(57)【要約】  本開示は、遺伝子改変細胞を含む組換えタンパク質発現系であって、遺伝子改変細胞が、遺伝子コードにおける遺伝子縮重のための塩基ミスマッチを低減させるためにｔＲＮＡ遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされている、発現系に関する。【選択図】図８
2019500875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写カセットを含む核酸分子でのトランスフェクションまたは形質転換により改変された単離された真核細胞であって、前記転写カセットが、トランスファーＲＮＡ［ｔＲＮＡ］をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、前記ｔＲＮＡが、真核細胞にないアンチコドンヌクレオチド配列を含み、前記アンチコドン配列が、対応するメッセンジャーＲＮＡ［ｍＲＮＡ］コドンにおける同族の第１、第２または第３のヌクレオチド位置のいずれか１つで塩基ミスマッチを修正して、翻訳効率を改善し、および／または遺伝子コードの縮重の結果としてのアミノ酸誤取り込みを減少させる、単離された真核細胞。
【請求項２】
前記塩基ミスマッチ修正が、前記細胞の前記ｍＲＮＡの翻訳中のゆらぎに対する依存を低減する、請求項１に記載の単離された真核細胞。
【請求項３】
前記ｔＲＮＡが、前記対応するｍＲＮＡコドンにおける前記第１、第２または第３のヌクレオチド位置における塩基ミスマッチを修正する、請求項１または２に記載の単離された真核細胞。
【請求項４】
前記核酸分子が、前記ｔＲＮＡの真核生物発現に適合された発現ベクターの部分である、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項５】
組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸分子での形質転換またはトランスフェクションによりさらに改変されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項６】
前記発現ベクターが、哺乳動物細胞における発現に適合されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項７】
前記発現ベクターが、真菌細胞における発現に適合されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項８】
前記発現ベクターが、昆虫細胞における発現に適合されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項９】
前記発現ベクターが、植物細胞における発現に適合されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１０】
昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１１】
単離された前記哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の単離された真核細胞。
【請求項１２】
単離された前記哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣［ＣＨＯ］、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０またはＣＡＰ細胞からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の単離された真核細胞。
【請求項１３】
前記真菌細胞が、酵母：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された真核細胞。
【請求項１４】
前記発現カセットが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の異なるｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１５】
前記核酸が、Ａｌａ−ｔＲＮＡ、Ａｒｇ−ｔＲＮＡ、Ａｓｐ−ｔＲＮＡ、Ａｓｎ−ｔＲＮＡ、Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡ、Ｇｌｎ−ｔＲＮＡ、Ｇｌｙ−ｔＲＮＡ、Ｈｉｓ−ｔＲＮＡ、Ｉｌｅ−ｔＲＮＡ、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡ、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡ、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ、Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ、Ｐｒｏ−ｔＲＮＡ、Ｓｅｒ−ｔＲＮＡ、Ｔｈｒ−ｔＲＮＡ、Ｔｒｐ−ｔＲＮＡ、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡおよびＶａｌ−ｔＲＮＡの群から選択されるトランスファーＲＮＡをコードする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１６】
前記アンチコドンが、シトシンおよび／またはアデニンを多く含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１７】
前記アンチコドンが、ウラシルを含まない、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１８】
前記アンチコドンが、ＡＧＣ、ＧＧＣ、ＣＧＣ、ＵＧＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＣＣＣ、ＵＣＣ、ＡＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧ、ＵＧＧ、ＡＧＵ、ＧＧＵ、ＣＧＵ、ＵＧＵ、ＡＡＣ、ＧＡＣ、ＣＡＣ、ＵＡＣ、ＡＡＡ、ＧＡＡ、ＡＵＵ、ＧＵＵ、ＣＵＵ、ＵＵＵ、ＡＵＣ、ＧＵＣ、ＣＵＣ、ＵＵＣ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＣＧＡ、ＵＧＡ、ＡＣＵ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＧＣＧ、ＣＣＧ、ＵＣＧ、ＣＣＵ、ＵＣＵ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、ＵＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＵ、ＵＡＵ、ＣＡＵ、ＡＵＡ、ＧＵＡ、ＡＣＡ、ＧＣＡ、ＡＵＧ、ＧＵＧ、ＣＵＧ、ＵＵＧ、ＣＣＡからなる群から選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項１９】
前記改変細胞が、治療用抗体をコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされている、請求項１から１８のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項２０】
前記改変細胞が、医薬または治療用タンパク質またはペプチドをコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされている、請求項１から１８のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項２１】
前記改変細胞が、工業用酵素をコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされている、請求項１から１８のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項２２】
前記改変細胞が、７ＳＬヌクレオチド配列を含む核酸分子での形質転換またはトランスフェクションによりさらに改変されている、請求項１から２１のいずれか一項に記載の単離された真核細胞。
【請求項２３】
前記核酸分子が、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列または配列番号１０で示されるヌクレオチド配列に全長にわたり少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列バリアントを含む、請求項２２に記載の単離された真核細胞。
【請求項２４】
前記核酸分子が、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項２３に記載の単離された真核細胞。
【請求項２５】
組換えタンパク質の生成における遺伝子コードの縮重の結果としてのｔＲＮＡミスマッチを低減することにおける使用のための請求項１から２４のいずれか一項に記載の改変細胞。
【請求項２６】
ｔＲＮＡミスマッチにおける前記低減が、前記改変細胞による前記ｍＲＮＡの翻訳中の前記細胞のゆらぎへの依存を低減させる、請求項２５に記載の改変細胞。
【請求項２７】
遺伝子コードの縮重の結果としてのｔＲＮＡミスマッチを低減させるための方法であって、
ｉ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の改変細胞を提供するステップ、
ｉｉ）前記改変細胞により発現される１つまたは複数の組換えタンパク質／ペプチドの発現に好適な細胞培養条件下でｉ）の前記細胞をインキュベートするステップ、および任意で
ｉｉｉ）前記改変細胞または細胞培養培地から、発現した組換えタンパク質／ペプチドを単離するステップ
を含む、方法。
【請求項２８】
細胞発現系における選択された組換えタンパク質の発現をカスタマイズする方法であって、
ｉ）発現させようとする組換えタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を分析して、１つまたは複数のコドン／アンチコドンｔＲＮＡミスマッチを特定するステップ、
ｉｉ）少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つの塩基対形成ミスマッチを修正する１つまたは複数のｔＲＮＡ遺伝子を含む１つまたは複数の転写カセットで細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、改変細胞を提供するステップ、
ｉｉｉ）発現させようとする前記組換えタンパク質で前記改変細胞をトランスフェクトまたは形質転換するステップ、および任意で
ｉｖ）前記組換えタンパク質を発現するための細胞培養条件を提供するステップ
を含む、方法。
【請求項２９】
前記細胞が、真核細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞または植物細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、原核細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記原核細胞が、細菌細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法により得られるか、または得ることができる改変細胞。
【請求項３４】
請求項１から２５または３３のいずれか一項に記載の改変細胞を含む細胞培養容器。
【請求項３５】
前記細胞培養容器が、発酵槽のようなバイオリアクターである、請求項３４に記載の容器。
【請求項３６】
組換えタンパク質のカスタマイズされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の方法であって、
