(57)【要約】  本発明は、３ｐＥ  Ａβに結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法、並びに製剤の使用、投与、及びキットを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを使用する方法を提供する。開示される抗体及びその抗原結合フラグメント並びに方法は、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患の診断、予後診断及び治療に有用である。
2019534010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、
ｂ）配列番号１３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、を含む、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ａ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号３を含み、
ｂ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号４を含み、
ｃ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号５を含み、
ｄ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号１４を含み、
ｅ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１５を含み、かつ、
ｆ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１６を含む、請求項１のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ａ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号３であり、
ｂ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号４であり、
ｃ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号５であり、
ｄ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号１４であり、
ｅ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１５であり、かつ、
ｆ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１６である、請求項１〜２のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ａ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号６を含み、
ｂ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号７を含み、
ｃ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号８を含み、
ｄ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号１７を含み、
ｅ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１８を含み、かつ、
ｆ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１９を含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ａ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号６であり、
ｂ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号７であり、
ｃ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号８であり、
ｄ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号１７であり、
ｅ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１８であり、かつ、
ｆ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１９である、請求項１又は４のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
ａ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号９を含み、
ｂ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１０を含み、
ｃ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１１を含み、
ｄ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号２０を含み、
ｅ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１８を含み、かつ、
ｆ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１６を含む、請求項１に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ａ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号９であり、
ｂ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１０であり、
ｃ）前記重鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１１であり、
ｄ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１が、配列番号２０であり、
ｅ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ２が、配列番号１８であり、かつ、
ｆ）前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３が、配列番号１６である、請求項１又は６のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ａ）前記重鎖可変領域が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ、
ｂ）前記軽鎖可変領域が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ａ）配列番号１の重鎖と、
ｂ）配列番号１２の軽鎖と、を含む、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を生成するハイブリドーマ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のハイブリドーマを使用することを含む、モノクローナル抗体を生成する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
β−アミロイドタンパク質を含有するプラークの形成に関連する状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１６】
前記状態が、アルツハイマー病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記状態が、トリソミー２１（ダウン症候群）、びまん性レビー小体病、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、及びオランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）に関連する認知症からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
アルツハイマー病に関連するプラークを減少させる方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【請求項１９】
３ｐＥ  Ａβのシーディング活性を阻害する方法であって、それを必要とする対象に請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドに対する抗体及びその抗体を使用した治療方法の分野に関する。具体的には、抗体は、アミロイド関連障害を同定及び治療するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に激しい精神機能低下を導き、最終的には死に至らしめる、記憶、認知、論理的思考、判断力、及び情緒的安定性の進行性喪失を臨床的特徴とする、退行性脳障害である。アルツハイマー病は、高齢者における進行性の精神障害（認知症）の一般的な原因である。アルツハイマー病は世界中で確認されており、主要な公衆衛生問題を表す。この疾患は、現在、米国だけで５００万人を超える個体が罹患していると推定されている。現在のところ、それは不治であり、いかなる治療もＡＤを効果的に防止しない、又はその症状若しくは経過を逆転させない。
【０００３】
ＡＤの個体の脳は、アミロイド斑、アミロイド血管症（血管におけるアミロイド沈着）及び神経原線維変化と呼ばれる特徴的な病変を呈する。これら病変の大多数、特にアミロイド斑及び神経原線維変化は、一般に、記憶及び認知機能に重要な脳のいくつかの領域に見られる。アミロイド斑及びアミロイド血管症はまた、トリソミー２１（ダウン症候群）、びまん性レビー小体病及びオランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）の個体の脳を特徴付ける。
【０００４】
アミロイド斑の主要な構成成分は、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断によって産生される様々なアミロイドβ（Ａβ）ペプチドである。脳におけるＡβペプチドの付着は、ＡＤをもたらす疾患カスケードにおける早期の及び必要な工程であると仮定されている。Ａβ産生の変化をもたらし、家族性早発型ＡＤを引き起こす、アミロイド前駆体タンパク質及びプレセニリン遺伝子における変異の同定は、アミロイド代謝の変化がこの疾患の根底にある病原性過程の中心的な事象であるという強力な証拠を提供する。
【０００５】
第３残基がピログルタメートを有するアミロイド−βペプチド（３ｐＥ  Ａβ）は、ＡＤ患者の脳に蓄積した主要な種である。３ｐＥ  Ａβは、ＡＤにおけるほぼ全てのびまん性プラーク及び成熟プラークに存在し、代謝的に安定であり、プラークシーディング（plaque seeding）及び安定化の両方において役割を果たし得る（Ｃｙｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，２０１６；１１：４８）。検出可能な量の３ｐＥ  Ａβは、ＣＳＦ又は血漿中で報告されていないので、標的ペプチドが病理学特異的であることを示唆している（ＤｅＭａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２０１２；７６：１−１３）。３ｐＥ  Ａβに選択的に結合する抗体は、免疫療法に有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
