(57)【要約】本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を調製するための方法を提供する。滅菌可能な組成物であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適である、滅菌可能な組成物も提供される。さらなる有用な方法、デバイス、キットおよび使用も提供される。さらに、本明細書に記載の滅菌された組成物もまた、細胞内核酸（例えば、ゲノムＤＮＡなどの細胞内ＤＮＡおよび／もしくは細胞内ＲＮＡ）、および例えば細胞表面タンパク質などの細胞特性ならびに／または細胞形態の安定化に好適である。
2019500023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成するための方法であって、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミン、および水溶性ビタミンＥ誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために前記組成物を照射するステップ
を含む方法。
【請求項２】
滅菌のために前記組成物を照射するステップが、以下：
ａ）前記組成物が、イオン化照射により照射される；
ｂ）前記組成物が、ガンマ線照射、電子ビーム照射、もしくはＸ線により照射される；
ｃ）前記組成物が、ガンマ線照射もしくはＸ線により照射される；
ｄ）前記組成物が、ガンマ線照射により照射される；
ｅ）前記組成物が、５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、もしくは約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの照射線量で照射される；
ｆ）前記組成物か、５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、もしくは約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの照射線量でガンマ線照射により照射される；
ｇ）前記組成物が、８ｋＧｙから２５ｋＧｙ、もしくは８ｋＧｙから１５ｋＧｙの照射線量でガンマ線照射により照射される；および／または
ｈ）照射による滅菌の結果、前記組成物の無菌性保証水準（ＳＡＬ）が１０−６以下になる
の特徴の１つ以上を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、固体形態で調製される；
ｂ）前記組成物が、固体形態で調製され、照射前に溶解されて、水性であることが好ましい液体組成物が提供される；
ｄ）前記組成物が、液体形態で調製され照射される；
ｅ）前記組成物が、水性である；
ｆ）前記組成物が、酸性ｐＨを有する；
ｇ）前記組成物が、ｐＨ４．０から７．０、ｐＨ４．１から６．９、ｐＨ４．２から６．８、ｐＨ４．３から６．６、ｐＨ４．４から６．３、ｐＨ４．５から６．０、またはｐＨ４．５から５．５を有する、および／または
ｈ）前記組成物が緩衝されている
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミン、および水溶性ビタミンＥ誘導体より選択される前記少なくとも１つの化合物を、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ以下、１０ｍｇ／ｍｌ以下、７ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、または１．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、
ｉ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６、アスコルビン酸、およびトロロックスより選択される化合物；
ｉｉ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、アスコルビン酸、およびトロロックスより選択される化合物；
ｉｉｉ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６、およびアスコルビン酸より選択される化合物；
ｉｖ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、およびアスコルビン酸より選択される化合物；または
ｖ．Ｎ−アセチル−システイン
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ａ）
ｉ．好ましくは請求項１３に記載の少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．
ａａ）０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン；
ａｂ）還元型であることが好ましい、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度のグルタチオン；
ａｃ）２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度のアスコルビン酸；
ａｄ）０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、または０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６；
ａｅ）０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のトロロックス
の少なくとも１つを含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために前記組成物を照射するステップ
を含み、
前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインをａａ）に記載の濃度で含むことが好ましい、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射される、および／または、前記組成物が、滅菌のためにガンマ線照射により照射される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを含む；
ｂ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で含む；
ｃ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを含み、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される；および／または
ｄ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、水性液体形態で滅菌される
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、グルタチオンを含む；
ｂ）前記組成物が、グルタチオンを還元型として含む；
ｃ）前記組成物が、グルタチオンを、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、前記グルタチオンは、還元型であることが好ましい；
ｄ）前記組成物が、グルタチオンを含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌され、前記グルタチオンは、還元型であることが好ましい；および／または
ｅ）前記組成物が、グルタチオンを、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、水性液体形態で滅菌され、前記グルタチオンは、還元型であることが好ましい
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、少なくとも１つの水溶性ビタミンを含み、前記水溶性ビタミンが、アスコルビン酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびパントテン酸より選択されることが好ましく、前記組成物が、アスコルビン酸を含むことがさらに好ましい；
ｂ）前記組成物が、アスコルビン酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびパントテン酸より選択されることが好ましく、アスコルビン酸であることがさらに好ましい少なくとも１つの水溶性ビタミンを、２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含む；
ｃ）前記組成物が、少なくとも１つの水溶性ビタミンを含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｄ）前記組成物が、アスコルビン酸を含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｅ）前記組成物が、少なくとも１つの水溶性ビタミンを２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｆ）前記組成物が、アスコルビン酸を２０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で含み、前記濃度が、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌより選択されてもよく、また、前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される；
ｇ）前記組成物が、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６を０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、または０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む；ならびに／または
ｈ）前記組成物が、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６を０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、または０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される
の特徴の１つ以上を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体を含み、前記水溶性ビタミンＥ誘導体は、トロロックスであることが好ましい；
ｂ）前記組成物が、トロロックスを含む；
ｃ）前記組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体、さらに好ましくはトロロックスを、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む；
ｄ）前記組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体、好ましくはトロロックスを含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｅ）前記組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体、必要に応じてトロロックスを、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記カスパーゼ阻害剤が、以下：
ａ）前記カスパーゼ阻害剤が、汎カスパーゼ阻害剤である；
ｂ）前記カスパーゼ阻害剤が、改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む；
ｃ）前記カスパーゼ阻害剤が、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）基で改変されている改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む；
ｄ）前記カスパーゼ阻害剤が、好ましくはＮ末端においてグルタミン（Ｑ）基で改変されている改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む；
ｅ）前記カスパーゼ阻害剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される；
ｆ）前記カスパーゼ阻害剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される；ならびに／または
ｇ）前記カスパーゼ阻害剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈである
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、
ａ）抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ；
ｂ）安定化剤としてポリ（オキシエチレン）ポリマー；および／または
ｃ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド
のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含み、必要に応じて、前記組成物が、以下：
ａ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコール、好ましくは非置換ポリエチレングリコールである；
ｂ）前記組成物が、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；
ｃ）前記組成物が、１５００未満の分子量を有する少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、さらに好ましくは、前記分子量は、１００から８００、１５０から７００、２００から６００および２００から５００より選択される範囲に存する；
ｄ）前記組成物が、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマー、および、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；ならびに／または
ｅ）前記組成物が、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、１５００から５００００、１５００から４００００、２０００から３００００、２５００から２５０００、３０００から２００００、３５００から１５０００および４０００から１２５００より選択される範囲に存する分子量を有し、かつ／または、前記低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、１０００以下の分子量を有し、好ましくは、前記分子量は、１００から１０００、１５０から８００、１５０から７００、２００から６００および２００から５００より選択される範囲に存する
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミドをさらに含み、必要に応じて、前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、式１
【化６】
2019500023.tif 000020
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は同一であり、もしくは異なり、水素残基、および線状もしくは分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基、好ましくはアルキル残基から選択され、Ｒ４は、酸素、硫黄もしくはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
に従う少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミドを含む；ならびに／または
ｂ）前記組成物が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、および／もしくはブタンアミド
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、式１
【化７】
2019500023.tif 000021
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基、好ましくはアルキル残基から選択され、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
に従う少なくとも１つの化合物を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
式１に従う前記少なくとも１つの化合物が、第一級、第二級または第三級カルボン酸アミドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記滅菌された組成物が、以下：
ｉ）細胞含有試料に含まれている細胞内核酸の安定化に好適であり、好ましくは、細胞内ＲＮＡおよび／または細胞内ＤＮＡを安定化する；
ｉｉ）細胞含有試料中に存在する核酸の分解を、安定化に起因して低減させる；
ｉｉｉ）試料に含有されている細胞におけるトランスクリプトームおよび／または転写レベルの安定化に好適であり、好ましくは、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８およびｐ５３より選択される１つ以上のマーカー遺伝子の転写レベルを、安定化すると少なくとも１２時間にわたって、少なくとも２４時間にわたっておよび好ましくは少なくとも４８時間にわたって安定化するのに好適である
の特徴の１つ以上を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記滅菌された組成物により有核細胞または一般の細胞の溶解が誘導されない、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記滅菌された組成物が、核酸−核酸架橋、タンパク質−核酸架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まず、また、ホルムアルデヒド放出剤の使用を含まない、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記滅菌された組成物が、以下：
ａ）安定化により、安定化された細胞含有試料から細胞を単離することが可能になる；
ｂ）前記細胞含有試料が血液試料であり、血液試料に含有されている細胞が安定化される；
ｃ）前記細胞含有試料が血液試料であり、白血球が安定化される；
ｄ）細胞の形態が保存される；
ｅ）有核細胞の形態が保存される；
ｆ）前記試料が血液試料であり、含有されるリンパ球および／もしくは単球が安定化される；
ｇ）細胞表面エピトープが保存される；ならびに／または
ｈ）細胞表面タンパク質が保存される
の安定化特性を有する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
滅菌可能な組成物であって、滅菌された形態の前記組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であり、前記組成物が、請求項１から１６のいずれか一項または請求項１７から２２のいずれか一項に記載されているものであり、好ましくは前記組成物が滅菌されている、滅菌可能な組成物。
【請求項２４】
細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、
ａ）請求項１から１６のいずれか一項もしくは請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法に従って生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を得る、または滅菌された形態の請求項２３に記載の組成物を得るステップ；および
ｂ）前記細胞含有生体試料を、安定化のために前記滅菌された組成物と接触させるステップ
を含む方法。
【請求項２５】
安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するための方法であって、
ａ）請求項２４に記載の方法に従って細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）細胞外核酸を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２６】
生体試料の細胞外核酸集団またはその成分の安定化に好適な組成物を照射による滅菌中に防護するための、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミン、および水溶性ビタミンＥ誘導体から成る群より選択される少なくとも１つの化合物の使用。
【請求項２７】
安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法であって、
ａ）細胞含有生体試料を安定化するステップであり、安定化が、
ｉ）請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って滅菌された組成物を得ること；または
ｉｉ）滅菌されている、請求項２３に記載の組成物を得ること；および
前記細胞含有生体試料を前記滅菌された組成物と接触させること
を含む、ステップ；ならびに
ｂ）前記安定化された試料から核酸を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２８】
ａａ）ステップｂ）が、細胞内核酸、好ましくは細胞内ＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡなどの細胞内ＤＮＡを単離することを含む；
ｂｂ）ステップｂ）が、細胞外核酸を単離することを含む；
ｃｃ）前記方法が、前記安定化された試料から細胞を取り出し、取り出された細胞から核酸を単離するステップを含む
の特徴の１つ以上を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
安定化された細胞含有生体試料から細胞を単離するための方法であって、
ａ）細胞含有生体試料を安定化するステップであり、安定化が、
ｉ）請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って滅菌された組成物を得ること；または
ｉｉ）滅菌されている、請求項２３に記載の組成物を得ること；および
前記細胞含有生体試料を前記滅菌された組成物と接触させること
を含むステップ；ならびに
ｂ）前記安定化された試料から細胞を単離するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を調製するための方法を提供する。滅菌可能な組成物であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適である、滅菌可能な組成物も提供される。さらなる有用な方法、デバイス、キットおよび使用も提供される。特に、例えば血液試料などの細胞含有試料の安定化に好適な滅菌可能な組成物および滅菌された組成物が提供される。複数の実施形態では、これらの組成物は、細胞内核酸（例えば、細胞内ＤＮＡおよび／もしくは細胞内ＲＮＡ）、細胞表面特性ならびに／または細胞形態の安定化に好適である。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞外核酸は、血液、血漿、血清および他の体液中で同定されている。それぞれの試料中に見出される細胞外核酸は、それらがヌクレアーゼから保護されることに起因して（例えば、それらが、プロテオリピド複合体の形態で分泌されるため、タンパク質と会合している、または小胞内に含有される）、ある程度は分解耐性である。多くの医学的状態、悪性疾患および感染プロセスにおける上昇したレベルの細胞外核酸、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡの存在は、とりわけ、疾患進行についてのスクリーニング、診断、予後予測、監視のために、潜在的な治療標的の同定のために、および処理応答のモニタリングのために関心をもたれている。加えて、母体血中の上昇した胎児ＤＮＡ／ＲＮＡは、例えば性同一性を決定するために、染色体異常を評価するために、および妊娠関連合併症をモニターするために用いられている。したがって、細胞外核酸は、非侵襲的診断および予後予測に特に有用であり、例えば、多くの応用分野、例えば非侵襲性出生前遺伝子検査、腫瘍学、移植医療または多くの他の疾患においてそれらを診断マーカーとして使用することができ、それ故、診断に適している（例えば、胎児由来または腫瘍由来核酸）。しかし、細胞外核酸は、健常な人間においても見出される。例えば腫瘍細胞または胎児に由来する哺乳動物細胞外核酸に加えて、細胞含有試料は、細胞に含まれていない目的の他の核酸も含むことがある。重要な、非限定的な例は、病原体核酸、例えばウイルス核酸である。細胞含有試料、例えば特に配送および取り扱い中の血液検体中の、ウイルス核酸の完全性の保存も、後の分析およびウイルス量モニタリングに非常に重要である。細胞外核酸の一般的応用例および分析方法は、例えば、国際公開第９７／０３５５８９号、国際公開第９７／３４０１５号、Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１（２００７）７９５−７９９、Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：４０−４９（２００６）、ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７５（２００７）１９１−２３２、Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら（２００６）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、２５、１１、６３５−６４０；Ｆａｎら（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：８に記載されている。
【０００３】
細胞外核酸の分析はとても興味深いものであるが、それらの分析はいくつかの理由で難しいことが判明した。細胞外核酸は、通常、試料中に低濃度でしか含まれない。さらに、細胞外核酸は、多くの場合、５００ｎｔ、３００ｎｔ（サイズおよびしたがって鎖長を示すとき、用語「ｎｔ」は、ＤＮＡの場合の「ｂｐ」も包含する）またはさらに小さい（循環ヌクレオソーム）サイズの断片として循環する。血漿中の循環無細胞ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）については、平均長は、多くの場合、わずかおよそ１４０から１７０ｂｐである。加えて、診断のために同定すべきであると考えられる実際の標的細胞外核酸もまた、通常、全細胞外核酸の中のほんの一部にしか相当しない。ｃｃｆＤＮＡに関しては、通常、例えば妊娠の状態または腫瘍悪性度に依存し、血液１ｍｌ当たりに存在する増幅可能なコピーはわずか数千である。特に、腫瘍特異的ＤＮＡ断片は非常に希少であり、多くの場合、「正常」細胞外核酸バックグラウンドより１０００倍低い濃度で含まれる。この低濃度により、試料の安定化およびその後の安定化された試料からの細胞外核酸の単離に関する難題が提起される。循環する無細胞核酸（ｃｆＮＡ）の分析に関する大きな問題は、−血清中でおよびことによると血漿中でも発生する分解に加えて−試料採集後の、損傷したかまたは崩壊している細胞からの遺伝物質による細胞外ＤＮＡ（およびＲＮＡ）の起こり得る希釈である。試料を採集した後、生体外でのインキュベーション中、一般には試料採集後、比較的短い期間内に、細胞破壊に起因して、試料に含有されている細胞から細胞核酸が放出される。細胞溶解が始まると、溶解された細胞が大量のさらなる核酸を放出し、それらが細胞外核酸と混合され、試験のために細胞外核酸を回収することがますます難しくなる。
【０００４】
例えば、全血試料を用いる場合のように試料が大量の細胞を含む場合、試料採集後の細胞内核酸の放出が特に問題である。血液試料については、特に、白血球はＲＮＡに加えて大量のゲノムＤＮＡを放出するので、白血球の溶解は問題である。赤血球はゲノムＤＮＡを含有しない。したがって、全血中の循環核酸の安定化は、安定化の間の細胞ゲノムＤＮＡおよびまたＲＮＡによる細胞外核酸集団の汚染を防止するために血球を安定化する機序を含まなければならない。特に、細胞外核酸、特に、希少な標的細胞外核酸の希釈が問題であり、防止すべきである。これらの問題は、先行技術分野で論じられている（例えば、Ｃｈｉｕら（２００１）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：９  １６０７−１６１３；Ｆａｎら（２０１０）および米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書を参照されたい）。さらに、利用可能な細胞外核酸の量および回収可能性は、時間が経つにつれて分解に起因して実質的に減少し得る。
【０００５】
これらの問題および細胞外核酸の効率的な安定化の必要性に取り組むために、細胞外核酸集団を安定化するためのいくつもの方法、組成物およびデバイスが開発されてきた。
【０００６】
安定化のためのホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤の使用は、ＵＳ７，３３２，２７７、ＵＳ７，４４２，５０６およびＵＳ２０１１／０１１１４１０に記載されている。血液試料を安定化するための方法は、例えば、ＵＳ２０１０／０１８４０６９およびＵＳ２０１０／０２０９９３０にも記載されている。しかし、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出物質の使用には欠点がある。ホルムアルデヒドは、毒性である。さらに、これらの安定剤により、タンパク質および核酸のような生体分子が化学的に改変される可能性がある。したがって、これらの安定剤により、核酸分子間の架橋またはタンパク質と核酸の間の架橋が誘導されることによって細胞外核酸単離の有効性が損なわれる可能性がある。これにより、特に診断のために増幅可能または利用可能な核酸分子の数が減少する可能性がある。血漿中のｃｃｆＤＮＡの数は血液１ミリリットル当たりほんの数千コピーに限られるので、これは莫大な短所である。
【０００７】
診断分野では、細胞外核酸に加えて他の核酸も重要なバイオマーカーである。例えば、ゲノムの転写物（特に、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）のプロファイルが分子インビトロ診断におけるバイオマーカーとして広く使用されており、疾患転帰の予測および療法の個別化された経過の指示を目的として通常の生物学的プロセスおよび病理学的プロセスの内部に提供されている。したがって、核酸、特に、ＲＮＡのプロファイリングは、疾患の診断、予後判定において、およびバイオマーカーを発見するための臨床試験において重要である。しかし、分析される試料の安定性に注意を払わなければ、試料は、輸送および保管の間に変化し、これにより、標的とされた分子の発現プロファイルが重度に変化する（例えば、Ｒａｉｎｅｎら、２００２年；Ｂａｅｃｈｌｅｒら、２００４年を参照されたい）。したがって、遺伝子発現、特に、血液細胞の遺伝子発現は、エクスビボにおける試料の取り扱いに注意を要する。試料の取り扱いに起因して発現プロファイルが変化した場合、その後の分析には試料、したがって患者の元の状況が反映されるのではなく、試料の取り扱い、輸送および保管の間に生じた人工的なプロファイルが測定される。したがって、発現プロファイルを安定化し、それにより、信頼できる分析を可能にする最適化された安定化プロセスが必要である。特に、血液細胞の遺伝子発現プロファイルの分析を可能にするために血液試料を安定化する必要がある。
【０００８】
発現プロファイルを安定化するための多くの公知の技術は、細胞溶解に基づく（例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｔｕｂｅｓ、ＵＳ６，６１７，１７０、ＵＳ７，２７０，９５３、Ｋｒｕｈｏｆｆｅｒら、２００７年）。それぞれの方法の短所は、安定化の結果、細胞が完全に溶解されることである。細胞の破壊の結果、細胞内核酸が細胞外核酸と混合され、それにより、これらの２つの核酸集団を別々に分析することが妨げられる。さらに、細胞の破壊により、それぞれ任意の細胞選別または細胞富化による細胞分析が不可能になる。したがって、ある特定の適用に関しては、細胞の形態を保存すると同時に核酸を安定化する試料採集および安定化系が必要である。同時の細胞安定化および核酸安定化の必要性に取り組むために、ホルムアルデヒド放出剤の使用に基づく安定化系が開発された（例えば、無細胞ＲＮＡ  ＢＣＴ（採血チューブ）、ＵＳ２０１１／０１１１４１０）。しかし、使用されたホルムアルデヒド放出剤がその後の核酸単離プロセスに干渉するので、それぞれ安定化された試料からの核酸単離は非常に難しい。したがって、細胞外核酸に関して上記と同様の問題が生じる。
【０００９】
上記の短所を克服するために、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤などの架橋剤の使用を必要としない安定化技術が開発された。これらの安定化技術は、例えば、ＷＯ２０１３／０４５４５７Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８０Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８２Ａ１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９（ＷＯ２０１５／１４０２１８）、ＷＯ２０１４／０４９０２２Ａ１、ＷＯ２０１３／０４５４５８Ａ１、ＷＯ２０１３／０４５４３２Ａ１、およびＷＯ２０１４／１４６７８１Ａ１に開示されている。記載の技術では、細胞外核酸集団を安定化するために、とりわけカスパーゼ阻害剤を単独で、または第一級、第二級もしくは第三級アミドなどの他の安定化化合物と組み合わせてのいずれかで使用する。これらの安定化技術により、試料採集および安定化後の細胞内核酸、特にゲノムＤＮＡによる細胞外核酸集団の汚染が低減する。ＷＯ２０１４／０４９０２２、ＷＯ２０１４／１４６７８０、ＷＯ２０１４／１４６７８２およびＷＯ２０１４／１４６７８１にも、細胞内核酸（特に、遺伝子発現プロファイル）の安定化に好適な、対応する安定化組成物が教示されている。さらに、これらの適用には、細胞表面特性および／または細胞形態などの、安定化された細胞のその後の分析を可能にする安定化組成物が開示されている。さらに、ＷＯ２００８／１４５７１０には、例えば、細胞、トランスクリプトーム、ゲノムおよびプロテオームを安定化する、血液または組織試料などの細胞含有試料を安定化するための方法が記載されている。これらの適用は、例えば細胞外核酸の安定化を確実にする効率的な安定化技術をもたらすものであるが、開示する安定化組成物およびデバイスの滅菌および無菌性の側面に特異的に対処するものではない。
【００１０】
しかし、これらの安定化組成物を滅菌された形態で使用することにより、いくつかの利点がもたらされる。例えば、組成物の貯蔵寿命を増大させることができる。また、ある特定の適用では、試料を安定化のために滅菌された組成物と接触させた場合、安定化された試料の保管時間をさらに延長することができる。細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物は、生体試料を、例えば、ヒトまたは動物から採集し、安定化組成物と直接接触させる場合に特に有用である。これは、例えば、安定化組成物が採血デバイスまたはチューブなどの試料採集デバイスに含まれる場合であり、これもまた規制要件の対象となり得る。細胞内核酸も安定化する安定化組成物を使用する場合にも同じことが当てはまる。
【００１１】
したがって、無菌安定化組成物を提供することにより、多数の適用における安全性および／または規制の見解から有意な利点がもたらされる。それにもかかわらず、たとえ細胞外核酸および／または細胞内核酸を安定化するための組成物およびかかる組成物を含むデバイスの滅菌が望ましくとも、滅菌プロセスによりいくつかの問題が提起される。一方では、滅菌は、得られる組成物またはデバイスの無菌性を確実にするために十分にストリンジェントな条件下で実施されるべきである。他方では、かかる滅菌条件の適用は、安定化組成物の関連する性質に干渉する可能性がある。例えば、一般的な滅菌プロセスでは生体試料中の細胞外核酸集団の安定化における組成物の安定化性能が有意に低下する可能性があることが判明した。さらに、滅菌のために実行される措置は、理想的には、安定化された細胞外核酸の単離および単離された核酸の処理または分析などのさらなる下流の適用に干渉すべきでない。細胞内核酸も安定化する安定化組成物を使用する場合にも同じことが当てはまる。
【００１２】
利用可能な滅菌方法の中で、照射による滅菌は利点をもたらすものである。照射は過剰な熱を伴わずに作用し、また、滅菌される製品が毒性の化学物質に曝露することもない。滅菌のために一般に適用される照射の形態としては、一般に、ガンマ線照射、Ｘ線および電子ビーム照射などのイオン化照射形態が挙げられる。例えば、ＩＳＯ標準（特に、ＩＳＯ１１１３７−１：２００６、ＩＳＯ１１１３７−２：２０１２、ＩＳＯ１１１３７−３：２００６）に従ったガンマ線照射による滅菌を、採血チューブのような試料採集デバイスの生産プロセスなどの使い捨て医療デバイスの生産プロセスの一部として実施することができる。電子ビーム照射による使い捨て医療デバイスの滅菌も同様にＩＳＯ標準１１３７および１３４０９により支配される。
【００１３】
照射、例えばガンマ線照射による滅菌に関して、所望の無菌性のレベルが確実になるように十分に高い照射線量を選択するべきである。また、組成物および特に採血デバイスまたはチューブなどの試料採集用のデバイスの生産では、関連するＩＳＯ標準に詳述されている無菌性および照射線量に関する最低限の要件が満たされるべきである。一般には、医学的適用のための滅菌は、単一の単位が滅菌に供された後に非無菌性である確率が１０−６以下であることを確実にするものでなければならない。微生物が生存する確率が１０−６であることにより、１，０００，０００分の１の「無菌性保証水準（Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ  Ｌｅｖｅｌ）」（ＳＡＬ）  −  滅菌後に物品に単一の生存可能な微生物が１つ存在する見込みが導かれる。ガンマ線照射の実行および１０−６のＳＡＬを確実にする最小線量の決定は、いくつかのＩＳＯ標準（ＩＳＯ１１１３７−１：２００６、ＩＳＯ１１１３７−２：２０１２、ＩＳＯ１１１３７−３：２００６）によって標準化されている。最小線量は、製品の最初のバイオバーデンに応じて１０−６のＳＡＬに達することが必要とされる。
【００１４】
多くの場合、最小滅菌線量を超える照射線量で滅菌を行うことも望ましい。例えば、多くの場合、照射設備におけるワークフローの実用的な観点から、所与の高線量での照射がより都合がよい。また、適用される線量に応じて簡易微生物検査を実施して製品の無菌性を確認することができるので、最小滅菌線量を超える照射線量を選択することにより、重要な利点がもたらされ得る。適用される照射線量に応じて、微生物検査を低減して、またはさらには微生物検査を伴わずに、製品に無菌とラベルすることができる。例えば、採血チューブなどの試料採集デバイスの滅菌に関する関連する下限の１つは、約７．８ｋＧｙまたは８ｋＧｙの線量での照射である。一般に、８ｋＧｙ以上の線量が低バイオバーデンレベルの排除に好適である。バイオバーデンレベルが高い場合には、無菌性を達成するために高線量が必要になり得る。チューブが１５ｋＧｙの線量で照射される場合には、多くの場合、簡易微生物検査を適用して無菌性を決定および確認することができる。一般に、２５ｋＧｙにより、１０−６の無菌性保証水準（ＳＡＬ）で無菌性を達成することができる。バイオバーデンレベルが高くても、低い無菌性確率（例えば、１０−５または１０−４のＳＡＬ）をもってバイオバーデンの低下を達成することができる。したがって、（同程度に高い）線量である２５ｋＧｙで照射を行った採血チューブに無菌とラベル可能にするために微生物検査は必要とされなくなる可能性があり、これは有意な利点である。
【００１５】
それにもかかわらず、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線または電子ビーム照射などの照射により、フリーラジカルの形成がもたらされる。適用される照射線量が最大照射線量よりも高くなると、照射中のラジカルの形成により、滅菌される製品の活性成分の効力の分解または消失が導かれる可能性がある。最大照射線量は、製品の完全性に影響を及ぼさない滅菌線量、すなわち、分解効果を導かない最大線量と定義することができる。例えば、公知の分解問題が原因で、ガンマ線照射は、タンパク質成分を有する水性の薬品および医薬品に対して広範には使用されない（ＳＴＥＲＩＳ（登録商標）Ｉｓｏｍｅｄｉｘ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＴｅｃｈＴｉｐ  ０１：０９／０７、Ｒｅｖ  １）。
【００１６】
製品の最初のバイオバーデンにより、最大耐量よりも高い最小滅菌線量が決定される場合の措置がいくつか提唱されてきた。これらの措置は、例えば、清潔な滅菌された成分および設備、濾過の使用などの生産プロセスの改善を含む。しかし、これらの措置の実行は高価であり、また、滅菌された成分の使用が常に実行可能であるとは限らない。たとえこれらの措置がより低い最小滅菌線量の達成に役立つ可能性があるとしても、最終製品の滅菌はなお必要である。分解効果の緩和に関して記載されている他の戦略としては、温度を低下させたまたは制御した照射、線量率の調整、水分の最小化または乾燥したまたは固体形態での照射、および放射線防護剤としての機能を果たす添加剤の使用が挙げられる。しかし、これらの戦略は、全身的に適用できないことが多く、また、適切な戦略の実行は滅菌される製品または組成物にも依存する。
【００１７】
