(57)【要約】本発明は、結合した治療剤または造影剤をさらに含んでいてもよい、リガンド−イオノフォアコンジュゲート、並びに該コンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。さらに、治療剤または造影剤のエンドソーム蓄積および脱出を増大させるために該コンジュゲートを使用する方法を記載する。
2019535719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および／または
siRNA、iRNAまたはマイクロRNAを含んでなる治療剤（ＴＡ）
を含んでなり、
（Ｌ）は場合により少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）および／または（ＴＡ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項３】
治療剤（ＴＡ）が（Ｌ）と共有結合している、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項４】
治療剤（ＴＡ）がsiRNAを含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項５】
治療剤（ＴＡ）がiRNAを含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項６】
治療剤（ＴＡ）がマイクロRNAを含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項７】
（Ｂ）が葉酸である、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項８】
（Ｂ）がＰＳＭＡ結合リガンドである、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項９】
（Ａ）がＮａ＋／Ｈ＋交換輸送体の阻害剤である、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項１０】
イオノフォア（Ａ）がニゲリシンまたはサリノマイシンを含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項１１】
（Ｌ）が約７〜約４５原子の鎖を含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項１２】
以下からなる群
【化１】
2019535719.tif 000050
【化２】
2019535719.tif 000051
【化３】
2019535719.tif 000052
【化４】
2019535719.tif 000053
【化５】
2019535719.tif 000054
【化６】
2019535719.tif 000055
【化７】
2019535719.tif 000056
および
【化８】
2019535719.tif 000057
から選択される式を有する、請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項１３】
次式
【化９】
2019535719.tif 000058
【化１０】
2019535719.tif 000059
【化１１】
2019535719.tif 000060
または
【化１２】
2019535719.tif 000061
を有する請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項１４】
請求項１記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体または添加剤を含有する医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩と、さらなる治療剤を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
治療剤または造影剤のエンドソーム蓄積および脱出を増加させる方法であって、治療剤または造影剤と共に有効量の請求項１記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
治療剤または造影剤が癌に対して標的化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌が、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、腎臓癌、前立腺癌および大腸癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療剤が炎症部位に標的化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
炎症部位が、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、移植片対宿主病、多発性硬化症、骨髄炎、乾癬、クローン病、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される炎症性疾患によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡから選択されるＲＮＡ；または造影剤（ＩＡ）の１またはそれ以上
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）、該ＲＮＡおよび／または（ＩＡ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２２】
次式
【化１３】
2019535719.tif 000062
を有する請求項２１に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２３】
次式
【化１４】
2019535719.tif 000063
または
【化１５】
2019535719.tif 000064
を有する請求項２１に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）に基づき、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１１月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／４２２，９２２号および２０１７年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／４７８，０６３号について優先権を主張する。
【０００２】
政府の権利
本発明は、グラントＰ３０ ＣＡ０２３１６８を通じて国立衛生研究所および国立癌研究所により授与された政府の支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本明細書中に記載される発明は、連結した治療剤または造影剤を含み得る、リガンドイオノフォアコンジュゲート、およびこのコンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。また、記載されたコンジュゲートを、エンドサイトーシスまたは他の同様のプロセスによって内在化される治療剤または造影剤のエンドソーム蓄積および脱出を増加させるために使用する方法も記載される。葉酸受容体を過剰発現する細胞内へのコンジュゲートされたマイクロＲＮＡの送達を媒介する、マイクロＲＮＡの葉酸への直接の結合（FolamiR）による、マイクロＲＮＡの腫瘍組織への送達も記載される。
【背景技術】
【０００４】
背景
多くの病気は、薬または生物学的薬剤で治療することができる（生物学的薬剤の例としては、ヌクレオチド、例えばsiRNA、miRNAなど；天然には存在しない合成アミノ酸を含むアミノ酸；酵素、ペプチド、アプタマー、抗原などを含むタンパク質；および抗体、例えば糖タンパク質、免疫グロブリンなど）。これらの薬物または生物製剤は、それらの標的とするリガンド（例えば葉酸受容体結合リガンド）を用いてそれらの標的細胞に送達することができるが、例えば葉酸が介在するエンドサイトーシス後に、その薬物がエンドソームから放出されないことでその有効性が阻害されることがある。したがって、細胞質への閉じ込められた積み荷（cargo）の「エンドソーム放出」のための新しい方法の発見は、標的化された薬物または生物製剤の増大した有効性を達成するために有用であろう。エンドソーム放出は、健康な組織に対して毒性の低い既知のイノフォアを用いて、この積み荷を含むエンドソームを破裂させるための浸透圧を作り出すためのリガンドイオノフォアコンジュゲートの使用によって促進することができることが見出された。理論に縛られることなく、Ｈ＋イオンの流出とＫ＋イオンの流入が共役するイオノフォアおよびアンチポーターである、ニゲリシンは、細胞内に送達さると、エンドソームの内部でエンドソームの膨潤および／または崩壊をもたらす浸透圧の不均衡とエンドソーム内容物の細胞質内への放出を引き起こすと考えられている。サリノマイシンのようなカリウムイオンを輸送する他のＫ＋イノノフォアもエンドソーム放出に利用できると考えられる。
【化１】
2019535719.tif 000003
【０００５】
エンドソームの膨潤を誘導するために、浸透圧的に活性な（osmotically active）イオンがエンドソームに入り込み、それに付随して浸透圧による水の流入を促進することができる。この水の流入がエンドソームを膨張させ、最終的にはその破裂を引き起こす。しかしながら、浸透圧的に活性なイオンの流入が別の浸透圧的に活性なイオンの流出を伴う場合、水流の正味の変化は起こらず、エンドソームは膨張しないであろう。したがって、エンドソーム膨潤が起こるためには、浸透圧的に活性なイオン（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋）が、本質的に唯一の浸透圧的に不活性なカチオンであるＨ＋と交換にエンドソームに入る必要がある。さらに、自発的に濃度勾配をもってエンドソームに流れ込む唯一の浸透圧的に活性なイオンがK+であるため、エンドソームの膨潤を引き起こすのに有用なイノフォアはH+イオンとK+イオンを交換することができるイノフォアである。
【０００６】
Ｎａ＋／Ｈ＋交換輸送体（アンチポーター）は天然のエンドソームトランスポーターであり、その機能はエンドソームのｐＨを変えることである。それは、H+と引き換えにナトリウムイオンをエンドソームから移動させ、エンドソームの収縮を引き起こすことにより、Ｋ+イノフォア誘導エンドソーム膨潤に対して作用し得る。したがって、Ｋ+イノフォアの作用は、天然に存在するNa+/H+交換輸送体（アンチポーター）によって軽減される可能性があるが、アミロライド、またはHOE 694などのNa+/H+交換輸送体の阻害剤の同時添加によって増強される。
【０００７】
葉酸受容体は、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、腎臓癌および大腸癌などの多くのヒトの癌の細胞膜上、ならびに慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、変形性関節症、糖尿病、乾癬などの炎症性疾患に関与する活性化マクロファージにおいて過剰発現する。葉酸は、葉酸受容体に対して高い結合親和性（Ｋｄ＝１０−１０Ｍ）を有し、オフサイト毒性を回避する選択的な方法で、放出可能な積荷を葉酸受容体に送達することができる。これらの受容体に結合したリガンドは、膜がカベオラに侵入し、内在化し、そして表面から分離した後、エンドソームの一部となる。
【０００８】
エンドサイトーシスまたは同様のプロセスが可能な受容体に送達された薬物の積み荷は罹患細胞に選択的に送達されるが、細胞質または核へ送達される積み荷の経路は、「エンドソーム」と呼ばれる陥入した原形質膜によって完全にまたは部分的に遮断され得る。ペプチド、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、アプタマー、オリゴ糖類、多糖類などの高分子量の薬剤は、リガンド標的化エンドサイトーシス経路を介して内在化されると、エンドソームから脱出することができない。したがって、閉じ込められた積み荷はエンドソーム内に留まり、最終的にはエンドソーム内に存在する酸および酵素の作用によってより小さな断片に分解されてから不活性な形態で放出される。本発明のコンジュゲートは、標的細胞における、治療剤または造影剤のエンドソーム蓄積および脱出の両方を増大させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
概要
いくつかの実施形態では、本開示は、共有結合した葉酸とマイクロＲＮＡとのコンジュゲートまたはその模倣体、および薬理学的に許容できる担体、希釈剤、または添加剤を含んでなる標的化されたマイクロＲＮＡ送達システムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態を以下に記載する：
１．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および／または
siRNA、iRNAまたはマイクロRNAを含んでなる治療剤（ＴＡ）
を含んでなり、
（Ｌ）は場合により少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）および／または（ＴＡ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
１ａ．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および
siRNA、iRNAまたはマイクロRNAを含んでなる治療剤；
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１１】
２．（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１２】
３．治療剤（ＴＡ）が（Ｌ）と共有結合している、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１３】
４．治療剤（ＴＡ）がsiRNAを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１４】
５．治療剤（ＴＡ）がiRNAを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１５】
６．治療剤（ＴＡ）がマイクロRNAを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１６】
７．（Ｂ）が葉酸である、上記項目のいずれかに記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１７】
８．（Ｂ）がＰＳＭＡ結合リガンドである、上記１〜６のいずれかに記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１８】
９．（Ａ）がＮａ＋／Ｈ＋交換輸送体の阻害剤である、上記項目のいずれかに記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００１９】
１０．イオノフォア（Ａ）がニゲリシンまたはサリノマイシンを含んでなる、上記９に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００２０】
１１．（Ｌ）が約７〜約４５原子の鎖を含んでなる、上記項目のいずれかに記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００２１】
１２．以下からなる群
【化２】
2019535719.tif 000004
【化３】
2019535719.tif 000005
【化４】
2019535719.tif 000006
【化５】
2019535719.tif 000007
【化６】
2019535719.tif 000008
【化７】
2019535719.tif 000009
【化８】
2019535719.tif 000010
および
【化９】
2019535719.tif 000011
から選択される式を有する、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００２２】
１３．次式
【化１０】
2019535719.tif 000012
【化１１】
2019535719.tif 000013
【化１２】
2019535719.tif 000014
または
【化１３】
2019535719.tif 000015
を有する上記１のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００２３】
１４．上記１〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩、および少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体または添加剤を含有する医薬組成物。
【００２４】
１５．上記１〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩、およびさらなる治療剤を含有する医薬組成物。
【００２５】
１６．治療剤または造影剤のエンドソーム蓄積および脱出を増加させる方法であって、治療剤または造影剤と共に有効量の上記１〜１３のいずれかに記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩を投与する工程を含む方法。
【００２６】
１７．治療剤または造影剤が癌に対して標的化されている、上記１６に記載の方法。
【００２７】
１８．癌が、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、腎臓癌、前立腺癌および大腸癌からなる群から選択される、上記１７に記載の方法。
【００２８】
１９．治療剤が炎症部位に標的化されている、上記１６に記載の方法。
【００２９】
２０．炎症部位が、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、移植片対宿主病、多発性硬化症、骨髄炎、乾癬、クローン病、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される炎症性疾患によって引き起こされる、上記１９に記載の方法。
【００３０】
２１．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡから選択されるＲＮＡ；または造影剤（ＩＡ）の１またはそれ以上
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）、該ＲＮＡおよび／または（ＩＡ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００３１】
２２．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および
Ｃｙ５を含んでなる蛍光色素
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００３２】
２３．次式
【化１４】
2019535719.tif 000016
を有する上記２１または２２に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００３３】
２３．次式
【化１５】
2019535719.tif 000017
または
【化１６】
2019535719.tif 000018
を有する上記２１に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、in vivoで葉酸コンジュゲートを用いたmiR-34a Renillaセンサーの標的化されたサイレンシングを示す。データポイントは、各時間の葉酸−ＮＣ（ネガティブコントロール：スクランブルmiRNA)に対して正規化した。(Fol-DB-miR-34a：葉酸−DBCO−miR-34a；Fol−SS−Nig miR-34a：葉酸−ss−DBCO−ニゲリシン−miR-34a；Fol-DB-Nig miR-34a：葉酸−DBCO−ニゲリシン−miR-34a)
【００３５】
【図２】図２は、ネガティブコントロールに対して正規化したルシフェラーゼ発光量（relative light unit）の時間（ｈ）に対するプロットを示す。データは、MDA-MB-231細胞においてFol-Nig-siLucが初期（early）ルシフェラーゼノックダウンを誘導することを示す。Fol-ネガティブコントロール（Fol-NC：葉酸−DBCO−ネガティブコントロール（スクランブルRNA)またはFol-Nig-NC：葉酸−ニゲリシン−DBCO−ネガティブコントロール（スクランブルRNA））に対して正規化したMDA-MB-231センサー細胞からのルシフェラーゼ活性レベル。平均 ± S.D., 反復データ（technical replicates）＝ 3, n＝3, ＊＊ Ｐ<0.01.  矢印は、葉酸コンジュゲートの新用量(50 nM)の培地に置換したことを示す。Fol-siLuc2：葉酸−DBCO−siLuc2；Fol-Nig-siLuc2：葉酸−ニゲリシン−DBCO−siLuc2.
