(57)【要約】本明細書において、プロバイオティクス腸内微生物であるユーバクテリウム・ハリー（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ）を培養し、保存する方法が開示される。その方法は、ヒトへの投与または摂取に適し、高いＥ．ｈａｌｌｉｉバイオマス収量を提供するＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を提供する。好ましくは、高いバイオマス収量でＥ．ｈａｌｌｉｉを培養するために使用される培地は食品等級成分のみを含み、動物源を含まず、および／またはコーシャーである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトによる摂取に適したＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を調製する方法であって、
ａ）
−  １〜１００ｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｇ／ｋｇの糖、好ましくはグルコースと、
−  １〜１００ｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｇ／ｋｇの窒素源および増殖因子、例えば酵母エキスと、
−  ０．１〜５０ｇ／ｋｇの植物ペプトン、好ましくは大豆ペプトンと、
−  酢酸塩と、
−  ｐＨ６〜８における緩衝系と、
−  任意にシステインと、
−  任意にマグネシウムイオンと、
−  任意にカルシウムイオンと、
−  任意にカリウムイオンと、
−  任意にビタミンと
を含む培地を提供する工程と、
ｂ）前記培地にＥ．ｈａｌｌｉｉを接種する工程と、
ｃ）前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉを前記培地中で増殖させる工程と、
ｄ）前記培地から前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物を収集する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
嫌気性条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３０〜４２℃の範囲、好ましくは３４〜４０℃の範囲の温度で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物が濾過により前記培地から収集される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
濾液がリン酸緩衝生理食塩水でさらに洗浄される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉを凍結乾燥させて、凍結乾燥したＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を得る工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥が、スクロース、マルトース、マルトデキストリン、トレハロース、マンニトール、イヌリン、グリセロール、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリグリセロール、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される凍結保護物質を使用して実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により得られるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物。
【請求項９】
医薬として使用するための請求項８に記載のＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物。
【請求項１０】
インスリン耐性および／またはメタボリックシンドローム、脂質異常症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などのインスリン耐性関連合併症、ならびに内分泌疾患（例えば、１型糖尿病、クッシング病およびリポジストロフィー症候群を有する肥満患者）におけるインスリン耐性を予防および／または治療する際に使用するため、乳酸アシドーシス、短腸症候群または炎症性腸疾患を予防および／または治療するため、大腸がんもしくは大腸炎の発症を予防、低減させるか、または大腸がんもしくは大腸炎の重症度を低減させるための請求項８に記載のＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物。
【請求項１１】
