(57)【要約】  本発明は、プロセス溶液中に含有され、かつ濾別対象の粒子に関するサイズ排除フィルターの対数減少値ＬＲＶを決定する方法に関し、ここで、サイズ排除フィルターは、サイズ排除フィルターの上流に連続して取り付けられるプロセス吸着体を用いて、プロセス溶液中に含有される遮断吸着種から保護される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロセス溶液の粒子に関するサイズ排除フィルターＧの対数減少値ＬＲＶサイズ排除フィルターを決定する方法であって、該粒子は、浄化対象物であり、該サイズ排除フィルターＧは、連続して上流に接続されるプロセス吸着体Ｐによって、該プロセス溶液中に存在する遮断吸着種から保護され、浄化対象の該粒子は、０．５以上のＬＲＶプロセス吸着体を有する該プロセス吸着体Ｐによって保持され、
（ａ）ＬＲＶサイズ排除フィルターを決定するサイズ排除フィルターＧ、及び、
テスト吸着体Ｔであって、該テスト吸着体は、連続して該サイズ排除フィルターＧの上流に接続され、かつ該プロセス吸着体Ｐに類似した材料のみからなり、該テスト吸着体を用いることで、浄化対象の該粒子が、２以下の既知のＬＲＶテスト吸着体で保持され、ここで、ＬＲＶテスト吸着体＜ＬＲＶプロセス吸着体である、テスト吸着体Ｔ、
を含むテストシステムを準備する工程と、
（ｂ）浄化対象の該粒子に関する該テストシステムのＬＲＶテストシステムを決定する工程と、
（ｃ）ＬＲＶテストシステムからＬＲＶテスト吸着体を差し引くことによって、ＬＲＶサイズ排除フィルターを算出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記テスト吸着体Ｔは、１以下のＬＲＶテスト吸着体を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロセス吸着体Ｐは、比吸着容量ｋ１を有し、スケールＭ１で存在し、ｋ１×Ｍ１の総吸着容量を有し、前記テスト吸着体Ｔは、比吸着容量ｋ２を有し、スケールＭ２で存在し、ｋ２×Ｍ２の総吸着容量を有し、０．１＜ｋ１Ｍ１／ｋ２Ｍ２＜１０である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
０．５＜ｋ１Ｍ１／ｋ２Ｍ２＜５である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
０．９＜ｋ１Ｍ１／ｋ２Ｍ２＜１．１である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロセス吸着体Ｐ及び前記テスト吸着体Ｔの前記総吸着容量は、ガス吸着測定によって、破過曲線の決定によって、モデルタンパク質との結合実験によって、又は静的インキュベーションによって決定される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プロセス吸着体Ｐ及び前記テスト吸着体Ｔは、機械的な一体成型体として存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロセス吸着体（Ｐ）及び前記テスト吸着体Ｔは、膜の形態で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遮断吸着種は、生体高分子、生体高分子凝集体、生物学的粒子、ウイルスベクター、ウイルス及び微生物からなる群の少なくとも１種である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロセス溶液の粒子に関するサイズ排除フィルターの対数減少値ＬＲＶを決定する方法であって、該粒子は、浄化（clarified：清澄化）対象物であり、該サイズ排除フィルターは、連続して上流に接続されるプロセス吸着体によって、該プロセス溶液中に存在する遮断吸着種から保護される、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（バイオ）医薬品産業において、ウイルス除去研究の結果は、許可関係書類の不可欠部分であり、したがって、哺乳動物細胞において産生される産物の薬物安全性の実証にとって極めて重要である。これに関連して、ウイルスの除去は、例えば、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体の両方を含有するタンパク質溶液から行われる。ウイルス除去研究において、及び生産規模での両方で、吸着性様式でタンパク質凝集体を、またサイズ排除の原理に従ってウイルスをともに保持するプレフィルター（プロセス吸着体）、及びサイズ排除の原理に従ってウイルスのみを保持するウイルスフィルターの組合せが、通常使用される。ウイルス除去研究において、プレフィルターによるこの（望ましくない）ウイルス保持のために、ウイルスフィルター単独のウイルス保持が研究された場合の実際のものよりもウイルスフィルターによって達成されるウイルス保持が高く見えることがある。したがって、プレフィルターに起因するウイルス保持と、ウイルスフィルターに起因するウイルス保持との間で正確な区別を行うことは、これまで従来技術では不可能であった。
【０００３】
ウイルス除去研究は、大部分が、契約研究所として知られる専門企業で実行される。この目的で、一般的に、個々のプロセス工程用の出発材料を、契約研究所に送る必要がある。多くの場合、輸送は、急速冷凍条件（−２０℃／−７０℃）で行われる。産物安定性（凝集体形成）のため、凍結が不可能である場合には、輸送は、冷却条件（２℃〜８℃）下で行われる。
【０００４】
「凍結／解凍」方法は、標的産物又はそうでなければプロセス溶液中の同様の二次産物の凝集体の形成を促進するか、又はより一層高める傾向にある。これらは、プロセス中間体の直接的な更なるプロセシングによりＧＭＰプロセス（適正製造基準プロセス）において見出されるべきではない人工産物であるといえる。ウイルス研究の「典型（representative）」である解凍されたプロセス溶液の使用が可能であるためには、上記凝集体を、プロセス吸着体として既知のプレフィルターを介した予備濾過（prefiltration）によって除去しなくてはならない。
【０００５】
「ウイルス濾過」プロセス工程において、凝集体は、狭孔のウイルスフィルター膜（サイズ排除膜）を遮断することがあり、それにより、（サイズ排除）フィルターの性能（流速／濾過容量／耐用寿命）が大いに損なわれることから、実際のプロセスにおける凝集体の形成は同様に望ましくない。
【０００６】
したがって、ウイルス研究中のプロセス吸収体による予備濾過は、「濾過するのが困難な溶液」のためのプロセス管理の一部として、又はそうでなければ「凍結／解凍」後の調整（correction）の状況のため、不可避である。
