(57)【要約】本発明は、2種もしくはそれ以上の抗原または2種もしくはそれ以上のエピトープと結合することができる多価多重特異性結合タンパク質を提供する。本発明はまた、そのような多価多重特異性結合タンパク質の作製および使用の方法、例えば、様々な疾患の予防もしくは処置のため、またはインビトロもしくはインビボで特異的抗原を検出するための、そのような結合タンパク質を使用する方法も提供する。2019514839.tif 000112
2019514839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT013aが結合するのと同一のc-Metのエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT013aが、SEQ ID NO:240のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:254のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項２】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:242のVLA CDR1、SEQ ID NO:243のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:244のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:246のVHB CDR1、SEQ ID NO:247のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:248のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:251のVHA CDR1、SEQ ID NO:252のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:253のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:256のVLB CDR1、SEQ ID NO:257のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:258のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:242のVLA CDR1、SEQ ID NO:243のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:244のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:246のVHB CDR1、SEQ ID NO:247のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:248のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:251のVHA CDR1、SEQ ID NO:252のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:253のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:256のVLB CDR1、SEQ ID NO:257のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:258のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項87記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３】
SEQ ID NO:241の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:245の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:250の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:255の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項87記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４】
SEQ ID NO:240のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:254のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項87記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、上皮増殖因子受容体（EGFR）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項６】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、ヒト上皮増殖因子受容体3（Her3）の1種またはそれ以上のエピトープと結合することができ、かつインスリン様増殖因子1受容体（IGF-1R）の1種またはそれ以上のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項７】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、デルタ様4（DLL4）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつ血管内皮増殖因子（VEGF）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項８】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、ヒト上皮増殖因子受容体3（Her3）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつ上皮増殖因子受容体（EGFR）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項９】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、プログラム細胞死1（PD-1）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項１０】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、ヒト上皮増殖因子受容体3（Her3）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死1（PD-1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項１１】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、間葉上皮転換因子（c-Met）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項１２】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、BおよびTリンパ球関連（B and T lymphocyte associated）（BTLA）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死1（PD-1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項１３】
3種のポリペプチド鎖を含み、第2のポリペプチド鎖がVHAおよびCH1、またはVLBおよびCLを含み、第3のポリペプチド鎖がVLBおよびCL、またはVHAおよびCH1を含む、請求項5〜12のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
2種のポリペプチド鎖を含み、第2のポリペプチド鎖がVHA、CH1、VLB、およびCL、またはVLB、CL、VHA、およびCH1を含む、請求項5〜12のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
二重特異性結合タンパク質FIT012bが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT012bが、SEQ ID NO:202のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:211のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:216のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項5記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１６】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、VLAが、SEQ ID NO:204のVLA CDR1、SEQ ID NO:205のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:206のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、VHBが、SEQ ID NO:208のVHB CDR1、SEQ ID NO:209のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:210のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、VHAが、SEQ ID NO:213のVHA CDR1、SEQ ID NO:214のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:215のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、VLBが、SEQ ID NO:218のVLB CDR1、SEQ ID NO:219のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:220のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、VLAが、SEQ ID NO:204のVLA CDR1、SEQ ID NO:205のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:206のVLA CDR3を含み、VHBが、SEQ ID NO:208のVHB CDR1、SEQ ID NO:209のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:210のVHB CDR3を含み、VHAが、SEQ ID NO:213のVHA CDR1、SEQ ID NO:214のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:215のVHA CDR3を含み、VLBが、SEQ ID NO:218のVLB CDR1、SEQ ID NO:219のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:220のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項15記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１７】
SEQ ID NO:203の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:207の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:212の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:217の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項15記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１８】
SEQ ID NO:202のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:211のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:216のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項15記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項１９】
二重特異性結合タンパク質FIT012dが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT012dが、SEQ ID NO:221のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:230のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:235のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項5記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２０】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:223のVLA CDR1、SEQ ID NO:224のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:225のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:227のVHB CDR1、SEQ ID NO:228のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:229のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:232のVHA CDR1、SEQ ID NO:233のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:234のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:237のVLB CDR1、SEQ ID NO:239のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:239のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:223のVLA CDR1、SEQ ID NO:224のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:225のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:227のVHB CDR1、SEQ ID NO:228のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:229のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:232のVHA CDR1、SEQ ID NO:233のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:234のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:237のVLB CDR1、SEQ ID NO:238のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:239のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項19記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２１】
SEQ ID NO:222の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:226の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:231の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:236の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項19記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２２】
SEQ ID NO:221のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:230のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:235のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項19記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２３】
二重特異性結合タンパク質FIT016aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のIGF-1Rのエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT016aが、SEQ ID NO:278のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:287のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:292のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項6記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２４】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:280のVLA CDR1、SEQ ID NO:281のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:282のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:284のVHB CDR1、SEQ ID NO:285のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:286のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:289のVHA CDR1、SEQ ID NO:290のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:291のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:294のVLB CDR1、SEQ ID NO:295のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:296のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:280のVLA CDR1、SEQ ID NO:281のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:282のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:284のVHB CDR1、SEQ ID NO:285のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:286のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:289のVHA CDR1、SEQ ID NO:290のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:291のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:294のVLB CDR1、SEQ ID NO:295のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:296のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項23記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２５】
SEQ ID NO:279の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:283の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:288の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:293の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項23記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２６】
SEQ ID NO:278のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:287のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:292のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項23記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２７】
二重特異性結合タンパク質FIT017aが結合するのと同一のDLL4のエピトープおよび同一のVEGFのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT017bが、SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項7記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２８】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:299のVLA CDR1、SEQ ID NO:300のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:301のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:303のVHB CDR1、SEQ ID NO:304のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:305のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:308のVHA CDR1、SEQ ID NO:309のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:310のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:313のVLB CDR1、SEQ ID NO:314のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:315のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:299のVLA CDR1、SEQ ID NO:300のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:301のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:303のVHB CDR1、SEQ ID NO:304のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:305のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:308のVHA CDR1、SEQ ID NO:309のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:310のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:313のVLB CDR1、SEQ ID NO:314のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:315のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項27記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項２９】
SEQ ID NO:298の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:302の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:307の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:312の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項27記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３０】
SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項27記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３１】
二重特異性結合タンパク質FIT019aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT019aが、SEQ ID NO:335のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:344のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:349のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項8記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３２】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:337のVLA CDR1、SEQ ID NO:338のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:339のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:341のVHB CDR1、SEQ ID NO:342のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:343のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:346のVHA CDR1、SEQ ID NO:347のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:348のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:351のVLB CDR1、SEQ ID NO:352のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:353のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:337のVLA CDR1、SEQ ID NO:338のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:339のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:341のVHB CDR1、SEQ ID NO:342のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:343のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:346のVHA CDR1、SEQ ID NO:347のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:348のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:351のVLB CDR1、SEQ ID NO:352のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:353のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項31記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３３】
SEQ ID NO:336の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:340の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:345の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:350の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項31記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３４】
SEQ ID NO:335のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:344のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:349のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項31記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３５】
二重特異性結合タンパク質FIT019bが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT019bが、SEQ ID NO:354のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:363のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:368のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項8記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３６】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:356のVLA CDR1、SEQ ID NO:357のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:358のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:360のVHB CDR1、SEQ ID NO:361のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:362のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:365のVHA CDR1、SEQ ID NO:366のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:367のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:370のVLB CDR1、SEQ ID NO:371のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:372のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:356のVLA CDR1、SEQ ID NO:357のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:358のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:360のVHB CDR1、SEQ ID NO:361のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:362のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:365のVHA CDR1、SEQ ID NO:366のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:367のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:370のVLB CDR1、SEQ ID NO:371のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:372のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項35記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３７】
SEQ ID NO:355の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:359の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:364の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:369の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項35記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３８】
SEQ ID NO:354のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:363のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:368のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項35記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項３９】
二重特異性結合タンパク質FIT020aまたはFIT020bが結合するのと同一のPD-1のエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT020aが、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:121のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:122のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含み、該二重特異性結合タンパク質FIT020bが、SEQ ID NO:373のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:382のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:387のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項9記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４０】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、（a）SEQ ID NO:389のVLA CDR1、SEQ ID NO:390のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLA CDR3；または（b）SEQ ID NO:375のVLA CDR1、SEQ ID NO:376のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、（a）SEQ ID NO:384のVHB CDR1、SEQ ID NO:385のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHB CDR3；または（b）SEQ ID NO:379のVHB CDR1、SEQ ID NO:380のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、（a）SEQ ID NO:379のVHA CDR1、SEQ ID NO:380のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHA CDR3、または（b）SEQ ID NO:384のVHA CDR1、SEQ ID NO:385のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、（a）SEQ ID NO:375のVLB CDR1、SEQ ID NO:376のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLB CDR3、または（b）SEQ ID NO:389のVLB CDR1、SEQ ID NO:390のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、（a）第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:389のVLA CDR1、SEQ ID NO:390のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:384のVHB CDR1、SEQ ID NO:385のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:379のVHA CDR1、SEQ ID NO:380のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:375のVLB CDR1、SEQ ID NO:376のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLB CDR3を含むか；または（b）第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:375のVLA CDR1、SEQ ID NO:376のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:379のVHB CDR1、SEQ ID NO:380のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:384のVHA CDR1、SEQ ID NO:385のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:389のVLB CDR1、SEQ ID NO:390のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項39記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４１】
（a）SEQ ID NO:388の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:383の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:378の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:374の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含むか、または
（b）SEQ ID NO:374の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:378の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:383の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:388の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、
請求項39記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４２】
（a）SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:121のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:122のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖、または
（b）SEQ ID NO:373のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:382のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:387のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖
を含む、請求項39記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４３】
二重特異性結合タンパク質FIT022aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT022aが、SEQ ID NO:411のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:420のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:425のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項10記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４４】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:413のVLA CDR1、SEQ ID NO:414のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:415のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:417のVHB CDR1、SEQ ID NO:418のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:419のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:422のVHA CDR1、SEQ ID NO:423のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:424のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:427のVLB CDR1、SEQ ID NO:428のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:429のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:413のVLA CDR1、SEQ ID NO:414のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:415のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:417のVHB CDR1、SEQ ID NO:418のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:419のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:422のVHA CDR1、SEQ ID NO:423のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:424のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:427のVLB CDR1、SEQ ID NO:428のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:429のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項43記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４５】
SEQ ID NO:412の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:416の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:421の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:426の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項43記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４６】
SEQ ID NO:411のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:420のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:425のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項43記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４７】
二重特異性結合タンパク質FIT023aが結合するのと同一のc-Metのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT023aが、SEQ ID NO:430のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:439のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:444のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項11記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４８】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:432のVLA CDR1、SEQ ID NO:433のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:434のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:436のVHB CDR1、SEQ ID NO:437のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:438のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:441のVHA CDR1、SEQ ID NO:442のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:443のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:446のVLB CDR1、SEQ ID NO:447のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:448のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:432のVLA CDR1、SEQ ID NO:433のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:434のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:436のVHB CDR1、SEQ ID NO:437のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:438のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:441のVHA CDR1、SEQ ID NO:442のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:443のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:446のVLB CDR1、SEQ ID NO:447のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:448のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項47記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項４９】
SEQ ID NO:431の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:435の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:440の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:445の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項47記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５０】
SEQ ID NO:430のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:439のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:444のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項47記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５１】
二重特異性結合タンパク質FIT024aが結合するのと同一のBTLAのエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT024aが、SEQ ID NO:449のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:458のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:463のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項12記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５２】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:451のVLA CDR1、SEQ ID NO:452のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:453のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:455のVHB CDR1、SEQ ID NO:456のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:457のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:460のVHA CDR1、SEQ ID NO:461のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:462のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:465のVLB CDR1、SEQ ID NO:466のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:467のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:451のVLA CDR1、SEQ ID NO:452のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:453のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:455のVHB CDR1、SEQ ID NO:456のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:457のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:460のVHA CDR1、SEQ ID NO:461のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:462のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:465のVLB CDR1、SEQ ID NO:466のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:467のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項51記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５３】
SEQ ID NO:450の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:454の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:459の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:464の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項51記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５４】
SEQ ID NO:449のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:458のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:463のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項51記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５５】
二重特異性結合タンパク質FIT024bが結合するのと同一のBTLAのエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT024bが、SEQ ID NO:468のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:477のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:482のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項12記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５６】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:470のVLA CDR1、SEQ ID NO:471のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:472のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:474のVHB CDR1、SEQ ID NO:475のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:476のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:479のVHA CDR1、SEQ ID NO:480のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:481のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:484のVLB CDR1、SEQ ID NO:485のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:486のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:470のVLA CDR1、SEQ ID NO:471のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:472のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:474のVHB CDR1、SEQ ID NO:475のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:476のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:479のVHA CDR1、SEQ ID NO:480のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:481のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:484のVLB CDR1、SEQ ID NO:485のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:486のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項55記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５７】
SEQ ID NO:469の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:473の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:478の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:483の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項55記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５８】
SEQ ID NO:468のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:477のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:482のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項55記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項５９】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT014aが結合するのと同一の第IXa因子のエピトープおよび同一の第X因子のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT014aが、SEQ ID NO:259のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:268のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:273のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項６０】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:261のVLA CDR1、SEQ ID NO:262のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:263のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:265のVHB CDR1、SEQ ID NO:266のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:267のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:270のVHA CDR1、SEQ ID NO:271のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:272のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:275のVLB CDR1、SEQ ID NO:276のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:277のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:261のVLA CDR1、SEQ ID NO:262のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:263のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:265のVHB CDR1、SEQ ID NO:266のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:267のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:270のVHA CDR1、SEQ ID NO:271のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:272のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:275のVLB CDR1、SEQ ID NO:276のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:277のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項59記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６１】
SEQ ID NO:260の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:264の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:269の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:274の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項59記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６２】
SEQ ID NO:259のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:268のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:273のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項59記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６３】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT018aが結合するのと同一のCD20のエピトープおよび同一のCD3のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT018aが、SEQ ID NO:316のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:325のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:330のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項６４】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:318のVLA CDR1、SEQ ID NO:319のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:320のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:322のVHB CDR1、SEQ ID NO:323のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:324のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:327のVHA CDR1、SEQ ID NO:328のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:329のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:332のVLB CDR1、SEQ ID NO:333のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:334のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:318のVLA CDR1、SEQ ID NO:319のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:320のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:322のVHB CDR1、SEQ ID NO:323のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:324のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:327のVHA CDR1、SEQ ID NO:328のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:329のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:332のVLB CDR1、SEQ ID NO:333のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:334のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項63記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６５】
SEQ ID NO:317の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:321の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:326の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:331の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項63記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６６】
SEQ ID NO:316のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:325のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:330のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項63記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６７】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3が結合するのと同一のCLTA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3が、SEQ ID NO:126のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:135のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項６８】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:128のVLA CDR1、SEQ ID NO:129のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:130のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:132のVHB CDR1、SEQ ID NO:133のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:134のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:137のVHA CDR1、SEQ ID NO:138のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:139のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:142のVLB CDR1、SEQ ID NO:143のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:144のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:128のVLA CDR1、SEQ ID NO:129のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:130のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:132のVHB CDR1、SEQ ID NO:133のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:134のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:137のVHA CDR1、SEQ ID NO:138のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:139のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:142のVLB CDR1、SEQ ID NO:143のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:144のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項67記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項６９】
SEQ ID NO:127の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:131の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:136の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:141の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項67記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７０】
SEQ ID NO:126のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:135のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項67記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７１】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3Rが結合するのと同一のCTLA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3Rが、SEQ ID NO:145のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:154のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:159のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項７２】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:147のVLA CDR1、SEQ ID NO:148のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:149のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:151のVHB CDR1、SEQ ID NO:152のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:153のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:156のVHA CDR1、SEQ ID NO:157のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:158のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:161のVLB CDR1、SEQ ID NO:162のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:163のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:147のVLA CDR1、SEQ ID NO:148のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:149のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:151のVHB CDR1、SEQ ID NO:152のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:153のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:156のVHA CDR1、SEQ ID NO:157のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:158のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:161のVLB CDR1、SEQ ID NO:162のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:163のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項71記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７３】
SEQ ID NO:146の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:150の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:155の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:160の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項71記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７４】