哺乳動物の腸において酪酸形成を促進する方法であって、請求項８に記載のＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロバイオティクスの分野であり、特に、ヒトへの投与に適し、高いバイオマス収量を与え、さらに理想的には信仰に関わらずヒトへの投与に適したＥ．ｈａｌｌｉｉ（ユーバクテリウム・ハリー（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ））組成物を提供するＥ．ｈａｌｌｉｉの培養方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管は多種多様の微生物を含有し、それらの中で細菌が最も優勢であり、多様である。微生物叢は５００〜１０００の異なる細菌種から構成され、それらのほとんどは嫌気性であると考えられる。腸内微生物叢は全体的な代謝に寄与し、食物を栄養素およびエネルギーに変換する役割を果たす。微生物叢の組成の変動はヒトの間で見られており、特定の変動は特定の疾患または状態に相関する可能性がある。
【０００３】
特許文献１は、インスリン耐性および脂質異常症における小腸微生物叢の因果的役割を開示している。メタボリックシンドロームと新たに診断された１８人の男性対象に小腸の生検を行い、その後、十二指腸管挿入によりポリエチレングリコールで腸洗浄し、続いて同種異系または自己糞便移植に無作為に割り当てた。９人の対象で実施した同種異系糞便移植群において、糞便物質は健康および痩せたドナーに由来した。自己移植群は他の９人の対象を含み、彼らは彼ら独自の糞便物質を受容した。同種異系群の対象は、自己群の対象と比べて異なるＳ状腸内微生物叢を特徴とすることが見出された。ＴＧリッチリポタンパク質（ＴＧ／ＡｐｏＢ比）の空腹時レベルは同種異系群の対象において顕著に減少し、自己糞便注入後は影響がなかった。対象の体重は安定なままであったが、糞便移植の６週後、末梢（Ｒｄ）および肝臓インスリン感受性（ＥＧＰの抑制）の両方の改善が、同種異系群において６週で見出されたが、自己処置群において有意な変化は観察されなかった。
【０００４】
同種異系または自己糞便移植を受けた対象間での小腸微生物叢の変化を特定した。同種異系群のベースライン時および６週後の小腸微生物叢組成を比較すると、ブチラート産生Ｅ．ｈａｌｌｉｉの個体数の増加が示された。注目すべきことに、Ｅ．ｈａｌｌｉｉは自己群において注入後、ほぼ２倍減少した。
【０００５】
ユーバクテリウム・ハリー等に属する細菌は比較的成長の速い嫌気性生物を含む。それらは酢酸塩を必要とするプロセスにおいて乳酸塩をブチラートに変換する代謝能を有する（非特許文献１）。乳酸塩および酢酸塩は、特に連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）および乳酸菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）が定着している上部腸管における豊富な代謝産物であり、それらがこれらの化合物を産生し得る（Ｂｏｏｉｊｉｎｋら、２０１０、前出）。
【０００６】
ｄｂ／ｄｂマウス（肥満、糖尿病および脂質異常症のモデル）において、インスリン耐性（ＨＯＭＡ算出および経口耐糖能曲線のＡＵＣによる食後グルコース代謝によって検出した）およびｄｂ／ｄｂマウスの空腹時脂質プロファイルの正常化に対する明白な効果が、小腸への短期間の経口Ｅ．ｈａｌｌｉｉ  Ｌ２−７補給で見出された（特許文献１）。
【０００７】
偏性嫌気性腸内微生物の培養は困難であることが知られており、高いバイオマス収量が得られることはほとんどない。
【０００８】
今まで、Ｅ．ｈａｌｌｉｉは複合培地中で培養され、比較的低いバイオマス収量が得られている（特許文献１；非特許文献２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０３２３２８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｕｎｏｚ−Ｔａｍａｙｏら  ２０１１  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｅｃｏｌｏ  ７６：６１５−６２４
【非特許文献２】Ｄｕｎｃａｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５８１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当該技術分野において、ヒトへの投与に適した組成物を提供し、高いバイオマス収量を与える、偏性嫌気性菌であるＥ．ｈａｌｌｉｉを培養する方法についての必要性が存在している。好ましくは、そのような組成物は、全ての食品等級源を含むべきであり、動物成分を含まないべきであり、および／またはコーシャー（ｋｏｓｈｅｒ）であるべきである。好ましくは、培養方法は単純な培地に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヒトへの投与または摂取に適しており、高いバイオマス収量、好ましくは商業生産に適した収量を与える、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物を調製する方法を開発した。理想的には、培地は食品等級成分のみを含み、あらゆる動物源は含まず、および／またはコーシャーである。本発明の方法は単純な培地に基づく。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に使用される場合、「有効量」という用語は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書において教示される疾患および状態の治療および／または予防をもたらす量を指す。治療または予防適用の文脈において、動物対象、好ましくはヒト対象へ投与されるＥ．ｈａｌｌｉｉ細菌の量は、疾患または状態の種類および重症度ならびに全体的な健康、年齢、性別、体重および薬物耐性などの対象の特徴に依存する。当業者は周知の要因に応じて適切な投薬量を決定できる。細菌はまた、１種以上のさらなる治療化合物と組み合わせて投与されてもよい。
