(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を持つ、抗体またはその抗原結合断片、当該抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、ならびに治療のための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む重鎖可変領域を持つ、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
上記抗体またはその抗原結合断片が、
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖可変領域を持つ、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
上記重鎖可変領域は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
上記軽鎖可変領域が、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
上記重鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
上記軽鎖可変領域が、配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
上記重鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
上記軽鎖可変領域が、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
上記重鎖が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
上記軽鎖が、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
上記抗体またはその抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体またはＢｉＴＥからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片が、一部分に結合した免疫複合体。
【請求項１３】
上記部分が治療部分である、請求項１２に記載の免疫複合体。
【請求項１４】
上記治療部分が、細胞毒性剤、アポトーシス促進剤、放射性同位体、および免疫毒素からなる群から選択される、請求項１３に記載の免疫複合体。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫複合体を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を発現する、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項１５に記載の薬学的組成物を有効量投与することを含む、ＣＤ３００ｆ発現に関連する状態を治療する方法。
【請求項２０】
上記状態がＡＭＬである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ブダペスト条約の下、セルバンクオーストラリアに寄託され、アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９に指定されている、ハイブリドーマ。
【請求項２２】
請求項２１に記載のハイブリドーマによって産生される、モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＣＤ３００ｆポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、および治療におけるその抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＭＬのような骨髄性白血病は、血液細胞の骨髄系の癌である。ＡＭＬは、骨髄に蓄積して正常な血液細胞の産生を妨害する異常な白血球が、急速に増加することを特徴とする。ＡＭＬは、成体に影響を及ぼす最も一般的な急性白血病であり、ＡＭＬの発生率は年齢とともに増加する。結果として、ＡＭＬは、人口が高齢化するにつれて発生率が増加すると予想される。
【０００３】
ＡＭＬのような骨髄性白血病の病因の理解における大きな進歩にもかかわらず、患者の転帰は依然として満足するものではない。ＡＭＬの主な治療は化学療法である。若年患者のかなりの割合は、同種骨髄移植を伴うまたは伴わない集中化学療法で治癒し得る。しかし、これらの治療法は、ＡＭＬと診断される患者の大部分を構成する高齢患者には適していない。抗体療法もまた、ＡＭＬの治療のために試験されている。この点に関して、ＣＤ３３免疫複合体ゲムツズマブ・オゾガミシン（ＧＯ）が試験されたが、第ＩＩＩ相試験における期待はずれの結果に続いて２０１０年に中止された。しかし、後に続く研究は、併用療法において、ＧＯが数人の患者に対して、全体的な生存状況を改善したことを示した（Gamis AS, et al. J Clin Oncol. 2014;32(27):3021-32.; Hills RK, et al. The Lancet Oncology. 2014;15(9):986-96）。
【０００４】
骨髄細胞系およびいくつかのＡＭＬ試料の様々なプロテオミクスおよびトランスクリプトミクスによって、潜在的標的として同定されている他の標的としては、ＣＤ３３に加えて、ＣＤ１２３、ＣＤ９６、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ３２、ＣＬＬ−１、ＩＲＡＰおよびＴＩＭ−３が挙げられる。これらの分子はすべて、骨髄系統の正常細胞によって多かれ少なかれ発現され、多数が健康な骨髄ＨＳＣ上にも発現され、血液毒性の可能性を高める。
【０００５】
ＡＭＬなどの骨髄性白血病の治療のために、急性骨髄性白血病細胞および／またはその前駆体上の標的に結合する代替分子が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
ＣＤ３００ｆは、染色体１７ｑ２５上の遺伝子複合体によってコードされる免疫調節分子のＣＤ３００ｆファミリーのメンバーである。これは、細胞質領域および細胞外ドメインを有する膜貫通糖タンパクである。細胞質領域は、阻害性ＩＴＩＭおよびＰＩ３Ｋリン酸化部位の両方を含む。ＣＤ３００ｆは、ＡＭＬサンプルにおいてアップレギュレートされる。そのため、ＣＤ３００ｆは、ＡＭＬなどのＣＤ３００ｆの発現に関連する状態の治療のための標的である。
【０００７】
本発明者らは、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、本明細書中でＤＣＲ−２と称されるモノクローナル抗体を産生した。
【０００８】
第１の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む重鎖可変領域を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００９】
第２の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む軽鎖可変領域を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１０】
第３の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、ならびに
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１１】
第４の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変領域
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域
を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１２】
第５の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１３】
第６の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１４】
第７の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ１と同一である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ２と同一である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはモノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ３と同一である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１と同一の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２と同一の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはモノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３と同一の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を持つ、抗体または抗原結合断片を提供する。
【００１５】
第８の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体であって、
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を持つ、抗体または抗原結合断片を提供し、
ここで、上記抗体またはその抗原結合断片は、一部分に結合される。
【００１６】
第９の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合断片であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで、上記抗体またはその抗原結合断片は、一部分に結合される。
【００１７】
第１０の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）下記を含む重鎖可変領域：
（ｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ１と同一である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ２と同一である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはモノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ３と同一である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１と同一の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２と同一の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはモノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３と同一の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を持つ、抗体またはその抗原結合断片を提供し、
ここで上記抗体またはその抗原結合断片は、一部分に結合している。
【００１８】
第１１の態様は、第１〜第６の態様のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片、または第７〜第９の態様の免疫複合体を含む組成物を提供する。
【００１９】
第１２の態様は、
（ａ）下記を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を持つポリペプチドをコードする、核酸を提供する。
【００２０】
第１３の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列および／または配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸配列を提供する。
【００２１】
第１４の態様は、第１〜第７の態様の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸を提供する。
【００２２】
第１５の態様は、第１２〜第１４の態様の核酸を含む、細胞を提供する。
【００２３】
第１６の態様は、第１〜第７の態様の抗体またはその抗原結合断片、第８〜第１０の態様の免疫複合体、第１１の態様の組成物、または第１５の態様の細胞を、対象に、有効量投与することを含む、それらを必要とする上記対象における、ＣＤ３００ｆ発現に関連する状態を治療する方法を提供する。
【００２４】
第１６の代替的な態様は、第１〜第７の態様の抗体またはその抗原結合断片、第８〜第１０の態様の免疫複合体、第１１の態様の組成物、または第１５の態様の細胞、またはＣＤ３００ｆ発現に関連する状態を治療するための医薬の製造における、それらを必要とする対象におけるＣＤ３００ｆ発現に関連する状態を治療するための医薬の製造における、第１〜第７の態様の抗体またはその抗原結合断片、第８〜第１０の態様の免疫複合体、第１１の態様の組成物、または第１５の態様の細胞の使用を提供する。
【００２５】
第１７の態様は、第１〜第７の態様の抗体またはその抗原結合断片、第８〜第１０の態様の免疫複合体、第１１の態様の組成物、第１２〜第１４の態様の核酸、または第１５の態様の細胞を含むキットを提供する。
【００２６】
第１８の態様は、２０１６年９月２７日に、ブダペスト条約の下、セルバンクオーストラリアに寄託され、アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９を割り当てられた、ハイブリドーマを提供する。
【００２７】
第１９の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに結合するためにＤＣＲ−２と断面競合する、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２８】
第２０の態様は、第１２〜第１４の態様の核酸を発現する、発現ベクターを提供する。
【００２９】
第２１の態様は、第２０の態様の発現ベクターを含む、細胞を提供する。
【００３０】
第２２の態様は、２０１６年９月２７日に、ブダペスト条約の下、セルバンクオーストラリアに寄託され、アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９を割り当てられたハイブリドーマによって産生される、モノクローナル抗体を提供する。
【００３１】
第２３の態様は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、
（ａ）抗体またはその抗原結合断片の産生を可能にする条件下で、第１５の態様の細胞または第１８の態様のハイブリドーマをインキュベートする工程、および
（ｂ）工程（ａ）において産生される上記抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、ＤＣＲ−２および市販のＣＤ３００ｆ抗体（ＵＰ−Ｄ１、ＵＰ−Ｄ２、２３４９０３、ＣＭＬ−１およびｇＬＭＩＲ３）の特異性を示すグラフである。図１Ａは、フローサイトメトリーによって測定された、ＤＣＲ−２および市販のＣＤ３００ｆ抗体のＣＤ３００ｆトランスフェクトＣＨＯ細胞への結合度の結果を示すヒストグラムである。抗体結合（影なしヒストグラム）を、各抗体の関連アイソタイプ（影付きヒストグラム）と比較した。図１Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＣＤ３００ｆ−Ｉｇ融合タンパク質に対する、ＤＣＲ−２抗体および市販のＣＤ３００ｆ抗体の結合度を示すグラフである。図１Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＣＤ３００ｂ−Ｉｇ融合タンパク質に対する、ＤＣＲ−２抗体および市販のＣＤ３００ｆ抗体の結合度を示すグラフである。
