(57)【要約】本発明は、新規のバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種、および、当該細菌を使用して乳酸またはその塩を製造するための方法に関する。当該新規の細菌種は、高い光学純度で、オリゴ糖、二糖、および単糖を含む炭水化物炭素源から、Ｌ−乳酸またはその塩を製造することができる。当該細菌は、好気的条件下でよく生育することができ、４５〜６０℃の範囲における高温耐性を有し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物寄託センターに寄託している、分離したバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種（NITE：BP-01943）であって、
Ｌ−乳酸またはその塩を製造する、バチルス エアロラクティカスＢＣ−００１種。
【請求項２】
Ｌ−乳酸またはその塩を製造するための方法であって、以下の工程を含む：
（１）種培養を得るための、請求項１に記載のバチルス エアロラクティカス種の培養工程、および、
（２）炭素源での、上記工程（１）から得た種培養の発酵工程。
【請求項３】
上記培養工程（１）を２〜１０時間行う、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項４】
上記培養工程（１）を３〜５時間行う、請求項３に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項５】
上記培養工程（１）を５時間行う、請求項４に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項６】
上記培養工程におけるバチルス エアロラクティカス種の濃度は、０．５〜５体積％の範囲である、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項７】
上記培養工程におけるバチルス エアロラクティカス種の濃度は、０．５〜２体積％の範囲である、請求項６に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項８】
上記培養工程におけるバチルス エアロラクティカス種の濃度は、１体積％の範囲である、請求項７に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項９】
上記工程（２）における種培養の発酵は、温度４５〜６０℃の範囲にて行う、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１０】
上記工程（２）における種培養の発酵は、温度５０℃にて行う、請求項９に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１１】
上記工程（２）における種培養の発酵は、微好気的条件下にて行う、請求項２，９または１０の何れか１項に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１２】
上記炭素源は、発酵性糖、デンプン、またはそれらの混合物から選択される、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１３】
上記発酵性糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物から選択される単糖である、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１４】
上記発酵性糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、セルビオース、またはそれらの混合物から選択される二糖である、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１５】
上記発酵性糖は、ラフィノース、イソマルトトリオース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、ケストース、またはそれらの混合物から選択される三糖である、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１６】
上記発酵性糖は、グルコース、スクロース、またはそれらの混合物から選択される、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１７】
上記デンプンは、アミラーゼ酵素と接触したタピオカデンプン、コーンデンプン、コムギデンプン、またはポテトデンプンから選ばれる液化デンプンである、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１８】
上記種培養の発酵における上記炭素源の濃度は、５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である、請求項２，１２〜１７の何れか１項に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１９】
上記工程（２）における種培養の発酵は、種培養の発酵中に、グルコアミラーゼ酵素を添加する工程をさらに含む、請求項２，９〜１２，１４〜１８の何れか１項に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項２０】
上記Ｌ−乳酸またはその塩は、光学純度９５％以上である、請求項２〜１９の何れか１項に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項２１】
