(57)【要約】本開示は、ＰＤ１特異的アプタマー及びがんを処置する方法に関する。【選択図】図１
2019534708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式
ｎ−Ｌ−ｎ−Ｚ−ｎ−Ｒ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマー
［式中、
「Ｌ」は、核酸配列ＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＣＧＡ（配列番号２）、または配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）を含み、ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、
「Ｒ」は、核酸配列ＣＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＣＧ（配列番号３）、または配列番号３に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
前記ＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【請求項２】
配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
薬学的に許容される担体中に請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡアプタマーを含む組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡアプタマーがナノ粒子にカプセル化されている、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＮＡアプタマーがペグ化されている、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＤＮＡアプタマーが１０ｎＭ〜１０μＭの濃度で存在する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
追加のＤＮＡアプタマーをさらに含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ＣＤ３８に特異的に結合するＤＮＡアプタマーをさらに含む、請求項４〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＣＤ１１７に特異的に結合するＤＮＡアプタマーをさらに含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
抗体をさらに含む、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象においてがんを処置するための方法。
【請求項１３】
前記がんが、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び膀胱癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんが白血病である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんが急性骨髄性白血病である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象がヒトである、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
対象においてＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害するための方法であって、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記ＤＮＡアプタマーがＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する、前記方法。
【請求項１８】
前記対象が、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び膀胱癌からなる群から選択されるがんに罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が急性骨髄性白血病に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月６日出願の米国特許仮出願第６２／３８３，９５２号の利益を請求し、その開示は参照によって本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
分野
本開示は、ＰＤ１特異的アプタマー及びがんを処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
大部分のヒト腫瘍は、腫瘍細胞の除去に有利なステップである細胞傷害性Ｔ細胞応答を開始させる腫瘍関連抗原の発現をもたらす重要な遺伝子的変化及び後成的変化を有する。しかしながら、自己免疫を妨げ、したがって、がん細胞増殖にとって有利であることが分かっている多くのチェックポイント機構が存在する。がん細胞は、免疫学的監視から免れてがんを進行させるために、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を分泌し、Ｔ細胞機能のＰＤ−１媒介阻害を利用することが示されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，ＤＭ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２：２５２−２６４）。近年、マウス及びヒトにおいて腫瘍に対するＴ細胞応答を活性化させるためにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とするいくつかの治療用抗体が開発されており、ＦＤＡの認可を受けている。しかしながら、治療用抗体は、他の免疫学的副作用のために、すべての患者について適しているわけではない。
【発明の概要】
【０００４】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とする治療用抗体を模倣するＤＮＡアプタマーを本明細書で開示する。がんの進行に関与する重要なタンパク質に選択的に結合する高親和性ＤＮＡアプタマーが、新しいクラスの薬物及び診断薬として出現している。ＤＮＡアプタマーは、治療上のタンパク質標的に対するそれらの高い特異性及びがん細胞を死滅させるための有毒なカーゴを身体に運搬するために容易に修飾されるそれらの従順性によって、小分子及び抗体ベースの薬物の代替物である。
【０００５】
一部の態様では、下式：
ｎ−Ｌ−ｎ−Ｚ−ｎ−Ｒ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマーを本明細書で開示する
［式中、
「Ｌ」は、核酸配列ＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＣＧＡ（配列番号２）、または配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）を含み、ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、
「Ｒ」は、核酸配列ＣＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＣＧ（配列番号３）、または配列番号３に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
このＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【０００６】
一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列を含む。
【０００８】
薬学的に許容される担体中に本明細書で開示するＤＮＡアプタマーを含む治療用組成物も開示する。一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーをナノ粒子にカプセル化する。例えば、ＤＮＡアプタマーをＰＥＧ化することができる。
【０００９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡアプタマーは、追加のモジュラーユニットが付加され得る化合物のモジュラー部分として作用する。一部の実施形態では、アプタマーを追加のアプタマーにコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、アプタマーを、抗体または抗体断片にコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、追加のアプタマーにコンジュゲートさせたＤＮＡアプタマーは、二重特異性アプタマーとして作用する。一部の実施形態では、抗体にコンジュゲートさせたＤＮＡアプタマーは、二重特異性アプタマー／抗体分子として作用する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡアプタマーを、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ）の追加のアプタマー（複数可）とコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡアプタマーを、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ）の抗体または抗体断片とコンジュゲートさせる。
【００１０】
一部の実施形態では、アプタマーを、治療薬、例えば抗新生物薬及び／または放射線増感薬にコンジュゲートさせる。一部の実施形態では、アプタマーを、治療薬、例えば抗新生物薬及び／または放射線増感薬と組み合わせて投与する。
【００１１】
抗腫瘍薬（抗新生物薬）には、これに限定されないが、アバレリクス、アビラテロン、アド−トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アフリベルセプト、アルデスロイキン、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、抗胸腺細胞グロブリン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＣＧ、ベリノスタット、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、カルモフール、カルムスチン、クロラムブシル、クロルメチン、セリチニブ、セツキシマブ、チダミド、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、コビメチニブ、クリゾチニブ、シクロフォスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダウノルビシン、ダサチニブ、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキソルビシン、エロツズマブ、エンザルタミド、エピルビシン、エトポシド、エリブリン、エルロチニブ、エストラムスチン、エベロリムス、エキセメスタン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオキシメステロン、フルタミド、フォテムスチン、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、ヒストレリン、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、イミキモド、インターフェロン、ヨーベングアン、イピリムマブ、イリノテカン、イソトレチノイン、ロイプロリド、ロムスチン、メルファラン、メトトレキサート、メルカプトプリン、ミフェプリストン、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ナブ−パクリタキセル、ネシツムマブ、ネダプラチン、ネララビン、ニロチニブ、ニルタミド、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オクトレオチド、オファツムマブ、オラパリブ、オマセタキシン、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パルボシクリブ、パクリタキセル、パニツムマブ、パノビノスタット、パゾパニブ、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、ペントスタチン、プリカマイシン、ポマリドミド、ポナチニブ、プララトレキサート、プロカルバジン、二塩化ラジウムＲａ２２３、ラルチトレキセド、ラムシルマブ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ロミデプシン、ルクソリチニブ、サマリウム（１５３Ｓｍ）レキシドロナム、シルツキシマブ、シプロイセル−Ｔ、ソニデギブ、ソラフェニブ、ストロンチウム−８９、スニチニブ、タリモゲンラヘルパレプベック、タミバロテン、タモキシフェン、テガフール、テガフール／ウラシル、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、トポテカン、トレミフェン、トシリズマブ、トシツモマブ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレチノイン、トリフルリジン／チピラシル併用、トリプトレリン、バルプロエート、バルルビシン、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ベネトクラックス、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビスモデギブ、ボリノスタット、ジブ−アフリベルセプトが含まれる。一部の実施形態では、抗新生物薬は、ヒドロキシ尿素を含む。一部の実施形態では、抗新生物薬は、インターフェロンを含む。一部の実施形態では、抗新生物薬は、ベネトクラックスを含む。
【００１２】
公知の放射線増感薬の例には、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ペントキシフィリン、及びビノレルビンが含まれる。
【００１３】
一部の実施形態では、アプタマーは、分子薬物を標的輸送するための「ＤＮＡナノトレイン」を形成するための係留ＤＮＡ「ボックスカー」である。ＤＮＡ「ボックスカー」は、化学療法薬インターカレーションのための標的であるタンデム型ｄｓＤＮＡ配列である。ドキソルビシン（Ｄｏｘ）、ダウノルビシン（ＤＮＲ）、及びエピルビシン（ＥＰＲ）を含むいくつかの広く使用されているアンスラサイクリン抗がん薬が二本鎖５’−ＧＣ−３’または５’−ＣＧ−３’に優先的にインターカレートし得ることは周知である。したがって、このボックスカーは、薬物インターカレーション部位、例えばＡＣＧ／ＣＧＴを含み得る。
【００１４】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とする治療用抗体を模倣する本開示のアプタマーを２つ以上含む多価アプタマーも開示する。
【００１５】
一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、１０ｎＭ〜２００μＭの濃度で存在する。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法を、対象においてがん、例えば血液悪性病変を処置するために使用する。一部の実施形態では、血液悪性病変には、これに限定されないが、とりわけ白血病、リンパ腫、骨髄障害、リンパ障害、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、肥満細胞障害、及び骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）が含まれる。一部の実施形態では、がんは、白血病である。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、がんは、急性リンパ芽急性白血病（ＡＬＬ）である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【００１７】
対象において感染症を処置するための方法であって、ＰＤ−１特異的アプタマーを含有する本明細書で開示する組成物の有効量を対象に投与することを含む方法も開示する。例えば、感染症は、結核、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及び急性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）からなる群から選択され得る。
【００１８】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面及び下の説明で記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗ＰＤ１抗体を使用してヒト白血病細胞系の溶解産物からＰＤ−１を免疫沈降させた後のイムノブロット分析を示している。細胞を５０ＩＵのインターフェロンで２４時間にわたって処理した。
【図２】選択の代表反復ラウンドからのＰＣＲ増幅ＰＣＲのためのＰＡＧＥ分析を示している。
【図３】ラウンド６及び７からの収束配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ多重配列分析を示している。高反復エレメントＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号６４）が、すべての収束配列に存在する。
【図４】選択の第７ラウンド後の収束配列における近接関係を表す系統樹を示している。
【図５】別々にストレプトアビジン磁気ビーズと混合され、１時間にわたってインキュベートされたそれぞれ５００ピコモルの６つの選択アプタマーを示している。非結合アプタマーを洗浄によって除去し、そのようなビーズを上記ＨＥＬ細胞溶解産物と共にさらにインキュベートし、非結合タンパク質を徹底的に洗浄し、ビーズ上の結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛け、続いて、ＰＤ−１特異的抗体を使用してウェスタン分析した。
【図６】図６Ａは、フローサイトメトリーによる、ＨＥＬ細胞へのＰＤ−１フルオロセインアプタマーの結合を示している。図６Ｂは、ＨＥＬ細胞におけるＰＤ−１アプタマーの蛍光顕微鏡観察を示している。
【図７】ＰＤ−１特異的アプタマーの予測二次構造及び保存的ＧリッチリピートにおけるＧ四重鎖の図である。
【図８】ＰＤ−１抗体及びＰＤ−１アプタマーによって刺激された同種ＭＬＲの７日目の活性化を示している。
【図９−１】図９Ａは、ＰＤ１に結合しているアプタマーｆｐｆ２（１０−１５０−３７３）を示している。
【図９−２】図９Ｂは、ＰＤ１（溶解産物）に結合しているアプタマーｆｐｆ２を示している。
【図１０】ＰＤ−１特異的アプタマーをスクリーニングするためのＳＥＬＥＸ法の略図である。
【図１１】ＳＥＬＥＸのためのＰＤ−１タンパク質の単離及び調製を示している。
【図１２】ＰＤ−１抗体の存在下及び非存在下での、ＰＤ−１への選択ＤＮＡアプタマー間の競合結合アッセイを示している。
【図１３−１】図１３Ａは、ＰＤ−１タンパク質に対する選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証を示している。
【図１３−２】図１３Ｂは、ＰＤ−１タンパク質に対する選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証を示している。
【図１３−３】図１３Ｃ，Ｄは、ＰＤ−１タンパク質に対する選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証を示している。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＰＤ−１タンパク質へのＰＤ−１アプタマーの結合を検証するためのフィルター結合アッセイを示している。
【図１５−１】図１５Ａ、Ｂは、ウェスタン及び免疫沈降分析による、白血病患者サンプルにおけるＰＤ−１タンパク質への選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証を示している。
【図１５−２】図１５Ｃは、ウェスタン及び免疫沈降分析による、白血病患者サンプルにおけるＰＤ−１タンパク質への選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証を示している。
【図１６】抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの文脈における、細胞ベースのアッセイを使用してのＰＤ−１とそのリガンドとの間の相互作用の生物学的活性のスクリーニング及び特徴づけを示している。
【図１７】９６％のヒトＡＢ血清中で検査されたアプタマーの種々の時点での安定性を示している。
【図１８】８０％のヒトＡＢ血清中で検査されたアプタマーの種々の時点での安定性を示している。
【図１９】ＰＤ−１抗体及びＰＤ−１アプタマーによって刺激された同種ＭＬＲの１日目の活性化を示している。
【図２０】ＰＤ−１抗体及びＰＤ−１アプタマーによって刺激された同種ＭＬＲの３日目の活性化を示している。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの機能活性を示している。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｃは、ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの機能活性を示している。
【図２３】ＰＤ−１抗体及びＰＤ−１アプタマーによって刺激された、ＣＤ４を含む混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の１、３、５、及び７日目の活性化を示している。
【図２４】ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１発現対照、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１抗体でのＣＤ４＋Ｔ細胞（ＭＬＲアッセイ）の共焦点顕微鏡分析を示している。
【図２５】ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１発現対照、ＰＤ１アプタマー及びＰＤ−Ｌ１抗体でのＣＤ４＋Ｔ細胞（ＭＬＲアッセイ）の共焦点顕微鏡分析を示している。
【図２６】ＰＤ−１抗体及びＰＤ−１アプタマーによって刺激された、ＣＤ４を含む混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の１、３、及び５日目の活性化を示している。
【図２７】ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの１日目の機能活性を示している（ＣＤ４を含むＭＬＲ）。
【図２８】ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの３日目の機能活性を示している（ＣＤ４を含むＭＬＲ）。
