(57)【要約】真核生物細胞中のレポータータンパク質コード配列にイントロンを挿入するための方法及び構築物、ならびにゲノム改変をモニタリング及び報告するというそれらの適用が提供される。様々な関連組成物、細胞及びキットも提供される。【選択図】図１
2019506891.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え構築物であって、上流から下流へと順に以下：
プロモーター配列と、
Ｎ末端を含むレポータータンパク質の第１部分をコードする核酸配列であって、前記レポータータンパク質のタンパク質産物がレポーター発現を提供するには不十分である、前記核酸配列と、
スプライスドナー部位と、
異種核酸配列と、
スプライスアクセプター部位と、
Ｃ末端を含むレポータータンパク質の第２の部分をコードする核酸配列と、
ポリ（Ａ）シグナル配列と、
を含む、前記組換え核酸構築物。
【請求項２】
レポータータンパク質をコードする条件付き及び分割されたポリヌクレオチド配列をマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入する方法であって：
（ａ）ＤＮＡ標的化ベクターを構築することであって、前記ベクターが、順番に
５’相同性アームと、
前記異種配列が２つの組換え部位が隣接する標的配列を含む、請求項１に記載の構築物と、
３’相同性アームと、を備え、
ここでＤＮＡ標的化ベクターが、前記５’相同性アームと３’相同性アームとの間に挿入された抗生物質選択マーカー遺伝子をさらに含む、前記構築することと、
（ｂ）（ａ）の前記ＤＮＡ標的化ベクターをＥＳ細胞に導入することと、
（ｃ）標的クローンについて（ｂ）の前記ＥＳ細胞を選択することと、を包含する、前記方法。
【請求項３】
遺伝子欠失を報告する方法であって、
（ａ）請求項２に記載のＤＮＡ標的化ベクターを構築することと、
（ｂ）標的生殖系列マウスを生成することと、
（ｃ）前記標的マウスをリコンビナーゼ発現マウスと交配させることと、
（ｄ）前記組換え部位間の組換えにより前記標的配列を除去することによってレポータータンパク質を活性化することと、を包含する、前記方法。
【請求項４】
前記プロモーターが、真核生物細胞中の下流の配列の遺伝子発現を駆動し得る核酸配列である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記プロモーターがポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
プロモーターが、真核生物細胞における偏在性プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群より選択される、請求項４に記載のプロモーター。
【請求項７】
プロモーターがＣＡＧ（配列番号１）、ＣＡＧＧＳ、ＣＭＶ、ｈＣＭＶ、ＥＦ１、ＰＧＫ、ＦＡＢＰ、Ｌｃｋ、ＣａｍＫＩＩ、ＣＤ１９、ケラチン、アルブミン、ａＰ２、インスリン、ＭＣＫ、ＭｙＨＣ、ＷＡＰ、Ｃｏｌ２Ａ、Ｍｘ、ｔｅｔ及びＴｒｅｘプロモーターから選択される、請求項６に記載のプロモーター。
【請求項８】
前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質を含み、前記蛍光タンパク質が、真核生物細胞中で、より高いエネルギーの光子を吸収し、かつより低いエネルギーの光子を放出し得るタンパク質である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記蛍光タンパク質が、青色／ＵＶ蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、遠赤色蛍光タンパク質、近赤外線蛍光タンパク質、ロングストロークシフト蛍光タンパク質、光活性化可能蛍光タンパク質、光変換可能蛍光タンパク質、及び光切り替え可能蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
蛍光タンパク質が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ（配列番号２）、及びＤｓＲｅｄ（配列番号３）から選択される、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記スプライスドナー部位が、スプライソソームによってスプライシングされ得るイントロンの開始時の機能的ＤＮＡ配列である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記イントロンの５’末端の第１のヌクレオチドがＧである、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記スプライスアクセプター部位が、スプライソソームによってスプライシングされ得る末端の機能的ＤＮＡ配列である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記イントロンの３’末端の最後のヌクレオチドがＧである、請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記組換え部位の両方が同一である、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記組換え部位の両方が同一ではない、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記組換え部位の１つが突然変異組換え部位である、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
少なくとも１つの組換え部位が、ｌｏｘｐ（配列番号４）、ｆｒｔ（配列番号５）、ｒｏｘ（配列番号６）、Ｖｌｏｘ、Ｓｌｏｘ、ａｔｔＲ、ａｔｔＬ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、またはＩＲ／ＤＲ配列からなる野生型組換え部位である、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
前記組換え部位の１つが、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、ｌｏｘＮ、ｌｏｘｐ５１７１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、ＦＬ−ＩＬ  １０Ａ、Ｖｌｏｘ２２７２、Ｓｌｏｘ２２７２、ＶｌｏｘＭ１、ＳｌｏｘＭ２、ＶｌｏｘＭ２、ＳｌｏｘＭ２、Ｖｌｏｘ４３Ｒ、Ｖｌｏｘ４３Ｌ、Ｓｌｏｘ１Ｒ、またはＳｌｏｘ１Ｌからなる群より選択される、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項２０】
前記リコンビナーゼが、２つの組換え部位の間の配列を欠失または反転し得る酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記リコンビナーゼが、組換え部位の２つの間の配列を欠失または反転し得る酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｄｒｅ、Ｖｃｒｅ、Ｓｃｒｅ、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、ＰｈｉＣ３１、またはスリーピングビューティートランスポゾンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種配列がエキソントラッピング配列をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記エキソントラッピング配列がＥＮ２エキソントラッピング配列（配列番号７）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記３’相同性アームが、第２の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む前記異種配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記異種配列が、第２のレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のレポータータンパク質が第２の蛍光タンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のレポータータンパク質がβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項２６に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
前記レポータータンパク質が、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項２９】
蛍光タンパク質が、青色／ＵＶ蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、遠赤色蛍光タンパク質、近赤外線蛍光タンパク質、ロングストロークシフト蛍光タンパク質、光活性化可能蛍光タンパク質、光変換可能蛍光タンパク質、及び光切り替え可能蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項８に記載の核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部位特異的組換えによって導入された少なくとも１つのレポータータンパク質をコードするＤＮＡ配列の活性化による遺伝子改変のモニタリング及び可視化に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患に関与すると仮定された特定の遺伝子（複数可）を改変または欠失（切除）することによって、非ヒト哺乳動物のヒト疾患をモデル化することは一般的である。
【０００３】
一般的に用いられる技術は、動物モデルにおいて遺伝子全体またはその必須部分を除去することである。これを達成するには、少なくとも２つの方法がある。第一に、この遺伝子は、初期段階で生殖細胞段階から除去してもよく、これは「ノックアウト」とも呼ばれる。ノックアウト動物では、あらゆる細胞に遺伝子欠失がある。多くの遺伝子が胚発生に必須であるので、胚死が起こる場合がある。
【０００４】
この問題を解決するために、条件付きノックアウトと呼ばれる第２の技術が開発され、ここでは、特定の遺伝子が寿命の早期ではなく特定の組織及び時間で欠失され得る。これは、一般に、Ｃｒｅのような特定のリコンビナーゼの転写を活性化することによって行われる。リコンビナーゼは、部位が同じ方向を向いている場合、２つの組換え部位の間の配列を欠失させる。リコンビナーゼの発現は、それ自身の遺伝子プロモーターによって制御されるので、標的遺伝子の欠失は、このプロモーターが活性化する場所及び時期によって決定される。
【０００５】
一般的に使用されるプロモーターは、どこで（例えば、どの組織において）、及びいつ（例えば、生理学的ストレッサーの発達段階または存在）それらがリコンビナーゼの発現を駆動するかという観点からは十分には定義されていない。研究者が、遺伝子がどこでいつ欠失されたかを追跡することに戻ったとき、彼らは大変な問題に直面した。臓器は多くの異なる細胞及び細胞型から構成され、レポーターなしで、研究者らはその欠失がいつどこで生じたかを正確に知ることができなかった。
【０００６】
従って、遺伝子が条件付きノックアウトモデルにおいていつどこで欠失されたかをモニタリング及び可視化する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本明細書に記載の実施形態の概略図を示す。
【図２】本明細書に記載の条件付き構築物の実施形態の概略図を示す。
【図３】本明細書に記載の方法の概略図を示す。
【図４】図３の方法で利用できるエキソントラッピング配列を示す。
【図５】本明細書に記載の別の実施形態の概略図を示す。
【図６】実験例１のベクターの概略図を示す。
【図７】実験例２のベクターの概略図を示す。
【図８】実験例３のベクターの概略図を示す。
【図９】図９ａは、実験例４のベクターの概略図を示す。図９ｂは、実験例５のベクターの概略図を示す。
【図１０】図１０ａは、マウスＳＬＣ３９Ａ４遺伝子の標的化ベクターによる標的対立遺伝子の概略図を示す。図１０ｂは、ＥＮ２エキソントラッピング部位を付加したマウスＢａｓｉｇｉｎ遺伝子の標的化ベクターによる標的対立遺伝子の概略図を示す。図１０ｃは、ＥＮ２エキソントラッピング部位を有する異なるマウス遺伝子、ＫＬＨＬ１２の標的対立遺伝子の概略図を示す。
【図１１】実施例１で生成された緑色蛍光を示す。
【図１２】実施例２で生成された緑色蛍光を示す。
【図１３】実施例３で生成した赤色蛍光を示す。
【図１４】マウスＳＬＣ３９Ａ４遺伝子の標的ＥＳクローンについてのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１５】標的化されたＳＬＣ３９Ａ４遺伝子を、Ｃｒｅリコンビナーゼ含有マウスと交配することによって生成された緑色蛍光を示す。
【図１６ａ】図１６ａ及び図１６ｂは、マウスＢａｓｉｇｉｎ遺伝子の標的ＥＳクローンについてのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１６ｂ】図１６ａ及び図１６ｂは、マウスＢａｓｉｇｉｎ遺伝子の標的ＥＳクローンについてのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１７】標的化されたＢａｓｉｇｉｎ遺伝子を、Ｃｒｅリコンビナーゼ含有マウスと交配することによって生成された緑色蛍光を示す。
【図１８ａ】図１８ａ及び図１８ｂは、マウスＫＬＨＬ１２遺伝子の標的ＥＳクローン及びマウス腸細胞で同定された緑色蛍光についてのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１８ｂ】図１８ａ及び図１８ｂは、マウスＫＬＨＬ１２遺伝子の標的ＥＳクローン及びマウス腸細胞で同定された緑色蛍光についてのサザンブロット分析の結果を示す。
【図１９】ＫＬＨＬ標的マウスをＩＬ１７駆動Ｃｒｅリコンビナーゼと交配させ、緑色蛍光が、マウス腸細胞において共焦点顕微鏡によって観察された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に記載の実施形態は、動物におけるヒト疾患モデル化に関連する問題に対する独特の解決策を提供する。条件付き遺伝子ノックアウトは、伝統的な遺伝子ノックアウト技術によって引き起こされる胚死を回避するために、ヒト疾患をモデル化するためにしばしば使用される方法である。条件付き遺伝子ノックアウト法は、部位特異的リコンビナーゼ及びその組換え部位を含む。リコンビナーゼは、これらの組換え部位の２つの間で配列（標的配列）を欠失または逆転させる。このように、リコンビナーゼの発現は、特定することが困難な、標的配列がどこでいつ欠失されるか、または逆転されるかを制御する。１つの実施形態では、組換え核酸構築物が提供され、この構築物は、上流から下流の順序で、及び／または作動可能に接続されたプロモーター配列、Ｎ末端を含むレポータータンパク質の第１の部分をコードする核酸配列（ここで上記第一部分は、レポーター発現を提供するには不十分である）、スプライスドナー部位、異種核酸配列、スプライスアクセプター部位、Ｃ末端を含むレポータータンパク質の第２の部分をコードする核酸配列、ならびにポリ（Ａ）シグナル配列を含む。ある実施形態では、プロモーターは、真核生物細胞において下流の配列の遺伝子発現を駆動し得る核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、真核生物細胞における、遍在性プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または構成的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＡＧ（配列番号１）、ＣＡＧＧＳ、ＣＭＶ、ｈＣＭＶ、ＥＦ１、ＰＧＫ、ＦＡＢＰ、Ｌｃｋ、ＣａｍＫＩＩ、ＣＤ１９、ケラチン、アルブミン、ａＰ２、インスリン、ＭＣＫ、ＭｙＨＣ、ＷＡＰ、Ｃｏｌ２Ａ、Ｍｘ、ｔｅｔ、及び／またはＴｒｅｘプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、レポートタンパク質は、蛍光タンパク質及び他のタンパク質を含む。蛍光タンパク質は、より高いエネルギーの光子を吸収し、より低いエネルギーの光子を真核細胞で放出することができるタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、青色／ＵＶ蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、遠赤色蛍光タンパク質、近赤外線蛍光タンパク質、ロングストロークシフト蛍光タンパク質、光活性化可能蛍光タンパク質、光変換可能蛍光タンパク質、及び／または光切り替え可能蛍光タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ（配列番号２）及び／またはＤｓＲｅｄ（配列番号３）であり得る。レポータータンパク質の他の非限定的な例としては、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、スプライスドナー部位は、スプライソソームによってスプライシングされ得る機能的ＤＮＡ配列であってもよい。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、異種配列、スプライスドナー配列及び／またはスプライスアクセプター配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、イントロンは５’末端（スプライスドナー部位の一部）を有し、ここでイントロンの５’末端の第１のヌクレオチドは、Ｇヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、イントロンは３’末端（スプライスアクセプター部位の一部）を有し、ここでイントロンの３’末端の最後のヌクレオチドもまたＧであってもよい。いくつかの実施形態では、スプライスドナー部位は、スプライソソームによってスプライスアクセプターにスプライシングされる、機能的なＤＮＡ配列であってもよい。
【００１０】
一実施形態では、蛍光タンパク質をコードする条件付きポリヌクレオチド配列及び分割されたポリヌクレオチド配列をマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入する方法が記載され、この方法は、ＤＮＡ標的化ベクターを構築することであって、順番に及び／または作動可能に接続された、５’相同性アーム、上記の組換え核酸構築物（異種配列が、２つの組換え部位に隣接する標的配列を含む）、３’相同性アームを含み、ここで、このＤＮＡ標的化ベクターは、５’相同性アームと３’相同性アームとの間に挿入された抗生物質選択マーカー遺伝子をさらに含む、ＤＮＡ標的化ベクターを構築すること、ＤＮＡ標的化ベクターをＥＳ細胞に導入すること、及び標的クローンのＥＳ細胞を選択することを包含する。いくつかの実施形態では、両方の組換え部位は同一である。いくつかの実施形態では、組換え部位の両方が異なるか、または同一ではない。いくつかの実施形態において、組換え部位の１つは、突然変異組換え部位であってもよい。いくつかの実施形態では、組換え部位は野生型組換え部位であってもよい。いくつかの実施形態では、野生型組換え部位は、ｌｏｘＰ（配列番号４）、ｆｒｔ（配列番号５）、ｒｏｘ（配列番号６）、Ｖｌｏｘ、Ｓｌｏｘ、ａｔｔＲ、ａｔｔＬ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢまたはＩＲ／ＤＲ配列であってもよい。いくつかの実施形態において、組換え部位は、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、ｌｏｘＮ、ｌｏｘｐ５１７１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、ＦＬ−ＩＬ  １０Ａ、Ｖｌｏｘ２２７２、Ｓｌｏｘ２２７２、ＶｌｏｘＭ１、ＳｌｏｘＭ２、ＶｌｏｘＭ２、ＳｌｏｘＭ２、Ｖｌｏｘ４３Ｒ、Ｖｌｏｘ４３Ｌ、Ｓｌｏｘ１Ｒ、及び／またはＳｌｏｘ１Ｌであってもよい。
【００１１】
ある実施形態では、遺伝子欠失を報告する方法が記載されており、この方法は、上記のようなＤＮＡ標的化ベクターを構築すること、標的化された生殖系列マウスを作製すること、標的マウスをリコンビナーゼ発現マウスと交配させること、その組換え部位間での組換えによる標的配列を除去することによって蛍光タンパク質を活性化することを包含する。いくつかの実施形態では、第２の蛍光タンパク質をコードする配列を標的配列に含めてもよく、その結果、標的配列の除去によって第２の蛍光タンパク質の発現も除去し、例えば、蛍光を第二の放射された蛍光から第一へ変化するか、または、例えば、赤色から緑色（ＧＦＰ）に変化する蛍光タンパク質放射を示す。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、２つの組換え部位の間で配列を欠失または逆転し得る酵素であり得る。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、その認識可能な２つの部位の間で配列を欠失または逆転し得る酵素であり得る。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｄｒｅ、Ｖｃｒｅ、Ｓｃｒｅ、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、ＰｈｉＣ３１、及び／またはスリーピングビューティートランスポーゼースであってもよい。
