(57)【要約】リポソーム集団を製造する方法及び装置を提供する。本方法の態様は、リポソーム集団を製造するためにリポソームを多孔性の膜に通過させるために十分なやり方でリポソームの懸濁液に遠心力を加えることを含む。本発明の態様は、本方法の実施に役立つ装置、システム及びキットを更に含む。
2019522631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム集団を製造する方法であって、
多孔性の膜と、液体容器の内部に前記膜を配置するように構成される要素とを有するリポソーム押出装置内に、リポソームの懸濁液を導入すること、及び、
リポソーム集団を製造するためにリポソームを前記膜に通過させるために十分なやり方で前記リポソームの懸濁液に遠心力を加えること
を含む、方法。
【請求項２】
前記リポソームの懸濁液を前記リポソーム押出装置内に導入する前に、前記要素を前記液体容器に配置することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体容器は遠心管を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記要素は前記液体容器の内部と同心の円筒を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記要素は、開口部を有する第１端と、前記膜を含む第１端の反対側の第２端とを備える、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記要素の前記第２端が前記液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記要素の前記第２端と前記液体容器の前記閉鎖端との間の前記液体容器の容積は、前記要素の内部容積以上である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記膜は膜材料の１つ以上の層を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記膜材料はポリマーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーはポリカーボネートを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体容器は封止体を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記遠心力を加えることは、遠心機中の前記液体容器を回転させることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記リポソームの懸濁液を調製することを更に含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法を実施するためのリポソーム押出装置であって、
ポリカーボネート材料の１つ以上の層を含む多孔性の膜と、
液体容器の内部に前記膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と前記膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素と
を備える、装置。
【請求項１５】
リポソーム集団を製造するシステムであって、
液体容器と、
前記液体容器に配置される請求項１４に記載のリポソーム押出装置と
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
リポソームは１つまたは複数の脂質二重層を有する球状小胞である。単一の脂質二重層を含むリポソームは単層リポソームと呼ばれることがあり、複数の脂質二重層を含むリポソームは多層小胞と呼ばれることがある。リポソームは異なる方法を使用して調製でき、それは要因（例えばリポソームの脂質二重層の脂質組成、脂質小胞が分散する培養液の種類、リポソームの所望のサイズ、リポソームの所望の多分散性、頑健性及び製造方法のバッチ間再現性）、及び他の要因（例えば得られたリポソームの使用目的）に依存し得る。
【０００２】
例えばリポソームは物質（例えば薬物）を含むことができて、その物質を患者の標的領域に送達するために使用できる。したがってこのようなリポソームを製造するために使用する方法は、リポソームに封入された物質の物理化学的特性、封入された物質の濃度または患者へのリポソームの適用／送達中に関係する追加の工程にも依存し得る。
【０００３】
リポソームの懸濁液（例えば大きな多層小胞の懸濁液）を製造した後、特定のサイズ範囲内のサイズを有するリポソームを製造することが望ましい場合がある。リポソームをサイズ設定する１つの一般的な技術は超音波処理法であり、大きな多層小胞は超音波エネルギーを使用して破壊され得る。例えば超音波処理は、大きな多層小胞から小さな単層小胞を製造するために使用できる。
【発明の概要】
【０００４】
リポソームを製造するための方法及び装置を提供する。前記方法の態様は、リポソーム集団を製造するためにリポソームを多孔性の膜に通過させるために十分なやり方でリポソームの懸濁液に遠心力を加えることを含む。本発明の態様は前記方法の実施に役立つ装置、システム及びキットを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】本開示の実施形態によるリポソーム押出装置の例である。
【図１Ｂ】本開示の実施形態によるリポソーム集団を製造するためにリポソーム押出装置を使用する方法の例である。
【図２Ａ】本発明の遠心法によって調製されるリポソームのフローサイトメトリー分析からのデータを提供し、側方散乱（ＳＣＣ）とリポソームサイズとの間の線形相関関係を示す。
【図２Ｂ】本発明の遠心法によって調製されるリポソームのフローサイトメトリー分析からのデータを提供し、フルオレセイン蛍光とリポソームサイズとの間の線形相関関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
リポソーム集団を製造する方法及び装置を提供する。この方法の態様は、リポソーム集団を製造するためにリポソームを多孔性の膜に通過させるために十分なやり方でリポソームの懸濁液に遠心力を加えることを含む。本発明の態様はこの方法の実施に役立つ装置、システム及びキットを更に含む。
【０００７】
本開示の実施形態がより詳細に記載される前に、これらの実施形態が記載した特定の実施形態に限定されない（したがって変化し得る）と理解すべきである。本開示の実施形態の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用する技術用語は特定の実施形態のみを説明する目的であり、限定することを意図するものではないと理解すべきである。
【０００８】
値の範囲が提供される場合、文脈で明らかにそうではないことを記載する場合を除いてその範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその言及した範囲の任意の他の表示値または介在値が本開示の実施形態内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値はより小さい範囲内にそれぞれ独立して含まれてもよく、言及した範囲の具体的に除外された任意の値に従って本開示の実施形態内にも包含される。言及した範囲が上限値及び下限値のうちの１つまたは両方を含む場合、その包含した上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示の実施形態に含まれる。
【０００９】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料も本開示の実施形態を実施または試験するために使用できるが、代表的な例示の方法及び材料を以下に記載する。
【００１０】
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許は、あたかもそれぞれの出版物または特許が具体的及び個々に参照により組み込まれると示されるように、参照により本明細書に組み込まれており、出版物が引用されたことに関連する方法及び／または材料を開示かつ記載するために参照により本明細書に組み込まれるものとする。いかなる出版物の引用も出願日前のその開示のためであり、本開示の実施形態が先行発明であるがゆえに前記出版物に先行する権利を有しない容認として解釈されるべきでない。更に提供される刊行物の日付は実際の出版日とは異なる場合があり、それぞれ確認する必要があり得る。
【００１１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈で明らかにそうではないことを記載する場合を除いて、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことに注意する。特許請求の範囲が任意の要素を除外するように作成されてもよいことに更に注意する。したがって本記述は、特許請求の範囲の要素の詳述に関連した「単に」「のみ」などの排他的な専門用語の使用について、または「否定的な」限定の使用について先行詞としての役目を果たすことを意図する。
【００１２】
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態はそれぞれ、別個の構成要素及び特徴を有しており、別個の構成要素及び特徴は、本開示の実施形態の範囲または趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、またはいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。すべての記載された方法は、記載された事象の順序でまたは論理的に可能な任意の他の順序で実行できる。
【００１３】
以上で要約したように、本開示はリポソーム集団を製造する方法を提供する。本開示の実施形態を更に記載する際、本方法が最初により詳細に記載される。次に本方法の実施に役立つ装置を記載する。更に本装置を含むシステムならびにキットも提供される。
【００１４】
リポソームの製造方法
本開示の態様はリポソーム集団を製造する方法を含む。いくつかの例で、この方法によって製造されるリポソーム集団は規定サイズのリポソーム集団である。リポソームを製造する方法のため、規定サイズとは、集団の種々のリポソームのサイズが公知であること、特に集団のリポソームサイズの範囲が公知であることを意味する。場合によっては、リポソームは実質的に同一の平均サイズを有する。例えば球状リポソームの場合、リポソーム集団は実質的に同一の平均直径を有してよい。「平均」とは算術平均を意味する。実質的に同一である値は、５０％以下（例えば４５％以下、または４０％以下、または３５％以下、または３０％以下、または２５％以下、または２０％以下、または１５％以下、または１０％以下、または５％以下、または３％以下、または１％以下、または０．５％以下）互いとは異なる値を含む。場合によっては、実質的に同一の値は１０％以下互いとは異なる値を含む。場合によっては、実質的に同一の値は５％以下互いとは異なる値を含む。場合によっては、実質的に同一の値は３％以下互いとは異なる値を含む。場合によっては、実質的に同一の値は１％以下互いとは異なる値を含む。場合によっては、実質的に同一の値は０．５％以下互いとは異なる値を含む。いくつかの例で、リポソームの平均サイズは５０％以下（例えば４５％以下、または４０％以下、または３５％以下、または３０％以下、または２５％以下、または２０％以下、または１５％以下、または１０％以下、または５％以下、または３％以下、または１％以下、または０．５％以下）変化してよい。場合によっては、リポソームの平均サイズは１０％以下変化する。場合によっては、リポソームの平均サイズは５％以下変化する。場合によっては、リポソームの平均サイズは３％以下変化する。場合によっては、リポソームの平均サイズは１％以下変化する。場合によっては、リポソームの平均サイズは０．５％以下変化する。
【００１５】
特定の実施形態で、リポソーム集団はリポソームの多分散性によって記載され得る。「分散度」または「多分散性」は、混合物の粒子のサイズの不均一性の程度である。リポソームに関して、多分散性は０〜１の範囲であることができ、そこで０の多分散性はリポソーム（例えば、同じ平均サイズを有するリポソーム）の単分散集団を示し、１の多分散性はリポソームの不均一混合物を示す。場合によっては、リポソームのサイズ（したがって多分散性）は動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定できる。
【００１６】