Ｌ−乳酸またはその塩は、光学純度９９％以上である、請求項２０に記載のＬ−乳酸又はその塩を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の要約］
本発明は、新規なバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種、および、当該細菌を使用して乳酸またはその塩を製造するための方法に関する。ここで、当該新規の細菌は、ＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ：NITE Patent Microorganisms Depositary、日本、アクセッションナンバー：NITE BP-01943）に寄託している。上記バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）は、種々の炭素源から、Ｌ−乳酸またはその塩を製造することができる。
【０００２】
上記細菌は、好気的条件下において生育がよく、４５℃以上の高温に対して耐性を有し、さらに、Ｌ−乳酸またはその塩を高い光学純度で製造することができる。
【０００３】
その上、本発明は、Ｌ−乳酸またはその塩を製造するための方法と関連しており、以下の工程を含む：
（１）種培養を得るための、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種の培養工程、および、
（２）炭素源での、工程（１）から得た種培養の発酵工程。
【０００４】
［本発明の技術分野］
乳酸を製造することができる細菌に係るバイオテクノロジーに関する。
【０００５】
［本発明の背景］
乳酸がプラスチック、食品、製薬、および化粧品産業において広く用いられていることは、よく知られている。
【０００６】
乳酸は、その極性特性によって、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、およびラセミ乳酸の３つの異性体に分類される化学分子である。プラスチック産業において、Ｌ−乳酸は、例えば、ポリ乳酸またはポリ（乳酸−コ−グリコール酸）等のポリエステルの製造において、広く使用されている。乳酸から製造されるポリマーは、生分解性および生体適合性という利点を有している。上記ポリマーは、織物の繊維、フィルム、梱包材、ガット、および医学における足場等の多くの用途に用いることができる。
【０００７】
現在、化学合成およびバイオテクノロジー等の、乳酸のいくつかの製造プロセスが存在する。バイオテクノロジーのプロセスは、タピオカ、トウモロコシ、小麦、またはサトウキビ等の、微生物による発酵によって再生可能な資源の利用を含む、いくつかの利点を有する。その上、微生物による発酵は、乳酸を高い光学純度で製造することができる。
【０００８】
工業的な乳酸製造の大部分は、グルコース、スクロース、マルトース等の糖、またはデンプンもしくはセルロース等の他の炭水化物の発酵であり、乳酸を製造することができる微生物は、細菌および糸状菌である。
【０００９】
Lactobacillus（ラクトバチルス）、Leuconostoc（ロイコノストック）、およびStreptococcus（ストレプトコッカス）属の細菌は、嫌気的条件下において、糸状菌よりも低エネルギー消費で高い力価の製品につながる、糖から乳酸を製造することがよく知られている。しかしながら、上記属の細菌は、特殊栄養要求性の（fastidious）細菌であり、ビタミンおよび必須アミノ酸を成長に必要とする。その上、上記属の細菌は、発酵に先立つ前処理工程の必要につながる、デンプンを糖へと変換する酵素を製造することができず、製造コストを増加させる。
【００１０】
Persson et al., (Biotechnol. Bioeng., 2001, 72, 269-277)、およびSoccol et al., (Biochem. Eng. J., 2003, 13, 205-218) は、乳酸製造プロセスにおけるLactobacilli（ラクトバシリ）細菌の使用に関して記載されている。しかしながら、当該細菌は、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸の混合物を生産するので、ポリ乳酸製造に使用するのに先立って異性体を分離する追加の精製プロセスが必要であり、このことが制限となっている。Min Young Jung et al., (IJSEM, 2009, 59, 2226-2231) は、乳酸を製造することができる新規なバチルス（Bacillus）種の種名を、バチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）として報告している。しかしながら、当該文献には、バチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）がデンプン等のいくつかの炭素源からは乳酸を製造することができないことが開示されており、製造された乳酸の光学純度は明確に記載されていない。現在までに、当該バチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）による乳酸製造の収率は、未だ研究されておらず、報告されていない。
【００１１】
乳酸からのポリマー製造の問題の一つは、製造コストが高いことである。製造コストが低価格である乳酸製造工程の発展、収率の増加、および異性体製造の高い光学純度を提供することが必要である。従って、高速度で生育および増殖する能力を有し、乳酸製造において、原材料として低コストである炭素源を利用することができる微生物である、頑健な（robust）微生物を研究し発展させるためにいくつかの試みがなされている。