【００１４】
本明細書およびその請求項において、「含む」という動詞およびその活用は、その非限定的な意味において、その用語の前の項目が含まれるが、具体的に述べられていない項目が排除されないことを意味するために使用される。さらに、「からなる」という動詞は、本発明の組成物が、具体的に特定されているもの以外のさらなる組成物（複数も可）（そのさらなる組成物は本発明の特有の性質を変化させない）を含んでもよいことを意味する「から本質的になる」と置き換えられてもよい。
【００１５】
さらに、不定冠詞「一つの（ａまたはａｎ）」は、要素の一つおよび一つのみが存在することを文脈が明確に必要としない限り、要素の１つより多くが存在する可能性を排除しない。したがって不定冠詞「一つの（ａまたはａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００１６】
本発明の詳細な説明
Ｅ．ｈａｌｌｉｉを培養し、保存する方法
本発明は、ヒトによる摂取に適したＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を調製する方法であって、
ａ）約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０〜３０ｇ／ｋｇの糖、好ましくはグルコースと；約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜３０ｇ／ｋｇの窒素源および増殖因子、例えば酵母エキスと；約１〜２０ｇ／ｋｇ、例えば約２〜１６ｇ／ｋｇ、または約３〜１２ｇ／ｋｇの植物ペプトン、好ましくは大豆ペプトンと；約０．０１〜２０ｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜１８ｇ／ｋｇ、約０．２〜１６ｇ／ｋｇ、約０．５〜１４ｇ／ｋｇ、約０．７５〜１２ｇ／ｋｇ、約１〜１０ｇ／ｋｇ、約１．５〜８ｇ／ｋｇ、約２〜６ｇ／ｋｇ、または約２．５〜４ｇ／ｋｇの酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムと；Ｅ．ｈａｌｌｉｉによる酸性化の前にｐＨを約６〜８に維持する緩衝系と；任意にシステインと；任意にマグネシウムイオンと；任意にカルシウムイオンと；任意にカリウムイオンと；任意にビタミンとを含む培地を提供する工程と、
ｂ）前記培地にＥ．ｈａｌｌｉｉを接種する工程と、
ｃ）前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉを前記培地中で増殖させる工程と、
ｄ）前記培地から前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物を収集する工程と
を含む、方法を提供する。
【００１７】
前記培地は、約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０〜３０ｇ／ｋｇの糖を含んでもよい。前記糖は、グルコース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、およびラクトース、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。培地は、好ましくは、炭素源として、約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０〜３０ｇ／ｋｇのグルコース、フルクトースまたはスクロースを含む。
【００１８】
培地は、約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜３０ｇ／ｋｇの窒素源および増殖因子、例えば酵母エキスをさらに含んでもよい。
【００１９】
本明細書において教示される培地は、約０．１〜５０ｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜４０ｇ／ｋｇ、約１〜２０ｇ／ｋｇ、約２〜１６ｇ／ｋｇ、または約３〜１２ｇ／ｋｇの植物ペプトンをさらに含んでもよい。植物ペプトンは植物タンパク質加水分解物である。それは任意の植物に由来してもよい。植物ペプトンは、例えば、限定されないが、大豆ペプトン、小麦ペプトン、綿ペプトン、エンドウマメペプトン、ソラマメペプトン、ルピンペプトン、およびジャガイモペプトンからなる群から選択されてもよい。培地は、例えば、約０．１〜５０ｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜４０ｇ／ｋｇ、約１〜２０ｇ／ｋｇ、約２〜１６ｇ／ｋｇ、または約３〜１２ｇ／ｋｇの大豆ペプトンを含んでもよい。
【００２０】