【図２】図２は、骨髄由来細胞株ＨＥＬ、ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１およびＵ９３７に対する、ＤＣＲ−２および市販の抗体（ＵＰ−Ｄ１、ＵＰ−Ｄ２、２３４９０３、ＣＭＬ−１およびｇＬＭＩＲ３）の結合度についての幾何ＭＦＩ比を示すグラフである。ＥＬＩＳＡはｎ＝２で実施され、エラーバーは代表的な結果の重複ウェルからのＳＥＭを表す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、健康な細胞および白血病細胞に対する、ＣＤ３００ｆ抗体の結合度を示すグラフである。図３Ａ〜３Ｃは、（Ａ）マルチパラメータフローサイトメトリーによって評価された、健康なＰＢＭＣ群（Ｂ）ＡＭＬ芽球およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−白血病幹細胞（ＬＳＣ）（ｎ＝５）、ならびに（Ｃ）Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋臍帯血造血幹細胞（ｎ＝３）に対する、ＤＣＲ−２および市販のＣＤ３００ｆ抗体ＵＰ−Ｄ１、ＵＰ−Ｄ２、２３４９０３、ＣＭＬ−１およびｇＬＭＩＲ３結合度の比較である。対象の群の幾何ＭＦＩを、アイソタイプ対照の幾何ＭＦＩで除して、「幾何ＭＦＩ比」を得た。系統抗体（Ｌｉｎ）は、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６およびＣ１４に対するモノクローナル抗体を含む。
【図４】図４は、ｍＡｂＵＰ−Ｄ２を用いて検出された種々の細胞上のＣＤ３００ｆの抗原濃度を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｅは、ＣＤ３００ｆ抗体ＤＣＲ−２、ＵＰ−Ｄ１、ＵＰ−Ｄ２、２３４９０３、ＣＭＬ−１およびｇＬＭＩＲ３を用いた競合試験の結果を示すグラフである。ＣＤ３００ｆトランスフェクトＣＨＯ細胞を、ｘ軸に示されるような、飽和量のＤＣＲ−２または市販のＣＤ３００ｆ抗体と共にインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、試験抗体（Ａ）ＵＰ−Ｄ１（Ｂ）ＵＰ−Ｄ２（Ｃ）２３４９０３（Ｄ）ウサギＣＬＭ−１および（Ｅ）ヤギＬＭＩＲ３で染色した。第２の抗体をブロックする第１の抗体の能力は、結合度パーセンテージとして計算され、結合度０％は完全なブロッキング（エピトープの完全な重複）を示し、結合度１００％はブロッキングされていない（エピトープの重複なし）を示す（ｎ＝３）。
【図６】図６は、ＤＣＲ−２の存在下における、ＣＤ３００ｆ（ＣＨＯ−Ｌ５）を発現するＣＨＯ細胞に対する、ＣＤ３００ｆ抗体の結合度を示すグラフである。
【図７】図７は、ＤＣＲ−２または２４３９０３の存在下における、細胞株ＨＥＬ、ＨＬ−６０およびＴＨＰ−１に対する、ｍＡｂ  ＵＰ−Ｄ２の結合度を示すグラフである。
【図８】図８Ａ〜８Ｅは、ＣＤ３００ｆＬ４およびＣＤ３００ｆＳ４細胞外アイソフォームを発現するトランスフェクタントに対する、ＣＤ３００ｆ抗体の結合度を示すヒストグラム（左側）およびウェスタンブロット（右側）である。フローサイトメトリーによって、アミノ酸配列ＳＴＰＡＰＴＴＰＴＳＴＴＦＴ（ＣＤ３００ｆＬ４）を含むか、またはアミノ酸配列ＳＴＰＡＰＴＴＰＴＳＴＴＦＴ（ＣＤ３００ｆＳ４）を含まないＣＤ３００ｆのアイソフォームを発現するＣＨＯトランスフェクタントに対する結合について、ＤＣＲ−２および市販のＣＤ３００ｆ抗体を試験した。各ＣＤ３００ｆ抗体（オープンヒストグラム）を、適切なアイソタイプ対照（影付きヒストグラム）と比較した。非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）条件下で分離したＣＤ３００ｆＬ４またはＣＤ３００ｆＳ４溶解物中のＣＤ３００ｆタンパク質のウェスタンブロット解析を、ヒストグラムの右側に示す。図８Ｆにおいて、ＣＬＭ−１ペプチド抗体を用いて、ＣＤ３００ｆＳ４トランスフェクタントよりもＣＤ３００ｆＬ４トランスフェクタントにより多くのＣＤ３００ｆタンパク質が発現されたが、ＰＡＧＥゲル上でＣＤ３００ｆＬ４よりも５倍多くのＣＤ３００ｆＳ４溶解物を分離したにもかかわらず、ｇＬＭＩＲ３は、ＣＤ３００ｆＬ４のみに結合することを実証した。同様に、ＤＣＲ−２、２３４９０３およびｇＬＭＩＲ３は、ＣＤ３００ｆＬ４トランスフェクタントからの非還元溶解物にのみ結合することができ、一方、ＵＰ−Ｄ２は、ウエスタンによっていかなるタンパク質にも結合しなかった。アクチン結合をローディング対照として使用した。ＮＲは非還元、Ｎは還元を表す。分子量マーカーは同定されている。
【図９】図９は、ＤＣＲ−２の生体層干渉分析の結果を示す。BLItz System(Fortebio、Pall Life Sciences)を用いて、ＣＤ３００ｆに対する親和性について、ＤＣＲ−２を評価した。ＣＤ３００ｆ−Ｆｃ組換えタンパク質を、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉感知部に固定した。結合および解離について、各ｍＡｂをある５点で連続希釈したものを試験した。BLItz Proソフトウェアを用いて、グローバルフィッティング１：１結合モデルを用いて、速度定数を推定した。Ａは実行条件を示し、Ｂはデータの分析を示す。
【図１０】図１０Ａは、アイソタイプ対照（ＣＭＲＦ−８１）と比較した、ＤＣＲ−２によって生じたＨＬ−６０細胞の抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示すグラフである。図１０Ｂは、抗マウスＡＦ６４７（表面）によって検出された残りの表面Ｉｇと比較して、直接的に標識された抗体（全体）を経時的に監視することによって検出されたＵ９３７およびＨＬ−６０の表面からの、３７℃におけるＵＰ−Ｄ１およびＤＣＲ−２ｍＡｂの内部移行を示すグラフである。三角形はＤＣＲ−２を表し、円はＵＰ−Ｄ１を表す。実線および黒塗り記号は全染色を表し、破線および白抜き記号は表面染色を表す。
【図１１】図１１は、芽球、ＬＳＣおよびＨＳＣを同定するためのゲート解析を示す。（Ａ）最初にＰＩ陰性生存細胞にゲートをかけた後、造血幹細胞を、系統−ＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋として同定した。（Ｂ）芽球を、ＣＤ４５ｄｉｍＳＳＣｌｏｗとして同定した。白血病幹細胞濃縮ＣＤ３４＋ＣＤ３８画分を、当該ゲートから同定した。
【図１２】図１２は、ＤＣＲ−２のマウス重鎖可変領域（Ａ）、およびＤＣＲ−２の予想ヒト化マウス重鎖可変領域（Ｂ）のアミノ酸配列の並びを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３配列は、示されるように破線の枠内に示される。ヒト配列で置換されたマウス配列のアミノ酸は、下線および太字で示される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ＣＤ３００ｆは、ヒト染色体１７ｑ２５上の遺伝子複合体によってコードされる、免疫調節分子のＣＤ３００ファミリーのメンバーである。ＣＤ３００ｆは、阻害性免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）およびホスファチジルイノシチド‐３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）リン酸化部位の両方を含む細胞質領域を有する膜貫通糖タンパクである。このファミリーの他のメンバーと同様に、ＣＤ３００ｆは、単一のＩｇ様細胞外ドメインを有する膜貫通糖タンパクである。
【００３４】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体を単離した。モノクローナル抗体は、本明細書ではＤＣＲ−２と呼ばれる。ＤＣＲ−２を産生するハイブリドーマを、ブダペスト条約の下、セルバンクオーストラリア（CellBank Australia, 214 Hawkesbury Rd, Westmead, NSW 2145, Australia）に、２０１６年９月２７日に寄託し、アクセッション番号をＣＢＡ２０１６００２９に指定した。
【００３５】
本明細書に記載されるように、ＤＣＲ−２は、ＡＭＬおよびＣＤ３４＋ＣＤ３８−白血病幹細胞（ＬＳＣ）によって発現されるＣＤ３００ｆの複数のアイソフォームに結合する。より詳しく言うと、ＤＣＲ−２は、配列ＳＴＰＡＰＴＴＰＴＳＴＴＦＴを含むＣＤ３００ｆのアイソフォーム（ＣＤ３００ｆＬ４）と、配列ＳＴＰＡＰＴＴＰＴＳＴＴＦＴが存在しないＣＤ３００ｆのアイソフォーム（ＣＤ３００ｆＳ４）とに結合する。
【００３６】
また、本明細書に記載されるように、ＤＣＲ−２は、ＣＤ３００ｆを発現する細胞に対する市販のＣＤ３００ｆモノクローナル抗体であるＵＰ−Ｄ２の結合度を増強する。したがって、ＤＣＲ−２は、ＣＤ３００ｆを発現する細胞に対するＵＰ−Ｄ２の結合度および取り込みを増強するために、ＵＰ−Ｄ２と組み合わせて使用され得る。ＤＣＲ−２を用いて、ＣＤ３００ｆを発現する細胞に対するＵＰ−Ｄ２またはＵＰ−Ｄ２免疫複合体の結合を増強することは、ＡＭＬ細胞および白血病幹細胞などのＣＤ３００ｆを発現する細胞への、治療部分および／または診断部分の輸送を増強し得る。
【００３７】
本明細書にさらに記載されるように、ＤＣＲ−２自体は、ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０において、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す。
【００３８】
したがって、本開示の一態様はＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片（本明細書ではＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片とも称される）に関し、上記抗体またはその抗原結合断片は以下を含む：
（ａ）下記を含む重鎖可変領域：
（ｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ１と同一である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ２と同一である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはモノクローナル抗体ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ３と同一である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１と同一の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２と同一の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはモノクローナル抗体ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３と同一の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。
【００３９】
本発明者らは、ＤＣＲ−２の重鎖可変領域およびＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定した。
【００４０】
【表１】
2019535753.tif 000002
【００４１】
ＤＣＲ−２の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列によって表される：
ＭＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＰＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＧＦＳＧＳＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＱＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＩＮＫＶＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＲＧＦＦＥＧＹＳＡＷＦＡＹＷ（配列番号１）
ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＧＦＧＦＳＧＳＷ（配列番号２）によって表される。
【００４２】
ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＩＮＰＤＳＳＴＩ（配列番号３）によって表される。
【００４３】
ＤＣＲ−２の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＲＲＧＦＦＥＧＹＳＡＷＦＡＹ（配列番号４）によって表される。
【００４４】
ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列によって表される：
ＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＳＬＬＩＹＹＡＳＮＲＮＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＥＴＤＦＴＦＴＩＳＴＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＴＳＰＷＴＦＧＧＧ（配列番号５）。
【００４５】
ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＱＳＶＳＮＤ（配列番号６）によって表される。
【００４６】
ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＹＡＳ（配列番号７）によって表される。
【００４７】
ＤＣＲ−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴ（配列番号８）によって表される。
【００４８】
したがって、本開示の一態様ではＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片に関し、上記抗体またはその抗原結合断片は以下を含む：
（ａ）下記を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ＧＦＳＧＳＷ（配列番号２）を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列ＩＮＰＤＳＳＴＩ（配列番号３）を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはアミノ酸配列ＡＲＲＧＦＦＥＧＹＳＡＷＦＡＹ（配列番号４）を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ＱＳＶＳＮＤ（配列番号６）を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列ＹＡＳ（配列番号７）を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／またはアミノ酸配列ＱＱＤＹＴＳＰＷＴ（配列番号８）を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。
【００４９】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。
【００５０】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列。
【００５１】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。
【００５２】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域。
【００５３】
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列と同一の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。
【００５４】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域が配列番号５で表されるアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５６】
種々の実施形態では、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片は以下を含む：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む計鎖可変領域；
（ｇ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｈ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｉ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｊ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｋ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｌ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｍ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｏ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｐ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｑ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｒ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｓ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｔ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｕ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｖ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｗ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
