(57)【要約】  部分的ホスホロチオエート化を伴う、毒性が低減された阻害性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９アゴニストおよびＴＬＲ７／８アゴニストにより誘導されるＮＦ−κＢの活性化を強く遮断する。インターロイキン−６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）などの炎症誘発性サイトカインの産生は、前記阻害性オリゴヌクレオチドにより阻害される。ＴＬＲ９アゴニストにより誘導されるヒトＰＢＭＣからのインターフェロン（ＩＦＮ）産生は、前記阻害性オリゴヌクレオチドにより妨げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、敗血症、多臓器不全症候群および炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患などの免疫介在性疾患の治療のため治療薬として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式５’−ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ−３’｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６から選択される整数であり、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０である場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）を表し、かつ、ｍは０、１または２である｝の配列を有する部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドであって、完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドＣＣＴＣＣＴＣＣＴ、ＣＴＣＣＴＣＣＴＣまたはＴＣＣＴＣＣＴＣＣおよび／またはそれらの末端切断誘導体の、間をホスホジエステル結合により連結されたストレッチを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２１），
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２２）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２３）
５’−ＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２４）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２５）
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２６）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２７）
５’−ＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２８）
５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号２９）
５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３０）
５’−ＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣｃ−３’（配列番号３１）
５’−ＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＴＣｃ−３’（配列番号３２）
５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号３３）
５’−ＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣｃ−３’（配列番号３４）
５’−ＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＴＣｃ−３’（配列番号３５）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３６）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３７）
５’−ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣｃ−３’（配列番号３８）
５’−ＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３９）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４０）
５’−ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣｃ−３’（配列番号４１）、および
５’−ＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４２）
（配列中、大文字は、その塩基は３’においてホスホジエステルヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されていることを表し、小文字は、その塩基は修飾されていないことを表す）
からなる群から選択される、請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２５）
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２６）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２７）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３６）、及び
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４０）
（配列中、大文字は、その塩基は３’においてホスホジエステルヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されていることを表し、小文字は、その塩基は修飾されていないことを表す）
からなる群から選択される、請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの各／両末端に、そのオリゴヌクレオチドにおいて全部で１または数個の塩基を変更または挿入することにより１または数個のヌクレオチドをさらに含み、新たに付加された１または複数のヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの各末端にホスホジエステル結合かホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
他のＤＮＡ分子、プラスミドまたはウイルスベクターの一部を構成する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ホスホロチオエート化以外の化学修飾を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ペグ化されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
インターフェロン産生の抑制のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項９】
炎症誘発性サイトカイン産生の抑制のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項１０】
免疫介在性疾患の治療のための治療薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫介在性疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
薬学上許容される担体をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腸内投与、非経口投与、局所投与または吸入を含む経路を介して対象に投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
単独でまたは付加的有効成分と組み合わせて投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患、ＴＬＲ９介在性疾患、ＴＬＲ７および／または８介在性疾患、過敏症、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患、移植片拒絶、インターフェロン介在性疾患または炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体介在性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体９介在性疾患である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体７および／または８介在性疾患である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患が敗血症、拡張型心筋、糖尿病、実験的自己免疫性脳脊髄炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、喘息、慢性閉塞性肺疾患または臓器不全である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記免疫介在性疾患がＮＦ−κＢ介在性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＮＦ−κＢ介在性疾患が関節リウマチ、胃炎および炎症性腸疾患である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記免疫介在性疾患がインターフェロン介在性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記免疫介在性疾患が炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患が敗血性ショックまたは多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記過敏症がアレルギー性外因性喘息、季節性アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、自己免疫性溶血性貧血、胎児赤芽球症、グッドパスチャー病、アルサス反応、血清病、全身性紅斑性狼瘡、特定のタイプの糸球体腎炎、接触性皮膚炎または同種移植片拒絶である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記免疫介在性疾患が全身性紅斑性狼瘡、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、炎症性関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、慢性劇症肝炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、悪性貧血の自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性睾丸炎、後天性血友病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、心筋症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、多発性筋炎・皮膚筋炎、円板状狼瘡、交感神経性眼炎、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛症、線維筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、全身性硬化症、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、高免疫グロブリンＥ症候群、進行性全身性硬化症、乾癬、ライター症候群、サルコイドーシス、スティッフマン症候群、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー病、悪性貧血、アジソン病、シェーグレン症候群、重症筋無力症、グレーブス病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、顕微鏡的多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫、自己免疫性甲状腺疾患、若年性特発性関節炎、巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、またはクローン病である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが１μｇ〜１０ｇ／日で投与される、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
対象の血清中のＡＬＴ値で診断される肝毒性を持たない、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
対象に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドを１μｇ〜１０ｇ／日で投与することを含む、対象における免疫介在性疾患の治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫介在性疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドおよびそれらのオリゴヌクレオチドを用いた治療薬に関する。免疫介在性疾患には、自己免疫疾患、移植片拒絶、過敏症、自己抗原、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患、Ｔｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ―ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＬＲ）介在性疾患、ＮＦ−κＢ介在性疾患、インターフェロン介在性疾患、および炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、細菌、寄生虫、真菌、ウイルスの感染から、また、腫瘍細胞の増殖からヒトの身体を保護する。免疫は自然免疫と適応免疫に分類することができる。自然免疫応答は一般に、感染性疾患に対する初期障壁を設けるために感染時に即生じ、一方、適応免疫応答はその後、抗原特異的な長期防御免疫の生成を伴って生じる。
【０００３】
しかしながら、時に望まれない免疫応答が生じることがあり、その結果、免疫介在性疾患が起こり得る。これらの疾患には、自己免疫疾患、移植片拒絶、過敏症、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患、インターフェロン介在性疾患、ＮＦ−κＢ介在性疾患および炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患が含まれる。自己免疫疾患は、内因性および／または外因性抗原に対する適応免疫応答、自然免疫応答、またはその双方から生じる。細菌、寄生虫、真菌またはウイルスに由来する生体異物は、自己タンパク質を模倣し、免疫系を刺激して自己の細胞および組織に対する応答を惹起させ、限定されるものではないが、全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）（ＳＬＥ）および関節リウマチをはじめとする疾患をもたらし得る。移植片拒絶は、器官または組織移植の帰結であり、移植された器官／組織に対する移植レシピエント（宿主）の免疫応答により引き起こされる。対象に腎臓、膵臓、心臓、肺、骨髄、角膜および皮膚をはじめとする移植片を移植すると、その対象はそれらの移植片に対して免疫応答（拒絶）を惹起することがある。過敏症は、重大な組織損傷または死さえももたらす有害な影響を持つ不適切な免疫応答である。過敏症は４つのタイプ（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型）に分けられる。微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患は、インフルエンザウイルスなどのウイルスおよびその他の微生物の感染により誘発される。インフルエンザウイルスおよびグラム陰性菌の感染の場合、それらの侵入者に対する過剰な免疫応答が患者において致命的な要因になると見られる。この応答はサイトカインの過剰産生を特徴とする。敗血症性ショック症候群の研究では、サイトカインの過剰産生／異常産生がサイトカイン介在性の致死性ショックに起因する急死につながることがあると実証されている（非特許文献１）。グラム陰性菌感染後の敗血症性ショックは、重症患者の主要な死因である。サイトカインの過度な産生は、サイトカイン介在性の致死性ショックを特徴とする敗血症に寄与することが知られている（非特許文献２）。多臓器不全症候群（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）（ＭＯＤＳ）は、重症敗血症およびショックにおける主要な罹患および死亡の原因である。宿主サイトカインの過剰産生から起こるサイトカイン介在性の致死性ショックは、ＭＯＤＳに至る主要な機構であると考えられる（非特許文献３）。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化により引き起こされる障害である。