したがって、滅菌を達成するために必要な条件、特に、照射による滅菌により、安定化組成物の活性成分の分解がもたらされる可能性があり、したがって、安定化組成物の細胞外核酸集団を安定化する能力が、滅菌されると低下するまたはさらには消滅することが周知の問題である。細胞内核酸および／または細胞特性も安定化する安定化組成物を使用する場合にも同じことが当てはまる；安定化性は、滅菌後も維持されなければならない。
【００１８】
本発明者らにより、試料中の細胞外核酸集団を安定化するためのカスパーゼ阻害剤含有組成物が、照射による滅菌後に性能の有意な低下を示すことが判明した。当然、安定化組成物の安定化性に対する滅菌プロセスのかかる負の影響は望ましくない。たとえ所与の製品に対して必要な最小滅菌線量を低下させる措置をとることができたとしても、これらの措置は、一般には、それ自体で最終製品の無菌性を確実にするために十分なものではなく、最小滅菌線量の低下は、例えば上記の理由で最大滅菌線量を超える照射線量の適用が望ましい状況に対する対処とはならない。上記の分解効果を緩和するための戦略の多くは、医薬製品に対して開発されたものであり、異なる考慮事項が適用されるので核酸に関連する適用に容易には変換可能でない。
【００１９】
生体試料中の核酸集団の安定化に好適な組成物を滅菌するための適切な戦略では、滅菌後の適切な安定化機能を確実にし、理想的には、核酸単離および／または分析などのさらなる下流のプロセスに干渉しない必要がある。滅菌後の適切な安定化性能は、特に、生体試料中に低濃度で含まれることが多い細胞外核酸集団に関連する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第９７／０３５５８９号
【特許文献２】国際公開第９７／３４０１５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献４】米国特許第７，３３２，２７７号明細書
【特許文献５】米国特許第７，４４２，５０６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１０号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１０／０１８４０６９号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１０／０２０９９３０号明細書
【特許文献９】米国特許第６，６１７，１７０号明細書
【特許文献１０】米国特許第７，２７０，９５３号明細書
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１（２００７）７９５−７９９、Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：４０−４９（２００６）
【非特許文献２】ＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７５（２００７）１９１−２３２
【非特許文献３】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら（２００６）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、２５、１１、６３５−６４０；Ｆａｎら（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：８
【非特許文献４】Ｃｈｉｕら（２００１）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：９  １６０７−１６１３；Ｆａｎら（２０１０）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
したがって、上記の先行技術の欠点の少なくとも１つを克服することが本発明の目的である。特に、カスパーゼ阻害剤を含み、また、滅菌後にも細胞含有生体試料などの生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適である、滅菌された組成物を調製する方法を提供することが本発明の目的である。滅菌された形態の組成物がかかる生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適である、対応する滅菌可能な組成物を提供することは本発明のさらなる目的である。滅菌された組成物の安定化特性を維持するために、照射による滅菌中の、カスパーゼ阻害剤などの安定化組成物中に含有される１つ以上の活性成分の分解を防止することは本発明のさらなる目的である。したがって、滅菌された組成物中の滅菌可能な組成物の１つ以上の安定化特性を維持することが望ましく、したがって、本発明の目的である。例えば、ｉ）生体試料に含まれている細胞、ｉｉ）含まれている細胞内核酸（例えば、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ、特に、含有されている細胞の遺伝子発現プロファイルの安定化のため）ならびに／またはｉｉｉ）細胞表面タンパク質などの細胞関連タンパク質を安定化する、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物のための対応する滅菌技術を提供することがさらなる目的である。
【００２３】
本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であるカスパーゼ阻害剤含有組成物（本明細書では「安定化組成物（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」または「安定化組成物（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とも称される）を、チオアルコール（例えば、好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオンなど）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物を安定化組成物中に含めた場合に、照射による滅菌中の分解効果から効率的に防護することができるという驚くべき所見に基づく。驚くべきことに、これらの化合物のうちの１つ以上を、分解からの防護のために、細胞外核酸の安定化性に負の影響を及ぼすことなく安定化組成物中に含めることができる。また、有利なことに、これらの化合物の少なくとも１つを安定化組成物中に含めることは、安定化された細胞外核酸集団の単離および／または分析などの下流の適用に干渉しない。したがって、これらの化合物により、組成物が、それぞれ少なくとも１つのその活性成分、例えば、特にカスパーゼ阻害剤などが照射による滅菌中に分解されることから防護され、また、安定化組成物の安定化特性が滅菌時に効率的に保存される。
【００２４】
本発明の方法は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な組成物の、ガンマ線照射、電子ビーム照射またはＸ線などの照射による滅菌を有意に容易にするものである。本発明の方法により、１つ以上のカスパーゼ阻害剤および必要に応じて参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０４５４５７Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８０Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８２Ａ１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９、ＷＯ２０１４／０４９０２２Ａ１、ＷＯ２０１３／０４５４５８Ａ１およびＷＯ２０１４／１４６７８１Ａ１に開示されている１つ以上の他の安定化剤を含む安定化組成物に基づく滅菌された安定化組成物を調製することが可能になる。論じたように、これらの出願には、含有されている細胞の細胞内ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）および／または細胞内ＲＮＡなどの細胞内核酸（特に、遺伝子発現プロファイル）の安定化に好適な安定化組成物も開示されている。本方法により、特に、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９に開示されている１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む高度に効率的かつ有利な安定化組成物に基づく滅菌された安定化組成物を調製することが可能になる。安定化組成物は、試料採集デバイス中で直接、都合よく調製および／または滅菌することができる。
【００２５】
チオアルコール、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される化合物を使用することによって、照射によって滅菌することができる液体組成物を調製することがさらに可能になる。液体、特に水性の形態の滅菌された組成物が高度に有利である。例えば血液試料の安定化では、滅菌された液体または水性の安定化組成物の使用により、例えば、溶血を低減し、したがって、安定化効果を改善することが可能になる。本方法を用いて、穏やかなｐＨ、特に、弱酸性ｐＨを有するものを含めた液体安定化組成物を調製し、滅菌することが可能である。滅菌は、強塩基性ｐＨまたは強酸性ｐＨ条件に戻す必要なく実施することができる。弱酸性ｐＨは、滅菌中の安定化組成物における沈殿物の出現の回避または低減に寄与する。
【００２６】
本発明はまた、滅菌されていない安定化組成物および上述の化合物を用いずに滅菌された滅菌組成物と比較して貯蔵寿命が延長された、滅菌された安定化組成物を調製することも可能にするものである。
【００２７】
第一の態様に従って、本発明は、したがって、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成するための方法であって、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を提供するステップ；および
ｂ）滅菌のために組成物を照射するステップ
を含む方法を提供する。
【００２８】
第二の態様に従って、本発明は、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、
ａ）ｉ）本発明の第一の態様の方法による生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物、またはｉｉ）滅菌された形態の、本発明の第六の態様による組成物を得るステップ；および
ｂ）安定化のために、細胞含有生体試料を滅菌された組成物と接触させるステップ
を含む方法を提供する。
【００２９】
第三の態様に従って、本発明は、安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するための方法であって、
ａ）本発明の第二の態様の方法に従って細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）細胞外核酸を単離するステップ
を含む方法を提供する。
【００３０】
第四の態様に従って、本発明は、細胞外核酸を処理および／または分析するための方法であって、
ａ）安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を本発明の第三の態様の方法に従って単離するステップ；ならびに
ｂ）単離された細胞外核酸を処理および／または分析するステップ
を含む方法を提供する。
【００３１】
第五の態様に従って、本発明は、滅菌可能な組成物を生成するための方法であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であり、方法が、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を調製するステップ、ならびに、必要に応じて、
ｂ）組成物を滅菌するステップ
を含む方法を提供する。
【００３２】
この方法を使用して、第六の態様による組成物を調製することができる。
【００３３】
第六の態様に従って、本発明は、滅菌可能な組成物であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であり、組成物が、本発明の第一の態様による方法のステップａ）において提供される組成物である、滅菌可能な組成物を提供する。滅菌可能な組成物は、ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、ならびにｉｉ．チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物を含む。本発明の第一の態様による方法のステップａ）において提供される組成物であり得る第六の態様による滅菌可能な組成物は、複数の実施形態では、滅菌して、滅菌された組成物をもたらすことができる。
【００３４】
第七の態様に従って、本発明は、本発明の第六の態様による滅菌可能な組成物を含む試料採集デバイス、例えば、容器、好ましくは試料採集チューブなどを提供する。
【００３５】
第八の態様に従って、本発明は、本発明の第六の態様による組成物、または本発明の第七の態様による試料採集デバイスを含むキットを提供する。
【００３６】
第九の態様に従って、本発明は、照射による滅菌中に生体試料の細胞外核酸集団またはその成分の安定化に好適な組成物を防護するための、チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体から成る群より選択される少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００３７】
本発明のさらなる態様を以下の詳細な説明において提示する。
【００３８】
本技術は、生体試料中の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌可能な組成物および滅菌された組成物を、都合がよく、信頼でき、安全であり、かつ費用効率が高い様式で調製することを可能にするものである。かかる安定化組成物は、特に、生体試料がヒトまたは動物から採集される、例えば血液試料などである適用に有利である。これらの適用では、安全性の観点から、安定化組成物およびデバイスが無菌状態であることが高度に好ましい。さらに、本発明に従って、同様に安全性に寄与する無毒性化合物を照射防護剤として使用することができる。複数の実施形態では、提供される滅菌可能な組成物および滅菌された組成物は、含有されている細胞の細胞内核酸（例えば、ゲノムＤＮＡなどの細胞内ＤＮＡおよび／または細胞内ＲＮＡ）、特に、遺伝子発現プロファイルの安定化にも好適である。さらなる実施形態では、提供される滅菌可能な組成物および滅菌された組成物は、細胞含有試料の安定化に好適であり、したがって、安定化された試料に含有されている細胞を、例えば、細胞表面特性および／または細胞形態に基づいて分析することができる。
【００３９】
特に、本発明は、照射により滅菌された、カスパーゼ阻害剤を含む液体安定化組成物を調製することを可能にするものである。照射による液体の滅菌は、滅菌される製品の活性に頻繁に干渉する。本発明者らにより、チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインおよび／またはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物を、カスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物に組み入れることにより、安定化組成物が照射により誘導される分解から防護される一方で、安定化組成物の安定化性は干渉されないことが判明した。これにより、安定化特性を維持する滅菌された組成物が提供される。これらの有利な効果は、ラジカルスカベンジャーとして使用される他の化合物では見られなかった。Ｎ−アセチル−システイン、アスコルビン酸および還元型グルタチオンが特に有効であることが判明した。
【００４０】
液体無菌組成物をもたらすことが特に有用である。例えば、それにより、安定化組成物と全血または血漿もしくは血清のような血液由来試料などの液体生体試料の迅速かつ均一な混和が可能になる。さらに、液体、好ましくは水性の組成物の使用により、溶血が低減される。
【００４１】
さらに、本発明の方法に従って安定化組成物を滅菌することにより、安定化組成物の保管性をさらに改善することができ、また、滅菌されていない組成物およびチオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システイン、グルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体の少なくとも１つを用いずに滅菌された組成物と比較して貯蔵寿命の延長が可能になる。これは別の利点である。
【００４２】
本出願の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになる。しかし、以下の記載、添付の特許請求の範囲および特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すものであるが、単に実例として与えるものに過ぎないことを理解されたい。開示されている発明の主旨および範囲内の種々の変化および改変は、以下を読むことにより当業者には容易に明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ガンマ線照射のカスパーゼ阻害剤含有組成物の安定化性に対する効果を示すグラフである。効果を血漿中のｃｃｆＤＮＡレベルに基づいて分析する。図は、保管後の、非安定化ＥＤＴＡ血液中（左）、および、カスパーゼ阻害剤（非無菌性のものまたは異なる線量のガンマ線照射で滅菌されたもの）を含む安定化組成物を含むチューブ中に引き込んだ安定化血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化および標準偏差を示す。
【００４４】
【図２】図２は、ＤＭＳＯに溶解させた異なる濃度の純粋なカスパーゼ阻害剤を用いて調製したＨＰＬＣ標準曲線である。
【００４５】
【図３】図３は、Ｎ−アセチル−システイン、アスコルビン酸、没食子酸およびタンニン酸の、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物への添加を示すグラフである。保管後の、安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化。
【００４６】
【図４】図４は、異なる濃度のアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオン（還元型）の、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物への添加を示すグラフである。保管後の、安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化。
【００４７】
【図５】図５は、異なる濃度のアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオンの、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物への添加を示すグラフである。保管後の、安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の平均全コピー数。
【００４８】
【図６】図６は、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオンの種々の組み合わせのカスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物への添加を示すグラフである。保管後の、安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化。
【００４９】
【図７】図７は、スカベンジャー添加を伴う安定化血液中のｃｃｆＤＮＡレベルに対するガンマ線照射の効果を示すグラフである。保管後の、照射を行った安定化試薬を用いて安定化された血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化。
【００５０】
【図８Ａ】図８Ａ、図８Ｂは、Ｎ−アセチル−システインの安定化試薬への添加および漸増線量のガンマ線照射の、血漿中のｃｃｆＤＮＡレベルに対する効果を示すグラフである。非安定化ＥＤＴＡ血液中（左）、ならびに、０．５、１．０、２．０および４．０ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−システインをチューブに引き込んだ安定化血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化および標準偏差；非無菌性のものまたは異なる線量のガンマ線照射で滅菌されたもの；ｃｃｆＤＮＡレベルは安定化された試料を保管した後に決定した。
【図８Ｂ】図８Ａ、図８Ｂは、Ｎ−アセチル−システインの安定化試薬への添加および漸増線量のガンマ線照射の、血漿中のｃｃｆＤＮＡレベルに対する効果を示すグラフである。非安定化ＥＤＴＡ血液中（左）、ならびに、０．５、１．０、２．０および４．０ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−システインをチューブに引き込んだ安定化血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化および標準偏差；非無菌性のものまたは異なる線量のガンマ線照射で滅菌されたもの；ｃｃｆＤＮＡレベルは安定化された試料を保管した後に決定した。
【００５１】
【図９】図９は、室温で５日間保管した８名のドナーからの血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の平均全コピー数を示すグラフである。血液試料を、スカベンジャーとしてビタミンＢ６を伴う安定化試薬（左のバー）または伴わない安定化試薬（左から３番目のバー）を用いて安定化した。これらの安定化試薬は滅菌されたものであった。対照として、ビタミンＢ６を伴うが滅菌されていない安定化試薬（左から２番目のバー）および非安定化ＥＤＴＡ血液（左から４番目のバー）を含めた。
【００５２】
【図１０】図１０は、室温で５日間保管した６名のドナーからの血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の平均全コピー数を示すグラフである。血液試料を、異なるカスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬を用いて安定化した。左のバー：カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（滅菌されていないもの）を含む安定化試薬；左から２番目のバー：カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびスカベンジャーとしてＮ−アセチル−システイン（滅菌されたもの）を含む安定化試薬；左から３番目のバー：カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（滅菌されていないもの）を含む安定化試薬；左から４番目のバー：カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびスカベンジャーとしてＮ−アセチル−システイン（滅菌されたもの）を含む安定化試薬；左から５番目のバー：ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ｔｕｂｅ；左から６番目のバー：非安定化ＥＤＴＡ血液。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
上記のいくつもの理由から、生体試料の細胞外核酸集団、特にｃｃｆＤＮＡ集団の安定化に好適な滅菌された組成物を提供することが望ましい。さらに細胞内ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）および／または細胞内ＲＮＡなどの細胞内核酸の安定化に好適であり、特に、遺伝子発現プロファイルの安定化に好適である安定化組成物に関して同じことが当てはまる。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らにより、照射による滅菌、特に、ガンマ線照射により、安定化試薬、カスパーゼ阻害剤の主要な成分の分解が導かれる可能性があることが判明した。照射エネルギーおよび時間に応じて、カスパーゼ阻害剤の９５％に至るまでが滅菌プロセス中に分解される可能性がある。滅菌中のカスパーゼ阻害剤の分解により、安定化組成物の性能の低下が導かれる。この効果は、血液試料を安定化するためにかかる滅菌された安定化組成物を使用した場合の血液細胞からのゲノムＤＮＡの放出の増加による例において見ることができる。したがって、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物中の１つ以上の活性成分、例えば、特に、カスパーゼ阻害剤などが、照射を伴う滅菌プロセス中、特にガンマ線照射による滅菌中に実質的に分解されるのを防止するために、方法が必要とされていた。
【００５４】
本発明者らにより、ある特定の化合物のみが、ガンマ線照射による滅菌などの照射を伴う滅菌中に安定化組成物を防護することができることが判明した。これらの化合物としては、特にＮ−アセチル−システインおよびグルタチオン（特に、還元型）などのチオアルコール、アスコルビン酸、およびビタミンＥまたはトロロックスなどのその誘導体などの水溶性ビタミンが挙げられる。試験した多数の化合物候補のうち、これらの化合物のみが、安定化組成物の安定化性能に負の影響を及ぼすことなく、安定化組成物に含まれているカスパーゼ阻害剤（および必要に応じて他の分解感受性成分）を照射による滅菌中の実質的な分解から防護することが判明した。この有利な効果の組み合わせは、血液試料中のｃｃｆＤＮＡ集団の安定化に関する実施例において示す。参照しやすさのために、特にＮ−アセチル−システインおよびグルタチオン（特に、還元型）などのチオアルコール、アスコルビン酸、およびビタミンＥまたはトロロックスなどのその誘導体などの水溶性ビタミンは、本明細書では、時には、集合的に「本発明の化合物」と称される。
【００５５】
例えば医薬組成物中でラジカルスカベンジャーとしての機能を果たすことが公知であるタンニン酸および没食子酸などの他の化合物は、滅菌後に、細胞外核酸集団の安定化に好適なカスパーゼ阻害剤含有組成物の安定化性能に干渉することが判明した。したがって、得られる、これらの化合物を含む滅菌された組成物は、試料中の細胞外核酸集団を安定化するためには不適当であった。また、ラジカルスカベンジャーとしての機能を果たすことが当技術分野において記載されている他の化合物、例えば、マンニトール、イソプロパノールまたはＴｗｅｅｎ−８０などは、生体試料に含まれている細胞外核酸集団の安定化に好適なカスパーゼ阻害剤含有組成物に対する適切な放射線防護を媒介すると判明することはなかった。
【００５６】
実施例によって実証されるように、本発明の化合物によって媒介される防護効果は、広範囲の滅菌条件および広範囲の照射線量にわたって達成される。有利なことに、化合物は、弱酸性ｐＨにおいて有効であり、また、有利なことに、滅菌中に強酸性または強塩基性ｐＨ条件に戻す必要はない。
【００５７】
したがって、本発明者らにより、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適なカスパーゼ阻害剤含有組成物を、滅菌前に本発明の化合物の少なくとも１つを組成物中に含めることによって滅菌中の分解から効率的に防護できることが判明した。驚くべきことに、これらの防護用化合物は、基本的に細胞外核酸集団の安定化における組成物の性能に悪影響を及ぼすことなく添加することが可能である。得られる滅菌された組成物により、含有される安定化された細胞外核酸集団の単離および／または分析などの下流の適用も可能になる。さらに細胞内ＤＮＡおよび／または細胞内ＲＮＡなどの細胞内核酸の安定化に好適であり、特に、遺伝子発現プロファイルの安定化に好適であるカスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物に関しても同じことが当てはまる。それにより、本発明は、当技術分野に重要な貢献をする。
【００５８】
本発明において使用するための最も好ましい化合物は、Ｎ−アセチル−システインである。Ｎ−アセチル−システインは、照射、特にガンマ線照射による滅菌などの滅菌中に優れた防護をもたらす。同時に、実施例において実証するように、Ｎ−アセチル−システインは、安定化性、特に、ｃｃｆＤＮＡ安定化に対する安定化組成物の性能に干渉しない。
【００５９】
Ａ．滅菌された組成物を生成するための方法
上記の所見は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む滅菌された組成物を生成するための方法に有利に適用することができる。
【００６０】
したがって、第一の態様に従って、本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法であって、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために組成物を照射するステップ
を含む方法を提供する。
【００６１】
本明細書において用いる場合の用語「細胞外核酸」（複数）または「細胞外核酸」（単数）は、特に、細胞に含有されない核酸を指す。それぞれの細胞外核酸は、多くの場合、無細胞核酸とも呼ばれる。これらの用語は、本明細書では同義語として用いている。したがって、細胞外核酸は、通常、試料中の１細胞の外部または複数の細胞の外部に存在する。用語「細胞外核酸」は、例えば、細胞外ＤＮＡならびに細胞外ＲＮＡも指す。例えば体液などの生体試料の無細胞画分（それぞれ部分）において見出される典型的な細胞外核酸の例としては、哺乳動物細胞外核酸、例えば、細胞外腫瘍関連または腫瘍由来ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他の細胞外疾患関連ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、エピジェネティック修飾ＤＮＡ、胎児ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなど）など、ならびに非哺乳動物細胞外核酸、例えば、ウイルス核酸、細胞外核酸集団へと例えば原核生物（例えば細菌）、ウイルス、真核寄生虫または真菌から放出される病原体核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞外核酸集団は、損傷細胞または死細胞から放出されたある一定の量の細胞内核酸を通常含む。例えば、血液中に存在する細胞外核酸集団は、損傷細胞または死細胞から放出された細胞内グロビンｍＲＮＡを通常含む。これは、インビボで発生する自然プロセスである。細胞外核酸集団中に存在するかかる細胞内核酸は、後の核酸検出方法における対照という目的に役立つこともできる。上述の適用において記載する安定化方法は、特に、細胞外核酸集団に含まれている細胞内核酸、例えばゲノムＤＮＡの量が、細胞含有試料を採集した後、その試料のエクスビボでの取り扱いに起因して有意に増加するリスクを低減させる。したがって、エクスビボでの取り扱いのための細胞外核酸集団の変更を低減させ、さらに防止することができる。本明細書において、循環体液、例えば血液またはリンパ液から得られる細胞外核酸は循環細胞外核酸または循環無細胞核酸と呼ばれる。本明細書において使用される場合、用語細胞外核酸は、特に、哺乳動物細胞外核酸を指し得る。例としては、疾患関連または疾患由来細胞外核酸、例えば、腫瘍関連または腫瘍由来細胞外核酸、炎症、壊死もしくは傷害、特に外傷に起因して放出される細胞外核酸、他の疾患に関係したおよび／もしくは他の疾患に起因して放出される細胞外核酸、または胎児に由来する細胞外核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。ｃｃｆＤＮＡ、およびしたがってｃｃｆＤＮＡ集団の安定化は特に好ましい。本明細書に記載される場合の用語「細胞外核酸」（複数）または「細胞外核酸」（単数）は、他の細胞含有生体試料、特に、体液以外の生体試料から得られる細胞外核酸も指す。通常、試料は、１つより多くの種類またはタイプの細胞外核酸を含む。
【００６２】
本明細書において用いる場合の用語「細胞外核酸集団」は、特に、細胞含有試料に含まれている様々な細胞外核酸の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ）を指す。細胞含有試料は、通常、特徴的なおよびしたがってユニークな細胞外核酸集団を含む。したがって、特定試料の細胞外核酸集団に含まれる１つ以上の細胞外核酸のタイプ、種類、比および／または量は、重要な試料特性であり得る。１つの実施形態によると、細胞外核酸集団は、細胞外ＤＮＡ、特に無細胞循環ＤＮＡを指す。上で論じたように、前記細胞外核酸集団を安定化することおよびしたがって試料を採集した状態で前記細胞外核酸集団を実質的に保存することは重要である。試料の細胞外核酸集団に含まれる１つ以上の細胞外核酸のその組成および／または量は、価値のある医学、予後予測または診断情報を提供することができるからである。したがって、細胞外核酸集団のプロファイルが、意図される安定化期間にわたって効率的に安定化されると有利である。本明細書に記載する安定化技術は、試料採集および安定化後、細胞内核酸による、特にゲノムＤＮＡによる、細胞外核酸集団の汚染およびしたがって希釈を低減させる。かくして、細胞外核酸集団の実質的保存が達成される。実施例によって証明するように、細胞外核酸集団（ここでは細胞外ＤＮＡ集団について証明される）の、含まれている細胞外核酸の量、質および／または組成に関する変化、特に、放出されたゲノムＤＮＡの増加に起因する変化は、安定化期間にわたって、本明細書に記載されるようなカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物を使用する場合、非安定化試料に比べてまたは血液試料もしくは血液由来試料の場合は例えばＥＤＴＡによって安定化されている対応する試料に比べて、相当低減される。１つの実施形態によると、Ｔ０（安定化時点）から安定化期間の終わり（好ましくは、Ｔ０の４８時間、７２時間または９６時間後）までのゲノムＤＮＡの増加は、非安定化試料に比べて、または血液試料もしくは血液に由来する試料の場合は例えばＥＤＴＡによって安定化されている対応する試料（例えば、１．５ｍｇＥＤＴＡ／ｍｌ安定化血液試料）に比べて、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低減される。
【００６３】
複数の実施形態では、提供される滅菌された組成物は、さらに、細胞内ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）および／または細胞内ＲＮＡなどの細胞内核酸の安定化に好適である。特に、提供される滅菌された組成物は、含有されている細胞の遺伝子発現プロファイルを安定化し、それにより、遺伝子発現の信頼できるプロファイリングを可能にするのに好適であり得る。含有されている細胞の遺伝子転写プロファイルが安定化され、したがって保存されることにより、安定化期間中、遺伝子発現プロファイルの変化が低減する、またはさらには防止される。したがって、所望であれば、安定化された試料中の細胞外核酸集団と細胞内核酸集団を別々に分析することを可能にする滅菌された安定化組成物が提供される。
【００６４】
複数の実施形態では、滅菌された安定化組成物により、生体試料に含まれている細胞を安定化し、したがって実質的にインタクトなままにすることにより、安定化された試料に含有されている細胞を分析することも可能になる。例えば、細胞表面特性および／または細胞形態などの細胞の性質を安定化することが有利である。これにより、安定化された試料に含有される特定の細胞、例えば、血液試料に含有される血液細胞または循環する腫瘍細胞などを分析することおよび分離することも可能になる。
【００６５】
生体試料は、細胞含有生体試料または細胞を含有することが疑われる生体試料であり得る。生体試料は、体液、および体液に由来する細胞含有試料より成る群から選択され得る。例として、全血、血液に由来する試料、例えば血漿もしくは血清、バフィコート、尿、痰、涙液、リンパ液、羊水、汗、髄液、脳脊髄液、腹水、乳、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、鼻分泌物、膣分泌物、精液／精漿、創傷分泌物、細胞培養物およびスワブ試料が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料は、体液、身体の分泌物または身体の排泄物、好ましくは、体液、最も好ましくは、尿、リンパ液、血液、バフィコート、血漿または血清である。特に、細胞含有生体試料は、循環体液、例えば、血液またはリンパ液であり得る。好ましくは、細胞含有生体試料は、ときには全血と呼ばれる、血液試料である。血液試料は、好ましくは、安定化の前に希釈または分画されていない。１つの実施形態によると、血液試料は末梢血である。また好ましくは、生体試料は血漿または血清であり得る。１つの実施形態によると、細胞含有生体試料をヒトから得た。細胞含有生体試料は、試料の細胞外部分の中の細胞外核酸を含むか、またはこれを含むことが疑われる。
【００６６】
本発明の第一の態様による方法において、ステップａ）において提供され、ステップｂ）において照射される組成物は、まだ安定化すべき生体試料と接触していないことが理解されるべきである。組成物は、滅菌のために照射する、生体試料を伴わない安定化組成物自体、すなわち試薬である。したがって、ステップａ）において提供され、ステップｂ）において照射される組成物は、まだ生体試料と接触しておらず、したがって、ステップａ）およびｂ）において生体試料を含んでいない。したがって、ステップａ）において提供され、ステップｂ）において照射される組成物は、細胞および／または細胞断片を含んでいない。したがって、ステップａ）において提供され、ステップｂ）において照射される組成物は、体液および／または体液に由来する細胞含有試料を含んでいない。
【００６７】
この方法をここでより詳細に記載する。その際、方法のステップａ）およびｂ）を最初に記載する。ステップａ）を論じる際、ステップａ）の特徴ｉｉ．に従って有利な化合物をさらに記載することに重きを置く。次いで、ステップａ）において提供、例えば調製される例示的な組成物をさらに記載する。
【００６８】
ステップａ）、組成物の提供
ステップａ）は、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、ならびにチオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインおよび／もしくはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥもしくはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物を含む組成物を提供することを包含する。かかる組成物は、第五の態様による方法を使用して生成し、したがって調製することができる。
【００６９】
提供されるカスパーゼ阻害剤含有組成物は、生体試料の細胞外核酸集団、特にｃｃｆＤＮＡの安定化に好適である。安定化効果を増強するために組成物にさらに含めることができるさらなる添加剤は、当業者に公知であり、本明細書にも記載している。
【００７０】
ステップａ）において提供される組成物の形態は、特に限定されない。例えば、組成物は、固体形態で提供することができる。所望であれば、組成物は、凍結乾燥形態で提供することができる。組成物を固体形態で提供、例えば調製する場合には、方法ステップｂ）を実施する前に改変して液体組成物を提供することができる。例えば、固体組成物を照射前に液体に溶解させて、照射ステップｂ）のために水性組成物であることが好ましい液体組成物を提供することができる。
【００７１】
ステップａ）において提供される組成物は液体形態であることが好ましい。組成物を水性形態で調製することが好ましい。例えば、組成物の成分を適切な溶媒と接触させる、好ましくは混合して、液体組成物を得ることができる。液体組成物は、水性組成物であることが好ましい。水を溶媒として使用することができる。
【００７２】
「液体形態」で提供または調製される、とは、本明細書で使用する場合、特に、液体組成物を提供または調製されることを意味し得る。液体組成物は、１つの相のみの均一の混合物であってよいが、例えば沈殿物などの固体成分を含む液体組成物も本発明の範囲内に入る。「水性形態」で提供または調製される、とは、本明細書で使用する場合、特に、水溶液組成物を提供または調製されることを意味し得る。「水性」組成物は、水を含む。１つの実施形態によると、「水性」組成物は、主要な成分として水を含む（％ｖ／ｖ）。
【００７３】
理論に束縛されることを望むものではないが、液体、特に、水性の組成物を調製すると、生体試料中の細胞外核酸集団を安定化するために使用する際にいくつかの利点がもたらされる。液体組成物では、例えば、安定化すべき細胞外核酸を含むまたは含む疑いがある液体試料と迅速に都合よく混和することが可能になる。液体試料の例は、血液試料、血漿試料および血清試料である。また、血液試料を安定化する場合には、水を含有する安定化組成物を調製することが、この実施形態により溶血が有意に低減するので、特に好ましい。したがって、水を含有する安定化組成物を調製することにより、前記安定化組成物をその後、血液試料を安定化するために使用する際に利点が生じる。
【００７４】
ステップａ）において調製される組成物の成分は、溶媒、例えば、水、または、例えば、例えばＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＰＢＳなどの生物学的緩衝液を含む緩衝液体中に含めることができ、それぞれ、溶解させることができる。さらに、安定化組成物の成分をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン溶媒に溶解させることもでき、安定化組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性非プロトン溶媒を含んでもよい。ＤＭＳＯは、特に、ビタミンＥまたはトロロックスなどのその誘導体と組み合わせて使用する場合に、本発明の化合物によって付与される、滅菌中の安定化組成物の防護を支持することも判明した。