（ｙ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｚ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ａａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｂｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
（ｃｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｄｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、ならびに配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域、アミノ酸を含むＣＤＲ２  配列番号７によって表される配列、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
【００５７】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００５８】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００５９】
一実施形態では、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６０】
一実施形態では、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６１】
一実施形態では、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６２】
一実施形態では、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６３】
一実施形態では、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６４】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、当業者に公知の任意の配列アルゴリズムを使用して特定し得る。例えば、配列分析プログラムであるＦＡＳＴＡパッケージ（Lipman & Pearson, (1985) Science 227(4693): 1435-1441）およびＢＬＡＳＴ（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215(3):403-410）が挙げられる。
【００６５】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、１０−７Ｍ未満、典型的には、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、９×１０−１０Ｍ未満、８×１０−１０未満、７×１０−１０未満、６×１０−１０未満、５×１０−１０未満、または４×１０−１０Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。
【００６６】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、１×１０−１０〜１×１０−７Ｍ、典型的には、１×１０−１０〜１×１０−７Ｍ、１×１０−１０〜１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−１０〜１×１０−９Ｍ、１×１０−１０〜９×１０−１０Ｍ、１×１０−１０−８ｘ１０−１０Ｍ、または１ｘ１０−１０〜７×１０−１０Ｍ、２×１０−１０〜６×１０−１０または３×１０−１０〜５×１０−１０Ｍの平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。
【００６７】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、約１×１０６Ｍ−１ｓ−１以下のＫＡで、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。種々の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、１×１０５〜５×１０６Ｍ−１ｓ−１、典型的には、１×１０５〜１×１０６Ｍ−１ ｓ−１のＫＡで、ヒトＣＤ３００ｆに結合する。
【００６８】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、５×１０−２ｓ−１以下、典型的には１×１０−２ｓ−１以下、５×１０−３ｓ−１以下、１×１０−３ｓ−１以下、又は５×１０−４ｓ-1以下、４×１０−４ｓ−１以下、３×１０−４ｓ−１以下、または２×１０−４ｓ−１以下の解離速度（off rate）でヒトＣＤ３００ｆに結合する。
【００６９】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、５×１０−２ｓ−１〜１×１０−５ｓ−１、１×１０−２〜５×１０−５ｓ−１、５×１０−３〜５×１０−４ｓ−１、１×１０−３〜５×１０−４ｓ−１、または１×１０−３〜１×１０−１の範囲の解離速度でヒトＣＤ３００ｆに結合する。
【００７０】
別の態様は、２０１６年９月２７日にセルバンクオーストラリア（CellBank Australia,214 Hawkesbury Road、Westmead、NSW 2145、Australia）にブダペスト条約の下で寄託され、アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９に指定されているハイブリドーマを提供する。ブダペスト条約の下に寄託され、アクセッション番号ＣＮＡ２０１６００２９に指定されているハイブリドーマはＤＣＲ−２を発現する。
【００７１】
別の態様は、ブダペスト条約の下に寄託され、アクセッション番号ＣＮＡ２０１６００２９に指定されているハイブリドーマによって産生される抗体を提供する。
【００７２】
抗体は、抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を表す。抗体は、キメラ、ヒト化、脱免疫化、ＣＤＲ移植、同時ヒト化(synhumanised)、二重特異性ヒト化(bi-specific human)を含む、組換え型であってもよく、または修飾されていてもよい。全長抗体は、典型的には、２つの重鎖に共有結合した２つの軽鎖を含む。全長抗体の各重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。全長抗体の各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む。全長抗体は、以下のタイプのいずれかであり得る：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ。一実施形態では、抗体はＩｇＧである。
【００７３】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体の抗原結合ドメインを含み、典型的には、抗体全長として、同じエピトープに特異的に結合する抗体の一部を含む。典型的には、抗体の抗体断片は、抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の一部を含む。典型的には、抗原結合断片が、重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および／または３領域、および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および／または３領域を含む。より典型的には、抗原結合断片が、重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域、および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域を含む。さらに典型的には、抗原結合断片が重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域、ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合断片は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域および軽鎖可変領域の一部は、Ｆｖ断片などの別々のポリペプチド鎖上にあってもよく、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）によって連結されている単一のポリペプチド鎖中にあってもよい。抗体の抗原結合断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどが挙げられ得る。
【００７４】
本明細書で使用される抗体の抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合ドメインを含む１つ以上のポリペプチドを含む。
【００７５】
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に特異的に結合できる抗体の領域のことを表す。典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、および／または抗体の重鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む。より典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および／または抗体の重鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む。さらに典型的には、抗原結合ドメインが、抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに抗体の重鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
【００７６】
「可変領域」という用語は、抗原に特異的に結合することができる抗体の軽鎖および／または重鎖の部分を表す。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。フレームワーク領域は、相補性決定領域以外の可変領域である。
【００７７】
「相補性決定領域」という用語は、抗体が抗原に特異的に結合する能力に主に関与する、抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の可変領域の３つのアミノ酸配列のうちの１つを指す。軽鎖および重鎖の可変領域の３つの相補性決定領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。
【００７８】
軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲ領域およびフレームワーク（ＦＲ）領域を決定するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991; Enhanced Clothia Numbering Scheme; Clothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917; Clothia et al. Nature 342: 877-883; HonnegherおよびPlukthun, J. Mol. Biol. 309: 657-670に従って定義され得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する。本明細書中で使用される「ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片」は、他の抗原も含め、より頻繁に、より迅速に、より長い時間にわたって、またはより高い親和性で、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインと会合する抗体またはその抗原結合断片である。
【００７９】
抗体由来の可変ドメインは、当該分野で公知であり、例えば、Sambrook and Russell, Eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載される、従来の技術により行われ得る。一般に、マウス抗体などの抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、およびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの種々の分子クローニング手順によって得ることができる。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、キメラ抗体は、１つの種に由来する抗体、典型的にはマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、典型的には可変領域を含む抗体タンパク質である。一方、抗体分子の定常ドメイン、およびいくつかの実施形態におけるフレームワーク領域（ＦＲ）は、別の種（例えば、ヒト）に由来する。
【００８１】
ヒト化抗体は、ＣＤＲのアミノ酸配列が１つの種由来の抗体、例えばマウス抗体由来であり、定常領域、および典型的にはフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト抗体由来であるキメラ抗体の形態である。
【００８２】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、ＤＣＲ−２の相補性決定領域（ＣＤＲ）、および典型的にはフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。キメラ抗体は、ヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域を含み得る。キメラ化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を低減する。典型的には、抗体はヒト化抗体である。マウス抗体および抗体断片のヒト化は、当業者に公知であり、例えば、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ６０５４２９７、およびＵＳ７５６６７７１に記載されている。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変鎖からのマウス相補的決定領域を、ヒト可変ドメインに移入し、次いで、マウス対応物のフレームワーク領域中のヒト残基を置換することによって産生され得る。ヒト定常領域配列に加えて、ヒトフレームワーク領域配列の使用は、ＨＡＭＡ反応を誘導する機会をさらに低減する。
【００８３】
