(57)【要約】SEQ ID NO:11のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり変異D101SおよびK137Sを含むアミノ酸配列を含むソルターゼが、本明細書において報告される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり変異D101SおよびK137Sを含むアミノ酸配列を含むソルターゼであって、ソルターゼによって媒介されるカップリング反応において、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有するソルターゼより高い酵素活性を有する、ソルターゼ。
【請求項２】
A2E、A2T、E47G、N48W、F85L、およびG108E（SEQ ID NO:11に基づく位置）からなる変異の群より選択される1個または複数個の変異をさらに含む、請求項1記載のソルターゼ。
【請求項３】
（i）変異D101S、K137S、およびE47G；
（ii）変異D101S、K137S、およびN48W；
（iii）変異D101S、K137S、およびF85L；
（iv）変異D101S、K137S、およびG108E；
（v）変異D101S、K137S、N48W、およびF85L；
（vi）変異D101S、K137S、F85L、およびG108E；
（vii）変異D101S、K137S、N48W、およびG108E；または
（viii）変異D101S、K137S、N48W、F85L、およびG108E
を含む、請求項1または2記載のソルターゼ。
【請求項４】
アミノ酸配列が、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、またはSEQ ID NO:20である、請求項1〜3のいずれか一項記載のソルターゼ。
【請求項５】
（i）ソルターゼ認識配列を含む第1のポリペプチド、
（ii）ソルターゼアクセプター配列を含む第2のポリペプチド、および
（iii）請求項1〜4のいずれか一項記載のソルターゼ
を共にインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドを作製するための方法。
【請求項６】
・（i）アミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）を含み、Xが任意のアミノ酸残基であり得る、第1のポリペプチド、
（ii）（I）N末端のグリシニル化合物、
（II）N末端のオリゴグリシン、
（III）N末端のシステインアミノ酸残基に続く1〜3個のグリシンアミノ酸残基、または
（IV）N末端の5個のアミノ酸残基内のリジンアミノ酸残基
より選択されるソルターゼアクセプター配列を含む、第2のポリペプチド、
（iii）請求項1〜4のいずれか一項記載のソルターゼ
を共にインキュベートする工程；および
・反応混合物からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
第1のポリペプチドが、C末端の20個のアミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）を含み、Xが任意のアミノ酸残基であり得る、請求項5または6記載の方法。
【請求項８】
第1のポリペプチドが、C末端の20個のアミノ酸残基内にアミノ酸配列LPETG（SEQ ID NO:22）を含む、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第2のポリペプチドが、N末端にアミノ酸配列GG（SEQ ID NO:23）、GGG（SEQ ID NO:24）、CGG（SEQ ID NO:25）、またはKGG（SEQ ID NO:26）を有する、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、相互に独立に、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、標識、毒素、および非ソルターゼポリペプチドからなる群より選択される、請求項5〜9のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソルターゼの分野に属する。改善された酵素活性を有するソルターゼ、および、アミド基転移反応においてそれを使用する方法を、本明細書において報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ソルターゼA（SrtA）は、タンパク質を細菌細胞壁に共有結合で付着させる膜結合型酵素である。SrtA基質上の特異的な認識モチーフは、LPXTGであり、酵素は、残基トレオニンとグリシンとの間で切断する。ペプチドグリカン上の認識モチーフは、ペンタグリシンモチーフである。N末端のトリグリシンモチーフ、そしてジグリシンモチーフですら、SrtA反応を支持するのに十分であることが示されている（Clancy, K. W. et al., Peptide science 94(2010)385-396（非特許文献1））。その反応は、チオエステルアシル酵素中間体を通して進行し、それが、オリゴグリシンからのアミン求核剤の攻撃によって分離され、ペプチドグリカンがタンパク質基質に共有結合で連結され、SrtAが再生される。化学合成されたペプチドを組換え発現されたタンパク質に共有結合でコンジュゲートするため、SrtAを使用することが可能である。
【０００３】
WO 2010/087994（特許文献1）に、ライゲーションのための方法およびその使用が報告されている。IgG様二重特異性抗体の組換えアプローチは、Marvin, J. S.ら（Acta Pharmacol. Sinica 26(2005)649-658（非特許文献2））によって報告されている。WO 2013/003555（特許文献2）には、タンパク質ライゲーションのためのクリックケミストリーハンドルを設置するためのソルターゼの使用が報告されている。
【０００４】
Levary, D. A.らは、ソルターゼAによって触媒されたタンパク質間融合を報告している（PLOS ONE 6(2011)（非特許文献3））。抗上皮増殖因子受容体抗体の単鎖フォーマットへの設計およびソルターゼAによって媒介されるタンパク質ライゲーションによる標識は、Madej, M. P.ら（Biotechnol. Bioeng. 109(2012)1461-1470（非特許文献4））によって報告されている。Ta, H. T.らは、心血管疾患における分子標的イメージングおよび細胞ホーミングのためのユニバーサルなアプローチとして、酵素的単鎖抗体タグ付けを報告している（Cir. Res. 109(2011)365-373（非特許文献5））。Popp, M.らは、ソルターゼを使用した、ペプチド結合の作成および破壊、即ち、タンパク質設計を報告している（Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50(2011)5024-5032（非特許文献6））。DOTAキレートに対する高い親和性を有するよう設計されたタンパク質は、WO 2010/099536（特許文献3）に報告されている。
【０００５】
ソルターゼの逆向き反応を阻止するための種々の努力が報告されている。Yamamura,Y.ら（Chem. Commun. 47(2011)4742-4744（非特許文献7））は、基質の認識部位の周辺にβヘアピンを導入することによって、ライゲーション部位の周辺にβヘアピン構造を誘導することによる、ソルターゼAによって媒介されるタンパク質ライゲーションの増強を報告した。
【０００６】
原型ソルターゼAによるLPXTGペプチドの選別、酵素動力学をモジュレートするための不変基質残基の役割、および生成基質のコンフォメーションサインは、Biswas, T.ら（Biochem. 53(2014)2515-2524（非特許文献8））によって報告された。
【０００７】
Li, Y. M.らは、ソルターゼの使用による、タンパク質の不可逆性の部位特異的なヒドラジン分解を報告している（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53(2014)2198-2202（非特許文献9））。
【０００８】
増強された反応速度論および/または改変された基質の好みを示す進化型ソルターゼ、ならびにそのような進化型結合形成酵素を使用する方法が、US 9,267,127（特許文献4）において報告されている。そこには、P94S、P94R、E106G、F122Y、K154R、D160N、D165A、G174S、K190E、およびK196Tからなる群より選択される2個以上の変異を含む、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ソルターゼAのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むソルターゼが報告されている。同一の進化型ソルターゼが、WO 2014/70865（特許文献5）およびWO 2015/42393（特許文献6）において使用されている。
【０００９】
Chen,I.らは、酵母ディスプレイを使用した、結合形成酵素の進化のための一般的な戦略を報告している（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11399-11404（非特許文献10））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2010/087994
【特許文献２】WO 2013/003555
【特許文献３】WO 2010/099536
【特許文献４】US 9,267,127
【特許文献５】WO 2014/70865
【特許文献６】WO 2015/42393
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Clancy, K. W.ら、Peptide science 94(2010)385-396
【非特許文献２】Marvin, J. S.ら、Acta Pharmacol. Sinica 26(2005)649-658
【非特許文献３】Levary, D. A.ら、PLOS ONE 6(2011)
【非特許文献４】Madej, M. P.ら、Biotechnol. Bioeng. 109(2012)1461-1470
【非特許文献５】Ta, H. T.ら、Cir. Res. 109(2011)365-373
【非特許文献６】Popp, M.ら、Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 50(2011)5024-5032
【非特許文献７】Yamamura,Y.ら、Chem. Commun. 47(2011)4742-4744
【非特許文献８】Biswas, T.ら、Biochem. 53(2014)2515-2524
【非特許文献９】Li, Y. M.ら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53(2014)2198-2202
【非特許文献１０】Chen,I.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(2011)11399-11404
【発明の概要】
【００１２】
改善された触媒特性を有する黄色ブドウ球菌ソルターゼAが、本明細書において報告される。SEQ ID NO:01の野生型黄色ブドウ球菌ソルターゼAに変異D160SおよびK196Sを導入することによって、ソルターゼの酵素特性が改善され得ることが見出された（例えば、D160Sという用語は、SEQ ID NO:01の160位のアミノ酸残基Dがアミノ酸残基Sに交換され/変異していることを示す）。本明細書において報告されるソルターゼは、（本明細書において報告されるアッセイにおいて決定される）黄色ブドウ球菌由来の野生型ソルターゼAの酵素活性の約5倍である酵素活性を有する。
【００１３】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり変異D101SおよびK137Sを含むアミノ酸配列を含み、かつソルターゼによって媒介されるカップリング反応において、SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有するソルターゼより高い（本明細書において報告されるアッセイにおいて決定される）酵素活性を有するソルターゼである。
【００１４】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:01の黄色ブドウ球菌ソルターゼAのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり（SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を有するソルターゼAをもたらす）変異D160SおよびK196Sを含むアミノ酸配列を含むソルターゼである。
【００１５】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:01の黄色ブドウ球菌ソルターゼAのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり（SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を有するソルターゼAをもたらす）変異D160SおよびK196Sを含むアミノ酸配列を含む、ソルターゼ活性を有するポリペプチド、即ち、アミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）を含む第1の化合物と、N末端にジグリシンまたはトリグリシンを含む第2の化合物との間のペプチド結合の形成を触媒するポリペプチドである。
【００１６】
一つの態様において、SEQ ID NO:01のソルターゼ/ポリペプチドは、A61E、A61T、E106G、N107W、F144L、およびG167Eからなる変異の群より選択される1個または複数個の変異をさらに含む。
【００１７】
一つの態様において、ソルターゼ/ポリペプチドは、
（i）変異D160S、K196S、およびE106G（SEQ ID NO:03）；
（ii）変異D160S、K196S、およびN107W（SEQ ID NO:04）；
（iii）変異D160S、K196S、およびF144L（SEQ ID NO:05）；
（iv）変異D160S、K196S、およびG167E（SEQ ID NO:06）；