特定の実施形態で、本開示の方法はリポソーム集団をリポソームの懸濁液（例えばリポソームの水性懸濁液）から製造するために十分である。場合によっては、リポソームの出発懸濁液は不均一なサイズを有するリポソーム集団を含む。したがって本開示の方法は、リポソーム（例えば不均一なサイズを有するリポソーム集団）の懸濁液から出発することと、リポソーム集団をリポソームの出発懸濁液から製造することとを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態で、本方法はリポソーム集団を不均一なリポソーム懸濁液から製造することを含み、そこでリポソーム集団の平均サイズは５０％以下（例えば４５％以下、または４０％以下、または３５％以下、または３０％以下、または２５％以下、または２０％以下、または１５％以下、または１０％以下、または５％以下、または３％以下、または１％以下、または０．５％以下）変化する。場合によっては、本方法はリポソーム集団を不均一なリポソーム懸濁液から製造することを含み、そこでリポソーム集団の平均サイズは１０％以下変化する。場合によっては、本方法はリポソーム集団を不均一なリポソーム懸濁液から製造することを含み、そこでリポソーム集団の平均サイズは５％以下変化する。場合によっては、本方法はリポソーム集団を不均一なリポソーム懸濁液から製造することを含み、そこでリポソーム集団の平均サイズは３％以下変化する。場合によっては、本方法はリポソーム集団を不均一なリポソーム懸濁液から製造することを含み、そこでリポソーム集団の平均サイズは１％以下変化する。場合によっては、本方法はリポソーム集団を不均一なリポソーム懸濁液から製造することを含み、そこでリポソーム集団の平均サイズは０．５％以下変化する。更に他の例で、集団の異なるリポソーム要素の平均サイズは１００％以上を含む５０％以上（例えば７５％以上）変化し得る。
【００１８】
いくつかの例でリポソームの出発懸濁液は、製造したリポソーム集団と比べて高い多分散性を有する。したがって本開示の方法は、リポソームの出発懸濁液の多分散性を下回る多分散性を有するリポソーム集団を製造することにとって有用である。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．９以下（例えば０．８以下、または０．７以下、または０．５以下、または０．４以下、または０．３以下、または０．２以下、または０．１以下、または０．０５以下、または０．０１以下）である。例えば、製造したリポソーム集団の多分散性は０．５以下であり得る。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．４以下であり得る。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．３以下であり得る。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．２以下であり得る。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．１以下であり得る。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．０５以下であり得る。場合によっては、製造したリポソーム集団の多分散性は０．０１以下であり得る。特定の例で、製造したリポソーム集団の多分散性は０．０１〜０．５（例えば０．０１〜０．４、または０．０１〜０．３、または０．０１〜０．２、または０．０１〜０．１）の範囲である。他の実施形態で、製造したリポソーム集団の多分散性は０．０１〜０．５（例えば０．０１〜０．５、または０．０１〜０．４、または０．０１〜０．３、または０．０１〜０．２）の範囲である。他の実施形態で、製造したリポソーム集団の多分散性は０．０１〜０．５（例えば０．０５〜０．５、または０．１〜０．５、または０．１〜０．４、または０．１〜０．３）の範囲である。他の実施形態で、製造したリポソーム集団の多分散性は０．０１〜０．５（例えば０．０５〜０．５、または０．１〜０．５、または０．２〜０．５、または０．２〜０．４）の範囲である。
【００１９】
いくつかの例で、リポソームの出発懸濁液は製造したリポソーム集団より大きいサイズを有するリポソームを含む。いくつかの例で、リポソームの出発懸濁液は５００ｎｍ以上（例えば６００ｎｍ以上、または７００ｎｍ以上、または８００ｎｍ以上、または９００ｎｍ以上、または１０００ｎｍ以上、または１２５０ｎｍ以上、または１５００ｎｍ以上、または１７５０ｎｍ以上、または２０００ｎｍ以上、または２２５０ｎｍ以上、または２５００ｎｍ以上、または２７５０ｎｍ以上、または３０００ｎｍ以上）の平均サイズ（例えば平均直径）を有するリポソームを含み、いくつかの例で、このサイズは３０００ｎｍ以下のものを含む５０００ｎｍ以下（例えば４０００ｎｍ以下）である。例えばリポソームの出発懸濁液は大きな多層小胞（ＬＭＶ）を含んでもよく、多層小胞は２００ｎｍ以上の平均サイズ（２００ｎｍ〜３，０００ｎｍの範囲）を有する。いくつかの例で、リポソームの出発懸濁液は大きな単層小胞（Ｌ∪Ｖ）を含んでもよく、例えば単層小胞は１００ｎｍ以上の平均サイズ（１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲）を有する。
【００２０】
場合によっては、本方法の実施形態はリポソームの出発懸濁液を製造する工程を含んでよい。上述したように、リポソームの懸濁液はリポソームの懸濁液中のリポソームのサイズに関して不均一でもよい。不均一なリポソームの懸濁液は、リポソーム製造のための任意の簡便な方法（例えば、溶媒分散工程（例えばＢａｎｇｈａｍ法（有機溶媒中の脂質の溶解、次いで有機溶媒の除去（例えば有機溶剤の蒸発による）を含む）、界面活性剤除去工程（例えば界面活性剤−脂質ミセルを形成して、続いて界面活性剤を除去してリポソームを形成する）、注入工程（例えば脂質を有機溶媒中に溶解させて、得られた脂質溶液は水性媒体内に注入される）、マイクロ流体工程（例えば有機溶媒中に溶解させた脂質の流れが、マイクロ流体チャネルの２つの水性流れの間を行き来する）、機械的分散工程、超音波処理工程、これらの組み合わせなど））を使用して製造してよいが、これらに限定されない。
【００２１】
本開示の実施形態で有用なリポソームは脂質からなる。特定の実施形態で脂質は両親媒性である。両親媒性脂質は、親水基と、親水基に共有結合した１つ以上の親油基とを含んでよい。場合によっては、親水基は荷電基（例えばアニオン基またはカチオン基）である。いくつかの例で、親水基は無荷電の極性基である。いくつかの実施形態で、親水基は荷電基及び極性基を含む。親水基の例は、ホスフェート、ホスホコリン、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホイノシトール、エチルホスホスホリルコリン、ポリエチレングリコール、ポリグリセリン、スフィンゴシン、ホスホスフィンゴシン、トリニトリロ三酢酸、メラミン、グルコサミン、トリメチルアミン、スペルミン、スペルミジン、及び共役カルボン酸塩、硫酸塩、ホウ酸、スルホン酸塩、硫酸塩、炭水化物、アミノ酸などを含むが、これらに限定されない。場合によっては、親水基はホスホコリンを含む。
【００２２】
特定の実施形態で、親油基は脂肪族鎖（例えば飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖、置換または非置換の脂肪族鎖）を含む。例えば親油基は長さ２〜４０個の炭素原子の脂肪族鎖を含んでもよく、それは飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖、置換または非未置換であり得る。例えば親油基は、２〜４０個の炭素原子（例えば４〜３０個の炭素原子、または４〜２５個の炭素原子、または６〜２４個の炭素原子、または１０〜２０個の炭素原子）を有する飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖、置換または非置換の炭化水素鎖を含んでもよい。特定の場合に親油基は、１８個の炭素原子を有する飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を含む。特定の場合に親油基は、１６個の炭素原子を有する飽和または不飽和、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を含む。
【００２３】
リポソームの実施形態は、検出可能な標識を有するリポソームを含んでもよい。場合によっては、検出可能な標識は安定的に支持体に付随する。「安定的に付随する」とは、標準条件下で、一部分が別の部分または構造に結合するまたはそれに付随することを意味する。結合は共有結合及び非共有結合性相互作用（例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力（例えば、ロンドン分散力）、双極子間相互作用など）を含むことができるが、これらに限定されない。特定の実施形態で、検出可能な標識はリポソームに共有結合する。例えば上述したように、リポソームを含む脂質は親水基を含んでもよく、場合によっては、それは検出可能な標識に共有結合を提供する活性化官能基を含んでもよい。化学合成に有用な任意の便利な活性化官能基は、脂質（例えばアミン、カルボキシル、アミド、ヒドロキシ、アジド、マレイミド、ブロモアセチル、２−ピリジルジチオ、ハロアルキル、アルケンまたはプロパルギルなど）の親水基に共有結合的に検出可能な標識を結合するために使用してよいが、これらに限定されない。
【００２４】
本開示の実施形態によるリポソームは、リポソームと関連したペイロードを含むことができる。本明細書で使用する場合「ペイロード」とは、リポソームの構造内に含有される、脂質粒子の二重層に存在する、またはリポソームの表面に結合される（例えば、共有結合または非共有相互作用によって）構成成分を意味する。したがってペイロードはリポソームに封入される成分（例えば、薬学活性剤、栄養補助剤、薬用化粧剤、造影剤、放射性医薬品、核磁気共鳴造影剤など）を含むことができる。特定の実施形態で封入されるペイロードは溶液中にあり、それは結晶として、粉末としてまたはこれらの組み合わせとして存在し得る。例えば封入したペイロード（例えば封入した薬剤、治療薬、造影剤など）を備えたリポソームを提供することが望ましい実施形態で、このような薬剤はリポソーム内部の水相中に含まれてよい。あるいは薬品が疎水性で、したがって水に溶解しない実施形態で、疎水性薬品は脂質二重層の一部内に含まれることができる。
【００２５】
本方法の実施形態は、リポソーム集団を製造する方法で使用するリポソーム押出装置を準備することも含み得る。通常、本開示の実施形態によるリポソーム押出装置は、多孔性の膜と、液体容器の内部にこの膜を配置するように構成される要素とを含む。リポソーム押出装置の更に詳細な態様は、下記の装置の箇所に記載される。膜を液体容器の内部に配置するように構成される要素は、本明細書で膜要素または膜支持体とも呼ばれてよい。いくつかの例で、膜要素は液体容器の内部で膜を支持する。場合によっては、膜要素は液体容器から取り外し可能である。したがって本方法の実施形態は、膜要素を液体容器に配置することと、そうして膜を液体容器に配置することとを含んでもよい。リポソーム集団を製造するリポソーム押出装置内にリポソームの懸濁液を導入する前に、膜要素は液体容器に配置されてよい。
【００２６】
上述したように本方法の実施形態は、リポソームの懸濁液をリポソーム押出装置内に導入することを含む。リポソームの懸濁液が膜の片面上に配置されるように、リポソームの懸濁液はリポソーム押出装置内に導入されてよい。例えばリポソームの懸濁液は、膜の片面上の室（例えば膜要素により形成される室）内に含まれてもよい。リポソーム集団の製造の間、リポソームの懸濁液は膜の一方から多孔性の膜を通過して膜の反対側に横断してよい。例えばリポソームの懸濁液はリポソーム集団の製造の間、最初に膜の第１面の第１室に含まれ得て、そうして多孔性の膜を横断して、膜の反対側の第２室に含まれ得る。場合によっては、第２室は膜要素を含む液体容器の一部によって形成される。特定の態様でリポソームの懸濁液は、任意の便利な液体運搬技術を使用してリポソーム押出装置内に導入される。例えばリポソーム懸濁液の量を、他の液体運搬装置中の任意の便利な液体運搬装置（例えばシリンジ、針、ピペット、アスピレーター）を使用してリポソーム押出装置に加えてもよいが、これらに限定されない。
【００２７】
