(57)【要約】  本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性を示す親酵素に対して改変を示すペクチン酸リアーゼ変異体；このような酵素の生成方法；ならびに、生地、洗剤およびセルロース繊維加工産業におけるこのような酵素の使用方法に関する。親酵素に比して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤中において向上した安定性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペクチン酸リアーゼ変異体であって、ペクチン酸リアーゼ活性を有すると共に：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含み、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する変異体。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する親ペクチン酸リアーゼの変異体である、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記改変が正電荷アミノ酸であり、好ましくは前記正電荷アミノ酸はリシンまたはアルギニンであり、さらに好ましくは、前記改変が、位置：４８、４９、１０８、１２４および１４９からなる群から選択される１つ以上の位置におけるリシンまたはアルギニンに対する置換である、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体が：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項５】
位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体であって、番号付けは配列番号１に従い、および、前記改変は、独立して：
（ｉ）前記位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）前記位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）前記位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、変異体ペクチン酸リアーゼは、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する、ペクチン酸リアーゼ変異体。
【請求項６】
前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する親ペクチン酸リアーゼの変異体である、請求項５に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、好ましくは、洗剤中における安定性の尺度として半減期向上係数または残存洗浄性能を用い、さらに好ましくは、熱安定性の尺度としてサーマルシフトアッセイを用いた場合に、親酵素と比して、洗剤中における向上した安定性、または、向上した熱安定性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体を含む組成物。
【請求項９】
前記組成物が、クリーニングまたは洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄組成物である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ｉ）１種以上の洗剤成分であって、好ましくは：界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルダー、コビルダー、キレート剤、漂白剤成分、ポリマー、布地色相剤、布地コンディショナ、起泡増進剤、泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光白化剤、芳香剤、光学的増白剤、殺菌剤、殺菌・殺カビ剤、汚染物懸濁剤、汚染物遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素阻害剤、酵素安定剤、酵素活性化剤、酸化防止剤および溶解剤からなる群から選択される洗剤成分；ならびに／または
ｉｉ）１種以上の追加の酵素であって、好ましくは：プロテアーゼ、アミラーゼ、リケナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、マンナナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エステラーゼ、アラビナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ＤＮアーゼ、ペルヒドロラーゼ、βグルカナーゼ、キサンタンリアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、ラッカーゼ、アリールエステラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポオキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラギナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、エンド型β−マンナナーゼ、エクソ型β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される追加の酵素
をさらに含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペクチン酸リアーゼ変異体または組成物の使用であって：
ｉ）ペクチン質の切断における使用であって、好ましくは、前記ペクチン質はポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）またはその誘導体を含む使用、
ｉｉ）洗濯クリーニングまたは食器洗浄などの硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける使用、
ｉｉｉ）生地および／またはセルロース系繊維の加工における使用、
ｉｖ）生地からの細胞壁材料の酵素的除去における使用、
ｖ）ワインまたはジュースの加工における使用、ならびに
ｖｉ）動物飼料添加剤としての使用
からなる群から選択される、使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１４】
親ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を向上させる方法であって：前記親ペクチン酸リアーゼに：４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４８＋２５７、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６および２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を導入するステップを含み、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、前記改変されたペクチン酸リアーゼが、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％であるが、１００％未満の配列同一性を有する、方法。
【請求項１５】
１つ以上の位置における前記改変が：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ
からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ペクチン酸リアーゼ（例えば、親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号１または配列番号２を有する親ペクチン酸リアーゼ）の洗剤安定性を向上させる方法であって：前記ペクチン酸リアーゼ（例えば、前記親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号１または配列番号２を有する前記親ペクチン酸リアーゼ）中に、位置（例えば位置の組み合わせ）：２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変（例えば、置換、挿入または欠失）を導入するステップを含み、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有する前記ペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、前記ペクチン酸リアーゼ（例えば、前記改変されたペクチン酸リアーゼであって、例えば、前記改変を１つ以上の位置に含むペクチン酸リアーゼ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６であるが、１００％未満の配列同一性を有する方法。
【請求項１７】
前記親ペクチン酸リアーゼが、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上の位置における前記改変が、前記親ペクチン酸リアーゼと比して、＞１．０の半減期向上係数（ＨＩＦ）を有する変異体をもたらす、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、親酵素に対して改変を示すペクチン酸リアーゼ変異体；このような酵素の生成方法；ならびに、生地、洗剤およびセルロース繊維加工産業におけるこのような酵素の使用方法に関する。親酵素と比して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤中における向上した安定性、ならびに／または、例えば、洗濯プロセスおよび／もしくは洗濯および／もしくは食器洗浄用洗剤における向上した熱安定性を示す。
【０００３】
ペクチンポリマーは、植物細胞壁の重要な構成成分である。ペクチンは、交互に存在するホモガラクツロナン（平滑領域）およびラムノガラクツロナン（毛様領域）から組成される主鎖を有するヘテロ−多糖類である。平滑領域は、１，４−結合α−Ｄ−ガラクツロン酸の直鎖ポリマーである。ガラクツロン酸残基は、様々な程度で、通常は非ランダム形態に、カルボキシル基においてメチルエステル化されていることが可能であるが、ここで、ポリガラクツロン酸ブロックは完全にメチルエステル化されている。
【０００４】
ペクチン分解酵素（ペクチナーゼ）は、高メチルエステル化ペクチンまたは低メチルエステル化ペクチンおよびポリガラクツロン酸（ペクチン酸）といった好まれる基質に従って分類が可能であり、その反応メカニズムは、β−脱離または加水分解である。ペクチナーゼは主にエンド作用型であることが可能であり、鎖中の無作為な部位でポリマーを切断してオリゴマーの混合物をもたらすか、または、これらは、エクソ作用型であり得、ポリマーの一端から作用して、モノマーもしくはダイマーをもたらす。ペクチンの平滑領域において作用する数々のペクチナーゼ活性は、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）、ペクチンリアーゼ（ＥＣ４．２．２．１０）、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）、エクソ型ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．６７）、エクソ型ポリガラクツロ酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．９）およびエクソ型ポリ−α−ガラクツロノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．８２）などの、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（１９９２）によって提供されている酵素分類に含まれる。
【０００５】
ペクチン酸リアーゼは、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などの異なる細菌属からクローン化されてきている。バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｎａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＦＥＢＳ  ３３５：３１９−３２６）およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＹＡ−１４（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９４７−９４９）からのペクチン酸リアーゼのクローン化もまた記載されてきている。
【０００６】
バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のペクチン酸リアーゼの変異体は、国際公開第２００２／０９２７４１号パンフレットおよび国際公開第２００３／０９５６３８号パンフレットに開示されている。
【０００７】
ペクチン酸リアーゼは一般に、アルカリ性のｐＨが至適条件であると共に、二価カチオンが絶対条件であることにより特徴付けられ、Ｃａ２＋がもっとも促進性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、例えば洗剤または生地産業プロセスにおいて適用された場合に親ペクチン酸リアーゼを超える向上した性能を示す、細胞壁分解酵素変異体、ペクチン−分解酵素変異体、特にペクチン酸リアーゼ酵素変異体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ここで、本発明者らは、ペクチン酸リアーゼ中の一定のアミノ酸置換により、親酵素と比して中性またはアルカリ性のｐＨ範囲内において向上した性能および／または安定性を有する酵素変異体がもたらされることを見出しており、ここで、前記性能および／または安定性は例えば、保管の後および／またはその最中において特に向上している。本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤組成物中において用いられた場合に、向上した保管安定性、すなわち、洗剤成分に対する低い感受性または高温での向上した安定性を有する。
【００１０】
それ故、いくつかの態様において、本発明は、位置番号：２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体に関し、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【００１１】
いくつかの態様において（例えば、上記の態様のいずれか）、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、位置：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８および１４９（例えば、所与の順番で）からなる群から選択される位置に１つ以上の改変を含み、例えば、もっとも好ましい変異体は位置２５０に改変を含み、さらに好ましくは、変異体は位置１７６に改変を含み；さらに好ましくは、変異体は位置１２４に改変を含み；さらに好ましくは、変異体は位置３２５に改変を含み、さらに好ましくは、変異体は位置１０８に改変を含み、さらに好ましくは、変異体は位置１４９に改変を含む。
【００１２】
一態様に係るこのような変異体ペクチン酸リアーゼは、好ましくは：Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｄ１２４Ｙ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５ＬおよびＩ３２５Ｙからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。
【００１３】
本発明の変異体は、さらなる改変を含んでいてもよく；または、他の態様に係る変異体ペクチン酸リアーゼであって、好ましくは：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含むものであってもよい。
【００１４】
他の態様において、本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性（ＥＣ４．２．２．２）を有すると共に：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む親酵素の変異体に関し、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し（例えば、配列番号１の番号付けを用いて）、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【００１５】
他の態様において、本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性（ＥＣ４．２．２．２）を有すると共に、ｉ）実施例２の表１、ｉｉ）実施例３の表２、ｉｉｉ）実施例３の表３、ｉｖ）実施例４の表４、ｖ）実施例５の表５において本明細書に記載されている置換からなる群から選択される１つ以上の置換を含む親酵素の変異体に関し、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し（例えば、配列番号１の番号付けを用いて）、および、ここで、変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【００１６】
他の態様において、本発明は、ペクチン酸リアーゼ変異体をコードする核酸配列に関する。
【００１７】
本発明の他の態様においては、発現ベクターが提供されている。
【００１８】
本発明の他の態様においては、上記の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞が提供されている。
【００１９】
本発明の他の態様においては、１つ以上のアミノ酸を改変させるステップを含む、ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を向上させる方法が提供されている。
【００２０】
本発明の他の態様においては、上記に開示されている発現ベクターが導入されている細胞を培養し、これにより、核酸配列によってコードされた変異体を前記細胞に産生させるステップ、および、ペクチン酸リアーゼ変異体を回収するステップを含む本発明に係るペクチン酸リアーゼ変異体を産生する方法が提供されている。
【００２１】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、特にセルロースを含有する繊維、ヤーン、織布または不織布といったセルロース系材料の処理、機械製紙パルプまたは再生古紙の処理、および、繊維の発酵精錬に有用である。処理は、例えばのり抜きもしくは精錬ステップといった衣服製造もしくは布地製造に適した材料へのセルロース系材料の加工の最中に；または、このような布地もしくは衣服の産業もしくは家庭洗濯の最中に実施することが可能である。
【００２２】
従って、さらなる態様において、本発明は、かなりの細胞壁分解活性を有するペクチン酸リアーゼ変異体を含む洗剤組成物に関し；ならびに、例えば、セルロースを含有する繊維、ヤーン、織布または不織布のクリーニングといった処理のための本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の使用に関する。さらに、本発明の追加の態様は、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を他の酵素と組み合わせて含む酵素組成物に関し、ならびに、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を含むクリーニングまたは洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄組成物に関する。
【００２３】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、例えばその後の染色作業において適切に対応するためのセルロース系材料の調製における酵素による精錬プロセスにきわめて効果的である。
【００２４】
本発明の他の態様は、ワインおよびジュースの加工に関する。酵素または酵素調製物は、果実および野菜のマッシュの抽出性または分解性を向上させるために、マッシュの処理に用いても良い。
【００２５】
さらに、本発明の一態様は、動物飼料添加剤としての用途である。大豆、ナタネ、ルピナス等由来の植物材料を含有する飼料に添加した場合、ペクチン酸リアーゼ変異体によって、植物細胞壁材料のインビボ分解が顕著に向上され、これにより、動物による植物栄養分のより良好な利用が達成される。
【００２６】
さらに、本発明の一態様は、ペクチンを含有する天然の食品および加工食品による汚れを分解するための本発明の変異体の使用である。
【００２７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明の変異体が基づいている親ペクチン酸リアーゼを示す。親ペクチン酸リアーゼは、国際公開第２００２／０９２７４１号パンフレットに開示されているバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のペクチン酸リアーゼの変異体である。
【００２８】
配列番号２は、親ペクチン酸リアーゼと等しく好適である同族体ポリペプチドを示す（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ６ＬＥＱ４−Ｋｉｍ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  ５８：９４７−９４９）。
【００２９】
定義
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製されることが可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次ＲＮＡ転写物は、成熟型のスプライシングされたｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡの前駆体である。
【００３０】
コード配列：「コード配列」という用語は、変異体のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧまたはＴＴＧなどの開始コドンで開始され、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはこれらの組み合わせであり得る。
【００３１】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来（すなわち、同一の遺伝子由来）もしくは外来（すなわち、異なる遺伝子由来）のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。
【００３２】
対応する：本明細書において用いられるところ、「対応する」という用語は、特定のアミノ酸配列に対して参照がなされている配列の特定のアミノ酸を決定する方法を指す。例えば、本発明の目的のために、特定のアミノ酸位置に対して参照がなされている場合、他のアミノ酸配列においてどの特定のアミノ酸が目的のものであり得るかを決定するために、参照がなされている前記アミノ酸配列に対して前記他のアミノ酸配列をアラインメントすることが当業者は可能であろう。例えば、配列番号１もしくは２に前出の成熟配列、または、本明細書において列挙されているいずれかの他の配列に対する他のアミノ酸配列のアラインメントは、本明細書において他の箇所において記載されている。代替的なアラインメント法を使用し得、これらは当業者に周知である。
【００３３】
「洗剤安定性」または「保管安定性」：「洗剤安定性」または「保管安定性」という用語は、例えばアニオン性界面活性剤といった洗剤を含有する配合物中におけるタンパク質の安定性を意味することが意図されている。アニオン性界面活性剤は、アニオン基と疎水性末端との組み合わせにより特徴付けられる。それ故、タンパク質に結合する場合、リシンまたはアルギニンのような正に荷電された残基、および、疎水性の領域が相互作用点となりやすい。同様に、特定のフレキシブル領域の動きが、通常はタンパク質の内部に埋もれているアミノ酸へのアクセスを開く。これらの残基は、典型的には疎水性であり、それ故、界面活性剤の末端に誘引性である。酵素と界面活性剤との化学的相互作用では、高い確率で、酵素が不活性な状態とされることとなる。それ故、向上した洗剤安定性または保管安定性とは、一定の洗剤濃度および温度で、一定の期間後においてもより高い酵素活性が残存していることとなること（高い残存活性）を意味する。
【００３４】
従って、熱安定性および洗剤安定性はタンパク質または酵素の２つの独立した特徴である。
【００３５】
向上した洗剤安定性を有する本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、実施例３および／または４に記載されている分析方法に供した場合に、親ペクチン酸リアーゼと比して、少なくとも１２０％（好ましくは少なくとも１４０％、より好ましくは少なくとも１６０％、さらにより好ましくは少なくとも１８０％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、もっとも好ましくは少なくとも２５０％、および、特に少なくとも３００％）の残存活性を示し得る。
【００３６】
発現：「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含む、変異体の産生に関与するいずれかのステップを含む。
【００３７】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、その発現をもたらす制御配列作動可能にリンクされている直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００３８】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入等を受けやすい細胞種のいずれかを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを含む。
【００３９】
半減期向上係数：「半減期向上係数」または「ＨＩＦ」という用語は、以下の式：ＨＩＦ＝（Ｔ１／２）（変異体）／（Ｔ１／２）（基準ポリペプチド、例えば、親または主鎖ポリペプチド）に従って定義することが可能である。ＨＩＦを算出するための好ましい方法は、本明細書において参照により援用されている以下の実施例２にも記載されている。
【００４０】
硬質面クリーニング：「硬質面クリーニング」という用語は硬質面のクリーニングとして本明細書において定義され、ここで、硬質面は、床、机、壁、屋根等、ならびに、自動車（自動車洗浄）および食器（食器洗浄）などの硬質の物体の表面を含み得る。食器洗浄は、これらに限定されないが、プレート、カップ、ガラス、ボール、スプーン、ナイフ、フォークなどのカトラリー、配膳用具、セラミック、プラスチック、金属、陶磁器、ガラスおよびアクリルのクリーニングを含む。
【００４１】
向上した洗浄性能：「向上した洗浄性能」という用語は、本明細書において、例えば増大した汚れ除去による、親酵素の洗浄性能と比して増大した洗浄性能を示す変異体酵素として定義される。「向上した洗浄性能」という用語は、洗濯における洗浄性能、また、例えば自動食器洗浄（ＡＤＷ）などの硬質面クリーニングにおける洗浄性能をも含む。
【００４２】
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比して向上している変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、例えば液体洗剤中における安定性といった洗剤安定性、化学安定性、酸化安定性、ｐＨ安定性、保管条件下での安定性が挙げられる。
【００４３】
単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）特にこれらに限定されないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくはすべてが少なくとも部分的に除去されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補助因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質と相対的に人工的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界においては関連している他の成分に対する物質の量を増やすことにより修飾されたいずれかの物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連しているプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質が発酵ブロスサンプルに存在していてもよい。
【００４４】
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。
【００４５】
修飾：「修飾」という用語は、本発明のポリペプチドの文脈において、アミノ酸の挿入または欠失、好ましくは少なくとも１つの欠失によって、基準アミノ酸配列（すなわち、配列番号：１または２）中の１つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸よる置換で改変されることを意味する。「修飾」、「改変」および「突然変異」という用語は同義的に用いられ得ると共に、本発明の範囲内において同一の意味および目的を構成し得る。