抗体は、種々の十分に確立された技術によって、血清およびハイブリドーマ培養物から単離および精製され得る。このような単離技術には、プロテイン−Ａセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3を参照されたい。また、Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、抗体のその抗原結合断片が、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域の一部を含む。重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の一部は、Ｆｖ断片などの別々のポリペプチド鎖上にあってもよく、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（例えば、ｓｃＦｖタンパク質）によって連結されている単一のポリペプチド鎖中にあってもよい。抗体断片の例には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどが含まれる。典型的には、抗体断片が、重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域、および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３領域を含む。特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は例えば、抗体分子のペプシン消化によって産生され得る。これらおよび他の方法は、例えば、Coliganによって、２．８．１〜２．８．１０ページおよび２．１０．〜２．１０．４ページに記載されている。あるいは、Ｆａｂ’発現ライブラリーが、所望の特異性を有するＦａｂ’断片の迅速かつ容易な同定を可能にするように構築され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合断片は、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であり得る。単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、典型的には軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、典型的にはペプチドリンカー（Ｌ）によって共有結合され、折り畳まれて抗原結合部位を形成する。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は直接一緒に連結され得るが、当業者にとって当該領域が１つ以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって分離され得ることは公知である。またペプチドリンカーおよびそれらの使用は、当該分野で公知である。一般に、ペプチドリンカーは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の領域を連結するか、またはある最小距離または他の空間的関係を保存すること以外に、特異的な生物学的活性を有さない。しかし、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は折り畳み、正味電荷、または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を及ぼすように選択され得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、場合により、５０アミノ酸以下、一般に４０アミノ酸以下、好ましくは３０アミノ酸以下、より好ましくは２０アミノ酸以下の長さのペプチドリンカーを含む。
【００８６】
ｓｃＦｖ抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、例えば、ＵＳ５２６０２０３に記載されている。手短に言えば、免疫動物由来のＢ細胞由来のｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いて増幅される。ＰＣＲ産物を精製し、核酸配列を連結する。リンカーペプチドが所望される場合、ペプチドをコードする核酸配列を、重鎖核酸配列と軽鎖核酸配列との間に挿入される。ｓｃＦｖをコードする核酸をベクターに挿入し、適切な宿主細胞中で発現させる。所望の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖは、典型的にはファージディスプレイライブラリーのパンニング(panning)によって見出される。パンニングは、いくつかの方法のいずれかによって行うことができる。パンニングは、その表面上に所望の抗原を発現する細胞を使用するか、または所望の抗原で被覆された固体表面を使用して、簡便に実施され得る。好ましくは、上記表面は磁気ビーズであってもよい。結合していないファージを固体表面から洗い流し、結合したファージを溶出する。
【００８７】
抗体の他の抗原結合断片を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、抗原結合断片は、全長抗体のタンパク質分解加水分解によって、または大腸菌もしくは断片をコードするＤＮＡの別の宿主における発現によって調製され得る。抗体断片は、従来の方法による全長抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２と示される約１００Ｋｄの断片を提供するために、ペプシンを用いた抗体の酵素的切断によって産生され得る。この断片は、チオール還元剤、および場合によりジスルフィド結合の開裂から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用してさらに開裂されて、約５０ＫｄのＦａｂ’一価断片を生成し得る。あるいは、パパインを用いた酵素的切断によって、２つの一価Ｆａｂ断片およびＦｃ断片を直接産生する。
【００８８】
断片が無傷の抗体によって認識されるエピトープに結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば、重鎖を分離して一価の軽−重鎖断片を形成し、断片をさらに切断する方法、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術もまた、使用され得る。
【００８９】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するか、または同じ抗原上の２つのエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。種々の実施形態では、二重特異抗体は、（ａ）ＤＣＲ−２の結合特異性およびＵＰ−Ｄ２の結合特異性、（ｂ）ＤＣＲ−２の結合特異性およびＣＤ３の結合特異性、（ｃ）ＤＣＲ−２の結合特異性および別の癌抗原、典型的にはＣＤ１２３、ＣＤ９６、ＣＤ４４、ＣＤ４７またはＣＤ３３などのＡＭＬ抗原の結合特異性を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体が、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャーである。Ｂｉ特異的Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）は、人工的な二重特異的モノクローナル抗体のクラスである。ＢｉＴＥは融合タンパク質であり、典型的には、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ペプチド鎖上の４つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖの一方は腫瘍抗原（例えば、ＣＤ３００ｆ）に結合し、他方は一般に、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞などのエフェクター細胞に結合する。二重特異性抗体を調製する方法は例えば、Laszlo et al. Blood. 2014 Jan 23; 123(4): 554-561; Loffler, Blood (2000), 95: 2098-103に記載されている。
【００９１】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞(ＣＡＲ  Ｔ細胞）のためのキメラ抗原受容体である。この点に関して、シグナル伝達分子と共に、ｓｃＦｖなどの抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を用いて、Ｔ細胞に形質導入し、ＣＡＲ  Ｔ細胞を産生することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞において発現される抗原結合ドメインは、非ＭＨＣ制限様式で抗原を認識することができる。従って、Ｔ細胞の表面上における、例えば本明細書中に記載される抗体の抗原結合ドメインをコードするｓｃＦｖの発現は、例えば、ＡＭＬ細胞または白血病幹細胞を標的化するのに有効であり得る。ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製方法は当該分野で公知であり、例えば、Shannon et al. Blood, 25 June 2015 Volume 125, No. 26: 4017-4023; O’Hear et al. (2015) Haematologica; 100(3): 336-344に記載される。従って、一態様では、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞が、提供される。典型的には、細胞が、配列番号１および配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖなどのＤＣＲ−２抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む。一実施形態では、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチドが、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインおよびエンドドメインを含む。エンドドメインの例としては、Ｔ細胞受容体ゼータ鎖、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ３−ゼータ−ＣＤ２８、ＣＤ３−ゼータ−ＣＤ２８−ＯＸ４０が挙げられる。典型的には、エンドドメインは膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、典型的には細胞膜にまたがる疎水性αヘリックスを含む。
【００９２】
エピトープに対する交差競合を評価することによって、同じエピトープまたは重複エピトープに結合する他の抗体またはその抗原結合断片を単離するために、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片が、使用され得る。本明細書中に記載される抗体またはその抗原結合断片との交差競合は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ分析などの当技術分野で知られている方法を使用して評価することができる。したがって、別の態様では、ＤＣＲ−２またはその抗原結合断片と断面競合する抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ３００ｆの細胞外ドメインに結合するために提供され、ＤＣＲ−２と交差競合する抗体またはその抗原結合断片は、ＵＰ−Ｄ２またはその抗原結合断片ではない。
【００９３】
抗体またはその抗原結合断片は、一部分に結合され得る。したがって、別の態様は、
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
（ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、典型的には少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
を含む免疫複合体を提供し、ここで、上記抗原またはその抗原結合断片は、一部分に結合される。
【００９４】
上記部分は、抗体またはその抗原結合断片に直接的または間接的に結合され得る（例えば、間接的結合の場合、リンカーを含み得る）。部分の例としては、放射性同位元素（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０またはインジウム−１１１）、検出可能な標識（例えば、フルオロフォアまたは蛍光ナノクリスタル）、治療用化合物（例えば、化学療法剤または抗炎症剤）、コロイド（例えば、金）、毒素（例えば、リシン）、核酸、ペプチド（例えば、血清アルブミン結合ペプチド）、タンパク質（例えば、抗体または血清アルブミンの抗原結合ドメインを含むタンパク質）、対象における抗体または抗原結合タンパク質の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコールまたはこの活動を有する他の水溶性ポリマー）またはそれらの混合物等が挙げられる。部分をタンパク質に結合するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ２０１０／０５９８２１に記載されている。
【００９５】
一実施形態では、上記部分が治療部分および／または診断部分である。
【００９６】
一実施形態では、上記部分が治療部分である。治療部分は、疾患または状態の治療に有用な化合物、分子または原子である。治療部分の例としては、化学療法剤、アポトーシス促進剤、放射性同位体、免疫毒素複合体などの細胞毒性剤などの薬剤が挙げられる。細胞毒性剤は、細胞に対して毒である化合物である。細胞毒性剤の例としては、サイトカラシンＢ、グラミシジン、エメチン、テノポシド、コルヒチン、デュオカルマイシン、カリケアミシン、マイタンシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルビン、プレドニゾロン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、シクロホスファミド、プロカルバジン、パクリタキセル、イリノテカン、ゲムシタビン、フルオロラシル、シタラビン、オゾガマイシン、アドリアマイシン、エトポシド、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムイル、ダウノルビシン、モノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）が挙げられる。放射性同位元素の例としては、リン−３２、銅−６７、ヒ素−７７、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、銀−１１１、スズ−１２２１、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、ホルミウム−１６６、ルテチウム−１７７、レニウム−１８６、イリジウム−１９４、金−１９９、アスタチウム−２１１、イトリウム−９０、およびビスマス−２１２が挙げられる。免疫毒素の例は例えば、Wayne et al. (2016) Blood, 123: 2470-2477に記載されており、例えば、ジフテリア毒素Ａ、リシン−ｄｇＡ、シュードモナス外毒素Ａ、グロノイン、破傷風を含む。
【００９７】
一実施形態では、上記部分は診断部分である。診断部分は、抗体またはその抗原結合断片のその標的抗原への結合の検出に有用な化合物、分子または原子である。診断部分は、放射性核種または非放射性核種、造影剤（例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影または超音波のための）を含み得る。診断部分は、例えば、放射性同位元素、染料（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を有する）、造影剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）走査のための増強剤（例えば、常磁性イオン）を含む。一実施形態では、診断部分が放射性同位元素、磁気共鳴画像法に使用するための増強剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを負荷するためには、イオンを結合させるための多数のキレート基が結合している長い尾部を有する試薬と抗体成分を反応させる必要があり得る。このような尾部は、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシムなどのキレート群、およびこの目的に有用であることが知られている同様の群に結合され得るペンダント群を有する、ポリリジン、多糖、または他の誘導されたもしくは誘導され得る鎖などの高分子であり得る。キレートを、標準化学を用いて抗体に結合させる。キレートは、通常、免疫反応性の損失値を最小にし、凝集および／または内部架橋を最小にして、分子への結合の形成を可能にする基によって抗体に連結される。
【００９８】
一実施形態では、この部分がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。部分がＭＭＡＥである免疫複合体を生成するために、例えば、Francisco et al. 2003, Blood, 102: 1458-1465に記載されているように、部分的に還元された抗体またはその抗原結合断片への複合体化のために、リソソームカテプシンB切断可能な自己溶血性ジペプチドバリン−シトルリン（ＶａｌＣｉｔ）マレイミドリンカーをアウリスタチンＥに連結することができる。
【００９９】
ＤＣＲ−２抗体、またはＤＣＲ−２抗体の一部、またはＤＣＲ−２抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸もまた、本明細書中に提供される。種々の実施形態において、核酸は、以下を含むポリペプチドをコードする：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列
（ｈ）配列番号８で表されるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号２、３および４で表されるアミノ酸配列
