(57)【要約】本開示は、リソソーム酵素をリン酸化させる能力が増強された、修飾されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：リソソーム酵素ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、及びその使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を有する全長ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットを基準にしてアミノ酸の内部欠失を含む、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットであって、配列番号１が、Ｎ末端からＣ末端の順に、スペーサー１ドメイン（スペーサー１）、Ｎｏｔｃｈ１ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１）、Ｎｏｔｃｈ２ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２）、スペーサー２ドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質相互作用ドメイン（ＤＭＡＰ）、スペーサー３ドメイン（スペーサー３）、α／βサブユニット切断部位、及びスペーサー４ドメイン（スペーサー４）を含み、前記スペーサー１が内部欠失している、前記修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項２】
配列番号１を基準にしてアミノ酸８６とアミノ酸３２２との間のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項３】
Ｎｏｔｃｈ１と前記α／β切断部位との間の領域が欠失している、請求項１に記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項４】
配列番号１を基準にしてアミノ酸４３８とアミノ酸９２８との間のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項５】
スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１と前記α／β切断部位との間の領域が欠失している、請求項１に記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項６】
配列番号１を基準にしてアミノ酸８６とアミノ酸３２２との間のアミノ酸が欠失しており、アミノ酸４３８とアミノ酸９２８との間のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項７】
Ｎｏｔｃｈ１と前記α／β切断部位との間の前記欠失が、配列番号１を基準にしてアミノ酸９２８を超えて伸長しない、請求項４〜６に記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている、請求項９〜１１のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記目的のタンパク質がリソソームタンパク質である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記リソソームタンパク質が、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及びリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記目的のタンパク質が非リソソームタンパク質である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記非リソソームタンパク質が、ＤＮａｓｅ１、レニン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ２（ＰｏＦＵＴ２）、グリコペプシノゲン（ＧＰ）、及びフォンウィルブランド因子Ａ１Ａ２Ａ３ドメインからなる群から選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記目的のタンパク質が、ポンペ病酵素（酸性α−グルコシダーゼ、ＧＡＡ）及びアルファマンノシドーシス酵素（リソソーム酸性α−マンノシダーゼ、ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
細胞において、外来性の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットを発現させることを含む、目的のタンパク質のオリゴ糖リン酸化を増加させる方法。
【請求項１９】
細胞において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットを発現させることを含む、細胞表面マンノース６−リン酸受容体（Ｍａｎ−６−Ｐ）に対する目的のタンパク質の結合を増加させる方法。
【請求項２０】
前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、前記目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記目的のタンパク質がリソソームタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記リソソームタンパク質が、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及びリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的のタンパク質が非リソソームタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記非リソソームタンパク質が、ＤＮａｓｅ１、レニン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ２（ＰｏＦＵＴ２）、グリコペプシノゲン（ＧＰ）、及びフォンウィルブランド因子Ａ１Ａ２Ａ３ドメインからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的のタンパク質が、ポンペ病酵素（酸性α−グルコシダーゼ、ＧＡＡ）及びアルファマンノシドーシス酵素（リソソーム酸性α−マンノシダーゼ、ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットがマンノース−６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）タグを糖タンパク質上に生成することを条件として、前記ポリペプチドが配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を含む、請求項１９〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットが配列番号１を含み、配列番号１が、Ｎ末端からＣ末端の順に、スペーサー１ドメイン（スペーサー１）、Ｎｏｔｃｈ１ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１）、Ｎｏｔｃｈ２ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２）、スペーサー２ドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質相互作用ドメイン（ＤＭＡＰ）、スペーサー３ドメイン（スペーサー３）、α／βサブユニット切断部位、及びスペーサー４ドメイン（スペーサー４）を含む、請求項１９〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記スペーサー１が内部欠失している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１を基準にしてアミノ酸８６とアミノ酸３２２との間のアミノ酸が欠失している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ｎｏｔｃｈ１と前記α／β切断部位との間の領域が欠失している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１を基準にしてアミノ酸４３８とアミノ酸９２８との間のアミノ酸が欠失している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１と前記α／β切断部位との間の領域が欠失している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
配列番号１を基準にしてアミノ酸８６とアミノ酸３２２との間のアミノ酸が欠失しており、アミノ酸４３８とアミノ酸９２８との間のアミノ酸が欠失している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
Ｎｏｔｃｈ１と前記α／β切断部位との間の前記欠失が、配列番号１を基準にしてアミノ酸９２８を超えて伸長しない、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの量が、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットと比べて増加する、請求項２８〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜７のいずれかに記載の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βを目的のリソソーム酵素と共発現させることを含む、リソソーム酵素のリン酸化を増強させる方法。
【請求項３８】
前記目的のリソソーム酵素が、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及びリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府の権利
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）により付与されたＣＡ００８７５９に基づく政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年９月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／４０２，４６８号に基づく利益を主張するものである。
【０００３】
本開示は、リソソーム酵素をリン酸化させる能力が増強された、修飾されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：リソソーム酵素ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、及びその使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
酵素補充療法（ＥＲＴ）は現在、いくつかのリソソーム蓄積症のための主要な処置形態であるが、その効力は個々の障害において異なる。これらの遺伝性障害のほとんどは、単一のリソソーム酵素の活性不足により、この酵素によって通常分解される物質が蓄積することに起因する。リソソーム内の蓄積物質が増えると、やがて細胞及び臓器の機能不全が生じる。ＥＲＴの目的は、欠損細胞のリソソームに十分な量の正常な酵素を導入して蓄積物質を排出し、リソソーム機能を回復させることである。この形態の療法が初めて使用されたのは、酸性β−グルコセレブロシダーゼ活性が欠如しており、主にマクロファージ系細胞にグルコシルセラミドが蓄積する、１型ゴーシェ病患者においてであった。末端マンノース残基を含むＮ−結合型グリカンを含有する補充酵素が静脈内に注入され、細胞表面マンノース受容体を介してマクロファージに取り込まれる。飲食された酵素は次にエンドソームによってリソソームに輸送され、ここで酵素が機能することでこの障害の良好な臨床結果が得られる。
【０００５】
ほとんどの細胞型はマンノース受容体を欠いているため、マクロファージ以外の細胞型が関与するリソソーム蓄積障害を処置するために使用される補充酵素は、その後のリソソームへの送達のために、細胞表面のマンノース６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）受容体への結合を利用する。これらの酵素は、目的の酵素を高レベルで産生するように工学操作された哺乳動物細胞、主にチャイニーズハムスター卵巣細胞の分泌物から精製される。この手法は、発現されたリソソーム酵素のＮ−グリカンのマンノース残基をリン酸化させる内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼの能力に依存する。この技術により産生される補充酵素の一部は高度にリン酸化されており、Ｍａｎ−６−Ｐ受容体に良好に結合する。しかしながら、その他のものは十分にリン酸化されず、ＥＲＴにおけるその有効性は限られている。これには、ポンペ病酵素（酸性α−グルコシダーゼ、ＧＡＡ）及びアルファマンノシドーシス酵素（リソソーム酸性α−マンノシダーゼ、ＬＡＭＡＮ）が含まれる。
【０００６】
よって、酵素補充療法の方法の改善及び酵素産生の改善が当技術分野では必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
ある態様において、本開示は、配列番号１の全長ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットを基準にしてアミノ酸の内部欠失を含む、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを提供する。全長ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βは、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端の順に配置された、スペーサー１ドメイン（スペーサー１）、Ｎｏｔｃｈ１ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１）、Ｎｏｔｃｈ２ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２）、スペーサー２ドメイン（スペーサー２）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質相互作用ドメイン（ＤＭＡＰ）、スペーサー３ドメイン（スペーサー３）、α／βサブユニット切断部位、及びスペーサー４ドメイン（スペーサー４）を含む。この修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットにおいて、スペーサー１は内部欠失している。加えて、Ｎｏｔｃｈ−１とα／βサブユニット切断部位との間の領域も欠失していてよい。
【０００８】
別の態様では、本開示は、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットのポリヌクレオチドを含むベクターであって、スペーサー１、またはスペーサー１及びＮｏｔｃｈ−１とα／βサブユニット切断部位との間の領域が欠失している、ベクターを提供する。
【０００９】
ある態様において、本開示は、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットのポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞であって、スペーサー１、またはスペーサー１及びＮｏｔｃｈ−１とα／βサブユニット切断部位との間の領域が欠失している、宿主細胞を提供する。
【００１０】
ある態様において、本開示は、細胞において、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットを発現させることにより、目的のタンパク質、例えばβ−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、またはリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）のオリゴ糖リン酸化を増加させる方法を提供する。
【００１１】
ある態様において、本開示は、細胞において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットを発現させることにより、細胞表面マンノース６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）受容体（Ｍａｎ−６−Ｐ）に対する目的のタンパク質の結合を増加させる方法を提供する。
【００１２】
ある態様において、本開示は、細胞において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βを、目的のリソソーム酵素、例えばＧＢＡ、ＧａｌＡ、ＣａｔｈＤ、ＮＰＣ２、ＨＥＸＢ、ＧＬＡ、ＭＡＮＢＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、ＧＡＡ、またはＬＡＭＡＮと共発現させることにより、リソソーム酵素のリン酸化を増強させる方法を提供する。
【００１３】
本出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも１つ含む。カラー図面（複数可）を含む本特許出願公報のコピーは、要請及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ及び図１Ｇは、スペーサー１ドメインがα／β前駆体の切断部位を調節することを示す、概略図、アライメント、イムノブロット、及びグラフを示す。（図１Ａ）ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットモジュール配置及びＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍスペーサー１とのヒトスペーサー１配列の置き換えの概略図。（図１Ｂ）抗Ｖ５抗体を用いてプローブされたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞において発現されたＤＳ１欠失変異体に対する野生型（ＷＴ）α／βのイムノブロット解析。（図１Ｃ）ベクター、ＷＴα／β前駆体、または種々の変異体ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−細胞の抽出物を使用した、単糖αＭＭに対するホスホトランスフェラーゼ活性。活性は、全タンパク質濃度に対して正規化した。（図１Ｄ）ＷＴα／β前駆体またはＤＳ１変異体ｃＤＮＡのいずれかをトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞のＳ１Ｐ活性の阻害。トランスフェクションの２４時間後、ＰＦ−４２９２４２を１０μＭの最終濃度で細胞に添加し、細胞を更に２４時間インキュベートしてから採取した。細胞抽出物を調製し、各ライセート２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ウェスタンブロッティングに供した。（図１Ｅ）２つのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴαサブユニットＳ１Ｐ基質部位の、他の既知のＳ１Ｐ部位とのアミノ酸アライメント。網掛けの四角は、保存されたコンセンサス切断モチーフを示す。（図１Ｆ）ＷＴα／βまたはＤＳ１欠失変異体のいずれかとの関連における、点変異体Ｒ９２５Ａ、Ｒ８７９Ａ、及びＲ９２５Ａ／Ｒ８７９Ａのイムノブロット解析。ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞において発現されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離させ、ニトロセルロースに移し、抗Ｖ５抗体を用いてプローブした。（図１Ｇ）ＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズに対する３種の内在性リソソーム酵素の結合によって定量した場合の酵素のリン酸化を定量するための、ＷＴα／βまたは図１Ｆに示した種々の変異体のいずれかのＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション。結合した物質の活性についてアッセイした。ＷＴα／βをトランスフェクトした細胞で得られた値を１００％に設定してある。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、スペーサー１の欠失がいくつかの非リソソーム糖タンパク質のリン酸化を増強させることを示すグラフ及びイムノブロットを示す。（図２Ａ）ベクター単独、ＷＴα／β前駆体、またはＤＳ１変異体ｃＤＮＡのいずれかをＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、［２−３Ｈ］マンノース標識を行うことにより、全可溶性タンパク質のマンノースリン酸化を定量した。示されている値は、ＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズを用いて回収された計数の百分率を、リンタングステン酸沈殿物中の総計数に対する割合として計算したものである。＊は、ｐ＝＜０．０５を表す。