【００４６】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成され、１つ以上制御配列を含む。
【００４７】
作動可能にリンク：「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
【００４８】
親または親ペクチン酸リアーゼ：「親」または「親ペクチン酸リアーゼ」という用語は、改変が行われて本発明の酵素変異体を産生する、ペクチン酸リアーゼ活性を有するいずれかのポリペプチドを意味する。例示的な親ペクチン酸リアーゼが配列番号１に示されている。親ペクチン酸リアーゼと等しく好適である同族体ポリペプチドが、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９４７−９４９（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｑ６ＬＥＱ４）に公知である。
【００４９】
ペクチン酸リアーゼ：「ペクチン酸リアーゼ」という用語は、非還元性末端に４−デオキシ−α−Ｄ−ガラクタ−４−エヌロノシル基を有するオリゴ糖をもたらす（１→４）−α−Ｄ−ガラクツロナンの切断脱離を触媒する活性（ＥＣ４．２．２．２）を意味する。
【００５０】
本発明の目的上、ペクチン酸リアーゼ活性は、方法の欄、または、実施例３および／もしくは４に記載される手法に従って測定され得る。一態様において、本発明の変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドのペクチン酸リアーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％を有する。
【００５１】
ペクチン：「ペクチン」という用語は、高度または低度にエステル化されていてもよいペクチン酸、ポリガラクツロン酸およびペクチンを指す。
【００５２】
ペクチナーゼ：「ペクチナーゼ」という用語は、当技術分野に従って定義されるペクチナーゼ酵素を指すと共に、例えばポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）およびその誘導体といった、ペクチン質中の多糖および／またはオリゴ糖鎖を切断する酵素を含む（文献：Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｃｔｉｎ，ｐｅｃｔｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｐｅｃｔｉｎａｓｅ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  ２１３−２９４：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ：３９，１９９３を参照のこと）。ペクチナーゼの非限定的な例としては、ヒドロラーゼタイプのペクチナーゼ（例えばラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）およびリアーゼタイプのペクチナーゼ（例えば、ペクチン酸リアーゼ）が挙げられる。好ましくは、本発明のペクチナーゼは、転移脱離によるポリガラクツロン酸とも呼ばれるペクチン酸におけるα−１，４−グリコシド結合のランダムな切断を触媒するペクチナーゼ酵素（ペクチン酸リアーゼとしても知られるポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）リアーゼとしても知られる酵素クラスポリガラクツロ酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）（ＰＧＬ）など）である。
【００５３】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。
【００５４】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００５５】
本発明の目的上、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，前掲書）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，前掲書）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００５６】
スワッチ：「スワッチ」という用語は、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２０，３１３３  ＫＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手される、実施例で用いられた生地を意味する。
【００５７】
変異体：「変異体」という用語は、改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を１つ以上の（例えば数々の）位置に含む、ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に直に続くように隣接したアミノ酸の付加を意味する。
【００５８】
本発明の変異体は、配列番号１の成熟型ポリペプチドのペクチン酸リアーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％の活性を有する。
【００５９】
野生型ペクチン酸リアーゼ：「野生型ペクチン酸リアーゼ」という用語は、本明細書において用いられるところ、自然界において見出されるバクテリア、イースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されるペクチン酸リアーゼを指す。
【００６０】
変異体を決定するための定法
本発明の目的のために、配列番号１に開示されている成熟型ポリペプチドは、他のペクチン酸リアーゼにおける対応するアミノ酸残基を決定するために用いられる。他のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列が配列番号１に開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号１に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）において実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【００６１】
他のペクチン酸リアーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  ｌｏｇ−ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：１８９９−１９００）、および、ＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ  ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）を含む数々のコンピュータプログラムを、それぞれのデフォルトパラメータを利用して用いることで、複数のポリペプチド配列のアラインメントによって判定することが可能である。
【００６２】
配列番号１の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを使用することが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つ以上の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、アライン未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
【００６３】
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ａｎｄ  Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：５６６−５６７）。
【００６４】
本発明の変異体の説明において、下記に記載の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
【００６５】
置換．アミノ酸置換に関しては、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、アラニンによる位置２２６におけるスレオニンの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示されている。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」はそれぞれ、位置２０５および４１１における、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による置換、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による置換を表している。
【００６６】
欠失．アミノ酸欠失に関しては、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、＊。位置１９５における従って、グリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」または「Ｇ１９５＊」と示される。複数の欠失は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」または「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」とされる。
【００６７】
挿入．アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置１９５でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］と示される。例えば、位置１９５でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
【００６８】
このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。
【００６９】
【表１】
2019522988.tif 000002
【００７０】
複数の改変．複数の改変を含む変異体は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」はそれぞれ、チロシンおよびグルタミン酸による位置１７０および１９５におけるアルギニンおよびグリシンの置換を表している。
【００７１】
異なる改変．異なる改変がある位置で導入可能である場合、異なる改変はコンマによって分けられており、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、チロシンまたはグルタミン酸による位置１７０におけるアルギニンの置換を表している。それ故、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を示す：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本発明は、親ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）の変異体に関する。これらの変異体は、親酵素と比して向上した特性を有するものであり、特に洗剤安定性または洗剤組成物中における保管安定性が向上している。
【００７３】
親ペクチン酸リアーゼの特性を向上させるプロセスにおいて、本発明者らは、親ポリペプチド主鎖における特定のアミノ酸の改変が、生成される変異体の洗剤安定性を大きく変化させることを見出した。
【００７４】
変異体
一態様において、本発明は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体を提供するものであり、ここで、番号付けは配列番号１の成熟ポリペプチドに従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【００７５】
一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５に相当する１つ以上の（例えば数々の）位置に置換を含み、ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【００７６】
特定の実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は、以下の位置：２５０＋１２４、２５０＋１０８、２５０＋１４９、２５０＋３２５、１７６＋１２４、１７６＋１０８、１７６＋１４９、１７６＋３２５、１２４＋１０８、１２４＋１４９、１２４＋３２５、１０８＋１４９、１０８＋３２５、１４９＋３２５、２５０＋１７６＋１２４、２５０＋１７６＋１０８、２５０＋１７６＋１４９、２５０＋１７６＋３２５、２５０＋１２４＋１０８、２５０＋１２４＋１４９、２５０＋１２４＋３２５、２５０＋１０８＋１４９、２５０＋１０８＋３２５、２５０＋１４９＋３２５、１７６＋１２４＋１０８、１７６＋１２４＋１４９、１７６＋１２４＋３２５、１７６＋１０８＋１４９、１７６＋１０８＋３２５、１７６＋１４９＋３２５、１２４＋１０８＋１４９、１２４＋１０８＋３２５、１２４＋１４９＋３２５、１０８＋１４９＋３２５、２５０＋１７６＋１２４＋１０８、２５０＋１７６＋１２４＋１４９、２５０＋１７６＋１２４＋３２５、２５０＋１７６＋１０８＋１４９、２５０＋１７６＋１０８＋３２５、２５０＋１７６＋１４９＋３２５、２５０＋１２４＋１０８＋１４９、２５０＋１２４＋１０８＋３２５、２５０＋１２４＋１４９＋３２５、２５０＋１０８＋１４９＋３２５、１７６＋１２４＋１０８＋１４９、１７６＋１２４＋１０８＋３２５、１７６＋１２４＋１４９＋３２５、１７６＋１０８＋１４９＋３２５、１２４＋１０８＋１４９＋３２５、２５０＋１７６＋１２４＋１０８＋１４９、２５０＋１７６＋１２４＋１０８＋３２５、２５０＋１７６＋１２４＋１４９＋３２５、２５０＋１７６＋１０８＋１４９＋３２５、２５０＋１２４＋１０８＋１４９＋３２５、１７６＋１２４＋１０８＋１４９＋３２５および２５０＋１７６＋１２４＋１０８＋１４９＋３２５に置換を含み、ここで、番号付けは成熟ポリペプチド配列番号１に従い、および、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【００７７】
他の態様において、本発明は、位置４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５および３５６（例えば、番号付けは配列番号１基準）に相当する１つ以上の（例えば、数々の）位置に置換を含むペクチン酸リアーゼ変異体を提供するものであり、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【００７８】
一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は、以下の位置：４８＋４９、４８＋９９、４８＋１０８、４８＋１２４、４８＋１４９、４８＋１７６、４８＋２２９、４８＋２５０、４８＋２５７、４８＋３２５、４８＋３５６、４９＋９９、４９＋１０８、４９＋１２４、４９＋１４９、４９＋１７６、４９＋２２９、４９＋２５０、４９＋２５７、４９＋３２５、４９＋３５６、９９＋１０８、９９＋１２４、９９＋１４９、９９＋１７６、９９＋２２９、９９＋２５０、９９＋２５７、９９＋３２５、９９＋３５６、１０８＋１２４、１０８＋１４９、１０８＋１７６、１０８＋２２９、１０８＋２５０、１０８＋２５７、１０８＋３２５、１０８＋３５６、１２４＋１４９、１２４＋１７６、１２４＋２２９、１２４＋２５０、１２４＋２５７、１２４＋３２５、１２４＋３５６、１４９＋１７６、１４９＋２２９、１４９＋２５０、１４９＋２５７、１４９＋３２５、１４９＋３５６、１７６＋２２９、１７６＋２５０、１７６＋２５７、１７６＋３２５、１７６＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋２５７、２２９＋３２５、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５０＋３２５、２５０＋３５６、２５７＋３２５、２５７＋３５６、３２５＋３５６、４８＋４９＋９９、４８＋４９＋１０８、４８＋４９＋１２４、４８＋４９＋１４９、４８＋４９＋１７６、４８＋４９＋２２９、４８＋４９＋２５０、４８＋４９＋２５７、４８＋４９＋３２５、４８＋４９＋３５６、４８＋９９＋１０８、４８＋９９＋１２４、４８＋９９＋１４９、４８＋９９＋１７６、４８＋９９＋２２９、４８＋９９＋２５０、４８＋９９＋２５７、４８＋９９＋３２５、４８＋９９＋３５６、４８＋１０８＋１２４、４８＋１０８＋１４９、４８＋１０８＋１７６、４８＋１０８＋２２９、４８＋１０８＋２５０、４８＋１０８＋２５７、４８＋１０８＋３２５、４８＋１０８＋３５６、４８＋１２４＋１４９、４８＋１２４＋１７６、４８＋１２４＋２２９、４８＋１２４＋２５０、４８＋１２４＋２５７、４８＋１２４＋３２５、４８＋１２４＋３５６、４８＋１４９＋１７６、４８＋１４９＋２２９、４８＋１４９＋２５０、４８＋１４９＋２５７、４８＋１４９＋３２５、４８＋１４９＋３５６、４８＋１７６＋２２９、４８＋１７６＋２５０、４８＋１７６＋２５７、４８＋１７６＋３２５、４８＋１７６＋３５６、４８＋２２９＋２５０、４８＋２２９＋２５７、４８＋２２９＋３２５、４８＋２２９＋３５６、４８＋２５０＋２５７、４８＋２５０＋３２５、４８＋２５０＋３５６、４８＋２５７＋３２５、４８＋２５７＋３５６、４８＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８、４９＋９９＋１２４、４９＋９９＋１４９、４９＋９９＋１７６、４９＋９９＋２２９、４９＋９９＋２５０、４９＋９９＋２５７、４９＋９９＋３２５、４９＋９９＋３５６、４９＋１０８＋１２４、４９＋１０８＋１４９、４９＋１０８＋１７６、４９＋１０８＋２２９、４９＋１０８＋２５０、４９＋１０８＋２５７、４９＋１０８＋３２５、４９＋１０８＋３５６、４９＋１２４＋１４９、４９＋１２４＋１７６、４９＋１２４＋２２９、４９＋１２４＋２５０、４９＋１２４＋２５７、４９＋１２４＋３２５、４９＋１２４＋３５６、４９＋１４９＋１７６、４９＋１４９＋２２９、４９＋１４９＋２５０、４９＋１４９＋２５７、４９＋１４９＋３２５、４９＋１４９＋３５６、４９＋１７６＋２２９、４９＋１７６＋２５０、４９＋１７６＋２５７、４９＋１７６＋３２５、４９＋１７６＋３５６、４９＋２２９＋２５０、４９＋２２９＋２５７、４９＋２２９＋３２５、４９＋２２９＋３５６、４９＋２５０＋２５７、４９＋２５０＋３２５、４９＋２５０＋３５６、４９＋２５７＋３２５、４９＋２５７＋３５６、４９＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１２４、９９＋１０８＋１４９、９９＋１０８＋１７６、９９＋１０８＋２２９、９９＋１０８＋２５０、９９＋１０８＋２５７、９９＋１０８＋３２５、９９＋１０８＋３５６、９９＋１２４＋１４９、９９＋１２４＋１７６、９９＋１２４＋２２９、９９＋１２４＋２５０、９９＋１２４＋２５７、９９＋１２４＋３２５、９９＋１２４＋３５６、９９＋１４９＋１７６、９９＋１４９＋２２９、９９＋１４９＋２５０、９９＋１４９＋２５７、９９＋１４９＋３２５、９９＋１４９＋３５６、９９＋１７６＋２２９、９９＋１７６＋２５０、９９＋１７６＋２５７、９９＋１７６＋３２５、９９＋１７６＋３５６、９９＋２２９＋２５０、９９＋２２９＋２５７、９９＋２２９＋３２５、９９＋２２９＋３５６、９９＋２５０＋２５７、９９＋２５０＋３２５、９９＋２５０＋３５６、９９＋２５７＋３２５、９９＋２５７＋３５６、９９＋３２５＋３５６、１０８＋１２４＋１４９、１０８＋１２４＋１７６、１０８＋１２４＋２２９、１０８＋１２４＋２５０、１０８＋１２４＋２５７、１０８＋１２４＋３２５、１０８＋１２４＋３５６、１０８＋１４９＋１７６、１０８＋１４９＋２２９、１０８＋１４９＋２５０、１０８＋１４９＋２５７、１０８＋１４９＋３２５、１０８＋１４９＋３５６、１０８＋１７６＋２２９、１０８＋１７６＋２５０、１０８＋１７６＋２５７、１０８＋１７６＋３２５、１０８＋１７６＋３５６、１０８＋２２９＋２５０、１０８＋２２９＋２５７、１０８＋２２９＋３２５、１０８＋２２９＋３５６、１０８＋２５０＋２５７、１０８＋２５０＋３２５、１０８＋２５０＋３５６、１０８＋２５７＋３２５、１０８＋２５７＋３５６、１０８＋３２５＋３５６、１２４＋１４９＋１７６、１２４＋１４９＋２２９、１２４＋１４９＋２５０、１２４＋１４９＋２５７、１２４＋１４９＋３２５、１２４＋１４９＋３５６、１２４＋１７６＋２２９、１２４＋１７６＋２５０、１２４＋１７６＋２５７、１２４＋１７６＋３２５、１２４＋１７６＋３５６、１２４＋２２９＋２５０、１２４＋２２９＋２５７、１２４＋２２９＋３２５、１２４＋２２９＋３５６、１２４＋２５０＋２５７、１２４＋２５０＋３２５、１２４＋２５０＋３５６、１２４＋２５７＋３２５、１２４＋２５７＋３５６、１２４＋３２５＋３５６、１４９＋１７６＋２２９、１４９＋１７６＋２５０、１４９＋１７６＋２５７、１４９＋１７６＋３２５、１４９＋１７６＋３５６、１４９＋２２９＋２５０、１４９＋２２９＋２５７、１４９＋２２９＋３２５、１４９＋２２９＋３５６、１４９＋２５０＋２５７、１４９＋２５０＋３２５、１４９＋２５０＋３５６、１４９＋２５７＋３２５、１４９＋２５７＋３５６、１４９＋３２５＋３５６、１７６＋２２９＋２５０、１７６＋２２９＋２５７、１７６＋２２９＋３２５、１７６＋２２９＋３５６、１７６＋２５０＋２５７、１７６＋２５０＋３２５、１７６＋２５０＋３５６、１７６＋２５７＋３２５、１７６＋２５７＋３５６、１７６＋３２５＋３５６、２２９＋２５０＋２５７、２２９＋２５０＋３２５、２２９＋２５０＋３５６、２２９＋２５７＋３２５、２２９＋２５７＋３５６、２２９＋３２５＋３５６、２５０＋２５７＋３２５、２５０＋２５７＋３５６、２５０＋３２５＋３５６および２５７＋３２５＋３５６に置換を含み、ここで、番号付けは配列番号１の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【００７９】
本発明はさらに、位置：４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４８＋２５７、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、２２９＋２５０＋３５６（例えば、番号付けは配列番号１基準）に相当する１つ以上の（例えば、数々の）位置に１つの置換（または、複数の置換）を含むペクチン酸リアーゼ変異体を提供するものであり、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【００８０】
好ましい実施形態において、変異体は、正の電荷を有するアミノ酸（すなわち、リシンまたはアルギニン）に対して、位置４８、４９、１０８、１２４および１４９（例えば、番号付けは配列番号１に従う）の１つ以上において置換を含む。本発明の好ましい変異体はそれ故、位置４８、４９、１０８、１２４および１４９（例えば、番号付けは配列番号１に従う）の１つ以上における置換によって、酵素の全体の電荷がさらに陽性とされている変異体を含む。
【００８１】
一実施形態において、変異体は、親ペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【００８２】
他の実施形態において、変異体は、配列番号１または配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％であって、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などであるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【００８３】
他の実施形態において、親は、配列番号１または配列番号２の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％であって、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％などであるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【００８４】
一態様において、本発明の変異体における改変の数は、１〜２０、例えば１〜１０および１〜５であって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３などの改変である。
【００８５】
他の態様において、変異体は、位置４８に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置４８に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｈｒで置換されている。
【００８６】
他の態様において、変異体は、位置４９に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置４９に相当する位置におけるアミノ酸が、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＡｒｇ、ＬｙｓまたはＴｒｐで置換されている。
【００８７】
他の態様において、変異体は、位置９９に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置９９に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＣｙｓまたはＧｌｕまたはＡｓｐで置換されている。
【００８８】
他の態様において、変異体は、位置１０８に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置１０８に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＴｒｐで置換されており、好ましくはＬｙｓ、ＡｓｎまたはＡｒｇで置換されている。
【００８９】
他の態様において、変異体は、位置１２４に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置１２４に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＡｒｇまたはＴｒｐで置換されている。
【００９０】
他の態様において、変異体は、位置１４９に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置１４９に相当する位置におけるアミノ酸が、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＴｒｐで置換されており、好ましくはＬｙｓまたはＡｒｇで置換されている。
【００９１】
他の態様において、変異体は、位置１７６に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置１７６に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されており、好ましくはＣｙｓまたはＡｓｐで置換されている。
【００９２】
他の態様において、変異体は、位置２２９に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置２２９に相当する位置におけるアミノ酸が、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＩｌｅ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＶａｌで置換されている。
【００９３】
他の態様において、変異体は、位置２５０に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置２５０に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒで置換されており、好ましくはＬｅｕ、ＡｓｎまたはＴｈｒで置換されている。
【００９４】
他の態様において、変異体は、位置２５７に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置２５７に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｒｐで置換されており、好ましくはＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＣｙｓまたはＡｓｐで置換されている。
【００９５】
他の態様において、変異体は、位置３２５に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置３２５に相当する位置におけるアミノ酸が、Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＰｈｅで置換されている。
【００９６】
他の態様において、変異体は、位置３５６に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置３５６に相当する位置におけるアミノ酸が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒで置換されており、好ましくはＧｌｕまたはＰｈｅで置換されている。
【００９７】
