(57)【要約】  本発明は、抗体−薬物コンジュゲートなどのバイオコンジュゲートにおいて使用されるリンカーは治療的に不活性ではないが、バイオコンジュゲートの治療指数に効果を有するという驚くべき所見に基づく。よって、本発明はバイオコンジュゲートの治療指数を増加させるための方法、および、特に癌の治療において使用するためのバイオコンジュゲートに関する。本発明によるバイオコンジュゲートは式（１）に従う基を含むスルファミドリンカーを有する：  【化１】2019507741.tif 000034【選択図】なし
2019507741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオコンジュゲートの治療指数を増加させるための方法であって、式（Ａ）のバイオコンジュゲート：
Ｂ−Ｌ−Ｄ
（Ａ）、
式中：
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｌは、ＢおよびＤを連結させるリンカーであり；
−Ｄは、標的分子であり；ならびに
−「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分である、
を、Ｌが式（１）に従う基またはその塩を含むように、標的分子（Ｄ）上の反応基Ｑ１を生体分子（Ｂ）上の官能基Ｆ１と反応させることにより、調製する工程を含み：
【化１】
2019507741.tif 000028
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳまたはＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、Ｒ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１は追加の標的分子Ｄであり、前記標的分子は任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される、方法。
【請求項２】
前記バイオコンジュゲートをその必要のある被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体は癌患者である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体分子は抗体であり、前記バイオコンジュゲートは抗体−薬物−コンジュゲートである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標的分子Ｄは活性物質、好ましくは細胞毒である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記バイオコンジュゲートは式Ｂ−Ｚ３−Ｌ−Ｄを有し、Ｚ３は前記反応基Ｑ１を前記官能基Ｆ１と反応させることにより得られる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｚ３は式Ｑ１−Ｌ−Ｄ（式中、Ｌは式（１）に従う基またはその塩を含む）を有するリンカー−コンジュゲート：
【化２】
2019507741.tif 000029
を、式Ｂ−Ｆ１を有する生体分子と反応させることにより得られ、Ｂ、Ｄ、ａおよびＲ１は請求項１で規定される通りである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカー−コンジュゲートは式（４ａ）または（４ｂ）、またはその塩に従い：
【化３】
2019507741.tif 000030
式中：
−ａは独立して０または１であり；
−ｂは独立して０または１であり；
−ｃは０または１であり；
−ｄは０または１であり；
−ｅは０または１であり；
−ｆは１〜１５０の範囲の整数であり；
−ｇは０または１であり；
−ｉは０または１であり；
−Ｄは、標的分子であり；
−Ｑ１は生体分子上に存在する官能基Ｆ１と反応することができる反応基であり；
−Ｓｐ１はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ２はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ３はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ４はスペーサ部分であり；
−Ｚ１はＱ１またはＳｐ３をＳｐ２、ＯまたはＣ（Ｏ）またはＮ（Ｒ１）に連結させる連結基であり；
−Ｚ２はＤまたはＳｐ４をＳｐ１、Ｎ（Ｒ１）、ＯまたはＣ（Ｏ）に連結させる連結基であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、Ｒ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され；あるいはＲ１はＤ、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］または−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］であり、Ｄは標的分子であり、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｄ、Ｑ１、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｉは以上で規定される通りである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ２００アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、前記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｚ１およびＺ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＳＣ（Ｏ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＳ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＳＳ（Ｏ）２−、−ＳＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＳＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＮＲ２Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２−およびその２つ以上の組み合わせからなる群より独立して選択され、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、前記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基からなる群より独立して選択され、前記アルキレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳまたはＮＲ３からなる群より選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より独立して選択され、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｑ）、（９ｎ）、（９ｏ）または（９ｐ）、（９ｔ）または（９ｚｈ）に従い：
【化４】
2019507741.tif 000031
式中：
−ＵはＯまたはＮＲ９であり、Ｒ９は水素、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１２アルキル基またはＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基であり；
−Ｒ１０は（チオ）エステル基であり；ならびに
−Ｒ１８は、任意で置換された、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群より選択される、請求項８−１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
反応基Ｑ１と官能基Ｆ１の間の前記反応は、（１０ａ）または（１０ｂ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのチオール−アルケンコンジュゲーション、（１０ｃ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのアミノ−（活性化）カルボン酸コンジュゲーション、（１０ｄ）（式中、Ｙ＝ＮＨである）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのケトン−ヒドラジノコンジュゲーション、（１０ｄ）（式中、Ｙ＝Ｏである）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのケトン−オキシアミノコンジュゲーション、（１０ｅ）または（１０ｇ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのアルキン−アジドコンジュゲーションならびにＮ２が脱離する（１０ｈ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのアルケン−１，２，４，５−テトラジンコンジュゲーションまたはアルキン−１，２，４，５−テトラジンコンジュゲーションから選択されるコンジュゲーション反応であり、部分（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）、（１０ｄ）、（１０ｅ）、（１０ｇ）および（１０ｈ）は、下記式により表される、前記請求項のいずれかに記載の方法：
【化５】
2019507741.tif 000032
式中、Ｚは水素、メチルおよびピリジルから選択される。
【請求項１３】
ａ＝０である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
その必要のある被験体の治療において使用するためのバイオコンジュゲートであって、式（Ａ）により表される、バイオコンジュゲート：
Ｂ−Ｌ−Ｄ
（Ａ）、
式中：
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｌは、ＢおよびＤを連結させるリンカーであり；
−Ｄは、標的分子であり；ならびに
−「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分であり、
Ｌは式（１）に従う基またはその塩を含み：
【化６】
2019507741.tif 000033
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、前記Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、Ｒ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１は追加の標的分子Ｄであり、前記標的分子は任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【請求項１５】
癌の治療において使用するための、請求項１４に記載の使用のためのバイオコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオコンジュゲーションの分野にある。本発明はスルファミドリンカーおよびそのコンジュゲート、ならびにその調製方法に関する。より特定的には、本発明は、アシルスルファミド基および／またはカルバモイルスルファミド基を含むリンカーおよび前記リンカーを含むコンジュゲートに関する。発明はさらに、リンカーを含むバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスに関し、リンカーはアシルスルファミド基および／またはカルバモイルスルファミド基を含む。
【背景技術】
【０００２】
バイオコンジュゲーションは、その少なくとも１つが生体分子である、２つ以上の分子を連結させるプロセスである。生体分子（複数可）は、「対象生体分子（複数可）」とも呼ばれ得、他の分子（複数可）は、「標的分子」または「対象分子」とも呼ばれ得る。典型的には、対象生体分子（ＢＯＩ）はタンパク質（またはペプチド）、グリカン、核酸（またはオリゴヌクレオチド）、脂質、ホルモンまたは天然薬物（またはそれらの断片もしくは組み合わせ）から構成されるであろう。他の対象分子（ＭＯＩ）もまた、生体分子であってもよく、よって、ホモまたはヘテロ二量体（または高級オリゴマー）の形成へと導かれ、または他の分子は、コンジュゲーションプロセスにより対象生体分子に付与される特別な特徴を有してもよい。例えば、検出および／または単離のための化学プローブを用いた共有結合的修飾によるタンパク質構造および機能の調節がプロテオームに基づく研究および生物医学適用における強力なツールとして発達してきた。タンパク質の蛍光または親和性タギングがそれらの生息環境におけるタンパク質の輸送の研究に重要である。タンパク質−炭水化物コンジュゲートに基づくワクチンはＨＩＶ、癌、マラリアおよび病原菌に対する闘いにおいて名を上げてきたが、一方、マイクロアレイ上に固定された炭水化物はグライコームの解明に役立つ。合成ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＮ）は、診断および治療適用、例えばマイクロアレイ技術、アンチセンスおよび遺伝子−サイレンシング療法、ナノテクノロジーおよび様々な材料科学適用のために、好適な官能基の導入を必要とする。例えば、細胞透過性リガンドの付着が、オリゴヌクレオチドに基づく治療（アンチセンス、ｓｉＲＮＡ）中に直面するＯＮの低いインターナリゼーション速度に取り組むために最も一般的に適用される戦略である。同様に、オリゴヌクレオチドに基づくマイクロアレイの調製では、好適な固体表面、例えばガラス上でのＯＮの選択的固定化が必要とされる。
【０００３】
２つ（またはそれ以上）の分子構造を共有結合により連結させるのに好適な化学反応の多くの例が存在する。しかしながら、生体分子のラベリングは、適用することができる反応条件に対し高い制限を有し（溶媒、濃度、温度）、一方、化学選択的ラベリングの要求は、反応基の選択を制限する。明らかな理由から、生物システムは一般に水性環境において最もよく繁栄し、バイオコンジュゲーションのための試薬は、水性系における適用に好適でなければならないことが意味される。一般に、２つの戦略構想はバイオコンジュゲーション技術の分野で認識することができる：（ａ）対象生体分子中にすでに存在する官能基、例えば、例として、チオール、アミン、アルコールまたはヒドロキシフェノール単位に基づくコンジュゲーションまたは（ｂ）１つ（またはそれ以上）の特有の反応基のＢＯＩ中への改変操作、その後の実際のコンジュゲーションプロセスを含む２段プロセス。
【０００４】
第１のアプローチは典型的には、タンパク質中の反応性アミノ酸側鎖（例えばシステイン、リジン、セリンおよびチロシン）、またはグリカン（例えばアミン、アルデヒド）もしくは核酸（例えばプリンまたはピリミジン官能基またはアルコール）中の官能基を含む。とりわけ、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３（参照により組み込まれる）において要約されているように、多数の反応性官能基が、長年にわたって、これらの官能基の１つの化学選択的ターゲティングに使用可能になっており、例えばマレイミド、ハロアセトアミド、活性化エステル、活性化カーボネート、ハロゲン化スルホニル、活性化チオール誘導体、アルケン、アルキン、アレンアミドおよびそれ以上であり、その各々が、コンジュゲーションのためにそれ自体の特定的な条件（ｐＨ、濃度、化学量論、光、など）を必要とする。最も顕著に、システイン−マレイミドコンジュゲーションが、その高い反応速度および化学選択性のために、タンパク質コンジュゲーションについて傑出している。しかしながら、多くのタンパク質における、および確かに他の生体分子におけるように、システインがコンジュゲーションに使用できない場合、他の方法がしばしば要求され、各々がそれ自体の欠点に苦しむ。
【０００５】
バイオコンジュゲーションのための洗練された、広く適用可能な解決策は２段階アプローチに関与する。より骨が折れるが、官能基操作による２段階コンジュゲーションは典型的には、天然官能基に基づくコンジュゲーションよりも高い選択性（部位特異性）に導く。それ以外に、コンストラクトの適正な選択により、完全な安定性を達成することができ、それは、特にシステイン−マレイミドコンジュゲーションでは、天然官能基上での１段階コンジュゲーションの重要な欠点となり得る。ＢＯＩ上に付与することができる官能基の典型的な例としては、（歪んだ）アルキン、（歪んだ）アルケン、ノルボルネン、テトラジン、アジド、ホスフィン、ニトリルオキシド、ニトロン、ニトリルイミン、ジアゾ化合物、カルボニル化合物、（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミンおよびヒドラジンが挙げられ、それは、化学または分子生物学アプローチのいずれかにより達成することができる。上記官能基の各々は少なくとも１つの反応パートナーを有することが知られており、多くの場合完全相互反応性を含む。例えば、シクロオクチンは、選択的に、かつ排他的に１，３−双極子と、歪んだアルケンはテトラジンと、ホスフィンはアジドと反応し、完全に安定な共有結合が得られる。しかしながら、上記官能基のいくつかは、高親油性であるという不利益を有し、これは、特に、対象親油性分子と組み合わせた場合、コンジュゲーション効率を損なう可能性がある（下記を参照されたい）。
【０００６】
生体分子と他の対象分子の間の最終連結単位は優先的に、また、溶解度、安定性および生体適合性の観点から、水性環境と完全に適合可能でなければならない。例えば、高親油性リンカーは凝集を引き起こす可能性があり（コンジュゲーション中および／または後）、これは、特にＭＯＩがまた、疎水性の性質を有する場合、著しく反応時間を増加させ、および／またはコンジュゲーション収率を低減させる可能性がある。同様に、高親油性リンカー−ＭＯＩの組み合わせは、同じまたは他の生体分子上の表面または特定の疎水性パッチへの非特異的結合を引き起こす可能性がある。リンカーが加水分解または他の水により誘導される開裂反応を受けやすい場合、元のバイオコンジュゲートを構成する成分は拡散により分離する。例えば、ある一定のエステル部分は鹸化のために好適ではなく、一方、β−ヒドロキシカルボニルまたはγ−ジカルボニル化合物は、それぞれ、レトロアルドールまたはレトロマイケル反応を引き起こす可能性がある。最後に、リンカーは、バイオコンジュゲート中に存在する官能基、またはバイオコンジュゲートの適用中に遭遇し得る任意の他の官能基に対して不活性でなければならず、特に、例えば、ケトンまたはアルデヒド部分（イミン形成に至る可能性がある）、α，β−不飽和カルボニル化合物（マイケル付加）、チオエステルまたは他の活性化エステル（アミド結合形成）を特徴とするリンカーの使用は排除される。
【０００７】
エチレングリコールの直鎖オリゴマーから生成される化合物、いわゆるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、最近、生体分子コンジュゲーションプロセスにおいて特に好評である。ＰＥＧリンカーは水溶性が高く、無毒性で、非抗原性で、凝集は無視でき、またはない。この理由から、多種多様の直鎖、二官能性ＰＥＧリンカーが様々な供給元から市販されており、これらは、いずれかの端で、対象（生体）分子で選択的に修飾することができる。ＰＥＧリンカーはエチレンオキシドの重合プロセスの生成物であり、よって、典型的には鎖長の確率的混合物として得られ、それらは部分的に約１、２、４ｋＤａまたはそれ以上（最大６０ｋＤａまで）を中心とする平均重量分布を有するＰＥＧコンストラクトに分解することができる。最大４ｋＤａの分子量を有する均質の個別ＰＥＧ（ｄＰＥＧ）も知られており、その分枝バージョンは最大１５ｋＤａになる。興味深いことに、ＰＥＧ単位それ自体は、生体分子に特別な特徴を付与する。特に、タンパク質ペグ化は、インビボにおける滞留の延長、代謝酵素による分解の減少、およびタンパク質免疫原性の低減または消失に至ることがある。いくつかのペグ化タンパク質はＦＤＡに認可されており、現在市場に出ている。
【０００８】
その高い極性のために、ＰＥＧリンカーは、水性条件下での小さい部分および／または水溶性部分のバイオコンジュゲーションに完全に好適である。しかしながら、疎水性の非水溶性対象分子のコンジュゲーションの場合において、ＰＥＧ単位の極性は疎水性を相殺するのに不十分で、反応速度の著しい低減、より低い収率および凝集誘発の課題に至り得る。こうした場合において、長いＰＥＧリンカーおよび／またはかなりの量の有機共溶媒が、試薬を可溶化するために必要とされることがある。例えば、抗体−薬物コンジュゲートの分野において、モノクローナル抗体への別々の数の毒性ペイロードの付着の制御が鍵であり、ペイロードは典型的には、アウリスタチンＥもしくはＦ、マイタンシノイド、デュオカルマイシン、カリチアマイシンまたはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）の群から選択され、多くの他のものも検討中である。アウリスタチンＦを除いて、全ての毒性ペイロードは非水溶性に乏しく、成功コンジュゲーションを達成するために、例えば２５％ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）または５０％プロピレングリコール（ＰＧ）などの有機共溶媒を必要とする。疎水性ペイロードの場合において、前記共溶媒の使用にもかかわらず、大化学量論の試薬がコンジュゲーション中に必要とされることがあり、一方、効率および収率は、例えば、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．２０１４，２４，１２５６−１２６３（参照により組み込まれる）においてＳｅｎｔｅｒらによって記載されているように、凝集により著しく損なわれることがある（プロセス中または生成物単離後）。長いＰＥＧスペーサ（１２単位以上）の使用は、溶解度および／またはコンジュゲーション効率を部分的に増強することができるが、長いＰＥＧスペーサはより急速なインビボクリアランスを引き起こす可能性があり、よって、ＡＤＣの薬物動態プロファイルに負の影響を及ぼすことが示されている。
【０００９】
従来のリンカー（例えばＰＥＧ）を使用すると、有効なコンジュゲーションは、とりわけ相対的水不溶性または疎水性標的分子が使用される場合に、水性媒体におけるリンカー−コンジュゲートの比較的低い溶解度によってしばしば妨げられる。疎水性部分の速く、効率的なコンジュゲーションを可能にする短い極性スペーサを求めて、発明者らは、リンカー−コンジュゲートの溶解度を改善し、ひいては、コンジュゲーションの効率を著しく改善し、プロセス中における凝集および生成物の凝集の両方を低減することが見出されたスルファミドリンカーを開発した。これは特許出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）（本明細書においてその全体が組み込まれる）に開示される。
【００１０】
リンカーは当技術分野で知られており、例えば、ＷＯ２００８／０７０２９１号（参照により組み込まれる）に開示されている。ＷＯ２００８／０７０２９１号は、アンカー成分へのターゲティング剤のカップリングのためのリンカーを開示する。リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって代表される親水性領域およびターゲティング剤にカップリングされるキラル中心を欠く伸長部を含む。
【００１１】
ＷＯ０１／８８５３５号（参照により組み込まれる）は、バイオコンジュゲーションのための表面用のリンカー系、特に、新規親水性スペーサ基を有するリンカー系を開示している。リンカー系における使用のための親水性原子または基は、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｏ（ケト基）、Ｏ−Ｃ＝Ｏ（エステル基）およびＣＲ３Ｒ４からなる群より選択され、ここでＲ３およびＲ４はＨ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシおよびＣ１−Ｃ４アシルオキシからなる群より独立して選択される。
【００１２】
ＷＯ２０１４／１００７６２号（参照により組み込まれる）は、適切な条件下で切断可能であるとともに親水基を組み込むことで化合物のより良好な溶解度を提供する、親水性自壊性リンカーを有する化合物を記載する。化合物は薬物部分、選択された細胞集団を標的にすることができるターゲティング部分、ならびにアシル単位、薬物部分とターゲティング部分との間の距離を提供するための任意的なスペーサ単位、適切な条件下で切断可能であり得るペプチドリンカー、親水性自壊性リンカー、および任意的な第２の自壊性スペーサまたは環化自己脱離リンカーを含むリンカーを含む。親水性自壊性リンカーは、例えばベンジルオキシカルボニル基である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明はバイオコンジュゲート、生体分子および標的分子のコンジュゲートの治療指数を増加させるための方法に関する。発明者らは驚いたことに、式（１）に従う基またはその塩を含むリンカーＬを含むように調製されたバイオコンジュゲート：
【化１】
2019507741.tif 000003
が、式（１）に従う基が存在しないリンカーを含む同じバイオコンジュゲート、すなわち同じ生体分子、同じ標的分子（例えば活性物質）および同じ生体分子薬物比と比べてより優れた治療指数を示すことを見出した。リンカーが、抗体−薬物−コンジュゲートなどのバイオコンジュゲートの治療指数に対して効果を有し得ることは、現在の知識に基づいては想起され得ない。本分野では、リンカーは治療に関しては不活性と考えられ、バイオコンジュゲートの調製の結果として存在するにすぎない。特定のリンカーの選択が治療指数に対して効果を有することは前例がなく、バイオコンジュゲート、特に抗体−薬物−コンジュゲートの分野における画期的発見である。
【００１４】
本発明によるバイオコンジュゲートは、一方で、異なるリンカーを含む同じバイオコンジュゲート、すなわち同じ生体分子、同じ標的分子（例えば活性物質）および同じ生体分子／標的分子比よりも効果的（治療的に有効）であり、他方で、より大きな耐容性を示す。この知見は、治療ウィンドウが広がるので、本発明によるバイオコンジュゲートを用いる被験体の治療に対して劇的な意義を有する。治療ウィンドウの拡大の結果として、治療投与量が低下され得、帰結として、潜在的な望まれない副作用が低減される。
【００１５】
本発明によるバイオコンジュゲートは、式（Ａ）により表され：
Ｂ−Ｌ−Ｄ
（Ａ）、
式中：
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｌは、ＢおよびＤを連結するリンカーであり；
−Ｄは、標的分子であり；ならびに
−「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分である。
【００１６】
式（１）に従う基では、
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１はさらなる標的分子Ｄであり、ここでＤは任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【００１７】
よって、本発明は、第１の態様では、以上で規定されるリンカーＬがバイオコンジュゲートに含まれるように式（Ａ）のバイオコンジュゲートを調製する工程を含む、バイオコンジュゲートの治療指数を増加させるための方法に関する。１つの実施形態では、本発明による方法はバイオコンジュゲートをその必要のある被験体に投与することをさらに含む。第１の態様による発明はまた、バイオコンジュゲートの治療指数を増加させるための、バイオコンジュゲートにおける以上で規定されるリンカーＬの使用と表すことができる。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるバイオコンジュゲートの投与を含む、その必要のある被験体の治療に関する。典型的には、バイオコンジュゲートは治療的に有効な用量で投与される。治療有効性の増加を考慮すると、投与は従来のバイオコンジュゲートを用いる治療におけるよりも頻繁に行わない、および／またはより低い用量で行うことがある。あるいは、耐容性の増加を考慮すると、投与は従来のバイオコンジュゲートを用いる治療におけるよりも頻繁に、および／またはより高い用量で行うことができる。投与は単一用量であり得るか、または例えば、１ヶ月１−４回、好ましくは１ヶ月１−２回行うことができ、より好ましい投与は３週または４週毎に、最も好ましくは４週毎に１回行う。当業者によって認識されるように、本発明によるバイオコンジュゲートの用量は多くの因子に依存することがあり、最適用量は当業者によりルーチン実験を介して決定することができる。バイオコンジュゲートは典型的には、０．０１−５０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、より正確には０．１−２５ｍｇ／ｋｇまたは最も正確には０．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。１つの実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲートの投与は同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０よりも低い用量であり、好ましくは用量は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０のせいぜい９９−９０％、より好ましくはせいぜい８９−６０％、さらにいっそう好ましくは５９−３０％、最も好ましくはせいぜい２９−１０％である。あるいは、本発明によるバイオコンジュゲートの投与は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０より高い用量であり、好ましくは、用量は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０のせいぜい１０−２９％、より好ましくはせいぜい３０−５９％、さらにいっそう好ましくは６０−８９％、最も好ましくはせいぜい９０−９９％である。
【００１９】
バイオコンジュゲートの調製は典型的には、式Ｑ１−Ｌ−Ｄを有するリンカー−コンジュゲート（ここで、ＬおよびＤは以上で規定される通りであり、Ｑ１は官能基Ｆ１と反応することができる反応基である）を、式Ｂ−Ｆ１を有する生体分子（ここで、Ｂは以上で規定される通りであり、Ｆ１は、Ｑ１と反応することができる官能基である）と反応させる工程を含む。ここで、Ｑ１およびＦ１は反応し、式（Ａ）に従うバイオコンジュゲート中、ＢとＬの間のスペーサ部分に位置する連結基Ｚ３を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】生体分子のコンジュゲーションの一般概念を示し：１つ以上の官能基Ｆ１を含む対象生体分子（ＢＯＩ）は、特定のリンカーを介して反応基Ｑ１に共有結合された（過剰の）標的分子Ｄ（対象分子またはＭＯＩとも呼ばれる）と共にインキュベートされる。バイオコンジュゲーションのプロセスにおいて、Ｆ１とＱ１との間の化学反応が起き、よって、ＢＯＩとＭＯＩの間の共有結合的連結を含むバイオコンジュゲートが形成される。ＢＯＩは、例えばペプチド／タンパク質、グリカンまたは核酸であってもよい。
【図２】例えば３−メルカプトプロピオニル基（１１ａ）、アジドアセチル基（１１ｂ）、またはアジドジフルオロアセチル基（１１ｃ）を用いて２位で、またはアジドアジドアセチル基を用いてＮ−アセチルガラクトサミンの６位で（１１ｄ）修飾することができる、ガラクトサミンのＵＤＰ糖類の誘導体のいくつかの構造を示す。
【図３】ＵＤＰ−糖類１１ａ−ｄのいずれかを、ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体またはＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの作用下で、ＧｌｃＮＡｃ部分を含む糖タンパク質１２（例えば、グリカンがエンドグリコシダーゼによってトリミングされているモノクローナル抗体）に付着させることができ、よって、ＧａｌＮＡｃ誘導体とＧｌｃＮＡｃの間にβ−グリコシド１−４連結を生成させる方法を概略的に表示する（それぞれ、化合物１３ａ−ｄ）。
【図４】修飾抗体１３ａ−ｄが、マレイミドへの求核付加により（チオエーテルコンジュゲート１４に至る３−メルカプトプロピオニル−ガラクトサミン修飾１３ａ、またはチオエーテルコンジュゲート１７に至る改変システイン残基へのコンジュゲーションに関する）、またはシクロオクチン試薬を用いる歪み促進付加環化で（それぞれ、トリアゾール１５ａ、１５ｂまたは１６に至る１３ｂ、１３ｃまたは１３ｄに関する）バイオコンジュゲーションプロセスを受けることができる方法を示す。
【図５】Ｎ−マレイミジル反応基Ｑ１が従来リンカー単位１７または本発明によるリンカー単位１８を介してピレン基（Ｄ）に連結されているいくつかの化合物の構造を示す。
【図６】ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］反応基Ｑ１（ＢＣＮ基とも呼ばれる）が従来リンカー単位（１９、２２）または本発明によるリンカー単位（２０、２１、２３）を介してベンジルアミン（Ｄ）に連結されているいくつかの化合物の構造を示す。
【図７】ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］反応基Ｑ１（ＢＣＮ基とも呼ばれる）またはジベンゾアゾシクロオクチン反応基Ｑ１（ＤＩＢＡＣ基またはＤＢＣＯ基とも呼ばれる）がリンカー単位を介してピレンに連結されているいくつかの化合物の構造を示す。リンカー２６および２９は本発明によるものであり、リンカー２４、２５、２７および２８は本発明によるものではない。
【図８】ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］反応基Ｑ１（ＢＣＮ基とも呼ばれる）がリンカー単位を介してマイタンシンに連結されている、リンカー−コンジュゲート３０および３３の構造を示す。リンカー−コンジュゲート３３は本発明によるものであり、リンカー−コンジュゲート３０はそうではない。、トラスツズマブにコンジュゲートされたこれらの２つのリンカー−コンジュゲート（すなわちＡＤＣ９７および９８）は実施例２９および３１の有効性および安全性研究において使用されてきた。
【図９】ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］反応基Ｑ１（ＢＣＮ基とも呼ばれる）がリンカー単位を介してＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−デュオカルマイシンコンストラクトに連結されている２つの化合物の構造を示す。リンカー−コンジュゲート３５は本発明によるものであり、一方、リンカー−コンジュゲート３４はそうではない。
【図１０】ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］反応基Ｑ１（ＢＣＮ基とも呼ばれる）がスルファミドリンカーを介してＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−Ａｈｘ−マイタンシンにコンジュゲートされている、本発明によるリンカー−コンジュゲートとして好適な化合物３６−３９の構造を示す。
【図１１】天然に存在するかまたは改変することによって導入されるかのいずれかである、生体分子における代表的な一組の官能基（Ｆ１）であって、反応基Ｑ１との反応で連結基Ｚ３に至る官能基（Ｆ１）を示す。官能基Ｆ１はまた、任意の選択位置で生体分子に人工的に導入され得る（改変）。同じ官能基および反応性部分が、それぞれ、Ｆ２およびＱ２として好適に使用される。連結基Ｚ３はまた、Ｆ２とＱ２の間の反応の結果であってもよい。
【図１２】実施例１−４において調製され、実施例２９および３１において使用される、抗体−薬物−コンジュゲート９５−９８の調製を示す。
【図１３】実施例２６−２８において調製され、実施例３０において使用される、抗体−薬物−コンジュゲート１１２−１１４の調製を示す。１１２では：Ｒ＝−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−Ｃ（Ｏ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（１３ｄの１１１とのコンジュゲーションにより調製）；１１３では：Ｒ＝−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−Ｃ（Ｏ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（１３ｄの１００とのコンジュゲーションにより調製）；１１４では：Ｒ＝−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＭ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−Ｃ（Ｏ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（１３ｄの１０８とのコンジュゲーションにより調製）。
【図１４】実施例２９の結果のグラフを示し、ここで腫瘍体積（ｍｍ３で表される）が、本発明による２つのバイオコンジュゲート（９５および９７）および本発明以外のリンカーのみを有する２つの同じバイオコンジュゲート（９６および９８）を使用して、時間の経過に伴って示される。
【図１５】実施例３０の結果のグラフを示し、ここで、腫瘍体積中央値（ｍｍ３で表される）が、本発明による２つのバイオコンジュゲート（１１３および１１４）ならびに本発明以外のリンカーのみを有する同じバイオコンジュゲート（１１２）を使用して、時間の経過に伴って示される。
【図１６Ａ】本発明によるリンカーを含むバイオコンジュゲート９７、および従来のＰＥＧ−リンカーを含む９８についての、実施例３１の安全性結果を示す。図１６Ａは、２および４日目での血小板数を示す（対照の％で表される）。
【図１６Ｂ】本発明によるリンカーを含むバイオコンジュゲート９７、および従来のＰＥＧ−リンカーを含む９８についての、実施例３１の安全性結果を示す。図１６Ｂは、２および４日目での体重を示す（対照の％で表される）。
【図１７ａ】図１７ａ及び１７ｂは、実施例４９の結果を示し、ここで、平均腫瘍体積（ｍｍ３で表される）が、本発明によるバイオコンジュゲート（１１６、図１７ｂ）および本発明の範囲外リンカーを有する同じバイオコンジュゲート（１１５、図１７ａ）について、時間の経過に伴って示される。図１７ａおよび１７ｂは、２つの別々のインビボ有効性研究（各研究においてアドセトリスを陽性対照として用いる）において測定された平均腫瘍体積を表す。異なる研究における腫瘍成長遅延に対するアドセトリスの効果の差は、細胞の倍加時間の差により合理的に説明することができる（ビヒクルで処置された群の腫瘍サイズにおいて明らかになる）。
【図１７ｂ】図１７ａ及び１７ｂは、実施例４９の結果を示し、ここで、平均腫瘍体積（ｍｍ３で表される）が、本発明によるバイオコンジュゲート（１１６、図１７ｂ）および本発明の範囲外リンカーを有する同じバイオコンジュゲート（１１５、図１７ａ）について、時間の経過に伴って示される。図１７ａおよび１７ｂは、２つの別々のインビボ有効性研究（各研究においてアドセトリスを陽性対照として用いる）において測定された平均腫瘍体積を表す。異なる研究における腫瘍成長遅延に対するアドセトリスの効果の差は、細胞の倍加時間の差により合理的に説明することができる（ビヒクルで処置された群の腫瘍サイズにおいて明らかになる）。
【図１８ａ】図１８ａ−ｃは、実施例５０の安全性結果を示し、ここで、ラットは、１１２、１１３または１１４で処置した（全てのＤＡＲ２  ＡＤＣが同じ抗体ブレンツキシマブおよび同じペイロードＭＭＡＥを有する）。図１８ａは、１１２で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１８ｂは、１１３で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１８ｃは、１１４で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。これらの結果に基づき、ＭＴＤは、１１２−１１４の各々について、１２０ｍｇ／ｋｇであることが確立される。
【図１８ｂ】図１８ａ−ｃは、実施例５０の安全性結果を示し、ここで、ラットは、１１２、１１３または１１４で処置した（全てのＤＡＲ２  ＡＤＣが同じ抗体ブレンツキシマブおよび同じペイロードＭＭＡＥを有する）。図１８ａは、１１２で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１８ｂは、１１３で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１８ｃは、１１４で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。これらの結果に基づき、ＭＴＤは、１１２−１１４の各々について、１２０ｍｇ／ｋｇであることが確立される。
【図１８ｃ】図１８ａ−ｃは、実施例５０の安全性結果を示し、ここで、ラットは、１１２、１１３または１１４で処置した（全てのＤＡＲ２  ＡＤＣが同じ抗体ブレンツキシマブおよび同じペイロードＭＭＡＥを有する）。図１８ａは、１１２で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１８ｂは、１１３で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１８ｃは、１１４で８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。これらの結果に基づき、ＭＴＤは、１１２−１１４の各々について、１２０ｍｇ／ｋｇであることが確立される。
