(57)【要約】  本発明は、細胞、特に幹細胞の三次元培養のためのマイクロバイオリアクターモジュールに関する。本モジュールは使い捨てを意図しており、本発明の一実施形態ではマルチマイクロバイオリアクターとして使用され得る。本モジュールは、培養容器１と、装着管２と、非対称プラグ３と、シース７とを備え、培養容器は、生体適合性の担体材料又はスキャフォールドを封入する半透膜材料の外側シェルを有し、装着管は、培養容器に取り付けられるとともに、サンプルを採取して細胞又は生物活性分子及び栄養素を前記培養容器に供給できるようにする排出・供給ラインを取り囲み、非対称プラグは、非対称の長さを有し、本モジュールの内部に突出して、装着管を開口に固定するとともに、シースとの接触により本モジュールを外側に対してシールして、位置に応じてシースの壁の開口を開閉する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器（１）と、装着管（２）と、非対称プラグ（３）と、シース（７）とを備えるマイクロバイオリアクターモジュールにおいて、
前記培養容器（１）が、生体適合性の担体材料又はスキャフォールドを封入する半透膜材料の外側シェルを有し、
前記装着管（２）が、前記培養容器に取り付けられるとともに、サンプルを採取して細胞又は生物活性分子及び栄養素を前記培養容器に供給できるようにする排出・供給ラインを取り囲み、
前記非対称プラグ（３）が、非対称の長さを有し、当該マイクロバイオリアクターモジュールの内部に突出して、前記装着管（２）を開口に固定するとともに、前記シース（７）との接触により当該マイクロバイオリアクターモジュールを外側に対してシールして、位置に応じて前記シースの壁の開口を開閉する、
ことを特徴とする、マイクロバイオリアクターモジュール。
【請求項２】
前記培養容器（１）の前記外側シェルが、１〜５０ｋＤａの排除サイズを伴う半透性の有機膜材料又は無機膜材料、例えば透析ホース材料のバッグからなることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロバイオリアクターモジュール。
【請求項３】
前記培養容器（１）中の前記担体材料が、天然ポリマー、合成ポリマー、無機材料又はこれらの組み合わせ、又は、対応するスキャフォールドからなることを特徴とし、適切な前記担体材料は、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルギン酸塩、絹、グリコアミノグルカン、ヒアルロン酸、キトサン、セルロース、フコイダン、又は、シラフィンであり得る、請求項１又は２に記載のマイクロバイオリアクターモジュール。
【請求項４】
前記装着管（２）、排出・供給ライン（４）及び前記シース（７）が、弾性を有するガス透過性材料、例えばシリコーン又は同等のプラスチックからなり、前記シース（７）が、フラップ（９）によって閉じられ得る複数の貫流開口（８）を備えることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロバイオリアクターモジュール。
【請求項５】
前記担体材料又は前記スキャフォールドが幹細胞、例えば間葉系幹細胞で被覆されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロバイオリアクターモジュール。
【請求項６】
前記培養容器がガス透過性エアバッグを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマイクロバイオリアクターモジュール。
【請求項７】
並列に配置されて共通の培養室内に導入される請求項１〜６のいずれか一項に記載の１つ以上のマイクロバイオリアクターモジュールからなるマルチマイクロバイオリアクターであって、個々の前記マイクロバイオリアクターモジュールにおける増殖条件は、培養容器内の組成及び供給、並びに、モジュールの長さ及び関連する浸漬深さによって個々に適合され得る、マルチマイクロバイオリアクター。
【請求項８】
１つ以上の前記マイクロバイオリアクターモジュールが共通のプラスチックカバー（１１）内に固定され、前記プラスチックカバー（１１）には、測定プローブ（１８）及び場合により圧力逃し弁（２３）のための接続可能性も設けられることを特徴とする、請求項７記載のマルチマイクロバイオリアクター。
【請求項９】
前記共通の培養室が培地で満たされる反応容器（１２）であり、前記反応容器内では、流れ分配器（１４）と組み合わせて圧縮空気により動作されるポンプ要素（１３）により均質化が確保されることを特徴とする、請求項７又は８に記載のマルチマイクロバイオリアクター。
【請求項１０】