（図２Ｂ）３種のリソソームタンパク質または４種の非リソソームタンパク質のいずれかをコードするプラスミドを、ＷＴα／β前駆体またはＤＳ１変異体ｃＤＮＡと併せて、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトした。細胞を［２−３Ｈ］−マンノースで標識し、その後、培地に分泌されたタンパク質の免疫沈降を行い、Ｍａｎ−６−Ｐを含むＮ−グリカンのパーセントを判定した。ＷＴで得られた値を１．０に設定してある。ＷＴα／β前駆体と共発現された、示されているタンパク質のリン酸化の絶対値は、ＧＬＡ、３６±３％；ＮＰＣ２、５１±６％Ｃ；ＣａｔｈＤ  ２５±８％；ＤＮａｓｅＩ、２３±４％；レニン、２１±４％；ＬＩＦ、２４±７％；ＰｏＦｕｔ２、１２．６％であった。（図２Ｃ）示されているタンパク質の発現プラスミドを、空ベクター、ＷＴα／β前駆体、またはＤＳ１変異体ｃＤＮＡと併せてコトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞のウェスタンブロット。細胞ライセートをＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズとともにインキュベートし、レニン−抗ＨＡ、ＮＰＣ２、ＧＰ、Ｌａｍｐ１及びＬａｍｐ２の各抗体を用いてブロットをプローブすることにより、種々のタンパク質の結合を定量した。抗体は天然タンパク質に対して生成されたものであった。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、及び図３Ｇは、多くの糖タンパク質を非特異的にリン酸化することができる最小限の酵素の生成を示す概略図、グラフ、及びイムノブロットを示す。（図３Ａ）ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞において発現された種々のα／β前駆体欠失構築物の概略図。（図３Ｂ）ＷＴα／β前駆体または示されている欠失変異体ｃＤＮＡをＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、［２−３Ｈ］マンノース標識を行うことにより、全可溶性タンパク質のマンノースリン酸化を定量した。示されている値は、ＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズを用いて回収された計数の百分率を、リンタングステン酸沈殿物中の総計数に対する割合として計算したものである。０．８±０．３％のバックグラウンド値を差し引いて、最終的な表示値を求めた。＊は、ｐ＝＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＝＜０．０１を表す。（図３Ｃ）ＷＴα／β前駆体、Ｎ１−Ｄ、またはＳ１−Ｄ欠失変異体ｃＤＮＡのいずれかのＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション。ＷＴまたは変異体タンパク質によって媒介されるリン酸化の度合いを、ＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズに対する３種の内在性リソソーム酵素の結合によって定量した。結合した物質の活性についてアッセイした。ＷＴα／βをトランスフェクトした細胞で得られた値を１００％に設定してある。（図３Ｄ）ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞において発現されたＷＴα／β前駆体及び欠失変異体のウェスタンブロット。示されている量で各細胞抽出物を負荷し、α／β前駆体及びβサブユニットを抗Ｖ５抗体によって検出した。（図３Ｅ）等量の全細胞抽出物を使用したαＭＭに対するＷＴα／β前駆体及び変異体の触媒活性。ベクター単独をトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞抽出物を対照とし、ベクター単独のバックグラウンドを差し引いた後のＷＴ値を１００％に設定した。（図３Ｆ）示されているタンパク質の発現プラスミドを、空ベクター、ＷＴα／β前駆体、または示されている欠失変異体ｃＤＮＡと併せてコトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞のイムノブロット解析。細胞ライセートをＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズとともにインキュベートし、図２Ｃに記載の抗体を用いて、またはＰｏＦｕｔ２には抗ｍｙｃ、ｖＷＦ  Ａ１Ａ２Ａ３ドメインには抗Ｓｔｒｅｐタグを用いてブロットをプローブすることにより、種々のタンパク質の結合を定量した。（図３Ｇ）ＷＴα／β前駆体、Ｎ１−Ｓ３、またはＳ１−Ｓ３欠失変異体ｃＤＮＡのいずれかのＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション。ＷＴまたは変異体タンパク質によって媒介されるリン酸化の度合いを、ＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズに対する３種の内在性リソソーム酵素の結合によって定量した。結合した物質の活性についてアッセイした。ＷＴα／βをトランスフェクトした細胞で得られた値を１００％に設定してある。
【図４】図４は、非リソソーム糖タンパク質のリン酸化が最小限のα／β前駆体によって媒介されることを示すグラフを示す。ＷＴα／β前駆体またはＳ１−Ｓ３欠失変異体ｃＤＮＡのいずれかを、４種の非リソソーム糖タンパク質の発現プラスミドと併せてＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、［２−３Ｈ］−マンノースで細胞を２時間標識し、その後、培地に分泌されたタンパク質の免疫沈降を行い、Ｍａｎ−６−Ｐを含むＮ−グリカンのパーセントを判定した。ＷＴで得られた値を１に設定してある。ＷＴα／β前駆体と共発現された、示されているタンパク質のリン酸化の絶対値は、ＬＩＦ、２６±５％；レニン、２２±２％；ＰｏＦｕｔ２、２６±２％、ＤＮａｓｅＩ、２２±３％であった。
【図５】図５は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ機能のモデルを示す。（上部）基礎状態にあるＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、４つのステルスドメイン（ピンク）によって形成された触媒部位とスペーサー１ドメイン（紫）が干渉するため、基質分子のグリカン鎖と会合することができない。リソソーム酵素タンパク質ドッキング部位がＮｏｔｃｈモジュール／ＤＭＡＰ相互作用ドメイン（オレンジ）に結合することでコンフォメーション変化が誘導され、その結果スペーサー１ドメインが移動し、リソソーム酵素の高マンノースグリカンのマンノース残基が触媒部位に入り、リン酸化できるようになる。一部の事例では、γサブユニット（緑）のＭａｎ−６−Ｐ受容体相同性ドメインが、オリゴ糖を触媒部位に対して導くのに役立つ。（下部）スペーサー１ドメイン及びＮｏｔｃｈモジュール／ＤＭＡＰ相互作用ドメインを欠いている最小限の酵素は、阻害されることもなければ、リン酸化のために基質分子にタンパク質ドッキング部位がある必要もない。この酵素は非常に高いレベルで発現し、ゴルジを通過する全ての可溶性糖タンパク質をその最終的な目的地にかかわらずリン酸化することができる。
【図６】図６は、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体の様々なドメインのモジュール構成ならびにＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴとのアライメントを示す概略図を示す。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍタンパク質がヒトタンパク質のようにタンパク質分解プロセシングを受けるかどうかは分かっていない。緑で示されている４つの領域は一緒になってステルスを構成する。ステルスは、莢膜多糖類の生合成に関与する細菌タンパク質において初めて特定された進化的に保存されたドメインである。
【図７】図７は、ＷＴα／β前駆体または示されている変異体ｃＤＮＡのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞のウェスタンブロットを示す。種々の構築物はＶ−エピトープに加えて６Ｘ−ＨｉｓヒスチジンタグをＣ末端に有したため、α／β前駆体及びβサブユニットの親和性精製を行うために細胞ライセートをＮｉ−ＮＴＡアガロースとともにインキュベートした。矢印は、ＷＴタンパク質で見られた小量のＱ８８２切断βサブユニットを示し、＊は、Ｋ９２８における切断に起因する正常なβである。Ｒ９２５Ａ変異体は小量のＱ８８２切断βも示したが、Ｋ９２８切断βはこの場合完全になくなっている。ＤＳ１／Ｒ８７９Ａ／Ｒ９２５Ａ変異体では両方のβサブユニットが全く存在しない。
【図８Ａ】図８Ａは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットモジュール配置ならびにＧｌｙ及びＳｅｒ残基を含む２６ａａのリンカー配列とのヒトスペーサー１配列の置き換えの概略図を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞において発現され、抗Ｖ５抗体を用いてプローブされたＤＳ１及びΔＳ１欠失変異体に対するＷＴα／βのイムノブロット解析を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＷＴα／β前駆体またはΔＳ１変異体ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−細胞の抽出物を使用した、単糖αＭＭに対するホスホトランスフェラーゼ活性を示すグラフを示す。活性は、全タンパク質濃度に対して正規化した。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＷＴα／β前駆体、ＤＳ１変異体ｃＤＮＡ、またはΔＳ１変異体ｃＤＮＡのいずれかをトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞のＳ１Ｐ活性の阻害を示すイムノブロットを示す。トランスフェクションの２４時間後、ＰＦ−４２９２４２を１０μＭの最終濃度で細胞に添加し、細胞を更に２４時間インキュベートしてから採取した。細胞抽出物を調製し、各ライセート２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ウェスタンブロッティングに供した。
【図９】図９は、それぞれ、ＷＴα／β前駆体、ＤＳ１変異体ｃＤＮＡ、またはΔＳ１変異体ｃＤＮＡのいずれかをトランスフェクトし、ゴルジマーカーＧＯＬＰＨ４と共存させた、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞の共焦点免疫蛍光画像を示す（「方法」を参照されたい）。
【図１０】図１０は、それぞれ、ＷＴα／β前駆体、または示されている変異体ｃＤＮＡのいずれかをトランスフェクトし、ゴルジマーカーＧＯＬＰＨ４と共存させた、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞の共焦点免疫蛍光画像を示す（「方法」）。
【図１１】図１１は、それぞれ、ＷＴα／β前駆体、Ｎ１−Ｓ３変異体ｃＤＮＡ、またはＳ１−Ｓ３変異体ｃＤＮＡのいずれかをトランスフェクトし、ゴルジマーカーＧＯＬＰＨ４と共存させた、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞の共焦点免疫蛍光画像を示す（「方法」を参照されたい）。
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂ、及び図１２Ｃは、最小限のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼの発現及び酵素活性の解析を示す概略図及びグラフを示す。（図１２Ａ）ＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットのモジュール配置及び最小限の酵素であるＳ１−Ｓ３のモジュール配置の概略図。最小限の酵素は、ヒトスペーサー１配列をＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍスペーサー１に置き換え、アミノ酸４３８〜９２８を除去することにより生成された。（図１２Ｂ）示されているリソソーム酵素の発現プラスミドを、空ベクター、ＷＴα／β前駆体、またはＳ１−Ｓ３変異体ｃＤＮＡと併せて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞またはマウスＤ９細胞にコトランスフェクトした。「方法」において記述されるように、ＣＩ−ＭＰＲ親和性ビーズへの結合、及び結合した物質の活性をアッセイすることにより、ＷＴα／β前駆体またはＳ１−Ｓ３変異体のいずれかによって媒介されるリン酸化の度合いを各酵素で定量した。空ベクターで得られた値は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼによって媒介される活性を示す。（図１２Ｃ）ＷＴα／β前駆体またはＳ１−Ｓ３欠失変異体ｃＤＮＡのいずれかを、４種のリソソーム酵素の発現プラスミドと併せて、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトしたが、親ＨｅＬａ細胞には後者のｃＤＮＡのみをトランスフェクトし、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ活性を利用した。トランスフェクションの４８時間後、［２−３Ｈ］−マンノースで細胞を２時間標識し、その後、培地に分泌されたタンパク質の免疫沈降を行い、Ｍａｎ−６−Ｐを含むＮ−グリカンのパーセントを判定した。リン酸化％の絶対値を示してある。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明者らは、触媒的「ステルス」ドメインを保持しながらもαサブユニットエレメントのうちのいくつかを欠いている切断型α／β前駆体が非常に高いレベルで発現され、ＷＴ酵素の場合に生じるものよりも２０倍高い触媒活性をもたらすことを示す。切断型α／β前駆体は、種々のリソソームタンパク質及び非リソソームタンパク質の内在性レベルを超えるマンノースのリン酸化を刺激した。更に、この切断型酵素は、マンノース−６−Ｐ受容体への大幅に高い親和性をもたらす、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの形成を増加させた。リソソーム酵素のリン酸化は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼのＷＴまたは切断型のいずれかのα／β前駆体とのコトランスフェクションにより、実質的に増加し得る。リン酸化の増強は、結合及び細胞による取り込みを増加させる。この効果は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼによって良好にリン酸化されるＧａｌＡなどのリソソーム酵素においても生じる。更にこの方法は、ＬＡＭＡＮ及びＧＡＡという、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼにより十分にリン酸化されない２つのリソソーム酵素のリン酸化及び取り込みを増強させる。本開示の種々の態様について、より詳細に以下に記述する。
【００１６】
Ｉ．組成物
ある態様において、本開示は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含む単離されたポリペプチドを提供する。別の態様では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。更に別の態様では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含む、ベクターを提供する。なおも更に別の態様では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含む、宿主細胞を提供する。
【００１７】
ある態様において、全長ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴタンパク質は、αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットという３つのサブユニットを含み得る。α及びβ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β）サブユニットは、γサブユニットの非存在下でほとんどのリソソーム酵素をリン酸化させることができる場合がある。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、種々の保存ドメインを含み得る。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットの保存ドメインは、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端の順に配置された、スペーサー１ドメイン（スペーサー１）、Ｎｏｔｃｈ１ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１）、Ｎｏｔｃｈ２ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２）、スペーサー２ドメイン（スペーサー２）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質相互作用ドメイン（ＤＭＡＰ）、スペーサー３ドメイン（スペーサー３）、及びスペーサー４ドメイン（スペーサー４）を含み得る。αサブユニットは、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端の順に配置された、スペーサー１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、スペーサー２、及びＤＭＡＰを含み得る。スペーサー３は、α及びβサブユニットにまたがっていてよく、αサブユニットとβサブユニットとが切断され得る部位、すなわちα／βサブユニット切断部位を含み得る。スペーサー４はβサブユニット内にあってもよい。
【００１８】
ある態様において、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、１つ以上の保存ドメインの欠失によって修飾されていてよい。非限定的な例として、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、スペーサー２、ＤＭＡＰ、及びスペーサー３の一部のうちの１つ以上の欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１の欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１及びＮｏｔｃｈ１の欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１及びＮｏｔｃｈ２の欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１、Ｎｏｔｃｈ１、及びＮｏｔｃｈ２の欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、及びスペーサー２の欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、スペーサー２、及びＤＭＡＰの欠失を含み得る。ある態様において、修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、スペーサー１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、スペーサー２、及びＤＭＡＰの欠失、ならびにスペーサー３のα／βサブユニット切断部位におけるスペーサー３の一部の欠失を含み得る。
【００１９】
ある態様において、本開示は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含む単離されたポリペプチドであって、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、ポリペプチドを提供する。別の態様では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含み、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、単離されたポリヌクレオチドを提供する。更に別の態様では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含み、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、ベクターを提供する。なおも更に別の態様では、本開示は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）α／βサブユニットを含み、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、宿主細胞を提供する。
【００２０】
（ａ）ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ
ある態様において、本開示は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）を提供する。本明細書で使用される場合、「ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ」という用語には、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、変異体ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼの機能的ホモログ、及びそれらの断片が含まれる。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、２つの遺伝子によってコードされるα２β２γ２六量体タンパク質である。より小さなγサブユニットは、ＧＮＰＴＧ遺伝子によってコードされ、一方でαサブユニット及びβサブユニットは、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子によって単一のα／β前駆体としてコードされる。ゴルジ内のサイト１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）により、ヒトα／β前駆体のＫ９２８におけるタンパク質分解切断が媒介され、この切断は、このタンパク質の触媒能力に必須である。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、リソソーム酸性ヒドロラーゼのコンフォメーション依存性タンパク質決定基に特異的に結合し、このヒドロラーゼの高マンノース型Ｎ−結合型グリカン上のマンノース残基に対するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの輸送を触媒することにより、Ｍａｎ−６−Ｐタグの生成において最初で最も重要なステップを行う。したがって、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、機能的ホモログまたは断片を含め、Ｍａｎ−６−Ｐタグを生成する。ある特定の実施形態では、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、α／βサブユニットを含む。全長ヒトα／βＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼアミノ酸配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＪ３００１４．１を使用して入手することができる。全長ヒトα／βＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼｍＲＮＡ配列の配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＭ０８５４３８．１を使用して入手することができる。ある特定の実施形態では、本開示のα／βＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼは、配列番号１（ＭＬＦＫＬＬＱＲＱＴ  ＹＴＣＬＳＨＲＹＧＬ  ＹＶＣＦＬＧＶＶＶＴ  ＩＶＳＡＦＱＦＧＥＶ  ＶＬＥＷＳＲＤＱＹＨ  ＶＬＦＤＳＹＲＤＮＩ  ＡＧＫＳＦＱＮＲＬＣ  ＬＰＭＰＩＤＶＶＹＴ  ＷＶＮＧＴＤＬＥＬＬ  ＫＥＬＱＱＶＲＥＱＭ  ＥＥＥＱＫＡＭＲＥＩ  ＬＧＫＮＴＴＥＰＴＫ  ＫＳＥＫＱＬＥＣＬＬ  ＴＨＣＩＫＶＰＭＬＶ  ＬＤＰＡＬＰＡＮＩＴ  ＬＫＤＬＰＳＬＹＰＳ  ＦＨＳＡＳＤＩＦＮＶ  ＡＫＰＫＮＰＳＴＮＶ  ＳＶＶＶＦＤＳＴＫＤ  ＶＥＤＡＨＳＧＬＬＫ  ＧＮＳＲＱＴＶＷＲＧ  ＹＬＴＴＤＫＥＶＰＧ  ＬＶＬＭＱＤＬＡＦＬ  ＳＧＦＰＰＴＦＫＥＴ  ＮＱＬＫＴＫＬＰＥＮ  ＬＳＳＫＶＫＬＬＱＬ  ＹＳＥＡＳＶＡＬＬＫ  ＬＮＮＰＫＤＦＱＥＬ  ＮＫＱＴＫＫＮＭＴＩ  ＤＧＫＥＬＴＩＳＰＡ  ＹＬＬＷＤＬＳＡＩＳ  ＱＳＫＱＤＥＤＩＳＡ  ＳＲＦＥＤＮＥＥＬＲ  ＹＳＬＲＳＩＥＲＨＡ  ＰＷＶＲＮＩＦＩＶＴ  ＮＧＱＩＰＳＷＬＮＬ  ＤＮＰＲＶＴＩＶＴＨ  ＱＤＶＦＲＮＬＳＨＬ  ＰＴＦＳＳＰＡＩＥＳ  ＨＩＨＲＩＥＧＬＳＱ  ＫＦＩＹＬＮＤＤＶＭ  ＦＧＫＤＶＷＰＤＤＦ  ＹＳＨＳＫＧＱＫＶＹ  ＬＴＷＰＶＰＮＣＡＥ  ＧＣＰＧＳＷＩＫＤＧ  ＹＣＤＫＡＣＮＮＳＡ  ＣＤＷＤＧ���ＤＣＳＧ  ＮＳＧＧＳＲＹＩＡＧ  ＧＧＧＴＧＳＩＧＶＧ  ＱＰＷＱＦＧＧＧＩＮ  ＳＶＳＹＣＮＱＧＣＡ  ＮＳＷＬＡＤＫＦＣＤ  ＱＡＣＮＶＬＳＣＧＦ  ＤＡＧＤＣＧＱＤＨＦ  ＨＥＬＹＫＶＩＬＬＰ  ＮＱＴＨＹＩＩＰＫＧ  ＥＣＬＰＹＦＳＦＡＥ  ＶＡＫＲＧＶＥＧＡＹ  ＳＤＮＰＩＩＲＨＡＳ  ＩＡＮＫＷＫＴＩＨＬ  ＩＭＨＳＧＭＮＡＴＴ  ＩＨＦＮＬＴＦＱＮＴ  ＮＤＥＥＦＫＭＱＩＴ  ＶＥＶＤＴＲＥＧＰＫ  ＬＮＳＴＡＱＫＧＹＥ  ＮＬＶＳＰＩＴＬＬＰ  ＥＡＥＩＬＦＥＤＩＰ  ＫＥＫＲＦＰＫＦＫＲ  ＨＤＶＮＳＴＲＲＡＱ  ＥＥＶＫＩＰＬＶＮＩ  ＳＬＬＰＫＤＡＱＬＳ  ＬＮＴＬＤＬＱＬＥＨ  ＧＤＩＴＬＫＧＹＮＬ  ＳＫＳＡＬＬＲＳＦＬ  ＭＮＳＱＨＡＫＩＫＮ  ＱＡＩＩＴＤＥＴＮＤ  ＳＬＶＡＰＱＥＫＱＶ  ＨＫＳＩＬＰＮＳＬＧ  ＶＳＥＲＬＱＲＬＴＦ  ＰＡＶＳＶＫＶＮＧＨ  ＤＱＧＱＮＰＰＬＤＬ  ＥＴＴＡＲＦＲＶＥＴ  ＨＴＱＫＴＩＧＧＮＶ  ＴＫＥＫＰＰＳＬＩＶ  ＰＬＥＳＱＭＴＫＥＫ  ＫＩＴＧＫＥＫＥＮＳ  ＲＭＥＥＮＡＥＮＨＩ  ＧＶＴＥＶＬＬＧＲＫ  ＬＱＨＹＴＤＳＹＬＧ  ＦＬＰＷＥＫＫＫＹＦ  ＱＤＬＬＤＥＥＥＳＬ  ＫＴＱＬＡＹＦＴＤＳ  ＫＮＴＧＲＱＬＫＤＴ  ＦＡＤＳＬＲＹＶＮＫ  ＩＬＮＳＫＦＧＦＴＳ  ＲＫＶＰＡＨＭＰＨＭ  ＩＤＲＩＶＭＱＥＬＱ  ＤＭＦＰＥＥＦＤＫＴ  ＳＦＨＫＶＲＨＳＥＤ  ＭＱＦＡＦＳＹＦＹＹ  ＬＭＳＡＶＱＰＬＮＩ  ＳＱＶＦＤＥＶＤＴＤ  ＱＳＧＶＬＳＤＲＥＩ  ＲＴＬＡＴＲＩＨＥＬ  ＰＬＳＬＱＤＬＴＧＬ  ＥＨＭＬＩＮＣＳＫＭ  ＬＰＡＤＩＴＱＬＮＮ  ＩＰＰＴＱＥＳＹＹＤ  ＰＮＬＰＰＶＴＫＳＬ  ＶＴＮＣＫＰＶＴＤＫ  ＩＨＫＡＹＫＤＫＮＫ  ＹＲＦＥＩＭＧＥＥＥ  ＩＡＦＫＭＩＲＴＮＶ  ＳＨＶＶＧＱＬＤＤＩ  ＲＫＮＰＲＫＦＶＣＬ  ＮＤＮＩＤＨＮＨＫＤ  ＡＱＴＶＫＡＶＬＲＤ  ＦＹＥＳＭＦＰＩＰＳ  ＱＦＥＬＰＲＥＹＲＮ  ＲＦＬＨＭＨＥＬＱＥ  ＷＲＡＹＲＤＫＬＫＦ  ＷＴＨＣＶＬＡＴＬＩ  ＭＦＴＩＦＳＦＦＡＥ  ＱＬＩＡＬＫＲＫＩＦ  ＰＲＲＲＩＨＫＥＡＳ  ＰＮＲＩＲＶ）に記載の配列を含む。他の実施形態では、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同じ機能活性を有することを条件として、配列番号１に対して約８０％の同一性を有し得る。例えば、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同じ機能活性を有することを条件として、配列番号１に対して約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の同一性を有し得る。
【００２１】
ある態様では、全長ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ（配列番号１）を基準にして、スペーサー１は、およそアミノ酸８６とアミノ酸３２２との間にあり、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ２は、およそアミノ酸４３８とアミノ酸４３５との間にあり、スペーサー２は、およそアミノ酸５３５とアミノ酸６９４との間にあり、ＤＭＡＰは、およそアミノ酸６９４とアミノ酸８１９との間にあり、スペーサー３は、およそアミノ酸８１９とアミノ酸９５５との間にあり、α／βサブユニット切断部位は、およそアミノ酸９２８にあり、スペーサー４は、およそアミノ酸１０４１とアミノ酸１１４９との間にある。
【００２２】
本開示は他の生物におけるＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのホモログも対象とし、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴに限定されないことが理解される。他の種におけるホモログは、当技術分野で公知の方法により見出され得る。タンパク質が本発明の配列と有意な相同性を有するかどうか、または本発明の配列とある特定の配列同一性百分率を共有するかどうかを判定する際、従来のアルゴリズムによって配列類似性が判定され得る。このアルゴリズムは通常、最良な適合度を達成するために少数のギャップを導入することを可能にするものである。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９３）のアルゴリズムを使用して判定される。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことにより、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。同様に、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことにより、本発明のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップ付きアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記述されているＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータを用いる。更なる詳細についてはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００２３】
ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴホモログは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同じ機能活性を有することを条件として、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％相同であり得る。ある特定の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴホモログは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同じ機能活性を有することを条件として、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、または７０％相同であり得る。異なる実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴホモログは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同じ機能活性を有することを条件として、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、または７９％相同であり得る。一実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴホモログは、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、または８９％相同であり得る。別の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴホモログは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％相同であり得る。なおも別の実施形態では、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴホモログは、全長ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同じ機能活性を有する切断型またはバリアントであり得る。
【００２４】
他の実施形態では、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、スペーサー１が欠失しているα／βサブユニットを含む。より特定すると、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、配列番号１を基準にして約アミノ酸８６と約アミノ酸３２２との間のアミノ酸が欠失しているα／βサブユニットを含む。スペーサー１の欠失は、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐにより十分にリン酸化されないいくつかの非リソソーム糖タンパク質をリン酸化させる能力が増強されたＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐをもたらす。更に他の実施形態では、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失しているα／βサブユニットを含む。より特定すると、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、配列番号１を基準にして約アミノ酸４３８と約アミノ酸９２８との間のアミノ酸が欠失しているα／βサブユニットを含む。特定の実施形態では、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、α／βサブユニットを含む。より特定すると、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐは、配列番号１を基準にして約アミノ酸８６と約アミノ酸３２２との間のアミノ酸が欠失しており、約アミノ酸４３８と約アミノ酸９２８との間のアミノ酸が欠失している、α／βサブユニットを含む。重要なことに、欠失は、アミノ酸９２８を超えて伸長してはならない。Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域とともにスペーサー１を除去すると、細菌タンパク質を思わせるＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐがもたらされ、この最小限のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを発現する細胞は、その高い発現レベルの結果として、単糖α−メチルＤ−マンノシド（αＭＭ）及び非リソソーム糖タンパク質に対して劇的に増加した活性を提示する。スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失しているＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットと比べて約５倍高い触媒活性を有する。例えば、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失しているＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットと比べて約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、または約３０倍高い触媒活性を有する。スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失しているＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの含有量を、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットと比べて増加させる。例えば、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失しているＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの含有量を、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットと比べて約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％増加させる。図３Ａには、他の本開示の修飾されたＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐが示されている。
【００２５】
（ｂ）酵素構築物
ある態様において、本開示は、酵素構築物を提供する。本開示のある酵素構築物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列である。本明細書で使用される場合、「本開示のポリヌクレオチド配列」及び「酵素構築物」という用語は交換可能である。本開示は、酵素構築物によってコードされる単離されたポリペプチド、酵素構築物を含むベクター、及び該ベクターを含む単離細胞も提供する。
【００２６】
ｉ．ポリヌクレオチド配列
本開示のある酵素構築物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含む、ポリヌクレオチド配列である。別の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含み、スペーサー１が欠失している、ポリヌクレオチド配列である。更に別の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含み、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、ポリヌクレオチド配列である。なおも更に別の実施形態では、酵素構築物は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含み、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、ポリヌクレオチド配列である。異なる実施形態では、酵素構築物は、少なくとも２つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、ポリペプチドがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む、ポリヌクレオチド配列である。
【００２７】
１つより多くのポリペプチドが本開示のポリヌクレオチドによってコードされる場合、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドに作動可能に連結した１つより多くのプロモーターを含んでいてよい。非限定的な例として、第１のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに作動可能に連結していてよく、第２のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、第２のプロモーターに作動可能に連結していてよい。第１及び第２のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片は、同じであっても異なっていてもよい。第１及び第２のプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。プロモーターについては、以下により詳細に記述する。
【００２８】
あるいは、１つより多くのポリペプチドが本開示のポリヌクレオチドによってコードされる場合、ポリヌクレオチドは、単一のプロモーターに作動可能に連結していてもよい。かかる実施形態では、当技術分野において一般的ないくつかの方策を使用して、１つより多くの発現産物を生成してよい。非限定的な例として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド同士の間に、スプライシングシグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、またはタンパク質分解切断部位を挿入してよい。非限定的な例として、単一のプロモーターに作動可能に連結した第１のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片と第２のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片とを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、第１及び第２のＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片のコード領域同士の間に、スプライシングシグナル、ＩＲＥＳ、またはタンパク質分解切断部位を更に含み得る。
【００２９】
上記実施形態のそれぞれにおいて、「ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ」、「その断片」、「ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニット」、及び「ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼＳ１−Ｓ３」は、参照により本セクションに組み込まれている上記セクションＩ（ａ）に詳細に記述した通りであり得る。
【００３０】
本開示のポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の分子生物学的方法を使用して核酸分子から産生され得る。本開示のポリヌクレオチド配列を構築するためには、当業者に公知のポリヌクレオチド断片を増幅する方法及びポリヌクレオチド断片をベクターに挿入する方法のうち、いずれを使用してもよい。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ及び合成技術ならびにインビボ組換えが含まれ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照されたい）。
