｗ／２）２）。
【０１２２】
[00161]Ａｄ−ｈｕＳＴＥＡＰ後に生じた平均免疫応答は、腫瘍フリーの試験のものに比較して減少した（０．１５％対５％）。しかし、ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰ投与後、およそ１５％の平均ブースト応答は、腫瘍フリーの実験で観察されたものに近かった（およそ１７％）。これらのデータをそれぞれ図１６及び図１７に例示する。
【０１２３】
[00162]図１８に例示するように、ＴｒａｍｐＣ２腫瘍増殖は、Ａｄ−ｈｕＳＴＥＡＰ投与の３日以内にＡｄ−ｈｕＳＴＥＡＰにより抑えられた。腫瘍が徐々に増殖し始めたとき、ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰに続いてもう１０日間、腫瘍制御は継続した。しかし、ＭＧ１−ＧＦＰは、腫瘍増殖において２〜３日の小さなプラトーを持つ非常に限られた効果しか有さず、その後、腫瘍は増殖して対照サイズに戻り、実験の残りの部分を通し継続して対照動物と同様であった。Ａｄ−ＢＨＧ／ＭＧ１−ＧＦＰによる処置は生存に影響を与えなかった。しかし、Ａｄ：ＭＧ１−ｈｕＳＴＥＡＰでの処置によって、図１９で分かるように、有意な延命効果がもたらされた。
【０１２４】
[00163]前述の説明では、説明の目的のために、多数の詳細が、本例の完全な理解を提供するべく記載されている。上記の例は単なる例示であるものとする。当業者であれば、ここに添付の特許請求の範囲のみによって規定される本発明の範囲を逸脱せずに、特定の例に対して変更、修正及び変形形態をもたらすことができる。
【０１２５】
付属書Ａ−タンパク質及びヌクレオチド配列
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号１）：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQ*
注記：ボールド／イタリックで特定されているジアミノ酸（すなわちＤＫ、ＩＮ、ＨＫ及びＬＲ）は、野生型配列に普通なら見い出されるＣＸＸＣモチーフのＸＸアミノ酸に相応し、この場合、システインを欠失させた；及び、下線で特定されているジアミノ酸は、野生型配列に普通なら見い出されるＬＸＣＸＥモチーフのＬＸアミノ酸に相応し、この場合、ＣＸＥアミノ酸を欠失させた。
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のＤＮＡ配列（配列番号３）：
ATGCATCAGAAGCGAACTGCTATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCGGCCACGCAAACTGCCTCAGCTGTGCACCGAACTGCAGACAACTATCCACGACATCATTCTGGAATGCGTGTACTGTAAGCAGCAGCTGCTGAGGAGAGAGGTCTATGACTTCGCTTTTCGCGATCTGTGCATCGTGTACCGAGACGGAAACCCATATGCAGTCGATAAGCTGAAGTTCTACAGCAAGATCTCCGAATACAGGCATTACTGTTACAGCGTGTACGGGACCACACTGGAGCAGCAGTATAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCAGAATTAATCAGAAGCCCCTGTGCCCTGAGGAAAAACAGAGGCACCTGGATAAGAAACAGAGATTTCATAACATCCGAGGACGATGGACCGGGCGGTGCATGTCCTGCTGTAGAAGCTCCCGGACTCGACGAGAGACCCAGCTGGGCGGAGGAGGAGGAGCAGCTTACATGGCACGATTCGAGGACCCTACCCGAAGGCCATATAAGCTGCCCGACCTGTGCACAGAACTGAATACTTCTCTGCAGGACATCGAGATTACATGCGTGTACTGTAAAACCGTCCTGGAGCTGACAGAAGTGTTCGAGTTTGCTTTCAAGGACCTGTTTGTGGTCTACCGGGATTCAATCCCTCACGCAGCCCATAAAATCGACTTCTACAGCAGGATCAGGGAACTGCGCCACTACTCCGACAGCGTGTACGGGGATACACTGGAGAAGCTGACAAACACTGGCCTGTACAATCTGCTGATCCGACTGCGACAGAAGCCACTGAACCCAGCCGAAAAACTGAGACACCTGAACGAGAAGAGACGGTTTCACAATATTGCAGGCCATTATAGGGGACAGTGCCATAGTTGCTGTAATCGAGCCAGGCAGGAAAGACTGCAGCGCCGAAGGGAGACTCAAGTCGGCGGAGGAGGAGGAGCTGCATACATGCACGGCGACACCCCCACACTGCATGAATATATGCTGGATCTGCAGCCTGAGACTACCGACCTGTACCAGCTGAACGATTCTAGTGAGGAAGAGGACGAAATCGACGGACCAGCAGGACAGGCAGAGCCTGACCGGGCCCACTATAATATTGTGACATTCTGCTGTAAGTGCGATTCTACTCTGCGGCTGTGCGTGCAGAGTACTCATGTCGACATCCGCACCCTGGAGGATCTGCTGATGGGGACTCTGGGCATCGTCCCAATTTGTAGCCAGAAACCAGGCGGCGGCGGCGGAGCAGCTTACATGCACGGACCCAAGGCTACCCTGCAGGACATCGTGCTGCATCTGGAACCTCAGAATGAGATTCCAGTCGACCTGCTGCAGCTGAGTGATTCAGAAGAGGAAAACGACGAGATCGACGGCGTGAATCACCAGCATCTGCCTGCTAGACGGGCAGAGCCACAGCGACACACAATGCTGTGCATGTGCTGTAAGTGTGAAGCCAGGATCAAGCTGGTGGTCGAGTCAAGCGCCGACGATCTGCGCGCCTTCCAGCAGCTGTTCCTGAATACTCTGTCATTTGTCCCTTGGTGTGCCTCCCAGCAGTGA
ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質をコードする例示的Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１  ＤＮＡ配列（配列番号４）
acgaagacaa acaaaccatt gatagaatta agaggctcatgaaaatcctt aacagcgttc       60
aaaatgtctg ttacagtcaa gagagtcatt gatgattcactcatcacccc caaattgcct      120
gcgaatgagg accctgtgga gtaccctgct gattatttcaaaaagtcccg tgatattccg      180
gtgtacataa acacgaccaa aagtttgtct gatttgcggggctatgttta tcaaggccta      240
aagtcaggca acatctctat aattcatgtc aacagttatctgtatgcagc attaaaagag      300
atcagaggaa aattggacag agattggatc acctttggtatccaaatcgg aaaaacagga      360
gatagcgtgg ggatattcga tttactgacc ctaaaacctctagatggtgt tttaccagat      420
ggggtgtctg atgctactcg aactagctca gacgatgcatggcttccact gtatctattg      480
gggttataca gagttggtcg aacacagatg ccagaatacaggaagaagct gatggatggt      540
ctgattaatc aatgtaagat gatcaatgag cagtttgaaccactgttgcc agaaggaaga      600
gatgtctttg atgtctgggg aaatgacagc aattacacaaagattgtggc cgctgtagat      660
atgttcttcc atatgttcaa aaagcatgag aaggcctctttcaggtatgg cacaatagtg      720
tcaagattta aggattgtgc agcattggct acatttggtcatctgtgtaa gatcactggt      780
atgtccactg aagatgtgac aacttggatt ctaaacagggaggtggctga tgagatggtt      840
caaatgatgt acccaggaca ggagatagat aaggctgattcttacatgcc ttatctaatc      900
gacttaggtc tgtcctcaaa atctccatat tcatcagttaaaaatccagc tttccatttt      960
tggggtcaat tgaccgcatt gttactgaga tcaaccagagccagaaatgc acgtcagccg     1020
gatgacatcg agtatacatc cctgaccact gctgggctgttgtatgcata tgccgttggt     1080
tcgtctgcag acctggctca acaattctac gttggggacaacaagtatgt gccagaaact     1140
ggagatggag gattaaccac caatgcaccg ccacaagggcgagatgtggt cgagtggctt     1200
agttggtttg aagatcaaaa cagaaaacct accccagacatgctcatgta tgctaagaga     1260
gctgtcagtg ctttacaagg attgagggag aagacgattggcaagtacgc caagtcagag     1320
tttgacaaat gacaactcac tcaccatatg tattactacctttgcttcat atgaaaaaaa     1380
ctaacagcga tcatggatca gctatcaaag gtcaaggaattccttaagac ttacgcgcag     1440
ttggatcaag cagtacaaga gatggatgac attgagtctcagagagagga aaagactaat     1500
tttgatttgt ttcaggaaga aggattggag attaaggagaagccttccta ttatcgggca     1560