前記共通の培養室が培地で満たされる反応容器であり、前記反応容器内では、格子状態様で配置される穴により上方に向けて開口するプレートに脈動圧縮空気を通過させることによって気泡発生器（１９）により均質化が達成されることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載のマルチマイクロバイオリアクター。
【請求項１１】
上方に向けて及び下方に向けて開口する内側反応器シェル（２１）が装着ブラケット（２２）によって反応容器（１２）の内側に固定され、それにより、培地内の流れ循環が達成されることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のマルチマイクロバイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
幹細胞の使用は、医学研究、特に再生医療の分野において益々重要になってきている。また、製薬研究及び化粧品産業においても、幹細胞の培養は、例えばＡＤＭＥ／Ｔｏｘ研究を実行するために、すなわち、吸収、分布、代謝、排泄物、及び、毒性に関するそれらの特性に関して新たな潜在的活性物質を検査するために幾つかの領域で使用される。
【０００２】
胚幹細胞、いわゆる人工多能性幹細胞は、細胞培養においても、自己複製、増殖、及び、分化に関するそれらのほぼ無限の可能性によって特徴付けられる。しかしながら、培養のためのオーダーメイドの方法及び装置は、特定の組織型への分化を確実に方向付けると同時に望ましくない悪性腫瘍形成を防止するのに決定的な役割を果たす（Ｌｕｔｏｌｆ，Ｍ．Ｐ．；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐ．Ｍ．；Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ．，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００９，４６２（７２７２），４３３−４４１参照）。
【０００３】
特に再生医療で用いるため、体外で得られる細胞材料に高い関心があり、この細胞材料は、高度の一貫した品質を示し、それにより、制御された条件下での幹細胞の長期培養及び長期分化を保証するとともにプロセスの自動化又は少なくともプロセスの並列化を理想的に可能にする標準化された細胞培養方法に対する大きな需要がある。
【０００４】
したがって、多能性幹細胞からの異なる細胞型の標的培養のための解決策が強く求められている。第一に、組織製造のために部分的に非常に複雑な可能性及び装置が開発されてきた。特に、例えば肺、肝臓、心臓、皮膚、又は、気管支組織の培養を可能にするいわゆる臓器チップが使用される（Ｌａｎｇ，Ｑ．；Ｒｅｎ，Ｙ．；Ｗｕ，Ｙ．；Ｇｕｏ，Ｙ．；Ｚｈａｏ，Ｘ．；Ｔａｏ，Ｙ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｚｈａｏ，Ｈ．；Ｌｅｉ，Ｌ．；Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｌａｂｌｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｉｐ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２０１６，６（３２），２７１８３−２７１９０参照）。
【０００５】
体内では、身体の組織特異性の幹細胞ニッチにおいて幹細胞を見出すことができる。そのようなニッチでは、幹細胞が物理的に結合するだけでなく、ニッチの特別な微小環境が、生化学的プロセスのその調節ネットワークとケモカイン、サイトカイン、増殖因子、膜貫通受容体、並びに、細胞外マトリックスによって誘導される信号とを通じて幹細胞の発生を決定する。したがって、体外での幹細胞の培養のために、幹細胞ニッチの微小環境を人工的に模倣する試みがなされている（Ｌｕｔｏｌｆ，Ｍ．Ｐ．；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐ．Ｍ．；Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ．，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００９，４６２（７２７２），４３３−４４１参照）。
【０００６】
幹細胞ニッチの自然環境を模倣する際、他の細胞型並びに培地における勾配及び濃度勾配は、細胞の微小環境に加えてプロセスの有効性に関して最も重要な役割を果たす。
【０００７】
欧州特許第２１８１１８８号は、マイクロ流体システムとして構成されて高度な細胞培養物、特に３Ｄ細胞培養物及び幹細胞培養物の培養に適したマイクロバイオリアクターを開示する。特別な特徴は、マイクロバイオリアクターの灌流のための培地回路の構築である。細胞増殖が起こるサンプルキャリアは、上下に積み重ねられた１つ以上の３Ｄ細胞チップである。マイクロタイタープレート上の幾つかの相互に独立したマイクロバイオリアクターの配置は、特にハイスループットスクリーニングのためにマルチマイクロバイオリアクターを使用できるようにする。