【０００７】
予備濾過が、「凍結／解凍」中に形成される凝集体を除去するのに役立つ場合に関して、実際のウイルスフィルター（サイズ排除フィルター）を遮断する危険性は、これらの場合において、プロセス溶液が自発的に凝集体を再形成する傾向にない場合には、「オフラインで」実行される予備濾過によってすでに回避されている。
【０００８】
しかしながら、「濾過するのが困難な溶液」の場合における手順は、ウイルス研究の一部として「オフラインで」実行される予備濾過後に、プロセス溶液がもう一度凝集体を形成するのに十分な時間を有する場合には、予備濾過もまたウイルス研究の一部として「インラインで」行う必要がある。しかしながら、上記の「インラインでの」予備濾過は、それらの現在の形態ではウイルス研究において確立されたアプローチと不適合である。
【０００９】
吸着材料は、プレフィルター（プロセス吸着体）として通常使用される。かかる吸着材料は、特異的又は非特異的な吸着に基づく分離を達成するために産業界における多種多様な部門で使用される。これに関連して、吸着は、表面現象である。多くの場合、多孔質材料は、小型の外側形態で、結合不純物が近づきやすい大きな内部表面を提供するため、吸着性プレフィルターとして使用される。上記多孔質材料はとりわけ、サイズ排除に基づく材料の分離特性に対して効果を有する孔径を特徴とする。第一に、結合するための大きな表面を提供しながら、小型の外側形態を維持することが困難であり、第二に、孔径を選択することが困難であることから、ウイルスの有意なサイズ排除が、ウイルス除去研究における使用の場合にプレフィルターで明らかに観察することができない。これは、生産規模に、同時にウイルス除去研究に使用される孔径では、不十分な程度でのみ可能である。
【００１０】
本発明において、サイズ排除特性は、粒子のサイズ、即ち長軸又は容積の範囲に基づく機械的分離に役立つ全ての特性である。粒子分離限界が、試料粒子に基づいて規定され得ることは、サイズ排除特性を有する成型体又はデバイスに特有である。粒子分離限界は、規定比率の濃度又は数に保持される試料粒子の直径によって規定される。粒子分離限界の典型的な定義は、９０％カットオフである。所要の試料サイズに応じて、最も狭い考え得るサイズ分布を有する成型体又は粒子分離限界の決定に適した分子が使用される。分子粒子の場合、分子量が直径の代わりに使用される。
【００１１】
吸着性プレフィルターが従来技術においてどのように使用されているか、また本出願において吸着性プレフィルター（プロセス吸着体）が意味すると理解されるべきものに関する記述は、例えば、特許文献１に見られる。特許文献１では、ポリアミドで構成される成型体を、生体高分子及びウイルスを流体から除去する方法において使用することができることが開示されている。特許文献２において開示される異なる方法は、ウイルス除去濾過に先立つ凝集体の除去に使用される珪藻土を含有する荷電及び／又は修飾膜又はデプスフィルター材料の使用について記載している。しかしながら、上記出願はいずれも、除去研究における使用の課題を追求しておらず、また詳細に規定されていないプレフィルターのウイルス除去の結果としてこれらの方法を使用する場合に生じる問題を解決していない。
【００１２】
ウイルス除去研究における溶液の不純物により生じる問題、即ち、フィルター面積のスケーリング（scaling：拡張）がウイルス除去研究と生産規模との間で体系統的に異なることは、特許文献３に記載されている。特許文献３では、超遠心分離及び陽イオン交換体での吸着工程、又は一般にクロマトグラフィー精製工程を実行することによって、ウイルスストック溶液由来の不純物を最低限に抑えること、及びストック溶液の濃度を増加させることが可能であることが開示されている。クロマトグラフィー精製に関して特許文献３に記載される材料は、ほとんどが特許文献２においても言及されている材料に相当する。さらに、クロマトグラフィーカラムはまた、媒体として明確に言及されている。しかしながら、特許文献３からの方法を使用する場合には、不純物が、プロセス溶液から生じることもあり、吸着プレフィルターによって生産規模で除去されるという問題は、解決されておらず、それらの使用は、ウイルス除去研究において「インラインで」は不可能である。
【００１３】
「インラインで」行われる予備濾過を用いたウイルス除去研究は、例えば、下記の通りに実行することができる：
任意選択：（急速）冷凍プロセス溶液の解凍
プロセス溶液の分取
予め規定した比（［（ｖ／ｖ）％］での「スパイク比」）でのウイルスストック溶液の添加
添加されたウイルスの種類／サイズに応じて、添加されるウイルス粒子が、確実に「単分散」様式で、即ちウイルス凝集体を伴わずに存在するように、プロセス非依存的な予備濾過が実行される。例えば、予備濾過は、モデルウイルスＭｕＬＶ（マウス白血病ウイルス、８０ｎｍ〜１２０ｎｍ）に関して孔径０．４５μｍを有するサイズ排除フィルターを用いて実行され、典型的なパルボウイルス（例えば、ＰＰＶ又はＭＶＭ、１８ｎｍ〜２４ｎｍ）に関しては、０．１μｍのサイズ排除フィルターが使用される。
ウイルス濃度の出発値を決定することが可能であるように、契約研究所の従業員による試料「負荷（load）」の減少。
実際のウイルスフィルター（サイズ排除フィルター）の上流に「インラインで」統合されたプレフィルター（プロセス吸着体）を使用したウイルス濾過の実施。
ウイルス濾過後のウイルス濃度の最終値を決定することが可能であるように、契約研究所の従業員による試料「濾液」の減少。
【００１４】
規制当局による要件（例えば、非特許文献１）は、個々のウイルス除去プロセス工程の作用メカニズムが、既知であり、かつ明らかに同定されていなければならないことである。例えば、吸着及びサイズ排除の組合せによるウイルス除去に関する多重工程の同時使用は、この場合、除去が、規制に準じて、規定の作用機序に帰することができないため、望ましくない。通常、ウイルス除去は、単離されたサイズ排除フィルターを使用する場合に、サイズ排除のメカニズムにより行われる。しかしながら、上述の方法の場合、吸着及びサイズ排除の両方がここで寄与し得るため、メカニズムは不明瞭である。
【００１５】
さらに、直交性の（orthogonal：次元の異なる）除去方法が、生物医薬品を生産するプロセス全体において必要とされる。ここで、直交性とは、除去に関する方法の基本的な作用機序に関する。例えば、除去はまた、同じ方法の一連の実施によって示され得るが、示される除去の総和は、おそらく実際の値を過大評価するであろう。
【００１６】