このような変異体ペクチン酸リアーゼは、好ましくは：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含み、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【００９８】
より好ましくは、変異体ペクチン酸リアーゼは：Ｓ２２９Ｉ、Ｉ２５０Ｌ、Ｔ４９Ｒ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｋ、Ｉ２５０ＮおよびＩ２５０Ｔからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。
【００９９】
さらにより好ましくは、変異体ペクチン酸リアーゼは、Ｓ２２９ＩおよびＩ２５０Ｎからなる群から選択される置換の一方または両方を含む。従って、一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は：Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｔ、Ｉ２５０Ｌ＋Ｓ２２９Ｖ、Ｉ２５０Ｌ＋Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｖ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｖ＋Ｉ２５０Ｔ、Ｓ２２９Ｋ＋Ｉ２５０ＮおよびＳ２２９Ｋ＋Ｉ２５０Ｔからなる群から選択される置換を含むか、または、これらから構成され、ここで、番号付けは配列番号１の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【０１００】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置４８および２２９に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０１】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置４９および２２９に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。従って、一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は：Ｓ２２９Ｉ＋Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｒ＋Ｓ２２９ＶおよびＴ４９Ｒ＋Ｓ２２９Ｋからなる群から選択される置換を含むか、または、これらから構成され、ここで、番号付けは配列番号１の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【０１０２】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置４８および２５０に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。従って、一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は：Ｉ２５０Ｌ＋Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｒ＋Ｉ２５０ＮおよびＴ４９Ｒ＋Ｉ２５０Ｔからなる群から選択される置換を含むか、または、これらから構成され、ここで、番号付けは配列番号１の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。
【０１０３】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置２２９および２５７に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０４】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置２２９および２５０に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０５】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置２２９および３５６に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０６】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置２５０および２５７に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０７】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置４９、９９、１７６、２２９、２５７、３２５および３５６に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０８】
他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置４９、９９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５および３５６に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。
【０１０９】
好ましい態様において、変異体は、４９Ｒ、９９Ｄ、１０８Ｎ／Ｋ／Ｒ、１２４Ｒ、１４９Ｋ／Ｒ、２２９Ｉ／Ｖ／Ｙ、２５０Ｌ／Ｎ／Ｔ、２５７Ｃ／Ｄ／Ｈ／Ｍ／Ｑおよび３２５Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。
【０１１０】
ここでは、これらの置換の１つ以上は、親酵素と比した場合に、単独で、または、組み合わせでペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤安定性を高めることが予期されている。
【０１１１】
変異体ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を高める好ましい多重置換としては：Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、およびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆが挙げられ、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１２】
洗剤安定性を高めるより好ましい多重置換としては：Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９＋ＩＱ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０ＮおよびＩ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆが挙げられる。
【０１１３】
さらに好ましくは、変異体は：Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０ＮおよびＳ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される置換の組み合わせを含む。
【０１１４】
一態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、置換Ｓ２９９Ｉを含むか、または、これから構成され、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一性を有する。
【０１１５】
一態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、置換Ｉ２５０Ｎを含むか、または、これから構成され、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１６】
他の態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１７】
他の態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、置換Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１８】
他の態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、置換Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１１９】
他の態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、置換Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。
【０１２０】
変異体はさらに：配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、１、２、３、４、６、７、８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２９、３２、３３、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４２、４３、４４、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６５、６６、６７、７２、７３、７７、７８、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１７、１１９、１２０、１２１、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３５、１３７、１３８、１４２、１４３、１４４、１４５、１４７、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８３、１８４、１８７、１８８、１９０、１９１、１９２、１９５、１９７、１９８、２００、２０３、２０５、２０５、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１４、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２５、２２６、２２７、２３０、２３１、２３２、２３３、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５２、２５３、２５４、２５５、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、３６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７３、２７４、２７５、２７６、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９６、２９７、２９９、３００、３０４、３０６、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１５、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６４、３６５、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７９、３８０、３８２、３８３、３８５、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９５、３９６、３９８および３９９からなる群から選択される１つ以上の追加の置換を含み得、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。
【０１２１】
変異体はまた：配列番号１の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドについて、５、９、１１、２６、２８、３０、３１、３７、４０、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、６１、６４、６８、６９、７０、７１、７４、７５、７６、７９、８６、８７、９１、９９、１０５、１０６、１０７、１１１、１１５、１１６、１１８、１２２、１２３、１３４、１３６、１３９、１４０、１４１、１４６、１４８、１５６、１５８、１７０、１８２、１８５、１８６、１８９、１９３、１９４、１９６、１９９、２０１、２０２、２０４、２１３、２１５、２１８、２２４、２２８、２２９、２３４、２３５、２３７、２５１、２５６、２５７、２５８、２７２、２７７、２８６、２９５、２９８、３０１、３０２、３０３、３０５、３０７、３０８、３１４、３１６、３２３、３２４、３２６、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４９、３５６、３５７、３６３、３６６、３７８、３８１、３８４、３８６、３８７、３８９、３９０、３９１、３９３および３９７からなる群から選択される１つ以上の追加の置換を含み得、および、変異体はさらに、配列番号１の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。
【０１２２】
このような追加の置換はまた、タンパク質のフォールディングおよび／または活性に顕著に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小さなアミノもしくはカルボキシル末端の延伸；２０〜２５以下の残基の小さなリンカーペプチド；または、ポリ−ヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどの正味電荷または他の機能を変化させることによって精製を促進する小さな延伸といった、副次的な性質のアミノ酸の変更を含み得る。
【０１２３】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【０１２４】
あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適ｐＨを変化させることであり得る。変異体の特性に顕著に影響を与えるこのような追加の置換としては、国際公開第２００２／０９２７４１号パンフレットおよび国際公開第２００３／０９５６３８号パンフレットに開示されているものが挙げられる。
【０１２５】
ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにペクチン酸リアーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、関連するポリペプチドとのアラインメントから推測されることも可能である。
【０１２６】
配列番号１のペクチン酸リアーゼは、１種の親酵素の一例として用いられる。親ペクチン酸リアーゼは、（ａ）少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列番号１の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する、ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。特定の実施形態において、親酵素は、配列番号１の成熟ポリペプチドに対する少なくとも９６％の配列同一性を有する親ペクチン酸リアーゼである。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号１の成熟ポリペプチドとは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０といった１０以下のアミノ酸で異なる。
【０１２７】
他の態様において、親は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親は、配列番号１の成熟ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。
【０１２８】
ポリペプチドは、一のポリペプチドの領域が、他のポリペプチドの領域のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【０１２９】
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０１３０】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
【０１３１】
親は、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された菌株によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。
【０１３２】
親は細菌性ペクチン酸リアーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ペクチン酸リアーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）ペクチン酸リアーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。
【０１３３】
一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ペクチン酸リアーゼである。
【０１３４】
これらの種の菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、および、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【０１３５】
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより入手し得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化することが可能である。
【０１３６】
変異体の調製
本発明はまた、ペクチン酸リアーゼ活性を有する変異体を得る方法であって：（ａ）親ペクチン酸リアーゼ（例えば、配列番号１または配列番号２を有する）に、位置：４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６および４８＋２５７（例えば、配列番号１に従う番号付けを用いる）に相当する１つ以上の（例えば、数々の）位置に置換を導入するステップ、および／または、（ｂ）親ペクチン酸リアーゼ（例えば、配列番号１または配列番号２を有する）に、配列番号１の成熟ポリペプチドの：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６ＦおよびＩ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を導入するステップ（ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する）；ならびに、（ｃ）変異体を回収するステップを含む方法に関する。
【０１３７】
好ましい実施形態において、方法は：（ａ）親ペクチン酸リアーゼ（例えば、配列番号１を有する）に、配列番号１の成熟ポリペプチドの：Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つの改変（または複数の改変）を導入するステップ（ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する）；ならびに、（ｂ）変異体を回収するステップを含む。
【０１３８】
さらなる態様において、本発明はまた、ペクチン酸リアーゼ活性を有する変異体を得る方法であって：（ａ）親ペクチン酸リアーゼ（例えば、配列番号１または配列番号２を有する）に、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１の成熟ポリペプチドに従い、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する）に相当する１つ以上の（例えば、数々の）位置に置換を導入するステップ；ならびに、（ｂ）任意選択により、変異体を回収するステップを含む方法に関する。
【０１３９】
いくつかの態様において（例えば、上記の態様のいずれか）、この方法はさらに、変異体を精製するステップを含む。
【０１４０】
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、ランダム突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
【０１４１】
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つ以上の定義された部位に１つ以上（例えば、数々）の突然変異を導入する技術である。
【０１４２】
部位特異的突然変異誘発は、所望される突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによりインビトロで達成可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中における部位での制限酵素による開裂を含むカセット突然変異誘発により、および、その後の、ポリヌクレオチド中に突然変異を含有するオリゴヌクレオチドの連結により、インビトロで行うことが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と、インサートとの互いの連結が可能とされる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
【０１４３】
部位特異的突然変異誘発はまた、当技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
【０１４４】
部位特異的突然変異誘発法のいずれかを本発明において用いることが可能である。変異体の調製に用いることが可能である多数の市販キットが入手可能である。
【０１４５】
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
【０１４６】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組み換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１４７】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、当技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【０１４８】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
【０１４９】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。従って、一態様において、本発明は：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する。
【０１５０】
他の態様において、本発明は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【０１５１】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つ以上の制御配列に作動的に結合された本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。従って、一態様において、本発明は：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有し、これは、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞にコード配列を発現させる１つ以上の制御配列に作動的に結合している。
【０１５２】
他の態様において、本発明は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有し、これは、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞にコード配列を発現させる１つ以上の制御配列に作動的に結合している。
【０１５３】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は当技術分野において周知である。
【０１５４】
制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【０１５５】
細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニッアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，  １９９４，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されている。タンデムプロモータの例は国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
【０１５６】
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｄａｒｉａ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｑｕｉｎｎ）（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、ならびに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ；非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオース��ン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる）の遺伝子から得られたプロモータ；ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。
【０１５７】
イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８により記載されている。
【０１５８】
制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの３’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。
【０１５９】
細菌性宿主細胞に好ましいターミネータは、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）リボソーム性ＲＮＡ（ｒｒｎＢ）の遺伝子から入手される。
【０１６０】
糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。
【０１６１】
イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）チトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２に記載されている。
【０１６２】
制御配列はまた、プロモータの下流および遺伝子のコード配列の上流における、遺伝子の発現を高めるｍＲＮＡスタビライザ領域であり得る。
【０１６３】
好適なｍＲＮＡスタビライザ領域の例は、バチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５−３４７１）から得られる。
【０１６４】
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダーであり得る。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダーが用いられ得る。
【０１６５】
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１６６】
イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１６７】
制御配列はまた、変異体コーディング配列の３’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。
【０１６８】
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコα−アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびフザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン−様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１６９】
イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【０１７０】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列が用いられてもよい。
【０１７１】
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０１７２】
糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０１７３】
イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のＲｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２により記載されている。
【０１７４】