具体化され十分に記載されたとおり、本発明は、第３残基がピログルタメートを有するアミロイド−β（３ｐＥ  Ａβ）に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント、３ｐＥ  Ａβに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法、そのような抗体又はその抗原結合フラグメントを使用したアッセイ方法、並びにアルツハイマー病及び他のβ−アミロイド関連疾患の少なくとも１つの病状又は症状を治療、その発症を遅延させる、又はそれを回復させるための薬剤の製造のための、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用に関する。本発明の抗体は、３ｐＥを含有しないＡβペプチドよりも３ｐＥを含有するＡβペプチドに優先的に結合する。
【０００７】
具体的には、本発明は、配列番号１の重鎖と配列番号１２の軽鎖とを含む、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。他の実施形態では、本発明は、配列番号２の重鎖可変領域と配列番号１３の軽鎖可変領域とを含む、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。他の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３、６及び９のいずれかのＣＤＲ１と、配列番号４、７及び１０のいずれかのＣＤＲ２と、配列番号５、８及び１１のいずれかのＣＤＲ３と、を含み、かつ、軽鎖可変領域は、配列番号１４、１７及び２０のいずれかのＣＤＲ１と、配列番号１５及び１８のいずれかのＣＤＲ２と、配列番号１６及び１９のいずれかのＣＤＲ３と、を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号３〜５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域は、配列番号１４〜１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む。別の特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号６〜８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域は、配列番号１７〜１９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む。別の特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９〜１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域は、配列番号２０、１８及び１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ含む。
【０００８】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
【０００９】
本発明の一実施形態は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５を含むＣＤＲ１配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸残基５０〜６６を含むＣＤＲ２配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸残基９９〜１０８を含むＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸残基２４〜３９を含むＣＤＲ１配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸残基５５〜６１を含むＣＤＲ２配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸残基９４〜１０２を含むＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、配列番号４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、配列番号５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、配列番号１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００１１】
好ましい実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの好ましい実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなるフラグメントの群から選択される。抗体又はその抗原結合フラグメントは、３ｐＥ  Ａβペプチド（例えば、Ａβ３ｐＥ−４０及びＡβ３ｐＥ−４２）に選択的に結合し、他のＡβペプチド又はβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対する交差反応性がほとんどないか、又は全くない。
【００１２】
本発明の実施形態は、３ｐＥ  Ａβに対するモノクローナル抗体を生成する方法を含む。本発明の特定の実施形態は、３ｐＥ  Ａβに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。別の実施形態では、３ｐＥ  Ａβに結合するモノクローナル抗体は、組換えにより産生される。実施形態において、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって発現されるか、又は組換えにより発現される。生成されるモノクローナル抗体は、配列番号２からなる重鎖可変領域と配列番号１３からなる軽鎖可変領域とを含む。
【００１３】
本発明の実施形態は、アルツハイマー病及び他のβ−アミロイド関連疾患を治療する方法であって、３ｐＥ  Ａβに結合する上記の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患を有する個体に投与することを含む、方法に関する。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態は、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患に関連するプラークを除去する方法であって、３ｐＥ  Ａβに結合する上記の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患を有する個体に投与することを含む、方法である。
【００１５】
他の実施形態は、３ｐＥ  Ａβのプラークシーディング活性（seeding activity）を阻害する方法であって、３ｐＥ  Ａβに結合する上記の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患を有する個体に投与することを含む、方法に関する。
【００１６】
実施形態は、上記の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を含む。そのような医薬組成物は、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患を有する対象に投与され得、又は上記の方法などの、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患を治療するための方法に使用され得る。
【００１７】
一実施形態は、上記の抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキット及びデバイスを含む。本発明のさらなる目的、特徴及び利点が、以下の好ましい実施形態の詳細な考察から、当業者に明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】完全長ヒト（Ａβ１−４２）（配列番号２５）、Ｎ−切断（Ａβ３−４２）（配列番号２６）、及びピログルタメート修飾（Ａβ  ３ｐＥ−４２）（配列番号３０）のＡβペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】サンドイッチＥＬＩＳＡにおける合成ヒトＡβペプチドの検出によるＡβ／ｐＥ３／１の選択性を示す。Ａβ／ｐＥ３／１は、Ａβ３ｐＥ−４０に結合する。
【図２Ｂ】サンドイッチＥＬＩＳＡにおける合成ヒトＡβペプチドの検出によるＡβ／ｐＥ３／１の選択性を示す。Ａβ／ｐＥ３／１は、Ａβ３−４０に結合する。
【図２Ｃ】サンドイッチＥＬＩＳＡにおける合成ヒトＡβペプチドの検出によるＡβ／ｐＥ３／１の選択性を示す。Ａβ／ｐＥ３／１は、Ａβ１−４０には結合しない。
【図２Ｄ】サンドイッチＥＬＩＳＡにおける合成ヒトＡβペプチドの検出によるＡβ／ｐＥ３／１の選択性を示す。Ａβ／ｐＥ３／１は、ＡβｐＥ１１−４０には結合しない。
【図３Ａ】（Ａ）Ａβ／ｐＥ３／１及び（Ｂ）陽性対照ポリクローナル抗体による免疫組織化学法による、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＡＤ脳組織におけるプラークに対する反応性を示す。
【図３Ｂ】（Ａ）Ａβ／ｐＥ３／１及び（Ｂ）陽性対照ポリクローナル抗体による免疫組織化学法による、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＡＤ脳組織におけるプラークに対する反応性を示す。
【図４Ａ】（Ａ）Ａβ／ｐＥ３／１及び（Ｂ）陽性対照ポリクローナル抗体による免疫組織化学法による、非固定凍結保存ＡＤ脳組織におけるプラークに対する反応性を示す。
【図４Ｂ】（Ａ）Ａβ／ｐＥ３／１及び（Ｂ）陽性対照ポリクローナル抗体による免疫組織化学法による、非固定凍結保存ＡＤ脳組織におけるプラークに対する反応性を示す。
【図５Ａ】Ａβ抗体又は対照で処置したマウスにおける脳の代表的な画像を示す。６ヶ月齢のマウスを、（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）末端特異的Ａβ抗体３Ｄ６（６０ｍｇ／ｋｇ）又は（Ｃ）３Ｄ６（２０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。１９〜２０ヶ月齢のマウスを、（Ｄ）ＰＢＳ又は（Ｅ）Ａβ／ｐＥ３／１（６０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。矢印は、剖検時の出血の観察結果を示す。
【図５Ｂ】Ａβ抗体又は対照で処置したマウスにおける脳の代表的な画像を示す。６ヶ月齢のマウスを、（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）末端特異的Ａβ抗体３Ｄ６（６０ｍｇ／ｋｇ）又は（Ｃ）３Ｄ６（２０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。１９〜２０ヶ月齢のマウスを、（Ｄ）ＰＢＳ又は（Ｅ）Ａβ／ｐＥ３／１（６０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。矢印は、剖検時の出血の観察結果を示す。
【図５Ｃ】Ａβ抗体又は対照で処置したマウスにおける脳の代表的な画像を示す。６ヶ月齢のマウスを、（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）末端特異的Ａβ抗体３Ｄ６（６０ｍｇ／ｋｇ）又は（Ｃ）３Ｄ６（２０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。１９〜２０ヶ月齢のマウスを、（Ｄ）ＰＢＳ又は（Ｅ）Ａβ／ｐＥ３／１（６０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。矢印は、剖検時の出血の観察結果を示す。