【図１９ａ】図１９ａ−ｃは、実施例５１の安全性結果を示し、ここで、ラットは、アドセトリス、１１５または１１６で処置した（全てのＤＡＲ４  ＡＤＣは同じ抗体ブレンツキシマブおよびペイロードＭＭＡＥを有する）。図１９ａはアドセトリスで１５、２０または４０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１９ｂは、１１５で４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１９ｃは、１１６で４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。これらの結果に基づき、ＭＴＤはアドセトリスについて１５ｍｇ／ｋｇ（報告１８ｍｇ／ｋｇ）および１１５および１１６の両方について６０ｍｇ／ｋｇとして確立される。
【図１９ｂ】図１９ａ−ｃは、実施例５１の安全性結果を示し、ここで、ラットは、アドセトリス、１１５または１１６で処置した（全てのＤＡＲ４  ＡＤＣは同じ抗体ブレンツキシマブおよびペイロードＭＭＡＥを有する）。図１９ａはアドセトリスで１５、２０または４０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１９ｂは、１１５で４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１９ｃは、１１６で４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。これらの結果に基づき、ＭＴＤはアドセトリスについて１５ｍｇ／ｋｇ（報告１８ｍｇ／ｋｇ）および１１５および１１６の両方について６０ｍｇ／ｋｇとして確立される。
【図１９ｃ】図１９ａ−ｃは、実施例５１の安全性結果を示し、ここで、ラットは、アドセトリス、１１５または１１６で処置した（全てのＤＡＲ４  ＡＤＣは同じ抗体ブレンツキシマブおよびペイロードＭＭＡＥを有する）。図１９ａはアドセトリスで１５、２０または４０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１９ｂは、１１５で４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。図１９ｃは、１１６で４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇにて処置した群の平均体重を示す。これらの結果に基づき、ＭＴＤはアドセトリスについて１５ｍｇ／ｋｇ（報告１８ｍｇ／ｋｇ）および１１５および１１６の両方について６０ｍｇ／ｋｇとして確立される。
【図２０】実施例５２の結果を示し（ＭＤ−ＭＢＡ−２３１における有効性研究）、ここで、腫瘍体積（ｍｍ３で表される）が、本発明によるバイオコンジュゲート（１１８）および本発明以外のリンカーのみを有する同じバイオコンジュゲート（１１７）を使用して、時間の経過に伴って示される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明との関連で、コンジュゲーション反応は、一方では官能基Ｆ１を含有する生体分子（ＢＯＩ）、および他方では、反応基Ｑ１を含有する標的分子（ＭＯＩ）、または本明細書で規定される「リンカー−コンジュゲート」を伴い、ここで、Ｑ１は、Ｆ１と反応し、バイオコンジュゲートにおいてＢＯＩおよびＭＯＩを接合させる連結基を形成する。本明細書では、反応基Ｑ１はリンカーを介してＭＯＩに接合され、前記リンカーは式（１）に従うスルファミド部分を含む。
【化２】
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【００２２】
反応基Ｑ１は、式（１）の部分のいずれかの端部に付着されてもよく、この場合、ＭＯＩは、式（１）の部分の反対端に付着される。１つの実施形態では、反応基Ｑ１は、カルボニル端を介して式（１）の部分に付着され、ＭＯＩは式（１）の部分のスルファミド端を介して付着される。１つの実施形態では、反応基Ｑ１は、スルファミド端を介して式（１）の部分に付着され、ＭＯＩは式（１）の部分のカルボニル端を介して付着される。
【００２３】
定義
「含むこと」という動詞、およびそれの活用は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、その単語に追従する項目が含まれるが、具体的に記述されてない項目が除かれないことを意味する非限定的な意味において使用される。
【００２４】
加えて、不定冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」による要素への言及は、要素のうちの１つおよび１つだけがあることを文脈が明確に必要としていない限り、１を超える要素が存在するという可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００２５】
本明細書および特許請求の範囲に開示されている化合物は、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、その化合物の異なるジアステレオマーおよび／または鏡像異性体が存在し得る。本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の記載は、別記されない限り、全てのジアステレオマー、およびそれらの混合物を含むことが意味される。加えて、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の記載は、別記されない限り、個々の鏡像異性体、ならびに鏡像異性体の任意の混合物、ラセミまたはそうでないものの両方を含むことが意味される。化合物の構造が、特定の鏡像異性体として図示されている場合、本出願の発明は、その特定の鏡像異性体に限定されないことが理解されるべきである。
【００２６】
化合物は、異なる互変異性型で出現し得る。本発明による化合物は、別記されない限り、全ての互変異性型を含むことが意味される。化合物の構造が、特定の互変異性体として図示されている場合、本出願の発明は、その特定の互変異性体に限定されないことが理解されるべきである。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲において開示される化合物はエキソおよびエンドジアステレオ異性体としてさらに存在し得る。別記されない限り、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の記載は、化合物の個々のエキソおよび個々のエンドジアステレオ異性体の両方、ならびにその混合物を含むことが意味される。化合物の構造が、特定のエンドまたはエキソジアステレオマーとして図示されている場合、本出願の発明は、その特定のエンドまたはエキソジアステレオマーに限定されないことが理解されるべきである。
【００２８】
さらに、本明細書および特許請求の範囲において開示される化合物は、シスおよびトランス異性体として存在してもよい。別記されない限り、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の記載は、化合物の個々のシスおよび個々のトランス異性体の両方、ならびにその混合物を含むことが意味される。一例として、化合物の構造が、シス異性体として図示されている場合、対応するトランス異性体またはシスおよびトランス異性体の混合物は本出願の発明から排除されないことが理解されるべきである。化合物の構造が、特定のシスまたはトランス異性体として図示されている場合、本出願の発明は、その特定のシスまたはトランス異性体に限定されないことが理解されるべきである。
【００２９】
非置換アルキル基は一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有し、直鎖または分枝であってもよい。任意で、アルキル基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基によって置換されている。アルキル基の例としてはメチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｔ−ブチル、１−ヘキシル、１−ドデシル、などが挙げられる。
【００３０】
シクロアルキル基は環状アルキル基である。非置換シクロアルキル基は少なくとも３つの炭素原子を含み、一般式ＣｎＨ２ｎ−１を有する。任意で、シクロアルキル基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基によって置換されている。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。
【００３１】
アルケニル基は１つ以上の炭素−炭素二重結合を含み、直鎖または分枝であってもよい。１つのＣ−Ｃ二重結合を含む非置換アルケニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ−１を有する。２つのＣ−Ｃ二重結合を含む非置換アルケニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ−３を有する。アルケニル基は末端炭素−炭素二重結合および／または内部炭素−炭素二重結合を含んでもよい。末端アルケニル基は、炭素−炭素二重結合が炭素鎖の末端位置に位置するアルケニル基である。アルケニル基はまた、２つ以上の炭素−炭素二重結合を含んでもよい。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ｔ−ブテニル、１，３−ブタジエニル、１，３−ペンタジエニル、などが挙げられる。別記されない限り、アルケニル基は、下記で定義される１つ以上の、独立して選択された、置換基で任意で置換されてもよい。別記されない限り、アルケニル基は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より独立して選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断されることがある。
【００３２】
アルキニル基は１つ以上の炭素−炭素三重結合を含み、直鎖または分枝であってもよい。１つのＣ−Ｃ三重結合を含む非置換アルキニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ−３を有する。アルキニル基は末端炭素−炭素三重結合および／または内部炭素−炭素三重結合を含んでもよい。末端アルキニル基は、炭素−炭素三重結合が炭素鎖の末端位置に位置するアルキニル基である。アルキニル基はまた、２つ以上の炭素−炭素三重結合を含んでもよい。別記されない限り、アルキニル基は、下記で定義される１つ以上の、独立して選択された、置換基で任意で置換されてもよい。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、イソプロピニル、ｔ−ブチニル、などが挙げられる。別記されない限り、アルキニル基は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群より独立して選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断されることがある。
【００３３】
アリール基は６〜１２個の炭素原子を含み、単環式および二環式構造を含み得る。任意で、アリール基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基により置換されてもよい。アリール基の例はフェニルおよびナフチルである。
【００３４】
アリールアルキル基およびアルキルアリール基は少なくとも７つの炭素原子を含み、単環式および二環式構造を含み得る。任意で、アリールアルキル基およびアルキルアリールは本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基によって置換されてもよい。アリールアルキル基は例えばベンジルである。アルキルアリール基は例えば４−ｔ−ブチルフェニルである。
【００３５】
ヘテロアリール基は少なくとも２つの炭素原子（すなわち、少なくともＣ２）および１つ以上のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、ＰまたはＳを含む。ヘテロアリール基は単環式または二環式構造を有してもよい。任意で、ヘテロアリール基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基により置換されてもよい。好適なヘテロアリール基の例としては、ピリジニル、キノリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピロリル、フラニル、トリアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、プリニル、ベンゾキサゾリル、チエニル、ホスホリルおよびオキサゾリルが挙げられる。
【００３６】
ヘテロアリールアルキル基およびアルキルヘテロアリール基は少なくとも３つの炭素原子（すなわち、少なくともＣ３）を含み、単環式および二環式構造を含み得る。任意で、ヘテロアリール基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基により置換されてもよい。
【００３７】
アリール基が、（ヘテロ）アリール基として示される場合、表記は、アリール基およびヘテロアリール基を含むことが意味される。同様に、アルキル（ヘテロ）アリール基は、アルキルアリール基およびアルキルヘテロアリール基を含むことが意味され、（ヘテロ）アリールアルキルは、アリールアルキル基およびヘテロアリールアルキル基を含むことが意味される。よって、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基はＣ２−Ｃ２４ヘテロアリール基およびＣ６−Ｃ２４アリール基を含むと解釈されるべきである。同様に、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基は、Ｃ７−Ｃ２４アルキルアリール基およびＣ３−Ｃ２４アルキルヘテロアリール基を含むことが意味され、Ｃ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキルは、Ｃ７−Ｃ２４アリールアルキル基およびＣ３−Ｃ２４ヘテロアリールアルキル基を含むことが意味される。
【００３８】
シクロアルキニル基は環状アルキニル基である。１つの三重結合を含む非置換シクロアルキニル基は一般式ＣｎＨ２ｎ−５を有する。任意で、シクロアルキニル基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基により置換される。シクロアルキニル基の例はシクロオクチニルである。
【００３９】
ヘテロシクロアルキニル基は酸素、窒素および硫黄の群から選択されるヘテロ原子により中断されるシクロアルキニル基である。任意で、ヘテロシクロアルキニル基は、本文書においてさらに特定されている１つ以上の置換基により置換される。ヘテロシクロアルキニル基の例はアザシクロオクチニルである。
【００４０】
（ヘテロ）アリール基は、アリール基およびヘテロアリール基を含む。アルキル（ヘテロ）アリール基はアルキルアリール基およびアルキルヘテロアリール基を含む。（ヘテロ）アリールアルキル基はアリールアルキル基およびヘテロアリールアルキル基を含む。（ヘテロ）アルキニル基はアルキニル基およびヘテロアルキニル基を含む。（ヘテロ）シクロアルキニル基はシクロアルキニル基およびヘテロシクロアルキニル基を含む。
【００４１】
（ヘテロ）シクロアルキン化合物は本明細書で、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む化合物として規定される。
【００４２】
本明細書および特許請求の範囲において開示される化合物のいくつかは、縮合（ヘテロ）シクロアルキン化合物、すなわち第２の環構造が、（ヘテロ）シクロアルキニル基に縮合されている、すなわち環状化されている（ヘテロ）シクロアルキン化合物として記載することができる。例えば縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物において、シクロアルキル（例えばシクロプロピル）またはアレーン（例えばベンゼン）は（ヘテロ）シクロオクチニル基に環状化され得る。縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物における（ヘテロ）シクロオクチニル基の三重結合は、３つの可能な位置、即ち、シクロオクチン部分の２位、３位または４位（“ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｒｕｌｅ  Ａ３１．２による番号付け）のうちのいずれか１つに位置し得る。本明細書および特許請求の範囲における任意の縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の記載は、シクロオクチン部分の全ての３つの個々の位置異性体を含むことが意味される。
【００４３】
別記されない限り、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基、アルキル（ヘテロ）アリール基、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、（ヘテロ）アリーレン基、アルキル（ヘテロ）アリーレン基、（ヘテロ）アリールアルキレン基、（ヘテロ）アリールアルケニレン基、（ヘテロ）アリールアルキニレン基、アルケニル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、（ヘテロ）アリールオキシ基、アルキニルオキシ基およびシクロアルキルオキシ基は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ５−Ｃ１２シクロアルケニル基、Ｃ８−Ｃ１２シクロアルキニル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２−Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２−Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソおよびシリル基からなる群より独立して選択される１つ以上の置換基で置換されてもよく、ここで、シリル基は、式（Ｒ２０）３Ｓｉ−により表すことができ、ここでＲ２０はＣ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ２−Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２−Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２−Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２−Ｃ１２アルキニルオキシ基およびＣ３−Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群より独立して選択され、ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基およびシクロアルキルオキシ基は任意で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基およびシクロアルコキシ基はＯ、ＮおよびＳからなる群より選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断されている。
【００４４】
「糖」という一般用語は、本明細書では、単糖、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）およびフコース（Ｆｕｃ）を示すために使用される。「糖誘導体」という用語は、本明細書では、単糖の糖の誘導体、すなわち、置換基および／または官能基を含む単糖の糖を示すために使用される。糖誘導体の例としては、アミノ糖類および糖酸、例えばグルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）、ガラクトサミン（ＧａｌＮＨ２）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれるシアル酸（Ｓｉａ）、ならびにＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）およびイズロン酸（ＩｄｏＡ）が挙げられる。
【００４５】
「ヌクレオチド」という用語は本明細書では、その通常の科学的意味で使用される。「ヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、５−炭素糖（リボースまたは２−デオキシリボースのいずれか）、および１、２または３つのリン酸基で構成される分子を示す。リン酸基なしで、核酸塩基および糖がヌクレオシドを構成する。よって、ヌクレオチドはまた、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド三リン酸と呼ぶこともできる。核酸塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンであり得る。ヌクレオチドの例としては、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）およびシチジン一リン酸（ＣＭＰ）が挙げられる。
【００４６】
「タンパク質」という用語は本明細書では、その通常の科学的意味で使用される。本明細書では、約１０以上のアミノ酸を含むポリペプチドはタンパク質と考えられる。タンパク質は、天然だけでなく非天然のアミノ酸を含むことがある。
【００４７】
「糖タンパク質」という用語は、本明細書では、その通常の科学的意味で使用され、タンパク質に共有結合された１つ以上の単糖またはオリゴ糖鎖（「グリカン」）を含むタンパク質を示す。グリカンは、タンパク質上のヒドロキシル基（Ｏ−連結グリカン）に、例えば、セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシリジンまたはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基に、またはタンパク質（Ｎ−糖タンパク質）、例えばアスパラギンまたはアルギニン上のアミド官能基に、またはタンパク質（Ｃ−糖タンパク質）、例えばトリプトファン上の炭素に付着されてもよい。糖タンパク質は１を超えるグリカンを含んでもよく、１つ以上の単糖および１つ以上のオリゴ糖グリカンの組み合わせを含んでもよく、Ｎ−連結、Ｏ−連結およびＣ−連結グリカンの組み合わせを含んでもよい。全てのタンパク質の５０％超はグリコシル化のいくつかの形態を有し、よって、糖タンパク質として認定されることが推定される。糖タンパク質の例としては、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＣＡＬ（カンジダアンタルチカ（ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼ）、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、不凍タンパク質および抗体が挙げられる。
【００４８】
「グリカン」という用語は本明細書では、その通常の科学的意味で使用され、タンパク質に連結された単糖またはオリゴ糖鎖を示す。よって、グリカンという用語は、糖タンパク質の炭水化物部分を示す。グリカンは、さらなる置換を有さなくてもよい（単糖）、またはそのヒドロキシル基の１つ以上でさらに置換されてもよい（オリゴ糖）１つの糖のＣ−１炭素を介してタンパク質に付着される。天然起源のグリカンは典型的には１〜約１０の糖部分を含む。しかしながら、より長い糖鎖がタンパク質に連結されている場合、前記糖鎖はまた、本明細書ではグリカンとも考えられる。糖タンパク質のグリカンは単糖であってもよい。典型的には、糖タンパク質の単糖グリカンは、タンパク質に共有結合された単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）またはフコース（Ｆｕｃ）から構成される。グリカンはまた、オリゴ糖であってもよい。糖タンパク質のオリゴ糖鎖は、直鎖または分枝であってもよい。オリゴ糖において、タンパク質に直接付着された糖はコア糖と呼ばれる。オリゴ糖では、タンパク質に直接付着されておらず、少なくとも２つの他の糖類に付着された糖は内部糖と呼ばれる。オリゴ糖では、タンパク質に直接付着されていないが、単一の他の糖に付着されている糖、すなわち、その、他のヒドロキシル基の１つ以上でさらなる糖置換基を保有しない糖は末端糖と呼ばれる。疑いを回避するため、糖タンパク質のオリゴ糖において複数の末端糖類が存在することがあるが、コア糖はたった１つである。グリカンはＯ−連結グリカン、Ｎ−連結グリカンまたはＣ−連結グリカンであってもよい。Ｏ−連結グリカンでは、単糖またはオリゴ糖グリカンは、典型的にはセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル基を介して、タンパク質のアミノ酸におけるＯ−原子に結合される。Ｎ−連結グリカンでは、単糖またはオリゴ糖グリカンは、タンパク質のアミノ酸におけるＮ−原子を介して、典型的にはアスパラギン（Ａｓｎ）またはアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖におけるアミド窒素を介して、タンパク質に結合される。Ｃ−連結グリカンでは、単糖またはオリゴ糖グリカンはタンパク質のアミノ酸におけるＣ−原子に、典型的にはトリプトファン（Ｔｒｐ）のＣ−原子に結合される。
【００４９】
「抗体」という用語は本明細書では、その通常の科学的意味で使用される。抗体は、特異抗原を認識し、結合することができる、免疫系によって生成されたタンパク質である。抗体は糖タンパク質の例である。抗体という用語は本明細書では、その最も広い意味において使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗体断片、ならびに二重鎖および単鎖抗体が挙げられる。「抗体」という用語はまた、本明細書では、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および癌抗原に特異的に結合する抗体を含むことが意味される。「抗体」という用語は、全抗体だけでなく、抗体の抗原結合断片、例えば抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、切断された抗体由来のＦｖ断片もしくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片、ミニボディ、ダイアボディまたはｓｃＦｖを含むことが意味される。さらに、この用語は遺伝子操作された抗体および抗体の誘導体を含む。抗体、抗体の断片および遺伝子操作された抗体は当技術分野で知られている方法により得ることができる。抗体の典型的な例としては、とりわけ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブおよびブレンツキシマブが挙げられる。
【００５０】
リンカーは本明細書で、化合物の２つ以上の要素を連結する部分として規定される。例えば、バイオコンジュゲートでは、生体分子および標的分子は、リンカーを介して互いに共有結合により連結され；リンカー−コンジュゲートでは、反応基Ｑ１はリンカーを介して標的分子に共有結合により連結され；リンカー−コンストラクトでは、反応基Ｑ１は、リンカーを介して反応基Ｑ２に共有結合により連結される。リンカーは、１つ以上のスペーサ部分を含んでもよい。
【００５１】
スペーサ部分は本明細書で、間隔をあける（即ち、間に距離を提供する）とともに、リンカーの２つ（またはそれ以上）の部分を一緒に共有結合により連結させる部分として規定される。リンカーは、下記で定義される通り、例えば、リンカー−コンストラクト、リンカー−コンジュゲートまたはバイオコンジュゲートの一部であり得る。
【００５２】
リンカー−コンストラクトは本明細書で、反応基Ｑ１がリンカーを介して反応基Ｑ２に共有結合により連結される化合物として規定される。リンカー−コンストラクトは、生体分子上に存在する反応基と反応することができる反応基Ｑ１、および標的分子上に存在する反応基と反応することができる反応基Ｑ２を含む。Ｑ１およびＱ２は同じであってもよく、または異なっていてもよい。リンカー−コンストラクトはまた、１を超える反応基Ｑ１および／または１を超える反応基Ｑ２を含んでもよい。リンカー−コンストラクトはまた、Ｑ１−Ｓｐ−Ｑ２として表されてもよく、ここで、Ｑ１は生体分子上に存在する反応基Ｆ１と反応することができる反応基であり、Ｑ２は標的分子上に存在する反応基Ｆ２と反応することができる反応基であり、Ｓｐはスペーサ部分である。リンカー−コンストラクトが１を超える反応基Ｑ１および／または１を超える反応基Ｑ２を含む場合、リンカー−コンストラクトは、（Ｑ１）ｙ−Ｓｐ−（Ｑ２）ｚとして表され得、ここで、ｙは１〜１０の範囲の整数であり、ｚは１〜１０の範囲の整数である。好ましくは、ｙは１、２、３または４であり、より好ましくはｙは１または２であり、最も好ましくは、ｙは１である。好ましくは、ｚは１、２、３、４、５または６であり、より好ましくはｚは１、２、３または４であり、さらにいっそう好ましくはｚは１、２または３であり、さらによりいっそう好ましくはｚは１または２であり、最も好ましくはｚは１である。より好ましくは、ｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１、２、３または４であり、さらによりいっそう好ましくはｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１、２または３であり、さらによりいっそう好ましくはｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１または２であり、最も好ましくはｙは１であり、ｚは１である。
【００５３】
バイオコンジュゲートは本明細書で、生体分子がリンカーを介して標的分子に共有結合により連結される化合物として規定される。バイオコンジュゲートは１つ以上の生体分子および／または１つ以上の標的分子を含む。リンカーは、１つ以上のスペーサ部分を含んでもよい。
【００５４】
化合物が本明細書で、α端およびω端を含む化合物と呼ばれる場合、前記化合物は２つ（またはそれ以上）の端を含み、第１端がα端と呼ばれ、第２端がω端と呼ばれる。前記化合物は、２を超える端を含んでもよく、すなわち第３、第４などの端が化合物中に存在してもよい。
【００５５】
生体分子は本明細書で、自然から単離することができる任意の分子として、または自然から誘導される巨大分子構造の構成要素、特に核酸、タンパク質、グリカンおよび脂質であるより小さな分子ビルディングブロックから構成される任意の分子として規定される。生体分子の例としては、酵素、（非触媒）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、多糖、グリカン、脂質およびホルモンが挙げられる。
【００５６】
対象分子（ＭＯＩ）とも呼ばれる標的分子は本明細書で、コンジュゲーションで生体分子に付与される所望の特性を有する分子構造として規定される。
【００５７】
「その塩」という用語は、酸性プロトン、典型的には酸のプロトンが、カチオン、例えば金属カチオンまたは有機カチオンなどによって置き換えられる場合に形成される化合物を意味する。適用可能な場合、塩は薬学的に許容される塩であるが、これは患者への投与が意図されない塩には必要とされない。例えば、化合物の塩において、化合物は無機または有機酸によってプロトン化されてもよく、カチオンを形成し、塩のアニオン性成分として無機または有機酸の共役塩基を有する。
【００５８】
「薬学的に許容される」塩という用語は、患者、例えば哺乳類への投与に許容される塩（所定の投与計画について許容される哺乳類安全性を有する対イオンとの塩）を意味する。そのような塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基から、薬学的に許容される無機または有機酸から誘導され得る。「薬学的に許容される塩」は、化合物の薬学的に許容される塩を示し、この塩は当技術分野で知られている様々な有機および無機対イオンから誘導され、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム、など、および分子が塩基性官能基を含む場合には、有機または無機酸の塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、などが挙げられる。
【００５９】
本明細書では、スルファミドリンカーおよび前記スルファミドリンカーのコンジュゲートが開示される。「スルファミドリンカー」という用語は、スルファミド基、より特定的にはアシルスルファミド基［−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１）−］および／またはカルバモイルスルファミド基［−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｓ（Ｏ）２−Ｎ（Ｒ１）−］を含むリンカーを示す。
【００６０】
本明細書では、「治療指数」（ＴＩ）という用語は当業者によく知られている従来の意味を有し、集団の５０％において所望の薬理効果に至る用量（有効用量またはＥＤ５０）によって割られた、集団の５０％に毒性である（すなわち、標的適応症と適合性のない発生率または重症度で有害作用を引き起こす）薬物の用量（ＴＤ５０）の比を示す。よって、ＴＩ＝ＴＤ５０／ＥＤ５０。治療指数は臨床試験により、または例えば血漿曝露試験により決定されてもよい。Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１２，１１，７５１−７６１もまた、参照されたい。初期開発段階では、薬物候補の臨床ＴＩはしばしば、まだわかっていない。しかしながら、薬物候補の予備ＴＩを理解することは、できるだけ早く、最も重要である。というのも、ＴＩは薬物の成功した開発の確率の重要な指標となるからである。できるだけ早期の段階で潜在的に最適以下のＴＩを有する薬物候補を認識すると、軽減を開始する、または資源を潜在的に再配置することが助けられる。この初期段階では、ＴＩは典型的には、安全性（マウスまたはラットにおける最大耐容量）と有効性（マウス異種移植片における最小有効用量）の間の量的比として規定される。
【００６１】
本明細書では、「治療有効性」という用語はある一定の治療効果、例えば腫瘍体積の低減を達成するための物質の能力を示す。治療効果は、典型的には同じ状況下で別の物質との比較において物質が所望の効果を達成し得る程度を決定して測定することができる。治療有効性のための好適な尺度はＥＤ５０値であり、これは、例えば臨床試験中に、または血漿曝露試験により決定することができる。前臨床治療有効性決定の場合、バイオコンジュゲート（例えば、ＡＤＣ）の治療効果は、マウスにおける患者由来の腫瘍異種移植片により検証することができ、この場合、有効性は、有益な効果を提供するためのＡＤＣの能力を示す。あるいは齧歯類安全性研究における前記ＡＤＣの耐容性はまた、治療効果の尺度となり得る。
【００６２】
本明細書では、「耐容性」という用語は、標的適応症と適合性のない発生率または重症度で有害作用を引き起こさない特定の物質の最高用量を示す。特定の物質についての耐容性の好適な尺度はＴＤ５０値であり、これは、例えば臨床試験中、または血漿曝露試験により決定することができる。
【００６３】
リンカー
本発明によるバイオコンジュゲートは生体分子Ｂと標的分子Ｄを連結させるリンカーＬを含む。リンカーは式（１）に従う基またはその塩を含み：
【化３】
2019507741.tif 000005
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１はさらなる標的分子Ｄであり、ここでＤは任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【００６４】
式（１）の基が塩を含む場合、塩は好ましくは薬学的に許容される塩である。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明によるリンカーＬは式（１）に従う基（式中、ａは０である）、またはその塩を含む。この実施形態では、よって、リンカーＬは式（２）に従う基またはその塩を含み：
【化４】
2019507741.tif 000006
式中、Ｒ１は以上で規定される通りである。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、本発明によるリンカーＬは式（１）に従う基（式中、ａは１である）、またはその塩を含む。この実施形態では、よって、リンカーＬは式（３）に従う基またはその塩を含み：
【化５】
2019507741.tif 000007
式中、Ｒ１は以上で規定される通りである。
【００６７】
式（１）、（２）および（３）による基では、Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１はさらなる標的分子Ｄであり、ここでＤは任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【００６８】
好ましい実施形態では、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ２０アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１６アルキル基であり、さらにいっそう好ましくは、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、ここで、アルキル基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯにより任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より独立して選択される。好ましい実施形態では、Ｒ１は水素である。別の好ましい実施形態では、Ｒ１はＣ１−Ｃ２０アルキル基、より好ましくはＣ１−Ｃ１６アルキル基、さらにいっそう好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、ここで、アルキル基は、１つ以上のＯ−原子により任意で中断され、ここで、アルキル基は、−ＯＨ基、好ましくは末端−ＯＨ基で任意で置換される。この実施形態では、Ｒ１は末端−ＯＨ基を含む（ポリ）エチレングリコール鎖であることが、さらに好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｒ１は水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルおよびｔ−ブチルからなる群より、より好ましくは水素、メチル、エチル、ｎ−プロピルおよびｉ−プロピルからなる群より、さらにいっそう好ましくは水素、メチルおよびエチルからなる群より選択される。さらによりいっそう好ましくは、Ｒ１は水素またはメチルであり、最も好ましくは、Ｒ１は水素である。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、Ｒ１はさらなる標的分子Ｄである。任意で、Ｄは１つ以上のスペーサ部分を介してＮに連結される。スペーサ部分は、存在する場合、ＤとＮとの間に間隔をあけ、すなわち、特定の距離を提供し、ＤおよびＮを共有結合により連結する部分として規定される。
【００７０】
バイオコンジュゲーションの分野における標的分子は当業者に知られており、ペイロードとも呼ばれ得る。標的分子Ｄは、活性物質、レポーター分子、ポリマ、固体表面、ヒドロゲル、ナノ粒子、微小粒子および生体分子からなる群より選択され得る。
【００７１】
Ｄとの関連で、「活性物質」という用語は、薬理学的および／または生物学的物質、すなわち生物学的におよび／または薬学的に活性である物質、例えば薬物、プロドラッグ、診断薬、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドタグ、アミノ酸、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに関する。ペプチドタグの例としては、ヒトラクトフェリンまたはポリアルギニンのような細胞透過性ペプチドが挙げられる。グリカンの例はオリゴマンノースである。アミノ酸の例はリジンである。
【００７２】
標的分子が活性物質である場合、活性物質は好ましくは薬物およびプロドラッグからなる群より選択される。より好ましくは、活性物質は薬学的に活性な化合物、特に低〜中分子量化合物（例えば約２００〜約２５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１７５０Ｄａ）からなる群より選択される。さらに好ましい実施形態では、活性物質は細胞毒、抗ウイルス薬、抗菌薬、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選択される。細胞毒の例としては、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、ツブリシン、イリノテカン、阻害ペプチド、アマニチン、デボウガニン（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチンまたはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が挙げられる。それらの難水溶性を考慮すると、好ましい活性物質としては、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、タキサン、ツブリシン、アマニチン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチンおよびピロロベンゾジアゼピン、特にビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、タキサン、ツブリシン、アマニチン、マイタンシンおよびアウリスタチンが挙げられる。
