(57)【要約】  本発明の抗−ヒトＩＬ−３抗体又はそのフラグメントは、治療剤として有用である。その抗体は、患者におけるｈＩＬ−３の高められた発現又はレベルに関連する疾患、特に炎症又は自己免疫疾患、例えば関節リウマチの治療又は予防のための医薬組成物に使用され得る。その抗体はまた、ヒト細胞により発現されるヒトＩＬ−３を検出するためにも使用され得る。
2019507102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化ｈＩＬ−３に対する阻害活性を有する抗ｈＩＬ−３抗体であって、当該抗ｈＩＬ−３抗体のＩＣ５０が１００ｎｇ／ｍｌ以下であり、他のサイトカイン及び非ヒトＩＬ−３との交差反応性が５％未満であり、治療に用いる、当該抗体、又はその変異体。
【請求項２】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３２８１によって生産された抗体、又はハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４によって生産された抗体、又はハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３２８１によって生産された抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体、又はハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４によって生産された抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体である、請求項１に記載の抗ｈＩＬ−３抗体。
【請求項３】
前記抗体とｈＩＬ−３との結合と比較して、ＩＬ−５又はＧＭ−ＣＳＦとの結合の程度が５％未満、好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満である；及び／又はマウス又はラットＩＬ−３と交差反応しない；及び／又はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の抗ｈＩＬ−３抗体。
【請求項４】
４０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でｈＩＬ−３に対して阻害活性を有し；
又は当該抗体が完全な抗体、フラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体であり；又は当該抗体がｈＩＬ−３依存的疾患及び症状の治療に用いられ、又は患者のｈＩＬ−３の発現又はレベルの増大に関連する疾患又は機能不全の治療又は予防に使用され；又は
当該抗体が患者のｈＩＬ−３の発現又はレベルの増大に関連する疾患又は機能不全の治療又は予防に使用され、ここで任意で当該疾患又は機能不全が、炎症性又は自己免疫性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎、慢性移植片対宿主疾患、多発性硬化症、又は全身性エリテマトーデスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ｈＩＬ−３抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３２８１によって生産された抗ｈＩＬ−３抗体、又はハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４によって生産された抗体の１つ以上のＣＤＲ、又はハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ３２８１によって生産された抗体の１つ以上のＣＤＲを含む抗ｈＩＬ−３抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ＩＬ−３抗体、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ｈＩＬ−３モノクローナル抗体を生産することを特徴とするハイブリドーマ細胞株。
【請求項８】
医薬として有効な量の、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ｈＩＬ−３抗体、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体、及び任意で医薬として許容される助剤及び／又は担体を含有する、医薬組成物。
【請求項９】
患者のｈＩＬ−３の発現又はレベルの増大に関連する疾患又は機能不全の治療又は予防に使用される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
抗ｈＩＬ−３抗体、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体のｈＩＬ−３阻害活性を決定する方法であって、以下の工程：
ａ）１つ以上の濃度のｈＩＬ−３と共に、ｈＩＬ−３抗体、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体をプレインキュベーションする工程；
ｂ）工程ａ）の混合物を試料に添加する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を１つ以上の細胞マーカーと接触する工程；
ｄ）１つ以上の細胞マーカーの上方制御及び／又は下方制御を定量する工程；
を含み、ｈＩＬ−３によって上方制御される細胞マーカーの減少及び／又はｈＩＬ−３によって下方制御される細胞マーカーの増大が、阻害活性の指標である、方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ａ）１つ、２つ又はそれ以上の濃度のｈＩＬ−３と共に、ｈＩＬ−３抗体、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体を、グリコシル化抗ＩＬ−３と共にプレインキュベーションする工程；
ｂ）工程ａ）の混合物を一次ヒト血液細胞を含有する試料に添加する工程；
ｃ）工程ｂ）の混合物の血液細胞を、好塩基球、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１４＋＋単球及び／又は好酸球のための標識された細胞マーカー又はそれらの任意の組み合わせで標識する工程；
ｅ）解析、任意でフローサイトメトリー解析により、好塩基球、形質細胞様樹状細胞、単球及び／又は好酸球を同定する工程；
ｆ）好塩基球上のＣＤ２０３ｃ又はＣＤ１１ｂの上方制御、又はＣＤ１３１の下方制御を定量する工程；及び／又は
ｇ）形質細胞様樹状細胞上のＨＬＡ−ＤＲの上方制御又はＣＤ１３１の下方制御を定量する工程；及び／又は
ｈ）ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１４＋＋単球及び／又は好酸球上のＣＤ１３１の下方制御を定量する工程；
を含み、ｈＩＬ−３により上方制御される細胞マーカーの減少及び／又はｈＩＬ−３によって下方制御される細胞マーカーの増大が阻害活性の指標であり、１００ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０が、インビボでのｈＩＬ−３の効率的なブロック又はｈｌＬ−３／ｈｌＬ−３受容体相互作用の指標である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｈＩＬ−３抗体又はそのフラグメント又は変異体の濃度が約０〜３０μｇ／ｍｌであり；及び／又は工程ａ）におけるｈＩＬ−３の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌであり；及び／又はプレインキュベーション工程ａ）が約２０分間室温で実施され；及び／又は一次ヒト血液細胞がＥＤＴＡ血液試料に由来し；及び／又は一次ヒト血液細胞が関節リウマチに罹患した患者から得られたものであり；及び／又はインキュベーション工程ｃ）が３７℃で約１時間実施され；及び／又は染色工程ｄ）が約２０分間氷上で実施され；及び／又は好塩基球、形質細胞様樹状細胞、単球又は好酸球のための蛍光標識された細胞マーカーの組み合わせが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０３Ｃ、ＣＤ１３１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１６、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２を含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体、そのフラグメント、コンストラクト、変異体又は接合体が、４０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有する、ｈＩＬ−３抗体、そのフラグメント、コンストラクト、変異体又は接合体である、請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ｈＩＬ−３抗体を取得する方法であって、グリコシル化ｈＩＬ−３ペプチド又はその活性部分が免疫化の抗原として使用され、及び／又はグリコシル化ヒトｈＩＬ−３ペプチドが、ハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体のスクリーニングに使用され、及び／又はグリコシル化ｈＩＬ＝３が抗体の阻害能力を試験するために使用され；任意で抗ｈＩＬ−３ペプチドが初代ヒト細胞から発現及び翻訳される、方法。
【請求項１５】
ヒト細胞中又は患者試料中のｈＩＬ−３を検出する、好ましくはＥＬＩＳＡ法によって検出するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗ｈＩＬ−３抗体又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗−ヒトインターロイキン（ＩＬ−３）抗体、そのような抗体をコードする核酸配列及び本発明の抗体を生成するハイブリドーマ細胞系に関する。本発明はさらに、ヒト患者におけるＩＬ−３の高められたレベルに関連する疾患又は機能障害の予防又は治療のために有用である、抗−ヒトＩＬ−３抗体を含む医薬組成物、及びヒトにおけるＩＬ−３の活性を阻止する抗−ヒトＩＬ−３抗体の能力を決定するための方法に関する、さらに、本発明は、ヒトＩＬ−３の検出方法へのそのような抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキンは、サイトカインと呼ばれる大きなタンパク質ファミリーに属する。サイトカインは、特定の細胞に結合すると特定の細胞の機能に影響を及ぼすポリペプチドであり、サブクラス、すなわちインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、リンホカイン、成長因子及びモノカインに分けられる。サイトカインが細胞増殖及び例えば、また炎症疾患において主要役割を果たすことは良く知られている。
【０００３】
細胞増殖は、成長因子が細胞表面上の特定の受容体に結合し、この後、エンドサイトーシスが起こり、そしてサイトカイン及び受容体の複合体が内在化され、細胞応答を引起す複雑な工程である。そのような細胞応答は、ＤＮＡ合成及び細胞複製のような特定の遺伝子転写活性を含む。比較的高い濃度で試験される場合、サイトカインの大部分は、いくつかの異なる生物学的効果を有する。それらのサイトカインの効果のために、それらのタンパク質の可能な治療用途についての調査に高い関心がある。
【０００４】
インターロイキンは、大部分、白血球において低濃度で生成される免疫系のメディエーターである。それらは、免疫系の細胞の増殖、分化及び活性に影響を及ぼし、そして従って、免疫モジュレーターに属する。それらはまた、標的細胞の表面上の受容体に結合することにより効果を発揮し、そして従って、特定遺伝子の転写速度を変える。それらは、多数の細胞応答の誘発において重要な役割を果たす。
【０００５】
インターロイキンは、例えば免疫細胞活性化カスケード及び続く炎症性変化に関与する。不規則及び／又は異常炎症は、広範なヒト疾患の主要成分及び因子であり、それらの１つは免疫学的障害である関節リウマチ（ＲＡ）である。しかしまた、他の免疫学的疾患もインターロイキンにより影響される。
【０００６】
マルチＣＳＦとも呼ばれるＩＬ−３は、インターロイキンファミリーの良く知られたメンバーである。それは、種々の造血前駆体細胞に対する増殖刺激及び分化効果を有し、そして肥満細胞のための増殖因子として作用する。ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦと共に、ＩＬ−３は、４つの短いα−へリックス束を有する造血サイトカインのファミリーに属する。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３は、好中球及び抗酸性顆粒球コロニー及びマイクロファージの形成を刺激する。それはさらに、マスト、巨核球、及び純粋な及び混合された赤血球コロニーの形成を刺激する（Ｄ．  Ｍｅｔｃａｌｆ，  ,,Ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ“，  １９８４，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【０００７】
ＩＬ−３は、１３３個のアミノ酸から成り、そしてヒト造血前駆体細胞によるコロニー形成の刺激、及びヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球によるＤＮＡ合成の刺激のために知られている。ＩＬ−３は、ＣＤ１２３抗原として知られている独自の受容体に結合する。この受容体は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーに属し、そして共通のβ−サブユニット（βＣ又はＣＤＷ１３１）と対になるユニークα鎖を有するヘテロダイマーである。ＩＬ−３はユニークα−受容体サブユニットに結合する。しかしながら、シグナル伝達は、ＪＡＫ２−ＳＴＡＴＳ経路による共通のβ−受容体サブユニット（βＣ）により媒介される。
【０００８】
ヒトＩＬ−３は、配列番号１０で定義されるようなヒトＩＬ−３のアミノ酸配列の２つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位、すなわちａａＮ１５及びａａＮ７０を有する：
ＡＰＭＴＱＴＴＳＬＫ  ＴＳＷＶＮＣＳＮＭＩ  ＤＥＩＩＴＨＬＫＱＰ  ＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬ  ＮＧＥＤＱＤＩＬＭＥ  ＮＮＬＲＲＰＮＬＥＡ  ＦＮＲＡＶＫＳＬＱＮ  ＡＳＡＩＥＳＩＬＫＮ  ＬＬＰＣＬＰＬＡＴＡ  ＡＰＴＲＨＰＩＨＩＫ  ＤＧＤＷＮＥＦＲＲＫ  ＬＴＦＹＬＫＴＬＥＮ  ＡＱＡＱＱＴＴＬＳＬ  ＡＩＦ（グリコシル化部位は太字である）。
【０００９】
真核細胞により発現されたＩＬ−３は、Ｎ−グリコシル化されることは十分に確立されている（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００３  Ｓｅｐ；３１（１）：３４−４１からのデータシートを参照のこと）。ＩＬ−３のグリコシル化された及び非グリコシル化されたバージョンは、腫瘍細胞のＩＬ−３誘発された増殖により測定された場合と類似する生物活性を有する（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，  Ｂｉｏｍｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００３  Ｓｅｐ；３１（１）：３４−４１からのデータシート、以下同様）。ネズミＩＬ−３に関しては、グリコシル化はＩｌ−３の生物活性に影響を及ぼさないことも示されている（Ｃｙｔｏｋｉｎ  １９９３；５：２９１−２９７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８８，  ２６３：１４５１１−１７）。
【００１０】
これまで、グリコシル化がＩＬ−３生物活性を阻止するモノクローナル抗体の能力に影響を及ぼすというヒントは文献には存在しなかった。モノクローナル抗体の阻害活性は、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３（Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ  １９９１；  ２６６：１０６２４−３１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１；  １４６：８９３−８）又は非グルコシル化ＩＬ−３（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９１；  ２６６：２１３１０−１７）のいずれかにより特徴づけられた。ＩＬ−３への抗体の結合は、グリコシル化及び非グリコシル化ＩＬ−３により試験され、そしてグリコシル化に無関係であることが見出された。ＩＬ−３は主に、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞により生成され、そして特に、ＣＤ３４＋造血前駆体細胞の増殖、分化及び生存に寄与する。ＩＬ−３は、インビトロで、好塩基球及び肥満細胞の骨髄細胞からの分化を促進することが観察されている。さらに、マウス好塩基球によるＩＬ−６放出を誘発し、そして単球／マクロファージにおけるＭＨＣ−II発現及びＩＬ−１分泌をアップレギュレートすることが観察されている。さらに、ＩＬ−３は、単球の樹状細胞及び破骨細胞への分化を支持する。
【００１１】
ヒトゲノムライブラリーにおけるＩＬ−３の最初の検出以来、健康なヒトにおけるその役割及び疾患の発生におけるその可能性ある役割を決定することが、調査の焦点であった。サイトカインが造血を開始するか又は調節する能力は、特に免疫系の機能不全又は疾患に関連する限り、興味あるものである。そのような障害は造血系の妨害に関連されているようであり、そしてそのような疾患は、生存可能な前駆体細胞を造血系に提供することにより治療され得ると考えられている。そのような前駆体細胞を分化させるように誘発することは、それぞれの疾患を治療する手段としてみなされた。
【００１２】
数年前まで、自己免疫疾患及び特に関節リウマチ（ＲＡ）におけるＩＬ−３の役割についてはほとんど知られていなかった。ＲＡは、関節の最も一般的な炎症性疾患である。最初の疾患段階はしばしば、徐々に進行するが、しかしまた、瞬間的爆発で出現することもあり得ます。主に痛みは、指又はつま先関節で発生するが、また他の関節も影響を受けます。罹患した関節は腫脹を示し、そして通常、異常高熱である。ほとんど、この疾患はエピソードで進行し、エピソードは通常、数週〜週ヶ月間、持続する。エピソードの間、一般的に症状の改善がある。
【００１３】
ＲＡの病因はまだ知られていない。自己免疫の原因はウィルスによって強く疑われ、そして細菌原因もまた論じられている。遺伝的影響は、何人かの著者により報告されてきた（Ｈｅｍｍｉｎｋｉ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００９；  ６０（３）：  ６６１−８，  Ｐａｄｙｕｋｏｖ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００４；  ５０（１０）  ３０８５−９２）。間違った免疫細胞が影響された関節に侵入し、そして前症炎性サイトカインの生成を引起すと推定される。１つの理論によれば、サイトカイン間のバランスがＲＡにおいて妨げられる。ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦαはＲＡにおいて過剰に存在し、そして軟骨組織において有害な炎症工程及び破骨細胞の活性化を担当していることが報告されている。
【００１４】
関節リウマチの治療は、有害な副作用の高いリスクを有する医薬が使用されなければならないので、患者にとって、まだ困難で且つ負担がかかると考えられている。この疾患を治療する１つの手段は、主に、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を用いての対症療法を行うことである。それらの薬物は、抗炎症及び鎮痛剤として作用し、そしてしばしば、痛みの緩和のみを達成する。薬物はさらに、プロスタグランジンがシクロオキシゲナーゼにより生成される、炎症カスケードにおける特定段階を妨害する。しかしながら、ＮＳＡＩＤは、根底にある炎症工程に影響を及ぼさず、そして従って、ＲＡの最も有害な効果である関節破壊を遅らせることができない。
【００１５】
関節破壊及び疾患活動を予防するために、ＲＡを治療するためのさらなる現在のアプローチは、疾患改変抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の使用である。それらの医薬品は実際、疾患工程を改変する。ＤＭＡＲＤの例は、メトトレキセートであり、最も一般的に使用される抗リウマチ薬であり、その効果は、酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼの可逆的阻害に基いている。ＲＡを治療するための別の一般的に使用される物質は、レフルノミドであり、これはピリミジン代謝を介することにより効果をもたらす。両医薬品は、長時間作用し、そして従って、所望の効果を示すためには、長時間（通常１２−１６週）にわたって投与されるべきである。ＤＭＡＲＤが患者を改善するまでの時間を埋めるためには、ほとんどの患者はステロイドが投与される。
【００１６】
ＲＡを治療するためのさらなるアプローチは、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１のようなサイトカイン、又はＢ７のような共刺激性分子をブロックするか、又は白血球サブセット（例えば、Ｂ細胞）を枯渇させる「生物学的製剤」である。生物学的製剤（例えば、ＴＮＦ抗体インフリキシマブ）は、重篤な疾患段階に、及びＤＭＡＲＤが疾患の活動を十分に制御できなかった後に、主に使用される。生物学的製剤は、免疫系における多くのシグナル系に影響を及ぼし、そして細菌及びウィルス感染、及び腫瘍の発生の高いリスクを含む種々の重度の副作用を有する。
【００１７】
全ての既知治療は、重度の欠点及び副作用を有し、そして従って、効果的であり、自己免疫疾患に罹患している患者において他のサイトカインよりもより選択的に発現され、そして現在使用される治療レジームよりも低い副作用を有する、ＲＡの治療のための新規薬物を開発することが目的であった。
【００１８】