（v）変異D160S、K196S、N107W、およびF144L（SEQ ID NO:07）；
（vi）変異D160S、K196S、F144L、およびG167E（SEQ ID NO:08）；
（vii）変異D160S、K196S、N107W、およびG167E（SEQ ID NO:09）；または
（viii）変異D160S、K196S、N107W、F144L、およびG167E（SEQ ID NO:10）
を含む。
【００１８】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09、またはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有するソルターゼ/ポリペプチドである。
【００１９】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:11の短縮型黄色ブドウ球菌ソルターゼAのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり（SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する短縮型ソルターゼAをもたらす）変異D101SおよびK137Sを含むアミノ酸配列を含むソルターゼである。
【００２０】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:11の黄色ブドウ球菌ソルターゼAのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり（SEQ ID NO:02のアミノ酸配列を有するソルターゼAをもたらす）変異D101SおよびK137Sを含むアミノ酸配列を有する、ソルターゼ活性を有するポリペプチド、即ち、アミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）を含む第1の化合物と、N末端にジグリシンまたはトリグリシンを含む第2の化合物との間のペプチド結合の形成を触媒するポリペプチドである。
【００２１】
一つの態様において、SEQ ID NO:12のソルターゼ/ポリペプチドは、A2E、A2T、E47G、N48W、F85L、およびG108Eからなる変異の群より選択される1個または複数個の変異をさらに含む。
【００２２】
一つの態様において、ソルターゼ/ポリペプチドは、
（i）変異D101S、K137S、およびE47G（SEQ ID NO:13）；
（ii）変異D101S、K137S、およびN48W（SEQ ID NO:14）；
（iii）変異D101S、K137S、およびF85L（SEQ ID NO:15）；
（iv）変異D101S、K137S、およびG108E（SEQ ID NO:16）；
（v）変異D101S、K137S、N48W、およびF85L（SEQ ID NO:17）；
（vi）変異D101S、K137S、F85L、およびG108E（SEQ ID NO:18）；
（vii）変異D101S、K137S、N48W、およびG108E（SEQ ID NO:19）；または
（viii）変異D101S、K137S、N48W、F85L、およびG108E（SEQ ID NO:20）
を含む。
【００２３】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、またはSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含むソルターゼ/ポリペプチドである。
【００２４】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、またはSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有するソルターゼ/ポリペプチドである。
【００２５】
本明細書において報告される一つの局面は、（i）ソルターゼ認識配列を含む第1のポリペプチド、（ii）ソルターゼアクセプター配列を含む第2のポリペプチド、および（iii）本明細書において報告されるソルターゼ/ポリペプチドを共にインキュベートし、それによってポリペプチドを作製する工程を含む、ポリペプチドを作製するための方法である。
【００２６】
一つの態様において、方法は、
・（i）アミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）を含み、Xが任意のアミノ酸残基であり得る、第1のポリペプチド、
（ii）（I）N末端のグリシニル化合物、
（II）N末端のオリゴグリシン、
（III）N末端のシステインアミノ酸残基に続く1〜3個のグリシンアミノ酸残基、または
（IV）N末端の5個のアミノ酸残基内のリジンアミノ酸残基
より選択されるソルターゼアクセプター配列を含む、第2のポリペプチド、
（iii）本明細書において報告されるソルターゼ/ポリペプチド
を共にインキュベートする工程；および
・反応混合物からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む。
【００２７】
一つの態様において、方法は、2個のポリペプチドの酵素的コンジュゲーションのためのものである。
【００２８】
一つの態様において、第1のポリペプチドは、C末端の20個のアミノ酸残基内にアミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）を含み、Xは任意のアミノ酸残基であり得る。一つの態様において、第1のポリペプチドは、C末端の20個のアミノ酸残基内にアミノ酸配列LPETG（SEQ ID NO:22）を含む。
【００２９】
一つの態様において、第2のポリペプチドは、N末端にアミノ酸配列GG（SEQ ID NO:23）、GGG（SEQ ID NO:24）、CGG（SEQ ID NO:25）、またはKGG（SEQ ID NO:26）を有する。
【００３０】
一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、相互に独立に、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、標識、毒素、および非ソルターゼポリペプチドからなる群より選択される。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌の全長野生型ソルターゼAのアミノ酸残基D160およびK196、またはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌の短縮型ソルターゼAの残基D101およびK137を、それぞれ、両方ともセリンに変異させることによって、ソルターゼの酵素活性を改善することができるという所見に少なくとも一部分基づく。
【００３２】
I.定義
本明細書において使用されるように、与えられたアミノ酸位置は、言及されたアミノ酸配列におけるそれぞれの（連続的な）位置である。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1個の（a）」、「1個の（an）」、および「その（the）」には、前後関係が明白にそうでないことを指示しない限り、複数の言及が含まれることに注意しなければならない。従って、例えば、「1個の細胞（a cell）」へ言及には、複数のそのような細胞および当業者に公知のそれらの等価物が含まれ、他も同様である。同様に、「1個の（a）」（または「1個の（an）」）、「1個または複数」、および「少なくとも1個」という用語は、交換可能に本明細書において使用され得る。「含む（comprising）」、「含む（including）」、および「有する」という用語が、交換可能に使用され得ることにも注意すべきである。
【００３４】
さらに、具体的に開示されていない場合でも、本明細書において報告される局面および態様の全ての可能な変動、組み合わせ、および並び替えが、内含され、本発明の具体的な態様を形成する。これには、請求項のうちの一つもしくは複数、または説明の関連部分からの、一つまたは複数の限定、要素、条項、記述的用語等の、もう一つの請求項への導入が包含される。例えば、任意の請求項が、それに依存する他の請求項に見出される一つまたは複数の限定を含むよう修飾され得る。さらに、請求項が化合物または組成物を記載する場合、そうでないことが示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、本明細書において開示された目的のために、化合物または組成物を使用する方法が含まれ、本明細書に開示された作成の方法または当技術分野において公知の他の方法のいずれかに従って、化合物または組成物を作成する方法が含まれることが理解されるべきである。
【００３５】
特色がリストとして提示される場合、特色のサブグループも個々の特色も各々開示されており、本開示を拡張することなく、任意の特色が群から除去され得ることが理解されるべきである。
【００３６】
範囲が与えられる場合、範囲の終点が、明白に含まれ、個々の値としても開示されている。前後関係および/または当業者の理解からそうでないことが示されるかまたはそうでないことが明らかでない限り、範囲として表された値は、その範囲内の特定の値に関する全ての態様を、この特定の値を明白に挙げる必要なしに、含み、開示する。また、前後関係および/または当業者の理解からそうでないことが示されるかまたはそうでないことが明らかでない限り、範囲として表された値には、範囲の所定の終点内の部分範囲が含まれ、部分範囲の終点は、範囲のものと同一の程度の正確さで表されている。
【００３７】
「変異」という用語は、予定された親アミノ酸配列の少なくとも1個のアミノ酸残基の、異なる「交換」アミノ酸残基への交換を意味する。交換残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」（即ち、遺伝暗号によってコードされたもの）であってよく、アラニン（Ala）；アルギニン（Arg）；アスパラギン（Asn）；アスパラギン酸（Asp）；システイン（Cys）；グルタミン（Gln）；グルタミン酸（Glu）；グリシン（Gly）；ヒスチジン（His）；イソロイシン（Ile）:ロイシン（Leu）；リジン（Lys）；メチオニン（Met）；フェニルアラニン（Phe）；プロリン（Pro）；セリン（Ser）；トレオニン（Thr）；トリプトファン（Trp）；チロシン（Tyr）；およびバリン（Val）からなる群より選択される。一つの態様において、交換残基はシステインではない。1個または複数個の天然に存在しないアミノ酸残基への置換も、本明細書において使用される変異の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖において近位アミノ酸残基と共有結合することができる、上記の天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を意味する。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、aib、およびEllman et al., Meth.Enzym.202(1991)301-336に記載されたもののようなその他のアミノ酸残基類似体が含まれる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するためには、Norenら（Science 244(1989)182）および/またはEllmanら（前記）の手法を使用することができる。簡単に説明すると、これらの手法は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むサプレッサーtRNAの化学的な活性化に続く、RNAのインビトロの転写および翻訳を含む。化学的なペプチド合成、およびその後の抗体または抗体断片のような組換え作製されたポリペプチドとのこれらのペプチドの融合により、天然に存在しないアミノ酸をペプチドへ組み込むこともできる。
【００３８】
「タグ」という用語は、特異的結合特性を有する、ペプチド結合によって相互に接続されたアミノ酸残基の配列を意味する。一つの態様において、タグは、アフィニティタグまたは精製タグである。一つの態様において、タグは、Argタグ、Hisタグ、Flagタグ、3×Flagタグ、Strepタグ、HAタグ、ナノタグ、SBPタグ、c-mycタグ、Sタグ、SNUTタグ、NusA、T7、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、GSTタグ、またはMBPタグより選択される（例えば、Amau, J. et al., Prot. Expr. Purif. 48 (2006) 1-13を参照すること）。一つの態様において、タグは、
2019516353.tif 000002
からなるタグの群より選択される。
【００３９】
「位置」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基の位置を意味する。位置は、例えばポリペプチドにおいて連続的にナンバリングされてもよいし、または確立されているフォーマット、例えば、抗体ナンバリングのためのKabatのEUインデックスに従ってナンバリングされてもよい。いずれの場合でも、最初のアミノ酸残基が1番となる。
【００４０】
「ソルターゼ」という用語は、ソルターゼ活性を有するポリペプチドを示す。即ち、ソルターゼは、アミド基転移を介して第2のポリペプチドのN末端に第1のポリペプチド（のC末端）をコンジュゲートするペプチド転移反応を触媒する酵素である。その用語には、全長ソルターゼ、例えば、天然に存在する全長ソルターゼ、ソルターゼ活性を有するそれらの断片、および修飾された、例えば、変異した、それらのバリアントが含まれる。当業者は、例えば、ペプチド転移のために適当な条件の下で、当該ポリペプチドを、第1および第2のポリペプチド（一方はソルターゼ認識モチーフを含み、他方はソルターゼアクセプターモチーフを含む）と共にインキュベートし、即ち、接触させ、それぞれのペプチド転移反応生成物が形成されるか否かを決定することによって、所定のポリペプチドがソルターゼ活性を有するか否かを決定することが容易にできるであろう。ソルターゼポリペプチドは、ソルターゼ活性を有する限り、任意の数のアミノ酸残基を含んでいてよい。これは、ソルターゼが野生型ソルターゼと同一の活性を有していなければならないことを意味するものではない。適当なアッセイによってソルターゼ活性が検出可能であれば、十分である。ソルターゼという用語には、例えば、ソルターゼA、ソルターゼB、ソルターゼC、およびソルターゼDのような全ての公知のソルターゼが包含される。一つの態様において、ソルターゼは、ソルターゼAである。このソルターゼAは、任意の細菌の種または株に由来してよい。一つの態様において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌のソルターゼAである。黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼAのアミノ酸配列は、公知であり、代表的な配列は、例えば、SEQ ID NO:01：