この仮定は、ウイルスの集団が、それらの特性に関して当然異種性であり得るという事実に基づき、それは、特異的な方法を使用した除去には不可欠である。例えば、吸着体に対するウイルスの親和性は、同じウイルス種内でさえ、除去が、選択につながるような程度に異種性であり得る。この前選択したウイルス集団は、更なる吸着工程において第１の工程とは異なる挙動をする。
【００１７】
ウイルス除去研究の中心となる要件は、拡張可能性（scalability：スケーラビリティ）である。実際の生産規模で研究を実施することは、技術的に不可能であるが、それは、研究において、可能な限り的確に反映される（represented）べきである。生産規模の反映は、生産規模で首尾よくかつ好適に使用される吸着性プレフィルター（プロセス吸着体）の使用の場合、今日までに既知の方法で、限られた程度でのみ可能である。特に、現在までに既知の従来技術において、上流にプロセス吸着体を使用する場合に、吸着特性に基づく分離と、サイズ排除特性に基づく分離との間を区別することは、多くの場合で不可能であるという問題が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】独国特許第１０２０１１１０５５２５号
【特許文献２】米国特許第７，１１８，６７５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０８８２２８号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】ICH Guideline Q5A(R1), page 8, 2nd paragraph
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の課題は、連続して上流に接続されるプロセス吸着体によって遮断吸着種から保護されるサイズ排除フィルターの対数減少値（ＬＲＶ）を決定する方法を提供することであり、この方法は、この結果として、研究室規模のウイルス除去研究における生産規模のより現実的な反映を達成するように、２つの分離メカニズム「吸着」及び「サイズ排除」を互いに分離させることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明は、プロセス溶液の粒子に関するサイズ排除フィルターＧの対数減少値ＬＲＶサイズ排除フィルターを決定する方法であって、該粒子は、浄化対象物であり、該サイズ排除フィルターＧは、連続して上流に接続されるプロセス吸着体Ｐによって、該プロセス溶液中に存在する遮断吸着種から保護され、浄化対象の該粒子は、０．５以上のＬＲＶプロセス吸着体を有する該プロセス吸着体Ｐによって保持され、
（ａ）ＬＲＶサイズ排除フィルターを決定するサイズ排除フィルターＧ、及び、
テスト吸着体Ｔであって、該テスト吸着体は、連続して該サイズ排除フィルターＧの上流に接続され、かつ該プロセス吸着体Ｐに類似した材料からなり、該テスト吸着体を用いることで、浄化対象の該粒子が、２以下の既知のＬＲＶテスト吸着体で保持され、ここで、ＬＲＶテスト吸着体＜ＬＲＶプロセス吸着体である、テスト吸着体Ｔ、
を含むテストシステムを準備する工程と、
（ｂ）浄化対象の該粒子に関する該テストシステムのＬＲＶテストシステムを決定する工程と、
（ｃ）ＬＲＶテストシステムからＬＲＶテスト吸着体を差し引くことによって、ＬＲＶサイズ排除フィルターを算出する工程と、
を含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明によれば、対数減少値ＬＲＶは、フィルターの通過前の除去対象のプロセス溶液（「供給溶液」）中の物質の濃度「Ｃ供給」と、フィルターの通過後の除去対象のプロセス溶液中の（即ち、濾液中の）物質の濃度「Ｃ濾液」との商の対数、即ち、ＬＲＶ＝ｌｏｇＣ供給／Ｃ濾液として定義される。
【００２３】
本発明によれば、「プロセス溶液」という用語は、いかなる特定の制限も受けず、特に、遮断吸着種（例えば、生体高分子及び／又はポリペプチド）、除去対象の粒子（例えば、ウイルス）及び標的分子（例えば、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、組換えタンパク質、又はアルブミン、免疫グロブリン、凝固因子及び血液、血漿中若しくは真核細胞の内部に存在する他のタンパク質若しくはポリペプチド等の血液及び血漿由来の産物）を含む水溶液（例えば、タンパク質水溶液）を指す。
【００２４】
本発明による方法は、サイズ排除フィルターＧ及び連続して上流に接続されるプロセス吸着体Ｐを含む濾過システムにおいて、浄化対象のプロセス溶液の粒子に関するサイズ排除フィルターＧのＬＲＶサイズ排除フィルターを決定することを可能にする。連続して上流に接続されるプロセス吸着体は、サイズ排除フィルターＧを、プロセス溶液中に存在する遮断吸着種から保護するために、上記濾過システムにおいて必要とされる。これに関連して、プロセス吸着体Ｐ自体はすでに、０．５以上のＬＲＶプロセス吸着体で、浄化対象の粒子を保持し、即ち、浄化対象の粒子の少なくとも６８．４％がすでに、プロセス吸着体Ｐによりプロセス溶液から除去されている。好適には、通常の操作で（即ち、生産規模で）、浄化対象の種の一部がすでに、プロセス吸着体Ｐによってプロセス溶液から除去されているとしても、本発明による方法により、除去対象の粒子に関するサイズ排除フィルターＧのＬＲＶサイズ排除フィルターを決定することが可能である（図１を参照）。
【００２５】
本発明によれば、プロセス吸着体又はテスト吸着体による予備濾過は、「インラインで」実行され、それは、明らかに同定されているウイルス除去のメカニズムのガイドラインを満たすことを意味する。
【００２６】
本発明による方法の工程（ａ）において、ＬＲＶサイズ排除フィルターを決定するサイズ排除フィルターＧ、及び連続してサイズ排除フィルターＧの上流に接続されるテスト吸着体Ｔを含むテストシステムが提供される。これに関連して、テスト吸着体Ｔは、プロセス吸着体Ｐに類似した材料からなり、即ち、テスト吸着体Ｔ及びプロセス吸着体Ｐは、同じ基材（例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等）のみからなる。
【００２７】
本発明によれば、テスト吸着体Ｔは、２以下の既知のＬＲＶテスト吸着体で、浄化対象の粒子を保持し、ここで、ＬＲＶテスト吸着体＜ＬＲＶプロセス吸着体であり、即ち、テスト吸着体Ｔは、プロセス吸着体Ｐよりも少ない浄化対象の粒子を保持する。
【００２８】