【００７３】
「レポーター分子」という用語は、本明細では、存在が容易に検出される分子、例えば診断薬、色素、フルオロフォア、放射性同位元素標識、造影剤、磁気共鳴イメージング剤または質量標識を示す。
【００７４】
蛍光プローブとも呼ばれる多種多様のフルオロフォアが、当業者に知られている。いくつかのフルオロフォアが、例えばＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０：“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ”，ｐ．３９５−４６３（参照により組み込まれる）においてより詳細に記載されている。フルオロフォアの例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒの全ての種類（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５）、シアニン色素（例えばＣｙ３またはＣｙ５）およびシアニン色素誘導体、クマリン誘導体、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、ローダミンおよびローダミン誘導体、ホウ素ジピロメテン誘導体、ピレン誘導体、ナフタルイミド誘導体、フィコビリンタンパク質誘導体（例えばアロフィコシアニン）、クロモマイシン、ランタニドキレートならびに量子ドットナノ結晶が挙げられる。それらの難水溶性を考慮すると、好ましいフルオロフォアとしては、シアニン色素、クマリン誘導体、フルオレセインおよびその誘導体、ピレン誘導体、ナフタルイミド誘導体、クロモマイシン、ランタニドキレートならびに量子ドットナノ結晶、特にクマリン誘導体、フルオレセイン、ピレン誘導体およびクロモマイシンが挙げられる。
【００７５】
放射性同位元素標識の例としては、任意で、例えばＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸無水物）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＴＴＡ（Ｎ１−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−四酢酸）、デフェロキサミンまたはＤＦＡ（Ｎ’−［５−［［４−［［５−（アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］−Ｎ−（５−アミノペンチル）−Ｎ−ヒドロキシブタンジアミド）またはＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）などのキレート部分を介して連結された９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１５Ｉｎ，１８Ｆ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、２１２Ｂｉ、８８Ｙ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、６６Ｇａ、６７Ｇａおよび１０Ｂが挙げられる。同位元素標識技術は当業者に知られており、例えばＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：“Ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，ｐ．５０７−５３４（参照により組み込まれる）に、より詳細に記載されている。
【００７６】
本発明による化合物における標的分子Ｄとしての使用に好適なポリマは当業者に知られており、いくつかの例が、例えばＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １８：“ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，ｐ．７８７−８３８（参照により組み込まれる）に、より詳細に記載されている。標的分子Ｄがポリマである場合、標的分子Ｄは好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、１，ｘ−ジアミノアルカンポリマ（ここで、ｘはアルカン中の炭素原子の数であり、好ましくはｘは２〜２００、好ましくは２〜１０の範囲の整数である）、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンおよびより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、多糖（例えばデキストラン）、ポリ（アミノ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−リジン））およびポリ（ビニルアルコール）からなる群より独立して選択される。それらの難水溶性を考慮すると、好ましいポリマとしては、１，ｘ−ジアミノアルカンポリマおよびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。
【００７７】
標的分子Ｄとしての使用に好適な固体表面は当業者に知られている。固体表面は、例えば機能性表面（例えば、ナノ材料、カーボンナノチューブ、フラーレンまたはウイルスカプシドの表面）、金属表面（例えばチタン、金、銀、銅、ニッケル、スズ、ロジウムまたは亜鉛表面）、金属合金表面（ここで、合金は、例えばアルミニウム、ビスマス、クロム、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀、ニッケル、カリウム、プルトニウム、ロジウム、スカンジウム、銀、ナトリウム、チタン、スズ、ウラン、亜鉛および／またはジルコニウム由来である）、ポリマ表面（ここで、ポリマは、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（ジメチルシロキサン）またはポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミドである）、ガラス表面、シリコーン表面、クロマトグラフィー支持体表面（ここで、クロマトグラフィー支持体は例えばシリカ支持体、アガロース支持体、セルロース支持体またはアルミナ支持体である）、などである。標的分子Ｄが固体表面である場合、Ｄは機能性表面またはポリマ表面からなる群より独立して選択されることが好ましい。
【００７８】
ヒドロゲルは当業者に知られている。ヒドロゲルはポリマ構成要素間の架橋により形成される水膨潤ネットワークである。例えば、Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２０１２，６４，１８（参照により組み込まれる）を参照されたい。標的分子がヒドロゲルである場合、ヒドロゲルは、ポリマ基礎としてポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）から構成されることが好ましい。
【００７９】
標的分子Ｄとしての使用に好適なミクロおよびナノ粒子は当業者に知られている。様々な好適なミクロおよびナノ粒子は、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４：“Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，ｐ．５４９−５８７（参照により組み込まれる）に記載される。ミクロまたはナノ粒子は、任意の形状、例えば球体、ロッド、チューブ、立方体、三角形および円錐であり得る。好ましくは、ミクロまたはナノ粒子は球状形状である。ミクロおよびナノ粒子の化学組成は変動し得る。標的分子Ｄがミクロまたはナノ粒子である場合、ミクロまたはナノ粒子は、例えば、ポリマミクロまたはナノ粒子、シリカミクロまたはナノ粒子または金ミクロまたはナノ粒子である。粒子がポリマミクロまたはナノ粒子である場合、ポリマは好ましくはポリスチレンまたはスチレンのコポリマ（例えば、スチレンとジビニルベンゼン、ブタジエン、アクリレートおよび／またはビニルトルエンのコポリマ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルトルエン、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）またはポリエチレングリコールジメタクリレート／２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［ポリ（ＥＤＧＭＡ／ＨＥＭＡ）］である。任意で、ミクロまたはナノ粒子の表面は、例えば、界面活性剤を用いて、二次ポリマのグラフト重合により、または別のポリマもしくはスペーサ部分の共有結合による付着により、などにより修飾される。
【００８０】
標的分子Ｄはまた、生体分子であってもよい。生体分子、およびその好ましい実施形態は、より詳細に下記に記載されている。標的分子Ｄが生体分子である場合、生体分子はタンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖類、オリゴ糖類、酵素、ホルモン、アミノ酸および単糖類からなる群より選択されることが好ましい。
【００８１】
式（Ａ）のバイオコンジュゲートを得るために、式（１）の基は、３つの選択肢のうちの１つに導入することができる。まず第１に、式（１）に従う基またはその塩を含むリンカーＬはＱ１−Ｄにより表されるリンカー−コンジュゲート中に存在することができ、ここで、ＬはＱ１とＤの間のスペーサである。第２に、式（１）に従う基またはその塩を含むリンカーＬは、Ｂ−Ｆ１により表される生体分子中に存在することができ、ここで、Ｌは、ＢとＦ１の間のスペーサである。第３に、式（１）に従う基またはその塩はコンジュゲーション反応自体中に形成され得る。後者の選択肢において、Ｑ１およびＦ１は、それらの反応生成物、すなわち連結基Ｚ３が式（１）に従う基またはその塩を含む、または式（１）に従う基またはその塩であるように選択される。好ましくは、式（１）に従う基またはその塩は上記選択肢のうちの第１または第２に従って導入され、最も好ましくは第１の選択肢に従って導入される。式（１）に従う基またはその塩がコンジュゲーション反応中にそのようなものとしてすでに存在する場合、溶解度およびインプロセス凝集の非存在に対するプラス効果、上記で列挙されるように、コンジュゲーション反応の効率を改善する。式（１）に従う基またはその塩がリンカー−コンジュゲート中に存在する場合、疎水性薬物であっても、コンジュゲーション反応に容易に供することができる。
【００８２】
リンカー−コンジュゲート
リンカー−コンジュゲートは、Ｑ１−Ｄにより、好ましくはＱ１−Ｌ−Ｄにより表され、ここで、Ｄは標的分子であり、Ｌはさらに以上で規定されている通りのＱ１およびＤを連結するリンカーであり、Ｑ１は生体分子上の官能基Ｆ１と反応することができる反応基であり、「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分である。１つの実施形態では、「−」は本明細書で規定される通りのスペーサ部分である。１つの実施形態では、「−」は、結合、典型的には共有結合である。リンカー−コンジュゲートは、標的分子が、好ましくはリンカーまたはスペーサを介して、最も好ましくは以上で規定されるリンカーＬを介して、反応基Ｑ１に共有結合により連結される化合物である。リンカー−コンジュゲートは、リンカー−コンストラクト上に存在する反応基Ｑ２の標的分子上に存在する反応基との反応を介して得られ得る。
【００８３】
好ましくは、式（１）に従う基、またはその塩はＱ１とＤの間に位置する。言い換えれば、反応基Ｑ１は式（１）に従う基の第１の端に共有結合により結合され、標的分子Ｄは式（１）に従う基の第２の端に共有結合により結合される。本明細書では、「第１の端」および「第２の端」はどちらも、式（１）に従う基のカルボニルまたはカルボキシ端または式（１）に従う基のスルファミド端のいずれかを示すが、論理的には同じ端を示していない。
【００８４】
当業者によって認識されるように、本発明によるリンカー−コンジュゲートは、１を超える標的分子Ｄ、例えば２、３、４、５つなどを含んでもよい。その結果として、リンカー−コンジュゲートは、よって、１を超える「第２の端」を含んでもよい。同様に、リンカー−コンジュゲートは、１を超える反応基Ｑ１を含んでもよく、すなわち、リンカー−コンジュゲートは、１を超える第１の端を含んでもよい。１を超える反応基Ｑ１が存在する場合、基Ｑ１は同じか、または異なってもよく、１を超える標的分子Ｄが存在する場合、標的分子Ｄは同じか、または異なっていてもよい。
【００８５】
本発明によるリンカー−コンジュゲートはそのため、（Ｑ１）ｙＳｐ（Ｄ）ｚと表すこともでき、ここで、ｙは１〜１０の範囲の整数であり、ｚは１〜１０の範囲の整数である。本明細書では：
−ｙは１〜１０の範囲の整数であり；
−ｚは１〜１０の範囲の整数であり；
−Ｑ１は生体分子上に存在する官能基Ｆ１と反応することができる反応基であり；
−Ｄは、標的分子であり；
−Ｓｐはスペーサ部分であり、ここでスペーサ部分は反応基Ｑ１および標的分子Ｄの間隔をあける（すなわち、その間にある一定の距離を提供する）と共に、それらを共有結合により連結させる部分として規定され、好ましくはここで、前記スペーサ部分は以上で規定されるリンカーＬであり、よって式（１）に従う基またはその塩を含む。
【００８６】
好ましくは、ｙは１、２、３または４であり、より好ましくはｙは１または２であり、最も好ましくは、ｙは１である。好ましくは、ｚは１、２、３、４、５または６であり、より好ましくはｚは１、２、３または４であり、さらにいっそう好ましくはｚは１、２または３であり、さらによりいっそう好ましくはｚは１または２であり、最も好ましくはｚは１である。より好ましくは、ｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１、２、３または４であり、さらによりいっそう好ましくはｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１、２または３であり、さらによりいっそう好ましくはｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１または２であり、最も好ましくはｙは１であり、ｚは１である。好ましい実施形態では、リンカー−コンジュゲートは式Ｑ１Ｓｐ（Ｄ）４、Ｑ１Ｓｐ（Ｄ）３、Ｑ１Ｓｐ（Ｄ）２またはＱ１ＳｐＤに従うものである。
【００８７】
標的分子Ｄは以上で規定される。Ｄは好ましくは「活性物質」または「薬学的に活性な物質」であり、薬理学的および／または生物学的物質、すなわち生物学的におよび／または薬学的に活性な物質、例えば薬物、プロドラッグ、診断薬を示す。好ましくは、活性物質は、薬物およびプロドラッグからなる群より選択される。より好ましくは、活性物質は薬学的に活性な化合物、特に低〜中分子量化合物（例えば約２００〜約２５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１７５０Ｄａ）である。さらに好ましい実施形態では、活性物質は細胞毒、抗ウイルス薬、抗菌薬、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群より選択される。細胞毒の例としては、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、ツブリシン、イリノテカン、阻害ペプチド、アマニチン、デボウガニン（ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ）、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチンまたはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が挙げられる。好ましい活性物質としては、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、タキサン、ツブリシン、アマニチン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチンおよびピロロベンゾジアゼピン、特にビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、タキサン、ツブリシン、アマニチン、マイタンシンおよびアウリスタチンが挙げられる。
【００８８】
リンカー−コンジュゲートは、生体分子上に存在する官能基Ｆ１と反応することができる反応基Ｑ１を含む。官能基は当業者に知られており、それを保有する分子に特定の特性を付与する任意の分子実体と規定することができる。例えば、生体分子における官能基はアミノ基、チオール基、カルボン酸、アルコール基、カルボニル基、リン酸基、または芳香族基を構成することができる。生体分子における官能基は天然に存在し得るか、または特定の技術、例えば（生）化学または遺伝的技術により生体分子に入れることができる。生体分子に入れられる官能基は本来天然に存在する官能基であってもよく、または化学合成により調製される官能基であってもよく、例えばアジド、末端アルキンまたはホスフィン部分である。本明細書では、「反応基」という用語は官能基を含むある一定の基を示してもよいが、官能基それ自体を示してもよい。例えば、シクロオクチニル基は官能基、すなわちＣ−Ｃ三重結合を含む反応基である。同様に、Ｎ−マレイミジル基は官能基としてＣ−Ｃ二重結合を含む反応基である。しかしながら、官能基、例えばアジド官能基、チオール官能基またはアミノ官能基は本明細書で、反応基とも呼ばれ得る。
【００８９】
リンカー−コンジュゲートは、１を超える反応基Ｑ１を含んでもよい。リンカー−コンジュゲートが２つ以上の反応基Ｑ１を含む場合、反応基Ｑ１は、互いに異なっていてもよい。好ましくは、リンカー−コンジュゲートは１つの反応基Ｑ１を含む。
【００９０】
リンカー−コンジュゲート中に存在する反応基Ｑ１は、生体分子中に存在する官能基Ｆ１と反応し、連結基Ｚ３を形成することができる。言い換えれば、反応基Ｑ１は、生体分子中に存在する官能基Ｆ１に相補的であることが必要とされる。本明細書では、前記反応基が、任意で他の官能基の存在下で、前記官能基と選択的に反応し、連結基Ｚ３を形成する場合、反応基は、官能基に「相補的」として示される。相補的反応基および官能基は当業者に知られており、より詳細に下記に記載されている。好ましくは、反応基Ｑ１および官能基Ｆ１は生体直交型反応において反応することができ、というのも、それらの反応はこの反応中に存在する生体分子を妨害しないからである。生体直交型反応およびそれらにおいて好適な官能基は、例えばＧｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２０１５，５６，２１２３−２１３２から当業者に知られており、シュタウディンガーライゲーションおよび銅を含まないクリックケミストリーが挙げられる。よって、Ｑ１は１，３−双極子、アルキン、（ヘテロ）シクロオクチン、シクロオクテン、テトラジン、ケトン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドラジンおよびトリフェニルホスフィンからなる群より選択されることが好ましい。
【００９１】
好ましい実施形態では、反応基Ｑ１は、任意で置換された、Ｎ−マレイミジル基、ハロゲン化Ｎ−アルキルアミド基、スルホニルオキシＮ−アルキルアミド基、エステル基、カーボネート基、ハロゲン化スルホニル基、チオール基またはその誘導体、アルケニル基、アルキニル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトリルオキシド基、ニトロン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化Ｎ−マレイミジル基、１，１−ビス（スルホニルメチル）メチルカルボニル基またはその脱離誘導体、ハロゲン化カルボニル基、アレンアミド基、１，２−キノン基またはトリアジン基からなる群より選択される。
【００９２】
好ましい実施形態では、Ｑ１はＮ−マレイミジル基である。Ｑ１がＮ−マレイミジル基である場合、Ｑ１は好ましくは非置換である。Ｑ１は、よって、好ましくは、下記に示されるように、式（９ａ）に従う。そのようなマレイミジル基の好ましい例は２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）マレイミジルであり、これは、カルボン酸部分を介して、リンカー−コンジュゲートの残りに連結され得る。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はハロゲン化Ｎ−アルキルアミド基である。Ｑ１がハロゲン化Ｎ−アルキルアミド基である場合、Ｑ１は、下記に示されるように、式（９ｂ）に従うことが好ましく、ここで、ｋは１〜１０の範囲の整数であり、Ｒ４は−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉからなる群より選択される。好ましくはｋは１、２、３または４であり、より好ましくはｋは１または２であり、最も好ましくはｋは１である。好ましくは、Ｒ４は−Ｉまたは−Ｂｒである。より好ましくは、ｋは１または２であり、Ｒ４は−Ｉまたは−Ｂｒであり、最も好ましくはｋは１であり、Ｒ４は−ＩまたはＢｒである。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はスルホニルオキシＮ−アルキルアミド基である。Ｑ１がスルホニルオキシＮ−アルキルアミド基である場合、Ｑ１は、下記に示されるように、式（９ｂ）に従うことが好ましく、ここで、ｋは１〜１０の範囲の整数であり、Ｒ４は−Ｏ−メシル、−Ｏ−フェニルスルホニルおよび−Ｏ−トシルからなる群より選択される。好ましくはｋは１、２、３または４であり、より好ましくはｋは１または２であり、さらにいっそう好ましくはｋは１である。最も好ましくはｋは１であり、Ｒ４は−Ｏ−メシル、−Ｏ−フェニルスルホニルおよび−Ｏ−トシルからなる群より選択される。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はエステル基である。Ｑ１がエステル基である場合、エステル基は活性化エステル基であることが好ましい。活性化エステル基は当業者に知られている。活性化エステル基は本明細書で、良好な脱離基を含むエステル基として規定され、ここで、エステルカルボニル基は前記良好な脱離基に結合される。良好な脱離基は当業者に知られている。活性化エステルは、下記に示されるように、式（９ｃ）に従うことが、さらに好ましく、ここで、Ｒ５は−Ｎ−スクシンイミジル（ＮＨＳ）、−Ｎ−スルホ−スクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ）、−（４−ニトロフェニル）、−ペンタフルオロフェニルまたは−テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）からなる群より選択される。
【００９６】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はカーボネート基である。Ｑ１がカーボネート基である場合、カーボネート基は活性化カーボネート基であることが好ましい。活性化カーボネート基は当業者に知られている。活性化カーボネート基は本明細書で、良好な脱離基を含むカーボネート基として規定され、ここで、カーボネートカルボニル基は前記良好な脱離基に結合される。カーボネート基は、下記に示されるように、式（９ｄ）に従うことが、さらに好ましく、ここで、Ｒ７は−Ｎ−スクシンイミジル、−Ｎ−スルホ−スクシンイミジル、−（４−ニトロフェニル）、−ペンタフルオロフェニルまたは−テトラフルオロフェニルからなる群より選択される。
【００９７】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は、下記に示されるように、式（９ｅ）によるハロゲン化スルホニル基であり、ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選択される。好ましくは、ＸはＣｌまたはＢｒであり、より好ましくはＣｌである。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はチオール基（９ｆ）、またはチオール基の誘導体もしくは前駆体である。チオール基は、メルカプト基とも呼ばれ得る。Ｑ１がチオール基の誘導体または前駆体である場合、チオール誘導体は、好ましくは、下記に示されるように、式（９ｇ）、（９ｈ）または（９ｚｂ）に従い、ここで、Ｒ８は、任意で置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基またはＣ２−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基であり、ＶはＯまたはＳであり、Ｒ１６は、任意で置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基である。より好ましくは、Ｒ８は、任意で置換された、Ｃ１−Ｃ６アルキル基またはＣ２−Ｃ６（ヘテロ）アリール基であり、さらにいっそう好ましくは、Ｒ８はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルまたはフェニルである。さらにいっそう好ましくは、Ｒ８はメチルまたはフェニルであり、最も好ましくはメチルである。より好ましくは、Ｒ１６は任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基であり、さらにいっそう好ましくは、Ｒ１６はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルまたはｔ−ブチルであり、最も好ましくはメチルである。Ｑ１が式（９ｇ）または（９ｚｂ）に従うチオール−誘導体であり、Ｑ１が、生体分子上の反応基Ｆ１と反応させられる場合、前記チオール−誘導体はプロセス中にチオール基に変換される。Ｑ１が式（９ｈ）に従う場合、Ｑ１は−ＳＣ（Ｏ）ＯＲ８または−ＳＣ（Ｓ）ＯＲ８、好ましくはＳＣ（Ｏ）ＯＲ８であり、ここで、Ｒ８およびその好ましい実施形態は以上で規定される通りである。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はアルケニル基であり、ここで、アルケニル基は直鎖または分枝であり、ここで、アルケニル基は任意で置換される。アルケニル基は末端または内部アルケニル基であってもよい。アルケニル基は、１を超えるＣ−Ｃ二重結合を含んでもよく、そうであるならば、好ましくは、２つのＣ−Ｃ二重結合を含む。アルケニル基がジエニル基である場合、２つのＣ−Ｃ二重結合は１つのＣ−Ｃ単結合により分離されていることが、さらに好ましい（すなわち、ジエニル基は共役ジエニル基であることが好ましい）。好ましくは、前記アルケニル基はＣ２−Ｃ２４アルケニル基、より好ましくはＣ２−Ｃ１２アルケニル基、さらにいっそう好ましくはＣ２−Ｃ６アルケニル基である。アルケニル基は末端アルケニル基であることが、さらに好ましい。より好ましくは、アルケニル基は下記に示されるように、式（９ｉ）に従い、ここで、ｌは０〜１０の範囲、好ましくは０〜６の範囲の整数であり、ｐは０〜１０、好ましくは０〜６の範囲の整数である。より好ましくは、ｌは０、１、２、３または４であり、より好ましくはｌは０、１または２であり、最も好ましくはｌは０または１である。より好ましくは、ｐは０、１、２、３または４であり、より好ましくはｐは０、１または２であり、最も好ましくはｐは０または１である。ｐは０であり、ｌは０または１である、またはｐは１であり、ｌは０または１であることが特に好ましい。
【０１００】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はアルキニル基であり、ここでアルキニル基は直鎖または分枝であり、アルキニル基は任意で置換される。アルキニル基は末端または内部アルキニル基であってもよい。好ましくは、前記アルキニル基はＣ２−Ｃ２４アルキニル基、より好ましくはＣ２−Ｃ１２アルキニル基、さらにいっそう好ましくはＣ２−Ｃ６アルキニル基である。アルキニル基は末端アルキニル基であることが、さらに好ましい。より好ましくは、アルキニル基は下記に示されるように、式（９ｊ）に従い、ここで、ｌは０〜１０の範囲、好ましくは０〜６の範囲の整数である。より好ましくは、ｌは０、１、２、３または４であり、より好ましくはｌは０、１または２であり、最も好ましくはｌは０または１である。さらに好ましい実施形態では、アルキニル基は式（９ｊ）に従い、ここでｌは３である。
【０１０１】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はシクロアルケニル基である。シクロアルケニル基は任意で置換される。好ましくは、前記シクロアルケニル基はＣ３−Ｃ２４シクロアルケニル基、より好ましくはＣ３−Ｃ１２シクロアルケニル基、さらにいっそう好ましくはＣ３−Ｃ８シクロアルケニル基である。好ましい実施形態では、シクロアルケニル基はｔｒａｎｓ−シクロアルケニル基、より好ましくはｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基（ＴＣＯ基とも呼ばれる）であり、最も好ましくは下記に示されるように、式（９ｚｉ）または（９ｚｊ）に従うｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基である。別の好ましい実施形態では、シクロアルケニル基はシクロプロペニル基であり、ここでシクロプロペニル基は任意で置換される。別の好ましい実施形態では、シクロアルケニル基はノルボルネニル基、オキサノルボルネニル基、ノルボルナジエニル基またはオキサノルボルナジエニル基であり、ここで、ノルボルネニル基、オキサノルボルネニル基、ノルボルナジエニル基またはオキサノルボルナジエニル基は任意で置換される。さらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基は下記に示されるように、式（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）または（９ｚｃ）に従い、ここで、ＴはＣＨ２またはＯであり、Ｒ９は水素、直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ１２アルキル基またはＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群より独立して選択され、Ｒ１９は水素およびフッ素化炭化水素からなる群より選択される。好ましくは、Ｒ９は独立して水素またはＣ１−Ｃ６アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ９は独立して水素またはＣ１−Ｃ４アルキル基である。さらにいっそう好ましくは、Ｒ９は独立して水素またはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルもしくはｔ−ブチルである。さらによりいっそう好ましくは、Ｒ９は独立して水素またはメチルである。さらに好ましい実施形態では、Ｒ１９は、水素ならびに−ＣＦ３、−Ｃ２Ｆ５、−Ｃ３Ｆ７および−Ｃ４Ｆ９、より好ましくは水素および−ＣＦ３の群から選択される。さらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基は式（９ｋ）に従い、ここで、一方のＲ９は水素であり、他方のＲ９はメチル基である。別のさらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基は式（９ｌ）に従い、ここで、両Ｒ９は水素である。これらの実施形態ではｌは０または１であることが、さらに好ましい。別のさらに好ましい実施形態では、シクロアルケニル基は、式（９ｍ）に従うノルボルネニル（ＴはＣＨ２である）もしくはオキサノルボルネニル（ＴはＯである）基、または式（９ｚｃ）に従うノルボルナジエニル（ＴはＣＨ２である）もしくはオキサノルボルナジエニル（ＴはＯである）基であり、ここで、Ｒ９は水素であり、Ｒ１９は水素または−ＣＦ３、好ましくは−ＣＦ３である。
【０１０２】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は（ヘテロ）シクロアルキニル基である。（ヘテロ）シクロアルキニル基は任意で置換される。好ましくは、（ヘテロ）シクロアルキニル基は（ヘテロ）シクロオクチニル基、すなわちヘテロシクロオクチニル基またはシクロオクチニル基であり、ここで、（ヘテロ）シクロオクチニル基は任意で置換される。さらに好ましい実施形態では、（ヘテロ）シクロオクチニル基は１つ以上のハロゲン原子、好ましくはフッ素原子で置換され、より好ましくは（ヘテロ）シクロオクチニル基は、モノ−フルオロ−シクロオクトシン（ｏｃｔｃｙｎｅ）（ＭＣＦＯ）におけるように、１つのフッ素原子で置換される。好ましくは、モノ−フルオロ−シクロオクトシン（ｏｃｔｃｙｎｅ）基は式（９ｚｏ）に従う。さらに好ましい実施形態では、（ヘテロ）シクロオクチニル基は、ＤＩＢＯ基とも呼ばれる式（９ｎ）、ＤＩＢＡＣ基とも呼ばれる（９ｏ）、またはＢＡＲＡＣ基とも呼ばれる（９ｐ）、またはＣＯＭＢＯ基とも呼ばれる（９ｚｋ）に従い、全て下記に示される通りであり、ここでＵはＯまたはＮＲ９であり、およびＲ９の好ましい実施形態は以上で規定される通りである。（９ｎ）における芳香環は任意で、１つ以上の位置でＯ−スルホニル化され、一方、（９ｏ）および（９ｐ）の環は１つ以上の位置でハロゲン化され得る。（９ｎ）では、Ｕは好ましくはＯである。
【０１０３】
とりわけ好ましい実施形態では、化合物（４ｂ）におけるＲ１に付着された窒素原子はヘテロシクロアルキン基の環中の窒素原子、例えば（９ｏ）における窒素原子である。言い換えれば、ｃ、ｄおよびｇは化合物（４ｂ）において０であり、Ｒ１およびＱ１、それらに付着された窒素原子と一緒に、ヘテロシクロアルキン基、好ましくはヘテロシクロオクチン基、最も好ましくは式（９ｏ）または（９ｐ）に従うヘテロシクロオクチン基を形成する。本明細書では、（９ｏ）のカルボニル部分は、式（１）に従う基のスルホニル基により置き換えられる。あるいは、Ｒ１に付着された窒素原子は式（９ｎ）においてＵと指定された原子と同じ原子である。言い換えれば、Ｑ１が式（９ｎ）に従う場合、Ｕは式（１）に従う基の右の窒素原子であってもよく、またはＵ＝ＮＲ９であり、Ｒ９は式（１）に従う基の残りであり、Ｒ１はシクロオクチン部分である。
【０１０４】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は、ＢＣＮ基とも呼ばれる、任意で置換された、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基である。好ましくは、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基は下記に示されるように、式（９ｑ）に従う。
【０１０５】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応において反応することができる共役（ヘテロ）ジエン基である。好ましい（ヘテロ）ジエン基としては、任意で置換されたテトラジニル基、任意で置換された１，２−キノン基および任意で置換されたトリアジン基が挙げられる。より好ましくは、前記テトラジニル基は、下記に示されるように、式（９ｒ）に従い、式中、Ｒ９は水素、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１２アルキル基またはＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群より選択される。好ましくは、Ｒ９は水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル基またはＣ４−Ｃ１０（ヘテロ）アリール基であり、より好ましくは、Ｒ９は水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル基またはＣ４−Ｃ６（ヘテロ）アリール基である。さらにいっそう好ましくは、Ｒ９は水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルまたはピリジルである。さらによりいっそう好ましくは、Ｒ９は水素、メチルまたはピリジルである。より好ましくは、前記１，２−キノン基は式（９ｚｌ）または（９ｚｍ）に従う。前記トリアジン基は任意の位置異性体であってもよい。より好ましくは、前記トリアジン基は１，２，３−トリアジン基または１，２，４−トリアジン基であり、これは、例えば式（９ｚｎ）において示される任意の可能な位置を介して付着されてもよい。１，２，３−トリアジンはトリアジン基として最も好ましい。
【０１０６】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は下記に示される式（９ｓ）に従うアジド基である。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は、シュタウディンガーライゲーション反応を受けるのに好適な、任意で置換された、トリアリールホスフィン基である。好ましくは、ホスフィン基は下記に示される式（９ｔ）に従い、式中、Ｒ１０は（チオ）エステル基である。Ｒ１０が（チオ）エステル基である場合、Ｒ１０は−Ｃ（Ｏ）−Ｖ−Ｒ１１であることが好ましく、ここで、ＶはＯまたはＳであり、Ｒ１１はＣ１−Ｃ１２アルキル基である。好ましくは、Ｒ１１はＣ１−Ｃ６アルキル基であり、より好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル基である。最も好ましくは、Ｒ１１はメチル基である。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は下記に示される式（９ｕ）に従うニトリルオキシド基である。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はニトロン基である。好ましくはニトロン基は、下記に示される式（９ｖ）に従い、式中、Ｒ１２は直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群より選択される。好ましくは、Ｒ１２はＣ１−Ｃ６アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ１２はＣ１−Ｃ４アルキル基である。さらにいっそう好ましくは、Ｒ１２はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルまたはｔ−ブチルである。さらによりいっそう好ましくは、Ｒ１２はメチルである。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はニトリルイミン基である。好ましくは、ニトリルイミン基は下記に示される式（９ｗ）または（９ｚｄ）に従い、式中、Ｒ１３は直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群より選択される。好ましくは、Ｒ１３はＣ１−Ｃ６アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ１３はＣ１−Ｃ４アルキル基である。さらにいっそう好ましくは、Ｒ１３はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルまたはｔ−ブチルである。さらによりいっそう好ましくは、Ｒ１３はメチルである。
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はジアゾ基である。好ましくは、ジアゾ基は下記に示される式（９ｘ）に従い、式中、Ｒ１４は水素またはカルボニル誘導体からなる群より選択される。より好ましくは、Ｒ１４は水素である。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はケトン基である。より好ましくは、ケトン基は下記に示される式（９ｙ）に従い、式中、Ｒ１５は直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ６−Ｃ１２アリール基からなる群より選択される。好ましくは、Ｒ１５はＣ１−Ｃ６アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ１５はＣ１−Ｃ４アルキル基である。さらにいっそう好ましくは、Ｒ１５はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルまたはｔ−ブチルである。さらによりいっそう好ましくは、Ｒ１５はメチルである。
【０１１３】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基である。より好ましくは、（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基は下記に示される式（９ｚ）に従う。
【０１１４】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はヒドラジン基である。好ましくは、ヒドラジン基は下記に示される式（９ｚａ）に従う。
【０１１５】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１はハロゲン化Ｎ−マレイミジル基またはスルホニル化Ｎ−マレイミジル基である。Ｑ１がハロゲン化またはスルホニル化Ｎ−マレイミジル基である場合、Ｑ１は好ましくは下記に示される式（９ｚｅ）に従い、式中、Ｒ６は水素、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ−ＳＲ１８ａおよび−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ１８ｂからなる群より独立して選択され、ここで、Ｒ１８ａは任意で置換されたＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基であり、好ましくはフェニルまたはピリジルであり、Ｒ１８ｂは、任意で置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基、好ましくはトリルまたはメチルからなる群より選択され、ただし、少なくとも１つのＲ６が水素ではないということを条件とする。Ｒ６がハロゲンである場合（すなわち、Ｒ６がＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである場合）、Ｒ６はＢｒであることが好ましい。１つの実施形態では、ハロゲン化Ｎ−マレイミジル基はハロゲン化２，３−ジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）マレイミジルであり、これは、カルボン酸部分を介してリンカー−コンジュゲートの残りに連結され得る。