本明細書に教示される培地は、約０．０１〜２０ｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜１８ｇ／ｋｇ、約０．２〜１６ｇ／ｋｇ、約０．５〜１４ｇ／ｋｇ、約０．７５〜１２ｇ／ｋｇ、約１〜１０ｇ／ｋｇ、約１．５〜８ｇ／ｋｇ、約２〜６ｇ／ｋｇ、または約２．５〜４ｇ／ｋｇの酢酸塩をさらに含む。酢酸塩は、それがＥ．ｈａｌｌｉｉによるブチラート形成のための基質を形成するので重要である。さらに、酢酸塩は消泡化合物である。酢酸塩は、限定されないが、酢酸ナトリウム、酢酸アルミニウム、酢酸アンモニウム、および酢酸カリウム、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。一実施形態において、培地は、約０．０１〜２０ｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜１８ｇ／ｋｇ、約０．２〜１６ｇ／ｋｇ、約０．５〜１４ｇ／ｋｇ、約０．７５〜１２ｇ／ｋｇ、約１〜１０ｇ／ｋｇ、約１．５〜８ｇ／ｋｇ、約２〜６ｇ／ｋｇ、または約２．５〜４ｇ／ｋｇの酢酸ナトリウムを含む。
【００２１】
培地は、Ｅ．ｈａｌｌｉｉによる酸性化の前に培地のｐＨを約６〜８に維持する緩衝系をさらに含んでもよい。適切な緩衝系としては、本明細書において教示されるような炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二カリウムおよびリン酸二水素カリウムが挙げられ得る。当業者は、本発明の方法における用途のための適切な食品等級の緩衝系を完全に選択できる。
【００２２】
培地は、その培地を還元状態にするシステイン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、および／またはビタミンをさらに含んでもよい。本明細書に教示される培地へのこれらの化合物の添加により、さらにもっとバイオマス収量が改善されたことが見出された。
【００２３】
一実施形態において、使用される培地は、約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは約５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０〜３０ｇ／ｋｇのグルコースと；約１〜１００ｇ／ｋｇ、例えば約２〜８０ｇ／ｋｇ、約４〜６０ｇ／ｋｇ、好ましくは５〜４０ｇ／ｋｇ、より好ましくは１０〜３０ｇ／ｋｇの酵母エキスと；約１〜２０ｇ／ｋｇ、例えば約２〜１６ｇ／ｋｇ、または約３〜１２ｇ／ｋｇの大豆ペプトンと；約０．０１〜２０ｇ／ｋｇ、例えば約０．１〜１８ｇ／ｋｇ、約０．２〜１６ｇ／ｋｇ、約０．５〜１４ｇ／ｋｇ、約０．７５〜１２ｇ／ｋｇ、約１〜１０ｇ／ｋｇ、約１．５〜８ｇ／ｋｇ、約２〜６ｇ／ｋｇ、または約２．５〜４ｇ／ｋｇの酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムと；Ｅ．ｈａｌｌｉｉによる酸性化の前にｐＨを約６〜８に維持する緩衝系と；任意にシステインと；任意にマグネシウムイオンと；任意にカルシウムイオンと；任意にカリウムイオンと；任意にビタミンとを含む。
【００２４】
本明細書において教示される方法に使用されるＥ．ｈａｌｌｉｉ株は、ＤＳＭＺに寄託され、寄託番号１７６３０として受領されている、Ｌ２−７と指定されているＥ．ｈａｌｌｉｉ株などの、任意のヒトＥ．ｈａｌｌｉｉ単離株であってもよい。
【００２５】
好ましくは、培地は動物性製品または動物由来製品などの任意の動物源を含まない。
【００２６】
本明細書において教示される方法は、好ましくは、嫌気条件下で実施される。Ｅ．ｈａｌｌｉｉは偏性嫌気性菌であるので、その生存能力は空気との接触によって影響を受ける。嫌気条件は、Ｎ２フラッシングを含む周知の方法を使用して維持することができる。
【００２７】
本明細書において教示される方法は、３０〜４２℃の範囲、好ましくは３４〜４０℃の範囲の温度で好ましくは実施される。
【００２８】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、当業者に公知の任意の技術、特に濾過などの嫌気条件下での実施に適している収集技術を使用して前記培地から収集することができる。
【００２９】
さらなる培地成分を除去または希釈するために、収集されたＥ．ｈａｌｌｉｉ細胞は、リン酸緩衝生理食塩水などの生理学的に許容可能な溶液で洗浄され得る。当業者は、適切な生理学的に許容可能な溶液、および所望の結果を達成する洗浄方法を選択することができる。例えば、透析濾過がＥ．ｈａｌｌｉｉ細胞を洗浄するために使用されてもよい。あるいは、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細胞は洗浄緩衝液中で遠心分離され、再懸濁されてもよいか、またはそれらは凍結保護物質および脱酸素剤を含有する緩衝液中に直接取られてもよい。
【００３０】