本開示の方法は、上述したようにリポソーム集団（例えば規定サイズのリポソーム集団）を製造するために有用である。いくつかの実施形態で、リポソーム集団はリポソームの出発懸濁液の平均サイズに満たない平均サイズを有する。場合によっては製造したリポソーム集団は、１０００ｎｍ以下（例えば９００ｎｍ以下、または８００ｎｍ以下、または７００ｎｍ以下、または６００ｎｍ以下、または５００ｎｍ以下、または４００ｎｍ以下、または３００ｎｍ以下、または２５０ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、または１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下、または７５ｎｍ以下、または５０ｎｍ以下、または２５ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下、または１５ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下、または５ｎｍ以下、または１ｎｍ以下）の平均サイズ（例えば平均直径）を有し、いくつかの例でサイズの平均サイズは１ｎｍ以上（例えば５ｎｍ以上）である。特定の例で、製造したリポソーム集団は１０００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は８００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は５００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は４００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は３００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は２５０ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は２００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は１００ｎｍ以下の平均サイズを有する。特定の例で、製造したリポソーム集団は５０ｎｍ以下の平均サイズを有する。例えば製造したリポソーム集団は小さな単層小胞（Ｓ∪Ｖ）を含んでもよく、例えば単層小胞は１００ｎｍ以下の平均サイズ（１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲）を有する。
【００２８】
リポソーム集団を製造するために、本開示の方法は本明細書に記載されるようにリポソーム押出装置の使用を含む。上述したように特定の実施形態で、リポソーム押出装置の膜は多孔性の膜であり、本方法はリポソームの懸濁液（例えばリポソームの不均一な集団）を多孔性の膜に通してリポソーム集団を製造することを含む。特定の実施形態で、リポソームが膜の片側から膜の反対側に横断するように、リポソームの懸濁液を膜に通すことはリポソームの懸濁液に力を加えることを含む。リポソームが膜を横断する際、リポソームは膜の孔を通過してリポソーム集団を製造する。本方法の実施形態は、多孔性の膜からリポソーム集団を押し出すことを含む。特定の例で、リポソームの出発懸濁液は膜の孔より大きい平均サイズを有する。いくつかの例で、大きなサイズのリポソームを膜の小さな孔に通すことは、膜の孔のサイズとほぼ同じ平均サイズにリポソームをサイズ変更する。したがって特定の場合に、リポソームを膜に通過させることがリポソーム集団を製造する。
【００２９】
いくつかの例でリポソームの懸濁液に力を加えることは、リポソーム集団を製造するためにリポソームを膜に通過させるために十分なやり方でリポソームの懸濁液に遠心力を加えることを含む。例えば、本方法は遠心機の使用を含んでもよく、リポソームの懸濁液は遠心機に配置され、リポソームの懸濁液に遠心力を加えるために十分なやり方で遠心機は作動する。リポソームが上述したように膜の孔を通して押し出されるように、遠心力はリポソームの懸濁液に加えられてもよく、そうして膜からリポソーム集団を押し出す。したがって場合によっては本方法は、遠心機のリポソームの懸濁液を回転させることを含む。リポソームの懸濁液は膜を収容する液体容器に含まれてもよく、したがってリポソームが上述したように膜の孔を通して押し出されるように、本方法は遠心機のリポソームの懸濁液を含む液体容器を回転させることを含んでよい。
【００３０】
特定の実施形態で遠心力をリポソームの懸濁液に加えることは、リポソームを膜の孔に通過させるために十分な遠心力を加えることを含む。場合によっては、加えられる遠心力は標準重力より大きい（例えば２ｇ以上、または５ｇ以上、または１０ｇ以上、または２５ｇ以上、または５０ｇ以上、または１００ｇ以上、または２５０ｇ以上、または５００ｇ以上、または７５０ｇ以上、または１０００ｇ以上、または１５００ｇ以上、または２０００ｇ以上、または２５００ｇ以上、または３０００ｇ以上、または３５００ｇ以上、または４０００ｇ以上、または４５００ｇ以上、または５０００ｇ以上、または５５００ｇ以上、または６０００ｇ以上、または６５００ｇ以上、または７０００ｇ以上、または７５００ｇ以上、または８０００ｇ以上、または８５００ｇ以上、または９０００ｇ以上、または９５００ｇ以上、または１０，０００ｇ以上）。
【００３１】
上述したように場合によっては、遠心力を加えることは遠心機のリポソームの懸濁液を回転させることを含む。したがってこれらの実施形態で、十分な遠心力を加えることは、１０回転／分以上で（例えば５０回転／分以上、または１００回転／分以上、または２５０回転／分以上、または５００回転／分以上、または７５０回転／分以上、または１０００回転／分以上、または１５００回転／分以上、または２０００回転／分以上、または２５００回転／分以上、または３０００回転／分以上、または３５００回転／分以上、または４０００回転／分以上、または４５００回転／分以上、または５０００回転／分以上、または５５００回転／分以上、または６０００回転／分以上、または６５００回転／分以上、または７０００回転／分以上、または７５００回転／分以上、または８０００回転／分以上、または８５００回転／分以上、または９０００回転／分以上、または９５００回転／分以上、または１０，０００回転／分以上）回転することを含み得る。
【００３２】
いくつかの例で、遠心力はある程度の時間加えられる。遠心力を加える時間量は、リポソームの懸濁液が適用した遠心力で膜の孔を通過するために必要な時間以上の時間であり得る。例えば本方法は、１分以上、または２分以上、または３分以上、または４分以上、または５分以上、または６分以上、または７分以上、または８分以上、または１０分以上などの時間、遠心力を加えることを含み得る。場合によっては本方法は、１０分以下、または９分以下、または８分以下、または７分以下、または６分以下、または５分以下、または４分以下、または３分以下、または２分以下、または１分以下などの時間、遠心力を加えることを含み得る。
【００３３】
特定の実施形態で、遠心力はリポソームに多孔性の膜を横断させるために加えられるので、本開示の方法は大気圧で実施してよい。場合によっては、標記方法は大気圧で遠心力を加えることを含む。例えば本開示の方法は、大気圧より高い圧力がリポソームの懸濁液に加えられることを必要としない場合もある。場合によっては本開示の方法を使用して、リポソーム集団は標準大気圧で製造される。したがって標記方法の特定の実施形態は、例えば手動でまたはリポソームの懸濁液に接触するガスまたは液体の圧力を増加させることによってリポソームの懸濁液へ圧力を加えることを含まない。
【００３４】
上述したように標記方法の実施形態は、リポソーム集団を製造するためにリポソームを膜に通過させるために十分なやり方でリポソームの懸濁液に遠心力を加えることを含む。標記方法のいくつかの実施形態は、リポソーム集団を製造するためにリポソームを膜に通過させるために十分なやり方で、リポソームの懸濁液に遠心力を１回加えることを含む。他の実施形態で、遠心力はリポソームの懸濁液に２回以上加えてもよい。例えば本方法は、遠心力をリポソームの懸濁液に加えることを繰り返すことを含み得る。したがって遠心力を加えることは、２回以上繰り返され得る。上述したように遠心力を加えることは、膜の片側から膜の反対側にリポソームの懸濁液の横断をもたらす場合がある。場合によっては最初に遠心力を加えた後、本方法は液体容器から膜要素を取り出すことを含む。液体容器から膜要素を取り出すことは、膜を横断したリポソームの懸濁液へのアクセスを可能にし得る。場合によってはリポソームの懸濁液は液体容器から収集され得て、本方法は１つ以上の追加の回数、収集したリポソームに実施してもよく、例えば本方法は上述したように繰り返すことができる。
【００３５】
特定の実施形態で、本方法は遠心力を加える前にリポソーム押出装置を封止することを含む。リポソーム押出装置を封止することは、遠心力を加えると共に、リポソーム押出装置内部のリポソームの懸濁液の保持を容易にし得る。例えば場合によっては、液体容器は封止体例えばキャップまたは取り外し可能なキャップ）を含む。したがって特定の実施形態で、リポソーム押出装置が封止体（例えば水密及び／または気密シール）を含むように、リポソーム押出装置は封止されたリポソーム押出装置である。これらの例で本方法は、リポソームの懸濁液の量をリポソーム押出装置に導入する前に封止体を除去することを含み得る。リポソーム押出装置の封止体を除去することは、リポソーム押出装置の内容物を周囲環境に曝露し得て、リポソーム押出装置の内部容積へのアクセスを可能にし得る。したがってリポソーム押出装置の内部容積にアクセスするユーザーは、リポソーム集団を製造するためにリポソームの懸濁液の量をリポソーム押出装置内に導入し得る。
【００３６】
特定の実施形態で本方法は、リポソームの懸濁液をリポソーム押出装置に導入した後にリポソーム押出装置の内容物を混合することも含む。混合は、任意の便利なプロトコルを使用して実施してよい。例えば混合は撹拌器を使用して実行してよい。撹拌器は、他の撹拌プロトコル中のボルテキサー、ソニケーター、振とう器（例えば手動、機械式または電動振とう器）、ロッカー、振動プレート、電磁撹拌器、静的ミキサー、回転器、ブレンダー、ミキサー、タンブラー、オービタルシェーカーを含む、液体容器内部の液体を混合するために十分な任意の便利な撹拌器でよいが、これらに限定されない。
【００３７】
場合によっては本方法は、製造したリポソーム集団をアッセイすることも含む。リポソーム集団をアッセイすることは、任意の好適なアッセイ装置を使用して実施してよい。例えばアッセイは、リポソーム集団の平均サイズ、リポソーム集団の多分散性またはこれらの組み合わせを測定するためでもよい。場合によってはアッセイは、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって実施してよい。場合によっては、アッセイ装置はフローサイトメーターでもよい。これらの実施形態で、アッセイすることはフローサイトメトリー的にリポソーム集団を分析することを含む。特定の実施形態でリポソームは蛍光標識を含み、したがってアッセイすることの特定の実施形態は、電磁放射（例えば光）（例えばリポソームの蛍光標識の最大励起に対応する波長を有する電磁放射）とリポソーム集団とを接触させることを含む。アッセイすることは、励起した蛍光標識からの放射光線を検出することを更に含んでよい。例えば本方法は、蛍光標識の最大発光に対応する１つ以上の波長で励起した蛍光標識からの放射光線を検出することを含んでよい。特定の実施形態でリポソーム集団はフローサイトメーターを較正する方法で使用してもよく、例えばリポソーム集団はフローサイトメーターの較正基準として使用してよい。
【００３８】
特定の実施形態で蛍光標識は、例えば最大蛍光発光、蛍光偏光、蛍光寿命、光散乱、質量、分子量またはこれらの組み合わせに基づいて検出する１つ以上の検出可能な部分またはマーカーを含む。特定の実施形態で、蛍光標識は蛍光物質（すなわち蛍光標識、蛍光色素など）を含む。目的の蛍光物質は分析用途（例えばフローサイトメトリー、画像撮影など）での使用に適する色素を含んでもよいが、これらに限定されない。多数の色素（例えば非高分子色素）は、様々な供給元（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）及びＥｘｃｉｔｏｎ（Ｄａｙｔｏｎ、ＯＨ））から市販されている。