SEQ ID NO:145のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:154のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:159のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項71記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７５】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3-Cが結合するのと同一のCTLA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3-Cが、SEQ ID NO:164のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:173のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:178のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項７６】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:170のVHB CDR1、SEQ ID NO:171のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:172のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:170のVHB CDR1、SEQ ID NO:171のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:172のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項75記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７７】
SEQ ID NO:165の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:169の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:174の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:179の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項75記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７８】
SEQ ID NO:164のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:173のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:178のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項71記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項７９】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3R-Cが結合するのと同一のCTLA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3R-Cが、SEQ ID NO:183のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項８０】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:185のVLA CDR1、SEQ ID NO:186のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:187のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:189のVHB CDR1、SEQ ID NO:190のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:191のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:194のVHA CDR1、SEQ ID NO:195のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:196のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:199のVLB CDR1、SEQ ID NO:200のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:201のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:185のVLA CDR1、SEQ ID NO:186のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:187のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:189のVHB CDR1、SEQ ID NO:190のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:191のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:194のVHA CDR1、SEQ ID NO:195のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:196のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:199のVLB CDR1、SEQ ID NO:200のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:201のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項79記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８１】
SEQ ID NO:184の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:188の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:193の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:198の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項75記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８２】
SEQ ID NO:183のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項71記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８３】
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT021bが結合するのと同一のCD20のエピトープおよび同一のCD22のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT021bが、SEQ ID NO:392のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:401のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:406のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
【請求項８４】
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:394のVLA CDR1、SEQ ID NO:395のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:396のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:398のVHB CDR1、SEQ ID NO:399のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:400のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:403のVHA CDR1、SEQ ID NO:404のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:405のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:408のVLB CDR1、SEQ ID NO:409のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:410のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:394のVLA CDR1、SEQ ID NO:395のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:396のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:398のVHB CDR1、SEQ ID NO:399のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:400のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:403のVHA CDR1、SEQ ID NO:404のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:405のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:408のVLB CDR1、SEQ ID NO:409のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:410のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、請求項83記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８５】
SEQ ID NO:393の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:397の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:402の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:407の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項83記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８６】
SEQ ID NO:392のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:401のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:406のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、請求項87記載の二重特異性結合タンパク質。
【請求項８７】
Fcをさらに含む、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項８８】
FcがヒトIgG1のFcである、請求項87記載の結合タンパク質。
【請求項８９】
FcがSEQ ID NO:20による、請求項87記載の結合タンパク質。
【請求項９０】
少なくとも1つのポリペプチドリンカーをさらに含む、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項９１】
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLA-CL-VHB-CH1-Fcを含み、第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含み、第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含む、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項９２】
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み、第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含み、第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含む、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項９３】
第1のポリペプチド鎖のCLが、直接またはアミノ酸もしくはオリゴペプチドリンカーを介して、VHBと融合している、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項９４】
第1のポリペプチド鎖のCH1が、直接またはアミノ酸もしくはオリゴペプチドリンカーを介して、VLAと融合している、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項９５】
保存的アミノ酸置換を含まない請求項1〜86のいずれか一項記載の対応する結合タンパク質と同等の活性を有する、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質の中に1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する結合タンパク質。
【請求項９６】
前記請求項のいずれか一項記載の結合タンパク質と1種または複数の薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項９７】
有効量の請求項96記載の薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における状態の処置または予防の方法。
【請求項９８】
状態の処置または予防のための医薬の製造における、請求項1〜86のいずれか一項記載の結合タンパク質の使用。
【請求項９９】
状態が炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん、または脊髄損傷である、請求項98記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によって事実上その全体が本明細書に組み入れられる、2016年2月6日に出願された国際特許出願番号PCT/CN2016/073722に基づく優先権およびその恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多価多重特異性結合タンパク質、ならびに多価多重特異性結合タンパク質の作製および使用の方法に関する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる：コンピュータによって読み取り可能な配列表のフォーマットコピー（ファイル名：EPBI_002_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：2017年2月3日、ファイルサイズ510KB）。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
様々な炎症性疾患、がん、およびその他の障害の処置のために有用な分子を調製する試みにおいて、二重特異性または多重特異性の抗体が生成されている。
【０００５】
二重特異性抗体の所望の特異性を有するマウスモノクローナル抗体を発現する2種の異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマテクノロジー（Milstein,C.and A.C.Cuello,Nature,1983.305(5934):p.537-40を参照すること）を使用して、二重特異性抗体は作製されている。2種の異なるmAbの化学的複合化によって、二重特異性抗体を作製することもできる（Staerz,U.D.,et al.,Nature,1985.314(6012):p.628-31を参照すること）。他のアプローチは、2種の異なるモノクローナル抗体またはより小さい抗体断片の化学的複合化を使用している（Brennan,M.,et al.,Science,1985.229(4708):p.81-3を参照すること）。
【０００６】
もう一つの方法は、ヘテロ二官能性架橋剤による2種の親抗体のカップリングである。具体的には、2種の異なるFab断片が、部位特異的に、ヒンジシステイン残基において化学的に架橋されてきた（Glennie,M.J.,et al.,J Immunol,1987.139(7):p.2367-75を参照すること）。
【０００７】
近年、他の組換え二重特異性抗体フォーマットが開発された（Kriangkum,J.,et al.,Biomol Eng,2001.18(2):p.31-40を参照すること）。とりわけ、タンデム単鎖Fv分子およびダイアボディ（diabody）ならびにそれらの様々な誘導体が、組換え二重特異性抗体の構築のために使用されている。通常、これらの分子の構築は、異なる抗原を認識する2種の単鎖Fv（scFv）断片から出発する（Economides,A.N.,et al.,Nat Med,2003.9(1):p.47-52を参照すること）。タンデムscFv分子（taFv）とは、付加的なペプチドリンカーによって2種のscFv分子を単に接続した簡単なフォーマットを表す。これらのタンデムscFv分子に存在する2種のscFv断片は、別々のフォールディングエンティティを形成する。2種のscFv断片を接続するため、最大63残基の長さを有する様々なリンカーを使用することができる（Nakanishi,K.,et al.,Annu Rev Immunol,2001.19:p.423-74を参照すること）。
【０００８】
最近の研究において、CD28および黒色腫関連プロテオグリカンに対するタンデムscFvの、トランスジェニックのウサギおよびウシによるインビボ発現が報告された（Gracie,J.A.,et al.,J Clin Invest,1999.104(10):p.1393-401を参照すること）。この構築物においては2種のscFv分子がCH1リンカーによって接続されており、血清中濃度が最高100mg/Lである二重特異性抗体が見出された。極めて短いAla3リンカーまたは長いグリシン/セリンリッチリンカーのいずれかを使用した、細菌における可溶性タンデムscFv分子の発現を、少数の研究が現在までに報告している（Leung,B.P.,et al.,J Immunol,2000.164(12):p.6495-502；Ito,A.,et al.,J Immunol,2003.170(9):p.4802-9；Karni,A.,et al.,J Neuroimmunol,2002.125(1-2):p.134-40を参照すること）。
【０００９】
最近の研究において、3残基または6残基の長さを有するランダムな中央リンカーを含有しているタンデムscFvレパートリーのファージディスプレイによって、細菌において可溶性かつ活性の形態で産生される分子が濃縮された。このアプローチは、6アミノ酸残基リンカーを含む好ましいタンデムscFv分子の単離をもたらした（Arndt,M.and J.Krauss,Methods Mol Biol,2003.207:p.305-21を参照すること）。
【００１０】
二重特異性ダイアボディ（Db）は、発現のためにダイアボディフォーマットを利用する。ダイアボディは、VHドメインとVLドメインとを接続するリンカーの長さを、およそ5残基に低下させることによって、scFv断片から作製される（Peipp,M.and T.Valerius,Biochem Soc Trans,2002.30(4):p.507-11を参照すること）。リンカーサイズのこの低下は、VHドメインとVLドメインとのクロスオーバー対形成による2本のポリペプチド鎖の二量体形成を容易にする。二重特異性ダイアボディは、構造VHA-VLBおよびVHB-VLA（VH-VL配置）またはVLA-VHBおよびVLB-VHA（VL-VH配置）のいずれかを有する2種のポリペプチド鎖を同一細胞内で発現させることによって作製される。最近の比較研究は、可変ドメインの方向が活性結合部位の発現および形成に影響を及ぼし得ることを証明している（Mack,M.,G.Riethmuller,and P.Kufer,Proc Natl Acad Sci U S A,1995.92(15):p.7021-5を参照すること）。
【００１１】
二重特異性ダイアボディを生成させる一つのアプローチは、ノブイントゥホール（knob-into-hole）ダイアボディの作製である（Holliger,P.,T.Prospero,and G.Winter,Proc Natl Acad Sci U S A,1993.90(14):p.6444-8.18を参照すること）。これは、HER2およびCD3に対する二重特異性ダイアボディについて証明された。抗HER2または抗CD3の可変ドメインのいずれかにおいて、Val37をPheに、Leu45をTrpに交換することによって、大きいノブがVHドメインに導入され、Phe98をMetに、Tyr87をAlaに変異させることによって、相補的なホールがVLドメインにおいて作製された。このアプローチを使用することによって、二重特異性ダイアボディの作製を、親ダイアボディによる72％からノブイントゥホールダイアボディによる90％超にまで増加させることができた。
【００１２】
単鎖ダイアボディ（scDb）は、二重特異性ダイアボディ様分子の形成を改善するための代替的な戦略を表す（Holliger,P.and G.Winter,Cancer Immunol Immunother,1997.45(3-4):p.128-30；Wu,A.M.,et al.,Immunotechnology,1996.2(1):p.21-36を参照すること）。二重特異性単鎖ダイアボディは、およそ15アミノ酸残基の長さを有する付加的な中央リンカーによって、ダイアボディを形成する2本のポリペプチド鎖を接続することによって作製される。したがって、単量体の単鎖ダイアボディに相当する分子量（50〜60kDa）を有する分子は、全て、二重特異性である。いくつかの研究は、二重特異性単鎖ダイアボディが、可溶性かつ活性の形態で細菌において発現され、精製された分子の大多数が、単量体として存在することを証明した（Holliger,P.and G.Winter,Cancer Immunol Immunother,1997.45(3-4):p.128-30；Wu,A.M.,et al.,Immunotechnology,1996.2(1):p.21-36；Pluckthun,A.and P.Pack,Immunotechnology,1997.3(2):p.83-105；Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng,1996.9(7):p.617-21を参照すること）。
【００１３】
ジダイアボディ（di-diabody）と命名された、よりIg様の分子を生成するため、ダイアボディがFcに融合させられた（Lu,D.,et al.,J Biol Chem,2004.279(4):p.2856-65を参照すること）。さらに、IgGの重鎖に2個のFabリピートを含み、4個の抗原分子と結合することができる多価抗体構築物が記載されている（米国特許第8,722,859 B2号およびMiller,K.,et al.,J Immunol,2003.170(9):p.4854-61を参照すること）。
【００１４】
最も最近の例は、4価IgG単鎖可変断片（scFv）融合物（Dong J,et al.2011 MAbs 3:273-288；Coloma MJ,Morrison SL 1997 Nat Biotechnol 15:159-163；Lu D,et al.2002 J Immunol Methods 267:213-226）、カツマキソマブ、三機能性（trifunctional）ラット/マウスハイブリッド二重特異性上皮細胞接着分子-CD3抗体（Lindhofer H,et al 1995 J Immunol 155:219-225）、二重特異性CD19-CD3 scFv抗体ブリナツモマブ（Bargou R,et al.2008 Science 321:974-977）、「二重作用性（dual-acting）Fab」（DAF）抗体（BostromJ,et al.2009 Science 323:1610-1614）、触媒抗体に共有結合で連結されたファーマコフォアペプチド（Doppalapudi VR,et al.2010 Proc Natl Acad Sci USA 107:22611-22616）、二重特異性抗体を生成するための半IgG4分子間の動的交換の使用（van der Neut Kolfschoten M,et al.2007 Science 317:1554-1557；Stubenrauch K,et al.2010 Drug Metab Dispos 38:84-91）、または二重特異性抗体の半分の抗原結合断片（Fab）内の重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインの交換（CrossMabフォーマット）（Schaefer Wet al 2011Proc Natl Acad Sci 108:11187-92）である。
【００１５】
二重の抗原結合機能を有する単一分子エンティティ、およびそのような多価多重特異性結合タンパク質を生成する方法が、当技術分野において必要とされている。本発明は、これらおよびその他の必要性を解決する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、多価多重特異性結合タンパク質、ならびにそのような結合タンパク質の作製および使用の方法を提供する。一つの態様において、本明細書において提供される多価多重特異性結合タンパク質は、タンデム型Fab（Fabs-in-tandem）免疫グロブリン（FIT-Ig）であり、2種またはそれ以上の抗原、または同一の抗原の2種またはそれ以上のエピトープ、または同一のエピトープの2つまたはそれ以上のコピーと結合することができる。本明細書において提供される多価多重特異性結合タンパク質は、急性および慢性の炎症性疾患および炎症性障害、自己免疫疾患、がん、脊髄損傷、敗血症、ならびにその他の疾患、障害、および状態の処置および/または予防のために有用である。多価多重特異性結合タンパク質を含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。さらに、そのようなFIT-Igを作製するための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞が、本明細書において提供される。インビボまたはインビトロで特異的な抗原を検出するために本発明のFIT-Igを使用する方法も、本発明に包含される。
【００１７】
本発明は、例えば、高い親和性で、2種またはそれ以上の抗原と結合することができる結合タンパク質のファミリーを提供する。一つの局面において、本発明は、2種の親モノクローナル抗体：抗原Aと結合するmAb Aおよび抗原Bと結合するmAb Bを使用して、二重特異性結合タンパク質を構築するアプローチを提供する。本明細書に開示された結合タンパク質は、一つの態様において、抗原、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン関連分子、ケモカイン関連分子、または細胞表面タンパク質と結合することができる。
【００１８】
したがって、一つの局面において、2種またはそれ以上の抗原と結合することができる結合タンパク質が提供される。一つの態様において、本発明は、2種またはそれ以上の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成する、少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供する。一つの態様において、結合タンパク質は、2種、3種、4種、5種、またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む。一つの態様において、結合タンパク質は、少なくとも1つのVLA、少なくとも1つのVLB、少なくとも1つのVHA、少なくとも1つのVHB、少なくとも1つのCL、および少なくとも1つのCH1を含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原である。さらなる態様において、第1のポリペプチド鎖は、VLA、CL、VHB、およびCH1を含む。さらなる態様において、結合タンパク質は、Fcをさらに含む。もう一つの態様において、Fc領域は、バリアントFc領域である。さらなる態様において、バリアントFc領域は、改変されたADCCまたはCDCのようなエフェクター機能を示す。もう一つの態様において、バリアントFc領域は、1種または複数のFcγRに対する改変された親和性またはアビディティを示す。
【００１９】
一つの態様において、結合タンパク質は、3種のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、VLA、CL、VHB、およびCH1を含み、第2のポリペプチド鎖は、VHAおよびCH1を含み、第3のポリペプチド鎖は、VLBおよびCLを含む。さらなる態様において、結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖は、Fcをさらに含む。もう一つの態様において、結合タンパク質は、2種のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖は、VLA、CL、VHB、およびCH1を含み、第2のポリペプチド鎖は、VHA、CH1、VLB、およびCLを含む。さらなる態様において、第1のポリペプチド鎖は、Fcをさらに含む。
【００２０】
一つの態様において、結合タンパク質は、3種のポリペプチド鎖を含み、コトランスフェクションの間、それらの対応するcDNAは、1:1:1、1:1.5:1、1:3:1、1:1:1.5、1:1:3、1:1.5:1.5、1:3:1.5、1:1.5:3、または1:3:3という第1:第2:第3のモル比で存在する。もう一つの態様において、結合タンパク質は、2種のポリペプチド鎖を含み、コトランスフェクションの間、それらの対応するcDNAは、1:1、1:1.5、もしくは1:3という第1:第2のモル比で、または任意の所与のトランスフェクションにおいて単量体FIT-Ig画分を最大化する目的での最適化を通して、その他の比で、存在する。
【００２１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、ペプチドリンカーを含まない。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、少なくとも1つのアミノ酸またはポリペプチドリンカーを含む。さらなる態様において、リンカーは、
2019514839.tif 000003
からなる群より選択される。リンカーは、以前に記載されたような（Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals:Applications and Challenges,edited by Stefan R.Schmidt）、インビボで切断可能なペプチドリンカー、（MMPなどの）プロテアーゼに感受性のリンカー、還元によって切断され得るジスルフィド結合に基づくリンカー等、または当技術分野において公知の任意の切断可能リンカーであってもよい。そのような切断可能リンカーは、様々な目的のためにインビボで上部Fabを放出させるため、組織/細胞の透過性および分布を改善するため、標的との結合を増強するため、起こり得る副作用を低下させるために使用され得、2種の異なるFab領域のインビボの機能的半減期および物理的半減期をモジュレートするためにも使用され得る。
【００２２】
一つの態様において、結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端へVLA-CL-VHB-CH1-Fcを含む第1のポリペプチド鎖、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含む第2のポリペプチド鎖、およびアミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含む第3のポリペプチド鎖を含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1のエピトープまたは抗原であり、Bは第2のエピトープまたは抗原である。一つの態様において、Fc領域は、ヒトIgG1である。もう一つの態様において、Fc領域は、バリアントFc領域である。さらなる態様において、Fc領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:20と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一である。さらなる態様において、第1のポリペプチド鎖のCLは、VHBに直接融合している。もう一つの態様において、第1のポリペプチド鎖のCLは、アミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを介してVHBに連結されている。さらなる態様において、リンカーは、GSG（SEQ ID NO:26）またはGGGGSGS（SEQ ID NO:28）である。
【００２３】
もう一つの態様において、結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端へVHB-CH1-VLA-CL-Fcを含む第1のポリペプチド鎖、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含む第2のポリペプチド鎖、およびアミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含む第3のポリペプチド鎖を含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1のエピトープまたは抗原であり、Bは第2のエピトープまたは抗原である。一つの態様において、Fc領域は、ヒトIgG1である。もう一つの態様において、Fc領域は、バリアントFc領域である。さらなる態様において、Fc領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:20と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一である。一つの態様において、第1のポリペプチド鎖のCH1は、VLAに直接融合している。もう一つの態様において、第1のポリペプチド鎖のCH1は、アミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを介してVLAに連結されている。さらなる態様において、リンカーは、GSG（SEQ ID NO:26）またはGGGGSGS（SEQ ID NO:28）である。
【００２４】
もう一つの態様において、結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端へVLA-CL-VHB-CH1-Fcを含む第1のポリペプチド鎖、およびアミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1-VLB-CLを含む第2のポリペプチド鎖を含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1のエピトープまたは抗原であり、Bは第2のエピトープまたは抗原である。一つの態様において、Fc領域は、ヒトIgG1である。もう一つの態様において、Fc領域は、バリアントFc領域である。さらなる態様において、Fc領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:20と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一である。さらなる態様において、第1のポリペプチド鎖のCLは、VHBに直接融合している。もう一つの態様において、第1のポリペプチド鎖のCLは、アミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを介してVHBに連結されている。さらなる態様において、リンカーは、GSG（SEQ ID NO:26）またはGGGGSGS（SEQ ID NO:28）である。
【００２５】
もう一つの態様において、結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端へVHB-CH1-VLA-CL-Fcを含む第1のポリペプチド鎖、およびアミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CL-VHA-CH1を含む第2のポリペプチド鎖を含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1のエピトープまたは抗原であり、Bは第2のエピトープまたは抗原である。一つの態様において、Fc領域は、ヒトIgG1である。もう一つの態様において、Fc領域は、バリアントFc領域である。さらなる態様において、Fc領域のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:20と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％同一である。一つの態様において、第1のポリペプチド鎖のCH1は、VLAに直接融合している。もう一つの態様において、第1のポリペプチド鎖のCH1は、アミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを介してVLAに連結されている。さらなる態様において、リンカーは、GSG（SEQ ID NO:26）またはGGGGSGS（SEQ ID NO:28）である。
【００２６】
本発明の結合タンパク質は、サイトカインの対と結合することができる。例えば、本発明の結合タンパク質は、IL-1αおよびIL-1β；IL-12およびIL-18、TNFαおよびIL-23、TNFαおよびIL-13；TNFおよびIL-18；TNFおよびIL-12；TNFおよびIL-1β；TNFおよびMIF；TNFおよびIL-6、TNFおよびIL-6受容体、TNFおよびIL-17；IL-17およびIL-20；IL-17およびIL-23；TNFおよびIL-15；TNFおよびVEGF；VEGFRおよびEGFR；PDGFRおよびVEGF、IL-13およびIL-9；IL-13およびIL-4；IL-13およびIL-5；IL-13およびIL-25；IL-13およびTARC；IL-13およびMDC；IL-13およびMIF；IL-13およびTGFβ；IL-13およびLHRアゴニスト；IL-13およびCL25；IL-13およびSPRR2a；IL-13およびSPRR2b；IL-13およびADAM8；ならびにTNFαおよびPGE4、IL-13およびPED2、TNFおよびPEG2からなる群より選択されるサイトカインの対と結合することができる。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、IL-17およびIL-20と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、IL-17およびIL-20と結合することができ、抗IL-17抗体LYおよび抗IL-20抗体15D2に由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、IL-17およびTNFと結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、IL-17およびTNFと結合することができ、抗IL-17抗体LYおよびTNF抗体ゴリムマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。
【００２７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、IL-17およびIL-20と結合し、SEQ ID NO:15、25、および27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチドと；SEQ ID NO:21によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:23による配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。もう一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、IL-27およびIL-20と結合し、SEQ ID NO:15、25、および27からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチドと、SEQ ID NO:29、30、および31からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖とを含む。
【００２８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、TNFおよびIL-17と結合し、SEQ ID NO:87によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチドと；SEQ ID NO:89によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:91による配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。もう一つの態様において、結合タンパク質は、CD137およびCD20、CD137およびEGFR、CD137およびHer-2、CD137およびPD-1、CD137およびPDL-1、VEGFおよびPD-L1、 Lag-3およびTIM-3、OX40およびPD-1、TIM-3およびPD-1、TIM-3およびPDL-1、EGFRおよびDLL-4、CD138およびCD20；CD138およびCD40；CD19およびCD20；CD20およびCD3；CD3およびCD33；CD3およびCD133；CD47およびCD20、CD38およびCD138；CD38およびCD20；CD20およびCD22；CD38およびCD40；CD40およびCD20；CD-8およびIL-6；CSPGおよびRGM A；CTLA-4およびBTNO2；IGF1およびIGF2；IGF1/2およびErb2B；IGF-1RおよびEGFR；EGFRおよびCD13；IGF-1RおよびErbB3；EGFR-2およびIGFR；VEGFR-2およびMet；VEGF-Aおよびアンジオポエチン-2（Ang-2）；IL-12およびTWEAK；IL-13およびIL-1β；PDGFRおよびVEGF、EpCAMおよびCD3、Her2およびCD3、CD19およびCD3、EGFRおよびHer3、CD16aおよびCD30、CD30およびPSMA、EGFRおよびCD3、CEAおよびCD3、TROP-2およびHSG、TROP-2およびCD3、MAGおよびRGM A；NgRおよびRGM A；NogoAおよびRGM A；OMGpおよびRGM A；PDL-1およびCTLA-4；CTLA-4およびPD-1；PD-1およびTIM-3；RGM AおよびRGM B；Te38およびTNFα；TNFαおよびBlys；TNFαおよびCD-22；TNFαおよびCTLA-4ドメイン；TNFαおよびGP130；TNFαおよびIL-12p40；ならびにTNFαおよびRANKリガンド、第IXa因子および第X因子；EGFRおよびPD-L1；EGFRおよびcMet；Her3およびIGF-IR；DLL-4およびVEGF；PD-1およびPD-L1；ならびにHer3およびPD-1からなる群より選択される標的の対と結合することができる。
【００２９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、CD3およびCD20と結合することができ、抗CD3抗体OKT3または参照によってその全体が本明細書に組み入れられるU.S.2009/0252683に開示された抗CD3抗体；および抗CD20抗体オファツムマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、CD3抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、CD20抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。本明細書において使用されるように、上部ドメインは、N末端または「アミノ近位」ドメインであり、下部ドメインは、C末端ドメイン、または、存在する場合、Fcに近いドメインである。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはCD3であり、抗原BはCD20である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはCD3であり、抗原AはCD20である。いくつかの態様において、CD3抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、CD20抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはCD20であり、抗原BはCD-3である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはCD20であり、抗原AはCD3である。
【００３０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、SEQ ID NO:41および48からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:44によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:46によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。もう一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD3と結合し、SEQ ID NO:114によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチドと；SEQ ID NO:115によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:116によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【００３１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT018aが結合するのと同一のCD20のエピトープおよび同一のCD3のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT018aは、SEQ ID NO:316のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:325のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:330のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００３２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:318のVLA CDR1、SEQ ID NO:319のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:320のVLA CDR3を含む。
【００３３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:322のVHB CDR1、SEQ ID NO:323のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:324のVHB CDR3を含む。
【００３４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:327のVHA CDR1、SEQ ID NO:328のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:329のVHA CDR3を含む。
【００３５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:332のVLB CDR1、SEQ ID NO:333のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:334のVLB CDR3を含む。
【００３６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:318のVLA CDR1、SEQ ID NO:319のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:320のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:322のVHB CDR1、SEQ ID NO:323のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:324のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:327のVHA CDR1、SEQ ID NO:328のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:329のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:332のVLB CDR1、SEQ ID NO:333のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:334のVLB CDR3を含む。
【００３７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、SEQ ID NO:317の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:321の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:326の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:331の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００３８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、SEQ ID NO:316のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:325のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:330のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【００３９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【００４０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA-4およびPD-1と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、CTLA-4およびPD-1と結合することができ、CTLA-4抗体イピリムマブおよびPD-1抗体ニボルマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。
【００４１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA-4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:92によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:95によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:97によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。一つの態様において、本明細書において提供される結合タンパク質は、CTLA-4の1種または複数のエピトープと結合することができる。一つの態様において、本明細書において提供される結合タンパク質は、PD-1の1種または複数のエピトープと結合することができる。いくつかの態様において、CTLA-4抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはCTLA-4であり、抗原BはPD-1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはCTLA-4であり、抗原AはPD-1である。いくつかの態様において、CTLA-4抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-1であり、抗原BはCTLA-4である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-1であり、抗原AはCTLA-4である。
【００４２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質NBS3、NBS3R、NBS3-C、またはNBS3R-Cが結合するのと同一のCTLA-4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができる。
【００４３】
二重特異性結合タンパク質NBS3は、SEQ ID NO:126のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:135のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００４４】
二重特異性結合タンパク質NBS3Rは、SEQ ID NO:145のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:154のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:159のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００４５】
二重特異性結合タンパク質NBS3-Cは、SEQ ID NO:164のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:173のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:178のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００４６】
二重特異性結合タンパク質NBS3R-Cは、SEQ ID NO:183のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００４７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:128のVLA CDR1、SEQ ID NO:129のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:130のVLA CDR3を含む（例えば、NBS3のもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:147のVLA CDR1、SEQ ID NO:148のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:149のVLA CDR3を含む（例えば、NBS3Rのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含む（例えば、NBS3-Cのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:185のVLA CDR1、SEQ ID NO:186のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:187のVLA CDR3を含む（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００４８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:132のVHB CDR1、SEQ ID NO:133のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:134のVHB CDR3を含む（例えば、NBS3のもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:151のVHB CDR1、SEQ ID NO:152のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:153のVHB CDR3を含む（例えば、NBS3Rのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:166のVHB CDR1、SEQ ID NO:167のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:168のVHB CDR3を含む（例えば、NBS3-Cのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:185のVHB CDR1、SEQ ID NO:186のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:187のVHB CDR3を含む（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００４９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:137のVHA CDR1、SEQ ID NO:138のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:139のVHA CDR3を含む（例えば、NBS3のもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:156のVHA CDR1、SEQ ID NO:157のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:158のVHA CDR3を含む（例えば、NBS3Rのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含む（例えば、NBS3-Cのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:194のVHA CDR1、SEQ ID NO:195のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:196のVHA CDR3を含む（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００５０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:142のVLB CDR1、SEQ ID NO:143のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:144のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3のもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:161のVLB CDR1、SEQ ID NO:162のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:163のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3Rのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3-Cのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:199のVLB CDR1、SEQ ID NO:200のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:201のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００５１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:128のVLA CDR1、SEQ ID NO:129のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:130のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:132のVHB CDR1、SEQ ID NO:133のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:134のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:137のVHA CDR1、SEQ ID NO:138のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:139のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:142のVLB CDR1、SEQ ID NO:143のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:144のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3のもの）。
【００５２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:147のVLA CDR1、SEQ ID NO:148のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:149のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:151のVHB CDR1、SEQ ID NO:152のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:153のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:156のVHA CDR1、SEQ ID NO:157のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:158のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:161のVLB CDR1、SEQ ID NO:162のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:163のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3Rのもの）。
【００５３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:170のVHB CDR1、SEQ ID NO:171のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:172のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3-Cのもの）。
【００５４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:170のVHB CDR1、SEQ ID NO:171のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:172のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００５５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:127の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:131の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:136の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:141の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、NBS3のもの）。
【００５６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:146の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:150の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:155の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:160の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、NBS3Rのもの）。
【００５７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:165の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:169の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:174の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:179の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、NBS3-Cのもの）。
【００５８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:184の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:188の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:193の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:198の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００５９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:126のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:135のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、NBS3のもの）。
【００６０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:145のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:154のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:159のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、NBS3Rのもの）。
【００６１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:164のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:173のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:178のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、NBS3-Cのもの）。
【００６２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:183のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、NBS3R-Cのもの）。
【００６３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CTLA4およびPD-1と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【００６４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、EGFRおよびPD-L1と結合することができ、EGFR抗体パニツムマブおよびPD-L1抗体1B12に由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、EGFR抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはEGFRであり、抗原BはPD-L1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはEGFRであり、抗原AはPD-L1である。いくつかの態様において、EGFR抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-L1であり、抗原BはEGFRである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-L1であり、抗原AはEGFRである。
【００６５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:99によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチドと；SEQ ID NO:100によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:101による配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT012aが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT012aは、SEQ ID NO:99のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:100のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:101のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT012aのもの）。
【００６６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT012bが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT012bは、SEQ ID NO:202のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:211のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:216のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT012bのもの）。
【００６７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT012dが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT012dは、SEQ ID NO:221のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:230のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:235のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００６８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:204のVLA CDR1、SEQ ID NO:205のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:206のVLA CDR3を含む（例えば、FIT012bのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:223のVLA CDR1、SEQ ID NO:224のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:225のVLA CDR3を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００６９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:208のVHB CDR1、SEQ ID NO:209のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:210のVHB CDR3を含む（例えば、FIT012bのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:227のVHB CDR1、SEQ ID NO:228のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:229のVHB CDR3を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００７０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:213のVHA CDR1、SEQ ID NO:214のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:215のVHA CDR3を含む（例えば、FIT012bのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:232のVHA CDR1、SEQ ID NO:233のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:234のVHA CDR3を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００７１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:218のVLB CDR1、SEQ ID NO:219のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:220のVLB CDR3を含む（例えば、FIT012bのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:237のVLB CDR1、SEQ ID NO:238のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:239のVLB CDR3を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００７２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、VLAは、SEQ ID NO:204のVLA CDR1、SEQ ID NO:205のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:206のVLA CDR3を含み、VHBは、SEQ ID NO:208のVHB CDR1、SEQ ID NO:209のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:210のVHB CDR3を含み、VHAは、SEQ ID NO:213のVHA CDR1、SEQ ID NO:214のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:215のVHA CDR3を含み、VLBは、SEQ ID NO:218のVLB CDR1、SEQ ID NO:219のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:220のVLB CDR3を含む（例えば、FIT012bのもの）。
【００７３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:223のVLA CDR1、SEQ ID NO:224のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:225のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:227のVHB CDR1、SEQ ID NO:228のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:229のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:232のVHA CDR1、SEQ ID NO:233のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:234のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:237のVLB CDR1、SEQ ID NO:239のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:239のVLB CDR3を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００７４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:203の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:207の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:212の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:217の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT012bのもの）。