本明細書において教示される方法は、前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉを凍結乾燥して凍結乾燥したＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を得る工程をさらに含んでもよい。あるいはまたはさらに、方法は、前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉをカプセル化して、カプセル化したＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を得る工程をさらに含んでもよい。
【００３１】
カプセル化の技術はプロバイオティクス細菌を保存するための分野において周知である（例えば、Ｓｅｒｎａ−ＣｏｃｋおよびＶａｌｌｅｊｏ−Ｃａｓｔｉｌｌｏ、２０１３．Ａｆｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｓ、７（４０）：４７４３−４７５３（本明細書に参照により組み込まれる）に概説されている）。Ｓｅｒｎａ−ＣｏｃｋおよびＶａｌｌｅｊｏ−Ｃａｓｔｉｌｌｏによって教示されている保存技術および保存システムのいずれかが本発明に利用されてもよい。
【００３２】
凍結乾燥工程は当該分野において公知の任意の方法を使用して実施され得る。フリーズドライまたは凍結乾燥は一般的に微生物を保存するために使用される。いずれにしろ、凍結乾燥物は数十年間保存することができる。したがって、多くの微生物が収集菌において凍結乾燥物として保存される。形成の間の生存能力の低下の可能性を克服するために、例えば少なくとも１０７個の細胞を含有する濃縮培養液を凍結乾燥することが一般的に推奨されている。これにより、凍結乾燥、長期の保存および再構成後、十分な生存細胞の存在が確保される。本明細書において教示されているＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物などのプロバイオティクス調製物に関して、可能な限り多くの細菌が凍結乾燥およびその後の保存で生存していることが重要である。
【００３３】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉは凍結および凍結乾燥に対して非常に感受性があることが見出された。凍結保護物質は、しばしば、凍結乾燥の間、プロバイオティクス製剤を保護し、保存可能期間を向上させるために利用される。しかしながら、適切および適合性の凍結保存の選択は大きな課題のままである。これまで、Ｅ．ｈａｌｌｉｉに対して適切な凍結保護物質は報告されていない。
【００３４】
本明細書において教示される方法において、スクロース、マルトース、マルトデキストリン、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イヌリン、グリセロール、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリグリセロール、スキムミルク、乳タンパク質、乳清タンパク質、ＵＨＴミルク、ベタイン、アドニトール、スクロース、グルコース、ラクトースまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される凍結保護物質が利用されてもよい。
【００３５】
デンプンおよびふすまなどのプレバイオティクスが、本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物の有効性を向上させるために凍結乾燥前にさらに加えられてもよい。リボフラビン、リン酸リボフラビンまたはそれらの生理学的に許容可能な塩、グルタチオン、アスコルビン酸塩、グルタチオンおよびシステインなどの酸化防止剤の、凍結乾燥混合物への添加は、保存の間、本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物の生存能力をさらに向上させることができる。
【００３６】
凍結乾燥法としては、限定されないが、乾燥前の−４０℃への遅く段階的な凍結、乾燥前に−８０℃に置くことによる急速凍結、または乾燥前に低温保護した細胞を液体窒素中に落とすことによる超高速凍結が挙げられる。
【００３７】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉを凍結に対してより抵抗性があるようにするために、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細胞を悪条件で調製する培養の間、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細胞を軽度から中度のストレス処理に供することは有益であり得る。例えば、培養の間、細胞を、例えば低用量の過酸化水素を加えること、特定の栄養素を制限すること、低ｐＨ値で培養することなどによって軽度の酸化ストレスに供してもよい。
【００３８】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物
本発明はまた、本明細書において教示される方法によって得られるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物にも関する。前記調製物はヒトによる摂取に適していることを特徴とする。
【００３９】
本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、好ましくは、生理学的に許容可能な担体と共に有効量のＥ．ｈａｌｌｉｉを含む。