【図２９】ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの５日目の機能活性を示している（ＣＤ４を含むＭＬＲ）。
【図３０】ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの１日目の機能活性を示している（ＣＤ４を含むＭＬＲ）。
【図３１】ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの３日目の機能活性を示している（ＣＤ４を含むＭＬＲ）。
【図３２】ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの５日目の機能活性を示している（ＣＤ４を含むＭＬＲ）。
【図３３】ＰＤ−１抗体及びＰＤ−１アプタマーによって刺激された、ＣＤ８を含む混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の１、３、及び５日目の活性化を示している。
【図３４】ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの１日目の機能活性を示している（ＣＤ８を含むＭＬＲ）。
【図３５】ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの３日目の機能活性を示している（ＣＤ８を含むＭＬＲ）。
【図３６】ＩＦＮγサイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの５日目の機能活性を示している（ＣＤ８を含むＭＬＲ）。
【図３７】ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの１日目の機能活性を示している（ＣＤ８を含むＭＬＲ）。
【図３８】ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの３日目の機能活性を示している（ＣＤ８を含むＭＬＲ）。
【図３９】ＩＬ−２サイトカイン分析のためにＥＬＩＳＡによって、ＰＤ−１抗体と比較して特徴づけられたＰＤ−１アプタマーの５日目の機能活性を示している（ＣＤ８を含むＭＬＲ）。
【図４０】ＴＣＲ／ＰＤ−Ｌ１  ＨＥＫを伴うＪｕｒｋａｔにおけるＰＤ１  ＮＦＡＴｃルシフェラーゼレポーターを示している。
【図４１】Ｉｎｃｕｃｙｔｅ標的細胞溶解活性を示している。
【図４２】ペグ化を用いてアプタマーの安定性を改善するための図を示している。
【図４３】対照と比較して、Ｃｙ３ペグ化アプタマーの平均血漿中濃度を示している。
【図４４】ＨＮＳＧ−ＳＧＭ３マウスを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ実験の略図を示している。
【図４５】Ｈ−ＮＳＧ  ＨＥＬ９２．１．７異種移植片モデルにおける平均腫瘍容積を示している。
【図４６】Ｈ−ＮＳＧ  ＨＥＬ９２．１．７異種移植片モデルにおける中央腫瘍容積を示している。
【図４７】１３日までのＨ−ＮＳＧ  ＨＥＬ９２．１．７異種移植片モデルにおける平均腫瘍容積を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
急性骨髄性白血病は、異常に高い個数の骨髄由来未熟白血球によって特徴づけられる。これには、年に２０，０００人が罹患し、多くは成人である１０，０００人の死亡の原因となっている。これは一般に、加齢個体群（６５＋）において見られる疾患であるが、小児では急性リンパ芽急性白血病に次いで２番目に多いがんの形態である。免疫系によるがん細胞上の腫瘍抗原の認識は、腫瘍細胞の除去において最も重要なステップの１つである。しかしながら、がん細胞は、免疫チェックポイントを活性化させるいくつかのタンパク質を発現することによって免疫応答を免れる異常な能力を発生させ得る。そのような分子には、Ｔ細胞活性化を効果的に阻害し、続いて、免疫学的監視を免れるＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４及びそれらの同族リガンドが含まれる。免疫チェックポイントは、自己免疫を防止するためのビルトイン機構である。また、マクロファージ及び樹状細胞による抗原提示中のタンパク質分解プロセシングは、免疫応答、さらには自己免疫の調節において重要で密接な関係を有する。この高度に組織化された生物学的現象は、適応免疫の樹立にとって重要である。抗原プロセシングのいずれかのステップにおける調節解除は、自己反応性Ｔ細胞の発生または腫瘍の免疫回避をもたらし得る。近年、ヒトにおいて腫瘍に対するＴ細胞応答を活性化させるためにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とするいくつかの治療用抗体が開発されており、ＦＤＡに認可されている。
【００２１】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的とする治療用抗体を模倣し、がん患者においてＴ細胞活性化の回復によって活発な宿主免疫応答を誘発することができるＰＤ−１特異的ＤＮＡアプタマー（抗ＰＤ１−Ａｐｔ）を本明細書で開示する。アプタマーは、３０〜６０塩基長の範囲である短い一本鎖オリゴヌクレオチドから構成される小分子リガンドである。タンパク質抗体と同様に、オリゴヌクレオチドアプタマーは、それらの独特な３次元構造に基づき高い親和性で、それらの標的を特異的に認識し、結合する。ヒトＰＤ１及びそのリガンドＰＤＬ１の相互作用を特異的に遮断するＤＮＡアプタマーを本明細書で開示する。本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴｈ１サイトカインインターフェロン−ガンマ及びＩＬ−２の誘導と共に、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における強固な抗ＰＤ１遮断を実証している。
【００２２】
次いで、本発明の代表的な実施形態に詳細に言及する。本発明を、列挙している実施形態と併せて記載するが、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図したものではないことは理解されるであろう。むしろ本発明は、特許請求の範囲において定義されているとおりの本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替形態、変更形態、及び同等形態に及ぶことが意図されている。
【００２３】
当業者であれば、本発明で使用することができるであろう、かつ本発明の実施の範囲内である、本明細書に記載のものと同様または同等の多くの方法及び物質が分かるであろう。本発明は、記載の方法及び物質に決して限定されない。
【００２４】
別段に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野（複数可）の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法、デバイス、及び物質を本発明の実施または検査において使用することができるが、次では、好ましい方法、デバイス及び材料を記載する。
【００２５】
本開示に引用するすべての刊行物、公開特許文献、及び特許出願は、本開示が属する分野（複数可）の技能レベルを示している。本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文献、及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物、公開特許文献、及び特許出願が特異的に、かつ個別に、参照によって援用されていると示されているのと同じ程度に、参照によって本明細書に援用される。
【００２６】
添付の特許請求の範囲を含めて、本開示で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段に規定していない限り、複数形の言及も含み、「少なくとも１つ」及び「１つまたは複数」と互換的に使用される。したがって、「アプタマー」という言及は、アプタマーの混合物などを含む。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、その数値が関連する項目の基本的な機能が変化しないような数値のささいな変異または変化を表す。一部の実施形態では、用語「約」は、数値の２０％（例えば、２０％、１０％、５％、１％）以内の値を含み得る。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「含む」、「含むこと」、「包含する」、「包含すること」、「含有する」、「含有すること」及びその任意の変形は、非排他的包含に及ぶことが意図されていて、要素または要素のリストを含む、包含する、または含有するプロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または物質組成はこれらの要素を包含するだけでなく、明白に列挙されていないか、またはそのようなプロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、もしくは物質組成に固有の他の要素を包含してよいこととなる。
【００２９】
用語「アプタマー」は、特異的な標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子に関する。これらの分子は一般に、無作為配列プールから選択される。選択されるアプタマーは、独特の三次構造を取り、高い親和性及び特異性で標的分子を認識し得る。「核酸アプタマー」は、その配座によって標的分子に結合し、それによって、そのような分子の機能を阻害または抑制するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組合せによって構成され得る。「ペプチドアプタマー」は、定常骨格タンパク質内に挿入された可変ペプチド配列を含むコンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの同定は典型的には、選択されたペプチドアプタマーが細胞内の状況で安定発現され、正確に折り畳まれる確率が向上するストリンジェントな酵母ジハイブリッド条件下で行われる。
【００３０】
核酸アプタマーは典型的には、規定の二次及び三次構造、例えばステムループまたはＧ四重鎖へと折り畳まれる１０〜１５０塩基長（または例えば１５〜５０塩基長）の範囲のオリゴヌクレオチドである。核酸アプタマーは好ましくは、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合する。核酸アプタマーはまた、非常に高度な特異性で標的分子に結合し得る。核酸アプタマーは、他の非標的分子のＫｄよりも少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍低い標的分子とのＫｄを有することが好ましい。
【００３１】
核酸アプタマーは典型的には、吸着、回収及び再増幅からなる反復プロセスによって、合成オリゴヌクレオチドの複合ライブラリーから単離される。例えば、核酸アプタマーを、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を使用して調製してもよい。ＳＥＬＥＸ法は、無作為配列領域及びその両端にあるプライマー結合領域をそれぞれ有するＲＮＡ分子からなるＲＮＡプールから標的分子に結合するＲＮＡ分子を選択すること、ＲＴ−ＰＣＲによって回収されたＲＮＡ分子を増幅すること、得られたｃＤＮＡ分子をテンプレートとして使用して転写を行うこと、ならびに得られたものをその後の手順のためのＲＮＡプールとして使用することを伴う。そのような手順を、数回から数十回繰り返して、より強い能力で標的分子に結合するＲＮＡを選択する。無作為配列領域及びプライマー結合領域の塩基配列長は、特に限定されない。一般に、無作為配列領域は約２０〜８０塩基を含有し、プライマー結合領域は約１５〜４０塩基を含有する。標的分子に対する特異性を、先を見越して標的分子と同様の分子をＲＮＡプールと混合し、目的の分子に結合しなかったＲＮＡ分子を含有するプールを使用することによって増強してもよい。そのような技法により最終生成物として得られたＲＮＡ分子をＲＮＡアプタマーとして使用する。様々な異なる標的分子に結合するアプタマーを作製及び使用する方法の代表的な例を、米国特許第５，４７６，７６６号、同第５，５０３，９７８号、同第５，６３１，１４６号、同第５，７３１，４２４号、同第５，７８０，２２８号、同第５，７９２，６１３号、同第５，７９５，７２１号、同第５，８４６，７１３号、同第５，８５８，６６０号、同第５，８６１，２５４号、同第５，８６４，０２６号、同第５，８６９，６４１号、同第５，９５８，６９１号、同第６，００１，９８８号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０１３，４４３号、同第６，０２０，１３０号、同第６，０２８，１８６号、同第６，０３０，７７６号、及び同第６，０５１，６９８号において見い出すことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法によって作製されているアプタマー及び非天然リボザイムについての包括的な配列情報を含有するアプタマーデータベースは、ａｐｔａｍｅｒ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕで入手可能である。
【００３２】
核酸アプタマーは一般に、抗体よりも、標的分子に対して高い特異性及び親和性を有する。したがって、核酸アプタマーは、標的分子に特異的に、直接的に、かつ堅固に結合し得る。結合に必要な標的アミノ酸残基の数が、抗体においての数よりも少なくてよいので、例えば、高度に相同なタンパク質のなかから所与のタンパク質の機能を選択的に抑制することが意図されているとき、核酸アプタマーは抗体よりも優れている。
【００３３】
非修飾核酸アプタマーは、主にヌクレアーゼ分解及び腎臓による身体からのクリアランス、アプタマーに固有の低分子量の結果によって、数分から数時間の半減期で血流から急速に除去される。この急速なクリアランスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断などの用途では有利であり得る。しかしながら、いくつかの修飾、例えば２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結などを、アプタマーの血清半減期を日での、さらには週での時間尺度へと延長するために使用可能である。
【００３４】
アプタマーのヌクレアーゼ抵抗性を上昇させるための別のアプローチは、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒを使用することである。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、非天然Ｌ−リボヌクレオチドから構成されたリボ核酸（ＲＮＡ）様分子である。したがって、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、天然オリゴヌクレオチドの立体化学鏡像（鏡像異性体）である。他のアプタマーと同様に、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、タンパク質などの標的分子に結合し得る。それらの標的分子へのＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒの親和性は多くの場合に、ピコモルからナノモル範囲にあり、したがって、抗体に匹敵する。他のアプタマーとは対照的に、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、酵素による加水分解切断を受けにくいので、血清中での安定性が高い。それにもかかわらず、それらは、低い分子量によって短時間で腎臓によって排出される。他のアプタマーとは異なり、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、ＳＥＬＥＸ法によって直接的に生成することができない。これは、Ｌ−核酸が酵素法、例えばポリメラーゼ連鎖反応に適していないためである。代わりに、ＳＥＬＥＸ法によって同定された天然アプタマーの配列が決定され、次いで、それが、天然アプタマーの鏡像の人工合成において使用される。
【００３５】
「ＰＤ−１アプタマー」は、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊するアプタマーである。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ＳＯＭＡマー」またはＳｌｏｗ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒは、＞３０分、＞６０分、＞９０分、＞１２０分、＞１５０分、＞１８０分、＞２１０分、または＞２４０分のオフ速度（ｔ１／２）を有するアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むアプタマーを含む）を指す。一部の実施形態では、ＳＯＭＡマーを、「オフ速度が改善されたアプタマーを生成するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ）」と標題された米国特許第７，９４７，４４７号に記載の改良ＳＥＬＥＸ法を使用して生成する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾形態、さらにはそれらの類似体を指す。ヌクレオチドには、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにそれらの誘導体及び類似体）、さらにはピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにそれらの誘導体及び類似体）を含む種が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指すために互換的に使用され、それらには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾形態が含まれ、ここで、任意の位置でのヌクレオチド単位への様々な実体または部分の結合が含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」には、二本鎖または一本鎖分子、さらには三重らせん分子が含まれる。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語には、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーが含まれるが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限られない。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「修飾する」、「修飾された」、「修飾」及びその任意の変形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用するとき、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）の少なくとも１つが天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を付与する。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、主にタンパク質標的とのアプタマーの疎水性の相互作用を導き、高い結合効率及び安定な共結晶複合体をもたらす。Ｃ−５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾には、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどの異常な塩基対合の組合せが含まれ得る。修飾には、キャッピングのなどの３’及び５’修飾も含まれ得る。他の修飾には、類似体での天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）及び荷電連結（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）での修飾など、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）での修飾、キレート形成剤（例えば金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、及び修飾連結（例えばアルファ−アノマー核酸など）での修飾が含まれ得る。さらに、普通はヌクレオチドの糖に存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホネート基またはリン酸基に置き換える；標準的な保護基によって保護する；または追加のヌクレオチドまたは固体支持体への追加の連結を調製するために活性化することができる。５’及び３’末端ＯＨ基をリン酸化し得るか、またはアミン、約１〜約２０個の炭素原子の有機キャッピング基の部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー（一部の実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲である）、ＰＥＧポリマー（一部の実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲である）、または他の親水性もしくは疎水性の生体もしくは合成ポリマーで置換し得る。一部の実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ−５位の修飾である。これらの修飾は、Ｃ−５位で直接的にアミド連結によって、または他の種類の連結によって生成され得る。ポリヌクレオチドはまた、当技術分野で一般に知られていて、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖似体、α−アノマー糖、エピマー糖（アラビノース、キシロース、またはリキソースなど）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び非塩基性ヌクレオシド類似体（メチルリボシドなど）が含まれる、リボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含有することができる。上述のとおり、１つまたは複数のホスホジエステル連結を代替の連結基に置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）［ここで、各���またはＲ’は独立に、Ｈであるか、またはエーテル（−Ｏ−）連結を任意選択で含有する置換または非置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である］によって置き換えられた実施形態が含まれる。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、最終産物を設計する際に有利であり得る（例えば、ポリアミド骨格のような代替的な骨格構造が有利であり得るように）。
【００４０】
ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの合成の前後いずれでも修飾することができる。オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの配列を、１つまたは複数の非ヌクレオチド構成成分によって中断してもよい。修飾オリゴヌクレオチドを、例えば任意の適切な標識成分とのコンジュゲーションなどによって、重合の後にさらに修飾してもよい。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「少なくとも１個のピリミジン」は、核酸の修飾に関する場合、核酸内の１個、複数個、またはすべてのピリミジンを指し、核酸中のＣ、Ｔ、またはＵの全部または一部の出現の全部または一部を修飾してもしなくてもよいことを示している。
【００４２】
本明細書で使用する場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ及びＴは、別段に指定しない限り、それぞれｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＵ及びｄＴを示す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義的に使用される。「精製」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、そのアミノ酸配列を得る細胞、組織、または細胞非含有供給源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に非含有であるか、または化学的に合成するときの化学的前駆体または他の薬品を実質的に非含有である。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「がん」は、未制御で異常な細胞増殖を伴う疾患または状態を意味する。一般的ながんの一部の例は、膀胱癌、肺癌、乳癌、黒色腫、結腸及び直腸癌、リンパ腫、子宮内膜癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽急性白血病（ＡＬＬ））及び甲状腺癌である。一部の実施形態では、がんは、これに限定されないが、とりわけ白血病、リンパ腫、骨髄障害、リンパ障害、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、肥満細胞障害、及び骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）が包含される血液悪性病変である。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、共有結合または非共有結合による相互作用によって２つ以上の分子実体を接続させ、分子実体の１つまたは複数の機能特性を保存するような分子実体の空間的分離を可能にし得る分子実体である。リンカーはまた、スペーサーとしても知られ得る。適切なリンカー配列は、本開示に基づき当業者によって容易に確認されるであろう。
【００４６】
本明細書で使用する場合、リンカーは、これに限定されないが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、脂肪族、芳香族もしくはヘテロ芳香族炭素分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、細胞受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片もしくは誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、または任意の他の化学構造もしくは構成成分を含む群から選択される１つまたは複数の分子またはサブ構成成分を含み得る。
【００４７】
一部のそのような実施形態では、本開示のアプタマーは、疎水性ヌクレオ塩基修飾を含む少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。さらに、一部のそのような実施形態では、疎水性ヌクレオ塩基修飾は、修飾ピリミジンである。一部の実施形態では、それぞれの修飾ピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）から独立に選択され得る。
【００４８】
一部の実施形態では、本開示のアプタマーは、２〜５０個の炭素原子の鎖（Ｃ２〜Ｃ５０）（飽和、不飽和、直鎖、分枝または環式）、０〜１０個のアリール基、０〜１０個のヘテロアリール基、及び０〜１０個の複素環基を含み、任意選択でエーテル（−Ｏ−）連結、（例えば、これに限定されないが、１つまたは複数のエチレングリコール単位−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−；１つまたは複数の１，３−プロパンジオール単位−Ｏ−（α３／４α３／４α３／４Ｏ）−などを含む１つまたは複数のアルキレングリコール単位）；アミン（−ＮＨ−）連結；アミド（−ＮＣ（Ｏ）−）連結；及びチオエーテル（−Ｓ−）連結などを含む骨格であってよく；各骨格炭素原子が独立に非置換であってもよいし（すなわち、−Ｈ置換基を含む）、またはＣ３アルキル、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）などから選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよいＣ２〜Ｃ５０リンカーまたはスペーサーを含み得る。一部の実施形態では、Ｃ２〜Ｃ５０リンカーは、Ｃ２〜Ｃ２０リンカー、Ｃ２〜Ｃ１０リンカー、Ｃ２〜Ｃ８リンカー、Ｃ２〜Ｃ６リンカー、Ｃ２〜Ｃ５リンカー、Ｃ２〜Ｃ４リンカー、またはＣ３リンカーであり、各炭素は、上記のとおり独立に置換されていてもよい。
【００４９】
一部の実施形態では、本開示のアプタマーの１個または複数のヌクレオシドは、２’位糖修飾（２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）など）、シトシン環外アミンでの修飾、ヌクレオシド間連結修飾、及び５−メチル−シトシンから選択される修飾を含む。一部の実施形態では、ＰＤＧＦアプタマーは、３’キャップ、５’キャップ、及び／または３’末端での逆位デオキシチミジンを含む。
【００５０】
一部の実施形態では、本開示のアプタマーは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【００５１】
一部の実施形態では、本開示のアプタマーは、表２（配列番号６〜６３）に示されている配列から選択される配列を有する。一部の実施形態では、本開示のアプタマーは、表２（配列番号６〜６３）に示されている配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一な配列を有する。
【００５２】
用語「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、「同一性パーセント」、「％同一な」、「同一性％」、及びその変形は、２つの核酸配列の文脈において使用されるとき、互換的に使用されて、最大一致について参照核酸と比較し、整列させ、（１）最も５’側の対応する（すなわち整列した）ヌクレオチド塩基と最も３’側の対応する（すなわち整列した）ヌクレオチド塩基を含むこれらのヌクレオチド塩基の間の、クエリー配列のヌクレオチド塩基の数、または（２）参照配列の全体の長さのいずれかのどちらか長い方で割った場合に、クエリー核酸またはクエリー核酸の一部においてと同じヌクレオチド塩基の数を指す。比較のための例示的配列アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって行うことができる（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照されたい）。［００１３５］配列同一性パーセントを決定するために適したアルゴリズムの一例は、ベーシック・ローカル・アライメント・検索ツール（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）（以下「ＢＬＡＳＴ」）で使用されるアルゴリズムである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３３８９を参照されたい。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（以下「ＮＣＢＩ」）を通して公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）を使用して配列同一性を決定するのに使用されるデフォルトパラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：Ｗ２０に記載されている。
【００５３】
本明細書で使用する場合、アプタマーなどの核酸の同一性パーセントを記載するとき、その配列は、少なくとも、例えば参照ヌクレオチド配列と約９５％同一であるとは、その核酸配列が参照核酸配列の１００ヌクレオチドのそれぞれにつき５つの点変異までを含み得ることを除いて、核酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照核酸配列と少なくとも約９５％同一である所望の核酸配列を得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までは、欠損していてもよいし、別のヌクレオチドで置換されていてもよいし、または参照配列中のヌクレオチドの総数の５％までのいくらかの数のヌクレオチドは、参照配列に挿入されてもよい（本明細書で挿入と言及する）。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端の位置で生じてもよく、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に分散して、もしくは参照配列内の１つもしくは複数の連続した群として分散して生じてもよい。さらに、ヌクレオチド塩基が、（１）参照配列のヌクレオチド塩基と同じである、または（２）参照配列のヌクレオチド塩基に由来する、または（３）参照配列のヌクレオチド塩基の由来となったのと同じヌクレオチド塩基に由来する場合、同一性パーセントを決定する目的で、ヌクレオチド塩基は「同一」であるとみなされることが意図される。例えば、同一性パーセント計算する目的で、５−メチルシトシンは、シトシンと「同一」であるとみなされる。
【００５４】
一部の態様では、下式
ｎ−Ｌ−ｎ−Ｚ−ｎ−Ｒ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する
［式中、
「Ｌ」は、核酸配列ＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＣＧＡ（配列番号２）、または配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）を含み、ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、
「Ｒ」は、核酸配列ＣＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＣＧ（配列番号３）、または配列番号３に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
このＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【００５５】
一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、配列番号１２を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、配列番号１８を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、本開示のアプタマーは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列の少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、本開示のアプタマーは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列の１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００５９】
一部の実施形態では、ＤＮＡは、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、及び６３からなる群から選択される核酸配列を含み、これらの配列は、配列番号６〜６３のそれぞれにおいて、配列番号２と配列番号３との間に位置する核酸配列断片を含む。
【００６０】
本開示のアプタマーは、ＰＤ−１結合領域に加えて、任意の数のヌクレオチドを含有し得る。様々な実施形態では、本開示のアプタマーは、最大で約１００個のヌクレオチド、最大で約９５個のヌクレオチド、最大で約９０個のヌクレオチド、最大で約８５個のヌクレオチド、最大で約８０個のヌクレオチド、最大で約７５個のヌクレオチド、最大で約７０個のヌクレオチド、最大で約６５個のヌクレオチド、最大で約６０個のヌクレオチド、最大で約５５個のヌクレオチド、最大で約５０個のヌクレオチド、最大で約４５個のヌクレオチド、最大で約４０個のヌクレオチド、最大で約３５個のヌクレオチド、最大で約３０個のヌクレオチド、最大で約２５個のヌクレオチド、または最大で約２０個のヌクレオチドを含むことができる。
【００６１】
ＰＤ−１について任意の適切な解離定数（Ｋｄ）を有するように、本開示のアプタマーを選択することができる。一部の実施形態では、ＰＤ−１アプタマーは、ＰＤ−１について３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する。解離定数は、多点タイトレーションを使用する結合アッセイで、式ｙ＝（最大−最少）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最少に当てはめて決定することができる。一部の実施形態では、ＰＤ−１アプタマーは、表２に示すアプタマーのＫｄ以下のＫｄを有するアプタマーである。
【００６２】
一部の態様では、下式
ｎ−Ｌ−ｎ−Ｚ−ｎ−Ｒ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する
［式中、
「Ｌ」は、核酸配列ＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＣＧＡ（配列番号２）、または配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）、または配列番号１に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み；ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり；
「Ｒ」は、核酸配列ＣＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＣＧ（配列番号３）、または配列番号３に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
このＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【００６３】
一部の態様では、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）を含み、ここで、「ｘ」がＡ、Ｔ、またはＣである一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する。一部の態様では、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）、または配列番号１に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列を含み、ここで、「ｘ」が、Ａ、Ｔ、またはＣである一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する。一部の態様では、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）、または配列番号１に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み；ここで、「ｘ」が、Ａ、Ｔ、またはＣである一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する。
【００６４】
一部の態様では、下式
ｎ−Ｚ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する
［式中、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）を含み、ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり、
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
このＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【００６５】
一部の態様では、下式
ｎ−Ｚ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する
［式中、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）、または配列番号１に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み；ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり；
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
このＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【００６６】
一部の実施形態では、ｎは独立に、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドから選択される。一部の実施形態では、ｎは、０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、１個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、２個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、３個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、４個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、５個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、６個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、７個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、８個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、９個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは、１０個のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ｎは独立に、０〜５０個のヌクレオチドから選択される。
【００６７】
一部の態様では、下式
ｎ−Ｌ−ｎ−Ｚ−ｍ−Ｒ−ｎ
を含む一本鎖ＤＮＡアプタマーを開示する
［式中、
「Ｌ」は、核酸配列ＴＡＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＴＡＴＧＣＧＡ（配列番号２）、または配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
「Ｚ」は、核酸配列ＧＧＧｘＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧ（配列番号１）、または配列番号１に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み；ここで、「ｘ」は、Ａ、Ｔ、またはＣであり；
「Ｒ」は、核酸配列ＣＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＧＣＧ（配列番号３）、または配列番号３に対して少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列、またはその少なくとも１５ヌクレオチド長の断片を含み、
各「ｎ」は独立に、任意の０〜１０個のヌクレオチドであり、
「ｍ」は、任意の０〜５０個のヌクレオチドであり、
このＤＮＡアプタマーは、ＰＤ−１に特異的に結合し、生理学的条件下でＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する］。
【００６８】
アプタマー及びアプタマー構築物を含む医薬組成物
一部の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのアプタマーまたはアプタマー構築物及び少なくとも１個の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。適切な担体は、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓによって出版された「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載されており、これは参照によって本明細書に援用される。
【００６９】
本明細書に記載のアプタマーは、これに限定されないが、注射用剤形、分散液剤、ゲル剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、凍結乾燥製剤、乾燥散剤、錠剤、カプセル剤、制御放出製剤、速溶性製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、即時放出と制御放出の混合製剤などを含む、任意の薬学的に許容される剤形で利用することができる。特に、本明細書に記載のアプタマーは（ａ）経口、肺、静脈内、動脈内、髄腔内、関節内、直腸、眼、結腸、非経口、大槽内、腟内、腹腔内、局部、頬側、経鼻、及び局所投与のいずれかから選択される投与用に；（ｂ）分散液剤、ゲル剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、錠剤、サシェ剤及びカプセル剤のいずれかから選択される剤形に；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥散剤、速溶性製剤、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、及び即時放出と制御放出の混合製剤のいずれかから選択される剤形に；または（ｄ）それらの任意の組み合わせで製剤化することができる。
【００７０】