【０００４】
ＴＬＲは、微生物由来の分子構造（病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）またはＰＡＭＰ）を認識する受容体のファミリーである。ＴＬＲ発現免疫細胞は、ＰＡＭＰの結合時に活性化される。ＴＬＲは、一定の範囲の病原体由来産物を認識し、活性化される。細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）はＴＬＲ４により認識され；リポテイコ酸およびジアシル化リポペプチドはＴＬＲ２−ＴＬＲ６二量体により認識され；トリアシル化リポペプチドはＴＬＲ２−ＴＬＲ１二量体により認識され；ウイルスもしくは細菌のいずれかにより合成された、またはウイルスもしくは細菌のいずれかに由来するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）はＴＬＲ９により認識され；細菌フラジェリンはＴＬＲ５により認識され；ザイモサンはＴＬＲ２−ＴＬＲ６二量体により認識され；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）由来Ｆタンパク質はＴＬＲ４により認識され；ウイルス由来二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびｄｓＲＮＡの合成類似体であるポリＩ：ＣはＴＬＲ３により認識され；ウイルスＤＮＡはＴＬＲ９により認識され；一本鎖ウイルスＲＮＡ（ＶＳＶおよびインフルエンザウイルス）ならびにイミダゾキノリンおよびイミキモドなどの合成グアノシン類似体はＴＬＲ７およびＴＬＲ８により認識される（非特許文献４）。
【０００５】
近年、ＴＬＲの活性化は、敗血症、拡張型心筋症、糖尿病、実験的自己免疫性脳脊髄炎、全身性紅斑性狼瘡、アテローム性動脈硬化症、喘息、慢性閉塞性肺疾患および臓器不全をはじめとするいくつかの疾患の病因に関連付けられてきた（非特許文献４）。自己ＤＮＡによるＴＬＲ９の活性化は、乾癬（非特許文献５）、ＳＬＥ（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８) および関節リウマチ（非特許文献９；非特許文献１０）などの自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たす。ＴＬＲ９アゴニストは自然免疫応答と適応免疫応答の両方を活性化することもまた文献に記載されている（非特許文献１１）。
【０００６】
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９アゴニストにより誘導されるヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）（ＰＢＭＣ）の増殖とインターフェロン（ＩＦＮ）の産生を妨げたことが文献に記載されている（特許文献１）。また、ヌクレオチド配列（ＣＣＴ）ｎＣｍ（配列中、ｎは２〜５０の整数であり、ｍは０、１、または２である）により示されるオリゴヌクレオチドは、ＮＦ−κＢ依存性免疫応答とＩＦＮアルファおよび腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）などの炎症性サイトカインの産生の抑制を伴ったＴＬＲ７／８および９の阻害特性を有することも文献に記載されており（特許文献２、特許文献３）、このことは免疫介在性疾患の治療のためのオリゴヌクレオチド（ＣＣＴ）ｎＣｍの幅広い使用を暗示している。
【０００７】
骨格に単純なホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血清エキソヌクレアーゼまたは細胞内エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに対するその感受性が通常報告されており（非特許文献１２）、薬物動態特性が不良となる。このような問題を解決するために、ホスホロチオエート化を含むヌクレアーゼ耐性構造で骨格を修飾するなどのいくつかの戦略が採られてきた。一方、ホスホロチオエート化は、良くないことに、強い肝毒性および腎毒性を有することが記載されており（非特許文献１３；非特許文献１４）、このことが全身性疾患の治療のためのホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドの使用を阻んでいる。よって、ヌクレオチド配列の変更など、毒性を低減するためのいくつかの試みがなされてきた（非特許文献１５，非特許文献１６）。しかしながら、ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍとして記載される本発明のオリゴヌクレオチドについては、これらのオリゴヌクレオチドの有効性はもっぱらユニークなヌクレオチド配列に依存するので、ヌクレオチド配列を変更するという上述の戦略はなし得ようがなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ８０３０２８９Ｂ２
【特許文献２】ＥＰ２１５４１４４
【特許文献３】ＷＯ２０１４／０８２２５４
【特許文献４】ＪＰ５０１１５２０
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【非特許文献４６】Maeda et al., Int J Hematol., 2005, 81, 148-54
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、より安全な医薬組成物を提供すること、および対象疾患に対してより高い有効性を有する前記医薬組成物の増強された投与計画を可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、毒性のないオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合の１以上の非架橋酸素を硫黄原子で置換することにより部分的にホスホロチオエート化されたＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６の整数であり、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０である場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）を表し、かつ、ｍは０、１または２である｝の式を有するオリゴヌクレオチドストレッチを含む。
本発明において、本発明者らは、部分的ホスホロチオエート化を有するいくつかのオリゴヌクレオチドが血清中での安定性の維持とともに毒性の低減を達成し、これは医薬組成物のより安全な製剤を可能とし、同時に、そのオリゴヌクレオチドの安全特性が前記各オリゴヌクレオチドの投与レベルの引き上げを可能とし、これにより、その治療を受けるヒトまたは非ヒト動物において対象疾患の治療の有効性の増強がもたらされることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１ａは、部分的にホスホロチオエート化された（ＣＣＴ）１２オリゴヌクレオチド種の、血清含有培地中での安定性を示す。オリゴヌクレオチドを、血清を添加した培地中でインキュベートし、培地中に残存するオリゴヌクレオチドを定量した。図に示されるように、通常のホスホジエステルヌクレオチド間結合を有するＣＣＴ１２ＰＯは１日のインキュベーション後にほぼ完全な分解を示したが、完全にリン酸化されたＣＣＴ１２ＰＳはより長い持続時間を示し、このことはヌクレオチド間修飾無しのオリゴヌクレオチドの早い分解を示している。一方、部分的にホスホロチオエート化されたＣＣＴ１２−３（詳細は実施例の節を参照）は、ＣＣＴ１２ＰＳに匹敵する安定性を示し、このことは、血清中でヌクレアーゼに対する安定性を達成するためには、ヌクレオチド間結合において少なくともある一定のレベルのホスホロチオエート化で十分であることを示している。図１ｂは、血清含有培地中での部分的にホスホロチオエート化された（ＴＣＣ）１２オリゴヌクレオチド種の安定性を示す。ホスホロチオエート化無しの（ＴＣＣ１２ＰＯ）は１日のインキュベーション後に急速な分解を示したが、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド（ＴＣＣ１２−６）は、同じ配列を有する完全にホスホロチオエート化された種（ＴＣＣ１２ＰＳ）と同程度に高い安定性を示したことが示された。
【図２】図２は、一定のパターンを有する低ホスホロチオエート化レベルによるオリゴヌクレオチドの毒性の低下を示す。図２ａは、ホスホロチオエート化レベルの低下による（ＣＣＴ）１２の毒性の低下を示す。ここに示されているように、ＣＣＴ１２−１は、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドＣＣＴ１２ＰＳが、別の完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドＣＣＴ８ＰＳの場合と同等に強い毒性を示したとしても、見掛けの体重減少を示さなかった。図２ｂは、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３、ＣＣＴ１２−４、およびＣＣＴ１２−５の間のオリゴヌクレオチドの比較を示し、このことは、毒性の低減がホスホロチオエート化レベルの低減により達成されたわけではなく、むしろホスホロチオエート化パターンと関連を持つことを暗示している。  図２ｃは、ホスホロチオエート化パターンの変化によるホスホロチオエート化の低減も、（ＴＣＣ）リピートに適用可能であることを示す。ＴＣＣ１２−６は毒性の低減を示したが、同レベルのホスホロチオエート化を有するＴＣＣ１２−７は、なお有意な毒性を保有していたことを示す。図２ｄおよび図２ｅは、強い毒性を示したオリゴヌクレオチドによりＡＬＴの増加もまた生じたことを示す。
【図３】図３ａは、ＮＦ−κＢ転写活性に対する部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの阻害効果を示す。ＣＣＴ１２−１、ＣＣＴ１２−２、およびＣＣＴ１２−３は低毒性を示したが、それらはなお阻害活性を保存している。図３ｂおよび図３ｃは、ホスホロチオエート化パターンの変化による毒性の低減は、オリゴヌクレオチドＣＣＴ１２−３およびＴＣＣ１２−６により示されるようなオリゴヌクレオチドの阻害活性に影響を及ぼさないことを示す。
【図４】図４ａ、図４ｂ、および図４ｃは、ＴＬＲ７／８アゴニストであるガーディキモドまたはＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ２３９５で刺激されたＣＡＬ−１細胞からのＴＮＦアルファおよびインターロイキン（ＩＬ）−６産生に対する阻害性オリゴヌクレオチドの抑制能を表すグラフを示す。毒性を減弱するホスホロチオエート化パターンの変化は、ＴＬＲ７、８、またはＴＬＲ９活性に対する抑制効果には明らかな影響を与えない。
【図５】図５ａおよび図５ｂは、ＣｐＧ２２１６で刺激されたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮアルファ産生に対する阻害性オリゴヌクレオチドの抑制活性を表すグラフを示す。これらのグラフ（５ａおよび５ｂ）はまた、ホスホロチオエート化パターンの変化は、ＴＬＲ９アゴニストにより誘導されたＩＦＮアルファ産生レベルに対するオリゴヌクレオチドの阻害活性に有意な影響を及ぼさないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６の整数であり、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０である場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）を表し、かつ、ｍは０、１または２のいずれかである｝の式を有するオリゴヌクレオチドを含む１または複数のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物を提供する。オリゴヌクレオチド配列の例は次の通りである。
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号１）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号２）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号３）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’（配列番号４）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号５）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号６）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’（配列番号７）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号８）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号９）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’（配列番号１０）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号１１）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号１２）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’（配列番号１３）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号１４）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号１５）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号１６）
５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号１７）
５’−ｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号１８）
５’−ｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号１９）
５’−ｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号２０）
ここで、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合における化学修飾のパターンの配置により、同じ配列を有する完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドに比べての毒性の低減に基づいてスクリーニングすることができ、その化学修飾は、任意選択によるホスホロチオエート化である。
【００１４】
好ましくは、本発明は、オリゴヌクレオチドの活性およびｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性の維持をもたらす一方で、動物に投与された際に最小レベルの毒性しかもたらさない、非架橋Ｏ原子が特定のパターンでＳに置換される部分的ホスホロチオエート化を有するオリゴデオキシヌクレオチドを提供する。低毒性を有する本発明の前記オリゴデオキシヌクレオチドの例は、完全ホスホロチオエート化ＣＣＴＣＣＴＣＣＴ、ＣＴＣＣＴＣＣＴＣもしくはＴＣＣＴＣＣＴＣＣ、またはそれらの末端切断型誘導体を含んでおり、それらのストレッチ及び／又はそれらの末端切断型誘導体は、お互いに通常のホスホジエステル結合により連結される。前記オリゴヌクレオチドは以下のものを含む。
５’−  ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２１）、
５’−  ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２２）、
５’−  ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２３）、
５’−  ＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２４）、
５’−  ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２５）、
５’−  ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２６）、
５’−  ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２７）、
５’−  ＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２８）、
５’−  ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号２９）、