より最近では、自己免疫疾患、及び特にＲＡにおけるＩＬ−３の関与が記載されて来た。国際公開第２０１０／０６３４８８号は、ＩＬ−３インヒビターが関節リウマチの初期段階の治療に使用され得ることを記載している。上記特許出願は、ＩＬ−３  ｍＲＮＡがＲＡ患者の滑膜に検出されず、そしてＩＬ−３の効果が培養線維芽細胞に観察されなかったことを述べているが、遺伝子分析によれば、ＩＬ−３プロモーター遺伝子中の単一のヌクレオチド多型とＲＡとの間に関連性が見出された。ＲＡ患者における相当に高められたレベルのＩＬ−３の存在を示すこの発見及びまたさらなる研究に基いて、国際公開第２０１０／０６３４８８号は、予防的ＲＡ治療、疾患の初期段階における治療処置、又は維持処置への阻害剤、主に抗体又は抗体フラグメント、抗体変異体又は抗体マルチマーのそのような使用を提案している。
【００１９】
しかしながら、高い親和性及びアビディティをまた示すＩＬ−３に対して高い特異性を有する効果的な抗体の必要性がまだ存在する。患者の身体における疾患又は機能不全の治療に使用される抗体のインビボ有効性は必須であるので、インビボ状況下で有効である抗体に対する緊急の必要性もまた存在する。そのような抗ＩＬ−３抗体は好ましくは、他の種からのＩＬ−３との交差反応性を示さないが、又は非常に低いはずである。本発明のこの目的の範囲内で、ＩＬ−３の活性をインビボで効率的且つ特異的に阻害することができる抗体を提供することが望ましく、従って、ＩＬ−３のレベルの上昇と診断された患者における疾患を治療するのに有用な薬剤となる。
【発明の概要】
【００２０】
本発明のそれらの目的は、添付の請求項及び以下の記載に特定されるような本発明の抗ＩＬ−３抗体又はそのフラグメント、コンストラクト、変異体又は接合体により解決される。
【００２１】
抗ヒトＩＬ−３抗体を効率的に得るための方法を提供することがさらなる目的である。ヒトにおけるＩＬ−３活性を阻止できる抗ヒトＩＬ−３抗体を同定するための方法及び試験を提供することが本発明のさらなる目的であった。本発明のさらなる目的は、ヒト細胞により発現されるヒトＩＬ−３の検出のための方法において効率的に使用され得る抗体を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明はまた、以下の図面を参照しても説明される。以下の図面は、本発明をさらに例示し、そして説明するが、しかしその範囲を限定するものではない。
【００２３】
【図１】図１は、種々の種のアミノ酸配列相同性を示す。
【００２４】
【図２】図２は、ＩＬ−３に結合するモノクローナル抗体の能力をウェスターンブロットで示す。
【００２５】
【図３】図３は、異なる量のＩＬ−３が、上昇する量の被覆されたヤギ抗―ｈＩＬ−３抗体を介して固体表面にヤギ抗−ヒト−ＩＬ−３抗体により結合された、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて種々の量の抗体を用いることにより決定されたような、ＩＬ−３のための抗体クローン１１の相対的親和性を示す。
【００２６】
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて固相に結合された一定量のＩＬ−３で種々の濃度の抗体を用いて決定された抗体の相対的ＩＬ−３親和性を示す。
【００２７】
【図５】図５は、他のヒトサイトカインと抗−ＩＬ−３抗体との可能性ある交差反応性を検出するために実施された試験の結果を示す。試験では、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−５への抗体の結果が比較された。
【００２８】
【図６】図６は、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６が、ヒトＩＬ−５又はヒトＧＭ−ＣＳＦとの交差反応性を示さないことを示す。ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳ、ＰＢＳ中、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＩＬ−５又はヒトＩＬ−３（１μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆された。洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によりブロックした後、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６（４０μｇ／ｍｌ）又は培地を、室温で１時間、適用した。洗浄の後、二次ＨＲＰ−標識ウサギ抗−マウスポリクローナル抗体（Ｐ２６０，  ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を適用した。洗浄の後、色基質反応をＡＢＴＳにより実施し、そして光学濃度を測定した。図６に示される結果を、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの組換えヒトＩＬ−３（キャリアフリー）カタログ番号５７００２）により発現されたヒトＩＬ−３を用いることにより得た。従って、ヒトＩＬ−３ペプチドをグリコシル化した。
【００２９】
【図７】図７−９は、他の種からのＩＬ−３と、種々の抗−ＩＬ３抗体との可能性ある交差反応性を検出するために行われた試験の結果を示す。図８は、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６がマウス又はラットＩＬ−３との交差反応性を示さないことを示している。ＥＬＩＳＡウェルが、ＰＢＳ、ＰＢＳ中、マウスＩＬ−３、ラットＩＬ−３又はヒトＩＬ−３（１μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆された。洗浄、及びＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によるブロッキングの後、クローンＰＳＣ１１Ｃ８−６（４０μｇ／ｍｌ）又は培地が、室温で１時間、適用された。洗浄の後、二次ＨＲＰ標識ウサギ抗−マウスポリクローナル抗体（Ｐ２６０，  ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）が適用された。洗浄の後、色基質反応がＡＢＴＳにより行われ、そして光学濃度が測定された。図８に示される結果は、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの組換えヒトＩＬ−３（キャリアフリー）カタログ番号５７００２）により発現されたヒトＩＬ−３を用いることにより得られた。従って、そのヒトＩＬ−３ペプチドはグリコシル化された。図９に示される試験においては、また商業的に入手できる抗−ＩＬ−３が含まれた。
【図８】図７−９は、他の種からのＩＬ−３と、種々の抗−ＩＬ３抗体との可能性ある交差反応性を検出するために行われた試験の結果を示す。図８は、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６がマウス又はラットＩＬ−３との交差反応性を示さないことを示している。ＥＬＩＳＡウェルが、ＰＢＳ、ＰＢＳ中、マウスＩＬ−３、ラットＩＬ−３又はヒトＩＬ−３（１μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆された。洗浄、及びＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によるブロッキングの後、クローンＰＳＣ１１Ｃ８−６（４０μｇ／ｍｌ）又は培地が、室温で１時間、適用された。洗浄の後、二次ＨＲＰ標識ウサギ抗−マウスポリクローナル抗体（Ｐ２６０，  ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）が適用された。洗浄の後、色基質反応がＡＢＴＳにより行われ、そして光学濃度が測定された。図８に示される結果は、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの組換えヒトＩＬ−３（キャリアフリー）カタログ番号５７００２）により発現されたヒトＩＬ−３を用いることにより得られた。従って、そのヒトＩＬ−３ペプチドはグリコシル化された。図９に示される試験においては、また商業的に入手できる抗−ＩＬ−３が含まれた。
【図９】図７−９は、他の種からのＩＬ−３と、種々の抗−ＩＬ３抗体との可能性ある交差反応性を検出するために行われた試験の結果を示す。図８は、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６がマウス又はラットＩＬ−３との交差反応性を示さないことを示している。ＥＬＩＳＡウェルが、ＰＢＳ、ＰＢＳ中、マウスＩＬ−３、ラットＩＬ−３又はヒトＩＬ−３（１μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆された。洗浄、及びＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によるブロッキングの後、クローンＰＳＣ１１Ｃ８−６（４０μｇ／ｍｌ）又は培地が、室温で１時間、適用された。洗浄の後、二次ＨＲＰ標識ウサギ抗−マウスポリクローナル抗体（Ｐ２６０，  ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）が適用された。洗浄の後、色基質反応がＡＢＴＳにより行われ、そして光学濃度が測定された。図８に示される結果は、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの組換えヒトＩＬ−３（キャリアフリー）カタログ番号５７００２）により発現されたヒトＩＬ−３を用いることにより得られた。従って、そのヒトＩＬ−３ペプチドはグリコシル化された。図９に示される試験においては、また商業的に入手できる抗−ＩＬ−３が含まれた。
【００３０】
【図１０】図１０は、ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖を示し、ここで生存細胞はＩＬ−３の不在下で増殖せず、そして細胞増殖は増殖培地においてＩＬ−３の量に依存することが示され得る。
【００３１】
【図１１】図１１−１４は、市販の抗−ＩＬ−３抗体を含む種々のモノクローナル抗体の、ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖を阻害する能力を示す。細胞増殖培地に依存する異なる濃度のｈＩＬ−３に関して、抗体クローン１１、クローン１３及びＲ＆Ｄ抗−ＩＬ−３抗体の細胞増殖の明確な阻害を示す抗体の効果が試験されたが、クローン８はわずかな効果しか有さなかった。使用されたヒトＩＬ−３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手され、そしてＥ．コリにより発現された。従って、使用されたヒトＩＬ−３は、非グリコシル化ＩＬ−３ペプチドであった。
【図１２】図１１−１４は、市販の抗−ＩＬ−３抗体を含む種々のモノクローナル抗体の、ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖を阻害する能力を示す。細胞増殖培地に依存する異なる濃度のｈＩＬ−３に関して、抗体クローン１１、クローン１３及びＲ＆Ｄ抗−ＩＬ−３抗体の細胞増殖の明確な阻害を示す抗体の効果が試験されたが、クローン８はわずかな効果しか有さなかった。使用されたヒトＩＬ−３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手され、そしてＥ．コリにより発現された。従って、使用されたヒトＩＬ−３は、非グリコシル化ＩＬ−３ペプチドであった。
【図１３】図１１−１４は、市販の抗−ＩＬ−３抗体を含む種々のモノクローナル抗体の、ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖を阻害する能力を示す。細胞増殖培地に依存する異なる濃度のｈＩＬ−３に関して、抗体クローン１１、クローン１３及びＲ＆Ｄ抗−ＩＬ−３抗体の細胞増殖の明確な阻害を示す抗体の効果が試験されたが、クローン８はわずかな効果しか有さなかった。使用されたヒトＩＬ−３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手され、そしてＥ．コリにより発現された。従って、使用されたヒトＩＬ−３は、非グリコシル化ＩＬ−３ペプチドであった。
【図１４】図１１−１４は、市販の抗−ＩＬ−３抗体を含む種々のモノクローナル抗体の、ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖を阻害する能力を示す。細胞増殖培地に依存する異なる濃度のｈＩＬ−３に関して、抗体クローン１１、クローン１３及びＲ＆Ｄ抗−ＩＬ−３抗体の細胞増殖の明確な阻害を示す抗体の効果が試験されたが、クローン８はわずかな効果しか有さなかった。使用されたヒトＩＬ−３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手され、そしてＥ．コリにより発現された。従って、使用されたヒトＩＬ−３は、非グリコシル化ＩＬ−３ペプチドであった。
【００３２】
【図１５】図１５は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ又はそれらの組合せの存在下で、又はそれらのサイトカインの不在下で、ＴＦ１細胞の増殖に対する、培地中の種々の抗体（クローン８、クローン１１、クローン１３及びＲ＆Ｄ）及びそれらの異なる濃度の抗体の効果を示す。いずれの抗体も、ＧＭ−ＣＳＦの存在下でＴＦ１細胞の増殖に対する顕著な阻害効果を示さなかったのに対して、クローン１１、及び高濃度でのクローン１３及びＲ＆Ｄ抗体はＴＦ１細胞の増殖に対するＩＬ−３効果を明白に阻害した。使用されたヒトＩＬ−３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから入手され、そしてＥ．コリにより発現された。従って、使用されたヒトＩＬ−３は、非グリコシル化ＩＬ−３ペプチドであった。
【００３３】
【図１６】図１６は、抗−ＩＬ−３クローン１１及びクローン１３のＢｉａｃｏｒｅ−Ａｎａｌｙｓｉｓを示す。
【００３４】
【図１７】図１７は、好塩基球上のＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１１ｂのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションを示す。
【００３５】
【図１８】図１８は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）に対するＨＬＡ−ＤＲのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションを示す。
【００３６】
【図１９】図１９−２１は、好塩基球上のＣＤ２０３のＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対する抗体の効果を示す。
【図２０】図１９−２１は、好塩基球上のＣＤ２０３のＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対する抗体の効果を示す。
【図２１】図１９−２１は、好塩基球上のＣＤ２０３のＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対する抗体の効果を示す。
【００３７】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）が、室温で２０分間、抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートされ、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加された。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞は、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色され、そしてフローサイトメトリーより分析され、好塩基球が同定され、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションが定量化された。
【００３８】
ＭＯＰＣ−２１＝マウスＩｇＧ１κアイソタイプ対照抗体。クローン１１、１３、３６、４４、４７、Ｒ＆Ｄ２０３  ４３０６＝抗ヒトＩＬ−３抗体。
【００３９】
【図２２】図２２は、ＲＡ患者から入手された血液サンプルに由来する一次ヒト血液細胞におけるＩＬ−３遮断を示す。
【００４０】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）が、室温で２０分間、抗体（１０μｇ／ｍｌのクローン１３又は１０μｇ／ｍｌのＰ８Ｃ１１Ｃ８−６）と共にプレインキュベートされ、そして関節リウマチ（ＲＡ）を有する新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加された。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞は、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色され、そしてフローサイトメトリーより分析され、好塩基球が同定され、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションが定量化された。
【００４１】
【図２３】図２３は、２人のＲＡ患者から得られたサンプルにおける好塩基球上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対する抗体の効果を示す。
【００４２】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）が、室温で２０分間、抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートされ、そしてＲＡを罹患する患者からの新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加された。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞は、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色され、そしてフローサイトメトリーより分析され、好塩基球が同定され、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションが定量化された。
【００４３】
ＭＯＰＣ−２１＝マウスＩｇＧ１κアイソタイプ対照抗体。クローン１１、１３、４８０６＝抗ヒトＩＬ−３抗体。
【００４４】
【図２４】図２４は、クローン１３による好塩基上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【００４５】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、種々の濃度のＩＬ−３抗体クローン１３と共にプレインキュベートし、そして新鮮なＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ２０３のアップレギュレーションを定量化した。
【００４６】
【図２５】図２５は、クローン１３による好塩基球上のＣＤ１１ｂのＩｌ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【００４７】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、種々の濃度のＩＬ−３抗体クローン１３と共に、又は１０μｇ／ｍｌのＭＯＰＣ−２１（マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）、クローン１１又はＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３（クローン４８０６）と共にプレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベートの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ１１ｂのアップレギュレーションを定量化した。
【００４８】
【図２６】図２６は、クローン１３によるｐＤＣｓ上のＨＬＡ−ＤＲのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【００４９】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、種々の濃度のＩＬ−３抗体クローン１３と共に、又は１０μｇ／ｍｌのＭＯＰＣ−２１（マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体）、クローン１１又はＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３（クローン４８０６）と共にプレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベートの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）上のＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを定量化した。
【００５０】
【図２７】図２７は、好塩基球上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対する抗体の効果を示す。
【００５１】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベーションし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【００５２】
ＭＯＰＣ−２１＝マウスＩｇＧ１κアイソタイプ対照抗体。クローン１１、１３、３６、４８０６＝抗ヒトＩＬ−３抗体。
【００５３】
クローン３２７０３＝抗ヒトＩＬ−３受容体抗体。ＡＦ−４０３＝Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのポリクローナルヤギ抗−ヒトＩＬ−３。
【００５４】
【図２８】図２８は、好塩基球上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対する抗体の効果を示す。