例えば色素の蛍光物質は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体（例えばアクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アクリジンレッド及びイソチオシアン酸アクリジン）；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ブリリアントイエロー；クマリン及び誘導体（例えばクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（クマラン１５１））；シアニン及び誘導体（例えばシアノシン、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７）；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチルアミノクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体（例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート）；エリスロシン及び誘導体（例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート）；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体（例えば５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン及びＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ））；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）；珊瑚由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）；Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（登録商標）；リッサミンローダミン、ルシファーイエロー；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベ���フェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；ナイルレッド；オレゴングリーン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン（ＰＥ）；ｏ−フタルアルデヒド；ピレン及び誘導体（例えばピレン、ピレンブチレート及びスクシンイミジル１−ピレンブチレート）；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミン及び誘導体（例えば６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミンリッサミン、ローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）のスルホニルクロリド誘導体、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体；キサンテン；カロチノイドタンパク質複合体（例えばペリジニン−クロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ））；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；またはこれらの組み合わせでよい。
【００３９】
本発明の方法で使用され得る試料を分析するための好適なフローサイトメトリーは、Ｏｒｍｅｒｏｄ（ｅｄ．），Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｎｏ．９１，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９５）；Ｖｉｒｇｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊａｎ；４９（ｐｔ１）：１７−２８；Ｌｉｎｄｅｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍ  Ｈｅｍｏｓｔ．２００４Ｏｃｔ；３０（５）：５０２−１１；Ａｌｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，２０１０Ｄｅｃ；２２２（４）：３３５−３４４；及びＨｅｒｂｉｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２４（３）：２０３−２５５を含むがこれらに限定されず、これらの開示は本明細書に参照により組み込まれる。特定の例で、目的のフローサイトメトリーシステムは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）及びＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（登録商標）フローサイトメトリー、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳｏｒｔ（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣｏｕｎｔ（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）、ならびにＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）システム、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｆｌｕｘ（登録商標）セルソーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）フローサイトメーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ−２０フローサイトメーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（登録商標）フローサイトメーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）ＩＩＩ及びＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）Ｆｕｓｉｏｎフローサイトメーター、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＪａｚｚ（登録商標）フローサイトメーターなどを含む。特定の実施形態で、標記システムはフローサイトメトリー（例えば米国特許第３，９６０，４４９号；同第４，３４７，９３５号；同第４，６６７，８３０号；同第５，２４５，３１８号；同第５，４６４，５８１号；同第５，４８３，４６９号；同第５，６０２，０３９号；同第５，６４３，７９６号；同第５，７００，６９２号；同第６，３７２，５０６号及び同第６，８０９，８０４号に記載のもの）であり、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
分析の他の方法（例えば液体クロマトグラフィー質量分析またはガスクロマトグラフィー質量分析システム）も使用してよい。例えばアッセイすることは、分析分離装置（例えば高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、マイクロもしくはナノ液体クロマトグラフまたは超高圧液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）装置を含む液体クロマトグラフ（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）またはキャピラリー電気泳動クロマトグラフ（ＣＥＣ）装置）の使用を含んでよい。質量分析（ＭＳ）システムは、色素組成物を色素組成物をアッセイするためにも使用してよい。質量分析計の例は、例えばエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）もしくは誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）イオン化、またはこれらの任意の組み合わせを含んでよいが、これらに限定されない。同様に、飛行時間形分析器（ＴＯＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共振（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ、四重もしくは二重集束型磁気電気セクター質量分析器、またはその任意の複合型を含む、様々な異なる質量分析計のいずれかを使用してもよい。
【００４１】
特定の実施形態で、本方法はある期間リポソームを保存することも含む。リポソーム集団を製造する前に及び／またはその後に、リポソームをしばらくの間保存してよい。いくつかの例で、リポソームはしばらくの間（例えば１時間以上、または４時間以上、または６時間以上、または１２時間以上、または１８時間以上、または２４時間以上、または４８時間以上、または７２時間以上、または４日間以上、または５日間以上、または６日間以上、または１週間以上）保存される。
【００４２】
本方法の実施形態は、遠隔地にリポソームを輸送することを更に含んでもよい。「遠隔地」とはリポソームを製造する位置以外の位置である。例えば遠隔地は同じ都市の別の位置（例えば事務所、研究室など）、異なる都市の別の位置、異なる州の別の位置、異なる国の別の位置などである可能性がある。したがって１つの品目が別から「離れている」と示されるとき、その意味は２つの品目が同じ部屋にあるが分離されている、または少なくとも異なる部屋もしくは異なる建物にある可能性がある、及び少なくとも１マイル、１０マイルもしくは１００マイル以上離れている可能性があるということである。
【００４３】
リポソーム押出装置
本開示の態様はリポソーム押出装置を含む。本開示のリポソーム押出装置は、リポソーム集団の製造のために有用である。本開示の特定の実施形態によるリポソーム押出装置は、多孔性の膜と、液体容器の内部にこの膜を配置するように構成される要素とを含む。リポソーム押出装置の要素のそれぞれの更なる態様は、以下で更に詳細に記載される。
【００４４】
上述したように、リポソーム押出装置は多孔性の膜を含む。多孔性の膜は、膜に複数の孔を含む膜である。孔は、規定の孔サイズを有する孔でよい。孔のサイズは、孔の開口部の寸法として（例えば孔の開口部の最大寸法として）測定され得る。例えば場合によっては、孔は実質的に円形断面を有する膜の開口部である。したがってこれらの場合、孔サイズは孔の直径として測定できる。例えば膜の孔は、１０００ｎｍ以下（例えば９００ｎｍ以下、または８００ｎｍ以下、または７００ｎｍ以下、または６００ｎｍ以下、または５００ｎｍ以下、または４００ｎｍ以下、または３００ｎｍ以下、または２５０ｎｍ以下、または２００ｎｍ以下、または１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下、または７５ｎｍ以下、または５０ｎｍ以下、または２５ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下、または１５ｎｍ以下、または１０ｎｍ以下、または５ｎｍ以下、または１ｎｍ以下）の孔サイズ（例えば平均孔サイズ）を有してよい。特定の例で、膜の孔は１０００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は８００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は５００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は４００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は３００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は２５０ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は２００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は１００ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。特定の例で、膜の孔は５０ｎｍ以下の平均孔サイズを有する。いくつかの実施形態では、膜の孔は実質的に同じサイズである。換言すると、膜の孔はサイズが均一であり得る。均一にサイズ設定された孔を含む多孔性の膜は、リポソーム集団の製造を促進し得る。
【００４５】
特定の実施形態で、膜の孔は非蛇行性経路で膜を貫通する。例えば多孔性の膜は、膜表面と実質的に垂直な長手方向軸を有する孔を含んでもよい。場合によっては多孔性の膜は、膜表面に対して９０度未満の角度で長手方向軸を有する孔を含んでもよい。特定の例で、多孔性の膜はウェブ状またはマトリックス構造を含まず、孔のネットワークは相互連結し、したがって膜を通過して蛇行経路を形成する。換言すると、多孔性の膜は膜の他の孔を横断せずに膜を通過する異なる孔を含んでよい。
【００４６】
特定の実施形態で、多孔性の膜は膜材料の１つ以上の層からなる。例えば、膜は膜材料の単層からなり得る。他の実施形態で、膜は膜材料の２つ以上の層からなる。例えば、膜は２層の膜材料（例えば３層以上、または４層以上、または５層以上、または６層以上、または７層以上、または８枚の層以上、または９層以上、または１０層以上の膜材料）を含んでもよい。場合によっては、膜は２層の膜材料を含む。場合によっては、膜は３層の膜材料を含む。２層以上の膜材料を含む実施形態にて、各層の膜材料は同じでも異なっていてもよい。特定の実施形態で、２層以上の膜材料のそれぞれの孔径は同じである。他の実施形態で、２層以上の膜材料の少なくとも２つの孔径は異なる。
【００４７】