【００１２】
発明の詳細な説明
核酸配列及び／または遺伝子配列という用語は、それと少なくとも最小量の相同性を有するヌクレオチド配列を指す。例えば、特定された配列番号は、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％及び／または同一の核酸配列を有する配列を含んでもよい。
【００１３】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、真核生物細胞において遺伝子の転写を開始し得る任意のポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターの配列は、典型的には、真核生物、ウイルスまたは人工の配列に由来するが、これに限定されない。
【００１４】
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、配列の上流及び下流に１つの組換え部位を有するヌクレオチド配列を指す。リコンビナーゼの作用の際に、標的配列は、その元の状態及び／または天然の状態から改変され得る。これは、限定されるものではないが、欠失、逆転であってもよい。
【００１５】
本明細書中で使用される「イントロン」という用語は、遺伝子の転写領域内にまたはメッセンジャーＲＮＡ前駆体内に存在するヌクレオチド配列を指し、このヌクレオチド配列は、翻訳前にメッセンジャーＲＮＡ前駆体から宿主細胞によって切り出されてもまたはスプライシングされてもよい。本発明の一実施形態での使用に適したイントロンの配列は、天然に存在してもよいし、または人工配列であってもよい。人工配列は、スプライスドナー及びアクセプター配列を含んでもよく、他の配列は、ドナー及びアクセプター配列を接続する。
【００１６】
本明細書で使用される「異種配列」という用語は、ヌクレオチド配列を指し、外来、すなわち、遺伝子改変が起こる生物において天然には見出されないなどの「外因性」を指す。生物において自然発生した配列は、「内因性」配列と呼ばれる。異種ヌクレオチド配列を含む核酸配列は、内因性ヌクレオチド配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なってもよい。具体的には、異種ヌクレオチド配列とは、天然の生物の細胞と同じ関係では見出されない配列である。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、内因性配列とは完全に異なっていてもよい。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、内因性配列と相同性である。
【００１７】
本明細書で使用される「エキソン」という用語は、イントロンがＲＮＡスプライシングによって除去された後に遺伝子によって産生される最終的な成熟ＲＮＡの一部をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００１８】
エキソンという用語は、遺伝子内のＤＮＡ配列及びＲＮＡ転写物中の対応する配列の両方を指す。ＲＮＡスプライシングでは、成熟メッセンジャーＲＮＡを生成する過程の一部として、イントロンを取り除き、エキソンを互いに共有結合させ、これを次にタンパク質に翻訳する。
【００１９】
本明細書で使用される「蛍光タンパク質」という用語は、タンパク質であって、より高いエネルギーの光子（励起）を吸収し得、分子（フルオロフォア）から、より低エネルギーの光子を放出し得るか、または前の吸収からタンパク質の内部の２つ以上の分子の放出をし得るタンパク質を指す。
【００２０】
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」という用語は、単一のヌクレオチド配列上に物理的に分離されている規定された部位か、またはその部位が別個のヌクレオチド配列上に存在する規定された部位の間の部位特異的組換えを促進し得る酵素群を指す。規定の組換え部位のヌクレオチド配列は必ずしも同一でなくてもよい。
【００２１】
本明細書で使用される「組換え部位」という用語は、特定のヌクレオチド配列がリコンビナーゼによって組換えられ得ることを指す。野生型組換え部位及び突然変異組換え部位が存在し得る。典型的には、野生型組換え部位は、天然に、具体的には、相同なファージ／細菌系で生じる。突然変異組換え部位とは、その部位がその野生型組換え部位の配列と同一の配列を有していない場合でさえ、リコンビナーゼが組換えを促進し得る部位を指す。リコンビナーゼは、野生型及び突然変異組換え部位の両方に結合し得る。広範な実施形態では、本発明の文脈において本明細書で使用される「突然変異体」という用語は、例えば、サイズ変動、例えば、伸長もしくは断片化、突然変異、ハイブリダイゼーション（配列の組合せを含む）、または特定の程度の相同性、または類似性によって、親配列（野生型）に由来する任意の配列を具体的に指すものとする。
【００２２】
本明細書で使用される「ハイブリッド組換え部位」とは、野生型及び／または擬似組換え部位の部分から構築された組換え部位を指す。例えば、野生型組換え部位は、パリンドロームに隣接する短いコア領域を有し得る。「ハイブリッド組換え部位」の一実施形態において、ハイブリッド組換え部位の短いコア領域配列は、擬似組換え部位のコア配列に一致し、ハイブリッド組換え部位のパリンドロームは、野生型組換え部位と一致する。代替の実施形態では、ハイブリッド組換え部位は、突然変異組換え部位由来の隣接部位及び野生型組換え部位由来のコア部位から構成され得る。
【００２３】
本明細書で使用される「エキソントラッピング」という用語は、ヌクレオチド配列が、転写中にスプライシングをエキソンの上流からそれ自体に強制するスプライスアクセプターを、含むことを意味する。典型的には、エキソントラッピング配列は、ＲＮＡスプライスを通じてトラッピングされることが意図され得るエキソンのすぐ下流のイントロンに挿入され得る。得られた配列は、エキソンの最初の部分とのハイブリッドメッセージとして転写されてもよく、ハイブリッドタンパク質が産生され得る。
【００２４】
本明細書で使用する「ポリ（Ａ）シグナル」という用語は、典型的には、ポリアデニル化複合体によって認識され、メッセンジャーＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加するポリアデニル化を開始及び実行するヌクレオチド配列を指す。ポリ（Ａ）テールは、アデニン塩基のみを有する一連のＲＮＡであり得る複数のアデノシン一リン酸から構成され得る。真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳のための成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するプロセスの一部であり得る（Ｗａｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．１２（２）：５８５−５９４．（１９９３））。ポリアデニル化のための配列エレメントは、ポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）シグナル）及びポリアデニル化部位（ポリ（Ａ）部位）を含む。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡにおいて、付加された一連のポリアデノシン一リン酸は、ポリアデニル化テール（ポリ（Ａ）テール）であってもよい。ポリ（Ａ）シグナルの典型的な配列は、限定するものではないが、ＡＡＴＡＡＡであってもよいが、他の同様の配列がまた、ポリアデニル化複合体によるポリ（Ａ）シグナルとして用いられてもよい（Ｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２９（１３）：ｉ１０８−ｉ１１６（２０１３））。多くのタンパク質コード遺伝子は、２つ以上のポリアデニル化部位を有し得るので、遺伝子はそれらの３’末端が異なるいくつかのｍＲＮＡをコードし得る（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３３（１）：２０１−１２．（２００５））。
【００２５】
本明細書で使用する「機能的蛍光タンパク質」という用語は、より高いエネルギーの光子（励起）を吸収し得、分子（フルオロフォア）から、より低エネルギーの光子を放出し得るか、または前の吸収からタンパク質の内部の２つ以上の分子（フルオロフォア）を放出し得るタンパク質を指す。前記タンパク質によって生成された蛍光は、光学検出器によって検出することができる。
【００２６】
本明細書で使用する「蛍光発現」という用語は、蛍光タンパク質を通じて生成された蛍光が光検出器によって検出可能であることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用する「二重蛍光レポーター」という用語は、同じ細胞内に異なる波長を有する２つの蛍光タンパク質が存在することを指す。いくつかの態様において、１つはオンになってもよい。他の態様では、両方ともオフまたはオンである。
【００２８】
本明細書中で使用される「スプライストラッピングアクセプター部位」という用語は、あるヌクレオチド配列が、転写中に上流の任意のエキソンからそれ自体にスプライシングを強制することを指す。典型的には、スプライストラップアクセプター部位は、ＲＮＡスプライシングを通じてトラッピングされることを意図したエキソンのすぐ下流のイントロンに挿入されてもよい。得られた配列は、エキソンの最初の部分とのハイブリッドメッセージとして転写されてもよく、ハイブリッドタンパク質が産生され得る。スプライストラッピングアクセプター部位は、限定するものではないが、自然発生スプライスアクセプター、人工スプライスアクセプター、またはコンピュータ支援プログラムによって生成されたアクセプターから構成されてもよい。
【００２９】
本明細書で用いられる「遺伝子改変」という用語は、内因性ヌクレオチド配列の挿入及び欠失を含む少なくとも１つのヌクレオチド変化を指す。
【００３０】
本明細書で用いられる「相同組換え」という用語は、ＤＮＡの２つの類似または同一の分子間でヌクレオチド配列が交換される、一種の遺伝子組換えを指す。
【００３１】
本明細書で使用する「遺伝子標的化」という用語は、相同組換えを用いて内因性遺伝子を変化させる遺伝子技術を指す。具体的には、導入されたＤＮＡ断片と天然染色体との中に含まれる相同領域間の組換えは、染色体の一部を遺伝子操作ＤＮＡに置換する。
【００３２】
本明細書で使用される「標的化ベクター」という用語は、２つの相同性アーム、例えば５’及び３’相同性アーム、抗生物質選択マーカー遺伝子、及び２つの相同性アーム間の他の配列を含むＤＮＡ配列を指すものとする。標的化ベクターは、標的化構築物と同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書で使用される場合「５’及び３’相同性アーム」という用語は、相同組換えが起こる内因性ＤＮＡ配列と同一であるかまたは有意な相同性を有する標的化ベクター中のＤＮＡ配列を指す。相同性は、８０％〜１００％の範囲であってもよい。
【００３４】
本明細書で使用する「５’及び３’相同性アーム内の抗生物質選択マーカー遺伝子」という用語は、抗生物質選択マーカー遺伝子が標的化ベクター内の多くの位置に挿入され得ることを指す。それは、限定するものではないが、５’ＧＦＰ、３’ＧＦＰ、組換え部位、ポリ（Ａ）シグナル、プロモーター、標的配列の次に配列を挿入されてもよい。抗生物質選択マーカー遺伝子は、ＦＬＰ組換え系のような異なる組換え系からの２つの組換え部位、例えばｆｒｔ部位に隣接される場合が多い。標的化または標的化プロセス中に、抗生物質選択マーカー遺伝子は、第２のリコンビナーゼを導入することによって除去されてもよい。一般に、抗生物質選択マーカー遺伝子の挿入は、限定するものではないが、機能的エキソン、機能的プロモーター、機能的スプライス部位、機能的組換え部位、機能的標的配列、機能的ポリ（Ａ）配列、ＧＦＰをコードする機能的５’及び３’ＤＮＡ、５’及び３’相同性アームを避けるべきである。典型的には、選択マーカー遺伝子の挿入は、標的ベクター内の遺伝子の機能的部分及び他の導入された配列を妨害しないか、または実質的に干渉しないであろう。
【００３５】
本明細書で使用される「スプライソソーム」という用語は、主に真核生物細胞の細胞核のスプライシングスペックル内に見出される複合分子機械を指す。スプライソソームは、ｓｎＲＮＡ及びタンパク質複合体からアセンブルされ得る。スプライソソームは、一次転写物の一種である、転写されたプレｍＲＮＡからイントロンを除去する。このプロセスは、一般にスプライシングと呼ばれる。
【００３６】
本明細書中で使用される「標的生殖細胞系マウス」という用語は、その生殖細胞系において標的化された改変を保有するマウスを意味するものとする。この標的改変は次世代に引き継がれ得る。
【００３７】
本明細書で使用する「レポーター」という用語は、生物内で容易に同定及び測定することができるタンパク質をコードする遺伝子を意味するものとする。レポーターは、選択マーカーとして使用されてもよい。レポーターは、特定の遺伝子が細胞集団または生物集団によって取り込まれたか、または発現されたかの指標としてしばしば使用され得る。
【００３８】
図１には、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質を、スプライスドナー及びアクセプター配列を有する異種配列によって、少なくとも２つの部分に分割する基本概念が示されている。蛍光タンパク質は、２つの部分、例えば、５’部分及び３’部分に分けることができる。図１の５’部分をプロモーター配列に連結し、３’部分をポリ（Ａ）配列に連結した。本明細書に記載される一実施形態は、レポーターとしてしばしば使用されるように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質が利用され得ることであってもよい。一旦、発現されると、レポーター蛍光タンパク質は、蛍光顕微鏡または他の蛍光検出装置の下での観察によって検出され得る。リコンビナーゼによって遺伝子がいつどこで欠失されたかを観察するために、レポーターは、リコンビナーゼの作用の前に、非活性または実質的に非活性のまま、例えばＧＦＰについては、非緑色であるか、または実質的に非緑色である必要がある。リコンビナーゼの作用及び標的遺伝子の除去の後、レポーターは、標的遺伝子がどこでいつ欠失されたかを示すために、標的細胞において活性または実質的に活性、例えば緑色であるか、または実質的に緑色である必要がある。いくつかの実施形態では、非常にしばしば標的遺伝子プロモーターが検出可能蛍光を生成するほど強くない場合があり、天然遺伝子間にプロモーター強度の大きな変動があるので、標的遺伝子由来の内因性プロモーターは使用しない。
【００３９】
従来、動物モデル作製の分野において、ＧＦＰは、単一の一連のポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸の単一の直鎖として主に使用されていた。
【００４０】
本発明によれば、一連のポリヌクレオチド配列をレポーター、例えばＧＦＰの所定のコード領域に挿入し、レポーター（例えば、ＧＦＰ）を少なくとも２つの部分（または２つの部分）、例えば、Ｎ末端部分及びＣ末端部分に分割する。一実施形態では、少なくともＮ末端部分（第１の部分）は、レポーターシグナル、例えば、緑色蛍光を生成することができない。いくつかの実施形態では、レポーターシグナル、例えば緑色蛍光を生成することは部分でも一部分でもできない。挿入された一連の配列は、ＲＮＡスプライソソームによってスプライシング除去され得るイントロンスプライシングエレメントを含んでもよい。
【００４１】
リコンビナーゼの作用の前に標的遺伝子発現をインタクトまたは実質的にインタクトに保つために、いくつかの実施形態では、遺伝子の機能に不可欠であり得る標的遺伝子及び／または領域は、２つの組換え部位例えば、第１及び第２の組換え部位に隣接し得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の組換え部位は、所望の欠失した配列がそれぞれ開始及び終了する位置であり得る。理論によって制限されることを望むわけではないが、遺伝子改変を最小限に保つことは、これら２つの組換え部位及び他の遺伝子改変体の挿入中に妨げられない標的遺伝子発現の利益を提供し得ると考えられる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｌｏｘＰ部位は、余分な改変配列、例えば、制限酵素部位及び他の有用な配列のような他の配列を有してもよい。いくつかの実施形態では、組換え部位は同一であっても異なっていてもよい。
【００４２】
ある実施形態では、レポーター、例えば蛍光タンパク質をコードする配列は、標的遺伝子の転写の反対方向に配置することができる。前記レポーター（例えば、蛍光タンパク質）のＮ末端部分または第１の部分は、プロモーターと一緒に、標的遺伝子の３’末端に、標的遺伝子のポリＡシグナルの後ろに、第１の組換え部位とともに挿入されてもよい。いくつかの実施形態において、第１組換え部位は、ｌｏｘＰ部位であっても、またはＲｏｘであってもよい。いくつかの実施形態では、別のｌｏｘＰ及び／またはＲｏｘ部位などの第２組換え部位を有するレポーターのＣ末端部分、例えば蛍光タンパク質を、標的遺伝子のイントロンに挿入してもよい。第２の組換え部位の配置は、限定するものではないが、標的配列が機能配列を含むように、標的配列をどのくらい長く欠失する必要があるかによって決定され得る。標的遺伝子が欠失されると、それは生物体、より具体的には動物の表現型の変化につながる可能性がある。
【００４３】
リコンビナーゼの発現の際に、２つの組換え部位の間の標的遺伝子を欠失させてもよく、これによって、Ｎ末端及びＣ末端をコードする配列をはるかに短いイントロンと一緒にし得る。Ｎ末端はそれ自体のプロモーターを有するので、このプロモーターは、レポーター（例えば、蛍光タンパク質）のＮ末端、イントロン、及びＣ末端のコード領域を含むＲＮＡの発現を駆動し得る。ＲＮＡスプライソソームは、ＲＮＡ配列を、Ｎ末端とＣ末端をスプライシングし、一緒にしてｍＲＮＡを作り出し得る。このｍＲＮＡは、蛍光タンパク質などの完全なレポーターをコードし、特定の波長による励起時にレポーターシグナル（例えば、蛍光）をオンにする。
【００４４】
１つの実施形態において、Ｎ末端レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードする配列が、外来配列の挿入の影響を最小限に抑えるために、機能的レポーター（例えば、蛍光タンパク質）を生成できない限り、レポーターのＣ末端部分（例えば、蛍光タンパク質）はできるだけ小さく保持され得る。
【００４５】
別の実施形態では、前記プロモーターは、柔軟性及び多様性を提供する標的遺伝子プロモーターとは独立して選択され得る。研究者は、限定するものではないが、偏在性、細胞特異的及び誘導性であるプロモーターの中からプロモーターを選択し得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、組換え核酸構築物が記載されており、この構築物は、上流（５’末端）から下流（３’末端）の順序で、及び／または作動可能に互いに連結された、プロモーター配列、レポーターのＮ末端を含む第１の部分の遺伝子産物（例えば、蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする核酸配列であって、この第１の部分のタンパク質産物は、レポーター発現（例えば、蛍光発現）を提供するには不十分である配列、スプライスドナー部位、異種核酸配列、スプライスアクセプター部位、レポーター（例えば、蛍光タンパク質）のＣ末端を含む第２の部分のタンパク質遺伝子産物をコードする核酸配列、及びポリ（Ａ）シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｐＣＡＧであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、目的の細胞においてその下流配列の発現を開始するのに十分な強度の配列である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、ほとんどの細胞においてその下流配列の発現を開始するのに十分な強度である。いくつかの実施形態では、配列の第１及び第２の部分がスプライスドナー及びアクセプターを含む異種配列によって連結されない限り、蛍光は生成され得ない。それらが接続されると、ＲＮＡスプライソソームは、スプライスドナー及びアクセプターを含む異種配列をススプライシングし、第１及び第２の部分を一緒にさせて、機能的レポーター（例えば、機能的蛍光タンパク質）に翻訳され得る完全なレポーター配列（例えば、蛍光タンパク質配列）を形成し得る。