５’−  ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号３０）、
５’−  ＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴｃ−３’（配列番号３１）、
５’−  ＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号３２）、
５’−  ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号３３）、
５’−  ＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴｃ−３’（配列番号３４）、
５’−  ＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号３５）、
５’−  ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３６）、
５’−  ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３７）、
５’−  ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣｃ−３’（配列番号３８）、
５’−  ＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３９）、
５’−  ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４０）、
５’−  ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣｃ−３’（配列番号４１）、
５’−  ＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４２）、
ここで、大文字は、その塩基は３’においてヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されていることを表し、小文字は、その塩基は修飾されていないことを表す。通常のホスホジエステル結合により連結された、完全ホスホロチオエート化ＣＣＴＣＣＴＣＣＴ、ＣＴＣＣＴＣＣＴＣもしくはＴＣＣＴＣＣＴＣＣ、またはそれらの末端切断型誘導体のストレッチを含む、オリゴヌクレオチドの共通の構造的特徴は、ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６の整数であり、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０の場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）、かつ、ｍは０、１、または２のいずれかである｝として構成された構造を有する完全ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドにより示される毒性の低減を可能とする。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９の活性化を強く阻害する。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、ＴＬＲ９アゴニストとして知られる（非特許文献１７）。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ  ＯＤＮにより刺激されたサイトカインを強く阻害し、本発明のオリゴヌクレオチドがＴＬＲ９の過剰な活性化に関連する疾患、またはＴＬＲ９シグナル伝達の抑制により治療され得る他の疾患の治療のための治療薬として使用することができることを示す。例えば、ＴＬＲ９の活性化は、乾癬（非特許文献５）、ＳＬＥ（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献６）および関節リウマチ（非特許文献９；非特許文献１０）の発症に寄与することが報告されているので、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９の活性化を阻害することにより、乾癬、ＳＬＥおよび関節リウマチの治療のための治療薬として使用することができる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９アゴニストにより誘導されるヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ産生を強く阻害する。従って、本発明は、ＩＦＮアルファの過剰産生に関連する疾患またはＩＦＮアルファ産生の抑制により治療される疾患を治療することができる。例えば、報告されているように（非特許文献７；非特許文献８）、ＩＦＮの産生の上昇はＳＬＥの発症に寄与するので、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮの産生を阻害することにより、ＳＬＥの治療のための治療薬として使用することができる。
【００１７】
ＴＬＲ９アゴニストである、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌ）を伴うＣｐＧ  ＯＤＮのマウスへの注射は過敏免疫応答を誘導したということが示されている。モデルマウスは１２〜２４時間以内に死亡した。血漿サイトカインの分析によれば、ＴＮＦアルファなどの炎症誘発性サイトカインの過剰産生が明らかになった（非特許文献１８、非特許文献１９）。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９の刺激により誘導されるマウス細胞からのＴＮＦアルファの産生を強く阻害する。サイトカイン介在性致死性ショックは敗血性ショック（非特許文献１；非特許文献２）および多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）（非特許文献３）に寄与するので、本発明のオリゴヌクレオチドは、サイトカイン介在性致死性ショックから宿主を救済することにより敗血症およびＭＯＧＳの治療のための治療薬として使用することができる。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８アゴニストにより誘導されるサイトカイン産生も強く阻害する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８を阻害することによりＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患の治療のための治療薬として使用することができる。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ刺激により誘導されるＮＦ−κＢの活性化を強く阻害するが、このことは本発明のオリゴヌクレオチドがＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患の治療のための治療薬として使用できることを示す。ＮＦ−κＢの活性化は、様々な疾患の発症に寄与することが報告されているので（非特許文献２０；非特許文献２１）、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することによりそのような疾患で見られる症状の治療のための治療薬として使用することができる。数種の癌では、ＮＦ−κＢの過剰活性化が報告されており、本発明の阻害機能はまた、このような癌を治療するためにも使用され得る。
【００２０】
ＮＦ−κＢは、炎症誘発性遺伝子発現の最も重要なレギュレーターの１つである。ＮＦ−κＢの活性化は、その炎症誘発性サイトカインの転写を誘導する能力を介して炎症に中枢的役割を果たす（非特許文献２２）。ＮＦ−κＢは関節リウマチ（ＲＡ）滑膜線維芽細胞において構成的ＩＬ−６産生に役割を果たすことが示されている（非特許文献２３）。ＮＦ−κＢはまた、ヒト単球においてＩＬ−１またはＴＮＦアルファによる炎症性遺伝子の活性化にも関与している（非特許文献２４）。ＮＦ−κＢ陽性細胞の数は胃炎の程度に相関する。同様に、炎症性腸疾患ではＮＦ−κＢの活性化の証拠があり、この場合、粘膜固有層マクロファージが活性化されたＮＦ−κＢを呈する（非特許文献２５）。
【００２１】
リガンドによるＴＬＲの活性化は、ＮＦ−κＢおよびインターフェロン応答因子（ＩＲＦ）などの転写因子の活性化を誘導する。それらの活性化された転写因子は、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＴＮＦアルファおよびＩＦＮなどの炎症性サイトカインの産生をさらに誘導する。炎症性サイトカインの産生産生は、限定されるものではないが、自己免疫疾患、アレルギー、および過敏症などの疾患を引き起こし得るので、本発明は炎症を伴うこのような疾患の治療のために期待される。
【００２２】
ＴＮＦアルファ、ＩＦＮ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１２などの炎症性サイトカインはまた、下流のプロスタグランジン産生も活性化し、これが疾病状態下で疼痛の生成に関与している。ＴＬＲはまた、ＣＮＳおよびＰＮＳでも発現されることが報告されており、これは疼痛感知に関与している（非特許文献２６；非特許文献２７）。よって、本発明は、炎症状態により引き起こされるそのような疼痛症状の治癒における使用に関して期待される。
【００２３】
本発明の機能に対する上記の概念から結論づけられるように、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを単独でまたは薬学上許容される担体とともに対象に投与することにより免疫介在性疾患を治療するための治療薬を提供し、この投与は、腸内投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、経皮投与、舌下投与、鼻腔内投与、経粘膜投与、肺投与、経口投与、胃投与、腸管投与、直腸投与、膣投与、エアゾール投与、眼内投与、気管内投与、直腸内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、心臓内投与、骨内投与、くも膜下腔内投与、硝子体内投与、吸入投与または局所投与であり得る。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを単独でまたは付加的有効成分と組み合わせて投与することによる免疫介在性疾患の治療のための治療薬を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、送達ビヒクル中の本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによる免疫介在性疾患の治療のための治療薬を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の連結で修飾することができる。ペグ化オリゴヌクレオチドは、腎クリアランスを低減することによりｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環時間を延長することができる。
【００２７】
上記に示したように、本発明は、個体において免疫応答を調節する方法であって、個体に、免疫刺激性化合物を、前記個体における免疫応答を調節するために十分な量で投与することを含む方法を提供する。本発明の方法による免疫調節は、望まれない免疫応答の活性化に関連する障害に罹患している個体をはじめとする個体において実施され得る。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて免疫介在性疾患を治療するための治療薬を提供する。免疫介在性疾患には、自己免疫疾患、移植片拒絶、過敏症、自己抗原、微生物による宿主の免疫系による過剰刺激に関連する疾患およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患が含まれる。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用い、自己免疫患者においてウイルスまたは自己抗原などのＴＬＲアンタゴニストにより誘導されるＴＬＲの活性化および炎症性サイトカインの産生を阻害することにより、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患、ＴＬＲ９介在性疾患、ＴＬＲ７および／または８介在性疾患、過敏症、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患、移植片拒絶、インターフェロン介在性疾患および炎症性サイトカイン介在性炎症疾患を治療するための治療薬を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、個体において、ＴＬＲ９依存性免疫応答を、前記個体におけるＴＬＲ９依存性サイトカイン産生を防ぐために十分な量で調節する方法であって、個体に免疫刺激性化合物を共投与することを含む方法を提供する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、個体において、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８依存性免疫応答を、前記個体におけるＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８依存性サイトカイン産生を防ぐために十分な量で調節する方法であって、個体に免疫刺激性化合物を共投与することを含む方法を提供する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用い、炎症誘発性サイトカインの産生を阻害して、対象を炎症またはサイトカイン介在性致死性ショックなどの疾患から救済することにより免疫介在性疾患を治療するための治療薬を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、個体において、ＮＦ−κＢ依存性免疫応答を、前記個体におけるＮＦ−κＢ依存性サイトカイン産生を防ぐために十分な量で調節する方法であって、個体に免疫刺激性化合物を共投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用い、ＴＬＲ刺激により誘導されるＮＦ−κＢの活性化を阻害することにより、免疫介在性疾患を治療するための治療薬を提供する。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、ＴＬＲの活性化および関連の下流シグナル伝達を大きく阻害し、ＮＦ−κＢの転写活性ならびにＩＦＮおよび炎症性サイトカインの分泌などの広範囲の重要な生体システムに対して様々な影響を示す。よって、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、限定されるものではないが、自己免疫疾患、炎症、癌、腫瘍、アレルギーをはじめとする、上述のシステムの異常により引き起こされる様々な疾患に対して使用することができる。
【００３６】
本発明により示されるＴＬＲを含む標的に対する阻害効果はむしろ、ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６の整数を表し、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０である場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）を表し、かつ、ｍは０、１または２の整数を表す｝として記載されるオリゴヌクレオチドの配列に依存し（非特許文献２８；非特許文献２９；特許文献２、特許文献３）、薬物プロフィールを改善するための化学修飾は当業者の間で慣用されているので、本発明のオリゴヌクレオチドは、化学修飾を含み得る。
【００３７】
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合において部分的にホスホロチオエート化され、この場合、非架橋ＯがＳで置換される。報告されているように、オリゴヌクレオチドは、血清中に存在するヌクレアーゼにより引き起こされ得る急速な分解のためにｉｎ  ｖｉｖｏでは不安定である。従って、オリゴヌクレオチドの安定性を増してより長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を可能とするために、化学修飾または血清ヌクレアーゼからの攻撃を防ぐ薬物送達ツールの使用などの多くの試みがなされている。このような化学修飾の中で、ヌクレオチド間修飾におけるホスホロチオエート化は、核酸薬物の開発の初期から利用されている。しかしながら、このようなホスホロチオエート化はまたその毒性に関しても知られており、これが核酸薬物の開発の障害となる原因であった。一方、本発明におけるオリゴヌクレオチドは、特定のパターンでホスホロチオエート化結合を低減することにより、活性および安定性に大きな支障なく肝毒性を首尾良く低減する。
【００３８】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、上述のようなホスホロチオエート化に加えて、天然核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）のホスホジエステル核酸間結合、糖および／または核酸塩基におけるものに相当する化学残基に、様々な化学修飾を含む。
【００３９】
