(57)【要約】単離または組換え抗ＥＧＦＬ６モノクローナル抗体が提供される。いくつかの場合では、実施形態の抗体は、癌のような、ヒト疾患の検出、診断、及び／または治療処置に使用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離モノクローナル抗体であって、前記抗体が、ＥＧＦＬ６に特異的に結合し、
（Ｉ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号４と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号５と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号６と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号７６と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号７７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号７８と同一であること、
（ＩＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号１０と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号１１と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号１２と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号８２と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号８３と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号８４と同一であること、
（ＩＩＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号１６と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号１７と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号１８と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号８８と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号７７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号８９と同一であること、
（ＩＶ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号２２と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号２３と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号２４と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号９３と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号９４と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号９５と同一であること、
（Ｖ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号２８と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号２９と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号３０と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号９９と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１０１と同一であること、
（ＶＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号３４と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号３５と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号３６と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１０４と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１０５と同一であること、
（ＶＩＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号４０と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号４１と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号４２と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１０８と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号７７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１０９と同一であること、
（ＶＩＩＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号４６と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号４７と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号４８と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１１３と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号８３と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１１４と同一であること、
（ＩＸ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号５２と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号５３と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号５４と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１１７と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号８３と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１１９と同一であること、
（Ｘ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号５８と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号５９と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号６０と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１２１と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１２２と同一であること、
（ＸＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号６４と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号６５と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号６６と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１２６と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１２７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１２８と同一であること、または
（ＸＩＩ）
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号７０と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号７１と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号７２と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１３１と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１３２と同一であること
を含む、単離抗体。
【請求項２】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号４と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号５と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号６と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号７６と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号７７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号７８と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号１０と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号１１と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号１２と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号８２と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号８３と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号８４と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項４】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号１６と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号１７と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号１８と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号８８と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号７７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号８９と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項５】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号２２と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号２３と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号２４と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号９３と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号９４と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号９５と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項６】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号２８と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号２９と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号３０と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号９９と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１０１と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項７】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号３４と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号３５と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号３６と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１０４と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１０５と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項８】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号４０と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号４１と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号４２と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１０８と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号７７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１０９と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項９】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号４６と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号４７と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号４８と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１１３と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号８３と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１１４と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１０】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号５２と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号５３と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号５４と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１１７と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号８３と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１１９と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１１】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号５８と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号５９と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号６０と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１２１と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１２２と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１２】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号６４と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号６５と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号６６と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１２６と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１２７と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１２８と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１３】
（ａ）第１のＶＨＣＤＲが配列番号７０と同一であることと、
（ｂ）第２のＶＨＣＤＲが配列番号７１と同一であることと、
（ｃ）第３のＶＨＣＤＲが配列番号７２と同一であることと、
（ｄ）第１のＶＬＣＤＲが配列番号１３１と同一であることと、
（ｅ）第２のＶＬＣＤＲが配列番号１００と同一であることと、
（ｆ）第３のＶＬＣＤＲが配列番号１３２と同一であること
を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項１４】
（ｉ）Ｅ１−３３（配列番号１５７）のＶＨドメインもしくはＥ１−３３ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−３３（配列番号１５８）のＶＬドメインもしくはＥ１−３３ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｉｉ）Ｅ１−３４（配列番号１５９）のＶＨドメインもしくはＥ１−３４ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−３４（配列番号１６０）のＶＬドメインもしくはＥ１−３４ｍＡのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｉｉｉ）Ｅ１−８０（配列番号１６１）のＶＨドメインもしくはＥ１−８０ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−８０（配列番号１６２）のＶＬドメインもしくはＥ１−８０ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｉｖ）Ｅ１−８９（配列番号１６３）のＶＨドメインもしくはＥ１−８９ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−８９（配列番号１６４）のＶＬドメインもしくはＥ１−８０ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｖ）Ｅ２−９３（配列番号１６５）のＶＨドメインもしくはＥ２−９３ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ２−９３（配列番号１６６）のＶＬドメインもしくはＥ２−９３ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｖｉ）Ｅ１−３８（配列番号１６７）のＶＨドメインもしくはＥ１−３８ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−３８（配列番号１６８）のＶＬドメインもしくはＥ１−３８ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｖｉｉ）Ｅ１−５２（配列番号１６９）のＶＨドメインもしくはＥ１−５２ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−５２（配列番号１７０）のＶＬドメインもしくはＥ１−５２ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｖｉｉｉ）Ｅ２−３６（配列番号１７１）のＶＨドメインもしくはＥ２−３６ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ２−３６（配列番号１７２）のＶＬドメインもしくはＥ２−３６ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｉｘ）Ｅ１−９５（配列番号１７３）のＶＨドメインもしくはＥ１−９５ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−９５（配列番号１７４）のＶＬドメインもしくはＥ１−９５ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｘ）Ｅ２−１１６（配列番号１７５）のＶＨドメインもしくはＥ２−１１６ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ２−１１６（配列番号１７６）のＶＬドメインもしくはＥ２−１１６ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、