【００３６】
【図３】図３Ａ〜Ｂは、処理後３時間の葉酸−Ｃｙ５（５０ｎＭ）で処理したＲａｂ５Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現するMDA-MB-231細胞の生細胞画像を示す。
【００３７】
【図４】図４Ａ〜Ｂは、処理後３時間の葉酸−ニゲリシン−Ｃｙ５（５０ｎＭ）で処理したＲａｂ５Ｂ−ＧＦＰを安定的に発現するMDA-MB-231細胞の生細胞画像を示す。
【００３８】
【図５】図５Ａ〜Ｆは、培養中の細胞におけるFolamiR取り込みの特異性を示す。図５Ａは、FolamiRの提案された作用機序を示す。図５Ｂは、放出不能なリガンドを保持しているFolamiR-34aコンジュゲート−FolamiR-34a、放出可能なリガンドを保持しているFolamiR-34aコンジュゲート−FolamiR-SS-34a（ジスルフィド結合を赤で示す）、および放出不能な葉酸リガンドおよびＮＩＲ部分（緑色で表示）を保持しているmiR-34aコンジュゲート−NIR-FolamiR-34aの構造を示す。葉酸部分は青で、miRNAは赤で示す。図５Ｃは、ＦＲ陽性MDA-MB-231乳癌細胞およびＦＲ陰性Ａ５４９肺癌細胞における葉酸受容体α（ＦＲα）の同定を示す。ヒストグラムは、未染色（Ａ）、ＦＲα（Ｃ）およびアイソタイプ対照（Ｂ）染色細胞の百分率として、オーバーレイフローサイトメトリーデータを表す。図５Ｄは、ＦＲ陰性Ａ５４９肺癌細胞と比較した、ＦＲ陽性MDA-MB-231乳癌細胞におけるNIR-F-34a取り込みを示す。ヒストグラムは、未染色（Ａ）の、およびNIR-FolamiR-34a（５０ｎＭ）染色（Ｂ）の細胞の百分率として、重ね合わせたフローサイトメトリーデータを表す。図５Ｅは、ＦＲ陰性Ａ５４９肺癌細胞と比較した、ＦＲ陽性MDA-MB-231乳癌細胞における葉酸−フルオレセインイソチオシアネート（Ｆｏｌ−ＦＩＴＣ）取り込みを示す。スケールバー：50μｍ。図５Ｆは、in vitroでのFolamiRを使用したmiR-34a Renillaセンサーの標的化されたサイレンシングを示す。
【００３９】
【図６】図６Ａ〜Ｅは、FolamiRに対する細胞応答を示す。図６Ａは、in vitroでのFolamiRを用いたmiR-34a Renillaセンサーの標的化されたサイレンシングを示す。各時間について、データポイントをFolamiR-NC（ネガティブコントロールロール：スクランブルmiRNA）に対して正規化した。図６Ｂは、FolamiR処理（５０ｎＭ）に対するMDA-MB-231癌細胞の増殖および生存を示す。各時間について、データポイントをFolamiR-NCに対して正規化した。エラーバーは平均±s.d.を表す。実験はそれぞれ、ｎ＝３、処理毎に少なくとも４回の反復データである。図６Ｃは、FolamiR-34aに対するMDA-MB-231の用量応答を示す。Renilla値は処置の９６時間後に測定した。データポイントはFolamiR-NCに対して正規化した。エラーバーは平均±s.d.を表す。実験はそれぞれ、ｎ＝３、処理毎に少なくとも４回の反復データである。統計解析は、事後ボンフェローニ検定を用いるone-way ANOVAで行った（**、Ｐ＜0.01；****、Ｐ＜0.0001）。図６Ｄは、漸増濃度の葉酸グルコサミンコンジュゲートを用いた、ヒトMDA-MB-231細胞（５０ｎＭ、４℃）からのNIR-FolamiR-34a結合の置換を示す。ヒストグラムは、未染色の、およびNIR-FolamiR-34a染色の細胞の百分率として、オーバーレイフローサイトメトリーデータを表す。図６Ｅは、in vitroでのFolamiR-34a競合アッセイを示す。
【００４０】
【図７】図７Ａ〜Ｇは、FolamiR-34aがMDA-MB-231腫瘍の増殖を阻害することを実証する。図７Ａは、５ｎｍｏｌのNIR-FolamiR-34a、NIR-FolamiR-SS-34aまたはNIR-FolamiR-NCの静脈内注射後にMDA-MB-231センサー異種移植片を移植した雌性Nu/Nuコンジェニックマウスの代表的なライブイメージングを示す。左側は蛍光分布を示し、右側はmiR-34aRenillaセンサーシグナルを示す。図７Ｂは、MDA-MB-231 Renillaセンサー活性に対するNIR-FolamiR-34a送達の効果を示す；データはすべて、０日目のRenillaシグナルに対して正規化し、平均±s.e.mとして示す（ｎ＝３）。統計分析は事後ボンフェローニ検定を用いるone-way ANOVAで行った（＊＊、Ｐ＜0.01）。図７Ｃは、蛍光に関して可視化されたMB-231乳癌および全身器官の肉眼画像を示す（Ｔ、腫瘍；Ｉｎｔ、腸；Ｓ、脾臓；Ｋ、腎臓；Ｌｖ、肝臓；ＨＬｕ、心肺；）。図７Ｄは、NIR-FolamiRコンジュゲート注射後７２時間目のｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された切除されたMDA-MB-231腫瘍からのmiR-34aレベルを示す（ｎ＝３、エラーバーは平均±s.d.を表す。統計分析は事後ボンフェローニ検定を用いるone-way ANOVAで行った、＊＊、Ｐ＜0.01）。図７Ｅは、生きた動物からのＮＩＲ落射蛍光定量化を示す。雌のNu/Nuコンジェニックマウスの左肩にA549細胞を移植し、右肩にMDA-MB-231センサー異種移植片を移植し、100倍モル過剰以上の葉酸−グルコサミンの存在下（右）または非存在下（左）で5nmolのNIR-FolamiR-34aを静脈内注射した後にライブイメージングを実施した（１群あたりｎ＝３）。エラーバーは平均±s.d.を表し、統計分析はone-way ANOVAで行った、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。図７Ｆは、図７Ｅから得た器官および腫瘍の蛍光分布を示す：Ａ５４９：ＦＲ陰性腫瘍；ＭＢ２３１（MDA-MB-231）：ＦＲ陽性腫瘍；Ｉｎｔ、腸；Ｓ、脾臓；Ｋ、腎臓；Ｌｖ、肝臓；HLu、心肺。図７Ｇは、FolamiR-34a処置後の腫瘍サイズを示す（ｎ＝５、エラーバーは平均±s.e.m.を表す、統計分析はtwo-way ANOVAで行った、＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。矢印は処置の時点（１ｎｍｏｌ、静脈内注射）を表す。腫瘍をノギスで測定し、腫瘍体積を体積（ｍｍ３）＝幅×（長さ２）×２−１により計算した。
【００４１】
【図８】図８Ａ〜Ｄは、マウスＫｒａｓLSL-G12D/+；ｐ５３flx/flx肺腺癌がＦＲ（葉酸受容体）を発現することを示す。  図８Ａは、蛍光画像化リガンドＯＴＬ３８（On Target Laboratories, LLC、West Lafayette, IN；蛍光近赤外（ＮＩＲ）色素にコンジュゲートした葉酸受容体α（ＦＲα）ターゲティングリガンド）が肺腫瘍に優先的に保持され、正常な健康組織から排出されることを示している。KrasLSL-G12D/+；腫瘍誘発の８週間後にp53 Flox/Floxマウスに5nmolのOTL38を注射し、注射の２４時間後に屠殺した。対照として非誘導の健康なマウスを使用した。RC、右後葉；RM、内側右葉；RA、右副葉、RCr、右前葉；L、左葉。  図８Ｂは、ＯＴＬ３８で処置したマウスからの肺の右葉の組織図を示す。左：一致するH&E染色スライドを用いた臓器全体の近赤外イメージング。右：腫瘍組織および健常組織の高倍率画像。H&E画像は、明視野および近赤外画像で示される組織のタイプを示す。スケールバー：50μｍ；挿入図：20μｍ。低倍率画像に示された番号付きボックスは、高倍率画像の番号と対応する。  図８Ｃは、１００倍モル過剰以上の葉酸−グルコサミンの存在下または非存在下でのＯＴＬ３８（５nmole）で処置したマウスからの肺葉の全体図を示す（１群あたりｎ＝３）。  図８Ｄは、図８Ｃの組織の代表的な組織図を示す。  図８Ｂ、Ｄは、低倍率のＨ＆Ｅ染色組織を、対応する腫瘍組織の高倍率画像と共に示す。左：高倍率の近赤外画像と対応する臓器全体の近赤外画像。H&E画像は近赤外画像で示される組織のタイプを表する。低倍率H&E画像の四角は、高倍率で示された画像と対応している。10スケールバー：20μm。
【００４２】
【図９】図９Ａ〜Ｆは、FolamiRによるmiR-34aの標的化された置換が肺腺癌のマウスモデルにおいて有益な効果を有することを実証する。図９Ａは、FolamiR-34a処置後のＭＲＩ測定腫瘍量を示す（ｎ＝４または５、エラーバーは平均±s.e.m.を示す。統計分析はtwo-way ANOVAおよび事後ボンフェローニ検定で行った、＊＊、Ｐ＜０．０１）。矢印は処置の時点を表す（１nmol静脈内注射；計１０回）。図９Ｂは、処置期間中（８日目）および処置期間終了時（２９日目）にFolamiRで処置したマウスの代表的なＭＲＩ画像および３Ｄレンダリングを示す。図９Ｃは、示された時間における腫瘍／肺全体の比を示し、肺の体積に対して腫瘍が占めるパーセンテージを示している。エラーバーは平均±s.d.を表し、統計分析はone-way ANOVAで行った、＊ Ｐ＜０．０５。図９Ｄは、各処置群からの動物の左葉の代表的なＨ＆Ｅ染色組織を示す。スケールバー＝１ｍｍ。図９Ｅは、全腫瘍量が、肺の全面積に対する各処置動物から得られた３つの切片から平均した全腫瘍面積から計算されることを示す（バーは中央値を示す、FolamiR-NC：n＝4、FolamiR-34a：n＝5；独立t検定）。図９Ｆは、miR-34標的遺伝子、Ｍｅｔ、Ｍｙｃ、およびＢｃｌ−２をｑＲＴ−ＰＣＲによって評価し、アクチンに対して正規化し、FolamiR-NC処置腫瘍に対してグラフ化したことを示す（バーは中央値を示す、独立t検定：＊ Ｐ＜0.05）。
【００４３】
【図１０】図１０は、miRNA模倣トランスフェクションに対するmiR-34a Renillaセンサーの応答を示す。miR-34a Renillaセンサーを一時的に発現するMDA-MB-231乳癌細胞およびＡ５４９肺癌細胞を用いて、miR-34aの送達および活性をモニターした。Lipofectamine RNAimax（Life Technologies）を用いて、MDA-MB-231およびA549細胞に５０ｎＭのmiR-34a模倣体をトランスフェクトし、処理の９６時間後にRenillaシグナルを測定した。
【００４４】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、MDA-MB-231 miR-34aセンサー細胞の評価を示す。図１１Ａは、MDA-MB-231細胞におけるmiR-34aセンサー特異性および内因性miR-34aのサイレンシング活性を示す。エラーバーは平均±s.d.を表し、実験は３回行った。図１１Ｂは、renilla活性に基づくMB-231クローンの選択を示す。１つのクローンにつき１×１０４細胞を用いてRenilla読み取りを行い、Renilla Glulesferase Kit（Promega）を用いてRenillaレベルを測定した。
【００４５】
【図１２】図１２は、FolamiR-34aの用量増加に対する腫瘍増殖の応答を示す。FolamiR-34a処置後の腫瘍サイズ（ｎ＝５、エラーバーは平均±s.e.m.を表す、統計分析はtwo-way ANOVAで行った、＊＊＊ Ｐ＜０．００１）。矢印は処置の時点（静脈内注射）を表す。腫瘍をノギスで測定し、腫瘍体積を体積（ｍｍ３）＝幅×（長さ２）×２−１により計算した。
【００４６】
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、FolamiRで処置した腫瘍におけるmiR-34aのコピー数を示す。最後の注射の２４時間後に、乳癌異種移植腫瘍（図１３Ａ）および肺腺癌KrasLSL-G12D/+；p53flx/flx腫瘍（図１３Ｂ）からｑＲＴ−ＰＣＲにより測定したMiR-34aレベル（ｎ＝５、エラーバーは平均±s.d.を表す。統計分析はone-way ANOVAまたはスチューデントｔ検定で行った）。
【００４７】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは血清サイトカインおよび最大耐量試験を示す。図１４Ａは、MDA-MB-231腫瘍を有する、FolamiR処置したNu/Nuマウスから得られた血清を関連サイトカインについて評価した：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、およびインターロイキン（ＩＬ）−６（ｎ＝５）を示す。リポ多糖（ＬＰＳ）処置マウスからの血清を陽性検出対照として含めた（ｎ＝２；統計分析は事後ボンフェローニ検定を用いてone-way ANOVAで行った）。図１４Ｂは、漸増用量のFolamiR-34aの静脈内投与前後の体重を示す。統計分析は、事後Bonferroni補正を用いてtwo-way ANOVAで行った。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な記載
本開示の原理の理解を促進するために、図面に示された実施形態を参照し、特定の用語を用いて説明する。但し、それによって本開示の限定が意図されないことは理解されよう。
【００４９】
本開示において、「約」という用語は、記載した値または記載した範囲の限定に関して、例えば、２０％以内、１０％以内、５％以内、または１％以内の、数値または範囲におけるある程度の変動を許容し得る。
【００５０】
本開示において、「実質的に」という用語は、記載した値または記載した範囲の限定に関して、例えば、７０％以内、８０％以内、９０％以内、９５％以内、又は９９％以内の、数値または範囲におけるある程度の変動を許容し得る。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の列挙された条項に記載され、これらの実施形態とこの詳細な説明のセクションに記載されている実施形態の任意の組み合わせが企図される。
【００５２】
１．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および／または
siRNA、iRNAまたはマイクロRNAを含んでなる治療剤（ＴＡ）
を含んでなり、
（Ｌ）は場合により少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）および／または（ＴＡ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５３】
１ａ．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および
siRNA、iRNAまたはマイクロRNAを含んでなる治療剤；
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５４】
２．（Ｌ）少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５５】
３．治療剤（ＴＡ）が（Ｌ）と共有結合している、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５６】
４．治療剤（ＴＡ）がsiRNAを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５７】
５．治療剤（ＴＡ）がiRNAを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５８】
６．治療剤（ＴＡ）がマイクロRNAを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００５９】
７．（Ｂ）が葉酸である、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６０】
８．（Ｂ）がＰＳＭＡ結合リガンドである、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６１】
９．（Ａ）がＮａ＋／Ｈ＋交換輸送体の阻害剤である、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６２】
１０．イオノフォア（Ａ）がニゲリシンまたはサリノマイシンを含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６３】