gatgaagaag agattgattc agatgaagac agcgtggatgatgcacaaga cttagggata     1620
cgtacatcaa caagtcccat cgaggggtat gtggatgaggagcaggatga ttatgaggat     1680
gaggaagtga acgtggtgtt tacatcggac tggaaacagcctgagctgga atccgacggg     1740
gatgggaaaa ctctccgatt gacgatacca gatggattgactggggagca gaagtcgcaa     1800
tggcttgcca cgattaaggc agttgttcag agtgctaaatattggaacat ctcagaatgt     1860
tcatttgaga gttatgagca aggggttttg attagagagagacaaatgac tcctgatgtc     1920
tacaaagtca ctcctgtttt aaatgctcca ccggttcaaatgacagctaa tcaagatgtt     1980
tggtctctca gcagcactcc atttacattt ttgcccaagaaacaaggtgt gactccattg     2040
accatgtcct tagaagaact cttcaacacc cgaggtgaattcatatctct gggaggaaac     2100
gggaaaatga gtcaccggga ggccatcatt ctagggttgagacacaagaa gctctataat     2160
caagccagac taaagtataa cttagcttga atatgaaaaaaactaacaga tatcaaaaga     2220
tatctctaac tcagtccatt gtgttcagtt caatcatgagctctctcaag aaaattttgg     2280
gtattaaagg gaaagggaag aaatctaaga aattaggtatggctccccca ccctatgaag     2340
aagagactcc aatggaatat tctccaagtg caccttatgataagtcattg tttggagtcg     2400
aagatatgga tttccatgat caacgtcaac tccgatatgagaaatttcac ttctcattga     2460
agatgactgt gagatcaaac aaaccatttc gaaattatgatgacgttgca gcagcggtgt     2520
ccaattggga tcatatgtac atcggcatgg caggaaaacgtcctttttat aagatattag     2580
cattcatggg ttctactcta ttgaaggcta caccagccgtctgggctgac caaggacagc     2640
cagaatatca tgctcactgt gagggacgag cttacttgccgcatcggtta gggccgaccc     2700
ctccgatgtt gaatgtccct gaacattttc gccgtccatttaacatcgga ttattcagag     2760
ggacaatcga cataaccctg gtacttttcg atgatgaatctgtagattct gccccggtca     2820
tatgggatca ttttaatgca tccagattga gcagcttcagagaaaaggct ttgttgtttg     2880
gtttgattct agaaaagaaa gccactggga attgggtattggactctatt agtcatttca     2940
agtaattatc acaagtgttg aggtgatggg cagactatgaaaaaaactaa cagggttcaa     3000
acactcttga tcgaggtacc cagttatatt tgttacaacaatgttgagac tttttctctt     3060
ttgtttcttg gccttaggag cccactccaa atttactatagtattccctc atcatcaaaa     3120
agggaattgg aagaatgtgc cttccacata tcattattgcccttctagtt ctgaccagaa     3180
ttggcataat gatttgactg gagttagtct tcatgtgaaaattcccaaaa gtcacaaagc     3240
tatacaagca gatggctgga tgtgccacgc tgctaaatgggtgactactt gtgacttcag     3300
atggtacgga cccaaataca tcacgcattc catacactctatgtcaccca ccctagaaca     3360
gtgcaagacc agtattgagc agacaaagca aggagtttggattaatccag gctttccccc     3420
tcaaagctgc ggatatgcta cagtgacgga tgcagaggtggttgttgtac aagcaacacc     3480
tcatcatgtg ttggttgatg agtacacagg agaatggattgactcacaat tggtgggggg     3540
caaatgttcc aaggaggttt gtcaaacggt tcacaactcgaccgtgtggc atgctgatta     3600
caagattaca gggctgtgcg agtcaaatct ggcatcagtggatatcacct tcttctctga     3660
ggatggtcaa aagacgtctt tgggaaaacc gaacactggattcaggagta atcactttgc     3720
ttacgaaagt ggagagaagg catgccgtat gcagtactgcacacgatggg gaatccgact     3780
accttctgga gtatggtttg aattagtgga caaagatctcttccaggcgg caaaattgcc     3840
tgaatgtcct agaggatcca gtatctcagc tccttctcagacttctgtgg atgttagttt     3900
gatacaagac gtagagagga tcttagatta ctctctatgccaggagacgt ggagtaagat     3960
acgagccaag cttcctgtat ctccagtaga tctgagttatctcgccccaa aaaatccagg     4020
gagcggaccg gccttcacta tcattaatgg cactttgaaatatttcgaaa caagatacat     4080
cagagttgac ataagtaatc ccatcatccc tcacatggtgggaacaatga gtggaaccac     4140
gactgagcgt gaattgtgga atgattggta tccatatgaagacgtagaga ttggtccaaa     4200
tggggtgttg aaaactccca ctggtttcaa gtttccgctgtacatgattg ggcacggaat     4260
gttggattcc gatctccaca aatcctccca ggctcaagtcttcgaacatc cacacgcaaa     4320
ggacgctgca tcacagcttc ctgatgatga gactttattttttggtgaca caggactatc     4380
aaaaaaccca gtagagttag tagaaggctg gttcagtagctggaagagca cattggcatc     4440
gttctttctg attataggct tgggggttgc attaatcttcatcattcgaa ttattgttgc     4500
gattcgctat aaatacaagg ggaggaagac ccaaaaaatttacaatgatg tcgagatgag     4560
tcgattggga aataaataac agatgacgca tgagggtcagatcagattta cagcgtaagt     4620
gtgatattta ggattataaa ggttccttaa ttttaatttgttacgcgttg tatgaaaaaa     4680
actcatcaac agccatcatg catcagaagc gaactgctatgtttcaggac cctcaggagc     4740
ggccacgcaa actgcctcag ctgtgcaccg aactgcagacaactatccac gacatcattc     4800
tggaatgcgt gtactgtaag cagcagctgc tgaggagagaggtctatgac ttcgcttttc     4860
gcgatctgtg catcgtgtac cgagacggaa acccatatgcagtcgataag ctgaagttct     4920
acagcaagat ctccgaatac aggcattact gttacagcgtgtacgggacc acactggagc     4980
agcagtataa caagcccctg tgcgacctgc tgatcagaattaatcagaag cccctgtgcc     5040
ctgaggaaaa acagaggcac ctggataaga aacagagatttcataacatc cgaggacgat     5100
ggaccgggcg gtgcatgtcc tgctgtagaa gctcccggactcgacgagag acccagctgg     5160
gcggaggagg aggagcagct tacatggcac gattcgaggaccctacccga aggccatata     5220
agctgcccga cctgtgcaca gaactgaata cttctctgcaggacatcgag attacatgcg     5280
tgtactgtaa aaccgtcctg gagctgacag aagtgttcgagtttgctttc aaggacctgt     5340
ttgtggtcta ccgggattca atccctcacg cagcccataaaatcgacttc tacagcagga     5400
tcagggaact gcgccactac tccgacagcg tgtacggggatacactggag aagctgacaa     5460