【００４７】
図２に示すように、図１のさらなる開発された構築物が提供される。異種配列は、２つの組換え部位が隣接する標的配列からなる。この標的配列は、遺伝子改変が起こり得る目的のある配列であり得る。いくつかの実施形態では、構築物は、５’相同性アーム及び３’相同性アーム、２つの組換え部位、ならびに標的化ベクターを形成するための遺伝子操作のための目的の配列をさらに含んでもよい。
【００４８】
図３に示すように、いくつかの実施形態では、蛍光をオンにする方法が記載されており、この方法は、図２のさらなる開発された構築物をリコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼに曝すことを包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、（ステップ１）、図２に記載された配列を含むＤＮＡ構築物を構築することを包含してもよく、標的遺伝子は内因性遺伝子の一部である。この構築物は、標的挿入のための５’及び３’相同性アームをさらに含んでもよい。本発明によるＤＮＡ構築物は、適切な薬物による選択を提供するための抗生物質選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、この方法は、（ステップ２）、（ａ）ＤＮＡ構築物を細胞、例えば、マウス胚性幹細胞に導入するステップ、（ｂ）標的化されたクローンをスクリーニングするステップ、及び／または（ｃ）標的クローンに由来するマウス、例えば条件付きマウスを生成するステップを包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法は、（ステップ３）、前記条件付きマウスとリコンビナーゼ含有マウスとを交配させることを包含し得る。リコンビナーゼは、標的配列、例えば、欠失の標的遺伝子を含む組換え部位の間の配列を除去し、例えば、５’及び３’蛍光部分を一緒にスプライシングすることにより、蛍光タンパク質をコードする５’及び３’配列を作動可能に一緒にし得る。配列の５’部分に連結されたプロモーターは、完全な蛍光タンパク質に翻訳され得る全ＲＮＡを生成するためにＲＮＡスプライソソームによってスプライシングされ得る、５’及び３’配列を含むＲＮＡの発現を駆動し得る。図３はさらに、蛍光タンパク質をコードする５’及び３’部分配列が、標的遺伝子の反対方向に挿入され得ることを示す。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質をコードする分割されたポリヌクレオチド配列をマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入し、標的化されたクローンを選択する方法が記載される。別の実施形態では、この方法は、ＥＳ細胞を用いて標的生殖系列マウス（条件付き）を生成すること、前記マウスをリコンビナーゼ含有マウスと交配させることをさらに包含する。リコンビナーゼは、第２世代のマウスにおいて２つの組換え部位を認識し得、遺伝子操作のための目的の配列を含むこれらの２つの部位の間の配列を欠失し得る。目的の配列が欠失している場合、蛍光タンパク質をコードする配列の第１及び第２の部分を、ＲＮＡスプライソソームによって一緒にスプライシングして、完全な蛍光タンパク質をコードする配列を形成してもよい。翻訳の際に、特定の波長の光に細胞を曝露することによって蛍光を生成して、細胞内のリコンビナーゼによる欠失事象を示してもよい。蛍光は、蛍光タンパク質によって生成された放射波長を受容するかまたは読み取ることができる系によって検出され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、プラスミドが記載されており、このプラスミドは上記の核酸構築物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞が記載され、このゲノムは上記の核酸構築物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットが記載されており、このキットは上記のような核酸構築物の成分を含んでもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼが記載されており、このリコンビナーゼは、上記の組換え部位、例えばｌｏｘＰを認識するか、及び／またはｌｏｘＰと反応し得る。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ（配列番号１９）であってもまたはコドン最適化ｉＣｒｅであってもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（配列番号２）、または赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）（配列番号３）の選択であってもよい。いくつかの実施形態において、レポータータンパク質は、β−ｇａｌ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼであってもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、構築物は標的配列を含んでもよい。図４は、エキソントラッピング配列を図３に記載されているような構築物に挿入して、リコンビナーゼに対する曝露の前に、５’部分が蛍光タンパク質の３’部分にススプライシングするのを防ぎ得ることを示す。エキソントラッピング配列は、２つの組換え部位内に挿入されてもよい。組換え部位（複数可）という用語は、リコンビナーゼによって認識されるかまたはリコンビナーゼと結合して、リコンビナーゼの作用によって配列の切除を可能にする核酸配列を指す。リコンビナーゼを露出させる前に、５’部分を３’部分配列の代わりにエキソントラッピング配列にススプライシングしてもよい。リコンビナーゼに曝露した後、エキソントラッピング及び標的配列を含む配列を除去してもよく、これによって、図３に記載されるように、５’部分を３’部分と一緒にして蛍光タンパク質の完全な発現を開始させた。
【００５３】
いくつかの実施形態では、標的配列は、エキソンをトラッピングし得る配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この配列は、ＥＮ２エキソントラッピング配列（配列番号７）を含んでもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質のＮ末端をコードする配列の第１の部分は、ＡＴＧ開始部位を有する。いくつかの実施形態では、異種配列は、遺伝子改変が起こる生物体由来の内因性配列の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、異種配列は、少なくとも１つの組換え部位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、異種配列は、少なくとも２つの組換え部位を含んでもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、図５に示すように、本明細書に記載の方法は、二重蛍光タンパク質、例えば、赤及び緑を利用して、細胞内のリコンビナーゼに曝露する前後に色の切り替えを提供する。この実施形態において、リコンビナーゼに曝露する前に、細胞及び／または動物は、観察された赤色蛍光を発現する赤色蛍光タンパク質をコードする。リコンビナーゼに曝露した後、赤色蛍光タンパク質をコードする配列を除去し、緑色蛍光タンパク質を発現させてもよい。これによって、標的化配列の欠失を示す異なる方法が提供され得る。
【００５６】
プロモーター及びそれらの特定用途
いくつかの実施形態では、構築物はプロモーターを含んでもよい。典型的には、プロモーターは、遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域であり得る。一般に、プロモーターは、真核生物細胞において、遺伝子の転写開始部位の近く、ＤＮＡ鎖上の同じ鎖上（センス鎖の５’に向かって）に位置し得る（Ｇａｇｎｉｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３（１）：５１２．（２０１２））。一実施形態では、プロモーターは、天然に存在してもよいし、及び／または人工的ではない天然ＤＮＡ配列であってもよい。別の実施形態において、プロモーターは、人工的であってもよく、及び／または天然由来であってもよい。さらなる実施形態において、プロモーターは、人工ＤＮＡ配列及び非人工ＤＮＡ配列の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、異なる起源のプロモーターエレメントを組み合わせる複合プロモーターであってもよく、または遠位エンハンサーを同じ起源または異なる起源のプロモーターとアセンブルすることによって生成された複合プロモーターであってもよい。広義には、真核生物プロモーターは、遺伝子、特に、真核生物細胞における蛍光遺伝子または蛍光遺伝子の一部の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列であってもよい。
【００５７】
一実施形態では、真核生物プロモーターは、転写複合体の形成に関与し得る転写因子と呼ばれるタンパク質によって典型的に結合される調節配列を含み得る。複数の転写因子によって標的とされ得るいくつかのプロモーターは、過活動または低活性状態を達成し、転写活性の増大または減少を導く場合がある（Ｌｉｅｆｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．７（１）：６６（Ｊｕｎｅ  ２０１５））。
【００５８】
一実施形態では、プロモーターは、目的の特定の細胞に基づいて選択されてもよい。他の実験によって示唆された特定の生物学的プロセスに関与するこの特定の細胞においてある遺伝子の兆候がある場合、これらの細胞で遺伝子発現を駆動することが知られているプロモーターを選択してもよい。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、２つの組換え部位によって隣接され得る。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子は、２つのｌｏｘＰ部位に隣接してもよく、５’末端及び３’末端を含むＧＦＰカセットを遺伝子の反対方向に挿入してもよい。いくつかの実施形態では、配置された適切な突然変異体ｌｏｘＰを用いてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子がＣｒｅリコンビナーゼによって一旦欠失されると、このプロモーターはＧＦＰ発現を駆動し得る。遺伝子欠失の後に、元の構築物に予め分裂していたＧＦＰは、予想される細胞で作動し得、除去される介在標的遺伝子／所望の配列の除去または欠失が成功したことが示される。いくつかの実施形態では、実験は予想外になる可能性があり、その結果、Ｃｒｅリコンビナーゼは、異なる細胞タイプで、または計画したのとは異なるタイミングで標的細胞において発現された。いくつかの実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼは発現されているかもしれないが、遺伝子位置がクロマチン構造または他の染色体保護機構によって保護され得るため、標的細胞を除去できなかった。いくつかの実施形態では、望ましくない位置でＣｒｅの欠失が行われた可能性がある。典型的には、動物間に遺伝的変異及び後成的変異が存在し得る。欠失が行われた場所及びタイミングは、全ての動物が同じ遺伝子型を有するにもかかわらず、互いに大きく異なる可能性がある。実際には、プロモーターが作成する発現パターンを予測することは、不可能ではないにしても困難であり得る。
【００５９】
理想的には、Ｃｒｅリコンビナーゼのようなリコンビナーゼによって生じる欠失を追跡するために、欠失が起こり得る細胞内で５’−ＧＦＰを発現してもよい。典型的には、欠失事象は予測できなかったので、最も安全な方法の１つは、欠失を予期するためにあらゆる細胞において５’−ＧＦＰを発現させようと試みることであろう。５’−ＧＦＰそれ自体は機能的蛍光タンパク質を生成することができないので、欠失がない場合、細胞は蛍光を発しない。欠失が生じた場合にのみ、リコンビナーゼによる組換えは５’及び３’ＧＦＰ配列を一緒にして蛍光を発し得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、あらゆる細胞において遺伝子発現を駆動するプロモーターは、実際には存在し得ない。しかし、大部分の細胞で遺伝子発現を駆動し得るプロモーターはある。それらは多くの場合、偏在性プロモーターと呼ばれた。偏在性プロモーターは、広範囲の細胞、組織及び細胞周期において強力な発現駆動プロモーターである（Ｓｃｈｏｒｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４（９）：１７８７−１７８８．（１９９６））。それらのうちでも、限定するものではないが、ｐＣＡＧプロモーターは、多くの組織においてＧＦＰ発現を駆動し得る（配列番号１）。
【００６１】
ｐＣＡＧプロモーターは、以下の配列から、Ｄｒ  Ｊｕｎ−ｉｃｈｉ  Ｍｉｙａｚａｋｉの実験室で構築された（Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．７９（２）：２６９−７７．（１９８９）及びＮｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１０８（２）：１９３−９．（１９９１）：１）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、２）ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーター、第１エキソン及び第１イントロン、３）ウサギのβグロビン遺伝子のスプライスアクセプター。
【００６２】
ｐＣＡＧプロモーターは、多くの哺乳類発現ベクターにおいて高レベルの遺伝子発現を駆動するために高頻度に用いられる強力な合成プロモーターであり得る（Ｏｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５；４０７（３）：３１３−９．（１９９７）、及びＡｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：２（２００８）。
【００６３】
一実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼの導入前の標的細胞において、３’ＧＦＰが５’ＧＦＰ配列から遠く離れて位置し得るので、ｐＣＡＧはＧＦＰの５’部分の発現のみを駆動し得る。標的配列内には多くの潜在的なエキソントラッピング配列が存在し得る。転写された５’ＧＦＰは、３’ＧＦＰに到達し得ない場合があり、その後にそれが妨害される場合がある。利用可能な３’ＧＦＰがなければ、５’ＧＦＰは機能的でなく、蛍光に影響を及ぼし得る。結果として、蛍光は検出されない可能性がある。いくつかの実施形態において、転写された５’ＧＦＰは、標的細胞において常に利用可能であり得る。ｃｒｅリコンビナーゼの発現時にのみ、５’ＧＦＰ及び３’ＧＦＰを一緒にスプライシングして機能的ＧＦＰを産生させてもよく、これが次に、適切な励起の際に蛍光を発して、欠失がいつどこで起こったかを示し得る。
【００６４】
さらなる実施形態では、それらは、限定するものではないが、多くの偏在性プロモーターであり、これには以下が挙げられる：βアクチンプロモーター、ＥＦ１（伸長因子−１α）プロモーター、ＥＧＲ１（初期増殖応答１）プロモーター、ｅｌＦ４Ａ１プロモーター、ＦｅｒＨ（ヒトフェリチン重鎖）プロモーター、ＦｅｒＬ（ヒトフェリチン軽鎖）プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＰＲ７８（グルコース調節タンパク質７８）プロモーター、ＧＰＲ９４（グルコース調節タンパク質９４）プロモーター、ＨＳＰ７０（ヒートショックプロテイン７０）プロモーター、ベータ−Ｋｉｎプロモーター、ＰＧＫ−１（ホスホグリセレートキナーゼ１）プロモーター、ユビキチンＢプロモーター、ベータＡｃｔ／ＲＵ５’プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター。ＭＣ１（ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター。適切なプロモーターの非限定的な例としては、ＣＡＧＧＳ、ｈＣＭＶ、ＰＧＫ、ＦＡＢＰ、Ｌｃｋ、ＣａｍＫＩＩ、ＣＤ１９、ケラチン、アルブミン、ａＰ２、インスリン、ＭＣＫ、ＭｙＨＣ、ＷＡＰ、Ｃｏｌ２Ａ、Ｍｘ、ｔｅｔ、ユビキチンＣ及びＴｒｅｘプロモーターが挙げられる。
【００６５】
偏在性プロモーターとして、ポリメラーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ依存性プロモーターから選択される他のプロモーターが挙げられ、好ましくは、ポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ依存性プロモーターであり、例としては、ｓｎＲＮＡプロモーター、例えば、Ｕ６、ＲＮＡｓｅ  Ｐ  ＲＮＡプロモーター、例えば、Ｈ１、ｔＲＮＡプロモーター、７ＳＬ  ＲＮＡプロモーター、５Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターなどである。
【００６６】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、３つの他のタイプのプロモーターであってもよく、限定するものではないが、遺伝子発現の意図されたタイプの制御に従って使用され得る。いくつかの実施形態では、これらの他のプロモーターは、以下であってもよい：
１．構成的プロモーター。これらのプロモーターは、事実上全ての組織において発現を指示し、かつ環境的及び発生的因子とは完全には完全ではないにしても大部分は独立している。それらの発現は内因性因子によって通常は条件付けされないので、構成的プロモーターは通常、種にまたがって、さらには界にまたがっても活性である。
２．組織特異的または発達段階特異的なプロモーター。これらは、特定の組織（複数可）または発達の特定の段階で遺伝子の発現を指示する。組織特異的プロモーターとしては、ＦＡＢＰ（Ｓａａｍ＆Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３８０７１−３８０８２（１９９９））、Ｌｃｋ（Ｏｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６８６１−５（１９９２））、ＣａｍＫＩＩ（Ｔｓｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８７：１３１７−１３２６（１９９６））、ＣＤ１９（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１３１７−１３１８（１９９７））、ケラチン（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８：６７５−８８（２０１））、アルブミン（Ｐｏｓｔｉｃ＆Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６：１４９−１５０（２０００））、ａＰ２（Ｂａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５（１９９７））、インスリン（Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ．２５：１５７−６３（１９９９）、ＭＣＫ（Ｂｒｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ２：５５９−５６９（１９９８））、ＭｙＨＣ（Ａｇａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：１６９−１７９（１９９７））、ＷＡＰ（Ｕｔｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１０９１−１０９６（１９９９））、Ｃｏｌ２Ａ（Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２６：１４５−１４６（２０００））、誘導性プロモーター部位の例はＭｘ（Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１４２７−１４２９（１９９５））、ｔｅｔ（Ｕｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：７９６３−８（２０００））、Ｔｒｅｘ（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｅｒｉｋｓｏｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：４１９−２７）が挙げられる。上記のプロモーターは、限定するものではないが、ｔｅｔ、Ｇａｌ４、ｌａｃなどを含むオペレーター配列とそれらを組み合わせることにより誘導性プロモーターに変わってもよい。