（ｘｉ）Ｅ２−１３５（配列番号１７７）のＶＨドメインもしくはＥ２−１３５ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ２−１３５（配列番号１７８）のＶＬドメインもしくはＥ２−１３５ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン、または
（ｘｉｉ）Ｅ１−１４２（配列番号１７９）のＶＨドメインもしくはＥ１−１４２ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％同一のＶＨドメイン、及びＥ１−１４２（配列番号１８０）のＶＬドメインもしくはＥ１−１４２ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％同一のＶＬドメイン
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
Ｅ１−３３（配列番号１５７）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−３３（配列番号１５８）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
Ｅ１−３４（配列番号１５９）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−３４（配列番号１６０）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
Ｅ１−８０（配列番号１６１）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−８０（配列番号１６２）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１８】
Ｅ１−８９（配列番号１６３）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−８９（配列番号１６４）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１９】
Ｅ２−９３（配列番号１６５）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ２−９３（配列番号１６６）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２０】
Ｅ１−３８（配列番号１６７）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−３８（配列番号１６８）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２１】
Ｅ１−５２（配列番号１６９）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−５２（配列番号１７０）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２２】
Ｅ２−３６（配列番号１７１）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ２−３６（配列番号１７２）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２３】
Ｅ１−９５（配列番号１７３）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−９５（配列番号１７４）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２４】
Ｅ２−１１６（配列番号１７５）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ２−１１６（配列番号１７６）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２５】
Ｅ２−１３５（配列番号１７７）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ２−１３５（配列番号１７８）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２６】
Ｅ１−１４２（配列番号１７９）のＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、Ｅ１−１４２（配列番号１８０）のＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２７】
Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２抗体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項２８】
組換え体である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの抗原結合断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３０】
Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
ヒト抗体、ヒト化抗体、または脱免疫化抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
イメージング剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種と複合されている、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
毒素と複合されている、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記毒素が、アウリスタチンである、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
前記毒素が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３６】
薬学的に許容される担体中に請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項３７】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項３８】
Ｅ１−３３（配列番号４、５、及び６）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−３４（配列番号１０、１１、及び１２）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−８０（配列番号１６、１７、及び１８）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−８９（配列番号２２、２３、及び２４）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−９３（配列番号２８、２９、及び３０）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−３８（配列番号３４、３５、及び３６）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−５２（配列番号４０、４１、及び４２）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−３６（配列番号４６、４７、及び４８）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−９５（配列番号５２、５３、及び５４）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−１１６（配列番号５８、５９、及び６０）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−１３５（配列番号６４、６５、及び６６）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、または
Ｅ１−１４２（配列番号７０、７１、及び７２）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３
を含む抗体ＶＨドメインを含む、組換えポリペプチド。
【請求項３９】
Ｅ１−３３（配列番号７６、７７、及び７８）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−３４（配列番号８２、８３、及び８４）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−８０（配列番号８８、７７、及び８９）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−８９（配列番号９３、９４、及び９５）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−９３（配列番号９９、１００、及び１０１）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−３８（配列番号１０４、１００、及び１０５）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−５２（配列番号１０８、７７、及び１０９）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−３６（配列番号１１３、８３、及び１１４）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ１−９５（配列番号１１７、８３、及び１１８）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−１１６（配列番号１２１、１００、及び１２２）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、
Ｅ２−１３５（配列番号１２６、１２７、及び１２８）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、または
Ｅ１−１４２（配列番号１３１、１００、及び１３２）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３
を含む抗体ＶＬドメインを含む、組換えポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項４１】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体または請求項３８または３９に記載の組換えポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、宿主細胞。
【請求項４２】
哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫細胞、または昆虫細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
（ａ）細胞中で、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体のＶＬ及びＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を発現させる段階と、
（ｂ）前記細胞から前記抗体を精製する段階と
を含む、抗体の製造方法。
【請求項４４】
有効量の請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体を対象に投与する段階を含む、癌を有する対象を治療するための方法。
【請求項４５】
前記癌が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、皮膚癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、または皮膚癌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌が、上皮癌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌が、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、淡明細胞型腎細胞癌、肺癌、または腎臓癌である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、薬学的に許容される組成物中にある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が、全身投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象に少なくとも第２の抗癌療法を施す段階をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２の抗癌療法が、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
対象からの試料中の対照と比較して高いＥＧＦＬ６の存在について試験する段階を含む、対象における癌を検出するための方法であって、
前記試験する段階が、前記試料を請求項１４〜２７または３２のいずれか一項に記載の抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項５４】
インビトロ方法としてさらに定義される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）Ｅ１−３３（配列番号４）、Ｅ１−３４（配列番号１０）、Ｅ１−８０（配列番号１６）、Ｅ１−８９（配列番号２２）、Ｅ２−９３（配列番号２８）、Ｅ１−３８（配列番号３４）、Ｅ１−５２（配列番号４０）、Ｅ２−３６（配列番号４６）、Ｅ１−９５（配列番号５２）、Ｅ２−１１６（配列番号５８）、Ｅ２−１３５（配列番号６４）、またはＥ１−１４２（配列番号７０）のＶＨＣＤＲ１と少なくとも８０％同一の第１のＶＨＣＤＲと、
（ｂ）Ｅ１−３３（配列番号５）、Ｅ１−３４（配列番号１１）、Ｅ１−８０（配列番号１７）、Ｅ１−８９（配列番号２３）、Ｅ２−９３（配列番号２９）、Ｅ１−３８（配列番号３５）、Ｅ１−５２（配列番号４１）、Ｅ２−３６（配列番号４７）、Ｅ１−９５（配列番号５３）、Ｅ２−１１６（配列番号５９）、Ｅ２−１３５（配列番号６５）、またはＥ１−１４２（配列番号７１）のＶＨＣＤＲ２と少なくとも８０％同一の第２のＶＨＣＤＲと、
（ｃ）Ｅ１−３３（配列番号６）、Ｅ１−３４（配列番号１２）、Ｅ１−８０（配列番号１８）、Ｅ１−８９（配列番号２４）、Ｅ２−９３（配列番号３０）、Ｅ１−３８（配列番号３６）、Ｅ１−５２（配列番号４２）、Ｅ２−３６（配列番号４８）、Ｅ１−９５（配列番号５４）、Ｅ２−１１６（配列番号６０）、Ｅ２−１３５（配列番号６６）、またはＥ１−１４２（配列番号７２）のＶＨＣＤＲ３と少なくとも８０％同一の第３のＶＨＣＤＲと、
（ｄ）Ｅ１−３３（配列番号７６）、Ｅ１−３４（配列番号８２）、Ｅ１−８０（配列番号８８）、Ｅ１−８９（配列番号９３）、Ｅ２−９３（配列番号９９）、Ｅ１−３８（配列番号１０４）、Ｅ１−５２（配列番号１０８）、Ｅ２−３６（配列番号１１３）、Ｅ１−９５（配列番号１１７）、Ｅ２−１１６（配列番号１２１）、Ｅ２−１３５（配列番号１２６）、またはＥ１−１４２（配列番号１３１）のＶＬＣＤＲ１と少なくとも８０％同一の第１のＶＬＣＤＲと、
（ｅ）Ｅ１−３３（配列番号７７）、Ｅ１−３４（配列番号８３）、Ｅ１−８０（配列番号７７）、Ｅ１−８９（配列番号９４）、Ｅ２−９３（配列番号１００）、Ｅ１−３８（配列番号１００）、Ｅ１−５２（配列番号７７）、Ｅ２−３６（配列番号８３）、Ｅ１−９５（配列番号８３）、Ｅ２−１１６（配列番号１００）、Ｅ２−１３５（配列番号１２７）、またはＥ１−１４２（配列番号１００）のＶＬＣＤＲ２と少なくとも８０％同一の第２のＶＬＣＤＲと、
（ｆ）Ｅ１−３３（配列番号７８）、Ｅ１−３４（配列番号８４）、Ｅ１−８０（配列番号８９）、Ｅ１−８９（配列番号９５）、Ｅ２−９３（配列番号１０１）、Ｅ１−３８（配列番号１０５）、Ｅ１−５２（配列番号１０９）、Ｅ２−３６（配列番号１１４）、Ｅ１−９５（配列番号１１８）、Ｅ２−１１６（配列番号１２２）、Ｅ２−１３５（配列番号１２８）、またはＥ１−１４２（配列番号１３２）のＶＬＣＤＲ３と少なくとも８０％同一の第３のＶＬＣＤＲと
を含む、単離抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２９１，９８７号の利益を主張し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、一般的には癌生物学の分野に関する。より具体的には、癌の治療及び検出のためのＥＧＦＬ６を標的とするモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
2．関連技術の説明
ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン６（ＥＧＦＬ６）は、腫瘍及び胎児組織中で最初に発見され、ＥＧＦ反復スーパーファミリーのメンバーである。ＥＧＦＬ６は、４つと半分のＥＧＦ様反復ドメイン、２つのＮ結合グリコシル化部位、１つのインテグリン関連モチーフ（ＲＧＤ）、チロシンリン酸化部位、及びＭＡＭドメインを有する分泌タンパク質として同定された（Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。研究は、ＥＧＦＬ６の高発現が、卵巣癌及び肺癌のような特定の癌タイプにおける腫瘍組織と関連していることを示し、健康な成人組織中で見られる発現は限られていた（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｃｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、及びＯｂｅｒａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。しかしながら、ＥＧＦＬ６陽性癌の治療のための試薬及び療法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、ＥＧＦＬ６に結合するＥＧＦＬ６モノクローナル抗体について記載される。さらなる態様では、提供されるＥＧＦＬ６結合抗体は、ＥＧＦＬ６シグナル伝達を低減し、癌細胞増殖を阻害するのに使用することができる。よって、第１の実施形態では、ＥＧＦＬ６に特異的に結合する単離または組換えモノクローナル抗体が提供される。特定の態様では、ＥＧＦＬ６のＥ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２モノクローナル抗体との結合を競合する抗体が提供される。特定の態様では、抗体は、Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び／または軽鎖可変領域の全部または一部を含み得る。さらなる態様では、抗体は、本実施形態のＥ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２モノクローナル抗体の軽鎖及び／または重鎖からの第１、第２、及び／または第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列を含み得る。
【０００５】