ｉ）発現させようとする組換えタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を分析して、１つまたは複数のコドン／アンチコドンｔＲＮＡミスマッチを特定するステップ、
ｉｉ）前記組換えタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡ中の少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つの塩基対形成ミスマッチを修正する１つまたは複数のｔＲＮＡを含む反応混合物を提供するステップ、および
ｉｉｉ）前記ｍＲＮＡからの前記組換えタンパク質の合成のための反応条件を提供するステップ
を含む、方法。
【請求項３７】
前記反応混合物が、発現ベクターおよびＲＮＡポリメラーゼを含み、前記方法が、組合せ転写／翻訳反応である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
１つまたは複数のｔＲＮＡ遺伝子を含む発現ベクター、任意で
１つまたは複数の組換え核酸分子を受容するように適合した発現ベクター、ならびに
サブクローニングおよび／またはトランスフェクション／形質転換に必要な酵素および緩衝液
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、遺伝子改変細胞を含む組換えタンパク質発現系であって、遺伝子改変細胞が、遺伝子コードにおける遺伝子縮重のための塩基ミスマッチ、したがって解読のためのゆらぎに対する依存を低減させるためにｔＲＮＡ遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされている、発現系に関し、改変細胞は、そのようにして改善された組換えタンパク質発現を有する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のアミノ酸組成は、それらの特性を決定し、遺伝子のＤＮＡ配列によりコードされる。遺伝子配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に複製され、特定の順序でアミノ酸を送達するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を使用して解読される。コードは、コドンと呼ばれる連続した三つ組塩基で書かれ、アンチコドンと呼ばれるｔＲＮＡの相補的塩基三つ組に結合することにより解読される。各ｔＲＮＡは、単一のアンチコドンを有し、特定のアミノ酸を送達する。しかしながら、ＤＮＡに存在する４つの塩基の組合せから６４個のコドンが提供されるが、それより少ないｔＲＮＡおよびアンチコドンしか存在しない。
【０００３】
ＤＮＡは、４つの異なる塩基を含み、アデノシンはチミンに特異的に結合し、グアニンはシトシンに特異的に結合する。全ての生物は、コドンより少ない種類のｔＲＮＡしか有さず、それゆえ、一部のｔＲＮＡ種は、１つを超えるコドンと対形成しなければならず、このことは、ｍＲＮＡ上の３’塩基に結合するアンチコドン上の５’塩基は、３つの塩基のうちの２つのみが最適にマッチする非標準塩基対形成を有し得ると仮定する「ゆらぎ」説をもたらした。最適以下の塩基対形成は、翻訳に際して誤取り込みエラーをもたらし得る。最も頻繁に起こるエラーは、翻訳中のＧ（ｍＲＮＡ）／Ｕ（ｔＲＮＡ）塩基対ミスマッチおよび追加のゆらぎ位置ミスマッチ（Ｃ／ＵおよびＵ／Ｕ）に対応する。
【０００４】
組換えタンパク質の異種発現は、豊富な診断剤および治療剤を提供した。多くの場合、細菌系は、維持に手間がかからず取り扱いが容易なためにタンパク質発現の好ましい宿主である。しかしながら、翻訳後改変に適応できないために、他の発現系、例えば酵母、昆虫細胞、植物または哺乳動物発現系の利用がもたらされた。約７０％の組換えタンパク質医薬および予防接種、ヒトの治療または診断に使用されるタンパク質ほとんどのタンパク質の大半が現在、哺乳動物細胞または細胞株、例えばＣＨＯまたはＨＥＫ２９３で生成されている。しかしながら、発現系の選択は発現を補助するが、それでも臨床開発中にＣＨＯ細胞で治療用モノクローナル抗体を発現する場合に報告される顕著な誤取り込みレベルがある。かかる配列変動の影響は、質および効率に影響するだけでなく、免疫原性応答を誘発することにより患者の安全性を損ない得る。
【０００５】
エラーのない、可溶性タンパク質発現をもたらす最適なタンパク質発現系が強く求められている。上記に説明するように、完全な組のｔＲＮＡを持つ生物はなく、さらに、種依存的差異がある。細菌系における例えばヒト由来導入遺伝子の発現は多くの場合、コドンの利用および頻度が大きく異なり、非効率的な発現をもたらし得るので、問題がある。この問題は一般的に、発現宿主に好ましいコドン利用にコドンを最適化することにより対処される。しかしながら、導入遺伝子配列の操作は、コードされるｍＲＮＡ転写産物の構造、折畳み、安定性および調節を、理解が不十分で予測が極めて難しい様式で妨害することから、非常に問題がある。代替のアプローチは、コドン認識を改善するために宿主に追加のｔＲＮＡ導入遺伝子を導入することであり、これはＥ．ｃｏｌｉで成功して使用されているが、真核生物宿主では試みられていない。加えて、このアプローチは、ゆらぎに関連する問題、例えば非効率的な翻訳および翻訳忠実度の低減には対処しない。
【０００６】
本開示は、さもなくばゆらぎに依存するコドンを最適にマッチさせるために、アンチコドンを有するｔＲＮＡ遺伝子を導入することに関し、このようにして、意図されない不均質性を低減することができ、タンパク質合成の効率を改善することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様によれば、転写カセットを含む核酸分子でのトランスフェクションまたは形質転換により改変された単離された真核細胞を提供することであって、上記転写カセットが、トランスファーＲＮＡ［ｔＲＮＡ］をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、上記ｔＲＮＡが、真核細胞にないアンチコドンヌクレオチド配列を含み、上記アンチコドン配列が、対応するメッセンジャーＲＮＡ［ｍＲＮＡ］コドンにおける同族の第１、第２または第３のヌクレオチド位置のいずれか１つで塩基ミスマッチを修正して、翻訳効率を改善し、および／または遺伝子コードの縮重の結果としてのアミノ酸誤取り込みを減少させる、
が提供される。
【０００８】
本発明の代替の態様では、上記細胞は原核細胞である。本発明の好ましい実施形態では、上記塩基ミスマッチ補正は、上記ｍＲＮＡの翻訳中の上記細胞のゆらぎへの依存を低減させる。
【０００９】
「ゆらぎ」は、周知の自然現象である。遺伝子コードは、細胞が、使用可能な６１個のコドンを補完する６１個の異なるアンチコドンを有するｔＲＮＡを必要とし得ることを意味する。しかしながら、遺伝子コードの縮重のために、第３の塩基は、他の２つの塩基よりアミノ酸の識別性が低い。コドン中のこの第３の位置は、「ゆらぎ」位置と呼ばれる。この位置では、ＵおよびＣは、アンチコドン中でＧと読まれ得る。同様に、ＡおよびＧは、アンチコドン中でＵまたはｙ（プソイドウリジン）と読まれる場合があり、Ａ、ＵまたはＣは、アンチコドン中でイノシンと読まれる場合がある。コドン認識におけるこの融通性は、あまり効率的でない翻訳およびアミノ酸の誤取り込みの可能性をもたらし得る。本発明は、翻訳を向上させ、かつ翻訳忠実度を増大させるために「ゆらぎ」への依存を低減させるように細胞を遺伝子組み換えすることにより、これらの問題に取り組む。本発明に記載の転写カセットは、上記ｔＲＮＡの発現に適合される。これは、好適なＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの供給を含む。あるいは、転写カセットは、好適なプロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに近い位置で上記細胞のゲノムに統合することができる。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、上記ｔＲＮＡは、対応するｍＲＮＡコドンの第１、第２または第３のヌクレオチド位置で塩基ミスマッチを修正する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、上記核酸分子は、上記ｔＲＮＡの真核生物発現に適合させた発現ベクターの部分である。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、上記細胞は、組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸分子での形質転換またはトランスフェクションによりさらに改変されている。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、上記発現ベクターは、哺乳動物細胞での発現に適合する。
【００１４】
典型的に、上記調整は、細胞／組織特異的発現を仲介する転写制御配列（プロモーター配列）の供給を含む。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的、誘導性または構成的であってもよい。「プロモーター」は、本分野で理解されている用語であり、明確に述べると、例としてのみ提供する以下の特色を含む。エンハンサーエレメントは、多くの場合遺伝子の転写開始部位の５’で見られるシス作用ヌクレオチド配列である（また、エンハンサーは、遺伝子配列の３’で見られるか、またはイントロン配列に位置することさえもあり得る）。エンハンサーは、エンハンサーが連結する遺伝子の転写率を増大するように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用転写因子（ポリペプチド）に応答性である。転写因子の結合／活性は、例として、限定の目的ではなく、中間代謝産物（例えばグルコース、脂質）、環境因子（例えば熱）を含むいくつかの生理学的／環境的キューに応答性である。また、プロモーターエレメントは、転写開始の部位を選択するように機能する、いわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択配列を含む。また、これらの配列は、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドに結合する。ベクターは、多数の宿主で機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合、これは、それ自体のプロモーターまたは他の調節エレメントを含有する場合があり、ｃＤＮＡの場合、これは、宿主細胞での発現のための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり得る。
【００１５】
また、その調整は、真核細胞または原核生物宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を促進する、選択可能マーカーおよび自律的複製配列の供給を含む。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと呼ばれる。これらの分子は大きなＤＮＡ断片（３０〜５０ｋｂ  ＤＮＡ）を組み込むことができるので、エピソームベクターは望ましい。この種類のエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６号で説明されている。あるいは、ベクターは、統合ベクターが組み込まれる細胞を安定に形質転換するための、染色体ＤＮＡと組み換える「統合ベクター」であってもよい。
【００１６】