【００７５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:222の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:226の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:231の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:236の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT012dのもの）。
【００７６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:202のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:211のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:216のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT012bのもの）。
【００７７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:221のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:230のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:235のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT012dのもの）。
【００７８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、EGFRおよびPD-L1と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【００７９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、cMetおよびEGFRと結合することができ、cMet抗体（h1332（13.3.2L-A91T,H-42K,S97T））およびEGFR抗体パニツムマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、cMet抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、EGFR抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはcMetであり、抗原BはEGFRである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはcMetであり、抗原AはEGFRである。いくつかの態様において、cMet抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、EGFR抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはEGFRであり、抗原BはcMetである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはEGFRであり、抗原AはcMetである。
【００８０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、SEQ ID NO:102によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:103によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:104によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【００８１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT013aが結合するのと同一のc-Metのエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT013aは、SEQ ID NO:240のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:254のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００８２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:242のVLA CDR1、SEQ ID NO:243のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:244のVLA CDR3を含む。
【００８３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:246のVHB CDR1、SEQ ID NO:247のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:248のVHB CDR3を含む。
【００８４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:251のVHA CDR1、SEQ ID NO:252のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:253のVHA CDR3を含む。
【００８５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:256のVLB CDR1、SEQ ID NO:257のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:258のVLB CDR3を含む。
【００８６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:242のVLA CDR1、SEQ ID NO:243のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:244のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:246のVHB CDR1、SEQ ID NO:247のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:248のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:251のVHA CDR1、SEQ ID NO:252のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:253のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:256のVLB CDR1、SEQ ID NO:257のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:258のVLB CDR3を含む。
【００８７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、SEQ ID NO:241の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:245の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:250の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:255の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００８８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、SEQ ID NO:240のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:254のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【００８９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびEGFRと結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【００９０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、第IXa因子および第X因子と結合することができ、第IXa因子抗体に由来する重鎖および軽鎖の可変領域ならびに第X因子抗体に由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、第IXa因子抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、第X因子抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原Aは第IXa因子であり、抗原Bは第X因子である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原Bは第IXa因子であり、抗原Aは第X因子である。いくつかの態様において、第IXa因子抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、第X因子抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原Aは第X因子であり、抗原Bは第IXa因子である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原Bは第X因子であり、抗原Aは第IXa因子である。
【００９１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、SEQ ID NO:105によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:106によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:107によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【００９２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT014aが結合するのと同一の第IXa因子のエピトープおよび同一の第X因子のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT014aは、SEQ ID NO:259のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:268のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:273のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００９３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:261のVLA CDR1、SEQ ID NO:262のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:263のVLA CDR3を含む。
【００９４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:265のVHB CDR1、SEQ ID NO:266のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:267のVHB CDR3を含む。
【００９５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:270のVHA CDR1、SEQ ID NO:271のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:272のVHA CDR3を含む。
【００９６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:275のVLB CDR1、SEQ ID NO:276のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:277のVLB CDR3を含む。
【００９７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:261のVLA CDR1、SEQ ID NO:262のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:263のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:265のVHB CDR1、SEQ ID NO:266のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:267のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:270のVHA CDR1、SEQ ID NO:271のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:272のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:275のVLB CDR1、SEQ ID NO:276のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:277のVLB CDR3を含む。
【００９８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、SEQ ID NO:260の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:264の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:269の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:274の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【００９９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、SEQ ID NO:259のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:268のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:273のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１００】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、第IXa因子および第X因子と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１０１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、Her3およびIGF-1Rと結合することができ、Her3抗体パトリツマブおよびIGF-1R抗体フィギツムマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、Her3抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、IGF-1R抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはHer3であり、抗原BはIGF-1Rである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはHer3であり、抗原AはIGF-1Rである。いくつかの態様において、Her3抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、IGF-1R抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはIGF-1Rであり、抗原BはHer3である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはIGF-1Rであり、抗原AはHer3である。
【０１０２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、SEQ ID NO:108によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:109によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:110によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【０１０３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT016aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のIGF-1Rのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT016aは、SEQ ID NO:278のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:287のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:292のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１０４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:280のVLA CDR1、SEQ ID NO:281のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:282のVLA CDR3を含む。
【０１０５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:284のVHB CDR1、SEQ ID NO:285のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:286のVHB CDR3を含む。
【０１０６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:289のVHA CDR1、SEQ ID NO:290のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:291のVHA CDR3を含む。
【０１０７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:294のVLB CDR1、SEQ ID NO:295のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:296のVLB CDR3を含む。
【０１０８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:280のVLA CDR1、SEQ ID NO:281のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:282のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:284のVHB CDR1、SEQ ID NO:285のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:286のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:289のVHA CDR1、SEQ ID NO:290のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:291のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:294のVLB CDR1、SEQ ID NO:295のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:296のVLB CDR3を含む。
【０１０９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、SEQ ID NO:279の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:283の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:288の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:293の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１１０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、SEQ ID NO:278のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:287のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:292のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１１１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびIGF-1Rと結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１１２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、DLL-4およびVEGFと結合することができ、DLL-4抗体デムシズマブおよびVEGF抗体ベバシズマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、DLL-4抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、VEGF抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはDLL-4であり、抗原BはVEGFである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはDLL-4であり、抗原AはVEGFである。いくつかの態様において、DLL-4抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、VEGF抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはVEGFであり、抗原BはDLL-4である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはVEGFであり、抗原AはDLL-4である。
【０１１３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、SEQ ID NO:111によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:112によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:113によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【０１１４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT017aが結合するのと同一のDLL-4のエピトープおよび同一のVEGFのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT017aは、SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１１５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:299のVLA CDR1、SEQ ID NO:300のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:301のVLA CDR3を含む。
【０１１６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:303のVHB CDR1、SEQ ID NO:304のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:305のVHB CDR3を含む。
【０１１７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:308のVHA CDR1、SEQ ID NO:309のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:310のVHA CDR3を含む。
【０１１８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:313のVLB CDR1、SEQ ID NO:314のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:315のVLB CDR3を含む。
【０１１９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:299のVLA CDR1、SEQ ID NO:300のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:301のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:303のVHB CDR1、SEQ ID NO:304のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:305のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:308のVHA CDR1、SEQ ID NO:309のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:310のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:313のVLB CDR1、SEQ ID NO:314のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:315のVLB CDR3を含む。
【０１２０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、SEQ ID NO:298の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:302の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:307の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:312の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１２１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１２２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、DLL-4およびVEGFと結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１２３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、Her3およびEGFRと結合することができ、Her3抗体パトリツマブおよびEGFR抗体パニツムマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、Her3抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、EGFR抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはHer3であり、抗原BはEGFRである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはHer3であり、抗原AはEGFRである。いくつかの態様において、Her3抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、EGFR抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはEGFRであり、抗原BはHer3である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはEGFRであり、抗原AはHer3である。
【０１２４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、SEQ ID NO:117によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:118によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:119によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【０１２５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT019aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT019aは、SEQ ID NO:335のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:344のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:349のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT019bが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT019bは、SEQ ID NO:354のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:363のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:368のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１２６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:337のVLA CDR1、SEQ ID NO:338のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:339のVLA CDR3を含む（例えば、FIT019aのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:356のVLA CDR1、SEQ ID NO:357のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:358のVLA CDR3を含む（例えば、FIT019bのもの）。
【０１２７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:341のVHB CDR1、SEQ ID NO:342のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:343のVHB CDR3を含む（例えば、FIT019aのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:360のVHB CDR1、SEQ ID NO:361のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:362のVHB CDR3を含む（例えば、FIT019bのもの）。
【０１２８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:346のVHA CDR1、SEQ ID NO:347のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:348のVHA CDR3を含む（例えば、FIT019aのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:365のVHA CDR1、SEQ ID NO:366のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:367のVHA CDR3を含む（例えば、FIT019bのもの）。
【０１２９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:351のVLB CDR1、SEQ ID NO:352のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:353のVLB CDR3を含む（例えば、FIT019aのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:370のVLB CDR1、SEQ ID NO:371のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:372のVLB CDR3を含む（例えば、FIT019bのもの）。
【０１３０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:337のVLA CDR1、SEQ ID NO:338のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:339のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:341のVHB CDR1、SEQ ID NO:342のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:343のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:346のVHA CDR1、SEQ ID NO:347のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:348のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:351のVLB CDR1、SEQ ID NO:352のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:353のVLB CDR3を含む（例えば、FIT019aのもの）。
【０１３１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:356のVLA CDR1、SEQ ID NO:357のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:358のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:360のVHB CDR1、SEQ ID NO:361のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:362のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:365のVHA CDR1、SEQ ID NO:366のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:367のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:370のVLB CDR1、SEQ ID NO:371のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:372のVLB CDR3を含む（例えば、FIT019bのもの）。
【０１３２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、SEQ ID NO:336の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:340の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:345の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:350の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT019aのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、SEQ ID NO:355の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:359の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:364の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:369の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT019bのもの）。
【０１３３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、SEQ ID NO:335のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:344のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:349のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT019aのもの）。一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、SEQ ID NO:354のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:363のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:368のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT019bのもの）。
【０１３４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびEGFRと結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１３５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、PD-1およびPD-L1と結合することができ、PD-1抗体ニボルマブおよびPD-L1抗体1B12に由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-1であり、抗原BはPD-L1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-1であり、抗原AはPD-L1である。いくつかの態様において、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-L1であり、抗原BはPD-1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-L1であり、抗原AはPD-1である。
【０１３６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:120によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:121によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:122によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【０１３７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT020aが結合するのと同一のPD-1のエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT020aは、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:121のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:122のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１３８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT020bが結合するのと同一のPD-1のエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT020bは、SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１３９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:389のVLA CDR1、SEQ ID NO:390のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLA CDR3を含む（例えば、FIT020aのもの）。
【０１４０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:375のVLA CDR1、SEQ ID NO:376のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLA CDR3を含む（例えば、FIT020bのもの）。
【０１４１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:384のVHB CDR1、SEQ ID NO:385のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHB CDR3を含む（例えば、FIT020aのもの）。
【０１４２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:379のVHB CDR1、SEQ ID NO:380のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHB CDR3を含む（例えば、FIT020bのもの）。
【０１４３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:379のVHA CDR1、SEQ ID NO:380のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHA CDR3を含む（例えば、FIT020aのもの）。
【０１４４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:384のVHA CDR1、SEQ ID NO:385のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHA CDR3を含む（例えば、FIT020bのもの）。
【０１４５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:375のVLB CDR1、SEQ ID NO:376のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLB CDR3を含む（例えば、FIT020aのもの）。
【０１４６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:389のVLB CDR1、SEQ ID NO:390のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLB CDR3を含む（例えば、FIT020bのもの）。
【０１４７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:389のVLA CDR1、SEQ ID NO:390のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:384のVHB CDR1、SEQ ID NO:385のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:379のVHA CDR1、SEQ ID NO:380のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:375のVLB CDR1、SEQ ID NO:376のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLB CDR3を含む（例えば、FIT020aのもの）。
【０１４８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:375のVLA CDR1、SEQ ID NO:376のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:379のVHB CDR1、SEQ ID NO:380のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:384のVHA CDR1、SEQ ID NO:385のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:389のVLB CDR1、SEQ ID NO:390のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLB CDR3を含む（例えば、FIT020bのもの）。
【０１４９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:388の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:383の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:378の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:374の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT020aのもの）。
【０１５０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:374の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:378の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:383の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:388の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT020bのもの）。
【０１５１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:121のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:122のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT020aのもの）。
【０１５２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:373のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:382のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:387のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT020bのもの）。
【０１５３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-1およびPD-L1と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１５４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、Her3およびPD-1と結合することができ、Her3抗体パトリツマブおよびEGFR抗体ニボルマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、Her3抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはHer3であり、抗原BはPD-1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはHer3であり、抗原AはPD-1である。いくつかの態様において、Her3抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-1であり、抗原BはHer3である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-1であり、抗原AはHer3である。
【０１５５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:123によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第1のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:124によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第2のポリペプチド鎖と；SEQ ID NO:125によるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる、第3のポリペプチド鎖とを含む。
【０１５６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT022aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT022aは、SEQ ID NO:411のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:420のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:425のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１５７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:413のVLA CDR1、SEQ ID NO:414のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:415のVLA CDR3を含む。
【０１５８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:417のVHB CDR1、SEQ ID NO:418のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:419のVHB CDR3を含む。
【０１５９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:422のVHA CDR1、SEQ ID NO:423のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:424のVHA CDR3を含む。
【０１６０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:427のVLB CDR1、SEQ ID NO:428のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:429のVLB CDR3を含む。
【０１６１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:413のVLA CDR1、SEQ ID NO:414のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:415のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:417のVHB CDR1、SEQ ID NO:418のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:419のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:422のVHA CDR1、SEQ ID NO:423のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:424のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:427のVLB CDR1、SEQ ID NO:428のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:429のVLB CDR3を含む。
【０１６２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:412の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:416の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:421の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:426の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１６３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、SEQ ID NO:411のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:420のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:425のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１６４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、Her3およびPD-1と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１６５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、cMetおよびPD-L1と結合することができ、cMet抗体h1332およびPD-L1抗体1B12に由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、cMet抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはcMetであり、抗原BはPD-L1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはcMetであり、抗原AはPD-L1である。いくつかの態様において、cMet抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-L1であり、抗原BはcMetである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-L1であり、抗原AはcMetである。
【０１６６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT023aが結合するのと同一のc-Metのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT023aは、SEQ ID NO:430のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:439のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:444のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１６７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:432のVLA CDR1、SEQ ID NO:433のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:434のVLA CDR3を含む。
【０１６８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:436のVHB CDR1、SEQ ID NO:437のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:438のVHB CDR3を含む。
【０１６９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:441のVHA CDR1、SEQ ID NO:442のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:443のVHA CDR3を含む。
【０１７０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:446のVLB CDR1、SEQ ID NO:447のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:448のVLB CDR3を含む。
【０１７１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:432のVLA CDR1、SEQ ID NO:433のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:434のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:436のVHB CDR1、SEQ ID NO:437のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:438のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:441のVHA CDR1、SEQ ID NO:442のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:443のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:446のVLB CDR1、SEQ ID NO:447のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:448のVLB CDR3を含む。
【０１７２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:431の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:435の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:440の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:445の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１７３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、SEQ ID NO:430のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:439のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:444のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１７４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、cMetおよびPD-L1と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１７５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、BTLAおよびPD-1と結合することができ、BTLA抗体6A5およびPD-1抗体ニボルマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、BTLA抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはBTLAであり、抗原BはPD-1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはBTLAであり、抗原AはPD-1である。いくつかの態様において、BTLA抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、PD-1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-1であり、抗原BはBTLAである。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-1であり、抗原AはBTLAである。
【０１７６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT024aが結合するのと同一のBTLAのエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT024aは、SEQ ID NO:449のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:458のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:463のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１７７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT024bが結合するのと同一のBTLAのエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT024bは、SEQ ID NO:468のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:477のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:482のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１７８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:451のVLA CDR1、SEQ ID NO:452のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:453のVLA CDR3を含む（例えば、FIT024aのもの）。
【０１７９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:470のVLA CDR1、SEQ ID NO:471のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:472のVLA CDR3を含む（例えば、FIT024bのもの）。
【０１８０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:455のVHB CDR1、SEQ ID NO:456のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:457のVHB CDR3を含む（例えば、FIT024aのもの）。
【０１８１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:474のVHB CDR1、SEQ ID NO:475のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:476のVHB CDR3を含む（例えば、FIT024bのもの）。
【０１８２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:460のVHA CDR1、SEQ ID NO:461のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:462のVHA CDR3を含む（例えば、FIT024aのもの）。
【０１８３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:479のVHA CDR1、SEQ ID NO:480のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:481のVHA CDR3を含む（例えば、FIT024bのもの）。
【０１８４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:465のVLB CDR1、SEQ ID NO:466のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:467のVLB CDR3を含む（例えば、FIT024aのもの）。
【０１８５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:484のVLB CDR1、SEQ ID NO:485のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:486のVLB CDR3を含む（例えば、FIT024bのもの）。
【０１８６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:451のVLA CDR1、SEQ ID NO:452のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:453のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:455のVHB CDR1、SEQ ID NO:456のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:457のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:460のVHA CDR1、SEQ ID NO:461のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:462のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:465のVLB CDR1、SEQ ID NO:466のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:467のVLB CDR3を含む（例えば、FIT024aのもの）。
【０１８７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:470のVLA CDR1、SEQ ID NO:471のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:472のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:474のVHB CDR1、SEQ ID NO:475のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:476のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:479のVHA CDR1、SEQ ID NO:480のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:481のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:484のVLB CDR1、SEQ ID NO:485のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:486のVLB CDR3を含む（例えば、FIT024bのもの）。
【０１８８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、SEQ ID NO:450の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:454の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:459の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:464の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT024aのもの）。
【０１８９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、SEQ ID NO:469の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:473の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:478の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:483の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む（例えば、FIT024bのもの）。
【０１９０】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、SEQ ID NO:449のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:458のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:463のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT024aのもの）。
【０１９１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、SEQ ID NO:468のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:477のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:482のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる（例えば、FIT024bのもの）。
【０１９２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、BTLAおよびPD-1と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０１９３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合することができる。本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、CD20およびCD22と結合することができ、CD20抗体オファツムマブおよびCD22抗体エプラツズマブに由来する重鎖および軽鎖の可変領域を含む。いくつかの態様において、CD20抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、CD22抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはCD20であり、抗原BはCD22である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはCD20であり、抗原AはCD22である。いくつかの態様において、CD20抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、CD22抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはCD22であり、抗原BはCD20である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはCD22であり、抗原AはCD20である。
【０１９４】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、二重特異性結合タンパク質FIT021bが結合するのと同一のCD20のエピトープおよび同一のCD22のエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT021bは、SEQ ID NO:392のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:401のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:406のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０１９５】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、第1のポリペプチドにVLAを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:394のVLA CDR1、SEQ ID NO:395のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:396のVLA CDR3を含む。
【０１９６】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、第1のポリペプチドにVHBを含み、第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:398のVHB CDR1、SEQ ID NO:399のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:400のVHB CDR3を含む。
【０１９７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、第2のポリペプチドにVHAを含み、第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:403のVHA CDR1、SEQ ID NO:404のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:405のVHA CDR3を含む。
【０１９８】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、第3のポリペプチドにVLBを含み、第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:408のVLB CDR1、SEQ ID NO:409のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:410のVLB CDR3を含む。
【０１９９】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含み、第1のポリペプチドのVLAは、SEQ ID NO:394のVLA CDR1、SEQ ID NO:395のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:396のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBは、SEQ ID NO:398のVHB CDR1、SEQ ID NO:399のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:400のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAは、SEQ ID NO:403のVHA CDR1、SEQ ID NO:404のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:405のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBは、SEQ ID NO:408のVLB CDR1、SEQ ID NO:409のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:410のVLB CDR3を含む。
【０２００】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、SEQ ID NO:393の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:397の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:402の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:407の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む。
【０２０１】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、SEQ ID NO:392のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:401のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:406のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０２０２】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、CD20およびCD22と結合し、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、またはそれ以上（その間の全ての値を含む）のアミノ酸を、保存的アミノ酸置換によって交換することによって、本明細書に記載された結合タンパク質に由来するが、置換なしの対応する結合タンパク質と同等の活性をなお維持している。