（ｊ）配列番号６、７および８で表されるアミノ酸配列
（ｋ）配列番号２、３、４、６、７および８で表されるアミノ酸配列
（ｌ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列
（ｍ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列
（ｎ）配列番号１で表されるアミノ酸配列および配列番号５で表されるアミノ酸配列。
【０１００】
一実施形態において、ＤＣＲ−２抗体、ＤＣＲ−２抗体の一部、またはＤＣＲ−２抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸は、特定の宿主における発現のために最適化されたコドンである。例えば、配列番号１１によって表される核酸配列は、抗ＴＮＦ  ＩｇＧ１のヒト重鎖定常領域に連結されたＤＣＲ−２の重鎖可変領域、すなわちＣＨＯ細胞における発現のために最適化されたコドンをコードする核酸である。配列番号１２で表される核酸配列は、ＣＨＯ細胞における発現のために最適化されたコドンである抗ＴＮＦカッパ鎖のヒト軽鎖定常領域に連結されたＤＣＲ−２の軽鎖可変領域をコードする核酸である。核酸のコドン最適化のための方法は当該分野で公知であり、そして例えば、Raab et al. (2010) Systems and Synthetic Biology, 4(3),pp. 215-225; Graf et al. (2004) Methods Mol. Med. 94:197-210に記載されている。
【０１０１】
典型的には、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸は、抗体またはその抗原結合断片の発現のための１つ以上の調節配列に作動可能に連結される。「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列である。調節配列は当該分野で公知であり、そして例えば、転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列）を含み得る。「作動可能に連結される」という表現は、コード配列の発現に影響を及ぼすような様式での調節配列の配置を指す。いくつかの実施形態では、例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、キャップ構造、ポリＡ尾部、翻訳開始部位、シグナルペプチドをコードする配列、翻訳エンハンサー、転写エンハンサー、翻訳ターミネーター、転写ターミネーター、転写プロモーター、および／またはタンパク質の単離または細胞の特定の部分に対するタンパク質の標的化のための融合ペプチドをコードする核酸配列、を含む調節配列または他の核酸配列は、タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結され得る（例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd edition (2001)を参照)。利用される宿主細胞および／またはベクターに依存して、当該分野で公知の多数の適切な調節エレメントのいずれか１つが使用され得る。「コード配列」は特定のアミノ酸配列、例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。コード配列は、コード配列中の核酸が異なる遺伝子由来であるという点で、キメラコード配列であってもよい。例えば、キメラ人工Ｔ細胞受容体は、ｓｃＦｖをコードするコード配列を、Ｔ細胞膜貫通およびエンドドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータ膜貫通およびエンドドメイン）をコードするコード配列に連結することによって調製され得る。コード配列は、典型的には、プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、特定の状態下で、ＲＮＡポリメラーゼを結合すること、およびプロモーターから通常下流（３’方向）に位置するコード配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ領域である。コード配列はまた、終結シグナルに作動可能に連結され得る。典型的には、コード配列は、発現ベクターにおけるコード配列の発現を容易にするために、調節配列に作動可能に連結される。発現ベクターはまた、コード配列の適切な翻訳に必要な配列を含み得る。発現ベクター中のコード配列は、構成的プロモーター、または特定の細胞型においてのみ転写を開始するか、もしくは宿主細胞がいくつかの特定の刺激に曝露される場合に転写を開始する調節可能なプロモーターの制御下にあり得る。例えば、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む発現ベクターにおいて、コード配列は、種々の宿主細胞においてコード配列を発現するかまたは種々の宿主細胞において誘導可能であるプロモーターに、作動可能に連結され得る。種々の宿主細胞で抗体またはその抗原結合断片の発現を容易にするために使用される調節配列は、当該分野で公知であ��。
【０１０２】
本明細書で使用される、核酸配列の「発現」は、コード配列によってコードされるポリペプチドを産生するためのコード配列を含む核酸配列の転写および翻訳をいう。
【０１０３】
細菌細胞における発現に適したプロモーターには、例えば、ｌａｃｚ、Ｉｐｐ、温度感受性ＬまたはＲプロモーター、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、または半人工プロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーターまたはｌａｃＵＶ５プロモーター）が含まれる。酵母細胞（例えば、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiaeおよびS. pombeなど）における発現に適切なプロモーターとしては、例えば、以下の遺伝子ＡＤＨ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＣＵＰ１、ＰＨＯ５、ＲＰＲ１またはＴＥＦ１由来のプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞における発現に適切なプロモーターとしては例えば、レトロウイルスＬＴＲエレメント、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ（サイトメガロウイルス即時初期）プロモーター、ＥＦ１プロモーター（ヒト伸長因子１由来）、ＥＭ７プロモーター、ＵｂＣプロモーター（ヒトユビキチンＣ由来）からなる群より選択されるプロモーターが挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶｌ株、ヒト胚腎臓株（ＨＥＫ−２９３細胞）、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、アフリカ緑色サル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、または骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０細胞）が挙げられる。
【０１０４】
ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸は代表的にはベクター（例えば、発現ベクター）中の宿主細胞に導入される。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、試験管内、生体外または生体内のいずれかで、核酸を宿主細胞に移入するための任意のメカニズムを意味する。ベクターは、Promega、StratageneまたはInVitrogenなどの会社から商業的に入手することができる。ベクターはまた、例えば、Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd edition (2001))に概説されるように、標準的な分子生物学技術を使用して、個々に構築または改変され得る。ベクターは、タンパク質形質導入ドメインを含むポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る、所望のエレメントをコードする任意の数のヌクレオチド配列を含み得る。所望のエレメントをコードするこのようなヌクレオチド配列は例えば、転写プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター、翻訳開始剤、翻訳、ターミネーター、リボソーム結合部位、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、キャップ構造、ポリＡ尾部、複製起点、検出可能なマーカー、親和性タグ、シグナルまたは標的ペプチドが挙げられる。適当なベクターの選択および／または構築は、例えば、細胞または宿主細胞の型、所望の転写および翻訳制御エレメントの型、所望のタンパク質の単離の手段、染色体組込みが所望されるかどうか、所望の選択過程の型を含むいくつかの因子に依存し得ることが理解されるであろう。
【０１０５】
適切なベクターとしては実施例に記載されるベクター、ｐＣＥＬＦ、ｐＣＥＬＰ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＣ１ｎｅｏ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ＥＢＯ−ｐＳＶ２、ｐＢＰＶ−１、ｐＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＵＣＴａｇ、ＩＺＤ３５、ｐＨＢ−ＡｐＲ−１−ｎｅｏ、ＥＢＯ−ｐｃＤ−ＸＮ、ｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐＫｏｎｅｏおよびｐＨｙｇが挙げられるが、これらに限定されない。このようなベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、多数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、および特定の細胞型において活性なプロモーターを含み得る。
【０１０６】
適当な宿主細胞は、発現される核酸、核酸に作動可能に連結された制御エレメント、および単離されたタンパク質の目的に依存する。適当な宿主細胞としては、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ＶＥＲＯ−７６および骨髄腫細胞）が挙げられ得る。哺乳動物細胞における発現のために、適切なプロモーターは当該分野で公知であり、そして例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、およびＥＭ７プロモーターを含む。
【０１０７】
核酸がＣＡＲＴ細胞の産生のためにＴ細胞において発現される実施形態において、宿主細胞はＴ細胞であり得る。ＣＡＲＴのためのＴ細胞は当該分野で公知の方法（例えば、白血球除去）を使用して単離され得る。ＣＡＲＴ細胞を調製するための方法は当該分野で公知であり、Shannon et al. (2015) Blood, 125(26): 4017-4023; O’Hear et al. (2015) Haematologica 100(3): 336-344に記載される。
【０１０８】
発現ベクターを産生するための方法、例えば、発現構築物／ベクターへのクローニングは、当該分野で公知であり、および／またはAusubel et al., (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)、およびSambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)およびＵＳ７２７０９６９に記載されている。
【０１０９】
発現ベクターは、当該分野で公知の任意の方法を使用して、適当な宿主細胞に導入され得る。適切な方法には、数ある中でも例えば、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Gibco、MD、USA）および／またはセルフェクチン（Gibco、MD、USA）を使用することなどによるリポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、およびＤＮＡ被覆タングステンまたは金粒子(Agracetus Inc、WI、USA)などを用いたパーティクルボンバードメントなどが挙げられる。
【０１１０】
次に、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を発現させるために使用される細胞を、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を発現させるために当技術分野で知られている条件下で培養することができる。
【０１１１】
本明細書中に記載される抗体、またはその抗原結合断片、免疫複合体、核酸、および細胞は、薬学的組成物として処方され得る。したがって、さらなる態様は、
（ａ）本明細書中に記載される、単離されたＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片
（ｂ）治療または診断部分のような部分に結合した、本明細書中に記載される、単離されたＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体
（ｃ）本明細書中に記載される、ＤＣＲ−２抗体を含むポリペプチドをコードする核酸、またはＤＣＲ−２抗体の一部、またはＤＣＲ−２抗体の抗原結合断片を含む細胞、または
（ｄ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体、またはその一部、またはＤＣＲ−２抗体の抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸、および
薬学的に許容可能な担体
を含む薬学的組成物を提供する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物が治療部分および／または診断部分に結合した、モノクローナル抗体ＵＰ−Ｄ２またはその抗原結合断片、またはＵＰ−Ｄ２を含む免疫複合体またはその抗原結合断片をさらに含む。
【０１１３】
種々の実施形態では、上記組成物は以下を含む：
（ａ）本明細書中に記載される、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片
（ｂ）本明細書中に記載される、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片およびＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片
（ｃ）本明細書に記載される、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体
（ｄ）本明細書中に記載される、ＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片、およびＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体
（ｅ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片、およびＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体、または
（ｆ）または本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体、およびＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体、およびその抗原結合断片、ならびに
薬学的に許容可能な担体。
【０１１４】
「薬学的に許容可能な担体」とは、当該組成物の他の成分と適合性があり、対象にとって有害ではないことを意味する。組成物は以下に記載されるような他の治療剤、例えば、従来の液体媒体または希釈剤、ならびに医薬製剤の分野で周知の技術（例えば、Remington: the Science and Practice of Pharmacy、21st Ed、2005、Lippincott Williams & Wilkinsを参照）に従って、所望の投与様式に適切な種類の薬学的添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、香料など）を含み得る。
【０１１５】