【００７５】
本方法を用いて、照射を伴う滅菌プロセス中、安定化組成物中に含有されるカスパーゼ阻害剤を防護することが可能である。これは、穏やかなｐＨ条件においても有利である。強酸性または強塩基性ｐＨ条件に戻す必要はない。チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインおよび／またはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物は、穏やかなｐＨ条件下で活性である。これは、防護のためのアスコルビン酸の使用を含む。弱酸性条件などの穏やかなｐＨ条件を使用することは、低温で安定化試薬の単一成分が沈殿するのが特によく防止されるので、有利である。それにより、液体試料とのいっそう迅速な混和も可能になり、これが溶血の低減に寄与し、したがって、安定化効果が改善される。組成物は弱酸性ｐＨを有することが好ましい。
【００７６】
一つの実施形態に従って、ステップａ）で提供される安定化組成物は、４．０から７．０のｐＨ、４．１から６．９のｐＨ、４．２から６．８のｐＨ、４．３から６．６のｐＨ、４．４から６．３のｐＨ、４．５から６．０のｐＨ、または４．５から５．５のｐＨから選択されるｐＨを有する。
【００７７】
１つの実施形態によると、照射ステップｂ）を実施する前に組成物を試料採集デバイス中に提供する、または組成物を試料採集デバイス中に充填する。試料採集デバイスは、本発明の第七の態様によるデバイスであってよい。試料採集デバイスは、照射を伴う滅菌に好適なものである。
【００７８】
特徴ｉ、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤
ステップａ）において提供される安定化組成物は、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む。
【００７９】
カスパーゼ阻害剤は、ＷＯ２０１３／０４５４５７Ａ１またはＷＯ２０１３／０４５４５８Ａ１に記載されているカスパーゼ阻害剤であってよい。そこで開示されているカスパーゼ阻害剤は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの先行技術文書に記載されているように、カスパーゼ阻害剤は、単独でおよび他の安定化剤との組み合わせでも、生体試料、例えば血液試料などの細胞外核酸集団（例えば、細胞外ＤＮＡ）の安定化において高度に有効である。
【００８０】
好ましくは、カスパーゼ阻害剤は細胞透過性である。カスパーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは、アポトーシスに重要な役割を果たす。個々のカスパーゼの基質選好または特異性は、カスパーゼと結合についてうまく競合するペプチドの開発に活用されている。カスパーゼ特異的ペプチドを例えばアルデヒド化合物、ニトリル化合物またはケトン化合物にカップリングさせることによりカスパーゼ活性化の可逆的または不可逆的阻害剤を生成することができる。例えば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫなどのフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）誘導体化ペプチドは、追加の細胞毒性効果のない有効な不可逆的阻害剤として作用する。Ｎ末端およびＯメチル側鎖にベンジルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）を有する、合成された阻害剤は、細胞透過性増強を呈示する。Ｃ末端にフェノキシ基を有する、さらなる好適なカスパーゼ阻害剤が合成される。例はＱ−ＶＤ−ＯＰｈであり、これは、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫよりアポトーシスの防止およびしたがって安定化の支援にさらにいっそう有効である、細胞透過性の不可逆的広域カスパーゼ阻害剤である。
【００８１】
１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、汎カスパーゼ阻害剤、したがって、広域カスパーゼ阻害剤である。１つの実施形態によると、１つの実施形態によると、前記カスパーゼ阻害剤は、ペプチドまたはタンパク質を含むか、またはこれからなる。１つの実施形態によると、前記カスパーゼ阻害剤は、改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む。好ましくは、前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド化合物、ニトリル化合物またはケトン化合物によって改変されている。１つの実施形態によると、前記カスパーゼ特異的ペプチドは、Ｏ−フェノキシ（ＯＰｈ）基またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で好ましくはカルボキシル末端が修飾されている。タンパク質またはペプチドを含む、またはそれから成る好適なカスパーゼ阻害剤、および改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤は、ＷＯ２０１３／０４５４５７の表１に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。この表には、好適なカスパーゼ阻害剤の例が提示されている。
【００８２】
理論に束縛されることを望むものではないが、本発明の化合物は、とりわけ、ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、および特に官能基により改変されたペプチドであるカスパーゼ阻害剤を防護するために活性であると考えられる。本発明の化合物は、特に、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）基で改変されており、かつ／または、好ましくはＮ末端においてグルタミン（Ｑ）基で改変されているペプチド性カスパーゼ阻害剤を防護するのに好適である。かかるカスパーゼ阻害剤の例は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈである。
【００８３】
１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＢｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。１つの実施形態によると、前記カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。好ましい実施形態では、カスパーゼの広域阻害剤であるＱ−ＶＤ−ＯＰｈを安定化のために使用する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、細胞透過性であり、アポトーシスによる細胞死を阻害する。Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈは、極めて高濃度でも細胞に対して毒性でなく、アミノ酸バリンおよびアスパラギン酸にコンジュゲートされたカルボキシ末端フェノキシ基を含む。それは、カスパーゼ−９とカスパーゼ−３、カスパーゼ−８とカスパーゼ−１０、およびカスパーゼ−１２という３つの主要アポトーシス経路によって媒介されるアポトーシスの防止に等しく有効である（Ｃａｓｅｒｔａら、２００３）。
【００８４】
実施例において示すように、本発明の化合物は、広い濃度範囲で有効であり、照射中、安定化組成物中に含有されるカスパーゼ阻害剤を防護する。本発明の防護用化合物について試験した濃度範囲内で、防護は、安定化組成物に含まれている広範囲のカスパーゼ阻害剤濃度にわたって達成され、付与される防護の程度は、試験したカスパーゼ阻害剤濃度にほとんど依存しなかった。
【００８５】
安定化組成物は、１つ以上のカスパーゼ阻害剤、特に、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈなどの改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤を、生体試料に含有されている細胞外核酸集団に対する安定化効果がもたらされるのに十分な量で含む。１つの実施形態によると、安定化組成物は、カスパーゼ阻害剤を、安定化組成物を意図された体積の安定化すべき試料と接触させた後に、０．１μＭから２５μＭ、０．５μＭから２０μＭ、１μＭから１７μＭ、２μＭから１６μＭ、さらに好ましい３μＭから１５μＭの最終濃度のカスパーゼ阻害剤がもたらされる濃度で含む。実施例から分かるように、約５μＭ、約１０μＭおよび約１５μＭの最終濃度が十分に好適であることが判明した。上でも説明したように、安定化組成物を意図された体積の安定化すべき試料と接触させた後にある最終濃度のカスパーゼ阻害剤がもたらされる濃度に言及されていたとしても、本発明の第一の態様による方法において、ステップａ）において提供され、ステップｂ）において照射される組成物は、まだ安定化すべき生体試料と接触していないことが理解されるべきである。
【００８６】
一つの実施形態に従えば、安定化組成物およびしたがって安定化試薬は、０．３５μｇ／ｍｌから７０μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌから６３μｇ／ｍｌ、１．７４μｇ／ｍｌから５９μｇ／ｍｌ、１０．５μｇ／ｍｌから５６μｇ／ｍｌ、または１５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌから４５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌから３８μｇ／ｍｌから選択される濃度のカスパーゼ阻害剤を含む。濃度は、０．７μｇ／ｍｌから４５μｇ／ｍｌおよび１．７４μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌから選択され得る。
【００８７】
一つの実施形態に従えば、安定化組成物およびしたがって安定化試薬は、０．６８μＭから１３６μＭ、１．３６μＭから１２２．５μＭ、３．３８μＭから１１４．７２μＭ、２０．４μＭから１０９μＭ、または２９．２μＭから９７．２μＭ、３８．９μＭから８７．５μＭ、４８．６μＭから７７．８μＭおよび５８．３μＭから７４μＭから選択される濃度のカスパーゼ阻害剤を含む。濃度は、２０．４μＭから９７．２μＭおよび２９．２μＭから８７．５μＭから選択され得る。
【００８８】
安定化組成物（試薬）と安定化すべき生体試料の混合物および安定化組成物（試薬）自体中の上記の濃度のカスパーゼ阻害剤は、単一のカスパーゼ阻害剤の使用ならびにカスパーゼ阻害剤の組み合わせの使用に適用される。上述の濃度は、特に、汎カスパーゼ阻害剤、特に、改変カスパーゼ特異的ペプチド、例えば、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよび／またはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを使用する場合に好適である。改変カスパーゼ特異的ペプチドのさらなる例は、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫである。上述の濃度は、例えば、血液試料の安定化に好適である。個々のカスパーゼ阻害剤および／または他の細胞含有生体試料の好適な濃度範囲は、当業者が、例えば、実施例に記載する試験アッセイで異なる濃度のそれぞれのカスパーゼ阻害剤を試験することにより決定することができる。
【００８９】
特徴ｉｉ、チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインおよび／またはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
ステップａ）において提供される組成物は、チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物をさらに含む。したがって、組成物は、照射によって（例えば、ガンマ線照射によってなど）滅菌することができ、ここで、滅菌された組成物は、その安定化性、したがって、性能を本質的に維持する。理論に束縛されることを望むものではないが、これらの化合物は、照射される安定化組成物、特に、その中に含まれているカスパーゼ阻害剤（単数または複数）を防護するのに役立つ。同時に、これらの化合物は、安定化効果には干渉せず、それにより、特にｃｃｆＤＮＡなどの細胞外核酸集団の安定化における組成物の機能性が保証される。驚くべきことに、本発明の化合物により、これらのバランスの取れた効果が達成された。実施例において示すように、いくつもの他のラジカルスカベンジャーは、照射からの防護を付与せず、かつ／または組成物の安定化性能を干渉し、したがって、不適当であった。
【００９０】
安定化組成物に含まれる少なくとも１つの化合物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオン、アスコルビン酸、ビタミンＢ、および／または水溶性ビタミンＥ誘導体から選択され得る。安定化組成物に含まれる少なくとも１つの化合物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオン、アスコルビン酸、および／または水溶性ビタミンＥ誘導体から選択され得る。好ましくは、少なくとも１つの化合物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオン、アスコルビン酸、および／またはトロロックスから選択される。より好ましくは、少なくとも１つの化合物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオン、ビタミンＢ６および／またはアスコルビン酸から選択される。より好ましくは、少なくとも１つの化合物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオン、および／またはアスコルビン酸から選択される。Ｎ−アセチル−システインおよびアスコルビン酸は、グルタチオン、特に還元形態のものと同様に、特に有効であることが見出された。ビタミンＢ６は、同様に、有用であることが見出されたＮ−アセチル−システインは、本発明に従って最も好ましい。
【００９１】
実施例において示すように、本発明の化合物は、組成物中に含めることができ、また、広範な濃度範囲において有効である。
【００９２】
一つの実施形態に従えば、安定化組成物は、２０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは、１５ｍｇ／ｍｌ以下、１０ｍｇ／ｍｌ以下、１２ｍｇ／ｍｌ以下、７ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、１．５ｍｇ／ｍｌ以下または０．７５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度のチオアルコール（好ましくは、Ｎ−アセチル−システインおよび／またはグルタチオン（好ましくは、還元型の）である）、水溶性ビタミンおよびビタミンＥもしくはその誘導体から選択される少なくとも１つの化合物を含む。好ましくは、組成物は、少なくとも０．０５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも０．３ｍｇ／ｍｌの少なくとも１つの化合物を含む。一つの実施形態に従えば、組成物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン（好ましくは、還元型の）、アスコルビン酸、ビタミンＢ、例えば、ビタミンＢ６、およびトロロックスから選択される少なくとも１つの化合をこれらの濃度で含む。一つの実施形態に従えば、組成物は、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン（好ましくは、還元型の）、アスコルビン酸およびトロロックスから選択される少なくとも１つの化合物をこれらの濃度で含む。
【００９３】
本発明の少なくとも１つの化合物は、照射による滅菌前の安定化組成物に含まれているカスパーゼ阻害剤の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３５％、または少なくとも５０％が滅菌後の安定化組成物に存在するようになる濃度で含めることができる。本発明の少なくとも１つの化合物は、照射による滅菌前の安定化組成物に含まれているカスパーゼ阻害剤の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも８０％が滅菌後の安定化組成物に存在するようになる濃度で含まれることが好ましい。これは、例えば、実施例において行ったように、ＨＰＬＣ分析を使用して決定することができる。実施例により示されるように、照射後のカスパーゼ阻害剤の分解の程度および分解されていない形態でなお存在するカスパーゼ阻害剤の百分率は、照射線量に依存する。所与の照射線量で照射後に残存する所望のカスパーゼ阻害剤の百分率を達成するための例示的な化合物濃度も実施例に示す。
【００９４】
本発明の少なくとも１つの化合物は、上で定義したように滅菌中にカスパーゼ阻害剤に対する防護効果を発揮できる一方で、同時に、安定化組成物の安定化性には実質的に干渉しない濃度で含めることができる。１つの実施形態によると、本発明の防護用化合物を含む安定化組成物の安定化効果は、防護用化合物を含まず他は同一の組成物の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または１００％である。防護用化合物を添加することによって安定化効果を増大させることさえできる。例えば、本発明の防護用化合物を含む安定化組成物の安定化効果は、防護用化合物を含まず他は同一の組成物の１２０％、１１５％、１１０％または１０５％であり得る。本発明の防護用化合物を含む安定化組成物および防護用化合物を含まず他は同一の組成物を滅菌されていないまたは照射を行っていない形態で互いと比較することが好ましい。目的の化合物を伴うまたは伴わない安定化組成物の安定化性を決定するための試験は実施例において提示し、その中の実験手順の節に記載する。試料中の細胞外核酸は、リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して定量化することができ、記載の経時的なコピー数の増加を使用して所与の安定化組成物の安定化効果を決定することができる。したがって、所与の安定化組成物の安定化効果は、１つの実施形態では、実施例に記載のように、０日目の採血直後の総ｃｃｆＤＮＡと、例えば室温で６日間保管した後の総ｃｃｆＤＮＡの比を決定することによって決定することができる。
【００９５】
１つの実施形態によると、本発明の少なくとも１つの化合物は、上で定義したように滅菌中にカスパーゼ阻害剤に対する防護効果を発揮することが可能である一方、同時に、安定化された試料中の検出可能な目的の細胞外核酸の量は実質的に減少させない濃度で含める。１つの実施形態では、防護用化合物を含む組成物を用いて試料を安定化した場合に、他は同一であるが防護用化合物を含まない組成物を用いて安定化した試料中で検出される目的の細胞外核酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％が検出される。細胞外核酸の量は、例えば、実施例において示すように、リアルタイムＰＣＲを使用し、絶対的なコピー数を決定して決定することができる。
【００９６】
本発明の化合物の２つ以上を含む組成物の調製も提供され、包含される。この場合、組成物は、含有される化合物それぞれを上に示した濃度で含んでよい。あるいは、上に示した濃度は、組成物中に含まれる全ての本発明の化合物の全体の濃度を指す。個々の化合物および化合物の組み合わせについての好適な濃度は、当業者が本明細書に提示する技術的な情報に従って決定することができる。実施例において示すように、本発明の化合物を組み合わせることにより、滅菌中の安定化組成物の防護を個々の化合物の使用と比較してさらに改善することができる。この有利な効果は、高い照射線量においてより明白になる傾向があり、比較的低い濃度の個々の化合物をそれぞれ使用した場合に既に達成された。図６および実施例の表７に示す例示的な組み合わせおよび濃度が、本明細書における使用に関して特に意図されている。
【００９７】
組成物を最初に固体形態で提供する場合、照射前に組成物を液体形態にすることができる。液体組成物は、少なくとも１つの化合物を上述の濃度で含んでよい。この実施形態に従って、固体組成物は、１つ以上の本発明の化合物を、溶媒和の際に前記１つ以上の化合物を上記および下記の濃度で含む液体組成物をもたらすのに十分な量で含む。
【００９８】
防護のために組成物中に含有させることができる本発明の個々の成分をここでさらに詳細に説明する。
【００９９】
１つの実施形態によると、ステップａ）において提供、例えば調製される組成物は、少なくとも１つのチオアルコールを含む。「チオアルコール」または「チオール」とは、本明細書で使用する場合、特に、Ｒｏｍｐｐ  Ｌｅｘｉｋｏｎ  Ｃｈｅｍｉｅ、第１０版、１９９９年、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて定義されているチオールまたはチオアルコールであってよい。
【０１００】
特に好ましいチオアルコールは、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオンである。本発明の目的に関して高度に好適であり、非常に好ましい成分は、Ｎ−アセチル−システインである。「Ｎ−アセチル−システイン」とは、本明細書で使用する場合、「Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン」であることが好ましい。したがって、「Ｎ−アセチル−システイン」とは、本明細書で使用する場合、化合物「Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン」を指すことが好ましい。したがって、本明細書において「Ｎ−アセチル−システイン」に言及する場合、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、それぞれの開示にも「Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン」が適用される。「Ｎ−アセチル−システイン」に言及するときはいつも、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが好ましい。Ｎ−アセチル−Ｄ−システインも使用することができる。Ｎ−アセチル−システインは、グルタチオンと同様に、チオアルコールである。本明細書で使用する場合、「Ｎ−アセチル−システイン」は、特に、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ  Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅｓ  Ｗｏｒｔｅｒｂｕｃｈ（２５８．  Ａｕｆｌａｇｅ、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）において定義されているＮ−アセチル−システインであってよい。
【０１０１】
Ｎ−アセチル−システインは、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物、特に、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈなどの改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物を、ガンマ線照射などの照射による滅菌中、効率的に防護することが判明した。同時に、Ｎ−アセチル−システインは、有利なことに、ｃｃｆＤＮＡなどの細胞外核酸集団の安定化には実質的に干渉しない。したがって、好ましい実施形態では、安定化組成物は、Ｎ−アセチル−システインを含む。Ｎ−アセチル−システインにより、さらに、弱酸性ｐＨなどの穏やかなｐＨの安定化組成物が可能になる。好適なｐＨ値は上に記載している。有利なことに、Ｎ−アセチル−システインを含む安定化組成物は、水性形態を含めた液体形態で照射および滅菌することができる。有利なことに、カスパーゼ阻害剤含有組成物の安定化性能を維持するために組成物が固体または凍結形態として照射される必要はなかった。
【０１０２】
安定化組成物は、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、または０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システインを含むことができる。好ましくは、組成物は、少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも０．３ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−システインを含む。０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌを含む組成物が特に好ましい。
【０１０３】
安定化組成物は、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システインを含むことができ、液体、好ましくは水性の形態で滅菌のために照射され得る。
【０１０４】
Ｎ−アセチル−システインは、特に、安定化組成物に含まれている１つ以上のカスパーゼ阻害剤の良好な防護をもたらす一方、同時に、下流の適用における安定化組成物の良好な性能を確実にすることが判明した。上述のＮ−アセチル−システイン濃度は良好に作用し、特に良好な結果がもたらされる。実施例において示すように、試験した全ての濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌ）のＮ−アセチル−システインにより、照射中の安定化組成物の優れた防護が付与された。同時に、Ｎ−アセチル−システインは、高い濃度であってさえ、その後の適用における安定化組成物の性能には干渉しなかった。
【０１０５】
カスパーゼ阻害剤含有組成物中０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまたは０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−システイン濃度が特に好ましい。かかる組成物により、滅菌の際に、照射／滅菌された安定化組成物に特に良好な保管性がもたらされることが判明した。特に、貯蔵寿命の最後に優れた安定性が観察された。これらの濃度を使用して、滅菌された安定化組成物の貯蔵寿命を有利に延長することができる。
【０１０６】
１つの実施形態によると、安定化組成物は、Ｎ−アセチル−システイン、ならびに必要に応じて、グルタチオン、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される１つ以上の化合物を含む。１つの実施形態によると、安定化組成物は、Ｎ−アセチル−システインを含み、グルタチオン、好ましくは還元型グルタチオン、アスコルビン酸、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６、および水溶性ビタミンＥ誘導体、好ましくはトロロックスのうちの１つ以上をさらに含んでよい。特に、組成物は、Ｎ−アセチル−システインを含んでよく、グルタチオン、好ましくは還元型グルタチオン、アスコルビン酸、および水溶性ビタミンＥ誘導体、好ましくはトロロックスのうちの１つ以上をさらに含んでよい。したがって、ステップａ）の安定化組成物が、Ｎ−アセチル−システインを含み、グルタチオン、好ましくは還元型グルタチオン、および／またはアスコルビン酸をさらに含むことも意図されている。１つの実施形態によると、組成物は、Ｎ−アセチル−システインおよびアスコルビン酸を含む。１つの実施形態によると、組成物は、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオン、好ましくは還元型グルタチオンを含む。上述の組み合わせの全てが、照射によって滅菌される１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物の防護に非常に有用であることが判明したが、Ｎ−アセチル−システイン単独でも優れた結果がもたらされることが判明した。Ｎ−アセチル−システインと、特にビタミンＢ６などのビタミンＢの組み合わせも意図されている。
【０１０７】
１つの実施形態によると、ステップａ）において提供される安定化組成物は、グルタチオンを含む。チオアルコールであるグルタチオン、特に還元型グルタチオンもまた、実施例において示すように、組成物を、照射による滅菌中、基本的にカスパーゼ阻害剤含有組成物の安定化性に負の効果を及ぼすことなく防護するのに好適である。グルタチオンは、還元型および酸化型の両方で存在する。還元型では、化合物に含まれるシステインのチオール基が還元当量を供与することができる。「グルタチオン」とは、本明細書で使用する場合、特に、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ  Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅｓ  Ｗｏｒｔｅｒｂｕｃｈ（２５８．  Ａｕｆｌａｇｅ、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）において定義されているグルタチオンであってよい。
【０１０８】
組成物は、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度のグルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオンを含むことができる。
【０１０９】
組成物は、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度のグルタチオン、好ましくは、還元形態のグルタチオンを含むことができ、液体、好ましくは水性の形態で照射され得る。
【０１１０】
安定化組成物中の還元型グルタチオンの量は、照射および／または滅菌中にグルタチオンの一部または全部が酸化される可能性があるので、このプロセス後に減少する可能性があることが当業者には理解されよう。したがって、上記の還元型グルタチオンの濃度は、特に、滅菌のために照射する前の組成物中の濃度を指す。
【０１１１】
実施例において示すように、グルタチオン、特に還元型グルタチオンは、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物の防護において非常に有効である。還元型のグルタチオンは安定化組成物に対して特に良好な防護効果を伝える。比較的低い濃度および穏やかなｐＨ条件、特に、弱酸性条件をこの実施形態において使用することができる。有利なことに、組成物を液体形態として照射を行い、滅菌することが可能であった。組成物の安定化性能を維持するために組成物が固体または凍結形態として照射される必要はなかった。実施例において示すように、０．０５ｍｇ／ｍｌという低いグルタチオン濃度でカスパーゼ阻害剤に対する防護効果が観察された。わずかに高い濃度、例えば、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも０．２ｍｇ／ｍｌなどでより明白な効果が観察された。０．５ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌの濃度により、特に良好な結果がもたらされた。
【０１１２】
実施例において示すように、アスコルビン酸などの水溶性ビタミンも、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物の防護において活性である。実施例により、水溶性ビタミンＢ６が１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物の防護において活性であることがさらに示される。したがって、ステップａ）において、防護のために少なくとも１つの水溶性ビタミンを含む安定化組成物を提供することができる。水溶性ビタミンの誘導体も同様に本明細書において意図されており、使用することができる。「水溶性ビタミンの誘導体」とは、本明細書で使用する場合、特に、それぞれのビタミンと同様にラジカルスカベンジャーとしての活性を有する誘導体であってよい。水溶性ビタミンは、１つの実施形態では、ビタミンＣおよびビタミンＢより選択される。水溶性ビタミンは、１つの実施形態では、アスコルビン酸およびビタミンＢより選択される。複数の実施形態では、ビタミンＢは、ビタミンＢ６である。ビタミンＢ６は、本明細書で使用する場合、特にピリドキシンを指す。したがって、本明細書に提示する「ビタミンＢ６」についての開示はいずれも、一般に、実施形態ピリドキシンに特に適用され、それを指す。したがって、本出願に記載するビタミンＢ６についての開示は全て、一般に、明記されていなくとも、好ましい実施形態ピリドキシンに特に適用され、特にそれを指す。複数の実施形態では、ビタミンＢ６は、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミンおよび／またはピリドキサールリン酸より選択することができる。
【０１１３】
水溶性ビタミンは、アスコルビン酸、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシン（ビタミンＢ３）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２（コバラミン）、ビオチンおよびパントテン酸より選択することができる。
水溶性ビタミンとしてアスコルビン酸を使用することが好ましい。アスコルビン酸は、次式：
【化１】
2019500023.tif 000003
によって表すことができる。
【０１１４】
「アスコルビン酸」は、本明細書で使用する場合、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−アスコルビン酸、Ｌ−イソアスコルビン酸、Ｄ−イソアスコルビン酸などの立体異性体を包含し得る。「アスコルビン酸」は、本明細書で使用する場合、特に、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ  Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅｓ  Ｗｏｒｔｅｒｂｕｃｈ（２５８．  Ａｕｆｌａｇｅ、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）において定義されているアスコルビン酸であってよい。アスコルビン酸の誘導体も本発明において同様に意図されており、使用することができることが理解されよう。「アスコルビン酸の誘導体」とは、本明細書で使用する場合、特に、アスコルビン酸と同様にラジカルスカベンジャーとしての活性を有する誘導体であってよい。
【０１１５】
解釈しやすいように、以下、その誘導体にも明確に言及することはせずに「水溶性ビタミン」と言及する。また、アスコルビン酸の誘導体に明確に言及することはせず、「アスコルビン酸」と言及する。しかし、全体を通して、水溶性ビタミンに関連する（例えば濃度範囲に関する）開示は、文脈により他の指示がなければ水溶性ビタミンの誘導体にも適用され、また、全体を通して、アスコルビン酸についての（例えば濃度範囲に関する）開示は、文脈により他の指示がなければ、アスコルビン酸の誘導体にも適用される。
【０１１６】
安定化組成物は、アスコルビン酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびパントテン酸より選択されることが好ましく、アスコルビン酸であることがさらに好ましい少なくとも１つの水溶性ビタミンを、２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含んでよい。複数の実施形態では、安定化組成物は、ビタミンＢ６などのビタミンＢを上述の濃度のうちの１つで含む。特に、ビタミンＢ６であることが好ましいビタミンＢは、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれてよい。ビタミンＢ６は既に約２ｍｇ／ｍｌの濃度などの比較的低い濃度で、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物を滅菌中に防護することが判明した。したがって、ビタミンＢ、特にビタミンＢ６を例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌまたはさらには０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの比較的低い濃度で使用することもできる。ビタミンＢ６などのビタミンＢを応じた低濃度で使用することはまた、より経済的でもある。
【０１１７】
組成物は、アスコルビン酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびパントテン酸より選択されることが好ましく、アスコルビン酸であることがさらに好ましい少なくとも１つの水溶性ビタミンを、２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含んでよく、また、液体形態、好ましくは水性形態で照射されることができる。複数の実施形態では、安定化組成物は、ビタミンＢ６などのビタミンＢを上述の濃度のうちの１つで含む。特に、ビタミンＢ６であることが好ましいビタミンＢは、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌまたは０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれてよい。
【０１１８】
安定化組成物は、２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸を含むことができる。
【０１１９】
組成物は、２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸を含むことができ、液体、好ましくは水性の形態で滅菌のために照射され得る。
【０１２０】
実施例において示すように、例えば、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌの多数の濃度のアスコルビン酸が、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物を、滅菌中、適用される広範囲の照射線量にわたって防護することが判明した。試験した濃度範囲内で、防護効果は、アスコルビン酸濃度が上昇するとともに上昇する傾向がある。これは、約５ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で最も明白であった。アスコルビン酸が、広い濃度範囲にわたって使用した場合に安定化組成物を滅菌中に防護することが判明したが、２０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度のアスコルビン酸を使用することが好ましい。特に好適なアスコルビン酸の濃度は、上記のように、０．５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、例えば、２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどにわたる濃度（例えば、２、４または５ｍｇ／ｍｌ）である。驚くべきことに、アスコルビン酸は、これらの比較的低い濃度において防護的であり、有利なことに、これにより、アスコルビン酸を弱酸性ｐＨなどの穏やかなｐＨで用いることが可能になることが判明した。有利なことに、組成物を液体形態として照射を行い、滅菌することが可能であった。驚くべきことに、組成物の安定化性能を維持するために、組成物が固体または凍結形態として照射される必要はなかった。さらに、アスコルビン酸を２０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で使用することにより、血漿中のｃｃｆＤＮＡの安定化に対するアスコルビン酸の阻害効果が有利に防止される。
【０１２１】
組成物は、アスコルビン酸を１つ以上の本発明のさらなる化合物と組み合わせて含んでよい。Ｎ−アセチル−システインについて論じた際に説明したように、カスパーゼ阻害剤を含む組成物は、防護のために、例えばアスコルビン酸およびＮ−アセチル−システインを含んでよい。同様に組成物は、アスコルビン酸およびグルタチオン、好ましくは還元型グルタチオンを含んでよい。例示的な組み合わせを図６および表７の例に示し、また、これは本発明において具体的に意図されている。
【０１２２】
実施例において示すように、ビタミンＥおよびその誘導体によっても、照射による滅菌中の１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物に対する防護効果がもたらされる。ビタミンＥおよびその誘導体、特に、トロロックスなどの水溶性誘導体も、例えばトロロックスによって媒介される防護の程度がＮ−アセチル−システイン、アスコルビン酸またはグルタチオンについて観察されるものよりも低いとはいえ、同様に防護活性を示す。ビタミンＤ、ビタミンＫおよびビタミンＡの水溶性誘導体などの、他の脂溶性ビタミンの水溶性誘導体も、本明細書において意図されている；誘導体は、特に、それぞれの脂溶性ビタミンと同様にラジカルスカベンジャーとしての活性を有し得る。
【０１２３】
「ビタミンＥ」は、本明細書で使用する場合、特に、Ｐｓｃｈｙｒｅｍｂｅｌ  Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅｓ  Ｗｏｒｔｅｒｂｕｃｈ（２５８．  Ａｕｆｌａｇｅ、Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８年）において定義されているビタミンＥであってよい。「ビタミンＥの誘導体」は、本明細書で使用する場合、特に、ビタミンＥと同様にラジカルスカベンジャーとしての活性を有する誘導体であってよい。「ビタミンＥの誘導体」とは、本明細書で使用する場合、特に、ラジカルスカベンジャーとしての活性を有する水溶性ビタミンＥの誘導体であってよい。水溶性ビタミンＥ誘導体の特に好ましい１つの例は、トロロックスである。トロロックスは、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸と表すことができる。