１１．（Ｌ）が約７〜約４５原子の鎖を含んでなる、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６４】
１２．以下からなる群：
【化１７】
2019535719.tif 000019
【化１８】
2019535719.tif 000020
【化１９】
2019535719.tif 000021
【化２０】
2019535719.tif 000022
【化２１】
2019535719.tif 000023
【化２２】
2019535719.tif 000024
【化２３】
2019535719.tif 000025
【化２４】
2019535719.tif 000026
から選択される式を有する、上記１または１ａのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６５】
１３．次式
【化２５】
2019535719.tif 000027
【化２６】
2019535719.tif 000028
【化２７】
2019535719.tif 000029
または
【化２８】
2019535719.tif 000030
を有する上記１のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００６６】
１４．上記１〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩、および少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体または添加剤を含有する医薬組成物。
【００６７】
１５．上記１〜１３のいずれかに記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩、およびさらなる治療剤を含有する医薬組成物。
【００６８】
１６．治療剤または造影剤のエンドソーム蓄積および脱出を増加させる方法であって、治療剤または造影剤と共に有効量の上記１〜１３のいずれかに記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩を投与する工程を含む方法。
【００６９】
１７．治療剤または造影剤が癌に対して標的化されている上記１６に記載の方法。
【００７０】
１８．癌が、卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、脳腫瘍、腎臓癌、前立腺癌および大腸癌からなる群から選択される、上記１７に記載の方法。
【００７１】
１９．治療剤が炎症部位に標的化されている、上記１６に記載の方法。
【００７２】
２０．炎症部位が、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、移植片対宿主病、多発性硬化症、骨髄炎、乾癬、クローン病、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される炎症性疾患によって引き起こされる、上記１９に記載の方法。
【００７３】
２１．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡから選択されるＲＮＡ；または造影剤（ＩＡ）の１またはそれ以上；
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）、該ＲＮＡおよび／または（ＩＡ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００７４】
２２．細胞表面受容体に標的化されたリガンド（Ｂ）；
１以上のリンカー（Ｌ）；
プロトン（Ｈ＋イオン）の流出とカリウムイオン（Ｋ＋イオン）の流入が共役する１以上のイオノフォア（Ａ）；および
Ｃｙ５を含んでなる蛍光色素
を含んでなり、
（Ｌ）が少なくとも１つの放出可能なリンカーを含んでなり；
（Ｂ）が（Ｌ）と共有結合しており；および
（Ａ）がそれぞれ（Ｌ）と共有結合している、
コンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００７５】
２３．次式
【化２９】
2019535719.tif 000031
を有する上記２１または２２に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００７６】
２３．次式
【化３０】
2019535719.tif 000032
または
【化３１】
2019535719.tif 000033
を有する上記２１に記載のコンジュゲートまたはその薬学的に許容し得る塩。
【００７７】
本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」は、その通常の慣習的な意味であり、リボヌクレオチドを含み得る。リボヌクレオチドの略語（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）は、それらの通常のそして慣用の意味である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートは、ＲＮＡ配列（すなわち、マイクロＲＮＡまたは「miRNA」）を包含し得る。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドは、配列中の文字「ｒ」の直前にあるそれらの通常の一文字略語によって表される（例えば、ｒＡ、ｒＧ、ｒＣ）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列は修飾リボヌクレオチドを含み得る。そのような実施形態では、リボヌクレオチドは、修飾を示すために文字によって配列の直前に置かれた一文字の略語によって表される。一般的な修飾としては、メチル（ｍ）、エチル（ｅ）、アミノ（ａ）、デアミノ（ｏ）などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、メチル化されたシチジンは、本明細書中に記載される配列においてｍＣによって表され得る。当分野において公知の他の改変もまた本開示によって企図されることが理解されよう。
【００７８】
本明細書中で使用される用語「コンジュゲート」は、リガンド−イオノフォア（リガンド−イオノフォアは、リガンドとイオノフォアの間のリンカーがあるまたはないことを意味する）コンジュゲート、または治療剤もしくは造影剤と結合したリガンド−イオノフォア（リガンド−イオノフォアは、リガンドとイオノフォアの間のリンカーがあるまたはないことを意味する）コンジュゲート、あるいはそのコンジュゲートの薬学的に許容し得る塩または溶媒和物を意味する；このコンジュゲートは、プロトン化された形態等の、イオン化された形態で溶液または懸濁液中に存在し得る。
【００７９】
本明細書で使用される用語「イノフォア」はまた、イノフォアのクラスター（例えば樹状構造）も意味する。同様に、リガンド−イオノフォアコンジュゲートとコンジュゲートした治療剤または造影剤は、その薬剤のクラスター（例えば樹状構造）であり得る。
【００８０】
本明細書で使用される用語「放出可能な」は、特定の部分が放出可能なリンカーによってリンカー（Ｌ）に共有結合していることを意味する。
【００８１】
本明細書中で使用される、薬物、治療剤、化学療法剤などの用語には、標的化された形態で、コンジュゲートに組み込むことができる、または個別に投与することができる、それらの類似体が含まれる。
【００８２】
本明細書中で使用される用語「エンドサイトーシス」には、当分野で認識されている意味を有し、ＰＳＭＡ内在化のプロセスなどのいくつかの類似のプロセスが含まれる。
【００８３】
治療剤または造影剤は、合成化学によって調製された薬剤、天然物から単離された薬剤、生物学的に合成された薬剤、またはその治療剤もしくは造影剤を含んでなるリポソーム等の高分子構造物またはデンドリマーであってもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、治療剤は、ポリペプチド、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、糖タンパク質、抗体、抗原、合成アミノ酸、アプタマー、オリゴ糖、または多糖などの生物製剤である。いくつかの実施形態では、治療剤はｓｉＲＮＡ、ｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを含んでなる。
【００８５】
薬剤が造影剤（ＩＡ）である場合、薬剤は、蛍光剤、Ｘ線造影剤（例えばイオビトリドールなど）、ＰＥＴ造影剤、近赤外色素（ＮＩＲ色素）または放射性核種（例えば、ガリウム、インジウム、銅、テクニチウム、あるいはレニウムの同位体）などを含んでなることができる。蛍光剤としては、フルオレセイン、５−アミノ−フルオレセイン、６−アミノ−フルオレセイン、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、ＮＨＳ−フルオレセイン、オレゴングリーン蛍光剤（Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４などが挙げられるがこれらに限定されない）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ蛍光剤（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７などが挙げられるがこれらに限定されない）、フルオレセイン、および関連する類縁体、ＢＯＤＩＰＹ蛍光剤（ＢＯＤＩＰＹ Ｆ１、ＢＯＤＩＰＹが挙げられるがこれらに限定されない）、ローダミン蛍光剤（５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ＴＲＩＴＣ、テキサスレッド、ローダミン１２３、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミンが挙げられるがこれらに限定されない）、ＤｙＬｉｇｈｔ蛍光剤（ＤｙＬｉｇｈｔ ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００などが挙げられるがこれらに限定されない）、ＣＷ ８００、フィコエリスリンなどが挙げられる。本教示に従って使用され得る代表的な近赤外色素としては、ＬＳ２８８、ＩＲ８００、ＳＰ０５４、Ｓ０１２１、ＫＯＤＡＫ、ＩＲＤ２８、Ｓ２０７６、Ｓ０４５６、およびそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８６】
特定の同位体標識されたコンジュゲート、例えば放射性同位元素を組み込んだものとしては、薬物および／または基質の組織分布研究に有用であり得る。放射性同位体トリチウム（すなわち３Ｈ）、および炭素−１４（すなわち１４Ｃ）は、それらの組み込みの容易さおよび容易な検出手段を考慮すると、この目的に特に有用である。
【００８７】
１１Ｃ、１８Ｆおよび１３Ｎなどの陽電子放出同位体での置換は、基質受容体の占有を調べるための陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）試験に有用であり得る。同位体標識されたコンジュゲートは、一般に、当業者に知られている慣用技術、または、以前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を用いて実施例に記載された方法と同様の方法により調製することができる。
【００８８】
「ペイロード」を放出するための放出可能なリンカーの調製と使用は十分に裏付けられている。リガンドとイオノフォアのコンジュゲーションは、例えば、WO 2003/097647、WO 2004/069159、WO 2006/012527、WO 2007/022493、WO 2007/022494、WO 2009/002993、WO 2010/033733およびWO 2010/045584に記載されているような、放出可能なリンカーを用いる薬物の一重または二重コンジュゲーションに使用されるものと同様の手順を利用することができる。上記の特許出願のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの同じ参考文献はまた、治療剤または造影剤をリガンド−イオノフォアコンジュゲートに結合させるため、または、個別にリガンド−治療剤またはリガンド−造影剤化合物を調製するために使用できる方法も記載している。
【００８９】
例えば、フリーのヒドロキシルおよびカルボン酸官能基を含むイオノフォアであり水素イオン／カリウムイオンアンチポーターであるニゲリシンは、実施例に示されるように、ヒドロキシルまたはカルボン酸基に結合した放出可能なリンカーを介してリガンドに化学的に結合する。１つの例では、葉酸−ニゲリシンエステルコンジュゲートにおいて、葉酸リガンドは、ニゲリシンのカルボン酸官能基とジスルフィド含有リンカーを介してコンジュゲートしている。葉酸-S,S-ニゲリシン-S,S-ローダミン二重コンジュゲートについて、同様のコンジュゲーション法が用いられる。別の例としては、葉酸リガンドは、ヒドロキシル基へのジスルフィド結合を介して、葉酸−ニゲリシンコンジュゲートを形成する。
【００９０】
miRNA二本鎖は、２本のＲＮＡオリゴヌクレオチド（miR-34a-5pガイド鎖およびmiR-34a-3pパッセンジャー鎖と呼ばれる）を用いて構築することができる。いくつかの実施形態では、miR-34a-3pパッセンジャー鎖は、５’末端にアジドリンカー、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８位に２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基（ｍと標識）で修飾された２０ｎｔ ＲＮＡオリゴ二重鎖を含んでなり、miR-34a-5pガイド鎖は、５’末端にリン酸基、３’の20および21位に２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を有する２２ｎｔのＲＮＡオリゴを含んでなる。
【００９１】
腫瘍抑制性miRNA、即ちmiR-34aの、レンチウイルス媒介およびリポソーム媒介の送達が、様々な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）マウスモデルにおいて腫瘍量を減少させることが理解されよう。ビークル媒介およびウイルス媒介のmiRNA送達に加え、オリゴヌクレオチドをそのまま全身注射することも試験されており、問題となり得ることもまた理解されるであろう。理論に縛られるわけではないが、静脈内送達に伴う薬物動態学および安定性に関する制限は、局所送達または腎臓や肝臓でのみしばしば見られる高いオリゴヌクレオチド濃度の達成を必要とするかもしれない。いくつかの実施形態では、局所配達は選択肢となり得る。いくつかの実施形態では、本開示のコンジュゲートを用いて、微小転移巣のような、局所送達でアクセス可能な部位を超えた送達を達成することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、非標的送達の課題の克服は、腫瘍細胞上に特異的に過剰発現している細胞表面受容体のコンジュゲートを適用することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、本開示のコンジュゲートは、局所送達でアクセス可能な部位を超えたmiRNA模倣体送達を行うために適用され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体に結合するリガンドを機能的に活性なmiRNAにコンジュゲートさせることができ、得られた分子を用いてmiRNAを腫瘍細胞に特異的に標的化することができる。いくつかの実施形態では、標的受容体は葉酸受容体（ＦＲ）であり得る。葉酸受容体は正常細胞と比較して癌細胞上で過剰発現することが知られており、受容体の発現レベルは癌細胞への治療的量のmiRNAの送達を可能にするのに十分でなければならない。葉酸受容体（ＦＲ）は、乳癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、および結腸癌を含む多くの上皮癌、ならびに急性骨髄性白血病などの様々な血液悪性腫瘍において過剰発現することが知られている。対照的に、正常組織上のＦＲの存在は量が限られており、標的化された薬物適用においては無視できるものであり、または血液由来の葉酸にはアクセスできないと思われる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、結合するリガンドは、高い結合親和性でＦＲと結合し、ＦＲに対して選択的であり、受容体への結合を妨げない造影剤または治療剤とのコンジュゲーションを容易にする誘導体化が可能な官能基を含むＦＲリガンド、ビタミンＢ９（葉酸）であり得る。いくつかの実施形態では、miRNAまたはsiRNAなどの低分子ＲＮＡの送達に関して、ＦＲ／葉酸−コンジュゲート療法が本明細書に記載される。