acactggcct gtacaatctg ctgatccgac tgcgacagaagccactgaac ccagccgaaa     5520
aactgagaca cctgaacgag aagagacggt ttcacaatattgcaggccat tataggggac     5580
agtgccatag ttgctgtaat cgagccaggc aggaaagactgcagcgccga agggagactc     5640
aagtcggcgg aggaggagga gctgcataca tgcacggcgacacccccaca ctgcatgaat     5700
atatgctgga tctgcagcct gagactaccg acctgtaccagctgaacgat tctagtgagg     5760
aagaggacga aatcgacgga ccagcaggac aggcagagcctgaccgggcc cactataata     5820
ttgtgacatt ctgctgtaag tgcgattcta ctctgcggctgtgcgtgcag agtactcatg     5880
tcgacatccg caccctggag gatctgctga tggggactctgggcatcgtc ccaatttgta     5940
gccagaaacc aggcggcggc ggcggagcag cttacatgcacggacccaag gctaccctgc     6000
aggacatcgt gctgcatctg gaacctcaga atgagattccagtcgacctg ctgcagctga     6060
gtgattcaga agaggaaaac gacgagatcg acggcgtgaatcaccagcat ctgcctgcta     6120
gacgggcaga gccacagcga cacacaatgc tgtgcatgtgctgtaagtgt gaagccagga     6180
tcaagctggt ggtcgagtca agcgccgacg atctgcgcgccttccagcag ctgttcctga     6240
atactctgtc atttgtccct tggtgtgcct cccagcagtgacgtacgtgt atgaaaaaaa     6300
ctcatcaaca gccatcatgg atgttaacga ttttgagttgcatgaggact ttgcattgtc     6360
tgaagatgac tttgtcactt cagaatttct caatccggaagaccaaatga catacctgaa     6420
tcatgccgat tataatttga attctccctt aatcagcgatgatattgatt tcctgatcaa     6480
gaaatataat catgagcaaa ttccgaaaat gtgggatgtcaagaattggg agggagtgtt     6540
agagatgttg acagcctgtc aagccagtcc aattttatctagcactatgc ataagtgggt     6600
gggaaagtgg ctcatgtctg atgatcatga cgcaagccaaggcttcagtt ttcttcatga     6660
agtggacaaa gaagctgatc tgacgtttga ggtggtggagacattcatta gaggatgggg     6720
aggtcgagaa ttgcagtaca agaggaaaga cacatttccggactccttta gagttgcagc     6780
ctcattgtgt caaaaattcc ttgatttgca caaactcactctgataatga attcagtctc     6840
tgaagtcgaa cttaccaacc tagcaaagaa ttttaaaggaaaaaacagga aagcaaaaag     6900
cggaaatctg ataaccagat tgagggttcc cagtttaggtcctgcttttg tgactcaggg     6960
atgggtgtac atgaagaagt tggaaatgat tatggatcggaattttttgt tgatgttgaa     7020
agacgttatc atcgggagga tgcagacgat cctgtccatgatctcaagag atgataatct     7080
cttctccgag tctgatatct ttactgtatt aaagatataccggatagggg ataagatatt     7140
agaaaggcaa gggacaaagg gttacgactt gatcaaaatgattgagccta tttgtaactt     7200
aaagatgatg aatctggcac gtaaatatcg tcctctcatccctacatttc ctcattttga     7260
aaaacatatt gctgactctg ttaaggaagg atcgaaaatagacaaaggga ttgagtttat     7320
atatgatcac attatgtcaa tccctggtgt ggacttgaccttagttattt acggatcatt     7380
tcggcactgg ggtcatcctt ttatcaacta ctatgagggcttagagaagc tacacaagca     7440
ggttacaatg cccaagacta ttgacagaga atatgcagaatgtcttgcta gtgatctggc     7500
aagaatcgtt cttcagcaac aattcaatga acataagaaatggtttgttg atgtagataa     7560
agtcccacaa tcccatcctt tcaaaagcca tatgaaagagaatacttggc ctactgcagc     7620
ccaagttcag gattacggcg atcgctggca tcagctcccactcatcaaat gcttcgaaat     7680
cccagatttg ttagatccat cgatcatcta ctcagacaaaagtcattcca tgaaccggtc     7740
tgaagtacta cgacatgtaa gacttacacc tcatgtgcccattccaagca ggaaagtatt     7800
gcagacaatg ttggagacta aggcaacaga ctggaaagagtttttaaaga aaattgacga     7860
agaggggtta gaggatgatg atcttgtcat aggactcaaagggaaagaga gagaattaaa     7920
aattgcggga agattctttt ctttgatgtc ctggaagctcagagagtatt ttgtcatcac     7980
tgagtatttg attaagacgc actttgtccc gatgtttaaagggttgacca tggcggatga     8040
cttgacagcg gtgataaaga agatgatgga cacatcttcaggacaaggct tagataatta     8100
tgaatccatt tgtatagcca accatattga ctatgagaagtggaacaatc atcaaagaaa     8160
agagtcgaac gggcccgtgt tcaaggtgat gggtcaattcttgggatatc cacgtctgat     8220
tgagagaact catgaatttt ttgagaagag tctgatatattacaatggac gaccagatct     8280
gatgcgggtt cgaggaaatt ctctagtcaa cgcctcatctttaaatgtct gctgggaggg     8340
tcaagctggg ggattagaag gactgcgaca gaagggatggagtattctaa atttgcttgt     8400
cattcagaga gaagcaaaaa taaggaacac cgccgtgaaagtgctagctc aaggtgacaa     8460
tcaggtgata tgtactcagt ataaaacgaa gaaatcccggaatgatattg agcttaaggc     8520
agctctaaca cagatggtat ctaataatga gatgattatgtctgcgatta aatcaggcac     8580
cgagaaactg ggtcttttga ttaatgatga tgagacaatgcaatctgctg attacctcaa     8640
ttacgggaag gttcccattt tcagaggagt aatcagaggccttgagacaa aaagatggtc     8700
tcgagtgacc tgtgtgacaa atgatcagat tccaacgtgtgcgaacatta tgagctctgt     8760
gtcaactaat gcattaactg tagcccattt tgccgagaatccagtcaatg ccatcattca     8820
gtataactac tttggaacat ttgcaaggct actgctgatgatgcatgacc ccgctctgag     8880
gatctctctg tatgaagtcc aatcaaaaat tccaggacttcacagtttga catttaaata     8940
ttctatgttg tatctggatc cttcgatagg aggagtctccggaatgtcac tctcgagatt     9000
cctcataaga tcatttccag atccagtgac agaaagtttggcgttctgga aatttatcca     9060
ctctcatgca agaagcgatt cattaaagga gatatgtgcagtttttggaa atcctgaaat     9120
tgcaagattt cggctaactc atgtcgataa attggtggaagacccaacct cattgaacat     9180
agctatggga atgagtcctg ctaatctatt aaagacagaggtaaaaaaat gtctactgga     9240
atcaaggcag agcatcaaga accagattgt aagagatgctactatttacc tacaccatga     9300
ggaagacaaa cttcgtagtt tcttatggtc cataacaccactgttccctc ggttcttgag     9360