製薬目的として使用される、このようなオリゴヌクレオチドに対するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかでの化学修飾は、これまでに幅広く研究されている（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。
【００４０】
ヌクレオチド間結合における修飾には、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノアセテート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、メチルホスフェート、エチルホスフェート、エチルホスホロチオエート、ボラノホスフェート、ボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスフェート、メチルボラノホスホロチオエート、メチルボラノホスホネート、ホスホラミダイト、ホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホロチオアミダート、ホスホロチオジアミダート、スルファメート、ジメチレンスルホン、スルホネート、スルフィド、スルホン酸エステル、メチレンイミノ、オキサリル、チオアセトアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、カルボン酸エステル、カルボキサミド、アミド、トリアゾール、イミノおよびそれらの誘導体が含まれる。
【００４１】
糖修飾における修飾には、限定されるものではないが、（ａ）糖部分の２’位における電気陰性原子／置換基の導入、（ｂ）余分な環を縮合させることによる糖部分における二環形成、（ｃ）ペントース環構造における修飾、および（ｄ）糖環における炭素へのスピロ環構造の導入（非特許文献３４）が含まれる。糖部分における修飾にはまた、核酸の、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸／架橋核酸（ＬＮＡ、ＢＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＨＮＡ）、ならびにグリコール核酸および／またはトレオース核酸（ＴＮＡ）などの核酸類似体への変換も含まれる。
【００４２】
核酸塩基の修飾には、限定されるものではないが、（ａ）５−プロピニルＵ、２−チオＴ、およびＮ３−チオエチルＴなどの修飾ピリミジン塩基、ならびに（ｂ）３−ニトロピロール、イミダゾール−４−カルボキサミド、および５−ニトロインドールなどの汎用され得る修飾塩基が含まれる。この修飾にはまた、シトシン類似体を形成するためのシトシン核酸塩基における修飾も含み得る。
【００４３】
本発明における上述の化学修飾は、単独で生じることもでき、または他の化学修飾と同時にもしくは天然核酸を伴って生じることもできる。
【００４４】
本発明を構成するオリゴヌクレオチドは、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成品である。本発明のオリゴヌクレオチドは、市販の様々な自動核酸合成装置によって合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または一本鎖と二本鎖のハイブリッドのいずれかであり得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、その単一の分子の５’末端と３’末端を連結することにより環状構造を形成することもでき、本発明の２個以上のオリゴヌクレオチドを共有結合により連結するか、または５’末端もしくは３’末端のいずれかで特徴的なリンカーを介して連結して直列の細長い構造または多価構造を形成することができる。リンカーは、限定されるものではないが、グリセロール、（Ｓ）−（−）−１，２，４−ブタントリオール、１，３，５−ペンタントリオール、シス，シス−１，３，５，−シクロヘキサントリオール、シストランス−１，３，５−シクロヘキサントリオール、１，３，５−トリス−（２−ヒドロキシエチル）イソシアヌレート、テトラエチレングリコール、およびヘキサエチレングリコールをはじめとする、当業者に一般に使用されている有機化学化合物であり、ここでは、アミノ酸ヌクレオチドおよび／またはそれらの誘導体で構成することもできる。本発明におけるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ホスホジエステル結合により連結された、完全にホスホロチオエート化された（ＣＣＴ）３、（ＣＴＣ）３もしくは（ＴＣＣ）３モチーフ、またはその末端切断型を有し、これらは中央部分に、ヌクレオチドの変化または挿入により１または数個のヌクレオチドが挿入できるが、単一の分子に２〜５０個、または好ましくは５〜１６個のＣＣＴ、ＣＴＣ、またはＴＣＣリピートを含む必要がある。
【００４６】
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、互いに、同様の作用機序を有する他のオリゴヌクレオチドと、（ポリ）ペプチド／抗体もしくは核酸／オリゴヌクレオチドなどの他の有機化合物と、または多くの場合、細胞傷害性薬剤などの薬物の物理的特性の改良もしくは改変のために使用される無機化合物と併用することができる。このような組合せは、共有結合を用いてまたは用いずに生成することができる。
【００４７】
「オリゴヌクレオチド」：  オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチド（すなわち、リン酸基に、および置換ピリミジン（Ｐｙ）（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ））または置換プリン（Ｐｕ）（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に結合された糖（例えば、デオキシリボース）を含む分子）を意味する。オリゴヌクレオチドという用語は、本明細書で使用する場合、主として、限定されるものではないが機能的に同一であれば、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）を指す。
【００４８】
「化学修飾」：  本発明に開示されるオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオシド間架橋、リボース単位および／または天然ヌクレオシド塩基（シトシン、およびチミン）に様々な化学修飾を包含し得る。これらの修飾はオリゴヌクレオチドの合成中または合成後のいずれかに生じ得る。合成中には、修飾塩基は内部またはその末端に組み込むことができる。合成後は、修飾は活性基を用いて（アミノ変性剤を介して、３’もしくは５’ヒドロキシル基を介して、またはリン酸基を介して）行うことができる。当業者は化学修飾の例を知っている。本発明によるオリゴヌクレオチドは１以上の修飾を有してよく、各修飾は、天然ＤＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間架橋に、および／または特定のリボース単位に、および／または特定の天然ヌクレオシド塩基位に位置する。化学修飾は、本発明のオリゴヌクレオチドの「骨格修飾」を含む。本明細書で使用する場合、本発明のオリゴヌクレオチドの修飾された骨格には、限定されるものではないが、「ホスホロチオエート骨格」が含まれ、これは、非架橋リン酸酸素が硫黄で置換されている、核酸分子の安定化された糖リン酸骨格を指す。他の骨格修飾は、アルキル−ホスホネートおよびアリール−ホスホネート（荷電ホスホン酸酸素がアルキル基またはアリール基で置換されている）、ホスホジエステル、および荷電酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性ＤＮＡ類似体による修飾を表す。化学修飾にはまた、本発明で開示されるオリゴヌクレオチドの塩基置換も含まれる。置換塩基には、限定されるものではないが、シトシン、チミン、および他の構造的に関連のある天然または非天然核酸塩基が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドの化学修飾は、オリゴヌクレオチドの塩基の修飾をさらに含む。修飾塩基とは、ＤＮＡに一般に見られるＴ、Ｃ、ＧおよびＡなどの天然塩基とは化学的に異なるが、これらの天然塩基と基本化学構造を共通に持つ任意の塩基である。本発明のオリゴヌクレオチドは、シチジン誘導体および／またはチミジン誘導体を使用することにより修飾することができる。「シチジン誘導体」という用語はシチジン様ヌクレオチド（シチジンを除く）を指し、「チミジン誘導体」という用語はチミジン様ヌクレオチド（チミジンを除く）を指す。加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの一方または両方の末端に、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを連結することにより化学的に修飾することもできる。
【００４９】
「免疫介在性疾患」：  免疫介在性疾患は、対象において望まれない免疫応答により引き起こされる疾患である。この疾患には、自己免疫疾患、移植片拒絶、過敏症、微生物による宿主の免疫系過剰刺激に関連する疾患が含まれる。免疫介在性疾患は、その疾患において影響を受けた生理学的経路に基づき、ＴＬＲの活性化に関連する疾患（ＴＬＲ介在性疾患、ＴＬＲ９介在性疾患、ＴＬＲ７および／または８介在性疾患）、ＮＦ−κＢ介在性疾患、インターフェロン介在性疾患、または炎症性サイトカイン介在性疾患などに分類することができる。本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、上述のような免疫介在性疾患を治療するための治療薬として使用することができる。
【００５０】
「免疫応答」：  刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、好中球およびマクロファージなどの免疫系の細胞の応答。この応答には、自然免疫応答と適応（特異的または後天的）免疫応答が含まれる。適応（特異的または後天的）免疫応答には、液性免疫応答と細胞性免疫応答が含まれる。
【００５１】
「免疫介在性疾患を予防または治療する」：  本明細書で使用する場合、予防とは、対象における免疫介在性疾患の完全な発症を防ぐことを指し、治療とは、免疫介在性疾患の徴候もしくは症状を改善するため、前記疾病の進行を停止させるため、または前記疾病の病状を除去するための対象における治療的介入を指す。
【００５２】
「対象」：  本明細書で使用する場合、対象とは、ヒトまたは非ヒト脊椎動物を指す。非ヒト脊椎動物は、非ヒト霊長類、家畜および伴侶動物である。本発明のオリゴヌクレオチドは、対象における免疫介在性疾患を予防または／および治療するために投与することができる。
【００５３】
「自己免疫疾患」：  「自己免疫疾患」という用語は、自己寛容の破綻により引き起こされ、その結果、適応免疫系および自然免疫系が自己抗原に応答し、細胞および組織の傷害を媒介する疾患を指す。自己免疫疾患は、多くの場合、単一器官型もしくは単一細胞型のそれらの関与または複数の器官もしくは組織系の関与を特徴とする。自己免疫疾患はまた、「コラーゲン」または「コラーゲン−血管」または「結合組織」疾患とも呼ばれてきた。自己免疫障害は、多くの場合、過敏反応に関連する。本発明のオリゴヌクレオチドは、様々なタイプの自己免疫疾患を治療および／または予防するために有用であり得る。自己免疫障害の特定の限定されない例は、全身性紅斑性狼瘡、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、炎症性関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、慢性劇症肝炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、悪性貧血の自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性睾丸炎、後天性血友病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、心筋症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、多発性筋炎皮膚筋炎、円板状狼瘡、交感神経性眼炎、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛症、線維筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、全身性硬化症、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、高免疫グロブリンＥ症候群、進行性全身性硬化症、乾癬、ライター症候群、サルコイドーシス、スティッフマン症候群、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー病、悪性貧血、アジソン病、シェーグレン症候群、重症筋無力症、グレーブス病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、顕微鏡的多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫、自己免疫性甲状腺疾患、若年性特発性関節炎、巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、クローン病などである（非特許文献３５；非特許文献３６）。ＤＮＡまたはＲＮＡ含有微生物から放出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、自己ＤＮＡまたはＲＮＡ含有複合体に特異的な自己抗体の産生を刺激し、その結果、限定されるものではないがＳＬＥをはじめとする上記の自己免疫疾患の多くをもたらし得る。
【００５４】
「移植片拒絶」：  移植片拒絶は、器官または組織移植により引き起こされる免疫介在性疾患であり、移植は、ドナーからレシピエントへの移植片の移植を意味する。移植片は、ドナーからレシピエントへ移植される生きている細胞、組織、または器官である。自己移植片はある場所から別の場所に移植される自己の組織の移植片であり、同系移植片は一卵性双生児間の移植片であり、同種移植片は同じ種の遺伝的に異なるメンバー間の移植片であり、異種移植片は異なる種のメンバー間の移植片である。対象が同種移植片または異種移植片のレシピエントである場合、その身体はドナー組織に対して免疫応答を生じる可能性がある。この状況では、その移植片の拒絶を避けるために免疫応答を抑制する明確な必要性がある（非特許文献３７）。本発明のオリゴヌクレオチドは、移植片拒絶の予防のために投与される場合に有用である。移植片の例は、心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｕｍ  ｔｅｎｕｅ）、四肢、筋肉、神経、十二指腸、小腸（ｓｍａｌｌ−ｂｏｗｅｌ）、膵島細胞などである。いくつかの場合、レシピエントは本発明の「対象」に定義される動物であり得る。
【００５５】
「過敏症」：  過敏症は、組織損傷が内因または外因起源の抗原に対する液性または細胞介在性応答の結果として生じる障害とされ、４タイプに分類されている。Ｉ型過敏症（しばしば、アナフィラキシー、即時型、アトピー性、レアギン性、ＩｇＥ介在性過敏症反応またはアレルギーと呼ばれる）は一般に、ヒスタミン、アナフィラキシーの遅反応性物質（ＳＲＳ−Ａ）、および特定の外因性抗原と接触した後のＩｇＥ感作好塩基球および肥満細胞からの好酸球走化因子（ＥＣＦ）などの薬理活性物質の放出から生じる。Ｉ型過敏症には、限定されるものではないが、アレルギー性外因性喘息、季節性アレルギー性鼻炎および全身性アナフィラキシーが含まれる。ＩＩ型過敏症（細胞傷害性、細胞溶解性補体依存性または細胞刺激性過敏反応とも呼ばれる）は、抗体が、細胞もしくは組織要素の抗原成分とまたは細胞もしくは組織と密接に結合するようになった抗原もしくはハプテンと反応する場合に起こる。ＩＩ型過敏症には、限定されるものではないが、自己免疫性溶血性貧血、胎児赤芽球症およびグッドパスチャー病が含まれる。ＩＩＩ型過敏症（毒性複合体、可溶性複合体、または免疫複合体過敏反応とも呼ばれる）は、血管または組織における可溶性循環抗原−抗体複合体の沈着から生じ、免疫複合体沈着の部位における急性炎症反応を伴う。ＩＩＩ型過敏症には、限定されるものではないが、アルサス反応、血清病、全身性紅斑性狼瘡、および特定のタイプの糸球体腎炎が含まれる。ＩＶ型過敏症（しばしば、細胞性、細胞介在性、遅延型、またはツベルクリン型過敏反応と呼ばれる）は、特定の抗原との接触から生じる感作Ｔリンパ球により引き起こされる。ＩＶ型過敏症には、限定されるものではないが、接触性皮膚炎および同種移植片拒絶が含まれる（非特許文献３７）。
【００５６】