【００９４】
小さい放射性医薬品から大きいＤＮＡ含有製剤まで、様々なペイロードによる葉酸−標的化送達の成功例が、前臨床および臨床の両方のレベルで示されてきた。しかしながら、循環中の低分子ＲＮＡは保護する必要があるという仮説のために、低分子ＲＮＡの葉酸介在の送達は遅れをとっている。このレベルの保護を達成するために低分子ＲＮＡ送達の分野で研究されている様々な戦略において、担体ビークル（デンドリマー、コポリマー、リポソーム）上に葉酸が組み込まれた。これらの複合体は非常に大きいサイズを有することがあり、大部分の固形腫瘍にみられる高密度の細胞外マトリックスによって標的組織への侵入が妨げられることが多い。本明細書では、FolamiRと名付けたmiRNA模倣体を葉酸リガンドに直接結合させたコンジュゲートについての証拠を示す。理論に拘束されることなく、本明細書に記載のFolamiRは、より大きなmiRNA封入ビークルよりも容易に固形腫瘍を灌流することができる。考えられる１つの問題は、天然型の低分子ＲＮＡが血中で比較的不安定であるということである。いくつかの実施形態では、本開示のコンジュゲートは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基で最小限の修飾がされたmiRNA模倣体のパッセンジャー鎖を含み、これは、ＲＮＡを安定化し、アルゴノートローディング（loading）を損なうことなくヌクレアーゼ耐性を増大することが可能である。
【００９５】
ローダミンに結合した葉酸は、静脈内投与後５分以内に固形腫瘍で飽和状態となるとみられる。葉酸コンジュゲート分子が腫瘍に侵入する速度は、本明細書に記載のFolamiRが循環中でごく短期間存続すればよいことを示している。
【００９６】
いくつかの実施形態において、本開示は、機能的で事実上保護されていないmiRNAを腫瘍組織に特異的かつ迅速に送達するための方法を提供する。本明細書では、miRNA-34a（miR-34a）が腫瘍を選択的に標的とし得、腫瘍形成性細胞に入り、標的遺伝子を下方制御し得、そしてインビボで腫瘍の増殖を抑制し得ることが実証される。いくつかの実施形態では、miR-34aを葉酸に直接コンジュゲート（FolamiR-34a）することによって媒介される迅速な腫瘍取り込みが有益であり得る。
【００９７】
本明細書中に記載される発明にはさらに、本明細書中に記載されるリガンド−イオノフォアコンジュゲートおよびさらに少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体または添加剤を含有する医薬組成物が含まれる。リガンド−イオノフォアコンジュゲートは好ましくは、非経口的に（例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内または髄腔内）患者（すなわち、それを必要とする対象）に投与される。あるいは、リガンド−イオノフォアコンジュゲートは、他の医学的に有用な方法（例えば、吸入、経鼻投与、口腔吸収、経皮、直腸または膣座薬、経口など、および有効な用量と適当な剤型（徐放製剤を含む）など）によって患者（例えば、ヒトまたは動物）に投与することができる。
【００９８】
非経口剤形の例としては、等張生理食塩水、グルコース溶液または他の周知の薬理学的に許容できる液体担体（例えば、液体のアルコール、グリコール、エステル、およびアミド）中のリガンド−イオノフォアコンジュゲートの水溶液、またはリポソームの懸濁液が挙げられる。本発明の非経口剤形は、リガンド−イノフォアコンジュゲートの用量を含む再構成可能な凍結乾燥物の形態でもよい。一実施形態では、例えば、本明細書の一部を構成する米国特許第４，７１３，２４９号；第５，２６６，３３３号；および第５，４１７，９８２号に記載されている生分解性炭水化物マトリックスなどの当技術分野で公知の数多くの徐放製剤を投与する、あるいは、低速ポンプ（例えば、浸透圧ポンプ）を使用することができる。
【００９９】
関係する医療専門家によって決定されるように、リガンド−イオノフォアコンジュゲートの投与は、エンドサイトーシスによって内在化される治療剤または造影剤の投与の前、後または同時に行うことができる。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をさらに説明する。但し、以下の例示的な実施例は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書で使用される略語として以下が挙げられる：ＤＣＣ、ジシクロヘキシルカルボジイミド；Ｐｙ、２−ピリジル；ＲＴ、室温。
【０１０１】
製造実施例
材料
ペプチド合成のためのアミノ酸はAapptec, USAから購入した。Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（HATU）およびベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBOP）はSigma-Aldrichから入手した。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、標準的なペプチド合成装置（Chemglass、Vineland、NJ）を用いて行った。特に記載しない限り、他の化学物質は全てSigma-Aldrichから購入した。葉酸コンジュゲートはいずれも分取逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ（Agilent）によって精製し、ＬＣ／ＭＳ分析は、ＵＶダイオードアレイ検出器と組み合わせたAgilent質量分析計を使用した。
【０１０２】
葉酸-EDAコンジュゲートの合成
【化３２】
2019535719.tif 000034
ペプチド合成容器に、エチレンジアミン、ポリマー結合（２００〜４００メッシュ）樹脂（１．０００ｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１当量）を入れ、ジクロロメタン（３ｍＬ）、続いてジメチルホルムアミド（３ｍＬ）で１時間膨潤させた。次いで、この容器に、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ溶液（０．１８０８ｇ、０．４２５ｍｍｏｌ、２．５当量）、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ−ｉ−Ｐｒ２Ｎｅｔ、０．２２０２ｇ、１．７ｍｍｏｌ、１０当量）および（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ、０．２２１２ｇ、０．４３ｍｍｏｌ、２．５当量）を加えた。アルゴンを４時間通気し、カップリング溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびイソプロパノール（ｉ−ＰｒＯＨ）（３×１０ｍＬ）で洗浄した。カイザーテストを実施して反応の完了を確認した。各アミノ酸カップリングの前に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（３×１０ｍＬ）を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。上記の順序を繰り返して、Tfa.プテロイン酸との反応を完了させた。最後に、樹脂をＤＭＦ中の５０％水酸化アンモニウム（３×１０ｍＬ）で５分間洗浄してプテロイン酸上のトリフルオロ−アセチル保護基を切断し、ｉ−ＰｒＯＨ（３×１０ｍＬ）、続いてＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をアルゴン下で３０分間乾燥した。９５％ＣＦ３ＣＯＯＨ、２．５％Ｈ２Ｏおよび２．５％トリイソプロピルシランからなる開裂混合物を用いて、葉酸−ＥＤＡペプチドを樹脂から切断した。開裂混合物１０mlを入れて、アルゴンを１．５時間通気した。開裂混合物をきれいなフラスコに排出した。さらなる開裂混合物で樹脂を３回洗浄した。合わせた混合物を減圧下で少量（約５ｍＬ）まで濃縮し、冷エチルエーテルを添加することによって沈殿させた。沈殿物を遠心分離により集め、エチルエーテルで洗浄し（３回）、高真空下で乾燥した。粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから３０％Ｂ）により精製し、葉酸−ＥＤＡを６５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから３０％Ｂ）ＲＴ＝３．２６分（Ｍ＋Ｈ＋＝４８４．０）。
【０１０３】
葉酸−DBCOコンジュゲートの合成
【化３３】
2019535719.tif 000035
ＤＭＳＯ中の葉酸−ＥＤＡ（０．０１００ｇ、０．０２０６ｍｍｏｌ、１当量）およびＮＨＳ−ＤＢＣＯ（０．００９１ｇ、０．０２２７ｍｍｏｌ、１．１当量）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００３９ｇ、０．０３０９ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴加した。反応混合物を室温で撹拌し続けた。反応の進行をＬＣＭＳによってモニターした。葉酸−ＥＤＡが完全に変換されたら、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−ＤＢＣＯを８５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから５０％Ｂ）ＲＴ＝４．６２分（Ｍ＋Ｈ＋＝７７１．０）。
【０１０４】
葉酸−SS−DBCOコンジュゲートの合成
【化３４】
2019535719.tif 000036
ＤＭＳＯ中の葉酸−ＥＤＡ（０．０１００ｇ、０．０２０６ｍｍｏｌ、１当量）およびＮＨＳ−SS−DBCO（０．０１２８ｇ、０．０２２７ｍｍｏｌ、１．１当量）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００３９ｇ、０．０３０９ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴加した。反応混合物を室温で撹拌し続けた。反応の進行をＬＣＭＳでモニターした。葉酸−ＥＤＡを完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分で０％Ｂから５０％Ｂ）、８２％の収率で葉酸−ＳＳ−ＤＢＣＯを得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから５０％Ｂ）ＲＴ＝５．４分（Ｍ＋Ｈ＋＝９３４．０）
【０１０５】
葉酸−Cysコンジュゲートの合成
【化３５】
2019535719.tif 000037
ペプチド合成容器にH-Cys（Trt）-2-Cl-Trt-樹脂（100-200メッシュ、0.200 g、0.088 mmol、１当量）を入れ、ジクロロメタン（３mL）、続いてジメチルホルムアミド（３mL）で１時間膨潤させた。次いで、この容器に、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ溶液（０．０８０ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ、２．０当量）、ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（０．０６８４ｇ、０．５２８ｍｍｏｌ、６．０当量）、およびＰｙＢＯＰ（０．１８３２ｇ、０．３５ｍｍｏｌ、４．０当量））を加えた。アルゴンを４時間バブリングし、カップリング溶液を排出し、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）およびｉ−ＰｒＯＨ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。カイザーテストを実施して反応の完了を確認した。各アミノ酸カップリングの前に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（３×１０ｍＬ）を用いてＦｍｏｃ脱保護を行った。上記の順序を繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（０．０７４９ｇ、０．１７６ｍｍｏｌ、２．０当量）との反応およびＴｆａ．プテロイン酸（０．０３５９ｇ、０．０８８ｍｍｏｌ、１．０当量）カップリング工程を完了させた。最後に、樹脂をＤＭＦ中の２％ヒドラジン（３×１０ｍＬ）で５分間洗浄してプテロイン酸上のトリフルオロ−アセチル保護基を切断し、ｉ−ＰｒＯＨ（３×１０ｍＬ）、続いてＤＭＦ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。樹脂をアルゴン下で３０分間乾燥した。９２．５％ＣＦ３ＣＯＯＨ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％のエタンジチオールおよび２．５％トリイソプロピルシランからなる開裂混合物を用いて、葉酸−Ｃｙｓペプチドを樹脂から切断した。開裂混合物１０ｍｌを入れて、アルゴンを１．５時間通気した。開裂混合物をきれいなフラスコに排出した。さらなる開裂混合物で樹脂を３回洗浄した。合わせた混合物を減圧下で少量（約５ｍＬ）まで濃縮し、エチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物を遠心分離により集め、エチルエーテルで洗浄し（３回）、高真空下で乾燥した。粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから３０％Ｂ）により精製し、葉酸−Ｃｙｓを収率７２％で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから３０％Ｂ）ＲＴ＝３．７３分（Ｍ＋Ｈ＋＝６５９．０）。
【０１０６】
ニゲリシンのピリジルジスルフィドアミド誘導体の調製
【化３６】
2019535719.tif 000038
ニゲリシン遊離酸（０．０３５ｍｍｏｌ）、Ｐｙ−ＳＳ−（ＣＨ２）２ＮＨ２（０．０５２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．０５２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．０６９ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ）に溶解し、室温にて一晩アルゴン下で撹拌した。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。ニゲリシン遊離酸を完全に変換した後、粗製の反応混合物をR-HPLC（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから１００％Ｂ）により精製し、ニゲリシン−SS−アミド誘導体を収率５５％で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから１００％Ｂ） ＲＴ＝7.53分（M+Na+＝910.5) 
【０１０７】
ニゲリシンの葉酸−ピリジルジスルフィドアミド誘導体の調製
【化３７】
2019535719.tif 000039