【０２０３】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、PD-L1およびTIM3と結合することができる。いくつかの態様において、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにあり、TIM3抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはPD-L1であり、抗原BはTIM3である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはPD-L1であり、抗原AはTIM3である。いくつかの態様において、PD-L1抗体に由来するポリペプチドは、下部ドメインにあり、TIM3抗体に由来するポリペプチドは、上部ドメインにある。例えば、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VLA-CL-VHB-CH1-Fcの第1のポリペプチド、VHA-CH1の第2のポリペプチド、およびVLB-CLの第3のポリペプチドを含み、抗原AはTIM3であり、抗原BはPD-L1である。もう一つの例として、いくつかの態様において、結合タンパク質は、VHB-CH1-VLA-CL-Fcの第1のポリペプチド、VLB-CLの第2のポリペプチド、およびVHA-CH1の第3のポリペプチドを含み、抗原BはTIM3であり、抗原AはPD-L1である。
【０２０４】
一つの態様において、結合タンパク質は、例えば、TIM-3、Lag3、ICOS、BTLA、CD160、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、およびA2aRのようなT細胞の1種または複数の免疫チェックポイントタンパク質の1種または複数のエピトープと結合することができる。もう一つの態様において、結合タンパク質は、例えば、PD-L1、PD-L2、ガレクチン9、HVEM、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、およびCD40のような、免疫チェックポイント経路に関与する1種またはそれ以上の腫瘍細胞表面タンパク質の1種または複数のエピトープと結合することができる。
【０２０５】
一つの局面において、本発明は、本明細書に記載された結合タンパク質を含む薬学的組成物を提供する。一つの態様において、前記請求項のいずれか一項記載の結合タンパク質と、1種または複数の薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。
【０２０６】
もう一つの局面において、本発明は、その必要のある対象における炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん、敗血症、または脊髄損傷の処置または予防の方法を提供する。一つの態様において、方法は、本明細書において提供される結合タンパク質のうちの1種もしくは複数、または本明細書において提供される結合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む1種もしくは複数の薬学的組成物の有効量を、対象へ投与する工程を含む。炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん、脊髄損傷、またはその他の状態の処置または予防のための医薬の製造における本明細書に記載された結合タンパク質の使用も、本明細書において提供される。一つの態様において、炎症性疾患、自己免疫疾患、がん、神経変性疾患、およびその他の状態には、喘息、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、感染性の疾患および障害、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、全身性硬化症、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸促迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、糸球体腎炎、湿疹、喘息、アテローム性動脈硬化症、白血球粘着不全症、レイノー症候群、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、免疫複合体腎炎、IgAネフロパシー、IgM多発ニューロパチー、免疫によって媒介される血小板減少症、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、アトピー性皮膚炎、天疱瘡、グレーブス病、重症急性呼吸促迫症候群、脈絡網膜炎、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性伝染性単核症、HIV、ヘルペスウイルス関連疾患、1型糖尿病、移植片対宿主病（GVHD）；移植片移植拒絶に関連した免疫障害；T細胞リンパ腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性T細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、原発性粘液水腫、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存性糖尿病、グッドパスチャー症候群、交感性眼炎、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、多発性筋炎、強皮症、混合性結合組織病、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、男性不妊、水晶体原性ブドウ膜炎、原発性粘液水腫、ライター症候群、全身硬直症候群、甲状腺中毒症、潰瘍性大腸炎、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、食道がん、膣がん、子宮頸がん、脾臓のがん、精巣がん、胸腺のがん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、芽細胞腫、肉腫、肺の腺がん、肺の扁平上皮がん、腹膜がん、皮膚がん、皮膚または眼の黒色腫、直腸がん、肛門周囲がん、食道がん、小腸がん、内分泌腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部肉腫、尿道がん、男性/女性生殖器がん、神経がん、慢性または急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞腫、胃がん、膠芽腫、卵巣がん、肝臓がん���肝腫瘍、結腸がん、大腸がん、子宮内膜がん、子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、外陰がん、甲状腺がん、妊娠糖尿病、慢性血栓塞栓性疾患またはフィブリン形成に関連した障害、例えば、血管障害、例えば、深部静脈血栓症、動脈血栓症、脳卒中、腫瘍転移、血栓溶解、動脈硬化症、および血管形成術後の再狭窄、敗血症性ショック、敗血症、低血圧、成人型呼吸促迫症候群（ARDS）、播種性血管内凝固障害（DIC）、サルコイドーシス、動脈硬化症、消化性潰瘍、熱傷、膵炎、多嚢胞性卵巣疾患（POD）、子宮内膜症、子宮筋腫、良性前立腺肥大症、T細胞急性リンパ芽球性白血病（T-ALL）、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（CADASIL）、ファロー四徴症（TOF）、アラジール症候群（AS）、黄斑変性および加齢黄斑変性疾患、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症、および肝硬変）、骨関節炎、骨粗鬆症、喘息（アレルギー喘息を含む）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、若年発症I型糖尿病、移植片拒絶、ならびにSLEが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２０７】
一つの態様において、本開示は、IL-17およびIL-20と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における慢性関節リウマチ、乾癬、骨粗鬆症、脳卒中、肝疾患、または口腔がんの処置または予防の方法を提供する。さらなる態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、SEQ ID NO:15、25、および27より選択されるアミノ酸配列；ならびにSEQ ID NO:21によるアミノ酸配列；ならびにSEQ ID NO:23によるアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、SEQ ID NO:15、25、および27より選択されるアミノ酸配列；ならびにSEQ ID NO:29、30、および31より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２０８】
一つの態様において、本開示は、1種または複数のB細胞抗原と結合することができるFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象におけるB細胞がんの処置または予防の方法を提供する。さらなる態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、CD20と結合することができる。さらなる態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、CD20およびもう1種の抗原と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質は、CD3およびCD20と結合することができる。さらなる態様において、がんは、B細胞がんである。さらなる態様において、B細胞がんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫［NHL］、前駆B細胞リンパ芽球白血病/リンパ腫、成熟B細胞新生物、B細胞慢性リンパ球性白血病/小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、ヘアリーセル白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫からなる群より選択される。一つの態様において、本開示は、SEQ ID NO:41または48によるアミノ酸配列；およびSEQ ID NO:44によるアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:46によるアミノ酸配列を含むFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象におけるB細胞がんの処置または予防の方法を提供する。
【０２０９】
一つの態様において、本開示は、TNFおよびIL-17と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における自己免疫疾患、炎症性疾患、または炎症の処置または予防の方法を提供する。さらなる態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、SEQ ID NO:87、89、および91による配列を含む。もう一つの態様において、本開示は、TNFおよびIL-17と結合することができるFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置または予防の方法を提供し、自己免疫疾患または炎症性疾患は、クローン病、乾癬（尋常性乾癬を含む）、関節炎（慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、骨関節炎、または若年性特発性関節炎を含む）、多発性硬化症、強直性脊椎炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、ブドウ膜炎、敗血症、神経変性疾患、ニューロン再生、脊髄損傷、原発がんおよび転移がん、呼吸器障害；喘息；アレルギー性喘息および非アレルギー性喘息；感染による喘息；呼吸器多核体ウイルス（RSV）感染による喘息；慢性閉塞性肺疾患（COPD）；気道炎症を伴う状態；好酸球増加；線維症および過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性障害；アトピー性皮膚炎；蕁麻疹；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症状態および/または自己免疫状態；胃腸器官の炎症状態および/または自己免疫状態；炎症性腸疾患（IBD）；潰瘍性大腸炎；肝臓の炎症状態および/または自己免疫状態；肝硬変；肝線維症；ならびにB型肝炎ウイルスおよび/またはC型肝炎ウイルスによって引き起こされた肝線維症；強皮症からなる群より選択される。もう一つの態様において、本開示は、TNFおよびIL-17と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象におけるがんの処置または予防の方法を提供する。さらなる態様において、がんは、肝細胞がん；膠芽腫；リンパ腫；またはホジキンリンパ腫である。もう一つの態様において、本開示は、本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における感染の処置または予防の方法を提供し、感染は、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、HTLV-1感染である。一つの態様において、本開示は、防御1型免疫応答の発現の抑制、および予防接種における防御1型免疫応答の発現の抑制のための方法を提供する。
【０２１０】
一つの態様において、本開示は、SEQ ID NO:87、89、および91による配列を含むFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における慢性関節リウマチの処置の方法を提供する。
【０２１１】
一つの態様において、本開示は、CTLA-4およびPD-1と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象におけるがんの処置または予防の方法を提供する。さらなる態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、SEQ ID NO:92、95、および97を含むアミノ酸配列を含む。もう一つの態様において、本開示は、その必要のある対象におけるがんの処置または予防の方法を提供し、結合タンパク質は、CTLA-4およびPD-1と結合することができ、がんは、典型的に免疫治療に応答性のがんである。もう一つの態様において、がんは、免疫治療に関連していていないがんである。もう一つの態様において、がんは、難治性または再発性の悪性疾患である。もう一つの態様において、結合タンパク質は、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害する。もう一つの態様において、がんは、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン難治性前立腺腺がん）、膵臓腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部の扁平上皮がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、およびその他の新生物性悪性疾患からなる群より選択される。
【０２１２】
一つの態様において、本開示は、CTLA-4およびPD-1と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における黒色腫の処置または予防の方法を提供する。さらなる態様において、本開示は、SEQ ID NO:92、95、および97によるアミノ酸配列を含むFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における黒色腫の処置または予防の方法を提供する。
【０２１３】
もう一つの態様において、本開示は、CTLA-4およびPD-1と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における感染または感染性疾患の処置または予防の方法を提供する。一つの態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激するため、単独で、またはワクチンと組み合わせて投与される。したがって、一つの態様において、本明細書に提供された結合タンパク質は、以下に限定されるわけではないが、ヒト免疫不全ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、およびC型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、細菌、真菌性寄生生物、またはその他の病原体のようなヒトに感染性のウイルスに対する免疫応答を刺激するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】図1Aは、FIT1-Ig、FIT2-Ig、およびFIT3-Igなど、3種の構築物で作製されるFIT-Igの構造を示す。図1BはそのようなFIT1-Igを調製するのに用いた3種の構築物を示す。
【図２】図2Aは、2種の構築物で作製されるFIT-Igの基本構造を示す。図2BはそのようなFIT-Igを調製するのに用いた2種の構築物を示す。
【図３】Biacoreによって測定したFIT1-Igの二重特異性抗原結合を提供する。図3の上のパネルは、FIT1-Igが最初にIL-17続いてIL-20によって飽和される、Biacore結合アッセイの結果を示す。図3の下のパネルは、FIT1-Igが最初にIL-20続いてIL-17によって飽和される、Biacoreアッセイの結果を示す。
【図４】PEG誘導性沈殿によって測定された、あるpH範囲での抗IL-17/IL-20 FIT Igまたはモノクローナル抗体リツキシマブの溶解性を示す。
【図５】ELISAによって評価された、FIT10-Igまたは親抗体イピリムマブおよびニボルマブによるCTLA-4（図5A）またはPD-1（図5B）への結合を示す。
【図６】CTLA-4およびPD-1の両方に対するFIT10-Igの多重結合試験を示す。CTLA-4続いてPD-1への結合；およびPD-1続いてCTLA-4による結合は両方とも図6に表示すように示される。
【図７Ａ】FIT12a-Ig（EGFR/PD-L1）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｂ】FIT13a-Ig（cMet/EGFR）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｃ】FIT14-Ig（第IXa因子/第X因子）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｄ】FIT16a-Ig（Her3/IGF-1R）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｅ】FIT17a-Ig（DLL-4/VEGF）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｆ】FIT18a-Ig（CD20/CD3）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｇ】FIT19a-Ig（Her3/EGFR）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｈ】FIT20a-Ig（PD-1/PD-L1）のSECプロファイルを示す。
【図７Ｉ】FIT22a-Ig（Her3/PD-1）のSECプロファイルを示す。
【図８】cMetおよびEGFRの両方に対するFIT13a-Igの多重結合試験を示す。
【図９】ELISAによって評価された、PD-1（図9A）またはCTLA-4（図9B）に対するNBSRまたは親抗体ニボルマブの結合を示す。ヒトIgG1を対照として含む。
【図１０】CTLA-4およびPD-1の両方に対するNBS3多重結合試験を示す。CTLA-4続いてPD-1への結合；およびPD-1続いてCTLA-4による結合は両方とも表示のように示される。
【図１１】図11Aは静脈内に（IV）または皮下に（SC）投与された5 mg/kg NBS3の平均血清中濃度-時間プロファイルを示す。図11Bはこの試験の詳細なPKパラメータを提供する。
【図１２】親抗体ニボルマブと比較した、NBS3、NBS3-C、NBS3R-Cの細胞ベースの受容体ブロッキングアッセイを示す。ヒトIgG4を対照として含む。
【図１３】図13Aは、0、0.01、0.1、1、または10 μg/mlの濃度で親抗体ニボルマブと比較した、MLRアッセイにおけるNBS3、NBS3-C、およびNBS3R-Cの機能活性を示す。各抗体についてIFN-γの誘導を測定した。ヒトIgGを対照として含む。図13Bはこれらの抗体によるIL-2の誘導を示す。
【図１４】0.016. 0.08、0.4、2、または10 μg/mlの濃度で、親抗体イピリムマブと比較した場合の、PBMC SEB刺激アッセイにおけるNBS3、NBS3-C、およびNBS3R-Cの機能活性を示す。上清中のIL-2サイトカイン産生をELISAによって検出した。
【図１５】EGFRおよびPD-L1両方に対するFIT012bの多重結合試験を示す。ヒトEGFR続いてヒトPD-L1への結合；およびヒトPD-L1続いてヒトEGFRによる結合は両方とも表示のように示される。
【図１６】ヒトEGFRおよびヒトPD-L1両方に対するFIT012dの多重結合試験を示す。ヒトEGFR続いてヒトPD-L1（図16A）への結合；およびヒトPD-L1続いてヒトEGFRによる結合（図16B）は両方とも表示のように示される。
【図１７】cMetおよびEGFR両方に対するFIT013aの多重結合試験を示す。cMet続いてEGFRへの結合；およびEGFR続いてcMetによる結合は両方とも表示のように示される。
【図１８Ａ】膜c-MetおよびEGFRに対するFIT013aの結合活性を試験したFACSアッセイを示す。図18A（右パネル）はBD FACSVerseフローサイトメトリーによって測定されたMKN-45細胞に対する二重結合を示す。図18A（左パネル）は、MKN-45細胞では、c-Metの膜発現レベルがEGFRよりはるかに高いので、FIT013aおよびFIT013a-Fabのc-Met結合部位は膜c-Metによって占有され、FIT013aおよびFIT013a-FabのフリーのEGFR結合部位はビオチン化EGFRによって検出されることを示す。
【図１８Ｂ】膜c-MetおよびEGFRに対するFIT013aの結合活性を試験したFACSアッセイを示す。図18B（右パネル）は、BD FACSVerseフローサイトメトリーによって測定されるSGC-7901細胞に対する二重結合を示す。図18B（左パネル）は、SGC-7901細胞では、EGFRの膜発現レベルがc-Metよりはるかに高いので、FIT013aおよびFIT013a-FabのEGFR結合部位は膜EGFRによって占有され、FIT013aおよびFIT013a-Fabのフリーのc-Met結合部位がビオチン化c-Metによって検出されることを示す。
【図１８Ｃ】膜c-MetおよびEGFRに対するFIT013aの結合活性を試験したFACSアッセイを示す。図18C（右パネル）はBD FACSVerseフローサイトメトリーによって測定されるNCI-H1975細胞への二重結合を示す。図18C（左パネル）は、NCI-H1975細胞では、c-Metの膜発現レベルはEGFRと等しいので、FIT013aおよびFIT013a-Fabのc-MetおよびEGFR結合部位は同時に占有され、FIT013aおよびFIT013a-FabのフリーのEGFRまたはc-Met結合部位は検出されないことを示す。
【図１９】NCI-H292細胞でのFIT013aのHGF誘導性AKTリン酸化を阻害する能力を示す。FIT013a、h1332、パニツムマブ、h1332/パニツムマブの組み合わせ、およびヒトIgG1を細胞に加え、30分間インキュベートし、次いで、40 ng/ml HGFを5分間アッセイプレートに添加した。細胞を溶解し、AKTリン酸化をERKホスホT202/Y204キットによって検出した。
【図２０】AKTリン酸化によって測定したHGF非存在下でのFIT013aのアゴニスト作用を示す。連続希釈したFIT013aまたは他のAb（h1332、h1332/パニツムマブの組み合わせ、エミベツズマブ（emibetuzumab）、9.1.2、およびヒトIgG1）を細胞に添加し、30分間インキュベートした。細胞を溶解し、AKTリン酸化をERKホスホT202/Y204キットによって検出した。
【図２１Ａ】雄のSDラット(N＝4/時点、c-metプレート）における5 mg/kgのIV投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の個々の血清中濃度-時間プロファイルを示す。
【図２１Ｂ】雄のSDラット(N＝4/時点、c-metプレート）における5 mg/kgのSC投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の個々の血清中濃度-時間プロファイルを示す。
【図２１Ｃ】雄のSDラット（N＝4/時点、EGFRプレート）における5 mg/kgのIV投与後のFIT013a（c-Met/EGFR）の個々の血清中濃度-時間プロファイルを示す。
【図２１Ｄ】雄のSDラット（N＝4/時点、EGFRプレート）における5 mg/kgのSC投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の個々の血清中濃度-時間プロファイルを示す。
【図２２】NCI-H1975-HGF腫瘍細胞を接種されたヌードBALB/cマウス（N＝3動物/群）中の血清および腫瘍におけるFIT013a、パニツムマブ、およびH1332の分布を示す。
【図２３】NCI-H1975-HGF腫瘍細胞を接種されたヌードBALB/cマウス（N＝8動物/群）での腫瘍サイズの阻害におけるFIT013a、パニツムマブ、H1332、媒体の有効性を示す。抗体を2回/週i.p.で3週間投与した。FIT013aの投与量は16 mg/kgであり、H1332またはパニツムマブでは10 mg/kgであった。
【図２４】BIOPHEN FVIII:Cキット(Hyphen-Biomed）を用いる第VIIIa様活性についての酵素アッセイを示す。mAb FIX、mAb FX、mAb FIXおよびmAb FXの組み合わせ、エミシズマブ、FIT014a、ならびに精製したFVIIIaを含む試料を分析した。
【図２５】FIXおよびFX両方に対するFIT014aの多重結合試験を示す。FIX続いてFXへの結合；およびFX続いてFIXによる結合は両方とも表示のように示される。
【図２６】hIgGプレートまたは第X因子プレートいずれかでの静脈内に（IV）または皮下に（SC）投与した5 mg/kg FIT014aの平均血清中濃度-時間プロファイルを示す。ラット血清試料中の抗体濃度を62.5 ng/mLのLLOQによるELISAによって検出した。hIgGプレートでは、コーティングタンパク質は抗hIgG Fcであり、検出抗体は抗hIgG Fabである。第X因子プレートでは、コーティングタンパク質は第X因子であり、検出抗体は抗ヒトIgG Fcである。
【図２７】Her3およびIGF1R両方に対するFIT016aの多重結合試験を示す。Her3続いてIGF1Rへの結合；およびIGF1R続いてHer3による結合は両方とも表示のように示される。
【図２８】DLL4およびVEGF両方に対するFIT017aの多重結合試験を示す。DLL4続いてVEGFへの結合；およびVEGF続いてDLL4による結合は両方とも表示のように示される。
【図２９】ヒトB細胞およびヒトT細胞上のCD20およびCD3に結合する能力について、その関連する親抗体（CD3 mAb、オファツムマブ、ならびにCD3 mAbおよびオファツムマブの組み合わせ）、およびヒトIgG1と比較した、FIT018aの細胞ベースのFACS結合アッセイを示す。図29Aのアッセイでは、ヒトB細胞株 Rajiが用いられた。図29Bのアッセイでは、ヒトT細胞株 Jurkatが用いられた。
【図３０】図30Aは、カニクイザルCD20細胞に結合するその能力について、オファツムマブ（CD20）および抗RAC-ヒトIgG1と比較した、FIT018aの細胞ベースのFACS結合アッセイを示す。図30Bは、カニクイザルT細胞に結合するその能力について、オファツムマブ（CD20）、CD3 mAbと比較した、FIT018aの細胞ベースのFACS結合アッセイを示す。
【図３１】B細胞除去アッセイで測定した、2日目（図31A）および3日目（図31B）でのヒトB細胞（Raji）のアポトーシス誘導におけるFIT018a、オファツムマブ、CD3 mAb、ならびにオファツムマブおよびCD3 mAbの組み合わせ（1:1）の能力を示す。
【図３２】Her3およびEGFR両方に対するFIT019aの多重結合試験を示す。Her3続いてEGFRへの結合、およびEGFR続いてHer3による結合は両方とも表示のように示される。
【図３３】Her3およびhEGFR両方に対するFIT019bの多重結合試験を示す。EGFR続いてHer3への結合（図33A）；およびHer3続いてEGFRによる結合（図33B）は両方とも表示のように示される。
【図３４】図34Aは、誘導されたIL-2のレベルによって測定される、0、0.01、0.1、1、10、または100 nMの濃度で、親抗体ニボルマブ、1B12ならびにニボルマブおよび1B12の組み合わせ（1:1）と比較した場合のMLRアッセイにおけるFIT020bの機能活性を示す。図34Bは、これらの抗体による0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、および100 nMの濃度でのIL-2の誘導を示す。
【図３５】PD-L1およびPD-1両方に対するFIT020bの多重結合試験を示す。PD-L1続いてPD-1への結合；およびPD-1続いてPD-L1による結合は両方とも表示のように示される。
【図３６】ヒトB細胞に結合するその能力について、その関連する親抗体（オファツムマブ、エプラツズマブ、およびオファツムマブとエプラツズマブとの組み合わせ（1:1））、およびヒトIgG1と比較した、FIT021bの細胞ベースのFACS結合アッセイを示す。図36Aのアッセイでは、ヒトB細胞株 Rajiを用いた。図36Bのアッセイでは、ヒトB細胞株 Daudiを用いた。
【図３７】Her3およびヒトPD-1両方に対するFIT022aの多重結合試験を示す。Her3続いてヒトPD-1への結合；およびヒトPD-1続いてHer3による結合は両方とも表示のように示される。
【図３８】図38A は、0、0.01、0.1、1、または10 μg/mlの濃度で親抗体ニボルマブおよびパトリツマブと比較した場合の、MLRアッセイにおけるFIT022aの機能活性を示す。LI-2の誘導を各抗体について測定した。ヒトIgG1およびヒトIgG4を対照として含めた。図38Bは、これらの抗体によるIFN-γの誘導を示す。
【図３９】cMet-hisおよびPD-L1-his両方に対するFIT023aの多重結合試験を示す。cMet-his続いてPD-L1-hisへの結合（図39A）；およびPD-L1-his続いてcMet-hisによる結合（図39B）は両方とも表示のように示される。
【図４０】BTLA-hisおよびPD1-his両方に対するFIT024aの多重結合試験を示す。BTLA-his続いてPD1-hisへの結合（図40A）；およびPD1-his続いてBTLA-hisによる結合（図40B）は両方とも表示のように示される。
【図４１】BTLA-hisおよびPD1-his両方に対するFIT024bの多重結合試験を示す。BT:A-his続いてPD1-hisへの結合（図41A）；およびPD1-his続いてBTLA-hisによる結合（図41B）は両方とも表示のように示される。
【図４２】図42Aは、誘導されたIL-2のレベルによって測定された、0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、または100 nMの濃度で親抗体ニボルマブと比較した場合の、MLRアッセイにおけるFIT024aおよびFIT024bの機能活性を示す。ヒトIgG1を対照として含めた。図42Bは、これらの抗体による0、0.01、0.1、1、10、または100の濃度でのIL-2の誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２１５】
詳細な説明
本発明は、多価および多重特異性の結合タンパク質、結合タンパク質を作製する方法、ならびに急性および慢性の炎症性疾患および障害、がん、および他の疾患の予防および／または処置におけるそれらの使用に関する。本発明は、2種またはそれ以上の抗原と結合することができる多価および／または多重特異性の結合タンパク質に関係する。具体的には、本発明は、タンデム型Fab免疫グロブリン (FIT-Ig)、およびその薬学的組成物、ならびにそのようなFIT-Igを作製するための核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞に関する。インビトロまたはインビボのいずれかで特異的抗原を検出するために本発明のFIT-Igを使用する方法もまた、本発明に包含される。
【０２１６】
本明細書において提供される結合タンパク質の新規ファミリーは、例えば高い親和性で、2種またはそれ以上の抗原と結合することができる。具体的には、本発明は、2種の親モノクローナル抗体：抗原aに結合するmAb Aおよび抗原bに結合するmAb Bを使用して、二重特異性結合タンパク質を構築するためのアプローチを提供する。
【０２１７】
一つの局面において、本発明は、第1の抗原またはエピトープに特異的な可変軽鎖、第1の軽鎖定常ドメイン、第2の抗原またはエピトープに特異的な可変重鎖、第1の重鎖CH1、第1の抗原またはエピトープに特異的な可変重鎖、第2の重鎖CH1、第2の抗原またはエピトープに特異的な可変重鎖、および第2の軽鎖定常ドメインを含む結合タンパク質を提供する。一つの態様において、結合タンパク質はFc領域をさらに含む。結合タンパク質は、結合タンパク質の構成成分の2つまたはそれ以上を連結する1つまたは複数のアミノ酸またはポリペプチドリンカーをさらに含み得る。例えば、結合タンパク質は、軽鎖可変領域を軽鎖定常領域に連結するポリペプチドリンカーを含み得る。
【０２１８】
一つの態様において、本開示は、VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)nを含むポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供し、ここで、VLAはmAb Aの軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、X1はアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを表し、VHBはmAb Bの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X2はFc領域または異なる二量体化ドメインを表し、およびnは0または1である。
【０２１９】
一つの態様において、本発明は3つの異なるポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（図1）を提供し、ここで、第1のポリペプチド鎖（構築物#1）はVLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)nを含み、ここで、VLAはmAb Aの軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、X1はアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを表し、VHBはmAb Bの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X2はFc領域または異なる二量体化ドメインを表し、かつnは0または1である。第2のポリペプチド鎖（構築物#2）はVHA-CH1を含み、ここで、VHAはmAb Aの重鎖可変ドメインであり、およびCH1は重鎖の第1の定常ドメインである。第3のポリペプチド鎖（構築物#3）はVLB-CLを含み、ここで、VLBはmAb Bの軽鎖可変ドメインであり、およびCLは軽鎖の定常ドメインである。
【０２２０】
別の態様において、本発明は、可変ドメインの順序が逆向きであることを除いて全体的な分子設計が先の態様と同様である、3つの異なるポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供する。この態様において、第1のポリペプチド鎖はVHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)nを含み、ここで、VLAはmAb Aの軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、X1はアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを表し、VHBはmAb Bの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X2はFc領域または異なる二量体化ドメインを表し、およびnは0または1である。第2のポリペプチド鎖はVHA-CH1を含み、ここで、VHAはmAb Aの重鎖可変ドメインであり、およびCH1は重鎖の第1の定常ドメインである。第3のポリペプチド鎖はVLB-CLを含み、ここで、VLBはmAb Bの軽鎖可変ドメインであり、およびCLは軽鎖の定常ドメインである。
【０２２１】
別の態様において、本発明は2種の異なるポリペプチド鎖を含む結合タンパク質（図2）を提供し、ここで、第1のポリペプチド鎖（構築物#1）はVLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)nを含み、ここで、VLAはmAb Aの軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、X1はアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを表し、VHBはmAb Bの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X2はFc領域または異なる二量体化ドメインを表し、およびnは0または1である。第2のポリペプチド鎖（構築物#4）はVHA-CH1-(X3)n-VLB-CLを含み、ここで、VHAはmAb Aの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X3は定常ドメインではないアミノ酸またはポリペプチドを表し、nは0または1であり、VLBはmAb Bの軽鎖可変ドメインであり、およびCLは軽鎖定常ドメインである。
【０２２２】
別の態様において、本発明は、可変ドメインの順序が逆向きであることを除いて全体的な分子設計が先の態様と同様である、2種のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質を提供する。この態様において、第1のポリペプチド鎖はVHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)nを含み、ここで、VLAはmAb Aの軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、X1はアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを表し、VHBはmAb Bの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X2はFc領域または異なる二量体化ドメインを表し、およびnは0または1である。第2のポリペプチド鎖はVLB-CL-(X3)n-VHA-CH1を含み、ここで、VHAはmAb Aの重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、X3はアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーを表し、nは0または1であり、VLBはmAb Bの軽鎖可変ドメインであり、およびCLは軽鎖の定常ドメインである。
【０２２３】
一つの態様において、結合タンパク質中のVHドメインおよびVLドメインは、マウス重鎖／軽鎖可変ドメイン、完全なヒト重鎖／軽鎖可変ドメイン、CDR移植された重鎖／軽鎖可変ドメイン、ヒト化重鎖／軽鎖可変ドメイン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。好ましい態様において、VHA/VLAおよびVHB/VLBは同一の抗原と結合することができる。別の態様において、VHA/VLAおよびVHB/VLBは異なる抗原と結合することができる。
【０２２４】
一つの態様において、第1のポリペプチド鎖はVLA-CL-VHB-CH1-Fcを含み、第1のポリペプチド鎖のCLとVHBは直接融合されている。別の態様において、CLとVHBはアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーによって連結されている。別の態様において、第1のポリペプチド鎖はVHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み、CH1とVLAは直接融合されている。別の態様において、CH1とVLAはアミノ酸またはオリゴペプチドリンカーによって連結されている。さらなる態様において、オリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーは、柔軟性を提供する任意の合理的な配列の1つまたは複数のアミノ酸を含む。好ましくは、リンカーは、
2019514839.tif 000004
からなる群より選択される。一つの態様において、リンカーのアミノ酸配列は、SEQ ID NO. 26、28、および49〜86からなる群より選択され得る。一つの態様において、リンカーはGSG (SEQ ID NO: 26) またはGGGGSGS (SEQ ID NO: 28) である。リンカーはまた、以前に記載されたような（Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges、Stefan R. Schmidt編）、インビボで切断可能なペプチドリンカー、プロテアーゼ（MMPなど）感受性リンカー、還元により切断され得るジスルフィド結合に基づくリンカー等、または当技術分野において公知の任意の切断可能なリンカーであってもよい。そのような切断可能なリンカーは、2種の異なるFab領域の組織／細胞の浸透および分布を改善するため、標的への結合を増強するため、潜在的副作用を軽減するため、ならびにインビボでの機能的および物理的半減期を調節するために、様々な目的で上部Fabをインビボで放出するために使用することができる。一つの態様において、結合タンパク質はFc領域を含む。本明細書で用いられる場合、「Fc領域」という用語はIgG重鎖のC末端領域を指す。ヒトIgG1 Fc領域を含むアミノ酸配列の例は、SEQ ID NO: 20である。IgGのFc領域は、2つの定常ドメイン、CH2およびCH3を含む。
【０２２５】
一つの態様において、Fc領域はバリアントFc領域である。一つの態様において、バリアントFc領域は、親Fc領域と比較して、置換、欠失、または挿入などの1つまたは複数のアミノ酸修飾を有する。さらなる態様において、Fc領域のアミノ酸修飾は、親Fc領域の活性と比較してエフェクター機能活性を変化させる。例えば、一つの態様において、バリアントFc領域は、変化した（すなわち、増加または減少した）抗体依存性細胞傷害 (ADCC)、補体媒介性細胞傷害(CDC)、食作用、オプソニン作用、または細胞結合を有し得る。別の態様において、Fc領域のアミノ酸修飾は、親Fc領域と比較して、FcγRに対するバリアントFc領域の親和性を変化（すなわち、増加または減少）させ得る。例えば、バリアントFc領域は、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIに対する親和性を変化させ得る。
【０２２６】
1つの好ましい態様において、本明細書において提供される結合タンパク質は、1種または複数の標的と結合することができる。一つの態様において、標的は、サイトカイン、細胞表面タンパク質、酵素、および受容体からなる群より選択される。好ましくは、結合タンパク質は、1種または複数の標的の生物学的機能を調節することができる。より好ましくは、結合タンパク質は、1種または複数の標的を中和することができる。
【０２２７】
一つの態様において、本発明の結合タンパク質は、リンホカイン、モノカイン、およびポリペプチドホルモンからなる群より選択されるサイトカインと結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質は、IL-1αおよびIL-1β；IL-12およびIL-18、TNFαおよびIL-23、TNFαおよびIL-13；TNFおよびIL-18；TNFおよびIL-12；TNFおよびIL-1β；TNFおよびMIF；TNFおよびIL-6、TNFおよびIL-6受容体、TNFおよびIL-17；IL-17およびIL-20；IL-17およびIL-23；TNFおよびIL-15；TNFおよびVEGF；VEGFRおよびEGFR；IL-13およびIL-9；IL-13およびIL-4；IL-13およびIL-5；IL-13およびIL-25；IL-13およびTARC；IL-13およびMDC；IL-13およびMIF；IL-13およびTGF-β；IL-13およびLHRアゴニスト；IL-13およびCL25；IL-13およびSPRR2a；IL-13およびSPRR2b；IL-13およびADAM8；ならびにTNFαおよびPGE4、IL-13およびPED2、TNFおよびPEG2からなる群より選択されるサイトカインの対と結合することができる。
【０２２８】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、CD137およびCD20、CD137およびEGFR、CD137およびHer-2、CD137およびPD-1、CD137およびPDL-1、VEGFおよびPD-L1、Lag-3およびTIM-3、OX40およびPD-1、TIM-3およびPD-1、TIM-3およびPDL-1、EGFRおよびDLL-4、VEGFおよびEGFR、HGFおよびVEGF、VEGFおよびVEGF（同一または異なるエピトープ）、VEGFおよびAng2、EGFRおよびcMet、PDGFおよびVEGF、VEGFおよびDLL-4、OX40およびPD-L1、ICOSおよびPD-1、ICOSおよびPD-L1、Lag-3およびPD-1、Lag-3およびPD-L1、Lag-3およびCTLA-4、ICOSおよびCTLA-4、CD138およびCD20；CD138およびCD40；CD19およびCD20；CD20およびCD3；CD3およびCD33；CD3およびCD133；CD38 & CD138；CD38およびCD20；CD20およびCD22；CD38およびCD40；CD40およびCD20；CD47およびCD20、CD-8およびIL-6；CSPGおよびRGM A；CTLA-4およびBTNO2；CTLA-4およびPD-1；IGF1およびIGF2；IGF1/2およびErb2B；IGF-1RおよびEGFR；EGFRおよびCD13；IGF-1RおよびErbB3；EGFR-2およびIGFR；Her2およびHer2（同一または異なるエピトープ）；第IXa因子および第X因子、VEGFR-2およびMet；VEGF-Aおよびアンジオポエチン-2 (Ang-2)；IL-12およびTWEAK；IL-13およびIL-1β；MAGおよびRGM A；NgRおよびRGM A；NogoAおよびRGM A；OMGpおよびRGM A；PDL-1およびCTLA-4；PD-1およびCTLA-4、PD-1およびTIM-3；RGM AおよびRGM B；Te38およびTNFα；TNFαおよびBlys；TNFαおよびCD-22；TNFαおよびCTLA-4ドメイン；TNFαおよびGP130；TNFαおよびIL-12p40；TNFαおよびRANKリガンド；EGFRおよびPD-L1；EGFRおよびcMet；Her3およびIGF-IR；DLL-4およびVEGF；PD-1およびPD-L1；Her3およびPD-1、Her3およびEGFR、cMetおよびPD-L1、ならびにBTLAおよびPD-1からなる群より選択される標的の対と結合することができる。
【０２２９】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、オファツムマブ、リツキシマブ、ヨードi 131トシツモマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第9228008号、第8206711号、第7682612号、第8562992号、第7799900号、第7422739号、第7850962号、第8097713号、第8057793号、第8592156号、第6652852号、第6893625号、第6120767号、第8084582号、第8778339号、第9184781号、第7381560号、第8101179号、第9382327号、第7151164号、第7435803号、第8529902号、第9416187号、第7812116号、第8329181号、第8034902号、第9289479号、第9234045号、第4987084号、第9173961号、第9175086号、第6410319号に記載されているものを含むがこれらに限定されないCD20抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３０】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ムロモナブ-CD3、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビジリズマブ、ならびにその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8569450号、第7635472号、第5585097号、第6706265号、第5834597号、第9056906号、第9486475号、第7728114号、第8551478号、第9226962号、第9192665号、第9505849号、第8394926号、第6306575号、第5795727号、第8840888号、第5627040号、第9249217号、第8663634号、第6491917号、第5877299号に記載されているものを含むがこれらに限定されないCD3抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３１】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、イピリムマブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第5434131号、第5968510号、第5844095号、第7572772号、第6090914号、第7311910号、第5885796号、第5885579号、第5770197号、第5851795号、第5977318号、第7161058号、第6875904号、第7504554号、第7034121号、第6719972号、第7592007号に記載されているものを含むがこれらに限定されないCTLA-4抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３２】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8741295号、第7029674号、第7722868号、第9243052号、第8927697号、第9181342号、第8552154号、第9102727号、第9220776号、第9084776号、第8008449号、第9387247号、第9492540号、第8779105号、第9358289号、第9492539号、第9205148号、第8900587号、第8952136号、第8460886号、第7414171号、第8287856号、第8580247号、第7488802号、第7521051号、第8088905号、第7709214号、第8617546号、第9381244号、第8993731号、第8574872号、第7432059号、第8216996号、第9499603号、第9102728号、第9212224号に記載されているものを含むがこれらに限定されないPD-1抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３３】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、デュルバルマブ、アベルマブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8741295号、第9102725号、第8168179号、第8952136号、第8552154号、第8617546号、第9212224号、第8217149号、第8383796号に記載されているものを含むがこれらに限定されないPD-L1抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３４】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、オシメルチニブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第7723484号、第9044460号、第9226964号、第8658175号、第7618631号、第8748175号、第9499622号、第9527913号、第9493568号、第8580263号、第7514240号、第9314536号、第9051370号、第9233171号、第9029513号、第8592152号、第8597652号、第9327035号、第8628773号、第9023356号、第9132192号、第8637026号、第9283276号、第9540440号、第9545442号、第8758756号、第9120853号、第7981605号、第8546107号、第7598350号、第5212290号、第8017321号、第7589180号、第9260524号、第8790649号、第9125896号、第9238690号、第8071093号に記載されているものを含むがこれらに限定されないEGFR抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３５】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、4C4G3、7D3、B8.2C12、F38-2E2、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8841418号、第8552156号、第9556270号に記載されているものを含むがこれらに限定されないTIM3 (CD366) 抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３６】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、h1332、71-8000、ab74217、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8673302号、第9120852号、第7476724号、第7892550号、第9249221号、第9535055号、第9487589号、第8329173号、第9101610号、第8101727号、第9068011号、第9260531号、第9296817号、第8481689号、第8546544号、第8563696号、第8871909号、第8889832号、第8871910号、第9107907号、第8747850号、第9469691号、第8765128号、第8729249号、第8741290号、第8637027号、第8900582号、第9192666号、第9201074号、第9505843号、第8821869号、第8163280号、第7498420号、第8562985号、第8545839号、第9213031号、第9213032号、第8217148号、第8398974号、第9394367号、第9364556号、第8623359号、第9011865号、第9375425号、第9233155号、第9169329号、第9150655号に記載されているものを含むがこれらに限定されないcMet抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３７】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ab97619、ab128048、ab128038、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第7279161号、第7033590号、第4786726号、第6624295号、第7049411号、第7297336号に記載されているものを含むがこれらに限定されない第IXa因子抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３８】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、PA5-22059、ab97632、B122Mを含むがこれらに限定されない第X因子抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２３９】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ドゥリゴツマブ (duligotumab)、エルゲムツマブ (elgemtumab)、ルムレツズマブ (lumretuzumab)、パトリツマブ (patritumab)、セリバンツマブ (seribantumab)、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第9346883号、第9321839号、第8859737号、第8362215号、第8828388号、第9220775号、第9217039号、第9527913号、第9085622号、第9192663号、第8735551号、第9011851号、第7846440号、第9284380号、第8791244号、第8691225号、第9487588号、第8961966号、第9034328号、第5968511号、第9346889号、第9217039号、第9346890号に記載されているものを含むがこれらに限定されないHer3 (ErbB3) 抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２４０】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、シズツムマブ、ダロツズマブ、フィギツムマブ、ガニツマブ、ロバツムマブ (robatumumab)、テプロツムマブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第7572897号、第7579157号、第7968093号、第7638605号、第7329745号、第7037498号、第7982024号、第8642037号、第7700742号、第9234041号、第7815907号、第8945871号、第8361461号、第9056907号、第8168410号、第7241444号、第7914784号、第9150644号、第7985842号、第7538195号、第8268617号、第8034904号、第8344112号、第7553485号、第8101180号、第8105598号、第7824681号、第8124079号、第8420085号、第7854930号に記載されているものを含むがこれらに限定されないIGF-1R (CD221) 抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２４１】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、デムシズマブ、エノチクマブ (enoticumab)、ナビシキズマブ (navicixizumab)、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第9469689号、第9115195号、第8623358号、第9132190号、第9469688号、第9403904号、第8663636号、第8192738号、第750124号に記載されているものを含むがこれらに限定されないDLL4抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２４２】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ベバシズマブ、ブロルシズマブ (Brolucizumab)、ラニビズマブ、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8921537号、第7910098号、第7365166号、第7060269号、第7169901号、第6884879号、第7297334号、第7375193号、第9388239号、第8834883号、第8287873号、第7998931号、第8007799号、第7785803号、第9102720号、第8486397号、第6730489号、第6383484号、第9441034号、第7097986号、第9079953号、第8945552号、第8236312号、第7740844号、第6403088号、第9018357号、第8975381号、第7691977号、第7758859号、第8512699号、第8492527号、第9353177号、第8092797号、第7811785号、第8101177号、第8592563号、第9090684号、第8349322号に記載されているものを含むがこれらに限定されないVEGF抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２４３】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、ベクツモマブ (bectumomab)、エプラツズマブ、イノツズマブ、モキセツモマブ (moxetumomab)、ピナツズマブ (pinatuzumab)、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第9181343号、第5484892号、第9279019号、第8591889号、第9499632号、第8481683号、第7355012号、第7777019号、第8809502号、第8389688号、第7829086号に記載されているものを含むがこれらに限定されないCD22抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２４４】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、MIH26、AAP44003、MA5-16843、6A5、およびその各々が全体として参照により組み入れられる米国特許第8563694号、第9346882号、第8580259号、第8247537号に記載されているものを含むがこれらに限定されないBTLA (CD272) 抗体に由来する可変領域またはCDRを含む。
【０２４５】
いくつかの態様において、結合タンパク質は、全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2015103072に記載されている抗体を含む。
【０２４６】
一つの態様において、結合タンパク質はヒトIL-17およびヒトIL-20と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はヒトIL-17およびヒトIL-20と結合することができ、SEQ ID NO. 15、25、および27からなる群より選択される配列と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 21と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；ならびにSEQ ID NO. 23と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。別の態様において、結合タンパク質はヒトIL-17およびヒトIL-20と結合することができ、SEQ ID NO. 15、25、および27からなる群より選択される配列と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；ならびにSEQ ID NO. 29、30、および31からなる群より選択される配列と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#4を含む。
【０２４７】
一つの態様において、結合タンパク質はヒトCD3およびヒトCD20と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質は、SEQ ID NO. 41、48、および316からなる群より選択される配列と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO.44またはSEQ ID NO. 325と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；ならびにSEQ ID NO. 46またはSEQ ID NO. 330と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２４８】
一つの態様において、結合タンパク質はヒトIL-17およびヒトTNFと結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質は、結合タンパク質はヒトIL-17およびヒトTNFと結合することができ、SEQ ID NO. 87と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 89と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 91と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２４９】
一つの態様において、結合タンパク質はヒトCTLA-4およびヒトPD-1と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はヒトCTLA-4およびヒトPD-1と結合することができ、SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 126、SEQ ID NO. 145、SEQ ID NO. 164、またはSEQ ID NO. 183と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 95、SEQ ID NO. 135、SEQ ID NO. 154、SEQ ID NO. 173、またはSEQ ID NO. 192と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 97、SEQ ID NO. 140、SEQ ID NO. 159、SEQ ID NO. 178、またはSEQ ID NO. 197と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５０】
一つの態様において、結合タンパク質はEGFRおよびPD-L1と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はEGFRおよびPD-L1と結合することができ、SEQ ID NO. 99、SEQ ID NO. 202、またはSEQ ID NO. 221と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 211、またはSEQ ID NO. 230と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 101、SEQ ID NO. 216、またはSEQ ID NO. 235と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５１】
一つの態様において、結合タンパク質はcMetおよびEGFRと結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はcMetおよびEGFRと結合することができ、SEQ ID NO. 102またはSEQ ID NO. 240と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 103またはSEQ ID NO. 249と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 104またはSEQ ID NO. 254と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５２】
一つの態様において、結合タンパク質は第IXa因子および第X因子と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質は第IXa因子および第X因子と結合することができ、SEQ ID NO. 105またはSEQ ID NO. 259と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 106またはSEQ ID NO. 268と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 107またはSEQ ID NO. 273と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５３】
一つの態様において、結合タンパク質はHer3およびIGF-1Rと結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はHer3およびIGF-1Rと結合することができ、SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 278と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 109またはSEQ ID NO. 287と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 110またはSEQ ID NO. 292と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５４】
一つの態様において、結合タンパク質はDLL-4およびVEGFと結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はDLL-4およびVEGFと結合することができ、SEQ ID NO. 111またはSEQ ID NO. 297と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 112またはSEQ ID NO. 306と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 113またはSEQ ID NO. 311と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５５】
一つの態様において、結合タンパク質はCD20およびCD3と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はCD20およびCD3と結合することができ、SEQ ID NO. 114またはSEQ ID NO. 316と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 115またはSEQ ID NO. 325と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 116またはSEQ ID NO. 330と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５６】
一つの態様において、結合タンパク質はHer3およびEGFRと結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はHer3およびEGFRと結合することができ、SEQ ID NO. 117、SEQ ID NO. 335、またはSEQ ID NO. 354と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 118、SEQ ID NO. 344、またはSEQ ID NO. 363と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 119、SEQ ID NO. 349、またはSEQ ID NO. 368と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５７】
一つの態様において、結合タンパク質はPD-1およびPD-L1と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はPD-1およびPD-L1と結合することができ、SEQ ID NO. 120またはSEQ ID NO. 373と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 121またはSEQ ID NO. 382と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 122またはSEQ ID NO. 387と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５８】
一つの態様において、結合タンパク質はHer3およびPD-1と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はHer3およびPD-1と結合することができ、SEQ ID NO. 123またはSEQ ID NO. 411と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 124またはSEQ ID NO. 420と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 125またはSEQ ID NO. 425と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２５９】
一つの態様において、結合タンパク質はcMetおよびPD-L1と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はcMetおよびPD-L1と結合することができ、SEQ ID NO. 430と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 439と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 444と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２６０】
一つの態様において、結合タンパク質はBTLAおよびPD-1と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はBTLAおよびPD-1と結合することができ、SEQ ID NO. 449またはSEQ ID NO. 468と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 458またはSEQ ID NO. 477と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 463またはSEQ ID NO. 482と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２６１】
一つの態様において、結合タンパク質はCD20およびCD22と結合することができる。さらなる態様において、結合タンパク質はCD20およびCD22と結合することができ、SEQ ID NO. 392と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるFIT-Igポリペプチド鎖#1配列；SEQ ID NO. 401と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#2配列；およびSEQ ID NO. 406と約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%、または100%同一であるポリペプチド鎖#3配列を含む。
【０２６２】
本明細書において記載される例示的な結合タンパク質の生物学的活性バリアントまたは機能的バリアントもまた、本発明の一部である。本明細書で用いられる場合、タンパク質に関する「生物学的活性バリアント」または「機能的バリアント」という語句は、参照配列の実質的な生物学的活性をなお維持しながら、参照配列に対して1つまたは複数のアミノ酸が変更されたアミノ酸配列を指す。バリアントは「保存的な」変化を有してよく、ここで、置換アミノ酸は類似の構造または化学的特性を有し、例えばロイシンのイソロイシンによる置換である。以下の表は例示的な保存的アミノ酸置換を示す。いくつかの態様において、バリアントは1つまたは複数のアミノ酸置換を有し、ここで、1つもしくは複数または全ての置換は、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンなどの酸性アミノ酸である。
2019514839.tif 000005
あるいは、バリアントは「非保存的な」変化を有してよく、例えばグリシンのトリプトファンによる置換である。類似の軽微な変化には、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方もまた含まれ得る。生物学的または免疫学的活性を除去することなくどのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかを決定する際のガイダンスは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウェア用いて見出すことができる。
【０２６３】
本明細書において記載される例示的な二重特異性結合タンパク質と同一の、所与の標的群上のエピトープと結合することができる結合タンパク質もまた、本発明の一部である。エピトープは、直鎖状エピトープ、構造的エピトープ、またはそれらの混合物であってよい。いくつかの態様において、そのような同一のエピトープは、X線共結晶解析、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的変異誘発、ハイスループット変異誘発マッピング、バクテリオファージ表面ディプレイ、および水素重水素交換を含むがこれらに限定されない、適切なエピトープマッピング技法によって同定され得る。さらなる方法は、米国特許第5955264号、第65796676号、第6984488号、および第8802375に記載されており、これらはそれぞれ全ての目的のために全体として参照により組み入れられる。
