(57)【要約】  ＩＣＯＳ(誘導性Ｔ細胞共刺激因子(Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｃｏ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ))に結合する抗体。癌治療における使用を含む、制御性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞との間の割合を調節して、患者の免疫系を刺激するための抗ＩＣＯＳ抗体の治療的使用。トランスジェニックノックアウトマウスを使用する、種交差反応性抗体を含む抗ＩＣＯＳ抗体を産生する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメイン(配列番号４０８)と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、
ＳＴＩＭ００３  ＶＬドメイン(配列番号４１５)と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインと
を含む、ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離された抗体。
【請求項２】
前記ＶＨドメインが１セットの重鎖相補性決定領域(ＨＣＤＲ) ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が配列番号４０５のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＨＣＤＲ１であり、
ＨＣＤＲ２が配列番号４０６のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＨＣＤＲ２であり、
ＨＣＤＲ３が配列番号４０７のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＨＣＤＲ３である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＶＬドメインが１セットの軽鎖相補性決定領域(ＬＣＤＲ) ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
ＬＣＤＲ１が配列番号４１２のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＬＣＤＲ１であり、
ＬＣＤＲ２が配列番号４１３のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＬＣＤＲ２であり、
ＬＣＤＲ３が配列番号４１４のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＬＣＤＲ３である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号４０８であり、及び/又は前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が配列番号４１５である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
相補性決定領域(ＣＤＲ) ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインと、
相補性決定領域 ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインと
を含み、
前記ＨＣＤＲ１が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲ１であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ１を含み、
前記ＨＣＤＲ２が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲ２であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ２を含み、及び/又は
前記ＨＣＤＲ３が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲ３であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ３を含む、
ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離された抗体。
【請求項６】
前記抗体重鎖ＣＤＲが、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のものであるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９重鎖ＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体ＶＨドメインがＳＴＩＭ００３の重鎖ＣＤＲを有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
相補性決定領域 ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインと、
相補性決定領域 ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインと
を含み、
前記ＬＣＤＲ１が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＬＣＤＲ１であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ１を含み、
前記ＬＣＤＲ２が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＬＣＤＲ２であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ２を含み、及び/又は
前記ＬＣＤＲ３が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＬＣＤＲ３であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ３を含む、
ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離された抗体。
【請求項９】
前記抗体軽鎖ＣＤＲが、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のものであるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９軽鎖ＣＤＲを含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体ＶＬドメインがＳＴＩＭ００３の軽鎖ＣＤＲを有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト生殖細胞系遺伝子セグメント配列のＶＨ及び/又はＶＬドメインフレームワーク領域を含む請求項５〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
(ｉ)Ｖセグメントが、ＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)であり、
Ｄ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＤ６−１９(例えば、ＩＧＨＤ６−１９＊０１)、ＩＧＨＤ３−１０(例えば、ＩＧＨＤ３−１０＊０１)若しくはＩＧＨＤ３−９(例えば、ＩＧＨＤ３−９＊１)であり、及び/又は
Ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＪ６(例えば、ＩＧＨＪ６＊０２)、ＩＧＨＪ４(例えば、ＩＧＨＪ４＊０２)若しくはＩＧＨＪ３(例えば、ＩＧＨＪ３＊０２)である、
ヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント及びヒト重鎖Ｊ遺伝子セグメントの組換えに由来し、又は
(ｉｉ)ＦＲ１が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、
ＦＲ２が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、
ＦＲ３が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、及び/又は
ＦＲ４が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｊ遺伝子セグメントＩＧＪＨ６(例えば、ＪＨ６＊０２)、ＩＧＪＨ４(例えば、ＪＨ４＊０２)若しくはＩＧＪＨ３(例えば、ＪＨ３＊０２)と整列する、
フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含む
ＶＨドメインを含む請求項５〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
(ｉ)Ｖセグメントが、ＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)であり、及び/又は
Ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＫＪ４(例えば、ＩＧＫＪ４＊０１)、ＩＧＫＪ２(例えば、ＩＧＫＪ２＊０４)、ＩＧＬＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)若しくはＩＧＫＪ１(例えば、ＩＧＫＪ１＊０１)である
ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及びヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントの組換えに由来するか、又は
(ｉｉ)ＦＲ１が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、
ＦＲ２が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、
ＦＲ３が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、及び/又は
ＦＲ４が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｊ遺伝子セグメントＩＧＫＪ４(例えば、ＩＧＫＪ４＊０１)、ＩＧＫＪ２(例えば、ＩＧＫＪ２＊０４)、ＩＧＫＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)若しくはＩＧＫＪ１(例えば、ＩＧＫＪ１＊０１)と整列する、
フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む
抗体ＶＬドメインを含む請求項５〜１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＨドメインであるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＨドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する
抗体ＶＨドメインを含む請求項５〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＬドメインであるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＬドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する
抗体ＶＬドメインを含む請求項５〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＨドメインから選択されるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＨドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する
抗体ＶＨドメインと、
前記選択された抗体のＶＬドメインであるか、又は前記選択された抗体のＶＬドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する
抗体ＶＬドメインと
を含む請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメイン及び前記ＳＴＩＭ００３  ＶＬドメインを含む請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体定常領域を含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記定常領域がヒト重鎖及び/又は軽鎖定常領域を含む、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記定常領域がＦｃエフェクター陽性である、請求項１８又は１９に記載の抗体。
【請求項２１】
天然型ヒトＦｃ領域と比較して増強したＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び/又はＣＤＣ機能を有するＦｃ領域を含む請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
ＩｇＧ１である請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
フコシル化されていない請求項２１又は２２に記載の抗体。
【請求項２４】
細胞傷害性薬物又はプロドラッグと接合された請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２５】
多重特異性抗体である請求項１〜２４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２６】
表面プラズモン共鳴によって測定したとき５０ｎＭ未満の親和性(ＫＤ)でヒト及びマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離抗体。
【請求項２７】
表面プラズモン共鳴によって測定したとき５ｎＭ未満の親和性(ＫＤ)でヒト及びマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインへの結合に関するＫＤがマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインへの結合に関するＫＤの１０倍以内である、請求項２６又は２７に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離抗体と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体をコードする単離核酸と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体又は請求項２９に記載の組成物を患者に投与することを含む、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)とエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)とのバランスを調整して、患者におけるＴｅｆｆ応答を増大させる方法。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体又は請求項２９に記載の組成物を患者に投与することを含む、該患者における制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)の枯渇及び/又はエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)応答の増大による治療法に適する疾患又は病的状態を処置する方法。
【請求項３３】
治療法による人体の処置方法に用いるための、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体又は請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)とエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)とのバランスを調節して、患者におけるエフェクターＴ細胞応答の増大に用いるための請求項３３に記載の抗体又は組成物。
【請求項３５】
患者における制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)の枯渇及び/又はエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)応答の増大による治療法に適する疾患又は病的状態の処置に用いるための請求項３３に記載の抗体又は組成物。
【請求項３６】
前記疾患が癌又は固形腫瘍である、請求項３２に記載の方法又は請求項３５に記載の抗体若しくは組成物。
【請求項３７】
ヒト患者の癌を処置する方法に用いるための請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体又は請求項２９に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体又は請求項２９に記載の組成物を患者に投与することを含む、ヒト患者の癌を処置する方法。
【請求項３９】
前記癌が腎細胞癌、頭頸部癌、黒色腫、非小細胞肺癌又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４０】
前記方法が前記抗体並びに別の治療剤及び/又は放射線療法を前記患者に施すことを含む、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４１】
前記治療剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項４０に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４２】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が配列番号２９９のアミノ酸配列を有するＶＨドメインと配列番号３００のアミノ酸配列を有するＶＬドメインとを含む、請求項４１に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４３】
前記治療剤が抗ＰＤ−Ｌ１  ＩＬ−２免疫サイトカインである、請求項４１又は４２に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４４】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体がヒト野生型又は変異型ＩＬ−２を含む免疫サイトカインである、請求項４３に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４５】
前記抗ＩＣＯＳ抗体及び前記抗ＰＤＬ１抗体が各々、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び/又はＣＤＣを媒介することができる、請求項４４に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４６】
前記抗ＩＣＯＳ抗体がヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗ＰＤＬ１抗体がヒトＩｇＧ１抗体である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４７】
前記治療剤が抗ＰＤ−１抗体である、請求項４０に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４８】
前記他の治療剤がＩＬ−２である、請求項４０に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項４９】
前記方法が前記他の治療剤及び/又は放射線療法を施した後に抗ＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項５０】
前記抗ＩＣＯＳ抗体がプロドラッグと接合され、
前記方法又は使用が、
前記抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することと、
標的組織部位で前記プロドラッグを選択的に活性化させることと
を含む、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項５１】
前記患者が固形腫瘍を有し、前記方法が前記腫瘍において前記プロドラッグを選択的に活性化させることを含む、請求項５０に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項５２】
前記プロドラッグを光活性化により選択的に活性化させることを含む、請求項５０又は請求項５１に記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【請求項５３】
患者における癌を処置する方法における使用のための、抗ＩＣＯＳヒトＩｇＧ１抗体と抗ＰＤＬ１ヒトＩｇＧ１抗体との組合せ。
【請求項５４】
抗ＩＣＯＳヒトＩｇＧ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１抗体を患者に投与することを含む、患者の癌を処置する方法。
【請求項５５】
抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を患者に投与することを含み、前記抗ＩＣＯＳ抗体が単回用量で投与される患者の癌を処置する方法に用いるための抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項５６】
前記抗ＩＣＯＳ抗体がヒトＩｇＧ１抗体であり、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体がヒトＩｇＧ１抗体である、請求項５５に記載の抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項５７】
前記癌が腎細胞癌、頭頸部癌、黒色腫、非小細胞肺癌又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項５３に記載の組合せ、請求項５４に記載の方法又は請求項５５若しくは５６に記載の抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項５８】
前記方法が前記抗ＩＣＯＳ抗体及び前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体を前記患者に投与することを含み、前記抗ＩＣＯＳ抗体が単回用量で投与される、請求項４１〜４６若しくは５３〜５４のいずれか１項に記載の方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【請求項５９】
前記方法が単回用量の前記抗ＩＣＯＳ抗体、続いて複数回用量の前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、請求項５８に記載の方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【請求項６０】
前記抗ＩＣＯＳ抗体及び前記抗ＰＤＬ１抗体がその投与のための別々の組成物で提供される、請求項４１〜４６又は５３〜５４のいずれか１項に記載の方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【請求項６１】
前記抗ＩＣＯＳ抗体及び/又は前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が配列番号３４０のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域を含む、請求項４１〜４６又は５３〜６０のいずれか１項に記載の方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【請求項６２】
抗ＩＣＯＳ抗体を、別の治療剤での処置後にＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞のレベルが増加した患者に投与することを含む患者を処置する方法において用いるための抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項６３】
抗ＩＣＯＳ抗体を、別の治療剤での処置後にＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞のレベルが増加した患者に投与することを含む、患者を処置する方法。
【請求項６４】
前記方法が、治療剤を前記患者に投与することと、前記患者が前記治療剤での処置後にＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞のレベルが増加したと判定することと、抗ＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与して前記制御性Ｔ細胞のレベルを低減させることとを含む、請求項６２に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療剤がＩＬ−２又は免疫調節抗体(例えば、抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤ−１、又は抗ＣＴＬＡ−４)である、請求項６２〜６４のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項６６】
前記方法が腫瘍、例えば、転移性黒色腫等の黒色腫を処置することを含む、請求項６２〜６５のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項６７】
癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす治療法で患者を処置し、抗原特異的エフェクターＴ細胞に対して抗原を提示させることと、
前記抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強するＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与することと
を含む、癌細胞に対するワクチンのインビボ接種により患者の癌を処置する方法に用いるための抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項６８】
癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす治療法で患者を処置し、抗原特異的エフェクターＴ細胞に対して抗原を提示させることと、
前記抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強するＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与することと
を含む、癌細胞に対するワクチンのインビボ接種により患者の癌を処置する方法。
【請求項６９】
癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす治療法で処置された結果、抗原特異的エフェクターＴ細胞に対する抗原が提示されている患者に、前記抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強する抗ＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、癌細胞に対するワクチンのインビボ接種により患者の癌を処置する方法。
【請求項７０】
前記免疫学的細胞死を引き起こす治療法が癌細胞の放射線照射、化学療法剤の投与及び/又は腫瘍関連抗原に対する抗体の投与である、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項７１】
前記化学療法剤がオキサリプラチンである、請求項７０に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項７２】
前記腫瘍関連抗原がＨＥＲ２又はＣＤ２０である、請求項７０に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項７３】
癌がＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３の発現について陽性であると特徴付けられるか又は特徴付けられた患者の癌を処置する方法に用いるための抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項７４】
抗ＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与することを含む、癌がＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３の発現について陽性であると特徴付けられるか又は特徴付けられた患者の癌を処置する方法。
【請求項７５】
前記方法が、
患者からの試料を検査して、癌がＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３を発現することを判定することと、
前記患者を抗ＩＣＯＳ抗体での処置のために選択することと、
前記抗ＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与することと
を含む請求項７３に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、癌がＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３の発現について陽性であることを示した検査試料を採取した患者に投与することを含む、請求項７３に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記試料が固形腫瘍の生検試料である、請求項７５又は７６に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項７８】
前記癌が免疫腫瘍学的薬物、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７抗体又は抗ＧＩＴＲ抗体での処置に対して難治性であると特徴付けられるか又は特徴付けられた患者の癌を処置する方法に用いるための抗ＩＣＯＳ抗体。
【請求項７９】
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することを含む、患者における、免疫腫瘍学的薬物、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７抗体又は抗ＧＩＴＲ抗体での処置に対して難治性であると特徴付けられるか又は特徴付けられた癌を処置する方法。
【請求項８０】
前記方法が、
前記患者を前記免疫腫瘍学的薬物で処置することと、
前記癌が前記薬物に応答しないことを判定することと、
前記患者を前記抗ＩＣＯＳ抗体での処置のために選択することと、
前記抗ＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与することと
を含む、請求項７８に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、癌が前記免疫腫瘍学的薬物での前処置に応答しなかった患者に投与することを含む、請求項７８に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記癌がＩＣＯＳリガンドを発現する能力を獲得した細胞に由来する腫瘍である、請求項７３〜８１のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８３】
前記癌が黒色腫である、請求項８２に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８４】
前記癌がＢリンパ球(例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫等のＢ細胞リンパ腫)又はＴリンパ球等の抗原提示細胞に由来する、請求項７３〜８１のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８５】
前記癌が抗ＣＤ２０抗体による処置に耐性である、請求項７３〜８１のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８６】
前記癌がＢ細胞リンパ腫である、請求項８５に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８７】
前記抗ＣＤ２０抗体がリツキシマブである、請求項８６に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８８】
前記方法が、
前記患者を前記抗ＣＤ２０抗体で処置することと、
前記癌が前記抗ＣＤ２０抗体に応答しないことを判定することと、
前記患者からの試料を検査して、前記癌がＩＣＯＳリガンドを発現することを判定することと、
前記患者を前記抗ＩＣＯＳ抗体による処置のために選択することと、
前記抗ＩＣＯＳ抗体を前記患者に投与することと
を含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項８９】
前記方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、癌が前記ＣＤ２０抗体での前処置に応答しなかった患者に投与することを含む、請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項９０】
前記癌が固形腫瘍である、請求項６７〜８９のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項９１】
前記癌が血液学的液体腫瘍である、請求項６７〜８９のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項９２】
前記腫瘍が制御性Ｔ細胞に富む、請求項９０又は９１に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項９３】
前記抗ＩＣＯＳ抗体が請求項１〜２８のいずれか１項に規定される通りであるか又は請求項２９に記載の組成物中に提供される、請求項５３〜９２のいずれか１項に記載の抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【請求項９４】
ヒト可変領域遺伝子セグメントをコードするヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有し、ＩＣＯＳを発現しないトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９５】
(ａ)請求項９４に記載の哺乳動物をヒトＩＣＯＳ抗原で免疫することと、
(ｂ)前記哺乳動物が産生した抗体を単離することと、
(ｃ)ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について前記抗体を試験することと、
(ｄ)ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳの両方に結合する１以上の抗体を選択することと
を含む、ヒト及び非ヒトのＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する抗体を製造する方法。
【請求項９６】
前記哺乳動物を、ヒトＩＣＯＳを発現する細胞で免疫することを含む請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
(ｃ)表面プラズモン共鳴を用いてヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について前記抗体を試験し、結合親和性を判定することと、
(ｄ)ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが５０ｎＭ未満であり、非ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが５００ｎＭ未満である１以上の抗体を選択することと
を含む請求項９５又は９６に記載の方法。
【請求項９８】
(ｄ)ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが１０ｎＭ未満であり、非ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが１００ｎＭ未満である１以上の抗体を選択することを含む請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
(ｃ)表面プラズモン共鳴を用いてヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について前記抗体を試験し、結合親和性を判定することと、
(ｄ)ヒトＩＣＯＳへの結合に関するＫＤが非ヒトＩＣＯＳへの結合に関するＫＤの１０倍以内である１以上の抗体を選択することと
を含む請求項９５〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
(ｄ)ヒトＩＣＯＳへの結合に関するＫＤが非ヒトＩＣＯへの結合に関するＫＤの５倍以内である１以上の抗体を選択することを含む請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記哺乳動物と同じ種からの非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について前記抗体を試験することを含む請求項９５〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記哺乳動物とは異なる種からの非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について前記抗体を試験することを含む請求項９５〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記哺乳動物がマウス又はラットである、請求項９５〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記非ヒトＩＣＯＳがマウスＩＣＯＳ又はラットＩＣＯＳである、請求項９５〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座が、内因性定常領域の上流にヒト可変領域遺伝子セグメントを含む、請求項９５〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０６】
(ａ)マウスである請求項９４に記載の哺乳動物をヒトＩＣＯＳ抗原で免疫することと、
(ｂ)前記マウスが産生する抗体を単離することと、
(ｃ)ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳに結合する能力について前記抗体を試験することと、
(ｄ)ヒト及びマウスＩＣＯＳの両方に結合する１以上の抗体を選択することと
を含む請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
抗体重鎖可変ドメイン及び/又は抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸を単離することを含む請求項９５〜１０６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記哺乳動物がヒト可変領域遺伝子セグメント及び内因性定常領域の組換えによって抗体を産生する、請求項９５〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記重鎖及び/又は前記軽鎖可変ドメインをコードする核酸をヒト重鎖定常領域及び/又はヒト軽鎖定常領域とそれぞれ接合することを含む、請求項１０７又は１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記核酸を宿主細胞に導入することを含む、請求項１０７〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体又は前記抗体重鎖及び/若しくは軽鎖可変ドメインの発現のための条件下で前記宿主細胞を培養することを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
請求項９５〜１１１のいずれか１項に記載の方法により製造された抗体又は抗体重鎖及び/若しくは軽鎖可変ドメイン。
【請求項１１３】
アッセイが、
試験ウェル中の基質に不動化(固定又は付着)された抗体アレイを提供することと、
前記試験ウェルに、ＩＣＯＳ発現細胞(例えば、活性化初代Ｔ細胞又はＭＪ細胞)を添加することと、
前記細胞の形態を観察することと、
ウェル内の基質に対する、丸形状から平坦形状への細胞形状の変化を検出すること、ここで、前記形状変化は抗体がＩＣＯＳアゴニスト抗体であってもよいＩＣＯＳに結合する抗体であることを示す、
前記試験ウェルから前記抗体を選択することと、
前記選択された抗体のＣＤＲをコードする核酸を発現させることと、
前記抗体を、１又は２以上の追加成分を含む組成物に製剤化することと
を含む、ＩＣＯＳアゴニスト抗体であってもよいＩＣＯＳに結合する抗体を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物免疫応答、特に、Ｔ細胞応答を刺激するための組成物に関する。本発明はまた、患者における抗腫瘍Ｔ細胞応答の促進による抗腫瘍療法を含む免疫腫瘍学におけるこのような組成物の医学的使用、並びに例えばエフェクターＴ細胞の刺激及び/又は制御性Ｔ細胞の枯渇を介して、エフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞との間のバランスをエフェクターＴ細胞に有利なように調節することが治療上の利点を有する、他の疾患及び状態における組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＣＯＳ(誘導性Ｔ細胞共刺激因子)は、免疫応答、特に、液性免疫応答の調節に関与するＣＤ２８遺伝子ファミリーのメンバーであり、１９９９年に初めて同定された［１］。これは、２つの異なるグリコシル化サブユニットを有するジスルフィド結合したホモ二量体として存在する、５５ｋＤａの膜貫通タンパク質である。ＩＣＯＳは、Ｔリンパ球上で独占的に発現され、様々なＴ細胞サブセットに見出される。これは、ナイーブＴリンパ球上に低レベルで存在するが、その発現は、免疫活性化により急速に誘導され、ＴＣＲの従事及びＣＤ２８との共刺激等の炎症誘発性刺激に応答して上方調節される［２、３］。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化の後期、メモリＴ細胞形成の遅い段階、及び重要なことにＴ細胞依存性Ｂ細胞応答を介した液性応答の調節において役割を果たす［４、５］。細胞内で、ＩＣＯＳはＰＩ３Ｋに結合し、キナーゼであるホホイノシチド(ｐｈｏｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ)依存性キナーゼ１(ＰＤＫ１)及びタンパク質キナーゼＢ(ＰＫＢ)を活性化する。ＩＣＯＳの活性化により、細胞死が防止され、細胞代謝が上方調節される。ＩＣＯＳの非存在下(ＩＣＯＳノックアウト)又は抗ＩＣＯＳ中和抗体の存在下では、炎症誘発性応答の抑制が存在する。
【０００３】
ＩＣＯＳは、Ｂ細胞及び抗原提示細胞(ＡＰＣ)上に発現されるＩＣＯＳリガンド(ＩＣＯＳＬ)に結合する［６、７］。これは、共刺激分子として、抗原に対するＴＣＲ媒介性免疫応答及び抗体応答を調節するのに役立つ。この細胞型が癌細胞の免疫監視に負の役割を果たすことが示唆されているため、Ｔ制御性細胞上のＩＣＯＳの発現は重要であり、卵巣癌においてこれに関する新たな証拠が存在する［８］。重要なことに、ＩＣＯＳ発現は、腫瘍微小環境に存在するＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクター細胞と比較して、腫瘍内制御性Ｔ細胞(ＴＲｅｇ)上でより高いことが報告されている。Ｆｃ媒介細胞エフェクター機能を有する抗体を使用したＴＲｅｇの枯渇は、前臨床モデルにおいて強い抗腫瘍効果を示した［９］。増え続ける証拠により、ＩＣＯＳが免疫チェックポイント阻害剤で処置された動物モデル及び患者の両方において抗腫瘍効果に関与することが示される。ＩＣＯＳ又はＩＣＯＳＬ枯渇マウスでは、抗ＣＴＬＡ４療法の抗腫瘍効果は減少するが［１０］、正常マウスでは、ＩＣＯＳリガンドにより、黒色腫及び前立腺癌における抗ＣＴＬＡ４処置の有効性が増加する［１１］。さらに、ヒトでは、進行性黒色腫患者の後ろ向き研究により、イピリムマブ(抗ＣＴＬＡ４)治療後のＩＣＯＳレベルの上昇が示された［１２］。加えて、ＩＣＯＳ発現は、抗ＣＴＬＡ４で処置した膀胱癌患者において上方調節される［１３］。抗ＣＴＬＡ４療法による処置を受けた癌患者では、腫瘍特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ４  Ｔ細胞の大部分がＩＣＯＳ陽性であり、同時に、ＩＣＯＳ陽性ＣＤ４  Ｔ細胞の持続的上昇が生存率と相関することも観察されている［１２、１３、１４］。
【０００４】
ＷＯ２０１６/１２０７８９により、抗ＩＣＯＳ抗体が説明され、Ｔ細胞を活性化するため、並びに癌、感染症、及び/又は敗血症を治療するためのそれらの使用が提案された。ある数のネズミ抗ＩＣＯＳ抗体が生成され、そのサブセットはヒトＩＣＯＳ受容体のアゴニストであると報告されている。抗体「４２２．２」をリード抗ＩＣＯＳ抗体として選択し、ヒト化して「Ｈ２Ｌ５」と命名されたヒト「ＩｇＧ４ＰＥ」抗体を産生した。Ｈ２Ｌ５は、ヒトＩＣＯＳに対して１．３４ｎＭ、及びカニクイザルＩＣＯＳに対して０．９５ｎＭの親和性を有し、Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を誘導し、ＣＤ３刺激と共にＴ細胞活性化マーカーを上方調節すると報告された。しかし、移植されたヒト黒色腫細胞を保有するマウスは、対照処置群と比較して、Ｈ２Ｌ５  ｈＩｇＧ４ＰＥで処置した場合、最小限の腫瘍増殖遅延又は生存率増加しか示さないことが報告された。また、この抗体は、イピリムマブ(抗ＣＴＬＡ−４)又はペンブロリズマブ(抗ＰＤ−１)との併用実験において、イピリムマブ又はペンブロリズマブ単独療法と比較して、腫瘍増殖のさらなる阻害を有意には生じなかった。最後に、移植された結腸癌細胞(ＣＴ２６)を保有するマウスにおいて、イピリムマブ又はペンブロリズマブのマウス代用物と組み合わせた低用量のマウス交差反応性のＨ２Ｌ５代用物では、抗ＣＴＬ４及び抗ＰＤ１療法のみと比較して、全生存が軽度に改善されただけであった。移植されたＥＭＴ６細胞を保有するマウスにおいて、同様の強い治療効果の欠如が示された。
【０００５】
ＷＯ２０１６/１５４１７７により、抗ＩＣＯＳ抗体のさらなる例が説明されている。これらの抗体は、エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞(ＴＥｆｆ)を含むＣＤ４＋  Ｔ細胞のアゴニストであること、及びＴ制御性細胞(ＴＲｅｇ)を枯渇させることが報告されている。ＴＥｆｆ細胞対ＴＲｅｇ細胞に対する抗体の選択的効果が説明されており、これらの抗体は、ＴＲｅｇを優先的に枯渇させることができるが、より低いレベルのＩＣＯＳを発現するＴＥｆｆに対して最小の効果しか有しない。抗ＩＣＯＳ抗体は、癌の治療に使用するために提案され、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用療法が説明されている。
【発明の概要】
【０００６】
エフェクターＴ細胞活性を増加させるように作用するＩＣＯＳに対する抗体は、様々な疾患及び状態並びにワクチン接種レジメンを含む、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が有益である免疫腫瘍学及び他の医学的状況における治療アプローチを表す。免疫成分が関与する多くの疾患及び状態において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答を発揮するエフェクターＴ細胞(ＴＥｆｆ)と、ＴＥｆｆを下方調節することによってその免疫応答を抑制する制御性Ｔ細胞(ＴＲｅｇ)との間にはバランスが存在する。本発明は、このＴＥｆｆ/ＴＲｅｇバランスをエフェクターＴ細胞活性に有利なように調節する抗体に関する。ＩＣＯＳが高度に陽性である制御性Ｔ細胞の枯渇を引き起こす抗体は、ＴＥｆｆの抑制を緩和し、これによりエフェクターＴ細胞応答を促進する正味の効果を有するであろう。抗ＩＣＯＳ抗体の追加的又は相補的機序は、ＩＣＯＳ受容体レベルでのアゴニスト活性を介して、エフェクターＴ細胞応答を刺激することである。
【０００７】
制御性Ｔ細胞(ＴＲｅｇ)と比較したエフェクターＴ細胞(ＴＥｆｆ)上のＩＣＯＳの相対的発現及びこれらの細胞集団の相対的活性は、インビボでの抗ＩＣＯＳ抗体の全体的な効果に影響を与えることになる。想定される作用様式は、エフェクターＴ細胞のアゴニズムとＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞の枯渇とを組み合わせる。これら２つの異なるＴ細胞集団に対する差異的効果及びさらには反対の効果は、それらの異なるレベルのＩＣＯＳ発現により達成可能であり得る。抗ＩＣＯＳ抗体の可変領域及び定常領域それぞれの二重操作により、ＣＤ８/ＴＲｅｇ比に影響を及ぼすことによってエフェクターＴ細胞応答に正味の正の効果を発揮する分子を提供することができる。ＩＣＯＳ受容体を活性化するアゴニスト抗体の抗原結合ドメインは、抗体が結合する高発現細胞の下方調節及び/又はクリアランスを促進する抗体定常(Ｆｃ)領域と組み合わされ得る。エフェクター陽性定常領域は、標的細胞(ＴＲｅｇ)に対する細胞エフェクター機能を動員して、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)又は抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)を促進するために使用され得る。したがって、抗体は、エフェクターＴ細胞活性化の促進と、免疫抑制性Ｔ制御性細胞の下方調節との両方を行うように作用し得る。ＩＣＯＳはＴＥｆｆよりもＴＲｅｇ上でより高度に発現されるので、治療バランスが達成され、それにより、ＴＲｅｆが枯渇すると同時にＴｅｆｆ機能が促進され、Ｔ細胞免疫応答(例えば、抗腫瘍応答又は他の治療的に有益なＴ細胞応答)の正味の増加がもたらされる。
【０００８】
いくつかの前臨床及び臨床研究により、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)における高いエフェクターＴ細胞対Ｔ−ｒｅｇ細胞の比と、全生存との間に強い正の相関が示された。卵巣癌患者では、ＣＤ８：Ｔ−ｒｅｇ細胞の比が、良好な臨床転帰の指標であることが報告されている［１５］。イピルママブを受けた後の転移性黒色腫患者でも同様の所見が得られた［１６］。前臨床試験では、ＴＭＥにおける高いエフェクター細胞：Ｔ−ｒｅｇの比が抗腫瘍応答と関連していることも示されている［４３］。
【０００９】
本発明は、ヒトＩＣＯＳに結合する抗体を提供する。本抗体は、ＩＣＯＳ細胞外ドメインを標的とすることにより、ＩＣＯＳを発現するＴ細胞に結合する。ＩＦＮγの発現及び分泌を増加させる能力によって示されるように、ＩＣＯＳにアゴニスト作用を有することでエフェクターＴ細胞の機能を増強するように設計された抗体の例が提供される。上述のように、抗ＩＣＯＳ抗体は、それらが結合する細胞を枯渇させるように操作されてもよく、これは、制御性Ｔ細胞を優先的に下方調節して、エフェクターＴ細胞応答に対するこれらの細胞の抑制効果を高め、それにより全体的なエフェクターＴ細胞応答を促進するはずである。それらの作用機序にかかわらず、本発明に従う抗ＩＣＯＳ抗体は、実施例に示すように、Ｔ細胞応答を刺激し、インビボでの抗腫瘍効果を有することが実験的に実証されている。所望のレベルのＦｃエフェクター機能を有するか、又は適切な場合にはそのようなエフェクター機能が不在である定常領域を含むもの等の適切な抗体フォーマットを選択することにより、本抗ＩＣＯＳ抗体は、エフェクターＴ細胞応答が有益であり、及び/又は制御性Ｔ細胞の抑制が所望される疾患及び状態の治療を含む様々な医学的状況での使用に合わせて調整され得る。
【００１０】
例示的な抗体には、本明細書に記載されている配列であるＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９が含まれる。
【００１１】
本発明に従う抗体は、ヒトＩＣＯＳへの結合についてＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、又はＳＴＩＭ００９の重鎖及び軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む抗体(例えば、ヒトＩｇＧ１、又はｓｃＦｖ)、任意選択でＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、又はＳＴＩＭ００９のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体と競合するものであってもよい。
【００１２】
本発明に従う抗体は、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９のいずれかの１つ以上のＣＤＲ(例えば、任意のこのような抗体の６つ全てのＣＤＲ、又は１セットのＨＣＤＲ及び/若しくはＬＣＤＲ)、又は本明細書に記載のそれらの変異型を含んでもよい。
【００１３】
本抗体は、ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインと、ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインとを含んでもよく、ＨＣＤＲ３は、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９から選択される抗体のＨＣＤＲ３であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ３を含む。ＨＣＤＲ２は、選択された抗体のＨＣＤＲ２であってもよく、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ２を含んでもよい。ＨＣＤＲ１は、選択された抗体のＨＣＤＲ１であってもよく、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ１を含んでもよい。
【００１４】
本抗体は、ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインと、ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインとを含んでもよく、ＬＣＤＲ３は、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９から選択される抗体のＬＣＤＲ３であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ３を含む。ＬＣＤＲ２は、選択された抗体のＬＣＤＲ２であってもよく、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ２を含んでもよい。ＬＣＤＲ１は、選択された抗体のＬＣＤＲ１であってもよく、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ１を含んでもよい。
【００１５】
抗体は、
相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインと、
相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインと、を含んでもよく、
抗体重鎖ＣＤＲは、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のものであるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有する、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４若しくはＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９重鎖相補性決定領域を含み、及び/又は
抗体軽鎖ＣＤＲは、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のものであるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有する、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９軽鎖相補性決定領域を含む。
【００１６】
抗体は、次の１セットの重鎖相補性決定領域(ＨＣＤＲ) ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３：
ＨＣＤＲ１は、ＳＴＩＭ００３のＨＣＤＲ１であり、
ＨＣＤＲ２は、ＳＴＩＭ００３のＨＣＤＲ２であり、
ＨＣＤＲ３は、ＳＴＩＭ００３のＨＣＤＲ３である
を含むか、又は１、２、３、４、５若しくは６個のアミノ酸改変を有する前記ＨＣＤＲセットを含むＶＨドメインを含んでもよい。
【００１７】
抗体は、次の１セットの軽鎖相補性決定領域(ＬＣＤＲ) ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３：
ＬＣＤＲ１は、ＳＴＩＭ００３のＬＣＤＲ１であり、
ＬＣＤＲ２は、ＳＴＩＭ００３のＬＣＤＲ２であり、
ＬＣＤＲ３は、ＳＴＩＭ００３のＬＣＤＲ３である、
を含むか、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸改変を有する前記ＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインを含んでもよい。
【００１８】
アミノ酸改変(例えば、置換)は、ＣＤＲの任意の残基位置にあり得る。アミノ酸改変の例は、抗ＩＣＯＳ抗体の変異型配列のアライメントを示す図３５、図３６、及び図３７に示されるものである。したがって、ＳＴＩＭ００３  ＣＤＲ中のアミノ酸改変は、図３６に示すように、抗体ＣＬ−７４５７０又は抗体ＣＬ−７１６４２中の対応する位置に存在する残基の置換であり得る。
【００１９】
ＳＴＩＭ００３  ＣＤＲ中のアミノ酸改変の例は、ＩＭＧＴに従って定義して、以下の残基位置での置換である：
【００２０】
ＨＣＤＲ１における、ＩＭＧＴの２８位での置換、任意選択で保存的置換、例えばＶ２８Ｆ。
【００２１】
ＨＣＤＲ２における、ＩＭＧＴの５９、６３、及び/又は６４位での置換。任意選択で、５９位での置換はＮ５９Ｉであり、６３位での置換はＧ６３Ｄであり、及び/又は６４位での置換はＤ６４Ｎ及び/若しくはＤ６４Ｓである。
【００２２】
ＨＣＤＲ３における、ＩＭＧＴの１０６、１０８、１０９、及び/又は１１２位での置換。任意選択で、１０６位での置換はＲ１０６Ａであり、１０８位での置換はＦ１０８Ｙであり、１０９位での置換はＹ１０９Ｆであり、及び/又は１１２位での置換はＨ１１２Ｎである。
【００２３】
ＬＣＤＲ１における、３６位での置換、例えば、Ｒ３６Ｓ。
【００２４】
ＬＣＤＲ３における、１０５、１０８、及び/又は１０９位での置換。任意選択で、１０５位での置換はＨ１０５Ｑであり、１０８位での置換はＤ１０８Ｇであり、及び/又は１０９位での置換はＭ１０９Ｎ若しくはＭ１０９Ｓである。
【００２５】
本発明の抗体は、ヒト生殖細胞系遺伝子セグメント配列に対応するＶＨ及び/又はＶＬドメインフレームワーク領域を含み得る。例えば、これは、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、又はＳＴＩＭ００９の１つ以上のフレームワーク領域を含んでもよい。フレームワーク領域(単数又は複数)は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及び/又はＦＲ４であり得る。
【００２６】
実施例１２に記載されているように、表Ｅ１２−１は、組換えによりこれらの抗体のＶＨドメインを生成したヒト生殖細胞系Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントを示し、表Ｅ１２−２は、組換えによりこれらの抗体のＶＬドメインを生成したヒト生殖細胞系Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを示す。本発明の抗体ＶＨ及びＶＬドメインは、これらのＶ(Ｄ)Ｊセグメントに基づいてもよい。
【００２７】
本発明の抗体は、
(ｉ)ヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及びヒト重鎖Ｊ遺伝子セグメントの組換えに由来するＶＨドメインであって、
Ｖセグメントが、ＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)であり、
Ｄ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＤ６−１９(例えば、ＩＧＨＤ６−１９＊０１)、ＩＧＨＤ３−１０(例えば、ＩＧＨＤ３−１０＊０１)若しくはＩＧＨＤ３−９(例えば、ＩＧＨＤ３−９＊０１)であり、及び/又は
Ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＪ６(例えば、ＩＧＨＪ６＊０２)、ＩＧＨＪ４(例えば、ＩＧＨＪ４＊０２)若しくはＩＧＨＪ３(例えば、ＩＧＨＪ３＊０２)である、ＶＨドメイン、又は
(ｉｉ)フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含むＶＨドメインであって、
ＦＲ１が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、
ＦＲ２が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、
ＦＲ３が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、及び/又は
ＦＲ４が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＪＨ６(例えば、ＪＨ６＊０２)、ＩＧＪＨ４(例えば、ＪＨ４＊０２)若しくはＩＧＪＨ３(例えば、ＪＨ３＊０２)と整列する、ＶＨドメインを含んでもよい。
【００２８】
ＶＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、典型的には、同じ生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントと整列する。したがって、例えば、本抗体は、ヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ３−２０(例えば、ＶＨ３−２０＊ｄ０１)、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント及びヒト重鎖Ｊ遺伝子セグメントＩＧＪＨ４(例えば、ＪＨ４＊０２)の組換えに由来するＶＨドメインを含んでもよい。抗体は、ＶＨドメインフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含んでもよく、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、各々、１、２、３、４、又は５個までのアミノ酸改変を有する、ヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ３−２０(例えば、ＩＧＶＨ３−２０＊ｄ０１)と整列し、ＦＲ４は、１、２、３、４、又は５個までのアミノ酸改変を有する、ヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子セグメントＩＧＨＪ４(例えば、ＩＧＨＪ４＊０２)と整列する。アラインメントは正確であることもあるが、場合によっては、生殖細胞系から１つ以上の残基を突然変異させることができるので、アミノ酸置換、又はまれに欠失若しくは挿入が存在してもよい。
【００２９】
本発明の抗体は、
(ｉ)ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及びヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントの組換えに由来する抗体ＶＬドメインであって、
Ｖセグメントが、ＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)であり、及び/又は
Ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＫＪ４(例えば、ＩＧＫＪ４＊０１)、ＩＧＫＪ２(例えば、ＩＧＫＪ２＊０４)、ＩＧＬＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)若しくはＩＧＫＪ１(例えば、ＩＧＫＪ１＊０１)である、抗体ＶＬドメイン、又は
(ｉｉ)フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体ＶＬドメインであって、
ＦＲ１が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、
ＦＲ２が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、
ＦＲ３が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、及び/又は
ＦＲ４が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＪ４(例えば、ＩＧＫＪ４＊０１)、ＩＧＫＪ２(例えば、ＩＧＫＪ２＊０４)、ＩＧＫＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)若しくはＩＧＫＪ１(例えば、ＩＧＫＪ１＊０１)と整列する、抗体ＶＬドメインを含んでもよい。
【００３０】
ＶＬドメインのＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、典型的には、同じ生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントと整列する。したがって、例えば、本抗体は、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントＩＧＫＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)の組換えに由来するＶＨドメインを含んでもよい。抗体は、ＶＬドメインフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含んでもよく、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、各々、１、２、３、４、又は５個までのアミノ酸改変を有する、ヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)と整列し、ＦＲ４は、１、２、３、４、又は５個までのアミノ酸改変を有する、ヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子セグメントＩＧＫＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)と整列する。アラインメントは正確であることもあるが、場合によっては、生殖細胞系から１つ以上の残基を突然変異させることができるので、アミノ酸置換、又はまれに欠失若しくは挿入が存在してもよい。
【００３１】
本発明に従う抗体は、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４若しくはＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＨドメインであるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＨドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、抗体ＶＨドメインを含んでもよい。アミノ酸配列同一性は、少なくとも９５％であり得る。