組換え遺伝子をコードしたベクターの発現を促進する調整は、転写終止／ポリアデニル化配列の供給を含む。また、これは、二シストロン性または多シストロン性発現カセットに配置された、ベクターにコードされた遺伝子の発現を最大限にするように機能する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）の供給を含む。また、発現制御配列は、いわゆる遺伝子座調節領域（ＬＣＲ：Ｌｏｃｕｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｇｉｏｎ）を含む。これらは、トランスジェニック構築物として評価される場合、連結される遺伝子に位置非依存的な、コピー数依存的発現を与える調節エレメントである。ＬＣＲは、導入遺伝子を隣接するヘテロクロマチンのサイレンシング効果から保護する調節エレメントを含む（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、Ｃｅｌｌ（１９８７）、５１：９７５〜９８５）。一般的な発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技術についてのかなりの量の既刊文献がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ  ＩＩＩ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ  Ｍ  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。
【００１７】
加えて、いくつかのウイルスは通常、外因性遺伝子の送達のためのベクターとして使用される。通常使用されるベクターは、組換え改変エンベロープまたは無エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科またはピコルナウイルス科から選択される。また、親ベクター特性の各々の有利なエレメントを利用するキメラベクターを使用してもよい（例えばＦｅｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８６６〜８７０を参照のこと）。かかるウイルスベクターは野生型であってもよく、または複製欠損、条件付き複製もしくは複製可能となるように組換えＤＮＡ技術により改変してもよい。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、上記発現ベクターは、真菌細胞における発現に適合する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、上記発現ベクターは、昆虫細胞における発現に適合する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、上記発現ベクターは、植物細胞における発現に適合する。
【００２１】
植物細胞における組換えタンパク質またはｔＲＮＡの発現に好適なプロモーターは、植物細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導型、発生的または他のプロモーターを含む。かかるプロモーターは、植物細胞で機能することができるウイルス、真菌、細菌、動物および植物由来プロモーターを含む。構成的プロモーターは、例えばＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３、９８１０〜８１２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８（６７５〜６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら（１９９１）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３．２７２３〜２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許出願第０８／４０９，２９７号）などを含む。他の構成的プロモーターは、米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号および同第５，６０８，１４２号中のものを含み、これらの特許の各々は参照により組み込まれる。
【００２２】
化学物質調節植物プロモーターは、外因性化学物質レギュレーターの適用を通して、植物細胞において遺伝子の発現を調節するために使用することができる。目的によって、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学物質誘導性プロモーターであってもよく、または化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学物質抑制性プロモーターであってもよい。化学物質誘導性プロモーターは、植物トランスジェニック発現の分野で既知であり、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤により活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、出現前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物により活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーターおよびサリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の目的の化学物質調節植物プロモーターは、ステロイド応答性プロモーター（例えばＳｃｈｅｎａら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１〜１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７〜２５７のグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照のこと）ならびにテトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えばＧａｔｚら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９〜２３７ならびに米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照のこと）を含み、これらの文献および特許は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
特定の組織での向上した発現が所望される場合、組織特異的プロモーターを利用することができる。組織特異的プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５〜２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２〜８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７〜３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７〜１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１〜１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５〜５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｎｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３〜５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３〜７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１〜１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９〜１１３８；Ｍｕｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６〜９５９０；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５〜５０により説明されているものを含む。
【００２４】
本発明の状況において特に興味深いものは、植物ベクターとして作動する核酸構築物である。以前に植物において広範に成功して使用されている特定の手技およびベクターは、ＧｕｅｒｉｎｅａｕおよびＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３）（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ  ＲＲＤ編）Ｏｘｆｏｒｄ中のＰｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１２１〜１４８頁）により説明されている。好適なベクターは、植物ウイルス由来ベクターを含み得る（例えばＥＰ１９４８０９を参照のこと）。所望の場合、選択可能な遺伝子マーカー、例えば選択可能な表現型、例えば除草剤（例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノンおよびグリホセート）に対する抵抗性を与えるものを構築物に含めることができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、上記単離された真核細胞は、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、上記単離された哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。
【００２７】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記単離された哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣［ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ］、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０またはＣＡＰ細胞からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記真菌細胞は、酵母：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属［例えばＡ．ｎｉｇｅｒ］、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓならびにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａからなる群から選択される。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、上記植物細胞は、群：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ属）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕａｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（ｌｏｐｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ属）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類樹（Ｃｉｔｒｕｓ属）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｅｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ属）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、オート、オオムギ、野菜および観賞植物から選択される植物種から単離される。