ＤＭＳＯ中の葉酸−Ｃｙｓ（０．００４ｇ、０．００７ｍｍｏｌ、１．５当量）およびニゲリシンのピリジルジスルフィドアミド誘導体（０．００４ｇ、０．００５ｍｍｏｌ、１．０当量））の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡを滴加した。室温にて反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−Cysを完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから４０％Ｂ）により精製し、ニゲリシンの葉酸−ピリジルジスルフィドアミド誘導体を収率６５％で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから１００％Ｂ） ＲＴ＝4.2分（Ｍ＋Ｈ＋＝1441.0) 
【０１０８】
ニゲリシンの葉酸−DBCO−ピリジルジスルフィドアミド誘導体の調製（放出不能なコンジュゲート）
【化３８】
2019535719.tif 000040
DMSO中のニゲリシンの葉酸−ピリジルジスルフィドアミド誘導体（0.010 g、0.0069 mmol、1当量）およびNHS-DBCO（0.003 g、0.0076 mmol、1.5当量）の攪拌溶液に、DIPEA（0.0013 g、0.010 mmol、1.5当量）を滴加した。室温にて反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−SS−ニゲリシンを完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−DBCO−ニゲリシンを６５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから１００％Ｂ） ＲＴ＝5.38分（Ｍ＋Ｈ＋＝1728.4) 
【０１０９】
ニゲリシンの葉酸−SS−DBCO−ピリジルジスルフィドアミド誘導体の調製（放出可能なコンジュゲート）
【化３９】
2019535719.tif 000041
DMSO中のニゲリシンの葉酸−ピリジルジスルフィドアミド誘導体（0.010 g、0.0069 mmol、1当量）およびNHS−SS−DBCO（0.005 g、0.010 mmol、1.5当量）の攪拌溶液に、DIPEA（0.0013 g、0.010 mmol、１．５当量）を滴加した。室温にて反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−SS−nigを完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−SS−DBCO−ニゲリシンを６５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから１００％Ｂ） ＲＴ＝6.52分（Ｍ/２＋Ｈ＋＝945.4) 
【０１１０】
葉酸−ニゲリシン−miR-34aコンジュゲートの調製
葉酸−ニゲリシン DBCO miR-34aコンジュゲート：
【化４０】
2019535719.tif 000042
葉酸−ニゲリシン−SS−DBCO miR-34aコンジュゲート：
【化４１】
2019535719.tif 000043
miR-34a-5pガイド鎖およびmiR-34a-3pパッセンジャー鎖（いずれもIntegrated DNA Technologiesによって調製）と称する２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用してmiRNA二本鎖を構築した。miR-34a-3pパッセンジャー鎖は、５’末端にアジドリンカーおよび３’末端に２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基で修飾された２０ｎｔ ＲＮＡオリゴ二重鎖（mCmArAmCrCmArGmCrUmArAmGrAmCrAmCrUmGrCC）を含んでなり、miR-34a-5pガイド鎖は、３’上に２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基で最小限の修飾を有する２２ntのＲＮＡオリゴを含んでなる（rUmGmUrUrGrGrUrCrGrArUrUrCrUrGrUrGrArCrGrGrU / 5Phos）。同じ修飾を用いて合成したスクランブルmiRNA（ネガティブコントロール）を用いて対照の二本鎖を形成した。葉酸−DBCO−ニゲリシンまたは葉酸−SS−DBCO−ニゲリシンコンジュゲートとアジド修飾アンチセンスmiR-34a（またはスクランブル）との間でビ−オルトゴナル（bi-orthogonal）なクリック反応を行った。クリック反応は、水中で室温にて８時間、モル比１：１０（アジドオリゴ：葉酸コンジュゲート）で行った後、４℃にて４時間冷却した。コンジュゲートしていない葉酸は、Oligo Clean and Concentrator（Zymo Research）を製造業者の説明書に従って使用して反応物から除去した。コンジュゲーションは、１５％TAEネイティブPAGEおよびMALDIスペクトル分析を用いて確認した。コンジュゲート後、miR-34a-5pガイド鎖を葉酸コンジュゲートにアニーリングした。簡潔に言えば、アニーリング緩衝液：５０ｍＭのＮａＣｌ（Sigma）、および１ｍＭのＥＤＴＡ（Sigma）を添加した１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７（Sigma）中で、葉酸-miR-34a-3pとmiR-34a-5pとを等モル比（１：１、最終濃度各５μＭ）で混合し、９５℃で５分間インキュベートし、１時間かけて室温まで冷却した後、−８０℃で保存した。
【０１１１】
葉酸−ニゲリシン−DBCO−siRNAコンジュゲートの調製
葉酸−ニゲリシン DBCO-siLuc2コンジュゲート：
【化４２】
2019535719.tif 000044
葉酸−ニゲリシン−SS−DBCO−siLuc2コンジュゲート：
【化４３】
2019535719.tif 000045
siLuc2センス鎖（GGACGAGGACGAGCACUUCUU）およびsiLuc2アンチセンス鎖（GAAGUGCUCGUCCUCGUCCUU）として表される２つのＲＮＡオリゴヌクレオチド（Integrated DNA Technologies）を使用して、siRNA二本鎖を構築した。葉酸−ニゲリシン−DBCOまたは葉酸−ニゲリシン−ss−DBCOとアジド修飾アンチセンスsiRNA（またはスクランブル）との間でビ−オルトゴナル（bi-orthogonal）クリック反応を行った。クリック反応は、水中で室温にて１：１０のモル比（アジドオリゴ：葉酸−ニゲリシン−ＤＢＣＯ）で８時間行なった後、４℃で４時間冷却した。コンジュゲートしなかった葉酸を、Oligo Clean and Concentrator（Zymo Research）を製造業者の説明書に従って使用し、反応物から除去した。１５％TAEネイティブPAGEおよびMALDIスペクトル分析を用いてコンジュゲーションを確認した。コンジュゲート後、siLuc2センス鎖を葉酸−ニゲリシン−DBCO−siRNAアンチセンスコンジュゲートにアニーリングさせた。簡潔に言えば、葉酸−siLuc2アンチセンスとsiLuc2センスをアニーリング緩衝液：５０ｍＭ ＮａＣｌ（Sigma）を添加した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７（Sigma）および１ｍＭのＥＤＴＡ（Sigma）中で、等モル比（１：１、最終濃度各５μＭ）で混合し、９５℃で５分間インキュベートした後、室温までゆっくり冷却した後、−８０℃で保存した。
【０１１２】
葉酸−Cy5色素コンジュゲートの調製
【化４４】
2019535719.tif 000046
ＤＭＳＯ中の葉酸−ＥＤＡ（０．０００８ｇ、０．００１６ｍｍｏｌ、１当量）およびＮＨＳ−Ｃｙ５（０．００１ｇ、０．００１ｍｍｏｌ、１．１当量）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．０００４ｇ、０．００３２ｍｍｏｌ、２当量）を滴加した。室温にて反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−EDAを完全に変換した後、粗製の反応混合物をRP-HPLC（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−Cy5色素コンジュゲートを８５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから５０％Ｂ）ＲＴ＝2.40分（Ｍ＋Ｈ＋＝949.2) 
【０１１３】
ニゲリシンの葉酸−Cy 5−ピリジルジスルフィドアミド誘導体色素コンジュゲートの調製
【化４５】
2019535719.tif 000047
DMSO中のニゲリシンの葉酸−ピリジルジスルフィドアミド誘導体（0.0023g、0.0016mmol、1当量）およびNHS-Cy5（0.001g、0.0016mmol、1当量）の撹拌溶液に、DIPEA（0.0004g、0.0032mmol、2等量）を滴加した。室温にて反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−ss−nigを完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−ニゲリシン−Cy5を６５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから１００％Ｂ） ＲＴ＝7.05分（Ｍ＋Ｈ＋＝1906.0) 
【０１１４】
葉酸−NIR色素コンジュゲートの合成:
ＤＭＳＯ中の葉酸−Ｃｙｓ（０．０１０ｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１当量）およびマレイミド−ＮＩＲ色素（０．０１９ｇ、ｍｍｏｌ、１．１当量））の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００２９ｇ、０．０２２８ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴加した。反応混合物を室温で撹拌し続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳによってモニターした。葉酸−Cysを完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから３０％Ｂ）により精製し、葉酸−NIRを８５％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから３０％Ｂ） ＲＴ＝3.30分（Ｍ＋Ｈ＋＝1179.0).
【０１１５】
葉酸−DBCO−NIR色素コンジュゲートの合成：
ＤＭＳＯ中の葉酸−ＮＩＲ色素（０．００５０ｇ、０．００２７ｍｍｏｌ、１当量）およびＮＨＳ−ＤＢＣＯ（０．００１６ｇ、０．００４１ｍｍｏｌ、１．５当量）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００５４ｇ、０．００４１ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴加した。室温で反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−NIR色素を完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−DBCO−NIRを８６％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから５０％Ｂ） ＲＴ＝4.75分（Ｍ/２＋Ｈ＋＝1043.0).
【０１１６】
葉酸−SS−DBCO−NIRコンジュゲートの合成:
ＤＭＳＯ中の葉酸−ＮＩＲ色素（0.0050ｇ、0.0027mmol、１当量）およびＮＨＳ−SS−DBCO（0.0023ｇ、0.0041mmol、1.5当量）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（0.0054ｇ、0.0041mmol、1.5当量）を滴加した。室温で反応混合物の攪拌を続けた。反応の進行をＬＣ−ＭＳでモニターした。葉酸−NIR色素を完全に変換した後、粗製の反応混合物をＲ−ＨＰＬＣ（移動相Ａ＝１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１３ｍｌ／分にて３５分間で０％Ｂから５０％Ｂ）により精製し、葉酸−SS−DBCO−NIRを８４％の収率で得た。ＬＣ−ＭＳ（Ａ＝１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ＝７；有機相Ｂ＝アセトニトリル；方法：１２分で０％Ｂから５０％Ｂ） ＲＴ＝4.991分（Ｍ/２＋Ｈ＋＝1125.0).
【０１１７】
葉酸−miRNAs（FolamiRs)の調製
miR-34a-5pガイド鎖およびmiR-34a-3pパッセンジャー鎖（いずれもIntegrated DNA Technologiesによって調製）として示される２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用してmiRNA二本鎖を構築した。miR-34a-3pパッセンジャー鎖は、５’末端にアジドリンカーおよび３’末端に２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基で修飾された２０ｎｔ ＲＮＡオリゴ二重鎖（mCmArAmCrCmArGmCrUmArAmGrAmCrAmCrUmGrCC）を含んでなり、miR-34a-5pガイド鎖は、３’上に２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基で最小限の修飾を有する２２ntのＲＮＡオリゴを含んでなる（rUmGmUrUrGrGrUrCrGrArUrUrCrUrGrUrGrArCrGrGrU/5Phos）。同じ修飾を用いて合成したスクランブルmiRNA（ネガティブコントロール）を用いて対照の二本鎖を形成した。葉酸−DBCO−ニゲリシンまたは葉酸−SS−DBCO−ニゲリシンコンジュゲートとアジド修飾アンチセンスmiR-34a（またはスクランブル）との間でビ−オルトゴナル（bi-orthogonal）なクリック反応を行った。クリック反応は、水中で室温にて８時間、モル比１：１０（アジドオリゴ：葉酸DBCOまたは葉酸−SS−DBCO）で行った後、４℃にて４時間冷却した。コンジュゲートしていない葉酸は、Oligo Clean and Concentrator（Zymo Research）を製造業者の説明書に従って使用して反応物から除去した。コンジュゲーションは、１５％TAEネイティブPAGEおよびMALDIスペクトル分析を用いて確認した。葉酸-NIR化合物のコンジュゲーションについては、さらにLicor Odyssey CLX（Licor）を用いて確認した。コンジュゲート後、miR-34a-5pガイド鎖を葉酸とNIR-葉酸コンジュゲートにアニーリングした。簡潔には、アニーリング緩衝液：５０ｍＭのＮａＣｌ（Sigma）、および１ｍＭのＥＤＴＡ（Sigma）を添加した１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７（Sigma）中で、葉酸-miR-34a-3pとmiR-34a-5pとを等モル比（１：１、最終濃度各５μＭ）で混合し、９５℃で５分間インキュベートし、１時間かけて室温まで冷却した後、−８０℃で保存した。
【０１１８】
血清中の安定性アッセイ
二本鎖RNAオリゴヌクレオチドおよびFolamiRコンジュゲートを、３７℃の水中の５０％ウシ胎児血清（Sigma）中で、表示した時間インキュベートした。ＲＮＡ試料を回収し、１５％ＴＡＥポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分析した。
【表１】
2019535719.tif 000048
【表２】
2019535719.tif 000049
【０１１９】
方法実施例
細胞系