【００１２】
乳酸製造コストを削減するための一つの試みは、発酵において、高価な単糖よりも、植物バイオマス、農業残渣、および産業廃棄物から精製された複合炭素源を使用することである。しかしながら、天然に見出される乳酸細菌の殆どは、複合炭素源を消化し利用することができない。従って、乳酸発酵に先立つ前処理工程が必要である。それら炭素源の物理的、化学的、および栄養学的特性に基づいて、機械処理、加熱処理、化学処理、または酵素処理を含む、いくつかの前処理を用いることができる。当該前処理工程は、通常、略５０〜略６０℃の範囲における高温において実施される。通常、細菌は当該温度において生育することができず、それゆえ、発酵に先立って、温度を室温にまで下げる追加工程が必要であり、結果として、製造工程が複雑になり、製造コストが増加する。
【００１３】
上述した理由から、高温に対して耐性を有し、高い光学純度を伴う高い乳酸収率で供給し、さらに、種々の炭素源を利用することができる微生物が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図２】バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１の系統樹を示す。横の実線は、最も類似する同類の株であるバチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）ＳＬ２１３Ｔ株（IJSEM, 2009, 59, 2226-2231から）と比較した、ＢＣ−００１の系統学的な違いを示す。
【図３】３時間、温度５０℃、振盪スピード２５０ｒｐｍにて培養して得られた、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１のＳＥＭでの顕微鏡写真を示す。
【図４】ＢＣ−００１の種々の初期濃度、および異なる培養時間における、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１の光学密度を示す。
【００１５】
［本発明の詳細な説明］
〔定義〕
本願において用いられる技術的用語または科学的用語は、別に言及しない限り、当業者によって理解される定義を有する。
【００１６】
本願で述べる装置、器具、方法、または化合物も、本発明において特に用いられる装置、器具、方法、または化合物であると別に解説し言及しない限り、当業者によって一般的に操作され、または用いられる装置、器具、方法、または化合物を意味する。
【００１７】
請求項または明細書における「含む」と共に使用される単数名詞または単数代名詞の使用は、「一つ」、また「一つ以上」、「少なくとも一つ」、および「一つまたは一つより多く」を意味する。
【００１８】
本願全体を通じて、用語「略」は、本願において示すいずれの値も、変わる、または逸脱する可能性があることを示す。そのような変更または逸脱は、装置、計算で使用する方法、または装置もしくは方法を実施する個々の操作員の誤りによる。物理的性質の変化によってこれらの変更または逸脱が引き起こされることを包含する。
【００１９】
「デンプン」は、精製したデンプン、生デンプン、液化デンプン、または、デンプンまたは液化デンプンを含むいかなる材料をも意味する。本発明におけるデンプンの例は、これらに限定されないが、タピオカデンプン、コーンデンプン、コムギデンプン、またはポテトデンプンを含む。
【００２０】
「液化デンプン」は、液化工程から得られたデンプンを意味する。当該工程は、これらに限定されないが、加熱、減圧下での加熱、化学処理、および酵素処理等の、物理的方法、および／または、化学的方法によりデンプン構造が崩壊することを含む。
【００２１】
「微好気的条件」は、発酵中または微生物の生育中に更なる空気を加えないという制限において、空気が制御されている条件を意味する。
【００２２】
以下、発明の実施形態を、本発明の範囲を限定することを目的とせずに示す。
【００２３】
本発明は、種々の炭素源から乳酸を製造することができる、新規な耐熱性のバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種、および、当該細菌を用いてＬ−乳酸を製造するための方法に関する。
【００２４】
本発明のバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、好気的条件下においてよく生育することができ、４５℃以上の高温に対して耐性を有し、さらに、Ｌ−乳酸またはその塩を高い光学純度で製造することができる。
【００２５】
本発明のバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、ブダペスト条約のもと、ＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ：NITE Patent Microorganisms Depositary、日本）に寄託している。ＮＰＭＤにより与えられたアクセッションナンバーは、NITE BP-01943である。
【００２６】
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、図１に示した１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列から、グラム陽性細菌である。
【００２７】