薬学的組成物は、典型的には、無菌注射用水性懸濁液の形態である。この懸濁液は公知技術に従って製剤化することができ、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した活性物質を含有する。このような賦形剤には懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム）を含み得、分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）または脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）または長鎖脂肪族アルコールとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）または脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、または脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。水性懸濁液はまた、１種以上の防腐剤（例えばエチル、またはｎ−プロピル、Ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤、および１種以上の甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含み得る。
【０１１６】
無菌注射用調整剤はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒、例えば１，３−ブタンジオール中の水溶液中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用してよい許容可能な媒体及び溶媒に包含されるものは水、リンゲル液及び生理食塩水である。さらに、無菌の固定油を、溶媒または懸濁媒として常用できる。この目的のためには、任意の銘柄の固定油を使用してよく、例えば合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドが挙げられる。加えて、オレイン酸のような脂肪酸は、注射用製剤の調製において使用される。
【０１１７】
実施例に記載されるように、本発明者らは、ＤＣＲ−２が、ＡＭＬおよび白血病幹細胞を含むＣＤ３００ｆを発現する細胞に結合することを見出した。ＤＣＲ−２の使用は、ＡＭＬのような骨髄性白血病の文脈において記載されているが、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片もまた、ＣＤ３００ｆ発現に関連する他の状態を治療するために使用され得ることを、当業者には理解されたい。
【０１１８】
従って、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤ３００ｆ発現に関連する状態に罹患している対象を治療するために使用され得る。従って、さらなる態様は、治療を必要とする対象に、ＣＤ３００ｆに特異的に結合する有効量の抗体またはその抗原結合断片、またはその免疫複合体を投与する工程を含む、ＣＤ３００ｆ発現に関連する状態（例えば、ＡＭＬ）を治療する方法を提供し、
ここで、上記抗体とその抗原結合断片は以下を含む：
（ａ）以下を含む重鎖可変領域：
(i)配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および／または
(ii)配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、および／または
（ｂ）以下を含む軽鎖可変領域：
(i)配列番号５で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、および／または
(ii)配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）。
【０１１９】
典型的には、上記状態は骨髄性白血病である。典型的には、骨髄性白血病はＡＭＬである。
【０１２０】
一実施形態では、上記方法は、対象に、一部分、典型的には治療部分に連結したモノクローナル抗体ＵＰ−Ｄ２またはその抗原結合断片または誘導体、またはＵＰ−Ｄ２またはその抗原結合断片または誘導体を含む免疫複合体を投与することを、さらに含む。
【０１２１】
種々の実施形態では、治療を必要とする対象に、
（ａ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体、またはその抗原結合断片
（ｂ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片、および本明細書中に記載されるＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片
（ｃ）治療部分に結合した、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体
（ｄ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体を含むポリペプチドをコードする核酸、またはその一部、またはその抗原結合断片を含む細胞
（ｅ）本明細書中に記載される、治療部分に結合したＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片および本明細書中に記載されるＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体、または
（ｆ）本明細書中に記載される、治療部分に結合したＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片および本明細書中に記載される、治療部分に結合したＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体
を有効量投与することを含む、ＡＭＬなどのＣＤ３００ｆ発現に関連する状態を治療する方法が提供される。
【０１２２】
典型的には、抗体、その抗原結合断片は、本明細書中に記載される薬学的に許容可能な組成物中で投与される。
【０１２３】
薬学的組成物は、任意の適切な手段によって、典型的には非経口的に、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、（経）皮内、または槽内注射または注入技術によって（例えば、無菌注射用溶液または懸濁液として）、非毒性の薬学的に許容可能な媒体または希釈剤を含む投薬単位製剤中で投与され得る。抗体またはその抗原結合断片は、例えば、即時放出または徐放性に適した形態で投与することができる。即時放出または徐放性は、化合物を含む適切な薬学的組成物の使用によって、特に徐放性の場合には皮下注入または浸透圧ポンプなどの装置の使用によって、達成され得る。
【０１２４】
投与のための薬学的組成物は、好都合には投薬単位形態で提供され得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。一般に、薬学的組成物は、化合物を液体担体と均一かつ緊密に会合させることによって調製される。薬学的組成物において、活性化合物は、疾患のプロセスまたは状態に所望の効果をもたらすのに十分な量で含まれる。本明細書で使用する場合、「組成物」という用語は、特定の量の特定の成分を含む生成物、ならびに特定の量の特定の成分の組み合わせから直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することを意図する。
【０１２５】
一般に、「治療する」という用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得るために、対象、組織または細胞に影響を及ぼすことを意味し、（ａ）疾患の要因となり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、または（ｃ）疾患の症状を軽減または改善すること、すなわち、疾患の症状の回復であることを含む。一実施形態では、処置はレシピエント被験体において、ＣＤ３００ｆ発現細胞（例えば、ＡＭＬおよび／またはＬＳＣ細胞）の数を減少させる結果を達成する。
【０１２６】
「対象」という用語は、本方法による治療を必要とする疾患を有する任意の動物を表す。霊長類（例えば、ヒト）に加えて、種々の他の哺乳類が、本発明の方法を使用して処置され得る。例えば、限定するものではないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラットまたは他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類もしくはネズミ種を含む哺乳動物を治療することができる。特に犬は多発性骨髄腫を発症することが知られている。
【０１２７】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって求められている組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する抗体、その抗原結合断片または免疫複合体の量を指す。
【０１２８】
ＡＭＬの治療または予防において、適切な用量レベルは一般に、患者の体重ｋｇ当たり約０．０１〜５０ｍｇ／日であり、これは、単回または複数回用量で投与され得る。好ましくは、投与量が約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日である。適切な用量レベルは、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。この範囲内で、投与量は、０．０５〜０．５、０．５〜５またはｍｇ／ｋｇ／日であり得る。
【０１２９】
任意の特定の患者のための特定の用量レベルおよび投薬頻度は、変化され得、そして使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物組み合わせ、特定の状態の重症度、ならびに治療を受ける宿主を含む種々の因子に依存することが理解される。
【０１３０】
また、ＡＭＬなどのＣＤ３００ｆ発現に関連する状態の治療のための、本明細書に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含むキットであって、典型的には、抗体またはその抗原結合断片で充填された１つ以上の容器を含むキットもまた、本明細書に開示される。種々の実施形態では、上記キットは以下を含む：
（ａ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体、またはその抗原結合断片
（ｂ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片、および本明細書中に記載されるＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片
（ｃ）本明細書中に記載される、治療部分に結合したＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体
（ｄ）本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体、またはその一部、またはその抗原結合断片を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞
（ｅ）本明細書中に記載される、治療部分に結合したＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片および本明細書中に記載されるＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体、または
（ｆ）本明細書中に記載される、治療部分に結合したＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片および本明細書中に記載される、治療部分に結合したＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体。
【０１３１】
別の実施形態では、キットが本明細書に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を、１つ以上の容器中に含み、そしてＣＤ３００ｆ発現に関連する状態（例えば、ＡＭＬ）の処置に有用な１つ以上の他の治療剤を含む。別の実施形態では、キットが本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片を、１つ以上の容器中に、および1つ以上の他の診断剤中に含む。さらなる実施形態では、ＣＤ３００ｆ発現に関連する状態（例えば、ＡＭＬ）の治療のための、本明細書中に記載されるＤＣＲ−２抗体またはその抗原結合断片、およびＵＰ−Ｄ２抗体またはその抗原結合断片もしくは誘導体を含むキットを提供する。
【０１３２】
本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の限定された特許請求の範囲のみに本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は文脈が明確に指定することを示さない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「抗体」への言及は、複数の類似した抗体を含む。特記しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１３３】
本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を使用して、本発明を実施または試験することができるが、本明細書に記載するのは好ましい材料および方法である。
【０１３４】
本明細書で言及される全ての刊行物は、当該刊行物に報告され、本発明に関連して使用され得るプロトコルおよび試薬を説明および開示する目的で引用される。本明細書のいかなる内容も、先の発明を根拠にして、本発明が、参照した開示に先行する権利がないことを認めると解釈するものではない。
【０１３５】
本明細書で言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。当業者であれば、広く説明されている本発明の意図または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されているように、本発明に対して多数の変形および／または修正を行うことができることを理解されたい。したがって、本実施形態はすべての点で例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。
【０１３６】
以下の請求項および本発明の先行する説明において、文脈が明示的な言語または必要な含意のために別途必要とする場合を除いて、「備える(comprise)」という用語または「備える(comprises)」もしくは「備えている(comprising)」などの変形は包括的な意味で、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するために使用されるが、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【０１３７】
本発明の性質をより明確に理解できるように例示するために、以下の実施例を提供するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１３８】
〔方法〕
［抗体］
モノクローナル抗体ＤＣＲ−２（ＩｇＧ１、κ）は、ＣＤ３００ｆ  Ｉｇドメインの組換え体で形質転換させ、組換えタンパク質ＣＤ３００ｆ−Ｆｃ（Sino Biologicals）で発現量を増加させた、ＣＨＯ形質転換を発現するＣＤ３００ｆで免疫を与えたマウスから収集された脾細胞を使用して生成した。また、当該脾細胞をＮＳ−１骨髄腫細胞株に融合させた。
【０１３９】
ＤＣＲ−２を発現する、実験産物であるハイブリドーマを、２０１６年９月２７日に、ブダペスト条約の下、セルバンクオーストラリア（CellBank Australia, 214 Hawkesbury Rd., Westmead, NSW 2145, Australia）へ寄託し、アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９に指定した。
【０１４０】
本研究で使用した市販のＣＤ３００ｆ抗体はモノクローナル抗体ＵＰ−Ｄ１（マウスＩｇＧ１、κ、ＥＦ６６０共役、Jomar Life Research, Victoria, Australia）、ＵＰ−Ｄ２（マウスＩｇＧ１、κ、ＰＥ共役および精製、Biolegend, CA, USA）および２３４９０３（ラットＩｇＧ２ｂ、R&D Systems, MN, USA）であり、使用したポリクローナル抗体は、ウサギ抗体ＣＬＭ−１（ＣＬＭ−１、Ｎ−端末６３−９２、Abcam, Cambridge, UK）、ヤギ抗ヒトＬＭＩＲ３（ｇＬＭＩＲ３、R&D Systems, MN, USA）である。
【０１４１】
以下の抗体も使用した：ＣＤ４５  Ｖ５００（ＨＩ３０クローン）、ＣＤ３４  ＰＥ−ＣＹ７（５８１クローン）、ＣＤ３８  Ｖ４５０（ＨＢ７クローン）およびBD Biosciencesから得た細胞の生育量を決定するためのヨウ化プロピジウム、ＣＤ１４１（ＰＥ）およびＣＤ３０４（ＡＰＣ）(Miltenyi Biotech、R&D Systems)。
【０１４２】
［細胞株］