３．誘導性プロモーター。それらの能力は、内在的な要因に対してではなく、人為的に制御できる環境条件及び外部刺激に条件付けられるかもしれない。このグループ内には、光、酸素レベル、熱、寒さ及び創傷などの非生物的因子によって調節されるプロモーターが存在する。これらの因子のいくつかは、実験的な環境の外で制御することが困難であるため、目的の生物体に天然には存在しない化合物に応答するプロモーターが目的のプロモーターである。これらの方針に沿って、他の化合物の中でも抗生物質、銅、アルコール、ステロイド及び除草剤に応答するプロモーターを、他の生物的または非生物的因子とは無関係に自由に遺伝子活性の誘導を可能にするように適応させ洗練した。
４．合成プロモーター。多様な起源由来のプロモーター領域の主要なエレメントをまとめることによって作製したプロモーター。
【００６７】
上記のプロモータータイプの他に、トランス活性化タンパク質に基づく調節発現系がある。これらの系は、標的遺伝子に対するそれらの物理的位置に関係なく、目的の遺伝子の発現を調節する。実際、いくつかの化学誘導性プロモーターは、調節系の一部としてトランス活性化タンパク質及び構成的プロモーターを組み込んでいる。トランス活性化タンパク質は、遺伝子調節の分野における分子の全領域を構成する（Ｂｅａｕｌｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７２（１）：１−２３．（２０１５））。
【００６８】
レポータータンパク質及びその用法
一実施形態では、レポータータンパク質は蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質は、限定するものではないが、より高いエネルギーの光子（励起）を吸収し得、前の吸収からタンパク質内部の分子（フルオロフォア）由来の低エネルギーの光子を放出し得る。
【００６９】
他の実施形態では、フルオロフォアは２つ以上の分子であり得る。
【００７０】
他のいくつかの実施形態では、限定するものではないが、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニン残基をその配列内に含むタンパク質を、蛍光タンパク質として利用してもよい。
【００７１】
いくつかの他の実施形態では、限定するものではないが、蛍光タンパク質は、非タンパク質性発色団に結合して蛍光になり得るタンパク質であってもよい。
【００７２】
一実施形態において、蛍光タンパク質は、光学マーカーとも呼ばれる場合がある。細胞内で使用されている場合は、光学細胞マーカーと呼ばれる場合がある。
【００７３】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とは、青色〜紫外領域の光に曝露されたとき明るい緑色の蛍光を示す２３８アミノ酸残基（２６．９ｋＤａ）からなるタンパク質であってもよい（Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１７（１７）：３４４８−５３（１９７８）、及びＴｓｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６７：５０９−４４．（１９９８））。多くの他の海洋生物は類似の緑色蛍光タンパク質を有するが、ＧＦＰは、伝統的にクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから最初に単離されたタンパク質を指す。Ａ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰは、３９５ｎｍの波長で大きな励起ピークを有し、４７５ｎｍではわずかな励起ピークを有する。その発光ピークは５０９ｎｍであり、これは可視スペクトルの低い緑色部分にある。ＧＦＰの蛍光量子収量（ＱＹ）は、０．７９である。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＧＦＰは、４９８ｎｍに単一の主要な励起ピークを有する。ＧＦＰは、補助的補因子、遺伝子産物、または分子酸素以外の酵素／基質を必要とすることなく内部発色団を形成する能力に起因して、多くの形態の生物学において優れたツールとなる。
【００７４】
ＧＦＰの別の用途は、特定の細胞の小さなセットでタンパク質を発現させることであり得る。これにより、研究者はインビトロ（皿内）で、またはインビボ（生体内）でも特定のタイプの細胞を光学的に検出することが可能である（Ｃｈｕｄａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２３（１２）：６０５−１３．（２００５））。
【００７５】
広範囲にわたる使用の可能性及び研究者の進化する必要性に起因して、ＧＦＰの多くの異なる突然変異体が設計されている（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２（１２）：９０５−９（２００５）、ならびにＷｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｔｏｒ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｓ：Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｗｉｌｅｙ．ＩＳＢＮ  ９７８−１−１１８−１７５８６−６．（２０１６））。
【００７６】
第１の大きな改善点は、１９９５年にＲｏｇｅｒ  Ｔｓｉｅｎ（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７３（６５１６）：６６３−４．（１９９５））によって報告された単一点突然変異（Ｓ６５Ｔ）であった。この突然変異は、ＧＦＰのスペクトル特性を劇的に改善し、蛍光、光安定性を増大させた。増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を生じる、この足場に対する３７℃折り畳み効率（Ｆ６４Ｌ）点突然変異体は、１９９５年に発見された（米国特許第６１７２１８８号、Ｔｈａｓｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．、及びＣｏｒｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１７３（１  Ｓｐｅｃ  Ｎｏ）：３３−３８，（１９９６）．）。あまり折り畳まれていないペプチドに融合した場合でさえＧＦＰが急速に折り畳まれて成熟することを可能にする一連の突然変異であるスーパーフォルダーＧＦＰは、２００６年に報告された（Ｐｅｄｅｌａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４（１）：７９−８８（Ｊａｎ  ２００６））。
【００７７】
ＧＦＰに加えて、他の蛍光タンパク質も細胞内の遺伝子改変を報告し得る。それらは、限定するものではないが、青色／ＵＶ蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、遠赤色蛍光タンパク質、近赤外線蛍光タンパク質、ロングストロークシフト蛍光タンパク質、光活性化可能蛍光タンパク質、光変換可能蛍光タンパク質、光切り替え可能蛍光タンパク質であり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は交換可能であり、レポーターとして使用されている。例えば、限定するものではないが、ＧＦＰまたはＥＧＦＰは、光学レポーターとして機能し得る限り、ＹＦＰ、またはＣｅｒｕｌｅａｎ、またはｍＴＦＰ１に置き換えられてもよい。他の実施形態では、２つ以上の蛍光タンパク質が特定の実験に必要とされる場合、それらが生成した色の適合性のために慎重な計画が必要とされ得る。蛍光タンパク質間のスペクトルクロストーク及び改変体間の相互作用は、多色イメージングのために注意深く検査されるべきである。一実施形態では、コード配列は変更され得るが、それでもなお同じアミノ酸をコードしている。
【００７９】
いくつかの実施形態では、複数の蛍光タンパク質間の相互作用により、生存細胞における生化学的プロセスを報告する蛍光（またはフォルスター）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変化が生じ得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、青色／ＵＶ蛍光タンパク質は、限定するものではないが、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｗ、ＥＢＦＰ、ｍＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ（Ｍａｒｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１５６９−１５７１（２００６））、ＧＦＰｕｖ（ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ９（７）：１５５８−１５６４．（２０１３）、ＥＢＦＰ２（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６０７．（２０１５））、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６０７．（２０１５）、ＣｙＰｅｔ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；５：１０２７０．（２０１５））、ＴａｇＢＦＰ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６０７．（２０１５））、ｍＴａｇＢＦＰ２（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．６（１２）：ｅ２８６７４．（２０１１））、ＥＢＦＰ２（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５９０４−５９１０．（２００７））、ｍＫａｌａｍａ１（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５９０４−５９１０．（２００７））、Ｓｉｒｉｕｓ（Ｔｏｍｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄ．５：ｐ．３５１−３５３．（２００９））、Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｃｕｂｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，５８：ｐ１９−３０．（１９９９）、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ（Ｚａｐａｔａ−Ｈｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３（５）．２００３））、ＴａｇＢＦＰ、ＴａｇＣＦＰ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６０７．（２０１５））、ＳＢＦＰ２（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６０７．（２０１５））、ＡｍＣｙａｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｍＴＦＰ１（Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ６３  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ（２００９））、Ｓ６５Ａ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１９６０−１９７０．（２００５））であってもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、シアン蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ＥＣＦＰ（Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｄｕｃ．４３（１）：５２−９（２０１５））、Ｃｅｒｕｌｅａｎ（Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，．２２（４）：ｐ．４４５−４４９（２００４））、ＳＣＦＰ３Ａ（Ｋｒｅｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇ−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，４５：ｐ．６５７０−６５８０．（２００６））、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ（Ｇｏｅｄｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．７：ｐ．１３７−１４１．（２０１０）、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２（Ｇｏｅｄｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０；３：７５１．（２０１２）、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１（Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ６３  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ（２００９））であってもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、緑色蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ（Ｃｕｂｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５８：ｐ．１９−３０．（１９９９））、スーパーフォルダーＧＦＰ（Ｐｅｄｅｌａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：ｐ．７９−８８．（２００６）、アザミグリーン単量体（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＴａｇＧＦＰ２（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、ｍＵＫＧ（Ｔｓｕｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５（８）：ｐ．６８３−６８５．（２００８）、ｍＷａｓａｂｉ（Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ６３  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ（２００９））、Ｃｌｏｖｅｒ（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，１００５−１０１２．（２０１２））、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０：４０７−４０９．（２０１３））、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８９３−９００．（１９９６））、ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ（Ｈａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．１０２：９５１１−９５１６．（２００５））、ＴａｇＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、ＡｃＧＦＰ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣｏｐＧｒｅｅｎ（Ｃｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１６（５）：５７３−８０．（２００７））であってもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、黄色蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：ｐ．２９１８８−９４．（２００１））、Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１）：ｐ８７−９０．（２００２））、ＳＹＦＰ２（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２８（９）：９５９−６７．（２０１５））、ＴａｇＹＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、Ｔｏｐａｚ（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍ  Ｄａｔａ．５：３１８−３１９．（２０１５））、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ６３  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ（２００９））、Ｙｐｅｔ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；５：１０２７０．（２０１５））、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ（Ｃｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１６（５）：５７３−８０．（２００７））、ＰｈｉＹＦＰ−ｍ（Ｃｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１６（５）：５７３−８０．（２００７））、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１；４８（２）：１０６−１２．（２００２））、ｍＢａｎａｎａ（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１５（１）：１１３−４．（２００８））、Ｙ６６Ｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１９６０−１９７０．（２００５））であってもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、オレンジ蛍光タンパク質は限定するものではないが、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ｍＫＯｘ（Ｔｓｕｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５（８）：ｐ．６８３−６８５．（２００８））、ｍＫＯ２（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ｍＯｒａｎｇｅ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２（１２）：１５６７−７２．（２００４））、ｍＯｒａｎｇｅ２（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．５：ｐ．５４５−５５１（２００８））、及びｍＫＯ（Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０；１０（１１）：ｅ０１４１５８５（２０１５））であってもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、赤色蛍光タンパク質は限定するものではないが、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；５：１０２７０．（２０１５））、ＴａｇＲＦＰｔ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；５：１０２７０．（．２０１５））、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；５：１０２７０．