【００３０】
好ましくは、本発明の植物細胞は、作物植物（例えば穀物および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、コメ、モロコシ、キビ、キャッサバ、オオムギ、エンドウならびに他の根、塊茎または種子作物）である。重要な種子作物は、アブラナ、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズおよびモロコシである。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、ならびにキャベツ、ブロッコリーおよびカリフラワーを含むアブラナ属の野菜；ならびにカーネーションおよびゼラニウムを含み得る。本発明は、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、コショウ、キクで適用され得る。目的の種子を提供する穀物植物は、油料種子植物およびマメ科植物を含む。目的の種子は、穀物種子、例えばトウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、ライムギなどを含む。油料種子植物は、綿、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツなどを含む。マメ科植物は、マメ類およびエンドウを含む。マメ類は、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ（ｇａｒｄｅｎ  ｂｅａｎ）、ササゲ、リョクトウ、アオイマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメを含む。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記発現カセットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のさまざまなｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、上記核酸は、Ａｌａ−ｔＲＮＡ、Ａｒｇ−ｔＲＮＡ、Ａｓｐ−ｔＲＮＡ、Ａｓｎ−ｔＲＮＡ、Ｃｙｓ−ｔＲＮＡ、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡ、Ｇｌｎ−ｔＲＮＡ、Ｇｌｙ−ｔＲＮＡ、Ｈｉｓ−ｔＲＮＡ、Ｉｌｅ−ｔＲＮＡ、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡ、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡ、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ、Ｐｈｅ−ｔＲＮＡ、Ｐｒｏ−ｔＲＮＡ、Ｓｅｒ−ｔＲＮＡ、Ｔｈｒ−ｔＲＮＡ、Ｔｒｐ−ｔＲＮＡ、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡおよびＶａｌ−ｔＲＮＡの群から選択されるトランスファーＲＮＡをコードする。
【００３３】
好ましい実施形態では、上記アンチコドンは、シトシンおよび／またはアデニン含量が高い。
【００３４】
好ましい実施形態では、上記アンチコドンは、ウラシルを含まない。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、上記アンチコドンは、ＡＧＣ、ＧＧＣ、ＣＧＣ、ＵＧＣ、ＡＣＣ、ＧＣＣ、ＣＣＣ、ＵＣＣ、ＡＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧ、ＵＧＧ、ＡＧＵ、ＧＧＵ、ＣＧＵ、ＵＧＵ、ＡＡＣ、ＧＡＣ、ＣＡＣ、ＵＡＣ、ＡＡＡ、ＧＡＡ、ＡＵＵ、ＧＵＵ、ＣＵＵ、ＵＵＵ、ＡＵＣ、ＧＵＣ、ＣＵＣ、ＵＵＣ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＣＧＡ、ＵＧＡ、ＡＣＵ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＧＣＧ、ＣＣＧ、ＵＣＧ、ＣＣＵ、ＵＣＵ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、ＵＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＵ、ＵＡＵ、ＣＡＵ、ＡＵＡ、ＧＵＡ、ＡＣＡ、ＧＣＡ、ＡＵＧ、ＧＵＧ、ＣＵＧ、ＵＵＧ、ＣＣＡからなる群から選択される。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、上記改変細胞は、治療用抗体をコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされている。
【００３７】
本発明の代替の実施形態では、上記改変細胞は、医薬または治療用タンパク質またはペプチドをコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされている。
【００３８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、上記改変細胞は、工業用酵素をコードする核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされている。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、上記改変細胞は、７ＳＬヌクレオチド配列を含む核酸分子での形質転換またはトランスフェクションによりさらに改変されている。
【００４０】
分泌型タンパク質および膜タンパク質は、小胞体へ分泌されるために標的タンパク質が必要とするシグナル配列を含有する。分泌が予定された天然および組換えタンパク質のシグナル配列は、６個の異なるタンパク質およびおよそ３００ヌクレオチドの７ＳＬ ＲＮＡと呼ばれる構造的ＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体であるシグナル認識粒子と相互作用する。７ＳＬ ＲＮＡは、種間で保存されており、配列同一性のレベルではほとんどホモロジーがないが、２つの小ステムループ構造により１つの末端に、さらに２つの比較的大きなステムループ構造により他方の末端に隣接する中心二重鎖領域を含む７ＳＬ ＲＮＡの二次構造は、高度に保存されている。本発明者らは、当該改変細胞における７ＳＬ核酸の共発現が、組換えタンパク質の発現を大いに向上させることを開示する。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、上記核酸分子は、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列または配列番号１０で示されるヌクレオチド配列に全長にわたり少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列バリアントを含む。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列に全長にわたり少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００４３】
好ましくは、上記核酸分子は、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、翻訳効率は、同じ種の非改変細胞と比較すると、１倍超向上されている。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、翻訳効率は、同じ種の非改変細胞と比較すると、少なくとも２倍向上されている。
【００４６】
好ましくは、翻訳効率は、同じ種の非改変細胞と比較すると、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または少なくとも１０倍向上されている。好ましくは、翻訳は、同じ種の非改変細胞と比較すると、１０倍超向上されている。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、上記組換えタンパク質のアミノ酸の誤取り込みは、同じ種の非改変細胞におけるアミノ酸誤取り込み率と比較すると、１分の１より低く抑制されている。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、上記組換えタンパク質のアミノ酸の誤取り込みは、同じ種の非改変細胞におけるアミノ酸誤取り込み率と比較すると、少なくとも２分の１に抑制されている。
【００４９】
好ましくは、誤取り込みは、同じ種の非改変細胞におけるアミノ酸誤取り込み率と比較すると、少なくとも３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、３５分の１または少なくとも４０分の１に抑制されている。
【００５０】
本発明の一態様に従って、組換えタンパク質の生成における遺伝子コードの縮重の結果としてのｔＲＮＡミスマッチを低減させることにおける使用のための、本発明に記載の改変細胞が提供される。
【００５１】
好ましくは、上記ｔＲＮＡミスマッチの低減は、上記改変細胞による上記ｍＲＮＡの翻訳中の上記細胞のゆらぎへの依存を低減させる。
【００５２】
本発明のさらなる態様によれば、遺伝子コードの縮重の結果としてのｔＲＮＡミスマッチを低減させる方法を提供することであって、
ｉ）本発明に記載の改変細胞を提供するステップ、
ｉｉ）上記改変細胞により発現される１つまたは複数の組換えタンパク質／ペプチドの発現に好適な細胞培養条件下でｉ）の細胞をインキュベートするステップ、および任意選択で
ｉｉｉ）改変細胞または細胞培養培地から、発現した組換えタンパク質／ペプチドを単離するステップ
を含む、方法が提供される。
【００５３】
本発明のさらなる態様によれば、細胞発現系における選択された組換えタンパク質の発現をカスタマイズする方法を提供することであって、
ｉ）発現させようとする組換えタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を分析して、１つまたは複数のコドン／アンチコドンｔＲＮＡミスマッチを特定するステップ、
ｉｉ）少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つの塩基対形成ミスマッチを修正する１つまたは複数のｔＲＮＡ遺伝子を含む１つまたは複数の転写カセットで細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、改変細胞を提供するステップ、
ｉｉｉ）発現させようとする組換えタンパク質で上記改変細胞をトランスフェクトまたは形質転換するステップ、および任意選択で
ｉｖ）上記組換えタンパク質を発現するための細胞培養条件を提供するステップ
を含む、方法が提供される。
【００５４】
本発明の好ましい方法では、上記細胞は真核細胞である。
【００５５】
好ましくは、上記細胞は、哺乳動物細胞、真菌細胞、昆虫細胞または植物細胞である。
【００５６】
本発明の代替の好ましい方法では、上記細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞である。
【００５７】
本発明の一態様によれば、本発明に記載の方法により得られるか、または得ることができる改変細胞が提供される。
【００５８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明に記載の改変細胞を含む細胞培養容器が提供される。本発明の好ましい実施形態では、上記細胞培養容器は、発酵槽のようなバイオリアクターである。
