(57)【要約】いくつかの態様において、本発明は、がんを処置する方法であって、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を、がんを有する対象に投与する段階を含む方法を提供する。2019534316.tif 000021
2019534316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照に対するMYC、NEDD4-1、またはWWP1の発現増加を検出する段階を含む方法によって選択された対象においてがんを処置する方法であって、NEDD4-1またはWWP1の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
対象においてがんを処置する方法であって、NEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項３】
新生物細胞中のNEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)およびWWP1(WW domain-containing protein-1)を阻害する方法であって、該細胞を、NEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と接触させる段階を含む、方法。
【請求項４】
MYC発現が増加している新生物細胞の生存または増殖を阻害する方法であって、MYC発現が増加していると特徴づけられる細胞を、NEDD4-1を阻害する作用物質およびWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と接触させる段階を含み、それによって新生物細胞の生存または増殖を阻害する、方法。
【請求項５】
新生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞が、マウス細胞、ラット細胞、またはヒト細胞である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞がインビトロまたはインビボに存在する、請求項5記載の方法。
【請求項８】
新生物細胞またはがんが、PTENに変異を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
新生物細胞またはがんが、cMYCを過剰発現している、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
新生物細胞の生存または増殖を減少させる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
新生物細胞が、前立腺がん、乳がん、または結腸直腸がんに由来する、請求項3または4記載の方法。
【請求項１２】
対象が、前立腺がん、乳がん、または結腸直腸がんを有する、請求項1または2記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、NEDD4-1またはWWP1の発現を阻害する阻害性核酸分子である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
作用物質が、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンおよびインドール-3-カルビノールからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
作用物質が、NEDD4-1/WWP1ヘテロ二量体の形成を阻害する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
対象のための治療法を選択する方法であって、PTEN、MYC、WWP1、およびNEDD4-1からなる群より選択されるマーカーにおける変化を検出する段階を含み、該変化の検出により、該対象が、WWP1および／またはMEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質で処置されるべきことが示される、方法。
【請求項１９】
PTENにおける変化が、PTENの発現または活性を減少させる変異である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
MYCにおける変化が、MYCの増幅または過剰発現をもたらす、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
WWP1およびNEDD4-1における変化が、WWP1またはNEDD4-1の過剰発現をもたらす、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
MYC、NEDD4-1、およびWWP1の過剰発現が検出される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
作用物質が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドが、NEDD4-1またはWWP1の発現を阻害する阻害性核酸分子である、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
作用物質が、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンおよびインドール-3-カルビノールからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2016年8月30日に出願された米国仮特許出願第62/381,294号の恩典および優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援の研究に基づいてなされた発明に対する権利の言明
本発明は、米国立衛生研究所により付与された助成金第CA082328号の下で、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)は、脂質およびタンパク質の二重ホスファターゼであり、腫瘍抑制因子である。PTENは、様々な種類のヒトがんにおいて頻繁に変異しているか、欠失しているか、または後成的に発現抑制されている。細胞質中で、PTENは主に、PI3K-Akt発がん経路をアンタゴナイズするその脂質ホスファターゼ活性を介して、細胞の生存、増殖、老化、血管新生、および代謝を含む重要な細胞過程をつかさどる。PTENは、膜区画内で二量体として活性を有する。しかしながら、PTENの二量体化を調節する機構は、いまだ完全には特徴づけられていない。
【０００４】
ユビキチン化により、76アミノ酸のユビキチンポリペプチドが標的タンパク質のリジン残基に共有結合される。この共有結合修飾は、哺乳動物細胞における最も多くかつ最も重要な翻訳後タンパク質修飾の1つである。ユビキチン分子中の7個のリジン残基およびMet-1残基が、別のユビキチン部分の結合を媒介するために利用され得、基質上で長さおよび結合型が様々なポリユビキチン鎖が形成される。トポロジー的に異なるこれらのポリマーは、多様な生物学的機能に影響を及ぼし、それによってユビキチン化は、細胞における最も汎用性の高い翻訳後修飾の1つとなっている。例えば、プロテアソーム分解におけるK48結合型鎖の必須の役割が多くの研究によって示された一方で、K63結合型鎖は、様々なシグナル伝達経路において重要なタンパク質間相互作用のプラットフォームとして機能する。K11結合型ユビキチン鎖もまたプロテアソーム分解の基質を標的化し、直鎖状Met1結合型鎖は非分解性のシグナルとして役立ち、免疫およびNFκB経路において機能することが、新たに出てきた証拠によって示された。対照的に、K27を介して結合された鎖型を含む、残りの非定型のユビキチン鎖型の機能については、ほとんどわかっていない。
【０００５】
PTENは、ヒトがんにおいて最も頻繁に変異しているか、欠失しているか、または発現抑制されている腫瘍抑制因子遺伝子の1つである。機能的に、PTENは二重特異性ホスファターゼをコードし、その主要な基質はホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸(PIP3)である。PTENは二次メッセンジャーPIP3のD3-リン酸を脱リン酸化し、がん原性PI3K/AKTシグナル伝達経路の活性化を妨害し、ひいては細胞増殖、細胞成長、および細胞代謝を制御する。
【０００６】
MYCは、複製、細胞分裂、タンパク質合成、および代謝を含む複数の生物学的過程に関与する重要な転写因子である。MYCの増幅を引き起こす、MYCの領域での染色体8q24における高頻度の変化は、疾患攻撃性と関連づけられている。多様な組織学的起源のがんにおける多くの研究により、前立腺がんおよび乳がんなどの腫瘍進行中に、MYCが広範に活性化されると考えられることが示された。その腫瘍形成促進性機能の多くは、下流の標的遺伝子の発現を異常に活性化するその能力に原因があるとされている。さらに、PI3K-AKTシグナル伝達経路の活性化とMYC増幅は、がんにおいて同時に起こることが頻繁に見出され、高い組織学的異型度および予後不良と相関する。しかしながら、MYCがPI3K-AKT経路活性化とどのようにクロストークするかの基本的機構は、依然として理解しにくい。
【０００７】
PTENは厳密に調節されており、異常な細胞内局在性および翻訳後修飾を介したその機能の調節解除は、腫瘍形成における重要な事象である。機構的に、モノユビキチン化はPTENの核区画化を調節し、そこでPTENはPIP3非依存的機能を発揮する。PTENは二量体として存在することもでき、そのような二量体形成および膜動員は、PTENの機能および活性化に不可欠である。しかしながら、PTENの二量体化を調節し、膜動員を支持する機構は、依然として大部分が不明である。そのような機構の解明は、緊急に必要とされている新たながん治療を明らかにすると予測される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は概して、がんを処置する方法であって、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を、がんを有する対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【０００９】
1つの局面において、本発明は、参照に対するMYC、NEDD4-1、またはWWP1の発現増加を検出する段階を含む方法によって選択された対象においてがんを処置する方法であって、NEDD4-1またはWWP1の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を対象に投与する段階を含む方法に注目する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、対象においてがんを処置する方法であって、NEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を対象に投与する段階を含む方法に注目する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、新生物細胞中のNEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)およびWWP1(WW domain-containing protein-1)を阻害する方法であって、細胞を、NEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と接触させる段階を含む方法に注目する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、MYC発現が増加している新生物細胞の生存または増殖を阻害する方法であって、MYC発現が増加していると特徴づけられる細胞を、NEDD4-1を阻害する作用物質およびWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と接触させる段階を含み、それによって新生物細胞の生存または増殖を阻害する方法に注目する。
【００１３】
本明細書において詳細に説明される本発明の上記局面または任意の他の局面のいずれかの様々な態様において、新生物細胞は哺乳動物細胞である。他の態様において、哺乳動物細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはヒト細胞である。さらなる他の態様において、細胞はインビトロまたはインビボに存在する。さらなる他の態様において、新生物細胞またはがんはPTENに変異を含む。さらなる他の態様において、新生物細胞またはがんはcMYCを過剰発現する。さらなる他の態様において、本方法は新生物細胞の生存または増殖を減少させる。さらなる他の態様において、新生物細胞は、前立腺がん、乳がん、または結腸直腸がんに由来する。さらなる他の態様において、対象は、前立腺がん、乳がん、または結腸直腸がんを有する。さらなる他の態様において、作用物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である。さらなる他の態様において、ポリヌクレオチドは、NEDD4-1またはWWP1の発現を阻害する阻害性核酸分子である。さらなる他の態様において、阻害性核酸分子は、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである。さらなる他の態様において、作用物質は、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンおよびインドール-3-カルビノールからなる群より選択される。さらなる他の態様において、作用物質はNEDD4-1/WWP1ヘテロ二量体の形成を阻害する。さらなる他の態様において、PTEN、MYC、WWP1、およびNEDD4-1からなる群より選択されるマーカーにおける変化を検出する段階を含み、該変化の検出により、対象が、WWP1および／またはNEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質で処置されるべきことが示される、方法。さらなる他の態様において、PTENにおける変化は、PTENの発現または活性を減少させる変異である。さらなる他の態様において、MYCにおける変化は、MYCの増幅または過剰発現をもたらす。さらなる他の態様において、WWP1およびNEDD4-1における変化は、WWP1またはNEDD4-1の過剰発現をもたらす。さらなる他の態様において、MYC、NEDD4-1、およびWWP1の過剰発現が検出される。さらなる他の態様において、作用物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である。さらなる他の態様において、ポリヌクレオチドは、NEDD4-1またはWWP1の発現を阻害する阻害性核酸分子である。さらなる他の態様において、阻害性核酸分子は、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである。さらなる他の態様において、作用物質は、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンおよびインドール-3-カルビノールからなる群より選択される。
【００１４】
本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離されたまたはその他の方法で製造されたものである。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１５】
定義
特に定義されない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明において用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で用いられる場合、以下の用語は、特に指定がない限り、以下でそれらに割り当てられる意味を有する。
【００１６】
「PTEN(Phosphatase And Tensin Homolog Deleted On Chromosome Ten)ポリペプチド」とは、NCBI参照配列：NP_002985.1に提供される配列と少なくとも約85%のアミノ酸同一性を有し、かつホスファターゼ活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。PTENタンパク質の例には、NCBI参照配列NP_00305.3に記載される配列を有するヒトPTENタンパク質が含まれ、その配列は本明細書において以下に提供される。
(SEQ ID NO: 1)：
2019534316.tif 000003
【００１７】
「PTENポリヌクレオチド」とは、PTENポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なPTENポリヌクレオチド配列は、NCBI参照配列：NM_00314.6に提供され、本明細書において以下に転載される。
(SEQ ID NO: 2)：
2019534316.tif 000004
2019534316.tif 000005
2019534316.tif 000006
2019534316.tif 000007
【００１８】
「NEDD4(Neural Precursor Cell Expressed Developmentally Down-Regulated Protein 4 polypeptide)」または「NEDD4-1」とは、NCBI参照配列：NP_001271267と少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつE3ユビキチン-タンパク質リガーゼ活性を有するタンパク質を意味する。NEDD4-1は、例えば、胃腺がん、結腸腺がん、前立腺がん、膀胱がん、および乳がんなどのがんにおいて過剰発現される場合が多い。例示的なNEDD4-1アミノ酸配列は、本明細書において以下に提供される。
(SEQ ID NO: 3)：
2019534316.tif 000008
【００１９】
「NEDD4またはNEDD4-1ポリヌクレオチド」とは、NEDD4-1ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なNEDD4-1ポリヌクレオチド配列は、NCBI参照配列：NM_001284338に提供され、本明細書において以下に転載される。
(SEQ ID NO: 4)：
2019534316.tif 000009
2019534316.tif 000010
2019534316.tif 000011
2019534316.tif 000012
【００２０】
「WWP1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1)」とは、NCBI参照配列：NP_008944.1と約85%のアミノ酸配列同一性を有し、かつE3リガーゼ活性を有するタンパク質を意味する。WWP1は、例えば、前立腺がん、乳がん、胃がん、および肝がんなどのがんにおいて過剰発現される場合が多い。例示的なWWP1アミノ酸配列は、本明細書において以下に提供される。
(SEQ ID NO: 5)：
2019534316.tif 000013
【００２１】
「WWP1ポリヌクレオチド」とは、WWP1ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なWWP1ポリヌクレオチド配列は、NCBI参照配列：NM_007013に提供され、本明細書において以下に転載される。
(SEQ ID NO: 6)：
2019534316.tif 000014
2019534316.tif 000015
2019534316.tif 000016
【００２２】
「作用物質」とは、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、もしくはポリペプチド、またはそれらの断片を意味する。
【００２３】
「改善する」とは、疾患の発症または進行を減らす、抑制する、減弱する、軽減する、停止させる、または安定化させることを意味する。
【００２４】
「改変」とは、本明細書において記載されるものなどの標準的な当技術分野で公知の方法によって検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化(増加または減少)を意味する。本明細書において用いられる場合、改変は、発現レベルの10%の変化、好ましくは25%の変化、より好ましくは40%の変化、および最も好ましくは50%またはそれ以上の発現レベルの変化を含む。
【００２５】
「類似体」とは、同一ではないが、しかし類似の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチド類似体は、対応する天然ポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然ポリペプチドと比べて類似体の機能を増強するある種の生化学的修飾を有する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、類似体のプロテアーゼ耐性、膜透過性、または半減期を増加させることができる。類似体は、非天然アミノ酸を含みうる。
【００２６】
本開示において、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含有する(containing)」、および「有する(having)」などは、米国特許法でそれらに帰属する意味を有することができ、「含む(includes)」、「含む(including)」などを意味することができる; 「から本質的になる」または「から本質的になる」は同様に、米国特許法に基づく意味を有し、この用語は制限がなく、記載されているものの基本のまたは新規の特徴が、記載されているものよりも多くの存在によって変えられるのではなく、先行技術の態様を除外する限り、記載されているものよりも多くの存在を許容する。
【００２７】
「検出する」とは、検出されるべき分析物の存在、非存在または量を同定することをいう。
【００２８】
「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態または障害を意味する。疾患の例としては、乳がん、前立腺がん、および大腸がんが挙げられる。
【００２９】