【００３１】
ｉｉ．ベクター
別の態様では、本開示は、本開示の酵素構築物を含むベクターを提供する。本明細書で使用される場合、ベクターは、遺伝子材料を輸送するためのビヒクルとして使用される核酸分子と定義される。ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、転位因子、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えばレトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するもの）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来するもの）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能形態、複製欠損形態、及びガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）形態を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ベクターは、高コピー数、中コピー数、または低コピー数を有し得る。コピー数は、酵素構築物の発現レベルを制御するために、また発現ベクターの安定性を制御する手段として利用することができる。一実施形態では、高コピー数ベクターが利用される場合がある。高コピー数ベクターは、細菌細胞１つ当たり少なくとも３１、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００個のコピーを有し得る。他の実施形態では、高コピー数ベクターは、宿主細胞１つ当たり少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、または４００個のコピーを有し得る。代替的な実施形態では、低コピー数ベクターが利用される場合がある。例えば、低コピー数ベクターは、宿主細胞１つ当たり１個、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のコピーを有し得る。別の実施形態では、中コピー数ベクターが利用される場合がある。例えば、中コピー数ベクターは、宿主細胞１つ当たり少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のコピーを有し得る。
【００３３】
本開示のベクターは、通常、タンパク質発現のために使用される。当技術分野において周知であるように、かかるベクターは、幅広い複製起点、複数のクローニング配列、プロモーター、リボソーム結合部位／リボソーム侵入部位、翻訳開始部位、転写ターミネーターなどを保有し得る。ベクターは、選択可能マーカー、レポーター、及びペプチドタグをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む場合もある。
【００３４】
酵素構築物をコードする核酸は、選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。選択可能マーカーを使用すると、外来性核酸を組み込んだ細胞を効率的に選択及び特定することができる。選択可能マーカーは、外来性核酸を受ける細胞に、ある特定の毒素または抗生物質に対する耐性といった選択上の利点を与える。抗生物質耐性マーカーの好適な例としては、限定されるものではないが、カナマイシン、スペクトマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン（Ｇ４１８）、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、及びブラストサイジンに対する耐性をもたらすタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００３５】
一部の実施形態では、ベクターは、レポータータンパク質を発現させるための転写カセットを含んでもよい。例として、レポータータンパク質としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びそれらのバリアントを挙げることができる。
【００３６】
酵素構築物をコードする発現ベクターは、ウイルスベクターを使用して、またはウイルスによらない輸送方法によって、細胞に送達され得る。核酸を細胞に導入するために好適なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ラブドウイルス、及びヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスによらない核酸輸送方法としては、ネイキッド核酸、リポソーム、及びタンパク質／核酸コンジュゲートが挙げられる。細胞に導入される酵素構築物をコードする発現構築物は、線状であっても環状であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの任意の修飾形態もしくは組み合わせであってもよい。
【００３７】
酵素構築物をコードする発現構築物は、トランスフェクションによって細胞に導入されてもよい。核酸をトランスフェクトするための方法は、当業者に周知である。トランスフェクション方法としては、ウイルス形質導入、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、電気穿孔、熱ショック、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、ナノ粒子、微粒子銃送達（遺伝子銃）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｈｉｌｙｍａｘ、Ｆｕｇｅｎｅ、ｊｅｔＰＥＩ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、またはＤｒｅａｍＦｅｃｔなどの商標登録されたトランスフェクション試薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
細胞に導入されると、酵素構築物をコードする発現構築物は、染色体に組み込まれ得る。一部の実施形態では、酵素構築物をコードする発現構築物の細胞染色体への組み込みは、可動エレメントを用いて達成され得る。可動エレメントは、トランスポゾンまたはレトロエレメントであってよい。様々なトランスポゾンが、本発明において使用するのに好適である。使用することのできるＤＮＡトランスポゾンの例としては、Ｍｕトランスポゾン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＰエレメントトランスポゾン、及び魚由来のｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンといったトランスポゾンのＴｃ１／Ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーのメンバーが挙げられる。様々なレトロエレメントが本発明において使用するのに好適であり、これには、ＬＴＲを含むレトロトランスポゾン及び非ＬＴＲレトロトランスポゾンが含まれる。レトロトランスポゾンの非限定的な例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＣｏｐｉａ及びｇｙｐｓｙ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴｙエレメント、真核生物由来の長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）及び短鎖散在反復配列（ＳＩＮＥ）が挙げられる。ＬＩＮＥの好適な例としては、哺乳動物由来のＬ１及びカイコ由来のＲ２Ｂｍが挙げられる。
【００３９】
外来性核酸の細胞染色体への組み込みは、ウイルスによって媒介されてもよい。核酸を染色体に組み込むウイルスとしては、バクテリオファージ、アデノ随伴ウイルス、及びレトロウイルスが挙げられる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ヒトまたは非ヒト霊長類ＡＡＶの血清型及びそれらのバリアントに由来してよい。好適なアデノ随伴ウイルスとしては、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、及びＡＡＶ１１型が挙げられる。様々なレトロウイルスが、本発明において使用するのに好適である。レトロウイルスベクターは、複製可能または複製欠損のいずれでもよい。レトロウイルスベクターは、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、またはスプーマレトロウイルスであってよい。ある実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってよい。レンチウイルスベクターは、ヒト、サル、ネコ、ウマ、ウシ、または他の哺乳動物種に感染するレンチウイルスに由来し得る。好適なレンチウイルスの非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が挙げられる。
【００４０】
酵素構築物をコードする発現構築物の、細胞の染色体への組み込みは、ランダムであってよい。あるいは、酵素構築物をコードする発現構築物の組み込みは、染色体の特定の配列または位置を標的としてもよい。概して、組み込み部位における全体的環境は、組み込まれた酵素構築物をコードする発現構築物が発現されるかどうかだけでなく、その発現レベルにも影響を与え得る。
【００４１】
酵素構築物をコードする発現構築物がトランスフェクトされた細胞は、概して、核酸が染色体に組み込まれている細胞を単離して増やすため、選択下で増殖する。酵素構築物をコードする発現構築物が染色体に組み込まれている細胞は、上述の選択可能マーカーを用いた連続選択により維持され得る。組み込まれた外来性核酸配列の存在及び維持は、当業者に公知の標準的技術、例えばサザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した特定の核酸配列の増幅、及び／またはヌクレオチドシーケンシングを使用して検証することができる。
【００４２】
核酸分子は、適切な宿主細胞に導入された場合に融合ポリペプチドを発現することのできるベクターに挿入される。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
ｉｉｉ．調節
ある特定の態様において、本開示のポリヌクレオチド配列の発現は調節され得る。かかる調節により、酵素構築物がいつどこで機能するかの制御が可能になり得る。
【００４４】
発現ベクターは通常、次のエレメント：プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位／リボソーム侵入部位、及び翻訳開始部位のうちの１つ以上を含む。かかるエレメントは、本開示の酵素構築物の発現を制御するために使用され得る。本開示の核酸分子の発現は、組換えＤＮＡ分子によって形質転換された宿主において分子が発現されるように、第２の核酸配列によって調節され得る。例えば、本開示の核酸分子の発現は、当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御されてよい。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、核酸の発現をもたらすこと、活性化させること、または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味する場合がある。プロモーターは、構成的、誘導性／抑制性、または細胞型特異的であってよい。ある特定の実施形態では、プロモーターは構成的であり得る。哺乳動物細胞の構成的プロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１α、ＳＶ４０、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＣＢＡ／ＣＡＧＧＳ／ＡＣＴＢ、ＣＢｈ、ＭｅＣＰ２、Ｕ６、及びＨ１が挙げられる。他の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。誘導性プロモーターは、テトラサイクリン、熱ショック、ステロイドホルモン、重金属、ホルボールエステル、アデノウイルスＥ１Ａエレメント、インターフェロン、及び血清誘導性プロモーターからなる群から選択され得る。異なる実施形態では、プロモーターは細胞型特異的であり得る。例えば、ニューロン（例えばシナプシン）、アストロサイト（例えばＧＦＡＰ）、オリゴデンドロサイト（例えばミエリン塩基性タンパク質）、ミクログリア（例えばＣＸ３ＣＲ１）、神経内分泌細胞（例えばクロモグラニンＡ）、筋細胞（例えばデスミン、Ｍｂ）、または心筋細胞（例えばアルファミオシン重鎖プロモーター）の各細胞型特異的プロモーターを使用してよい。例示的な実施形態において、プロモーターは、Ｎｒｌ（杆体光受容器特異的）プロモーターまたはＨＢＢ（ヘモグロビンベータ）プロモーターであり得る。プロモーターは、核酸の発現を更に増強するため、及び／または空間的発現及び／または時間的発現を変化させるための、１つ以上の特異的転写調節配列を更に含んでいてよい。エンハンサーの非限定的な例としては、ＣＭＶエンハンサー及びＳＰ１エンハンサーが挙げられる。
【００４５】
１つより多くのポリペプチドが本開示のポリヌクレオチドによってコードされ、かつポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする各ポリヌクレオチドに作動可能に連結した１つより多くのプロモーターを含む実施形態において、プロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。本明細書で使用される「作動可能に連結した」という用語は、核酸配列の発現が、それが空間的に結合しているプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある核酸配列の５’（上流）に位置し得る。プロモーターと、発現される核酸配列との間の距離は、プロモーターと、それが制御する天然核酸配列との間の距離とおよそ同じであってよい。当技術分野において公知であるように、この距離のばらつきは、プロモーター機能を喪失することなく許容される場合がある。
【００４６】
ｉｖ．宿主細胞
別の態様では、本開示は、本開示のベクターを含む宿主細胞を提供する。この細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。適切な細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本開示による宿主細胞は、実質的に純粋な培養物においてインビトロで維持される細胞（すなわち単離された細胞）である。本開示のベクターを含む宿主細胞は、タンパク質発現、また場合により精製のために使用され得る。タンパク質を発現させ、場合により、宿主から発現されたタンパク質を精製するための方法は、当技術分野において標準的である。
【００４７】
一部の実施形態では、本開示のベクターを含む宿主細胞を使用して、本開示の酵素構築物によってコードされるポリペプチドを産生することができる。概して、本開示のポリペプチドの産生は、酵素構築物を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、次に、この細胞が所望のポリペプチドを転写及び翻訳するように細胞を培養することを伴う。次に、単離された宿主細胞を溶解させて、発現されたポリペプチドをその後の精製のために抽出することができる。
【００４８】
一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。好適な原核細胞の非限定的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の腸内細菌科、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ種、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｖｉｂｒｉｏ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ種、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ種、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ種、Ｚｙｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ種、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｆｒａｎｋｉａ種、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ種、Ｎｏｃａｒｄｉａ種、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ種、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｈｅｌｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ種、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ種、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ種、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ種、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ種、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｓｅｒｒａｔｉａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ種、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ種、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｋｉｎｇｅｌｌａ種、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、及びアルファプロテオバクテリア、例えばＷｏｌｂａｃｈｉａ種、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄細菌及び緑色非硫黄細菌、グラム陰性球菌、偏好性グラム陰性桿菌、腸内細菌科グルコース発酵グラム陰性桿菌、非グルコース発酵性グラム陰性桿菌、グルコース発酵性グラム陰性桿菌、オキシダーゼ陽性グラム陰性桿菌が挙げられる。タンパク質発現に特に有用な細菌宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＣ１０、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖａ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓなどのグラム陰性細菌、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓなどのグラム陽性細菌が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉは、最も広く使用されている発現宿主のうちの１つである。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける過剰発現のための技術は十分に開発されており、当業者にとって容易に利用可能である。更に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、組換えタンパク質の高レベル産生のために（すなわち、バイオ治療薬及びワクチンの開発のために）一般的に使用されている。
【００４９】
一部の実施形態では、宿主細胞は酵母または真菌細胞である。タンパク質発現のために特に有用な真菌宿主細胞としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍが挙げられる。タンパク質発現のために特に有用な酵母宿主細胞としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【００５０】
一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。タンパク質発現のために特に有用な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、ヒト胎児腎臓細胞、Ｂｏｓ  ｐｒｉｍｉｇｅｎｉｕｓ、及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓが挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。更に、哺乳動物宿主細胞は、確立された市販の細胞株であってよい（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。宿主細胞は不死化細胞であってもよい。あるいは、宿主細胞は初代細胞であってもよい。「初代細胞」とは、生きた組織（すなわち生検材料）から直接採取され、インビトロ増殖のために確立された細胞で、ごくわずかな集団倍加しか経ていないため、連続分裂性（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）細胞株または人工的に不死化した細胞株と比較して、細胞の由来となる組織の主要な機能的構成要素及び特徴をよりよく代表するものである。