【００５５】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、種々の濃度の抗ＩＬ−３抗体と共にプレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【００５６】
【図２９】図２９は、好塩基球上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションに対するＲ＆Ｄ抗−ＩＬ−３受容体クローン３２７０３の阻止効果を示す。
【００５７】
新鮮なヒトＥＤＴＡ血液を、種々の濃度の抗−ＩＬ−３受容体クローン３２７０３と共に室温で２０分間、プレインキュベートした。洗浄しないで、ＩＬ−３（０．３ｎｇ／ｍｌ）を添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【００５８】
図１７〜２９に示される結果は、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの組換えヒトＩＬ−３（キャリアフリー）カタログ番号５７００２）により発現されたヒトＩＬ−３を用いることにより得られた。従って、ヒトＩＬ−３ペプチドはグリコシル化された。
【００５９】
【図３０】図３０及び３１Ａ及び３１Ｂは、ヒトＩＬ−３由来の種々のペプチドへのＰ８Ｃ１１Ｃ８−６の結合を示す。Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６により認識されたエピトープは、アミノ酸２７−２９（ＬＫＱ）を含む。それは、アミノ酸２２−４８内に位置し、そして配列番号１０で定義されるようなアミノ酸配列のアミノ酸２６（Ｈ）−３６（Ｄ）のいくつか又はすべては結合に関与するようである。
【図３１】図３０及び３１Ａ及び３１Ｂは、ヒトＩＬ−３由来の種々のペプチドへのＰ８Ｃ１１Ｃ８−６の結合を示す。Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６により認識されたエピトープは、アミノ酸２７−２９（ＬＫＱ）を含む。それは、アミノ酸２２−４８内に位置し、そして配列番号１０で定義されるようなアミノ酸配列のアミノ酸２６（Ｈ）−３６（Ｄ）のいくつか又はすべては結合に関与するようである。
【００６０】
【図３２】図３２及び３３は、クローン１３及びクローンＰ８Ｃ１１８−６による、好塩基球上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【図３３】図３２及び３３は、クローン１３及びクローンＰ８Ｃ１１８−６による、好塩基球上のＣＤ２０３ｃのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【００６１】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、種々の濃度の抗ＩＬ−３抗体と共にプレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【００６２】
【図３４】図３４及び３５は、クローン１３及びクローンＰ８Ｃ１１８−６による、好塩基球上のＣＤ１３１のＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【図３５】図３４及び３５は、クローン１３及びクローンＰ８Ｃ１１８−６による、好塩基球上のＣＤ１３１のＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションの阻止を示す。
【００６３】
ＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、種々の濃度の抗ＩＬ−３抗体と共にプレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球上のＣＤ１３１のアップレギュレーションを定量化した。
【００６４】
【図３６】図３６は、クローン１３及びクローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６がＩＬ−３の同じエピトープに結合しないことを示す。
【００６５】
【図３７】図３７は、Ｐ３Ｃ１１Ｃ８−６がＩＬ−３へのクローン１３又はクローン１１の結合を妨害しないことを示す。
【００６６】
【図３８】図３８は、Ｐ３Ｃ１１Ｃ８−６がＩＬ−３へのクローン１３（ＡＫ１３）又はクローン１１（ＡＫ１１）の結合を妨げないことを示す。
【００６７】
図３２〜３８に示される結果は、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの組換えヒトＩＬ−３（キャリアフリー）カタログ番号５７００２）により発現されたヒトＩＬ−３を用いることにより得られた。従って、ヒトＩＬ−３ペプチドはグリコシル化された。
【００６８】
【図３９】図３９は、ヒト好塩基球に対するＥ．コリ又は昆虫細胞由来のＩＬ−３の同等の活性を示す。
【００６９】
【図４０】図４０は、ヒト好塩基球によるバイオアッセイにおける種々の源からのＩＬ−３の類似する活性を示す。
【００７０】
【図４１】図４１は、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３が、好塩基球を用いたアッセイにおいて、昆虫細胞又はＨＥＫ２９３細胞由来のＩＬ−３の活性を阻止するのではなく、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３の活性を単に阻止することを示す。
【００７１】
【図４２】図４２は、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３が、好塩基球を用いたアッセイにおいて、昆虫細胞由来のＩＬ−３の活性を阻止するのではなく、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３の活性を単に阻止することを示す。
【００７２】
【図４３】図４３は、クローン１３及びＰ３Ｃ１１Ｃ８−６が、ＲＡ患者からの一次Ｔ細胞により放出されるＩＬ−３の生物活性を阻止し、そしてクローン１１がほとんど阻害活性を有さないことを示す。
【００７３】
【図４４】図４４は、クローン１３及びＰ３Ｃ１１Ｃ８−６が、ヒトＰＢＭＣにより生成されたＩＬ−３の生物活性を阻止し、そしてクローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３がほとんど阻害活性を有さないことを示す。
【００７４】
【図４５】図４５は、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３が、ＴＦ−１アッセイにおいて、昆虫細胞由来のＩＬ−３の活性を阻止するのではなく、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３の活性を単に阻止することを示す。
【００７５】
【図４６】図４６は、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３が、ＴＦ−１アッセイにおいて、昆虫細胞又はＨＥＫ２９３細胞からのＩＬ−３の活性を阻止するのではなく、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３の活性を単に阻止し；そしてアカゲザルＩＬ−３は抗体により阻止されないことを示す。
【００７６】
【図４７】図４７Ａ−Ｃは、サンドイッチＥＬＩＳＡによる種々の源からのＩＬ−３の検出を示し、そしてクローン１３＋Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６の対のみがＨＥＫ２９３細胞を検出することを示す。
【００７７】
【図４８】図４８は、２つの異なるサンドイッチＥＬＩＳＡによる種々の源からＩＬ−３の検出、及びＩＬ−３の定量化のための標準曲線（図４８の下の図）を示す。
【００７８】
【図４９】図４９は、２つの異なるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてのヒトＰＢＭＣにより生成されたＩＬ−３の検出を示す。
【００７９】
【図５０】図５０は、種々の源からのＩＬ−３の検出のためのヒト好塩基球を用いてのバイオアッセイの結果、及びＩＬ−３生物活性の定量化のための標準曲線（図５０の下の図）を示す。
【００８０】
【図５１】図５１は、ＥＬＩＳＡ及びバイオアッセイを用いてのヒトＰＢＭＣ由来のＩＬ−３の定量化、及びＥＬＩＳＡ（Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６＋クローン１３−ＨＲＰ）を用いてのＩＬ−３の定量化がヒトＰＢＭＣ由来のＩＬ−３の生物活性を非常に良く相関することを示す。昆虫由来のＩＬ−３を標準として使用する。
【００８１】
【図５２】図５２は、ヒトＩＬ−３のグリコシル化の程度により引起される分子量の差異を示すウェスターンブロットを提供する。さらに、それは、ｈＩＬ−３のグリコシル化状態に依存して、いくつかの抗−ｈＩＬ−３抗体の異なる結合能力を示す（１μｇのＩＬ−３がレーン当たりブロットされた；抗体が１μｇ／ｍｌで適用され；ＨＥＫ：ＩＬ−３がＨＥＫ細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）において発現され；昆虫：ＩＬ−３が昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）において発現され；Ｅ．コリ：ＩＬ−３がＥ．コリ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）において発現された。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
従来技術においては、可能性あるＩＬ−３特異的な抗体の効力が、白血病細胞系又はＴＦ１細胞に対して試験された。ＴＦ１は、ヒト赤芽球細胞系のモデルであり、重度の汎血球減少症を有する３５歳の日本人男性の骨髄から、１９８７年Ｔ．  Ｋｉｔａｍｕｒａにより確立された。ＴＦ１細胞の増殖は、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦの存在に完全に依存する。従って、ＴＦ１細胞の細胞増殖に基く試験が、ＩＬ−３活性の遮断を決定するために使用され得、これはＴＦ１細胞の増殖の減少又はさらに、完全な阻害を導く。
【００８３】
ヒトの治療に抗体を使用するためには、ＩＬ−３活性を遮断する能力もまた、ＴＦ１細胞系モデルのように、インビボの状況から離れていないモデルにおいてアッセイされるべきである。従って、本発明者は、ＩＬ−３抗体により治療されるべき患者、又は対照としての健康な対象から得られた一次ヒト細胞について、本発明のＩＬ−３抗体を試験した。一次細胞及び一次ヒト細胞により生成されるＩＬ−３の使用は、細胞系モデルよりも卓越している。
【００８４】
しかしながら、ＴＦ１細胞増殖を効率的に遮断したＩＬ−３抗体は、ＩＬ−３抗体により治療されるべき患者から得られた一次ヒト細胞の増殖に対して同じ効果を必ずしも有する必要は無かったことが見出された。ＴＦ１細胞系モデルにおいて効率的な遮断能力を示すが、しかし一次ヒト血液細胞を用いてのアッセイにおいてはもはや存在しない抗体の例は、本明細書においては「クローン１１」とも呼ばれる、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６３により生成される抗体である。本発明者は、ＴＦ１細胞系を用いてのインビトロモデルにより得られた結果は、潜在的なＩＬ−３抗体が患者におけるＩＬ−３関連患者又は機能不全の治療のために有効である場合、正しく予測するのに使用され得ないことを見出し、そして本発明者はこの理由を見出した。他方では、ＴＦ１細胞系増殖を非常に効率的に遮断できなかったＩＬ−３抗体は、一次ヒト細胞の増殖を効率的に遮断するために使用され得たことが見出された。言い換えれば、ＴＦ１細胞系により得られた結果は、信頼性がなく、そして「偽陽性」及び「偽陰性」の結果をもたらすことができ、すなわち一次ヒト細胞において不活性である抗体についての活性、又は一次ヒト細胞においては活性的である抗体については低い活性を示すことができる。このシナリオの１つの例は、本明細書においては、「クローン１３」としても呼ばれる、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４により生成される抗体である。細胞系モデルにおけるその挙動により、クローン１３は、効率的な治療抗体ではないと思われた。しかしながら、本発明者は、一次ヒト血液細胞に使用される場合、驚くべき高い可能性を有することを見出した。従って、ＴＦ１細胞系の細胞における抗体の試験は、患者における意図される使用のための信頼できる結果を必ずしも提供しない。
【００８５】
本発明は、ＩＬ−３抗体の挙動の予測不能についての理由を、現在見出した。これが、何れかのＩＬ−３誘発された効果を観察するのに必要なＩＬ−３の濃度のためであることが、発明者により最初に想定された。ＴＦ１細胞に関しては、細胞増殖の半最大刺激が約１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３で見られ得る。対象的に、ＣＤ２０３ｃ好塩基球の半最大アップレギュレーションは、約０．０１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３で既に観察され得る。別の説明は、ＴＦ１細胞がＩＬ−３受容体α鎖のＮ末端切断スプライス変異体を発現することであった（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００９；２８４：５７６３−７３）。このスプライス変異体の発現は、一次ヒト細胞ではあまり顕著ではあり得ない。
【００８６】
しかしながら、本発明者は、インビボでｈＩＬ−３遮断活性の予測が困難である別の理由を見出した。驚くべきことには、彼らは、ＩＬ−３のグリコシル化及びグリコシル化の程度が、抗体がＩＬ−３に結合するかどうかを決定し、そしてグリコシル化されたｈＩＬ−３に結合する抗体がＩｌ−３活性を遮断することを見出した。
【００８７】
グリコシル化状態は、ヒトＩＬ−３を生成する細胞のタイプに依存する。ＩＬ−３がＥ．コリ細胞により組換え的に生成され得る場合、得られるヒトＩＬ−３は、グリコシル化されないであろう。非グリコシル化されたヒトＩＬ−３の分子量は約１５ｋＤである。ＩＬ−３が昆虫細胞により生成される場合、得られるヒトＩＬ−３は弱くグリコシル化されるであろう。この弱くグリコシル化されたＩＬ−３の分子量は、約１５〜約２０ｋＤであり、そして約１８ｋＤで最大である。ＩＬ−３がヒト細胞、例えばＨＥＫ細胞により生成される場合、得られるヒトＩＬ−３はより強くグリコシル化されるであろう。ＨＥＫ細胞により生成された、グリコシル化されたヒトＩＬ−３の分子量は、約１７〜約４０ｋＤであり、約２５〜３５ｋＤで最大であった。従って、本発明において適切なグリコシル化されたヒトＩＬ−３は、少なとも１７ｋＤ、好ましくは少なくとも２０ｋＤ又はそれ以上の分子量を有するグリコシル化されたヒトＩＬ−３として定義され得る。
【００８８】
本発明において適切な「グリコシル化されたヒトＩＬ−３」はまた、グリコシル化が、グリコシル鎖の構造、タイプ、及び／又は長さに関して、ＨＥＫ細胞又は一次ヒト細胞により生成されたｈＩＬ−３におけるグリコシル鎖の構造、タイプ、及び／又は長さに非常に類似する、グリコシル化されたヒトＩＬ−３としても定義され得る。グリコシル鎖は、グリコシル鎖の長さ及び／又は構造がＨＥＫ細胞又は一次ヒト細胞により生成された、グリコシル化されたｈＩＬ−３における長さ／構造の少なくとも８０％、９０％、９５％又は１００％である場合、「非常に類似する」と見なされる。ヒト細胞は、ヒト細胞系又は一次ヒト細胞であり得る。「強くグリコシル化された」ヒトＩＬ−３は、「少なくとも２０ｋＤ〜約４０ｋＤの分子量を有するグリコシル化されたヒトＩＬ−３」として定義され得る（また、図５２を参照のこと）。
【００８９】
遮断すると記載される抗体（例えば、クローン１１、Ｒ＆Ｄ  ｃｌｏｎｅ  ４８０６，  Ｒ＆Ｄ  ｃｌｏｎｅ  ４８１５，  Ｎｏｖｕｓ  ｃｌｏｎｅ  ＭＭ０４０２−１０Ｂ３５）は、非グリコシル化されたＩＬ−３に非常に良く結合し、そして遮断する。それらはまた、弱くグリコシル化されたＩＬ−３（昆虫細胞において発現される）に非常に良く結合するが、しかしながら、それらはＩｌ−３のことタイプを遮断しない。ＩＬ−３のグリコシル化がより顕著である場合（例えば、ＨＥＫ細胞における発現）、それらの抗体はＩＬ−３に結合も、遮断もしない。従って、所望する活性を有する抗体は、阻害性質の試験について、グリコシル化されたｈＩＬ−３を用いて同定され得るか、又は言い換えれば、グリコシル化されたｈＩＬ−３に非常に良く結合し、そしてインビトロでＩＬ−３活性を遮断する抗体はまた、インビボで使用される場合、ｈＩＬ−３についの阻害性質も有するであろう。トランスフェクトされたヒト細胞により生成されたｈＩＬ−３、又はさらに良好には、一次活性化されたヒトＴ細胞により生成されたＩＬ−３が、それらの試験に使用され得る。さらに、グリコシル化されたｈＩＬ−３に対して特異的な抗体の生成、及びハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体のスクリーニングのための抗原として、グリコシル化されたｈＩＬ−３を用いることは効率的であり得る。
【００９０】
本発明の抗−ｈＩＬ−３抗体は、患者に投与される場合、すなわちインビボで、グリコシル化されたＩＬ−３を遮断する場合、阻害効果を有する抗体を言及する。用語「抗−ｈＩＬ−３抗体」とは、本発明の状況下で使用される場合、ｈＩＬ−３のグリコシル化された形、特にヒト身体において見出されるようなグリコシル化された形を有するｈＩＬ−３に対して特異的な抗体に使用される。さらに、用語「抗体」とは、全ての免疫学的に有効な単位又は要素、例えば、抗体の全長抗体、フラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体、又は上記で定義されたような活性抗体の少なくともひとつのＣＤＲを含む組換え抗体を包含することを意味する。
【００９１】
用語「ヒトＩＬ−３」又は「ｈＩＬ−３」とはそれぞれ、天然に存在するような形でのｈＩＬ−３、すなわち一次ヒト細胞において生成されたか、又は一次ヒト細胞において生成された、グリコシル化された形でのヒトＩＬ−３、又はグリコシル化された形でのヒトＩＬ−３の配列を有する、組換え的に生成されたＩＬ−３、例えば、ヒト細胞により発現されたｈＩＬ−３、又は同じ結合性質を有するそのフラグメントを言及する。用語ＩＬ−３及びｈＩＬ−３は、その機能に関して、交換可能的に使用される。用語ｈＩＬ−３が使用される場合いつでも、それはヒト又はヒト由来のＩＬ−３を言及する。
【００９２】
用語「インビボでのｈＩＬ−３遮断活性」が本発明の状況下で使用される場合、それは、ｈＩＬ−３と、細胞系の細胞のみならず、またインビボでの抗体との間の結合を遮断できる本発明の抗−ｈＩＬ−３抗体の活性を言及する。
【００９３】
本発明は、患者におけるＩＬ−３関連の疾患又は機能不全の治療に使用され得る抗体を同定するための効果的手段、すなわちｈＩＬ−３抗体の試験のためへの、グリコシル化された形、特に一次ヒト細胞におけるようにグリコシル化された形でのｈＩＬ−３の使用を提供する。さらに、特異的抗−ｈＩＬ−３抗体を生成するために、好ましい実施形態によれば、グリコリス化された形でのｈＩＬ−３が抗原として使用される。驚くべきことには、グリコシル化された形でのｈＩＬ−３の使用は、非グリコシル化された組換え的に発現されたＩＬ−３よりも卓越しており、そしてｈＩＬ−３抗体による患者の治療の間、インビボ状況下で得られるであろう結果をより良く示すであろう。驚くべきことにことには、ヒトＩＬ−３に類似するグリコシル化された形でのｈＩＬ−３に結合する抗体は、昆虫細胞において得られるような弱くグリコシル化されたｈＩＬ−３に結合するそれらの抗体よりも卓越している。さらに、ヒト血液に関するアッセイにおいては、本発明の抗体は、ｈＩＬ−３濃度０．１ｎｇ／ｍｌですでに強いｈＩＬ−３シグナルを与える一方、ＴＦ―１細胞に関するアッセイは、典型的には、２．５〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３濃度で実施される。ヒト血液に関するアッセイは、活性化されたヒトＰＢＭＣの上清液に存在するｈＩＬ−３の生物活性の直接的な検出を可能にする。
【００９４】
本発明の抗体は、当業界において知られている方法により生成され得、そして下記に詳細に概説されている。従って、マウスのような哺乳類が、下記に記載されるような少なくともエピトープを含むＩＬ−３又はそのフラグメントである抗原により免疫化され得る。１つの実施形態によれば、グリコシル化されたｈＩＬ−３が免疫化のために使用される。ハイブリドーマ、公知のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ方法に基く方法により創造され得、そして次に、そして次に、ＩＬ−３へのそれらの結合についてスクリーニングされる。次に、ＩＬ−３結合クローンが、グリコシル化されたｈＩＬ−３へのそれらの結合により試験され得る。ファージディスプレイ方法もまた、さらなる試験のために抗体を選択するのに使用され得、そしてパニングのためにグリコシル化されたｈＩＬ−３を使用することが好ましい。
【００９５】
本発明が、グリコシル化された形でのｈＩＬ−３、例えば一次ヒトＴ細胞又はトランスフェクトされたヒト細胞により発現されるようなｈＩＬ−３のみによる診断及び治療のための抗−ｈＩＬ−３抗体を選択するための機能的試験を実施することは重要である。これに関する機能的試験は、特にｈＩＬ−３への結合についての試験、又はｈＩＬ−３への抗体の結合の遮断、阻害、干渉における試験された抗体の性質に関する。ｈＩＬ−３又はその誘導体は、天然、すなわちインビボでのグリコシル化されたｈＩＬ−３と同じ結合性質を有する限り使用され得る。一次ヒト細胞、例えば活性化されたＴ−細胞から得られたｈＩＬ−３の使用が最も好ましい。組換えｈＩＬ−３はまた、それが本明細書に定義されるようにグリコシル化されている限り使用され得る。例としては、一次ヒト細胞から得られたか、又はＨＥＫ細胞において発現されたｈＩＬ−３を列挙できる。例えば、Ｅ．コリから得られたような非グリコシル化された形でのｈＩＬ−３、及び昆虫細胞からの弱くグリコシル化されたｈＩＬ−３は、ＩＬ−３結合抗体のいずれかの機能的スクリーニング又は選択のために適切でないか又は適切でないようであるので、有用ではない。
【００９６】
本発明のｈＩＬ−３抗体の効率を決定するために使用される一次細胞は、当業者に知られているような一次ヒト血液細胞であり、そして好ましくは、関節リウマチ（ＲＡ）に罹患している患者から得られる。一次ヒト血液細胞はまた、健康な対象から得られ、そして対象として使用され得る。試験のためには、血液サンプルは、当業界において知られている抗−凝固剤としてのヘパリン、クエン酸塩又はＥＤＴＡにより処理され得る。好ましくは、ＥＤＴＡが、抗−凝固剤として血液サンプルに添加される。血液サンプルのこの種類はまた、「ＥＤＴＡ血液」と呼ばれる。