【０１２４】
したがって、ビタミンＥまたはその誘導体を含む組成物を調製することができる。組成物は、水溶性ビタミンＥ誘導体を含んでよい。水溶性ビタミンＥ誘導体はトロロックスであることが好ましい。本出願全体を通して、「ビタミンＥまたはその誘導体」に関する開示は、文脈により他の指示がなければ、特に、トロロックスを含めた水溶性ビタミンＥ誘導体に適用される。「ビタミンＥまたはその誘導体」に言及するときはいつも、特にトロロックスなどの水溶性ビタミンＥ誘導体が好ましい。
【０１２５】
ビタミンＥもしくはその誘導体、例えば、好ましくは水溶性ビタミンＥ誘導体、より好ましくはトロロックスは、特に、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で安定化組成物中で利用され得る。したがって、組成物は、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のトロロックスを含むことができる。
【０１２６】
少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＥもしくはその誘導体、好ましくは、水溶性ビタミンＥ誘導体、より好ましくはトロロックスを含むことができ、液体、好ましくは水性の形態で滅菌のために照射され得る。
【０１２７】
組成物は、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶性ビタミンＥ誘導体、好ましくは、トロロックスを含むことができ、液体、好ましくは水性の形態で滅菌のために照射され得る。実施例において示すように、約１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＥ誘導体により、照射中に安定化組成物の防護が付与されることが判明した。そこでは、ビタミンＥ誘導体であるトロロックスが試験された。
【０１２８】
それぞれの化合物について本明細書に開示されている濃度および濃度範囲は、２つ以上の化合物を組み合わせる場合にも使用することができる。例えば、２つ以上の化合物を組み合わせる場合、以下の表Ａによる範囲を使用することができる。Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオンおよびアスコルビン酸についての例示的な組み合わせおよび濃度範囲を図６および実施例の表７に示し、これらは本発明において具体的に意図されている。
【０１２９】
実施例から分かるように、組み合わせて使用される場合、既に比較的低い濃度の個々の化合物が、照射による滅菌中、防護的である。したがってこれらの化合物のうちの１つ以上を組み合わせる場合、例えば、Ｎ−アセチル−システインおよびアスコルビン酸のそれぞれについては約０．３ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌの濃度を使用することができ、グルタチオンについては例えば約０．１ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度範囲を使用することができる。
【０１３０】
ステップａ）において提供される安定化組成物中に含まれる本発明の例示的な好ましい化合物および有利な濃度範囲を以下の表に開示する。
【表Ａ】
2019500023.tif 000004
【０１３１】
ステップａ）において提供される安定化組成物中に含まれる本発明の例示的な好ましい化合物および有利な濃度範囲を以下の表にも開示する。
【表Ｂ】
2019500023.tif 000005
【０１３２】
ステップａ）において調製または提供される組成物のさらなる特徴
ステップａ）において提供される安定化組成物は、上記の少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤およびチオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物に加えて、さらなる成分を含んでよい。これらのさらなる成分は、特に、細胞外核酸集団に対する安定化効果を支持するために含めることができる。
【０１３３】
ステップａ）において提供、例えば調製することができる組成物に含めることができ、有利である、さらなる成分を下に記載する。当然、特に特徴ｉ．およびｉｉ．に関連する上記の好ましい実施形態が適用され、本明細書で提示する見出しおよびサブセクションは、単に解釈を容易にするのに役立つものである。
【０１３４】
１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む、細胞外核酸集団の安定化に好適な有利な組成物は、ＷＯ２０１３／０４５４５７Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８０Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８２Ａ１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９、ＷＯ２０１４／０４９０２２Ａ１、ＷＯ２０１３／０４５４５８Ａ１およびＷＯ２０１４／１４６７８１Ａ１に開示されている。参照されるこれらの参考文献には、細胞外核酸集団を安定化するための安定化組成物がいくつか記載されている。記載されている安定化組成物の細胞外核酸安定化効果は、カスパーゼ阻害剤または安定化のためにカスパーゼ阻害剤と併せて使用することができる１つ以上のさらなる化合物のいずれかの使用に基づく。ＷＯ２０１４／０４９０２２およびＷＯ２０１４／１４６７８１にも、細胞内核酸の安定化に好適な（例えば、細胞内ＤＮＡおよび／または細胞内ＲＮＡなど、特に、遺伝子発現プロファイルの安定化に好適な）、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物が教示されている。さらに、これらの出願には、細胞形態および／または細胞表面特性などの、安定化された細胞のその後の分析を可能にする安定化組成物が開示されている。これらの参考文献に記載されている、そこで開示されている１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物は、参照により本明細書に組み込まれ、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９に記載されている安定化組成物が特に好ましい。これらのカスパーゼ阻害剤含有組成物は、本発明の方法を用いて滅菌することができる。したがって、ステップａ）において、上述の参考文献のうちの１つに開示されている、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む組成物を提供することが好ましく、ここで、組成物は、チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン、グルタチオンは還元型であることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物をさらに含み、Ｎ−アセチル−システインが非常に好ましい。ＷＯ２００８／１４５７１０に開示されている安定化組成物（例えば、ゲノム、トランスクリプトームおよびプロテオームの安定化を可能にする）とカスパーゼ阻害剤を組み合わせてカスパーゼ阻害剤含有組成物を提供する場合にも同じことが当てはまり、ここで、組成物は、記載のように、チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン、グルタチオンは還元型であることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物をさらに含み、Ｎ−アセチル−システインが非常に好ましい。
【０１３５】
したがって、ステップａ）において提供、例えば調製される安定化組成物は、以下：
ａ）抗凝固薬および／またはキレート剤；
ｂ）ポリ（オキシエチレン）ポリマー；および／または
ｃ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド
のうちの１つ以上をさらに含んでよい。
【０１３６】
抗凝固薬、キレート剤、ポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび第一級、第二級または第三級アミドの好適な濃度は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９に開示されている。
【０１３７】
その後に、安定化組成物中に存在する場合の個々の薬剤の例示的な好適な濃度が示されている。
【０１３８】
安定化組成物は、液体であり得る。示される濃度は、血液試料の安定化に特に好ましい。例えば、０．５ｍｌから２．５ｍｌ、０．５ｍｌから２ｍｌ、好ましくは１ｍｌから２ｍｌまたは１ｍｌから１．５ｍｌの液体の安定化組成物を使用することができる。下に示す濃度の安定化剤を含むかかる安定化組成物を、例えば１０ｍｌ血液を安定化するために使用することができる。
【０１３９】
例えば、組成物は、抗凝固薬、好ましくはキレート剤、さらに好ましくはＫ２ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡをさらに含んでよい。この実施形態は、安定化すべき試料が血液である場合に特に有用である。１つの実施形態によると、前記組成物は、抗凝固薬またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡを、９．５ｍＭから１１００ｍＭ、２０ｍＭから７５０ｍＭ、５０ｍＭから６００ｍＭ、７５ｍＭから５５０ｍＭ、１００ｍＭから５００ｍＭ、１２５ｍＭから４５０ｍＭ、１３０ｍＭから３００ｍＭおよび１４０ｍＭから２５０ｍＭより選択される濃度で含む。１つの実施形態によると、濃度は１００ｍＭから２５０ｍＭまでである。
【０１４０】
１つの実施形態では、ステップａ）において提供される組成物は、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む。参照されるＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９に詳細に記載されているように、ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、細胞外核酸の安定化が意図されている場合に有利な安定化性を示す。これらは、特に、カスパーゼ阻害剤と組み合わせて使用する場合に有効であり、安定化効果を改善することができる。したがって、滅菌されるべき安定化組成物がポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含むことが有利である。組成物は、以下：
ａ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコール、好ましくは非置換ポリエチレングリコールである；
ｂ）前記組成物が、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；
ｃ）前記組成物が、１５００未満の分子量を有する少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、さらに好ましくは、前記分子量は、１００から８００、１５０から７００、２００から６００および２００から５００より選択される範囲に存する；
ｄ）前記組成物が、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマー、および、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；ならびに／または
ｅ）前記組成物が、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、１５００から５００００、１５００から４００００、２０００から３００００、２５００から２５０００、３０００から２００００、３５００から１５０００および４０００から１２５００より選択される範囲に存する分子量を有し、かつ／または、前記低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、１０００以下の分子量を有し、好ましくは、前記分子量は、１００から１０００、１５０から８００、１５０から７００、２００から６００、２００から５００および２００から４００より選択される範囲に存する
の特徴の１つ以上を有し得る。
【０１４１】
１つの実施形態によると、安定化組成物は、好ましくはポリエチレングリコールである高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを０．４％から３５％（ｗ／ｖ）、０．８％から２５％（ｗ／ｖ）、１．５％から２０％（ｗ／ｖ）、２．５％から１７．５％（ｗ／ｖ）、３％から１５％（ｗ／ｖ）、４％から１０％（ｗ／ｖ）および３％から５％（ｗ／ｖ）より選択される濃度で含む。好適な濃度は、当業者が決定することができ、とりわけ、高分子量ポリ（オキシエチレン）グリコールを、単独で使用するかさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、例えば低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと併用するか、およびある特定の量の細胞含有試料を安定化するために使用する安定化組成物の量、例えば、体積に依存し得る。高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを単独で使用する場合に好適な濃度範囲の例としては、２．２％から３３．０％（ｗ／ｖ）、４．４％から２２．０（ｗ／ｖ）％、６．６％から１６．５％（ｗ／ｖ）および８．８％から１３．２％（ｗ／ｖ）より選択される濃度が挙げられるが、これらに限定されない。高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーと併用する場合に好適な濃度範囲の例としては、０．４％から３０．７％、０．８％から１５．３％、１％から１０％、１．５％から７．７％、２．５％から６％、３．１％から５．４％および３％から４％より選択される濃度が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
１つの実施形態によると、前記安定化組成物は、ポリエチレングリコールであることが好ましい低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを、０．８％から９２．０％、３．８％から７６．７％、１１．５％から５３．７％、１９．２％から３８．３％、２０％から３０％および２０％から２７．５％より選択される濃度で含む。１つの実施形態によると、濃度は、１１．５％から３０％までである。上述の濃度は、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが液体であるかそうでないかに応じて（ｗ／ｖ）または（ｖ／ｖ）を指す。ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９の実施例において実証されているように、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーは、特に、そこに記載されている１つ以上のさらなる安定化剤と組み合わせて使用した場合に、細胞含有試料の安定化を効率的に支持することができる。
【０１４３】
１つの実施形態によると、ステップａ）において調製または提供される安定化組成物は、少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミドを含む。参照される出願ＷＯ２０１３／０４５４５７Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８０Ａ１、ＷＯ２０１４／１４６７８２Ａ１、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９、ＷＯ２０１４／０４９０２２Ａ１、ＷＯ２０１３／０４５４５８Ａ１またはＷＯ２０１４／１４６７８１Ａ１において実証されているように、これらのアミドのうちの１つ以上を使用することにより、細胞外核酸集団の安定化が支持される。ＷＯ２０１４／０４９０２２およびＷＯ２０１４／１４６７８１にも、かかるアミドが細胞内核酸（特に、遺伝子発現プロファイル）の安定化に好適であることが教示されている。これらのアミドのうちの１つ以上を、安定化のために、カスパーゼ阻害剤に加えて、好ましくは、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーに加えて使用することができる。
【０１４４】
１つの実施形態によると、したがって、組成物は、式１
【化２】
2019500023.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基、好ましくはアルキル残基から選択され、ならびにＲ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
に従う１つ以上の化合物を含む。
【０１４５】
安定化のために、式１に従う１つ以上の化合物の組み合わせも使用することができる。Ｒ１が、アルキル残基である複数の実施形態では、Ｒ１については１または２の鎖長が好ましい。式１に従う化合物のＲ２および／またはＲ３は同一であり、または異なり、水素残基および炭化水素残基より選択され、好ましくは、アルキル残基である。１つの実施形態によると、Ｒ２およびＲ３は両方とも水素である。１つの実施形態によると、Ｒ２およびＲ３のうちの一方は水素であり、他方は炭化水素残基である。１つの実施形態によると、Ｒ２およびＲ３は、同一のまたは異なる炭化水素残基である。炭化水素残基Ｒ２および／またはＲ３は、互いに独立して、アルキル（短鎖アルキルおよび長鎖アルキルを含む）、アルケニル、アルコキシ、長鎖アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、アルキルシリル、アルキルシリルオキシ、アルキレン、アルケンジイル、アリーレン、カルボキシレートおよびカルボニルを含む群より選択することができる（これらの残基に関しては、例えば、本明細書に参考として援用されるＷＯ２０１３／０４５４５７、２０〜２１頁を参照）。Ｒ２および／またはＲ３の鎖長ｎは、特に、値１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０を有することができる。１つの実施形態によると、Ｒ２およびＲ３は、１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましい１〜２の炭素鎖長を有する。１つの実施形態によると、Ｒ２および／またはＲ３は、アルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基である。好ましくは、式１に従う化合物は、カルボン酸アミドであり、したがって、Ｒ４は酸素である。それは、第一級、第二級または第三級カルボン酸アミドであることができる。
【０１４６】
一つの実施形態において、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−カルボン酸アミドである。好ましいＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基は、上に記載してある。式１に従うそれぞれの化合物の使用には、さらに、細胞含有試料中の細胞内核酸、例えば、特にＲＮＡ、例えばｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ転写産物を安定化することができるという利点がある。細胞内核酸、特に、遺伝子転写産物レベルのこのさらなる安定化は、例えば、含有される細胞における標的転写産物または転写産物プロファイルの後の分析を可能にするので、有利である。１つの実施形態によると、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ，Ｎ−ジエチルホルムアミドから成る群より選択される。Ｒ４として酸素ではなく硫黄を含むそれぞれのチオ類似体も好適である。好ましくは、ＧＨＳ分類に従って毒性物質ではない少なくとも１つの式１に従う化合物が使用される。１つの実施形態によると、式１に従う化合物は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドである。
【０１４７】
また、例えば、組成物は、式１’
【化３】
2019500023.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、さらに好ましいメチル残基であり、Ｒ２およびＲ３は、線状または分岐した様式で配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する同一のまたは異なる炭化水素残基であり、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基である）
に従う１つ以上の化合物を含んでよい。
【０１４８】
式１’は、上記の式１に包含され、それと比較するとＲ２およびＲ３が同一のまたは異なる炭化水素残基である（水素ではない）という点で限定される。他の点では、残基Ｒ１からＲ４は、式１について上記したものに対応し、それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。
【０１４９】
好ましくは、組成物は、ブタンアミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを含む。
【０１５０】
１つの実施形態によると、安定化組成物は、１つ以上の第一級、第二級または第三級アミドを、０．４％から３８．３％、０．８％から２３．０％、２．３％から１１．５％、３．８％から９．２％、５％から１５％および７．５％から１２．５％より選択される濃度で含む。上述の濃度は、第一級、第二級または第三級アミドが液体であるかそうでないかに応じて（ｗ／ｖ）または（ｖ／ｖ）を指す。論じたように、第一級、第二級または第三級カルボン酸アミドが好ましい。
【０１５１】
組成物は、ＤＭＳＯをさらに含んでよい。例えば、組成物は、０．０５％から２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．１％から１．８％、または０．２％から１．４％ＤＭＳＯを含んでよい。ＤＭＳＯは、好適な溶媒であり、照射、より具体的にはガンマ線照射中の安定化組成物の防護を支持することが判明した。この効果は、特に、ＤＭＳＯをトロロックスと組み合わせて使用した場合に観察されたが、それに限定されるものではなかった。
【０１５２】
上で説明した通り、組成物は、最初に固体形態で提供することができる。その後、照射前に液体形態にすることができる。固体組成物は、溶媒和した際に、前記カスパーゼ阻害剤、前記１つ以上の化合物および必要に応じてさらなる成分を上記および下記の濃度で含む液体組成物をもたらすために十分な量で、カスパーゼ阻害剤、１つ以上の本発明の化合物および必要に応じて本明細書で論じたさらなる成分を含んでよい。
【０１５３】
非限定的な例示的な実施形態に従って、０．００１％から０．０１％（ｗ／ｗ）カスパーゼ阻害剤、例えば、０．００５％から０．００９％（ｗ／ｗ）カスパーゼ阻害剤などを含む固体組成物を調製することができる。この例示的な実施形態による組成物は、約０．０５から約０．５％（ｗ／ｗ）、例えば、０．１％から０．４％（ｗ／ｗ）などの本発明の化合物、例えば、チオアルコール、特にＮ−アセチル−システインを含んでよい。さらなる成分を上記および下記の例示的な固体組成物に含めることができる。存在する場合、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの例示的な濃度は、例えば、３．２５％から１０％（ｗ／ｗ）、例えば、５％から８．５％（ｗ／ｗ）などである。存在する場合、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの例示的な濃度は、例えば、２０％から７０％（ｗ／ｗ）、例えば、４０％から６５％（ｗ／ｗ）などである。存在する場合、第一級、第二級または第三級アミドの例示的な濃度は、例えば、１５％から３０％（ｗ／ｗ）、例えば、１８％から２５％（ｗ／ｗ）などである。存在する場合、抗凝固薬および／またはキレート剤の例示的な濃度は、例えば、６％から２４％（ｗ／ｗ）、例えば、８％から１５％（ｗ／ｗ）などである。
【０１５４】
好ましい滅菌すべき組成物は、
ａ）１つ以上のカスパーゼ阻害剤、
ｂ）チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたは上記のその誘導体より選択される１つ以上の化合物（組成物はＮ−アセチル−システインを含むことが好ましい）
ｃ）安定化剤として、好ましくは、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー；
を含み、ならびに必要に応じて、
ｄ）第１のポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する、好ましくは高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｅ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド；
ｆ）抗凝固薬および／またはキレート剤
から成る群より選択される１つ以上、好ましくは２つ以上のさらなる添加剤
を含む。
【０１５５】
安定化組成物は、本発明による化合物のうちの１つ以上を、特徴ｉｉを論じる際には上に開示した濃度で、さらに好ましくは上の表Ａに開示した濃度で含むことが好ましい。安定化組成物は、上で表Ｂに開示した化合物のうちの１つ以上を含んでよい。Ｎ−アセチル−システインの使用が特に好ましい。
【０１５６】
それぞれの安定化組成物は、細胞含有生体試料、例えば血液、血漿および／または血清の、前記試料中に含まれている細胞および細胞外核酸集団を安定化することによる安定化に特に有効である。細胞含有生体試料に含有されている細胞外核酸集団は、安定化期間にわたって、生体試料を前記安定化組成物と接触させた時点でそれが示した状態に実質的に保存される。例えば、本実施例およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９の実施例によって証明するように、ゲノムＤＮＡおよび他の細胞内核酸の放出が有意に低減される。それぞれに安定化された試料から単離される細胞外核酸は、非安定化試料から単離される細胞外核酸と比較して、細胞内核酸、特に断片化ゲノムＤＮＡでの有意に少ない汚染を含む。それぞれの安定化組成物は、安定化された試料、例えば血液の、室温での数日間の保管および／または取り扱い、例えば配送を、その試料（それぞれその試料に含有されている細胞外核酸集団）の質を実質的に損なわせることなく、可能にする。
【０１５７】
さらに好ましい滅菌すべき組成物は、
ａ）１つ以上のカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましい改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、さらに好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＢｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択されるカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ；
ｂ）チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン（ビタミンＢ６またはアスコルビン酸であることが好ましい）、およびビタミンＥまたは上記のその誘導体より選択される１つ以上の化合物（組成物は、Ｎ−アセチル−システインを含むことが好ましい）、
ｃ）安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ならびに、必要に応じて、１つ以上、好ましくは２つの、
ｄ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド；
ｅ）抗凝固薬および／またはキレート剤
から成る群より選択されるさらなる添加剤
を含む。
【０１５８】
安定化組成物は、本発明による化合物のうちの１つ以上を、特徴ｉｉを論じる際には上に開示した濃度で、さらに好ましくは上の表Ａまたは表Ｂに開示した濃度で含むことが好ましい。Ｎ−アセチル−システインの使用が特に好ましい。
【０１５９】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０１６０】
優れた安定化性および滅菌性を有する好ましい安定化組成物の別の例は、
ａ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ；
ｂ）Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン（好ましくは、還元形態）および／またはアスコルビン酸、好ましくはＮ−アセチル−システイン、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン；
ｃ）少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｄ）式１に従う１つ以上の化合物（組成物は、ブタンアミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを含むことが好ましい）；
ｅ）使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｆ）必要に応じて、抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
を含む。
【０１６１】
優れた安定化性および滅菌性を有する好ましい安定化組成物の別の例は、
ａ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、さらに最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ；
ｂ）Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン（好ましくは、還元形態）および／またはアスコルビン酸、好ましくはＮ−アセチル−システイン、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン；
ｃ）安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｄ）式１に従う１つ以上の化合物（組成物は、ブタンアミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミドを含むことが好ましい）；
ｅ）必要に応じて、抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
を含む。
【０１６２】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０１６３】
ステップａ）において提供される安定化組成物は、以下：
ａ）細胞を安定化することおよび細胞含有生体試料に含有されている細胞から試料の無細胞部分へのゲノムＤＮＡの放出を低減させることが可能である；
ｂ）安定化された試料中に存在する核酸、特にゲノムＤＮＡ、の分解を低減させることが可能である；
ｃ）安定化された生体試料に含有されている細胞に由来するゲノムＤＮＡでの試料に含まれている細胞外ＤＮＡ集団の汚染を低減させるもしくは防止することが可能である；
ｄ）安定化された生体試料に含有されている細胞に由来する細胞内核酸での試料に含まれている細胞外核酸集団の汚染を低減させるもしくは防止することが可能である；
ｅ）安定化組成物が、添加剤を、前記添加剤が細胞溶解を誘導もしくは促進する濃度で含まない；
ｆ）安定化組成物が、タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤、例えばホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤を含まない；
ｇ）安定化組成物が、毒性物質を含まない；
ｈ）細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を冷蔵せずに、好ましくは室温で、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日もしくは少なくとも６日より選択される期間、安定化することが可能である；ならびに／または
ｉ）組成物が、好ましくは血液である安定化すべき細胞含有試料を含まない；
の特徴の１つ以上を有し得る。
【０１６４】
特に、組成物は、タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まないことが好ましい。タンパク質−ＤＮＡ架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤は、例えば、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤である。これにより、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド放出剤などの架橋試薬の使用を伴う公知の現行技術の安定化試薬および方法に勝る重要な利点がもたらされる。架橋試薬は、核酸分子間のまたは核酸とタンパク質の間の分子間共有結合または分子内共有結合を引き起こす。この効果により、複雑な生体試料からの精製または抽出後のかかる安定化され部分的に架橋した核酸の回収率の低下が導かれる。例えば、全血試料中の循環核酸の濃度は既に比較的低いので、かかる核酸の収率をさらに低下させるあらゆる措置を回避すべきである。これは、悪性腫瘍に由来するまたは妊娠第一三半期の発育中の胎児からの非常に希少な核酸分子を検出および分析する場合に特に重要であり得る。したがって、滅菌された安定化組成物にホルムアルデヒド放出剤が含まれず、それぞれさらに安定化に使用されないことが好ましい。したがって、１つの実施形態によると、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出剤などの架橋剤は安定化組成物に含まれず、それぞれさらに安定化に使用されない。さらに、記載したように、安定化組成物は、例えばカオトロピック塩などの、有核細胞または一般の細胞の溶解を誘導するいかなる添加剤も含まないことが好ましい。
【０１６５】
カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、ジメチルプロピオンアミド、ＰＥＧ、Ｋ２ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡおよび上記の表Ａによる１つ以上の化合物を含む組成物は、非常に好適であり、優れた滅菌性ならびに安定化性を有する。カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、ジメチルプロピオンアミド、ＰＥＧ、Ｋ２ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡおよび上記の表Ｂによる１つ以上の化合物を含む組成物についても同じことが当てはまる。組成物は、Ｎ−アセチル−システインを含むことが最も好ましい。アスコルビン酸を含む組成物およびグルタチオン（好ましくは還元型）を含む組成物も好ましい。トロロックスも、滅菌中の防護を付与することが判明した。しかし、他の化合物がさらに好ましい。
【０１６６】
論じたように、複数の実施形態では、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物は、細胞内核酸、特に、細胞内ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）および／または細胞内ＲＮＡの安定化にも好適である。カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物は、特に、細胞内ＲＮＡの安定化に好適であり得、好ましくは、含有されている細胞の遺伝子転写プロファイルの安定化に好適である。したがって、それぞれ安定化された試料から単離された細胞内核酸は、例えば、遺伝子発現プロファイリングおよび安定化された試料中のインビボ転写レベルの正確な表示を必要とする他の分析方法も非常に好適である。さらに、有利なことに、かかる安定化により、所望であれば、同じ安定化された試料から、安定化された細胞外核酸と安定化された細胞内核酸を別々に単離することが可能になる。それぞれの組成物は、例えば、少なくとも１つの第一級または第二級カルボン酸アミドおよび／または少なくとも１つの第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド（例えば、ＷＯ２０１４／０４９０２２およびＷＯ２０１４／１４６７８１を参照されたい）を含んでよい。試料の安定化後、細胞内ＲＮＡを分解から防護し、さらに、含有されている細胞の遺伝子転写プロファイルの変化を阻害する。したがって、安定化により、特に、インビトロにおける分解が低減され、遺伝子誘導が最小限になる。含有されている細胞の遺伝子転写レベルの安定化は、新しい転写物の生成および安定化された試料中に存在する転写物の分解が非安定化試料と比較して阻害され、それにより、安定化されると、含有されている細胞の遺伝子転写プロファイルが実質的に「凍結」されるので、有利である。したがって、安定化は、トランスクリプトームを、転写レベルをそれらが試料採集および安定化時に示していた状態に維持することによって安定化するのにも好適である。トランスクリプトームという用語は、特に、１つの細胞または細胞の集団において産生されるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および、ｍｉＲＮＡなどの他の非コードＲＮＡを含めた、全てのＲＮＡ分子のセットを指す。複数の実施形態では、血液試料などの細胞含有生体試料を、少なくとも３日間、転写レベルの実質的な変化を伴わずに安定化することができる。遺伝子転写プロファイルは、特に、ＲＮＡの分解を低減させること、および、特に遺伝子誘導または下方制御などの遺伝子発現の変化を最小限にすることによって安定化される。それにより、採集時に存在していたインビボ遺伝子発現プロファイル、それぞれ安定化が保存される。さらに、試料採集、それぞれ試料安定化時に、ＲＮＡの品質および完全性を維持し、それにより、インビボ転写レベルの正確な表示をもたらすことができる。安定化の際のインビボ遺伝子転写プロファイルの保存により、例えば、それぞれ安定化された試料を使用して、遺伝子発現プロファイリングまたは転写レベルの正確な表示を必要とする他の分析方法を実施することが可能になる。しかし、望ましくはあるが、多くの場合、全ての転写レベルが安定化されるまたは同等に良好に安定化される必要はない。遺伝子転写プロファイルを安定化する先行技術でも通例であるように、特定のまたは新しい標的転写物についての安定化特性、したがって性能特性を検証すべきである。遺伝子転写プロファイルまたは特定の転写レベルの安定化が達成されたことは、例えば、遺伝子転写プロファイルの安定化を分析するために確立されたマーカー遺伝子に基づいて決定することができる。１つの実施形態によると、含有されている細胞の遺伝子転写プロファイルまたは転写レベルの安定化により、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８およびｐ５３より選択される１つ以上、好ましくは２つ以上のマーカー遺伝子が、安定化されたら少なくとも１２時間にわたって、少なくとも２４時間にわたってまたは少なくとも４８時間にわたって安定化されている。これらのマーカー遺伝子は、保管中、非常に不安定な転写物をもたらすと識別され、したがって、適切な安定化の不在下では、試料採集後に上方制御または下方制御される。したがって、これらの遺伝子の転写レベルは、遺伝子転写レベルの安定化が達成されたかどうかを分析するためのマーカーとして好適である。安定化効果は、実施例に記載のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して分析することができる。１つの実施形態によると、これらのマーカー遺伝子のうちの１つ以上の転写レベルは、Ｔ０（安定化点）と安定化期間の最後との間で１．５  ＣＴ値より大きくは変化しない、好ましくは１．２５  ＣＴ値より大きく変化しない、さらに好ましい１  ＣＴ値より大きく変化しない。それぞれの安定化効果は、少なくとも１２時間にわたって、少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、または少なくとも９６時間にわたって達成されることが好ましい。それぞれの安定化特性は、少なくともマーカー遺伝子ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ８およびＩＬ−１ベータで、好ましくは上述のマーカー遺伝子の全てで達成されることが好ましい。Ｗ２０１４／０４９０２２およびＷ２０１４／１４６７８１において実証されているように、第一級および／または第二級カルボン酸アミドなどの種々のアミドはそれぞれの安定化性能を達成する。
【０１６７】
