(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ−１ワクチン免疫原を提供する。該免疫原の幾つかは、ｇｐ４１におけるＨＲ１領域の修飾Ｎ末端を含有する可溶性ｇｐ１４０由来タンパク質を含有する。該免疫原の幾つかは、８ナノ粒子プラットフォーム上に提示されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質を含有する。本発明はまた、免疫応答を誘発させるための、またはＨＩＶ感染を治療するための、ＨＩＶ−１ワクチン免疫原の使用方法を提供する。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドを含む修飾ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１４０タンパク質であって、ｇｐ４１ポリペプチドのヘプタド１領域（ＨＲ１）のＮ末端が、融合前ｇｐ１４０構造を安定化させる約６〜約１４アミノ酸残基の長さのループ配列で置換されている、修飾ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１４０タンパク質。
【請求項２】
ｇｐ４１ポリペプチドがｇｐ４１ＥＣＴＯである、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項３】
三量体である、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項４】
ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドが、異なるＨＩＶ−１株に由来する、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項５】
ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来する、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項６】
ループ配列が（ＧＳ）ｎ（配列番号２３）を含有し、ここで、ｎは３〜７（３および７を含む）の任意の整数である、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項７】
ループ配列が（ＧＳ）４（配列番号２４）である、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項８】
ループ配列が１０アミノ酸残基を含む、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項９】
ループ配列が配列番号１〜５のいずれか１つを含む、請求項８記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１０】
ループ配列が８アミノ酸残基を含む、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１１】
ループ配列が配列番号６〜１０のいずれか１つを含む、請求項１０記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１２】
ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の切断部位配列の代わりに柔軟なリンカー配列を更に含む、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１３】
リンカー配列が（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）またはＳＧＳを含み、切断部位における残基５０８〜５１１を置き換えている、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１４】
リンカー配列が８アミノ酸残基を含み、切断部位における残基５０１〜５１８を置き換えている、アミノ酸残基の番号付けがＨＩＶ−１株ＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０の番号付けに対応する、請求項１２記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１５】
リンカー配列が、配列番号１６〜２０のいずれか１つに示されている配列を含む、請求項１４記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１６】
（ａ）ｇｐ１２０とｇｐ４１との間に操作されたジスルフィド結合、および／または（ｂ）ｇｐ４１における安定化変異を更に含む、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１７】
前記操作されたジスルフィド結合が残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間に存在し、前記安定化変異がＩ５５９Ｐである、請求項１６記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１８】
請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質がｇｐ１４０三量体を含み、各単量体がｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドを含み、ｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドがＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来し、ｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドにおけるヘプタド１領域（ＨＲ１）（配列番号２８）のＮ末端が、配列番号６に示されているループ配列で置換されている、請求項１記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項１９】
（ａ）切断部位における残基５０８〜５１１を置き換えるリンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、および（ｂ）残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間の操作されたジスルフィド結合を更に含む、請求項１８記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項２０】
請求項１記載の修飾三量体ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１４０タンパク質を含む、ＨＩＶ−１ワクチン免疫原。
【請求項２１】
自己集合性ナノ粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）上に提示されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体免疫原を含むＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２２】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来の三量体免疫原がＶ１Ｖ２、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０である、請求項２１記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２３】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来の三量体免疫原が、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドを含む修飾ｇｐ１４０タンパク質であり、ｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドのヘプタド１領域（ＨＲ１）のＮ末端が、融合前ｇｐ１４０構造を安定化させる約６〜約１４アミノ酸残基のループ配列で置換されている、請求項２１記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２４】
ループ配列が、（ａ）（ＧＳ）ｎ（配列番号２３）（ここで、ｎは３〜７（３および７を含む）の任意の整数である）、または（ｂ）アンサンブルに基づくタンパク質設計によって合理的に再設計された配列を含む、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２５】
修飾ｇｐ１４０タンパク質がナノ粒子プラットフォームに共有結合により融合している、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２６】
ナノ粒子プラットフォームは三量体配列を含む、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２７】
ナノ粒子プラットフォームがジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２Ｐ）、フェリチンまたはルマジンシンターゼ（ＬＳ）を含む、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２８】
ナノ粒子プラットフォームが表面上に１以上の３回軸を有し、各単量体サブユニットのＮ末端が３回軸に近接しており、３つのＮ末端の間隔が修飾ｇｐ１４０タンパク質三量体のＣ−末端の間隔に合致している、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項２９】
修飾ｇｐ１４０タンパク質配列のＣ末端がナノ粒子プラットフォーム配列のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項３０】
ナノ粒子プラットフォームが、１２または２４個のサブユニットから構築される約２０ｎｍ以下の直径を有する自己集合性ナノ粒子を含む、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項３１】
アジュバントを更に含む、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項３２】
ｇｐ１４０三量体がＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来し、ループ配列が、配列番号６に示されている配列を有する、請求項２３記載のＨＩＶ−１ワクチン組成物。
【請求項３３】
（ａ）切断部位における残基５０８〜５１１を置き換えるリンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、および（ｂ）残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間の操作されたジスルフィド結合を更に含む、請求項３２記載の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質。
【請求項３４】
請求項２０記載のワクチン免疫原の治療的有効量を対象に投与し、それにより、対象におけるＨＩＶ−１感染を予防することを含む、対象におけるＨＩＶ−１感染の予防方法。
【請求項３５】
請求項２０記載のワクチン免疫原の治療的有効量を含む医薬組成物を対象に投与し、それにより、対象においてＨＩＶ−１感染を治療し、または対象においてＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘発させることを含む、対象におけるＨＩＶ−１感染の治療方法、または対象におけるＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘発させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１免疫原に関連した組成物および方法に関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は、米国仮特許出願第６２／３３０，６０４号（２０１６年５月２日付け出願）に基づく優先権の利益を主張するものである。該優先権出願の全開示をその全体において及びあらゆる目的で本明細書に組み入れることとする。
【０００３】
米国政府の援助に関する陳述
本発明は、米国国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与されたＡＩ１００６６３およびＡＩ０８４８１７に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、世界的な重大な健康問題の１つとみなされている後天性免疫不全症候群（エイズ）の主要原因である。それはレトロウイルス科のＲＮＡウイルスである。ＨＩＶ−１ゲノムは少なくとも９つのタンパク質をコードしており、これらは、３つのクラス、すなわち、主要構造タンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ、調節タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ、ならびにアクセサリータンパク質Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆに分類される。ＨＩＶ−１は、幾つかの異なるクレード、例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪおよびＫに分類可能であり、これらは世界的な蔓延率において様々である。各クレードは、異なるＨＩＶ−１株を含み、これらはそれらの遺伝的類似性に基づいて一緒にグループ分けされている。
【０００５】
ＨＩＶ−１複製サイクルの初期段階は感受性宿主細胞への該ウイルスの付着およびそれに続くウイルス膜と細胞膜との融合を含む。これらの事象は、ｇｐ１６０として公知の融合不能前駆体エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）として最初に合成される外部ウイルスエンベロープ糖タンパク質によってもたらされる。ＨＩＶ−１の遺伝的多様性は複数のＨＩＶ−１クレードの株に対する有効なワクチンの開発を極めて困難にする。予防用ＨＩＶワクチンを得るために過去２０年間に多大な労力が費やされてきた。幾つかの候補ワクチンが開発されているが、それらは全て、臨床試験においてＨＩＶ−１感染を予防することができなかった。
【０００６】
広範囲の臨床分離体を中和しうる抗体応答の生成は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ワクチンの開発において、依然として大きな課題である。世界中で安全かつ効果的であるワクチンが強く且つ緊急に必要とされている。本発明はこの要求および当技術分野における他の未解決の要求に対処するものである。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概括
１つの態様においては、本発明は修飾ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１４０タンパク質を提供する。該タンパク質はｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドから構成され、ｇｐ４１ポリペプチドのヘプタド（ｈｅｐｔａｄ；７成分）１領域（ＨＲ１）のＮ末端は、融合前ｇｐ１４０構造を安定化させる約６〜約１４アミノ酸残基長のループ配列により置換されている。これらのタンパク質の幾つかにおいては、ｇｐ４１ポリペプチドはｇｐ４１ＥＣＴＯである。好ましくは、修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質は三量体である。幾つかの実施形態においては、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドは、同じＨＩＶ−１株または亜型に由来する。例えば、修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質におけるｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドは共にＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来しうる。幾つかの実施形態においては、ｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ポリペプチドは、異なるＨＩＶ−１株または亜型に由来する。例えば、本明細書に例示されているＨＩＶ−１株ＢＧ５０５からの操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ｇｐ４１ポリペプチドは、多数の他のＨＩＶ株または亜型に由来するｇｐ１２０ポリペプチドとのキメラｇｐ１４０免疫原を形成させるために使用されうる。
【０００８】
本発明の幾つかの修飾ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１４０タンパク質においては、ループ配列は（ＧＳ）ｎ（配列番号２３）を含有し、ここで、ｎは３〜７（３および７を含む）の任意の整数である。これらの実施形態の幾つかにおいては、ループ配列は（ＧＳ）４（配列番号２４）である。幾つかの実施形態においては、ループ配列は合理的な再設計により得られる。これらの実施形態の幾つかにおいては、ループ配列は、アンサンブルに基づくタンパク質設計により得られる。本発明の幾つかの修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質においては、ループ配列は１０アミノ酸残基を含有する。これらのループ配列の幾つかの例を配列番号１〜５に示す。幾つかの他の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質においては、ループ配列は８アミノ酸残基を含有する。これらのループ配列の幾つかの例を配列番号６〜１０に示す。
【０００９】
幾つかの実施形態においては、本発明の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質は更に、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の切断部位配列の代わりに柔軟なリンカー配列を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、リンカー配列は（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）またはＳＧＳの配列を有し、これは切断部位における残基５０８〜５１１の代わりに存在する。幾つかの他の実施形態においては、リンカー配列は８アミノ酸残基を含有し、切断部位における残基５０１〜５１８の代わりに存在する。これらの実施形態においては、アミノ酸残基の番号付けは、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０の番号付けに対応する。幾つかの例示されているタンパク質においては、リンカー配列は、配列番号１６〜２０のいずれか１つに示されている配列を含有する。
【００１０】
幾つかの実施形態においては、本発明の修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質は更に、（ａ）ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の操作されたジスルフィド結合および／または（ｂ）ｇｐ４１における安定化変異を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、操作されたジスルフィド結合は残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃの間に存在し、安定化変異はＩ５５９Ｐである。
【００１１】
本発明の幾つかの修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質は、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来するｇｐ１４０三量体を含有し、各ｇｐ１４０単量体はｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドを含有し、ｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドにおけるヘプタド１領域（ＨＲ１）（配列番号２８）のＮ末端は、配列番号６に示されているループ配列で置換されている。これらの実施形態の幾つかにおいては、該タンパク質は更に、（ａ）切断部位における残基５０８〜５１１の代わりに存在するリンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、および（ｂ）残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間の操作されたジスルフィド結合を含有する。
【００１２】
もう１つの態様においては、本発明は、修飾三量体ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１４０タンパク質を含有するＨＩＶ−１ワクチン免疫原を提供する。これらの免疫原においては、該ｇｐ１４０タンパク質はｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドを含有し、ｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドのヘプタド１領域（ＨＲ１）のＮ末端は、融合前ｇｐ１４０構造を安定化させる約６〜約１４アミノ酸残基のループ配列で置換されている。幾つかの実施形態においては、ループ配列は（ＧＳ）ｎ（配列番号２３）を含み、ここで、ｎは３〜７（３および７を含む）の任意の整数である。これらの実施形態の幾つかにおいては、ループ配列は（ＧＳ）４（配列番号２４）の配列を有する。幾つかの実施形態においては、ループ配列は、合理的な再設計、例えば、アンサンブルに基づくタンパク質設計により得られる。幾つかの実施形態においては、ループ配列は１０アミノ酸残基、例えば、配列番号１〜５に示されている任意の配列を含有する。幾つかの他の実施形態においては、ループ配列は８アミノ酸残基、例えば、配列番号６〜１０のいずれか１つに示されている配列を含有する。
【００１３】
本発明の幾つかのＨＩＶ−１ワクチン免疫原は更に、ｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間の切断部位配列の代わりに柔軟なリンカー配列を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、リンカー配列は（Ｇ４Ｓ）２またはＳＧＳを含有し、切断部位における残基５０８〜５１１の代わりに存在する。幾つかの実施形態においては、リンカー配列は８アミノ酸残基を含有し、切断部位における残基５０１〜５１８の代わりに存在する。これらの実施形態においては、アミノ酸残基の番号付けは、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５．ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０の番号付けに対応する。幾つかの実施形態においては、リンカー配列は、配列番号１６〜２０のいずれか１つに示されている配列を含有する。
【００１４】
本発明の幾つかのＨＩＶ−１ワクチン免疫原は更に、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間に操作されたジスルフィド結合を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、操作されたジスルフィド結合は残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間に存在する。ＨＩＶワクチン免疫原の幾つかは、ＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来するｇｐ１４０三量体を含有し、各ｇｐ１４０単量体はｇｐ１２０ポリペプチドおよびｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドを含有し、ｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドにおけるヘプタド１領域（ＨＲ１）（配列番号２８）のＮ末端は、配列番号６に示されているループ配列で置換されている。幾つかの実施形態においては、該修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質は更に、（ａ）切断部位における残基５０８〜５１１の代わりに存在するリンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、および（ｂ）残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間の操作されたジスルフィド結合を含有する。
【００１５】