tgaattcaaa tctgggacat tcatcggagt agcagatggcctgatcagct tatttcagaa     9420
ctctaggact attcgaaatt cttttaaaaa gcgttatcacagggaacttg atgatttaat     9480
aatcaagagc gaagtttcct cacttatgca tttgggtaagctacatttga ggcgaggctc     9540
agttcgtatg tggacttgct cttctactca ggctgatcttctccgattcc ggtcatgggg     9600
aagatctgtt ataggaacca cagtccctca tcccttagagatgttaggac aacattttaa     9660
aaaggagact ccttgcagtg cttgcaacat atccggattagactatgtat ctgtccactg     9720
tccgaatggg attcatgacg tttttgaatc acgtggtccactccctgcat atttgggttc     9780
taaaacatcc gaatcaactt cgatcttgca gccgtgggagagagagagta aagtaccgtt     9840
gattaagcgt gccacaaggc ttcgtgatgc aatttcatggtttgtgtctc ccgactctaa     9900
cttggcctca actatcctta agaacataaa tgcattaacaggagaagaat ggtcaaagaa     9960
gcagcatgga tttaaaagga cgggatcggc gttacacaggttctccacat ccaggatgag    10020
tcatggtggt tttgcttctc agagtacggc tgccttgactagattgatgg caactactga    10080
cactatgaga gatctgggag aacagaacta tgatttcctgtttcaggcga cattattgta    10140
tgctcaaata accacaactg tagtcaggaa tggatcatttcatagctgca cggaccatta    10200
ccatataacc tgcaaatctt gtctgagggc cattgatgagattaccttgg attcagcgat    10260
ggaatatagc cctccagatg tatcatcagt tttacaatcttggaggaatg gagaaggctc    10320
ttggggacat gaagtgaaac aaatataccc agttgaaggtgactggaggg gactatctcc    10380
tgttgaacaa tcttatcaag tcggacgctg tatcgggtttctgttcggtg atctggcgta    10440
tagaaaatca tcccatgcag atgatagctc catgtttccgttatctatac aaaacaaagt    10500
cagaggaaga ggctttttaa aagggcttat ggatgggttaatgagagcca gttgttgcca    10560
ggtgatccat cgtcgaagct tagcccatct gaagagaccggctaatgcag tctatggagg    10620
gctgatttat ttgatagaca aattgagtgc atctgccccttttctttcac tgacgagaca    10680
tggaccttta agggaagaat tagaaactgt tccacataagataccgactt cttatcctac    10740
gagcaaccga gatatggggg tgatagttcg taattattttaaatatcagt gcagactggt    10800
agaaaaaggt cggtacaaga cacattatcc tcaattgtggcttttctcag atgtgctgtc    10860
cattgatttc ttaggacccc tgtctatatc ttcaactctattgggtattc tgtataaaca    10920
gacgttatct tctcgagaca aaaatgagtt gagagaactcgctaacttgt cttcattgtt    10980
gagatcagga gaaggatggg aagatatcca tgtcaaattcttctctaagg acactttact    11040
ctgccctgaa gagatccgac atgcgtgcaa atttgggattgctaaggaat ccgctgtttt    11100
aagctattat cctccttggt ctcaagagtc ttatggaggcatcacctcga tccccgtata    11160
tttttcgacc aggaagtatc ccaaaatttt agatgtccctcctcgggttc aaaacccatt    11220
ggtctcgggt ctacgattgg ggcaactccc tactggagcacattataaga ttaggagcat    11280
tgtaaagaac aagaaccttc gttatagaga tttccttagttgtggggatg gatctggggg    11340
gatgaccgcg gcactattga gagaaaacag acaaagtaggggaatcttca acagcctgtt    11400
agagttagcc ggatctctta tgagaggagc atctccagagcctccaagtg cactggagac    11460
gctcgggcaa gaacgatcta ggtgtgtgaa tggaagcacatgttgggagt actcatctga    11520
cctaagccaa aaagagacat gggattactt cttaagattgaagagaggcc tgggtttgac    11580
cgtggactta atcaccatgg acatggaggt cagagaccctaatacaagtt tgatgataga    11640
aaagaacctc aaagtttatc tgcatcagat attagaaccaactggtgtct taatatataa    11700
aacatacggg acccatattg cgacacaaac agataatatcctgacgataa tcggtccttt    11760
ctttgagacg gttgacctag tccagtccga atacagcagctcacaaacgt ccgaggtcta    11820
ttttgtagga cgaggcttgc gctctcatgt tgacgaaccctgggtggact ggccatcctt    11880
aatggacaat tggagatcca tttatgcttt tcatgatcctactacagaat ttatcagagc    11940
aaaaaaagtc tgtgaaattg acagtcttat aggcattccggctcaattca ttccagaccc    12000
atttgtaaat ctcgagacca tgctacagat agttggtgttccaacaggag tttcgcatgc    12060
cgcagctcta ttatcatcac aatatccaaa tcaattggtcacaacgtcaa tattttatat    12120
gacactcgtg tcttattata atgtaaacca tattcgaagaagccccaagc ctttctctcc    12180
tccgtctgat ggagtctcac agaacattgg ttcagccatagtcggactaa gtttttgggt    12240
gagtttgatg gagaatgatc tcggattata caaacaggctctaggtgcaa taaagacgtc    12300
attccctatt agatggtcct ctgtccagac caaggatgggtttacacaag aatggagaac    12360
taaaggaaac ggaattccta aagattgtcg tctctcagactctttggctc agataggaaa    12420
ctggatcaga gcgatggaat tggttaggaa caaaacgaggcaatcaggat tttctgaaac    12480
cctatttgat caattctgcg gacttgcaga ccatcacctcaaatggcgga agttgggaaa    12540
cagaacagga attattgatt ggctaaataa tagaatttcatccattgaca aatccatctt    12600
ggtgaccaaa agtgatctgc atgacgagaa ctcatggagggagtgaagat gtattcttcc    12660
acctctcatt gggtgatacc catatatgaa aaaaactataagtactttaa actctctttg    12720
ttttttaatg tatatctggt tttgttgttt ccgt
例示的ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号５）：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKP*
例示的ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号６）：
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKP*
例示的ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号７）：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQVGGGGGAAYMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL*