膜は、任意の好適な膜材料からなり得る。場合によっては、膜材料は膜と接触する液体及び／またはリポソームと相溶性がある。例えば、膜材料は液体相溶性の膜材料（例えば親水性膜材料）であることができる。場合によってはリポソームは水性液体中にあってもよく、この場合、膜材料は水性媒体と相溶性でもよい。「相溶性」とは、膜材料が、膜と接触する液体及び／またはリポソームまたは他の成分が実質的に不活性（例えば著しい反応をしなかった）であることを意味する。適切な膜材料の例は、ポリマー材料（例えばポリマー（例えばこれらに限定されないがポリカーボネート、ポリエステル、ナイロン、セルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレートなど））を含む。いくつかの例で、膜材料はポリカーボネートである。いくつかの例で、膜材料はポリエステルである。
【００４８】
標記リポソーム押出装置の実施形態は、液体容器の内部に膜を配置するように構成される要素も含む。膜を液体容器の内部に配置するように構成される要素は、本明細書で膜要素または膜支持体とも呼ばれてよい。いくつかの例で、膜要素は液体容器の内部で膜を支持する。更に膜要素は、液体（例えばリポソームの懸濁液）の量を含有するように構成され得る。例えば膜要素は、第１端と、第１端の反対側の第２端とを含んでもよい。いくつかの実施形態で、第１端は開口部を含む。いくつかの例で、例えば膜要素の内容物が周囲環境と同じ大気圧の下にあるように、膜要素の開口部は膜要素の内部を周囲環境に曝露する。例えば開口部は、リポソームの懸濁液（例えば不均一なリポソームの懸濁液）を膜要素内に導入するために使用してよい。いくつかの実施形態では、膜要素の第２端は膜（例えば本明細書に記載されている多孔性の膜）を含む。膜要素は１つ以上の側壁を更に含んでもよく、それは膜要素の第１端の開口部と膜要素の対向する第２端の膜との間に膜要素の側部を形成する。いくつかの例で、膜と膜要素の側壁との間に間隙が存在せず、その結果、膜は膜要素の側壁（複数可）に対して液密の封止を形成する。したがって膜を横断する液体及び／またはリポソームは、膜の孔を通過し得るだけである。特定の実施形態で、膜要素は円筒形状であり、円筒は円筒の第１端の開口部と第２の反対端の膜とを有する。場合によっては、膜要素は円形断面を有する。
【００４９】
上述したように、膜要素は容器として構成されてもよく、この容器は流体（例えばガスまたは液体）の特定の量を保持するように構成される。特定の実施形態で、膜要素は液体容器として構成される。例えば膜要素は、液体（例えばリポソームの懸濁液）の量を保持するように構成され得る。膜要素の大きさは、膜要素に保持される液体の容積に依存し得る。例えば膜要素は、０．１ｍｌ〜１０００ｍｌ（例えば０．１ｍｌ〜９００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜８００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜７００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜６００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜４００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜３００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５０ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１０ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１．５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１ｍｌ、または０．１ｍｌ〜０．５ｍｌ）の範囲の量（例えば液体の量）を保持するように構成されてよい。特定の例で、膜要素は０．１ｍｌ〜５ｍｌの範囲の量（例えば０．５ｍｌ、または１ｍｌ、または１．５ｍｌ、または２ｍｌ）を保持するように構成される。他の例で、膜要素は０．１ｍｌ〜１００ｍｌの範囲の量（例えば５０ｍｌ、または２５ｍｌ）を保持するように構成される。
【００５０】
特定の実施形態で、膜要素は０．５ｃｍ〜５ｃｍ（例えば０．５ｃｍ〜４．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜４ｃｍ、または０．５ｃｍ〜３．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜３ｃｍ、または０．５ｃｍ〜２．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜２ｃｍ、または０．５ｃｍ〜１．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜１ｃｍ）の範囲の幅（円筒状膜要素の直径とも呼ばれてよい）を有する。いくつかの例で、膜要素は０．５ｃｍ〜２．５ｃｍの範囲の幅（または直径）を有する。いくつかの例で、膜要素は０．５ｃｍ〜１ｃｍの範囲の幅（または直径）を有する。特定の実施形態で、膜要素は１ｃｍ〜２０ｃｍ（例えば１ｃｍ〜１５ｃｍ、または１ｃｍ〜１０ｃｍ、または１ｃｍ〜５ｃｍ、または１ｃｍ〜２．５ｃｍ）の範囲の長さを有する。いくつかの例で、膜要素は１ｃｍ〜１０ｃｍの範囲の長さを有する。いくつかの例で、膜要素は１ｃｍ〜５ｃｍの範囲の長さを有する。いくつかの例で、膜要素は１ｃｍ〜２．５ｃｍの範囲の長さを有する。
【００５１】
膜要素の実施形態は、膜要素と接触し得る液体及び／またはリポソームまたは他の要素と適合性であることができる。リポソーム押出装置のための好適な膜要素材料の例は、プラスチック（例えばポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロエーテル（ＰＦＥ）、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）など）を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
場合によっては、膜要素は液体容器の内部に膜を配置するように構成される。上述したように、膜要素は膜要素の１つの端で多孔性の膜を含んでもよい。したがって膜要素の膜が液体容器の内部に配置されるように、少なくとも一部の膜要素は液体容器の内部に配置されてもよい。場合によっては膜要素の少なくとも一部は、液体容器の内側寸法（例えば内径）より小さい外側寸法（例えば外径）を有する。換言すると、膜要素の少なくとも一部（例えば膜を有する膜要素の端）は、液体容器の内部に収まるようにサイズ設定される。特定の例で、液体容器は円形断面を有する。これらの例で、膜要素は液体容器の内部と同心の円筒を含んでもよい。
【００５３】
上述したように特定の実施形態で、膜要素は液体容器の内部に膜を配置するように構成される。したがっていくつかの例で、リポソーム押出装置は液体容器を含む。この液体容器の実施形態は、液体（例えばリポソームの懸濁液及び／またはリポソーム集団）の量を含有するように構成され得る。いくつかの例で、液体容器は第１端と、第１端の反対側の第２端とを含む。いくつかの実施形態で、第１端は開口部を含む。これらの例で、例えば液体容器の内容物が周囲環境と同じ大気圧の下にあるように、液体容器の開口部は液体容器の内部を周囲環境に曝露する。例えば開口部は、リポソーム集団の製造で液体容器に膜要素を配置することのために使用してよい。場合によっては、膜要素の少なくとも一部（例えば膜を有する膜要素の端）は、液体容器の開口部を通って液体容器内に挿入される。特定の例で膜要素は液体容器から取り出し可能であり、その結果、リポソームを膜に通すために十分なやり方で遠心力を加えた後、膜要素は液体容器から取り出され得る。これらの例で、取り外し可能な膜要素は膜を通過したリポソームへのアクセスを可能にする。これらのリポソームは上述したように収集して、分析されるまたは再遠心分離され得る。
【００５４】
いくつかの例で、液体容器は液体容器の開口端とは反対側の閉鎖端を含む。したがってこの液体容器は、上述したように液体の量を含有するように構成され得る。液体容器の大きさは、液体容器に保持される液体の容積に依存し得る。例えば液体容器は、０．１ｍｌ〜１０００ｍｌ（例えば０．１ｍｌ〜９００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜８００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜７００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜６００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜４００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜３００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５０ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１０ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１．５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１ｍｌ、または０．１ｍｌ〜０．５ｍｌ）の範囲の量（例えば液体の量）を保持するように構成されてよい。特定の例で、液体容器は０．１ｍｌ〜５ｍｌの範囲の量（例えば０．５ｍｌ、または１ｍｌ、または１．５ｍｌ、または２ｍｌ）を保持するように構成される。他の例で、液体容器は０．１ｍｌ〜１００ｍｌの範囲の量（例えば５０ｍｌ、または２５ｍｌ）を保持するように構成される。
【００５５】
液体容器は１つ以上の側壁を更に含んでもよく、それは液体容器の第１端の開口部と液体容器の液体容器の閉じた第２端との間に膜要素の側部を形成する。特定の実施形態で、液体容器は円筒形状であり、円筒は円筒の第１端の開口部と閉じた第２の反対端とを有する。場合によっては、液体容器は円形断面を有する。液体容器の形状は変化してよく、リポソーム押出装置の使用に依存し得る。例えば液体容器を、本開示の方法と適合する形状に構成し得る。例えば液体容器を、本方法を実施するために使用する典型的な研究室装置と適合する形状（例えば遠心分離機と適合する形状）に構成し得る。上述したように液体容器は、液体の量を保持するように構成され得る。これらの実施形態で、液体容器はバイアルまたは試験管でよい。特定の場合に、液体容器はバイアルである。特定の場合に、液体容器は試験管である。好適な液体容器の実施形態は、遠心管、マイクロ遠心管、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）管などを含むが、これらに限定されない。
【００５６】
特定の実施形態で、液体容器は０．５ｃｍ〜５ｃｍ（例えば０．５ｃｍ〜４．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜４ｃｍ、または０．５ｃｍ〜３．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜３ｃｍ、または０．５ｃｍ〜２．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜２ｃｍ、または０．５ｃｍ〜１．５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜１ｃｍ）の範囲の幅（円筒状液体容器の直径とも呼ばれてよい）を有する。いくつかの例で、液体容器は０．５ｃｍ〜２．５ｃｍの範囲の幅（または直径）を有する。いくつかの例で、液体容器は０．５ｃｍ〜１ｃｍの範囲の幅（または直径）を有する。特定の実施形態で、液体容器は１ｃｍ〜２０ｃｍ（例えば１ｃｍ〜１５ｃｍ、または１ｃｍ〜１０ｃｍ、または１ｃｍ〜５ｃｍ、または１ｃｍ〜２．５ｃｍ）の範囲の長さを有する。いくつかの例で、液体容器は１ｃｍ〜１０ｃｍの範囲の長さを有する。いくつかの例で、液体容器は１ｃｍ〜５ｃｍの範囲の長さを有する。いくつかの例で、液体容器は１ｃｍ〜２．５ｃｍの範囲の長さを有する。
【００５７】
液体容器の実施形態は、液体容器と接触し得る液体及び／またはリポソームまたは他の成分と適合性であることができる。リポソーム押出装置のための好適な液体容器の材料の例は、プラスチック（例えばポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、パーフルオロエーテル（ＰＦＥ）、フッ化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、パーフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）など）を含むが、これらに限定されない。