【０１１６】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は下記に示される式（９ｚｆ）に従うハロゲン化カルボニル基であり、ここで、ＸはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選択される。好ましくは、ＸはＣｌまたはＢｒであり、最も好ましくは、ＸはＣｌである。
【０１１７】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ｚｇ）に従うアレンアミド基である。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ｚｈ）に従う１，１−ビス（スルホニルメチル）メチルカルボニル基、またはその脱離誘導体であり、ここで、Ｒ１８は、任意で置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群より選択される。より好ましくは、Ｒ１８は、任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル基またはＣ４−Ｃ６（ヘテロ）アリール基であり、最も好ましくはフェニル基である。
【０１１９】
【化６】
2019507741.tif 000008
【化７】
2019507741.tif 000009
式中、ｋ、ｌ、Ｘ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は以上で規定される通りである。
【０１２０】
本明細書において下記で記載される本発明によるコンジュゲーションプロセスの好ましい実施形態では、コンジュゲーションはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応または１，３−双極子付加環化、好ましくは１，３−双極子付加環化などの付加環化を介して達成される。この実施形態によれば、反応基Ｑ１（ならびに生体分子上のＦ１）は付加環化反応において反応性の基から選択される。本明細書では、反応基Ｑ１およびＦ１は相補的であり、すなわち、それらは付加環化反応において互いと反応することができ、得られた環状部分は連結基Ｚ３である。
【０１２１】
Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応では、Ｆ１およびＱ１のうちの一方はジエンであり、Ｆ１およびＱ１のうちの他方はジエノフィルである。当業者により認識されるように、「ジエン」という用語は、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応との関連で１，３−（ヘテロ）ジエンを示し、共役ジエン（Ｒ２Ｃ＝ＣＲ−ＣＲ＝ＣＲ２）、イミン（例えばＲ２Ｃ＝ＣＲ−Ｎ＝ＣＲ２またはＲ２Ｃ＝ＣＲ−ＣＲ＝ＮＲ、Ｒ２Ｃ＝Ｎ−Ｎ＝ＣＲ２）およびカルボニル（例えばＲ２Ｃ＝ＣＲ−ＣＲ＝ＯまたはＯ＝ＣＲ−ＣＲ＝Ｏ）が含まれる。ＮおよびＯ含有ジエンとのヘテロ−Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応は当業者に知られている。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に好適であると当技術分野で知られている任意のジエンは、反応基Ｑ１またはＦ１として使用され得る。好ましいジエンとしては、以上で記載されるテトラジン、以上で記載される１，２−キノンおよび以上で記載されるトリアジンが挙げられる。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に好適であると当技術分野で知られている任意のジエノフィルは、反応基Ｑ１またはＦ１として使用され得るが、ジエノフィルは好ましくは、以上で記載されるアルケンまたはアルキン基、最も好ましくはアルキン基である。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応を介するコンジュゲーションでは、Ｆ１はジエンであり、Ｑ１はジエノフィルであることが好ましい。本明細書では、Ｑ１がジエンである場合、Ｆ１はジエノフィルであり、Ｑ１がジエノフィルである場合、Ｆ１はジエンである。最も好ましくは、Ｑ１はジエノフィルであり、好ましくはＱ１はアルキニル基であり、またはこれを含み、Ｆ１はジエン、好ましくはテトラジン、１，２−キノンまたはトリアジン基である。
【０１２２】
１，３−双極子付加環化では、Ｆ１およびＱ１のうちの一方は１，３−双極子であり、Ｆ１およびＱ１のうちの他方は親双極子である。１，３−双極子付加環化に好適であるとは当技術分野で知られている任意の１，３−双極子は、反応基Ｑ１またはＦ１として使用され得る。好ましい１，３−双極子としては、アジド基、ニトロン基、ニトリルオキシド基、ニトリルイミン基およびジアゾ基が挙げられる。１，３−双極子付加環化に好適であると当技術分野で知られている任意の親双極子は、反応基Ｑ１またはＦ１として使用され得るが、親双極子は好ましくはアルケンまたはアルキン基、最も好ましくはアルキン基である。１，３−双極子付加環化を介するコンジュゲーションでは、Ｆ１は１，３−双極子であり、Ｑ１は親双極子であることが好ましい。本明細書では、Ｑ１が１，３−双極子である場合、Ｆ１は親双極子であり、Ｑ１が親双極子である場合、Ｆ１は１，３−双極子である。最も好ましくは、Ｑ１は親双極子であり、好ましくはＱ１はアルキニル基であり、またはこれを含み、Ｆ１は１，３−双極子、好ましくはアジド基である。
【０１２３】
よって、好ましい実施形態では、Ｑ１は親双極子およびジエノフィルから選択される。好ましくは、Ｑ１はアルケンまたはアルキン基である。とりわけ好ましい実施形態では、Ｑ１はアルキン基を含み、好ましくは、以上で記載されるアルキニル基、以上で記載されるシクロアルケニル基、以上で記載される（ヘテロ）シクロアルキニル基およびビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基から選択され、より好ましくはＱ１は、以上で規定され、下記で図示される式（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｚｋ）および（９ｚｏ）から選択され、例えば式（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）および（９ｚｋ）から選択され、より好ましくは式（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）および（９ｚｋ）から、または式（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｑ）および（９ｚｏ）から選択される。最も好ましくは、Ｑ１は、好ましくは式（９ｑ）の、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基である。これらの基は本明細書で記載されるアジド官能化生体分子とのコンジュゲーションにおいて高度に有効であると知られており、本発明によるスルファミドリンカーがそのようなリンカー−コンジュゲートにおいて用いられる場合、任意の凝集は有益に最小に低減される。
【０１２４】
以上で記載された通り、リンカー−コンジュゲートでは、Ｑ１は生体分子上に存在する反応基Ｆ１と反応することができる。反応基Ｑ１に対する相補的反応基Ｆ１は当業者に知られており、より詳細に下記に記載されている。Ｆ１とＱ１の間の反応および連結基Ｚ３を含むその対応する生成物のいくつかの代表例は、図１１に図示されている。
【０１２５】
以上で記載される通り、ＤおよびＱ１は本発明によるリンカー−コンジュゲートにおいて、好ましくは以上で規定されるリンカーＬを介して、共有結合により付着される。リンカーへのＤの共有結合は、例えば、Ｄ上に存在する官能基Ｆ２のリンカー上に存在する反応基Ｑ２との反応を介して起こり得る。リンカーへのＤの付着のために好適な有機反応は当業者に知られており、官能基Ｆ２は反応基Ｑ２に相補的であるからである。その結果として、Ｄは、リンカーに連結基Ｚを介して付着されてもよい。
【０１２６】
「連結基」という用語は、本明細では、化合物の１つの部分および同じ化合物の別の部分を連結させる構造要素を示す。当業者により理解されるように、連結基の性質は、前記化合物の部分間の連結が得られた有機反応の型に依存する。一例として、Ｒ−Ｃ（Ｏ）−ＯＨのカルボキシル基が、Ｈ２Ｎ−Ｒ’のアミノ基と反応させられ、Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｒ’を形成する場合、ＲがＲ’に連結基Ｚを介して連結され、Ｚは−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−基により表され得る。
【０１２７】
反応基Ｑ１は、同様の様式でリンカーに付着されてもよい。その結果として、Ｑ１は、スペーサ部分に連結基Ｚを介して付着されてもよい。
【０１２８】
標的分子のリンカーへの付着および反応基Ｑ１のリンカーへの付着について多くの反応が当技術分野で知られている。その結果として、多種多様の連結基Ｚがリンカー−コンジュゲート中に存在し得る。
【０１２９】
１つの実施形態では、リンカー−コンジュゲートは下記式に従う化合物であり：
（Ｑ１）ｙ（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）（Ｄ）ｚ、
式中：
−ｙは１〜１０の範囲の整数であり；
−ｚは１〜１０の範囲の整数であり；
−Ｑ１は生体分子上に存在する官能基Ｆ１と反応することができる反応基であり；
−Ｄは、標的分子であり；
−Ｓｐは、Ｑ１およびＤの間隔をあける（すなわち、間にある一定の距離を提供する）とともにＱ１およびＤを共有結合により連結させる部分として規定されるスペーサ部分であり；
−ＺｗはＱ１を前記スペーサ部分に連結させる連結基であり；
−ＺｘはＤを前記スペーサ部分に連結させる連結基であり；ならびに
前記スペーサ部分はリンカーＬであり、よって、式（１）に従う基またはその塩を含み、ここで、式（１）に従う基は以上で規定される通りである。
【０１３０】
好ましい実施形態では、式（１）に従う基におけるａは０である。別の好ましい実施形態では、式（１）に従う基におけるａは１である。
【０１３１】
ｙおよびｚについての好ましい実施形態は（Ｑ１）ｙＳｐ（Ｄ）ｚについて以上で規定される通りである。化合物は式Ｑ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）（Ｄ）４、Ｑ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）（Ｄ）３、Ｑ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）（Ｄ）２またはＱ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）Ｄ、より好ましくはＱ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）（Ｄ）２またはＱ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）Ｄ、最も好ましくはＱ１（Ｚｗ）Ｓｐ（Ｚｘ）Ｄに従うことが、さらに好ましく、ここで、ＺｗおよびＺｘは以上で規定される通りである。
【０１３２】
好ましくは、ＺｗおよびＺｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＳＣ（Ｏ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＳ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＳＳ（Ｏ）２−、−ＳＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＳＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＮＲ２Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２−およびその２つ以上の組み合わせからなる群より独立して選択され、ここで、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０１３３】
ＤおよびＱ１についての好ましい実施形態は以上で規定される通りである。
【０１３４】
１つの実施形態では、リンカー−コンジュゲートは、式（４ａ）または（４ｂ）に従う化合物、またはその塩であり：
【化８】
2019507741.tif 000010
式中：
−ａは独立して０または１であり；
−ｂは独立して０または１であり；
−ｃは０または１であり；
−ｄは０または１であり；
−ｅは０または１であり；
−ｆは１〜１５０の範囲の整数であり；
−ｇは０または１であり；
−ｉは０または１であり；
−Ｄは、標的分子であり；
−Ｑ１は生体分子上に存在する官能基Ｆ１と反応することができる反応基であり；
−Ｓｐ１はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ２はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ３はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ４はスペーサ部分であり；
−Ｚ１はＱ１またはＳｐ３をＳｐ２、ＯまたはＣ（Ｏ）またはＮ（Ｒ１）に連結させる連結基であり；
−Ｚ２はＤまたはＳｐ４をＳｐ１、Ｎ（Ｒ１）、ＯまたはＣ（Ｏ）に連結させる連結基であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ１−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ１−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され；または
−Ｒ１はＤ、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］または−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］であり、ここでＤはさらなる標的分子であり、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｑ１、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｉは以上で規定される通りである。
【０１３５】
好ましい実施形態では、式（４ａ）または（４ｂ）に従う化合物においてａは１である。別の好ましい実施形態では、式（４ａ）または（４ｂ）に従う化合物においてａは０である。
【０１３６】
以上で規定されるように、Ｚ１はＱ１またはＳｐ３をＳｐ２、ＯまたはＣ（Ｏ）またはＮ（Ｒ１）に連結させる連結基であり、Ｚ２はＤまたはＳｐ４をＳｐ１、Ｎ（Ｒ１）、ＯまたはＣ（Ｏ）に連結させる連結基である。上記でより詳細に記載されるように、「連結基」という用語は、化合物の１つの部分と同じ化合物の別の部分を連結させる構造要素を示す。
【０１３７】
式（４ａ）に従う化合物では、連結基Ｚ１は、存在する場合（すなわちｄが１である場合）、Ｑ１（任意でスペーサ部分Ｓｐ３を介して）を式（４ａ）に従う化合物のＯ−原子またはＣ（Ｏ）基に、任意でスペーサ部分Ｓｐ２を介して連結させる。より特定的には、Ｚ１が存在する（すなわちｄが１である）場合、ならびにＳｐ３およびＳｐ２が存在しない（すなわちｇが０であり、ｃが０である）場合、Ｚ１は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのＯ−原子（ａが１である）またはＣ（Ｏ）基（ａが０である）にＱ１を連結させる。Ｚ１が存在し（すなわちｄが１である場合）、Ｓｐ３が存在し（すなわちｇが１である）およびＳｐ２が存在しない（すなわちｃが０である）場合、Ｚ１は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのＯ−原子（ａが１である）またはＣ（Ｏ）基（ａが０である）にスペーサ部分Ｓｐ３を連結させる。Ｚ１が存在する（すなわちｄが１である）場合、ならびにＳｐ３およびＳｐ２が存在する（すなわちｇが１であり、ｃが１である）場合、Ｚ１は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのスペーサ部分Ｓｐ２にスペーサ部分Ｓｐ３を連結させる。Ｚ１が存在し（すなわちｄが１である場合）、Ｓｐ３が存在せず（すなわちｇが０である）、およびＳｐ２が存在する（すなわちｃが１である）場合、Ｚ１は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのスペーサ部分Ｓｐ２にＱ１を連結させる。
【０１３８】
式（４ｂ）に従う化合物では、連結基Ｚ１は、存在する場合（すなわちｄが１である場合）、式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートにおけるＮ（Ｒ１）基のＮ−原子にＱ１（任意でスペーサ部分Ｓｐ３を介して）を、任意でスペーサ部分Ｓｐ２を介して連結させる。より特定的には、Ｚ１が存在する（すなわちｄが１である）場合、ならびにＳｐ３およびＳｐ２が存在しない（すなわちｇが０であり、ｃが０である）場合、Ｚ１は、式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートのＮ（Ｒ１）基のＮ−原子にＱ１を連結させる。Ｚ１が存在し（すなわちｄが１である場合）、Ｓｐ３が存在し（すなわちｇが１である）ならびにＳｐ２が存在しない（すなわちｃが０である）場合、Ｚ１は、式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートのＮ（Ｒ１）基のＮ−原子にスペーサ部分Ｓｐ３を連結させる。Ｚ１が存在する（すなわちｄが１である）場合、ならびにＳｐ３およびＳｐ２が存在する（すなわちｇは１であり、ｃが１である）場合、Ｚ１は、式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートのスペーサ部分Ｓｐ２にスペーサ部分Ｓｐ３を連結させる。Ｚ１が存在し（すなわちｄが１である場合）、Ｓｐ３が存在せず（すなわちｇが０である）、ならびにＳｐ２が存在する（すなわちｃが１である）場合、Ｚ１は、式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートのスペーサ部分Ｓｐ２にＱ１を連結させる。
【０１３９】
式（４ａ）に従う化合物において、ｃ、ｄおよびｇがすべて０である場合、Ｑ１は式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのＯ−原子（ａが１である場合）またはＣ（Ｏ）基（ａが０である場合）に直接付着される。
【０１４０】
式（４ｂ）に従う化合物において、ｃ、ｄおよびｇがすべて０である場合、Ｑ１は式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートのＮ（Ｒ１）基のＮ−原子に直接付着される。
【０１４１】
式（４ａ）に従う化合物において、連結基Ｚ２は、存在する場合（すなわちｅが１である場合）、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートにおけるＮ（Ｒ１）基のＮ−原子にＤ（任意でスペーサ部分Ｓｐ４を介して）を、任意でスペーサ部分Ｓｐ１を介して連結させる。より特定的には、Ｚ２が存在する（すなわちｅが１である）場合、ならびにＳｐ１およびＳｐ４が存在しない（すなわちｂが０であり、ｉが０である）場合、Ｚ２は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのＮ（Ｒ１）基のＮ−原子にＤを連結させる。Ｚ２が存在し（すなわちｅが１である場合）、Ｓｐ４が存在し（すなわちｉが１である）ならびにＳｐ１が存在しない（すなわちｂが０である）場合、Ｚ２は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのＮ（Ｒ１）基のＮ−原子にスペーサ部分Ｓｐ４を連結させる。Ｚ２が存在する（すなわちｅが１である）場合、ならびにＳｐ１およびＳｐ４が存在する（すなわちｂは１であり、ｉが１である）場合、Ｚ２は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのスペーサ部分Ｓｐ４にスペーサ部分Ｓｐ１を連結させる。Ｚ２が存在し（すなわちｅが１である場合）、Ｓｐ４が存在せず（すなわちｉが０である）ならびにＳｐ１が存在する（すなわちｂが１である）場合、Ｚ２は、式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのスペーサ部分Ｓｐ１にＤを連結させる。
【０１４２】
式（４ａ）に従う化合物において、ｂ、ｅおよびｉがすべて０である場合、Ｄは式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートのＮ（Ｒ１）基のＮ−原子に直接付着される。
【０１４３】
式（４ｂ）に従う化合物において、ｂ、ｅおよびｉがすべて０である場合、Ｄは式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートのＯ−原子（ａが１である場合）またはＣ（Ｏ）基（ａが０である場合）に直接付着される。
【０１４４】
当業者により理解されるように、連結基の性質は、前記化合物の特定の部分間の連結が得られた有機反応の型に依存する。反応基Ｑ１をスペーサ部分に連結させるのに、および標的分子をスペーサ部分に連結させるのに多数の有機反応が使用可能である。その結果として、多種多様の連結基Ｚ１およびＺ２が存在する。
【０１４５】
式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートの好ましい実施形態では、Ｚ１およびＺ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＮＲ２−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＳＣ（Ｏ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＳ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＳＳ（Ｏ）２−、−ＳＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＳＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＮＲ２Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２−およびその２つ以上の組み合わせからなる群より独立して選択され、ここで、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０１４６】
以上で記載される通り、式（４ａ）または（４ｂ）に従う化合物において、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４はスペーサ部分である。Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、独立して、存在してもしなくてもよい（ｂ、ｃ、ｇおよびｉは、独立して、０または１である）。Ｓｐ１は、存在する場合、Ｓｐ２（存在する場合）、Ｓｐ３および／またはＳｐ４（存在する場合）とは異なっていてもよい。
【０１４７】
スペーサ部分は当業者に知られている。好適なスペーサ部分の例としては、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタンまたはより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール鎖またはポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール鎖またはポリプロピレンオキシド鎖および１，ｘ−ジアミノアルカン（ｘはアルカンにおける炭素原子の数である）が挙げられる。
【０１４８】
好適なスペーサ部分の別のクラスは切断可能なスペーサ部分、または切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは当技術分野でよく知られている。例えばＳｈａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ２０１２，６，１０７３（参照により本明細書に組み込まれる）は、生物学的トリガー、例えば酵素切断または酸化事象で放出される自壊性部分を含む切断可能なリンカーを開示する。好適な切断可能なリンカーのいくつかの例は、還元で切断されるジスルフィド−リンカー、プロテアーゼ、例えばカテプシン、プラスミンまたはメタロプロテアーゼによる特異的認識で切断されるペプチド−リンカー、またはグリコシダーゼ、例えばグルコロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）による特異的認識で切断されるグリコシドベースのリンカー、または酸素の乏しい低酸素性領域で還元されるニトロ芳香族である。本明細書では、好適な切断可能なスペーサ部分としては、アミノ酸の特定の、切断可能な、配列を含むスペーサ部分も挙げられる。例として、例えば、Ｖａｌ−Ａｌａ（バリン−アラニン）またはＶａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン）部分を含むスペーサ部分が挙げられる。
【０１４９】
式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートの好ましい実施形態では、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３および／またはＳｐ４は、存在する場合、アミノ酸の配列を含む。アミノ酸の配列を含むスペーサ部分は当技術分野で知られており、ペプチドリンカーとも呼ばれ得る。例としては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ部分を含むスペーサ部分、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、などが挙げられる。好ましくは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ部分がリンカー−コンジュゲートにおいて用いられる。
【０１５０】
式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートの好ましい実施形態では、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ２００アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基が以上で規定される１つ以上のヘテロ原子により中断される場合、前記基は１つ以上のＯ−原子、および／または１つ以上のＳ−Ｓ基により中断されることが好ましい。
【０１５１】
より好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２−Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ１００アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０１５２】
さらにいっそう好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ５０アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０１５３】
さらによりいっそう好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ２０アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０１５４】
これらの好ましい実施形態では、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は非置換であり、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯにより任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基、好ましくは水素またはメチルからなる群より独立して選択されることが、さらに好ましい。
【０１５５】
最も好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。この実施形態では、アルキレン基は非置換であり、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯおよび／またはＳにより任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基、好ましくは水素またはメチルからなる群より独立して選択されることが、さらに好ましい。
【０１５６】
よって、好ましいスペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４としては、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−が挙げられ、ここで、ｎは１〜５０の範囲、好ましくは１〜４０の範囲、より好ましくは１〜３０の範囲、さらにいっそう好ましくは１〜２０の範囲、さらによりいっそう好ましくは１〜１５の範囲の整数である。より好ましくはｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７または８、さらにいっそう好ましくは１、２、３、４、５または６、さらによりいっそう好ましくは１、２、３または４である。
【０１５７】
Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は独立して選択されるので、Ｓｐ１は、存在する場合、Ｓｐ２（存在する場合）、Ｓｐ３および／またはＳｐ４（存在する場合）とは異なっていてもよい。
【０１５８】
反応基Ｑ１はより詳細に以上で記載されている。式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートでは、反応基Ｑ１は、任意で置換された、Ｎ−マレイミジル基、ハロゲン化Ｎ−アルキルアミド基、スルホニルオキシＮ−アルキルアミド基、エステル基、カーボネート基、ハロゲン化スルホニル基、チオール基またはその誘導体、アルケニル基、アルキニル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトリルオキシド基、ニトロン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化Ｎ−マレイミジル基、ハロゲン化カルボニル基、アレンアミド基および１，１−ビス（スルホニルメチル）メチルカルボニル基またはその脱離誘導体からなる群より選択されることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）、（９ｇ）、（９ｈ）、（９ｉ）、（９ｊ）、（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｒ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｕ）、（９ｖ）、（９ｗ）、（９ｘ）、（９ｙ）、（９ｚ）、（９ｚａ）、（９ｚｂ）、（９ｚｃ）、（９ｚｄ）、（９ｚｅ）、（９ｚｆ）、（９ｚｇ）、（９ｚｈ）、（９ｚｉ）、（９ｚｊ）または（９ｚｋ）に従い、ここで、（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）、（９ｇ）、（９ｈ）、（９ｉ）、（９ｊ）、（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｒ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｕ）、（９ｖ）、（９ｗ）、（９ｘ）、（９ｙ）、（９ｚ）、（９ｚａ）、（９ｚｂ）、（９ｚｃ）、（９ｚｄ）、（９ｚｅ）、（９ｚｆ）、（９ｚｇ）、（９ｚｈ）、（９ｚｉ）、（９ｚｊ）、（９ｚｋ）、（９ｚｏ）およびその好ましい実施形態は以上で規定される通りである。好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｆ）、（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｒ）に従う。さらにいっそう好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｑ）、（９ｐ）、（９ｔ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｓ）に従い、特に好ましい実施形態では、Ｑ１は、以上で規定される、式（９ａ）、（９ｑ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｔ）、（９ｚｏ）または（９ｚｈ）、およびその好ましい実施形態に従う。
【０１５９】
式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートにおける標的分子Ｄおよび標的分子Ｄのための好ましい実施形態は以上で規定される通りである。
【０１６０】
以上で記載される通り、Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１はＤ、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］または−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］であり、ここで、Ｄはさらなる標的分子であり、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｑ１、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｉは以上で規定される通りである。
【０１６１】
好ましい実施形態では、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ２０アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１６アルキル基であり、さらにいっそう好ましくは、Ｒ１は水素またはＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、ここでアルキル基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯにより任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より独立して選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｒ１は水素である。別のさらに好ましい実施形態では、Ｒ１はＣ１−Ｃ２０アルキル基、より好ましくはＣ１−Ｃ１６アルキル基、さらにいっそう好ましくはＣ１−Ｃ１０アルキル基であり、ここで、アルキル基は、１つ以上のＯ−原子により任意で中断され、ここで、アルキル基は、−ＯＨ基、好ましくは末端−ＯＨ基で任意で置換される。この実施形態では、Ｒ１は末端−ＯＨ基を含むポリエチレングリコール鎖であることが、さらに好ましい。別のさらに好ましい実施形態では、Ｒ１はＣ１−Ｃ１２アルキル基、より好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル基、さらにいっそう好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル基であり、さらによりいっそう好ましくは、Ｒ１はメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチルおよびｔ−ブチルからなる群より選択される。
【０１６２】
別の好ましい実施形態では、Ｒ１はさらなる標的分子Ｄ、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］または−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］であり、ここで、Ｄは標的分子であり、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｑ１、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｉは以上で規定される通りである。Ｒ１がＤまたは−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］である場合、リンカー−コンジュゲートは式（４ａ）に従うことが、さらに好ましい。この実施形態では、リンカー−コンジュゲート（４ａ）は２つの標的分子Ｄを含み、それらは同じか、または異なっていてもよい。Ｒ１が−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］である場合、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］におけるＳｐ１、ｂ、Ｚ２、ｅ、Ｓｐ４、ｉおよびＤは、Ｎ（Ｒ１）のＮ−原子に付着される−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］におけるＳｐ１、ｂ、Ｚ２、ｅ、Ｓｐ４、ｉおよびＤと同じか、または異なっていてもよい。好ましい実施形態では、Ｎ（Ｒ１）のＮ−原子上の−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］および−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］はどちらも同じである。
【０１６３】
Ｒ１が−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］である場合、リンカー−コンジュゲートは式（４ｂ）に従うことが、さらに好ましい。この実施形態では、リンカー−コンジュゲート（４ｂ）は２つの標的分子Ｑ１を含み、それらは同じか、または異なっていてもよい。Ｒ１が−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］である場合、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］におけるＳｐ２、ｃ、Ｚ１、ｄ、Ｓｐ３、ｇおよびＤはＮ（Ｒ１）のＮ−原子に付着される他の−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］におけるＳｐ１、ｂ、Ｚ２、ｅ、Ｓｐ４、ｉおよびＱ１と同じか、または異なっていてもよい。好ましい実施形態では、Ｎ（Ｒ１）のＮ−原子上の−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］基は同じである。
【０１６４】
式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートでは、ｆは１〜１５０の範囲の整数である。よって、リンカー−コンジュゲートは１を超える式（１）に従う基を含んでもよく、式（１）に従う基は以上で規定される通りである。１を超える式（１）に従う基が存在する場合、すなわちｆが２以上である場合、ａ、ｂ、Ｓｐ１およびＲ１は独立して選択される。言い換えれば、ｆが２以上である場合、各ａは独立して０または１であり、各ｂは独立して０または１であり、各Ｓｐ１は同じか、または異なっていてもよく、各Ｒ１は同じか、または異なっていてもよい。好ましい実施形態では、ｆは１〜１００の範囲、好ましくは１〜５０の範囲、より好ましくは１〜２５の範囲、さらにいっそう好ましくは１〜１５の範囲の整数である。より好ましくは、ｆは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、さらにいっそう好ましくはｆは１、２、３、４、５、６、７または８であり、さらによりいっそう好ましくはｆは１、２、３、４、５または６であり、さらによりいっそう好ましくはｆは１、２、３または４であり、最も好ましくはｆはこの実施形態では１である。別の好ましい実施形態では、ｆは２〜１５０の範囲、好ましくは２〜１００の範囲、より好ましくは２〜５０の範囲、より好ましくは２〜２５の範囲、さらにいっそう好ましくは２〜１５の範囲の整数である。より好ましくは、ｆは２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、さらにいっそう好ましくはｆは２、３、４、５、６、７または８であり、さらによりいっそう好ましくはｆは２、３、４、５または６であり、さらによりいっそう好ましくはｆは２、３または４であり、最も好ましくはｆはこの実施形態では２である。
【０１６５】
以上で記載される通り、好ましい実施形態では、式（４ａ）または（４ｂ）に従う化合物においてａは０である。リンカー−コンジュゲートはそのため、式（６ａ）または（６ｂ）に従う化合物、またはその塩であってもよく：
【化９】
2019507741.tif 000011