例示的ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号８）：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVDKLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRINQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQLGGGGGAAYMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVPICSQKPGGGGGAAYMHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVPWCASQQGGGGGAAYMARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAHKIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRLRQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV*
ＨＰＶ１６  Ｅ６（配列番号９）：
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILEXaaVYXaaKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVXaaDKXaaLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRXaaINXaaQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRXaaMSXaaCRSSRTRRETQL
注記：全Ｘａａがシステインである場合、配列は野生型配列である
ＨＰＶ１８  Ｅ６（配列番号１０）：
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITXaaVYXaaKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAAXaaHKXaaIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRXaaLRXaaQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQXaaHSXaaCNRARQERLQRRRETQV
注記：全Ｘａａがシステインである場合、配列は野生型配列である
ＨＰＶ１６  Ｅ７（配列番号１１）：
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYXaaXaaXaaQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVXaaPIXaaSQKP
注記：野生型配列はＸａａＸａａＸａａ＝ＣＹＥを有する
注記：野生型配列は９１位及び９４位にシステインを有する
ＨＰＶ１８  Ｅ７（配列番号１２）：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLXaaXaaXaaQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVXaaPWXaaASQQ
注記：野生型配列はＸａａＸａａＸａａ＝ＣＨＥを有する
注記：野生型配列は９８位及び１０１位にシステインを有する
例示的ｈｕＳＴＥＡＰのタンパク質配列（配列番号１３）
MESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSELQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPMVSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTKYKKFPHWLDKWMLTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSLSYPMRRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVWRMEIYVSLGIVGLAILALLAVTSIPSVSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFLPIVVLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQLKL
ｈｕ−ＳＴＥＡＰタンパク質のＤＮＡ配列（配列番号１４）：
atggaatcac ggaaggacat cactaatcag gaggaactgtggaaaatgaa gccaagaagg       60
aatctggaag aggacgacta tctgcacaag gacaccggcgaaacaagtat gctgaaacga      120
ccagtgctgc tgcacctgca tcagactgct cacgcagacgagtttgattg cccctctgaa      180
ctgcagcaca cccaggagct gttcccacag tggcatctgcccatcaagat tgccgctatc      240
attgcttcac tgacatttct gtacactctg ctgagagaagtgatccaccc cctggccacc      300
agccatcagc agtacttcta taagatccct atcctggtcatcaacaaggt cctgccaatg      360
gtgagcatca cactgctggc cctggtctac ctgcctggagtgatcgcagc cattgtccag      420
ctgcacaatg ggacaaagta taagaaattt ccacattggctggataagtg gatgctgact      480
aggaaacagt tcggactgct gtccttcttt ttcgccgtgctgcacgctat ctacagcctg      540
tcctatccca tgaggaggag ctaccggtat aagctgctgaactgggctta ccagcaggtg      600
cagcagaaca aggaggacgc atggattgaa catgacgtgtggcgcatgga aatctacgtg      660
agcctgggca ttgtcggact ggccatcctg gctctgctggcagtgaccag tatcccttct      720
gtcagtgact cactgacatg gagagagttt cactacattcagagcaagct ggggatcgtg      780
tccctgctgc tgggcaccat ccatgcactg atttttgcctggaacaagtg gatcgatatc      840
aagcagttcg tgtggtatac tccccctacc tttatgattgccgtcttcct gcccatcgtg      900
gtcctgatct tcaagtccat cctgttcctg ccttgtctgcggaagaaaat cctgaaaatt      960
cggcacggat gggaggatgt caccaaaatc aataagactgaaatctgtag ccagctgaag     1020
ctttaa                                                             1026
ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質をコードする例示的Ｍａｒａｂａ  ＭＧ１  ＤＮＡ配列（配列番号１５）
acgaagacaa acaaaccatt gatagaatta agaggctcatgaaaatcctt aacagcgttc       60
aaaatgtctg ttacagtcaa gagagtcatt gatgattcactcatcacccc caaattgcct      120
gcgaatgagg accctgtgga gtaccctgct gattatttcaaaaagtcccg tgatattccg      180
gtgtacataa acacgaccaa aagtttgtct gatttgcggggctatgttta tcaaggccta      240
aagtcaggca acatctctat aattcatgtc aacagttatctgtatgcagc attaaaagag      300
atcagaggaa aattggacag agattggatc acctttggtatccaaatcgg aaaaacagga      360
gatagcgtgg ggatattcga tttactgacc ctaaaacctctagatggtgt tttaccagat      420
ggggtgtctg atgctactcg aactagctca gacgatgcatggcttccact gtatctattg      480
gggttataca gagttggtcg aacacagatg ccagaatacaggaagaagct gatggatggt      540
ctgattaatc aatgtaagat gatcaatgag cagtttgaaccactgttgcc agaaggaaga      600
gatgtctttg atgtctgggg aaatgacagc aattacacaaagattgtggc cgctgtagat      660
atgttcttcc atatgttcaa aaagcatgag aaggcctctttcaggtatgg cacaatagtg      720
tcaagattta aggattgtgc agcattggct acatttggtcatctgtgtaa gatcactggt      780
atgtccactg aagatgtgac aacttggatt ctaaacagggaggtggctga tgagatggtt      840
caaatgatgt acccaggaca ggagatagat aaggctgattcttacatgcc ttatctaatc      900
gacttaggtc tgtcctcaaa atctccatat tcatcagttaaaaatccagc tttccatttt      960
tggggtcaat tgaccgcatt gttactgaga tcaaccagagccagaaatgc acgtcagccg     1020
gatgacatcg agtatacatc cctgaccact gctgggctgttgtatgcata tgccgttggt     1080
tcgtctgcag acctggctca acaattctac gttggggacaacaagtatgt gccagaaact     1140
ggagatggag gattaaccac caatgcaccg ccacaagggcgagatgtggt cgagtggctt     1200
agttggtttg aagatcaaaa cagaaaacct accccagacatgctcatgta tgctaagaga     1260