細胞内のFolamiR-34aコンジュゲート活性をモニターするために、miR-34a Renillaセンサー（MB-231センサー）を発現するMDA-MB-231細胞を作製した。最初に、miRNAセンサーの特異性を、MDA-MB-231乳癌細胞中で、miR-34a模倣体またはネガティブコントロール（スクランブルＲＮＡ）とともにmiR-34aセンサーまたは変異センサーを一過性に発現させることによってモニターした。その目的のために、1×104の細胞を9６ウェルのプレートに播種し、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を用いて、２５ngのプラスミドおよび６nMのmiRNA模倣体で同時トランスフェクトした。Renilla Gloルシフェラーゼキット（Promega）を用いて、トランスフェクションの４８時間後にRenilla活性を測定した。結果は、miR-34aがMB-231細胞において内因的に活性であること、および外因的なmiR-34aの送達がRenillaセンサーのさらなるサイレンシングを促進することを示唆する。これらの結果は、miR-34aセンサーがmiR-34aに特異的であり、MB-231細胞中の内因的レベルのmiR-34aがmiR-34aセンサーを完全に沈黙させるのに十分ではなく外因性のmiR-34aでのノックダウンを増大させる余地があることを示唆している。安定なクローンを作製し、Renilla活性について試験した。１５種の安定なクローンのうち、高いRenillaレベルとmiR-34a活性をモニターするその能力から、クローン５をさらなる実験のために選択した。（図１）
【０１２０】
In vitro Renilla ルシフェラーゼ活性
MDA-MB-231トリプルネガティブ乳癌細胞（HTB-26、MycoAlert Mycoplasma検出Kit−Lonzaによるマイコプラズマ混入試験によりマイコプラズマ不含を確認済）を、１０％胎児ウシ血清（Sigma）、１００Ｕ／ｍｌ-1のペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Hyclone、GE Healthcare Life Sciences）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（葉酸不含、Life Technologies）で培養し、５％ＣＯ２中３７℃に維持した。ルシフェラーゼレポーター実験用に、ベクター（psiCHECK、Promega）中のRenillaルシフェラーゼの3’非翻訳領域に、miR-34aに対するアンチセンス配列を挿入することにより、miR-34aセンサープラスミドを作製した。miR-34a特異的サイレンシングは、MDA-MB-231細胞においてmiR-34aセンサーまたは変異miR-34aセンサーを一過性でトランスフェクトすることによって確認した。miR-34aセンサー発現細胞を、Lipofectamine RNAimax（Life Technologies）を使用してmiR-34a模倣体でトランスフェクトし、外因的なmiRNAによって媒介されるサイレンシングを確認した。安定なクローンを作製するために、MDA-MB-231細胞を６ウェルのプレートに1×106細胞/ウェルの密度で播種し、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を用いて2μgのmiR-34aセンサープラスミドをトランスフェクトした。選択マーカーとしてハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍL；Hyclone、GE Healthcare Life Sciences）を用いて安定なクローンを選択した。単一のクローンをRenilla発現について評価し、最も高いRenilla発現を有するクローンを選択した。MB-231センサー細胞を、葉酸および血清不含RPMI培地中、葉酸−DBCO−miR-34a、葉酸−ニゲリシン−DBCO−miR-34a、葉酸−ニゲリシン−SS−DBCO−miR-34aおよびFolamiR-NC（陰性対照）を含む（最終濃度50nM）９６ウェルのプレートに播種した。対照として、非処理および非コンジュゲート二本鎖miRNAを含めた。Renilla Glo ルシフェラーゼキット（Promega）を製造業者の指示に従って使用し、インキュベーション後１２〜４８時間の間のRenillaルシフェラーゼ値を得た。各時点について、Renillaレベルを FolamiR-NCに対して正規化した。実験は、各条件につき３連で３回行った。
【０１２１】
miR-34a-Renilla ルシフェラーゼ遺伝子ノックダウン活性
葉酸−ニゲリシン−DBCO−miR-34aまたは葉酸−ニゲリシン−SS−DBCO−miR-34aで（トランスフェクション試薬非存在下で）処理したMB-231センサー細胞は、処理後４８時間で最大８０％のRenilla活性の低下を示す（図１）。しかしながら、ニゲリシンを欠く葉酸−DBCO−miR-34aは、４８時間までに３０％の遺伝子ノックダウン活性しか示さず、このことは、ニゲリシンがエンドソームからのmiR-34aの放出を助けることを裏付ける。データに基づけば、意外にも、放出可能および放出不能の両方の葉酸−ニゲリシン−miR-34aが細胞に効率的に入り、活性を保持しており、このことはコンジュゲートされた葉酸がmiR-34a-5pのアルゴノート（Argonaute）へのローディングを妨げないことを示唆する。
【０１２２】
siRNA遺伝子ノックダウンアッセイ
siRNA標的化アッセイとして、MDA-MB-231細胞を１×１０６細胞／ウェルの密度で６ウェルのプレートに播種し、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を用い、２μｇのpmiRGloプラスミド（Promega）でトランスフェクトした。２４時間後、葉酸および血清不含RPMI培地中、Fol−DBCO−siLuc2、Fol−ニゲリシン−DBCO−siLuc2、Fol−DBCO−NC（ネガティブコントロール）、Fol−ニゲリシン−DBCO−NCを含む（最終濃度50nM）９６穴プレートに細胞を再播種した。対照として、非処理および非コンジュゲート二本鎖miRNAを含めた。各時点について、Renillaおよびホタルルシフェラーゼの値を、デュアルルシフェラーゼレポーターキット（Promega）を製造元の指示に従って使用して得た。Firefly／Renillaの比率は、各時点について、Fol−DBCO−NCまたはFol−ナイリシン−DBCO−NCに対して正規化した。実験は、各条件につき３連で３回行った。二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ事後検定を用いて統計的有意性を検定した。
【０１２３】
siRNA遺伝子ノックダウンアッセイの結果と考察
MDA-MB-231細胞を、葉酸とコンジュゲートしたルシフェラーゼ(siLuc2)（Fol−DBCO−siLuc)またはニゲリシンの分子を有する修飾された葉酸リガンドとコンジュゲートしたルシフェラーゼ(siLuc2)（Fol−ニゲリシン−DBCO−siLuc）についてsiRNAとともにインキュベートすることにより、ルシフェラーゼ標的化アッセイを行った。これら細胞ベースの実験は、Fol−ニゲリシン−DBCO−siLucで処理した細胞において、処理後１８時間で急速なルシフェラーゼ活性の低下を示し、２４時間後で４０％に達することを示した（図２）。しかし、Fol−DBCO−siLucでは、３２時間でもルシフェラーゼ活性の低下はみられない。興味深いことに、このルシフェラーゼ活性の低下は、Fol-NC（ネガティブコントロール）処理した細胞またはFol-siLuc処理した細胞では観察されず、ニゲリシンの存在に特異的であることを示唆している。
Fol-siLuc2とそのニゲリシン対応物との間でのルシフェラーゼ低下における違いは、エンドソームから細胞質への葉酸−siLuc2コンジュゲートの脱出におけるニゲリシンの促進を実証している。
【０１２４】
エンドソーム脱出アッセイ：生細胞共焦点実験
生細胞イメージング
生細胞イメージングのため、細胞をガラス底の２穴チャンバースライド（Lab-TekTM Chambered Coverglass、Thermo Fisher Scientific、デンマーク）上にプレーティングした。簡潔に言えば、チャンバースライドをポリ−Ｄ−リジン（０．１ｍｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich）で５分間前処理し、ＰＢＳで洗浄し、５分間風乾させた。Rab5B-GFPを安定に発現するMDA-MB-231細胞を実験の１日前に３×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、１０％ウシ胎児血清（Sigma）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Hyclone, GE Healthcare Life Sciences)を添加した葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地（Life Technologies）中、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。実験当日、培地を１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、Sigma-Aldrich）を添加した培地と交換し、スライドを、共鳴スキャナーと、東海ヒットライブイメージングチャンバー（ＩＮＵ−ＴＩＺ−Ｆ１；東海ヒット社、日本）を取り付けたピエゾＺドライブ（ニコンインスツルメンツ社）とを備えたＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒｓｉ共焦点顕微鏡（温度は３７℃に設定）にセットした。画像取得は単一焦点面で行ない、NIS-elements software 4.5（Nikon Instruments Inc.、日本）を使用し、葉酸-Cy5コンジュゲート（50nM）を添加後に開始した。ImageJ 2.0.0（NIH）を用いて画像をさらに分析した。
【０１２５】
生細胞イメージング
最初のエンドソーム脱出実験は、５０ｎＭの葉酸−ｃｙ５色素コンジュゲートまたは葉酸−ニゲリシン−Ｃｙ５色素コンジュゲートを用いて、Rab5B-GFPを安定的に発現するMDA-MB-231細胞において行った。１時間ごとに２４時間まで観察を行った。３時間での細胞の代表的な画像を図３および４に示す。葉酸−ｃｙ５コンジュゲートの結果の有意な違いが、内在化から３時間以内にみられ、このとき葉酸−ニゲリシン−ｃｙ５色素コンジュゲートで処理した細胞において顕著に大きいエンドソームが観察された。３時間後、葉酸−ニゲリシン−ｃｙ５で処理したエンドソームは、葉酸−ｃｙ５色素コンジュゲートよりも大きくなり、凝集しプルームを形成し始めた。３時間後、膨潤したエンドソームはより大きな構造に凝集したが、葉酸−ｃｙ５色素３のみで処理されたものは実験の過程を通して比較的変化しなかった。図３は、葉酸−Ｃｙ５で処理したMDA-MB-231細胞が、処理後３時間で主に細胞膜およびエンドソームから点状にＣｙ５蛍光シグナルを生じたことを示す。しかしながら、葉酸−ニゲリシン−Ｃｙ５処理細胞では、大きなエンドソームの形成と細胞質中のＣｙ５の蛍光シグナルのぼやけた分散がみられた（図４）。
【０１２６】
実験計画：
アプリオリパワー解析を用いて、統計学的有意性０．０５、α＜０．５、および検出力８０％に必要なサンプルサイズを推定した。パワー計算に基づいて、各処置群に含めるべき推奨動物数を６匹とした。次に、小規模のパイロット試験から予想されるエフェクトサイズを決定した。３匹の動物をFolamiR-34aで処置した後に観察されたRenillaレポーター活性が強力で有意な減少であったため（図７Ａ、Ｂ）、残り３匹の動物は処置しなかった。この場合、０．５の検出力によって、α＜０．５で３匹の動物を使用して有意性が正確に予測される。他の試験はすべて、最初に計算した６匹の動物を使用した。
【０１２７】
フローサイトメトリー
上記のとおり培養したＦＲ陽性ヒトMDA-MB-231細胞およびＦＲ陰性ヒトA549細胞をトリプシン処理により剥がし、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）中で２回洗浄し、無血清培地中１×１０７細胞／密度で再懸濁した。細胞生存率をトリパンブルー排除法により測定し、細胞の生存率が＞８０％である場合のみ細胞を使用した。次に、標準プロトコルに従ってフローサイトメトリー分析を行った。簡潔に言えば、１×１０6細胞をＰＥ抗ＦＯＬＲ１抗体（カタログ番号９０８３０３、Biolegend）または対照としてマッチアイソタイプ抗体（カタログ番号４００２１３、Biolegend）と共にインキュベートし、LSR Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用いてフローサイトメトリー分析により解析した。データは、FlowJoソフトウェアv10（Tree Star、Inc、OR、USA）を用いて解析した。ＦＲの機能性は、第一に、MDA-MB-231およびA549細胞をFolamiR-34a-NIR（５０ｎＭ）と共にインキュベートした後、上記のようにフローサイトメトリー分析によって確認し、第二に、最終濃度５０ｎＭに葉酸−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とインキュベートした細胞の顕微鏡分析によって確認した。１．２５倍の対物レンズとOlympus DP80カメラを取り付けたOlympus IX73顕微鏡およびCellSens 1.11を使用して細胞を種々の時点で評価した。
【０１２８】
インビトロFolamiRデリバリー
MDA-MB-231トリプルネガティブ乳がん細胞（HTB-26）およびＡ５４９非小細胞肺がん細胞（CCL-185）（いずれも、MycoAlert Mycoplasma検出Kit−Lonzaによるマイコプラズマ混入試験によりマイコプラズマ不含を確認済）を、５％ＣＯ２、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（Sigma）、１００ＵｍＬ-1ペニシリンおよび１００μｇｍＬ-1ストレプトマイシン（Hyclone、GE Healthcare Life Sciences）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（葉酸不含（Life Technologies））中で培養し、維持した。
MDA-MB-231およびA549細胞を500ngのmiR-34a Renillaセンサーでトランスフェクトし、FolamiRと共にインキュベートした。処置の９６時間後にRenillaシグナルを測定した。各時点について、データ点をFolamiR-NC（ネガティブコントロールロール：スクランブルmiRNA）に対して正規化した。エラーバーは平均±s.d.を表す。各実験は、各処理につき、少なくとも４回の技術的反復、ｎ＝３とし、統計分析は事後ボンフェローニ検定を用いたone-way ANOVAにて行った（＊＊、Ｐ＜０．０１）。
ルシフェラーゼレポーター実験用に、ベクター（psiCHECK, Promega）中のRenillaルシフェラーゼの３’非翻訳領域にmiR-34aに対するアンチセンス配列を挿入することによってmiR-34aセンサープラスミドを作製した。miR-34a特異的サイレンシングは、miR-34aセンサーまたは変異miR-34aセンサーを一過性でトランスフェクトすることによってMDA-MB-231細胞において確認した。Lipofectamine RNAimax（Life Technologies)を使用してmiR-34aセンサー発現細胞をmiR-34a模倣体でトランスフェクトし、外因的なmiRNAによって媒介されるサイレンシングを確認した。安定なクローンを作製するため、MDA-MB-231細胞を１×１０6細胞／ウェルの密度で６ウェルのプレートに播種し、Lipofectamine 2000（Life Technologies）を使用して２μｇのmiR-34aセンサープラスミドでトランスフェクトした。選択マーカーとしてハイグロマイシンＢ（５００μｇ／ｍL；Hyclone、GE Healthcare Life Sciences）を用いて安定なクローンを選択した。単一のクローンをRenilla発現について評価し、Renilla発現が最も高いクローンを選択した。