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、Ｄ、Ｑ１、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２およびＲ１、ならびにそれらの好ましい実施形態は（４ａ）および（４ｂ）について以上で規定される通りである。
【０１６６】
以上で記載される通り、別の好ましい実施形態では、式（４ａ）または（４ｂ）に従う化合物においてａは１である。リンカー−コンジュゲートはそのため、式（７ａ）または（７ｂ）に従う化合物、またはその塩であってもよく：
【化１０】
2019507741.tif 000012
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｉ、Ｄ、Ｑ１、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２およびＲ１、ならびにそれらの好ましい実施形態は（４ａ）および（４ｂ）について以上で規定される通りである。
【０１６７】
式（４ａ）に従うリンカー−コンジュゲートにおいてＳｐ４が存在しない場合、すなわちｉが０である場合、ＤはＺ２（ｅが１である場合）に、Ｓｐ１（ｅが０であり、ｂが１である場合）に、またはＮ（Ｒ１）（ｅが０であり、ｂが０である場合）に連結される。式（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートにおいてＳｐ４が存在しない場合、すなわちｉが０である場合、ＤはＺ２（ｅが１である場合）に、Ｓｐ１（ｅが０であり、ｂが１である場合）に、Ｏ−原子（ａが１であり、ｂおよびｅが０である場合）に、またはＣ（Ｏ）基（ａが０であり、ｂおよびｅが０である場合）に連結される。リンカー−コンジュゲートはそのため、式（４ｃ）または（４ｄ）に従う化合物、またはその塩であってもよく：
【化１１】
2019507741.tif 000013
式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、Ｄ、Ｑ１、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｚ１、Ｚ２およびＲ１、ならびにそれらの好ましい実施形態は（４ａ）および（４ｂ）について以上で規定される通りである。
【０１６８】
好ましい実施形態では、式（４ｃ）または（４ｄ）に従うリンカー−コンジュゲートにおいて、ａは０である。別の好ましい実施形態では、式（４ｃ）または（４ｄ）に従うリンカー−コンジュゲートにおいて、ａは１である。
【０１６９】
リンカー−コンジュゲート、特に式（４ａ）、（４ｂ）、（４ｃ）、（４ｄ）、（６ａ）、（６ｂ）、（７ａ）または（７ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートの特定の実施形態では、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３からなる群より選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より独立して選択され、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）、（９ｇ）、（９ｈ）、（９ｉ）、（９ｊ）、（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｒ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｕ）、（９ｖ）、（９ｗ）、（９ｘ）、（９ｙ）、（９ｚ）、（９ｚａ）、（９ｚｂ）、（９ｚｃ）、（９ｚｄ）、（９ｚｅ）、（９ｚｆ）、（９ｚｇ）（９ｚｈ）、（９ｚｉ）、（９ｚｊ）または（９ｚｋ）に従い、ここで、（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）、（９ｇ）、（９ｈ）、（９ｉ）、（９ｊ）、（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｒ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｕ）、（９ｖ）、（９ｗ）、（９ｘ）、（９ｙ）、（９ｚ）、（９ｚａ）、（９ｚｂ）、（９ｚｃ）、（９ｚｄ）、（９ｚｅ）、（９ｚｆ）、（９ｚｇ）、（９ｚｈ）、（９ｚｉ）、（９ｚｊ）、（９ｚｋ）、（９ｚｏ）およびその好ましい実施形態は以上で規定される通りである。好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｆ）、（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｓ）（９ｔ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｒ）に従う。さらにいっそう好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｔ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｓ）に従い、特に好ましい実施形態では、Ｑ１は、以上で規定される、式（９ａ）、（９ｑ）、（９ｎ）、（９ｐ）、（９ｔ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｏ）、およびその好ましい実施形態に従う。
【０１７０】
好ましくは、以上で規定される、式（４ａ）、（４ｂ）、（４ｃ）、（４ｄ）、（６ａ）、（６ｂ）、（７ａ）または（７ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートに含まれるリンカーＬ、以上で規定されるリンカーは、それぞれ式（８ａ）および（８ｂ）により表すことができる：
【化１２】
2019507741.tif 000014
【０１７１】
当業者により理解されるように、スペーサ部分（８ａ）および（８ｂ）の好ましい実施形態は、例えば、リンカー−コンジュゲートにおける反応基Ｑ１およびＤの性質、リンカー−コンジュゲートを調製するための合成方法（例えば、標的分子上の相補的官能基Ｆ２の性質）、リンカー−コンジュゲートを使用して調製されるバイオコンジュゲートの性質（例えば、生体分子上の相補的官能基Ｆ１の性質）に依存し得る。
【０１７２】
Ｑ１が例えば、以上で規定される、式（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）または（９ｚｋ）に従うシクロオクチニル基である場合、好ましくはＳｐ３が存在する（ｇが１である）。
【０１７３】
例えば、リンカー−コンジュゲートが、式（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）または（９ｚｋ）に従うシクロオクチニル基である反応基Ｑ２のアジド官能基Ｆ２との反応を介して調製された場合、好ましくはＳｐ４が存在する（ｉが１である）。
【０１７４】
さらに、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４の少なくとも１つは存在する、すなわちｂ、ｃ、ｇ、およびｉの少なくとも１つは０ではないことが好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｓｐ１およびＳｐ４の少なくとも１つおよびＳｐ２およびＳｐ３の少なくとも１つは存在する。
【０１７５】
ｆが２以上である場合、Ｓｐ１は存在することが好ましい（ｂは１である）。
【０１７６】
リンカー−部分（８ａ）および（８ｂ）のこれらの好ましい実施形態はまた、下記でより詳細に記載されるように、本発明によるバイオコンジュゲートに含まれる場合、リンカー−コンジュゲートにも成り立つ。
【０１７７】
Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４の好ましい実施形態は以上で規定される通りである。
【０１７８】
生体分子
生体分子は、Ｂ−Ｆ１により表され、ここでＢは生体分子であり、Ｆ１は、リンカー−コンジュゲート上の反応基Ｑ１と反応することができる官能基であり、「−」は結合またはスペーサ部分である。１つの実施形態では、「−」は本明細書で規定される通りのスペーサ部分である。１つの実施形態では、「−」は、結合、典型的には共有結合である。生体分子は、「対象生体分子」（ＢＯＩ）とも呼ばれ得る。生体分子は天然起源の生体分子であってもよく、ここで、官能基Ｆ１は、対象生体分子、例えば例としてチオール、アミン、アルコールまたはヒドロキシフェノール単位中にすでに存在する。リンカー−コンジュゲートとのコンジュゲーションはその後、以上で規定される第１のアプローチを介して生じる。あるいは、生体分子は修飾生体分子であってもよく、ここで、官能基Ｆ１は対象生体分子に特異的に組み込まれ、リンカー−コンジュゲートとのコンジュゲーションは、この官能基操作、すなわち以上で規定されるバイオコンジュゲーションの２段階アプローチを介して生じる。特定の官能基を組み込むための生体分子のそのような修飾は、例えばＷＯ２０１４／０６５６６１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）から知られている。
【０１７９】
本発明によるバイオコンジュゲートにおいて、生体分子Ｂは好ましくは、タンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖類、オリゴ糖類、酵素、ホルモン、アミノ酸および単糖類からなる群より選択される。より好ましくは、生体分子Ｂはタンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖類、オリゴ糖類および酵素からなる群より選択される。より好ましくは、生体分子Ｂはタンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチドおよびグリカンからなる群より選択される。最も好ましくは、生体分子Ｂは抗体またはその抗原結合断片である。
【０１８０】
官能基Ｆ１はリンカー−コンジュゲート上の反応基Ｑ１と反応して、連結基Ｚ３を形成することができる。当業者には、どの官能基Ｆ１が相補的反応基Ｑ１と反応することができるか明らかである。以上で規定される通りの、当業者に知られている反応基Ｑ１に相補的な官能基Ｆ１は、より詳細に下記に記載されている。Ｆ１とＱ１の間の反応および連結基Ｚ３を含むそれらの対応する生成物のいくつかの代表例は、図１１に図示されている。
【０１８１】
本発明によるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスでは、リンカー−コンジュゲート中に存在する反応基Ｑ１は、典型的には官能基Ｆ１と反応させられる。１を超える官能基Ｆ１が生体分子中に存在してもよい。２つ以上の官能基が存在する場合、前記基は同じか、または異なっていてもよい。別の好ましい実施形態では、生体分子は２つ以上の官能基Ｆを含み、それらは同じか、または異なっていてもよく、２つ以上の官能基はリンカー−コンジュゲートの相補的反応基Ｑと反応する。例えば、２つの官能基Ｆ、すなわちＦ１およびＦ２を含む生体分子は、同じか、または異なっていてもよい官能基Ｑ１を含む２つのリンカー−コンジュゲートと反応して、バイオコンジュゲートを形成してもよい。
【０１８２】
生体分子における官能基Ｆ１の例は、アミノ基、チオール基、カルボン酸、アルコール基、カルボニル基、リン酸基、または芳香族基を含む。生体分子における官能基は天然に存在してもよく、または特定の技術、例えば（生）化学または遺伝的技術により生体分子に入れられてもよい。生体分子に入れられる官能基は本来天然に存在する官能基であってもよく、または化学合成により調製される官能基、例えばアジド、末端アルキン、シクロプロペン部分またはホスフィン部分であってもよい。付加環化によるコンジュゲーションの好ましい様式を考慮すると、Ｆ１は付加環化において反応することができる基、例えばジエン、ジエノフィル、１，３−双極子または親双極子であることが好ましく、好ましくはＦ１は、１，３−双極子（典型的には、アジド基、ニトロン基、ニトリルオキシド基、ニトリルイミン基またはジアゾ基）または親双極子（典型的にはアルケニルまたはアルキニル基）から選択される。本明細書では、Ｆ１は、Ｑ１が親双極子である場合、１，３−双極子であり、Ｆ１は、Ｑ１が１，３−双極子である場合、親双極子であり、またはＦ１は、Ｑ１がジエノフィルである場合、ジエンであり、Ｆ１は、Ｑ１がジエンである場合ジエノフィルである。最も好ましくは、Ｆ１は１，３−双極子であり、好ましくはＦ１はアジド基であり、またはこれを含む。
【０１８３】
生体分子に入れられる官能基のいくつかの例は図２に示されている。図２はガラクトサミンのＵＤＰ糖類の誘導体のいくつかの構造を示し、それらは、例えばチオプロピオニル基（１１ａ）、アジドアセチル基（１１ｂ）、またはアジドジフルオロアセチル基（１１ｃ）を用いて２位で、またはアジド基を用いてＮ−アセチルガラクトサミン（１１ｄ）の６位で修飾されてもよい。１つの実施形態では、官能基Ｆ１はチオプロピオニル基、アジドアセチル基、またはアジドジフルオロアセチル基である。
【０１８４】
図３はどのようにして、ＵＤＰ−糖類１１ａ−ｄのいずれかが、ＧｌｃＮＡｃ部分を含む糖タンパク質１２（例えばグリカンがエンドグリコシダーゼによってトリミングされているモノクローナル抗体）に、ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体またはＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼの作用下で付着され、それによってＧａｌＮＡｃ誘導体とＧｌｃＮＡｃの間にβ−グリコシド１−４連結を生成することができるかを概略的に表示する（それぞれ、化合物１３ａ−ｄ）。
【０１８５】
天然に存在する官能基Ｆ１の好ましい例としては、チオール基およびアミノ基が挙げられる。生体分子への組込みのための化学合成により調製される官能基の好ましい例としては、ケトン基、末端アルキン基、アジド基、シクロ（ヘテロ）アルキン基、シクロプロペン基、またはテトラジン基が挙げられる。
【０１８６】
以上で記載された通り、相補的反応基Ｑ１および官能基Ｆ１は当業者に知られており、Ｑ１およびＦ１のいくつかの好適な組み合わせは以上で記載されており、図１１に示されている。相補的基Ｑ１およびＦ１のリストは、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３（ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０）の３章の２３０−２３２ページ、表３．１に開示されており、この表の内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１８７】
バイオコンジュゲート
バイオコンジュゲートは本明細書で、生体分子がリンカーを介して標的分子Ｄに共有結合により連結される化合物として規定される。バイオコンジュゲートは１つ以上の生体分子および／または１つ以上の標的分子を含む。リンカーは、１つ以上のスペーサ部分を含んでもよい。本発明によるバイオコンジュゲートは便宜上本発明によるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスにより調製され、ここで、反応基Ｑ１を含むリンカー−コンジュゲートは官能基Ｆ１を含む生体分子にコンジュゲートされる。このコンジュゲーション反応において、Ｑ１およびＦ１基は互いに反応し、連結基Ｚ３を形成し、これは標的分子Ｄを生体分子Ｂと連結させる。よって、リンカー−コンジュゲートおよび生体分子について本明細書で記載される全ての好ましい実施形態は、Ｑ１およびＦ１について言われたこと全てを除き、本発明によるバイオコンジュゲートに同様に当てはまり、ここで、本発明によるバイオコンジュゲートは、Ｑ１およびＦ１の反応生成物、すなわち連結基Ｚ３を含む。
【０１８８】
本発明によるバイオコンジュゲートは式（Ａ）を有し：
Ｂ−Ｌ−Ｄ
（Ａ）、
式中：
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｌは、ＢおよびＤを連結させるリンカーであり；
−Ｄは、標的分子であり；ならびに
−「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分であり、
ここで、Ｌは式（１）に従う基またはその塩を含み：
【化１３】
2019507741.tif 000015
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され；またはＲ１は標的分子Ｄであり、ここでＤは任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【０１８９】
１つの実施形態では、「−」は本明細書で規定される通りのスペーサ部分である。１つの実施形態では、「−」は結合、典型的には共有結合である。
【０１９０】
好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートはＢ−Ｚ３−Ｌ−Ｄにより表され、ここで、Ｂ、Ｌ、Ｄおよび「−」は以上で規定される通りであり、Ｚ３はＱ１とＦ１との反応により得ることができる連結基である。好ましくは、部分Ｚ３は付加環化、好ましくは１，３−双極子付加環化反応により得ることができ、最も好ましくはＺ３は１，２，３−トリアゾール環であり、これは、スペーサ部分、好ましくはＢとＬとの間、最も好ましくはＢと式（１）に従う基のカルボニルまたはカルボキシル端との間のスペーサ部分に位置する。
【０１９１】
本発明によるバイオコンジュゲートが式（１）に従う基の塩を含む場合、塩は好ましくは、薬学的に許容される塩である。
【０１９２】
本発明によるバイオコンジュゲートは、１を超える標的分子を含んでもよい。同様に、バイオコンジュゲートは、１を超える生体分子を含んでもよい。生体分子Ｂおよび標的分子Ｄ、ならびにその好ましい実施形態はより詳細に以上で記載される。本発明によるバイオコンジュゲートにおけるＤについての好ましい実施形態は、より詳細に以上で記載された本発明によるリンカー−コンジュゲートにおけるＤの好ましい実施形態に対応する。本発明によるバイオコンジュゲートにおけるリンカー（８ａ）または（８ｂ）についての好ましい実施形態は、より詳細に以上で記載された、リンカー−コンジュゲートにおけるリンカーの好ましい実施形態に対応する。本発明によるバイオコンジュゲートにおけるＢについての好ましい実施形態は、より詳細に以上で記載された、本発明による生体分子におけるＢの好ましい実施形態に対応する。
【０１９３】
本発明によるバイオコンジュゲートはまた、生体分子がスペーサ部分を介して標的分子にコンジュゲートされるバイオコンジュゲートとして規定されてもよく、ここで、スペーサ部分は式（１）に従う基、またはその塩を含み、ここで、式（１）に従う基は以上で規定される通りである。
【０１９４】
本発明によるバイオコンジュゲートはまた、（Ｂ）ｙＳｐ（Ｄ）ｚとして表されてもよく、ここで、ｙは１〜１０の範囲の整数であり、ｚは１〜１０の範囲の整数である。
【０１９５】
よって、発明はまた、下記式に従うバイオコンジュゲートに関し：
（Ｂ）ｙＳｐ（Ｄ）ｚ、
式中：
−ｙは１〜１０の範囲の整数であり；
−ｚは１〜１０の範囲の整数であり；
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｄは、標的分子であり；
−Ｓｐはスペーサ部分であり、ここで、スペーサ部分は、生体分子Ｂおよび標的分子Ｄの間隔をあける（すなわち間にある一定の距離を提供する）と共に生体分子Ｂおよび標的分子Ｄを共有結合により連結させる部分として規定され；ならびに、前記スペーサ部分は式（１）に従う基またはその塩を含み、ここで式（１）に従う基は以上で規定される通りである。
【０１９６】
好ましい実施形態では、前記スペーサ部分は、付加環化、好ましくは１，３−双極子付加環化反応、最も好ましくは１，２，３−トリアゾール環（Ｂと式（１）に従う前記基との間に位置する）により得ることができる部分をさらに含む。
【０１９７】
好ましくは、ｙは１、２、３または４であり、より好ましくはｙは１または２であり、最も好ましくは、ｙは１である。好ましくは、ｚは１、２、３、４、５または６であり、より好ましくはｚは１、２、３または４であり、さらにいっそう好ましくはｚは１、２または３であり、さらによりいっそう好ましくはｚは１または２であり、最も好ましくはｚは１である。より好ましくは、ｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１、２、３または４であり、さらによりいっそう好ましくはｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１、２または３であり、さらによりいっそう好ましくはｙは１または２であり、好ましくは１であり、ｚは１または２であり、最も好ましくはｙは１であり、ｚは１である。好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートは式ＢＳｐ（Ｄ）４、ＢＳｐ（Ｄ）３、ＢＳｐ（Ｄ）２またはＢＳｐＤに従う。
【０１９８】
以上で記載される通り、本発明によるバイオコンジュゲートは、以上で規定される式（１）に従う基、またはその塩を含む。好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートは、式（１）に従う基（式中、ａは０である）、またはその塩を含む。この実施形態では、よって、バイオコンジュゲートは式（２）に従う基またはその塩を含み、ここで（２）は以上で規定される通りである。
【０１９９】
別の好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートは、式（１）に従う基（ａは１である）、またはその塩を含む。この実施形態では、よって、バイオコンジュゲートは式（３）に従う基またはその塩を含み、ここで（３）は以上で規定される通りである。
【０２００】
本発明によるバイオコンジュゲートにおいて、Ｒ１、スペーサ部分Ｓｐ、ならびにＲ１およびＳｐの好ましい実施形態は、本発明によるリンカー−コンジュゲートについて以上で規定される通りである。
【０２０１】
好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートは式（５ａ）または（５ｂ）、またはその塩に従い：
【化１４】
2019507741.tif 000016
式中、
−ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、Ｄ、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＲ１、およびその好ましい実施形態はリンカー−コンジュゲート（４ａ）および（４ｂ）について以上で規定される通りであり；ならびに
−ｈは０または１であり；
−Ｚ３は、ＢをＳｐ３、Ｚ１、Ｓｐ２、ＯまたはＣ（Ｏ）に連結させる連結基であり；ならびに
−Ｂは生体分子である。
【０２０２】
好ましくは、ｈは１である。
【０２０３】
生体分子Ｂの好ましい実施形態は以上で規定される通りである。
【０２０４】
本発明によるバイオコンジュゲートが（５ａ）または（５ｂ）の塩である場合、塩は好ましくは、薬学的に許容される塩である。
【０２０５】
Ｚ３は連結基である。以上で記載される通り、「連結基」という用語は、本明細では、化合物の１つの部分および同じ化合物の別の部分を連結させる構造要素を示す。典型的には、バイオコンジュゲートは、リンカー−コンジュゲート中に存在する反応基Ｑ１と生体分子中に存在する官能基Ｆ１との反応を介して調製される。当業者により理解されるように、連結基Ｚ３の性質は、生体分子とリンカー−コンジュゲートの間の連結を確立するために使用された有機反応の型に依存する。言い換えれば、Ｚ３の性質は、リンカー−コンジュゲートの反応基Ｑ１の性質および生体分子における官能基Ｆ１の性質に依存する。生体分子とリンカー−コンジュゲートとの間の連結を確立するために使用可能な多数の異なる化学反応が存在するので、その結果として、Ｚ３について多数の可能性がある。
【０２０６】
Ｑ１を含むリンカー−コンジュゲートが相補的官能基Ｆ１を含む生体分子にコンジュゲートされる場合にバイオコンジュゲート中に存在するＦ１およびＱ１の好適な組み合わせ、ならびに連結基Ｚ３のいくつかの例は図１１に示されている。
【０２０７】
Ｆ１が例えばチオール基である場合、相補的基Ｑ１としてはＮ−マレイミジル基およびアルケニル基が挙げられ、対応する連結基Ｚ３は図１１に示される通りである。Ｆ１がチオール基である場合、相補的基Ｑ１としては、アレンアミド基も挙げられる。
【０２０８】
Ｆ１が例えばアミノ基である場合、相補的基Ｑ１としては、ケトン基および活性化エステル基が挙げられ、対応する連結基Ｚ３は図１１に示される通りである。
【０２０９】
Ｆ１が例えばケトン基である場合、相補的基Ｑ１としては、（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基およびヒドラジン基が挙げられ、対応する連結基Ｚ３は図１１に示される通りである。
【０２１０】
Ｆ１が例えばアルキニル基である場合、相補的基Ｑ１としては、アジド基が挙げられ、対応する連結基Ｚ３は図１１に示される通りである。
【０２１１】
Ｆ１が例えばアジド基である場合、相補的基Ｑ１としては、アルキニル基が挙げられ、対応する連結基Ｚ３は図１１に示される通りである。
【０２１２】
Ｆ１が例えばシクロプロペニル基、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン基またはシクロオクチン基である場合、相補的基Ｑ１としては、テトラジニル基が挙げられ、対応する連結基Ｚ３は図１１に示される通りである。これらの特別な場合において、Ｚ３は中間体構造にすぎず、Ｎ２を排出し、それによってジヒドロピリダジン（アルケンとの反応から）またはピリダジン（アルキンとの反応から）を生成させる。
【０２１３】
Ｆ１およびＱ１の追加の好適な組み合わせ、ならびに結果として得られる連結基Ｚ３の性質は当業者に知られており、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３（ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０）、特に第３章、２２９−２５８ページ（参照により組み込まれる）に記載される。バイオコンジュゲーションプロセスに好適な相補的反応基のリストは、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，第３版  ２０１３（ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０）の第３章の、２３０−２３２ページ、表３．１に開示されており、この表の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０２１４】
（５ａ）および（５ｂ）に従うバイオコンジュゲートにおいて、Ｚ３、Ｓｐ３、Ｚ１およびＳｐ２の少なくとも１つは存在する、すなわちｈ、ｇ、ｄおよびｃの少なくとも１つは０ではないことが好ましい。Ｓｐ１、Ｚ２およびＳｐ４の少なくとも１つは存在する、すなわちｂ、ｅおよびｉの少なくとも１つは０ではないこともまた好ましい。より好ましくは、Ｚ３、Ｓｐ３、Ｚ１およびＳｐ２の少なくとも１つは存在し、Ｓｐ１、Ｚ２およびＳｐ４の少なくとも１つは存在し、すなわちｂ、ｅおよびｉの少なくとも１つは０ではなく、ｈ、ｇ、ｄおよびｃの少なくとも１つは０ではないことが好ましい。
【０２１５】
バイオコンジュゲートの調製のためのプロセス
本発明の様々な態様では、本発明によるバイオコンジュゲートは典型的には、本明細書で規定されるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスにより得られる。バイオコンジュゲートのリンカーＬにおける式（１）に従う基またはその塩の存在が本発明の鍵であるので、バイオコンジュゲートを調製する任意の方法は、得られたバイオコンジュゲートが、本明細書で規定されるリンカーＬを含む限り使用することができる。式（１）に従う基はＢとＺ３の間のリンカーＬ中に存在してもよく、すなわち生体分子に由来し、またはＺ３とＤの間、すなわちリンカー−コンジュゲートに由来し、またはＺ３は式（１）に従う基であるかもしくはこれを含み、すなわち式（１）に従う基はコンジュゲーションで形成される。好ましくは、式（１）に従う基はＢとＺ３の間またはＺ３とＤの間のリンカーＬ中に存在し、最も好ましくは、式（１）に従う基はＺ３とＤの間のリンカーＬ中に存在する。同様に、Ｑ１およびＦ１の性質を含めて、コンジュゲーションの正確な様式は、本発明との関連で大きなフレキシビリティを有する。ＢＯＩをＭＯＩにコンジュゲートするための多くの技術が当業者に知られており、本発明との関連で使用することができる。コンジュゲーションは、反応基Ｑ１が、生体分子の官能基Ｆ１と反応させられ、生体分子をリンカー−コンジュゲートに共有結合により連結させるような条件下で起こる。
【０２１６】
１つの実施形態では、コンジュゲーションの様式は、図１１に図示されているコンジュゲーション様式のいずれかから、すなわち、（１０ａ）または（１０ｂ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのチオール−アルケンコンジュゲーション（好ましくはシステイン−アルケンコンジュゲーション、好ましくはここで、アルケンはペンダントアルケン（−Ｃ＝ＣＨ２）またはマレイミド部分、最も好ましくはマレイミド部分である）、（１０ｃ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのアミノ−（活性化）カルボン酸コンジュゲーション（ここで、（活性化）カルボン酸は、−Ｃ（Ｏ）Ｘにより表され、ここでＸは脱離基である）、（１０ｄ）（ここで、Ｙ＝ＮＨである）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのケトン−ヒドラジノコンジュゲーション（好ましくはアセチル−ヒドラジノコンジュゲーション）、（１０ｄ）（ここで、Ｙ＝Ｏである）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのケトン−オキシアミノコンジュゲーション（好ましくはアセチル−オキシアミノコンジュゲーション）、（１０ｅ）、（１０ｆ）、（１０ｉ）、（１０ｇ）、（１０ｊ）または（１０ｋ）、好ましくは（１０ｅ）、（１０ｆ）または（１０ｇ）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのアルキン−アジドコンジュゲーション（好ましくはここで、アルキンはペンダントアルキン（−Ｃ≡ＣＨ）またはシクロオクチン部分、最も好ましくはシクロオクチン部分である）、（１０ｈ）（これからＮ２が脱離し、ジヒドロピリダジン生成物を与える）として表され得る連結部分Ｚ３を形成するためのアルケン−１，２，４，５−テトラジンコンジュゲーションまたはアルキン−１，２，４，５−テトラジンコンジュゲーションから選択される。とりわけ好ましいコンジュゲーション様式はシステイン−アルケンコンジュゲーションおよびアルキン−アジドコンジュゲーションであり、より好ましくはシステイン−マレイミドコンジュゲーションおよびシクロオクチン−アジドコンジュゲーションである。
【０２１７】
１つの実施形態では、コンジュゲーション様式は、下記により表される通りの、（１０ｅ）、（１０ｉ）、（１０ｇ）、（１０ｊ）または（１０ｋ）により、好ましくは（１０ｅ）、（１０ｉ）、（１０ｇ）により、最も好ましくは（１０ｇ）により表される連結部分Ｚ３を形成するための、（シクロ）アルキン−アジドコンジュゲーションであり：
【化１５】
2019507741.tif 000017
式中、環Ａは７−１０−員（ヘテロ）環状部分である。連結部分（１０ｅ）、（１０ｊ）および（１０ｋ）は可能な２つの位置異性体のいずれか１つで存在し得る。
【０２１８】
本発明によるバイオコンジュゲートは典型的には、本明細書で規定されるようにリンカー−コンジュゲートの反応基Ｑ１を、生体分子とも呼ばれる生体分子の官能基Ｆ１と反応させる工程を含むプロセスにより調製される。リンカー−コンジュゲートおよび生体分子、ならびにその好ましい実施形態は、より詳細に以上で記載される。そのようなプロセスは、コンジュゲーションまたはバイオコンジュゲーションとして当業者に知られている。図１は生体分子のコンジュゲーションの一般概念を示す：１つ以上の官能基Ｆ１を含む対象生体分子（ＢＯＩ）は、特定のリンカーを介して反応基Ｑ１に共有結合された、（過剰の）標的分子Ｄ（対象分子またはＭＯＩとも呼ばれる）と共にインキュベートされる。バイオコンジュゲーションのプロセスにおいて、Ｆ１とＱ１との間に化学反応が起き、それによって、ＢＯＩとＭＯＩの間の共有結合を含むバイオコンジュゲートが形成される。ＢＯＩは、例えば、ペプチド／タンパク質、グリカンまたは核酸であり得る。
【０２１９】
バイオコンジュゲーション反応は典型的には、リンカー−コンジュゲートの反応基Ｑ１を生体分子の官能基Ｆ１と反応させる工程を含み、式（Ａ）のバイオコンジュゲートが形成され、ここで、リンカーＬは式（１）に従う基またはその塩を含み：
【化１６】
2019507741.tif 000018
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１はさらなる標的分子Ｄであり、これは任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【０２２０】
好ましい実施形態では、バイオコンジュゲートは、付加環化、例えば（４＋２）−付加環化（例えば、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応）または（３＋２）−付加環化（例えば１，３−双極子付加環化）を介して調製される。好ましくは、コンジュゲーションはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応または１，３−双極子付加環化である。好ましいＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応は逆電子要求Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加環化である。別の好ましい実施形態では、１，３−双極子付加環化、より好ましくはアルキン−アジド付加環化が使用され、最も好ましくはここで、Ｑ１はアルキン基であるかまたはこれを含み、Ｆ１はアジド基である。Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応および１，３−双極子付加環化などの付加環化は当技術分野で知られており、当業者はどのようにそれらを実施するかを知っている。
【０２２１】
Ｑ１がＦ１と反応する場合、生体分子とリンカー−コンジュゲートに由来する標的分子の間の共有結合的連結が形成される。相補的反応基Ｑ１および官能基Ｆ１はより詳細に以上および以下で記載される。
【０２２２】
バイオコンジュゲートを調製するためのプロセスの好ましい実施形態では、式（１）に従う基においてａは０である。この実施形態では、よって、リンカー−コンジュゲートは以上で規定される式（２）に従う基を含む。バイオコンジュゲートを調製するためのプロセスの別の好ましい実施形態では、式（１）に従う基においてａは１である。この実施形態では、よって、リンカー−コンジュゲートは、以上で規定される式（３）に従う基を含む。
【０２２３】
生体分子はより詳細に以上で記載される。好ましくは、本発明によるプロセスでは、生体分子はタンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖類、オリゴ糖類、酵素、ホルモン、アミノ酸および単糖類からなる群より選択される。より好ましくは、生体分子Ｂはタンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖類、オリゴ糖類および酵素からなる群より選択される。より好ましくは、生体分子Ｂはタンパク質（糖タンパク質および抗体を含む）、ポリペプチド、ペプチドおよびグリカンからなる群より選択される。最も好ましくは、Ｂは抗体またはその抗原結合断片である。
【０２２４】
バイオコンジュゲートを調製するためのプロセスにおいて、反応基Ｑ１は、任意で置換された、Ｎ−マレイミジル基、ハロゲン化Ｎ−アルキルアミド基、スルホニルオキシＮ−アルキルアミド基、エステル基、カーボネート基、ハロゲン化スルホニル基、チオール基またはその誘導体、アルケニル基、アルキニル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基、ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基、シクロアルケニル基、テトラジニル基、アジド基、ホスフィン基、ニトリルオキシド基、ニトロン基、ニトリルイミン基、ジアゾ基、ケトン基、（Ｏ−アルキル）ヒドロキシルアミノ基、ヒドラジン基、ハロゲン化Ｎ−マレイミジル基、１，１−ビス（スルホニルメチル）メチルカルボニル基またはその脱離誘導体、ハロゲン化カルボニル基およびアレンアミド基からなる群より選択されることが好ましい。
【０２２５】
さらに好ましい実施形態では、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）、（９ｇ）、（９ｈ）、（９ｉ）、（９ｊ）、（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｒ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｕ）、（９ｖ）、（９ｗ）、（９ｘ）、（９ｙ）、（９ｚ）、（９ｚａ）、（９ｚｂ）、（９ｚｃ）、（９ｚｄ）、（９ｚｅ）、（９ｚｆ）、（９ｚｇ）、（９ｚｈ）、（９ｚｉ）、（９ｚｊ）または（９ｚｋ）に従い、ここで、（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｄ）、（９ｅ）、（９ｆ）、（９ｇ）、（９ｈ）、（９ｉ）、（９ｊ）、（９ｋ）、（９ｌ）、（９ｍ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｒ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｕ）、（９ｖ）、（９ｗ）、（９ｘ）、（９ｙ）、（９ｚ）、（９ｚａ）、（９ｚｂ）、（９ｚｃ）、（９ｚｄ）、（９ｚｅ）、（９ｚｆ）、（９ｚｇ）、（９ｚｈ）、（９ｚｉ）、（９ｚｊ）、（９ｚｋ）、（９ｚｏ）、およびその好ましい実施形態は、本発明によるリンカー−コンジュゲートについて以上で規定される通りである。より好ましくは、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（９ｆ）、（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｓ）、（９ｔ）、（９ｚｅ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｒ）に従う。さらにいっそう好ましくは、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｔ）、（９ｚｅ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｓ）に従い、最も好ましくは、Ｑ１は、以上で規定される、式（９ａ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｎ）、（９ｔ）、（９ｚｅ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｏ）、およびその好ましい実施形態に従う。
【０２２６】
とりわけ好ましい実施形態では、Ｑ１は、好ましくは以上で記載されるアルキニル基、以上で記載されるシクロアルケニル基、以上で記載される（ヘテロ）シクロアルキニル基およびビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基から選択されるアルキン基を含み、より好ましくは、Ｑ１は以上で規定される式（９ｊ）、（９ｎ）、（９ｏ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｚｏ）および（９ｚｋ）から選択される。最も好ましくは、Ｑ１は、好ましくは式（９ｑ）のビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イル］基である。
【０２２７】
バイオコンジュゲートを調製するためのプロセスのさらに好ましい実施形態では、リンカー−コンジュゲートは式（４ａ）または（４ｂ）、またはその塩に従い：
【化１７】
2019507741.tif 000019
式中：
−ａは独立して０または１であり；
−ｂは独立して０または１であり；
−ｃは０または１であり；
−ｄは０または１であり；
−ｅは０または１であり；
−ｆは１〜１５０の範囲の整数であり；
−ｇは０または１であり；
−ｉは０または１であり；
−Ｄは、標的分子であり；
−Ｑ１は生体分子上に存在する官能基Ｆ１と反応することができる反応基であり；
−Ｓｐ１はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ２はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ３はスペーサ部分であり；
−Ｓｐ４はスペーサ部分であり；
−Ｚ１はＱ１またはＳｐ３をＳｐ２、ＯまたはＣ（Ｏ）またはＮ（Ｒ１）に連結させる連結基であり；
−Ｚ２はＤまたはＳｐ４をＳｐ１、Ｎ（Ｒ１）、ＯまたはＣ（Ｏ）に連結させる連結基であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され；あるいはＲ１はＤ、−［（Ｓｐ１）ｂ（Ｚ２）ｅ（Ｓｐ４）ｉＤ］または−［（Ｓｐ２）ｃ（Ｚ１）ｄ（Ｓｐ３）ｇＱ１］であり、ここで、Ｄは標的分子であり、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３、Ｓｐ４、Ｚ１、Ｚ２、Ｑ１、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｇおよびｉは以上で規定される通りである。