もう１つの態様においては、本発明は、自己集合性ナノ粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）上に提示されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体免疫原を含有するＨＩＶ−１ワクチン組成物を提供する。これらの実施形態の幾つかにおいては、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来の三量体免疫原はＶ１Ｖ２、ｇｐ１２０またはｇｐ１４０である。幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来の三量体免疫原は、融合前ｇｐ１４０構造を安定化させる約６〜約１４アミノ酸残基のループ配列で置換されたｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドのヘプタド１領域（ＨＲ１）のＮ末端を有するｇｐ４１ＥＣＴＯポリペプチドおよびｇｐ１２０ポリペプチドを含有する修飾ｇｐ１４０タンパク質である。
【００１６】
幾つかの実施形態においては、ループ配列は、（ａ）（ＧＳ）ｎ（配列番号２３）の配列（ここで、ｎは３〜７（３および７を含む）の任意の整数である）、または（ｂ）アンサンブルに基づくタンパク質設計によって合理的に再設計された配列を含有する。幾つかの実施形態においては、該修飾ｇｐ１４０タンパク質はナノ粒子プラットフォームに共有結合により融合している。種々の実施形態においては、ナノ粒子プラットフォームは三量体配列を含有する。これらの実施形態の幾つかにおいては、ナノ粒子プラットフォームはジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２Ｐ）、フェリチンまたはルマジンシンターゼ（ＬＳ）である。幾つかの実施形態においては、ナノ粒子プラットフォームは表面上に１以上の３回軸（３−ｆｏｌｄ  ａｘｉｓ）を有し、各単量体サブユニットのＮ末端は３回軸に近接しており、３つのＮ末端の間隔は修飾ｇｐ１４０タンパク質三量体のＣ−末端の間隔に合致している。幾つかの実施形態においては、修飾ｇｐ１４０タンパク質配列のＣ末端はナノ粒子プラットフォーム配列のサブユニットのＮ末端に融合している。幾つかの実施形態においては、ナノ粒子プラットフォームは、１２または２４個のサブユニットから構築される約２０ｎｍ以下の直径を有する自己集合性ナノ粒子を含有する。本発明の幾つかのＨＩＶ−１ワクチン組成物は更に、アジュバントを含有しうる。
【００１７】
本発明の幾つかのＨＩＶ−１ワクチン組成物においては、ｇｐ１４０三量体はＨＩＶ−１株ＢＧ５０５に由来し、ループ配列は配列番号６に示されている。該組成物の幾つかは更に、（ａ）切断部位における残基５０８〜５１１の代わりに存在するリンカー配列（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）、および（ｂ）残基Ａ５０１ＣとＴ６０５Ｃとの間の操作されたジスルフィド結合を含有する。
【００１８】
更にもう１つの態様においては、本発明は、対象におけるＨＩＶ−１感染の予防方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１免疫原またはワクチン組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む。該免疫原の投与は対象におけるＨＩＶ−１感染の予防をもたらす。関連態様においては、本発明は、対象におけるＨＩＶ−１感染の治療方法、または対象におけるＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘発（惹起）させる方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１免疫原またはワクチンの治療的有効量を含有する医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００１９】
本発明の性質および利点の更なる理解は、本明細書および特許請求の範囲の残りの部分を参照することによってもたらされうる。
【００２０】
詳細な説明
１．概要
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対するワクチン開発の目標は、ワクチン接種により、防御用または治療用の広範中和抗体（ｂＮＡｂ）応答を誘導することである。これまでに特定されている全てのｂＮＡｂはＨＩＶ−１ビリオンの表面上のエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）三量体を標的とする。前駆体Ｅｎｖタンパク質ｇｐ１６０は小胞体（ＥＲ）からゴルジ体に輸送され、フューリン・ファミリーの細胞プロテアーゼによってその成熟形態へと切断される。切断されたＥｎｖ三量体は宿主受容体に結合してウイルス侵入を媒介し、該三量体は体液性免疫応答の主要標的である。機能的Ｅｎｖはヘテロ二量体の三量体であり、それぞれは受容体結合タンパク質ｇｐ１２０および膜貫通タンパク質ｇｐ４１を含有し、それらは非共有結合性相互作用により結合している。Ｅｎｖのこの成熟形態は準安定性である。なぜなら、それは、宿主受容体および共受容体に結合して膜融合を引き起こす際に、劇的で不可逆的なコンホメーション変化を受ける態勢になっているからである。Ｅｎｖの準安定性はまた、ｇｐ１２０の排出を引き起こすことにより、ならびに天然の、より開けた、および非天然のコンホメーションの多様な組合せ（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を生成することにより、免疫回避を促進させる。
【００２１】
Ｅｎｖの準安定性を克服し、構造研究およびワクチン研究のために安定で均一なｇｐ１４０三量体を作製する試みにおいて、種々の戦略が提示されている。例えば、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０三量体（Ｓａｎｄｅｒｓら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９（９）：ｅ１００３６１８，２０１３）の開発は高分解能構造解析を促進しており、三量体に基づくワクチン設計のための合理的根拠を提供し、他のＨＩＶ−１株へのＳＯＳＩＰ設計の拡張、および新たな安定化変異の組込み、および切断部位修飾によるフューリン依存性の排除を可能にした。しかし、望ましくないＥｎｖ形態およびミスフォールドした三量体を最少にするために、三量体の精製が重視される。ｂＮＡｂアフィニティー精製、ネガティブセレクションおよび多サイクルＳＥＣのような複雑な方法が三量体精製のために開発されている。これらは確かに工業的規模の製造に適合可能であるが、特別な配慮を要しうるであろう。三量体不純物および一般的なタンパク質製造の非効率性は、これまでのＨＩＶ−１三量体設計によっては完全には解決されていない準不安定性の根本原因に関連していると考えるのがもっともらしい。
【００２２】
本発明はワクチン免疫原としてのコンピュータ利用再設計ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ三量体分子の本発明者らの開発に部分的に依拠している。後記実施例に詳細に記載されているとおり、本発明者らはＨＩＶ−１三量体準安定性の主要原因を調べ、代替的な三量体設計を探究した。本発明者らは、ＨＲ１  Ｎ末端（残基５４８〜５６８）で観察される無秩序さが、タンパク質工学によって潜在的に最小化されうる準安定性を示すと仮定した。本発明者らは、長い中央ＨＲ１ヘリックスを融合ペプチド領域に連結するヘプタド領域１（ＨＲ１）における大部分が無秩序であるベンド（ｂｅｎｄ；曲がり）を再設計して、良好にフォールドした三量体の収率を実質的に改善させた。また、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の切断部位をＨＲ１再設計の場合の種々のリンカーで置換した。特に、本発明者らは、コンピュータを利用して再設計したＨＲ１のＮ末端領域を含有する１０個のＢＧ５０５三量体を試験した。これらの構築物は、結晶構造、ＥＭおよび抗体結合によって示されるＳＯＳＩＰ様特性を有する、実質的に、より高い三量体収率および純度を示した。ついで本発明者らは、選択されたＨＲ１再設計の場合のリンカーによるｇｐ１２０とｇｐ４１との間のフューリン切断部位の置換の構造的および抗原的影響を調べた。これらの研究は、このタンパク質分解部位の修飾に対するｇｐ１４０フォールディングの感受性を明らかにし、ＳＯＳ変異を欠く短いリンカーを含有する三量体に関して融合中間状態が観察された。これとは対照的に、未切断融合前最適化（ＵＦＯ）三量体と称される、長いリンカーを含有するＨＲ１再設計三量体は、ＳＯＳＩＰ三量体の多数の顕著な特徴に類似した天然様コンホメーションをとった。また、本発明者らは、多様なＨＩＶ−１株に関する三量体安定化における一般的ＨＲ１リンカーの有用性を実証した。本発明者らが行った更に詳細な研究は、本明細書に記載されている操作ｇｐ４１ドメインが、多数の異なるＨＩＶ−１株または亜型からのｇｐ１２０ポリペプチドとペア形成させて「キメラ」ｇｐ１４０三量体、例えば、本明細書に例示されている「ＵＦＯ−ＢＧ」または「ＵＦＯ−Ｕ」を形成させるために使用されうることを示した。総合すると、これらの研究は多様なＨＩＶ−１株からのＥｎｖ三量体の安定化のための一般的アプローチを実証した。
【００２３】
修飾ＨＲ１領域を含有するｇｐ１４０由来可溶性三量体免疫原以外に、本発明者らは更に、ナノ粒子上の三量体ＨＩＶ−１抗原の提示を、詳細な構造的および抗原的特徴と共に調べた。本発明者らは、Ｖ１Ｖ２およびｇｐ１２０のような三量体Ｅｎｖ抗原がナノ粒子の表面上に３回軸周囲の天然様コンホメーションで提示されうると仮定した。この仮説を検証するために、本発明者らは、フューリンサブユニットのＮ末端に融合したＶ１Ｖ２およびｇｐ１２０を含有する構築物を設計した。これらのキメラ抗原は、天然様三量体コンホメーションに合致して、頂点および他の鍵エピトープを標的化するｂＮＡｂに対する高いアフィニティで、ナノ粒子に集合した。ついで本発明者らは、三量体純度における実質的な改善を示した再設計ヘプタドリピート１（ＨＲ１）ベンドを含有する安定化ｇｐ１４０三量体の微粒子提示を調べた。この分析を容易にするために、本発明者らは、６６４位または６８１位のいずれかにおいてトランケート化したｇｐ４１を含有する、異なるリンカーを含有する３つのｇｐ１４０−フェリチン構築物を設計した。全てのｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子がピコモル以下のアフィニティで頂点指向性ｂＮＡｂに結合したが、ＭＰＥＲ含有ｇｐ１４０ナノ粒子もＭＰＥＲ特異的ｂＮＡｂ  ４Ｅ１０によって認識可能であった。フェリチンに加えて、本発明者らは、ｇｐ１２０およびｇｐ１４０三量体を提示させるための、大きな６０マー（６０量体）Ｅ２ｐナノ粒子の有用性をも調べた。本明細書中に実証されているとおり、２０個の良好にフォールドした三量体を担持するｇｐ１４０−Ｅ２ｐナノ粒子は効率的な粒子集合および所望の抗原性を示した。
【００２４】
これらの例示研究に従い、本発明者らは種々のＨＩＶ−１ワクチン免疫原およびそれらの臨床用途を提供する。本発明の幾つかのＨＩＶ−１ワクチン免疫原は、本明細書に開示されているとおり、ｇｐ４１におけるＨＲ１領域の修飾Ｎ末端を含有する可溶性ｇｐ１４０由来タンパク質である。本発明の幾つかのＨＩＶ−１免疫原は、ナノ粒子プラットフォーム上に提示されるＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体タンパク質を含有する。本発明のＨＩＶ−１ワクチン組成物の治療用途および予防用途も本発明において提供する。
【００２５】
本明細書中に特に示されていない限り、本発明のワクチン免疫原、コード化ポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞ならびに関連治療用途は全て、本明細書に例示されている方法または当技術分野においてよく知られた常套的に行われている方法に従い製造（作製）され、または実施されうる。例えば、以下を参照されたい：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２８９：Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９７）（ＩＳＢＮ−１３：９７８−０１２１８２１９０６）；米国特許第４，９６５，３４３号および第５，８４９，９５４号；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｂｒｅｎｔら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；またはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．ＢｅｒｇｅｒおよびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｒｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ  Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）ならびにＣｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｂｙ  Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ；５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｊｅｎｎｉｅ  Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＤａｖｉｄ  Ｂａｒｎｅｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８）。以下の節は、本発明の組成物および方法を実施するための追加的指針を記載する。
【００２６】
ＩＩ．定義
特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で用いる用語の多くの一般的定義を当業者に提供するものである：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｒｒｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９２）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｍｉｔｈら（編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，２０００）；Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉｃ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ（編），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（編），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．，２００２）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｕｎｔ（編），Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ（１ｓｔ  ｅｄ．，１９９９）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｈｌｅｒ（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ（１９９４）；Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ａｎａｎｄａｎｄ（編），Ａｎｍｏｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．（２００２）；ならびにＡ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐａｐｅｒｂａｃｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ），ＭａｒｔｉｎおよびＨｉｎｅ（編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（４ｔｈ  ｅｄ．，２０００）。本発明に具体的に適用される場合のこれらの用語の幾つかの更なる明瞭化が本明細書に記載されている。
【００２７】
本明細書中で用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を指す。例えば、「Ｅｎｖ由来三量体」は単一または複数の両方のＥｎｖ由来三量体分子を指すことが可能であり、「少なくとも１つのＥｎｖ由来三量体」なる語と同意義とみなされうる。
【００２８】
本明細書中で用いる「抗原」または「免疫原」なる語は、対象において免疫応答を誘導しうる物質、典型的にはタンパク質を意味するものとして互換的に用いられる。この用語は、（直接的に、または該タンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはベクターを対象に投与することにより）対象に投与されると、そのタンパク質に対する体液性および／または細胞性免疫応答を誘発しうるという意味で免疫学的に活性であるタンパク質をも意味する。
【００２９】
機能的に類似したアミノ酸を与える保存的アミノ酸置換は当技術分野でよく知られている。以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。タンパク質における全ての残基位置が、それ以外では「保存的」である置換を許容するわけではない。例えば、あるアミノ酸残基がタンパク質の機能に必須である場合、それ以外では保存的である置換でさえも、その活性を損ないうる。例えば、標的エピトープに対する抗体の特異的結合は該標的エピトープにおける保存的変異によって損なわれうる。
【００３０】
エピトープは抗原決定基を意味する。これらは、抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であって、特異的な免疫応答を誘発するものであり、例えば、エピトープは、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、連続的アミノ酸、またはタンパク質の三次元フォールディングにより並置される不連続的アミノ酸の両方から形成されうる。
【００３１】
ワクチンまたは他の物質の有効量は、所望の応答を生成させるのに十分な量、例えば、エイズのような病態または疾患の徴候または症状を軽減または排除するのに十分な量である。例えば、これは、ウイルス複製を抑制するのに、またはウイルス感染の表立った症状、例えば、ＨＩＶ−１感染の場合のＴ細胞数の増加を測定可能な様態で変化させるのに必要な量でありうる。一般に、この量は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の複製または感染性を測定可能な様態で抑制するのに十分なものである。対象に投与する場合、ウイルス複製のインビトロ抑制を達成することが示されている標的組織濃度（例えば、リンパ球におけるもの）を与える投与量が一般に使用される。幾つかの例においては、「有効量」は、例えばＨＩＶを治療するために、障害または疾患のいずれかの１以上の症状および／または根本原因を治療する（予防を含む）ものである。一例においては、有効量は治療的有効量である。一例においては、有効量は、特定の疾患または状態の徴候または症状の１以上、例えば、エイズに関連した徴候または症状の１以上の発生を予防する量である。
【００３２】
フェリチンは、全ての動物、細菌および植物において見出される球状タンパク質である。これは主として、水和鉄イオンおよびプロトンをミネラル化コアから及びミネラル化コアへ輸送することにより多核Ｆｅ（ＩＩＩ）２Ｏ３形成の速度および位置を制御するように作用する。球状形態のフェリチンは、約１７〜２０ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである単量体サブユニットタンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも称される）から構成される。
【００３３】
本明細書中で用いる融合タンパク質は、単一タンパク質を形成するようにペプチド結合により連結された、少なくとも２つの無関係なタンパク質からのアミノ酸配列を含有する組換えタンパク質である。無関係なアミノ酸配列は互いに直接連結されることが可能であり、あるいはそれらは、リンカー配列を使用して連結されうる。本明細書中で用いるタンパク質が無関係であると言えるのは、それらのアミノ酸配列が、通常、それらの天然環境（例えば、細胞内）においてペプチド結合により互いに連結された状態では見出されない場合である。例えば、フェリチンを構成する単量体サブユニットのアミノ酸配列、およびＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはｇｐ４１糖タンパク質のアミノ酸配列は、通常、ペプチド結合により互いに連結された状態では見いだされない。
【００３４】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）は、最初は、８４５〜８７０アミノ酸の、より長い前駆体タンパク質（ｇｐ１６０と称される）として合成される。ｇｐ１６０はホモ三量体を形成し、ゴルジ装置内でグリコシル化を受ける。インビボにおいて、ｇｐ１６０糖タンパク質はエンドタンパク質分解によって成熟エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１へとプロセシングされ、これらは該ウイルスの表面上で複合体として非共有結合によって互いに結合する。ｇｐ１２０表面タンパク質は、ＨＩＶの主要受容体であるヒトＣＤ４に対する、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のような融合補助受容体と相互作用するドメインに対する高アフィニティ結合部位を含有する。ｇｐ４１タンパク質はウイルス膜にわたって広がり、そのアミノ末端に、ウイルス膜と細胞膜との融合に重要なアミノ酸配列を含有する。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質複合体の天然融合許容形態は、３つのｇｐ１２０サブユニットおよび３つのｇｐ４１サブユニットから構成される三量体構造である。受容体結合（ＣＤ４および補助受容体）部位はｇｐ１２０部分に位置し、一方、融合ペプチドはｇｐ４１成分に位置する。野生型ｇｐ１６０ポリペプチドの典型的配列は、ＧｅｎＢａｎｋに、例えばアクセッション番号ＡＡＢ０５６０４およびＡＡＤ１２１４２として示されている。
【００３５】
ｇｐ１４０は、ｇｐ１２０および全ｇｐ４１外部ドメインの全てを含有する、ＨＩＶエンベロープタンパク質のオリゴマー形態を意味する。
【００３６】
ｇｐ１２０はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエンベロープタンパク質である。ｇｐ１２０はＨＩＶエンベロープ糖タンパク質複合体の外部表面露出ドメインの大部分を含有し、細胞ＣＤ４受容体および細胞ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ５）の両方に結合するのはｇｐ１２０である。成熟ｇｐ１２０野生型ポリペプチドは一次配列内に約５００個のアミノ酸を有する。Ｇｐ１２０は高度にＮ−グリコシル化されていて、１２０ｋＤの見掛け分子量を有する。該ポリペプチドは５つの保存領域（Ｃ１〜０５）および５つの高可変性領域（Ｖ１〜Ｖ５）から構成される。ｇｐ１２０糖タンパク質は、その三次構造において、３つの主要構造ドメイン（外部ドメイン、内部ドメインおよび架橋シート）および可変ループを含む。例えば、Ｗｙａｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，７０５−７１１，１９９８およびＫｗｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６４９−５９，１９９８を参照されたい。内部ドメインはｇｐ４１エンベロープ糖タンパク質と相互作用すると考えられており、一方、外部ドメインは、集合したエンベロープ糖タンパク質三量体上に露出している。
【００３７】
ｇｐ１２０の可変領域１および可変領域２（Ｖ１／Ｖ２ドメイン）は、ＨＩＶ−１の最も可変性の部分のうちの２つ（Ｖ１ループおよびＶ２ループ）を含有する約５０〜９０残基を含み、Ｖ１／Ｖ２ドメインの１０残基のうちの１つはＮ−グリコシル化されている。
【００３８】
ｇｐ４１は前駆体ＨＩＶエンベロープタンパク質のタンパク質分解産物である。それはＮ末端融合ペプチド（ＦＰ）、膜貫通ドメイン、および該融合ペプチドと膜貫通ドメインとを連結する外部ドメインを含む。ｇｐ４１は三量体立体配置のままであり、非共有結合的にｇｐ１２０と相互作用する。典型的なｇｐ４１のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＣＡＤ２０９７５として記載されている。
【００３９】
ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０は、クレードＡ株ＢＧ５０５由来のｇｐ１４０三量体を使用して開発されたＨＩＶ−１  Ｅｎｖ免疫原である。それは、切断されたｇｐ１２０とｇｐ４１ＥＣＴＯとの間に、操作されたジスルフィド結合（ＳＯＳと呼ばれる）による共有結合を含有する。また、それは、ｇｐ４１融合後コンホメーションを不安定化させるためのＩ５５９Ｐ変異（ＩＰと称される）、そしてまた、可溶性を改善するための残基６６４における膜近位外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＭＰＥＲ）のトランケート化を有する。このＨＩＶ−１免疫原は顕著な抗原プロファイルおよび天然スパイクの優れた構造擬態を示す。選別プローブとしてＳＯＳＩＰ三量体を使用して、新規ｂＮＡｂを特定し、特徴づけした。ＳＯＳＩＰの設計は他のＨＩＶ−１株にも拡張されており、追加的な安定化変異の組込みを可能にしている。最近、ウサギおよび非ヒト霊長類におけるＳＯＳＩＰ三量体の免疫原性が報告され、ヒトのワクチン試験のための道が開かれた。