「有効量」とは、未処置の患者と比べて疾患の症状を改善するのに必要な量を意味する。疾患の治療的処置のため本発明を実践するために用いられる活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、および全身の健康状態に応じて変わる。最終的には、担当医または獣医が適切な量および投与計画を決定するであろう。そのような量は「有効」量と称する。
【００３０】
本発明は、本明細書において記載される方法によって特徴付けられる障害を処置するための非常に特異的な薬物の開発に有用ないくつかの標的を提供する。さらに、本発明の方法は、対象で用いるのに安全である療法を同定するための容易な手段を提供する。さらに、本発明の方法は、本明細書において記載される疾患に対する効果について実質的に任意の数の化合物を高容量処理、高感度、かつ低複雑度で分析するための経路を提供する。
【００３１】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含有する。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有しうる。
【００３２】
「ハイブリダイゼーション」は相補的核酸塩基間の、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でありうる、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的核酸塩基である。
【００３３】
「阻害性核酸」とは、哺乳動物細胞に投与された場合に標的遺伝子の発現の減少(例えば10%、25%、50%、75%、またはさらには90〜100%だけの)をもたらす、二本鎖RNA、siRNA、shRNA、もしくはアンチセンスRNA、またはそれらの一部分、またはそれらの模倣体を意味する。典型的には、核酸阻害剤は、標的核酸分子の少なくとも一部分、またはその相同分子種を含み、あるいは標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部分を含む。例えば、阻害性核酸分子は、本明細書において記載される核酸のいずれかまたは全ての少なくとも一部分を含む。
【００３４】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態で見られる通常付随している成分を程度の差はあれ含まない材料をいう。「単離する」とは、元の供給源または周囲からのある程度の分離を示す。「精製する」とは、単離よりも高い分離度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物もタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさない、または他の有害な結果を引き起こさないように、他の材料を十分に含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組み換えDNA技法によって産生される場合には細胞材料、ウイルス材料もしくは培地、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないならば精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを用いて判定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中に本質的に1本のバンドを生じさせることを意味することができる。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化を受けることができるタンパク質の場合、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離タンパク質を生じさせうる。
【００３５】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えば、DNA)を意味する。それゆえ、この用語は、例えば、ベクターに組み込まれている組み換えDNA; 自律複製プラスミドもしくはウイルスに組み込まれている組み換えDNA; または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれている組み換えDNA; あるいは他の配列とは独立した別個の分子(例えば、cDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるゲノム断片もしくはcDNA断片)として存在するものを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、ならびにさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えDNAを含む。
【００３６】
「単離されたポリペプチド」とは、天然に付随する成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結び付いているタンパク質および天然有機分子を、少なくとも60重量%含まない場合に、単離されている。好ましくは、調製物は、本発明のポリペプチドの少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、および最も好ましくは少なくとも99重量%である。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然の供給源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって; またはタンパク質を化学合成することによって得てもよい。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはHPLC分析によって測定することができる。
【００３７】
「マーカー」とは、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。本発明のがんは、マーカーPtenおよびp53の低減、変化、または喪失によって特徴付けられるものである。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「作用物質を得ること」のように「得ること」は、作用物質を合成すること、購入すること、または他の方法で取得することを含む。
【００３９】
「低減する」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の変化を意味する。
【００４０】
「参照」とは、標準または対照の状態を意味する。
【００４１】
「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義された配列である。参照配列は特定の配列のサブセットまたは全体; 例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全cDNAもしくは遺伝子配列でありうる。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは概して、少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸であろう。核酸の場合、参照核酸配列の長さは概して、少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらにより好ましくは約100ヌクレオチドまたは約300ヌクレオチドあるいはその付近またはその間の任意の整数であろう。
【００４２】
「siRNA」とは、二本鎖RNAを意味する。最適には、siRNAは長さが18、19、20、21、22、23または24ヌクレオチドであり、その3'末端に2塩基突出部を有する。これらのdsRNAは、個々の細胞にまたは動物全体に導入することができる; 例えば、それらは血流を介して全身的に導入されうる。そのようなsiRNAは、mRNAレベルまたはプロモーター活性を下方制御するために用いられる。
【００４３】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識かつ結合するが、サンプル、例えば本発明のポリペプチドを天然に含む生物学的サンプル中の他の分子を実質的に認識かつ結合しない化合物または抗体を意味する。
【００４４】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、さまざまなストリンジェンシー条件の下で、相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書において記載する遺伝子)またはその一部分の間に二本鎖分子を形成する対を意味する。(例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照のこと)。
【００４５】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は通常、約750 mM NaClおよび75 mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500 mM NaClおよび50 mMクエン酸三ナトリウム未満、およびより好ましくは約250 mM NaClおよび25 mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができ、一方で高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、およびより好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約30℃の、より好ましくは少なくとも約37℃の、および最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度、および担体DNAの包含または排除のような、さまざまな追加のパラメータは、当業者に周知である。必要に応じてこれらのさまざまな条件を組み合わせることにより、さまざまなレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、750 mM NaCl、75 mMクエン酸三ナトリウム、および1% SDS中30℃で行われるであろう。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、500 mM NaCl、50 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS, 35%ホルムアミド、および100 μg/mlの変性サケ精子DNA (ssDNA)中37℃で行われるであろう。最も好ましい態様において、ハイブリダイゼーションは、250 mM NaCl、25 mMクエン酸三ナトリウム、1% SDS, 50%ホルムアミド、および200 μg/ml ssDNA中42℃で行われるであろう。これらの条件に対する有用な変形は当業者には容易に明らかであろう。
【００４６】
ほとんどの用途の場合、ハイブリダイゼーションに続く洗浄段階もストリンジェンシーが変わるであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を下げることによってまたは温度を上げることによって高めることができる。例えば、洗浄段階のためのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30 mM NaClおよび3 mMクエン酸三ナトリウム未満、および最も好ましくは約15 mM NaClおよび1.5 mMクエン酸三ナトリウム未満であろう。洗浄段階のためのストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約25℃の、より好ましくは少なくとも約42℃の、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含むであろう。好ましい態様において、洗浄段階は、30 mM NaCl、3 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中25℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中42℃で行われるであろう。より好ましい態様において、洗浄段階は、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウム、および0.1% SDS中68℃で行われるであろう。これらの条件に対するさらなる変形は当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技法は当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００４７】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書において記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ)または核酸配列(例えば、本明細書において記載される核酸配列のいずれか1つ)に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較のために用いられる配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸で少なくとも60%、より好ましくは80%もしくは85%、より好ましくは90%、95%またはさらに99%同一である。
【００４８】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を用いて測定される。そのようなソフトウェアは、相同性の程度をさまざまな置換、欠失、および/または他の修飾に割り当てることによって同一または類似の配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む: グリシン、アラニン; バリン、イソロイシン、ロイシン; アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン; セリン、トレオニン; リジン、アルギニン; およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を判定するための例示的なアプローチにおいて、e-3とe-100の間の確率スコアが密接に関連した配列を示す、BLASTプログラムを用いてもよい。
【００４９】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコなどを含むが、これらに限定されない、哺乳動物を意味する。
【００５０】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、1から50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分的な範囲を含むと理解される。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、障害および/またはそれに関連する症状を低減または改善することをいう。当然のことながら、排除されるものではないが、障害または状態を処置することは、障害、状態またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としない。本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、障害または状態を有するわけではないが、障害または状態を発症するリスクがあるまたは発症しやすい対象において障害または状態を発症する確率を低減することをいう。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、特に明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り、「または」という用語は包括的であると理解される。本明細書において用いられる場合、特に明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り、「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という用語は、単数または複数であると理解される。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、特に明記されない限りまたは文脈から明らかでない限り、「約」という用語は当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の2標準偏差以内と理解される。約は、記載されている値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、または0.01%内と理解することができる。文脈から他に明らかでない限り、本明細書において提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【００５４】
本明細書における変数の任意の定義における化学基のリストの列挙は、任意の単一の基または列挙された基の組み合わせとしてのその変数の定義を含む。本明細書における変数または局面に関する態様の列挙は、任意の単一の態様として、または任意の他の態様もしくはその一部分と組み合わせたその態様を含む。
【００５５】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の任意の組成物および方法のうちの1つまたは複数と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図1A〜1Eは、WWP1/NEDD4-1が、タンパク質分解のシグナルではないPTEN K27結合型ポリユビキチン化に必要であることを示す。図1Aは、定常状態におけるPTEN K27結合型ユビキチン化のウェスタンブロット解析である。プロテアソーム阻害剤MG132の非存在下で、PTENをHis-ユビキチン (His-Ub) および表示のHis-Ub KR変異体と共に293T溶解物にトランスフェクトした；溶解物を収集し、Ni-NTAプルダウンを行い、続いてウェスタンブロット解析を行った。図1Bは、Myc-PTENと個々のFlagタグ化NEDD4-1ファミリーユビキチンE3リガーゼとの間の相互作用の共免疫沈降解析の結果を示す。Flag抗体でFlag-NEDD4-1ファミリーリガーゼを免疫沈降(IP)させ、次いでPTEN抗体でプロービングして、PTEN／個々のNEDD4-1ファミリーリガーゼの相互作用を検出した。図1Cは、図1Aのように、表示のNEDD4-1ファミリーユビキチンリガーゼを発現するDU145細胞におけるPTEN K27結合型ポリユビキチン化のウェスタンブロット解析である。図1Dはウェスタンブロットである。表示の構築物がトランスフェクトされたDU145細胞を100μg/mlシクロヘキシミドで様々な時間処理し、内因性PTENをウェスタンブロットおよびImageJソフトウェアによって解析した。図1Eはウェスタンブロットである。表示の構築物がトランスフェクトされたPC3細胞を100μg/mlシクロヘキシミドで様々な時間処理し、内因性PTENをウェスタンブロットおよびImageJソフトウェアによって解析した。
【図２】図2A〜2Kは、PTEN K27結合型ポリユビキチン化に関するWWP1/NEDD4-1 E3の同定特徴づけを示す。図2Aはウェスタンブロットである。HA-PTENがトランスフェクトされたDU145細胞からの溶解物を、抗PTEN抗体で免疫沈降させ、続いて質量分析ペプチド配列決定を行った。WWP1およびNEDD4-1が同定された。図2Bは、インビボで内因性のWWP1、NEDD4-1、およびPTENが複合体を形成することを示すウェスタンブロットである。DU145細胞を抗PTEN抗体で免疫沈降させ、次いでウェスタンブロットによって解析した。図2Cは、インビトロでWWP1がNEDD4-1と結合することを示すウェスタンブロットである。組換えFlag-WWP1を免疫精製組換えNEDD4-1と共にインキュベートし、次いでウェスタンブロットによって解析した。図2Dは、表示のユビキチンKR変異体がWWP1/NEDD4-1媒介性PTENポリユビキチン化に及ぼす影響を示すウェスタンブロットである。293T細胞に表示の構築物をトランスフェクトし、PTENユビキチン化を解析した。ユビキチン化タンパク質をNi-NTAアガロースによって変性条件下でプルダウンし、ウェスタンブロットによって解析した。図2Eは、図1Dのように、表示のNEDD4-1ファミリーユビキチンリガーゼを発現するPC3細胞におけるPTEN K27結合型ポリユビキチン化の解析を示すウェスタンブロットである。図2Fおよび2Gは、WWP1/NEDD4-1 E3複合体によるPTENのインビトロユビキチン化のウェスタンブロット解析を示す。293細胞から精製されたFlag-PTENを、E1、E2、E3複合体、およびユビキチンまたはユビキチンの様々な変異体の存在下でインビトロユビキチン化反応に供し、次いで抗PTEN抗体を用いてウェスタンブロットによって調べた。図2Hは、タンデム質量分析のフローチャートを提供する（上部）。ユビキチンのK27残基におけるユビキチン結合を示す、ユビキチン化PTEN由来のペプチドのタンデム質量スペクトル（下部）。図2Iは、WWP1/NEDD4-1過剰発現細胞から精製されたユビキチン化PTENのMS解析によって検出された表示のユビキチン結合型の、対照細胞から精製されたものに対する比率を示すグラフである。各ユビキチン結合型の存在量は、方法に記載される通りに算出した。図2Jは、アミノ酸342（上部）および344（下部）におけるユビキチン結合を示す、ユビキチン化PTEN由来のペプチドのタンデム質量スペクトルである。「0」と表示されたイオンは、H2Oの中性損失を示す。
【図３】図3A〜3Gは、K27結合型ポリユビキチン化の発がん性の役割を示す。図3Aは、ドキシサイクリンで2日間処理された様々なユビキチン置換細胞株におけるAKT活性化およびユビキチン発現レベルのウェスタンブロット解析を提供する。図3Bは、ドキシサイクリンで2日間処理された様々なユビキチン細胞株におけるPTENポリユビキチン化のウェスタンブロット解析を提供する。図3Cは、異種間でのK342/K344パッチの保存を示す。図3Dは、PC3細胞の増殖に及ぼすPTEN K342/K344Rr変異体の影響を示す。図5N、PにおけるようなPC3細胞のインビトロ増殖速度。図3Eは、図5N、Pにおいても記載されているようなPC3細胞が、軟寒天におけるそのコロニー形成能についてアッセイされたことを示す写真である。コロニー数を定量し、平均値±SDとして示す（***P<0.0005、**P<0.005、n=3)。図3Fは、異種移植モデルにおける、表示の構築物を発現するPC3細胞の腫瘍成長を示す。図3Gは、各細胞株に由来する腫瘍がPTEN染色によって解析されたことを示す、2枚の顕微鏡写真を提供する。四角で囲った範囲を2倍に拡大して、右側に示す。バー、50μm。