【図５Ｄ】Ａβ抗体又は対照で処置したマウスにおける脳の代表的な画像を示す。６ヶ月齢のマウスを、（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）末端特異的Ａβ抗体３Ｄ６（６０ｍｇ／ｋｇ）又は（Ｃ）３Ｄ６（２０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。１９〜２０ヶ月齢のマウスを、（Ｄ）ＰＢＳ又は（Ｅ）Ａβ／ｐＥ３／１（６０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。矢印は、剖検時の出血の観察結果を示す。
【図５Ｅ】Ａβ抗体又は対照で処置したマウスにおける脳の代表的な画像を示す。６ヶ月齢のマウスを、（Ａ）ＰＢＳ、（Ｂ）末端特異的Ａβ抗体３Ｄ６（６０ｍｇ／ｋｇ）又は（Ｃ）３Ｄ６（２０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。１９〜２０ヶ月齢のマウスを、（Ｄ）ＰＢＳ又は（Ｅ）Ａβ／ｐＥ３／１（６０ｍｇ／ｋｇ）で処理した。矢印は、剖検時の出血の観察結果を示す。
【図６Ａ】（Ａ及びＣ）ＰＢＳ又は（Ｂ及びＤ）Ａβ／ｐＥ３／１による処置後のヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現しているマウスの脳の凍結切片を示す。二次抗マウスＩｇＧ２ａ抗体のみを使用して、（Ａ及びＢ）を染色した。一次抗体及び二次抗体の両方を提供した後に、（Ｃ及びＤ）を染色した。スケールバーは、２．５ｍｍを表す。
【図６Ｂ】（Ａ及びＣ）ＰＢＳ又は（Ｂ及びＤ）Ａβ／ｐＥ３／１による処置後のヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現しているマウスの脳の凍結切片を示す。二次抗マウスＩｇＧ２ａ抗体のみを使用して、（Ａ及びＢ）を染色した。一次抗体及び二次抗体の両方を提供した後に、（Ｃ及びＤ）を染色した。スケールバーは、２．５ｍｍを表す。
【図６Ｃ】（Ａ及びＣ）ＰＢＳ又は（Ｂ及びＤ）Ａβ／ｐＥ３／１による処置後のヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現しているマウスの脳の凍結切片を示す。二次抗マウスＩｇＧ２ａ抗体のみを使用して、（Ａ及びＢ）を染色した。一次抗体及び二次抗体の両方を提供した後に、（Ｃ及びＤ）を染色した。スケールバーは、２．５ｍｍを表す。
【図６Ｄ】（Ａ及びＣ）ＰＢＳ又は（Ｂ及びＤ）Ａβ／ｐＥ３／１による処置後のヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現しているマウスの脳の凍結切片を示す。二次抗マウスＩｇＧ２ａ抗体のみを使用して、（Ａ及びＢ）を染色した。一次抗体及び二次抗体の両方を提供した後に、（Ｃ及びＤ）を染色した。スケールバーは、２．５ｍｍを表す。
【図７Ａ】ヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現している６ヶ月又は１９〜２０ヶ月齢のマウスにおける、（Ａ）３Ｄ６抗体、（Ｂ）Ａβ／ｐＥ３／１又は（Ｃ）ＰＢＳによる処置後のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色を示す。
【図７Ｂ】ヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現している６ヶ月又は１９〜２０ヶ月齢のマウスにおける、（Ａ）３Ｄ６抗体、（Ｂ）Ａβ／ｐＥ３／１又は（Ｃ）ＰＢＳによる処置後のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色を示す。
【図７Ｃ】ヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現している６ヶ月又は１９〜２０ヶ月齢のマウスにおける、（Ａ）３Ｄ６抗体、（Ｂ）Ａβ／ｐＥ３／１又は（Ｃ）ＰＢＳによる処置後のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）による染色を示す。
【図８】ヒトＡβ（３ｐＥ−４０）ペプチドに対するＡβ／ｐＥ３／１の親和性結合相互作用の、表面プラズモン共鳴標識を含まない検出によるセンサグラム（シングルサイクルキネティクス）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物学的システムに限定されるものではなく、これらは変更可能であることを理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、限定的なものではない点も理解すべきである。
【００２０】
本発明は、３ｐＥを含有しないＡβペプチドよりも３ｐＥ  Ａβペプチドに特に優先的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。３ｐＥ  Ａβペプチドに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを生成する方法、及び３ｐＥ  Ａβペプチドに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するハイブリドーマを生成する方法をさらに提供する。本発明はまた、個体におけるアルツハイマー病及び他のβ−アミロイド関連疾患を治療する方法、アルツハイマー病又は他のβ−アミロイド関連疾患に関連するプラークを除去する方法、及び３ｐＥ  Ａβのプラークシーディング活性を阻害する方法を含む。本発明はまた、記載される方法で使用するための抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキット及びデバイスを提供する。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、配列番号２と配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３と配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明の一実施形態は、配列番号２のアミノ酸残基３１〜３５を含むＣＤＲ１配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１のアミノ酸残基５０〜６６を含むＣＤＲ２配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸残基９９〜１０８を含むＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸残基２４〜３９を含むＣＤＲ１配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸残基５５〜６１を含むＣＤＲ２配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸残基９４〜１０２を含むＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００２３】
好ましい実施形態は、配列番号３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、配列番号４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、配列番号５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列と、配列番号１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列と、配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列と、を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００２４】
抗体
本発明は、３ｐＥ  Ａβに結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本明細書において、用語「抗体」は、抗原又はその一部に結合することができる免疫グロブリンタンパク質、特に３ｐＥ  Ａβに特異的に結合することができる免疫グロブリンタンパク質を指す。抗原への抗体の結合は、当業者に既知の方法によって測定することができ、一例として、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）器具の使用がある。一般的に言えば、抗体又は抗原結合抗体フラグメントは、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下であるとき、抗原に特異的に結合すると言われている。
【００２５】
抗体の抗原結合フラグメントは、無傷の抗体が結合する抗原に結合することができ、抗原結合に関して無傷の抗体と競合する、抗体のフラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、抗原結合を可能にする無傷の抗体の一部分（すなわち、無傷の抗体の可変領域）を含む。抗原結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦＶ）、ダイアボディ、ミニボディ、及び線状抗体；並びに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００２６】
抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖とからなる。各重鎖は、１つの可変ドメイン又は領域（ＶＨ）、続いて定常ドメイン又は領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、並びにさらに２つの定常ドメイン又は領域（ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。各軽鎖は、１つの可変ドメイン又は領域（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン又は領域（ＣＬ）を有する。重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は領域は、特定のエピトープ（鍵に類似の構造）に特異的な抗体（同様に錠に類似の構造）のパラトープを形成し、パラトープ及びエピトープを精度よく一緒に結合することを可能にする。可変ドメイン内では、軽鎖及び重鎖にそれぞれ３つある可変ループのβ−ストランドが抗原への結合を担っている。これらのループは、相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）と称される。
【００２７】
ＣＤＲは、抗体の相補性決定領域として定義される。これらは、抗原への結合に主に関与する、抗体の重鎖及び軽鎖の超可変領域である。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれに、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が存在する。抗体のＣＤＲは、多くの方法で定義され得る。例えば、可変領域内のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴの定義、及び／又は立体構造定義、又は当該技術分野において周知のＣＤＲ決定の任意の方法に従って特定され得る。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）によって元来定義される超可変領域、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３（１９８９））によって元来説明される構造的ループ構造、又は独自の付番方式のＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ７：１３２−１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９）；Ｓｃａｖｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１６：２３４−２４０（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３：Ｄ４１３−４２２（２０１５））として特定され得る。