2019516353.tif 000003
のコード配列（フレーム1リーディング）を開示するアクセッション番号AF162687の下で、またはSEQ ID NO:46：
2019516353.tif 000004
のコード配列を開示するアクセッション番号WP_000759359.1の下で、寄託されている。
【００４１】
一つの態様において、ソルターゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のソルターゼAである。
【００４２】
II.変異型ソルターゼA
改善された触媒特性を有する黄色ブドウ球菌ソルターゼAが、本明細書において報告される。野生型黄色ブドウ球菌ソルターゼAに変異D160SおよびK196Sを導入することによって（SEQ ID NO:01からSEQ ID NO:02へ）、酵素特性が改善され得ることが見出された。本明細書において報告される変異型ソルターゼは、本明細書において報告されるアッセイを使用して、黄色ブドウ球菌由来の野生型ソルターゼAの酵素活性の約5倍である酵素活性を有する。6個の変異を有する当技術分野において公知の参照変異体は、本明細書において報告されるアッセイにおいて約4倍増加した活性しか有していなかった。黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼAの短縮バージョンにおけるそれぞれの位置における同一の変異も、本明細書において包含される。アミノ酸配列の長さ（即ち、残基の数）の違いのため、アミノ酸配列における異なる絶対的な位置を有するが、短縮バージョンにおいても、同一のアミノ酸残基を変異させることができる。
【００４３】
変異型黄色ブドウ球菌ソルターゼAが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、変異型ソルターゼは、それぞれの野生型ソルターゼより大きいスピードおよび/または代謝回転速度で、ペプチド転移反応を触媒するという点で、改善された（即ち、より速い）反応速度論のような、改善された触媒特性を有する。いくつかの態様において、変異型ソルターゼは、それぞれの野生型ソルターゼより改善された（即ち、より高い）もしくは低下した（即ち、より低い）親和性で、または改善された（即ち、より特異的な）もしくは低下した（即ち、より非特異的、より非選択的な）特異性で、所定の基質に結合するという点で、改変された基質特異性を有する。
【００４４】
本明細書において報告される精製された二重変異型ソルターゼの特性は、以下の表に要約される：
2019516353.tif 000005
【００４５】
粗培養上清から決定された、本明細書において報告される個々の変異型ソルターゼの特性は、以下の表において要約される：
2019516353.tif 000006
【００４６】
野生型酵素と比較された相対活性の100％超への変化は、変異体がより高い初速度を有することを示す。
【００４７】
野生型酵素と比較された相対安定性の100％超への変化は、熱処理の後により多くの酵素が活性を維持することを示し、100％未満への変化は、熱処理の後により少ない酵素が活性を維持することを示す。
【００４８】
野生型酵素と比較されたLPXTG（ソルターゼ認識モチーフを含むポリペプチド）に対する見かけの相対「Km」の100％超への変化は、変異体が、高い基質濃度での活性と比較してより高い活性を、低い基質濃度で有することを示し、100％未満への変化は、変異体が、高い基質濃度での活性と比較してより低い活性を、低い基質濃度で有することを示す。
【００４９】
野生型酵素と比較されたGG（ソルターゼアクセプターモチーフを含むポリペプチド）に対する見かけの相対「Km」の100％超への変化は、変異体が、高い基質濃度での活性と比較してより高い活性を、低い基質濃度で有することを示し、100％未満への変化は、変異体が、高い基質濃度での活性と比較してより低い活性を、低い基質濃度で有することを示す。
【００５０】
本明細書において報告される一つの局面は、SEQ ID NO:01の黄色ブドウ球菌ソルターゼAのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であり変異D160SおよびK196Sを含むアミノ酸配列を含むソルターゼである。
【００５１】
一つの態様において、SEQ ID NO:01のソルターゼは、A61E、A61T、E106G、N107W、F144L、およびG167Eからなる変異の群より選択される1個または複数個の変異をさらに含む。
【００５２】
一つの態様において、ソルターゼは、
（i）変異D160S、K196S、およびE106G（SEQ ID NO:03）；
（ii）変異D160S、K196S、およびN107W（SEQ ID NO:04）；
（iii）変異D160S、K196S、およびF144L（SEQ ID NO:05）；
（iv）変異D160S、K196S、およびG167E（SEQ ID NO:06）；
（v）変異D160S、K196S、N107W、およびF144L（SEQ ID NO:07）；
（vi）変異D160S、K196S、F144L、およびG167E（SEQ ID NO:08）；
（vii）変異D160S、K196S、N107W、およびG167E（SEQ ID NO:09）；または
（viii）変異D160S、K196S、N107W、F144L、およびG167E（SEQ ID NO:10）
を含む。
【００５３】
野生型黄色ブドウ球菌ソルターゼA（SEQ ID NO:01）またはその断片（SEQ ID NO:11）のそれぞれのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む変異型ソルターゼが、本明細書において提供される。いくつかの態様において、変異型ソルターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:01における変異D160SおよびK196S、またはSEQ ID NO:11におけるD101SおよびK137Sを含む。一つの態様において、変異型ソルターゼは、1個または複数個のさらなる変異を含む。例えば、変異型ソルターゼは、（90％超の同一性をもたらす）SEQ ID NO:01に対する2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、もしくは20個の変異、または（90％超の同一性をもたらす）SEQ ID NO:11に対する2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、もしくは14個の変異を含んでいてよい。一つの態様において、変異型ソルターゼは、SEQ ID NO:01のアミノ酸配列を有するソルターゼまたはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有するソルターゼ断片に対する2個、3個、4個、5個、6個、または7個の変異を含む。一つの態様において、変異型ソルターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:01の配列と少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、少なくとも98％同一、少なくとも99％同一、または99％超同一である。一つの態様において、変異型ソルターゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:11の配列と少なくとも90％同一、少なくとも95％同一、少なくとも98％同一、または98％超同一である。
【００５４】
一つの態様において、本明細書において報告される（変異型）ソルターゼは、同一のポリペプチドについて、それぞれ、SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:11の対応する親ソルターゼのKMより低いKM値を、ソルターゼ認識モチーフを含むポリペプチドに対して有し、同一のポリペプチドについて、それぞれ、SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:11の対応する親ソルターゼのKMより大きいKM値を、ソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドに対して有する。
【００５５】
一つの態様において、本明細書において報告される（変異型）ソルターゼは、同一のポリペプチドについて、それぞれ、SEQ ID NO:01またはSEQ ID NO:11の対応する親ソルターゼのKMと少なくとも同一であるか、または少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、もしくは少なくとも50倍低いKM値を、ソルターゼ認識モチーフを含むポリペプチドに対して有する。一つの態様において、本明細書において報告される（変異型）ソルターゼは、同一のポリペプチドについて、親ソルターゼのKMと少なくとも同一であるか、または2倍まで、5倍まで、10倍まで、もしくは20倍まで大きいKM値を、ソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドに対して有する。
【００５６】
本明細書において報告される変異型ソルターゼの酵素特性を維持している、本明細書において報告される変異型ソルターゼのバリアントも、本発明の局面である。
【００５７】
バリアントアミノ酸配列は、親アミノ酸配列または参照アミノ酸配列と相違している。極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、ヘリックス形成特性、および/または両親媒特性の類似性に基づき、アミノ酸置換を作成することができ、欧州特許出願EP14198535において報告されたもののような適当なアッセイによって、得られたバリアントを酵素活性についてスクリーニングする。例えば、陰性荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；陽性荷電アミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ；類似した親水性値を有する非荷電極性頭部を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。ある種の態様において、保存的置換は、以下の表に従って作成され得る。第2列の同一ブロック、第3列の同一行のアミノ酸は、保存的置換において相互に置換され得る。ある種の保存的置換は、第2列のあるブロックに対応する第3列の一つの行のアミノ酸の、第2列の同一ブロック内の第3列のもう一つの行からのアミノ酸との置換である。
【００５８】
2019516353.tif 000007
【００５９】
ある種の態様において、例えば、塩基性アミノ酸と塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸と酸性アミノ酸、極性アミノ酸と極性アミノ酸、および疎水性アミノ酸と疎水性アミノ酸のような、類似アミノ酸の置換または交換である相同的置換が存在してもよい。異なるクラスの残基（例えば、非疎水性アミノ酸と疎水性アミノ酸）、または天然に存在するアミノ酸と非天然アミノ酸との置換、または非古典的アミノ酸交換のような非相同的置換が、親配列または参照配列に導入されてもよい。
【００６０】
ソルターゼ活性アッセイ：
200mM NaClを含有している50mMトリス緩衝液pH7.5において、精製されたソルターゼまたはそのバリアントを、LPETGモチーフを含有しているグルコースデヒドロゲナーゼ（20μM）およびN末端グリシンを含有しているビオチン誘導体（20μM）と混合した。反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。10〜40倍過剰の阻害緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mMヨードアセトアミド）の添加によって、反応を停止した。停止された反応混合物を、5000×gで10分間遠心分離した。上清（50μL）を、200mM NaCl、10mM CaCl2を含む100μLの50mMトリス緩衝液（pH7.5）に添加し、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチタイタープレートに添加し、200rpmで30℃で30分間インキュベートした。その後、マルチタイタープレートを、各300μLの洗浄緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1％トリトンX-100）によって5回洗浄した。それに、150μLの試験緩衝液（0.2Mクエン酸ナトリウム、pH5.8、0.3g/L 4-ニトロソアニリン、1mM CaCl2、30mMグルコース）を添加した。
【００６１】
レポーター酵素の速度論を、620nmで5分間にわたり測定した。レポーター酵素の活性は、固定化された酵素の量に比例し、それはビオチン化された酵素の量に比例し、これはソルターゼの活性に比例する。
【００６２】
III.ソルターゼAを使用した酵素的コンジュゲーション
インビボでは共有結合で会合していない2種の要素を含む共有結合コンジュゲートを、酵素ソルターゼ、特に、ソルターゼAを使用することによって、インビトロで入手することができる。
【００６３】
トランスアミダーゼは、一般に、アシルドナーと求核性アシルアクセプターとの間のペプチド結合（アミド結合）の形成を触媒する。ペプチド結合を形成するため、アシルアクセプターは、NH2-CH2部分を含有していなければならない。グラム陽性菌には、以下の属が含まれる：アクチノミセス（Actinomyces）、バチルス、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、セルロモナス（Cellulomonas）、クロストリジウム、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルジア（Nocardia）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、およびストレプトマイセス（Streptomyces）。