複数の実施形態では、滅菌された安定化組成物は、安定化すべき試料に含有されている細胞の特徴を保存することができ、例えば、含有されている細胞の細胞表面特性および／または細胞形態などが保存される。細胞は、安定化に起因してインタクトなままになる。これにより、例えば、安定化期間後に、安定化された試料から細胞を分離することが可能になり、安定化された試料から単離された細胞は、分析に好適である。例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡなどの細胞内核酸を、含まれている細胞から単離し、分析することができる。さらに、安定化された試料中の細胞の保存により、細胞を選別または捕捉する可能性、さらには、例えば、そのあと特異的に分析することができる腫瘍細胞などの特定の細胞を富化する可能性が開かれる。例えば、循環する腫瘍細胞を単離することができ、それらの遺伝子発現プロファイルを分析することができる。さらに、得られる細胞を特徴付けるために、細胞形態および／または細胞マーカー、特に、細胞表面マーカーを分析することができる。さらに、細胞内核酸を前記富化された特定の細胞から単離することができる。例えば、ＲＮＡを前記細胞から単離することができる。本明細書に記載の安定化組成物の転写レベル安定化性により、単離されたＲＮＡを遺伝子発現プロファイリングおよび他の重要な分析に使用することが有利に可能になる。したがって、かかる安定化は、細胞を富化した後に富化された細胞から核酸を抽出することを可能にし、それにより、例えば、細胞含有試料中、例えば血液試料中の循環する腫瘍細胞の希少な事象が検出される機会が増大するので、例えば、がんまたは他の疾患の分子診断に有利である。これにより、試料中の特定のバイオマーカー、特に、希少なバイオマーカーが識別される機会も増大する。１つの実施形態によると、細胞の形態は、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間およびさらに好ましい少なくとも４８時間であることが好ましい安定化期間中、保存される。これにより、含有されている細胞をそれらの形態に基づいて分析し、必要に応じて、特徴付けることが可能になる。１つの実施形態によると、有核細胞の形態が保存される。１つの実施形態によると、滅菌された安定化組成物を使用した場合、血液試料に含有されているリンパ球の形態が安定化中、保存される。１つの実施形態によると、細胞の細胞表面エピトープが保存される。１つの実施形態によると、ＣＤタンパク質などの細胞表面タンパク質が保存される。細胞表面エピトープおよび細胞表面タンパク質の保存は、含有されている細胞をこれらの細胞表面特性に基づいて特徴付けることおよび／または単離することが可能になるので、利点である。特に、細胞表面上に存在する腫瘍マーカーの分析または前記マーカーに基づいて特定の細胞を単離することが可能になる。その目的のための好適な安定化組成物は、例えば、参照されるＷＯ２０１４／０４９０２２およびＷＯ２０１４／１４６７８１に記載されている。
【０１６８】
複数の実施形態では、使用される安定化組成物は、プロテオームの安定化に好適である。
【０１６９】
ステップｂ）滅菌のために組成物を照射するステップ
方法は、ステップｂ）において、滅菌のために安定化組成物を照射することをさらに含む。上で説明した通り、組成物を生体試料と接触させる前に、組成物を照射する。目的は、例えば試料を滅菌された組成物と接触させることによって生体試料中の細胞外核酸集団を安定化するために使用することができる、滅菌された、カスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物を提供することである。
【０１７０】
いくつかの照射形態が好適であり、適用することができる。組成物およびデバイスの滅菌に好適な照射形態は当業者に公知である。例えば、イオン化照射を使用することができ、組成物およびデバイスの滅菌に好適なイオン化形態の照射も同様に当業者に公知である。イオン化照射の例は、ガンマ線照射、電子ビーム照射、Ｘ線およびイオン化紫外線放射である。本発明を実施するために、ガンマ線照射、電子ビーム照射およびＸ線が好ましい；ガンマ線照射およびＸ線がさらに好ましい。ガンマ線照射による照射が最も好ましい。
【０１７１】
ガンマ線照射線量は、キログレイ（ｋＧｙ）単位で測定され、これは、吸収された放射線のエネルギーを定量化するものである。１グレイは、１キログラムの物質による１ジュールの放射線エネルギーの吸収（１ｋＧｙ＝１ジュール／グラム）である。
【０１７２】
組成物は、５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、例えば、約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙまたは約１５ｋＧｙから約２５ｋＧｙなどの照射線量で照射されることができる。約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの照射線量での照射により、照射を受けた組成物の安定化性の維持をさらに支持する、比較的穏やかな照射条件の利点がもたらされる。約１５ｋＧｙから約２５ｋＧｙの照射線量での照射も同様に良好に実行可能であり、特に、費用効率が高く、これは大規模生産に関して重要な利点である。組成物を、ガンマ線照射を約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙまたは約１５ｋＧｙから約２５ｋＧｙの照射線量で照射することができる。組成物を、ガンマ線照射を５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、例えば、約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙまたは約１５ｋＧｙから約２５ｋＧｙなどの照射線量で照射することができる。
【０１７３】
照射線量を広範囲の照射時間にわたって適用することができる。照射時間は安定化溶液の照射に関して重大なパラメータではないことが判明したが、実用的観点および経済的観点から、比較的短い照射時間を選択することが好ましい場合がある。当業者は、適切な照射時間の選択に詳しい。例示的な範囲は、１秒から１時間、１秒から３０分、２秒から１０分、または５秒から１分を含む。
【０１７４】
一般には、組成物は、組成物が確実に滅菌されるのに十分に高い照射線量で照射される。
【０１７５】
「無菌性」または「滅菌された」とは、本明細書で使用する場合、特に、滅菌後の製品において生存可能な微生物の確率によって定義することができる。この確率は、無菌性保証水準（ＳＡＬ）と称することができる。例として、医療デバイスの滅菌に関しては１０−６のＳＡＬが頻繁に使用される。１０−６のＳＡＬとは、本明細書で使用する場合、特に、滅菌後に、非無菌性の単位、例えば、非無菌性の組成物またはデバイスなどが判明する確率が１，０００，０００分の１であることを意味し得る。「無菌性」または「滅菌された」とは、本明細書で使用する場合、特に、ＳＡＬが１０−４以下、さらに好ましくは１０−５以下、最も好ましくは１０−６以下であることを指す。１つの実施形態によると、「無菌性」または「滅菌された」とは、「生存可能な微生物を含まない」ことを示す。
【０１７６】
滅菌プロセスにより、選択されたＳＡＬが慣用的に送達されることを実証するための適切な検証方法は当業者に公知であり、照射に関しては、例えば、ＡＮＳＩ／ＡＡＭＩ／ＩＳＯ  １１１３７：２００６に詳述されている。
【０１７７】
したがって、照射による滅菌の結果、組成物またはデバイスの無菌性保証水準（ＳＡＬ）を１０−４以下、さらに好ましくは１０−５以下、最も好ましくは１０−６以下にすることができる。照射は、ＩＳＯ標準ＩＳＯ１１１３７−１：２００６、ＩＳＯ１１１３７−２：２０１２、および／またはＩＳＯ１１１３７−３：２００６の要件を満たすことができる。
【０１７８】
好ましい実施形態に従って、無菌性は、５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、例えば、約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙまたは約１５ｋＧｙから約２５ｋＧなどの照射線量での照射によって達成され、約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙが特に好ましく、照射は、ガンマ線照射によるものであることが好ましい。
【０１７９】
照射される組成物の形態は限定されない。したがって、組成物は、例えば、固体または液体形態として照射されることができる。しかし、本明細書に記載の実施形態の全てについて、滅菌のために照射する組成物は、液体形態、好ましくは水性形態であることが好ましい。
【０１８０】
Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物は、液体、特に、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含み、特に、１つ以上のペプチド性カスパーゼ阻害剤を含む水性安定化組成物防護において特に活性であることが判明した。先行技術において（例えば、医薬分野で）液体組成物は組成物の機能を損なわずに滅菌するのが難しいことが頻繁に判明しているので、これは驚くべきことである。生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む組成物は、液体、特に水性の形態として照射されることが望ましい。これにより、都合よく取り扱い、生体試料、特に、血液、血漿または血清などの液体生体試料と混合することができる滅菌された安定化組成物を提供することが可能になる。
【０１８１】
組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射される場合、最初に、ステップａ）において、組成物を固体形態で提供、例えば、調製し、その後、それを好適な溶媒に溶解させて液体、好ましくは水性組成物を提供し、その後、滅菌のため照射することが可能である。これは、例えば、ステップｂ）の前またはステップｂ）中に組成物を溶解させることによって行うことができる。
【０１８２】
１つの実施形態によると、安定化組成物は、固体ではない状態で照射される。１つの実施形態によると、安定化組成物は、凍結していない状態で照射される。
【０１８３】
少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物は、容器などの試料採集デバイス中で滅菌することができる。容器は、チューブ、さらに好ましくは採血チューブであってよい。容器は、一般には、照射に好適な材料から成る。例えば、採血チューブなどの容器は、ポリエチレンテレフタレートを含んでよいか、またはそれから成ってよい。採集デバイスは、本発明の第七の態様によるデバイスであってよい。
【０１８４】
滅菌のために組成物を照射することにより、滅菌された組成物を提供することができる。したがって、本発明の第一の態様の方法は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法であって、
ａ）上記の安定化組成物を提供するステップ；および
ｂ）組成物を照射によって滅菌するステップ
を含む方法であることが好ましい。
【０１８５】
安定化組成物のさらなる詳細および実施形態は、上に記載しており、それについてはそれぞれの開示を参照する。複数の実施形態では、滅菌された組成物は、さらに細胞内核酸（特に、細胞内ＲＮＡおよび／または例えばゲノムＤＮＡなどの細胞内ＤＮＡ）を安定化するのに好適である。複数の実施形態では、滅菌された組成物は、さらに例えば細胞表面特性および／または細胞形態などの細胞特性を安定化するのに好適である。それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。組成物は、液体、さらに好ましくは水性の形態で滅菌されることが好ましい。それについては上記の開示を参照する。
【０１８６】
本発明の第一の態様による特定の実施形態
本発明の第一の態様による方法の好適なおよび好ましい実施形態を以下に記載する。
【０１８７】
本発明の第一の態様の一実施形態に従って、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法が提供され、この方法は、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤。前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド、ニトリルまたはケトン化合物によって改変されたものであってよい。１つの実施形態によると、カスパーゼ特異的ペプチドは、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で改変されている。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択され、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが最も好ましい。
ｉｉ．以下：
−  ０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
−  ０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度の還元形態のグルタチオン、および／または
−  ２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸、
−  ０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌまたは０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６
の化合物のうちの１つ以上
を含む液体、好ましくは水性の組成物を提供するステップであって、組成物は、必要に応じて、
ｉｉｉ．安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコール、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｖ．抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、水性組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために、組成物が、好ましくはガンマ線照射によって照射されるステップ
を含む。
【０１８８】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０１８９】
組成物は、組成物を照射することによって滅菌することができる。
【０１９０】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態に従って、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法が提供され、この方法は、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤。前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド、ニトリルまたはケトン化合物によって改変されたものであってよい。１つの実施形態によると、カスパーゼ特異的ペプチドは、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で改変されている。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択され、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが最も好ましい。
ｉｉ．以下：
−  ０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
−  ０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度の還元形態のグルタチオン、および／または
−  ２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸、
の化合物のうちの１つ以上
を含む液体、好ましくは水性の組成物を提供するステップであって、組成物は、必要に応じて、
ｉｉｉ．少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｖ．使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）である、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、ならびに
ｖｉ．抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、水性組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために、組成物が、好ましくはガンマ線照射によって照射されるステップ
を含む。
【０１９１】
組成物は、組成物を照射することによって滅菌することができる。
【０１９２】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態に従って、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法が提供され、この方法は、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは上で記載のとおりの改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｉｉ．上記の表Ａまたは表Ｂに記載される通りの少なくとも１つの化合物（好ましくは、組成物はＮ−アセチル−システインを含む）、
の化合物のうちの１つ以上
を含む、好ましくは水性である液体組成物を提供するステップであって、組成物は、必要に応じて、
ｉｉｉ．少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｖ．使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）である、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、ならびに
ｖｉ．抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために、組成物が、好ましくはガンマ線照射によって照射されるステップ
を含む。
【０１９３】
安定化組成物は、組成物を照射することによって滅菌することができる。
【０１９４】
好ましい実施形態に従って、本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法であって、
ａ）
ｉ．少なくとも１つの汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは上記の改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、最も好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｉｉ．０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン
を含み、必要に応じて、
ｉｉｉ．安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコール、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、および
ｖ．必要に応じて、抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む、水性組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために、組成物が、好ましくはガンマ線照射によって、さらに好ましくは５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの線量で照射されるステップ
を含む方法を提供する。
【０１９５】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０１９６】
安定化組成物は、組成物を照射することによって滅菌することができる。
【０１９７】
さらなる好ましい実施形態に従って、本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法を提供し、この方法は、
ａ）
ｉ．少なくとも汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは上で記載される通りの改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｉｉ．０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
を含み、必要に応じて、
ｉｉｉ．少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｖ．使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）である、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、ならびに
ｖｉ．必要に応じて、抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む水性の組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために、組成物が、好ましくはガンマ線照射によって、好ましくは５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの線量で照射されるステップ
を含む。
【０１９８】
安定化組成物は、組成物を照射することによって滅菌することができる。
【０１９９】
上記の好ましい実施形態における一つの実施形態に従って、ステップａ）で提供される水性の組成物は、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度の還元形態のグルタチオンを含み、および／または２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸を含む。
【０２００】
Ｎ−アセチル−システインに加えて、またはＮ−アセチル−システインの代わりとして、還元型グルタチオンおよびアスコルビン酸を組成物に含めることができる。しかし、前に説明したように、組成物がＮ−アセチル−システインを含むことが有利である。
【０２０１】
さらなる好ましい実施形態に従って、本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法であって、
ａ）
ｉ．カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｉｉ．０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン
を含み、組成物は必要に応じて、
ｉｉｉ．安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコール、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、および
ｖ．必要に応じて、抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む、水性組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）組成物をガンマ線照射によって、好ましくは５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの線量で滅菌するステップ
を含む方法を提供する。
【０２０２】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０２０３】
さらなる好ましい実施形態に従って、本発明は、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成する方法を提供し、この方法は、
ａ）
ｉ．カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｉｉ．０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
を含む水性の組成物を提供するステップであって、組成物は、必要に応じて、
ｉｉｉ．少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｉｖ．少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｖ．使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）である、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、ならびに
ｖｉ．抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む、組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）組成物をガンマ線照によって、好ましくは５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、または約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの線量で滅菌するステップ
を含む。
【０２０４】
１つの実施形態によると、ステップａ）において提供され、ステップｂ）において照射される組成物は、タンニン酸を含まず、没食子酸も含まない。１つの実施形態によると、組成物は、さらに、マンニトール、イソプロパノールおよび／またはＴｗｅｅｎ−８０または安定化効果に干渉する可能性がある他の化合物を含まない。１つの実施形態によると、組成物は弱酸性ｐＨを有する。
【０２０５】
一つの実施形態に従えば、安定化組成物は、０．３５μｇ／ｍｌから７０μｇ／ｍｌ、０．７μｇ／ｍｌから６３μｇ／ｍｌ、１．７４μｇ／ｍｌから５９μｇ／ｍｌ、１０．５μｇ／ｍｌから５６μｇ／ｍｌ、または１５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌから４５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌから３８μｇ／ｍｌから選択される濃度のカスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを含む。
【０２０６】
Ｂ．細胞外核酸集団を安定化するための方法
第二の態様に従って、本発明は、細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、
ａ）本発明の第一の態様の方法に従って生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成するステップ；および
ｂ）細胞含有生体試料を滅菌された組成物と接触させるステップ
を含む方法を提供する。
【０２０７】
細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、
ａ）本発明の第六の態様による組成物であり、滅菌されている組成物を得る、または、本発明の第七の態様による試料採集デバイスであり、その中に含まれる組成物が滅菌されている、試料採集デバイスを得るステップ；および
ｂ）細胞含有生体試料を滅菌された組成物と接触させるステップ
を含む方法も意図されている。
【０２０８】
滅菌防護のために使用される安定化組成物および化合物の好適なおよび好ましい実施形態は上に記載しており、それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。好ましい実施形態に従って、安定化された細胞外核酸集団は、ｃｃｆＤＮＡである。
【０２０９】
細胞含有生体試料を組成物と接触させた後、得られる混合物は、例えば、
ａ）好ましくは０．１μＭから２０μＭ、０．２μＭから１８μＭ、０．５μＭから１７μＭ、３μＭから１６μＭ、さらに好ましい３μＭから１２μＭの範囲に存する濃度の、少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈ；
および、
ｂ）０．０５ｍＭから１３．４ｍＭ、０．０９ｍＭから８．９ｍＭ、０．０９ｍＭから６．７ｍＭ、０．０９ｍＭから４．５ｍＭ、０．０９ｍＭから１．８ｍＭ、０．１８ｍＭから０．９ｍＭ、または０．２７ｍＭから０．７１ｍＭから選択される濃度範囲のＮ−アセチル−システイン；
ｃ）０．０１ｍＭから４．２ｍＭ、０．０２ｍＭから３．１５ｍＭ、０．０３ｍＭから２．１ｍＭ、０．０６ｍＭから１．６８ｍＭ、０．１３ｍＭから１．２６ｍＭ、０．１７ｍＭから０．９５ｍＭまたは０．１７ｍＭから０．６１ｍＭから選択される濃度範囲のグルタチオン、好ましくは還元形態のもの；
ｄ）１６．５ｍＭ未満、例えば、０．０８ｍＭから１２．４ｍＭ、０．８３ｍＭから１０．７２ｍＭ、１．２４ｍＭから９．９ｍＭ、または１．６５ｍＭから９．１ｍＭから選択される濃度範囲の水溶性ビタミン、好ましくは、アスコルビン酸；
ｅ）０．２９ｍＭから２．９ｍＭ、０．４４ｍＭから１．７４ｍＭ、０．５２ｍＭから１．１６ｍＭ、または０．５８ｍＭから０．８１ｍＭから選択される濃度範囲のビタミンＥもしくはその誘導体、好ましくは、水溶性ビタミンＥ誘導体、より好ましくはトロロックス
のうちの１つ以上を含み得る。
【０２１０】
得られる混合物は、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６を、０．０８ｍＭから１２．９ｍＭ、０．０８ｍＭから１２ｍＭ、０．１ｍＭから９．４ｍＭ、０．１７ｍＭから６．４ｍＭ、または０．１７ｍＭから１．７ｍＭより選択される濃度範囲で含み得ることも意図されている。
【０２１１】
Ｎ−アセチル−システインの使用が好ましい。
細胞含有生体試料を滅菌された安定化組成物と接触させた後、得られる混合物は、
ａ）０．２５％から５％、０．３％から４％、０．４％から３％、０．５％から２．５％または０．７５％から２％の範囲に存する濃度の、式１に従う１つ以上の化合物；
ｂ）少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコール、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｃ）キレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
のうちの１つ以上を含み得る。
【０２１２】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０２１３】
したがって、細胞含有生体試料を滅菌された安定化組成物と接触させた後、得られる混合物は、
ａ）０．２５％から５％、０．３％から４％、０．４％から３％、０．５％から２．５％または０．７５％から２％の範囲における濃度の式１に従う１つ以上の化合物；
ｂ）０．１％から３％（ｗ／ｖ）、０．２％から２．５％（ｗ／ｖ）、０．２５％から２％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．７５％（ｗ／ｖ）および０．３５％から１．５％（ｗ／ｖ）から選択される、または０．２５％から１．５％（ｗ／ｖ）、０．３％から１．２５％（ｗ／ｖ）、０．３５％から１％（ｗ／ｖ）および０．４％から０．７５％（ｗ／ｖ）から選択される濃度範囲の高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｃ）０．５％から１０％、１．５％から９％、１．７５％から８％、２％から７％および２．５％から６％から選択される濃度範囲の低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｄ）キレート剤、さらに好ましくはＥＤＴＡ
のうちの１つ以上を含み得る。
【０２１４】
１つの実施形態によると、細胞含有試料は、血液試料である。この実施形態では、安定化は、ＥＤＴＡなどのキレート剤であってよい抗凝固薬の使用を伴うことが好ましい。
【０２１５】
本明細書に記載のように、複数の実施形態では、滅菌された組成物は、さらに細胞内ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）および／またはＲＮＡなどの細胞内核酸を安定化するのに好適である。１つの実施形態によると、細胞含有試料中に存在する核酸の分解は、安定化に起因して低減される。特に、細胞内ＲＮＡが安定化される。試料に含有されている細胞におけるトランスクリプトームおよび／または転写レベルが安定化されることが好ましい。詳細は上に記載している。１つの実施形態によると、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８およびｐ５３より選択される１つ以上のマーカー遺伝子の転写レベルは、安定化されると少なくとも１２時間にわたって、少なくとも２４時間にわたって、好ましくは少なくとも４８時間にわたって安定化されている。１つの実施形態によると、安定化組成物を血液試料と接触させると、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８およびｐ５３より選択される１つ以上のマーカー遺伝子の転写レベルが、安定化されると少なくとも１２時間にわたって、少なくとも２４時間にわたって、好ましくは少なくとも４８時間にわたって安定化され、１つの実施形態では、安定化組成物と細胞含有試料の体積比は、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０および１：２から１：５より選択される。
【０２１６】
複数の実施形態では、滅菌された組成物は、さらに例えば細胞表面特性および／または細胞形態などの細胞特性を安定化するのに好適である。重要なことに、安定化された細胞はインタクトなままであり、したがって、安定化された試料から単離することができる。それについては上記の開示を参照する。１つの実施形態では、安定化する方法は、以下の特性：
ａ）安定化により、安定化された試料から細胞を単離することが可能になる；
ｂ）前記細胞含有試料が血液試料であり、血液試料に含有されている細胞が安定化される；
ｃ）前記細胞含有試料が血液試料であり、白血球が安定化される；
ｄ）細胞の形態が保存される；
ｅ）有核細胞の形態が保存される；
ｆ）前記試料が血液試料であり、含有されるリンパ球および／もしくは単球が安定化される；
ｇ）細胞表面エピトープが保存される；ならびに／または
ｈ）細胞表面タンパク質が保存される
のうちの１つ以上を有する。
【０２１７】
１つの実施形態によると、試料は、血液試料であり、白血球、好ましくはリンパ球の形態および／または細胞表面エピトープは保存される。上記のように、血液試料に含まれている他の細胞、例えば、存在する場合、循環する腫瘍細胞の特徴も保存することができる。
【０２１８】
安定化期間後、方法は、以下
ａ）安定化された試料を核酸分析および／もしくは検出方法に供する；
ｂ）細胞外核酸を安定化された試料から単離する；
ｃ）細胞外核酸を安定化された試料から単離し、単離された核酸を分析および／もしくは検出する；
ｄ）安定化された試料に含まれている細胞を取り出す；
ｅ）安定化された試料に含まれている細胞を、核酸の単離、分析および／もしくは検出ステップを実施する前に取り出す；
ｆ）安定化された試料から細胞を取り出し、安定化された試料の無細胞部分もしくは細胞枯渇部分から細胞外核酸を単離する；
ｇ）（ｉ）安定化された試料、（ｉｉ）細胞が取り出された、安定化された試料および／もしくは（ｉｉｉ）試料から取り出された細胞を保管する；
ｈ）安定化された試料から細胞を取り出し、廃棄する；ならびに／または
ｉ）安定化された試料から細胞を取り出し、安定化された試料から取り出された細胞から核酸を単離する；
ｊ）安定化された試料から細胞を取り出し、安定化された試料から取り出された細胞からタンパク質および／もしくは代謝産物などの生体分子、核酸を単離する；
ｋ）安定化された試料から細胞を取り出し、安定化された試料から取り出された細胞から核酸およびタンパク質および／もしくは代謝産物などの生体分子を単離する
ｌ）安定化された試料から細胞を取り出し、安定化された試料の無細胞部分または細胞枯渇部分から細胞外核酸をサイズ選択核酸単離法を使用して単離する
のうちの１つ以上を含んでよい。
【０２１９】
したがって、本発明の方法を用いて安定化された細胞含有生体試料を、核酸分析方法および／もしくは核酸検出方法で分析することができ、ならびに／またはさらに処理してもよい。生体試料の安定化の直ぐ後に核酸の分析が続くこともあり、またはその安定化された試料から先ずは核酸を単離することもある。核酸単離および分析に関する詳細は、本発明の第三の態様に関連して下にも記載し、それについては前記開示を参照する。
【０２２０】
さらに、記載したように、細胞を、安定化された試料から取り出し、分析することができ、かつ／または、核酸を、得られる細胞から単離することができる。これにより、例えば、腫瘍細胞を識別することが可能になる。１つの実施形態によると、細胞内ＲＮＡを、安定化された試料に含有されている細胞から単離し、および分析することができる。１つの実施形態によると、方法は、１つ以上の遺伝子転写物の定性分析または定量分析を実施することを含む。さらに、複数の実施形態では、細胞を、それらの形態または細胞表面特性に関して分析することができる。
【０２２１】
１つの実施形態によると、細胞含有試料は血液試料であり、滅菌された安定化組成物により、白血球の安定化が達成される。これにより、白血球を安定化された試料から分離することが可能になる。含有されている血液細胞の少なくとも１つの型が、少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、さらに好ましくは少なくとも４８時間であることが好ましい安定化期間中安定化されれば、白血球が安定化される。１つの実施形態によると、血液試料に含有されているリンパ球および／または単球が安定化される。１つの実施形態では、滅菌された組成物は、細胞含有試料に含有される有核細胞の溶解を誘導または促進しない。したがって、安定化は、細胞溶解に基づくものではない。好ましくは、細胞含有試料が血液であり、目的の核酸が細胞外核酸、特に細胞外ＲＮＡである場合、滅菌された安定化組成物により溶血が防止される。インビトロ溶血の大半の原因は、検体採集に関係づけられる。しかし、インビトロ溶血は、通常、エクスビボ保管中の血液試料でも適正な安定化方法を用いないと発生する。目的の細胞外核酸によっては、溶血は相当な問題であり得る。目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合、赤血球が核を含有しない、したがって、ゲノムＤＮＡを含有しないので、溶血はあまり問題にならない。それ故、溶血中に赤血球から細胞内ＤＮＡは放出されない。目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合、特に、白血球の溶解または崩壊は問題である。この場合は細胞内ＲＮＡに加えてゲノムＤＮＡが放出されるからである。したがって、目的の細胞外核酸が細胞外ＤＮＡである場合、特に、白血球の溶解は防止されなければならない。白血球は、それらの安定特性が互いに異なり得る。したがって、一部のタイプの白血球は他のものより安定している。しかし、一般に、白血球は赤血球より有意に安定している。それ故、赤血球の溶解は、白血球が溶解されたことを必ずしも示すとは限らない。溶解に対する白血球および赤血球のこの異なる感受性をまた、当該技術分野において用いて、例えば、赤血球を特異的に溶解する一方で白血球を保存して例えば白血球の収集を可能にした。しかし、目的の細胞外核酸がＲＮＡである場合、溶血およびしたがって赤血球の溶解は問題となる。成熟赤血球もＲＮＡを含有しないが、それらの前駆体（網状赤血球）は含有する。網状赤血球は、赤血球のおおよそ０．５％から１％を構成し、大量のグロビンＲＮＡを含有する。したがって、特に、目的の細胞外核酸がＲＮＡである場合、細胞外核酸集団、特に細胞外ＲＮＡ集団のグロビンｍＲＮＡでの希釈を低減させるために、保管中の赤血球およびしたがって網状赤血球の溶解は防止／低減されるべきである。１つの実施形態では、滅菌された安定化組成物によって溶血を効率的に防止／低減することができる（例えば、本発明の教示を使用して滅菌することができる、好適な、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化組成物に関してはＷＯ２０１４／１４６７８１を参照されたい）。それによって、細胞外核酸集団は実質的に保存され、さらに、安定化された血液試料、特に、その安定化された血液試料から得られる血漿または血清は、溶血および一般に細胞溶解の防止に起因して、他の標準的実験室分析にも好適である。さらに、白血球の溶解の防止により、それぞれの細胞を単離し、分析することが可能になる。特に、白血球の溶解の防止により、細胞内ＲＮＡなどの細胞内核酸を、安定化された試料に含有されている白血球または他の保存されている細胞から単離することが可能になる。さらに、無核細胞（例えば、網状赤血球）および細胞内核酸を含む細胞を安定化する場合、例えば、かかる無核細胞のトランスクリプトームを分析することもできる。
【０２２２】
Ｃ．細胞外核酸を単離する方法
第三の態様に従って、本発明は、安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するための方法であって、
ａ）本発明の第二の態様の方法に従って細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）細胞外核酸を単離するステップ
を含む方法を提供する。
【０２２３】
ステップａ）において、細胞含有試料に含まれている細胞外核酸集団を本発明の第二の態様に記載されている方法に従って安定化し、ここで、上記の滅菌された安定化組成物を使用する。それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。
【０２２４】