【００５８】
上述したように、膜要素（例えば膜を有する膜要素の端）が液体容器に挿入されるとき、膜要素は膜を液体容器の内部に配置するように構成され得る。場合によっては、膜要素は膜を液体容器の内部に支持する。膜を有する膜要素の端が液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置されるように、膜要素は液体容器の内部の膜を支持し得る。これらの例で、リポソーム押出装置は２つの室に分けられ得る。第１室は、膜要素の内部容積によって形成され得る。更に膜要素が液体容器の閉鎖端から離れた距離で膜を支持するので、膜要素の膜と液体容器の閉鎖端との間の間隙の容積は第２室を形成し得る。これらの実施形態で、リポソーム押出装置の使用中、リポソームの懸濁液（例えばリポソームの不均一な懸濁液）は膜要素の内部容積内に導入され得る。次に遠心力をリポソームの懸濁液に加えることは、膜を通過させて、膜要素の膜と液体容器の閉鎖端との間の間隙の容積（例えばリポソーム押出装置の第２室）へリポソームを押し込み得る。
【００５９】
特定の実施形態で、膜を有する膜要素の端と液体容器の閉鎖端との間の液体容器の容積は、膜要素の容積以上である。これらの例で、リポソームの第２室の容積以上であることによって、膜要素中のリポソームの懸濁液の容積全体が膜を通過してリポソーム押出装置の第２室内に入ることが可能になる。特定の実施形態で、膜要素が液体容器内に挿入されるとき、膜と液体容器の閉鎖端との間の距離は０．５ｃｍ〜１０ｃｍ（例えば０．５ｃｍ〜７ｃｍ、または０．５ｃｍ〜５ｃｍ、または０．５ｃｍ〜３ｃｍ、または０．５ｃｍ〜１ｃｍ）の範囲である。いくつかの例で、膜と液体容器の閉鎖端との間の距離は０．５ｃｍ〜１０ｃｍの範囲である。いくつかの例で、膜と液体容器の閉鎖端との間の距離は０．５ｃｍ〜５ｃｍの範囲である。いくつかの例で、膜と液体容器の閉鎖端との間の距離は０．５ｃｍ〜１ｃｍの範囲である。いくつかの例で、膜要素が液体容器内に挿入されるとき、膜と液体容器の閉鎖端との間の容積は０．１ｍｌ〜５００ｍｌ（例えば０．１ｍｌ〜４００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜３００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１００ｍｌ、または０．１ｍｌ〜７５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５０ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１０ｍｌ、または０．１ｍｌ〜５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２．５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜２ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１．５ｍｌ、または０．１ｍｌ〜１ｍｌ、または０．１ｍｌ〜０．５ｍｌ）の範囲である。特定の例で、膜と液体容器の閉鎖端との間の容積は０．１ｍｌ〜５ｍｌの範囲（例えば０．５ｍｌ、または１ｍｌ、または１．５ｍｌ、または２ｍｌ）である。他の例では、膜と液体容器の閉鎖端との間の容積は０．１ｍｌ〜５０ｍｌの範囲（例えば２５ｍｌ、または１０ｍｌ）である。
【００６０】
いくつかの実施形態で、上述したように、液体容器は容器として構成され、この容器は流体の特定の量を保持するように構成される。いくつかの実施形態で、液体容器は封止されてもよい。すなわち液体容器は、液体容器の内容物（例えば液体容器内部の液体）が液体容器から出ることを実質的に防ぐ封止体を含んでもよい。液体容器の封止体は、他の物質が液体容器に入ることも実質的に防ぎ得る。例えば封止体は、液体が液体容器に入ることもしくは出ることを実質的に防ぐ水密封止体でもよく、またはガスが液体容器に入ることもしくは出ることを実質的に防ぐ気密封止体でもよい。いくつかの例で封止体は取り外し可能または壊れやすい封止体であり、その結果、液体容器の内容物の一部を取り出すことが望ましい場合（例えばそれを希望する場合）には液体容器の内容物を周囲環境に曝露してよい。いくつかの例で封止体は弾性材料から作成されており、液体容器内部に液体容器の内容物を保持するためのバリア（例えば水密及び／または気密封止）を提供する。特定の種類の封止体は、容器の種類に応じてフィルム（例えばポリマーフィルム、キャップなど）を含むが、これに限定されない。封止体のための好適な材料は、例えばゴムまたはポリマー封止（例えばこれらに限定されないが、シリコーンゴム、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム、エチレン−プロピレンコポリマー、ポリクロロプレン、ポリアクリレート、ポリブタジエン、ポリウレタン、スチレンブタジエンなど及びこれらの組み合わせ）を含む。例えば特定の実施形態で封止体は、針、シリンジまたはカニューレによって貫通可能なセプタムである。封止体は、容器中の試料及び容器の開口部の上にある保護バリアへの便利なアクセスも提供し得る。いくつかの例で、封止体は着脱可能な封止体（例えば液体容器の開口部に適用できるねじ付きもしくはスナップ式キャップ、または他の適切な封止要素）である。例えばリポソームの懸濁液が容器に添加される前にまたはその後に、ねじ付きキャップは開口部上に螺入されることができる。場合によって封止体は、リポソームの懸濁液が容器に添加される前にまたはその後に開けることができる取り外し可能なキャップ（例えばスナップ式キャップ）である。いくつかの実施形態で、封止体は液体容器に取り付けられる。いくつかの例で、封止体は液体容器の開口端に密閉部を提供するように構成される。いくつかの例で、封止体は膜要素の開口端に密閉部を提供するように構成される。換言すると、液体容器の開口部及び膜要素の開口部の両方は、同じ種類の封止体と共に作動するように構成され得る。これらの実施形態で、膜要素が液体容器内に挿入されるとき、同じ封止体を液体容器または膜要素の密閉部として使用してよい。
【００６１】
リポソーム押出装置の特定の実施形態は、本明細書に記載されているようにポリカーボネート材料の１つ以上の層を含む多孔性の膜を含む。リポソーム押出装置は、液体容器の内部に膜を配置するように構成される要素も含み得る。膜要素は、開口部を備える第１端と、第１端の反対側の第２端とを有してよい。膜要素の第２端は多孔性の膜を含んでよい。
【００６２】
本開示の実施形態によるリポソーム押出装置の例を図１Ａに示す。図１Ａで、リポソーム押出装置はバイアルとして構成される。リポソーム押出装置は、液体容器４０に取り付けたキャップ５０を備えるバイアル（例えばエッペンドルフ管）の形状の液体容器４０を含む。リポソーム押出装置は、第１端３０（それは開口部を有する）を有する膜要素１０も含む。膜要素の開口した第１端３０は、膜要素の内部容積を周囲環境に曝露する。例えば膜要素内部の圧力は、周囲の大気圧と同じでもよい。膜要素１０は、開口した第１端３０の反対側の膜要素１０の第２端の多孔性の膜２０も含む。図１Ａに示すように、使用中、膜２０を有する膜要素１０の第２端は液体容器４０の内部に配置され得る。膜要素１０は液体容器の底部から離れた距離で膜２０を支持するように構成され、そうして膜２０と液体容器４０の底部との間の間隙の容積を形成する。本明細書に記載されるように、膜２０は膜材料の１つ以上の層からなる。
【００６３】
膜要素１０が液体容器４０に配置された後で、図１Ｂに示すように、リポソームの懸濁液６０（例えばリポソームの不均一な懸濁液）は膜要素１０内に導入されることができる。キャップ５０は閉じられてもよく（図示せず）、そうしてリポソーム押出装置は遠心機に置かれてよい。リポソームが多孔性の膜２０を通過して、膜２０と液体容器４０の底部との間の間隙の容積内に入るように、遠心機はリポソームの懸濁液に遠心力を加えるために作動し得る。本明細書に記載のように、膜の孔によるリポソームの押し出しはリポソーム集団７０を製造し得る。
【００６４】
システム
本開示のシステムは、本明細書に記載されるようにリポソーム押出装置を含む。例えばリポソーム押出装置は、本明細書に記載されているようにポリカーボネート材料の１つ以上の層を含む多孔性の膜を含んでよい。リポソーム押出装置は、液体容器の内部に膜を配置するように構成される要素も含み得る。膜要素は、開口部を備える第１端と、第１端の反対側の第２端とを有してよい。膜要素の第２端は多孔性の膜を含んでよい。更に本開示のシステムは、本明細書に記載されるように液体容器（例えば遠心管）も含んでよい。
【００６５】
特定の実施形態で、リポソーム押出装置はリポソームの懸濁液を含む。例えば、リポソーム押出装置の使用中、不均一なリポソームの懸濁液は膜要素内に導入され得る。本明細書に記載されるように、リポソームが多孔性の膜を通過してリポソーム集団を製造するように、次いで遠心力はリポソームの懸濁液に加えられてもよい。したがって本開示のシステムの特定の実施形態は、遠心機も含んでよい。このシステムの使用に好適な遠心機は、様々な種類の遠心機のいずれかを含む。例えば好適な遠心機は、リポソームの懸濁液に遠心力を加えるように構成される遠心機を含んでもよく、それはリポソームを膜の孔に通過させるために十分な遠心力を加えるように構成される遠心機を含み得る。場合によっては遠心機は、標準重力より大きい（例えば２ｇ以上、または５ｇ以上、または１０ｇ以上、または２５ｇ以上、または５０ｇ以上、または１００ｇ以上、または２５０ｇ以上、または５００ｇ以上、または７５０ｇ以上、または１０００ｇ以上、または１５００ｇ以上、または２０００ｇ以上、または２５００ｇ以上、または３０００ｇ以上、または３５００ｇ以上、または４０００ｇ以上、または４５００ｇ以上、または５０００ｇ以上、または５５００ｇ以上、または６０００ｇ以上、または６５００ｇ以上、または７０００ｇ以上、または７５００ｇ以上、または８０００ｇ以上、または８５００ｇ以上、または９０００ｇ以上、または９５００ｇ以上、または１０，０００ｇ以上、または１５，０００ｇ以上、または２０，０００ｇ以上、または２５，０００ｇ以上）遠心力を適用するように構成され、いくつかの例で遠心力は３０，０００ｇ以下（例えば２７，５００ｇ以下）である。場合によっては遠心機は、１０回転／分以上で（例えば５０回転／分以上、または１００回転／分以上、または２５０回転／分以上、または５００回転／分以上、または７５０回転／分以上、または１０００回転／分以上、または１５００回転／分以上、または２０００回転／分以上、または２５００回転／分以上、または３０００回転／分以上、または３５００回転／分以上、または４０００回転／分以上、または４５００回転／分以上、または５０００回転／分以上、または５５００回転／分以上、または６０００回転／分以上、または６５００回転／分以上、または７０００回転／分以上、または７５００回転／分以上、または８０００回転／分以上、または８５００回転／分以上、または９０００回転／分以上、または９５００回転／分以上、または１０，０００回転／分以上）回転することによって遠心力を加えるように構成される。
【００６６】
キット
本開示の態様は、このリポソーム押出装置を含むキットも含む。特定の実施形態で、キットはこのリポソーム押出装置と、リポソーム押出装置を保持するように構成される包装とを含む。包装は、密封包装（例えば所望により気密及び／または真空封入下の耐水及び／または耐水蒸気容器）でもよい。特定の例で包装は滅菌包装であり、無菌環境の包装に同梱される装置を維持するように構成される。「滅菌」とは、微生物（例えば菌類、細菌、ウイルス、胞子形態など）が実質的にはないことを意味する。いくつかの例で、キットは本明細書に記載されるように液体容器（例えば遠心管）も含んでよい。
【００６７】
このキットは液体を更に含んでもよい。例えばキットは、緩衝液（例えば試料緩衝液、洗浄緩衝液、アッセイ緩衝液など）を含んでよい。場合によっては、キットはリポソームの懸濁液に好適な液体を含んでよい。キットは、追加の試薬（例えば検出可能な標識（例えば蛍光標識、比色標識、化学発光標識、多色試薬、アビジン−ストレプトアビジン関連検出試薬、放射線標識、金粒子、磁気標識など）など）を更に含んでよいが、これらに限定されない。
【００６８】