【０２６４】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、BMP1、BMP2、BMP3B (GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1 (M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (aFGF)、FGF2 (bFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1 (ε)、FIL1 (ζ)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、ROR1、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA (TNF-b)、LTB、TNF (TNF-a)、TNFSF4（OX40リガンド）、TNFSF5（CD40リガンド）、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7（CD27リガンド）、TNFSF8（CD30リガンド）、TNFSF9（4-1BBリガンド）、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (APO3L)、TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、FIGF (VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP（レプチン）、PTN、およびTHPOからなる群より選択される1つまたは2つのサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、およびサイトカイン受容体と結合することができる。
【０２６５】
本発明の結合タンパク質は、CCL1 (I-309)、CCL2 (MCP -1 / MCAF)、CCL3 (MIP-1a)、CCL4 (MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCL11（エオタキシン）、CCL13 (MCP-4)、CCL15 (MIP-1d)、CCL16 (HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18 (PARC)、CCL19 (MIP-3b)、CCL20 (MIP-3a)、CCL21 (SLC / exodus-2)、CCL22 (MDC / STC-1)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24（MPIF-2／エオタキシン-2）、CCL25 (TECK)、CCL26（エオタキシン-3）、CCL27 (CTACK / ILC)、CCL28、CXCL1 (GRO1)、CXCL2 (GRO2)、CXCL3 (GRO3)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9 (MIG)、CXCL10 (IP 10)、CXCL11 (I-TAC)、CXCL12 (SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL1 (SCYD1)、SCYE1、XCL1（リンホタクチン）、XCL2 (SCM-1b)、BLR1 (MDR15)、CCBP2 (D6 / JAB61)、CCR1 (CKR1 / HM145)、CCR2 (mcp-1RB / RA)、CCR3 (CKR3 / CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5 / ChemR13)、CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6)、CCR7 (CKR7 / EBI1)、CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1)、CCR9 (GPR-9-6)、CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5 / CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Ra)、IL8RB (IL8Rb)、LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10 (C10)、EPO、FY (DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2、およびVHLからなる群より選択される1つまたは複数のケモカイン、ケモカイン受容体、およびケモカイン関連タンパク質と結合することができる。
【０２６６】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、例えばインテグリンなどの細胞表面タンパク質と結合することができる。別の態様において、本発明の結合タンパク質は、キナーゼおよびプロテアーゼからなる群より選択される酵素と結合することができる。さらなる別の態様において、本発明の結合タンパク質は、リンホカイン受容体、モノカイン受容体、およびポリペプチドホルモン受容体からなる群より選択される受容体と結合することができる。
【０２６７】
一つの態様において、結合タンパク質は多価である。別の態様において、結合タンパク質は多重特異性である。上記の多価およびまたは多重特異性の結合タンパク質は、特に治療の観点から望ましい特性を有する。例えば、多価およびまたは多重特異性の結合タンパク質は、(1)その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（および／もしくは異化）され得；(2) アゴニスト抗体であってよく；ならびに／または (3) 多価抗体が結合し得る抗原を発現する細胞の細胞死および／もしくはアポトーシスを誘導し得る。多価およびまたは多重特異性の結合タンパク質の少なくとも1つの抗原結合特異性を提供する「親抗体」は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって内部移行（および/もしくは異化）されるものであってよく；ならびに／またはアゴニスト、細胞死誘導性、および／もしくはアポトーシス誘導性抗体であってよく、本明細書において記載される多価およびまたは多重特異性の結合タンパク質は、これらの特性の1つまたは複数において改善を示し得る。さらに、親抗体は、これらの特性のいずれか1つまたは複数を欠いてもよいが、本明細書において記載される多価結合タンパク質として構築された場合には、それらが与えられ得る。
【０２６８】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、少なくとも約102M-1s-1；少なくとも約103M-1s-1；少なくとも約104M-1s-1；少なくとも約105M-1s-1；および少なくとも約106M-1s-1（それらの間の全ての値を含む）からなる群より選択される、1種または複数の標的に対するオン速度定数 (Kon) を有する。好ましくは、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、102M-1s-1〜103M-1s-1；103M-1s-1〜104M-1s-1；104M-1s-1〜105M-1s-1；または105M-1s-1〜106M-1s-1（それらの間の全ての値を含む）という、1種または複数の標的に対するオン速度定数 (Kon) を有する。
【０２６９】
別の態様において、結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、最大で約10-3s-1；最大で約10-4s-1；最大で約10-5s-1；および最大で約10-6s-1（それらの間の全ての値を含む）からなる群より選択される、1種または複数の標的に対するオフ速度定数 (Koff) を有する。好ましくは、本発明の結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴により測定した場合に、10-3s-1〜10-4s-1；10-4s-1〜10-5s-1；または10-5s-1〜10-6s-1（それらの間の全ての値を含む）という、1種または複数の標的に対するオフ速度定数 (Koff) を有する。
【０２７０】
別の態様において、結合タンパク質は、最大で約10-7 M；最大で約10-8 M；最大で約10-9 M；最大で約10-10 M；最大で約10-11 M；最大で約10-12 M；および最大で10-13 M（それらの間の全ての値を含む）からなる群より選択される、1種または複数の標的に対する解離定数 (KD) を有する。好ましくは、本発明の結合タンパク質は、10-7 M〜10-8 M；10-8 M〜10-9 M；10-9 M〜10-10 M；10-10 M〜10-11 M；10-11 M〜10-12 M；または10-12 M〜10-13 M（それらの間の全ての値を含む）という、IL-12またはIL-23に対する解離定数 (KD) を有する。
【０２７１】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィ (SEC) HPLCを用いた1段階プロテインA精製において少なくとも約75%、約76%、約77%、約78%、約79%、約80%、約80%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約99.1%、約99.2%、約99.3%、約99.4%、約99.5%、約99.6%、約99.7%、約99.8%、約99.9%、もしくはそれ以上、または100%（それらの間の全ての値を含む）という単量体%を有する。
【０２７２】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、最適化条件において、少なくとも約0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、約0.2 mg/L、約0.3 mg/L、約0.4 mg/L、約0.5 mg/L、約0.6 mg/L、約0.7 mg/L、約0.8 mg/L、約0.9 mg/L、約1.0 mg/L、約2 mg/L、約3 mg/L、約4 mg/L、約5 mg/L、約6 mg/L、約7 mg/L、約8 mg/L、約9 mg/L、約10 mg/L、約11 mg/L、約12 mg/L、約13 mg/L、約14 mg/L、約15 mg/L、約16 mg/L、約17 mg/L、約18 mg/L、約19 mg/L、約20 mg/L、約21 mg/L、約22 mg/L、約23 mg/L、約24 mg/L、約25 mg/L、約26 mg/L、約27 mg/L、約28 mg/L、約29 mg/L、約30 mg/L、約40 mg/L、約50 mg/L、約60 mg/L、約70 mg/L、約80 mg/L、約90 mg/L、約100 mg/L、約200 mg/L、約300 mg/L、約400 mg/L、約500 mg/L、約600 mg/L、約700 mg/L、約800 mg/L、約900 mg/L、約1000 mg/L（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上の発現レベルを有する。いくつかの態様において、本発明の結合タンパク質は、293E細胞または目的に適した任意の他の細胞において発現される。
【０２７３】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、少なくとも約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃、約70℃、約71℃、約72℃、約73℃、約74℃、約75℃、約76℃、約77℃、約78℃、約79℃、約80℃、約81℃、約82℃、約83℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約95℃、約99℃（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上である、示差走査熱量測定 (DSC) により測定されたTm1転移温度を有する。
【０２７４】
本発明の結合タンパク質は、凍結融解試験において優れた安定性を有する。いくつかの態様において、本発明の結合タンパク質試料を融解し、4℃、25℃、および40℃で1日、3日、または7日間インキュベートした際、凝集物に起因するインタクトな結合タンパク質の減少は、SEC-HPLCにより測定した場合に、約5%、約4%、約3%、約2%、約1%、約0.5%、約0.1%、約0.05%、約0.01%（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ未満よりも少ない。
【０２７５】
別の態様において、本発明の結合タンパク質を静脈内投与した場合、それは、以下のPKパラメータのうちの1つまたは複数を有する：(1) 血漿からの薬物のみかけの全身クリアランス（CL、mL／日／kg）が、約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(2) みかけの定常状態分布容積（Vss、mL/kg）が、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(3) 2-コンパートメントモデルにおける中央または血漿コンパートメントのみかけの容積(V1、mL/kg）が、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(4) 初期または動態半減期（αt1/2、日）が、約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(5) 最終消失半減期（βt1/2、日）が、約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(6) 血漿濃度‐時間曲線下面積（AUC、日 x μg/mL）が、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；および (6) 平均滞留時間（MRT、日）が、約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上。いくつかの態様において、上記パラメータは、約1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上という投与量と関連している。
【０２７６】
別の態様において、本発明の結合タンパク質を皮下投与した場合、それは、以下のPKパラメータのうちの1つまたは複数を有する：(1) 薬物投与後の最大（ピーク）血漿中濃度到達時間（Tmax、日）が、約0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(2) 最大（ピーク）血漿中薬物濃度（Cmax、μg/ml)が、約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(3) 消失半減期（最終t1/2、日）が、約0.01、0.05、0.1、0.2 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(4) ゼロ時間から最終測定可能濃度時間までの血漿濃度‐時間曲線下面積（AUClast、日 x μg/ml）が、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(5) ゼロ時間から無限大までの血漿濃度‐時間曲線下面積（AUCinf、日 x μg/ml）が、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上；(6) 薬物から代謝物への生成クリアランス（CL/F、mL／日／kg)が、約0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上； (7) 生物学的利用能（F、%）が、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上。いくつかの態様において、上記パラメータは、約1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg（それらの間の全ての値を含む）、またはそれ以上という投与量と関連している。
【０２７７】
別の態様において、上記の結合タンパク質は、免疫接着分子、造影剤、治療剤、および細胞毒性剤からなる群より選択される薬剤をさらに含む複合物である。一つの態様において、造影剤は、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、およびビオチンからなる群より選択される。さらなる態様において、造影剤は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、および153Smからなる群より選択される放射標識である。一つの態様において、治療剤または細胞毒性剤は、免疫抑制剤、免疫刺激剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素、およびアポトーシス剤からなる群より選択される。一つの態様において、結合タンパク質は薬剤に直接複合化される。別の態様において、結合タンパク質はリンカーを介して薬剤に複合化される。適切なリンカーには、本明細書において開示されるアミノ酸およびポリペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。リンカーは、切断可能であっても切断可能でなくてもよい。
【０２７８】
別の態様において、上記の結合タンパク質は結晶化結合タンパク質であり、結晶として存在する。好ましくは、結晶は、担体を含まない薬学的徐放性結晶である。より好ましくは、結晶化結合タンパク質は、該結合タンパク質の可溶性対応物よりも優れたインビボ半減期を有する。最も好ましくは、結晶化結合タンパク質は生物学的活性を保持する。
【０２７９】
別の態様において、上記の結合タンパク質はグリコシル化される。好ましくは、グリコシル化はヒトのグリコシル化パターンである。
【０２８０】
本発明の一つの局面は、上記で開示された結合タンパク質のいずれか1つをコードする単離核酸に関係する。さらなる態様は、上記で開示された単離核酸を含むベクターを提供し、ここで、該ベクターは、pcDNA；pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2)；pTT3（付加的な多重クローニング部位を有するpTT；pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、およびpBJからなる群より選択される。多重特異性結合タンパク質およびそれを作製する方法が提供される。結合タンパク質は、様々な技法を用いて生成することができる。発現ベクター、宿主細胞、および結合タンパク質を生成する方法が、本開示において提供される。
【０２８１】
本開示の結合タンパク質の抗原結合可変ドメインは、ポリクローナルAb、モノクローナルAb、およびまたは関心対象の抗原と結合し得る受容体を含む親結合タンパク質から得ることができる。これらの親結合タンパク質は、天然に存在してよく、または組換え技術によって生成することができる。当業者は、抗体および／または単離受容体を産生するための多くの方法に十分に精通しており、これには、ハイブリドーマ技法を使用すること、選択リンパ球抗体法 (SLAM)、ファージ、酵母、もしくはRNA-タンパク質融合ディスプレイ、または他のライブラリーの使用、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくともいくつかを含む非ヒト動物を免疫化すること、ならびにキメラ抗体、CDR移植された抗体、およびヒト化抗体の調製が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許出願公開第20090311253 A1号を参照されたい。可変ドメインはまた、親和性成熟技法を用いて調製することも可能である。結合タンパク質の結合可変ドメインはまた、当技術分野で公知の抽出手順によって（例えば、溶媒、界面活性剤、および／もしくは親和性精製を用いて）得ることもでき、または当技術分野で公知の生物物理学的方法（例えば、X線結晶学、NMR、干渉法、および／もしくはコンピュータモデリング）によって決定することもできる。
【０２８２】
結合タンパク質分子において望ましい少なくとも1つまたは複数の特性を備えた親結合タンパク質を選択することを含む態様が提供される。一つの態様において、望ましい特性は、例えば、抗原特異性、抗原に対する親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解度、産生効率、免疫原性、薬物動態、生物学的利用能、組織交差反応性、またはオルソロガス抗原結合などの、抗体パラメータを特徴づけるために用いられるもののうちの1つまたは複数である。例えば、米国特許出願公開第20090311253号を参照されたい。
【０２８３】
多重特異性抗体はまた、抗原結合ドメインの1つまたは複数が機能しなくなるように設計することもできる。可変ドメインは、本明細書において記載される方法のいずれか1つによって生成された親結合タンパク質から、組換えDNA技法を用いて得ることができる。一つの態様において、可変ドメインはマウスの重鎖または軽鎖可変ドメインである。別の態様において、可変ドメインは、CDR移植されたまたはヒト化された可変重鎖ドメインまたは軽鎖ドメインである。一つの態様において、可変ドメインはヒトの重鎖または軽鎖可変ドメインである。
【０２８４】
一つの態様では、1つまたは複数の定常ドメインが、組換えDNA技法を用いて可変ドメインに連結される。一つの態様では、1つまたは複数の重鎖可変ドメインを含む配列が重鎖定常ドメインに連結され、1つまたは複数の軽鎖可変ドメインを含む配列が軽鎖定常ドメインに連結される。一つの態様において、定常ドメインは、それぞれヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインである。一つの態様において、重鎖はさらにFc領域に連結される。Fc領域は、天然配列Fc領域またはバリアントFc領域であってよい。別の態様において、Fc領域はヒトFc領域である。別の態様において、Fc領域には、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、またはIgD由来のFc領域が含まれる。
【０２８５】
加えて、本明細書において提供される結合タンパク質は、細胞内送達（内部移行受容体および細胞内分子を標的とする）、脳内への送達（血液脳関門を横断するためにトランスフェリン受容体およびCNS疾患メディエーターを標的とする）を含む組織特異的送達（局所PKの増強、ひいてはより高い有効性および／またはより低い毒性のために、組織マーカーおよび疾患メディエーターを標的とする）のために用いることができる。結合タンパク質はまた、抗原の非中和エピトープへの結合を介して該抗原を特定の位置に送達するための、およびまた抗原の半減期を延長するための担体タンパク質として役立ち得る。さらに、結合タンパク質は、患者に埋め込まれた医療用装置に物理的に連結されるように、またはこれらの医療用装置を標的とするように設計することができる（Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446；Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397を参照されたい）。適切な種類の細胞を医療用インプラントの部位に指向させることによって、正常な組織機能の治癒および回復が促進され得る。あるいは、装置に結合された、または装置を標的とする受容体抗体融合タンパク質による、装置移植の際に放出されたメディエーター（サイトカインを含むが、これに限定されない）の阻害もまた提供される。
【０２８６】
一つの局面において、宿主細胞は、上記で開示されたベクターで形質転換される。一つの態様において、宿主細胞は原核細胞である。さらなる態様において、宿主細胞は大腸菌 (Escherecia coli) である。別の態様において、宿主細胞は真核細胞である。さらなる態様において、真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞からなる群より選択される。一つの態様において、宿主細胞は、293、COS、NS0、およびCHOを含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞、ならびに；またはサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) などの真菌細胞；またはSf9などの昆虫細胞である。
【０２８７】
本発明の別の局面は、上記で開示された結合タンパク質を生産する方法であって、同様に上記で開示された宿主細胞のいずれか1つを、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下にて培地中で培養する段階を含む、方法を提供する。好ましくは、この方法によって生産される結合タンパク質の50%〜75%が二重特異性四価結合タンパク質である。より好ましくは、この方法によって生産される結合タンパク質の75%〜90%が二重特異性四価結合タンパク質である。最も好ましくは、生産される結合タンパク質の90%〜95%が二重特異性四価結合タンパク質である。
【０２８８】
別の態様は、上記で開示された方法に従って生産された結合タンパク質を提供する。
【０２８９】
一つの態様は、結合タンパク質を放出するための組成物を提供し、ここで、組成物は製剤を含み、製剤は次に、上記で開示された結晶化結合タンパク質、および成分；ならびに少なくとも1つのポリマー担体を含む。好ましくは、ポリマー担体は、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(酸無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)またはPLGA、ポリ(b-ヒドロキシ酪酸）、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)；ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸-アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、それらの混合物および共重合体からなる群の1つまたは複数より選択されるポリマーである。好ましくは、成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される。別の態様は、上記で開示された組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を処置する方法を提供する。
【０２９０】
本発明はまた、上記で開示された結合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される担体には、リン酸緩衝液または生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口媒体には、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、体液および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンゲルデキストロースに基づくもの等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等などの保存剤および他の添加物もまた存在し得る。より具体的には、注射用途に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。場合によっては、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【０２９１】
さらなる態様において、薬学的組成物は、障害を処置するための少なくとも1つの付加的な治療剤を含む。一つの態様において、付加的な薬剤は、治療剤、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤（抗VEGF抗体またはVEGFトラップを含むが、これらに限定されない）、キナーゼ阻害剤（KDR阻害剤およびTIE-2阻害剤を含むが、これらに限定されない）；共刺激分子遮断剤（抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗PD-1、抗CD20を含むが、これらに限定されない）；接着分子遮断剤（抗LFA-1 Ab、抗E/LセレクチンAb、小分子阻害剤を含むが、これらに限定されない）；抗サイトカイン抗体またはその機能的断片（抗IL-18、抗TNF、抗IL-6／サイトカイン受容体抗体を含むが、これらに限定されない）；メトトレキサート；シクロスポリン；ラパマイシン；FK506；検出可能な標識またはレポーター；TNFアンタゴニスト；抗リウマチ薬；筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬 (NSAID)、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、β作動薬、吸入ステロイド、エピネフリンまたは類似体、サイトカイン、およびサイトカインアンタゴニストからなる群より選択される。
【０２９２】
別の局面において、本発明は、上記で開示された結合タンパク質によって結合され得る1種または複数の標的が害をもたらす障害に罹患しているヒト対象を処置する方法であって、ヒト対象における1種または複数の標的の活性が阻害され、障害の処置または予防が達成されるように、上記で開示された結合タンパク質をヒト対象に投与する段階を含む方法を提供する。一つの態様において、疾患または障害は、炎症状態、自己免疫疾患、またはがんである。一つの態様において、疾患または障害は、関節炎、骨関節炎、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎 強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に関連した急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、腎臓の微視的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性多腺性機能不全I型および多腺性機能不全II型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎関節症、腸炎性滑膜炎、クラミジア、エルシニアおよびサルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、B型肝炎、C型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、原因不明線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風関節炎、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎（古典的な自己免疫性肝炎またはルポイド肝炎）、2型自己免疫性肝炎（抗LKM抗体肝炎）、自己免疫介在性低血糖症、黒色表皮腫を伴うB型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した急性免疫疾患、臓器移植に関連し���慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、乾癬1型、乾癬2型、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患NOS、糸球体腎炎、腎臓の微視的血管炎 (vasulitis)、ライム病、円板状エリテマトーデス、男性不妊症特発性またはNOS、精子自己免疫、多発性硬化症（全てのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織病に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病/動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝障害、胆汁うっ滞 (choleosatatis)、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギーおよび喘息、B群連鎖球菌 (GBS) 感染症、精神障害（例えば、うつ病および統合失調症）、Th2型およびTh1型媒介性疾患、急性および慢性疼痛（疼痛の様々な形態）、ならびに例えば肺がん、乳がん、胃がん、膀胱がん、結腸がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、および直腸がん、ならびに造血器悪性腫瘍（白血病およびリンパ腫）などのがん、無βリポタンパク血症、先端チアノーゼ、急性および慢性の寄生または感染過程、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病 (ALL)、急性骨髄性白血病 (AML)、急性または慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺がん、心房 (aerial) 異所性拍動、エイズ認知症複合、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶、α-1-アンチトリプシン欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗cd3療法、抗リン脂質症候群、抗受容体過敏症反応、大動脈瘤 (aordic aneuryism) および末梢動脈瘤 (aneuryism)、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調、心房細動（持続性または発作性）、心房粗動、房室ブロック、B細胞リンパ腫、骨移植片拒絶、骨髄移植 (BMT) 拒絶反応、脚ブロック、バーキットリンパ腫、熱傷、心不整脈、心機能不全 (stun) 症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植片拒絶、小脳皮質変性症、小脳障害、無秩序型または多巣性心房頻拍、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病 (CML)、慢性アルコール症、慢性炎症性病態、慢性リンパ性白血病 (CLL)、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸がん、うっ血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、ボクサー認知症、脱髄性疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚疾患、糖尿病、真正糖尿病、糖尿病性動脈硬化性 (ateriosclerotic) 疾患、びまん性レビー小体病、拡張型うっ血性心筋症、基底核障害、中年期ダウン症候群、CNSドーパミン受容体遮断薬によって誘発される薬物誘発性運動障害、薬物感受性、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌疾患、喉頭蓋炎、エプスタイン・バーウイルス感染症、肢端紅痛症、錐体外路および小脳障害、家族性血球貪食性 (hematophagocytic) リンパ組織球症、胎児���腺移植拒絶反応、フリードライヒ失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意の臓器または組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物に起因する肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハラーホルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、枯草熱、心臓移植拒絶反応、血色素症、血液透析、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解血小板減少性紫斑病、出血、肝炎 (A型)、ヒス束不整脈、HIV感染症／HIV神経障害、ホジキン病、運動過剰障害、過敏性 (hypersensitity) 反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下障害、視床下部-下垂体-副腎系評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体媒介性細胞傷害性、無力症、乳児脊髄性筋萎縮症、大動脈の炎症、a型インフルエンザ、電離放射線被曝、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、虚血再灌流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶反応、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、脂肪性浮腫、肝移植拒絶反応、リンパ浮腫 (lymphederma)、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性／特発性、片頭痛、ミトコンドリア多系統障害、混合性結合組織病、単クローン性免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager、およびMachado-Joseph）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ (mycobacterium avium intracellulare)、結核菌 (mycobacterium tuberculosis)、骨髄異形成 (myelodyplastic) 症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、上咽頭がん、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性I筋萎縮症、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈およびその分枝の閉塞、閉塞性動脈疾患、okt3療法、精巣炎／精巣上体炎(epidydimitis)、精巣炎／精管復元術処置、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶反応、膵がん、腫瘍随伴症候群／悪性腫瘍の高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶反応、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム硬化性 (atherlosclerotic) 疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ (pneumocystis carinii) 肺炎、肺炎、POEMS症候群（多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性免疫グロブリン血症、および皮膚変化症候群）、灌流後症候群、ポンプ後症候群、MI後心臓切開術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象およびレイノー病、レイノー病、レフサム病、規則的な狭QRS頻拍、腎血管性高血圧症、再灌流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老人性舞踏病、レビー小体型老年認知症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶反応、固形腫瘍、固有不整脈、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性症、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、失神、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、T細胞またはFAB ALL、毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎 (thromboangitis obliterans)、血小板減少症、毒性、移植、外傷／出血、III型過敏性反応、IV型過敏症、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、��脈血栓症、心室細動、ウイルスおよび真菌感染症、ウイルス性 (vital) 脳炎／無菌性髄膜炎、ウイルス (vital) 関連血球貪食 (hemaphagocytic) 症候群、ウェルニッケ・サコフ症候群、ウィルソン病、任意の臓器または組織の異種移植片拒絶からなるより選択される。
【０２９３】
別の局面において、本発明は、障害に罹患している患者を処置する方法であって、先に上記で開示された結合タンパク質のいずれか1つを、上記で考察された第2の薬剤の投与の前、それと同時に、またはその後に投与する段階を含む方法を提供する。好ましい態様において、第2の薬剤は、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、IL-1受容体アンタゴニスト、抗IL-1βモノクローナル抗体、抗IL-6モノクローナル抗体、増殖因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニル-イミダゾール化合物、TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF、およびPDGFの抗体またはアゴニスト、CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90、またはそれらのリガンドの抗体、メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、IRAK、NIK、IKK、P38、MAPキナーゼ阻害剤、IL-1β変換酵素阻害剤、TNFα変換酵素阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6-メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性p55 TNF受容体、可溶性p75 TNF受容体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、抗炎症性サイトカイン、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、およびTGFβからなる群より選択される。
【０２９４】
一つの態様において、上記で開示された薬学的組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣内、直腸内、頬側、舌下、鼻腔内、および経皮より選択される少なくとも1つの様式によって、対象に投与される。
【０２９５】
本発明の一つの局面は、本発明の少なくとも1つの結合タンパク質に対する少なくとも1つの抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体には、本発明の結合タンパク質中に組み込まれ得る免疫グロブリン分子の少なくとも一部、例えば、これらに限定されないが、重鎖もしくは軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域 (CDR) またはそのリガンド結合部分、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、または；それらの任意の部分など、を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子が含まれる。
【０２９６】
別の態様において、本発明の結合タンパク質は、ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；アグリカン；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1（亜鉛-a-糖タンパク質）；B7.1；B7.2；BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1 (MDR15)；BlyS；BMP1；BMP2；BMP3B (GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1（プレクチン）；BRCA1；C19orf10 (IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2 (D6 / JAB61)；CCL1 (I-309)；CCL11（エオタキシン）；CCL13 (MCP-4)；CCL15 (MIP-1d)；CCL16 (HCC-4)；CCL17 (TARC)；CCL18 (PARC)；CCL19 (MIP-3b)；CCL2 (MCP -1)；MCAF；CCL20 (MIP-3a)；CCL21 (MIP-2)；SLC；exodus-2；CCL22 (MDC / STC-1)；CCL23 (MPIF-1)；CCL24 (MPIF-2／エオタキシン-2)；CCL25 (TECK)；CCL26（エオタキシン-3）；CCL27 (CTACK / ILC)；CCL28；CCL3 (MIP-1a)；CCL4 (MIP-1b)；CCL5 (RANTES)；CCL7 (MCP-3)；CCL8 (mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1 (CKR1 / HM145)；CCR2 (mcp-1RB / RA)；CCR3 (CKR3 / CMKBR3)；CCR4；CCR5 (CMKBR5 / ChemR13)；CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6)；CCR7 (CKR7 / EBI1)；CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1)；CCR9 (GPR-9-6)；CCRL1 (VSHK1)；CCRL2 (L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD47、CD48、CD52；CD69；CD70、CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CD137、CD138、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1（E-カドヘリン）；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A (p21Wap1/Cip1)；CDKN1B (p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A (p16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；キチナーゼ；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7（クローディン-7）；CLN3；CLU（クラスタリン）；cMet；CMKLR1；CMKOR1 (RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1 (M-CSF)；CSF2 (GM-CSF)；CSF3 (GCSF)；CTLA-4；CTNNB1（b-カテニン）；CTSB（カテプシンB）；CX3CL1 (SCYD1)；CX3CR1 (V28)；CXCL1 (GRO1)；CXCL10 (IP-10)；CXCL11 (I-TAC / IP-9)；CXCL12 (SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2 (GRO2)；CXCL3 (GRO3)；CXCL5 (ENA-78 / LIX)；CXCL6 (GCP-2)；CXCL9 (MIG)；CXCR3 (GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DLL-4；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2 (Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3 (TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1 (aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2 (bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3 (int-2)；FGF4 (HST)；FGF5；FGF6 (HST-2)；FGF7 (KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF (VEGFD)；FIL1 (ε)；FIL1 (ζ)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1（フィブロネクチン）；FLT1；FOS；FOSL1 (FRA-1)；FY (DARC)；GABRP (GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2 (CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81 (FKSG80)；GRCC10 (C10)；GRP；GSN（ゲルゾリン）；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1；ヒスタミンおよびヒスタミン受容体；Her3；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；IFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP���IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2 IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST（糖タンパク質130）；IL7；IL7R；IL8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；IL9；IL9R；ILK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6（a6インテグリン）；ITGAV；ITGB3；ITGB4（b 4インテグリン）；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5（GCボックスBP）；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19（ケラチン19）；KRT2A；KRTHB6（毛髪特異的II型ケラチン）；LAMA5；LEP（レプチン）；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA (TNF-b)；LTB；LTB4R (GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAGまたはOmgp；MAP2K7 (c-Jun)；MDK；MIB1；ミッドカイン；MIF；MIP-2；MKI67 (Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3（メタロチオネクチン-III）；MTSS1；MUC1（ムチン）；MYC；MYD88；NCK2；ニューロカン；NFKB1；NFKB2；NGFB (NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66 (Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1 (NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；PCSK9；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-1；PD-L1；α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、第IXa因子、第X因子、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、2B4、KIR、CD27、OX40、CD40L、A2aR、PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4 (CXCL4)；PGF；PGR；ホスファカン；PIAS2；PIK3CG；PLAU (uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP (CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2 (COX-2)；PTN；RAC2 (p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF110 (ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2（リポフィリンB）；SCGB2A1（マンマグロビン2）；SCGB2A2（マンマグロビン1）；SCYE1（内皮単球活性化サイトカイン）；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERPINB5（マスピン）；SERPINE1 (PAI-1)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPP1；SPRR1B (Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1（トロンボスポンジン-1）；THBS2；THBS4；THPO；TIE (Tie-1)；TIMP3；組織因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAIP2 (B94)；TNFAIP3；TNFRSF11A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 (Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10 (TRAIL)；TNFSF11 (TRANCE)；TNFSF12 (APO3L)；TNFSF13 (April)；TNFSF13B；TNFSF14 (HVEM-L)；TNFSF15 (VEGI)；TNFSF18；TNFSF4（OX40リガンド）；TNFSF5（CD40リガンド）；TNFSF6 (FasL)；TNFSF7（CD27リガンド）；TNFSF8（CD30リガンド）；TNFSF9（4-1BBリガンド）；TOLLIP；Toll様受容体；TOP2A（トポイソメラーゼIia）；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；バーシカン；VHL C5；VLA-4；XCL1（リンホタクチン）；XCL2 (SCM-1b)；XCR1 (GPR5 / CCXCR1)；YY1；およびZFPM2からなる群より選択される1種または複数の標的と結合することができる。
【０２９７】
2種またはそれ以上の抗原に結合するそれらの能力を考えると、本発明の結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)、放射免疫測定法 (RIA)、または組織免疫組織化学などの従来の免疫測定法を用いて抗原（例えば、血清または血漿などの生物学的試料中）を検出するために、使用することができる。FIT-Igは、結合したまたは結合していない抗体の検出を容易にするために、検出可能な物質で直接または間接的に標識される。適切な検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例にはルミノールが含まれ；および適切な放射性物質の例には、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、または153Smが含まれる。
【０２９８】
本発明の結合タンパク質は、一つの態様において、インビトロおよびインビボの両方で抗原の活性を中和することができる。したがって、そのようなFIT-Igは、例えば、抗原を含む細胞培養物において、または本発明の結合タンパク質が交差反応する抗原を有するヒト対象もしくは他の哺乳動物対象において、抗原活性を阻害するために使用することができる。別の態様において、本発明は、抗原活性が害をもたらす疾患または障害に罹患している対象において抗原活性を低下させる方法を提供する。本発明の結合タンパク質は、治療目的でヒト対象に投与することができる。
【０２９９】
本明細書で用いられる場合、「抗原活性が害をもたらす障害」という用語は、その障害に罹患している対象におけるその抗原の存在が障害の病態生理の原因であるか、または障害の悪化に寄与する因子であることが示されるかまたは疑われている疾患または他の障害を含むことが意図される。したがって、抗原活性が害をもたらす障害は、抗原活性の低下によって障害の症状および／または進行が軽減されると予測される障害である。そのような障害は、例えば、障害に罹患している対象の生物学的体液中の抗原の濃度の上昇（例えば、対象の血清、血漿、滑液等における抗原濃度の上昇）によって明らかとなり得る。本発明の結合タンパク質で処置され得る障害の非限定的な例には、以下で、および本発明の抗体の薬学的組成物に関係する章で考察される障害が含まれる。
【０３００】
本発明のFIT-Igは、1種または複数の抗原と結合し得る。そのような抗原には、参照により本明細書に組み入れられる以下のデータベース中に列記されている標的が含まれるが、それらに限定されない。これらの標的データベースには、以下のリスト：
・治療標的 (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；
・サイトカインおよびサイトカイン受容体（http://www.cytokinewebfacts.com/、http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi、および
・http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html）；
・ケモカイン (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；
・ケモカイン受容体およびGPCR（http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html、http://www.gpcr.org/7tm/）；
・嗅覚受容体 (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；
・受容体 (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；
・がん標的 (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；
・潜在的抗体標的としての分泌タンパク質 (http://spd.cbi.pku.edu.cn/)；
・プロテインキナーゼ (http://spd.cbi.pku.edu.cn/)、ならびに
・ヒトCDマーカー (http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) および (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6) 
が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０１】
FIT-Igは、有効性／安全性を高め、および／または患者適用範囲を広げるために2種の異なる標的を同時に遮断する治療剤として有用である。このような標的には、可溶性標的（IL-13およびTNF）ならびに細胞表面受容体標的（例えば、VEGFRおよびEGFR）が含まれ得る。それはまた、がん治療のために腫瘍細胞とT細胞（HER2およびCD3）との間に、または自己免疫／移植のために自己反応性細胞とエフェクター細胞との間に、または任意の所与の疾患において疾患原因細胞を除去するために任意の標的細胞とエフェクター細胞との間に、再指向される細胞傷害性を誘導するために使用することもできる。
【０３０２】
加えて、FIT-Igが同一受容体上の2種の異なるエピトープを標的とするように設計される場合には、これを用いて受容体のクラスタリングおよび活性化を誘発することができる。これは、アゴニストおよびアンタゴニスト抗GPCR治療剤を作製する上で利点を有し得る。この場合には、FIT-Igを用いて、クラスタリング／シグナル伝達（2つの細胞表面分子）またはシグナル伝達（1つの分子上）のために、1つの細胞上の2つの異なるエピトープを標的とすることができる。同様に、FIT-Ig分子は、CTLA-4細胞外ドメインの2種の異なるエピトープ（または同一のエピトープの2つのコピー）を標的とすることによりCTLA-4連結および負のシグナルを誘発するように設計することができ、これは免疫応答の下方制御を導く。CTLA-4は、多くの免疫学的障害の治療処置のための臨床的に検証された標的である。CTLA-4/B7相互作用は、細胞周期進行、IL-2産生、および活性化後のT細胞の増殖を減衰させることによりT細胞活性化を負に調節し、CTLA-4 (CD152) 会合はT細胞活性化を下方制御し、免疫寛容の誘導を促進し得る。しかしながら、CTLA-4活性化は連結を必要とするため、CTLA-4のアゴニスト抗体会合によってT細胞活性化を減衰させる戦略は成功していない。結晶構造解析 (Stamper 2001 Nature 410:608)によって実証されるように、CTLA-4/B7の分子間相互作用は「歪んだジッパー」アレイの状態にある。しかしながら、現在入手可能なCTLA-4結合試薬は、抗CTLA-4モノクローナル抗体を含めて、いずれも連結特性を有していない。この問題に対処するために、いくつかの試みがなされてきた。1つの事例では、細胞メンバーに結合した一本鎖抗体が生成され、これはマウスにおいて同種拒絶を有意に阻害した (Hwang 2002 JI 169:633)。別の事例では、CTLA-4に対する人工APC表面に連結された一本鎖抗体が生成され、T細胞応答を減衰させることが実証された (Griffin 2000 JI 164:4433)。いずれの事例においても、CTLA-4連結は、人工系において密に局在化されたメンバー結合抗体によって達成された。これらの実験は、CTLA-4の負のシグナル伝達を誘発することによる免疫下方制御の概念実証を提供するが、これらの報告で使用された試薬は治療的用途には適していない。この目的のために、CTLA-4細胞外ドメインの2種の異なるエピトープ（または同一のエピトープの2つのコピー）を標的とするFIT-Ig分子を使用することによって、CTLA-4連結が達成され得る。その理論的根拠は、IgGの2つの結合部位にまたがる距離、およそ150〜170Åは、CTLA-4の活性連結（2つのCTLA-4ホモ二量体間の30〜50Å）には大きすぎるということである。しかしながら、FIT-Ig（1つのアーム）上の2つの結合部位間の距離はずっと短く、これも30〜50Åの範囲にあり、CTLA-4の適切な連結を可能にする。
【０３０３】
同様に、FIT-Igは、細胞表面受容体複合体の2種の異なるメンバー（例えば、IL-12Rαおよびβ）を標的とすることができる。さらに、FIT-Igは、CR1および可溶性タンパク質／病原体を標的として、標的可溶性タンパク質／病原体の迅速なクリアランスを駆動することができる。
【０３０４】
加えて、本明細書のFIT-Igは、細胞内送達（内部移行受容体および細胞内分子を標的とする）、脳内への送達（血液脳関門を横断するためにトランスフェリン受容体およびCNS疾患メディエーターを標的とする）を含む組織特異的送達（局所PKの増強、ひいてはより高い有効性および／またはより低い毒性のために、組織マーカーおよび疾患メディエーターを標的とする）のために用いることができる。FIT-Igはまた、抗原の非中和エピトープへの結合を介して該抗原を特定の位置に送達するための、およびまた抗原の半減期を延長するための担体タンパク質として役立ち得る。さらに、FIT-Igは、患者に埋め込まれた医療用装置に物理的に連結されるように、またはこれらの医療用装置を標的とするように設計することができる（Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B. Zotarolimus (ABT-578) eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446.；Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices. Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F. Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324.；Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis. Wu, Peng; Grainger, David W. Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467.；Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices. Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L. Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397; Page: 52）。
【０３０５】
簡潔に説明すると、適切な種類の細胞を医療用インプラントの部位に指向させることによって、正常な組織機能の治癒および回復が促進され得る。あるいは、装置に結合された、または装置を標的とするFIT-Igによる、装置移植の際に放出されたメディエーター（サイトカインを含むが、これに限定されない）の阻害もまた提供される。例えば、ステントは、閉塞した動脈を開通させるため、および心筋への血流を改善するために、介入性心臓病学において長年使用されてきた。しかしながら、従来の剥き出しのままの金属ステントは、一部の患者では再狭窄（処置領域における動脈の再狭窄）を引き起こすことが知られており、血液凝固を招き得る。最近、抗CD34抗体でコーティングされたステントが記載されており、これは血液全体を循環する内皮前駆細胞 (EPC) を捕捉することによって、再狭窄を減少させ、血液凝固の発生を予防する。内皮細胞は血管を裏打ちする細胞であり、血液が滑らかに流れることを可能にする。EPCは、ステントの硬い表面に付着して滑らかな層を形成し、これは治癒を促進するのみならず、これまでステントの使用に付随していた合併症である再狭窄および血液凝固を予防する (Aoji et al . 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9)。ステントを必要とする患者の転帰を改善することに加えて、心血管バイパス手術を必要とする患者にも潜在的重要性がある。例えば、抗EPC抗体でコーティングされた補綴血液導管（人工動脈）によって、バイパス手術移植のために患者の脚または腕の動脈を使用する必要がなくなる。これによって手術および麻酔の時間が短縮され、ひいては冠動脈手術の死亡が減少する。FIT-Igは、細胞動員を促進するために埋め込み装置上にコーティングされた細胞表面マーカー（CD34など）ならびにタンパク質（またはこれらに限定されないが脂質および多糖類を含む任意の種類のエピトープ）に結合するように設計される。このようなアプローチは、他の医療用インプラントにも一般に適用することができる。あるいは、FIT-Igを医療用装置上にコーティングすることができ、移植、および装置から全てのFITが放出した（または既に負荷されたFIT-Igの劣化および変性を含む、さらなる新鮮なFIT-Igを必要とし得る任意の他の必要性の）時点で、患者への新鮮なFIT-Igの全身投与によって装置に再負荷することができ、ここで、FIT-Igは、結合部位の一方のセットで関心対象の標的（サイトカイン、細胞表面マーカー（CD34など）等）に結合し、他方のセットで装置上にコーティングされた標的（タンパク質、これらに限定されないが脂質、多糖類、およびポリマーを含む任意の種類のエピトープを含む）に結合するように設計される。この技術は、コーティングされたインプラントの有用性を広げる利点を有する。
【０３０６】
本発明のFIT-Ig分子はまた、様々な疾患を処置するための治療用分子としても有用である。そのようなFIT-Ig分子は、特定の疾患に関与する1種または複数の標的と結合し得る。様々な疾患におけるそのような標的の例を以下に記載する。
【０３０７】
C5、CCL1 (I-309)、CCL11（エオタキシン）、CCL13 (mcp-4)、CCL15 (MIP-1d)、CCL16 (HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18 (PARC)、CCL19、CCL2 (mcp-1)、CCL20 (MIP-3a)、CCL21 (MIP-2)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24（MPIF-2／エオタキシン-2）、CCL25 (TECK)、CCL26、CCL3 (MIP-1a)、CCL4 (MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (mcp-3)、CCL8 (mcp-2)、CXCL1、CXCL10 (IP-10)、CXCL11 (I-TAC / IP-9)、CXCL12 (SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5 (ENA-78 / LIX)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13 (mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1 (CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1（内皮単球活性化サイトカイン）、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA-4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10 (IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2、およびRNF110 (ZNF144) を含む多くのタンパク質が、一般的な自己免疫応答および炎症反応に関係づけられている。上記で列記された標的のうちの1種または複数と結合し得るFIT-Igもまた企図される。
【０３０８】
アレルギー性喘息は、好酸球増加症、杯細胞異形成、上皮細胞変化、気道過敏症 (AHR)、ならびにTh2およびTh1サイトカイン発現の存在、ならびに血清中IgEレベルの上昇を特徴とする。気道炎症が、喘息の病因の根底にある重要な要因であることが現在広く認められており、これには、T細胞、B細胞、好酸球、肥満細胞、およびマクロファージなどの炎症細胞、ならびにサイトカインおよびケモカインを含むそれらの分泌メディエーターの複雑な相互作用が関与している。コルチコステロイドは今日の喘息に対する最も重要な抗炎症処置であるが、それらの作用機序は非特異的であり、特に若年患者集団において安全性の問題が存在する。したがって、より特異的かつ標的指向性の治療法の開発が必要とされる。マウスにおけるIL-13が、好酸球性炎症とは独立して、AHR、粘液分泌過多、および気道線維症を含む喘息の特徴の多くを模倣することを示す証拠が、ますます増えている（Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007；Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105）。
【０３０９】
IL-13は、喘息に関連した病理学的応答を引き起こす上で重要な役割を有することが示唆されている。肺におけるIL-13の影響を減少させるための抗IL-13モノクローナル抗体療法の開発は、喘息の新規な処置としてかなり有望である、刺激的な新しいアプローチである。しかしながら、異なる免疫学的経路の他のメディエーターもまた喘息の病因に関与しており、IL-13に加えてこれらのメディエーターを遮断することは、さらなる治療的利点を提供し得る。そのような標的対には、IL-13、および腫瘍壊死因子-α (TNF-α) などの炎症促進性サイトカインが含まれるが、これらに限定されない。TNF-αは喘息における炎症反応を増幅させ得、疾患重症度と関連し得る (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.)。このことから、IL-13およびTNF-αの両方を遮断することが、特に重篤な気道疾患において有益な効果を有し得ることが示唆される。好ましい態様において、本発明のFIT-Igは標的IL-13およびTNFαと結合し、喘息を処置するために使用される。
【０３１０】
炎症およびAHRの両方を評価することができるOVA誘発性喘息マウスモデルなどの動物モデルは、当技術分野で公知であり、様々なFIT-Ig分子の喘息を処置する能力を決定するために使用され得る。喘息を研究するための動物モデルは、Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879；Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295；Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873；およびSnibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52において開示されている。これらの標的対の定型的な安全性評価に加えて、免疫抑制の程度に関する特殊試験が是認され得、最良の標的対を選択するのに役立ち得る（Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43；Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102；Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257を参照されたい）。
【０３１１】
上記で開示された理論的根拠に基づき、ならびに有効性および安全性のための同じ評価モデルを使用して、FIT-Ig分子が結合し得、喘息を処置するのに有用であり得る他の標的対を決定することができる。好ましくは、そのような標的には、IL-13およびIL-1β（IL-1βもまた、喘息における炎症反応に関係づけられているため）；IL-13ならびに炎症に関与するサイトカインおよびケモカイン、例えば、IL-13およびIL-9；IL-13およびIL-4；IL-13およびIL-5；IL-13およびIL-25；IL-13およびTARC；IL-13およびMDC；IL-13およびMIF；IL-13およびTGF-β；IL-13およびLHRアゴニスト；IL-13およびCL25；IL-13およびSPRR2a；IL-13およびSPRR2b；ならびにIL-13およびADAM8などが含まれるが、これらに限定されない。本発明はまた、CSF1 (MCSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、ヒスタミンおよびヒスタミン受容体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR、ならびにキチナーゼからなる群より選択される、喘息に関与する1種または複数の標的と結合し得るFIT-Igを企図する。
【０３１２】
全身性疾患である関節リウマチ (RA) は、関節の滑膜における慢性炎症反応を特徴とし、軟骨の変性および傍関節骨の侵食を伴う。TNF、ケモカイン、および増殖因子を含む多くの炎症促進性サイトカインが、罹患関節において発現される。RAのマウスモデルへの抗TNF抗体またはsTNFR融合タンパク質の全身投与は、抗炎症性かつ関節保護的であることが示された。RA患者におけるTNFの活性が、キメラ抗TNFモノクローナル抗体 (mAB) であるインフリキシマブの静脈内投与により阻止された臨床研究 (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:I61-4) によって、TNFが、IL-6、IL-8、MCP-1、およびVEGFの産生、関節への免疫細胞および炎症細胞の動員、血管新生、マトリクスメタロプロテイナーゼ-1および-3の血中レベルの低下を調節するという証拠が提供された。関節リウマチにおける炎症経路のより良い理解は、関節リウマチに関与する他の治療標的の同定をもたらした。インターロイキン-6アンタゴニスト (MRA)、CTLA4Ig（アバタセプト、Genovese Mc et al 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.）、および抗B細胞療法（リツキシマブ、Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909）などの有望な処置は、ここ1年にわたって無作為化対照試験において既に試験されている。インターロイキン-15、インターロイキン-17、およびインターロイキン-18を含む他のサイトカインが同定され、動物モデルにおいて有益であることが示されており、これらの薬剤の臨床試験が現在進行中である。抗TNFと別のメディエーターを組み合わせた二重特異性抗体療法は、臨床的有効性および／または患者適用範囲を向上させる点で大きな可能性を有する。例えば、TNFおよびVEGFの両方を遮断することは、いずれもRAの病態生理に関与している炎症および血管新生を潜在的に根絶し得る。TNFおよびIL-18；TNFおよびIL-12；TNFおよびIL-23；TNFおよびIL-1β；TNFおよびMIF；TNFおよびIL-17；ならびにTNFおよびIL-15を含むがこれらに限定されない、RAに関与する他の標的対を、特異的FIT-Ig Igで遮断することもまた企図される。これらの標的対の定型的な安全性評価に加えて、免疫抑制の程度に関する特殊試験が是認され得、最良の標的対を選択するのに役立ち得る（Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43；Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102；Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257を参照されたい）。FIT-Ig Ig分子が関節リウマチの処置に有用であるかどうかは、コラーゲン誘発性関節炎マウスモデルなどの前臨床動物RAモデルを用いて評価することができる。他の有用なモデルもまた、当技術分野において周知である（Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2):114-22を参照されたい）。
【０３１３】
全身性エリテマトーデス (SLE) の免疫病原的特徴は、ポリクローナルB細胞活性化であり、これが高グロブリン血症、自己抗体産生、および免疫複合体形成をもたらす。基本的な異常は、全身性T細胞調節不全が原因で、T細胞が禁止B細胞クローンを抑制できないことであると考えられる。加えて、B細胞およびT細胞の相互作用は、IL-10などのいくつかのサイトカイン、ならびにCD40およびCD40L、B7およびCD28およびCTLA-4などの共刺激分子によって促進され、これが二次シグナルを開始する。これらの相互作用は、免疫複合体およびアポトーシス物質の食作用性クリアランス障害と共に、免疫応答を永続化させ、結果として組織損傷が起こる。以下の標的はSLEに関与している可能性があり、治療介入のためのFIT-Igアプローチのために潜在的に使用され得る：B細胞標的療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA、およびNT5E；共刺激シグナル：CTLA-4またはB7.1/B7.2；B細胞生存の阻害：BlyS、BAFF；補体不活性化：C5；サイトカイン調節：基本原理は、任意の組織における正味の生物学的応答は、炎症促進性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインの局所レベル間のバランスの結果であるということである（Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7を参照されたい）。SLEは、血清中IL-4、IL-6、IL-10の上昇が実証された、Th-2駆動性疾患と考えられている。IL-4、IL-6、IL-10、IFN-a、およびTNF-aからなる群より選択される1種または複数の標的と結合し得るFIT-Ig Igもまた企図される。上記で考察された標的の組み合わせは、SLEの治療有効性を高め、これは多くのループス前臨床モデルにおいて試験することができる（Peng SL (2004) Methods Mol Med.;102:227-72を参照されたい）。