【００４０】
ＨＸＢ２の番号付け系は、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２株配列を他の全てのＨＩＶ株配列に関する基準として使用する、ＨＩＶタンパク質および核酸配列の参照番号付け系である。ＨＸＢ２番号付け系は当業者によく知られており、この系は、“Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＨＩＶ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＨＸＢ２ＣＧ”，Ｂｅｔｔｅ  Ｋｏｒｂｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９８：Ａ  Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｋｏｒｂｅｒ  Ｂ，Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃ  Ｌ，Ｆｏｌｅｙ  Ｂ，Ｈａｈｎ  Ｂ，ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  Ｆ，Ｍｅｌｌｏｒｓ  Ｊ  ＷおよびＳｏｄｒｏｓｋｉ  Ｊ編，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎ．Ｍｅｘに記載されている。
【００４１】
免疫原は、哺乳動物、例えば、病原体に感染した又は病原体による感染のリスクを有する哺乳動物において免疫応答を誘導しうるタンパク質またはその一部である。免疫原の投与は、関心のある病原体に対する防御免疫および／または予防免疫をもたらしうる。
【００４２】
免疫原性表面は、免疫応答を惹起しうる分子、例えばｇｐ１２０のようなタンパク質の表面である。免疫原性表面は、その表面の特徴的特性、例えば三次元形状および表面電荷を含む。幾つかの例においては、免疫原性表面は、タンパク質と抗体とが互いに結合する場合に抗体（例えば、中和抗体）と接触するタンパク質またはペプチドの表面上のアミノ酸によって定められる。標的エピトープは免疫原性表面を含む。免疫原性表面は抗原表面と同義である。
【００４３】
免疫応答は、免疫系の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞または単球の、刺激に対する応答を意味する。幾つかの実施形態においては、該応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。幾つかの実施形態においては、免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えばＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答である。幾つかの他の実施形態においては、該応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。
【００４４】
免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導する、または免疫原性ポリペプチドに対する測定可能なＢ細胞応答（例えば、抗体の産生）を誘導する免疫原性ポリペプチドを含む組成物を意味する。
【００４５】
２以上の核酸配列または２以上のアミノ酸配列間の配列同一性または類似性はそれらの配列間の同一性または類似性として表される。配列同一性は同一性の割合（％）として測定可能であり、その割合が高ければ高いほど、それらの配列の同一性はより高い。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を用いてアライメント（整列）された場合、比較的高い度合の配列同一性／類似性を有する。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野においてよく知られている。種々のプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，１５５−６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０は配列アライメント方法およびホモロジー計算の詳細な考察を記載している。
【００４６】
回転対称性（回転対称）は、生物学的状況においては放射相称としても公知であり、ある量の回転の後に同じに見える物体の特性を意味する。物体は、例えば反射およびそれを回転させることが考慮されない場合には、複数の回転対称性を有しうる。回転対称度は、異なる側面または頂点において同じに見えるために形状が回転されることを要する角度である。それは、同じ側面または頂点であってはならない。特定の点（二次元において）または軸（三次元において；例えば、本明細書に記載されている３回軸）に関するｎ次の回転対称（ｎ回回転対称またはｎ次の離散回転対称とも称される）は、３６０°／ｎ（１８０°、１２０°、９０°、７２°、６０°、５１  ３／７°など）の角度の回転が物体を変化させないことを意味する。
【００４７】
バクテリオファージＱβ（本明細書においてはＱβまたはＱとして示されている）は、２５ｎｍの直径を有する二十面体ウイルスである。その宿主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。ＱβはＦ線毛の側面からその宿主細胞に侵入する。Ｑβのゲノムは４２１７ヌクレオチド長である。該ゲノムは３つのオープンリーディングフレームを有し、４つのタンパク質、すなわち、Ａ１、Ａ２、ＣＰおよびｑβレプリカーゼをコードしている。例えば、ｖａｎ  Ｄｕｉｎら，“Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｐｈａｇｅｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ  １５”．Ｉｎ  Ｃａｌｅｎｄａｒ，Ｒ．Ｌ．Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，２００６）．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．１７５−１９６を参照されたい。Ｑβのゲノムは高度に構造化されており、これは遺伝子発現を調節し、宿主のＲＮアーゼからゲノムを保護する。
【００４８】
「対象」なる語は、哺乳動物、例えばヒト、および非ヒト哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。非ヒト動物の例には、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどが含まれる。特に示されていない限り、「患者」または「対象」なる語は本明細書においては互換的に用いられる。好ましくは、対象はヒトである。
【００４９】
「治療」または「緩和」は、疾患（例えば、ＨＩＶ感染）の症状、合併症または生化学的兆候の発生開始を予防し又は遅延させるために対象に化合物または物質を投与すること、症状を緩和すること、あるいは疾患、状態または障害の更なる進行を阻止または抑制することを含む。治療を要する対象は、疾患または障害に既に罹患している対象、および障害を発生するリスクを有する対象を含む。治療は（疾患の発生開始を予防し又は遅延させるための、あるいはその臨床的または亜臨床的症状の発現を予防するための）予防的抑制、または疾患の発現の後の症状の治療的抑制もしくは緩和でありうる。
【００５０】
ワクチンは、対象において予防的または治療的免疫応答を惹起する医薬組成物を意味する。幾つかの場合には、免疫応答は防御免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体の抗原、例えばウイルス病原体、または病理学的状態と相関する細胞成分に対する抗原特異的免疫応答を惹起する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（例えば、開示されている抗原をコードする核酸）、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、開示されている抗原）、ウイルス、細胞または１以上の細胞成分を含みうる。
【００５１】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、幾つかのウイルスのいずれかに由来する非複製性ウイルス殻を意味する。ＶＬＰは、一般に、１以上のウイルスタンパク質、例えば、カプシド、コート（外被）、殻、表面および／またはエンベロープタンパク質と称されるタンパク質（これらに限定されるものではない）、あるいはこれらのタンパク質に由来する粒子形成性ポリペプチドから構成される。ＶＬＰは適切な発現系におけるタンパク質の組換え発現に際して自発的に生成しうる。特定のＶＬＰの製造方法は当技術分野で公知である。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、当技術分野で公知の通常の技術、例えば電子顕微鏡法、生物物理学的特徴づけなどを用いて検出されうる。例えばＢａｋｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０：１４４５−１４５６；およびＨａｇｅｎｓｅｅら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４５０３−４５０５を参照されたい。例えば、ＶＬＰは密度勾配遠心分離により単離可能であり、および／または特徴的密度バンディングにより特定可能である。あるいは、極低温電子顕微鏡法が、問題のＶＬＰ調製物のガラス化水性サンプルに対して実施可能であり、適切な曝露条件下でイメージが記録されうる。
【００５２】
ＩＩＩ．再設計ＨＲ１領域を含有する修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質および免疫原
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖは膜貫通糖タンパク質（ｇｐ４１）と表面糖タンパク質（ｇｐ１２０）とのヘテロ二量体である。これらの二量体はウイルス膜の表面上の三量体として構成されている。本発明のＨＩＶ−１三量体免疫原は、ｇｐ４１におけるヘプタド領域１（ＨＲ１）の再設計Ｎ末端（残基５４８〜５６８）を有するｇｐ４１由来ポリペプチドとｇｐ１２０由来のポリペプチドとを含有するｇｐ１４０関連タンパク質から形成される。該ｇｐ１４０関連タンパク質は、本明細書に記載されている適切な三量体構造（例えば、天然様三量体コンフォメーション）を維持すべきである。ｇｐ１２０由来ポリペプチドとｇｐ４１由来のポリペプチドとは天然ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０タンパク質の場合のように非共有結合することが可能であり、または本明細書に記載されているリンカー配列を介して共有結合することが可能である。十分に特徴づけされたｇｐ１２０糖タンパク質はコアおよび幾つかの可変ループまたはドメイン（例えば、Ｖ１Ｖ２ドメインおよびＶ３ドメイン）を含有する。種々のｇｐ１２０由来ポリペプチドが本発明の実施において使用されうる。ｇｐ１２０由来ポリペプチドは野生型ｇｐ１２０糖タンパク質の全長配列を含有する必要はない。したがって、ｇｐ１２０由来ポリペプチドは、例えば、天然ｇｐ１２０タンパク質、ｇｐ１２０糖タンパク質のＶ１Ｖ２ドメイン、ｇｐ１２０コア（すなわち、内部ドメインおよび外部ドメイン）、およびｇｐ１２０コアの外部ドメインのみでありうる。幾つかの実施形態においては、使用されるｇｐ１２０由来ポリペプチドはそのｇｐ４１相互作用領域および抗原エピトープ（例えば、外部ドメイン）を含む。
【００５３】
典型的には、ｇｐ１４０由来ポリペプチドは、十分に特徴づけされたＨＩＶ  ｂｎＡｂ（例えば、ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨ０３、ＰＧＤＭ１４００、ＶＲＣ０１、４Ｅ１０および１０Ｅ８）の１以上により認識される天然エピトープ（例えば、「ＨＩＶ−１脆弱性部位」または「広範中和エピトープ」）を含有し、露出しているすべきである。例えば、ＰＧ９は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＶ１／Ｖ２ドメインに特異的に結合し、標的細胞のＨＩＶ−１感染を予防する広範中和性モノクローナル抗体である（例えば、Ｗａｌｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，４７７：４６６−４７０，２０１１；およびＷＯ／２０１０／１０７９３９を参照されたい）。また、保存的アミノ酸置換を含有する配列、または本明細書に例示されているｇｐ１４０由来ポリペプチドと実質的に同一である配列も、本発明において使用されうる。種々の実施形態においては、本発明のワクチン免疫原は、よく知られたＨＩＶ−１  ｂｎＡｂ（例えば、ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨ０３、ＰＧＤＭ１４００、ＶＲＣ０１，４Ｅ１０および１０Ｅ８）の１以上（例えば、２、３、４、５つ以上）に特異的に結合するそれらの抗原性によって更に特徴づけられる。そのような抗原性は、当技術分野で常套的に実施されている方法、例えば、オクテット測定（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）によって容易に評価されうる。例えば、Ｆｅｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１１：１０２７５−１０２８０，２０１４；およびＭｃＧｕｉｒｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８：２６４５−２６５７，２０１４を参照されたい。
【００５４】
ｇｐ１２０由来ポリペプチド以外に、本発明のＨＩＶ−１三量体免疫原を製造するためのｇｐ１４０関連タンパク質は、ヘプタド領域１（ＨＲ１）の再設計Ｎ末端（残基５４８〜５６８）を有するｇｐ４１由来ポリペプチドをも含有する。幾つかの実施形態においては、本発明の操作ｇｐ１４０免疫原におけるｇｐ１２０およびｇｐ４１ポリペプチドは、同じＨＩＶ−１株または亜型に由来する。幾つかの実施形態においては、ｇｐ１４０タンパク質におけるｇｐ１２０およびｇｐ１２０ポリペプチドは、異なるＨＩＶ−１株または亜型に由来する。例えば、本明細書に例示されているとおり、ＢＧ５０５株由来の修飾ｇｐ４１またはＨＩＶ−１配列データベース由来の汎用ｇｐ４１ドメインは、種々の他のＨＩＶ株または亜型に由来するｇｐ１２０と組合されて、異なるキメラｇｐ１４０三量体免疫原を形成しうる。本発明の操作ｇｐ１４０免疫原における修飾ｇｐ４１由来ポリペプチドは、典型的には、本明細書に記載されているＮ末端修飾を除いて、天然ｇｐ４１タンパク質のＨＲ１領域を含有する。ＨＲ１領域は宿主細胞とのウイルス融合中に劇的なコンホメーション変化を受ける。好ましくは、ｇｐ４１由来ポリペプチドは、膜貫通領域がトランケート化された可溶性ポリペプチド、例えば、外部ドメイン（ｇｐ４１ＥＣＴＯ）を含有するポリペプチド、または融合ペプチドと外部ドメインとを含むポリペプチドである。種々の実施形態においては、ｇｐ４１由来ポリペプチドのＨＲ１の２１残基のＮ末端（残基５４８〜５６８）は、融合前ｇｐ１４０構造を安定化させるために、より短いループ配列で置換される。該ループ配列は約６〜約１４個のアミノ酸残基を含有しうる。本発明のＨＩＶ−１三量体免疫原に適した特定のループ配列は、適切な機能（例えば、ｇｐ１４０の融合前コンホメーションを安定化させるもの）を保証する合理的設計により得られうる。例えば、ＨＲ１  Ｎ末端を置換する、より短いループ配列は、本明細書に例示されている、アンサンブルに基づくデノボタンパク質設計方法により設計されうる。本明細書中の実施例に詳細に記載されているとおり、コンピュータによる方法に基づくＨＲ１再設計のほぼ全てが三量体の収率および純度に関する実質的な改善を示した。
【００５５】
幾つかの実施形態においては、ＨＲ１  Ｎ末端を置換する挿入ループ配列は１０アミノ酸残基を含有する。そのようなループ配列の具体例を配列番号１〜５に示す。幾つかの他の実施形態においては、該置換ループ配列は８アミノ酸残基を含有する。そのようなループ配列の例を配列番号６〜１５に示す。更に幾つかの他の実施形態においては、ＨＲ１  Ｎ末端を置換するループ配列は約６、７、９、１１、１２、１３または１４アミノ酸残基を含有しうる。そのようなループ配列は、８残基および１０残基ループ配列に関して本明細書に例示されているのと同じ合理的再設計法を適用することによって容易に得られうる。幾つかの他の実施形態においては、ＧＳ（（ＧＳ）ｎ；配列番号２３）の２〜７個の縦列反復を含有する一般的ループ配列がＨＲ１  Ｎ末端の再設計において使用されうる。本明細書に示されているとおり（例えば、図２ａ）、一般的ループ配列（ＧＳ）４（配列番号２４）は種々のＨＩＶ−１株由来の修飾ｇｐ１４０免疫原の構築に有効であることが示された。
【００５６】
本発明のＨＩＶ−１三量体免疫原を形成させるための幾つかのｇｐ１４０由来タンパク質は、ＨＲ１  Ｎ末端修飾に加えて、非切断性ｇｐ１４０タンパク質を作製するために、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間のプロテアーゼ切断部位がリンカー配列で置換されている。本明細書に例示されているとおり、本発明のｇｐ１４０由来タンパク質免疫原において種々の切断部位リンカーが使用されうる。種々の実施形態においては、該リンカーは種々の長さの種々のアミノ酸残基を含有しうる。幾つかの実施形態においては、４残基切断部位（すなわち、残基５０８〜５１１）がリンカー配列で置換される。例えば、該切断部位は、ＳＧＳモチーフの縦列反復の１以上を含有するリンカーで置換されうる。あるいは、該切断部位は（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２２）のリンカーで置換されうる。幾つかの他の実施形態においては、より長い切断部位含有領域（例えば、残基５０１〜５１８）がリンカー配列で置換される。これらの実施形態の幾つかにおいては、リンカーは８アミノ酸残基配列を含有する。ｇｐ１４０由来タンパク質における切断部位を置換する幾つかの特定のリンカー配列を配列番号１６〜２０に示す。本明細書に例示されているとおり、本発明のｇｐ１４０免疫原における切断部位リンカー配列と再設計ＨＲ１  Ｎ末端との組合せは三量体の収率および純度における更なる改善をもたらす。
【００５７】
幾つかの実施形態においては、ｇｐ１２０とｇｐ４１との結合は、Ｅｎｖ、ＳＯＳ  ｇｐ１４０の可溶性形態を得るための適切に配置された分子間ジスルフィド結合の導入によって安定化されうる。そのような安定化天然Ｅｎｖ複合体は、三量体ｇｐ１２０−ｇｐ４１複合体が免疫系に提示される時間を延長させるであろう。第１および第２可変（Ｖ１およびＶ２）ループを欠失させ、ｇｐ４１の約５５９位のＮ末端ヘプタド反復領域にアミノ酸置換を導入することによっても、ＳＯＳ  ｇｐ１４０におけるｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用は安定化されうる（例えば、ＷＯ  ０３／０２２８６９を参照されたい）。１つのそのような修飾ｇｐ１４０タンパク質はＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０であり、これはＩ５５９Ｐ置換を含有する。ＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０は、適切にフォールディングされタンパク質分解的に切断される実質的に三量体であり、適切な受容体結合および抗原特性を有する。ｇｐ１４０または他のＥｎｖ由来三量体の安定性および免疫原性は、本明細書に記載されている三量体提示形態によって更に増強されうる。
【００５８】
幾つかの実施形態においては、修飾ｇｐ１４０関連タンパク質は更に、残基３３２に修飾グリカン部位を含みうる（Ｔ３３２Ｎ）。幾つかの他の実施形態においては、再設計ＨＲ１  Ｎ末端を含有する修飾ｇｐ１４０タンパク質は、切断部位に導入された他の変異または改変をも有し、例えば、ＲＥＫＲ（配列番号２５）がＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）で置換されている。種々の実施形態においては、修飾ｇｐ１４０タンパク質のＣ末端は残基６６４または６８１（ＨＸＢ２命名法による）のいずれかへとトランケート化されて、当技術分野で公知の「ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．ｇｐ１４０．６６４」および「ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．ｇｐ１４０．６８１」のような２つのｇｐ１４０形態をもたらしうる。また、本発明のＨＩＶ−１免疫原は種々のＨＩＶ−１クレードまたは株（例えば、株ＢＧ５０５（クレードＡ）、ＪＲＦＬ（クレードＢ）ＣＡＰ４５（クレードＣ）、ＺＭ１０９（クレードＣ）、ＤＵ１７２．１７（クレードＣ）およびＣＨ１１５．１２（クレードＢ’／Ｃ））からの種々のｇｐ１４０由来タンパク質を使用しうる。ＨＩＶ−１は、４つの群、すなわち、「主要」群Ｍ、「アウトライヤー」群Ｏ、群Ｎおよび群Ｐに分類されうる。群Ｍには、遺伝的に異なる幾つかのＨＩＶ−１クレード（または亜型）が存在する。本発明のためのｇｐ１４０三量体は、ＨＩＶの任意の亜型、例えば、群Ｍ、Ｎ、ＯもしくはＰ、またはクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＪもしくはＫなどに由来しうる。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする配列、ならびにそのような核酸配列の操作およびベクター内への挿入のための方法は公知である（例えば、ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）；ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ  ｅｄ．，２０００）；およびＢｒｅｎｔら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（ｒｉｎｇｂｏｕ編，２００３）を参照されたい）。更に、同様の１型融合メカニズムを用いるほとんどの包膜ウイルス、例えばインフルエンザウイルス、エボラおよび呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）にはＨＲ１型領域が存在する。本発明のＨＩＶ−１  ｇｐ１４０免疫原を作製するための方法は、その他の包膜ウイルスに関するワクチン免疫原を設計し製造する際にＥｎｖスパイクを安定化させるためにも用いられうる。
【００５９】
後記に詳細に記載されているとおり、ｇｐ１４０由来タンパク質は種々の手段により提示プラットフォーム（例えば、ナノ粒子またはＶＬＰ）にコンジュゲート化されうる。好ましくは、コンジュゲート化は、共有結合、例えばタンパク質融合または挿入により達成される。幾つかの好ましい実施形態においては、タンパク質配列は、リンカー配列を介して提示プラットフォーム配列と融合される。本発明の種々の免疫原においては、安定性または抗原性を改善するために、ｇｐ１４０由来三量体または結合相手に対して他の修飾も施されうる。
【００６０】
本発明で使用される種々のｇｐ１４０由来タンパク質は、本明細書に例示されている方法または当技術分野でよく知られた方法により入手または製造されうる。組換え発現（例えば、本明細書に詳細に記載されているＨＥＫ２９３Ｆ細胞におけるもの）に際して、該タンパク質は、常套的に実施されている方法のいずれかにより精製されうる。例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０；およびＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２を参照されたい。実質的な精製は他のタンパク質または細胞成分からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質は少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の純度を有する。また、一旦精製されたら、ｇｐ１４０由来タンパク質から形成されたｇｐ１４０三量体免疫原の抗原性および他の特性は、標準的な方法、例えば、公知ｂＮＡｂおよび非Ｎａｂを使用する抗原プロファイリング、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡおよびバイオレイヤー（Ｂｉｏｌａｙｅｒ）光干渉法（ＢＬＩ）による結合分析、ならびに本明細書に例示されている共結晶学的分析によって容易に試験されうる。
【００６１】
ＩＶ．スキャフォールドＨＩＶ−１三量体免疫原組成物