骨髄由来細胞株、ＨＥＬ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７およびＴＨＰ−１（全てＡＴＣＣ由来）を、２００ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ThermoFisher）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μg／ｍｌストレプトマイシン（ThermoFisher）および１０％熱不活化ウシ胎児血清を含む完全ＲＰＭＩ中で培養した。
【０１４３】
［ヒト検体］
静脈および骨髄サンプルを、インフォームドコンセントを行ったうえで、Concord Repatriation General Hospital(CRGH)の血液科(Department of Hematology)を通して募集した健康なボランティアから得た。単核細胞を、製造業者（GE Healthcare Life Sciences）の推奨設定を使用して、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用して調製した。過剰量のＡＭＬ診断サンプルから単核芽球を調製した。表２は、ＡＭＬ試料の特性をまとめたものである。CRGH Human Ethics Committeeによりすべての手順は承認されている。
【０１４４】
【表２】
2019535753.tif 000003
【０１４５】
2019535753.tif 000004
【０１４６】
ＣＤ１４+単球を、ＣＤ１４ＭＡＢ（Ｍ５Ｅ２クローン、BD Biosciences）で標識したＰＢＭＣから直接的に結合したＦＩＴＣで精製し、ＢＤインフラックス上でのサイトメトリーソーティングによって精製した。ＡＭＬサンプルは、BD Biosciences提供による以下のｍＡＢで表現型を決定した。ＣＤ４５−ｖ５００（ＨＩ３０クローン）、ＣＤ３４−ＰＥ−ＣＹ７（５８１クローン）、ＣＤ−３８Ｖ４５０（ＨＢ７クローン）およびＣＤ３３−ＰＥ（ＷＭ５３クローン）。結果をＦｌｏｗＪｏ（Treestar）で分析した。最初にＰＩ非生存細胞をグループとして分けた後、造血幹細胞を系統−ＣＤ４５ｄｉｍＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋として同定した。芽球はＣＤ４５ｄｉｍＳＳＣｌｏｗとして同定された。白血病幹細胞濃縮ＣＤ３４＋ＣＤ３８画分をこのグループから同定した。
【０１４７】
その後ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて生存率を決定した。ＡＭＬ芽球を、ＣＤ４５−Ｖ５００（BD Biosciences）で標識された末梢血または骨髄ＡＭＬサンプルから、ＳＳＣＬｏＣＤ４５ｄｉｍグループに対してのサイトメトリーソーティングによって精製した。
【０１４８】
［ＣＤ３００ｆ形質転換体の生成］
リーダー配列の後に位置するｃ−ｍｙｃエピトープを含む全長ＣＤ３００ｆ  ｃＤＮＡ（アイソフォーム１）を、ｐＢｕｄベクター上のＣＭＶプロモーターにクローニングした。ＣＨＯ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を用いて生成物で形質転換し、ゼオシンで選別して安定な形質転換体を生成した。さらに、表面上にｃ−ｍｙｃを発現する細胞をＢＤインフラックス上で選別した。ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｆＬ４、ＣＤ３００ｆＳ４も同様にＣＨＯ細胞で発現させた。全ての生成物の配列を、オーストラリアリサーチゲノムファシリティー(Australian Research Genome Facility)によって検証した。
【０１４９】
［フローサイトメトリー］
細胞を、異なるグループに区別するために、直接結合する特異的抗体またはアイソタイプ対照を用いて、標準的な手順に従って染色した。簡潔には、細胞を、ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡで希釈したｍＡＢと共に４℃で２０分間インキュベートした。標識されていないマウス抗体を、種特異的Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（ＡＦ）４８８ Ｆ（ａｂ）２試薬（ヤギ抗マウス、ヤギ抗ラットまたはウサギ抗ヤギ、またはロバ抗ウサギ、Invitrogen）との２回目のインキュベーションで検出した。細胞の生死をそれぞれ、ヨウ化プロピジウム-試験により同定した。細胞の分析は、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲまたはＩｎｆｌｕｘ(共にBD Biosciences）のいずれかで行った。
【０１５０】
ブロッキング実験は、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中で、氷上で３０分間、１０５のＣＤ３００ｆ−ＣＨＯ細胞を５０％飽和濃度のブロッキング抗体と共に前培養することによって行われた。その後細胞を０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、直接標識した試験抗体とインキュベートした。実験は３回繰り返された。パーセント結合度は、幾何平均蛍光強度(geometric mean fluorescence intensity)（ＭＦＩ）を用いた計算式［ブロックされた抗体のＭＦＩ−ブロックされていないアイソタイプのＭＦＩ］／［ブロックされていない抗体のＭＦＩ−アイソタイプ対照］×１００により決定された。
【０１５１】
［ＥＬＩＳＡ］
ＣＤ３００ｆ  Ｉｇドメインに対する各抗体の特異性をＥＬＩＳＡにより確認した。Maxisorpプレートを、炭酸緩衝液中のヤギ抗ヒトＩｇ Ｆｃ(Sigma)で被覆し、５％ＢＳＡ／ＰＢＳで阻害した後、ＣＤ３００ｆ−Ｉｇ、ＣＤ３００ｂ−Ｉｇまたは制御組換え融合タンパク質（Sino）を特定した。次いで、各抗体ならびに適切な実験対象およびアイソタイプ対照を、特定した融合タンパク質（またはコントロール）と共にインキュベートし、そしてそれらの結合を、適切なＨＲＰ標識二次抗体およびＯＰＤを用いて検出した。
【０１５２】
［免疫沈降およびウェスタンブロット］
免疫沈降のために、２．５×１０７の細胞をスルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ThermoFisher）溶解物でビオチン化した後、Ｍ−ＰＥＲ緩衝液中で溶解した。タンパク質を、製造業者（ThermoFisher）の推奨設定に従って、タンパク質Ｇダイナビーズに結合した抗体で免疫沈降させた。免疫沈降タンパク質またはＭ−ＰＥＲ溶解物を、（還元条件のために）酸化防止剤を含むまたは含まない４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓゲル（Invitrogen）上で分離し、ｉＢｌｏｔシステム（Thermo）を用いてニトロセルロースに移した。膜を５％ＢＳＡ/ＴＴＢＳでブロックし、一次抗体、続いてHRP結合種特異的抗体とインキュベートし、増強化学発光（ＥＣＬ）試薬（Clarity ECL kit, Bio Rad）で検出し、ＢｉｏＲａｄ  Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて分析した。ビオチン化タンパク質は、ストレプアビジン−ＨＲＰおよびＥＣＬで検出した。
【０１５３】
［遺伝子発現解析］
新たに精製した細胞グループまたは指数増殖期に増殖する細胞からの全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬を製造業者(Thermo Fisher)の指示書に従って調製した。抽出したｍＲＮＡの完全性および量を、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies）を用いて評価した。結果、使用した全てのＲＮＡは、８．８を超えるＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）を有していた。ｃＤＮＡについては、１００ｎｇのＤＮａｓｅ I(Thermo Fisher)処理ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット(Thermo Fisher)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。加水分解プローブを、スプライス変異体を検出するように設計し、ＢＬＡＳＴによる配列確認で特異性についてチェックした。３００ｍＭプライマー、３００ｍＭ Ｆａｍ ＢＨＱｕｅｎｃｈｅｒ標識プローブ（EBiosearch）および１ｘＦａｓｔ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Thermo Fisher）を用いてｃＤＮＡ上で遺伝子発現を行った。７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher）で、ｃＤＮＡの重複サンプルを増幅した。スプライスバリアント増幅のＣＴ値をＵＢＣ内因性遺伝子に対して正規化し、次式を用いてＣＤ１４＋ｃＤＮＡ基準試料に対する倍数変化として提示した。倍数変化＝２−ΔΔＣＴ（１１）。全てのプライマー対のプライマー効率は９８％より大きかった。プライマーおよびプローブ配列は、以下の通りである。
Ｌ５−Ｌ１（アイソフォーム１、３、４、７を検出）
５’ＴＡＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧ（配列番号１６）；
Ｌ５−Ｒ１：５’ＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＴＧＴＴ（配列番号１７）；
Ｌ５−Ｐ１：５’ＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＴＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＡＣＴＣＡＦＡＭ−ＢＨＱ（配列番号１８）；
Ｌ５−ＳＶ１−１（アイソフォーム１、４、５を検出）：５’ＣＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴ（配列番号１９）；
Ｌ５−ＳＶ１−２：５’ＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＡＧＧＴ（配列番号２０）；
Ｌ５−ＳＶ１−Ｐ：５’ＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴＧＦＡＭ−ＢＨＱ（配列番号２１）；
Ｘ５−３’−ＦＳＰ（検出アイソフォーム２：５’ＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＧ（配列版号２２）；
Ｘ５−３’−ＲＳＰ：５’ＣＡＴＣＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣ（配列番号２３）；
Ｘ５−３’−プローブ：５’ＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＦＡＭ−ＢＨＱ（配列番号２４）；
Ｘ４−３’−ＦＳＰ（アイソフォーム１、４、５を検出）：５’ＧＴＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＣＴＴＧ（配列番号２５）；
Ｘ４−３’−ＲＳＰ：５’ＧＧＧＴＣＡＧＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＣＡ（配列番号２６）；
Ｘ４−３’−プローブ：５’ＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＦＡＭ−ＢＨＱ（配列番号２７）；
Ｘ３−３’−ＦＳＰ（アイソフォーム３を検出）：５’ＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＧＣＡ（配列番号２８）；
Ｘ３−３’−ＲＳＰ：５’ＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＧＴＣ（配列番号２９）；
Ｘ３−３’−プローブ：５’ＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＦＡＭ−ＢＨＱ  （配列番号３０）；
Ｘ２−５’−ＦＳＰ（アイソフォーム２、５、６を検出）：５’ＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧ（配列番号３１）；
Ｘ２−５’−ＲＳＰ：５’ＧＧＡＧＴＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡ（配列番号３２）；
Ｘ２−５’−プローブ：５’ＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＴＯＡ（配列番号３３）；
ＵＢＣ−Ｆ：５’ＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡ（配列番号３４）；
ＵＢＣ−Ｒ：５’ＣＡＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧ（配列番号３５）；および
ＵＢＣ−プローブ５’ＴＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＦＡＭ−ＢＨＱ（配列番号３６）。
【０１５４】
全長の配列を増幅およびクローニングするために使用したプライマーは、以下のとおりである。
【０１５５】
ＣＤ３００ｆ＿Ｆｏｒ＿１６４：ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＴＡＧＴＴＴＧＴＴＣＣ（配列番号３７）
ＣＤ３００ｆ  Ｒｅｖ：ＴＡＴＣＧＡＴＴＣＧＡＴＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＧＴ（配列番号３８）およびＸ２−５’−ＦＳＰ。
【０１５６】
［細胞毒性に依存する抗体］
Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞を、１００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有する完全ＲＰＭＩ中で、指示されたエフェクター：標的の比でカルセイン標識ＨＬ−６０細胞と共に培養した。培養物は、２０μｇ／ｍｌのＣＤ３００ｆまたはアイソタイプｍＡＢを含んでいた。死んだＨＬ−６０細胞（ＤＡＰＩ+カルセイン-）の割合を、フローサイトメトリーによって２０時間培養した後に決定した。
【０１５７】
［ＣＤ３００ｆの内部移行］
抗体の内部移行をフローサイトメトリーにより測定した。細胞をＣＤ３００ｆ ｍＡｂで３０分間氷上にて標識した後、３７℃（またはコントロールとして氷）でインキュベートし、次いでＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡ／０．０２％アジ化物中で洗浄した。ＡＦ４８８またはＡＦ６４７結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ'）2（Thermo Scientific）を用いて残存抗体を検出した。内部移行は、アジ化物を用いて氷上の３７℃／幾何ＭＦＩ[ｍＡｂ−アイソタイプにより標識］での幾何ＭＦＩ[ｍＡｂ−アイソタイプにより標識］として測定した。細胞表面のＡＦ４８８に対する直接標識された共役内部移行の比率は、細胞表面上で内在化したＣＤ３００ｆの％の指標となった。共焦点顕微鏡を用いた検査のために、細胞を精製したｇＬＭＩＲ３抗体と共に４℃で１時間インキュベートし、次いで洗浄して余分な抗体を除去した後、３７℃でインキュベートした。細胞をＳｈａｎｄｏｎサイトスピン中の顕微鏡スライド上で遠心分離し、アセトン中で固定し、次いでウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＦ４８８で染色した。遠心し、標識前に固定した細胞であるコントロールを、免疫内在化前の膜染色を実証するために含めた。
【０１５８】
Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８  Ｘ共焦点顕微鏡および×６３油浸対物レンズを用いて細胞を可視化した。画像をＩｍａｇｅＪソフトウェア（National Institutes of Health）で処理した。
【０１５９】
［ＤＣＲ−２の配列決定］
全ｍＲＮＡを、ＤＣＲ２を発現するハイブリドーマ（アクセッション番号ＣＢＡ２０１６００２９）から、ＴＲＩｚｏｌ方を使用して、製造業者の指示に従って単離し、単離したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡを、Krebber et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. 1997. J Immunol Methods. 201: 35に記載される、プライマーを用いたＶＬ領域のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。これらのプライマーは、ＤＣＲ−２ ｃＤＮＡからのＶＬ配列の増幅を可能にする。