【００６４】
ソルターゼは、グラム陽性菌ゲノム由来の61のソルターゼの配列アライメントおよび系統発生学的分析に基づき、A、B、C、およびDと名付けられた四つのクラスへ分類されている（Dramsi,S. et al., Res.Microbiol.l56(2005)289-297）。これらのクラスは、ComfortおよびClubb（Comfort,D.and Clubb,R.T.,Infect.Immun.72(2004)2710-2722）によってソルターゼが分類された以下のサブファミリーに相当する：クラスA（サブファミリー1）、クラスB（サブファミリー2）、クラスC（サブファミリー3）、クラスD（サブファミリー4および5）。前記の参照は、多数のソルターゼおよび認識モチーフを開示している（Pallen,M.J. et al., Trends Microbiol.9(2001)97-101も参照すること）。この情報によって、当業者は、Drami（前記）に記載されたもののような、配列および/またはその他の特徴に基づき、正確なクラスにソルターゼを割り当てることができる。
【００６５】
ソルターゼA（SrtA）は、トランスアミダーゼ活性を有する膜結合型酵素であり、グラム陽性菌から同定され単離された。インビボでソルターゼAは、タンパク質を細菌細胞壁に共有結合で付着させる。SrtA基質上の特異的認識モチーフは、LPXTG（SEQ ID NO:21）であり、酵素は、残基トレオニンとグリシンとの間で切断する。ペプチドグリカン上の認識モチーフは、ペンタグリシンモチーフである。N末端のトリグリシンモチーフ、そしてジグリシンモチーフですら、SrtA反応を支持するのに十分であることが示されている（Clancy, K. W. et al., Peptide science 94(2010)385-396）。反応は、チオエステルアシル酵素中間体を通して進行し、それが、オリゴグリシンからのアミン求核剤の攻撃によって分離され、ペプチドグリカンがタンパク質基質に共有結合で連結され、SrtAが再生される。化学的に合成されたペプチドを、組換え発現されたタンパク質に共有結合でコンジュゲートするため、SrtAを使用することが可能である。
【００６６】
多くのグラム陽性菌が、病原性因子を含む多様な表面タンパク質を細胞壁（ペプチドグリカン）に共有結合でアンカリングするためにソルターゼを使用する。ソルターゼは膜会合型酵素である。野生型黄色ブドウ球菌ソルターゼA（SrtA）は、N末端膜貫通領域を含む206アミノ酸のポリペプチドである。第1工程において、ソルターゼAが、LPXTG（SEQ ID NO:21）アミノ酸配列モチーフを含有している基質タンパク質を認識し、活性部位Cysによって、ThrとGlyとの間のアミド結合を切断する。このペプチド切断反応は、ソルターゼA基質チオエステル中間体をもたらす。第2工程において、（黄色ブドウ球菌のペプチドグリカンのペンタグリシン単位に相当する）オリゴグリシンを含有している第2の基質ポリペプチドのアミノ基の求核攻撃によって、チオエステルアシル酵素中間体が分離され、共有結合で連結された細胞壁タンパク質およびソルターゼAの再生に至る。オリゴグリシン求核剤の非存在下では、アシル酵素中間体は水分子によって加水分解され得る。
【００６７】
ソルターゼによって媒介されるライゲーション/コンジュゲーションは、多様なタンパク質工学およびバイオコンジュゲーションの目的のために適用され始めている。この技術は、LPXTGタグ付きの組換えのまたは化学的に合成されたポリペプチドへの天然および合成の官能性の導入を可能にする。例には、オリゴグリシンによって誘導体化されたポリマー（例えば、PEG）、フルオロフォア、ビタミン（例えば、ビオチンおよび葉酸）、脂質、炭水化物、核酸、合成のペプチドおよびタンパク質（例えば、GFP）の共有結合性の付着が含まれる（例えば、Tsukiji,S.and Nagamune,T.,ChemBioChem 10(2009)787-798；Popp,M.W.L.and Ploegh,H.L.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.50(2011)5024-5032を参照すること）。
【００６８】
酵素的コンジュゲーションのため、膜通過領域を欠く可溶性短縮型ソルターゼA（SrtA；黄色ブドウ球菌SrtAのアミノ酸残基60〜206）を使用することができる（SEQ ID NO:11；Ton-That,H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)12424-12429；Ilangovan,H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)6056-6061も参照すること）。
【００６９】
ソルターゼAによって媒介される反応は、ソルターゼ認識配列（ソルターゼモチーフ）を含有している種の、ソルターゼアクセプター配列（例えば、1個または複数個のN末端グリシン残基）を保持するものとのライゲーションをもたらす。ソルターゼ認識配列は、アミノ酸配列LPXTG（SEQ ID NO:21）であってもよいが、それと異なっていてもよい。しかしながら、そのような配列をアシルドナーとして使用することの欠点は、求核性アシルアクセプターへのLPXT（SEQ ID NO:47）単位の転移が、少なくとも1個のN末端グリシン残基を含有している対応する断片を、化学量論的な量、遊離させるということである。遊離したグリシン含有断片は、意図されたアシルアクセプターと酵素中間体について競合し、酵素的ライゲーション反応の進行に拮抗する。さらに、酵素中間体およびLPXTG含有基質の加水分解的切断も、比較的遅いプロセスであるが、その反応と競合する。ソルターゼによって媒介される反応の使用の最初に、少なくとも5mMの濃度のソルターゼモチーフを含むアシルドナーを使用した場合にのみ、有用なレベルのライゲーションが入手され得る。
【００７０】
ある種の態様において、ソルターゼモチーフは、アミノ酸配列LPX1TX2（SEQ ID NO:48）を有し、（i）X1はD、E、A、N、Q、K、およびRからなるアミノ酸残基の群より選択され、（ii）X2はアラニンおよびグリシンからなるアミノ酸残基の群より選択される。ある種の態様において、ソルターゼモチーフは、LPX1TG（SEQ ID NO:49）である。ある種の態様において、ソルターゼモチーフは、LPX1TA（SEQ ID NO:50）である。X1は前述の意味を有する。
【００７１】
ソルターゼアミド基転移活性を有するソルターゼ断片は、本明細書において報告される方法において使用され得る。ソルターゼ断片は、例えば、組換え技術またはタンパク質分解消化によって、親ソルターゼの断片を作製し、ペプチド結合形成、即ち、ライゲーションの速度を決定することによって同定され得る。断片は、親ソルターゼのアミノ酸配列の約80％、親ソルターゼのアミノ酸配列の約70％、約60％、約50％、約40％、または約30％を含んでいてよい。いくつかの態様において、断片は、ソルターゼの触媒活性に必須でない親ソルターゼアミノ酸配列のN末端部分を欠き、例えば、断片は、膜アンカー配列の末端までのN末端部分を欠く。いくつかの態様において、断片は、親ソルターゼアミノ酸配列のC末端を含む。いくつかの態様において、断片は、ソルターゼの触媒コア領域を含む。一つの態様において、コア領域は、SEQ ID NO:01の黄色ブドウ球菌ソルターゼAの約60位〜約206位である。
【００７２】
本明細書において報告される方法において、ソルターゼ、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチド（即ち、アシルドナー）、およびソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチド（即ち、求核剤/アシルアクセプター）が、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドのN末端部分とソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドのC末端部分との間のペプチド結合の形成を達成するのに適当な条件の下で、共にインキュベートされる。本明細書において使用されるように、「インキュベートする」という用語またはその文法的な等価物は、分子の間の接触を可能にするため、列挙された成分を相互に密接に接近させることを示す。例えば、1個の反応容器にそれらを添加することによって、インキュベーションを行うことができる。多様な様式で、例えば、容器を振とうするか、容器をボルテックス生成装置に供するか、またはピペットによって繰り返し混合することによって、系内の成分を混合することができる。成分は、任意の順序で、系に添加されてよい。
【００７３】
ソルターゼ反応は、任意の便利な容器（例えば、微量遠心管のような試験管、フラスコ、ディッシュ）、マイクロタイタープレート（例えば、96穴もしくは384穴のプレート）、ガラススライド、シリコンチップ、フィルタ、または分子が固定化され任意でアレイ状に配置された（任意でコーティングされた）表面を有する固体もしくは半固体の支持体（例えば、米国特許第6,261,776号およびFodor,Nature 364(1993)555-556を参照すること）、ならびにマイクロ流体デバイス（例えば、米国特許第6,440,722号；米国特許第6,429,025号；米国特許第6,379,974号；および米国特許第6,316,781号を参照すること）において実施され得る。
【００７４】
反応混合物は、一般に、細胞を含まず、さらに、細菌細胞壁成分または完全細菌細胞壁を含まない。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドおよび/またはソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドは、ヌクレオチド配列が細胞ゲノムへ組み込まれているかまたは組み込まれずに維持されている（例えば、プラスミド内に存在する）細胞において、1種または複数種の組換えヌクレオチド配列によって発現される。
【００７５】
反応混合物は、ソルターゼ反応が実施され得る任意の便利な温度に維持される。いくつかの態様において、ソルターゼ反応は、約15℃〜約50℃の温度で実施される。一つの態様において、インキュベーションは、30℃〜40℃の温度でなされる。いくつかの態様において、ソルターゼ反応は、約23℃〜約37℃の温度で実施される。一つの態様において、インキュベーションは、約37℃の温度でなされる。ある種の態様において、温度は室温（即ち、約20℃〜25℃）である。温度は、異なる温度で同一のソルターゼ反応を反復的に実施し、ライゲーション速度を決定することによって最適化されてよい。
【００７６】
任意の便利な体積および成分比を使用することができる。
【００７７】
ある種の態様において、ソルターゼ酵素とソルターゼ認識配列を含むポリペプチドとの1:1000以上の（モル濃度）比が利用され、またはソルターゼ酵素とソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドとの1:1000以上の（モル濃度）比が利用される。具体的な態様において、ソルターゼ酵素とソルターゼ認識配列を含むポリペプチドとの比または酵素とソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドとの比は、約1:1、例えば、1:2以上、1:3以上、1:4以上、1:5以上、1:6以上、1:7以上、1:8以上、および1:9以上である。
【００７８】
いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドは、約10μM〜約10mMの範囲の濃度で存在する。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドは、約100μM〜約1mMの範囲の濃度で存在する。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドは、約100μM〜約5mMの範囲の濃度で存在する。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドは、約200μM〜約1mMの範囲の濃度で存在する。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドは、約200μM〜約800μMの範囲の濃度で存在する。いくつかの態様において、ソルターゼ認識配列を含むポリペプチドは、約400μM〜約600μMの範囲の濃度で存在する。
【００７９】
ある種の態様において、ソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドは、約1μM〜約500μMの範囲の濃度で存在する。ある種の態様において、ソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドは、約15μM〜約150μMの範囲の濃度で存在する。ある種の態様において、ソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドは、約25μM〜約100μMの範囲の濃度で存在する。ある種の態様において、ソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドは、約40μM〜約60μMの範囲の濃度で存在する。
【００８０】
ある種の態様において、ソルターゼは、約1μM〜約500μMの範囲の濃度で存在する。ある種の態様において、ソルターゼは、約15μM〜約150μMの範囲の濃度で存在する。ある種の態様において、ソルターゼは、約25μM〜約100μMの範囲の濃度で存在する。ある種の態様において、ソルターゼは、約40μM〜約60μMの範囲の濃度で存在する。
【００８１】
ある種の態様において、方法は、水性環境を含む反応混合物において実施される。適切な緩衝剤および/または塩含量を含む水が、しばしば、利用され得る。アルコールまたは有機溶媒が、ある種の態様において、含まれていてもよい。有機溶媒の量は、しばしば、ライゲーション処理においてタンパク質またはペプチドを認識可能な程度にエステル化しないものである（例えば、アルコールまたは有機溶媒の添加によって、エステル化されたタンパク質またはペプチドは、しばしば、5％以下しか増加しない）。アルコールおよび/または有機溶媒の含量は、時に、20％以下、15％以下、10％以下、または5％以下であり、より多量のアルコールまたは有機溶媒が利用される態様において、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下、または80％以下のアルコールまたは有機溶媒が存在する。ある種の態様において、反応混合物は、アルコールまたは有機溶媒のみを含み、存在する場合、限定された量の水しか含まない。