【０３１４】
多発性硬化症 (MS)は、病因の大部分が不明である複雑なヒト自己免疫型疾患である。神経系全体にわたるミエリン塩基性タンパク質 (MBP) の免疫学的破壊が、多発性硬化症の主要な病態である。MSは、CD4+およびCD8+ T細胞による浸潤を伴う複雑な病態の疾患であり、中枢神経系内の応答の疾患である。サイトカイン、反応性窒素種、および共刺激分子のCNSにおける発現は全て、MSにおいて記載されている。自己免疫の発生に寄与する免疫学的機序は、主要な検討事項である。特に、抗原発現、サイトカインおよび白血球相互作用、ならびにTh1およびTh2細胞などの他のT細胞のバランス／調節を補助する調節性T細胞は、治療標的の同定のための重要な領域である。
【０３１５】
IL-12は、APCによって産生される炎症促進性サイトカインであり、Th1エフェクター細胞の分化を促進する。IL-12は、MS患者およびEAE罹患動物の発達中の病変において産生される。これまでに、IL-12経路の干渉が齧歯類においてEAEを効果的に予防すること、および抗IL-12 mAbを用いたIL-12p40のインビボ中和が、コモンマーモセットにおけるミエリン誘発性EAEモデルにおいて有益な効果を有することが示された。
【０３１６】
TWEAKは、中枢神経系 (CNS) において構成的に発現されるTNFファミリーのメンバーであり、細胞型に応じて炎症促進効果、増殖効果、またはアポトーシス効果を有する。その受容体であるFnl4は、内皮細胞、反応性星状細胞、およびニューロンによってCNSにおいて発現される。TWEAKおよびFnl4 mRNA発現は、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の際に脊髄において増加した。C57BL/6マウスにおけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質 (MOG) 誘発性EAEでの抗TWEAK抗体処置は、マウスを初回刺激相後に処置した場合に、疾患重症度および白血球浸潤の低下をもたらした。
【０３１７】
本発明の一つの局面は、IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52、およびCCR2からなる群より選択される1種または複数、好ましくは2種の標的と結合し得るFIT-Ig Ig分子に関係する。好ましい態様は、MSの処置にとって有益な治療剤として、二重特異性抗IL-12/TWEAK FIT-Ig Igを含む。MSを処置するためのFIT-Ig分子の有用性を評価するためのいくつかの動物モデルが、当技術分野において公知である（Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71；Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208；Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97；Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42；Owens T, et al., (1995) Neurol Clin.13(1):51-73；および;'t Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761-8を参照されたい。これらの標的対の定型的な安全性評価に加えて、免疫抑制の程度に関する特殊試験が是認され得、最良の標的対を選択するのに役立ち得る（Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43；Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102；Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3(4):442-6を参照されたい)。
【０３１８】
敗血症の病態生理は、グラム陰性生物（リポ多糖 [LPS]、リピドＡ、エンドトキシン）およびグラム陽性生物（リポテイコ酸、ペプチドグリカン）の両方の外膜構成成分によって惹起される。これらの外膜構成成分は、単球の表面上のCD14受容体に結合し得る。最近記載されたtoll様受容体により、シグナルは次いで細胞に伝達され、炎症促進性サイトカイン、腫瘍壊死因子-α (TNF-α) およびインターロイキン-1 (IL-1) の最終的な産生が生じる。圧倒的な炎症反応および免疫応答は、敗血症性ショックの本質的な特徴であり、敗血症によって誘導される組織損傷、多臓器不全、および死亡の病因において中心的な役割を果たす。サイトカイン、特に腫瘍壊死因子 (TNF) およびインターロイキン (IL)-1は、敗血症性ショックの重要なメディエーターであることが示されている。これらのサイトカインは、組織に対して直接的な毒性効果を及ぼし；それらはまたホスホリパーゼA2を活性化する。これらおよびその他の効果は、血小板活性化因子の濃度の上昇、一酸化窒素合成酵素活性の促進、好中球による組織浸潤の促進、および好中球活性の促進をもたらす。
【０３１９】
敗血症および敗血症性ショックの処置は依然として臨床的な難問であり、炎症反応を目的とした生物学的応答調節物質（すなわち、抗TNF、抗MIF）を用いる最近の前向き試験は、わずかな臨床的有用性しか示さなかった。最近、免疫抑制の付随する期間を逆転させることを目的とした治療に関心が移っている。実験動物および重症患者における研究によって、リンパ器官およびいくつかの実質組織のアポトーシスの増大が、この免疫抑制、アネルギー、および臓器系機能不全に寄与することが実証された。敗血症症候群の際には、IL-2の非存在によって、またはグルココルチコイド、グランザイム、もしくはいわゆる「死」サイトカイン：腫瘍壊死因子αもしくはFasリガンドの放出によって、リンパ球アポトーシスが誘発され得る。アポトーシスは、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバーおよび抗アポトーシスメンバーによって影響を受け得る、サイトゾルカスパーゼおよび／またはミトコンドリアカスパーゼの自己活性化を介して進行する。実験動物において、アポトーシスの阻害剤を用いる処置は、リンパ系細胞のアポトーシスを予防できるだけでなく；転帰もまた改善し得る。抗アポトーシス剤を用いる臨床試験は、大部分はそれらの投与および組織標的指向に関連した技術的な問題のために依然として現実的ではないが、リンパ球アポトーシスの阻害は、敗血症患者に対する魅力的な治療標的である。同様に、炎症性メディエーターおよびアポトーシスメディエーターの両方を標的とする二重特異性薬剤は、さらなる利点を有し得る。本発明の一つの局面は、TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll様受容体、TLR-4、組織因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、IL10、IL1B、IL6、ADORA2A、CCR3、IL10、IL1B、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、ミッドカイン、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1、およびTREM1からなる群より選択される、敗血症に関与する1種または複数の標的、好ましくは2種の標的と結合し得るFIT-Ig Igに関係する。敗血症に対するそのようなFIT-Ig Igの有効性は、当技術分野において公知の前臨床動物モデルにおいて評価することができる（Buras JA, et al.,(2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65、および Calandra T, et al., (2000) Nat Med. 6(2):164-70を参照されたい）。
【０３２０】
慢性神経変性疾患は、通常、神経機能の進行性の喪失（神経細胞死、脱髄）、運動機能の喪失、および記憶の喪失を特徴とする年齢依存性疾患である。慢性神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）の根底にある機序の新たな知識は、複雑な病因を示し、それらの発達および進行に、種々の要因、例えば、年齢、血糖状態、アミロイドの産生および多量体化、それらの受容体RAGE（AGEの受容体）に結合する終末糖化産物 (AGE) の蓄積、脳の酸化ストレスの増大、脳血流の減少、炎症性サイトカインおよびケモカインの放出を含む神経炎症、神経機能障害、ならびにミクログリアの活性化が寄与することが認識されている。したがって、これらの慢性神経変性疾患は、複数の細胞型とメディエーターとの間の複雑な相互作用を示す。そのような疾患に対する処置戦略は限られており、大部分が、非特異的抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、COX阻害剤）により炎症過程を遮断すること、またはニューロン喪失および／もしくはシナプス機能を防ぐための薬剤のいずれかに相当する。これらの処置は、疾患の進行を止めることができない。最近の研究により、可溶性A-βペプチド（A-bオリゴマー形態を含む）に対する抗体などの、より標的指向性の治療法は、疾患進行の停止に役立ち得るのみならず、記憶の維持にも役立ち得ることが示唆されている。これらの予備知見により、2種以上の疾患メディエーター（例えば、A-β、およびTNFなどの炎症促進性サイトカイン）を標的とする特異的治療法は、慢性神経変性疾患に関して、単一の疾患機序（例えば、可溶性A-βのみ）を標的とする場合に観察されたものよりもさらにより良好な治療有効性を提供し得ることが示唆される（C.E. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 2005 Oct 24；Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11:3335；William L. Klein.; Neurochem Int. 2002 ;41:345；Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005 ;2:23；Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004;1:149；Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005;11:556-61；Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10；Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63；Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13；およびEliezer Masliah, et al., Neuron. 2005;46:857を参照されたい）。
【０３２１】
本発明のFIT-Ig分子は、アルツハイマー病などの慢性神経変性疾患に関与する1種または複数の標的と結合し得る。そのような標的には、ADの病因に関係づけられる可溶性または細胞表面の任意のメディエーター、例えばAGE（S100 A、アンホテリン）、炎症促進性サイトカイン（例えば、IL-1）、ケモカイン（例えば、MCP 1）、神経再生を阻害する分子（例えば、Nogo、RGM A）、神経突起成長を増強する分子（ニューロトロフィン）が含まれるが、これらに限定されない。FIT-Ig分子の有効性は、アミロイド前駆体タンパク質またはRAGEを過剰発現し、アルツハイマー病様の症状を発症するトランスジェニックマウスなどの前臨床動物モデルにおいて検証することができる。加えて、FIT-Ig分子を構築し、動物モデルにおいて有効性について試験することができ、ヒト患者において試験するために最良の治療用FIT-Igを選択することができる。FIT-Ig分子はまた、パーキンソン病などの他の神経変性疾患の処置にも使用することができる。α-シヌクレインは、パーキンソンの病態に関与している。α-シヌクレイン、およびTNF、IL-1、MCP-1などの炎症性メディエーターを標的とし得るFIT-Igは、パーキンソン病の効果的な治療法を証明することができ、本発明において企図される。
【０３２２】
病理学的機序の知識の増大にもかかわらず、脊髄損傷 (SCI) はなお深刻な被害をもたらす状態であり、高度な医学的必要性を特徴とする医学的適応症に相当する。大部分の脊髄損傷は挫傷または圧迫損傷であり、通常、一次的損傷に続いて二次的損傷機序（炎症性メディエーター、例えばサイトカインおよびケモカイン）が起こり、これが初期損傷を悪化させ、場合によっては10倍を超える病変領域の大幅な拡大をもたらす。SCIにおけるこれらの一次的および二次的機序は、他の手段、例えば脳卒中によって引き起こされる脳損傷のものと非常に類似している。満足のいく処置は存在せず、メチルプレドニゾロン (MP) の高用量ボーラス注射が、損傷後8時間という狭い時間枠内で使用される唯一の治療法である。しかしながら、この処置は二次的損傷の予防を意図しているに過ぎず、顕著な機能回復を生じることは全くない。それは、明確な有効性の欠如、ならびにその後の感染症を伴う免疫抑制および重篤な組織病理学的筋肉変化のような重篤な有害作用について厳しく批判されている。内在性の再生能を刺激する他の薬物、生物製剤、または小分子は認可されていないが、近年、有望な処置原理および薬物候補がSCIの動物モデルにおいて有効性を示している。多くの場合、ヒトSCIにおける機能回復の欠如は、病変部位における、瘢痕組織中の、ミエリン中の、および損傷関連細胞における、神経突起成長を阻害する因子によって引き起こされる。そのような因子は、ミエリン関連タンパク質NogoA、OMgpおよびMAG、RGM A、瘢痕関連CSPG（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ならびに反応性星状細胞に対する阻害因子（一部のセマフォリンおよびエフリン）である。しかしながら、病変部位では、成長阻害分子のみならず、ニューロトロフィン、ラミニン、L1、およびその他のような神経突起成長刺激因子もまた見出される。神経突起成長阻害分子および成長促進分子のこのアンサンブルによって、阻害的影響の低減がバランスを成長阻害から成長促進へと変化させ得るために、NogoAまたはRGM Aのような単一因子を遮断することが、齧歯類SCIモデルにおいて顕著な機能的回復をもたらしたことを説明することができる。しかしながら、単一の神経突起成長阻害分子を遮断することによって観察された回復は、完全ではなかった。より速くかつより明白な回復を達成するには、2種の神経突起成長阻害分子、例えばNogoおよびRGM Aを遮断すること、または神経突起成長阻害分子を遮断し、かつ神経突起成長増強分子の機能を増強すること、例えばNogoおよびニューロトロフィン、または神経突起成長阻害分子、例えばNogo、および炎症促進性分子、例えばTNFを遮断することが望ましい場合がある（McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003;26:193；Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005;233:43；Milan Makwana1, et al., FEBS J. 2005;272:2628；Barry J. Dickson, Science. 2002;298:1959；Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005;79:273；Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736；Gang Xu, et al., J. Neurochem.2004; 91; 1018を参照されたい）。
【０３２３】
企図される他のFIT-Igは、NgRおよびRGM A；NogoAおよびRGM A；MAGおよびRGM A；OMGpおよびRGM A；RGM AおよびRGM B；CSPGおよびRGM A；アグリカン、ミッドカイン、ニューロカン、バーシカン、ホスファカン、Te38、およびTNF-a；樹状突起および軸索の発芽を促進する抗体と組み合わされたAβグロブロマー (globulomer) 特異的抗体などの標的対と結合し得るものである。樹状突起病態は、ADの非常に初期の徴候であり、NOGO Aは樹状突起成長を制限することが知られている。そのような種類のabを、SCI候補（ミエリン-タンパク質）Abのいずれかと組み合わせることができる。他のFIT-Ig標的には、NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66 (Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG、またはOmgpの任意の組み合わせが含まれ得る。加えて、標的には、神経突起の阻害に関係づけられる可溶性または細胞表面の任意のメディエーター、例えば、Nogo、Ompg、MAG、RGM A、セマフォリン、エフリン、可溶性A-b、炎症促進性サイトカイン（例えば、IL-1）、ケモカイン（例えば、MIP 1a）、神経再生を阻害する分子もまた含まれ得る。抗nogo／抗RGM Aまたは類似のFIT-Ig分子の有効性は、脊髄損傷の前臨床動物モデルにおいて検証することができる。加えて、これらのFIT-Ig分子を構築し、動物モデルにおいて有効性について試験することができ、ヒト患者において試験するために最良の治療用FIT-Igを選択することができる。加えて、単一の受容体、例えば3つのリガンドNogo、Ompg、およびMAGと結合するNogo受容体ならびにA-bおよびS100 Aと結合するRAGE上の2種の異なるリガンド結合部位を標的とするFIT-Ig分子を構築することもできる。さらに、神経突起成長阻害剤、例えばnogoおよびnogo受容体はまた、多発性硬化症のような免疫疾患において神経再生を妨げる上でも役割を果たす。nogo-nogo受容体相互作用の阻害は、多発性硬化症の動物モデルにおいて回復を強化することが示されている。したがって、1つの免疫メディエーター、例えばIL-12のようなサイトカイン、および神経突起成長阻害剤分子、例えばnogoまたはRGMの機能を阻止し得るFIT-Ig分子は、免疫分子または神経突起伸長阻害剤分子のいずれかのみを遮断するよりも、より速くかつ高い有効性を提供し得る。
【０３２４】
モノクローナル抗体療法は、がんの重要な治療様式として現れた（von Mehren M, et al 2003 Monoclonal antibody therapy for cancer. Annu Rev Med.;54:343-69）。抗体は、アポトーシス、再指向された細胞傷害性を誘導すること、リガンド-受容体相互作用を妨げること、または新生物表現型に重要なタンパク質の発現を防ぐことによって、抗腫瘍効果を発揮し得る。加えて、抗体は、腫瘍微小環境の構成成分を標的とし、腫瘍関連脈管構造の形成などの重要な構造を乱すことができる。抗体はまた、そのリガンドが増殖因子である、上皮成長因子受容体などの受容体を標的とすることもできる。したがって、抗体は、細胞増殖を刺激する天然リガンドが、標的とされる腫瘍細胞に結合するのを阻害する。あるいは、抗体は、抗イディオタイプネットワーク、補体媒介性細胞傷害、または抗体依存性細胞傷害 (ADCC) を誘導し得る。2種の別個の腫瘍メディエーターを標的とする二重特異性抗体の使用は、単一特異的療法と比較してさらなる利点をもたらす可能性が高い。腫瘍性疾患を処置するために以下の標的対と結合し得るFIT-Ig Igもまた企図される：IGF1およびIGF2；IGF1/2およびErb2B；VEGFRおよびEGFR；CD20およびCD3、CD138およびCD20、CD38およびCD20、CD38およびCD138、CD40およびCD20、CD138およびCD40、CD38およびCD40。他の標的組み合わせには、EGF/erb-2/erb-3ファミリーの1種または複数のメンバーが含まれる。FIT-Ig Igが結合し得る、腫瘍性疾患に関与する他の標的（1種または複数）には、CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、EGF、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1、IGF1R、IL2、VEGF、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2���FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1（E-カドヘリン）、CDKN1B (p27Kip1)、CDKN2A (p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1（b-カテニン）、CTSB（カテプシンB）、ERBB2 (Her-2)、ESR1、ESR2、F3 (TF)、FOSL1 (FRA-1)、GATA3、GSN（ゲルゾリン）、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST（糖タンパク質130）、ITGA6（a6インテグリン）、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7 (c-Jun)、MKI67 (Ki-67)、NGFB (NGF)、NGFR、NME1 (NM23A)、PGR、PLAU (uPA)、PTEN、CTLA-4、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、SERPINB5（マスピン）、SERPINE1 (PAI-1)、TGFA、THBS1（トロンボスポンジン-1）、TIE (Tie-1)、TNFRSF6 (Fas)、TNFSF6 (FasL)、TOP2A（トポイソメラーゼIia）、TP53、AZGP1（亜鉛-a-糖タンパク質）、BPAG1（プレクチン）、CDKN1A (p21Wap1/Cip1)、CLDN7（クローディン-7）、CLU（クラスタリン）、ERBB2 (Her-2)、FGF1、FLRT1（フィブロネクチン）、GABRP (GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6（a6インテグリン）、ITGB4（b 4インテグリン）、KLF5（GCボックスBP）、KRT19（ケラチン19）、KRTHB6（毛髪特異的II型ケラチン）、MACMARCKS、MT3（メタロチオネクチン-III）、MUC1（ムチン）、PTGS2 (COX-2)、RAC2 (p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2（リポフィリンB）、SCGB2A1（マンマグロビン2）、SCGB2A2（マンマグロビン1）、SPRR1B (Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4、およびTNFAIP2 (B94) からなる群より選択されるものが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３２５】
一つの態様において、本明細書において提供される組成物および方法で処置または診断され得る疾患には、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱、および尿路上皮を含む）、女性生殖器（子宮頸部、子宮、卵巣、ならびに絨毛がんおよび妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖器（前立腺、精嚢、精巣、および胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、および脳下垂体を含む）、および皮膚のがん腫、ならびに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるもの、ならびにカポジ肉腫を含む）、脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍（星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン腫、および髄膜腫を含む）、白血病などの造血器悪性腫瘍から生じる固形腫瘍、ならびにリンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方）を含む原発性および転移性のがんが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２６】
一つの態様において、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合部分は、単独で、または放射線療法および／もしくは他の化学療法剤と組み合わせて使用される場合、がんを処置するために、または本明細書において記載される腫瘍からの転移の予防において使用される。
【０３２７】
本発明の別の態様によれば、ヒト免疫エフェクター細胞は、ヒトリンパ系細胞系列のメンバーである。この態様において、エフェクター細胞は、有利にはヒトT細胞、ヒトB細胞、またはヒトナチュラルキラー (NK) 細胞であってよい。有利には、そのような細胞は、標的細胞に対して細胞傷害性またはアポトーシスのいずれかの効果を及ぼす。特に有利には、ヒトのリンパ系細胞は、活性化された場合に標的細胞に対して細胞傷害効果を発揮する細胞傷害性T細胞である。この態様によれば、次いで、ヒトエフェクター細胞の動員される活性が、この細胞の細胞傷害活性である。
【０３２８】
好ましい態様によれば、細胞傷害性T細胞の活性化は、本発明のこの態様の二重特異性抗体による、細胞傷害性T細胞の表面上のエフェクター抗原としてのCD3抗原の結合を介して生じ得る。ヒトCD3抗原は、ヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞の両方に存在する。ヒトCD3は、多分子T細胞複合体の一部としてT細胞上に発現され、かつ3つの異なる鎖：CD3-ε、CD3-δ、およびCD3-γを含む抗原を意味する。
【０３２９】
T細胞の細胞傷害能の活性化は、複数のタンパク質の相互作用を必要とする複雑な現象である。T細胞受容体（「TCR」）タンパク質は、2種の異なる糖タンパク質サブユニットからなる膜結合型ジスルフィド結合ヘテロ二量体である。TCRは外来ペプチド抗原を認識してこれと結合し、この抗原自体は、高度に多様なクラスの主要組織適合複合体（「MHC」）タンパク質のメンバーにより結合されており、抗原提示細胞（「APC」）の表面上に、MHCに結合して提示されている。
【０３３０】
可変TCRは上記で概説したように外来抗原と結合するが、この結合が起こったT細胞へのシグナル伝達は、TCRと会合した他の不変のシグナル伝達タンパク質の存在に依存する。会合した形態でのこれらのシグナル伝達タンパク質は、まとめてCD3複合体と称され、本明細書ではまとめてCD3抗原と称される。
【０３３１】
それ故に、T細胞の細胞傷害性の活性化は、通常はまず、別の細胞上に位置している、それ自体が外来抗原に結合しているMHCタンパク質とTCRとの結合に依存する。この最初のTCR-MHC結合が起こった場合にのみ、T細胞クローン増殖に関与するCD3依存性シグナル伝達カスケード、および最終的にはT細胞の細胞傷害性が結果として生じ得る。
【０３３２】
しかしながら、本発明の二重特異性抗体の第1または第2の部分によるヒトCD3抗原の結合は、独立したTCR-MHC結合の非存在下において、他の細胞に対して細胞傷害効果を発揮するようにT細胞を活性化する。このことは、クローン的に独立した様式で、すなわちT細胞によって保有される特異的TCRクローンとは独立した様式で、T細胞が細胞傷害的に活性化され得ることを意味する。これは、ある特定のクローン同一性の特異的T細胞のみでなく、T細胞区画全体の活性化を可能にする。
【０３３３】
したがって、前述の考察の観点から、本発明の特に好ましい態様は、エフェクター抗原がヒトCD3抗原である二重特異性抗体を提供する。本発明のこの態様による二重特異性抗体は、合計で2つまたは3つの抗体可変ドメインを有し得る。
【０３３４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の二重特異性抗体によって結合される他のリンパ系細胞会合エフェクター抗原は、ヒトCD16抗原、ヒトNKG2D抗原、ヒトNKp46抗原、ヒトCD2抗原、ヒトCD28抗原、またはヒトCD25抗原であってよい。
【０３３５】
本発明の別の態様によれば、ヒトエフェクター細胞は、ヒト骨髄細胞系列のメンバーである。有利には、エフェクター細胞は、ヒト単球、ヒト好中性顆粒球、またはヒト樹状細胞であってよい。有利には、そのような細胞は、標的細胞に対して細胞傷害性またはアポトーシスのいずれかの効果を及ぼす。本発明の二重特異性抗体によって結合され得るこの態様内の有利な抗原は、ヒトCD64抗原またはヒトCD89抗原であってよい。
【０３３６】
本発明の別の態様によれば、標的抗原は、疾患状態においては標的細胞またはエフェクター細胞上に特有に発現されるが、健常状態においては発現されないままであるか、低レベルで発現されるか、または利用不可能であるかのいずれかである抗原である。本発明の二重特異性抗体によって特異的に結合され得るそのような標的抗原の例は、有利には、EpCAM、CCR5、CD19、HER-2 neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1（ムチン）、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、ルイス-Y、CD20、CD33、CD30、ガングリオシドGD3、9-O-アセチル-GD3、GM2、Globo H、フコシルGM1、ポリSA、GD2、炭酸脱水酵素IX (MN/CA IX)、CD44v6、ソニックヘッジホッグ (Shh)、Wue-1、形質細胞抗原、（膜結合型）IgE、黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン (MCSP)、CCR8、TNF-α前駆体、STEAP、メソテリン、A33抗原、前立腺幹細胞抗原 (PSCA)、Ly-6；デスモグレイン4、E-カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、CD25、CA19-9マーカー、CA-125マーカーおよびミュラー管 (Muellerian) 抑制物質 (MIS) 受容体II型、sTn（シアル酸付加Tn抗原；TAG-72）、FAP（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン、EGFRvIII、LG、SAS、ならびにCD63より選択され得る。
【０３３７】
特定の態様によれば、二重特異性抗体によって特異的に結合される標的抗原は、がん関連抗原、例えば悪性状態に関連した抗原であってよい。そのような抗原は悪性細胞上で発現されるかまたは利用可能であるかのいずれかであるのに対して、抗原は非悪性細胞上では存在しないか、有意に存在しないか、または利用不可能であるかのいずれかである。したがって、本発明のこの態様による二重特異性抗体は、標的抗原を有するかまたは標的抗原を利用可能にする悪性標的細胞に対して、ヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員する二重特異性抗体である。
【０３３８】
遺伝子治療：特定の態様において、本明細書において提供される結合タンパク質または本明細書において提供される別の予防剤もしくは治療剤をコードする核酸配列は、遺伝子治療によって、障害またはその1つもしくは複数の症状を処置、予防、管理、または改善するために投与される。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を対象へ投与することによって行われる治療を指す。この態様において、核酸は、予防効果もしくは治療効果を媒介する、本明細書において提供されるそれらのコードされた抗体または予防剤もしくは治療剤を生成する。
【０３３９】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法はいずれも、本明細書において提供される方法において使用することができる。遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharmacy 12:488-505；Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev (1993) Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan (1993) Science 260:926-932；Morgan and Anderson (1993) Ann Rev. Biochem. 62:191-217；およびMay (1993) TIBTECH 11(5):155-215を参照されたい。使用され得る組換えDNA技術の、当技術分野において一般的に公知の方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993)；およびKriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990) に記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳細な説明は、米国特許出願公開第US20050042664号に開示されている。
【０３４０】
診断：本明細書における開示はまた、診断アッセイ法、1つまたは複数の結合タンパク質を含む診断用キット、ならびに自動化および／または半自動化システムで使用するための方法およびキットの適合化を含むがこれらに限定されない診断的適用を提供する。提供される方法、キット、および適合化は、個体における疾患または障害の検出、モニタリング、および／または処置において利用され得る。これは以下でさらに明らかにされる。
【０３４１】
A．アッセイの方法：本開示はまた、本明細書において記載される少なくとも1つの結合タンパク質を用いて、試験試料中の分析物またはその断片の存在、量、または濃度を決定する方法を提供する。当技術分野で公知の任意の適切なアッセイを、本方法において使用することができる。例には、免疫測定法、および／または質量分析を用いる方法が含まれるが、これらに限定されない。本開示によって提供される免疫測定法には、とりわけ、サンドイッチ免疫測定法、放射免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測定法 (EIA)、酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA)、競合阻害免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法 (FPIA)、酵素多重免疫測定技法 (EMIT)、生物発光共鳴エネルギー移動 (BRET)、および均質化学発光アッセイが含まれ得る。化学発光微粒子免疫測定法、特にARCHITECT（登録商標）自動分析計（Abbott Laboratories、Abbott Park, Ill.）を使用するものは、免疫測定法の一例である。質量分析を用いる方法が本開示によって提供され、これにはMALDI（マトリクス支援レーザー脱離／イオン化）またはSELDI（表面増強レーザー脱離／イオン化）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４２】
生物学的試験試料を採取する、取り扱う、処理する、ならびに免疫測定法および質量分析を用いて分析する方法は当業者に周知であり、本開示の実施において提供される (US 2009-0311253 A1)。
【０３４３】
B．キット：試験試料中の分析物またはその断片の存在、量、または濃度について試験試料をアッセイするためのキットもまた提供される。キットは、分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも1つの構成成分、および分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための説明書を含む。分析物またはその断片について試験試料をアッセイするための少なくとも1つの構成成分は、任意に固相上に固定化された、本明細書において開示される結合タンパク質および／または抗分析物結合タンパク質（またはその断片、バリアント、もしくはバリアントの断片）を含む組成物を含み得る。任意に、キットは、単離または精製された分析物を含み得る標準物質または対照を含み得る。キットは、免疫測定法および／または質量分析により分析物について試験試料をアッセイするための少なくとも1つの構成成分を含み得る。分析物、結合タンパク質、および／もしくは抗分析物結合タンパク質、またはそれらの断片を含むキット構成成分は、当技術分野で公知の任意の検出可能な標識を用いて任意に標識され得る。本開示の実施において提供される作製のための材料および方法は、当業者に公知である (US 2009-0311253 A1)。
【０３４４】
C．キットおよび方法の適合化：本明細書において記載される免疫測定法などのアッセイによって試験試料中の分析物の存在、量、または濃度を決定するキット（またはその構成成分）および方法は、例えば米国特許第5,089,424号および第5,006,309号に記載されているような、ならびに例えばAbbott Laboratories (Abbott Park，Ill) によりARCHITECT（登録商標）として市販されているような種々の自動化および半自動化システム（固相が微粒子を含むものを含む）で使用するために適合化することができる。Abbott Laboratoriesから入手可能な他のプラットフォームには、AxSYM（登録商標）、IMx（登録商標）（例えば米国特許第5,294,404号を参照されたい）、PRISM（登録商標）、EIA（ビーズ）、およびQuantum（商標）II、ならびに他のプラットフォームが含まれるが、これらに限定されない。加えて、アッセイ、キット、およびキット構成成分は、他の形式、例えば、電気化学的または他の手持ち式またはポイントオブケア型のアッセイ系でも使用され得る。本開示は、例えば、サンドイッチ免疫測定法を実施する市販のAbbottポイントオブケア（i-STAT（登録商標）、Abbott Laboratories）電気化学免疫測定系に適用可能である。免疫センサー、ならびにその製造方法および使い捨て試験装置におけるにその操作方法は、例えば、米国特許第5,063,081号、第7,419,821号、および第7,682,833号；ならびに米国特許出願公開第20040018577号、第20060160164号および、第US20090311253号に記載されている。本明細書において記載される方法の他の適切な修正および適合化は明らかであり、本明細書において開示される態様の範囲から逸脱することなく適切な均等物を使用してなされ得ることは、当業者には容易に明白であろう。ある特定の態様をここで詳細に説明してきたが、これらの態様は、例示のみを目的として含まれ、限定が意図されない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されるであろう。
【０３４５】
明確に理解できるように説明および例により前述の本発明をある程度詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対していくらかの変更および修正がなされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明白であろう。以下の実施例は説明のためのみに提供するものであって、限定のために提供するものではない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る、重要ではない種々のパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０３４６】
実施例1. 抗IL17/IL-20タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、精製、および分析
FIT-Ig技術を実証するために、発明者らは、抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子：FIT1-Ig、FIT2-Ig、およびFIT3-Igのグループを作製した。これらは全て、図1に示すような、3種の異なるポリペプチドを含有し、ここで、抗原AはIL-17であり、抗原BはIL-20である。IL-17およびIL-20に結合する能力を有するFIT-Igを作製するために用いたDNA構築物を図1Bに図示する。簡単に説明すると、親mAbには、2種の高親和性抗体、抗IL-17（クローンLY）（米国特許第7,838,638号）および抗hIL-20（クローン15D2）（米国特許出願公開第US2014/0194599号）が含まれる。FIT-Ig構築物#1を作製するために、（表1に示すように）LYのVL-CLを、直接的に（FIT1-Ig）、または3アミノ酸（FIT2-Ig）もしくは7アミノ酸（FIT3-Ig）のリンカーを介して、15D2重鎖のN末端に融合させた。構築物#2はLYのVH-CH1であり、3番目の構築物は15D2のVL-CLである。各FIT-Igについての3種の構築物を293細胞にコトランスフェクトし、その結果、FIT-Igタンパク質の発現および分泌を生じた。
【０３４７】
発明者らはまた、図2に示すように、それぞれが2種の異なるポリペプチドを含有する、抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子：FIT4-Ig、FIT5-Ig、およびFIT6-Igのグループも作製した。IL-17およびIL-20に結合する能力を有するFIT-Igを作製するために用いたDNA構築物を図2Bに図示し、ここで、抗原AはIL-17であり、抗原BはIL-20である。簡単に説明すると、親mAbには2種の高親和性抗体、抗IL-17（クローンLY）および抗hIL-20（クローン15D2）が含まれる。FIT-Ig構築物#1を作製するために、（表1に示すように）LYのVL-CLを、直接的に（FIT4-Ig）、または3アミノ酸（FIT5-Ig）もしくは7アミノ酸（FIT6-Ig）のリンカーを介して、15D2重鎖のN末端に融合させた。FIT-Ig構築物#4を作製するために、LYのVH-CH1を、直接的に（FIT4-Ig）、または3アミノ酸（FIT5-Ig）もしくは7アミノ酸（FIT6-Ig）のリンカーを介して、15D2軽鎖のN末端に融合させた。各FIT-Igについての2種のDNA構築物（構築物#1および#4）を293細胞にコトランスフェクトし、その結果FIT-Igタンパク質の発現および分泌を生じた。PCRクローニングの詳細な手法を以下に説明する。
【０３４８】
実施例1.1：抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子の分子クローニング
構築物#1のクローニングのために、軽鎖シグナル配列にアニーリングするフォワードプライマーおよび軽鎖のC末端にアニーリングするリバースプライマーを用いるPCRによって、LY軽鎖を増幅した。15D2 VHのN末端にアニーリングするフォワードプライマーおよびCHのC末端にアニーリングするリバースプライマーを用いるPCRによって、15D2重鎖を増幅した。これらの2種のPCR断片をゲル精製し、シグナルペプチドおよびCHのプライマー対を用いるオーバーラッピングPCRによって組み合わせた。組み合わされたPCR産物を、既にヒトFc配列を含有する293発現ベクター内にクローニングした。
【０３４９】
（表１）抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子およびDNA構築物
2019514839.tif 000006
【０３５０】
構築物#2のクローニングのために、重鎖シグナルペプチドにアニーリングするフォワードプライマーおよびCH1のC末端にアニーリングするリバースプライマーを用いるPCRによって、LY VH-CH1を増幅した。PCR産物をゲル精製した後に、293発現ベクター内にクローニングした。
【０３５１】
構築物#3のために、軽鎖シグナルペプチドのN末端にアニーリングするフォワードプライマーおよびCLの末端にアニーリングするリバースプライマーを用いるPCRによって、15D2軽鎖を増幅した。PCR産物をゲル精製した後に、293発現ベクター内にクローニングした。
【０３５２】
構築物#4のクローニングのために、重鎖シグナルペプチドのN末端にアニーリングするフォワードプライマーおよびCH1の末端にアニーリングするリバースプライマーを用いるPCRによって、LY VH-CH1を増幅した。15D2 VLを、15D2 VLの末端にアニーリングするプライマーを用いて増幅した。両方のPCR産物をゲル精製し、オーバーラップPCRによって組み合わせた。組み合わされたPCR産物をゲル精製し、293発現ベクター内にクローニングした。表2は、上述の分子クローニングで用いたPCRプライマーの配列を示す。
【０３５３】
（表２）抗IL-17/抗CD20 FIT-Igの分子構築で用いたPCRプライマー
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【０３５４】
hIL-17/hIL-20 FIT1-Ig、FIT2-Ig、FIT3-Ig、FIT4-Ig、FIT5-Ig、およびFIT6-Igの最終配列を表3に列記する。
【０３５５】
（表３）抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子のアミノ酸配列
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【０３５６】
実施例1.2：抗IL-17/IL-20 FIT-Igタンパク質の発現、精製、および分析
各FIT-Igの全DNA構築物をpBOSベースのベクター内にサブクローニングし、正確性を確実にするために配列決定した。各FIT-Ig（1、2、および3）の構築物#1、#2、および#3、または各FIT-Ig（4、5、および6）の構築物#1および#4を、293E細胞中でポリエチレンイミン（PEI）を用いて一過性に共発現させた。簡単に説明すると、FreeStyle（商標）293発現培地中のDNAを1:2のDNA対PEI比の最終濃度でPEIと混合し、室温で15分間（20分を超えない）インキュベートし、次いで、60 μg DNA/120 ml培養物で293E細胞（1.0〜1.2×106/ml、細胞生存率＞95％）に加えた。振とう機で6〜24時間培養した後、トランスフェクトした細胞に5％の最終濃度でペプトンを添加し、37℃、8％ CO2にて125 rpm/分で振とうした。6〜7日目に、遠心分離およびろ過によって上清を回収し、FIT-Igタンパク質を、プロテインAクロマトグラフィ（Pierce, Rockford, IL）を用いて製造者による説明書にしたがって精製した。タンパク質をSDS-PAGEによって分析し、その濃度をA280およびBCA（Pierce, Rockford, IL）によって決定した。
【０３５７】
FIT1-Ig、FIT2-Ig、およびFIT3-Igの発現のために、構築物#1:#2:#3＝1:1:1、構築物#1:#2:#3＝1:1.5:1.5、および構築物#1:#2:#3＝1:3:3を含む、異なるDNAモル比の3種の構築物を用いた（表4）。FIT-Igタンパク質をプロテインAクロマトグラフィによって精製した。精製収量（7〜16 mg/L）は、各タンパク質についての発現培地のhIgG定量化と一致した。精製したFIT-Igの組成および純度を還元条件および非還元条件の両方でSDS-PAGEによって分析した。非還元条件では、FIT-Igはおよそ250 KDaの単一バンドとして移動した。還元条件では、FIT-Igタンパク質はそれぞれ2つのバンドを生じ、一方のより高いMWのバンドはおよそ75 KDaの構築物#1であり、一方のより低いMWのバンドはおよそ25 KDaで重なり合う構築物#2および#3の両方に対応する。SDS-PAGEは、各FIT-Igが単一の種として発現されること、および3種のポリペプチド鎖は効率的に対を形成し、IgG様分子を形成することを示した。FIT-Ig分子の鎖ならびに全長タンパク質の大きさは、アミノ酸配列に基づくそれらの計算した分子質量と一致する。
【０３５８】
（表４）hIL-17/IL-20 FIT-Igタンパク質の発現およびSEC分析
2019514839.tif 000015
【０３５９】
溶液中のFIT-Igの物理的性質をさらに試験するために、サイズ排除クロマトグラフィ（SEC）を用いて各タンパク質を分析した。FIT-IgのSEC分析のために、PBS中の精製FIT-Igを TSKゲルSuperSW3000、300×4.6 mmカラム（TOSOH）にアプライした。HPLC装置、Model U3000（DIONEX）をSECで用いた。全てのタンパク質を280 nmおよび214 nmでのUV検出を用いて決定した。溶出は0.25 mL/分の流速で均一濃度であった。3種のFIT-Igタンパク質は全て単一の主要ピークを呈し、単量体タンパク質としての物理的均一性を実証した（表4）。構築物#1:#2:#3＝1:3:3の比は、全3種のFIT-Igタンパク質についてSECによってより優れた単量体プロファイルを示した（表4）。
【０３６０】
表4はまた、FIT-Igタンパク質全ての発現レベルが通常のmAbのものに匹敵することも示し、FIT-Igが哺乳類細胞において効率的に発現され得ることを示唆した。FIT4-Ig、FIT5-Ig、およびFIT6-Igの発現について、DNA比は構築物#1:#4＝1:1であり、発現レベルは1〜10 mg/Lの範囲内であり、かつSECによって決定された％ピーク単量体画分は58〜76％の範囲内であった。この特定のmAb組み合わせ（LYおよび15D2）に基づくと、3ポリペプチドのFIT-Ig構築物（FIT1-Ig、FIT2-Ig、および FIT3-Ig）は、2ポリペプチドのFIT-Ig構築物（FIT4-Ig、FIT5-Ig、およびFIT6-Ig）のものより優れた発現プロファイルを示したため、FIT1-Ig、FIT2-Ig、およびFIT3-Igについて機能的特性をさらに分析した。
【０３６１】
実施例1.3 抗IL-17/IL-20 FIT-Igの抗原結合親和性の決定
rhIL-17およびrhIL-20へのFIT-Ig結合のキネティクスを、25℃にてHBS-EP（10 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、および0.005％界面活性剤P20）を用いるBiacore X100装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）による表面プラズモン共鳴（表5）によって決定した。簡単に説明すると、ヤギ抗ヒトIgG Fcγ断片特異的ポリクローナル抗体（Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL）を、標準的なアミンカップリングキットを用いて製造者による説明書にしたがって、CM5研究グレードバイオセンサーチップの全域に直接的に固定化した。精製したFIT-Ig試料を、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的反応表面での捕捉のためにHEPES緩衝化食塩水で希釈し、5 μl/分の流速で反応マトリクスに注入した。会合および解離速度定数、kon（M-1s-1）およびkoff（s-1）を30 μl/分の連続流速下で決定した。速度定数を、1.25から1000 nMの範囲の10種の異なる抗原濃度で結合速度の測定を行うことによって得た。次いで、FIT-Igと標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数（M）を、以下の式：KD＝koff/konによって動的速度定数（kinetic rate constant）から計算した。抗原試料のアリコートもまたブランク参照および反応CM表面に同時に注入し、任意の非特異的結合バックグラウンドを記録し差し引き、屈折率変化および注入ノイズの大部分を除去した。表面を、10 μL/分の流速での10 mMグリシン（pH 1.5）の連続する2回の25 ml注入によって再生した。抗Fc抗体を固定化した表面は完全に再生され、12サイクルにわたってその最大限の捕捉能力を保持した。
【０３６２】
（表５）抗IL-17/IL-20 FIT-Ig分子の機能的特徴
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【０３６３】
Biacore分析は、3種のFIT-IgのhIL-17およびhIL-20への全般的結合パラメータは類似しており、FIT-Igの親和性は親mAb LYおよび15D2のものと非常に近く、いずれの抗原結合ドメインに対する結合親和性も失われていないことを示唆した（表5）。
【０３６４】
加えて、FIT-Igの4価二重特異性抗原結合もまたBiacoreによって分析した。最初に、FIT1-IgをBiacoreセンサーチップ上のヤギ抗ヒトFc抗体を介して捕捉し、第1の抗原を注入し、結合シグナルを観察した。FIT1-Igを第1の抗原によって飽和させ、次いで、第2の抗原を注入し、第2のシグナルを観察した。FIT2-Igでは、これは、最初にIL-17を次いでIL-20を注入すること、または最初にIL-20を続いてIL-17を注入することのいずれかによって行われた（図3）。いずれの配列でも、二重結合活性が検出され、両方の抗原結合とも25〜30 RUで飽和した。同様の結果はFIT2-IgおよびFIT3-Igでも得られた。したがって、各FIT-Igは、二重特異性4価分子として両方の抗原に同時に結合することができた。
【０３６５】
FIT-Igの発現プロファイルおよび二重結合特性は、FIT-Ig分子内で、両方のVL-CLがその対応するVH-CH1と正確に対を形成し、2機能性結合ドメインを形成し、単一の単量体で4価かつ二重特異性の全長FIT-Igタンパク質を発現したことを明確に実証した。これは、4価だが1種の標的抗原への単一特異性結合活性を呈する、多価抗体型の分子（Miller and Presta, 米国特許第8722859号）とは対照的である。
【０３６６】
実施例1.4 抗IL-17/IL-20 FIT-Igの生物活性の決定
IL-17機能を中和するFIT-Igの生物活性を、GROαバイオアッセイを用いて測定した。簡単に説明すると、Hs27細胞を10000細胞/50 μL/ウェルで96ウェルプレート内に播種した。FIT-Igまたは抗IL-17対照抗体（25 μL）を2連のウェルに添加し、濃度を2.5 nMで開始し、続いて5 pMまで1:2で段階希釈した。次いで、IL-17A（25 μL）を各ウェルに添加した。IL-17Aの最終濃度は0.3 nMであった。細胞を37℃にて17時間インキュベートした後に、細胞培養上清を収集した。細胞培養上清中のGRO-αの濃度を、ヒトCACL1/GROアルファQuantikineキットによって製造者によるプロトコール（R&D systems）にしたがって測定した。
【０３６７】
IL-20機能を中和するFIT-Igの生物活性を、IL-20R+ BAF3細胞増殖アッセイを用いて測定した。簡単に説明すると、25 μLの0.8 nM組換えヒトIL-20を96ウェルプレートの各ウェルに添加した（IL-20の最終濃度は0.2 nMである）。抗IL20抗体またはFIT-Igまたは他の対照抗体を400 nMに希釈し（作用濃度は100 nMであった）、続いて5倍の段階希釈を行い、96ウェルアッセイプレートに添加した（1ウェルあたり25 μL）。次いで、IL-20受容体を安定的にトランスフェクトしたBaF3細胞を、10％ FBS、800 μg/mlの濃度でのハイグロマイシンB、800 μg/mlの濃度でのG418を加えた50 μLの体積の RPMI 1640中に10000細胞/ウェルの濃度で各ウェルに添加した。48時間のインキュベーションの後に、100 μL CellTiter-Glo Luminescent緩衝液を各ウェルに加えた。内容物をオービタルシェーカー上で2分間混合して細胞溶解を誘導し、プレートを室温で10分間インキュベートして発光シグナルを安定化させた。発光をSpectraMax M5によって記録した。
【０３６８】
表5に示すように、全てのFIT-Igは、親抗体のものと類似する親和性で、hIL-20およびhIL-17の両方を中和することができた。Biacoreおよび細胞ベースの中和アッセイの両方を用いる機能分析に基づくと、3種のFIT-Igは全て、親mAbの活性を完全に保持するように見える。3種のFIT-Igの間で重大な機能的差異はなく、リンカーが必須ではないこと、およびFIT-Ig構築物が、2つのFab結合領域間のペプチドスペーサーの非存在下での二重結合を可能にするのに十分な柔軟性および特別な寸法を提供することを示唆した。これは、2本のポリペプチド鎖のそれぞれにある2つの可変ドメインの間のリンカーが下側の（第2の）可変ドメインの活性を保持するのに必要とされる、DVD-Ig型の分子と対照的である。
【０３６９】
実施例1.5 抗IL-17/IL-20 FIT-Igの安定性試験
クエン酸緩衝液（pH＝6.0）中のFIT1-Igタンパク質試料を、4℃、25℃および40℃の一定の温度で1日、3日または7日間個別にインキュベートした；同じように、FIT1-Igタンパク質試料を1回、2回または3回凍結融解した。10 μgの各タンパク質試料をSuperdex200 5/150 GLを備えるUtimate 3000 HPLC内に流速0.3 mL/分で15分間注入し、製造者により供給されるChromeleonソフトウェアを用いてデータを記録および分析することによって、全試料のインタクトな完全な単量体タンパク質の画分をSEC-HPLCによって検出した。表6は、FIT1-IgおよびFIT3-Igがこれらの熱負荷した条件下で完全にインタクトな単量体分子のままであったことを示す。
【０３７０】
（表６）SECによって％完全単量体画分を測定することによるFIT-Igの安定性分析
2019514839.tif 000017
【０３７１】
実施例1.6 抗IL-17/IL-20 FIT-Igの溶解性試験
FIT1-Igの溶解性を、増加濃度のPEG6000（PEG6000はShanghai lingfeng chemical reagent co. Ltdから購入した）の存在下で沈殿の徴候を測定することによって分析した。簡単に説明すると、PEG6000の存在下でのタンパク質の溶解性をPEG6000濃度（0、5％、10％、15％、20％、25％および30％）の関数として得た。溶解性試験は、25℃の温度にて6.0の溶解pHで行われた。簡単に説明すると、タンパク質を、適切な量のタンパク質の緩衝化保存液、PEGおよび緩衝液と混合し、所望の濃度の成分を得ることによって沈殿させた。最終体積は最大で200 μlで作製され、タンパク質の濃度は1.0 mg/mLで設定された。最終溶液を十分に混合し、16時間平衡化した。平衡化後、溶液を13000 rpmで10分遠心分離し、タンパク質沈殿物を分離させた。タンパク質溶解性を、Spectra Max Plus384（Molecular Device）を用いて280 nmで測定し、上清の吸光度から得て、タンパク質濃度の標準的曲線に基づき濃度を計算した（図4A）。発明者らはまた、3種の異なるpH条件下で同じ実験方法を用いて市販の抗体リツキサンも分析した（図4B）。タンパク質溶解性はpH条件に左右され、かつFIT-Igの予想溶解性はモノクローナル抗体の範囲内であるように見える。
【０３７２】
実施例1.7 抗IL-17/IL-20 FIT-Igの薬物動態試験
FIT1-Igの薬物動態特性を雄のSprague-Dawley（SD）ラットで評価した。FIT-Igタンパク質を、頸静脈カニューレを介してまたは背面皮膚下の静脈内に5 mg/kgの単回静脈内投与量で雄SDラットに投与した。血清試料を、0、5、15、および30分；1、2、4、8、および24時間；ならびに2、4、7、10、14、21、および28 日で尾静脈を介する連続出血を試料採取することによって28日間にわたって異なる時点で収集し、ヒトIL-17捕捉および/またはヒトIL-20捕捉ELISAによって分析した。簡単に説明すると、ELISAプレートをヤギ抗ビオチン抗体でコーティングし（5 μg/ml、4℃、一晩）、Superblock（Pierce）でブロッキングし、10％Superblock TTBS中で50 ng/mlでのビオチン化ヒトIL-17（IL-17捕捉ELISA）またはIL-20（IL-20捕捉ELISA）と一緒に室温にて2時間インキュベートした。血清試料を段階希釈（TTBS中に0.5％血清、10％ Superblock）し、プレート上で室温にて30分間インキュベートした。検出をHRP標識ヤギ抗ヒト抗体によって行い、4係数ロジスティック適合（four parameter logistic fit）を用いる標準曲線を活用して、濃度を決定した。複数の動物、特に皮下群における動物が、おそらく抗ヒト反応を発症したために、10日目以降にFIT-Ig濃度の急落を示した。これらの動物は最終的な計算から除外した。薬物動態パラメータの値を、WinNonlinソフトウェア（Pharsight Corporation, Mountain View, Calif.）を用いてノンコンパートメントモデルによって決定した。
【０３７３】
ラットPK試験、FIT1-Ig血清中濃度は、2種の異なるELISA法によって決定すると非常に類似しており、分子がインタクトでありかつインビボで両方の抗原に結合する能力を有していたことを示唆した。IV投与すると、FIT1-Igは、一般的なIgG分子のPKプロファイルに類似する、分布相とその後の排出相からなる、二相性の薬物動態プロファイルを呈した。2種の異なる分析方法に基づき計算した薬物動態パラメータは非常に類似しており、表7に示される。FIT-Igのクリアランスは低く（約12 mL/日/kg）、低い分布容積（Vss約130 mL/kg）が長い半減期（T1/2＞10日）をもたらした。皮下投与後、FIT-Igはゆっくり吸収され、投与後4日目でおよそ26.9 μg/mlの最大血清中濃度に到達した。終末相半減期は約11日であり、皮下生物学的利用能は100％に近かった。これらの結果によって実証されるように、FIT1-Igの特性は、インビボでの一般的なIgG分子に非常に類似しており、同等の投与計画を用いる治療応用の可能性を示唆した。
【０３７４】
FIT-Igの薬物動態試験は、多重特異性Ig様生物製剤開発の分野において驚くべき飛躍的進歩を実証した。ラット薬物動態システムは、製薬業界において治療用mAbの前臨床評価のために通常用いられ、ヒトにおけるmAbの薬物動態プロファイルを適切に予測する。FIT-Igの長い半減期および低いクリアランスは、治療用mAbと同様に、投与頻度が低い慢性適応症でのその治療的有用性を可能にする。加えて、FIT-Igは、IgGより100kDa大きく、PK試験からのそのIgG様の分布容積パラメータに基づくと、組織内に効率的に浸透するように思われる。
【０３７５】
（表７）SDラットにおけるFIT1-Igの薬物動態分析
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【０３７６】
実施例1.8 FIT-Igの安定的なCHO細胞株開発試験
FIT-Igは一過性にトランスフェクトした293E細胞において効率的に発現されることが観察されている。FIT-Igの製造実現可能性をさらに判定するために、CHO-DG44細胞株およびCHO-S細胞株の両方で安定なトランスフェクションを実施し、その後のクローン選択ならびに生産性分析を行った。簡単に説明すると、Freedom pCHOベクター（Life Technologies）中にサブクローニングした20 μg DNA（CHO DG44細胞に対して）または25 μg DNA（CHO-S細胞に対して）を加えた400 μlトランスフェクション溶液中に8×106細胞で、CHO細胞を電気穿孔によってトランスフェクトした。安定細胞株の選択を日常的な手法を用いて行った。簡単に説明すると、CHO-DG44選択のために、トランスフェクション時に、安定なプールを選択し（-HT/2P/400G、ここで、Pはμg/mLピューロマイシンであり、Gはμg/mL G418）、タンパク質産生をIgG ELISAによって分析した。最上位のプールを選択し、増加濃度のMTX（50、100、200および500 nM）で複数回増幅を進め、その後IgG ELISAによってタンパク質産生を分析した。次いで、最上位のプールをサブクローニングのために選択した。CHO-S細胞選択のために、10P/400G/100M（M はnM MTX）を含有する培地中で第1相選択を行い、その後タンパク質産生を分析した。次いで、最上位のプールを選択し、30P/400G/500Mまたは50P/400G/1000Mのいずれか中で第2相選択を進め、その後ELISAによってタンパク質産生を測定した。次いで、最上位のプールをサブクローニングのために選択した。タンパク質生産性分析では、完全に回復させた細胞プール（生存率＞90％）を、5×105生細胞/mL（CHO DG44）または3×105生細胞/mL（CHO-S）で30 mLの新鮮な培地（6 mM L-グルタミンを補充したCD FortiCHO（商標）培地）を用いて125-mL振とうフラスコ中に播種した。細胞を、37℃、80％相対湿度、8％ CO2、および130 rpmで振とうプラットフォーム上でインキュベートした。試料を毎日または一定の間隔で（例えば、0、3、5、7、10、12、および14日目に）培養し、培養生存率が50％を下回るかまたは培養が14日目に到達するまで細胞密度、生存率、および生産性を決定した。試料採取後、必要に応じてグルコースを培養物に与えた。
【０３７７】
FIT1-Ig CHO安定細胞株開発の全体工程は、CHO細胞におけるモノクローナル抗体開発の工程と類似する特徴を示した。例えば、2P/400G下でのDG44プール分析の間、VCDは10〜12日まで最大で約1.3E7まで増加し続けたのに対し、細胞生存率は13〜14日まで80％超のままであり、生産性は14日目にほぼ40 mg/mLに達した。5P/400G/50Mでの増幅時に、生産性は14日目に50 mg/mL超に達した。CHO-S細胞選択では、力価は第1段階選択時に200 mg/mLを上回り、第2段階の選択時には370 mg/mLを上回った。これらの生産性のレベルは、発明者らの研究室で通常のヒトmAbについて以前に観察されたものと類似していて、FIT-Igが商業的応用についてmAbのように製造実現可能性を呈することを示唆する。
【０３７８】
実施例2：抗CD3/CD20タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、および精製
FIT-Igが細胞表面抗原に結合できるかどうかを実証するために、発明者らは、図1に示すように、3ポリペプチド構築物である、抗CD3/CD20 FIT-Ig分子 FIT7-IgおよびFIT8-Igを作製した。細胞表面CD3およびCD20に結合する能力を有するFIT-Igを作製するために用いた構築物を図1Bに図示する。簡単に説明すると、親mAbには2種の高親和性抗体、抗CD3（OKT3）および抗CD20（オファツムマブ）が含まれる。FIT7-Ig構築物#1を作製するために、（表8に示すように、）OKT3のVL-CLをオファツムマブ重鎖のN末端に直接的に（FIT7-Ig）または7アミノ酸リンカーのリンカーを介して（FIT8-Ig）融合させた。構築物#2はOKT3のVH-CH1であり、第3の構築物はオファツムマブのVL-CLである。FIT-Igについての3種の構築物を293細胞中にコトランスフェクトし、その結果FIT-Igタンパク質の発現および分泌を生じた。PCRクローニングの詳細な手法を以下に説明する。
【０３７９】
実施例2.1  抗CD3/CD20 FIT-Igの分子クローニング
分子クローニング方法は、抗hIL-17/hIL-20 FIT-Igのものと同様である。
【０３８０】
（表８）抗CD3/CD20 FIT-Ig分子および構築物
2019514839.tif 000019
【０３８１】
表9は上記の分子構築で用いられるPCRプライマーの配列を示す。
【０３８２】
（表９）抗IL-17/IL-20 FIT-Igの分子構築で用いられたPCRプライマー
2019514839.tif 000020
【０３８３】
抗CD3/CD20 FIT-Igの最終配列を表10に記載する。
【０３８４】
（表１０）抗CD3/CD20 FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000021
2019514839.tif 000022
2019514839.tif 000023
【０３８５】
実施例2.2 抗CD3/CD20 FIT-Igの発現および精製
各FIT-Igの全DNA構築物をpBOSベースのベクター内にサブクローニングし、正確性を確実にするために配列決定した。各FIT-Igの構築物#1、#2、および#3を293E細胞においてポリエチレンイミン（PEI）を用いて一過性に共発現させた。簡単に説明すると、FreeStyle（商標）293発現培地中のDNAを1:2のDNA対PEI比の最終濃度でPEIと混合し、室温で15分間（20分を超えない）インキュベートし、次いで、60 μg DNA/120 ml培養物で293E細胞（1.0〜1.2×106/ml、細胞生存率＞95％）に加えた。振とう機で6〜24時間培養した後、トランスフェクトした細胞に5％の最終濃度でペプトンを添加し、37℃、8％ CO2にて125 rpm/分で振とうした。6〜7日目に、遠心分離およびろ過によって上清を回収し、FIT-Igタンパク質を、プロテインAクロマトグラフィ（Pierce, Rockford, IL）を用いて製造者による説明書にしたがって精製した。タンパク質をSDS-PAGEによって分析し、その濃度をA280およびBCA（Pierce, Rockford, IL）によって決定した（表11）。
【０３８６】
（表１１）抗CD3/CD20 FIT-Igタンパク質の発現およびSEC分析
2019514839.tif 000024
【０３８７】
実施例2.3 抗CD3/CD20 FIT-Ig分子の結合活性
抗CD3/CD20 FIT-Igの両方の標的への結合を、細胞表面上にCD3を発現するJurkat細胞ならびに細胞表面上にCD20を発現するRaji細胞を用いて、FACSによって分析した。簡単に説明すると、氷冷したPBSで5×105細胞を洗浄し、氷上で1時間2％ FBSによってブロッキングした。細胞を抗体、FIT-Ig（100 nM）、またはアイソタイプ対照と共に氷上で1時間インキュベートし、PBSで3回洗浄した。二次抗体（Alexa Fluor 488で標識したヤギ抗ヒトIgG、Invitrogen）を添加し、細胞と共に氷上で1時間暗中でインキュベートし、その後、PBSで3回洗浄した。試料をFAC caliburで分析した。細胞表面結合は、FIT7-IgおよびFIT8-Igどちらも細胞表面抗原CD3およびCD20の両方に濃度依存的に結合することができたことを示す。親mAbの結合活性と比較して、FIT-IgはJurkat細胞上のCD3への結合強度の低下を示したが、Raji細胞上のCD20への結合強度は増強した。全ての結合試験において、FIT7-IgおよびFIT8-Igは、両方の抗原に対して類似の結合活性を示し、リンカーがFIT8-Igについてその結合活性に重大な影響を与えなかったことを示唆した（表12）。
【０３８８】
（表１２）抗CD3/CD20 FIT-Igタンパク質の細胞表面抗原結合試験
2019514839.tif 000025
【０３８９】
実施例3：抗TNF/IL-17タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、および精製
ヒトIL-17およびヒトTNFαに結合できる別のFIT-Ig（FIT9-Ig）もまた、抗IL-17 mAbクローンLY、および抗TNF mAbゴリムマブを用いて、図1に示すように、3ポリペプチド構築物で作製した。FIT9-Ig構築物#1を作製するために、（表13に示すように）ゴリムマブのVL-CLをLY重鎖のN末端に直接的に融合した。構築物#2はゴリムマブのVH-CH1であり、第3の構築物はLYのVL-CLである。FIT9-Ig用の3種の構築物を293細胞中にコトランスフェクトし、その結果FIT9-Igタンパク質の発現および分泌を生じた。抗TNF/IL-17 FIT-Igの最終配列を表14に記載する。
【０３９０】
実施例3.1 抗TNF/IL-17 FIT-Igの分子クローニング
分子クローニング方法は抗hIL-17/hIL-20 FIT-Igのものと同様である。
【０３９１】
（表１３）抗TNF/IL-17 FIT-Ig分子および構築物
2019514839.tif 000026
【０３９２】
（表１４）抗TNF/IL-17 FIT-Ig分子のアミノ酸配列
2019514839.tif 000027
2019514839.tif 000028
【０３９３】
実施例3.2 抗TNF/IL-17 FIT-Igタンパク質の発現、精製、および分析
各FIT-Igの全DNA構築物をpBOSベースのベクター内にサブクローニングし、正確性を確実にするために配列決定した。FIT9-Igの構築物#1、#2、および#3を、前に記載したように、293E細胞においてポリエチレンイミン（PEI）を用いて一過性に共発現させ、FIT9-Igタンパク質をプロテインAクロマトグラフィによって精製した。発現レベルは10〜23 mg/Lであった。精製したタンパク質を、IL-17（Hs27細胞によるGROαの産生）およびTNF（L929細胞によるIL-8の産生）について細胞ベースのアッセイを用いる機能分析に供した。ヒトTNFに対するFIT9-Igの中和能は（同じ実験でのゴリムマブによる15.9 pMと比較して）11.6 pMであり、ヒトIL-17に対しては（同じ実験でのLYによる51.5 pMと比較して）122 pMであった。全体的にFIT9-Igは親mAbの生物活性を維持した。
【０３９４】
実施例4：抗CTLA-4/PD-1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、および精製
ヒトCTLA-4およびヒトPD-1に結合できる別のFIT-Ig（FIT10-Ig）もまた、抗CTLA-4 mAbイピリムマブ、および抗PD-1 mAbニボルマブを用いて、図1に示すように、3ポリペプチド構築物で作製した。FIT10-Ig構築物#1を作製するために、（表15に示すように）イピリムマブのVL-CLをニボルマブ重鎖のN末端に直接的に融合した。構築物#2はイピリムマブのVH-CH1であり、第3の構築物はニボルマブのVL-CLである。FIT10-Ig用の3種の構築物を293細胞中にコトランスフェクトし、その結果FIT10-Igタンパク質の発現および分泌を生じた。
【０３９５】
実施例4.1 抗CTLA-4/PD-1 FIT-Igの分子クローニング
分子クローニング方法は抗hIL-17/hIL-20 FIT-Igのものと同様である。抗 CTLA-4/PD-1 FIT-Igの最終配列を表16に記載する。
【０３９６】
（表１５）抗CTLA-4/PD-1 FIT-Ig分子および構築物
2019514839.tif 000029
【０３９７】
（表１６）抗CTLA-4/PD-1 FIT-Ig分子のアミノ酸配列
2019514839.tif 000030
【０３９８】
実施例4.2 抗CTLA-4/PD-1 FIT-Igタンパク質の発現、精製、および機能分析
各FIT-Igの全DNA構築物をpBOSベースのベクター内にサブクローニングし、正確性を確実にするために配列決定した。FIT10-Igの構築物#1、#2、および#3を、前に記載したように、293E細胞においてポリエチレンイミン（PEI）を用いて一過性に共発現させ、FIT9-Igタンパク質をプロテインAクロマトグラフィによって98％の完全な単量体タンパク質に精製した。発現レベルは最大で43 mg/Lであった。精製したタンパク質を組換えCTLA-4IgおよびPD-1に対するELISAを用いる結合分析に供した。簡単に説明すると、CTLA-4への結合について、ヒトCTLA-4Ig（R&D Systems）を96ウェルプレート上に固定化し、続いて通常の洗浄およびブロッキング手法を行った。次いで、FIT-10-Igまたはイピリムマブを様々な濃度でプレートに添加し、続いてインキュベーションおよび複数回の洗浄工程を行い、抗ヒトFab-HRPで検出した。PD-1への結合について、ヒトPD-1（hisタグを有する）（R&D Systems）を96ウェル上に固定化し、続いて通常の洗浄およびブロッキング手法を行った。次いで、FIT10-Igまたはニボルマブを様々な濃度でプレートに添加し、続いてインキュベーションおよび複数回の洗浄工程を行い、抗ヒトFc-HRPで検出した（図5）。FIT10-Igは、親mAbイピリムマブおよびニボルマブそれぞれに類似する活性でCTLA-4（A）およびPD-1（B）の両方に結合できたように見える。
【０３９９】
加えて、複数抗原結合試験をOctetRedを用いて行い、FIT10-Igが組換えCTLA-4およびPD-1に同時に結合できたかどうかを決定した。簡単に説明すると、FIT10-IgをAR2Gセンサー上に10 μg/mlの濃度で固定化し、続いて、アッセイ緩衝液（PBS pH 7.4、0.1％ BSA、0.02％ Tween）中で80 nMの濃度でCTLA-4Igを次にPD-1（または最初にPD-1、次にCTLA-4Ig）を結合させた。実験の最後に、表面をpH 1.5の10 mM グリシン5回によって再生した（図6）。この実験は、FIT10-Igが、既にCTLA-4に結合している場合にもPD-1に結合できたこと、および逆の場合も同様であったことを示し、FIT10-IgがCTLA-4IgおよびPD-1の両方に同時に結合できたことを示唆する。
【０４００】
実施例5：さらなるタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、および精製
EGFRおよびPD-L1；cMetおよびEGFR；第IXa因子および第X因子；Her3およびIGF-1R；DLL-4およびVEGF；CD20およびCD3；Her3およびEGFR；PD-1およびPD-L1；ならびにHer3およびPD-1に対して特異性を有するFIT-Igを、前述の実施例のように構築した。これらの例示的FIT-Igおよびそれらの対応する配列を以下の表17に提供する。表18は、FIT-Igのそれぞれについての293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４０１】
（表１７）さらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000031
2019514839.tif 000032
2019514839.tif 000033
2019514839.tif 000034
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【０４０２】
（表１８）FIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイル
2019514839.tif 000036
【０４０３】
表17および18のFIT-IgそれぞれのSECプロファイルは図7A〜図7Iにも提供される。
【０４０４】
FIT13a-Igの機能的結合データを以下の表19に提供する。加えて、複数抗原結合試験を行い、FIT13a-IgがcMetおよびEGFRに結合できたかどうかを決定した。試験の結果は図8に示され、FIT13a-IgがcMetおよびEGFRの両方に同時に結合できたことを示す。
【０４０５】
（表１９）FIT13a-Igの機能的結合データ
2019514839.tif 000037