gctgtcagtg ctttacaagg attgagggag aagacgattggcaagtacgc caagtcagag     1320
tttgacaaat gacaactcac tcaccatatg tattactacctttgcttcat atgaaaaaaa     1380
ctaacagcga tcatggatca gctatcaaag gtcaaggaattccttaagac ttacgcgcag     1440
ttggatcaag cagtacaaga gatggatgac attgagtctcagagagagga aaagactaat     1500
tttgatttgt ttcaggaaga aggattggag attaaggagaagccttccta ttatcgggca     1560
gatgaagaag agattgattc agatgaagac agcgtggatgatgcacaaga cttagggata     1620
cgtacatcaa caagtcccat cgaggggtat gtggatgaggagcaggatga ttatgaggat     1680
gaggaagtga acgtggtgtt tacatcggac tggaaacagcctgagctgga atccgacggg     1740
gatgggaaaa ctctccgatt gacgatacca gatggattgactggggagca gaagtcgcaa     1800
tggcttgcca cgattaaggc agttgttcag agtgctaaatattggaacat ctcagaatgt     1860
tcatttgaga gttatgagca aggggttttg attagagagagacaaatgac tcctgatgtc     1920
tacaaagtca ctcctgtttt aaatgctcca ccggttcaaatgacagctaa tcaagatgtt     1980
tggtctctca gcagcactcc atttacattt ttgcccaagaaacaaggtgt gactccattg     2040
accatgtcct tagaagaact cttcaacacc cgaggtgaattcatatctct gggaggaaac     2100
gggaaaatga gtcaccggga ggccatcatt ctagggttgagacacaagaa gctctataat     2160
caagccagac taaagtataa cttagcttga atatgaaaaaaactaacaga tatcaaaaga     2220
tatctctaac tcagtccatt gtgttcagtt caatcatgagctctctcaag aaaattttgg     2280
gtattaaagg gaaagggaag aaatctaaga aattaggtatggctccccca ccctatgaag     2340
aagagactcc aatggaatat tctccaagtg caccttatgataagtcattg tttggagtcg     2400
aagatatgga tttccatgat caacgtcaac tccgatatgagaaatttcac ttctcattga     2460
agatgactgt gagatcaaac aaaccatttc gaaattatgatgacgttgca gcagcggtgt     2520
ccaattggga tcatatgtac atcggcatgg caggaaaacgtcctttttat aagatattag     2580
cattcatggg ttctactcta ttgaaggcta caccagccgtctgggctgac caaggacagc     2640
cagaatatca tgctcactgt gagggacgag cttacttgccgcatcggtta gggccgaccc     2700
ctccgatgtt gaatgtccct gaacattttc gccgtccatttaacatcgga ttattcagag     2760
ggacaatcga cataaccctg gtacttttcg atgatgaatctgtagattct gccccggtca     2820
tatgggatca ttttaatgca tccagattga gcagcttcagagaaaaggct ttgttgtttg     2880
gtttgattct agaaaagaaa gccactggga attgggtattggactctatt agtcatttca     2940
agtaattatc acaagtgttg aggtgatggg cagactatgaaaaaaactaa cagggttcaa     3000
acactcttga tcgaggtacc cagttatatt tgttacaacaatgttgagac tttttctctt     3060
ttgtttcttg gccttaggag cccactccaa atttactatagtattccctc atcatcaaaa     3120
agggaattgg aagaatgtgc cttccacata tcattattgcccttctagtt ctgaccagaa     3180
ttggcataat gatttgactg gagttagtct tcatgtgaaaattcccaaaa gtcacaaagc     3240
tatacaagca gatggctgga tgtgccacgc tgctaaatgggtgactactt gtgacttcag     3300
atggtacgga cccaaataca tcacgcattc catacactctatgtcaccca ccctagaaca     3360
gtgcaagacc agtattgagc agacaaagca aggagtttggattaatccag gctttccccc     3420
tcaaagctgc ggatatgcta cagtgacgga tgcagaggtggttgttgtac aagcaacacc     3480
tcatcatgtg ttggttgatg agtacacagg agaatggattgactcacaat tggtgggggg     3540
caaatgttcc aaggaggttt gtcaaacggt tcacaactcgaccgtgtggc atgctgatta     3600
caagattaca gggctgtgcg agtcaaatct ggcatcagtggatatcacct tcttctctga     3660
ggatggtcaa aagacgtctt tgggaaaacc gaacactggattcaggagta atcactttgc     3720
ttacgaaagt ggagagaagg catgccgtat gcagtactgcacacgatggg gaatccgact     3780
accttctgga gtatggtttg aattagtgga caaagatctcttccaggcgg caaaattgcc     3840
tgaatgtcct agaggatcca gtatctcagc tccttctcagacttctgtgg atgttagttt     3900
gatacaagac gtagagagga tcttagatta ctctctatgccaggagacgt ggagtaagat     3960
acgagccaag cttcctgtat ctccagtaga tctgagttatctcgccccaa aaaatccagg     4020
gagcggaccg gccttcacta tcattaatgg cactttgaaatatttcgaaa caagatacat     4080
cagagttgac ataagtaatc ccatcatccc tcacatggtgggaacaatga gtggaaccac     4140
gactgagcgt gaattgtgga atgattggta tccatatgaagacgtagaga ttggtccaaa     4200
tggggtgttg aaaactccca ctggtttcaa gtttccgctgtacatgattg ggcacggaat     4260
gttggattcc gatctccaca aatcctccca ggctcaagtcttcgaacatc cacacgcaaa     4320
ggacgctgca tcacagcttc ctgatgatga gactttattttttggtgaca caggactatc     4380
aaaaaaccca gtagagttag tagaaggctg gttcagtagctggaagagca cattggcatc     4440
gttctttctg attataggct tgggggttgc attaatcttcatcattcgaa ttattgttgc     4500
gattcgctat aaatacaagg ggaggaagac ccaaaaaatttacaatgatg tcgagatgag     4560
tcgattggga aataaataac agatgacgca tgagggtcagatcagattta cagcgtaagt     4620
gtgatattta ggattataaa ggttccttaa ttttaatttgttacgcgttg tatgaaaaaa     4680
actcatcaac agccatcatg gaatcacgga aggacatcactaatcaggag gaactgtgga     4740
aaatgaagcc aagaaggaat ctggaagagg acgactatctgcacaaggac accggcgaaa     4800
caagtatgct gaaacgacca gtgctgctgc acctgcatcagactgctcac gcagacgagt     4860
ttgattgccc ctctgaactg cagcacaccc aggagctgttcccacagtgg catctgccca     4920
tcaagattgc cgctatcatt gcttcactga catttctgtacactctgctg agagaagtga     4980
tccaccccct ggccaccagc catcagcagt acttctataagatccctatc ctggtcatca     5040
acaaggtcct gccaatggtg agcatcacac tgctggccctggtctacctg cctggagtga     5100
tcgcagccat tgtccagctg cacaatggga caaagtataagaaatttcca cattggctgg     5160