【００５９】
真核微生物発現または原核生物発現が本発明に記載の方法で好ましい場合、それらを、宿主生物によって、当業者が精通している様式で生育または培養する。概して、微生物を、通常、糖の形態の炭素源；通常、酵母抽出物などの有機窒素源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態の窒素源；鉄、マンガンおよびマグネシウムの塩などの微量元素；ならびに適切な場合、ビタミンを含む液体培地中で、０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃の温度で、酸素供給しながら生育させる。
【００６０】
液体培地のｐＨは、一定に維持する、すなわち、培養期間中調節してもよく、またはそうでなくてもよい。培養物は、バッチ毎に、半バッチ毎にまたは連続して生育させてもよい。栄養素は、発酵の開始時に提供してもよく、または半連続的もしくは連続的に供給してもよい。生成される組換えタンパク質は、当業者に既知のプロセスにより、例えば抽出、適切な場合塩での沈殿および／またはクロマトグラフィーにより上記に説明するように生物から単離することができる。この目的のために、生物は有利に予め破壊することができる。
【００６１】
このプロセスでは、ｐＨ値は、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ６〜９、とりわけ好ましくはｐＨ７〜８に維持した。使用される培養培地は、当該株の必要条件を好適に満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）の教本「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」で見ることができる。
【００６２】
上記に説明するように、本発明に従って使用され得るこれらの培地は通常、１つまたは複数の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。好ましい炭素源は、糖、例えば単糖類、二糖類または多糖類である。炭素源の例は、グルコース、果糖、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。また、糖は、糖蜜または糖精製からの他の副生成物などの複合体化合物により培地に添加することができる。また、様々な炭素源の混合物の添加は、有利であり得る。他の可能性のある炭素源は、油および脂肪、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油および／もしくはココナッツ脂肪；脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸および／もしくはリノール酸；アルコールおよび／もしくは多価アルコール、例えばグリセロール、メタノールおよび／もしくはエタノール、ならびに／または有機酸、例えば酢酸および／もしくは乳酸である。
【００６３】
窒素源は通常、有機または無機窒素化合物またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例は、液体もしくは気体形態のアンモニアもしくはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸；または複合体窒素源、例えばコーンスティープリカー、ダイズミール、ダイズタンパク質、酵母抽出物、肉抽出物およびその他のものを含む。窒素源は、個々にまたは混合物として使用することができる。
【００６４】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リンおよび硫酸塩を含む。無機硫黄含有化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、四チオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物または他の有機硫黄化合物など、例えばメルカプタンおよびチオールは、硫黄含有精密化学品、特にメチオニンの生成のための硫黄の供給源として使用され得る。リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩は、リンの供給源として使用され得る。
【００６５】
また、微生物を培養するために本発明に従って使用される発酵培地は通常、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む、ビタミンまたは増殖プロモーターなどの他の増殖因子を含む。増殖因子および塩は多くの場合、複雑な培地構成成分、例えば酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどに由来する。さらに、培養培地に好適な前駆体を添加することが可能である。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、組換えタンパク質のカスタマイズされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の方法であって、
ｉ）発現させようとする組換えタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を分析して、１つまたは複数のコドン／アンチコドンｔＲＮＡミスマッチを特定するステップ、
ｉｉ）上記組換えタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび上記ｍＲＮＡ中の少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つの塩基対形成ミスマッチを修正する１つまたは複数のｔＲＮＡを含む反応混合物を提供するステップ、および
ｉｉｉ）上記ｍＲＮＡからの上記組換えタンパク質の合成のための反応条件を提供するステップ
を含む、方法が提供される。
【００６７】
本発明の好ましい方法では、上記反応混合物は、発現ベクターおよびＲＮＡポリメラーゼを含み、上記方法は、組合せ転写／翻訳反応である。
【００６８】
本発明のさらなる態様によれば、
１つまたは複数のｔＲＮＡ遺伝子を含む発現ベクター、任意で
１つまたは複数の組換え核酸分子を受容するように適合した発現ベクター、ならびに
サブクローニングおよび／またはトランスフェクション／形質転換に必要な酵素および緩衝液
を含むキットが提供される。
【００６９】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む」および「含有する」という単語ならびにこれらの単語の変形、例えば「含むこと」および「含む」は、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味し、他の部分、補助剤、構成成分、要素（ｉｎｔｅｇｅｒ）またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。「から本質的になる」は、本質的な要素を有するが、これらの本質的な要素の機能に実質的に影響しない要素を含むことを意味する。
【００７０】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、文脈において別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不確定な物品が使用される場合、明細書は、文脈において別段の要求がない限り、複数形および単数形を企図すると理解されるべきである。
【００７１】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して説明される特色、要素、特徴、化合物、化学部分または基は、本明細書で説明する任意の他の態様、実施形態または実施例に、それらと不適合でない限り、適用可能であると理解されるべきである。
【００７２】
好ましい実施形態
抗体は、ポリクローナル、モノクローナル抗体、ＣＤＲを含むヒト化およびキメラ抗体ならびに由来断片を含む。
【００７３】
キメラ抗体は、マウスまたはラット抗体のＶ領域の全てをヒト抗体Ｃ領域と組み合わせた組換え抗体である。ヒト化抗体は、げっ歯類抗体Ｖ領域の相補性決定領域とヒト抗体Ｖ領域のフレームワーク領域とを融合した組換えハイブリッド抗体である。また、ヒト抗体のＣ領域が使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）は、Ｖ領域の変形の大部分が制限されている、抗体の重鎖および軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域である。これらの領域は、抗体分子の表面でループを形成する。これらのループは、抗体と抗原との間の結合表面を提供する。
【００７４】
非ヒト動物からの抗体は、外来性抗体への免疫応答および循環からのその除去を引き起こす。キメラおよびヒト化抗体の両方は、組換えハイブリッド抗体内に低減された量のげっ歯類（すなわち、外来性）抗体しかなく、一方でヒト抗体領域は免疫応答を誘発しないので、ヒト対象に注射されたとき低減した抗原性しか有しない。このことは、より弱い免疫応答および抗体のクリアランスにおける減少をもたらす。これは、ヒト疾患の治療において治療用抗体を使用する場合に、明らかに望ましい。ヒト化抗体は、より少ない「外来性」抗体領域を有するように設計され、それゆえキメラ抗体より免疫原性が低いと考えられる。
【００７５】
様々な抗体の断片は、本分野で既知である。Ｆａｂ断片は、共に共有結合し、かつ抗原に特異的に結合することができる、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質である。Ｆａｂ断片は、インタクトな免疫グロブリン分子の（例えばパパインでの）タンパク質溶解切断により発生する。Ｆａｂ２断片は、２つの接合したＦａｂ断片を含む。これらの２つの断片が免疫グロブリンヒンジ領域により接合される場合、Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆｖ断片は、共に共有結合し、かつ抗原に特異的に結合することができる、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなる多量体タンパク質である。また、断片は、１つの軽鎖可変領域のみを含有する単鎖ポリペプチドまたは軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片であって、関連付けられる重鎖可変領域または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を伴わず、関連付けられる軽鎖部分を伴わないもの；および抗体断片から形成される多特異性抗体であってもよく、これは例えば米国特許第６，２４８，５１６号で説明されている。Ｆｖ断片または単一領域（ドメイン）断片は典型的に、関連が特定された領域の、宿主細胞株における発現により発生する。これらおよび他の免疫グロブリンまたは抗体断片は、本発明の範囲内であり、標準の免疫学教本、例えばＰａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙまたはＪａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（上記に引用される）で説明されている。今や、分子生物学は、これらの断片の（細胞での発現による、または化学的な）直接合成およびこれらの組合せの合成を可能にする。また、抗体または免疫グロブリンの断片は、上記に説明するように二重特異性機能を有し得る。
【００７６】
医薬タンパク質およびペプチド