【００９７】
一次ヒト血液細胞は、標識された抗体、例えば好塩基球発現細胞マーカー、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１２３、ＣＣＲ３及びＣＤ２０３ｃに対して向けられた蛍光標識された抗体の組合せを用いてのフローサイトメトリーのような既知方法により検出され得る「好塩基球」とも呼ばれる好塩基球顆粒球を含む。例えば、ｈＩＬ−３活性を遮断する能力が、好塩基球顆粒球におけるＣＤ２０３ｃのｈＩＬ−３誘発アップレギュレーションをアッセイすることにより試験され得る（Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ  ＡＷ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００７；  ２０：２６７−２７８）。ＩＬ−３はまた、好塩基球におけるＣＤ１１ｂのアップレギュレーション及びＣＤ１３１のダウンレギュレーションも誘発する。さらに、ｈＩＬ−３は、一次ヒト血液細胞を含む血液サンプルにも含まれる、形質細胞様樹状細胞（ｐＰＣ）におけるＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーション及びＣＤ１３１のダウンレギュレーションを誘発する。ｐＤＣは、樹状細胞発現細胞マーカー、例えばＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１２３及びＣＤ４に対して向けられた蛍光標識された抗体の組合わせを用いての当業界において知られているフローサイトメトリーにより検出され得る。さらに、ＣＤ１３１のＩＬ−３誘発ダウンレギュレーションは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１４＋＋単球及び好酸球に対して定量化され得る。従って、ｈＩＬ−３活性を効果的に遮断する抗−ｈＩＬ−３抗体の能力は、既知試験により、例えば好塩基球におけるＣＤ１１６及びＣＤ２０３ｃ又はｐＤＣにおけるＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーション、又は好塩基球、ｐＤＣ、単球又は好酸球を含む種々の細胞型におけるＣＤ１３１のダウンレギュレーションを定量化することによりアッセイされ得る。好塩基球は、ヒトサンプルにおけるＩＬ−３の生物活性を定量化するための好ましい細胞型である。なぜならば、好塩基球は、ＩＬ−３と強く反応し、そしてＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦのような密接に関連するサイトカインに対してほとんど反応性を示さないからである。
【００９８】
ヒト血液細胞の主要性質及び従ってインビボモデルとしてのそれらの適合性を維持するためには、得られた一次ヒト血液細胞の亜画分の単離又は精製を導く工程は行われてはいけないことが見出されている。例えば、好塩基球顆粒球を産生する単離及び精製工程（例えば、フィコール調製又は細胞選別）により得られた好塩基球細胞集団は、ＩＬ−３に対してあまり良好には応答しないことが驚くべきことには示されている。結果的に、高濃度のＩＬ−３が、いずれかのＩＬ−３誘発された効果を観察できるためには必要である。従って、一次ヒト血液細胞、例えば好塩基球の亜画分を含む単離された及び精製された集団は、ＩＬ−３抗体の中和特性を調べるためにはあまり適切ではない。
【００９９】
従って、特異的で且つ効果的に、有用なｈＩＬ−３抗体を同定し、そして新規抗−ｈＩＬ−３抗体を開発する重要な工程は同定されている。効果的手段で特異的抗体を得るためには、ハイブリドーマ細胞技法を用いて抗体、例えばモノクローナル抗体を開発しながら、スクリーニングのための正しい抗原を提供することが重要である。先行技術の知識に基いて、グルコシル化は、ｈＩＬ−３の生物活性に大きな影響を与えないと思われ、そしてＩＬ−３に対する阻害活性を特徴付けられるすべてのモノクローナル抗体は、そのグリコシル化とはほとんど無関係にＩｌ−３を認識する。従って、グリコシル化がｈＩＬ−３生物活性を遮断するモノクローナル抗体の能力に影響を及ぼす可能性は非常に低いと思われる。
【０１００】
しかしながら、驚くべきことには、特徴的且つ効率的な抗体を調製するために、ｈＩＬ−３特異的抗体、例えばモノクローナル抗−ＩＬ−３抗体を生成するためにｈＩＬ−３をそのグリコシル化された状態で抗原として用いて、結合について抗体を試験することは重要である。
【０１０１】
ヒトにおけるｈＩＬ−３生物活性を遮断する抗−ｈＩＬ−３の能力は、ｈＩＬ−３のグリコシル化に依存し、すなわち非グリコシル化されたｈＩＬ−３への強い親和性を有する抗−ｈＩＬ−３抗体はグリコシル化されたｈＩＬ−３に対する遮断活性を必ずしも示さないことが示されている。しかしながら、インビボｈＩＬ−３はグリコシル化された形で存在し、従って、それぞれ、インビボで又は治療のために使用されることが予期される任意の抗体がグリコシル化されたｈＩＬ−３に対するその結合性質について試験されるべきである。この特異的スクリーニングを用いることにより、非常に低いＩＣ５０を有する抗体がもたらされ、そして従って、治療のために非常に価値ある抗体が得られる。
【０１０２】
この効果を示す対応するデータは、実施例において詳細に概説されている。以下の３種の型の組換えヒトＩＬ−３が比較された：Ｅ．コリ発現された非グリコシル化ＩＬ−３（約１５キロダルトン（ｋＤ））、昆虫細胞発現されたグリコシル化ＩＬ−３（約１５−２０ｋＤ）及びＨＥＫ細胞発現されたグリコシル化ＩＬ−３（約１７−４０ｋＤ）。
【０１０３】
ＩＬ−３のすべてのバージョンが、一次ヒト好塩基球又はＴＦ−１細胞を用いてのアッセイにおいて、非常に類似する生物活性を有することが見出された。Ｅ．コリ発現された非グリコシル化ＩＬ−３は、ＩＬ−３抗体クローン１１及びＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｍａｂ  ２０３  （クローン４８０６）により非常に効率的に遮断されるが、ところがグリコシル化昆虫細胞又はＨＥＫ細胞発現のＩＬ−３は、ほとんどわずか程度しか遮断されない。対照的に、ハイブリドーマ細胞クローン１３及びクローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６により生成された抗体は、グリコシル化ＩＬ−３及び非グリコシル化ＩＬ−３の両者の生物活性を遮断する。ＩＬ−３を遮断する抗体の能力は、ＴＦ−１腫瘍細胞及び一次ヒト好塩基球を用いてのアッセイにおいて類似した。
【０１０４】
昆虫細胞又はＨＥＫ細胞において組換え的に発現されたヒトＩＬ−３は、一次ヒト細胞により発現されたｈＩＬ−３よりも異なった型のグリコシル化を有することができる。一次ヒト細胞により発現されたｈＩＬ−３に対する抗体の効果を分析するために、ヒトＰＢＭＣが、抗−ＣＤ３抗体を用いて３日間、ＲＡ−患者から活性化され、そして細胞培養上清液におけるＩＬ−３の濃度が測定された。ＩＬ−３の非常に低いレベル、中位のレベル及び非常に高いレベルで生成するＰＢＭＣの上清液が、ヒト一次好塩基球を用いてＩＬ−３活性について非常に高感度のバイオアッセイで試験された。上清液が、種々のＩＬ−３抗体と共にプレインキュベートされた。結果は、クローン１３及びＰ８Ｃ１１Ｃ８−６が一次ヒトＩＬ−３の生物活性を遮断するか、ところがクローン１１及びＲ＆Ｄ２０３はほとんど無効化であったことを示す。（実施例９を参照のこと）。
【０１０５】
従って、本発明は、ヒトＩＬ−３に対する遮断抗体の開発のための効果的な方法を提供し、そして特に、抗体の阻害活性の分析のためには、グリコシル化されたｈＩＬ−３（例えば、昆虫細胞からの）又はヒト細胞により発現されたｈＩＬ−３が使用される。ＩＬ−３に対するモノクローナル抗体の阻害活性を特徴づけるために先行技術においてしばしば使用されるような、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３は、誤解を招く可能性があり、そして本発明の抗体のように特異的で且つ関係のある抗体を生成するのには適していない。
【０１０６】
さらなる試験が、実施例において詳細の記載されるようにして、本発明者により実施され、そして結果は、本発明の抗体の好ましい特性を示す。グリコシル化及び非グリコシル化ｈＩＬ−３を認識するＩＬ−３抗体の種々の組合せの能力が、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された（実施例１０を参照のこと）。抗体クローン１１、クローン１３及びＰ３Ｃ１１Ｃ８−６の種々の組合せが試験された。すべての組合せが、Ｅ．コリ由来の非グリコシル化ｈＩＬ−３及び昆虫細胞由来のグリコシル化ｈＩＬ−３を検出し、クローン１３及びｐ８Ｃ１１Ｃ８−６の組合せのみがまた、同等の効力でＨＥＫ細胞由来のｈＩＬ−３を検出した。ＨＥＫ細胞由来のｈＩＬ−３は、昆虫細胞由来のｈＩＬ−３よりも、より強くグリコシル化される。サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてクローン１１を含む任意の組合せは、ＨＥＫ細胞由来のｈＩＬ−３で非常に低いシグナルのみを生成した。
【０１０７】
さらに、抗体は、一次抗−ＣＤ３活性化ヒトＰＢＭＣ（上記を参照のこと）により発現されたＩＬ−３の検出において、それらの選択性及び正確さについて分析された。それらの実験においては、ＥＬＩＳＡ、及びヒト好塩基球を用いての機能的バイオアッセイにおけるＩＬ−３の濃度が、昆虫細胞由来及びＨＥＫ細胞由来のｈＩＬ−３を標準として用いて測定された。抗体Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６＋クローン１３−ＨＲＰを用いてのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定された活性化ヒトＰＢＭＣの上清液におけるＩＬ−３濃度は、生物活性アッセイにおいて測定されたＩＬ−３濃度と非常に良く相関した。抗体クローン１３＋クローン１１−ＨＲＰを用いてのサンドイッチＥＬＩＳＡは、活性化されたヒトＰＢＭＣの上清液中のＩＬ−３濃度を約４倍低下させた。市販の抗体Ｒ＆Ｄ  クローン４８０６、Ｒ＆Ｄ  クローン４８１５  及びＮｏｖｕｓ  クローンＭＭ０４０２−１０Ｂ３５は、ＨＥＫ細胞由来のｈＩＬ−３を検出することができず、そして従って、診断方法のために有用ではなく、そして治療のためにも適切でないこともまた示された。さらに、これは、本発明の抗体の優位性、及び検出されるか又は阻害されるべきｈＩＬ−３ペプチドのグリコシル化状態の重要性を示す。
【０１０８】
本発明のｈＩＬ−３抗体は、インビボで特異的且つ有効であり、そしてインビボ状況下で使用され得る。本発明の抗体はまた、他の哺乳類起源のＩＬ−３分子との交差反応性が驚くほど低いことも示している。さらに、より効果的な手段で抗体を開発し、そして使用する方法が提供される。ＩＬ−３のみに対する（但し、他のサイトカインに対してはそうではない）非常に高い特異性は別として、本発明の抗体は、驚くべきことには、哺乳類ＩＬ−３との交差反応性をほとんど示さないが、しかしヒトタンパク質及び哺乳類タンパク質のアミノ酸同一性は９９％までであり得、例えばマーモセット、アカゲザル又はチンパンジータンパク質のアミノ酸同一性は、７２〜９９％の範囲である（図１を参照のこと）。
【０１０９】
自己免疫疾患において高められたレベルで存在し得るさらなるサイトカインの中で、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦが特に重要である。イムノアッセイにおけるそのようなサイトカインと抗−ＩＬ−３抗体との高い交差反応性は、自己免疫疾患の出現及び進行において重要な影響を有する事実に関して誤った結果を導く可能性がある。しかしながら、そのような結果は、抗−ＩＬ−３抗体の適用が有望な治療アプローチであると考えられ得るかどうかの決定に対して重要な影響を有する。
【０１１０】
従って、本発明の抗体がヒトＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦとの可能な限り低い交差反応性を示すことが好ましい。特に好ましくは、抗体により結合されたｈＩＬ−３の量に比較して、本発明の抗体がＩＬ−５又はＧＭ−ＣＳＦに対して、５％以下、より好ましくは２％以下、及び特に好ましくは、１％以下の程度まで結合することが、本発明の抗体の特徴である。そのような抗体は、本発明により提供され、そしてさらに、そのような低い交差反応性を有する抗体を、特に調製及び検出のためにグリコシル化形でｈＩＬ−３を用いることにより、開発するための方法が提供される。
【０１１１】
本発明は、インビボでｈＩＬ−３活性を効果的に遮断するので、治療のために適切である上記のような特性を有する抗−ｈＩＬ−３抗体を提供する。従って、１つの側面によれば、本発明は、グリコシル化形でのｈＩＬ−３による免疫化により、及び／又はＩＬ−３依存性疾患及び状態の治療への使用のために、１００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下のＩＣ５０値を有し、そして５％以下の他のサイトカイン及び非ヒトＩＬ−３との交差反応性を有するグリコシル化形でのｈＩＬ−３によるスクリーニングにより得られる抗−ｈＩＬ−３抗体を提供する。
【０１１２】
一次ヒト血液細胞に対するｈＩＬ−３活性を効果的に遮断し、そして好ましくはヒト細胞において発現されるグリコシル化ｈＩＬ−３の生物活性を阻害する抗体の能力は、下記のようにして決定され得る。
【０１１３】
ＩＬ−３特異的抗体が一次ヒト細胞におけるｈＩＬ−３活性を効果的に遮断できるかどうかを分析するために、当業界において知られている方法が適用され得る。以下では、この特性の分析のために有用である方法が記載されている。
【０１１４】
一次ヒト血液細胞におけるｈＩＬ−３活性を遮断する効果を決定するための方法の第１段階において、試験されるべきＩＬ−３抗体は、ＩＬ−３と共にプレインキュベートされる。
【０１１５】
試験は、ＩＣ５０値を決定するための一定濃度のグリコシル化ｈＩＬ−３を用いて、少なくとも１つの濃度、好ましくは少なくとも２又は種々の濃度の抗体を用いて実施されるべきである。例えば、一定濃度のｈＩＬ−３は０．１ｎｇ／ｍｌであり得る。任意には、負の対照はＩＬ−３を完全に除外することによりアッセイに含められ得る。このようにして、ＩＬ−３が、添加される場合、活性を有することが確認され得る。
【０１１６】
試験されるべき抗−ｈＩＬ−３抗体の濃度範囲は、約０〜１００μｇ／ｍｌであり得る。好ましくは、その範囲は約０〜３０μｇ／ｍｌである。試験されるべき抗体が添加されない場合、ｈＩＬ＝３誘発された活性の完全な効果が決定され得る。
【０１１７】
プレインキュベーションは、当業者に良く知られている条件下で行われ得る。例えば、プレインキュベーション工程は、室温で、約１〜約６０分間、例えば約２０分間、実施され得る。
【０１１８】
次に、ＩＬ−３及び試験されるべきプレインキュベートされた抗体を含む混合物が、サンプル、例えば一次ヒト血液細胞を含む溶液に添加される。サンプルは、血液又はヒト血液細胞を含む血液誘導体、又は組織であり得る。一次ヒト血液細胞は、関節リウマチを罹患している患者から得られた血液サンプルに含まれ得る。一次ヒト血液細胞はまた、対照サンプルを提供するために健康な対象から得られた血液サンプルにも含まれ得る。血液サンプルは、抗凝固剤、例えばヘパリン、クエン酸塩又はＥＤＴＡを含むことができる。好ましくは、血液サンプルは、抗凝固剤としてＥＤＴＡを含む。このタイプの血液サンプルはまた、「ＥＤＴＡ血液」とも呼ばれる。
【０１１９】
次にｈＩＬ−３、試験されるべき抗体、及び一次ヒト血液細胞を含む混合物は、当業者に良く知られている条件下でインキュベートされる。例えば、インキュベーション工程は、３７℃で、約１０〜約１２０分間、例えば約１時間、実施され得る。
【０１２０】
インキュベーションの後、一次ヒト血液細胞は、当業界において知られているようにして、例えば当業者に良く知れているようなフローサイトメトリーにより分析される。一次ヒト血液細胞は、当業界において知られているようにして、検出可能なユニットにより標識される少なくとも１つの細胞マーカーにより標識される。例えば、好塩基球及び形質細胞様樹状細胞に対する蛍光標識された細胞マーカーの組合せが使用され得る。好塩基球顆粒球に対して特異的な細胞マーカーの例は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１２３及びＣＤ２０３ｃである。形質細胞様樹状細胞に対して特異的な細胞マーカーの例は、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ４である。それらの及び／又は他の既知マーカーの任意の組合せが使用され得る。
【０１２１】
標識工程は、フローサイトメトリーによる分析のために細胞を調製する当業者に良く知られている条件下で実施され得る。例えば、染色工程は、低温度で、例えば氷上で行われ、そして約１〜約６０分、例えば２０分を要する。
【０１２２】
次に、標識された細胞、例えば好塩基球顆粒球及び形質細胞様樹状細胞が、当業者に公知のフローサイトメトリーにより固定される。
【０１２３】
評価のために、少なくとも１つの細胞マーカーのアップレギュレーション及び／又はダウンレギュレーションが定量化される。例えば、好塩基球に対するＣＤ２０３ｃ及び／又はＣＤ１１ｂのアップレギュレーション、及び／又は好塩基球及び他の細胞型、例えばｐＤＣ、単球及び好酸球に対するＣＤ１３１のダウンレギュレーションが定量化される。他方では又は累積的には、形質細胞様樹状細胞上のＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションが定量化され得る。好ましくは、マーカーのアップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両者は、いくつかの異なる細胞型で定量化され得る。アップレギュレートされる好塩基球上のＩＬ−３  ＣＤ２０３ｃ及び／又はＣＤ１１ｂにより誘発される場合、それらのマーカーの低下は、候補抗体によるＩＬ−３／ＩＬ−３受容体相互作用に対する干渉を示す。ダウンレギュレートされる好塩基球及び他の細胞型上のＩＬ−３  ＣＤ１３１により誘発される場合、このマーカーの上昇は、候補抗体によるＩＬ−３／ＩＬ−３受容体相互作用に対する干渉を示す。アップレギュレートされる形質細胞様樹状細胞上のＩＬ−３  ＨＬＡ−ＤＲにより誘発される場合、このマーカーの低下は、候補抗体によるＩＬ−３／ＩＬ−３受容体相互作用に対する干渉を示す。従って、候補抗体の阻害活性が、ｈＩＬ−３によりアップレギュレートされる細胞マーカーの低下、及び／又はｈＩＬ−３によるダウンレギュレートされる細胞マーカーの上昇が阻害活性の指標である、細胞マーカーの上昇又は低下を通して試験される。阻害活性の量は、ＩＣ５０、すなわちｈＩＬ−３の生化学的機能を阻害するのに必要な最大阻害濃度の半分により決定される。
【０１２４】
インビボでのｈＩＬ−３活性を遮断するＩＬ−３抗体が、ｈＩＬ−３抗体のＩＣ５０
が１００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下であるように、グリコシル化ｈＩＬ−３に対する阻害活性を有することが重要であることが見出された。好ましくは、ＩＣ５０は、４０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ又はそれ以下である。ＩＣ５０を決定するための方法は、当業者に知られており、そして既知の何れかの方法が本試験に使用され得る。
【０１２５】
本発明の抗体はそのような低いＩＣ５０を有するので、それらは、あらゆる目的、特に診断及び治療に使用され得、そして従って、非常に価値ある。
【０１２６】
抗体、そのフラグメント又は変異体は、「効率的に遮断する」と見なされ、すなわち前記抗体、そのフラグメント、コンストラクト、変異体又は接合体が、遮断活性を測定するための試験、例えば一次ヒト血液細胞における好塩基球上のＣＤ２０３ｃの誘発されたアップレギュレーションの遮断、又は一次ヒト血液細胞における形質細胞様樹状細胞上のＨＬＡ−ＤＲの誘発されたアップレギュレーションの遮断のフローサイトメトリー試験において測定され得る、ｈＩＬ−３を阻害のために、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、又は約４０ｎｇ／ｍｌ以下、又は約１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を示す場合、本発明の抗体であると見なされる。言い換えれば、ｈＩＬ−３／ＩＬ−３受容体相互作用についての阻害活性を測定するための試験において、約１００ｎｇ／ｍｌ以下、又は約４０ｎｇ／ｍｌ以下、又は約１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を示し、そして従って、効果的な遮断活性を有する、抗体又はそのフラグメント、コンストラクト、変異体又は接合体は、ｈＩＬ−３のためのインヒビターとして有用であり、そして以下に定義されるような組成物に使用され得る。
【０１２７】
本発明の抗体の１つの条件は、本明細書においては「Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６」とも呼ばれる、ハイブリドーマ細胞系により生成される抗体である。この抗体のフラグメント及び変異体、並びにこの抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む組換え抗体も使用され得る。
【０１２８】
Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６は、上記方法により測定される場合、約１０ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を示す。
【０１２９】
Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６は、シグナルペプチド（配列番号１０）なしでヒトｈＩＬ−３のアミノ酸残基２２−４８に対応する以下のアミノ酸配列を有するペプチドに含まれるｈＩＬ−３における線状エピトープに結合する：ＥＩＩＴＨＬＫＱＰＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬＮＧＥＤＱＤＩＬ（配列番号１）。実験は、Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６により認識されるエピトープが配列番号１０で定義されるようなアミノ酸配列２６（Ｈ）〜３６（Ｄ）内に位置し、そして少なくともアミノ酸２７−２９（ＬＫＱ）を含み、そしてアミノ酸３１−３６はまた、結合に関与している可能性があることを示唆する。