特定の態様では、単離抗体は、Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のＣＤＲ領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＣＤＲ配列を含む。さらなる態様では、抗体は、ＣＤＲのうちの１つ以上での１つまたは２つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を除き、Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２ＣＤＲ領域と同一のＣＤＲ領域を含む。例えば、抗体は、ＣＤＲ配列が、Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２モノクローナル抗体のＣＤＲと比較して、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及び／またはＶＬＣＤＲ３における１つまたは２つのアミノ酸置換を含む、ＣＤＲを含むことができる。よって、いくつかの特定の態様では、実施形態の抗体は、（ａ）Ｅ１−３３（配列番号４）、Ｅ１−３４（配列番号１０）、Ｅ１−８０（配列番号１６）、Ｅ１−８９（配列番号２２）、Ｅ２−９３（配列番号２８）、Ｅ１−３８（配列番号３４）、Ｅ１−５２（配列番号４０）、Ｅ２−３６（配列番号４６）、Ｅ１−９５（配列番号５２）、Ｅ２−１１６（配列番号５８）、Ｅ２−１３５（配列番号６４）、またはＥ１−１４２（配列番号７０）のＶＨＣＤＲ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨＣＤＲと、（ｂ）Ｅ１−３３（配列番号５）、Ｅ１−３４（配列番号１１）、Ｅ１−８０（配列番号１７）、Ｅ１−８９（配列番号２３）、Ｅ２−９３（配列番号２９）、Ｅ１−３８（配列番号３５）、Ｅ１−５２（配列番号４１）、Ｅ２−３６（配列番号４７）、Ｅ１−９５（配列番号５３）、Ｅ２−１１６（配列番号５９）、Ｅ２−１３５（配列番号６５）、またはＥ１−１４２（配列番号７１）のＶＨＣＤＲ２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第２のＶＨＣＤＲと、（ｃ）Ｅ１−３３（配列番号６）、Ｅ１−３４（配列番号１２）、Ｅ１−８０（配列番号１８）、Ｅ１−８９（配列番号２４）、Ｅ２−９３（配列番号３０）、Ｅ１−３８（配列番号３６）、Ｅ１−５２（配列番号４２）、Ｅ２−３６（配列番号４８）、Ｅ１−９５（配列番号５４）、Ｅ２−１１６（配列番号６０）、Ｅ２−１３５（配列番号６６）、またはＥ１−１４２（配列番号７２）のＶＨＣＤＲ３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第３のＶＨＣＤＲと、（ｄ）Ｅ１−３３（配列番号７６）、Ｅ１−３４（配列番号８２）、Ｅ１−８０（配列番号８８）、Ｅ１−８９（配列番号９３）、Ｅ２−９３（配列番号９９）、Ｅ１−３８（配列番号１０４）、Ｅ１−５２（配列番号１０８）、Ｅ２−３６（配列番号１１３）、Ｅ１−９５（配列番号１１７）、Ｅ２−１１６（配列番号１２１）、Ｅ２−１３５（配列番号１２６）、またはＥ１−１４２（配列番号１３１）のＶＬＣＤＲ１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＬＣＤＲと、（ｅ）Ｅ１−３３（配列番号７７）、Ｅ１−３４（配列番号８３）、Ｅ１−８０（配列番号７７）、Ｅ１−８９（配列番号９４）、Ｅ２−９３（配列番号１００）、Ｅ１−３８（配列番号１００）、Ｅ１−５２（配列番号７７）、Ｅ２−３６（配列番号８３）、Ｅ１−９５（配列番号８３）、Ｅ２−１１６（配列番号１００）、Ｅ２−１３５（配列番号１２７）、またはＥ１−１４２（配列番号１００）のＶＬＣＤＲ２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第２のＶＬＣＤＲと、（ｆ）Ｅ１−３３（配列番号７８）、Ｅ１−３４（配列番号８４）、Ｅ１−８０（配列番号８９）、Ｅ１−８９（配列番号９５）、Ｅ２−９３（配列番号１０１）、Ｅ１−３８（配列番号１０５）、Ｅ１−５２（配列番号１０９）、Ｅ２−３６（配列番号１１４）、Ｅ１−９５（配列番号１１８）、Ｅ２−１１６（配列番号１２２）、Ｅ２−１３５（配列番号１２８）、またはＥ１−１４２（配列番号１３２）のＶＬＣＤＲ３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第３のＶＬＣＤＲと、を含む。特定の態様では、こうした抗体は、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、または遺伝的に修飾されたＩｇＧ）骨格上に前述のＣＤＲを含むヒト化または脱免疫化抗体である。
【０００６】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号４、５、６、７６、７７、及び７８により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−３３の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−３３のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【０００７】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−３３（配列番号１５７）のＶＨドメインまたはＥ１−３３ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−３３のＶＬドメイン（配列番号１５８）またはＥ１−３３ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−３３ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−３３ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−３３ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−３３ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−３３のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【０００８】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号１０、１１、１２、８２、８３、及び８４により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−３４の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−３４のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【０００９】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−３４（配列番号１５９）のＶＨドメインまたはＥ１−３４ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−３４（配列番号１６０）のＶＬドメインまたはＥ１−３４ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−３４ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−３４ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−３４ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−３４ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−３４のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００１０】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号１６、１７、１８、８８、７７、及び８９により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−８０の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−８０のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００１１】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−８０（配列番号１６１）のＶＨドメインまたはＥ１−８０ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−８０（配列番号１６２）のＶＬドメインまたはＥ１−８０ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−８０ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−８０ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−８０ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−８０ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−８０のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００１２】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号２２、２３、２４、９３、９４、及び９５により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−８９の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−８９のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００１３】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−８９（配列番号１６３）のＶＨドメインまたはＥ１−８９ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−８９（配列番号１６４）のＶＬドメインまたはＥ１−８９ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−８９ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−８９ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−８９ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−８９ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−８９のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００１４】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号２８、２９、３０、９９、１００、及び１０１により表される、モノクローナル抗体Ｅ２−９３の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−９３のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００１５】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ２−９３（配列番号１６５）のＶＨドメインまたはＥ２−９３ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ２−９３（配列番号１６６）のＶＬドメインまたはＥ２−９３ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ２−９３ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−９３ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ２−９３ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−９３ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−９３のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００１６】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号３４、３５、３６、１０４、１００、及び１０５により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−３８の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−３８のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００１７】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−３８（配列番号１６７）のＶＨドメインまたはＥ１−３８ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−３８（配列番号１６８）のＶＬドメインまたはＥ１−３８ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−３８ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−３８ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−３８ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−３８ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−３８のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００１８】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号４０、４１、４２、１０８、７７、及び１０９により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−５２の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−５２のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００１９】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−５２（配列番号１６９）のＶＨドメインまたはＥ１−５２ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−５２（配列番号１７０）のＶＬドメインまたはＥ１−５２ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−５２ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−５２ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−５２ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−５２ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−５２のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００２０】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号４６、４７、４８、１１３、８３、及び１１４により表される、モノクローナル抗体Ｅ２−３６の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−３６のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００２１】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ２−３６（配列番号１７１）のＶＨドメインまたはＥ２−３６ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ２−３６（配列番号１７２）のＶＬドメインまたはＥ２−３６ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ２−３６ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−３６ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ２−３６ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−３６ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−３６のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００２２】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号５２、５３、５４、１１７、８３、及び１１９により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−９５の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−９５のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００２３】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−９５（配列番号１７３）のＶＨドメインまたはＥ１−９５ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−９５（配列番号１７４）のＶＬドメインまたはＥ１−９５ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−９５ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−９５ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−９５ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−９５ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−９５のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００２４】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号５８、５９、６０、１２１、１００、及び１２２により表される、モノクローナル抗体Ｅ２−１１６の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−１１６のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００２５】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ２−１１６（配列番号１７５）のＶＨドメインまたはＥ２−１１６ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ２−１１６（配列番号１７６）のＶＬドメインまたはＥ２−１１６ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ２−１１６ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−１１６ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ２−１１６ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−１１６ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−１１６のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００２６】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号６４、６５、６６、１２６、１２７、及び１２８により表される、モノクローナル抗体Ｅ２−１３５の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−１３５のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００２７】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ２−１３５（配列番号１７７）のＶＨドメインまたはＥ２−１３５ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ２−１３５（配列番号１７８）のＶＬドメインまたはＥ２−１３５ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ２−１３５ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−１３５ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ２−１３５ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ２−１３５ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ２−１３５のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００２８】
さらなる態様では、単離抗体は、それぞれ、配列番号７０、７１、７２、１３１、１００、及び１３２により表される、モノクローナル抗体Ｅ１−１４２の対応するＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の第１のＶＨ、第２のＶＨ、第３のＶＨ、第１のＶＬ、第２のＶＬ、及び第３のＶＬＣＤＲ配列を含む。１つの態様では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−１４２のＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００２９】
別の態様では、単離抗体は、Ｅ１−１４２（配列番号１７９）のＶＨドメインまたはＥ１−１４２ｍＡＢのヒト化ＶＨドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＨドメインと、Ｅ１−１４２（配列番号１８０）のＶＬドメインまたはＥ１−１４２ｍＡＢのヒト化ＶＬドメインと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＶＬドメインと、を含む。例えば、抗体は、ヒト化Ｅ１−１４２ｍＡＢのＶＨドメインと少なくとも９５％同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−１４２ｍＡＢのＶＬドメインと少なくとも９５％同一のＶＬドメインと、を含むことができる。よって、いくつかの態様では、抗体は、ヒト化Ｅ１−１４２ｍＡＢのＶＨドメインと同一のＶＨドメインと、ヒト化Ｅ１−１４２ｍＡＢのＶＬドメインと同一のＶＬドメインと、を含む。具体的な例では、単離抗体は、モノクローナル抗体Ｅ１−１４２のものと同一のＶＨ及びＶＬドメインを含むことができる。