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、図３に示した形態を有する。
【００２８】
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、タイのロッブリーでタマリンドの葉および樹皮から分離した。
【００２９】
一実施形態において、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、好気的条件下においてよく生育することができ、４５〜６０℃付近の範囲における温度に対して耐性を有している。好ましくは、当該バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、当該好気的条件下においてよく生育することができ、５０℃付近の温度に対して耐性を有している。
【００３０】
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、９５％以上の高い光学純度、好ましくは９９％以上の高い光学純度で、Ｌ−乳酸およびその塩を製造することができる。
【００３１】
他の実施形態において、本発明は、上述したバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）を使用してＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法に関する。
【００３２】
Ｌ−乳酸またはその塩を製造するための方法は、以下の工程を含む：
（１）種培養を得るための、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種の培養工程、および、
（２）炭素源での、上記工程（１）から得た種培養の発酵工程。
【００３３】
一実施形態において、上記工程（１）における培養は略２〜１０時間行ってもよく、好ましくは略３〜５時間であり、そして最も好ましくは略５時間である。
【００３４】
一実施形態において、培養工程における上述したバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）種の濃度は、略０．５〜５体積％であり、好ましくは略０．５〜２体積％であり、最も好ましくは略１体積％である。
【００３５】
一実施形態において、上記工程（２）における種培養の発酵は、略４５〜６０℃の温度範囲で行われてもよく、好ましくは略５０℃の温度である。
【００３６】
一実施形態において、上記工程（２）における種培養の発酵は、微好気的条件下にて行われてもよい。
【００３７】
上記発酵のための炭素源は、これらに限定されないが、発酵性糖、デンプン、液化デンプン、またはそれらの混合物から選択されてもよい。
【００３８】
発酵性糖は、天然で検出することができるあらゆる糖、または、糖を含む物質から生成されるあらゆる糖である。当該糖は、修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。
【００３９】
一実施形態において、上記発酵性糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物から選択され得る単糖である。
【００４０】
一実施形態において、上記発酵性糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、セルビオース、またはそれらの混合物から選択され得る二糖である。
【００４１】
一実施形態において、上記発酵性糖は、ラフィノース、イソマルトトリオース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、ケストース、またはそれらの混合物から選択され得る三糖である。
【００４２】
好ましくは、上記発酵性糖は、グルコース、スクロース、またはそれらの混合物から選択される。
【００４３】
一実施形態において、デンプンは、タピオカデンプン、コーンデンプン、コムギデンプン、ポテトデンプン、またはそれらの混合物から選ばれる。
【００４４】
上記液化デンプンは、アミラーゼ酵素と接触したデンプンである。
【００４５】
さらに好ましくは、上記種培養の発酵における炭素源の濃度は、略５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である。
【００４６】
一実施形態において、上記工程（２）における種培養の発酵は、種培養の発酵中に、グルコアミラーゼ酵素を添加する工程をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
以下は、本発明に係る特性試験であり、ここで、当該試験に使用される方法および装置は、一般的に用いられており、さらに、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【００４８】
グルコース、乳酸、および副生成物は、４５℃付近の温度において、Biorad, Aminex HPX-87Hイオン排除有機酸３００ｍｍ×７．８ｍｍカラムを装備したShimadzu、および標準シグナルと比較したシグナルを検出するための反射指数検出器であるShimadzu-RID-10Aを用いた、高速液体クロマトグラフィーによって分析した。
【００４９】
Ｌ−乳酸の光学純度は、４０℃の温度において、キラルカラム Sumipack Sumichiral  OA5000によって分析した。硫酸銅（ＣｕＳＯ４）は、略１ｍｌ／分の流速で溶離剤として使用した。当該シグナルは、ＵＶ検出機を用いて２５４ｎｍの波長で検出した。
【００５０】