【００８２】
いくつかの態様において、反応混合物は緩衝液を含む。本明細書において報告される方法に従って使用され得る多様な緩衝液は、当業者に周知であろう。いくつかの態様において、緩衝溶液はカルシウムイオンを含む。ある種の態様において、緩衝溶液は、カルシウムイオンを沈殿させる物質を含有していない。いくつかの態様において、緩衝溶液はリン酸イオンを含まない。いくつかの態様において、緩衝溶液はキレート剤を含有していない。
【００８３】
いくつかの態様において、方法は、6〜8.5の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、6〜8の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、6〜7.5の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、6.5〜8.5の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、7〜8.5の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、7.5〜8.5の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、7.0〜8.5の範囲のpH値で実施される。いくつかの態様において、方法は、7.3〜7.8の範囲のpH値で実施される。
【００８４】
いくつかの態様において、反応は、深共融溶媒において実施される。
【００８５】
一つの態様において、深共融溶媒は、塩化コリンを含む。一つの態様において、深共融溶媒は、1:2のモル比の塩化コリンとグリセロールとの混合物である。一つの態様において、深共融溶媒は、水性共溶媒を含む。一つの態様において、深共融溶媒は、30％(v/v)までの共溶媒を含む。一つの態様において、深共融溶媒は、15％(v/v)までの共溶媒を含む。一つの好ましい態様において、深共融溶媒は、5％(v/v)までの水性共溶媒を含む、1:2のモル比の塩化コリンとグリセロールとの混合物である。
【００８６】
一つの態様において、深共融溶媒は、チオールに基づく深共融溶媒である。一つの態様において、チオールに基づく深共融溶媒は、（a）少なくとも1個の水素結合アクセプター、ならびに（b）(i）少なくとも1個のチオール基および(ii）少なくとも1個のヒドロキシ基もしくは陰性荷電酸素原子またはそれらの塩を含む少なくとも1個の脂肪族水素結合ドナーを含み、少なくとも1個の水素結合アクセプターと少なくとも1個の脂肪族水素結合ドナーとのモル比は、2:1〜1:10である。一つの態様において、少なくとも1個の水素結合アクセプターは、塩化コリンである。一つの態様において、少なくとも1個の水素結合アクセプターは、(2-ヒドロキシエチル)トリメチルアンモニウム塩、メチルトリフェニルホスホニウム塩、エチレンアミン塩、およびトリブチルアミン塩からなる群より選択される。一つの態様において、塩は、塩化物、臭化物、および水酸化物である。一つの態様において、塩化コリンとジチオスレイトールとのモル比は、約1:2.5〜1:3である。一つの態様において、塩化コリンと2-メルカプトエタノールとのモル比は、約1:2である。一つの態様において、塩化コリンと4-メルカプト-1-ブタノールとのモル比は、約1:2である。一つの態様において、塩化コリンと1-メルカプト-2-プロパノールとのモル比は、約1:2である。一つの好ましい態様において、塩化コリンと2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムとのモル比は、約1:1である。
【００８７】
反応混合物の1個もしくは複数個の成分または生成物が、固体支持体に固定化されてもよい。反応混合物成分と固体支持体との間の付着は、共有結合性または非共有結合性であり得る（非共有結合性の付着については、例えば、米国特許第6,022,688号を参照すること）。固体支持体は、例えば、マイクロタイタープレートの各ウェルの1個または複数個の表面、ガラススライドまたはシリコンウエハ、BIAcoreチップの表面、もう一つの固体支持体に任意で連結されていてもよい粒子、例えば、ビーズ（例えば、Lam,Nature 354(1991)82-84を参照すること）、またはマイクロ流体デバイスのチャンネルの表面のような、系の1個または複数個の表面であり得る。固体支持体の型、固体支持体への共有結合性および非共有結合性の付着のためのリンカー分子、ならびに固体支持体へ分子を固定化する方法は、公知である（例えば、米国特許第6,261,776号；米国特許第5,900,481号；米国特許第6,133,436号；米国特許第6,022,688号；WO 2001/18234を参照すること）。任意の材料、例えば、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、金属、ガラス、セルロース、（例えば、PDMSのような有機ポリマーから少なくとも一部分形成された）ゲル等が使用され得る。いくつかの態様において、固体支持体は、半固体かつ/またはゲル様、変形可能、フレキシブル等である。
【００８８】
任意のポリペプチドが、ソルターゼ認識配列またはオリゴグリシンの導入の後、最終的には、本明細書において報告される方法において、ソルターゼモチーフを含むポリペプチドまたはソルターゼアクセプター配列を含むポリペプチドとして使用され得る。
【００８９】
非ソルターゼモチーフ部分
ソルターゼ認識配列LPXTG（SEQ ID NO:21）は、ポリペプチドのアミノ酸配列内に直接含まれない場合、治療剤（薬）、毒性薬剤（例えば、ドキソルビシンもしくは百日咳毒素のような毒素）、フルオロフォア（例えば、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光色素）、イメージング用もしくは放射線治療用の金属のキレート剤、ペプチド性もしくは非ペプチド性の標識、タグ、またはポリエチレングリコールの様々な異性体のようなクリアランス修飾剤、第3の成分と結合するペプチド、またはもう一つの炭水化物、または親油性薬剤、または結合対のメンバー（例えば、ビオチン）にコンジュゲートされてもよい。コンジュゲーションは、直接的であってもよいしまたは介在するリンカーを介したものであってもよい。
【００９０】
（a）治療剤
薬物部分は、抗体、細胞傷害性もしくは細胞分裂阻害性の化合物のような、治療効果を有する任意の化合物、部分、または基であり得る。
【００９１】
リツキサン（Rituxan）/マブセラ（MabThera）/リツキシマブ、2H7/オクレリズマブ、ゼヴァリン（Zevalin）/イブリツモマブ、アーゼラ（Arzerra）/オファツムマブ（CD20）、HLL2/エプラツズマブ、イノツズマブ（CD22）、ゼナパックス（Zenapax）/ダクリズマブ、シムレクト（Simulect）/バシリキシマブ（CD25）、ハーセプチン（Herceptin）/トラスツズマブ、ペルツズマブ（Her2/ERBB2）、マイロターグ（Mylotarg）/ゲムツズマブ（CD33）、ラプティバ（Raptiva）/エファリズマブ（Cd11a）、アービタックス（Erbitux）/セツキシマブ（EGFR、上皮増殖因子受容体）、IMC-1121B（VEGF受容体2）、タイサブリ（Tysabri）/ナタリズマブ（α4β1インテグリンおよびα4β7インテグリンのα4サブユニット）、レオプロ（ReoPro）/アブシキシマブ（gpIIb-gpIIaおよびαvβ3インテグリン）、オルソクローン（Orthoclone）OKT3/ムロモナブ-CD3（CD3）、ベンリスタ（Benlysta）/ベリムマブ（BAFF）、Tolerx/オテリキシズマブ（CD3）、ソリリス（Soliris）/エクリズマブ（C5補体タンパク質）、アクテムラ（Actemra）/トシリズマブ（IL-6R）、パノレックス（Panorex）/エドレコロマブ（EpCAM、上皮細胞接着分子）、CEA-CAM5/ラベツズマブ（CD66/CEA、癌胎児抗原）、CT-11（PD-1、プログラム死1、T細胞阻害性受容体、CD-d279）、H224G11（c-Met受容体）、SAR3419（CD19）、IMC-A12/シズツムマブ（IGF-1R、インスリン様増殖因子1受容体）、MEDI-575（PDGF-R、血小板由来増殖因子受容体）、CP-675、206/トレメリムマブ（細胞傷害性Tリンパ球抗原4）、RO5323441（胎盤増殖因子またはPGF）、HGS1012/マパツズマブ（TRAIL−R1）、SGN-70（CD70）、ベドチン(Vedotin)（SGN-35）/ブレンツキシマブ（CD30）、ならびにARH460-16-2（CD44）のような、細胞表面分子およびそれらのリガンドに対する多数の治療用抗体が公知である。
【００９２】
本明細書において報告される方法によって入手されたコンジュゲートは、例えば、腫瘍性疾患、心血管疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性（例えば、内分泌腺）疾患、または神経学的（例えば、神経変性）疾患の治療のための医薬の調製において使用され得る。これらの疾患の例示的な非限定的な例は、アルツハイマー病、非ホジキンリンパ腫、急性および慢性のB細胞リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性および慢性の骨髄性白血病、T細胞リンパ腫およびT細胞白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、（口腔、胃腸管、結腸、胃、気道、肺、乳房、卵巣、前立腺、子宮、子宮内膜、子宮頚部、膀胱、膵臓、骨、肝臓、胆嚢、腎臓、皮膚、および精巣の細胞腫のような）細胞腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、および皮膚癌、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎/多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維性肺胞炎である。
【００９３】
多数の細胞表面マーカーおよびそれらのリガンドが公知である。例えば、癌細胞は、炭酸脱水酵素IX、αフェトプロテイン、αアクチニン4、A3（A33抗体に特異的な抗原）、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CD1-1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、結腸特異的抗原p（CSAp）、CEA（CEACAM5）、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸受容体、G250抗原、GAGE、GROB、HLA-DR、HM1.24、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）およびそのサブユニット、HER2/neu、HMGB-1、低酸素誘導因子（HIF-1）、HSP70-2M、HST-2または1a、IGF-1R、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、インスリン様増殖因子1（IGF-1）、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、膵臓癌ムチン、胎盤増殖因子、p53、PLAGL2、前立腺酸性ホスファターゼ、PSA、PRAME、PSMA、P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、サバイビン、サバイビン2B、TAC、TAG-72、テネイシン、TRAIL受容体、TNFα、Tn抗原、トムソン・フリーデンライヒ（Thomson-Friedenreich）抗原、腫瘍壊死抗原、VEGFR、ED-Bフィブロネクチン、WT-1、17-1A抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管形成マーカー、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、癌遺伝子マーカー、および癌遺伝子産物（例えば、Sensi et al., Clin.Cancer Res.12(2006)5023-5032；Parmiani et al, J.Immunol.178(2007)1975-1979；Novellino et al., Cancer Immunol.Immunother.54(2005)187-207を参照すること）を含むが、これらに限定されるわけではない細胞表面マーカーおよびまたはリガンドのうちの少なくとも一つを発現することが報告されている。
【００９４】
従って、リガンドを含む特異的な細胞表面受容体を認識する抗体は、疾患に関連している多数/複数の細胞表面マーカーへの特異的かつ選択的なターゲティングおよび結合のために使用され得る。細胞表面マーカーは、例えば、シグナリングイベントまたはリガンド結合に関連している、細胞（例えば、疾患関連細胞）の表面に位置するポリペプチドである。
【００９５】
一つの態様において、癌/腫瘍の治療のため、Herberman,"Immunodiagnosis of Cancer",in Fleisher(ed.),"The Clinical Biochemistry of Cancer",page 347(American Association of Clinical Chemists(1979))、ならびにUS 4,150,149；US 4,361,544；およびUS 4,444,744において報告されたもののような、腫瘍関連抗原を標的とする多重特異性結合分子/二重特異性抗体が作製される。
【００９６】
腫瘍関連抗原（TAA）に関する報告には、同定されたTAAに関して、参照によって各々本明細書に組み入れられる、Mizukamiら（Nature Med.11(2005)992-997）；Hatfieldら（Curr.Cancer Drug Targets 5(2005)229-248）；Vallbohmerら（J Clin.Oncol.23(2005)3536-3544）；およびRenら（Ann.Surg.242(2005)55-63）が含まれる。