非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の１つまたは複数の成分を含むことができる：（１）注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；（２）ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；（３）アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；（４）エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；（５）酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝剤；及び（５）塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調整用の薬剤。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の多回投与バイアルに封入することができる。
【００７１】
注射使用に適した医薬組成物は、滅菌注射用液剤もしくは分散剤を即時調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤及び滅菌粉末を含んでよい。静脈内投与については、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は滅菌であるべきであり、容易に注射できる程度に流体であるべきである。医薬組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定的であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。本明細書で使用する場合、用語「安定的」は、対象への投与に適した状況または状態のままであることを意味する。
【００７２】
担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合には必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって、微生物作用の防止を達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムなどの無機塩を組成物に含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【００７３】
滅菌注射液は、活性試薬（例えば、アプタマー及び／またはアプタマー構築物）を、所望に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な量で適切な溶媒中に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散剤は、基本的な分散媒及び任意の他の所望の成分を含有する滅菌ビヒクルに、少なくとも１つのアプタマー及び／またはアプタマー構築物を組み入れることによって調製される。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合には、例示的調製方法には、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれ、これらの両方によって、アプタマー及び／またはアプタマー構築物及び任意のさらなる所望の成分の粉末が、前もって滅菌濾過したそれらの溶液から得られる。
【００７４】
一部の実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物は、硝子体内注射用に製剤化される。硝子体内投与用の適切な製剤は、例えば、に記載されている。眼部薬物送達は、例えばＲａｗａｓ−Ｑａｌａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．３７：３４５；Ｂｏｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６１：６２８；Ｙａｓｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｆｏｒｍｕｌ．５：１；及びＤｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２６：１０４で論述されている。一部の実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む医薬組成物を、１週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回、６週に１回、７週に１回、８週に１回、９週に１回、１０週に１回、１１週に１回、１２週に１回、または１２週に１回より少ない頻度で、硝子体内注射によって投与する。［００１７７］経口組成物は一般に、不活性な希釈剤または食用担体を含む。これらは、例えばゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮され得る。治療的経口投与の目的で、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を添加剤と併合することができ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物はまた、口腔洗浄薬として使用するための液体担体を使用して調製することができ、ここでは、液体担体中の化合物は、経口的に適用され、口の中で動かされ、吐き出されるか、飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤及び／またはアジュバント物質が、組成物の一部として含まれ得る。
【００７５】
吸入による投与については、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサーからのエアゾールスプレー、噴霧化液剤、または適切な装置からの乾燥散剤の形で送達される。経粘膜または経皮投与については、浸透すべきバリアに適切な浸透剤が、製剤中に使用される。そうした浸透剤は一般に、当技術分野で既知であり、それには例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻噴霧剤または坐剤を使用して達成することができる。経皮投与については、活性試薬は、一般に当技術分野で公知のように、軟膏剤、膏薬、ゲル剤またはクリーム剤に製剤化される。試薬は、（例えば、カカオバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）坐剤または直腸送達用の停留浣腸剤の形で調製することもできる。
【００７６】
一部の実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を、体からの急速な排除を防ぐ担体と共に調製する。例えば、埋め込み及びマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤を使用することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そうした製剤の調製方法は当業者には明白である。材料は、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。
【００７７】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いた、感染細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に公知の方法に従って、調製することができる。
【００７８】
加えて、アプタマー及び／またはアプタマー構築物の懸濁液を、適切な油性の注射懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーを、送達のために使用してもよい。任意選択で、懸濁液は、化合物の溶解度を増大させ、高濃度の溶液の調製を可能にするために適した安定化剤または薬剤を含んでもよい。
【００７９】
場合によっては、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、投薬単位剤形で経口または非経口組成物を製剤化することが特に有利であり得る。
【００８０】
本明細書で使用する場合、投薬単位剤形は、処置される対象に対する単位投薬量として適する、物理的に別々の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体と共に、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量のアプタマー及び／またはアプタマー構築物を含有する。本明細書に記載のアプタマー及び／または構築物の投薬単位剤形に関する仕様は、特定のアプタマー及び／またはアプタマー構築物の特性ならびに達成すべき特定の治療効果ならびに個体を処置するためのそうした活性薬剤を調合する分野に固有の制限によって決まり、それらに直接依存する。
【００８１】
少なくとも１つのアプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む医薬組成物は、１種または複数の医薬品添加剤を含むことができる。そうした添加剤の例には、これに限定されないが、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁化剤、甘味剤、着香剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤及び他の添加剤が含まれる。そのような添加剤は当技術分野で公知である。例示的添加剤には、以下が含まれる：（１）様々なセルロース及び架橋型ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２、ケイ化微結晶セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖ  ＳＭＣＣ（商標））、トラガカントゴム及びゼラチンを含む結合剤；（２）充填剤、例えば様々なデンプン、ラクトース、ラクトース一水和物、及び無水ラクトース；（３）崩解剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチ、軽度に架橋結合したポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、及び修飾デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物；（４）圧縮される粉末の流動性に作用する薬剤ならびにステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、例えばエーロシル２００、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルを含む滑沢剤；（５）流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；（６）防腐剤、例えばソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸及びその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、例えばブチルパラベン、アルコール、例えばエチルアルコールまたはベンジルアルコール、フェノール化合物、例えばフェノール、または第四級化合物、例えば塩化ベンザルコニウム；（７）希釈剤、例えば薬学的に許容される不活性な増量剤、例えば微結晶セルロース、ラクトース、第２リン酸カルシウム、糖及び／または前述のいずれかの混合物；希釈剤の例には、微結晶セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１及びＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２が含まれる；ラクトース、例えばラクトース一水和物、無水ラクトース及びＰｈａｒｍａｔｏｓｅ（登録商標）ＤＣＬ２１；第２リン酸カルシウム、例えばＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓ；マンニトール；デンプン；ソルビトール；スクロース；及びグルコース；（８）任意の天然または人工の甘味剤、例えばスクロース、サッカリンスクロース、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラメート、アスパルテーム及びアセスルファムを含む甘味剤；（９）着香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ（登録商標）（ＭＡＦＣＯの商標）、風船ガム香料、果実香料など；ならびに（１０）有機酸及び炭酸または炭酸水素塩などの発泡性カップル（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｅ）を含む発泡剤。適切な有機酸には、例えばクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸及びアルギン酸ならびに無水物及び酸性塩が含まれる。適切な炭酸及び炭酸水素塩には、例えば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、グリシン炭酸ナトリウム、Ｌ−リジン炭酸塩及びアルギニン炭酸塩が含まれる。別法では、発泡性カップルの炭酸水素ナトリウム成分のみが存在してもよい。
【００８２】
様々な実施形態では、本明細書に記載の製剤は実質的に純粋である。本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」は、活性成分（例えば、アプタマー及び／またはアプタマー構築物）が存在する主な種である（すなわち、モル基準で、これらが、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味する。一部の実施形態では、実質的に精製された画分は、活性成分が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）を占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％より多くを含む。様々な実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中の存在するすべての高分子種の少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％を含む。様々な実施形態では、活性成分は、均一になるまで精製され（従来の検出方法によって組成物中に混入種が検出され得ない）、ここでは、組成物は、本質的に、単一の高分子種から成る。
【００８３】
アプタマー及びアプタマー構築物を含むキット
本開示は、本明細書に記載のアプタマー及び／またはアプタマー構築物のいずれかを含むキットを提供する。そのようなキットは、例えば（１）少なくとも１つのアプタマー及び／またはアプタマー構築物；ならびに（２）少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体、例えば溶媒または溶液を含むことができる。追加のキットの構成成分は、例えば（１）本明細書で特定した薬学的に許容される添加剤、例えば安定剤、緩衝剤などのいずれか、（２）キットの構成成分を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアルまたは同様の器具、ならびに（３）送達用器具を任意選択で含むことができる。
【００８４】
処置方法
本開示は、ＰＤ−１アプタマーまたはアプタマー構築物の使用を介して医学的状態を予防または処置する（例えば、医学的状態の１つまたは複数の症状を緩和する）方法を提供する。この方法は、それを必要とする対象に、そのようなアプタマー及び／またはアプタマー構築物の治療有効量を投与することを含む。記載のアプタマーは、予防的療法に使用することもできる。一部の実施形態では、アプタマー及び／またはアプタマー構築物を、経口または静脈内で投与する。
【００８５】
一部の態様では、対象においてＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害するための方法であって、対象に、本明細書に記載のとおりのＤＮＡアプタマー（またはＤＮＡアプタマーを含む組成物）の有効量を投与することを含み、そのＤＮＡアプタマーが、生理学的条件下でＰＤ−１に特異的に結合し、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する方法を本明細書で開示する。
【００８６】
一部の実施形態では、対象は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、及び膀胱癌からなる群から選択されるがんに罹患している。一部の実施形態では、対象は、急性骨髄性白血病に罹患している。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８７】
用語「処置」は、疾患、病的状態、または障害を治癒させる、寛解させる、安定させる、または予防することを意図した患者の医学的管理を指す。この用語は、積極的な処置、すなわち、特に疾患、病的状態、または障害の改善を目指す処置を含み、原因的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の原因の除去を目指す処置も含む。加えて、この用語は、姑息的処置、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒ではなく症状の軽減のために設計された処置；予防的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の発生を最小化する、または一部もしくは完全に阻害することを目指す処置；及び支持処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の改善を目指す他の特異的な治療を補充するために用いられる処置を含む。処置という用語は、本明細書で開示する組成物のいずれの投与も含む。
【００８８】
用語「対象」または「宿主」は、投与または処置の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは家畜患者であり得る。用語「患者」は、臨床医、例えば医師の処置下にある対象を指す。
【００８９】
用語「治療上有効」は、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を寛解するために十分な量である使用する組成物の量を指す。そのような寛解は、必ずしも除去ではなく、縮小または変化を必要とするに過ぎない。
【００９０】
一部の実施形態では、本開示の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを、上記のような疾患状態を改善または根絶する他の治療と組み合わせて投与することができる。本開示のアプタマー及び／またはアプタマー構築物を含む組成物は、例えば１種を超えるアプタマーを含んでもよい。一部の例では、１種または複数のアプタマーを含む組成物を、別の有用な心血管系薬剤または抗がん薬または抗線維化薬などと組み合わせて投与する。一般に、そのような組み合わせでの使用が知られている治療薬の現在利用可能な剤形が適切である。
【００９１】
「組み合わせ療法」（または「併用療法」）は、アプタマー及び／またはアプタマー構築物組成物と少なくとも１種の第２の薬剤とを、これらの治療薬の共作用から有益効果をもたらすことが意図される特定の治療レジメンの一部として投与することを含む。組み合わせの有益効果には、これに限定されないが、治療薬の組み合わせから生じる薬物動態的または薬力学的な共作用が含まれる。これらの治療薬を組み合わせて投与することは典型的には、規定された期間（選択される組み合わせに応じて、通常、数分間、数時間、数日間または数週間）にわたって行われる。
【００９２】
アプタマー及び／またはアプタマー構築物を利用する投与レジメンは、例えば対象の種類、種、年齢、体重、性別及び医学的状態；処置すべき状態の重症度；投与経路；対象の腎及び肝機能；ならびに用いられる特定のアプタマー及び／またはアプタマー構築物または塩を含む様々な因子に従って選択される。通常の技能の医師または獣医師であれば、状態を予防する、無効にする、またはその進行を停止するために必要な組成物の有効量を容易に決定及び処方することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、本明細書で開示する方法を、対象においてがん、例えば血液悪性病変を処置するために使用する。一部の実施形態では、血液悪性病変には、これに限定されないが、とりわけ白血病、リンパ腫、骨髄障害、リンパ障害、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、肥満細胞障害、及び骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）が含まれる。一部の実施形態では、がんは、白血病である。一部の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、がんは、急性リンパ芽急性白血病（ＡＬＬ）である。
【００９４】
本明細書で企図するように、処置されるがんは、原発性腫瘍または転移性腫瘍であってよい。一態様では、本明細書に記載の方法を、とりわけ固形腫瘍、例えば黒色腫、肺癌（肺腺癌、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、大細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、気管支癌、非小細胞癌、小細胞癌、中皮腫を含む）；乳癌（腺管癌、小葉癌、炎症性乳癌、明細胞癌、粘液性癌、漿膜腔乳癌を含む）；結腸直腸癌（結腸癌、直腸癌、結腸直腸腺癌）；肛門癌；膵臓癌（膵臓腺癌、島細胞癌、神経内分泌腫瘍を含む）；前立腺癌；前立腺腺癌；卵巣癌（漿液性腫瘍を含む卵巣上皮癌または表面上皮間質性腫瘍、子宮内膜性腫瘍及び粘液性嚢胞腺癌、性索間質性腫瘍）；肝臓及び胆管癌（肝細胞癌、胆管細胞癌、血管腫を含む）；食道癌（食道腺癌及び扁平上皮細胞癌を含む）；口腔及び口喉頭扁平上皮細胞癌；唾液腺嚢胞癌；膀胱癌；膀胱癌腫；子宮癌（子宮内膜腺癌、眼性、子宮乳頭漿液性癌、子宮明細胞癌、子宮肉腫、平滑筋肉腫、混合ミュラー管腫瘍を含む）；膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、及び脳の他の腫瘍；腎臓癌（腎細胞癌、明細胞癌、ウィルムス腫瘍を含む）；頭頚部癌（扁平上皮細胞癌を含む）；胃の癌（胃癌、胃腺癌、消化管間質腫瘍）；睾丸癌；生殖細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍；子宮頸癌；胃腸管、乳房、及び他の器官の類癌腫；印環細胞癌；肉腫を含む間葉性腫瘍、線維肉腫、血管腫、血管腫症、血管周皮細胞腫、偽血管腫間質性過形成、筋組織新生物、線維種症、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、脂肪腫、血管脂肪腫、顆粒細胞腫、神経線維種、神経鞘腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、黒色腫を含む皮膚、頸部、網膜芽細胞腫、頭頚部癌、膵臓、脳、甲状腺、精巣、腎臓、膀胱、軟部組織、副腎、尿道、陰茎癌、粘液肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、悪性線維性組織球腫、リンパ管肉腫、中皮腫、扁平上皮細胞癌；類表皮癌、悪性皮膚付属器腫瘍、腺癌、肝細胞癌、肝細胞癌、腎細胞癌、副腎腫、胆管癌、移行上皮癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胚的細胞癌、未分化膠腫；多形神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、髄芽細胞腫、悪性髄膜腫、悪性神経鞘腫、神経線維肉腫、副甲状腺癌、甲状腺の髄様癌、気管支類癌腫、褐色細胞種、膵島細胞癌、悪性類癌腫、悪性傍神経節腫、黒色腫、メルケル細胞新生物、葉状腫瘍、唾液腺癌、胸腺癌ならびに膣癌を処置するために使用する。