【図４】図4A〜4Gは、K27結合型PTENポリユビキチン化におけるWWP1/NEDD4-1 E3の役割を示す。図4Aおよび4Bは、図1Dのように、表示のsiRNAを発現するDU145細胞におけるWWP1媒介性またはNEDD4-1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化のウェスタンブロット解析を提供する。表示のsiRNAを発現するDU145における、WWP1、TRIM27、ITCH、およびRNF168のRT-qPCR解析。個々のsiRNAのノックダウン効率をRT-qPCRによって判定し、mRNAレベルの低下の割合として示す（図1A；下部）。図4Cは、WTまたは触媒不活性のWWP1および／またはNEDD4-1リガーゼを発現する293細胞におけるPTEN K27結合型ポリユビキチン化のウェスタンブロット解析を提供する。図4Dは、この研究において使用されたPTENの表示領域の略図である（上部）。表示のプラスミドを発現する293細胞からのPTENとWWP1との相互共免疫沈降のウェスタンブロット解析（下部）。図4Eは、WWP1のPTENとの結合ドメインのマッピングを示す。表示の構築物がトランスフェクトされた293細胞の溶解物を、表示の抗体を用いて免疫沈降および／またはウェスタンブロットにより解析した。図4Fは、Flag-WWP1とPTENの個々の変異体との間の相互作用の共免疫沈降解析を示す。Flagタグ抗体でFlag-WWP1を免疫沈降(IP)させ、次いでPTEN抗体でプロービングして、個々のPTEN変異体／WWP1の相互作用を検出した。図4Gは、WWP1/NEDD4-1媒介性PTENポリユビキチン化に及ぼす、表示のPTEN変異体の影響を示す。293細胞に表示の構築物をトランスフェクトし、図1DのようにPTENユビキチン化を解析した。
【図５】図5A〜5Pは、K27結合型PTENポリユビキチン化が、PTENの二量体化、膜動員、および機能を抑制することを示す。図5Aは、Flagタグ化された非修飾／ユビキチン化PTENと細菌由来のGST-PTENとのインビトロ結合解析の略図を提供する（上部）。表示のFlagタグ化された非修飾／ユビキチン化PTENおよびGST-PTENを用いたインビトロプルダウンアッセイ。Flag-PTEN、WWP1/NEDD4-1が個々のHis-ユビキチン変種と共にトランスフェクトされた293細胞から、M2ビーズを用いて、Flag化された非タグ化PTENまたはユビキチン化PTENを精製した；一方で、GST-PTENは細菌から精製されたものである（下部）。図5Bは、非還元ゲルによる、DU145細胞における内因性PTEN二量体化／オリゴマー化のウェスタンブロット解析を提供する。表示の構築物がトランスフェクトされたDU145細胞を、抗ウサギPTEN抗体で免疫沈降させた；未変性溶出およびウェスタンブロットは、マウス抗PTEN抗体を用いることにより、PTEN二量体および／またはオリゴマーを示す。図5Cは、表示の構築物がトランスフェクトされたDU145細胞から単離された膜画分および可溶性画分が、ウェスタンブロットによって解析されたことを示す。EGFRを膜マーカーとし、アクチンを内部対照とする。図5Dは、DU145細胞におけるAKT活性化のウェスタンブロット解析を提供する。全溶解物をSDS-PAGEによって分離し、次いで表示の抗体でプロービングした。図5Eは、ドキシサイクリンありまたはなしで処理された野生型(WT)またはK27Rユビキチン置換細胞におけるPTEN細胞内局在性を示す。代表的な共焦点画像を示す。矢印はPTEN形質膜局在性を示す。バー、20μm。図5Fは、図3Bのように、Wwp1+/+およびWwp1-/- MEFにおけるPTEN二量体化解析を示す。図5Gは、Wwp1+/+およびWwp1-/- MEFにおけるAKT活性化の解析を示す。図5Hは、Wwp1+/+およびWwp1-/- MEFから単離された膜画分および可溶性画分が、ウェスタンブロットによって解析されたことを示す。EGFRを膜マーカーとし、アクチンを内部対照とする。図5Iは、図5Bのように、Nedd4+/+およびNedd4-/- MEFにおけるPTEN二量体化解析を示す。図5Jは、Wwp1+/+およびWwp1-/- MEFから単離された膜画分および可溶性画分が、ウェスタンブロットによって解析されたことを示す。図5Hのように、EGFRを膜マーカーとし、アクチンを内部対照とする。図5Kは、PC3細胞におけるPTEN二量体化に及ぼすPTEN K342/K344R変異体の影響を示す。表示の構築物がトランスフェクトされたPC3細胞を6時間にわたり血清飢餓状態にし、次いで100 ng/mlインスリンで10分間処理した。全溶解物をウサギ抗PTEN抗体で免疫沈降させた；未変性溶出およびウェスタンブロットは、マウス抗PTEN抗体を用いることにより、矢印によって示されるように、タンパク質の単量体および二量体を示す。図5Lは、293細胞におけるPTEN二量体／オリゴマー形成に及ぼすPTEN K342/K344R変異体の影響を示す。Myc-PTENまたはMyc-PTEN K342/K344R変異体がトランスフェクトされたHEK293細胞からの溶解物を、ゲル濾過によって分離した。画分をSDS-PAGEによって分離し、抗Myc抗体でプロービングした。図5Mは、PC3におけるPTEN K342/K344R変異体の膜局在性を示す。表示の構築物がトランスフェクトされたPC3細胞を6時間にわたり血清飢餓状態にし、100 ng/mlインスリンで10分間処理した。PC3細胞から単離された膜画分および可溶性画分を、ウェスタンブロットによって解析した。EGFRを膜画分のマーカーとし、アクチンを��溶性画分の内部対照とする。図5Nは、PC3におけるPTEN K342/K344R変異体の細胞内局在性を示す。PC3細胞を6時間にわたり血清飢餓状態にし、100 ng/mlインスリンで10分間処理した。表示のPTEN WTまたはK342/K344R変異体を安定して発現するPC3細胞をDAPIおよび表示の抗体で染色した共焦点画像。矢印はPTEN形質膜局在性を示す。バー、20μm。PTEN形質膜局在性を示す細胞の割合を定量した（下部パネル）。データは平均値±SDである；n=3、細胞50個／群／実験。図5Oは、PC3細胞におけるAKT活性化に及ぼす表示のPTEN KR変異体の影響を示す、一連の顕微鏡写真を提供する。表示のPTEN KR変異体がトランスフェクトされたPC3細胞を6時間にわたり血清飢餓状態にし、100 ng/mlインスリンで10分間処理した。全溶解物を収集し、次いで表示の抗体でプロービングした。図5Pは、異種移植マウスモデルにおける、(N) におけるようなPC3細胞の腫瘍成長に及ぼすPTEN K342/K344R変異体の影響を示すグラフである。エラーバーはSEMを示す（n=マウス5匹／群）。
【図６】図6A〜6Oは、MYCが、PTEN抑制に向かってWWP1/NEDD4-1遺伝子発現をトランス活性化すること、および前立腺がんの進行におけるWWP1/NEDD4-1/PTEN軸のヒト関連性を示す。図6Aは、Wwp1および Nedd4-1プロモーター上のMYC応答エレメントの模式的説明である（上部）。DU145細胞において、ヒトWwp1およびNedd4-1のプロモーターにおけるMYCのクロマチンレベルを実施した。定量的クロマチン免疫沈降(qChIP)アッセイにより、MYCの濃縮倍率を決定した。TSS、転写開始部位。データを平均値±SDとして示す（***P<0.0005、**P<0.005、n=3)。図6Bは、表示の構築物を発現するDU145細胞におけるWWP1およびNEDD4-1のRT-qPCR解析である。WWP1およびNEDD4-1のmRNAレベルをRT-qPCRによって決定し、ベクター対照と比較した増加倍率として示す。図6Cおよび6Dは、異なる量のHA-MYCまたは表示のsiRNA SMARTpoolを発現するDU145細胞における、WWP1/NEDD4-1/PTEN発現およびAKT活性化の解析を示す。全溶解物をSDS-PAGEによって分離し、次いで表示の抗体でプロービングした。図6Eは、MYCおよび／またはWWP1/NEDD4-1 shRNAを安定して発現するDU145細胞における、PTEN K27結合型ポリユビキチン化の解析を示す。図6Fは、表示のプラスミドがトランスフェクトされたDU145細胞における、Myc-PTENとGFP-PTENとの間の相互作用の共免疫沈降解析を示す。図6Gは、異なる用量のMYCを発現するDU145細胞における内因性PTENの膜局在性を示す。細胞から単離された膜画分および可溶性画分を、ウェスタンブロットによって解析した。EGFRを膜マーカーとする。図6Hは、MYCおよび／またはWWP1/NEDD4-1 shRNAを安定して発現するDU145細胞における、WWP1/NEDD4-1/PTEN発現およびAKT活性化の解析を示す。図6Iは、表示のsiRNAを発現するDU145細胞における、WWP1/NEDD4-1/PTENおよびAKT活性化の解析を示す。図6Jは、軟寒天におけるMYC誘導性コロニー形成活性に及ぼすWWP1/NEDD4-1の影響を示すグラフである。コロニー数を定量し、平均値±SDとして示す（***P<0.0005、**P<0.005、n=3)。図6Kは、MYCおよび／またはWWP1/NEDD4-1 shRNAを安定して発現するDU145細胞のアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。アポトーシス細胞の割合は、Sub-G1期の比率によって定量した。（***P<0.0005、**P<0.005、n=3)。図6Lは、ヒトCaP標本におけるNEDD4-1発現の相関およびPTEN膜動員の逆相関を示す表である。図6Mは、前立腺腫瘍悪性度とのNEDD4-1発現の正相関およびPTEN膜動員の逆相関を示す表である。図6Nは、NEDD4-1発現の増加およびPTEN膜動員の消失と疾患進行との有意な相関を示す表である。統計学的有意性はピアソンカイ二乗検定により決定した（l〜n）。図6Oは、ヒト前立腺腺がんのTCGA (n=419) およびMSKCC (n=85) データセットにおけるNEDD4-1とWWP1との間の発現解析である。両データセットにおいて、NEDD4-1 mRNAはWWP1 mRNAと正に相関する。
【図７】図7A〜7Dは、表示の構築物を安定して発現するDU145細胞の細胞周期プロファイルを示す。図7Aは4つのグラフからなり、ヨウ化プロピジウム (PI) で染色し、続いてFACS解析することによる、表示のものを安定して発現するDU145細胞の細胞周期プロファイルの解析を提供する。結果はFlowJoソフトウェアによって解析した。図7Bは、異なるCaP細胞株から単離された全画分、膜画分、および可溶性画分が、ウェスタンブロットによって解析されたことを示す。EGFRを膜マーカーとし、アクチンを内部対照とする。図7Cは、NEDD4-1およびPTENの免疫組織化学的解析を提供する。ヒトCaP標本におけるNEDD4-1およびPTENに関する代表的な免疫組織化学アッセイ(IHC)結果。バー、20μm。図7Dは、ヒト前立腺腺がんのTCGAデータセットにおける、MYCとWWP1またはNEDD4-1との間の発現解析を提供する。MYC mRNAは、WWP1またはNEDD4-1 mRNAと正に相関する。
【図８】図8は、ヒト前立腺腫瘍においてWWP1がMYCと同時増幅されることを示す‐ヒト前立腺腺がんのTCGAデータセットにおける、MYCとWWP1との間の同時増幅解析。
【図９】図9A〜9Dは、Myc駆動性前立腺がんに関与するWWP1の影響を示す。図9Aは、マウス前立腺のH&E染色および代表的なマウス尿生殖路の肉眼解剖学の画像を提供する。3ヵ月齢のマウスを解析した（n=5匹／遺伝子型）。スケールバー、50μm。図9Bは、代表的なマウス尿生殖路の肉眼解剖学の画像を提供する。3ヵ月齢のマウスを解析した（n=5匹／遺伝子型）。スケールバー、50μm。図9Cは、Hi-Myc; Wwp1+/+およびHi-Myc; Wwp1+/-マウス由来の背外側前立腺(DLP)のウェスタンブロット解析を提供する。図9Dは、PTEN染色によって解析された、Hi-Myc; Wwp1+/+およびHi-Myc; Wwp1+/-マウス由来の背外側前立腺(DLP)の画像を提供する。バー、50μm。
【図１０】図10A〜10Dは、インドール-3-カルビノール(I3C)と、WWP1のHECTドメインとの、予測される相互作用のインシリコモデリング、ならびにWWP1阻害剤であるインドール-3-カルビノール(I3C)が、細胞成長およびPTEN細胞内局在性に及ぼす影響を示す。図10Aは、I3CとWWP1のHECTドメインとの予測される相互作用のインシリコモデリングを提供する。図10Bは、WWP1に対するI3CのMST解析を提供する。図10Cは、100μM I3Cで処理されたWwp1+/+およびWwp1-/- MEFの成長曲線を提供する。3日目の細胞の代表的な写真を下部に示す。図10Dは、DU145細胞におけるPTEN細胞内局在性に及ぼすI3Cの影響を示す、一連の顕微鏡写真を提供する。20μM I3Cで4日間処理されたDU145細胞。I3Cあり／なしで処理されたDU145細胞をDAPIおよび表示の抗体で染色した共焦点画像。バー、20μm。
【図１１】図11A〜11Gは、インビトロにおいて、WWP1/NEDD4-1 E3を標的化することの治療可能性を示す。図11Aは、WWP1/NEDD4-1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化に及ぼすI3Cの影響を示す。表示のプラスミドを発現するDU145細胞を、10μMまたは20μMのI3Cで4日間処理した。ユビキチン化PTENをNi-NTAアガロースによって変性条件下でプルダウンし、ウェスタンブロットによって解析した。図11Bは、ウェスタンブロット解析による、DU145またはPC3細胞におけるPTEN/AKT経路に及ぼすI3Cの影響の解析を提供する。細胞を異なる用量のI3Cで3日間処理し、続いてウェスタンブロット解析を行った。図11Cは、DU145細胞（PTENコンピテント）またはPC3細胞（PTENヌル）を、様々な用量のI3Cで5日間処理し、次いで比色MTTアッセイによってアッセイした成長曲線を提供する（3回の実験）。図11Dは、対照ベクターまたは2種類の独立したshRNAを安定して発現するDU145細胞を、様々な用量のI3Cで5日間処理し、次いで比色MTTアッセイによってアッセイした成長曲線を提供する（3回の実験）。図11Eは、MYCまたはベクター対照を安定して発現するDU145細胞を、様々な用量のI3Cで5日間処理し、次いで比色MTTアッセイによってアッセイした成長曲線を提供する（3回の実験）。図11Fは、WTまたはHi-Myc前立腺の前立腺上皮細胞の前立腺スフィア形成能に関するI3Cの解析を示す顕微鏡写真である。10μM I3Cで3日間処理されたP1継代におけるスフィアの代表的な画像（左側）。バー、20μm。スフィア数を定量し、平均値±SDとして示す（***P<0.0005、**P<0.005、n=3)(右側)。図11Gは、20μM I3Cで3日間処理されたP1継代における前立腺スフィアのウェスタンブロット解析である。
【図１２】図12A〜12Eは、インビボにおけるWWP1/NEDD4-1 E3の治療標的化を示す。図12Aおよび12Bは、マウス前立腺のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色、ならびに代表的なHi-Myc尿生殖路の肉眼解剖学を提供する。(A) に示されるように6ヵ月の時点での、媒体またはI3Cで処置されたHi-Mycマウスにおける正常上皮の割合の定量化（右側）。5ヵ月齢のマウスを、0日目から開始して1ヵ月間にわたり週に3回、I3C (20 mg/kg) でI.P.処置した。（n=4匹／遺伝子型）スケールバー、50μM。図12Cは、(A) におけるようなHi-Mycマウス由来の背外側前立腺 (DLP) 溶解物のウェスタンブロット解析を提供する。図12Dは、媒体またはI3C (20 mg/kg) で処置されたHi-Mycマウス前立腺由来のDLPがPTEN染色によって解析されたことを示す。四角で囲った範囲を3倍に拡大して、右側にPTENの細胞内局在性を示す。矢印はPTEN形質膜局在性を示す。バー、50μm。図12Eは、細胞成長、腫瘍の発生および進行におけるWWP1/NEDD4-1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化に関するモデルを提供する。調節解除されたMYC過剰発現またはMYC増幅は、WWP1/NEDD4-1発現を促進し、次にPTEN K27結合型ポリユビキチン化を誘発する。異常なK27結合型ポリユビキチン化は、PTENの二量体化、形質膜動員、および腫瘍抑制機能を抑制し、腫瘍の開始および進行を引き起こす。
【図１３】図13A〜13Dは、異なる生理的刺激下でのPTEN K27結合型ポリユビキチン化の調節を示す。図13Aおよび図13Bは、増殖因子刺激時のPTEN K27結合型ユビキチン化の解析を示す。Nedd4+/+およびNedd4-/- MEFを3時間にわたり血清飢餓状態にし、10% FBS/200 ng/mlインスリンのありまたはなしで15分間処理した；溶解物を収集し、Ni-NTAプルダウンを行い、続いてウェスタンブロット解析を行った。図13Cは、正常酸素または低酸素条件下での、NEDD4-1媒介性PTENユビキチン化状態の解析を示す。表示の構築物を発現する293細胞を、低酸素または正酸素条件において16時間培養した。全細胞溶解物を変性条件下でNi-NTAビーズによってプルダウンし、続いてウェスタンブロット解析を行って、PTENユビキチン化を解析した。図13Dは、NEDD4-1が、異なる生理的条件下でその相互作用タンパク質を切り換えることを示すウェスタンブロットである。PWRE-1細胞を正常酸素または低酸素条件において16時間培養した。全細胞溶解物を抗NEDD4抗体で免疫沈降させ、次いで表示の抗体を用いてウェスタンブロットによって調べた。
【図１４】図14Aおよび図14Bは、NEDD4-1が、がん関連変異を有するPTENにおいて、K27結合型ポリユビキチン化およびAKT活性化を強く誘導することを示す。図14Aは、表示のPTEN WTまたはそのがん関連変異体（C124S、G129E、およびR130G）をNEDD4-1と共に発現するPC3細胞における、PTEN K27結合型ポリユビキチン化の解析を示す。図14Bは、HA-NEDD4-1を発現する元のPTEN+/+、PTENCS/+、およびPTENGE/+ MEFにおけるAKT活性化のウェスタンブロット解析を示す。
【図１５】NEDD4および／またはWWP1媒介性ユビキチン化の阻害剤を同定するのに有用なELISAベースのアッセイを示す。
【図１６】PTEN二量体化の阻害剤を同定するのに有用な蛍光ベースのアッセイを示す。
【図１７】NEDD4-1/WWP1ヘテロ二量体形成の阻害剤を同定するのに有用な蛍光ベースのアッセイを示す。
【図１８】PTEN会合タンパク質のリストを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
本発明は概して、がん（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸腺がん、胃腺がん、前立腺がん、肝がん）を処置する方法であって、NEDD4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を、がんを有する対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【００５８】
本発明は、少なくとも部分的に、K27結合型ポリユビキチン化が、PTENの二量体化、膜動員、および機能を抑制するという発見に基づく。以下に、より詳細に報告されるように、WWP1/NEDD4-1 E3リガーゼは、PTENと相互作用することが見出され、この非分解性修飾を協調的に触媒するのに必須であった。WWP1およびNEDD4-1は、いずれも直接的なMYC標的遺伝子であることが見出され、その腫瘍形成機能に重要であった。ヒト腫瘍の解析により、MYC/NEDD4-1/WWP1の同時過剰発現が、疾患進行およびPTENの膜置換と相関したことが明らかになる。重要なことには、WWP1/NEDD4-1の薬理学的阻害が、インビトロおよびインビボの両方で、PTENの再活性化およびMYC駆動性腫瘍形成の強力な抑制を誘発することが実証された。したがってこれらの知見により、K27結合型PTENポリユビキチン化の発がん性の役割、およびPTENの再活性化によりMYC駆動性がんを処置するための治療戦略が解明される。
【００５９】
よって、本発明は、がん（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸腺がん、胃腺がん、前立腺がん、肝がん）を処置するために、NEDD4-1および／またはWWP1の発現または活性を阻害する作用物質（例えば、ポリペプチド、阻害性核酸、および小分子を）を使用する方法を提供する。
【００６０】
阻害性核酸
阻害性核酸分子とは、NEDD4-1またはWWP1の発現または活性を阻害するオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドには、NEDD4-1またはWWP1ポリペプチドをコードする核酸分子と結合する一本鎖および二本鎖核酸分子（例えば、DNA、RNA、およびその類似体）（例えば、アンチセンス分子、siRNA、shRNA）、ならびにポリペプチドに直接結合してその生物学的活性を調節する核酸分子（例えば、アプタマー）が含まれる。本明細書に記載される阻害性核酸分子は、がん（例えば、（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸腺がん、胃腺がん、前立腺がん、肝がん）の処置に有用である。
【００６１】
siRNA