【０２２８】
Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、独立して、スペーサ部分であり、言い換えれば、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、互いに異なっていてもよい。Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は存在してもしなくてもよい（ｂ、ｃ、ｇおよびｉは、独立して、０または１である）。しかしながら、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４の少なくとも１つは存在することが好ましく、すなわち、ｂ、ｃ、ｇおよびｉの少なくとも１つは０ではないことが好ましい。
【０２２９】
存在する場合、好ましくはＳｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ２００アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基が、以上で規定される１つ以上のヘテロ原子により中断される場合、前記基は１つ以上のＯ−原子、および／または１つ以上のＳ−Ｓ基により中断されることが好ましい。
【０２３０】
より好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２−Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ１００アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０２３１】
さらにいっそう好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ５０アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０２３２】
さらによりいっそう好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３−Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５−Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８−Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７−Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７−Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８−Ｃ２０アリールアルケニレン基およびＣ９−Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０２３３】
これらの好ましい実施形態では、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は非置換であり、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯにより任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基、好ましくは水素またはメチルからなる群より独立して選択されることが、さらに好ましい。
【０２３４】
最も好ましくは、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。この実施形態では、アルキレン基は非置換であり、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯおよび／またはＳ−Ｓにより任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基、好ましくは水素またはメチルからなる群より独立して選択されることが、さらに好ましい。
【０２３５】
特に好ましいスペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４としては−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−が挙げられ、ここで、ｎは１〜５０の範囲、好ましくは１〜４０の範囲、より好ましくは１〜３０の範囲、さらにいっそう好ましくは１〜２０の範囲、さらによりいっそう好ましくは１〜１５の範囲の整数である。より好ましくは、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７または８、さらにいっそう好ましくは１、２、３、４、５または６、さらによりいっそう好ましくは１、２、３または４である。
【０２３６】
本発明によるプロセスの別の好ましい実施形態では、式（４ａ）および（４ｂ）に従うリンカー−コンジュゲートにおいて、スペーサ部分Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３および／またはＳｐ４は、存在する場合、アミノ酸の配列を含む。アミノ酸の配列を含むスペーサ部分は当技術分野で知られており、ペプチドリンカーとも呼ばれ得る。例としては、Ｖａｌ−Ａｌａ部分またはＶａｌ−Ｃｉｔ部分を含むスペーサ部分、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、などが挙げられる。
【０２３７】
以上で記載される通り、Ｚ１およびＺ２は連結基である。本発明によるプロセスの好ましい実施形態では、Ｚ１およびＺ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ２−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＳＣ（Ｏ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＳ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＯＣ（Ｓ）−、−ＯＣ（Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）Ｏ−、−ＮＲ２Ｃ（Ｓ）ＮＲ２−、−ＳＳ（Ｏ）２−、−ＳＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＳＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−ＮＲ２ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２−、−ＯＮＲ２Ｓ（Ｏ）２−、−ＯＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＳＰ（Ｏ）（Ｒ２）２−、−ＮＲ２Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２−およびその２つ以上の組み合わせからなる群より独立して選択され、ここで、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ２−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２−Ｃ２４アルキニル基およびＣ３−Ｃ２４シクロアルキル基からなる群より独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は任意で置換される。
【０２３８】
本発明による特に好ましいプロセスでは、Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４は、存在する場合、直鎖または分枝Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基からなる群より独立して選択され、アルキレン基は任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３からなる群より選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここで、Ｒ３は水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より独立して選択され、ここで、Ｑ１は式（９ａ）、（９ｊ）、（９ｐ）、（９ｑ）、（９ｎ）、（９ｔ）、（９ｚｅ）、（９ｚｈ）、（９ｚｏ）または（９ｏ）に従い：
【化１８】
2019507741.tif 000020
式中：
−ｌは０〜１０の範囲の整数であり；
−Ｒ１０は（チオ）エステル基であり；ならびに
−Ｒ１８は、任意で置換された、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基およびＣ４−Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群より選択される。
【０２３９】
バイオコンジュゲートを調製するためのプロセスの一実施形態は、図４に図示される。図４は、修飾抗体１３ａ−ｄが、マレイミドを用いた求核付加の手段により（３−メルカプトプロピオニル−ガラクトサミン修飾１３ａではチオエーテルコンジュゲート１４に至り、または改変システイン残基へのコンジュゲーションでは、チオエーテルコンジュゲート１７に至る）またはシクロオクチン試薬を用いた歪み促進付加環化で（１３ｂ、１３ｃまたは１３ｄでは、それぞれ、トリアゾール１５ａ、１５ｂまたは１６に至る）、バイオコンジュゲーションプロセスをどのように受け得るかを示す。
【０２４０】
本発明によるバイオコンジュゲートの治療指数の増加に加えて、本明細書で記載されるバイオコンジュゲート、および本発明によるリンカー−コンジュゲートおよびスルファミドリンカーの調製のためのプロセスのさらなる利点は、コンジュゲーション効率が、典型的なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサの代わりにスルファミドリンカーが使用される場合において増加することである。スルファミド基、特にアシルスルファミドまたはカルバモイルスルファミド基の追加の利点は、そのような基を含むリンカーの溶解度に対して、ならびにコンジュゲーション前、中、後の全体としてのコンストラクトに対してプラス効果を付与する、その高い極性である。この増加された極性を考慮すると、本発明によるスルファミドリンカーを含有するリンカー−コンジュゲートを用いるコンジュゲーションは、疎水性標的化合物を生体分子にコンジュゲートさせるのに特に好適である。スルファミドの高い極性は、疎水性部分が、コンジュゲーション中に大量の有機共溶媒を必要とするおよび／またはバイオコンジュゲートの凝集を誘発することが知られている対象生体分子にコンジュゲートされる場合においてもプラスの影響を持つ。高レベルの共溶媒（２５％までのＤＭＦまたはＤＭＡ、プロピレングリコール、またはＤＭＳＯの実に５０％）はコンジュゲーションプロセス中にタンパク質変性を誘発することがあり、および／または製造プロセスにおいて特別な機器を必要とすることがある。よって、バイオコンジュゲートにおける疎水性連結部分と関連する凝集の問題は、バイオコンジュゲートの形成において、リンカー−コンジュゲートにおける標的分子と反応基Ｑ１の間のスペーサに本発明によるスルファミドリンカーを使用することにより、効率的に解決される。発明によるスルファミドリンカーおよびバイオコンジュゲーションプロセスにおけるその使用の追加の利点はその合成の簡便さおよび高収率である。
【０２４１】
本発明によるスルファミドリンカーの使用のこれらの有益な効果の証拠について、ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）、特にその中の表１−３、図１１−１４、２３および２４、ならびに実施例５７、５８、６０および６１が参照される。ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）のこれらの表、図および実施例は本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
第１の態様による方法
よって、発明は、第１の態様では、バイオコンジュゲートの治療指数を増加させるための方法に関し、方法は、式（Ａ）のバイオコンジュゲート：
Ｂ−Ｌ−Ｄ
（Ａ）、
式中：
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｌは、ＢおよびＤを連結させるリンカーであり；
−Ｄは、標的分子であり；ならびに
−「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分である、
を、Ｌが式（１）に従う基またはその塩を含むように、標的分子（Ｄ）上の反応基Ｑ１を生体分子（Ｂ）上の官能基Ｆ１と反応させることにより、調製する工程を含み：
【化１９】
2019507741.tif 000021
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１は追加の標的分子Ｄであり、ここでＤは任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【０２４３】
式（Ａ）のバイオコンジュゲートは非常に詳細に上記で記載され、これは同様に、発明の第１の態様において使用されるバイオコンジュゲートに当てはまる。
【０２４４】
本明細書では、治療指数は、リンカーＬは式（１）に従う基またはその塩を含まない、式（Ａ）のバイオコンジュゲートと比べて増加される。発明者らは驚いたことに、本発明によるバイオコンジュゲートの治療指数は、本発明によるリンカーＬが使用された場合、例え、他の因子全て、特に生体分子の型および標的分子の型ならびに生体分子−標的分子−比が一定に維持されても、著しく増加されたことを見出した。治療指数の増加はもっぱら、リンカー中の式（１）に従う基の存在に起因することがあり得る。
【０２４５】
治療指数の増加は好ましくは癌の治療における治療指数の増加である。
【０２４６】
発明の第１の態様による方法はまた、バイオコンジュゲートの治療指数を増加させるための方法として表現することもでき、これは式（Ａ）により表されるバイオコンジュゲートを提供する工程を含み：
Ｂ−Ｌ−Ｄ
（Ａ）、
式中：
−Ｂは、生体分子であり；
−Ｌは、ＢおよびＤを連結させるリンカーであり；
−Ｄは、標的分子であり；ならびに
−「−」の各出現は、独立して、結合またはスペーサ部分であり、
ここで、Ｌは式（１）に従う基またはその塩を含み：
【化２０】
2019507741.tif 000022
式中：
−ａは０または１であり；ならびに
−Ｒ１は水素、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群より選択され、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３−Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３−Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意で置換され、および、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子により任意で中断され、ここでＲ３は独立して水素およびＣ１−Ｃ４アルキル基からなる群より選択され、またはＲ１は追加の標的分子Ｄであり、ここで、標的分子は任意で、スペーサ部分を介してＮに連結される。
【０２４７】
発明者らは、本発明によるリンカーは、本発明によるバイオコンジュゲートに含まれている場合、治療指数の両方の観点：（ａ）治療有効性および（ｂ）耐容性について効果を有することを見出した。よって、治療指数を増加させるための方法は好ましくは、式（Ａ）のバイオコンジュゲートの（ａ）治療有効性を増加させる、および／または（ｂ）耐容性を増加させるためである。
【０２４８】
よって、１つの実施形態では、第１の態様による方法は、式（Ａ）のバイオコンジュゲートの治療有効性を増加させるためである。本明細書では、「治療有効性を増加させること」はまた、「有効用量を低下させること」または「ＥＤ５０値を低下させること」または「保護指数を増加させること」と表すことができる。同様に、１つの実施形態では、第１の態様による方法は、式（Ａ）のバイオコンジュゲートの耐容性を増加させるためである。本明細書では、「耐容性を増加させること」はまた、「最大耐容量（ＭＴＤ）を増加させること」、「ＴＤ５０値を増加させること」または「毒性を低減させること」と表すことができる。１つのとりわけ好ましい実施形態では、第１の態様による方法は、式（Ａ）のバイオコンジュゲートの（ａ）治療有効性を増加させるため、および（ｂ）耐容性を増加させるためである。
【０２４９】
第１の態様による方法は非常に非医学的である。１つの実施形態では、方法はバイオコンジュゲートの治療有効性を増加させるための非医学的または非治療的方法である。
【０２５０】
発明の第１の態様はまた、式（Ａ）のバイオコンジュゲートの治療有効性を改善するのに使用するためのリンカーＬと表すことができ、ここで、Ｌおよび（Ａ）は以上で規定される通りである。言い換えれば、第１の態様はバイオコンジュゲートの治療有効性を改善するための、式（Ａ）のバイオコンジュゲートの調製のためのリンカーＬの使用に関し、ここで、Ｌおよび（Ａ）は以上で規定される通りである。第１の態様による発明はまた、バイオコンジュゲートの治療有効性を増加させるための、式（Ａ）のバイオコンジュゲート、または式（Ａ）のバイオコンジュゲートの調製におけるリンカーＬの使用と表すことができ、ここで、Ｌおよび（Ａ）は以上で規定される通りである。本明細書で規定される使用は非医学的または非治療的使用と呼ばれ得る。
【０２５１】
本態様による方法において使用されるバイオコンジュゲートは好ましくは、以上で規定されるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスにより得ることができ、より好ましくは、バイオコンジュゲートは以上で規定されるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスにより得られる。このように得られたバイオコンジュゲートは、さらにもっと改善された治療指数を有したことが見出された。
【０２５２】
１つの実施形態では、発明の第１の態様による使用のための方法、使用またはリンカーは、その必要のある被験体、最も好適には癌患者への本発明によるバイオコンジュゲートの投与をさらに含む。抗体−薬物−コンジュゲートなどのバイオコンジュゲートの使用は、癌治療の分野でよく知られており、本発明によるバイオコンジュゲートは、この点においてとりわけ適している。
【０２５３】
典型的には、バイオコンジュゲートは治療的有効用量で投与される。投与は単一用量であってもよく、または、例えば、１ヶ月１−４回、好ましくは１ヶ月１−２回行い得る。好ましい実施形態では、投与は３週または４週毎に、最も好ましくは４週毎に１回行う。治療有効性の増加を考慮すると、投与は従来のバイオコンジュゲートを用いる治療中の場合よりも頻繁には行わなくてもよい。当業者によって認識されるように、本発明によるバイオコンジュゲートの用量は多くの因子に依存することがあり、最適投与計画は当業者によりルーチン実験を介して決定することができる。バイオコンジュゲートは典型的には、０．０１−５０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、より正確には０．１−２５ｍｇ／ｋｇ、または最も正確には０．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。１つの実施形態では、投与は静脈内注射を介して行う。
【０２５４】
第２の態様による方法
発明は、第２の態様では、以上で規定される式（Ａ）のバイオコンジュゲートの投与を含む、その必要のある被験体の治療のための方法に関する。その必要のある被験体は最も好ましくは癌患者である。抗体−薬物−コンジュゲートなどのバイオコンジュゲートの使用は、癌治療の分野においてよく知られており、本発明によるバイオコンジュゲートは、この点においてとりわけ適している。記載されている方法は典型的には癌の治療に適している。式（Ａ）のバイオコンジュゲートは以上で非常に詳細に記載され、これは、発明の第２の態様で使用されるバイオコンジュゲートに同様にあてはまる。
【０２５５】
発明の第２の態様はまた、その必要のある被験体の治療において、好ましくは癌の治療のために使用するための、式（Ａ）のバイオコンジュゲートと表すことができ、ここで、（Ａ）は以上で規定される通りである。言い換えれば、第２の態様は、その必要のある被験体の治療における使用のための、好ましくは癌の治療における使用のための薬剤の調製のための式（Ａ）のバイオコンジュゲートの使用に関し、ここで、（Ａ）は以上で規定される通りである。
【０２５６】
第２の態様による方法はまた、腫瘍細胞をターゲティングするための方法と表すことができる。本態様との関連で、腫瘍細胞のターゲティングは、腫瘍細胞を治療すること、画像化すること、診断すること、その増殖を防止すること、封じ込めることおよび低減することの１つ以上を含む。第２の態様による方法はまた、腫瘍をターゲティングするための方法と表すことができる。本態様との関連で、腫瘍細胞のターゲティングは、腫瘍を治療すること、画像化すること、診断すること、その増殖を防止すること、封じ込めることおよび低減することの１つ以上を含む。最も好ましくは、本態様は腫瘍の治療のためである。
【０２５７】
当業者は、標的分子Ｄの選択は、本態様による本発明によるバイオコンジュゲートの特定の使用目的により決定され得ることを理解する。例えば、本態様による方法が治療するためのものである場合、標的分子Ｄは薬物、より好ましくは細胞毒であることが好ましい。同様に、本態様による方法が画像化するまたは診断するためのものである場合、標的分子Ｄはレポーター分子であることが好ましい。本態様による方法との関連で、生体分子Ｂは抗体であることが好ましい。同様に、バイオコンジュゲートは抗体−薬物−コンジュゲートであることが好ましい。
【０２５８】
本態様による方法において使用されるバイオコンジュゲートは、好ましくは、以上で規定されるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスにより得ることができ、より好ましくは、バイオコンジュゲートは、以上で規定されるバイオコンジュゲートの調製のためのプロセスにより得られる。
【０２５９】
第２の態様による方法において、バイオコンジュゲートは典型的には治療的有効用量で投与される。投与は単一用量であってもよく、または、例えば１ヶ月１−４回、好ましくは１ヶ月１−２回行ってもよい。好ましい実施形態では、投与は３週または４週毎に、最も好ましくは４週毎に１回行う。当業者によって認識されるように、本発明によるバイオコンジュゲートの用量は多くの因子に依存することがあり、最適投与計画は当業者によりルーチン実験を介して決定することができる。バイオコンジュゲートは典型的には、０．０１−５０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、より正確には０．１−２５ｍｇ／ｋｇ、最も正確には０．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。１つの実施形態では、投与は静脈内注射を介して行う。
【０２６０】
治療有効性の増加を考慮すると、投与は従来のバイオコンジュゲートを用いる治療におけるよりも頻繁に行わなくてもよく、および／またはより低い用量で行ってもよい。１つの実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲートの投与は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０よりも低い用量であり、好ましくは、用量は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０のせいぜい９９−９０％、より好ましくはせいぜい８９−６０％、さらにいっそう好ましくはせいぜい５９−３０％、最も好ましくはせいぜい２９−１０％である。１つの実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲートの投与は同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＥＤ５０よりも低い用量であり、好ましくは、用量は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＥＤ５０のせいぜい９９−９０％、より好ましくはせいぜい８９−６０％、さらにいっそう好ましくはせいぜい５９−３０％、最も好ましくはせいぜい２９−１０％である。１つの実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲートの投与は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないものについて行う投与よりも頻繁に行わず、好ましくは、投与事象の数は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないものの投与事象の数のせいぜい７５％、より好ましくはせいぜい５０％である。あるいは、耐容性の増加を考慮すると、投与は従来のバイオコンジュゲートを用いる治療におけるより高い用量で行ってもよい。１つの実施形態では、本発明によるバイオコンジュゲートの投与は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０より高い用量であり、好ましくは、用量は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０のせいぜい２５−５０％、より好ましくはせいぜい５０−７５％、最も好ましくはせいぜい７５−１００％である。１つの実施形態では、用量は、同じバイオコンジュゲートであるが本発明によるリンカーを含まないもののＴＤ５０の少なくとも１．１−１．４９倍高く、より好ましくは少なくとも１．５−１．９９倍高く、さらにいっそう好ましくは２−４．９９倍高く、最も好ましくは少なくとも５−１０倍高い。
【実施例】
【０２６１】
本発明による方法、またはそのモデルにおいて使用されるリンカー−コンジュゲートとして好適な下記化合物の合成のために、ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）が参照される：
・化合物１８（実施例２０）；
・化合物２０（実施例２１、２３−２５）；
・化合物２１（実施例２６−２７）；
・化合物２３（実施例２９−３１）；
・化合物２６（実施例３６−３８）；
・化合物３０（実施例４３−１、３２）；
・化合物３３（実施例３６−３７、４７）；
・化合物３５（実施例３６−３７、４９）；
・化合物３６（実施例２９、５０）；
・化合物３７（実施例５１−５３）；
・化合物３８（実施例２９、５４−５５）；
・化合物３９（実施例２９、５４、５６）。
【０２６２】
本発明による方法において使用される生体分子として好適な、下記修飾生体分子の調製は、ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）に記載される：
・トラスツズマブ（ＧａｌＮＰｒｏＳＨ）２１３ａ（実施例１−６、１２−１４）；
・トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２１３ｂ（実施例１２、１３、１５、１６−１）；
・トラスツズマブ（Ｆ２−ＧａｌＮＡｚ）２１３ｃ（実施例１、７−１３、１６−２）
【０２６３】
本発明によるバイオコンジュゲートは、ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）の実施例５９に従い調製することができる。リンカー−コンジュゲート３０または３３の修飾生体分子１３ｂまたは１３ｃとのコンジュゲートはそのようなものとして調製されており（コンジュゲート９５−９８、実施例１−４および図１２を参照されたい）、実施例２９および３１のインビボ研究において使用される。
【０２６４】
ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）の前記実施例は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
還元モノクローナル抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ分析
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析前に、試料を、１０μｇの（修飾）ＩｇＧの溶液を１５分間３７℃で１０ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０と共に５０μＬの総体積でインキュベートすることにより還元させた。４９％ＡＣＮ、４９％ＭＱおよび２％ギ酸の溶液（５０μＬ）を還元試料に添加した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ上でＺＯＲＢＡＸ  Ｐｈｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ８  １×７５  ５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カラムを使用し、１ｍｌ／分で７０℃にて２５〜５０％バッファーＢの１６．９分直線勾配（バッファーＡ＝９０％ＭＱ、１０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡおよびバッファーＢ＝９０％ＡＣＮ、１０％ＭＱ、０．１％ＴＦＡを用いる）を使用して実行して、逆相ＨＰＬＣを実施した。
【０２６６】
モノクローナル抗体の質量スペクトル分析
質量スペクトル分析前に、ＩｇＧを、軽鎖および重鎖の両方の分析を可能にするＤＴＴで処理したか、またはＦｃ／２断片の分析を可能にするＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎから市販）で処理した。軽鎖および重鎖の両方の分析のために、２０μｇ（修飾）ＩｇＧの溶液を５分間３７℃で、１００ｍＭ  ＤＴＴと共に４μＬの総体積でインキュベートした。存在する場合、アジド−官能基を、これらの条件下で、アミンに還元する。Ｆｃ／２断片の分析のために、２０μｇの（修飾）ＩｇＧの溶液を１時間の間３７℃で、Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ（商標）（１．２５Ｕ／μＬ）と共にホスフェート−緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中にて、１０μＬの総体積でインキュベートした。還元またはＦａｂｒｉｃａｔｏｒ−消化後、試料をｍｉｌｌｉＱを用いて、アミコンウルトラ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２回洗浄し、およそ４０μＬの最終試料体積を得た。次に、試料をエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）により、ＪＥＯＬ  ＡｃｃｕＴＯＦ上で分析した。Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを使用して、デコンボリューションされたスペクトルを得た。
【０２６７】
実施例１：コンジュゲート９６を得るための１３ｂの３０とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物３０の生体分子としての修飾生体分子１３ｂへのコンジュゲーションにより調製した。トラスツズマブ（アジド）２（１３ｂ）（１５．５ｍＬ、２５５ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１６．４７ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＤＭＡ（１．４５ｍＬ）および化合物３０（２５５μＬ、４０ｍＭ  ＤＭＡ溶液）を添加した。反応物を一晩室温でインキュベートし、続いて、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲート重鎖に対応する１つの主要な重鎖生成物を示した（観察質量５０９３８Ｄａ、総重鎖断片のおよそ８０％）。
【０２６８】
実施例２：コンジュゲート９５を得るための１３ｂの３３とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物３３の生体分子としての修飾生体分子１３ｂへのコンジュゲーションにより調製した。トラスツズマブ（アジド）２（１３ｂ）（６０７μＬ、１０ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１６．４７ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、ＭｉｌｌｉＱ（５０μＬ）および化合物３３（１０μＬ、４０ｍＭ  ＤＭＡ溶液）を添加した。反応物を一晩室温でインキュベートし、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲート重鎖に対応する１つの主要な重鎖生成物を示した（観察質量５０９８２Ｄａ、総重鎖断片のおよそ８０％）。
【０２６９】
実施例３：コンジュゲート９８を得るための１３ｃの３０とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物３０の生体分子としての修飾生体分子１３ｃへのコンジュゲーションにより調製した。トラスツズマブ（アジド）２（１３ｃ）（１４．２５ｍＬ、２５０ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１７．５５ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＤＭＡ（１．４ｍＬ）および化合物３０（２５０μＬ、４０ｍＭ  ＤＭＡ溶液）を添加した。反応物を一晩室温でインキュベートし、続いて、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲート重鎖に対応する１つの主要な重鎖生成物を示した（観察質量５０９６９Ｄａ、総重鎖断片のおよそ７０％）。
【０２７０】
実施例４：コンジュゲート９７を得るための１３ｃの３３とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物３３の生体分子としての修飾生体分子１３ｃへのコンジュゲーションにより調製した。トラスツズマブ（アジド）２（１３ｃ）（１４．２５ｍＬ、２５０ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１７．５５ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、化合物３３（１８８μＬ、４０ｍＭ  ＤＭＡ溶液）を添加した。反応物を一晩室温でインキュベートし、続いて、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲート重鎖に対応する１つの主要な重鎖生成物を示した（観察質量５１０２０Ｄａ、総重鎖断片のおよそ９０％）。
【０２７１】
実施例５−１６：リンカーコンジュゲート１００、１０８および１１１の調製
本発明によるリンカー−コンジュゲート１００および１０８、ならびに対照リンカー−コンジュゲート１１１の合成は本明細書で記載される。化合物１００、１０８および１１１に向かう合成スキームはここで以下に図示される。
【化２１】
2019507741.tif 000023
【０２７２】
実施例５：化合物１００の調製
化合物９９（ＰＣＴ／ＮＬ２０１５／０５０６９７号（ＷＯ２０１６／０５３１０７号）の実施例５０において開示され、これに従い調製された化合物５８の活性化を介して調製；４．７ｍｇ、９．０μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２００μＬ）の溶液を固体Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｖｃ−ＰＡＢＭＭＡＥ、１０ｍｇ、８．１μｍｏｌ）に添加し、続いて、Ｅｔ３Ｎ（３．７μＬ、２．７ｍｇ、２７μｍｏｌ）を添加した。２３時間後、２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．３μＬ、１．３ｍｇ、８．９μｍｏｌ）を含むＤＭＦを添加した（１３μＬの１０％ＤＭＦ溶液）。混合物を４時間の間放置し、逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣクロマトグラフィーを介して精製した（３０→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）を含むＨ２Ｏ（１％ＡｃＯＨ）。生成物を無色フィルムとして得た（１０．７ｍｇ、７．１μｍｏｌ、８７％）ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ７４Ｈ１１７Ｎ１２Ｏ１９Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ＋）について計算１５０９．８３  観測１５１０．５９
【０２７３】
実施例６：化合物１０１の調製
ＢＣＮ−ＯＳｕ（１．００ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦおよび水の混合物（８０ｍＬ／８０ｍＬ）の溶液にγ−アミノ酪酸（０．６０ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．４３ｍＬ、１．０４ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、４時間の間撹拌し、続いて、ＤＣＭ（２００ｍＬ）およびＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（８０ｍＬ）を添加した。分離後、水層をＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（ＭｅＯＨを含むＤＣＭ０→１０％）。生成物を無色濃厚油として得た（７３０ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ、７６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）４．８１（ｂｓ、１Ｈ）、４．１５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．３０−３．２１（ｍ、２Ｈ）、２．４２（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．３５−２．１６（ｍ、６Ｈ）、１．８５（五重線、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．６４−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．３５（五重線、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．００−０．９０（ｍ、２Ｈ）
【０２７４】
実施例７：化合物１０２の調製
クロロスルホニルイソシアネート（ＣＳＩ；０．９１ｍＬ、１．４８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブタノール（５．０ｍＬ、３．８８ｇ、５２ｍｍｏｌ）を含むＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）の冷却（−７８℃）溶液に添加した。反応混合物を室温まで温めさせ、濃縮した。残渣をＤＣＭ（２００ｍＬ）に懸濁させ、その後、Ｅｔ３Ｎ（４．２ｍＬ、３．０ｇ、３０ｍｍｏｌ）および２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１．０ｍＬ、１．０５ｇ；１０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１０分間撹拌させ、濃縮させた。残渣を２回カラムクロマトグラフィーを用いて精製した（ＭｅＯＨを含むＤＣＭ０→１０％）。生成物を無色濃厚油として得た（２．９ｇ、１０ｍｍｏｌ、１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．７５（ｂｓ、１Ｈ）、３．７９−３．７４（ｍ、２Ｈ）、３．６７−３．６２（ｍ、２Ｈ）、３．６１−３．５７（ｍ、２Ｈ）、３．３５−３．２８（ｍ、２Ｈ）、１．５０（ｓ、９Ｈ）。
【０２７５】
実施例８：化合物１０３の調製
１０２（２．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（４０ｍＬ）の溶液にＡｃ２Ｏ（２．９ｍＬ、３．１１ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１２．８ｍＬ、９．２９ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、２時間の間撹拌し、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。残渣を２回カラムクロマトグラフィーを用いて精製した（２０％→１００％ＥｔＯＡｃを含むヘプタン）。生成物を無色油として得た（２．５ｇ、７．７ｍｍｏｌ、７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．４８（ｂｓ、１Ｈ）、４．２５−４．２０（ｍ、２Ｈ）、３．７０−３．６０（ｍ、４Ｈ）、３．３３−３．２３（ｍ、２Ｈ）、２．１０（ｓ、３Ｈ）、１．５０（ｓ、９Ｈ）
【０２７６】
実施例９：化合物１０４の調製