医薬タンパク質の例は、「サイトカイン」を含む。サイトカインは、いくつかの多様な細胞機能に関連する。これらは、免疫系の調節、エネルギー代謝の調節ならびに増殖および発達の制御を含む。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現される受容体を介してそれらの効果を仲介する。サイトカインの例として、インターロイキン、例えばＩＬ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２および３３が挙げられる。他の例として、成長ホルモン、レプチン、エリスロポエチン、プロラクチン、腫瘍壊死因子［ＴＮＦ：ｔｕｍｏｕｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ］、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ：ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１：ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）、白血病阻止因子（ＬＩＦ：ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ：ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンε、インターフェロンκおよびωインターフェロンが挙げられる。
【００７７】
薬学的に活性なペプチドの例として、ＧＬＰ−１、抗利尿ホルモン；オキシトシン；性腺刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン；カルシトニン、グルカゴン、アミリン、Ａ型ナトリウム利尿ホルモン、Ｂ型ナトリウム利尿ホルモン、グレリン、神経ペプチドＹ、神経ペプチドＹＹ３〜３６、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン；またはこれらのホモログもしくはアナログが挙げられる。
【００７８】
「ケモカイン」という用語は、分裂促進活性、走化活性または炎症活性を有する細胞により分泌される、一群の構造的に関連する低分子量因子を指す。それらは主に、４つの保存されたシステイン残基を共有する７０〜１００個のアミノ酸残基のカチオン性タンパク質である。これらのタンパク質は、２つのアミノ末端システインの間隔に基づいて、２つの群に分類することができる。第１の群では、２つのシステインは単一の残基により分離されており（Ｃ−ｘ−Ｃ）、一方で第２の群では、それらは隣接している（Ｃ−Ｃ）。「Ｃ−ｘ−Ｃ」ケモカインのメンバーの例として、血小板因子４（ＰＦ４：ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｆａｃｔｏｒ  ４）、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ：ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）、黒色腫増殖刺激活性タンパク質（ＭＧＳＡ：ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、マクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ−２：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、マウスＭｉｇ（ｍ１１９）、ニワトリ９Ｅ３（またはｐＣＥＦ−４）、ブタ肺胞マクロファージ走化性因子ＩおよびＩＩ（ＡＭＣＦ−Ｉおよび−ＩＩ：ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ）、プレＢ細胞増殖刺激因子（ＰＢＳＦ：ｐｒｅ−Ｂ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）ならびにＩＰ１０が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｃ−Ｃ」群のメンバーの例として、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１：ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、単球走化性タンパク質２（ＭＣＰ−２）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）、単球走化性タンパク質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１−α：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１−β）、マクロファージ炎症性タンパク質１−γ（ＭＩＰ−１−γ）、マクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ−３−α）、マクロファージ炎症性タンパク質３β（ＭＩＰ−３−β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質−４（ＭＩＰ−４）、マクロファージ炎症性タンパク質５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−イプシロン（ｐ５００）、胸腺および活性化制御ケモカイン（ＴＡＲＣ：ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒトタンパク質ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒトタンパク質ＨＣＣ−３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
内皮細胞が血管新生を受けるように促進／活性化するいくつかの増殖因子が特定されている。これらは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）Ａ；ＶＥＧＦ  Ｂ、ＶＥＧＦ  ＣおよびＶＥＧＦ  Ｄ；形質転換増殖因子（ＴＧＦ：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ｂ；酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ：ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）；ならびに血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含む。ＶＥＧＦは、非常に特異的な作用部位、すなわち、内皮細胞増殖、遊走および分化の促進を有する内皮細胞特異的増殖因子である。ＶＥＧＦは、２つの同一の２３ｋＤポリペプチドを含む複合体である。ＶＥＧＦは、異なる分子量の４つの別個のポリペプチドとして存在し、各々は、二者択一的にスプライスされたｍＲＮＡに由来し得る。ｂＦＧＦは、線維芽細胞および内皮細胞の増殖を刺激するように機能する増殖因子である。ｂＦＧＦは、１６．５Ｋｄの分子量を有する単鎖ポリペプチド鎖である。アミノ末端領域で長さが異なる、ｂＦＧＦのいくつかの分子形態が発見されている。しかしながら、様々な分子形態の生物学的機能は、同じであるように見える。
【００８０】
ここで、本発明の実施形態を、単なる例示として、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、ＣＨＯ細胞にないｔＲＮＡ  ＴｙｒＡＴＡ遺伝子を含む５７０ｂｐインサートを有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３  Ｔｙｒ−ＡＴＡを例示する。
【図２】図２は、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞におけるヒトｔＲＮＡ  Ｔｙｒ−ＡＴＡ遺伝子の発現を示すＲＴ−ＰＣＲアッセイを例示する。
【図３】図３は、ＣＨＯゲノムで同等物がない３つのヒトｔＲＮＡ遺伝子を有するトランスジェニッククラスターを例示する。これらを、ｐｃＤＮＡ３に組み込み、クローニングしてｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを作製し、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトした。
【図４】図４は、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるヒトｔＲＮＡ  Ｔｙｒ−ＡＴＡ、ｔＲＮＡ  Ａｓｎ−ＡＴＴおよびｔＲＮＡ  Ｉｌｅ−ＧＡＴ遺伝子の発現を示すＲＴ−ＰＣＲアッセイを例示する。
【図５】図５は、ハーセプチン軽鎖および重鎖をコードする発現ベクターｐＣＥＴ  １００６Ｌ＆Ｈを例示する。
【図６】図６は、安定に組み込まれたｐＣＥＴ  １００６Ｌ＆Ｈを有するクローニングした細胞を、空のベクター、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮ＋ｐＳＵＰＥＲ．７ＳＬ、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮ＋ベクターまたはｐＳＵＰＥＲ−７ＳＬ＋ベクターで一過的にトランスフェクトすることの、分泌ハーセプチン（トラスツズマブ）の相対的発現に対する効果を例示する。相対的発現の平均値（ｎ＝３）は、ベクター１．００、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮ＋ｐＳＵＰＥＲ−７ＳＬ  １．４９、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮ＋ベクター１．２０、ｐＳＵＰＥＲ−７ＳＬ＋ベクター１．２４であった。
【図７】図７は、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを有するか、または有しないｐＣＥＴ  １００６Ｌ＆Ｈで安定にトランスフェクトした細胞の対応するクローンによる分泌ハーセプチン（トラスツズマブ）の相対的発現を例示する。分泌フィブロネクチン（ＣＨＯ遺伝子生成物、対照）に対する分泌ハーセプチン（トラスツズマブ）の比は、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮで約５９％増大した（ｎ＝４）。
【図８】図８は、軽鎖の残基１５６ならびに重鎖の残基３０７、３３６および４０５でアスパラギンの代わりに誤って組み込まれたリジンを有する、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを有するか、または有しないｐＣＥＴ  １００６Ｌ＆Ｈで安定にトランスフェクトした細胞の対応するクローンにより分泌されたハーセプチン（トラスツズマブ）ポリペプチドの割合を例示する。
【図９】図９は、ｐＡＵ３９を作製するための、ｔＲＮＡ４９−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子（配列番号９）を含有するＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅゲノム配列の３００ｂｐ断片を受容したベクターｐＲＳ４２６を例示する。
【図１０】図１０は、ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧを発現するプラスミドｐＡＵ３９を有するか、または有しないＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ウェスタンブロットにより決定されたＣＯＧ８およびＰｇｋ１の発現を例示する（ｎ＝３）。