【００９７】
疾患がリンパ腫、白血病、または自己免疫障害を含む場合、標的とされる抗原は、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1または1a、HM1.24、HLA-DR、テネイシン、VEGF、P1GF、ED-Bフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物（例えば、c-metまたはPLAGL2）、CD66a-d、壊死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1（DR4）、およびTRAIL-R2（DR5）からなる群より選択され得る。
【００９８】
BCMA/CD3、HERファミリーの異なる抗原（EGFR、HER2、HER3）の組み合わせ、CD19/CD3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL-1β/IL-8、IL-6またはIL-6R/IL-21またはIL-21R、ルイスx構造、ルイスb構造、およびルイスy構造、グロボ（Globo）H構造、KH1、Tn抗原、TF抗原、およびムチンの炭水化物構造、CD44、Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、シアリルテトラオシルセラミドのような糖脂質および糖スフィンゴ脂質からなる群より選択される抗原の糖鎖エピトープに対する第1の特異性、ならびにEGFR、HER2、HER3、およびHER4からなる群より選択されるErbB受容体チロシンキナーゼに対する第2の特異性、Tリンパ球、NK細胞、Bリンパ球、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、間葉系幹細胞、神経幹細胞からなる群より選択される免疫学的細胞に関連している第2の抗原結合部位と組み合わせられたGD2、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFRβ、血管内皮増殖因子（VEGF）アクセプター2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FLT3、c-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、インテグリン、およびMMPからなる群より選択される抗原と、VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF、およびアンジオポエチンからなる群より選択される水溶性リガンドとの組み合わせ、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受容体1/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、エンドシアリン/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-1R、IL 17A/F、EGF受容体1/CD3、ならびにCD19/CD16のような、2種の異なる標的に対する多数の二重特異性抗体が、公知である。
【００９９】
（b）毒性剤
毒性薬物部分には、（i）微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはDNA挿入剤として機能し得る化学療法剤；（ii）酵素的に機能し得るタンパク質毒素；および（iii）放射性同位体が含まれる。
【０１００】
例示的な毒性薬物部分には、マイタンシノイド、アウリスタチン（auristatin）、ドラスタチン、トリコテシン、CC1065、カリチアマイシンおよびその他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、ならびにそれらの立体異性体、アイソスター、類似体、または誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１０１】
タンパク質毒素には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来の）外毒素A鎖、リシンA鎖（Vitetta et al., Science, 238 (1987)1098）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-5）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、ならびにトリコテシン（WO 93/21232）が含まれる。
【０１０２】
（c）放射性同位体を含むキレート剤
治療用放射性同位体には、32P、33P、90Y、125I、131I、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212B、212Pb、およびLuの放射性同位体が含まれる。
【０１０３】
放射性同位体またはその他の標識は、公知の方式で組み入れられ得る（Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57;"Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"Chatal,CRC Press 1989）。炭素14によって標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、複合体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である（WO 94/11026）。
【０１０４】
（d）標識
非ソルターゼモチーフ部分は、標識であり得る。ソルターゼアミノ酸配列に共有結合で付着し得る任意の標識部分が使用され得る（例えば、Singh et al.(2002)Anal.Biochem.304:147-15；Harlow E.and Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,2nd ed.CRC Press,Boca Raton,Fla.を参照すること）。標識は、（i）検出可能なシグナルを提供するか；（ii）第1もしくは第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するため、例えば、FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）を与えるため、第2の標識と相互作用するか；（iii）電荷、疎水性、形、もしくはその他の物理的パラメータによって、移動度、例えば、電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与えるか、または（iv）ビオチンなどのキャプチャー部分を提供するよう、機能し得る。
【０１０５】
ハプテン化された標識を含むコンジュゲートは、例えば、特異的な細胞、組織、または血清における関心対象の抗原の発現を検出するための診断アッセイにおいて有用であり得る。診断的な適用のため、第1の結合特異性が標的に結合し、第2の結合特異性がハプテン化された標識に結合する二重特異性抗体が使用されるであろう。ハプテンは、典型的には、検出可能部分によって標識されるであろう。一般に以下のカテゴリへ分類され得る多数の標識が入手可能である：
【０１０６】
（a）3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、または131Biのような放射性同位体（放射性核種）。放射性同位体によって標識されたコンジュゲートは、受容体標的イメージング実験において有用である。抗原（ハプテン）は、Current Protocols in Immunology,(1991)Volumes 1 and 2,Coligen et al., Ed.Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubsに記載された技術を使用して、放射性同位体金属に結合するか、キレート化するか、またはその他の方法で錯体化するリガンド試薬によって標識され得る。金属イオンを錯体化し得るキレーティングリガンドには、DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA、およびTETA（Macrocyclics,Dallas,Tex.）が含まれる。放射性核種は、本明細書において報告される複合体との錯体化を介してターゲティングされ得る（Wu et al., Nature Biotechnology 23(9)(2005)1137-1146）。放射性核種によって標識された複合体による受容体標的イメージングは、腫瘍組織における複合体または対応する治療用抗体の進行的な蓄積の検出および定量化によって経路活性化のマーカーを提供することができる（Albert et al.(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210）。
【０１０７】
イメージング実験のための標識として適当な金属キレート錯体（US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al., J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al., Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al., Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al., J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al., Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al., Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al., Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al., J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al., J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al., Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al., Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al., Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al., J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al., Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al., J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al., J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al., Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-220）。
【０１０８】
（b）希土類キレート（ユーロピウムキレート）、FITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインを含むフルオレセイン型；TAMRAを含むローダミン型；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリトリン；テキサスレッド；およびそれらの類似体のような蛍光標識。蛍光標識は、例えば、Current Protocols in Immunology（前記）において開示された技術を使用して、抗原（ハプテン）にコンジュゲートされ得る。蛍光色素および蛍光標識試薬には、Invitrogen/Molecular Probes（Eugene,Oregon,USA）およびPierce Biotechnology,Inc.（Rockford,Ill.）から市販されているものが含まれる。
【０１０９】
蛍光色素および化学発光色素のような検出標識（Briggs et al., "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1(1997)1051-1058）は、検出可能なシグナルを提供し、特に、以下の特性によって、標識のために一般に適用可能である：（i）少量のコンジュゲートが無細胞アッセイおよび細胞アッセイの両方において高感度に検出され得るよう、標識されたコンジュゲートは低いバックグラウンドで極めて高いシグナルを生ずるべきであり；かつ（ii）蛍光シグナルが有意な光退色なしに観察され、モニタリングされ、記録され得るよう、標識されたコンジュゲートは光に対して安定であるべきである。標識されたコンジュゲートの膜または細胞表面、特に、生細胞への細胞表面結合を含む適用のため、標識は、（iii）有効なコンジュゲート濃度および検出感度を達成するために良好な水溶解度を有しており、かつ（iv）細胞の正常な代謝プロセスを妨害せず早熟の細胞死を引き起こさないよう、生細胞に対して非毒性であるべきである。
【０１１０】
（c）様々な酵素基質標識が、入手可能であるかまたは開示されている（例えば、US 4,275,149を参照すること）。酵素は、一般に、様々な技術を使用して測定され得る発色性基質の化学的改変を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法によって測定され得る基質の色変化を触媒してもよい。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変してもよい。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、（例えば、ケミルミノメーターを使用して）測定され得る光を放射するか、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与することができる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；US 4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（AP）、(3-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸脱水素酵素）、（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのような）複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ（microperoxidase）等が含まれる。酵素をポリペプチドへコンジュゲートするための技術は、O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay",in Methods in Enzym.(ed.by J.Langone & IT Van Vunakis),Academic Press,New York,73(1981)147-166に記載されている。