前記の可溶性ｇｐ１４０ベース三量体免疫原以外に、本発明は、三量体Ｅｎｖ由来タンパク質を提示する又は組込む異種スキャフォールドを含有するＨＩＶ−１免疫原をも提供する。幾つかの実施形態においては、該異種スキャフォールドはナノ粒子またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。本発明のワクチン組成物を製造する際には、種々のナノ粒子プラットフォームが使用されうる。一般に、本発明で使用されるナノ粒子は単一サブユニットの複数コピーにより形成される必要がある。追加的または代替的に、粒子サブユニットのアミノ末端は露出されており、３回軸に近接している必要があり、３つのアミノ末端の間隔は種々のＨＩＶ−１三量体成分のカルボキシオール末端の間隔と厳密に一致している必要がある。幾つかの好ましい実施形態においては、免疫原は、約２０ｎｍ以下の直径（通常は１２、２４または６０個のサブユニットから構成される）および粒子表面上の３回軸を有する自己集合性ナノ粒子を含む。そのようなナノ粒子は、多価ＨＩＶ−１三量体ワクチンを製造するための適切な粒子プラットフォームを提供する。
【００６２】
幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１三量体提示ナノ粒子は、天然に存在するナノ粒子、例えば、表面上に３回軸を有するフェリチンイオンケージである。それらはＨＩＶ−１エンベロープ複合体（Ｅｎｖ）の三量体成分の複数コピーの提示を可能にし、一連の多価三量体ワクチン候補を可能にする。一例としては、そのようなナノ粒子の１つはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）由来のフェリチンナノ粒子である。フェリチンは、全ての動物、細菌および植物において見出される球状タンパク質である。その主要機能は、水和鉄イオンおよびプロトンをミネラル化コアに又はミネラル化コアから輸送することにより多核Ｆｅ（ＩＩＩ）２Ｏ３形成の速度および位置を制御することである。球状形態のフェリチンは単量体サブユニットタンパク質（単量体フェリチンサブユニットとも称される）から構成され、これは、約１７〜２０ｋＤａの分子量を有するポリペプチドである。
【００６３】
本発明において使用される単量体フェリチンサブユニットはフェリチンタンパク質の全長単一ポリペプチドまたはその任意の部分であり、これは単量体フェリチンサブユニットの自己集合を該タンパク質の球状形態へと向けさせうる。単量体フェリチンサブユニットが、表面上にＨＩＶ−１エピトープを提示するナノ粒子へと自己集合しうる限り、本発明の融合タンパク質を製造するために、任意の公知フェリチンタンパク質の単量体フェリチンサブユニットからのアミノ酸配列が使用されうる。本発明は、フェリチンに加えて、類似分子特性を有する多数の他の自己集合性ナノ粒子を使用しうる。これらには、例えば、１ＪＩＧ（バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来の１２量体Ｄｌｐ−２）、１ＵＶＨ（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）由来の１２量体ＤＰＳ）、２ＹＧＤ（２４量体眼レンズシャペロンαＢ−クリスタリン）、３ＣＳ０（２４量体ＤｅｇＰ２４）、３ＭＨ６および３ＭＨ７（２４量体ＨｔｒＡプロテアーゼ）、３ＰＶ２（１２量体ＨｔｒＡホモログＤｅｇＱ  ＷＴ）、４Ａ８Ｃ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の１２量体ＤｅｇＱ）、４Ａ９Ｇ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の２４量体ＤｅｇＱ）、４ＥＶＥ（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）株ＹＳ２９由来の１２量体ＨＰ−ＮＡＰ）および４ＧＱＵ（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の２４量体ＨｉｓＢ）を含有する分子が含まれる。
【００６４】
幾つかの実施形態においては、ＨＩＶ−１三量体免疫原提示ナノ粒子は、耐熱性６０量体ナノ粒子、例えば、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ（Ｅ２ｐ）である。幾つかの実施形態においては、使用されるナノ粒子はアクイフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）由来のルマジンシンターゼ（ＬＳ）でありうる。Ｅ２ｐは、２３．２ｎｍの直径と、粒子表面上の３回転軸頂点（ｔｈｒｅｅｆｏｌｄ  ｖｅｒｔｉｃｅｓ）を分離する１２個の大きな開口とを有する中空十二面体である。１４．８ｎｍの直径を有するＬＳは、Ｔ  １／４  １正二十面体対称性を有するカプシドに配置された６０個のサブユニットの集合体である。本明細書に例示されているとおり、これらのナノ粒子（例えば、Ｅ２ｐ）上に提示される三量体免疫原は、ＤＣによる直接的取り込みのための最適サイズおよびｂＮＡｂによる認識の増強を含む、優れた構造的および機能的特性を有する。
【００６５】
任意のＥｎｖ由来ＨＩＶ−１三量体タンパク質がナノ粒子提示ワクチン組成物において使用されうる。幾つかの実施形態においては、ナノ粒子は、天然三量体形態の、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖに基づく糖タンパク質またはドメイン、例えば、本明細書（例えば、表２を参照されたい）に例示されているｇｐ１４０、ｇｐ１２０またはＶ１Ｖ２ドメインを提示する。幾つかの実施形態においては、ナノ粒子は、修飾ｇｐ１４０三量体免疫原、例えば、本明細書に記載されているＨＲ１修飾ｇｐ１４０三量体を提示する。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの受容体結合タンパク質として、ｇｐ１２０はワクチン免疫原として広範に研究されているが、天然スパイク内に埋もれている非中和面の露出ゆえに、準最適であると現在では考えられている。本明細書中で実証されているとおり、フェリチンおよびＥ２ｐナノ粒子との全長ｇｐ１２０の提示はｇｐ４１の非存在下で天然様三量体コンホメーションを回復させうる。ＳＯＳＩＰ様抗原性、ならびに粒子サイズおよび表面間隔の変動により、これらのナノ粒子は、ｇｐ１２０に基づくＨＩＶ−１ワクチンを研究するための汎用プラットフォームを提供する。
【００６６】
また、Ｅｎｖ由来三量体タンパク質は種々のＨＩＶ−１株から得られうる。幾つかの実施形態においては、Ｅｎｖ由来三量体はＨＩＶ−１株ＢＧ５０５由来である。例示として、ＨＩＶ−１株ＺＭ１０９およびＣＡＰ４５の三量体タンパク質を使用して、Ｖ１Ｖ２−フェリチンナノ粒子を製造した。ｇｐ１４０三量体、ｇｐ１２０末端を安定化させるための追加的ジスルフィド結合を有する全長ｇｐ１２０および種々の長さのｇｐ１２０分子を提示するナノ粒子（Ｅ２ｐまたはフェリチン）も本明細書に例示されている。これらの例示は、本明細書に記載されている一般的ナノ粒子構造および設計の戦略が、他のＨＩＶ−１株に基づく多価ＨＩＶ−１ワクチン候補を作製するために適用されうることを示している。
【００６７】
種々の実施形態においては、これらのＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来免疫原のいずれかを提示するナノ粒子は、三量体免疫原をナノ粒子のサブユニット（例えば、Ｅ２ｐまたはフェリチンサブユニット）に融合させることにより構築されうる。これらのナノ粒子に基づくＨＩＶ−１免疫原の抗原性および構造的完全性は、標準的なアッセイ、例えば、抗体結合アッセイおよびネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によって容易に分析されうる。本明細書に例示されているとおり、種々の融合分子が全て、Ｅｎｖ由来三量体（例えば、ｇｐ１４０）の免疫原性エピトープを提示するナノ粒子へと自己集合しうる。頑強な三量体特異的ｂｎＡｂを誘導することにより、これらのナノ粒子は、広範なＨＩＶ−１ウイルスに対して個体をワクチン接種するのに有用である。
【００６８】
幾つかの実施形態においては、三量体Ｅｎｖ由来タンパク質、例えば、本明細書に記載されているｇｐ１４０由来三量体タンパク質を提示または組込む異種スキャフォールドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えば、本明細書に例示されているバクテリオファージＱβ  ＶＬＰであり、あるいは、ＶＬＰと同じ分子的および幾何学的特性を有する自己集合性ナノ粒子である。一般に、本発明において使用されるＶＬＰは、以下の基準の少なくとも１つ、好ましくは全てを満たす必要がある：（１）ＶＬＰは単一サブユニットの複数コピーにより形成される必要がある；（２）ＶＬＰは、表面上に提示される３回軸を有する必要がある；および（３）各ＶＬＰサブユニットのＮ末端は露出しており、３回軸に近接している必要があり、３つのＮ末端の間隔はＨＩＶ−１三量体抗原のＣ末端の間隔に合致していて、ＨＩＶ−１抗原はＶＬＰサブユニットのＮ末端に融合可能である。あるいは、３回軸は、ＶＬＰサブユニットにそれぞれが由来する３つの表面ループにより包囲されており、ここで、ＨＩＶ−１抗原はサブユニット鎖内に挿入されうる。
【００６９】
種々の実施形態においては、本発明の、ＶＬＰに基づくＨＩＶ−１免疫原は、Ｂ細胞活性化に十分である５〜１０ｎｍの間隔で隔てられた少なくとも２０〜２５個のエピトープを有しうる。幾つかの実施形態においては、ＶＬＰは３０〜４０ｎｍの直径および表面上の３回軸を有し、これらは、多価ＨＩＶ−１三量体ワクチンを開発するための理想的プラットフォームを提供する。幾つかの実施形態においては、ＶＬＰに基づくＨＩＶ−１免疫原は、正二十面体ウイルスカプシドに関する注釈付きデータベースＶＩＰＥＲｄｂ（ｈｔｔｐ：／／ｖｉｐｅｒｄｂ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／）のバイオインフォマティクス分析により本発明者らにより特定されたＶＬＰのいずれかを使用しうる。これらは、３．５オングストロームの結晶構造を有するバクテリオファージＱ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＱＢＥ）、３．５オングストロームの結晶構造を有するフロックハウスウイルス（ＦＨＶ）カプシド（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＦＳＪ）、３．２５オングストロームの結晶構造を有するオルセーウィルスカプシド（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＮＷＶ）（ＰＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）におけるもの）、および３．０オングストロームの結晶構造を有するＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＪＨ５）（これは６０量体ＶＬＰ様集合体を形成する）を含む。幾つかの好ましい実施形態においては、バクテリオファージＱはその最適構造的特徴ゆえに使用される。本発明に適した追加的ＶＬＰは、これらの例示されたＶＬＰのいずれかに関して特定されているものに類似した粒子集合体およびサブユニット構造のバイオインフォマティクス検索によって容易に特定されうる。例えば、バクテリオファージＭＳ２（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＷＢＨ）およびＰ２２（２ＸＹＹおよび２ＸＹＺ）は、抗原提示ＶＬＰワクチンプラットフォームを設計するために使用されている。これらの２つのバクテリオファージＶＬＰは、本発明の多価ＨＩＶ−１ワクチン免疫原を構築するためにも使用されうる。
【００７０】
本発明の多価スキャフォールドＨＩＶ−１三量体免疫原は、本明細書に記載されている方法（例えば、実施例９〜１３）に従い構築されうる。ＨＩＶ−１三量体免疫原を提示する種々のナノ粒子が本明細書に例示されている。これらには、フェリチン上に提示されるＶ１Ｖ２三量体（配列番号２９〜３１）、フェリチン上に提示されるｇｐ１２０三量体（配列番号３２〜３４）、Ｅ２ｐまたはＬＳにより提示されるｇｐ１２０三量体（配列番号３５〜３６）、フェリチンナノ粒子上に提示されるｇｐ１４０三量体（配列番号３７〜３９）、およびＬＳまたはＥ２ｐナノ粒子上に提示されるｇｐ１４０三量体免疫原（配列番号４０〜４１）を含む。一般に、ＨＩＶ−１三量体免疫原を提示するＶＬＰを構築するために、該三量体配列はＶＬＰ配列に（例えば、ＶＬＰのＮ末端において）融合され、またはＶＬＰ配列内に挿入されうる。幾つかの実施形態においては、ＶＬＰは、そのＮ末端において、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体、例えばＨＩＶ−１  Ｖ１Ｖ２、ｇｐ１２０に融合され、前記のＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０三量体の２つの形態はＶＬＰ上に提示されうる。幾つかの他の実施形態においては、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ由来三量体はＶＬＰ内に挿入される。これらの実施形態においては、ＨＩＶ−１三量体は、Ｖ１Ｖ２ドメインまたはｇｐ１２０タンパク質でありうる。ｇｐ１４０のＮ末端およびＣ末端は遠いため、このＥｎｖ由来三量体はＶＬＰ内への挿入には適していない。本明細書に例示されているとおり、ＨＩＶ−１  Ｖ１Ｖ２、ｇｐ１２０、およびＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０の２つの形態をＱサブユニットに融合させること、Ｖ１Ｖ２をＦＨＶおよびオルセー（Ｏｒｓａｙ）サブユニットの表面ループ内に挿入すること、ならびにＶ１Ｖ２およびｇｐ１２０をＢＡＦＦの表面ループ内に挿入することにより、一連のＶＬＰ構築物を作製した。後記実施例に詳細に記載されているとおり、抗体結合アッセイおよびネガティブ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）を用いて、全てのＱベースＶＬＰに関して、抗原性およびＶＬＰ集合を確認した。また、ＦＨＶ、オルセーおよびＢＡＦＦに基づくＶＬＰに関しても、抗原性を確認した。
【００７１】
Ｖ．医薬組成物および治療用途
本発明は、ＨＩＶ−１感染を予防および治療するための、本明細書に記載されているＨＩＶ−１免疫原（例えば、可溶性ｇｐ１４０由来タンパク質、またはＥｎｖ由来三量体を提示するナノ粒子）を使用する医薬組成物および関連方法を提供する。幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されている免疫原は医薬組成物中に含まれる。該医薬組成物は治療用製剤または予防用製剤のいずれかでありうる。典型的には、該組成物は更に、１以上の医薬上許容されるビヒクル、そして所望により、他の治療成分（例えば、抗生物質または抗ウイルス薬）を含む。種々の医薬上許容される添加物も該組成物において使用されうる。
【００７２】
本発明の医薬組成物の幾つかはワクチンである。ワクチン組成物においては、適切なアジュバントが追加的に配合されうる。適切なアジュバントの例には、例えば、水酸化アルミニウム、レシチン、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）およびＩＬ−１２が含まれる。幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているＨＩＶ−１免疫原は制御放出（コントロールリリース）または徐放性製剤として製剤化されうる。これは、徐放性ポリマーを含有する組成物において、またはマイクロカプセル化送達系もしくは生体接着性ゲルにより達成されうる。種々の医薬組成物は、当技術分野でよく知られた標準的な方法に従い製造されうる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５；Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８）；米国特許第４，６５２，４４１号および第４，９１７，８９３号；米国特許第４，６７７，１９１号および第４，７２８，７２１号；ならびに米国特許第４，６７５，１８９号を参照されたい。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、対象においてＨＩＶ−１感染を治療するために又はＨＩＶ−１に対する免疫応答を惹起するために、種々の治療用途または予防用途において容易に使用されうる。例えば、該組成物は、免疫応答を誘導するために、例えば、ＨＩＶ−１に対する広範中和性抗体の産生を誘導するため、対象に投与されうる。ＨＩＶ感染の発生のリスクを有する対象には、本発明のワクチン組成物を投与して、ウイルス感染に対する予防的防御をもたらすことが可能である。具体的な対象および状態に応じて、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の種々の投与方法により、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内または非経口経路により投与されうる。一般に、医薬組成物は、選択された疾患もしくは状態またはその１以上の症状を予防、抑制および／または改善するのに十分な時間にわたり、およびそれらのために十分な条件下で、そのような治療を要する対象に投与される。免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１に対する免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。治療用途には、該組成物は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１免疫原の治療的有効量を含有すべきである。予防用途には、該組成物は、本明細書に記載されているＨＩＶ−１免疫原の予防的有効量を含有すべきである。該免疫原の適切な量は、治療または予防される具体的な疾患または状態、重症度、対象の年齢、および具体的な対象の他の個人的属性（例えば、対象の健康の全般的状態および対象の免疫系の頑健性）に基づいて決定されうる。有効投与量の決定は更に、動物モデル研究、およびそれに続く、ヒトでの臨床試験により導かれ、標的疾患症状または状態の発生頻度または重症度を有意に低減する投与プロトコールにより導かれる。
【００７４】
予防用途には、免疫原性組成物は、いずれかの症状に先立って、例えば、感染に先立って投与される。免疫原性組成物の予防投与は、いずれかの後の感染を予防または改善するのに役立つ。したがって、幾つかの実施形態においては、治療される対象は、例えばＨＩＶに対する曝露または曝露の可能性ゆえに、ＨＩＶ感染を有する者またはＨＩＶ感染の発生リスクを有する者である。開示されている治療用組成物の治療的有効量の投与の後、対象は、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−１感染に関連する症状またはその両方に関してモニターされうる。
【００７５】
治療用途には、免疫原性組成物は、疾患または感染の発生開始時または発生開始後、例えばＨＩＶ−１感染の症状の発生の後またはＨＩＶ−１感染の診断の後に投与される。したがって、免疫原性組成物は、感染および／または関連疾患症状の予想される重症度、持続時間または度合を低減するために、ＨＩＶウイルスへの予想される暴露の前に、またはウイルスへの曝露の後もしくは該曝露が疑われた後、または感染の実際の開始の後に投与されうる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、ＨＩＶ感染を治療または予防するための当技術分野で公知の他の物質と組合されうる。これらには、例えば抗体、または他の抗ウイルス剤、例えばヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばアボカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）、ＡＺＴ、ジダノシン（ｄｉｄａｎｏｓｉｎｅ）、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、ジドブジン（ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）など、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、例えばデラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）、エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）、ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）、プロテアーゼインヒビター、例えばアンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、アタザナビル（ａｔａｚａｎａｖｉｒ）、インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）、ロピナビル（ｌｏｐｉｎａｖｉｒ）、ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ）、オサムプレナビル（ｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ）、サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ）、チプラナビル（ｔｉｐｒａｎａｖｉｒ）など、および融合タンパク質インヒビター、例えばエフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）などが含まれる。該医薬組成物および該公知抗ＨＩＶ剤の投与は同時または連続的でありうる。
【００７７】
本発明のＨＩＶ−１ワクチン免疫原または医薬組成物はキットの成分として提供されうる。所望により、そのようなキットは、追加的成分、例えばパッケージング、説明、ならびに種々の他の試薬、例えばバッファー、基質、抗体またはリガンド、例えば対照抗体もしくはリガンド、および検出試薬を含みうる。所望により含まれうる説明書が更に、キットにおいて提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１はＨＲ１  Ｎ末端および切断部位のコンピュータ利用（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ）再設計を例示する。（ａ）ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４三量体（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＴＶＰ）の原子モデルおよび分子表面。１つのｇｐ１４０プロトマー内のｇｐ１２０およびｇｐ４１ＥＣＴＯの２つの領域（残基５１８−５４７および５６９−６６４）がそれぞれ青色、オレンジ色および赤色で着色されている。ＨＲ１  Ｎ末端（残基５４８〜５６８）および切断部位含有領域（残基５０５〜５１８）を包囲するｇｐ１４０構造の拡大図が右側に示されており、ここで、構造間隙が黒色点線により連結されている。（ｂ）ＨＲ１再設計の概要図。（ｃ）ＨＲ１領域（残基５４８〜５６８）の、アンサンブルに基づくデノボタンパク質設計のためのコンピュータ利用手順。ねじれ空間（ｔｏｒｓｉｏｎ  ｓｐａｃｅ）における局所的バックボーンサンプリング（工程１）および配列構造空間における悉皆的探索（工程２）の後、設計配列＃１〜５（それぞれ配列番号１１〜１５）をエネルギーによりランク付けし、ついで、実験的検証のために候補体の手動選択を行う。
【図２】図２は、Ｅｎｖ三量体を安定化させるための一般的なＨＲ１ループ配列（リンカー）（ＧＳ）４（配列番号２４）の設計および検証を示す。（ａ）一般的なＨＲ１リンカー（ＨＲ１−Ｇ）の設計の概要図。（ｂ）クレードＡ  ＢＧ５０５（左上）、クレードＢ  ＪＲＦＬ（右上）、クレードＣ  ＤＵ１７２．１７（中；アンサンブルに基づくデノボタンパク質設計から得られた２つのＨＲ１再設計が右側に含まれている）、およびＢ’／Ｃ組換え株ＣＨ１１５．１２（下；ＣＳＦ−ＳＯＳが右側に含まれている）に関する、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラムからのＳＯＳＩＰおよびＨＲ１−Ｇ三量体のＳＥＣプロファイル。三量体ピークのＵＶ値、ならびに（１０．５ｍＬにおける）三量体ピークに対する（９ｍＬにおける）凝集ピークおよび（１２ｍＬにおける）二量体／単量体ピークに関するＵＶ値の比が表示されている。
【図３】図３は、８および１０残基のループ長を有するＨＲ１領域の、アンサンブルに基づくタンパク質設計を示す。（ａ）８残基（左）および１０残基（右）のＨＲ１ループのコンホメーションアンサンブルが緑色で着色されており、ｇｐ１４０プロトマー内のｇｐ１２０および２つのｇｐ４１ＥＣＴＯ領域（５１８〜５４７および５６９〜６６４）がそれぞれ青色、オレンジ色および赤色で着色されている。（ｂ）８残基（上パネル）および１０残基（下パネル）再設計ＨＲ１ループのＣα二乗平均平方根（ＲＭＳ）変動。（ｃ）８残基（左）および１０残基（右）再設計ＨＲ１ループに関して決定されたＲＡＰＤＦスコアとＣα二乗平均平方根（ＲＭＳ）変動との間の相関性。（ｄ）残基Ｇ５４７とＴ５６９との間の８残基ＨＲ１再設計に関して手動で選択された５つの最高ランクの配列（左；それぞれ配列番号６〜１０）および１０残基ＨＲ１再設計に関して手動で選択された５つの最高ランクの配列（右；それぞれ配列番号１〜５）。ループ配列により置換される残基５４８〜５６８（配列番号２８）を含む、Ｎ末端（配列番号２７）を含むＨＲ１配列が、これらの最高ランクのループ配列の上に示されている。コンピュータ利用設計に付されたＷＴ  ＳＯＳＩＰ．６６４における領域。