【００４０】
好ましくは、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、約１０６〜約１０１２、好ましくは約１０８〜約１０１２個の生存Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌を含む。好ましくは、前記細菌は１日用量に含まれる。
【００４１】
好ましくは、本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物は腸内または経口投与用である。腸内または経口投与用の組成物は、食品組成物、飼料組成物、または医薬組成物のいずれであってもよい。
【００４２】
本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、通常、医薬担体、好ましくは不活性担体などの担体を含む。好ましい形態は意図する投与様式および（治療）用途に依存する。医薬担体は、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌を対象の胃腸管に送達するのに適した任意の相溶性の非毒性物質であり得る。例えば、滅菌水または不活性固体が、通常、薬学的に許容可能なアジュバント、緩衝剤、分散剤などと共に補足される担体として使用されてもよい。組成物は、液体形態、例えばＥ．ｈａｌｌｉｉ細菌の安定化された懸濁液、または固体形態、例えば凍結乾燥したＥ．ｈａｌｌｉｉ細菌の粉末のいずれかである。経口投与に関して、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌は、カプセル剤、錠剤および粉剤などの固体剤形、またはエリキシル剤、シロップ剤および懸濁剤などの液体剤形で投与されてもよい。Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌は、例えば、不活性成分および粉末担体、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどと一緒にゼラチンカプセルなどのカプセル中にカプセル化されてもよい。
【００４３】
本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、栄養補助食品または食品もしくは食品組成物（本明細書においてまとめて「食品組成物」と称する）の形態であってもよく、それらはＥ．ｈａｌｌｉｉ細菌以外に、適切な食品基材も含有してもよい。あるいは、そのような調製物は、栄養補助飼料または飼料もしくは飼料組成物（本明細書においてまとめて「飼料組成物」と称する）の形態であってもよい。食品もしくは食品組成物または飼料組成物は、本明細書において、ヒトまたは非ヒト動物消費用の液体、すなわちドリンクまたは飲料を含むと理解される。食品もしくは食品組成物または飼料組成物は、固体、半固体および／または液体の食品または食品組成物であってもよく、特に、限定されないが、ヨーグルト、ヨーグルトベースのドリンクまたはバターミルクを含む発酵乳製品などの乳製品であってもよい。このような食品もしくは食品組成物または飼料組成物は、例えば、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌を適切な食品、食品基材または飼料基材に適切な量で加えることによって、それ自体公知の様式で調製されてもよい。同様に、それらは胃の低ｐＨを通過しなければならないので、上記のカプセル化形態中でのこれらの細菌の使用を含んでもよい。また、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌の増殖と関連する微量のブチラートを低減させ、食品または食品組成物のオフフレーバーを生じ得るのに好ましい手段があり得る。別の実施形態において、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌は、例えば発酵によって食品もしくは食品組成物または飼料組成物中に使用されてもよいか、またはそれらの調製のために使用されてもよい。そうする際に、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌は、このような発酵食品もしくは食品組成物または発酵飼料組成物の調製のためのそれ自体公知の様式で、例えば乳酸菌を使用した発酵乳製品の調製のためのそれ自体公知の様式で使用されてもよい。このような方法において、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細菌は通常使用される微生物に加えて使用されてもよく、および／または通常使用される微生物の１種以上または一部と置き換えられてもよい。
【００４４】
好ましくは、本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、１日または１週間につき１回または複数回の用量として、あるいは１日または１週間につき１回または複数回の用量で上記に示した簡便な（経口）投与を可能にする量でＥ．ｈａｌｌｉｉ細菌を含有してもよい。特に、調製物は単位用量のＥ．ｈａｌｌｉｉを含有してもよい。
【００４５】