【０１１１】
酵素と基質の組み合わせ（US 4,275,149；US 4,318,980）の例には、例えば、以下のものが含まれる:
（i）過酸化水素が色素前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（OPD）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB））を酸化する、過酸化水素を基質として用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）；
（ii）発色性基質としてパラニトロフェニルリン酸を用いるアルカリホスファターゼ（AP）；および
（iii）発色性基質（例えば、p-ニトロフェニル-(3-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光発生性基質4-メチルウンベリフェリル-(3-D-ガラクトシダーゼを用いる(3-D-ガラクトシダーゼ（(3-D-Gal）。
【０１１２】
本明細書において報告される標識されたコンジュゲートは、ELISA、競合結合アッセイ、直接および間接のサンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような任意の公知のアッセイ法において利用され得る（Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques(1987)pp.147-158,CRC Press,Inc.）。
【０１１３】
本明細書において報告される標識されたコンジュゲートは、以下のもののような、生物医学的イメージングおよび分子イメージングの様々な方法および技術によるイメージングバイオマーカーおよびイメージングプローブとして有用である:（i）MRI（磁気共鳴画像法）；（ii）マイクロCT（コンピュータ断層撮影法）；（iii）SPECT（単一光子放射型コンピュータ断層撮影法）；（iv）PET（ポジトロン放出断層撮影法）（Tinianow,J.et al., Nuclear Medicine and Biology,37(3)(2010)289-297；Chen et al., Bioconjugate Chem.15(2004)41-49;US 2010/0111856）、（v）生物発光；（vi）蛍光；ならびに（vii）超音波。イムノシンチグラフィは、放射性物質によって標識されたコンジュゲートを動物またはヒトの患者へ投与し、コンジュゲートが局在する体内の部位の写真を撮影するイメージング手法である（US 6,528,624）。イメージングバイオマーカーは、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定され評価され得る。バイオマーカーは、いくつかの型のものであり得る：0型マーカーは、疾患の自然経過マーカーであり、公知の臨床的指標、例えば、慢性関節リウマチにおける滑膜炎症のMRI査定と長期的に相関する；I型マーカーは、機序が臨床的転帰に関連していないとしても、作用機序によって介入の効果を捕獲する；II型マーカーは、バイオマーカーの変化またはバイオマーカーからのシグナルが、CTによって測定された慢性関節リウマチにおける骨びらんのような標的とされた応答を「バリデートする」ため、臨床的利益を予測する、代理終点として機能する。従って、イメージングバイオマーカーは、以下のものに関する薬力学的（PD）な治療情報を提供し得る：（i）標的タンパク質の発現、（ii）治療薬の標的タンパク質への結合、即ち、選択性、ならびに（iii）クリアランスおよび半減期の薬物動態学的データ。実験室に基づくバイオマーカーと比べたインビボイメージングバイオマーカーの利点には、以下のものが含まれる：非侵襲的な処置、定量可能な全身査定、反復的な投薬および査定、即ち、複数の時点、ならびに前臨床の結果（小動物）から臨床の結果（ヒト）への可能性のある転移可能な効果。いくつかの適用のため、バイオイメージングは、前臨床研究における動物実験に取って代わるかまたはその数を最小化する。
【０１１４】
ペプチド標識法は、周知である。Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al., Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York; and Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al., Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155; Lewis et al., Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324; Li et al., Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115; Mier et al., Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237を参照すること。
【０１１５】
（e）結合対
間接検出系には、例えば、検出試薬、例えば、検出抗体が、バイオアフィニティ結合対の第1のパートナーによって標識されるものが含まれる。適当な結合対の例は、ハプテンまたは抗原/抗体、ビオチン、またはアミノビオチン、イミノビオチン、もしくはデスチオビオチンのようなビオチン類似体/アビジンまたはストレプトアビジン、糖/レクチン、核酸または核酸類似体/相補的核酸、および受容体/リガンド、例えば、ステロイドホルモン受容体/ステロイドホルモンである。好ましい第1の結合対メンバーには、ハプテン、抗原、およびホルモンが含まれる。特に好ましいのは、ジゴキシンおよびビオチンならびにそれらの類似体のようなハプテンである。そのような結合対の第2のパートナー、例えば、抗体、ストレプトアビジン等は、一般的には、例えば、前述のような標識によって、直接検出を可能にするために標識される。
【０１１６】
リンカー
「リンカー」という用語は、第1の部分を第2の部分とコンジュゲート（連結）するために使用され得る二官能性または多官能性の部分を意味する。2種の反応官能性を有するリンカーを使用して、連結されたコンジュゲートを便利に調製することができる。
【０１１７】
一つの態様において、リンカーは、ソルターゼアミノ酸配列内に存在する求核基に対して反応性の求電子基を有する反応部位を有する。有用な求電子基には、もう一つのチオール基、マレイミド基、およびハロアセトアミド基が含まれるが、これらに限定されるわけではない（例えば、Klussman et al., Bioconjugate Chemistry 15(4)(2004)765-773の766頁のコンジュゲーション法を参照すること）。
【０１１８】
チオール反応官能基の例には、チオール、マレイミド、αハロアセチル、活性化エステル、例えば、スクシンイミドエステル、4-ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、無水物、酸塩化物、スルホニルクロリド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１９】
リンカーには、ソルターゼアミノ酸配列を非ソルターゼモチーフ部分に連結するアミノ酸残基が含まれ得る。アミノ酸残基は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチド、またはドデカペプチドの単位を形成していてよい。アミノ酸残基には、天然に存在するものが含まれ、例えば、シトルリンのような天然に存在しないアミノ酸類似体、または、例えば、βアラニンのようなβアミノ酸、または4−アミノ酪酸のようなωアミノ酸も含まれる。
【０１２０】
もう一つの態様において、リンカーは、ソルターゼアミノ酸配列内に存在する求電子基に対して反応性の求核基を有する反応官能基を有する。有用な求電子基には、アルデヒドおよびケトンのカルボニル基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。リンカーの求核基のヘテロ原子は、ソルターゼアミノ酸配列内の求電子基と反応し、ソルターゼアミノ酸配列との共有結合を形成することができる。リンカー上の有用な求核基には、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。抗原（ハプテン）上の求電子基は、リンカーとの付着のために便利な部位を提供する。
【０１２１】
典型的には、ペプチド型リンカーは、2個以上のアミノ酸および/またはペプチド断片の間のペプチド結合の形成によって調製され得る。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の領域において周知である液相合成法（E.Schroder and K.Lubke "The Peptides",volume 1(1965)76-136,Academic Press）によって調製され得る。
【０１２２】
もう一つの態様において、リンカーは、可溶性または反応性をモジュレートする基によって置換されていてもよい。例えば、スルホネート（SO3−）もしくはアンモニウムのような荷電置換基またはPEGのようなポリマーは、試薬の水溶解度を増加させ、リンカー試薬の抗原（ハプテン）もしくは薬物部分とのカップリング反応を容易にするか、または利用された合成経路に依るカップリング反応を容易にすることができる。
【０１２３】
本明細書において報告される非ソルターゼモチーフ部分を含むコンジュゲートは、以下のリンカー試薬：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホEMCS、スルホGMBS、スルホKMUS、スルホMBS、スルホSIAB、スルホSMCC、およびスルホSMPB、およびSVSB（サクシニミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）、ならびにPierce Biotechnology,Incより市販されているビスマレイミド試薬：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)3、およびBM(PEO)4によって調製された複合体を明確に企図するが、これらに限定されるわけではない。ビスマレイミド試薬は、例えば、チオール基のチオール含有薬物部分、標識、またはリンカー中間体への連続的なまたは同時の付着を可能にする。例えば、チオール基と反応性であるマレイミド以外の官能基には、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが含まれる。
【０１２４】
例示的なリンカーには、マレイミドストレッチャーおよびパラアミノベンジルカルバモイル（PAB）自己犠牲スペーサーを有するバリンシトルリン（val-citまたはvc）ジペプチドリンカー試薬、ならびにマレイミドストレッチャー単位およびp-アミノベンジル自己犠牲スペーサーを有するphe-lys（Mtr）ジペプチドリンカー試薬が含まれる。
【０１２５】
システインチオール基は、求核性であり、以下のものを含む、リンカー試薬および非ソルターゼモチーフ部分またはソルターゼアミノ酸配列の求電子基と共有結合を形成するよう反応することができる：（i）NHSエステル、HOBtエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物のような活性エステル；（ii）ハロアセトアミドのようなアルキルハロゲン化物およびベンジルハロゲン化物；（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、およびマレイミド基；ならびに（iv）スルフィド交換を介したピリジルジスルフィドを含むジスルフィド。ハプテン化された化合物の求核基には、リンカー部分およびリンカー試薬の求電子基と共有結合を形成するよう反応することができる、アミン基、チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカルバゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基、およびアリールヒドラジド基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２６】
IV.組換え方法
例えば本明細書において報告される変異ソルターゼのような任意のポリペプチド、および、ソルターゼ認識配列またはソルターゼアクセプター配列を含む、scFv、scFab、もしくはdarpinのような単鎖抗原結合ポリペプチド、またはdsFvもしくはFabのような多鎖抗原結合ポリペプチドを、発現させ、真核細胞（例えば、HEK293細胞、CHO細胞）の上清から精製することができる。ポリペプチドが、単離されたポリペプチドであるか、それとも多量体またはヘテロマーの要素に含まれているかは、重要でない。
【０１２７】
ポリペプチドをコードするベクターのクローニングまたは発現/分泌のために適当な宿主細胞には、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、特に、グリコシル化が必要でない時、細菌において作製され得る（例えば、大腸菌（E.coli）における抗体断片の発現を記載している、US 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523、Charlton,Methods in Molecular Biology 248(2003)245-254(B.K.C.Lo,(ed.),Humana Press,Totowa,NJ)を参照すること）。発現の後、ポリペプチドは、細菌細胞ペーストから可溶性画分へ単離されてもよいし、または可溶化され生理活性型へと再び折り畳まれ得る不溶性画分、いわゆる封入体から単離されてもよい。その後、ポリペプチドはさらに精製され得る。