【００３２】
本抗体は、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４若しくはＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＬドメインであるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＬドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、抗体ＶＬドメインを含んでもよい。アミノ酸配列同一性は、少なくとも９５％であり得る。
【００３３】
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲを有するか、又はこれらのＣＤＲの変異型を有する抗体ＶＨドメインは、同じ抗体のＬＣＤＲを有するか、又はそれらのＣＤＲの変異型を有する抗体ＶＬドメインと対形成し得る。同様に、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のいずれかのＶＨドメイン又はそのＶＨドメインの変異型は、同じ抗体のＶＬドメイン、又は同じ抗体のＶＬドメイン変異型と対形成し得る。
【００３４】
例えば、本抗体は、抗体ＳＴＩＭ００１  ＶＨドメイン及びＳＴＩＭ００１  ＶＬドメインを含んでもよい。別の例では、本抗体は、抗体ＳＴＩＭ００２  ＶＨドメイン及びＳＴＩＭ００２  ＶＬドメインを含んでもよい。別の例では、本抗体は、抗体ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメイン及びＳＴＩＭ００３  ＶＬドメインを含んでもよい。
【００３５】
抗体は、定常領域、任意選択でヒト重鎖及び/又は軽鎖定常領域を含んでもよい。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１である。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される抗体の配列をコードする核酸分子、そのような核酸を含む宿主細胞、及び宿主細胞を培養し、抗体を発現させ、任意選択で抗体を単離又は精製することによって抗体を産生する方法を含む。これにより発現された抗体が得られる。本明細書に記載される抗体のＶＨ及びＶＬドメインも、同様に産生され得、また本発明の態様である。本抗体を含む薬学的組成物も提供される。
【００３７】
本発明の他の態様は、ＩＣＯＳノックアウト非ヒト動物、及びヒトＩＣＯＳに対する抗体を生成するためのそれらの使用に関する。ＩＣＯＳノックアウト動物では、例えば、ＩＣＯＳをコードする遺伝子が動物のゲノムから不活性化又は欠失されているため、ＩＣＯＳは発現されない。そのような動物は、非ヒト種由来のヒトＩＣＯＳ及びＩＣＯＳの両方を認識する種交差反応性抗体を生成するために有用である。免疫寛容の正常な過程は、「自己」抗原を認識するリンパ球が、体内での自己免疫反応を防ぐために欠失又は不活性化されることを意味し、一方、非ヒトノックアウト動物における内因性ＩＣＯＳ抗原の不在は、組換えタンパク質として注入される場合、又はＩＣＯＳを発現する細胞系又は小胞を使用する場合には、動物の免疫系がその抗原に対して寛容化されるべきではないため、ＩＣＯＳに対する免疫応答を生じさせることができることを意味する。ノックアウト動物の免疫レパートリーは、その動物種からのＩＣＯＳタンパク質を認識することができるリンパ球を含むべきである。ヒトＩＣＯＳで免疫付与した非ヒト試験動物(例えば、マウス)は、このようにして、ヒトＩＣＯＳ及び試験動物ＩＣＯＳ(例えば、マウスＩＣＯＳ)の両方に結合する抗体を生成し得る。
【００３８】
これには少なくとも２つの利点がある。第一に、種交差反応性抗体は、非ヒト試験動物における前臨床試験に使用してから、ヒト臨床試験における開発に進めることができる。第二に、ノックアウト動物の免疫系は、ＩＣＯＳ発現動物によって認識されるものと比較して、ヒトＩＣＯＳ分子上でより多数の可能性のあるエピトープを認識することができ、その結果、ノックアウト動物の免疫レパートリーが抗体のより優れた機能的多様性を含むようになり得る。異なる種由来の相同ＩＣＯＳ分子の配列間に類似性があるので、非ヒト動物の免疫系は、通常、非ヒト動物ＩＣＯＳのタンパク質と一致するヒトＩＣＯＳタンパク質の領域に対して寛容化され得るが、この寛容化はノックアウト動物では起こらない。
【００３９】
ＩＣＯＳノックアウト動物を使用する能力、及び交差反応性抗体を生成するためのその利点は、実施例に示されている。ＩＣＯＳノックアウト動物が首尾よく免疫付与されて、抗体応答を生み得ることは特に驚くべきことであり、これは、ＩＣＯＳ自体が、胚中心の形成及び維持等の免疫系生物学に関与し、ＩＣＯＳ陽性細胞であるＴ濾胞ヘルパー細胞に対するその役割を介して免疫応答の生成に寄与するためである［３７］。これを考慮すると、ＩＣＯＳノックアウト動物は、よくても不良な抗体応答した生まないことが予測され得る。驚くべきことに、ＩＣＯＳノックアウトマウスにおいて強い力価が得られ、所望の交差反応性抗体を含む、高機能抗体が、抗体レパートリーの中から単離された。
【００４０】
本発明の例示的な実施形態は、添付の特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
これから、本発明のある特定の態様及び実施形態を、添付の図面を参照してより詳細に説明する。
【００４２】
【図１】フローサイトメトリーによりＣＨＯ細胞上に発現されたヒト及びマウスＩＣＯＳに対するＩＣＯＳ  ＫＯ及び野生型Ｋｙｍｏｕｓｅの血清力価の測定。データは、ヒトＩＣＯＳ発現ＭＥＦ細胞及びヒトＩＣＯＳタンパク質で各々免疫付与した、(ａ)ＩＣＯＳ  ＫＯマウス(ＫＯ)又は(ｂ)野生型非ＩＣＯＳ  ＫＯマウス(ＨＫ又はＨＬ)の血清中の免疫グロブリンが、ＣＨＯ細胞上で発現されるヒトＩＣＯＳ(ヒトＩＣＯＳ結合)又はマウスＩＣＯＳ(マウスＩＣＯＳ結合)に結合する能力を示す。幾何平均は、フローサイトメトリーによって判定した場合の、細胞への免疫グロブリン結合の蛍光強度の尺度である。
【図２】ヒトＩＣＯＳ受容体を用いたヒトＩＣＯＳ−リガンド中和ＨＴＲＦ。Ｃ３９８．４Ａ及びそれぞれのアイソタイプ対照と比較したヒトＩｇＧ１フォーマットのＳＴＩＭ００１〜ＳＴＩＭ００９抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの中和プロファイル。データは、４つの実験を代表する。
【図３】マウスＩＣＯＳ受容体を用いたマウスＩＣＯＳ−リガンド中和ＨＴＲＦ。Ｃ３９８．４Ａ及びそれぞれのアイソタイプ対照と比較したヒトＩｇＧ１フォーマットのＳＴＩＭ００１〜ＳＴＩＭ００９抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの中和プロファイル。データは、３つの実験を代表する。
【図４】ヒトＩＣＯＳ受容体を用いたヒトＩＣＯＳ−リガンド直接中和ＨＴＲＦ。Ｃ３９８．４Ａ及びそれぞれのアイソタイプ対照と比較したヒトＩｇＧ４．ＰＥフォーマットのＳＴＩＭ００１〜ＳＴＩＭ００９抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの中和プロファイル。データは、４つの実験を代表する。
【図５】マウスＩＣＯＳ受容体を用いたマウスＩＣＯＳ−リガンド中和ＨＴＲＦ。Ｃ３９８．４Ａ及びそれぞれのアイソタイプ対照と比較したヒトＩｇＧ４．ＰＥフォーマットのＳＴＩＭ００１〜ＳＴＩＭ００９抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの中和プロファイル。データは、４つの実験を代表する。
【図６】ａ．新しく単離されたＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用することによるＭＪ細胞におけるＳＴＩＭ００１媒介性ＡＤＣＣの濃度依存的研究。エフェクター細胞及び標的細胞(エフェクター：標的比５：１)を抗体とともに２時間インキュベートした。溶解した標的細胞から放出されるＢＡＴＤＡを、製造業者のキット説明書に記載されているように測定した。ＨＣは、ハイブリッドアイソタイプ対照である。ｂ、ｃ、ｄ．新しく単離されたＮＫ細胞をエフェクター細胞としたＭＪ細胞におけるＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３媒介性ＡＤＣＣの濃度依存的研究。エフェクター細胞及び標的細胞(エフェクター：標的比５：１)を抗体とともに２時間インキュベートした。溶解した標的細胞から放出されるＢＡＴＤＡを、製造業者のキット説明書に記載されているように測定した。ＨＣは、ハイブリッドアイソタイプ対照である。ｅ、ｆ、ｇ．新しく単離されたＮＫ細胞をエフェクター細胞とするＩＣＯＳトランスフェクトＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞におけるＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)媒介性ＡＤＣＣの濃度依存的研究。エフェクター細胞及び標的細胞(エフェクター：標的比５：１)を抗体とともに４時間インキュベートした。溶解した標的細胞から放出されるＢＡＴＤＡを、製造業者のキット説明書に記載されているように測定した。ＨＣは、ハイブリッドアイソタイプ対照である。
【図７】抗ＩＣＯＳ抗体は、単剤療法として又は抗ＰＤＬ１と組み合わせて投与した場合、ＣＴ２６腫瘍成長を阻害し、生存率を改善させた。ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａは、ｍＩｇＧ１フォーマットよりも強力である。治癒したか又は不変状態にある動物の数が、各グラフに示される。
【図８】抗ＩＣＯＳ抗体は、単剤療法として又は抗ＰＤＬ１と組み合わせて投与した場合、ＣＴ２６腫瘍成長を阻害し、生存率を改善させた。ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａは、ｍＩｇＧ１フォーマットよりも強力である。治癒したか又は不変状態にある動物の数が、各グラフに示される。
【図９】抗ＩＣＯＳ抗体は、単剤療法として又は抗ＰＤＬ１と組み合わせて投与した場合、ＣＴ２６腫瘍成長を阻害し、生存率を改善させた。ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａは、ｍＩｇＧ１フォーマットよりも強力である。治癒したか又は不変状態にある動物の数が、各グラフに示される。
【図１０】２×２組合せのＣＴ２６インビボ有効性試験。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝１０)の腫瘍サイズを示す「スパイダープロット」によって表される。抗ＰＤＬ１抗体と組み合わせると、ＳＴＩＭ００１は、腫瘍成長を遅延させ、処置動物の生存率を改善する。ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａの存在下で観察された有効性は、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ１の有効性よりも優れている。最後に、抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａと組み合わせたＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａは、抗腫瘍応答を引き起こす最も強力な組合せであり、動物の６０％が疾患治癒した。各群について、疾患の治癒した動物の数が、それぞれのグラフの右上に示される。投薬は、６、８、１０、１３、１５、及び１７日目であった。
【図１１】抗ＩＣＯＳ又は抗ＰＤＬ１単独療法又は併用療法で処置した動物の経時的ＣＴ２６腫瘍体積を示すグラフ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝１０)の腫瘍サイズを示す「スパイダープロット」によって表される。各群について、腫瘍サイズが１００ｍｍ＾３未満(疾患の安定/治癒)の動物の数が、それぞれのグラフの右上に示される。投薬は、６、８、１０、１３、１５、及び１７日目に行われた。投与時間は、網掛け部分によって示される。(ａ)アイソタイプ対照、(ｂ)抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａ  ＡｂＷ、(ｃ)抗ＩＣＯＳ  ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ１、(ｄ)抗ＩＣＯＳ  ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ、(ｅ)抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａ  ＡｂＷ＋ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ１、(ｆ)抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａ  ＡｂＷ＋ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ。ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２は、抗ＰＤＬ１(ＡｂＷ)ｍＩｇＧ２ａと組み合わせた場合、ＣＴ２６腫瘍成長を有意に阻害する。
【図１２】ＭＪ細胞インビトロ活性化アッセイ−ビーズ結合。抗ＩＣＯＳ  Ｃ３９８．４Ａ及びそれぞれのアイソタイプ対照と比較した、ビーズに結合したＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、及びＳＴＩＭ００３抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの刺激プロファイル。データは２回の実験の平均を表す(Ｃ３９８．４Ａアイソタイプ対照ビーズの場合、ｎ＝１)。
【図１３】ＭＪ細胞インビトロ活性化アッセイ−プレート結合。抗ＩＣＯＳ  Ｃ３９８．４Ａ及びそれぞれのアイソタイプ対照と比較した、プレートに結合したＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００３、及びＳＴＩＭ００４抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂの刺激プロファイル。データは２回の実験の平均を表す。
【図１４】活性化Ｔ細胞へのＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３  ｈＩｇＧ１結合のＦＡＣＳ分析。(ａ)は、活性化Ｔ細胞に結合する前標識抗体の用量応答の代表的な実験を示し、(ｂ)は、裸の抗体の用量応答後の結合、続く二次標識抗体による検出を示す。表は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して判定した関連ＥＣ５０(Ｍ)を示す。
【図１５】ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３は、腫瘍部位のＴ細胞コンパートメントに対するアイソタイプ依存性の効果を示した。合計１×１０Ｅ５  ＣＴ−２６腫瘍細胞をＢａｌｂ/ｃ雌マウスに皮下移植した。移植後１３日目及び１５日目に、動物に抗体又は生理食塩水を腹腔内投与した(ｎ＝１０/各群)。移植後１６日目に、腫瘍を有する動物(ｎ＝８/各群)から脾臓及び腫瘍を採取し、ＦＡＣＳ分析のために解離させ染色した。Ａ、ＣＤ４細胞について陽性であるＣＤ３細胞のパーセンテージ。Ｂ、ＣＤ８細胞について陽性であるＣＤ３細胞のパーセンテージ。Ｃ、Ｆｏｘｐ３＋及びＣＤ２５＋であるＣＤ４細胞のパーセンテージ。Ｄ、Ｆｏｘｐ３＋及びＣＤ２５＋について陽性である脾臓におけるＣＤ４細胞のパーセンテージ。Ｅ、全ＣＤ４細胞におけるＣＤ４エフェクター細胞のパーセンテージ。Ｆ、ＣＤ８エフェクター対Ｔ−Ｒｅｇ細胞の比。Ｇ、ＣＤ４エフェクター対Ｔ−Ｒｅｇ細胞の比。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して統計分析を行い、抗体処置群全てを生理食塩水処置群と比較し、Ｐ値を、有意(ｐ＜０．０５)である場合に記録した。値は平均＋ＳＤを示す(ｎ＝８マウス/群)。Ｆについて、値は平均＋ＳＥＭを示す。
【図１６】Ｔ細胞活性化アッセイ１における抗ＣＤ３/抗ＣＤ２８ダイナビーズで３日間共刺激した単離されたヒトＴ細胞に対するＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)アゴニスト効果の濃度依存的研究からのデータ例(実施例９ｂ参照)。ＩＦＮ−γ産生をアゴニスト効果の指標として使用した。ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)を、プレート結合、可溶性又は架橋可溶性(Ｆｃ結合Ａｂ)フォーマットで試験し、ハイブリッドアイソタイプ対照(ＨＣ  ｈＩｇＧ１)と比較した。プレート結合アッセイにおける比較のために、ハムスター抗体Ｃ３９８．４Ａ及びそのアイソタイプ対照(ハムスターＩｇＧ)を含めた。上のパネルは、プレート結合抗体からのデータを示す。下のパネルは、可溶性及び架橋フォーマットのＩｇＧ１抗体からのデータを示す。左パネル及び右パネルは、それぞれ、２人の独立したヒトドナー由来のＴ細胞を使用する。
【図１７】Ｔ細胞活性化アッセイ１におけるＳＴＩＭ００１のデータセット例(実施例９参照)。データは、８人の独立したヒトドナー由来のＴ細胞について、ある所定の用量でＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)又はそのハイブリッドアイソタイプ対照(ＨＣ  ＩｇＧ１)によって誘導されたＩＦＮ−γのレベルを示す。プレート結合抗体(図１７ａ)は５μｇ/ｍｌで使用した。可溶性抗体(図１７ｂ)は１５μｇ/ｍｌで使用した。各点は、番号(例えば、Ｄ２１４)で識別される１人のドナーを表す。ウィルコクソン統計学的検定を使用して有意性を評価した。＊はｐ  ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。
【図１８】Ｔ細胞活性化アッセイ１におけるＳＴＩＭ００３のデータセット例(実施例９参照)。データは、８人の独立した健康なヒトドナー由来のＴ細胞について、ある所定の用量でＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)又はそのハイブリッドアイソタイプ対照(ＨＣ  ｈＩｇＧ１)によって誘導されたＩＦＮ−γのレベルを示す。可溶性抗体(図１８ａ)は１５μｇ/ｍｌで使用した。プレート結合抗体(図１８ｂ)は５μｇ/ｍｌで使用した。各点は、番号(例えば、Ｄ２１４)で識別される１人のドナーを表す。ウィルコクソン統計学的検定を使用して有意性を評価した。＊はｐ  ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。
【図１９】Ｔ細胞活性化アッセイ２からのデータ例(実施例９ｃ参照)。抗ＣＤ３/抗ＣＤ２８ダイナビーズで３日間刺激した後、培地中で３日間静置し、最後にプレートに結合したＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、又はＣ３９８．４Ａ  Ａｂ＋/−ＣＤ３  Ａｂで再刺激した、単離されたヒトＴ細胞に対する、ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)アゴニスト効果の研究。１つの所定の用量による、及びＣＤ３  Ａｂと組み合わせた(ＴＣＲ従事)、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３によって誘導されたＩＦＮ−γ(Ａ、Ｂ)、ＴＮＦ−α(Ｃ、Ｄ)、及びＩＬ−２(Ｅ、Ｆ)のレベルと、それらのハイブリッド対照ＩｇＧ１(Ａ、Ｃ、Ｅ)又はＣ３９８．４Ａのレベルと、そのハムスターＩｇＧ対照(Ｂ、Ｄ、Ｆ)のレベルとを比較したデータ。各点は、その番号(例えば、Ｄ１９０)によって識別可能な独立したドナーを表す。Ａｂとそれらのアイソタイプ対照との間の統計学的有意性を、ウィルコクソン統計学的検定及び示されるｐ値を使用して評価した。ＳＴＩＭ００３の濃度がＨＣ  ＩｇＧ１の濃度とわずかに異なっていた(５．４対５μｇ/ｍｌ)ことに留意されたい。
【図２０】ＣＴ２６腫瘍、及びその表面上にＩＣＯＳを発現する腫瘍保有動物の脾臓における免疫細胞(ＣＤ８  Ｔ−エフェクター、ＣＤ４  Ｔ−エフェクター、及びＣＤ４/ＦｏｘＰ３  ＴＲｅｇ細胞)のパーセンテージを示すグラフ。値は平均±ＳＤ(ｎ＝８)を示す。ノンパラメトリックのダンの多重比較検定を使用して、Ｐ値を計算した。ＮＳ＝有意ではない、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図２１】平均蛍光強度(ＭＦＩ)によって判定した、免疫細胞ＣＤ８  Ｔエフェクター、ＣＤ４  Ｔエフェクター、及びＣＤ４/ＦｏｘＰ３  ＴＲｅｇの表面上のＩＣＯＳの相対的発現。値は平均±ＳＤ(ｎ＝８)を示す。ノンパラメトリックのダンの多重比較検定を使用して、Ｐ値を計算した。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、＊＊＝ｐ＜０．０１。脾臓(低)と腫瘍(高)との蛍光強度の差に留意されたい。
【図２２】ＣＴ２６腫瘍の微小環境における異なる免疫細胞のパーセンテージに対するＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の効果。＊＝ｐ＜０．０５。
【図２３】ＣＴ２６腫瘍の微小環境における制御性Ｔ細胞(ＣＤ４＋/ＦｏｘＰ３＋細胞)のパーセンテージに対する抗体ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の効果。＊＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。値は平均±ＳＤ(ｎ＝８)を示す。ノンパラメトリックのダンの多重比較検定を使用して、Ｐ値を計算した。
【図２４】ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２は、ＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ８エフェクターＴ細胞対ＴＲｅｇ比及びＣＤ４エフェクターＴ細胞対ＴＲｅｇ比を有意に増加させる。比は、腫瘍中のエフェクター細胞のパーセンテージを、腫瘍中の制御性Ｔ細胞のパーセンテージで割ることによって判定した。
【図２５】ＣＴ２６腫瘍を有する動物の脾臓における免疫細胞のパーセンテージに対する抗体の効果。
【図２６】ＣＴ２６腫瘍を有する動物の脾臓における制御性Ｔ細胞(ＣＤ４＋/ＦｏｘＰ３＋細胞)のパーセンテージに対する抗体の効果。
【図２７】ＣＴ２６腫瘍を有する動物の脾臓における、(Ａ)ＣＤ８エフェクター：Ｔｒｅｇ比、及び(Ｂ)ＣＤ４：ＴＲｅｇ比。
【図２８】ＡＦ６４７結合ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３及びｈＩｇＧ１ハイブリッドコントロール(ＨＣ  ＩｇＧ１)の活性化モーリシャスカニクイザルｐａｎ  Ｔ細胞に対する表面染色。Ｔ細胞の異なるドナー源を使用したアッセイからのデータを、それぞれＡ及びＢに示す。ＥＣ５０値を表に示す。
【図２９】ＣＴ２６  Ｂａｌｂ/ＣモデルのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。網掛け部は投薬ウィンドウを示す。ログランクｐ＜０．０００１。
【図３０】実施例２０に記載の研究のためのマウスにおけるＡ２０腫瘍の経時的な体積を示すグラフ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝８)における腫瘍サイズを示すスパイダープロットによって表される。各群について、腫瘍の徴候のない(疾患の治癒を示す)動物の数がグラフの左下に示される。投与は、腫瘍細胞移植の８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目に行われ、投与時間は灰色の網掛け部分によって示される。対照群(図３０)及び抗ＰＤ−Ｌ１処置群(図３１)と比較して、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ(図３２)及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ(図３３)処置群は、Ａ２０腫瘍増殖の有意な阻害を示した。
【図３１】実施例２０に記載の研究のためのマウスにおけるＡ２０腫瘍の経時的な体積を示すグラフ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝８)における腫瘍サイズを示すスパイダープロットによって表される。各群について、腫瘍の徴候のない(疾患の治癒を示す)動物の数がグラフの左下に示される。投与は、腫瘍細胞移植の８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目に行われ、投与時間は灰色の網掛け部分によって示される。対照群(図３０)及び抗ＰＤ−Ｌ１処置群(図３１)と比較して、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ(図３２)及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ(図３３)処置群は、Ａ２０腫瘍増殖の有意な阻害を示した。
【図３２】実施例２０に記載の研究のためのマウスにおけるＡ２０腫瘍の経時的な体積を示すグラフ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝８)における腫瘍サイズを示すスパイダープロットによって表される。各群について、腫瘍の徴候のない(疾患の治癒を示す)動物の数がグラフの左下に示される。投与は、腫瘍細胞移植の８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目に行われ、投与時間は灰色の網掛け部分によって示される。対照群(図３０)及び抗ＰＤ−Ｌ１処置群(図３１)と比較して、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ(図３２)及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ(図３３)処置群は、Ａ２０腫瘍増殖の有意な阻害を示した。
【図３３】実施例２０に記載の研究のためのマウスにおけるＡ２０腫瘍の経時的な体積を示すグラフ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝８)における腫瘍サイズを示すスパイダープロットによって表される。各群について、腫瘍の徴候のない(疾患の治癒を示す)動物の数がグラフの左下に示される。投与は、腫瘍細胞移植の８、１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目に行われ、投与時間は灰色の網掛け部分によって示される。対照群(図３０)及び抗ＰＤ−Ｌ１処置群(図３１)と比較して、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ(図３２)及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ(図３３)処置群は、Ａ２０腫瘍増殖の有意な阻害を示した。
【図３４】抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＩｇＧ２ａ抗体と単回用量又は複数回用量のＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａとの組合せを使用した実施例１１ｃに記載のＣＴ２６インビボ有効性試験からのデータ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝８)の腫瘍サイズを示す「スパイダープロット」によって表される。各群について、疾患の治癒した動物の数が、それぞれのグラフの右下に示される。各抗体の投薬日数は、それぞれのグラフの下の矢印によって示される。
【図３５】ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２Ｂ、並びに関連抗体ＣＬ−６１０９１、ＣＬ−６４５３６、ＣＬ−６４８３７、ＣＬ−６４８４１、及びＣＬ−６４８４１の対応する配列、並びに/又はヒト生殖細胞系列が異なる残基を示す、ＳＴＩＭ００２  ＶＨ(上)及びＶＬ(下)ドメインのアミノ酸配列。配列番号はＩＭＧＴに従う。
【図３６】関連抗体ＣＬ−７１６４２及びＣＬ−７４５７０の対応する配列並びに/又はヒト生殖細胞系列が異なる残基を示す、ＳＴＩＭ００３  ＶＨ(上)及びＶＬ(下)ドメインのアミノ酸配列。配列番号はＩＭＧＴに従う。配列決定から得られた抗体ＣＬ−７１６４２のＶＬドメインが、Ｎ末端残基を伴わずにここに示される。この整列から、完全ＶＨドメイン配列はＮ末端グルタミン酸を含むことが分かる。
【図３７】ＳＴＩＭ００７の対応する配列及び/又はヒト生殖細胞系列が異なる残基を示す、ＳＴＩＭ００７  ＶＨ(上)及びＶＬ(下)ドメインのアミノ酸配列。配列番号はＩＭＧＴに従う。
【図３８】Ｊ５５８同系モデルにおけるＳＴＩＭ００３(抗ＩＣＯＳ)及びＡｂＷ(抗ＰＤ−Ｌ１)ｍＩｇＧ２ａ抗体の効果。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝１０又はｎ＝８)の腫瘍サイズを示す「スパイダープロット」によって表される。ＳＴＩＭ００３単独療法は、疾患から治癒した動物８匹のうち３匹でいくらかの有効性を示した。同様に、抗ＰＤＬ１は、このモデルにおいて有効であり、３７日目までに動物８匹のうち６匹が疾患から治癒した。抗ＰＤＬ１抗体と組み合わせると、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２は、腫瘍増殖を完全に阻害し、処置動物の生存率を改善した。各群について、疾患の治癒した動物の数が、それぞれのグラフの右下に示される。投薬日は点線で示される(１１、１５、１８、２２、２５、及び２９日目)。
【図３９】腫瘍組織中の異なるＴＩＬＳ細胞サブタイプ上のＩＣＯＳ発現の定量(陽性細胞のパーセンテージ及び相対的発現/ｄＭＦＩ)。生理食塩水又は抗ＰＤ−Ｌ１若しくは抗ＰＤ−１代理抗体で処置した動物の免疫細胞サブタイプの、(Ａ)ＩＣＯＳ発現について陽性である免疫細胞サブタイプの％、(Ｂ)ＩＣＯＳ  ｄＭＦＩ(ＩＣＯＳ陽性細胞上の相対的ＩＣＯＳ発現)。０日目に１００μｌの１×１０６生存細胞/ｍｌをマウスに移植した(ｎ＝７又はｎ＝８)。１３日目及び１５日目に、動物に１３０μｇの抗体を腹腔内投与した。組織試料を単離し、１６日目に分析した。ＣＤ４＋/ＦＯＸＰ３＋細胞は、ＴＲｅｇ集団(右端側のグラフ)にのみ含まれ、全てＦｏｘｐ３陰性である「エフェクター」ＣＤ４細胞(左端側のグラフ)から除外された。実施例２２を参照されたい。
【図４０】Ａ２０インビボ有効性試験のデータ。各処置群は、個々の動物(群当たりｎ＝１０)の腫瘍サイズを示す「スパイダープロット」によって表される。各群について、疾患の治癒した動物の数が、それぞれのグラフに示される。複数回用量について、投薬は、点線で示される、８、１１、１５、１８、２２、及び２５日目に行われた。単回用量については、動物は８日目にのみ腹腔内注射を受けた。(Ａ)生理食塩水、(Ｂ)ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ複数回用量、(Ｃ)ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ単回用量。実施例２３を参照されたい。
【図４１】ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの固定用量６０μｇによる実施例２３に報告される研究についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。ＳＤ＝単回用量、８日目。ＭＤ＝８日目からの複数回用量のＢＩＷ。
【図４２】生理食塩水を投与したＣＴ２６腫瘍を有する動物(１時点あたりｎ＝４)由来の主要なＴ細胞サブセット(Ｔ−ｒｅｇ［ＣＤ４＋/ＦｏｘＰ３＋］、ＣＤ４  Ｅｆｆ［ＣＤ４＋/ＦｏｘＰ３−］細胞及びＣＤ８＋)上のＩＣＯＳ発現。免疫細胞の表現型決定を、処置後１、２、３、４、及び８日目に行い、全ての時点で全ての組織においてＩＣＯＳ発現について染色した。Ａ〜Ｄは、４つの異なる組織における全ての時点でのＩＣＯＳ陽性細胞のパーセンテージを示す。Ｅ〜Ｈは、４つの異なる組織における全て時点でのＩＣＯＳ  ｄＭＦＩ(相対的発現)を示す。実施例２４を参照されたい。
【図４３】ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ抗体に応答したＴＭＥのＴ−ｒｅｇ枯渇を実証するＦＡＣＳ分析。ＣＴ−２６腫瘍を有する動物を、腫瘍細胞移植後１２日目にＳＴＩＭ００３の単回用量(６、６０、又は２００μｇ)で処置した。組織(１時点あたりｎ＝４)を、処置後１、２、３、４、及び８日目にＦＡＣＳ分析のために採取した。全腫瘍におけるＴ−ｒｅｇ細胞(ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｆｏｘｐ３＋  )(Ａ)のパーセンテージ及び血液中のＴ−ｒｅｇ細胞のパーセンテージ(Ｂ)を、異なる時点で示す。実施例２４を参照されたい。
【図４４】ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａに応答した、ＣＤ８：Ｔ  ｒｅｇ及びＣＤ４  ｅｆｆ：Ｔ−ｒｅｇの比の増加。ＣＴ−２６腫瘍を有する動物に、腫瘍細胞移植後１２日目にＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの単回用量(６、６０、又は２００μｇ)を与えた。組織(１時点あたりｎ＝４)を、処置後１、２、３、４、及び８日目にＦＡＣＳ分析のために採取し、Ｔ  ｅｆｆ対Ｔ  ｒｅｇ比を計算した。(Ａ)及び(Ｂ)は腫瘍及び血液中のＣＤ８：Ｔｒｅｇ比であり、(Ｃ)及び(Ｄ)は腫瘍及び血液中のＣＤ４−ｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比である。実施例２４を参照されたい。
【図４５】ＳＴＩＭ００３処置は、ＴＩＬによる脱顆粒及びＴｈ１サイトカイン産生の増加と相関する。処置後８日目に、ＴＩＬを単離し、ＦＡＣＳ分析を行って、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞(Ａ〜Ｂ)上のＣＤ１０７ａ発現を検出した。平行して、解離した腫瘍由来の細胞をＢｒｅｆｅｌｄｉｎ−Ａの存在下で４時間静置し、細胞をＴ細胞マーカーについて染色し、細胞内染色のために透過処理して、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α(Ｃ〜Ｈ)を検出した。実施例２４を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
ＩＣＯＳ
本発明に従う抗体は、ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する。したがって、抗体は、ＩＣＯＳ発現Ｔリンパ球に結合する。本明細書で言及される「ＩＣＯＳ」又は「ＩＣＯＳ受容体」は、文脈によって別段の指示がない限り、ヒトＩＣＯＳであり得る。ヒト、カニクイザル、及びマウスＩＣＯＳの配列は、添付の配列表に示され、ヒトＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０３６２２４．１、マウスＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０５９５０８．２、及びカニクイザルＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＥＨＨ５５０９８．１として、ＮＣＢＩから入手可能である。
【００４４】
交差反応性
本発明に従う抗体は、好ましくは交差反応性であり、例えば、マウスＩＣＯＳ及びヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合し得る。本抗体は、カニクイザル等の霊長類のＩＣＯＳを含む他の非ヒトＩＣＯＳに結合し得る。ヒトにおける治療的使用を意図した抗ＩＣＯＳ抗体はヒトＩＣＯＳに結合しなければならないが、他の種のＩＣＯＳに対する結合はヒト臨床的状況において直接の治療的関連性を有しない。それにもかかわらず、本明細書のデータにより、ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳの両方に結合する抗体が、それらをアゴニスト及び枯渇分子として特に好適にする特性を有することが示される。これは、交差反応性抗体によって標的化される１つ以上の特定のエピトープから生じ得る。しかし、基礎となる理論にかかわらず、交差反応性抗体は高価値であり、前臨床及び臨床試験のための治療分子として優れた候補である。
【００４５】
実験実施例で説明するように、マウスＩＣＯＳ(ＩＣＯＳノックアウト)の発現を欠くようにマウスを操作したＫｙｍｏｕｓｅ(商標)技術を使用して、本明細書に記載のＳＴＩＭ抗体を生成した。ＩＣＯＳノックアウトトランスジェニック動物、及び交差反応性抗体を生成するためのその使用は、本発明のさらなる態様である。
【００４６】
抗体の種交差反応性の程度を定量する１つの方法は、ある種の抗原に対する、別の種の抗原と比較したその親和性の倍数差、例えば、ヒトＩＣＯＳ対マウスＩＣＯＳに対する親和性の倍数差としてである。親和性は、本明細書の他箇所に記載されるＦａｂフォーマットの抗体を用いてＳＰＲによって判定される抗体−抗原反応の平衡解離定数を指すＫＤとして定量されてもよい。種交差反応性抗ＩＣＯＳ抗体は、ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳに結合する親和性の倍数差が、３０倍以下、２５倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１０倍以下、又は５倍以下であり得る。別の言い方をすれば、ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合するＫＤは、マウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合するＫＤの３０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍、又は５倍以内であり得る。抗体はまた、両種の抗原に結合するＫＤが閾値を満たす場合、例えば、ヒトＩＣＯＳに結合するＫＤ及びマウスＩＣＯＳに結合するＫＤが、両方とも、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である場合、交差反応性であるとみなすことができる。ＫＤは、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下であってもよい。ＫＤは、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下であってもよい。
【００４７】
ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳに結合するための交差反応性の別の尺度は、ＨＴＲＦアッセイ等における、ＩＣＯＳ受容体に対するＩＣＯＳリガンドの結合を中和する抗体の能力である(実施例８参照)。種交差反応性抗体の例が提供され、これには、各々が、ＨＴＲＦアッセイにおいて、ヒトＩＣＯＳに対するヒトＢ７−Ｈ２(ＩＣＯＳリガンド)の結合を中和し、マウスＩＣＯＳに対するマウスＢ７−Ｈ２の結合を中和するものとして確認された、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００５、及びＳＴＩＭ００６が含まれる。ヒト及びマウスのＩＣＯＳに対して交差反応性の抗体が所望される場合に、これらの抗体又はその変異型のいずれかが選択され得る。種交差反応性抗ＩＣＯＳ抗体は、ヒトＩＣＯＳのヒトＩＣＯＳ受容体に対する結合を阻害するＩＣ５０が、ＨＴＲＦアッセイにおいて判定した場合、マウスＩＣＯＳのマウスＩＣＯＳ受容体に対する結合を阻害するＩＣ５０の２５倍、２０倍、１５倍、１０倍、又は５倍以内であり得る。抗体はまた、ヒトＩＣＯＳのヒトＩＣＯＳ受容体に対する結合を阻害するＩＣ５０とマウスＩＣＯＳのマウスＩＣＯＳ受容体に対する結合を阻害するＩＣ５０とが、両方とも、１ｍＭ以下、好ましくは０．５ｍＭ以下、例えば、３０ｍＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下であるである場合、交差反応性であるとみなすことができる。ＩＣ５０は、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、又は２ｎＭ以下であってもよい。いくつかの場合には、ＩＣ５０は、少なくとも０．１ｎＭ、少なくとも０．５ｎＭ、又は少なくとも１ｎＭとなる。
【００４８】
特異性
本発明に従う抗体は、好ましくはＩＣＯＳに特異的である。つまり、本抗体は、標的タンパク質であるＩＣＯＳ(ヒトＩＣＯＳ、及び好ましくは上述のようなマウス及び/又はカニクイザルＩＣＯＳ)上のそのエピトープに結合するが、ＣＤ２８遺伝子ファミリー中の他の分子を含む、そのエピトープを提示しない分子には有意な結合を示さない。本発明に従う抗体は、好ましくはヒトＣＤ２８に結合しない。本抗体は、好ましくは、マウス又はカニクイザルＣＤ２８にも結合しない。
【００４９】
ＣＤ２８は、ＴＣＲを介した抗原認識の状況において、専門的な抗原提示細胞上のそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６によって従事させられるときに、Ｔ細胞応答を共刺激する。本明細書に記載の抗体の様々なインビボでの使用のために、ＣＤ２８に対する結合の回避は有利であると考えられる。抗ＩＣＯＳ抗体のＣＤ２８に対する非結合により、ＣＤ２８がその天然のリガンドと相互作用し、Ｔ細胞活性化のための適切な共刺激シグナルを生成することが可能となるはずである。加えて、抗ＩＣＯＳ抗体のＣＤ２８に対する非結合により、スーパーアゴニズムの危険性が回避される。ＣＤ２８の過剰刺激により、ＴＣＲを介した同族抗原の認識のための通常の必要条件なしに休止Ｔ細胞における増殖が誘発され得、特にヒト対象において、Ｔ細胞の暴走した活性化及びその結果としてのサイトカイン放出症候群が引き起こされる可能性がある。したがって、本発明に従う抗体によるＣＤ２８の非認識は、ヒトにおけるそれらの安全な臨床的使用の観点から利点を示す。
【００５０】
本明細書の他箇所で考察するように、本発明は多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)に及ぶ。多重特異性(例えば、二重特異性)抗体は、(ｉ)ＩＣＯＳのための抗体抗原結合部位と、(ｉｉ)別の抗原(例えば、ＰＤ−Ｌ１)を認識するさらなる抗原結合部位(任意選択で本明細書に記載の抗体抗原結合部位)とを含んでもよい。個々の抗原結合部位の特異的結合を判定してもよい。したがって、ＩＣＯＳに特異的に結合する抗体には、ＩＣＯＳに特異的に結合する抗原結合部位を含む抗体、例えば、ＩＣＯＳ及びＰＤ−Ｌ１に結合する二重特異性抗体が含まれ、これらの抗体中では、任意選択で、ＩＣＯＳの抗原結合部位が、１つ以上の他の抗原の１つ以上の追加の結合部位をさらに含む抗原結合部位内に含まれる。
【００５１】
親和性
ＩＣＯＳに対する抗体の結合親和性が判定され得る。抗体のその抗原に対する親和性は、平衡解離定数ＫＤ、抗体−抗原相互作用の会合又はオン速度(Ｋａ)及び解離又はオフ速度(ｋｄ)の比Ｋａ/Ｋｄの観点から定量され得る。抗体−抗原結合のためのＫｄ、Ｋａ、及びＫｄは、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)を使用して測定することができる。
【００５２】
本発明に従う抗体は、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下のＫＤでヒトＩＣＯＳのＥＣドメインに結合し得る。ＫＤは、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下であってもよい。ＫＤは、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下であってもよい。ＫＤは、少なくとも０．００１ｎＭ、例えば、少なくとも０．０１ｎＭ、又は少なくとも０．１ｎＭであってもよい。
【００５３】
親和性の定量は、Ｆａｂフォーマットの抗体によってＳＰＲを使用して行われ得る。好適なプロトコルは以下の通りである。
１．一級アミン結合等によって、抗ヒト(又は種が一致した他の抗体定常領域)ＩｇＧをバイオセンサチップ(例えば、ＧＬＭチップ)に結合させる。
２．抗ヒトＩｇＧ(又は他の一致した種の抗体)を、例えばＦａｂフォーマットの試験ＩｇＧ抗体に曝露して、チップ上で試験抗体を捕捉する。
３．例えば、５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、及び２ｎＭ、並びに０ｎＭ(すなわち、緩衝液のみ)の濃度の範囲でチップの捕捉表面上に試験抗原を通過させる。
４．２５℃で表面プラズモン共鳴を使用して、試験抗原に対する試験抗体の結合の親和性を判定する。緩衝液は、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤(例えば、Ｐ２０)、及び３ｍＭのＥＤＴＡであり得る。緩衝液は、任意選択で１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有してもよい。ＨＢＳ−ＥＰを泳動用緩衝液として使用することができる。ＨＢＳ−ＥＰは、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ(Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、カタログ番号Ｈ８０２２)から入手可能である。
【００５４】
捕捉表面の再生は、ｐＨ１．７の１０ｍＭグリシンを用いて実施され得る。これにより、捕捉された抗体が除去され、表面を別の相互作用に使用することが可能となる。結合データは、標準的な技法を使用して、例えば、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６(商標)分析ソフトウェアに固有のモデルを使用して、１：１の固有モデルに適合させることができる。
【００５５】
Ｂｉａｃｏｒｅ(商標)、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６(商標)(Ｂｉｏ−Ｒａｄ(登録商標))、及びＫｉｎＥｘＡ(登録商標)(Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ)等の様々なＳＰＲ装置が知られている。ＳＰＲの作業例は、実施例７に見出される。
【００５６】
記載されたように、親和性は、Ｆａｂフォーマットの抗体を用い、抗原をチップ表面に結合させ、試験抗体を溶液中でＦａｂフォーマットでチップ上に通過させて、モノマー性抗体−抗原相互作用の親和性を判定することによって、判定され得る。親和性はまた、任意の所望のｐＨ、例えば、ｐＨ５．５又はｐＨ７．６、及び任意の所望の温度、例えば、２５℃又は３７℃で判定することができる。実施例７に報告されるように、本発明に従う抗体は、１価(Ｆａｂ)フォーマットの抗体を用いてＳＰＲによって判定される場合、２ｎＭ未満の見かけの親和性でヒトＩＣＯＳに結合した。
【００５７】
抗体のＩＣＯＳに対する結合を測定する他の方法には、例えば、ＩＣＯＳの外因性表面発現を伴う細胞(例えば、ＣＨＯ細胞)又は内因性レベルのＩＣＯＳを発現する活性化された初代Ｔ細胞を使用する蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)が含まれる。ＦＡＣＳによって測定されるＩＣＯＳ発現細胞への抗体結合により、抗体がＩＣＯＳの細胞外(ＥＣ)ドメインに結合できることが示される。
【００５８】
ＩＣＯＳ受容体アゴニズム
ＩＣＯＳリガンド(Ｂ７−Ｈ２としても知られるＩＣＯＳＬ)は、ＩＣＯＳ受容体に結合する細胞表面発現分子である［１７］。この細胞間リガンド−受容体相互作用は、Ｔ細胞表面上のＩＣＯＳの多量体化を促進し、受容体を活性化し、Ｔ細胞における下流シグナル伝達を刺激する。エフェクターＴ細胞において、この受容体活性化により、エフェクターＴ細胞応答が刺激される。
【００５９】
抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳのアゴニストとして作用し、受容体に対する天然のＩＣＯＳリガンドのこの刺激効果を模倣し、さらにはこれを凌ぎ得る。そのようなアゴニズムは、Ｔ細胞上のＩＣＯＳの多量体化を促進する抗体の能力に起因し得る。これに対する１つの機序は、抗体がＴ細胞表面上のＩＣＯＳと隣接細胞(例えば、Ｂ細胞、抗原提示細胞、又は他の免疫細胞)上の受容体、例えばＦｃ受容体との間の細胞間架橋を形成する場合である。別の機序は、複数(例えば、２つ)の抗原結合部位(例えば、２つのＶＨ−ＶＬドメイン対)を有する抗体が複数のＩＣＯＳ受容体分子を架橋し、それにより多量体化を促進する場合である。これらの機序の組合せが生じてもよい。
【００６０】
アゴニズムは、架橋剤を含むか又はそれを排除して可溶性形態(例えば、免疫グロブリンフォーマット又は２つの空間的に離間した抗原結合部位、例えば、２つのＶＨ−ＶＬ対))の抗体を使用して、又は繋がれた抗原結合部位のアレイを提供するために固体表面に結合した抗体を使用して、インビトロＴ細胞活性化アッセイにおいて試験され得る。アゴニズムアッセイは、ＭＪ細胞(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４)等のヒトＩＣＯＳ陽性Ｔリンパ球細胞株をかかるアッセイにおける活性化のための標的Ｔ細胞として使用し得る。試験抗体についてＴ細胞活性化の１つ以上の尺度を判定することができ、参照分子又は陰性対照と比較して、試験抗体によってもたらされたＴ細胞活性化に、参照分子又は対照と比較した統計学的に有意な(ｐ＜０．０５)差異が存在するかどうかを判定することができる。Ｔ細胞活性化の１つの好適な尺度は、サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、又はＩＬ−２の産生である。当業者は、適宜、好適な対照を含め、試験抗体と対照との間のアッセイ条件を標準化するであろう。好適な負の対照は、ＩＣＯＳに結合しない同じフォーマットの抗体(例えば、アイソタイプ対照)、例えば、アッセイ系に存在しない抗原について特異的である抗体である。アッセイのダイナミックレンジ内で同起源のアイソタイプ対照と比較して試験対象について認められる有意差は、そのアッセイにおいて、抗体が、ＩＣＯＳ受容体のアゴニストとして作用することを示す。
【００６１】
アゴニスト抗体は、Ｔ細胞活性化アッセイで試験したときに、
対照抗体と比較して、ＩＦＮγ産生の誘導について有意に低いＥＣ５０を有し、
対照抗体と比較して、有意に高い最大ＩＦＮγ産生を誘導し、
ＩＣＯＳＬ−Ｆｃと比較して、ＩＦＮγ産生の誘導について有意に低いＥＣ５０を有し、
ＩＣＯＳＬ−Ｆｃと比較して、有意に高い最大ＩＦＮγ産生を誘導し、
参照抗体Ｃ３９８．４Ａと比較して、ＩＦＮγ産生の誘導について有意に低いＥＣ５０を有し、及び/又は
参照抗体Ｃ３９８．４Ａと比較して、有意に高い最大ＩＦＮγ産生を誘導するものとして定義され得る。
【００６２】
インビトロＴ細胞アッセイには、実施例１３のビーズ結合アッセイ、実施例１４のプレート結合アッセイ、及び実施例１５の可溶性形態アッセイが含まれる。
【００６３】
有意に低い又は有意に高い値は、例えば、参照又は対照値と比較して、最大で０．５倍異なる、最大で０．７５倍異なる、最大で２倍異なる、最大で３倍異なる、最大で４倍異なる、又は最大で５倍異なることであり得る。
【００６４】
したがって、一例では、ビーズ結合フォーマットの抗体を使用するＭＪ細胞活性化アッセイにおいて、本発明に従う抗体は、ＩＦＮγの誘導について、対照と比較して有意に低い、例えば少なくとも２倍低いＥＣ５０を有する。
【００６５】
ビーズ結合アッセイは、ビーズの表面に結合した抗体(及び、対照又は参照実験について、対照抗体、参照抗体、又はＩＣＯＳＬ−Ｆｃ)を使用する。磁気ビーズを使用してもよく、様々な種類、例えば、トシル活性化ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｍ−４５０(ＤＹＮＡＬ  Ｉｎｃ，５  Ｄｅｌａｗａｒｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１１０４２  Ｐｒｏｄ  Ｎｏ．１４０．０３，１４０．０４)が市販されている。ビーズは、実施例１３に記載のように、又は一般に、炭酸緩衝液(ｐＨ９．６、０．２Ｍ)中にコーティング材を溶解することによって、又は当該技術分野で既知の他の方法によって、コーティングされてもよい。ビーズの使用は、ビーズ表面に結合したタンパク質の量を良好な程度の精度で判定することを好都合に可能にする。標準的なＦｃタンパク質定量化方法は、ビーズ上に結合したタンパク質の定量化のために使用され得る。アッセイのダイナミックレンジ内の妥当な標準に関して、任意の好適な方法が使用され得る。ＤＥＬＦＩＡが実施例１３で例示されるが、ＥＬＩＳＡ又は他の方法を使用することができる。
【００６６】
抗体のアゴニズム活性はまた、初代ヒトＴリンパ球においてエクスビボで測定することもできる。このようなＴ細胞におけるＩＦＮγの発現を誘導する抗体の能力は、ＩＣＯＳアゴニズムの指標である。初代細胞を使用する２つのＴ細胞活性化アッセイが本明細書に記載される(実施例２、Ｔ細胞活性化アッセイ１及びＴ細胞活性化アッセイ２を参照されたい)。好ましくは、抗体は、Ｔ細胞活性化アッセイ１及び/又はＴ細胞活性化アッセイ２において、対照抗体と比較して、５μｇ/ｍＬのＩＦＮγの有意な(ｐ＜０．０５)誘導を示す。上記のように、抗ＩＣＯＳ抗体は、かかるアッセイにおいて、ＩＣＯＳ−Ｌ又はＣ３９８．４よりも大きい程度までＴ細胞活性化を刺激し得る。したがって、抗体は、Ｔ細胞活性化アッセイ１又は２において、対照又は参照抗体と比較して、５μｇ/ｍＬの有意に(ｐ＜０．０５)大きいＩＦＮγの誘導を示し得る。ＴＮＦα又はＩＬ−２誘導は、代替的なアッセイ読み出し値として測定され得る。
【００６７】
抗ＩＣＯＳ抗体のアゴニズムは、例えば、腫瘍微小環境等の病理部位において、ＴＥｆｆ細胞のために、インビボでＴＲｅｇ及びＴＥｆｆ細胞の集団のバランスを変えるその能力に貢献し得る。本明細書の他の箇所に考察されるように、活性化されたＩＣＯＳ陽性エフェクターＴ細胞による腫瘍細胞殺滅を増強する抗体の能力が判定され得る。
【００６８】
Ｔ細胞依存性殺滅
エフェクターＴ細胞機能は、インビトロ共培養アッセイを使用して生物学的に関連する状況で判定することができ、このアッセイでは、腫瘍細胞を関連する免疫細胞と共にインキュベートして免疫細胞依存性殺滅を引き起こし、ＴＥｆｆによる腫瘍細胞殺滅に対する抗ＩＣＯＳ抗体の効果を観察する。
【００６９】
活性化されたＩＣＯＳ陽性エフェクターＴ細胞による腫瘍細胞殺滅を増強する抗体の能力が判定され得る。抗ＩＣＯＳ抗体は、対照抗体と比較して有意に大きい(ｐ＜０．０５)腫瘍細胞殺滅を刺激し得る。抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳリガンド又はＣ３９８．４抗体等の参照分子と比較して、そのようなアッセイにおいて類似又はより大きい腫瘍細胞殺滅を刺激し得る。同様の程度の腫瘍細胞殺滅とは、試験抗体についてのアッセイ読み出し値と参照分子の読み出し値との差が２倍未満であるものとして表され得る。
【００７０】
ＩＣＯＳリガンド−受容体中和能
本発明に従う抗体は、ＩＣＯＳとそのリガンドＩＣＯＳＬとの結合を阻害する抗体であってもよい。
【００７１】
抗体がＩＣＯＳ受容体とそのリガンドとの結合を阻害する程度は、そのリガンド−受容体中和能と呼ばれる。中和能は、別途記載されない限り、通常、ｐＭ単位のＩＣ５０値として表される。リガンド結合研究において、ＩＣ５０は、最大特異的結合レベルの５０％まで受容体結合を減少させる濃度である。ＩＣ５０は、抗体濃度の対数の関数として特異的受容体結合％をプロットし、Ｐｒｉｓｍ(ＧｒａｐｈＰａｄ)等のソフトウェアプログラムを使用してシグモイド関数をデータに適合させてＩＣ５０値を生成することにより、計算すされ得る。中和能は、ＨＴＲＦアッセイにおいて判定されてもよい。リガンド−受容体中和能についてのＨＴＲＦアッセイの詳細な作業例を実施例８に示す。
【００７２】
ＩＣ５０値は、複数の測定値の平均を表し得る。したがって、例えば、３回の実験の結果からＩＣ５０値を得てもよく、その後、平均のＩＣ５０値を計算し得る。
【００７３】
抗体は、ＩＣ５０が、リガンド−受容体中和アッセイにおいて１ｍＭ以下、例えば、０．５ｍＭ以下であってもよい。ＩＣ５０は、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、又は２ｎＭ以下であってもよい。ＩＣ５０は、少なくとも０．１ｎＭ、少なくとも０．５ｎＭ、又は少なくとも１ｎＭであってもよい。
【００７４】
抗体
実施例でより詳細に記載するように、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９と称する特に関心対象である抗体を単離し特徴付けた。本発明の様々な態様において、文脈により別途示されない限り、抗体は、これらの抗体のいずれか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、及びＳＴＩＭ００５のサブセットから選択され得る。これらの抗体の各々の配列は添付の配列表に提供され、この中では、各抗体について、以下の配列が示される：それぞれ、ＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列、ＶＨドメインのアミノ酸配列、ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列、ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列、ＶＬドメインのアミノ酸配列；  ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列。本発明は、添付の配列表及び/又は図面に示される全ての抗体のＶＨ及び/又はＶＬドメイン配列を有する抗ＩＣＯＳ抗体、並びにこれらの抗体のＨＣＤＲ及び/又はＬＣＤＲを含み、任意選択で全長重鎖及び/又は全長軽鎖アミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００７５】
ＳＴＩＭ００１は、配列番号３６３のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３６４のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号３６５のＣＤＲＨ３アミノ酸を含む、配列番号３６６の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３６７である。ＳＴＩＭ００１は、配列番号３７０のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３７１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３７２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号３７３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号３７４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３６８(重鎖核酸配列配列番号３６９)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３７５(軽鎖核酸配列配列番号３７６)である。
【００７６】
ＳＴＩＭ００２は、配列番号３７７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３７８のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号３７９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３８０の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３８１である。ＳＴＩＭ００２は、配列番号３８４のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８５のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３８６のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号３８７の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号３８８又は配列番号５１９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３８２(重鎖核酸配列配列番号３８３)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３８９(軽鎖核酸配列配列番号３９０又は配列番号５２０)である。
【００７７】
ＳＴＩＭ００２−Ｂは、配列番号３９１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３９２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号３９３のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３９４の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３９５である。ＳＴＩＭ００２−Ｂは、配列番号３９８のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３９９のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４００のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４０１の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４０２である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３９６(重鎖核酸配列配列番号３９７)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４０３(軽鎖核酸配列配列番号４０４)である。
【００７８】
ＳＴＩＭ００３は、配列番号４０５のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４０６のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４０７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４０８の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４０９又は配列番号５２１である。ＳＴＩＭ００３は、配列番号４１２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４１３のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４１４のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４１５の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４１６である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４１０(重鎖核酸配列配列番号４１１又は配列番号５２２)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４１７(軽鎖核酸配列配列番号４１８)である。
【００７９】
ＳＴＩＭ００４は、配列番号４１９のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４２０のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４２１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４２２の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４２３である。ＳＴＩＭ００４は、配列番号４２６のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４２７のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４２８のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４２９の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４３０又は配列番号４３１である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４２４(重鎖核酸配列配列番号４２５)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４３２(軽鎖核酸配列配列番号４３３又は配列番号４３４)である。
【００８０】
ＳＴＩＭ００５は、配列番号４３５のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４３６のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４３７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４３８の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４３９である。ＳＴＩＭ００５は、配列番号４４２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４４３のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４４４のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４４５の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４６である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４４０(重鎖核酸配列配列番号４４１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４４７(軽鎖核酸配列配列番号４４８)である。
【００８１】
ＳＴＩＭ００６は、配列番号４４９のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４５０のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４５１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４５２の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４５３である。ＳＴＩＭ００６は、配列番号４５６のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４５７のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４５８のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４５９の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４６０である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４５４(重鎖核酸配列配列番号４５５)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４６１(軽鎖核酸配列配列番号４６２)である。