【００２８】
抗体の文脈において使用される場合、「単離された」とは、「人間の手によって」任意の天然の状態から変化したことを意味し、すなわち、自然に単離が生じた場合は、その元の環境から変化するか若しくは除去されるか、又はその両方が行われている。本明細書においてこの用語が使用される場合、例えば、自然状態において生存している動物に自然に存在する自然発生の抗体は「単離され」ていないが、自然状態の共存物質から分離された同じの抗体は、「単離され」ている。抗体は、イムノアッセイ試薬などの自然発生しない組成物において生じることができ、本明細書において本用語が用いられる場合、用語の意味の範囲において、組成物において単離された抗体のままであり続けることができる。
【００２９】
抗体を生成する方法は、宿主に所望の免疫原を接種することを含む。好適な宿主としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ロバ、ウマ、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ヒト、及び成熟した免疫応答を起こすことができる任意の種が挙げられるが、これらに限定されない。免疫化手順は、当該技術分野において確立されており、「Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２０００）を含む、多くの論文及び出版物に記載されている。
【００３０】
好ましくは、本発明の特徴を具現化する免疫原は、宿主対象、例えば、動物又はヒトに、アジュバントと組み合わせて投与される。好適なアジュバントとしては、フロイント（Freund's）アジュバント、粉末水酸化アルミニウム（ミョウバン）、百日咳菌と合わせた水酸化アルミニウム、及びモノホスホリルリピドＡ−合成トレハロースジコリノミコレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
典型的には、免疫原又は免疫原とアジュバントとの組み合わせは、１つ又は複数の皮下若しくは腹腔内注入によって哺乳動物の宿主に注入される。好ましくは、免疫化プログラムは、少なくとも１週間にわたって、より好ましくは、２週間以上にわたって実行される。この様式で産生されるポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法を利用して単離及び精製され得る。
【００３２】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）の、確立されたハイブリドーマ方法によって産生可能である。ハイブリドーマ方法は、典型的には、宿主又は宿主由来のリンパ球を免疫化することと、リンパ球を分泌するか、それを分泌する可能性のあるモノクローナル抗体を採取することと、リンパ球を不死化細胞に融合することと、及び所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択することと、を伴う。
【００３３】
宿主は、免疫化されて、免疫原に対して特異的な抗体を産生するか、又は産生することのできるリンパ球を誘発することができる。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化することもできる。ヒト細胞が所望される場合、末梢血リンパ球を使用することができるが、他の哺乳動物の供給源由来の脾臓細胞又はリンパ球が好ましい。
【００３４】
リンパ球を不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することができるが、これは融剤、例えば、ポリエチレングリコールの使用によって促進され得るプロセスである。例として、形質転換によって不死化された変異体げっ歯類、ウシ、又はヒト骨髄腫細胞を用いることができる。非融合不死化細胞とは対照的に、ハイブリドーマ細胞の実質的に純粋な集団が好ましい。したがって、融合後、例えば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ）を欠く変異骨髄腫細胞を用いることによって、非融合不死化細胞の増殖又は生存を阻害する好適な培地内で細胞を増殖させることができる。そのような事例において、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを培地（ＨＡＴ培地）に添加して、ＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止すると同時に、ハイブリドーマの増殖を可能にすることができる。
【００３５】
好ましくは、不死化細胞は、効率的に融合し、ＨＡＴなどの培地の選択によって混合集団から単離され得、融合後の抗体の安定した高レベルの発現を支持する。好ましい不死化細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な骨髄腫細胞株を含む。
【００３６】
本発明の一態様は、アミロイドβペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞株を生成する方法である。そのような方法は、当業者に一般的に知られており、一般に、（ｉ）抗体産生のための宿主を選択することと、（ｉｉ）宿主に所望の免疫原を接種することと、（ｉｉｉ）免疫原に結合するモノクローナル抗体を産生することができる融合細胞を作製するために、接種された宿主由来の細胞株を連続的に分裂する細胞と融合させることと、（ｉｖ）融合細胞をクローニングしてハイブリドーマ細胞株を得ることと、を含む。
【００３７】
本発明の一方法は、３ｐＥ  Ａβペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生できるハイブリドーマ細胞株を生成することを含む。ハイブリドーマは、フロイントアジュバント中のピログルタメートを有するＡβペプチドなどの所望の免疫原の最初の腹腔内注射、続いて、例えば１〜２週間ごとの追加免疫注射で、Ｂａｌｂ／ｃマウスなどのハイブリドーマを生成することができる動物を免疫化することによって生成され得る。その後の単離された脾臓の融合は、当業者に一般に知られている任意の技術を使用して、好ましくは、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの改変手順（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９７６；６：２９２−２９５）によって、ＳＰ２／０細胞を使用して実施することができる。３ｐＥ  Ａβペプチドに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマを決定するためのハイブリドーマのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイなどの標準的なアッセイで行うことができる。本発明の一態様は、モノクローナル抗体Ａβ／ｐＥ３／１を産生するハイブリドーマ細胞株を生成する方法である。
【００３８】
モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第４，１６６，４５２号に記載されているような当該技術分野において既知の遺伝子組換え方法によっても産生され得る。ＤＮＡコード化モノクローナル抗体は、従来の手順を使用して、例えば、マウスの重及び軽抗体鎖遺伝子に特異的に結合し、好ましくは、ピログルタメートを有するＡβに対して特異的な抗体を分泌するモノクローナル抗体ハイブリドーマ細胞株から単離されたＤＮＡを探索する、オリゴヌクレオチド探索子を使用して単離及び配列決定され得る。
【００３９】
アミロイドβペプチドに対して特異的な結合部位を含有する抗体フラグメントも生成され得る。このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることにより発生し得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定することができるように、Ｆａｂ発現ライブラリを構築してもよい（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７０−１２８１（１９８９））。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体フラグメントは全て、大腸菌において発現し、大腸菌から分泌され得、これらのフラグメントの大量生産を可能にする。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収され、化学的に連結されて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者に既知である。単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）もまた想定される（米国特許第５，７６１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号参照）。Ｆｖ及びｓＦｖフラグメントは、定常領域を有さない完全な組み合わせ部位を有する唯一の種であり、これにより、非特異的な結合の低減が示される可能性が高い。例えば、抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４２，８７０号に記載されるような「線状抗体」であってもよい。
【００４０】
したがって、本発明の目的は、上記のハイブリドーマ細胞によって発現される単離されたモノクローナル抗体を提供することであり、この抗体は３ｐＥ  Ａβを特異的に認識することができる。単離されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって発現させるか、又は組換えにより発現させることができる。
【００４１】
好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、３ｐＥ  Ａβに選択的に結合し、３ｐＥを有していない他のＡβ又はβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対する交差反応性がほとんどないか、又は全くない。具体的には、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ａβ  ３ｐＥ−４０（配列番号２２）及びＡβ  ３ｐＥ−４２（配列番号３０）のペプチドに選択的に結合し、他の３ｐＥを含有していないＡβペプチド又はＡＰＰに対する交差反応性がほとんどないか、又は全くない。
【００４２】
表１は、本発明の抗体のアミノ酸配列を提供する。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴによって定義される重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲは、別個の配列として説明される。
【００４３】
【表１】
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１ＩＭＧＴによって定義されるＬＣＤＲ２は、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義されるＬＣＤＲ２と同一である。
２ＩＭＧＴによって定義されるＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔによって定義されるＬＣＤＲ３と同一である。
【００４４】
本発明の抗体はまた、Ａβ／ｐＥ３／１に由来する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを包含し、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。好ましい実施形態において、誘導される抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲは、Ａβ／ｐＥ３／１と同じである。