【０１２８】
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす真菌株および酵母株を含む、糸状菌または酵母のような真核微生物も、ポリペプチドをコードするベクターのための適当なクローニング宿主または発現宿主である（例えば、Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414およびLi et al., Nat.Biotech.24(2006)210-215を参照すること）。
【０１２９】
グリコシル化ポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。具体的には、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのため、昆虫細胞と共に使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【０１３０】
植物細胞培養物も宿主として利用され得る（例えば、（トランスジェニック植物における抗体の作製のためのPLANTIBODIES（商標）テクノロジーを記載している）US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429を参照すること）。
【０１３１】
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中での増殖に適した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、COS-7細胞株（SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1細胞）；HEK293細胞株（ヒト胎児腎臓）；BHK細胞株（ベビーハムスター腎臓）；TM4マウスセルトリ細胞株（例えば、Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251に記載されたようなTM4細胞）；CV1細胞株（サル腎臓細胞）；VERO-76細胞株（アフリカミドリザル腎臓細胞）；HELA細胞株（ヒト子宮頚癌細胞）；MDCK細胞株（イヌ腎臓細胞）；BRL-3A細胞株（バッファローラット肝臓細胞）；W138細胞株（ヒト肺細胞）；HepG2細胞株（ヒト肝臓細胞）；MMT 060562細胞株（マウス乳房腫瘍細胞）；（例えば、Mather et al., Anal.N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載された）TRI細胞株；MRC5細胞株；およびFS4細胞株である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR陰性CHO細胞株（例えば、Urlaub et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216を参照すること）を含むCHO細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ならびにY0細胞株、NS0細胞株、およびSp2/0細胞株のような骨髄腫細胞株が含まれる。ポリペプチド産生のために適当なある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,and Wu,Methods in Molecular Biology,Antibody Engineering 248(2004)255-268(B.K.C.Lo,(ed.),Humana Press,Totowa,NJ)を参照すること。
【０１３２】
以下の実施例および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の本旨から逸脱することなく、示された手法に修飾を施し得ることが理解される。
【実施例】
【０１３３】
組換えDNA技術
Sambrook,J. et al., Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用された。
【０１３４】
遺伝子およびオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH（Regensburg,Germany）において、化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増大/増幅のため、大腸菌プラスミドへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、またはPCRによって、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH（Planegg-Martinsried,Germany）によって調製された。
【０１３５】
基本的/標準的な哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子/タンパク質（例えば、全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはN末端にオリゴグリシンを含有しているFc鎖）の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を使用する：
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス（P-CMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域（5'UTR）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−発現させるべき遺伝子/タンパク質（例えば、全長抗体重鎖）、ならびに
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（BGH pA）。
【０１３６】
発現させるべき所望の遺伝子を含む発現単位/カセットの他に、基本的/標準的な哺乳動物発現プラスミドは、以下のものを含有している：
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
−大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
【０１３７】
タンパク質測定
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmにおける光学濃度（OD）を決定することによって、精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
【０１３８】
実施例1
ソルターゼのための発現プラスミドの生成
HEK293細胞における可溶性ソルターゼの一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ソルターゼ発現カセットに加えて、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。
【０１３９】
可溶性ソルターゼの転写単位は、以下の機能性要素を含んでいた：
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス（P-CMV）由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域（5'UTR）、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−精製タグをコードする核酸、
−ソルターゼをコードする核酸、ならびに
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（BGH pA）。
【０１４０】
成熟野生型可溶性ソルターゼのアミノ酸配列は、
2019516353.tif 000008
である。
【０１４１】
本明細書において報告される変異ソルターゼのアミノ酸配列は、
2019516353.tif 000009
であり、下線を引かれた残基は変異してセリンになる。任意で、太字の残基のうち1つもまた変異させることができる。
【０１４２】
精製タグは、アミノ酸配列
2019516353.tif 000010
を有する。
【０１４３】
実施例2
一過性発現および分析的特徴決定
F17培地（Invitrogen Corp.）において培養されたHEK293細胞（ヒト胎児腎臓細胞株293由来）の一過性トランスフェクションによって、組換え作製を実施した。トランスフェクションのため、「293-Fectin」トランスフェクション試薬（Invitrogen）を使用した。製造業者の説明書に指定されたように、トランスフェクションを実施した。細胞培養上清をトランスフェクションの3〜7日後に採集した。上清を低温（例えば、-80℃）で保管した。
【０１４４】
例えば、HEK293細胞における、ヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Meissner,P. et al., Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203に与えられる。
【０１４５】
アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmでの光学濃度（OD）を測定することによって、タンパク質濃度を決定した。還元剤（5 mM 1,4-ジチオスレイトール）の存在下および非存在下でのSDS-PAGEならびにクーマシーブリリアントブルーによる染色によって、純度を分析した。
【０１４６】
実施例3
ライブラリーの構築および発現
同時多重部位飽和（OminiChange）を、Dennig,A.ら（PLoS ONE 6(2011)e26222）によって記載されたように行った。EpPCR（配列飽和変異誘発、SeSam）を、Wong,T.S.ら（Nucl.Acids Res.32(2004)e26）によって記載されたように行った。単一部位飽和を、変異させるべき位置においてNNKを有するプライマーを使用して行った。変異型ソルターゼを、4×酵母培地において発現系を使用して発現させた。従って、200μlを接種し、37℃で一晩インキュベートした。この培養物のうちの20μlを、ソルターゼ発現を誘導するためのIPTGを含有している200μlの4×酵母培地に接種するために使用した。37℃で7時間の後、培養物を、12.5％の最終濃度でグリセリンと混合し、-20℃で保管した。
【０１４７】
実施例4
ソルターゼ活性アッセイによるライブラリースクリーニング
以下に概説されるような方法によって、レポーター酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼをソルターゼアミノ酸モチーフ（LPETG（SEQ ID NO:22））と融合させ、第1の基質としてこれを使用することによって、ソルターゼによって媒介される酵素的コンジュゲーション/カップリング反応の活性を測光法で決定することができる。第2の基質として、ビオチン化されたオリゴグリシンまたはオリゴアラニンが使用される（求核剤）。ソルターゼが、第1および第2の基質を含有している溶液に添加される時、第1および第2の基質のソルターゼによって媒介されるコンジュゲーションによって、ビオチン化されたレポーター酵素であるコンジュゲートが形成される。ビオチン化されたレポーター酵素は、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチタイタープレートを使用して回収され得る。レポーター酵素の基質が添加される時、光学濃度の変化によって生成物を検出することができる。
【０１４８】
200mM NaClを含有する50mMトリス緩衝液pH7.5において、精製されたソルターゼを、その基質、即ち、LPETGモチーフを含有しているグルコースデヒドロゲナーゼ（20μM）、およびN末端グリシンを含有しているビオチン誘導体（20μM）と混合した。反応混合物を、37℃で2時間インキュベートした。10〜40倍過剰の阻害緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mMヨードアセトアミド）の添加によって、反応を停止した。停止された反応混合物を、5000×gで10分間遠心分離した。上清（50μL）を、200mM NaCl、10mM CaCl2を含む100μLの50mMトリス緩衝液（pH7.5）に添加し、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチタイタープレートに添加し、200rpmで30℃で30分間インキュベートした。その後、マルチタイタープレートを、各300μLの洗浄緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1％トリトンX-100）によって5回洗浄した。それに、150μLの試験緩衝液（0.2Mクエン酸ナトリウム、pH5.8、0.3g/L 4-ニトロソアニリン、1mM CaCl2、30mMグルコース）を添加した。
【０１４９】
レポーター酵素の速度論を、620nmで5分間にわたり測定する。レポーター酵素の活性は、固定化された酵素の量に比例し、それはビオチン化された酵素の量に比例し、これはソルターゼの活性に比例する。
【０１５０】
実施例5
Km値推定（低い基質濃度における活性）
ソルターゼ変異体のKm値の推定
溶解物中の変異体の活性を、高い基質濃度および低い基質濃度で決定した。商（低い基質濃度における活性/高い基質濃度における活性）を計算し、変異体の親と比較した。より高い商は、より低いKmを有する変異体を表す。
【０１５１】
LPKTGについて：低：4μM、高：20μM
【０１５２】
GGGGについて：低、0.5μM、高、20μM
【０１５３】
実施例6
ソルターゼバリアントの安定性の決定
スクリーニングされた変異体の安定性の推定
熱による前処理（30分、60〜65℃）を行わない場合および行った場合の溶解物中の変異体の活性を決定した。商（熱処理後の活性/熱処理前の活性）を計算し、変異体の親と比較した。より高い商は、より高い安定性を有する変異体を表す。
【配列表】
2019516353000001.app
【国際調査報告】
2019516353.tif 000011
2019516353.tif 000012
2019516353.tif 000013
2019516353.tif 000014