【００５１】
ある態様において、宿主細胞は、目的のタンパク質を高レベルで産生するように工学操作されている。例えば、宿主細胞は、マンノース−６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）でタグ付けすることにより役立つタンパク質を産生するように工学操作されている。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質はリソソームタンパク質である。リソソームタンパク質の非限定的な例としては、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及びリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）が挙げられる。特定すると、リソソームタンパク質は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）である。これらのタンパク質は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴにより十分にリン酸化されない場合があるため、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと組み合わせた場合に特に有用である。他の実施形態では、目的のタンパク質は非リソソームタンパク質である。非リソソームタンパク質の非限定的な例としては、ＤＮａｓｅ１、レニン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ２（ＰｏＦＵＴ２）、グリコペプシノゲン（ＧＰ）、及びフォンウィルブランド因子Ａ１Ａ２Ａ３ドメインが挙げられる。
【００５２】
ｖ．ポリペプチド配列
別の態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上の単離されたポリペプチド（複数可）を提供する。本開示のポリヌクレオチド配列は、セクションＩ（ｂ）ｉに詳細に記述されており、参照により本セクションに組み込まれている。本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを産生した細胞から部分的または完全に精製されたポリペプチドを指す。本開示の単離されたポリペプチドは、当技術分野で公知の分子生物学的方法を使用して産生され得る。大まかに言うと、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞に導入された場合にポリペプチドを発現することのできるベクターに挿入される。適切なベクター及び宿主細胞については、それぞれセクションＩ（ｂ）ｉｉｉ及びセクションＩ（ｂ）ｉｖに記述されている。ポリペプチドが発現されたら、一般的な精製方法を使用してこれを細胞から得ることができる。例えば、ポリペプチドが分泌シグナルを有する場合、発現されたポリペプチドを細胞培養上清から単離することができる。あるいは、分泌シグナルを欠いているポリペプチドは、封入体及び／または細胞抽出物から精製することができる。本開示のポリペプチドは、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性によるもの、及びサイズカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度差、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい）を含む、当業者に公知の任意の方法を使用して、培養上清、封入体、または細胞抽出物から単離することができる。ポリペプチドの単離は、ポリペプチドが本明細書に記述されている親和性タグまたは精製タグを含む場合、大いに促進される。
【００５３】
ある実施形態では、本開示の単離されたポリペプチドは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼまたはその断片を含む。別の実施形態では、本開示の単離されたポリペプチドは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含む。更に別の実施形態では、本開示の単離されたポリペプチドは、スペーサー１が欠失しているＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含む。なおも更に別の実施形態では、本開示の単離されたポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含む。なおも更に別の実施形態では、本開示の単離されたポリペプチドは、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットを含む。
【００５４】
ＩＩ．方法
ある態様において、本開示は、細胞において、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを発現させることを含む、目的のタンパク質のオリゴ糖リン酸化を増加させる方法を提供する。外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、セクションＩ（ａ）に記述した通りであり得る。細胞は、セクションＩ（ｂ）ｉｖに記述した通りの宿主細胞であり得る。特定すると、細胞はＣＨＯ細胞である。リン酸化の量は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下におけるリン酸化と比べて１％超増加し得る。更に、リン酸化の量は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下におけるリン酸化と比べて２％超、３％超、４％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、または７５％超増加し得る。特定すると、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットである場合、リン酸化の量は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下におけるリン酸化と比べて２％超、３％超、４％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、または２５％超増加し得る。更に、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットであり、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している場合、リン酸化の量は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下におけるリン酸化と比べて５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、または７５％超増加し得る。更に、本方法は、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの含有量を増加させ得る。例えば、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失しているＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットは、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの含有量を、野生型ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βサブユニットと比べて約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、または約２５％増加させる。目的のタンパク質は、マンノース−６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）でタグ付けすることにより役立つタンパク質である。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質はリソソームタンパク質である。リソソームタンパク質の非限定的な例としては、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及びリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）が挙げられる。特定すると、リソソームタンパク質は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）である。他の実施形態では、目的のタンパク質は非リソソームタンパク質である。非リソソームタンパク質の非限定的な例としては、ＤＮａｓｅ１、レニン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、��ンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ２（ＰｏＦＵＴ２）、グリコペプシノゲン（ＧＰ）、及びフォンウィルブランド因子Ａ１Ａ２Ａ３ドメインが挙げられる。
【００５５】
別の態様では、本開示は、細胞において、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを発現させることを含む、細胞表面（Ｍａｎ−６−Ｐ）受容体に対する目的のタンパク質の結合を増加させる方法を提供する。外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、セクションＩ（ａ）に記述した通りであり得る。細胞は、セクションＩ（ｂ）ｉｖに記述した通りの宿主細胞であり得る。特定すると、細胞はＣＨＯ細胞である。細胞表面（Ｍａｎ−６−Ｐ）受容体に対する目的のタンパク質の結合が増加すると、目的のタンパク質の取り込みが増加し得る。結合は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下におけるリン酸化と比べて１．５倍超増加し得る。更に、結合は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下における結合と比べて２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、１０倍超、２０倍超、３０倍超、４０倍超、５０倍超、６０倍超、７０倍超、８０倍超、９０倍超、１００倍超、１１０倍超、１２０倍超、１３０倍超、１４０倍超、または１５０倍超増加し得る。特定すると、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットである場合、結合は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下における結合と比べて１．５倍超、２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、１０倍超、２０倍超、３０倍超、４０倍超、５０倍超、６０倍超、７０倍超、８０倍超、９０倍超、１００倍超、１１０倍超、１２０倍超、１３０倍超、１４０倍超、または１５０倍超増加し得る。更に、外来性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／βサブユニットであり、スペーサー１が欠失しており、Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域が欠失している場合、結合は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのみの存在下における結合と比べて２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、１０倍超、２０倍超、３０倍超、４０倍超、５０倍超、６０倍超、７０倍超、８０倍超、９０倍超、１００倍超、１１０倍超、１２０倍超、または１３０倍超増加し得る。目的のタンパク質は、マンノース−６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）でタグ付けすることにより役立つタンパク質である。ある特定の実施形態では、目的のタンパク質はリソソームタンパク質である。リソソームタンパク質の非限定的な例としては、β−グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、ニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、アリールスルファターゼＢ、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、及びリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）が挙げられる。特定すると、リソソームタンパク質は、酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）またはリソソーム酸性α−マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）である。他の実施形態では、目的のタンパク質は非リソソームタンパク質である。非リソソームタンパク質の非限定的な例としては、ＤＮａｓｅ１、レニン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、タンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ２（ＰｏＦＵＴ２）、グリコペプシノゲン（ＧＰ）、及びフォンウィルブランド因子Ａ１Ａ２Ａ３ド��インが挙げられる。
【００５６】
種々の態様において、本方法は、酵素補充療法において使用される目的のタンパク質を単離または精製することを更に含む。タンパク質を単離または精製する方法は、当技術分野において公知である。酵素補充療法（ＥＲＴ）は、リソソーム蓄積症を処置するために使用され得る。ＥＲＴにおいて使用される酵素（及びそれに対応するリソソーム蓄積症）の非限定的な例としては、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、α−ガラクトシダーゼＡ（ファブリー病）、酸性α−グルコシダーゼ（ポンペ病）、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ（ムコ多糖症Ｉ、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、シャイエ症候群）、イズロン酸スルファターゼ（ムコ多糖症ＩＩ、ハンター症候群）、アリールスルファターゼＢ（ムコ多糖症ＶＩ、マロトー・ラミー症候群）が挙げられる。酵素補充療法は、生涯にわたる療法である。産物は全て、末梢ラインまたは中心アクセスデバイスのいずれかによって静脈内投与される。注入は通常、２週間毎、または場合によっては毎週行われる。本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを使用した場合、調製した酵素は、より低い用量またはより低頻度の間隔で投与され得る。更に、本開示のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを使用した場合、リン酸化が低いため通常は使用できないリソソーム酵素が、ＥＲＴに使用され得る。更に、高レベルのＭａｎ−６−Ｐを含むＧＢＡの産生は、マンノース受容体を欠いているゴーシェ病患者の細胞型に対する酵素活性を回復させる機会を提示する。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を示すために含まれている。当業者には、続く実施例において開示される技術が、本発明の実施において良好に機能するものとして本発明者らが発見した技術を代表するものであり、したがって発明を実施するための好ましい形態を構成するものと解釈され得ることが理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえ、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行っても、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく同様または類似の結果が得られる場合があることを理解すべきである。
【００５８】
実施例１〜４の序論。
細胞内の飲食された物質を効率的に分解するリソソームの能力は、６０種程度の可溶性酸性ヒドロラーゼがこの小器官に適切に輸送されることに依存する。高等真核生物において、この選別プロセスは、マンノース６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）認識系によって媒介される。新しく合成された酸性ヒドロラーゼは、シスゴルジにおいてＭａｎ−６−Ｐ残基を獲得し、この残基が、トランスゴルジ網におけるＭａｎ−６−Ｐ受容体（ＭＰＲ）への結合、及びその後のエンドリソソーム系への輸送のための高親和性リガンドとしての役割を果たす（１）。シスゴルジ酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：リソソーム酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ）は、リソソーム酸性ヒドロラーゼのコンフォメーション依存性タンパク質決定基に特異的に結合し、このヒドロラーゼの高マンノース型Ｎ−結合型グリカン上のマンノース残基に対するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの輸送を触媒することにより、Ｍａｎ−６−Ｐタグの生成において最初で最も重要なステップを行う（２）。同一のＮ−結合型グリカンを有する分泌性糖タンパク質は、分泌経路を通過する際にＭａｎ−６−Ｐタグを獲得しない。我々の研究室による過去の研究は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴの２つのＮｏｔｃｈモジュール及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ関連タンパク質（ＤＭＡＰ）相互作用ドメインが、リソソーム酸性ヒドロラーゼにあるタンパク質決定基を特異的に認識し、結果としてそれらの高マンノースオリゴ糖をリン酸化させる役割を示した（３）。非リソソームＮ−グリコシル化タンパク質がこのプロセスから除外され、誤ってリソソームを標的とすることが防止される理由はおそらく、かかる決定基の欠如である。
【００５９】
ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、２つの遺伝子によってコードされるα２β２γ２六量体タンパク質である。より小さなγサブユニットは、ＧＮＰＴＧ遺伝子によってコードされ、一方でαサブユニット及びβサブユニットは、ＧＮＰＴＡＢ遺伝子によって単一のα／β前駆体としてコードされる（４、５）。ゴルジ内のサイト１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）により、ヒトα／β前駆体のＫ９２８におけるタンパク質分解切断が媒介され、この切断は、このタンパク質の触媒能力に必須である（６）。α及びβサブユニットは、Ｎｏｔｃｈ及びＤＭＡＰ相互作用ドメインの他に、併せてタンパク質の触媒コアを形成する４つのステルスドメインも保有する（図１Ａ）。あらゆる真核生物のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのステルスドメインは高度に保存されており、細胞壁多糖類の生合成に関与する糖リン酸トランスフェラーゼをコードする細菌遺伝子内の配列に似ている（図６）（７）。細菌酵素はタンパク質決定基の関与なしに糖リン酸を多糖受容体に直接輸送するため、現在持たれている見解は、哺乳動物ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴが、タンパク質の進化過程において、リソソーム酸性ヒドロラーゼにあるタンパク質決定基の特異的認識において機能するようにＮｏｔｃｈ及びＤＭＡＰ相互作用ドメインを獲得したというものである。
【００６０】