制御配列はまた、変異体のＮ−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性タンパク分解酵素（ａｐｒＥ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性タンパク分解酵素（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコールミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子の遺伝子から得られ得る。
【０１７５】
シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のＮ−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ−末端に隣接して位置されている。
【０１７６】
宿主細胞の増殖に対した変異体の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。
【０１７７】
発現ベクター
本発明はまた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。従って、一態様において、本発明は：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。
【０１７８】
他の態様において、本発明は：位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。
【０１７９】
種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組み換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【０１８０】
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【０１８１】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含み得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【０１８２】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【０１８３】
細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーとしては、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびに、ストレプトマイセスハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞における使用に好ましい。
【０１８４】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含むことが好ましい。
【０１８５】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組み換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組み換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組み換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組み換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【０１８６】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【０１８７】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０１８８】
イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、および、ＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。
【０１８９】
糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）である。ＡＭＡ１遺伝子の単離およびＡＭＡ１遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。
【０１９０】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０１９１】
上記の要素を連結して本発明の組み換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０１９２】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体を産生させる１つ以上の制御配列に作動的に結合した本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの組み換え宿主細胞に関する。従って、一態様において、本発明は：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体を産生させる１つ以上の制御配列に作動的に結合した本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関し、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する。
【０１９３】
他の態様において、本発明は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関し、ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する。
【０１９４】
ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【０１９５】
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組み換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
【０１９６】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０１９７】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスクラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスコアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラスフィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルスチューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【０１９８】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカスウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカスズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０１９９】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセスアベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセスコエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０２００】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、またはＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）行われ得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）または電気穿孔法により（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）行われ得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、電気穿孔法（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入により（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）行われ得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、電気穿孔法（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）行われ得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、天然コンピテンス（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照のこと）、電気穿孔法（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）、または、接合により（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）行われ得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知である方法のいずれかを用いることが可能である。
【０２０１】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核生物であり得る。
【０２０２】
宿主細胞は真菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）およびすべての栄養胞子形成真菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）を含む。
【０２０３】
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
【０２０４】
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセスジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセスドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセスクルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセスノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセスオビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイアリポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
【０２０５】
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
【０２０６】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
【０２０７】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルスフォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスフミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルスジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスオリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシスアネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシスカレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシスギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシスパンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシスリブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシススブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシススブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウムイノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウムケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウムルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウムメルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウムパンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウムクイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウムトロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウムゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌスシネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルスヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウムバクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウムクロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウムクルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム  グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウムヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムレチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム  ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウムサムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕ��）、フザリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムスルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウムトルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウムトリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウムベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウムプルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビアラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツスエリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビアテルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテスビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテスベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマレエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
【０２０８】
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
【０２０９】
生成方法
本発明はまた：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ；および、（ｂ）変異体を回収するステップを含む変異体の製造方法に関する。それ故、一態様において、本発明は、変異体を生成する方法であって：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は、配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体を発現する宿主細胞を培養するステップ；ならびに、（ｂ）任意選択により、変異体を回収するステップを含む方法に関する。
【０２１０】
他の態様において、本発明は、変異体の生成方法であって：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体を発現する宿主細胞を培養するステップ；ならびに、（ｂ）任意選択により、変異体を回収するステップを含む方法に関する。
【０２１１】
宿主細胞は、当技術分野において公知である方法を用いて変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびに変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる、振盪フラスコ培養により、または、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、当技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
【０２１２】
変異体は、変異体に特異的な、当技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素産生物の形成、または、酵素基質の消失を含む。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定してもよい。
【０２１３】
変異体は当技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、採取、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。
【０２１４】
変異体は、実質的に純粋な変異体を得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０２１５】
代替的な態様においては、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体のソースとして用いられ得る。
【０２１６】
変異体の使用
洗剤産業における使用
さらなる態様において、本発明は、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体またはペクチン酸リアーゼ変異体調製物を含む洗剤組成物に関する。従って、一態様において、本発明は：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体を含む洗剤組成物、または：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体を含むペクチン酸リアーゼ変異体調製物を含む洗剤組成物に関する。
【０２１７】
他の態様において、本発明は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；もしくは
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体を含む洗剤組成物に関し、または、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；もしくは
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体を含むペクチン酸リアーゼ変異体調製物を含む洗剤組成物に関する。
【０２１８】
本発明の洗剤組成物は、例えば、洗濯用添加剤組成物、および、汚れた布地の前処理に好適に用いられる組成物、リンスが追加された布地柔軟剤組成物、ならびに、一般家庭における硬質面クリーニング作業および食器洗浄作業に用いられる組成物を含む手洗い用および機械洗濯用洗剤組成物として配合され得る。
【０２１９】
本発明の一実施形態において、本発明の変異体は、洗浄液１リットル当たり、０．００１〜２００ｍｇのタンパク質であって、０．００５〜１００ｍｇのタンパク質、好ましくは０．０１〜５０ｍｇのタンパク質、より好ましくは０．０５〜２０ｍｇのタンパク質、さらにより好ましくは０．１〜１０ｍｇのタンパク質などに相当する量で洗剤組成物に添加され得る。一実施形態において、本発明は、本発明の変異体を、１種以上の追加のクリーニング組成物成分との組み合わせで含む洗剤組成物に関する。追加の成分の選択は当業者により、以下に記載されている例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分を含む。
【０２２０】
成分の選択は、生地の取り扱いに関して、クリーニングされる生地のタイプ、汚染物のタイプおよび／または程度、クリーニングを行う温度、ならびに、洗剤生成物の配合に関する考慮が含まれ得る。以下に記載の成分は特定の官能基に従う一般的なヘッダによって分類されるが、当業者によって認識されるであろうとおり、成分は追加の官能基を含み得るために、これは限定として解釈されるべきではない。
【０２２１】
一実施形態において、本発明は、本発明の変異体を、１種以上の追加のＡＤＷ組成物成分との組み合わせで含む自動食器洗浄（ＡＤＷ）組成物に関する。追加の成分の選択は当業者の技能の範囲内であり、以下に記載されている例示的な非限定的な成分を含む従来の処方成分を含む。
【０２２２】
洗剤組成物は、アニオン性および／またはカチオン性および／またはノニオン性および／または半極性および／または両イオン性またはこれらの混合物であり得る１種以上の界面活性剤を含み得る。特定の実施形態において、洗剤組成物は、１種以上のノニオン性界面活性剤および１種以上のアニオン性界面活性剤の混合物を含む。界面活性剤は、典型的には、約１重量％〜約４０重量％または約３重量％〜約２０重量％または約３重量％〜約１０重量％などの約０．１重量％〜６０重量％のレベルで存在する。界面活性剤は所望のクリーニング用途に基づいて選択され、技術分野において公知であるいずれかの従来の界面活性剤を含み得る。
【０２２３】
含まれる場合、洗剤は通常、約５重量％〜約３０重量％などの、約５重量％〜約１５重量％または約１５重量％〜約２０重量％または約２０重量％〜約２５重量％のアニオン性界面活性剤を含む約１重量％〜約４０重量％のアニオン性界面活性剤を含むであろう。アニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、硫酸塩およびスルホン酸塩、特に、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、ＬＡＳの異性体、分岐アルキルベンゼンスルホネート（ＢＡＢＳ）、フェニルアルカンスルホネート、α−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、オレフィンスルホネート、アルケンスルホネート、アルカン−２，３−ジイルビス（硫酸塩）、ヒドロキシアルカンスルホネートおよびジスルホネート、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのアルキルスルフェート（ＡＳ）、脂肪族アルコールスルフェート（ＦＡＳ）、第１級アルコールスルフェート（ＰＡＳ）、アルコールエーテルスルフェート（アルコールエトキシスルフェートまたは脂肪族アルコールエーテルスルフェートとしても公知であるＡＥＳまたはＡＥＯＳまたはＦＥＳ）、第２級アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、パラフィンスルホネート（ＰＳ）、エステルスルホネート、スルホン化脂肪酸グリセロールエステル、メチルエステルスルホネート（ＭＥＳ）を含むα−スルホ脂肪酸メチルエステル（α−ＳＦＭｅまたはＳＥＳ）、アルキル−またはアルケニルコハク酸、ドデセニル／テトラデセニルコハク酸（ＤＴＳＡ）、アミノ酸の脂肪酸誘導体、スルホコハク酸のジエステルおよびモノエステル、または、脂肪酸の塩（セッケン）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２４】
含まれる場合、洗剤は通常、例えば約０．５重量％〜約３０重量％、特に約１重量％〜約２０重量％、約３重量％〜約１０重量％であって、約３重量％〜約５重量％、約８重量％〜約１２重量％または約１０重量％〜約１２重量％などの約１重量％〜約４０重量％のカチオン性界面活性剤を含むであろう。カチオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルエタノール第４級アミン（ＡＤＭＥＡＱ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ジメチルジステアリル塩化アンモニウム（ＤＳＤＭＡＣ）およびアルキルベンジルジメチルアンモニウム、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルコキシル化第四級アンモニウム（ＡＱＡ）化合物、エステルクワット、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２５】
含まれる場合、洗剤は通常、例えば約０．５重量％〜約３０重量％、特に約１重量％〜約２０重量％、約３重量％〜約１０重量％であって、約３重量％〜約５重量％、約８重量％〜約１２重量％または約１０重量％〜約１２重量％などの約０．２重量％〜約４０重量％のノニオン性界面活性剤を含むであろう。ノニオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルコールエトキシレート（ＡＥまたはＡＥＯ）、アルコールプロポキシレート、プロポキシル化脂肪族アルコール（ＰＦＡ）、エトキシル化および／またはプロポキシル化脂肪酸アルキルエステルなどのアルコキシル化脂肪酸アルキルエステル、アルキルフェノールエトキシレート（ＡＰＥ）、ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰＥ）、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）、アルコキシル化アミン、脂肪酸モノエタノールアミド（ＦＡＭ）、脂肪酸ジエタノールアミド（ＦＡＤＡ）、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＥＦＡＭ）、プロポキシル化脂肪酸モノエタノールアミド（ＰＦＡＭ）、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、または、グルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（グルコサミドＧＡまたは脂肪酸グルカミドＦＡＧＡ）、ならびに、商品名ＳＰＡＮおよびＴＷＥＥＮで入手可能な生成物、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２６】
洗剤は、半極性界面活性剤を含み得る。半極性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルアミンオキシド、Ｎ−（ココアルキル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンオキシドおよびＮ−（獣脂−アルキル）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミンオキシドなどのアミンオキシド（ＡＯ）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２７】
洗剤は、両性イオン性界面活性剤を含み得る。両性イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、アルキルジメチルベタイン、スルホベタインなどのベタイン、および、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２２８】
洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤ヒドロトロープを含み得る。ヒドロトロープは、疎水性化合物を水溶液（または、反対に、極性物質を非極性環境）中に可溶化させる化合物である。典型的には、ヒドロトロープは、親水特性および疎水特性の両方を有する（いわゆる、界面活性剤から公知である両親媒性特性）が；しかしながら、ヒドロトロープの分子構造は、一般に、自発的な自己凝集を好まず、例えば、Ｈｏｄｇｄｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｌｅｒ（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ＆  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１２１−１２８による概説を参照のこと。ヒドロトロープは、ミセル相、層状相または他の良好に画定されたメソ相を形成する界面活性剤および脂質について見出されるような、超えると自己凝集を生じる限界濃度を示さない。代わりに、多くのヒドロトロープは、凝集物の大きさが濃度の増加に伴って大型化する連続タイプの凝集プロセスを示す。しかしながら、多くのヒドロトロープは、水、脂、界面活性剤およびポリマーの混合物を含む、極性および非極性特性の物質を含有する系の相挙動、安定性およびコロイド特性を改変させる。ヒドロトロープは、伝統的に、製薬、パーソナルケア、食品から技術的用途にわたり産業で用いられている。洗剤組成物中においてヒドロトロープを使用することにより、相分離または高粘度などの望ましくない現象を誘起することなく、例えば、界面活性剤のより濃縮された配合物（水を排除することにより液体洗剤をコンパクトにするプロセスのとおり）が可能となる。
【０２２９】
洗剤は、０〜１０重量％、例えば０〜５重量％であって、約０．５〜約５重量％または約３重量％〜約５重量％などのヒドロトロープを含み得る。洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかのヒドロトロープが利用され得る。ヒドロトロープの非限定的な例としては、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、ｐ−トルエンスルホン酸ナトリウム（ＳＴＳ）、キシレンスルホン酸ナトリウム（ＳＸＳ）、クメンスルホン酸ナトリウム（ＳＣＳ）、シメンスルホン酸ナトリウム、アミンオキシド、アルコールおよびポリグリコールエーテル、ヒドロキシナフタレンナトリウム、ヒドロキシナフタレンスルホン酸ナトリウム、エチルヘキシル硫酸ナトリウム、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２３０】
洗剤組成物は、約５重量％〜約５０重量％などの約０〜６５重量％の洗剤ビルダーもしくはコビルダー、または、これらの混合物を含み得る。食器洗浄洗剤において、ビルダーのレベルは、典型的には４０〜６５％、特に５０〜６５％である。ビルダーおよび／またはコビルダーは特に、ＣａおよびＭｇと共に水溶性錯体を形成するキレート化剤であり得る。ランドリーおよび／またはＡＤＷ洗剤における使用について技術分野において公知である任意のビルダーおよび／またはコビルダーを利用し得る。ビルダーの非限定的な例としては、ゼオライト、二リン酸塩（ピロリン酸塩）、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰまたはＳＴＰＰ）などの三リン酸塩、炭酸ナトリウムなどの炭酸塩、メタケイ酸ナトリウムなどの可溶性ケイ酸塩、層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫＳ−６）、２−アミノエタン−１−オール（ＭＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ、２，２’−イミノジエタン−１−オールとしても知られている）、トリエタノールアミン（ＴＥＡ、２，２’，２”−ニトリロトリエタン−１−オールとしても知られている）などのエタノールアミン、および、（カルボキシメチル）イヌリン（ＣＭＩ）、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。
【０２３１】
洗剤組成物はまた、約５重量％〜約３０重量％などの０〜５０重量％の洗剤コビルダーを含み得る。洗剤組成物は、コビルダーを単独で含み得、または、例えばゼオライトビルダーといったビルダーと組み合わせて含み得る。コビルダーの非限定的な例としては、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）またはコポリ（アクリル酸／マレイン酸）（ＰＡＡ／ＰＭＡ）などのポリアクリレートのホモポリマーまたはそのコポリマーが挙げられる。さらなる非限定的な例としては、クエン酸塩、アミノカルボン酸塩、アミノポリカルボン酸塩およびホスホン酸塩などのキレート剤、ならびに、アルキル−またはアルケニルコハク酸が挙げられる。追加の特定の例としては、２，２’，２”−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−二ホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＭＰＡ）、ジエチレン−トリアミン−ペンタキス（メチレンホスホン酸）（ＤＴＭＰＡまたはＤＴＰＭＰＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＥＤＧ）、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−モノプロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）−アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）−アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）−グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）−グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）およびスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエタノールグリシン（ＤＥＧ）、ジエチレン−トリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、アミノトリス（メチレンホスホン酸）（ＡＴＭＰ）、ならびに、これらの組み合わせおよび塩が挙げられる。さらなる例示的なビルダーおよび／またはコビルダーは、例えば、国際公開第０９／１０２８５４号パンフレット、米国特許第５９７７０５３号明細書に開示されている。
【０２３２】
洗剤は、約１重量％〜約２０重量％などの０〜３０重量％の漂白系を含み得る。ランドリーおよび／またはＡＤＷ洗剤における使用について技術分野において公知である任意の漂白系を利用し得る。好適な漂白系成分としては、漂白触媒、光漂白剤、漂白剤活性化剤、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウムおよび過酸化水素―尿素（１：１）などの過酸化水素源、事前に形成した過酸、ならびに、これらの混合物が挙げられる。好適な事前に形成した過酸としては、これらに限定されないが、ペルオキシカルボン酸および塩、ジペルオキシジカルボン酸、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、オキソン（Ｒ）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。漂白系の非限定的な例としては、例えば、過ホウ酸（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過ケイ酸のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機塩を、過酸−形成性漂白活性化剤と組み合わせて含み得るペルオキシド系漂白系が挙げられる。漂白剤活性化剤という用語は、本明細書において、過酸化水素と反応して過加水分解を介して過酸を形成する化合物を意味する。このようにして形成された過酸は、活性化された漂白剤を構成する。本明細書において用いられる好適な漂白活性化剤は、エステルアミド、イミドまたは無水物の分類に属するものを含む。好適な例は、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ナトリウム４−［（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）オキシ］ベンゼン−１−スルホネート（ＩＳＯＮＯＢＳ）、４−（ドデカノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホネート（ＬＯＢＳ）、４−（デカノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホネート、４−（デカノイル）安息香酸塩（ＤＯＢＳまたはＤＯＢＡ）、４−（ノナノイルオキシ）ベンゼン−１−スルホネート（ＮＯＢＳ）、および／または、国際公開９８／１７７６７号パンフレットに開示されているものである。対象の漂白活性化剤の特定のファミリーは欧州特許第６２４１５４号明細書に開示されており、アセチルトリエチルシトレート（ＡＴＣ）が特に好ましいファミリーである。ＡＴＣまたは短鎖トリグリセリド様トリアシンは、環境にやさしいという利点を有する。さらに、アセチルトリエチルクエン酸およびトリアセチンは、保管に際して生成物における良好な加水分解安定性を有しており、効果的な漂白活性化剤である。最後に、過加水分解反応において遊離されるクエン酸がビルダーとして機能し得るために、ＡＴＣは多官能性である。あるいは、漂白系は、例えば、アミド、イミドまたはスルホンタイプのペルオキシドを含み得る。漂白系はまた、６−（フタルイミド）ペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）などの過酸を含み得る。漂白系はまた、漂白触媒を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、漂白剤成分は、以下の式を有する有機触媒：
【化１】
2019522988.tif 000003
およびこれらの混合物（式中、各Ｒ１は、独立して、９〜２４個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜２４個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、好ましくは、各Ｒ１は、独立して、９〜１８個の炭素を含有する分岐アルキル基または１１〜１８個の炭素を含有する直鎖アルキル基であり、より好ましくは各Ｒ１は、独立して、２−プロピルヘプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イソノニル、イソデシル、イソトリデシルおよびイソペンタデシルからなる群から選択される）からなる群から選択される有機触媒であり得る。
【０２３３】
好ましくは、漂白剤成分は、漂白剤触媒、特に有機漂白剤触媒に追加して、過酸の供給源を含む。過酸の供給源は、（ａ）事前に形成された過酸；（ｂ）過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩（過酸化水素源）（好ましくは、漂白剤活性化剤との組み合わせで）；および、（ｃ）ペルヒドロラーゼ酵素、ならびに、生地または硬質面処理ステップ中において、水の存在下にインサイツで過酸を形成するエステルから選択され得る。
【０２３４】
洗剤組成物は、０．５〜５重量％、２〜５重量％、０．５〜２重量％または０．２〜１重量％などの０〜１０重量％のポリマーを含み得る。洗剤における使用について技術分野において公知である任意のポリマーを利用し得る。ポリマーは、上記のとおりコビルダーとして機能し得、または、再汚染防止、繊維保護、汚染物遊離、移染防止、グリースクリーニングおよび／もしくは消泡特性を提供し得る。いく種かのポリマーは、上記の特性を２つ以上、および／または、下記のモチーフを２つ以上有し得る。例示的なポリマーとしては、（カルボキシメチル）セルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）、エトキシル化ポリ（エチレンイミン）、カルボキシメチルイヌリン（ＣＭＩ）、および、ＰＡＡ、ＰＡＡ／ＰＭＡ、ポリアスパラギン酸およびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーなどのポリカルボキシレート、疎水性修飾ＣＭＣ（ＨＭ−ＣＭＣ）およびシリコーン、テレフタル酸とオリゴマー系グリコールとのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）とポリ（オキシエテンテレフタレート）とのコポリマー（ＰＥＴ−ＰＯＥＴ）、ＰＶＰ、ポリ（ビニルイミダゾール）（ＰＶＩ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）（ＰＶＰＯまたはＰＶＰＮＯ）およびポリビニルピロリドン−ビニルイミダゾール（ＰＶＰＶＩ）が挙げられる。さらに例示的なポリマーとしては、スルホン化ポリカルボキシレート、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド（ＰＥＯ−ＰＰＯ）およびジクオタニウムエトキシスルフェートが挙げられる。他の例示的なポリマーが、例えば国際公開第２００６／１３０５７５号パンフレットに開示されている。上記のポリマーの塩もまた想定される。
【０２３５】
本発明の洗剤組成物はまた、染料または顔料などの布地色調剤を含んでいてもよく、これは、洗剤組成物に配合された場合に、前記布地が前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触させられる際に布地に付着し、これにより、可視光の吸収／反射を介して前記布地の色合いを変えることが可能である。蛍光性白色化剤は少なくともいくらかの可視光を放つ。対照的に、布地色調剤は、可視光スペクトルの少なくとも一部分を吸収することで表面の色合いを変える。好適な布地色調剤としては、染料および染料−クレイ複合体が挙げられ、また、顔料もまた挙げられ得る。好適な染料としては、微小分子染料および高分子染料が挙げられる。好適な微小分子染料としては、例えば国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７５号パンフレット、国際公開第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１８７６２２６号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｌｕｅ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ａｃｉｄ  Ｂｌｕｅ、Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ、Ａｃｉｄ  Ｖｉｏｌｅｔ、Ｂａｓｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｂａｓｉｃ  ＶｉｏｌｅｔおよびＢａｓｉｃ  Ｒｅｄ、または、これらの混合物の染料索引（Ｃ．Ｉ．）分類に属する染料からなる群から選択される微小分子染料が挙げられる。洗剤組成物は、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％またはさらには約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色調剤を含むことが好ましい。組成物は、０．０００１重量％〜０．２重量％の布地色調剤を含み得、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合に特に好ましい場合がある。好適な色調剤はまた、例えば国際公開第２００７／０８７２５７号パンフレットおよび国際公開第２００７／０８７２４３号パンフレットに開示されている。
【０２３６】
洗剤添加剤、ならびに、洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼ、および／または、ペルオキシダーゼなどの１種以上の追加の酵素を含み得る。
【０２３７】
普通、選択された酵素の特性は選択された洗剤と適合性であるべきであり（すなわち、至適ｐＨ、他の酵素的および非酵素的処方成分等との親和性）、酵素は有効量で存在しているべきである。
【０２３８】
好適なセルラーゼは、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。好適なセルラーゼとしては、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム  オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼといった、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼが挙げられる。
【０２３９】
特に好適なセルラーゼは、色の取り扱いに関する有益性を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０  ４９５  ２５７、欧州特許第０  ５３１  ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０  ５３１  ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよび国際公開第９９／００１５４４号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
【０２４０】
他のセルラーゼは、国際公開第２００２／０９９０９１号パンフレットに係る配列番号２の位置１〜位置７７３のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するエンド型β−１，４−グルカナーゼ酵素であり、または、国際公開第２００１／０６２９０３号パンフレットに係る配列番号２の位置４０〜５５９に対して少なくとも６０％の配列同一を有するキシログルカナーゼ酵素であるファミリー４４キシログルカナーゼである。
【０２４１】
市販されているセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、および、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）Ｃａｒｅｚｙｍｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ  Ｃｌａｓｓｉｃ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｅｌｌｕｓｏｆｔ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｗｈｉｔｅｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、および、Ｐｕｒａｄａｘ  ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、および、ＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【０２４２】
好適なマンナナーゼは細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾された、または、遺伝子操作されたミュータントが含まれる。マンナナーゼは、ファミリー５または２６のアルカリ性マンナナーゼであり得る。これは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）またはフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来の野生型であって、特にＢ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ハロヅランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）またはＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）であり得る。好適なマンナナーゼは、国際特許出願第１９９９／０６４６１９号パンフレットに記載されている。市販されているマンナナーゼはＭａｎｎａｗａｙ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）である。
【０２４３】
好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、Ｃ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）といったコプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、および、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。市販されているペルオキシダーゼとしては、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０２４４】
好適なプロテアーゼとしては、細菌、真菌、植物、ウイルスまたは動物由来、例えば野菜または微生物由来のものが挙げられる。微生物由来のものが好ましい。化学的に修飾された、または、プロテインエンジニアリングを受けた突然変異体が含まれる。これは、セリンプロテアーゼなどのアルカリプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼであってもよい。セリンプロテアーゼは、例えばトリプシンなど、Ｓ１ファミリーのもの、または、スブチリシンなど、Ｓ８ファミリーのものであってもよい。メタロプロテアーゼ類のプロテアーゼは例えば、例えばファミリーＭ４のサーモリシンまたはＭ５、Ｍ７またはＭ８ファミリーのものなど、他のメタロプロテアーゼであってもよい。
【０２４５】
「サブチラーゼ」という用語は、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６（１９９７）５０１−５２３に従うセリンプロテアーゼのサブグループを指す。セリンプロテアーゼは、基質と共有結合付加物を形成するセリンを活性部位に有することにより特徴付けられるプロテアーゼのサブグループである。サブチラーゼは、６つの下位区分、すなわち、サブチリシンファミリー、テルミターゼファミリー、プロテイナーゼＫファミリー、ランチビオティックペプチダーゼファミリー、ケキシンファミリーおよびピロリシンファミリーに区分され得る。
【０２４６】
スブチラーゼの例は、米国特許第７２６２０４２号明細書および国際公開第０９／０２１８６７号パンフレットに記載される、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスプミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）およびバチルスギブソニイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するもの、ならびに国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載されるスブチリシンレンタス、スブチリシンＮｏｖｏ、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、スブチリシンＢＰＮ’、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７およびスブチリシン１６８および（国際公開第９３／１８１４０号パンフレット）に記載されるプロテアーゼＰＤ１３８である。他の有用なプロテアーゼは、国際公開第９２／１７５１７７号パンフレット、国際公開第０１／０１６２８５号パンフレット、国際公開第０２／０２６０２４号パンフレットおよび国際公開第０２／０１６５４７号パンフレットに記載されるものであり得る。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えばブタまたはウシ由来）ならびに国際公開第８９／０６２７０号パンフレット、国際公開第９４／２５５８３号パンフレットおよび国際公開第０５／０４０３７２号パンフレットに記載されるフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ、ならびに国際公開第０５／０５２１６１号パンフレットおよび国際公開第０５／０５２１４６号パンフレットに記載されるセルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｍｏｎａｓ）に由来するキモトリプシンプロテアーゼである。
【０２４７】
さらなる好ましいプロテアーゼは、例えば国際公開第９５／２３２２１号パンフレットに記載されるとおりのバチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）ＤＳＭ  ５４８３のアルカリプロテアーゼ、ならびに国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、欧州特許第１９２１１４７号明細書および欧州特許第１９２１１４８号明細書に記載されるその変異体である。
【０２４８】
好適なリパーゼおよびクチナーゼは細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータント酵素が含まれる。例としては、欧州特許第２５８０６８号明細書および欧州特許第３０５２１６号明細書に記載されている例えばＴ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（過去にはフミコララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）と命名されていた）といったテルモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）由来のリパーゼ、例えばＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）といったフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のクチナーゼ（国際特許出願第９６／１３５８０号パンフレット）、例えばＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリゲネス（欧州特許第２１８２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１３７６号明細書）、Ｐ．ｓｐ．ＳＤ７０５株（国際特許出願第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際特許出願第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際特許出願第９６／１２０１２号パンフレット）といったシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株（これらのいく種かは、現在ではバークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）に改名されている）由来のリパーゼ、ＧＤＳＬ−タイプストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）リパーゼ（国際公開第１０／０６５４５５号パンフレット）、マグナポルテ  グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）由来のクチナーゼ（国際公開第１０／１０７５６０号パンフレット）、シュードモナスメンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）由来のクチナーゼ（米国特許第５，３８９，５３６号明細書）、テルモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）由来のリパーゼ（国際公開第１１／０８４４１２号パンフレット）、ゲオバチルスステアロテルモイルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第１１／０８４４１７号パンフレット）、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のリパーゼ（国際公開第１１／０８４５９９号パンフレット）、および、ストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）（国際公開第１１／１５０１５７号パンフレット）およびＳ．プリスティナエスピラリス（Ｓ．ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）（国際公開第１２／１３７１４７号パンフレット）由来のリパーゼが挙げられる。
【０２４９】
好ましい市販されているリパーゼ生成物としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｅｘ（商標）；Ｌｉｐｏｌｅｘ（商標）およびＬｉｐｏｃｌｅａｎ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｌｕｍａｆａｓｔ（元はＧｅｎｅｎｃｏｒ製）およびＬｉｐｏｍａｘ（元はＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ製）が挙げられる。
【０２５０】