「微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患」：  微生物の侵入は、重篤であれば、時に対象において全身性の炎症性応答を生じ、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患に至ることがある。Ａ型インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）または細菌感染の場合などの疾患の発症のイベントには、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ケモカインＩＦＮ誘導性タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、ＩＬ−８、ＩＬ−１ｂ、および単球走化性タンパク質１の血液レベルの有意な上昇が含まれる。このような応答は、多くの患者に見られる敗血症、ＡＲＤＳ、および多臓器不全の部分的原因となるサイトカイン介在性致死性ショックをもたらし得る（非特許文献３８）。微生物感染後のサイトカインの血液レベルの有意な上昇は高サイトカイン血症またはサイトカインストームと呼ばれる。前記研究は、鳥インフルエンザまたはＳＡＲＳに罹患した患者は、サイトカインの上昇を抑制するため、抗ウイルス薬に加えて免疫応答を抑制する薬物が必要とする可能性があることを示唆している。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、対象において微生物による宿主の免疫系の刺激に関連する疾患を治療および／または予防するために使用することができる。疾病を引き起こす微生物には、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫および海綿状脳症の病因因子が含まれる。微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こすウイルスには、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、インフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ＨＩＶ−１、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、出血熱ウイルス；レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およびＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、海綿状脳症の病因因子、デルタ肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルスおよび鳥インフルエンザウイルスが含まれる。微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こし得る細菌には、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア種（例えば、結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥結核菌（Ｍ．  ａｖｉｕｍ）、Ｍ．  Ｅ  イントラセルラーレ（Ｍ．  Ｅ  ｉｎｔｒａｃｅ��ｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．  ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ａ群連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群連鎖球菌属、連鎖球菌属、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、腸球菌種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モリニフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびアクチノミセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）が含まれる。微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こし得る真菌には、限定されるものではないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患を引き起こし得る寄生虫には、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
【００５７】
「Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患」：  Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患は、ＴＬＲファミリーのメンバーの活性化に関連する免疫介在性疾患を意味する。この疾患には、限定されるものではないが、リポ多糖（ＬＰＳ）によるＴＬＲ４の活性化に関連する敗血症、ＴＬＲ２、３、４、９の活性化に関連する拡張型心筋症、ＴＬＲ２，３，４，９の活性化に関連する糖尿病、ＴＬＲ３の活性化に関連する実験的自己免疫性脳脊髄炎、ＴＬＲ３の活性化に関連する加齢性黄斑疾患（非特許文献３９）、ＴＬＲ９の活性化に関連する全身性紅斑性狼瘡、ＴＬＲ４の活性化に関連するアテローム性動脈硬化症、ＬＰＳによるＴＬＲ４の活性化に関連する喘息、ＴＬＲ４の活性化に関連する慢性閉塞性肺疾患、ＴＬＲ４の活性化に関連するＥＡＥおよびＴＬＲ４の活性化に関連する臓器不全（非特許文献４）が含まれる。核酸含有感染性因子に由来するＣｐＧ含有ＤＮＡ（ＴＬＲ９アゴニスト）は、ＳＬＥ血清から、ＳＬＥの発症に寄与すると考えられるＩＦＮアルファ分泌によって支配される効率的な免疫応答を誘導するものとして同定することができた。本発明のオリゴヌクレオチドは、対象において、限定されるものではないがＳＬＥをはじめとするＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患を治療および／または予防するために投与することができる。
【００５８】
「ＴＬＲ９介在性疾患」：  「ＴＬＲ−９介在性疾患」という用語は、制御を欠いたＴＬＲ９発現および／またはＴＬＲ９シグナル伝達の活性化を含み、これらが症状の原因であると考えられる疾患を表し、このような疾患には、限定されるものではないが、全身性紅斑性狼瘡、ＩｇＡ腎症、歯周炎、硬化性胆管炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、劇症１型糖尿病（ＦＴ１Ｄ）、末期腎疾患、急性膵炎（ＡＰ）、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、ドライアイ疾患、ウィスコット・アルドリッチ症候群、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、慢性鼻副鼻腔炎、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、疼痛、早期陣痛および子癇前症が含まれる。
【００５９】
「ＴＬＲ７および／または８介在性疾患」：  「ＴＬＲ７および／または８介在性疾患」という用語は、制御を欠いたＴＬＲ７および／もしくは８の過剰発現ならびに／またはＴＬＲ７および／もしくは８シグナル伝達の過剰な活性化を含む疾患を表す。このような現象は、限定されるものではないが、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎（非特許文献４０）、多発性硬化症（非特許文献４１）、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群（非特許文献４２）、喘息（非特許文献４３］）をはじめとする疾患の治療の良好な標的であると考えられる。
【００６０】
「ＮＦ−κＢ介在性疾患」：  「ＮＦ−κＢ介在性疾患」という用語は、ＮＦ−κＢの制御を欠いた過剰な活性化を含み、下流の遺伝子発現に影響を及ぼす疾患を表す。この疾患には、限定されるものではないが、関節リウマチ、胃炎および炎症性腸疾患、アレルギー、頭痛、疼痛、複合性局所疼痛症候群、心肥大、筋ジストロフィー、筋消耗、異化障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、胎児成長遅滞、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、心疾患、慢性心不全、虚血／再潅流、脳卒中、脳動脈瘤、狭心症、肺疾患、嚢胞性線維症、酸誘発肺損傷、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ヒアリン膜症、腎疾患、糸球体疾患、アルコール性肝疾患、レプトスピラ症腎疾患、消化管疾患、腹膜子宮内膜症、鼻副鼻腔炎、免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成異常症、ベーチェット病、色素失調症、結核、喘息、関節炎、クローン病、眼アレルギー、緑内障、虫垂炎、パジェット病、膵炎、歯周炎、子宮内膜症、炎症性肺疾患、敗血症、睡眠時無呼吸、抗リン脂質抗体症候群、狼瘡、ループス腎炎、慢性疾患症候群、家族性地中海熱、遺伝性周期熱症候群、パーキンソン病、多発性硬化症、リウマチ性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、白内障、慢性炎症性脱髄性多発神経炎 、ヘリコバクター・ピロリに関連した胃炎、全身性炎症反応症候群および癌（非特許文献２０；非特許文献２１）が含まれる。
【００６１】
「インターフェロン介在性疾患」：  この疾患は、インターフェロンの過剰産生および／またはインターフェロン下流遺伝子の過剰な活性化により引き起こされ、限定されるものではないが、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、シェーグレン症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、強皮症、炎症性関節炎、１型糖尿病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、グレーブス病、顕微鏡的多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫、自己免疫性甲状腺疾患、若年性特発性関節炎、巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、およびクローン病（非特許文献３６）が含まれる。
【００６２】
「炎症性サイトカイン介在性炎症疾患」：  この疾患は、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）および／またはＩＬ−１２などの、これらのサイトカインの下流シグナル伝達経路を介して免疫を過剰に活性化する炎症性サイトカインにより誘発される。炎症性サイトカインはまた、下流のプロスタグランジン産生も活性化し、これが疾患状態下で疼痛の生成に関与する。このような炎症性サイトカインにより誘発される疾患は、腫脹、発赤、発熱、疼痛および機能喪失などの特徴により現れるような炎症性応答を示す。慢性炎症はまた、創傷治癒反応に関連する線維症を引き起こすこともあり、これが正常な組織機能への支障をもたらし得る。線維症には、限定されるものではないが、肺線維症、肝硬変、心線維症、および嚢胞性線維症が含まれる。慢性炎症はまた、活性化されたマクロファージ（類上皮細胞）で構成された制御を欠いた炎症塊である肉芽腫を引き起こすこともある（非特許文献３７）。
【００６３】
「ＣｐＧ  ＯＤＮ」：  ＴＬＲ９アゴニストは自然免疫応答と適応免疫応答の両方を活性化することが文献に記載されている（非特許文献１１）。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）はＴＬＲ９アゴニストである（非特許文献１７）。機能的特徴に基づき、ＣｐＧ  ＯＤＮは３つのタイプに分けられる（非特許文献４４）。  Ａ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を活性化して多量のＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮアルファ／ベータ）を産生し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を強く活性化する。Ｂ型ＣｐＧ  ＯＤＮは主としてＢ細胞を活性化し、それらの増殖と抗体分泌をもたらす。Ｃ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、Ａ型およびＢ型ＣｐＧ  ＯＤＮの活性を併せ持つ。ＴＬＲ９アゴニストとして、ＣｐＧ  ２２１６またはＣｐＧ  ２００６またはＣｐＧ  ２３９５などのＣｐＧ  ＯＤＮは、細胞コンパートメントに内部移行され、そこでＴＬＲ９に曝され、ＴＬＲ９を活性化し得る。ｐＤＣでは、ＴＬＲ９の活性化は、炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦアルファ）の分泌、Ｉ型ＩＦＮの分泌およびＩＦＮ誘導性ケモカインの分泌を特徴とする即時自然免疫応答を誘発する。ＩＦＮ依存性経路とＩＦＮ非依存性経路の両方を介し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球および好中球をはじめとする自然免疫細胞がｐＤＣにより二次的に活性化される。ＴＬＲ９を介して活性化されたＢ細胞は、抗原刺激に対して著しく高まった感受性を有し、抗体分泌細胞に効率的に分化し、従って、適応免疫応答、特に液性免疫応答に寄与する。ＴＬＲ９を介して活性化されたｐＤＣは、リンパ節およびその他の二次リンパ組織へのｐＤＣの移動およびクラスタリングを促すＩＦＮアルファを分泌し、そこでｐＤＣはナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を活性化し、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）への可溶性タンパク質抗原の交差提示を補助し、強いＴＨ１偏向型の細胞性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答を促進する。上述の知見に基づけば、ＣｐＧ  ＯＤＮの活性に拮抗する薬剤は、自然免疫応答と適応免疫応答の両方を阻害することにより免疫介在性疾患を治療または予防するために使用可能であることが明らかである。
【００６４】
「薬学上許容される担体」：  薬学上許容される担体とは、本発明のオリゴヌクレオチドを対象に投与するために好適な１以上の固体もしくは液体増量剤、希釈剤または封入物質を表す。担体は有機、無機、天然または合成であり得る。担体には、本発明のオリゴヌクレオチドを投与するために好適な溶液、希釈剤、溶媒、分散媒、リポソーム、エマルション、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤のいずれかおよび全て、ならびに他のいずれかの担体が含まれ、それらの使用は当技術分野で周知である。薬学上許容される担体は、本オリゴヌクレオチドの特定の投与様式に応じて選択される。非経口製剤は、通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、またはグリセロールなどの薬学上および生理学上許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の剤形）の場合、従来の非毒性固体担体としては、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加え、投与される医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの微量の非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。
【００６５】
「治療上有効な量」：  免疫介在性疾患を治療または予防するために、治療上有効な量の本発明のオリゴヌクレオチドが対象に投与される。１または複数のオリゴヌクレオチドの「治療上有効な量」は、対象において免疫介在性疾患を治療または予防するという所望の結果を達成するために使用されるオリゴヌクレオチドの十分な量を意味する。本発明のオリゴヌクレオチドは、純粋な形態または薬学上許容される担体中で使用可能である。あるいは、本オリゴヌクレオチドは、医薬組成物として投与してもよい。本発明においてこの「量」は、用量を指すものとする。用量は当業者に周知の標準技術によって決定することができ、限定されるものではないが、対象の大きさもしくは／および全体的な健康または疾病の重篤度を含む因子に応じて異なり得る。本発明のオリゴヌクレオチドの導入は、単一の治療としてまたは一連の治療にわたって行うことができる。投与のための本発明のオリゴヌクレオチドの対象用量は、投与当たり約１μｇ〜１０ｇの範囲である。好ましくは、用量は０．１ｍｇ〜５ｇの範囲である。より好ましくは、用量は０．３ｍｇ〜３ｇの範囲である。最も好ましくは、用量は１ｍｇ〜１ｇの範囲である。より好ましい用量は、当業者により、例えば、担当医師により、適切な医学的判断の範囲内で最適な治療効果をもたらすように調節することができる。
【００６６】
「投与経路」：  臨床使用に関して、本発明のオリゴヌクレオチドは、所望の治療結果を達成するために効果的な任意の好適な投与経路を介して単独で投与することまたは医薬組成物として処方することができる。本発明のオリゴヌクレオチドを投与する「経路」は、腸内投与、非経口および局所投与または吸入を意味するものとする。本発明のオリゴヌクレオチドの腸内投与経路には、経口投与、胃投与、腸管投与、および直腸投与が含まれる。非経口経路には、皮下投与、静脈内投与、経皮投与、舌下投与、鼻腔内投与、経粘膜投与、肺投与、膣投与、エアゾール投与、眼内投与、気管内投与、直腸内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、関節内投与、腹腔内投与、心臓内投与、骨内投与、くも膜下腔内投与、硝子体内投与、吸入投与または局所投与が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドの局所投与経路は、表皮、口腔ならびに耳、眼および鼻への本オリゴヌクレオチドの外的適用を表す。
【００６７】