【００８２】
ＳＴＩＭ００７は、配列番号４６３のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４６４のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４６５のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４６６の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４６７である。ＳＴＩＭ００７は、配列番号４７０のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４７１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４７２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４７３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４７４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４６８(重鎖核酸配列配列番号４６９)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４７５(軽鎖核酸配列配列番号４７６)である。
【００８３】
ＳＴＩＭ００８は、配列番号４７７のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４７８のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４７９のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４８０の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４８１である。ＳＴＩＭ００８は、配列番号４８４のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４８５のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４８６のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４８７の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４８８である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４８２(重鎖核酸配列配列番号４８３)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４８９(軽鎖核酸配列配列番号４９０)である。
【００８４】
ＳＴＩＭ００９は、配列番号４９１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号４９２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号４９３のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４９４の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号４９５である。ＳＴＩＭ００９は、配列番号４９８のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号４９９のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号５００のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号５０１の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号５０２である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４のうちのいずれかと組み合わされてもよい。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８のうちのいずれかと組み合わされてもよい。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４９６(重鎖核酸配列配列番号４９７)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号５０３(軽鎖核酸配列配列番号５０４)である。
【００８５】
本発明に従う抗体は、天然又は部分的若しくは完全に合成によって産生された免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリンドメインを含む分子である。抗体は、抗体を天然に産生するのか、又は組換えＤＮＡ技術によって創出される任意の種に由来するのかにかかわらず、また血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、又は細菌から単離されるのかにかかわらず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＥ分子又はその抗原特異的抗体断片(Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、閉構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃｆｖ、ダイアボディ、又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されない)であり得る。  抗体は、常法を用いてヒト化することができる。抗体という用語は、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質を網羅する。抗原結合部位(パラトープ)は、その標的抗原(ＩＣＯＳ)のエピトープに結合し、それに相補的である抗体の一部である。
【００８６】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、構造的又は機能的であると定義されてもよい。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体配座、すなわち、非線形アミノ酸から構成されてもよい。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基等の分子の化学的に活性な表面群である決定基を含んでもよく、またある特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及び/又は特定の電荷特性を有してもよい。
【００８７】
抗原結合部位は、抗体の１つ以上のＣＤＲを含み、抗原に結合することができるポリペプチド又はドメインである。例えば、ポリペプチドは、ＣＤＲ３(例えば、ＨＣＤＲ３)を含む。例えば、ポリペプチドは、抗体の可変ドメインのＣＤＲ１及び２(例えば、ＨＣＤＲ１及び２)又はＣＤＲ１〜３(例えば、ＨＣＤＲ１〜３)を含む。
【００８８】
抗体抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供されてもよい。一例では、抗体結合部位は、単一の可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン(ＶＨドメイン)又は軽鎖可変ドメイン(ＶＬドメイン)によって提供される。別の例では、結合部位は、ＶＨ/ＶＬ対又はそのような対の２つ以上を含む。したがって、抗体抗原結合部位は、ＶＨ及びＶＬを含み得る。
【００８９】
本抗体は、定常領域を含む免疫グロブリン全体であってもよく、又は抗体断片であってもよい。抗体断片は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合及び/又は可変領域を含む部分である。抗体断片の例には、
(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、(ｉｉ)ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ(ａｂ’)２断片、
(ｉｉｉ)ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、
(ｉｖ)抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、
(ｖ)ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片(全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，(１９８９)Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６)、並びに
(ｖｉ)特異的抗原結合機能を保持する単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)が挙げられる。
【００９０】
抗体のさらなる例は、重鎖の二量体(５’−ＶＨ−(任意選択のヒンジ)−ＣＨ  ２−ＣＨ３−３’)を含み、軽鎖を欠くＨ２抗体である。
【００９１】
一本鎖抗体(例えば、ｓｃＦｖ)は、一般的に使用される断片である。多重特異性抗体は、抗体断片から形成されてもよい。本発明の抗体は、適宜、任意のこのようなフォーマットを採用することができる。
【００９２】
任意選択で、抗体免疫グロブリンドメインは、追加のポリペプチド配列、及び/又は標識、タグ、毒素若しくは他の分子に融合又は接合されてもよい。抗体免疫グロブリンドメインは、１つ以上の異なる抗原結合領域に融合又は接合されて、ＩＣＯＳに加えて第２の抗原に結合することができる分子を提供し得る。本発明の抗体は、(ｉ)ＩＣＯＳのための抗体抗原結合部位と、(ｉｉ)別の抗原(例えば、ＰＤ−Ｌ１)を認識するさらなる抗原結合部位(任意選択で本明細書に記載の抗体抗原結合部位)とを含む、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体であってもよい。
【００９３】
抗体は、通常、抗体ＶＨ及び/又はＶＬドメインを含む。抗体の単離されたＶＨ及びＶＬドメインも本発明の一部である。抗体可変ドメインは、相補性決定領域(ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３)及びフレームワーク領域(ＦＲ)のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖及び重鎖の部分である。したがって、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの各々の中には、ＣＤＲ及びＦＲがある。ＶＨドメインは１セットのＨＣＤＲのを含み、ＶＬドメインは１セットのＬＣＤＲを含む。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。本発明で使用される方法によれば、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ(Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ(Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１))に従って、又はＩＭＧＴ命名法に従って、定義され得る。抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含んでもよい。代替的に又は追加的に、抗体は、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。本発明に従う抗体ＶＨ及びＶＬドメイン並びにＣＤＲの例は、本開示の一部を成す添付の配列表に列挙されている通りである。配列表に示されるＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムに従って定義される［１８］。本明細書に開示される全てのＶＨ及びＶＬ配列、ＣＤＲ配列、１セットのＣＤＲ並びに１セットのＨＣＤＲ及び１セットのＬＣＤＲは、本発明の態様及び実施形態を表す。本明細書に記載されるように、「１セットのＣＤＲ」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。したがって、１セットのＨＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指し、１セットのＬＣＤＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指す。別途断りのない限り、「１セットのＣＤＲ」には、ＨＣＤＲ及びＬＣＤＲが含まれる。
【００９４】
本発明の抗体は、１セットのＣＤＲを形成するために、本明細書に記載の１つ以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を含み、任意にＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含んでいてもよい。ＣＤＲ又はＣＤＲセットは、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８及びＳＴＩＭ００９のいずれかのＣＤＲ又はＣＤＲセットであってもよく、本明細書に記載のそれらの変異型であってもよい。
【００９５】
本発明は、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び/若しくはＨＣＤＲ３、並びに/又はこれらの抗体のいずれかのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び/若しくはＬＣＤＲ３、例えば、１セットのＣＤＲを含む抗体を提供する。本抗体は、これらの抗体のうちの１つのＶＨ  ＣＤＲセットを含んでもよい。本抗体は、任意に、これらの抗体のうちの１つのＶＬ  ＣＤＲセットを含んでもよく、ＶＬ  ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲと同じ抗体に由来する場合も、異なる抗体に由来する場合もある。
【００９６】
開示されるＨＣＤＲセットを含むＶＨドメイン及び/又は開示されるＬＣＤＲセットを含むＶＬドメインも、本発明によって提供される。
【００９７】
典型的には、ＶＨドメインはＶＬドメインと対形成して抗体抗原結合部位を提供するが、以下でさらに考察するように、ＶＨドメイン又はＶＬドメインのみを使用して抗原に結合させてもよい。ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメインは、ＳＴＩＭ００３  ＶＬドメインと対形成してもよく、その結果、ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。類似の実施形態が、本明細書に開示される他のＶＨ及びＶＬドメインについて提供される。他の実施形態では、ＳＴＩＭ００３  ＶＨは、ＳＴＩＭ００３  ＶＬ以外のＶＬドメインと対形成する。軽鎖の乱雑性は、当該技術分野において十分に確立されている。繰り返しだが、類似の実施形態が、本明細書に開示される他のＶＨ及びＶＬドメインについて本発明によって提供される。
【００９８】
したがって、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、及びＳＴＩＭ００５のいずれかのＶＨは、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、及びＳＴＩＭ００５のいずれかのＶＬと対形成してもよい。さらに、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９のいずれかのＶＨは、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、又はＳＴＩＭ００９のいずれかのＶＬと対形成してもよい。
【００９９】
抗体は、抗体フレームワーク内に、１つ以上のＣＤＲ、例えば、１セットのＣＤＲを含んでもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列遺伝子セグメント配列であってもよい。したがって、本抗体は、ヒト生殖細胞系列フレームワーク中に１セットのＨＣＤＲを含むＶＨドメインを有するヒト抗体であってもよい。通常、本抗体は、例えばヒト生殖細胞系列フレームワーク中に１セットのＬＣＤＲを含むＶＬドメインも有する。抗体「遺伝子セグメント」、例えば、ＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、又はＪＨ遺伝子セグメントは、抗体のその部分が由来する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを指し、例えば、ＶＨ遺伝子セグメントは、ＦＲ１からＣＤＲ３の部分までのポリペプチドＶＨドメインに対応する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。ヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントは組み換えられてＶＨドメインを生成し、ヒトＶ及びＪセグメントは組み換えられてＶＬドメインを生成する。Ｄドメイン又は領域は、抗体鎖の多様性ドメイン又は領域を指す。Ｊドメイン又は領域は、抗体鎖の接合ドメイン又は領域を指す。体細胞超変異は、対応する遺伝子セグメントと正確に一致又は整列しないフレームワーク領域を有する抗体ＶＨ又はＶＬドメインをもたらし得るが、配列アラインメントを使用して、最も近い遺伝子セグメントを同定し、これにより、特定のＶＨ又はＶＬドメインが遺伝子セグメントのどの特定の組合せに由来するのかを同定することができる。抗体配列を遺伝子セグメントと整列させる場合、抗体アミノ酸配列を遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列と整列させてもよく、又は抗体ヌクレオチド配列を遺伝子セグメントのヌクレオチド配列と直接整列させてもよい。
【０１００】
関連する抗体及びヒト生殖細胞系配列に対するＳＴＩＭ抗体ＶＨ及びＶＬドメイン配列のアライメントを、図３５、図３６、及び図３７に示す。
【０１０１】
本発明の抗体は、ヒト可変領域及び非ヒト(例えば、マウス)定常領域を含むヒト抗体又はキメラ抗体であってもよい。本発明の抗体は、例えば、ヒト可変領域を有し、任意選択でヒト定常領域も有する。
【０１０２】
したがって、抗体は、任意選択で定常領域又はその一部、例えば、ヒト抗体定常領域又はその一部を含む。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端で抗体軽鎖カッパ又はラムダ定常ドメインに結合されてもよい。同様に、抗体ＶＨドメインは、そのＣ末端で、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ、並びにＩｇＧ１又はＩｇＧ４等のアイソタイプサブクラスのうちのいずれかに由来する免疫グロブリン重鎖定常領域の全部又は一部(例えば、ＣＨ１ドメイン又はＦｃ領域)に結合されてもよい。
【０１０３】
ヒト重鎖定常領域の例を表Ｓ１に示す。
【０１０４】
本発明の抗体の定常領域は、代替的に、非ヒト定常領域であってもよい。例えば、抗体がトランスジェニック動物(それらの例は本明細書の他箇所に記載されている)において生成される場合、ヒト可変領域及び非ヒト(宿主動物)定常領域を含むキメラ抗体が産生されてもよい。いくつかのトランスジェニック動物は完全ヒト抗体を生成する。他のものは、キメラ重鎖及び完全ヒト軽鎖を含む抗体を生成するように操作されている。抗体が１つ以上の非ヒト定常領域を含む場合、これらをヒト定常領域と置き換えることでその免疫原性が低下するため、治療用組成物としてのヒトへの投与により好適な抗体を提供することができる。
【０１０５】
酵素パパインによる抗体の消化により、「Ｆａｂ」断片としても知られている２つの同一の抗原結合断片、及び抗原結合活性を有しないが結晶化する能力を有する「Ｆｃ」断片が生じる。「Ｆａｂ」は、本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む抗体の断片を指す。本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。「Ｆｃ断片」は、ジスルフィドによって共に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を指す。抗体のエフェクター機能は、ある種の細胞に見られるＦｃ受容体(ＦｃＲ)によっても認識される領域であるＦｃ領域の配列によって決定される。酵素ペプシンによる抗体の消化により、抗体分子の２つのアームが連結したままであり、２つの抗原結合部位を含む、Ｆ(ａｂ’)２断片が生じる。Ｆ(ａｂ’)２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【０１０６】
「Ｆｖ」は、本明細書で使用される場合、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。この領域は、強い非共有結合又は共有結合によって会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲにより、抗体に抗原結合特異性が付与される。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえも、抗原を認識して結合する能力を有するが、これは結合部位全体よりも親和性が低い。
【０１０７】
本明細書に開示される抗体は、血清半減期を増加又は減少させるように改変されてもよい。一実施形態では、突然変異Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、又はＴ２５６Ｆのうちの１つ以上を導入して、抗体の生物学的半減期を増加させる。生物学的半減期は、米国特許第５，８６９，０４６号及び同第６，１２１，０２２号に記載されているように(これらに記載の修飾は参照により本明細書に組み込まれる)、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン又はＣＬ領域を改変して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含めることによって増加させることもできる。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体又は断片の生物学的半減期を減少させる。１つ以上のアミノ酸突然変異をＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入すると、結果、その抗体又は断片のブドウ球菌タンパク質Ａ(ＳｐＡ)結合が天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合と比較して損なわれる。血清半減期を増加させる他の方法は、当業者には既知である。したがって、一実施形態では、本抗体又は断片はＰＥＧ化される。別の実施形態では、本抗体又は断片は、アルブミン結合ドメイン、例えば、アルブミン結合単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)に融合される。別の実施形態では、本抗体又は断片はＰＡＳ化される(すなわち、大きな流体力学的体積を有する非電荷ランダムコイル構造を形成するＰＡＳ(ＸＬ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨ)から構成されるポリペプチド配列の遺伝子融合)。別の実施形態では、本抗体又は断片は、ＸＴＥＮｙｌａｔｅｄ(登録商標)/ｒＰＥＧ化される(すなわち、非正確な反復ペプチド配列(Ａｍｕｎｉｘ，Ｖｅｒｓａｒｔｉｓ)と治療用ペプチドとの遺伝子融合)。別の実施形態では、本抗体又は断片はＥＬＰ化される(すなわち、ＥＬＰ反復配列(ＰｈａｓｅＢｉｏ)への遺伝子融合)。これらの様々な半減期を延長する融合は、Ｓｔｒｏｈｌ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ(２０１５)２９：２１５−２３９により詳細に記載されており、例えば表２及び６にあるこれらの融合は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
本抗体は、安定性を増加させる修飾された定常領域を有してもよい。したがって、一実施形態では、重鎖定常領域は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される抗体及び断片は、システイン残基の数を改変するように修飾された重鎖ヒンジ領域を含む。この修飾は、軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にするために、又は抗体の安定性を増加若しくは減少させるために使用することができる。
【０１０９】
Ｆｃエフェクター機能、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ
上で考察した通り、抗ＩＣＯＳ抗体は、様々なアイソタイプにおいて、また異なる定常領域を伴って提供され得る。ヒトＩｇＧ抗体重鎖定常領域配列の例を表Ｓ１に示す。本抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)活性、及び抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)活性に関して、主にそのエフェクター機能を決定する。これらの「細胞エフェクター機能」は、エフェクターＴ細胞機能とは異なり、Ｆｃ受容体を有する細胞の標的細胞部位への動員を伴い、抗体結合細胞の死滅をもたらす。ＡＤＣＣ及びＣＤＣに加えて、ＡＤＣＰ機序［１９］は、抗体結合Ｔ細胞を枯渇させ、それにより欠失のために高ＩＣＯＳ発現ＴＲｅｇを標的とする手段を表す。
【０１１０】
細胞エフェクター機能ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣはまた、Ｆｃ領域を欠く抗体によって示され得る。抗体は、複数の異なる抗原結合部位を含むことができ、１つはＩＣＯＳに向けられ、もう１つは標的分子に向けられ、その標的分子の従事により、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣが誘導される。例えば、リンカーによって接合される２つのｓｃＦｖ領域を含み、一方のｓｃＦｖがエフェクター細胞を従事させることができる抗体である。
【０１１１】
本発明に従う抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣを呈するものであってもよい。或いは、本発明に従う抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣ活性を欠いていてもよい。いずれの場合も、本発明に従う抗体は、１種以上のＦｃ受容体に結合するＦｃ領域を含んでもよく、又は任意選択でそれを欠いてもよい。異なる抗体フォーマットの使用、並びにＦｃＲ結合機能及び細胞エフェクター機能の存在又は非存在により、本明細書の他箇所で考察されるように、特定の治療目的での使用に合わせて抗体を調整することが可能となる。
【０１１２】
いくつかの治療用途に好適な抗体フォーマットは、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を用いる。定常領域は、任意選択でＡＤＣＣ及び/又はＣＤＣ及び/又はＡＤＣＰ活性を有するエフェクター対応ＩｇＧ１定常領域であってもよい。好適な野生型ヒトＩｇＧ１対応領域配列は、配列番号３４０(ＩＧＨＧ１＊０１)である。ヒトＩｇＧ１定常領域のさらなる例を表Ｓ１に示す。
【０１１３】
ヒト疾患のマウスモデルにおける候補治療抗体の試験のために、エフェクター陽性のヒト定常領域の代わりに、マウスＩｇＧ２ａ(ｍＩｇＧ２ａ)等のエフェクター陽性のマウス定常領域を含めてもよい。
【０１１４】
増強されたＡＤＣＣ及び/又はＣＤＣ及び/又はＡＤＣＰのために定常領域を操作してもよい。
【０１１５】
Ｆｃ媒介性効果の効力は、様々な確立された技法によってＦｃドメインを操作することによって増強され得る。そのような方法により、ある特定のＦｃ受容体に対する親和性を増加させ、それにより活性化増強の可能性のある多様なプロファイルを創出する。これは、１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾によって達成することができる［２０］。残基Ａｓｎ２９７に特定の突然変異又は改変されたグリコシル化(例えば、ＥＵインデックス付番のＮ２９７Ｑ)を含むヒトＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体に対する結合を増強することが示されている。例示的な突然変異は、ヒトＩｇＧ１定常領域(又は他のＩｇＧアイソタイプにおける等価位置)について、２３９、３３２、及び３３０から選択される残基のうちの１つ以上である。したがって、抗体は、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、及びＡ３３０Ｌ(ＥＵインデックス付番)から独立して選択される１つ以上の突然変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含み得る。ＦｃＲｎに対する結合を増強するために三重突然変異(Ｍ２５２Ｙ/Ｓ２５４Ｔ/Ｔ２５６Ｅ)を使用してもよく、ＦｃＲｎ結合に影響を与える他の突然変異は［２１］の表２において考察され、そのいずれも本発明において使用され得る。
【０１１６】
Ｆｃ受容体に対する親和性の増加は、例えば、フコシル化又は脱フコシル化変異型の下での生成によって、Ｆｃドメインの天然のグリコシル化プロファイルを改変することによっても達成することができる［２２］。非フコシル化抗体は、フコース残基を有しないＦｃの複合型Ｎ−グリカンのトリマンノシルコア構造を有する。Ｆｃ  Ｎ−グリカンからのコアフコース残基を欠くこれらの糖鎖操作抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合能力の増強に起因してフコシル化等価物よりも強いＡＤＣＣを示し得る。例えば、ＡＤＣＣを増加させるために、ヒンジ領域の残基を改変して、Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩに対する結合を増加させることができる［２３］。したがって、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域の変異型であるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含んでもよく、この変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ＦｃｙＲＩＩＢ及びＦｃｙＲＩＩＡからなる群から選択されるヒトＦｃγ受容体に、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃγ受容体に結合する親和性よりも高い親和性で結合する。本抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域の変異型であるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含んでもよく、この変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＦｃγＲＩＩＢに、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃγＲＩＩＢに結合する親和性よりも高い親和性で結合する。変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、変異型ヒトＩｇＧ１、変異型ヒトＩｇＧ２、又は変異型ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり得る。一実施形態では、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｇ２３６Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、及びＬ３２８Ｅ(ＥＵインデックス付番システム)から選択される１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。別の実施形態では、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２６７ＥとＬ３２８Ｆ；Ｐ２３８ＤとＬ３２８Ｅ；Ｐ２３８Ｄと、Ｅ２３３Ｄ、Ｇ２３７Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、及びＡ３３０Ｒからなる群から選択される１つ以上の置換；Ｐ２３８Ｄと、Ｅ２３３Ｄと、Ｇ２３７Ｄと、Ｈ２６８Ｄと、Ｐ２７１Ｇと、Ａ３３０Ｒ；Ｇ２３６ＤとＳ２６７Ｅ；Ｓ２３９ＤとＳ２６７Ｅ；Ｖ２６２Ｅと、Ｓ２６７Ｅと、Ｌ３２８Ｆ；並びにＶ２６４Ｅと、Ｓ２６７Ｅと、Ｌ３２８Ｆ(ＥＵインデックス付番システム)からなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットを含む。ＣＤＣの増強は、古典的な補体活性化カスケードの第１の成分であるＣ１ｑに対する親和性を増加させるアミノ酸変化によって達成され得る［２４］。別のアプローチは、Ｃ１ｑに対するＩｇＧ３のより高い親和性を利用するヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ３セグメントから創出されたキメラＦｃドメインを創出することである［２５］。本発明の抗体は、残基３２９、３３１、及び/又は３２２に突然変異したアミノ酸を含むことで、Ｃ１ｑ結合及び/又はＣＤＣ活性の低下又は消失を改変し得る。別の実施形態では、本明細書に開示される抗体又は抗体断片は、残基２３１及び２３９に修飾を有するＦｃ領域を含んでもよく、それにより、抗体の補体を固定する能力を変化させるようにアミノ酸が置換される。一実施形態では、本抗体又は断片は、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、Ｒ３４４Ｄ、及びＤ３５６Ｒ、特にＲ３４４Ｄ及びＤ３５６Ｒ(ＥＵインデックス付番システム)���含む二重突然変異から選択される１つ以上の突然変異を含む定常領域を有する。
【０１１７】
ＷＯ２００８/１３７９１５は、増強されたエフェクター機能を有する修飾されたＦｃ領域を伴う抗ＩＣＯＳ抗体を記載している。これらの抗体は、ＶＨ及びＶＫドメイン及び野生型Ｆｃ領域を含む親抗体によって媒介されるＡＤＣＣ活性のレベルと比較して、増強されたＡＤＣＣ活性を媒介することが報告された。本発明に従う抗体は、その中に記載されているようなエフェクター機能を有するそのような変異型Ｆｃ領域を用いてもよい。
【０１１８】
抗体のＡＤＣＣ活性は、本明細書に記載のアッセイで判定され得る。抗ＩＣＯＳ抗体のＡＤＣＣ活性は、実施例１０に記載したようにＩＣＯＳ陽性Ｔ細胞株を使用してインビトロで判定されてもよい。抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＡＤＣＣ活性は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞を使用するＡＤＣＣアッセイにおいてインビトロで判定されてもよい。
【０１１９】
ある特定の用途(例えば、ワクチン接種の背景において)では、Ｆｃエフェクター機能を有しない抗体を使用することが好ましい場合がある。抗体は、定常領域なしで、又はＦｃ領域なしで提供されてもよく、このような抗体フォーマットの例は、本明細書の他箇所に記載されている。或いは、抗体は、エフェクターヌルである定常領域を有してもよい。抗体は、Ｆｃγ受容体に結合しない重鎖定常領域を有してもよく、例えば、定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ突然変異(すなわち、野生型ロイシン残基がグルタミン酸残基に突然変異している)を含んでもよい。重鎖定常領域の別の任意選択の突然変異は、安定性を高めるＳｅｒ２２８Ｐｒｏである。重鎖定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ突然変異及びＳｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異の両方を含むＩｇＧ４であってもよい。この「ＩｇＧ４−ＰＥ」重鎖定常領域は、エフェクターヌルである。
【０１２０】
代替的なエフェクターヌルのヒト定常領域は、無効化されたＩｇＧ１である。無効化されたＩｇＧ１重鎖定常領域は、２３５位及び/又は２３７位(ＥＵインデックス付番)にアラニンを含んでもよく、例えば、Ｌ２３５Ａ及び/又はＧ２３７Ａ突然変異(「ＬＡＧＡ」)を含むＩｇＧ１＊０１配列であってもよい。
【０１２１】
変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、又はヒトＦｃγＲＩに対するＩｇＧの親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸突然変異を含んでもよい。一実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢは、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、内皮細胞、及び活性化Ｔ細胞からなる群から選択される細胞上で発現される。一実施形態において、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、アミノ酸突然変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ、及びＰ３９６Ｌ(ＥＵインデックス付番システム)のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９Ｄ；Ｔ２５６Ａ；Ｋ２９０Ａ；Ｓ２９８Ａ；Ｉ３３２Ｅ；Ｅ３３３Ａ；Ｋ３３４Ａ；Ａ３３９Ｔ；Ｓ２３９ＤとＩ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄと、Ａ３３０Ｌと、Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２９８Ａと、Ｅ３３３Ａと、Ｋ３３４Ａ；Ｇ２３６Ａと、Ｓ２３９Ｄと、Ｉ３３２Ｅ；及びＦ２４３Ｌと、Ｒ２９２Ｐと、Ｙ３００Ｌと、Ｖ３０５Ｉと、Ｐ３９６Ｌ(ＥＵインデックス付番システム)からなる群から選択されるアミノ酸突然変異のセットを含む。一実施形態では、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、又はＩ３３２Ｅアミノ酸突然変異(ＥＵインデックス付番システム)を含む。一実施形態では、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅアミノ酸突然変異(ＥＵインデックス付番システム)を含む。一実施形態では、変異型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ｓ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅアミノ酸突然変異(ＥＵインデックス付番システム)を含む変異型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。一実施形態では、本抗体又は断片は、アフコシル化Ｆｃ領域を含む。別の実施形態では、本抗体又はその断片は、脱フコシル化されている。別の実施形態では、本抗体又は断片は、フコシル化されている。
【０１２２】
抗体は、１種以上のＦｃ受容体に結合するが細胞エフェクター機能を誘導しない、すなわち、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はＡＤＣＰ活性を媒介しない、重鎖定常領域を有してもよい。そのような定常領域は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はＡＤＣＰ活性を引き起こす原因となる特定のＦｃ受容体(複数可)に結合できない場合がある。
【０１２３】
抗体の生成及び修飾
抗体を同定及び調製するための方法は周知である。抗体は、ＩＣＯＳ若しくはその断片又は目的のＩＣＯＳ配列モチーフを含む合成ペプチドで免疫付与し、その後、任意選択で、ヒト又はヒト化抗体を産生するように定常領域及び/又は可変領域をヒト化した、トランスジェニックマウス(例えば、Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)、Ｖｅｌｏｃｉｍｏｕｓｅ(登録商標)、Ｏｍｎｉｍｏｕｓｅ(登録商標)、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ(登録商標)、ＨｕＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ(登録商標)、又はＭｅＭｏ  Ｍｏｕｓｅ(登録商標))、ラット(例えば、Ｏｍｎｉｒａｔ(登録商標))、ラクダ科動物、サメ、ウサギ、ニワトリ、又は他の任意の非ヒト動物を使用して生成され得る。一例では、当業者には明らかとなる通り、酵母、ファージ、又はリボソームディスプレイ等のディスプレイ技術を使用することができる。例えばディスプレイ技術を用いた標準的親和性成熟は、トランスジェニック動物、ファージディスプレイライブラリー、又は他のライブラリーから導出した抗体を単離した後のさらなるステップで行うことができる。好適な技術の代表的な例は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１２００９３８１８(Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ)、例えば、段落［０３０９］〜［０３４６］に示されている方法に記載されている。
【０１２４】
ヒトＩＣＯＳ抗原を用いたＩＣＯＳノックアウト非ヒト動物への免疫付与ににより、ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳの両方を認識する抗体の生成が促進される。本明細書に記載され、実施例で説明されているように、ＩＣＯＳノックアウトマウスは、ヒトＩＣＯＳを発現する細胞で免疫付与して、マウスにおけるマウスＩＣＯＳ及びヒトＩＣＯＳに対する抗体の産生を刺激することができ、これを、ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳに対する結合について回収及び試験することができる。このようにして、交差反応性抗体を選択することができ、これを本明細書に記載の他の望ましい特性についてスクリーニングし得る。内因性抗原(例えば、内因性マウス抗原)の発現が動物においてノックアウトされている抗原で動物に免疫付与することにより、抗原(例えば、ヒト抗原)に対する抗体を生成する方法は、ヒト可変ドメインを含む抗体を産生することができる動物において行われ得る。そのような動物のゲノムは、ヒト可変領域遺伝子セグメント、及び任意選択で内因性定常領域又はヒト定常領域をコードするヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作することができる。ヒト可変領域遺伝子セグメントの組換えにより、非ヒト又はヒト定常領域のいずれかを有し得るヒト抗体が生成される。非ヒト定常領域は、その後、抗体をヒトにおいてインビボで使用することが意図される場合、ヒト定常領域によって代置されてもよい。そのような方法及びノックアウトトランスジェニック動物は、ＷＯ２０１３/０６１０７８に記載されている。
【０１２５】
一般に、Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ(登録商標)、又は他のマウス若しくはラット(記載されるように、任意選択でＩＣＯＳノックアウトマウス又はラット)を目的の抗原で攻撃し、抗体を発現するマウスから、リンパ細胞(Ｂ細胞等)を回収することができる。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死ハイブリドーマ細胞株を調製し、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングして、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定してもよい。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖及び軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結させてもよい。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞等の細胞内で産生され得る。或いは、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離してもよい。
【０１２６】
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。これらの抗体は、親和性、選択性、アゴニズム、Ｔ細胞依存性殺滅、中和能、エピトープ等を含む望ましい特性について特徴付けられ、選択される。マウス定常領域は、任意選択で所望のヒト定常領域で代置されて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型又は修飾されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４(例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１/００６５９０２中の配列番号７５１、７５２、７５３)を生成する。選択される定常領域は特定の用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特性及び標的特異特性は可変領域に属する。
【０１２７】
したがって、さらなる態様では、本発明は、ヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供し、この哺乳動物はＩＣＯＳを発現しない。哺乳動物は、例えば、ノックアウトマウス若しくはラット、又は他の実験動物種であってもよい。Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)等のトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座が、対応する内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座に挿入されている。本発明に従うトランスジェニック哺乳動物は、そのような標的化された挿入を含むものであってもよく、或いは、そのゲノム中にランダムに挿入されるヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座又は免疫グロブリン遺伝子が、内因性Ｉｇ遺伝子座以外の場所に挿入されるか、又は追加の染色体若しくは染色体断片に提供されてもよい。
【０１２８】
本発明のさらなる態様は、ＩＣＯＳに対する抗体を産生させるためのそのような非ヒト哺乳動物の使用、並びにそのような哺乳動物において抗体又は抗体重鎖及び/若しくは軽鎖可変ドメインを産生させる方法である。
【０１２９】
ヒト及び非ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する抗体を産生させる方法は、ヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有する、ＩＣＯＳを発現しないトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することを含み、
(ａ)哺乳動物をヒトＩＣＯＳ抗原で免疫付与する(例えば、ヒトＩＣＯＳを発現する細胞又は精製された組換えＩＣＯＳタンパク質を用いて)こと、
(ｂ)哺乳動物によって生成された抗体を単離すること、
(ｃ)ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験すること、並びに
(ｄ)ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳの両方に結合する１つ以上の抗体を選択することを含み得る。
【０１３０】
ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力についての試験は、表面プラズモン共鳴、ＨＴＲＦ、ＦＡＣＳ、又は本明細書に記載の任意の他の方法を使用して行われ得る。任意選択で、ヒト及びマウスＩＣＯＳに対する結合親和性が判定される。ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳに対する結合の親和性又は親和性の倍数差が判定されてもよく、したがって、種交差反応性を示す抗体が選択され得る(選択基準として使用され得る親和性閾値及び倍数差は本明細書の他箇所に例示される)。それぞれヒト及びマウスＩＣＯＳリガンドのヒト及びマウスＩＣＯＳ受容体に対する結合を阻害するための抗体の中和能又は中和能の倍数差が、例えばＨＴＲＦアッセイにおいて、交差反応性抗体をスクリーニングする方法として加えて又は代替的に判定されてもよい。ここでも、選択基準として使用され得る可能性のある閾値及び倍数差は、本明細書の他箇所に例示される。
【０１３１】
本方法は、免疫付与された哺乳動物と同じ種又は異なる種からの非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験することを含み得る。したがって、トランスジェニック哺乳動物がマウス(例えば、Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標))である場合、抗体はマウスＩＣＯＳに結合する能力について試験され得る。トランスジェニック哺乳動物がラットである場合、抗体はラットＩＣＯＳに結合する能力について試験され得る。しかしながら、別の種の非ヒトＩＣＯＳに対する単離された抗体の交差反応性を判定することも同等に有用であり得る。したがって、ヤギで生成された抗体が、ラット又はマウスＩＣＯＳに対する結合について試験されてもよい。任意選択で、ヤギＩＣＯＳに対する結合が、代わりに又は追加で判定されてもよい。
【０１３２】
他の実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒトＩＣＯＳの代わりに、非ヒトＩＣＯＳ、任意選択で同じ哺乳動物種のＩＣＯＳで免疫付与されてもよい(例えば、ＩＣＯＳノックアウトマウスをマウスＩＣＯＳで免疫付与されてもよい)。次いで、ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに対する結合のための単離された抗体の親和性が同じ方法で判定され、ヒト及び非ヒトＩＣＯＳの両方に結合する抗体が選択される。
【０１３３】
選択された抗体の抗体重鎖可変ドメイン及び/又は抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸が単離されてもよい。そのような核酸は、完全な抗体重鎖及び/若しくは軽鎖、又は関連する定常領域(複数可)を有さない可変ドメイン(複数可)をコードし得る。記載したように、コードヌクレオチド配列はマウスの抗体産生細胞から直接得てもよく、或いはＢ細胞を不死化又は融合させて抗体を発現するハイブリドーマを生成し、このような細胞からコード核酸を得てもよい。任意選択で、次に、可変ドメイン(複数可)をコードする核酸を、ヒト重鎖定常領域及び/又はヒト軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に接合させて、ヒト抗体重鎖及び/又はヒト抗体軽鎖をコードする、例えば、重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体をコードする核酸を提供する。本明細書の他箇所に記載されているように、このステップは、免疫付与された哺乳動物が、好ましくは、医薬品としてヒトに投与したときに免疫原性がより低くくなる抗体を生成するようにヒト定常領域で代置される非ヒト定常領域を有するキメラ抗体を産生する場合に、特に有用である。特定のヒトアイソタイプ定常領域の提供もまた、抗体のエフェクター機能を判定するために重要であり、多数の好適な重鎖定常領域が本明細書で考察される。
【０１３４】
本明細書に記載のように、抗体の重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸に対する他の改変、例えば残基の変異及び変異の生成を行うことができる。
【０１３５】
単離された(任意選択で突然変異した)核酸は、記載したように宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞に導入され得る。その後、抗体、又は抗体重鎖及び/若しくは軽鎖可変ドメインの発現のための条件下で、宿主細胞は任意の所望の抗体フォーマットで培養される。いくつかの可能な抗体フォーマット、例えば全免疫グロブリン、抗原結合断片、及び他の設計を本明細書に記載する。
【０１３６】
その配列が本明細書に具体的に開示されるＶＨ及びＶＬドメイン又はＣＤＲのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列変異型は、記載したように、本発明に従って使用され得る。
【０１３７】
大規模製造のために抗体配列を最適化すること、精製を容易にすること、安定性を増強すること、又は所望の医薬製剤に含めるための適合性を改善することを含む変異型を作製することが望ましくあり得る理由は数多くある。タンパク質操作作業は、抗体配列中の１つ以上の標的残基で行われることができ、例えば、１つのアミノ酸を代替アミノ酸で置換し(任意選択で、可能であればＣｙｓ及びＭｅｔを除いた、この位置で全ての天然型アミノ酸を含有する変異型を生成し)、最良の置換を判定するために機能及び発現への影響を監視する。例えば、新しい分子内又は分子間のシステイン−システイン結合の形成を通じて、製造上の困難を生じさせ得るように、残基をＣｙｓ又はＭｅｔで置換するか、又はこれらの残基を配列に導入することは、いくつかの場合において望ましくない。鉛候補が選択され、製造及び臨床開発のために最適化されている場合、その抗原結合特性を可能な限り小さく、又は少なくとも親分子の親和性及び効力を保持することが一般に望ましい。しかし、親和性、交差反応性、又は中和効力等の重要な抗体特性を調節するために、変異型を生成することもできる。
【０１３８】
抗体は、開示された抗体のいずれかの１セットのＨ  ＣＤＲ及び/又はＬ  ＣＤＲにおいて、開示されたＨ  ＣＤＲ及び/又はＬ  ＣＤＲセット内の１つ以上のアミノ酸変異を有するものを含み得る。変異は、アミノ酸置換、欠失、又は挿入であり得る。したがって、例えば、開示されたＨ  ＣＤＲ及び/又はＬ  ＣＤＲセット内に１つ以上のアミノ酸置換が存在し得る。例えば、Ｈ  ＣＤＲ及び/又はＬ  ＣＤＲのセット内に、最大１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２つの変異、例えば置換が存在し得る。例えば、ＨＣＤＲ３で、最大６、５、４、３、又は２つの変異、例えば置換が存在し得て、及び/又はＬＣＤＲ３で、最大６、５、４、３、又は２つの変異、例えば置換が存在し得る。抗体は、本明細書中の任意のＳＴＩＭ抗体について示されるＨＣＤＲセット、ＬＣＤＲセット、又は６つの(Ｈ及びＬ)ＣＤＲセットを含み得るか、又は１つ又は２つの保存的置換を有するＣＤＲセットを含み得る。
【０１３９】
１つ以上のアミノ酸変異は、本明細書に開示される抗体ＶＨ又はＶＬドメインのフレームワーク領域に任意選択で作製され得る。例えば、対応するヒト生殖細胞系セグメント配列とは異なる１つ以上の残基が、生殖細胞系に復帰されることができる。例示的な抗ＩＣＯＳ抗体のＶＨ及びＶＬドメインに対応するヒト生殖細胞系遺伝子セグメント配列を、表Ｅ１２−１、表Ｅ１２−２、及び表Ｅ１２−３に示し、対応する生殖細胞系配列に対する抗体ＶＨ及びＶＬドメインの整列を、図像に示す。
【０１４０】
抗体は、添付の配列表に示される抗体のいずれかのＶＨドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含み得、及び/又はこれらの抗体のいずれかのＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含み得る。２つのアミノ酸配列の％同一性を計算するために使用され得るアルゴリズムには、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、例えばデフォルトパラメータを使用することが含まれる。特定の変異型は、１つ以上のアミノ酸配列改変(アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び/又は挿入)を含み得る。
【０１４１】
改変は、１つ以上のフレームワーク領域及び/又は１つ以上のＣＤＲで行われ得る。変異型は、ＣＤＲ変異誘発によって任意選択で提供される。改変は、通常、機能の喪失をもたらさないので、このように改変されたアミノ酸配列を含む抗体は、ＩＣＯＳを結合する能力を保持し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイで測定されるように、改変が行われない抗体と同じ定量的結合能力を保持し得る。このように改変されたアミノ酸配列を含む抗体は、ＩＣＯＳを結合する改善した能力を有し得る。
【０１４２】
改変は、１つ以上のアミノ酸残基を非天然型又は非標準アミノ酸で置換すること、１つ以上のアミノ酸残基を非天然型又は非標準形態に改変すること、又は１つ以上の非天然型又は非標準アミノ酸を配列に挿入することを含み得る。本発明の配列における改変の数及び位置の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。天然型アミノ酸は、標準の１文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される２０個の「標準」Ｌ−アミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、ポリペプチド主鎖に組み込まれ得るか、又は既存のアミノ酸残基の修飾に起因し得る任意の他の残基を含む。非標準アミノ酸は、天然型でも非天然型でもよい。
【０１４３】
本明細書で使用する「変異体」という用語は、１つ以上のアミノ酸又は核酸の欠失、置換、又は付加による親ポリペプチド又は核酸とは異なるが、親分子の１つ以上の特定の機能又は生物学的活性を保持するペプチド又は核酸を指す。アミノ酸置換には、アミノ酸が異なる天然型アミノ酸残基で置き換えられる改変が含まれる。かかる置換は、「保存的」として分類され得、この場合、ポリペプチド中に含有されるアミノ酸残基は、極性、側鎖官能性、又はサイズのいずれかについて類似の特徴を有する別の天然型アミノ酸で置き換えられる。かかる保存的置換は、当該技術分野で周知である。本発明に包含される置換はまた、「非保存的」であってもよく、ここでは、ペプチド中に存在するアミノ酸残基は、異なる基からの天然型アミノ酸等の異なる特性を有するアミノ酸で置換(例えば、荷電又は疎水性アミノ酸をアラニンで置換)されるか、或いは、天然型アミノ酸は、非在来型アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は保存的である。また、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して使用される場合、変異型という用語内に包含されて、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較して、それぞれ(例えば、野生型ポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較して)、１次、２次、又は３次構造において変化し得るポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。
【０１４４】
いくつかの態様では、当該技術分野で周知の方法を用いて単離又は生成された「合成変異型」、「組換え変異型」、又は「化学的に修飾された」ポリヌクレオチド変異型若しくはポリペプチド変異型を使用することができる。「修飾された変異型」は、以下に記載するように、保存的又は非保存的アミノ酸変化を含み得る。ポリヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及びトランケーションをもたらすことができる。いくつかの態様の使用は、例えば、ヒトタンパク質中で通常は起こらないオルニチンの挿入であるが、これに限定されない、変異型の基盤であるペプチド配列中で通常は起こらない、アミノ酸及び他の分子の挿入及び置換を含む)挿入変異型、欠失変異型、又はアミノ酸の置換を有する置換変異型を含む。「保存的置換」という用語は、ポリペプチドを記載する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化を指す。例えば、保存的置換は、アミノ酸残基を、類似の化学的特性(例えば、酸性、塩基性、正又は負に帯電した、極性又は非極性等)を有する異なるアミノ酸残基に、置換することを指す。保存的アミノ酸置換は、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンによる代置、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による代置、又はトレオニンのセリンによる代置を含む。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。例えば、以下の６つの群は、互いについて保存的置換であるアミノ酸を各々含有する：１)アラニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、トレオニン(Ｔ)；２)アスパラギン酸(Ｄ)、グルタミン酸(Ｅ)；３)アスパラギン(Ｎ)、グルタミン(Ｑ)；４)アルギニン(Ｒ)、リジン(Ｋ)；５)イソロイシン(Ｉ)、ロイシン(Ｌ)、メチオニン(Ｍ)、バリン(Ｖ)；及び６)フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)、トリプトファン(Ｗ)。(Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ(１９８４)を参照されたく、参照によりその全体が組み込まれる。)一部の実施形態では、１個のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を改変、付加、又は欠失する個々の置換、欠失、又は付加も、その変化がペプチドの活性を低減しない場合は「保存的置換」と見なされ得る。挿入又は欠失は、典型的には、約１〜５個のアミノ酸の範囲である。保存的アミノ酸の選択は、ペプチドにおける置換されるアミノ酸の位置、例えば、アミノ酸がペプチドの外側にあり溶媒に露出するか、又は内側にあり溶媒に露出しないかに基づいて選択してもよい。
【０１４５】
既存のアミノ酸を置換することになるアミノ酸を、溶媒への露出を含む、その既存のアミノ酸の位置(すなわち、アミノ酸が溶媒に露出するか、又は溶媒に露出しない内側に位置するアミノ酸と比較して、ペプチド又はポリペプチドの外面に存在するか)に基づいて選択し得る。かかる保存的アミノ酸置換の選択は、例えば、Ｄｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７，７２１−７３９  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９(１９８６)；２０５−２１８及びＳ．Ｆｒｅｎｃｈ  ａｎｄ  Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９(１９８３)１７１で開示されるように、当該技術分野で周知である。したがって、タンパク質又はペプチドの外側にあるアミノ酸(即ち、溶媒に露出するアミノ酸)に好適な保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、限定的ではなく、以下の置換を使用することができる：ＹのＦによる置換、ＴのＳ又はＫによる置換、ＰのＡによる置換、ＥのＤ又はＱによる置換、ＮのＤ又はＧによる置換、ＲのＫによる置換、ＧのＮ又はＡによる置換、ＴのＳ又はＫによる置換、ＤのＮ又はＥによる置換、ＩのＬ又はＶによる置換、ＦのＹによる置換、ＳのＴ又はＡによる置換、ＲのＫによる置換、ＧのＮ又はＡによる置換、ＫのＲによる置換、ＡのＳ、Ｋ、又はＰによる置換。
【０１４６】
代替的な実施形態では、タンパク質又はペプチドの内側にあるアミノ酸に好適な含まれる保存的アミノ酸置換を選択することもでき、例えば、タンパク質又はペプチドの内側にあるアミノ酸(即ち、アミノ酸が溶媒に露出しない)に好適な保存的置換を使用することができ、例えば、以下の保存的置換を使用することができる：ＹがＦで置換され、ＴがＡ又はＳで置換され、ＩがＬ又はＶで置換され、ＷがＹで置換され、ＭがＬで置換され、ＮがＤで置換され、ＧがＡで置換され、ＴがＡ又はＳで置換され、ＤがＮで置換され、ＩがＬ又はＶで置換され、ＦがＹ又はＬで置換され、ＳがＡ又はＴで置換され、ＡがＳ、Ｇ、Ｔ又はＶで置換される。一部の実施形態では、非保存的アミノ酸置換も、変化形の範囲内に包含される。
【０１４７】
本発明は、添付の配列表に示される抗体ＶＨ及び/又はＶＬドメインのＶＨ及び/又はＶＬドメイン変異体を含有する抗体を産生する方法を含む。かかる抗体は、
(ｉ)親抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、又は挿入によって、親抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列変異型である抗体ＶＨドメインを提供することであって、
親抗体ＶＨドメインは、抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９のいずれかのＶＨドメイン又はそれらの抗体のいずれかの重鎖相補性判定領域を含むＶＨドメインである、提供することと、
(ｉｉ)任意選択で、そのように提供されたＶＨドメインをＶＬドメインと組み合わせて、ＶＨ/ＶＬの組合せを提供することと、
(ｉｉｉ)ＶＨドメイン又はそのように提供されたＶＨ/ＶＬドメインの組合せを試験して、１つ以上の所望の特性を有する抗体を同定することと、を含む方法によって産生され得る。
【０１４８】
所望の特性には、ヒトＩＣＯＳに対する結合、マウスＩＣＯＳに対する結合、及びカニクイザルＩＣＯＳのような他の非ヒトＩＣＯＳに対する結合が含まれる。ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳに匹敵する又はそれより高い親和性を有する抗体を同定することができる。他の所望の特徴には、免疫抑制性ＴＲｅｇの枯渇を介して間接的に、又はＴエフェクター細胞に対するＩＣＯＳシグナル伝達活性化を介して直接的に、エフェクターＴ細胞機能を増加させることが含まれる。所望の特性を有する抗体を同定することは、そのいずれかが本明細書に記載のアッセイにおいて判定され得る、その親和性、交差反応性、特異性、ＩＣＯＳ受容体アゴニズム、中和効力、及び/又はＴ細胞依存性殺滅の促進等の本明細書に記載の機能的属性を有する抗体を同定することを含み得る。
【０１４９】
ＶＬドメインが本方法に含まれる場合、ＶＬドメインは、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のいずれかのＶＬドメインであってもよく、又は、親ＶＬドメインが、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９のいずれかのＶＬドメインであるか若しくはＶＬドメインがこれらの抗体のいずれかの軽鎖相補性判定領域を含む、親ＶＬドメインのアミノ酸配列における、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換若しくは挿入によって提供される変異型であり得る。
【０１５０】
変異型抗体を生成する方法は、任意選択で、抗体又はＶＨ/ＶＬドメインの組合せのコピーを産生することを含み得る。方法はさらに、得られた抗体を発現させることを含み得る。所望の抗体ＶＨ及び/又はＶＬドメインに対応するヌクレオチド配列を、任意選択で１つ以上の発現ベクターで産生することが可能である。宿主細胞における組換え発現を含む適切な発現方法は、本明細書に詳細に記載されている。