培養中または発酵中のＢＣ−００１の光学密度（ＯＤ：optical density）は、６００ｎｍの波長で分光光度法（Spectrophotometry）によって分析した。
【００５１】
収率は、発酵中に用いた炭素源の量に対する生成された乳酸の量の比率から算出した。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定せず、本発明の説明をするために提示する。
【００５３】
〔本発明に係る細菌の分離および特徴〕
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、タイのロッブリーでタマリンドの葉および樹皮から分離した。土壌サンプルを、１０〜１５ｇ／Ｌ付近の濃度のグルコースを含む、微生物を分離するための培地で満たした試験管に添加した。分離は、５０℃付近の温度にて行った。培地を酸性にした、または透明なゾーンを生じさせたコロニーを採取した。その後、好気的条件下において生育することができるコロニーを選抜するために、得られたコロニーのカタラーゼ試験を実施した。当該方法の後、乳酸を製造することができ、好気的条件下で生育することができ、さらに高温耐性を有する、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１を他の細菌の株から分離した。
【００５４】
上記方法により分離したバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１の、１６ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列、系統樹、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによる細菌種の同定、および形態に関して、次に分析した。その結果を、図１，２、表１、および図３にそれぞれ示す。
【００５５】
図２の系統樹は、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１が、バチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）ＳＬ２１３Ｔ株と最も近接していることを示している。図１のＢＣ−００１の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ＳＬ２１３Ｔ株と９８．８５％相似していることを示している。従って、ＢＣ−００１の種を同定するために、ＢＣ−００１のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションをさらに行った。ここで、ＢＣ−００１と、バチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）１３０７８型株とをＤＮＡプローブとして使用し、そして、バチルス コアギュランス（Bacillus coagulans）６３２６型株をネガティブコントロールとして使用した。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションの結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
2019514364.tif 000002
【００５７】
表１より、バチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）１３０７８、およびバチルス コアギュランス（Bacillus coagulans）６３２６にＢＣ−００１をＤＮＡプローブとして使用した場合、並びに、ＢＣ−００１にバチルス アシディプロデュセンス（Bacillus acidiproducens）１３０７８をＤＮＡプローブとして使用した場合、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（％）は、７０％以下である。従って、その結果、ＢＣ−００１は、明らかにバチルス属（Bacillus genus）に属することを示唆し、そして、ＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ：NITE Patent Microorganisms Depositary、日本、アクセッションナンバー：NITE BP-01943）に、学名バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）として寄託した。
【００５８】
〔培養工程におけるＢＣ−００１の濃度〕
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１を、１Ｌ当たり以下の組成を含む培養培地に添加した：略１０ｇのグルコース、略１５ｇの酵母エキス、略４ｇの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、略５ｇの水酸化カルシウム、および略２０ｍｌの食塩水。０．５体積％、１体積％、および２体積％を含む種々の濃度のＢＣ−００１を検討した。その後、上記混合液を、温度略５０℃にて２５０ｒｐｍ付近で振盪した。ＢＣ−００１の光学密度（ＯＤ）を異なる時間において分析した。その結果を図４に示す。
【００５９】
〔培養工程および発酵工程における種々の条件の検討〕
培養期間の結果、およびＢＣ−００１が乳酸を製造する能力における発酵中のエアレーション条件の結果を検討するために、表１に示した種々の条件を、乳酸製造のために検討した。
【００６０】