「医薬組成物」：  医薬組成物は、治療上有効な量の本発明のオリゴヌクレオチドを薬学上許容される担体とともにまたは伴わずに含む組成物を意味するものとする。医薬組成物は、１以上の本発明のオリゴヌクレオチドを含み得る。本組成物には、限定されるものではないが、水溶液または生理食塩水、粒子、エアゾール、ペレット、顆粒、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ、エマルション、懸濁液、クリーム、滴剤および様々な薬物送達システムにおいて使用するために好適なその他の医薬組成物が含まれる。これらの組成物は非経口、経口、直腸、腟内、腹膜内、局所（散剤、軟膏、ゲル、滴剤もしくは経皮パッチとしての投与形で）、頬側に、または経口もしくは鼻腔スプレーとして投与してもよい。全ての場合で、本組成物は、製造および保存の条件下で無菌かつ安定であり、微生物汚染から保護されなければならない。非経口注射用の本発明の医薬組成物は、薬学上許容される無菌水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、ならびに使用直前に無菌注射溶液または分散液へと再構成するための無菌散剤を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、水性担体中、例えば、等張バッファー溶液中にｐＨ約３．０〜約８．０、好ましくは、ｐＨ約３．５〜約７．４、３．５〜６．０、または３．５〜約５．０で懸濁させることができる。バッファー溶液には、クエン酸ナトリウム−クエン酸バッファーおよびリン酸ナトリウム−リン酸バッファー、および酢酸ナトリウム−酢酸バッファーが含まれる。経口投与の場合、本組成物は、可食担体を用いて調剤し、散剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などを形成させる。固体組成物の場合、従来の非毒性固体担体は、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。頬側投与の場合、本組成物を従来の様式で錠剤またはトローチ剤とする。吸入の場合、本組成物を与圧パック、ネブライザーからのエアゾールスプレー、またはドライパウダーとし、当業者により選択することができる。いくつかの場合、本発明のオリゴヌクレオチドの効果を延長するために、本発明のオリゴヌクレオチドはまた除放系によって適宜投与される。本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの放出を緩慢にするために水溶解度の低い結晶性または非晶質材料の液体懸濁物として使用することができる。あるいは、本オリゴヌクレオチドの非経口投与薬物形態の遅延放出は、本オリゴヌクレオチドを疎水性材料（例えば、許容される油性ビヒクル）に溶解または懸濁させることにより達成される。注射用デポー形態は、本オリゴヌクレオチドをリポソームまたはマイクロエマルションまたは他の生分解性半透性ポリマーマトリックス、例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）に封入することにより作製される。
【００６８】
「有効成分」：  本発明のオリゴヌクレオチドは、単独で、それら自体と組み合わせて、薬学上許容される担体中で、１以上の付加的有効成分と組み合わせて使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドおよび付加的有効成分の投与は逐次または同時であり得る。有効成分には、非ステロイド系抗炎症剤、ステロイド、非特異的免疫抑制剤、生物反応修飾物質、化学化合物、小分子、核酸分子およびＴＬＲアンタゴニストが含まれる。有効成分はまた、ケモカインと拮抗すること、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の生成を誘導すること、補体、マトリックスメタロプロテアーゼおよび酸化窒素シンターゼを阻害すること、共刺激因子を遮断すること、および免疫細胞のシグナル伝達カスケードを阻害することによって免疫の活性化を抑制する薬剤も表す。非ステロイド系抗炎症剤には、限定されるものではないが、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメティン(tolnetin)、セレコキシブおよびロフェコキシブが含まれる。ステロイドには、限定されるものではないが、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロンが含まれる。非特異的免疫抑制剤とは、免疫介在性疾患の発症を予防するために使用される薬剤を意味する。非特異的免疫抑制剤には、限定されるものではないが、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ステロイド、ＦＫ５０６、タクロリムス、ミコフェノール酸およびシロリムスが含まれる。生物反応修飾物質には、限定されるものではないが、以下のように、小分子、組換えタンパク質またはモノクローナル抗体標的分子が含まれる：
ｉ）ＩＬ−１を標的とする：キネレット／アナキンラおよびリロナセプト／アルカリスト、
ｉｉ）ＴＮＦアルファシグナル伝達を標的とする：エタネルセプト／エンブレル、インフリキシマブ／レミケード、およびゴリムマブ／シンポニー、
ｉｉｉ）ＩＬ−６を標的とする：トシリズマブ／アクテムラ、シルタキシマブ／シルバント、シルクマブ、およびオロキスマブ、
ｉｖ）ＩＦＮアルファを標的とする：シファルマブおよびロンタリズマブ、
ｖ）ＢＡＦＦを標的とする：ベリムマブ／ベンリスタ、ブリシビモド、およびアタシセプト、
ｖｉ）ＩＬ−１７を標的とする：セクキヌマブ／コセンティクス、ブロダルマブ／ルミセフ、およびイキセキズマブ／トルツ、
ｖｉｉ）ＩＬ−２３またはＩＬ−１２／２３を標的とする：ウステキヌマブ／ステラーラ、グセルクマブ、ブリアキヌマブ、およびチルドラキズマブ、
ｖｉｉｉ）ＪＡＫ（ヤーヌスキナーゼ）を阻害する：ルキソリチニブ／ジャカビ、およびトファシチニブ／ゼルヤンツ。
これらの薬剤にはまた、インターフェロンベータ−１ａ、ＩＬ−１０およびＴＧＦベータまたはそれらの誘導体が含まれる。これらの薬剤にはまた、Ｂ細胞などの特定の免疫細胞を除去するためのモノクローナル抗体／組換えタンパク質（リツキシマブ／リツキサン、エプトラツズマブ）ならびにアバタセプト／オレンシア、ナタリズマブ／タイサブリおよびダクリズマブ／ジムブリタなどのリンパ球の活性を抑制するためのタンパク質も含まれる。
【００６９】
「送達ビヒクル」：  本発明のオリゴヌクレオチドは、送達ビヒクル中／送達ビヒクルとともに、またはビヒクルと連結した形態で投与することができる。ビヒクルには、限定されるものではないが、ステロール（例えば、コレステロール）、コクレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、エマルソーム、ＩＳＣＯＭ；脂質（例えば、陽イオン脂質、陰イオン脂質）、リポソーム；エチレングリコール（ＰＥＧ）；生菌ベクター（例えば、サルモネラ菌属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｒｉｎ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、生ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）、ビロソーム、ウイルス様粒子、ミクロスフェア、核酸ワクチン、ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）、ポリマー環および特異的受容体により標的細胞を認識する標的化薬剤が含まれる。
【００７０】
「ペグ化」：  ペグ化は、ポリ(エチレングルコール）ポリマー鎖の、別の分子、通常には薬物または治療用タンパク質への共有結合の方法である。ペグ化は、慣例的に、ＰＥＧの反応性誘導体を標的薬剤とともにインキュベーションすることにより達成される。ペグ化薬剤は、薬剤を宿主の免疫系から「マスク」し、薬剤の流体力学的サイズを増してその循環時間を延長することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ペグ化することができる。
【００７１】
そうではないことが示されない限り、本発明における用語は全て、本開示が属する技術分野の熟練者によって共通に理解されているものと同じ意味を持つ。単数の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、「または」という語は、文脈がそうでないことを示さない限り、「および」を含むものとする。「少数の」という用語は、本明細書では２〜３の数を意味する。「いくつかの」という用語は、本明細書では２〜６の数を意味する。矛盾がある場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先する。加えて、材料、方法および例は単に例示であって、限定することを意図するものではない。治療（ｔｒｅａｔ，  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、文法に関わらず同じ意味を有する。同様に、予防（ｐｒｅｖｅｎｔ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）も文法に関わらず同じ意味を有する。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明を下記の実施例でより詳しく記載する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されない。本明細書において、これらの実施例では、市販のキットおよび試薬を用いた実験は、そうではないことが述べられない限り、付属のプロトコールに従って行った。当業者ならば、本発明のオリゴヌクレオチドは免疫介在性疾患を治療するために容易に適用可能であることを認識するであろう。以下、本発明を下記の限定されない例により示す。
【００７３】
ＴＬＲ９刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ２３９５（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣｇ−３’、配列番号４３）、ＣｐＧ２２１６（５’−ＧＧｇｇｇａｃｇａｔｃｇｔｃＧＧＧＧＧｇ−３’、配列番号４４）であり、これらは全て一本鎖ＤＮＡであり、北海道システム・サイエンス株式会社（札幌、日本）で合成され、ここで、オリゴヌクレオチド内の大文字はホスホロチオエート化されたヌクレオチドを表し、小文字はそれらの３’末端にホスホジエステル結合を有するヌクレオチドを表す。ＴＬＲ７または８刺激は、ガーディキモド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の添加により達成した。本実施例で使用した本発明の全てのオリゴヌクレオチドも北海道システム・サイエンス株式会社（札幌、日本）で合成された一本鎖ＤＮＡであった。本実施例で使用したものは、ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６の整数であり、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０である場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）を表し、かつ、ｍは０、１または２である｝と記載することができ、ヌクレオチド間結合が完全にまたは部分的にホスホロチオエート化されているオリゴヌクレオチドである。本実施例に記載されるサンプルオリゴヌクレオチドは次のとおりである：
ＣＣＴ８ＰＳ（２３個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号４５）
ＣＣＴ１２ＰＯ（０個のホスホロチオエート化結合）：５’−ｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔ−３’（配列番号１５）
ＣＣＴ１２ＰＳ（３５個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号４６）
ＣＣＴ１２−１（３０個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２５）
ＣＣＴ１２−２（３２個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２６）
ＣＣＴ１２−３（３１個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２７）
ＣＣＴ１２−４（３２個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号４７）
ＣＣＴ１２−５（３１個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号４８）
ＴＣＣ１２ＰＯ（０個のホスホロチオエート化結合）：５’−ｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃ−３’（配列番号２０）
ＴＣＣ１２ＰＳ（３５個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４９）
ＴＣＣ１２−６（３２個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４０）
ＴＣＣ１２−７（３２個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号５０）
ＴＣＣ６−１（１６個のホスホロチオエート化結合）：５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３６）
（配列中、大文字は、その塩基は３’においてヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されていることを表し、小文字は、その塩基は修飾されていないことを表す）。下記の実施例でオリゴヌクレオチドを操作するために使用した試薬は全て発熱物質不含であった。
【００７４】
実施例１
通常のホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドに比べた場合の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの安定性
＜実験方法＞
オリゴヌクレオチド（１０ｎｇ／ｕＬ）を３７℃で蒸留水（ＤＷ）中、２０％（ｖ／ｖ）のヒト血清（Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ，  カタログ１２１８１２０１）とともにインキュベートした。オリゴヌクレオチドを含有する溶液をインキュベーション１日後に回収し、残存する非分解オリゴヌクレオチドの濃度を調べた。溶液中のオリゴヌクレオチドの濃度は、プローブとして（ＣＣＴ）１２または（ＴＣＣ）１２の相補的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションアッセイで決定し、これは（ＣＣＴ）１２または（ＴＣＣ）１２配列を含む全長オリゴヌクレオチドを有するもののみを検出する。
【００７５】
＜実験結果＞
図１は、血清含有培地で１日のインキュベーション後に残留する無傷のオリゴヌクレオチドの割合を示し、この割合は、試験開始時のオリゴヌクレオチドの濃度に対する％により示される。図１ａに示されるように、通常のホスホジエステルヌクレオチド間結合を有するＣＣＴ１２ＰＯは、１日のインキュベーション中にほぼ完全な分解を示したが、完全にホスホロチオエート化されたＣＣＴ１２ＰＳはより長い持続時間を示し、このことはヌクレオチド間修飾の無いオリゴヌクレオチドの速い分解を示す。図１ａに示されるように、非ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドＣＣＴ１２ＰＯは、水溶液中、血清の存在下で急速な分解を示したものの、完全にまたは部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド（ＣＣＴ１２ＰＳおよびＣＣＴ１２−３）は、２４時間にわたって安定を示した。図１ｂは、部分的にホスホロチオエート化された（ＴＣＣ）１２種の安定性を示す。ホスホロチオエート化の無いオリゴヌクレオチド（ＴＣＣ１２ＰＯ）は１日のインキュベーション後に急速な分解を示したが、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド（ＴＣＣ１２−６）は、同じ配列を有する完全ホスホロチオエート化種（ＴＣＣ１２ＰＳ）と同程度の安定性の増強を示したことが示された。
【００７６】
実施例２
オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性検査
＜実験方法＞
オリゴヌクレオチドを生理食塩水に２ｍｇ／ｍｌで溶解させた後、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に１００μＬ／１０ｇ体重で毎日１回注射した（連続７日間で２０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）となる）。これらのオリゴヌクレオチドが体重に影響を及ぼすかどうかを調べるために、マウスの体重を調べた。図２ａ〜図２ｃの図面では、Ｘ軸は最初の投与からの日数を表す（すなわち、０日目は投与初日であり、６日目は投与の最終日である）。体重の平均（各群３個体）をＹ軸に、１００％とした試験の開始からの割合で示す。