【０１５１】
核酸のコード化及び発現の方法
本発明による抗体をコードする単離された核酸を提供することができる。核酸は、ＤＮＡ及び/又はＲＮＡであり得る。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ、又はこれらの任意の組合せは、抗体をコードし得る。
【０１５２】
本発明は、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写、又は発現カセットの形態で構築物を提供する。例示的なヌクレオチド配列が配列表に含まれる。本明細書に記載されるヌクレオチド配列への言及は、指定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、文脈が別途必要とされない限り、ＵがＴで置換される指定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１５３】
本発明はまた、抗体をコードする１つ以上の核酸を含む組換え宿主細胞を提供する。コードされた抗体を産生する方法は、例えば、核酸を含有する組換え宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を含むことができる。このようにして、抗体を得ることができ、任意の適切な技術を用いて単離及び/又は精製し、次いで適宜使用することができる。産生方法は、薬学的に許容される賦形剤等の少なくとも１つの追加成分を含む組成物に製剤を製剤化することを含むことができる。
【０１５４】
様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母及びバキュロウイルス系、並びにトランスジェニック植物及び動物が含まれる。
【０１５５】
原核細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当該技術分野において十分に確立されている。一般的な細菌宿主は大腸菌である。培養中の真核細胞における発現も、産生の選択肢として当業者に利用可能である。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、ＹＢ２/０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト胎児網膜細胞、及び多くの他のものが含まれる。
【０１５６】
ベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び適宜他の配列を含む適切な調節配列を含有し得る。抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入することができる。核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、及びレトロウイルス若しくは他のウイルス、例えば、ワクシニア、又は昆虫細胞のためにバキュロウイルスを用いた形質導入を含む様々な方法によって真核細胞に導入することができる。宿主細胞、特に真核細胞に核酸を導入することは、ウイルス又はプラスミドベース系を使用することができる。プラスミド系は、エピソーム的に維持されてもよく、又は宿主細胞若しくは人工染色体に組み込まれてもよい。組み込みは、単独又は複数の遺伝子座における１つ以上のコピーの無作為の組み込みによるか、又は標的化された組み込みによるかのいずれかであり得る。細菌細胞の場合、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが含まれる。導入の後、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養し、次いで任意選択で抗体を単離又は精製することによって、核酸を発現させ得る。
【０１５７】
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム(例えば、染色体)に組み込まれ得る。組込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることによって促進され得る。
【０１５８】
本発明はまた、抗体を発現させるために本明細書に記載の核酸を発現系において使用することを含む方法を提供する。
【０１５９】
治療的使用
本明細書に記載される抗体は、治療によるヒト又は動物の身体の治療方法において使用され得る。抗体は、癌又は固形腫瘍の治療を含む、及びワクチン接種の状況における、疾患又は病的状態の範囲で有益である、エフェクターＴ細胞応答の増加における使用が見出される。Ｔｅｆｆ反応の増加は、Ｔｅｆｆ活性に有利なＴｅｆｆとＴｒｅｇとの間のバランス又は比を調節する抗体を用いて達成することができる。
【０１６０】
抗ＩＣＯＳ抗体は、制御性Ｔ細胞を枯渇させ、及び/又は患者のエフェクターＴ細胞応答を増加させるために使用され得て、患者に投与されて、制御性Ｔ細胞を枯渇させ、及び/又は患者のエフェクターＴ細胞応答を増加させることによって療法を受けることができる疾患又は病的状態を治療し得る。
【０１６１】
本発明の抗体、又はかかる抗体分子若しくはそのコード核酸を含む組成物は、任意のかかる方法における使用のために使用又は提供され得る。任意のかかる方法で使用するための医薬品の製造のための、抗体、又は抗体若しくはそのコード核酸を含む組成物の使用も想定される。この方法は、典型的には、抗体又は組成物を哺乳動物に投与することを含む。適切な製剤及び投与方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。
【０１６２】
抗体の１つの想定される治療的使用は、癌の治療である。癌は、固形腫瘍、例えば、腎細胞癌(任意選択で腎細胞癌、例えば、腎明細胞癌)、頭頸部癌、黒色腫(任意選択で悪性黒色腫)、非小細胞肺癌(例えば、腺癌)、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、精巣胚細胞性癌若しくは列挙されているような固形腫瘍の転移であり得るか、又は、液体血液腫瘍、例えば、リンパ腫(例えばホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＤＬＢＣＬ)若しくは白血病(例えば、急性骨髄性白血病)であり得る。抗ＩＣＯＳ抗体は、黒色腫、頭頸部癌、及び非小細胞肺癌、並びに中〜高変異性負荷を有する他の癌における腫瘍クリアランスを増強し得る［２６］。それらの腫瘍性病変に対する患者の免疫応答を増強することにより、抗ＩＣＯＳ抗体を用いた免疫療法は、耐久性のある治癒又は長期の寛解の可能性を、潜在的に後期の疾患の状況においても提供する。
【０１６３】
癌は多様な疾患群であるが、抗ＩＣＯＳ抗体は、癌を正常組織と区別する変異体又は過剰発現エピトープの認識によって任意の癌細胞を死滅させる潜在的可能性を有する、患者自身の免疫系を利用することにより、異なる癌の範囲の治療の可能性を提供する。Ｔｅｆｆ/Ｔｒｅｇバランスを調節することにより、抗ＩＣＯＳ抗体は、癌細胞の免疫認識及び殺滅を可能にし、及び/又は促進することができる。したがって、抗ＩＣＯＳ抗体は広範囲の癌のための有用な治療剤であるが、抗ＩＣＯＳ療法が特に適している及び/又は抗ＩＣＯＳ療法が他の治療剤が有効でない場合に有効であり得る特定のカテゴリーの癌がある。
【０１６４】
１つのかかる群は、ＩＣＯＳリガンドの発現に対して陽性である癌である。黒色腫について記載されているように、癌細胞はＩＣＯＳリガンドの発現を獲得することができる［２７］。ＩＣＯＳリガンドの発現は、表面発現リガンドがＴｒｅｇ上のＩＣＯＳを結合し、Ｔｒｅｇの拡大及び活性化を促進し、それにより癌に対する免疫応答を抑制するので、細胞に選択的利点を提供し得る。ＩＣＯＳリガンドを発現する癌細胞は、Ｔｒｅｇによる免疫系のこの抑制に対する生存に依存し得、したがってＴｒｅｇを標的とする抗ＩＣＯＳ抗体での治療に対して脆弱であり得る。これは、ＩＣＯＳリガンドを天然に発現する細胞由来の癌にも適用される。これらの細胞によるＩＣＯＳリガンドの継続的な発現は、免疫抑制を通じて生存の利点を再び提供する。ＩＣＯＳリガンドを発現する癌は、Ｂ細胞、樹状細胞、及び単球等の抗原提示細胞に由来し得、本明細書に記載されるような液体血液腫瘍であり得る。興味深いことに、これらのタイプの癌は、ＩＣＯＳ及びＦＯＸＰ３発現(ＴＣＧＡデータ)も高いことが示されている(実施例２５参照)。本明細書の実施例２０は、ＩＣＯＳリガンドを発現する癌性Ｂ細胞(Ａ２０同系細胞)に由来する腫瘍の治療における例示的な抗ＩＣＯＳ抗体の有効性を実証する。
【０１６５】
したがって、抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳリガンドの発現が陽性である癌を治療する方法において使用することができる。さらに、本発明による抗ＩＣＯＳ抗体で治療される癌は、ＩＣＯＳ及び/又はＦＯＸＰ３の発現に対して陽性で、任意選択でＩＣＯＳリガンドも発現する癌であり得る。
【０１６６】
患者は、例えば、試験試料(例えば、腫瘍生検)を患者から採取し、目的のタンパク質の発現を判定することによって、それらの癌が目的のタンパク質(例えば、ＩＣＯＳリガンド、ＩＣＯＳ、及び/又はＦＯＸＰ３)の発現に対して陽性であるかどうかを判定するために試験を受けることができる。目的の１つ、２つ、又は全てのかかるタンパク質の発現に対して陽性として癌が特徴付けられている患者を、抗ＩＣＯＳ抗体での治療のために選択する。本明細書の他の箇所で記載されるように、抗ＩＣＯＳ抗体は、単独療法として、又は１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用することができる。
【０１６７】
抗ＩＣＯＳ抗体はまた、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、又はＣＤ７３のような免疫チェックポイント分子に対する抗体又は他の薬物による治療に対して、癌が難治性である患者に希望を提供する。これらの免疫療法はいくつかの癌に対して有効であるが、場合によっては癌が応答しないか、又は抗体による継続的な治療に対して応答しなくなることがある。免疫チェックポイント阻害剤に対する抗体と同様に、抗ＩＣＯＳ抗体は患者の免疫系を調節するが、抗ＩＣＯＳ抗体はかかる他の抗体が失敗した場合に成功し得る。本明細書では、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ腫を有する動物を抗ＩＣＯＳ抗体で治療して、腫瘍の増殖を減少させ、腫瘍を縮小させ、実際に腫瘍を体から除去し得るが、抗ＰＤ−Ｌ１抗体による治療は、対照よりも優れていなかったことが示された。Ａ２０細胞株は、抗ＣＴＬＡ−４に対して耐性であることも報告されている［２８］。
【０１６８】
従って、抗ＩＣＯＳ抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、又は抗ＣＤ７３抗体(のうちのいずれか又は全て)等の１つ以上の免疫療法による治療に対して難治性である癌を治療する方法で使用され得る。癌は、その抗体若しくは薬物による治療が癌の増殖を有意に減少させない場合、例えば腫瘍が成長し続けている若しくはサイズが減少していない場合、又は応答期間の後に腫瘍がその増殖を再発する場合、抗体若しくは他の薬物による療法に対して難治性であるとして特徴付けられ得る。治療剤に対する非応答は、癌細胞の殺滅又は増殖阻害のための試料(例えば、腫瘍生検試料)を試験することによってエクスビボで、及び/又は臨床設定で療法で治療を受けた患者が治療に応答していないことを観察することによって(例えば、ＭＲＩを含む画像化技術を用いて)判定され得る。かかる免疫療法による治療に対して難治性として癌が特徴付けられている患者を、抗ＩＣＯＳ抗体での治療のために選択する。
【０１６９】
さらに、抗ＩＣＯＳ抗体は、抗ＣＤ２０抗体での治療に耐性のあるＢ細胞由来の癌を治療するために使用され得る。抗ＩＣＯＳ抗体は、リツキシマブのような抗ＣＤ２０抗体による治療に応答しないか、又は耐性をもつようになる癌の治療を表す。抗ＩＣＯＳ抗体は、かかる癌の第２選択の(又はさらなる、又は追加の)治療として使用することができる。抗ＣＤ２０抗体耐性癌は、Ｂ細胞癌、例えばＢ細胞リンパ腫、例えばびまん性大Ｂ細胞リンパ腫であり得る。抗ＣＤ２０に対する癌の耐性は、抗ＣＤ２０抗体による癌細胞の殺滅若しくは増殖阻害のための試料(例えば、腫瘍生検試料)を試験することによってエクスビボで、及び/又は臨床設定で抗ＣＤ２０抗体で治療を受けた患者が治療に応答していないことを観察することによって判定され得る。代替的に又は追加的に、癌(例えば、腫瘍生検試料)を試験して、ＣＤ２０の発現を評価することができ、ＣＤ２０発現の非存在又は低レベルは、抗ＣＤ２０抗体に対する感受性の喪失を示す。
【０１７０】
従って、患者から得られた試料を試験して、目的のタンパク質、例えばＩＣＯＳリガンド、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３、及び/又は別の治療剤(例えば、抗受容体抗体)に対する標的受容体の表面発現を判定することができる。標的受容体は、(リツキシマブ等の抗ＣＤ２０抗体療法に対する)ＣＤ２０、又はＰＤ１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、又はＨＥＲ３等の別の受容体であり得る。ＩＣＯＳリガンド、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３の表面発現及び/又は標的受容体の表面発現の欠如若しくは喪失は、癌が抗ＩＣＯＳ抗体療法に対して感受性があるという指標である。抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳリガンド、ＩＣＯＳ、ＦＯＸＰ３の表面発現及び/又は標的受容体の表面発現の欠如若しくは喪失によって特徴付けられる癌を有する患者への投与のために提供することができ、任意選択で、患者は以前抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、抗ＰＤ−Ｌ１によって又は標的受容体に対する抗体によって治療され、例えば、継続された又は再生された癌細胞の増殖、例えば、腫瘍サイズの増殖によって測定されるように、抗体による治療に応答していないか、又は応答を停止していた。
【０１７１】
任意の適切な方法を用いて、癌細胞が、ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２０、又は本明細書に記載の他の標的受容体等のタンパク質の表面発現について陽性を試験するかどうかを判定することができる。典型的な方法は、免疫組織化学であり、細胞の試料(例えば、腫瘍生検試料)を目的のタンパク質の抗体と接触させ、抗体の結合は標識試薬、典型的には第１の抗体のＦｃ領域を認識し、蛍光マーカーのような検出可能な標識を有する第２の抗体を用いて判定される。細胞染色又は他の標識の検出によって視覚化されるように、少なくとも５％の細胞が標識されている場合、陽性を試験するために試料を宣言することができる。任意選択で、１０％又は２５％等のより高いカットオフを使用することができる。抗体は、一般に過剰量で使用される。目的の分子に対する試薬抗体が入手可能であるか、又は直接的な方法によって生成され得る。ＩＣＯＳリガンドを試験するために、抗体ＭＡＢ１６５１は現在、ヒトＩＣＯＳリガンドを認識するマウスＩｇＧとしてＲ＆Ｄシステムから入手可能である。ＣＤ２０発現を試験するために、リツキシマブを使用することができる。目的のＩＣＯＳリガンド又は標的受容体のｍＲＮＡレベルの検出は代替技術である［２７］。
【０１７２】
腫瘍が抗ＩＣＯＳ抗体による治療に応答することのさらなる示唆は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの存在である。活性化されたＴｒｅｇは、ＩＣＯＳの高い表面発現及びＦｏｘｐ３の高い表面発現によって特徴付けられる。腫瘍におけるＴｒｅｇの存在は、特に上昇した数において、抗ＩＣＯＳ抗体による治療のために患者を選択することができるさらなる基盤を提供する。Ｔｒｅｇは、エクスビボでの腫瘍生検試料で、例えば免疫組織化学(上記のようなＦｏｘｐ３とＩＣＯＳの両方の同時発現のアッセイ、標識の検出の後の標的タンパク質に対する抗体の使用)によって、又はＩＣＯＳ及びＦｏｘｐ３に対する標識された抗体でＦＡＣＳで使用するための試料の単独細胞分散によって、検出され得る。ＦＡＣＳ法は、実施例１７及び実施例１８で例示されている。
【０１７３】
抗ＩＣＯＳ抗体は、ウイルス誘発性癌等の感染性因子に関連する癌を治療するために使用され得る。このカテゴリーには、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、メルケル細胞癌、多くの他のものがある。癌に関連するウイルスには、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ(子宮頸癌、中咽頭癌)、及びＥＢＶ(バーキットリンパ腫、胃癌、ホジキンリンパ腫、他のＥＢＶ陽性Ｂ細胞リンパ腫、鼻咽頭癌、及び移植後リンパ増殖性疾患)が含まれる。Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ(Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ１００Ｂ)は、感染性因子に関連する以下の主要な癌部位を同定した：
●胃(Ｓｔｏｍａｃｈ)/胃(Ｇａｓｔｒｉｃ)：Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ
●肝臓：Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ  ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ
●子宮頸部：ＨＩＶ陽性又は陰性のヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)
●肛門性器(陰茎、陰門、膣、肛門)：ＨＩＶ陽性又は陰性のＨＰＶ
●鼻咽頭：エプスタイン・バーウイルス(ＥＢＶ)
●中咽頭：タバコやアルコール消費の有無に関わらないＨＰＶ
●カポジ肉腫：ＨＩＶ陽性又は陰性のヒトヘルペスウイルス８型
●非ホジキンリンパ腫：Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、ＨＩＶ陽性又は陰性のＥＢＶ、ＨＣＶ、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型
●ホジキンリンパ腫：ＨＩＶ陽性又は陰性のＥＢＶ
●膀胱：Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ
【０１７４】
本発明による抗体は、これらの感染性因子のいずれか、例えば、上記で特定された癌に付随するか、又はそれによって誘導される癌を治療するために使用され得る。
【０１７５】
エフェクターＴ細胞応答の刺激はまた、感染性疾患に対する免疫及び/又は患者における感染性疾患からの回復に寄与し得る。従って、抗ＩＣＯＳ抗体は、抗体を患者に投与することによって感染性疾患を治療するために使用され得る。
【０１７６】
感染性疾患には、病原体、例えば、細菌、真菌、ウイルス又は原生動物の病原体によって引き起こされるものが含まれ、治療は、病原体感染に対する患者の免疫応答を促進することができる。細菌病原体の例は、結核である。ウイルス性病原体の例は、Ｂ型肝炎及びＨＩＶである。原虫病原体の例は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのようなマラリアを引き起こすＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種である。
【０１７７】
この抗体は、感染、例えば本明細書に記載の任意の病原体による感染の治療に使用することができる。感染は持続性感染又は慢性感染であり得る。感染は限局性又は全身性であり得る。病原体と免疫系との広域の接触は、(例えば、Ｔｒｅｇのレベルの上昇、Ｔｒｅｇに有利なＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆバランスの調整によって現れる)免疫系の枯渇若しくは寛容の発達、及び/又は提示された病原体抗原の進化及び改変を通じて病原体による免疫回避をもたらし得る。これらの特徴は、癌で起こると考えられる同様の過程を反映している。抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｔｅｆｆに有利なＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比及び/又は本明細書中に記載される他の効果の調整を通じて、病原体による感染、例えば慢性感染を治療するための治療的アプローチを提示する。
【０１７８】
治療は、感染性疾患又は感染を有すると診断された患者のものであってもよい。或いは、本明細書の他の箇所に記載されているように、治療は予防的であってもよく、患者に投与して、例えばワクチンとして疾患に罹患しないようにすることができる。
【０１７９】
免疫応答、とりわけＩＦＮγ依存性全身性免疫応答が、部分として神経炎症性の構成要素を共有するアルツハイマー病及び他のＣＮＳの病理学について有益であり得ることが、また、提唱されている［２９］。ＷＯ２０１５/１３６５４１は、抗ＰＤ−１抗体を用いたアルツハイマー病の治療を提案した。抗ＩＣＯＳ抗体は、アルツハイマー病又は他の神経変性疾患の治療において、任意選択で１つ以上の他の免疫調節剤(例えば、ＰＤ−１に対する抗体)と組み合わせて使用することができる。
【０１８０】
併用療法
抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１、又は抗ＰＤＬ１等の免疫調節抗体、特にＦｃエフェクター機能を有する免疫調節抗体による治療は、ＩＣＯＳ高発現免疫抑制細胞のさらなる枯渇が有益な環境を作り出すことができる。その治療効果を高めるために、抗ＩＣＯＳ抗体とかかる免疫調節剤とを組み合わせることが有利であり得る。
【０１８１】
免疫調節抗体(例えば、抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４)で治療された患者は、抗ＩＣＯＳ抗体での治療から特に利益を得ることができる。これの１つの理由は、免疫調節抗体が、患者のＩＣＯＳ陽性Ｔｒｅｇ(例えば、腫瘍内Ｔｒｅｇ)の数を増加させ得ることである。この効果は、組換えＩＬ−２のようなある種の他の治療剤でも観察される。抗ＩＣＯＳ抗体は、患者を別の治療剤で治療した結果生じるＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ(例えば、腫瘍内Ｔｒｅｇ)の急激な上昇又は上昇を低減及び/又は逆転させることができる。従って、抗ＩＣＯＳ抗体による治療のために選択された患者は、第１の治療剤による治療を既に受けている患者であり得て、第１の治療剤は、患者のＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの数が増加する抗体(例えば、免疫調節抗体)又は他の薬剤(例えば、ＩＬ−２)である。
【０１８２】
抗ＩＣＯＳ  抗体と組み合わされ得る免疫調整剤は、ＰＤＬ１(例えば、アベルマブ)、ＰＤ−１(例えば、ペンブロリズマブ又はニボルマブ)、又はＣＴＬＡ−４(例えば、イピリムマブ又はトレメリムマブ)のいずれかに対する抗体を含む。抗ＩＣＯＳ抗体は、ピジリズマブと組み合わせてもよい。他の実施形態では、抗ＩＣＯＳ抗体は抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与されず、及び/又は任意選択で抗ＣＴＬＡ−４抗体ではない治療抗体と組み合わせて投与される。
【０１８３】
例えば、抗ＩＣＯＳ抗体は、抗ＰＤＬ１抗体との併用療法において使用され得る。好ましくは、抗ＩＣＯＳ抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣを媒介するものである。好ましくは、抗ＰＤＬ１抗体は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣを媒介するものである。そのような併用療法の例は、両方の抗体がエフェクター陽性定常領域を有する抗ＰＤＬ１抗体を有する抗ＩＣＯＳ抗体の投与である。したがって、抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤＬ１抗体は、両方ともＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び/又はＡＤＣＰを媒介することができる。Ｆｃエフェクター機能及び定常領域の選択は、本明細書の他の箇所で詳細に記載されるが、一例として、抗ＩＣＯＳヒトＩｇＧ１を抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１と組み合わせることができる。抗ＩＣＯＳ抗体及び/又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域を含み得る。或いは、抗体のエフェクター陽性定常領域は、増強されたエフェクター機能、例えば増強されたＣＤＣ、ＡＤＣＣ、及び/又はＡＤＣＰのために操作されたものであり得る。野生型ヒトＩｇＧ１配列及びエフェクター機能を変更する変異を含む例示的な抗体定常領域は、本明細書の他の箇所で詳細に記載される。
【０１８４】
抗ＩＣＯＳ抗体を組み合わせることができる抗ＰＤＬ１抗体には、
●任意選択でエフェクター陽性ヒトＩｇＧ１として、ＰＤＬ１へのＰＤ−１の結合を阻害し、及び/又はＰＤＬ１を阻害する抗ＰＤＬ１抗体；
●ＰＤＬ１及び/又はＰＤＬ２へのＰＤ−１の結合を阻害する抗ＰＤ−１抗体；
●ＰＤＬ−１へのＰＤ−１結合を阻害するヒトＩｇＧ１抗体であるアベルマブ、ＷＯ２０１３/０７９１７４を参照されたい；
●変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及び３３１を有する変異型ヒトＩｇＧ１抗体であるデュルバルマブ(又は「ＭＥＤＩ４７３６」)、ＷＯ２０１１/０６６３８９を参照されたい；
●変異Ｎ２９７Ａ、Ｄ３５６Ｅ、及びＬ３５８Ｍを有する変異体ヒトＩｇＧ１抗体であるアテゾリズマブ、ＵＳ２０１０/０２０３０５６を参照されたい；
●変異Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４抗体であるＢＭＳ−９３６５５９、ＷＯ２００７/００５８７４を参照されたい、が含まれる。
【０１８５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の数多くのさらなる例が、本明細書に開示されており、その他は当該技術分野で既知である。本明細書に言及された抗ＰＤ−Ｌ１抗体の多くの特性評価データは、両方とも参照により本明細書に組み込まれるＵＳ９，５６７，３９９及びＵＳ９，６１７，３３８に公開されている。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＵＳ９，５６７，３９９又はＵＳ９，６１７，３３８に記載されているように、１Ｄ０５、８４Ｇ０９、１Ｄ０５ＨＣ変異体１、１Ｄ０５ＨＣ変異体２、１Ｄ０５ＨＣ変異体３、１Ｄ０５ＨＣ変異体４、１Ｄ０５ＬＣ変異体１、１Ｄ０５ＬＣ変異体２、１Ｄ０５ＬＣ変異体３、４１１Ｂ０８、４１１Ｃ０４、４１１Ｄ０７、３８５Ｆ０１、３８６Ｈ０３、３８９Ａ０３、４１３Ｄ０８、４１３Ｇ０５、４１３Ｆ０９、４１４Ｂ０６、又は４１６Ｅ０１のいずれかのＨＣＤＲ及び/又はＬＣＤＲを含むＶＨ及び/又はＶＬドメインを有する。抗体は、これらの抗体のいずれかのＶＨ及びＶＬドメインを含み得、これらの抗体のいずれかの重鎖及び/又は軽鎖アミノ酸配列を有する重鎖及び/又は軽鎖を任意選択で含み得る。これらの抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＶＨ及びＶＬドメインは、本明細書の他の箇所でさらに記載される。
【０１８６】
さらなる例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＫＮ−０３５、ＣＡ−１７０、ＦＡＺ−０５３、Ｍ７８２４、ＡＢＢＶ−３６８、ＬＹ−３３０００５４、ＧＮＳ−１４８０、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＲＥＧＮ３５０４のＨＣＤＲ及び/若しくはＬＣＤＲを含む、又はＷＯ２０１７/０３４９１６、ＷＯ２０１７/０２０２９１、ＷＯ２０１７/０２０８５８、ＷＯ２０１７/０２０８０１、ＷＯ２０１６/１１１６４５、ＷＯ２０１６/１９７３６７、ＷＯ２０１６/０６１１４２、ＷＯ２０１６/１４９２０１、ＷＯ２０１６/０００６１９、ＷＯ２０１６/１６０７９２、ＷＯ２０１６/０２２６３０、ＷＯ２０１６/００７２３５、ＷＯ２０１５/１７９６５４、ＷＯ２０１５/１７３２６７、ＷＯ２０１５/１８１３４２、ＷＯ２０１５/１０９１２４、ＷＯ２０１５/１１２８０５、ＷＯ２０１５/０６１６６８、ＷＯ２０１４/１５９５６２、ＷＯ２０１４/１６５０８２、ＷＯ２０１４/１０００７９、ＷＯ２０１４/０５５８９７、ＷＯ２０１３/１８１６３４、ＷＯ２０１３/１７３２２３、ＷＯ２０１３/０７９１７４、ＷＯ２０１２/１４５４９３、ＷＯ２０１１/０６６３８９、ＷＯ２０１０/０７７６３４、ＷＯ２０１０/０３６９５９、ＷＯ２０１０/０８９４１１、及びＷＯ２００７/００５８７４のいずれかに開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＶＨ及び/又はＶＬドメインを有する。抗体は、これらの抗体のいずれかのＶＨ及びＶＬドメインを含み得、これらの抗体のいずれかの重鎖及び/又は軽鎖アミノ酸配列を有する重鎖及び/又は軽鎖を任意選択で含み得る。抗ＰＤ−Ｌ１による併用療法で使用される抗ＩＣＯＳ抗体は、本明細書で開示される本発明の抗体であり得る。或いは、抗ＩＣＯＳ抗体は、以下の刊行物のいずれかに開示される抗ＩＣＯＳ抗体のＣＤＲ、又はそのＶＨ及び/又はＶＬドメインを含み得る：ＷＯ２０１６１５４１７７、ＵＳ２０１６３０４６１０−例えば７Ｆ１２、３７Ａ１０、３５Ａ９、３６Ｅ１０、１６Ｇ１０、３７Ａ１０Ｓ７１３、３７Ａ１０Ｓ７１４、３７Ａ１０Ｓ７１５、３７Ａ１０Ｓ７１６、３７Ａ１０Ｓ７１７、３７Ａ１０Ｓ７１８、１６Ｇ１０Ｓ７１、１６Ｇ１０Ｓ７２、１６Ｇ１０Ｓ７３、１６Ｇ１０Ｓ８３、３５Ａ９Ｓ７９、３５Ａ９Ｓ７１０、又は３５Ａ９Ｓ８９抗体のいずれか；ＷＯ１６１２０７８９、ＵＳ２０１６２１５０５９−例えば４２２．２及び/又はＨ２Ｌ５として知られている抗体；ＷＯ１４０３３３２７、ＥＰ２８９２９２８、ＵＳ２０１５２３９９７８−例えば３１４−８として知られている及び/又はハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−４１８０から生成される抗体；ＷＯ１２１３１００４、ＥＰ２６９１４１９、ＵＳ９３７６４９３、ＵＳ２０１６０２６４６６６−例えば抗体Ｉｃｏｓ１４５−１及び/又はハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−４１７９によって生成される抗体；ＷＯ１００５６８０４−例えば抗体ＪＭＡｂ１３６又は「１３６」；ＷＯ９９１５５５３、ＥＰ１０１７７２３Ｂ１、ＵＳ７２５９２４７、ＵＳ７１３２０９９、ＵＳ７１２５５５１、ＵＳ７３０６８００、ＵＳ７７２２８７２、ＷＯ０５１０３０８６、ＥＰ１７４０６１７、ＵＳ８３１８９０５、ＵＳ８９１６１５５−例えば抗体ＭＩＣ−９４４又は９Ｆ３；ＷＯ９８３８２１、ＵＳ７９３２３５８Ｂ２、ＵＳ��００２１５６２４２、ＥＰ０９８４０２３、ＥＰ１５０２９２０、ＵＳ７０３０２２５、ＵＳ７０４５６１５、ＵＳ７２７９５６０、ＵＳ７２２６９０９、ＵＳ７１９６１７５、ＵＳ７９３２３５８、ＵＳ８３８９６９０、ＷＯ０２０７００１０、ＥＰ１２８６６６８、ＥＰ１３７４９０１、ＵＳ７４３８９０５、ＵＳ７４３８９０５、ＷＯ０１８７９８１、ＥＰ１１５８００４、ＵＳ６８０３０３９、ＵＳ７１６６２８３、ＵＳ７９８８９６５、ＷＯ０１１５７３２、ＥＰ１１２５５８５、ＵＳ７４６５４４５、ＵＳ７９９８４７８−例えば任意のＪＭＡｂ抗体、例えばＪＭＡｂ−１２４、ＪＭＡｂ−１２６、ＪＭＡｂ−１２７、ＪＭＡｂ−１２８、ＪＭＡｂ−１３５、ＪＭＡｂ−１３６、ＪＭＡｂ−１３７、ＪＭＡｂ−１３８、ＪＭＡｂ−１３９、ＪＭＡｂ−１４０、ＪＭＡｂ−１４１、例えば、ＪＭＡｂ１３６のいずれか；ＷＯ２０１４/０８９１１３−例えば抗体１７Ｇ９；ＷＯ１２１７４３３８；ＵＳ２０１６１４５３４４；ＷＯ１１０２００２４、ＥＰ２４６４６６１、ＵＳ２０１６００２３３６、ＵＳ２０１６０２４２１１、ＵＳ８８４０８８９；ＵＳ８４９７２４４。
【０１８７】
抗ＩＣＯＳ抗体は、任意選択で、ＷＯ２０１６１５４１７７に開示されている３７Ａ１０Ｓ７１３のＣＤＲを含む。それは、３７Ａ１０Ｓ７１３のＶＨ及びＶＬドメインを含んでいてもよく、３７Ａ１０Ｓ７１３の抗体重鎖及び軽鎖を任意選択で有していてもよい。
【０１８８】
抗ＩＣＯＳ抗体と免疫調節剤との組合せは、単独療法と比較して増加した治療効果を提供することができ、免疫調節剤(複数可)のより低い用量で治療利益を達成することができる。したがって、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて使用される抗体(例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、任意選択でイピリムマブ)は、より通常の１０ｍｇ/ｋｇの用量ではなく３ｍｇ/ｋｇで投与され得る。抗ＰＤ−Ｌ１又は他の抗体の投与レジメンは、合計４用量の３週間ごと９０分の期間にわたる静脈内投与を伴い得る。
【０１８９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体が治療上の利益を発揮する用量の減少として認識され得る、抗ＰＤ−Ｌ１抗体での治療に対する腫瘍の感受性を増加させるために、抗ＩＣＯＳ抗体を使用することができる。したがって、抗ＩＣＯＳ抗体は、患者の癌又は腫瘍を治療するのに効果的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体の用量を減少させるために患者に投与され得る。抗ＩＣＯＳ抗体の投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が抗ＩＣＯＳなしで投与された場合の投与量と比較して、例えば、７５％、５０％、２５％、２０％、１０％未満まで、その患者への抗ＰＤ−Ｌ１抗体投与の推奨又は必要な投与量を減少し得る。患者は、本明細書に記載の併用療法において抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与によって治療され得る。
【０１９０】
抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＩＣＯＳとを組み合わせる利点は、単独療法としての使用と比較した場合、各薬剤の用量の減少に及び得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗ＩＣＯＳ抗体が治療上の利益を発揮する用量を減少させるために使用され得、したがって、患者の癌又は腫瘍を治療するのに効果的な抗ＩＣＯＳ抗体の用量を減少させるために患者に投与され得る。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、抗ＩＣＯＳ抗体が抗ＰＤ−Ｌ１なしで投与された場合の投与量と比較して、例えば、７５％、５０％、２５％、２０％、１０％未満まで、その患者への抗ＩＣＯＳ抗体投与の推奨又は必要な投与量を減少し得る。患者は、本明細書に記載の併用療法において抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与によって治療され得る。
【０１９１】
本明細書の実施例２２で記載されるように、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、特にエフェクター陽性Ｆｃを有する抗体による処理は、Ｔｅｆｆ細胞上のＩＣＯＳの発現を増加させないようである。これは、かかる抗体を、エフェクター陽性抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて投与する場合に有利であり、Ｔｅｆｆ上でのＩＣＯＳ発現の増加は、これらの細胞を抗ＩＣＯＳ抗体による枯渇に対して、不所望に、より敏感にする。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１との組合せにおいて、抗ＩＣＯＳ療法は、Ｔｒｅｇと比較されるＴｅｆｆ上のＩＣＯＳの異なる発現を利用し得て、枯渇のためにＩＣＯＳ高Ｔｒｅｇを優先的に標的とする。これは、次に、ＴＥｆｆの抑制を緩和し、患者のエフェクターＴ細胞応答を促進する正味の効果を有する。免疫チェックポイント分子をＴ細胞上のＩＣＯＳの発現上で標的化する効果も以前に研究されている−ＣＴＬＡ−４抗体及び/又は抗ＰＤ−１抗体での治療がＩＣＯＳを発現するＣＤ４＋Ｔｒｅｇの割合を増加させることが報告されている、参照［３０］(補足資料)における図Ｓ６Ｃを参照されたい。Ｔｒｅｇ及びＴｅｆｆにおけるＩＣＯＳ発現に対する治療剤の効果は、抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて使用するための適切な薬剤の選択の要因であり得て、抗ＩＣＯＳ抗体の効果は、Ｔｒｅｇ対Ｔｅｆｆに関するＩＣＯＳの高い異なる発現が存在する条件下で増強され得ることに注目されたい。
【０１９２】
本明細書に記載されるように、抗ＩＣＯＳ抗体の単回用量は、特に抗ＰＤ−Ｌ１抗体のような他の治療剤と組み合わせて、治療効果を提供するのに十分であり得る。腫瘍療法において、この単一用量の利益の根底にある理論的根拠は、少なくとも部分的に、腫瘍の微小環境を十分にリセット又は変更して腫瘍を免疫攻撃及び/又は言及されたような他の免疫調節剤の効果に対してより感受性にすることによって、抗ＩＣＯＳ抗体がその効果に媒介することであり得る。腫瘍の微小環境のリセットは、例えば、ＩＣＯＳ陽性腫瘍浸潤Ｔ−ｒｅｇの枯渇により引き起こされる。したがって、例えば、患者は、単回用量の抗ＩＣＯＳ抗体、続いて１回又は複数回の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療され得る。治療期間、例えば６ヶ月又は１年間にわたって、抗ＩＣＯＳ抗体は単回用量で投与されてもよく、一方で、他の薬剤、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、任意選択で、その治療期間にわたって複数回、好ましくは、抗ＩＣＯＳ抗体での処置に続いて投与されるかかる用量の少なくとも１つで、投与される。
【０１９３】
併用療法のさらなる例には、抗ＩＣＯＳ抗体と、以下との組合せが含まれる：
−アデノシンＡ２Ａ受容体(「Ａ２ＡＲ阻害剤」)のアンタゴニスト；
−ＣＤ１３７アゴニスト(例えば、アゴニスト抗体)；
−トリプトファン(「ＩＤＯ阻害剤」)の分解を触媒するインドールアミン−２，３ジオキシゲナーゼ酵素であるアンタゴニスト。ＩＤＯは免疫チェックポイントであり、樹状細胞及びマクロファージにおいて活性化され、免疫抑制/耐性に寄与する。
【０１９４】
抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＬ−２(例えば、アルデスロイキンのような組換えＩＬ−２)との併用療法において使用され得る。ＩＬ−２は高用量(ＨＤ)で投与することができる。典型的なＨＤ  ＩＬ−２療法は、治療サイクルあたりの５００，０００ＩＵ/ｋｇを超えるボーラス注入、例えば６００，０００又は７２０，０００ＩＵ/ｋｇのボーラス注入を伴い、５〜１０時間の間隔で１０〜１５回のかかるボーラス注入、例えば、８時間ごとに最大１５回のボーラス注入を行い、治療サイクルを約１４〜２１日ごとに最大６〜８サイクルを繰り返す。ＨＤ  ＩＬ−２療法は、腫瘍、特に黒色腫(例えば、転移性黒色腫)、及び腎細胞癌の治療に成功しているが、その使用は、重篤な有害作用を引き起こし得るＩＬ−２の高い毒性に限定される。
【０１９５】
高用量のＩＬ−２による治療は、癌患者におけるＩＣＯＳ陽性Ｔｒｅｇの集団を増加させることが示されている［３１］。ＨＤ  ＩＬ−２療法の最初のサイクルに続くＩＣＯＳ＋ＴＲｅｇのこの増加は、より悪い臨床結果と相関することが報告された−ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの数が多いほど、予後が悪い。ＩＬ−２変異体Ｆ４２Ｋは、ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ細胞のこの望ましくない増加を避けるための代替療法として提案されている［３２］。しかしながら、別のアプローチは、本発明による抗体を第２選択の治療剤として使用することによってＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの増加を利用することであろう。
【０１９６】
ＩＣＯＳを高発現するＴＲｅｇを標的とし、これらの細胞を阻害し、ＩＬ−２療法を受けている患者の予後を改善する抗ＩＣＯＳ抗体の能力を利用して、抗ＩＣＯＳ抗体とＩＬ−２療法を組み合わせることは有益であり得る。ＩＬ−２及び抗ＩＣＯＳ抗体の同時投与は、治療された患者集団における有害事象を回避又は軽減しながら、奏効率を増加させ得る。この組合せは、ＩＬ−２単独療法と比較してより低い用量でＩＬ−２を使用することを可能にし、ＩＬ−２療法から生じる有害事象の危険性又はレベルを低下させ、一方で臨床的利益(例えば、腫瘍増殖の減少、固形腫瘍のクリアランス及び/又は転移の減少)を保持するか、又は増強する。このようにして、抗ＩＣＯＳの添加は、高用量(ＨＤ)又は低用量(ＬＤ)ＩＬ−２のいずれであっても、ＩＬ−２を受けている患者の治療を改善することができる。
【０１９７】
したがって、本発明の一態様は、抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することによって患者を治療する方法を提供し、患者はＩＬ−２、例えばＨＤ  ＩＬ−２でも治療される。本発明の別の態様は、患者の治療に使用するための抗ＩＣＯＳ抗体であり、患者はＩＬ−２、例えばＨＤ  ＩＬ−２でも治療される。抗ＩＣＯＳ抗体は、第２選択の療法として使用することができる。したがって、患者は、例えばＨＤ  ＩＬ−２療法の少なくとも１サイクルを受けた、及び増加したＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇレベルを有する、ＩＬ−２で治療された患者であり得る。アッセイは、ＩＣＯＳ、Ｆｏｘｐ３、ＩＣＯＳＬについて陽性の細胞、及び任意選択で１つ以上のさらなる目的のマーカーを検出するために、本明細書の他の箇所に記載されるような免疫組織化学又はＦＡＣＳを用いて、癌細胞の試料、例えば腫瘍生検試料に対して行うことができる。方法は、ＩＬ−２治療後に患者が(例えば、末梢血中又は腫瘍生検中の)上昇したＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇレベルを有することを判定することを含むことができ、上昇したレベルは、患者が抗ＩＣＯＳ抗体による治療から利益を受けることを示す。Ｔｒｅｇの増加は、対照(未治療)個体又はＩＬ−２治療前の患者に対するものであり得る。上昇したＴｒｅｇを有するかかる患者は、継続的なＩＬ−２治療単独から利益を得ることができない群を表すが、抗ＩＣＯＳ抗体とＩＬ−２療法の組合せ、又は抗ＩＣＯＳ抗体単独による治療は治療上の利益をもたらす。したがって、患者がＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの上昇したレベルを有するという肯定的な判定に続いて、抗ＩＣＯＳ抗体及び/又はさらなるＩＬ−２療法を施すことができる。抗ＩＣＯＳ抗体による治療は、そのような患者における他のＴ細胞集団と比較して、ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇを選択的に標的とし、枯渇させることができる。これは、これらの細胞によって媒介される免疫抑制を緩和し、それによって標的細胞、例えば腫瘍細胞又は感染細胞に対するＴｅｆｆの活性を増強することによって治療効果を提供する。
【０１９８】
抗ＩＣＯＳ抗体及びＩＬ−２との併用療法は、本明細書に記載された任意の治療適応症、特に腫瘍、例えば転移性黒色腫等の黒色腫又は腎細胞癌の治療に用いることができる。したがって、一例では、抗ＩＣＯＳ抗体で治療された患者は、転移性黒色腫を提示し、ＩＬ−２、例えばＨＤ  ＩＬ−２療法又はＬＤ  ＩＬ−２療法で治療された患者である。
【０１９９】
一般に、抗ＩＣＯＳ抗体が、第１の治療剤(例えば、免疫調節抗体)又は他の薬剤(例えば、ＩＬ−２)による治療を受けた患者に投与される場合、抗ＩＣＯＳ抗体は、第１の治療剤の投与後の、例えば、２４時間、４８時間、７２時間、１週間、又は２週間の最短期間の後に投与され得る。抗ＩＣＯＳ抗体は、第１の治療剤の投与後、２、３、４、又は５週間以内に投与され得る。これは、患者の服薬遵守を容易にし、コストを低減するために、投与される治療の回数を最小限に抑えることが望ましいが、いつでもいずれかの薬剤の追加投与を排除するものではない。むしろ、投与の相対的なタイミングは、その組合せ効果を最適化するように選択され、第１の治療剤は、抗ＩＣＯＳ抗体の効果が特に有利である免疫環境(例えば、上昇したＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ又は以下に記載される抗原放出)を創出する。したがって、第１の治療剤及びその後の抗ＩＣＯＳ抗体の逐次投与は、第１の薬剤が作用する時間を可能にし、抗ＩＣＯＳ抗体がその増強された効果を示すことができるインビボ条件を創出する。同時又は逐次組合せ治療を含む様々な投与レジメンが本明細書に記載され、適切に利用され得る。第１の治療剤が患者のＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの数を増加させるものである場合、患者の治療レジメンは、患者がＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇの増加した数を有することを判定し、次いで抗ＩＣＯＳ抗体を投与することを含むことができる。
【０２００】
上記のように、併用療法における抗ＩＣＯＳ抗体の使用は、治療剤の有効用量を減少させる及び/又は患者のＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇを増加させる治療剤の有害作用に対抗する利点を提供し得る。さらに、「免疫学的細胞死」によって標的細胞から抗原を放出させる第１の治療剤を選択すること、及び抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて第１の治療剤を投与することによって、さらなる治療利益を達成することができる。上記のように、抗ＩＣＯＳ抗体の投与は、第１の治療剤の投与に順次続いてもよく、２つの薬剤の投与は、上記のような特定の時間窓によって分離される。
【０２０１】
免疫学的細胞死は、アポトーシスとは対照的に、細胞死の認識された様式である。それは、細胞からのＡＴＰ及びＨＭＧＢ１の放出及び原形質膜上のカルレティキュリンの曝露によって特徴付けられる［３３、３４］。
【０２０２】
標的組織又は標的細胞における免疫学的細胞死は、抗原提示細胞による細胞の貪食を促進し、標的細胞からの抗原の提示をもたらし、次に抗原特異的なＴｅｆｆ細胞を誘導する。抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｔｅｆｆ細胞上のＩＣＯＳのアゴニストとして作用することによって、Ｔｅｆｆ応答の大きさ及び/又は持続時間を増加させることができる。さらに、抗ＩＣＯＳ抗体がＦｃエフェクター機能が可能な場合(例えば、ヒトＩｇＧ１抗体)、抗ＩＣＯＳ抗体は抗原特異型Ｔｒｅｇの枯渇を引き起こし得る。したがって、これらの効果のいずれか又は両方の組合せにより、ＴｅｆｆとＴｒｅｇ細胞との間のバランスは、Ｔｅｆｆ活性を増強することに有利に調節される。抗ＩＣＯＳ抗体と、例えば、腫瘍又は癌細胞中に標的組織又は細胞型における免疫学的細胞死を誘導する治療との組合せは、それにより、標的組織又は細胞に対する患者の免疫応答を促進し、ワクチン抗原がインビボで生成されるワクチン接種の形態で表す。
【０２０３】
したがって、本発明の一態様は、患者の癌細胞に対する患者のインビボワクチン接種による、患者の癌を治療する方法である。本発明の別の態様は、このような方法で使用するための抗ＩＣＯＳ抗体である。抗ＩＣＯＳ抗体は、以下を含む方法において使用され得る：
癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす療法によって患者を治療し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞に対する抗原の提示をもたらすことと、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することであって、抗ＩＣＯＳ抗体が、癌細胞に対する抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強する、投与すること。
【０２０４】
免疫学的細胞死を誘導する治療は、放射線(例えば、ＵＶＣライト又はγ光線を用いる細胞のイオン化照射)、化学療法剤(例えば、オキサリプラチン、ドキソルビシン等のアントラサイクリン、イダルビシン又はミトキサントロン、フロレチン又はピマル酸等のＢＫチャネルアゴニスト、ボルテゾミブ、強心配糖体、シクロホスファミド、マイトマイシンを有するＧＡＤＤ３４/ＰＰ１阻害剤、ヒペリシンを有するＰＤＴ、ポリイノシン・ポリシチジン酸、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、ゲフィトニブ、エルロチニブ、又はシスプラチンを有するタプシガルジン)、及び腫瘍関連抗原に対する抗体を含む。腫瘍関連抗原は、同じ組織の非腫瘍細胞(例えば、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ)に対して、腫瘍細胞によって過剰発現される任意の抗原であり得る。適切な抗体には、ハーセプチン(抗ＨＥＲ２)、リツキシマブ(抗ＣＤ２０)、又はセツキシマブ(抗ＥＧＦＲ)が含まれる。
【０２０５】
したがって、抗ＩＣＯＳ抗体と１つ以上のかかる治療とを組み合わせることが有利である。任意選択で、抗ＩＣＯＳ抗体は、かかる治療を既に受けている患者に投与される。抗ＩＣＯＳ抗体は、免疫学的細胞死を誘発する治療後、例えば、治療後の２４〜７２時間の間の、例えば、２４時間、４８時間、７２時間、１週間、又は２週間の期間の後に投与され得る。抗ＩＣＯＳ抗体は、治療後の２、３、４、又は５週間以内に投与することができる。併用療法の他のレジメンは、本明細書の他の箇所で記載されている。
【０２０６】
「インビボワクチン接種」は上記に記載されているが、エクスビボで免疫学的細胞死を誘導するために腫瘍細胞を治療することも可能であり、その後、細胞を患者に再導入することができる。免疫学的細胞死を患者に直接誘導する薬剤又は治療を投与するのではなく、処置された腫瘍細胞を患者に投与する。患者の治療は、上記の投与レジメンに従うことができる。
【０２０７】
既に述べたように、抗ＩＣＯＳ抗体の単回用量は、治療上の利益を提供するのに十分であり得る。したがって、本明細書に記載される治療方法では、抗ＩＣＯＳ抗体は、単回用量として任意選択で投与される。抗ＩＣＯＳ抗体の単回用量は、患者のＴｒｅｇを枯渇させ、癌等の疾患に結果的に有益な効果をもたらし得る。これまで、Ｔｒｅｇの一過性切除には、腫瘍進行の減少、確立された腫瘍及び転移の治療、及び生存の延長を含む抗腫瘍効果があり、腫瘍照射の治療効果を増強し得ることが報告されている［３５］。単回用量の抗ＩＣＯＳの投与は、かかるＴｒｅｇ枯渇を提供し得、放射線療法のような組み合わせて使用される他の治療アプローチの効果を増強するために使用され得る。
【０２０８】
ＰＤ−Ｌ１に対する抗体
本明細書に記載のように、別個の治療剤又は多重特異性抗体であろうと、抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて使用するＰＤ−Ｌ１に対する抗体は、任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抗原結合部位を含み得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の数多くの例が、本明細書に開示されており、その他は当該技術分野で既知である。本明細書に言及された抗ＰＤ−Ｌ１抗体の多くの特性評価データは、両方とも参照により本明細書に組み込まれるＵＳ９，５６７，３９９及びＵＳ９，６１７，３３８に公開されている。
【０２０９】
１Ｄ０５は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３３の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３４である。１Ｄ０５は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５(重鎖核酸配列配列番号３６)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５(軽鎖核酸配列配列番号４６)である。
【０２１０】
８４Ｇ０９は、配列番号７(ＩＭＧＴ)又は配列番号１０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号８(ＩＭＧＴ)又は配列番号１１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号９(ＩＭＧＴ)又は配列番号１２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号１３の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号１４である。８４Ｇ０９は、配列番号１７(ＩＭＧＴ)又は配列番号２０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号１９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号２３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号２４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１５(重鎖核酸配列配列番号１６)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２５(軽鎖核酸配列配列番号２６)である。
【０２１１】
１Ｄ０５  ＨＣ変異体１は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４７の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。１Ｄ０５  ＨＣ変異体１は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５(軽鎖核酸配列配列番号４６)である。
【０２１２】
１Ｄ０５  ＨＣ変異体２は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。１Ｄ０５  ＨＣ変異体２は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５(軽鎖核酸配列配列番号４６)である。
【０２１３】
１Ｄ０５  ＨＣ変異体３は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号４９の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。１Ｄ０５  ＨＣ変異体３は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５(軽鎖核酸配列配列番号４６)である。
【０２１４】
１Ｄ０５  ＨＣ変異体４は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３４２の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。１Ｄ０５  ＨＣ変異体４は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号４３の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５(軽鎖核酸配列配列番号４６)である。
【０２１５】
１Ｄ０５  ＬＣ変異体１は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３３の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３４である。１Ｄ０５  ＬＣ変異体１は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号５０の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。１Ｄ０５  ＬＣ変異体１のＣＤＲＬ２配列は、配列番号５０のＶＬ配列からＫａｂａｔ又はＩＭＧＴシステムによって定義される通りである。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５若しくは配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５(重鎖核酸配列配列番号３６)である。
【０２１６】
１Ｄ０５  ＬＣ変異体２は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３３の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３４である。１Ｄ０５  ＬＣ変異体２は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号５１の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５(重鎖核酸配列配列番号３６)である。
【０２１７】
１Ｄ０５  ＬＣ変異体３は、配列番号２７(ＩＭＧＴ)又は配列番号３０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２８(ＩＭＧＴ)又は配列番号３１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２９(ＩＭＧＴ)又は配列番号３２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３３の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３４である。１Ｄ０５  ＬＣ変異体３は、配列番号３７(ＩＭＧＴ)又は配列番号４０(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、及び配列番号３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号２９８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。１Ｄ０５  ＬＣ変異体３のＣＤＲＬ２配列は、配列番号２９８のＶＬ配列からＫａｂａｔ又はＩＭＧＴシステムによって定義される通りである。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号４４である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５若しくは配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５(重鎖核酸配列配列番号３６)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５(軽鎖核酸配列配列番号４６)である。
【０２１８】
４１１Ｂ０８は、配列番号５２(ＩＭＧＴ)又は配列番号５５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号５３(ＩＭＧＴ)又は配列番号５６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号５４(ＩＭＧＴ)又は配列番号５７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号５８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号５９である。４１１Ｂ０８は、配列番号６２(ＩＭＧＴ)又は配列番号６５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号６３(ＩＭＧＴ)又は配列番号６６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号６４(ＩＭＧＴ)又は配列番号６７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号６８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号６９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号６０(重鎖核酸配列配列番号６１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号７０(軽鎖核酸配列配列番号７１)である。
【０２１９】
４１１Ｃ０４は、配列番号７２(ＩＭＧＴ)又は配列番号７５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号７３(ＩＭＧＴ)又は配列番号７６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号７４(ＩＭＧＴ)又は配列番号７７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号７８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号７９である。４１１Ｃ０４は、配列番号８２(ＩＭＧＴ)又は配列番号８５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号８３(ＩＭＧＴ)又は配列番号８６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号８４(ＩＭＧＴ)又は配列番号８７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号８８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号８９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号８０(重鎖核酸配列配列番号８１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号９０(軽鎖核酸配列配列番号９１)である。
【０２２０】
４１１Ｄ０７は、配列番号９２(ＩＭＧＴ)又は配列番号９５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号９３(ＩＭＧＴ)又は配列番号９６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号９４(ＩＭＧＴ)又は配列番号９７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号９８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号９９である。４１１Ｄ０７は、配列番号１０２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１０５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１０３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１０６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号１０４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１０７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号１０８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号１０９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１００(重鎖核酸配列配列番号１０１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１１０(軽鎖核酸配列配列番号１１１)である。
【０２２１】
３８５Ｆ０１は、配列番号１１２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１１５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号１１３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１１６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号１１４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１１７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号１１８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号１１９である。３８５Ｆ０１は、配列番号１２２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１２５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１２３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１２６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号１２４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１２７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号１２８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号１２９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１２０(重鎖核酸配列配列番号１２１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１３０(軽鎖核酸配列配列番号１３１)である。
【０２２２】
３８６Ｈ０３は、配列番号１５２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１５５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号１５３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１５６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号１５４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１５７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号１５８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号１５９である。３８６Ｈ０３は、配列番号１６２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１６５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１６３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１６６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号１６４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１６７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号１６８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号１６９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１６０(重鎖核酸配列配列番号１６１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１７０(軽鎖核酸配列配列番号１７１)である。