【００４５】
「配列同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列が最適に整列されている場合、ＢＬＡＳＴ、ＴｏＰＬｉｇｎ、Ｓｕｐｅｒｍａｔｃｈｅｒ及びＭａｔｃｈｅｒなどの配列同一性決定の周知のアルゴリズムによって測定されるとき、それらがどれだけ類似しているかに関して比較ウィンドウにわたって比較を行うことができる（すなわち、アミノ酸残基ごとに）ことを意味する。
【００４６】
インビトロ法
抗体又はその抗原結合フラグメントが固相に結合しているアッセイ、及び抗体が液体媒体の中にあるアッセイを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを用いるイムノアッセイの全ての様式が、現在の好ましい実施形態に係る使用に関して想到されることが理解されるべきである。本発明の特徴を具体化する抗体を使用して、検体を検出するために使用され得るイムノアッセイの方法としては、標識された検体（検体類似体）と試料中の検体とが抗体に対して競い合う競合的（試薬限定）アッセイ、及び抗体が標識された単一部位免疫測定アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントは、β−アミロイド関連疾患をモニタリングするための生物学的試料、及びＡＰＰの細胞内プロセッシングをモニタリングするための細胞培養からのコンディショニングした培地を含め、存在する場合はどこでもＡβ３ｐＥを検出するために通例の免疫学的技術で使用され得る。適切な免疫学的技術は当業者には周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析、競合又はサンドイッチイムノアッセイ等を含み、これらは全て抗原−抗体免疫複合体の形成に依存することは周知であるが、ここでアッセイの目的のために、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば放射性、酵素、発光又は蛍光標識で検出可能に標識することができ、あるいは抗体又はその抗原結合フラグメントは不溶性担体に固定化することができる。したがって、本発明の目的は、試料中のＡβ３ｐＥ又はその断片の測定又は検出のためのイムノアッセイを提供することであり、この方法は、本発明に従って抗体又はその抗原結合フラグメントを有する試料をＡβ３ｐＥ又はその断片と接触させ、抗体又はその抗原結合フラグメントとＡβ３ｐＥ又はその断片との間に免疫複合体が形成されるかどうかを判断することを含む。これらの方法は組織試料又は体液試料のいずれかで行うことができ、一般に個体の身体から試料を得ること、当該試料を、造影に有効量の検出可能に標識された、本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること、及び標識を検出して試料中のＡβ３ｐＥ又はその断片の存在を確立することを含む。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用する測定方法は、特に限定されない。抗原の量、特に測定される溶液中のＡβ３ｐＥ又はその断片の量に対応する抗体、抗原又は抗原−抗体複合体の量が化学的又は物理的手段により検出され、既知の量の抗原を含有する標準溶液の使用により調製された標準曲線から算出される限り、任意の測定法を使用してもよい。例えば、比濁法、競合法、免疫測定法、及びサンドイッチ法が好適に使用される。感度及び特異性に関しては、サンドイッチ法を使用することが特に好ましい。
【００４８】
サンドイッチ法では、試験溶液を不溶化された抗Ａβ３ｐＥ抗体などの不溶化抗体と反応させ（第１の反応）、さらに、標識された二次抗体を反応させる（第２の反応）。次いで、不溶化担体上の標識剤の活性をアッセイすることにより、試験溶液中のＡβ３ｐＥ又はそのフラグメントの量を決定することができる。第１の反応及び第２の反応は、同時に行ってもよいし、連続して行ってもよい。
【００４９】
測定方法では、標識物質、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質などを標識剤として使用する。放射性同位体の例としては、１２５１、１３１Ｉ、３Ｈ及び１４Ｃが挙げられる。酵素は通常、次いで検出可能な反応を触媒する適切な基質との結合により検出可能とされる。それらの例としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びマレイン酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリン及びルシフェラーゼが挙げられる。さらに、アビジン−ビオチン系も、本発明の抗体及び免疫原を標識するために使用することができる。免疫原又は抗体が不溶化されている場合、通常、タンパク質又は酵素の不溶化又は固定化に使用する物理的吸着又は化学的結合のいずれかを使用することができる。担体の例としては、アガロース、デキストラン及びセルロースのような不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド及びシリコンポリマーのような合成樹脂、並びにガラスが挙げられる。
【００５０】
β−アミロイド関連疾患を検出又は診断するためのさらなる実施形態では、組織、体液、例えば、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿等を含む生物学的試料が含まれ、適当量の一次抗体と接触させて免疫複合体を形成する。接触は、典型的には、一次抗体でコーティングされた固体マトリックスに試料を添加することを伴う。試料と一次抗体との接触から生成された複合体は、溶出により試料から分離される。しかしながら、他の回収法を使用してもよい。回収した複合体は、抗原上の抗原決定基に向けられ複合体中の抗原に結合することができる、少なくとも１つの二次抗体と接触させる。二次抗体が向けられる抗原決定基は、抗原実体のマルチエピトープ性により一次抗体が向けられる抗原決定基と同じであってもよい。一次抗体又は二次抗体のいずれかを、上記の標識のいずれかを使用して検出可能にしてもよい。好ましい実施形態では、二次抗体を検出可能とする。一次抗体及び二次抗体に結合した抗原からなる複合体に結合した検出可能な抗体の存在は、当該技術分野において知られている技法を使用して容易に検出され得る。生物学的試料で得られた結果を、対照試料で得られた結果と比較することにより、変化したＡβ３ｐＥの存在又はそのフラグメントレベルが測定され得る。
【００５１】
インビボ法
本発明の態様は、アミロイドβ関連状態におけるアミロイドβの沈着を予防、改善、治療、及び／又は減少させるための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合フラグメントを治療有効量で投与することを含む、方法に関する。本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、アミロイドβ関連状態におけるアミロイドの沈着を予防、改善、治療、及び／又は減少させるための医薬組成物を含む。本発明の方法は、有効量の、本明細書に記載される１つ以上の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００５２】
一態様において、本発明は、ヒトにおけるβ−アミロイドタンパク質を含有するプラークの形成によって特徴付けられる状態におけるアミロイドβの沈着を予防、改善、治療、及び／又は減少させる方法に関し、この方法は、治療的又は予防的に有効な量の、ヒトＡβ３ｐＥに特異的に結合する抗体である、本発明による抗体又はその免疫学的に反応性のフラグメントを、そのような治療を必要とするヒトに、好ましくは末梢的に投与することを含む。別の態様では、本発明は、アミロイド斑の形成を阻害する方法、及び／又はヒトにおけるアミロイド斑を除去する方法に関し、この方法は、脳内のＡβ３ｐＥペプチドを捕捉し、脳内における変化したＡβ３ｐＥクリアランスを誘導する、本発明による有効量の抗体を、そのような阻害又は除去を必要とするヒト対象に投与することを含む。さらなる態様では、本発明は、免疫学的に有効な部分を含む、そのようなヒト化抗体、及びそれらの調製のための方法に関する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、Ａβ／ｐＥ３／１のＣＤＲ（すなわち、配列番号３〜１１及び１４〜２０のいずれか）を有する。
【００５３】
それを必要とする対象は、βアミロイドタンパク質を含有するプラークの形成によって特徴付けられる状態に罹患しているか、又は罹患する素因のあるヒトである。一実施形態において、その状態はアルツハイマー病である。他の実施形態では、その状態は、トリソミー２１（ダウン症候群）、びまん性レビー小体病、封入体筋炎、脳アミロイド血管症、又はオランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）に関連する認知症である。
【００５４】
ヒト化抗体は、ヒトにおいて自然に産生される抗体変異体との類似性を増加させるためにタンパク質配列が修飾された非ヒト種由来の抗体である。概して、ヒト化抗体のタンパク質配列は、抗体がその標的抗原に結合する能力に関与する、非ヒト起源のその相補性決定領域（ＣＤＲ）セグメントの一部又は全てを除いて、ヒト変異体のタンパク質配列と本質的に同一である。可変領域のフレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域によって置換され、非ヒトＣＤＲは実質的に無傷のままである。いくつかの場合において、ヒト化抗体は、非ヒト抗体の結合親和性及び／又は解離定数を保持するために、非ヒトＣＤＲ領域のうちの１つ以上において少数の置換を有する。
【００５５】
またヒト化抗体は、ヒトフレームワークと、非ヒト抗体からの少なくとも１つのＣＤＲと、を含む抗体を指し、これは存在する任意の定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一である、すなわち、少なくとも約８５％、９０％、好ましくは、少なくとも９５％が同一又は９８％が同一である。したがって、ヒト化抗体の全ての部分（１つ以上のＣＤＲを除く）は、ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、典型的にはキメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を包含しない。
【００５６】
ヒト化抗体は、ヒトの治療に使用するために非ヒト及びキメラ抗体よりも少なくとも３つの潜在的な利点を有する：１）エフェクター部分がヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とより良く相互反応することができる（例えば、ミクログリアを活性化して、プラークを除去する）、２）ヒトの免疫系はヒト化抗体のフレームワーク又はＣ領域を外来とは認識しないはずなので、そのような投与された抗体に対する抗体応答は、全部が外来の非ヒト抗体又は部分的に外来のキメラ抗体に対するよりも低いはずである、３）投与された非ヒト抗体は、ヒトの循環においてヒト抗体の半減期よりも短い半減期を有すると報告されている。
【００５７】
β−アミロイドタンパク質を含むプラークの形成を特徴とする状態を処置又は防止するための方法において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント（免疫学的に反応性の断片を含む）は、臨床的又は症状発現前のアルツハイマー病、ダウン症候群に関連する認知症、又は臨床的又は症状発現前のアミロイド血管症のようなアミロイドβ関連症状又は病状の危険性があるか、それらを現す個体に、標準的な投与技術を使用して投与される。好ましくは、末梢に（すなわち中枢神経系に投与するものではない）、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻内、頬内、舌下、又は坐薬投与により投与される。抗体又はその結合フラグメントは、脳室系、脊髄液又は脳実質に直接投与してもよく、これらの位置へ向けた技術は当該技術分野では周知であるが、これらのより複雑な手法を利用する必要はない。本発明の抗体又はその結合フラグメントは、末梢循環系に依る、より単純な技術により投与するときに効果的である。本発明の利点は、たとえ中枢神経系自体に直接提供されなくても、抗体又はその抗原結合フラグメントがその有利な効果を発揮する能力を含む。