テスト吸着体Ｔの正確なＬＲＶテスト吸着体は、本発明による方法の特異的なプロセス条件に関して既知である（例えば、テスト吸着体の製造業者のデータから）か、又は特異的なプロセス条件に関して、即ち、浄化対象の粒子、浄化対象の溶液のｐＨ及び塩濃度等に応じて、工程（ａ）の前の任意選択の工程で決定される。例えば、このことは、上述するように、テスト吸着体の通過前のプロセス溶液中の浄化対象の粒子の濃度（「Ｃ供給」）及びテスト吸着体の通過後のプロセス溶液中の浄化対象の粒子の濃度（「Ｃ濾液」）を決定すること、並びにこれらの変数の商から対数を算出することによって行われる。ＬＲＶテスト吸着体の上述の決定は、本発明による方法のテストシステムに未だに適合されていないテスト吸着体Ｔで行われることが好ましい。
【００２９】
したがって、工程（ａ）の前に、本発明による方法は、任意選択で、浄化対象のプロセス溶液粒子に関するテスト吸着体ＴのＬＲＶテスト吸着体を決定する工程（ａ’）を含み、工程（ａ’）におけるテスト吸着体Ｔは、構成が同一である（例えば、同じバッチ）か、又は本発明による方法の工程（ａ）におけるテストシステムのテスト吸着体Ｔと同一である（例えば再生後の更なる使用）。
【００３０】
本発明による方法の工程（ｂ）において、テストシステムのＬＲＶテストシステムは、浄化対象の粒子に関して決定される。
【００３１】
本発明による方法の工程（ｃ）において、ＬＲＶサイズ排除フィルターは、ＬＲＶテストシステムからＬＲＶテスト吸着体を差し引くことによって算出され、即ち、ＬＲＶサイズ排除フィルター＝ＬＲＶテストシステム−ＬＲＶテスト吸着体である。
【００３２】
本発明は、連続して上流に接続されるプロセス吸着体Ｐが、サイズ排除フィルターＧを遮断吸着種から保護するのに必要とされる生産規模の濾過システムにおける、浄化対象のプロセス溶液の粒子に関するサイズ排除フィルターＧのＬＲＶサイズ排除フィルターが、プレフィルター（テスト吸着体Ｔ）によって遮断吸着種から同じ様式で同様に保護される同じサイズ排除フィルターＧを有する（即ち、同一の「カットオフ」値を有するが、より小さい寸法である）テストシステムに対する実験を実行することによって決定することができるが、研究室規模のテストシステムのテスト吸着体Ｔは、より大きな孔のため、十分大量（ＬＲＶテスト吸着体≦２）の浄化対象の粒子を通過させることが可能であるという見解に基づく。
【００３３】
妨げられずにテストシステムのテスト吸着体Ｔを通過可能な浄化対象の粒子の量がより多いと、浄化対象のプロセス溶液粒子に関するサイズ排除フィルターＧの対数減少値ＬＲＶサイズ排除フィルターの決定はより信頼性が高くなる。したがって、本発明の好ましい実施の形態によれば、テスト吸着体Ｔは、１．５又以下、より好ましくは１．０以下、更に好ましくは０．５以下のＬＲＶテスト吸着体を有する。最も好ましくは、テスト吸着体Ｔは、この場合において、（ほぼ）全ての浄化対象のプロセス溶液粒子が、妨げられずにテスト吸着体を通過するため、「０」に近いか又はちょうど「０」のＬＲＶテスト吸着体を有し、サイズ排除フィルターＧは、遮断吸着種から保護され続ける（図２を参照）。
【００３４】
吸着体、即ち、本発明の方法で使用され得るプロセス吸着体及びテスト吸着体は、概して、それらの外側及び内側表面上で、表面上に結合された特異的な化学基（いわゆるリガンド）を用いて、物質を化学的又は物理的に結合する、即ち固定化することができる材料である。リガンドを有する上記吸着体の例は、特許文献２に記載されるような荷電及び／又は修飾膜、並びに更には、リガンドが付されているか、又はそれらの製造の結果としてリガンドを保有する、例えば、シリカゲル、珪藻土若しくは酸化アルミニウム等の高分子支持体材料又は無機支持体材料で構成されるゲル、モノリス、ビーズ及び他のカラム材料等の典型的なクロマトグラフィー媒体である。さらに、本発明の吸着体はまた、外側又は内側表面上でのそれらの特性において、全体として特性が異ならず（即ち、リガンドを含有しない）、同様に適切な条件下でそれらの表面上に物質を固定化する特性を有する材料を意味する。この種類の吸着体として、例えば、特許文献１に記載される材料、より具体的には、吸着特性を有し、また外側又は内側表面上でのそれらの特性において、全体として特性が異ならない膜が挙げられる。さらに、米国特許出願公開第２０１０／０１０００２７号に記載されるような珪藻土、シリカゲル、珪藻土、活性炭、及び鉱物土類（mineral earths）、ナノ構造を有する吸着材料及び土等の材料が、本発明では吸着体である。
【００３５】
本発明の好ましい実施の形態において、機械的な一体成型体として存在する吸着体、即ち、バルク充填ではない吸着体が使用される。特に好ましい実施の形態は、膜の形態での多孔質成型体としての吸着体の実現である。
【００３６】
本発明による方法のプロセス吸着体Ｐは、遮断吸着種に関する比吸着容量ｋ１を有し、スケールＭ１で存在し、したがって、遮断吸着種に関してｋ１×Ｍ１の総吸着容量を有する。同様に、テスト吸着体Ｔは、遮断吸着種に関する比吸着容量ｋ２を有し、スケールＭ２で存在し、したがって、遮断吸着種に関してｋ２×Ｍ２の総吸着容量を有する。
【００３７】
本発明の好ましい実施の形態によれば、この場合において、遮断吸着種に関するプロセス吸着体Ｐ及びテスト吸着体Ｔの総吸着容量はほぼ同じであり、したがって、テストシステムは、生産規模の濾過システムについて非常に現実的な提示を可能にするため、０．１＜ｋ１Ｍ１／ｋ２Ｍ２＜１０である。プロセス吸着体Ｐ及びテスト吸着体Ｔの総吸着容量が、より類似すると、テストシステムによる生産規模の濾過システムのミラーリングはより現実的となる。したがって、より好ましくは、０．５＜ｋ１Ｍ１／ｋ２Ｍ２＜５であり、より好ましくは０．９＜ｋ１Ｍ１／ｋ２Ｍ２＜１．１である。
【００３８】
結合又は固定化特性は、吸着体の材料に特有である。結合され得る物質の量は、分子結合場所の利用可能性に依存する。本明細書で記載及び使用するようなかかる吸着現象について記載するための根本的な研究は、例えば、「S. Brunauer, P. H. Emmett, E. Teller: Adsorption of Gases on Multimolecular Layers. In: J. Am. Chem. Soc. 60, No. 2, 1938, pages 309-319」又は「Langmuir: Surface Chemistry. Nobel Lecture, December 14, 1932. In: Nobel Lectures, Chemistry 1922-1941. Elsevier Publishing Company, Amsterdam, 1966」に見出される。特定の吸着剤に関する結合部位の数は、吸着剤の取り込まれる質量、即ち吸着又は固定化される質量（容量）として巨視的に記載される。これに関連して、容量はまた、結合部位の数がそれに比例するため、規模非依存性材料定数、比容量に達するように、吸着体の質量又は容積に対して標準化され得る。
【００３９】