【０２２３】
３８９Ａ０３は、配列番号１７２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１７５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号１７３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１７６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号１７４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１７７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号１７８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号１７９である。３８９Ａ０３は、配列番号１８２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１８５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１８３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１８６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号１８４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１８７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号１８８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号１８９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１８０(重鎖核酸配列配列番号１８１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１９０(軽鎖核酸配列配列番号１９１)である。
【０２２４】
４１３Ｄ０８は、配列番号１３２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１３５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号１３３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１３６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号１３４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１３７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号１３８の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号１３９である。４１３Ｄ０８は、配列番号１４２(ＩＭＧＴ)又は配列番号１４５(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号１４３(ＩＭＧＴ)又は配列番号１４６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号１４４(ＩＭＧＴ)又は配列番号１４７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号１４８の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号１４９である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１４０(重鎖核酸配列配列番号１４１)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１５０(軽鎖核酸配列配列番号１５１)である。
【０２２５】
４１３Ｇ０５は、配列番号２３８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２４１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２３９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２４２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２４０(ＩＭＧＴ)又は配列番号２４３(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号２４４の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号２４５である。４１３Ｇ０５は、配列番号２４８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２５１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２４９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２５２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号２５０(ＩＭＧＴ)又は配列番号２５３(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号２５４の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号２５５である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号２４６(重鎖核酸配列配列番号２４７)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２５６(軽鎖核酸配列配列番号２５７)である。
【０２２６】
４１３Ｆ０９は、配列番号２５８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２６１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２５９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２６２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２６０(ＩＭＧＴ)又は配列番号２６３(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号２６４の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号２６５である。４１３Ｆ０９は、配列番号２６８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２７１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２６９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２７２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号２７０(ＩＭＧＴ)又は配列番号２７３(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号２７４の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号２７５である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号２６６(重鎖核酸配列配列番号２６７)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２７６(軽鎖核酸配列配列番号２７７)である。
【０２２７】
４１４Ｂ０６は、配列番号２７８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２８１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号２７９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２８２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号２８０(ＩＭＧＴ)又は配列番号２８３(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号２８４の重鎖可変(ＶＨ)領域アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号２８５である。４１４Ｂ０６は、配列番号２８８(ＩＭＧＴ)又は配列番号２９１(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号２８９(ＩＭＧＴ)又は配列番号２９２(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号２９０(ＩＭＧＴ)又は配列番号２９３(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号２９４の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号２９５である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号２８６(重鎖核酸配列配列番号２８７)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２９６(軽鎖核酸配列配列番号２９７)である。
【０２２８】
４１６Ｅ０１は、配列番号３４３(ＩＭＧＴ)又は配列番号３４６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３４４(ＩＭＧＴ)又は配列番号３４７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ２アミノ酸配列、及び配列番号３４５(ＩＭＧＴ)又は配列番号３４８(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む、配列番号３４９の重鎖可変領域(ＶＨ)アミノ酸配列を有する。ＶＨドメインの重鎖核酸配列は、配列番号３５０である。４１６Ｅ０１は、配列番号３５３(ＩＭＧＴ)又は配列番号３５６(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３５４(ＩＭＧＴ)又は配列番号３５７(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号３５５(ＩＭＧＴ)又は配列番号３５８(Ｋａｂａｔ)のＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む、配列番号３５９の軽鎖可変領域(ＶＬ)アミノ酸配列を有する。ＶＬドメインの軽鎖核酸配列は、配列番号３６０である。ＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号３４０、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、又は配列番号５３４と組み合わされ得る。ＶＬドメインは、本明細書に記載される軽鎖定常領域配列のうちのいずれか、例えば、配列番号２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、５３６、及び５３８と組み合わされ得る。全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号３５１(重鎖核酸配列配列番号３５２)である。全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３６１(軽鎖核酸配列配列番号３６２)である。
【０２２９】
抗体−薬物コンジュゲート
抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｔｒｅｇを標的とするために、細胞傷害性薬物の担体として使用することができる。実施例１８に報告されるように、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)に位置するＴｒｅｇはＩＣＯＳを強く発現する。ＩＣＯＳは、腫瘍内のＴｅｆｆ又は末梢Ｔｒｅｇよりも腫瘍内のＴｒｅｇでより強く発現する。したがって、有毒な薬剤又はプロドラッグで標識された抗ＩＣＯＳ抗体は、ＴＭＥ中のＴｒｅｇを優先的に標的にして、有毒なペイロードを送達し、それらの細胞を選択的に阻害し得る。かかる細胞傷害性薬物の標的化は、Ｔｒｅｇの免疫抑制効果を除去するためのさらなる経路を提供し、それによってＴｅｆｆ活性に有利なＴｒｅｇ：Ｔｅｆｆバランスを改変し、本明細書に記載の他の治療アプローチのうち任意の１つ以上(例えば、ＴｒｅｇのＦｃエフェクター媒介性阻害、エフェクターＴ細胞のアゴニズム)の代替物として、又はそれと組み合わせて使用され得る。
【０２３０】
したがって、本発明は、細胞傷害性薬物又はプロドラッグに接合している抗ＩＣＯＳ抗体を提供する。プロドラッグの場合、プロドラッグはＴＭＥ又は治療活性の他の標的部位において活性化可能であり、細胞傷害性薬物を生成する。活性化は、例えば、近赤外光を用いて光吸収体コンジュゲートを活性化する等の、光活性化のようなトリガに応答してもよい［３６］。プロドラッグの空間選択的活性化は、これらの細胞に対して高度に選択的な細胞毒性効果を提供するために、腫瘍内Ｔｒｅｇ上の高いＩＣＯＳ発現と組み合わせて、抗体−薬物コンジュゲートの細胞毒性効果をさらに高める。
【０２３１】
抗体−薬物コンジュゲートにおける使用のために、細胞傷害性薬物又はプロドラッグは、好ましくは、血液中の抗体−薬物コンジュゲートの循環中に、非免疫原性及び非毒性(休眠中又は不活性)である。好ましくは、細胞傷害性薬物(又は活性化された場合のプロドラッグ)は強力であり、例えば、薬物の２〜４分子が標的細胞を殺滅するのに十分であり得る。光活性化可能なプロドラッグは、近赤外光曝露後に細胞膜に致命的な損傷を誘導する、シラカプトハロシアニン色素(ＩＲＤｙｅ  ７００  ＤＸ)である。細胞傷害性薬物には、モノメチルオーリスタチンＥ等の抗有糸分裂剤、及びメイタンシン誘導体、例えばメルタンシン、ＤＭ１、エムタンシン等の微小管阻害剤が含まれる。
【０２３２】
薬物(又はプロドラッグ)の抗体へのコンジュゲーションは、通常、リンカーを介する。リンカーは、切断可能なリンカー、例えばジスルフィド、ヒドラゾン、又はペプチド結合であってもよい。薬剤が腫瘍細胞中のカテプシンによって放出されるように、カテプシン切断可能なリンカーを使用してもよい。或いは、非切断性リンカー、例えば、チオエーテル結合を使用することができる。追加の付着基及び/又はスペーサーを含むこともできる。
【０２３３】
抗体−薬物コンジュゲート中の抗体は、かかる断片の小さなサイズが組織部位(例えば、固形腫瘍)への浸透を助けることができるので、本明細書に記載のＦａｂ’２又は他の抗原結合断片のような抗体断片であってもよい。
【０２３４】
本発明による抗ＩＣＯＳ抗体は、免疫サイトカインとして提供され得る。抗ＩＣＯＳ抗体はまた、併用療法において免疫サイトカインと共に投与され得る。抗体の多くの例が抗ＩＣＯＳとの併用療法における使用について本明細書に記載されており、これらのいずれか(例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体)は本発明での使用のための免疫サイトカインとして提供され得る。免疫サイトカインは、ＩＬ−２等のサイトカインに接合した抗体分子を含む。したがって、抗ＩＣＯＳ：ＩＬ−２コンジュゲート及び抗ＰＤ−Ｌ１：ＩＬ−２コンジュゲートは、本発明のさらなる態様である。
【０２３５】
ＩＬ−２サイトカインは、高(αβγ)親和性のＩＬ−２受容体及び/又は中親和性(αβ)ＩＬ−２受容体で活性を有し得る。免疫サイトカインで使用されるＩＬ−２は、１つ以上のアミノ酸欠失、置換、又は付加を有するヒト野生型ＩＬ−２又は変異型ＩＬ−２サイトカイン、例えば、Ｎ末端で１〜１０のアミノ酸欠失を有するＩＬ−２であり得る。他のＩＬ−２変異型には、変異Ｒ３８Ａ又はＲ３８Ｑが含まれる。
【０２３６】
例示的な抗ＰＤ−Ｌ１免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖を含み、重鎖はＮ末端からＣ末端方向に：
ａ)ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインと、
ｂ)重鎖定常領域と、を含み、
軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、
ｃ)ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含むＶＬドメインと、
ｄ)軽鎖定常領域(ＣＬ)と、
ｅ)任意選択で、リンカー(Ｌ)と、
ｆ)ＩＬ−２サイトカインと、を含み、
ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位によって構成され、
免疫サイトカインが、モチーフＸ１ＧＳＧＸ２ＹＧＸ３Ｘ４ＦＤ(配列番号６０９)を含むＣＤＲＨ３を含むＶＨドメインを含み、式中、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が独立して任意のアミノ酸であり、Ｘ４が存在するか又は存在しないかのいずれかであり、存在する場合、任意のアミノ酸であり得る。
【０２３７】
ＶＨ及びＶＬドメインは、本明細書で言及される任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＶＨ及びＶＬドメイン、例えば、１Ｄ０５  ＶＨ及びＶＬドメインであり得る。
【０２３８】
ＩＬ−２は、ヒト野生型又は変異型ＩＬ−２であり得る。
【０２３９】
ワクチン接種
抗ＩＣＯＳ抗体は、ワクチン組成物中に提供され得るか、又はワクチン調製物と同時投与され得る。ＩＣＯＳは、Ｔ濾胞ヘルパー細胞形成及び胚中心反応に関与している［３７］。したがって、アゴニストＩＣＯＳ抗体は、ワクチン有効性を増強する分子アジュバントとしての潜在的な臨床的有用性を有する。抗体は、Ｂ型肝炎、マラリア、ＨＩＶに対するワクチンのような多数のワクチンの防御有効性を増加させるために使用することができる。
【０２４０】
ワクチン接種の文脈において、抗ＩＣＯＳ抗体は、一般に、Ｆｃエフェクター機能を欠き、したがってＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はＡＤＣＰを媒介しない抗体である。抗体は、Ｆｃ領域を欠くか、又はエフェクターヌル定常領域を有するフォーマットで提供され得る。任意選択で、抗ＩＣＯＳ抗体は、１つ以上の型のＦｃ受容体に結合するが、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はＡＤＣＰ活性を誘導しないか、又は野生型ヒトＩｇＧ１と比較してより低いＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰ活性を示す重鎖定常領域を有し得る。かかる定常領域は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はＡＤＣＰ活性を引き起こす原因となる特定のＦｃ受容体(複数可)に結合できないか、又はより低い親和性で結合し得る。或いは、細胞エフェクター機能がワクチン接種の文脈において許容可能又は望ましい場合、抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｆｃエフェクター機能陽性である重鎖定常領域を含み得る。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４．ＰＥのフォーマットのいずれかは、ワクチン接種レジメンにおいて抗ＩＣＯＳ抗体に使用されてもよく、適切なアイソタイプ及び抗体定常領域の他の例は、本明細書の他の箇所でより詳細に説明される。
【０２４１】
製剤及び投与
抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得るが、好ましくは、治療的使用のためのモノクローナル抗体として提供される。これらは、任意選択で異なる結合特異性の抗体を含む他の抗体の混合物の一部として提供されてもよい。
【０２４２】
本発明による抗体及びコードする核酸は、通常、単離された形態で提供される。したがって、抗体、ＶＨ及び/又はＶＬドメイン、及び核酸は、その天然の環境又はそれらの産生環境から精製されて提供され得る。単離された抗体及び単離された核酸は、インビボで、又はかかる調製物がインビトロでの組換えＤＮＡ技術による場合、それらが調製される環境(例えば、細胞培養物)で見出される他のポリペプチド又は核酸等のそれらが天然に付随する物質を含まないか、実質的に含まない。任意選択で、単離された抗体又は核酸(１)は、それが通常見られる少なくとも一部の他のタンパク質を含まない、(２)同一源、例えば同一種からの他のタンパク質を本質的に含まない、(３)異なる種からの細胞によって発現される、(４)少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物若しくはそれが自然界で関連付けられる他の物質から分離されている、(５)(共有結合又は非共有結合の相互作用によって)それが自然界で関連付けられないポリペプチドと機能可能に関連付けられる、又は(６)自然界で発生しない。
【０２４３】
抗体又は核酸は、希釈剤又はアジュバントと処方されてもよく、実際の目的では単離されてもよく、例えば、免疫アッセイでの使用のためにマイクロタイタープレートを被覆するために使用される場合は担体と混合され得、治療中に使用される場合は薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合され得る。本明細書の他の箇所に記載されているように、他の活性成分もまた、治療用調製物に含まれ得る。抗体は、インビボで天然に、又はＣＨＯ細胞のような異種真核細胞の系によってグリコシル化されてもよく、又は非グリコシル化されていてもよい(例えば、原核細胞での発現によって産生される場合)。本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗体を包含する。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用であり得るか、又は例えば、ＡＤＣＣ機能を増加させるためのフコース部分の除去が、有用であり得る［３８］。他の用途では、ＣＤＣを改変するためにガラクトシル化の改変を行うことができる。
【０２４４】
典型的には、単離された生成物は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、又は少なくとも約５０％を構成する。抗体は、タンパク質若しくはポリペプチド、又はその治療的、診断的、予防的、研究的若しくは他の使用に干渉し得るその自然又は産生環境において見られる他の汚染物質を実質的に含まないことができる。
【０２４５】
抗体は、その産生環境(例えば、天然又は組み換え)の構成要素から特定され、分離され、及び/又は回収されたものであり得る。単離された抗体は、例えば、抗体がＦＤＡによって認可可能な基準又は認可された基準に単離されているように、その産生環境からの全ての他の構成要素との関連がなくてもよい。組み換えトランスフェクト細胞から生じるもの等の、その産生環境の汚染構成要素は、抗体への研究的、診断的、又は治療的使用に典型的に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、(１)例えばローリー法によって決定して、９５重量％超の抗体、一部の実施形態では、９９重量％超の抗体に、(２)スピニングカップシークエネーターの使用によって、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に、又は(３)クマシーブルー、好ましくは銀染色を使用して、非還元若しくは還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に、精製されることになる。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しなくなるため、組み換え細胞内でその場で抗体を含む。一般には、単離された抗体又はそのコードする核酸は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
【０２４６】
本発明は、本明細書に記載の抗体を含む治療用組成物を提供する。かかる抗体をコードする核酸を含む治療用組成物も提供される。コードする核酸は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載され、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。本明細書に記載の治療方法において、抗体をコードする核酸及び/又はかかる核酸を含有する細胞の使用は、抗体自体を含む組成物の代替物(又はそれに加えて)として使用することができる。任意選択で、核酸がゲノムに安定に組み込まれている抗体をコードする核酸を含む細胞は、したがって、患者における治療用途のための治療薬を表す。抗ＩＣＯＳ抗体をコードする核酸は、ヒトＢリンパ球、任意選択で意図された患者由来のＢリンパ球に導入され、エクスビボで修飾されてもよい。任意選択で、メモリＢ細胞が使用される。患者にコードする核酸を含有する細胞の投与は、単離された核酸又は単離された抗体の投与と比較してより長期にわたって治療上の利益を提供し得る、抗ＩＣＯＳ抗体を発現することができる細胞のリザーバを提供する。
【０２４７】
組成物は、改善された移動、送達、寛容等を提供するために、製剤に組み込まれる適切な担体、賦形剤、及び他の薬剤を含み得る。多くの適切な製剤は、全ての製薬化学者に知られている処方で見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、ベシクル(ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴ(商標)等)を含有する脂質(カチオン性又はアニオン性)、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳濁液、乳濁液カーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、及びカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ(１９９８)Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照されたい。組成物は、医療用注射緩衝液及び/又はアジュバントと組み合わせて抗体又は核酸を含んでもよい。
【０２４８】
抗体又はそのコードする核酸は、患者への所望の投与経路、例えば注射用の液体(任意選択で水溶液)中に製剤化することができる。様々な送達系が知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。皮下投与のための抗体を製剤化するには、典型的には静脈内製剤と比較してそれらをより少量に濃縮することが必要である。本発明による抗体の高い効力は、それらが弱い抗ＩＣＯＳ抗体と比較して利点を示す、皮下製剤を実用的にするために十分に低い用量で使用することを可能にし得る。
【０２４９】
組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮内層又は粘膜皮膚内層(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜等)からの吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。投与は、全身又は局所であり得る。
【０２５０】
医薬組成物はまた、ベシクル、特に、リポソーム中で送達され得る(Ｌａｎｇｅｒ(１９９０)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．(１９８９)ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ(ｅｄｓ．)，Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７−３２７を参照；概して同書を参照)。
【０２５１】
特定の状況では、医薬組成物は放出制御系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる(Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ(１９８７)ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ(ｅｄｓ．)，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．(１９７４)を参照されたい。さらに別の実施形態では、放出制御系を組成物の標的の近傍に配置することができるので、したがって全身用量の一部しか必要としない(例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８，１９８４を参照されたい)。
【０２５２】
注射用製剤には、静脈内、皮下、皮内、及び、筋肉内注射剤、点滴剤等の剤形が含まれ得る。これらの注射用製剤は、公知の方法により調製することができる。例えば、上記の抗体又はその塩を、慣用的に注射用に使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に、例えば溶解、懸濁、又は乳化させることにより、注射用製剤を調製することができる。注射用水性媒体としては、適切な可溶薬剤、例えば、アルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０(硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン(５０モル)付加物)］等と組み合わせて使用され得る、生理食塩水、グルコースを含有する等張液、及び他の補助剤等がある。可溶化剤、例えばベンジルベンゾネート、ベンジルアルコール等と組み合わされて使用され得る、例えば、ゴマ油、大豆油等が使用される。このようにして調製した注射液を適切なアンプルに充填することができる。本発明の医薬組成物は、標準針及び注射器を用いて皮下又は静脈内に送達することができる。治療は診療所での使用に限定されないことが想定される。したがって、無針装置を用いた皮下注射も有利である。皮下送達に関して、ペン送達装置は、本発明の医薬組成物を送達する用途を容易に有する。かかるペン送達装置は、再使用可能又は使い捨て可能であり得る。再使用可能なペン送達装置は、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを使用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次いで、ペン送達装置を再使用することができる。使い捨てペン搬送装置には、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスには、デバイス内のリザーバに保持された医薬組成物が予め充填されている。リザーバの医薬組成物が空になると、装置全体が廃棄される。数多くの再使用可能なペン及び自己注射器送達装置は、本発明の医薬組成物の皮下送達に用途を有する。例としては、いくつか例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ(商標)(Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ)、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ(商標)ペン(Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ)、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５/２５(商標)ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ(商標)ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０/３０(商標)ペン(Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．)、ＮＯＶＯＰＥＮ(商標)Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ(Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ)、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ(商標)(Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ)、ＢＤ(商標)ペン(Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．)、ＯＰＴＩＰＥＮＴ(商標)、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ(商標)、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ(商標)、及びＯＰＴＩＣＬＩＫＴ(商標)(Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ)が挙げられるが、これらに特に限定されない���本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達装置の例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ(商標)ペン(Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ)、ＦＬＥＸＰＥＮ(商標)(Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ)、及びＫＷＩＫＰＥＮ(商標)(Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ)が挙げられるが、これらに特に限定されない。
【０２５３】
好都合には、上記の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。単位用量のかかる剤形は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤等を含む。前述の抗体の含有量は、単位用量における剤形当たり、通常約５〜約５００ｍｇであり、特に注射の形態で、前述の抗体は、約５〜約１００ｍｇ、及び他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有され得る。
【０２５４】
それを含む抗体、核酸、又は組成物は、医療用容器、例えば薬瓶、シリンジ、静脈内容器、又は注射装置に含有されることができる。一例では、抗体、核酸、又は組成物は、インビトロであり、滅菌容器中であり得る。一例では、本明細書に記載の治療方法における使用のための抗体、パッケージング、及び使用説明書を含むキットが提供される。
【０２５５】
本発明の一態様は、抗体又は核酸と、上記に例が列挙されている１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と、を含む組成物である。「薬学的に許容される」とは、ヒトを含む動物における使用について、米国連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されている若しくは承認可能であるか、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認識された薬局方に列挙されていることを指す。薬学的に許容される担体、賦形剤、又はアジュバントは、薬剤、例えば、本明細書に記載される任意の抗体又は抗体鎖と一緒に患者に投与されてもよく、それらの薬理活性を損なわず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与された場合に無毒である。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ抗体は、本発明による組成物中の唯一の活性成分である。したがって、組成物は、抗体からなり得るか、又は抗体及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤からなり得る。しかしながら、本発明による組成物は、任意選択で、１つ以上の追加の活性成分を含む。抗ＩＣＯＳ抗体が組み合わされ得る薬剤の詳細な説明は、本明細書の他の箇所に提供される。任意選択で、組成物は、例えば、抗ＩＣＯＳ抗体及び１つ以上の他の抗体を含む単一製剤のように、組み合わされた調製物中に複数の抗体(又はコード核酸)を含有する。本発明による抗体又は核酸と共に投与するのに望ましい場合がある他の治療剤には、鎮痛剤が含まれる。任意のかかる薬剤又は薬剤の組合せは、組み合わされるか又は別個の調製物であるかにかかわらず、本発明による抗体又は核酸と組み合わせて投与され得るか、又はそれと共に組成物中に提供される。本発明による抗体又は核酸は、言及されたもの等の別の治療剤(複数可)と共に、別々に連続的に、又は同時に、任意選択で、組み合わされた調製物として投与され得る。
【０２５７】
特定の治療適応症における使用のための抗ＩＣＯＳ抗体は、受け入れられた標準治療と組み合わされてもよい。したがって、抗癌治療の場合、抗体療法は、例えば、化学療法、外科手術、及び/又は放射線療法も含む治療レジメンにおいて用いられ得る。放射線療法は、患部組織に直接、又は全身のいずれかに送達される、単回線量又は分割線量であり得る。
【０２５８】
複数の組成物が、別個又は同時に投与され得る。別個の投与は、１０、２０、３０若しくは１０〜６０分の間隔で、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２時間の間隔で２つの組成物が投与されることを指す。２４時間の間隔で、又はさらに長い間隔で組成物を投与することもできる。代替的には、２つ以上の組成物が、同時に、例えば、１０分未満又は５分未満の間隔で投与され得る。いくつかの態様では、同時に投与される組成物は、構成要素の各々について同様又は異なる時間放出機構の有無にかかわらず、混合物として投与され得る。
【０２５９】
抗体及びそれらのコード核酸は、治療剤として使用され得る。本明細書における患者は、一般に、哺乳動物、典型的には、ヒトである。抗体又は核酸は、例えば、本明細書において言及される任意の投与経路によって、哺乳動物に投与され得る。
【０２６０】
投与は通常、「治療有効量」であり、これは、患者に利益を示すのに十分な、投与されるものへの所望の効果を生み出す量である。正確な量は治療の目的に依拠し、既知の技術を使用して当業者によって確認されるであろう(例えば、Ｌｌｏｙｄ(１９９９)Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい)。治療の処方、例えば、投薬量の決定等は、一般医師及び他の医師の責任の範囲内であり、治療される疾患の症状の重度及び/又はその進行に依存し得る。抗体又は核酸の治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって判定することができる。マウス及び他の実験動物における有効投薬量の外挿方法は、既知である。
【０２６１】
本明細書の実施例に記載されるインビボ研究によって示されるように、抗ＩＣＯＳ抗体は、一定範囲の用量で有効であり得る。薬力学研究は、実施例２４に報告される。
【０２６２】
抗ＩＣＯＳ抗体は、１用量当たり、以下の範囲のうちの１つの量で投与され得る：
約１０μｇ/体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ/体重１ｋｇ、
約５０μｇ/体重１ｋｇ〜約５ｍｇ/体重１ｋｇ、
約１００μｇ/体重１ｋｇ〜約１０ｍｇ/体重１ｋｇ、
約１００μｇ/体重１ｋｇ〜約２０ｍｇ/体重１ｋｇ、
約０．５ｍｇ/体重１ｋｇ〜約２０ｍｇ/体重１ｋｇ、又は
約５ｍｇ/体重１ｋｇ未満、例えば、４ｍｇ/ｋｇ未満、３ｍｇ/ｋｇ未満、２ｍｇ/ｋｇ未満、又は１ｍｇ/ｋｇの抗体。
【０２６３】
最適な治療用量は、ヒトにおいて、０．１〜０．５ｍｇ/ｋｇ、例えば、約０．１ｍｇ/ｋｇ、０．１５ｍｇ/ｋｇ、０．２ｍｇ/ｋｇ、０．２５ｍｇ/ｋｇ、０．３ｍｇ/ｋｇ、０．３５ｍｇ/ｋｇ、０．４ｍｇ/ｋｇ、０．４５ｍｇ/ｋｇ、又は０．５ｍｇ/ｋｇであり得る。成人のヒトにおける固定用量の場合、好適な用量は、８〜５０ｍｇ又は８〜２５ｍｇ、例えば、１５ｍｇ又は２０ｍｇであり得る。
【０２６４】
本明細書に記載される治療方法において、１回以上の用量が投与され得る。場合によっては、単回用量が長期的な利益を達成するのに有効であり得る。したがって、本方法は、単回用量の抗体、そのコード核酸、又は組成物を投与することを含み得る。代替的には、通常、連続的に、数日、数週、又は数カ月の間隔で別個に、複数回用量が投与されてもよい。抗ＩＣＯＳ抗体は、４〜６週間の間隔で、例えば、４週間ごと、５週間ごと、又は６週間ごとの間隔で患者に反復投与され得る。任意選択で、抗ＩＣＯＳ抗体は、１カ月に１回、又はより少ない頻度で、例えば、２カ月ごと又は３カ月ごとに患者に投与され得る。したがって、患者を治療する方法は、抗ＩＣＯＳ抗体の単回用量を患者に投与し、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間この投与を反復せず、任意選択で、少なくとも１２カ月個の投与を反復しないことを含み得る。
【０２６５】
実施例１１ｃにおいて考察したように、抗ＩＣＯＳ抗体の１回又は複数回用量のいずれかを使用して同等の治療効果が得られる場合があり、これは、抗体の単回用量が腫瘍微小環境のリセットに有効であることの結果であり得る。医師は、疾患状態、並びに抗ＩＣＯＳ抗体が組み合わされる任意の他の治療剤及び治療手段(例えば、外科手術、放射線療法等)を考慮に入れて、抗ＩＣＯＳ抗体の投与レジメンを、療法を受ける疾患及び患者に適合させることができる。いくつかの実施形態では、有効用量の抗ＩＣＯＳ抗体は、例えば、３週間ごとに１回、２週間ごとに１回、又は毎週１回等、１カ月に１回よりも多い頻度で投与される。抗ＩＣＯＳ抗体による治療は、少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、又は少なくとも１年の期間をかけて投与される複数回用量を含み得る。
【０２６６】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、又は「改善」という用語は、疾患又は障害に関連する状態の進行又は重度を、逆転、軽減、改善、阻害、減速、又は停止することが目的である、治療処置を指す。「治療すること」という用語は、状態、疾患、又は障害の少なくとも１つの副作用又は症状を低減又は改善することを含む。１つ以上の症状又は臨床マーカーが低減した場合、治療は、概して「有効」である。代替的には、疾患の進行が低減又は停止した場合、治療は、「有効」である。つまり、「治療」は、症状又はマーカーの向上だけでなく、治療しない場合に予想されるものと比較した、症状の進行又は悪化の休止又は少なくとも原則を含む。有益な又は所望の臨床結果には、１つ以上の症状(複数可)の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定した(すなわち、悪化していない)状態、疾患進行の遅延若しくは減速、疾患状態の改善若しくは緩和、寛解(部分寛解若しくは完全寛解)、及び/又は検出可能若しくは検出不可能にかかわらない死亡率の減少が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語にはまた、疾患の症状又は副作用の軽減を提供すること(緩和療法を含む)も含まれる。治療が有効であるために、根治は企図されない。本方法は、ある特定の態様では、治癒も含み得る。本発明の文脈では、治療は、予防的治療であってもよい。
【０２６７】
Ｔ細胞療法
ＷＯ２０１１/０９７４７７は、Ｔ細胞集団を、任意選択でＩＬ−１β、ＩＬ−６、中和抗ＩＦＮγ、及び/又は抗ＩＬ−４等のＴｈ１７分極剤の存在下で、一次活性化シグナルを提供する第１の薬剤(例えば、抗ＣＤ３抗体)及びＩＣＯＳを活性化させる第２の薬剤(例えば、抗ＩＣＯＳ抗体)と接触させることによって、Ｔ細胞を生成及び増殖させるためのＩＣＯＳ抗体の使用について記載した。本明細書に記載される抗ＩＣＯＳ抗体は、Ｔ細胞集団を提供するかかる方法において使用され得る。治療活性(例えば、抗腫瘍活性)を有する培養増殖されたＴ細胞集団が生成され得る。ＷＯ２０１１/０９７４７７に記載されるように、かかるＴ細胞は、免疫療法によって患者を治療する方法において治療上使用され得る。
【０２６８】
治療候補としての抗ＩＣＯＳ抗体のための形態学的アッセイ
候補治療用抗ＩＣＯＳ抗体が固体表面を固体表面に結合させ、ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞と接触させると、それらは細胞中に形態変化を誘導することができることが認められた。抗ＩＣＯＳ抗体で内部をコーティングしたウェルへのＩＣＯＳ＋  Ｔ細胞を添加すると、細胞は、それらの元の丸い形状から変化して紡錘形を採用し、広がって抗体コーティング表面に接着する。この形態変化は、対照抗体では認められなかった。さらに、この効果は、用量依存性であることが見出され、表面上の抗体の濃度が増加するにつれて、より速く及び/又はより明白な形状変化が生じた。この形状変化は、ＩＣＯＳへのＴ細胞結合及び/又は抗ＩＣＯＳ抗体によるアゴニズムの代理の指標を提供する。このアッセイを使用して、Ｔ細胞表面上のＩＣＯＳの多量体化を促進する抗体を同定することができる。かかる抗体は、治療用候補アゴニスト抗体を表す。好都合なことに、このアッセイによって提供される視覚的指標は、とりわけ多数の抗体又は細胞をスクリーニングする単純な方法である。このアッセイは、ハイスループットシステムで実行されるように自動化されてもよい。
【０２６９】
したがって、本発明の一態様は、任意選択で、ＩＣＯＳアゴニスト抗体を選択するために、ＩＣＯＳに結合する抗体を選択するためのアッセイであって、
試験ウェル中で基質に固定化(結合又は接着)された抗体のアレイを提供することと、
試験ウェルに、ＩＣＯＳ発現細胞(例えば、活性化初代Ｔ細胞又はＭＪ細胞)を添加することと、
細胞の形態を観察することと、
ウェル内での、丸い形状から基質に対して平坦化された形状への形状変化を検出することであって、形状変化は、抗体が、ＩＣＯＳに結合する抗体、任意選択でＩＣＯＳアゴニスト抗体であることを示す、検出することと、
試験ウェルから抗体を選択することと、を含む、アッセイである。
【０２７０】
このアッセイは、任意選択で並行して、例えば、９６ウェルプレートフォーマットで、試験用の異なる抗体を各々含有する複数の試験ウェルで実行されてもよい。基質は、好ましくは、ウェルの内面である。したがって、二次元表面が提供され、それに対する細胞の平坦化が認められ得る。例えば、ウェルの底及び/又は壁が抗体でコーティングされ得る。基質に対する抗体の繋がりは、抗体の定常領域を介したものであり得る。
【０２７１】
陰性対照が含まれてもよく、かかる抗体は、ＩＣＯＳに結合しないことが既知であるか、好ましくは、使用されるＩＣＯＳ発現細胞の表面上の抗原に結合しない抗体である。このアッセイは、形態変化の程度を定量化することと、複数の抗体が試験される場合、１つ以上の他の試験抗体よりも大きい形態変化を誘導する抗体を選択することと、を含み得る。
【０２７２】
抗体の選択は、目的の試験ウェル中に存在する抗体をコードする核酸を発現させること、又はその抗体のＣＤＲ若しくは抗原結合ドメインを含む抗体を発現させることを含み得る。抗体は、任意選択で、例えば、選択された抗体の抗原結合ドメインを含む抗体、例えば、抗体断片、又は異なる定常領域を含む抗体を提供するために、再フォーマット化されてもよい。選択された抗体は、好ましくは、ヒトＩｇＧ１定常領域又は本明細書に記載される他の定常領域を伴う。選択された抗体はさらに、１つ以上の追加の成分を含む組成物中に製剤化されてもよく、好適な薬学的製剤は本明細書の他の箇所に考察される。
【０２７３】
条項
本発明の実施形態は、以下の付番された条項に記載され、これは明細書の一部である。
【０２７４】
条項１．ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離された抗体であって、ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメイン(配列番号４０８)と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、ＳＴＩＭ００３  ＶＬドメイン(配列番号４１５)と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインと、を含む、抗体。
【０２７５】
条項２．ＶＨドメインが、１セットの重鎖相補性決定領域(ＨＣＤＲ) ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号４０５のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＨＣＤＲ１であり、
ＨＣＤＲ２が、配列番号４０６のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＨＣＤＲ２であり、
ＨＣＤＲ３が、配列番号４０７のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＨＣＤＲ３である、条項１に記載の抗体。
【０２７６】
条項３．ＶＬドメインが、１セットの軽鎖相補性判定領域(ＬＣＤＲ) ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、
ＬＣＤＲ１が、配列番号４１２のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＬＣＤＲ１であり、
ＬＣＤＲ２が、配列番号４１３のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＬＣＤＲ２であり、
ＬＣＤＲ３が、配列番号４１４のアミノ酸配列を有するＳＴＩＭ００３  ＬＣＤＲ３である、条項１又は条項２に記載の抗体。
【０２７７】
条項４．ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号４０８であり、及び/又はＶＬドメインのアミノ酸配列が配列番号４１５である、条項１に記載の抗体。
【０２７８】
条項５．ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離された抗体であって、
相補性決定領域(ＣＤＲ)、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインと、
相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインと、を含み、
ＨＣＤＲ１が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲ１であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ１を含み、
ＨＣＤＲ２が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲ２であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ２を含み、及び/又は
ＨＣＤＲ３が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＨＣＤＲ３であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＨＣＤＲ３を含む、抗体。
【０２７９】
条項６．抗体重鎖ＣＤＲが、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のものであるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有する、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９重鎖ＣＤＲを含む、条項５に記載の抗体。
【０２８０】
条項７．抗体ＶＨドメインが、ＳＴＩＭ００３の重鎖ＣＤＲを有する、条項６に記載の抗体。
【０２８１】
条項８．ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する単離された抗体であって、
相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインと、
相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインと、を含み、
ＬＣＤＲ１が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＬＣＤＲ１であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ１を含み、
ＬＣＤＲ２が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＬＣＤＲ２であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ２を含み、及び/又は
ＬＣＤＲ３が、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＬＣＤＲ３であるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有するそのＬＣＤＲ３を含む、抗体。
【０２８２】
条項９．抗体軽鎖ＣＤＲが、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のものであるか、又は１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有する、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９軽鎖ＣＤＲを含む、条項５〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【０２８３】
条項１０．抗体ＶＬドメインが、ＳＴＩＭ００３の軽鎖ＣＤＲを有する、条項９に記載の抗体。
【０２８４】
条項１１．ヒト生殖細胞系遺伝子セグメント配列のＶＨ及び/又はＶＬドメインフレームワーク領域を含む、条項５〜１０のいずれかに記載の抗体。
【０２８５】
条項１２．
(ｉ)ヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメント、ヒト重鎖Ｄ遺伝子セグメント、及びヒト重鎖Ｊ遺伝子セグメントの組換えに由来するＶＨドメインであって、
Ｖセグメントが、ＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)であり、
Ｄ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＤ６−１９(例えば、ＩＧＨＤ６−１９＊０１)、ＩＧＨＤ３−１０(例えば、ＩＧＨＤ３−１０＊０１)若しくはＩＧＨＤ３−９(例えば、ＩＧＨＤ３−９＊０１)であり、及び/又は
Ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＪ６(例えば、ＩＧＨＪ６＊０２)、ＩＧＨＪ４(例えば、ＩＧＨＪ４＊０２)若しくはＩＧＨＪ３(例えば、ＩＧＨＪ３＊０２)である、ＶＨドメイン、又は
(ｉｉ)フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含むＶＨドメインであって、
ＦＲ１が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、
ＦＲ２が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、
ＦＲ３が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＨＶ１−１８(例えば、Ｖ１−１８＊０１)、ＩＧＶＨ３−２０(例えば、Ｖ３−２０＊ｄ０１)、ＩＧＶＨ３−１１(例えば、Ｖ３−１１＊０１)若しくはＩＧＶＨ２−５(例えば、Ｖ２−５＊１０)と整列し、及び/又は
ＦＲ４が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＪＨ６(例えば、ＪＨ６＊０２)、ＩＧＪＨ４(例えば、ＪＨ４＊０２)若しくはＩＧＪＨ３(例えば、ＪＨ３＊０２)と整列する、ＶＨドメインを含む、条項５〜１１のいずれかに記載の抗体。
【０２８６】
条項１３．
(ｉ)ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及びヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメントの組換えに由来する抗体ＶＬドメインであって、
Ｖセグメントが、ＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)であり、及び/又は
Ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＫＪ４(例えば、ＩＧＫＪ４＊０１)、ＩＧＫＪ２(例えば、ＩＧＫＪ２＊０４)、ＩＧＬＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)若しくはＩＧＫＪ１(例えば、ＩＧＫＪ１＊０１)である、抗体ＶＬドメイン、又は
(ｉｉ)フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含む抗体ＶＬドメインであって、
ＦＲ１が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、
ＦＲ２が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、
ＦＲ３が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＶ２−２８(例えば、ＩＧＫＶ２−２８＊０１)、ＩＧＫＶ３−２０(例えば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１)、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９(例えば、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９＊０１)若しくはＩＧＫＶ３−１１(例えば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１)と整列し、及び/又は
ＦＲ４が、１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸改変を有していてもよいヒト生殖細胞系Ｖ遺伝子セグメントＩＧＫＪ４(例えば、ＩＧＫＪ４＊０１)、ＩＧＫＪ２(例えば、ＩＧＫＪ２＊０４)、ＩＧＫＪ３(例えば、ＩＧＫＪ３＊０１)若しくはＩＧＫＪ１(例えば、ＩＧＫＪ１＊０１)と整列する、抗体ＶＬドメインを含む、条項５〜１２のいずれかに記載の抗体。
【０２８７】
条項１４．ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＨドメインであるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＨドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、抗体ＶＨドメインを含む、条項５〜１３のいずれかに記載の抗体。
【０２８８】
条項１５．ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＬドメインであるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＬドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、抗体ＶＬドメインを含む、条項５〜１３のいずれかに記載の抗体。
【０２８９】
条項１６．
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９のＶＨドメインから選択されるか、又はＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８若しくはＳＴＩＭ００９の抗体ＶＨドメイン配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、抗体ＶＨドメインと、
選択された抗体のＶＬドメインであるか、又は選択された抗体の抗体ＶＬドメイン配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、抗体ＶＬドメインと、を含む、条項１５に記載の抗体。
【０２９０】
条項１７．ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメイン及びＳＴＩＭ００３  ＶＬドメインを含む、条項１６に記載の抗体。
【０２９１】
条項１８．抗体定常領域を含む、条項１〜１７のいずれかに記載の抗体。
【０２９２】
条項１９．定常領域が、ヒト重鎖及び/又は軽鎖定常領域を含む、条項１８に記載の抗体。
【０２９３】
条項２０．定常領域が、Ｆｃエフェクター陽性である、条項１８又は条項１９に記載の抗体。
【０２９４】
条項２１．天然のヒトＦｃ領域と比較して増強したＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣ機能を有するＦｃ領域を含む、条項２０に記載の抗体。
【０２９５】
条項２２．抗体が、ＩｇＧ１である、条項１８〜２１のいずれかに記載の抗体。
【０２９６】
条項２３．抗体が、フコシル化されていない、条項２１又は条項２２に記載の抗体。
【０２９７】
条項２４．細胞傷害性薬物又はプロドラッグと接合された、条項１〜２３のいずれかに記載の抗体。
【０２９８】
条項２５．多重特異性抗体である、条項１〜２４のいずれかに記載の抗体。
【０２９９】
条項２６．表面プラズモン共鳴によって判定した場合、５０ｎＭ未満の親和性(ＫＤ)でヒト及びマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する、単離された抗体。
【０３００】
条項２７．抗体が、表面プラズモン共鳴によって判定した場合、５ｎＭ未満の親和性(ＫＤ)でヒト及びマウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する、条項２６に記載の抗体。
【０３０１】
条項２８．ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合するＫＤが、マウスＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合するＫＤの１０倍以内である、条項２６又は条項２７に記載の抗体。
【０３０２】
条項２９．条項１〜２８のいずれかに記載の単離された抗体と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、組成物。
【０３０３】
条項３０．条項１〜２９のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、組成物。
【０３０４】
条項３１．制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)とエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)とのバランスを調節して、患者のＴｅｆｆ応答を増加させる方法であって、条項１〜２８のいずれかに記載の抗体、又は条項２９に記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。
【０３０５】
条項３２．患者において制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させ、及び/又はエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)応答を増加させることによって療法を受けることができる疾患又は病的状態を治療する方法であって、条項１〜２８のいずれかに記載の抗体、又は条項２９に記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。
【０３０６】
条項３３．療法によるヒトの身体の治療方法において使用するための、条項１〜２８のいずれかに記載の抗体、又は条項２９に記載の組成物。
【０３０７】
条項３４．制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)とエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)とのバランスを調節して、患者のエフェクターＴ細胞応答を増加させることに使用するための、条項３３に記載の使用のための抗体又は組成物。
【０３０８】
条項３５．患者における制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)の枯渇及び/又はエフェクターＴ細胞(Ｔｅｆｆ)応答の増加による療法を受けることができる疾患又は病的状態の治療における使用のための、条項３３に記載の使用のための抗体又は組成物。
【０３０９】
条項３６．疾患が、癌又は固形腫瘍である、条項３２に記載の方法、又は条項３５に記載の使用のための抗体若しくは組成物。
【０３１０】
条項３７．ヒト患者の癌を治療する方法における使用のための、条項１〜２８のいずれかに記載の抗体又は条項２９に記載の組成物。
【０３１１】
条項３８．ヒト患者の癌を治療する方法であって、条項１〜２８のいずれかに記載の抗体、又は条項２９に記載の組成物を、患者に投与することを含む、方法。
【０３１２】
条項３９．癌が、腎細胞癌、頭頸部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、条項３６〜３８のいずれかに記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１３】
条項４０．方法が、抗体並びに別の治療剤及び/又は放射線療法を患者に施すことを含む、条項３１〜３９のいずれかに記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１４】
条項４１．治療剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、条項４０に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１５】
条項４２．抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号２９９のアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号３００のアミノ酸配列を有するＶＬドメインと、を含む、条項４１に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１６】
条項４３．治療剤が、抗ＰＤ−Ｌ１  ＩＬ−２免疫サイトカインである、条項４１又は条項４２に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１７】