ataagtggat gctgactagg aaacagttcg gactgctgtccttctttttc gccgtgctgc     5220
acgctatcta cagcctgtcc tatcccatga ggaggagctaccggtataag ctgctgaact     5280
gggcttacca gcaggtgcag cagaacaagg aggacgcatggattgaacat gacgtgtggc     5340
gcatggaaat ctacgtgagc ctgggcattg tcggactggccatcctggct ctgctggcag     5400
tgaccagtat cccttctgtc agtgactcac tgacatggagagagtttcac tacattcaga     5460
gcaagctggg gatcgtgtcc ctgctgctgg gcaccatccatgcactgatt tttgcctgga     5520
acaagtggat cgatatcaag cagttcgtgt ggtatactccccctaccttt atgattgccg     5580
tcttcctgcc catcgtggtc ctgatcttca agtccatcctgttcctgcct tgtctgcgga     5640
agaaaatcct gaaaattcgg cacggatggg aggatgtcaccaaaatcaat aagactgaaa     5700
tctgtagcca gctgaagctt taacgtacgt gtatgaaaaaaactcatcaa cagccatcat     5760
ggatgttaac gattttgagt tgcatgagga ctttgcattgtctgaagatg actttgtcac     5820
ttcagaattt ctcaatccgg aagaccaaat gacatacctgaatcatgccg attataattt     5880
gaattctccc ttaatcagcg atgatattga tttcctgatcaagaaatata atcatgagca     5940
aattccgaaa atgtgggatg tcaagaattg ggagggagtgttagagatgt tgacagcctg     6000
tcaagccagt ccaattttat ctagcactat gcataagtgggtgggaaagt ggctcatgtc     6060
tgatgatcat gacgcaagcc aaggcttcag ttttcttcatgaagtggaca aagaagctga     6120
tctgacgttt gaggtggtgg agacattcat tagaggatggggaggtcgag aattgcagta     6180
caagaggaaa gacacatttc cggactcctt tagagttgcagcctcattgt gtcaaaaatt     6240
ccttgatttg cacaaactca ctctgataat gaattcagtctctgaagtcg aacttaccaa     6300
cctagcaaag aattttaaag gaaaaaacag gaaagcaaaaagcggaaatc tgataaccag     6360
attgagggtt cccagtttag gtcctgcttt tgtgactcagggatgggtgt acatgaagaa     6420
gttggaaatg attatggatc ggaatttttt gttgatgttgaaagacgtta tcatcgggag     6480
gatgcagacg atcctgtcca tgatctcaag agatgataatctcttctccg agtctgatat     6540
ctttactgta ttaaagatat accggatagg ggataagatattagaaaggc aagggacaaa     6600
gggttacgac ttgatcaaaa tgattgagcc tatttgtaacttaaagatga tgaatctggc     6660
acgtaaatat cgtcctctca tccctacatt tcctcattttgaaaaacata ttgctgactc     6720
tgttaaggaa ggatcgaaaa tagacaaagg gattgagtttatatatgatc acattatgtc     6780
aatccctggt gtggacttga ccttagttat ttacggatcatttcggcact ggggtcatcc     6840
ttttatcaac tactatgagg gcttagagaa gctacacaagcaggttacaa tgcccaagac     6900
tattgacaga gaatatgcag aatgtcttgc tagtgatctggcaagaatcg ttcttcagca     6960
acaattcaat gaacataaga aatggtttgt tgatgtagataaagtcccac aatcccatcc     7020
tttcaaaagc catatgaaag agaatacttg gcctactgcagcccaagttc aggattacgg     7080
cgatcgctgg catcagctcc cactcatcaa atgcttcgaaatcccagatt tgttagatcc     7140
atcgatcatc tactcagaca aaagtcattc catgaaccggtctgaagtac tacgacatgt     7200
aagacttaca cctcatgtgc ccattccaag caggaaagtattgcagacaa tgttggagac     7260
taaggcaaca gactggaaag agtttttaaa gaaaattgacgaagaggggt tagaggatga     7320
tgatcttgtc ataggactca aagggaaaga gagagaattaaaaattgcgg gaagattctt     7380
ttctttgatg tcctggaagc tcagagagta ttttgtcatcactgagtatt tgattaagac     7440
gcactttgtc ccgatgttta aagggttgac catggcggatgacttgacag cggtgataaa     7500
gaagatgatg gacacatctt caggacaagg cttagataattatgaatcca tttgtatagc     7560
caaccatatt gactatgaga agtggaacaa tcatcaaagaaaagagtcga acgggcccgt     7620
gttcaaggtg atgggtcaat tcttgggata tccacgtctgattgagagaa ctcatgaatt     7680
ttttgagaag agtctgatat attacaatgg acgaccagatctgatgcggg ttcgaggaaa     7740
ttctctagtc aacgcctcat ctttaaatgt ctgctgggagggtcaagctg ggggattaga     7800
aggactgcga cagaagggat ggagtattct aaatttgcttgtcattcaga gagaagcaaa     7860
aataaggaac accgccgtga aagtgctagc tcaaggtgacaatcaggtga tatgtactca     7920
gtataaaacg aagaaatccc ggaatgatat tgagcttaaggcagctctaa cacagatggt     7980
atctaataat gagatgatta tgtctgcgat taaatcaggcaccgagaaac tgggtctttt     8040
gattaatgat gatgagacaa tgcaatctgc tgattacctcaattacggga aggttcccat     8100
tttcagagga gtaatcagag gccttgagac aaaaagatggtctcgagtga cctgtgtgac     8160
aaatgatcag attccaacgt gtgcgaacat tatgagctctgtgtcaacta atgcattaac     8220
tgtagcccat tttgccgaga atccagtcaa tgccatcattcagtataact actttggaac     8280
atttgcaagg ctactgctga tgatgcatga ccccgctctgaggatctctc tgtatgaagt     8340
ccaatcaaaa attccaggac ttcacagttt gacatttaaatattctatgt tgtatctgga     8400
tccttcgata ggaggagtct ccggaatgtc actctcgagattcctcataa gatcatttcc     8460
agatccagtg acagaaagtt tggcgttctg gaaatttatccactctcatg caagaagcga     8520
ttcattaaag gagatatgtg cagtttttgg aaatcctgaaattgcaagat ttcggctaac     8580
tcatgtcgat aaattggtgg aagacccaac ctcattgaacatagctatgg gaatgagtcc     8640
tgctaatcta ttaaagacag aggtaaaaaa atgtctactggaatcaaggc agagcatcaa     8700
gaaccagatt gtaagagatg ctactattta cctacaccatgaggaagaca aacttcgtag     8760
tttcttatgg tccataacac cactgttccc tcggttcttgagtgaattca aatctgggac     8820
attcatcgga gtagcagatg gcctgatcag cttatttcagaactctagga ctattcgaaa     8880
ttcttttaaa aagcgttatc acagggaact tgatgatttaataatcaaga gcgaagtttc     8940
ctcacttatg catttgggta agctacattt gaggcgaggctcagttcgta tgtggacttg     9000
ctcttctact caggctgatc ttctccgatt ccggtcatggggaagatctg ttataggaac     9060