特定の実施形態で、キットは較正標準も含み得る。例えばキットは、一組の標識ビーズ（例えば一組の標準蛍光標識ビーズ）を含んでもよい。較正標準は、アッセイ装置の精度を決定するため、及び次のアッセイの間の整合性を確実にするために有用であり得る。例えば較正標準は、フローサイトメーターの精度を決定するために有用であり得る。場合によっては、較正標準は標識ビーズ（例えば蛍光標識ビーズ）を含む。蛍光標識ビーズは、較正標準として通常使用する標準蛍光標識ビーズでもよい。標準蛍光標識ビーズの例は、蛍光標識マイクロ粒子またはナノ粒子を含むがこれらに限定されない。場合によっては、それらが分析混合物中に懸濁したままで、実質的に沈殿しないまたは凝集しないように、蛍光標識ビーズは構成される。いくつかの実施形態で蛍光標識ビーズは、蛍光標識ポリスチレンビーズ、フルオレセインビーズ、ローダミンビーズ及び蛍光色素で標識した他のビーズを含むが、これらに限定されない。蛍光標識ビーズの追加の例は米国特許第６，３５０，６１９号、同第７，７３８，０９４号及び同第８，２４８，５９７号に記載されており、そのそれぞれの開示は参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
【００６９】
上述した構成要素に加えて、このキットはこの方法を実施するための使用説明書を更に含んでもよい。これらの使用説明書は様々な形態でこのキット中に存在してよく、そのうちの１つ以上が本キット中に存在し得る。これらの使用説明書の存在し得る１つの形態は、キットのパッケージ中、添付文書中などにて適した媒体または基材に関する印刷された情報（例えば情報が印刷された紙片（複数可））としてある。別の手段は、コンピュータ可読媒体（例えばＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイ、コンピュータ読取可能メモリ（例えばフラッシュメモリ）など）であり、そこに情報が記録または保存されている。存在し得る更に別の形態は、離れた場所で情報にアクセスするためのインターネットを経由して使用され得るウェブサイトアドレスである。使用説明書の任意の便利な形態が、キット中に存在してもよい。
【００７０】
有用性
この方法、装置及びシステムは、規定サイズのリポソーム集団は研究または実験室内試験が望ましい場合がある用途を見出す。いくつかの実施形態でこの標記方法、装置及びシステムは、生体試料（例えば器官、組織、組織片、流体）から得た分析物（例えば細胞）の正確な分析を容易にする。特定の例で、この方法、装置及びシステムは、研究または実験室内試験のためにこのような分析物の分析で使用する装置の精度を試験する用途を見い出す。例えばこの方法、装置及びシステムは、フローサイトメーターの精度を試験する用途を見い出す。場合によっては、本開示の方法、装置及びシステムを使用して製造したリポソーム集団を、装置（例えばフローサイトメーター）の較正基準として使用する。したがってこの方法、装置及びシステムは、不均一なリポソームの懸濁液からリポソーム集団の効率的な調製の用途を見い出す。更にこの方法、装置及びシステムは、専門のリポソーム押出システム（例えばリポソームの懸濁液へ増加した圧力を加えて、押出膜を通過させてリポソームを押し込むためのシリンジまたはガス／液体処理要素）を必要とせずに、リポソーム集団の調製の用途を見い出す。いくつかの例でこの方法、装置及びシステムは、標準大気圧にて標準実験室装置を使用したリポソーム集団の製造に用途を見い出す。換言するとこの方法、装置及びシステムは、リポソームの懸濁液への増加した圧力を適用せずに、リポソーム集団の製造での用途を見い出す。
【００７１】
上述した本開示から明らかなように、本開示の実施形態は多種多様な用途を有する。したがって本明細書に示す図面は例示目的のために提供されており、いかなる場合であっても本開示の実施形態を制限するものとして解釈されることを意図していない。当業者であれば本質的に同様の結果を得るための変更または修正できる様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するであろう。したがって以下の実施例は、当業者に本開示の実施形態をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示され、本発明者が自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験がすべてまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確さを確実にする努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差を考慮すべきである。特に指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧またはそれに近い。
【実施例】
【００７２】
実施例１
実験は、本開示の実施形態に従ってリポソーム集団を製造するために実施した。
【００７３】
乾燥脂質混合物を、不活性ガスの流れの下で凍結乾燥または乾燥によって調製し、続いて真空で乾燥した。乾燥脂質を３０〜６０分間、水溶液（例えば緩衝生理食塩溶液）によって水和した。高い相転移温度を有する脂質において、乾燥脂質に加える前に水溶液を予熱した。所望する場合、水和した脂質懸濁液に、１つ以上の凍結／解凍サイクル（例えば３〜５つの凍結／解凍サイクル）を行うことができる。
【００７４】
膜要素は遠心管内に置かれた。高い相転移温度を有する脂質において、膜要素は予熱された。乾燥脂質を水溶液で水和した後、水性懸濁液の試料を膜要素内に入れた。試料を遠心分離した。遠心分離の時間及び速度（毎分回転数）は使用する膜の種類に応じて変化した。遠心分離を、必要に応じて繰り返した。
【００７５】
リポソーム集団を、上述した手順に従って５４ｍｏｌ％の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、４５ｍｏｌ％のコレステロール及び１ｍｏｌ％のＮ−（フルオレセイン−５−チオカルバモイル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、トリエチルアミニウム塩（ＤＨＰＥ−Ｆ）からなる大きな多層小胞（ＬＭＶ）を使用して調製した。
【００７６】
孔径２００ｎｍを有する１つのポリカーボネート膜を含む本開示によるリポソーム押出装置で、ＬＭＶを３回遠心分離する実験を実施した。動的光散乱法（ＤＬＳ）により決定される製造したリポソーム集団のサイズは２２３．６±０．６ｎｍだった。
【００７７】
それぞれが孔径２００ｎｍを有する３つのポリカーボネート膜を含む本開示によるリポソーム押出装置で、ＬＭＶを１回遠心分離する実験を実施した。ＤＬＳにより決定される製造したリポソーム集団のサイズは２１０．０±８．２ｎｍだった。
【００７８】
それぞれが孔径４００ｎｍを有する２つのポリカーボネート膜を含む本開示によるリポソーム押出装置で、ＬＭＶを１回遠心分離する実験を実施した。ＤＬＳにより決定される製造したリポソーム集団のサイズは３１５．６±９．１ｎｍだった。
【００７９】
実施例２
リポソームの４つの集団は、上述した手順に従って２００、４００、８００または１，０００ｎｍの孔径を備えたポリカーボネート膜と、４２ｍｏｌ％の１−パルミトイル−２−ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＭＰＣ）、３０ｍｏｌ％のコレステロール、１４ｍｏｌ％の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、１３ｍｏｌ％の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１ｍｏｌ％のＮ−（フルオレセイン−５−チオカルバモイル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＨＰＥ−Ｆ）からなるＬＭＶとを使用して調製した。リポソームのサイズは、ＤＬＳを使用して分析かつサイズ設定した。調製したリポソームのナノ粒子の側方散乱（ＳＳＣ）及びフルオレセイン蛍光を分析するために、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを利用した。結果は、ＳＳＣ（図２Ａ）またはフルオレセイン蛍光（図２Ｂ）とリポソームのサイズとの間の異なる線形相関を示す。
【００８０】
実施形態
一実施形態で、本開示はリポソーム集団の製造ための方法を提供する。本方法は、リポソームの懸濁液をリポソーム押出装置内に導入することを含む。リポソーム押出装置は、多孔性の膜と、液体容器の内部に膜を配置するように構成される要素とを含む。本方法は、リポソーム集団を製造するためにリポソームを膜に通過させるために十分なやり方でリポソームの懸濁液に遠心力を加えることも含む。
【００８１】
いくつかの実施形態で、本方法はリポソームの懸濁液をリポソーム押出装置内に導入する前に、要素を液体容器に配置することを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態で、液体容器は遠心管である。
【００８３】
いくつかの実施形態で、要素は液体容器の内部と同心の円筒を含んでもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態で、膜要素は、開口部を有する第１端と、膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む。いくつかの実施形態で、要素の第２端は液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置される。いくつかの実施形態で、要素の第２端と液体容器の閉鎖端との間の液体容器の容積は、要素の内部容積以上である。
【００８５】
いくつかの実施形態で、膜は１０００ｎｍ以下の孔径を有する。いくつかの実施形態で、膜は５００ｎｍ以下の孔径を有する。いくつかの実施形態で、膜は２５０ｎｍ以下の孔径を有する。
【００８６】
いくつかの実施形態で、膜は膜材料の１つ以上の層を含む。いくつかの実施形態で、膜材料はポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーはポリカーボネートを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態で、膜は膜材料の２つ以上の層を含む。いくつかの実施形態で、２層以上の膜材料のそれぞれの孔径は同じである。いくつかの実施形態で、２層以上の膜材料の少なくとも２つの孔径は異なる。
【００８８】
いくつかの実施形態で、液体容器は封止体を含む。いくつかの実施形態で、封止体は取り外し可能なキャップを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態で、遠心力を適用することは、遠心機中の液体容器を回転させることを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態で、遠心力を適用することは１回以上繰り返される。
【００９１】
いくつかの実施形態で、遠心力を適用することは大気圧で実施される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本方法はリポソームの懸濁液を調製することも含む。いくつかの実施形態で、リポソームの懸濁液は不均一なサイズを有するリポソーム集団を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態で、リポソームは蛍光標識を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態で、リポソーム集団は１０００ｎｍ以下の平均直径を有する。いくつかの実施形態で、リポソーム集団は５００ｎｍ以下の平均直径を有する。いくつかの実施形態で、リポソーム集団は２５０ｎｍ以下の平均直径を有する。
【００９５】
本開示の実施形態は、ポリカーボネート材料の１つ以上の層を有する多孔性の膜、及び、液体容器の内部に膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素を含むリポソーム押出装置を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態で、リポソーム押出装置は液体容器も含む。いくつかの実施形態で、液体容器は遠心管である。
【００９７】
本開示の実施形態は、リポソーム集団を製造するためのシステムを含む。このシステムは、液体容器と、液体容器に配置されるリポソーム押出装置とを含む。リポソーム押出装置は、ポリカーボネート材料の１つ以上の層を有する多孔性の膜、及び、液体容器の内部に膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態で、リポソーム押出装置はリポソームの懸濁液を含有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、システムは遠心機も含む。
【０１００】
本開示の選択された実施形態はキットを含む。このキットは、リポソーム押出装置と、リポソーム押出装置を保持するように構成される包装とを含む。リポソーム押出装置は、ポリカーボネート材料の１つ以上の層を有する多孔性の膜、及び、液体容器の内部に膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態で、キットは液体容器も含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態で、キットは一組の標準蛍光標識ビーズを含む。