【０１３０】
Ｐ３Ｃ１１Ｃ８−６により認識されるエピトープがａａ２２（Ｅ）〜ａａ３０（Ｐ）を含んだことが見出された。ペプチドＩＬ−３−２ａ（配列番号９）はまた、いくつかのシグナルも付与し、これは、より多くのＣ末端アミノ酸（例えば、ａａ３１−３６）が結合に関与している可能性があることを示唆する。
【０１３１】
本発明の抗体のさらなる例は、本明細書においては、「クローン１３」とも呼ばれる、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４により生成される抗体である。この抗体のフラグメント及び変異体、並びにこの抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む組換え抗体もまた使用され得る。
【０１３２】
クローン１３は、上記方法により決定される場合、約４０−１００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を示す。
【０１３３】
クローン１３は、立体配座エピトープである、ｈＩＬ−３における異なるエピトープに結合する。
【０１３４】
クローン１３及びＰ３Ｃ１１Ｃ８−６は、お互い競争しないことが見出され、このことは、それらが、ｈＩＬ−３受容体へのｈＩＬ−３の結合に関与する異なるエピトープをカバーすることを示唆する。従って、クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６の抗体は、組合して適用される場合、他の抗体の遮断活性に影響を及ぼさない。従って、１つの実施形態によれば、本発明の少なくとも１つの抗体、例えば上記抗体の１つ、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト又は接合体は、単独で、又は少なくとも２つの抗体又はそれらのフラグメント、又は変異体、又はコンストラクト、又は接合体の組合せで、治療のために、及び本発明の抗体、又はそのフラグメントの少なくとも１つ、又は少なくとも２つの抗体、及び／又はそれらのフラグメント、及び／又は変異体、及び／又はコンストラクトの組合せを含む組成物を調製するために使用され得る。
【０１３５】
この明細書に含まれる実施例は、他の種のＩＬ−３及び本発明の抗体のために他のヒトサイトカインとの交差反応性の特異性及び欠如に関する卓越した特性を示す。
【０１３６】
本発明の抗体は、異なる性質のものであり得、そして可能性ある抗体、又は抗体フラグメント、コンストラクト、変異体、又は接合体の以下のより詳細な説明は、例示的であることのみを意味する。これは、本発明の状況内で、用語抗体はその広い意味で理解されるべきであることを意味する。本発明の実施例に示される抗体の特徴を含み、そしてその抗体の特異性を保持する任意の抗体、又はその何れかの部分に由来するか、又はそれに基く抗体、例えばコンストラクト、フラグメント、変異体、又は接合体は、本発明の状況において用語抗体に包含されるものと見なされる。
【０１３７】
原則的に、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が使用され得る。モノクローナル抗体は一般的に、ポリクローナル抗体に比較して、より高い特性の利点を有し、そして従って、本発明の観点から好ましい。本発明に関して、用語「抗体」とはまた、好ましくは、ＩＬ−３特異的結合部位であるいくつかの抗原結合部位を有するフラグメント、二重、三重又は多重体又は二重又は三重又は多官能性抗体を含むことができる。本発明に関して、用語「抗体」とはさらに、融合タンパク質の一部として、本発明の抗体の対応する特異性を示し、そしてさらに、ｈＩＬ−３へのそれらの結合能力を保持している、本発明の抗体、又は抗体フラグメント、又は本発明の抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０１３８】
従って、１つの実施形態によれば、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３２８１又はＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４により生成される抗体の補体決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗ｈＩＬ−３抗体、そのフラグメント、変異体、コンストラクト、又は接合体である。
【０１３９】
さらに、一本鎖抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体は、任意の適切な抗体クラスに属することができるが、しかしながら、治療へのそれらの使用が可能であることは必須である。好ましくは、本発明の抗−ＩＬ−３抗体又はそのフラグメントは、クラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭのものである。
【０１４０】
本発明の抗体の記載において、用語「抗体」とは、すべての免疫学的に有効な単位又は要素、例えば全抗体、そのフラグメント、変異体、コンストラクト、又は接合体、又は上記及び請求項において定義されるような抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む組換え抗体を包含することを意味する。これに関して、「免疫学的に有効」とは、ｈＩＬ−３とその受容体との間の相互作用を阻害し、低め、妨害し、又は何れか他の手段で影響を与え、そしてそれにより、ｈＩＬ−３の活性を低め、遮断し、又は妨害する単位又は要素を言及する。本発明の抗体フラグメントが関与している限り、そのフラグメントは、抗原結合ドメイン及びＦｃドメインを保持することが好ましい。あるいは、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ）２フラグメントは、それらがｈＩＬ−３の細胞表面上のその受容体への結合、又はその受容体を活性化するｈＩＬ−３の能力に介入する限り、使用され得る。本発明の接合体は、抗−ｈＩＬ−３抗体又はその活性部分が機能的分子に結合され、その機能的分子が固定化、標識、等の所望する機能を提供できる単位である。
【０１４１】
用語「少なくとも１つの抗体」とは、本明細書において使用される場合、所望する活性を有する、少なくとも１つの抗体、又は少なくとも１つの抗体フラグメント、又は少なくとも１つの抗体コンストラクト、又は少なくとも１つの抗体変異体、又は少なくとも１つの抗体接合体、等が存在することを意味する。本発明の抗体の組合せは、２つの上記抗体、又はその変異体、例えばそれらの抗体のヒト化形の組合せ、又は抗体、及び／又はその抗体のフラグメント、及び／又はコンストラクト、及び／又は変異体、及び／又は接合体の組合せであり得る。
【０１４２】
要約すると、本発明のためには、用語「抗体」により包含されると考えられる分子の実際の形は、それが、ｈＩＬ−３と天然の受容体との相互作用を阻害し、そして従って、それにより引起される細胞反応を妨げるのに十分な態様で、ｈＩＬ−３に特異的に結合する限り、無関係である。
【０１４３】
本発明の抗体は、当業界において知られている何れかの方法により生成され得る。例えば、抗体は、免疫原として完全なｈＩＬ−３タンパク質を用い、そして後で、言及された配列に対して特異的である抗体及び抗体クローンを選択することにより生成され得る。あるいは、ｈＩＬ−３の所望する部分又はエピトープを、その配列内に含むペプチドが、免疫化のために使用され得る。さらなる可能性は、抗体の生成を可能にする環境に組込まれるエピトープ（立体配座的に識別するエピトープ、ＣＤＥ）のみを含む人工エピトープの使用である。そのような方法は、当業者に知られており、そして国際公開第２００５／０５１９９９号に記載されている。要約すると、抗体を生成するための任意の方法は、それが、必要とされる特性を有し、そして必要に応じて、ＩＬ−３又はその一部による免疫化に基いて生成される多くの抗体から本発明の抗体の選択を可能にする限り、本発明の状況内で有用である。
【０１４４】
本発明の抗体は、任意の起源、例えばヒト、マウス、ヤギ、ウサギのものであり得る。ヒト又はヒト化抗体が特に好ましい。一般的に使用される方法として、抗体の生成は、適切な哺乳類、例えばマウス、ラット、ハムスター又はウサギを免疫化することにより行われる。上記のように、本発明の抗体はまた、それらが上記で定義された特性を有する限り、組換え的に生成され得る。
【０１４５】
しかしながら、治療的使用のためには、それらは免疫系のかなり重度の副作用を引起し得るので、非ヒトタンパク質を使用することはあまり望ましくない。これは、例えば、上記の現在使用されるマウス抗体インフリキシマブの重度の副作用の１つの原因である。
【０１４６】
従って、抗体がヒト抗体であり、又は他の種において生成される抗体のヒト化が行われることが特に好ましい。抗体のヒト化のための方法は、当業者に知られており、そして例えばＪｏｎｅｓ  Ｐ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８６；  ３２１：５２２−５２５，  Ｓａｎｔｏｓ  Ａ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ．，  Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９８；  ６０：１６９−９４，  Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ．Ｇ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８  Ａｕｇ；２０（４）：４６０−７０，  Ａｌｍａｇｒｏ  Ｊ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ．，  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００８  Ｊａｎ  １；１３：１６１９−３３に記載されている。
【０１４７】
ヒト化抗体の用語は、ヒト起源の９５％以上の抗体について一般的に使用される。例えば、７０％のヒト抗体部分を有する、より少ないヒト特徴を有する抗体は、しばしば、キメラ抗体と呼ばれる。ヒト又はキメラ抗体は、組換えＤＮＡ技法を用いて生物工学的方法により生成され、それによれば、少なくとも抗原結合部分を含む、動物／哺乳類タンパク質の一部が、機能的抗体又はそのフラグメント、コンストラクト、変異体又は接合体が生成されるよう、ヒト抗体の追加の部分と組合される。
【０１４８】
ヒト化抗体を生成する可能性は、例えばヒト哺乳類において生成されたｈＩＬ−３特異的抗体の１つにより、ヒト抗体である、受容体抗体のＣＤＲの少なくとも１つを置換することである。さらに、全ＣＤＲ−領域、全可変領域、又はＦａｂ−又はＦａｂ′−部分がヒト抗体の対応するさらなる部分と組合されるよう、哺乳類抗体の少なくとも１つのＣＤＲよりも多くの部分を使用することが可能である。
【０１４９】
ヒト化及びキメラ抗体に加えて、またヒト抗体は、本発明の状況内で使用され得る。ヒト抗体は、当業界において記載されるようなヒトモノクローナル抗体生成のための技法を用いて調製され得る。１つの通常使用される方法は、ヒト抗体がファージディスプレイされたライブラリーを用いて生成される、いわゆるファージディスプレイ技法である。この技法においては、ヒト抗体をコードするＤＮＡ配列が、ファージＤＮＡ中に挿入され、ファージＤＮＡライブラリーが提供される。ライブラリー中の各ファーは、その表面上に異なる抗体を担持する。そのようなライブラリーは、所望の抗原を結合する抗体についてスクリーニングされ得る。本発明によれば、スクリーニングは、ｈＩＬ−３のアミノ酸残基２２−４８内に含まれるエピトープに関して実施され得る。そのようなライブラリーと、抗原／エピトープ担持のタンパク質又はペプチドとの混合に基いて、抗原特異的抗体を有するファージのみが選択される。特異的抗体を担持するそのようなファージは増殖され得、そしてそれから、抗体が大量に得られる。ハイブリドーマ細胞に類似して、そのようなファージからの遺伝子情報により形質転換される哺乳類細胞が連続的に抗体を生成することができる（例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２３，  ２００８  ｖｏｌ．  １０５  ｎｏ．  ３８  １４３３６−１４３４１を参照のこと）。
【０１５０】
さらなる可能性として、ヒト抗体はまた、トランスジェニック動物から得られ得る。この方法によっても、完全なヒト抗体が得られる。この技法に関しては、遺伝子操作されたトランスジェニックマウスがヒト抗体遺伝子を担持するよう調製される。マウス特異的抗体遺伝子の発現は抑制されるが、ヒト抗体遺伝子の発現はそのようなマウスにおいて促進される。免疫化に応答してヒト抗体を生成できるトランスジェニック変異体マウスを用いる技法、例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ技法（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，  １１３４  −  １１４３  （２００７）を参照のこと）、又はＭｅｄａｒｅｘからのＵｌｔｉＭａｂ（登録商標）マウス技法は、当技術分野において記載されており、そして当業者には利用可能である。
【０１５１】
本発明の抗体のｈＩＬ−３特異性及び交差反応性は、当業界において知られている方法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により容易に決定され得る。特異性及び交差反応性を決定するための１つの既知方法においては、組換え的に生成されたサイトカイン（例えば、それぞれ、ｈＩＬ−３、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦ、又は他の種からのＩＬ−３）が固定され、例えば試験配列中の適切な表面上に被覆され、生成された抗−ヒト−ＩＬ−３−抗体が添加され、そしてそれらの結合が、検出試薬、例えば標識された抗−ＩｇＧ−抗体により、被覆された表面上で検出される。そのような試験レジメンにおいては、本発明の抗体はほぼ排他的にＩＬ−３に結合するが、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦへの結合は非常にわずかな範囲でしか発生しない。他の種からのＩＬ−３が関与する限り、本発明の抗体についても同様である（実施例４を参照のこと）。
【０１５２】
一次ヒトＩＬ−３（一次ヒト細胞により生成されたグリコシル化ＩＬ−３）に結合し、そして一次ヒトＩＬ−３の検出のために有用である新規抗体を同定するために、抗体クローン１３又はＰ８Ｃ１１が使用され得る。クローン１３又はＰ８Ｃ１１は、標準としてＥ．コリ、昆虫細胞又はヒト細胞において組換え的に発現されたＩＬ−３を用いてのサンドイッチＥＬＩＳＡで両抗体に関して測定された一次ヒトＩＬ−３の濃度は、一次ヒト細胞を用いての機能的アッセイ（上記のような）において、一次ヒトＩＬ−３及び組換え的に発現されたＩＬ−３の生物活性と非常に良く相関するので、完全にグリコシル化された一次ヒトＩＬ−３を結合することが示されている。新規の抗−ＩＬ−３抗体（クローンＸ）が一次ヒトＩＬ−３の検出のために使用され得るかどうかを決定するために、クローンＸがＥＬＩＳＡプレートの被覆のために使用され得た。次に、一次ヒトＩＬ−３及び組換え的に発現されたＩＬ−３（標準として）が、種々の希釈度で添加される。次に、結合されたＩＬ−３は、ＨＲＰ−標識Ｐ８Ｃ１１を用いた第２アッセイにおいては、ＨＲＰ−標識クローン１３を用いた１つのアッセイにおいて検出される。クローン１３及びＰ８Ｃ１１は、ＩＬ−３の非オーバーラッピングエピトープを認識する。クローンＸ＋クローン１３−ＨＲＰ又はクローンＸ＋Ｐ８Ｃ１１−ＨＲＰを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡが、標準及び既知濃度の一次ヒトＩＬ−３（例えば、Ｐ８Ｃ１１及びクローンを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより決定された）に比較して、一次ヒトＩＬ−３についての正しい濃度を与える場合、この新規の抗体クローンＸは、一次ヒトＩＬ−３の検出のために適切であろう。他方では、新規クローンＸは、被覆のためのクローン１３又はＰ８Ｃ１１と組合して、検出（例えば、ＨＲＰ−標識されたクローンＸ）のために使用され得る。
【０１５３】
本発明は、多くの点で既知抗体よりも卓越する抗体、及びそれを得るための方法を提供する。多くの実験及びまた、本明細書に包含される実施例において、本発明の抗体、例えばクローン１３及びＰ３Ｃ１１Ｃ８−６は、特異性、ｈＩＬ−３誘発された活性のインビボ遮断能力、交差反応性の欠如、又は親和性及び結合活性に関して非常に卓越した特性が証明されている。従って、それらの好ましい抗体は、治療処置への使用のために特に適切であると思われる。従って、本発明の１つの側面は、治療への使用のためのそれらの抗体、例えばそれらのフラグメント、変異体、コンストラクト、及び接合体を言及する。
【０１５４】
治療に使用される場合、本発明の抗−ＩＬ−３抗体、例えばクローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６を、ヒト化バージョンで使用することが好ましい。このためには、クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６が当業界において知られている任意の態様でヒト化される。この状況下で、クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６のＣＤＲの少なくとも１つが同様に維持／保存され、マウス抗体クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６の他の部分がヒト抗体起源の配列により、完全に又は部分的に置換され得る。この状況下で、得られたヒト化された抗体は、既知方法を用いて容易に決定され得る同じ特異性をまだ示していることが必須である。好ましくは、そのようなヒト抗体クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６はまた、ヒト以外の種のＩＬ−３、及び寄託されたマウスクローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６のような他のヒトサイトカインとの交差反応性もわずかに示す。
【０１５５】
本発明のさらなる主題は、抗体、抗体フラグメント、抗体変異体、抗体コンストラクト、抗体接合体、又は本発明の抗体の特異性を伝達するＣＤＲの配列をコードする核酸である。動物／哺乳類経路の免疫化、及び／又はモノクローナル抗体の生成のためのハイブリドーマ技法を通しての抗体の生成に加えて、組換え方法により抗体を生成することはまた、現在確立されている。
【０１５６】
従って、細菌又は真核細胞において抗体フラグメントを生成するために、それぞれの核酸を用いることはまだ、可能であり、そして好ましい方法である。組換え抗体又は抗体のフラグメントを生成するための対応する方法は、当業者に知られている（例えば、Ｊｅｏｎｇ  ＫＪ，  Ｊａｎｇ  ＳＨ，  Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ  Ｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．  ２０１１  Ｊａｎ；６（１）：１６−２７．；  Ｌｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００７  Ｊａｎ  １０；  ３１８（１−２）：１１３−２４を参照のこと）。
【０１５７】
組換え的に得られた抗体の利点は、それらが完全に動物／哺乳類生物外で生成され得ることである。この側面によれば、例えば、抗原は生物にとって有害である物質であり、又は一定の生化学条件は、インビトロシステムにおいて正確に制御され得る所望の抗体に関連しているので、動物／哺乳類において生成され得なかった抗体を得ることもまた可能である。
【０１５８】
特に、ヒト又はヒト化抗体の生成に関して、特に治療に関して、組換え抗体技法の使用は、上記で既に言及されたように、他の生物において生成された抗体に対する患者の免疫応答は防止され得るので、好都合である。抗体の非ヒト部分に対するそのような免疫応答は、治療剤を中和できるか、又は重度の副作用を伴うことにより患者に任意の否定的な効果を危険にさらす可能性がある。
【０１５９】
組換え方法により、抗体及び／又はそれらのフラグメントはまた、他のタンパク質と容易にカップリングされ得、そして従って、多機能コンストラクト、多特異的又は二又は多官能性接合体、多機能及び多特異的抗体、等が生成され得（Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ２００１，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｎ：  Ｒ．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｄｕｂｅｌ  （ＥＤＳ），  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐａｇｅｓ  ３−１６）。
【０１６０】
本発明によれば、本発明の抗体をコードする核酸配列は、ｈＩＬ−３のアミノ酸残基２２−４８内の特異的エピトープに対する抗体の特異的結合を付与する抗体の少なくともそれらの部分をコードするヌクレオチドを含む。
【０１６１】
好ましい実施形態によれば、前記核酸は、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４（クローン１３）又はＤＳＭ  ＡＣＣ３２５１（Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６）により生成される抗体、又はそのフラグメント、変異体、コンストラクト、又は接合体をコードする。さらなる、特に好ましい核酸は、ヒト化クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６をコードし、それにより、それは、本発明の特異的ｈＩＬ−３エピトープへの結合を伴う、抗体クローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６における領域をコードする少なくともそれらのヌクレオチドを含む。
【０１６２】