短い21〜25ヌクレオチド二本鎖RNAは、遺伝子発現を下方制御するのに有効である(参照により本明細書に組み入れられるZamore et al., Cell 101: 25-33; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001)。哺乳動物におけるsirNAアプローチの治療有効性は、McCaffreyら(Nature 418: 38-39.2002)によりインビボで実証された(Nature 418: 38-39.2002)。
【００６２】
標的遺伝子の配列を考慮して、siRNAはその遺伝子を不活性化するようにデザインされうる。そのようなsiRNAは、例えば、罹患組織に直接投与することも、または全身投与することもできる。遺伝子の核酸配列は、低分子干渉RNA (siRNA)をデザインするために用いることができる。21〜25ヌクレオチドのsiRNAは、例えば、がんを処置するための治療用物質として用いてもよい。
【００６３】
本発明の阻害性核酸分子は、RNA干渉(RNAi)媒介性発現ノックダウンのための二本鎖RNAとして利用されうる。1つの態様において、NEDD4-1ポリペプチドおよび/またはWWP1ポリペプチドの発現は、PTENおよびp53欠損であるがんを有する対象において低減される。RNAiは、関心対象の特定のタンパク質の細胞発現を減少させるための方法である(Tuschl, Chembiochem 2:239-245, 2001; Sharp, Genes & Devel. 15:485-490, 2000; Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Devel. 12:225-232, 2002; おおびHannon, Nature 418:244-251, 2002に概説されている)。dsRNAのトランスフェクションによるまたはプラスミドに基づく発現系を用いたsiRNAの発現による細胞へのsiRNAの導入は、哺乳動物細胞において機能喪失表現型を作製するためにますます用いられている。
【００６４】
本発明の1つの態様において、本発明の核酸塩基オリゴマーの8〜19個の連続した核酸塩基を含む二本鎖RNA (dsRNA)分子が作製される。dsRNAは、二重鎖を有する2本の異なるRNA鎖、または自己二重鎖を有する1本のRNA鎖(小型ヘアピン(sh)RNA)であることができる。典型的には、dsRNAは約21または22塩基対であるが、しかし必要に応じてより短くてもより長くてもよい(最大で約29核酸塩基)。dsRNAは標準的な技法(例えば、化学合成またはインビトロ転写)を用いて作製することができる。キットは、例えば、Ambion (Austin, Tex.)およびEpicentre (Madison, Wis.)から入手可能である。哺乳動物細胞においてdsRNAを発現させるための方法は、Brummelkamp et al. Science 296:550-553, 2002; Paddison et al. Genes & Devel. 16:948-958, 2002. Paul et al. Nature Biotechnol. 20:505-508, 2002; Sui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-5520, 2002; Yu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052, 2002; Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20:497-500, 2002; およびLee et al. Nature Biotechnol. 20:500-505 2002に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
低分子ヘアピンRNA (shRNA)は、ステム-ループ構造を有するRNA配列を含む。「ステム-ループ構造」とは、片側で主に一本鎖ヌクレオチドの領域(ループ部分)によって連結されている二本鎖または二重鎖(ステム部分)を形成することが知られているまたは予測されるヌクレオチドの領域を含む二次構造を有する核酸をいう。「ヘアピン」という用語はまた、ステム-ループ構造をいうために本明細書において用いられる。そのような構造は当技術分野において周知であり、この用語は当技術分野におけるその既知の意味と一貫して用いられる。当技術分野において公知であるように、二次構造は正確な塩基対合を必要としない。したがって、ステムは1つまたは複数の塩基ミスマッチまたはバルジを含むことができる。あるいは、塩基対合は正確であることができ、すなわち、いかなるミスマッチも含まない。複数のステム-ループ構造は、例えば、核酸リンカー、miRNAフランキング配列、他の分子、またはそれらのいくつかの組み合わせのような、リンカーを通じて互いに連結することができる。
【００６６】
本明細書において用いられる場合、「低分子ヘアピンRNA」という用語は、前駆体miRNA (プレmiRNA)を形成する従来のステム-ループshRNAを含む。範囲にいくらかのバラツキがありうるが、従来のステム-ループshRNAは、19から29 bpに及ぶステム、および4から30 bpに及ぶループを含むことができる。「shRNA」はまた、マイクロRNA埋め込みshRNA (miRNAに基づくshRNA)を含み、ここでmiRNA二重鎖のガイド鎖およびパッセンジャ鎖は、既存の(もしくは天然の) miRNAにまたは修飾もしくは合成(デザインされた) miRNAに組み込まれる。場合によっては、前駆体miRNA分子は、2つ以上のステム-ループ構造を含むことができる。マイクロRNAは、約22ヌクレオチド長であり、通常、高度に組織特異的または発生段階特異的な形で発現され、かつ標的遺伝子を転写後に調節する内在的にコードされたRNA分子である。植物および動物において200種を超える異なるmiRNAが同定されている。これらの小さな調節RNAは、2つの優勢な作用様式によって: (1) 標的mRNAの翻訳を抑制することによって、ならびに(2) RNA干渉(RNAi)、すなわち、mRNAの切断および分解を通じて重要な生物学的機能を果たすと考えられる。後者の場合、miRNAは低分子干渉RNA (siRNA)と同様に機能する。したがって、既存のmiRNA遺伝子の特徴に基づいて人工miRNAをデザインおよび発現することができる。
【００６７】
shRNAをDNAベクターから発現させて、持続的サイレンシングおよび高収率送達をほとんどいなかる細胞型にも提供することができる。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである。例示的なウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスおよびトリウイルスベクターを含めて、ならびに安定な単一コピーゲノム組み込みを可能にするそのようなベクターを含めて、レトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスプラスミドベクターが由来しうるレトロウイルスは、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスを含むが、これらに限定されることはない。レトロウイルスプラスミドベクターを利用してパッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成させることができる。トランスフェクトすることができるパッケージング細胞の例としては、参照により全体が本明細書に組み入れられるMiller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990)に記載されているようにPE50l、PA3l7、R-2、R-AM、PA12、T19-14x、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されることはない。ベクターは、当技術分野において公知の任意の手段によってパッケージング細胞に形質導入することができる。プロデューサー細胞株は、DNA複製タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を利用して、インビトロまたはインビボのいずれかで真核細胞に形質導入することができる。形質導入された真核細胞はDNA複製タンパク質を発現するであろう。
【００６８】
本発明のアンチセンス配列を含む触媒RNA分子またはリボザイムは、インビボで核酸分子(例えば、NEDD4-1またはWWP1をコードする核酸)の発現を阻害するために用いることができる。アンチセンスRNA内にリボザイム配列を含めて、それらにRNA切断活性を与え、それによって構築体の活性を増加させる。標的RNA特異的リボザイムのデザインおよび使用は、Haseloff et al., Nature 334:585-591. 1988、および米国特許出願公開第2003/0003469 A1号に記載されており、これらの各々は参照により組み入れられる。
【００６９】
したがって、本発明はまた、結合アーム中に、8〜19個の連続した核酸塩基を有するアンチセンスRNAを含む触媒RNA分子を特徴とする。本発明の好ましい態様において、触媒核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフ中に形成される。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi et al., Aids Research and Human Retroviruses, 8:183, 1992によって記載されている。ヘアピンモチーフの例は、1988年9月20日付で出願された米国特許出願第07/247,100号の一部継続出願である1989年9月20日付で出願されたHampel et al.,「RNA Catalyst for Cleaving Specific RNA Sequences」、Hampel and Tritz, Biochemistry, 28:4929, 1989、およびHampel et al., Nucleic Acids Research, 18: 299, 1990によって記載されている。これらの特定のモチーフは本発明を限定するものではなく、当業者なら、本発明の酵素的核酸分子において重要な全てのことは、それが標的遺伝子RNA領域の1つまたは複数に相補的である特異的基質結合部位を有すること、およびそれが分子にRNA切断活性を付与するその基質結合部位内または周囲のヌクレオチド配列を有することを認識するであろう。
【００７０】
あるいは、NEDD4-1、WWP1、またはその両方の発現は、NEDD4-1、WWP1、またはその両方を標的とするよう操作されたCRISPR/Cas9ヌクレアーゼをコードするベクターを導入することによって、阻害またはサイレンシングされてもよい。
【００７１】
核酸構築体を細胞に導入するための本質的に任意の方法を利用することができる。核酸を導入する物理的方法は、構築体を含有する溶液の注入、構築体によって覆われた粒子による衝撃、細胞、組織サンプル、もしくは生物を核酸の溶液中に浸すこと、または構築体の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子にパッケージングされたウイルス構築体を用いて、細胞への発現構築体の効率的な導入とコードされたshRNAの転写の両方を達成することができる。脂質媒介性の担体輸送、リン酸カルシウムのような化学物質媒介性の輸送などのような、核酸を細胞に導入するための当技術分野において公知の他の方法を用いることができる。したがって、shRNAをコードする核酸構築体は、以下の活性の1つまたは複数を実行する: 細胞によるRNA取り込みを増強する、二重鎖のアニーリングを促進する、アニーリングされた鎖を安定化する、またはそれ以外の場合は標的遺伝子の阻害を増大する、成分とともに導入することができる。
【００７２】
細胞内での発現の場合、DNAベクター、例えばRNAポリメラーゼIIまたはRNAポリメラーゼIIIプロモーターのいずれかを含むプラスミドベクターを利用することができる。内因性miRNAの発現はRNAポリメラーゼII (Pol II)プロモーターにより制御され、場合によっては、shRNAはRNAポリメラーゼIIIプロモーターと比較して、Pol IIにより最も効率的に駆動される(Dickins et al., 2005, Nat. Genet. 39: 914-921)。いくつかの態様において、shRNAの発現は、非限定的に、RNAポリメラーゼII型プロモーターを含む、誘導性プロモーターまたは条件付き発現系によって制御することができる。本発明との関連で有用なプロモーターの例は、テトラサイクリン誘導性プロモーター(TRE-tightを含む)、IPTG誘導性プロモーター、テトラサイクリントランス活性化系、および逆テトラサイクリントランス活性化(rtTA)系である。細胞または組織特異的プロモーターと同様に、構成的プロモーターも使用することができる。多くのプロモーターは遍在しているので、それらは全ての細胞および組織型において発現される。ある種の態様では、インビトロおよびインビボ研究において最も効果的な条件付き遺伝子発現系の1つであるテトラサイクリン応答性プロモーターを用いる。誘導性shRNAの説明については、国際特許出願PCT/US2003/030901 (公開番号WO 2004-029219 A2)およびFewell et al., 2006, Drug Discovery Today 11: 975-982を参照されたい。
【００７３】
ポリヌクレオチドの送達
裸のポリヌクレオチド、またはその類似体は、哺乳動物細胞に侵入し、関心対象の遺伝子(例えば、NEDD4-1またはWWP1のポリヌクレオチド)の発現を阻害しうる。それにもかかわらず、細胞へのオリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマーの送達を補助する製剤を利用することが望ましい可能性がある(例えば、米国特許第5,656,611号、同第5,753,613号、同第5,785,992号、同第6,120,798号、同第6,221,959号、同第6,346,613号、および同第6,353,055号を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる)。
【００７４】
小分子阻害剤
本発明は、がんの処置に有用である、NEDD4-1および／またはWWP1活性を阻害し得る小分子を提供する。NEDD4-1阻害剤として適している化合物の例には、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンが含まれる。
【００７５】
NEDD4-1阻害剤として適している化合物の別の例は、インドール-3-カルビノール (I3C) である。I3Cの構造を以下に示す。
2019534316.tif 000017
【００７６】
NEDD4-1阻害剤として適している化合物の別の例は、米国特許出願第US20140179637 A1号（全体として参照により組み入れられる）に収載されている化合物である。
【００７７】
治療方法
本明細書において提供される方法および組成物を用いて、がん（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸腺がん、胃腺がん、前立腺がん、肝がん）の進行を処置または予防することができる。一般に、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも1つの作用物質の有効量を、治療的におよび／または予防的に投与することができる。
【００７８】
処置は、そのようながんを患っている、有する、そのようながんに罹りやすい、またはそのようながんを発症するリスクがある対象、特にヒトに適切に施行される。「リスクがある」対象の判定は、診断検査または対象もしくは医療提供者の見解（例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴等）による任意の客観的または主観的判定によってなされ得る。そのような処置を必要とする対象の同定は、対象または医療専門家の判断によるものであってよく、主観的（例えば、見解）または客観的（例えば、検査もしくは診断法により測定可能）であってよい。
【００７９】
いくつかの局面では、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも1つの作用物質の有効量を、任意の他の標準的な抗がん療法の1つまたは複数と組み合わせて投与することができる。例えば、本明細書に記載される作用物質を、標準的な化学療法薬と組み合わせて投与することができる。併用療法を（例えば、同時にまたはその他の方法で）施行する方法は、当業者に公知であり、例えばE. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【００８０】
化学療法剤
本発明はさらに、NEDD4-1またはWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と組み合わせた従来の化学療法薬の使用を提供する。本発明の方法において使用するのに適している化学療法剤には、これに限定されるわけではないがアルキル化剤が含まれる。任意の特定の理論に限定されることは意図しないが、アルキル化剤はDNAを直接損傷して、細胞が複製されないようにする。アルキル化剤は細胞周期の全期において働き、白血病、リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、および肉腫、ならびに肺、乳房、および卵巣のがんを含む多くの異なるがんを処置するために使用される。
【００８１】
アルキル化剤は、(i) ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、クロラムブシル、シクロホスファミド (Cytoxan（登録商標）)、イホスファミド、およびメルファランなど；(ii) ニトロソ尿素、例えば、ストレプトゾシン、カルムスチン (BCNU)、およびロムスチンなど；(iii) スルホン酸アルキル、例えばブスルファンなど；(iv) リアジン (riazine)、例えばダカルバジン (DTIC) およびテモゾロミド (Temodar（登録商標）)など；(v) エチレンイミン、例えばチオテパおよびアルトレタミン（ヘキサメチルメラミン）など；ならびに (v) 白金剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサラプラチン (oxalaplatin) などを含むがこれらに限定されない、異なるクラスに分類される。
【００８２】
薬学的組成物
本発明は、がんを処置するのに有用な組成物を特徴とする。本方法は、生理学的に許容される担体中で、がんを有する対象に、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも一つの作用物質の有効量を投与する段階を含む。
【００８３】
典型的には、本明細書において提供される組成物のための担体または賦形剤は、滅菌水、生理食塩水溶液、緩衝生理食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、またはそれらの組み合わせのような、薬学的に許容される担体または賦形剤である。無菌性、pH、等張性、および安定性を確実にするそのような溶液の調製は、当技術分野において確立されたプロトコルにしたがって行われる。通常、担体または賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない作用を最小限に抑えるために、および特定の投与経路、例えば、皮下、筋肉内、鼻腔内などに適するように選択される。
【００８４】
投与は、他の成分と組み合わせて、対象における疾患症状を改善、低減、または安定化させるのに有効な濃度の治療用物質をもたらす任意の適当な手段によるものでありうる。組成物は全身投与されてもよく、例えば、生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中で製剤化されてもよい。好ましい投与経路には、例えば、患者において連続的で持続的なレベルの作用物質を提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内または皮内注射が含まれる。投与される治療剤の量は、投与方法、患者の年齢および体重、ならびにがんの臨床症状に応じて変わる。通常、量は、がんの処置において用いられる他の作用物質のために用いられるものの範囲内であろうが、ある場合には作用物質の特異性が増すので、より少ない量が必要とされるであろう。組成物は、当業者に公知の方法によって判定されるようにがんの影響を改善または減少させる投与量で投与される。
【００８５】
治療用または予防用組成物は、任意の適当な担体物質中に任意の適切な量で含まれていてもよく、概して組成物の総重量の1〜95重量%の量で存在する。組成物は、非経口(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内)投与経路に適した投与量形態で提供されうる。薬学的組成物は、従来の薬学的手法にしたがって製剤化されうる(例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと)。
【００８６】
本発明による薬学的組成物は、投与したら実質的にすぐに、または投与から任意の所定の時間後もしくは期間後に活性剤を放出するように製剤化されうる。後者のタイプの組成物は通常、制御放出製剤として知られており、これには、(i) 長期間にわたって実質的に一定濃度の薬物を体内にもたらす製剤; (ii) 所定の遅延時間の後、長期間にわたって実質的に一定の濃度の薬物を体内にもたらす製剤; (iii) 活性物質の血漿レベルの変動(鋸歯状動態パターン)に関連する望ましくない副作用を同時に最小化しながら、体内で比較的一定の有効レベルを維持することによって所定の期間に作用を持続させる製剤; (iv) 例えば心臓のような臓器に隣接または接触して制御放出組成物を空間的に配置することによって、作用を局所化する製剤; (v) 例えば、1週間または2週間に1回用量が投与されるように、便利な投薬を可能にする製剤; および(vi) 治療剤を特定の細胞型に送達するために担体または化学的誘導体を用いて疾患を標的とする製剤が含まれる。いくつかの用途の場合、制御放出製剤は、血漿レベルを治療レベルに維持するために日中に頻繁に投薬する必要性をなくす。
【００８７】