例えば全血での場合のように、細胞含有生体試料が大量の細胞を含む場合、細胞を残りの試料から好ましくは分離して、安定化された試料の無細胞の、それぞれに細胞低減または細胞枯渇画分を得、次いで、ステップｂ）においてそれらから細胞外核酸を単離する。したがって、１つの実施形態によると、ステップａ）およびステップｂ）の間に細胞含有試料から細胞を除去する。この中間ステップは、血漿もしくは血清などの少量の残留細胞しか含まない試料を処理する場合、および／または目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合、もう用いられないこともある。本発明の安定化のために、含有細胞からの安定化期間中のゲノムＤＮＡの放出が低減されるか、またはさらには防止され、およびさらに、ゲノムＤＮＡの断片化がカスパーゼ阻害剤のために低減される。その相当大きいサイズのために、非断片化ゲノムＤＮＡをより小さい細胞外ＤＮＡと区別することができる。これにより、例えば、サイズ選択的単離プロトコルを使用することによって非断片化ゲノムＤＮＡの存在下でさえ細胞外ＤＮＡを選択的に単離することが可能になる。しかし、結果を改善するためには、ステップｂ）で細胞外核酸を単離する前にその安定化された試料から細胞（または潜在的に残存細胞）を除去して、そうしなければ核酸単離中に細胞から放出される細胞内核酸での細胞外核酸集団の汚染を低減させることが好ましい。含有細胞の除去もまた、目的の細胞外核酸がＲＮＡである場合、細胞内ＲＮＡと細胞外ＲＮＡを区別することが困難であり得るため、およびさらに細胞外ＲＮＡの希釈をそれによって防止することができるので、特に有利である。目的の細胞外核酸がＤＮＡである場合もステップｂ）の前の細胞枯渇ステップが一般に有利であり、したがって好ましい。なぜなら、これによりステップｂ）での標準的核酸単離手順の使用が可能になるからである。
【０２２５】
細胞含有生体試料のタイプに依存して、細胞（残留細胞を含む）を、例えば、遠心分離、例えば、温和な速度の遠心分離によって、または遠心分離ステップを避けるべき場合には遠心分離以外の手段、例えば濾過、沈降もしくは表面への結合、例えば（必要に応じて磁性）粒子上への結合によって、分離および除去することができる。それぞれの細胞分離方法は先行技術分野において周知であり、したがって、それらを詳細に記載する必要なはい。それぞれの細胞枯渇ステップを自動試料分離プロトコルに容易に含めることもできる。それぞれに除去された細胞を、所望される場合には、さらに処理してもよい。細胞を、例えば、保管することができ、分析することができ、および／または除去された細胞から生体分子、例えば核酸もしくはタンパク質などを単離することができる。さらに、細胞内核酸（例えば、細胞内ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を、含有されている細胞から、例えば、細胞を残存試料から分離した後に、単離することができる。例えば、細胞内ＲＮＡを単離し、遺伝子発現分析に使用することができる。これらの実施形態に関しては、滅菌された組成物により、特にＲＮＡなどの細胞内核酸および／または上記の細胞特性も安定化されることが好ましい。それぞれの開示が参照される。
【０２２６】
さらに、安定化された試料を処理するためのさらなる中間ステップを含めることも本発明の範囲内である。
【０２２７】
ステップｂ）で、好ましくは、安定化された試料の無細胞の、それぞれに細胞枯渇画分から、例えば、安定化された細胞含有試料が血液試料である場合には上清からまたは血漿および／または血清から、細胞外核酸を単離する。細胞外核酸を単離するために、安定化された試料、それぞれに得られた細胞枯渇試料から核酸を単離するのに好適である任意の公知核酸単離方法を使用することができる。それぞれの精製方法の例としては、抽出、固相抽出、シリカベースの精製方法、磁性粒子ベースの精製、フェノール−クロロホルム抽出、クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（アニオン交換表面を使用）、電気泳動、濾過、沈殿およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、配列特異的結合を可能にする固体支持体にカップリングされた適切なプローブを使用することによって、特異的標的細胞外核酸を特異的に単離することも本発明の範囲内である。当業者に公知の任意の他の核酸単離技術も使用することができる。細胞外核酸を単離するための典型的な方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０４５４３２Ａ１に記載されている。ＷＯ２０１３／０４５４３２Ａ１の細胞外核酸を単離するための方法は、本発明の第三の態様による方法に適用することができる。
【０２２８】
Ｄ．細胞外核酸を処理および／または分析するための方法
第四の態様に従って、本発明は、細胞外核酸を処理および／または分析するための方法であって、
ａ）安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を本発明の第三の態様の方法に従って単離するステップ；ならびに
ｂ）単離された細胞外核酸を処理および／または分析するステップ
を含む方法を提供する。
【０２２９】
ステップａ）において細胞外核酸を単離するために使用される第三の態様による方法は上に記載しており、それについてはそれぞれの開示を参照し、そのそれぞれの開示はここにも適用される。ステップｂ）において、単離された細胞外核酸をその後、分析および／またはさらに処理する。これは、好適なアッセイおよび／または分析方法を使用して行うことができる。例えば、それらを同定することができ、改変することができ、少なくとも１つの酵素と接触させることができ、増幅することができ、逆転写することができ、クローニングすることができ、配列決定することができ、プローブと接触させることができ、（それらの存在または不在を）検出することができ、および／または定量することができる。それぞれの方法が先行技術分野において周知であり、一般に、医療、診断および／または予後予測分野において細胞外核酸を分析するために応用されている（本発明の背景技術における詳細な記載も参照されたい）。したがって、細胞外核酸をステップａ）においてした後、それを分析して、例えば、多数の新生物疾患、特に、前悪性疾患および悪性疾患、例えば、様々な形態の腫瘍またはがんをはじめとする（しかしこれらに限定されない）疾患状態の存在、不在または重症度を同定することができる。例えば、単離された細胞外核酸を分析して、非侵襲性出生前遺伝子検査、それぞれにスクリーニング、疾患スクリーニング、染色体異常、トリソミー、点突然変異についてのスクリーニング、病原体スクリーニング、腫瘍学、がんスクリーニング、早期がんスクリーニング、がん治療モニタリング、遺伝子検査（遺伝子型判定）、感染症検査、傷害診断、外傷診断、移植医療もしくは多くの他の疾患を含む（しかしこれらに限定されない）、多くの応用分野において診断および／または予後予測マーカー（例えば、胎児由来または腫瘍由来細胞外核酸）を検出することができ、したがって、単離された細胞外核酸は、診断および／または予後予測に適切なものである。１つの実施形態によると、単離された細胞外核酸を分析して、疾患または胎児の特性を同定および／または特性評価する。したがって、上で論じたように、本明細書に記載する単離方法は、核酸分析および／または処理のステップｃ）をさらに含むことがある。
【０２３０】
したがって、１つの実施形態によると、疾患および／または少なくとも１つの胎児の特徴を識別、検出、スクリーニング、モニタリングまたは排除するために、単離された細胞外核酸をステップｂ）において分析する。
【０２３１】
Ｅ．滅菌可能な組成物を生成するための方法
第五の態様に従って、本発明は、滅菌可能な組成物を生成するための方法であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であり、方法が、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を調製するステップ
を含む方法を提供する。
【０２３２】
方法は、
ｂ）組成物を滅菌するステップ
をさらに含んでよい。
【０２３３】
方法は、本発明の第一の態様のステップａ）において提供されるような滅菌可能な組成物または本発明の第六の態様による滅菌可能な組成物を生成するために使用することができる。組成物の成分を互いと接触させる順序は限定されない。例えば、限定するものではないが、ステップａ）の組成物は、まず、１つ以上のカスパーゼ阻害剤を含む組成物を調製し、次いで、チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインおよび／またはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物を組成物に添加することによって調製することができる。所望であれば、チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインおよび／またはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物を、１つ以上のカスパーゼ阻害剤の添加前に添加することもできる。液体組成物（例えば水性組成物など）を調製する場合、便宜上、液体（例えば、水）を最初に提供することができるが、そうする必要はない。同様に、ステップａ）の組成物は、例えば、調製される組成物の個々の成分を同時にまたは逐次的に任意の順序で互いと接触させることによって調製することができる。したがって、組成物の成分を互いと接触させることができる。組成物の成分を混合して液体組成物、好ましくは水性組成物をもたらすことが好ましい。液体組成物は、１つの相のみの均一の混合物であってよいが、例えば沈殿物などの固体成分を含む液体組成物も本発明の範囲内に入り得る。本発明の第五の態様による方法のステップａ）は、本発明の第一の態様による方法のステップａ）に対応し得る。それについては上記の開示を参照する。そこには、安定化組成物の好適なおよび好ましい実施形態ならびに達成可能な安定化特性も記載されている。
【０２３４】
必要に応じてステップｂ）に従って、組成物をその後、滅菌する。滅菌は、照射または他の好適な手段によって達成することができる。特に、滅菌は、上記のように、本発明の第一の態様の方法と併せて達成することができる。それについては上記の開示を参照する。
【０２３５】
Ｆ．滅菌可能な組成物
第六の態様に従って、本発明は、滅菌可能な組成物であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適である、滅菌可能な組成物を提供する。組成物は、本発明の第一の態様のステップａ）の方法において提供される組成物である。本発明による好適な滅菌可能な組成物は、上で第一の態様による方法を論じる際に記載しており、それについてはそれぞれの開示を参照する。それについては特に、その組成物、特に含まれている成分、それについての好適なおよび好ましい実施形態、ならびに好適なおよび好ましい濃度および上記の他の特徴の詳細に関する上記の開示を参照する。複数の実施形態では、滅菌可能な組成物は、さらに細胞内核酸（特に、細胞内ＲＮＡおよび／または細胞内ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ））を安定化するのに好適である。複数の実施形態では、滅菌可能な組成物は、さらに例えば細胞表面特性および／または細胞形態などの細胞特性を安定化するのに好適である。詳細は上に記載し、それについては上記の開示を参照する。
【０２３６】
組成物は滅菌されていることが好ましい。論じたように、ガンマ線照射などの照射による滅菌が好ましい。１つの実施形態によると、組成物は、本発明の第一の態様による方法によって得ることができるおよび／または得られた、滅菌された組成物である。したがって、本発明の第一の態様による方法を用いて調製された、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物が意図されており、好ましい。
【０２３７】
組成物は液体であることが好ましく、組成物は水性であることがさらに好ましい。
【０２３８】
本発明の第六の態様の滅菌可能な組成物は、細胞含有生体試料、好ましくは血液試料中の細胞外核酸集団を安定化するために使用することができる。複数の実施形態では、滅菌可能な組成物は、さらに細胞内核酸（特に、細胞内ＲＮＡおよび／または細胞内ＤＮＡ）、好ましい遺伝子発現プロファイルを安定化するために使用することができる。複数の実施形態では、滅菌可能な組成物は、さらに例えば細胞表面特性および／または細胞形態などの細胞特性を安定化するために使用することができる。それについては上記の開示を参照する。
【０２３９】
組成物は、滅菌された形態で使用することが有利である。
【０２４０】
Ｇ．採集デバイス
本発明の第七の態様に従って、細胞含有生体試料、好ましくは血液試料を採集するための採集デバイスも提供される。続いて、採集デバイスは、容器とも称される。
【０２４１】
デバイスは、本発明の第六の態様による組成物を含む。したがって、デバイスに含まれている組成物は、本発明の第一の態様による方法のステップａ）において提供される組成物であってよい。それについては上記の詳細についての開示を参照する。
【０２４２】
一つの実施形態に従って、採集デバイスは、好ましくは液体であり、より好ましくは水性である組成物を含み、この組成物は、
ａ）１つ以上のカスパーゼ阻害剤、
ｂ）チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたは上記のその誘導体より選択される１つ以上の化合物（組成物はＮ−アセチル−システインを含むことが好ましい）
ｃ）安定化剤として、好ましくは、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー；
を含み、ならびに必要に応じて、
ｄ）第１のポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する、好ましくは高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ｅ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド；
ｆ）抗凝固薬および／またはキレート剤
から成る群より選択される１つ以上、好ましくは２つ以上のさらなる添加剤
を含む。
【０２４３】
安定化組成物は、本発明による化合物のうちの１つ以上を、特徴ｉｉを論じる際には、本開示の第１の態様において上に開示した濃度で、さらに好ましくは上の表Ａに開示した濃度で含むことが好ましい。適切な化合物および濃度はまた、表Ｂに示されている。Ｎ−アセチル−システインの使用が特に好ましい。
【０２４４】
一つの実施形態に従って、採集デバイスは、好ましくは液体であり、より好ましくは水性である組成物を含み、この組成物は、
ａ）１つ以上のカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましい改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、さらに好ましいＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＢｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択されるカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ；
ｂ）チオアルコール（Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであることが好ましい）、水溶性ビタミン（ビタミンＢ６またはアスコルビン酸であることが好ましい）、およびビタミンＥまたは上記のその誘導体より選択される１つ以上の化合物（組成物は、Ｎ−アセチル−システインを含むことが好ましい）、
ｃ）安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコールであり、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー；
ならびに、必要に応じて、１つ以上、好ましくは２つの、
ｄ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド；
ｅ）抗凝固薬および／またはキレート剤
から成る群より選択されるさらなる添加剤
を含む。
【０２４５】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０２４６】
安定化組成物は、本発明による化合物のうちの１つ以上を、特徴ｉｉを論じる際には上に開示した濃度で、さらに好ましくは上の表Ａまたは表Ｂに開示した濃度で含むことが好ましい。Ｎ−アセチル−システインの使用が特に好ましい。
【０２４７】
さらなる実施形態では、採集デバイスは、好ましくは液体であり、より好ましくは水性である安定化組成物を含み、この組成物は、
ａ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤。前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド、ニトリルまたはケトン化合物によって改変されたものであってよい。１つの実施形態によると、カスパーゼ特異的ペプチドは、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で改変されている。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択され、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが最も好ましい。
ｂ）以下：
−  ０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
−  ０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度の還元形態のグルタチオン、および／または
−  ２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸、
−  ０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌまたは０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６
の化合物のうちの１つ以上を含み、
組成物は、必要に応じて、
ｃ）安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコール、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｄ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、および
ｅ）抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
から選択される１つ以上の化合物をさらに含む。
【０２４８】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０２４９】
さらなる実施形態では、採集デバイスは、好ましくは液体であり、より好ましくは水性である安定化組成物を含み、この組成物は、
ａ）少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、好ましくは汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤。前記カスパーゼ特異的ペプチドは、アルデヒド、ニトリルまたはケトン化合物によって改変されたものであってよい。１つの実施形態によると、カスパーゼ特異的ペプチドは、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）またはフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）基で改変されている。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される。１つの実施形態によると、カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択され、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが最も好ましい。
ｂ）以下：
−  ０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
−  ０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度の還元形態のグルタチオン、および／または
−  ２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌから１３．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌまたは２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸、
の化合物のうちの１つ以上を含み、
組成物は、必要に応じて、
ｃ）少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｄ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｅ）使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、および
ｆ）抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
から選択される１つ以上の化合物をさらに含む。
【０２５０】
さらなる実施形態では、採集デバイスは、好ましくは液体であり、より好ましくは水性である安定化組成物を含み、この組成物は、
ａ）少なくとも汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは上で記載される通りの改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｂ）０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
を含み、組成物は、必要に応じて、
ｃ）安定化剤として、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくはポリエチレングリコール、さらに好ましくは非置換ポリエチレングリコールである、ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｄ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、および
ｅ）抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む。
【０２５１】
複数の実施形態では、ポリエチレングリコールであることが好ましい少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーは、低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、および／または少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーより選択される。
【０２５２】
さらなる実施形態では、採集デバイスは、好ましくは液体であり、より好ましくは水性である安定化組成物を含み、この組成物は、
ａ）少なくとも１つの汎カスパーゼ阻害剤、さらに好ましくは上で記載される通りの改変カスパーゼ特異的ペプチドを含むカスパーゼ阻害剤、最も好ましくはＱ−ＶＤ−ＯＰｈ、
ｂ）０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン、
を含み、組成物は、必要に応じて、
ｃ）少なくとも１５００、好ましくは２０００から４００００、さらに好ましい２５００から３００００、２５００から２５０００または３０００から２００００の範囲の分子量を有する少なくとも１つの高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマー、
ｄ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド）および／またはブタンアミド、
ｅ）使用される高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量よりも少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い分子量を有する少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは、１０００以下の分子量を有する、好ましくは２００から８００または２００から６００の範囲の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）である、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマー、ならびに
ｆ）必要に応じて、抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ
をさらに含む。
【０２５３】
採集デバイスに含まれている組成物は、本発明の第一の態様による方法のステップａ）に記載のように、採集デバイス中に直接、提供、および例えば調製することもでき、調製後に採集デバイスに充填することもできる。
【０２５４】
本発明の第六の態様による組成物を含むそれぞれの採集デバイス、例えば、試料採集チューブ、好ましくは採血チューブなどの容器を提供することには、細胞含有生体試料が、試料がそれぞれのデバイスに採集されると直ちに安定化されるという利点がある。
【０２５５】
採集容器に含まれている安定化のために使用される安定化組成物および／または個々の化合物を、液体；半液体、または乾燥形態で提供することができる。安定化のために使用される化合物を前記容器に別々の実体として提供してもよく、および異なる形態で前記容器に提供してもよい。例えば、１つの成分を乾燥形態で提供してもよく、その一方で他の化合物を液体として提供してもよい。他の組み合わせも実施可能である。好適な処方および製造選択肢は当業者に公知である。
固体の安定化組成物を使用する利点は、固体が、通常、化学的に液体より安定していることである。１つの実施形態によると、前記容器の内壁を本発明による安定化組成物で、またはその個々の成分、例えば抗凝固物質などで処理／被覆する。例えば噴霧乾燥法を用いて、前記組成物または成分を前記内壁に塗布することができる。液体除去技術を安定化組成物に対して実施して、実質的に固体状態の保護組成物を得ることができる。かかる液体除去条件および技法は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９に記載されており、この開示を参照する。
【０２５６】
しかし、上で説明したように安定化組成物は液体形態、好ましくは水性形態で提供されることが好ましい。これには、照射による滅菌に関して利点があり、また、例えば血液試料などの特定の試料に関しても利点がある。液体組成物には、安定化すべき細胞含有生体試料との混合を迅速に達成することができ、それによって基本的に、その試料を液体の安定化組成物と接触させるやいなや即時安定化効果をもたらすという利点が、多くの場合ある。さらに、液体組成物は、より大量の安定化組成物を使用する、したがって噴霧乾燥できないか噴霧乾燥が難しい場合、または前記組成物が乾燥組成物をもたらすことを妨げる場合に有利である。
【０２５７】
安定化組成物は、容器に、前記容器に採集する試料量の安定化をもたらすのに有効な量で含まれる。１つの実施形態によると、液体の安定化組成物を生体試料と、１０：１から１：２０、５：１から１：１５、１：１から１：１０、１：４から１：１０、および１：５から１：９より選択される体積比、特に約１：６から１：８で接触させる。
【０２５８】
採集デバイスは、滅菌可能であることが好ましく、本発明の第一の態様による方法を使用して滅菌可能であることがさらに好ましい。重ねて、それについては詳細に関して本発明の第一の態様における上記の開示を参照し、上記の開示はここにも適用される。したがって、液体形態、好ましくは水性形態の組成物を含む採集デバイスを照射することが非常に好ましい。採集デバイスが最初に組成物を固体形態で含む場合、照射前に組成物を液体形態にすることができる。
【０２５９】
その中に含まれているデバイスおよび組成物は、例えば本発明の第一の態様による方法において、一緒に滅菌することができる。これにより、試料採集の用意ができた、滅菌された最終製品を提供することが有利に可能になる。
【０２６０】
したがって、デバイスは滅菌されていることが好ましい。本発明の第一の態様による方法によって得ることができるおよび／または得られたデバイスは、滅菌されたデバイスであることがさらに好ましい。したがって、本発明の第一の態様による方法を用いて調製された、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を含むデバイスが意図されており、好ましい。
【０２６１】
採集デバイスは排気することができる。排気は、好ましくは、特定の体積の流体の細胞含有生体試料を内部に引き込むのに有効である。それにより、正確な量の試料を、前記容器に含まれている予め充填された量の安定化組成物と確実に接触させ、およびしたがって、安定化を確実に効率的にする。１つの実施形態によると、前記容器は、セプタムによって封止された開口端を有するチューブを含む。例えば、前記容器は、固体または液体いずれかの形態の定義された量の安定化組成物が予め充填され、定義された真空度を与えられ、セプタムで封止されている。前記セプタムは、標準的な試料採取用付属品（例えば、カニューレなど）に適合可能であるように構成される。例えばカニューレと接触したとき、前記真空度によって予め決められる試料量が前記容器内に採集される。それぞれの実施形態は、採血に特に有利である。適する容器は、例えば、米国特許第６，７７６，９５９号明細書に開示されている。
【０２６２】
容器は、ガラス製、プラスチック製、または他の好適な材料製であることができる。プラスチック材料は、酸素不透過性材料であることができ、または酸素不透過層を含有することができる。あるいは、前記容器は、通気性プラスチック材料製であることができる。本発明による容器は、好ましくは、透明材料製である。適する透明熱可塑性材料の例としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリエチレンテレフタレートが挙げられる。前記容器は、採集する生体試料の必要とされる体積に従って選択される好適な寸法を有し得る。上に記載したように、好ましくは、前記容器を大気圧より低い内部圧力に排気する。かかる実施形態は、全血などの体液の採集に特に好適である。前記圧力は、好ましくは、前記容器に所定体積の生体試料を引き込むように選択される。かかる真空チューブに加えて、非真空チューブ、機械式分離チューブ（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ｔｕｂｅ）またはゲル―バリアチューブも、特に血液試料採集用の、試料容器として使用することができる。適する容器およびキャッピングデバイスは、米国特許第５，８６０，３９７号明細書および米国特許出願公開第２００４／００４３５０５号明細書に開示されている。細胞含有試料を採集するための容器として、さらなる採集デバイス、例えば注射器、尿採集デバイスまたは他の採集デバイスも使用することができる。容器のタイプは、採集すべき試料タイプにも依存することがあり、好適な容器も当業者に利用可能である。
【０２６３】
１つの実施形態によると、容器は、開口上部と、底部と、チャンバーを規定するそれらとの間に広がる側壁とを有し、本発明の第六の態様による組成物または本発明の第一の態様による方法のステップａ）において提供される組成物がチャンバーに含まれている。組成物は、チャンバー内に液体または固体形態で含まれている。１つの実施形態によると、それは液体、好ましくは水性液体である。１つの実施形態によると、前記容器はチューブであり、その底部は、閉鎖底部であり、前記容器は、開口上部にクロージャーを備えており、前記チャンバーは、減圧下にある。前記チャンバーにおける減圧の利点は上に記載した。好ましくは、前記クロージャーは、針またはカニューレでの貫入が可能であり、指定体積の液体試料を前記チャンバーに引き込むように減圧を選択する。１つの実施形態によると、前記チャンバーは、指定体積の液体試料を前記チャンバーに引き込むように選択された減圧下にあり、前記安定化組成物は液体であり、該安定化組成物の前記指定体積の細胞含有試料に対する体積比が１０：１から１：２０、５：１から１：１５、および１：１から１：１０より選択され、好ましくは１：５から１：１０であり、より好ましくは１：６から１：８であるように前記チャンバーの中に配置される。付随する利点は上に記載し、またＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９においても議論されている。  
【０２６４】
好ましくは、前記容器は、患者からの採血用である。１つの実施形態によると、前記容器は、患者からの１０ｍｌ血液の採血用である。１つの実施形態によると、安定化組成物は、液体であり、体積は２ｍｌ以下であり、０．５ｍｌから２ｍｌ、０．７５ｍｌから１．７５ｍｌおよび１ｍｌから１．５ｍｌの範囲に存してよい。
【０２６５】
生体試料、好ましくは血液を患者から本発明の第七の態様によるデバイスまたは容器のチャンバー内に直接採集する、好ましくは引き込むステップを含む方法も提供される。
【０２６６】
Ｈ．キット
第八の態様に従って、本発明は、本発明の第六の態様による組成物または本発明の第七の態様による採集デバイスを含むキットを提供する。キットは、細胞外核酸を単離するための試薬などのさらなる構成要素をさらに含んでよい。
【０２６７】
Ｉ．使用
第九の態様に従って、本発明は、生体試料の細胞外核酸集団またはその成分の安定化に好適な組成物を滅菌、特に照射による滅菌中防護するための、チオアルコール（好ましくはＮ−アセチル−システインまたはグルタチオン）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたはその誘導体から成る群より選択される少なくとも１つの化合物の使用に関する。これらの化合物は、特に、上記のように、含有されているカスパーゼ阻害剤を照射中に分解から防護するのに好適である。これらの化合物のうちの１つ以上を使用した場合、分解の程度は有意に低減される。照射は、好ましくはイオン化照射、さらに好ましくはガンマ線照射、電子ビーム照射、またはＸ線であってよく、ガンマ線照射が最も好ましい。適用される照射および／または滅菌条件は、本発明の第一の態様に関連して上記の通りであってよい。
【０２６８】
本発明の好適な化合物および化合物の組み合わせならびに好適な濃度に関する本発明の第一の態様による方法の開示は、本態様にも適用される。化合物は、例えば、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン（好ましくは還元型）、アスコルビン酸、および／またはトロロックスであってよい。Ｎ−アセチル−システインが非常に好ましい。好適な濃度も上記しており、化合物は、例えば、これだけに限定することなく、上の表Ａに示されている濃度に適用される。好適な濃度は上の表Ｂにも示している。
【０２６９】
カスパーゼ阻害剤は、特に、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択することができる。カスパーゼ阻害剤は、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫより選択することができ、カスパーゼ阻害剤はＱ−ＶＤ−ＯＰｈであることが最も好ましい。
【０２７０】
Ｊ．さらなる態様
第十の態様に従って、本発明は、少なくとも１つのラジカルスカベンジャーの、試料採集デバイス、特に採血チューブに含まれている水性組成物を照射中に防護することにおける、使用を提供する。
【０２７１】
第十一の態様に従って、試料採集デバイスに含まれている水性組成物を滅菌するための方法であって、
ａ）試料採集デバイスに含まれている、少なくとも１つのラジカルスカベンジャーを含む水性組成物を調製するステップ、および
ｂ）組成物を照射によって滅菌するステップ
を含む方法が提供される。
【０２７２】
本発明の第十の態様および第十一の態様の水性組成物は、細胞を含有する生体試料、好ましくは血液などの生体試料に含まれている成分を安定化するための組成物であってよい。目的の生体試料の例は、本発明の第一の態様に記載しており、水性組成物によって安定化される試料は、かかる試料であってよい。防護すべき水性組成物は、カスパーゼ阻害剤を含むことが好ましい。カスパーゼ阻害剤は、ＷＯ２０１３／０４５４５７Ａ１またはＷＯ２０１３／０４５４５８Ａ１に開示されている阻害剤であってよい。好適なカスパーゼ阻害剤および濃度は、上で本発明の第一の態様において開示している。この開示を参照し、この開示はここにも適用される。また、好適なおよび好ましい水性組成物は、上で本発明の第一の態様において開示している。この開示もここにも適用される、つまり、第一の態様による水性組成物は、本発明の第十の態様および第十一の態様において使用することができる水性組成物の例である。水性組成物は、特に、循環する腫瘍細胞、循環する無細胞ＲＮＡ、循環する無細胞ｍｉＲＮＡ、ウイルスおよび／またはエキソソームを安定化するための組成物であってよい。安定化により、その後の単離、分析および／または診断を容易にすることができる。循環する腫瘍細胞は、がんに罹患している哺乳動物およびヒトにおいて特に関心がもたれる。循環する腫瘍細胞の分析により、例えば、腫瘍量、腫瘍のステージおよび／または遠隔転移の形成に関する情報を提供することができる。循環する無細胞ＲＮＡおよび循環する無細胞ｍｉＲＮＡは、細胞外核酸集団の例である。ウイルスは、例えば、ウイルスに感染した哺乳動物またはヒトからの生体試料に含有されている。エキソソームは、血液および尿を含めた多くの生体液中に存在する細胞由来小胞である。エキソソームは、例えば、凝固および細胞間シグナル伝達に関与する。無細胞ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの分析は、循環するバイオマーカーの識別、体細胞突然変異および癌遺伝子発現の検出に使用することができる。複数の実施形態では、滅菌された水性組成物は、細胞内核酸（特に、細胞内ＲＮＡおよび／または細胞内ＤＮＡ）の安定化に好適である。複数の実施形態では、滅菌された水性組成物は、さらに例えば細胞表面特性および／または細胞形態などの細胞特性を安定化するのに好適である。かかる組成物および安定化特性の詳細は上に記載し、それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。
【０２７３】
第十の態様および第十一の態様による少なくとも１つのラジカルスカベンジャーは、生物系においてフリーラジカルと反応することが可能な化合物であってよい。ラジカルスカベンジャーは、特に、チオール（例えば、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンなど）、水溶性ビタミン、およびビタミンＥまたは本発明の第一の態様に記載のその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物であってよい。好適な化合物および濃度は、本発明の第一の態様に記載の通りであってよく、それが適用される。好ましくは、少なくとも１つのラジカルスカベンジャーは、水性組成物を照射中に防護して、照射に起因する水性組成物の安定化機能の低下を低減させるまたは排除するために活性である。安定化機能の低下を低減または排除することにおける活性は、少なくとも１つのラジカルスカベンジャーを含む滅菌された水性組成物の安定化機能と、同一の組成物の下で滅菌され、少なくとも１つのラジカルスカベンジャーが含まれないことのみが試験される組成物と異なることが好ましい水性組成物の安定化機能を比較することによって決定することができる。
【０２７４】
本発明の第十の態様および第十一の態様において使用することができる好適な試料採集デバイスは上で本発明の第七の態様において記載しており、この記載はここにも適用される。したがって、採集デバイスは排気することができる。採集デバイスは、ガラス、プラスチックまたは他の好適な材料製であってよい。１つの実施形態によると、採集デバイスまたは容器は、開口上部と、底部と、チャンバーを規定するそれらとの間に広がる側壁とを有してもよく、水性組成物が含まれる。
【０２７５】
例えば血液試料などの安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するための方法は、上に第三の態様と併せて記載している。さらなる態様に従えば、安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法が提供され、方法は、
ａ）細胞含有生体試料を安定化するステップであり、安定化が、
ｉ）本発明の第１の態様の方法に従って滅菌された組成物を得ること；または
ｉｉ）滅菌されている、本発明の第６の態様に記載の組成物を得ること；または
ｉｉｉ）その中に含まれる組成物が滅菌されている本発明の第７の態様に記載の試料採集デバイスを得ること；および
前記細胞含有生体試料を前記滅菌された組成物と接触させること
を含む、ステップ；ならびに
ｂ）前記安定化された試料から核酸を単離するステップ
を含む。
【０２７６】
滅菌された安定化組成物およびそれらの安定化性に関する詳細は、上で詳細に記載しており、それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。ステップｂ）において、細胞内核酸および／または細胞外核酸を安定化された試料から単離することができる。好適な単離方法は上に本発明の第三の態様と併せて記載しており、それについてはそれぞれの開示を参照し、そのそれぞれの開示はここにも適用される。複数の実施形態では、核酸を単離する前に、細胞を含有する安定化された試料から細胞を取り出す。複数の実施形態では、細胞内核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を、含有されている細胞から、例えば、細胞を残存試料から分離した後に単離する。例えば、ＲＮＡを単離し、遺伝子発現分析のために使用することができる。詳細は上に記載し、それについてはそれぞれの開示を参照する。
【０２７７】
次いで、単離された核酸を、ステップｃ）において、好適なアッセイおよび／または分析方法を使用して分析し、かつ／またはさらに処理することができる。