本発明で、吸着剤の適切なモデルを使用して容量を決定するのは十分である。本明細書に提示するスケーリング方法に関して、同じ材料の異なる吸着体の利用可能な結合場所の一定の比率が、それによって表される限り、即ち、異なるサイズ排除特性を有する同じ材料で構成された２つの吸収体の容量の比率を決定することができる限りは、吸着体の決定される容量が、実際の吸着剤の量に正確に対応するかどうかは重要ではない。
【００４０】
本発明によれば、プロセス吸着体Ｐ及びテスト吸着体Ｔの総吸着容量の決定は、いかなる特定の制限も受けない。本発明において、容量を決定するのに適した方法は、例えば、ガス吸着による、より具体的には、ラングミュアの等温式又はＢＥＴ等温式（ブルナウア・エメット・テラーの等温式）に従う、内側表面積の決定である。
【００４１】
吸着容量を決定する代替的な方法は、破過曲線による決定である。この方法において、各種物質の混合物の構成成分としての、又は純粋な物質としての、一定濃度の吸着剤の一定の内向き流を吸着体に適用して、吸着剤の濃度及び量を吸着体の上流及び下流の両方で測定する。吸着体の下流の濃度が、吸着体の上流の濃度の１０％に達する場合、吸着体の容量は消耗され、内向き流における適用された吸着剤と、吸着体の外向き流における外に流れる吸着剤との間の質量の差は、吸着体の容量の尺度として役立つ。動力学的効果を同定して、最低限に抑えるために、破過曲線は、少なくとも５倍異なる様々な内向き流の速度（単位時間当たりの吸着剤の内向きに流れる質量として定義される）で決定される。次に、内向き流の速度を、容量が、内向き流の速度と無関係になるまで減少させる。当業者にとって、同様に、スケーリングされる特定の規模で実際に使用されるプロセスパラメーターに関する動的容量を決定するのは十分であることが明白である。吸着剤の濃度を決定する方法は、吸着剤の性質に応じて実行される。当業者は、必須の方法を認識しており、したがって、例として、確立された方法の包括的ではない選択についてのみ、本明細書で言及される：確率された方法は、ＩＲ、可視光、ＵＶの領域内での吸収又は蛍光ベースの検出；屈折率、適切な電極上での電気化学的電位による検出；伝導性、比熱、誘電性による検出、並びに吸着剤含有混合物の組成及び吸着剤の濃度を考慮に入れる他の方法である。
【００４２】
本発明の１つの実施の形態において、容量を決定するために、モデルタンパク質を用いた結合実験を使用することもまた可能である。これに関連して、タンパク質結合を決定する確立された方法は、ＢＣＡアッセイである（「ＢＣＡ」は、２，２−ビキノリン−４，４−ジカルボン酸二ナトリウム塩二水和物に相当する）。
【００４３】
更なる方法は、静的インキュベーション、即ち、吸着剤を、吸着体と接触させること、続いて、未結合吸着剤と結合吸着剤とのマスバランスを決定することである。タンパク質の使用の場合、例えば、タンパク質濃度の基の蛍光による決定、又は２７０ｎｍ〜２８０ｎｍの範囲内の、若しくは２３０ｎｍの波長でのＵＶ光の吸収を用いた決定が利用可能である。結合又は未結合吸着剤の質量の平衡を保つ方法は、当業者によって容易に選択することができ、吸着剤の性質によって導かれる。
【００４４】
１つの実施の形態によれば、特に好ましいテスト粒子が、１００ｎｍ〜２００ｎｍのサイズのウイルスであるため、テスト吸着体Ｔは、１０ｎｍ以上、好ましくは２０ｎｍ以上、特に好ましくは５０ｎｍ以上のサイズ排除限界（９０％カットオフ）を有する。
【００４５】
サイズ排除フィルターは、本発明において、Pure Appl. Chem., 1996, 68, 1479で規定されるようなマイクロフィルター及びウルトラフィルターである。これに関連して、関係する精密濾過（microfiltration）は、０．１μｍよりも大きな粒子及び溶解された巨大分子が保持される圧力駆動型の膜ベースの分離方法として規定される。対比して、限外濾過は、０．１μｍよりも小さく、かつ約２ｎｍよりも大きな粒子及び溶解された巨大分子が保持される圧力駆動型の膜ベースの分離方法として規定される。サイズ排除フィルター用の考え得る材料は、例えば、セルロース、酢酸セルロース及び硝酸セルロース等のセルロース誘導体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテルケトン、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、芳香族及び脂肪族ポリアミドで構成されるポリマー、Ａｌ２Ｏ３、ケイ酸塩、窒化物、ホウ化物及びこれらの物質の混合物等のセラミック、即ち、多孔質の機械的な一体成型体が生産され得る材料である。本発明による方法において、サイズ排除フィルターのサイズ排除限界（９０％カットオフ）は、テスト吸着体のサイズ排除限界（９０％カットオフ）よりも小さい。好ましい実施の形態によれば、サイズ排除フィルターのサイズ排除限界（９０％カットオフ）は、１μｍよりも小さく、より好ましくは２００ｎｍよりも小さく、特に好ましくは５０ｎｍ〜２ｎｍである。
【００４６】
本発明によれば、サイズ排除フィルターＧが、連続して上流に接続されるプロセス吸着体Ｐ又はテスト吸着体Ｔによって保護される遮断吸着種は、いかなる特定の制限も受けない。例えば、遮断吸着種は、生体高分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ、多糖等の細胞外基質の成分）、生体高分子凝集体（例えば、タンパク質凝集体、上述の生体高分子の純粋物質凝集体及びそれらの混合凝集体）、生物学的粒子（例えば、細菌及びマイコプラズマ等の微生物）からなる群の少なくとも１種である。
【００４７】
好適には、本発明による方法は、小規模反映及び生産規模のウイルス除去研究の分析に使用することができる。特に、本発明による方法は、従来技術で既知の方法と対比して、プレフィルターに起因するウイルス保持と、ウイルスフィルターによって引き起こされるウイルス保持との間を定量的に区別することを可能にさせる。結果として、好適には、信頼性が高く、かつ正確な様式でウイルス除去研究におけるウイルス保持を決定することが可能であり、そのウイルス保持は、単にウイルスフィルターから生じるものであり、ウイルス保持値は、プレフィルターによって成される寄与により変造されない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】プロセス吸着体Ｐ及びサイズ排除フィルターＧを含む生産規模の濾過システムを示す図である。
【図２】生産規模の濾過システム（左）及びテストシステム（右）を示す図である。
【図３】金ナノ粒子に関する実施例１の結果を示す図である。
【図４】ラテックスビーズに関する実施例１の結果を示す図である。
【図５】実施例３からの濾過の結果を示す図である。