【００３０】
いくつかの態様では、実施形態の抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、遺伝的に修飾されたＩｇＧアイソタイプ、またはこれらの抗原結合断片であり得る。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、一価ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、二重特異性、または単一ドメイン抗体であり得る。抗体は、ヒト、ヒト化、または脱免疫化抗体であり得る。さらなる態様では、単離抗体は、Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、またはＥ１−１４２抗体である。
【００３１】
いくつかの態様では、抗体は、イメージング剤、化学療法剤、毒素、または放射性核種と複合され得る。具体的な態様では、抗体は、アウリスタチンまたは特にモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）と複合され得る。
【００３２】
１つの実施形態では、Ｅ１−３３（配列番号４、５、及び６）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−３４（配列番号１０、１１、及び１２）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−８０（配列番号１６、１７、及び１８）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−８９（配列番号２２、２３、及び２４）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−９３（配列番号２８、２９、及び３０）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−３８（配列番号３４、３５、及び３６）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−５２（配列番号４０、４１、及び４２）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−３６（配列番号４６、４７、及び４８）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−９５（配列番号５２、５３、及び５４）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−１１６（配列番号５８、５９、及び６０）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−１３５（配列番号６４、６５、及び６６）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３、またはＥ１−１４２（配列番号７０、７１、及び７２）のＶＨドメインのＣＤＲ１〜３を含む抗体ＶＨドメインを含む、組換えポリペプチドが提供される。別の実施形態では、Ｅ１−３３（配列番号７６、７７、及び７８）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−３４（配列番号８２、８３、及び８４）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−８０（配列番号８８、７７、及び８９）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−８９（配列番号９３、９４、及び９５）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−９３（配列番号９９、１００、及び１０１）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−３８（配列番号１０４、１００、及び１０５）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−５２（配列番号１０８、７７、及び１０９）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−３６（配列番号１１３、８３、及び１１４）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ１−９５（配列番号１１７、８３、及び１１８）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−１１６（配列番号１２１、１００、及び１２２）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、Ｅ２−１３５（配列番号１２６、１２７、及び１２８）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３、またはＥ１−１４２（配列番号１３１、１００、及び１３２）のＶＬドメインのＣＤＲ１〜３を含む抗体ＶＬドメインを含む、組換えポリペプチドが提供される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、抗体または本明細書に開示される抗体ＶＨもしくはＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド分子が提供される。
【００３４】
さらなる実施形態では、実施形態のモノクローナル抗体または組換えポリペプチドを産生する宿主細胞が提供される。いくつかの態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、繊毛虫細胞、または昆虫細胞である。特定の態様では、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞である。
【００３５】
またさらなる実施形態では、細胞中で本明細書に開示される抗体のＶＬまたはＶＨ鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を発現させることと、細胞から抗体を精製することと、含む、本発明の抗体の製造方法が提供される。
【００３６】
追加の実施形態では、本明細書に記載されるような抗体または抗体断片を含む薬学的組成物がある。こうした組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み、追加の有効成分を含有してもしなくてもよい。
【００３７】
本発明の実施形態では、有効量の本明細書に開示される抗体を投与することを含む、癌を有する対象の治療方法が提供される。特定の態様では、抗体は、Ｅ１−３３、Ｅ１−３４、Ｅ１−８０、Ｅ１−８９、Ｅ２−９３、Ｅ１−３８、Ｅ１−５２、Ｅ２−３６、Ｅ１−９５、Ｅ２−１１６、Ｅ２−１３５、もしくはＥ１−１４２抗体またはこれらから誘導される抗体断片を含む組換えポリペプチドのような、本明細書における実施形態のモノクローナル抗体である。
【００３８】
特定の態様では、癌は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、前立腺癌、食道癌、気管癌、脳癌、肝臓癌、膀胱癌、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、結腸癌、直腸癌、または皮膚癌であり得る。具体的な態様では、癌は、上皮癌である。他の態様では、癌は、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、乳癌、肝細胞癌、卵巣癌、淡明細胞型腎細胞癌、肺癌、または腎臓癌であり得る。
【００３９】
１つの態様では、抗体は、全身投与され得る。追加の態様では、抗体は、静脈内、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、または局所投与され得る。方法は、対象に少なくとも第２の抗癌療法を行うことをさらに含み得る。第２の抗癌療法の例としては、これらに限定されないが、外科療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法が挙げられる。
【００４０】
さらなる態様では、方法は、対象に本発明の組成物を、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０回以上のような、１回以上投与することをさらに含み得る。
【００４１】
別の実施形態では、対象からの試料中の対照と比較して高いＥＧＦＬ６の存在について試験することを含む、対象における癌の検出方法であって、試験が、試料を本明細書に開示される抗体と接触させることを含む、方法が提供される。例えば、方法は、インビトロまたはインビボ方法であり得る。
【００４２】
特定の実施形態は、ＥＧＦＬ６に特異的に結合する抗体または単離及び／もしくは組換え抗体もしくはポリペプチドを含む組換えポリペプチド組成物を対象とする。特定の態様では、抗体またはポリペプチドは、本明細書で提供されるいずれかのモノクローナル抗体の全部または一部と、少なくとも、または多くて８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一（またはその中で誘導可能ないずれかの範囲）である配列を有する。またさらなる態様では、単離及び／または組換え抗体またはポリペプチドは、本明細書で提供される配列のいずれかまたはこうした配列の組み合わせからの、少なくとも、または多くて１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の隣接するアミノ酸を有する。
【００４３】
またさらなる態様では、実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかの１つ以上のアミノ酸セグメントを含む。例えば、抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である、その間の全ての値及び範囲を含む、約、少なくとも、または多くて５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００個のアミノ酸長を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸セグメントを含むことができる。特定の態様では、アミノセグメントは、本明細書で提供されるＥＧＦＬ６結合抗体のアミノ酸配列のうちの１つから選択される。
【００４４】
またさらなる態様では、実施形態の抗体またはポリペプチドは、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸セグメントを含み、セグメントは、本明細書で提供されるいずれかの配列においてアミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００で始まり、同じ提供される配列においてアミノ酸位置４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５〜２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００で終わる。特定の態様では、アミノセグメント、またはその部分は、本明細書で提供されるＥＧＦＬ６結合抗体のアミノ酸配列のうちの１つから選択される。
【００４５】
またさらなる態様では、実施形態の抗体またはポリペプチドは、（表１及び２に提供されるような）ＥＧＦＬ６結合抗体のＶ、ＶＪ、ＶＤＪ、Ｄ、ＤＪ、Ｊ、またはＣＤＲドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一（またはその中で誘導可能ないずれかの範囲）であるアミノ酸セグメントを含む。例えば、ポリペプチドは、表１及び２に提供されるようなＥＧＦＬ６結合抗体のＣＤＲ１、２、及び／または３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一（またはその中で誘導可能ないずれかの範囲）である１、２、または３つのアミノ酸セグメントを含み得る。
【００４６】
本発明の方法及び／または組成物の文脈において議論される実施形態は、本明細書に記載されるいずれかの他の方法または組成物に関して使用され得る。よって、１つの方法または組成物に関する実施形態は、本発明の他の方法及び組成物にも適用され得る。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａ）ｎ」という語は、１つ以上を意味し得る。
【００４８】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すという明らかな指示がない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「及び／または」を意味するが、本開示は、代替物及び「及び／または」のみを指すという定義を支持する。本明細書で使用されるとき、「別の」とは、少なくとも第２の以上を意味し得る。
【００４９】
本明細書全体を通して、「約」という用語は、値が、装置についての誤差の固有変動、値を決定するのに使用される方法、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すのに使用される。
【００５０】
本発明の他の対象、特徴、及び利点は、下記の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本発明の精神及び範囲内での様々な変更及び修正が明らかとなるので、詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ与えられていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに明示するために含まれる。本発明は、本明細書で提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせた、これらの図面のうちの１つ以上への参照によって、より良く理解され得る。特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含有する。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、申請及び必要な手数料の支払い後、特許庁より提供されるであろう。
【００５２】
【図１】ＡＤＣ（抗体−薬物複合体）の作用原理を示す概略図。その標的抗原との結合後、ＭＡｂ−抗原複合体はエンドソームに内在化され、これは次にリソソームと融合され、そこでＭＡｂが分解され、薬物が放出される。
【図２】ＥＬＩＳＡによる高結合ＥＧＦＬ６抗体の検出。ヒト（左バー）またはマウス（右バー）ＥＧＦＬ６タンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は、９６ウェル高結合プレートに、一晩、４℃、ＰＢＳ中でコーティングされた。Ｂ細胞培養上清（５μｌの培地及び９５μｌのＰＢＳ）は、プレート上にコーティングされたＥＧＦＬ６抗原に、これとの結合のために添加された。結合した抗体は、ＨＲＰ及びＴＭＢ基質と複合されたウサギＩｇＧに対する二次抗体を使用して検出された。実験は確認のために２回繰り返された。
【図３】ＥＬＩＳＡにおけるＥＧＦＬ６抗体の結合親和性の決定。一連の抗体濃度はＥＬＩＳＡにおいて分析され、４パラメータフィッティングは抗体の結合親和性を計算するのに使用された。実験は３回の繰り返しを有し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】ＥＧＦＬ６は、腫瘍関連内皮細胞では上方調節されるが、正常卵巣及び創傷治癒組織ではされない。Ａ）内皮細胞の単離の要約。Ｂ）正常卵巣からの内皮細胞、創傷治癒組織、及び卵巣腫瘍関連内皮細胞の遺伝子マイクロアレイ。Ｃ）卵巣患者におけるＥＧＦＬ６、ＣＤ３１、及びＶＥＧＦの発現。Ｄ）Ｑ−ＲＴ  ＰＣＲを使用する遺伝子マイクロアレイデータのバリデーション。スケールバー＝１００μｍ。
【図５】ＥＧＦＬ６遺伝子サイレンシングは、Ａ２７８０ｉｐ２卵巣同所性マウスモデルにおいて、創傷治癒を悪化させず、腫瘍負荷を低減した。Ａ）ｓｉ対照及びＳｉＥＧＦＬ６処理皮膚内皮細胞におけるＥＧＦＬ６の発現。Ｂ）インビトロでの創傷治癒に対するＥＧＦＬ６サイレンシングの効果。Ｃ）棒グラフは創傷治癒面積を表す。Ｄ）創傷治癒に対するＥＧＦＬ６サイレンシングの効果Ｅ）創傷体積Ｆ）腫瘍負荷の代表画像Ｇ）腫瘍重量、及びＨ）腫瘍結節。
【図６】ＴＷＩＳＴ１は低酸素においてＥＧＦＬ６発現を誘発する。Ａ、Ｂ）正常酸素及び低酸素条件下でのＥＧＦＬ６プロモーターレポーター分析。Ｃ）ＴＷＩＳＴ１は低酸素条件下でＥＧＦＬ６の発現を増加させるＤ）ＴＷＩＳＴ１はＥＧＦＬ６のプロモーター領域に結合する。Ｅ及びＦ）ＴＷＩＳＴ１の異所性発現はＲＦ２４細胞におけるＥＧＦＬ６発現を増加させる。Ｇ）正常酸素と比較した低酸素においてＥＧＦＬ６プロモーター領域に結合するＴＷＩＳＴ１のＣｈＩＰ分析。ヒト卵巣内皮細胞（ＲＦ２４）においてＥＧＦＬ６プロモーターに結合するＴＷＩＳＴ１のＥＧＦＬ６及びＣｈＩＰアッセイ。ＴＷＩＳＴ１で処理され、ＥＧＦＬ６またはＩｇＧ対照抗体で免疫沈降されたＲＦ２４細胞からの架橋クロマチン。インプット及び免疫沈降ＤＮＡに、ＥＧＦＬ６転写開始部位の塩基対上流に対応するプライマーを使用してＰＣＲが行われた。ＰＣＲ産物は臭化エチジウム染色アガロースゲル上で調査された。Ｈ）ｓｉＲＮＡを使用するＥＧＦＬ６遺伝子サイレンシングは、低酸素条件において増加した細胞死をもたらす。Ｉ）後肢虚血。動脈結紮後、大腿動脈は摘出され、マウスは３つのグループ（ｎ＝５）：正常、虚血−２４時間、及び虚血−９６時間に分離された。血流は、連続レーザードップラーを使用して、大腿動脈結紮の前及び後にモニタリングされた。各時点で、組織は採取され、凍結され、免疫蛍光が行われた。Ｊ、Ｋ）ＥＧＦＬ６発現は、正常条件と比較して虚血（低酸素）条件において内皮細胞中で増加した。
【図７】内皮細胞のＥＧＦＬ６での処理は、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化する。Ａ）対照及びＥＧＦＬ６処理ＲＦ２４細胞におけるＲＰＰＡ分析。Ｂ）ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴシグナル伝達のＥＧＦＬ６媒介性活性化のウェスタンブロッティング。Ｃ）ＥＧＦＬ６媒介性ＩＧＦ−Ｒ、ＥＧＦＲ、及びＴｉｅ２受容体活性化のウェスタンブロッティング。Ｄ）Ｔｉｅ２抗体はインテグリンタンパク質をプルダウンした。Ｅ）サイトゾル及び膜画分タンパク質におけるＴｉｅ２及びＡＫＴシグナル経路。Ｆ）ｓｉＩＴＧＢ１及びｓｉＴｉｅ２処理ＲＦ２４細胞におけるＴｉｅ２及びＡＫＴシグナル経路。Ｇ、Ｈ）特異的ｓｉＲＮＡを使用するインテグリン及びＴｉｅ２のサイレンシングは、（Ｈ）内皮細胞中のＥＧＦＬ６媒介性チューブ形成（Ｇ）及び遊走を減少させる。Ｉ）ＲＧＤ遮断ペプチドは、インテグリン媒介シグナル経路Ｊ）遊走Ｋ）及び内皮細胞中のチューブ形成を減少させる。
【図８−１】ＥＧＦＬ６機能的遮断抗体は、血管新生及び腫瘍増殖を低減する。Ａ）線グラフは抗体結合親和性を表す。Ｂ）ＲＦ２４細胞におけるＴｉｅ２／ＡＫＴ活性化に対するＥＧＦＬ６遮断抗体の効果。対照、ｍＡｂ９３、及びｍＡｂ１３５作用濃度は、１０ｕｇ／ｍｌである。Ｃ）皮膚内皮細胞での創傷治癒アッセイに対するＥＧＦＬ６遮断抗体の効果。Ｄ）ＲＦ２４細胞におけるチューブ形成及びＥ）遊走に対するＥＧＦＬ６遮断抗体の効果。Ｆ）ＳＫＯＶ３ｉｐ１腫瘍保有マウス腫瘍重量、腫瘍結節に対するＥＧＦＬ６遮断抗体の効果。Ｇ）Ｋｉ６７及びＣＤ３１発現は細胞増殖及び管密度を示した。腫瘍細胞注入の７日後、マウスはランダムに３つのグループ（１０匹のマウス／グループ）：（１）対照Ａｂ（５ｍｇ／ｋｇ）、（２）ＥＧＦＬ６Ａｂ９３（５ｍｇ／ｋｇ）、及び（３）ＥＧＦＬ６Ａｂ１３５（５ｍｇ／ｋｇ）に分けられ、療法を受けた。抗体は週１回投与された。本明細書における実施例に記載されるように腫瘍は採取された。本明細書における実施例に記載されるように創傷は形成され、腫瘍は採取された。エラーバーはＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５対対照Ａｂ。
【図８−２】ＥＧＦＬ６抗体による内皮細胞（ＲＦ２４細胞）のチューブ形成の阻害。対照抗体との比較において、抗体は（５μｇ／ｍｌ濃度で）細胞培養物（ＲＦ２４）に添加された。チューブの数は９６ウェルアッセイプレートにおいて４８時間の処理後に計測された。図８Ｈは各グループの代表を示し、棒グラフは各処理グループにおけるチューブ数の平均を示す。エラーバーは標準誤差を示し、ｎ＝３である。
【図９−１】Ｔｉｅ２−ｃｒｅ、ＥＧＦＬ６ｆ／ｆノックアウトマウスの作製。Ａ）Ｔｉｅ２  ｃｒｅ、ＥＧＦＬ６ノックアウトマウスの作製。Ｂ）同腹子及びＥＧＦＬ６ノックアウトマウスでの単離内皮細胞におけるＣＤ３１発現。Ｃ）単離内皮細胞におけるＥＧＦＬ６発現。