１０３（８０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（８ｍＬ）の溶液にＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。４０分後、反応混合物を濃縮させた。残渣をトルエン（３０ｍＬ）に入れ、混合物を濃縮させた。生成物を無色油として得た（５４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．１５（ｂｓ、２Ｈ）、４．２６−４．１８（ｍ、２Ｈ）、３．７１−３．６０（ｍ、４Ｈ）、３．３５−３．２７（ｍ、２Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）。
【０２７７】
実施例１０：化合物１０５の調製
ＢＣＮＧＡＢＡ（１０１）（６７ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）および１０４（５４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（２０ｍＬ）の混合物にＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ．ＨＣｌ；５５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．８ｍｇ、２３μｍｏｌ）を添加した。混合物を１６の間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。分離後、水層をＤＣＭで抽出した（２０ｍＬ）。有機層を合わせて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（ＭｅＯＨを含むＤＣＭ０→１０％）。生成物を無色濃厚油として得た（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、４２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．８３−５．７２（ｍ、１Ｈ）、５．１４−５．０４（ｍ、１Ｈ）、４．２３−４．１９（ｍ、２Ｈ）、４．１５（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．６７−３．５７（ｍ、４Ｈ）、３．２９−３．１８（ｍ、４Ｈ）、２．４１−２．３２（ｍ、２Ｈ）、２．３１−２．１５（ｍ、６Ｈ）、２．１０（ｓ、３Ｈ）、１．８５（五重線、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．６５−１．４９（ｍ、２Ｈ）、１．３８−１．２８（ｍ、１Ｈ）、１．００−０．８９（ｍ、２Ｈ）
【０２７８】
実施例１１：化合物１０６の調製
１０５（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ（１０ｍＬ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（４３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３時間の間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（２０ｍＬ）で希釈した。混合物をＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。生成物を無色フィルムとして得た（３９ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ、８８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）６．２５（ｂｓ、１Ｈ）、５．２６−５．１８（ｍ、１Ｈ）、４．１５（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．７７−３．７１（ｍ、２Ｈ）、３．６３−３．５３（ｍ、４Ｈ）、３．３３−３．２７（ｍ、２Ｈ）、３．２７−３．１７（ｍ、２Ｈ）、２．４５−２．３４（ｍ、２Ｈ）、２．３４−２．１４（ｍ、６Ｈ）、１．８５（五重線、Ｊ＝６．７ｈｚ、２Ｈ）、１．６５−１．４８（ｍ、２Ｈ）、１．４１−１．２８（ｍ、１Ｈ）、１．０１−０．８８（ｍ、２Ｈ）。
【０２７９】
実施例１２：化合物１０７の調製
１０６（１５２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（２０ｍＬ）の溶液にクロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ−ＣＯＣｌ；６９ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）およびピリジン（２８μＬ、２７ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１．５時間の間撹拌し、濃縮させた。残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（５０％→１００％ＥｔＯＡｃを含むヘプタン）。生成物を無色濃厚油として得た（９８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、４７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３１−８．２６（ｍ、２Ｈ）、７．４６−７．４０（ｍ、２Ｈ）、５．６９−５．５９（ｍ、１Ｈ）、４．９８−４．９１（ｍ、１Ｈ）、４．４６−４．４２（ｍ、２Ｈ）、４．１８（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．７９−３．７５（ｍ、２Ｈ）、３．６９−３．６４（ｍ、２Ｈ）、３．３３−３．２４（ｍ、４Ｈ）、２．３９−２．３１（ｍ、２Ｈ）、２．３２−２．１８（ｍ、６Ｈ）、１．８４（五重線、Ｊ＝６．３Ｈｚ２Ｈ）、１．６５−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．３５（五重線、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．０１−０．９１（ｍ、２Ｈ）。
【０２８０】
実施例１３：化合物１０８の調製
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（１６．４ｍｇ、１３．２μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４００μＬ）の溶液にＥｔ３Ｎ（３．４μＬ、２．５ｍｇ、２４μｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、１０７（６．７ｍｇ、１１μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３００μＬ）の溶液に添加した。ＤＭＦ（５０μＬ）を添加した。２１．５時間後、２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．２μＬ、１．２ｍｇ、８．２μｍｏｌ）を含むＤＭＦを添加した（１２μＬの１０％ＤＭＦ溶液）。混合物を逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣクロマトグラフィーを介して精製した（３０→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）を含むＨ２Ｏ（１％ＡｃＯＨ）。生成物を無色フィルムとして得た（４．３ｍｇ、２．７μｍｏｌ、２５％）ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ７８Ｈ１２４Ｎ１３Ｏ２０Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ＋）について計算１５９４．８８  観測１５９４．９７
【０２８１】
実施例１４：化合物１０９の調製
２−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタノール（２５６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（３０ｍＬ）の溶液に、ＢＣＮ−ＯＳｕ（３５１ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（５０２μＬ、３６４ｍｇ、３．６０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を３０分間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液で洗浄した。分離後、水相をＤＣＭ（３０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（ＭｅＯＨを含むＤＣＭ０→１０％）。生成物を無色油として得た（３９７ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．９３（ｂｓ、１Ｈ）、４．１４（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、３．７７−３．６９（ｍ、４Ｈ）、３．６８−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．５８−３．５２（ｍ、２Ｈ）、３．４２−３．３２（ｍ、２Ｈ）、２．３４−２．１６（ｍ、６Ｈ）、１．６６−１．５１（ｍ、２Ｈ）、１．３６（五重線、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．００−０．８５（ｍ、２Ｈ）。
【０２８２】
実施例１５：化合物１１０の調製
１０９（０．４０ｇ、１．０８ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５０ｍＬ）の溶液に、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰ−ＣＯＣｌ；２４０ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（４５２μＬ、３２８ｍｇ、３．２４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、２０時間の間撹拌し、濃縮させた。残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製した（２０％→７０％ＥｔＯＡｃを含むヘプタン）。生成物を無色油として得た（４２４ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、７３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３１−８．２６（ｍ、２Ｈ）、７．４２−７．３７（ｍ、２Ｈ）、５．２０（ｂｓ、１Ｈ）、４．４７−４．４３（ｍ、２Ｈ）、４．１５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．８４−３．８０（ｍ、２Ｈ）、３．７５−３．６０（ｍ、８Ｈ）、３．５９−３．５４（ｍ、２Ｈ）、３．４２−３．３２（ｍ、２Ｈ）、２．３５−２．１６（ｍ、６Ｈ）、１．６６−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．４０−１．３０（ｍ、１Ｈ）、１．００−０．８５（ｍ、２Ｈ）。
【０２８３】
実施例１６：化合物１１１の調製
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｖｃ−ＰＡＢＭＭＡＥ；１３．９ｍｇ；０．０１１ｍｍｏｌを含むＤＭＦ（４００μＬ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（３．４μＬ、２．５ｍｇ、２４．３μｍｏｌ）および１１０（３．０ｍｇ、５．６μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２００μＬ）の溶液を添加した。２５分後、Ｅｔ３Ｎ（１．１μＬ、０．８０ｍｇ、７．９μｍｏｌ）および追加の、１１０（２．２ｍｇ、４．１μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３３μＬ）の溶液。１７．５時間後、２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．２μＬ、１．２ｍｇ、８．１μｍｏｌ）を含むＤＭＦを添加した（１２μＬの１０％ＤＭＦ溶液）。混合物を一晩、フリーザー内で放置し、逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣクロマトグラフィーを介して精製した（３０→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）を含むＨ２Ｏ（１％ＡｃＯＨ）。生成物を無色フィルムとして得た（１０．９ｍｇ、７．２μｍｏｌ．７４％）ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ７８Ｈ１２４Ｎ１１Ｏ１９＋（Ｍ＋Ｈ＋）について計算１５１８．９１  観測１５１９．０９。
【０２８４】
実施例１７−２１：ＥｎｄｏＳＨ
１つの態様では、発明は２つのエンドグリコシダーゼを含む融合酵素に関する。特定の例では、２つのエンドグリコシダーゼＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＨはリンカー、好ましくは−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−（Ｈｉｓ）６−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−リンカーを介して連結される。本発明による融合酵素はＥｎｄｏＳＨとも呼ばれる。本発明による酵素はＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも５０％の配列同一性、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１と好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、例えば、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。同一性は公知の方法および／または当技術分野で知られているコンピュータプログラム法、例えばＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に入手可能なＢＬＡＳＴＰ（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））により容易に計算することができる。好ましくは、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１に対して上記で示される配列同一性を有する発明の酵素は、ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＨ活性を有する。最も好ましくは、本発明による酵素はＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１と１００％の配列同一性を有する。
【０２８５】
ＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＨの融合酵素もまた包含され、ここで、リンカーは、当技術分野で知られている別の好適なリンカーにより置き換えられ、ここで、前記リンカーは剛性であっても可撓性であってもよい。好ましくは、前記リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して相対的に自由に動くことを可能にする可撓性リンカーである。好ましくは、前記可撓性リンカーは、グリシン、セリン、ヒスチジンおよび／またはアラニンのようなアミノ残基から構成され、３〜５９アミノ酸残基、好ましくは１０〜４５または１５〜４０アミノ酸残基、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０アミノ酸残基、または２０〜３８、２５〜３７もしくは３０〜３６アミノ酸残基の長さを有する。任意で、融合酵素は、Ｆｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ポリ（Ｈｉｓ）−タグ、ＨＡ−タグおよびＭｙｃ−タグなど、当技術分野で知られている精製およびまたは検出を容易にするためのタグに共有結合により連結され、またはこれを含む。
【０２８６】
糖タンパク質のトリミングは当技術分野で、例えばＷＯ２００７／１３３８５５号またはＷＯ２０１４／０６５６６１号から知られている。本発明による酵素はＥｎｄｏＳおよびＥｎｄｏＨ活性の両方を示し、糖タンパク質（抗体など）上のグリカンをコアＧｌｃＮＡｃ単位でトリミングし、糖タンパク質上のコアＧｌｃＮＡｃ残基だけを残すことができ（ＥｎｄｏＳ活性）、ならびに高マンノースグリカンを分離することもできる（ＥｎｄｏＨ活性）。驚いたことに、融合酵素の両活性は約７−８のｐＨで円滑に機能し、一方、モノマＥｎｄｏＨは、最適に動作するために、６のｐＨを必要とする。
【０２８７】
本発明による融合酵素は酵素コード配列を含む発現ベクター（例えばプラスミド）を宿主細胞（例えば大腸菌）に導入して発現させるなどの、当技術分野におけるルーチン技術により調製することができ、宿主細胞から、酵素は単離することができる。本発明による融合酵素の調製および精製のための可能なアプローチは実施例１７−１９で与えられ、その機能は実施例２０および２１で証明されており、ここで、トラスツズマブおよび高マンノーストラスツズマブは単一工程で効率的にトリミングされる。融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨによるグリカンの効率的なトリミングの別の例は実施例２４で提供される。
【０２８８】
実施例１７：融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨの（ｐＥＴ２２Ｂ）発現ベクターへのクローニング
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位間にＥｎｄｏＳ−（Ｇ４Ｓ）３−（Ｈｉｓ）６−（Ｇ４Ｓ）３−ＥｎｄｏＨ（ＥｎｄｏＳＨ）コード配列（ＥｎｄｏＳＨはＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１により同定される）を含有するｐＥＴ２２Ｂ−ベクターをＧｅｎｓｃｒｉｐｔから得た。ＥｎｄｏＳＨ融合タンパク質のためのＤＮＡ配列は、Ｎ末端連結グリシン−セリン（ＧＳ）リンカーを介してＥｎｄｏＨに縮合されたＥｎｄｏＳのコード残基４８−９９５から構成される。グリシン−セリン（ＧＳ）リンカーは、−（Ｇ４Ｓ）３−（Ｈｉｓ）６−（Ｇ４Ｓ）３−フォーマットを含み、２つの酵素のスペーシングを可能にし、同時にＩＭＡＣ−精製タグを導入する。
【０２８９】
実施例１８：融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨの大腸菌発現
ＥｎｄｏＳＨ融合タンパク質（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１により同定される）の発現は、プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ−ＥｎｄｏＳＨ）のＢＬ２１細胞中への形質転換で開始する。次の工程はＢＬ２１細胞を用いた５００ｍＬ培養物（ＬＢ培地＋Ａｍｐｉｌｉｃｉｎ）の接種である。ＯＤ６００が０．７に到達した時に、培養物を１ｍＭ  ＩＰＴＧ（５００μＬの１Ｍ原液）で誘発した。
【０２９０】
実施例１９：大腸菌からの融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨの精製
３７℃での一晩誘発後、培養物を遠心分離によりペレット化した。ペレットを４０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、氷上で５ｍｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍＬ）と共に３０分間インキュベートした。半時間後、５ｍｌの１０％トリトン−Ｘ−１００を添加し、氷上で超音波処理した（１０分）。音波処理後、細胞デブリを遠心分離（１０分８０００ｘｇ）により除去し、続いて、０，２２μＭ−孔径フィルターを介して濾過した。可溶性抽出物をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  ５ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを最初にバッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。保持されたタンパク質をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５、１０ｍＬ）で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりポリアクリルアミドゲル（１２％）上で分析した。精製標的タンパク質を含有した画分を合わせ、バッファーを、一晩４℃で実施された透析により２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５および１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して交換した。アミコンウルトラ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、精製タンパク質を少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。生成物をさらなる使用の前に−８０℃で貯蔵する。
【０２９１】
実施例２０：ＥｎｄｏＳＨによるトラスツズマブのトリミング
２５ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８中のトラスツズマブ（Ｅｐｉｒｕｓ  ｂｉｏｐｈａｒｍａ（Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダ）から入手；１４ｍｇ／ｍＬ）を０．１または１ｗ／ｗ％のいずれかの濃度のＥｎｄｏＳＨを用いてトリミングした。反応物、３５０μｇトラスツズマブ（２５μＬ）および適切な量のＥｎｄｏＳＨを３７℃で撹拌し、ＭＳ分析により時間と共に、１〜３時間分析した。試料を分析前にＦａｂｒｉｃａｔｏｒ処理に供した。トリミング生成物（コアＧｌｃＮＡｃ糖残基にトリミングされている）への完全変換を３７℃で０．１ｗ／ｗ％  ＥｎｄｏＳＨを用いて１時間後に観察した。
【０２９２】
実施例２１：融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨによる高マンノーストラスツズマブのトリミング
２５ｍＭ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ８中の、高マンノースグリカンを有するトラスツズマブ（Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により実施された、キフネンシンの存在下でのＣＨＯ  Ｋ１細胞における一過性発現を介して得られた）（１４ｍｇ／ｍＬ）を、０．１または１ｗ／ｗ％のいずれかの濃度のＥｎｄｏＳＨを用いてトリミングした。反応物、３５０μｇ高マンノーストラスツズマブ（２５μＬ）および適切な量のＥｎｄｏＳＨを３７℃で撹拌し、ＭＳ分析により時間と共に、１〜３時間分析した。試料を分析前にＦａｂｒｉｃａｔｏｒ処理に供した。トリミング生成物（コアＧｌｃＮＡｃ糖残基にトリミングされている）への完全変換を３７℃で１ｗ／ｗ％  ＥｎｄｏＳＨを用いて３時間後に観察した。
【０２９３】
実施例２２−２８：ｃＡＣ１０バイオコンジュゲートの調製
修飾生体分子１３ｄの調製を以下で記載される手順に従い、ｃＡＣ１０のグリカンのトリミングのためのエンドグリコシダーゼ融合タンパク質ＥｎｄｏＳ−リンカー−ＥｎｄｏＨ（ＥｎｄｏＳＨとも呼ばれ、ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：１により同定される）を使用して、実施する。第２の工程ではトリミングされたｃＡＣ１０を、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴの作用により、基質としての６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（ＧｌｙｃｏＨｕｂから市販）の存在下で、アジド修飾ｍＡｂ１３ｄに変換させた。ｃＡＣ１０バイオコンジュゲートの調製は、図１３に概略的に図示される。修飾生体分子１３ｅ（抗体ｍＡｂ−３に基づくが、その他の点では１３ｄに同一）を、さらに下記で記載されるように、同じ様に調製した。
【０２９４】
実施例２２：ｃＡＣ１０の一過性発現および精製
ｃＡＣ１０をＣＨＯ  Ｋ１細胞中にＥｖｉｔｒｉａ（Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により５Ｌスケールで一過性発現させた。上清を、５０ｍＬプロテインＡセファロースで充填されたＸＫ  ２６／２０カラムを用いて精製した。単一実行で、５Ｌの上清をカラムにロードし、続いて、少なくとも１０カラム体積の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。保持されたタンパク質を０．１ＭグリシンｐＨ２．７で溶出した。溶出したｃＡＣ１０を１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８で直ちに中和し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に対して透析した。次に、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  Ｔｕｒｂｏ  １５限外濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、ＩｇＧをおよそ２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、さらなる使用の前に−８０℃で貯蔵した。
【０２９５】
実施例２３：Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）の一過性発現および精製
Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２により同定される）をＣＨＯ  Ｋ１細胞中にＥｖｉｔｒｉａ（Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により５Ｌスケールで一過性発現させた。上清を、２５ｍＬ  Ｎｉセファロースエクセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で充填されたＸＫ  １６／２０カラムを用いて精製した。各実行でおよそ１．５Ｌ上清をカラムにロードし、続いて、少なくとも１０カラム体積のバッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、５ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄した。保持されたタンパク質をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）で溶出した。ＨｉＰｒｅｐ  Ｈ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、溶出画分のバッファーを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０に交換した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  Ｔｕｒｂｏ  ４限外濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、精製タンパク質を少なくとも３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、さらなる使用の前に−８０℃で貯蔵した。
【０２９６】
実施例２４：融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨによるトリミングされたｃＡＣ１０の調製
ｃＡＣ１０（Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により実施されたＣＨＯ  Ｋ１細胞における一過性発現を介して得られた）のグリカントリミングを、融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨを用いて実施した。よって、ｃＡＣ１０（１４．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＥｎｄｏＳＨ（１ｗ／ｗ％）と共に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと共におよそ１６時間の間３７℃でインキュベートした。トリミングされたＩｇＧを、３×１Ｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に対して透析した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析はコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換ｃＡＣ１０に対応する１つの主要生成物（観察質量２４１０５Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ８０％）、および、コアＧｌｃＮＡｃ−置換ｃＡＣ１０およびＣ末端リジンを有するコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換ｃＡＣ１０に対応する２つの微量生成物（観察質量２３９５９および２４２３３Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ５および１５％）に属するＦｃ／２−断片の３つのピークを示した。
【０２９７】
実施例２５：ＴｎＧａｌＮＡｃＴの作用下でのトリミングされたｃＡＣ１０への６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰの糖転移
基質６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（１１ｄ）を、発明との関連で生体分子として好適な修飾生体分子ｃＡＣ１０−（６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ）２１３ｄの調製のために使用する。実施例２４において以上で記載される通りのｃＡＣ１０のＥｎｄｏＳＨ処理により得られた、トリミングされたｃＡＣ１０（１０ｍｇ／ｍＬ）を基質６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（２．５ｍＭ、ＧｌｙｃｏＨｕｂから市販）および０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）（５ｗ／ｗ％）と共に１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２および２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中、３０℃でインキュベートした。３時間後、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）の量を１ｍｇ／ｍＬ（１０ｗ／ｗ％）の最終濃度まで増加させ、反応物を一晩３０℃でインキュベートした。生体分子１３ｄを反応混合物から、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ５ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。溶出ＩｇＧを１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８で直ちに中和し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４．に対して透析した。次に、ＩｇＧをアミコンウルトラ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２３．３８ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析はコア６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換ｃＡＣ１０に対応する１つの主要生成物（観察質量２４３３３Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ８０％）、および、コア６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−置換ｃＡＣ１０およびＣ末端リジンを有する６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換ｃＡＣ１０に対応する２つの微量生成物（観察質量２４１８７および２４４６１Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ５および１５％）に属するＦｃ／２−断片の３つのピークを示した。
【０２９８】
実施例２６：コンジュゲート１１３を得るための１３ｄの１００とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物１００の生体分子としての修飾生体分子１３ｄへのコンジュゲーションにより調製した。ｃＡＣ１０（アジド）２（１３ｄ）（２８７μＬ、６．７ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２３．３８ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＰＢＳ  ｐＨ７．４（１３３μＬ）および化合物１００（２７μＬ、１０ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物を示した（観察質量２５８４４Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ８０％）。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は１．８８の平均ＤＡＲを示した。
【０２９９】
実施例２７：コンジュゲート１１４を得るための１３ｄの１０８とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物１０８の生体分子としての修飾生体分子１３ｄへのコンジュゲーションにより調製した。ｃＡＣ１０（アジド）２（１３ｄ）（２８７μＬ、６．７ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２３．３８ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＰＢＳ  ｐＨ７．４（１３３μＬ）および化合物１０８（２７μＬ、１０ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物を示した（観察質量２５９２８Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ７０％）。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は１．８５の平均ＤＡＲを示した。
【０３００】
実施例２８：コンジュゲート１１２を得るための１３ｄの１１１とのコンジュゲーション
対照バイオコンジュゲートを、リンカー−コンジュゲートとしての化合物１１１の生体分子としての修飾生体分子１３ｄへのコンジュゲーションにより調製した。ｃＡＣ１０（アジド）２（１３ｄ）（２８７μＬ、６．７ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２３．３８ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（４８．２μＬ）および化合物１１１（１１１．８μＬ、４ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物を示した（観察質量２５８５３Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ８０％）。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は１．８８の平均ＤＡＲを示した。
【０３０１】
実施例２９−３２：トラスツズマブおよびｃＡＣ１０  ＡＤＣを用いたインビボ有効性および毒性研究
実施例２９：トラスツズマブＡＤＣ９５−９８を用いて実施したインビボ有効性研究
雌ＳＨＯマウス（Ｃｒｌ：ＳＨＯ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈｒｈｒ、実験相の初めに６〜９週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、フランスから入手）をケタミン／キシラジンで麻酔し、皮膚を、クロルヘキシジン溶液で消毒し、肩甲骨間領域のレベルで切開し、２０ｍｍ３腫瘍断片２０（ＨＢＣｘ−１３Ｂ乳癌患者由来異種移植片モデル）を皮下組織内に置き、皮膚をクリップで閉じた。腫瘍体積が６０−２００ｍｍ３の範囲にあった場合、４匹のマウス群にビヒクル、９５（３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇ）、９６（３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇ）、９７（３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇ）、９８（３ｍｇ／ｋｇおよび９ｍｇ／ｋｇ）のいずれかをｉ．ｖ．注射した。腫瘍を毎週２回測定した。
【０３０２】
腫瘍体積についての結果は、図１４に図示されている。リンカーの型は腫瘍体積に著しい効果を有することが見出された。本発明によるリンカーを含むＡＤＣ（９５および９７）はＰＥＧ−リンカーを有するＡＤＣ（９６および９８）よりも著しく優れている。
【０３０３】
実施例３０：ｃＡＣ１０  ＡＤＣ１１２−１１４を用いて実施したインビボ有効性研究
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）から得られたＣＲ雌ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウス、実験相の初めに８〜１２週齢を５０％マトリゲル中１×１０７  ＫＡＲＰＡＳ−２９９腫瘍細胞を皮下、側腹部に（Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞異種移植片モデル）注射した。腫瘍体積が１００−１５０ｍｍ３の範囲にあった場合、８匹のマウスの群にビヒクル、１１２（１ｍｇ／ｋｇ）、１１３（１ｍｇ／ｋｇ）、および１１４（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかをｉ．ｖ．注射した。腫瘍を毎週２回測定した。
【０３０４】
腫瘍体積についての結果は、図１５に図示されている。リンカーの型は腫瘍体積に著しい効果を有することが見出された。本発明によるリンカーを含むＡＤＣ（１１３および１１４）はＰＥＧ−リンカーを有するＡＤＣ（１１２）よりも著しく優れている。
【０３０５】
実施例３１：トラスツズマブＡＤＣ９７および９８を用いて実施されたラット安全性研究
スプラーグドーリーラット（１群当たり３匹の雄および３匹の雌）：ＯＦＡ：ＳＤ、実験相の初めに６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−Ｎｕｅｌｌｅｓ、フランスから入手を、９７（（１）２０ｍｇ／ｋｇおよび（２）４０ｍｇ／ｋｇ）、または９８（（１）２０ｍｇ／ｋｇおよび（２）４０ｍｇ／ｋｇ）静脈内（ボーラス）注射を用いて、尾静脈に導入されたマイクロフレックス注入セットを使用して（１ｍＬ／分で２ｍＬ／ｋｇ）処置した。１つの動物群（対照）をビヒクルで処置した。投与後、全ての動物を５日の観察期間の間維持した。生存する動物を５日目に死亡させた。各動物を無作為化／選択時に、投与前に（０日目）ならびに２日目および４日目に秤量した。全ての動物（死亡が見出された、または瀕死で死亡させたものを含む）を完全剖検手順に供した。肝臓、脾臓および坐骨神経の病理組織学的検査を、全ての動物について実施した。血液試料（瀕死で死亡させた動物に対するものを含む）を回収し、血液学的ならびに血清臨床的化学パラメータの両方の決定に供した。
【０３０６】
血小板数および体重についての結果は、図１６Ａ及び図１６Ｂに図示されており、動物は本発明によるコンジュゲート（９７）および従来リンカーを有するコンジュゲート（９８）に同等に良好に耐容性を示すことができたことを証明する。血小板数および体重における有意な差異は観察されなかったが、両方のパラメータはビヒクル処置ラットでは急速に減少した。
【０３０７】
実施例３２−４２：リンカー−コンジュゲート１２１、１２４、１２９および１３０の調製
本発明によるリンカー−コンジュゲート１２４、１２６および１３０、ならびに対照リンカー−コンジュゲート１２１、１２５および１２９の合成が本明細書で記載される。
【化２２】
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【０３０８】
実施例３２：化合物１１９の調製