cacagtccct catcccttag agatgttagg acaacattttaaaaaggaga ctccttgcag     9120
tgcttgcaac atatccggat tagactatgt atctgtccactgtccgaatg ggattcatga     9180
cgtttttgaa tcacgtggtc cactccctgc atatttgggttctaaaacat ccgaatcaac     9240
ttcgatcttg cagccgtggg agagagagag taaagtaccgttgattaagc gtgccacaag     9300
gcttcgtgat gcaatttcat ggtttgtgtc tcccgactctaacttggcct caactatcct     9360
taagaacata aatgcattaa caggagaaga atggtcaaagaagcagcatg gatttaaaag     9420
gacgggatcg gcgttacaca ggttctccac atccaggatgagtcatggtg gttttgcttc     9480
tcagagtacg gctgccttga ctagattgat ggcaactactgacactatga gagatctggg     9540
agaacagaac tatgatttcc tgtttcaggc gacattattgtatgctcaaa taaccacaac     9600
tgtagtcagg aatggatcat ttcatagctg cacggaccattaccatataa cctgcaaatc     9660
ttgtctgagg gccattgatg agattacctt ggattcagcgatggaatata gccctccaga     9720
tgtatcatca gttttacaat cttggaggaa tggagaaggctcttggggac atgaagtgaa     9780
acaaatatac ccagttgaag gtgactggag gggactatctcctgttgaac aatcttatca     9840
agtcggacgc tgtatcgggt ttctgttcgg tgatctggcgtatagaaaat catcccatgc     9900
agatgatagc tccatgtttc cgttatctat acaaaacaaagtcagaggaa gaggcttttt     9960
aaaagggctt atggatgggt taatgagagc cagttgttgccaggtgatcc atcgtcgaag    10020
cttagcccat ctgaagagac cggctaatgc agtctatggagggctgattt atttgataga    10080
caaattgagt gcatctgccc cttttctttc actgacgagacatggacctt taagggaaga    10140
attagaaact gttccacata agataccgac ttcttatcctacgagcaacc gagatatggg    10200
ggtgatagtt cgtaattatt ttaaatatca gtgcagactggtagaaaaag gtcggtacaa    10260
gacacattat cctcaattgt ggcttttctc agatgtgctgtccattgatt tcttaggacc    10320
cctgtctata tcttcaactc tattgggtat tctgtataaacagacgttat cttctcgaga    10380
caaaaatgag ttgagagaac tcgctaactt gtcttcattgttgagatcag gagaaggatg    10440
ggaagatatc catgtcaaat tcttctctaa ggacactttactctgccctg aagagatccg    10500
acatgcgtgc aaatttggga ttgctaagga atccgctgttttaagctatt atcctccttg    10560
gtctcaagag tcttatggag gcatcacctc gatccccgtatatttttcga ccaggaagta    10620
tcccaaaatt ttagatgtcc ctcctcgggt tcaaaacccattggtctcgg gtctacgatt    10680
ggggcaactc cctactggag cacattataa gattaggagcattgtaaaga acaagaacct    10740
tcgttataga gatttcctta gttgtgggga tggatctggggggatgaccg cggcactatt    10800
gagagaaaac agacaaagta ggggaatctt caacagcctgttagagttag ccggatctct    10860
tatgagagga gcatctccag agcctccaag tgcactggagacgctcgggc aagaacgatc    10920
taggtgtgtg aatggaagca catgttggga gtactcatctgacctaagcc aaaaagagac    10980
atgggattac ttcttaagat tgaagagagg cctgggtttgaccgtggact taatcaccat    11040
ggacatggag gtcagagacc ctaatacaag tttgatgatagaaaagaacc tcaaagttta    11100
tctgcatcag atattagaac caactggtgt cttaatatataaaacatacg ggacccatat    11160
tgcgacacaa acagataata tcctgacgat aatcggtcctttctttgaga cggttgacct    11220
agtccagtcc gaatacagca gctcacaaac gtccgaggtctattttgtag gacgaggctt    11280
gcgctctcat gttgacgaac cctgggtgga ctggccatccttaatggaca attggagatc    11340
catttatgct tttcatgatc ctactacaga atttatcagagcaaaaaaag tctgtgaaat    11400
tgacagtctt ataggcattc cggctcaatt cattccagacccatttgtaa atctcgagac    11460
catgctacag atagttggtg ttccaacagg agtttcgcatgccgcagctc tattatcatc    11520
acaatatcca aatcaattgg tcacaacgtc aatattttatatgacactcg tgtcttatta    11580
taatgtaaac catattcgaa gaagccccaa gcctttctctcctccgtctg atggagtctc    11640
acagaacatt ggttcagcca tagtcggact aagtttttgggtgagtttga tggagaatga    11700
tctcggatta tacaaacagg ctctaggtgc aataaagacgtcattcccta ttagatggtc    11760
ctctgtccag accaaggatg ggtttacaca agaatggagaactaaaggaa acggaattcc    11820
taaagattgt cgtctctcag actctttggc tcagataggaaactggatca gagcgatgga    11880
attggttagg aacaaaacga ggcaatcagg attttctgaaaccctatttg atcaattctg    11940
cggacttgca gaccatcacc tcaaatggcg gaagttgggaaacagaacag gaattattga    12000
ttggctaaat aatagaattt catccattga caaatccatcttggtgacca aaagtgatct    12060
gcatgacgag aactcatgga gggagtgaag atgtattcttccacctctca ttgggtgata    12120
cccatatatg aaaaaaacta taagtacttt aaactctctttgttttttaa tgtatatctg    12180
gttttgttgt ttccgt                                                 12196
【図１】
2019514988.tif 000007
【図２】
2019514988.tif 000008
【図３】
2019514988.tif 000009
【図４Ａ】
2019514988.tif 000010
【図４Ｂ】
2019514988.tif 000011
【図４Ｃ】
2019514988.tif 000012
【図４Ｄ】
2019514988.tif 000013
【図５Ａ】
2019514988.tif 000014
【図５Ｂ】
2019514988.tif 000015
【図６】
2019514988.tif 000016
【図７Ａ】
2019514988.tif 000017
【図７Ｂ】
2019514988.tif 000018
【図７Ｃ】
2019514988.tif 000019
【図７Ｄ】
2019514988.tif 000020
【図８Ａ】
2019514988.tif 000021
【図８Ｂ】
2019514988.tif 000022
【図９】
2019514988.tif 000023
【図１０】
2019514988.tif 000024
【図１１Ａ】
2019514988.tif 000025
【図１１Ｂ】
2019514988.tif 000026
【図１２】
2019514988.tif 000027
【図１３】
2019514988.tif 000028
【図１４】
2019514988.tif 000029
【図１５】
2019514988.tif 000030
【図１６】
2019514988.tif 000031
【図１７】
2019514988.tif 000032
【図１８】
2019514988.tif 000033
【図１９】
2019514988.tif 000034
【配列表】
2019514988000001.app
【国際調査報告】
2019514988.tif 000035
2019514988.tif 000036
2019514988.tif 000037
2019514988.tif 000038
2019514988.tif 000039