【００５８】
投与のための医薬組成物は、選択された投与様式に適するように設計され、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定剤などの医薬的に許容される賦形剤が適切な場合に使用される。参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎは、一般に熟練者に知られているような処方技術の概論を提供する。
【００５９】
例えば、リポソーム中にそれらを封入することによって、又は極性基を遮断することによって、それらをより親油性にして、本発明の抗体の溶解度特性を変更することは、特に有用であり得る。
【００６０】
静脈内又は腹腔内又は皮下注射による末梢全身送達が好ましい。そのような注射のための好適なビヒクルは簡単である。しかしながら、さらに、投与はまた、鼻エアロゾル又は坐薬によって粘膜を通して行ってもよい。そのような投与形態に好適な製剤は周知であり、典型的には、膜間移動を促進する界面活性剤を含む。そのような界面活性剤は、多くの場合、ステロイド類に由来するか、又はＮ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性脂質、又はコレステロールヘミサクシネート、ホスファチジルグリセロールなどの様々な化合物である。
【００６１】
製剤中のヒト化抗体の濃度は、わずか約０．１％〜約１５又は２０重量％まで、主に流体体積、粘度等に基づき、選択した特定の投与様式に従って選択される。したがって、注射用の典型的な医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水の１ｍＬの滅菌緩衝水、及び１〜１００ｍｇの本発明のヒト化抗体を含有するように作製され得る。製剤は、製剤を作製した後に滅菌ろ過されてもよく、又は別の方法で微生物学的に許容可能にされてもよい。静脈内注入用の典型的な組成物は、２５０ｍＬの流体、例えば、滅菌リンガー溶液の体積、及び１ｍＬあたり１〜１００ｍｇ／ｍＬ以上の抗体濃度を有し得る。
【００６２】
抗体の投与について、投与量は、宿主の体重に対して、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜７５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、宿主の体重に対して、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、又は７５ｍｇ／ｋｇであり得る。実施形態において、投与量は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、又は０．１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内、又は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内、又は０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、又は０．１〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、又は０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲内、又は０．１〜６０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも６０ｍｇ／ｋｇである。好ましい例では、投与量は、約１０ｋｇ／ｍｇ、約２０ｋｇ／ｍｇ、約３０ｋｇ／ｍｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、又は約７０ｍｇ／ｋｇであり得る。特に好ましい例では、抗体は、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で腹腔内投与される。例示的な治療レジメンにおいて、抗体は、約１０ｋｇ／ｍｇ、約２０ｋｇ／ｍｇ、約３０ｋｇ／ｍｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約６０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与される。
【００６３】
本明細書で使用する場合、量などの測定可能な値に関して使用する「約」という用語は、±２０％〜±０．１％、好ましくは±１５％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．５％、±０．１％の変動を包含することを意味する。このような、特定の値から±０．０５％又は±０．０１％の変動は、適切なものである。
【００６４】
例示的な治療レジメンは、２週間に１回又は１ヶ月に１回又は３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。いくつかの方法において、結合特異性の異なる２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、このとき、投与される各抗体の投与量は、指示された範囲内にある。抗体は通常、複数回にわたって投与される。投与と投与との間の間隔は、毎週、毎月、又は毎年であり得る。間隔は、不規則にすることもでき、これは対象におけるＡβに対する抗体の血中レベルを測定することによって示される。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与の頻度が少なくなる。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体の順である。
【００６５】
投与量及び投与頻度は、治療が予防的であるか治癒的であるかどうかによって異なり得る。予防的用途においては、比較的低用量の投与が、比較的低頻度の間隔で、長期間にわたって投与される。一部の対象は、生涯にわたって治療を受け続ける。治癒的用途では、疾患の進行が減少又は停止するまで、好ましくは対象が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量の投与が必要となり得る。その後、予防レジメンが投与され得る。
【００６６】
いくつかの方法では、投与量は、血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍＬになるように、またいくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍＬになるように、投与される。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、必要な投与の頻度が少なくなる。投与量及び頻度は、対象における抗体の半減期に応じて変わる。
【００６７】
本発明の抗体による治療は、単独治療であってもよい。あるいは、本発明の抗体による治療は、個体を治療する１つ以上の追加の治療薬も使用する、併用療法レジメンの１つの構成要素又は段階であってもよい。
【００６８】
インビボ療法に使用される場合、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、治療有効量、例えば、β−アミロイドプラークを減少、除去、若しくは予防するか、又はＡＤ若しくは他のβ−アミロイド関連疾患を有する対象における認知機能を改善する量で個体に投与される。抗体又はその抗原結合フラグメントは、静脈内投与、例えば、ボーラスとして又はある期間にわたる連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所又は吸入経路によってなどの既知の方法に従って個体に投与される。本発明の薬剤は、所望により、アミロイドジェニック疾患の治療に少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。アルツハイマー病、及び脳内にアミロイド沈着物が生じる関連状態の場合、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、血液脳関門を横切る本発明の薬剤の通過を増加させる他の薬剤と併用して投与され得る。
【００６９】
本発明の一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、プラーク沈着物中の３ｐＥ  Ａβに結合する。プラーク沈着物中の３ｐＥ  Ａβに結合することにより、抗体又はその抗原結合フラグメントは、プラークの除去を誘発することができる。プラークの除去の誘発は、プラーク周囲の微小膠の活性化、及び安定したＡβ形態を除去することによるプラークの不安定化によるものであってよい。さらに、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、３ｐＥ  Ａβのプラークシーディング活性を防止し得る。血管アミロイドと比較してプラーク中の３ｐＥ  Ａβの可能な濃縮は、免疫療法のための治療上の安全性の範囲を増大させ得る。
【００７０】
キット及びデバイス
本発明は、上述の方法で使用することができるキット及びデバイスを提供する。好ましくは、キット及びデバイスは、３ｐＥ  Ａβに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。さらに、キットは、試薬及び指示書を含んでもよい。使用説明書は、例えば、紙に印刷されてもよく、かつ／又は電子可読媒体において提供されてもよい。あるいは、使用説明書は、例えば、キットの製造業者又は流通業者によって指定されたインターネットウェブサイトにユーザを誘導することによって提供されてもよい。
【００７１】
本発明のキットに含まれる試薬は、成分自体が容器の材料によって実質的に吸着又は変更されない一方で、様々な成分の活性が実質的に失われないように、あらゆる種類の容器で供給され得る。
【００７２】
一実施形態において、キット又はデバイスは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、好ましくは精製された抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、さらにより好ましくは３ｐＥ  Ａβペプチドに結合する単離されたモノクローナル抗体を含む。実施形態において、抗体は、ハイブリドーマ細胞によって発現される。
【実施例】
【００７３】
本発明は、以下の非限定的な実施例を考察することによってさらに理解され得る。
【００７４】
（実施例１）
モノクローナル抗体の生成
３匹のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）を、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中のＨ２Ｎ−ｐＥＦＲＨＤＳＧＣ−ＣＯＯＨ（配列番号２１）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）で初回免疫した。ペプチドは、製造業者の指示に従って、Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＢＳＡ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）などの市販のキットを使用して、ペプチドをＣＯＯＨ−末端システイン残基を介してＭａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にカップリングすることによって調製した。マウスを、最初は完全な、続いて不完全なフロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の１００μｇ又は２００μｇのＢＳＡにカップリングしたペプチドで２週間ごとに追加免疫した。