さらに他の例は、例えば、カンジダアンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ（国際公開第１０／１１１１４３号パンフレット）、マイコバクテリウムスメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来のアシルトランスフェラーゼ（国際特許出願第０５／５６７８２号パンフレット）、ＣＥ７ファミリー由来のペルヒドロラーゼ（国際特許出願第０９／６７２７９号パンフレット）、および、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ペルヒドロラーゼの変異体、特に市販の生成物Ｇｅｎｔｌｅ  Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｅａｃｈ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ  Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ製）において用いられるＳ５４Ｖ変異体（国際公開第１０／１０００２８号パンフレット）と同族関係にあるアシルトランスフェラーゼといったアシルトランスフェラーゼまたはペルヒドロラーゼと度々称されるリパーゼである。
【０２５１】
本発明の変異体と一緒に用いることが可能である好適なアミラーゼは、α−アミラーゼまたはグルコアミラーゼであり得、これは、細菌性または真菌性由来のものであり得る。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。アミラーゼとしては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、バチルスリケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊な株（英国特許第１，２９６，８３９号明細書においてより詳述されている）から得られる、例えばα−アミラーゼが挙げられる。
【０２５２】
好適なアミラーゼとしては、国際公開第９５／１０６０３号パンフレットにおける配列番号２を有するアミラーゼ、または、その配列番号３に対して９０％の配列同一性を有する変異体が挙げられる。好ましい変異体が、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９７／４３４２４号パンフレット、および、国際公開第９９／０１９４６７号パンフレットの配列番号４に記載されている。
【０２５３】
市販されているアミラーゼは、ＤＵＲＡＭＹＬ（商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（商標）、Ｅｖｅｒｅｓｔ（商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（商標）およびＢＡＮ（商標）、Ａｍｐｌｉｆｙ（商標）、Ａｍｐｌｉｆｙ  Ｐｒｉｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ  Ｓ１００、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ  Ｓ１１０、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ  Ｓ１０００、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｚ  Ｓ１１０、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｚ  Ｓ１０００、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｚ  Ｓ２０００、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（商標）およびＰＵＲＡＳＴＡＲ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔ製）である。
【０２５４】
組成物は、ペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼを含み得る。
【０２５５】
ペルオキシダーゼは、酵素分類ＥＣ１．１１．１．７に含まれるペルオキシダーゼ酵素である。
【０２５６】
好適なペルオキシダーゼは、植物、細菌性または真菌性由来のものを含む。化学的に修飾されたミュータントまたはタンパク質改変ミュータントが含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）由来のペルオキシダーゼ、例えば、Ｃ．シネレア（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅａ）由来のペルオキシダーゼ（欧州特許第１７９，４８６号明細書）、および、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレットおよび国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載のものなどのこれらの変異体が挙げられる。
【０２５７】
本発明に係るペルオキシダーゼはまた、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼなどのハロペルオキシダーゼ酵素、および、クロロペルオキシダーゼまたはブロモペルオキシダーゼ活性を示す化合物を含む。ハロペルオキシダーゼは、ハロゲンイオンに対する特異性に従って分類される。クロロペルオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１１．１．１０）は、塩素イオンからの次亜塩素酸イオンの形成を触媒する。
【０２５８】
本発明に係るオキシダーゼは、特に、酵素分類ＥＣ１．１０．３．２に含まれるいずれかのラッカーゼ酵素、または、ラッカーゼ活性を示すこれに由来するいずれかの断片、または、カテコールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．１）、ｏ−アミノフェノールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．４）もしくはビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．５）などの同様の活性を示す化合物を含む。
【０２５９】
好ましいラッカーゼ酵素は微生物由来の酵素である。これらの酵素は、植物、バクテリアまたは真菌（糸状菌および酵母を含む）由来であり得る。
【０２６０】
コプリノプシス属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）またはミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）由来のラッカーゼが好ましく；特に、国際公開第９７／０８３２５号パンフレットに開示されているとおりコプリノプシスシネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）由来のラッカーゼ；または、国際公開第９５／３３８３６号パンフレットに開示されているミセリオフトラテルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に由来のラッカーゼが好ましい。
【０２６１】
洗剤酵素は、１種以上の酵素を含有する別の添加剤を加えることにより、または、これらの酵素のすべてを含む複合添加剤を加えることにより、洗剤組成物中に含まれることとし得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち、個別の添加剤または複合添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として配合されることが可能である。好ましい洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非発塵性粒質物、液体、特に安定化された液体、または、スラリーである。
【０２６２】
非発塵性粒質物は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および米国特許第４，６６１，４５２号明細書に開示のとおり生成され得、任意選択により、技術分野において公知である方法によりコーティングされてもよい。ワックス状コーティング材の例は、１０００〜２００００の平均モル重量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；１６〜５０個のエチレンオキシドユニットを有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、および、１５〜８０個のエチレンオキシドユニットが存在するエトキシル化脂肪族アルコール；脂肪族アルコール；脂肪酸；ならびに、脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドである。流動床技術による用途に対して好適なフィルム形成性コーティング材の例は英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、プロピレングリコールなどのポリオール、糖質または糖質アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示されている方法に従って調製され得る。
【０２６３】
洗濯および／またはＡＤＷ洗剤において用いられる技術分野において公知であるいずれかの洗剤成分もまた利用され得る。このような任意の洗剤成分としては、単独もしくは組み合わせで、耐食剤、収縮防止剤、再汚染防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、腐食抑制剤、崩壊剤／分解剤、染料、酵素安定化剤（ホウ酸、ホウ酸塩、ＣＭＣ、および／または、プロピレングリコールなどのポリオールを含む）、クレイを含む布地コンディショナ、充填材／加工助剤、蛍光性白色化剤／光学増白剤、起泡増進剤、起泡（泡）調節剤、香料、汚染物−懸濁剤、軟化剤、泡抑制剤、色あせ防止剤、および、ウィッキング剤が挙げられる。このような処方成分の選択は十分に当業者の技能の範囲内である。
【０２６４】
本発明の洗剤組成物はまた、分散剤を含有することが可能である。特に粉末洗剤が分散剤を含み得る。好適な水溶性有機材料としては、ホモ−またはコポリマー酸またはその塩が挙げられ、ここで、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子によって相互に分離された少なくとも２つのカルボキシルラジカルを含む。好適な分散剤は、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０２６５】
本発明の洗剤組成物はまた、１種以上の移染防止剤を含み得る。好適なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンおよびＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールまたはこれらの混合物が挙げられる。主題の組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、または、さらには約０．１重量％〜約３重量％のレベルで存在し得る。
【０２６６】
本発明の洗剤組成物はまた、蛍光白化剤または光学増白剤などの、クリーニングされる物品の色合いを調整し得る追加の成分を含み得る。存在している場合、増白剤は、約０．０１％〜約０．５％のレベルであることが好ましい。洗濯洗剤組成物における使用に好適であるいずれかの蛍光白化剤が、本発明の組成物中において用いられ得る。最も一般的に用いられる蛍光白化剤は、ジアミノスチルベンスルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビフェニルジスチリル誘導体のクラスに属するものである。ジアミノスチルベンスルホン酸誘導体タイプの蛍光白化剤の例としては：４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−二スルホン酸塩、４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２．２’−二スルホン酸塩、４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ヒドロキシ−エチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−二スルホン酸塩、４，４’−ビス−（４−フェニル−１，２，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−二スルホン酸塩およびナトリウム５−（２Ｈ−ナフト［１，２−ｄ］［１，２，３］トリアゾール−２−イル）−２−［（Ｅ）−２−フェニルビニル］ベンゼンスルホネートといったもののナトリウム塩が挙げられる。好ましい蛍光白化剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能であるＴｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−二スルホン酸塩のジナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）−二スルホン酸塩のジナトリウム塩である。また、好ましい蛍光白化剤は、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ製の市販されているＰａｒａｗｈｉｔｅ  ＫＸである。本発明における使用に好適である他の蛍光剤としては、１−３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンが挙げられる。
【０２６７】
好適な蛍光性増白剤レベルは、約０．０１、０．０５、約０．１、または、さらには約０．２重量％の下限レベルから、０．５またはさらには０．７５重量％の上限レベルを含む。
【０２６８】
本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステル系布地などの布地からの汚染物の除去、特にポリエステル系布地からの疎水性汚染物の除去を補助する１種以上の汚染物遊離ポリマーを含み得る。汚染物遊離ポリマーは、例えば、ノニオン性またはアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連するコポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであり得る（例えばＣｈａｐｔｅｒ  ７，Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。他のタイプの汚染物遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化油脂クリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）に詳述されているとおり、ポリアルキレンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーは、好適な汚染物遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４号パンフレット、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレット（本明細書において参照により援用されている）により詳細に記載されている。他の汚染物遊離ポリマーは、欧州特許第１８６７８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレット（共に本明細書において参照により援用されている）に記載されているものなどの変性セルロース誘導体などの特に置換セルロース系構造といった置換多糖類構造である。好適なセルロース系ポリマーとしては、セルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、アニオン性変性セルロース、ノニオン性変性セルロース、カチオン性変性セルロース、両性イオン性変性セルロース、および、これらの混合物が挙げられる。好適なセルロース系ポリマーとしては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロースおよびこれらの混合物が挙げられる。
【０２６９】
本発明の洗剤組成物はまた、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸およびマレイン酸のコポリマー、ならびに、エトキシル化ポリエチレンイミンなどの１種以上の再付着防止剤を含み得る。上記の汚染物遊離ポリマーにおいて記載されているセルロース系ポリマーはまた、再付着防止剤としても機能し得る。
【０２７０】
本発明の洗剤組成物はまた、減粘剤とは異なる、１種以上のレオロジー変性剤、構造化剤または増粘剤を含み得る。レオロジー変性剤は、非高分子結晶性ヒドロキシ機能性材料、液体洗剤組成物の水性液体マトリックスにずり流動化特性を付与する高分子レオロジー変性剤からなる群から選択される。洗剤のレオロジーおよび粘度は、例えば欧州特許第２１６９０４０号明細書に示されている技術分野において公知である方法によって変性および調整が可能である。
【０２７１】
他の好適な処方成分としては、これらに限定されないが、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、バインダ、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地柔軟剤、充填材、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、泡抑制剤、溶剤、液体洗剤用構造化剤、および／または、構造弾性化剤が挙げられる。
【０２７２】
本発明の変異体を含む洗剤組成物は、例えばバー、均一錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、１つ以上のコンパートメントを有するポーチ、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の液体、圧縮液体もしくは濃縮液体といったいずれかの簡便な形態であり得る。
【０２７３】
ポーチは、単一または複数のコンパートメントとして構成されることが可能である。例えば水との接触に先だってポーチから組成物が漏れ出るような組成物の漏れが防止される、組成物の保持に好適であれば如何なる形態、形状および材料のものであることも可能である。ポーチは、内部容積を有する水溶性フィルム製のものである。前記内部容積は、ポーチのコンパートメントに分離されていることが可能である。好ましいフィルムは、フィルムまたはシートに形成される好ましくはポリマーであるポリマー材料である。好ましいポリマー、コポリマーまたはその誘導体は、ポリアクリレート、および、水溶性アクリレートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムデキストリン、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、もっとも好ましくはポリビニルアルコールコポリマーおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）から選択される。好ましくは、フィルム中のポリマーのレベルは、例えばＰＶＡで少なくとも約６０％である。好ましい平均分子量は、典型的には約２０，０００〜約１５０，０００であろう。フィルムはまた、ポリアクチドおよびポリビニルアルコール（ＭｏｎｏＳｏｌ  ＬＬＣ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡから市販されているＴｒａｄｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍ８６３０で知られている）などの加水分解的に分解性および水溶性のポリマーブレンドと、グリセロール、エチレングリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびこれらの混合物のような可塑剤とを含むブレンド組成物であることが可能である。ポーチは、水溶性フィルムにより分離された固体洗濯クリーニング組成物または部分成分および／または液体クリーニング組成物または部分成分を含んでいることが可能である。液体成分用のコンパートメントは、固形分を含有するコンパートメントとは組成が異なっていることが可能である：米国特許出願公開第２００９／００１１９７０  Ａ１号明細書。
【０２７４】
洗剤処方成分は、水溶性ポーチ中のコンパートメントにより、または、錠剤の異なる層中において相互に物理的に分離されていることが可能である。これにより、成分間の負の保管相互作用を防止することが可能である。コンパートメントの各々の異なる溶解プロファイルはまた、洗浄溶液中における選択された成分の溶解を遅延させることが可能である。
【０２７５】
単位用量にない液体またはゲル洗剤は、水性であり得、典型的には、最大で約７０重量％の水、最大で約６５重量％の水、最大で約５５重量％の水、最大で約４５重量％の水、最大で約３５重量％の水などの少なくとも２０重量％および最大で９５重量％の水を含み得る。特に限定されないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む他のタイプの液体が、水性液体またはゲル中に含まれていてもよい。水性液体またはゲル洗剤は０〜３０％の有機溶剤を含んでいてもよい。液体またはゲル洗剤は非水性であってもよい。
【０２７６】
本発明の変異体は、固形洗濯石鹸に添加して、洗濯物、布地および／または生地の手洗いに使用し得る。固形洗濯石鹸という用語は、洗濯石鹸、固形石鹸、複合化粧石鹸、合成化粧石鹸および洗剤石鹸を含む。固形石鹸の種類は通常、それが含有する界面活性剤の種類が異なり、固形洗濯石鹸という用語は、脂肪酸由来の石鹸および／または合成石鹸を含有するものが含まれる。固形洗濯石鹸は、室温で固体であって液体、ゲルまたは粉末でない物理的形態を有する。固形という用語は、時間が経っても大きく変化することのない物理的形態として定義され、すなわち、固形物体（例えば固形洗濯石鹸）が容器内に置かれた場合に、その固形物体が変化して、それが置かれている容器に充満することがない。固形石鹸は、典型的には棒型の固体であるが、丸または楕円などの他の固体形状であってもよい。
【０２７７】
固形洗濯石鹸は、１種以上のさらなる酵素、ペプチドアルデヒド（またはハイドロサルファイト付加物またはヘミアセタール付加物）などのプロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ酸ナトリウムおよび／または４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体、１種以上の石鹸または合成界面活性剤、グリセリンなどのポリオール、脂肪酸、クエン酸、酢酸および／またはギ酸などのｐＨ調整化合物、ならびに／または、一価カチオンおよび有機アニオンの塩を含み得、ここで一価カチオンは、例えばＮａ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋であってもよく、および、有機アニオンは、例えばギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩または乳酸塩であってもよく、従って一価カチオンおよび有機アニオンの塩は、例えばギ酸ナトリウムであってもよい。
【０２７８】
固形洗濯石鹸はまた、ＥＤＴＡおよびＨＥＤＰなどの錯化剤、香料および／または各種充填剤、界面活性剤、例えばアニオン性合成界面活性剤、ビルダー、ポリマー汚れ遊離剤、洗剤キレート剤、安定化剤、充填剤、染料、着色料、移染防止剤、アルコキシ化ポリカーボネート、泡抑制剤、構造化剤、バインダ、浸出剤、白化活性化剤、泥汚れ除去剤、再沈着防止剤、ポリマー分散剤、増白剤、布地柔軟剤、香料および／または技術分野において公知である他の化合物も含み得る。
【０２７９】
固形洗濯石鹸は、特にこれらに限定されないが：ミキサ、プロッダー、例えば二段式真空プロッダー、押出機、カッター、ロゴスタンパー、冷却トンネルおよび包装機などの従来の固形洗濯石鹸製造設備で加工され得る。本発明は、いかなる単一の方法による固形洗濯石鹸の調製にも限定されない。プロセスの様々な段階で石鹸に本発明のプレミックスが添加されてもよい。例えば、石鹸、本発明の変異体、任意選択により１種以上の追加の酵素、プロテアーゼ阻害剤、ならびに、一価カチオンおよび有機アニオンの塩を含有するプレミックスを調製し得、次にその混合物をプロッダー混練する。変異体および任意選択の追加の酵素は、例えば液体形態でプロテアーゼ阻害剤と同時に添加してもよい。混合ステップおよびプロッダー混練ステップに加え、プロセスには、粉砕、押出、切断、スタンピング、冷却および／または包装ステップがさらに含まれ得る。
【０２８０】
本発明の酵素は、顆粒、例えば１種以上の酵素が組み合わされた複合顆粒として配合されてもよい。このとき各酵素がより多くの顆粒に存在することになり、洗剤中でより一様な酵素分布が確保される。これはまた、粒径が異なることに起因する異なる酵素の物理的な分離も低減する。洗剤工業用の多酵素複合顆粒状物質の作製方法が、ＩＰ．ｃｏｍ開示ＩＰＣＯＭ０００２００７３９Ｄに開示される。
【０２８１】
複合顆粒状物質を用いた酵素の配合物の他の例が国際公開第２０１３／１８８３３１号パンフレットに開示されており、これは、（ａ）多酵素複合顆粒；（ｂ）１０ｗｔ未満のゼオライト（無水基準）；および（ｃ）１０ｗｔ未満のリン酸塩（無水基準）を含む洗剤組成物に関し、ここで前記酵素複合顆粒は１０〜９８ｗｔ％の吸湿成分を含み、および、組成物は、２０〜８０ｗｔ％の洗剤吸湿成分をさらに含む。
【０２８２】
国際公開第２０１３／１８８３３１号パンフレットはまた、表面、好ましくは布地表面を処理および／またはクリーニングする方法に関し、これは、（ｉ）前記表面に、水性洗浄液中の、特許請求されていると共に本明細書に記載されている洗剤組成物を接触させるステップ、（ｉｉ）表面をリンスおよび／または乾燥させるステップを含む。
【０２８３】
多酵素複合顆粒は、本発明の酵素、および、（ａ）リパーゼ、クリーニングセルラーゼ、キシログルカナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポオキシゲナーゼ、ラッカーゼおよびこれらの混合物からなる群から選択される１種以上の酵素；ならびに、（ｂ）ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、ケアセルラーゼ、セロビオース脱水酵素、キシラナーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、リケナーゼグルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、アミラーゼ、および、これらの混合物からなる群から選択される１種以上の酵素を含み得る。
【０２８４】
生地およびセルロース系繊維加工産業における使用
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、他の炭水化物−分解酵素（例えば、アラビナナーゼ、キシログルカナーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼなどのヘミセルラーゼ）と組み合わせて、繊維のバイオプレパレーションに、または、洗剤と組み合わせて繊維のクリーニングに用いられることが可能である。従って、一態様において、本発明は：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体の、ヘミセルラーゼ、より具体的には、アラビナナーゼ、キシログルカナーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼなどの他の炭水化物−分解酵素と組み合わせた繊維のバイオプレパレーションのための使用、または、洗剤と組み合わせた繊維のクリーニングのための使用に関する。
【０２８５】
他の態様において、本発明は、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するものである）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体の使用であって、ヘミセルラーゼ、より具体的には、アラビナナーゼ、キシログルカナーゼ、マンナナーゼおよびペクチナーゼなどの他の炭水化物−分解酵素と組み合わせた繊維のバイオプレパレーションのための使用、または、洗剤と組み合わせた繊維のクリーニングのための使用に関する。
【０２８６】
綿繊維は、ペクチンを含有する一次細胞壁層、および、主にセルロースを含有する二次層からなる。綿調製または綿精錬下において、一次細胞壁の一部が除かれることとなる。本発明の変異体はそれ故、綿精錬の最中に一次細胞壁の除去を、または、綿のクリーニングの最中に残存ペクチン質の除去および生地のグレーイングの防止を補助するために添加され得る。
【０２８７】
本文脈においては、「セルロース系材料」という用語は、綿、綿混合物または天然もしくは人工セルロース系材料（例えば、木材パルプ由来ものなどのキシラン含有セルロース繊維由来）、または、これらのブレンドから形成されたニット、織布、デニム、ヤーンおよびタオル地を含む、繊維、縫製された布地および未縫製の布地を意味することが意図されている。ブレンドの例は、綿またはレーヨン／ビスコースと、ウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、および、セルロース含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、カラムシ、アサ、亜麻／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）などの１種以上の混合用材料とのブレンドである。
【０２８８】