【００９５】
一部の態様では、細胞においてＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害するための方法であって、細胞に、本明細書に記載のとおりのＤＮＡアプタマー（またはＤＮＡアプタマーを含む組成物）を投与することを含み、ＤＮＡアプタマーが生理学的条件下でＰＤ−１に特異的に結合し、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）とＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＤ−Ｌ１）との間の相互作用を破壊する方法を本明細書で開示する。
【００９６】
一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは、単離または精製されたＤＮＡアプタマーである。一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは天然に存在しない配列である。一部の実施形態では、ＤＮＡアプタマーは合成ＤＮＡである。
【００９７】
本発明のいくつかの実施形態を記載してきた。しかしながら、本発明の意図及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が成されてもよいことは理解されるであろう。したがって、他の実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【００９８】
実施例１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）特異的ＤＮＡアプタマー配列の同定及びがんの診断及び処置における免疫治療薬としてのそれらの有用性。
いくつかの変更を含むＳＥＬＥＸ手順を使用して、天然ヒトＰＤ１タンパク質に対して選択された高親和性ＤＮＡアプタマーの配列を開示する。
【００９９】
ライブラリーの設計：両端で１９塩基プライマーに隣接する２５塩基ランダム領域を含むコンビナトリアルＤＮＡライブラリーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。表１は、選択したアプタマープールをＰＣＲ増幅するために使用したフォワード及びリバースプライマーを示している。加えて、５’ビオチンを含むリバースプライマーを、スクリーニングの反復ラウンド中にストレプトアビジン磁気ビーズを使用する一本鎖ＤＮＡ調製のために利用した。フォワードプライマー上の５’ＦＡＭは、選択及びｓｓＤＮＡ調製中に、選択したストランドを追跡する際に有用であった。
【表１】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【０１００】
表２の配列を一般に、上の欄１の最初の３つの数字を使用して呼ぶことができる。一部の配列名では、最初の３つの数字が同じことがあり、したがって、それらは、さらに４つの数字も使用して特定される。
【０１０１】
ＳＥＬＥＸでのＰＤ１の単離及び調製。内因性ＰＤ１発現レベルを４種の別個のヒト細胞系において、インターフェロン処置の６及び２４時間後にイムノブロット分析によって比較した。２４時間後のＰＤ−１の発現レベルに基づき、２つの個々の細胞系、すなわちＨＥＬ９２．１．７（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）を、免疫沈降によって個別にＰＤ１をさらに単離するために選択した。
【０１０２】
ＳＥＬＥＸスクリーニングのためにＰＤ−１を調製するために、プロテインＡ及びプロテインＧ磁気ビーズの１：１混合物１００μｌをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、細胞溶解産物をプレクリアするために使用し、次いで、廃棄した。同量の同様に調製されたビーズを抗ＰＤ−１抗体１０ｕｇと共に４℃で２時間にわたってインキュベートした。３回のＰＢＳ−Ｔ洗浄の後に、各ＨＥＬ（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）細胞系からの５００μｇの全タンパク質に対応するプレクリア溶解産物を、抗体コーティングされたビーズと共に終夜、４℃でインキュベートして、その表面上にＰＤ−１を捕捉した。捕捉されたＰＤ−１を含むそのようなビーズを上清から分離し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。そのようなビーズの小さなアリコットをイムノブロット分析に掛けて、捕捉されたＰＤ−１の存在を確認し、その残りを、下記のとおりのＳＥＬＥＸラウンドのために使用した。
【０１０３】
ＳＥＬＥＸ手順、次世代シーケンシング及びデータ分析。１ナノモルの購入ライブラリーを、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．４に懸濁させ、水浴内で１０分間にわたって９５℃に加熱し、次いで、室温でゆっくり冷却した。室温に冷却した後に、抗ＰＤ１抗体でコーティングされた磁気ビーズをライブラリーミックスに添加し、３０分間にわたって室温でインキュベートして、磁気ビーズ、さらには抗ＰＤ１抗体に対して高い親和性を有するアプタマーを除去した。磁気分離によって、ビーズを除去し、縮小したライブラリーを含有する上清を次いで、ＰＤ−１が捕捉されている磁気ビーズと共にインキュベートし、１時間にわたって室温でインキュベートした。インキュベーション後に、ビーズを分離し、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４で３回（各回１０ｍｌ）徹底的に洗浄した。洗浄したビーズを、プライマーＡＭＬＩＢ３及びＡＭＬＩＢ４（ライブラリーの設計を参照されたい）を用いるＰＣＲ増幅においてテンプレートとして使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間の初回変性；［９５℃で４５秒間、５４℃で４５秒間及び７２℃で４５秒間］×２０サイクル；続いて、７２℃で５分間の最終伸長であった（図２）。（ビオチン化プライマーから生じる）ビオチン化ストランドをストレプトアビジン磁気ビーズ上に捕捉し、続いて、０．１Ｍ  ＮａＯＨの存在下でストランドを分離することによって、選択の次の反復ラウンドのための一本鎖ＤＮＡを調製した。１０Ｋセントリコンスピン濾過によって、一本鎖ＤＮＡ調製物から、ＮａＯＨを除去した。上記と同様の様式で、各回、新たに調製したＰＤ−１磁気ビーズを用いて、７ラウンドの反復選択を行った。各ラウンドで、ＰＣＲ産物の選択プールのアリコットをＰＣＲ増幅のために貯蔵したが、その際、次世代シーケンシングの後に、それらの源を後で同定することができるように追加の「タグ」配列を含むプライマーを使用した。そのような解析は、選択の反復ラウンドで、結合配列の収束を追跡するために非常に有用である。７つすべてのラウンド及び２つの異なる系（５’及び３’位に追跡タグ（特有のバーコード）をそれぞれ有する）から同じ割合でＰＣＲ産物をプールした後に、単一のＩｏｎ−ｔｏｒｒｅｎｔ  ３１４  ｃｈｉｐ（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ）で、次世代シーケンシングを行った。
【０１０４】
ＮＧＳデータの解析を、Ｇａｌａｘｙ  ｐｒｏｊｅｃｔ配列解析ツール及びＦａｓｔＡｐｔａｍｅｒソフトウェアスーツ［Ａｌａｍ  ＫＫ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ４：ｅ２３０：１−１０．］を使用して行った。このソフトウェアは、シーケンシングデータをクラスターに分類してアラインさせ、かつＤＮＡタグに応じて各配列を集計するためのマニュアルツールを含み、本発明者らがＰＤ−１に対する最良の結合配列を同定することを可能にする（図３）。ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：４８７６−４８８２］を使用して、多重配列比較及び系統樹をさらに作成した（図４）。
【０１０５】
ＰＤ−１に対する選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証。内因性ＰＤ−１を認識する選択アプタマーの能力を決定するために、６つの最良と示されたビオチン化アプタマーを使用して、ＨＥＬ９２．１．７（ＡＴＣＣ）の全細胞溶解産物から、ＰＤ−１プルダウンアッセイを行った。プルダウンアッセイからのＰＤ−１タンパク質レベルは、ＰＤ１特異的抗体を使用する免疫沈降タンパク質に匹敵した（図５）。
【０１０６】
２つの選択された１５−１２０−２９８及び１０−１５０−３７３アプタマーをさらに、フローサイトメトリー及び顕微鏡法によってＰＤ−１結合について検証した。簡単に述べると、蛍光標識アプタマーを、ＰＤ−１を発現するＨＥＬ細胞と共にインキュベートし、徹底的に洗浄して非結合アプタマーを除去した。次いで、細胞を平均蛍光強度についてフローサイトメトリーによって分析した（図６Ａ）。また、細胞を蛍光顕微鏡法によって検査した（図６Ｂ）。
【０１０７】
ＰＤ−１特異的アプタマーの二次構造。ｍｆｏｌｄアルゴリズムを使用して、選択アプタマーの二次構造を予測した。すべてのアプタマーについて、最適な構造及び最適以下の構造は、−１．５〜−４．０ｋｃａｌ／モルの範囲の最低遊離エネルギーを有し、これらの構造が低い安定性を有することを示唆した（図７）。
【０１０８】
平均蛍光強度を使用するフローサイトメトリーによるアプタマーの親和性の決定。ＨＥＬ細胞溶解産物でのポリアクリルアミドゲルにおいて、アプタマーの移動変化が観察されたが、同じ現象は、これらのアプタマーが、複雑な立体配座または代替の立体配座にあるかもしれない免疫沈降内因性ＰＤ−１タンパク質に対して選択されたという事実によって、商業的に生産された精製ＰＤ−１タンパク質では観察されなかった。したがって、結合親和性を決定するために、ＰＤ−１発現細胞の固定数に対して蛍光標識アプタマーをタイトレートする際にフローサイトメーターを使用して平均蛍光強度を測定した。ＰＤ１発現をしない細胞を陰性対照として使用した。ＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１細胞系に対する選択ＰＤ−１アプタマーの結合親和性を決定するために、５００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲の様々な濃度のカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＰＤ−１特異的アプタマー及び非特異的（陰性対照）アプタマーをＨＥＬ９２．１．７またはＫＧ−１細胞（それぞれ１×１０５細胞）のいずれかと共に、それぞれ１５分間にわたって結合緩衝液５０μｌ中でインキュベートした。次いで、細胞を洗浄緩衝液１００μｌと共に５〜６回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーによる分析のために結合緩衝液５０μｌ中に再懸濁させ、１×１０４細胞を分析のためにカウントした。アプタマー処理をしなかった細胞は、背景対照として役立つ。背景強度から平均蛍光強度を引くことによって、特異的結合強度を計算した。得られた特異的ＰＤ−１アプタマーの平均蛍光強度を、平衡解離定数（Ｋｄ）を計算するためにさらに使用した。結合部位は１個のみと仮定して、特異的結合強度の平均蛍光強度（Ｙ）とアプタマー濃度（Ｘ）とのプロット、Ｙ＝ＢｍａｘＸ／（Ｋｄ＋Ｘ）としてフィットさせることができるプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、蛍光ＰＤ−１アプタマーのＫｄをプロットした（Ｈｕｎｇ，Ｌ．−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１０３２６；Ｓｅｆａｈ，Ｋｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５，１１６９−１１８５；Ｗｅｎｇ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ  １４，７５３−７６５）。
【０１０９】
プレートリーダーによる蛍光強度値からのＰＤ−１アプタマーの結合親和性の決定。ＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１細胞系に対する選択ＰＤ−１アプタマーの結合親和性を決定するために、５００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲の様々な濃度のカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＰＤ−１特異的アプタマー及び非特異的アプタマー（陰性対照）をＨＥＬ９２．１．７またはＫＧ−１細胞（それぞれ１×１０５細胞）のいずれかと共に、それぞれ１５分間にわたって結合緩衝液５０μｌ中でインキュベートした。次いで、１×１０４細胞を洗浄緩衝液１００μｌで５〜６回洗浄し、次いで、結合緩衝液５０μｌ中に再懸濁させ、プレートリーダー（ＢｉｏＴＥＫ）によって蛍光強度について測定した。以下の実験を再現性のために３回繰り返した。アプタマー処理をしなかった細胞は、背景対照として役立つ。背景強度から蛍光強度値を引くことによって、特異的蛍光強度を計算した。得られた特異的ＰＤ−１アプタマーの蛍光強度を、平衡解離定数（Ｋｄ）を計算するためにさらに使用した。結合部位は１個のみと仮定して、特異的結合強度の平均蛍光強度（Ｙ）とアプタマー濃度（Ｘ）とのプロット、Ｙ＝ＢｍａｘＸ／（Ｋｄ＋Ｘ）としてフィットさせることができるプリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を使用することによって、蛍光ＰＤ−１アプタマーのＫｄを得た。
【０１１０】
共焦点顕微鏡像によるＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１細胞へのＰＤ−１特異的アプタマー及び抗体の結合。共焦点顕微鏡によってＨＥＬ９２．１．７またはＫＧ−１細胞での選択ＰＤ−１アプタマーの結合位置を可視化するために、１×１０５細胞をプレーティングした。次いで、細胞を１倍ＰＢＳで穏やかに洗浄し、結合緩衝液２００μｌ中に再懸濁し、続いて、２５０ｎＭ及び２５ｎＭ  ＦＡＭ標識ＰＤ−１アプタマー及び非特異的アプタマー（陰性対照として）５０μｌで３０分間にわたって処理した。インキュベーションの後に、標識細胞を１倍ＰＢＳで３回洗浄し、氷冷４％パラホルムアルデヒドで５分間にわたって固定し、次いで、サイトスピンによって６００ｋで６分間にわたって顕微鏡スライドに接着させた。ＰＤ−１抗体標識の場合には、細胞をＰＤ−１一次抗体と共に、続いて、二次抗体と共にインキュベートした。次いで、スライドを５分間にわたって空気乾燥し、次いで、核染色のためにＤＡＰＩを含むマウンティング培地と共にマウントした（退色防止試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。次いで、スライドを、Ａｘｉｏ共焦点顕微鏡を使用することによって最適に分析した。
【０１１１】
種々の種類のがん細胞に対する特異的ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの結合選択性試験。結合選択性試験によって、ＰＤ−１を発現する種々のがん細胞モデル及び選択されたＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーにおける捕捉率の間接的な測定が得られる。種々のモデルのがん細胞系（１×１０５）を、特異的ＰＤ−１アプタマーでコーティングされたＭｙＯｎｅビーズ１０μｌと共に、結合緩衝液中で３０分間にわたって２００μｌの最終容積でインキュベートした。次いで、インキュベーション後に、がん細胞を洗浄緩衝液２００μｌで５回洗浄し、次いで、結合緩衝液２００μｌ中に再懸濁させた。捕捉されたがん細胞の数を、血球計算板を使用して明視野観察下でカウントしたが、ＭｙＯｎｅビーズの排除が対照として役立つであろう。捕捉率を次のとおり計算した：
捕捉率（％）＝捕捉がん細胞／対照試験でカウントされた総がん細胞×１００％（１）
【０１１２】
種々のがんモデルにおいてＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーを使用してＰＤ−１発現レベルを検出するための逆相タンパクアレイ（ＲＰＰＡ）。ＲＰＰＡにおいてＰＤ−１抗体の代わりに特異的ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーを使用することは、種々のがんモデルにおいてＰＤ−１タンパク質発現及び翻訳後修飾を評価するための理想的な選択肢であろう。ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーは、理想的なＰＤ−１バイオマーカー検出薬として役立ち得るであろう。
【０１１３】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する特異的抗ＰＤ−１アプタマーまたは抗体の能力を試験するためのＰＤ−Ｌ１阻害薬スクリーニングＥＬＩＳＡアッセイ。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断するＰＤ−１特異的アプタマーの能力を、ＰＤ−Ｌ１阻害薬スクリーニングＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。９６ウェルプレートをヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質でコーティングし、特異的ＰＤ−１アプタマーまたは陽性対照のための標準抗体、及び陰性対照としての非特異的アプタマーと共にインキュベートした。次いで、ビオチン化ヒトＰＤ−１を、結合ｈＰＤ−Ｌ１に添加し、続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加した。ＴＭＢまたは他の比色ＨＲＰ基質を使用して、呈色を観察した。最後に、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１結合を阻害するＰＤ−１アプタマーの能力をＯＤ測定によって決定する。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性アッセイ
混合リンパ球反応。Ｔ細胞活性化を促進するＰＤ−１特異的アプタマーの能力を、同種混合リンパ球反応を使用して評価した。同種ＭＬＲは、一方のドナーからのリンパ球（レスポンダー）の、他方のドナーからのリンパ球（スティミュレーター）に対する増殖応答を測定する機能性アッセイである。レスポンダー及びスティミュレータードナーの両方からのＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用して血液から単離した。スティミュレーターＰＢＭＣを５００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４）及び２５０Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間にわたってインキュベートした。７日間のインキュベーション後に、スティミュレーター細胞を、ＤＮＡに結合する５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理して、細胞を非増殖性にした。１セットのスティミュレーター細胞を、陽性対照としてＴ細胞増殖応答に必要な２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（フィトヘマグルチニン）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。処理しないままになっているレスポンダー細胞は、刺激されると増殖することができた。１セットのレスポンダー細胞を、陰性ＢｒｄＵ対照のために、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理した。レスポンダー細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤ−１特異的アプタマーまたは非特異的アプタマーのいずれかと共に２４時間にわたってインキュベートした。次いで、生存可能なスティミュレーター細胞（１５０，０００）を、種々の試験条件に従ってレスポンダー細胞（１００，０００）と共に共培養し、５日間にわたってインキュベートした。６日目に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）をウェルに添加して、増殖性細胞のＤＮＡ中のチミジンの代わりに組み込む（ＢｒｄＵ  Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ）。２４時間後に、細胞をプレートベースのルミノメーターによってＢｒｄＵ組み込みについて分析して、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定する。刺激された試験細胞と対照の非刺激レスポンダー細胞との比較によって、刺激指数が得られ、これを使用すると、様々な細胞処理の組合せにおいて増殖を比較することができる。同じセットの条件であるがＢｒｄＵを含まない別のセットのプレートを生細胞について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、代謝活性な細胞のインジケーターであるＡＴＰの存在を定量することで分析した。データによると、強固なＭＬＲ応答が５０及び１００ｎｇの抗体処理で観察され、匹敵する応答がＰＤ−１特異的アプタマーでも観察される（図８）。
【０１１５】
制御性Ｔ細胞での抑制アッセイ。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞をＰＢＭＣから精製した（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｔｒｅｇ（５×１０４）をレスポンダーＴ細胞１×１０５及び２×１０４刺激樹状細胞（ＤＣ）と共に２０ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌのＰＤ−１特異的アプタマーまたは対照非特異的アプタマーのいずれかと共培養することによって、同種混合リンパ球反応アッセイを行った。ＩＦＮ−γ産生を上清で評価し、細胞を、増殖分析のためにチミジンの代わりに組み込むためにさらに１８時間にわたって（ＢｒｄＵ）で標識した。
【０１１６】
ｅｘ  ｖｉｖｏサイトカイン放出アッセイ。健康なドナーからのヘパリン化血液（５００μｌ）をＰＤ−１特異的アプタマーまたは対照非特異的ＤＮＡアプタマーと共に４８ウェルプレート内、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間にわたってインキュベートした。サイトカイン応答（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α）を、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して血漿中で測定し、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。