【図１１】図１１は、ウコン酵素ジケチド−ＣｏＡ合成酵素（ＤＣＳ：ｄｉｋｅｔｉｄｅ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現するために使用したベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰを例示する。
【図１２】図１２は、ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧを発現するプラスミドｐＡＵ３９を有するか、または有しないＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ウェスタンブロットにより決定されたＤＣＳおよびＰｇｋ１の発現を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
材料および方法
ヒトｔＲＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡ遺伝子のｐｃＤＮＡ３へのクローニング
５’末端でａｔｔＢ配列の付加を伴い、ＢｇｌＩＩ（５’）およびＸｈｏＩ（３’）制限酵素配列を端部に有するヒトｔＲＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡ遺伝子（ｃｈｒ２：２１９１１０２７０−２１９１１０７７０）を含有する５００ｂｐゲノムＤＮＡ断片（配列番号１）をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により合成し、ベクターｐＭＫ−Ｔｙｒ＿ＡＴＡで提供した。この配列を、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩによる３７℃での消化により放出し、ゲルを精製した。真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、ＣＭＶプロモーターを除去し、ゲルを精製した。２つのＤＮＡ断片を、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社）を使用して接合し、化学誘導コンピテントＥ．ｃｏｌｉに４２℃で１分間のヒートショックにより導入した。プラスミドを続いて、得られたカルベニシリン抵抗性（５０μｇ／ｍｌ）コロニーから単離し、インサートの存在を制限酵素消化および続くシークエンシングにより確認した。
【００８３】
【化１】
2019500875.tif 000003
【００８４】
配列１−標的化ゲノム統合のために３’末端に融合したラムダＡｔｔｂ統合部位（黄色ハイライト）を有するヒトＴｙｒ−ＡＴＡ遺伝子（緑色の文字）を含有する合成したゲノム断片の配列。
【００８５】
ｐｃＤＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡのＣＨＯ細胞へのトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清で補充したハムＦ１２培地中で生育させ、３７℃で５％ＣＯ２中にて培養した。トランスフェクションのために、３ｍｌの培地を含む６ウェルプレート中の１ウェル当たり３５０，０００個の細胞を播種した。翌日、培地を除去し、１ｍｌの新しい培地で置換し、Ｘ−ｆｅｃｔ試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して製造者の使用説明書に従い５μｇのプラスミドを細胞に導入した。２４時間後、３ウェルからの全ての細胞を回収し、ｐｃＤＮＡベクターがネオマイシン抵抗性遺伝子を有するので、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充した１５ｍｌの培地を含むＴ７５フラスコに再播種した。これらの細胞を３日後に１：４に分け、Ｇ４１８は６００μｇ／ｍｌまで増大させた。細胞を続いて２〜３日毎に１：４に分け、Ｇ４１８はさらに１２日目で８００μｇ／ｍｌまで増大させた。完全に形質転換された抵抗性細胞株を示す、さらなる細胞死が起こらなくなるときまで、選択を８００μｇ／ｍｌで継続した。Ｇ４１８の存在下で培養した形質転換されていない細胞は増殖せず、着実に数が減った。
【００８６】
ｐｃＤＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡの発現分析
１ｍｌ／ウェルのＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して製造者の使用説明書に従い、ＣＨＯ細胞からＲＮＡを抽出した。沈殿後、ＲＮＡペレットを、４ｕのＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼ１（ＮＥＢ社  Ｍ０３０３Ｓ）を含有する３０μｌの１×ＤＮアーゼ１緩衝液中に懸濁し、ＲＮＡを３７℃で３０分間インキュベートし、その後反応を７０℃で１０分間にて停止させた。その後、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびランダムモノマー（Ｓｉｇｍａ社）を使用して、１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した［１μｇのＲＮＡ、１μｌのランダムモノマー、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、ＲＮアーゼ非含有水を１４μｌになるように混合し、７０℃まで５分間加熱し、その後氷上で冷却し、４μｌの５×ＳＳＩＶ緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴおよび１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ逆転写酵素を添加し、室温で１０分間、その後５５℃で３０分間静置し、その後反応を８０℃で１０分間にて停止させる］。このｃＤＮＡを続いてＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ非含有水で１００μｌまで希釈し、ＯｎｅＴａｑポリメラーゼ２×混合物（ＮＥＢ社）および遺伝子特異的プライマー（配列番号２：ＡＴＡフォワード−ＧＣＴＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＣＴＡＴ、配列番号３：ＡＴＡ（２）リバース−ＴＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＣ）でのＰＣＲ反応で使用した。［標準緩衝液を伴うＯｎｅＴａｑ２×−１０μｌ、ｃＤＮＡ−２μｌ、１０μＭプライマー−０．２μｌ、ｄＨ２Ｏで２０μｌにする］。ＰＣＲ条件−［９４℃−３分間、（９４℃−３０秒間、６２℃−１２秒間、６８℃−１２秒間）×３５、６８℃−３分間］。ＰＣＲの結果は、３％ＴＢＥアガロースゲル上でＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて可視化した。
【００８７】
ヒトｔＲＮＡ遺伝子（ｔＲＮＡ−ＩｌｅＧＡＴ１−１、ｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴ１−１およびｔＲＮＡ−ＴｙｒＡＴＡ）のＹＩＮクラスターの構築
各ｔＲＮＡ遺伝子につき、Ｉｌｅ−ＧＡＴ１−１  ｈｇ１９＿ｄｎａ範囲ＣｈｒＸ：３７５６４１８〜３７５６４９１、Ａｓｎ−ＡＴＴ１−１  ｈｇ１９＿ｄｎａ範囲ｃｈｒ１：１４７７１８７２９〜１４７７１９２０２である配列を以下のようにして得た。これらの配列を、それらを分離するＨｉｎｄＩＩＩ部位を有し、ｐｃＤＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡ中のＴｙｒ−ＡＴＡ  ｔＲＮＡ配列に隣接するクローニングのためのＢａｍＨＩ部位を端部に有するＤＮＡの１断片（配列番号４）として合成した（図３）。得られた構築物は、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮと命名した。
【００８８】
【化２】
2019500875.tif 000004
【００８９】
ＹＩＮ  ｔＲＮＡ遺伝子クラスターのＣＨＯ細胞への導入および発現の確認。
ｐｃＤＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡについて上記に説明するように、ｐｃＤＮＡ−ＹＩＮを、ＣＨＯ  Ｋ１細胞に安定にトランスフェクトした。ｔＲＮＡ−Ｔｙｒ−ＡＴＡについて上記に説明するように、各ｔＲＮＡの発現をトランスフェクタントにおいて確認した（図４）。ｔＲＮＡ−Ｉｌｅ−ＧＡＴのプライマー配列は、（配列番号５：フォワード−ＴＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣ、配列番号６：リバース−ＧＣＴＡＡＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＧ）であり、ｔＲＮＡ−Ａｓｎ−ＡＴＴのプライマー配列は、（配列番号７フォワード−ＴＣＧＣＴＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＧおよび配列番号８：リバース−ＣＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＴＡＣＴＣ）であった。
【００９０】
ハーセプチン（トラスツズマブ）を発現する安定にトランスフェクトしたクローンの作製
細胞がトランスフェクション時に５０〜７０％コンフルエントになるように、トランスフェクションの１日前に、３×１０５個のＣＨＯ細胞を、６ウェルＣｏｓｔａｒ透明ＴＣ処理細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中の１ｍｌの完全増殖培地（Ｆ１２／ＤＭＥＭ）中に播種した。微量遠心分離管中で、ハーセプチン（トラスツズマブ）をコードする５μｇのプラスミドｐＣＥＴ  １００６Ｌ＋Ｈ（図５）ＤＮＡを、最終体積が１００μｌになるようにＸｆｅｃｔ反応緩衝液で希釈し、高速で５秒間のボルテックスにより混合した。１．５μｌ  Ｘｆｅｃｔポリマーを、希釈したプラスミドＤＮＡに添加し、高速で１０秒間のボルテックスにより十分に混合した（ポリマー：ＤＮＡの比は一定に維持した：１μｇのプラスミドＤＮＡ当たり０．３μｌのＸｆｅｃｔポリマー）。混合物を室温で１０分間インキュベートしてナノ粒子複合体を形成させた。１００μｌのナノ粒子複合体溶液全てを、ウェル中の細胞培養培地に一滴ずつ添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間から一晩インキュベートし、その後ナノ粒子複合体を吸引により細胞から除去し、２〜３ｍｌの新しい完全増殖培地で置換し、プレートを３７℃のインキュベーターに戻した。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、非処理プレート中のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社）およびピューロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）で補充したＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）半固体培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に２００、５００または１０００個の細胞／ｍｌで再懸濁した。プレートを、コロニーが明らかに見えるようになるまで、３７℃、５％ＣＯ２で１４〜２１日間インキュベートした。個々のコロニーを、１０％ＦＣＳおよび１０ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを補充した液体Ｆ１２培地にピペットで入れ、増殖させ、その後、ウェスタンブロットにより分析した。
【００９１】