【００７５】
ハイブリドーマ及び抗体の産生：最も高い血清力価を示すマウスを、融合のために選択し、一方、他のマウスの脾臓を単離し、液体窒素中で凍結させた。４日目、融合又は脾臓摘出の前に、全てのマウスを、塩水中のＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ）にカップリングされた１００μｇのｐＥＦＲＨＤＳＧＣ（配列番号２１）で腹腔内に追加免疫した。マウスの脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの改良手順（Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９７６；２９２−２９５）により、ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）と融合させた。ハイブリドーマを３０ｘ９６ウェルプレートにシーディングし、１０日後に、０．５μｇ／ウェルのカップリングしていないＡβ３ｐＥ−４０ペプチド（配列番号２２）（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）で直接的ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性細胞を、０．５μｇ／ｍｌのコーティングされたＡβ１−４０ペプチド（配列番号２３）（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）で交差反応性（の欠如）について試験し、直ちにサブクローニングした。
【００７６】
第１の融合後、１７のクローンがヒトＡβ３ｐＥ−４０（配列番号２２）合成ペプチドを用いて直接コーティングされたＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて陽性として反応し、液体窒素中で凍結させた。１７のクローンをＡβ／ｐＥ３／１〜Ａβ／ｐＥ３／７と命名した。第２の融合を実施し、この第２の融合から２つの他のクローンもまた、さらなる特徴化に含まれた（Ａβ／ｐＥ３／１８及びＡβ／ｐＥ３／１９）。
【００７７】
１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｅｕｒｏｐｅ）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２％）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２％のＨＴ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、並びにストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地で全てのハイブリドーマを増殖させた。全ての製品は市販されており、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。細胞は、加湿した８％ＣＯ２エアーインキュベーター内でインキュベートした。
【００７８】
抗体の選択のための直接ＥＬＩＳＡ：上記Ａβ  ３ｐＥ−４０抗体の検出に使用したスクリーニングＥＬＩＳＡは、０．５μｇ／ｍｌの遊離ヒトＡβ  ３ｐＥ−４０ペプチド（配列番号２２）を４℃にて一晩、５０μｌ／ウェルのコーティング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＮａＮ３、ｐＨ８．５）中でＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）平底高結合９６ウェルマイクロタイタープレートにコーティングした直接ＥＬＩＳＡであった。
【００７９】
翌日、室温で６０分間、７５μＬ／ウェルのＰＢＳ中０．１％カゼイン（Ｍｅｒｃｋ）でプレートをブロッキングして、非特異的結合を減少させた。次に、５０μＬのハイブリドーマ上清を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合したモノクローナル抗体を、３７℃で１時間、５０μＬ／ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と複合体化したヒツジ抗マウスＩｇＧで検出した。両試薬を０．１％カゼイン／ＰＢＳで希釈した。プレートを洗浄し、５０μｌの、０．４２ｍＭの３，５，３’，５’−テトラメチル−ベンジジン（Ｂｉｏｒａｄ）、０．００３％（容量／容量）のＨ２Ｏ２（Ｂｉｏｒａｄ）（１００ｍＭのクエン酸（Ｂｉｏｒａｄ）中）、１００ｍＭのリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ４．３）（Ｂｉｏｒａｄ）の溶液を基質として添加した。室温でプレートシェーカー上で最大１５分間反応を進行させ、その後、５０μＬ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ）で顕色を停止させ、マイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍにてプレートを読み取った（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。選択したモノクローナル抗体と完全サイズのヒト遊離Ａβ  １−４０（配列番号２３）との交差反応性は、スクリーニングアッセイと同一の直接ＥＬＩＳＡで試験した。
【００８０】
Ａβ／ｐＥ３／１は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ重鎖及びマウスκ軽鎖を有すると判定された。マウスＩｇＧ１  Ｆｃは、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃに対して７０％の配列同一性及び７６％の配列類似性のみを有するが、これらのアイソタイプは、異なる活性及びタンパク質プロファイルを有する。マウスＩｇＧ２ａと比較して、マウスＩｇＧ１は、マウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶ受容体並びにマウスＣ１ｑへのより弱い結合により、マウスＦｃエフェクター及び補体機能が弱い。ヒトＩｇＧ１活性に最も近いアイソタイプであると考えられるため、マウスＩｇＧ２ａは、マウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶ受容体並びにマウスＣ１ｑに結合し、それによって、Ａβプラークのクリアランスに寄与し得る、補体、ＡＤＣＣ、及びＡＤＣＰ活性を有する。
【００８１】
Ａβ／ｐＥ３／１重鎖の配列を、マウスＩｇＧ１（配列番号３１）からマウスＩｇＧ２ａ（配列番号１）に変更した。以下に記載の実験データは、ＩｇＧ２ａ重鎖を有するＡβ／ｐＥ３／１を使用した。重鎖可変領域（ＣＤＲを含む）は、変更しなかった。
【００８２】
（実施例２）
感度試験のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
選択されたＡβ３ｐＥモノクローナル抗体について、Ａβ３−４０（配列番号２４）（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）及びＡβ３ｐＥ−４０（配列番号２２）（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ）の検出に対する感度を、合成ペプチドを標準物質として使用してサンドイッチアッセイで評価した。コーティングのためのＡβ／ｐＥ３／１〜１９抗体及び検出のためのＪＲＦ／ｃＡβ４０／２８−ＨＲＰＯの組み合わせを使用して、検出の感度を調査した。
【００８３】
材料及び方法：Ａβ３−４０（配列番号２４）及びＡβ３ｐＥ−４０（配列番号２２）のペプチドの標準物質を、０．１ｍｇ／ｍＬでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ）に溶解し、−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡでの使用のために、ペプチドをＰＢＳ中の０．１％カゼインで１ｐｇ／ｍＬまでさらに希釈した。９６ウェルプレート（ハーフエリア黒色プレート；Ｃｏｓｔａｒ）を、コーティング緩衝液中１．５μｇ／ｍＬの濃度でモノクローナル抗体Ａβ／ｐＥ３／１〜Ａβ／ｐＥ３／１９を用いて４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中０．１％カゼインを用いて室温で１〜４時間ブロッキングした。標準物質をＨＲＰＯ−標識二次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、プレートを洗浄し、製造業者の推奨に従って、Ｑｕａｎｔａｂｌｕ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてアッセイを行った。
【００８４】
結果：Ａβ３ｐＥ−４０（配列番号２２）ペプチドに対する高い感度及び選択性に基づくさらなる特徴付けのために、抗体Ａβ／ｐＥ３／１を選択した（表２）。さらに、この抗体は、トランスジェニックマウス及びヒトＡＤ脳でプラーク標識を実証した（表２並びに実施例５及び６）。
【００８５】
【表２】
2019534010.tif 000004
【００８６】
（実施例３）
交差反応性試験のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
選択されたＡβ３ｐＥモノクローナル抗体Ａβ／ｐＥ３／１について、げっ歯類Ａβ３ｐＥ−４０並びにヒトＡβ１−４０（配列番号２３）、Ａβ３−４０（配列番号２４）、Ａβ１−４２（配列番号２５）、Ａβ３−４２（配列番号２６）、Ａβ１１ｐＥ−４０（配列番号２８）及びＡβ１１ｐＥ−４２（配列番号２９）との交差反応性を、合成ペプチドを使用して評価した。Ａβ／ｐＥ３／１＋ＪＲＦ／ｃＡβ４０／２８−ＨＲＰＯの組み合わせを使用して、Ａβ１−４０（配列番号２３）、Ａβ３−４０（配列番号２４）、Ａβ１１ｐＥ−４０及びげっ歯類Ａβ３ｐＥ−４０との交差反応性を調査した。Ａβ／ｐＥ３／１＋ＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６−ＨＲＰＯの組み合わせを使用して、Ａβ１−４２（配列番号２５）、Ａβ１１ｐＥ−４２及びＡβ３−４２（配列番号２６）との交差反応性を調査した。最大１０，０００ｐｇ／ｍＬの濃度を試験した。
【００８７】
材料及び方法：標準物質を０．１ｍｇ／ｍＬでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ）に溶解し、−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡでの使用のために、ペプチドをＰＢＳ中の０．１％カゼインで１ｐｇ／ｍＬまでさらに希釈した。９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート；ＮＵＮＣ）を、コーティング緩衝液中、１．５μｇ／ｍＬの濃度でモノクローナル抗体Ａβ／ｐＥ３／１を用いて４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中０．１％カゼインを用いて室温で１〜４時間ブロッキングした。標準物質をＨＲＰＯ−標識二次抗体（ＪＲＦ／ｃＡβ４０／２８−ＨＲＰＯ又はＪＲＦ／ｃＡβ４２／２６−ＨＲＰＯ）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、プレートを洗浄し、製造業者の推奨に従って、ＴＭＢ過酸化物ＥＩＡ基質キット（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてアッセイを行った。