（２０１５））、ｍＲｕｂｙ２（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ；５：１０２７０．（２０１５））、ＤｓＲｅｄ（Ｙａｒｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１６；９８（２）：４６２−７．（２００１））、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２（Ｇｏｔｔｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８５（１７）：８９１３−２８．（２０１１））、ＤｓＲｅｄ単量体（Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８；５８（１）：２７−３７．（２０１５））、ＤｓＲｅｄ２（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．５：６７．（２０１５））、ＴｕｒｂｏＲＦ６０２（Ｋｈｏｄｏｓｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：７（２００９））、ＡｓＲｅｄ２（Ｈｉｒｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（３）：２９１−３０３．（２００５））、ｍＲＦＰ１（Ｗａｌｌｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．８７（６）：５８０−８．（２０１５））、Ｊ−Ｒｅｄ（Ｃｏｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１６（５）：５７３−８０．（２００７））、ＨｃＲｅｄ１（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０；１５（１０）：１１１６−２４．（２００８））、ＴｕｒｂｏＲＦ６３５（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、Ｋａｔｕｓｈｋａ（Ｋｉｎｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．１９；１０（６）：ｅ０１３０３７５．（２０１５））、及びＫａｔｕｓｈｋａ２（Ｋｉｎｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．１９；１０（６）：ｅ０１３０３７５．（２０１５））、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０１（４８）：ｐ．１６７４５−１６７４９．（２００４））、ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２（１２）：１５６７−７２．（２００４））、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２（１２）：１５６７−７２．（２００４））、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２（１２）：１５６７−７２．（２００４））、ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２（１２）：１５６７−７２．（２００４））、ＴａｇＲＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．５：ｐ．５４５−５５１．（２００８））、ｍＡｐｐｌｅ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．５：ｐ．５���５−５５１．（２００８））、ｍＲｕｂｙ（Ｋｒｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，４：ｅ４３９１．（２００９））、ｍＲｕｂｙ２（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．９，１００５−１０１２．（２０１２））であってもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、遠赤外蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ｍＰｌｕｍ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１０１（４８）：ｐ．１６７４５−１６７４９．（２００４））、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ（Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２８２，２４８６６−２４８７２．（２００７））、ｍＫａｔｅ（Ｇｕｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｋｅｌｅｔ  Ｍｕｓｃｌｅ．３：１９．（２０１３））、ｍＫａｔｅ２（Ｔａｎｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．Ｏｃｔ  ２３；９（１０）：ｅ１１０６００．（２０１４））、ｍＮｅｐｔｕｎｅ（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１６：ｐ．１１６９−１１７９．（２００９））、ＮｉｒＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ（Ｂａｒｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３；１１（３）：ｅ０１４６８２７．（２０１６））であり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、近赤外線蛍光タンパク質は限定するものではないが、ＴａｇＲＦＰ６５７（ｍｏｒｏｚｏｖａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．２１；９９（２）：Ｌ１３−５．（２０１０））、ＩＦＰ１．４（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．１５；５：３６２６（２０１４））、ｉＲＦＰ（Ａｇｏｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２３；５（９）：７７４−８３．（２０１４）であり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ロングストロークシフト蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ｍＫｅｉｍａ  Ｒｅｄ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０；８（６）：ｅ６４８４９．（２０１３））．、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ１（Ｐｉａｔｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７：ｐ．５３６９−５３７４．（２０１０））、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２（Ｐｉａｔｋｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７：ｐ．５３６９−５３７４．（２０１０））、ｍＢｅＲＦＰ（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０；８（６）：ｅ６４８４９．（２０１３））であり得る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、光活性化可能蛍光タンパク質は、限定するものではないが、ＰＡ−ＧＦＰ（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，．２９７（５５８８）：ｐ．１８７３−７．（２００２））、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．６：ｐ．１５３−１５９．（２００９））、ＰＡＴａｇＲＦＰ（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ  １３２：ｐ．６４８１−６４９１．（２０１０））であり得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、光変換可能蛍光タンパク質は、限定するものではないが、Ｋａｅｄｅ（緑色）（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｋａｅｄｅ（赤色）（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＰＳ−ＣＦＰ２（Ｅｖｒｏｇｅｎ）、ｍＥｏｓ２（緑色）（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ．６：ｐ．１３１−１３３．（２００９））、ｍＥｏｓ２（赤色）（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ．６：ｐ．１３１−１３３．（２００９））、ｍＥｏｓ３．２（緑色）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．９：ｐ．７２７−７２９．（２０１２））、ｍＥｏｓ３．２（赤色）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．９：ｐ．７２７−７２９．（２０１２））、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．８：ｐ．７７１−７７７．（２０１１））であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、光活性化可能蛍光タンパク質ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰは、サイレントのままである場合があり、タンパク質が特定の波長光で活性化された場合にのみオンになる場合がある。
【００９２】
いくつかの実施形態では、光変換可能蛍光タンパク質、例えば、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ｍＥｏｓ３．２（緑色）、ｍＥｏｓ３．２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅは、特定の波長の照射下で緑色蛍光から赤色蛍光に切り替わり得る。それは、個々の神経細胞及び細胞の動きを追跡する能力を提供する。目的の組織に自家蛍光がある場合が多い。それはレポーターの色と同じ色である場合がある。このせいで、バックグラウンド（自動蛍光）または標的欠失から生成された蛍光を区別することが非常に困難になる可能性がある。このバックグラウンド自己蛍光問題を解決するために、Ｋａｅｄｅのような光変換可能蛍光タンパク質を使用してもよい。顕微鏡の２つの写真の方法で、励起された２つの異なる波長を撮影してもよい。例えば、元の色は自己蛍光のバックグラウンドを有する。同じサンプルを、蛍光タンパク質の構造変化を引き起こす特定の波長の放射線によって処理してもよい。蛍光タンパク質は異なる色に変化するが、バックグラウンドは変化しない場合がある。従って、色の変化を伴うシグナルだけが、標的遺伝子が欠失したシグナルであり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、２つの蛍光タンパク質は、二重蛍光タンパク質として一緒に融合され得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、３つ以上の蛍光タンパク質を融合させて多蛍光タンパク質を形成してもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質の一部が完全な蛍光タンパク質と融合した。
【００９６】
いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質の一部が多蛍光タンパク質と融合した。
【００９７】
いくつかの実施形態では、新たに開発された蛍光タンパク質が存在する。それらは、限定するものではないが、ＵｎａＧ（Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｊｕｎ  ２０；１５３（７）：１６０２−１１．（２０１３））、ｅｑＦＰ６１１（Ｋｒｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．４（２）：ｅ４３９１．（２００９））、ＫＦＰ（Ｋｈｒｅｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．１０８（１）：１２６−３２．（２０１５））、ＥｏｓＦＰ（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．４３：３０３−２９．（２０１４））、ＩｒｉｓＦＰ（Ｇａｙｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．１０３（１２）：２５２１−３１．（２０１２））、ｓｍｕｒｆｐ、ＦＭＮ結合蛍光タンパク質（ＦｂＦＰ）（Ｄｒｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｅｐ；７６（１７）；５９９０−４．（２０１０））である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどの細胞及び生物体において検出及び測定され得る任意のタンパク質及び他の適切なタンパク質をレポータータンパク質として使用してもよい。
【００９９】
スプライス部位の発明的詳細及び蛍光タンパク質をコードする配列へのその挿入
いくつかの実施形態では、構築物はレポータータンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、レポータータンパク質は蛍光タンパク質であってもよく、さらに蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であってもよい。ＧＦＰのコード配列をイントロンからスプライスドナー及びアクセプター部位によって少なくとも２つの部分または３つ以上の部分に分割することにより、リコンビナーゼ及び欠失が存在しない場合にはＧＦＰをサイレントに保ち得（指示されていないかまたは認識された蛍光）、欠失がある場合、活性に保ち得る（指示された、または知覚された蛍光）。
【０１００】
一実施形態では、挿入は、挿入部位周辺のコード配列及びスプライスドナー部位及びアクセプター部位の配列によって決定され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、構築物はイントロンを含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、ドナー部位（イントロンの５’末端）、分枝部位（イントロンの３’末端付近）、異種配列及び／またはアクセプター部位（イントロンの３’末端）（スプライシングに必要な場合がある）を含んでもよい。イントロンは、天然源から得てもよいし、または完全に人工的であってもよい。
【０１０２】
一実施形態では、スプライソソームは、イントロンの５’末端周辺の配列からコンセンサス配列Ａ−Ｇ−［ｃｕｔ］−Ｇ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｔを認識し、Ａ−Ｇは上流エキソンから提供され、Ｇ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｔは、スプライスドナー部位の必須部分であり得るイントロンの５’末端由来であり、Ｒは、ＡまたはＧの選択を表す（Ｉｕｐａｃ−Ｉｕｂ  Ｃｏｍｍ．Ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｏｍｅｎｃｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９：４０２２−４０２７（１９７０）、及びＤｅ  Ｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  ＲＮＡ，４（１）：４９−６０．（２０１３）、及びＬｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ」．の書籍２０１２、及びＷｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７（３）：２１１−２１．（２００６）、及びＯｈｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９５：２４７−２５９（１９８７））。
【０１０３】
別の実施形態では、スプライソソームはイントロンの３’末端周辺の配列から別のコンセンサス配列Ｙ−リッチ−Ｎ−Ｃ−Ａ  Ｇ−［ｃｕｔ］−Ｇを認識し、ここでＹ−リッチ−Ｎ−Ｃ−Ａ  Ｇは、スプライスアクセプター部位の必須部分であり得るイントロンの３’末端から来る。前記コンセンサス配列の終わりのＧは、イントロンの下流のエキソンに寄与し、ＹはＣまたはＴの可能性を表す。ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴの可能性を表す。（Ｉｕｐａｃ−Ｉｕｂ  Ｃｏｍｍ．Ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｏｍｅｎｃｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９：４０２２−４０２７（１９７０）、及びＤｅ  Ｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  ＲＮＡ，４（１）：４９−６０．（２０１３）、及びＬｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ」の書籍２０１２、及びＷｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．７（３）：２１１−２１．（２００６）、及びＯｈｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９５：２４７−２５９（１９８７））。
【０１０４】
別の実施形態では、イントロンの３’末端のＡＧからの上流（５’末端方向）は、ピリミジンの高い領域（Ｃ及びＴ）であっても、またはポリピリミジン領域であってもよい。ポリピリミジン領域のさらに上流は、分岐点があり、これは、コンセンサス配列Ｙ−Ｎ−Ｃ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ｃとのラリアット形成に関与するアデニンヌクレオチドを含み得る（Ｃｌａｎｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ．１（１）：３１．（２００８）、及びＢｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．７２（１）：２９１−３３６．（Ｊｕｎｅ  ２００３））。この分岐点は、スプライスアクセプター部位の２０〜５０ヌクレオチド上流であり得る。
【０１０５】
一実施形態では、蛍光タンパク質コード配列の第１部分の末端がイントロンのスプライスドナー部位に連結され得るように、及び蛍光タンパク質コード配列の第２部分の最初が、イントロンのスプライスアクセプター部位に連結し得るように、蛍光タンパク質のヌクレオチドコード配列内の多くの位置が選択され得る。
【０１０６】
一実施形態では、蛍光タンパク質のコード配列を２つの別個の部分に分割するために、潜在的な挿入部位（ドナー及びアクセプター部位）を取り囲む配列を、上記コンセンサス配列によって示唆される規則を満たすことによって詳しく検査すべきである。コンセンサス配列に非常によく似ている配列を有するデザインのみが構築され試験を開始され得る。
【０１０７】
別の実施形態では、ＲＮＡスプライソソームによって正しく認識されスプライシングされ得る限り、任意の配列をスプライスドナー及びアクセプターとして利用し得る。
【０１０８】
別の実施形態において、イントロン配列は、Ｕ２及びＵ１２分類（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．９１：８７５−８７９．（１９９７））に従って利用してもよい。
【０１０９】