【０００８】
米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２６号明細書は、間葉系結合組織幹細胞を有するスキャフォールドが取り付けられてスキャフォールド上で臍帯血幹細胞が培養される回転培養チャンバを備える人工幹細胞ニッチを開示する。培養チャンバは、栄養供給とガス及び廃棄物の交換とが透析膜を介して行われる流体供給システムを介して供給され、また、第２の流体システムが培養チャンバ内の懸濁液からの細胞採取を可能にする。
【０００９】
米国特許出願公開第２０１１／０２０７１６６号明細書は、間葉系幹細胞で被覆されたスキャフォールドと、幹細胞の培養物中への増殖を可能にする培地とからなる骨髄微小環境におけるニッチの複製に対応する人工微小環境を開示する。人工ニッチは造血細胞及び白血病細胞の培養に適している。スキャフォールドは、エラストマー材料、例えばポリカーボネート又はポリウレタンから形成される網状の膨張性マトリックスからなる。
【００１０】
しかしながら、前述の周知のバイオリアクターは全て、それらの構造が非常に複雑であるために容易な取り扱い、製造、及び、特に使い捨てシステムとしての使用が制限されるという欠点を有する。
【００１１】
独国特許出願第１０２０１４００１６１５．３号明細書は、連続プロセスにおいて使い捨てシステムとして操作される接着細胞の培養のための装置を開示する。この装置の特別な特徴は、それぞれが圧縮空気によって動作される水平及び垂直クッション形ポンプ要素による反応容器内の培地の均質化である。対応する流れ分配器が均一な混合を確保する。培地のガス処理は、半透膜ホースを通じて行われる。しかしながら、この装置は、接着細胞の培養のためだけに設計されており、それらの特別な要件を伴う幹細胞用には設計されていないという欠点を有する。
【００１２】
米国特許第４６４９１１７号は、細胞の培養のための発酵槽として使用され得る反応器を開示し、この場合、特に、反応器が内側チャンバと外側チャンバとからなるとともに穏やかなガス流が下方から中心に導入されるという事実によって剪断力がない混合が達成される。しかしながら、この反応器は、対応する増殖領域が与えられないため、接着細胞又は幹細胞の培養には適していない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、既知の装置の利点を利用して、欠点を回避するとともに、幹細胞培養の問題のためのより簡単で柔軟に使用可能な解決策を提供することである。本発明に係るマイクロバイオリアクターモジュールは、使い捨てシステムとして有効に使用することができる。共通の又は別々の培養室における幾つかのモジュールの並列配置は、マルチマイクロバイオリアクターとしての使用を可能にする。マルチマイクロバイオリアクターとしての構成において、本発明に係るマイクロバイオリアクターモジュールは、その画定された制御可能な微小環境に起因して、最適な培養条件をスクリーニング及び選択するのに特に適している。
【００１４】
本発明をより良く理解するために、以下の図に示される実施形態を用いてこの発明をより詳細に説明する。同一の部品には同一の参照符号及び同一の構成要素表示が与えられる。更に、図示して説明される異なる実施形態からの幾つかの特徴又は特徴の組み合わせは、独立した解決策、発明的解決策、又は、本発明に係る解決策を表し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】幹細胞の培養が培養容器（１）内で行われるマイクロバイオリアクターモジュールの概略図である。
【図２】幾つかのマイクロバイオリアクターモジュールが独国特許出願第１０２０１４００１６１５．３号明細書に係る培養室内へ導入されるマルチマイクロバイオリアクターの概略図である。
【図３】カバー（１１）の平面図の略図であり、この場合、上方に開口する複数のモジュールスロット（１７）に加えて、反応容器（１２）内の様々な位置でオンラインプロセス制御を可能にするプローブ（１８）のための様々な接続オプションもある。
【図４】反応容器（１２）内の培地の混合が気泡塔又はループ反応器に対応する構成によって確保されるマイクロバイオリアクターモジュールの概略図である。
【図５】本発明に係るモジュールを含むスケールアップバイオリアクターの概略図である。
【図６】ガス透過性エアバッグが培養容器の内部に配置されるスケールアップバイオリアクターの側面図の略図である。
【図７】スケールアップバイオリアクターの正面図及び側面図の略図である。
【図８】スケールアップバイオリアクターの概略図であり、この場合、左側の図は、活性空気が供給されていない状態（反応器内の過剰圧力）を示し、右側の図は、活性空気が供給されている状態を示しており、特に血圧（収縮期及び拡張期）を模倣するべく使用され得る。