【図４】図４は、切断部位含有領域（５００〜５１９）の、アンサンブルに基づくタンパク質設計、および最高の５つの設計の生化学的特徴づけを示す。（ａ）Ｒ５００およびＦ５１９を連結する８残基ループのコンホメーションアンサンブル（左）、８残基ループのＣα  ＲＭＳＦ分布（右上）、ならびにＲＡＰＤＦスコアとＣα  ＲＭＳＦとの間の相関性（右下）。（ｂ）５つの最高ランクの８残基ＣＳＴ設計（それぞれ配列番号１６〜２０）が切断部位含有配列（配列番号２１）の下に示されている。コンピュータ利用設計に付されたＷＴ  ＳＯＳＩＰ．６６４における領域が黄色で強調表示されている。（ｃ）２９３  Ｆにおいて発現され、ＧＮＬ精製された５つの切断部位トランケート化（ＣＳＴ）ＢＧ５０５構築物（ＣＳＴ１〜５）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム上のＳＥＣの後のもの）。各三量体構築物に関して、ＳＥＣ画分の範囲が表示されている。ＣＳＴ１に関しては、三量体、二量体、単量体および未知のＥｎｖ形態がＢＮゲル上に表示されている。
【００７９】
実施例
以下の実施例は本発明を例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【００８０】
実施例１：ＨＲ１領域に関する、アンサンブルに基づくタンパク質設計
本発明者らは、ＨＲ１のＮ末端（残基５４８〜５６８）がＨＩＶ−１三量体の準安定性の重要な決定因子であると仮定した。なぜなら、それは融合中に伸長する態勢にあり、ＳＯＳＩＰ三量体の報告されている構造の１つを除く全てにおいて無秩序（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）であるからであり、この場合、それは、周囲の領域と比較して尚も無秩序であるようである（図１ａ）。長いＨＲ１中央へリックスの最上部の無秩序さは幾分か予想外である。なぜなら、この領域はＥｎｖ複合体のコアに存在するからである。しかし、この領域は、インフルエンザヘマグルチニンおよび他の１型ウイルス融合タンパク質の同等領域の場合と同様に（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８９，１９８１）、リフォールドし、融合後形態においてはヘリックスになり、したがって、融合前形態においては、より無秩序であり、または少なくとも、完全に異なるコンホメーションを取ると予想される。ＳＯＳＩＰ設計においては、操作されたジスルフィド結合（Ａ５０１Ｃ／Ｔ６０５Ｃ）に加えて、Ｉ５５９Ｐ変異が、融合後状態を不安定化させるために導入され、高品質Ｅｎｖタンパク質の製造に決定的に重要であった。このことは、このＨＲ１領域がＥｎｖの準安定性に関連しうるという見解を強く支持している。
【００８１】
この研究においては、ＨＲ１ベンド（ｂｅｎｄ；曲がり）を、ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４三量体（図１ｂ）のように、融合後コンホメーションを単に不安定化させるのではなく、融合前コンホメーションを安定化させるための合理的再設計に付した。この野生型（ＷＴ）ＨＲ１領域は２１残基からなるが、Ｇ５４７とＴ５６９との間のＣα距離は僅か２４．８オングストロームであり、これは僅か６．３個の残基の完全伸長ポリペプチドバックボーンに相当する。ここでは、本発明者らは、ＷＴ  ＨＲ１ループを劇的に短縮させる一方で低い柔軟性の度合を考慮して、ＨＲ１再設計のために２つのループ長（８および１０アミノ酸）を検討することにした。本発明者らは、融合前三量体構造を安定化させうる配列を特定するために、アンサンブルに基づくタンパク質設計（「方法」を参照されたい）を用いた（図１ｃ）。特定のループ長を仮定して、Ｇ５４７とＴ５６９との間の間隙を架橋するために、バックボーンコンホメーションの、大きなアンサンブルを作製した（図３ａ）。８残基ループでは、Ｃα二乗平均平方根変動（ｒｏｏｔ−ｍｅａｎ−ｓｑｕａｒｅ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ）（ＲＭＳＦ）は１．３〜５．７オングストロームの範囲（平均２．３オングストローム）であり、一方、１０残基ループでは、３．６オングストロームの平均ＣαＲＭＳＦで、より大きな立体配座（コンホメーション）空間がサンプリングされた（図３ｂ）。配列空間における悉皆的サンプリングの後、全ての設計をそれらのエネルギースコアによってランク付けした（図３ｃ）。各ループ長に関する５つの最高ランクの配列（合計１０個）を実験的検証へと進めた（図３ｄ）。
【００８２】
実施例２  ＨＲ１再設計の生化学的および生物物理学的特徴づけ
ＳＯＳＩＰ、ｓｃ−ｇｐ１４０およびＮＦＬ三量体に関して示されているとおり、生化学的および生物物理学的特性は三量体設計の初期評価をもたらす。同様の戦略に従い、本発明者らは、ＳＯＳＩＰ．６６４三量体（Ｉ５５９Ｐ以外）と同じＴ３３２Ｎ（Ｎ３３２エピトープを回復させるためのもの）、ＳＯＳ（Ａ５０１Ｃ／Ｔ６０５Ｃ）およびＲ６変異を含有する１０個のＨＲ１再設計ＢＧ５０５三量体を評価した。前記のとおり、種々の精製プロトコールが種々の品質の三量体を産生しうる。ここでは、本発明者らは、ほとんどの研究者に容易に入手可能であり工業的状況で大規模化されうる材料を利用する、やや単純なプロトコルを採用し、既に記載されているとおりに（Ｓａｎｄｅｒｓら，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．９，ｅ１００３６１８，２０１３）、コトランスフェクトされたフューリンを含有するＨＥＫ２９３Ｆ細胞において、全ての構築物を一過性に発現させた。ガランツス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン（ＧＮＬ）カラムを使用し、ついでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム上で単一ＳＥＣを使用して、分泌したＥｎｖタンパク質を精製した。１リットルの発現は、ＳＯＳＩＰ三量体に関する３つの別の２リットルの発現と比較して、十分な量（３〜７ｍｇ）のＨＲ１再設計三量体を産生した。ＧＮＬ精製は最も純粋な三量体を産生しないが、それは、種々の三量体構築物に関する基本特性の比較（例えば、単量体／二量体、およびより高度な精製方法によって濾別される、より高次の多量体種）を可能にする。
【００８３】
本発明者らは、紫外線２８０ｎｍ吸収値（ＵＶ）を利用する単純な測定に基づいて、ＳＥＣプロファイルを比較した。三量体ピークのＵＶ値を三量体収量の指標として用い、凝集体および二量体／単量体のピークを、それらのＵＶ値と三量体ピークのＵＶ値との比として測定した。前記の２リットルのＳＯＳＩＰ発現は、三量体ピークに関しては、３７１の平均ＵＶ値を示し、凝集体および二量体／単量体のピークに関しては、それぞれ３１％および４９％の平均比率を示した。前記の５つの８残基ＨＲ１再設計（それぞれ、ＨＲ１再設計１〜５と称される）は、ＳＥＣプロファイルにおける凝集体および二量体／単量体のピークを減少させ、三量体収量を有意に増加させた。全体として、ＨＲ１再設計１および２がこの群における最良の作用体であるようであった。例えば、ＨＲ１再設計２は、ＳＯＳＩＰと比較して凝集物および二量体／単量体ピークに関するＵＶ値における１６％および２２％の減少を示し、三量体ピークのＵＶ値における２倍近い増加を示し、これは三量体の収率および純度の両方の改善を示している。前記の５つの１０残基ＨＲ１再設計（それぞれ、ＨＲ１再設計６〜１０と称される）は類似傾向を示したが、それほど顕著な改善は示さなかった。それでも、ＨＲ１再設計１０は、２リットルの発現からのＳＯＳＩＰ三量体と同等の、三量体ピークに関するＵＶ値を示し、ＨＲ１再設計１および２と同じ低いレベルの、望ましくないＥｎｖ種を示した。この知見は、より濃縮した三量体バンドをゲル上に示したブルーネイティブ（ｂｌｕｅ  ｎａｔｉｖｅ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）分析と合致した。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による熱安定性の初期評価では、三量体含有画分は１０．２５〜１０．７５ｍＬで溶出した。試験した１０個全てのＨＲ１再設計に関して、ＤＳＣプロファイルは６５．７〜６９．２℃の熱変性中点（Ｔｍ）を有する類似したアンフォールディングピークを示し、これは、ＳＯＳＩＰ三量体に関して報告されている６８．１℃のＴｍに酷似している。
【００８４】
総合すると、このＨＲ１領域の短縮化および再設計は、産生されるＥｎｖタンパク質の組成に対して正の効果を及ぼした。ＨＲ１の再設計は、三量体の収率を増加させ他のＥｎｖ種を減少させることに加えて、親ＳＯＳＩＰ．６６４三量体の熱安定性を維持した。このことは、このＨＲ１連結ループ領域が、望ましくないＥｎｖ種の発現および存在に関するＨＩＶ−１三量体の準安定性の中心的な決定因子であるという見解を支持している。
【００８５】
実施例３  ２つの代表的なＨＲ１再設計の結晶解析
ＨＲ１再設計１および９を結晶解析のために選択した。これらの２つの構築物は再設計ループ長において異なる（８アミノ酸と１０アミノ酸）だけでなく、それらのＳＥＣプロファイルにおいても顕著に異なっており、再設計９はより多量の二量体を示し、これにより、ＨＲ１のトランケート化および設計変動がｇｐ１４０三量体構造にどのように影響を及ぼすかを調べるための機会がもたらされる。結晶化のためのサンプルの均質性の厳密な要件ゆえに、本発明者らは、Ｋｏｎｇら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ−Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．７１，２０９９−２１０８，２０１５に既に記載されているとおりに、ＨＲ１再設計およびＷＴ  ＳＯＳＩＰ三量体を調製した。簡潔に説明すると、全ての三量体をＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ陰性（ＧｎＴＩ−／−）ＨＥＫ２９３Ｓ細胞内で産生させ、２Ｇ１２アフィニティカラムおよびそれに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００カラム上のＳＥＣを用いて精製した。ＷＴ  ＳＯＳＩＰ三量体に関しては、ＳＥＣプロファイルは、三量体ピークの５８％であるＵＶ値、および単量体ｇｐ１４０を含有する、より低いピークを伴う、高分子量の顕著な凝集物ピークを示した。これとは対照的に、２Ｇ１２精製ＨＲ１再設計は三量体の収率および純度における顕著な改善を示した。特に注目すべきことに、ＨＲ１再設計１はほぼ検出不可能なレベルのｇｐ１４０単量体を示したが、ＨＲ１再設計９は少量の単量体を尚も含有していた。それでも、２９３  Ｓで発現され２Ｇ１２で精製された三量体のＳＥＣプロファイルは、前記の、２９３  Ｆで発現されＧＮＬで精製された三量体のものに合致している。この知見は更に、ＢＮ−ＰＡＧＥ、およびＤＳＣにより測定された該修飾三量体の熱安定性によって確認された。このことは、改善された三量体特性がＨＲ１再設計の本質的特徴であり、発現および精製系には無関係であることを示唆している。
【００８６】
ＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）での共結晶化は、８残基および１０残基のＨＲ１再設計三量体に関して、それぞれ６．９および６．３オングストロームの分解能で、複合構造を示した（表１）。全体として、該再設計三量体は、この中程度の分解能（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で、ＳＯＳＩＰ三量体とほぼ同一の構造を示し、０．２５オングストローム未満のＣα平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を示した。したがって、該結果は、短縮化され再設計されたＨＲ１を含有するｇｐ１４０三量体が尚もＳＯＳＩＰ様融合前構造をとることを証明した。分解能により制限されたため、本発明者らは、再設計ＨＲ１ループのおおよそのバックボーンコンホメーションを決定することしかできなかったが、それは、これらの２つの異なる設計が融合前三量体をどのように安定化させるのかを示唆した。本発明者らは、該短縮化ループ長（２１アミノ酸と比較した場合の８または１０アミノ酸）および再設計配列がヘプタドモチーフを破壊し、融合前形態を安定化させると推測した。更に、両方のＨＲ１再設計は８残基ループの２位および６位ならびに１０残基ループの８位にプロリンを含有していたが、これらがバックボーンの剛性を増強した可能性がある。注目すべきことに、ＨＲ１再設計９におけるＡｓｐ６は隣接ＨＲ１ヘリックスのＡｒｇ５７９と塩橋を形成して、わずかにターンしたループを安定化させる態勢にある。結論として、ｇｐ１４０は、全体の構造的完全性を犠牲にすることなくタンパク質産生効率を大幅に高めるＨＲ１再設計に非常に耐えるようである。
【００８７】
実施例４：ＨＲ１再設計ＢＧ５０５  ｇｐ１４０三量体の抗原プロファイリング
ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４三量体は抗体による免疫認識における天然スパイクの近似を表す。ここでは、本発明者らは、バイオレイヤー（ｂｉｏ−ｌａｙｅｒ）干渉法（ＢＬＩ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を使用して、ＨＲ１再設計がｂＮＡｂへのＥｎｖ三量体の結合に影響を及ぼす又は非ＮＡｂへの結合に影響を及ぼすかどうかを調べることに努めた。ここでもまた、種々の三量体構築物の基本特性がより容易に比較可能となるよう、単純なＧＮＬ精製を用いて調製された三量体を調べた。抗原プロファイリングのための、良好にフォールドした三量体の選択を容易にするために、ＧＮＬ精製後のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００カラムから得られたＳＥＣ画分のＢＮ−ＰＡＧＥを行った。この場合、ネガティブ染色ＥＭにより、ＨＲ１再設計を特徴づけした。リガンド未結合状態においては、２２オングストロームの再構築は、同じプロトコールを用いて調製されたＳＯＳＩＰ三量体のものに酷似した形態を示した。結晶構造およびＥＭ構造の合致は抗原の特徴づけの前のＨＲ１再設計三量体の完全性を更に証明した。
【００８８】
まず、代表的なｂＮＡｂのパネルへの三量体結合を測定した。付随グリカンシールドを有する三量体構造が天然様であるかどうかを調べるために、Ｖ１Ｖ２頂点指向性四次（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）ｂＮＡｂ  ＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１４５およびＰＧ１６を使用した。ＰＧＤ４００の場合、ＨＲ１再設計１および９は、７〜１１ｎＭの同等のＫＤ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）で、ＷＴ  ＳＯＳＩＰより速いオンおよびオフ速度を示した。ＰＧ１６およびＰＧＴ１４５に関しても同様のパターンが観察された。ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）指向性ｂＮＡｂのクラスの代表であるＶＲＣ０１に関しては、３つ全ての三量体がほぼ同一の結合プロファイルを示し、このことは、ＨＲ１再設計が脆弱性のこの保存部位の提示にほとんど影響を及ぼさなかったことを示唆している。ＶＲＣ０１とは異なる接近角度でＣＤ４に結合するＮＡｂ  ｂ１２に関しても同様のパターンが見られた。Ｖ３ステムおよび周囲のグリカン（ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２８およびＰＧＴ１３５）および高マンノースｇｐ１２０グリカンクラスター（２Ｇ１２）を標的とするｂＮＡｂに関しては、３つの全ての三量体が同一の結合プロファイルを示し、このことは、これらのグリカンエピトープがＨＲ１再設計後にも無傷のままであったことを示している。最後に、本発明者らは、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の両方の領域にまたがるコンホメーションエピトープを認識する２つのｂＮＡｂへの三量体結合を測定した。３つの三量体は全て、ＰＧＴ１５１に強く結合し、速いオン速度および平らな解離曲線を示し、３５Ｏ２２結合動態において微妙な差異が観察された。
【００８９】
次に、代表的な非ＮＡｂのパネルへの三量体結合を測定した。３つの試験された三量体は全て、ＣＤ４ｂｓ特異的ＭＡｂであるｂ６およびＦ１０５に結合した。ＨＲ１再設計三量体は、ＳＯＳＩＰ三量体より弱い、Ｆ１０５への結合を示し、ＨＲ１再設計１に関しては、僅かに速いオフ速度が検出された。しかし、ｂ６に関しては、動力学における差異は観察されなかった。２つのＶ３特異的ＭＡｂである１９ｂおよび４４７−５２Ｄに関しては、３つの三量体は全て、速い会合および遅い解離を示し、これらは、２Ｇ１２精製ＳＯＳＩＰ三量体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により確認された幾らかのＶ３露出を示すものであった。これまでに、１９ｂはＳＯＳＩＰ三量体に結合することがＥＬＩＳＡによって判明していたが、ＥＭによっては限られた度合でしか検出されなかった。それでも、Ｖ３露出は、ＳＯＳＩＰ三量体に関して最近示されたようなコンホメーション固定によって最小化されうる。ついで、本発明者らは、ｇｐ４１ＥＣＴＯのクラスターＩにおける免疫優性エピトープを標的とする２つのＭＡｂであるＦ２４０および７Ｂ２を試験した。ＳＯＳＩＰ三量体は低レベルで両方のＭＡｂに結合するようであり、Ｆ２４０に対する若干の優先性を示した。興味深いことに、それらの２つのＨＲ１再設計はＦ２４０への結合の減少および７Ｂ２へのほとんど無視できる結合を示し、このことは、より閉鎖性の又はより低い柔軟性のｇｐ４１ＥＣＴＯを示している。本発明者らはまた、２つのＣＤ４ｉ  ＭＡｂである１７ｂおよびＡ３２の結合を調べた。３つの三量体は全て、ｓＣＤ４の非存在下、１７ｂへの結合を示さず、ＨＲ１再設計１は最小レベルのＡ３２認識しか示さなかった。尤も、全ての三量体はこのＭＡｂには弱く結合した。
【００９０】
総合すると、それらの２つのＨＲ１再設計は、頂点指向性四次ｂＮＡｂに関する動力学の変化を除いて、ｂＮＡｂによるそれらの認識において、広く類似したパターンを示した。３つの三量体は全て、幾らかのＶ３露出を示したが、それらの２つのＨＲ１再設計は非中和性ｇｐ４１ＥＣＴＯエピトープをより有効に遮蔽するようであった。非ＮＡｂへの観察された結合は、Ｆａｂの代わりにＩｇＧを使用したこと、およびＢＬＩ実験における異なる固定化法に起因すると考えられうる。
【００９１】
実施例５  短いリンカーによるフューリン切断部位の置換
Ｓｈａｒｍａらは最近、ＮＦＬと称される天然様の切断非依存的ｇｐ１４０三量体を報告した（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１１，５３９−５５０，２０１５）。別の研究において、Ｇｅｏｒｇｉｅｖらは、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の切断部位を２０残基までのリンカーで置換した（ｓｃ−ｇｐ１４０と称される；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９，５３１８−５３２９，２０１５）。短いリンカーを有するｓｃ−ｇｐ１４０三量体に関しては、異常な構造の存在が推測されたが、ｇｐ１４０のフォールディングおよび構造に対する切断部位修飾の厳密な効果は依然として不明であった。ここでは、本発明者らは、構造および抗原性の両方で既に検証されたＨＲ１再設計１において、この決定的に重要な問題を検討した（図２および図３）。
【００９２】
本発明者らはまず、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の再設計連結ループで切断部位含有領域（残基５００〜５１９）を置換する結果を調べた。Ｒ５００とＦ５１９との間のＣα距離は１６．８オングストロームであり、これは４．４残基の完全伸長バックボーンに相当する。アンサンブルに基づくタンパク質設計は、Ｒ５００とＦ５１９とを連結する８残基ループの大きなプールを与えた（図４ａ）。注目すべきことに、この設計戦略はかなり積極的なものであった。というのも、Ａ５０１は、今や、再設計に付された領域の一部であったため（Ｔ６０５Ｃ変異は元に戻った）、これらのループは、この領域における１０残基のトランケート化およびＳＯＳ変異の除外ゆえに、未切断ＷＴ配列とは異なった様態でパックしうるからである。ＨＲ１再設計と同様に、フューリンの非存在下のＨＥＫ２９３  Ｆ細胞における一過性発現の後のＳＥＣおよびそれに続くＧＮＬ精製により、５つの最高ランクの設計（ＣＳＴ１〜５と称される；図４ｂ）を特徴づけした。総合すると、ＣＳＴ１〜５は、親ＨＲ１再設計と比較して減少した三量体収率および増加した凝集体を示した（これらは、ＳＥＣプロファイルにおける主要三量体ピークの左の、より高い肩状部分により示された）。５つ全てのＣＳＴ再設計に関して、ＢＮ−ＰＡＧＥ分析において、余分なバンドが観察された。これは産生タンパク質における特徴づけされていないＥｎｖ種の存在を示唆している（図４ｃ）。
【００９３】
次に、完全長に近いＳＧＳリンカー（ＣＳＦと称される）で切断部位（５０８ＲＥＫＲ５１１）を置換する効果を調べた。興味深いことに、ＣＳＦは、ＳＥＣプロファイルにおいて、ＣＳＴ１〜５と比較して顕著に減少した凝集ピークを示した。これは、ＳＯＳ変異（ＣＳＦ−ＳＯＳと称される）を再び加えることによって更に改善された。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００カラム上のＳＥＣの後の三量体含有画分のＢＮ−ＰＡＧＥ分析におけるＣＳＦ三量体に関して、ＣＳＴ１〜５と同様に、余分なバンドが観察された。これは、短い切断部位リンカーに関連する共通のパターンを示唆した。この未知Ｅｎｖ種を特定するために、ネガティブ染色ＥＭを用いてＣＳＦ三量体の３Ｄ再構築体を得た。顕著なことに、リガンド未結合三量体に関して、２つの異なる形態が観察された。１つは、ＳＯＳＩＰ三量体に類似した融合前状態（２０オングストローム）のものであり、もう１つは、これまでに報告されていない非融合前状態（１７オングストローム）におけるものである。この非融合前三量体コンホメーションは、伸長したｇｐ４１（約４０〜４５オングストローム）を含有し、本明細書では以後、「融合中間体」と称される。それらの２つの異なる状態におけるＰＧＶ０４結合ＣＳＦ三量体の約２０オングストロームのＥＭ再構築体は、この分解能では解釈できない幾つかの非占有密度を示した。これとは対照的に、リガンド未結合形態（２１オングストローム）およびＰＧＶ０４結合形態（２０オングストローム）の両方において、ＣＳＦ−ＳＯＳ三量体のＥＭ再構築体に関して、単一のコンホメーションが観察された。要約すると、短い切断部位リンカーでは、ＣＳＴおよびＣＳＦ三量体は、ＳＯＳ変異によって有効に抑制されうる融合中間状態を含有することを、ＥＭは示唆した。
【００９４】
次に、ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂの小さなパネルへのＣＳＦおよびＣＳＦ−ＳＯＳ三量体の結合を試験した。ｂＮＡｂに関しては、それぞれＶ１Ｖ２頂点、ＣＤ４ｂｓおよびｇｐ１２０−ｇｐ４１境界を標的とするＰＧＤＭ１４００、ＶＲＣ０１およびＰＧＴ１５１を使用した。ＣＳＦおよびＣＳＦ−ＳＯＳ三量体は共に、類似した動力学的プロファイルおよびアフィニティで、ＰＧＤＭ１４００に結合した。しかし、それらの２つの混合三量体形態ゆえに、ＣＳＦは、ＣＳＦ−ＳＯＳと比較して低下した結合を示した。ＣＳＦおよびＣＳＦ−ＳＯＳは、ＳＯＳＩＰ三量体の場合に類似した同一ＶＲＣ０１結合プロファイルを示した。このことは、ＣＤ４ｂｓがこれらの三量体において同等に接近可能であることを示唆している。ＰＧＴ１５１に関しては、ＣＳＦおよびＣＳＦ−ＳＯＳは、顕著なオフ速度で、結合の低下を示した。このことは、ｇｐ１２０とｇｐ４１との間のリンカーがＰＧＴ１５１の結合に影響を及ぼしうることを示唆している。３つの非中和性ＭＡｂも試験した。ＣＳＦは、混合融合中間体ゆえに、ＣＤ４ｂｓ指向性Ｆ１０５に、ＣＳＦ−ＳＯＳより強く結合した。Ｖ３指向性１９ｂに関しては、両方のＣＳＦ三量体は、ＳＯＳＰ三量体およびＨＲ１再設計１と比較して類似した結合プロファイルを示した。これとは対照的に、ＣＳＦは、ＣＳＦ−ＳＯＳにおけるＳＯＳ変異によって有効に低減したｇｐ４１指向性Ｆ２４０への結合の増強を示した。
【００９５】
実施例６  長いリンカーでのフューリン切断部位の置換