【００８８】
結果：Ａβ／ｐＥ３／１  Ａβ／ｐＥ３／１は、Ａβ３ｐＥ−４０（配列番号２２）（図２Ａ）及びＡβ３ｐＥ−４２（配列番号３０）への選択的結合を有することが示された（データは示さない）。ヒトＡβ１−４０（配列番号２３）（図２Ｃ）及びＡβｐＥ１１−４０（図２Ｄ）への結合は検出されなかった。ヒトＡβ１−４２（配列番号２５）、ヒトＡβｐＥ１１−４２及びげっ歯類Ａβ３ｐＥ−４０への最大１０ｎｇ／ｍＬの濃度での結合もまた、検出されなかった（データは示さない）。Ａβ３−４０（配列番号２４）（図２Ｂ）及びＡβ３−４２（配列番号２６）（データは示さない）のペプチドに対して限定的な交差反応性が検出された（表２及び図２）。
【００８９】
（実施例４）
ヒトＡＤ脳組織におけるプラークへの抗体反応性を試験するための免疫組織化学
ヒトＡＤ脳組織におけるプラークへのＡβ／ｐＥ３／１の反応性を、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳組織、並びに非固定凍結保存脳組織の両方において調査した。
【００９０】
材料及び方法
ホルマリン固定パラフィン包埋ＡＤ脳：厚さ６μｍの切片を、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋脳から調製した。Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）で染色を行った。簡潔に述べると、脱パラフィン化後及び７０％ギ酸（Ｍｅｒｃｋ）エピトープの回収後、内因性ペルオキシダーゼについて切片をブロッキングし、Ａβ／ｐＥ３／１一次抗体と共にインキュベートした。ＨＲＰＯにコンジュゲートした二次抗マウス又は抗ウサギ抗体を適用し（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｄａｋｏ）を色原体として利用した。最後に、全ての切片をヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で対比染色した。
【００９１】
非固定凍結保存ＡＤ脳：市販の供給源（Ｔ１２３６０５１Ａ１ｚ−切片、Ｇｅｎｔａｕｒ）から切片を入手し、室温で２時間風乾した。ＰＢＳ中ですすいだ後、切片をＡβ／ｐＥ３／１一次抗体と共に３７℃でインキュベートした。次に、切片をＮＢＦ４％（ホルマリン、ＶＷＲ（登録商標））／エタノールに固定し、ＰＢＳですすいだ。二次Ｃｙ３標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を室温で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳですすいだ。最後に、全ての切片をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色し、カバーガラスを加えた。
【００９２】
ＦＦＰＥ及び凍結保存されたＡＤ脳組織におけるプラークへの反応性についてのＡβ／ｐＥ３／１の免疫組織化学試験のために、ポリクローナル抗体を対照として使用した。
【００９３】
結果：Ａβ／ｐＥ３／１の反応性は、ＦＦＰＥ（図３Ａ）及び非固定凍結保存（図４Ａ）ヒトＡＤ脳の両方で実証され、参照抗体（抗ヒトアミロイドβ（Ｎ３ｐＥ）ウサギＩｇＧ、ＩＢＬ、Ｊａｐａｎ）と類似の染色パターンを示した（図３Ｂ及び４Ｂ）。これはＡβ／ｐＥ３／１がヒト脳組織におけるプラークを検出したことを実証した。
【００９４】
（実施例５）
脳組織における抗体のターゲットエンゲージメント及び毒性
Ａβ／ｐＥ３／１（クローン１からの抗体）による処置後のターゲットエンゲージメント及び毒性を調査した。
【００９５】
材料及び方法：ヒトＡβ４２及びＡβ４０のペプチドを高レベルで発現している老化したトランスジェニックマウス（１９〜２０ヶ月齢）は、１、４及び８日目にＡβ／ｐＥ３／１（クローン１）抗体（ＩｇＧ２ａ）を６０ｍｇ／ｋｇの用量で３回の腹腔内投与で処置された（ｎ＝１０）。ＰＢＳ注射を受ける対照群を実験に含めた（ｎ＝６）。第１の注射後１２日目に動物を安楽死させた。各群における治療されたマウスの半分は、ＰＢＳで灌流を受けたが、他方の半分は非灌流されて、剖検における潜在的異常の評価を可能にした。左半球を凍結保存したが、右半球をＤＭＦＡに固定し、続いてパラフィン包埋した。
【００９６】
ヒトＡβ４２及びＡβ４０のペプチドを高レベルで発現している６ヶ月齢のトランスジェニックマウスは、１日目にＡβ抗体３Ｄ６（ＩｇＧ２ａ；ＡβのＮ末端に結合する）を２０ｍｇ／ｋｇ又は６０ｍｇ／ｋｇの用量で１回の腹腔内投与で処置された（１群当たりｎ＝４）。この年齢では、動物は、脳内にかなりのＡβ沈着を有することが知られている。ＰＢＳ注射を受ける対照群を実験に含めた（ｎ＝３）。動物を４日目に安楽死させた。マウスは、剖検における潜在的異常の評価を可能にするために灌流を受けなかった。
【００９７】
抗体の全身投与後の脳におけるターゲットエンゲージメントを評価するために、二次抗マウスアイソタイプ特異的抗体（ビオチン化抗ｍＩｇＧ２ａ二次抗体；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた免疫組織化学を灌流マウスからの凍結切片に行い、標識面積の％（皮質及び海馬）を、一次抗体及び二次抗体とインキュベートした隣接切片について同じ測定値に正規化して、各マウスについて％プラーク標識を得た。
【００９８】
潜在的な毒性を評価するために、非灌流動物群において、剖検での出血を評価した。さらに、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、全ての処置マウスの脳で行った。
【００９９】
結果：Ａβ／ｐＥ３／１からの抗体を６０ｍｇ／ｋｇの用量で３回処置した後のターゲットエンゲージメント（プラーク結合）及び非毒性が、ヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現している１９〜２０ヶ月齢のマウスおいて観察された。非灌流動物では、剖検で出血は観察されなかった（図５Ｅ）。抗体３Ｄ６を２０ｍｇ／ｋｇ又は６０ｍｇ／ｋｇの用量で１回処置した後、ヒトＡβ４２及びＡβ４０を高レベルで発現している処置マウス（６ヶ月齢）の７５％において、剖検で出血が容易に観察された（図５Ｂ及び５Ｃ、矢印で示される）。ＰＢＳ処置群の動物はいずれも、剖検で出血を示さなかった（図５Ａ及び５Ｄ）。
【０１００】
Ａβ／ｐＥ３／１処置マウスからの凍結切片の調査により、６０％の皮質及び８４％の海馬の平均プラーク標識（％）によって実証されるとおり、高レベルのターゲットエンゲージメントが明らかになった（図６Ｂ）。ＰＢＳ注射動物ではプラーク標識は観察されなかった（図６Ａ）。対照として、一次抗体（Ａβ／ｐＥ３／１）を脳のパラレルセクションに添加し、二次抗体で染色して、両方の脳におけるプラークの存在を示した（ＰＢＳ及びＡβ／ｐＥ３／１処置）（図６Ｃ〜６Ｄ）。
【０１０１】
Ｈ＆Ｅ染色による脳組織の評価の際、Ａβ／ｐＥ３／１で処置したマウスは、ＰＢＳ注射された対照（図７Ｃ）と比較して異常がない（図７Ｂ）ことを実証した。一方、３Ｄ６抗体による処置は、以下の異常：皮質の変性／壊死（２０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇ群の３Ｄ６処置マウスにおいて、それぞれ２０％及び４０％）、鬱血及び微小血管症を伴う髄膜炎症性浸潤（２０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇ群の３Ｄ６処置マウスにおいて、それぞれ１００％及び８０％）、及び皮質微小出血（２０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇ群の３Ｄ６処置マウスにおいて、それぞれ６０％）が観察される結果となった（図７Ａ）。ＰＢＳ処置群の動物はいずれも、Ｈ＆Ｅ染色脳スライド上で異常を示さなかった（図７Ｃ）。Ａβ／ｐＥ３／１及びＰＢＳ処置マウスは１９〜２０ヶ月齢であったが、３Ｄ６処置マウスは６ヶ月齢であった。
【０１０２】
結論として、Ａβ／ｐＥ３／１をプラーク沈着マウスモデルに腹腔内注射した後に、出血を引き起こすことなくターゲットエンゲージメントを実証し、Ａβ／ｐＥ３／１抗体による処置後のターゲットエンゲージメント対毒性の好ましい比を示した。
【０１０３】
（実施例６）
Ａβ／ｐＥ３／１の生体分子親和性結合
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、生体分子相互作用を調査するために使用される無標識の検出方法である。センサ表面上の質量の小さい変化を監視して、この直接リアルタイム結合アッセイは、生体分子間の相互作用に関する定性的及び定量的データを提供する；すなわち、平衡結合定数（親和性、ＫＤ）及び速度定数（ｋａ／ｋｄ；複合体の会合速度ｋａ、及び複合体の解離速度ｋｄ）を決定する。この方法は、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−核酸の相互作用、並びにタンパク質と小分子との相互作用の研究において有用である。ここで、Ａβ／ｐＥ３／１とＡβ−３ｐＥ−４０ペプチドとの相互作用を調査した。
【０１０４】
材料及び方法：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによるマウス抗体捕捉キットを、Ａβ−３ｐＥ−４０ペプチド（配列番号２２）に対するＡβ／ｐＥ３／１の親和性試験に使用した。抗マウス抗体の固定化は、製造業者のプロトコルに従って、ＣＭ５センサチップ上のアミンカップリングを介して実施した。続いて、Ａβ／ｐＥ３／１（１μｇ／ｍｌ）を抗マウス抗体によって３００ＲＵの濃度まで捕捉した後、続いて、ランニング緩衝液（２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％界面活性剤Ｐ２０（Ｔｗｅｅｎ（商標）２０））を含む２０ｍＭリン酸緩衝液）で希釈した様々な濃度（３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ及び５０ｎＭ）のヒトＡβ−３ｐＥ−４０ペプチド（配列番号２２）を注入した。表面を、ｐＨ１．７の１０ｍＭグリシンＨＣｌで少なくとも１８０秒間、さらに６０秒間再生した。ヒトＡβ（１−４０）ペプチドを陰性対照として使用した。
【０１０５】
光学バイオセンサＴ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））を使用して，親和性測定を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン２．０）を用いて、１：１結合フィッティングモデルに従って動態分析を行った。
【０１０６】
結果：モノクローナル抗体Ａβ／ｐＥ３／１の動態分析により、Ａβ−３ｐＥ−４０ペプチドに対する親和性結合が確認された。平衡結合定数（親和性、ＫＤ）及び速度定数（ｋａ／ｋｄ）を表３に示す。ヒトＡβ−３ｐＥ−４０ペプチドに対するＡβ／ｐＥ３／１の結合相互作用を示すセンサグラム（シングルサイクルキネティクス）を図８に示す。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
本発明及び本発明の様々な実施形態を説明する際に、明瞭化のために特定の用語が用いられる。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されるように意図されていない。関連分野の当業者であれば、他の同等の構成要素を使用することができ、また、本発明の広い概念から逸脱することなく他の方法を開発することができることを認識するであろう。本明細書の至る所で引用される全ての参照文献は、それぞれが個々に組み込まれているかのように参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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