【図９】大きな増殖表面を有するスケールアップ培養ユニットの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
図１は、幹細胞培養が幹細胞ニッチの微小環境を模倣する培養容器（１）内で行われるマイクロバイオリアクターモジュールを示す。マイクロバイオリアクターモジュールの培養容器（１）は、半透性の天然又は合成の膜材料のバッグからなり、それにより、アミノ酸又はグルコースなどの小分子を環境とやりとりすることが可能であるが、細胞培養は物理的に固定される。培養容器（１）は、生体適合性の担体材料又はスキャフォールド（好ましくは有機又は無機ポリマー材料）を備えるとともに、例えば適切にコロニー形成された担体による間葉系幹細胞との共培養にも使用され得る。
【００１７】
培養容器（１）は、好ましくはプラスチックから形成されるガス透過性装着管（２）に取り付けられ、ガス透過性装着管（２）は、他端がプラスチック、ゴム、又は、シリコーンから形成されるプラグ（３）で終端する。プラグ（３）は厚さが非対称である。好ましい実施形態では、ガス透過性装着管（２）が弾性材料又は半弾性材料から形成される。
【００１８】
装着管（２）の内側には、細胞の接種、生物活性分子及び栄養素の供給、並びに、サンプルの採取を可能にする排出・供給ライン（４）がある。好ましい実施形態では、排出・供給ライン（４）が弾性材料又は半弾性材料から形成される。
【００１９】
ライン（４）は、プラグ（３）の上側で、例えばシリンジ（６）を装着するためのアダプタとして使用されるねじ付きの接続部品（５）内で終端し、シリンジ（６）によって物質、培地、細胞の供給及び排出制御される。接続部品（５）内のライン（４）の開口には、装着されたシリンジ（６）による穿刺を可能にするとともにシリンジ（６）が取り外されるときに閉じる弾性閉鎖材料が設けられる。
【００２０】
コア部品が、プラグと共に、下向きに開口されるシース（７）中へ挿入される。シース（７）は、全部で３つの開口を側壁に有する。開口のうちの２つはプラグ（３）の高さに配置され、もう１つはシース（７）の下側３分の１の位置にある。貫流開口（８）には、外部培地の流れの方向に応じて開閉するフラップ（９）が設けられる。第３の開口は、そのようなフラップを有さず、結果として生じる廃棄物、例えば望ましくない代謝物のための排出部（１０）として機能する。プラグ（３）の非対称な厚さ及びその状態は、シース（７）内でプラグ（３）を回転させることによって貫流開口（８）又は廃棄物排出部（１０）のいずれかの意図的な開閉を可能にする。シース（７）は、好ましくは半弾性プラスチック材料からなる。
【００２１】
培養細胞は、連続的なプロセス制御のために排出・供給ライン（４）を介した部分的な除去によって或いは培養容器（１）を装着管（２）から分離することによって採取され得る。
【００２２】
本発明に係るマイクロバイオリアクターユニットは、様々な培養システムで使用され得る。ユニットは、貫流開口（８）が本発明にしたがって機能するようにするべく装置のそれぞれの主な流れ方向に対して平行に挿入される。
【００２３】
図２は、幾つかのマイクロバイオリアクターモジュールが独国特許出願第１０２０１４００１６１５．３号明細書に係る培養室内に配置されるマルチマイクロバイオリアクターを示す。この好ましい実施形態において、本発明に係る１つ以上の異なるマイクロバイオリアクターモジュールは、シールを備える開口内のプラスチックカバー（１１）内に平行に固定され、交換可能な反応容器（１２）内に挿入される。培地で満たされた反応容器（１２）内では、底部に配置される圧縮空気駆動ポンプ要素（１３）によって均一で穏やかな剪断力のない均質化が達成される。流れ分配器（１４）として作用する多孔板によって強化される均質化の流れ方向は、マイクロバイオリアクターモジュールの向きと平行に延びる。半透膜ホース（１５）が反応容器内の培地の無気泡ガス処理を可能にする。反応容器（１２）を加熱素子（１６）中に導入することによって温度制御を達成することができ、この場合、加熱素子（１６）は反応容器（１２）の下端部のみを覆うことが好ましく、それにより、反応容器（１２）の内側で最小垂直温度勾配が生じる。
【００２４】
個々のマイクロバイオリアクターモジュールにおける増殖条件は個々に適合され得る。異なる担体材料及び細胞培養物を備えてもよい個々の培養容器（１）中の栄養素の組成は、個々のモジュールの別個の排出・供給ライン（４）によって適合され得る。マイクロバイオリアクターモジュールの長さは変化可能であり、したがって、反応容器（１２）中の培地中への異なる浸漬深さを達成することができる。そのため、温度（垂直温度勾配に対応する）及び圧力（静水圧に対応する）に関する増殖条件をプローブで測定して個別化できる。
【００２５】