条項４４．抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ヒト野生型又は変異型ＩＬ−２を含む免疫サイトカインである、条項４３に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１８】
条項４５．抗ＩＣＯＳ抗体及び前記抗ＰＤＬ１抗体が、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び/又はＣＤＣを各々媒介することができる、条項４４に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３１９】
条項４６．抗ＩＣＯＳ抗体が、ヒトＩｇＧ１抗体であり、抗ＰＤＬ１抗体が、ヒトＩｇＧ１抗体である、条項４１〜４５のいずれかに記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２０】
条項４７．治療剤が、抗ＰＤ−１抗体である、条項４０に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２１】
条項４８．他の治療剤が、ＩＬ−２である、条項４０に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２２】
条項４９．方法が、他の治療剤及び/又は放射線療法を施した後に抗ＩＣＯＳ抗体を投与することを含む、条項４０〜４８のいずれかに記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２３】
条項５０．
抗ＩＣＯＳ抗体が、プロドラッグと接合され、
方法又は使用が、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することと、
標的組織部位でプロドラッグを選択的に活性化させることと、を含む、条項３１〜４９のいずれかに記載の方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２４】
条項５１．患者が、固形腫瘍を有し、当該方法が、腫瘍においてプロドラッグを選択的に活性化させることを含む、条項５０に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２５】
条項５２．光活性化によってプロドラッグを選択的に活性化させることを含む、条項５０又は条項５１に記載の使用のための方法又は抗体若しくは組成物。
【０３２６】
条項５３．患者の癌を治療する方法における使用のための、抗ＩＣＯＳヒトＩｇＧ１抗体と抗ＰＤＬ１ヒトＩｇＧ１抗体との組合せ。
【０３２７】
条項５４．患者の癌を治療する方法であって、抗ＩＣＯＳヒトＩｇＧ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１ヒトＩｇＧ１抗体を患者に投与することを含む、方法。
【０３２８】
条項５５．患者の癌を治療する方法における使用のための抗ＩＣＯＳ抗体であって、当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を患者に投与することを含み、単回用量の抗ＩＣＯＳ抗体が投与される、抗ＩＣＯＳ抗体。
【０３２９】
条項５６．抗ＩＣＯＳ抗体が、ヒトＩｇＧ１抗体であり、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ヒトＩｇＧ１抗体である、条項５５に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体。
【０３３０】
条項５７．癌が、腎細胞癌、頭頸部癌、黒色腫、非小細胞肺癌、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、条項５３に記載の組合せ、条項５４に記載の方法、又は条項５５若しくは条項５６に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体。
【０３３１】
条項５８．方法が、抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を患者に投与することを含み、単回用量の抗ＩＣＯＳ抗体が投与される、条項４１〜４６又は５３〜５４のいずれかに記載の使用のための方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【０３３２】
条項５９．方法が、単回用量の抗ＩＣＯＳ抗体、続いて複数回用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む、条項５８に記載の使用のための方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【０３３３】
条項６０．抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤＬ１抗体が、投与のために別々の組成物で提供される、条項４１〜４６又は５３〜５４のいずれかに記載の使用のための方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【０３３４】
条項６１．抗ＩＣＯＳ抗体及び/又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、配列番号３４０のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域を含む、条項４１〜４６又は５３〜６０のいずれかに記載の使用のための方法又は抗体、組成物若しくは組合せ。
【０３３５】
条項６２．患者を治療する方法における使用のための抗ＩＣＯＳ抗体であって、当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、別の治療剤での治療後に増加したレベルのＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞を有する患者に投与することを含む、方法。
【０３３６】
条項６３．患者を治療する方法であって、当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、別の治療剤での治療後に増加したレベルのＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞を有する患者に投与することを含む、方法。
【０３３７】
条項６４．方法が、治療剤を患者に投与することと、患者が薬剤での治療後に増加したレベルのＩＣＯＳ陽性制御性Ｔ細胞を有すると判定することと、抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与して制御性Ｔ細胞のレベルを低減させることと、を含む、条項６２に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体、又は条項６３に記載の方法。
【０３３８】
条項６５．治療剤が、ＩＬ−２又は免疫調節抗体(例えば、抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤ−１、又は抗ＣＴＬＡ−１)である、条項６２〜６４のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３３９】
条項６６．方法が、腫瘍、例えば、転移性黒色腫等の黒色腫を治療することを含む、条項６２〜６５のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３４０】
条項６７．患者における癌を、患者に自身の癌細胞に対するインビボのワクチン接種を行うことによって治療する方法における使用のための抗ＩＣＯＳ抗体であって、当該方法が、
抗原特異的エフェクターＴ細胞に対する抗原の提示をもたらす、癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす療法によって患者を治療することと、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することであって、抗ＩＣＯＳ抗体が、抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強する、投与することと、を含む、抗ＩＣＯＳ抗体。
【０３４１】
条項６８．患者における癌を、患者に自身の癌細胞に対するインビボのワクチン接種を行うことによって治療する方法であって、当該方法が、
抗原特異的エフェクターＴ細胞に対する抗原の提示をもたらす、癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす療法によって患者を治療することと、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することであって、抗ＩＣＯＳ抗体が、抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強する、投与することと、を含む、方法。
【０３４２】
条項６９．患者における癌を、患者に自身の癌細胞に対するインビボのワクチン接種を行うことによって治療する方法であって、当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することを含み、
患者が、抗原特異的エフェクターＴ細胞に対する抗原の提示をもたらす、癌細胞の免疫学的細胞死を引き起こす療法によって以前に治療されている患者であり、そして
抗ＩＣＯＳ抗体が、抗原特異的エフェクターＴ細胞応答を増強する、方法。
【０３４３】
条項７０．免疫学的細胞死を引き起こす療法が、癌細胞の放射線照射、化学療法剤の投与、及び/又は腫瘍関連抗原に対する抗体の投与である、条項６７〜６９のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３４４】
条項７１．化学療法剤が、オキサリプラチンである、条項７０に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３４５】
条項７２．腫瘍関連抗原が、ＨＥＲ２又はＣＤ２０である、条項７０に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３４６】
条項７３．患者の癌を治療する方法における使用のための抗ＩＣＯＳ抗体であって、癌が、ＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３の発現について陽性であると特徴付けられるか、又は特徴付けられている、抗ＩＣＯＳ抗体。
【０３４７】
条項７４．患者の癌を治療する方法であって、癌が、ＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３の発現について陽性であると特徴付けられるか、又は特徴付けられており、当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することを含む、方法。
【０３４８】
条項７５．当該方法が、
患者からの試料を試験して、癌が、ＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３を発現することを判定することと、
患者を抗ＩＣＯＳ抗体による治療のために選択することと、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することと、を含む、条項８５〜８７のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３４９】
条項７６．当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、癌がＩＣＯＳリガンド及び/又はＦＯＸＰ３の発現について陽性であることを示した試験試料の患者に投与することを含む、条項７３に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は条項７４に記載の方法。
【０３５０】
条項７７．試料が、固形腫瘍の生検試料である、条項７５又は条項７６に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３５１】
条項７８．癌が、免疫腫瘍学的薬物、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７抗体、又は抗ＧＩＴＲ抗体での治療に対して難治性であると特徴付けられるか、又は特徴付けられている、患者の癌を治療する方法における使用のための抗ＩＣＯＳ抗体。
【０３５２】
条項７９．患者の癌を治療する方法であって、癌が、免疫腫瘍学的薬物、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７抗体、又は抗ＧＩＴＲ抗体での治療に対して難治性であると特徴付けられるか、又は特徴付けられており、当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することを含む、方法。
【０３５３】
条項８０．当該方法が、
患者を免疫腫瘍学的薬物で治療することと、
癌が薬物に応答しないことを判定することと、
患者を抗ＩＣＯＳ抗体による治療のために選択すること、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することと、を含む、条項７８に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は条項７９に記載の方法。
【０３５４】
条項８１．当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、癌が免疫腫瘍学的薬物での前治療に応答しなかった患者に投与することを含む、条項７８に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は条項７９に記載の方法。
【０３５５】
条項８２．癌が、ＩＣＯＳリガンドを発現する能力を獲得した細胞に由来する腫瘍である、条項７３〜８１のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３５６】
条項８３．癌が、黒色腫である、条項８２に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３５７】
条項８４．癌が、Ｂリンパ球(例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫等のＢ細胞リンパ腫)又はＴリンパ球等の抗原提示細胞に由来する、条項７３〜８１のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３５８】
条項８５．癌が、抗ＣＤ２０抗体による治療に耐性である、条項７３〜８１のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３５９】
条項８６．癌が、Ｂ細胞リンパ腫である、条項８５に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６０】
条項８７．抗ＣＤ２０抗体が、リツキシマブである、条項８６に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６１】
条項８８．当該方法が、抗ＣＤ２０抗体で患者を治療することと、
癌が抗ＣＤ２０抗体に応答しないことを判定することと、
患者からの試料を試験して、癌が、ＩＣＯＳリガンドを発現することを判定することと、
患者を抗ＩＣＯＳ抗体による治療のために選択することと、
抗ＩＣＯＳ抗体を患者に投与することと、を含む、条項８５〜８７のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６２】
条項８９．当該方法が、抗ＩＣＯＳ抗体を、癌が抗ＣＤ−２０抗体での前治療に応答しなかった患者に投与することを含む、条項８５〜８７のいずれか一項に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６３】
条項９０．癌が、固形腫瘍である、条項６７〜８９のいずれか一項に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６４】
条項９１．癌が、血液学的液体腫瘍である、条項６７〜８９のいずれか一項に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６５】
条項９２．腫瘍が、制御性Ｔ細胞に富む、条項９０又は９１に記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６６】
条項９３．抗ＩＣＯＳ抗体が、条項１〜２８のいずれかに定義される通りであるか、又は条項２９に記載の組成物中に提供される、条項５３〜９２のいずれかに記載の使用のための抗ＩＣＯＳ抗体又は方法。
【０３６７】
条項９４．ヒト可変領域遺伝子セグメントをコードするヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、当該哺乳動物が、ＩＣＯＳを発現しない、哺乳動物。
【０３６８】
条項９５．ヒト及び非ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合する抗体を産生する方法であって、
(ａ)条項９４に記載の哺乳動物をヒトＩＣＯＳ抗原で免疫付与することと、
(ｂ)哺乳動物によって生成された抗体を単離することと、
(ｃ)ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験することと、
(ｄ)ヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳの両方に結合する１つ以上の抗体を選択することと、を含む、方法。
【０３６９】
条項９６．哺乳動物を、ヒトＩＣＯＳを発現する細胞で免疫付与することを含む、条項９５に記載の方法。
【０３７０】
条項９７．
(ｃ)表面プラズモン共鳴を使用してヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験し、結合親和性を判定することと、
(ｄ)ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが５０ｎＭ未満であり、非ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが５００ｎＭ未満である１つ以上の抗体を選択することと、を含む、条項９５又は条項９６に記載の方法。
【０３７１】
条項９８．
(ｄ)ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが１０ｎＭ未満であり、非ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが１００ｎＭ未満である１つ以上の抗体を選択することを含む、条項９７に記載の方法。
【０３７２】
条項９９．
(ｃ)表面プラズモン共鳴を使用してヒトＩＣＯＳ及び非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験し、結合親和性を判定することと、
(ｄ)ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが非ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤの１０倍以内である１つ以上の抗体を選択することと、を含む、条項９５〜９８のいずれかに記載の方法。
【０３７３】
条項１００．
(ｄ)ヒトＩＣＯＳに対する結合のＫＤが非ヒトＩＣＯに対する結合のＫＤの５倍以内である１つ以上の抗体を選択することを含む、条項９９に記載の方法。
【０３７４】
条項１０１．哺乳動物と同じ種からの非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験することを含む、条項９５〜１００のいずれかに記載の方法。
【０３７５】
条項１０２．哺乳動物とは異なる種からの非ヒトＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験することを含む、条項９５〜１０１のいずれかに記載の方法。
【０３７６】
条項１０３．哺乳動物が、マウス又はラットである、条項９５〜１０２のいずれかに記載の方法。
【０３７７】
条項１０４．非ヒトＩＣＯＳが、マウスＩＣＯＳ又はラットＩＣＯＳである、条項９５〜１０３のいずれかに記載の方法。
【０３７８】
条項１０５．ヒト又はヒト化免疫グロブリン遺伝子座が、内在性定常領域の上流にヒト可変領域遺伝子セグメントを含む、条項９５〜１０４のいずれかに記載の方法。
【０３７９】
条項１０６．
(ａ)条項９４に記載の哺乳動物をヒトＩＣＯＳ抗原で免疫付与することであって、哺乳動物が、マウスである、免疫付与することと、
(ｂ)マウスによって生成された抗体を単離することと、
(ｃ)ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳに結合する能力について抗体を試験することと、
(ｄ)ヒト及びマウスＩＣＯＳの両方に結合する１つ以上の抗体を選択することと、を含む、条項１０５に記載の方法。
【０３８０】
条項１０７．抗体重鎖可変ドメイン及び/又は抗体軽鎖可変ドメインをコードする核酸を単離することを含む、条項９５〜１０６のいずれかに記載の方法。
【０３８１】
条項１０８．哺乳動物が、ヒト可変領域遺伝子セグメント及び内在性定常領域の組換えによって抗体を生成する、条項９５〜１０７のいずれかに記載の方法。
【０３８２】
条項１０９．重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸を、ヒト重鎖定常領域及び/又はヒト軽鎖定常領域とそれぞれ接合することを含む、条項１０７又は条項１０８に記載の方法。
【０３８３】
条項１１０．核酸を宿主細胞に導入することを含む、条項１０７〜１０９のいずれかに記載の方法。
【０３８４】
条項１１１．抗体、又は抗体重鎖及び/若しくは軽鎖可変ドメインの発現のための条件下で宿主細胞を培養することを含む、条項１１０に記載の方法。
【０３８５】
条項１１２．条項９５〜１１１のいずれかに記載の方法によって産生された、抗体、又は抗体重鎖及び/若しくは軽鎖可変ドメイン。
【０３８６】
条項１１３．任意選択で、ＩＣＯＳアゴニスト抗体を選択するために、ＩＣＯＳに結合する抗体を選択する方法であって、アッセイが、
試験ウェル中で基質に固定化(結合又は接着)された抗体のアレイを提供することと、
試験ウェルに、ＩＣＯＳ発現細胞(例えば、活性化初代Ｔ細胞又はＭＪ細胞)を添加することと、
細胞の形態を観察することと、
ウェル内での、丸い形状から基質に対して平坦化された形状への細胞の形状変化を検出することであって、形状変化が、抗体が、ＩＣＯＳに結合する抗体、任意選択でＩＣＯＳアゴニスト抗体であることを示す、検出することと、
試験ウェルから抗体を選択することと、
選択された抗体のＣＤＲをコードする核酸を発現させることと、
抗体を、１つ以上の追加の成分を含む組成物中に製剤化することと、を含む、方法。
【０３８７】
本発明の様々なさらなる態様及び実施形態は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。言及される任意の特許又は特許出願の公開された米国対応出願を含む、本明細書において言及される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８８】
実験例
以下の実施例は、抗ＩＣＯＳ抗体の生成、特性評価、及び性能を記載する。ヒト可変ドメインを有する抗体を生成することができるトランスジェニックマウスプラットフォームであるＫｙｍｏｕｓｅ(商標)を使用して抗体を生成した。Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)からの抗体は、ヒトＶ(Ｄ)及びＪセグメントから生成されたヒト可変ドメインと、マウス定常ドメインと、を有する。内因性マウス可変遺伝子は、沈静化され、レパートリーの非常に小さな部分を構成する(全ての重鎖可変領域の０．５％未満がマウス起源である)。Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)システムは、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４［３９］、ＷＯ２０１１/００４１９２、ＷＯ２０１１/１５８００９、及びＷＯ２０１３/０６１０９８に記載されている。このプロジェクトでは、重鎖遺伝子座及び軽鎖カッパ遺伝子座がヒト化されたＫｙｍｏｕｓｅ(商標)ＨＫ株を用いた。
【０３８９】
ＩＣＯＳノックアウトＫｙｍｏｕｓｅ(商標)に、ＩＣＯＳタンパク質、又はヒト及びマウスＩＣＯＳを発現するタンパク質及び細胞の交互のブーストの組合せのいずれかで免疫付与した。
【０３９０】
ヒトＩＣＯＳに結合したヒットを同定した。スクリーンの一次選択基準は、ヒト細胞発現ＩＣＯＳ(ＣＨＯ細胞)への結合及びＩＣＯＳタンパク質(ＨＴＲＦ)への結合であった。マウスＩＣＯＳタンパク質及びマウス細胞発現ＩＣＯＳ(ＣＨＯ細胞)への結合も評価し、一次スクリーンヒットを選択するときに考慮に入れた。これらの基準を使用して、ヒットを２次スクリーンに進めた。二次スクリーニングでは、フローサイトメトリーによってＣＨＯ細胞上に発現されたヒト及びマウスＩＣＯＳに対する結合を測定することにより、ヒットを確認した。
【０３９１】
スクリーニングされた多数の抗体から、表面プラズモン共鳴及びフローサイトメトリーによって判定された、ヒト/カニクイザル及びマウスＩＣＯＳに結合する小パネルを同定した。これらの抗体には、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２及びその変異型ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、並びにＳＴＩＭ００５が含まれた。マウスＩＣＯＳとの交差反応性は低いが、ヒトＩＣＯＳ受容体のアゴニズムを示す、さらなる４個の抗体ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９も選択された。ここに提示するデータは、ＩＣＯＳ陽性ＣＤ４＋細胞株及び初代Ｔ細胞アッセイにおいてＩＣＯＳ受容体のアゴニストとして作用する抗ＩＣＯＳ抗体の能力を示し、ＡＤＣＣアッセイにおける細胞死滅能力、及びインビボで抗腫瘍免疫応答を促進する能力を示す。
【０３９２】
実施例１：ＩＣＯＳノックアウトマウスの生成
Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)ＨＫ  ＥＳ細胞における相同組換えによって、ＩＣＯＳノックアウトＫｙｍｏｕｓｅ(商標)株を生成した。簡潔には、ピューロマイシン選択をコードする３．５ｋｂの標的化ベクターをＥＳ細胞に標的化した。標的化の成功により、マウスＩＣＯＳ遺伝子座の小さな領域(７２ｂｐ)がピューロマイシンカセットで置換され、遺伝子のシグナルペプチド/開始コドンを途絶させた。陽性ＥＳクローンを増殖させ、マウス胚盤胞に微量注入し、得られたキメラを繁殖させて、ヒト化重鎖及びカッパ免疫グロブリン遺伝子座、並びに修飾された機能的ヌルＩＣＯＳ遺伝子座の両方についてホモ接合性の動物を最終的に生成した。
【０３９３】
実施例２：抗原及び細胞株の調製
ヒト又はマウスＩＣＯＳを発現する、安定的にトランスフェクトされたＭＥＦ及びＣＨＯ−Ｓ細胞の生成
合成ＤＮＡ列として注文したヒト及びマウスＩＣＯＳをコードする全長ＤＮＡ配列を、哺乳動物発現についてコドン最適化し、ＣＭＶプロモーターの制御下で、３’及び５’  ｐｉｇｇｙＢａｃ特異的末端反復配列に隣接した発現ベクターにクローニングし、細胞ゲノム内への安定した組込みを容易にした(［４０］を参照されたい)。発現ベクターは、安定した細胞株生成を容易にするために、ピューロマイシン選択カセットを含有した。ヒトＩＣＯＳ発現細胞株及びマウスＩＣＯＳ発現細胞株の生成のために、製造業者の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘトランスフェクション試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を使用して、それぞれヒト又はマウスＩＣＯＳ発現プラスミドを、マウス胎仔線維芽(ＭＥＦ)細胞株及びＣＨＯ−Ｓ細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードするプラスミドと共に同時トランスフェクトした。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスと交配した１２９Ｓ５から得られた胚からＭＥＦ細胞を生成した。トランスフェクションの２４時間後に、培地にピューロマイシンを補充し、少なくとも２週間成長させて、安定した細胞株を選択した。３〜４日ごとに細胞培養培地を交換した。それぞれ抗ヒト又は抗マウスＩＣＯＳ−ＰＥに接合された抗体(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)を使用してフローサイトメトリーによってヒト又はマウスＩＣＯＳタンパク質の発現を評価した。完全ＭＥＦ培地は、１０％ｖ/ｖのウシ胎仔血清(Ｇｉｂｃｏ)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(Ｇｉｂｃｏ)で構成された。完全ＣＨＯ−Ｓ培地は、８ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ(Ｇｉｂｃｏ)で補充したＣＤ−ＣＨＯ培地で構成された。ＣＨＯ−Ｓ細胞は、カナダ国立研究機構から入手可能なｐＴＴ５系に含まれるＣＨＯ−３Ｅ７細胞株であるが、他のＣＨＯ細胞株を用いてもよい。
【０３９４】
マウス免疫付与のためのＭＥＦ細胞の調製
細胞培養培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した。細胞をトリプシンで５分間処理して、組織培養表面から細胞を離した。細胞を回収し、１０％ｖ/ｖウシ胎仔血清(ＦＣＳ)を含有する完全ＭＥＦ培地の添加によってトリプシン中和した。次いで、細胞を１０分間、３００ｇで遠心分離させ、２５ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄した。細胞を計数し、１×ＰＢＳ中、適切な濃度で再懸濁した。
【０３９５】
組換えタンパク質のクローニング及び発現
標準分子生物学技術を使用して、ヒトＩＣＯＳ(ＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０３６２２４．１)、マウスＩＣＯＳ(ＮＣＢＩ  ＩＤ：ＮＰ＿０５９５０８．２)、及びカニクイザル(ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＥＨＨ５５０９８．１)の細胞外ドメインをコードする合成ＤＮＡを、ｐＲＥＰ４(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)発現プラスミド又はｐＴＴ５(カナダ国立研究機構)発現プラスミドのいずれかにクローニングした。構築物はまた、精製及び検出を補助するために、ヒトＦｃ、マウスＦｃ、又はＦＬＡＧ  Ｈｉｓペプチドモチーフのいずれかを含有した。オーバーラップエクステンションによってこれらをＤＮＡ構築物に添加した。それらの正しい配列組成を確実にするために、発現前に全ての構築物を配列決定した。
【０３９６】
実施例３：免疫付与
表Ｅ３に示されるレジメンに従って、ＩＣＯＳノックアウトＨＫ  Ｋｙｍｉｃｅ(商標)(実施例１を参照されたい)、Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)野生型ＨＫ株、及びＫｙｍｏｕｓｅ(商標)野生型ＨＬ株に免疫付与した。Ｋｙｍｏｕｓｅ(商標)野生型ＨＫ及びＨＬ株は、野生型マウスＩＣＯＳを発現する。ＨＫ株では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び軽鎖カッパ遺伝子座がヒト化され、ＨＬ株では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び軽鎖ラムダ遺伝子座がヒト化された。
【表１】
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【０３９７】
ＲＩＭＭＳは、修正された皮下免疫付与手順(複数の部位での急速免疫付与)；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．［４１］の後に修正)である。免疫付与レジメンＫＭ１０３及びＫＭ１１１は、腹腔内(ｉ．ｐ．)投与によるプライム・レスト・ブーストであった。全ての免疫付与についてＳｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用し、安静間隔は通常、２〜３週間であった。アジュバントの不在下で、最終ブーストを静脈内に投与した。
【０３９８】
フローサイトメトリーによって特異的抗体の存在について連続血液試料又は末端血液試料からの血清を分析し、力価のデータを使用して(可能な場合)、Ｂ細胞分取に使用するマウスを選択した。
【０３９９】
実施例４：ＩＣＯＳ  ＫＯ及び野生型マウス間の血清力価の比較
フローサイトメトリーを使用して、免疫付与したＩＣＯＳ  ＫＯ及び免疫付与した野生型Ｋｙｍｏｕｓｅの血清力価を判定した。ＩＣＯＳ  ＫＯマウスでは、ヒトＩＣＯＳ抗原での免疫付与は、ＣＨＯ細胞上に発現されたヒト及びマウスＩＣＯＳの両方へのＩｇ結合に対する血清免疫グロブリン応答を誘導した(図１ａ)。逆に、野生型Ｋｙｍｏｕｓｅ(マウスＩＣＯＳを発現する)では、同じヒトＩＣＯＳ抗原での免疫付与は、ヒトＩＣＯＳに対する同じ血清の結合と比較して、マウスＩＣＯＳに対する結合の著しい低減を示した血清を産生した(図１ｂ)。
【０４００】
方法
ＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ＋１％ｗ/ｖ  ＢＳＡ＋０．１％ｗ/ｖアジ化ナトリウム)中に懸濁させた、ヒトＩＣＯＳ若しくはマウスＩＣＯＳを発現するＣＨＯ−Ｓ細胞(実施例２を参照されたい)又はトランスフェクトされていないＣＨＯ−Ｓ細胞(野生型(ＷＴ)と称される)を、ウェル当たり１０５細胞の密度で９６ウェル、Ｖ字底プレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ)に分配した。ＦＡＣ緩衝液中で試料を希釈して、マウス血清の滴定を調製した。次いで、この滴定の５０μＬ/ウェルを、細胞プレートに添加した。免疫付与に起因する活性レベルの変化を判定するために、免疫付与前の各動物からの血清をＦＡＣＳ緩衝液中で１/１００に希釈し、５０μＬ/ウェルを細胞に添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートした。細胞を１５０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、各洗浄ステップ後に遠心分離させて上清を吸引した(３００×ｇで３分間遠心分離させた)。抗体結合を検出するために、ＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)を、ＦＡＣＳ緩衝液中で１/５００に希釈し、５０μＬを細胞に添加した。場合によっては、ＡＦ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)を使用した。細胞を４℃の暗所で１時間インキュベートし、次いで、上記のように１５０μＬのＰＢＳで２回洗浄した。細胞を固定するために、１００μＬの２％ｖ/ｖパラホルムアルデヒドを添加し、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を３００×ｇでの遠心分離によってペレット化し、プレートを５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ器具を使用したフローサイトメトリーによって蛍光シグナル強度(幾何平均)を測定した。
【０４０１】
実施例５：ＦＡＣＳによる抗原特異的Ｂ細胞の分取
ＷＯ２０１５/０４０４０１の実施例１に記載されるものと実質的に同様の技術を使用して、抗ＩＣＯＳ抗体を発現するＢ細胞を免疫付与したマウスから回収した。簡潔には、免疫付与レジームから単離した脾臓細胞及び/又はリンパ節細胞を、目的の細胞(ＣＤ１９)の選択のためのマーカーを含有する抗体カクテルで染色し、一方で不要な細胞を最終選別集団から排除した(ＩｇＭ、ＩｇＤ、７ＡＡＤ)。ＣＤ１９＋  Ｂ細胞を蛍光タグ付きヒトＩＣＯＳ  ＥＣＤ−Ｆｃ二量体及び蛍光タグ付きマウスＩＣＯＳ  ＥＣＤ−Ｆｃでさらに標識して、抗ＩＣＯＳ抗体を産生するＢ細胞を検出した。ヒト及びマウスＩＣＯＳの蛍光標識には、それぞれＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を用いた(実施例６を参照されたい)。ヒトＩＣＯＳ、又はヒト及びマウスＩＣＯＳの両方に結合する細胞を選択した。これらの細胞をＦＡＣＳによって融解緩衝液内に単一細胞分取した。ＲＴ−ＰＣＲ、及びさらに２ラウンドのＰＣＲを使用してＶ領域配列を回収し、次いで、マウスＩｇＧ１定常領域に架橋し、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。ＩＣＯＳ結合及び機能的抗体の存在について、ＨＥＫ２９３細胞からの上清をスクリーニングした。この方法を、本明細書において以降、ＢＣＴと呼ぶ。
【０４０２】
実施例６：ＢＣＴからの抗体のスクリーニング
組換えヒト及びマウスＩＣＯＳ−Ｆｃへの結合についてのＢＣＴ上清のＨＴＲＦスクリーニング
分泌抗体の、組換えタンパク質として発現されたヒトＩＣＯＳ  Ｆｃ及びマウスＩＣＯＳ  Ｆｃに結合する能力について、実施例５でＢＣＴ発現から回収した上清をスクリーニングした。ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ(登録商標)６４７Ｈ(Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)で標識したＩＣＯＳ(本明細書において、それぞれＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ(登録商標)６４７Ｈで標識したヒトＩＣＯＳ及びＩＣＯＳについて６４７  ｈＩＣＯＳ又は６４７  ｍＩＣＯＳと呼ばれる)を使用して、ＨＴＲＦ(登録商標)(均一時間分解蛍光、Ｃｉｓｂｉｏ)アッセイフォーマットによって組換えヒト及びマウスＩＣＯＳに対する分泌抗体の結合を同定した。５μＬのＢＣＴ上清を白色の３８４ウェルの低容量非結合表面ポリスチレンプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ)に移した。ＨＴＲＦアッセイ緩衝液中で希釈した５μＬの２０ｎＭ  ６４７  ｈＩＣＯＳ又は６４７  ｍＩＣＯＳを全てのウェルに添加した。ヒトＩＣＯＳ結合アッセイについて、参照抗体をＢＣＴ培地(Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１４３５１−０１)中で１２０ｎＭまで希釈し、５μＬをプレートに添加した。ヒトＩＣＯＳ結合アッセイの陰性対照のウェルについては、ＢＣＴ培地中で１２０ｎＭまで希釈した５μＬのマウスＩｇＧ１(Ｓｉｇｍａ  Ｍ９２６９、場合によってはＣＭ７と呼ばれる)。マウスＩＣＯＳ結合アッセイの場合には、参照抗体をＢＣＴ培地(Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１４３５１−０１)中で１２０ｎＭまで希釈し、５μＬをプレートに添加した。ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照(Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ)を、ＢＣＴ培地(Ｇｉｂｃｏ＃Ａ１４３５１−０１)中で１２０ｎＭまで希釈した陰性対照ウェル(Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)に添加し、５μＬをプレートに添加した。ＨＴＲＦアッセイ緩衝液中で１/２０００に希釈したユーロピウムクリプテート(Ｃｉｓｂｉｏ)で直接標識した１０μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ)の添加によってヒトＩＣＯＳに対する分泌抗体の結合を検出した。マウスＩＣＯＳ結合アッセイの場合には、５μＬのマウス抗ラットＩｇＧ２Ｂ−ＵＢＬＢ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ)を陽性及び陰性対照ウェルに添加し、５μＬのＨＴＲＦアッセイ緩衝液をプレートの全ての他のプレートに添加した。次いで、ＨＴＲＦアッセイ緩衝液中で１/１０００に希釈したユーロピウムクリプテート(Ｃｉｓｂｉｏ)で直接標識した５μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ)を添加して、結合を検出した。ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を使用して６２０ｎｍ及び６６５ｎｍの発光波長、１００フラッシュで時間分解蛍光を読み取る前に、プレートを暗所で２時間インキュベートさせた。
【０４０３】
各試料について、それぞれ方程式２及び方程式１に従って６６５/６２０比及び効果パーセントを計算することによってデータを分析した。
【０４０４】
ＫＭ１０３及びＫＭ１１−Ｂ１について、ヒト及びマウスＩＣＯＳへの結合に対する５パーセント以上の効果に基づいて一次ヒットを選択した。ＫＭ１３５について、ヒト及びマウスＩＣＯＳへの結合に対する１０パーセント以上の効果に基づいて一次ヒットを選択した。ＫＭ１１１−Ｂ２について、ヒトＩＣＯＳへの結合に対する４パーセント以上の効果及びマウスＩＣＯＳへの結合に対する３パーセント以上の効果に基づいて一次ヒットを選択した。
【数１】
2019534892.tif 000003
【０４０５】
細胞発現ヒト及びマウスＩＣＯＳへの結合についてのＢＣＴ上清のスクリーニング
分泌抗体の、ＣＨＯ−Ｓ細胞の表面上に発現されたヒト又はマウスＩＣＯＳに結合する能力について、実施例５のＢＣＴから回収した上清をスクリーニングした。ＣＨＯ−Ｓヒト及びマウスＩＣＯＳ結合を判定するために、１０％のＦＢＳ(Ｇｉｂｃｏ)を補充したＦ１２培地(Ｇｉｂｃｏ)中で、組織培養処理した、黒壁の透明底３８４ウェルプレート(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)に４×１０４/ウェルで細胞をプレーティングし、一晩培養した。培養培地を３８４ウェルアッセイプレートから除去した。２μｇ/ｍＬでＢＣＴ培地中の少なくとも５０μＬのＢＣＴ上清若しくは５０μＬの参照抗体、又はＢＣＴ培地中に希釈したアイソタイプＩｇＧ１対照抗体(場合によってはＣｍ７と呼ばれ、Ｓｉｇｍａ  Ｍ９２６９、２μｇ/ｍＬの最終濃度)を各ウェルに添加した。プレートを４℃で１時間インキュベートした。上清を吸引し、二次抗体緩衝液(１×ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム)中で５００分の１に希釈した、鮮やかな緑色にＤＮＡ染色(Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)された５μｇ/ｍｌの５０μＬのヤギ抗マウス６４７(Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ)を添加して、抗体結合を検出し、細胞を可視化した。プレートを４℃で１時間インキュベートした。上清を吸引し、２５μＬの４％ｖ/ｖパラホルムアルデヒドを添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。プレートを１００μＬのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、洗浄緩衝液を完全に除去した。ＦＩＴＣ(励起４９４ｎｍ、発光５２０ｎｍ)及びａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ６４７(励起６５０ｎｍ、発光６６８ｎｍ)を測定するＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を使用して蛍光強度を測定した。方程式３に記載されるようにアッセイシグナルを判定し、方程式１に記載されるように効果パーセントを判定した。２μｇ/ｍＬの最終アッセイ濃度で参照抗体を使用して全結合を定義した。２μｇ/ｍＬの最終アッセイ濃度でマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照(Ｓｉｇｍａ)を使用して非特異的結合を定義した。ヒット選択のための基準は、アッセイシグナル及び効果パーセントに基づいた。
【０４０６】
ＫＭ１０３、ＫＭ１１１−Ｂ１、及びＫＭ１３５について、１０パーセント以上の効果に基づいて一次ヒットを選択した。ＫＭ１１１−Ｂ２について、４パーセント以上の効果に基づいて一次ヒットを選択した。
一次スクリーニング結果の要約
【表２】
2019534892.tif 000004
【０４０７】
細胞発現ヒト及びマウスＩＣＯＳへの結合についてのＦＡＣＳスクリーニング
ヒト又はマウスＩＣＯＳを発現するＣＨＯ−Ｓ細胞に結合する能力について、実施例５からのＢＣＴ上清及びＨＥＫ２９３発現抗体を試験した。
【０４０８】
ヒト又はマウスＩＣＯＳを発現するＣＨＯ−Ｓ細胞(実施例２を参照された)をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ  １％  ＢＳＡ  ０．１％アジ化ナトリウム)中で希釈し、ウェル当たり１×１０５細胞の密度で９６ウェルのＶ字底プレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ)に分配した。細胞を１５０μＬのＰＢＳで洗浄し、３００ｇで３分間遠心分離した。上清スクリーニングのために、上清を吸引し、１５０μＬのＰＢＳを添加した。この洗浄ステップを繰り返した。ＢＣＴ培地中で５μｇ/ｍｌまで希釈した、３０μＬのＢＣＴ未希釈上清、又は５０μＬの参照抗体若しくは対照抗体を、洗浄した細胞に添加した。細胞を４℃で６０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を上記のように洗浄した。抗体結合を検出するために、ＦＡＣＳ緩衝液中で２μｇ/ｍｌに希釈した５０μＬのヤギ抗マウスＡＰＣ(Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)を細胞に添加した。細胞を４℃で６０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、各洗浄ステップ後に３００×ｇで３分間遠心分離させて上清を吸引した。２５μＬの４％パラホルムアルデヒドの添加によって細胞を室温で２０分間固定した。細胞を上記のように１回洗浄し、分析のためにＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ器具を使用したフローサイトメトリーによってＡＰＣシグナル強度(幾何平均)を測定した。さらなる計算を伴わずに幾何平均値としてデータをプロットした。
【０４０９】
一次スクリーニングと比較して、このさらなるスクリーニングでにおいて、よりストリンジェントな種交差反応性基準を満たすものとして、抗体の小さいサブセットを選択下。簡潔には：
【０４１０】
ＫＭ１０３から、ｈＩＣＯＳ、ｍＩＣＯＳ、及びＷＴ  ＣＨＯ細胞に対するハイブリッド対照結合の平均幾何平均をとり、＞４倍を上回るマウス及びヒトバインダーを同定することによって、４つの抗体を選択した。これらの４つの抗体を、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００７、及びＳＴＩＭ００９と称した。
【０４１１】
ＫＭ１１１−Ｂ１から、ｈＩＣＯＳ、ｍＩＣＯＳ、及びＷＴ  ＣＨＯ細胞に対する陰性対照(アルメニアンハムスター：クローンＨＴＫ８８８)結合の幾何平均の平均をとり、＞１０倍を上回るマウス及びヒトバインダーを同定することによって、４つの抗体を選択した。
【０４１２】
ＫＭ１１１−Ｂ２から、ｈＩＣＯＳ、ｍＩＣＯＳ、及びＷＴ  ＣＨＯ細胞に対する陰性対照(アルメニアンハムスター：クローンＨＴＫ８８８)結合の幾何平均の平均をとり、＞４倍を上回るマウス及びヒトバインダーを同定することによって、４つの抗体を選択した。これらの４つの抗体には、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、及びＳＴＩＭ００５が含まれていた。
【０４１３】
ＫＭ１３５からは、交差反応性抗体は同定されなかった。ＦＡＣＳ二次スクリーニング方法の技術的失敗に起因して、ＳＰＲ及びＨＴＲＦを使用したスクリーニングも実施したが、所望の交差反応性レベルを満たす抗体は見出されなかった。
【０４１４】
結論として、実施例に記載される様々な複数の免疫付与レジメンから、ヒトＩＣＯＳ及びマウスＩＣＯＳへの結合について４０００を超えるＢＣＴ上清(ＩＣＯＳ  ＫＯマウスのみから)をスクリーニングし、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００７、及びＳＴＩＭ００９を含む候補の小パネルが、さらなる開発のための最も有望な特徴を有するものとして同定された。これらは、より詳細な特性評価のために進められた。
【０４１５】
これとは別に、種交差反応性基準を満たさなかった２つの抗体ＳＴＩＭ００６及びＳＴＩＭ００８も、ヒトＩＣＯＳに結合するそれらの能力に基づいてさらなる特性評価のために選択した。
【０４１６】
実施例７：表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)による親和性判定
ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３  ６(ＢｉｏＲａｄ)を使用したＳＰＲによって、ＩＣＯＳリードのＦａｂ親和性を生成した。一級アミン結合によって抗ヒトＩｇＧ捕捉表面をＧＬＣバイオセンサチップ上に作製し、３つの抗ヒトＩｇＧ抗体(Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  １０９−００５−００８、１０９−００６−００８、及び３０９−００６−００８)を固定化した。ヒトＦｃタグ付きヒトＩＣＯＳ(ｈＩＣＯＳ)及びマウスＩＣＯＳ(ｍＩＣＯＳ)を抗ヒトＩｇＧ表面上に個々に捕捉し、精製されたＦａｂを分析物として５０００ｎＭ、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、及び８ｎＭで使用した(１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、及び２ｎＭで使用したＳＴＩＭ００３を除いて)。緩衝液注入(すなわち、０ｎＭ)を使用して結合センサグラムを二重参照し、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６分析ソフトウェアに固有の１：１モデルにデータを適合させた。２５℃で、ＨＢＳ−ＥＰを泳動用緩衝液として使用してアッセイを行った。
【表３】
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【０４１７】
さらに、異なるｐＨ値での抗体：抗原結合親和性の比較を実施した。前と同様に、一級アミン結合によってＧＬＣバイオセンサチップ上に固定化された３つの抗体カクテルを使用して、ヒトＦｃ領域に融合したＩＣＯＳの細胞外ドメインとして提示された二量体ヒトＩＣＯＳタンパク質を抗ヒトＦｃ捕捉表面上に捕捉した。ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６  Ａｒｒａｙシステム(Ｂｉｏｒａｄ)で、組換え発現された抗ＩＣＯＳ  ＦａｂのＳＰＲ分析を実施した。Ｆａｂ断片を分析物として使用して、結合センサグラムを生成し、これを緩衝液注入(すなわち、０ｎＭ)と二重参照した。後続のの参照センサグラムをＰｒｏｔｅＯｎ分析ソフトウェアに固有の１：１モデルに適合させた。表Ｅ７−２は、抗体の親和性及び動態データを示し、これらは全て、ｐＨ７．４/７．６の又はｐＨ５．５のＨＢＳ−ＥＰのいずれかを使用して、指定されない限り３７℃で実施した。データを１：１モデルに適合させた。ＳＴＩＭ００２のデータは、ｐＨ７．４及び５．５の両方で適合が乏しく、したがって、この抗体の親和性は、表に示されるよりも低い可能性があることに留意されたい。
【表４】
2019534892.tif 000006
【０４１８】
異なるｐＨ値での親和性データの比較は、抗体が、生理学的ｐＨ範囲にわたってそれらの標的への結合を保持することを示した。腫瘍微小環境は、血液と比較して相対的に酸性であり得、したがって、低ｐＨでの親和性の維持は、腫瘍内Ｔ−ｒｅｇ枯渇を改善するためのインビボでの潜在的な利点である。
【０４１９】
実施例８：ＨＴＲＦによってアッセイされたＩＣＯＳ受容体へのＩＣＯＳリガンド結合の中和
均一性時間分解蛍光法(ＨＴＲＦ)を使用して、ＩＣＯＳに対するＩＣＯＳリガンド(Ｂ７−Ｈ２)結合を中和するそれらの能力について、選択されたＩＣＯＳ抗体をさらに評価した。ｍＡｂのヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ４．ＰＥ(ヌル−エフェクター)アイソタイプを、
−ヒトＩＣＯＳに対するヒトＢ７−Ｈ２結合の中和のためのＨＴＲＦアッセイ、及び
−マウスＩＣＯＳに対するマウスＢ７−Ｈ２結合の中和のためのＨＴＲＦアッセイにおいて評価した。
【０４２０】
抗ＩＣＯＳ抗体Ｃ３９８．４Ａ(いずれの場合もハムスターＩｇＧ)を比較のために含めた。
【０４２１】
ヒト及び/又はマウスＩＣＯＳ受容体−リガンド結合に対して高い中和効力を有する多くの抗体が見出され、結果は、これらの抗体のうちのいくつかが、良好な交差反応性を示したことを示した。抗体アイソタイプは有意な効果を有さず、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４．ＰＥアッセイ間の結果の差は実験誤差内であった。
【０４２２】
ＩｇＧ１
ヒトＩｇＧ１アッセイでは、抗体Ｃ３９８．４Ａは、ヒトＩＣＯＳリガンドの中和について、１．２±０．３０ｎＭのＩＣ５０を生成し、マウスＩＣＯＳリガンドの中和について、０．１４±０．０１ｎＭのＩＣ５０を生成した。
【０４２３】
ＩｇＧ１  ｍＡｂ  ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００３、及びＳＴＩＭ００５は、ヒトＩＣＯＳリガンド中和システムを使用するＣ３９８．４Ａと同様のＩＣ５０を生成し、交差反応性でもあり、マウスＩＣＯＳ受容体に対するマウスＩＣＯＳリガンドの結合を中和させた。
【０４２４】
２つのさらなる交差反応性ｍＡｂ  ＳＴＩＭ００２−Ｂ及びＳＴＩＭ００４は、より弱いヒト及びマウスＩＣＯＳリガンド中和を示した。
【０４２５】
ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９は、ヒトＩＣＯＳリガンドの中和を示したが、マウスＩＣＯＳリガンド中和システムでは有意な交差反応性を示さなかった。これらの抗体については、マウスＢ７−Ｈ２リガンドの中和ＩＣ５０値を計算することができなかった。
【表５】
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【表６】
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【０４２６】
ＩｇＧ４．ＰＥ
予想通り、ＩｇＧ４．ＰＥ  ｍＡｂは、ＩｇＧ１アイソタイプと同様の結果を生成した。
【０４２７】
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びＳＴＩＭ００５は、ヒトＩＣＯＳリガンド中和システムを使用するＣ３９８．４Ａと同様のＩＣ５０値を示した。これらのｍＡｂはまた、マウスＩＣＯＳリガンドの中和において交差反応性であった。ＳＴＩＭ００２−Ｂ及びＳＴＩＭ００４は、ヒトＩＣＯＳ  Ｂ７−Ｈ２中和及びマウスＢ７−Ｈ２リガンドについてより弱いＩＣ５０を生成した。ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９は、ヒトＩＣＯＳ受容体に対するヒトＩＣＯＳリガンド結合の中和を示したが、マウスＢ７−Ｈ２リガンドについての中和ＩＣ５０値はこれらのアッセイでは計算することができなかった。
【０４２８】
ＳＴＩＭ００６及びＳＴＩＭ００２のＩｇＧ４．ＰＥアイソタイプはアッセイしなかった。
【表７】
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【表８】
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【０４２９】
材料及び方法
試験抗体及びアイソタイプ対照を、最大で４μＭ、１μＭ最終の開始使用濃度から、０．００２ｎＭ、５．６４ｅ−４ｎＭ最終まで、１１点滴定、３分の１希釈で、アッセイ緩衝液(０．５３Ｍフッ化カリウム(ＫＦ)、１×ＰＢＳ中０．１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ))中で希釈した。５μｌの抗体の滴定を３８４ｗの白壁アッセイプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ)に添加した。陽性対照ウェルには、５μｌのアッセイ緩衝液のみを与えた。
【０４３０】
５μｌのＩＣＯＳ受容体(ヒトＩＣＯＳ−ｍＦｃ、２０ｎＭ、５ｎＭ最終、又はマウスＩＣＯＳ−ｍＦｃ  ４ｎＭ、１ｎＭ最終(Ｃｈｉｍｅｒｉｇｅｎ))を必要なウェルに添加した。プレートを室温(ＲＴ)で１時間インキュベートした。インキュベーション後、Ａｌｅｘａ  ６４７(Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)と接合したマウス又はヒトＩＣＯＳリガンド(Ｂ７−Ｈ２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)のいずれか５μｌを、ヒトＢ７−Ｈ２については３２ｎＭ(８ｎＭ最終)、又はマウスＢ７−Ｈ２については３０ｎＭ、７．５ｎＭ最終のいずれかまで希釈し、５μＬのアッセイ緩衝液を代わりに与えた陰性対照ウェルを除く、アッセイプレートの全てのウェルに添加した。
【０４３１】
最後に、ユーロピウムクリプテート(Ｃｉｓ  Ｂｉｏ)で標識された５μｌの抗マウスＩｇＧドナーｍＡｂ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ)(４０ｎＭ、１０ｎＭ最終の)を各ウェルに添加し、アッセイをＲＴで暗所に置いて、さらに２時間インキュベートさせた。インキュベーション後、標準ＨＴＲＦプロトコルを使用してアッセイをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)上で読み取った。６２０ｎｍ及び６６５ｎｍチャネル値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ(Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ)にエクスポートし、Ｄｅｌｔａ−Ｆ％及び中和％の計算を実施した。Ｇｒａｐｈｐａｄ(Ｐｒｉｓｍ)を使用して、滴定曲線及びＩＣ５０値［Ｍ］をプロットした。方程式Ｘ＝Ｌｏｇ(Ｘ)を使用してデータを最初に変換することによって、ＩＣ５０値を計算した。次いで、適合アルゴリズムｌｏｇ(阻害剤)対応答−可変スロープ(４パラメータ)を使用する非線形回帰を使用して、変換したデータを適合させた。
【数２】
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【０４３２】
実施例９ａ：Ｔ細胞活性化
ヒト初代Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、プレート結合及び可溶性形態でサイトカイン産生へのＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３アゴニスト潜在性を試験し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  Ａｂを抗ＩＣＯＳ  Ａｂに同時に添加して、エフェクターＴ細胞上のＩＣＯＳ発現を誘導した。これらの活性化Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮγのレベルに対するＩＣＯＳ同時刺激の効果を、活性化の７２時間後にＥＬＩＳＡを使用して評価した。
【０４３３】
材料及び方法
Ｔ細胞活性化アッセイ１：
ヒト末梢血(ＰＢＭＣ)からの単核細胞の単離：
健常なドナーから白血球コーンを回収し、それらの内容物を、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ)で最大で５０ｍｌ希釈し、２つの遠心管内で、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ(ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)の上に重ねた。密度勾配遠心分離(ブレーキなしで４０分間、４００ｇ)によってＰＢＭＣを分離し、清潔な遠心管に移し、その後、３００ｇで５分間、２回遠心分離させ、２００ｇで５分間、２回遠心分離させることにより５０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、ＰＢＭＣをＲ１０培地(ＲＰＭＩ＋１０％の熱失活したウシ胎仔血清、いずれもＧｉｂｃｏ)中で再懸濁させ、それらの細胞数及び生存能力をＥＶＥ(商標)Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ(ＮａｎｏＥｎＴｅｋ)で評価した。
【０４３４】
ＩＣＯＳ抗体(Ａｂ)の調製及び希釈：
ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３を３つのフォーマットで試験した：プレート結合、可溶性、又は抗ＩＣＯＳ  Ａｂｓと架橋する可溶性プラスＦ(ａｂ’)２断片(Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの１０９−００６−１７０。
【０４３５】
プレート結合フォーマットの場合：抗ＩＣＯＳ  Ａｂ及びそれらのアイソタイプ対照をＰＢＳ中で１：３に連続希釈して、４５〜０．１９μｇ/ｍＬの範囲の最終抗体濃度を得た。１００μＬの希釈した抗体を、９６ウェルの高結合平底プレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＥＩＡ/ＲＩＡプレート)内に４℃で一晩、二連でコーティングした。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄し、１２５μｌのＲ１０を各ウェルに添加した。
【０４３６】
可溶性フォーマットの場合：抗ＩＣＯＳ  Ａｂ及びそれらのアイソタイプ対照をＲ１０培地中で１：３に連続希釈して、９０〜０．３８μｇ/ｍＬの範囲の２Ｘ  Ａｂストック濃度を得た。１２５μｌの希釈したＡｂを、９６ウェルの平底プレート内に二連でピペッティングした。
【０４３７】
架橋した可溶性フォーマットの場合：抗ＩＣＯＳ抗体及びそれらのアイソタイプ対照を、１Ｍ対１Ｍの比でＦ(ａｂ’)２断片と混合した。次いで、Ａｂ/Ｆ(ａｂ’)２断片をＲ１０培地中で１：３に連続希釈して、９０〜０．３８μｇ/ｍＬ、及びＦ(ａｂ’)２断片について６０〜０．２４μｇ/ｍｌの範囲の２Ｘ  Ａｂ濃度を得た。１２５μｌの希釈したＡｂを、９６ウェルの平底プレート内に二連でピペッティングした。
【０４３８】
Ｔ細胞単離、培養、及びＩＦＮ−γ定量化：
ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を使用してＴ細胞をＰＢＭＣから陰性単離し、４０μｌ/ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３/ＣＤ２８(Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を補充したＲ１０培地中で２×１０６/ｍＬで再懸濁させた。
【０４３９】
１２５μｌのＴ細胞懸濁液をＡｂ含有プレートに添加して、１×１０６細胞/ｍｌの最終細胞濃度を得、３７℃及び５％  ＣＯ２で７２時間培養した。次いで、細胞不含上清を回収し、ＥＬＩＳＡ(Ｒ＆Ｄからのデュオセットキット)による分泌ＩＦＮγの分析まで−２０℃で保管した。
【０４４０】
この実験を、６人の独立ドナーから単離したＴ細胞上で繰り返し、各アッセイ条件について２つの技術的複製が含まれた。
【０４４１】
Ｔ細胞活性化アッセイ２(ＳＴＩＭ−ＲＥＳＴ−ＳＴＩＭアッセイ)：
サイトカイン放出へのＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３アゴニスト潜在性も、ヒトＴ細胞アッセイにおいてプレート結合で試験し、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８  Ａｂで３日間、事前刺激して、ＩＣＯＳ発現を誘導した後に、それらの活性化レベルを低減させるために３日間休止させた。刺激後(３日目)及び休止後(６日目)にＦＡＣＳ染色によってＩＣＯＳ発現を確認した。次いで、これらの刺激され、休止したＴ細胞を、ＣＤ３  Ａｂの存在又は不在下で、ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３と共に培養して、ＴＣＲ関与の必要条件を評価した。培養中に存在するＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２のレベルに対するＩＣＯＳ同時刺激の効果を評価した。
【０４４２】
ＩＣＯＳ  Ａｂの希釈及びコーティング：
抗ヒトＣＤ３(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのクローンＵＣＨＴ１)を、１０μｇ/ｍＬの２Ｘ  Ａｂ濃度までＰＢＳ中で希釈した。５０μｌのＰＢＳ又は５０μｌの希釈したＣＤ３  Ａｂを、９６ウェルの高結合平底プレート内にピペッティングした。ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びそれらのアイソタイプ対照をＰＢＳ中で１：２に連続希釈して、２０〜０．６２μｇ/ｍＬの範囲の最終２Ｘ抗体濃度を得た。ＰＢＳ(ＴＣＲ関与なし)又は希釈したＣＤ３  Ａｂ(ＴＣＲ関与)のいずれかを含有するウェルに５０μＬの希釈した抗ＩＣＯＳ  Ａｂを添加した。プレートを４℃で一晩コーティングした。
【０４４３】
Ｔ細胞単離、培養、及びＩＦＮ−γ定量化：
Ｔ細胞活性化アッセイ１に記載されるように、白血球コーン由来のＰＢＭＣを得た。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を使用してＴ細胞をこのＰＢＭＣから陰性単離した。２０μｌ/ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３/ＣＤ２８(Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を補充したＲ１０培地中で、Ｔ細胞を１×１０６/ｍｌで再懸濁させ、３７℃及び５％  ＣＯ２(刺激)で３日間培養した。３日目に、ダイナビーズを培養から除去した。次いで、Ｔ細胞を洗浄し(３００ｇで５分間)、計数し、Ｒ１０培地中で１．５×１０６/ｍｌで再懸濁させ、３７℃及び５％  ＣＯ２でさらに３日間培養した(休止期間)。
【０４４４】
６日目に、刺激された休止Ｔ細胞を洗浄し(３００ｇで５分間)、計数し、Ｒ１０培地中で１×１０６/ｍＬで再懸濁させ、２５０μｌのＴ細胞懸濁液をＩＣＯＳ  Ａｂでコーティングされたプレートに添加し、３７℃及び５％  ＣＯ２で７２時間培養した。次いで、細胞不含上清を回収し、ＭＳＤプラットフォーム上での分泌サイトカインの分析まで−２０℃で保管した。この実験を、５人の独立ドナーから単離したＴ細胞で繰り返し、各アッセイ条件について３つの技術的複製が含まれた。
【０４４５】
結果
ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の両方が、ＩＦＮγ発現の誘導について陽性であると試験され、したがって、両方のアッセイにおいてアゴニズムを実証した。
【０４４６】
実施例９ｂ：Ｔ細胞活性化アッセイ１データ
８人の独立ドナーから単離したＴ細胞を使用して、実施例９ａに記載されるようにＴ細胞活性化アッセイ１を実施し、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の各々をヒトＩｇＧ１フォーマットで試験した。比較のために、ハムスター抗ＩＣＯＳ抗体Ｃ３９８．４Ａ及びハムスター抗体アイソタイプ対照を含めた。各アッセイ条件について２つの技術的複製が含まれた。
【０４４７】