加えて、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、４つのいわゆる「スペーサー」ドメインを有し、そのうちの１つであるスペーサー２のみが、γ−サブユニット結合部位として特徴付けられている（３、８）。これまで、他のスペーサー領域に帰するとされる機能はない。この研究において我々は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴの機能におけるスペーサー１の役割を調査した。我々は予想外にも、スペーサー１の除去により代替的部位（Ｑ８８２）における切断及び触媒的に損なわれた酵素がもたらされることから、スペーサー１が正確にＫ９２８におけるサイト１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）によるα／β前駆体の切断を決定付けることで、完全な触媒活性を可能にしていることを見出した。加えて、スペーサー１の欠失は、ＷＴ酵素により十分にリン酸化されないいくつかの非リソソーム糖タンパク質をリン酸化させる能力が増強された酵素をもたらす。Ｎｏｔｃｈ１とα／β切断部位との間の領域とともにスペーサー１を除去すると、細菌タンパク質を思わせる最小限の酵素がもたらされる。この最小限のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを発現する細胞は、その高い発現レベルの結果として、単糖α−メチルＤ−マンノシド（αＭＭ）及び非リソソーム糖タンパク質に対して劇的に増加した活性を提示する。これらの所見をまとめると、非リソソームタンパク質のリン酸化の阻害におけるスペーサー１の新規かつ予想外の役割が明らかになり、また、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがリソソーム酵素を特異的にリン酸化すると同時に非リソソームタンパク質をリン酸化及びリソソームへの誤った選別の対象となることから除外するように進化した経緯に関する新たな見識がもたらされる。
【００６１】
実施例１。スペーサー１の欠失は、代替的部位におけるＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βの切断をもたらす。
ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのα／βサブユニットのスペーサー１ドメインの機能を解析するため、まず、ヒト及びＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴタンパク質配列、ならびに細菌のＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ配列の間でアライメントを行った。図６に示したように、ヒトのスペーサー１配列は、配列データが入手可能である全ての哺乳動物ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴスペーサー１領域と同様に、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ及び細菌タンパク質のものよりも２００ａａ長い。このことは、哺乳動物のスペーサー１領域が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのスペーサー１配列には関連付けられない特有の役割を果たし得ることを示唆した。よって、２３６ａａのヒトスペーサー１配列をＤＮＡレベルにおいてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ配列の２９ａａに置き換え、結果として得られた構築物（図１Ａ、ＤＳ１）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法（３）により生成されたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ＷＴ及びＤＳ１変異体を発現する全細胞抽出物のウェスタンブロット解析を行うことで、ヒトスペーサー１のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ配列への置き換えにより変異体タンパク質の効率的なフォールディングが起こり、それが小胞体（ＥＲ）から出て、α／β前駆体がα及びβのサブユニットに切断されるシスゴルジに至ったかどうかを判定した。図１Ｂ及び図１Ｃに示したように、変異体タンパク質は実際に良好に発現され、ＥＲを出て、単糖αＭＭに対するＷＴ触媒活性の６０％を呈する。しかしながら、タンパク質分解切断のβサブユニット産物の大部分は、ＷＴのβサブユニットよりもゆっくりとＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を泳動し（図１Ｂ、矢印）、Ｋ９２８で切断されるＷＴタンパク質に対して、ＤＳ１変異体のほとんどが代替的部位で切断されていることが示された（図１Ｂ、＊）。ＤＳ１では、小量の正常なβサブユニットも見られた（図１Ｂ及び図１Ｄ、長時間曝露、＊）。このことから、スペーサー１の除去から生じる代替的な切断が、ＷＴα／β前駆体をＫ９２８で切断するＳ１Ｐと同じプロテアーゼに起因するのか、または異なるプロテアーゼが関与し得るのかに関する疑問が生じた。我々はこの問題に対処するため、Ｓ１Ｐの阻害剤であるアミノピロリジンアミドＰＦ−４２９２４２（９）で細胞を処置した。この阻害剤の存在は、ＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ及びＤＳ１変異体の両方においてβサブユニット形成の喪失をもたらし（図１Ｄ）、代替的部位における切断がＳ１Ｐによって媒介されていることを示した。これが事実であれば、元の切断部位のＮ末端側に更なるコンセンサスＳ１Ｐ切断部位が存在するはずである。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／βアミノ酸配列の調査により、コンセンサスの主要なアルギニン残基Ｒ８７９がインバリアントな−４位に存在することから、これが真実であることが明らかになり、切断はＱ８８２で起こると仮定された（図１Ｅ）（１０）。Ｑ８８２における切断は、ＤＳ１で見られるβサブユニットの分子質量の増加と一致している。Ｒ９２５の変異は、Ｋ９２８におけるＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴの切断を消失させる（図１Ｆ、レーン２）。その一方で、Ｒ８７９の変異は、Ｋ９２８における全長α／β前駆体の正常なプロセシングには影響を与えなかったが（図１Ｆ、レーン３）、よりゆっくりと泳動するβサブユニットの喪失（図１Ｆ、レーン６）によって示されるように、ＤＳ１変異体のＱ８８２における切断を消失させた。この場合、微量のＫ９２８切断βは影響を受けなかった（図１Ｆ、レーン６、長時間曝露）。Ｒ９２５及びＲ８７９両方の変異は、β形成の完全な喪失をもたらした（図１Ｆ、レーン７）。これらのデータは、スペーサー１の非存在下を除いては稀にしか利用されないＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴにおける新規のＳ１Ｐ切断部位としてＱ８８２を明らかに特定するものである（図７）。
【００６２】
２３６ａａのヒトスペーサー１配列を２９ａａのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ配列に置き換えたため、代替的な切断部位の利用がヒトスペーサー１配列の除去ではなくＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ配列の導入の結果である可能性があった。この可能性を排除するため、ヒトスペーサー１を小さな残基Ｇｌｙ及びＳｅｒを含む２６ａａリンカーに置き換えた別のスペーサー１欠失変異体を作製した（図８Ａ、ΔＳ１）。Δスペーサー１（ΔＳ１）は、Ｓ１Ｐにより媒介されるタンパク質分解プロセシングがほとんどの場合において新たな部位（Ｑ８８２）での切断をもたらし（図８Ｂ）、ΔＳ１がαＭＭに対するＷＴ活性の４０％を有した（図８Ｃ）という意味で、あらゆる点でＤＳ１と同様の性質を示した。更に、Ｓ１Ｐ阻害剤であるＰＦ−４２９２４２は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのＷＴ及びＤＳ１変異体とともに用いた場合と同じく、ΔＳ１とともにβサブユニットの形成を遮断した（図８Ｄ）。また、ＤＳ１及びΔＳ１はいずれも、ＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴと同一のゴルジ局在化を示し（図９）、これら２つの変異体の誤った局在化が切断の変化の原因である可能性が除外された。これらの結果は、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴにおける２３６ａａのスペーサー１配列の存在がＱ８８２ではなくＫ９２８における切断を確実にすることを明白に示す。
【００６３】
実施例２。Ｑ８８２における切断は、不活性なＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴをもたらす。
ゴルジ内の残基Ｋ９２８におけるＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体のタンパク質分解プロセシングは、触媒活性酵素に不可欠である（５、１１）。α／βには２つのＳ１Ｐ切断部位があるため、Ｋ９２８ではなく新たな部位における切断も活性酵素をもたらすかどうかという疑問が提起される。この疑問に対処するため、図１Ｆに示した点変異体のαＭＭに対する活性（図１Ｃ）及びいくつかのリソソーム酵素に対する活性（図１Ｇ）を、ＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体及びＤＳ１変異体の両方との関連において試験した。種々の構築物をＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞において発現させ、トランスフェクションの４８時間後、細胞抽出物を調製し、それぞれのアリコートを取ってαＭＭ活性アッセイを行った（図１Ｃ）。固定化されたカチオン非依存性（ＣＩ）−ＭＰＲを含むビーズとともに残りの抽出物をインキュベートし、リン酸化されたリソソーム酵素に結合させた。ビーズを洗浄し、３種のリソソーム酵素の結合度について「方法」に記述したようにアッセイした（図１Ｇ）。図１Ｃ及び図１Ｇに示したように、ＷＴα／β前駆体との関連におけるＲ９２５Ａ変異体は、α／β前駆体の切断が活性に不可欠であるという有力な仮説と一致して、αＭＭ及びリソソーム酵素のいずれに対してもバックグラウンド活性しか有しなかった。その一方でＲ８７９Ａ／ＷＴは、ＷＴα／β前駆体と比較して、αＭＭに対する活性の３０％、及び３種のリソソーム酵素に対する活性の１１０〜１２５％を呈した。これらの点変異を個別にまたはＤＳ１バックグラウンドと併せて試験したとき、種々の変異体は依然としてＷＴのαＭＭ活性の２０〜３０％を保持していた（図１Ｃ）。タンパク質分解プロセシングを一切受けないＲ９２５Ａ／Ｒ８７９Ａ／ＤＳ１変異体が、αＭＭに対する相当な活性（図１Ｃ）及びリソソーム酵素に対する低レベルの活性（図１Ｇ）を保持したという事実は、スペーサー１の非存在下において切断されていないα／βが部分的に活性であることを示す。全ての変異体がＷＴと同一のゴルジ局在化を提示した（図１０）。これらの結果は、ＤＳ１に関連するリソソーム酵素に対する触媒活性が、Ｋ９２８における切断から生じる小量のβと、α／β前駆体が寄与する活性の組み合わせに起因し、Ｑ８８２において切断される主な形態のβが不活性であることを示す。
【００６４】
実施例３。スペーサー１の欠失は、いくつかの非リソソーム糖タンパク質のリン酸化を増強させる。
ＷＴもしくはＤＳ１変異体の構築物、またはベクター単独をトランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞における、可溶性糖タンパク質の全マンノースリン酸化を定量した。トランスフェクションの４８時間後、［２−３Ｈ］マンノースで細胞を２時間標識してから採取し、界面活性剤不含バッファー中で洗浄し溶解させた後、超遠心分離により膜タンパク質を可溶性画分から分離させた。次に、「方法」において記述したように、固定化されたＣＩ−ＭＰＲとともに可溶性画分をインキュベートしてＭａｎ−６−Ｐ修飾タンパク質を特異的に結合させてから、［２−３Ｈ］マンノース標識糖タンパク質の含有量についてそれらを解析した。驚くべきことに、ベクター単独の値を差し引いた後、ＤＳ１変異体は、ＷＴ構築物と比較して、全可溶性糖タンパク質のリン酸化レベルのわずかだが統計的に有意な上昇を一貫してもたらした（図２Ａ）。ＷＴまたはＤＳ１のいずれかによるリソソームタンパク質ＧａｌＡ、カテプシンＤ（ＣａｔｈＤ）、及びニーマン・ピック病Ｃ２型（ＮＰＣ２）のリン酸化の度合いも、「方法」に記述した［２−３Ｈ］マンノース標識、免疫沈降、及び直接的なグリカンの解析を使用して測定した。個々の酵素の発現ベクターと併せてＷＴまたはＤＳ１構築物のいずれがＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトされたかにかかわらず、３種全てのリソソーム酵素が同様のリン酸化度を示した（図２Ｂ、左パネル、ＷＴ値が１．０に設定されている）。これらの所見をまとめると、ＤＳ１による全リン酸化において観察された増加が、リソソームタンパク質に加えて非リソソーム糖タンパク質のリン酸化に起因したという可能性が高まった。これが事実であるかどうかを判定するために、非リソソーム糖タンパク質のＤＮａｓｅ１、レニン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及びタンパク質Ｏ−フコシルトランスフェラーゼ２（ＰｏＦＵＴ２）の各ｃＤＮＡをＷＴα／β前駆体またはＤＳ１変異体ｃＤＮＡのいずれかと併せてコトランスフェクトし、リン酸化度を［２−３Ｈ］マンノース標識によって定量化した。これらの糖タンパク質は本質的にリソソームタンパク質ではないが、低レベルのＭａｎ−６−Ｐタグを獲得することが知られているため（１２〜１５）、これらを解析のために選択した。４つの場合全てにおいて、ＤＳ１によって媒介されるマンノースリン酸化の程度は、ＷＴ構築物を用いて達成されたものよりも１．５〜２倍高かった（図２Ｂ、右パネル）。これと一致して、レニン及びＮＰＣ２のｃＤＮＡをＤＳ１とコトランスフェクトしたとき、レニンは、ＷＴα／β前駆体と比べて固定化されたＣＩ−ＭＰＲに対する結合の増加を提示したが、ＮＰＣ２はこの結合の増加を提示しなかった（図２Ｃ）。グリコペプシノゲン（ＧＰ）も、膜糖タンパク質のＬａｍｐ１及びＬａｍｐ２のいずれも、これらの条件下では結合を一切示さなかった（図２Ｃ）。これらの結果は、スペーサー１の非存在下では、非リソソーム基質のサブセットのうちの修飾されたα／βサブユニットによって媒介されるリン酸化が増加することを示す。これらのデータをまとめると、スペーサー１は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体の切断がほぼＫ９２８でのみ起こることを決定付け、かつ��くつかの非リソソーム糖タンパク質のリン酸化を最小限に抑えるように機能することが示される。
【００６５】
実施例４。アミノ酸４３８〜９２６の欠失は、活性ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴの高レベル発現をもたらす。
αサブユニットのＤＭＡＰ相互作用ドメインと併せて２つのＮｏｔｃｈリピートがリソソーム酵素の選択的認識を媒介することは、これまでに示された（図３Ａ、ＷＴα／β）。この領域の欠失（図３Ａ、Ｎ１−Ｄ）は、［２−３Ｈ］マンノース標識によって定量される全可溶性糖タンパク質のリン酸化を劇的に低減させた（図３Ｂ）。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴによってリン酸化されるタンパク質の大部分が事実上リソソームタンパク質であることを考えると、Ｎ１−Ｄ領域の非存在下におけるこの結果は驚くべきものではない。したがって、固定化されたＣＩ−ＭＰＲに結合する能力によって測定される、β−ヘキソサミニダーゼ（ＨＥＸＢ）、α−ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、及びβ−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）のリン酸化は、ほぼ完全に抑止された（図３Ｃ）。スペーサー１が阻害性ドメインとして機能するという所見を踏まえ、Ｎ１−Ｄと組み合わせてスペーサー１を欠失させれば（図３Ａ、Ｓ１−Ｄ）、２つのＮｏｔｃｈモジュール及びＤＭＡＰ相互作用ドメインを欠いているＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがリソソーム酵素をリン酸化できないことが部分的に克服され得ると仮定した。この予想は、Ｎ１−Ｄと比べてＳ１−Ｄ変異体により媒介される全可溶性タンパク質のリン酸化のわずかだが統計的に有意な増加（図３Ｂ、Ｎ１−Ｄ対Ｓ１−Ｄの比較）、ならびにＨＥＸＢ、ＧＬＡ、及びＭＡＮＢＡのリン酸化のわずかな増加（それぞれＷＴ値の１４％、１３％、及び５％）（図３Ｃ）を示す結果によって証明された。単糖αＭＭに対するＮ１−Ｄ及びＳ１−Ｄ変異体の活性は同様であるため（図３Ｅ、Ｎ１−Ｄ対Ｓ１−Ｄ）、Ｓ１−Ｄ欠失変異体によって媒介されるリソソーム酵素リン酸化のこうした増加は、スペーサー１の阻害機能の喪失によって最もよく説明される。
【００６６】
ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体から更にドメインを欠失させても触媒活性が保持されるかについて調べた。スペーサー３の大部分を含むＮｏｔｃｈ１の始点（Ｃ４３８）からＫ９２８までの全てのアミノ酸（ａａ）の欠失は、ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞においてＷＴよりもおよそ１０倍多く発現された（図３Ｄ、レーン３及び６の比較）、切断形態のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ（図３Ａ、Ｎ１−Ｓ３）をもたらし、この変異体は、２つのＮｏｔｃｈリピート及びＤＭＡＰ相互作用ドメインが存在しないにもかかわらず、可溶性糖タンパク質の全リン酸化をＷＴレベルまで回復させた（図３Ｂ、ＷＴ対Ｎ１−Ｓ３の比較）。欠失した領域が切断部位まで伸長したため、この変異体はタンパク質分解プロセシングを受けなかったが（図３Ｄ）、単糖αＭＭに対して劇的に増加した触媒活性を提示した（図３Ｅ）。この結果は、α／β前駆体の切断自体が触媒活性の必要条件ではないことを示した。Ｋ９２８を超える欠失は許容されなかった。
【００６７】
Ｎ１−Ｓ３との関連においてスペーサー１を欠失させることの結果を判定した。この新たな構築物（図３Ａ、Ｓ１−Ｓ３）は、更なる切断形態のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体をもたらし、これもまた、Ｎ１−Ｓ３と同様のレベルで劇的に増強された発現（図３Ｄ、レーン３及び７の比較）及びαＭＭに対する触媒活性（図３Ｅ）を提示した。最も注目すべきことには、Ｓ１−Ｓ３により媒介される可溶性糖タンパク質の全リン酸化は、ＷＴと比べて３倍超増加したが、Ｎ１−Ｓ３はＷＴと同様であった（図３Ｂ、ＷＴ、Ｎ１−Ｓ３及びＳ１−Ｓ３の比較）。Ｓ１−Ｓ３とＮ１−Ｓ３との間の唯一の違いはスペーサー１の非存在であるため、これらの結果は、スペーサー１の阻害的役割の更なる証拠を提供する。非リソソームタンパク質であるレニン、ＰｏＦｕｔ２、ＧＰ、及びフォンウィルブランド因子Ａ１Ａ２Ａ３ドメインのＳ１−Ｓ３によって媒介されるリン酸化もまた、Ｎ１−Ｓ３と比べて増加し（図３Ｆ）、リソソームタンパク質であるＨＥＸＢ、ＧＬＡ、及びＭＡＮＢＡの場合も同様であった（図３Ｇ）。４つ全ての変異体（Ｎ１−Ｄ、Ｓ１−Ｄ、Ｎ１−Ｓ３、及びＳ１−Ｓ３）がＷＴと同様にゴルジに局在化した（図１１）。
【００６８】
Ｓ１−Ｓ３変異体により媒介されるＭａｎ−６−Ｐ形成の度合いのより定量的な測定値を得るために、ＬＩＦ、レニン、ＰｏＦｕｔ２、及びＤＮａｓｅ１のいずれかのｃＤＮＡを、ＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴまたはＳ１−Ｓ３変異体のα／β前駆体ｃＤＮＡのいずれかと併せてコトランスフェクトした細胞の［２−３Ｈ］マンノース標識を行った。これらのタンパク質のそれぞれとＳ１−Ｓ３との共発現は、発現の著しい増強及びそれに付随したαＭＭに対する活性の増加（図３Ｄ及び図３Ｅ）と一致して、ＷＴと比べてリン酸化を２〜４倍増加させた（図４）。これらのタンパク質のリン酸化は、ＤＳ１変異体によって達成されたものよりもわずかに高かった（図４と図２Ｂの比較）。
【００６９】
実施例１〜４に関する考察。
ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのＮｏｔｃｈモジュール及びＤＭＡＰ相互作用ドメインは、リソソームタンパク質の選択的認識及びそれらのＮ−結合型グリカンのリン酸化において必須の役割を有する（３、１６）。分泌経路を通過する数多くの他の糖タンパク質は、リン酸化されないか、または低レベルのＭａｎ−６−Ｐタグしか獲得しないかのいずれかである、極めて類似または同一のＮ−結合型グリカンを提示する（１７）。この観察に関する有力な説明は、非リソソームタンパク質は、リソソームタンパク質とは異なり、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのＮｏｔｃｈモジュール及び／またはＤＭＡＰ相互作用ドメインによって認識され結合される構造決定基を欠いているというものである。よって、タンパク質に高マンノースオリゴ糖が存在するというだけでは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがグリカンをインビボでリン酸化させるには不十分である。インビトロでは、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは単糖αＭＭをリン酸化させることができるが、この基質に対するこの酵素のＫｍはリソソーム酵素のそれを優に３桁上回り、リソソームタンパク質にあるＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴに対するタンパク質ドッキング部位の主要な役割を示している（１８）。この研究の主要な所見は、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、リソソームタンパク質を特異的に認識しリン酸化することに加えて、非リソソームタンパク質のリン酸化を防止する役割を果たすエレメント（スペーサー１）を含むというものである。これは、スペーサー１ドメインに割り当てられた第１の機能である。ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのスペーサー１は２３６ａａ長であり、脊椎動物種間で高度に保存されている。これは、単に「スペーサー」として機能する以外の役割と一致して（１９）、明確な構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｎ６Ｄ）を有する。その一方で、下等真核生物であるＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのスペーサー１領域は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの細菌性Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼのそれと長さが同様であり（図６）、ヒト配列と同じように機能する可能性は極めて低い。ヒトとＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍとのスペーサー１配列間にアミノ酸レベルで有意な同一性は存在しない。隣接するステルス１＆２ドメインはこれら２つの種の間で酷似しているため、ヒトＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、ヒト配列のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ配列との置換を許容する可能性がある。ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞においてこのキメラを発現させると、ＤＳ１はちょうどＷＴ酵素のようにＥＲにおいて効率的にフォールディングされシスゴルジに輸送されたものの、後者の区画では差次的にタンパク質分解プロセシングされたという、予想外の結果がもたらされた。この代替的な切断を媒介したのはＳ１Ｐであったということが、Ｓ１Ｐ阻害剤ＰＦ−４２９２４２の使用によって確認された。ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴ患者変異を解析する近年の研究においてＶｅｌｈｏらは、残基Ｙ９３７〜Ｍ９７２のインフレーム欠失が、αサブユニット内の代替的な上流部位におけるＳ１Ｐによるα／β前駆体の切断をもたらしたことを報告したが、この研究ではこの新たな部位は特定されなかった（２０）。代替的切断部位としてのＱ８８２の特定は、ＤＳ１で見られるβ−サブユニットのより高い分子質量と一致している。Ｓ１Ｐがスペーサー１の非存在下でαサブユニット内のＫ９２８ではなくＱ８８２で切断する理由は、現時点では不明である。残基９３７〜９７２の欠失も新たな部位における切断をもたらしたという所見を踏まえると、１つの可能性は、スペーサー１がスペーサー３の一部の領域（ａａ８１９〜９５５、図１）と相互作用することにより、Ｓ１Ｐが切断される場所に影響が及ぶというものである。スペーサー１の非存在下でのＳ１Ｐによる新たな部位の使用についての代替的な説明は、通常はこのドメインによってもたらされるＱ８８２での切断を妨げる立体障害がもはや存在しないことから、小量の前駆体はＫ９２８でも切断されるものの、Ｓ１Ｐが主にＱ８８２で切断できるようになるというものである。興味深いことに、ＷＴのＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴは、Ｑ８８２におけるタンパク質分解プロセシングの結果として、微量の触媒不活性酵素をもたらすことが分かった。これらの結果により、脊椎動物のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴが、Ｋ９２８における切断を促進し、その触媒効率を最大にするためにスペーサー１を獲得したという可能性が高まる。
【００７０】
こうした結果は、スペーサー１が、正しくプロセシングされた形態のＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴを生成するためにＳ１Ｐによって利用される切断部位を決定付けることに加えて、非リソソーム酵素の高マンノースグリカンのリン酸化を最小限に抑えるにあたって重要な役割を有することも示す。ＤＮａｓｅＩ、レニン、ＬＩＦ、及びＰｏＦｕｔ２を含め、いくつかの非リソソーム糖タンパク質がそのオリゴ糖鎖に低レベルのＭａｎ−６−Ｐタグを獲得することは、十分に裏付けられている。これらのタンパク質の低レベルのＭａｎ−６−Ｐ修飾の生理学的意義は明らかではないが、Ｍａｎ−６−Ｐ修飾タンパク質はエンドソーム／リソソーム区画への送達のために分泌経路から分離されることになるため、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴによるこれらのタンパク質の広範なリン酸化は、細胞にとって非生産的である可能性が高いように思われる。ＤＮａｓｅＩ、レニン、ＬＩＦ、及びＰｏＦｕｔ２のＷＴ酵素と比べて、ＤＳ１により媒介されるリン酸化における１．５〜２倍の増加を示すデータは、非リソソームタンパク質のリン酸化の阻害におけるスペーサー１の役割を示す。
【００７１】
２つのＮｏｔｃｈモジュール及びＤＭＡＰ相互作用ドメインの欠失（Ｎ１−Ｄ）が、試験した全てのリソソーム酵素に対する変異体ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのリン酸化活性を実質的に消失させたことは、これまでに示された（３）。これに関して、スペーサー１欠失が、Ｎｏｔｃｈ１−ＤＭＡＰ欠失と組み合わせると（Ｓ１−Ｄ）、ＨＥＸＢ、ＧＬＡ、及びＭＡＮＢＡの低レベルのリン酸化を回復させることができたのは興味深い（それぞれＷＴ値の１４％、１３％、及び５％）。Ｎ１−Ｓ３変異体は、触媒活性のためにタンパク質分解プロセシングを必要としないため、同じ背景におけるスペーサー１欠失の影響を評価するための良好な対照としての役割を果たす。この新たな構築物Ｓ１−Ｓ３は、細菌の糖リン酸トランスフェラーゼ（図６）に似ており、Ｎ１−Ｓ３で得られたものと同様に高いレベルで発現され、αＭＭに対して同様の活性を有した。しかしながら、Ｓ１−Ｓ３構築物は、全可溶性糖タンパク質のリン酸化をＷＴと比べてほぼ４倍増加させたが、Ｎ１−Ｓ３の値はＷＴと同様であった。非リソソーム糖タンパク質であるグリコペプシノゲン及びｖＷＦ  Ａ１Ａ２Ａ３ドメインのリン酸化と同じく、リソソーム酵素ＨＥＸＢ、ＧＬＡ、及びＭＡＮＢＡのＳ１−Ｓ３媒介性リン酸化もＮ１−Ｓ３と比較して増加した。ＷＴ酵素の作用を受けない非リソソームタンパク質をリン酸化させるＳ１−Ｓ３構築物の能力は、これが細菌の糖リン酸トランスフェラーゼと同様にタンパク質ドッキング部位の非存在下で機能し得ることを示す。
【００７２】
これらの所見をまとめると、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴα／β前駆体が、脊椎動物の進化の過程において、リソソームタンパク質のリン酸化を促進すると同時に、非リソソーム糖タンパク質をリン酸化させるこの酵素固有の能力を無効にする、正の調節ドメイン（Ｎｏｔｃｈモジュール及びＤＭＡＰ相互作用ドメイン）と負の調節ドメイン（スペーサー１）との両方を獲得したという仮説が支持される。我々はこれらの所見に基づき、ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴがどのように機能するかを説明するために以下のモデルを提案する。基礎状態において（図５Ａ）、スペーサー１ドメインは、４つのステルスドメインによって形成された触媒部位のオリゴ糖との会合に干渉する。リソソーム酵素タンパク質ドッキング部位がＮｏｔｃｈモジュール及びＤＭＡＰ相互作用ドメインに結合すると、スペーサー１ドメインが移動するようなコンフォメーション変化が起こり、リソソーム酵素の高マンノースグリカンのマンノース残基が触媒部位に入り、リン酸化できるようになる。一部の事例では、γサブユニットのマンノース−６−リン酸受容体相同性ドメインが、オリゴ糖を触媒部位に対して導くのに役立つ。ＤＮａｓｅＩといった弱結合性の非リソソーム糖タンパク質は、スペーサー１を移動させるのに必要なコンフォメーション変化を誘導することができず、そのリン酸化の程度を限定する場合がある。スペーサー１が欠失すると、これらのタンパク質のリン酸化が増加する。Ｎｏｔｃｈモジュール及びＤＭＡＰ相互作用ドメインを結合させる構造決定基が完全に欠如している非リソソーム糖タンパク質は、全くリン酸化されない。スペーサー１をＮ１−Ｓ３エレメントと併せて除去すると、ゴルジを通過する可溶性糖タンパク質の全てをリン酸化することを可能にする完全な触媒活性を有する、高度に発現される酵素がもたらされる（図５Ｂ）。
【００７３】
実施例１〜４の方法。
細胞株  −  ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞株については、他所で詳細に記述されている（３）。０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム及び４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、細胞を維持した。
【００７４】
ＤＮＡ構築物  −  ｐｃＤＮＡ６におけるヒトＧＮＰＴＡＢ−Ｖ５／Ｈｉｓについては記述されている（１１）。ＰＣＲによって生成された問題の欠失をコードする制限断片が同じ領域内の天然ｃＤＮＡと取り替えられる、２ステップのオーバーラップ伸長（ＯＥ）ＰＣＲプロセスのいずれかにより、種々のα／β欠失構築物を作製した。ＤＳ１構築物を生成するために、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのスペーサー１配列をヒトのステルス１及びステルス２配列と併せてコードする０．５ｋｂのｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子断片を合成し（ＩＤＴ  Ｉｎｃ．）、ＯＥ−ＰＣＲの第１のステップで利用した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅの部位特異的変異誘発法によって点変異を生成し、全ての配列が正しいことをＤＮＡシーケンシングによって確認した。
【００７５】
ＬＩＦ  ｃＤＮＡ構築物はＲｉｃｈａｒｄ  Ｓｔｅｅｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ．Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）により提供していただき、ＰｏＦｕｔ２−ｍｙｃ  ｃＤＮＡはＲｏｂｅｒｔ  Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ．Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）から寄贈された。ＤＮａｓｅＩ、グリコペプシノゲン、ＣａｔｈＤ−ｍｙｃ、ａ−ＧａｌＡ、及びＮＰＣ２−ｍｙｃについては記述されている（３、１２、２１）。レニン−ＨＡ  ｃＤＮＡはＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入し、プラスミドのｖＷＦ−Ａ１Ａ２Ａ３−Ｓｔｒｅｐ−ｐＣＤＮＡ６はＪ．Ｅｖａｎ  Ｓａｄｌｅｒ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から提供された。
【００７６】
免疫蛍光顕微鏡  −  ＷＴα／β及び種々の変異体の細胞内局在を可視化するため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元のプロトコールに従って使用して、様々な構築物をＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を固定し、マウス抗Ｖ５モノクローナル抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてα／βサブユニットを検出した。それぞれ、ウサギ抗ＧＯＬＰＨ４ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて、ゴルジマーカーのＧＯＬＰＨ４を検出した。プロセシングされた細胞をＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ退色防止封入剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に封入し、ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）のいずれかを用いて画像を取得した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｆｉｊｉ）によって画像を解析した。
【００７７】
ウェスタンブロッティング  −  還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、図の凡例に示されている抗体を用いて検出した。
【００７８】
全可溶性糖タンパク質の［２−３Ｈ］マンノース標識実験  −  トランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞を用いた標識実験を次のように行った。トランスフェクションの４８時間後、６ウェルプレート内の細胞を１０μＣｉの［２−３Ｈ］マンノース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とともに２時間インキュベートした。２時間のパルスの後、細胞をＰＢＳで２回すすいで採取し、次に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ７．２）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む４℃の界面活性剤不含バッファーに再懸濁した。超音波処理により細胞を溶解させ、次に１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離に供し、膜タンパク質を可溶性画分から分離させた。次に、マンノースがリン酸化した糖タンパク質をペレット化するため、臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに共有結合により共役した精製したＣＩ−ＭＰＲとともに、可溶性画分の１００μｌをインキュベートした。一方、可溶性画分の１０μｌを１．５％リンタングステン酸によって沈殿させて、全［２−３Ｈ］マンノース標識を可溶性タンパク質に組み込ませた。この方法により、ＷＴまたは変異体ＧｌｃＮＡｃ−１−ＰＴのいずれかによってリン酸化されたマンノース標識糖タンパク質の全てを正確に数量化することができた。
【００７９】
リソソーム酵素の［２−３Ｈ］マンノース標識実験  −  トランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞を用いた標識実験を次のように行った。トランスフェクションの４８時間後、６０−ｍｍ組織培養プレート内の細胞を５０〜１５０μＣｉの［２−３Ｈ］マンノース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とともに２時間インキュベートし、その後、５ｍＭグルコース、５ｍＭマンノース、及び１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含む完全培地を添加してマンノースの取り込みを停止させ、分泌を誘導した。細胞を更に３時間インキュベートした後、培地を収集した。いくつかの実験において細胞抽出物を調製し、βサブユニットの含有量についてウェスタンブロッティングに供して、構築物が比較可能なレベルで発現されていることを確認した。
【００８０】
免疫沈降及びオリゴ糖解析  −  本質的にはこれまでに詳細に記述されているように（２３）、培地に分泌された酸性ヒドロラーゼを免疫沈降させ、オリゴ糖を単離し、解析した。ＣａｔｈＤ−ｍｙｃ、ＮＰＣ２−ｍｙｃ、ＰｏＦｕｔ２−ｍｙｃ、及びレニン−ＨＡの実験では、２０μｌの抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または５μｌの抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ａｇａｒｏｓｅ−ＰＬＵＳビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に予め結合させてから、標識されたリソソームヒドロラーゼを培地から免疫沈降させた。ＧＬＡ、ＤＮａｓｅＩ、及びＬＩＦの場合は、抗β−Ｇａｌ抗体（Ａｍｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に予め結合させたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ａｇａｒｏｓｅ−ＰＬＵＳビーズ、及び抗ＤＮａｓｅＩ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または抗ＬＩＦ抗体（寛大にもＦｒｅｄｅｒｉｃ  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎａｎｔｅｓ，Ｎａｎｔｅｓ，Ｆｒａｎｃｅから提供された）に予め結合させたｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−ａｇａｒｏｓｅビーズ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ）を用いて、分泌された酵素の免疫沈降を行った。免疫沈降した物質をＥｎｄｏ  Ｈ（ＮＥＢ）で処置し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。中性及びリン酸化された高マンノースグリカンを含む濾液を弱酸で処置して、リン酸部分に未だ結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基があればこれを除去し、ＱＡＥ−カラムマトリックスに加えて、０個、１個または２個のＭａｎ−６−Ｐ残基を有するオリゴ糖を分離させた。Ｅｎｄｏ  Ｈ耐性のある複合オリゴ糖を含む残余分をＰｒｏｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で処置し、ＣｏｎＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分画した。各画分の［２−３Ｈ］−マンノース含有量を定量し、記述されているように（２３）リン酸化パーセントを計算した。全ての場合において、偽性トランスフェクションで得られた値は差し引いた。
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【００８１】
実施例５。酵素補充療法のための高度にリン酸化されたリソソーム酵素を産生するための方法。
酵素補充療法（ＥＲＴ）は現在、いくつかのリソソーム蓄積症のための主要な処置形態であるが、その効力は個々の障害において異なる［１］。これらの遺伝性障害のほとんどは、単一のリソソーム酵素の活性不足により、この酵素によって通常分解される物質が蓄積することに起因する。リソソーム内の蓄積物質が増えると、やがて細胞及び臓器の機能不全が生じる。ＥＲＴの目的は、欠損細胞のリソソームに十分な量の正常な酵素を導入して蓄積物質を排出し、リソソーム機能を回復させることである。この形態の療法が初めて使用されたのは、酸性β−グルコセレブロシダーゼ活性が欠如しており、主にマクロファージ系細胞にグルコシルセラミドが蓄積する、１型ゴーシェ病患者においてであった［２］。末端マンノース残基を含むＮ−結合型グリカンを含有する補充酵素が静脈内に注入され、細胞表面マンノース受容体を介してマクロファージに取り込まれる。飲食された酵素は次にエンドソームによってリソソームに輸送され、ここで酵素が機能することでこの障害の良好な臨床結果が得られる［３］。
【００８２】
ほとんどの細胞型はマンノース受容体を欠いているため、マクロファージ以外の細胞型が関与するリソソーム蓄積障害を処置するために使用される補充酵素は、その後のリソソームへの送達のために、細胞表面のマンノース６−リン酸（Ｍａｎ−６−Ｐ）受容体への結合を利用する。これらの酵素は、目的の酵素を高レベルで産生するように工学操作された哺乳動物細胞、主にチャイニーズハムスター卵巣細胞の分泌物から精製される。この手法は、発現されたリソソーム酵素のＮ−グリカンのマンノース残基をリン酸化させる内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼの能力に依存する。この技術により産生される補充酵素の一部は高度にリン酸化されており、Ｍａｎ−６−Ｐ受容体に良好に結合する。しかしながら、その他のものは十分にリン酸化されず、ＥＲＴにおけるその有効性は限られている。これには、ポンペ病酵素（酸性α−グルコシダーゼ、ＧＡＡ）及びアルファマンノシドーシス酵素（リソソーム酸性α−マンノシダーゼ、ＬＡＭＡＮ）が含まれる［４、５］。
【００８３】