【０２７８】
さらなる態様に従えば、安定化された細胞含有生体試料から細胞を単離するための方法が提供され、方法は、
ａ）細胞含有生体試料を安定化するステップであり、安定化が、
ｉ）本発明の第１の態様の方法に従って滅菌された組成物を得ること；または
ｉｉ）滅菌されている、本発明の第６の態様に記載の組成物を得ること；または
ｉｉｉ）その中に含まれる組成物が滅菌されている本発明の第７の態様に記載の試料採集デバイスを得ること；および
前記細胞含有生体試料を前記滅菌された組成物と接触させること
を含む、ステップ；ならびに
ｂ）前記安定化された試料から細胞を単離するステップ
を含む。
【０２７９】
単離された細胞は、例えば、さらに分析することができる。上記のように、複数の実施形態では、滅菌された安定化組成物は、細胞表面特性（例えば、細胞表面エピトープまたはタンパク質）および／または細胞形態も保存する。詳細は上に記載し、それについては上記の開示を参照し、その開示はここにも適用される。
【０２８０】
さらなる態様によると、試料を患者から本発明の第七の態様による採集デバイスのチャンバー内に直接採集するステップを含む方法が提供される。採集デバイスおよび試料に関する詳細は上に記載している。それぞれの開示が参照される。１つの実施形態によると、血液試料を採集する、好ましくは、患者から抜き取る。
【０２８１】
本発明は、本明細書に開示する例示的方法および材料により限定されず、本明細書に記載するものと同様または等価のあらゆる方法および材料を本発明の実施形態の実施および試験に使用することができる。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。本明細書において提供する表題は、本明細書を全体として参照することにより読み取ることができる本発明の様々な態様または実施形態に対する限定ではない。
【０２８２】
主題の明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により明確に別段の規定がなされない限り、複数の態様を包含する。したがって、例えば、「１つの（ａ）カスパーゼ阻害剤」への言及は、単一のタイプのカスパーゼ阻害剤、ならびに２つ以上のカスパーゼ阻害剤を包含する。「本開示」および「本発明」などへの言及は、本明細書において教示される単一または複数の態様を包含する、などである。本明細書において教示される態様は、「発明」という用語に包含される。
【０２８３】
本明細書で使用する場合、「約」という表現は、所与の値±１０％を示すものとする。
【０２８４】
１つの実施形態によると、方法の場合に、ある一定のステップを含むとしてまたは組成物、溶液および／もしくは緩衝液の場合に、ある一定の成分を含むとして本明細書に記載する主題は、それぞれのステップまたは成分から成る主題を指す。本明細書に記載する好ましい実施形態を選択および組み合わせることは好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組み合わせから生ずる特定の主題も本開示に属する。
【０２８５】
以下の項目もまた開示される：
１．生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を生成するための方法であって、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコールおよびビタミンまたはそのビタミン誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために前記組成物を照射するステップ
を含む方法。
【０２８６】
２．
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコール、水溶性ビタミンまたはその誘導体、および脂溶性ビタミンより選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために前記組成物を照射するステップ
を含む、項目１に記載の方法。
【０２８７】
３．
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミンまたはその誘導体、および脂溶性ビタミンの水溶性誘導体より選択される少なくとも１つの化合物であって、必要に応じて、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミン、および水溶性ビタミンＥ誘導体より選択される、少なくとも１つの化合物
を含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために組成物を照射するステップ
を含む、項目１または２に記載の方法。
【０２８８】
４．滅菌のために前記組成物を照射するステップが、以下：
ａ）前記組成物が、イオン化照射により照射される；
ｂ）前記組成物が、ガンマ線照射、電子ビーム照射、もしくはＸ線により照射される；
ｃ）前記組成物が、ガンマ線照射もしくはＸ線により照射される；
ｄ）前記組成物が、ガンマ線照射により照射される；
ｅ）前記組成物が、５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、もしくは約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの照射線量で照射される；
ｆ）前記組成物か、５ｋＧｙから３５ｋＧｙ、６ｋＧｙから３０ｋＧｙ、７ｋＧｙから２６ｋＧｙ、約８ｋＧｙから約２５ｋＧｙ、もしくは約８ｋＧｙから約１５ｋＧｙの照射線量でガンマ線照射により照射される；
ｇ）前記組成物が、８ｋＧｙから２５ｋＧｙ、もしくは８ｋＧｙから１５ｋＧｙの照射線量でガンマ線照射により照射される；および／または
ｈ）照射による滅菌の結果、前記組成物の無菌性保証水準（ＳＡＬ）が１０−６以下になる
の特徴の１つ以上を有する、項目１から３のいずれかの項目に記載の方法。
【０２８９】
５．前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、固体形態で調製される；
ｂ）前記組成物が、固体形態で調製され、照射前に溶解されて、水性であることが好ましい液体組成物が提供される；
ｄ）前記組成物が、液体形態で調製され照射される；
ｅ）前記組成物が、水性である；
ｆ）前記組成物が、酸性ｐＨを有する；
ｇ）前記組成物が、ｐＨ４．０から７．０、ｐＨ４．１から６．９、ｐＨ４．２から６．８、ｐＨ４．３から６．６、ｐＨ４．４から６．３、ｐＨ４．５から６．０、またはｐＨ４．５から５．５を有する、および／または
ｈ）前記組成物が緩衝されている
の特徴の１つ以上を有する、項目１から４のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９０】
６．前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射される、項目１から５のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９１】
７．前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミンまたはその誘導体、および脂溶性ビタミンの水溶性誘導体より選択される前記少なくとも１つの化合物を、２０ｍｇ／ｍｌ未満、１５ｍｇ／ｍｌ以下、１０ｍｇ／ｍｌ以下、７ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、または１．５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で含む、項目１から６のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９２】
８．前記組成物が、
ｉ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６、アスコルビン酸またはその誘導体、およびトロロックスより選択される化合物；
ｉｉ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、アスコルビン酸またはその誘導体、およびトロロックスより選択される化合物；
ｉｉｉ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６、およびアスコルビン酸より選択される化合物；
ｉｖ．Ｎ−アセチル−システイン、還元型であることが好ましいグルタチオン、およびアスコルビン酸またはその誘導体より選択される化合物；または
ｖ．Ｎ−アセチル−システイン
を含む、項目１から７のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９３】
９．ａ）
ｉ．好ましくは項目１５に記載の少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．
ａａ）０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度のＮ−アセチル−システイン；
ａｂ）還元型であることが好ましい、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌまたは０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度のグルタチオン；
ａｃ）２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度のアスコルビン酸またはその誘導体；
ａｄ）０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、または０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度のビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６；
ａｅ）０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度のトロロックス
の少なくとも１つを含む組成物を提供するステップ；ならびに
ｂ）滅菌のために前記組成物を照射するステップ
を含み、
前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインをａａ）に記載の濃度で含むことが好ましい、
項目１から８のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９４】
１０．前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射される、および／または、前記組成物が、滅菌のためにガンマ線照射により照射される、項目９に記載の方法。
【０２９５】
１１．前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを含む；
ｂ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で含む；
ｃ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを含み、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される；および／または
ｄ）前記組成物が、Ｎ−アセチル−システインを、０．０５ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ、または０．３ｍｇ／ｍｌから０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、水性液体形態で滅菌される
の特徴の１つ以上を有する、項目１から１０のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９６】
１２．前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、グルタチオンを含む；
ｂ）前記組成物が、グルタチオンを還元型として含む；
ｃ）前記組成物が、グルタチオンを、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、前記グルタチオンは、還元型であることが好ましい；
ｄ）前記組成物が、グルタチオンを含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌され、前記グルタチオンは、還元型であることが好ましい；および／または
ｅ）前記組成物が、グルタチオンを、０．０３ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、０．０７５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌから４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または０．４ｍｇ／ｍｌから１．３ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、水性液体形態で滅菌され、前記グルタチオンは、還元型であることが好ましい
の特徴の１つ以上を有する、項目１から１１のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９７】
１３．前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、少なくとも１つの水溶性ビタミンまたはその誘導体を含み、前記水溶性ビタミンが、アスコルビン酸またはその誘導体、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびパントテン酸より選択されることが好ましく、前記組成物が、アスコルビン酸を含むことがさらに好ましい；
ｂ）前記組成物が、アスコルビン酸またはその誘導体、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、葉酸塩または葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびパントテン酸より選択されることが好ましく、アスコルビン酸であることがさらに好ましい少なくとも１つの水溶性ビタミンまたはその誘導体を、２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含む；
ｃ）前記組成物が、少なくとも１つの水溶性ビタミンまたはその誘導体を含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｄ）前記組成物が、アスコルビン酸を含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｅ）前記組成物が、少なくとも１つの水溶性ビタミンまたはその誘導体を２０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌなどの濃度で含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｆ）前記組成物が、アスコルビン酸またはその誘導体を２０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で含み、前記濃度が、０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌから１３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌ、または２ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌより選択されてもよく、また、前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される；
ｇ）前記組成物が、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６を０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、または０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む；ならびに／または
ｈ）前記組成物が、ビタミンＢ、好ましくはビタミンＢ６を０．１ｍｇ／ｍｌから１５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌから７．５ｍｇ／ｍｌ、または０．２ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、前記組成物が、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される
の特徴の１つ以上を含む、項目１から１２のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９８】
１４．組成物が、以下：
ａ）組成物が、脂溶性ビタミンの水溶性誘導体を含み、必要に応じて、脂溶性ビタミンが、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＡおよびビタミンＫより選択される；
ｂ）組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体を含み、水溶性ビタミンＥ誘導体は、トロロックスであることが好ましい；
ｃ）組成物が、トロロックスを含む；
ｄ）組成物が、脂溶性ビタミンの水溶性誘導体、好ましくは水溶性ビタミンＥ誘導体、さらに好ましくはトロロックスを、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌもしくは１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む；
ｅ）組成物が、脂溶性ビタミンの水溶性誘導体を含み、液体形態、好ましくは水性形態で照射により滅菌される；
ｆ）組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体、好ましくはトロロックスを含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；
ｇ）組成物が、脂溶性ビタミンの水溶性誘導体を、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌもしくは１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される；ならびに／または
ｈ）組成物が、水溶性ビタミンＥ誘導体、必要に応じてトロロックスを、０．５ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌから３ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌから１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、液体形態、好ましくは水性形態で滅菌される
の特徴の１つ以上を有する、項目１から１３のいずれかの項目に記載の方法。
【０２９９】
１５．前記カスパーゼ阻害剤が、以下：
ａ）前記カスパーゼ阻害剤が、汎カスパーゼ阻害剤である；
ｂ）前記カスパーゼ阻害剤が、改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む；
ｃ）前記カスパーゼ阻害剤が、好ましくはカルボキシル末端においてＯ−フェノキシ（ＯＰｈ）基で改変されている改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む；
ｄ）前記カスパーゼ阻害剤が、好ましくはＮ末端においてグルタミン（Ｑ）基で改変されている改変カスパーゼ特異的ペプチドを含む；
ｅ）前記カスパーゼ阻害剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される；
ｆ）前記カスパーゼ阻害剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈおよびＺ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−ＦＭＫから成る群より選択される；ならびに／または
ｇ）前記カスパーゼ阻害剤が、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈである
の特徴の１つ以上を有する、項目１から１４のいずれかの項目に記載の方法。
【０３００】
１６．前記組成物が、
ａ）抗凝固薬および／またはキレート剤、好ましくはＥＤＴＡ；
ｂ）安定化剤としてポリ（オキシエチレン）ポリマー；および／または
ｃ）少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミド
のうちの１つ以上をさらに含む、項目１から１５いずれかの項目に記載の方法。
【０３０１】
１７．前記組成物が、少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマーをさらに含み、必要に応じて、前記組成物が、以下：
ａ）前記ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、ポリエチレングリコール、好ましくは非置換ポリエチレングリコールである；
ｂ）前記組成物が、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；
ｃ）前記組成物が、１５００未満の分子量を有する少なくとも１つのポリ（オキシエチレン）ポリマー、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、さらに好ましくは、前記分子量は、１００から８００、１５０から７００、２００から６００および２００から５００より選択される範囲に存する；
ｄ）前記組成物が、少なくとも１５００の分子量を有する高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマー、および、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーの分子量より少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、少なくとも３００または少なくとも４００低い少なくとも１つのさらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーであって、好ましくは１０００以下の分子量を有する低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーである、さらなるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含む；ならびに／または
ｅ）前記組成物が、高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーおよび低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーであるポリ（オキシエチレン）ポリマーを含み、前記高分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、１５００から５００００、１５００から４００００、２０００から３００００、２５００から２５０００、３０００から２００００、３５００から１５０００および４０００から１２５００より選択される範囲に存する分子量を有し、かつ／または、前記低分子量ポリ（オキシエチレン）ポリマーが、１０００以下の分子量を有し、好ましくは、前記分子量は、１００から１０００、１５０から８００、１５０から７００、２００から６００および２００から５００より選択される範囲に存する
の特徴の１つ以上を有する、項目１から１６のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０２】
１８．前記組成物が、少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミドをさらに含み、必要に応じて、前記組成物が、以下：
ａ）前記組成物が、式１
【化４】
2019500023.tif 000008
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は同一であり、もしくは異なり、水素残基、および線状もしくは分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基、好ましくはアルキル残基から選択され、Ｒ４は、酸素、硫黄もしくはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
に従う少なくとも１つの第一級、第二級または第三級アミドを含む；ならびに／または
ｂ）前記組成物が、Ｎ，Ｎ−ジアルキルプロパンアミド、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルプロパンアミド、および／もしくはブタンアミド
の特徴の１つ以上を有する、項目１から１７のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０３】
１９．前記組成物が、式１
【化５】
2019500023.tif 000009
（式中、Ｒ１は、水素残基またはアルキル残基、好ましくはＣ１−Ｃ５アルキル残基、Ｃ１−Ｃ４アルキル残基またはＣ１−Ｃ３アルキル残基、さらに好ましいＣ１−Ｃ２アルキル残基であり、Ｒ２およびＲ３は同一であり、または異なり、水素残基、および線状または分岐した様式に配列された１〜２０原子の炭素鎖長を有する炭化水素残基、好ましくはアルキル残基から選択され、Ｒ４は、酸素、硫黄またはセレン残基であり、好ましくは、Ｒ４は酸素である）
に従う少なくとも１つの化合物を含む、項目１から１８のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０４】
２０．式１に従う前記少なくとも１つの化合物が、第一級、第二級または第三級カルボン酸アミドである、項目１９に記載の方法。
【０３０５】
２１．前記滅菌された組成物が、以下：
ｉ）細胞含有試料に含まれている細胞内核酸の安定化に好適であり、好ましくは、細胞内ＲＮＡおよび／または細胞内ＤＮＡを安定化する；
ｉｉ）細胞含有試料中に存在する核酸の分解を、安定化に起因して低減させる；
ｉｉｉ）試料に含有されている細胞におけるトランスクリプトームおよび／または転写レベルの安定化に好適であり、好ましくは、ｃ−ｆｏｓ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−８およびｐ５３より選択される１つ以上のマーカー遺伝子の転写レベルを、安定化すると少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも４８時間にわたって安定化するのに好適である
の特徴の１つ以上を有する、項目１から２０のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０６】
２２．前記滅菌された組成物により有核細胞または一般の細胞の溶解が誘導されない、項目１から２１のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０７】
２３．前記滅菌された組成物が、核酸−核酸架橋、タンパク質−核酸架橋および／またはタンパク質−タンパク質架橋を誘導する架橋剤を含まず、また、ホルムアルデヒド放出剤の使用を含まない、項目１から２２のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０８】
２４．前記滅菌された組成物が、以下：
ａ）安定化により、安定化された細胞含有試料から細胞を単離することが可能になる；
ｂ）前記細胞含有試料が血液試料であり、血液試料に含有されている細胞が安定化される；
ｃ）前記細胞含有試料が血液試料であり、白血球が安定化される；
ｄ）細胞の形態が保存される；
ｅ）有核細胞の形態が保存される；
ｆ）前記試料が血液試料であり、含有されるリンパ球および／もしくは単球が安定化される；
ｇ）細胞表面エピトープが保存される；ならびに／または
ｈ）細胞表面タンパク質が保存される
の安定化特性を有する、項目１から２３のいずれかの項目に記載の方法。
【０３０９】
２５．滅菌可能な組成物であって、滅菌された形態の前記組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であり、前記組成物が、項目１から１８のいずれかの項目または項目１９から２４のいずれかの項目のステップａ）において提供される通りの組成物であり、好ましくは前記組成物が滅菌されている、滅菌可能な組成物。
【０３１０】
２６．細胞含有生体試料に含まれている細胞外核酸集団を安定化するための方法であって、
ａ）項目１から１８のいずれかの項目もしくは項目１９から２４のいずれかの項目に記載の方法に従って生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適な滅菌された組成物を得る、または滅菌された形態の項目２５に記載の組成物を得るステップ；および
ｂ）前記細胞含有生体試料を、安定化のために前記滅菌された組成物と接触させるステップ
を含む方法。
【０３１１】
２７．安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を単離するための方法であって、
ａ）項目２６に記載の方法に従って細胞含有生体試料を安定化するステップ；および
ｂ）細胞外核酸を単離するステップ
を含む方法。
【０３１２】
２８．細胞外核酸を処理および／または分析するための方法であって、
ａ）安定化された細胞含有生体試料から細胞外核酸を項目２７の方法に従って単離するステップ；ならびに
ｂ）単離された細胞外核酸を処理および／または分析するステップ
を含む方法。
【０３１３】
２９．生体試料の細胞外核酸集団またはその成分の安定化に好適な組成物を照射による滅菌中に防護するための、チオアルコールおよびビタミンまたはその誘導体から成る群より選択される少なくとも１つの化合物の使用。
【０３１４】
３０．少なくとも１つの化合物が、チオアルコール、水溶性ビタミンまたはその誘導体、および脂溶性ビタミンの水溶性誘導体から成る群より選択される；または
少なくとも１つの化合物が、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミンまたはその誘導体、および脂溶性ビタミンの水溶性誘導体より選択される；または
少なくとも１つの化合物が、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、水溶性ビタミン、および水溶性ビタミンＥ誘導体より選択される；または
少なくとも１つの化合物が、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオンであるチオアルコール、アスコルビン酸またはその誘導体、および水溶性ビタミンＥ誘導体より選択される、
項目２９の使用。
【０３１５】
３１．滅菌可能な組成物を生成するための方法であって、滅菌された形態の組成物が、生体試料の細胞外核酸集団の安定化に好適であり、方法が、
ａ）
ｉ．少なくとも１つのカスパーゼ阻害剤、および
ｉｉ．チオアルコールおよびビタミンまたはその誘導体より選択される少なくとも１つの化合物
を含む組成物を調製するステップ、ならびに、必要に応じて
ｂ）組成物を滅菌するステップ
を含む方法。
【０３１６】
３２．項目３１のステップａ）において調製される組成物が、項目１から１８のいずれかの項目または項目１９から２４のいずれかの項目のステップａ）において調製される通りの組成物である、項目３１の方法。
【０３１７】
３３．項目２５に記載の滅菌可能な組成物を含む試料採集デバイス、例えば、容器、好ましくは試料採集チューブなど。
【０３１８】
３４．項目２５に記載の滅菌可能な組成物または項目３３に記載の試料採集デバイスを含むキット。
【０３１９】
３５．安定化された細胞含有生体試料から核酸を単離するための方法であって、
ａ）細胞含有生体試料を安定化するステップであり、安定化が、
ｉ）項目１から２４のいずれかの項目に記載の方法に従って滅菌された組成物を得ること；または
ｉｉ）滅菌されている、項目２５に記載の組成物を得ること；または
ｉｉｉ）その中に含まれる組成物が滅菌されている項目３３に記載の試料採集デバイスを得ること；および
前記細胞含有生体試料を前記滅菌された組成物と接触させること
を含む、ステップ；ならびに
ｂ）前記安定化された試料から核酸を単離するステップ
を含む方法。
【０３２０】
３６．ステップｂ）が、細胞内核酸、好ましくは細胞内ＲＮＡおよび／または細胞内ＤＮＡを単離することを含む、項目３５に記載の方法。
【０３２１】
３７．前記安定化された試料から細胞を取り出し、取り出された細胞から核酸を単離するステップを含む、項目３５または３６に記載の方法。
【０３２２】
３８．安定化された細胞含有生体試料から細胞を単離するための方法であって、
ａ）細胞含有生体試料を安定化するステップであり、安定化が、
ｉ）項目１から２４のいずれかの項目に記載の方法に従って滅菌された組成物を得ること；または
ｉｉ）滅菌されている、項目２５に記載の組成物を得ること；
ｉｉｉ）その中に含まれる組成物が滅菌されている項目３３に記載の試料採集デバイスを得ること；および
前記細胞含有生体試料を前記滅菌された組成物と接触させること
を含むステップ；ならびに
ｂ）前記安定化された試料から細胞を単離するステップ
を含む方法。
【０３２３】
３９．項目１から２４のいずれかの項目に記載の方法によって得ることができるおよび／または得られた、滅菌された組成物。
【０３２４】
４０．項目３９に記載の滅菌された組成物を含む滅菌された試料採集デバイス、例えば、容器、好ましくは試料採集チューブなどであって、項目１から２４のいずれかの項目に記載の方法によって得ることができるか、そして／または得られた、滅菌された試料採集デバイス。
【０３２５】
本出願は、２０１５年１１月２０日出願のＥＰ  １５  １９５  ６５６．２および２０１６年４月５日出願のＥＰ  １６  １６３  ８６３．０の優先権を主張するものである。ＥＰ１５  １９５  ６５６．２およびＥＰ  １６  １６３  ８６３．０の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３２６】
実施例は、単に例示目的のものであり、本発明をいかなる様式でも限定するものとは解釈されるべきではない。
使用する略語：
ｃｃｆＤＮＡ：循環する無細胞ＤＮＡ
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＤＭＰＡ：ジメチルプロピオンアミド
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＢＣＴ：採血チューブ
ｋＧｙ：キログレイ
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【０３２７】
Ｉ．実験手順
特にガンマ線照射による滅菌の、細胞外核酸集団を安定化するための組成物（以下、「安定化試薬」または「安定化組成物」とも称する）に対する効果を２つの異なる手段によって決定した。安定化組成物の化学的分解プロファイルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって評価した。機能アッセイを実施して、細胞外核酸に対する組成物の安定化活性に対する滅菌の影響を決定した。このアッセイでは、細胞外核酸集団の好ましい実施形態としてｃｃｆＤＮＡを分析した。
【０３２８】
本発明者らは、驚くべきことに滅菌中に安定化組成物において生じる化学的分解を緩和するまたはさらには消滅させることが可能な化合物を識別することができた。重要なことに、これらの化合物により、同時に、滅菌された安定化組成物の最適な機能が可能になる。
【０３２９】
１．安定化試薬のＨＰＬＣ試験：
標準曲線を作成するために、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）をＤＭＳＯ中に溶解させ、希釈した。７．５、１５、３０および６０μｇ／ｍｌの濃度を使用して標準曲線を作成した。
【０３３０】
カスパーゼ阻害剤、ＥＤＴＡ、ＤＭＰＡおよびＰＥＧの混合物を含有する安定化試薬をガンマ線照射の前後に試験した。カスパーゼ阻害剤についての独特のピークを識別し、カスパーゼ阻害剤の総定量化のために標準曲線と比較した。照射の前後のカスパーゼ阻害剤の濃度を決定し、相対的な定量化のためにこれらの濃度を比較した。
【０３３１】
２．ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブの作製：
ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａ採血チューブ（Ａｌｐｈａ  ＢＣＴ）を作製するために、１０ｍｌ採血用のＢＤ標準チューブにｃｃｆＤＮＡ安定化試薬１．３から１．７ｍｌを充填した。試験した例示的な安定化試薬は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９に従って、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）、Ｋ２ＥＤＴＡ、ＤＭＰＡ、ＰＥＧ３００およびＰＥＧ１００００の混合物を含むものであった。チューブに真空を適用して１０．２５ｍｌを採血した。チューブを、エネルギーガンマ線供給源としてコバルト−６０を使用した５から３５ｋＧｙの範囲のガンマ線照射によって滅菌した。
【０３３２】
３．全血の安定化：
ｃｃｆＤＮＡレベルの安定化のために、血液をＡｌｐｈａ  ＢＣＴ中に抜き取った。１ｍｌ全血当たり１．８ｍｇのＫ２ＥＤＴＡを伴う１０ｍｌの噴霧乾燥ＥＤＴＡチューブ（ＢＤ）が非安定化陰性対照として供した。チューブを１０回反転させることによって血液と試薬を混合した。安定化されたおよび非安定化血液試料を直立に立てて室温で保管した。
【０３３３】
４．血漿の調製：
全血試料を周囲温度、１．９００×ｇで１５分間遠心分離した。透明な血漿画分を新しい遠心管に移した。第二ラウンドにおいて、血漿試料を、非安定化ＥＤＴＡ−血液の場合には１６．０００×ｇで１０分間遠心分離し、安定化されたＡｌｐｈａ  ＢＣＴ血液の場合には１．９００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を新たなチューブに移し、ｃｃｆＤＮＡの精製に直接使用するか、または使用するまで−２０℃で保管した。
【０３３４】
５．ＱＩＡａｍｐ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｋｉｔを用いたｃｃｆＤＮＡの手動での精製：
１ｍｌ、２ｍｌまたは３ｍｌ血清または血漿からの循環核酸の精製についてのプロトコルを用いて、ＱＩＡａｍｐ循環核酸キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）で血漿からＤＮＡを単離した。別段の明記がない限り、２ｍｌの血漿をプロテイナーゼＫおよび溶解緩衝液ＡＣＬと混合し、３０分間、６０℃でインキュベートし、緩衝液ＡＣＢと混合し、製造業者の推奨に従って、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ真空マニホールドを使用してＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉカラムに結合させ、洗浄し、６０μｌ溶離緩衝液ＡＶＥで溶離した。
【０３３５】
６．ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙでのｃｃｆＤＮＡの自動精製：
ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の予備バージョンを用いて２ｍｌ血漿からｃｃｆＤＮＡを単離した。別段の規定がなされなければ、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙロボットにより２ｍｌ血漿をプロテイナーゼＫ、結合緩衝液および磁気ビーズと混合した。ＤＮＡが結合したビーズを３回洗浄し、溶出緩衝液６０μｌを使用したＤＮＡを溶出させた。
【０３３６】
７．定量的、リアルタイムＰＣＲアッセイおよびｃｃｆＤＮＡコピーの算出：
ｃｃｆＤＮＡの量を測定するために、Ａｂｉ  Ｐｒｉｓｍ  ＨＴ７９００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのリアルタイムＰＣＲアッセイを、溶出液３μｌを用いて実施した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を使用した２０μｌアッセイ体積で、ヒト１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の２つの断片を多重ＰＣＲで増幅した。３０００から０．３ゲノム当量に希釈したヒトゲノムＤＮＡ（１ゲノム当量は、約６．６ｐｇのヒトゲノムＤＮＡに等しい）を用いて作成した標準曲線との比較により完全定量を達成した。
【表１】
2019500023.tif 000010
【０３３７】
６６ｂｐ断片の定量を用いて、血漿中の１８Ｓ  ｒＤＮＡコピーの総量を反映させた。５００ｂｐの定量を用いて、アポトーシスに由来するまたは全血から機械的に溶解された白血球に由来する１８Ｓ  ｒＤＮＡコピーの量を決定した。無細胞ＤＮＡは、１４０〜１７０ｂｐの典型的長さ（Ｆｏｒｓｈｅｗら（２０１２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４（１３６）  １３６ｒａ６８）を有する。それ故、５００ｂｐ断片は、アポトーシス血球、溶解血球または別様に破壊された血球に由来すると考えられる。０日目と３または６日保管の間の５００ｂｐ断片からのコピー数の増加を安定性効率の測定値として使用した。
【０３３８】
ＩＩ．実施例
１．実施例１：ｃｃｆＤＮＡ安定化に対するガンマ線照射の効果
ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブを作製し、異なるエネルギーレベルのガンマ線照射によって滅菌した。８名のドナーからの１０ｍｌ全血の試料を１０ｍｌ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブ（非安定化対照）およびＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブに採集した。血漿を採血直後に５ｍｌの安定化血液試料または非安定化血液試料から生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍｌ血漿から手動で精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三連反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３３９】
ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９による安定化試薬混合物（１つのＡｌｐｈａチューブについて）は、１１．４５μｌカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ；１ｍｇを３８８μｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの）であった。試薬は、ＰＥＧ１０．０００、ＰＥＧ３００、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。全血の添加後、Ａｌｐｈａチューブは、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈをおよそ５μＭの最終濃度で含んだ。
【０３４０】
非安定化対照は、Ｋ２ＥＤＴＡを全血中１．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度で含んだ。
【０３４１】
血漿中のｃｃｆＤＮＡレベルに対するガンマ線照射の効果を図１に示す。図は、非安定化ＥＤＴＡ血液中（左）、および、Ａｌｐｈａチューブ（非無菌性のものまたは異なる線量のガンマ線照射で滅菌されたもの）中に引き込んだ安定化血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化および標準偏差を示す。試料は８名のドナーからのものであり、６日間、室温で保管した。
【０３４２】
分かるように、コピー数の比（６日目／０日目）は、安定化された試料（Ａｌｐｈａチューブ）において、非安定化対照（ＥＤＴＡ血液、左）と比較して低く、これにより、安定化された試料では細胞外核酸の安定化が起こったことが実証される。しかし、安定化された試料と比較すると分かるように、ｃｃｆＤＮＡ安定化の効率は、安定化試薬を、安定化すべき血液試料に添加する前に滅菌するために使用したガンマ線照射の線量が増大するとともに低下する。ガンマ線照射の線量の増大に伴う安定化効率の低下は、線量の増大について得られるコピー数の比（６日目／０日目）が増大することによって可視化される。
【０３４３】
結論：
カスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬に適用する場合、滅菌のために使用されるガンマ線照射には、その後の安定化試薬によるｃｃｆＤＮＡ安定化に対して線量依存的効果がある。滅菌のために適用される照射線量が高いほど、その後の適用における安定化が低くなる。
【０３４４】
２．実施例２：ガンマ線照射によるカスパーゼ阻害剤の分解
ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブを作製し、異なるエネルギーレベルを用いてガンマ線照射によって滅菌した。ＨＰＬＣによる定量化のために、ＤＭＳＯのみに溶解させたカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）について標準曲線を作成した。作成された標準曲線を図２に示す。表２（以下）に、カスパーゼ阻害剤の濃度ならびに異なる濃度のカスパーゼ阻害剤についてのピーク面積および保持時間を示す。
【表２】
2019500023.tif 000011
【０３４５】
次のステップとして、カスパーゼ阻害剤の濃度を決定するために、Ａｌｐｈａチューブからの安定化試薬を照射の前後に測定した。総定量化のために、カスパーゼ阻害剤についての独特のピークを標準曲線と比較した。滅菌後に分解されていないカスパーゼ阻害剤の百分率を、滅菌されていないＡｌｐｈａチューブと比較することによって算出した。
【０３４６】
結果を表３（以下）に示す。この表には、ＨＰＬＣによって決定された、試験した異なる試料についてのピーク面積および保持時間、ならびに標準曲線に基づいて算出した阻害剤の濃度を示す。
【表３】
2019500023.tif 000012
【０３４７】
ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９による安定化試薬中の他の成分によって引き起こされるピークは、プロセス中にカスパーゼ阻害剤についてのピークよりも前に生じる。カスパーゼ阻害剤は２６分の時点で生じるが、さらなる成分は、１６から２２分の範囲に近い。したがって、安定化試薬に関するＨＰＬＣ結果とカスパーゼ阻害剤のみ（標準曲線の作成のために使用した）に関するＨＰＬＣ結果を比較することにより、安定化試薬中のカスパーゼ阻害剤の検出に関して他の構成物（ＥＤＴＡ、ＰＥＧおよびＤＭＰＡ）によって引き起こされる干渉は存在しないことが実証される。
【０３４８】
結論：
結論として、ＨＰＬＣは、ガンマ線照射によって引き起こされるカスパーゼ阻害剤分解の程度を定量化するための有用な技法である。カスパーゼ阻害剤の分解は、照射中に起こり、滅菌後のｃｃＤＮＡレベルの安定化の低減（図１を参照されたい）は、インタクトな分解されていないカスパーゼ阻害剤の濃度の低下に関連する。
【０３４９】
異なる線量のガンマ線照射のカスパーゼ阻害剤に対する影響をさらに調査するために、異なる線量のガンマ線照射で滅菌された安定化試薬の異なるバッチからのＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブにおいてカスパーゼ阻害剤を定量化した。Ａｌｐｈａチューブには、上の表３に記載した安定化試薬を含めた。
【０３５０】
結果を表４（以下）に示す。分かるように、ガンマ線照射には、カスパーゼ阻害剤分解に対する線量依存的効果がある。
【表４】
2019500023.tif 000013
【０３５１】
結論：
ガンマ線照射には、安定化試薬中のカスパーゼ阻害剤分解に対する線量依存的効果がある。照射線量が高いほど、より多くの分解が起こる。カスパーゼ阻害剤に対するガンマ線照射によって引き起こされる分解効果を定量化するためにＨＰＬＣを使用することができる。
【０３５２】
３．実施例３：スカベンジャー添加のｃｃｆＤＮＡ安定化に対する効果
ガンマ線照射による滅菌中のカスパーゼ阻害剤の分解を防止するために、成分を、カスパーゼ阻害剤を照射中の分解から防護するそれらの能力について試験した。さらなる成分自体が細胞外核酸のレベルに対して負の影響を有することを排除するために、これらの化合物を、カスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）を含み、ＰＥＧ、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含む安定化試薬に添加し、機能アッセイにおいて試験した。
【０３５３】
８名のドナーからの１０ｍｌ全血の試料を１０ｍｌ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブ中に採集した。採血直後に、細胞外核酸安定化に対するそれらの影響について試験した異なる化合物の添加を伴ってまたは伴わずに、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９によるｃｃｆＤＮＡ安定化試薬１．７ｍｌを添加することにより、非安定化血液試料を安定化した。
【０３５４】
安定化試薬は以下を含むものであった（１０ｍｌ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血について）：
１１．４５μｌカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ；１ｍｇを３８８μｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの）、試薬は、ＰＥＧ１０．０００、ＰＥＧ３００、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。スカベンジャーを以下にさらに詳述する通り添加した。
全血の添加後、Ａｌｐｈａチューブには、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが５μＭの最終濃度で含まれた。
【０３５５】
血漿を採血直後（０日目）に５ｍｌの安定化血液試料から生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した（６日目）。ｃｃｆＤＮＡを２ｍｌ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三連反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３５６】
ａ）Ｎ−アセチル−システイン、アスコルビン酸、没食子酸およびタンニン酸の添加
Ｎ−アセチル−システイン、アスコルビン酸、没食子酸またはタンニン酸を安定化試薬に図３に示す濃度で添加した：Ｎ−アセチル−システイン、２ｍｇ／ｍｌ；アスコルビン酸、５ｍｇ／ｍｌ；没食子酸、２ｍｇ／ｍｌ；タンニン酸、１ｍｇ／ｍｌ。
【０３５７】
全血中の最終濃度は、１．７ｍＭ  Ｎ−アセチル−システインまたは４．０ｍＭ  アスコルビン酸または１．７ｍＭ  没食子酸または０．０９ｍＭ  タンニン酸であった。
【０３５８】
結果を図３に示す。この図は、安定化試薬のみについての保管後（左）およびＮ−アセチル−システイン、アスコルビン酸、没食子酸またはタンニン酸の添加した時の、安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化を示す。結果は、６日間、室温で保管した、８名のドナーからの血液からのものである。
【０３５９】
結論：
アスコルビン酸およびＮ−アセチル−システインなどのある特定のラジカルスカベンジャーの、カスパーゼ阻害剤を含有する安定化試薬への添加は、ｃｃｆＤＮＡ安定化特性に影響を及ぼすことなく可能である。
【０３６０】
しかし、驚くべきことに、図３において６日目と０日目の間の５００ｂｐコピー数の比の増大および６６ｂｐ断片および５００ｂｐ断片の両方について標準偏差が高いことから分かるように、先行技術においてガンマ線により誘導されるフリーラジカルに対して有効であることが報告されたタンニン酸または没食子酸などのある特定のラジカルスカベンジャーの添加により、ｃｃｆＤＮＡ安定化試薬を用いて安定化された血液中のＤＮＡの放出の増加が導かれることが判明した。したがって、これらの化合物は、細胞外核酸集団を安定化するための組成物における使用には不適当である。
【０３６１】
ｂ）異なる濃度のアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオン（還元型）の添加
さらなる実験において、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオン（還元型）を安定化試薬に図４に示す濃度で添加した：アスコルビン酸、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌ；Ｎ−アセチル−システイン、２ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌ；グルタチオン（還元型）、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ。
【０３６２】
全血中の最終濃度は：４．０ｍＭまたは８．０ｍＭまたは１６．０ｍＭのアスコルビン酸；１．７ｍＭまたは３．５ｍＭまたは８．７ｍＭのＮ−アセチル−システイン；または０．０５ｍＭまたは０．２３ｍＭまたは０．４７ｍＭのグルタチオン（還元型）であった。
【０３６３】
結果を図４に示す。この図は、安定化試薬のみについての保管後（左）およびアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオン（還元型）を異なる濃度で添加した時の安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化を示す。血液は、８名のドナーからのものであり、６日間、室温で保管した。
【０３６４】
図５は、採血直後に決定した安定化血液中の全１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片のコピー数の平均を示す。
【０３６５】
結論：
アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインまたはグルタチオン（還元型）を含む安定化試薬は、試験した濃度で良好な安定化性を示した（図４）。図５から分かるように、アスコルビン酸を、当技術分野においてガンマ線に誘導されるフリーラジカルに対して（放射線）防護的であることが報告されている濃度である２０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することにより、ｃｃｆＤＮＡの絶対的なコピー数の減少が導かれた。
【０３６６】
ｃ）アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオンの種々の組み合わせの添加
別の実験において、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオンの種々の組み合わせの、安定化試薬のｃｃｆＤＮＡ安定化特性に対する影響を試験した。
【０３６７】
この目的で、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオン（還元型）を、図６に示される通りの組み合わせおよび濃度で：アスコルビン酸（２ｍｇ／ｍｌ）およびグルタチオン（０．２ｍｇ／ｍｌ）；Ｎ−アセチル−システイン（１ｍｇ／ｍｌ）およびグルタチオン（０．２ｍｇ／ｍｌ）；アスコルビン酸（２ｍｇ／ｍｌ）およびＮ−アセチル−システイン（１ｍｇ／ｍｌ）；アスコルビン酸（２ｍｇ／ｍｌ）、Ｎ−アセチル−システイン（１ｍｇ／ｍｌ）およびグルタチオン（０．２ｍｇ／ｍｌ）、安定化試薬に添加した。
【０３６８】
全血中の最終濃度は：１．６５ｍＭのアスコルビン酸および０．１ｍＭのグルタチオン（還元型）；０．９ｍＭのＮ−アセチル−システインおよび０．１ｍＭのグルタチオン（還元型）；１．６５ｍＭのアスコルビン酸および０．９ｍＭのＮ−アセチル−システイン；１．６５ｍＭのアスコルビン酸および０．９ｍＭのＮ−アセチル−システインおよび０．１ｍＭのグルタチオン（還元型）であった。
【０３６９】
結果を図６に示す。この図は、６日間、室温で保管した、８名のドナーからの安定化血液中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化を示す。
【０３７０】
図６から分かるように、試験したスカベンジャーの組み合わせを用いて、良好なｃｃｆＤＮＡ安定化特性を得ることができた。
【０３７１】
結論：
カスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬にアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオン（還元型）などの本発明によるラジカルスカベンジャーの組み合わせを好適な濃度で添加することが、ｃｃｆＤＮＡ安定化特性に影響を及ぼすことなく可能である。
【０３７２】
４．実施例４：スカベンジャー添加のガンマ線照射後のカスパーゼ阻害剤濃度およびｃｃｆＤＮＡ安定化に対する効果
スカベンジャー添加の、ガンマ線照射による滅菌中のカスパーゼ阻害剤分解に対する効果を分析した。また、スカベンジャー添加（滅菌前、カスパーゼ阻害剤を防護するために）の、（滅菌された）安定化試薬のｃｃｆＤＮＡ安定化特性に対する効果を評価した。
【０３７３】
安定化試薬を、ラジカルスカベンジャーの添加を伴ってまたは伴わずに生成し、バルクでガンマ線照射によって滅菌した。カスパーゼ阻害剤濃度を照射の前後にＨＰＬＣによって測定して、スカベンジャー添加の、ガンマ線照射による滅菌中のカスパーゼ阻害剤分解に対する効果を決定した。
安定化試薬は以下を含むものであった（１０ｍｌ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血について）：
１１．４５μｌカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ；１ｍｇを３８８μｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの）、試薬は、ＰＥＧ１０．０００、ＰＥＧ３００、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。スカベンジャーを以下にさらに詳述する通り添加した。全血の添加後、Ａｌｐｈａチューブには、Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈが５μＭの最終濃度で含まれた。
【０３７４】
スカベンジャーを表５（以下）に示す濃度で安定化試薬に添加した。
【表５】
2019500023.tif 000014
【０３７５】
滅菌前のスカベンジャー添加の、滅菌された安定化試薬のｃｃｆＤＮＡ安定化特性に対する効果を分析するために、８名のドナーからの１０ｍｌ全血の試料を１０ｍｌ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブ中に採集し、スカベンジャーを伴うまたは伴わないｃｃｆＤＮＡ安定化試薬のそれぞれを１．７ｍｌで用いて安定化した。血漿を採血直後に５ｍｌの安定化血液試料から生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍｌ血漿から精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三重反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３７６】
添加したスカベンジャーおよび使用した濃度を図７に示す。全血中の最終濃度は、０．４２ｍＭ  没食子酸、４．０ｍＭ  アスコルビン酸、１２ｍＭ  Ｎ−アセチル−システイン、０．０５ｍＭ  グルタチオンまたは０．７３ｍＭ  トロロックスであった。
【０３７７】
結果を図７に示す。照射を行った、カスパーゼ阻害剤を含み、異なるスカベンジャーを含有する安定化試薬を用いて安定化された血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数の平均変化（×倍変化）。６日間、室温で保管した、８名のドナーからの平均値。
【０３７８】
採血後６日目と０日目の採血直後の間の６６ｂｐ断片および５００ｂｐ断片の全コピー数の比が高いこと、ならびに標準偏差が大きいことから認識できるように、没食子酸では、ガンマ線照射によって誘導されるｃｃｆＤＮＡ安定化の低下が防止されなかった。これは、ＨＰＬＣによって測定された高分解率と一致する（表５）。それとは対照的に、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオンなどのスカベンジャーでは、６日目と０日目の間のコピーの比によって測定されるｃｃｆＤＮＡのレベルが安定化された。トロロックスも安定化効果を示した。
【０３７９】
結論：
驚くべきことに、選択されたアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオンおよびトロロックスなどのスカベンジャーの添加によってのみ、カスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９による安定化試薬などのガンマ線照射によって引き起こされるカスパーゼ阻害剤の分解が防止される。
【０３８０】
同様に驚くべきことに、ある特定のアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオンおよびトロロックスなどのスカベンジャーの添加により、ガンマ線照射の、カスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬を用いて安定化された血液におけるｃｃｆＤＮＡの安定性レベルに対する負の効果が防止される。
【０３８１】
対照的に、フリーラジカルを取り除くことが公開されているいくつものスカベンジャーでは、照射によって引き起こされるカスパーゼ阻害剤分解は防止されず、かつ／または、血液保管後のｃｃｆＤＮＡのレベルの上昇が引き起こされ、したがって、安定化に干渉した。これは、特に、没食子酸に当てはまる。
【０３８２】
５．実施例５：スカベンジャー活性の概要
一方でガンマ線照射からの防護を示し、他方でｃｃｆＤＮＡ安定性に対する効果を示す、試験したスカベンジャーの概要を表６に示す。
【表６】
2019500023.tif 000015
【０３８３】
結論：
アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオンおよびトロロックスなどの特定のラジカルスカベンジャー、特に、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−システインおよびグルタチオンを添加するだけで、ガンマ線照射による滅菌の結果としてのカスパーゼ阻害剤の分解が防止されるまたは効率的に低減する。驚くべきことに、これらのラジカルスカベンジャーの添加により、カスパーゼ阻害剤を含む安定化組成物を用いて達成されるｃｃｆＤＮＡ安定化の質は保存される。
【０３８４】
有効なスカベンジング化合物およびそれらの有効濃度は、以前公開された放射線防護賦形剤とは有意に異なる。例えば、没食子酸およびタンニン酸だけでなくマンニトール、イソプロパノールおよびＴｗｅｅｎ−８０もスカベンジャーとして以前に記載されている。しかしこれらは、ガンマ線照射に対するカスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬の防護をなさない。また、タンニン酸および没食子酸などの以前に記載されたスカベンジャーは、安定化試薬の安定化効果に干渉した。
【０３８５】
６．実施例６：ガンマ線照射中のカスパーゼ阻害剤防護に対するスカベンジャーの効果およびカスパーゼ阻害剤濃度
ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９による安定化試薬を、異なる濃度のラジカルスカベンジャーの添加を伴ってまたは伴わずに、および異なる濃度のカスパーゼ阻害剤を用いて生成した。ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブを、それぞれの安定化試薬１．７ｍｌを標準のＶａｃｕｔａｉｎｅｒに充填することによって生成した。チューブを異なるエネルギーレベルのガンマ線照射によって滅菌した。カスパーゼ阻害剤濃度を照射の前後にＨＰＬＣによって測定した（以下の表７参照）。
【０３８６】
安定化試薬は、チューブ当たり以下を含むものであった：
３．３μｌまたは６．６μｌまたは９．８μｌカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ；１８ｍｇを２ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの；血中最終濃度それぞれ５、１０または１５μＭ）、試薬は、ＰＥＧ１０．０００、ＰＥＧ３００、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。
【０３８７】
スカベンジャーを表７に示す異なる濃度および組み合わせで安定化試薬に添加した。
【表７−１】
2019500023.tif 000016
【表７−２】
2019500023.tif 000017
【表７−３】
2019500023.tif 000018
【表７−４】
2019500023.tif 000019
【０３８８】
結論：
本発明と併せて有用なラジカルスカベンジャーは、広い濃度範囲にわたって有効である。試験した濃度範囲（スカベンジャーおよびカスパーゼ阻害剤）について、スカベンジャーによって付与された防護のレベルは、使用したカスパーゼ阻害剤濃度にほとんど依存しない。ラジカルスカベンジャーを組み合わせて防護をさらに改善することができる。
【０３８９】
７．実施例７：滅菌されたＡｌｐｈａチューブ中のスカベンジャー濃度のｃｃｆＤＮＡ安定化に対する効果
実施例６からのＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ａｌｐｈａチューブの選択を機能的試験に使用してｃｃｆＤＮＡ安定化特性を決定した。Ｎ−アセチル−システインを異なる濃度で安定化試薬に添加した。０．５、１．０、２．０および４．０ｍｇ／ｍｌ  Ｎ−アセチル−システインを伴うＡｌｐｈａチューブを図８に示す通り調製した。チューブを非無菌で使用したまたは使用前に異なる線量のガンマ線照射で滅菌した。４名のドナーからの１０ｍｌ全血の試料をそれぞれ１０ｍｌ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブ（非安定化対照）およびＡｌｐｈａチューブ（滅菌対照および非滅菌対照として）中に採集した。全血中のＮ−アセチル−システインの最終濃度は、０．４４、０．８８、１．７５および３．５ｍＭとした。非安定化対照チューブには、１．８ｍｇ／ｍｌ  Ｋ２ＥＤＴＡ（全血中の最終濃度）を含めた。血漿を採血直後に５ｍｌの安定化血液試料または非安定化血液試料から生成した。残りの血液は、さらに６日間、室温で保管した後、血漿を生成した。ｃｃｆＤＮＡを２ｍｌ血漿からＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙで精製し、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数を三連反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３９０】
安定化試薬は、チューブ当たり以下を含むものであった：
３．３μｌカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ；１８ｍｇを２ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの；血中最終濃度５μＭ）、試薬は、ＰＥＧ１０．０００、ＰＥＧ３００、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。
【０３９１】
ｃｃｆＤＮＡの安定化を定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。結果を図８Ａ、Ｂに示す。非安定化ＥＤＴＡ血液中、ならびに、０．５、１．０、２．０および４．０ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−システインをＡｌｐｈａチューブに引き込んだ安定化血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の６６ｂｐおよび５００ｂｐ断片のコピー数（×倍変化）の平均変化および標準偏差（非無菌性のものまたは異なる線量のガンマ線照射で滅菌されたもの）を比較した。
【０３９２】
図８Ａ、Ｂから分かるように、Ｎ−アセチル−システインにより、試験した全ての濃度で、広範囲の照射線量、およびさらには３０ｋＧｙという高線量においても優れた防護がもたらされた。さらに、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを含む非照射（０Ｇｙ）安定化試薬から分かるように、Ｎ−アセチル−システインの添加は、安定化試薬による細胞外核酸の安定化には干渉しない。
【０３９３】
結論：
Ｎ−アセチル−システインは、広範囲の濃度でガンマ線照射からの防護に役立つ。ラジカルスカベンジャーを安定化試薬に添加することで、ガンマ線照射のｃｃｆＤＮＡ安定性に対する線量依存的効果が排除される。Ｎ−アセチル−システインは、安定化試薬による細胞外核酸の安定化には干渉せず、照射中のカスパーゼ阻害剤の分解を防止するための防護剤として使用されることが好ましい。
【０３９４】
８．実施例８：水溶性ビタミンＢ６をスカベンジャーとして添加することの、ガンマ線照射後のｃｃｆＤＮＡレベル安定化に対する効果
ガンマ線照射による滅菌中のカスパーゼ阻害剤分解を防止するためにビタミンＢ６をスカベンジャーとして添加することの効果を分析した。安定化試薬を、ビタミンＢ６の添加を伴ってまたは伴わずに生成し、３０ｋＧｙのガンマ線照射によってバルクで滅菌した。
【０３９５】
８名のドナーからの１０ｍｌ全血の試料を１０ｍｌ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブ中に採集し、採血直後に、滅菌された、スカベンジャーを伴うまたは伴わないｃｃｆＤＮＡ安定化試薬１．７ｍｌを添加することによって安定化した。血液試料を室温で５日間保管した後、血漿を生成した。安定化血液試料を用いたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙでのｃｃｆＤＮＡの自動精製を、２．４ｍｌ血漿からＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡキットおよびプロトコルＰＡＸｃｉｒｃＤＮＡ＿２４００＿ＬＡＦ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を用いて実施した。対照として、非安定化血液試料からのｃｃｆＤＮＡ精製を、２．０ｍｌ血漿からＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて実施した。ビタミンＢ６の添加を伴って生成されたが滅菌されていない安定化試薬も実験に含めた。全１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数（５００ｂｐ断片）を三連反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０３９６】
安定化試薬は、以下を含むものであった（１０ｍｌ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血について）：
３．２８μｌカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ；１ｍｇを１１１μｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの）、試薬は、ＰＥＧ、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。ＰＥＧ３００およびＰＥＧ１０．０００などの好適なポリエチレングリコールは上に記載している。スカベンジャーであるビタミンＢ６（ピリドキシン）を含む安定化試薬については、ビタミンＢ６（ピリドキシン）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で安定化試薬に添加した。安定化された血液中の最終的なカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ）濃度はおよそ５μＭであった。全血中のビタミンＢ６（ピリドキシン）の最終濃度はおよそ１．７ｍＭであった。
【０３９７】
室温で５日間保管した８名のドナーからの血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の平均全コピー数が図９に示される。血液試料を、スカベンジャーとしてビタミンＢ６を伴う安定化試薬（左のバー）または伴わない安定化試薬（左から３番目のバー）を用いて安定化した。これらの安定化試薬は滅菌されたものであった（３０ｋＧｙ）。対照として、ビタミンＢ６を伴うが滅菌されていない安定化試薬（左から２番目のバー）および非安定化ＥＤＴＡ血液（左から４番目のバー）を含めた。
【０３９８】
スカベンジャーとしてビタミンＢ６を含有する安定化試薬（照射を行ったものならびに照射を行っていないもの）を用いて安定化した血液試料では、１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の数は、スカベンジャーを伴わない安定化試薬（照射を行ったもの）と比較してたった半分であった。天然に存在するｃｃｆＤＮＡのサイズはおよそ１５０ｂｐであるので、それよりも長い断片は、溶解されたまたはアポトーシス性の白血球に由来するものである。したがって、スカベンジャーとしてビタミンＢ６を含む安定化試薬を用いて安定化した血液試料中で観察された１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の数が少ないことは、血液が効率的に安定化されたことを示す。特に、照射を行った、ビタミンＢ６を含む安定化試薬を用いた安定化は、照射を行った、スカベンジャーを伴わない安定化試薬を用いて観察された安定化よりも優れたものであった。これにより、照射中、安定化試薬の安定化性がビタミンＢ６によって効率的に防護されたことが示される。非安定化血液を用いた陰性対照では、５００ｂｐ断片コピー数は、安定化された血液試料と比較して２５から５０倍も多かった。
【０３９９】
結論：
スカベンジャーのアスコルビン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、グルタチオンおよびトロロックスと同様に、水溶性ビタミンＢ６によっても、カスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬を用いて安定化された血液中のｃｃｆＤＮＡの安定性レベルに対するガンマ線照射の負の効果が防止された。したがって、ビタミンＢ６の添加により、照射中に安定化組成物が防護され、滅菌された安定化組成物を良好な安定化性で調製することが可能になる。
【０４００】
９．実施例９：異なるカスパーゼ阻害剤のｃｃｆＤＮＡレベル安定化に対する効果および滅菌中の異なるカスパーゼ阻害剤の効率的な防護
異なるカスパーゼ阻害剤（Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ）の添加の、全血中のｃｃｆＤＮＡレベルの安定化に対する効果を試験した。また、これらの異なるカスパーゼ阻害剤の滅菌中の照射による分解からの防護を分析した。
【０４０１】
安定化試薬を、カスパーゼ阻害剤としてＢｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫまたはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫの添加を伴って、滅菌に対する防護薬としてスカベンジャーであるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を伴ってまたは伴わずに生成した。ＮＡＣを添加した場合には、試薬を３０ｋＧｙのガンマ線照射によってバルクで滅菌した。ｃｃｆＤＮＡレベルの安定化をＰＡＸｇｅｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）および非安定化ＥＤＴＡ血液と比較した。
【０４０２】
６名のドナーからの１０ｍｌ全血の試料を１０ｍｌ噴霧乾燥Ｋ２ＥＤＴＡチューブ中に採集し、１．７ｍｌ安定化試薬を添加することによって安定化した。それに加えて、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡチューブ中に採集したまたは不安定なまま維持した。血液試料を室温で５日間保管した後、血漿を生成した。安定化血液試料を用いたＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙでのｃｃｆＤＮＡの自動精製を、２．４ｍｌ血漿からＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  ｋｉｔおよびプロトコルＰＡＸｃｉｒｃＤＮＡ＿２４００＿ＬＡＦ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）を用いて実施した。対照として、非安定化血液試料からのｃｃｆＤＮＡ精製を、２．０ｍｌ血漿からＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ａｎｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて実施した。全１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のコピー数（５００ｂｐ断片）を三連反復でリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０４０３】
安定化試薬は、以下を含むものであった（１０ｍｌ  Ｋ２ＥＤＴＡ全血について）：
３．２８μｌカスパーゼ阻害剤（Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、１ｍｇを２１７μｌ  ＤＭＳＯに溶解させたものまたはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ、１ｍｇを１２２μｌ  ＤＭＳＯに溶解させたもの）。試薬は、ＰＥＧ、ＥＤＴＡおよびＤＭＰＡをさらに含み、水で全量１．７ｍｌとした。ＰＥＧ３００およびＰＥＧ１０．０００などの好適なポリエチレングリコールは上に記載している。スカベンジャーとしてＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を含む安定化試薬については、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で安定化試薬に添加した。安定化された血液中の最終的なカスパーゼ阻害剤濃度はおよそ５μＭであった。全血中のスカベンジャーの最終濃度はおよそ０．４４ｍＭであった。
【０４０４】
室温で５日間保管した６名のドナーからの血液試料中の１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の５００ｂｐ断片の平均全コピー数が図１０に示される。血液試料を、異なるカスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬を用いて安定化した。左のバー：カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（滅菌されていないもの）を含む安定化試薬；左から２番目のバー：カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびスカベンジャーとしてＮ−アセチル−システイン（滅菌されたもの）を含む安定化試薬；左から３番目のバー：カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（滅菌されていないもの）を含む安定化試薬；左から４番目のバー：カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびスカベンジャーとしてＮ−アセチル−システイン（滅菌されたもの）を含む安定化試薬；左から５番目のバー：ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡ  Ｔｕｂｅ；左から６番目のバー：非安定化ＥＤＴＡ血液。
【０４０５】
図１０から分かるように、カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫまたはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを用いて安定化された血液試料では、アポトーシス細胞に由来するとみなすことができる５００ｂｐ断片のコピー数は、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｃｃｆＤＮＡチューブを用いて安定化された血液中の断片数と同等であった。したがって、カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫを含む安定化試薬により、良好な安定化特性が達成される。スカベンジャーであるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を添加することにより、カスパーゼ阻害剤Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫおよびＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫがガンマ線照射から効率的に防護された。非安定化血液を用いた陰性対照では、５００ｂｐ断片コピー数は安定化された血液試料と比較して５０から１００倍多かった。
【０４０６】
結論：
カスパーゼ阻害剤Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈを含む安定化試薬と同様に（例えば、図９を参照されたい）、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫまたはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫなどの他のカスパーゼ阻害剤を含む安定化試薬により、ゲノムＤＮＡの血漿中への放出が防止され、それにより、ｃｃｆＤＮＡレベルが安定化する。特にＮ−アセチル−システインなどの、本発明に従って使用される化合物により、異なるカスパーゼ阻害剤（Ｑ−ＶＤ−ＯＰｈ、Ｂｏｃ−Ｄ−（ＯＭｅ）−ＦＭＫまたはＺ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫなど）を含む安定化試薬がガンマ線照射中に防護され、ガンマ線照射の負の効果は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインなどのラジカルスカベンジャーを添加することによって防止することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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