これまでの本発明者らの分析ならびにＮＬおよびｓｃ−ｇｐ１４０三量体に関する報告に基づき、長い切断部位リンカーと組合されたＨＲ１再設計は、融合中間体を形成する傾向を克服することが可能であり、未切断融合前最適化（ＵＦＯ）三量体を与えうると仮定した。この目的のために、ＨＲ１再設計１およびＮＦＬ様リンカー（２×Ｇ４Ｓ）に基づく２つの三量体を試験した。ＣＳＬおよびＣＳＬ−ＳＯＳと称されるこれらの２つの構築物をＨＥＫ２９３  Ｆ細胞において一過性に発現させ、ついでＧＮＬ精製およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００カラム上のＳＥＣに付した。両方のＣＳＬ三量体は、ＣＳＦ三量体のものに類似したＳＥＣプロファイルを示し、妥当な収率を示した。ＣＳＬに関しては、余分なバンドはＢＮゲル上で明確には特定されなかったが、該三量体バンドは、ＣＳＬ−ＳＯＳに関して観察されたものより拡散しているようであった。それらの構造を更に特徴づけるために、それぞれ１７および２０オングストロームの分解能でリガンド未結合ＣＳＬおよびＣＳＬ−ＳＯＳ三量体のＥＭ再構築体を得た。ＣＳＬ三量体は、ＷＴ  ＳＯＳＩＰ、ＨＲ１再設計１、融合前ＣＳＦおよびＣＳＦ−ＳＯＳ三量体とは幾分異なる形態を示した。すなわち、ＣＳＬ三量体の密度は、三量体頂点の最上部において、より狭く、外側を向く追加的な密度を伴い、ｇｐ４１の周囲に、より広い底部を有するようであった。ＣＳＬ−ＳＯＳ三量体の全体的な形状はＣＳＦ−ＳＯＳ三量体のものに合致した。ＰＧＶ０４結合ＣＳＬおよびＣＳＬ−ＳＯＳ三量体の約２０オングストロームの再構築体はＳＯＳＩＰ三量体のものに類似しており、これはｂＮＡｂ結合の際の安定化を示している。総合すると、ＥＭによって示唆されるとおり、長い切断部位リンカーは、おそらく、より大きなコンホメーション変動性という代償を伴って、融合中間体の形成を低減しうる。
【００９６】
前記の２つのＨＲ１再設計の場合と同じｂＮＡｂｓおよび非ＮＡｂｓのパネルを使用して、ＣＳＬおよびＣＳＬ−ＳＯＳ三量体に関して抗原プロファイリングを行った。頂点指向性ｂＮＡｂであるＰＧＤＭ１４００、ＰＧ１６およびＰＧＤＭ１４５に関しては、２つのＣＳＬ三量体は、ＨＲ１再設計１の場合に類似した結合動力学およびＫＤ値を示した。ＣＤ４ｂｓ指向性ｂＮＡｂ（ＶＲＣ０１）、ＮＡｂ  ｂ１２およびグリカン反応性ｂＮＡｂ（ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２８、ＰＧＴ１３５および２Ｇ１２）に関しては、それらの２つのＣＳＬ三量体はＨＲ１再設計１およびＳＯＳＩＰ三量体とほぼ同じ結合プロファイルを示した。予想通り、ｂＮＡｂ  ＰＧＴ１５１および３５Ｏ２２に関して、最も明らかな差異が見出された。三量体における１つのｇｐ１２０および２つの隣接ｇｐ４１からなるエピトープに結合するＰＧＴ１５１に関しては、切断されたＨＲ１再設計三量体およびＳＯＳＩＰ三量体は平坦な解離曲線を示した。しかし、ＣＳＬ三量体は、ＣＳＦ三量体に関して観察されたものに類似した、より速いオフ速度を示した。このことは、切断部位リンカーにより引き起こされた一貫した効果を示している。これとは対照的に、単一ｇｐ１４０プロトマーにおけるｇｐ１２０およびｇｐ４１に結合する３５Ｏ２２に関しては、オフ速度は切断に依存しないようであった。ＭＡｂ  Ｆ２４０および７Ｂ２は、ＣＳＬ−ＳＯＳに関しては、ｇｐ４１上の、接近しにくい非中和性エピトープを示したが、ＣＳＬに関してはそうではなかった。これはそれらの２つのＣＳＦ三量体に関する観察と一致している。
【００９７】
要約すると、最適なＨＲ１再設計と組合せて使用されるｇｐ１２０とｇｐ４１との間のＮＦＬ様の長いリンカーは、融合前三量体の最も望ましい特徴を保持する未切断ｇｐ１４０を与えた。また、リンカーの長さの本発明者らの詳細な分析は切断部位修飾の複雑な結果を示した。したがって、切断部位におけるリンカーの長さの変化は三量体免疫原設計における各場合において注意深く評価される必要がある。
【００９８】
実施例７  多様なＨＩＶ株のＥｎｖ三量体を安定化させるための一般的ＨＲ１再設計
切断部位連結は複雑さをもたらしうるが、ＨＲ１再設計は三量体の構造および抗原性に全体的に正の効果をもたらすようであった。この知見を考慮して、本発明者らは、単純なＧＳリンカーの有用性を調べることにより、ＨＲ１再設計戦略を再検討した（図２ａ）。そのような「一般的」ＨＲ１リンカー（ＨＲ１−Ｇと称される）は、成功することが判明すれば、Ｅｎｖの準安定性におけるこのＨＲ１領域の役割を証明するだけでなく、多様なＨＩＶ−１株のための安定な三量体の開発をも可能にする。この目的のために、本発明者らは、クレードＡ  ＢＧ５０５、クレードＢ  ＪＲＦＬ、クレードＣ  ＤＵ１７２．１７およびＢ’／Ｃ組換え株ＣＨ１１５．１２（第３層）のバックグラウンドにおいて一般的ＨＲ１リンカーを試験した。この場合、それらのＳＯＳＩＰ三量体を比較のために含めた。全ての三量体構築物をフューリンの存在下でＨＥＫ２９３  Ｆ細胞において一過性に発現させ、ついで、ＧＮＬ精製およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム上のＳＥＣに付した。調べた４つの株に関して、一般的ＨＲ１リンカーは三量体の収率および純度における一貫した改善を示した（図２ｂ）。クレードＣ株において、最も大きな改善が観察され、ＷＴ  ＳＯＳＩＰと比較して、三量体ピークの、４６％の増加が見られ、凝集体および二量体／単量体のピークはそれぞれ３４％および３７％減少した。このクレードＣ株では、アンサンブルに基づくタンパク質設計からの２つの最高ランクのＨＲ１設計は更に、三量体ピークを約５０％増加させ、一般的ＨＲ１設計と同じＳＥＣプロファイルを示した。したがって、結果は、一般的ＨＲ１リンカーがＥｎｖの安定化のための一般的フレームワークをもたらす一方で、三量体特性の更なる最適化がコンピュータ利用設計によって株特異的に達成されうることを示している。
【００９９】
実施例８  ＨＲ１再設計ＨＩＶ−１免疫原に関する幾つかの例示方法
アンサンブルに基づくデノボタンパク質設計。本発明者らは、アンサンブルに基づくデノボタンパク質設計法を開発した（図１ｃ）。三量体構造（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＴＶＰ）および特定されたループ長が与えられたとして、３工程の設計プロセスを実施した：（１）ねじれ−空間ループサンプリングアルゴリズム４８を使用して、２つのアンカー残基を連結するために、バックボーンコンフォメーションのアンサンブル（１，０００）を作製する；（２）各バックボーンに関して、ＲＡＰＤＦポテンシャル４９に基づいて５０個のランダム配列のプールから開始配列を選択し、温度が３００Ｋから１０Ｋへと直線的に減少する５００段階のモンテ・カルロ・シミュレーション・アニーリング（Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）（ＭＣＳＡ）に付した；（３）各バックボーンに関する最低エネルギー配列を記録し、プロセス完了時のエネルギーに基づいて全てのＭＣＳＡ由来設計をランク付けする。実験的検証のための５つの候補体の選択を容易にするために、最高の２０個の設計を手動で検査する。
【０１００】
抗原プロファイリングのための抗体。本発明者らは、設計された三量体の抗原性を特徴づけるために、ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂのパネルを使用した。ｂＮＡｂ  ２Ｇ１２およびｂ１２ならびにＭＡｂ  Ｆ２４０、７Ｂ２、１７ｂおよびＡ３２はＮＩＨエイズ試薬プログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ／）から要求された。他のｂＮＡｂおよび非ＮＡｂはＤ．Ｓ．およびＤ．Ｒ．Ｂにより提供された。
【０１０１】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ三量体の発現および精製。Ｅｎｖ三量体を、結晶解析の場合以外では、ＨＥＫ２９３  Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）において一過性に発現させた。簡潔に説明すると、２９３Ｆ細胞を解凍し、シェーカー（Ｓｈａｋｅｒ）インキュベーター内でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）と共に３７℃、１２０ｒｐｍおよび８％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞が２．０×１０６／ｍｌの密度に達したら、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）によるトランスフェクションのために細胞密度を１．０×１０６／ｍｌに減少させるために、発現培地を添加した。ＳＯＳＩＰおよびＨＲ１再設計三量体に関しては、２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭトランスフェクション培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）内の８００μｇのＥｎｖプラスミドおよび３００μｇのフューリンプラスミドを２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の５ｍｌのＰＥＩ−ＭＡＸ（１．０ｍｇ／ｍｌ）と混合した。一方、未切断三量体に関しては、９００μｇのＥｎｖプラスミドをフューリンの非存在下で使用した。３０分間のインキュベーション後、該ＤＮＡ−ＰＥＩ−ＭＡＸ複合体を１Ｌの２９３Ｆ細胞に加えた。培養上清をトランスフェクションの５日後に採取し、１８００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により清澄化し、０．４５μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して濾過した。ガランツス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン（ＧＮＬ）カラム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、Ｅｎｖタンパク質を上清から抽出した。結合タンパク質を、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１Ｍ  メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含有するＰＢＳで溶出し、ついで、初期評価のためのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ならびにＥＭ分析および抗原プロファイリングのためのＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＰＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。理論吸光係数と共にＵＶ２８０吸光度を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１０２】
ブルー・ネイティブ（Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ）（ＢＮ）ＰＡＧＥ。Ｅｎｖタンパク質をブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシーブルーで染色した。タンパク質サンプルをローディング色素と混合し、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングした。ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ランニングバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従い使用して、ＢＮ  ＰＡＧＥゲルを１５０Ｖで２時間泳動させた。
【０１０３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）。ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−キャピラリー熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、ＳＯＳＩＰおよびＨＲ１再設計三量体の熱融解曲線を得た。ＳＥＣ精製糖タンパク質を１×ＰＢＳ中にバッファー交換し、装置による分析の前に０．５〜１μＭに濃縮した。融解を９０℃／時間の走査速度でプローブした。バッファー補正、正規化およびベースライン減算を含むデータ処理を、Ｏｒｉｇｉｎ  ７．０ソフトウェアからの標準化プロトコルを用いて行った。
【０１０４】
結晶化のためのタンパク質の製造および精製。２つのＨＲ１再設計三量体ならびに８ＡＮＣ１９５およびＰＧＴ１２８  Ｆａｂを、Ｋｏｎｇら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ−Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．７１，２０９９−２１０８，２０１５に記載されているとおりに製造し、精製した。簡潔に説明すると、全ての構築物を発現ベクターｐｈＣＭＶ３内にクローニングした。Ｆａｂを哺乳類Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３Ｆ細胞内に一過性にトランスフェクトし、三量体をＧｎＴ１−／−  ２９３Ｓ細胞内に一過性にトランスフェクトした。１週間のトランスフェクションの後、抗体トランスフェクト化細胞の上清を採取し、ＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５のためのそれぞれラムダ（Ｌａｍｂｄａ）またはカッパ（Ｋａｐｐａ）捕捉選択（Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ）カラム（ＢＡＣ  ＢＶ）を使用して精製した後、イオン交換クロマトグラフィーおよびＳＥＣを用いて更に精製した。２Ｇ１２アフィニティカラムを使用し、ついでＳＥＣを使用して、三量体トランスフェクト化細胞の上清を精製した。結晶化試験に使用した三量体複合体を、該三量体タンパク質をＦａｂ  ＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５と１．０：１．２：１．２のモル比で室温で２０分間混合することにより調製した。ついで、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中のエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）を製造業者のプロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従い使用して、この混合物を３７℃で１時間脱グリコシル化した後、ＳＥＣによる最終精製に付した。
【０１０５】
タンパク質の結晶化およびデータ収集。ＨＲ１再設計三量体に結合したＦａｂ  ＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５を含有する２つの精製タンパク質複合体を、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）中へのバッファー交換により、結晶化のために調製した。ついで、該複合体を５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２μｍフィルターに通過させた後、ＪＣＳＧにおいてＩＡＶＩ／ＪＣＳＧ／ＴＳＲＩＣｒｙｓｔａｌＭａｔｉｏｎロボット（Ｒｉｇａｋｕ）を使用する結晶スクリーニングに付した。ＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０三量体に結合したＦａｂ  ＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５を含有する既に記載されている複合体と同様に、ＨＲ−１再設計三量体／Ｆａｂ複合体を０．０５Ｍ  硫酸リチウム、０．０５Ｍ  硫酸ナトリウム、２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４００および０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）（ＪＣＳＧ  Ｃｏｒｅ  Ｓｕｉｔｅ条件：ＪＣＳＧＩ  Ａ０３，Ｑｉａｇｅｎ）中で２５℃で結晶化した。Ｘ線データ収集のための全ての結晶を、液体窒素中でフラッシュ冷却する前に４０％  ＰＥＧ４００で補足された母液中に短時間浸漬することによって凍結保護した。ＨＲ１再設計１複合体に関しては、６．３オングストロームの分解能までの回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅにおけるビームライン２３ＩＤ−Ｂで収集し、ＨＫＬ−２０００で処理し、１００％の完全性および最高分解能殻における２．３の＜Ｉ＞／＜σ＞で、空間群Ｉ２３において索引付けした。ＨＲ１再設計９複合体に関しては、６．９オングストロームの分解能までの回折データを、スタンフォード・シンクロトロン放射光源（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ）におけるビームライン１２−２で収集し、ＨＫＬ−２０００で処理し、１００％の完全性および最高分解能殻における１．３の＜Ｉ＞／＜σ＞で、空間群Ｉ２３において索引付けした。データ収集および処理統計を表１に要約する。
【０１０６】
構造決定および精密化。Ｆａｂ  ＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５（ＰＤＢＩＤ：５Ｃ７Ｋ）に結合したＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０三量体との複合体からなる検索モデルおよびＰｈａｓｅｒソフトウェアを使用する分子置換法を用いて、ＨＲ１再設計ｇｐ１４０三量体に結合したＰＧＴ１２８および８ＡＮＣ１９５の構造を解析した。既に記載されているとおり、精密化は、Ｃｏｏｔ−０．７を使用する手動モデル構築とＰｈｅｎｉｘプログラムにより実行される自動化精密化との交互ラウンドからなるものであった。データセットの分解能が限られていることを考慮して、各残基に関するグループ化Ｂ因子精密化を用いた。更に、拘束（ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）の参照モデルセットを使用して、位置座標の精密化を行った。Ｐｈｅｎｉｘにおける各自動化精密化セッションの開始モデルをそのセッションの参照モデルとして定めた。最後に、該モデルを、再設計のＨＲ１部位におけるもの以外は、最小限に修飾した。最終的なＲｃｒｙｓｔ値およびＲｆｒｅｅ値は、それぞれＨＲ１再設計１および９の複合構造に関して、２８．１％および３２．２％、ならびに２８．４％および３２．２％に収束した。最終的な精密化の統計情報に関しては、表１を参照されたい。埋め込まれた分子表面積を、１．７オングストロームのプローブ半径および標準的なファンデルワールス半径を用いて、分子表面パッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｕｓｅｒｇｕｉｄｅｓ／ｇｒａｐｈｉｃｓ／ｍｓｐ／ｍｓｕ ｌｏｃａｌ．ｈｔｍｌ）で分析した。Ｆａｂ残基はＫａｂａｔ命名法に従い番号付けされており、ｇｐ１４０は、標準的なＨＸＢｃ２規則を用いて番号付けされている。
【０１０７】
電子顕微鏡法のサンプルの調製。ｇｐ１４０三量体を、単独で、およびＰＧＶ０４との複合体として、ネガティブ染色ＥＭにより分析した。約０．０２ｍｇ／ｍＬの該三量体を含有する３μＬアリコートを、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させた炭素被覆４００Ｃｕメッシュグリッド上に１５秒間適用し、ついで２％  ウラニルホルマートで３０秒間、ネガティブ染色した。約３０ｅ−／オングストローム２の電子線量および５２，０００倍の倍率（これは検体面上で２．０５オングストロームのピクセルサイズをもたらした）を用いて１２０ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉスピリット電子顕微鏡を使用して、データを収集した。１０００ｎｍの公称焦点ずれ（デフォーカス）およびレジノン（Ｌｅｇｉｎｏｎ）パッケージを用いるＴｉｅｔｚ  ４ｋ×４ｋ  ＴｅｍＣａｍ−Ｆ４１６  ＣＭＯＳカメラを使用して、イメージを得た。
【０１０８】
電子顕微鏡データの処理およびイメージ再構築。粒子を、ＤｏＧ  Ｐｉｃｋｅｒを使用して自動的に選択し、Ａｐｐｉｏｎソフトウェアパッケージを使用して粒子スタック内に入れた。反復多変量統計分析（ＭＳＡ）／多参照アラインメント（ＭＲＡ）により２つの瓶に分割され、クラスにソートされた粒子を使用して、初期無参照２次元（２Ｄ）クラス平均を計算した。三量体に対応する粒子またはＰＧＶ０４に結合した三量体に対応する粒子をサブスタックへと選択し、２つの瓶に分割した後、反復ＭＳＡ／ＭＲＡならびにＸｍｉｐｐクラスタリング（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）および２Ｄアライメントプログラムを使用して、別のラウンドの無参照アライメントを行った。三量体（閉じた天然様、開いた天然様および非天然）の質を分析するために、無参照２Ｄクラス平均を、Ｐｕｇａｃｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９，３３８０−３３９５，２０１５に記載されている測定基準を用いて目視検査した。対称性Ｃ３を課すＥＭＡＮ２における無参照２Ｄクラス平均からアブイニシオ共通ライン（ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｎｅｓ）モデルを計算した。ついで、このモデルを、ＥＭＡＮ（Ｌｕｄｔｋｅら，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２８，８２−９７，１９９９）を使用する追加的な２５サイクルにわたって、生粒子に対して精密化した。最終モデルの分解能を、０．５のフーリエ・シェル相関（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｓｈｅｌｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）（ＦＦＳ）カットオフを使用して決定した。
【０１０９】
ＥＬＩＳＡおよびバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）による結合分析。ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂへの三量体結合の動力学を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６装置（ｆｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。全てのアッセイは、１０００ｒｐｍに設定された攪拌下で、ｆｏｒｔｅＢｉｏ  １×動力学的バッファー中で行った。全ての溶液の最終体積は２００μｌ／ウェルであった。アッセイは、固体黒色９６ウェルプレート（Ｇｅｉｇｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）において、３０℃で行った。抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサー（ＡＨＣ）の表面上に抗体を３００秒間ローディングするために、１×動力学的バッファー中の５μｇ／ｍｌのタンパク質を使用した。６０秒間のバイオセンサーベースライン工程を適用した後、溶液中でのバイオセンサー上の抗体とＥｎｖ三量体との結合を２００秒間にわたり分析した。２００ｎＭから開始する三量体の２倍濃度勾配を６滴定系列に用いた。相互作用の解離を３００秒間追跡した。抗体がローディングされたが三量体と共にインキュベートされなかったセンサー、または抗体を含有しないが三量体と共にインキュベートされたセンサーに関して記録された平均シフトを差し引くことにより、基線（ベースライン）変動の補正を行った。ｆｏｒｔｅＢｉｏのデータ収集ソフトウェアｖ．８．１でＯｃｔｅｔデータを処理した。ＫＤ値および他の動力学的パラメータを決定するために、グローバルフィット１：１モデルを用いて、実験データをＶ１Ｖ２頂点指向性ｂＮＡｂにフィットさせた。
【０１１０】
実施例９  天然様頂点を有する三量体Ｖ１Ｖ２を提示するフェリチンナノ粒子
ｇｐ１２０のＶ１Ｖ２領域は５０〜９０残基長の範囲であり、１０個中１個の残基がＮ−グリコシル化されており、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ上に高密度グリカンシールドが形成される。Ｖ１Ｖ２コード化グリカンエピトープは、ＰＧ９／ＰＧ１６、ＣＨ０１−０４、ＰＧＴ１４１−１４５およびＰＧＤＭ１４００のようなｂＮＡｂによって認識されうる。配列変異にもかかわらず、Ｎ１６０を中心とする短いセグメントが、最もよく知られたＶ１Ｖ２特異的ｂＮＡｂに対する特異性を定める。２つのクレードＣ株、すなわち、ＣＡＰ４５およびＺＭ１０９に関して、ＰＧ９と複合体形成したスキャフォールドＶ１Ｖ２の結晶構造が決定されており、これはグリークキー（Ｇｒｅｅｋ  ｋｅｙ）モチーフを示しており、ここで、Ｂ鎖およびＣ鎖は２つの極めて重要なグリカンを含有する。ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ．６６４  ｇｐ１４０三量体と複合体形成したＰＧ９およびＰＧＤＭ１４００のＥＭ構造は、これらの２つのｂＮＡｂが、異なる接近角で三量体頂点を向いていることを示した（例えば、Ｊｕｌｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０，４３５１−４３５６，２０１３；およびＳｏｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１，１７６２４−１７６２９，２０１４に記載されているとおり）。本研究において、本発明者らは、ＳＯＳＩＰ三量体の結晶構造および低温ＥＭにおいて見出される天然様三量体コンホメーションでＶ１Ｖ２を提示するためにフェリチンナノ粒子上の３回軸が利用されうると仮定した。この可能性を試験するために、本発明者らは、クレードＣ  ＺＭ１０９のＶ１Ｖ２に基づいて２つの構築物を設計した。すなわち、全３個のジスルフィド結合を含有するもの（Ｖ１Ｖ２Ｅｘｔと称される）、および２個を含有する短縮化形態（Ｖ１Ｖ２Ｓｈｔと称される）を設計し、ここで、両方のＶ１Ｖ２配列はフェリチンサブユニット（ＦＲ）のＮ末端（Ｄ５）に融合している（表２ａ）（例えば、Ｋａｎｅｋｉｙｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ４９９，１０２−１０６，２０１３；およびＨｅら，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１２５０１，２０１５を参照されたい）。粒子表面上の各３回軸の周囲のフェリチンサブユニットのＮ末端に三量体Ｖ１Ｖ２のＣ末端をフィットさせた後、構造モデリングはＶ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲおよびＶ１Ｖ２Ｓｈｔ−ＦＲに関してそれぞれ３．７および０．８オングストロームのＣα平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を示した。更なる分析は、どちらのナノ粒子に関しても、高密度グリカン表面を示し、Ｖ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲおよびＶ１Ｖ２Ｓｈｔ−ＦＲに関してはそれぞれ１６．６および１４．３の直径であった。