MB-231センサー細胞を、葉酸および無血清ＲＰＭＩ培地中、FolamiR-34a、Fol-SS-34aおよびFolamiR-NC（ネガティブコントロール）を最終濃度５０ｎＭで含む９６ウェルのプレートに播種した。対照として非処理および非コンジュゲート二本鎖miRNAを含めた。Renilla Glossiferaseキット（Promega）を製造業者の指示に従って使用し、インキュベーションから２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１２０時間後のRenillaルシフェラーゼ値を得た。Renillaレベルを、各時点について、FolamiR-NCに対して正規化した。実験は、各条件につき３連で３回行った。
MDA-MB-231乳癌細胞は、原形質膜上に検出可能なレベルのＦＲを発現することが報告されており、この細胞株はFolamiR活性を評価するための妥当なモデルである。ＦＲの発現を確認するため、MDA-MB-231細胞とA549細胞（ＦＲネガティブコントロール）を比較するフローサイトメトリー分析を行った。MDA-MB-231細胞は、検出可能なレベルのＦＲαを発現することが確認された（図５ｃ）。
これらの結果は、フローサイトメトリーを用いてNIR-FolamiR-34aの細胞内取り込みを分析すること（図５ｄ）および蛍光顕微鏡を用いて葉酸フルオレセインイソチオシアネート（Fol-FITC）コンジュゲート取り込みを分析することによって裏付けられた（図５Ｅ）。いずれの葉酸コンジュゲートも、ＦＲ陽性細胞株MDA-MB-231に取り込まれたが、ＦＲ陰性A549細胞株には取り込まれなかった。この観察結果は、miR-34a Renillaセンサーを一過性で発現するMDA-MB-231およびA549細胞株をFolamiRで処理した後、機能的に確認された。このセンサーは、１つのmiR-34a相補的結合部位が後に続くRenilla遺伝子であり、miR-34aによるRenillaの転写後調節のモニタリングを可能にする。両細胞株においてこのセンサーは、トランスフェクトされたmiR-34a模倣体に応答した（図１０）；但し、このセンサーはFolamiR-34a曝露後のMDA-MB231細胞においてのみ下方制御され（図５Ｆ）、FolamiR 標的化はＦＲ発現細胞に依存することを示唆する。これらの結果をまとめると、MDA-MB-231はＦＲ陽性細胞株であることを示唆しており、ＦＲ相互作用を介したFolamiRコンジュゲートの特異的取り込みについての予備的証拠となる。
FolamiR-34a活性をモニターするため、MDA-MB-231細胞を作製し、miR-34a Renilla ルシフェラーゼセンサー（MB-231センサー）またはmiR-34aに応答しないこのセンサーの変異体を安定的に発現させた。複数のクローンを作製し、最高レベルのRenillaを有するクローン（図１１）を用いてFolamiR-34a活性を評価した。FolamiR-34aまたはFolamiR-SS-34aをMB-231センサー細胞に添加した場合（トランスフェクション試薬の非存在下で）、曝露の７２時間後にRenilla活性の低下がみられた（図６ａ）。Renilla活性は、おそらく細胞内でのFolamiR-34aの複製誘導性の希釈またはFolamiR-34aの減少により、曝露後１２０時間で回復した。
MB-231センサー細胞の増殖は、１回のFolamiR-34a処理後に減少し（図６Ｂ）、これはRenilla活性の減少と相関していた。意外にも、放出可能および放出不能のFolamiRはいずれも細胞に効率的に侵入し、データに基づく活性を保持しており、コンジュゲート化した葉酸がmiR-34a-5pのアルゴノートへのローディングを妨げないことを示唆している。
【０１２９】
FR依存性応答
Lipofectamine 2000（Life Technologies）を使用し、ＦＲ陽性ヒトMDA-MB-231細胞およびＦＲ陰性ヒトA549細胞を、５００ｎｇのmiR-34aセンサープラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、細胞（４０００個／ウェル）を、葉酸および血清不含RPMI培地中、FolamiR-34aおよび FolamiR-NC（ネガティブコントロール）を最終濃度５０ｎＭまたは１００ｎＭで含有する９６ウェルのプレートに播種した。Lipofectamine RNAimax（Life Technologies）でトランスフェクトした細胞を、miR-34a模倣体に対するmiR-34a Renillaセンサー応答をモニターするための対照として使用した。対照として非処理および非コンジュゲート二本鎖miRNAを含めた。Renilla Glossiferaseキット（Promega）を製造業者の指示に従って使用し、インキュベーションの９６時間後にRenillaルシフェラーゼ値を得た。FolamiR-34a処理細胞のRenillaレベルを、各時点についてFolamiR-NCに対して正規化し、非コンジュゲート二本鎖miRNA処理細胞を未処理に対して正規化した。実験は、各条件につき３連で３回行った。Renilla活性の用量依存的減少が、FolamiR-34aで処理した細胞においてのみ観察された（図６ｃ）。
【０１３０】
in vitro FR結合競合アッセイ
in vitro FR結合競合アッセイは、Van Der Heijden, J. W. et al.（“Folate receptor β as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients，” Arthritis Rheum. 60, 12-21 (2009)) および Gent, Y. Y. et al.（“Evaluation of the novel folate receptor ligand [18F]fluoro-PEG-folate formacrophage targeting in a rat model of arthritis，” Arthritis Res. Ther. 15, R37 (2013))に記載のとおり行った。簡潔に言えば、ＦＲ陽性ヒトMDA-MB-231細胞およびＦＲ陰性ヒトA549細胞を前述のように培養し、トリプシン処理によって剥がし、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で２回洗浄し、血清不含培地中１×１０7細胞／mLの密度に再懸濁した）。次に、この細胞懸濁液１００μLを、（１〜１００倍モル過剰の葉酸グルコサミンコンジュゲートの存在下または非存在下で）FolamiR-34a-NIRと共に終濃度５０nMまでインキュベートした。細胞を４℃で２０分間インキュベートし、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、LSR Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences、San Jose、CA、USA）を用いるフローサイトメトリー分析によりFolamiR-34a-NIR結合の置換について分析した。FlowJoソフトウェアv10（Tree Star、Inc、Ashland、Ore）を用いてデータを解析した。
機能的競合は、１〜１００倍モル過剰の葉酸グルコサミンコンジュゲートの存在下で、FolamiR-34aまたはFolamiR-NCと共に終濃度５０nMでインキュベートしたMDA-MB-231センサー細胞を用いて検証した。対照として非処理および非コンジュゲート二本鎖miRNAを含めた。Renillaルシフェラーゼ値は、Renilla Glossiferaseキット（Promega）を製造業者の指示に従って使用し、インキュベーションの９６時間後に得た。FolamiR-34a処理細胞のRenillaレベルを、各時点についてFolamiR-NCに対して正規化し、非コンジュゲート二本鎖miRNA処理細胞を未処理に対して正規化した。実験は、各条件につき３連で３回行った。葉酸グルコサミンコンジュゲート（葉酸−グルコサミン）の量が増えると、細胞特異的なNIR-FolamiR-34aシグナルは用量依存的に減少し、葉酸−グルコサミンがNIR-FolamiR-34aと競合することが示された（図６Ｄ）。さらに重要なことに、葉酸−グルコサミン処理は、用量依存的に、miR-34a Renillaセンサーに対するNIR-FolamiR-34aのサイレンシング効果を無効にした（図６Ｅ）。これらの結果は、FolamiRがＦＲを過剰発現している細胞に機能的miRNAを送達することができ、その送達がＦＲ発現に依存することを裏付けている。
図６Ｄ、Ｅは、漸増濃度の葉酸グルコサミンコンジュゲートの存在下での、FolamiR-34a（５０ｎＭ、９６時間）に対するmiR-34a Renillaセンサー応答を示す。各実験条件について、データポイントをFolamiR-NC（ネガティブコントロールロール：スクランブルmiRNA）に対して正規化した。実験は、各処理につき少なくとも４回反復しておこない（ｎ＝３）、統計分析は事後ボンフェローニ検定を用いてone-way ANOVAで行った（＊ Ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
細胞増殖アッセイ
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ、Sigma）アッセイを、９６ウェルプレートにおける細胞増殖の代理として使用した。簡潔に言えば、FolamiR処理後、細胞を完全培地中１０％トリクロロ酢酸で固定し、１％酢酸中０．４％（wt/vol）のＳＲＢで１時間染色した。未結合の色素を１％酢酸で４回洗浄することにより除去した。最後に、タンパク質が結合した色素を１０ｍｍの非緩衝トリス塩基で抽出し、GloMax Multi+分光光度計（Promega）を用いて５１０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度（細胞量に代わるもの）を、各時点について、FolamiR-NCの存在下で培養した細胞の吸光度に対して正規化した。
【０１３２】
側腹部腫瘍の確立
単回投与試験のために、２００μＬのMatrigel（Corning)に懸濁した５×１０6のMDA-MB-231センサー細胞の皮下注射により、雌性Nu/Nu（NU-Foxn1nu；Charles River）コンジェニックマウス（６週齢、ｎ＝５）に皮下腫瘍を誘導した。長期的な研究のために、親のMDA-MB-231細胞を使用した。観察により、げっ歯類は、天然に存在する形態の葉酸である、５−メチル−テトラヒドロ葉酸の高い血漿および組織レベル（ヒトよりも約１０倍高い）を示すため、マウスは、腫瘍移植の２週間前と一連の実験期間中、葉酸欠乏食餌（Envigo、TD 95247）で飼育した。葉酸欠乏食餌は、葉酸レベルをヒトで見られる生理的レベルにまで下げることを示した。腫瘍の成長を測定するため、ノギスを用いて個々の腫瘍を測定し、腫瘍体積を次の式によって計算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝幅×（長さ２）×２-1。処置の時点までに腫瘍が１５０ｃｍ3の体積に達していない場合は動物を除外した。単回投与実験のために、発光および蛍光シグナルの取得後（０日目）、動物に５ｎｍｏｌのFolamiRを静脈内（i.v.）注射した。複数回投与実験では、動物の平均腫瘍サイズの差を最小にすることによって動物を実験群に無作為化した。
腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したら、指定されたモル濃度のFolamiRを動物に３日ごとに静脈内注射で投与した。すべての実験プロトコルは、Purdue Animal Care and Use Committeeによって承認されており、動物の使用に関するNIHガイドラインに準拠していた。
【０１３３】
生物発光および赤外線イメージング
IVIS Lumina II（Caliper）またはSpectral AMI（Spectral Instruments）を用いてin vivoで腫瘍の生物発光をモニターするため、RediJect Coelenterazine h生物発光基質（PerkinElmer）を製造元のプロトコルに従って投与した。基質の注入後の複数の時点（２０分を開始時とした）で発光値を取得し、最大平均放射輝度値のみを報告した。７４５ｎｍ励起でIVIS Lumina II（Caliper)およびＩＣＧ発光フィルターを使用して赤外線イメージングを実施した。腫瘍のルミネセンスおよび蛍光の非侵襲的な長期的モニタリングは、以下の時点で動物全体の画像化によって実施した：０時間、２４時間時間、４８時間および７２時間（実験群あたりｎ＝３動物）。全体的な臓器画像は、Licor Odyssey CLX（Licor）の800 nmチャンネルを用いて取得した。
【０１３４】
血清サイトカイン
マウス特異的サイトカインMulti-Analyte ELISAアレイキット（Qiagen）を製造元の指示に従って用い、複数回投与実験で得た血清試料（最後の注射の２４時間後）を用いてIL-6および腫瘍壊死因子（TNFα）濃度を試験した。簡潔に記載すると、血清サンプルを氷上で解凍し、分析前に４℃で１０分間１０００×ｇで遠心分離することにより沈殿物を取り除いた。全てのサンプルまたは標準品をアッセイ緩衝液と共に９６ウェルプレートに添加した。プレートを穏やかに振盪し、室温で２時間インキュベートした。
上清を除去し、ウェルを洗浄した。検出抗体を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをすすぎ、アビジン−ＨＲＰ溶液と共に室温で３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄し、GloMaxプレートリーダー（Promega）を用いてデータを取得するため現像液を加えた。４５０ｎｍおよび５７０ｎｍで吸光度を測定した。５７０ｎｍの値を４５０ｎｍの値から差し引いた。サイトカイン標準曲線を用いて、血清試料中のサイトカイン濃度（pg/ml）を計算した。検出限界は以下の通りであった：IL-6 58.8 pg/mL、およびTNFα 30.5 pg/mL。ＬＰＳ処置したNu/Nuマウス（NU-Foxn1nu；Charles River）を陽性対照として使用した。マウスに５００ｎｇ／ｋｇのリポ多糖（ＬＰＳ、L6529、Sigma）を腹腔内注射し、注射の２時間後に血清を採取した。
【０１３５】
最大耐量（MTD）試験
Balb/cマウス（８週齢）に３３．３ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌまたは１ｎｍｏｌのFolamiR-34aを１回静脈内注射した。動物を投与後２週間観察した。マウスの体重の変化および臨床的所見（急速な体重減少、下痢、ボサボサの毛、丸まった姿勢、倦怠、苦しい呼吸、神経学的徴候など）について観察した。マウスには自由に食餌および水を与えた。実験の最後に剖検を行った。さらなる分析のために、全血、血清、および臓器組織を採集した。
【０１３６】
乳癌の異種移植モデルにおけるin vivoでのFolamiRの活性
各NIR-Folタグ付きmiRNA（NIR-FolamiR）の１回用量（５ｎｍｏｌ）を、触診可能なMB-231センサー細胞異種移植片を有する動物に尾静脈注射により投与した。蛍光分布およびルシフェラーゼ活性を、腫瘍細胞標的化の特異性についてモニターするため、ならびに取り込みと細胞内標的の抑制の代理としてそれぞれ測定した。
注射の２４時間後、NIR-FolamiRは主に腫瘍組織に保持され、重要なことに、肝臓（図７Ｃ、Ｌｖ）を含む生物の他の部分からは除去された（図７Ａ、左-NIR）。しかしながら、放出不能なNIR-FolamiR-34aのみがin vivoでRenillaノックダウンを誘導した（図７Ａ、右ルシフェラーゼ、図７Ｂで定量）。重要なことに、１回の注射のみの後、RenillaレベルはNIR-FolamiR-34a処理後に約５０％減少し、これは培養細胞中で観察されたセンサー活性の減少よりもさらに大きかった（図６Ａ、Ｃ、Ｅ）。NIR-FolamiR-34aで処置した腫瘍には、全RNA １ナノグラムあたり約３．５×１０6コピーのmiR-34aが存在した（図７Ｄ）。