本発明のさらなる主題は、本発明のモノクローナル抗−ＩＬ−３抗体を生成するハイブリドーマ細胞系である。ハイブリドーマ細胞系の生成及びそれからのモノクローナル抗体の取得は、当業者において良く知られている。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎによる方法の最初の出版物から出発し、そしてそれに基いて、この方法は広く使用され、そしてさらに改善されて来た。一般的に、モノクローナル抗体の生成のためには、Ｂａｌｄ／ｃマウスが抗原、この場合、ｈＩＬ−３、例えばグリコシル化ｈＩＬ−３、及び好ましくは、ｈＩＬ−３のアミノ酸２２−４８を含むｈＩＬ−３のそれらの部分により免疫化される。所望するエピトープに対する特異的抗体の生成方法は、当業界において良く知られている。免疫化されたマウスの脾細胞が骨髄腫細胞により融合され、そして得られるハイブリドーマが、例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて、抗体の生成について試験される。特異的抗体の生成について陽性であると試験されたクローンはさらに、所望の抗体の連続的生成のために維持され、そして使用され得る安定したハイブリドーマ細胞系を形成するために増殖される。
【０１６３】
本発明の特に好ましいハイブリドーマ細胞系は、抗体クローン１３を生成する細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３１６４、又は抗体クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６を生成する細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ３２８１である。
【０１６４】
治療に使用される抗体は、例えば、他の無関係なサイトカインとの交差反応性、又は既知抗体により経験された重度の免疫学的応答により引起される欠点を伴わないことが重要である。
【０１６５】
本発明の抗体は、治療使用のために価値がある。従って、本発明のさらなる主題及び実施形態は、治療使用のための上記で定義された少なくとも１つの抗体、及び任意には、治療使用のための医薬的に許容できる賦形剤又は担体を含む組成物である。本発明のそのような医薬組成物は、活性成分として本明細書に記載されるような、医薬的有効量の少なくとも１つの抗体又はその活性部分、例えば抗体フラグメント、抗体コンストラクト、抗体変異体又は抗体接合体の存在により特徴づけられる。医薬製剤のための通常の賦形剤及び／又は担体物質は、必要に応じて、及び適切であると思われる場合、含まれ得る。そのような賦形剤及び担体は、当業界において良く知られており、そして当業者は、その最適な物質及び用量を知っている。
【０１６６】
本発明の抗体、及び上記で定義されるような少なくとも１つの抗体（そのフラグメント、変異体、コンストラクト及び接合体）を含む医薬組成物は、高められたレベルのＩＬ−３に関連する疾患又は機能不全の治療、又は防止及び予防のために使用され得る。本明細書の導入部分で論じたように、ＩＬ−３は、種々の造血前駆体細胞に対して有意な増殖刺激及び分化効果を有し、そしてまた、肥満細胞のための増殖因子である。ＩＬ−３により引起されるシグナルトランスダクションは、免疫系に主要影響を及ぼす。ＩＬ−３が発生又は進行において直接的又は間接的役割を演じる任意の疾患又は医学的状態は、本発明の抗体を投与することによる治療のための候補体である。好ましくは、ＩＬ−３を生成できる細胞、例えば好塩基球、好酸球、形質細胞様樹状細胞、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、及び特定タイプの癌／腫瘍、ニューロン及び他の細胞による高められたレベルのＩＬ−３、又は高められたＩＬ−３の発現に関連するそのような疾患又は機能不全は、免疫系、ほとんど自己免疫疾患及び特にＲＡ、又は急性又は慢性移植片対宿主病、及び多発性硬化症に関連している。
【０１６７】
本発明の抗体により治療されるべきＩＬ−３を生成できる細胞による高められたレベルのＩＬ−３又は高められた発現のＩＬ−３に関連する疾患又は機能不全は、以下から選択された疾患又は機能不全であり得る：尋常性ざ瘡、喘息、過敏症、アレルギー；自己免疫疾患、例えば心筋炎、心筋梗塞後症候群、心外膜後症候群、亜急性細菌性心内膜炎、糸球体腎炎（各種）、糸球体症（各種）、間質性膀胱炎、ループス腎炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血管性皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、瘢痕性虫垂炎、疱疹状皮膚炎、円板状紅斑性狼瘡、表皮剥離性水疱性口内炎、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、甲状腺炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患、モルフェア、尋常性天疱瘡、精神病性リケノイド類及びバリオフォルミスシスアクタ、ミュシャ  −  ハバーマン病、乾癬、全身性強皮症、白斑、アジソン病、自己免疫性内分泌症候群、自己免疫性多発内分泌症候群２型、自己免疫性多発内分泌症候群３型、自己免疫性膵炎、１型真性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、オーズ甲状腺炎、グレーブス病、自己免疫性卵巣炎、自己免疫腸炎、シェーグレン症候群、自己免疫性腸疾患、セリアック病、クローン病、微視的大腸炎、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、低温アグルチニン病、必須混合性クリオグロブリン血症、必須混合性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、ＩｇＧ４関連全身性疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、悪性貧血、純赤血球形成不全、血小板減少症、脂肪症ドロロサ、成人発症スティル病、強直性脊椎炎、ＣＲＥＳＴ症候群、薬物誘発性狼瘡、腱炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、フェルティー症候群、若年性関節炎、ライム病（慢性）、混合性結合組織疾患、パリンドローム性リウマチ、パリー・ロムバーグ症候群、パーソンズ・ターナー症候群、乾癬性関節炎、反応性関節炎、再発性多発軟骨症、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、線維筋痛、封入体筋炎、筋炎、重症筋無力症、神経線維腫、腫瘍性小脳変性症、 多発性筋炎、急性播種性脳脊髄炎、急性運動性軸索ニューロパシー、抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸レセプター脳炎、バロ同心硬化症、ビッカースタフ脳炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、特発性炎症性脱髄疾患、ランバート・イートン筋萎縮症候群、多発性硬化症、オシュトラン症候群、連鎖球菌に関連する小児自己免疫神経精神障害、進行性炎症性ニューロパチー、不穏下肢症候群、硬直者症候群、シデナム舞踏病、横断性脊髄炎、自己免疫性網膜症、自己免疫ブドウ膜炎、コガン症候群、グレーブス眼症、中間ブドウ膜炎、硝子体結膜炎、ムーレン潰瘍、視神経乳頭炎、オプソクロナスミオクローヌス症候群、視神経炎、強膜炎、スサック症候群、交感神経性眼炎、トロサ  −  ハント症候群、自己免疫内耳疾患、メニエール病、抗好中球細胞質抗体関連脈管炎、ベーチェット病、チャーグ・ストラウス症候群、巨細胞性動脈炎、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、川崎病、白血球梗塞性血管炎、狼瘡血管炎、リウマチ様血管炎、顕微鏡的多発血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、蕁麻疹性血管炎；又は自己炎症性疾患、例えば家族性地中海熱；  再発熱（ＨＩＤＳ）を伴う高免疫グロブリン血症；ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）；マックルウェルズ症候群（蕁麻疹難聴アミロイドーシス）；  家族性冷蕁麻疹；  新生児発症性多系統炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）；定期的な発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎及び腺炎（ＰＦＡＰＡ症候群）；ブラウ症候群；  化膿性無菌性関節炎、膿皮膿瘍、ざ瘡（ＰＡＰＡ）；  インターロイキン−１−受容体アンタゴニスト（ＤＩＲＡ）の効率）；又は移植拒絶、再灌流傷害、敗血症；又は血液悪性腫瘍、例えばリンパ腫、白血病又は他の血液腫瘍；又は非血液悪性腫瘍。
【０１６８】
好ましくは、本発明の医薬組成物を投与することにより治療されるさらなる状況は、アレルギー反応を患っている個人におけるヒト好塩基球の活性の抑制、及び血清又は血漿における高めれたＩＬ−３レベル、又はＩＬ−３を生成できる細胞によるＩＬ−３の高められた発現を有する患者の層別化への使用である。
【０１６９】
それぞれの疾患又は機能不全において、本発明の医薬組成物による治療に適格であるためには、健康な個人に比較して、ｈＩＬ−３を生成できる細胞（例えば、Ｔ細胞）による高められたレベルのｈＩＬ−３又は高められた発現のｈＩＬ−３が、滑液、又は血液、血漿及び血清を含む任意の体液に存在すべきである。医薬組成物に含まれる本発明の抗体は、ｈＩＬ−３に特異的に結合し、そしてそれにより、ｈＩＬ−３の活性を阻害する。
【０１７０】
特に、ＲＡの観点から、大きなグループの患者に関しては、Ｔ細胞により生成された高められたレベルのｈＩＬ−３は、患者において引起される悪化及び疾患の進行と相関することが見出されている。ＩＬ−３は主に活性ＲＡにおいて検出され、ところが非活性段階のＲＡを有する患者はｈＩＬ−３の高められた発現又は高められたレベルを通常示さない。従って、本発明の医薬組成物は、自己免疫の活発なエピソード、例えばＲＡを有する患者の治療に、及び疾患の活発なエピソードの発生を回避するための予防処置のために特に有用である。
【０１７１】
利用可能な治療は治療された患者の約５０％においてのみ有効であるので、本発明の組成物の提供は、患者における自己免疫疾患の新規且つ穏やかな治療の重要な工程である。ＩＬ−３欠損マウス（Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；  ３９２（６６７１）：９０−３）の明白な表現型の欠如、及びＩＬ−３に対する抗体により処置されたマウスの明白な副作用の欠落（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００９  ；６０（５）：１３５２−６１）に基いて、ＩＬ−３を標的とする治療は、特に感染又は新形成に関して、現在使用されている医薬品よりも低い重度の副作用を示す。ある場合、抗体及び本発明の医薬組成物と、メトトレキセート又はレフルノミドのような他の薬剤との治療を組合すことが所望される。血漿、血清又は他の体液中のＩＬ−３発現又はＩＬ−３レベルに従っての個別化された治療戦略は、現時点で、どの患者が特定の療法（生物学的製剤を含む）に応答するかを、確実に予測することは不可能であるので、入手できる生物学的製剤に比較して、利点を提供する。さらに、個別化されたアプローチは、無効果な治療の副作用のリスクを低めることにより治療の安全性を改善し、そしてＲＡの治療のためのコストを低める。
【０１７２】
また、本発明の抗体による治療は、血液、血漿又は血清中の高められたｈＩＬ−３発現又は高められたｈＩＬ−３レベルが発現されるとすぐに、優先的に開始されるであろう。従って、早期治療は、ＲＡ活性が、高められたｈＩＬ−３レベルと相関し、そして長期間の関節損傷が回避され、又は最小限に保持され得る患者に適用され得る。さらに、患者がＤＭＡＲＤ又は生物学的製剤によるこれまでの治療に失敗した場合、抗−ＩＬ−３抗体による治療が優先的に開始されるであろう。さらに、本発明の抗体の使用は、疾患病理においてさらなる負の要因であり得る滑膜組織の細胞浸潤を低めることができることが期待される。
【０１７３】
本発明の医薬組成物に含まれるｈＩＬ−３抗体の有効量は、当核分野で一般的に知られている医師により容易に決定され得る。有効量は、疾患の症状を緩和するか、又は患者の状態は、体液、好ましくは血液、血漿又は血清における炎症又は自己免疫についてｈＩＬ−３発現又はｈＩＬ−３レベル及び他のマーカーを決定し、そして疾患標的を決定し、又は既知診断方法を用いることによりモニターされ得る。ＲＡについては、疾患の進行及び患者の状態は、例えばＤＡＳ２８活性評点を用いて決定され得る。関節損傷を防ぐためには、ＤＡＳ２８≦２，６が達成されるべきである。治療の有効性は、疾患活性の一定（例えば、５０％又は７０％）の低下を達成する患者の％として測定され得る。体液中のｈＩＬ−３又は他の炎症マーカーの低下はまた、治療の成功の指標でもある。医薬組成物の有効量は、当業者に良く知られているような用量−応答−曲線を用いて決定され得る。本発明の診断方法を用い転決定される、患者の体液に存在するｈＩＬ−３の量はまた、各患者のための医薬組成物における抗体の有効量及び疾患及び機能不全の重症度を決定するための基礎となり得る。
【０１７４】
本発明の医薬組成物及びその中に含まれるｈＩＬ−３抗体の量に関して、用量はさらに、抗体の活性、結合活性及び半減期に依存する。約１〜２週の半減期を有する抗体の場合、その用量は、１回の投与当たり１〜１０００ｍｇ及びより好ましくは、１０〜１００ｍｇの範囲である。医薬組成物は好ましくは、抗体の半減期に依存して、１日１回〜１ヶ月に１回、適用される。本発明の医薬組成物は、固体又は液体形のような意図された目的のために有用である任意の形で存在し得る。例えば懸濁疫、溶液又はエマルジョンが有用である。組成物は、注射可能な製剤などの任意の有用な形での投与のために提供され得る。
【０１７５】
また、体液中の高められたｈＩＬ−３レベルと相関する患者の治療のための医薬組成物及びその使用に関して、抗体クローン１３及びＰ８Ｃ１１Ｃ８−６が特に好ましい候補体である。抗体クローン１３及びＰ１８Ｃ１１Ｃ８−６は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−５との検出できる交差反応を示さず、そして従って、患者におけるそれらのサイトカインの活性に影響を及ぼさない（感知例４ｂを参照のこと）。さらに、クローン１３及びＰ８Ｃ１１Ｃ８−６は、ヒト細胞系又は一次ヒト細胞において発現されるグリコシル化ｈＩＬ−３を用いて、一次ヒト血液細胞におけるｈＩＬ−３活性を遮断することにおいて非常に有効であることは示されている。
【０１７６】
クローン１３及びＰ３Ｃ１１Ｃ８−６はまた、非常に高い親和性及び結合活性を示し、そしてこの抗体の既に非常に少ない量が、一次ヒト血液細胞におけるその阻害活性のために十分である（実施例５を参照のこと）。
【０１７７】
本発明の抗体は、ＰＭＢＣなどの一次ヒト細胞により発現されるｈＩＬ−３が確実に及び効率的に検出され得るサンドイッチＥＬＩＳＡなどの検出方法にも使用され得る。好ましい実施形態によれば、検出方法に使用される抗体は、クローン１３及びＰ８Ｃ１１Ｃ８−６と呼ばれる抗体である。
【０１７８】
グリコシル化状態を診断の原因としての新規同定により、新規な抗−ｈＩＬ−３特異的抗体を効率的にスリーニングし、そして／又は開発することは現在、可能である。抗原として、それらの場合、グリコシル化ｈＩＬ−３ペプチドが使用される。「グリコシル化ｈＩＬ−３ペプチド」とは、配列番号１０のアミノ酸１５又は７０のいずれかで、又は配列番号１のアミノ酸１５又は７０の両者で、Ｎ−グリコシル化を含むペプチドとして、本明細書において定義される。そのようなペプチドは、昆虫細胞のような真核生物発現系、又はＨＥＫ細胞のようなヒト細胞系により、又は活性化されたＰＢＭＣのような一次ヒト細胞の発現により生成され得る。
【０１７９】
従って、本発明はまた、抗体の結合及び阻害活性を測定するために、グリコシル化ｈＩＬ−３ペプチドが抗原として、及びサイトカインとして使用される、本発明の抗−ｈＩＬ−３抗体を得るための方法を含む。この方法の好ましい実施形態によれば、グリコシル化ｈＩＬ−３ペプチドは、ヒト細胞から発現され、そして翻訳される。
【実施例】
【０１８０】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例に概説されるが、それらは本発明の範囲又は精神を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０１８１】
実施例１−モノクローナル抗−ＩＬ−３抗体の生成
ミョウバン中、ヒト真核生物グリコシル化ＩＬ−３の少なくとも６回のｉ．ｐ．注射を用いて、４週間隔でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化することにより、抗−ＩＬ−３抗体を生成した。細胞融合の２日前、ＰＢＳ中、ＩＬ−３を腹腔内注射した。免疫化されたマウスから得られた抗体−産生脾細胞（ＨＡＴ培地上で増殖できるＨＧＰＲＴ陽性）を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で、骨髄腫細胞系ｘｘ６３Ａｇ８．６．５．３と融合され、そしてハイブリドーマの選択を、ＨＡＴ選択培地において実施した。ハイブリドーマを、１０％ＦＣＳ（純粋に不活性された、ＮＩＡ）、Ｐ／Ｓ及びグルタミン（１：１００）により補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地において培養した。得られたば細胞は、懸濁状態で増殖することができ、そして１：４の比で３日ごとに分けた。
【０１８２】
貯蔵のために、ハイブリドーマ細胞を、細胞培養ボトルから、５０ｍｌ又は１５ｍｌの細胞培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））中に移す。室温で１４００ｒｐｍでの５分間の遠心分離の後、上清液を完全に除去する。細胞を、凍結培地（９０％ＦＣＳ（ＨＩＡ）＋１０％ＤＭＳＯ）において再懸濁し、そして１．５ｍｌのアリコートをバイアルに満たす。細胞を−８０℃でのフリーザーにおける凍結容器において予備凍結し、そして１−２日後、液体窒素貯蔵タンクに移す。
【０１８３】
得られた細胞系のクローニング及び再クローニングを、限界希釈法を用いて実施し、モノクローナル抗体の長期安定供給源を提供する。
【０１８４】
得れられた抗体が、表１に示される。
【０１８５】
抗体のアイソタイプを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、抗体が添加されたＩＬ−３被覆プレートを用いて実施した。結合された抗体を、アイソタイプ特異的二次抗体を用いて検出した。さらなる分析のために、アイソタイプＩｇＧの抗体のみを使用した。
【０１８６】
【表１】
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【０１８７】
実施例２−ハイブリドーマ上清液におけるＩｇＧ１の量の決定
タイプＩｇＧ１の得られた抗体のいくつかを、ハイブリドーマクローンから単離し、そしてそれらの濃度を決定した。濃度の決定を、以下の方法に従って実施した：９６ウェルプレートを、室温で一晩、１００μｌ／ウェルの濃度での抗−マウスＩｇＧ（ｐＢＳ中、１：１００）により被覆する。遮断を、ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ１００μｌ／ウェルを添加し、そして室温で２時間、インキュベートすることにより実施する。遮断反応の後、プレートを２度、洗浄する。クローン３．４７．２０、６．３８．１４、．３６．３８、  １０．１２．４、  １１．１４．６の上清液の２つのサンプル及びブランクをそれぞれ、希釈せずに、並びに１：３、  １：９、１：２７、１：８１、１：２４３、１：７２９  及び  １：２１８７（ウェル当たり１００μｌ、ＰＢＳ中、２％ＢＳＡでの希釈）の希釈度で、室温でインキュベートする。１ｍｇ／ｍｌの開始濃度でのマウスＩｇＧ１を標準として用いるが、２０ｎｇ／ｍｌの濃度を、１：２、  １：４、  １：８、１：１６、１：３２、１：６４  及び１：１２８の希釈度で適用する。
【０１８８】
プレートを３度、洗浄し、そして次に、ウェル当たり１００μｌで室温で１時間、ビオチン化された抗−マウスＩｇＧ１（ＰＢＳ中、２％ＢＳＡで１：２５０に希釈された）と共にインキュベートする。プレートを、さらに３度、洗浄した後、ストレアトアビジン−ＨＲＰ（ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ中、１：１０００）を、室温で及び暗室で１時間、添加する。抗体の濃度を、ＡＢＴＳを添加し、さらに３０分間インキュベートし、そして分光光度計上で４０５及び４９０ｎｍでシグナルを測定した後、決定する。この決定に基いて、所望する量の試験される抗体を、さらなる試験のために適用する。
【０１８９】
実施例３−ウェスターン−ブロットアッセイにおけるモノクローナル抗体によるＩＬ−３の決定
ゲルの調製及びウェスターンブロット分析の実施のために、標準方法を用いる。１２％ＰＡＡ分解ゲルを注ぎ、約１−２ｍｌの水により被覆し、そして認識可能な「ライン」が形成されるまで、重合を３０〜４５分間、行う。水を除去し、スタッキングゲルを分解ゲル上に注ぎ、そしてテフロン櫛を挿入する。重合を３０分間、実施し、次に櫛を注意して除く。
【０１９０】
ＩＬ−３のサンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と共に組換えヒトＩＬ−３（１：１）を混合し、そして６０℃で５分間、サンプルを加熱することにより、調製する。レーン当たり１μｇのＩＬ−３の量、及び分子サイズを決定するための通常の標準をゲル上に負荷する。次に、ゲルを、ランニング緩衝液をすでに含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動装置に装着する。次に、挿入されたゲルを、追加のランニング緩衝液により注意して重ね、そして約１．５時間、無限に調整された電圧で２０〜２５ｍＡで電気泳動を行う。ランが完結すると、ゲルを装置から回収し、そしてスタッキングゲルを除く。
【０１９１】
トランスファー緩衝液に予備浸漬された６層のワットマン紙、及びＰＶＤＦ膜を、ゲルのサイズに合わせて切断する。トランスファースタックを、通常の手段で調整し、そして２０−２５ｍＡ及び無限に調整され電圧で４０分間、セミドライブロッティングにより、トランスファーを行う。次に、膜を、遮断溶液（（ＰＢＳ中、５％粉末スキムミルク）と共に振盪装置上で４℃で一晩インキュベートし、そして膜を室温でＰＢＳによりそれぞれ５分間、３度洗浄する。