産生細胞により合成されている高レベルのＧＡＡ及びＬＡＭＡＮを効果的にリン酸化させるためには、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼの活性では不十分である可能性がある。この可能性について調査するため、Ｅｘｐｉ２９３Ｆまたはカチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）陰性マウスＤ９  Ｌ細胞に、目的のリソソーム酵素をコードするプラスミドを、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼα／β前駆体のｃＤＮＡと併せてコトランスフェクトした。ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼは２つの遺伝子（ＧＮＰＴＡＢ及びＧＮＰＴＧ）によってコードされるα２β２γ２六量体であるが、α／βサブユニットは、γの非存在下でほとんどのリソソーム酵素をリン酸化させることができる［６］。加えて、触媒的「ステルス」ドメインを保持しながらもαサブユニットエレメントのうちのいくつかを欠いている切断型α／β前駆体（Ｓ１−Ｓ３）も試験した（図１２Ａ）。この切断型酵素は非常に高いレベルで発現され、ＷＴ酵素の場合に生じるものよりも２０倍高い触媒活性をもたらす［７］。
【００８４】
トランスフェクト細胞により分泌された４種のリソソーム酵素のＣＩ−ＭＰＲビーズへの結合が図１２Ｂに示されている。この場合の結合の増加は、これらの酵素のリン酸化度の上昇を反映する。全ての事例において、切断型α／β前駆体をコトランスフェクトした細胞により分泌された酵素は、細胞において単独で発現される酵素について観察されるよりも大幅に大きくＣＩ−ＭＰＲビーズに結合した。ＣＩ−ＭＰＲビーズへのリソソーム酵素の結合に対してＷＴα／β前駆体とのコトランスフェクションが与える影響は、ＧＡＡ結合の最小限の刺激から、ＬＡＭＡＮの場合における結合の１２倍の増強に至るまでまちまちであった。α／β前駆体構築物がリソソーム酵素のリン酸化に与える影響をより直接的に調べるため、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９不活性化ＧＮＰＴＡＢ遺伝子［８］を有するＨｅＬａ細胞に種々のプラスミドをトランスフェクトし、次に［２−３Ｈ］マンノースとともに１時間インキュベートして、リソソーム酵素のＮ−結合型グリカンを標識した。対照として、活性な内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼを有する親ＨｅＬａ細胞に、リソソーム酵素をコードするプラスミドのみをトランスフェクトした。標識された酵素の分泌を刺激するため、ＮＨ４Ｃｌの存在下で４時間追跡した後、培地を採取し、目的のリソソーム酵素を免疫沈降させた。次に、１つまたは２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含む高マンノースＮ−結合型グリカンの含有量について、免疫沈降物を解析した［８、９］。これらの実験は、切断型α／β前駆体が、リソソーム酵素に応じて種々のレベルで親ＨｅＬａ細胞よりもマンノースリン酸化を刺激したことを示した（図１２Ｃ）。更に、切断型酵素は、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの形成を増加させた（表２）。これが重要であるのは、２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンが、１つのＭａｎ−６−Ｐ残基しか含まないグリカンよりも大幅に高い親和性でＣＩ−ＭＰＲに結合するからである［１０］。ＷＴα／β前駆体もＭａｎ−６−Ｐ形成を刺激したが、その程度は変異体α／βの場合に観察されたものよりも低かった。
【００８５】
表１には、種々のリソソーム酵素のＭａｎ−６−Ｐ含有量の増加が、ＨｅＬａ細胞によるそれらの取り込みに与える影響が示されている。ＧＡＡを例外として、ＷＴまたは切断型のいずれかのα／β前駆体をコードするプラスミドをコトランスフェクトした細胞によって分泌された酵素は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼのみを利用する細胞によって分泌された酵素より何倍も良好に内部移行した。取り込みのほとんどは、培地中に５ｍＭのＭａｎ−６Ｐが存在したことにより遮断され、取り込みがＭａｎ−６−Ｐ受容体により媒介されていることが示された。ＬＡＭＡＮでの結果は特に顕著であり、Ｍａｎ−６−Ｐに阻害され得る取り込みが１３０〜１５３倍刺激された。ＧＡＡの場合、切断型α／β前駆体をコトランスフェクトした細胞によって分泌された酵素のＭａｎ−６−Ｐ依存性取り込みは、ＷＴα／β前駆体をコトランスフェクトした、または内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼのみを発現する細胞によって分泌されたＧＡＡよりも、２．６倍高かった。
【００８６】
これらの所見は、リソソーム酵素のリン酸化が、ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼのＷＴまたは切断型のいずれかのα／β前駆体とのコトランスフェクションにより、実質的に増加し得ることを立証する。リン酸化の増強は、ＣＩ−ＭＰＲへの結合及び細胞による取り込みを増加させる。この効果は、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼによって良好にリン酸化されるＧａｌＡなどのリソソーム酵素においても生じる。しかし最も重要であるのは、この方法が、ＬＡＭＡＮ及びＧＡＡという、内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼにより十分にリン酸化されない２つのリソソーム酵素のリン酸化及び取り込みを増強させるという所見である。この方法により調製された酵素は、ＥＲＴにおけるその有用性を著しく改善する可能性を有する。これらの調製物は、より良好な細胞取り込みをもたらすことに加えて、より低い用量を、ことによるとより低頻度の間隔で患者に投与することを可能にし得る。この方法は、ＥＲＴに適し得る他のリソソーム蓄積症のためのリソソーム酵素の産生に適用可能なはずである。加えて、高レベルのＭａｎ−６−Ｐを含むＧＢＡの産生は、マンノース受容体を欠いているゴーシェ病患者の細胞型に対する酵素活性を回復させる機会を提示する。これは、特にマクロファージを対象とする現在の療法に更なる利益を提供する役割を果たし得る。
【００８７】
実施例５の方法。
細胞株  −  Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるものである。これらの細胞は、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁して増殖させた。ＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞株については、他所で詳細に記述されている［８］。０．１１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム及び４．５ｇ／Ｌのグルコースを含み、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン、１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、親細胞及びＧＮＰＴＡＢ−／−ＨｅＬａ細胞を単層として維持した。ＣＩ−ＭＰＲ陰性マウスＬ−細胞（Ｄ９細胞株）については記述されている［１１］。１００，０００Ｕ／Ｌのペニシリン及び１００ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むα−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、Ｄ９細胞を単層として維持した。
【００８８】
ＤＮＡ構築物  −  ｐｃＤＮＡ６におけるヒトＧＮＰＴＡＢ−Ｖ５／Ｈｉｓ及びＳ１−Ｓ３欠失変異体については記述されている［７］。ＬＡＭＡＮ−ｍｙｃ−Ｆｌａｇ  ｃＤＮＡはＯｒｉｇｅｎｅから購入し、ＧＡＡ  ｃＤＮＡは親切にもＥｌｉｎｅ  ｖａｎ  Ｍｅｅｌ（Ｌｅｉｄｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から寄贈された。ＧＢＡ及びＧＬＡ  ｃＤＮＡは、寛大にもＡｍｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから提供された。
【００８９】
ＣＩ−ＭＰＲ親和性クロマトグラフィ及び酵素アッセイ  −  可溶性ウシＣＩ−ＭＰＲをウシ胎仔血清から精製し、記述されているように［１２］、臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に共有結合により共役した。２日間トランスフェクトしたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞またはマウスＤ９細胞の培地を、ＣＩ−ＭＰＲビーズとともに４℃で１時間インキュベートして、リン酸化されたリソソーム酵素に結合させた。次にビーズを沈降させ、バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で洗浄し、リソソーム酵素活性について記述されているように［１３］アッセイした。ビーズで回収された出発酵素の量を計算した。
【００９０】
リソソーム酵素の細胞取り込み  −  細胞取り込み実験の１日前に、親ＨｅＬａ細胞を約８０％の密度で１２ウェルプレートに播種した。産生細胞からの各酵素を含む培地を親ＨｅＬａ細胞に加え、５００μｌの最終体積とした。競合実験のために、５ｍＭの最終濃度までＭａｎ−６−Ｐを加えた。細胞を更に２４時間インキュベートした後、培地及び細胞を別々に収集した。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、次に、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解させた。培地及び溶解した細胞を２０，０００×ｇで遠心分離し、培地及び細胞ライセートの上清中の酵素の活性をアッセイした。
【００９１】
リソソーム酵素の［２−３Ｈ］マンノース標識実験  −  トランスフェクトしたＧＮＰＴＡＢ−／−親ＨｅＬａ細胞を用いた標識実験を次のように行った。トランスフェクションの４８時間後、６０−ｍｍ組織培養プレート内の細胞を５０〜１５０μＣｉの［２−３Ｈ］マンノース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）とともに２時間インキュベートし、その後、５ｍＭグルコース、５ｍＭマンノース、及び１０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含む完全培地を添加してマンノースの取り込みを停止させ、分泌を誘導した。細胞を更に３時間インキュベートした後、解析のために培地を収集した。
【００９２】
免疫沈降及びオリゴ糖解析  −  本質的にはこれまでに詳細に記述されているように［９］、培地に分泌された酸性ヒドロラーゼを免疫沈降させ、オリゴ糖を単離し、解析した。ＬＡＭＡＮ、ＧＡＡ、及びＧＢＡ  ｃＤＮＡにｍｙｃタグが付加されたため、２０μｌの抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ａｇａｒｏｓｅ−ＰＬＵＳビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に予め結合させてから、標識されたリソソームヒドロラーゼを培地から免疫沈降させた。ＧＬＡの場合は、抗β−Ｇａｌ抗体（Ａｍｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に予め結合させたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ａｇａｒｏｓｅ−ＰＬＵＳビーズを用いて、分泌された酵素の免疫沈降を行った。免疫沈降した物質をＥｎｄｏ  Ｈ（ＮＥＢ）で処置し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。中性及びリン酸化された高マンノースグリカンを含む濾液を弱酸で処置して、リン酸部分に未だ結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基があればこれを除去し、ＱＡＥ−カラムマトリックスに加えて、０個、１個または２個のＭａｎ−６−Ｐ残基を有するオリゴ糖を分離させた。Ｅｎｄｏ  Ｈ耐性のある複合オリゴ糖を含む残余分をＰｒｏｎａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で処置し、ＣｏｎＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分画した。各画分の［２−３Ｈ］−マンノース含有量を定量し、記述されているように［９］リン酸化パーセントを計算した。
表１。内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、または過剰発現したＷＴ酵素、またはＳ１−Ｓ３変異体でリン酸化された、リソソーム酵素の細胞取り込み。取り込み実験は、リン酸化された酵素の取り込みを競合的に阻害するように、Ｍａｎ−６−Ｐの非存在下で、または５ｍＭ  Ｍａｎ−６−Ｐを用いて行った。
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表２。リソソーム酵素に存在する１つまたは２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含む高マンノースグリカンの分布。内在性ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホトランスフェラーゼ、または過剰発現したＷＴα／β前駆体、またはＳ１−Ｓ３欠失変異体の作用を受けたリソソーム酵素間の、１つまたは２つのＭａｎ−６−Ｐ残基を含むグリカンの含有量を示すため、図１２Ｃに提示されるデータを更に分析している。
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実施例５に関する参考文献。
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２．  Ｂａｒｔｏｎ，Ｎ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｆｏｒ  Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９９１．３２４（２１）：ｐ．１４６４−７０。
３．  Ｗｅｉｎｒｅｂ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  １０  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ，２０１３．３６（３）：ｐ．５４３−５３。
４．  ＭｃＶｉｅ−Ｗｙｌｉｅ，ＡＪ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｃｉｄ  ａｌｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｍｐｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ，２００８．９４（４）：ｐ．４４８−５５。
５．  Ｒｏｃｅｓ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｌｐｈａ−ｍａｎｎｏｓｉｄｏｓｉｓ  ｍｉｃｅ：ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，２００４．１３（１８）：ｐ．１９７９−８８。
６．  Ｑｉａｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ，ｂｅｔａ，ａｎｄ  ｇａｍｍａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｆ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０１０．２８５（５）：ｐ．３３６０−７０。
７．  Ｌｉｎ  Ｌｉｕ，Ｗ．−Ｓ．Ｌ．，Ｂａｌｒａｊ  Ｄｏｒａｙ，ａｎｄ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｓｏｓｍａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐａｃｅｒ−１  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ。論文準備中。
８．  ｖａｎ  Ｍｅｅｌ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ＧｌｃＮＡｃ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０１６．２９１（１５）：ｐ．８２９５−３０７。
９．  Ｄｕｓｔｉｎ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｄｉｓｔａｎｔｌｙ  ｓｐａｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ  ｂｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  １−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９５．２７０（１）：ｐ．１７０−９。
１０．  Ｔｏｎｇ，Ｐ．Ｙ．，Ｗ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｅ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９８９．２６４（１４）：ｐ．７９６２−９。
１１．  Ｇａｂｅｌ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｌ−ｃｅｌｌｓ：ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９８６．１０２（３）：ｐ．９４３−５０。
１２．  Ｖａｌｅｎｚａｎｏ，Ｋ．Ｊ．，Ｊ．Ｒｅｍｍｌｅｒ，ａｎｄ  Ｐ．Ｌｏｂｅｌ，Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ／ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃａｒｒｉｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ  ｉｎ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９５．２７０（２７）：ｐ．１６４４１−８。
１３．  Ｑｉａｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ  ＩＩ／ＩＩＩ  ＧＮＰＴＡＢ  Ｍｉｓｓｅｎｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＧｌｃＮＡｃ−１−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０１５．２９０（５）：ｐ．３０４５−５６。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019534712.tif 000005
【図１Ｃ】
2019534712.tif 000006
【図１Ｄ】
2019534712.tif 000007
【図１Ｅ】
2019534712.tif 000008
【図１Ｆ】
2019534712.tif 000009
【図１Ｇ】
2019534712.tif 000010
【図２Ａ】
2019534712.tif 000011
【図２Ｂ】
2019534712.tif 000012
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2019534712.tif 000014
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2019534712.tif 000016
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019534712.tif 000024
【図８Ａ】
2019534712.tif 000025
【図８Ｂ】
2019534712.tif 000026
【図８Ｃ】
2019534712.tif 000027
【図８Ｄ】
2019534712.tif 000028
【図９】
2019534712.tif 000029
【図１０】
2019534712.tif 000030
【図１１】
2019534712.tif 000031
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2019534712.tif 000033
【図１２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019534712.tif 000036
2019534712.tif 000037
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