乳酸の製造は、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１を、１Ｌ当たり以下の組成を含む培養培地に、略１体積％の濃度で添加することにより行った：略１０ｇのグルコース、略１５ｇの酵母エキス、略４ｇの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、略５ｇの水酸化カルシウム、および略２０ｍｌの食塩水。その後、上記混合液を、温度略５０℃にて２５０ｒｐｍ付近で、種培養を得るために振盪した。そして、略２５ｍｌの当該種培養を、炭酸カルシウム（Ｃａ（ＣＯ）３）を用いてｐＨを略６．５〜６．８に制御した、２００ｇ／Ｌグルコース溶液２５ｍｌで満たしたフラスコに添加した。その後、種培養を得るための発酵は、種々のエアレーションおよび振盪条件にて、２４時間、温度略５０℃で行った。発酵の終わりに、生産物を略１０,０００ｒｐｍで略５分間、遠心分離した。得られた生産物における、細菌の光学密度および製造された乳酸の量を分析した。その結果を表２に示す。
【００６１】
表２より、培養期間の延長、発酵中の振盪スピード、および発酵中の微好気条件は、結果として、細菌の光学密度、乳酸の最終濃度、および乳酸の生産性を増大させることが分かった。従って、当該結果より、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）の発酵中における微好気条件および振盪は、乳酸製造の効率を高め得る、と要約することができる。
【００６２】
【表２】
2019514364.tif 000003
【００６３】
〔種々の炭素源からのＢＣ−００１の乳酸製造能力〕
バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、種々の炭素源から乳酸を製造することが可能であることを実証するために、ＢＣ−００１の乳酸製造において、グルコース、スクロース、および液化タピオカデンプンを含む炭素源を使用した。これら炭素源は、上述した炭素源を説明するために選択した実施例とすることを意図し、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
乳酸の製造は、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１を、１Ｌ当たり以下の組成を含む培養培地に、略１体積％の濃度で添加することにより行った：略１０ｇのグルコース、略１５ｇの酵母エキス、略４ｇの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、略５ｇの水酸化カルシウム、および、略２０ｍｌの食塩水。上記混合液を、温度略５０℃にて２５０ｒｐｍ付近で、種培養を得るために５時間振盪した。そして、当該種培養の２５ｍｌを、以下の炭素源で満たしたフラスコに添加した。
【００６５】
〔実施例１〕
炭素源は、炭酸カルシウム（Ｃａ（ＣＯ）３）を用いてｐＨを略６．５〜６．８の範囲に制御した、濃度２４０ｇ／Ｌのグルコース溶液２５ｍｌである。その後、種培養を得るための発酵を、微好気条件下にて、２５０ｒｐｍ付近の振盪スピードで、略４８時間、略５０℃で行った。
【００６６】
〔実施例２〕
炭素源は、炭酸カルシウム（Ｃａ（ＣＯ）３）を用いてｐＨを略６．５〜６．８の範囲に制御した、初期濃度２００ｇ／Ｌのグルコース溶液２５ｍｌである。その後、種培養を得るための発酵を、微好気条件下にて、２５０ｒｐｍ付近の振盪スピードで、略２４時間、略５０℃で行った。そして、濃度を１５０ｇ／Ｌに調整するために、当該グルコース溶液を添加した。発酵を、さらに略２４時間行った。
【００６７】
〔実施例３〕
炭素源は、炭酸カルシウム（Ｃａ（ＣＯ）３）を用いてｐＨを略６．５〜６．８の範囲に制御した、濃度３００ｇ／Ｌのスクロース溶液２５ｍｌである。その後、種培養を得るための発酵を、微好気条件下にて、２５０ｒｐｍ付近の振盪スピードで、略４８時間、略５０℃で行った。
【００６８】
〔実施例４〕
炭素源は、炭酸カルシウム（Ｃａ（ＣＯ）３）を用いてｐＨを略６．５〜６．８の範囲に制御した、濃度３００ｇ／Ｌの液化タピオカデンプン２５ｍｌである。その後、種培養を得るための発酵を、微好気条件下にて、２５０ｒｐｍ付近の振盪スピードで、略４８時間、略５０℃で行った。
【００６９】
当該液化タピオカデンプンは、アルファ−アミラーゼ酵素をタピオカデンプン溶液に、ｐＨを５．８付近に制御しながら、温度１００℃付近で略１．５時間かけて添加することによって得た。
【００７０】
〔実施例５〕
炭素源は、実施例４で説明した方法によって得られたタピオカデンプン２５ｍｌである。炭酸カルシウム（Ｃａ（ＣＯ）３）を用いてｐＨを略６．５〜６．８の範囲に制御した。その後、種培養を得るための発酵を、微好気条件下にて、２５０ｒｐｍ付近の振盪スピードで、略４８時間、略５０℃で行った。濃度３７ｇ／Ｌのグルコアミラーゼ酵素２００μＬを発酵中、２時間後および２４時間後に添加した。
【００７１】
発酵の終わりに、生産物を１０,０００ｒｐｍで略５分間、遠心分離した。得られた生産物における、残りのグルコース、製造された乳酸の量、および乳酸の光学純度を分析した。その結果を表３に示す。
【００７２】
表３から明らかなように、バチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１は、単糖、二糖、および液化デンプンを含む種々の炭素源から乳酸を製造することができ、９９％以上の高い光学純度および乳酸の高い生産性でＬ−乳酸を提供することができる。発酵中にグルコアミラーゼ酵素を添加した液化タピオカデンプンは、乳酸の最も高い生産性をもたらす。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