本発明の変異体は、アサ、亜麻またはリネン由来の繊維の前処理または発酵精錬のために、セルロース系繊維加工産業において有用である。
【０２８９】
生地産業のためにセルロース系材料（例えば綿繊維）における、衣服の製造が可能である材料とするための加工には、ヤーンへの繊維の紡糸；ヤーンからの織布またはメリヤス生地の製作、ならびに、その後の調製、染色および仕上げ作業といった数々のステップが含まれる。織物は、一連の縦糸ヤーンの間に緯糸ヤーンを織り込むことにより製作され、これらのヤーンは２種の異なる種類であることが可能である。編み物は、一本の連続する長さのヤーンから結合させた輪のネットワークを形成することにより製作される。セルロース系繊維はまた、不織布にも用いられることが可能である。
【０２９０】
調製プロセスでは、染色作業において適切な結果が得られるように生地を調製する。調製においては以下のサブステップが含まれる。
ａ．のり抜き（織物用）：例えばデンプン、ＣＭＣまたはＰＶＡのようなポリマーのり剤が縦糸速度を高くするために織り上げ前に適用され、この材料はさらなる加工の前に除去しなければならない。
ｂ．精錬：特に角皮（主にワックスからなる）および一次細胞壁（主にペクチン、タンパク質およびキシログルカンからなる）といった綿繊維から、非セルロース系材料を除去することが目的である。適切なワックスの除去は、良好な染色を達成するための尺度である高い濡れ性を実現するために必要である。一次細胞壁（特にペクチン）を除去することでワックスの除去が向上され、染色がさらに確実となる。これはさらに、白化プロセスにおける白色度を向上する。精錬において用いられる主な薬品は、７０ｇ／綿（ｋｇ）以下の高濃度および８０〜９５℃の高温での水酸化ナトリウムである。
ｃ．白化：通常、精錬後には、酸化剤として過酸化水素を用いる漂白が、完全に漂白された（白色）布を得るために、または、染料のきれいな色調を保証するために行われる。
【０２９１】
精錬／漂白プロセスを組み合わせた１ステップもまた産業により用いられている。これらのプロセスはもっとも一般的には布地の状態で採用されるが；精錬、白化および染色作業は繊維またはヤーンの状態でも行うことが可能である。
【０２９２】
加工レジメンは、布地を拡布もしくはロープ形態で加工液流に接触させる連続式、または、バッチ式であることが可能である。連続作業では一般にサチュレータが用いられ、ここでは、布地の重量におおよそ等しい重量の薬品浴が布地に適用され、その後、化学反応が行われる加熱した滞留チャンバに入れられる。洗浄が行われ、次いで、次の加工ステップのために布地の調製が行われる。一般に、バッチ加工は１回加工浴で行われ、ここでは、布地は、その重量のおよそ８〜１５倍の薬品浴と接触させられる。反応期間の後、薬品を排出し、布地をすすぎ、次に薬品が適用される。非連続式のパッド−バッチ加工では、サチュレータが用いられ、ここでは、布地の重量におおよそ等しい重量の薬品浴が布地に適用され、その後、滞留期間は、冷式パッドバッチの場合には、１日以上とされ得る。
【０２９３】
織物は、編織布製作物の普及形態である。製織プロセスでは、擦過から保護するために縦糸ヤーンの「のり加工」が必要とされる。デンプン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、カルボキシメチルセルロース、ワックスおよびアクリルバインダが、入手容易性および費用の面から用いられる典型的なのり加工薬の例である。製織プロセス後に、織物の調製における最初のステップとしてのり剤は除去されなければならない。ロープまたは拡布形態でのり加工した布地が、のり抜き剤を含有する加工液と接触させられる。利用されるのり抜き剤は、除去されるべきのり剤の種類に応じる。ＰＶＡのり剤の場合、温水または酸化性プロセスが度々用いられる。綿の布地のためのもっとも一般的なのり加工剤はデンプン系のものである。従って、ほとんどの場合、温水、デンプンを加水分解する酵素α−アミラーゼ、および、湿潤剤または界面活性剤の組み合わせにより綿織布はのり抜きされる。セルロース系材料は、のり抜きを達成するために十分に長い「保持期間」の間、のり抜き薬中に留め置く。保持期間は、加工レジメンの種類および温度に応じ、１５分間〜２時間、または、いくつかの場合において数日間と様々であることが可能である。典型的には、のり抜き薬は、一般に約１５℃〜約５５℃の範囲であるサチュレータ浴中において適用される。次いで、布地を通常は約５５℃〜約１００℃といった十分な熱を付与する「Ｊボックス」などの器具中に保持して、のり抜き剤の活性が高められる。除去されたのり加工剤を含む薬品は、保持期間が終了した後に布地から洗い流される。
【０２９４】
高い白色度または良好な濡れ性および結果的に得られる可染性を保証するために、のり剤薬品および他の適用される薬品は完全に除去されなければならない。効率的なのり抜きは精錬および白化といった以降のプロセスのためにきわめて重要であると一般に考えられている。
【０２９５】
精錬プロセスでは、綿において見られる天然の非セルロース系化合物のほとんどが除去される。天然の非セルロース系不純物に追加して、精錬では、汚物、汚染物、および、紡糸、コーニング剤またはスラッシング潤滑剤などの残存する生産時に混入された薬剤の除去が可能である。精錬プロセスでは、水酸化ナトリウム、または、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムもしくはこれらの混合物などの関連する苛性化剤が利用される。一般に、アルカリ性安定界面活性剤は、疎水性化合物の可溶化を高めるために、および／または、布地への再付着を防止するために、プロセスに加えられる。この処理では一般に、８０〜１００℃の高温で、強アルカリ溶液（ｐＨ１３〜１４）の精錬剤が利用される。化学的プロセスの非特定的な性質のために、不純物だけではなくセルロース自体も侵されてしまい、強度または他の望ましい布地の特性に対するダメージにつながってしまう。セルロース系布地の柔らかさは残存する天然の綿ワックスに応じる。高温の強アルカリ性精錬プロセスの非特定的な性質では、望ましい天然の綿潤滑剤と、生産時に混入する潤滑剤との分別は不可能である。さらに、従来の精錬プロセスでは、これらのプロセスによる強アルカリ性の廃液によって環境問題が引き起こされる可能性がある。精錬ステージでは、白化における最適な結果が得られるよう布地が調製される。不適切に精錬された布地では、その後の白化ステージにおいて、より高いレベルの漂白薬剤が必要とされることとなる。
【０２９６】
白化ステップでは、ジンニング、カーディングまたは精錬中において完全に除去されなかった残存するいずれかの天然の木質綿片成分、および、天然の綿顔料が脱色される。今日用いられる主なプロセスは、アルカリ性過酸化水素漂白剤である。多くの事例において、きわめて高い白色度が必要とされない場合には特に、白化は、精錬と一緒に組み合わされることが可能である。
【０２９７】
精錬ステップは、約５０〜８０℃の温度および約７〜１１のｐＨで本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を用いることにより行うことが可能であり、それ故、強苛性化剤を置き換えるか補助することが可能である。最適な酵素プロセスでは、高いペクチンの除去性および完全な濡れ性が保証される。
【０２９８】
植物材料の分解または変性のための使用
本発明に係る変異体は、好ましくは、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の高い植物細胞壁分解活性により植物細胞壁または植物細胞壁由来のいずれかのペクチン含有材料を分解または変性するための薬剤として用いられる。それ故、本発明の一態様においては：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体が：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体の高い植物細胞壁分解活性により植物細胞壁または植物細胞壁由来のいずれかのペクチン含有材料を分解または変性するための薬剤として用いられる。
【０２９９】
本発明の他の態様において、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
および、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含む変異体が、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
および、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体の高い植物細胞壁分解活性により植物細胞壁または植物細胞壁由来のいずれかのペクチン含有材料を分解または変性するための薬剤として用いられる。
【０３００】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、ダイズ由来のダイズ油、オリーブ由来のオリーブ油、ナタネ由来のナタネ油またはヒマワリ由来のヒマワリ油のような、油分を多く含む植物材料由来の油の抽出を向上させるグルカナーゼ、ペクチナーゼおよび／またはヘミセルラーゼのような他の酵素と一緒に、または、単独で、用いられ得る。
【０３０１】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、植物細胞材料の成分の分離に用いられ得る。富糖質またはデンプン植物材料の、商業的な重要性がかなり高い成分（サトウダイコン由来のスクロースまたはジャガイモ由来のデンプンのようなもの）と、重要性が低い成分（パルプまたは外皮画分のようなもの）とへの分離が特に重要である。また、富タンパク質または富油分作物の、高価値のタンパク質および油と低価値の外皮画分とへの分離が特に重要である。分離プロセスは、技術分野において公知である方法を用いることによって実施され得る。
【０３０２】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体はまた、収率を高めるために果実または野菜ジュースの調製において用いられ得、および、例えばワインもしくはジュースの生産から生じる種々の植物細胞壁由来材料もしくは廃棄材料、または、野菜外皮、マメ外皮、サトウダイコンパルプ、オリーブパルプ、ジャガイモパルプ等などの農業残渣の酵素加水分解において用いられ得る。
【０３０３】
植物材料は、異なる種類の加工の向上、柑橘類からのペクチンの精製といったガラクタン以外の他の成分の精製または抽出の促進、飼料の価値の向上、水の結合能の低下、廃棄水草の分解性の向上、植物材料のエンシレージへの転換の向上等のために分解され得る。
【０３０４】
本発明の変異体により、加工した果実または野菜の均一性および外観を調節することが可能である。均一性および外観は、加工に用いられる酵素の実際の組み合わせの結果、すなわち、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体が組み合わされる酵素の特異性の結果によるものであると示されている。例としては、例えばリンゴ、セイヨウナシまたは液果類からの透明ジュース；例えばリンゴ、セイヨウナシ、液果類、柑橘類またはトマトからの混濁ジュース；ならびに、例えばニンジンおよびトマトのピューレの生産が挙げられる。
【０３０５】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、植物細胞壁由来材料の粘度の変更に用いられ得る。例えば、ペクチン酸リアーゼ変異体は、ガラクタンを含有する飼料の粘度を低下させるため、および、粘性のガラクタン含有材料の加工を促進させるために用いられ得る。粘度の低減は、ガラクタン含有材料の完全または部分的な分解のために好適な条件下において、ガラクタン含有植物材料を本発明の変異体で処理することにより達成され得る。
【０３０６】
ペクチン酸リアーゼ変異体は、例えば植物繊維からのペクチン質の除去のために他の酵素と組み合わせて用いられることが可能である。この除去は、例えば、生地繊維または他のセルロース系材料の生産に必須である。この目的のために、植物繊維材料は、植物繊維材料に関連するペクチン質の完全または部分的な分解を達成するための好適な条件下において、好適な量の本発明のペクチン酸リアーゼで処理される。
【０３０７】
動物飼料添加剤としての使用
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、動物飼料の変性に用いられ得、また、インビトロ（飼料の成分を変性することにより）またはインビボでその効果が与えられ得る。従って：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体が、動物飼料の変性に用いられ得、また、インビトロ（飼料の成分を変性することにより）またはインビボでその効果が与えられ得る。
【０３０８】
他の態様において、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
および、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体が、動物飼料の変性に用いられ得、また、インビトロ（飼料の成分を変性することにより）またはインビボでその効果が与えられ得る。
【０３０９】
ペクチン酸リアーゼ変異体は、例えば大豆、ナタネ、ルピナス等由来の植物材料を含有する飼料といったアラビノガラクタンまたはガラクタンを多く含有する動物飼料組成物への添加に特に好適である。飼料に添加した場合、ペクチン酸リアーゼ変異体によって、植物細胞壁材料のインビボ分解が顕著に向上され、これにより、動物による植物栄養分のより良好な利用が達成される。これにより、動物の成長速度および／または飼料要求率（すなわち、重量増加に比した摂取された飼料の重量）が向上する。例えば、摂取可能なガラクタンは、例えばβ−ガラクトシダーゼとの組み合わせで、ペクチン酸リアーゼによって、動物によって消化可能であるガラクトースまたはガラクトオリゴマーに分解され、それ故、飼料の利用可能なエネルギーに寄与する。また、ガラクタンの分解により、ペクチン酸リアーゼは、タンパク質、脂肪およびミネラルなどの非炭水化物飼料構成成分の消化性および吸収率を向上させ得る。
【０３１０】
ワインおよびジュース加工における使用
本発明の変異体は、野菜または果実ジュース、特にリンゴまたはセイヨウナシジュースにおける脱ペクチン化および粘度低減に用いられ得る。従って：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８、１４９、４８、４９、９９、２２９、２５７、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２５７および２２９＋２５０＋３５６（ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％であるが、１００％未満の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体は、野菜または果実ジュース、特にリンゴまたはセイヨウナシジュースにおける脱ペクチン化、および、任意選択により粘度低減に用いられ得る。
【０３１１】
他の態様において、位置２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５（ここで、番号付けは配列番号１に従い、および、ここで、改変は、独立して：
（ｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入；
（ｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の欠失；または
（ｉｉｉ）該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有する）からなる群から選択される１つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体は、野菜または果実ジュース、特にリンゴまたはセイヨウナシジュースにおける脱ペクチン化、および、任意選択により粘度低減に用いられ得る。
【０３１２】
これは、果実または野菜ジュースを、果実または野菜ジュースに含まれるペクチン含有材料の分解に有効な量の本発明の変異体で処理することにより達成され得る。
【０３１３】
変異体は、果実および野菜のマッシュの抽出性または分解性を向上させるために、マッシュの処理に用いても良い。例えば、変異体は、ジュースを生産するためのリンゴおよびセイヨウナシから得られるマッシュの処理、および、ワインの生産のためのブドウのマッシュ処理において用いられ得る。
【０３１４】
本発明はさらに、以下の段落において定義されている：
１．ペクチン酸リアーゼ変異体であって、ここで、前記変異体は、ペクチン酸リアーゼ活性（例えば、ＥＣ４．２．２．２）を有し、および、位置（例えば位置の組み合わせ）：４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４８＋２５７、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変（例えば、置換、挿入または欠失）を含み、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し（例えば、配列番号１の番号付けを用いて）、および、ここで、変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の同一性を有する。
【０３１５】
２．以下からなる群から選択される親ペクチン酸リアーゼの変異体である段落１の変異体：
ａ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）程度、中度または高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドをコードする配列と、または、（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；
ｃ）配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドをコードする配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；および
ｄ）ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドの断片。
【０３１６】
３．段落２の変異体であって、ここで、親ペクチン酸リアーゼは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または、これらから構成される。
【０３１７】
４．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、前記変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６５％、例えば、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であるが、１００％未満の同一性を有する。
【０３１８】
５．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、前記改変は置換である。
【０３１９】
６．段落５の変異体であって、前記置換は正電荷アミノ酸を伴い、好ましくは、前記正電荷アミノ酸はリシンまたはアルギニンである。
【０３２０】
７．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、変異体は、置換（例えば、置換の組み合わせ）：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６ＦおよびＩ２５０Ｎ＋Ｑ３５６ＦおよびＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される１つ以上の置換を含む。
【０３２１】
８．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、変異体は、以下からなる群から選択される：
ａ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６であるが、１００％未満の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）程度、中度または高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドをコードする配列と、または、（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；
ｃ）配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドをコードする配列に対して、少なくとも７５％例えば、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；ならびに
ｄ）ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドの断片。
【０３２２】
９．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、変異体は、位置：２５０、１７６、１２４、３２５、１０８および１４９からなる群から選択される位置の１つ以上に置換を含む。
【０３２３】
１０．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、変異体は、位置：４８、４９、１０８、１２４および１４９からなる群から選択される１つ以上の位置においてリシンまたはアルギニンに対する置換を含む。
【０３２４】
１１．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、変異体は、親酵素と比して、洗剤における向上した安定性（例えば、本明細書において実施例２に示されているとおりであり、例えば、半減期向上係数を洗剤中における安定性の尺度として用い、または、本明細書において実施例４に示されているとおりであり、例えば、残存洗浄性能アッセイを洗剤中における安定性の尺度として用いる）または向上した熱安定性（例えば、本明細書において実施例５に示されているとおりであり、例えば、サーマルシフトアッセイを熱安定性の尺度として用いる）を有する。
【０３２５】
１２．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、変異体は、１．０の半減期向上係数（ＨＩＦ）、例えば、＞２．０のＨＩＦ、＞３．０のＨＩＦ、＞４．０のＨＩＦ、＞５．０のＨＩＦ、＞６．０のＨＩＦ、＞７．０のＨＩＦ、＞８．０のＨＩＦ、＞９．０のＨＩＦ、＞１０．０のＨＩＦ、＞１１．０のＨＩＦ、＞１２．０のＨＩＦ、＞１３．０のＨＩＦ、＞１４．０のＨＩＦ、＞１５．０のＨＩＦ、＞１６．０のＨＩＦ、＞１７．０のＨＩＦ、＞１８．０のＨＩＦを有する。
【０３２６】
１３．前記段落のいずれかに記載の変異体であって、ここで、配列番号１または配列番号２と比した改変の総数は１〜２０、例えば、１〜１０および１〜５であって、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の改変などである。
【０３２７】
１４．前記段落のいずれかの変異体を含む組成物。
【０３２８】
１５．段落１４の組成物であって、ここで、前記組成物は、クリーニングまたは洗剤組成物であり、好ましくは洗濯または食器洗浄組成物である。
【０３２９】
１６．１種以上の洗剤成分をさらに含む前記段落のいずれかに記載の組成物。
【０３３０】
１７．段落１６の組成物であって、ここで、洗剤成分は：界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルダー、コビルダー、キレート剤、漂白剤成分、ポリマー、布地色相剤、布地コンディショナ、起泡増進剤、泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光白化剤、芳香剤、光学的増白剤、殺菌剤、殺菌・殺カビ剤、汚染物懸濁剤、汚染物遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素阻害剤、酵素安定剤、酵素活性化剤、酸化防止剤および溶解剤からなる群から選択される。
【０３３１】
１８．１種以上の追加の酵素をさらに含む前記段落のいずれかに記載の組成物。
【０３３２】
１９．プロテアーゼ、アミラーゼ、リケナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キサンタナーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシゲナーゼ、カタラーゼ、マンナナーゼ、オキシドレダクターゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エステラーゼ、アラビナナーゼ、他のペクチン酸リアーゼ、ＤＮアーゼ、ペルヒドロラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、βグルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キサンタナーゼ、キサンタンリアーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、アリールエステラーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポオキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラギナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、他のエンド型β−マンナナーゼ、エクソ型β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、または、これらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の追加の酵素をさらに含む前記段落のいずれかに記載の組成物。
【０３３３】
２０．前記段落のいずれかに記載の組成物であって、ここで、前記組成物は、バー、均質錠剤、２つ以上の層を有する錠剤、１つ以上のコンパートメントを有するポーチ、通常のもしくは圧縮された粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または、通常の液体、圧縮液体もしくは濃縮液体の形態である、クリーニングまたは洗剤組成物。
【０３３４】
２１．前記段落のいずれかのペクチン酸リアーゼ変異体または組成物の使用であって、ここで、前記使用は、以下を含むまたは以下からなる群から選択される：
ｉ）ペクチン質の切断における使用であって、好ましくは前記ペクチン質はポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）またはその誘導体を含む使用、
ｉｉ）洗濯クリーニングまたは食器洗浄などの硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける使用、
ｉｉｉ）生地および／またはセルロース系繊維の加工における使用、
ｉｖ）生地からの細胞壁材料の酵素的除去における使用、
ｖ）ワインまたはジュースの加工における使用および
ｖｉ）動物飼料添加剤としての使用。
【０３３５】
２２．洗剤組成物における前記段落のいずれかに記載の変異体の使用であって、好ましくは、前記洗剤組成物は、洗濯および／または食器洗浄洗剤組成物である。
【０３３６】
２３．ペクチン質を切断するための前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用であって、好ましくは、前記ペクチン質はポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）またはその誘導体を含む。
【０３３７】
２４．生地および／またはセルロース系繊維の加工をするための前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用。
【０３３８】
２５．生地からの細胞壁材料の酵素的除去のための前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用。
【０３３９】
２６．ワインまたはジュースの加工のための前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用。
【０３４０】
２７．動物飼料添加剤としての前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用。
【０３４１】
２８．洗濯クリーニングまたは食器洗浄などの硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用。
【０３４２】
２９．前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用であって、ここで、前記変異体は酵素洗浄力有益性を有する。
【０３４３】
３０．生地、および／または、自動食器洗浄（ＡＤＷ）を含む食器洗浄などの硬質面の洗浄またはクリーニングのための、前記段落のいずれかに記載の変異体または組成物の使用。
【０３４４】
３１．細胞壁材料を、前記段落のいずれかに記載のペクチン酸リアーゼ変異体または組成物と接触させるステップを含む、酵素による精錬方法。
【０３４５】
３２．生地を、前記段落のいずれかに記載のペクチン酸リアーゼ変異体または組成物と接触させるステップを含む、生地から細胞壁材料を酵素的に除去する方法。
【０３４６】
３３．表面を前記段落のいずれかに記載のペクチン酸リアーゼ変異体または組成物と接触させるステップを含む、表面から汚れを除去するための方法。