【０１１７】
ＰＥＧ化特異的ＰＤ−１アプタマーは細胞傷害性ではなく、ＴＬＲ９−先天免疫シグナル伝達を開始させない
ＤＮＡアプタマーのＰＥＧ化。３’ヘキシルアミン修飾因子を含む特異的及び非特異的ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーを１０倍過剰の４０ｋＤａ  ｍＰＥＧ−スクシンイミジルグルタル酸エステルと共にインキュベートした（すべてのアッセイでのＰ値を、適切な場合にはスチューデントのｔ検定または分散分析を使用して計算した）。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、すべてのデータをプロットし、統計的解析を行い、単一部位結合モデルを使用して結合曲線にフィットさせた。
【０１１８】
アプタマー誘導性ＴＬＲ９免疫応答。ＰＥＧ化ＰＤ−１特異的及び非特異的対照アプタマー（４０μｇ、１．３ｎｍｏｌ）またはＴＬＲ９  ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＯＤＮ  １８２６、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＣＡ）をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に腹腔内投与した。３時間後にマウスをと殺し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血清レベルを、市販のＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量化した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ヒトマクロファージ細胞系Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ）及びマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）を、３μｍｏｌ／ｌ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  １５８５またはＰＤ−１特異的アプタマーまたは対照の非特異的アプタマーで３時間にわたって処理した。上記の処理からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって単離されたＲＮＡから、ＴＬＲ９誘導が１ステップリアルタイムＰＣＲ反応によって観察された。
【０１１９】
統計。すべてのアッセイでのＰ値を、適切な場合にはスチューデントのｔ検定または分散分析を使用して計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して、すべてのデータをプロットし、統計的解析を行い、単一部位結合モデルを使用して結合曲線にフィットさせた。
【０１２０】
このような高度に特異的なＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーがあることで今や、これを臨床患者サンプルにおいてＰＤ−１タンパク質を検出するためのバイオマーカースクリーニングプロセスのために使用すること、さらには、白血病及び多くの他のＰＤ−１免疫応答関連慢性疾患を含む多くの種類のがんを有する患者を処置することが可能である。
【０１２１】
実施例２：ＰＤ１アプタマー及びタンパク質結合親和性
図９Ａ及び９Ｂならびに下の表３Ａ及び３Ｂは、ＰＤ１（図９Ａ）及びＰＤ１溶解産物（図９Ｂ）へのアプタマーｆｐｆ２（１０−１５０−３７３）結合を示している。
【表３Ａ】
2019534708.tif 000011
【表３Ｂ】
2019534708.tif 000012
【０１２２】
実施例３：ＰＤ１特異的ＤＮＡアプタマーの展開及び特徴づけ
腫瘍は、免疫チェックポイントを調節する受容体−リガンド相互作用をモジュレートすることによって免疫応答を免れる異常な能力を有する。Ｔ細胞上に発現される細胞表面タンパク質であるプログラム細胞死タンパク質（ＰＤ−１）は、そのような免疫チェックポイント受容体の１種であり、そのリガンドであるＰＤＬ１またはＰＤＬ２に結合すると、阻害シグナルを伝達する。そのようなモジュレーションは多くの場合に、Ｔ細胞活性化の阻害、及びその後に、免疫学的監視からの腫瘍の逃避をもたらす。最近では、数種のＦＤＡ認可された治療用抗体が、がんに対する免疫応答を増強するためにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的としている。アプタマーは、規定の三次元立体配座を有する約１５〜１００塩基長の範囲の短い一本鎖オリゴヌクレオチドから構成される合成リガンドであり、高い親和性でそれらの標的を認識し、それに結合することができる抗体に類似している。また、核酸構成成分は、タンパク質カウンターパートを上回るいくつかの利点、例えば、比較的低いストリンジェントな条件下での生成の容易性、長い貯蔵寿命及び低コストなどを有する。この実施例では、高度繰り返し保存領域からなるＰＤ−１特異的アプタマー（抗ＰＤ１−Ａｐｔ）を、白血病細胞溶解産物（細胞系及び一次患者サンプル）を使用する標的の検証で評価したところ、その天然状態でＰＤ−１に結合することが見出された。選択された抗ＰＤ１−アプタマーは、溶解産物からＰＤ−１タンパク質を特異的にプルダウンすることができ、抗ＰＤ−１抗体を模倣した。抗ＰＤ１−Ａｐｔの特異的相互作用をまた、フローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡法によって実証した。Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって評価されたように、抗ＰＤ１−Ａｐｔは、約５００ピコモル親和性のＫｄでＰＤ−１に結合し得た。さらに、ＰＤ−１／ＮＦＡＴ−レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を使用するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１細胞ベースアッセイを使用して、抗ＰＤ１−Ａｐｔ生物学的活性を確認し、特徴づけた。ＰＤ−Ｌ１及びＴＣＲアクチベーターを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞と共に共培養したＰＤ−１／ＮＦＡＴレポーター−Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター活性（相対ルシフェラーゼ単位）について、対照と比較して、抗ＰＤ１−Ａｐｔの存在下では数倍の誘導が観察された。これらのデータは、ＰＢＭＣの種々のドナーセットからのＴｈ１サイトカインインターフェロン−ガンマ及びＩＬ−２の誘導と共に、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における強固な抗ＰＤ１遮断を実証している。
【０１２３】
物質及び方法
細胞培養：ＨＥＬ９２．１．７、ＴＨＰ−１、ＪｕｒｋａｔクローンＥ６−１及びＨＥＫ２９３細胞系はＡＴＣＣから得た。ＨＥＬ９２．１．７、ＴＨＰ−１及びＪｕｒｋａｔクローンＥ６−１細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した（ＡＴＣＣの指示に従った）。ＨＥＫ２９３細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ  Ｈｉ−Ｇｌｕｃｏｓｅ中で培養した（ＡＴＣＣの指示に従った）。ＫＧ−１細胞系は、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。ＫＧ−１細胞系を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１００ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ中で培養した（ＤＳＭＺの指示に従った）。細胞系を用いる実験はすべて、解凍後またはＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから得てから６カ月以内に行った。細胞系の認証は、ＡＴＣＣ及びＤＳＭＺが行った。ＤＳＭＺは、細胞系の特徴づけ及び認証のために短反復配列（ＳＴＲ）プロファイリングを利用している。ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポーターを発現するＪＵＲＫＡＴ組み換え細胞系はＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た。ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポーター／Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン、１ｍｇ／ｍｌジェネテシン及び２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを補充して細胞に対する選択圧力を維持したＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。すべての細胞系を３７℃で、５％ＣＯ２及び９５％空気で維持し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）を製造者が記載しているとおりに使用して、マイコプラズマについて検査した。上述の細胞系を用いる実験をすべて、細胞が７０〜８０％集密になったときに行った。
【０１２４】
ＰＢＭＣ及び原発性ＡＭＬ芽細胞：末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び原発性ＡＭＬサンプルを、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド・コンセントのもとに得た。末梢血または骨髄穿刺液サンプルを収集し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心によって単核細胞を分離した。獲得したが、レシピエントにおける生着には使用していない寄託済みの（ｂａｎｋｅｄ）単離（ｄｅｌｉｎｋｅｄ）非特定化ドナー末梢血単核細胞を精製し、その後、細胞生存率アッセイ及びイムノブロット分析（Ｄｅｖａｒａｊ  ＳＧ  ２０１６）において利用した。
【０１２５】
抗体及び精製ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１タンパク質：抗ＰＤ−１及び抗Ａｃｔｉｎ抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。ヒト２９３細胞（ＨＥＫ２９３）で産生された組み換えヒト全長ＰＤＣＤ１タンパク質及びヒト２９３細胞（ＨＥＫ２９３）で産生されたＰＤ−Ｌ１タンパク質は、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。
【０１２６】
タンパク質の定量化、ウェスタン分析：細胞を氷冷溶解緩衝液での溶解に掛け、タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用することによって決定した。等量の細胞溶解産物を、タンパク質分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは免疫沈降のための利用によって使用した。タンパク質サンプルを１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、次いで、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上で電気泳動させた。ＰＶＤＦ膜を遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ）で遮断し、すすぎ、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１に対する一次抗体と共にインキュベートした。４℃で終夜インキュベートした後に、膜を洗浄し、それらの対応する近赤外蛍光二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）と共にインキュベートした。イムノブロットをＯＤＹＳＳＥＹ  ＣＬｘ（ＬＩ−ＣＯＲ）によってスキャンして、タンパク質発現を定量化した。負荷対照として、タンパク質β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用した。
【０１２７】
免疫沈降分析：プロテインＡ及びプロテインＧ磁気ビーズの１：１混合物１００μｌをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＥＬ（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）細胞系のそれぞれからの全細胞溶解産物タンパク質５００μｇをプレクリアするために使用し、次いで、廃棄した。同量の同様に調製されたビーズを抗ＰＤ−１抗体１０μｇと共に４℃で２時間にわたってインキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した後に、ＨＥＬ（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）細胞系のそれぞれからの全タンパク質５００μｇに対応するプレクリア溶解産物を、表面にＰＤ−１を捕捉するために抗体コーティングされたビーズと共に、４℃で終夜インキュベートした。捕捉されたＰＤ−１を伴うそのようなビーズを上清から分離し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した。そのようなビーズの小さなアリコットをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるイムノブロット分析に掛けて、捕捉されたＰＤ−１の存在を確認し、その残りは、下記のとおりのＳＥＬＥＸラウンド（Ｔｕｅｒｋ  Ｃ  １９９０）のために使用した。
【０１２８】
ＳＥＬＥＸのためのＰＤ−１タンパク質の単離及び調製：内因性ＰＤ１及びＰＤ−Ｌ１タンパク質発現レベルを４種の別個のヒト細胞系（ＨＥＬ  ９２．１．７、ＴＨＰ−１、ＪｕｒｋａｔクローンＥ６−１及びＫＧ−１）において、インターフェロン処理の６及び２４時間後のイムノブロット分析によって比較した。２４時間後のＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づき、ＰＤ−１細胞表面受容体及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１の両方を発現する２種の細胞系ＨＥＬ９２．１．７（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）を、個別に免疫沈降によってＰＤ１をさらに単離するために選択した。
【０１２９】
プロテインＡ及びプロテインＧ磁気ビーズの１：１混合物１００μｌをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＨＥＬ（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）細胞系のそれぞれからの全細胞溶解産物タンパク質５００μｇをプレクリアするために使用し、次いで、廃棄した。同量の同様に調製されたビーズを抗ＰＤ−１抗体１０μｇと共に４℃で２時間にわたってインキュベートした。ビーズをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した後に、ＨＥＬ（ＡＴＣＣ）及びＫＧ−１（ＤＳＭＺ）細胞系のそれぞれからの全タンパク質５００μｇに対応するプレクリア溶解産物を、表面にＰＤ−１を捕捉するために抗体コーティングされたビーズと共に、４℃で終夜インキュベートした。捕捉されたＰＤ−１を伴うそのようなビーズを上清から分離し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した。そのようなビーズの小さなアリコットをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるイムノブロット分析に掛けて、捕捉されたＰＤ−１の存在を確認し、その残りは、下記のとおりのＳＥＬＥＸラウンド（Ｔｕｅｒｋ  Ｃ  １９９０）のために使用した。
【０１３０】
ＳＥＬＥＸ手順、次世代シーケンシング及びデータ分析：１ナノモルの購入ライブラリーを、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．４中に懸濁させ、水浴中で１０分間にわたって９５℃に加熱し、次いで、室温でゆっくり冷却した。室温に冷却した後に、抗ＰＤ１抗体でコーティングした磁気ビーズをライブラリーミックスに添加し、３０分間にわたって室温でインキュベートして、磁気ビーズに対して高い親和性を有するアプタマー、さらには抗ＰＤ１抗体を除去した。ビーズを、磁気分離によって除去し、縮小したライブラリーを含有する上清を、捕捉されたＰＤ−１を有する磁気ビーズと共にここでインキュベートし、１時間にわたって室温でインキュベートした。インキュベーション後に、ビーズを分離し、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ  ｐＨ７．４で、３回（各回１０ｍｌ）で徹底的に洗浄した。洗浄したビーズを、プライマーＡＭＬＩＢ３及びＡＭＬＩＢ４を用いるＰＣＲ増幅においてテンプレートとして使用した（ライブラリーの設計を参照されたい）。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間の初期変性；［９５℃で４５秒間、５４℃で４５秒間及び７２℃で４５秒間］×２０サイクル；続いて、７２℃で５分間の最後の伸長であった（図２）。（ビオチン化プライマーから生じる）ビオチン化ストランドを--ストレプトアビジン磁気ビーズ上に捕捉し、続いて、０．１Ｍ  ＮａＯＨの存在下でストランドを分離することによって、選択の次の反復ラウンドのための一本鎖ＤＮＡを調製した。１０Ｋセントリコンスピン濾過によって、一本鎖ＤＮＡ調製物から、ＮａＯＨを除去した。上記と同様の様式で、各回、新たに調製したＰＤ−１磁気ビーズを用いて、７ラウンドの反復選択を行った。各ラウンドで、次世代シーケンシングの後に、それらの源を後で同定することができるように、追加の「タグ」配列を含むプライマーを使用するＰＣＲ増幅のために、ＰＣＲ産物の選択プールのアリコットを貯蔵した。そのような解析は、選択の反復ラウンドで、結合配列の収束を追跡するために非常に有用である。７つすべてのラウンド及び２つの異なる系（５’及び３’位に追跡タグ（特有のバーコード）をそれぞれ有する）から同じ割合でＰＣＲ産物をプールした後に、単一のＩｏｎ−ｔｏｒｒｅｎｔ  ３１４  ｃｈｉｐ（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ）で、次世代シーケンシングを行った。
【０１３１】
ＮＧＳデータの解析を、Ｇａｌａｘｙ  ｐｒｏｊｅｃｔ配列解析ツール及びＦａｓｔＡｐｔａｍｅｒソフトウェアスーツ（Ｋｈａｌｉｄ  Ｋ  Ａｌａｍ  ２０１５）を使用して行った。このソフトウェアは、シーケンシングデータをクラスターに分類してアラインさせ、かつＤＮＡタグに応じて各配列を集計するためのマニュアルツールを含み、本発明者らがＰＤ−１に対する最良の結合配列を同定することを可能にする。ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ  １９９７）を使用して、多重配列比較及び系統樹をさらに作成した。
【０１３２】
アプタマー合成：アプタマーを、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｓ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ）で標準的なホスホラミダイト化学作用（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ  １９８７）を使用して合成した。アプタマーを濃水酸化アンモニウム中で、終夜、室温で脱保護し、それらを終夜、真空乾燥させ、ＡＫＴＡ  １０  ｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）でのＨａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−１カラムによる逆相クロマトグラフィーによって、１００ｍＭ酢酸トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ８．４）を使用して装填し、アセトニトリル濃度を漸増させて溶離することによって精製した。ＯｌｉｇｏＣａｌｃ（ＷＡ  ２００７）によって推定した吸光係数を使用して、アプタマー濃度を決定した。
【０１３３】
ＰＤ−１に対する選択ＤＮＡアプタマーの結合特異性の検証：内因性ＰＤ−１を認識する選択アプタマーの能力を決定するために、ＰＤ−１プルダウンアッセイを、ＨＥＬ９２．１．７（ＡＴＣＣ）の全細胞溶解産物から、６種の最良と示されたビオチン化アプタマーを使用して行った。プルダウンアッセイからのＰＤ−１タンパク質レベルは、ＰＤ１特異的抗体を使用しての免疫沈降タンパク質に匹敵した。
【０１３４】
２種の選択された１５−１２０−２９８及び１０−１５０−３７３アプタマーをＰＤ−１結合について、フローサイトメトリー及び顕微鏡法によってさらに検証した。簡単に述べると、蛍光標識アプタマーを、ＰＤ−１を発現するＨＥＬ細胞と共にインキュベートし、徹底的に洗浄して非結合アプタマーを除去した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって、平均蛍光強度について分析した。また、細胞を蛍光顕微鏡法によって検査した。
【０１３５】
ＰＤ−１特異的アプタマーの二次構造：ｍｆｏｌｄアルゴリズムを使用して、選択されたＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの二次構造を予測した。すべてのアプタマーについて、最適な構造及び最適以下の構造は、−１．５〜−４．０ｋｃａｌ／モルの範囲の最低遊離エネルギーを有し、これらの構造が低い安定性を有することを示唆した。これらのアプタマーは、ＰＤ−１を認識する特異性／親和性に寄与し得るＧ四重鎖構造を取る（Ｂｏｃｈｍａｎ  ＭＬ  ２０１２）。
【０１３６】