最後の投与の翌日（７日目）に、マウスから採取した血液を生化学分析にかけ、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）などの肝障害を示すマーカーに対する作用を調べた。図２ｄおよび図２ｅは、Ｙ軸に血中ＡＬＴの濃度を示す。ＡＬＴは、肝臓の健康を判断するために、肝細胞損傷の診断評価の一部として臨床で慣例的に測定される。一般に、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ラットなどのいずれの哺乳動物でも１０〜４０ＩＵ／Ｌが標準参照範囲である。ＡＬＴ範囲は、齢、性別および人種などの対象の条件によってヒトの間でも変動する場合があり、従って、標的化合物の毒性は一般に、類似の背景を持つ対象で得られた参照との比較によって評価される。本出願では、ＡＬＴの測定は、オリエンタル酵母工業株式会社の長浜生物科学研究所に外注した。また、測定はＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＴｅｓｔｉｎｇキットであるＬ型ＡＬＴ  Ｊ２（和光純薬工業）を、製造者の標準プロトコールに従って用いても行った。測定されたＡＬＴ値が、生理食塩水を投与した動物のＡＬＴ値（図２ｄおよび図２ｅの生理食塩水）を有意に超えていれば、その対象は肝毒性を受けていると診断される。
【００７７】
＜実験結果＞
図２ａに示されるように、生理食塩水を投与したマウスは、体重の減少を示さなかったが、ＣＣＴ８ＰＳまたはＣＣＴ１２ＰＳのいずれかを投与したマウスは体重に有意な減少を示し、強い毒性のためにいずれの投与群でも１個体の死亡を伴った。一方、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドは、それらの間で変動性の挙動を示し（図２ａ〜図２ｃ）、結果として、ＣＣＴ１２−４（図２ｂ）、ＣＣＴ１２−５、およびＴＣＣ１２−７（図２ｃ）に関して示される強い毒性は、体重の劇的な減少によって明らかであったが、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３（図２ｂ）、ＴＣＣ６−１およびＴＣＣ１２−６（図２ｃ）に関しては明確な毒性は見られなかった。ＴＣＣ１２−７を投与したマウスの群では、１個体のマウスが投与過程で死に至り、強い毒性が明らかであった。興味深いことに、ＣＣＴ１２−２とＣＣＴ１２−４、ＣＣＴ１２−３とＣＣＴ１２−５、およびＴＣＣ１２−６とＴＣＣ１２−７など、同じ比率のホスホロチオエート化を有するオリゴヌクレオチドであっても、毒性の違いを示した。
また、最終投与後１日目にも（７日目、図２ｄおよび図２ｅ）、マウスを生化学的分析で調べた。完全にホスホロチオエート化されたＣＣＴ１２ＰＳまたは部分的にホスホロチオエート化されたＣＣＴ１２−４もしくはＴＣＣ１２−７などの毒性オリゴヌクレオチドを投与したマウスはＡＬＴに劇的な増加を示した。一方、ＣＣＴ１２−１、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３（図２ｄ）、およびＴＣＣ１２−６（図２ｅ）などの部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドのいくつかの投与はＡＬＴに増加を示さず、生理食塩水投与個体の場合と同様に、肝傷害が無いことが明らかになった。
【００７８】
全体として、毒性は各分子のホスホロチオエート結合の割合または数に寄らず、３２のホスホロチオエート結合を有する１２ＣＣＴリピートオリゴヌクレオチドの中では、ＣＣＴ１２−２は毒性を示さなかったが、ＣＣＴ１２−４は強い毒性を示し、３１個のホスホロチオエート結合を有する１２ＣＣＴリピートオリゴヌクレオチドの中では、ＣＣＴ１２−３は毒性を示さなかったが、ＣＣＴ１２−５は強い毒性を示し、３２個のホスホロチオエート結合を有する１２−ＴＣＣリピートオリゴヌクレオチドの中では、ＴＣＣ１２−６は毒性を示さなかったが、ＴＣＣ１２−７は強い毒性を示したと結論付けられた。
低毒性の全てのオリゴヌクレオチド間の共通の特徴は、ホスホジエステル結合により連結された３つのＣＣＴもしくはＴＣＣ完全ホスホロチオエート化ストレッチまたはその末端切断ストレッチの構造であるが、毒性を有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのＣＣＴまたはＴＣＣ完全ホスホロチオエート化ストレッチを共通に有する。
一方、本実施例で調べた２０ｍｇ／ｋｇの用量は、体表面積に基づくＦＤＡ指針（非特許文献４５）に従う用量変換によって計算した場合にヒトでは１．６２ｍｇ／ｋｇに相当すると考えることができ、単回用量はおよそ１００ｍｇとなる（体重６０ｋｇの場合）。従って、本発明のオリゴヌクレオチド１００ｍｇの少なくとも１週間の連続毎日の投与は、それがヒトに適用される場合に十分な忍容性があると考えられ、それはまたいっそう高い用量が許容されることも示す。投与計画および投与レベルは、医師または他の当業者によって調節される。
【００７９】
実施例３
ＮＦ−κＢ転写活性の阻害
＜実験方法＞
細胞アッセイにおいてＮＦ−κＢ転写因子の活性をモニタリングするために、ＣＡＬ−１／ＮＦ−κＢ−ＧＦＰ細胞株を樹立した（特許文献３）。ＮＦ−κＢコンセンサス転写応答要素により駆動されるＧＦＰリポーター遺伝子をコードするベクターをエレクトロポレーションによりヒト形質細胞様ＤＣ細胞株ＣＡＬ−１（ヒトｐＤＣ細胞株、非特許文献４６、特許文献４）にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をさらに抗生物質で選択した。次いでＣＡＬ−１／ＮＦ−κＢ−ＧＦＰ細胞（１×１０５／ウェル）を９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、ＴＬＲアゴニストとともに、本発明のオリゴヌクレオチドを含んでまたは含まずに培養した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で４（ＴＬＲ７／８）または６時間（ＴＬＲ９）インキュベートした。ＮＦ−κＢ転写活性の変化は、阻害剤不含の細胞からのデータを１００％とした場合の、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ）により検出されるＧＦＰ陽性細胞の比によって示した。ＴＬＲ７／８の下流のシグナル伝達の活性化は、図３ａ（オリゴヌクレオチド０．１μＭ）では３μｇ／ｍｌ、図３ｂおよび図３ｃ（オリゴヌクレオチド０．３３μＭ）では２μｇ／ｍｌのガーディキモドの添加により、またはＴＬＲ９の場合には、１μＭでのＣｐＧ２３９５の添加によって達成した。
【００８０】
＜実験結果＞
図３ａでは、水平軸は１００％（培地）としての培地単独で処理した細胞において示されたサンプルに比べた場合の、活性ＮＦ−κＢにより駆動された発光の割合を表す。図３ａに示されるように、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド（ＣＣＴ１２−１、２、３および４）は、完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドＣＣＴ１２−ＰＳと同等レベルの阻害活性を示した。従って、ここに示されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合のホスホロチオエート化レベルの低下にかかわらず、ＮＦ−κＢ転写活性に対する阻害活性の変化を示さなかった。図３ｂおよび図３ｃでは、ホスホロチオエート化のパターンは、同じ割合のホスホロチオエート化を有するオリゴヌクレオチド（ＣＣＴ１２−３とＣＣＴ１２−５；ＴＣＣ１２−６とＴＣＣ１２−７）はＴＬＲ７／８またはＴＬＲ９の活性化に対する阻害作用に有意な違いを示さなかったという事実により明らかにされる阻害効果に影響を及ぼさなかったことも示された。
【００８１】
実施例４
ＣＡＬ−１細胞における本オリゴヌクレオチドによるサイトカイン産生の阻害
＜実験方法＞
ＣＡＬ−１細胞（１×１０５／ウェルで播種）をＴＬＲアゴニスト（ＴＬＲ７／８アゴニストとしてのガーディキモド、図４ａでは３μｇ／ｍｌもしくは図４ｂでは２μｇ／ｍｌ；またはＴＬＲ９アゴニストとしてのＣｐＧ２３９５、１μＭ）とともに、阻害性オリゴヌクレオチドを伴ってまたは伴わずに３７℃で２４時間インキュベートし、上清を遠心分離により回収した。次に、ＴＮＦアルファまたはＩＬ−６などのサイトカインの培地の濃度をＥＬＩＳＡにより調べた。ＥＬＩＳＡは、以下のキットを製造者のプロトコールに従って用いて行った：Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦアルファ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．Ｄｙ２１０），  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  （Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｃａｔ．Ｄｙ２０６）。
図４ａ、図４ｂおよび図４ｃは、培地中のそのサイトカイン濃度を１００％（培地）とした、阻害性オリゴヌクレオチド不含のサンプルに対する割合により示される、ＴＮＦアルファまたはＩＬ−６の産生レベルを表す。図４ａでは、オリゴヌクレオチドＣＣＴ１２ＰＳ、ＣＣＴ１２−１、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３、およびＣＣＴ１２−４を、ＴＬＲ７／８アゴニストまたはＴＬＲ９アゴニストの両方に対して０．１μＭで使用し、図４ｂおよび図４ｃでは、オリゴヌクレオチドＣＣＴ１２−３、ＣＣＴ１２−５、ＣＣＴ１２−６およびＣＣＴ１２−７を、ＴＬＲ７／８アゴニストに対しては０．０３７μＭで、またはＴＬＲ９アゴニストに対しては０．０１１μＭで使用した。
【００８２】
＜実験結果＞
図４ａにより示されるように、部分的にホスホロチオエート化されたものを含む全てのオリゴヌクレオチド（ＣＣＴ１２−１、２、３および４）は、ＴＬＲ７／８またはＴＬＲ９のいずれかにより誘導されるサイトカイン産生に同レベルの阻害を示し、部分的なホスホロチオエート化がサイトカイン産生に対する阻害効果に影響を及ぼさないことを示す。図４ｂは、ガーディキモドまたはＣｐＧ２３９５により誘導されるＴＮＦアルファおよびＩＬ−６の産生に対する阻害効果は、ＣＣＴ１２−３とＣＣＴ１２−５、またはＴＣＣ１２−６とＴＣＣ１２−７の間で比較した場合に、ホスホロチオエート化レベルの違いにより影響を受けなかったことを示した。
【００８３】
実施例５
ヒトＰＢＭＣにおけるオリゴヌクレオチドによるＩＦＮアルファの阻害
＜実験方法＞
２名の健康なボランティアドナーから採取したヒトＰＢＭＣを、１ｕＭのＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ２２１６とともに、阻害性オリゴヌクレオチドを含んでまたは含まずに、３７℃で２４時間インキュベートし、上清中のＩＦＮアルファをＥＬＩＳＡにより調べた。
ＩＦＮアルファ濃度に関するＥＬＩＳＡ分析は、ヒトＩＦＮアルファモジュールセット（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、カタログＢＭＳ２１６ＭＳＴ）を用い、製造者のプロトコールに従って行った。
図５ａ（オリゴヌクレオチド、０．０３μＭ）および図５ｂ（オリゴヌクレオチド、０．０１１μＭ）では、各サンプル中のＩＦＮアルファのレベルを、ＴＬＲアゴニストを含むが阻害性オリゴヌクレオチドを含まない場合のＩＦＮアルファ産生に対する割合として示し、２名のドナーからの結果の平均をＹ軸にプロットした。
【００８４】
＜実験結果＞
図５ａに示されるように、ＴＬＲ９アゴニストにより誘導されるＩＦＮアルファ産生は、毒性を有するものまたは毒性を有さないものいずれでも、阻害性オリゴヌクレオチドのいずれによっても抑制され、ホスホロチオエート化の減少は、オリゴヌクレオチドの阻害効果に、同レベルのホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドであっても、影響を及ぼさないことを示した。ｔ検定の結果は、ＣＣＴ１２ＰＳと各部分的ホスホロチオエート化オリゴヌクレオチド（すなわち、ＣＣＴ１２−１、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３またはＣＣＴ１２−４；各ｐ値は０．３５０１、０．５１０８、０．３０９６、および０．２９２２である）間に有意差は無かったことを裏づけた。
図５ｃでは、種々のホスホロチオエート化パターンを有するＴＣＣ１２種を  ＩＦＮアルファ産生の抑制において比較したところ、ホスホロチオエート化パターンはオリゴヌクレオチドの活性に影響を及ばさないことが判明し、このことは、ｔ検定により計算されたｐ値がＴＣＣ１２−６およびＴＣＣ１２−７を用いた場合の結果に有意でない違いを示す（ｐ値＝０．４５４１）ということにより裏づけられる。
【００８５】
全体として、本発明は、以前の発明に比べてより安定で、毒性の低い、免疫介在性疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドを提供する。興味深いことに、低毒性を有する本発明のオリゴヌクレオチドは全て、間をホスホジエステル結合により連結された３つのＣＣＴもしくはＴＣＣリピートの、完全にホスホロチオエート化されたストレッチおよび／またはそれらの末端切断ストレッチのモチーフを有する構造を共通に持ち（例えば、ＣＣＴ１２−１、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３、ＴＣＣ１２−６、およびＴＣＣ６−１）、一方、強い毒性を有するオリゴヌクレオチドは、より大きな（３を超える）完全にホスホロチオエート化されたストレッチを有する（例えば、ＣＣＴ１２ＰＳおよびＴＣＣ１２ＰＳを含む、ＣＣＴ１２−４、ＣＣＴ１２−５、ＴＣＣ１２−７）。
結論として、本出願のオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが低毒性を持ち得、それにより前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物の漸増用量計画を可能とすることから、従来技術と比較して免疫介在性疾患の療法に効果的であり得る。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列番号１：＜２２３＞（ＣＣＴ）６阻害オリゴヌクレオチド
配列番号２：＜２２３＞（ＣＣＴ）７阻害オリゴヌクレオチド
配列番号３：＜２２３＞（ＣＣＴ）８阻害オリゴヌクレオチド
配列番号４：＜２２３＞（ＣＣＴ）８Ｃ阻害オリゴヌクレオチド
配列番号５：＜２２３＞（ＣＣＴ）８ＣＣ阻害オリゴヌクレオチド
配列番号６：＜２２３＞（ＣＣＴ）９阻害オリゴヌクレオチド
配列番号７：＜２２３＞阻害オリゴヌクレオチド
配列番号８：＜２２３＞阻害オリゴヌクレオチド
配列番号９：＜２２３＞（ＣＣＴ）１０阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１０：＜２２３＞（ＣＣＴ）１０Ｃ阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１１：＜２２３＞（ＣＣＴ）１０ＣＣ阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１２：＜２２３＞（ＣＣＴ）１１阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１３：＜２２３＞（ＣＣＴ）１１Ｃ阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１４：＜２２３＞（ＣＣＴ）１１ＣＣ阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１５：＜２２３＞（ＣＣＴ）１２阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１６：＜２２３＞（ＣＣＴ）１４阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１７：＜２２３＞（ＣＣＴ）１６阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１８：＜２２３＞（ＴＣＣ）６阻害オリゴヌクレオチド
配列番号１９：＜２２３＞（ＴＣＣ）９阻害オリゴヌクレオチド
配列番号２０：＜２２３＞（ＴＣＣ）１２阻害オリゴヌクレオチド
配列番号２１〜４２：＜２２３＞阻害オリゴヌクレオチド
＜２２３＞３’ヌクレオチド間結合でのホスホロチオエート化修飾
配列番号４３：＜２２３＞ＣｐＧ２３９５  ＴＬＲ９刺激性オリゴヌクレオチド
＜２２３＞３’ヌクレオチド間結合でのホスホロチオエート化修飾
配列番号４４：＜２２３＞ＣｐＧ２２１６  刺激性オリゴヌクレオチド
＜２２３＞３’ヌクレオチド間結合でのホスホロチオエート化修飾
配列番号４５〜５０：＜２２３＞阻害オリゴヌクレオチド
＜２２３＞３’ヌクレオチド間結合でのホスホロチオエート化修飾
【図１ａ】
2019500873.tif 000002
【図１ｂ】
2019500873.tif 000003
【図２ａ】
2019500873.tif 000004
【図２ｂ】
2019500873.tif 000005
【図２ｃ】
2019500873.tif 000006
【図２ｄ】
2019500873.tif 000007
【図２ｅ】
2019500873.tif 000008
【図３ａ】
2019500873.tif 000009
【図３ｂ】