対照的に、NIR-FolamiR-SS-34aで処置したマウスから採取した腫瘍中のmiR-34aのコピー数は、ネガティブコントロールロールの動物と同様であり、放出可能な葉酸コンジュゲートが循環血において分解するまたは早くに減少し得ることを示唆する。この可能性を検討するため、FolamiRコンジュゲートを５０％血清に暴露した。FolamiR-SS-34aは血清の存在下で非常に不安定であり、一方FolamiR-34aは６時間以上無傷のままであった。
FolamiR-34aは、非コンジュゲート型miR-34aよりも安定しているようであり、葉酸が血清ヌクレアーゼからmiRNAを保護することを示唆している。FolamiRがin vivoでＦＲに特異的に結合するかどうかを決定するため、１００倍モル過剰の葉酸−グルコサミンの存在下または非存在下で、５ｎｍｏｌのNIR-FolamiR-34aを、右側の肩にＦＲ陽性ヒトMDA-MB-231センサー細胞を移植し、左側の肩にＦＲ陰性ヒトA549細胞を移植したヌードマウスに静脈内注射した。結果は、ＦＲ陽性MDA-MB-231腫瘍がFolamiRコンジュゲートを蓄積する一方、ＦＲ陰性A549腫瘍では蓄積せず（図７Ｅ、Ｆ）、このＦＲ依存性蓄積は過剰の葉酸−グルコサミンによって阻止することができる（図７Ｅ、Ｆ）ことを示す。
次に、FolamiR-34aの有効性を評価するため複数回投与試験を実施した。MB-231異種移植動物を、用量を減らしたFolamiR-NCまたはFolamiR-34a（０．１ｎｍｏｌ、０．５ｎｍｏｌおよび１ｎｍｏｌ）で３日毎に合計７回投与して処置した。２０日間の投与期間中に対照の葉酸−コンジュゲートを投与した動物の腫瘍は約３．５倍に成長したが、FolamiR-34aで処置した動物の腫瘍サイズの成長は緩やか（約１．５倍）であった（図７Ｇおよび図１２）。０．１ナノモル程度の低い用量でも、腫瘍成長の抑制は有意であった。切除した腫瘍組織中のmiR-34aのコピー数は、対照を投与したマウスから切除した腫瘍よりも約１．５倍高かった（図１３Ａ）。重要なことに、FolamiR-34aで処置した動物では、臓器全体の毒性の兆候も血清サイトカインIL-6またはTNF-αの上昇も認められなかった（図１４Ａ）。これらの結果は、正常免疫能（immunocompetent）マウスにおいて実施された最大耐量（ＭＴＤ）試験によって裏付けられ、FolamiR-34aを投与したマウスは、試験した最大用量３３．３ｎｍｏｌまで毒性の病理学的徴候も有意の体重変化も認められず（図１４Ｂ）、ＭＴＤ＞３３．３ｎｍｏｌを示した。
【０１３７】
Kras；p53マウスにおける腫瘍形成の誘導
KrasLSL-G12D/+における腫瘍形成の誘導；Trp53flx/fl（FVB．１２９バックグラウンド）二重突然変異体マウス（６〜１０週齢）を用いて、DuPage, et al. (DuPage M, Dooley AL, Jacks T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat. Protoc. 2009； 4: 064-1072)の方法に基づいて行った。簡潔に言えば、肺特異的導入遺伝子活性化を、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルス粒子（１０６ＰＦＵ）の気管内送達により行った。実験前の８週間、腫瘍を予備形成させた。
【０１３８】
磁気共鳴画像法（MRI）を用いた腫瘍進行モニタリング
誘導および非誘導動物のＭＲＩスキャン（正常組織のスキャン）は、パーデューＭＲＩ施設にて、7.0 Tesla Bruker Biospec 70/30 USRスキャナー（Billerica, MA）および４０ｍｍマウスボリュームコイルを用いて得た。動物をＯ２中２．５％ｖ／ｖのイソフルランを用いて５分間麻酔した後、温めた動物用ベッドに移し、麻酔を２％に設定した。呼吸数は圧力センサーでモニターした。以下のパラメータを用いて、低解像度マルチプレーンスカウトスキャンを行った：ＴＲ＝４ｓ、ＴＥ＝１．５ｍｓ、ＦＯＶ＝３０×３０ｍｍ２、スライス厚＝１ｍｍ、データマトリックス＝２５６×２５６、７スライス／面（軸方向、冠状および矢状）、マウスあたりのスキャンのおおよその時間＝１分。スカウトスキャンを用いてマウスの背骨を整列させ、以下のパラメータを用いて肺の高解像度画像を収集した：ＴＲ＝４ｓ、ＴＥ＝１．５ｍｓ、ＦＯＶ＝３０×３０ｍｍ２、スライス厚＝０．５ｍｍ、データマトリックス＝２５６×２５６、３０スライス／面（軸方向および冠状）、マウス当たりのおおよそのスキャン時間＝５分。
腫瘍量の定量は、Krupnick et al (“Quantitative monitoring of mouse lung tumors by magnetic resonance imaging, ” Nat. Protoc., 2012, 7, 128-142)に記載されている手動セグメンテーションプロトコルに従って行った。ＭＲＩによる腫瘍量のこの分析は、腫瘍組織（明るい）と正常な肺組織（暗い）との間のＭＲ画像強度の大きな差を利用するもので、平均肺画像強度を腫瘍量の代理として用いるものである。簡潔に言えば、肺のＭＲ画像をImageJ 2.0.0を用いて手動でセグメント化し、同じ動物内の肝臓のそれに対して正規化された平均の肺画像の強度を計算する。動物内の腫瘍の進行を決定するために、平均肺画像強度を±s.d.の初日に対して正規化する。さらに、ITK-Snap and Paraview 5.2ソフトウェア（Kitware、NY、USA）を用いた三次元再構成法を用いて、動物あたりの腫瘍と全体の肺の体積を計算した。示された時間での腫瘍／肺全体の比を求め、腫瘍によって占められている肺の体積の割合（％）を示した。
【０１３９】
Kras；p53マウスにおける葉酸取り込み試験
葉酸取り込み試験のために、5nmolのOTL38（On Target Laboratories, LLC, West Lafayette, INにより提供、現在臨床試験中の（臨床試験ID：NCT02769533）蛍光近赤外（NIR）色素に結合した葉酸からなる蛍光イメージングコンジュゲート）を、健常マウスおよび腫瘍保有マウスに尾静脈からシステマティックに送達した（n＝3；導入遺伝子活性化の８週間後）。注射から２４時間後に、動物を殺して生理食塩水で灌流した。Licor Odyssey CLX（Licor）の800 nmチャンネルを使用して臓器全体の画像を取得した。肺を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、標準的な手順に従ってパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、１．２５倍の対物レンズとOlympus DP80カメラを取り付けたOlympus IX73顕微鏡およびCellSens 1.11を用いて評価した。腫瘍量をImageJ 2.0.0を用いて計算し、各動物について３つの独立した切片から得られた肺全体の面積に対する腫瘍面積で表した。染色していない切片をマウントし、Licor Odyssey CLX（Licor）の800 nmチャンネルで、２０倍対物レンズ、ICGバンドパスフィルター（Ex：780-800；Ex：810-860；Semrock、 Brightline）、キセノン／水銀光源（Nikon、日本）、Photometrics QuantEM EMCCDカメラ、およびNIS-Elements（Nikon、日本）を取り付けたNikon TiS顕微鏡を用いて評価した。
このモデルはＦＲ発現についてまだ検証されていないため、まず、このモデルの肺腺癌を葉酸受容体発現、ならびに腫瘍に特異的な葉酸コンジュゲートの取り込みおよび保持について評価した。近赤外蛍光（NIR）色素とコンジュゲートさせた葉酸受容体−α（FRα）を標的とするリガンドである、蛍光イメージングリガンドOTL38を、肺腫瘍を有するマウスまたは健常なマウスに静脈内投与した。
臓器全体のレベル（図８Ａ）および組織学的レベル（図８Ｂ）で観察されるように、葉酸コンジュゲートは、肺腫瘍において優先的に保持され、正常な健康な組織からは排出された。より高倍率の画像は、近赤外のシグナルが、健康な組織と悪性の組織との間の細胞密度差によるものではないことを示している；ＯＴＬ−３８の受容体介在のエンドサイトーシスに起因して前に観察されたように、明確な点状シグナル伝達がＯＴＬ３８投与後に腫瘍で観察される（図８Ｂの挿入図を参照）。肺腺癌におけるOTL38保持がＦＲとのその相互作用によって媒介されるかを確かめるため、in vivo遮断アッセイを実施した。肺腫瘍を有するマウスにおいて、１００倍モル過剰の葉酸−グルコサミンの存在下または非存在下で、OTL38（5 nmol）を静脈内注射した。肺腫瘍におけるＯＴＬ３８の優先的保持は、過剰の葉酸−グルコサミンによって減少し（図８Ｃ、Ｄ）、これは腫瘍におけるＯＴＬ−３８の蓄積がＦＲに依存することを示唆している。これらのデータによって、KrasLSL-G12D/+；Trp53flx/flx腫瘍がＯＴＬ−３８を特異的に取り込み保持することが確認され、これはFolamiR-34aが同様に腫瘍組織中に蓄積することを示唆している。
【０１４０】
Kras；p53マウスにおけるFolamiR処置
FolamiR-34aによる複数回投与実験のため、腫瘍を有する動物（８週齢）を、それらのＭＲＩ測定腫瘍量の差を最小にすることによって実験群に無作為化した。動物に１ｎｍｏｌのFolamiRを３日ごとに静脈内注入（合計１０回の注入）して処置し、上記のように7.0 Tesla Bruker Biospec 70/30 USR スキャナー（Billerica, MA)を用いて腫瘍の進行を１週間毎に４週間にわたってモニターした。最後の注射から２４時間後に、動物を屠殺して生理食塩水で灌流した。肺を摘出し、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、標準的な手順に従ってパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、前述のように評価した。マウスは、腫瘍の誘導から６週目から始めて一連の実験期間中は葉酸欠乏食餌（Envigo、TD 95247）で飼育した。すべての実験プロトコルは、Purdue Animal Care and Use Committeeによって承認されており、動物の使用に関するNIHガイドラインに準拠していた。
【０１４１】
ＦＲのin vivoブロッキング
雌性Nu/Nu（NU-Foxn1nu；Charles River）コンジェニックマウス（６週齢、ｎ＝３）に、200μLのMatrigel（Corning）に懸濁した、５×１０6ＦＲ陽性ヒトMDA-MB-231センサー細胞（右側）およびＦＲ陰性ヒトA549細胞（左側）を注射し、皮下腫瘍を誘導した。腫瘍を形成させ、同様の大きさのA549およびMDA-MB-231腫瘍を有するマウスを実験に含めた。Kras；p53マウスモデルについては、導入遺伝子活性化から８週間腫瘍を形成させた（ｎ＝３）。腫瘍形成はＭＲＩを用いてモニターした。５ｎｍｏｌ（≧１００倍モル過剰）の葉酸グルコサミンコンジュゲートの存在下または非存在下、異種移植モデルについては５ｎｍｏｌのFolamiR-34a-NIRを、Kras；p53マウスモデルについては５ｎｍｏｌのOTL38を、尾静脈を介し同時投与することにより競合試験を行った（ｎ＝３）。葉酸グルコサミンコンジュゲートは、葉酸と比較して低ｐＨでの溶解度が高いため、腎臓での析出を防ぐために使用した。in vivoでの動物全体の画像化およびex vivoでの組織分布実験を上記のように実施した。
【０１４２】
RNAの単離および定量的PCR（qPCR）を用いたmiRNA発現解析
Nu/Nuマウス（NU-Foxn1nu；Charles River）由来のMDA-MB-231由来腫瘍およびKrasLSL-G12D/+；Trp53flx/flxマウス由来の肺腫瘍をRNA Later（Life Technologies)に回収し、−８０℃で保存した。腫瘍組織（５０mg）を、７００μＬのQIAzol溶解試薬（Qiagen）と１．４ｍｍのセラミックビーズが入った２ｍＬのコレクションチューブに入れた。サンプルをビーズミル（Fisher Scientific）を用いて４m s-1にて３分間粉砕した。RNeasy Mini Kit（Qiagen）を製造業者の指示に従って用い全RNAを抽出した。次に、１μｇのトータルRNAを用い、miScript II RT Kit（Qiagen）とmiScript HiFlex Bufferを用いてcDNAを作製した。miR-34a標準の生成のため、miR-34a模倣体（Life Technologies）をｃＤＮＡ合成に使用した。qRT-PCRは、miRNAプライマーアッセイ（Qiagen）を用いて実施した。以下のサイクリング工程の下で、miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen)を使用するQuantStudio 6 Flex リアルタイムＰＣＲマシン（Life Technologies）を用いて反応を行った：９５℃で１５分；９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、７０℃で３０秒間を４０サイクル；１．６℃／秒で９５℃から６０℃の融解曲線。各生物学的複製について技術的反復（少なくとも３回）を実施した。１×１０８コピーから１×１０３コピーをカバーする標準曲線を用いてmiR-34aコピー数を決定した。
【０１４３】
統計
二群間解析のため、両側スチューデントのｔ検定を用いて群間差を調べた。Prism統計パッケージ（バージョン７、GraphPad Software）を用いた多群間比較のために、事後ボンフェローニ検定によるtwo-wayまたはone-way分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。図の説明で示したように、エラーバーは、平均±s.d.または平均±s.e.m.のいずれかで表す。統計的に有意なP値は、図および／または凡例において、***、Ｐ＜0.005；**、Ｐ＜0.01；*、Ｐ＜0.05として示す。
KrasLSL-G12D/+；Trp53flx/flx腫瘍がFolamiR-34aに応答性であるかどうかを調べるために、腫瘍を有する動物に３日ごとに１ナノモルのFolamiR-34aを合計１０回投与した。実験期間中、腫瘍の成長をＭＲＩによりモニターし、ＭＲＩデータから作成して得られた体積の測定値は、対照の葉酸−コンジュゲートを投与した動物と比較してFolamiR-34aが腫瘍の成長を減少させることを示している（図９Ａ、Ｂ、Ｃ）。腫瘍のサイズは、FolamiR-34aを投与した動物では統計的に変化がなかったが、FolamiR-NCで処置したマウスの腫瘍サイズは投与初日と比較して１．５倍に増大した。試験の終了時に組織学的レベルで同様の応答が観察された（図９Ｄ、Ｅ）。腫瘍量の定量は統計的有意性を示しており、FolamiR-34aで処置マウスから採取した肺において、FolamiR-NCで処置マウスと比較して、腫瘍体積の１．８倍の減少を示した。
MD-MBA-231異種移植片において観察されたmiR-34aコピー数の増加と同様に、切除された肺腫瘍組織におけるmiR-34aのコピー数は、対照を投与されたマウスから抽出された腫瘍における値より約３倍高かった（図１３Ｂ）。miR-34aが、miR-34a標的の内在性標的遺伝子の転写レベルを抑制するよう作用していることを検証するために、BCL-2、METおよびMYCを定量した。BCL-2とMYCはいずれも、FolamiR-34aを投与したマウスから採取した腫瘍では統計的に下方制御されており、内在性標的遺伝子に対するmiR-34a活性が確認された（図９Ｇ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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