フィルター結合アッセイ：ＰＤ−１−ＤＮＡアプタマーとＰＤ−１タンパク質との結合親和性を、二重膜フィルター結合アッセイによって決定した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ化学発光検出のために５’末端にビオチン−ＴＥＧ修飾を有するＰＤ−１−ＤＮＡアプタマーを、上記のとおり合成及び精製した。５０ｎＭ  ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー１μｌを、様々な濃度のＰＤ−１タンパク質（１０００〜０ｎＭ、連続半希釈）と共に１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４（ＴＥ緩衝液）３．５μｌ中で、３０分間にわたって室温でインキュベートした。インキュベーション後に、各反応物の容積をＴＥ緩衝液で最高３０μｌにし、ナイロン膜の上に層状のニトロセルロースを備えた９６ウェルドットブロット器具（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を通して濾過した。上部のニトロセルロースはタンパク質−ＤＮＡ複合体を保持し、下部のナイロン膜は遊離ＤＮＡを捕捉する。膜をＴＥ１００μＬで３回洗浄して、いずれの非結合ＤＮＡも、ニトロセルロース膜からナイロンへと洗い流した。洗浄後に、両方の膜をＵＶ架橋して、保持されたＤＮＡを固定し、Ｐｉｅｒｃｅビオチン化核酸検出キットを製造者指示に従って使用する化学発光検出のために処理した。化学発光シグナルを検出し、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ  ｉｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）で画像化した。画像分析及びスポット強度の定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。ナイロン膜からのデータを使用して結合割合を計算し、単一部位結合と仮定してグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して、結合曲線を作成した（Ｏｅｈｌｅｒ  Ｓ  １９９９）。
【０１３７】
バイオレイヤー干渉法結合研究：精製ＰＤ−１タンパク質及びＰＤ−１タンパク質複合体を含有する全細胞溶解産物とＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーとの結合反応速度を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ干渉法を用いて２５℃で、アッセイ緩衝液（１０ｍＭリン酸塩ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で特徴づけた。特異的ＰＤ−１  ５’ビオチン化ＤＮＡアプタマー（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｏｌｉｇｏｓ）を（１０ｎＭ及び１００ｎＭ）の濃度範囲で調製した。ビオチン化アプタマーをストレプトアビジンバイオセンサーチップ上に固定し、続いて、種々の濃度の精製ＰＤ−１タンパク質及び全細胞溶解産物からのＰＤ−１タンパク質（１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１２５μＭ、０．０６３μＭ、０．０３１２μＭ、０．０１５６μＭ、及び０μＭ）の会合時に、及びブランクアッセイ緩衝液へのＰＤ−１タンパク質のその後の解離時に、ＢＬＩシグナルを測定した。ＰＤ−１結合データの全タイトレーション範囲を会合及び解離関数の１：１モデルとフィットさせることによって、各ＤＮＡの解離定数（ＫＤ）を得た、ＦｏｒｔｅＢｉｏ及び（Ｋｅｌｌｙ  Ｈｅｗ及び２０１６）。Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ解析ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、センサーグラムデータを解析した。
【０１３８】
抗体としてのＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー機能を決定するためのフィルター結合アッセイ：ＰＤ−１抗体の役割を模倣するＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの機能を、ＰＶＤＦ膜フィルター結合アッセイによって決定した。Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ蛍光ストレプトアビジン二次Ａｂ（ＬＩ−ＣＯＲ）検出のために５’末端にビオチン−ＴＥＧ修飾を有するＰＤ−１−ＤＮＡアプタマーを上記のとおり合成及び精製した。ＰＤ−１タンパク質を含有するＨＥＬ及びＫＧ−１細胞系からの種々の濃度の全細胞溶解産物１μｌ（１００μｇ〜０．７８μｇ、連続半希釈）及び精製ＰＤ−１タンパク質（１０μｇ〜０．０７８μｇ、連続半希釈）を、９６ウェルドットブロット器具（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を通してＰＶＤＦ膜上に濾過した。膜をＴＥ１００μＬで３回洗浄して、いずれの非結合タンパク質も、ＰＶＤＦ膜から洗い流した。洗浄後に、膜をＵＶ架橋して、保持されたタンパク質を固定した。次いで、ＰＶＤＦ膜に結合したＰＤ−１タンパク質を遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ）で遮断し、すすぎ、一次ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー及びＰＤ−１に対する抗体と共にインキュベートした。室温（ＲＴ）での１時間のインキュベーションの後に、膜を洗浄し、それらの対応するＮｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ蛍光二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）と共にインキュベートした。イムノブロットを、タンパク質発現を定量化するためのＯＤＹＳＳＥＹ  ＣＬｘ（ＬＩ−ＣＯＲ）によってスキャンした（Ｏｅｈｌｅｒ  Ｓ  １９９９）。
【０１３９】
フローサイトメトリーによるＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーと抗体との間の親和性の競合：ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーと抗体との間の競合を決定するために、ＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１細胞系（それぞれで１×１０５細胞）をそれぞれ、１００ｎＭ及び１０ｎＭのカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＰＤ−１特異的アプタマーならびに５００ｎＭ及び５０ｎＭのＰＤ−１抗体と共に１５分間にわたって結合緩衝液５０μｌ中でインキュベートした。次いで、細胞を洗浄緩衝液１００μｌで５〜６回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーによる分析のために結合緩衝液５０μｌ中に再懸濁させ、１×１０４細胞を分析のためにカウントした。アプタマー処理をしなかった細胞は、背景対照として役立つ。
【０１４０】
蛍光顕微鏡法によるＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーと抗体との間の親和性の競合：ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーと抗体との間の競合を決定するために、ＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１細胞系（それぞれで１×１０５細胞）をそれぞれ、１００ｎＭ及び１０ｎＭのカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＰＤ−１特異的アプタマーならびに５００ｎＭ及び５０ｎＭのＰＤ−１抗体と共に１５分間にわたって結合緩衝液５０μｌ中でインキュベートした。次いで、細胞を洗浄緩衝液１００μｌで５〜６回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーによる分析のために結合緩衝液５０μｌ中に再懸濁させ、１×１０４細胞を分析のためにカウントした。アプタマー処理をしなかった細胞は、背景対照として役立つ。
【０１４１】
混合リンパ球反応：Ｔ細胞活性化を促進するＰＤ−１特異的アプタマーの能力を、同種混合リンパ球反応を使用して評価した。同種ＭＬＲは、一方のドナーからのリンパ球（レスポンダー）の、他方のドナーからのリンパ球（スティミュレーター）に対する増殖応答を測定する機能性アッセイである。レスポンダー及びスティミュレータードナーの両方からのＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用して血液から単離した。スティミュレーターＰＢＭＣを５００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４）及び２５０Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間にわたってインキュベートした。７日間のインキュベーション後に、スティミュレーター細胞を、ＤＮＡに結合する５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理して、細胞を非増殖性にした。１セットのスティミュレーター細胞を、陽性対照としてＴ細胞増殖応答に必要な２μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（フィトヘマグルチニン）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。処理しないままになっているレスポンダー細胞は、刺激されると増殖することができた。１セットのレスポンダー細胞を、陰性ＢｒｄＵ対照のために、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理した。レスポンダー細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌのＰＤ−１特異的アプタマーまたは非特異的アプタマーのいずれかと共に、また陽性対照のための１００ｎＭ／ｍｌのＰＤ−１抗体と共に２４時間にわたってインキュベートした。次いで、生存可能なスティミュレーター細胞（１５０，０００）を、種々の試験条件に従ってレスポンダー細胞（１００，０００）と共に共培養し、５日間にわたってインキュベートした。６日目に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）をウェルに添加して、増殖性細胞においてＤＮＡ中のチミジンの代わりに組み込む（ＢｒｄＵ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ）。２４時間後に、細胞をプレートベースのルミノメーターによってＢｒｄＵ組み込みについて分析して、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定する。刺激された試験細胞と対照の非刺激レスポンダー細胞との比較によって、刺激指数が得られ、これを使用すると、様々な細胞処理の組合せにおいて増殖を比較することができる。同じセットの条件であるがＢｒｄＵを含まない別のセットのプレートを生細胞について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、代謝活性な細胞のインジケーターであるＡＴＰの存在を定量することで分析した。データによると、強固なＭＬＲ応答が５０及び１００ｎｇの抗体処理で観察され、匹敵する応答がＰＤ−１特異的アプタマーでも観察される（Ｋ．Ｖ  Ｂｒｏｍｅｌｏｗ  ２００１）及びＸｅｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬＬＣ。
【０１４２】
ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー及び抗体でのＥＬＩＳＡ分析：（ＢＤ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ＥＬＩＳＡキット）を製造者指示に従って使用して、１日目、３日目及び７日目にＭＬＲアッセイから収集された上清をＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ発現レベルについてＥＬＩＳＡ分析に掛けた。
【０１４３】
抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの状況において細胞ベースのアッセイを使用するＰＤ−１及びそのリガンド相互作用の生物学的活性のスクリーニング及び特徴づけ：抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー  ＰＤ−１  ＤＮＡ−アプタマーの有効性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞系をＴＣＲアクチベーターまたはヒトＰＤ−Ｌ１  ＴＣＲアクチベーターでトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に、抗ＰＤ１アプタマーまたは抗体と共にプレインキュベートした。次いで、ＰＤ−１／ＮＦＡＴレポーター−Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＣＲ及びＰＤ−Ｌ１  ＴＣＲトランスフェクトされたＨＥＫ２９３に、種々の濃度の抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーまたは抗体の存在下で添加した。相対ルシフェラーゼまたはルミネセンス単位を、ルミノメーターを使用して測定した。ＰＤ−１／ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーター発現の誘導倍数を、背景を引いた刺激ウェルのルミネセンス／背景を引いた非刺激対照ウェルのルミネセンスの平均によって計算した（Ｍｅｉ  Ｃｏｎｇ  ２０１５）。
【０１４４】
ヒト血清におけるアプタマー安定性：１倍ＰＢＳに溶解させた各ＰＤ−１  ＤＮＡ−アプタマー（２μＭ）を（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）からの９６％または８０％ヒト血清中で、１時間から７日間までの範囲の期間にわたって３７℃でインキュベートした。示されている各時点で、血清５μＬのアリコット（２０ｐｍｏｌ  ＤＮＡ）を取り出し、１時間にわたって３７℃で、プロテイナーゼＫ溶液５μＬ（６００ｍＡＵ／ｍＬ）と共にインキュベートして、電気泳動を妨害する血清タンパク質を除去した。プロテイナーゼＫ処理の後に、変性ゲルローディング緩衝液１８μＬを各サンプルに添加し、次いで、サンプルを−８０℃で貯蔵した。ＤＮＡアプタマーを含まない血清サンプルは陰性対照として役立つ。各時点からのサンプルを１５％変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線光曝露によって可視化した（Ｋｅｎ−ｉｃｈｉｒｏ  Ｍａｔｓｕｎａｇａ  ２０１５）。
【０１４５】
ＰＤ−１を検出するための、アプタマーを使用しての免疫組織化学：ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄから、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織スライドを得た。組織切片を回転式ミクロトームで、厚さ５ｕｍで切り出し、帯電スライドにマウントし、終夜５０℃のオーブンで加熱乾燥させた。すべての染色手順を室温で行う。
【０１４６】
ＰＤ−１抗体のＩＨＣ染色：スライドを脱パラフィン化し、水に再水和させた。抗原賦活化を、スチーム及びプロテイナーゼＫ消化法を使用して行った。スチーム法では、スライドをＩＨＣ−Ｔｅｋ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＷ−１１００）中で３５分間にわたってスチーム処理し、次いで、２０分間にわたって冷却した。プロテイナーゼＫ法では、スライドをＩＨＣ−Ｔｅｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＷ−１１０１）中で２０分間にわたって３７℃オーブン内でインキュベートし、次いで、１０分間にわたって冷却した。抗原賦活化の後に、スライドを、次のステップの前に室温で２０分間にわたって冷却した。次いで、スライドを、ＰＢＳを３回交換してそれぞれ５分間にわたって洗浄し、３％Ｈ２Ｏ２で遮断した。ＰＢＳを３回変えて洗浄した後に、スライドを、抗体希釈剤で１：５０及び１：１００希釈したＰＤ−１抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ５２５８７）中で１時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ中で３回洗浄し、ウマ抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）と共に３０分間にわたってインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで３回、それぞれ５分間にわたって洗浄し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１：５００）と共に３０分間にわたってインキュベートした。次いで、ＤＡＢ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ、Ｃａｔ＃ＩＷ−１６００、０．０５％ＤＡＢ）と共に５〜１０分間にわたってインキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。
【０１４７】
ＰＤ−１アプタマーのＩＨＣ染色：スライドを脱パラフィン化し、水に再水和させた。抗原賦活化を、スチーム及びプロテイナーゼＫ消化法を使用して行った。スチーム法では、スライドをＩＨＣ−Ｔｅｋ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＷ−１１００）中で３５分間にわたってスチーム処理し、次いで、２０分間にわたって冷却した。プロテイナーゼＫ法では、スライドをＩＨＣ−Ｔｅｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＷ−１１０１）中で２０分間にわたって３７℃オーブン内でインキュベートし、次いで、１０分間にわたって冷却した。抗原賦活化の後に、スライドを、次のステップの前に室温で２０分間にわたって冷却した。次いで、スライドを、ＰＢＳを３回交換してそれぞれ５分間にわたって洗浄し、３％Ｈ２Ｏ２で遮断した。ＰＢＳを３回変えて洗浄した後に、スライドを、アプタマー希釈剤で１：５００ｎＭ及び１：１０００ｎＭ希釈したビオチン化ＰＤ−１アプタマーと共に１時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳ中で３回、それぞれ５分間にわたって洗浄し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１：５００）と共に３０分間にわたってインキュベートした。次いで、ＤＡＢ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ、Ｃａｔ＃ＩＷ−１６００、０．０５％ＤＡＢ）と共に５〜１０分間にわたってインキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。染色したスライドを通常の顕微鏡で検査した。代表的な写真を撮影した。
【０１４８】
ＰＤ−１アプタマーの機能を検出するための標的死滅アッセイ：免疫細胞活性化（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＴ細胞分集団）を促進するＰＤ−１特異的アプタマーの能力を、ＩｎｃｕｃｙｔｅによってアネキシンＶ陽性細胞の蛍光強度面積を測定することでＨＥＬ−９２−１腫瘍細胞の死滅を定量化することによって評価した。
【０１４９】
この機能性アッセイでは、アネキシンＶ陽性標識により生成される平均蛍光強度面積を測定する。ＰＢＭＣ（エフェクター）細胞及びＨＥＬ．９２．１（標的）細胞をこのアッセイでは使用した。ドナーからのＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用して血液から単離した。スティミュレーターＰＢＭＣを５００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−４（ＩＬ−４）及び２５０Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏで５日間にわたってインキュベートした。標的細胞を２０ｎＭ／ｍｌ  ＰＤ−１特異的アプタマーもしくは非特異的アプタマーまたは１００ｎＭ／ｍｌのＰＤ−１特異的アプタマーのいずれかと共にインキュベートし、生存可能なエフェクター細胞の存在下で２０：１または１０：１比で共培養した。次いで、アネキシンＶ溶液（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）をこれらの共培養細胞に添加し、少なくとも３０〜６０分間にわたって水準面に沈降させて、均一に分散させた。細胞プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ  ＺＯＯＭ器具に入れて、プレートを３７℃で１０〜２０分間にわたって加温し、その後に初めてスキャンした。スキャンを、２〜３時間ごとに２４時間の繰り返しで、最高５日間にわたってスケジューリングした。
【０１５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験（動物モデル）：すべての動物飼育及び取扱手順は、ＣｒｏｗｎＢｉｏ  ＩＡＣＵＣプロトコルに従うものであり、Ｃｒｏｗｎ  ＢｉｏＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒ＆Ｄ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（ＳＯＰ）に従って行った。６週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏ）（ｎ＝３）を２つの群に割り当てた。マウスの全平均体重は１８〜２２ｇｍであった。すべての動物飼育及び実験手順を、Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏの施設ガイドラインに従って行った。薬物動態研究を、６週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、ＣＹ３で標識されたＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー及びＣＹ３−Ｐ１０で標識されたＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーを注射することによって行った。尾静脈を介して（生理食塩水１００μｌ中４５μＭ）を静脈内に１回の単回投与短期間研究では、血液５０μｌを陰性対照として抜き取り、その後、ＰＤ−１アプタマー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：１０及び１：１００に希釈）を注射する。（４５μＭ／生理食塩水１００μｌ）のＣＹ３標識ＰＤ−１アプタマー及び（４５μＭ／生理食塩水１００μｌ）のＣＹ３−Ｐ１０標識ＰＤ−１アプタマーをマウスに注射し、血液５０μｌを５分〜７２０分の８つの時点で収集する。次いで、これらの時点からの血漿をＰＢＳ中で１：１０及び１：１００に希釈した。ＣＹ３蛍光を、５５０ｎｍでの励起ピーク及び５７０ｎｍでの発光ピークでＣＹ３フィルターを使用して測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン６．３（Ｃｅｒｔａｒａ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を使用して血漿中濃度−時間データを２コンパートメントモデルにフィットさせることによって、薬物動態パラメーターを得た（Ｋａｎｇ  ＳＡ  ２０１５）。