【図９−２】ＥＧＦＬ６遺伝子サイレンシングは、ＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣同所性マウスモデルにおいて、腫瘍負荷及び血管新生を低減する。Ｄ）様々な卵巣癌細胞におけるＥＧＦＬ６の発現。Ｅ、Ｆ）卵巣癌のＳＫＯＶ３ｉｐ１同所性マウスモデルにおける腫瘍重量及び腫瘍結節に対する内皮細胞（ｍＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ）または腫瘍（ｈＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ）標的化ＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡの効果。腫瘍細胞注入の７日後、マウスはランダムに４つのグループ（１０匹のマウス／グループ）：（１）対照ｓｉＲＮＡ、（２）ｍＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ、（３）ｈＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ、（４）ｍＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ＋ｈＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡに分けられ、療法を受けた。対照または処理グループ中のいずれかの動物が瀕死となった際（療法の３〜４週間後）マウスは犠死させ、腫瘍重量（Ｅ）及び腫瘍結節の数（Ｆ）が記録された。エラーバーはＳＥＭを示す。Ｇ）増殖及び微小血管密度に対する標的化ＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡの効果。採取された腫瘍はＫｉ６７増殖及びＣＤ３１について染色された。スケールバー＝５０μｍ。グラフ中のバーは左の画像の標識カラムに連続して対応する。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１０】ＥＧＦＬ６は腫瘍血管新生を調節する。Ａ）ヒト正常卵巣、卵巣腫瘍、及び創傷治癒組織は解離され、単離内皮細胞及び試料はマイクロアレイ用に加工された。Ｂ）ヒト正常卵巣、創傷、及び卵巣腫瘍試料におけるＶＥＧＦの発現。Ｃ）、Ｄ）、Ｅ）対照ｓｉＲＮＡ及びＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ処理ＲＦ２４細胞、ならびに特徴的なチューブ形成及び遊走。ＥＧＦＬ６についての低または高免疫組織化学染色を有するヒト卵巣癌血管系の代表画像。スケールバー＝２００μｍ。エラーバーはＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５対対照ｓｉＲＮＡ。
【図１１】動物は、創傷ありまたはなしで、対照ｓｉＲＮＡ−ＣＨまたはｍＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ−ＣＨのいずれかで処理された。採取された腫瘍はＫｉ６７（増殖）及びＣＤ３１（微小血管）について染色された。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１２】内皮細胞のＥＧＦＬ６での処理は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を活性化する。Ａ）対照及びＥＧＦＬ６処理ＲＦ２４内皮細胞におけるタンパク質発現変化を示すＲＰＰＡ分析のヒートマップ表示。Ｂ）対照及びＥＧＦＬ６処理ＲＭＧ２細胞におけるタンパク質発現変化を示すＲＰＰＡ分析のヒートマップ表示。Ｃ）、Ｄ）内皮細胞におけるＰＩ３Ｋ阻害により低減されたＥＧＦＬ６媒介性遊走及びチューブ形成（下パネル）。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
例示的態様の説明
ＥＧＦＬ６は、創傷治癒に関与するＥＧＦ反復スーパーファミリーのメンバーである。しかしながら、高いＥＧＦＬ６は、卵巣癌及び肺癌のような、様々な癌細胞タイプにおいても見出された。本明細書における研究は、ＥＧＦＬ６活性の阻害が腫瘍組織において癌細胞増殖及び血管新生を阻害するのに効果的であることを示す。また、ここで提供されるＥＧＦＬ６結合抗体は、ＥＧＦＬ６活性及び癌細胞増殖を阻害するのに効果的であることが見出された。よって、実施形態の抗体は、癌を治療及び血管新生を阻害するための新たな効果的な方法を提供する。
【００５４】
Ｉ．実施形態の抗体
特定の実施形態では、ＥＧＦＬ６タンパク質の少なくとも一部分に結合し、ＥＧＦＬ６シグナル伝達及び癌細胞増殖を阻害する、抗体またはその断片が考慮される。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及び遺伝的に修飾されたＩｇＧのような、いずれかの免疫学的結合剤、ならびに抗原結合活性を保持する抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドを広く指すことが意図される。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクロナール抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗原結合抗体断片または天然もしくは合成配位子からなる群から選択され得る。好ましくは、抗ＥＧＦＬ６抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
【００５５】
よって、既知の手段により、及び本明細書に記載されるように、ポリクロナールまたはモノクローナル抗体、抗体断片、ならびに結合ドメイン及びＣＤＲ（前述のいずれかの操作形態を含む）が作製され得、それらはＥＧＦＬ６タンパク質、その各エピトープのうちの１つ以上、または前述のいずれかの複合体、こうした抗原もしくはエピトープが天然供給源から単離されるか、または天然化合物の合成誘導体もしくは多様体であるかに特異的である。
【００５６】
本実施形態に適した抗体断片の例としては、限定なく、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる「Ｆｄ」断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる「Ｆｖ」断片、（ｉｖ）ＶＨドメインからなる、「ｄＡｂ」断片、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの結合Ｆａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して結合ドメインを形成するのを可能にするペプチドリンカーにより連結した、一本鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）、（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖダイマー（米国特許第５，０９１，５１３号参照）、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構成されるダイアボディ、多価または多重特異的断片（米国特許出願公開第２００５／０２１４８６０号）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得る。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも作製され得る（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００５７】
実施形態では、抗体様結合ペプチド模倣体も考慮される。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、漸減抗体として作用し、より長い血清半減期及びより面倒の少ない合成方法の特定の利点を有するペプチドである、「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）について記載する。
【００５８】
動物には、ＥＧＦＬ６タンパク質に特異的な抗体を産生するために、ＥＧＦＬ６細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質のような、抗原が接種され得る。しばしば、抗原は、免疫応答を向上させる別の分子に結合または複合される。本明細書で使用されるとき、複合体は、動物において免疫応答を誘導するのに使用される抗原に結合したいずれかのペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパク質性物質である。抗原接種に応答して動物において産生される抗体は、様々な個別の抗体産生Ｂリンパ球から作製される様々な非同一性分子（ポリクロナール抗体）を含む。ポリクロナール抗体は、抗体種の混合集団であり、その各々は同じ抗原上の異なるエピトープを認識し得る。動物におけるポリクロナール抗体産生のための正しい条件を前提として、動物の血清中の抗体のほとんどは、動物を免疫化した抗原性化合物上の集合的エピトープを認識するであろう。この特異性は、対象の抗原またはエピトープを認識する抗体のみを選別する親和性精製によりさらに向上する。
【００５９】
モノクローナル抗体は、抗体の単一種であり、全ての抗体産生細胞が単一Ｂリンパ球細胞株に由来するので、各抗体分子は同じエピトープを認識する。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための方法は、一般的には、ポリクロナール抗体を調製するためのものと同じように開始する。いくつかの実施形態では、マウス及びラットのような齧歯類が、モノクローナル抗体の産生に使用される。いくつかの実施形態では、ウサギ、ヒツジ、またはカエル細胞が、モノクローナル抗体の産生に使用される。ラットの使用は、周知であり、特定の利点を提供し得る。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）は、日常的に使用され、一般的には高割合の安定な融合体をもたらす。
【００６０】
ハイブリドーマ技術は、ＥＧＦＬ６抗原で予め免疫化されたマウスからの単一Ｂリンパ球の、不死骨髄腫細胞（通常はマウス骨髄腫）との融合を含む。この技術は、無限の量の同じ抗原またはエピトープ特異性（モノクローナル抗体）を有する構造的に同一の抗体が産生され得るように、不定数の産生物のために単一抗体産生細胞を増殖する方法を提供する。
【００６１】
形質Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５−ＣＤ１９＋）は、免疫化ウサギの調製されたばかりのウサギ末梢血単核細胞から単離され、ＥＧＦＬ６結合細胞からさらに選別され得る。抗体産生Ｂ細胞の富化後、トータルＲＮＡが単離され、ｃＤＮＡが合成され得る。重鎖及び軽鎖の両方からの抗体可変領域のＤＮＡ配列は、増幅され、ファージディスプレイＦａｂ発現ベクターに構成され、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換され得る。ＥＧＦＬ６特異的結合Ｆａｂは、複数回の富化パンニングを通して選別され、配列決定され得る。選別されたＥＧＦＬ６結合ヒットは、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の哺乳動物発現ベクター系を使用するウサギ及びウサギ／ヒトキメラ形態の完全長ＩｇＧとして表され、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）分離ユニットでタンパク質Ｇ樹脂を使用して精製され得る。
【００６２】
１つの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、例えば、異種の非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／または定常ドメイン配列）に移植された非ヒトドナーからの抗原結合配列を含む抗体である。方法は、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト由来の類似ドメインで置き換え、外来抗体の可変領域をインタクトなままにするように開発された。あるいは、「完全ヒト」モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックなマウスにおいて産生される。方法はまた、齧歯類、例えば、マウス、及びヒトの両方のアミノ酸配列を有する抗体可変ドメインを組換え構成することにより、モノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒト形態に変換するように開発された。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワーク及び定常領域はヒトアミノ酸配列に由来する（米国特許第５，０９１，５１３及び６，８８１，５５７号参照）。齧歯類に特徴的な抗体中のアミノ酸配列をヒト抗体の対応する位置に見られるアミノ酸配列で置き換えることは、治療的使用中の有害免疫反応の可能性を低減するであろうと考えられる。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞には、ハイブリドーマにより産生される抗体の結合特異性を変化してもしなくてもよい、遺伝子変異または他の変更も行われ得る。
【００６３】
様々な動物種においてポリクロナール抗体を産生するため、ならびにヒト化、キメラ、及び完全ヒトを含む、様々なタイプのモノクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野において周知であり、高度に予測可能である。例えば、下記の米国特許及び特許出願：米国特許出願第２００４／０１２６８２８及び２００２／０１７２６７７号、ならびに米国特許第３，８１７，８３７、３，８５０，７５２、３，９３９，３５０、３，９９６，３４５、４，１９６，２６５、４，２７５，１４９、４，２７７，４３７、４，３６６，２４１、４，４６９，７９７、４，４７２，５０９、４，６０６，８５５、４，７０３，００３、４，７４２，１５９、４，７６７，７２０、４，８１６，５６７、４，８６７，９７３、４，９３８，９４８、４，９４６，７７８、５，０２１，２３６、５，１６４，２９６、５，１９６，０６６、５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、５，４２０，２５３、５，５６５，３３２、５，５７１，６９８、５，６２７，０５２、５，６５６，４３４、５，７７０，３７６、５，７８９，２０８、５，８２１，３３７、５，８４４，０９１、５，８５８，６５７、５，８６１，１５５、５，８７１，９０７、５，９６９，１０８、６，０５４，２９７、６，１６５，４６４、６，３６５，１５７、６，４０６，８６７、６，７０９，６５９、６，７０９，８７３、６，７５３，４０７、６，８１４，９６５、６，８４９，２５９、６，８６１，５７２、６，８７５，４３４、及び６，８９１，０２４号は、こうした方法を実施可能にする説明を提供する。本明細書及びその中で引用される全ての特許、特許出願公開、及び他の刊行物は、これによって本明細書に参照により組み込まれる。
【００６４】
抗体は、鳥類及び哺乳類を含む、いずれかの動物供給源から産生され得る。好ましくは、抗体は、ヒツジ、ネズミ（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。加えて、より新しい技術は、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリからのヒト抗体の開発及びこれについてのスクリーニングを可能にする。例えば、バクテリオファージ抗体発現技術は、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第６，９４６，５４６号に記載されるように、特異的抗体を動物免疫化の非存在下で産生することを可能にする。これらの技法は、Ｍａｒｋｓ（１９９２）、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、及びＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）にさらに記載されている。
【００６５】
ＥＧＦＬ６に対する抗体が、動物種、モノクローナル細胞株、または抗体の他の供給源にかかわらず、ＥＧＦＬ６の効果を中和またはこれに対抗する能力を有するであろうことは、十分に予想される。特定の動物種は、抗体の「Ｆｃ」部分を通した補体系の活性化によってアレルギー応答を引き起こす可能性が高い場合があるので、治療抗体を産生するのに好ましくない場合がある。しかしながら、全抗体は、「Ｆｃ」（補体結合）断片に、及び結合ドメインまたはＣＤＲを有する抗体断片に酵素的に消化され得る。Ｆｃ部分の除去は、抗原抗体断片が望ましくない免疫学的応答を誘導する可能性を低減し、よって、Ｆｃを含まない抗体は、予防または治療処置について優先的であり得る。上で記載されたように、抗体はまた、動物に、他の種において産生されたか、または他の種からの配列を有する抗体を投与することからもたらされる有害な免疫学的結果を低減または排除するために、キメラまたは部分的もしくは完全にヒトであるように構成され得る。
【００６６】
置換多様体は、典型的には、タンパク質内の１つ以上の部位での１つのアミノ酸の別のアミノ酸との交換を含有し、他の機能または特性の喪失ありまたはなしで、ポリペプチドの１つ以上の特性を調整するように設計され得る。置換は保存的であり得、すなわち、１つのアミノ酸は、同様の形状及び電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの、アルギニンのリジンへの、アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの、アスパルテートのグルタメートへの、システインのセリンへの、グルタミンのアスパラギンへの、グルタメートのアスパルテートへの、グリシンのプロリンへの、ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの、イソロイシンのロイシンまたはバリンへの、ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの、リジンのアルギニンへの、メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの、フェニルアラニンのチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの、セリンのトレオニンへの、トレオニンのセリンへの、トリプトファンのチロシンへの、チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの、及びバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変更を含む。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように、非保存的であり得る。非保存的変更は、典型的には、極性または荷電アミノ酸を非極性または非荷電アミノ酸で、及びその逆のように、残基を化学的に非類似のもので置換することを含む。
【００６７】
タンパク質は、組換え体であるか、またはインビトロで合成され得る。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質は、細菌から単離され得る。こうした多様体を含有する細菌が、組成物及び方法において実現され得ることも考慮されている。結果として、タンパク質は、単離される必要はない。
【００６８】
組成物中に１ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの総ポリペプチド、ペプチド、及び／またはタンパク質があることが考慮されている。よって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または多くて約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌ以上（またはその中で誘導可能ないずれかの範囲）であり得る。このうち、約、少なくとも約、または多くて約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、ＥＧＦＬ６に結合する抗体であり得る。
【００６９】
抗体または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に複合されるか、またはそれとして表され得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的について、全てのこうした融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。
【００７０】
実施形態は、少なくとも１つの薬剤と結合したＥＧＦＬ６、ポリペプチド、及びペプチドに対する抗体及び抗体様分子を提供し、抗体複合体またはペイロードを形成する。診断または治療薬としての抗体分子の有効性を増加させるために、従来は、少なくとも１つの所望の分子または部分を結合または共有結合または錯化する。こうした分子または部分は、これらに限定されないが、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であり得る。エフェクター分子は、所望の活性、例えば、細胞毒性活性を有する分子を含む。抗体に付着したエフェクター分子の非限定的な例としては、毒素、治療酵素、抗生物質、放射線標識ヌクレオチド、等が挙げられる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得るいずれかの部分として定義される。抗体と複合されたレポーター分子の非限定的な例としては、酵素、放射線標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、クロモフォア、発光分子、光親和性分子、ビオチンのような、着色粒子または配位子が挙げられる。
【００７１】
抗体のその複合体部分への付着または複合のためのいくつかの方法は、当該技術分野において知られている。いくつかの付着方法は、例えば、抗体に付着したジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリアミン四酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、及び／またはテトラクロロ−３−６？−ジフェニルグリコウリル−３のような有機キレート剤を使用する金属キレート錯体の使用を含む。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下、酵素と反応させ得る。フルオレセインマーカーとの複合体は、これらのカップリング剤の存在下またはイソチオシアネートとの反応により調製される。
【００７２】
ＩＩ．疾患の治療
本実施形態の特定の態様を使用して、ＥＧＦＬ６シグナル伝達に関連した疾患または障害を予防または治療することができる。ＥＧＦＬ６のシグナル伝達は、いずれかの適切な薬物により低減され、癌細胞増殖が防止され得る。好ましくは、こうした物質は、抗ＥＧＦＬ６抗体であろう。
【００７３】
「治療」及び「治療する」とは、対象への治療薬の投与もしくは適用、または疾患もしくは健康関連状態の治療利益を得る目的のための対象に対する手順もしくはモダリティの実施を指す。例えば、治療は、薬学的有効量のＥＧＦＬ６シグナル伝達を阻害する抗体の投与を含み得る。
【００７４】