１１０（０．９０ｇ；１．６９ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（５０ｍＬ）の溶液に、ジエタノールアミン（ＤＥＡ、２３１ｍｇ；２．２０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（７ｍＬ）の溶液およびＥｔ３Ｎ（７０７μＬ；５１３ｍｇ；５．０７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で４３時間の間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。水相をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １／９）により精製した。生成物を無色フィルムとして得た（７８４ｍｇ；１．５７ｍｍｏｌ；９３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．６７−５．６０（ｍ、１Ｈ）、４．３２−４．２７（ｍ、２Ｈ）、４．１４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．８９−３．７９（ｍ、４Ｈ）、３．７５−３．６０（ｍ、１０Ｈ、３．５８−３．５３（ｍ、２Ｈ）、３．５３−３．４４（ｍ、４Ｈ）、３．４０−３．３３（ｍ、２Ｈ）、２．３５−２．１８（ｍ、６Ｈ）、１．６２−１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．４２−１．３０（ｍ、１Ｈ）、１．００−０．８８（ｍ、２Ｈ）。
【０３０９】
実施例３３：化合物１２０の調製
１１９（０．７８ｇ；１．５５ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（２０ｍＬ）の溶液にクロロギ酸４−ニトロフェニル（９３８ｍｇ；４．６５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．０８ｍＬ；７８４ｍｇ；７．７５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１７時間の間撹拌し、濃縮させた。残渣を２度フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １／９（カラム１）、５０％ＥｔＯＡｃを含むヘプタン→ＥｔＯＡｃ（カラム２））により精製した。生成物を淡黄色油として得た（４２３ｍｇ；０．５１ｍｍｏｌ；３３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３１−８．２５（ｍ、４Ｈ）、７．４２−７．３５（ｍ、４Ｈ）、５．２２−５．１４（ｍ、１Ｈ）、４．４８−４．４３（ｍ、４Ｈ）、４．３３−４．２８（ｍ、２Ｈ）、４．１４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．７８−３．６８（ｍ、６Ｈ）、３．６７−３．５９（ｍ、８Ｈ）、３．５７−３．５１（ｍ、２Ｈ）、３．３９−３．３２（ｍ、２Ｈ）、２．３４−２．１６（ｍ、６Ｈ）、１．６０−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．４０−１．３０（ｍ、１Ｈ）、０．９９−０．８８（ｍ、２Ｈ）。
【０３１０】
実施例３４：リンカー−コンジュゲート１２１の調製
１２０（３４ｍｇ、４１μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４００μＬ）の溶液に、トリエチルアミン（２８μｌ；２０ｍｇ；２０１μｍｏｌ）およびｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（８３ｍｇ；６７μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１．０ｍＬ）の溶液を添加した。混合物をＤＭＦ（１２００μＬ）で希釈し、４１時間の間放置し、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（４７μＬ、４８ｍｇ、３２２μｍｏｌ）を添加した。８０分後、反応混合物をＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した（Ｃ１８、３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）を含む水（１％ＡｃＯＨ）。所望の生成物を無色油として得た（６６ｍｇ、２４μｍｏｌ、５８％（１２０に基づく）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ１４２Ｈ２２６Ｎ２２Ｏ３５２＋（Ｍ＋２Ｈ＋）について計算１４００．３３  観測１４０１．０８。
【０３１１】
実施例３５：化合物１２２の調製
化合物９９（０．３９ｇ；０．７３４ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（３０ｍＬ）の溶液に、ジエタノールアミン（ＤＥＡ、１０７ｍｇ；１．０２ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（２ｍＬ）の溶液およびＥｔ３Ｎ（３０５μＬ；２２１ｍｇ；２．１９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１７時間の間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（３０ｍＬ）で洗浄した。水相をＤＣＭ（３０ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した（ＤＣＭ→ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １／９）。生成物を無色フィルムとして得た（１６３ｍｇ；０．３３ｍｍｏｌ；４５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）６．２９（ｂｓ、１Ｈ）、４．３３−４．２９（ｍ、２Ｈ）、４．２８（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．９０−３．８０（ｍ、４Ｈ）、３．６９−３．６４（ｍ、２Ｈ）、３．６１（ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、４Ｈ）、３．３２（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７−２．１８（ｍ、６Ｈ）、１．６０−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．３９（五重線、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．０５−０．９４（ｍ、２Ｈ）。
【０３１２】
実施例３６：化合物１２３の調製
１２２（１６３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸４−ニトロフェニル（１３４ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２３０μＬ；１６７ｍｇ；１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、１７時間の間撹拌し、濃縮させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した（５０％ＥｔＯＡｃを含むヘプタン→１００％ＥｔＯＡｃ）。生成物を無色油として得た（６９ｍｇ；０．０８４ｍｍｏｌ；２５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．２９−８．２３（ｍ、４Ｈ）、７．４２−７．３５（ｍ、４Ｈ）、５．８１−５．７１（ｍ、１Ｈ）、４．５３−４．４３（ｍ、４Ｈ）、４．３６−４．３０（ｍ、２Ｈ）、４．２５（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．８１−３．７０（ｍ、４Ｈ）、３．７０−３．６５（ｍ、２Ｈ）、３．６２−３．５６（ｍ、２Ｈ）、３．３２−３．２４（ｍ、２Ｈ）、２．３４−２．１４（ｍ、６Ｈ）、１．６０−１．４５（ｍ、２Ｈ）、１．３５（五重線、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．０２−０．９１（ｍ、２Ｈ）。
【０３１３】
実施例３７：リンカー−コンジュゲート１２４の調製
１２３（２７ｍｇ、３３μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４００μＬ）の溶液に、トリエチルアミン（２２μｌ；１６ｍｇ；１５８μｍｏｌ）および、ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（９６ｍｇ；７８μｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１．０ｍＬ）の溶液を添加した。混合物を１９時間の間放置し、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（３７μＬ、３８ｍｇ、２５３μｍｏｌ）を添加した。２時間後、反応混合物をＤＭＦで希釈し（１００μＬ）、ＲＰ  ＨＰＬＣにより精製した（Ｃ１８、３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）を含む水（１％ＡｃＯＨ）。所望の生成物を無色フィルムとして得た（４１ｍｇ、１４．７μｍｏｌ、４５％）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ１３８Ｈ２１９Ｎ２３Ｏ３５Ｓ２＋（Ｍ＋２Ｈ＋）について計算１３９５．７９  観測１３９６．３１。
【化２３】
2019507741.tif 000025
【０３１４】
実施例３８：化合物１２５の調製
ＢＣＮ−ＯＳｕカーボネート（６６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、アミノ−ｄＰＥＧ８−酸（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（６９ｍｇ、９４μＬ、０．６７８ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ／水（１０ｍＬ／１０ｍＬ）の混合物を一晩撹拌した。リン酸カリウムバッファー（０．５Ｍ、ｐＨ３．０）を添加し、ｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液の添加により３．０とした。水溶液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。生成物を無色油として得た（１３８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ；９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ５．４３−５．３５（ｍ、１Ｈ）、４．１４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、３．７７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．６８−３．６０（ｍ、２８Ｈ）、３．５８−３．５３（ｍ、２Ｈ）、３．４０−３．３３（ｍ、２Ｈ）、２．６０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、２．３５−２．１６（ｍ、６Ｈ）、１．６５−１．５０（ｍ、２Ｈ）、１．４０−１．３０（ｍ、１Ｈ）、１．００−０．８５（ｍ、２Ｈ）。
【０３１５】
実施例３９：化合物１２６の調製
ＢＣＮアルコール（０．３８４ｇ、２．５５ｍｍｏｌｅ）を含むＭｅＣＮ（２５ｍＬ）の溶液をＮ２雰囲気下で０℃まで冷却し、クロロスルホニルイソシアネート（ＣＳＩ）を１滴ずつ添加した（０．２５５ｍＬ、４１５ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌｅ、１．１５当量）。１５分間の撹拌後、Ｅｔ３Ｎを１滴ずつ添加し（１．４２ｍＬ、１．０３ｇ、１０．２ｍｍｏｌｅ、４当量）、撹拌をさらに１０分間続けた。次に、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）酢酸（１．０ｇ、６．１ｍｍｏｌｅ、２．４当量）を含むＨ２Ｏ（５ｍＬ）の溶液を添加し、反応混合物を室温まで２時間の間撹拌した。この時間の後、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１００ｍＬ）を添加し、層を分離した。分液漏斗中の水層に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を添加し、ｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌを用いて４に調整し、その後、層を分離した。水層を２回ＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮させた。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによりシリカ上で、ＣＨ２Ｃｌ２〜２０％ＭｅＯＨを含むＣＨ２Ｃｌ２で溶離して精製した。無色粘着性ろうとしての１２６の収率０．４２ｇ（１．０ｍｍｏｌｅ、３９％）。
【化２４】
2019507741.tif 000026
【０３１６】
実施例４０：化合物１２８の調製
パラジウムテトラキストリフェニルホスフィンＰｄ（ＰＰｈ３）４（４．８ｍｇ、４．１５μｍｏｌ）を秤量し、Ｎ２の雰囲気下に置く。ピロリジン（５．０μＬ、４．３ｍｇ、６０μｍｏｌ）を含むＤＣＭ（１ｍＬ）の溶液を、Ｎ２を溶液に通してバブリングすることにより脱気する。１２７（２７ｍｇ、２４μｍｏｌ）を含むＤＣＭ（６ｍＬ）の溶液を、Ｎ２を溶液に通してバブリングすることにより脱気する。Ｎ２を依然として溶液に通してバブリングさせながら、ピロリジンの脱気溶液を添加する。秤量したＰｄ（ＰＰｈ３）４をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解し、０．９ｍＬのこの溶液を添加する。Ｎ２の５０分のバブリング後、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２５ｍＬ）で洗浄する。分離後、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×２５ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせて乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させる。残渣をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する（３０−９０％ＭｅＣＮ（０．１％ギ酸）を含むＨ２Ｏ（０．１％ギ酸）。画分を合わせ、ＳＰＥ（ＨＣＯ３−）カラムに通過させ、濃縮させる。ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）の添加後、混合物を再び濃縮する。得られた残渣を次の工程で使用する。
【０３１７】
実施例４１：化合物１２９の調製
１２８（６．８ｍｇ、７．４μｍｏｌ）および１２５（５．６ｍｇ、９．０μｍｏｌ）を含むＣＨＣｌ３（４００μＬ）の混合物をＥＤＣ．ＨＣｌ（２．６ｍｇ、１３．５μｍｏｌ）に添加した。混合物を１．５時間の間放置し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（２．６ｍｇ、１３．６μｍｏｌ）および２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１．３μＬ、１．３ｍｇ、８．８μｍｏｌ）を添加した。混合物を一晩放置し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈した。有機溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣を逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣクロマトグラフィーを介して精製した（３０→９０％ＭｅＣＮ（酸なし）を含むＨ２Ｏ（０．０１％ギ酸）。ＨＰＬＣ捕集管を５％（ＮＨ４）ＨＣＯ３水溶液で充填し、その後、収集する。所望の生成物を含む画分をプールし、ジクロロメタン（１０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させ、これにより、所望の生成物を得た（４．６ｍｇ、３．０μｍｏｌ、４１％）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）  Ｃ７９Ｈ１０９Ｎ８Ｏ２２＋（Ｍ＋Ｈ＋）について計算１５２１．７７  観測１５２１．９９。
【０３１８】
実施例４２：化合物１３０の調製
１２８を含むＣＨＣｌ３（５ｍＬ）の溶液に、１２６（１５ｍｇ、３６μｍｏｌ）を含むＣＨＣｌ３（０．８ｍＬ）の溶液を添加する。得られた混合物を固体ＥＤＣ．ＨＣｌ（４．７ｍｇ、２５μｍｏｌ）に添加し、ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）を添加し、混合物を１６時間の間放置した。ＤＣＭ（３０ｍＬ）を添加し、得られた混合物を水（３０ｍＬ）で洗浄する。分離後、水相をＤＣＭ（３０ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせて乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。残渣をＲＰ−ＨＰＬＣ（３０−９０％ＭｅＣＮ（酸なし）を含むＨ２Ｏ（０．０１％ギ酸）により精製する。ＨＰＬＣ捕集管を５％（ＮＨ４）ＨＣＯ３水溶液で充填し、その後、収集する。ＨＰＬＣ画分を合わせ、ＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出する。有機層を合わせて乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮させた。生成物１３０を淡黄色油として得る（２１ｍｇ、１６μｍｏｌ、ｍｗ１３２３ｇ／ｍｏｌｅ、１２７から２工程で６７％）。
【０３１９】
実施例４３−４４：ｃＡＣ１０バイオコンジュゲートの調製
実施例４３：コンジュゲート１１５を得るための１３ｄの１２１とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートをリンカー−コンジュゲートとしての化合物１２１の生体分子１３ｄとしてのアジド修飾ｃＡＣ１０へのコンジュゲーションにより調製した。ｃＡＣ１０−（６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ）２（１３ｄ）（８．４０８ｍＬ、２４６．０ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２９．３ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、プロピレングリコール（１１．９０９ｍＬ）および化合物１２１（４１０．６μＬ、４０ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温でおよそ４０時間の間インキュベートした。反応混合物をＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して透析し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物を示した（観察質量２７１３２Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ８０％）。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は３．８１の平均ＤＡＲを示した。
【０３２０】
実施例４４：コンジュゲート１１６を得るための１３ｄの１２４とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートを、リンカー−コンジュゲートとしての化合物１２４の生体分子１３ｄとしてのアジド修飾ｃＡＣ１０へのコンジュゲーションにより調製した。よって、ｃＡＣ１０−（６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ）２（１３ｄ）（９．９５ｍＬ、２０５ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２０．７ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（１．０ｍＬ）、ＤＭＦ（２．５６８ｍＬ）および化合物１２４（１７１．７μＬ、４０ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、続いて、透析し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物を示した（観察質量２７１２４Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ８０％）。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は３．７９の平均ＤＡＲを示した。
【０３２１】
実施例４５−４８：ｍＡｂ−３バイオコンジュゲートの調製
修飾生体分子１３ｅの調製を、ｃＡＣ１０について以上で記載されるのと同様の手順に従い、ｍＡｂ−３のグリカンのトリミングのためのエンドグリコシダーゼ融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨを使用して、実施する。第２の工程では、トリミングされたｍＡｂ−３を、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴの作用により、基質としての６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（ＧｌｙｃｏＨｕｂから市販）の存在下、アジド修飾抗体１３ｅに変換させた。
【０３２２】
実施例４５：融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨによりトリミングされたｍＡｂ−３の調製
ｍＡｂ−３のグリカントリミングを、融合タンパク質ＥｎｄｏＳＨを用いて実施した。ｍＡｂ−３の溶液（２３．２１ｍＬ、２００ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中８．６ｍｇ／ｍｌ）にＥｎｄｏＳＨ（５２６μＬ、２．０ｍｇ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５中３．８ｍｇ／ｍｌ）を添加した。反応物をおよそ１６時間の間３７℃でインキュベートした。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換ｍＡｂ−３に対応する、１つの主要生成物（観察質量２４１３９Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ９０％）に属するＦｃ／２−断片の１つの主要ピークを示した。トリミングされたＩｇＧを、２×１Ｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを有する）に対して透析し、続いて、スピン濾過（アミコンウルトラ−４、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、２１．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した
【０３２３】
実施例４６：ＴｎＧａｌＮＡｃＴの作用下での６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰのトリミングされたｍＡｂ−３への糖転移
基質６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（１１ｄ）を、発明との関連で生体分子として好適な、修飾生体分子ｍＡｂ−３−（６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ）２１３ｅの調製のために使用する。実施例４８で得られた、トリミングされたｍＡｂ−３（９．２９７ｍＬ、２００ｍｇ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを有する２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中２１．５ｍｇ／ｍｌ）の溶液に、ＭｎＣｌ２（１３３μＬ、ＭＱ中０．１Ｍ）、Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）（３．１１２ｍＬ、１５ｍｇ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中４．８２ｍｇ／ｍｌ）および６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（１．０ｍＬ、６３ｍｇ、ＭＱ中０．１Ｍ）を添加した。反応物をおよそ１６時間の間３０℃でインキュベートした。生体分子１３ｅを反応混合物から、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ５ｍｌカラム（直列に連結された３つのカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。溶出ＩｇＧを１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８で直ちに中和し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４に対して透析した。次に、ＩｇＧをアミコンウルトラ−４、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２０．１７ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コア６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換ｍＡｂ−３に対応する、１つの主要生成物（観察質量２４３６５Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ９０％）に属するＦｃ／２−断片の１つの主要ピークを示した。
【０３２４】
実施例４７：コンジュゲート１１７を得るための１３ｅの１２９とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートを、リンカー−コンジュゲートとしての化合物１２９の生体分子としてのアジド修飾ｍＡｂ−３へのコンジュゲーションにより調製した。よって、ｍＡｂ−３−（６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ）２（１３ｅ）（１．６６７ｍＬ、４０．６ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２４．６ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＰＢＳ  ｐＨ７．４（６３６μＬ）、ＤＭＦ（１６３μＬ）および化合物１２９（２４４μＬ、１０ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、続いて、透析し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物（観察質量２５８９０Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ９０％）を示した。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は１．９６の平均ＤＡＲを示した。
【０３２５】
実施例４８：コンジュゲート１１８を得るための１３ｅの１３０とのコンジュゲーション
本発明によるバイオコンジュゲートを、リンカー−コンジュゲートとしての化合物１３０の生体分子としてのアジド修飾ｍＡｂ−３へのコンジュゲーションにより調製した。よって、ｍＡｂ−３−（６−Ｎ３−ＧａｌＮＡｃ）２（１３ｅ）（１．６６７ｍＬ、４０．６ｍｇ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中２４．６ｍｇ／ｍｌ）の溶液にＰＢＳ  ｐＨ７．４（６３６μＬ）、ＤＭＦ（１９０μＬ）および化合物１３０（２１７μＬ、１０ｍＭ  ＤＭＦ溶液）を添加した。反応物を室温で一晩インキュベートし、続いて、透析し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＡＫＴＡ清浄機−１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ消化試料の質量スペクトル分析は、コンジュゲートＦｃ／２断片に対応する、１つの主要生成物（観察質量２５６９１Ｄａ、総Ｆｃ／２断片のおよそ９０％）を示した。還元試料のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は１．９８の平均ＤＡＲを示した。
【０３２６】
実施例４９−５１：ｍＡｂ−３  ＡＤＣを用いたインビボ有効性および毒性研究
実施例４９：ｃＡＣ１０  ＡＤＣ１１５および１１６を用いて実施したインビボ有効性研究
ＣＲ雌ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウス、実験相の初めに８〜１２週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから入手）に５０％マトリゲル中１×１０７ＫＡＲＰＡＳ−２９９腫瘍細胞を皮下、側腹部に注射した（Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞異種移植片モデル）。腫瘍体積が１００−１５０ｍｍ３の範囲にあった場合、８匹のマウスの群に、ビヒクル、１１５（１および２ｍｇ／ｋｇ）およびアドセトリス（登録商標）（１および２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかをｉ．ｖ．注射した。腫瘍を毎週２回測定した。腫瘍体積についての結果は、図１７ａに図示されている。
【０３２７】
別々であるが同一の研究において、８匹のマウスの群に、ビヒクル、１１６（１ｍｇ／ｋｇ）およびアドセトリス（登録商標）（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを注射した。腫瘍を毎週２回測定した。腫瘍体積についての結果は、図１７ｂに図示されている。
【０３２８】
リンカーの型は腫瘍体積に著しい効果を有することが見出された。本発明によるリンカーを含むＡＤＣ（１１６）はアドセトリス（登録商標）よりも同じ用量で著しく優れていたが、一方、別の研究では、先行技術ＰＥＧ−リンカーを有するＡＤＣ（１１５）の有効性はアドセトリス（登録商標）よりも同じ用量で小さくなる。
【０３２９】
実施例５０：ｃＡＣ１０  ＡＤＣ１１２−１１４を用いて実施されたラット安全性研究
雌ウィスターラット（１群あたり２匹の雌）、実験相の初めに５〜６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから入手を、１１２（４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇ）、１１３（４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇ）または１１４（４０、６０、７０または８０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。試験アイテムを、尾静脈に導入されたマイクロフレックス注入セットを使用して、静脈内（ボーラス）注射により投与した（１ｍＬ／分で２ｍＬ／ｋｇ）。１つの動物群をビヒクルで処置した（対照）。投与後、全ての動物を１２日の観察期間の間維持した。生存する動物を１２日目に安楽死させた。各動物を無作為化／選択時に、投与前に（０日目）ならびに１２日目までのその後の日にち全てで秤量した。＞３０％体重減少の１回の観察または＞２５％体重減少の３回連続測定を有するいずれの個々の動物も安楽死させた。全ての動物（死亡が見出された、または瀕死で死亡させたものを含む）を完全剖検手順に供した。肝臓、脾臓および坐骨神経の病理組織学的検査を、全ての動物について実施した。血液試料（瀕死で死亡させた動物に対するものを含む）を回収し、血液学的ならびに血清臨床的化学パラメータの両方の決定に供した。
【０３３０】
ＡＤＣについての異なる投与計画に対するラットの体重減少パーセンテージについての結果は、図１８ａ−ｃに図示されている。これらの結果から、１１２−１１４全てについての最大耐容量（ＭＴＤ）は６０ｍｇ／ｋｇであると見出されることは明らかである。
【０３３１】
実施例５１：ｃＡＣ１０  ＡＤＣ１１５、１１６およびアドセトリス（登録商標）を用いて実施されたラット安全性研究
雌ウィスターラット（１群あたり２匹の雌）、実験相の初めに５〜６週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡから入手を、１１５（８０、１２０、１４０または１６０ｍｇ／ｋｇ）、１１６（８０、１２０、４０または１６０ｍｇ／ｋｇ）またはアドセトリス（登録商標）（１５、２０または４０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。試験アイテムを、尾静脈に導入されたマイクロフレックス注入セットを使用して、静脈内（ボーラス）注射により投与した（１ｍＬ／分で２ｍＬ／ｋｇ）。１つの動物群をビヒクルで処置した（対照）。投与後、全ての動物を１２日の観察期間の間維持した。生存する動物を１２日目に安楽死させた。各動物を無作為化／選択時に、投与前に（０日目）ならびに１２日目までのその後の日にち全てで秤量した。＞３０％体重減少の１回の観察または＞２５％体重減少の３回連続測定を有するいずれの個々の動物も安楽死させた。全ての動物（死亡が見出された、または瀕死で死亡させたものを含む）を完全剖検手順に供した。肝臓、脾臓および坐骨神経の病理組織学的検査を、全ての動物について実施した。血液試料（瀕死で死亡させた動物に対するものを含む）を回収し、血液学的ならびに血清臨床的化学パラメータの両方の決定に供した。
【０３３２】
ＡＤＣについての異なる投与計画に対するラットの体重減少パーセンテージについての結果は、図１９ａ−ｃに図示されている。これらの結果から、アドセトリスについての最大耐容量（ＭＴＤ）は１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、一方、ＡＤＣ１１５および１１６についてのＭＴＤは１２０ｍｇ／ｋｇであると見出されることは明らかである。
【０３３３】
実施例５２−５３：ｍＡｂ−３  ＡＤＣを用いたインビボ有効性および毒性研究
実施例５２：ｍＡｂ−３  ＡＤＣ１１７および１１８を用いて実施したインビボ有効性研究
５×１０６  ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１腫瘍細胞を雌胸腺欠損ヌードマウスに皮下移植した。ビヒクル、１１７、１１８または（標的陰性）対照ＡＤＣの投与を１０匹のマウスの群において、腫瘍体積が８８−１７２ｍｍ３に到達した時に開始した。全ての処置を、尾静脈注射により１回静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。投与体積を１０ｍＬ／ｋｇ体重とし、各個々の動物の体重まで増大させた。動物を、それらの腫瘍体積が１５００ｍｍ３のエンドポイント体積に到達した場合または研究の終わりに、どちらか最初に来た方で安楽死させた。群の平均腫瘍体積の計算については、下記規則を適用した：動物が腫瘍サイズのために研究を外れた場合、その動物について記録された最終腫瘍体積は、その後の時間点での平均体積を計算するために使用されるデータと共に含めた。腫瘍体積および体重値は、群内の動物の５０％未満が研究に残っていた場合、群平均腫瘍体積／体重を計算するために使用しなかった。Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をグラフィカルプレゼンテーションおよび統計分析のために使用した。エラーバーはＳＥＭを示す。４つ全ての群についての平均腫瘍体積は図２０においてグラフにより図示される。
【０３３４】
実施例５３：ｍＡｂ−３  ＡＤＣ１１７および１１８を用いて実施されたラット安全性研究
ラット耐容性研究を、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで米国農務省（ＵＳＤＡ）動物福祉法、実験動物研究協会からの実験動物の管理と使用に関するガイドライン、および国立衛生研究所（ＮＩＨ）ガイドラインを順守して実施した。２４匹の、およそ２５０グラムの体重を有するＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雄ラットを各々３匹の動物の群に無作為化した。ラットに単一ｉ．ｖ．用量（２、３または６ｍｇ／ｋｇ）の１１７、１１８またはビヒクルを尾静脈注射により与えた。投与体積は５ｍＬ／ｋｇ体重とし、各個々の動物の体重まで増大させた。動物を、それらが不良臨床状態を示した場合または研究の終わりに、どちらか最初に来た方で安楽死させた。動物の臨床観察を研究期間中定期的に実施した。血液試料（１００μＬ〜１．８ｍＬ）を１日目の１、３および６時間；ならびに２、３、７、８、１４および２１日目（研究日の最後）に収集した。
【０３３５】
結果：１１７は３ｍｇ／ｋｇで良好な耐容性を示したが、６ｍｇ／ｋｇでは、良好ではない耐容性を示し、１０日目に、不良臨床状態のために早期屠殺となった。１１８は３ｍｇ／ｋｇおよび６ｍｇ／ｋｇで良好な耐容性を示した。これらの群全てにおける体重増加は、研究の持続期間にわたって、ビヒクル処置群で観察されたものより著しく低く、これは摂食量の低減と関連した。網状赤血球、赤血球量、血小板、好中球、単球、白血球およびリンパ球における用量依存低減が、１１７および１１８で、試験した用量の両方にて（３および６ｍｇ／ｋｇ）処置した動物において観察された。３ｍｇ／ｋｇの１１８で処置した動物は、２１日目までにこれらのパラメータの可逆性のエビデンスを示した。１１７および１１８についてのＭＴＤを、それぞれ３および６ｍｇ／ｋｇと確立した。
【０３３６】
【化２５】
2019507741.tif 000027
【０３３７】
Ｈｉｓ−ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３３−４２１）の配列（ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ：２）：
1 MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSPLRTYLYT PLYNATQPTL RNVERLAANWPKKIPSNYIE 
61 DSEEYSIKNI SLSNHTTRAS VVHPPSSITE TASKLDKNMT IQDGAFAMISPTPLLITKLM
121 DSIKSYVTTE DGVKKAEAVV TLPLCDSMPP DLGPITLNKT ELELEWVEKKFPEVEWGGRY
181 SPPNCTARHR VAIIVPYRDR QQHLAIFLNH MHPFLMKQQI EYGIFIVEQEGNKDFNRAKL
241 MNVGFVESQK LVAEGWQCFV FHDIDLLPLD TRNLYSCPRQ PRHMSASIDKLHFKLPYEDI
301 FGGVSAMTLE QFTRVNGFSN KYWGWGGEDD DMSYRLKKIN YHIARYKMSIARYAMLDHKK
361 STPNPKRYQL LSQTSKTFQK DGLSTLEYEL VQVVQYHLYT HILVNIDERS
【図１】
2019507741.tif 000035
【図２】
2019507741.tif 000036
【図３】
2019507741.tif 000037
【図４】
2019507741.tif 000038
【図５】
2019507741.tif 000039
【図６】
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【図７】
2019507741.tif 000041
【図８】
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【図９】
2019507741.tif 000043
【図１０】
2019507741.tif 000044
【図１１】
2019507741.tif 000045
【図１２】
2019507741.tif 000046
【図１３】
2019507741.tif 000047
【図１４】
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【図１５】
2019507741.tif 000049
【図１６Ａ】
2019507741.tif 000050
【図１６Ｂ】
2019507741.tif 000051
【図１７ａ】
2019507741.tif 000052
【図１７ｂ】
2019507741.tif 000053
【図１８ａ】
2019507741.tif 000054
【図１８ｂ】
2019507741.tif 000055
【図１８ｃ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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