【０１５１】
抗ＰＤ１  アプタマー−ｐ１０の有効性は抗ＰＤ−１抗体に匹敵する
次に、抗ＰＤ１アプタマー有効性を、抗ＰＤ−１抗体と比較するために分析した。ＨＥＬ９２．１．７モデルを、ヒト化ＮＳＧに移植するために使用した。研究は、単一コホートから３つの群及び１群あたり３匹の動物を含む：ビヒクル群、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−１アプタマー。ヒト化ＮＳＧマウスに、右ひ腹で５，０００，０００細胞を皮下接種する。平均腫瘍が６０〜９０ｍｍ３になったときに、無作為化の翌日から、抗ＰＤ−１抗体のＩＶ、ＢＩＷでの３回投与及び抗ＰＤ−１アプタマーのＩＶ、ＢＩＷでの５回投与（この研究では合計８回投与）をこのｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために実施した。動物を生存について４〜６週間にわたってモニターする。腫瘍容積が２０００ｍｍ３を超えるか、または体重減少が２０％を超えたら、ＩＡＣＵＣプロトコルの規制に従って、動物を安楽死させる。
【０１５２】
統計的解析：結合曲線の計算を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行った。
【０１５３】
引用参照文献
Ｂｏｃｈｍａｎ  ＭＬ，Ｐ．Ｋ．，Ｚａｋｉａｎ  ＶＡ．（２０１２）．”ＤＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３（１１）：７７０−７８０．
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【０１５４】
結果
ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１過剰発現は、がん患者における低い生存率と関連している
初めに、免疫チェックポイントＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１発現と、ＨＣ患者の生存率との関連を決定するために、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースの血液がん（ＨＣ）データセットを解析した（図１５Ａ）。ＴＣＧＡデータは、ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１の過剰発現がＨＣ患者における腫瘍の進行及び低い生存率と関連していることを示した（図１５Ａ）。さらに、４種の白血病細胞系を含むパネルにおけるＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１タンパク質発現のレベルについてのウェスタン分析で、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１が白血病細胞系の多くで高度に発現されることが見出された（図１５Ａ）。高度で重篤なＨＣを有する患者からの腫瘍サンプルにおけるＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の免疫組織化学的分析は、これらの腫瘍における高いＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１発現を明らかにした（図１５Ａ、図１５Ｂ及び図１５Ｃ）。これらの所見は、ＨＣ患者のための治療標的としてのＰＤ−１の潜在的な重要性を指し示している。
【０１５５】
ヒト内因性ＰＤ−１結合性ＤＮＡアプタマーの同定
ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのＳＥＬＥＸを行って、特異的ＰＤ−１抗体を使用して白血病細胞系ＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１からの内因性発現した免疫沈降ＰＤ−１に対して無作為ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、内因性ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）を特異的に認識するＤＮＡアプタマーを同定し（図１、図２、図１０、図１１）、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルを共焦点顕微鏡法によって確認した（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ及び図１３Ｄ）。各回、新たに調製された免疫沈降天然ＰＤ−１を用いて、濃縮の７回の反復ラウンドを行い、抗ＰＤ−１抗体に結合したビーズによって対抗選択ステップを行って、ストレプトアビジンビーズに特異的なアプタマー配列または選択されたプールからの抗体を各反復ラウンドにおいて除去した。７つすべてのラウンド及び２つの異なる系（５’及び３’位に追跡タグ（特有のバーコード）をそれぞれ有する）から同じ割合でＰＣＲ産物をプールした後に、単一のＩｏｎ−ｔｏｒｒｅｎｔ  ３１４  ｃｈｉｐ（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ）で、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を行った。ＮＧＳデータによって、親の高濃縮配列に対して高い配列同一性を有する配列を含むアプタマーファミリーの有意な濃縮が明らかになった。特に、ラウンド６及び７からの収束配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ多重配列分析によって、「Ｔ及びＧ」を含む高度反復エレメントが明らかになり、これは、すべての存在する収束配列において観察された（図３及び図４）。磁気ストレプトアビジンビーズ上に固定された、これらのアプタマーのうちの６つのそのようなビオチン化バージョンを用いる免疫沈降分析を使用して、ＨＥＬ及びＫＧ−１細胞系の全細胞抽出物からｈＰＤ−１を免疫沈降させると、これらの配列が、その内因性複合体においてｈＰＤ−１に結合するそれらの能力によって、選択中にバルクライブラリーから濃縮されたことが確認された（図５）。ｈＰＤ−１に結合する抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの能力を、ＨＥＬ及びＫＧ−１細胞質及び核抽出物を用いる免疫沈降によって確認した。核抽出物よりもむしろ細胞質抽出物において、ＰＤ−１抗体に匹敵して、ＰＤ−１発現が観察された。
【０１５６】
抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーは安定している
最も濃縮された最良と示されたビオチン化抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー配列を、さらなる評価のために選択した。選択アプタマー配列でＭｆｏｌｄアルゴリズムを使用して行われた構造予測は、複雑なヘアピン−バルジ折り畳み状態を明らかにした。−１．５〜−４．０ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低Ｇｉｂｂｓ遊離エネルギーの最適な構造及び最適以下の構造を有する折り畳まれたアプタマー配列が観察された（図７）。濃縮ＤＮＡ配列のすべてがＧリッチ反復領域の高い出現率を有し、したがって、これらのアプタマーはＰＤ−１を認識する特異性／親和性に寄与し得るＧ四重鎖構造を取ることが可能である（図７）。９６％または８０％ヒト血清のいずれかを含有する培地中での１時間から７日間までの抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの安定性を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価した。これらのデータは、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーが９６％及び８０％血清の両方において最高７２時間にわたって安定していることを明らかに示す（図１７及び図１８）。
【０１５７】
抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーは、ナノモル親和性で、精製された過剰発現ＰＤ−１タンパク質に、かつピコモル親和性で、全細胞抽出物中に存在する内因性ＰＤ−１タンパク質に結合する
バイオレイヤー干渉法を使用して、精製ＰＤ−１タンパク質及び全細胞溶解産物（ＨＥＬ及びＫＧ−１細胞系）での結合反応速度データを作成し、抗ＰＤ１−ＤＮＡアプタマーの解離定数を５ｎＭ及び５００ｐＭと定義した（図９Ａ及び図９Ｂ）。解離定数を、ニトロセルロースフィルター結合アッセイによって確認し、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーが、その天然立体配座では、精製された過剰発現ＰＤ−１タンパク質よりも良好にＰＤ−１発現細胞系の全細胞溶解産物にピコモル濃度で結合することを実証した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。細胞におけるこの抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの局在化を評価するために、ＨＥＬ及びＫＧ−１細胞系を蛍光標識抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー（２５０ｎＭ）と共に３０分間にわたってインキュベートした。細胞を固定した後に、免疫蛍光を使用して、局在化を可視化した。抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーは細胞表面に局在化されたが、ＰＤ−１を発現しない陰性対照細胞系は、シグナルを示さなかった（図６Ｂ）。
【０１５８】
抗ＰＤ−１抗体が続く、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー結合部位の競合結合アッセイ。
抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー及び抗ＰＤ−１抗体が同じＰＤ−１結合部位について競合するかをフローサイトメトリーによってさらに検証するために、免疫蛍光及びゲルシフトアッセイを行った。ＰＤ−１結合部位についてのＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーと抗体との間の競合を決定するために、ＨＥＬ９２．１．７及びＫＧ−１細胞系を、１００ｎＭ及び１０ｎＭのカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＰＤ−１特異的アプタマーと、続いて、５００ｎＭ及び５０ｎＭのＰＤ−１抗体と共に１５分間にわたって結合緩衝液５０μｌ中でインキュベートした。フローサイトメトリーによる平均蛍光強度は、抗体の存在下で、アプタマー結合親和性が下方調節されることを明らかにし、抗体及びアプタマーの両方が少なくとも同様のＰＤ−１結合部位を共有することを示唆した（図６Ａ）。ＰＤ−１結合部位についての競合を蛍光顕微鏡法によって確認した（図６Ｂ）。ゲルシフトアッセイも、抗体とアプタマーとの間でＰＤ−１結合部位について同様の親和性を明らかにした（図１２）。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイを使用しての、ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１の相互作用における抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの生物学的活性
抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの機能性を、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１細胞ベースのアッセイを使用して検証した。ＰＤ−１／ＮＦＡＴを発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した一方で、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をＰＤ−Ｌ１と共に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、アクチベーター細胞として使用する。これら２種の細胞（エフェクター＋ＴＣＲアクチベーター）の共培養は、ＮＦＡＴルシフェラーゼレポーターの発現をもたらす一方で、（エフェクター＋ＴＣＲアクチベーター＋ＰＤ−Ｌ１）は、ＴＣＲ活性化の防止をもたらし、したがって、ＮＦＡＴ応答性ルシフェラーゼ活性を抑制する。この組み合わせ（エフェクター＋ＴＣＲアクチベーター＋ＰＤ−Ｌ１）において抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーで処理し、かつ抗ＰＤ−１中和Ａｂを陽性対照として使用した場合、特異的な阻害の除去が観察された（図４０）。抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの存在下での相対的ルシフェラーゼ単位の上昇は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断においてＰＤ−１中和ａｂを模倣し、Ｔ細胞活性化を促進し、ＮＦＡＴ応答性ルシフェラーゼレポーターの再活性化をもたらす抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの役割を示唆する。また、陽性対照抗ＰＤ−１中和Ａｂ（図１６Ａ）では０．２４７１μｇ／ｍｌのＥＣ５０値で、かつ抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー（図１６Ｂ）では０．１８４９μｇ／ｍｌのＥＣ５０値で、用量反応曲線が示された。これらの結果は、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーが抗体よりも低い濃度でＴ細胞活性化を促進することを示している。
【０１６０】
ＭＬＲアッセイによる、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物学的活性
Ｔ細胞活性化を促進する抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの存在下でＭＬＲ応答の反応速度を評価するために、増殖アッセイを行った。ＢｒｄＵ取り込みの連続的測定が、５日間の刺激の後に実証された。抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー（２０ｎＭ／ｍｌ及び１０ｎＭ／ｍｌの濃度）（図８）及び対照のＰＤ−１中和ａｂ（１００ｎＭ／ｍｌ及び５０ｎＭ／ｍｌの濃度）（図８）の存在下では、５日間の刺激の後、およそ１日目に、最大リンパ球増殖が見られた。低濃度の抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの存在下で、より良好な増殖応答が観察された（図１９及び図２０）。培養における生細胞の数は、活性化の最初の５日間にわたって、かつ抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーまたは抗体のいずれかの存在下で一定であり続け、増殖は、およそ６日目にピークに達し始め、８日目にゆっくり低下し始めた。セルタイターＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ生存率アッセイを使用することによるＡＴＰの存在の定量化によって、増殖応答の同様のパターンが、ＢｒｄＵを取り込んでいない細胞の生存率で観察された。比較可能な抗体処理において、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの存在下で、強固なＭＬＲ応答が観察される。ＥＬＩＳＡによって、ＭＬＲアッセイサンプルの上清において、ＰＤ−１抗体に匹敵するＩＦＮ−γ応答（図２１Ａ〜Ｃ）、さらにはＩＬ−２分泌（図２２Ａ〜Ｃ）の増強も、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの存在下で観察された。培養培地におけるＩＦＮ−γ応答の濃度の連続的測定は、５日間の刺激後の６日目にピークに達し、ＩＬ−２分泌の低下は、ほぼ８日目に観察され得る（図２１Ａ〜Ｃ及び図２２Ａ〜Ｃ）。培養培地におけるＩＬ−２の濃度の連続的測定は、５日間の刺激後の６日目にピークに達し、ＩＬ−２分泌の低下は、ほぼ８日目に観察され得る（図２２Ａ〜Ｃ）。総じて、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの添加は、ＩＬ−２分泌を対照に対して平均で約８０倍〜３８０倍に、及びＩＦＮ−γ応答を対照に対して平均で約２００倍〜４００倍に増加させた。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１発現も、共焦点顕微鏡法によって検査した（図２４及び図２５）。同様のパターンのＭＬＲ応答が、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２３及び図２６）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図３３）で観察された。ＩＦＮ−γ応答の濃度の増大が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清（図２７、図２８及び図２９）、さらにはＣＤ８＋Ｔ細胞の上清で観察された（図３４、図３５及び図３６）。ＩＬ−２応答の濃度の増大が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の上清（図３０、図３１及び図３２）、さらには、ＣＤ８＋Ｔ細胞の上清（図３７、図３８及び図３９）で観察された。
【０１６１】
免疫組織化学を用いるヒト組織におけるＰＤ−１の診断薬としてのビオチン化抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー
ＩＨＣ−ＤＡＢ法を使用して、ＰＤ−１アプタマーをヒト扁桃及び肺癌組織で検査した。これによって、このＰＤ−１アプタマーの最良の使用条件及び希釈を決定する。ＩＨＣ−Ｔｅｋ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌスチームプレトリートメントで、１：１０００ｎＭ濃度で最良のＰＤ−１アプタマー陽性染色が見出された（図１５Ｂ、１５Ｃ）。プロテイナーゼＫプレトリートメント及びインタクトなスライドでは、無染色または弱陽性染色が観察された。
【０１６２】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖベースのアッセイを使用しての、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの標的細胞溶解活性
抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーの機能性をまた、Ｉｎｃｕｃｙｔｅによる標的細胞溶解分析を使用して検証した。ＨＥＬ．９２．１．７細胞を標的細胞として使用した一方で、Ｔ細胞分集団を含むＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。アネキシンＶの存在下でのこれら２種の細胞（エフェクター＋標的細胞）の共培養は、平均緑色対象総面積をもたらす。ＰＤ−１アプタマーの存在下では、ＰＤ−１抗体の存在に匹敵する緑色対象面積の増加が見られ、対照条件では、緑色対照面積の減少が見られる。これらの結果は、抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーが抗体よりも低い濃度でＴ細胞活性化を促進することを示している（図４１）。
【０１６３】
ＰＥＧ化抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマー（抗ＰＤ−１−ｐ１０）は薬物動態の改善を示す
アプタマー（核酸）、タンパク質及びワクチンなどの生体分子へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコンジュゲーションは、血液中でのこれらの分子の半減期及び安定性を改善し、また免疫細胞の認識、さらには腎臓及び肝クリアランスからこれらの分子を保護するための最も一般的かつ重要なストラテジーの１つである。（Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ  Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（２０１６）５，ｅ３９９）（図４２）。アプタマー薬物動態を、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてＣｙ３標識ＰＤ−１及びＰＤ−１−ｐ１０を単回静脈内投与した後に決定した。ＰＤ−１と比較して、１０ｋＤａのＰＥＧを抗ＰＤ−１  ＤＮＡアプタマーにコンジュゲートさせることで、全身循環からのクリアランスが減少し、排出半減期が延びた（図８Ａ及び図８Ｂ）。これは、長期間にわたる抗ＰＤ−１−ｐ１０のより高い血漿中濃度（ｃｙ３での３７／３６０分に対して１１７／３６０分）及び総全身曝露の少なくとも３倍の増加をもたらした（図４３）。定常状態分布容積の総容積（Ｖｓ）は、抗ＰＤ−１−ｐ１０と抗ＰＤ−１との間で匹敵した。
【０１６４】
抗ＰＤ１アプタマー−ｐ１０の有効性は、抗ＰＤ−１抗体に匹敵する
ヒト化ＮＳＧでグラフトするためにＨＥＬ９２．１．７モデルを使用して、抗ＰＤ１アプタマーの有効性を抗ＰＤ−１抗体と比較して検査した（図４４）。腫瘍容積は、対照群での３００２．１８ｍｍ３対ＰＤ−１  Ａｂ（２２２４．０７ｍｍ３）対ＰＤ−１アプタマー（２１９０．８５ｍｍ３）で観察された（図４５〜４７）。このデータは、抗ＰＤ１アプタマー−ｐ１０が、抗ＰＤ−１抗体に匹敵して、血液白血病細胞をグラフトされたマウスにおいて、ＰＤ−１の機能性遮断及び腫瘍細胞を除去するための免疫応答の増強を介して、腫瘍量を減少させることを示している。
【０１６５】
別段に定義されない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語はすべて、本開示の発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書で引用した刊行物及び刊行物がそのために引用された物質は特に、参照によって援用される。
【０１６６】
当業者は、ルーチン以下の実験を使用することで、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物が分かるか、またはそれらを確認することができるであろう。そのような同等物は、次の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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