結果は、図１６、図１７、及び図１８に示される。前述のように、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の両方が、ＩＦＮγ発現の誘導について陽性であると試験され、したがって、ヒト初代Ｔ細胞に対するアゴニスト効果を実証した。
【０４４８】
可溶性抗体又は対象と比較して、Ｆｃ結合Ｆ(ａｂ’)２断片の存在下でのＩＦＮγ誘導の強い増強によって示されるように、架橋性抗体は、Ｔ細胞活性化のアゴニストとして作用した。Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現は、架橋性ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３の濃度の増加と共に増加した(図１６、下部パネル)。抗体の濃度の増加に伴うＴ細胞において認められるＩＦＮγ発現の増加によって示されるように、プレート結合形態のＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の両方について、及びより弱く、ハムスター抗体Ｃ３９８．４Ａについて、アゴニズムも認められた(図１６、上部パネル)。
【０４４９】
ＩＦＮγ応答の大きさは、異なるドナーから得られたＴ細胞間で変動したが、ＳＴＩＭ００１は一貫して、対照抗体(ＨＣ  ＩｇＧ１)で認められたＩＦＮγ発現と比較した、Ｔ細胞におけるＩＦＮγ発現の増加を生成した。８人全てのドナーからのＴ細胞でのアッセイからのデータを考慮すると、ＳＴＩＭ００１でのＴ細胞の治療は、プレート結合形態、可溶性形態、及び架橋性形態において、アイソタイプ対照抗体での治療と比較して、ＩＦＮγ発現を有意に増加させたことが見られる(図１７)。したがって、ＳＴＩＭ００１は、３つ全てのフォーマットにおいてＴ細胞活性化のアゴニストとして挙動した。
【０４５０】
同様の効果がＳＴＩＭ００３で認められた(図１８)。８人の独立ドナーについて、アッセイにおける所与の用量の抗体で、ＳＴＩＭ００３  ｈＩｇＧ１によって誘導されたＩＦＮγのレベルを、そのアイソタイプ対照(ＨＣ  ＩｇＧ１)によって誘導されたＩＦＮγのレベルと比較した。ドナー間の変動性にもかかわらず、ＳＴＩＭ００３によって誘導されたＩＦＮγレベルの平均増加は、ＨＣ  ＩｇＧ１と比較して有意であった。ＳＴＩＭ００１、及びここに記載される他のＳＴＩＭ抗体が、インビボでＴ細胞活性を同様に促進する潜在性を有することが提案される。前述のように、活性化ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞のアゴニズムは、Ｔ細胞表面上のＩＣＯＳ受容体に結合し、その多量体化を誘導する抗ＩＣＯＳ抗体によって媒介され得る。実施例９ｃ：Ｔ細胞活性化アッセイ２データ
【０４５１】
実施例９ａに記載されるようにＴ細胞活性化アッセイ２を実施した。
【０４５２】
ＴＣＲ関与の不在下(抗ＣＤ３抗体なし)で、初代Ｔ細胞から産生されたサイトカインのレベルは低く、１０μｇ/ｍｌの最高濃度でさえも、ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)、ＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)、又は抗体Ｃ３９８．４Ａによって増加は誘導されなかった。対照的に、抗ＣＤ３抗体と組み合わせて抗ＩＣＯＳ抗体がＴ細胞に添加されると、ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)、ＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)、及びＣ３９８．４Ａの各々は、ＩＦＮγ、ＴＮＦαの発現、及びより低い程度でＩＬ−２の発現の増加の用量依存性の傾向を示した。
【０４５３】
ＴＣＲ関与の条件下で、抗ＩＣＯＳ抗体で処置された初代Ｔ細胞からのデータは、図１９に示される。ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びＣ３８９．４Ａの各々について、それらのそれぞれのアイソタイプ対照と比べてサイトカイン発現の著しい増加が認められたものの、その差は、このアッセイにおいて統計学的に有意な差には達しなかった。より多くのドナーからの応答性初代Ｔ細胞を用いたアッセイのさらなる複製は、統計学的に有意な結果を生成すると予想される。
【０４５４】
実施例１０ａ：ＡＤＣＣアッセイ
ヒト初代ＮＫ細胞をエフェクターとして、及びＩＣＯＳ高ＭＪ細胞株(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−８２９４)を標的細胞として使用して、Ｄｅｌｆｉａ  ＢＡＴＤＡ細胞傷害性アッセイ(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)において、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３のＡＤＣＣを介して殺滅する潜在性を試験した。ＭＪ細胞は、高レベルのＩＣＯＳタンパク質を発現するヒトＣＤ４  Ｔリンパ球細胞である。
【０４５５】
この方法は、細胞膜を急速に貫通する蛍光増強リガンド(ＢＡＴＤＡ)のアセトキシメチルエステルを標的細胞に装填することに基づく。細胞内で、エステル結合は加水分解されて、親水性リガンド(ＴＤＡ)を形成し、これはもはや膜を通過しない。細胞溶解後、リガンドは放出され、ＢＡＴＤＡと共に高度蛍光で安定なキレート(ＥｕＴＤＡ)を形成するユーロピウムの添加によって検出され得る。測定されたシグナルは、溶解した細胞の量と直接相関する。
【０４５６】
材料及び方法
標的細胞標識：
製造業者の指示に従って、ＭＪ細胞を１０６/ｍＬでアッセイ培地(ＲＰＭＩ＋１０％超低ＩｇＧ  ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ)中で再懸濁させ、５μＬ/ｍＬのＤｅｌｆｉａ  ＢＡＴＤＡ試薬(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を３７℃で３０分間装填した。次いで、ＭＪ細胞を５０ｍＬのＰＢＳ(３００ｇで５分)で３回洗浄し、２ｍＭのプロベネシド(Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)で補充したアッセイ培地中で８ｘ１０５/ｍｌで再懸濁させて、細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出を低減させた。
【０４５７】
ＩＣＯＳ  Ａｂ希釈：
ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びそれらのアイソタイプ対照を、アッセイ培地＋２ｍＭプロベネシド中で１：４に連続希釈して、最小で８０ｐｇ/ｍＬの範囲の最終４Ｘ抗体濃度を得た。
【０４５８】
ＮＫ細胞の単離及び培養：
Ｔ細胞活性化アッセイ１に記載されるように、白血球コーン由来のＰＢＭＣを得た。ＥａｓｙＳｅｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を使用してＮＫ細胞をこのＰＢＭＣから陰性単離し、Ｒ１０培地＋２ｍＭプロベネシド中で４×１０６/ｍｌで再懸濁させた。ＣＤ３−/ＣＤ５６＋について、ＮＫ細胞の純度が９０％を上回ることを染色によって確認した。
【０４５９】
５０μｌの希釈したＡｂ、５０μｌのＢＡＴＤＡ担持ＭＪ細胞、５０μｌのＮＫ細胞、及び５０μＬのアッセイ培地＋２ｍＭプロベネシド(２００μｌ/ウェルの最終体積)を各ウェルに添加して、最小で２０ｐｇ/ｍＬの範囲の最終Ａｂ濃度及び５：１のエフェクター：標的比を得た。ＭＪ細胞のみ、又はＭＪ細胞＋ｄｅｌｆｉａ溶解緩衝液(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を含有するウェルを使用して、自然放出及び１００％  ＢＡＴＤＡ放出を判定する。
【０４６０】
アッセイを３７℃、５％  ＣＯ２で２時間実施した後、５０μｌの細胞不含上清をＤＥＬＦＩＡ微量滴定プレート(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)に移した。２００μｌのＤｅｌｆｉａユーロピウム溶液(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を上清に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、蛍光シグナルをＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)で定量化した。
【０４６１】
キットの説明書に従い、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３によって誘導された特異的放出を計算した。この実験を、独立ドナーからのＮＫ細胞で繰り返し、各アッセイ条件について３つの技術的複製が含まれた。
【０４６２】
結果
抗ＩＣＯＳ抗体ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)は、初代ＮＫ依存性ＡＤＣＣアッセイにおいてＩＣＯＳ陽性ヒトＭＪ細胞を殺滅する(２時間時点)。図６ａも参照されたい。試験した両方の分子について、このアッセイにおいてナノモル以下のＥＣ５０を達成した。
【表９】
2019534892.tif 000012
【０４６３】
実施例１０ｂ：ＭＪ標的細胞によるＡＤＣＣアッセイ
実施例１０ａに記載される材料及び方法に従って実験を実施した。ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びそれらのアイソタイプ対照を、アッセイ培地＋２ｍＭプロベネシド中で１：４に連続希釈して、４０μｇ/ｍＬ〜８０ｐｇ/ｍＬの範囲の最終４Ｘ抗体濃度を得た。５０μｌの希釈したＡｂ、５０μｌのＢＡＴＤＡ担持ＭＪ細胞、５０μｌのＮＫ細胞、及び５０μＬのアッセイ培地＋２ｍＭプロベネシド(２００μｌ/ウェルの最終体積)を各ウェルに添加して、１０μｇ/ｍＬ〜２０ｐｇ/ｍＬの範囲の最終Ａｂ濃度及び５：１のエフェクター：標的比を得た。
【０４６４】
結果は、図６(ｂ〜ｄ)及び以下の表に示される。ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)は、２時間時点で測定した初代ＮＫ依存性ＡＤＣＣアッセイにおいてＩＣＯＳ陽性ヒトＭＪ細胞を殺滅した。
【表１０】
2019534892.tif 000013
【０４６５】
実施例１０ｃ：ＩＣＯＳトランスフェクトＣＣＲＦ−ＣＥＭ標的細胞によるＡＤＣＣアッセイ
ヒト初代ＮＫ細胞をエフェクターとして、及びＩＣＯＳトランスフェクトＣＣＦＲ−ＣＥＭ細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１９)を標的細胞として使用して、Ｄｅｌｆｉａ  ＢＡＴＤＡ細胞傷害性アッセイ(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)において、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３  ｈＩｇＧ１のＡＤＣＣを介して殺滅する潜在性をさらに試験した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭは、急性リンパ芽球性白血病患者からの末梢血に由来するヒトＴリンパ芽球株である。このアッセイにおいて、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の両方について、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の抗体媒介性殺滅が確認された。
【０４６６】
材料及び方法
材料及び方法は、実施例１０ａに記載される通りであったが、ＭＪ細胞ではなく、ＡＴＣＣ(ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９)から得たＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を標的細胞として使用し、４時間のインキュベーション時間を使用した。
【０４６７】
ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞をＩＣＯＳでトランスフェクトした。哺乳動物発現についてコドン最適化された全長ヒトＩＣＯＳ(添付の配列表に示されるようにシグナルペプチドを有する)をコードする合成ＤＮＡ列を、ＣＭＶプロモーターの制御下で、３’及び５’  ｐｉｇｇｙＢａｃ特異的末端反復配列に隣接した発現ベクターにクローニングし、細胞ゲノム内への安定した組込みを容易にした(［４０］を参照されたい)。発現ベクターは、安定した細胞株生成を容易にするために、ピューロマイシン選択カセットを含有した。ヒトＩＣＯＳ発現プラスミドを、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードするプラスミドと共に、電気穿孔によってＣＥＭ  ＣＣＲＦ細胞内に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、培地にピューロマイシンを補充し、培地を３〜４日ごとに交換しながら少なくとも２週間成長させて、安定した細胞株を選択した。抗ヒトＩＣＯＳ−ＰＥに接合された抗体(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)を使用してフローサイトメトリーによってヒトＩＣＯＳの発現を評価した。完全ＣＥＭ培地は、１０％(ｖ/ｖ)ＦＢＳ及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍで構成された。
【０４６８】
ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)、ＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)、及びそれらのアイソタイプ対照抗体(ＨＣ  ＩｇＧ１)を、アッセイ培地中で連続希釈して、２０μｇ/ｍＬ〜８０ｐｇ/ｍＬの範囲の最終４Ｘ抗体濃度を得た。
【０４６９】
５０μｌの希釈したＡｂ、５０μｌのＢＡＴＤＡ担持ＩＣＯＳトランスフェクトＣＥＭ細胞、５０μｌのＮＫ細胞、及び５０μＬのアッセイ培地(２００μｌ/ウェルの最終体積)を各ウェルに添加して、５μｇ/ｍＬ〜２０ｐｇ/ｍＬの範囲の最終Ａｂ濃度及び５：１のエフェクター：標的比を得た。
【０４７０】
結果
ＳＴＩＭ００１(ｈＩｇＧ１)及びＳＴＩＭ００３(ｈＩｇＧ１)は、４時間時点で測定した初代ＮＫ依存性ＡＤＣＣアッセイにおいてＩＣＯＳトランスフェクトＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を殺滅した。結果は、図６(ｅ〜ｇ)及び以下の表に示される。
【表１１】
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【０４７１】
実施例１１ａ：ＣＴ２６同系モデル
抗ＩＣＯＳ(ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ、エフェクター可能化)を抗ＰＤＬ１(１０Ｆ９Ｇ２)と組み合わせることによって、ＣＴ２６同系モデルにおいて改善された抗腫瘍インビボ有効性が示された。
【０４７２】
材料及び方法
皮下ＣＴ２６結腸癌モデル(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２６３８)を使用して、Ｂａｌｂ/ｃマウスにおいて有効性試験を実施した。このモデルはＰＤ１/ＰＤＬ１遮断に対して感受性が乏しく、１０Ｆ９．Ｇ２(抗ＰＤＬ１)及びＲＭＴ１−１４(抗ＰＤ１)単独療法に応答して腫瘍成長遅延のみ(不変又は治癒なし)が通常認められる。したがって、このモデルは、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１に固有の抵抗性を考察するための関連モデルとなる。ＵＫ  Ａｎｉｍａｌ(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ)Ａｃｔ  １９８６及びＥＵ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６/６０９に従い、ＵＫ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｌｉｃｅｎｃｅ下で全てのインビボ実験を実施し、これは、Ｂａｂｒａｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏｄｙによって承認された。
【０４７３】
６〜８週齢及び＞１８ｇのＢａｌｂ/ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫによって供給され、特定病原体感染防止条件下で収容された。合計１×１０５個のＣＴ２６細胞(Ｐ２０未満の継代数)をマウスの左脇腹に皮下注射した。別途記載されない限り、腫瘍細胞注射後６日目に処置を開始した。Ａｃｃｕｔａｓｅ(Ｓｉｇｍａ)を使用してＣＴ２６細胞をインビトロで継代し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞生存率は、腫瘍細胞注射時に９０％を上回ることが確認された。
【０４７４】
インビボ研究のために、ＳＴＩＭ００１抗ＩＣＯＳアゴニスト(マウスＩＣＯＳタンパク質に対して交差反応性)をマウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａとして再フォーマット化して、同等エフェクター機能ヌル及び同等エフェクター機能可能をそれぞれ試験した。抗ＰＤＬ１は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ(Ｃａｔ．ｎｏ：１２４３２５)から供給された。ハイブリッド対照は、Ｋｙｍａｂ(ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ)から生成されたか、又は商業的供給源(ハムスターアイソタイプＨＴＫ８８８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ(Ｐａｒｔ  Ｎｏ９２２５７、Ｌｏｔ  Ｂ２１５５０４))からのものであった。単独療法として、又は抗ＰＤＬ１を抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせることによって、１０ｍｇ/ｋｇ(０．９％生理食塩水中１ｍｇ/ｍｌ)で、６日目から週に３回、全ての抗体を腹腔内(ＩＰ)投与した(６〜１８日目にかけて２週間の投与)。動物の体重及び腫瘍体積を腫瘍細胞注射の日から週に３回測定した。腫瘍体積は、修正された楕円式(ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａ)１/２(長さ×幅２)の使用によって計算された。マウスは、それらの腫瘍が１２ｍｍ３の平均直径に達するまで、又はまれに、腫瘍潰瘍の発生が認められる(福祉)まで、研究を続けた。５０日目に実験を停止した。ヒトエンドポイント生存統計は、Ｐｒｉｓｍを用いるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して計算した。このアプローチを使用して、特定の処置が生存の改善に関連付けられるかどうかを判定した。
【表１２】
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【０４７５】
結果
図７、図８、及び図９に示されるように、ＩＣＯＳアゴニストは、単独療法として、又は抗ＰＤＬ１と併用して、疾患進行を遅延させ、一定の割合の動物をＣＴ−２６皮下腫瘍から治癒させることができる。抗ＰＤＬ１単独療法は、腫瘍成長遅延を誘導したが、不変又は治癒の潜在性は認められなかった。併用は、腫瘍の治療において抗ＩＣＯＳ単独療法よりも有効であった。この研究はまた、このモデルにおいて抗腫瘍応答を引き起こすのに、マウスＩｇＧ２ａフォーマット(エフェクター機能可能化)のＳＴＩＭ００１がマウスＩｇＧ１(エフェクターヌル)フォーマットよりも強力であることを強調した。
【０４７６】
実施例１１ｂ：抗ＩＣＯＳ  ｍＩｇＧ２ａの抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａとの併用のためのＣＴ２６同系モデルにおけるインビボでの強い抗腫瘍有効性
ＡｂＷと呼ばれるマウス交差反応性抗ヒトＰＤＬ１抗体と共にＳＴＩＭ００１を用いてインビボ併用研究を実施した。このインビボ研究のために、ＳＴＩＭ００１をマウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２ａとして再フォーマット化して、その有効性を低エフェクター機能又は同等エフェクター機能可能化分子とそれぞれ比較した。抗ＰＤＬ１  ＡｂＷを同じフォーマット(マウスＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ２Ａ)で生成した。
【０４７７】
皮下ＣＴ２６結腸癌モデル(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２６３８)を使用して、Ｂａｌｂ/ｃマウスにおいて有効性試験を実施した。６〜８週齢及び＞１８ｇのＢａｌｂ/ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫによって供給され、特定病原体感染防止条件下で収容された。合計１ｘ１０Ｅ５個のＣＴ２６細胞(Ｐ２０未満の継代数)をマウスの右脇腹に皮下注射した。別途記載されない限り、腫瘍細胞注射後６日目に処置を開始した。ＴｒｙｐＬＥ(商標)Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)を使用してＣＴ２６細胞をインビトロで継代し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞生存率は、腫瘍細胞注射時に９０％を上回ることが確認された。
【０４７８】
腫瘍細胞移植後６日目から週に３回、ＳＴＩＭ００１及び抗ＰＤＬ１抗体を組み合わせて、各々２００μｇ(０．９％生理食塩水中１ｍｇ/ｍｌ)で同時に腹腔内(ＩＰ)投与した(６〜１７日目の間、２週間の投与)。腫瘍成長を監視し、アイソタイプ対照抗体(ｍＩｇＧ１及びｍＩｇＧ２Ａ)の混合物で処置した動物の腫瘍と比較した。動物の体重及び腫瘍体積を腫瘍細胞注射の日から週に３回測定した。腫瘍体積は、修正された楕円式１/２(長さ×幅２)の使用によって計算された。マウスは、それらの腫瘍が１２ｍｍ３の平均直径に達するまで、又はまれに、腫瘍潰瘍の発生が認められる(福祉)まで、研究を続けた。５０日目に実験を停止した。ヒトエンドポイント生存統計は、Ｐｒｉｓｍを用いるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して計算した。このアプローチを使用して、特定の処置が生存の改善に関連付けられるかどうかを判定した。
【表１３】
2019534892.tif 000016
【０４７９】
結果は、図１０に示される。全ての抗体の組合せは、アイソタイプ対照で処置した動物と比較したとき、処置した動物の腫瘍成長を遅延させ、生存期間(ヒトエンドポイントに達するまでの時間)を延長した。興味深いことに、抗ＰＤＬ１と組み合わせた場合(そのフォーマットｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２ａとは無関係に)、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ抗体は、腫瘍成長の阻害においてｍＩｇＧ１フォーマットのＳＴＩＭ００１よりも有効であった。これらのデータは、抗腫瘍有効性を最大化するエフェクター機能を有する抗ＩＣＯＳ抗体の利点を示す。特に、ａＰＤ−Ｌ１  ｍＩｇＧ２ａと組み合わせたＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａは、最も強い腫瘍有効性及び改善された生存期間を実証した(動物の９０％が応答を示し、６０％が６０日目に疾患から治癒した)。
【０４８０】
同様に、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ１及びｍＩｇＧ２ａを、単独療法として、又は抗ＰＤＬ１(ＡｂＷ)ｍＩｇＧ２ａと組み合わせて、同じＣＴ２６腫瘍モデルにおいて試験した。腫瘍細胞移植後６日目から週に３回、ＳＴＩＭ００１及び抗ＰＤＬ１抗体を組み合わせて、各々２００μｇ(０．９％生理食塩水中１ｍｇ/ｍｌ)で同時に腹腔内(ＩＰ)投与した(６〜１７日目の間、２週間の投与)。この実験では、腫瘍サイズを４１日間監視した。ヒトエンドポイント生存統計は、Ｐｒｉｓｍを用いるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して計算した。このアプローチを使用して、特定の処置が生存の改善に関連付けられるかどうかを判定した。
【表１４】
2019534892.tif 000017
【０４８１】
結果は、図１１に示される。ａＰＤＬ１(ＡｂＷ)及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａを使用する単独療法は、軽度の抗腫瘍活性を実証した(各群において１匹の動物が疾患から治癒した)。ａＰＤＬ１(ＡｂＷ)ｍＩｇＧ２ａとのＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ１又はｍＩｇＧ２ａの組合せは、強い抗腫瘍有効性を示した。興味深いことに、ａＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａと組み合わされた場合、４１日目までに、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａは、腫瘍成長の阻害においてＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ１よりも強力であった(それぞれ６０％対３０％の動物が疾患から治癒した)。このデータは、抗腫瘍有効性を最大化する抗ＩＣＯＳ抗体のエフェクターフォーマットの利点をさらに強調した。
【０４８２】
総じて、これらのデータは、抗ＰＤＬ１との抗ＩＣＯＳ抗体ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３の組合せは、両方の抗体がエフェクター可能化機能を有する場合に最も強い抗腫瘍応答をもたらすことを実証する。好適な対応するヒト抗体アイソタイプには、ヒトＩｇＧ１、任意選択で、さらに増強したエフェクター機能を有するもの、例えば、フコシル化されていないＩｇＧ１が含まれる。
【０４８３】
抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａ及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａで処置したマウス、及び個々の各薬剤のＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線は、図２９に示される。
【０４８４】
実施例１１ｃ：ＳＴＩＭ００３抗体の単一用量は、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)をリセットし、連続的な抗ＰＤ−Ｌ１投与と組み合わせて強い抗腫瘍有効性をもたらす
この研究では、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２Ａの単回対複数回投与を抗ＰＤＬ１抗体(ＡｂＷ)の複数回投与と比較した。このデータは、抗ＩＣＯＳ抗体の単一用量が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体がより大きい効果を発揮することを可能にするように腫瘍微小環境を改変し得る。これは、抗ＩＣＯＳ抗体によるＴＭＥの「リセット」として想定され得る。
【０４８５】
前と同様に、これらの皮下ＣＴ２６結腸癌モデル(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２６３８)を使用して、Ｂａｌｂ/ｃマウスにおいて有効性試験を実施した。６〜８週齢及び＞１８ｇのＢａｌｂ/ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫによって供給され、特定病原体感染防止条件下で収容された。合計１ｘ１０Ｅ５個のＣＴ２６細胞(Ｐ２０未満の継代数)をマウスの右脇腹に皮下注射した。別途記載されない限り、腫瘍細胞注射後６日目に処置を開始した。ＴｒｙｐＬＥ(商標)Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)を使用してＣＴ２６細胞をインビトロで継代し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清で補充したＲＰＭＩ中に再懸濁させた。細胞生存率は、腫瘍細胞注射時に９０％を上回ることが確認された。
【０４８６】
処置群は、表Ｅ１１−４に示される。１０ｍｇ/ｋｇ(０．９％生理食塩水中１ｍｇ/ｍｌ)で、ＳＴＩＭ００３及び抗ＰＤＬ１抗体を腹腔内(ＩＰ)投与した。腫瘍細胞移植後６日目から処置を開始した。腫瘍成長を監視し、生理食塩水で処置した動物の腫瘍と比較した。動物の体重及び腫瘍体積を腫瘍細胞注射の日から週に３回測定した。腫瘍体積は、修正された楕円式(ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａ)１/２(長さ×幅２)の使用によって計算された。マウスは、それらの腫瘍が１２ｍｍ３の平均直径に達するまで、又はまれに、腫瘍潰瘍の発生が認められる(福祉)まで、研究を続けた。５５日目に実験を停止した。
【０４８７】
データは、図３４に示される。６日目から６用量のＳＴＩＭ００３及び抗ＰＤＬ１の同時投与は、ＣＴ２６モデルにおいて強い抗腫瘍有効性をもたらし、５/８の動物が研究終了時(５５日目)に腫瘍がなくなった。興味深いことに、単独療法として、ＳＴＩＭ００３の単一用量に続く抗ＰＤＬ１の複数回用量により、同様の抗腫瘍有効性が達成された。抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＩｇＧ２ａと組み合わされた場合、ＳＴＩＭ００３を１回投与することと(Ｃ)６回投与することと(Ｂ)の間で同様の全体的な有効性が認められた。１匹の動物のみが自然発生腫瘍拒絶(このモデルではまれ)を有した生理食塩水処置分(Ａ)と比較した場合、組み合わされた薬物で処置された群は、実験の終了時(５５日目)までに動物の６２．５％において完全腫瘍拒絶を有した。このデータは、ＳＴＩＭ００３抗体を使用して腫瘍微小環境をリセットすることができること、及び抗体が免疫チェックポイント抵抗性腫瘍を抗ＰＤＬ１に対して感受性にさせることを示す。先に示されたように(実施例１１ｂ)、ＣＴ２６腫瘍細胞株は、抗ＰＤＬ１単独療法に対して強く応答性ではない。ＳＴＩＭ００３は、抗ＰＤＬ１療法の抗腫瘍活性を促進させる変化を引き起こすと考えられる。
【０４８８】
実施例１２：抗体配列分析
抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、ＳＴＩＭ００２−Ｂ、ＳＴＩＭ００３、ＳＴＩＭ００４、ＳＴＩＭ００５、ＳＴＩＭ００６、ＳＴＩＭ００７、ＳＴＩＭ００８、及びＳＴＩＭ００９のフレームワーク領域をヒト生殖細胞系遺伝子セグメントと比較して、最も近い一致を同定した。表Ｅ１２−１及び表Ｅ１２−２を参照されたい。
【表１５】
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【表１６】
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【０４８９】
実施例３に記載される免疫付与したマウスから分取したさらなるＩＣＯＳ特異的細胞からのＰＣＲ増幅抗体ＤＮＡの次世代配列決定によってさらなる抗体配列を得た。これは、それらの重鎖及び軽鎖ｖ及びｊ遺伝子セグメント並びにＣＤＲ３の長さに基づき、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、又はＳＴＩＭ００３と共に群分けしてクラスター化され得る多数の抗体を同定した。ＣＬ−６１０９１はＳＴＩＭ００１とクラスター化され、ＣＬ−６４５３６、ＣＬ−６４８３７、ＣＬ−６４８４１、及びＣＬ−６４９１２はＳＴＩＭ００２とクラスター化され、ＣＬ−７１６４２及びＣＬ−７４５７０はＳＴＩＭ００３とクラスター化された。抗体ＶＨ及びＶＬドメインの配列アライメントは、図３５〜３７に示される。
【表１７】
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【０４９０】
実施例１３：ビーズ結合抗体によるＩＣＯＳ発現ＭＪ細胞のアゴニズム
抗体ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、及びＳＴＩＭ００３、抗ＩＣＯＳ抗体Ｃ３９８．４Ａ、並びにＩＣＯＳリガンド(ＩＣＯＳＬ−Ｆｃ)をビーズと各々共有結合させ、培養中で成長させたＭＪ細胞からのサイトカインＩＦＮ−γの発現を誘導するそれらの能力について評価した。ビーズに結合したヒトＩｇＧ１及びクローンＣ３９８．４Ａアイソタイプ対照を並行して評価した。
【０４９１】
データは、以下の図１２及び表Ｅ１３に示される。
【０４９２】
抗ＩＣＯＳ抗体は各々、このアッセイにおいてアゴニズムを実証し、アッセイのダイナミックレンジ内のそれらの同起源のアイソタイプ対照によって認められたものを有意に上回るＩＦＮ−γ定量化によって判定されるようにＭＪ細胞を刺激した。
【０４９３】
ＳＴＩＭ００３及びクローンＣ３９８．４Ａは、ＳＴＩＭ００１(上位９５％ＣＩ：７．２１〜８．８８及びＬｏｇＥＣ５０  ９５％ＣＩ：−８．８２〜−８．６３)及びＳＴＩＭ００２(上位９５％ＣＩ：５．３８〜６．９５及びＬｏｇＥＣ５０  ９５％ＣＩ：−９．００〜−８．７４)と比較して、より低い上位漸近線値(それぞれ９５％ＣＩ：３．７９〜５．１３及び３．０７〜４．２２)を生成したが、より強力なＬｏｇＥＣ５０値(それぞれ９５％ＣＩ：−９．４０〜−９．１１及び９．５６〜−９．２３)を生成した。ＩＣＯＳＬ−Ｆｃ及びＣ３９８．４Ａアイソタイプ対照について不完全な曲線(上位がアッセイのダイナミックレンジ外)が生成されたため、適合した上位及びＬｏｇＥＣ５０値は、信頼できるものとして扱われなかった。ヒトＩｇＧ１ハイブリッド対照は完全な曲線を生成したが、曲線下の領域は０と有意に異ならなかったため、アゴニストと見なされなかった。
【表１８】
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【０４９４】
ＭＪ細胞活性化アッセイ材料及び方法−ビーズ結合
目的のタンパク質の磁性粒子への結合
抗ＩＣＯＳ抗体、対照抗体、及びＩＣＯＳＬ−Ｆｃを以下のようにビーズに結合させた。
【０４９５】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、約２×１０＾８ビーズ/試料)を１００μｇの各タンパク質試料と共に室温で一晩、撹拌しながらインキュベートした。ビーズをＤＰＢＳ(Ｇｉｂｃｏ)で３回洗浄し、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ(ｐＨ８．０)(ＵｌｔｒａＰｕｒｅ(商標)、Ｇｉｂｃｏ)と共に室温で１時間、撹拌しながらインキュベートして、未結合の反応部位を遮断した。再度ビーズをＤＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｌのＤＰＢＳ/試料中で最終的に再懸濁させた。
【０４９６】
次いで、ビーズ上の目的の各タンパク質の量を以下のように判定した。黒色平底の高結合ＥＬＩＳＡプレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ)を、ＤＰＢＳ中４μｇ/ｍｌ、５０μｌ/ウェルで、抗ヒトＩｇＧ(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ)又は抗アルメニアンハムスターＩｇＧ(Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)捕捉抗体によって４℃で一晩コーティングした。次いで、２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎでウェルを洗浄し、２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ＋１％  ＢＳＡで、室温で１時間遮断した。再度ウェルをＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ストックタンパク質試料を分光測定により定量化し、ビーズを細胞カウンターで計数した。次いで、タンパク質試料及びビーズの希釈系列を５０μｌ/ウェルで、室温で１時間プレート中でインキュベートした後、再度ＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ＤＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡ中の、５０μｌ/ウェルのビオチニル化抗アルメニアンハムスター抗体又は抗ヒトＩｇＧ−ユーロピウムのいずれかを添加し、室温で１時間インキュベートした。ビオチニル化アルメニアンハムスター抗体Ｃ３９８．４Ａを添加した場合、アッセイ緩衝液(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)中で１：５００に希釈された５０μｌ/ウェルのストレプトアビジン−ユーロピウム(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)との別のインキュベーションステップを追加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを２００μｌ/ウェルのＴＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、５０μｌ/ウェルのＤｅｌｆｉａ増強溶液(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)の添加、室温で１０分間のインキュベーション、及びＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ上で６１５ｎｍで発光した蛍光を測定することによってアッセイを進めた。未結合タンパク質試料の既知の濃度から得られたシグナルからの値を外挿することによって、ビーズ上のタンパク質の量を判定した。
【０４９７】
ＭＪ細胞インビトロ活性化アッセイ−ビーズ結合
２０％の熱不活性化ＦＢＳで補充したＩＭＤＭ(Ｇｉｂｃｏ又はＡＴＣＣ)中で、ＭＪ［Ｇ１１］細胞株(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４)を成長させた。細胞を計数し、１５０００細胞/ウェル(５０μｌ/ウェル)の細胞懸濁液を９６ウェルの透明平底ポリスチレン滅菌ＴＣ処理マイクロプレートに添加した。ビーズを計数し、１．５×１０＾６ビーズ/ウェル〜約５８６０ビーズ/ウェル(５０μｌ/ウェル)の範囲の連続１：２希釈を二連又は三連で細胞に添加した。バックグラウンドを説明するために、プレートのいくつかのウェルは、ＭＪ細胞のみ(１００μｌ/ウェル)を含有した。細胞及びビーズをプレート中で、３７℃及び５％ＣＯ２で３日間共培養した後、遠心分離によって上清を採取し、ＩＦＮ−γ含量判定のために回収した。
【０４９８】
ＩＦＮ−γレベルの測定
Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット(Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ)の修正を使用して、各ウェル中のＩＦＮ−γ含量を判定した。黒色平底高結合プレート(Ｇｒｅｉｎｅｒ)上で、捕捉抗体(５０μｌ/ウェル)をＤＰＢＳ中４μｇ/ｍｌで一晩コーティングした。ウェルを２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ウェルを２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ(ｗ/ｖ)中１％  ＢＳＡで遮断し、２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで、５０μｌ/ウェルの、ＲＰＭＩ中のＩＦＮ−γ標準溶液又は未希釈の細胞上清のいずれかを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ＤＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡ中で５０μｌ/ウェルのビオチニル化検出抗体を２００ｎｇ/ｍｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、アッセイ緩衝液(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)中で１：５００に希釈された、５０μｌ/ウェルのストレプトアビジンユーロピウム(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)を２００ｎｇ/ｍｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを２００μｌ/ウェルのＴＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、５０μｌ/ウェルのＤｅｌｆｉａ増強溶液(Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ)の添加、室温で１０分間のインキュベーション、及びＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ上で６１５ｎｍで発光した蛍光を測定することによってアッセイを進めた。
【０４９９】
データ分析
各ウェルのＩＦＮ−γ値を標準曲線から内挿し、細胞のみのウェルからの平均バックグラウンドレベルを減算した。次いで、バックグラウンド修正値をＧｒａｐｈＰａｄプリズムに使用して、４パラメータログロジスティック濃度反応曲線を適合させた。
【０５００】
実施例１４：プレート結合抗体によるＩＣＯＳ発現ＭＪ細胞のアゴニズム
ＩＣＯＳ発現Ｔ細胞のアゴニズムのための代替的なアッセイは、プレート結合フォーマットの抗体を使用する。
【０５０１】
ＭＪ細胞活性化アッセイ材料及び方法−プレート結合
抗体コーティング：９６ウェルの平らな滅菌高結合プレート(Ｃｏｓｔａｒ)を、ＤＰＢＳ(Ｇｉｂｃｏ)中で、１００μｌ/ウェルの目的のタンパク質(抗ＩＣＯＳ抗体、対照抗体、及びＩＣＯＳＬ−Ｆｃ)の連続１：２希釈によって１０μｇ/ｍｌ〜０．０２μｇ/ｍｌの範囲で二連又は三連で、４℃で一晩コーティングした。バックグラウンドを説明するために、プレートのいくつかのウェルは、ＤＰＢＳのみでコーティングした。プレートを２００μｌ/ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を添加した。
【０５０２】
細胞刺激：２０％の熱不活性化ＦＢＳで補充したＩＭＤＭ(Ｇｉｂｃｏ又はＡＴＣＣ)中で、ＭＪ［Ｇ１１］細胞株(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４)を成長させた。細胞を計数し、１５０００細胞/ウェル(１００μｌ/ウェル)の細胞懸濁液を、タンパク質でコーティングされたプレートに添加した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で３日間培養した。細胞を遠心分離によって培地から分離し、ＩＦＮ−γ含量判定のために上清を回収した。
【０５０３】
ＩＦＮγレベルの測定及びデータ分析は、実施例１３に記載の通りであった。
【０５０４】
結果
結果は、図１３及び表Ｅ１４−１に示される。要約すると、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、及びＳＴＩＭ００３は全て、ＩＦＮ−γ分泌によって測定される強力なアゴニズムを示し、同様のＬｏｇＥＣ５０値(それぞれＬｏｇＥＣ５０  ９５％ＣＩ：−７．７６〜−７．６４、−７．７９〜−７．７０、及び７．８２〜−７．７３)及び上位値(それぞれ上位９５％ＣＩ：２．０６〜２．５４、２．４４〜２．９３、及び２．０１〜２．４１)を有した。クローンＣ３９８．４Ａは、同様のＬｏｇＥＣ５０値(ＬｏｇＥＣ５０  ９５％ＣＩ：−７．７８〜−７．６０)を示したが、ＳＴＩＭ００１〜ＳＴＩＭ００３よりも低い上位値(上位９５％ＣＩ：１．２２〜１．６３)を示した。ＳＴＩＭ００４も、このアッセイにおいてアゴニズムを示したが、より強力ではなく、中等度の上位値(上位９５％ＣＩ：０．１６〜０．８２)に達し、同様のＬｏｇＥＣ５０値(ＬｏｇＥＣ５０  ９５％ＣＩ：−７．９１〜−７．２１)を有した。ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００２、及びＳＴＩＭ００３は、ＩＣＯＳＬ−Ｆｃ(ＬｏｇＥＣ５０  ９５％ＣＩ：−７．８５〜−７．３１及び上位９５％ＣＩ：０．８７〜２．４５)よりも強いアゴニストであった。
【表１９】
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【０５０５】
実施例１５：可溶性形態の抗体によるＩＣＯＳ発現ＭＪ細胞のアゴニズム
固体表面上に配列した抗体を使用した実施例１３及び実施例１４に記載されるアッセイとは対照的に、この阿世知は、可溶性形態の抗体がＩＣＯＳ発現Ｔ細胞のアゴニストとして働くかどうかを判定する。
【０５０６】
ＭＪ細胞活性化アッセイ材料及び方法−可溶性
２０％の熱不活性化ＦＢＳで補充したＩＭＤＭ(Ｇｉｂｃｏ又はＡＴＣＣ)中で、ＭＪ［Ｇ１１］細胞株(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４)を成長させた。細胞を計数し、１５０００細胞/ウェル(５０μｌ/ウェル)の細胞懸濁液を９６ウェルの透明平底ポリスチレン滅菌ＴＣ処理マイクロプレートに添加した。単独の、又は架橋試薬(ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ(ａｂ’)２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)を添加した、１０μｇ/ｍｌ〜０．０１９５３１２５μｇ/ｍｌの範囲の目的のタンパク質の連続１：２希釈を二連又は三連で細胞に添加した(５０μｌ/ウェル)。バックグラウンドを説明するために、プレートのいくつかの壁は、ＭＪ細胞のみ(１００μｌ/ウェル)を含有した。細胞及びビーズをプレート中で、３７℃及び５％ＣＯ２で３日間共培養した後、遠心分離によって上清を採取し、ＩＦＮ−γ含量判定のために回収した。
【０５０７】
ＩＦＮγレベルの測定及びデータ分析は、実施例１３に記載の通りであった。
【０５０８】
結果
ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００２はいずれも、ヒトＩｇＧ４．ＰＥハイブリッド対照と比較したＩＦＮ−γ分泌によって測定される有意な可溶性アゴニズムを示した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  Ｆ(ａｂ’)２断片を介したＭＡｂ架橋は、分泌ＩＦＮ−γレベルをより一層増加させた。
【０５０９】
実施例１６：活性化Ｔ細胞への抗体の結合
Ａ．ヒトＩＣＯＳ
抗ＩＣＯＳ抗体がその天然状況において活性化初代ヒトＴ細胞の表面上でＩＣＯＳ細胞外ドメインを認識する能力をこのアッセイで確認する。
【０５１０】
汎Ｔ細胞(ＣＤ３細胞)を単離し、ＣＤ３/ＣＤ２８ダイナビーズ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)を用いて３日間培養して、それらの表面上でＩＣＯＳ発現を誘導した。２つの方法、すなわち、事前標識した抗体(ＡＦ６４７と直接接合した抗体)の直接結合後の検出によって、又は二次ＡＦ６４７ヤギ抗ヒトＦｃ抗体の使用によって間接的に、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びｈＩｇＧ１ハイブリッド対照(ＨＣ  ＩｇＧ１)の表面染色を判定した。染色した細胞をＡｔｔｕｎｅ上で泳動し、染色強度が平均蛍光強度(ＭＦＩ)として提示された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０を判定した。
【０５１１】
結果は、図１４に示される。いったん活性化されると、汎ＣＤ３  Ｔ細胞は、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３  ｈＩｇＧ１の両方によって明確に染色された。特に、活性化Ｔ細胞へのＳＴＩＭ００３結合の飽和は、ＳＴＩＭ００１よりも低い濃度で生じ、これは、ヒトＩＣＯＳに対するＳＴＩＭ００３のより高い親和性を示す。ＳＴＩＭ００３のＥＣ５０は、ＳＴＩＭ００１よりもおよそ１００倍低かった(間接結合アッセイについて、０．１４８ｎＭ対１７ｎＭ)。
【０５１２】
Ｂ．非ヒト霊長類由来のＩＣＯＳ
抗ＩＣＯＳ抗体がその天然状況において非ヒト霊長類(ＨＨＰ)由来の活性化初代Ｔ細胞の表面上でＩＣＯＳ細胞外ドメインを認識する能力をこのアッセイで確認する。
【０５１３】
２匹のモーリシャスカニクイザル(Ｗｉｃｋｈａｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)の全血由来のＰＢＭＣを勾配遠心分離によって単離し、ＣＤ２/ＣＤ３/ＣＤ２８  ＭＡＣＳｉＢｅａｄｓ(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ)を用いて３日間培養して、それらの表面上でＩＣＯＳ発現を誘導した。ＡＦ６４７で事前標識した抗体(８０μｇ〜８ｐｇ/ｍｌ)の直接結合後に、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及びｈＩｇＧ１ハイブリッド対照(ＨＣ  ＩｇＧ１)の表面染色を判定した。Ｔ細胞サブセット上の染色を評価するために、細胞をＶ４５０−ＣＤ３でも標識した。染色した細胞をＡｔｔｕｎｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)上で泳動し、染色強度が平均蛍光強度(ＭＦＩ)として提示された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してＥＣ５０を判定した。
【０５１４】
結果は、図２８に示される。いったん活性化されると、Ｔ細胞は、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３  ｈＩｇＧ１の両方によって明確に染色された。ヒトＴ細胞への結合で認められたように、活性化ＮＨＰ  Ｔ細胞へのＳＴＩＭ００３結合の飽和は、ＳＴＩＭ００１よりも低い濃度で生じ、これは、ＳＴＩＭ０００３がこれらの２つの抗体ＩＣＯＳのより高い親和性を有することを示す。ＮＨＰ  ＩＣＯＳへの結合のＥＣ５０値は、ヒトＩＣＯＳへの結合について得られたものと同様であった。
【表２０】
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【０５１５】
実施例１７：腫瘍浸潤リンパ球及び末梢Ｔ細胞間のＴ細胞亜集団の分析
薬力学研究により、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプの抗ＩＣＯＳ抗体ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３が、であることがＴＲｅｇを著しく枯渇させ、ＣＤ４＋エフェクター細胞のパーセンテージを増加させ、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)内のＣＤ４＋エフェクター/ＴＲｅｇ比及びＣＤ８＋/ＴＲｅｇ比を増加させることが明かされた。
【０５１６】
ＴＭＥ内のＣＤ８＋/ＴＲｅｇ比の増加及びＣＤ４＋エフェクター細胞の数の増加は合わせて、ＳＴＩＭ００１＆ＳＴＩＭ００３有効性研究(実施例１１)のいてこれらの抗ＩＣＯＳ抗体を抗ＰＤＬ１抗体と同時注射したときに認められたＣＴ２６腫瘍クリアランスに寄与する。
【０５１７】
方法
薬力学研究を、ＣＴ−２６マウス結腸癌細胞(ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２６３８)を保有する雌のＢａｌｂ/ｃマウスで行った。Ｂａｌｂ/ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫから供給され、６〜８週齢、１８ｇ超であり、特定の病原体のない条件下で飼育された。合計１×１０Ｅ５のＣＴ−２６腫瘍細胞(継代数：Ｐ８)を右脇腹に皮下注射した。全てのＣＴ−２６腫瘍保有動物を６群に割り当て(表Ｅ１７−１)、個々のマウスに２００μｇの抗体又は生理食塩水を２回(腫瘍細胞移植後１３日目及び１５日目に)投与した。ＣＴ−２６腫瘍保有動物由来のＣＤ３＋  Ｔ細胞を、腫瘍細胞移植から１６日目にＦＡＣＳにより分析した。
【表２１】
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【０５１８】
結果
ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ中のＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３で処置した動物は、生理食塩水処置群(図１５Ａ)と比較した場合、腫瘍部位でのＣＤ４＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージが低かったが、ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３処置による腫瘍部位でのＣＤ８＋  ＣＤ３＋  ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの影響は、極めて僅かであった(図１５Ｂ)。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の減少は、ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３抗体で処置した全ての群におけるＴ制御性細胞のパーセンテージの著しい減少に起因し得る。とりわけ、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ中のＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３で処置した動物は、ＴＭＥ内のＴ−Ｒｅｇ(ＣＤ４＋  Ｆｏｘｐ３＋  ＣＤ２５＋)の劇的な減少を示したが、ｍＩｇＧ１アイソタイプ中のＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３は、ＴＭＥ中のＴ−Ｒｅｇ含有量にひかえめに影響しただけであった。加えて、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ中のＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３で処置した動物は、Ｔ−Ｒｅｇを枯渇させることが知られている［４２］市販の抗ＣＴＬＡ−４(９Ｈ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ＃１０６２０８)抗体で処置した動物と比較してＴＭＥ中のＴ−Ｒｅｇが減少したが、この結果は統計学的有意性に達しなかった(図１５Ｃ)。Ｔ−Ｒｅｇコンパートメントに対するｍＩｇＧ１アイソタイプ又はｍＩｇＧ２ａアイソタイプのいずれかにおけるＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３の効果は、腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)でより特異的であった。末梢にＴ−ｒｅｇ枯渇は観察されなかった(抗ＣＴＬＡ４について以前に記載された通り［４３］)(図１５Ｄ)。Ｔ−Ｒｅｇ含有量の変化はまた、腫瘍内ＣＤ４エフェクター細胞(ＣＤ４＋  Ｆｏｘｐ３−ＣＤ２５−)のパーセンテージを有意に増加させ(図１５Ｅ)、同様に、ｍＩｇＧ２ａ中のＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３で処置した動物におけるＣＤ４エフェクター/Ｔ−Ｒｅｇ比及びＣＤ８/Ｔ−Ｒｅｇ比も、ＴＭＥ内で有意に増加した(図１５Ｆ及び図１５Ｇ)。
【０５１９】
実施例１８：ＣＴ２６腫瘍及び脾臓におけるＩＣＯＳ発現Ｔ細胞のレベルに対する抗ＩＣＯＳ抗体の効果
抗ＩＣＯＳ抗体ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３で処置した後、腫瘍及び脾臓組織中の全免疫細胞を分析することによって、脾臓と比較した腫瘍内の免疫細胞のパーセンテージを定量するための分析を行った。ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの各々は、腫瘍内のＴｒｅｇの有意な減少を引き起こしたが、脾臓においてそれを引き起こすことはなかったため、腫瘍選択的効果が示された。この枯渇は、他のＴ細胞サブタイプと比較してＴｒｅｇに対して選択的であった。ここに示した結果により、ＳＴＩＭ抗体の免疫構造に対する効果についての理解が助けられ、エフェクター機能に対応するＦｃ領域を有する抗ＩＣＯＳ抗体がＴＲｅｇを強力に枯渇させ得ることが確認される。
【０５２０】
材料及び方法
ＣＴ２６腫瘍を保有するマウスに、ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、又は抗ＣＴＬＡ４抗体(９Ｈ１０)を２回投薬した。抗ＣＴＬＡ４抗体は腫瘍中のＴｒｅｇを選択的に減少させることが以前に示されていたので、これをＴｒｅｇ枯渇の陽性対照として含めた［４３］。
【０５２１】
腫瘍内の免疫構造及び処置動物の脾臓を組織解離後にＦＡＣＳによって分析した。
【０５２２】
この研究で用いたＦＡＣＳ抗体の詳細を表Ｅ１８に示す。全てのＦＡＣＳ抗体は、供給業者が推奨する濃度で使用した。Ａｔｔｕｎｅ  ＮｘＴフローサイトメーターを用いてＦＡＣＳデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを分析した。
【表２２】
2019534892.tif 000025
【０５２３】
結果
ＣＴ２６腫瘍及び腫瘍保有動物の脾臓においてＩＣＯＳ発現を測定した。ＩＣＯＳタンパク質を発現する腫瘍浸潤免疫細胞のパーセンテージの増加が観察され(図２０)、これにより、腫瘍中の免疫細胞が、末梢における免疫細胞よりも頻繁にＩＣＯＳ発現に対して陽性であることが示される。未処置動物の腫瘍におけるＴＲｅｇは、ＩＣＯＳ発現についてほぼ全て(９０％超)陽性であったが、腫瘍中のＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は陽性ではなかった(約６０％)。腫瘍中のＴ細胞亜集団(ここでも未処置マウスにおいて)を脾臓のものと比較すると、脾臓におけるＴｒｅｇｓと比較して有意に高い(ｐ＜０．０００１)パーセンテージの腫瘍内ＴｒｅｇがＩＣＯＳ陽性であり、脾臓におけるＣＤ４＋  Ｔｅｆｆ細胞と比較して有意に高い(ｐ＜０．００１)パーセンテージの腫瘍内ＣＤ４  ＋  Ｔｅｆｆ細胞がＩＣＯＳ陽性であった。
【０５２４】
処置前のマウスでも、ＣＴ２６腫瘍の微小環境における免疫細胞では、脾臓における免疫細胞と比較して、ＩＣＯＳ発現のレベルがはるかに高かった(図２１)。腫瘍微小環境において分析された全ての免疫細胞サブセット(ＣＤ８  Ｔ−エフェクター、ＣＤ４  Ｔ−エフェクター、及びＣＤ４/ＦｏｘＰ３  ＴＲｅｇ細胞)の表面上でＩＣＯＳ発現が増加した。腫瘍及び脾臓の免疫細胞は両方ともＩＣＯＳを発現しているが、腫瘍の免疫細胞は、脾臓の細胞(より低いＭＦＩによって示される、図２１)よりも有意に大きくＩＣＯＳを発現している(より高いＭＦＩによって示される、図２１)。重要なことに、腫瘍中のＴＲｅｇは、以前報告されているように［１１］、最高レベルのＩＣＯＳを発現している。
【０５２５】
ＣＴ２６腫瘍保有動物を、２用量の抗体ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３、及び抗ＣＴＬＡ−４抗体で処置した。ＳＴＩＭ抗体は、ｍＩｇＧ１フォーマット又はｍＩｇＧ２フォーマットのいずれかで使用された場合、腫瘍中のＣＤ４５陽性細胞(免疫細胞に対するマーカー)全体のパーセンテージに影響を与えなかった。これらの抗体による処置は、ＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ８エフェクターＴ細胞のパーセンテージに有意に影響しなかった(図２２)。ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ中のＳＴＩＭ００１を用いた処置により、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の有意な(ｐ＜０．０５)枯渇が導かれたが、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ１、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ１、及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａのいずれも、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞のパーセンテージに影響しなかった。
【０５２６】
抗ＣＴＬＡ−４処置により、ＴＭＥ中のＣＤ４５＋細胞及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の著しい(統計的に有意ではないが)増加が生じたが、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞には影響しなかった(図２２)。
【０５２７】
ＳＴＩＭ抗体は、腫瘍中の制御性Ｔ細胞に有意に影響した。図２３に示されるように、ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａは、腫瘍微小環境におけるＴＲｅｇ(ＩＣＯＳ発現について高い)を有意で選択的に枯渇させた。興味深いことに、抗ＣＴＬＡ４抗体は、この実験においてＴＲｅｇ枯渇の陽性対照として含まれているにもかかわらず、枯渇ＴＲｅｇを枯渇させることにおいてＳＴＩＭ  ｍＩｇＧ２ａ抗体よりも効果的ではなかった。
【０５２８】
この選択的なＴＲｅｇの枯渇により、腫瘍におけるＣＤ８エフェクターＴ細胞のＴＲｅｇに対する比の増加、及び腫瘍におけるＣＤ４エフェクターＴ細胞のＴＲｅｇに対する比の増加がもたらされ、これらは両方とも抗腫瘍免疫に有利であるはず。比のデータを図２４に示す。
【０５２９】
ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａによる腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇とは対照的に、脾臓におけるＴｒｅｇに対しては、そのような効果は観察されなかった(図２５、図２６、図２７)。これは、抗ＩＣＯＳ抗体のＴｒｅｇ枯渇の枯渇に対する効果が全組織における全身的なものではなかったことを示している。そのような選択性は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの優先的枯渇が、抗腫瘍エフェクターＴ細胞の抑制を選択的に緩和しながら、体内の他の部位における副作用を最小限に抑えることができるため、患者の腫瘍の治療において治療用抗ＩＣＯＳ抗体にとって有利であり得る。したがって、抗ＩＣＯＳ抗体は、治療を制限する自己免疫有害事象を引き起こし得るより幅広いＴ細胞応答の望ましくない活性化のリスクが低い、免疫系における抗腫瘍応答を促進し得る。
【０５３０】
実施例１９：抗体安定性
ＳＴＩＭ００３ヒトＩｇＧ１を、保存、凍結/解凍、及び精製中の安定性について試験すると、全ての試験条件下でその安定性が維持されることが判明した。凝集％をＨＰＬＣによって判定した。
【０５３１】
緩衝液(１０ｍＭのリン酸ナトリウム、４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０)中、４℃で３ヶ月間保存した後の単量体のパーセンテージ(９９％)に有意な変化はなかった。
【０５３２】
熱変性試験では、全ての試料(ｎ＝１５)が、同じＴｍを有し(アリコート間の有意差なし)、同等の熱変性曲線を有した。
【０５３３】
３サイクルの凍結及び解凍後、Ｔｍ(約７０．３℃)、単量体のパーセンテージ、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のプロファイルに有意な変化はなかった。
【０５３４】
室温で７日間保存した後、Ｔｍ(約７０．３℃)、単量体のパーセンテージ、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のプロファイルに有意な変化はなかった。
【０５３５】
タンパク質Ａ精製後、回収率は９０％であった。
【０５３６】
実施例２０：マウスにおけるＡ２０腫瘍増殖に対する抗ＩＣＯＳ  Ａｂの単剤療法効果
抗ＩＣＯＳ抗体ＳＴＩＭ００１  ｍＩｇＧ２ａ及びＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａは、各々、マウスＡ２０同系モデルにおけるインビボでの単剤療法として使用された場合、強い抗腫瘍効果を示した。
【０５３７】
材料及び方法
有効性試験は、皮下Ａ２０細網細胞肉腫モデル(ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０８)を使用してＢＡＬＢ/ｃマウスで行った。Ａ２０細胞株は、古いＢＡＬＢ/ｃＡｎＮマウスに見られる自然発生細網細胞腫瘍に由来するＢＡＬＢ/ｃ  Ｂ細胞リンパ腫株である。この細胞株は、ＩＣＯＳＬに対して陽性であると報告されている。
【０５３８】
ＢＡＬＢ/ｃマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫから供給され、１８ｇ超であり、特定の病原体のない条件下で飼育された。合計５ｘ１０ｅ５のＡ２０腫瘍細胞(Ｐ２０未満の継代数)をマウスの右脇腹に皮下注射した。Ａ２０細胞をインビトロで継代し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩに再懸濁した。細胞生存率は、腫瘍細胞注入時に８５％を上回ることが確認された。別途記載されない限り、抗体又はアイソタイプ投与は、腫瘍細胞注射後８日目から開始した。
【０５３９】
ＳＴＩＭ００１及びＳＴＩＭ００３抗ＩＣＯＳ抗体を、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプフォーマットで生成た。マウス交差反応性抗ＰＤ−Ｌ１抗体(ＡｂＷ)も同じアイソタイプフォーマット(マウスＩｇＧ２ａ)で生成した。ＳＴＩＭ００１、ＳＴＩＭ００３、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、腫瘍細胞移植後８日目から開始して週２回(８〜２９日目の３週間投薬)、各抗体２００μｇで腹腔内(ＩＰ)投与した。動物の体重及び腫瘍体積を、腫瘍細胞注射の日から週３回測定した。腫瘍体積は、修正された楕円の方程式１/２(長さ×幅２)を使用して計算した。腫瘍が平均直径１２ｍｍに達するまでマウスを研究し続けた。腫瘍細胞移植後４３日目に実験を中止した。腫瘍増殖をモニタリングし、アイソタイプ対照(ｍＩｇＧ２ａ)抗体で処置した動物の腫瘍と比較した。処置群を以下の表Ｅ２０に示す。
【表２３】
2019534892.tif 000026
【０５４０】
結果
Ａ２０腫瘍モデルにおいてＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３(ｍＩｇＧ２ａ)の単剤療法を施すことで、完全な抗腫瘍応答が生じた(図３２、図３３)。ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３のいずれかを投与した全動物の疾患が治癒した。これは、アイソタイプ対照及びＰＤ−Ｌ１  ｍＩｇＧ２ａ群の結果と対照的である(図３０、図３１)。まれなケースでは、アイソタイプ対照(自然退行)及び抗ＰＤＬ−１群において数匹の動物で腫瘍の退行が観察されたが、抗ＩＣＯＳ抗体を用いた処置では、有意により大きな有効性が生じた。試験の最後では、８匹の対照動物のうち３匹及び８匹の抗ＰＤＬ−１処置動物のうち２匹が腫瘍を有していなかった。しかしながら、ＳＴＩＭ００１又はＳＴＩＭ００３のいずれかで処置した全ての動物が試験の最後に腫瘍がなく(両方の群で８匹のマウスのうち８匹)、抗ＩＣＯＳ抗体を使用して１００％の治癒が示された。