2019500873.tif 000010
【図３ｃ】
2019500873.tif 000011
【図４ａ】
2019500873.tif 000012
【図４ｂ】
2019500873.tif 000013
【図４ｃ】
2019500873.tif 000014
【図５】
2019500873.tif 000015
【配列表】
2019500873000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月2日(2018.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】図１ａは、部分的にホスホロチオエート化された（ＣＣＴ）１２オリゴヌクレオチド種の、血清含有培地中での安定性を示す。オリゴヌクレオチドを、血清を添加した培地中でインキュベートし、培地中に残存するオリゴヌクレオチドを定量した。図に示されるように、通常のホスホジエステルヌクレオチド間結合を有するＣＣＴ１２ＰＯは１日のインキュベーション後にほぼ完全な分解を示したが、完全にホスホロチオエート化されたＣＣＴ１２ＰＳはより長い持続時間を示し、このことはヌクレオチド間修飾無しのオリゴヌクレオチドの早い分解を示している。一方、部分的にホスホロチオエート化されたＣＣＴ１２−３（詳細は実施例の節を参照）は、ＣＣＴ１２ＰＳに匹敵する安定性を示し、このことは、血清中でヌクレアーゼに対する安定性を達成するためには、ヌクレオチド間結合において少なくともある一定のレベルのホスホロチオエート化で十分であることを示している。図１ｂは、血清含有培地中での部分的にホスホロチオエート化された（ＴＣＣ）１２オリゴヌクレオチド種の安定性を示す。ホスホロチオエート化無しの（ＴＣＣ１２ＰＯ）は１日のインキュベーション後に急速な分解を示したが、部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド（ＴＣＣ１２−６）は、同じ配列を有する完全にホスホロチオエート化された種（ＴＣＣ１２ＰＳ）と同程度に高い安定性を示したことが示された。
【図２】図２は、一定のパターンを有する低ホスホロチオエート化レベルによるオリゴヌクレオチドの毒性の低下を示す。図２ａは、ホスホロチオエート化レベルの低下による（ＣＣＴ）１２の毒性の低下を示す。ここに示されているように、ＣＣＴ１２−１は、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドＣＣＴ１２ＰＳが、別の完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドＣＣＴ８ＰＳの場合と同等に強い毒性を示したとしても、見掛けの体重減少を示さなかった。図２ｂは、ＣＣＴ１２−２、ＣＣＴ１２−３、ＣＣＴ１２−４、およびＣＣＴ１２−５の間のオリゴヌクレオチドの比較を示し、このことは、毒性の低減がホスホロチオエート化レベルの低減により達成されたわけではなく、むしろホスホロチオエート化パターンと関連を持つことを暗示している。  図２ｃは、ホスホロチオエート化パターンの変化による毒性の低減も、（ＴＣＣ）リピートに適用可能であることを示す。ＴＣＣ１２−６は毒性の低減を示したが、同レベルのホスホロチオエート化を有するＴＣＣ１２−７は、なお有意な毒性を保有していたことを示す。図２ｄおよび図２ｅは、強い毒性を示したオリゴヌクレオチドによりＡＬＴの増加もまた生じたことを示す。
【図３】図３ａは、ＮＦ−κＢ転写活性に対する部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの阻害効果を示す。ＣＣＴ１２−１、ＣＣＴ１２−２、およびＣＣＴ１２−３は低毒性を示したが、それらはなお阻害活性を保存している。図３ｂおよび図３ｃは、ホスホロチオエート化パターンの変化による毒性の低減は、オリゴヌクレオチドＣＣＴ１２−３およびＴＣＣ１２−６により示されるようなオリゴヌクレオチドの阻害活性に影響を及ぼさないことを示す。
【図４】図４ａ、図４ｂ、および図４ｃは、ＴＬＲ７／８アゴニストであるガーディキモドまたはＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ２３９５で刺激されたＣＡＬ−１細胞からのＴＮＦアルファおよびインターロイキン（ＩＬ）−６産生に対する阻害性オリゴヌクレオチドの抑制能を表すグラフを示す。毒性を減弱するホスホロチオエート化パターンの変化は、ＴＬＲ７、８、またはＴＬＲ９活性に対する抑制効果には明らかな影響を与えない。
【図５】図５ａおよび図５ｂは、ＣｐＧ２２１６で刺激されたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮアルファ産生に対する阻害性オリゴヌクレオチドの抑制活性を表すグラフを示す。これらのグラフ（５ａおよび５ｂ）はまた、ホスホロチオエート化パターンの変化は、ＴＬＲ９アゴニストにより誘導されたＩＦＮアルファ産生レベルに対するオリゴヌクレオチドの阻害活性に有意な影響を及ぼさないことを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式５’−ＣｘＴｙ（ＣＣＴ）ｎＣｍ−３’｛式中、ｎは２〜５０、または好ましくは５〜１６から選択される整数であり、ｘは整数０または１を表し、ｙは整数０（ｘ＝０である場合のみ）または１（ｘは０または１のいずれかであり得る）を表し、かつ、ｍは０、１または２である｝の配列を有する部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドであって、完全にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドＣＣＴＣＣＴＣＣＴ、ＣＴＣＣＴＣＣＴＣまたはＴＣＣＴＣＣＴＣＣおよび／またはそれらの末端切断誘導体の、間をホスホジエステル結合により連結されたストレッチを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２１），
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２２）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２３）
５’−ＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２４）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２５）
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２６）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２７）
５’−ＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２８）
５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号２９）
５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３０）
５’−ＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣｃ−３’（配列番号３１）
５’−ＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＴＣｃ−３’（配列番号３２）
５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴＣｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃ−３’（配列番号３３）
５’−ＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣｃ−３’（配列番号３４）
５’−ＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＣＴＣＣＴｃＣＴＣＴＣｃ−３’（配列番号３５）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３６）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３７）
５’−ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣｃ−３’（配列番号３８）
５’−ＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３９）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４０）
５’−ＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣｃ−３’（配列番号４１）、および
５’−ＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４２）
（配列中、大文字は、その塩基は３’においてホスホジエステルヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されていることを表し、小文字は、その塩基は修飾されていないことを表す）
からなる群から選択される、請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２５）
５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔ−３’（配列番号２６）
５’−ＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣＴＣＣＴＣＣｔＣＣｔ−３’（配列番号２７）
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号３６）、及び
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃＴＣＣＴＣＣＴＣｃ−３’（配列番号４０）
（配列中、大文字は、その塩基は３’においてホスホジエステルヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されていることを表し、小文字は、その塩基は修飾されていないことを表す）
からなる群から選択される、請求項１に記載の部分的にホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの各／両末端に、そのオリゴヌクレオチドにおいて全部で１または数個の塩基を変更または挿入することにより１または数個のヌクレオチドをさらに含み、新たに付加された１または複数のヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの各末端にホスホジエステル結合かホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
他のＤＮＡ分子、プラスミドまたはウイルスベクターの一部を構成する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ホスホロチオエート化以外の化学修飾を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ペグ化されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
インターフェロン産生の抑制のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項９】
炎症誘発性サイトカイン産生の抑制のための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用。
【請求項１０】
免疫介在性疾患の治療のための治療薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、免疫介在性疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
薬学上許容される担体をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腸内投与、非経口投与、局所投与または吸入を含む経路を介して対象に投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
単独でまたは付加的有効成分と組み合わせて投与される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患、ＴＬＲ９介在性疾患、ＴＬＲ７および／または８介在性疾患、過敏症、微生物による宿主の免疫系の過剰刺激に関連する疾患、移植片拒絶、インターフェロン介在性疾患または炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体介在性疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体９介在性疾患である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記免疫介在性疾患がＴｏｌｌ様受容体７および／または８介在性疾患である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）介在性疾患が敗血症、拡張型心筋、糖尿病、実験的自己免疫性脳脊髄炎、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、アテローム性動脈硬化症、喘息、慢性閉塞性肺疾患または臓器不全である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記免疫介在性疾患がＮＦ−κＢ介在性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＮＦ−κＢ介在性疾患が関節リウマチ、胃炎および炎症性腸疾患である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記免疫介在性疾患がインターフェロン介在性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記免疫介在性疾患が炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記炎症性サイトカイン介在性炎症性疾患が敗血性ショックまたは多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記過敏症がアレルギー性外因性喘息、季節性アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、自己免疫性溶血性貧血、胎児赤芽球症、グッドパスチャー病、アルサス反応、血清病、全身性紅斑性狼瘡、特定のタイプの糸球体腎炎、接触性皮膚炎または同種移植片拒絶である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記免疫介在性疾患が全身性紅斑性狼瘡、インスリン依存性（Ｉ型）糖尿病、炎症性関節炎、関節リウマチ、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、慢性劇症肝炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、悪性貧血の自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性睾丸炎、後天性血友病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、心筋症、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、多発性筋炎・皮膚筋炎、円板状狼瘡、交感神経性眼炎、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛症、線維筋炎、ギラン・バレー症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、全身性硬化症、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、高免疫グロブリンＥ症候群、進行性全身性硬化症、乾癬、ライター症候群、サルコイドーシス、スティッフマン症候群、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、橋本甲状腺炎、グッドパスチャー病、悪性貧血、アジソン病、シェーグレン症候群、重症筋無力症、グレーブス病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、顕微鏡的多発性血管炎、ウェゲナー肉芽腫、自己免疫性甲状腺疾患、若年性特発性関節炎、巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、またはクローン病である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが１μｇ〜１０ｇ／日で投与される、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
対象の血清中のＡＬＴ値で診断される肝毒性を持たない、請求項２７に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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