【０４０６】
FIT14-Igの第IXa因子結合活性の機能的結合データを以下の表20に提供する。
【０４０７】
（表２０）FIT14-Igの機能的結合データ
2019514839.tif 000038
【０４０８】
試験の結果は、さらなるFIT-Igを構築、発現、および精製できること、および該FIT-Igが標的タンパク質への機能的結合を呈するであろうことを示す。
【０４０９】
実施例6：新たな抗CTLA-4/PD-1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現および精製
CTLA4およびPD1に特異性を有する新たなFIT-Igを前述の実施例のように構築した。これらの例示的FIT-Igおよびそれらの対応する配列を以下の表21に提供する。表21は、FIT-Igのそれぞれについての293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４１０】
（表２１）CTLA4およびPD1に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000039
2019514839.tif 000040
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2019514839.tif 000042
2019514839.tif 000043
【０４１１】
長鎖および短鎖はリーダー配列を含み、該リーダー配列は、
2019514839.tif 000044
のいずれかであり得る。
【０４１２】
（表２２）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000045
【０４１３】
発現レベルを、NBS3を除いて、いかなる最適化も行わずに小規模生産で評価した。全SEC試料は1段階プロテインA精製下であった。IgG1およびIgG4どちらの形式でのFIT-Igも、293細胞から均一タンパク質として産生することができる。
【０４１４】
機能試験
これらの抗体の機能的結合データを以下の表23に提供する。データにより、親和性はIgG定常配列を変更することによって影響を受けなかったが、上側ドメインにある特定のFabを配置することによって改善され得ることが示唆される。
【０４１５】
（表２３）機能的結合データ
2019514839.tif 000046
【０４１６】
ELISA結合試験：NBS3RのELISA結合を試験した。簡単に説明すると、CTLA-4への結合について、ヒトCTLA-4Ig（R&D Systems）を96ウェルプレート上に固定化し、続いて、通常の洗浄およびブロッキング手法を行った。次いで、FIT-Igまたは関連するモノクローナル抗体を様々な濃度でプレートに添加し、続いてインキュベーションおよび複数回の洗浄工程を行い、抗ヒトFab-HRPで検出した。PD-1への結合について、ヒトPD-1（hisタグあり）（R&D Systems）を96ウェルプレート上に固定化し、続いて通常の洗浄およびブロッキング手法を行った。次いで、NBS3Rまたはニボルマブを様々な濃度でプレートに添加し、続いてインキュベーションおよび複数回の洗浄工程を行い、抗ヒトFc-HRPで検出した。NBS3RはCTLA-4（A）およびPD-1（B）の両方にそれぞれ結合できるように見える。結果を図9Aおよび図9Bに示す。
【０４１７】
多重結合試験：NBS3の多重結合試験も実施した。結果を図10に示す。
【０４１８】
熱安定性試験：これらの抗体に対する熱安定性試験も行った、その結果を表24に示す。融解温度をDSCによって測定した。
【０４１９】
（表２４）熱安定性試験
2019514839.tif 000047
【０４２０】
保存安定性試験：NBS3の保存安定性をSEC-HPLC法によって評価し、結果を表25に示す。試料を、1回、2回または3回の凍結/融解サイクルによって処理し、凝集または分解がないことがSEC-HPLCプロファイルによって観察された。試料を4℃、25℃または40℃で1日、3日間または7日間処理し、凝集または分解がないことがSEC-HPLCプロファイルによって観察された。
【０４２１】
（表２５）NBS3の保存安定性
2019514839.tif 000048
【０４２２】
NBS3をラットPK試験でさらに試験し、結果を図11Aおよび図11Bに示す。この試験の目的は、SDラットにおける単回の静脈内（IV）または皮下（SC）投与後のNBS3の薬物動態を評価することであった。IV用量は足背部静脈注射を介して投与され、SC用量は皮下注射を介して投与された。指定された時点で、動物を手で拘束し、およそ240 μL血液/時点を尾静脈穿刺または心穿刺を介してチューブ内に収集した。血液試料を室温にて0.5時間静置した。血液試料を遠心分離（4℃で10000 g、5分）し、血清試料を得た。血液試料を直ちに−80℃で分析まで保存した。試料を投与溶液と一緒にELISAによって分析した。測定した投与濃度はPKパラメータ計算のために用いた。
【０４２３】
NBS3、NBS3-C、およびNBS3R-Cを細胞ベースの受容体ブロッキングアッセイで試験した。簡単に説明すると、PD1-Fcを96ウェルプレート上に固定化し、続いて通常の洗浄およびブロッキング法を行った。次いで、希釈したFIT-Igおよびビオチン化PD-L1-Fcを各ウェルに添加し、続いてインキュベーションおよび複数回の洗浄工程を行い、ストレプトアビジン-HRPで検出した。結果を図12に示す。
【０４２４】
NBS3、NBS3-C、およびNBS3R-Cをそれらの機能活性についてMLR（混合リンパ球反応）アッセイおよびPBMC SEB刺激アッセイでさらに試験した。
【０４２５】
MLRアッセイでは、1人のドナー由来の単球由来樹状細胞および別のドナー由来の同種異系CD4 T細胞を用いて、混合リンパ球反応を実施した。全血試料を健常なドナーから収集し、Ficoll-Pague勾配遠心分離を用いて、PBMCを全血から単離した。1日目に、1人のドナー由来のPBMCを単離し、無血清RPMI 1640によって1×106/mlで希釈した。希釈したPBMCを6ウェル組織培養プレート内に3 ml/ウェルで播種し、3時間インキュベートした。上清を除去し、未結合細胞を洗い落とした。付着した単球を、10％FBSを含むRPMI1640中で250 U/ml IL-4および500 U/ml GM-CSFによって樹状細胞に極性化させた。培地を4日目に新鮮なIL-4およびGM-CSFと交換した。7日目に、未成熟DCを収集し、成熟させるために10％FBSを含むRPMI 1640中で1 μg/ml LPSによってさらに24時間処理した。8日目に、CD4 T細胞をネガティブ選択によって別のドナーのPBMCから単離し、2×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。成熟DCをマイトマイシンCで37℃にて1.5時間処理した。次いで、DCをPBSで洗浄し、1×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。CD4 T細胞（レスポンダー細胞）を96ウェルプレート内に100 μl/ウェルで添加し、希釈濃度での試験抗体によって30分間予処理した。次いで、成熟DC（刺激細胞）をウェル内に100 μl/ウェルで添加した。各ウェルの最終体積は200 μlである。MLRを、37℃にて、ELSAを用いるIL-2試験のために72時間、IFN-γ試験のために120時間、それぞれインキュベートした。結果を図13Aおよび図13Bに示す。
【０４２６】
PBMC SEB刺激アッセイでは、PBMCを健常なドナー血液からFicoll-Pague勾配遠心分離によって単離した。単離したPBMCを1×105細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレート内に播種した。次いで、希釈した試験抗体でPBMCを30分間予処理した。ブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）を細胞培養培地内に100 ng/mlでの最終濃度で添加した。最終アッセイ体積は200 μl/ウェルであった。細胞を96時間培養し、培養上清を収集した。上清中のIL-2サイトカイン産生をELISAによって検出した。結果を図14に示す。
【０４２７】
実施例7：さらなる抗EGFR/PD-L1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、および精製
EGFRおよびPD-L1に特異性を有する新たなFIT-Igを前述の実施例のように構築した。これらの例示的FIT-Igおよびそれらの対応する配列を以下の表26に提供する。表27は、FIT-Igのそれぞれについての293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４２８】
（表２６）EGFRおよびPD-L1に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000049
2019514839.tif 000050
2019514839.tif 000051
【０４２９】
（表２７）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000052
【０４３０】
SECプロファイルおよび発現データにより、FIT012dは、PD-L1抗体配列を変更することによってFIT012bより優れた純度を示したことが示唆される。
【０４３１】
これらの2種の抗体の機能的結合データを以下の表28および表29に提供する。データにより、親和性はIgG定常配列を変更することによっては影響を受けなかったが、上側ドメイン中にある特定のFabを配置することによって改善できることが示唆される。
【０４３２】
（表２８）FIT012bの機能的結合データ
2019514839.tif 000053
【０４３３】
（表２９）FIT012dの機能的結合データ
2019514839.tif 000054
【０４３４】
FIT012bおよびFIT012dの多重結合試験も実施した。結果を表15（FIT012b）および図16Aから図16B（FIT012d）に示す。
【０４３５】
実施例8：抗cMet/EGFRタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の構築、発現、および精製
cMetおよびEGFRに特異性を有する新たなFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表30に提供する。表31は、FIT-Igのそれぞれについての293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４３６】
（表３０）cMetおよびEGFRに対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000055
2019514839.tif 000056
【０４３７】
（表３１）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000057
【０４３８】
安定性データ
FIT013aの保存安定性をSEC-HPLC法によって評価し、結果を表32に示す。試料を1回、2回または3回の凍結/融解サイクルによって処理し、凝集または分解がないことがSEC-HPLCプロファイルによって観察された。試料を4℃、25℃または40℃で1日、3日間または7日間処理し、凝集または分解がないことがSEC-HPLCプロファイルによって観察された。
【０４３９】
（表３２）FIT013aの保存安定性
2019514839.tif 000058
【０４４０】
機能試験：FIT013aのタンパク質ベースの結合データを以下の表33および表34に提供する。
【０４４１】
（表３３）FIT013aの機能的結合データ（ヒトcMet/ヒトEGFR）
2019514839.tif 000059
【０４４２】
（表３４）FIT013aの機能的結合データ（カニクイザルcMEt/カニクイザルEGFR）
2019514839.tif 000060
【０４４３】
FIT013aの多重結合試験も実施した。結果を図17に示す。
【０４４４】
さらに、がん細胞株におけるFIT013aの結合活性を、BD FACSVerseを用いるフローサイトメトリーによって決定した。培養中で増殖させた細胞をトリプシンフリーの培地によってフラスコから剥離させ、収集した。収集した細胞を、2％ FBSを含有するPBS緩衝液で洗浄した。次いで、細胞を等分し、1:5で連続的に希釈したFIT013aと一緒に氷上で1時間インキュベートした。FTI013aの出発作用濃度は20 μg/mlであった。細胞を洗浄し、再懸濁し、1:100に希釈したAlexa Fluor（登録商標）488標識マウス抗ヒトIgG1（Invitrogen, Cat.No.A-10631）と共に光から保護された氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、BD FACSVerseフローサイトメトリーによって製造者によるプロトコールにしたがって、シグナルを検出した。
【０４４５】
これらの実験は、FIT013aが、NCI-H1993、HCC827、MKN-45、SGC-7901、EBC-1、A549、KP4、NCI-H292、NCI-H1975などのような多数のがん細胞株に結合できることを実証する。各細胞株についての幾何平均蛍光強度（MFI）およびEC50を表35に列記する。
【０４４６】
（表３５）FIT013aの細胞ベースの結合データ
2019514839.tif 000061
【０４４７】
加えて、FACSアッセイを実行し、膜c-MetおよびEGFRへのFIT013aの二重結合を測定し、その多重結合活性を示した。
【０４４８】
複数の細胞株をこのアッセイで用いた。MKN-45（ヒト胃腺がん細胞）は高レベルのc-Metおよび低レベルのEGFRを発現した。SGC-7901（ヒト胃がん）は高レベルのEGFRおよび低レベルのc-Metを発現した。NCI-H1975（ヒト非小細胞肺がん）は同レベルのc-MetおよびEGFRを発現した。
【０４４９】
培養中で増殖させた細胞をトリプシンフリーの培地によってフラスコから剥離させ、収集した。収集した細胞を2％FBSを含有するPBS緩衝液で洗浄した。細胞を等分し、連続的に希釈したFIT013aまたはFIT013a-Fabと共に氷上で1時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、1 μg/mlビオチン化ヒトc-METまたはビオチン化EGFRと共に氷上で1時間インキュベートした。細胞を再懸濁し、4 μg/ml Alexa Fluor（登録商標）488標識ストレプトアビジン（Invitrogen, Cat.No S32354）と共に光から保護された氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、BD FACSVerseフローサイトメトリーによって製造者のプロトコールにしたがって、シグナルを検出した。
【０４５０】
c-Metの細胞膜発現レベルがEGFRよりはるかに高い場合（例えば、MKN-45細胞上）、FIT013aおよびFIT013a-Fabのc-Met結合部位は膜c-Metによって占有され、FIT013aおよびFIT013a-FabのフリーのEGFR結合部位がビオチン化EGFRによって検出される。EGFRの細胞膜発現レベルがc-Metよりはるかに高い場合（例えば、SGC-7901上）、FIT013aおよびFIT013a-FabのEFGR結合部位は膜EGFRによって占有され、FIT013aおよびFIT013a-Fabのフリーのc-Met結合部位がビオチン化c-Metによって検出される。c-Metの膜発現レベルがEGFRと等しい場合（例えば、NCI-H1975細胞上）、FIT013aおよびFIT013a-Fabのc-MetおよびEGFR結合部位は同時に占有され、FIT013aおよびFIT013a-FabのフリーのEGFRまたはc-Met結合部位は検出されない。図18Aおよび図18Cで実証するように、FIT013aおよびFIT013a-Fabは細胞表面上の2種の受容体、c-MetおよびEGFRに同時に結合することができる。
【０４５１】
シグナル伝達アッセイ：次に、FIT013aを使用して、細胞においてHGF誘導性AKTリン酸化を阻害した。NCI-H292細胞を96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり2×105個でプレーティングし、一晩血清飢餓させた。連続希釈したFIT013aまたは他の関連Abをプレートに加え、30分間インキュベートし、次いで、40 ng/ml HGFをアッセイプレートに5分間加えた。細胞を溶解し、AKTリン酸化をERKホスホT202/Y204キット（Cisbio, Cat: 64AKSPEG）によって検出した。実験は、FIT013aが、NCI-H292細胞におけるHGF誘導性AKTリン酸化の中和においてmAb組み合わせより優れた活性を示すことを実証した。FIT013aはAKTリン酸化の80％を阻害した一方で、EGFRおよびc-Met抗体組み合わせはAKTリン酸化の60％を阻害する。図19を参照されたい。
【０４５２】
アゴニストアッセイ：FIT013aにおけるc-Met、EGFR抗体のアゴニスト作用をAKTリン酸化によって試験した。NCI-H441細胞を96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり2×105個でプレーティングし、一晩血清飢餓させた。連続的に希釈したFIT013aまたは他の関連Abをプレートに添加し、30分間インキュベートした。細胞を溶解し、AKTリン酸化をERKホスホ-T202/Y204キット（Cisbio, Cat: 64AKSPEG）によって検出した。図20に示すように、実験は、FIT013aがHGFの非存在下で弱いアゴニスト作用を示したことを実証する。
【０４５３】
受容体除去試験：FIT013aを試験して、FIT013aが細胞膜上のc-MetおよびEGFRの両方を除去できるかどうか調べた。c-Met抗体、EGFR抗体およびFIT013aをH441細胞と共に37℃にて16時間超インキュベートし、次いで、細胞表面に残っているEGFRおよびc-MetをFACSによって検出した。結果は、FIT013aは、細胞膜c-MetおよびEGFRの70％近くを除去でき、c-Met抗体またはEGFR抗体より高かったことを示す、表36を参照されたい。
【０４５４】
（表３６）FIT013aによる受容体除去
2019514839.tif 000062
【０４５５】
ラットPK試験：この試験の目的は、SDラットに投与された単回の静注（IV）または皮下（SC）投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の薬物動態を評価することであった。IVおよびSC投与のために、試験物質FIT013a（c-met/EGFR）を（10 mMクエン酸ナトリウム、50 mM NaCl、pH 6.0で）2.3 mg/mLで溶解した（ロット：160408001）。Qualification No.：SCXK（SH）2008001659659でSLAC Laboratory Animal Co. LTD.から購入した、およそ195〜208 gの体重の合計8匹の雄SDラットをこの試験で用いた。投与および試料採取を表37として計画される。
【０４５６】
（表３７）投与および試料採取の計画
2019514839.tif 000063
【０４５７】
IV用量を足の背部静脈注射を介して投与し、SC用量を皮下注射を介して投与した。指定した時点で、動物を手で拘束し、およそ240 μL血液/時点を尾静脈穿刺または心穿刺を介してチューブ内に収集した。血液試料を室温で0.5時間静置した。血液試料を遠心し（4℃下で10000 g、5分）、血清試料を得た。血液試料を直ちに−80℃で分析まで保存した。試料を、それぞれc-MetおよびEGFRタンパク質を用いるELISAによって検出した。IVおよびSC試験のラット血清におけるFIT013a（c-met/EGFR）の濃度-時間データを表38から表41に列記し、図21Aから図21Dに図示する。
【０４５８】
（表３８）雄SDラットにおける5 mg/kgでのIV投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の血清中濃度-時間データおよび薬物動態パラメータ（c-metプレート）
2019514839.tif 000064
【０４５９】
（表３９）雄SDラットにおける5 mg/kgのSC投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の血清中濃度-時間データおよび薬物動態パラメータ（c-metプレート）
2019514839.tif 000065
＊：抗薬物抗体の可能性のために、これらの時点の血清中濃度は平均値およびPKパラメータ計算から除外される。
【０４６０】
（表４０）雄SDラットにおける5 mg/kgでのIV投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の血清中濃度-時間データおよび薬物動態パラメータ（EGFRプレート）
2019514839.tif 000066
【０４６１】
（表４１）雄SDラットにおける5 mg/kgでのSC投与後のFIT013a（c-met/EGFR）の血清中濃度-時間データおよび薬物動態パラメータ（EGFRプレート）
2019514839.tif 000067
＊：抗薬物抗体の可能性のために、これらの時点の血清中濃度は平均値およびPKパラメータ計算から除外される。
【０４６２】
NCI-H1975-HGF異種移植モデル腫瘍分布試験
この試験では、FIT013aの血清中濃度および腫瘍濃度を、NCI-H1975-HGF腫瘍を有するヌードBALB/cマウスにおいて単回IP投与後24時間測定した。
【０４６３】
NCI-H1975-HGF細胞をヌードBALB/cマウスに皮下接種した。平均腫瘍体積が200〜250 mm3に到達したとき、マウスを4群：FIT013a群、H1332群、パニツムマブ群および媒体群に無作為に割り当てた。FIT013a群は、単回IP投与、16 mg/kgであり；H1332またはパニツムマブは単回IP投与、10 mg/kgであった。媒体群は、製剤緩衝液10 mMクエン酸ナトリウム、50 mM NaCl、pH 6.0によって投与された。投与後24時間で、腫瘍および血清を収集した。腫瘍をホモジナイズし、上清をその後のELISA試験用に収集した。FIT013a、パニツムマブ、およびH1332を血清および腫瘍の両方について一般的なhIgG ELISA法を用いることによって定量化した。
【０４６４】
実験は、FIT013aが血清および腫瘍においてモノクローナル抗体に匹敵する分布活性を示したことを実証する。図22を参照されたい。
【０４６５】
NCI-H1975-HGF異種移植モデル有効性試験
この試験では、FIT013aの有効性をNCI-H1975-HGF異種移植モデルにおいて測定した。
【０４６６】
NCI-H1975-HGF細胞をヌードBALB/cマウスに皮下接種した。平均腫瘍体積が100〜130 mm3に到達したとき、最大の腫瘍体積は140 mm3未満であった。マウスを4群：FIT013a群、H1332群、パニツムマブ群および媒体群に無作為に割り当てた。抗体を2回/週i.p.で3週間投与した。FIT013aの投与は16 mg/kgであり、H1332またはパニツムマブでは10 mg/kgであった。媒体群は製剤緩衝液、10 mMクエン酸ナトリウム、50 mM NaCl、pH 6.0を投与された。腫瘍体積およびマウス体重を2回/週測定した。パーセンテージ腫瘍成長阻害（％ TGI）を対照処置群の平均腫瘍体積（MTV）と試験抗体処置群MTVとの間の差として定義した。
【０４６７】
実験は、FIT013aがEGFRまたはc-MetモノクローナルAbより優れた有効性を示したことを実証する。図23を参照されたい。
【０４６８】
実施例9：抗第IXa因子/第X因子タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
第IXa因子および第X因子に特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表42に提供する。表43は、FIT-Igそれぞれについての293E細胞における発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４６９】
（表４２）cMEtおよびEGFRに対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000068
2019514839.tif 000069
【０４７０】
（表４３）SECプロファイル/293E細胞における発現レベル
2019514839.tif 000070
【０４７１】
機能試験
表面プラズモン共鳴による親和性測定：h第IX因子およびh第X因子（Enzyme Research Laboratory）へのFIT-Ig結合のキネティクスを、25℃にてHBS-EP（10 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、および0.005％界面活性剤P20）を用いるBiacore X100装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）による表面プラズモン共鳴によって決定した。簡単に説明すると、ヤギ抗ヒトIgG Fc断片特異的ポリクローナル抗体（Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL）を、標準的なアミンカップリングキットを用いて製造者の説明書にしたがって、CM5研究グレードバイオセンサーチップ全域に直接的に固定化した。精製したFIT-Ig試料を、ヤギ抗ヒトIgG Fc 特異的反応表面全体にわたる捕捉のためにHEPES緩衝化食塩水で希釈し、5 μl/分の流速で反応マトリクスに注入した。会合および解離速度定数、kon（M-1s-1）およびkoff（s-1）を30 μL/分の連続流速下で決定した。速度定数を、500 nM抗原濃度で動的結合測定を行うことによって得た。次いで、FIT-Igと標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数（M）を、以下の式：KD＝koff/konによって動的速度定数から計算した。抗原試料のアリコートもまたブランク参照および反応CM表面に同時に注入し、任意の非特異的結合バックグラウンドを記録し差し引き、屈折率変化および注入ノイズの大部分を除去した。表面を、10 μL/分の流速での10 mMグリシン（pH 1.5）の2回の連続する25 ml注入で再生した。抗Fc抗体を固定化した表面は完全に再生され、12サイクルにわたってその最大限の捕捉能力を保持した。FIT014aのタンパク質ベースの結合データを以下の表44に提供する。
【０４７２】
（表４４）FIT014の機能的結合データ
2019514839.tif 000071
【０４７３】
第VIIIa因子様活性アッセイ：FIT-IgのFVIIIa様活性を、BIOPHEN FVIII:Cキット(Hyphen-Biomed, 221402-RUO）の製造者の説明書にしたがって酵素アッセイによって評価した。結果は、FIT014aが、エミシズマブおよび精製したFVIIIaに匹敵するFVIIIa様活性を有する一方で、第IX因子および第X因子のモノクローナル抗体、ならびにそれらの組み合わせは活性を有さないことを示す。図24を参照されたい。
【０４７４】
複数抗原結合試験：この試験はOctetRedを用いて行われ、FIT014aがh第IX因子およびh第X因子に同時に結合できるかどうかを決定した。簡単に説明すると、FIT014aを10 μg/mlの濃度でAR2Gセンサー上に固定化し、続いて、500 nMでの濃度で、アッセイ緩衝液（PBS pH 7.4、0.1％ BSA、0.02％ Tween）中でh第IX因子次いでh第X因子（Enzyme Research Laboratory）に結合させた。実験の最後に、表面を5回のpH 1.5での10 mM グリシンによって再生させた。この実験は、FIT014aが既にh第IX因子に結合しているときに、FIT014aがh第X因子に結合できることを示し、FIT014aがh第IX因子およびh第X因子の両方に同時に結合できることを示唆する。図25を参照されたい。
【０４７５】
安定性試験：クエン酸緩衝液（pH＝6.0）中のFIT014aタンパク質試料を4℃、25℃および40℃の一定の温度で、1日、3日または7日間個別にインキュベートした。同様に、FIT014aタンパク質試料を、1回、2回または3回凍結融解した。全試料のインタクトな完全な単量体タンパク質の画分を、10 μgの各タンパク質試料をSuperdex200 5/150 GLを備えたUtimate 3000 HPLC内に流速0.3 mL/分で15分間注入する、SEC-HPLCによって検出し、製造者によって供給されたChromeleonソフトウェアを用いて、データを記録および分析した。表45は、FIT014aはこれらの熱負荷した条件下で完全なインタクトな単量体分子のままであったことを示す。
【０４７６】
（表４５）FIT014の保存安定性
2019514839.tif 000072
【０４７７】
ラットPK試験：FIT014aをラットでのPK試験に供し、結果を図26および表46に示す。ラット血清試料中の抗体濃度を62.5 ng/mLのLLOQを用いるELISAによって検出した。hIgGプレート上では、コーティングタンパク質は抗hIgG Fcであり、検出抗体は抗hIgG Fabである。第X因子プレート上では、コーティングタンパク質はh第X因子であり、検出抗体は抗ヒトIgG Fcである。
【０４７８】
（表４６）FIT014aのラットPKデータ
2019514839.tif 000073
【０４７９】
実施例10：抗HER3/IGF-1Rタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
HER3およびIGF-1Rに対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表47に提供する。表48はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４８０】
（表４７）HER3およびIGF-1Rに対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000074
2019514839.tif 000075
【０４８１】
（表４８）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000076
【０４８２】
機能試験
機能的結合試験：FIT016aの機能的結合データを以下の表49に提供する。
【０４８３】
（表４９）機能的結合データ
2019514839.tif 000077
【０４８４】
複数抗原結合試験：この試験はOctetRedを用いて行われ、FIT016aがHer3およびIGF1Rに同時に結合できるかどうかを決定した。この実験は、FIT016aが既にIGF1Rに結合しているときに、FIT016aがHer3に結合できることを示し、FIT016aがHer3およびIGF-1Rの両方に同時に結合できることを示唆する。図27を参照されたい。
【０４８５】
実施例11：抗DLL4/VEGFタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
DLL4およびIGF1Rに対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表50に提供する。表51はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４８６】
（表５０）HER3およびIGF-IRのさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000078
2019514839.tif 000079
【０４８７】
（表５１）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000080
【０４８８】
機能試験
機能的結合試験：FIT017aの機能的結合データを以下の表52に提供する。
【０４８９】
（表５２）機能的結合データ
2019514839.tif 000081
【０４９０】
複数抗原結合試験：この試験はOctetRedを用いて行われ、FIT017aがDLL4およびVEGFに同時に結合できるかどうかを決定した。この実験は、FIT017aが既にVEGFに結合しているときに、FIT017aがDLL4に結合できることを示し、FIT017aがDLL4およびVEGFの両方に同時に結合できることを示唆する。図28を参照されたい。
【０４９１】
実施例12：抗CD20/CD3タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
CD20およびCD3に対して特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表53に提供する。表54は、FIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４９２】
（表５３）CD20およびCD3に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000082
2019514839.tif 000083
【０４９３】
（表５４）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000084
【０４９４】
機能試験
機能的結合試験：FIT018aの機能的結合データを以下の表55に提供する。
【０４９５】
（表５５）機能的結合データ
2019514839.tif 000085
【０４９６】
細胞ベースの結合試験：ヒトまたはカニクイザルのB細胞およびT細胞に対するFIT018aの結合活性を、BD FACSVerseを用いるフローサイトメトリーによって決定した。ヒトB細胞結合を検出するためにRaji細胞を用いた。ヒトT細胞結合を検出するためにJurakt細胞を用いた。カニクイザルT細胞結合を検出するために初代カニクイザルT細胞を用いた。カニクイザルB細胞結合を検出するためにcynoCD20で一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞を用いた。細胞を2％FBSを含有するPBS緩衝液で洗浄した。次いで、細胞を等分し、1:5で連続希釈したFIT018aと共に氷上で1時間インキュベートした。FIT018aの出発作用濃度は20 μg/mlであった。細胞を洗浄し、再懸濁し、1:100に希釈したAlexa Fluor（登録商標）488標識マウス抗ヒトIgG1（Invitrogen, Cat.No.A-10631）と共に光から保護された氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、BD FACSVerseフローサイトメトリーによって製造者によるプロトコールにしたがって、シグナルを検出した。これらの実験は、FIT018aがヒトB細胞およびT細胞に結合できる（RajiはヒトB細胞株であり、JurkatはヒトT細胞株である）ことを実証する。図29Aおよび図29Bを参照されたい。FIT018aはまた、カニクイザル CD20およびCD3にも結合できる。図30Aおよび図30Bを参照されたい。
【０４９７】
B細胞除去アッセイ：FIT018aのインビトロ活性をB細胞除去アッセイによって測定した。ヒトPBMCをFicoll Paque Plus（GE HEALTHCARE, cat: GE17144002）によって製造者の説明書にしたがって単離した。標的細胞Rajiを回収し、1ウェル当たり5×104個でアッセイプレートに播種した。抗体を連続希釈し、アッセイプレートに添加した。1ウェル当たり2.5×105個のPBMCをアッセイプレートに添加し、2日間または3日間インキュベートする。インキュベーション後、FACS装置を用いて、B細胞を抗CD19抗体によって検出した。実験は、FIT018aがB細胞アポトーシスを誘導できることを実証する。図31Aおよび図31Bを参照されたい。
【０４９８】
実施例13：抗HER3/EGFRタンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
HER3およびEGFRに対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよび対応する配列を以下の表56に提供する。表57はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０４９９】
（表５６）HER3およびEGFRに対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000086
2019514839.tif 000087
2019514839.tif 000088
【０５００】
（表５７）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000089
【０５０１】
機能試験
機能的結合試験：FIT019aおよびFIT019bの機能的結合データを以下の表58および表59にそれぞれ提供する。
【０５０２】
（表５８）FIT019aの機能的結合データ
2019514839.tif 000090
【０５０３】
（表５９）FIT019bの機能的結合データ
2019514839.tif 000091
【０５０４】
多重結合試験：FIT019aおよびFIT019bの多重結合試験を行った。結果を図32（FIT019a）および図33Aから図33B（FIT019b）にそれぞれ示す。結果は、FIT019aおよびFIT019bのどちらもHER3およびEGFRに同時に結合できることを示す。
【０５０５】
実施例14：抗PD-L1/PD-1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
PD-L1およびPD-1に対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表60に提供する。表61はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０５０６】
（表６０）PD-L1およびPD-1に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000092
2019514839.tif 000093
【０５０７】
（表６１）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000094
【０５０８】
機能試験
表面プラズモン共鳴による親和性測定：rhPD-L1およびrhPD-1へのFIT-Ig結合のキネティクスを、25℃にてHBS-EP（10 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、および0.005％界面活性剤P20）を用いるBiacore X100装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）による表面プラズモン共鳴によって決定した。簡単に説明すると、rhPD-L1およびrhPD-1について、標準的なアミンカップリングキットを用いて製造者の説明書にしたがって、CM5研究グレードバイオセンサーチップ全体にわたって40 RUで直接的に固定化した。速度定数を、1から40 nMの範囲の複数の異なる抗原濃度で動的結合測定を行うことによって得た。次いで、FIT-Igと標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数（M）を、以下の式：KD＝koff/konによって動的速度定数から計算した。FIT-Ig/Ab試料アリコートもまたブランク参照および反応CM表面に対して同時に注入し、任意の非特異的結合バックグラウンドを記録し差し引き、屈折率変化および注入ノイズの大部分を除去した。10 μL/分の流速での10 mMグリシン（pH 1.5）の2回の連続する25 ml注入でによって表面を再生した。FIT020bの機能的結合データを以下の表62に提供する。
【０５０９】
（表６２）機能的結合データ
2019514839.tif 000095
【０５１０】
MLRアッセイによる機能活性試験： 1人のドナー由来の単球由来樹状細胞および別のドナー由来の同種異系CD4 T細胞を用いて、混合リンパ球反応を実施した。全血試料を健常なドナーから収集し、Ficoll-Pague勾配遠心分離を用いてPBMCを全血から単離した。1日目に、1人のドナー由来のPBMCを単離し、無血清RPMI 1640によって1×106/mlで希釈した。希釈したPBMCを6ウェル組織培養プレート内に3 ml/ウェルで播種し、3時間インキュベートした。上清を除去し、未結合細胞を洗い落とした。付着した単球を、10％FBSを含むRPMI1640中で250 U/ml IL-4および500 U/ml GM-CSFによって樹状細胞に極性化させた。培地を4日目に新鮮なIL-4およびGM-CSFと交換した。7日目に、未成熟DCを収集し、成熟させるために10％FBSを含むRPMI 1640中で1 μg/ml LPSによってさらに24時間処理した。8日目に、CD4 T細胞をネガティブ選択によって別のドナーのPBMCから単離し、2×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。成熟DCをマイトマイシンCで37℃にて1.5時間処理した。次いで、DCをPBSで洗浄し、1×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。CD4 T細胞（レスポンダー細胞）を96ウェルプレート内に100 μl/ウェルで添加し、希釈濃度での試験抗体によって30分間予処理した。次いで、成熟DC（刺激細胞）をウェル内に100 μl/ウェルで添加した。各ウェルの最終体積は200 μlである。MLRをIL-2試験のために37℃にて72時間インキュベートした。結果を図34Aおよび図34Bに示す。
【０５１１】
多重結合試験：FIT020bの多重結合試験を実施した。結果を図35に示す。結果は、FIT020bがPD-L1およびPD-1に同時に結合できることを示唆する。
【０５１２】
実施例15：抗CD20/CD-22タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
CD20およびCD22に対して特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表63に提供する。表64はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０５１３】
（表６３）CD20およびCD22に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000096
2019514839.tif 000097
【０５１４】
（表６４）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000098
【０５１５】
機能試験
細胞ベースの結合試験：Bリンパ腫細胞株RajiまたはDaudiに対するFIT021bの結合活性をBD FACSVerseを用いるフローサイトメトリーによって決定した。細胞を2％FBSを含有するPBS緩衝液で洗浄した。次いで、細胞を等分し、1:5で連続希釈したFIT021bと共に氷上で1時間インキュベートした。FIT021bの開始作用濃度は20 μg/mlであった。細胞を洗浄し、再懸濁し、1:100に希釈したAlexa Fluor（登録商標）488標識マウス抗ヒトIgG1（Invitrogen, Cat.No.A-10631）と共に光から保護した氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄し、シグナルをBD FACSVerseフローサイトメトリーによって製造者のプロトコールにしたがって検出した。これらの実験は、FIT021bがBリンパ腫細胞株RajiまたはDaudiに結合できることを実証する。図36Aおよび図36Bを参照されたい。
【０５１６】
実施例16：抗HER3/PD-1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
HER3およびPD1に対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表65に提供する。表66はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０５１７】
（表６５）HER3およびPD-1に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000099
2019514839.tif 000100
【０５１８】
（表６６）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000101
【０５１９】
機能試験
表面プラズモン共鳴による親和性測定：Her3-hisおよびhPD-1-FcへのFIT022a-Ig結合のキネティクスを表面プラズモン共鳴によって決定した。結果を表67に示す。
【０５２０】
（表６７）FIT022aの機能的結合データ
2019514839.tif 000102
【０５２１】
多重結合試験：FIT022aの多重結合試験を行った。結果を図37に示す。結果は、FIT022aがPD-L1およびPD-1に同時に結合できることを示唆する。
【０５２２】
MLR機能アッセイ：1人のドナー由来の単球由来樹状細胞および別のドナー由来の同種異系CD4 T細胞を用いて、混合リンパ球反応を実施した。全血試料を健常なドナーから収集し、Ficoll-Pague勾配遠心分離を用いて、PBMCを全血から単離した。1日目に、1人のドナーからPBMCを単離し、無血清RPMI 1640によって1×106/mlで希釈した。希釈したPBMCを6ウェル組織培養プレート内に3 ml/ウェルで播種し、3時間インキュベートした。上清を除去し、未結合細胞を洗い落とした。付着した単球を、10％FBSを含むRPMI1640中で250 U/ml IL-4および500 U/ml GM-CSFによって樹状細胞に極性化させた。培地を4日目に新鮮なIL-4およびGM-CSFと交換した。7日目に、未成熟DCを収集し、成熟させるために10％FBSを含むRPMI 1640中で1 μg/ml LPSによってさらに24時間処理した。8日目に、CD4 T細胞をネガティブ選択によって別のドナーのPBMCから単離し、2×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。成熟DCをマイトマイシンCで37℃にて1.5時間処理した。次いで、DCをPBSで洗浄し、1×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。CD4 T細胞（レスポンダー細胞）を96ウェルプレート内に100 μl/ウェルで添加し、希釈濃度での試験抗体によって30分間予処理した。次いで、成熟DC（刺激細胞）をウェル内に100 μl/ウェルで添加した。各ウェルの最終体積は200 μlである。MLRを37℃にて、ELISAを用いるIL-2試験のために72時間、およびIFNγ試験のための120時間それぞれインキュベートした。結果を図38Aおよび図38Bに示す。
【０５２３】
実施例17：抗cMet/PD-L1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
cMetおよびPD-L1に対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表68に提供する。表69はFIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。
【０５２４】
（表６８）cMetおよびPD-L1に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000103
2019514839.tif 000104
【０５２５】
（表６９）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000105
【０５２６】
機能試験
表面プラズモン共鳴による親和性測定：cMetおよびPD-L1へのFIT023a-Ig結合のキネティクスを表面プラズモン共鳴よって決定した。結果を表70に示す。
【０５２７】
（表７０）FIT023aの機能的結合データ
2019514839.tif 000106
【０５２８】
多重結合試験：FIT023aの多重結合試験を行った。結果を図39Aおよび図39Bに示す。結果は、FIT023aがcMetおよびPD-L1に同時に結合できることを示唆する。
【０５２９】
実施例18：抗BTLA/PD-1タンデム型Fab免疫グロブリン（FIT-Ig）の試験
BTLAおよびPD-L1に対する特異性を有するFIT-Igを前述の実施例のように構築した。この例示的FIT-Igおよびその対応する配列を以下の表71に提供する。表72は、FIT-Igの293E細胞での発現レベルおよびSECプロファイルを提供する。FIT024aおよびFIT024bはどちらも、1段階プロテインA精製後に良好な純度を有する。
【０５３０】
（表７１）BTLAよびPD-1に対するさらなる例示的FIT-Igのアミノ酸配列
2019514839.tif 000107
2019514839.tif 000108
2019514839.tif 000109
【０５３１】
（表７２）SECプロファイル/293E細胞での発現レベル
2019514839.tif 000110
【０５３２】
機能試験
表面プラズモン共鳴による親和性測定：BTLA4およびPD-1に対するFIT024a-IgおよびFIT024b-Igの結合のキネティクスを表面プラズモン共鳴によって決定した。結果を表73に示す。
【０５３３】
（表７３）FIT024aおよびFIT024bの機能的結合データ
2019514839.tif 000111
【０５３４】
多重結合試験：FIT024aおよびFIT024bの多重結合試験を行った。結果を図40Aから図40Bおよび図41Aから図41Bに示す。結果は、FIT024aおよびFIT024bのどちらもBTLA4およびPD-1に同時に結合できることを示唆する。
【０５３５】
MLR機能アッセイ：1人のドナー由来の単球由来樹状細胞および別のドナー由来の同種異系CD4 T細胞を用いて、混合リンパ球反応を実施した。全血試料を健常なドナーから収集し、Ficoll-Pague勾配遠心分離を用いて、PBMCを全血から単離した。1日目に、1人のドナー由来のPBMCを単離し、無血清RPMI 1640によって1×106/mlで希釈した。希釈したPBMCを6ウェル組織培養プレート内に3 ml/ウェルで播種し、3時間インキュベートした。上清を除去し、未結合細胞を洗い落とした。付着した単球を、10％FBSを含むRPMI1640中で250 U/ml IL-4および500 U/ml GM-CSFによって樹状細胞に極性化させた。培地を4日目に新鮮なIL-4およびGM-CSFと交換した。7日目に、未成熟DCを収集し、成熟させるために10％FBSを含むRPMI 1640中で1 μg/ml LPSによってさらに24時間処理した。8日目に、CD4 T細胞をネガティブ選択によって別のドナーPBMCから単離し、2×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。成熟DCをマイトマイシンCで37℃にて1.5時間処理した。次いで、DCをPBSで洗浄し、1×106細胞/mlでの最終濃度に調整した。CD4 T細胞（レスポンダー細胞）を96ウェルプレート内に100 μl/ウェルで添加し、希釈濃度での試験抗体によって30分間予処理した。次いで、成熟DC（刺激細胞）をウェル内に100 μl/ウェルで添加した。各ウェルの最終体積は200 μlである。MLRをIL-2試験のために37℃にて72時間インキュベートした。結果を図42Aおよび図42Bに示す。FIT024aおよびFIT024bのどちらもMLR試験においてニボルマブと比較して、より高い活性を有し、T細胞活性を増強する。
【０５３６】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、および発行済み特許は、各個別の刊行物、特許出願、または発行済み特許がその全体が参照によって組み入れられることを具体的かつ個別に示されているかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０５３７】
他に定義されない限り、本明細書における全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものに類似するまたはそれと等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好適な方法および材料が本明細書において記載される。
【０５３８】
本明細書において言及される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示が提供されているに過ぎない。本明細書において、本発明が先行する発明によってこのような刊行物に先立つ権利がないという承認として解釈されるべきことは何らない。
【０５３９】
本発明はその特定の態様に関連して記載されているが、さらなる変更ができること、そして、本出願が、本発明の原理に概ね従う発明の任意の変化形、使用、または適合物を含むこと、ならびに、本発明が属する技術分野の範囲内で公知であるまたは慣用されている範囲内にくるような、および上記本質的な特徴に適用され得るような、および添付の特許請求の範囲の範囲内に従うような本開示からの逸脱を含むことを意図することが理解される。
【図１】
2019514839.tif 000113
【図２】
2019514839.tif 000114
【図３】
2019514839.tif 000115
【図４】
2019514839.tif 000116
【図５】
2019514839.tif 000117
【図６】
2019514839.tif 000118
【図７Ａ】
2019514839.tif 000119
【図７Ｂ】
2019514839.tif 000120
【図７Ｃ】
2019514839.tif 000121
【図７Ｄ】
2019514839.tif 000122
【図７Ｅ】
2019514839.tif 000123
【図７Ｆ】
2019514839.tif 000124
【図７Ｇ】
2019514839.tif 000125
【図７Ｈ】
2019514839.tif 000126
【図７Ｉ】
2019514839.tif 000127
【図８】
2019514839.tif 000128
【図９】
2019514839.tif 000129
【図１０】
2019514839.tif 000130
【図１１】
2019514839.tif 000131
【図１２】
2019514839.tif 000132
【図１３】
2019514839.tif 000133
【図１４】
2019514839.tif 000134
【図１５】
2019514839.tif 000135
【図１６】
2019514839.tif 000136
【図１７】
2019514839.tif 000137
【図１８Ａ】
2019514839.tif 000138
【図１８Ｂ】
2019514839.tif 000139
【図１８Ｃ】
2019514839.tif 000140
【図１９】
2019514839.tif 000141
【図２０】
2019514839.tif 000142
【図２１Ａ】
2019514839.tif 000143
【図２１Ｂ】
2019514839.tif 000144
【図２１Ｃ】
2019514839.tif 000145
【図２１Ｄ】
2019514839.tif 000146
【図２２】
2019514839.tif 000147
【図２３】
2019514839.tif 000148
【図２４】
2019514839.tif 000149
【図２５】
2019514839.tif 000150
【図２６】
2019514839.tif 000151
【図２７】
2019514839.tif 000152
【図２８】
2019514839.tif 000153
【図２９】
2019514839.tif 000154
【図３０】
2019514839.tif 000155
【図３１】
2019514839.tif 000156
【図３２】
2019514839.tif 000157
【図３３】
2019514839.tif 000158
【図３４】
2019514839.tif 000159
【図３５】
2019514839.tif 000160
【図３６】
2019514839.tif 000161
【図３７】
2019514839.tif 000162
【図３８】
2019514839.tif 000163
【図３９】
2019514839.tif 000164
【図４０】
2019514839.tif 000165
【図４１】
2019514839.tif 000166
【図４２】
2019514839.tif 000167
【配列表】
2019514839000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月21日(2018.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3種のポリペプチド鎖を含む、抗原Aおよび抗原Bに結合する二重特異性結合タンパク質であって、
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ（1）VLA-CL-VHB-CH1-Fcまたは（2）VHB-CH1-VLA-CL-Fcのいずれかを含み、ここで、VLAは、抗原Aに結合する第1の親抗体の抗体軽鎖可変ドメインであり、CLは抗体軽鎖定常ドメインであり、VHBは、抗原Bに結合する第2の親抗体由来の抗体重鎖可変ドメインであり、CH1は抗体重鎖の第1の定常ドメインであり；
第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含み、ここで、VHAは、抗原Aに結合する前記第1の親抗体の重鎖可変ドメインであり、CH1は抗体重鎖の第1の定常ドメインであり；
第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含み、ここで、VLBは、抗原Bに結合する前記第2の親抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLは抗体軽鎖定常ドメインであり；
該二重特異性結合タンパク質が、抗原AおよびBに結合し、3つのCDR配列（CDR-1、CDR-2、CDR-3）のそれぞれについて以下の配列より選択されるアミノ酸配列を有する可変ドメインVLA、VHA、VLB、およびVHBを含む、
二重特異性結合タンパク質：
2019514839.tif 000168
2019514839.tif 000169
。
【請求項２】
抗原AおよびBに結合し、VLA、VHA、VLB、およびVHBについて以下の群より選択されるアミノ酸配列を有するVLA、VHA、VLB、およびVHBドメインを含む、請求項1記載の二重特異性結合タンパク質：
2019514839.tif 000170
。
【請求項３】
抗原AおよびBに結合し、以下の群より選択されるアミノ酸配列を有する第1、第2、および第3のポリペプチド鎖を含む、請求項2記載の二重特異性結合タンパク質：
2019514839.tif 000171
。
【請求項４】
保存的アミノ酸置換を含まない請求項1〜3のいずれか一項記載の対応する結合タンパク質と同等の活性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の結合タンパク質の中に1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する結合タンパク質。
【請求項５】
請求項1〜3のいずれか一項記載の結合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、状態を処置または予防するための薬学的組成物。
【請求項６】
状態が炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん、または脊髄損傷である、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項７】
状態の処置または予防のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか一項記載の結合タンパク質の使用。
【請求項８】
状態が炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん、または脊髄損傷である、請求項7記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
もう一つの態様において、本開示は、CTLA-4およびPD-1と結合することができる本明細書に記載されたFIT-Ig結合タンパク質を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における感染または感染性疾患の処置または予防の方法を提供する。一つの態様において、FIT-Ig結合タンパク質は、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激するため、単独で、またはワクチンと組み合わせて投与される。したがって、一つの態様において、本明細書に提供された結合タンパク質は、以下に限定されるわけではないが、ヒト免疫不全ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、およびC型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、細菌、真菌性寄生生物、またはその他の病原体のようなヒトに感染性のウイルスに対する免疫応答を刺激するために使用され得る。
[本発明1001]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT013aが結合するのと同一のc-Metのエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT013aが、SEQ ID NO:240のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:254のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1002]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:242のVLA CDR1、SEQ ID NO:243のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:244のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:246のVHB CDR1、SEQ ID NO:247のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:248のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:251のVHA CDR1、SEQ ID NO:252のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:253のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:256のVLB CDR1、SEQ ID NO:257のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:258のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:242のVLA CDR1、SEQ ID NO:243のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:244のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:246のVHB CDR1、SEQ ID NO:247のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:248のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:251のVHA CDR1、SEQ ID NO:252のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:253のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:256のVLB CDR1、SEQ ID NO:257のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:258のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1087の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1003]
SEQ ID NO:241の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:245の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:250の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:255の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1087の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1004]
SEQ ID NO:240のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:249のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:254のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1087の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1005]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、上皮増殖因子受容体（EGFR）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1006]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、ヒト上皮増殖因子受容体3（Her3）の1種またはそれ以上のエピトープと結合することができ、かつインスリン様増殖因子1受容体（IGF-1R）の1種またはそれ以上のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1007]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、デルタ様4（DLL4）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつ血管内皮増殖因子（VEGF）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1008]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、ヒト上皮増殖因子受容体3（Her3）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつ上皮増殖因子受容体（EGFR）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1009]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、プログラム細胞死1（PD-1）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1010]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、ヒト上皮増殖因子受容体3（Her3）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死1（PD-1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1011]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、間葉上皮転換因子（c-Met）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1012]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、N末端からC末端へ順に（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、BおよびTリンパ球関連（B and T lymphocyte associated）（BTLA）の1種または複数のエピトープと結合することができ、かつプログラム細胞死1（PD-1）の1種または複数のエピトープと結合することができる、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1013]
3種のポリペプチド鎖を含み、第2のポリペプチド鎖がVHAおよびCH1、またはVLBおよびCLを含み、第3のポリペプチド鎖がVLBおよびCL、またはVHAおよびCH1を含む、本発明1005〜1012のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1014]
2種のポリペプチド鎖を含み、第2のポリペプチド鎖がVHA、CH1、VLB、およびCL、またはVLB、CL、VHA、およびCH1を含む、本発明1005〜1012のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1015]
二重特異性結合タンパク質FIT012bが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT012bが、SEQ ID NO:202のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:211のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:216のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1005の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1016]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、VLAが、SEQ ID NO:204のVLA CDR1、SEQ ID NO:205のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:206のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、VHBが、SEQ ID NO:208のVHB CDR1、SEQ ID NO:209のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:210のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、VHAが、SEQ ID NO:213のVHA CDR1、SEQ ID NO:214のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:215のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、VLBが、SEQ ID NO:218のVLB CDR1、SEQ ID NO:219のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:220のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、VLAが、SEQ ID NO:204のVLA CDR1、SEQ ID NO:205のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:206のVLA CDR3を含み、VHBが、SEQ ID NO:208のVHB CDR1、SEQ ID NO:209のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:210のVHB CDR3を含み、VHAが、SEQ ID NO:213のVHA CDR1、SEQ ID NO:214のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:215のVHA CDR3を含み、VLBが、SEQ ID NO:218のVLB CDR1、SEQ ID NO:219のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:220のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1015の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1017]
SEQ ID NO:203の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:207の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:212の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:217の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1015の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1018]
SEQ ID NO:202のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:211のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:216のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1015の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1019]
二重特異性結合タンパク質FIT012dが結合するのと同一のEGFRのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT012dが、SEQ ID NO:221のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:230のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:235のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1005の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1020]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:223のVLA CDR1、SEQ ID NO:224のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:225のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:227のVHB CDR1、SEQ ID NO:228のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:229のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:232のVHA CDR1、SEQ ID NO:233のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:234のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:237のVLB CDR1、SEQ ID NO:239のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:239のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:223のVLA CDR1、SEQ ID NO:224のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:225のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:227のVHB CDR1、SEQ ID NO:228のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:229のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:232のVHA CDR1、SEQ ID NO:233のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:234のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:237のVLB CDR1、SEQ ID NO:238のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:239のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1019の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1021]
SEQ ID NO:222の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:226の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:231の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:236の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1019の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1022]
SEQ ID NO:221のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:230のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:235のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1019の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1023]