本明細書の実施形態での使用に適したイントロンは、天然に存在する核酸からの精製またはデノボ合成などのいくつかの方法によって調製し得る。天然に存在する多くの真核生物遺伝子に存在するイントロンが同定され、特徴付けられている（Ｍｏｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：４５９（１９８２））。機能的スプライス部位を含む人工イントロンもまた記載されている。（Ｗｉｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９：３２９（１９８９）、及びＧａｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９：１５２６（１９８９））。イントロンは、例えば、天然に存在する核酸を適当な制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、またはイントロンの５’及び３’末端の配列に相補的なプライマーを用いるＰＣＲクローニングにより、天然に存在する核酸から得てもよい。あるいは、定義された配列及び長さのイントロンは、有機化学における種々の方法を用いて合成的に調製され得る（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８：９０（１９７９）、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７  １９８５）、及びＦｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９（１９８６））。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞特異的プロモーターを含む適切な配列、蛍光タンパク質の５’及び３’をコードする配列、スプライシング部位を有するイントロンを含み、及びポリ（Ａ）シグナルを構築して、インビトロ（細胞内）で試験してもよい。イントロン挿入の設計が右スプライシングに至る場合、蛍光顕微鏡下で蛍光が観察され得る。蛍光が観察されなかった場合、イントロンの挿入は、さらなる試験で蛍光タンパク質のコード配列内の異なる位置に変化する必要がある場合がある。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、上記の説明に続いて、イントロンは、ＧＦＰ内部の多くの位置、または研究者の選択肢の他の蛍光タンパク質に挿入してもよい。さらに、蛍光タンパク質またはレポータータンパク質をコードするものは、Ｎ末端からＣ末端部分の比率が異なる（例えば、限定するものではないが、それぞれ、フロント１０％、バック９０％、２０％対８０％、３０％対７０％、４０％対６０％、５０％対５０％、６０％対４０％、７０％対３０％、８０％対２０％）スプライスドナー及びアクセプター部位を有する異種配列によって分けることができる。蛍光タンパク質のコード配列はまた、パーセンテージの合計が１００％になる比率に分けることもできる。各前部は、蛍光発現を容易にするために、それ自身の後部にのみ接続し得る。蛍光タンパク質のコード配列を分割する異なる比率は、ニューロン発達及び疾患動物モデル作製を含む細胞発生の追跡に非常に有用であり得る。
【０１１２】
一実施形態では、イントロンのサイズは、わずか数ヌクレオチド程度から何十万ヌクレオチドまで変化し得る。従って、研究者がイントロン内に多くの機能的構成要素を構築できるように、研究を設計するためのさらなる柔軟性を提供する。
【０１１３】
さらなる実施形態では、少なくとも４つの別個のクラスのイントロンが天然に同定されており（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂｒｕｃｅ（２００８）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、これらのイントロンのほとんどは完全にまたは部分的に蛍光タンパク質に挿入するために用いられ得る。４つのクラスとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：１）スプライソソームによって除去される核タンパク質コード遺伝子のイントロン（スプライソソームイントロン）。２）タンパク質によって除去される核及び古細菌の転移ＲＮＡ遺伝子のイントロン（ｔＲＮＡイントロン）。３）ＲＮＡ触媒作用により除去される自己スプライシングＩ群イントロン。４）ＲＮＡ触媒作用によって除去される自己スプライシングＩＩ群イントロン。
【０１１４】
さらなる実施形態では、完全にまたは部分的に人工のイントロンが存在し、これはまた蛍光タンパク質に挿入するために使用してもよい。
【０１１５】
他の実施形態では、一連の配列を切り出し、続いてＧＦＰのＮ末端及びＣ末端を一緒にしてＧＦＰ発現を活性化する部位特異的組換え以外の方法を有し得る。それらは、限定するものではないが、Ｃｒｉｓｐｒ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、希少切断制限酵素、ゲノム転座、ホットスポット関連欠失、免疫学ＶＤＪ組換え、免疫クラス切り替え、遺伝子逆位、天然欠失及び当該分野で公知の他のものであってもよい。
【０１１６】
さらなる実施形態において、適切なイントロンは、限定するものではないが、アンサンブル、ＵＣ  Ｄａｖｉｓゲノムブラウザなどのゲノムデータソースから検索され得る。
【０１１７】
一実施形態では、イントロン挿入の設計を助けるためにバイオインフォマティクス分析を用いてもよい（Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ  ４（３）、３１１−２３．（１９９７））。
【０１１８】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ及び他の適用可能な組換え系
標的遺伝子を欠失させ、続いて蛍光を発する意図で、標的配列は、遺伝子工学によって２つの組換え部位と隣接させてもよい。いくつかの実施形態では、標的配列の除去によって第２の蛍光タンパク質の発現も除去される（例えば、第２の放出された蛍光から第１蛍光へ蛍光を変化させること、または蛍光タンパク質放射、例えば、赤色から緑色（ＧＦＰ）への変化を示すこと）ように、発現する第２の蛍光タンパク質を標的配列に含めてもよい。蛍光タンパク質のコード配列の２つの部分は、プロモーターを有する５’蛍光タンパク質のコード配列がイントロンドナー部位に連結され、３’蛍光タンパク質がイントロン受容部位に連結されている構成で、これらの２つの組換え部位に連結されてもよい。蛍光タンパク質をコードする５’及び３’配列は、これらの２つの部位とともに、標的遺伝子発現方向とは反対の方向に挿入され得る。リコンビナーゼ発現の際に、これら２つの組換え部位の間の配列は、欠失または切除されてもよく、このプロセスによって５’及び３’コーディング配列が一緒になる。５’ＧＦＰに連結されたプロモーターは、機能的蛍光タンパク質の発現を駆動し得る。
【０１１９】
一実施形態では、多くのリコンビナーゼが、組換え部位間の配列を除去するために使用されてもよい。Ｃｒｅリコンビナーゼは、最も頻繁に使用されるリコンビナーゼの１つである。
【０１２０】
Ｃｒｅタンパク質は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。それは、ＤＮＡ分子中の特定の部位の間でＤＮＡの組換えを触媒し得る。ｌｏｘＰ配列として公知のこれらの部位は、組換えが起こり得る方向性コア配列を囲むＣｒｅの特異的結合部位を含む。
【０１２１】
細胞がＣｒｅを発現するゲノムにｌｏｘＰ部位を有する場合、ｌｏｘＰ部位の間で組換え事象が生じ得る。Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質は、二量体を形成するｌｏｘＰ部位の最初及び最後の１３ｂｐ領域に結合する。次いで、この二量体は別のｌｏｘ部位上の二量体に結合して、四量体を形成する。ＬｏｘＰ部位は、指向性であり、四量体によって連結された２つの部位は向きが平行である。二本鎖ＤＮＡは、Ｃｒｅタンパク質によって両方のｌｏｘＰ部位で切断される。次いで、この鎖を迅速かつ効率的なプロセスでＤＮＡリガーゼを用いて再結合させる。組換えの結果は、ｌｏｘＰ部位の配向に依存する。同じ染色体アーム上の２つのｌｏｘ部位について、ｌｏｘＰ部位の直接反復は、欠失事象を引き起こすが、反転されたｌｏｘＰ部位は標的ＤＮＡの反転を引き起こす。
【０１２２】
一実施形態では、配列を欠失または逆転する他の系としては、限定ではない例として、以下が挙げられる。
１．ＦＬＰ／ｆｒｔ組換え系（Ｓｃｈｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３（４３）：１２７４６−１２７５１．（１９９４）及びＴｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０２（１）：５２−６９．（２０１０））。
２．Ｄｒｅ／ｒｏｘ組換え系（Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２（９−１０）：５０８−１５．（２００９））、Ｖｃｒｅ／ＶｌｏｘＰ組換え系（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（８）：ｅ４９．（２０１１））。
３．Ｓｃｒｅ／ＳｌｏｘｐＰ組換え系（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９（８）：ｅ４９．（２０１１））。
４．Ｎｉｇｒｉ／ｎｏｘ組換え系（Ｋａｒｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３０１３０（２０１６））。
５．Ｐａｎｔｏ／ｐｏｘ組換え系（Ｋａｒｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３０１３０（２０１６））。
６．ＰｈｉＣ３１／ａｔｔ組換え系（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１０：１７．（２０１０））。典型的には、部位特異的な組換えは、それ自体のリコンビナーゼ内でのみ生じ得る。
７．反映されたＩＲ／ＤＲ配列におけるＤＲ配列を欠失するスリーピングビューティートランスポーゼース（Ｚａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．９（２）：２９２−３０４．（２００４）。
【０１２３】
一般に、１つの特定のリコンビナーゼは、それ自身の特定の組換え部位でのみ作用し得る。異なるリコンビナーゼベースの系の間でクロストークが起こることはまれな事象である可能性がある。
【０１２４】
ＦＬＰ／ｆｒｔ系では、ＦＬＰリコンビナーゼは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで開発された（Ｓｃｈｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３３（４３）：１２７４６−１２７５１．（１９９４）及びＴｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０２（１）：５２−６９．（２０１０））。あらゆるＦＬＰ媒介組換えについて、合計４つのＦＬＰリコンビナーゼ及び２つのｆｒｔ配列が、必要とされ得る。あらゆるｆｒｔが８ｂｐのスペーサー領域によって中断される２つの１３ｂｐのＦＬＰ結合部位を有するので、４つのタンパク質のうち２つが１つのＦＲＴ配列に結合する。このスペーサーでは、ＤＮＡ鎖の切断が起こり、８ｂｐのオーバーハング端が生じる。鎖切断の後、２つのＦＲＴ断片の突出末端は、相補的な塩基対形成によって一緒になって、突然変異ｆｒｔ配列が生成される。
【０１２５】
別の組換え系は、Ｄｒｅ／ｒｏｘ組換え系であり、Ｄｒｅリコンビナーゼは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃから単離されたＰ１様の形質導入バクテリオファージＤ６に最初に記載されている。Ｄｒｅ及びＣｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子は、３９％の配列類似性を共有する。Ｄｒｅリコンビナーゼは、ｒｏｘ部位を認識することによって部位特異的ＤＮＡ組換えを触媒することができたが、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位とは異なるｒｏｘ部位を認識することができなかった。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様に、Ｄｒｅは、２つのｒｏｘ部位間の配列を、それらが同じ方向を向いている場合、欠失させることができた。
【０１２６】
ＶＣｒｅ／ＶｌｏｘＰ組換え系もまた使用され得る。Ｖｃｒｅは、Ｃｒｅと非常に弱い類似性を示し、Ｃｒｅアミノ酸配列と２９％の同一性を共有していた。これは、ＶｌｏｘＰ部位を認識する。
【０１２７】
２つの認識可能な部位の間で配列を欠失させるために使用され得る他の系がある。それらは、限定するものではないが、ＫＤ、Ｂ２  Ｂ３、ラムダ、ＨＫ０２２、ＨＰ１、ラムダガンマ、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、Ｇｉｎ、Ｂｘｂ１、Ｒ４及びＴＰ９０１−１である。
【０１２８】
典型的には、部位特異的リコンビナーゼは、それ自体の組換え部位を認識した。リコンビナーゼはまた、野生型リコンビナーゼ部位に類似した配列をわずか１塩基または数塩基で認識し得ることが発見された。これらの部位はまた、突然変異部位とも呼ばれた。
【０１２９】
例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系では、多くの突然変異体ｌｏｘＰ部位が作製された。突然変異組換え部位は、配列番号４に示される最小の天然のｌｏｘＰ組換え部位と類似しているが同一ではないヌクレオチド配列である。一方、突然変異体ｌｏｘＰ組換え部位は機能的であり得る。特に明記しない限り、突然変異体ｌｏｘＰ組換え部位は、野生型ｌｏｘＰ組換え部位の生物学的活性を保持し、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼ媒介組換え反応が可能な機能的組換え部位を含む。従って、突然変異体ｌｏｘＰ組換え部位は、最小天然ｌｏｘＰ組換え部位の５’または３’末端における１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加及び／または置換を、最小限の天然ｌｏｘＰ組換え部位中の１つまたは複数の内部部位に含んでもよい。一般的に、改変組換え部位は、その全長にわたってまたはその中に含まれる任意のドメインに対して最小限の天然組換え部位に対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。従って、突然変異体ｌｏｘＰ組換え部位は、１、２、３、４、５、８、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２８、２９またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加及び／または欠失を、最小組換え部位の全長にわたって、あるいは上記で概説したような組換え部位の種々のドメインのそれぞれに、含む。
【０１３０】
一実施形態では、突然変異体ｌｏｘＰ部位は、野生型（天然）ｌｏｘＰ部位とは異なる特徴を有し得る。野生型ｌｏｘＰ部位と互換性がないものもあれば、いくつかは互換可能なものもある。いくつかは実質的に互換性がある場合がある。突然変異ｌｏｘｐ部位が野生型ｌｏｘＰ部位と組換えられると、それらは新しい突然変異ｌｏｘＰ部位を作り出す。いくつかの組み合わせは可逆的であり、いくつかはそうではない。これらの突然変異体ｌｏｘＰ部位を用いて、標的遺伝子、及びＣｒｅリコンビナーゼによって欠失され得る部位間の配列を隣接させ得る。Ｃｒｅ反応の際に、２つの同一の突然変異体ｌｏｘＰの組合せは、親突然変異体ｌｏｘＰ部位と同一の配列を有し得る単一の突然変異部位を残してもよい。２つの異なる突然変異体ｌｏｘＰの組合せは、その親（野生型または天然）のいずれとも異なる配列を有する単一の突然変異体ｌｏｘＰ部位を残し得る。
【０１３１】
１つの実施形態では、突然変異体ｌｏｘＰ部位のうち、それらは、限定するものではないが、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、ｌｏｘＮ、ｌｏｘＰ５１７１及び他の公開及び未公開、ならびに開発中の突然変異体ｌｏｘＰ部位である。いくつかの実施形態において、突然変異体ｌｏｘＰ部位はまた、異種特異的ｌｏｘＰ部位または改変ｌｏｘＰ部位と呼んでもよい。その多様性は、８ｂｐのスペーサー配列内の変動によって生じ得る場合が多い。
【０１３２】
他の実施形態では、多くの突然変異組換え系は、野生型（天然）組換え部位及びそれらの突然変異組換え部位のそれ自身のセットを有し得る。それらは上記と非常によく似た方法で働いた。これらのうち、限定するものではないが、それらには、Ｆ３、Ｆ５、ＦＬ−ＩＬ  １０Ａ、Ｖｌｏｘ２２７２、Ｓｌｏｘ２２７２、ＶｌｏｘＭ１、ＳｌｏｘＭ２、ＶｌｏｘＭ２、ＳｌｏｘＭ２、Ｖｌｏｘ４３Ｒ、Ｖｌｏｘ４３Ｌ、Ｓｌｏｘ１Ｒ、Ｓｌｏｘ１Ｌ、ａｔｔＲ、ａｔｔＬ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ＩＲ／ＤＲ配列が挙げられる。
【０１３３】
一実施形態では、これらの組換え部位の適切な使用及び組合せ使用は、多くの他の異なる組み合わせ及び構成で、蛍光をオン及びオフ、オフ及びオンにする設計に組み込んでもよい。
【０１３４】
ポリ（Ａ）
いくつかの実施形態では、構築物はポリ（Ａ）配列を含んでもよい。典型的には、ポリアデニル化シグナルポリ（Ａ）は、真核生物タンパク質の適切な発現のために必要とされ得る。ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加する。ポリ（Ａ）テールは、アデニン塩基のみを有する一連のＲＮＡを構成する複数のアデノシン一リン酸から構成され得る。真核生物において、ポリアデニル化は、翻訳のための成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するプロセスの一部であり得る。これは、遺伝子発現のより大きなプロセスの一部を形成し得る。
【０１３５】
ポリアデニル化のプロセスは、遺伝子の転写が終結するときに開始し得る。新たに作製されたプレｍＲＮＡの３’末端部分は、最初にタンパク質のセットによって切断され得る（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１０８（４）：５０１−１２．（２００２）及びＧｕｈａｎｉｙｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．２６５（１−２）：１１−２３．Ｇ（２００１））。
【０１３６】
次に、これらのタンパク質は、ＲＮＡの３’末端でポリ（Ａ）テールを合成する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質は、いくつかの可能な部位の１つにポリ（Ａ）テールを付加し、選択的スプライシングと同様に、単一遺伝子由来の２つ以上の転写産物を産生する（代替ポリアデニル化）（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１０８（４）：５０１−１２．２００２））。
【０１３７】
ポリ（Ａ）テールは、核の輸出、翻訳、及びｍＲＮＡの安定性にとって重要であり得る。テールは時間の経過とともに短くなり、十分に短い場合、ｍＲＮＡは酵素的に分解される（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．２６５（１−２）：１１−２３．（２００１））。しかし、いくつかの細胞型では、短いポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡは、細胞質ゾルにおける再ポリアデニル化による後の活性化のために保存される（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｊｏｅｌ  Ｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６３（２）：４４６−５６．１９９９））。
【０１３８】
一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、終止配列の後で３’蛍光タンパク質コード配列の末端に連結され得る。終結配列を有するコード配列の３’末端及びポリ（Ａ）配列を含む組み合わされた配列は、標的遺伝子のイントロンの１つの内部の特定の位置に挿入され得る。
【０１３９】
一実施形態では、内因性配列に対する最小限の影響を維持するために、ポリ（Ａ）配列を可能な限り短く保つことが望ましい場合がある。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、類似の配列がシグナルとして機能し得る領域への３’ＧＦＰコード配列の伸長によってポリ（Ａ）を得てもよい（Ｅｄｗａｌｄｓ−Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１３）：２５４７−６１．（１９９７））。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子において、ポリアデニル化部位より前に、切断部位の前にＡＡＴＡＡＡまたはＡＴＴＡＡＡ約２０塩基が通常存在し、それより保存が弱いＧＴベースのモチーフが続いてもよい。ポリ（Ａ）関連タンパク質セットによって認識可能な他の可能な配列が存在し得る。これらの配列を使用することもできる。（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２２（１９）：２３２０−５．（２００６）及びＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．１１（１０）：１４８５−９３（２００５））。