放出速度が問題の作用物質の代謝速度を上回る制御放出を得るために、いくつかの戦略のうちのいずれかを追求することができる。1つの例では、制御放出は、例えばさまざまなタイプの制御放出組成物およびコーティングを含む、さまざまな製剤パラメータおよび成分の適切な選択によって得られる。したがって、治療用物質は、投与時に、制御された方法で治療用物質を放出する薬学的組成物に適切な賦形剤とともに製剤化される。例としては、単一または複数単位の錠剤またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、およびリポソームが挙げられる。
【００８８】
薬学的組成物は非経口的に注射、注入もしくは移植(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鞘内など)により投与量形態、製剤中で、または従来の無毒性の薬学的に許容される担体および補助剤を含有する適当な送達装置もしくはインプラントを介して投与されうる。そのような組成物の製剤化および調製は、薬学的製剤分野の当業者に周知である。製剤化については、前記のRemington: The Science and Practice of Pharmacyにおいて見出すことができる。
【００８９】
非経口使用のための組成物は、単位投与量形態で(例えば、単回用量アンプル中で)、または数回の用量を含有し、かつ適当な保存料が添加されてもよいバイアル中で提供されうる(下記参照)。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、注入装置、もしくは移植用の送達装置の形態であってもよく、または使用前に水もしくは別の適当な媒体で再構成される乾燥粉末として提供されてもよい。心機能障害または心疾患を低減または改善する活性剤とは別に、組成物は適当な非経口的に許容される担体および/または賦形剤を含みうる。活性治療剤(例えば、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも一つの作用物質)は、制御放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれうる。さらに、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、pH調整剤、張度調整剤(tonicity adjusting agent)、および/または分散剤を含みうる。
【００９０】
いくつかの態様において、活性治療用物質を含む組成物は、静脈内送達用に製剤化される。上記のように、本発明による薬学的組成物は無菌注射に適した形態でありうる。そのような組成物を調製するためには、適当な治療用物質を非経口的に許容される液体媒体に溶解または懸濁させる。利用されうる許容される媒体および溶媒のなかには、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムまたは適当な緩衝液の添加によって適当なpHに調整された水、1,3-ブタンジオール、リンゲル溶液、ならびに等張塩化ナトリウム溶液およびデキストロース溶液がある。水性製剤はまた、1つまたは複数の保存料(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルまたはn-プロピル)を含有しうる。作用物質の1つが水に少ししかまたはわずかしか溶解しない場合、溶解促進剤もしくは可溶化剤を添加することができ、または溶媒が10〜60% w/wのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【００９１】
キット
本発明は、がんを処置または予防するためのキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも1つの作用物質を含有する治療または予防組成物を単位剤形で含む。他の態様において、キットは、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも1つの作用物質を、無菌容器中に単位剤形で含む。そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、ブリスターパック、または当技術分野において公知である他の適切な容器形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または医薬品を保持するのに適した他の材料で作製されていてよい。
【００９２】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物は、がんを有するか、またはがんに罹患するもしくはがんを発症するリスクのある対象に薬学的組成物を投与するための説明書と共に提供される。説明書は一般に、がんを処置または予防するための組成物の使用に関する情報を含む。他の態様において、説明書は、以下：治療／予防用の作用物質の説明；がんもしくはその症状を処置もしくは予防するための投与計画および投与；注意；警告；適応症；禁忌症；過剰投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに／または参考文献のうちの少なくとも1つを含む。説明書は、容器（存在する場合）に直接印刷されてもよいし、あるいは容器に貼り付けられたラベルとして、または容器内にもしくは容器と共に供給される別のシート、パンフレット、カード、もしくは折りたたみ印刷物として印刷されてもよい。
【００９３】
治療法をスクリーニングするためのマウスプラットフォーム
本発明は、1つまたは複数の規定遺伝子病変（例えば、cMYCの過剰発現）を特徴とするがんを有する対象のための治療剤を同定する方法を提供する。本方法は、同一の規定遺伝子病変のうちの1つまたは複数を有するマウスから新生物細胞を採取する段階；新生物細胞をインビトロで培養して、1種または複数種の新生物細胞またはがんオルガノイドを得る段階；新生物細胞またはがんオルガノイドを免疫適格性同系マウスに移植する段階；1つまたは複数の候補作用物質を同系マウスに投与する段階；および候補作用物質に対する新生物細胞、オルガノイド、または同系マウスの生物学的応答をアッセイする段階を伴う。
【００９４】
本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞株または初代ヒト腫瘍が移植されている免疫不全マウス（PDXモデル）において治療法を特徴づける方法を提供する。特定の態様において、移植された腫瘍はMYCを構成的に過剰発現するか、MYCを過剰発現するように操作されているか、または（例えば、shRNAノックダウンを介して）MYCが減少するように操作されている。免疫不全マウスは一般に、適応免疫系成分を欠いているが、比較的無傷の自然免疫系を有する。したがって、腫瘍形成時に、マウスMDSCの浸潤をそれらの表現型特性（免疫抑制マーカー、細胞表面マーカー、免疫抑制効力）と共に評価する。同系宿主においてマウス腫瘍株を用いて、同様のアプローチが取られる。異種移植モデルまたは同系モデルのいずれかにおいて、ヒトまたはマウスMYCを過剰発現する腫瘍細胞株を評価する。そのようなマウスを用いて、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも1つの作用物質に対する生物学的応答を評価する。例えば、腫瘍の成長および／またはマウスの生存をアッセイすることにより、NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質からなる群より選択される少なくとも1つの作用物質の効果を評価する。
【００９５】
別の態様においては、内因的にMYCを発現するかまたはMYCを発現するように操作されたオルガノイドをマウスに移植する。オルガノイドを作製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Boj et al., Cell; 160: 324-338, 2015；Gao et al., Cell; 159: 176-187, 2014；Linde et al., PLoS ONE; 7(7): e40058, 2012に記載されている。別の態様においては、同一のヒト患者由来の腫瘍組織およびPBMCを用いて、自己PBMCとの共培養においてオルガノイドを維持する。
【００９６】
インビトロスクリーニング
図15、図16、および図17を参照して、本発明は、がんを有する対象のための治療剤を同定するためのインビトロスクリーニングプラットフォームを提供する。例えば、図15は、NEDD4-1および／またはWWP1媒介性ユビキチン化の阻害剤を同定するのに有用なELISAベースのアッセイを示す。（実施例1を参照されたい）。図16は、PTEN二量体化の阻害剤を同定するのに有用な蛍光ベースのアッセイを示す。（実施例4を参照されたい）。図17は、NEDD4-1/WWP1ヘテロ二量体形成の阻害剤を同定するのに有用な蛍光ベースのアッセイを示す。
【００９７】
本発明の実践には、特に指示のない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法が利用され、それらは十分に当業者の認識範囲内である。そのような技法は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, second edition (Sambrook, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(Gait, 1984)；「Animal Cell Culture」(Freshney, 1987)；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir, 1996);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller and Calos, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel, 1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullis, 1994)；「Current Protocols in Immunology」(Coligan, 1991) などの文献において十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用可能であり、したがって本発明の形成および実践において考慮され得る。特定の態様に特に有用な技法は、以下の項で論じられる。
【００９８】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療法を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例1‐WWP1/NEDD4-1 E3リガーゼは、PTEN K27結合型ポリユビキチン化を媒介する
本実施例において提示される研究により、プロテアソーム阻害剤MG132の非存在下でさえ、PTENがユビキチン化されていたことが示され（図1A）、ユビキチン化がPTENの代謝回転ではなくその機能を制御するかどうかを試験することが示唆される。PTEN上に形成されたユビキチン鎖の同一性を次に調査した。ユビキチンの各リジン残基を個々に変異させることにより、定常状態においてK27Rユビキチン変異体のみがPTENポリユビキチン化を顕著に損なうことが驚くべきことに見出され、PTENが、K27結合型ユビキチン鎖によって主に調節され、その他のリジン結合型ユビキチン鎖によっては調節されないことが示唆された（図1A）。
【０１００】
PTENの非定型K27結合型ポリユビキチン化を誘導するE3リガーゼを同定するために、外因性PTENをDU145細胞から免疫沈降させ、続いて質量分析によって、PTENと相互作用するタンパク質を同定した（図2A；図18）。2種類のNEDD4-1ファミリーHECT型ユビキチンE3リガーゼ、WWP1およびNEDD4-1が、PTENと相互作用することが示され、NEDD4-1ファミリーユビキチンE3リガーゼの中で、WWP1が最も強力な結合能を示し；基質アダプタータンパク質としてのWWP1の役割が示された（図1B）。興味深いことに、これら2種類のユビキチンE3リガーゼが、インビボおよびインビトロの両方で互いに相互作用し得ることもまた見出された（図2B、図2C）。
【０１０１】
WWP1/NEDD4-1 E3によってどの種類のユビキチン鎖型がPTEN上に作製されたのかをさらに解析するため、前述のユビキチン変異体を使用した。著しいことに、K27Rユビキチンのみが、WWP1/NEDD4-1媒介性PTENポリユビキチン化を阻止することができた（図2D）。次に、WWP1/NEDD4-1複合体が、PTEN K27結合型ポリユビキチン化に対する真正なE3であることを確認するために、K27リジン残基のみを保持しその他の6個のリジン残基がアルギニンに変異された、K27単独ユビキチンを使用した。これらのユビキチン化アッセイにより、WWP1またはNEDD4-1のいずれかの過剰発現が、K27結合型PTENポリユビキチン化を強く促進し、その他のNEDD4ファミリーE3リガーゼの過剰発現ではそのようなことはないことが明らかになった（図1C）。さらに、WWP1とNEDD4-1との過剰発現は、NEDD4-1またはWWP1単独と比較して、PTEN K27結合型ポリユビキチン化に対する相乗効果を示した（図2E）。
【０１０２】
PTENポリユビキチン化において果たし得るWWP1/NEDD4-1 E3の直接的役割を決定するため、インビトロユビキチン化アッセイを実施した。精製NEDD4-1単独のインキュベーションでは、PTEN K27結合型ポリユビキチン化を効率的に促進することはできないが、WWP1単独のインキュベーションのみでPTENポリユビキチン化をわずかに誘発することが見出された。しかしながら、WWP1およびNEDD4-1の両方の存在下で、PTENは強くK27結合型ポリユビキチン化された（図2F）。WWP1/NEDD4-1 E3がPTEN K27結合型ポリユビキチン化を特異的に誘発することをさらに確認するため、様々なユビキチン変異体を利用した。注目すべきことに、K48-ユビキチンおよびK63-ユビキチンは、WWP1/NEDD4-1媒介性PTENポリユビキチン化を著しく誘発することができなかったものの、K27-ユビキチンは、野生型ユビキチンと同程度に著しくPTEN上の鎖形成を促進した（図2G）。重要なことには、WWP1/NEDD4-1 E3はPTEN K27結合型ポリユビキチン化に対して注目すべき効果を示したが、WWP1または／およびNEDD4-1が過剰発現された場合に、PTENのタンパク質代謝回転速度は影響を受けなかった（図1D）。
【０１０３】
実施例2‐PTEN K27結合型ポリユビキチン化に関与しているリジン残基の同定
PTENユビキチン化の結合部位を同定するため、PTEN免疫沈降、トリプシンによる消化、および抗K-ε-GG抗体によるその後の濃縮により、対照細胞またはWWP1/NEDD4-1過剰発現細胞から単離されたユビキチン化PTENペプチドにおいて、質量分析(MS)解析を実施した。著しいことに、この解析によって、WWP1/NEDD4-1 E3複合体の過剰発現時に、K27残基上に二つのGly修飾を有するユビキチンペプチドが顕著に増加するのに対して、K11、K48、およびK63などのその他のLys残基におけるユビキチン修飾はわずかに増加するのみであることが明らかになった（図2L、図2H、図2I）。さらに、MS解析により、WWP1/NEDD4-1過剰発現細胞において、PTENのK342およびK344残基がユビキチンによって修飾されると同定された（図2J）。MS解析と一致して、K342およびK344残基のアルギニン(R)への変異により、WWP1/NEDD4-1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化が実質的に減少した一方で（図2K）、PTEN K342/K344R変異体のタンパク質代謝回転速度は野生型(WT) PTENのものと同様であった（図1E）。したがってこの解析により、PTENのK342およびK344残基におけるK27結合型ポリユビキチン鎖の形成がWWP1/NEDD4-1 E3複合体によって媒介されるという複数の証拠が提供される。さらに、K27結合型ポリユビキチン化がタンパク質分解のシグナルではないことを示す先の報告と一致して、この非定型ポリユビキチン化はPTENタンパク質の安定性を妨げない。重要なことには、このK342/K344リジンパッチは、図3A、図3B、および図3Cに示されるように、種にわたって十分に保存されている。さらに、WWP1またはNEDD4-1のいずれの触媒ドメインもまた、進化を通じて高度に保存されており、WWP1/NEDD4-1媒介性K27結合型ポリユビキチン化が進化的に保存され、種にわたってPTEN機能の調節において重要であることが示唆される。
【０１０４】
実施例3‐K27結合型PTENポリユビキチン化におけるWWP1/NEDD4-1 E3の必須の役割
K27結合型PTENポリユビキチン化におけるWWP1およびNEDD4-1のそれぞれの役割をさらに明らかにするため、PTENポリユビキチン化に及ぼすWWP1またはNEDD4-1のいずれかのノックダウンの影響を調べた。注目すべきことには、WWP1の枯渇によりNEDD4-1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化が顕著に減少したのに対して、その他のE3リガーゼを標的指向するsiRNAは、PTENポリユビキチン化に対する影響をほとんど示さなかった（図4A）。同様に、siRNAによるNEDD4-1の枯渇により、WWP1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化が劇的に損なわれ、WWP1またはNEDD4-1のいずれも、K27結合型PTENポリユビキチン化を促進するために不可欠であることが示された（図4A、B）。次に、WWP1またはNEDD4-1のいずれの触媒活性がPTEN K27結合型ポリユビキチン化に必要であるのかを調べた。触媒作用の欠損したWWP1変異体(C890A)またはNEDD4-1変異体(C867A)のいずれの過剰発現も、PTEN K27結合型ポリユビキチン化を強く抑止することが見出された。相乗的に、WWP1触媒変異体およびNEDD4-1触媒変異体の両方を過剰発現させると、PTENポリユビキチン化のみならずモノユビキチン化も著しく減少し、WWP1またはNEDD4-1のいずれの触媒活性もPTENポリユビキチン化に必要であることが示された（図4C）。
【０１０５】
WWP1はPTEN基質アダプターとして作用する可能性がある（図1B）。したがって、WWP1とPTENタンパク質との間の相互作用に必要なドメインをマッピングした。様々なPTEN機能的ドメインを、全長Flag-WWP1と同時発現させた。相互免疫沈降アッセイにより、WWP1は全長PTEN(1〜403)およびPTENのC末端(188〜403)の両方と相互作用するが、PTENのN末端(1〜187)とは相互作用しないことが示された（図4D）。WWドメインがHECT型E3リガーゼの中の基質相互作用モチーフであることを実証する知見と一致して、相互に、WWP1のWWドメインがPTENとのその相互作用に必要であることが見出された（図4E）。
【０１０６】
PTEN活性はC末端リン酸化（S380、T382、T383、およびS385）によって厳密に制御されることが公知である。C末端リン酸化は、PTENの不活性な「閉鎖」立体構造状態を支持する。PTENのリン酸化欠損4A変異体は活性があり、「開放」されておりかつ形質膜に局在しているのに対して、リン酸化模倣4Eは細胞質性でありかつ不活性である。どちらのPTEN状態がWWP1/NEDD4-1 E3の効果的な基質であるのかを判定した。WWP1はPTEN 4Aと優先的に相互作用し、PTEN 4E変異体とは相互作用しないことが見出された（図4F）。一貫して、インビボユビキチン化アッセイにより、WWP1/NEDD4-1 E3は、PTEN 4A K27結合型ポリユビキチン化を特異的に誘発し、PTEN 4E変異体では誘発しないことが明らかになり、WWP1/NEDD4-1 E3がPTENの活性「開放」プールに優先的に作用することが示唆された（図4G）。
【０１０７】
実施例4‐K27結合型PTENポリユビキチン化は、PTENの二量体化、膜動員、および機能を抑制する
ユビキチン化は、タンパク質間相互作用に空間的妨害を与え得る。したがって、WWP1/NEDD4-1媒介性K27結合型PTENユビキチンがPTEN二量体形成を制御するかどうかを調べた。この目的のために、Flagタグ化された非修飾PTENまたはユビキチン化PTENをビーズで精製し、続いて細菌由来のGST-PTENとのその相互作用を試験することにより、PTEN二量体化をインビトロでモニターした。興味深いことに、PTENのK27結合型ポリユビキチン化をもたらす、WTユビキチンとWWP1/NEDD4-1 E3との過剰発現により、Flag-PTENとGST-PTENとの相互作用が損なわれることが見出された。
【０１０８】
対照的に、K27R変異体ユビキチンとWWP1/NEDD4-1 E3複合体との過剰発現は、Flag-PTENとGST-PTENとの相互作用に影響を及ぼさず、PTENのK27結合型ポリユビキチン化がその二量体化を阻害することが示唆された（図5A）。この概念と一致して、非還元／非変性ゲルアッセイにより、WWP1およびNEDD4-1が、PTEN二量体／オリゴマー化を相乗的に抑制することが示された（図5B）。
【０１０９】
PTEN二量体化がPTENの膜動員および活性化と関連していることを考慮して、WWP1/NEDD4-1媒介性K27結合型PTENポリユビキチン化がPTENの膜動員およびその活性に及ぼす影響を調査した。分画実験により、WWP1とNEDD4-1との過剰発現がPTEN膜動員を相乗的に抑制し（図5C）、次に相乗的AKT活性化をもたらすことが示された（図5D）。
【０１１０】
次に、内因性ユビキチンの枯渇および外因性ユビキチンまたはその変種の発現をドキシサイクリンによって同時に可能にするユビキチン置換システムを利用した。内因性ユビキチンとK27R変異体との置換により、PTENポリユビキチン化が阻害されるのみならず、PTENの形質膜への局在化が誘導され、次にAKT活性化が抑制されるが、内因性ユビキチンと野生型ユビキチンとの置換ではそのようなことはないことが見出された（図5E；図7A、図7B）。
【０１１１】