【０１６０】
ＶＨ領域の配列を得るために、精製ＤＣＲ−２モノクローナル抗体タンパク質をトリプシン消化し、続いて質量分光光度分析を行った。質量分析を用いて同定されたペプチドから、ＭＡＳＣＯＴを用いてＤＣＲ−２のＶＨ配列のＦＲ１領域に対応するペプチドＥＶＫＬＶＥＳＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ（配列番号３９）を同定した。したがって、このペプチドは、Essono, S. et al. A general method allowing the design of oligonucleotide primers to amplify the variable regions from immunoglobulin cDNA. 2003. J Immunol Methods. 279: 251により公開されているペプチドを基にしたプライマーの調整の基礎部分として使用でき、これにより配列が増幅されると予想された。本発明者らは、これらのプライマーに基づいてＤＣＲ−２  ｃＤＮＡからＶＨ領域を増幅することに成功した。
【０１６１】
ＤＣＲ−２のＶＨ領域を増幅するために使用したプライマーセットは、以下の通りであった：
５'−ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＲＴＧＧＡＲＴＣＴＧＧ−３'（配列番号４０）
（ここで、ＲはＧまたはＡである）。
【０１６２】
ＶＨおよびＶＬＰＣＲ増幅産物を、ベクターｐＣＲ−ＢＬＵＮＴ(Thermo Fisher Scientific)にクローニングし、そして核酸配列は、Westmead Institute for Medical Researchの、Australian Genome Reseach Facility(AGRF)におけるサンガー法シーケンシングによって決定した。ＶＨ領域のアミノ酸配列を配列番号１に示す。増幅されたＶＬ領域のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【０１６３】
ＤＣＲ−２重鎖結合領域は、配列ＧＱＧＴＬＶＴＶを有する。
【０１６４】
定常領域と重複するＤＣＲ−２軽鎖配列は、配列ＴＫＬＥＩＫＲを有する。
【０１６５】
ＶＨおよびＶＬ配列を用いて、ヒト抗ＴＮＰκおよび抗ＴＮＰ重ＩｇＧ１重鎖の配列とコンピュータ内での組み合わせによりキメラｍＡｂ配列を生成した。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ThermoFisher Scientific）での発現のためのコドン最適化を、ＧｅｎｅＡｒｔウェブサイトの、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎを介して完了させた（ThermoFisher Scientific）（Raab et al. (2010) Systems and Synthetic Biology, 4(3),pp. 215-225; Graf et al. (2004) Methods Mol. Med. 94:197-210）。ＤＣＲ−２のＶＨ領域およびヒト抗ＴＮＰ重ＩｇＧ１重鎖の定常領域のコドン最適化組合せのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および１３に示す。
【０１６６】
ＤＣＲ−２のＶＬ領域およびヒト抗ＴＮＰκ鎖の定常領域のコドン最適化組合せのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２および１４に示す。
【０１６７】
〔結果〕
［ＣＤ３００ｆ抗体パネルの有効化］
本発明者らは開示されている方法に従って、ＤＣＲ−２と比較するための抗体パネルを作成した。各抗体は、アイソフォーム１（アクセッション番号ＮＰ＿６２０５８７）をコードする構築物から転写されたＣＨＯ形質転換細胞表面ＣＤ３００ｆに結合させた（図１Ａ）。ＣＤ３００ファミリーは、白血球上に発現される独立した遺伝子（ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｂ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｄ、ＣＤ３００ｅ）によってコードされる他の分子を含む。これらは、ＩｇドメインにおいてＣＤ３００ｆとよく似たアミノ酸配列を持つので、他のＣＤ３００ファミリーメンバーに対するＤＣＲ−２および他のＣＤ３００ｆ抗体の結合度を決定した。最初に、他の阻害ファミリーメンバーであるＣＤ３００ａについて、ＣＨＯ形質転換細胞表面への結合度を調べた。ＤＣＲ−２も、パネル中の他の抗体も、ＣＤ３００ａトランスフェクト細胞に結合しなかった（データは示さず）。ＣＤ３００ｆおよびＣＤ３００ｂ  Ｉｇ様ドメインは７５％同一であるので、本発明者らは、関連する種類それぞれのコントロールと比較して、ＣＤ３００ｆ Ｉｇ様ドメイン（図１Ｂ）およびＣＤ３００ｂ Ｉｇ様ドメイン（図１Ｃ）に対する各抗体のＥＬＩＳＡにおける結合度を評価した。ＤＣＲ―２、ＵＰ―Ｄ１、ＵＰ―Ｄ２および２３４９０３ｍＡｂはＣＤ３００ｆ  Ｉｇ様ドメインに特異的であったが、ＣＬＭ―１ペプチド抗体およびｇＬＭＩＲ３抗体は両方のＣＤ３００ｂ関連分子のＩｇドメインに結合した。
【０１６８】
ＴＨＰ−１のみに結合するＣＬＭ−１抗体を除いたそれぞれの抗体は、４つのＣＤ３００ｆ＋ＣＤ３００ｂ＋骨髄由来細胞株(Ｈｅｌ、ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１およびＵ９３７)への結合度を試験した（図２）。フローサイトメトリーＭＦＩ比（飽和状態における特定ｍＡｂの幾何ＭＦＩ／対応種アイソタイプの幾何ＭＦＩ）を比較すると、各ｍＡｂについて異なるパターンが観察された。ＵＰ−Ｄ１はＵ９３７、ＨＬ−６０、およびＴＨＰ−１に対する高い幾何ＭＦＩ結合を有していたが、ＨＥＬに対する結合比率は低かった（図２）。２３４９０３クローンおよびＤＣＲ−２ｍＡｂは、Ｕ９３７に対する高い幾何ＭＦＩ比率、ＨＬ−６０およびＴＨＰ−１に対する低い結合比率、ならびにＨＥＬに対するさらに低い結合比率で、互いに同様の結合パターンを有した。マウスＵＰ−Ｄ２クローニングおよびｇＬＭＩＲ３ポリクローナルは、同様の幾何ＭＦＩパターンを示した。このデータは、少なくとも4つのＣＤ３００ｆエピトープの存在が抗体パネルによって認識されることを示唆した。
【０１６９】
ＤＣＲ−２および他の抗体を、健康なＰＢＭＣ中のＤ３００ｆ＋単球群に対して試験した（図３Ａ）。４つのｍＡｂおよびｇＬＭＩＲ３抗体は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−（従来型）およびＣＤ１４ｄｉｍＣＤ１６＋（炎症性）単球群の両方に結合した。ＣＬＭ−１抗体は、いずれの単球群にも結合しなかった。興味深いことに、ＵＰ−Ｄ２およびＤＣＲ−２クローンは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６ｄｉｍ単球群よりも有意に強くＣＤ１４＋ＣＤ１６−単球に結合した（図３Ａ）。このパターンは、２３４９０３ ｍＡｂで逆転し、有意により強くＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球群に結合していた（図３Ａ）。本発明者らは、５つの代表的なＡＭＬサンプルについて、４つのｍＡｂおよび2つのポリクローナル抗体を試験した。全ての抗体は、１つのサンプルのみからの芽球に結合したＣＬＭ−１抗体を除いて、ＡＭＬ芽球およびＬＳＣの両方に結合した（図３Ｂ）。ＵＰ−Ｄ１、ＤＣＲ−２および２３４９０３ ｍＡｂは、健康な臍帯血からのＨＳＣに結合した（図３Ｃ）。ＵＰ−Ｄ２の弱い結合があり、健康なＨＳＣに対するＣＬＭ−１抗体との結合はなかった（図３Ｃ）。
【０１７０】
骨髄由来細胞株の表面上のＣＤ３００ｆの抗原密度、および高い割合で芽球を有する多数の一次ＡＭＬサンプルを、定量用ビーズベースキットを使用して実験した。結果を図４に示す。ＣＤ３００ｆアイソフォーム１ＣＨＯ形質転換体は１０５分子／細胞を発現した。骨髄由来細胞株は、細胞あたり１０４分子のオーダーで発現した。一次ＡＭＬ芽球は、１０１〜１０４分子／細胞の範囲のレベルでＣＤ３００ｆを発現した。
【０１７１】
［抗体による、異なるエピトープの認識］
本発明者らは、他のＣＤ３００ｆ抗体の存在下でＣＤ３００ｆアイソフォーム１形質転換体に結合するＤＣＲ−２およびＣＤ３００ｆパネル内の他の抗体の能力を試験した。ＵＰ−Ｄ１はＵＰ−Ｄ２またはｇＬＭＩＲ３の存在下で４５％の結合度を示し、２３４９０３の存在下で６５％の結合度を示した（図５）。同様に、ＵＰ−Ｄ２はＵＰ−Ｄ１の存在下で３０％の結合度を示し、２３４９０３またはｇＬＭＩＲ３の存在下で６０〜６５％の結合度を示した。２３４９０３ｍＡｂ結合はＤＣＲ―２およびｇＬＭＩＲ３により有意に阻害されたが、ＵＰ―Ｄ１またはＵＰ―Ｄ２により阻害されなかった。ＣＬＭ−１抗体は、抗体をブロックせず、アミノ酸残基６３〜９２内のエピトープに結合しないことを示した。ｇＬＭＩＲ３はそれぞれ２３４９０３およびＵＰ−Ｄ１の存在下で７０％および５０％の結合を示したが、ＵＰ−Ｄ２ｍＡｂはその結合に影響を及ぼさなかった。ＣＬＭ−１ペプチド抗体によって認識されるエピトープは、未成熟骨髄細胞上には存在せず、それらが成熟する際に上方調節されるので、他のエピトープと区別された。ＤＣＲ−２に結合を妨げられなかったため、ＵＰ−Ｄ１は異なるエピトープに結合することが分かったが、２３４９０３ｍＡｂはＤＣＲ−２に結合を完全に妨げられたため、エピトープにおける潜在的な重複を示した。興味深いことに、ＤＣＲ−２は、ＵＰ−Ｄ２の結合をブロックするのではなく、ＣＤ３００ｆへのＵＰ−Ｄ２の結合を増強した（図５Ｂ）。
【０１７２】
そこで、ＵＰ−Ｄ２の結合を増強するＤＣＲ−２の能力をさらに調査した。図６は、ＤＣＲ−２の存在下でＣＤ３００ｆ（ＣＨＯ−Ｌ５）を発現するＣＨＯ細胞に対するＣＤ３００ｆ抗体の結合度の結果を示す。図６から分かるように、ＤＣＲ−２は、ＵＰ−Ｄ２の結合を有意に増強する。ＤＣＲ−２はまた、これらの細胞株へのＵＰ−Ｄ２結合に対するｍＡｂ  ３４２９０３の効果と比較した場合、ＨＥＬ、ＨＬ−６０およびＴＨＰ−１細胞へのＵＰ−Ｄ２の結合を増強した（図７）。
【０１７３】
これらの結果は、ＤＣＲ−２が細胞上で発現されるＣＤ３００ｆへのＵＰ−Ｄ２の結合を選択的に増強することを示す。
【０１７４】
複数のＣＤ３００ｆ ＲＮＡ転写物は、骨髄由来細胞株によって発現される。
一次ＡＭＬで発現したＣＤ３００ｆ転写物を同定するために、健康なＣＤ１４＋単球、いくつかのＡＭＬ試料および骨髄由来細胞株ｃＤＮＡ鋳型から完全な転写領域を増幅し、配列を決定した。エキソン1特異的プライマー（ＣＤ３００ｆアイソフォーム１リーダー配列）を用いて、２つの配列を増幅した。第一の配列は２０アミノ酸の短いエキソン４（ＣＤ３００ｆＳ４）を有し、アイソフォーム１、２、３、５および７において見出された。第２の配列は追加の１４アミノ酸残基（ＣＤ３００ｆＳ４）（ＳＴＰＡＰＴＴＰＴＳＴＴＦＴ）を含む、選択的スプライシングされたエキソン４を有し、アイソフォーム４および６において見出された。各ＡＭＬサンプルから少なくとも１つのアイソフォームを増幅した。これは、ＣＤ３００ｆ細胞外成分の複数の形態が一緒に発現され得ることを実証した。
【０１７５】
ＣＤ３００ｆアイソフォームは、ＣＤ３００ｆ抗体によって認識される。
ＣＨＯ細胞で発現したＣＤ３００ｆＬ４およびＣＤ３００ｆＳ４細胞外領域への結合について、直接結合した抗ＣＤ３００ｆ抗体を試験することで、ＣＨＯ細胞で発現した場合、ＣＤ３００ｆのＣＤ３００Ｓ４およびＣＤ３００ｆＬ４細胞外領域にすべて結合することを見出した（図８）。それぞれに対するＵＰ―Ｄ１のＭＦＩ比を比較すると、ＵＰ―Ｄ１はＣＤ３００ｆＳ４と比べて３倍高い比率でＣＤ３００ｆＬ４に結合したが、ＵＰ―Ｄ２、２３４９０３、およびＤＣＲ―２のＣＤ３００ｆＬ４への結合度はＣＤ３００ｆＳ４と比べると半分未満であった。これは、ＵＰ−Ｄ１ｍＡｂがＣＤ３００ｆ上の異なるエピトープに結合することを示唆した。ウェスタンブロット法により、２３４９０３、ＤＣＲ―２ ｍＡｂおよびｇＬＭＩＲ３抗体が非還元条件下でＣＤ３００ｆＬ４由来の４９ｋＤタンパク質に結合することが示された。還元条件下では、抗体の結合度は著しく減少した。これらの結果は、ＣＤ３００ｆの三次構造を決定するジスルフィド結合が抗体結合エピトープに影響を及ぼすことを示している。対照的に、１０倍レベルのタンパク質を分析した場合でさえ、還元条件または非還元条件のいずれにおいてもＣＤ３００ｆＳ４形態への結合はほとんどなかった。形質転換体におけるＣＤ３００ｆ発現を確認するために、ＣＬＭ−１抗体を使用したが、ＣＤ３００ｆＳ４タンパク質に対してｍＡｂが結合しないか、または非常に弱い結合を形成する理由を説明することはできなかった。
【０１７６】
ＣＤ３００ｆ−Ｆｃ組換えタンパク質へのＤＣＲ−２の結合の原理を、ＢＬＩｔｚ  Ｓｙｓｔｅｍ(Fortebio、Pall Life Sciences)におけるＢｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓを使用して決定した。結果を図９に示す。
【０１７７】
ＣＤ３００ｆに対する抗体はＡＤＣＣを媒介し、ＣＤ３００ｆと共に吸収される。
ＤＣＲ―２は、ＩＬ―２活性化マウス脾細胞によるＨＬ―６０細胞株の抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）に有効であった（図１０Ａ）。さらに、３７℃で３０分後、４０％のＤＣＲ−２および２５％のＵＰ−Ｄ１は、フローサイトメトリーによる計測では、ＨＬ−６０またはＵ９３７の表面から吸収されたことが示された（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。ＵＰ−Ｄ２は、ＣＤ３００ｆに対して低い親和性を有することが見出され、吸収されるよりもむしろ結合を失うことになる。共焦点顕微鏡で確認されたＣＤ３００ｆ抗体は３７＋Ｃでのインキュベート後に、ＨＬ−６０およびＵ９３７、健康なＣＤ１４＋単球およびＡＭＬ芽球の表面膜から吸収された（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。この時点ではほとんど表面ＣＤ３００ｆは残っておらず、ほとんどのＣＤ３００ｆ結合抗体が、結合したＣＤ３００ｆの表面の形態にかかわらず、吸収されたことを示している。
【０１７８】
［ＤＣＲ−２配列］
ＤＣＲ−２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を配列決定した。配列番号1は、ＤＣＲ−２重鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。配列番号5は、ＤＣＲ−２軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表す。
【０１７９】
ＤＣＲ−２重鎖結合領域は、配列ＧＱＧＴＬＶＴＶを有する。
【０１８０】
定常領域と重複するＤＣＲ−２軽鎖配列は、配列ＴＫＬＥＩＫＲを有する。
【０１８１】
ＤＣＲ２のＶＨ領域のヒト化
マウスＤＣＲ−２のＶＨ領域のアミノ酸配列をヒトＶＨ配列と整列させて、マウスＤＣＲ−２配列をヒト化するために変化させるべきアミノ酸を同定するために、マウスとヒトとの間で異なるフレームワーク領域中のアミノ酸を同定した。図１２に示すのは、ＤＣＲ−２のマウス（上部、Ａ）および提案されたヒト化（下部、Ｂ）ＶＨ領域のアラインメントである。上部の配列はマウスＤＣＲ−２ＶＨアミノ酸配列を示し、下部の配列は提示されたヒト化ＤＣＲ−２ＶＨアミノ酸配列を示す。ヒト配列に変化させるアミノ酸残基は太字で下線を付してある。マウスＤＣＲ−２のＣＤＲ配列を囲む。
【０１８２】
〔考察〕
新しい抗体に基づく治療法の開発は、細胞表面タンパク質の対象を標的とする適切な抗体の利用可能性によって制限される。ＣＤ３００ｆはＣＤ３００遺伝子ファミリーのメンバーとして同定され、ＣＤ３００ｆはＡＭＬ芽球およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＬＳＣ富化画分で発現されることを示した。本発明者らは、モノクローナル抗体ＤＣＲ−２を産生した。
【０１８３】
ｍＡｂＤＣＲ−２は、高い親和性でＣＤ３００ｆを標的とする。ＤＣＲ−２は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性を媒介する。ＤＣＲ−２はまた、ＣＤ３００ｆへのＵＰ−Ｄ２の結合を増強する。
【０１８４】
本発明者らは、ＤＣＲ−２はＡＭＬなどの骨髄性白血病の治療に有用だと想定している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月21日(2019.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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