【０３４７】
３４．前記段落のいずれかのペクチン酸リアーゼ変異体または組成物に、前記ペクチン質を適用するステップを含むペクチン質を切断するプロセスであって、好ましくは前記ペクチン質は、ポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）またはその誘導体を含む。
【０３４８】
３５．段落３４のプロセスであって、ここで、前記ペクチン質は、生地または食器洗浄などの硬質面の表面上に存在している。
【０３４９】
３６．前記段落のいずれかの変異体をコードするポリヌクレオチド。
【０３５０】
３７．段落３６のポリヌクレオチドを発現可能である核酸構築物または発現ベクターであって、発現宿主においてポリペプチドを産生させる１つ以上の制御配列に作動的に結合した段落３６のポリヌクレオチドを含む好ましくは前記核酸構築物または前記発現ベクター。
【０３５１】
３８．段落３７の核酸構築物または発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞。
【０３５２】
３９．段落３８に記載の微生物宿主細胞であって、ここで、細胞は、バクテリア、好ましくはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、より好ましくはバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【０３５３】
４０．段落３６のポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞であって、好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを産生させる１つ以上の制御配列に作動的に結合しており、さらに好ましくは、前記組み換え宿主細胞は単離された組み換え宿主細胞である。
【０３５４】
４１．前記段落のいずれかに記載のペクチン酸リアーゼ変異体を生産する（または得る）ための方法であって、ここで、前記段落のいずれかに記載の微生物宿主細胞は、変異体の発現および分泌が実施可能な条件下で培養され、ならびに、変異体を回収するステップである。
【０３５５】
４２．ペクチン酸リアーゼ（例えば、親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号１または配列番号２を有する親ペクチン酸リアーゼ）の洗剤安定性を向上させる方法であって：前記ペクチン酸リアーゼ（例えば、前記親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号１または配列番号２を有する前記親ペクチン酸リアーゼ）中に、位置（例えば位置の組み合わせ）：４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４８＋２５７、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置に改変（例えば、置換、挿入または欠失）を導入するステップを含む方法であり、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、ペクチン酸リアーゼ（例えば、改変されたペクチン酸リアーゼであって、例えば、前記改変を１つ以上の位置に含むペクチン酸リアーゼ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【０３５６】
４３．以下をさらに含む段落４１に記載の方法：親ペクチン酸リアーゼに、位置（例えば位置の組み合わせ）：４８、４９、９９、１０８、１２４、１４９、１７６、２２９、２５０、２５７、３２５、３５６、９９＋１７６＋３２５、４９＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１２４＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋９９＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、９９＋４９＋１０８＋１７６＋３２５＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１０８＋１２４＋１７６＋２２９＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４８＋４９＋９９＋１７６＋２５０＋２５７＋３２５＋３５６、４９＋９９＋１７６＋２５０＋３２５＋２５７＋３５６、４８＋２２９、２２９＋２５７、２２９＋２５０、２２９＋３５６、４８＋２５７、２５０＋２５７、２５７＋３５６、４８＋２５０、４８＋３５６、２５０＋３５６、２２９＋２５０＋３５６からなる群から選択される１つ以上の位置で改変（例えば、置換、挿入または欠失）を導入するステップであって、ここで、ペクチン酸リアーゼ変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６であるが、１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【０３５７】
４４．段落２０〜２１のいずれかの方法であって、ここで、前記改変は、位置：４８、４９、１０８、１２４および１４９からなる群から選択される１つ以上の位置における置換であって、ここで、前記置換は正電荷アミノ酸を伴い、好ましくは、前記正電荷アミノ酸はリシンまたはアルギニンである。
【０３５８】
４５．段落４２〜４３のいずれかの方法であって、ここで、１つ以上の位置における前記改変は、置換（例えば、置換の組み合わせ）：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６ＦおよびＩ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆからなる群から選択される。
【０３５９】
４６．ペクチン酸リアーゼ（例えば、親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号１または配列番号２を有する親ペクチン酸リアーゼ）の洗剤安定性を向上させる方法であって：前記ペクチン酸リアーゼ（例えば、前記親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号１または配列番号２を有する前記親ペクチン酸リアーゼ）中に、位置（例えば位置の組み合わせ）：２５０、１７６、１２４、１０８、１４９および３２５からなる群から選択される１つ以上の位置に改変（例えば、置換、挿入または欠失）を導入するステップを含む方法であり、ここで、各位置は配列番号１のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、ペクチン酸リアーゼ（例えば、改変されたペクチン酸リアーゼであって、例えば、前記改変を１つ以上の位置に含むペクチン酸リアーゼ）は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
【０３６０】
４７．前記段落のいずれかの方法であって、ここで、親ペクチン酸リアーゼは：
ａ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ）中度または高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドをコードする配列と、または、（ｉｉ）（ｉ）の完全長補体と、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；
ｃ）配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドをコードする配列に対して、少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド；
ｄ）ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号１もしくは配列番号２のポリペプチドの断片
からなる群から選択される。
【０３６１】
４８．前記段落のいずれかの方法であって、ここで、１つ以上の位置における前記改変は、１．０の半減期向上係数（ＨＩＦ）、例えば、＞２．０のＨＩＦ、＞３．０のＨＩＦ、＞４．０のＨＩＦ、＞５．０のＨＩＦ、＞６．０のＨＩＦ、＞７．０のＨＩＦ、＞８．０のＨＩＦ、＞９．０のＨＩＦ、＞１０．０のＨＩＦ、＞１１．０のＨＩＦ、＞１２．０のＨＩＦ、＞１３．０のＨＩＦ、＞１４．０のＨＩＦ、＞１５．０のＨＩＦ、＞１６．０のＨＩＦ、＞１７．０のＨＩＦ、＞１８．０のＨＩＦを有する変異体を提供する。
【０３６２】
方法
ペクチン酸リアーゼ活性の定量化のためのマイクロタイターアッセイ
ペクチン酸リアーゼは、転移脱離メカニズムを介してポリガラクツロン酸を切断する。これは、分割された各基質に二重Ｃ−Ｃ結合が残されることを意味する。この結合は２３５ｎｍで吸収を示し、この波長における吸光度を計測することによる、可溶性のポリガラクツロン酸におけるペクチン酸リアーゼ作用の直接的な検出を可能とする。
【０３６３】
酵素サンプルを、アッセイ緩衝剤（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．６８ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）中において５〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈する。酵素サンプルが洗剤を含有する場合には、これは、洗剤に関して少なくとも１０００倍に希釈されるべきである。１００μｌの酵素緩衝剤希釈物を、１００μｌの基質（１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸、例えばＳｉｇｍａ製のＰ−３８５０、アッセイ緩衝剤は少なくとも１５分間撹拌し、２３００ｇで５分間遠心分離し、上澄を用いる）と加熱プレート中において混合し、加熱ブロック、好ましくは等しい正確度および加熱速度のＰＣＲ機器または器具中において１０分間、４０℃で加熱する。
【０３６４】
１００μｌの酵素／基質溶液を、１００μｌの停止剤（５０ｍＭのＨ３ＰＯ４）と、ＵＶ−透過型マイクロタイタープレート中において混合する。このＵＶプレートを短時間やさしく振盪し、２３５ｎｍでの吸光度をマイクロタイター分光計（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  １９０）において計測する。すべての計測値について、吸光度の読取値は、酵素を加えずに行った対照サンプルの吸光度を減じることによってバックグラウンドの吸光度を補正する。
【０３６５】
国際公開第２００３／０９５６３８号パンフレットにおける配列番号２のペクチン酸リアーゼの活性（ＩＦＯ３１３４として供託されているバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来）に基づく検量線は、反応混合物中において２．５〜１００ｎｇ／ｍｌの酵素の間で直線であった。
【０３６６】
【表２】
2019522988.tif 000004
【０３６７】
あるいは、ペクチン酸リアーゼの触媒活性は、粘度アッセイＡＰＳＵによって測定可能である。
【０３６８】
粘度アッセイ、ＡＰＳＵ
ＡＰＳＵ単位：ＡＰＳＵアッセイは、カルシウムイオンを添加していないポリガラクツロン酸の溶液の粘度変化を計測する。ポリガラクツロ酸ナトリウム（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｐ−１８７９）の５％  ｗ／ｖ溶液を、０．１Ｍのグリシン緩衝剤、ｐＨ１０中に可溶化する。４ｍｌのこの溶液を４０℃で５分間前保温する。次いで、２５０マイクロリットルの酵素（または酵素希釈物）を添加し、その後、反応をミキサにて高速で１０秒間混合し、４０℃または他の温度で２０分間インキュベートする。
【０３６９】
粘度は、粘度計（例えば、ＭＩＶＩ  ６００粘度計、Ｓｏｆｒａｓｅｒ，４５７００  Ｖｉｌｌｅｍａｎｄｅｕｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて計測する。粘度は、１０秒後にｍＶとして計測する。ＡＰＳＵ単位の計算には以下の検量線が用いられる。
【０３７０】
【表３】
2019522988.tif 000005
【０３７１】
テスト材料
ペクチン酸リアーゼの洗浄性能を、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＢＶ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １２０，  ３１３３  ＫＴ  Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手したテスト材料（スワッチ）で調べた。市販されている「ＥＵ重質液体洗剤」を、２０１３年２月に英国のスーパーマーケットで購入した。
【０３７２】
【表４】
2019522988.tif 000006
【０３７３】
本発明は以下の実施例によってさらに記載されており、これらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０３７４】
実施例１：ペクチン酸リアーゼ変異体のクローニング、発酵および精製。
配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼ主鎖に基づいて、以下に開示されている変異体を、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現により調製した。すべてのＤＮＡ操作および形質転換は、分子生物学における標準的な方法を用いて行った。
【０３７５】
ペクチン酸リアーゼ変異体をコードする組み換え型枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）構築物を用いて、リッチソルベント（１００ｇ／Ｌのスクロース、４０ｇ／Ｌのクラストソイ（ｃｒｕｓｔ  ｓｏｙ）（大豆粉）、１０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４．１２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｌ／ＬのＤｏｗｆａｘ６３Ｎ１０（例えば、略してＤｏｗ）を含有する振盪フラスコに播種した。Ｄｏｗｆａｘ６３Ｎ１はノニオン性界面活性剤である。３０℃で２２０ｒｐｍにて振盪しながら４日間培養した。ペクチン酸リアーゼ変異体を発現する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発酵培養物を１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、その後上澄を０．２２μｍのフィルタを通してろ過した。ろ液を１Ｍの濃度で硫酸アンモニウム（ＡｍＳ）に加え、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＡｍＳ、ｐＨ７で予め平衡化しておいたＭＥＰカラムに適用した。未結合の材料をカラムから洗浄し、その後、結合されたタンパク質を、１００ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＨ、ｐＨ４．５を用いて溶出した。その後、溶出液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて、２５ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＨ、ｐＨ４．５にバッファ交換し、同一の緩衝剤で予め平衡化しておいたＳｏｕｒｃｅ  １５Ｓカラムに適用した。未結合のタンパク質を洗浄した後、２５ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＨ、ｐＨ４．５中の０〜１ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いてペクチン酸リアーゼを溶出した。
【０３７６】
配列番号１に示されているアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼ主鎖の以下の変異体を調製した：Ｐ４８Ａ、Ｐ４８Ｆ、Ｐ４８Ｈ、Ｐ４８Ｉ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｌ、Ｐ４８Ｎ、Ｐ４８Ｑ、Ｐ４８Ｒ、Ｐ４８Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｗ、Ｐ４８Ｙ、Ｔ４９Ｆ、Ｔ４９Ｈ、Ｔ４９Ｉ、Ｔ４９Ｋ、Ｔ４９Ｌ、Ｔ４９Ｍ、Ｔ４９Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｔ４９Ｒ、Ｔ４９Ｖ、Ｔ４９Ｗ、Ｔ４９Ｙ、Ｋ９９Ａ、Ｋ９９Ｃ、Ｋ９９Ｄ、Ｋ９９Ｅ、Ｋ９９Ｆ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｈ、Ｋ９９Ｉ、Ｋ９９Ｌ、Ｋ９９Ｍ、Ｋ９９Ｎ、Ｋ９９Ｐ、Ｋ９９Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｋ９９Ｔ、Ｋ９９Ｖ、Ｋ９９Ｗ、Ｋ９９Ｙ、Ｅ１０８Ａ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ１０８Ｈ、Ｅ１０８Ｋ、Ｅ１０８Ｌ、Ｅ１０８Ｍ、Ｅ１０８Ｎ、Ｅ１０８Ｒ、Ｅ１０８Ｓ、Ｅ１０８Ｔ、Ｅ１０８Ｖ、Ｅ１０８Ｗ、Ｄ１２４Ａ、Ｄ１２４Ｅ、Ｄ１２４Ｆ、Ｄ１２４Ｇ、Ｄ１２４Ｉ、Ｄ１２４Ｌ、Ｄ１２４Ｍ、Ｄ１２４Ｎ、Ｄ１２４Ｐ、Ｄ１２４Ｑ、Ｄ１２４Ｒ、Ｄ１２４Ｓ、Ｄ１２４Ｔ、Ｄ１２４Ｖ、Ｄ１２４Ｗ、Ｓ１４９Ｋ、Ｓ１４９Ｌ、Ｓ１４９Ｒ、Ｓ１４９Ｗ、Ｓ１７６Ａ、Ｓ１７６Ｃ、Ｓ１７６Ｄ、Ｓ１７６Ｅ、Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｋ、Ｓ２２９Ｌ、Ｓ２２９Ｍ、Ｓ２２９Ｑ、Ｓ２２９Ｔ、Ｓ２２９Ｖ、Ｓ２２９Ｙ、Ｉ２５０Ａ、Ｉ２５０Ｇ、Ｉ２５０Ｌ、Ｉ２５０Ｍ、Ｉ２５０Ｎ、Ｉ２５０Ｓ、Ｉ２５０Ｔ、Ｋ２５７Ａ、Ｋ２５７Ｃ、Ｋ２５７Ｄ、Ｋ２５７Ｈ、Ｋ２５７Ｉ、Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｍ、Ｋ２５７Ｑ、Ｋ２５７Ｓ、Ｋ２５７Ｖ、Ｋ２５７Ｗ、Ｉ３２５Ｆ、Ｉ３２５Ｌ、Ｉ３２５Ｙ、Ｑ３５６Ｄ、Ｑ３５６Ｅ、Ｑ３５６Ｆ、Ｑ３５６Ｇ、Ｑ３５６Ｈ、Ｑ３５６Ｉ、Ｑ３５６Ｌ、Ｑ３５６Ｎ、Ｑ３５６Ｒ、Ｑ３５６Ｔ、Ｑ３５６Ｗ、Ｑ３５６Ｙ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｋ９９Ｄ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｅ１０８Ｎ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｓ２２９Ｉ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ、Ｋ２５７Ｌ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｐ４８Ｗ＋Ｑ３５６ＦおよびＩ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｑ３５６Ｆ（例えば、以下の実施例２の表１、実施例３の表２、実施例３の表３、実施例４の表４、実施例５の表５において本明細書に記載のとおり）。
【０３７７】
実施例２：液体洗剤中におけるペクチン酸リアーゼ変異体の安定性の計測
ペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤中の安定性を、酵素−洗剤混合物のインキュベーション後に変異体の活性を計測することにより評価した。半減期向上係数（ＨＩＦ）を１５％のモデルＡ洗剤において測定した。
【０３７８】
残存活性アッセイ：２０マイクロリットルの酵素溶液（培養上澄）を、３０マイクロリットルの「モデルＡ洗剤」（水中において２５％  ｖ／ｖに予め希釈した）と３８４ウェルマイクロプレート（ポリスチレン）中において混合した。各ウェルから、１０マイクロリットルを２枚の新たな３８４ウェルマイクロプレートに移した。２枚の同じプレートの一方を５℃で保管し、他方を４５．５℃で１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、４０マイクロリットルのアッセイ緩衝剤（１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、０．６８ｍＭのＣａＣＩ２、ｐＨ８．０）を両方のプレート中のサンプルに添加し、激しく混合した。両方のプレート中のすべてのサンプルをアッセイ緩衝剤により係数８でさらに希釈した。
【０３７９】
５℃で保管したプレートを、弱洗剤溶液（アッセイ緩衝剤中に０．４７％  ｖ／ｖ洗剤）中において係数５でさらに希釈した。２０マイクロリットルの希釈酵素−洗剤混合物を２０マイクロリットルの新たに調製した基質溶液（アッセイ緩衝剤中の１％ポリガラクツロン酸）と、ＵＶ−透過型３８４ウェルマイクロプレート中において混合し、分光測光計を用いて２３５ｎｍで吸光度を計測することにより、酵素活性を計測した。
【０３８０】
残存活性を、５℃で保管したサンプルにおける酵素活性を基準とした４５．５℃で１６時間インキュベートしたサンプルの酵素活性として算出した。残存活性（ＲＡ）＝１００％＊活性［サンプル（４５．５℃）］／活性［サンプル（５℃）］。
【０３８１】
半減期向上係数（ＨＩＦ）の算出：
変異体の残存活性（ＲＡ−ｖａｒ）を、主鎖（配列番号１）標準の残存活性（ＲＡ−Ｂｂ）と比較する。半減期値（Ｔ１／２（時間））は、分解後に指数関数的な減衰が続くために、主鎖／標準およびサンプルについて算出が可能であり、インキュベーション時間（時間）は既知である。半減期向上係数（ＨＩＦ）は（Ｔ１／２）（変異体）／（Ｔ１／２）（Ｂｂ）として算出される。両方のサンプルは同じ長さの時間だけインキュベートされているため、式の簡素化が可能であり：ＨＩＦ＝Ｌｎ（ＲＡ−Ｂｂ／１００）／Ｌｎ（ＲＡ−ｖａｒ／１００）に換算することが可能である。得られたＨＩＦ値が以下の表１に列挙されている。
【０３８２】
【表５】
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【０３８３】
洗剤における向上した安定性および／または向上した熱安定性に関して、正の電荷を有するアミノ酸（すなわちリシンまたはアルギニン）に対する位置４８、４９、１０８、１２４および１４９における置換が特に顕著であった。
【０３８４】
実施例３：９０％液体洗剤中における変異体の安定性の向上の測定
半減期向上係数（ＨＩＦ）を、９０％「ＥＵ重質液体洗剤」中において測定した。ペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤安定性は、以下に記載されている酵素−洗剤混合物のインキュベーション後に変異体の活性を計測することにより評価した。半減期向上係数（ＨＩＦ）測定アッセイ：サンプルは、１０００ｐｐｍに希釈した精製した酵素、または、振盪フラスコ培養上澄であった。２０マイクロリットルのサンプルを１８０マイクロリットルの「ＥＵ重質液体洗剤」と混合した。
【０３８５】
混合物のアリコートを、ＰＣＲ機器（ＰＴＣ２００）中において５５℃（精製サンプル）または５６℃（上澄）でインキュベートした。時間の関数として、アリコートをアッセイ緩衝剤により係数２５０で希釈し、上記の実施例２に記載されているとおり酵素活性について内容物を分析した。それ故、各変異体について、時間の関数としての分解に関数情報を入手する。酵素活性の指数関数的な減衰が予期され、これをすべてのサンプルについて観察した。
【０３８６】
Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１０）「Ｌｏｇｅｓｔ」機能を用いて、ｙ−およびｘ−値の提供されている組に最良に適合する指数関数曲線を算出する（ｙ＝ｂ＊ｍ＾ｘ、式中、演算子「＾」（またはカレット）は数を冪指数とし、および、演算子「＊」（またはアスタリスク）は、数を乗じる）。インキュベーション時間をＸ−値として用い、酵素活性をＹ−値として、指数関数的減衰に対するデータの最良適合を得：ｙ＝ｂ＊ｍ＾ｘ、ならびに、指数関数減衰定数（ｋ＝Ｌｎ（ｍ））、および、最後にＴ１／２時間（Ｔ１／２＝Ｌｎ２／ｋ）を算出した。最後に、半減期向上係数を：ＨＩＦ＝（Ｔ１／２）（変異体）／（Ｔ１／２）（主鎖）として算出する。得られたＨＩＦ値が、以下の表２（精製サンプル）および３（上澄サンプル）に列挙されている。
【０３８７】
【表６】
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【０３８８】
【表７】
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【０３８９】
以下の置換の組み合わせＰ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆ、Ｐ４８Ｗ＋Ｔ４９Ｗ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６ＦおよびＴ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆを有する変異体も発酵し、精製したところ、液体洗剤中における保管後に向上した残存活性を有することが見出された。
【０３９０】
実施例４：液体洗剤中における安定性の測定
ペクチン酸リアーゼ変異体の保管安定性を、モデルＡ液体洗剤中に保管した後に、残存洗浄性能により計測した（表４）。液体洗剤中における３７℃で４週間のペクチン酸リアーゼ変異体の保管、これに続く、ＣＦＴから購入した汚れＣ−Ｓ−５３（綿上のペクチン酸塩＋顔料）およびＰＣ−Ｓ−５３（ポリエステル／綿上のペクチン酸塩＋カーボンブラック）を用いて、ｍｉｎｉ−Ｔｅｒｇ−Ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ（ｍｉｎｉ−ＴＯＭ）洗浄アッセイにおける洗浄性能の評価により、安定性を測定した。ｍｉｎｉ−ＴＯＭ洗浄はＴＯＭ洗浄に類似するが、しかしながら、通常の２０００ｍＬビーカの代わりに４００ｍＬビーカが用いられる。残りの条件に変更はない。ｍｉｎｉ−ＴＯＭ洗浄を、３０分間、３０℃、１２０ＲＰＭで、１５°ｄＨの水（Ｃａ：Ｍｇ：ＨＣＯ３−＝４：１：７．５）および２００ｍＬの合計洗浄体積中で３．３３ｇ／Ｌの洗剤用量を用いて実施した。洗浄の後、汚れをすすぎ、乾燥させ、Ｄｉｇｉ−Ｅｙｅ分光測光計を用いて強度を定量化した。
【０３９１】
具体的には、密閉式ガラス容器中において、０．０１５ｍｇ酵素タンパク質／ｇ洗剤でモデルＡ液体洗剤中に各ペクチン酸リアーゼを仕込み（洗浄中の０．０５ｐｐｍの酵素に相当）、加熱キャビネット中において３７℃で４週間インキュベートした。同等の標準サンプルを代わりに−１８℃に置いた。４週間後、３７℃で保管した変異体の洗浄性能を−１８℃で保管したサンプルの洗浄性能と比較して、各変異体に係る残存洗浄性能を算出した。各変異体の残存洗浄性能は以下のとおり算出した：残存洗浄性能＝（ΔＩＮＴ３７℃）／（ΔＩＮＴ−１８℃）（式中、ΔＩＮＴは、特定の条件と相当する酵素を含まないブランクとの間で得られる強度として算出した）。
【０３９２】
【表８】
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【０３９３】
以下の置換の組み合わせＳ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ、Ｓ２２９Ｉ＋Ｑ３５６ＦおよびＴ４９Ｒ＋Ｋ９９Ｄ＋Ｄ１２４Ｗ＋Ｓ１７６Ｄ＋Ｓ２２９Ｉ＋Ｉ２５０Ｎ＋Ｋ２５７Ｌ＋Ｉ３２５Ｆ＋Ｑ３５６Ｆを有する変異体もまた発酵し、精製したところ、液体洗剤中における保管後に、ｍｉｎｉ−ＴＯＭ洗浄による計測で向上した残存洗浄性能を有することが見出された。
【０３９４】
実施例５：熱安定性の測定
熱安定性を、タンパク質熱アンフォールディング分析を用いて測定した（ＴＳＡ、サーマルシフトアッセイ）（表５）。
【０３９５】
タンパク質熱アンフォールディングを、リアルタイムＰＣＲ機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓｔｅｐ−Ｏｎｅ−Ｐｌｕｓ）を用い、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ−６６５０）で監視した。９６ウェル白色ＰＣＲ−プレート中に、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８，０中の１５マイクロリットルのサンプル（精製した酵素１００ｐｐｍ）を、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（濃度＝１０倍；サプライヤからのストック溶液＝５０００倍）と混合（１：１）した。プレートを、オプティカルＰＣＲシールで封止した。ＰＣＲ機器を７６℃／ｈｒの走査速度に設定し、２５℃で開始し、９６℃で終了した。蛍光は、備え付けの励起用ＬＥＤ青色光およびＲＯＸ−フィルタ（６１０ｎｍ、発光）を用いて２０秒毎に監視した。Ｔｍ−値は、最初の誘導体（ｄＦ／ｄＫ）（Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ２００９  １４：７００）の最大値として算出した。
【０３９６】
【表９】
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【０３９７】
【表１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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