【０１１１】
それらの２つのＶ１Ｖ２−フェリチン構築物および単量体Ｖ１Ｖ２をＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ陰性（ＧｎＴＩ−／−）ＨＥＫ２９３Ｓ細胞において一過性に発現させ、ガランツス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン（ＧＮＬ）カラムおよびそれに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム上のＳＥＣを用いて精製した。両方のＶ１Ｖ２−ＦＲ設計に関して、ＳＥＣプロファイルは、ブルーネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）により確認された良好に形成されたナノ粒子を示す単一ピークを示した。ついで、精製ナノ粒子を視覚化するためにネガティブ染色ＥＭを利用した。実際、ＥＭによるイメージングは、均一なＶ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲ粒子を示し、これは２次元（２Ｄ）クラス平均の計算を可能にした。Ｖ１Ｖ２Ｓｈｔ−ＦＲ粒子に関しても同様の結果が観察され、このことは、Ｖ１Ｖ２の長さおよび含有ジスルフィド結合の数の違いにもかかわらず、均一性および純度がこれらのナノ粒子に固有のものであることを示唆している。しかし、三量体Ｖ１Ｖ２スパイクは２Ｄクラス平均において拡散しているようであり、これは幾らかの移動性を示している。Ｖ１Ｖ２頂点の抗原性を調べるために、ＰＧ９（これは単量体および三量体形態の両方でＶ１Ｖ２を認識する）およびＰＧＤＭ１４００（これはＳＯＳＩＰ様三量体コンホメーションの頂点を標的とする）への粒子結合を測定した。酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）による両方のナノ粒子の分析は、単量体Ｖ１Ｖ２に比べて増強したｂＮＡｂ結合を示し、ＰＧＤＭ１４００はＶ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲへの優先的結合を示した。バイオレイヤー干渉計（ＢＬＩ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を使用して、単量体および微粒子形態のｂＮＡｂ  ＰＧ９およびＰＧＤＭ１４００へのＶ１Ｖ２結合の動力学を特徴づけした。予想通り、単量体Ｖ１Ｖ２はＰＧ９に低いアフィニティで結合し、ＰＧＤＭ１４００への結合を示さなかった。これとは対照的に、Ｖ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲは両方のｂＮＡｂに高いアフィニティで結合したが、異なる動力学を示した。ＰＧＤＭ１４００に関しては、Ｖ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲは極めて速いオン速度を示し、これは、この頂点指向性ｂＮＡｂによって容易に認識されうる安定した頂点を示している。Ｖ１Ｖ２Ｓｈｔ−ＦＲはＶ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲに類似した結合動力学を示したが、ＰＧＤＭ１４００に対するアフィニティの低下を示しており、これは、ＥＬＩＳＡに合致した頂点構造および抗原性に対する短縮化Ｖ１Ｖ２の逆効果を示唆するものである。
【０１１２】
本発明者らの結果は、ＨＩＶ−１  ＥｎｖのＶ１Ｖ２領域が天然様三量体コンフォメーションでフェリチンナノ粒子上に提示されうることを示している。注目すべきことに、この設計戦略は株には無関係である可能性が高い。なぜなら、クレードＣ  ＣＡＰ４５に基づいて設計されたＶ１Ｖ２Ｅｘｔ−ＦＲに関してもナノ粒子が観察されたからである（図８ｂ〜図８ｄ）。総合すると、三量体Ｖ１Ｖ２の微粒子提示は頂点指向性ｂＮＡｂによるその認識を実質的に改善した。このことは、Ｖ１Ｖ２ナノ粒子がｇｐ１４０三量体の有望な代替手段となり、Ｂ細胞応答をこの四次エピトープに集中させうることを示唆している。
【０１１３】
実施例１０  天然様頂点を有する三量体Ｖ１Ｖ２を提示するフェリチンナノ粒子
ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）指向性ｂＮＡｂであるＶＲＣ０１の生殖系列前駆体を標的化するために、可変ループ（Ｖ１Ｖ２およびＶ３）および内部ドメインを欠く操作ｇｐ１２０コアを提示する６０量体（６０マー）ＬＳナノ粒子が使用されている。しかし、ＶＲＣ０１クラスのｂＮＡｂ  ＰＧＶ０４と複合体形成しているＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ三量体の構造は、隣接ｇｐ１４０プロトマー上のグリカンもＣＤ４ｂ認識に関与することを示しており、このことは、三量体の状況によって制約される接近角を示唆している。ＨＩＶ−１の中和にとっての三量体の制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）の重要性はヒトＩｇノックインマウスにおいて更に実証された。それにおいては、ｅＯＤ−ＬＳナノ粒子ではなくＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ三量体のみがＮＡｂ応答を惹起した。これらの過去の研究およびＶ１Ｖ２ナノ粒子の結果に基づいて、本発明者らは、完全長ｇｐ１２０を提示し、全てのそのコード化ｎＮＡｂエピトープを露出させ、これをＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０三量体と同様のそれらの天然様コンホメーションで行うために、フェリチンナノ粒子が使用可能であると仮定した。この設計戦略は、準安定ｇｐ４１を含有するｇｐ１４０三量体に固有の複雑さを欠く代替的免疫原を与えうる。この可能性を試験するために、本発明者らは、クレードＡ  ＢＧ５０５  ｇｐ１２０に基づいて３つのフェリチン融合構築物を設計した。ｇｐ１２０Ｅｘｔ−ＦＲおよびｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲは種々の長さのｇｐ１２０を含有し、一方、ｇｐ１２０ＳＳ−ＦＲは、ｇｐ１２０末端を安定化させるための追加的なジスルフィド結合を含んでいた（表２ｂ）。ｇｐ１２０Ｅｘｔ−ＦＲの場合、構造モデリングは、粒子表面上の各３回軸の周囲にｇｐ１２０  Ｃ末端（Ｇ４９５）およびフェリチンＮ末端（Ｄ５）のほぼ完全な重ね合わせを示し、得られたナノ粒子の直径は２６．２ｎｍであり、Ｃα  ＲＭＳＤは１．９オングストロームであった。
【０１１４】
全３個のｇｐ１２０−フェリチン構築物および単量体ｇｐ１２０をＨＥＫ２９３  Ｆ細胞において一過性に発現させた。ＧＮＬカラムを使用し、ついでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ６  １０／３００  ＧＬカラム上でＳＥＣを使用して、分泌したタンパク質を精製した。それらの３つのキメラ構築物の中で、ｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲはＳＥＣプロファイルにおける最も顕著な粒子ピークを示した。注目すべきことに、ｇｐ１２０ＳＳ−ＦＲにおいては粒子ピークは観察されなかったが、これは変異ｇｐ１２０のミスフォールディングを示唆している。ＢＮ−ＰＡＧＥは、完全構築ナノ粒子に対応する、ｇｐ１２０Ｅｘｔ−ＦＲおよびｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲの両方に関する高い分子量（ｍ．ｗ．）バンドを示した。ついで、精製されたｇｐ１２０−ＦＲナノ粒子を視覚化するためにネガティブ染色ＥＭを用いた。ｇｐ１２０Ｅｘｔ−ＦＲおよびｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲの両方に関して均一粒子が観察され、後者に関して２Ｄクラス平均が算出された。ｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲはより効率的な粒子集合を示したため、低温ＥＭを利用してナノ粒子を更に特徴づけしたところ、ｇｐ１２０スパイクで修飾された粒子表面を示した。
【０１１５】
ｇｐ１２０ナノ粒子の抗原性を評価するために、代表的なｂＮＡｂおよび非ＮＡｂのパネルへの粒子結合の動力学を測定した。まず、頂点指向性ｂＮＡｂ  ＰＧ１６およびＰＧＤＭ１４００を試験した。予想通り、ｇｐ１２０単量体はＰＧ１６への最小限の結合しか示さず、ＰＧＤＭ１４００へのほとんど検出不可能な結合を示した。これとは対照的に、ｇｐ１２０ナノ粒子は、サブナノモルのアフィニティでの、両方のｂＮＡｂへの実質的に増強した結合を示し、ｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲはｇｐ１２０Ｅｘｔ−ＦＲよりもわずかに優れていた。これは、フェリチンナノ粒子上の各３回軸の周囲の３つのｇｐ１２０ｓがＳＯＳＩＰ様三量体コンホメーションを実際に形成しうることを証明した。ＣＤ４ｂｓ指向性ＶＲＣ０１の場合、両方のナノ粒子は、増加したオン速度を示し、平坦な解離曲線を示した。同じ部位を標的とするＮＡｂ  ｂ１２に関しても同様の傾向が観察された。多価提示から生じるアビディティ効果は、Ｖ３塩基および周囲のグリカンを標的とするｂＮＡｂ  ＰＧＴ１２１で最も顕著であった。単量体ｇｐ１２０はＰＧＴ１２１に、より低いレベルで、速いオフ速度で結合したが、両方のｇｐ１２０ナノ粒子は結合の増強を示し、より速いオン速度および平坦な解離曲線を示した。ついで、非中和性ＭＡｂに対する粒子結合を測定した。開いたｇｐ１２０コンホメーションを好むＦ１０５に関しては、単量体ｇｐ１２０は迅速なオン速度およびオフ速度を示したが、ナノ粒子は、ｇｐ１２０三量体の高密度提示により引き起こされる立体障害から生じうる、より遅いオン速度およびオフ速度を示した。しかし、ｇｐ１２０ナノ粒子は、単量体ｇｐ１２０と比較して増強した、Ｖ３特異的１９ｂによる認識を示した。これは、ＳＯＳＩＰ単量体に関して最近実証されたとおり、コンホメーション固定によって最小化されうる。最後に、ｇｐ１２０−ＦＲナノ粒子はＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂへのほとんど無視できる結合を示した。これは、このＭＡｂによる単量体ｇｐ１２０の顕著な認識とは対照的であった。
【０１１６】
実施例１１  三量体ｇｐ１２０を提示する６０量体ナノ粒子
本発明者らはまた、三量体ｇｐ１２０を提示するために６０量体ナノ粒子が使用可能であるかどうかを調べた。この可能性を調べるために、異なる構造的特徴を有する２つの熱安定性６０量体、すなわち、ＬＳ（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０６，１０９９−１１１４，２００１）およびＥ２ｐ（Ｉｚａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１２４０−１２４５，１９９９）を選択した。フェリチンの１２．２ｎｍの直径と比較して、ＬＳはサイズにおいてほんの僅かに大きく、１４．８ｎｍの直径を有する。ｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＬＳナノ粒子の構造モデリングは、ＬＳ表面が、２８．７ｎｍの推定直径を有する２０個の三量体ｇｐ１２０スパイクによって完全に覆われることを示した。ＨＥＫ２９３  Ｆ細胞における一過性発現およびＧＮＬ精製の後、分泌したタンパク質をＳＥＣにより分析した。しかし、このＬＳ構築物のＳＥＣプロファイルにおいて、粒子ピークは観察されなかった。一貫して、ＢＮ−ＰＡＧＥは優勢な５量体バンドを示し、これはネガティブ染色ＥＭ分析により確認された。要約すると、本発明者らの結果は、比較的小さなＬＳナノ粒子が全長ｇｐ１２０三量体スパイクを提示するのに最適でない可能性があることを示している。
【０１１７】
次に、粒子表面上の３回転軸頂点を分離する１２個の大きな開口と２３．２ｎｍの直径とを有する中空十二面体であるＥ２ｐを調べた。構造モデリングは、ＤＣによる直接取り込みのための最適なサイズに近い３７．６ｎｍの直径を有するｇｐ１２０Ｓｈｔ−Ｅ２ｐナノ粒子を与えた（表２ｃ）。ＨＥＫ２９３  Ｆ発現ＧＮＬ精製ｇｐ１２０Ｓｈｔ−Ｅ２ｐタンパク質をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム上のＳＥＣにより分析した。これは、キメラＥ２ｐ粒子に対応する顕著な高分子量ピークを示した。これと一致して、ＢＮ−ＰＡＧＥはゲル上に濃縮ナノ粒子バンドを示し、低分子量の、より軽いバンドを伴っており、これは解離ｇｐ１２０−Ｅ２ｐ三量体を示唆している。ついで、この６０量体の集合を特徴づけるためにネガティブ染色ＥＭを利用し、大きな均一ナノ粒子を観察した。２Ｄクラス平均は、結晶構造に似た中空タンパク質ケージを示した。しかし、ＥＭ分析は、三量体ｇｐ１２０のような大きな複合抗原のためのナノ粒子プラットフォームとしてのＥ２ｐの頑強性を証明したが、それは、ｇｐ１２０スパイクを欠く予想外の２Ｄクラス平均も示した。三量体ｇｐ１２０スパイクが生成したが、大きな間隔ゆえに可動性のままであったのかどうか、または各３回軸の周囲の３つのｇｐ１２０が安定三量体へと集合しなかったのうかどうかは、ＥＭ分析のみからは不明であった。この問題を検討するために、ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂの小さなパネルへのＥ２ｐ粒子の結合をＢＬＩにより測定した。注目すべきことに、ｇｐ１２０Ｓｈｔ−Ｅ２ｐは頂点指向性ｂＮＡｂ  ＰＧ１６およびＰＧＤＭ１４００にサブピコモルのアフィニティで結合した。速いオン速度および平坦な解離曲線は、ＳＯＳＩＰ三量体のものに類似しているがアビディティの追加的利点を有する天然様頂点を示した。ｇｐ１２０−フェリチンナノ粒子の場合と同様に、本発明者らは、ｂＮＡｂ  ＶＲＣ０１およびＰＧＴ１２１ならびにＮＡｂ  ｂ１２によるＣＤ４ｂｓおよびＶ３塩基の認識の増強を観察した。非中和性ＭＡｂに関しては、ｇｐ１２０Ｓｈｔ−Ｅ２ｐは、ＣＤ４ｂｓ特異的Ｍａｂ  Ｆ１０５およびＶ３特異的１９ｂに、ｇｐ１２０Ｓｈｔ−ＦＲに類似したレベルで結合した。このことは、サイズには無関係にｇｐ１２０ナノ粒子により共有される共通の特徴を示唆している。最後に、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂに関しては、最小限の結合しか観察されなかった。
【０１１８】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの受容体結合タンパク質として、ｇｐ１２０はワクチン免疫原として広範に研究されているが、天然スパイク内に埋もれている非中和性面の露出ゆえに最適ではないと考えられている。本発明者らの結果は、フェリチンおよびＥ２ｐナノ粒子による全長ｇｐ１２０の提示が、ｇｐ４１の非存在下で天然様三量体コンホメーションを回復させうることを示している。ＳＯＳＩＰ様抗原性、ならびに粒子サイズおよび表面間隔の変動により、これらのナノ粒子は、ｇｐ１２０に基づくＨＩＶ−１ワクチンを研究するための汎用プラットフォームを提供する。
【０１１９】
実施例１２  安定化ｇｐ１４０三量体を提示するフェリチンナノ粒子
ＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ  ｇｐ１４０三量体を提示するフェリチンナノ粒子の設計および免疫原性が最近報告された（Ｓｌｉｅｐｅｎら，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．１２：８２，２０１５）。ＥＬＩＳＡによるこのｇｐ１４０ナノ粒子の分析は、頂点指向性ｂＮＡｂ  ＰＧ９およびＰＧＴ１４５への、そしてｇｐ１２０−ｇｐ４１境界に対するｂＮＡｂであるＰＧＴ１５１への結合の顕著な低下を示した。これは、ＢＬＩを用いてｇｐ１２０ナノ粒子に関して本発明者らが観察した抗原プロファイルを考慮すると、少々驚くべきことである。本研究において、本発明者らは、修飾ＨＲ１ベンド（残基５４８〜５６８；ＨＲ１再設計１と称される）を含有する新規安定化設計により、ならびにリンカーの長さおよびｇｐ４１トランケート化の詳細な分析により、ｇｐ１４０三量体のフェリチン提示を達成することを追究した。ここで試験したｇｐ１４０構築物には、６６４位でトランケート化されたｇｐ１４０（ｇｐ１４０．６６４）、１０残基のリンカーを含有するｇｐ１４０．６６４（ｇｐ１４０．６６４−１０ａａ）、および同じリンカーを含有するＭＰＥＲを含むように６８１位でトランケート化されたｇｐ１４０（ｇｐ１４０．６８１−１０ａａ）が含まれた（表２ｄ）。ＨＲ１再設計ｇｐ１４０−フェリチン粒子の構造モデリングは、ｇｐ１４０．６６４−ＦＲ、ｇｐ１４０．６６４−１０ａａ−ＦＲおよびｇｐ１４０．６８１−１０ａａ−ＦＲに関してそれぞれ３０．１、３５．７および４０．１ｎｍの直径を有する十分に分離した三量体スパイクを示した。
【０１２０】
粒子集合中にコンタミナント（汚染）Ｅｎｖ種は排除できないため、ｇｐ１４０三量体の純度はｇｐ１４０ナノ粒子の質に有意な影響を及ぼす。この問題を例証するために、本発明者らはＢＧ５０５  ＳＯＳＩＰ三量体とＨＲ１再設計ｇｐ１４０三量体とのＳＥＣプロファイルを比較した。これは、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により示されるとおり、凝集体および二量体／単量体のピークにおける実質的な差異を示した。ＳＯＳＩＰに基づく設計を含む全てのｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子をＨＥＫ２９３  Ｆ細胞においてフューリンと共に一過性に共発現させ、ＧＮＬを用いて、ついでＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム上のＳＥＣを用いて精製した。ネガティブ染色ＥＭを用いて、本発明者らはＳＯＳＩＰ−フェリチンナノ粒子の集合を最初に確認した。ＨＲ１再設計１を含有するＧＮＬ精製ｇｐ１４０−フェリチンタンパク質は、８．５〜１０．５ｍＬにおける粒子含有ピークと比較して高い三量体および二量体／単量体ピークを有する、類似したＳＥＣプロファイルを示した。より多くのナノ粒子を含有するｇｐ１４０．６６４−１０ａａ−ＦＲに関しては、ＥＭは、
十分に集合した粒子および凝集物と混合した六角形構造を有する未知のタンパク質種を示した。粒子純度を改善させるために、ＶＬＰ精製に使用されているＣａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００カラムの有用性を検討した。Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００およびＧＮＬカラムを用いた精製の後、ｇｐ１４０．６６４−１０ａａ−ＦＲはＳＥＣプロファイルにおける非粒子ピークの低減を示した。一貫して、六角形構造が尚も存在することを示す高品質ＥＭ画像が得られ、これは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ特異的精製法が必要であることを示している。この目的のために、本発明者らは、Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００と２Ｇ１２アフィニティーカラムとの併用を検討した。その後者は、ＳＯＳＩＰ三量体を精製するために広く使用されている。全体的に、ｇｐ１４０．６６４−１０ａａ−ＦＲは尚も最高の作用物質であり、ＳＥＣプロフィールにおいて、より良好に視認可能な粒子ピークを示し、低減した三量体ピークを示し、二量体／単量体ピークを示さなかった。全３個の構築物に関して、粒子含有画分をＢＮ−ＰＡＧＥにより分析したところ、これは、個々の三量体と比較して、完全集合ｇｐ１４０ナノ粒子に対応する高い分子量バンドを示した。注目すべきことに、Ｓｌｉｅｐｅｎらの報告とは対照的に、これらのバンドは、ｇｐ１２０−フェリチン粒子バンドからの推定シフトＳＥＣプロファイルと一致する。ｇｐ１４０．６６４−１０ａａ−ＦＲに関しては、表面上に視認可能なスパイクを含有する均一ナノ粒子がネガティブ染色ＥＭにおいて観察された。ｇｐ１４０．６６４−１０ａａ−ＦＲナノ粒子の安定性が、凍結および融解されたサンプルのＥＭ分析により確認した。本発明者らはまた、ネガティブ染色ＥＭにおいて、ｇｐ１４０．６６４−ＦＲおよびｇｐ１４０．６８１−１０ａａ−ＦＲに関して、良好に形成したナノ粒子を観察した。総合すると、本発明者らの結果は、ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子の集合を立証し、ｇｐ１４０に基づくナノ粒子の開発における適切な精製および特徴づけの重要性を強調した。
【０１２１】
本発明者らは、対照として含まれるＨＲ１再設計三量体と共に代表的なｂＮＡｂのパネルおよびＢＬ１を用いて、ｇｐ１４０ナノ粒子の抗原プロフィールを特徴づけした。粒子表面上に提示されたｇｐ１４０三量体の頂点をプローブするために、Ｖ１Ｖ２頂点指向性ｂＮＡｂであるＰＧＤＭ１４００、ＰＧＴ１４５およびＰＧ１６を最初に使用した。注目すべきことに、全てのｇｐ１４０ナノ粒子が、アビディティゆえに平坦な解離曲線を有する個々の三量体と比較した場合のサブピコモルのアフィニティを示した。Ｎ３３２を中心とするＶ３エピトープを標的とするｂＮＡｂ  ＰＧＴ１２１に関しては、ｇｐ１４０ナノ粒子は、オン速度の増加を示すＨＲ１再設計三量体のものに類似した結合プロファイルを示した。ＣＤ４ｂｓ指向性ｂＮＡｂであるＶＲＣ０１に関しては、ｇｐ１４０−フェリチン粒子は、ｇｐ１２０−フェリチン粒子に類似した遅い結合を示した。ｇｐ１２０−ｇｐ４１境界を標的とするｂＮＡｂであるＰＧＴ１５１および３５Ｏ２２に関しては、認識の増強が見出されたが、異なる動力学が示された。ＰＧＴ１５１に関しては、より速いオン速度が、変化していない解離パターンで観察された。これとは対照的に、急速な解離を伴う３５００２に関して、増加したオン速度が観察された。要約すると、全３個のｇｐ１４０ナノ粒子は、ＶＲＣ０１以外のｂＮＡｂによる認識の改善を示した。このことは、ｇｐ１４０三量体の、混雑した表面提示が、制限された接近角でＣＤ４ｂに結合するＶＲＣ０１クラスのｂＮＡｂに最も有意な影響を及ぼしうることを示唆している。
【０１２２】
次に、非ＮＡｂへのｇｐ１４０ナノ粒子の結合動力学を測定した。注目すべきことに、ＣＤ４ｂ特異的ＭＡｂ  Ｆ１０５およびｂ６では結合の低減が観察され、ｂ６ではより顕著な低減が見られた。Ｖ３特異的ＭＡｂ  １９ｂの場合、ｇｐ１４０ナノ粒子に関して、三量体およびｇｐ１２０ナノ粒子と比較して遅い結合が観察された。このことは、ｇｐ１４０三量体の高密度提示による最小化されたＶ３露出を示唆している。ｇｐ４１のクラスターＩにおける免疫優性エピトープを標的とするＭＡｂ  Ｆ２４０に関しては、ｇｐ１４０ナノ粒子は、ＨＲ１再設計三量体に関して観察された残存結合と比較して、検出不能な結合を示した。ｇｐ１４０三量体およびｇｐ１４０ナノ粒子の両方に関して、ＣＤ４ｉ  ＭＡｂ  １７ｂおよびＡ３３２への結合は検出されなかった。最後に、本発明者らは、ｇｐ１４０．６８１−１０ａａ−ＦＲの場合にこのｇｐ４１エピトープをプローブするために、ＭＰＥＲ指向性ｂＮＡｂ  ４Ｅ１０および１０Ｅ８を使用した。驚くべきことに、このナノ粒子は迅速なオン速度および平坦な解離曲線で４Ｅ１０に結合したが、それは、４Ｅ１０結合部位を越えて広がるコンホメーションエピトープを認識する１０Ｅ８へは最小限の結合しか示さなかった。構造モデリングにより示されるとおり、ＭＰＥＲは外表面から１０ｎｍ以上の距離でフェリチン表面の近位にあるため、特定のエピトープコンホメーションを選択する１０Ｅ８のようなｂＮＡｂに対して、立体障害はより有意な影響を及ぼしうる。
【０１２３】