「対象」及び「患者」とは、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物のような、ヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００７５】
本願全体を通して使用される「治療利益」または「治療有効」という用語は、この状態の医学的処置に関して対象の健康を促進または向上させるいずれかのものを指す。これは、これに限定されないが、疾患の兆候または症状の頻度または重症度の低減を含む。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍のサイズの低減、腫瘍の侵襲性の低減、癌の増殖速度の低減、または転移の予防を含み得る。癌の治療はまた、癌を有する対象の生存期間の延長を指し得る。
【００７６】
Ａ．薬学的調製物
阻害抗体を含有する治療組成物の臨床適用が行われる場合、一般的には、意図される適用に適した薬学的または治療組成物を調製するのが有益であろう。特定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％、または、例えば、約２５％〜約６０％、及びその中で誘導可能ないずれかの範囲を含み得る。
【００７７】
本実施形態の治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注入可能な組成物の形態で有利に投与され、注入前の液体中での溶解、または懸濁に適した固体形態も調製され得る。これらの調製物はまた、乳化され得る。
【００７８】
「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じて、ヒトのような動物に投与される場合、有害、アレルギー、または他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。抗体または追加の有効成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らせば当業者に知られるであろう。また、動物（例えば、ヒト）投与について、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性、及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られるであろう、いずれか及び全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール性／水性溶液、食塩溶液、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロース、等のような、非経口ビヒクル）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチルのような、注入可能な有機エステル）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗細菌または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、補液及び栄養補給剤、同様の物質及びこれらの組み合わせを含む。薬学的組成物中の様々な成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータに従って調節される。
【００８０】
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に個別の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路及び治療レジメンと関連して上で議論された所望の応答をもたらすように計算された所定の量の治療組成物を含有する。処置の数及び単位用量の両方に従って投与される量は、所望の効果に依存する。患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、対象の体重、年齢、健康、及び性別、治療される疾患のタイプ、疾患浸透の程度、以前または併用の治療介入、患者の突発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の有効性、安定性、毒性のような、物理的及び生理的因子により決定することができる。例えば、用量はまた、投与当たり約１μｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（こうした範囲は介在する用量を含む）以上、及びその中で誘導可能ないずれかの範囲を含み得る。本明細書に挙げられる数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重、等の範囲を投与することができる。投与の責任を負う医師は、いずれかの事象において、組成物中の有効成分の濃度及び個別の対象に適した用量を決定するであろう。
【００８１】
活性化合物は、非経口投与用に配合、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、またはさらに腹腔内経路を介した注入用に配合することができる。典型的には、こうした組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができ、注入前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製する使用に適した固体形態も調製することができ、調製物は乳化することもできる。
【００８２】
注入可能な使用に適した薬学的形態は、無菌水性溶液または分散物、ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む配合物、及び無菌注入可能溶液または分散物の即席調製用の無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、無菌でなければならず、容易に注入され得る程度に流動性でなければならない。また、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌のような、微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
【００８３】
タンパク質性組成物は、中性または塩形態に配合され得る。薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸付加塩を含み、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸のような、無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸、等のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン、等のような有機塩基からも誘導することができる。
【００８４】
薬学的組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等）、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体を含むことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのような、コーティングの使用により、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等によりもたらすことができる。多くの場合では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注入可能組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によりもたらすことができる。
【００８５】
Ｂ．併用治療
特定の実施形態では、本実施形態の組成物及び方法は、第２のまたは追加の療法と組み合わせた、癌細胞増殖におけるその活性を阻害するＥＧＦＬ６に対する抗体または抗体断片を含む。こうした療法は、ＥＧＦＬ６媒介性細胞増殖に関連したいずれかの疾患の治療において適用することができる。例えば、疾患は、癌であり得る。
【００８６】
併用療法を含む、方法及び組成物は、治療もしくは予防効果を向上、及び／または別の抗癌もしくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加させる。治療及び予防方法及び組成物は、癌細胞の死滅及び／または細胞過剰増殖の阻害のような、所望の効果を達成するのに効果的な組み合わされた量で提供することができる。このプロセスは、細胞を、抗体または抗体断片及び第２の療法の両方と接触させることを含み得る。組織、腫瘍、または細胞は、薬剤（すなわち、抗体もしくは抗体断片または抗癌剤）のうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物または薬理学的配合物と接触させることができ、または組織、腫瘍、及び／もしくは細胞を２つ以上の異なる組成物もしくは配合物と接触させることにより、１つの組成物は、１）抗体もしくは抗体断片、２）抗癌剤、または３）抗体もしくは抗体断片及び抗癌剤の両方を提供する。また、こうした併用療法は、化学療法、放射線療法、外科療法、または免疫療法と共に使用することができることが考慮されている。
【００８７】
「接触された」及び「曝露された」という用語は、細胞に適用される場合、本明細書では、それにより治療構成物及び化学療法または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接隣接して配置されるプロセスを説明するのに使用される。細胞死滅を達成するには、例えば、両方の薬剤が細胞に、細胞を死滅させるか、またはこれが分裂するのを防止するのに効果的な組み合わされた量で送達される。
【００８８】
阻害抗体は、抗癌治療の前に、その間に、その後に、またはそれに関する様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時から数分、数日、数週間に及ぶ間隔が置かれ得る。抗体または抗体断片が患者に抗癌剤とは別々に提供される実施形態では、一般的には、２つの化合物が依然として患者に対して有利に組み合わされた効果を発揮することができるように、各送達間で有効期間が切れないことが確保されるであろう。こうした例では、患者に抗体療法及び抗癌療法を、互いの約１２〜２４または７２時間以内及び、より具体的には、互いの約６〜１２時間以内に提供し得ることが考慮されている。いくつかの状況では、治療期間を顕著に延長することが望ましい場合があり、各投与間で数日（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過する。
【００８９】
特定の実施形態では、治療の過程は、１〜９０日以上継続するであろう（こうした範囲は介在する日を含む）。１つの薬剤は、１日目〜９０日目（こうした範囲は介在する日を含む）のうちのいずれかの日またはこれらのいずれかの組み合わせに投与され得、別の薬剤は、１日目〜９０日目（こうした範囲は介在する日を含む）のうちのいずれかの日またはこれらのいずれかの組み合わせに投与されることが考慮されている。単日（２４時間）以内に、患者は、薬剤の１回または複数回の投与を受け得る。また、治療の過程後、抗癌治療が行われていない期間があることが考慮されている。この期間は、彼らの予後、体力、健康、等のような、患者の状態に応じて、１〜７日、及び／または１〜５週間、及び／または１〜１２か月以上（こうした範囲は介在する日を含む）継続し得る。治療サイクルは必要に応じて繰り返されるであろうと予想される。
【００９０】
様々な組み合わせが使用され得る。下の例について、抗体療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である。
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【００９１】
本実施形態のいずれかの化合物または療法の患者への投与は、薬剤の、もしあれば毒性を考慮して、こうした化合物の投与のための一般的なプロトコルに従うであろう。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法が原因である毒性をモニタリングするステップがある。
【００９２】
ｉ．化学療法
本実施形態に従って多種多様な化学療法剤が使用され得る。「化学療法」という用語は、癌を治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を示すのに使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすか、及びどのステージで影響を及ぼすかにより分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡに直接架橋、ＤＮＡにインターカレート、または核酸合成に影響を及ぼすことにより染色体及び有糸分裂異常を誘発するその能力に基づいて特徴付けられ得る。
【００９３】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロスホスファミドのような、アルキル化剤、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンのような、アルキルスルホネート、ベンゾドパ、カルボキオン、メツレドパ、及びウレドパのような、アジリジン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチイレンチオホスホラミド、及びトリメチルオルオメラミンを含む、エチレンイミン及びメチルアメラミン、アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）、（合成類似体トポテカンを含む）カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）、ドラスタチン、（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）デュオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンギスタチン、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸酸化物、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、及びウラシルマスタードのような、窒素マスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチンのような、ニトロスレア、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１及びカリケアマイシンオメガ１）のような、抗生物質、ダイネマイシンＡを含む、ダイネマイシン、クロドロネートのような、ビスホスホネート、エスペラマイシン、ならびにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連クロモタンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラルナイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣのような、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラルナイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような、抗代謝物、デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキサートのような、ギ酸類似体、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンのような、プリン類似体、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロキシウリジンのような、ピリミジン類似体、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピトスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトンのような、アンドロゲン、ミトタン及びトリロスタンのような、抗アドレナール、フロリン酸のような、葉酸補給剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エルフォルミチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシン及びアンサマイトシンのような、メイタンシノイド、マイトグアゾン、マイトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ多糖錯体、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、マイトブロニトール、マイトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンのような、白金配位錯体、ビンブラスチン、白金、エトポシド（ＶＰ−１６）、イフォスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン、テニポシド、エダトラキセート、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ、イバンドロネート、イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、ジフルオロメチロルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノール酸のような、レチノイド、カペシタビン、カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ノベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００９４】
ｉｉ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子は、γ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への放射性同位体の特異的送達として一般的に知られているものを含む。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５及び４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射のような、ＤＮＡ損傷因子の他の形態も考慮される。これらの因子の全ては、広範囲のＤＮＡ損傷、ＤＮＡ前駆体、ＤＮＡ複製及び修復、ならびに染色体の組立て及び維持に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までに及ぶ。放射性同位体の線量範囲は、広く変動し、同位体の半減期、放出される放射線の強度及びタイプ、ならびに新生細胞による取込みに依存する。
【００９５】
ｉｉｉ．免疫療法
当業者であれば、実施形態の方法と組み合わせて、またはこれらと共に、追加の免疫療法が使用され得ることを理解するであろう。癌治療の文脈において、免疫療法剤は、一般的には、癌細胞を標的化して破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））はこうした例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独では、療法のエフェクターとして作用し得るか、または細胞死滅に実際に影響を及ぼすように他の細胞を動員し得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素、等）と複合され、標的化剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接のいずれかで相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞毒性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む
【００９６】
抗体−薬物複合体は、癌治療薬の開発へのブレークスルーアプローチとして出現した。癌は、世界の主要な死亡原因の１つである。抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、細胞死滅薬物と共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む（図１）。このアプローチは、それらの抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を、高度に有効な細胞毒性薬物と組み合わせ、ペイロード（薬物）を富化レベルの抗原を有する腫瘍細胞に送達する「武装」ＭＡｂをもたらした（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｔｅｉｃｈｅｒ  ２０１４、Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。薬物の標的化送達はまた、正常組織中でのその曝露を最小化し、減少した毒性及び向上した治療指数をもたらす。ＦＤＡによる２つのＡＤＣ薬物、２０１１年のＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）及び２０１３年のＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）の承認は、このアプローチの有効性を立証した。現在、癌治療の臨床試験の様々な段階において３０個超のＡＤＣ薬物候補がある（Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。抗体操作及びリンカー−ペイロード最適化は、どんどん成熟しており、新たなＡＤＣの創薬は、このアプローチに適した新たな標的の同定及び検証（Ｔｅｉｃｈｅｒ  ２００９）及び標的化ＭＡｂの産生にますます依存している。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞中での上方調節された／高レベルの発現及びロバストな内在化である。
【００９７】