【０１４２】
広範な実施形態において、ポリ（Ａ）シグナルは、ＮがヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかを表すＮＮＴＡＮＮであってもよい（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２２（１９）：２３２０−５）．（２００６）及びＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．１１（１０）：１４８５−９３．（２００５））。
【０１４３】
エキソンスプライストラッピングアクセプター
一実施形態では、標的配列は、認識可能であり、かつＲＮＡスプライソソームによってスプライシングされ得る配列を含んでもよく、これは、蛍光タンパク質の３’コード配列とスプライシングされる蛍光タンパク質の５’コード配列をブロックするための天然のバリアを提供する。リコンビナーゼ活性に曝露する前に、蛍光タンパク質の５’コード配列を、スプライストラッピングアクセプター部位の１つとスプライシングして、蛍光タンパク質の５’コード配列によってコードされるキメラタンパク質、ならびにスプライストラッピングアクセプター部位の下流の配列及びその後ろにある配列をポリ（Ａ）まで生成し得る（Ｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６１：１８３−１８７（１９９５））及びＤａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２４：１１０５−１１１１（１９９６））。
【０１４４】
一実施形態では、標的領域に自然に利用可能なそのような適切なスプライストラッピングアクセプター部位が存在しない事象では、他の供給源由来のスプライストラッピングアクセプター配列を、蛍光タンパク質の５’コード配列の下流に位置する第１のｌｏｘＰ部位の下流配列に挿入してもよい。それはまた、蛍光タンパク質の５’及び３’コード配列間の早発性のスプライシングをブロックするために、２つの組換え部位の間の標的配列の任意の位置に挿入されてもよい。スプライストラッピングアクセプター配列の他の供給源としては、限定するものではないが、天然に見出されるエキソンアクセプター部位、人工配列、または上流エキソン配列をトラッピングし得る任意の配列に由来する配列が含まれ得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質の５’コード配列を中断する目的に適し得る多くのタイプのスプライストラッピングアクセプター部位が存在する。具体的には、トラッピングアクセプターをスプライシングするＥＮ２（マウスＥｎ２イントロン２／エキソン３スプライスアクセプター配列）（配列番号７）を用いて、蛍光タンパク質の５’コード配列をトラップすることができた（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，６９６−７０６（２０１０））。
【０１４６】
二重蛍光レポーター（図５）
いくつかの実施形態では、非蛍光細胞を蛍光顕微鏡で十分に検出できないため、単色蛍光は周囲細胞との関係で十分なコントラストを提供できなかった。いくつかの実施形態では、第２の蛍光レポーターを、それ自身のプロモーターを有してもよいし、または第１の蛍光タンパク質由来のプロモーターと共有する標的配列の内部に導入してもよい。リコンビナーゼに曝される細胞の前に、細胞は第２の蛍光タンパク質からの蛍光を有する。リコンビナーゼに曝された細胞の後、細胞は第１の蛍光タンパク質から蛍光を得る。この色切り替えスキームによって、細胞内で遺伝子欠失が起こった場所と時期がより詳細に可視化され得る。
【０１４７】
研究キット
キットは、本発明の構成要素を収容する１つ以上の容器及び使用説明書を備えてもよい。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載される１つまたは複数の薬剤を、意図された適用及びこれらの薬剤の適切な用法を説明する説明書と共に、含んでもよい。特定の実施形態では、キット中の薬剤は、特定の適用及び薬剤の投与方法に適した医薬製剤及び投薬量であってもよい。研究目的のキットには、様々な実験を行うための適切な濃度または量の成分が含まれている場合がある。
【０１４８】
以下は、本明細書において具体的に企図される実施形態のリストである。
【０１４９】
一実施形態では、上流から下流への順番で以下を含んでいる、組換え核酸構築物が提供される：
（１）プロモーター配列、
（２）Ｎ末端を含むレポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）の第１部分をコードする核酸配列であって、前記第１部分のタンパク質産物が蛍光発現を提供するのに不十分である核酸配列、
（３）スプライスドナー部位、
（４）異種核酸配列、
（５）スプライスアクセプター部位、
（６）Ｃ末端を含むレポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）の第２の部分をコードする核酸配列、ならびに
（７）ポリ（Ａ）シグナル配列。
【０１５０】
別の実施形態では、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質）をコードする条件付き及び分割されたポリヌクレオチド配列を、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入する方法が提供され、この方法は以下を包含する：
（ａ）ＤＮＡ標的化ベクターを構築することであって、このベクターが順に、
（１）５’相同性アームと、
（２）本発明による組換え核酸構築物であって、ここで異種配列が、２つの組換え部位が隣接する標的配列を含む、組換え核酸構築物と、
（３）３’相同性アームと、を備えること。
【０１５１】
ＤＮＡ標的化ベクターは、５’相同性アームと３’相同性アームとの間に挿入された抗生物質選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターをＥＳ細胞に導入すること、
（ｃ）標的クローンについて（ｂ）のＥＳ細胞を選択することを含む。
【０１５２】
別の実施形態では、遺伝子欠失を報告する方法が提供され、この方法は以下、
（ａ）本明細書に記載のＤＮＡ標的化ベクターを構築すること、
（ｂ）標的生殖系列マウスを生成すること、
（ｃ）標的マウスをリコンビナーゼ発現マウスと交配させること、
（ｄ）その組換え部位間の組換えにより標的配列を除去することによって蛍光タンパク質を活性化すること、を包含する。
【０１５３】
さらなる実施形態では、本発明の核酸構築物は、プロモーターを含み得、ここで、このプロモーターは、真核生物細胞において下流の配列の遺伝子発現を駆動し得る核酸配列を含む。
【０１５４】
ある実施形態では、プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーターであってもよい。
【０１５５】
別の実施形態では、プロモーターは、真核生物細胞中の偏在性プロモーター、細胞特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び構成的プロモーターからなる群より選択されるポリメラーゼＩＩプロモーターを含んでもよい。
【０１５６】
さらなる実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧ（配列番号１）、ＣＡＧＧＳ、ＣＭＶ、ｈＣＭＶ、ＥＦ１、ＰＧＫ、ＦＡＢＰ、Ｌｃｋ、ＣａｍＫＩＩ、ＣＤ１９、ケラチン、アルブミン、ａＰ２、インスリン、ＭＣＫ、ＭｙＨＣ、ＷＡＰ、Ｃｏｌ２Ａ、Ｍｘ、ｔｅｔ、及びＴｒｅｘプロモーターからなる群より選択される。
【０１５７】
他の実施形態では、本発明の核酸構築物は、レポーターを含んでもよく、このレポーターは、真核生物細胞で、より高いエネルギーの光子を吸収し得、より低いエネルギーの光子を放出し得るタンパク質を含む蛍光タンパク質である。
【０１５８】
特定の実施形態では、レポーターは、青／ＵＶ蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、遠赤色蛍光タンパク質、近赤外線蛍光タンパク質、ロングストロークシフト蛍光タンパク質、光活性化可能蛍光タンパク質、光変換可能蛍光タンパク質、及び光切り替え可能蛍光タンパク質からなる群より選択される蛍光タンパク質を含んでもよい。
【０１５９】
さらなる実施形態では、レポーターは、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ（配列番号２）、及びＤｓＲｅｄ（配列番号３）から選択される蛍光タンパク質を含む。
【０１６０】
本発明のある実施形態では、核酸構築物は、スプライスドナー部位を含んでもよく、ここでこのスプライスドナー部位は、スプライソソームによってスプライシングされ得る機能的ＤＮＡ配列である。
【０１６１】
ある実施形態では、イントロンの５’末端の最初のヌクレオチドはＧである。
【０１６２】
本発明の別の実施形態では、核酸構築物はスプライスアクセプター部位を含んでもよく、このスプライスアクセプター部位はスプライソソームによってスプライシングされ得る機能的ＤＮＡ配列である。
【０１６３】
ある実施形態では、イントロンの３’末端の最後のヌクレオチドはＧである。
【０１６４】
本発明の一実施形態では、核酸構築物は、少なくとも２つの組換え部位を含んでもよく、その両方の組換え部位は同一である。
【０１６５】
本発明のある実施形態では、核酸構築物は、少なくとも２つの組換え部位を含んでもよく、その両方の組換え部位は同一ではない。
【０１６６】
本発明のさらなる実施形態では、核酸構築物は、少なくとも２つの組換え部位を含んでもよく、その組換え部位の１つは突然変異組換え部位である。
【０１６７】
本発明のある実施形態では、組換え部位は、ｌｏｘＰ（配列番号４）、ｆｒｔ（配列番号５）、ｒｏｘ（配列番号６）、Ｖｌｏｘ、Ｓｌｏｘ、ａｔｔＲ、ａｔｔＬ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、またはＩＲ／ＤＲ配列からなる群より選択される野生型組換え部位である。
【０１６８】
ある実施形態では、組換え部位の１つは、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、Ｍ２、Ｍ７、Ｍ１１、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、ｌｏｘＮ、ｌｏｘｐ５１７１、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ７、ＦＬ−ＩＬ  １０Ａ、Ｖｌｏｘ２２７２、Ｓｌｏｘ２２７２、ＶｌｏｘＭ１、ＳｌｏｘＭ２、ＶｌｏｘＭ２、ＳｌｏｘＭ２、Ｖｌｏｘ４３Ｒ、Ｖｌｏｘ４３Ｌ、Ｓｌｏｘ１Ｒ、またはＳｌｏｘ１Ｌからなる群より選択される。
【０１６９】
さらなる実施形態において、レポーター遺伝子欠失の方法は、リコンビナーゼ酵素を含み、ここでリコンビナーゼは、２つの組換え部位の間の配列を欠失または逆転し得る酵素である。
【０１７０】
さらなる実施形態では、リコンビナーゼは、その認識可能な２つの部位の間で配列を欠失または逆転し得る酵素である。
【０１７１】
別の実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｄｒｅ、Ｖｃｒｅ、Ｓｃｒｅ、Ｎｉｇｒｉ、Ｐａｎｔｏ、ＰｈｉＣ３１、またはスリーピングビューティートランスポーゼースからなる群より選択される。
【０１７２】
本発明のさらなる実施形態では、異種配列は、エキソントラッピング配列をさらに含む。
【０１７３】
ある実施形態では、エキソントラッピング配列は、ＥＮ２エキソントラッピング配列（配列番号７）である。
【０１７４】
本発明のさらなる実施形態において、核酸構築物は、第２の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
【０１７５】
ある実施形態では、第２の蛍光タンパク質はＤｓＲｅｄ蛍光タンパク質（配列番号３）である。
【０１７６】
以下の実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明の範囲を限定することは意図されていない。本明細書に引用された全ての特許及び参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１７７】
実施例１
【０１７８】
ＧＦＰ配列の部位への合成イントロンの挿入及びそのインビトロでの可視化（図６）。
【０１７９】
ステップ１．ベクターの構築
【０１８０】
図６は、ベクターの概略図を示しており、ここで配列は、マウスＰＧＫ−１イントロン１スプライスドナー（配列番号８）及びアクセプター（配列番号９）及びＰＧＫ−１イントロン配列の一部を含む。ＰＧＫ−１イントロン配列の一部は、それぞれ（配列番号８）及び（配列番号９）に組み込まれた。適切な薬物による選択を提供するための抗生物質選択マーカー遺伝子も含まれていた。このベクターを蛍光タンパク質、例えばＧＦＰのコード配列に挿入した。Ｃｒｅ媒介による欠失の後に単一のｌｏｘＰ部位が生成され得るので、ｌｏｘＰが、５’ＧＦＰ（配列番号１０）及び３’ＧＦＰ（配列番号１１）のスプライスを妨害し得るかどうかを試験するために、スプライスドナー部位とスプライスアクセプター部位との間の配列に野生型ｌｏｘＰを含む。構築物を細胞、例えばマウス幹細胞に導入した。緑色蛍光を、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、挿入及びスプライシングの位置が成功し、ｌｏｘＰ部位が蛍光タンパク質の発現を妨げないことが示された。分割されたＧＦＰコード配列は、ＧＦＰコード配列の、より小さい部分を有する５’部分と、より大きい部分を有する３’部分とを有する。
【０１８１】
イントロンをＧＦＰのコード配列に挿入した後に、光学マーカー、ＧＦＰを発現させることを求めた。
【０１８２】
ベクターは、５’から３’へと以下を含んだ、
１）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
２）合成の５’ＧＦＰコード配列（配列番号１０）、
３）スプライシングドナー部位（配列番号８）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の５’末端の合成の短縮バージョン、
４）合成の野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
５）スプライシングアクセプター部位（配列番号９）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の３’末端の合成の短縮バージョン、
６）合成の３’コード配列ＧＦＰ（配列番号１１）、
７）合成ポリ（Ａ）部位（配列番号３２）。
【０１８３】
１〜７の成分は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な分子生物学手順を使用して、キャリアベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）中にアセンブルした。
【０１８４】
真核生物選択カセットである、ネオマイシン耐性遺伝子をまた、ネオマイシン耐性遺伝子カセットの挿入が成分１〜８の配列の外側に位置するように、上記の成分１〜８を有するキャリアベクターの内部に挿入した。
【０１８５】
ネオマイシン耐性遺伝子は、ＰＧＫ−１プロモーター（配列番号１８）を有する。
【０１８６】
ステップ２．エレクトロポレーションによるマウス胚性幹細胞へのベクターの導入
胚性幹細胞培地（ＥＳ）は、以下の成分を添加することによって調製した：５００ｍｌボトルに高グルコース（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６０−０４４）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）：・６ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ、（ＧｌｕｔａＭＡＸ−１、Ｇｉｂｃｏ  ３５０５０−０６１）・６ｍｌの希釈β−メルカプトエタノール、最終濃度１００μＭ。・６ｍｌのピルビン酸ナトリウム、最終１ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ、１１３６０−０７０）・６ｍｌの非必須アミノ酸、最終１００μＭ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０−０５０）・１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（白血病阻害因子、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＥＳＧ１１０７）・ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０−１４８、それぞれ最終濃度５０ｕｇ／ｍｌ）プラス１５％ウシ胎仔血清。
【０１８７】
エレクトロポレーションの前日、以下を調製しなければならない：（ｉ）ガンマ線不活性化ネオマイシン耐性線維芽細胞のフィーダー層を含む１枚の１０ｃｍプレート。（ｉｉ）ＥＳ細胞は、エレクトロポレーションの日に約１×１０７個の細胞が利用できるように、約８０％のコンフルエンシーまで増殖させるべきである。
【０１８８】
エレクトロポレーションの日に、以下の９つの手順に従う必要がある：
１．ＥＳ培地をエレクトロポレーションの２〜４時間前に交換し、細胞を収穫する。通常、ＥＳ細胞の１つの１０ｃｍプレートが必要となる。このプレートは約２×１０７個の細胞を提供する。これは１つのエレクトロポレーションに適している。
２．培地を除去し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄する。３ｍｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用い、３７℃で５分間インキュベートしてＥＳ細胞を消化する。１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて、トリプシン反応を停止させる。
３．細胞を１５ｍＬチューブに集め、ＥＳ細胞を１５００ｒｐｍで５分間スピンさせる。
４．細胞密度が約１×１０７細胞／ｍＬとなるように１ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液中にＥＳ細胞を再懸濁した。
５．ベクターをＮｏｔＩ制限酵素で３７℃、０．１ｍｌの反応液で２時間切断し、酵素を８０℃で１０分間加熱失活させる。１ｍｌのＥＳ細胞懸濁溶液に０．１ｍｌの切断ベクターを添加する。
６．混合物を０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに添加する。滅菌トランスファーピペットで穏やかに上下に混ぜる。０．４Ｋボルト、２５μＦＤに設定された遺伝子パルサーでエレクトロポレーションする（時定数は０．４または０．５秒であるべきである）。
７．室温で１０分間放置する。エレクトロポレーションされたＥＳ細胞０．３ｍｌを２回、１０ｃｍプレートに、比例量のＤＭＥＭ培地と共にプレートする。
８．２４時間後、１５０〜２５０μｇ／ｍｌの濃度でジェネティシン（Ｇ４１８）を用いて選択を開始する。
９．培地を毎日交換する。ＥＳ細胞は、増殖して１０日目または１１日目までにコロニーを形成する。
【０１８９】
ステップ３．蛍光顕微鏡下での緑色蛍光の可視化
手順番号９のＥＳ媒体を部分的に除去した。ニコン蛍光ズーム顕微鏡の観察台にプレートを移した。Ｅｐｉ蛍光発光体から発生した青色光によって励起された緑色蛍光シグナルを観察し、デジタルカメラで捉えた（図１１）。
【０１９０】
実施例２
ＧＦＰ配列の異なる部位への合成イントロンを挿入すること、及びそのインビトロでの可視化
【０１９１】
ステップ１．ベクターの構築
【０１９２】
図７は、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰのコード配列を異なる位置で分けることができるかどうかを試験するためのベクターの概略図を示す。実施例１の同じＰＧＫ−１イントロンを、ＧＦＰコード配列の異なる位置に挿入した。この実験のために選択された部位は、ＧＦＰ配列の下流に向かっていた。この設計は、３’ＧＦＰ配列を、実施例１の配列よりもかなり短く保った。
【０１９３】
ベクターは、５’から３’へ以下を含んだ、