【０１０３】
添付の請求項にもかかわらず、本明細書に記載される開示は、以下の付記によっても定義される。
１．リポソーム集団を製造する方法であって、多孔性の膜と、液体容器の内部に前記膜を配置するように構成される要素とを有するリポソーム押出装置内に、リポソームの懸濁液を導入すること、及び、リポソーム集団を製造するためにリポソームを前記膜に通過させるために十分なやり方で前記リポソームの懸濁液に遠心力を加えることを含む、方法。
２．前記リポソームの懸濁液を前記リポソーム押出装置内に導入する前に、前記要素を前記液体容器に配置することを更に含む、付記１に記載の方法。
３．前記液体容器は遠心管を有する、付記１または２に記載の方法。
４．前記要素は前記液体容器の内部と同心の円筒を有する、付記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．前記要素は、開口部を有する第１端と、前記膜を含む第１端の反対側の第２端とを備える、付記１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１０４】
６．前記要素の前記第２端が前記液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置される、付記５に記載の方法。
７．前記要素の前記第２端と前記液体容器の前記閉鎖端との間の前記液体容器の容積は、前記要素の内部容積以上である、付記６に記載の方法。
８．前記膜は１０００ｎｍ以下の孔径を有する、付記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記膜は５００ｎｍ以下の孔径を有する、付記１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．前記膜は２５０ｎｍ以下の孔径を有する、付記１〜９のいずれかに記載の方法。
【０１０５】
１１．前記膜は膜材料の１つ以上の層を含む、付記１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記膜材料はポリマーを含む、付記１１に記載の方法。
１３．前記ポリマーはポリカーボネートを含む、付記１２に記載の方法。
１４．前記膜は膜材料の２つ以上の層を含む、付記１１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記２層以上の膜材料のそれぞれの孔径が同じである、付記１４に記載の方法。
【０１０６】
１６．前記２層以上の前記膜材料の少なくとも２つの孔径が異なる、付記１４に記載の方法。
１７．前記液体容器は封止体を含む、付記１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記封止体が取り外し可能なキャップを含む、付記１７に記載の方法。
１９．前記遠心力を加えることは、遠心機中の前記液体容器を回転させることを含む、付記１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．前記遠心力を加えることが１回以上繰り返される、付記１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０１０７】
２１．前記遠心力を加えることが大気圧で実施される、付記１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記リポソームの懸濁液を調製することを更に含む、付記１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記リポソームの懸濁液は、不均一なサイズを有するリポソーム集団を含む、付記１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．前記リポソームは蛍光標識を含む、付記１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記リポソーム集団は１０００ｎｍ以下の平均直径を有する、付記１〜２４のいずれかに記載の方法。
【０１０８】
２６．前記リポソーム集団は５００ｎｍ以下の平均直径を有する、付記１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．前記リポソーム集団は２５０ｎｍ以下の平均直径を有する、付記１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．ポリカーボネート材料の１つ以上の層を含む多孔性の膜と、液体容器の内部に前記膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と前記膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素とを備える、リポソーム押出装置。
２９．前記液体容器を更に備える、付記２８に記載の装置。
３０．前記液体容器は遠心管を有する、付記２８または２９に記載の装置。
【０１０９】
３１．前記要素は前記液体容器の内部と同心の円筒を有する、付記２８〜３０のいずれかに記載の装置。
３２．前記要素の前記第２端が前記液体容器に挿入されるとき、前記要素の前記第２端が前記液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置される、付記２８に記載の装置。
３３．前記要素の前記第２端と前記液体容器の前記閉鎖端との間の前記液体容器の容積は、前記要素の容積以上である、付記３２に記載の装置。
３４．前記膜は１０００ｎｍ以下の孔径を有する、付記２８〜３３のいずれかに記載の装置。
３５．前記膜は５００ｎｍ以下の孔径を有する、付記２８〜３４のいずれかに記載の装置。
【０１１０】
３６．前記膜は２５０ｎｍ以下の孔径を有する、付記２８〜３５のいずれかに記載の装置。
３７．前記膜は膜材料の１つ以上の層を含む、付記２８〜３６のいずれかに記載の装置。
３８．前記膜は膜材料の２つ以上の層を含む、付記３７に記載の装置。
３９．前記２層以上の前記膜材料のそれぞれの孔径が同じである、付記３８に記載の装置。
４０．前記２層以上の前記膜材料の少なくとも２つの孔径が異なる、付記３８に記載の装置。
【０１１１】
４１．前記液体容器は封止体を含む、付記２８〜４０のいずれかに記載の装置。
４２．前記封止体は取り外し可能なキャップを含む、付記４１に記載の装置。
４３．リポソーム集団を製造するシステムであって、液体容器と、前記液体容器に配置されるリポソーム押出装置とを備え、前記リポソーム押出装置は、ポリカーボネート材料の１つ以上の層を含む多孔性の膜、及び、前記液体容器の内部に前記膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と前記膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素を備える、システム。
４４．前記リポソーム押出装置がリポソームの懸濁液を含有する、付記４３に記載のシステム。
４５．前記液体容器は遠心管を有する、付記４３または４４に記載のシステム。
【０１１２】
４６．遠心機を更に備える、付記４３〜４５のいずれかに記載のシステム。
４７．前記要素は前記液体容器の内部と同心の円筒を含む、付記４３〜４６のいずれかに記載のシステム。
４８．前記要素の前記第２端が前記液体容器に挿入されるとき、前記要素の前記第２端が前記液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置される、付記４３に記載のシステム。
４９．前記要素の前記第２端と前記液体容器の前記閉鎖端の間の前記液体容器の容積が、前記要素の容積以上である、付記４８に記載のシステム。
５０．前記膜は１０００ｎｍ以下の孔径を有する、付記４３〜４９のいずれかに記載のシステム。
【０１１３】
５１．前記膜は５００ｎｍ以下の孔径を有する、付記４３〜５０のいずれかに記載のシステム。
５２．前記膜は２５０ｎｍ以下の孔径を有する、付記４３〜５１のいずれかに記載のシステム。
５３．前記膜は膜材料の１つ以上の層を含む、付記４３〜５２のいずれかに記載のシステム。
５４．前記膜は膜材料の２つ以上の層を含む、付記５３に記載のシステム。
５５．前記２層以上の前記膜材料のそれぞれの孔径が同じである、付記５４に記載のシステム。
【０１１４】
５６．前記２層以上の前記膜材料の少なくとも２つの孔径が異なる、付記５４に記載のシステム。
５７．前記液体容器は封止体を含む、付記４３〜５６のいずれかに記載のシステム。
５８．前記封止体は取り外し可能なキャップを含む、付記５７に記載のシステム。
５９．ポリカーボネート材料の１つ以上の層を含む多孔性の膜、及び、液体容器の内部に前記膜を配置するように構成されて、開口部を有する第１端と前記膜を含む第１端の反対側の第２端とを含む要素を備えるリポソーム押出装置と、前記装置を保持するように構成される包装とを含む、キット。
６０．前記液体容器を更に含む、付記５９に記載のキット。
【０１１５】
６１．前記液体容器は遠心管を有する、付記５９または６０に記載のキット。
６２．前記要素は前記液体容器の内部と同心の円筒を有する、付記５９〜６１のいずれかに記載のキット。
６３．前記要素の前記第２端が前記液体容器に挿入されるとき、前記要素の前記第２端が前記液体容器の閉鎖端から離れて間隔をあけて配置される、付記５９に記載のキット。
６４．前記要素の前記第２端と前記液体容器の前記閉鎖端との間の前記液体容器の容積は、前記要素の容積以上である、付記６３に記載のキット。
６５．前記膜は１０００ｎｍ以下の孔径を有する、付記５９〜６４のいずれかに記載のキット。
【０１１６】
６６．前記膜は５００ｎｍ以下の孔径を有する、付記５９〜６５のいずれかに記載のキット。
６７．前記膜は２５０ｎｍ以下の孔径を有する、付記５９〜６６のいずれかに記載のキット。
６８．前記膜は膜材料の１つ以上の層を含む、付記５９〜６７のいずれかに記載のキット。
６９．前記膜は膜材料の２つ以上の層を含む、付記６８に記載のキット。
７０．前記２層以上の前記膜材料のそれぞれの孔径が同じである、付記６９に記載のキット。
【０１１７】
７１．前記２層以上の前記膜材料の少なくとも２つの孔径が異なる、付記６９に記載のキット。
７２．前記液体容器は封止体を含む、付記５９〜７１のいずれかに記載のキット。
７３．前記封止体は取り外し可能なキャップを含む、付記７２に記載のキット。
７４．一組の標準蛍光標識ビーズを更に含む、付記５９〜７３のいずれか一項に記載のシステム。
【０１１８】
理解を明瞭にするために図解及び例を用いてある程度詳しく本発明を記載したが、添付する請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに行うことができることは、本開示の教示を考慮すれば当業者には容易に明らかである。
【０１１９】
したがって、上述した内容は単に本開示の実施形態の原理を示している。本明細書で明確に記載されていないまたは示されないが、本開示の実施形態の原理を例示して、その趣旨及び範囲内に含有される種々の配置を考案することを、当業者が可能なことは理解されるであろう。更に本明細書で詳述されたすべての例及び条件付き言語は、これに限定されるものではないがこのような特に詳述された例及び条件への本開示の実施形態の原理を読者が理解することを助ける点を主に意図する。更に本開示の実施形態の原則、態様及び実施形態で詳述するすべての記載、ならびにその具体例は、その構造的及び機能的等価物の両方を包含することを目的とする。そのうえ、このような等価物が、現在周知の等価物及び将来開発される等価物（すなわち構造を問わず、同じ機能を実行する開発された任意の要素）の両方を含むことを意図する。したがって本開示の実施形態の範囲は、本明細書に示しかつ記載した例示的実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ本開示の実施形態の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【０１２０】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、本出願は２０１６年５月２６日出願の米国仮特許出願第６２／３４２，１１２号の出願日に対する優先権を主張し、その明細書の開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2019522631.tif 000003
【図１Ｂ】
2019522631.tif 000004
【図２Ａ】
2019522631.tif 000005
【図２Ｂ】
2019522631.tif 000006
【国際調査報告】
2019522631.tif 000007
2019522631.tif 000008
2019522631.tif 000009