免疫療法の１つの態様では、腫瘍細胞は、標的化に対して順応性である、すなわち、他の細胞の大半には存在しない、いくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちのいずれかは、本実施形態の文脈における標的化に適している場合がある。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮのような、サイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８のような、ケモカイン、ＦＬＴ３配位子のような、増殖因子を含む、免疫刺激分子も存在する。
【００９８】
現在調査または使用中である免疫療法の例としては、免疫補助剤、例えば、マイコバクテリウム・ボビス、プラスモジウム・ファルシパラム、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５及び５，７３９，１６９号、Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８、Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８、米国特許第５，８３０，８８０及び５，８４６，９４５号）、ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗−ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２、Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第５，８２４，３１１号）がある。本明細書に記載される抗体療法と共に１つ以上の抗癌療法が使用され得ることが考慮されている。
【００９９】
ｉｖ．外科手術
癌を有する人々の約６０％は、予防的、診断的または病期分類、根治、及び姑息手術を含む、何らかのタイプの外科手術を受けるであろう。根治手術は、癌性組織の全部または一部が物理的に除去、摘出、及び／または破壊される切除術を含み、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／または代替療法のような、他の療法と共に使用され得る。腫瘍切除術とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除術に加えて、外科手術による治療は、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び微視的制御手術（モース手術）を含む。
【０１００】
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の摘出後、体内には空洞が形成され得る。治療は、追加の抗癌療法を受けた領域の灌流、直接注入、またはの局所適用により達成され得る。こうした治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、及び５週間毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２か月毎に繰り返され得る。これらの治療は、変動する投与量も有し得る。
【０１０１】
ｖ．他の薬剤
処置の治療有効性を向上させるために本実施形態の特定の態様と組み合わせて他の薬剤が使用され得ることが考慮されている。これらの追加の薬剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰ結合の上方調節に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖細胞のアポトーシス誘発因子に対する感受性を増加させる薬剤、または他の生物学的薬剤が挙げられる。ＧＡＰ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤は、治療の抗過剰増殖有効性を向上させるために本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の有効性を向上させると考えられる。細胞接着阻害剤の例としては、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンがある。抗体ｃ２２５のような、過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる他の薬剤を、治療有効性を向上させるために本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用することができることは、さらに考慮されている。
【０１０２】
ＩＩＩ．キット及び診断薬
実施形態の様々な態様では、キットは、治療薬及び／または他の治療及び送達剤を含有すると想定される。いくつかの実施形態では、本実施形態は、実施形態の療法を調製及び／または投与するためのキットについて考慮する。キットは、本実施形態の薬学的組成物のうちのいずれかを含有する１つ以上の封止されたバイアルを含み得る。キットは、例えば、少なくとも１つのＥＧＦＬ６抗体ならびに実施形態の成分を調製、配合、及び／もしくは投与するか、または本発明の方法の１つ以上のステップを行うための試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブのような、キットの成分と反応しない容器である、適切な容器も含み得る。容器は、プラスチックまたはガラスのような殺菌可能な材料から作製され得る。
【０１０３】
キットは、本明細書に記載される方法の手順ステップを概説し、本明細書に記載されるものと実質的には同じか、または当業者に知られている手順に従う取扱説明書をさらに含み得る。取扱説明情報は、コンピュータを使用して実行される場合、薬学的有効量の治療薬を送達する現実または仮想の手順を表示させる、機械可読取扱説明を含有するコンピュータ可読媒体中にあり得る。
【実施例】
【０１０４】
ＩＶ．実施例
本発明の好ましい実施形態を示すために下記の実施例が含まれる。下記の実施例において開示される技法は、発明者により本発明の実施において十分に機能することが見出された技法を表し、よってその実施に好ましいモードを構成するものとみなすことができることが、当業者により理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更を行い、依然として同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０１０５】
実施例１−ヒトＥＧＦＬ６を標的とするモノクローナル抗体の産生及びクローニング
ＥＧＦＬ６（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション＃Ｑ８ＩＵＸ８）タンパク質を使用して、ＲｅｖＭＡｂ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．でニュージーランドウサギを免疫化した。抗ＥＧＦＬ６血清の力価を、ＥＧＦＬ６タンパク質を９６ウェルプレート（ｍａｘ−ｓｏｒｂプレート、Ｎｕｎｃ）にコーティングすることによる結合についてのＥＬＩＳＡにおける血清の一連の希釈により決定し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びＴＭＢ基質と複合された抗ウサギ抗体で検出した。２〜３回の追加の免疫化後、力価は＞１０６に到達し、末梢血試料を、蛍光補助細胞選別（ＦＡＣＳ）装置（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、調製されたばかりの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＢ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ５−ＣＤ１９＋）単離のために、免疫化ウサギから回収した。単離Ｂ細胞を単一Ｂ細胞として播種し、７〜１０日間培養した。培養上清をＥＧＦＬ６結合について分析した。陽性ウェルからの細胞を溶解し、トータルＲＮＡを単離し、スーパースクリプト逆転写酵素ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してｃＤＮＡを合成した。重鎖及び軽鎖の両方からの抗体可変領域のＤＮＡ配列を、設計されたプライマーのセットを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、配列決定した。ＤＮＡ及びアミノ酸配列の両方を下のセクションＶ．に挙げる。抗ＥＧＦＬ６モノクローナル抗体のＣＤＲを、ＩＭＧＴプログラムを使用して同定し、表１及び２に挙げる。
【０１０６】
（表１）ＥＧＦＬ６抗体の重鎖可変配列のＣＤＲ
2019512210.tif 000004
2019512210.tif 000005
【０１０７】
（表２）ＥＧＦＬ６抗体の軽鎖可変配列のＣＤＲ
2019512210.tif 000006
2019512210.tif 000007
2019512210.tif 000008
【０１０８】
選別されたＥＧＦＬ６結合ヒットを、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の哺乳動物発現ベクター系を使用するウサギまたはウサギ／ヒトキメラＩｇＧとして表した。抗体を、タンパク質Ａ樹脂を含むカラムを使用して、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）分離ユニットにより精製した。精製されたＥＧＦＬ６結合抗体を、それらの生物学的特性について特徴分析した。
【０１０９】
実施例２−ＥＧＦＬ６タンパク質に対する抗ＥＧＦＬ６モノクローナル抗体の結合親和性
モノクローナル抗体によるＥＧＦＬ６の結合を、Ｂ細胞培養物から回収された上清を使用するＥＬＩＳＡによりまずスクリーニングした（図２）。ＥＬＩＳＡ滴定を使用して、モノクローナル抗体のパネルのＥＧＦＬ６抗原に対する結合親和性を決定した（図３）。モノクローナル抗体のパネルの結合定数（ＫＤ及び／またはＥＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄプログラムで４パラメータ曲線フィッティングを使用して推定した。Ｂｉａｃｏｒｅ分析について、全ての実験を２５℃、４５μｌ／分の流量で行った。抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製、酢酸緩衝液中で各々５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０）を、製造業者からの指示に基づくアミンカップリング手順を使用して、カルボキシメチルデキストランセンサーチップ（ＣＭ５）上に固定した。試験される精製ウサギ／ヒトキメラ抗体を、０．５％Ｐ２０、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、５００〜１０００ＲＵに到達するようにＦＣ２に注入した。ＦＣ１を参照細胞として使用した。特異的なシグナルは、ＦＣ２対ＦＣ１で得られるシグナルの相違に対応する。分析物（組換えヒトＥＧＦＬ６、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の見かけ分子量６０ｋＤａ）を、９０秒間、０．５％Ｐ２０、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中での一連の濃度希釈（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、及び３．１３、１．５６ｎＭ）で注入した。これらの濃度は、０．５％Ｐ２０、ＨＢＳ−ＥＰ中のストック溶液から調製した。分析物の解離フェーズを、３０分間にわたりモニタリングした。ランニング緩衝液も、二重参照として同じ条件下で注入した。各ランニングサイクル後、両方のフローセルを、２０〜４５μｌのグリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ１．５を注入することにより再生成した。ＥＧＦＬ６に対する結合ＫＤを、各ＥＧＦＬ６モノクローナル抗体についてのｋオフ／ｋオン速度により計算した（表３）。
【０１１０】
（表３）ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ方法により決定されるＥＧＦＬ６抗体結合親和性
2019512210.tif 000009
【０１１１】
実施例３−実験手順及び方法
細胞株及び培養：ヒト上皮性卵巣癌細胞株、ＳＫＯＶ３ｉｐ１及びＡ２７８０ｉｐ２を、記載されるように維持した（Ｓｏｏｄ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５８，１２７９−１２８８，２００１）。ヒト不死化臍帯内皮細胞（ＲＦ２４）を、補充物（ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ＭＥＭビタミン、及びグルタミン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＭＥＭ培地において増殖させた。マウス卵巣内皮細胞（ＭＯＥＣ）の誘導及び特徴分析については、以前に記載されている（Ｌａｎｇｌｅｙ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈ−２Ｋ（ｂ）−ｔｓＡ５８  ｍｉｃｅ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３，２９７１−２９７６，２００３）。細胞培養物を、９５％湿度を含む５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持した。インビボ注入のために、細胞をトリプシン処理し、１，２００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清ハンクス平衡塩溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で再構成した。（トリパンブルー色素排除により決定される）９５％超の生存率を有する単細胞懸濁液のみを、インビボ腹腔内注入に使用した。
【０１１２】
内皮細胞単離：新鮮な組織試料（５個の正常卵巣、５個の創傷組織、及び１０個の上皮性高悪性度、ステージＩＩＩまたはＩＶ侵襲性漿液性卵巣癌）を、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒで初期の外科的診査を受けている患者から、施設内審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）からの承認後に入手した。精製内皮細胞からのトータルＲＮＡに、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐプラットフォームを使用してマイクロアレイ分析を行った（Ｌｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７，１７５７−１７６８，２００７）。
【０１１３】
定量的リアルタイムＰＣＲバリデーション：定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して単離された、５０ｎｇの精製内皮細胞からのトータルＲＮＡを使用して行った。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して０．５〜１μｇのトータルＲＮＡから合成した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して３通りで行った。相対定量を、正規化して倍率変化パーセントについて制御する２−ΔΔＣＴ方法を使用して計算した（Ｄｏｎｎｉｎｇｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅ  ｓｔａｇｅ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，８０６５−８０７７，２００４）。
【０１１４】
ＳｉＲＮＡ構成物及び送達：ＳｉＲＮＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）から購入した。ＢＬＡＳＴ検索に基づくいずれかの既知のヒトｍＲＮＡとの配列相同性を共有しない非サイレンシングｓｉＲＮＡを、標的ｓｉＲＮＡについての対照として使用した。インビトロ一過性形質導入を、記載されるように行った（Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＥｐｈＡ２  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，６９１０−６９１８，２００５）。簡潔には、ｓｉＲＮＡ（４μｇ）を、１０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００形質導入試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）で、製造業者の指示に従って２０分間室温でインキュベートし、１０ｃｍ培養プレートにおける８０％コンフルエンスの培養物中の細胞に添加した。
【０１１５】
逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）及びウェスタンブロット分析：ヒト組換えＥＧＦＬ６タンパク質の存在または非存在下のＲＦ２４及びＯＶＣＡＲ３細胞に、ＲＰＰＡ分析を行った。ウェスタンブロット分析を、以前のように行った（Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．２００５，同上、Ｈａｌｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，４９１６−４９２４，２００６）。ＲＦ２４細胞の細胞溶解物をヒト組換えＥＧＦＬ６タンパク質または抗ＥＧＦＬ６抗体で処理し、ＰＩ３キナーゼ及びＡＫＴシグナル伝達の活性化について抗ヒトＥＧＦＬ６、ＰＩ３キナーゼ、及びＡＫＴ抗体、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合された二次抗体を使用して確認した。
【０１１６】
細胞遊走アッセイ：０．１％ゼラチンでコーティングされた改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを使用して、ＲＦ２４細胞の遊走をｈＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡの存在または非存在下で評価した。ｈＥＧＦＬ６もしくはインテグリンｓｉＲＮＡでの４８時間またはＥＧＦＬ６抗体もしくはＰＩ３キナーゼ阻害剤での６時間の形質移入後、ＭＥＭ無血清培地中のＲＦ２４細胞（１．０×１０５）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ多孔質ポリカーボネート膜インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ，ＵＳＡ）の上チャンバーに播種した。チャンバーを、化学誘引物質として下チャンバー中に１５％の血清を含むＭＥＭ培地を含有する２４ウェルプレートに配置した。細胞を加湿されたインキュベーターにおいて６時間遊走させた。遊走した細胞を、ヘマトキシリン染色を使用して染色し、光学顕微鏡観察により試料当たり５つのランダムな視野（元の倍率の２００倍）で計測した。実験は２通りで行い、３回実施した。
【０１１７】
チューブ形成アッセイ：マトリゲル（１２．５ｍｇ／ｍＬ）を４℃で解凍し、５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに迅速に添加し、１０分間３７℃で凝固させた。ウェルを次に６時間３７℃で、ＥＧＦＬ６もしくはインテグリンｓｉＲＮＡ（４８時間）またはＥＧＦＬ６抗体もしくはＰＩ３キナーゼ阻害剤（６時間）で予め処理されたＲＦ２４細胞（ウェル当たり２０，０００）でインキュベートした。実験は３通りで行い、２回繰り返した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡を使用して、ウェル当たり５つの画像を１００倍で取得した。画像当たりの（少なくとも３つの細胞が単一点で形成された場合として定義される）節の量を定量化した。細胞凝集を説明するために、最高及び最低値を各グループから除去した。
【０１１８】
プロモーター分析及びクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ：ＲＦ２４細胞を、低血清培地（０．５％血清）中で１８時間培養した後、ＥＧＦＬ６またはＨＩＦ１α（５０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで６時間処理した。処理後、ＣｈＩＰアッセイを、ＥＺ  ＣｈＩＰ（商標）キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者により記載されるように使用して行った。簡潔には、架橋細胞を回収し、溶解し、音波処理し、その後にＥＧＦＬ６（Ａｂｃｈｅｍ）抗体またはＩｇＧ対照での免疫沈降を行った。免疫錯体を、タンパク質Ｇアガロースビーズで回収し、溶出した。架橋を６５℃でインキュベートすることにより元に戻した。ＤＮＡを次に、ＥＧＦＬ６転写開始部位のプライマー対上流を使用するＰＣＲのために、抽出及び精製した。
【０１１９】
フローサイトメトリー分析：ＲＦ２４細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ５ｍＭで採取した。細胞を次に異なるインテグリン一次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で免疫標識し、その後二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアで取得し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【０１２０】