〔本発明の最良の形態〕
本発明の最良の形態は、詳細な説明中に開示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月21日(2017.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物寄託センターに寄託している、分離したバチルス エアロラクティカス（Bacillus aerolacticus）ＢＣ−００１種（NITE：BP-01943）であって、
Ｌ−乳酸またはその塩を製造する、バチルス エアロラクティカスＢＣ−００１種。
【請求項２】
Ｌ−乳酸またはその塩を製造するための方法であって、以下の工程を含む：
（１）種培養を得るための、請求項１に記載のバチルス エアロラクティカス種の培養工程、および、
（２）炭素源での、上記工程（１）から得た種培養の発酵工程。
【請求項３】
上記培養工程（１）を２〜１０時間行う、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項４】
上記培養工程（１）を３〜５時間行う、請求項３に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項５】
上記培養工程（１）を５時間行う、請求項４に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項６】
上記培養工程におけるバチルス エアロラクティカス種の濃度は、０．５〜５体積％の範囲である、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項７】
上記培養工程におけるバチルス エアロラクティカス種の濃度は、０．５〜２体積％の範囲である、請求項６に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項８】
上記培養工程におけるバチルス エアロラクティカス種の濃度は、１体積％の範囲である、請求項７に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項９】
上記工程（２）における種培養の発酵は、温度４５〜６０℃の範囲にて行う、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１０】
上記工程（２）における種培養の発酵は、温度５０℃にて行う、請求項９に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１１】
上記工程（２）における種培養の発酵は、微好気的条件下にて行う、請求項２，９または１０の何れか１項に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１２】
上記炭素源は、発酵性糖、デンプン、またはそれらの混合物から選択される、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１３】
上記発酵性糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、またはそれらの混合物から選択される単糖である、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１４】
上記発酵性糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、セルビオース、またはそれらの混合物から選択される二糖である、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１５】
上記発酵性糖は、ラフィノース、イソマルトトリオース、マルトトリオース、ニゲロトリオース、ケストース、またはそれらの混合物から選択される三糖である、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１６】
上記発酵性糖は、グルコース、スクロース、またはそれらの混合物から選択される、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１７】
上記デンプンは、アミラーゼ酵素と接触したタピオカデンプン、コーンデンプン、コムギデンプン、またはポテトデンプンから選ばれる液化デンプンである、請求項１２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１８】
上記種培養の発酵における上記炭素源の濃度は、５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である、請求項２，１２〜１７の何れか１項に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項１９】
上記工程（２）における種培養の発酵は、種培養の発酵中に、グルコアミラーゼ酵素を添加する工程をさらに含む、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項２０】
上記Ｌ−乳酸またはその塩は、光学純度９５％以上である、請求項２に記載のＬ−乳酸またはその塩を製造するための方法。
【請求項２１】
Ｌ−乳酸またはその塩は、光学純度９９％以上である、請求項２０に記載のＬ−乳酸又はその塩を製造するための方法。
【国際調査報告】
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