本発明者らの分析は設計ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子の重要な特徴を明らかにした。Ｓｌｉｅｐｅｎらの報告とは対照的に、ＢＬＩによる抗原プロファイリングは、ｂＮＡｂによる認識の増強および非ＮＡｂへの結合の低下を明らかに示した。これらの結果は、これらのｇｐ１４０ナノ粒子が、ｂＮＡｂエピトープに対する強力なＢ細胞応答を惹起する際に、個々のｇｐ１４０三量体より優れた免疫原でありうることを示唆している。注目すべきことに、非ＮＡｂへの結合の著しい低減を示すＳＯＳＩＰ様抗原プロファイルを示す天然様ｇｐ１４０三量体を含有するナノ粒子の製造において、ＨＲ１再設計三量体の本質的純度が、不可欠な役割を果たしている。
【０１２４】
実施例１３  安定化ｇｐ１４０三量体を提示する６０量体Ｅ２ｐナノ粒子
ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子の有望な結果に基づいて、本発明者らは、２つの６０量体、すなわち、ＬＳおよびＥ２ｐ上のｇｐ１４０三量体の微粒子提示を調べた。ＬＳのサイズが小さいことを考慮して、まず、ＬＳサブユニットのＣ末端とｇｐ１４０のＮ末端との間に１０残基のリンカーを含有する構築物を設計した（表２ｅ）。ＬＳ−１０ａａ−ｇｐ１４０．６６４の構造モデリングは３９．２ｎｍの推定直径を示した。ＨＥＫ２９３  Ｆ細胞におけるフューリン共発現およびＧＮＬ精製の後、該キメラタンパク質をＳＥＣおよびネガティブ染色ＥＭにより分析したが、十分に形成されたナノ粒子は特定されなかった。次に、再設計ＨＲ１ベンドを含有するＢＧ５０５  ｇｐ１４０．６６４をＥ２ｐコアサブユニットのＮ末端に融合させることにより、６０量体Ｅ２ｐナノ粒子の有用性を調べた（表２ｅ）。構造モデリングは、直径４１．５ｎｍのｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子が、ＭＰＥＲ以外の全てのｂＮＡｂエピトープを露出させうることを示した。ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐ構築物をＨＥＫ２９３  Ｆ細胞内にフューリンと共にコトランスフェクトし、ついでＧＮＬ精製およびＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム上のＳＥＣを行った。全体的な発現は低かったが、ＳＥＣプロファイルにおける最高ピークは、２Ｇ１２精製サンプルのＳＥＣ分析によって更に確認された大きなＥ２ｐナノ粒子に対応していた。粒子集合における効率の改善の可能な説明は、３つのｇｐ４１サブユニットの結合がｇｐ１４０の三量体化およびＥ２ｐの集合を同時に促進しうるというものである。ＢＮ−ＰＡＧＥは、高い分子量ナノ粒子に特徴的なゲルの最上部にバンドを示した。三量体スパイクの緻密な層を有する均一なｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子がＥＭ分析から観察された。したがって、本発明者らの結果は、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐが、免疫認識に適したｇｐ１４０三量体の所望の構造規則性を有する均一なＶＬＰサイズのナノ粒子を形成しうることを示している。
【０１２５】
次に、ｂＮＡｂのパネルを使用してｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子の抗原性を特徴づけした。頂点指向性ＰＧ１６およびＰＧＤＭ１４００に関しては、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐは、平坦な解離曲線を有しピコモルのアフィニティより低い遅いオン速度を示した。ＣＤ４ｂｓ指向性ＶＲＣ０１に関しては、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐは、ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子によく似ているがより弱い平坦な解離曲線および結合の顕著な低減を示した。Ｖ３ステムのグリカンエピトープに結合するｂＮＡｂ  ＰＧＴ１２１に関しては、僅かに減少したオン速度を示す三量体様動力学を観察した。ＰＧＴ１５１および３５Ｏ２２に関しては、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐは、ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子のものに類似した結合プロファイルを示した。全体として、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐは、この分析で試験したｂＮＡｂによる認識の低減を示し、最も明白な変化はＶＲＣ０１において観察され、最も小さい変化はＰＧＴ１５１において観察された。この結果は、非天然ｇｐ１４０三量体コンホメーションがＥ２ｐナノ粒子上に提示される可能性を高めた。この重大な問題を検討するために、非ＮＡｂパネルへの粒子の結合を試験した。ＣＤ４ｂｓ特異的ＭＡｂ  Ｆ１０５に関しては、個々の三量体と比較して、より迅速な解離を伴う弱い結合を観察した。更に、本発明者らの驚いたことに、１９ｂ結合は、他の全てのｇｐ１２０およびｇｐ１４０ナノ粒子に関して観察された増強とは対照的に、Ｖ３の露出の顕著な減少を示した。ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子は、ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子に関する以前の観察と一致して、最小レベルでＣＤ４ｉ  ＭＡｂ１７ｂに結合した。しかし、ｇｐ４１特異的ＭＡｂ  Ｆ２４０に関しては、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐは、三量体およびｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子と比較して僅かに増強した結合を示した。更なる分析は、フェリチンにおける２０オングストロームのエッジ（縁）と比較して、Ｅ２ｐの３回転軸頂点を構成する約９オングストロームのエッジを示し、このことは、短いリンカーがｇｐ４１−Ｅ２ｐ連結領域における幾らかの歪みを引き起こし、結果として、それほど好ましくないｇｐ４１コンホメーションをもたらした可能性があることを示唆している。
【０１２６】
ＤＣ更新（ｕｐｄａｔｅ）のための最適なサイズ（４０〜５０ｎｍ）を有するｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子は、強力で持続的なＢ細胞応答を惹起する上でｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子より有利でありうる。ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子の効率的な集合を考慮すると、ｇｐ１４０．６８１の微粒子提示は、Ｅ２ｐを使用して達成可能であり、更なる研究を保証する。要約すると、ｇｐ１４０．６６４−Ｅ２ｐナノ粒子の本発明者らの特徴づけは高い価（ｖａｌｅｎｃｙ）のＶＬＰ様ＨＩＶ−１ワクチンの開発への重要な一歩をもたらした。
【表１】
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【表２】
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【０１２７】
実施例１４  ＨＩＶ−１三量体提示ナノ粒子の幾つかの例示方法
ナノ粒子の設計およびモデリング。（１）所定のナノ粒子またはＶＬＰの表面上の３回転軸頂点を探索し、（２）粒子表面上の各３回軸の周囲の３つの粒子サブユニットのＮ末端上に三量体ＨＩＶ−１抗原のＣ末端を重ね合わせ、ならびに（３）プロセスの完了時に計算された直径および他の構造パラメーターで三量体提示粒子のＸＹＺ座標を生成させるために、パール（Ｐｅｒｌ）スクリプトを開発した。得られた粒子モデルを、適切なリンカーの手動検査および選択のために、ＵＣＳＦキメラ（Ｃｈｉｍｅｒａ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｃｈｉｍｅｒａ／）を使用して可視化した。
【０１２８】
抗原プロファイリングのための抗体。本発明者らは、設計された三量体の抗原性を特徴づけるために、ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂのパネルを使用した。ｂＮＡｂ  ２Ｇ１２およびｂ１２ならびにＭＡｂ  Ｆ２４０、７Ｂ２、１７ｂおよびＡ３２はＮＩＨエイズ試薬プログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ／）から要求された。他のｂＮＡｂおよび非ＮＡｂは他の場所で得られた。
【０１２９】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ抗原およびナノ粒子の発現および精製。三量体および三量体提示ナノ粒子をＨＥＫ２９３  Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）において一過性に発現させ、単量体Ｖ１Ｖ２およびＶ１Ｖ２ナノ粒子をＨＥＫ２９３  Ｓ細胞において一過性の発現させた。簡潔に説明すると、２９３  Ｆ／Ｓ細胞を解凍し、シェーカー（Ｓｈａｋｅｒ）インキュベーター内でＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）と共に３７℃、１２０ｒｐｍおよび８％  ＣＯ２でインキュベートした。細胞が２．０×１０６／ｍｌの密度に達したら、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）によるトランスフェクションのために細胞密度を１．０×１０６／ｍｌに減少させるために、発現培地を添加した。ｇｐ１４０ナノ粒子に関しては、２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭトランスフェクション培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）内の８００μｇの融合タンパク質プラスミドおよび３００μｇのフューリンプラスミドを２５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の５ｍｌのＰＥＩ−ＭＡＸ（１．０ｍｇ／ｍｌ）と混合した。一方、Ｖ１Ｖ２およびｇｐ１２０ナノ粒子に関しては、９００μｇのキメラＥｎｖプラスミドをフューリンの非存在下で使用した。３０分間のインキュベーション後、該ＤＮＡ−ＰＥＩ−ＭＡＸ複合体を１Ｌの２９３  Ｆ／Ｓ細胞に加えた。培養上清をトランスフェクションの５日後に採取し、１８００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により清澄化し、０．４５μｍフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して濾過した。ガランツス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ）レクチン（ＧＮＬ）カラム（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用して、タンパク質を上清から抽出した。結合タンパク質を、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１Ｍ  メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含有するＰＢＳで溶出し、ついで、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラムまたはＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。理論吸光係数と共にＵＶ２８０吸光度を用いてタンパク質濃度を決定した。ｇｐ１４０−フェリチンナノ粒子に関しては、Ｃａｐｔｏ  ７００  Ｃｏｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２Ｇ１２アフィニティカラム６を使用して粒子純度を改善した。
【０１３０】
ブルー・ネイティブ（Ｂｌｕｅ  Ｎａｔｉｖｅ）（ＢＮ）ＰＡＧＥ。ＨＩＶ−１三量体提示ナノ粒子をブルー・ネイティブ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＢＮ−ＰＡＧＥ）により分析し、クーマシーブルーで染色した。タンパク質サンプルをローディング色素と混合し、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にローディングした。ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）ランニングバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従い使用して、ＢＮ  ＰＡＧＥゲルを１５０Ｖで２時間泳動させた。
【０１３１】
電子顕微鏡法のサンプルの調製およびデータ処理。精製されたナノ粒子をネガティブ染色ＥＭにより分析した。約０．０１ｍｇ／ｍＬのサンプルを含有する３μＬアリコートを、２０ｍＡで３０秒間グロー放電させた炭素被覆４００Ｃｕメッシュグリッド上に１５秒間適用し、ついで２％  ウラニルホルマートで３０秒間、ネガティブ染色した。約３０ｅ−／オングストローム２の電子線量および５２，０００倍の倍率（これは検体面上で２．０５オングストロームのピクセルサイズをもたらした）を用いて１２０ｋＶで作動するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉスピリット電子顕微鏡を使用して、データを収集した。１０００ｎｍの公称焦点ずれ（デフォーカス）およびレジノン（Ｌｅｇｉｎｏｎ）パッケージを用いるＴｉｅｔｚ  ４ｋ×４ｋ  ＴｅｍＣａｍ−Ｆ４１６  ＣＭＯＳカメラを使用して、イメージを得た。ナノ粒子を、ＤｏＧ  Ｐｉｃｋｅｒを使用して自動的に選択し、Ａｐｐｉｏｎソフトウェアパッケージを使用して粒子スタック内に入れた。反復ｍｓａ／ｍｒａクラスタリング２ＤアライメントおよびＩＭＡＧＩＣソフトウェアシステムにより２つの瓶に分割され、クラスにソートされた粒子を使用して、無参照２次元（２Ｄ）クラス平均を計算した。
【０１３２】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）による結合分析。Ｃｏｓｔａｒ（商標）９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をＶ１Ｖ２抗原で４℃で一晩コートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄し、ついでウェル当たり１５０μｌのブロッキングバッファー（５％  ｗ／ｖ  乾燥ミルクを含有するＰＢＳ）と共に室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、ついでＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中で５回洗浄した。ブロッキングバッファー中の５０μｌの頂点指向性ｂＮＡｂを２μｇ／ｍｌの最大濃度および５倍希釈系列で加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中で５回洗浄した後、ウェル当たりＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中の１：５０００の５０μｌのペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）と共にウェルを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中で５回洗浄した後、ＴＭＢを使用して、ウェルを室温で５分間現像させ、反応を２Ｎ硫酸で停止させた。読出しを４５０ｎｍの波長で測定した。
【０１３３】
バイオレイヤー光干渉法による結合分析。ｂＮＡｂおよび非ＮＡｂへのＨＩＶ−１抗原およびナノ粒子の結合の動力学を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６装置（ｆｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定した。全てのアッセイは、１０００ｒｐｍに設定された攪拌下で、ｆｏｒｔｅＢＩＯ  １×動力学的バッファー中で行った。全ての溶液の最終体積は２００μｌ／ウェルであった。アッセイは、固体黒色９６ウェルプレート（Ｇｅｉｇｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）において、３０℃で行った。抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサー（ＡＨＣ）の表面上に抗体を３００秒間ローディングするために、１×動力学的バッファー中の５μｇ／ｍｌのタンパク質を使用した。６０秒間のバイオセンサーベースライン工程を適用した後、溶液中でのバイオセンサー上の抗体とＥｎｖ三量体との結合を２００秒間にわたり分析した。試験抗原の２倍濃度勾配を６滴定系列において用いた。相互作用の解離を３００秒間追跡した。抗体がローディングされたが三量体と共にインキュベートされなかったセンサー、または抗体を含有しないが三量体と共にインキュベートされたセンサーに関して記録された平均シフトを差し引くことにより、基線（ベースライン）変動の補正を行った。ｆｏｒｔｅＢｉｏのデータ収集ソフトウェアｖ．８．１でＯｃｔｅｔデータを処理した。ＫＤ値および他の動力学的パラメータを決定するために、グローバルフィット１：１モデルを用いて、実験データをＶ１Ｖ２頂点指向性ｂＮＡｂにフィットさせた。
【０１３４】
実施例１５  三量体特性を改善するためのｇｐ４１ドメインの更なる修飾
本発明者らは、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖの準安定性には、準安定性の主要原因であるヘプタド領域１（ＨＲ１）のＮ末端ベンドに加えて、ｇｐ４１内の他の領域も寄与すると仮定している。これは、２つの異なる実施において実現されうるマスター仮説である。
【０１３５】
第１の実施においては、多様なＨＩＶ−１株または亜型のｇｐ４１ドメインを置換して、ＢＧ５０５  ＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体と同じ高い収率、純度および安定性を有する「キメラ」ｇｐ１４０三量体（「ＵＦＯ−ＢＧ」と称される）を得るために、再設計ＨＲ  Ｎ末端ベンドと切断部位リンカーとを含有するＢＧ５０５  ｇｐ４１ドメインが使用されうる、と本発明者らは仮定する。ｇｐ１２０ドメインはＥｎｖエピトープの大部分をコードしており、したがって、ＨＩＶ−１株またはサブタイプの同一性を定めるため、そのような「キメラ」ｇｐ１４０三量体は野生型（ＷＴ）ｇｐ１４０三量体に抗原的に類似しているが、有意に改善した収率、純度および安定性を有する。この仮説を検証するために、世界中の種々の地理的領域における循環ＨＩＶ−１分離体の大部分を含む、５つの多様なクレード（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｂ’／ＣおよびＡ／Ｅ）の１０個のＨＩＶ−１株を選択した。これらの１０個のＨＩＶ−１株には、ＢＧ５０５（クレードＡ、第２層）、Ｑ８４２−ｄ１２（クレードＡ、第２層）、６２４０．０８．ＴＡ５．４６２２（クレードＢ、第２層）、Ｈ０７８．１４（クレードＢ、第３層）、Ｄｕ１７２．１７（クレードＣ、第２層）、１６０５５−２．３（クレードＣ、第２層）、ＣＮ５４（クレードＢ’／Ｃ、未知の層）、ＣＨ１１５．１２（クレードＢ’／Ｃ、第３層）、９５ＴＮＩＨ０２２（クレードＡ／Ｅ、未知の層）および９３ＪＰ ＮＨ１（クレードＡ／Ｅ、未知の層）が含まれる。実際、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６００  Ｈｉ−Ｌｏａｄカラム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）から得られたプロファイルは、多様なＨＩＶ−１株に由来するＵＦＯ−ＢＧ三量体の例外的な純度を示した。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、更に、ｇｐ４１ドメインを交換することなく野生型（ＷＴ）ｇｐ１４０三量体に広範に類似したパターンを示す、１１個の広範中和性抗体（ｂＮＡｂ）および８個の非ＮＡｂのパネルに対するこれらの１０個のＵＦＯ−ＢＧ三量体の抗原プロファイルを測定した。１０個のＵＦＯ−ＢＧ三量体のネガティブ染色ＥＭ分析は、産生されたＥｎｖタンパク質の８０〜１００％が天然様ｇｐ１４０三量体に相当することを示した。最後に、クレードＢ、第３層株Ｈ０７８．１４のＵＦＯ−ＢＧ  ｇｐ１４０三量体の結晶構造が決定され、そのようなキメラｇｐ１４０設計の構造的完全性が確認された。
【０１３６】
第２の実施においては、多様なＨＩＶ−１株または亜型をｇｐ４１ドメインを置換して、改善された収率、純度および抗原性を有する「キメラ」ｇｐ１４０三量体（「ＵＦＯ−Ｕ」と称される）を得るために、再設計ＨＲ１  Ｎ末端ベンドと切断部位リンカーとを含有するＨＩＶ−１配列データベースに由来する「普遍的」（または「コンセンサス」）ｇｐ４１ドメインが使用されうる、と本発明者らは仮定する。そのような普遍的（またはコンセンサス）ｇｐ４１は、全てのＨＩＶ−１配列（ＵＦＯ−ＵＡＬＬ）のデータベース、または特定のＨＩＶ−１亜型（例えば、ＵＦＯ−ＵＡ、−ＵＢ、−ＵＣ、−ＵＢＣおよび−ＵＡＥ）に属するＨＩＶ−１配列のデータベースから計算されうる。これらのデータベース、および「コンセンサス」配列を得るためのそれらの使用は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｋｏｔｈｅら，Ｖｉｒｏｌ．３５２：４３８−４４９，２００６；およびＫｏｒｂｅｒら，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔ．５８：１９−４２，２００１を参照されたい。この設計戦略の有効性を実証するために、５つの代表的なＨＩＶ−１株（それぞれは、異なるクレード由来である）を選択して、ＵＦＯ−ＵＡＬＬ三量体を特徴づけした。ＵＦＯ−ＢＧ三量体に類似して、本発明者らは、ＵＦＯ−ＵＡＬＬ三量体に関して、ｇｐ４１ドメインの交換を伴わない野生型（ＷＴ）ｇｐ１４０三量体と比較して改善されたＳＥＣプロファイルおよびＢＬＩ抗体結合プロファイルを観察した。選択されたＵＦＯ−ＵＡＬＬ三量体のネガティブ染色ＥＭ分析は、産生されたＥｎｖタンパク質の９０〜１００％が天然様ｇｐ１４０三量体に対応することを示した。
【０１３７】
実施例１６  バクテリオファージＱβウイルス様粒子上のＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体の提示
バクテリオファージＱβは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に感染しうる、２５ｎｍの直径を有する正二十面体ウイルスである。Ｑβ由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザ（第Ｉ相）、アレルギー性鼻炎および喘息（第ＩＩ相、ＮＣＴ００８９０７３４）、悪性黒色腫（第ＩＩ相、ＮＣＴ００６５１７０３）、アルツハイマー病（第ＩＩ相、ＮＣＴ０１０９７０９６）、高血圧（ＮＣＴ００５００７８６）、ニコチン中毒（第ＩＩ相、ＮＣＴ０１２８０９６８）およびＩＩ型糖尿病（第Ｉ相、ＮＣＴ００９２４１０５）に対するワクチン開発において外来抗原を提示させるための多価担体として使用されている。臨床試験はヒトにおけるその安全性および免疫原性を実証している。Ｑβ  ＶＬＰは１８０個の同一サブユニットから構成され、原則として６０個のＨＩＶ−１  ｇｐ４１三量体を提示しうる。しかし、構造モデリングは、６０個のｇｐ１４０三量体を収容するのに十分なスペースがＶＬＰ表面上にない可能性があることを示唆した。表面密度を減少させるために、本発明者らは、短いグリシン−セリン（ＧＳ）リンカーで２つのＱβサブユニットを共有結合させることにより、Ｑβ  ＶＬＰを操作した。本発明者らは更に、哺乳類細胞におけるＱβ  ＶＬＰの集合に影響を及ぼしうる内向きのグリコシル化部位を除去した。ついで、Ｔ４ファージヘッドフィブリチン（ＰＤＢ識別子：４ＮＣＶ、４ＮＣＷ、４ＮＣＵ、１ＲＦＯ）の三量体フォールドンを、ＵＦＯ  ｇｐ１４０と操作Ｑβサブユニットとを連結する「首」として含めた。得られた構築物は、哺乳類細胞において発現されると、各粒子上に３０個のＵＦＯ  ｇｐ１４０三量体を提示する安定なＶＬＰへと集合した。
【０１３８】
このように、本発明は、前記の代表的な実施形態を参照して広範に開示されており、例示されている。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の修飾が施されうると理解される。
【０１３９】
本明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願の全体を、それぞれが個々にそのように示されている場合と同様に、あらゆる目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れることに更に留意されたい。参照により本明細書に組み入れられる本文に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する場合には除外される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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