PTENの二量体化、膜動員、および機能におけるWWP1およびNEDD4-1の役割をさらに確認するため、CRISPR/Cas9遺伝子編集アプローチを用いてWwp1-/- MEFを作製した（方法を参照されたい）。WWP1を遺伝子除去すると、非還元／非変性ゲル解析および膜分画解析により評価した場合、PTENの二量体化および膜動員は増加し、次にAKT活性が抑制された（図5F、図5G、図5H）。Nedd4-/- MEFにおいても同様の結果が得られた（図5I、図5J）。まとめると、これらのデータは、PTENの二量体化、膜動員、および機能の抑制におけるWWP1/NEDD4-1媒介性K27結合型ポリユビキチン化の新たな役割を裏付ける。
【０１１２】
WWP1/NEDD4-1媒介性K27結合型ポリユビキチン化におけるPTEN上のK342/K344残基の重要な役割と一致して（図5L、図5J、図5K）、PTEN K342/K344Rユビキチン化欠損変異体が著しい二量体化能を示すことが見出された（図5K）。さらに、ゲル濾過アッセイにより、PTEN K342/K344R変異体がより多くのオリゴマー／二量体複合体を形成するのに対して、PTEN WTはインビボで主に単量体複合体を形成することが明らかになり、したがって、PTENオリゴマー化／二量体化におけるK27結合型ポリユビキチン化の抑制的役割がさらに強調される（図5L）。それに応じて、PTEN K342/K344R変異体は、膜分画解析および共焦点解析により検出して、顕著な形質膜蓄積を示した（図5M、図5N、図5P）。機能的に、PTEN K342/K344R変異体は、その他のPTEN変異体および野生型対照と比較して、AKT活性に対して最も強力な阻害を示した（図5O）。
【０１１３】
最後に、インビボにおける細胞増殖、腫瘍形成能、および腫瘍成長に及ぼすPTEN K27結合型ポリユビキチン化の影響を判定するため、WTとユビキチン化欠損K342/K344R PTEN変異体の腫瘍抑制機能を比較した。際立ったことに、WT PTENと比較して、PTEN K342/K344R変異体は、細胞増殖および足場非依存性成長のより強力な阻害を誘導した（図3D、図3E）。次に、インビボにおける腫瘍成長に及ぼすNEDD4-WWP1/PTENクロストークの影響を、異種移植腫瘍モデルを採用することによって評価した。注目すべきことには、PTEN K342/344R変異体形質導入細胞に由来する腫瘍は、WT PTENに由来する腫瘍よりも遅い速度で成長し、したがって、PTEN K342/K344R変異体がWT PTENよりも強力な腫瘍形成の阻害を示すことが示された（図5M、および図3Fに示される代表的な画像）。一貫して、PTEN WTまたはK342/K344R変異体に由来する腫瘍の免疫組織化学 (IHC) 解析により、PTEN K342/K344Rがより多くの形質膜蓄積表現型を示すのに対して、PTEN WTは細胞内に分散していることが明らかになった（図3G）。合わせると、データから、インビトロおよびインビボの両方において、PTEN K342/K344残基におけるWWP1/NEDD4-1媒介性K27結合型PTENポリユビキチン化は、形質膜区画からPTENを解離させることにより、PTEN腫瘍抑制因子機能を阻害することが示唆される。
【０１１４】
実施例5‐MYCは、PTEN抑制に向かってWWP1/NEDD4-1遺伝子発現をトランス活性化する
PI3K-AKTシグナル伝達経路の活性化とMYC増幅は、がんにおいて共に起こる場合が多く、高い組織学的異型度および予後不良と相関するため、MYCがPTEN機能を阻害し、それによってPI3K-AKT経路を活性化する能力を試験した。MYCは転写因子として機能するため、WWP1およびNEDD4-1が推定上のMYC標的遺伝子であるかどうかを試験した。転写因子親和性予測(TRAP)ソフトウェア(http://trap.molgen.mpg.de/cgi-bin/home.cgi) およびクロマチン免疫沈降 (ChIP)-seqデータベース (https://genome.ucsc.edu/ENCODE/)の解析を通じて、Wwp1およびNedd4-1遺伝子の両方のプロモーターにおける推定MYC応答エレメントが同定された（図6A）。ChIPアッセイにより、MYCタンパク質が、WWP1およびNEDD4-1の両方のプロモーター上の予測領域に結合することが確認された（図6A）。この知見と一致して、MYCを過剰発現させると、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で、WWP1およびNEDD4-1のレベルは用量依存的に上昇し、WWP1およびNEDD4-1の両方がMYC標的遺伝子であることが示唆された（図6B、図6C）。WWP1/NEDD4-1上方制御の結果として、AKT活性化はMYC過剰発現時に著しく増加し、PTENタンパク質レベルには何も変化がなかった（図6C）。
【０１１５】
逆に、siRNA SMARTpoolによってMYCを枯渇させると、WWP1およびNEDD4-1タンパク質レベルの両方が抑制され、かつAKT活性化が同時に減少し、この場合も同様にPTENタンパク質レベルには何も変化がなく、MYCがWWP1/NEDD4-1経路の上流調節因子であることがさらに確認された（図6D）。
【０１１６】
MYCがWWP1およびNEDD4-1発現を顕著に誘導することを考慮して、MYCが、PTEN K27結合型ポリユビキチン化を誘発して、PTENの二量体化、膜動員、および機能を抑制し得るかどうかを調べた。実際に、MYCを過剰発現させると、インビボユビキチン化解析、免疫沈降解析、および膜分画解析により評価して、PTEN K27結合型ポリユビキチン化が促進されるのみならず、用量依存的様式でPTENの二量体化および形質膜区画とのその会合も破壊された（図6E、図6、図6G）。
【０１１７】
MYC活性化の下流のWWP1およびNEDD4-1の役割に取り組むため、WWP1およびNEDD4-1の両方をノックダウンするためのWWP1またはNEDD4-1のいずれかに対するshRNAを利用し、DU145細胞においてMYCを安定に過剰発現させるかまたは過剰発現させずに、PTENのユビキチン化状態および機能を調べた。際立ったことに、WWP1およびNEDD4-1の両方を枯渇させると、対照細胞においてPTEN K27結合型ポリユビキチン化は減少するものの、この効果はMYC過剰発現細胞においてはるかにより顕著であった（図6E）。機能的に、WWP1もしくはNEDD4-1のいずれかまたはその両方の枯渇は、PTENタンパク質レベルに影響を及ぼすことなく、MYC誘導性AKT活性化の強力な阻害を誘発し；MYC依存的AKT活性化におけるWWP1およびNEDD4-1の重要な役割が裏付けられる（図6H、図6I）。
【０１１８】
次に、MYC誘導性腫瘍形成能に及ぼすNEDD4-1およびWWP1の影響を判定するため、前述のMYC安定性DU145細胞を利用した（図6EおよびH）。WWP1およびNEDD4-1の両方を枯渇させると、軟寒天コロニーの形成は減少し、コロニーの形成に及ぼすこの阻害効果はMYC過剰発現細胞においてはるかにより顕著であった（図6J）。WWP1/NEDD4-1ノックダウンによって起こる軟寒天コロニーの減少が、アポトーシスに起因するのか、または細胞周期に及ぼすそれらの影響に起因するのかを調査するため、細胞をヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、続いてFACS解析を行った。WWP1/NEDD4-1の枯渇は、細胞周期プロファイルにほとんど影響を及ぼさないが（図7A）、MYC過剰発現細胞においてより顕著なアポトーシスを引き起こすことが見出された（図6K）。まとめると、本発明者らのデータにより、PTENの機能阻害を通じたMYC誘導性腫瘍進行におけるWWP1/NEDD4-1の重要な役割が実証され、次に、WWP1/NEDD4-1の標的化が、MYC駆動性がんを処置するための治療戦略を提供し得ることが示唆される。
【０１１９】
実施例6‐ヒトがんにおける異常なWWP1/NEDD4-1/PTENクロストーク
ヒトがんにおけるWWP1/NEDD4-1/PTENクロストークの病態生理学的関連性を調査した。最初に、様々なヒト前立腺がん(CaP)細胞株を調べた。著しいことに、膜画分では、WWP1およびNEDD4-1の発現がPTEN蓄積と逆相関したのに対して、全画分および可溶性画分では、PTENはNEDD4およびWWP1発現と著しい相関を示さなかった（図7B）。ヒトがんにおけるこの機能的クロストークの臨床的関連性をさらに検証するため、126名のヒトCaP患者に由来する連続スライドにおけるPTENおよびNEDD4-1/WWP1発現の細胞内局在性を調べた。免疫組織化学(IHC)解析により、ヒトCaP標本において、NEDD4-1が著しく上方制御されていること、および同時にPTEN膜動員が消失していることが明らかになった（図6Lおよび図6M、ならびに図7Cに示される代表的画像）。さらに、NEDD4-1発現が腫瘍悪性度と正に相関したのに対して、PTEN膜動員とは著しい負の相関が認められた（図6M）。さらに、NEDD4発現が高くかつPTEN膜動員が消失しているという特性を伴う患者の数は、腫瘍悪性度に伴って増加し、グリーソンスコア6/7とグリーソンスコア8/9との間で有意差が認められた（図6N）。
【０１２０】
バイオインフォマティクス解析を通して、ヒトCaP試料においてWWP1転写産物とNEDD4-1転写産物のレベルが正に相関することが見出された（TCGA ProvisionalおよびMSKCC, Cancer Cell 2010）（図6O）。重要なことには、MYC転写産物のレベルは、WWP1転写産物およびNEDD4-1転写産物のレベルの両方と正に相関した(TCGA Provisional)（図7D）。興味深いことに、乳がんおよび前立腺がんなどの多くのヒトがんにおいて頻繁に増幅される領域の1つであり、かつMYCもまた局在している領域である染色体8q21上に局在するWWP1は、ヒトCaP標本においてMYCと同時増幅されることが見出された（図6A、図6B、図6C；および、図8）。まとめると、これらの知見は、ヒト腫瘍形成およびCaP進行における異常なMYC/WWP1/NEDD4-1/PTENクロストークの関連性を支持するものである。
【０１２１】
実施例7‐マウスにおけるWWP1の不活性化は、MYC駆動性の前立腺腫瘍形成を抑制する
WWP1の喪失がMYC駆動性の前立腺腫瘍を阻害するというインビボの遺伝学的証拠を得るため、本実施例の実験では、前立腺上皮特異的様式でHi-Mycを発現して、3ヵ月齢で高悪性度前立腺上皮内腫瘍(PIN)の完全浸透度をもたらし、5〜12ヵ月齢のうちに浸潤性腺がんに進行するHi-Mycマウスを利用した (Ellwood-Yen et al., 2003)。Hi-MycマウスをWwp1ヘテロ接合体マウスと交配させて、Hi-Myc; Wwp1+/-変異体または Hi-Myc; Wwp1+/+対照を得た。一貫して、ヘテロ接合性Wwp1欠失がHi-Myc駆動性の腫瘍形成を著しく抑制することが見出された（図9A）。組織学的解析により、Wwp1ヘテロ接合体マウス由来の前立腺が、Wwp1 WT対応物と比較して、Hi-Myc駆動性の高悪性度PINの著しい減少を示すことが確認された（図9B）。この概念と一致して、前立腺由来の溶解物では、ヘテロ接合性Wwp1欠失はまた、PTENタンパク質レベルに影響を及ぼすことなく、AKT活性化を阻害した（図9C）。最後に、DLP組織におけるPTENタンパク質のIHC解析により、Wwp1ヘテロ接合体マウスが、Wwp1 WT対応物と比較して、前立腺上皮細胞において強いPTEN形質膜蓄積を示すことが明らかになった（図9D）。したがって、Wwp1のヘテロ接合性遺伝子除去により、インビボにおいてPTENの再活性化が誘発されて、Myc駆動性の腫瘍形成が妨げられかつ抑制される。
【０１２２】
実施例8‐WWP1阻害剤としてのインドール-3-カルビノール (I3C) の同定
I3Cは天然化合物であり、グルコシノレートグルコブラシシンの分解によって生成されるものであり、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、カラードグリーン、芽キャベツ、およびケールなどのアブラナ科の野菜中に比較的高レベルで見出すことができ、無視できる程度の毒性を示す（Aggarwal and Ichikawa, 2005；Ahmad et al., 2010, 2012；Firestone and Sundar, 2009；Sarkar and Li, 2009）。以前の研究により、I3Cがインシリコ分子モデリングでNEDD4-1のHECTドメインに適合することができ、それ故にNEDD4-1とおよそ88.1μMという算出された平衡解離定数（Kd：約88.1μM）で相互作用し、それによってNEDD4-1活性を阻害すること明らかになった (Aronchik et al., 2014)。WWP1のHECT触媒ドメインはNEDD4-1のものと構造的に類似しているため、したがってI3CはWWP1もまた阻害するかもしれないと仮定された。NEDD4-1の結晶構造により、共有結合阻害剤のそのN末端葉への結合が明らかになった (Kathman et al., 2015)。I3Cを共有結合阻害剤に重ね合わせ、かつWWP1をNEDD4-1に重ね合わせた場合に、結合ポケットが残基F577、L630、Y628、C629、N650、およびY656によって形成されたI3C結合WWP1を示すモデルが作成された。I3CのインドールコアはN末端ドメインポケットの中心に適合し、周囲の疎水性残基と広範囲の相互作用を形成することができ（図10A）、WWP1のE3リガーゼ活性に対するI3Cの阻害機能が示唆された。次に本実施例の実験で、マイクロスケール熱泳動 (MST) 結合解析によってこの仮説を確認した。驚くべきことに、MST結合解析により、I3Cが、NEDD4-1と比較して有意により強力な結合親和性を有して、およそ120 nMという解離定数（Kd；約120 nM）でWWP1と結合することが明らかになった（図10B、図10C、図10D）。
【０１２３】
実施例9‐K27結合型PTENポリユビキチン化の治療標的化は、インビトロにおいて腫瘍形成を強く抑制する
WWP1/NEDD4-1を標的化し、それによってPTENの二量体化および機能を強化することが、MYC駆動性がんを処置する無比の機会を提供し得るかどうかを調査した。図4A、図4B、および図4Cに示されるように、WWP1またはNEDD4-1のいずれの活性もK27結合型PTENポリユビキチン化に必要である。それ故に、WWP1またはNEDD4-1のいずれかを標的化する阻害剤の使用は、このE3活性を不活性化するのに理想的な方法であると考えられる。WWP1活性を抑制／阻害するために現在利用可能な小さな薬理学的阻害剤は存在しないため、そのHECTドメインに結合することによってWWP1活性を抑制する潜在的WWP1阻害剤であるインドール-3-カルビノール(I3C)を使用した。最初に、WWP1に対するI3Cのオンターゲット効果を評価するため、Wwp1-/- MEFを使用した。実際に、Wwp1-/-細胞は、Wwp1+/+細胞と比較して、I3C処理に対してより抵抗性であった（図10C）。次に、I3C処理によるWWP1の阻害が、細胞内でPTEN K27結合型ポリユビキチン化およびその細胞内局在性に影響を及ぼすかどうかを試験した。上記のデータと一致して、I3CによるNEDD4-1の阻害は、インビボユビキチン化解析および共焦点免疫蛍光解析によって明らかなように、WWP1/NEDD4-1 E3媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化を強く減少させるのみならず、その形質膜蓄積を誘導した（図11A；図10D）。結果として、これはDU145細胞（PTENコンピテント）において、PTENタンパク質レベルに影響を及ぼすことなく、用量依存的AKT抑制を引き起こし、かつアポトーシスの誘導を同時に引き起こし、その一方でPC3細胞（PTENヌル）では無視できるほどの影響が認められたにすぎない（図11B）。同様に、I3C処理は、DU145細胞において細胞成長の劇的な阻害を示したが、PC3細胞およびLNCaP細胞（PTENヌル）の両方においては細胞成長をわずかに抑制するのみであり；I3Cが、少なくとも部分的にPTEN依存的様式で、その抗増殖効果を発揮することが示唆された（図11C）。加えて、2つの独立したPTEN安定性ノックダウン細胞を作製した。一貫して、PTENが枯渇している細胞は、対照細胞と比較して、I3C処理に対する抵抗性を示し（図11D）、I3Cが、PTEN K27結合型ポリユビキチン化の抑止を通してその抗増殖効果を引き出すことが確認された。
【０１２４】
WWP1/NEDD4-1ノックダウンがMYC誘導性腫瘍形成能を抑制するという知見により、調節解除されたMYC過剰発現が、WWP1/NEDD4-1/PTEN軸に対する細胞の「がん遺伝子依存性」を示して、細胞成長を支持するかどうかの検討が示唆された。
【０１２５】
この仮説を試験するため、対照細胞を、細胞成長にほとんど影響を及ぼさないI3Cの用量で処理した。顕著に対照的に、細胞は、MYCの過剰発現に際してこの低用量のI3C処理に対して感受性になり、MYC過剰発現時に、細胞は細胞生存のためにWWP1/NEDD4-1/PTEN軸に依存するようになることが示唆された（図11E）。3ヵ月齢のWTマウスおよび前立腺特異的Mycトランスジェニックマウス (Hi-Myc) に由来する初代前立腺スフィアに及ぼすI3Cの影響もまた調べた。予測通り、Hi-Mycマウス由来の前立腺スフィアを培養および連続継代することによって、Hi-Myc前立腺上皮細胞が、WTマウス由来の細胞と比較して、有意に増強された幹／前駆細胞自己複製能および成長を示すことが明らかになった（図11F）。著しいことに、低用量のI3C処理は、大部分はアポトーシス誘導の結果として、Hi-Myc前立腺スフィア形成能を劇的に抑制した（図11F）。
【０１２６】
上記データと一致して、MYC発現はWWP1/NEDD4-1発現を誘導するのみならず、PTENタンパク質レベルに影響を及ぼすことなくAKT活性化を誘導した（図11G）。加えて、低用量のI3Cによる処理は、Hi-Myc前立腺スフィアにおいて、MYC発現によって駆動されるAKT活性化を無効にし、かつアポトーシスを同時に引き起こしたが、WT前立腺スフィアではそのようなことはなかった（図11G）。様々な細胞モデルにおいて総合すると、これらのデータから、Hi-MYC発現が、WWP1/NEDD4-1/PTEN経路への「がん遺伝子依存性」を誘導し、ひいては低用量I3C処理に対して細胞を感受性にすることが実証される。
【０１２７】
実施例10‐インビボにおけるK27結合型PTENポリユビキチン化の治療標的化
インビボにおけるWWP1/NEDD4-1/PTENクロストークの機能的関連性を調べるため、Hi-MycマウスでI3Cを用いる前臨床試験を実施した。マウス前立腺におけるHi-Mycの発現は、前立腺上皮内腫瘍(PIN)の完全浸透度をもたらし、5〜12ヵ月齢のうちに浸潤性腺がんへと進行する。この目的のために、5ヵ月齢のHi-Mycマウスのコホートを、媒体またはI3Cのいずれかで1ヵ月間処置した。
【０１２８】
媒体処置Hi-Mycマウスの前立腺は不均一な疾患進行を示し、その中で背外側前立腺(DLP)は広範囲の浸潤がんを示すのに対して、腹側前立腺(VP)および前側前立腺(AP)はPIN病変を同程度まで発症することが見出された（図12A）。注目すべきことには、I3C処置Hi-Mycマウスの前立腺では、VPでは顕著ではなかったものの、DLPおよびAPの両方で腫瘍サイズが著しく減少した（図12B）。
【０１２９】
組織学的解析により、Hi-Mycマウス由来のI3C処置APが、単層の上皮細胞で裏打ちされた正常様腺状構造を示して、完全に無病である一方で、DLPは浸潤がんの有意により低い浸透度を示すことが確認された（図12A）。組織病理学的解析と一致して、I3C処置は、Hi-Myc APおよびDLPの両方に由来する前立腺溶解物において、PTENタンパク質レベルに影響を及ぼすことなくAKT活性化を強く阻害したが、VP由来の前立腺溶解物ではそのようなことはなかった（図12C）。最後に、DLP組織におけるPTENタンパク質の免疫組織化学(IHC)解析により、I3C投与が、媒体処置と比較して、前立腺上皮細胞において強いPTEN形質膜蓄積を誘導することが明らかになった（図12D）。したがってI3CによるWWP1/NEDD4-1 E3の標的化は、インビボにおいて、PTENの形質膜動員を促進することによりその腫瘍抑制機能の再活性化を誘発して、MYC駆動性前立腺がんを抑制する。
【０１３０】
前述の実施例で示されたデータから、いくつかの結論を導き出すことができる：
i) MYC/WWP1/NEDD4-1媒介性PTEN K27結合型ポリユビキチン化がPTENの二量体形成および膜動員を制御し、それが次にその活性を抑制する新たな経路が同定された。この調節経路はPTENプロテアソーム分解を誘発せず、これはK27結合型が非効率的なタンパク質分解シグナルであるという概念と一致する（図12E）。本研究は、PTEN二量体化の制御およびその結果としてのPI3Kシグナル伝達活性化への初めての機構的洞察を提供するのみならず、明確な分子機能が、タンパク質二量体化の制御におけるK27結合型ユビキチン鎖に起因すると考える。これらのデータと一致して、以前の研究により、TRAF6ユビキチンリガーゼがAKTをK63結合型ポリユビキチン化の標的として、その膜動員および活性化を増強することが示される。PI3K/AKTシグナル伝達経路の重要な成分の非タンパク質分解性ユビキチン化はしたがって、それらの膜動員を調節するための一般的機構である可能性がある。
ii) これらのデータはまた、どのようにPTENの細胞内局在性および機能が調節されるのかに関する、理路整然としたかつ統一したワーキングモデルを提供する。NDFIP1が虚血条件下でPTENに結合し、NEDD4-1によるそのモノユビキチン化を増強して、PTENの核／サイトゾルシャトリングを誘発することが以前に示された。本明細書では、NEDD4-1がWWP1と複合体を形成して、PTEN K27結合型ポリユビキチン化を誘導し、PTEN二量体化を負に調節し得ること、さらにWWP1およびNEDD4-1の両方の触媒活性がこのE3リガーゼの完全な活性化に必要であることが見出された。重要なことには、インスリン、血清、および低酸素などの様々な生理的刺激下でのPTENユビキチン化の状態を調べることにより、低酸素が、ポリユビキチン化を阻害し得るのみならず、NEDD4-1によってPTEN上に複合化されるモノユビキチン鎖特異性を決定し得ることが見出された（図13A、図13B、および図13C）。これらの知見から次に、NEDD4-1 E3リガーゼが異なるパートナーと相互作用して、基質鎖特異性を決定し得ることが示唆された：モノユビキチン化に向かうNDFIP1；K27結合型ポリユビキチン化に向かうWWP1。この概念と一致して、正常酸素条件下では、NEDD4-1はWWP1と複合体を形成して、PTEN K27結合型ポリユビキチン化を促進し得る一方で、低酸素に応答して、NEDD4-1はその相互作用パートナーをNDFIP1に切り換え、PTENモノユビキチン化を増加させることが見出された（図13C、図13D）。興味深いことに、低酸素条件下においてNDFIP1を枯渇させるとPTENポリユビキチン化が回復し、PTENモノユビキチン化の決定におけるNDFIP1とNEDD4-1との重要な役割が示唆された（図13C）。したがってこれらの知見は、E3ユビキチンリガーゼの多用途性を増加させるためのその機構的調節の別の層を提供する。