１）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
２）合成の５’ＧＦＰコード配列（配列番号１２）、
３）スプライシングドナー部位（配列番号８）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の５’末端の合成の短縮バージョン、
４）合成の野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
５）スプライシングアクセプター部位（配列番号９）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の３’末端の合成の短縮バージョン、
６）合成の３’コード配列ＧＦＰ（配列番号１３）、
７）合成ポリ（Ａ）部位（配列番号２０）。
【０１９４】
１〜７の成分を、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な分子生物学手順を使用することにより、キャリアベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）にアセンブルした。
【０１９５】
真核生物選択カセットである、ネオマイシン耐性遺伝子をまた、ネオマイシン耐性遺伝子カセットの挿入が成分１〜８の配列の外側に位置するように、上記の成分１〜８を有するキャリアベクターの内部に挿入した。
【０１９６】
ネオマイシン耐性遺伝子は、ＰＧＫ−１プロモーター（配列番号１８）を有する。
【０１９７】
ステップ２．ステップ２．実施例１のステップ２に記載のとおり。
【０１９８】
ステップ３．蛍光顕微鏡下での緑色蛍光の可視化
【０１９９】
手順番号９のＥＳ媒体を部分的に除去した。ニコン蛍光ズーム顕微鏡の観察台にプレートを移した。緑色蛍光シグナルを観察し、デジタルカメラによって捉えた（図１２）。結果により、挿入が非常に柔軟であることが実証された。
【０２００】
実施例３
他の蛍光タンパク質へ合成イントロンを挿入すること、及びそのインビトロでの可視化
図８は、異なる蛍光タンパク質、例えば、ＤｓＲｅｄ（赤色蛍光タンパク質）のコード配列がスプライスドナー及びアクセプターの異なるセットによって分割され得るかどうかを試験するためのベクターの概略図を示す。スプライスドナー及びアクセプターは、スプライスドナー（配列番号１４）及びスプライスアクセプター（配列番号１５）の配列を有するマウスアルブミン遺伝子のイントロン９から選択した。ＤｓＲｅｄのコード配列を５’及び３’部分に分けた。５’部分（配列番号１６）は、より短い配列を有し、３’（配列番号１７）部分ははるかに長い配列を有する。実験は以下の４つのステップで構成された。
【０２０１】
ステップ１．ベクターの構築
【０２０２】
構築物ベクターは、５’から３’へ以下を含んだ、
１）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
２）合成の５’ＤｓＲｅｄコード配列（配列番号１６）、
３）スプライシングドナー部位（配列番号１４）を含むマウスアルブミンイントロン９の５’末端の合成の短縮バージョン、
４）合成野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
５）スプライシングアクセプター部位（配列番号１５）を含むマウスアルブミンイントロン９の３’末端の合成の短縮バージョン、
６）合成３’コード配列ＤｓＲｅｄ（配列番号１７）、
７）合成ポリ（Ａ）部位（配列番号２０）。
【０２０３】
１〜７の成分を、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な分子生物学手順を使用することにより、キャリアベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）にアセンブルした。
【０２０４】
真核生物選択カセットである、ネオマイシン耐性遺伝子をまた、ネオマイシン耐性遺伝子カセットの挿入が成分１〜７の配列の外側に位置するように、上記の成分１〜７を有するキャリアベクターの内部に挿入した。
【０２０５】
ネオマイシン耐性遺伝子は、ＰＧＫ−１プロモーター（配列番号１８）を有する。
【０２０６】
ステップ２．実施例１のステップ２に記載のとおり。
【０２０７】
ステップ３．以下の手順で、コロニーをピックアップする
ａ）１０ｍｌのＰＢＳでリンスすることによりＥＳ細胞プレートを調製する。
ｂ）プレートを顕微鏡の下に置き、未分化の健康なコロニーを選択する。
ｃ）Ｐ−２０ピペットチップを用いてコロニーを選択する。
ｄ）コロニーを単一細胞に壊すことなくコロニーを慎重に選び、０．２５％トリプシンを含む９６ウェルプレートに移す。
ｅ）１６個全てのコロニーをウェルに一旦採取して、そのプレートを３７℃のインキュベーターで５分間インキュベートする。
ｆ）各ウェルに１００μｌの培地を加える。コロニーを分解するためにマルチチャンネルピペットを使用して上下に約１０〜１５回ピペッティングする。
ｇ）細胞懸濁液を９６ウェルゼラチン化プレートに移す。
ｈ）８０％コンフルエンスまで毎日培地を交換する。
ｉ）ウェルから培地を除去し、１００μｌのＰＢＳで洗浄する。ｊ）１５μｌの０．２５％トリプシンを添加し、３７℃で５分間インキュベートする。
ｋ）ウシ胎仔血清を含む１００μｌのＥＳ培地を添加し、約１０〜１５回上下にピペッティングし、１６ウェルのＥＳ細胞を混合及び組み合わせる。
【０２０８】
ステップ４．蛍光顕微鏡下での赤色蛍光の可視化
【０２０９】
ＥＳ細胞を含む１０μｌのＥＳ培地を、共焦点顕微鏡観察のためにガラス底プレートに移した。赤色蛍光を観察し、共焦点顕微鏡によって捉えた（図１３）。結果によって、他の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、イントロン配列の挿入によって２つの部分にかなり分けやすく、他のエキソンドナー及びアクセプターも同様に使用できることが実証された。
【０２１０】
実施例４
図９ａはベクターの概略図を示しており、デザインごとに、ＤｅＲｅｄの５’部分またはＤｓＲｅｄの３’部分のみが機能的な赤色蛍光タンパク質を生成すべきではない。それが真であるかどうかを試験するために、以下の２つの構築物を作製した：構築物Ｃ１（対照１として）、及び構築物Ｃ２（対照２として）。
【０２１１】
構築物Ｃ１は、ｐＣＡＧプロモーターのすぐ後ろに直接挿入されたＤＳｒｅｄの５’部分のみを有する。実験は４段階で行った（図１０ａ）。
【０２１２】
ステップ１．ベクターの構築
【０２１３】
構築物ベクターは、５’から３’へ以下を含んだ、
１）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
２）合成の５’ＤｓＲｅｄコード配列（配列番号１６）、
３）スプライシングドナー部位（配列番号１４）を含むマウスアルブミンイントロン９の５’末端の合成の短縮バージョン、
【０２１４】
１〜３の成分を、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な分子生物学手順を使用して、キャリアベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）中にアセンブルした。
【０２１５】
真核生物選択カセットである、ネオマイシン耐性遺伝子をまた、ネオマイシン耐性遺伝子カセットの挿入が成分１〜３の配列の外側に位置するように、上記の成分１〜３を有するキャリアベクターの内部に挿入した。
【０２１６】
残りのステップは、実施例３に記載のステップ２〜４に記載したものと同じか、またはほぼ同じである。共焦点蛍光顕微鏡下で赤色蛍光は観察されず、５’ＤｓＲｅｄ単独では機能性赤色蛍光タンパク質が得られないことが判明した。
【０２１７】
実施例５
図９ｂは、実施例１（図６）に記載されているのと同じプロモーターに蛍光タンパク質の３’部分配列のみが連結されている、実験例５のベクターの概略図を示す。
【０２１８】
構築物Ｃ２は、ｐＣＡＧプロモーターのすぐ後ろに直接挿入されたＤｓＲｅｄの３’部分のみを有する。実験は４段階で行った（図１０ｂ）。
【０２１９】
ステップ１．ベクターの構築
【０２２０】
構築物ベクターは、５’から３’へ以下を含んだ、
１）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
２）合成の５’ＤｓＲｅｄコード配列（配列番号１７）、
３）ポリ（Ａ）シグナル配列（配列番号２０）
【０２２１】
１〜３の成分を、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な分子生物学手順を使用して、キャリアベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）中にアセンブルした。
【０２２２】
真核生物選択カセットである、ネオマイシン耐性遺伝子をまた、ネオマイシン耐性遺伝子カセットの挿入が成分１〜３の配列の外側に位置するように、上記の成分１〜３を有するキャリアベクターの内部に挿入した。
【０２２３】
残りのステップは、実施例３に記載のステップ２〜４に記載したものと同じか、またはほぼ同じである。共焦点蛍光顕微鏡下で赤色蛍光は観察されず、３’ＤｓＲｅｄ単独では機能性赤色蛍光タンパク質が生じないことが判明した。
【０２２４】
実施例６
分割されたＧＦＰをインビボで試験するために、マウスをそのＳＬＣ３９Ａ４遺伝子を標的化することによって作製した。
【０２２５】
図１０ａは、マウスＳＬＣ３９Ａ４遺伝子の標的化ベクターによる標的対立遺伝子の概略図を示す。２つの配列：５’−ＣＣＣＡＴＣＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＴＴＧ−３’（配列番号３０）及び５’−ＣＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＴＧＧＣ−３’（配列番号３１）を含むＰｓｐ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベースのプラスミドベクターを使用して、細菌の相同性ベースの組換え技術（Ｈｅｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．７：１４．（２００８）及びＡｎｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７，ｅ１６（１９９９））を用いることによって、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１５６Ｐ２３由来のゲノムフラグメントをサブクローニングした。ポリ（Ａ）シグナル配列、３’ＧＦＰ、スプライスアクセプター部位及びｌｏｘＰ部位を含む３’ＧＦＰカセットを、マウスＳＬＣ３９Ａ４遺伝子のイントロン２に挿入し、ｌｏｘＰ部位、スプライスドナー部位、５’ＧＦＰ、ｐＣＡＧ（ＣＡＧのプロモーター）、Ｇ４１８耐性選択カセット（Ｎｅｏ）（配列番号１８）を含む５’ＧＦＰカセットを、エキソン１２の下流の配列に挿入した。ＳＬＣ３９Ａ４遺伝子の標的化ベクターは、以下を含む：
（１）５’相同性アーム（配列番号２１）、
（２）合成ポリ（Ａ）部位（配列番号３２）、
（３）合成の３’コード配列ＧＦＰ（配列番号１１）、
（４）スプライシングアクセプター部位（配列番号９）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の３’末端の合成の短縮バージョン、
（５）合成の野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
（６）マウスＳＬＣ３９Ａ４遺伝子の標的配列（配列番号２２）、
（７）合成野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
（８）スプライシングドナー部位（配列番号８）を含むマウスキナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の５’末端の合成の短縮バージョン、
（９）合成の５’ＧＦＰコード配列（配列番号１０）、
（１０）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
（１１）Ｇ４１８耐性選択カセット（Ｎｅｏ）（配列番号１８）、
（１２）３’相同性アーム（配列番号２３）。
【０２２６】
標的化ベクターをエレクトロポレーション（実施例１、ステップ２）によってマウス幹細胞に導入した。Ｇ４１８を選択した後、サザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．９８（３）：５０３−５１７（１９７５）によって標的クローンを特定した（図１４）。
【０２２７】
陽性ＥＳクローンを、マウス胚盤胞に注入してマウスキメラを作製した。次いで、これらのキメラを、野生型マウスと交配させて、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１９９６３７９２８．（２０００））の書籍に記載されているような標的改変を有する生殖細胞系マウスを作製した。
【０２２８】
標的対立遺伝子を有する生殖細胞系マウスを、Ｃｒｅリコンビナーゼ含有マウス（例えば、Ｓｏｘ２Ｃｒｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））とさらに交配させて、ＧＦＰが発現された標的遺伝子欠損マウスを作製した（図１５）。
【０２２９】
実施例７
ＥＮ２エキソントラッピングアクセプター配列を含む、分割されたＧＦＰをインビボでさらに試験するために、マウスをそのＢａｓｉｇｉｎ遺伝子を標的化することによって作製した。
【０２３０】
図１０ｂは、マウスＢａｓｉｇｉｎ遺伝子の標的化ベクターによる標的対立遺伝子の概略図を示す。Ｐｓｐ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベースのプラスミドベクターを用いて、記載されているとおり（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、標準的な分子生物学手順（制限酵素切断及びライゲーション）を用いて、マウスフォスミドクローンＷＩ１−１４０５Ｅ１０からゲノム断片をサブクローニングした。同様に、ポリ（Ａ）シグナル配列、３’ＧＦＰ、スプライスアクセプター部位及びｌｏｘＰ部位を含む３’ＧＦＰカセットを、マウスＢａｓｉｇｉｎ遺伝子のイントロン１に挿入した。そしてＥＮ２エキソントラッピング部位、ｌｏｘＰ部位、スプライスドナー部位、５’ＧＦＰ、ｐＣＡＧ（ＣＡＧのプロモーター）、Ｇ４１８耐性選択カセット（Ｎｅｏ）を含む５’ＧＦＰカセットを、細菌の相同性ベースの組換え技術（Ｈｅｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．７：１４．（２００８）及びＡｎｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７，ｅ１６（１９９９））を用いることによって、エキソン８の下流配列に挿入した。
【０２３１】
Ｂａｓｉｇｉｎ遺伝子の標的化ベクターは、以下を含む：
（１）５’相同性アーム（配列番号２４）、
（２）合成ポリ（Ａ）部位（配列番号２０）、
（３）合成の３’コード配列ＧＦＰ（配列番号１３）、
（４）スプライシングアクセプター部位（配列番号９）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の３’末端の合成の短縮バージョン、
（５）合成野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
（６）マウスＢａｓｉｇｉｎ遺伝子の標的配列（配列番号２５）、
（７）合成野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
（８）スプライシングドナー部位（配列番号８）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の５’末端の合成の短縮バージョン、
（９）合成の５’ＧＦＰコード配列（配列番号１２）、
（１０）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
（１１）Ｇ４１８耐性選択カセット（Ｎｅｏ）（配列番号１８）、
（１２）３’相同性アーム（配列番号２６）。
【０２３２】
標的化ベクターをエレクトロポレーション（実施例１、ステップ２）によってマウス幹細胞に導入した。Ｇ４１８を選択した後、サザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．９８（３）：５０３−５１７．（１９７５））によって標的クローンを特定した（図１６ａ及び図１６ｂ）。
【０２３３】
陽性ＥＳクローンをマウス胚盤胞に注入してマウスキメラを作製した。次いで、これらのキメラを、野生型マウスと交配させて、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１９９６３７９２８．（２０００））の書籍に記載されているような標的改変を有する生殖細胞系マウスを作製した。
【０２３４】
標的対立遺伝子を有する生殖細胞系マウスを、Ｃｒｅリコンビナーゼ含有マウス（例えば、Ｓｏｘ２Ｃｒｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））とさらに交配させて、ＧＦＰが発現された標的遺伝子欠損マウスを作製した（図１７）。
【０２３５】
実施例８
ＥＮ２エキソントラッピングアクセプター配列を含む、分割されたＧＦＰをインビボでさらに試験するために、マウス遺伝子ＫＬＨＬ１２を標的化した。図１０ｃは、ＥＮ２エキソントラッピング部位を有する異なるマウス遺伝子、ＫＬＨＬ１２の標的対立遺伝子の概略図を示す。マウスフォスミドクローンＷＩ１−２３５１Ｋ２１を、実施例６及び７の記載の方法と同様の出発材料として用いた。標的化ベクターは、マウスＫＬＨＬ１２遺伝子のイントロン２に、ポリ（Ａ）シグナル配列、３’ＧＦＰ、スプライスアクセプター部位及びｌｏｘＰ部位を含む３’ＧＦＰカセットを挿入すること、及びエキソン１２の下流の配列に、ＥＮ２エキソントラッピング部位、ｌｏｘＰ部位、スプライスドナー部位、５’ＧＦＰ、ｐＣＡＧ（ＣＡＧのプロモーター）、Ｇ４１８耐性選択カセット（Ｎｅｏ）を含む５’ＧＦＰカセットを挿入することによって、構築した。マウスＫＬＨＬ１２遺伝子の標的化ベクターは、以下を含む：
（１）５’相同性アーム（配列番号２７）、
（２）合成のポリ（Ａ）部位（配列番号２０）、
（３）合成の３’コード配列ＧＦＰ（配列番号１３）、
（４）スプライシングアクセプター部位（配列番号９）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の３’末端の合成の短縮バージョン、
（５）合成の野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
（６）マウスＫＬＨＬ１２遺伝子の標的配列（配列番号２８）、
（７）合成の野生型ｌｏｘＰ部位（配列番号４）、
（８）スプライシングドナー部位（配列番号８）を含むマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ−１）イントロン１の５’末端の合成の短縮バージョン、
（９）合成の５’ＧＦＰコード配列（配列番号１２）、
（１０）ｐＣＡＧプロモーター（配列番号１）、
（１１）Ｇ４１８耐性選択カセット（Ｎｅｏ）（配列番号１８）、
（１２）３’相同性アーム（配列番号２９）。
【０２３６】
標的化ベクターをエレクトロポレーション（実施例１、ステップ２）によりマウス幹細胞に導入した。Ｇ４１８の選択後、サザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．９８（３）：５０３−５１７（１９７５））によって、標的クローンを特定した（図１８ａ及び図１８ｂ）。陽性ＥＳクローンをマウス胚盤胞に注入してマウスキメラを作製した。次いで、これらのキメラを、野生型マウスと交配させて、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１９９６３７９２８．（２０００））の書籍に記載されているような標的改変を有する生殖細胞系マウスを作製した。
【０２３７】
陽性ＥＳクローンをマウス胚盤胞に注入してマウスキメラを作製した。次いで、これらのキメラを、野生型マウスと交配させて、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１９９６３７９２８．（２０００））の書籍に記載されているような標的改変を有する生殖細胞系マウスを作製した。標的マウスを、インターロイキン１７プロモーターにより駆動されるＣｒｅリコンビナーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号０１６８７９）を担持するマウスと交配させ、緑色蛍光を腸で観察した（図１９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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