卵巣癌及び組織プロセッシングの同所性インビボモデル：雌無胸腺ヌードマウス（ＮＣｒ−ｎｕ）を、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入し、以前に記載されたように維持した（Ｌａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．２００５、同上）。全てのマウス研究は、施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ    Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。マウスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓにより記載されるガイドラインに従って飼育された。腫瘍細胞注入について、Ａ２７８０ｉｐ２またはＳＫＯＶ３ｉｐ１またはＯＶＣＡＲ３細胞（１×１０６）を腹腔内（ｉ．ｐ）に注入した。療法実験について、各ｓｉＲＮＡを、１５０μｇ／ｋｇ体重の用量で週２回投与した。犠死時、マウス及び腫瘍重量、腫瘍の数及び分布を記録した。解剖を行った個人には処理グループ割り当てがわからないようにした。組織検体を、ホルマリン、ＯＣＴ（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）、または液体窒素中での急速凍結のいずれかで固定した。オフターゲット効果について、ＳＫＯＶ３ｉｐ１腫瘍保有マウスを、上記と同じ２つの異なるＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ配列で処理した。
【０１２１】
異種移植片の免疫組織化学及び免疫蛍光染色：細胞増殖（Ｋｉ６７、１：２００、Ｚｙｍｅｄ）、微小血管密度（ＭＶＤ、ＣＤ３１、１：５００、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、及び低酸素（炭酸脱水酵素抗ＣＡ９、１：５００、Ｎｏｖｕｓ）についてのＩＨＣ分析を全て記載されるように行った（Ｔｈａｋｅｒ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２，９３９−９４４，２００６、Ｌｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ＥＺＨ２．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １８，１８５−１９７，２０１０）。統計分析のために、グループ当たり５つのランダムに選択された腫瘍からの断面を染色し、腫瘍当たり５つのランダムな視野にスコアを付けた。２００倍または１００倍で写真を撮った。マウス腫瘍試料中のＭＶＤを定量化するために、ＣＤ３１について陽性の血管染色の数を、１０個のランダムな０．１５９−ｍｍ２視野において２００倍で記録した。ＰＣＮＡ発現を定量化するために、陽性細胞（３，３’−ジアミノベンジン染色）の数を、１０個のランダムな０．１５９−ｍｍ２視野において１００倍で計測した（Ｔｈａｋｅｒ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００６、同上、Ｌｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０１０、同上）。全ての染色を２人の研究者が盲目で定量化した。ＥＧＦＬ６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びＣＤ３１についての染色は、記載されるように凍結組織を使用して行った（Ｌｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．２０１０、同上）。
【０１２２】
マトリゲルプラグアッセイ：インビボマトリゲルアッセイを、マトリゲルプラグをマウスに皮下注入することにより行った。マトリゲルプラグは、（陰性対照としての）無血清ＭＥＭ完全培地、（陽性対照としての）ＶＥＧＦ、または（試験グループとしての）ＥＧＦＬ６のいずれかを含んだ。注入の６時間後、動物を犠死させ、マトリゲルを回収し、ヘモグロビンアッセイを行った。
【０１２３】
創傷治癒アッセイ：１日目に、Ａ２７８０ｉｐ２細胞をヌードマウスに注入し、２日目に、創傷を腫瘍保有マウスの背中に形成した。動物は獣医の診察を受け、個別のケージに維持された。マウスを２つのグループ（ｎ＝１０）に分けた。
【０１２４】
ＣＨ／対照ｓｉＲＮＡ及びＣＨ／ｍＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡナノ粒子：ｓｉＲＮＡ処理を３日目に開始し、週２回（１５０μｇ／ｋｇ）行った。創傷を（創傷治癒の完了まで）０、１、３、５、７、９、１１、１３、及び１５日目に測定した。いずれかのグループの動物が瀕死となった際に腫瘍を採取した。
【０１２５】
後肢虚血：以前に記載されたような重症後肢虚血（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．，Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｈ．＆ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５，１０２−１１１，２００５）を、腹腔内注入によりケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた後の雌ヌードマウスにおいて誘発し、大腿動脈をその基部に近いところから、伏在及び膝窩動脈に分岐する遠位点への外腸骨動脈の分枝として摘出した。動脈結紮後、マウスを直ちに下記の実験グループ（ｎ＝５）：対照グループ、虚血−２４時間、及び虚血−９６時間に割り当てた。連続レーザードップラーイメージング分析（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｅｖｏｎ，ＵＫ）を行い、大腿動脈結紮前及び後（２４時間及び９６時間後）の後肢の血流をモニタリングした。デジタルカラーコード画像を分析し、膝から爪先までの領域における血流を定量化し、灌流の平均値を計算した。各時点で、虚血肢からの組織を採取し、ＯＣＴ培地において凍結した。マウスモノクローナル抗ＣＤ３１を使用してＭＶＤを、及び標準的な免疫染色手順を使用して、マウスポリクロナール抗ＥＧＦＬ６抗体で、凍結埋込み組織上でのＥＧＦＬ６発現について決定した。
【０１２６】
ヒト卵巣癌検体：施設内審査委員会による承認後、利用可能な臨床転帰データ及び委員会認定婦人科病理学者により確認された診断を有する（１９８５〜２００４年に回収された）１８０個のパラフィン埋込み上皮性卵巣癌検体を、Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ腫瘍バンクから入手した。
【０１２７】
ヒト卵巣癌試料について、ＥＧＦＬ６、ＣＤ３４、及びＶＥＧＦの免疫組織化学を、以前に記載されたように行った（Ａｌｉ−Ｆｅｈｍｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １９２，８１９−８２５，２００５）。ＥＧＦＬ６染色を、抗ヒトＥＧＦＬ６抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。簡潔に、ホルマリン固定パラフィン埋込み組織断面を、脱パラフィン化し、再水和した。Ｄｉｖａ溶液での抗原回収後、内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中の３％過酸化水素で１５分間遮断した。ＰＢＳでの洗浄後、断面を、タンパク質ブロック（５％正常ウマ血清及び１％ヤギ血清）で２０分間室温（ＲＴ）で遮断し、続いて抗ＥＧＦＬ６抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩４℃でインキュベーションを行った。ＰＢＳでの洗浄後、断面をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ヤギ抗ウサギ（１：２５０、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で１時間室温でインキュベートした。最後に、３，３’−ジアミノベンジン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）及びギルヘマトキシリン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）での対比染色で可視化を達成した。陰性染色をスコア０として報告し、ＥＧＦＬ６の増加する強度についてスコア１〜４を使用した。染色の強度及び染色された細胞の割合の両方を考慮する、以前に記載された方法（Ａｌｉ−Ｆｅｈｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００５同上）に従って、染色されたスライドに、組織化学スコア（Ｈ−スコア、＞１００が高発現、≦１００が低発現と定義される）に基づき、２人の研究者がスコアを付けた。
【０１２８】
統計分析：動物実験について、処理グループ当たり１０匹のマウスを割り当てた。この試料サイズは、９５％信頼性で腫瘍重量の５０％低減を検出する８０％の検出力をもたらした。各グループの腫瘍重量及び腫瘍結節の数を、（２つのグループの比較のための）スチューデントのｔ検定を使用して比較した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。全ての統計試験は、両側であり、Ｗｉｎｄｏｗｓ統計ソフトウェア（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）のＳＰＳＳバージョン１２を使用して行った。
【０１２９】
実施例４−腫瘍関連内皮細胞において上方調節されたＥＧＦＬ６発現
５個の正常卵巣、５個の創傷組織試料、及び１０個の侵襲性上皮性卵巣腫瘍を入手し、陰性及び陽性免疫選別を行った。マイクロアレイ分析を実施する前に、内皮細胞について全ての試料の純度を、内皮細胞マーカーＰ１Ｈ１２及びフォンウィレブランド因子を使用して確立した（図４Ａ）。免疫染色は、免疫精製技法が、全ての試料において＞９５％の内皮細胞純度をもたらしたことを明らかにした。データの分析は、３７５個の遺伝子が、正常及び創傷内皮細胞と比較して、卵巣腫瘍内皮細胞において上方調節されたことを明らかにした（図４Ｂ）。とりわけ、ＥＧＦＬ６は、正常及び創傷内皮細胞と比較して、腫瘍内皮細胞において最も高い分化発現を示した（図４Ｂ）。卵巣患者試料におけるＥＧＦＬ６、ＶＥＧＦ、及びＣＤ３１の発現を決定した（図４Ｃ）。この結果をさらに検証するために、内皮細胞を正常卵巣、卵巣腫瘍、及び創傷治癒組織から単離し、ＥＧＦＬ６の発現を、ＰＣＲを使用して決定した。ＥＧＦＬ６は、主に、正常または創傷内皮細胞と比較して、腫瘍内皮細胞においてのみ過剰発現した（図４Ｄ）。腫瘍内皮細胞におけるＥＧＦＬ６上方調節も示された。ＥＧＦＬ６は、内皮細胞及び試験される卵巣癌細胞のほとんどにおいて発現した。腫瘍血管新生におけるＥＧＦＬ６の役割を示すために、ＲＦ２４細胞をｓｉＥＧＦＬ６で処理し、これは対照細胞と比較して７２時間でのタンパク質レベルにおいて８０％超のノックダウンをもたらした。ＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ処理細胞は、対照ｓｉＲＮＡ処理細胞と比較して、顕著に少ない遊走及びチューブ形成を示し、血管新生におけるＥＧＦＬ６の重要性を示した。
【０１３０】
実施例５−ＥＧＦＬ６サイレンシングはマウスにおける創傷治癒に影響を及ぼさなかった
創傷治癒におけるＥＧＦＬ６の役割は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）を使用して、形成された創傷を使用して説明された。創傷治癒に対する効果を、下記の手順を使用して行った。１日目に、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞をヌードマウスに注入し、２日目に、創傷を腫瘍保有マウスの背中に形成した（２ｃｍ×２ｃｍ）。動物をランダムに２つのグループ（ｎ＝１０）に分け、一方に対照抗体を投与し、他方のグループのマウスをＥＧＦＬ６抗体で処理した。抗体処理を３日目に開始し、週１回行った（５ｍｇ／ｋｇ）。創傷（面積＝長さ×幅）を、２週間にわたり創傷治癒の完了までモニタリングした。ＥＧＦＬ６抗体は、インビボ研究において創傷治癒を使用して試験される場合、創傷治癒を妨げなかった（図９Ｃ）。
【０１３１】
創傷治癒アッセイでは、２４時間後、ｓｉ対照処理細胞及びｓｉＥＧＦＬ６処理細胞が、創傷治癒能力に対して効果を有さなかったことが明らかになった（図５Ａ〜５Ｃ）。また、腫瘍保有マウスに形成された同様の創傷を使用し、ネズミｓｉＲＮＡ配列を使用する内皮細胞区画におけるＥＧＦＬ６サイレンシングの創傷治癒に対する効果を決定した。図５Ｄ及び５Ｅに示されるように、対照ｓｉＲＮＡまたはマウスＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡで処理された動物の創傷治癒において顕著な相違は観察されず、両方のグループは創傷治癒の類似パターンも示した。
【０１３２】
しかしながら、マウスＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡで処理された動物は、腫瘍負荷の顕著な低減を示し（図５Ｆ〜５Ｈ）、内皮細胞区画におけるＥＧＦＬ６のサイレンシングが腫瘍増殖に顕著に影響を及ぼすが、創傷治癒を悪化させないことを示した。ＥＧＦＬ６遺伝子サイレンシングは、腫瘍血管における増殖の顕著な低減ももたらした（図１１Ａ〜１１Ｂ）。
【０１３３】
実施例６−ＥＧＦＬ６は内皮細胞における血管新生を向上させる
ＥＧＦＬ６が低酸素条件下で内皮細胞の増加した生存率をもたらすことを確立するために、ＥＧＦＬ６を、ＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡを使用して低酸素状態で低酸素ＲＦ２４細胞においてサイレンシングし、細胞死を調査した。図６Ａに示されるように、細胞のほぼ５０％は、正常酸素と比較して低酸素で５日後も生存した。これとは対照的に、低酸素におけるＥＧＦＬ６遺伝子サイレンシングは、低酸素及び正常酸素条件下の未処理細胞と比較して７５％の細胞死をもたらした（図６Ｈ）。マウスの後肢の大腿動脈を摘出することにより、マウスにおいて後肢虚血を形成し、これは後肢への血液及び酸素供給の遮断をもたらした（図６Ｉ）。図６Ｊ〜６Ｋに示されるように、虚血マウスは、ＭＶＤ（血管）の顕著な低減及び内皮細胞におけるＥＧＦＬ６発現の増加を示した。ＲＦ２４細胞の遊走（図１２Ｃ）及びチューブ形成（図１２Ｄ）は、ＥＧＦＬ６での処理後に増加した。
【０１３４】
実施例７−ＥＧＦＬ６サイレンシングは腫瘍増殖及び血管新生を阻害する
遺伝子サイレンシングにおけるＥＧＦＬ６の治療有効性を、２つの同所性卵巣癌腫瘍モデル、ＳＫＯＶ３ｉｐ１及びＯＶＣＡＲ５を使用して研究した。雌無胸腺ヌードマウス（ＮＣｒ−ｎｕ）は、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入し、全てのマウス研究は、施設内動物実験委員会により承認された。マウスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓにより記載されるガイドラインに従って飼育された。腫瘍細胞注入について、ＳＫＯＶ３ｉｐ１細胞（１×１０６）を腹腔内（ｉ．ｐ）経路を通して注入した。抗体処理グループについて、精製モノクローナル抗体を、５週間にわたり週１回５ｍｇ／ｋｇ体重で投与した。犠死時、マウス及び腫瘍重量、腫瘍の数及び分布を記録した。解剖を行った個人には処理グループ割り当てがわからないようにした。組織検体を、ホルマリン、ＯＣＴ（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）、または液体窒素中での急速凍結のいずれかで固定した。
【０１３５】
図８Ｆに示されるように、ＳＫＯＶ３ｉｐ１腫瘍保有動物のマウスＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ単独及びヒトＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡとの組み合わせでの処理は、対照ｓｉＲＮＡで処理された腫瘍保有マウスと比較して腫瘍増殖の顕著な低減をもたらした。ヒトＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ単独では、腫瘍低減に対する効果はあまりなかった。腫瘍結節の数及び観察された腫瘍負荷に対するＥＧＦＬ６の効果を図８Ｆに示す。マウスＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ単独及びヒトＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡとの組み合わせで処理されたＯＶＣＡＲ５腫瘍保有マウスも、腫瘍重量及び  結節の顕著な低減を示した。
【０１３６】
ｍＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡならびにマウス及びヒトＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡの組み合わせで処理したＳＫＯＶ３ｉｐ１腫瘍保有動物は、対照ｓｉＲＮＡで処理された動物と比較して、増殖細胞及び微小血管密度の顕著な低減を示した（図８Ｃ〜８Ｄ）。ＯＶＣＡＲ５腫瘍保有動物も同様の結果を示した。マウスＥＧＦＬ６  ｓｉＲＮＡ配列のオフターゲット効果を決定するために、ＳＫＯＶ３ｉｐ１腫瘍増殖に対するＥＧＦＬ６遺伝子サイレンシングの効果を、２つの他のマウスｓｉＲＮＡ配列を使用して確認し、両方の配列が腫瘍増殖及び腫瘍結節の実質的な低減を示した。
【０１３７】
抗ＥＧＦＬ６抗体Ｍａｂ＃１３５及び＃９３（Ｅ２−１３５＆Ｅ２−９３）での処理は、腫瘍増殖を大きく抑制し（図８Ｆ）、ＥＧＦＬ６抗体処理マウスでは残留癌細胞のみが検出されたが、未処理対照マウスは、腫瘍結節の数として示されるように、大きな腫瘍負荷及び腫瘍拡散を有した。抗ＥＧＦＬ６抗体（Ｍａｂ  Ｅ２−９３及びＥ２−１３５）での処理はまた、対照抗体処理グループと比較した場合、癌細胞増殖（Ｋｉ６７染色）を阻害し、微小血管密度（腫瘍血管新生、ＣＤ３１  ＩＨＣ染色）を低減した（図８Ｇ）。
【０１３８】
実施例８−抗ＥＧＦＬ６遮断抗体は内皮細胞における血管新生を低減する
ＥＧＦＬ６遮断がその血管新生媒介性機能に影響を及ぼすであろうことを示すために、ＥＧＦＬ６機能的遮断抗体を開発し、血管新生に対するその活性について試験した。ヒト及びマウスＥＧＦＬ６に結合したいくつかのＥＧＦＬ６抗体クローンを同等の親和性でスクリーニングした。２つの抗体（９３及び１３５）は、全ての結合親和性及びインビトロ活性基準を満たし、さらなる研究を実施するのに選択された。図８Ｂに示されるように、内皮細胞のＥＧＦＬ６組換えタンパク質での処理は、リン酸化Ｔｉｅ２及びＡＫＴタンパク質の両方の発現を増加させた。これとは対照的に、ＥＧＦＬ６遮断抗体９３及び１３５は、両方のリン酸化タンパク質の発現の低減をもたらした。図８Ｄ〜Ｅに示されるように、内皮細胞のＥＧＦＬ６組換えタンパク質での処理は、これらの細胞における遊走及びチューブ形成を向上させた。しかしながら、チューブ形成及び遊走の両方のＥＧＦＬ６媒介性機能効果は、ＥＧＦＬ６遮断抗体により顕著に低減された。
【０１３９】
抗体の１つにヒト化を行い、ヒトＩｇＧ１骨格内に配置してヒト癌患者における使用を可能にし、抗体の結合親和性及びインビトロ活性がヒト化後に保存されていたことを示した。
【０１４０】
実施例９−抗ＥＧＦＬ６遮断抗体は、卵巣癌モデルにおいて抗血管新生及び抗腫瘍効果を有した
上で報告されたＥＧＦＬ６のインビトロ活性は、ＥＧＦＬ６機能の遮断が、腫瘍血管を損傷する能力を向上させ、これにより抗腫瘍有効性を増加させるであろうことを示した。これを試験するために、ＥＧＦＬ６の活性を遮断し、血管新生及び腫瘍増殖及び血管新生を阻害するＥＧＦＬ６の能力について調査した。
【０１４１】
ＳＫＯＶ３−ｉｐ１腫瘍保有マウスを、対照抗体及び抗ＥＧＦＬ６抗体で処理した。処理の５週間後、腫瘍を採取し、抗腫瘍及び抗血管新生活性について分析した。抗ＥＧＦＬ６抗体での処理は、対照抗体での処理と比較して有効な抗腫瘍活性をもたらした。抗ＥＧＦＬ６抗体９３及び１３５両方での処理は、腫瘍重量及び腫瘍結節の顕著な低減をもたらした（図９Ｅ及び９Ｆ）。ＥＧＦＬ６遮断抗体で処理された動物は、対照抗体処理グループと比較して減少したＭＶＤも示し（図９Ｆ）、ＥＧＦＬ６活性の遮断が腫瘍増殖及び血管新生を阻害したことを示した。ＥＧＦＬ６抗体は、インビトロまたはインビボで創傷治癒を防げず（図９Ｇ）、正常な組織修復に影響を及ぼすことなく、腫瘍血管新生を調節することができることを示した。
【０１４２】
Ｖ．抗体可変配列
抗ＥＧＦＬ６抗体の可変ＤＮＡ配列を下に示す。
【０１４３】
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【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６６】
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【０１６７】
抗ＥＧＦＬ６抗体の可変アミノ酸配列を下に示す。
【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
開示及び特許請求される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験なく行うことができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されたが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法及び方法のステップまたはステップの順序に変更が適用され得ることは、当業者には明らかとなるであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連した特定の薬剤が、同じまたは類似の結果を達成しながら、本明細書に記載される試薬で置換され得ることは、明らかとなるであろう。当業者には明らかな全てのこうした類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、及び概念に含まれるものとする。
【０１９３】
参考文献
下記の参考文献は、それらが本明細書に記載されるものを補う例示的な手順または他の詳細を提供する程度まで、本明細書に参照により具体的に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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