【図６】実施例３からの濾過の結果を示す図である。
【実施例】
【００４９】
本発明は、下記の非制限的な実施例に基づいて、より詳細に解明される。
【００５０】
実施例１：吸着体のサイズ排除限界の決定
この例示的な実施形態において、ポリアミドで構成される微孔質膜を吸着体として使用する。上記実施形態において、「２５００６」及び「２５０５８」は、同じ基本物質（基材）から生産されたが、異なるサイズ排除特性を有する２つの膜である：「２５０５８」は、本発明においてはプロセス吸着体であり、「２５００６」は、本発明においてはテスト吸着体である。上述の材料は、下記特性を有する：
２５００６：ポリアミド吸着体、公称孔径０．４５μｍ、
２５０５８：ポリアミド吸着体、公称孔径０．１０μｍ。
【００５１】
膜は、フィルター円板として使用される。蛍光ラテックスビーズは、試料粒子として使用される。ビーズのサイズは、後方散乱モードで動的光散乱を使用して、ｚ平均値から決定される。決定は、Malvern社のゼータサイザーナノを使用することによって実行される。
【００５２】
その後、各種吸着体は、ＬＲＶテスト吸着体及びＬＲＶプロセス吸着体を決定するために、ａ）金ナノ粒子の濾過に、及びｂ）蛍光ラテックスビーズの濾過に使用される。
【００５３】
さらに、テスト吸着体Ｔ及びサイズ排除フィルターＧで構成されるテストシステムにおけるこれらの粒子の保持ＬＲＶテストシステムは、工程（ｂ）における本発明による方法に記載するように決定される。
【００５４】
比較のため、プロセス吸着体Ｐ及びサイズ排除フィルターＧで構成されるプロセスシステムにおけるこれらの粒子の保持も確認する。下記工程（ｃ）における上記プロセスシステムからのＬＲＶサイズ排除フィルターの確認は、本発明によるものではなく、従来技術によるものである。この例示的な実施形態において、これまでのこの通例のタイプの確認の不都合が示される。
【００５５】
本発明による方法の工程（ｃ）において、サイズ排除フィルターの保持は、差ＬＲＶテストシステム−ＬＲＶテスト吸着体から決定される。
【００５６】
従来技術による本発明ではない算出の場合、即ち、ＬＲＶサイズ排除フィルター＝ＬＲＶプロセスシステム−ＬＲＶプロセス吸着体に従って、この例示的な実施形態の結果の説明において後に記載するように、不都合が生じる。
【００５７】
粒径の決定及び濾過の説明
ウイルスの他に、ナノ粒子は、サイズ排除フィルターによって保持される粒子タイプである。この例示的な実施形態において、金ナノ粒子及び蛍光標識したラテックス粒子が使用される。ポリアミド膜層（ＰＡ膜層）は、吸着体Ｐ及び吸着体Ｔとして使用され、サイズ排除フィルターは、この場合、公称孔径２０ｎｍを有するポリエーテルスルホン膜である。
【００５８】
製造業者のデータに従って、５０ｎｍ（金／Nanopartz；ＣＡＳ：Ａ１１−５０−ＣＩＴ−１００；ロット：Ｅ２４５１Ｃ）及び２００ｎｍ（蛍光ラテックスビーズ／Thermo Fisher；Ｆｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ；ＣＡＳ：Ｇ１００）の公称サイズを有する粒子を使用する。このサイズの粒子は、異なる孔径のＰＡ吸着体を使用するウイルスのモデルの役割を果たす。
【００５９】
粒子の単分散性及びサイズを検証するために、動的光散乱を使用して確認する。
【００６０】
ＤＬＳ（動的光散乱）に基づく粒子のサイズの決定：
方法の説明：
−ＤＬＳ設定：
−材料：ラテックス又は金
−分散剤：保持温度２５℃の水、１８０ｓ
−セル型：ＺＥＮ００４０（小さなキュベット）
−測定：１７３°後方散乱
−データ加工処理：汎用（標準的な解像度）
【００６１】
粒子溶液の３つの独立した試料を用いた三重反復決定は、下記変数をもたらす：
金粒子、５０ｎｍ：
−ｚ平均値：５１．８±０．７ｎｍ
ラテックスビーズ、２００ｎｍ：
−ｚ平均値：２０１．６±０．３ｎｍ
【００６２】
誤差は、３回の測定の統計学的に決定される標準偏差に関する。
【００６３】
濾過並びに非濾液（nonfiltrate）及び濾液中の粒子濃度の決定：
プロセス吸着体Ｐは、公称孔径０．１μｍを有するポリアミド膜で構成される層構造によって表される。
【００６４】
テスト吸着体Ｔは、ポリアミド膜２５００５（公称孔径０．６５μｍ）の３つの層及び膜２５００６（公称孔径０．４５μｍ）の１つ層で構成される層構造における２つの異なる膜の組合せによって表される。
【００６５】
金、５０ｎｍ：ＵＶ−ＶＩＳによる検出。
【００６６】
溶液：約１の５２７ｎｍでの光学密度を有する０．２６％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有する金溶液。
【００６７】
濾過：膜に、５０Ｌ／ｍ２（吸着体のインシデントフロー面積当たりの容積）であるが、濾過装置のデッドボリュームの少なくとも５倍の０．２６％ＳＤＳ溶液を予め流す。
【００６８】
この後に、金−粒子溶液を濾過する。３０Ｌ／ｍ２であるが、濾過装置のデッドボリュームの少なくとも３倍の金−粒子溶液を、吸着体に通して濾過する。その後、粒子の濃度を決定するために、２つの試料を別々に収集する：
−１０Ｌ／ｍ２につき２つの画分を互いに別々に収集して、粒子含有量に関して分析する。
【００６９】
粒子の濃度の測定は、上述の粒子溶液の一連の希釈から作成される較正曲線に対して行われる。
【００７０】
金ナノ粒子は、５２７ｎｍでのそれらの吸収により定量化される。
【００７１】
ラテックスビーズは、それらの蛍光に基づいて定量化される。このことは、下記設定を使用することを含む：
【００７２】
溶液、２００ｎｍ：０．２６％ＳＤＳを含有するＲＯ−Ｈ２Ｏ中の０．５％の市販ラテックスビーズ溶液
−ラテックスを穏やかに回旋させ、続いて、超音波浴中でおよそ１５秒間維持する。
【００７３】
濾過：
−膜に、０．２６％ＳＤＳ溶液（Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）Ｍａｘ、０．５ｂａｒ；２５００６、０．１ｂａｒ）５ｍｌを流す、
−ラテックスビーズ溶液を含有する３ｇを流す、続いて、
−天秤によって、２×画分１ｇを収集する（蓋付きの４ｍｌガラス管）。
【００７４】
測定：
−分光計を蛍光に設定する（透明底黒色プレート「nunc社の９６Ｗｅｌｌ」ＣＡＳ：２６５３０１）
−励起波長：４６８ｎｍ；放出波長：５０８ｎｍ
−一連の標準物質／％：１００、７５、５０、２５、０
−測定容積：２００μｌ
−増幅、２００ｎｍ：８６
【００７５】
サイズ決定の結果：
金濾過（図３を参照）：
Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）Ｍａｘ（２５０５８＝プロセス吸着体）の保持は、平均で８０％であり、膜２５００５の場合では、その保持は、約２５％である（テスト吸着体）。膜２５０５８に関するｄ＝５０ｎｍの金ナノ粒子の保持は、ＬＲＶプロセス吸着体＝ｌｏｇ（Ｃ供給／Ｃ濾液）＝ｌｏｇ（１／０．２）＝０．６９に相当する。テスト吸着体に関しては、結果は、ＬＲＶテスト吸着体＝ｌｏｇ（Ｃ供給／Ｃ濾液）＝ｌｏｇ（１／０．７５）＝０．１２の保持である。
【００７６】
金ナノ粒子の濃度に関する決定様式              吸収
キュベット
波長                                        ５２７ｎｍ
バンド幅                                        ９ｎｍ
フラッシュの数                                ２５
静止時間                                        ０ｍｓ
【００７７】
ラテックス濾過（図４を参照）：
２００ｎｍ：Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）Ｍａｘ（２５０５８＝プロセス吸着体）の保持は、平均で９９．９％を上回り、膜２５００５（テスト吸着体）の場合では、その保持は、約１０％である。サイズが１９３ｎｍのラテックスビーズの保持は、プロセス吸着体に関して、大きなＬＲＶプロセス吸着体＝ｌｏｇ（Ｃ供給／Ｃ濾液）＝ｌｏｇ（１／０．００１）＝３である。テスト吸着体に関して、結果は、ＬＲＶテスト吸着体＝ｌｏｇ（Ｃ供給／Ｃ濾液）＝ｌｏｇ（１／０．９）＝０．０４である。
【００７８】
ラテックスビーズの濃度に関する決定様式          上記からの蛍光測定
励起波長                                                ４６８ｎｍ
放出波長                                                ５０８ｎｍ
励起バンド幅                                                ９ｎｍ
放出バンド幅                                              ２０ｎｍ
増幅                                                      ８６手動
フラッシュの数                                            ２５
積分時間                                                  ２０μｓ
遅延時間                                                    ０μｓ
静止時間                                                    ０ｍｓ
プレート領域                                    Ｄ６−Ｄ１０；Ｅ６−Ｈ９
【００７９】
本発明によれば、プロセス吸着体又はテスト吸着体による予備濾過は、「インライン」で実行され、それは、明らかに同定されているウイルス除去のメカニズムのガイドラインを満たすことを意味する。
【００８０】
テストシステムの保持ＬＲＶテストシステムは、サイズが５０ｎｍの金粒子に関して、及びサイズが１９３ｎｍのラテックスビーズに関して、テスト吸着体の組合せに関して決定され、比較例として、同様にプロセス吸着体を用いて決定される。粒子の濃度は、ＬＲＶテスト吸着体の決定に関して決定される。
【００８１】
この例示的な実施形態において、使用するサイズ排除フィルターは、Sartorius Stedim Biotech GmbHから市販されているＶｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＣＰＶ（公称孔径２０ｎｍを有するポリエーテルスルホン膜）ウイルスフィルターである。
【００８２】
２つのシステムの金ナノ粒子の保持は、
ＬＲＶテストシステム（２５００５／２５００６＋Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＣＰＶ）＞３．２
ＬＲＶテストシステム（２５０５８＋Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＣＰＶ）＞３．２
である。
【００８３】
２つのシステムのラテックスビーズの保持は、
ＬＲＶテストシステム（２５００５／２５００６＋Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＣＰＶ）≧３．２
ＬＲＶテストシステム（２５０５８＋Ｖｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＣＰＶ）≧３．２
である。
【００８４】
使用するテスト吸着体及びプロセス吸着体の保持の確認に類似して、ＬＲＶサイズ排除フィルターはここでは、本発明による方法の工程（ｃ）において、ＬＲＶテストシステムからＬＲＶテスト吸着体を差し引くことによって算出され、即ち、ＬＲＶサイズ排除フィルター＝ＬＲＶテストシステム−ＬＲＶテスト吸着体である。
【００８５】
サイズ排除フィルターＶｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＣＰＶの保持に関して、それにより、吸着体２５０５８を使用して、金ナノ粒子の保持に関して：
ＬＲＶサイズ排除フィルター＝ＬＲＶテストシステム−ＬＲＶテスト吸着体（２５０５８）
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧３．２−０．６９
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧２．５１
が得られる。
【００８６】
吸着体２５００６／２５００５を用いて、本発明による方法を使用して、金ナノ粒子の保持に関して：
ＬＲＶサイズ排除フィルター＝ＬＲＶテストシステム−ＬＲＶテスト吸着体（２５００６／２５００５）
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧３．２−０．１２
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧３．０８
が得られる。
【００８７】
類似して、ラテックスビーズに関する保持がここで決定される。吸着体２５０５８の使用に関して：
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧３．２−３．０