【０１９２】
抗体クローンを、振盪装置上で攪拌下で、室温で２時間、遮断溶液中、５μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートする。３回の洗浄工程の後、ＨＲＰ標識された抗−マウス免疫グロブリン（遮断溶液中、１：１００）を添加し、そしてインキュベーションを、振盪視ながら、室温で１時間、行う。３回のさらなる洗浄工程の後、検出溶液（ＮＡＬＧＥＮから入手されたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔの溶液Ａ及びＢの１：１混合物）を添加し、そして室温で１分間インキュベートする。次に、フィルムを、異なる時間の露光で膜上で調整し、そして暗室で現像する。
【０１９３】
図２は、抗体クローン２、３、５、６、７、８、１０、１１及び１３の結合の結果を示す。所定の濃度でのＩＬ−３への結合を、クローン８、１１について、及びそれにより低い程度でのクローンについて検出した。
【０１９４】
実施例４−モノクローナル抗体のＩＬ−３の親和性及び特異性の分析
ａ）ＩＬ−３に対する抗体の親和性
得られた抗体のＩＬ−３に対する親和性を、ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。ＥＬＩｓＡプレートを、異なった濃度（２μｇ／ｍｌ、０．６６μｇ／ｍｌ、０．２２μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌ）の抗−ヒトＩＬ−３抗体（ＲＤ、ヤギＩｇＧ  抗−ヒト  ＩＬ−３  ＡＦ−２０３−ＮＡ）、により一晩、被覆した。各濃度について、二重反復を用いた（２×１２ウェル）。このためには、第１の濃度（２μｇ／ｍｌ）をＰＢＳにより希釈し、ＩｇＧの全濃度を一定に保つために、さらなる希釈を、２μｇ／ｍｌの対照ヤギＩｇＧを含むＰＢＳで行う。２％ＢＳＡによる遮断を、室温で２時間、実施し、続いてＰＢＳを用いての５回の洗浄工程を行う。
【０１９５】
次に、ウェルを、ｈＩＬ−３（ＰＢＳ中、０．２５μｇ／ｍｌ）と共に室温で２時間インキュベートし、対照グループについては、ｈＩＬ−３を添加しない。ＰＢＳによる５回のさらなる洗浄工程の後、ウェルを、実施例１で得られた抗体クローン８及び１１の連続（１：３）希釈液と共に４℃で一晩インキュベートし、この抗体は、２％ＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液で使用され、そして２０μｇ／ｍｌの開始濃度を有する。
【０１９６】
５回のさらなる洗浄工程の後、結合された抗体を、ヤギ−抗−マウス−ＨＲＰ抗体（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：５００）を用いて検出し、そして室温で１時間インキュベートする。５回のさらなる洗浄工程の後、ＡＢＴＳ（ＲＯＣＨＥ、１ｍｇ／ｍｌ）を、基質として添加し、そして光学密度を４０５ｎｍでの分光計により測定する。
【０１９７】
結果は、クローン１１について図３に示されている。抗体クローン１１は、アッセイにおいてＩＬ−３に対する高い親和性を示す。図４は、他の抗体を含む、さらなる試験の結果を示す。試験は、記載されるのと同じ手段で行われたが、しかしながら、固相の被覆は、図に示されるように、１μｇ／ｍｌのヤギ抗−ヒトＩＬ−３（上記を参照のこと）及び異なる濃度／希釈度の抗体を用いて実施された。
【０１９８】
ｂ）他のサイトカインとの交差反応性
診断アッセイのための得られたモノクローナル抗体の有用性を決定するためには、患者の血液、血漿、血清又は他の体液にも存在する密接に関連するサイトカインとの交差反応を排除できないことは重要である。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、ＰＢＳ中、１００μｇ／ウェルのヒトＩＬ−３（１μｇ／ｍｌ）又はＩＬ−５（１μｇ／ｍｌ）を添加することにより被覆した。負の対照として、ＰＢＳを使用した（１００μｌ／ウェル）。試験された各抗体に関して、異なる希釈液を、ｈＩＬ−３、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｈＩＬ−５及びＰＢＳを有する共通プレート上で強制的に試験した。
【０１９９】
サイトカイン被覆されたプレートを、３回洗浄し、そして遮断を、ＰＢＳ中、２％ＢＳＡを用いて、室温で２時間、実施した。３回のさらなる洗浄工程の後、抗体クローン３．４７．２０、８．３６．３８、１０．１２．４、１１．１４．６、１３．４．４及び対照としての培地（１０％ＦＣＳと含むＲＰＭＩ１６４０）を、４０μｌ／ｍｌの濃度で添加し、そして１：５及び１：２５の希釈液を１００μｌ／ウェルの容量で含み、そして室温で１時間インキュベートした。各プレート上に負の対照が使用される。
【０２００】
３回の洗浄工程の後、二次ＨＲＰ−標識されたウサギ抗−マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐ２６０（ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ中、１：２０００、１００μｌ／ウェル））を添加し、そしてプレートを、暗室において室温で１時間インキュベートした。別の３回の洗浄工程の後、ＡＢＴＳ（ＲＯＣＨＥ、１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして分光測定を、４０５及び４９０ｎｍで実施した。
【０２０１】
結果は図５に示され、これは、クローン８及び１０については弱い交差反応性を示すが、しかしクローン１１及び１３については、有意な交差反応性は示されていない。図６は、クローンＰｌ８Ｃ１１Ｃ８−６により得られた結果を示す。
【０２０２】
ｃ）他の種からのＩＬ−３との交差反応性
モノクローナル抗体のさらなる性質として、他の種からのＩＬ−３とのそれらの交差反応性を決定した。それぞれのアッセイに関しては、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、ＰＢＳ中、ヒト、ネズミ、ラット及びアガゲザルＩＬ−３（１μｇ／ｍｌ）、及びバックグラウンドとしての１００μｌ／ウェルのＰＢＳにより被覆し、そして冷蔵庫で一晩インキュベートした。各抗体に関しては、異なる希釈溶液を、ｈＩＬ−３、ネズミＩＬ−３、ラットＩＬ−３、アカゲザルＩＬ−３及び負の対照としてのＰＢＳを有する共通プレート上で強制的に試験した。
【０２０３】
ＩＬ−３被覆プレートを、３回、洗浄し、そして遮断を、ＰＢＳ中、２％ＢＳＡにより、室温で２時間、行った。３回の洗浄工程の後、図７及び９に示されるような一定濃度での抗体クローン３．４７．２０、８．３６．３８、１０．１２．４、１１．１４．６、  １３．４．４、及びそれらの１：５、１：２５及び１：１２５希釈溶液を、１００μｌ／ウェルの容積で添加した。Ｒ＆Ｄモノクローナル抗−ＩＬ−３抗体クローン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  カタログ番号ＭＡＢ２０３）を、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用し（１００μｌ／ウェル）、そして負の対照として、抗体を含まない培地（１００μｇ／ウェル）（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）を使用した。各プレート上で、負の対照を使用した。図８は、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ９−６に得られた結果を示す。
【０２０４】
３回の洗浄工程の後、二次ＨＲＰ−標識されたウサギ抗−マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｐ２６０  （ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ中、１：２０００、１００μｌ／ウェル））を添加し、そしてプレートを、暗室において室温で１時間インキュベートした。別の３回の洗浄工程の後、ＡＢＴＳ（ＲＯＣＨＥ，１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして３０分後、４０５ｎｍで分光測定を行った。
【０２０５】
結果は、上記のように図７−９に示され、これは、クローン１０のわずかな交差反応性にもかかわらず、実施例１の抗体は検出できる交差反応性を示さなかったことを示唆する。他方では、Ｒ＆Ｄ抗体は、アカゲザルＩＬ−３とのいくらかは交差反応を示しました。
【０２０６】
実施例５−モノクローナル抗体の遮断性質の分析
実施例１に従って得られた抗体のＩＬ−３活性を遮断する能力を分析するために、いくつかの異なる実験を実施した。
【０２０７】
ａ）ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖に基いてＩＬ−３を遮断する抗体の能力の分析
ＴＦ１細胞はヒト赤芽球であり、そして重度の汎血球減少症に罹患している３５歳の日本人男性の骨髄からの細胞系が１９８７年、Ｔ．Ｋ．Ｋｉｔａｍｕｒａにより確立されている。ＴＦ１細胞の増殖は、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦの存在に完全に依存している。従って、ＴＦ１細胞の細胞増殖に基く試験を用いて、ＴＦ１細胞の増殖の低下又はさらに、完全な阻害を導くＩＬ−３活性の遮断を決定することができる。そのような試験に関しては、ＭＴＴ−細胞−増殖アッセイを行い、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼの活性に基いて細胞の生存性を決定する。溶液中で黄色を示すデヒドロゲナーゼの基質ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、酵素活性によりテトラゾリウム環で切断され、紫色のＭＴＴホルマザン結晶の形成が導かれる。そのような結晶は、イソプロパノールに溶解され、紫色の溶液が分光計で測定され、そしてその結果は、生存ＴＦ１細胞の量と相関する。
【０２０８】
ＴＦ１細胞の培養：
ＴＦ１細胞を、培養培地（１０％ＦＣＳ（ＨＩＡ）、Ｐ／Ｓ及びグルタミン（１：１００）を含み、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３又は５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦのいずれかにより補充されたＲＰＭＩ−１６４０）において増殖し、そして３日ごとに１：４に分割した。
【０２０９】
貯蔵のために、細胞を、細胞培養ボトルから、５０ｍｌ又は１５ｍｌの細胞培養フラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））に移した。室温で１４００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、上清液を完全に除去した。細胞を、培養培地（１０％ＦＣＳ（ＨＩＡ）、Ｐ／Ｓ及びグルタミン＋５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含むＲＰＭＩ−１６４０）において再懸濁し、そして５％ＤＭＳＯ及び１．５ｍｌのアリコートをバイアルに満たす。細胞を−８０℃でのフリーザーにおける凍結容器中で予備凍結し、そして１−２日後、液体窒素貯蔵タンクに移す。
【０２１０】
遮断実験：
上記プロトコルに従って３日ごとに分割されたＴＦ−１細胞を、実験が行われる前日、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３を含む培養培地中に１：２に分割する。
【０２１１】
実験のために、細胞を室温で１６００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。培養培地を除き、そして細胞を、ＲＰＭＩ培地により２度、洗浄し、続いて細胞を、１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ（ＨＩＳ）＋Ｐ／Ｓ＋グルタミン（１：１００）に再懸濁し、計数し、そして１×１０５個の細胞／ｍｌの最終濃度に緩衝液により補充する。
【０２１２】
９６ウェルにプレートにおいて、１００μｌの培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ＋グルタミン）中、１０，０００個の細胞を各ウェルに提供する。３７℃で６０分間、実施例１のモノクローナル抗体と共にプレインキュベートされたＩＬ−３（１００μｌ）を得た。プレインキュベーションのためには、異なる最終濃度の抗体及びＩＬ−３を使用する。そのような最終濃度を得るためには、抗体及びＩＬ−３溶液の濃度は、最終濃度の２倍である必要がある。３７℃での５日間のインキュベーション及び５％ＣＯ２の添加の後、１００μｌの培地を各ウェルから除去し、そして１０μｌのＭＴＴ溶液（ＬＣＧ標準−ＡＴＣＣ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを、３７℃及び５％ＣＯ２でのインキュベーターにおいて、さらに４時間インキュベートする。このさらなるインキュベーションの後、１００μｌのＭＴＴ溶液を添加し、そしてウェル中の内容物を注意して混合する。一服のインキュベーションの後、光学密度を、５７０及び６９０ｎｍで決定し、そして生存細胞の数をそれから計算する。
【０２１３】
実験を以下に対して実施した：抗体クローン８．３６．３８  （クローン８）、１１．１４．６  （クローン１１）  １３．４．４  （クローン１３）、市販の  抗−ｈＩＬ−３  抗体クローン４８０６  （ＲＤ  カタログ番号  ＭＡＢ２０３）  及びアイソタイプ対照としてのマウスＩｇＧ１κ  ＭＯＰＣ  ２１抗体（アジドを含まない）  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０２１４】
ＴＦ１の増殖に対するＩＬ−３の一般的影響を、図１０に示す。種々の濃度のｍＡＢを含み、及び含まないＩＬ−３の異なる量についての結果が図１１−１４に示されている。
【０２１５】
ｂ）ＴＦ１細胞のＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖に対する抗−ＩＬ−３抗体の可能性ある影響の分析
上記のように、ＴＦ１細胞の増殖は、ＩＬ−３又はＧＭ−ＣＳＦの存在に依存する。実施例５ａに示されるように、抗−ＩＬ−３抗体は、ＴＦＦ１細胞の増殖に対して負の効果を有する。ＩＬ−３は、７０ｋＤａのα鎖及び約１３０ｋＤａのβ鎖から構成されるＩＬ−３受容体に結合する。同じβ鎖がまた、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦの受容体上に存在する。従って、別の実験において、抗−ＩＬ−３抗体がまた、ＧＭ−ＣＳＦの存在下でＴＦ１細胞の増殖にも影響を及ぼすかどうかを試験した。このためには、上記実験を、抗−ＩＬ−３抗体と共にプレインキュベートされた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３及びそれらの混合物の、ＴＦ１細胞の培養培地への添加を反復した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３を含まない対照も含まれていた。
【０２１６】
この実施例において使用される、それぞれ、ＧＭ−ＣＳＦ及び抗体の影響及び量の遮断を考慮しての試験の結果が図１５に示されており、これは、試験したいずれの抗体も、ＧＭ−ＣＳＦに対する遮断効果及びＴＦ１細胞に対するその増殖誘導を有さないことを示唆する。
【０２１７】
ｃ）ｐＤＣ上の好塩基球及びＨＬＡ−ＤＲに対するＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１１ｂのＩＬ−３誘発されたアップレレギュレーションを阻害する抗−ＩＬ−３抗体の能力の分析
ヒト好塩基球顆粒球は、ＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１１ｂのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーションを示す。この実験においては、抗−ＩＬ−３抗体もまた、この点でＩＬ−３の効果を阻害できるかどうかを決定した。
【０２１８】
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体により染色された新鮮なヒトＥＤＴＡ血液中の好塩基球のフローサイトメトリー検出が、図１７の左上に示されている。ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体により染色された新鮮なヒトＥＤＴＡ血液中の形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）のフローサイトメトリー検出が、左側に示される。新鮮なヒトＥＤＴＡ血液を、図１８の種々の濃度のＩＬ−３と共に３７℃で１時間インキュベートした。
【０２１９】
一次ヒト細胞上のヒトＩＬ−３に対するモノクローナル抗体の中和能力を分析するために、好塩基球上のＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１１ｂのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーション又はＣＤ１３１のＩＬ−３誘発されたダウンレギュレーション（右側の図１７、図３４及び３５を参照のこと）、及びヒトｐＤＣ上のＨＬＡ−ＤＲのＩＬ−３誘発されたアップレギュレーション（図１８を参照のこと）を研究した。すべてのアッセイは、新鮮なＥＤＴＡ血液により実施された。
【０２２０】
新鮮なヒトＥＤＴＡ血液を、種々の濃度のＩＬ−３と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３１及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した（図１７及び１８の右側、及び図３４及び３５に示されている）。
【０２２１】
非常に驚くべきことには、ＴＦ１細胞に対するＩＬ−３効果を中和する抗−ＩＬ−３抗体の能力は、一次ヒト細胞に対するＩＬ−３効果を中和する能力とまったく相関しないことが見出された。
【０２２２】
クローン１１及びＲ＆Ｄクローン４８０６は、ＴＦ１細胞のＩＬ−３依存性増殖を効率的に遮断するが（２．５ｎｇ／ｍｌのＥ．コリ発現されたＩＬ−３の存在下で、ＩＣ５０はそれぞれ、１０ｎｇ／ｍｌ及び３３ｎｇ／ｍｌである；図１３及び１４を参照のこと）、しかし一次ヒト細胞に対する昆虫細胞発現されたＩＬ−３のＩＬ−３効果を基本的に遮断することができない（図１９−２１を参照のこと）。対照的に、ＴＦ１細胞に対するＩＬ−３効果を遮断する効果がはるかに低い抗体クローン１３（２００ｎｇ／ｍｌでのＩＣ５０；図１２を参照のこと）は、一次ヒト末梢白血球により測定される場合、ＩＬ−３効果を完全に且つ非常に効果的に遮断する（４０ｎｇ／ｍｌでのＩＣ５０；図１９−２２及び２４−２８を参照のこと）。
【０２２３】
クローン１３とは別に、一次ヒト細胞により測定される場合、ＩＬ−３活性を完全に遮断する二次モノクローナル抗体（クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６）は生成されている（図２２及び３２−３６を参照のこと）。ＲＡ患者から得られた一次血液細胞に対する本発明の抗体の遮断能力は、図２３に示される。
【０２２４】
実施例６−抗−ＩＬ−３抗体Ｐ３ｃ１１Ｃ８−６についてのエピトープマッピング
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ヒトＩＬ−３由来の種々のペプチドにより一晩、被覆した。ＰＢＳ単独による被覆を、負の対照として使用した。洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）により遮断した後、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６（４０μｇ／ｍｌ）を、室温で１時間、適用した。洗浄の後、結合されたＰ８Ｃ１１Ｃ８−６抗体を、二次ＨＲＰ−標識されたウサギ抗−マウスポリクローナル抗体及び色基質反応により検出した（図３０を参照のこと）。
【０２２５】
アミノ酸残基の位置は、最初の２７個のアミノ酸のシグナルペプチドを有さないヒトＩＬ−３の位置に由来する。ヒトＩＬ−３の配列は、受託番号ＮＰ＿０００５７９．２、  バージョン  ＧＩ：２８４１６９１５としてＧｅｎＢａｎｋに寄託される。
【０２２６】
ＩＬ３−１  （ａａ  １−２７）：  ＡＰＭＴＱＴＴＰＬＫＴＳＷＶＮＣＳＮＭＩＤＥＩＩＴＨＬ  （配列番号２）
ＩＬ３−１Ａ  （ａａ  １−２４  、２つの突然変異に下線を引く）：  ＡＰＭＴＱＴＴＰＬＫＴＳＷＡＫＣＳＮＭＩＤＥＩＩ  （配列番号３）
ＩＬ３−１Ｂ  （ａａ  １−２４  、２つの突然変異に下線を引く）：  ＡＰＭＴＱＴＴＳＬＫＴＳＷＶＮＣＳＮＭＩＤＥＩＩ  （配列番号４）
ＩＬ３−２  （ａａ  ２２−４８）：  ＥＩＩＴＨＬＫＱＰＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬＮＧＥＤＱＤＩＬ  （配列番号１）
ＩＬ３−３  （ａａ  ４３−６９）：  ＥＤＱＤＩＬＭＥＮＮＬＲＲＰＮＬＥＡＦＮＲＡＶＫＳＬＱ  （配列番号５）
ＩＬ３−４  （ａａ  ６４−９０）：  ＡＶＫＳＬＱＮＡＳＡＩＥＳＩＬＫＮＬＬＰＣＬＰＬＡＴＡ  （配列番号６）
ＩＬ３−５  （ａａ  ８５−１１１）：  ＬＰＬＡＴＡＡＰＴＲＨＰＩＨＩＫＤＧＤＷＮＥＦＲＲＫＬ  （配列番号７）
ＩＬ３−６  （ａａ  １０６−１３３）：  ＥＦＲＲＫＬＴＦＹＬＫＴＬＥＮＡＱＡＱＱＴＴＬＳＬＡＩＦ  （配列番号８）
【０２２７】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌの濃度で、ヒトＩＬ−３由来の種々のペプチドにより一晩、被覆した。ＰＢＳ単独による被覆を、負の対照として使用した。洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）により遮断した後、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６を、室温で１時間、適用した。洗浄の後、結合されたＰ８Ｃ１１Ｃ８−６抗体を、二次ＨＲＰ−標識されたウサギ抗−マウスポリクローナル抗体及び色基質反応により検出した。
【０２２８】