図３はカバー（１１）の上面図を示し、図中、上方に開口する複数のモジュールスロット（１７）とは別に、反応容器（１２）内の様々な位置でオンラインプロセス制御を可能にするプローブのための様々な接続オプション（１８）も設けられる。
【００２６】
単一の反応容器（１２）内の個々のマイクロバイオリアクターモジュールの数は反応容器のサイズによってのみ制限され、この場合、単一のモジュールの容積もマイクロリットルからミリリットルスケールまで変化し得る。
【００２７】
図４は、本発明に係るマイクロバイオリアクターモジュールを適用するための反応容器の他の想定し得る形態を示し、この場合、反応容器（１２）中の培地の混合は、気泡塔又はループ反応器に対応する構成によって確保される。格子状に配置される小開口を有する上方に開口するプレートは、圧縮空気が圧縮空気供給部（２０）を介して脈動的に流通する気泡発生器（１９）としての機能を果たす。カバー（１１）は、シール（２４）で反応容器（１２）に接続されるとともに、図１〜図３における構成に対応するが、圧力逃し弁（２３）を更に含む。気泡発生器（１９）によって生成される気泡は垂直方向に混合流を引き起こし、この混合流は、上端及び下端が開口して装着ブラケット（２２）により反応容器に固定される内側反応器シェル（２１）内を上向きに流れる。内側反応器シェル（２１）と反応容器（１２）との間の空間内で対応する向流が生じる。余剰空気は圧力逃し弁（２３）を通って外部に送られる。圧力逃し弁（２３）の開閉は圧縮空気の脈動供給を伴い、それにより、空気供給中に増大される圧力が弛緩相に置き換えられる。図１〜図３に示される好ましい実施形態と同様に、１つ以上のマイクロバイオリアクターモジュールが流れの方向と平行にカバー（１１）内に導入される。
【００２８】
好ましい実施形態において、マイクロバイオリアクターモジュールは、培養されるべきそれぞれの細胞型に適した微小環境をスクリーニングするのに役立つ。異なる増殖因子の組成及び濃度、細胞外マトリックス因子の存在、溶存酸素濃度、ｐＨ値、浸透圧、及び、栄養素の継続的供給、並びに、代謝産物の除去が最適化される。
【００２９】
他の好ましい実施形態は、大規模で最適化された条件下での所望の細胞型の培養を可能にするスケールアップバージョンのバイオリアクターである。図５〜図９は、スケールアップバイオリアクターの概略図を示す。スケールアップバイオリアクターは、より大きな容積を含む本発明に係る１つ以上のモジュールを含み、したがって、最適化されて制御された再現可能な条件下で高い細胞収率を可能にする。マイクロバイオリアクターにおける三次元培養は、生産への迅速な変換及び単純なスケールアッププロセスを可能にする。更に、培養中の制御可能なパラメータは、簡単で穏やかな細胞採取を可能にする。
【００３０】
他の実施形態において、スケールアップバイオリアクターは、制御可能な培養条件に起因して連続発酵を可能にする。１つの実施形態では、スケールアップバイオリアクターが培養容器（１）の上下に気泡発生器（１９）を有する。
【００３１】
一般的なマイクロバイオリアクターモジュール、特にスケールアップバイオリアクターの他の利点は、培養容器内の圧力を変化させることによって例えば収縮期及び拡張期（血圧１２０／６０ｍｍＨｇ、すなわち１１６０／６０ｍｂａｒ）を有する個体の体内で変化する血圧をシミュレートできる可能性である。マイクロバイオリアクターモジュールでは、これが圧縮空気供給部（２０）及び気泡発生器（１９）によって可能にされる。スケールアップバイオリアクターでは、培養容器内にガス透過性エアバッグ（２５）があり、このエアバッグは、該エアバッグ内の容積及び圧力を変えることによって培養容器内の脈動血液の脈動物性をシミュレートする。これは培養容器内での均質化を伴う。更に、培養容器の表面上にもたらされる圧力勾配によって材料交換及び酸素交換が促進される。また、エアバッグは、それが二酸化炭素（ＣＯ２）及びアンモニウム（ＮＨ４）のガス交換を可能にするという利点を有する。
【符号の説明】
【００３２】
１：培養容器
２：装着管
３：プラグ
４：排出・供給ライン
５：接続部品
６：シリンジ
７：シース
８：貫流開口
９：フラップ
１０：排出部
１１：カバー
１２：反応容器
１３：ポンプ要素
１４：流れ分配器
１５：膜ホース
１６：加熱素子
１７：モジュールスロット
１８：プローブ
１９：気泡発生器
２０：圧縮空気供給部
２１：内側反応器シェル
２２：装着ブラケット
２３：圧力逃し弁
２４：シール
２５：ガス透過性エアバッグ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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2019534703.tif 000013
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