前記Ｅ．ｈａｌｌｉｉ調製物は、医薬としての使用のため、特にインスリン耐性および／またはメタボリックシンドローム、脂質異常症、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）もしくは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などのインスリン耐性関連合併症、ならびに内分泌疾患（例えば、１型糖尿病、クッシング病およびリポジストロフィー症候群を有する肥満患者）におけるインスリン耐性を予防および／または治療する際に使用するため、乳酸アシドーシス、短腸症候群または炎症性腸疾患を予防および／または治療するため、大腸がんもしくは大腸炎の発症を予防、低減させるか、または大腸がんもしくは大腸炎の重症度を低減させるために適している。
【００４６】
本発明はまた、哺乳動物の腸において酪酸形成を促進する方法であって、本明細書において教示されるＥ．ｈａｌｌｉｉ調製物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を教示する。
【００４７】
本明細書に引用される全ての特許および文献の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
上記の説明は、本発明のいくつかの実施形態を例示することを意図し、保護の範囲を限定しないことは明白である。本開示から開始して、本発明の保護および本質の範囲内であり、従来技術および本特許の開示の明白な組み合わせである多くのさらなる実施形態が当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００４９】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉの培養
以下の成分および濃度を使用して培地を調製した：
【００５０】
【表１】
2019500035.tif 000002
【００５１】
培地を１２１℃にて２０分間オートクレーブに供し、続いてＮ２でフラッシュした。ｐＨを６．９±０．１に調整した。
【００５２】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉの約２０ｍｌの研究培養物を約１Ｌの培地に加え、３７℃にて１８時間培養した。続いて５００ｍｌのこの培養物を２０Ｌの培地に加え、３７℃にて１４〜１８時間培養した。全ての工程は無菌およびＮ２（フラッシュ）下で実施した。
【００５３】
培地をｐＨ６．９〜ｐＨ５．０に酸性化している間、細胞は８．５の光学濃度（ＯＤ６００）まで増殖した。
【００５４】
【表２】
2019500035.tif 000003
【００５５】
培地２に、以下の濾過滅菌した嫌気性溶液を加えた：
【００５６】
【表３】
2019500035.tif 000004
【００５７】
【表４】
2019500035.tif 000005
【００５８】
培地を１２１℃にて２０分間オートクレーブに供し、続いてＮ２でフラッシュした。ｐＨを６．９±０．１に調整した。
【００５９】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉの約２０ｍｌの研究培養物を約１Ｌの培地に加え、３７℃にて１８時間培養した。続いて５００ｍｌのこの培養物を２０Ｌの培地に加え、３７℃にて１４〜１８時間培養した。１０Ｌの前記培養物を３２０Ｌの培地に加え、３７℃にて１４〜１６時間培養した。全ての工程は無菌およびＮ２（フラッシュ）下で実施した。
【００６０】
培地をｐＨ６．９〜ｐＨ５．０に酸性化している間、細胞は９．４の光学濃度（ＯＤ６００）（１．４×１０９細胞／ｍｌ）まで増殖した。
【００６１】
中空繊維膜（Ｋｏｃｈ膜システム；ＨＦ３０４３−２５−４３−ＰＭ５００；ＨＦ３０４３−１６−１０６−ＰＭ５００）およびＰＢＳを使用した透析濾過による濃縮を使用して細胞を収集した。培地成分および発酵産物のレベルがそれらの初期濃度の約２％に達するまで透析濾過を継続した。試料を約２０倍に濃縮し、ＰＢＳ中に約１５Ｌの濃縮したＥ．ｈａｌｌｉｉ細胞を得た。培地化合物の約９９．８％を除去した。
【００６２】
試料を、グリセロールまたはグリセロールとＰＢＳ中の殺菌した層流キャビネット（予めオートクレーブし、予め冷却し、予めＮ２でフラッシュした）内に充填した。
【００６３】
細胞の凍結乾燥
８００ｍＬの最終培養物を含む遠心分離ボウルを４０００ｒｐｍ−１にて３０分間遠心分離した。上清を嫌気性チャンバ中で除去した。
【００６４】
続いて、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ細胞を凍結乾燥した。５つの異なる凍結保護溶液を試験した：
【００６５】
【表５】
2019500035.tif 000006
【００６６】
【表６】
2019500035.tif 000007
【００６７】
【表７】
2019500035.tif 000008
【００６８】
【表８】
2019500035.tif 000009
【００６９】
【表９】
2019500035.tif 000010
【００７０】