二重特異性結合タンパク質FIT016aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のIGF-1Rのエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT016aが、SEQ ID NO:278のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:287のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:292のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1006の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1024]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:280のVLA CDR1、SEQ ID NO:281のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:282のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:284のVHB CDR1、SEQ ID NO:285のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:286のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:289のVHA CDR1、SEQ ID NO:290のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:291のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:294のVLB CDR1、SEQ ID NO:295のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:296のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:280のVLA CDR1、SEQ ID NO:281のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:282のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:284のVHB CDR1、SEQ ID NO:285のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:286のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:289のVHA CDR1、SEQ ID NO:290のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:291のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:294のVLB CDR1、SEQ ID NO:295のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:296のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1023の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1025]
SEQ ID NO:279の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:283の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:288の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:293の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1023の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1026]
SEQ ID NO:278のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:287のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:292のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1023の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1027]
二重特異性結合タンパク質FIT017aが結合するのと同一のDLL4のエピトープおよび同一のVEGFのエピトープと結合することができ、二重特異性結合タンパク質FIT017bが、SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1007の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1028]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:299のVLA CDR1、SEQ ID NO:300のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:301のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:303のVHB CDR1、SEQ ID NO:304のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:305のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:308のVHA CDR1、SEQ ID NO:309のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:310のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:313のVLB CDR1、SEQ ID NO:314のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:315のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:299のVLA CDR1、SEQ ID NO:300のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:301のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:303のVHB CDR1、SEQ ID NO:304のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:305のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:308のVHA CDR1、SEQ ID NO:309のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:310のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:313のVLB CDR1、SEQ ID NO:314のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:315のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1027の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1029]
SEQ ID NO:298の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:302の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:307の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:312の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1027の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1030]
SEQ ID NO:297のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:306のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:311のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1027の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1031]
二重特異性結合タンパク質FIT019aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT019aが、SEQ ID NO:335のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:344のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:349のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1008の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1032]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:337のVLA CDR1、SEQ ID NO:338のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:339のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:341のVHB CDR1、SEQ ID NO:342のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:343のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:346のVHA CDR1、SEQ ID NO:347のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:348のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:351のVLB CDR1、SEQ ID NO:352のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:353のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:337のVLA CDR1、SEQ ID NO:338のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:339のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:341のVHB CDR1、SEQ ID NO:342のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:343のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:346のVHA CDR1、SEQ ID NO:347のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:348のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:351のVLB CDR1、SEQ ID NO:352のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:353のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1031の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1033]
SEQ ID NO:336の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:340の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:345の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:350の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1031の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1034]
SEQ ID NO:335のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:344のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:349のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1031の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1035]
二重特異性結合タンパク質FIT019bが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のEGFRのエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT019bが、SEQ ID NO:354のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:363のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:368のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1008の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1036]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:356のVLA CDR1、SEQ ID NO:357のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:358のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:360のVHB CDR1、SEQ ID NO:361のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:362のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:365のVHA CDR1、SEQ ID NO:366のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:367のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:370のVLB CDR1、SEQ ID NO:371のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:372のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:356のVLA CDR1、SEQ ID NO:357のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:358のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:360のVHB CDR1、SEQ ID NO:361のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:362のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:365のVHA CDR1、SEQ ID NO:366のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:367のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:370のVLB CDR1、SEQ ID NO:371のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:372のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1035の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1037]
SEQ ID NO:355の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:359の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:364の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:369の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1035の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1038]
SEQ ID NO:354のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:363のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:368のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1035の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1039]
二重特異性結合タンパク質FIT020aまたはFIT020bが結合するのと同一のPD-1のエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT020aが、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:121のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:122のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含み、該二重特異性結合タンパク質FIT020bが、SEQ ID NO:373のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:382のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:387のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1009の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1040]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、（a）SEQ ID NO:389のVLA CDR1、SEQ ID NO:390のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLA CDR3；または（b）SEQ ID NO:375のVLA CDR1、SEQ ID NO:376のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、（a）SEQ ID NO:384のVHB CDR1、SEQ ID NO:385のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHB CDR3；または（b）SEQ ID NO:379のVHB CDR1、SEQ ID NO:380のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、（a）SEQ ID NO:379のVHA CDR1、SEQ ID NO:380のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHA CDR3、または（b）SEQ ID NO:384のVHA CDR1、SEQ ID NO:385のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、（a）SEQ ID NO:375のVLB CDR1、SEQ ID NO:376のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLB CDR3、または（b）SEQ ID NO:389のVLB CDR1、SEQ ID NO:390のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、（a）第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:389のVLA CDR1、SEQ ID NO:390のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:384のVHB CDR1、SEQ ID NO:385のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:379のVHA CDR1、SEQ ID NO:380のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:375のVLB CDR1、SEQ ID NO:376のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLB CDR3を含むか；または（b）第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:375のVLA CDR1、SEQ ID NO:376のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:377のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:379のVHB CDR1、SEQ ID NO:380のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:381のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:384のVHA CDR1、SEQ ID NO:385のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:386のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:389のVLB CDR1、SEQ ID NO:390のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:391のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1039の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1041]
（a）SEQ ID NO:388の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:383の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:378の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:374の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含むか、または
（b）SEQ ID NO:374の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:378の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:383の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:388の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、
本発明1039の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1042]
（a）SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:121のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:122のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖、または
（b）SEQ ID NO:373のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:382のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:387のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖
を含む、本発明1039の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1043]
二重特異性結合タンパク質FIT022aが結合するのと同一のHer3のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT022aが、SEQ ID NO:411のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:420のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:425のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1010の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1044]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:413のVLA CDR1、SEQ ID NO:414のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:415のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:417のVHB CDR1、SEQ ID NO:418のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:419のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:422のVHA CDR1、SEQ ID NO:423のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:424のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:427のVLB CDR1、SEQ ID NO:428のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:429のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:413のVLA CDR1、SEQ ID NO:414のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:415のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:417のVHB CDR1、SEQ ID NO:418のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:419のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:422のVHA CDR1、SEQ ID NO:423のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:424のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:427のVLB CDR1、SEQ ID NO:428のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:429のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1043の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1045]
SEQ ID NO:412の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:416の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:421の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:426の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1043の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1046]
SEQ ID NO:411のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:420のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:425のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1043の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1047]
二重特異性結合タンパク質FIT023aが結合するのと同一のc-Metのエピトープおよび同一のPD-L1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT023aが、SEQ ID NO:430のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:439のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:444のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1011の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1048]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:432のVLA CDR1、SEQ ID NO:433のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:434のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:436のVHB CDR1、SEQ ID NO:437のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:438のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:441のVHA CDR1、SEQ ID NO:442のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:443のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:446のVLB CDR1、SEQ ID NO:447のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:448のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:432のVLA CDR1、SEQ ID NO:433のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:434のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:436のVHB CDR1、SEQ ID NO:437のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:438のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:441のVHA CDR1、SEQ ID NO:442のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:443のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:446のVLB CDR1、SEQ ID NO:447のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:448のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1047の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1049]
SEQ ID NO:431の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:435の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:440の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:445の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1047の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1050]
SEQ ID NO:430のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:439のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:444のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1047の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1051]
二重特異性結合タンパク質FIT024aが結合するのと同一のBTLAのエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT024aが、SEQ ID NO:449のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:458のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:463のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1012の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1052]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:451のVLA CDR1、SEQ ID NO:452のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:453のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:455のVHB CDR1、SEQ ID NO:456のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:457のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:460のVHA CDR1、SEQ ID NO:461のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:462のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:465のVLB CDR1、SEQ ID NO:466のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:467のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:451のVLA CDR1、SEQ ID NO:452のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:453のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:455のVHB CDR1、SEQ ID NO:456のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:457のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:460のVHA CDR1、SEQ ID NO:461のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:462のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:465のVLB CDR1、SEQ ID NO:466のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:467のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1051の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1053]
SEQ ID NO:450の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:454の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:459の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:464の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1051の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1054]
SEQ ID NO:449のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:458のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:463のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1051の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1055]
二重特異性結合タンパク質FIT024bが結合するのと同一のBTLAのエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、該二重特異性結合タンパク質FIT024bが、SEQ ID NO:468のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:477のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:482のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1012の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1056]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:470のVLA CDR1、SEQ ID NO:471のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:472のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:474のVHB CDR1、SEQ ID NO:475のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:476のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:479のVHA CDR1、SEQ ID NO:480のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:481のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:484のVLB CDR1、SEQ ID NO:485のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:486のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:470のVLA CDR1、SEQ ID NO:471のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:472のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:474のVHB CDR1、SEQ ID NO:475のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:476のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:479のVHA CDR1、SEQ ID NO:480のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:481のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:484のVLB CDR1、SEQ ID NO:485のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:486のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1055の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1057]
SEQ ID NO:469の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:473の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:478の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:483の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1055の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1058]
SEQ ID NO:468のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:477のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:482のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1055の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1059]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT014aが結合するのと同一の第IXa因子のエピトープおよび同一の第X因子のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT014aが、SEQ ID NO:259のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:268のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:273のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1060]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:261のVLA CDR1、SEQ ID NO:262のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:263のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:265のVHB CDR1、SEQ ID NO:266のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:267のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:270のVHA CDR1、SEQ ID NO:271のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:272のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:275のVLB CDR1、SEQ ID NO:276のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:277のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:261のVLA CDR1、SEQ ID NO:262のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:263のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:265のVHB CDR1、SEQ ID NO:266のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:267のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:270のVHA CDR1、SEQ ID NO:271のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:272のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:275のVLB CDR1、SEQ ID NO:276のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:277のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1059の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1061]
SEQ ID NO:260の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:264の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:269の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:274の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1059の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1062]
SEQ ID NO:259のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:268のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:273のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1059の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1063]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT018aが結合するのと同一のCD20のエピトープおよび同一のCD3のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT018aが、SEQ ID NO:316のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:325のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:330のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1064]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:318のVLA CDR1、SEQ ID NO:319のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:320のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:322のVHB CDR1、SEQ ID NO:323のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:324のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:327のVHA CDR1、SEQ ID NO:328のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:329のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:332のVLB CDR1、SEQ ID NO:333のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:334のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:318のVLA CDR1、SEQ ID NO:319のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:320のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:322のVHB CDR1、SEQ ID NO:323のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:324のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:327のVHA CDR1、SEQ ID NO:328のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:329のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:332のVLB CDR1、SEQ ID NO:333のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:334のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1063の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1065]
SEQ ID NO:317の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:321の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:326の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:331の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1063の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1066]
SEQ ID NO:316のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:325のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:330のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1063の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1067]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3が結合するのと同一のCLTA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3が、SEQ ID NO:126のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:135のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1068]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:128のVLA CDR1、SEQ ID NO:129のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:130のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:132のVHB CDR1、SEQ ID NO:133のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:134のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:137のVHA CDR1、SEQ ID NO:138のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:139のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:142のVLB CDR1、SEQ ID NO:143のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:144のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:128のVLA CDR1、SEQ ID NO:129のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:130のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:132のVHB CDR1、SEQ ID NO:133のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:134のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:137のVHA CDR1、SEQ ID NO:138のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:139のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:142のVLB CDR1、SEQ ID NO:143のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:144のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1067の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1069]
SEQ ID NO:127の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:131の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:136の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:141の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1067の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1070]
SEQ ID NO:126のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:135のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1067の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1071]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3Rが結合するのと同一のCTLA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3Rが、SEQ ID NO:145のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:154のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:159のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1072]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:147のVLA CDR1、SEQ ID NO:148のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:149のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:151のVHB CDR1、SEQ ID NO:152のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:153のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:156のVHA CDR1、SEQ ID NO:157のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:158のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:161のVLB CDR1、SEQ ID NO:162のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:163のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:147のVLA CDR1、SEQ ID NO:148のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:149のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:151のVHB CDR1、SEQ ID NO:152のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:153のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:156のVHA CDR1、SEQ ID NO:157のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:158のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:161のVLB CDR1、SEQ ID NO:162のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:163のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1071の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1073]
SEQ ID NO:146の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:150の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:155の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:160の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1071の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1074]
SEQ ID NO:145のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:154のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:159のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1071の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1075]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3-Cが結合するのと同一のCTLA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3-Cが、SEQ ID NO:164のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:173のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:178のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1076]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:170のVHB CDR1、SEQ ID NO:171のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:172のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:166のVLA CDR1、SEQ ID NO:167のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:168のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:170のVHB CDR1、SEQ ID NO:171のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:172のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:175のVHA CDR1、SEQ ID NO:176のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:177のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:180のVLB CDR1、SEQ ID NO:181のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:182のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1075の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1077]
SEQ ID NO:165の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:169の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:174の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:179の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1075の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1078]
SEQ ID NO:164のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:173のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:178のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1071の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1079]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質NBS3R-Cが結合するのと同一のCTLA4のエピトープおよび同一のPD-1のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質NBS3R-Cが、SEQ ID NO:183のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1080]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:185のVLA CDR1、SEQ ID NO:186のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:187のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:189のVHB CDR1、SEQ ID NO:190のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:191のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:194のVHA CDR1、SEQ ID NO:195のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:196のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:199のVLB CDR1、SEQ ID NO:200のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:201のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:185のVLA CDR1、SEQ ID NO:186のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:187のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:189のVHB CDR1、SEQ ID NO:190のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:191のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:194のVHA CDR1、SEQ ID NO:195のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:196のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:199のVLB CDR1、SEQ ID NO:200のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:201のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1079の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1081]
SEQ ID NO:184の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:188の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:193の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:198の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1075の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1082]
SEQ ID NO:183のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:192のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:197のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1071の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1083]
少なくとも2種のポリペプチド鎖を含む二重特異性結合タンパク質であって、
該ポリペプチド鎖が、2種の抗原と結合することができるIgG様分子を形成するために対形成し、
第1のポリペプチド鎖が、（1）VLA、CL、VHB、およびCH1、または（2）VHB、CH1、VLA、およびCLを含み、ここで、VLは軽鎖可変ドメインであり、CLは軽鎖定常ドメインであり、VHは重鎖可変ドメインであり、CH1は重鎖の第1の定常ドメインであり、Aは第1の抗原であり、Bは第2の抗原であり、
該結合タンパク質が、二重特異性結合タンパク質FIT021bが結合するのと同一のCD20のエピトープおよび同一のCD22のエピトープと結合することができ、
該二重特異性結合タンパク質FIT021bが、SEQ ID NO:392のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:401のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:406のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、
二重特異性結合タンパク質。
[本発明1084]
（i）第1のポリペプチドにVLAを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:394のVLA CDR1、SEQ ID NO:395のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:396のVLA CDR3を含む、結合タンパク質；
（ii）第1のポリペプチドにVHBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:398のVHB CDR1、SEQ ID NO:399のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:400のVHB CDR3を含む、結合タンパク質；
（iii）第2のポリペプチドにVHAを含む結合タンパク質であって、第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:403のVHA CDR1、SEQ ID NO:404のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:405のVHA CDR3を含む、結合タンパク質；
（iv）第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:408のVLB CDR1、SEQ ID NO:409のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:410のVLB CDR3を含む、結合タンパク質；ならびに
（v）第1のポリペプチドにVLAおよびVHB、第2のポリペプチドにVHA、第3のポリペプチドにVLBを含む結合タンパク質であって、第1のポリペプチドのVLAが、SEQ ID NO:394のVLA CDR1、SEQ ID NO:395のVLA CDR2、およびSEQ ID NO:396のVLA CDR3を含み；第1のポリペプチドのVHBが、SEQ ID NO:398のVHB CDR1、SEQ ID NO:399のVHB CDR2、およびSEQ ID NO:400のVHB CDR3を含み；第2のポリペプチドのVHAが、SEQ ID NO:403のVHA CDR1、SEQ ID NO:404のVHA CDR2、およびSEQ ID NO:405のVHA CDR3を含み；第3のポリペプチドのVLBが、SEQ ID NO:408のVLB CDR1、SEQ ID NO:409のVLB CDR2、およびSEQ ID NO:410のVLB CDR3を含む、結合タンパク質
からなる群より選択される、本発明1083の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1085]
SEQ ID NO:393の配列を有するVLAおよびSEQ ID NO:397の配列を有するVHBを含む第1のポリペプチド鎖を含み、SEQ ID NO:402の配列を有するVHAを含む第2のポリペプチド鎖を含み、かつSEQ ID NO:407の配列を有するVLBを含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1083の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1086]
SEQ ID NO:392のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖；SEQ ID NO:401のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖；およびSEQ ID NO:406のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖を含む、本発明1087の二重特異性結合タンパク質。
[本発明1087]
Fcをさらに含む、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1088]
FcがヒトIgG1のFcである、本発明1087の結合タンパク質。
[本発明1089]
FcがSEQ ID NO:20による、本発明1087の結合タンパク質。
[本発明1090]
少なくとも1つのポリペプチドリンカーをさらに含む、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1091]
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLA-CL-VHB-CH1-Fcを含み、第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含み、第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含む、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1092]
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHB-CH1-VLA-CL-Fcを含み、第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVHA-CH1を含み、第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へVLB-CLを含む、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1093]
第1のポリペプチド鎖のCLが、直接またはアミノ酸もしくはオリゴペプチドリンカーを介して、VHBと融合している、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1094]
第1のポリペプチド鎖のCH1が、直接またはアミノ酸もしくはオリゴペプチドリンカーを介して、VLAと融合している、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質。
[本発明1095]
保存的アミノ酸置換を含まない本発明1001〜1086のいずれかの対応する結合タンパク質と同等の活性を有する、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質の中に1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する結合タンパク質。
[本発明1096]
前記本発明のいずれかの結合タンパク質と1種または複数の薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1097]
有効量の本発明1096の薬学的組成物を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象における状態の処置または予防の方法。
[本発明1098]
状態の処置または予防のための医薬の製造における、本発明1001〜1086のいずれかの結合タンパク質の使用。
[本発明1099]
状態が炎症性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患、がん、または脊髄損傷である、本発明1098の使用。
【国際調査報告】
2019514839.tif 000172
2019514839.tif 000173
2019514839.tif 000174
2019514839.tif 000175
2019514839.tif 000176
2019514839.tif 000177