結果は、図３０及び３Ａに示される。
【０２２９】
実験を、以下のペプチドを用いて反復した。
ＩＬ３−２  （ａａ  ２２−４８）：  ＥＩＩＴＨＬＫＱＰＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬＮＧＥＤＱＤＩＬ  （配列番号１）
ＩＬ３−２ａ  （ａａ  ３０−４８）：ＰＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬＮＧＥＤＱＤＩＬ  （配列番号９）
ＩＬ３−２６  （ａａ  ２６−４８）：  ＨＬＫＱＰＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬＮＧＥＤＱＤＩＬ  配列番号１１）
ＩＬ３−２８  （ａａ２８−４８）：  ＫＱＰＰＬＰＬＬＤＦＮＮＬＮＧＥＤＱＤＩＬ  （配列番号１２）。
【０２３０】
実験条件は、上記に詳細される通りであったが、但し、洗浄、及びＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）による遮断の後、２０μｇ／ｍｌのクローンＰ８Ｃ１１８−６を室温で１時間、適用した。
【０２３１】
結果は、図３１Ｂに示される。Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６により認識されるエピトープは、ａａ２２（Ｅ）〜ａａ４８（Ｌ）内に含まれる。さらなる実験は、Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６により認識されるエピトープが、配列番号１０で定義されるアミノ酸配列のアミノ酸２６（Ｈ）〜３６（Ｄ）内に位置し、そしてＰ８Ｃ１１Ｃ８−６のエピトープがアミノ酸２７〜２９（ＬＫＱ）を含むことを示唆した。
【０２３２】
実施例７−クローン１３とクローンＰ３Ｃ１１Ｃ８−６との間の相互作用の分析
ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中、ヒトＩＬ−３（０．５μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆した。洗浄、及びＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）による遮断の後、標識されていない抗体クローン１３又はクローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６を、室温で１時間、種々の濃度で適用した。洗浄、又は標識されていない抗体の除去なしで、ＨＲＰ−標識された抗体クローン１３（０．４μｇ／ｍｌ）を、室温で１時間、添加した。洗浄の後、色基質反応を、ＡＢＴＳにより行い、そして光学密度（ＯＤ）を測定した。図３６−３８に示される結果からわかるように、クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６及びクローン１３は、お互いと競争しない。クローンＰ３Ｃ１１Ｃ８−６はまた、クローン１３又はクローン１１のＩＬ−３への結合を妨げない（図３７を参照のこと）。
【０２３３】
ＥＬＴＳＡを、抗体クローン１３（５μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆した。ＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ）を、種々の濃度のクローン１３Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６と共に３０分間プレインキュベートし、次にＥＬＩＳＡプレートに適用し、そして室温で１時間インキュベートした。洗浄の後、結合されたＩＬ−３を、ＨＲＰ−標識された抗体クローン１１（室温で１時間、０．４μｇ／ｍｌ）により検出した。洗浄の後、色基質反応をＴＭＢにより実施し、そして光学密度（ＯＤ）を測定した。
【０２３４】
Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６はまた、クローン１３又はクローン１１のＩＬ−３への結合を妨げない（図３８を参照のこと）。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中、ヒトＩＬ−３（０．５μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆した。洗浄、及びＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）による遮断の後、標識されていない抗体クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６、クローン１３（ＡＫ１３）又はクローン１１（ＡＫ１１）を、室温で１時間、種々の濃度で適用した。洗浄、又は標識されていない抗体の除去なしで、ＨＲＰ−標識された抗体クローン１１（０．４μｇ／ｍｌ）、ＨＲＰ標識された抗体クローン１３（０．４μｇ／  ｍｌ）又はＨＲＰ標識された抗体クローンＰ８Ｃ１１Ｃ８−６（０．１３μｇ／  ｍｌ）を、室温で１時間、添加した。洗浄の後、色基質反応を、ＴＭＢにより行い、そして光学密度（ＯＤ）を測定した。
【０２３６】
実施例８−ヒト好塩基球に対するＥ．コリ又は昆虫由来のＩＬ−３の活性の評価
図３９に示されるように、ヒト好塩基球に対するＥ．コリ又は昆虫細胞由来のＩＬ−３の活性は同等である。昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＥ．コリ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は負の対照としてのＰＢＳにおいて生成された種々の濃度のＩＬ−３を、新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に、３７℃で１時間、添加した。次に、細胞を、ＣＤ１１ｂ、Ｃ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する、直接的に標識された抗体により、氷上で２０分間、染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【０２３７】
図４０に示されるように、種々の源からのＩＬ−３の活性は、ヒト好塩基球とのバイオアッセイにおいて類似する。ＨＥＲ細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＥ．コリ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）において生成されたヒトＩＬ−３、及びＥ．コリにおいて発現されたアカゲザルＩＬ−３を、種々の濃度で、新鮮なヒトＥＤＴＡと共に、３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を、Ｃ２０３ｃ、及びＣＤ１２３に対する、直接的に標識された抗体により、氷上で２０分間、染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【０２３８】
実施例９−抗−ヒトＩＬ−３抗体の遮断活性の評価
図４１に示されるように、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３は単に、Ｅ．コリ由来の活性を遮断するが、しかし好塩基球によるアッセイにおける昆虫細胞由来のＩＬ−３の活性は遮断しない。
【０２３９】
昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｎｅｎｄ）又はＥ．コリ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）において生成されたＩＬ−３（０・１ｎｇ／ｍｌ）を、種々の濃度の抗−ＩＬ−３抗体又はマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＭＯＰＣ−２１）と共に室温で４５分間、プレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。ＰＢＳのみを、負の対照として、ヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する、直接的に標識された抗体により、氷上で２０分間、染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。負の対照（ＰＢＳ）のＣＤ２０３発現を差し引いた。
【０２４０】
図４２に示されるように、クローン１１及びＲ＆Ｄｍａｂ２０３は、好塩基球を用いたアッセイにおいて、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３の活性を単に遮断するが、しかし昆虫細胞由来のＩＬ−３の活性は遮断しない。ＨＥＫ細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＥ．コリ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）において生成されたＩＬ−３（０．１ｎｇ／ｍｌ又は０．２ｎｇ／ｍｌ）、又はＥ．コリ（Ｂｉｏｍｏｌ）において発現されたアカゲザルＩＬ−３を、種々の濃度の抗−ＩＬ−３抗体と共に室温で１時間プレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に添加した。ＰＢＳのみを、負の対照としてヒトＥＤＴＡ血液に添加した。３７℃での１時間のインキュベーションの後、細胞を、ＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１２３に対する、直接的に標識された抗体により、氷上で２０分間、染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【０２４１】
図４３に示されるように、クローン１３及びＰ８Ｃ１１Ｃ８−６は、ＲＡ患者からの一次Ｔ細胞により放出されるＩＬ−３の生物活性を遮断し、そしてクローン１１は、ほとんど阻害活性を有さない（ＲＡ患者からの抗−ＣＤ３活性化されたＰＢＭＣの細胞培養上清液中のＩＬ−３：ＩＬ−３の濃度を、クローン１３＋クローン１１−ＨＲＰ及び標準としての昆虫細胞由来のＩＬ−３を用いてのサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した）。６人のＲＡ患者からのＰＢＭＣ（５００，０００／ウェル）を、１０％ＦＣＳを含む、２００μｌのＲＰＭＩ培地中、抗−ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、５μｇ／ｍｌ）により３日間、活性化した。上清液（ＳＮ）を、種々の希釈度で、新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に３７℃で１時間、添加した。さらに、ＳＮを、抗−ＩＬ−３抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐ８Ｃ１１＝Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６、Ｋ１３＝クローン１３、Ｋ１１＝クローン１１）と共に室温で４５分間プレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に３７℃で１時間、添加した。上清液中のＩＬ−３濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定し、そしてＥＤＴＡ血液中のＳＮ１００％の最終濃度を図に提供する。次に、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１２３及びＨＬＡ−ＤＲに対する、直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【０２４２】
図４４に示されるように、クローン１３及びＰ８Ｃ１１Ｃ８−６は、ヒトＰＢＭＣにより生成されるＩＬ−３の生物活性を遮断し、そしてクローン及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３はほとんど阻害活性を有さない。ＲＡ患者からのＰＢＭ（５００，０００／ウェル）を、１０％ＦＣＳを含む２００μｌのＰＲＭＩ培地中、抗−ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、５μｇ／ｍｌ）により３日間、活性化した。上清液（ＰＢＭＣ−ＳＮ）を、１７５ｐｇ／ｍｌのＩＬ−３を含む希釈度（Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６＋クローン１３−ＨＲＰを用いてのＥＬＩＳＡにより測定された）で使用した。ＰＢＭＣ−ＳＮを、種々の濃度の種々の抗−ＩＬ−３抗体と共に室温で１時間プレインキュベートし、そして新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に、３７℃で１時間添加した。次に、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１２３に対する、直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【０２４３】
図４５に示されるように、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３は単に、ＴＦ−１アッセイにおいて、Ｅ．コリ由来のＩＬ−３の活性を遮断するが、しかし昆虫細胞由来のＩＬ−３の活性は遮断しない。昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又は（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）において生成されたＩＬ−３（２．５ｎｇ／ｍｌ）を、種々の濃度の抗−ＩＬ−３抗体又はマウスＩｇＧアイソタイプ対照抗体（ＭＯＰＣ−２１）と共に、室温で６０分間プレインキュベートし、そして５日間の培養の間、１０，０００のＴＦ−１細胞に添加した。生存細胞の数を、ＭＴＴアッセイ（ＬＣＧ標準−ＡＴＣＣ）を用いて定量化した。ＩＬ−３の不在下でのＴＦ−１細胞増殖を差し引いて、そして結果は、陽性対照（抗体を含まない２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３）の％として示される。
【０２４４】
図４６に示されるように、ＴＦ−１細胞アッセイにおいて、クローン１１及びＲ＆Ｄ  ｍａｂ２０３は単にＥ．コリ由来のＩＬ−３の活性を遮断するが、しかし、昆虫細胞又はＨＥＫ２０３細胞からのＩＬ−３の活性は遮断せず；そしてアカゲザルＩＬ−３はそれらの抗体によっては遮断されない。ヒトＨＥＫ２９３細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＥ．コリ（Ｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）において生成されたヒトＩＬ−３（２．５ｎｇ／ｍｌ）、又はＥ．コリ（Ｂｉｏｍｏｌ）において生成されたアカゲザルＩＬ−３を、種々の濃度の抗−ＩＬ−３抗体と共に、室温で６０分間プレインキュベートし、そして５０分間の培養の間、１０，０００ＴＦ−１細胞に添加した。生存細胞を、ＭＴＴアッセイ（ＬＣＧ標準−ＡＴＣＣ）により定量化し、そしてＯＤ値が示される。
【０２４５】
実施例１０−サンドイッチＥＬＩＳＡによるＩＬ−３検出
図４７Ａ−Ｃに示されるように、種々の供給源からのＩＬ−３がサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出され、そしてクローン１３＋Ｐ８Ｃ１１Ｃ８−６の対のみがＨＥＫ２９３細胞において発現されたＩＬ−３を検出する。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中、異なるＩＬ−３抗体（５μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆した。ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄し、そしてＲＴで２時間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡにより遮断した。次に、ＨＥＫ２９３細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）、昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＥ．コリ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）において生成されたＩＬ−３を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡに希釈された種々の濃度で適用した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄した後、異なるＨＲＰ−標識された検出−抗体（０．４μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ／ＢＳＡにＲＴで１時間、添加した。
【０２４７】
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０による洗浄の後、ＨＲＰ標識されたクローン１３（０．４μｇ／ｍｌ）を、検出抗体として使用し、そしてＰＢＳ／ＢＳＡにＲＴで１時間、添加した。その結果は、図４７Ｂに示される。
【０２４８】
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０による洗浄の後、ＨＲＰ標識されたＰ８Ｃ１１Ｃ８−６（０．１μｇ／ｍｌ）を、検出抗体として使用し、そしてＰＢＳ／ＢＳＡにＲＴで１時間、添加した。その結果は、図４７Ｃに示される。
【０２４９】
洗浄の後、色の反応を、ＴＭＢ基質を用いて実施し、そして光学密度を測定した。バックグラウンド値（ＩＬ−３の不在下で測定されるＯＤ値）を差し引いた。
【０２５０】
図４８に示されるように、種々の供給源からのＩＬ−３を、２つの異なるサンドイッチＥＬＩＳＡにより検出できる。
【０２５１】
ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中、異なるＩＬ−３抗体（５μｇ／ｍｌでのクローン１３又はＰ８Ｃ１１Ｃ８−６）により一晩、被覆した。ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＢＳＡによりＲＴで２時間、遮断した。次に、ＨＥＫ２９３細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）又は昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）において生成されたＩＬ−３を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡにより希釈された種々の濃度で適用した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０による洗浄の後、異なるＨＲＰ−標識された検出抗体（０．４μｇ／ｍｌでのクローン１１−ＨＲＰ又はクローン１３−ＨＲＰ）を、ＰＢＳ／ＢＳＡにＲＴで１時間、添加した。洗浄の後、色反応をＴＭＢ基質を用いて実施し、そして光学密度を測定した。バックグラウンド値（ＩＬ−３の不在下で測定されるＯＤ値）を差し引いた。
【０２５２】
図４９に示されるように、ヒトＰＢＭＣにより生成されたＩＬ−３を、２つの異なるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。
【０２５３】
９人のＲＡ患者からのＰＢＭＣ（５００，０００／ウェル）を、１０％ＦＣＳを含む２００μｌのＲＰＭＩ培地中、抗−ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３、５μｇ／ｍｌ）により３日間、活性化した。上清液（ＳＮ）を除いた。ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中、異なるＩＬ−３抗体（５μｇ／ｍｌ）により一晩、被覆した。ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＢＳＡによりＲＴで２時間、遮断した。上清液（ＳＮ）を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡに希釈された種々の濃度で適用した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０による洗浄の後、異なるＨＲＰ−標識された検出抗体（０．４μｇ／ｍｌでのクローン１１−ＨＲＰ又はクローン１３−ＨＲＰ）を、ＰＢＳ／ＢＳＡにＲＴで１時間、添加した。洗浄の後、色反応をＴＭＢ基質を用いて実施し、そして光学密度を測定した。バックグラウンド値（ＩＬ−３の不在下で測定されるＯＤ値）を差し引いた。
【０２５４】
図５０は、種々の供給源からのＩＬ−３の検出のためのヒト好塩基球を用いてのバイオアッセイの結果を示す。
【０２５５】
昆虫細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）又はＨＥＫ細胞（Ｂｉｏｍｏｌ）において生成された種々の濃度のＩＬ−３を、新鮮なヒトＥＤＴＡ血液に３７℃で１時間、添加した。次に、細胞を、氷上で２０分間、ＣＤ２０３ｃ及びＣＤ１２３に対する、直接的に標識された抗体により染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析し、好塩基球を同定し、そして好塩基球に対するＣＤ２０３ｃのアップレギュレーションを定量化した。
【０２５６】
図５１は、ＥＬＩＳＡ及びバイオアッセイによる、ヒトＰＢＭＣ由来のＩＬ−３の定量化を示し、そしてＥＬＩＳＡ（Ｐ３Ｃ１１Ｃ８−６＋クローン１３−ＨＲＰ）によるＩＬ−３の定量化が、ヒトＰＢＭＣ由来のＩＬ−３の生物活性と非常に良く相関することを示す。アッセイを、対応する図に示される標準曲線を用いて、上記のようにして行った。昆虫細胞由来のＩＬ−３を、標準として使用した。
【０２５７】
【表２】
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【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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