【０５４１】
実施例２１：抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せに関するＪ５５８骨髄腫同系モデルにおけるインビボでの強力な抗腫瘍効果
抗ＩＣＯＳ抗体ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＡｂＷ  ｍＩｇＧ２ａを、Ｊ５５８腫瘍モデルにおいて、個別に及び組み合わせて投与した。これは骨髄腫の同系マウスモデルである。抗ＩＣＯＳ抗体は、単剤療法として、又は抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせて投与した場合、腫瘍増殖を阻害することが分かった。
【０５４２】
材料及び方法
皮下Ｊ５５８形質細胞腫：骨髄腫細胞株(ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−６)を使用して、Ｂａｌｂ/ｃマウスで抗腫瘍有効性試験を行った。Ｂａｌｂ/ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫから供給され、６〜８週齢、１８ｇ超であり、特定の病原体のない条件下で飼育された。合計５×１０６の細胞(Ｐ１５未満の継代数)をマウスの右脇腹に皮下注射(１００μｌ)した。別途記載されない限り、腫瘍細胞注射後１１日目に、動物を腫瘍サイズに基づいてランダム化し、処置を開始した。Ｊ５５８細胞を、ＴｒｙｐＬＥ(商標)Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)を使用してインビトロで継代し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭに再懸濁した。細胞生存率は、腫瘍細胞注入時に９０％を上回ることが確認された。
【０５４３】
腫瘍が約１４０ｍｍ＾３の平均体積に達したときに処置を開始した。次いで、同様の平均腫瘍サイズを有する４つの群に動物を割り振った(投薬群については表Ｅ−２１を参照されたい)。福祉(まれ)又は腫瘍サイズを理由に試験から動物を除く必要がない限り、マウス交差反応性である両方の抗体を、１１日目(腫瘍細胞移植後)から３週間、週２回でＩＰ投与した(図３８)  。対照として、同時に、一群の動物(ｎ＝１０)に生理食塩水を投与した。併用群では、ＳＴＩＭ００３抗体及び抗ＰＤＬ１抗体の両方を、それぞれ６０μｇ及び２００μｇ(０．９％の生理食塩水中)で同時にＩＰ投与した。腫瘍増殖を３７日間にわたってモニタリングし、生理食塩水で処置した動物の腫瘍と比較した。動物の体重及び腫瘍体積を腫瘍細胞注入の日から週３回測定した。腫瘍体積は、修正された楕円の方程式１/２(長さ×幅２)の使用によって計算した。腫瘍が平均直径１２ｍｍ３に達するまで、又はまれな場合に腫瘍潰瘍の発生が観察されるまで(福祉)、マウスを研究し続けた。
【表２４】
2019534892.tif 000027
【０５４４】
結果
Ｊ５５８同系腫瘍は非常に侵攻性であり、生理食塩水対照群の全ての動物(ｎ＝１０)を、腫瘍サイズを理由に２１日までに研究から除く必要があった。抗ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ及び抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａの両方は、このモデルにいて単剤療法として良好な有効性を示し、それぞれ、３７．５％及び７５％の動物が疾患治癒した。    重要なことに、２つの抗体の組合せにより、１００％の動物が３７日目までに形質細胞腫腫瘍を拒絶した。データを図３８に示す。
【０５４５】
実施例２２：抗ＰＤ１の投与により、抗ＰＤ−Ｌ１抗体よりも有意に大きくＴＩＬ上のＩＣＯＳ発現が増加する
腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)のサブセットにおけるＩＣＯＳ発現に対する抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ−１抗体による処置の効果を評価するために、確立されたＣＴ２６腫瘍を宿す動物で薬力学研究を行った。以下の抗体を比較した：
●抗ＰＤ−Ｌ１  ＡｂＷ  ｍＩｇＧ１［限定されたエフェクター機能］
●抗ＰＤ−Ｌ１  ＡｂＷ  ｍＩｇＧ２ａ［エフェクター機能あり］
●抗ＰＤ−Ｌ１  １０Ｆ９．Ｇ２ラットＩｇＧ２ｂ［エフェクター機能あり］
●抗ＰＤ１抗体ＲＭＴ１−１４ラットＩｇＧ２ａ［エフェクターヌル］。
【０５４６】
処置したマウスの腫瘍を単離し、単一細胞に解離させ、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３、及びＩＣＯＳについて染色した。
【０５４７】
材料及び方法
ラット抗ＰＤ−１  ＲＭＰ１−１４  ＩｇＧ２ａ(ＢｉｏＸＣｅｌｌ、カタログ番号：ＢＥ０１４６)、ラット抗ＰＤ−Ｌ１  １０Ｆ９．Ｇ２  ＩｇＧ２ｂ(Ｂｉｏ−Ｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号：１２４３２５)、並びに抗ＰＤ−Ｌ１  ＡｂＷ  ｍＩｇＧ１及びｍＩｇＧ２ａを、腫瘍細胞移植後１３日目及び１５日目に１３０μｇで腹腔内投与することによって、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて試験した。１６日目に、動物を選び出し、ＦＡＣＳ分析のためにマウス腫瘍を採取した。マウス腫瘍解離キット(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ)を使用して腫瘍を解離させ、均質化した。得られた細胞懸濁液を７０μＭのフィルターを通して清澄化し、ペレット化し、９６ウェルプレート中２００万細胞/ウェルでＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。この細胞懸濁液を抗１６/３２  ｍＡｂ(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)と共にインキュベートし、全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄから入手したＣＤ３(１７Ａ２)、ＣＤ４５(３０−Ｆ１１)、ＣＤ４(ＲＭ４−５)、ＣＤ８(５３−６．７)、及びＩＣＯＳ(７Ｅ．１７Ｇ９)に特異的なＦＡＣＳ抗体で染色した。細胞を、ＬｉｖｅＤｅａｄ  Ｙｅｌｌｏｗ固定性生存率解析用色素(Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)でも染色した。Ｆｏｘｐ３細胞内染色のために、試料を固定し、透過処理し、Ｆｏｘｐ３に特異的な抗体(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＦＪＫ−１６ｓ)で染色した。試料をＰＢＳ中に再懸濁し、データをＡｔｔｕｎｅフローサイトメーター(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で取得し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０ソフトウェア(Ｔｒｅｅｓｔａｒ)を使用して分析した。
【０５４８】
結果
抗ＰＤ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた処置では、測定された時点でＩＣＯＳを発現しているＣＤ８細胞及びＴ  Ｒｅｇに対するパーセンテージは僅かしか増加しなかった。しかし、抗ＰＤ１ラットＩｇＧ２ａに応答して、ＩＣＯＳ陽性ＣＤ８細胞の表面上で、ＩＣＯＳ発現の明白で有意な(生理食塩水処置群と比べた)増加(ｄＭＦＩの増加)が観察された。ＩＣＯＳ発現はまた、ＣＤ４エフェクター及びＣＤ４  Ｔ  Ｒｅｇ細胞で上方調節されることが示されたが、これは統計的に有意ではなかった。この抗ＰＤ１抗体により、抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＩｇＧ２ａではほとんど見られなかったＣＤ８エフェクター細胞上のＩＣＯＳ発現の顕著な増加が誘導された。同様に、異なる形式の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を比較すると、処置された動物の数匹において、最も低いエフェクター機能を有する抗体(ｍＩｇＧ１)が、エフェクターＣＤ８及びＣＤ４細胞上のより高いＩＣＯＳ発現(これをほとんど示さなかったエフェクター機能を有する抗体(ｍＩｇＧ２ａ及びｒａｔＩｇＧ２ｂ)と比較して)と関連したことが観察された。図３９を参照されたい。
【０５４９】
エフェクターＣＤ８/ＣＤ４  Ｔ細胞上のＩＣＯＳ発現の増加は、これらの細胞を抗ＩＣＯＳ抗体による枯渇(例えば、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａを用いたマウスの処置)に対してより感受性にする効果を有し得る。エフェクターＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞においてより低いＩＣＯＳ誘導を呈する抗体は、抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて使用するのが好ましくてもよい。この研究のデータにより、本明細書の他の実施例で報告する抗ＰＤＬ１  ｍＩｇＧ２ａとＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａとを組み合わせた場合に観察される抗腫瘍有効性を反映して、抗ＰＤ−Ｌ１エフェクター陽性抗体が抗ＩＣＯＳエフェクター陽性抗体との組合せに特に好適であり得ることが示される。
【０５５０】
実施例２３：Ｂ細胞リンパ腫同系モデルにおけるインビボでの単回用量抗ＩＣＯＳ抗体単剤療法の強力な抗腫瘍有効性
この実験では、単剤療法としてのＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの抗腫瘍有効性を確認する。強力な抗腫瘍有効性が、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの短時間曝露後に実証された。
【０５５１】
材料及び方法
有効性試験は、皮下Ａ２０細網細胞肉腫モデル(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−ＴＩＢ−２０８)を使用してＢＡＬＢ/ｃマウスで行った。ＢＡＬＢ/ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＵＫから供給され、６〜８週齢、１８ｇ超であり、特定の病原体のない条件下で飼育された。合計５×１０Ｅ５のＡ２０腫瘍細胞(Ｐ２０未満の継代数)をマウスの右脇腹に皮下注射した。以下の表に示すように、腫瘍細胞注入後８日目に処置を開始した。Ａ２０細胞を、ＴｒｙｐＬＥ(商標)Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｅｎｚｙｍｅ(Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ)を使用してインビトロで継代し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩに再懸濁した。細胞生存率は、腫瘍細胞注入時に８５％を上回ることが確認された。ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａは、６０μｇ(２０ｇの動物では３ｍｇ/ｋｇに相当)の単回用量(ＳＤ)又は６０μｇの複数回用量(ＭＤ、週２回３週間)のいずれかとして使用した。２つのスケジュールに応答して観察された抗腫瘍有効性を、生理食塩水で「処置」した(ＭＤ、週２回３週間)動物の有効性と比較した。抗体を０．９％の生理食塩水中１ｍｇ/ｍｌとして腹腔内(ＩＰ)投与した。動物の体重及び腫瘍体積を腫瘍細胞注入の日から週３回測定した。腫瘍体積は、修正された楕円の方程式１/２(長さ×幅２)の使用によって計算した。腫瘍が平均直径１２ｍｍに達するまで、又はまれに腫瘍潰瘍の発生が観察されるまで(福祉)、マウスを研究し続けた。
【表２５】
2019534892.tif 000028
【０５５２】
結果
ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの複数回投与及び単回投与の両方により、終点(４１日目)に腫瘍増殖の徴候のない動物の数によって示されるように、強力で有意な単剤療法の抗腫瘍効果がもたらされた。ＳＤにより、１０匹の動物のうち７匹が疾患から治癒した一方、複数回用量では、Ａ２０  Ｂ細胞リンパ芽球を注射した１０匹の動物のうち９匹が治癒した。生理食塩水処置群の全ての動物を、腫瘍サイズを理由に４０日目までに研究から除く必要があった。図４０を参照されたい。
【０５５３】
人道的エンドポイント生存率統計を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ７．０を使用してＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線(図４１)から計算した。このアプローチを使用して、処置が改善された生存と関連しているかどうかを判定した。ハザード比(Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ)値及びそれらに関連するＰ値(Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ)を以下の表に示す。
【表２６】
2019534892.tif 000029
【０５５４】
実施例２４：ＣＴ−２６腫瘍保有動物における抗ＩＣＯＳ抗体の時間及び用量依存的効果
この実施例は、ＣＴ−２６腫瘍を保有するマウスにおける免疫細胞に対する抗ＩＣＯＳ抗体の効果を評価する薬力学研究の結果を提示する。異なる組織由来のＴ細胞サブタイプ及びＢ細胞サブタイプを、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａの単回投与後にＦＡＣＳによって分析した。
【０５５５】
方法
ＣＴ−２６腫瘍保有動物に、腫瘍細胞移植後１２日目に２００μｇ、６０μｇ、又は６μｇの生理食塩水又はＳＴＩＭ００３のいずれかを腹腔内投与した。処置後１、２、３、４、及び８日目に、腫瘍組織、血液、腫瘍流入領域リンパ節(ＴＤＬＮ)、及び脾臓を採取した。マウス腫瘍解離キット(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ)を使用して腫瘍を解離させて、単一細胞懸濁液を作製した。脾臓組織を穏やかなＭＡＣＳ解離を使用して解離させ、ＲＢＣ溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解させた。腫瘍流入領域リンパ節を機械的に分解して、単一細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液を、組織に応じて７０μＭ又は４０μＭいずれかのフィルターを通して清澄化し、次に細胞をＲＭＰＩ完全培地で２回洗浄し、最後に氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。プラズマ管に全血を集め、ＲＢＣ溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解させ、細胞をＲＭＰＩ完全培地で２回洗浄し、最後に氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。全組織からの単一細胞懸濁液をＦＡＣＳ分析のために深い９６ウェルプレートに分配した。細胞を生死に敏感な黄色生存性染料  Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｙｅｌｌｏｗ生存率解析用色素(Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)で染色した。細胞懸濁液を、抗ＣＤ１６  /  ＣＤ３２  ｍＡｂ(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)と共にインキュベートし、全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄから入手したＣＤ３(１７Ａ２)、ＣＤ４５(３０−Ｆ１１)、ＣＤ４(ＲＭ４−５)、ＣＤ８(５３−６．７)、ＣＤ２５(ＰＣ６１．５)、ＩＣＯＳＬ(ＨＫ５．３)、Ｂ２２０(ＲＡ３−６Ｂ２)、Ｋｉ−６７(ＳｏｌＡ１５)、ＣＤ１０７ａ(ｅＢｉｏ１Ｄ４Ｂ)、ＩＦＮ−γ(ＸＭＧ１．２)、ＴＮＦ−α(ＭＰ６−ＸＴ２２)、Ｆｏｘｐ３(ＦＪＫ−１６ｓ)、及びＩＣＯＳ(７Ｅ．１７Ｇ９)に特異的なＦＡＣＳ抗体で染色した。ＦＡＣＳによるサイトカイン読出しのために、腫瘍由来の単一細胞懸濁液をＢｒｅｆｅｌｄｉｎ−Ａの存在下で４時間かけて２４ウェルプレートにプレートした。細胞内染色のために、試料を固定し、透過処理し、特異的抗体で染色した。最後に、試料をＰＢＳ中に再懸濁し、データをＡｔｔｕｎｅフローサイトメーター(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)で取得し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０ソフトウェア(Ｔｒｅｅｓｔａｒ)を使用して分析した。
【０５５６】
結果を以下に提示し、考察する。
【０５５７】
ＩＣＯＳ発現は、ＣＴ２６モデルにおいて腫瘍内Ｔ−ｒｅｇ上で高い。
ＩＣＯＳを発現する腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)のパーセンテージを、脾臓、血液、及びＴＤＬＮ中の免疫細胞のパーセンテージと比較すると、他の組織に比べて、ＣＴ−２６腫瘍の微小環境におけるより多くの免疫細胞がＩＣＯＳを発現したことが示された。より重要なことに、全ての組織及び全ての時点におけるＩＣＯＳ陽性Ｔ−ｒｅｇ細胞のパーセンテージは、ＩＣＯＳ陽性のＣＤ４又はＣＤ８エフェクターＴ細胞のパーセンテージよりも高かった。重要なことに、ＩＣＯＳのｄＭＦＩ(相対的発現)もまた、発現において同様の順位に従い、腫瘍内Ｔｒｅｇが、他のＴＩＬサブタイプに比べてＩＣＯＳ発現について高度に陽性であった。興味深いことに、この実験の期間内にＩＣＯＳ＋  ＴＩＬのパーセンテージに顕著な変化はなかった。脾臓及びＴＤＬＮにおいても同様の結果が見られた。一方、血液中では、実験の経過中、ＩＣＯＳ発現はＴエフェクター細胞上では比較的安定であるが、Ｔ−ｒｅｇ上では増加する。まとめると、データにより、より多くの細胞が腫瘍微小環境においてＩＣＯＳを発現し、これらの陽性細胞はまた、その表面により多くのＩＣＯＳ分子を発現することが実証された。より重要なことに、ＴＩＬにおけるＴ  ｒｅｇは、ＩＣＯＳについて高度に陽性である。図４２を参照されたい。
【０５５８】
ＳＴＩＭ００３投与に応答した腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞の強力な枯渇
ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ抗体に応答して、ＴＭＥ中のＴ−ｒｅｇ細胞(ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３)の強力で急速な枯渇があった。Ｔｒｅｇは他のＴ細胞サブセットと比較して高いＩＣＯＳ発現を有するので、エフェクター機能を有する抗ＩＣＯＳ抗体がこれらの細胞を優先的に枯渇させ得ると予想される。低用量のＳＴＩＭ００３(２０ｇの動物についての０．３ｍｇ/ｋｇに相当する６μｇ)では、Ｔ−ｒｅｇの継続した枯渇があり、３日目までにＴ−ｒｅｇのほとんどがＴＭＥから枯渇した。興味深いことに、８日目までに、Ｔ−ｒｅｇ細胞はＴＭＥで再増殖し、続いて生理食塩水で処置した動物において観察されるレベルよりもわずかに高いレベルに達する。低用量のＴ−ｒｅｇ細胞の再増殖は、Ｋｉ−６７＋ＣＤ４  Ｔ細胞の観察された増加によって証明されるように、ＴＭＥにおける増殖するＣＤ４  Ｔ細胞の増加に起因し得る。６μｇより高い用量では、本研究で分析した最後の時点(８日目)までの完全なＴ  Ｒｅｇ枯渇によって示されるように、ＴＭＥにおけるＴ  ｒｅｇ細胞の長期枯渇があった。血液中では、全ての用量でＴｒｅｇ細胞が一時的に枯渇した。重要なことに、８日目までに、生理食塩水で処置した動物と比較した場合、処置した全ての動物が、血液中のＴ−ｒｅｇ細胞と同等の(又は６μｇ用量についてはより高い)レベルを有した。データを図４３に示す。とりわけ、またＣＴＬＡ−４抗体の枯渇に関して以前に公開されたデータと同様、脾臓又はＴＤＬＮ組織におけるＴ−ｒｅｇ細胞のパーセンテージに有意な変化はなく、Ｔ−ｒｅｇ細胞がこれらの器官において枯渇から保護され得ることを示唆している。
【０５５９】
要約すると、ＴＭＥにおけるＴ−ｒｅｇ細胞の強力な枯渇は、動物１匹あたり６μｇという低用量でＣＴ−２６モデルにおいて達成された。しかしながら、６０μｇの用量により、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａ注射後８日目までの長期間の枯渇がもたらされた。これは、より高い用量(２００μｇ)を使用することによっては改善されなかった。
【０５６０】
ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａにより、ＣＤ８：Ｔ  Ｒｅｇ比及びＣＤ４：Ｔ  Ｒｅｇ比が増加した
Ｔ−ｅｆｆ：Ｔ−ｒｅｇ比に対するＳＴＩＭ００３の効果を図４４に示す。
【０５６１】
ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａにより、ＣＤ８：Ｔ−ｒｅｇ比及びＣＤ４  ｅｆｆ：Ｔ−ｒｅｇ比が増加した。全ての処置用量がＴ−ｅｆｆ対Ｔ−ｒｅｇ比の増加と関連していたが、中間用量６０μｇ(２０ｇの動物についての３ｍｇ/ｋｇに相当する量)が、処置後８日目までの最も高い比と関連していた。
【０５６２】
興味深いことに、６μｇ用量では、比は４日目まで高かったが、治療後８日目には生理食塩水処置動物の比と一致した。これは、治療後８日目までにこの用量について観察されたＴＲｅｇの再増殖によって説明され得る。一方、用量６０又は２００μｇでは、Ｔｅｆｆ対Ｔ−ｒｅｇ比は全ての時点で高いままであった。これは、これらの用量におけるＴｒｅｇの長期間の枯渇によって説明される。とりわけ、高用量(２００μｇ)では、長期間のＴｒｅｇ枯渇にもかかわらず、その比は８日目までに穏やかにしか改善しなかった。これは、高濃度のＳＴＩＭ００３でのＩＣＯＳＩＮＴエフェクター細胞のいくらかの枯渇によって説明され得る。
【０５６３】
まとめると、データにより、試験した全ての用量で、ＴＲｅｇ枯渇及びエフェクター：Ｔ  ｒｅｇ比の増加が実証された。しかしながら、６０μｇ(約３ｍｇ/ｋｇ)の最適用量は、Ｔ−ｒｅｇの長期間の枯渇と、抗腫瘍免疫応答を開始するのに最も好ましい免疫状況に関連するＴ−ｅｆｆ対Ｔ−ｒｅｇ比との両方を達成した。興味深いことに、類似のパターンが血液中で観察され、６０μｇの中間用量が最も高いＴ−ｅｆｆ対Ｔ−ｒｅｇ比に関連していた。重要なことに、血液中では、より早い時点(３日目〜４日目)で比の改善が観察された。
【０５６４】
ＳＴＩＭ００３に応答するエフェクター細胞の活性化
腫瘍浸潤Ｔエフェクター細胞上のＣＤ１０７ａの表面発現は、活性化され、細胞傷害活性を発揮する細胞の信頼できるマーカーとして以前に同定された［４４］。本研究では、このマーカーを用いて、ＳＴＩＭ００３が、Ｔ−ｒｅｇを枯渇させることに加えて、ＴＭＥにおけるエフェクターＴ細胞の細胞傷害活性を刺激し得ることを確認した。興味深いことに、処置後８日目に、ＳＴＩＭ００３の全ての用量でＣＤ４エフェクターＴ細胞コンパートメント及びＣＤ８エフェクターＴ細胞コンパートメント両方においてＣＤ１０７ａの表面発現が増加した。さらに、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞両方の表面におけるＣＤ１０７ａ発現のこの上方調節は、動物に６０μｇを投与したときにプラトーに見え、これは２００μｇの投薬で改善が見られなかったためである。
【０５６５】
ＴＭＥにおけるエフェクター細胞の活性化をさらに実証するために、ＣＤ４  ＴＩＬ及びＣＤ８  ＴＩＬによるサイトカイン放出をＦＡＣＳによって分析した。予期した通り、また本明細書の先の実施例で提示したインビトロのアゴニズムデータと一致して、ＳＴＩＭ００３  ｍＩｇＧ２ａは、全ての用量で、エフェクターＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞による炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生を促進した。炎症誘発性サイトカイン産生の誘導は、最適用量６０μｇで高いようであった。実際に、６０μｇのＳＴＩＭ００３により、ＣＤ４  Ｔ細胞によるサイトカイン産生が有意に増加した。ＴＭＥ中のエフェクターＣＤ８  Ｔ細胞による炎症誘発性サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生についても同様の傾向が見られた。データを図４５に示す。
【０５６６】
要約すると、ＳＴＩＭ００３は、全ての用量で、(１)表面上の脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの存在、及び(２)Ｔ細胞によるＴｈ１サイトカイン(ＩＦＮγ及びＴＮＦα)の産生によって示される、ＴＭＥにおけるＴ細胞活性化をもたらした。これにより、ＳＴＩＭ００３がＴＭＥの免疫状況に強く影響し、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させ、Ｔエフェクター細胞の殺滅活性を刺激するという二重の役割を果たすことが示される。
【０５６７】
ヒト用量の推定
マウスに見られる前臨床有効性データを基にして、対応する生物学的表面積(ＢＳＡ)に基づき、ヒト患者に適切な臨床用量の最初の予測を行うことができる［４５］。
【０５６８】
例えば、マウスにおける最適な抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ用量を３ｍｇ/ｋｇ(６０μｇ)とし、参照方法［４５］に従うと、ヒトのための対応する用量は０．２５ｍｇ/ｋｇである。
【０５６９】
Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒの公式を使用すると、６０ｋｇ及び１．７０ｍの個体については、ＢＳＡは１．６８ｍ２である。単位ｍｇ/ｋｇの用量に３５．７(６０/１．６８)の因数を掛けると、１５ｍｇの固定用量が得られる。８０ｋｇの個体については、対応する固定用量は２０ｍｇであろう。
【０５７０】
用量は、安全で有効な処置レジメンを決定するために、臨床試験においてヒト療法のために最適化され得る。
【０５７１】
実施例２５：腫瘍試料からのデータのバイオインフォマティクス分析
本発明に従う癌の１つの標的群は、比較的高レベルのＩＣＯＳ＋免疫抑制性Ｔｒｅｇと関連する癌である。
【０５７２】
高含有量のＴｒｅｇに関連する癌種を同定するために、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ(ＴＣＧＡ)公開データセットからトランスクリプトームデータを得て、ＩＣＯＳ及びＦＯＸＰ３発現レベルについて分析した。ＴＣＧＡは、多数の異なるタイプの癌種について蓄積されたゲノム及びトランスクリプトームデータを目録にした大規模研究であり、膨大なサンプルメタデータを伴って、突然変異、コピー数変異、ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ遺伝子発現、並びにＤＮＡメチル化を含む。
【０５７３】
遺伝子セット富化分析(ＧＳＥＡ)を以下のように実施した。ＴＣＧＡコンソーシアムの一部として収集された遺伝子発現ＲＮＡ配列データを、ＵＣＳＣ  Ｘｅｎａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｂｒｏｗｓｅｒからｌｏｇ２(ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＿ｃｏｕｎｔ＋１)としてダウンロードした。非腫瘍組織試料をデータセットから取り出し、９７３２個の試料に由来する２０５３０個の遺伝子のデータを残した。指定の遺伝子セット内の遺伝子についての富化スコアを計算する［４６］におけるアルゴリズム及び［４７］におけるその実施を使用して、各試料について遺伝子レベルカウントを遺伝子セットスコアに転置した。目的の遺伝子セットは、ＩＣＯＳ及びＦＯＸＰ３の両方を含むものと定義した。試料を主な疾患によって群分けし、各群のｓｓＧＳＥＡスコアを３３個の主な疾患群にわたって比較した。最も高い中央値スコアを示した疾患群は、リンパ系腫瘍びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胸腺腫、頭頸部扁平上皮癌であることが分かったが、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫はスコアの多峰性分布を示し、スコアは、サブセットで高く、残りは群の中央値を下回った。
【０５７４】
ＩＣＯＳ及びＦＯＸＰ３発現のｓｓＧＳＥＡスコアの最高値から最低値の順位で、上位１５種類の癌は次の通りであった。
【表２７】
2019534892.tif 000030
【０５７５】
ここで、ｎは、ＴＣＧＡデータセットにおけるその癌種の患者試料の数である。本明細書に記載される抗ＩＣＯＳ抗体は、これら及び他の癌の治療に使用され得る。
【０５７６】
比較的高レベルのＩＣＯＳ＋免疫抑制性Ｔｒｅｇに関連し、ＰＤ−Ｌ１をさらに発現する癌は、抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せによる治療に特に良好に応答し得る。この目的に適切な治療レジメン及び抗体は、前述の記載において既に詳述されている。
【０５７７】
以前のようにＴＣＧＡデータセットを使用して、ＩＣＯＳ及びＦＯＸＰ３の富化スコアを、スピアマンの順位相関を使用してＰＤ−Ｌ１の発現レベルと相関させ、主な疾患の徴候によって群分けした。各群についてＰ値を計算し、０．０５のｐ値(ボンフェローニの多重比較補正を使用)を統計学的に有意とした。ＩＣＯＳ/ＦＯＸＰ３発現とＰＤ−Ｌ１発現との間の相関が最も高い疾患群は以下の通りであった。
【表２８】
2019534892.tif 000031
【０５７８】
患者は、その癌が、ＩＣＯＳ＋免疫抑制性Ｔｒｅｇ、及びＰＤ−Ｌ１の発現と関連していることを判定するアッセイの後に、治療のために選択され得る。上記のように相関スコアが高い癌種については、ＩＣＯＳ＋免疫抑制性Ｔｒｅｇ及びＰＤ−Ｌ１の発現のいずれかが存在する(例えば、閾値を超える)と判定することで十分であり得る。この状況では、ＰＤ−Ｌ１免疫組織化学アッセイを使用してもよい。
【０５７９】
実施例２６：さらなる抗ＩＣＯＳ抗体の評価
実施例１２で同定したＣＬ−７４５７０及びＣＬ−６１０９１抗体配列を合成し、ＨＥＫ細胞においてＩｇＧ１フォーマットで発現させた。
【０５８０】
これらの抗体の機能的特徴付けは、実施例６に記載のものと類似したＨＴＲＦアッセイを用いて行ったが、ＢＣＴ上清ではなく精製したＩｇＧ１の使用にアッセイを適合させる改変を伴った。ＨＥＫ細胞から発現されたヒトＩｇＧ１抗体を含有する５μＬの上清をＢＣＴ上清の代わりに使用し、以前のようにＨＴＲＦ緩衝液を使用して、総体積をウェル当たり最大２０μｌとした。陰性対照としてヒトＩｇＧ１抗体を使用した。両方の抗体は、式１を使用して計算して、ヒト及びマウスＩＣＯＳに対する結合について５％を超える効果を呈したため、このアッセイにおいて陽性であることが確認された。
【０５８１】
ＣＨＯ−Ｓ細胞の表面上に発現されたヒト及びマウスＩＣＯＳに結合するこれらの抗体の能力を、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌアッセイを使用してさらに確認した。このアッセイでは、抗ＩＣＯＳ  ＩｇＧ１を含有する５μｌの上清を、３８４個のミラーボールブラックプレート(Ｃｏｒｎｉｎｇ)の各ウェルに移した。全てのウェルに０．８ｍｇ/ｍｌの濃度でアッセイ緩衝液(ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム)中で希釈したヤギ抗ヒト４８８(Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ)１０μｌを添加することにより、抗ＩＣＯＳ抗体の結合を検出した。
【０５８２】
陽性対照ウェルについては、アッセイ培地で２．２μｇ/ｍＬに希釈した５μＬの参照抗体をプレートに加えた。陰性対照ウェルについては、アッセイ培地で２．２μｇ/ｍＬに希釈した５μｌのハイブリッド対照ＩｇＧ１をプレートに加えた。１０μＭのＤＲＡＱ５(Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を、アッセイ緩衝液に再懸濁した０．４×１０６/ｍｌの細胞に加え、５μｌを全ウェルに加えた。プレートを４度で２時間インキュベートした。
【０５８３】
Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダー(ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ)を使用し、５００〜７００個の単一細胞の集団からＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８(励起４９３ｎｍ、発光５１９ｎｍ)を測定することで、蛍光強度を測定した。アッセイシグナルを、中央(ＦＬ２)平均強度として測定した。
【０５８４】
参照抗体を２．２μｇ/ｍＬのアッセイ濃度で使用して、全結合を定義した。ハイブリッド対照ｈＩｇＧ１を２．２２μｇ/ｍＬのアッセイ濃度で使用して、非特異的結合を定義した。両方の抗体は、１パーセントを超える効果を呈したため、このアッセイにおいて陽性であることが確認された。
【数３】
2019534892.tif 000032
【０５８５】
ＣＬ−７４５７０及びＣＬ−６１０９１の各々はまた、フローサイトメトリーによって判定して、ＣＨＯ−Ｓ細胞上に発現されるヒト及びマウスＩＣＯＳに対する結合を示した。ＦＡＣＳスクリーニングは、実施例６に記載の方法と類似した方法を用いて行ったが、ＢＣＴ上清ではなく精製したＩｇＧ１の使用にアッセイを適合させる改変を伴った。両方の抗体が、ｈＩＣＯＳ、ｍＩＣＯＳ、及びＷＴ  ＣＨＯ細胞に対する陰性対照の結合の幾何平均の算術平均を１０倍超上回る結合を呈した。
【表２９】
2019534892.tif 000033
【０５８６】
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２２  Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．，３：７−１６  ｏｒ  ｂｙ  Ｚｈｏｕ  Ｑ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００８，Ｆｅｂ  １５，９９(３)：６５２−６５)
２３  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｒ  ２；  ２７６(９)：６５９１−６０４)
２４  Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１６６：２５７１−２５７５
２５  Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８：  ３８６３−３８７２
２６  Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ  ＬＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３  Ａｕｇ  ２２；５００(７４６３)：４１５−２１
２７  Ｍａｒｔｉｎ−Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＣＯＳ  Ｌｉｇａｎｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０(２３)：９５８１−９５９０  ２０１０
２８  Ｈｏｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＣＤ１３７  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｔｒｅｇ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，Ｂｌｏｏｄ  １１４：３４３１−３４３８  ２００９
２９  Ｂａｒｕｃｈ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＰＤ−１  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２２(２)：１３７−１３７  ２０１６
３０  Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＤ０１  ａｎｄ  ＣＴＬＡ−４  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｅｘｐａｎｄｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｕｒｓ，ＰＮＡＳ  １０７(９)：４２７５−４２８０  ２０１０
３１  Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＬ−２  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ＩＣＯＳ＋  Ｔｒｅｇ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１４
３２  Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＬ−２  ｖａｒｉａｎｔ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｓ  ＩＣＯＳ＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１６
３３  Ｋｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：５１−７２  ２０１３
３４  Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ＆  Ｋｒｏｅｍｅｒ  Ｃａｎｃ．Ｉｍｍ．Ｒｅｓ．４：８９５−９０２  ２０１６
３５  Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ｄｒｉｖｅｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０(１１)：２４３４−２４４６  ２０１３
３６  Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８(３５２)  ２０１６
３７  Ｃｒｏｔｔｙ  Ｓ．Ｔ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１４  Ｏｃｔ  １６；４１(４)：５２９−４２．
３８  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．(２００２)  ＪＢＣ  ２７７：２６７３３
３９  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：６−３６３，２０１４
４０  Ｙｕｓａ  Ｋ，Ｚｈｏｕ  Ｌ，Ｌｉ  ＭＡ，Ｂｒａｄｌｅｙ  Ａ，Ｃｒａｉｇ  ＮＬ．Ａ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊａｎ  ２５
４１  Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ；  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ；１６(４)：３８１−９  Ａｕｇ  １９９７
４２  Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏ−ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１０(９)：１６９５−７１０  ２０１３
４３  Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ２ａ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１(１)：３２−４２  ２０１３．
４４  Ｒｕｂｉｏ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３  Ｎｏｖ；９(１１)：１３７７−８２．
４５  Ｎａｉｒ  ＆  Ｊａｃｏｂ．，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｄｏｓｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ．Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａ  ２０１６；７：２７−３１
４６  Ｄ．Ａ．Ｂａｒｂｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＫＲＡＳ−ｄｒｉｖｅｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ＴＢＫ１．，”  Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４６２，ｎｏ．７２６９，ｐｐ．１０８−１２，２００９
４７  Ｓ．Ｈａｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｒ．Ｃａｓｔｅｌｏ，ａｎｄＪ．Ｇｕｉｎｎｅｙ，“ＧＳＶＡ：  ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎｄ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ，”  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１４，ｎｏ．１，ｐ．７，２０１３
【０５８７】
配列
抗体ＳＴＩＭ００１
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号３６７
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号３６６
ＱＶＱＶＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＴＦＧＩＴＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＤＴＮＹＡＱＮＬＱＧＲＶＩＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＳＧＨＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＹＴＦＳＴＦＧ  配列番号３６３
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＳＡＹＮＧＤＴ  配列番号３６４
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＳＳＧＨＹＹＹＹＧＭＤＶ  配列番号３６５
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号３７４
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＡＡＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＡＡＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号３７３
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＥＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＦＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＴＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＭＱＳＬＱＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＬＬＨＳＮＥＹＮＹ  配列番号３７０
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＬＧＳ  配列番号３７１
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＭＱＳＬＱＴＰＬＴ  配列番号３７２
【０５８８】
抗体ＳＴＩＭ００２
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号３８１
ＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号３８０
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＦＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＦＹＧＳＧＴＬＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＧ  配列番号３７７
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＳＡＹＮＧＮＴ  配列番号３７８
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＳＴＹＦＹＧＳＧＴＬＹＧＭＤＶ  配列番号３７９
ＶＬドメインヌクレオチド配列：３８８
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
修正ＳＴＩＭ００２  ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号５１９
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号３８７
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＦＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＬＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＬＬＨＳＤＧＹＮＹ  配列番号３８４
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＬＧＳ  配列番号３８５
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＭＱＡＬＱＴＰＬＳ  配列番号３８６
【０５８９】
抗体ＳＴＩＭ００２−Ｂ
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号３９５
ＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号３９４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＦＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＦＹＧＳＧＴＬＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＹＴＦＴＳＹＧ  配列番号３９１
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＳＡＹＮＧＮＴ  配列番号３９２
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＳＴＹＦＹＧＳＧＴＬＹＧＭＤＶ  配列番号３９３
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４０２
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４０１
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＹＮＣＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＴＲＡＳＧＦＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＣＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＬＬＨＳＤＧＹＮＣ  配列番号３９８
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＬＧＳ  配列番号３９９
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＭＱＡＬＱＴＰＣＳ  配列番号４００
【０５９０】
抗体ＳＴＩＭ００３
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号４０９
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＲＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
修正ＳＴＩＭ００３  ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号５２１
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号４０８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＶＴＦＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＮＷＮＧＧＤＴＤＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＦＹＧＳＧＳＹＹＨＶＰＦＤＹＷＧＱＧＩＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＶＴＦＤＤＹＧ  配列番号４０５
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＮＷＮＧＧＤＴ  配列番号４０６
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＤＦＹＧＳＧＳＹＹＨＶＰＦＤＹ  配列番号４０７
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４１６
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４１５
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＲＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＤＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＤＭＳＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＶＳＲＳＹ  配列番号４１２
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＧＡＳ  配列番号４１３
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＨＱＹＤＭＳＰＦＴ  配列番号４１４
【０５９１】
抗体ＳＴＩＭ００４
ＶＨドメインヌクレオチド配列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＴＡＣＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ  配列番号４２３
ＶＨドメインアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＬＴＦＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＮＷＮＧＤＮＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＹＹＧＳＧＳＹＹＮＶＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  配列番号４２２
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＬＴＦＤＤＹＧ  配列番号４１９
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＮＷＮＧＤＮＴ  配列番号４２０
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＤＹＹＧＳＧＳＹＹＮＶＰＦＤＹ  配列番号４２１
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４３１
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
上記のＶＬドメインヌクレオチド配列によってコードされたＶＬドメインアミノ酸配列。
修正ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４３０
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
修正ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４３２
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＲＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＦＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＶＳＳＳＹ  配列番号４２６
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＧＡＳ  配列番号４２７
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＱＱＹＧＳＳＰＦ  配列番号４２８
【０５９２】
抗体ＳＴＩＭ００５
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号４３９
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＴＧＧＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＧＴＴＡＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号４３８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＮＳＹＧＩＩＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＶＨＮＧＮＴＮＣＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＴＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＧＹＤＩＬＴＤＦＳＤＡＦＤＩＷＧＨＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＹＴＦＮＳＹＧ  配列番号４３５
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＳＶＨＮＧＮＴ  配列番号４３６
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＡＧＹＤＩＬＴＤＦＳＤＡＦＤＩ  配列番号４３７
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４４６
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴＣＣＣＧＴＧＧＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４４５
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＮＩＮＮＦＬＮＷＹＱＱＫＥＧＫＧＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＲＧＩＰＳＴＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＩＣＱＱＳＹＧＩＰＷＶＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＮＩＮＮＦ  配列番号４４２
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＡＡＳ  配列番号４４３
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＱＱＳＹＧＩＰＷ  配列番号４４４
【０５９３】
抗体ＳＴＩＭ００６
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号４５３
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＡＣＧＡＴＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＴＴＴＡＴＣＣＣＣＴＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＧＧＴＴＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号４５４
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＦＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＹＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＨＹＤＧＳＧＩＹＰＬＹＹＹＹＧＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＦＴＦＳＤＹＦ  配列番号４４９
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＳＳＳＧＳＴＩ  配列番号４５０
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＤＨＹＤＧＳＧＩＹＰＬＹＹＹＹＧＬＤＶ  配列番号４５１
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４６０
ＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＡＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４５９
ＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＹＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＹＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＳＦＧＱＧＴＴＬＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹ  配列番号４５６
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＬＧＳ  配列番号４５７
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＭＱＡＬＱＴＰＲＳ  配列番号４５８
【０５９４】
抗体ＳＴＩＭ００７
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号４６７
ＣＡＧＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＡＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号４６６
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＴＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＶＩＹＷＤＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＦＣＴＨＧＹＧＳＡＳＹＹＨＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＦＳＬＳＴＴＧＶＧ  配列番号４６３
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＹＷＤＤＤＫ  配列番号４６４
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＴＨＧＹＧＳＡＳＹＹＨＹＧＭＤＶ  配列番号４６５
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４７４
ＧＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＣＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４７３
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＴＮＹＬＡＷＨＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＲＳＮＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＶＴＮＹ  配列番号４７０
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＤＡＳ  配列番号４７１
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＱＨＲＳＮＷＰＬＴ  配列番号４７２
【０５９５】
抗体ＳＴＩＭ００８
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号４８１
ＣＡＧＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＣＡＣＧＧＡＴＡＴＧＧＴＴＣＧＧＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号４８０
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＶＩＹＷＤＤＤＫＲＹＳＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＦＣＴＨＧＹＧＳＡＳＹＹＨＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＦＳＬＳＴＳＧＶＧ  配列番号４７７
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＹＷＤＤＤＫ  配列番号４７８
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＴＨＧＹＧＳＡＳＹＹＨＹＧＭＤＶ  配列番号４７９
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号４８８
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号４８９
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＴＮＹＬＡＷＨＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＶＴＮＹ  配列番号４８４
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＤＡＳ  配列番号４８５
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＱＱＲＳＮＷＰＬＴ  配列番号４８６
【０５９６】
抗体ＳＴＩＭ００９
ＶＨドメインヌクレオチド配列：配列番号４９５
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧＡＴＡＧＴＣＣＧＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
ＶＨドメインアミノ酸配列：配列番号４９４
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＦＹＤＩＬＴＤＳＰＹＦＹＹＧＶＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＧＦＴＦＳＤＹＹ  配列番号４９１
ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＩＳＳＳＧＳＴＩ  配列番号４９２
ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＡＲＤＦＹＤＩＬＴＤＳＰＹＦＹＹＧＶＤＶ  配列番号４９３
ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号５０２
ＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＡＡＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＬドメインアミノ酸配列：配列番号５０１
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＡＬＱＴＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列：ＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹ  配列番号４９８
ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列：ＬＧＳ  配列番号４９９
ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列：ＭＱＡＬＱＴＰＲＴ  配列番号５００
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【表３４−２】
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【表３４−３】
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【表３４−６】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
2019534892.tif 000241
【図８】
2019534892.tif 000242
【図９】
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【図１０】
2019534892.tif 000244
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４５−３】
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【図４５−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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