８０ｍＬの凍結保護溶液を、細胞ペレットを含有する遠心分離ボウルに加えた。バイオマスおよび凍結保護溶液を均質化するためにボウルを振盪した。結果として得られた物質を嫌気性チャンバ中で５０ｍＬを含有する２つのプレートにまいた。これらのプレートを密封したボックスに置き、−４０℃にて冷凍した。プレートを１〜２日間、凍結乾燥機に置いたままにした。収集後、凍結乾燥物を手動で粉砕し、嫌気性条件下でバッグに詰めた。その後、それらを−４℃にて保存した。
【００７１】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉは凍結乾燥後、再増殖でき、細菌は凍結乾燥後、生存したままであることが実証された。この実施例において、凍結乾燥後の最も高い生存は凍結保護溶液１で見出された。凍結乾燥物の生存は、全過程を可能な限り嫌気性条件下で実施したときに良好であることが見出された。
【００７２】
実施例３
比較例
実施例１および２に記載したコーシャー（ｋｏｓｈｅｒ）培地での増殖収量は、動物源由来の成分を含有している従来の培地でのＥ．ｈａｌｌｉｉの増殖について記載されたものよりはるかに高かった。典型的な例は、グルコースまたは乳酸塩を加えた、Ｄｕｎｃａｎら、２００３（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６９：１１３６−４２）により記載されているＹＣＦＡ培地である。このＹＣＦＡ培地は嫌気性および腸内細菌の増殖を支援するために広範に使用されている（Ｂｒｏｗｎｅら、２０１６、Ｎａｔｕｒｅ  ５３３：５４３−４６を参照のこと）。しかしながら、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ  Ｌ２−７の増殖は、グルコースまたは他の化合物を加えたＹＣＦＡで０．８〜１．０のＯＤ６００のみに達しただけであることが記載されていた（Ｄｕｎｃａｎら、２００４、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０：５８１０−１７）。動物由来産物であるヘミンおよびカシトン（ｃａｓｉｔｏｎ）を、グルコースを有するＹＣＦＡに加えた場合、増殖はわずかにだけ良くなり、１．８の最大ＯＤ６００に達した（Ｅｎｇｅｌｓら、２０１６、Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：７１３）。
【００７３】
培地２についての９．４のＯＤ６００の上記の増殖収量は、まだ完全に増殖していない培養物から得たものであることに留意されるべきである。開発したコーシャー培地が他の今までに記載された培地より優れていることを示すために、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ株Ｌ２−７を、嫌気性チャンバにおいて２００ｍｌ体積の培地２中で３５〜４０時間培養した（実験番号１および実験番号２；以下の表を参照のこと）。さらに、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ  Ｌ２−７をまた、培地２で２．５リットル発酵槽においてラージスケールで増殖させた（実験２．５リットル；以下の表を参照のこと）。その結果により、スモールおよびラージスケールの発酵で、２０に近い高収量のＯＤ６００を得ることができたことが示される。
【００７４】
ＯＤ６００の特定の細胞数への変換はいくつかの要因に依存する。本発明者らはフローサイトメトリーにより細胞の数を決定し、１のＯＤ６００が約１×１０８〜１．３×１０８細胞／ｍｌに対応することを見出した。しかしながら、細胞の数だけでなく、細胞のサイズもまた、収量を決定する。Ｅ．ｈａｌｌｉｉの寸法はかなり変化する可能性があり、細胞は直径０．８〜２．４マイクロメートルであり、長さ４．７〜２５．０マイクロメートルであると記載されている（Ｄｅ  Ｖｏｓ  Ｐら、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３  Ｓｅｃ  Ｅｄ  ｐ．８８１）。位相差顕微鏡により、培地２において増殖した細胞はかなり長く、ＯＤ６００単位によって比較的少ない細胞数が得られたことが示された。したがって比較実験においてＯＤ６００値を使用した。
【００７５】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉ  Ｌ２−７の増殖
【００７６】
【表１０】
2019500035.tif 000011
【００７７】
Ｅ．ｈａｌｌｉｉの増殖を支援する際の本明細書において教示される培地の有用性はまた、単細胞の効率的な増殖が、高効率の平板培養（１０％以上）で１％の寒天を補足した培地２で得られたという観察によって示された。嫌気性生物を数え上げることは困難であることが知られており、通常、最確数（ＭＰＮ）法が、生存細胞の数を推定するために使用されており、それは時間のかかる手順である。さらに、Ｅ．ｈａｌｌｉｉの高い平板培養効率を支援する培地の有用性もまた、Ｅ．ｈａｌｌｉｉ株Ｌ２−７の誘導体または変異体を選択するために使用された。
【００７８】
これらの全てにより、Ｅ．ｈａｌｌｉｉの高密度までの効率的な増殖を可能にする本明細書において教示される培地の有用性が示された。
【国際調査報告】
2019500035.tif 000012
2019500035.tif 000013
2019500035.tif 000014