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧０．２
が得られる。
【００８８】
吸着体２５００６／２５００５を用いて、本発明による方法を使用して、より高い保持が検出される：
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧３．２−０．０４
ＬＲＶサイズ排除フィルター≧３．１６
【００８９】
実施例２：実施例１からの吸着体の吸着容量の決定
容量は、ＢＣＡ試薬を使用して、静的タンパク質吸着に基づいて確認される。ＢＣＡ試薬の酸化還元反応が、タンパク質の検出に使用される。ＢＣＡ試薬の溶液の呈色は、５６２ｎｍでの吸光度として定量化される。既知のタンパク質濃度の較正曲線を作成し、この較正を使用して、測定値を評価する。
【００９０】
詳細な説明：
１．ペトリ皿１つにつきγ−グロブリン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを添加する。
２．ピンセットを使用して、いかなる直接的な手の接触も回避しながら、個々のテスト試料（直径１３ｍｍ）及び参照試料を、それぞれの場合において、適切にラベルを付したペトリ皿（３．５ｃｍ）に入れる。（試料の直接的なマーキングは、必要に応じて、電気泳動ペンを用いて行うことができる）。
３．試料を振とう機（８０／分）において、室温（およそ２０℃）で３時間インキュベートする。
４．ピンセットを使用して、試料をペトリ皿から取り出して、それらを、適切にラベルを付したペトリ皿（１０ｃｍ）に移す。
５．ペトリ皿１つにつき、０．０５Ｍ  ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）１５ｍｌを添加して、１５分間振とうした後、ウォーターアスピレーター（water aspirator：水流吸引器）を使用して緩衝液溶液を慎重に吸引して、更にこの手順を３回繰り返す。
６．フィルター試料を、適切にマーキングしたペトリ皿（３．５ｃｍ）に個々に移す。
７．較正曲線を作成するために、γ−グロブリン溶液（１μｇ／μｌ）３×２５μｌ、３×５０μｌ、３×７５μｌ、３×１００μｌ（較正試料）及び３×０μｌ（＝ブランク試料）試料を、適切にラベルを付したペトリ皿（３．５ｃｍ）に個々にピペットで採取し（pipette）、皿１つにつきＢＣＡ試薬２０００μｌを添加して、振とう用プラットフォーム上に即座に配置して、続いて同様に、個々の膜試料に、それぞれＢＣＡ試薬２０００μｌを供給し、室温（およそ２０℃）で振とうする。
８．試料の光度測定は、１ｃｍのセミマイクロキュベット中で行われる。１時間後、まず、５６２ｎｍでブランク試料の吸光度値を決定し、対照目的で記入し（noted）、続く測定用にゼロに設定する。その後、較正溶液及び膜試料を、中断することなく、かつそれらの調製の順番で連続して測定し、吸光度値をテスト記録に記入する。
【００９１】
このようにして確認した吸着容量を使用して、この場合では、プロセス吸着体に対する面積比として、吸着体の量を決定する。相当する吸着体の容量決定及び得られた量の結果を表１に概要する。
【００９２】
【表１】
2019514672.tif 000003
【００９３】
実施例３：プロセス吸着体に関して様々なサイズ排除限界を有するテスト吸着体のスケーリング
上記表１において、ＢＣＡアッセイの結合容量から得られる倍率はすでに提示されている。上記倍率の実際の適用について以下に記載する。
【００９４】
各種ポリアミドプレフィルターを通るヒトＩｇＧタンパク質溶液の濾過：
濾過に関して、５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝液溶液（ｐＨ７．２）で、０．５％濃度に希釈したヒトＩｇＧ（５％溶液、SeraCare、カタログ番号ＨＳ−４７５−１Ｌ）の溶液を使用した。
【００９５】
使用した膜：
プレフィルター（ＶＦ）１：ナイロン６
公称孔径：０．３５μｍ
水に関するフロー時間［ｍｌ／（ｍｉｎ  ｃｍ２  ｂａｒ）］：２３
水を用いた場合の泡立ち点、目視［ｂａｒ］：２．９
【００９６】
プレフィルター（ＶＦ）２：ナイロン６
公称孔径：０．１μｍ
水に関するフロー時間［ｍｌ／（ｍｉｎ  ｃｍ２  ｂａｒ）］：６
水を用いた場合の泡立ち点、目視［ｂａｒ］：７
【００９７】
最終フィルター（ＥＦ）：表面修飾したウイルス保持性ポリエーテルスルホンＶｉｒｏｓａｒｔ（商標）ＨＣ膜（公称孔径２０ｎｍを有する表面修飾したポリエーテルスルホン膜）、二重層
公称孔径：２０ｎｍ
水に関するフロー時間［ｍｌ／（ｍｉｎ  ｃｍ２  ２ｂａｒ）］：０．１９
有効インシデントフロー面積：４．７ｃｍ２
【００９８】
濾過はともに、「インラインで」作動させ、即ち、ＶＦ及びＥＦは、濾過の開始前に、ルアーコネクターを介して互いに接続した。ＶＦ１モジュールは、有効インシデントフロー面積４．７ｃｍ２を有する一方で、ＶＦ２モジュールは、有効インシデントフロー面積３．１１ｃｍ２を有する。
【００９９】
同じストック溶液を用いて、かつ圧力２ｂａｒ下での濾過を並行して実行した。図５及び図６における異なる傾きは、２つの吸着体の流れ抵抗の差によって引き起こされる。
【０１００】
図５及び図６は、不純物に関する同じ結合容量が達成されるように、ここではＶＦ１及びＶＦ２と称される、使用した吸着体の量がスケーリングされるので、濾過した容積は、２つの濾過に関して事実上同一であることを示す。
【０１０１】
プレフィルターの膜面積の適切なスケーシングのおかげで、ほぼ同一の耐用寿命が達成された。
【０１０２】
プレフィルターの面積スケーリングに関する選択基準
膜の非特異的なタンパク質吸着を測定する方法の１つは、ＢＣＡ法において見出される。上記方法において、タンパク質は、膜に吸着して、ＢＣＡ試薬（２，２−ビキノリン−４，４−ジカルボン酸二ナトリウム塩二水和物）を使用して測光法により、定量的に決定される。
【０１０３】
これに関連して、下記の結果が確認された：
ＶＦ１：５２．７μｇ／ｃｍ２
ＶＦ２：８４．２μｇ／ｃｍ２
【０１０４】
続いて、濾過中に同一吸着に達するために、ＶＦ１の面積は、１．６倍増大されなければならなかった。
【図１】
2019514672.tif 000004
【図２】
2019514672.tif 000005
【図３】
2019514672.tif 000006
【図４】
2019514672.tif 000007
【図５】
2019514672.tif 000008
【図６】
2019514672.tif 000009
【国際調査報告】
2019514672.tif 000010
2019514672.tif 000011
2019514672.tif 000012
2019514672.tif 000013