iii) これらのデータはまた、PTENに対するNEDD4-1の機能に関する、腫瘍生物学における長年の議論を解決する。NEDD4-1媒介性のPTEN分解にはいまだ大いに議論の余地があるが、これらのデータにより、WWP1/NEDD4-1が、タンパク質分解を促進する基準のK48鎖ではなく、K27結合型ポリユビキチン化を通してPTENのサイトゾルおよび核機能を妨害し得る、PTENの強力な上流の負の調節因子であることが示される。これらの知見と一致して、WWP1/NEDD4-1の存在は、PTENのタンパク質レベルに影響を及ぼすことなく、膜から離れたその再局在化と強く相関し、このことは、定常状態において、またはシクロヘキサミド (cyclohexamide) パルス追跡解析によって評価した場合に、内因性PTENタンパク質安定性がWWP1またはNEDD4-1の過剰発現時に影響を受けなかったことを示すデータと一致する（図5および図1D）。遺伝学的に、CRISPR媒介性のWWP1ノックアウトまたはNEDD4の遺伝子除去は、PTEN二量体化を強く誘導し、次にPTENタンパク質レベルに影響を及ぼすことなくAKT活性を阻害した（図5F、図5G、および図5I）。合わせると、これらのデータから、PTENプロテアソーム分解が、WWP2などのその他のE3リガーゼによって制御されること；またはあるいは、他の細胞型または異なる生理的条件下において、NEDD4-1がその他のE3リガーゼと付加的なE3複合体を形成して、PTENのユビキチン化および分解を促進し得ることが強く示唆される。
iv) WWP1は、腫瘍増殖およびアポトーシスに関与する様々なシグナル伝達過程の調節に関係づけられている。本明細書において、これらのデータは、WWP1がMYCの新たな標的であることを明らかにするのみならず、ヒトCaP標本においてWWP1がMYCと同時増殖されることを特定した。機構的に、これらのデータは、PTENに対するWWP1の発がん機能を明らかにした。CRISPR/Cas9遺伝子編集アプローチによるWWP1の遺伝子除去は、PTENの二量体化および膜動員を誘導するのみならず、AKT活性化を強く阻害し（図5F〜H）、PTEN抑制におけるWWP1の重要な役割が確認された。したがって、これらのデータは、WWP1のPTENに対する初めての機能的連携を提供するのみならず、PTEN再活性化およびがん治療のための重要な治療標的を同定する。
v) WWP1またはNEDD4-1の過剰発現が、様々な組織起源のヒトがんにおいて非常に頻繁に認められることを考慮すると、このPTEN抑制経路の影響が十分に広く生きわたっている可能性がある。著しいことに、調節解除されたMYC過剰発現は、WWP1/NEDD4-1/PTEN軸に対する細胞の「がん遺伝子依存性」を誘導する。WWP1/NEDD4-1 E3経路が、ノックダウン(shRNA)または化合物処理(I3C)によって「依存」細胞において阻害された場合、がん細胞の生存および成長は抑制される。ヒトがんにおいてPTENは下方制御されているか、または単一対立遺伝子的に失われている場合が多いため、WWP1および／またはNEDD4-1の標的化によるこの経路の薬理学的遮断は、PTEN再活性化を通してMYC駆動性腫瘍を処置するための刺激的な治療戦略を示す。興味深いことに、WWP1/NEDD4-1は、変異体PTENの存在下でさえAKTの過度の活性化を誘発するため、この治療アプローチは「PTEN変異体がん」にまでも及び得る（図14Aおよび図14B）。概念的に、これらの知見は、がんを予防および処置するための念願の腫瘍抑制因子媒介性治療への道を開く。
【０１３１】
本明細書に記載された結果は、以下の材料および方法を用いて得られた。
【０１３２】
マウスモデル
Beth Israel Deaconess Medical Center IACUC動物研究委員会によって、すべての動物実験が承認された。ヒトc-Mycの前立腺特異的発現が、2つのアンドロゲン応答エレメントを有するラットプロバシンプロモーターによって駆動される、これらの研究で使用されたトランスジェニックマウス（Hi-Mycマウス）は、米国立がん研究所のMouse Repositoryから入手した。1つの遺伝子型につきマウス9匹をランダムに選択し、表示された齢において腫瘍を調べるために使用した。Wwp1-/-マウスおよびその対となるWwp1+/+マウス（C57/BL6バックグラウンド）は、Dr. L. Matesic（University of South Carolina、Columbia, SC, USA）(Shu et al., 2013) から入手した。病理学者が組織学的異型度を盲検的に判定した。
【０１３３】
プラスミド、抗体、および試薬
ヒトPTEN cDNAをpLVX-Puroベクターにクローニングして、PTENレンチウイルス発現プラスミド(Clontech)を作製した。LentiCRISPR v2プラスミドは、Feng Zhangから供与されたものである(Addgene #52961)。pCDH-puro-cMyc(46970)、HA-ヒトNEDD4-1 WT(24124)、HA-NEDD4-1 C867A(24125)は、Addgeneから購入した。Flag-WWP1 ΔWWドメイン（欠失341〜547）は、Q5部位特異的変異誘発キット(E0544S)によって作製し、PTENのすべての変異体構築物は、QuickChange Lightning特異的変異誘発(Agilent Technologies)を用いて作製した。変異体はすべて、配列決定によって確認した。His-ユビキチン、His-ユビキチンKR変異体、His-ユビキチンK単独変異体、Myc-PTENおよびその欠失構築物は、以前に記載されている。pcDNA3-HA-MYC、pcDNA3-Myc-PTEN、pcDNA3-Myc-PTEN 4A、pcDNA3-Myc-PTEN 4E、pcDNA3-HA-PTEN、pcDNA3-HA-PTEN N末端(1〜187)、pcDNA3-HA-PTEN-C末端(188〜403)、MYC-WWP1 WT、MYC-WWP1 C890A、ならびにFlag-NEDD4ファミリーリガーゼ構築物、例えばFlag-NEDD4-1、Flag-WWP1、Flag-WWP2、Flag-Smurf2、およびFlag-Itchなどは、Dr. Weiの研究室から供与されたものである。NEDD4-1、WWP1、Trim27、ITCH、RNF168、NDFIP1を標的指向する2つの個々のsiRNA二重鎖、および対照非標的siRNAは、Sigma Aldrichから購入し、MYCを標的指向するsiRNA SMARTpoolはDharmaconから購入した。ヒトWWP1(TRCN0000003398)、NEDD4-1(TRCN0000007553)、およびPTEN（TRC0000002746；TRC0000002747）を標的指向するレンチウイルスベースshRNA発現構築物は、GE Dharmaconから入手した。Lipofectamine 2000、RPMI、DMEM、Opti-MEM血清低減培地、およびウシ胎仔血清(FBS)は、Invitrogenから購入した。抗Flag-M2アフィニティーゲル、インスリン、およびピューロマイシンは、Sigma Aldrichから購入した。インスリンは100または200 ng/mlで使用した。ポリブレンはSanta Cruz Biotechnology, Incから購入した。インドール-3-カルビノール(I3C)はSigma Aldrichから購入した。ウェスタンブロッティングに関して：抗Mycタグ抗体(2276)、抗PTEN抗体(9559)、ウェスタンブロットおよびChIPアッセイ用の抗MYC抗体(13987)、抗NEDD4抗体（2740および3607）、抗EGFR抗体(4267)、抗ユビキチン抗体(3936)、抗切断型カスパーゼ3抗体 (9661)、抗ホスホ-AKT抗体（pSer473、9271；pThr308、9275）、抗AKT抗体（汎AKT、4685）はすべて、Cell Signaling Technologyから購入した。マウス抗PTEN抗体(6H2.1)はCascade Bioscienceから購入し；抗GFP(A-11120)はInvitrogenから購入し；抗WWP1（ヒト）(H00011059-M01)はNovus Biologicalsから購入し；抗WWP1（マウス）(13587-1-AP)はProteintechから購入し；抗アクチン（A3853および抗Flag-M2）はSigma Aldrichから購入し；抗HAタグ(16B12)はCovanceから購入した。組織マイクロアレイ(TMA)解析における免疫組織化学的検査に関して：抗PTEN(9559)はCell Signaling Technologyから購入し；抗NEDD4(07-049)はMilliporeから購入した。
【０１３４】
細胞培養、トランスフェクション、および安定な細胞株の確立
細胞株はすべてATCCから入手し、MycoAlertマイコプラズマ検出キット(Lonza)によってマイコプラズマについてチェックした。Nedd4-/- MEFおよび対となるNedd4+/+ MEFは、Dr. B. Yang(University of Iowa)の厚意により提供された。Wwp1-/- MEFは、CRISPR/Cas9遺伝子編集アプローチによって作製した。293、293T、および初代MEF細胞は、10%ウシ胎仔血清、2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したDMEM中で維持した。PC3、LNCaP、C4-2、22rv1、およびVCaP細胞は、10%ウシ胎仔血清、2 mMグルタミン、100 U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン(Invitrogen)を含有するRPMI培地で培養した。RWPE-1およびPWRE-1細胞は、組換えヒト上皮増殖因子(rhEGF)およびウシ下垂体抽出物(BPE)を補充したK-SFM培地で培養した。トランスフェクションは、製造業者の説明書に従ってLipofectamine 2000試薬(Invitrogen)を用いて実施した。簡潔に説明すると、6ウェルディッシュ中で、5x105個細胞に5μgのDNAプラスミドまたは20 nMのsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの12時間後に細胞を完全培地中に回収し、次いで表示の時点で収集した。安定な細胞株は、レンチウイルス形質導入によって作製した。
【０１３５】
レンチウイルスの生成および感染
組換えレンチウイルスを作製するため、293T細胞に、VSVG、PMDL、REV、および表示のレンチウイルスベースの構築物を同時トランスフェクトした。ウイルス含有上清を収集した。感染のために、ウイルス貯蔵物に10μg/mlのポリブレンを補充し、2μg/mlのピューロマイシンによって感染細胞を選択した。
【０１３６】
細胞増殖アッセイ
トランスフェクションの8時間後に、細胞をトリプシン処理し、再懸濁し、3枚の別個の12ウェルプレートに20,000個／ウェルの最終密度でプレーティングした。翌日(d0)から開始して、1日当たり1枚のプレートをPBSで1回洗浄し、10%ホルマリン溶液で室温にて10分間固定し、PBS中で4℃にて維持した。最終日に、ウェルをすべてクリスタルバイオレットで染色した。10%酢酸で溶解した後、吸光度を595nmで読み取った。
【０１３７】
インビボユビキチン化アッセイ
PTENのインビボユビキチン化を解析するため、細胞にHis-ユビキチンおよびMyc-PTENと共に様々な構築物をトランスフェクトした。細胞を緩衝液A（6 Mグアニジン-HCl、Na2HPO4/NaH2PO4 [pH 8.0]、および10 mMイミダゾール）によって溶解し、Ni-NTAアガロースと共に4℃で1.5時間インキュベートした。ビーズを緩衝液Aで1回、緩衝液A/TI（1容積の緩衝液A；3容積の緩衝液TI［25 mM Tris-HCl、pH 6.8,、および20 mMイミダゾール］)で2回、および緩衝液TIで3回洗浄し、次いでウェスタンブロットによって解析した。すべての実験において、ウェスタンブロット解析により、等量のHis-ユビキチン発現を検証した。
【０１３８】
インビトロユビキチン化アッセイ
インビトロユビキチン化のために、293細胞由来の400 ngの精製Flag-PTENを、40 ng E1(E-305 Boston Biochem)、500 ng E2(E2-616 Boston Biochem)、10μg His-Ub変種(Boston Biochem)、8 mM ATP、1xリガーゼ反応緩衝液(Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific) # B71)、および1xエネルギー再生システム(Boston Biochem #B-10)、400 ng NEDD4(Sigma Aldrich # SRP0226)、および400 ng WWP1(Sigma Aldrich # SRP0229)と共に、25 ul反応混合物中で37℃にて1時間インキュベートした。
【０１３９】
フローサイトメトリーによる細胞周期プロファイル解析
表示の構築物を安定して発現するDU145を収集した。細胞を75%エタノールにより-20℃で一晩固定し、冷PBSを用いて3回洗浄した。試料を1 ug/ml RNaseで37℃にて30分間処理し、5 ug/mlヨウ化プロピジウム(Roche)で氷上にて1時間染色した。染色された細胞をBD FACSCanto（商標）IIフローサイトメーターで選別した。結果はFlowJoソフトウェアによって解析した。
【０１４０】
質量分析
HA-PTENがトランスフェクトされたDU145細胞を抗PTEN抗体で免疫沈降させ、PTEN会合タンパク質を、4%〜12%勾配ゲル(Invitrogen)上でSDS-PAGEによって分離し、クマシーブルー染色を行った。ゲルから特異的バンドを切り出し、質量分析ペプチド配列決定に供した。
【０１４１】
ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降
ウェスタンブロッティングのために、細胞を、プロテアーゼ(Roche)およびホスファターゼ(Roche)阻害剤を補充したRIPA緩衝液(Boston BioProducts)中で溶解した。タンパク質をNuPAGE 4〜12% Bis-Tris勾配ゲル(Invitrogen)上で分離し、フッ化ポリビニリデン(polyvinylidine)膜（Immobilon P、Millipore）に転写し、ブロットを表示の抗体でプロービングした。免疫沈降のために、PC3、293T、およびMEF細胞に、LIPOFECTAMIN 2000(Life Technologies)を用いて表示の発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞を、プロテアーゼ(Roche)およびホスファターゼ(Roche)阻害剤を含むRIPA緩衝液中で溶解した。500μgの全溶解物を4℃で30分間、予め清澄化し、次いで抗Myc抗体（Cell Signaling Technology 9B11、1:500）または抗PTEN抗体（Cell Signaling Technology 9559、1:500)で4℃にて一晩免疫沈降させた。次いでプロテインAまたはプロテインGセファロースビーズ(GE Healthcare)を添加し、さらに2時間インキュベートした。免疫沈降物をRIPA緩衝液で3回洗浄した。変性条件の場合には、5%最終濃度のβ-メルカプトエタノールを含む標準的なLaemmli緩衝液を試料に添加し、次いでこれを煮沸し、NuPAGE 4〜12% Bis-Tris勾配ゲル(Invitrogen)上で分離した。非還元条件の場合には、細胞を、20 mM Tris-HCl pH7.5、150 mM NaCl、1% NP40、1 mM EDTA、1 mMプロテアーゼ(Roche)およびホスファターゼ阻害剤(Roche)を含有する溶解緩衝液中で溶解して、さらに免疫沈降を行った。未変性溶出のために、予め冷却した0.1 Mグリシン pH 2.5を用いて、4℃で10分間かけて免疫複合体を溶出し、1 M Tris-HCl pH 8.0でさらに中和した。還元剤を含まないLaemmli緩衝液を添加し、試料を直ちにNuPAGE 4〜12% Bis-Tris勾配ゲル(Invitrogen)上で泳動した。
【０１４２】
ユビキチン化PTENのNanoLC-MS/MS解析
Flag-PTEN、His-ユビキチンがWWP1/NEDD4-1と共にまたはそれなしでトランスフェクトされた細胞から、抗Flag M2ビーズによりユビキチン化PTENを単離した。8 M尿素、20 mM HEPES、1μg/ml アプロチニン、1μg/ml ロイペプチン、1 mM N-エチルマレイミド(Sigma)、および1 mM PMSFを含有する変性緩衝液で、結合しているタンパク質を溶出させた。溶出されたタンパク質をトリプシンで一晩消化し、トリフルオロ酢酸(TFA)で処理し、遠心分離により清澄化した。上清をSep-Pak C18カラム(Waters)で脱塩し、凍結乾燥されたペプチドを、50 mM MOPS、pH 7.2、10 mM リン酸ナトリウム、および50 mM NaClを含有するIP緩衝液で溶解した。トリプシン消化後にユビキチン化リジン残基上に生成されたジグリシル残遺物を特異的に認識する抗K-ε-GG抗体結合プロテインAアガロース(Cell Signaling Technology, Inc)と共に一晩インキュベートすることによって、ユビキチン化ペプチドを濃縮した。ビーズをIP緩衝液で、続いて水で洗浄し、結合しているペプチドを0.15% TFAで溶出させ、Stage tipクロマトグラフィーにより脱塩し、凍結乾燥させ、MS解析を行った。
【０１４３】
PicoViewナノスプレーインターフェース(New Objective)を備えたOrbitrap Eliteハイブリッド質量分析計(Thermo Electron)に接続されたnanoAcquityシステム(Waters)において、ナノLC-ナノESI-MS/MS解析を行った。ペプチド混合物を、130Åの細孔を有する1.7μm粒子が充填された75μm ID、25 cm長のC18 BEHカラム(Waters)にロードし、0.1%ギ酸中の5%〜35%アセトニトリルの分割勾配を用いて、流速300 nl/分で35℃にて90分間分離した。質量分析計はデータ依存的様式で操作した。簡潔に説明すると、分解能をm/z 400で120Kに設定し、自動ゲインコントロール(AGC)ターゲットを106に設定したorbitrap(m/z 350〜1600)で、サーベイフルスキャンMSスペクトルを取得した。HCD MS/MS断片化およびorbitrapでの検出のために、以前に選択されたイオンを60秒間動的に排除して、最も強力なイオン15個を順次単離した。MS/MSに関して、本発明者らは、最大蓄積時間200 msと共に、分解能15000、単離幅2 m/z、およびターゲット値50000イオンを使用した。断片化は、正規化衝突エネルギー30%および活性化時間0.1 msで行った。一価または認識されない荷電状態のイオンもまた排除した。Proteome Discoverer（v 2.1.0.81；Thermo Scientific）を通じてMascot検索エンジン（v.2.5.1；Matrix Science、Boston, MA, USA）を用いて、作成されたすべてのデータをカスタマイズ化Swiss-Protヒト(Homo sapiens)データベースおよびHisタグ化ユビキチンタンパク質配列（合計20,169エントリー）データベースに対して検索した。使用した検索基準は、トリプシン消化、可変修飾をカルバミドメチル(C)、酸化(M)、GlyGly(K)、およびLeuArgGlyGly(K)として設定、切断の見逃しを2つまで許容、質量確度は親イオンについて10 ppmおよび断片イオンにおいて0.02 Daであった。デコイデータベース検索のための2つのターゲット値を適用した：厳密なFDR 0.01および緩いFDR 0.05。MASCOT検索結果に含まれたユビキチン化部位およびペプチド配列指定は、生MS/MSデータから手動確認によって検証した。ラベルフリー定量のために、2 ppm質量精度でProteome Discoverer 2.1.0.81におけるPrecursor Ions Area Detectorノードを用いて、前駆イオン面積を抽出した（前駆体面積定量のために、実験m/zおよび保持時間を記録した）。
【０１４４】
ChIPアッセイ
37%ホルムアルデヒドを最終濃度1%のホルムアルデヒドになるように添加して、DU145細胞を固定し、室温で10分間インキュベートした。グリシンを最終濃度0.125 Mになるように添加して、架橋を停止させた。次いで細胞を剥離し、製造業者のプロトコルに従ってSimpleChIP酵素クロマチンIPキット（Cell Signaling、#9003）を用いて試料を調製した。クロマチン画分を、各場合において、以下：MYC（Cell Signaling、#13987）、ヒトRPL30または正常ウサギIgG（両者ともCell Signalingキット、Cell Signalingによって提供されたもの）のうちの1つに対する抗体10 mg、および磁気プロテインGビーズと共に、4℃で一晩インキュベートした。広範な洗浄および最終溶出の後、生成物を65℃で一晩処理して、架橋を逆転させた。インプットDNAおよび免疫沈降されたDNAをキットカラムを用いて精製し、以下のプライマーセット（近位および遠位プロモーター領域の両方）：
2019534316.tif 000018
と共にSYBRグリーンスーパーミックス(Bio-Rad)を用いてqPCRによって解析した。結果はすべて、各インプット値に対して正規化した。
【０１４５】
CRISPR/Cas9遺伝子編集アプローチ
MEFにおいてWWP1を標的指向するlenti-CRISPR/Cas9ベクターの構築は、骨格ベクター（Addgene、#52961）に付随するプロトコルに従って行った。ソフトウェア (http://crispr.mit.edu/)により、標的遺伝子の前方コードエキソンと一致する配列を優先して、以下の配列が予測された。配列の太字でない部分は、遺伝子特異的である。
2019534316.tif 000019
【０１４６】
細胞分画
表示の構築物がトランスフェクトされた293T、MEF、またはPC3細胞の膜 対 サイトゾル分画は、ProteoExtract非変性膜タンパク質抽出キット(Calbiochem)を用いて、かつ製造業者の手順に従って行った。
【０１４７】
ゲル濾過クロマトグラフィー
293細胞に表示の発現ベクターをトランスフェクトした。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解し、0.45μmシリンジフィルターを通して濾過した。500μlの溶解物(4 mg/ml)をSuperdex200 10/300 GLカラム(GE Lifesciences Cat. No. 17-5175-01)に負荷した。Superdex 75 10/300 GLカラム(GE Lifesciences Cat. No. 17-5174-01)を連続してさらに取り付けることにより、タンデムカラムゲル濾過を行った。試料を最初にSuperdex75カラムで分離し、続いてSuperdex 200カラムで分離した。AKTA FPLC(GE Lifesciences Cat. No. 18-1900-26)を用いてクロマトグラフィーを行い、タンパク質複合体を、溶解緩衝液を用いて0.5 ml／分、500μl／画分で分離および溶出した。各画分の一定分割量40μlをSDS-PAGEによって分離し、表示の抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。試料を分離する前に、ゲル濾過較正キット（GE Lifesciences、# 28-4038-42）を泳動して、クマシー染色SDS-PAGEタンパク質ゲル上での保持時間を決定することにより、カラムの分子量分解能を推定した。
【０１４８】
免疫蛍光解析
表示の構築物を安定して発現するPC3細胞およびDU145細胞を、カバーガラス上にプレーティングした。翌日、細胞を氷冷PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.02% Triton X-100で透過処理し、次いで20%ヤギ血清を補充したPBSでブロッキングした。細胞を、10%ヤギ血清を含有するPBSで希釈したCascade Bioscienceからの抗PTEN抗体（6H2.1、1:100）と共に一晩インキュベートし、次いでAlexa488結合二次抗体および1μg/mlのDAPIと共に1時間インキュベートした。BIDMC顕微鏡コア施設においてLSM510META共焦点レーザーシステムを用いて、画像を取得した。
【０１４９】
qPCR解析
Power SYBRグリーンPCRマスターキット(Applied Biosystems)を用いて、定量的リアルタイムPCRを行った。ABI 7500 FastリアルタイムPCRシステムで増幅を行い、アクチンを内部対照として使用した。使用したPCRプライマーは、以下のものであった。
2019534316.tif 000020
【０１５０】
軟寒天コロニー形成アッセイおよび異種移植
軟寒天におけるコロニー形成をアッセイするために、1.5 x 105個のPC3派生物を0.3%上層寒天中に再懸濁した。3週間後に形成されたコロニーをクリスタルバイオレットによって染色し、計数した。異種移植モデルにおける腫瘍成長をアッセイするために、特定病原体除去の環境において収容された7週齢NCrヌードマウスに、RPMI培地およびMatrigel（vol/vol、1:1）と混合した2.5 x 106個のPC3派生物をs.c.注射した（各群につきn=5）。
【０１５１】
免疫組織化学(IHC)アッセイ
NCrヌードマウスに由来する個々の腫瘍を切除し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、IHC解析を行った。染色のために、標準的な手順に従って組織をパラフィン中に包埋した。5μm切片を切断し、H&E染色のために処理するか、またはPTENについて染色した（Cascade BioScience 6H2.1、1:250）。染色されたスライドは、明視野顕微鏡によって可視化した。
【０１５２】
組織マイクロアレイ(TMA)解析
本研究で使用したTMAは、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)において構築された。研究コホートは、原発性CaPを有する患者126名からの根治的前立腺切除術標本からなった。腫瘍試料は、書面によるインフォームドコンセントを得て、外科的切除時に収集した。患者はMSKCCにおいて処置を受け、その進行が追跡された。PTEN(Cell Signaling Technology)およびNEDD4(Millipore)染色は、以前に記載された通りに実施した21。腫瘍細胞から構成されるコアを50%超含有する症例を解析した。
【０１５３】
I.P.投与
マウスは、0日目から開始して14日間にわたり週に3回、5% DMSOに溶解したI3C(20 mg/kg)でI.P.処置した。I.P.投与により、I3Cの最大全身曝露が達成されるようになる。
【０１５４】
遺伝子発現プロファイリング
TCGA(Provisional)およびMSKCCヒト前立腺腺がん遺伝子発現データセットは、cBioPortal(http://www.cbioportal.org/public-portal)からダウンロードした。解析のために、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用し、相関の解析はピアソン相関係数によって行った。
【０１５５】
統計解析
平均データの解析については、対応のない両側スチューデントt検定を用いてデータセットを比較した。TMA染色と臨床パラメータとの相関については、ピアソンカイ二乗相関を用いてデータセットを比較した。<0.05のP値を統計的に有意であると見なした。統計的検定はすべて、GraphPad Prismソフトウェアを用いて実行した。
【０１５６】
他の態様
前述の説明から、本明細書に記載される発明に変更および修正を加えて、それを様々な使用および条件に適合させることができることが明らかであろう。そのような態様もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１５７】
本明細書における変数の任意の定義における要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ（もしくはサブコンビネーション）としての、その変数の定義を含む。本明細書における態様の列挙は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部と組み合わせた、その態様を含む。
【０１５８】
本明細書において引用される特許および出版物はすべて、個々の特許および出版物が詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2019534316.tif 000022
【図１Ｂ】
2019534316.tif 000023
【図１Ｃ】
2019534316.tif 000024
【図１Ｄ】
2019534316.tif 000025
【図１Ｅ】
2019534316.tif 000026
【図２Ａ】
2019534316.tif 000027
【図２Ｂ】
2019534316.tif 000028
【図２Ｃ】
2019534316.tif 000029
【図２Ｄ】
2019534316.tif 000030
【図２Ｅ】
2019534316.tif 000031
【図２Ｆ】
2019534316.tif 000032
【図２Ｇ】
2019534316.tif 000033
【図２Ｈ】
2019534316.tif 000034
【図２Ｉ】
2019534316.tif 000035
【図２Ｊ−１】
2019534316.tif 000036
【図２Ｊ−２】
2019534316.tif 000037
【図３Ａ】
2019534316.tif 000038
【図３Ｂ】
2019534316.tif 000039
【図３Ｃ】
2019534316.tif 000040
【図３Ｄ】
2019534316.tif 000041
【図３Ｅ】
2019534316.tif 000042
【図３Ｆ】
2019534316.tif 000043
【図３Ｇ】
2019534316.tif 000044
【図４Ａ】
2019534316.tif 000045
【図４Ｂ】
2019534316.tif 000046
【図４Ｃ】
2019534316.tif 000047
【図４Ｄ】
2019534316.tif 000048
【図４Ｅ】
2019534316.tif 000049
【図４Ｆ】
2019534316.tif 000050
【図４Ｇ】
2019534316.tif 000051
【図５Ａ】
2019534316.tif 000052
【図５Ｂ】
2019534316.tif 000053
【図５Ｃ】
2019534316.tif 000054
【図５Ｄ】
2019534316.tif 000055
【図５Ｅ】
2019534316.tif 000056
【図５Ｆ】
2019534316.tif 000057
【図５Ｇ】
2019534316.tif 000058
【図５Ｈ】
2019534316.tif 000059
【図５Ｉ】
2019534316.tif 000060
【図５Ｊ】
2019534316.tif 000061
【図５Ｋ】
2019534316.tif 000062
【図５Ｌ】
2019534316.tif 000063
【図５Ｍ】
2019534316.tif 000064
【図５Ｎ】
2019534316.tif 000065
【図５Ｏ】
2019534316.tif 000066
【図５Ｐ】
2019534316.tif 000067
【図６Ａ】
2019534316.tif 000068
【図６Ｂ】
2019534316.tif 000069
【図６Ｃ】
2019534316.tif 000070
【図６Ｄ】
2019534316.tif 000071
【図６Ｅ】
2019534316.tif 000072
【図６Ｆ】
2019534316.tif 000073
【図６Ｇ】
2019534316.tif 000074
【図６Ｈ】
2019534316.tif 000075
【図６Ｉ】
2019534316.tif 000076
【図６Ｊ】
2019534316.tif 000077
【図６Ｋ】
2019534316.tif 000078
【図６ＬＭ】
2019534316.tif 000079
【図６Ｎ】
2019534316.tif 000080
【図６Ｏ】
2019534316.tif 000081
【図７Ａ−１】
2019534316.tif 000082
【図７Ａ−２】
2019534316.tif 000083
【図７Ｂ】
2019534316.tif 000084
【図７Ｃ】
2019534316.tif 000085
【図７Ｄ】
2019534316.tif 000086
【図８】
2019534316.tif 000087
【図９Ａ】
2019534316.tif 000088
【図９Ｂ】
2019534316.tif 000089
【図９Ｃ】
2019534316.tif 000090
【図９Ｄ】
2019534316.tif 000091
【図１０Ａ】
2019534316.tif 000092
【図１０Ｂ】
2019534316.tif 000093
【図１０Ｃ】
2019534316.tif 000094
【図１０Ｄ】
2019534316.tif 000095
【図１１Ａ】
2019534316.tif 000096
【図１１Ｂ】
2019534316.tif 000097
【図１１Ｃ】
2019534316.tif 000098
【図１１Ｄ】
2019534316.tif 000099
【図１１Ｅ】
2019534316.tif 000100
【図１１Ｆ】
2019534316.tif 000101
【図１１Ｇ】
2019534316.tif 000102
【図１２Ａ】
2019534316.tif 000103
【図１２Ｂ】
2019534316.tif 000104
【図１２Ｃ】
2019534316.tif 000105
【図１２Ｄ】
2019534316.tif 000106
【図１２Ｅ】
2019534316.tif 000107
【図１３Ａ】
2019534316.tif 000108
【図１３Ｂ】
2019534316.tif 000109
【図１３Ｃ】
2019534316.tif 000110
【図１３Ｄ】
2019534316.tif 000111
【図１４Ａ】
2019534316.tif 000112
【図１４Ｂ】
2019534316.tif 000113
【図１５−１】
2019534316.tif 000114
【図１５−２】
2019534316.tif 000115
【図１５−３】
2019534316.tif 000116
【図１６−１】
2019534316.tif 000117
【図１６−２】
2019534316.tif 000118
【図１７−１】
2019534316.tif 000119
【図１７−２】
2019534316.tif 000120
【図１８】
2019534316.tif 000121
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月24日(2019.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の任意の組成物および方法のうちの1つまたは複数と組み合わせることができる。
[本発明1001]
参照に対するMYC、NEDD4-1、またはWWP1の発現増加を検出する段階を含む方法によって選択された対象においてがんを処置する方法であって、NEDD4-1またはWWP1の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1002]
対象においてがんを処置する方法であって、NEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1(WW domain-containing protein-1)の発現または活性を阻害する作用物質の有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
[本発明1003]
新生物細胞中のNEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4)およびWWP1(WW domain-containing protein-1)を阻害する方法であって、該細胞を、NEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質およびWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と接触させる段階を含む、方法。
[本発明1004]
MYC発現が増加している新生物細胞の生存または増殖を阻害する方法であって、MYC発現が増加していると特徴づけられる細胞を、NEDD4-1を阻害する作用物質およびWWP1の発現または活性を阻害する作用物質と接触させる段階を含み、それによって新生物細胞の生存または増殖を阻害する、方法。
[本発明1005]
新生物細胞が哺乳動物細胞である、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
哺乳動物細胞が、マウス細胞、ラット細胞、またはヒト細胞である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
細胞がインビトロまたはインビボに存在する、本発明1005の方法。
[本発明1008]
新生物細胞またはがんが、PTENに変異を含む、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
新生物細胞またはがんが、cMYCを過剰発現している、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1010]
新生物細胞の生存または増殖を減少させる、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1011]
新生物細胞が、前立腺がん、乳がん、または結腸直腸がんに由来する、本発明1003または1004の方法。
[本発明1012]
対象が、前立腺がん、乳がん、または結腸直腸がんを有する、本発明1001または1002の方法。
[本発明1013]
作用物質が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1014]
ポリヌクレオチドが、NEDD4-1またはWWP1の発現を阻害する阻害性核酸分子である、本発明1012の方法。
[本発明1015]
阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
作用物質が、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンおよびインドール-3-カルビノールからなる群より選択される、本発明1013の方法。
[本発明1017]
作用物質が、NEDD4-1/WWP1ヘテロ二量体の形成を阻害する、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1018]
対象のための治療法を選択する方法であって、PTEN、MYC、WWP1、およびNEDD4-1からなる群より選択されるマーカーにおける変化を検出する段階を含み、該変化の検出により、該対象が、WWP1および／またはMEDD4-1の発現または活性を阻害する作用物質で処置されるべきことが示される、方法。
[本発明1019]
PTENにおける変化が、PTENの発現または活性を減少させる変異である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
MYCにおける変化が、MYCの増幅または過剰発現をもたらす、本発明1018の方法。
[本発明1021]
WWP1およびNEDD4-1における変化が、WWP1またはNEDD4-1の過剰発現をもたらす、本発明1018の方法。
[本発明1022]
MYC、NEDD4-1、およびWWP1の過剰発現が検出される、本発明1018の方法。
[本発明1023]
作用物質が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子である、本発明1018の方法。
[本発明1024]
ポリヌクレオチドが、NEDD4-1またはWWP1の発現を阻害する阻害性核酸分子である、本発明1018の方法。
[本発明1025]
阻害性核酸分子が、アンチセンス分子、siRNA、またはshRNAである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
作用物質が、4-(4-クロロベンゾイル)ピペラジン-1-イル)(4-(フォノキシメチル)フェニル)メタノンおよびインドール-3-カルビノールからなる群より選択される、本発明1018の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
ChIPアッセイ
37%ホルムアルデヒドを最終濃度1%のホルムアルデヒドになるように添加して、DU145細胞を固定し、室温で10分間インキュベートした。グリシンを最終濃度0.125 Mになるように添加して、架橋を停止させた。次いで細胞を剥離し、製造業者のプロトコルに従ってSimpleChIP酵素クロマチンIPキット（Cell Signaling、#9003）を用いて試料を調製した。クロマチン画分を、各場合において、以下：MYC（Cell Signaling、#13987）、ヒトRPL30または正常ウサギIgG（両者ともCell Signalingキット、Cell Signalingによって提供されたもの）のうちの1つに対する抗体10 mg、および磁気プロテインGビーズと共に、4℃で一晩インキュベートした。広範な洗浄および最終溶出の後、生成物を65℃で一晩処理して、架橋を逆転させた。インプットDNAおよび免疫沈降されたDNAをキットカラムを用いて精製し、以下のプライマーセット（近位および遠位プロモーター領域の両方）：
2019534316.tif 000122
と共にSYBRグリーンスーパーミックス(Bio-Rad)を用いてqPCRによって解析した。結果はすべて、各インプット値に対して正規化した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
CRISPR/Cas9遺伝子編集アプローチ
MEFにおいてWWP1を標的指向するlenti-CRISPR/Cas9ベクターの構築は、骨格ベクター（Addgene、#52961）に付随するプロトコルに従って行った。ソフトウェア (http://crispr.mit.edu/)により、標的遺伝子の前方コードエキソンと一致する配列を優先して、以下の配列が予測された。配列の太字でない部分は、遺伝子特異的である。
2019534316.tif 000123
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
qPCR解析
Power SYBRグリーンPCRマスターキット(Applied Biosystems)を用いて、定量的リアルタイムPCRを行った。ABI 7500 FastリアルタイムPCRシステムで増幅を行い、アクチンを内部対照として使用した。使用したPCRプライマーは、以下のものであった。
2019534316.tif 000124
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019534316000001.app
【国際調査報告】
2019534316.tif 000125
2019534316.tif 000126