ハーセプチン（トラスツズマブ）の発現を評価するために、１ｍｌの培地をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に除去し、１２００ｒｐｍで回転させて任意の細胞残屑をペレット化した。上清（８００μｌ）を取り除き、−８０℃で凍結した。培地の試料（３０μｌ）を、１０μｌのアルキル化ローディング緩衝液、（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、９０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ：Ｎ−Ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ブロモフェノールブルー）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。その後、試料を９５℃で１０分間加熱し、氷上で冷却し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質を、Ｈｏｅｆｅｒ社製Ｓｅｍｉｐｈｏｒ半乾燥ブロッターを使用して、移行緩衝液（Ｔｏｗｂｉｎ−２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．３、２０％ＭｅＯＨ）中に事前に浸漬した膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製Ｐｒｏｔｒａｎ  ０．４５ミクロン  ＮＣ１０６００００３番）に移した。この膜を１×ＰＢＳですすぎ、１×ＰＢＳ中の５％粉乳、１％  ＰＶＰ−４０（Ｓｉｇｍａ社  １０１６１６０２１）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ社  Ａ４９７４）中で４℃にて一晩ブロックした。その後、ブロッキング緩衝液を除去し、１／５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ社  ９７１６５  １ｍｇ／ｍｌ  ヒトＩｇＧ  ＨＲＰに対するヤギｐＡｂ）で置換し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。その後、この膜を１×ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中で３×１０分間洗浄した。３４０８７番  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉ基質を添加することにより、タンパク質を検出した。過剰な試薬を除去し、シグナルを、ＧｅｎｅＳｎａｐソフトウェアを伴うＳｙｎＧｅｎｅ  Ｇ  ｂｏｘ  ｃｈｅｍｉｉｍａｇｅｒで検出した。その後、膜を１×ＰＢＳですすぎ、フィブロネクチン抗体Ａｂ  ２４１３（Ａｂｃａｍ社）をブロッキング緩衝液中の１／１００００希釈で添加するか、またはＳｉｇｍａ  Ｆ６１４０フィブロネクチンマウスモノクローナル１／４０００希釈を５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社  Ａ７９０６）中でブロックし、４℃で一晩インキュベートした。その後、膜を３×１０分間、１×ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後、二次抗体を粉乳ブロッキング緩衝液（１／５０００希釈の抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ  ７０７４Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社または抗マウスＨＲＰ  １／５０００希釈  ７０７６Ｐ２番  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社）中に添加し、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
【００９２】
上記のように、膜を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で３×１０分間洗浄し、高感度基質を使用して現像した。ｉｍａｇｅ  Ｊ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して、Ｃｈｅｍｉｉｍａｇｅを分析した。
【００９３】
ハーセプチン（トラスツズマブ）の発現に対するＹＩＮによるゆらぎ抑制の効果
ハーセプチン（トラスツズマブ）発現がどのように、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを使用したヒトｔＲＮＡ−ＩｌｅＧＡＴ１−１、ｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴ１−１およびｔＲＮＡ−ＴｙｒＡＴＡ遺伝子の一過性または安定的導入によるゆらぎ抑制に応答するか試験するために、ｐＣＥＴ  １００６Ｌ＋Ｈで安定にトランスフェクトしたクローンを使用した。ＣＨＯ細胞は、これらの３つのｔＲＮＡを有さず、それゆえＩｌｅ、ＡｓｎおよびＴｙｒについて、それぞれ、ＡＴＣ、ＡＡＴおよびＴＡＴコドンを解読するためにゆらぎに依存する。
【００９４】
安定にトランスフェクトしたｐＣＥＴ  １００６Ｌ＋Ｈを発現するクローンを、３７℃で５％ＣＯ２中にて、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社  １０２７０）、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ社  １５１４０１２２）および１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ社  Ａ１１１３８）を補充した、Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ社  ＢＥ１２６１５Ｆ）含有ハムＦ１２培地中で生育させ、Ｇｅｎｅｃｅｌｉｎを使用してｐｃＤＮＡ．ＹＩＮまたは等量のｐｃＤＮＡ．３空ベクターでトランスフェクトした。ｐＳＵＰＥＲ−７ＳＬ（Ｍｉｓｒａら（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２８０、２９３６４）と等量のｐｃＤＮＡ．ＹＩＮまたは空ベクターとの共トランスフェクションにより、７ＳＬ ＲＮＡの過剰発現への応答を並行して試験した。培地に分泌されたハーセプチン（トラスツズマブ）のレベルを、トランスフェクション３日後に、上記のようにウェスタンブロットにより決定した（図６）。
【００９５】
安定に発現するｔＲＮＡ−ＩｌｅＧＡＴ１−１、ｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴ１−１およびｔＲＮＡ−ＴｙｒＡＴＡの効果を試験するために、ｐＣＥＴ  １００６Ｌ＋Ｈで安定にトランスフェクトしたクローンを、上記にようにｐｃＤＮＡ．ＹＩＮでさらにトランスフェクトした。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社）および継続するｐＣＥＴ  １００６Ｌ＋Ｈ統合の選択のためにピューロマイシン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ社  Ａ１１１３８）ならびにｐｃＤＮＡ．ＹＩＮ統合の選択のために８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ社  Ａ１７２０）で補充したＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）半固体培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に２００、５００または１０００個の細胞／ｍｌで再懸濁した。プレートを、コロニーが明らかに見えるようになるまで、３７℃、５％ＣＯ２で１４〜２１日間インキュベートした。個々のコロニーを、１０％ＦＣＳ、８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および１０μｇ／ｍｌピューロマイシンで補充した液体Ｆ１２培地にピペットで入れ、増殖させた。これらのクローンおよび親クローンを、Ｔ２５細胞培養フラスコ（Ｓｔａｒｓｔｅｄ社）中で３７℃にて５％ＣＯ２中で、適宜８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ社  Ａ１７２０）を伴うまたは伴わない、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社  １０２７０）、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ社  １５１４０１２２）および１０μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ社  Ａ１１１３８）で補充した、Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ社  ＢＥ１２６１５Ｆ）を含むハムＦ１２培地中にて培養した。ハーセプチン（トラスツズマブ）の発現を評価するために、５００，０００個の細胞（継代４〜８）を、上記のように、Ｔ２５フラスコ中の５ｍｌの培地中に播種した。７２時間後、１ｍｌの一定分量の培地をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に除去し、１２００ｒｐｍで回転させて任意の細胞残屑をペレット化した。上清（８８０μｌ）を取り除き、−８０で凍結した。上記に説明するように、発現を続いてウェスタンブロットにより評価した（図７）。
【００９６】
ハーセプチン（トラスツズマブ）におけるアスパラギンについてのリジンの誤取り込みに対するゆらぎ抑制の効果
質量分析（ＭＳ：ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による分析のために、ハーセプチンを、Ｐｉｅｒｃｅ社Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ社  ５０μｌ、０．５ｍｇ）を使用して、安定に発現するＣＨＯ細胞の単一細胞クローンの播種後７２〜９６時間で回収した細胞培養上清（１０％  Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社］を含むＦ１２：ＤＭＥＭ培地）から精製した。磁気ビーズをピペットで微量遠心分離管に移した。管を磁石上に置いて保存溶液からビーズを分離した。磁気ビーズを１ｍｌの洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０洗剤を含有するＴＢＳ）で洗浄し、ビーズを磁石により回収し、上清を除去した。３０ｍｌの細胞培養上清を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５０膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を有するＡｍｉｃｏｎ社製Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離フィルターユニットを使用して１．５ｍｌまで濃縮し、ビーズに添加し、回転しながら室温で６０分間インキュベートした。管を磁石上に置き、上清を除去した。ビーズ／抗体複合体を、５００μｌの洗浄緩衝液中に再懸濁し、穏やかなピペッティングにより洗浄した。ビーズ／抗体複合体を全部で３回洗浄し、各洗浄の間に磁石上で分離した。ビーズ懸濁液を、管壁に結合したタンパク質の共溶出を避けるために、クリーン管に移した。１００μｌの溶出緩衝液（５０ｍＭグリシンｐＨ２．８）をビーズに１０分間添加して抗体を溶出し、１５μｌ  １Ｍ  ＴＲＩＳ  ｐＨ７．５を添加することにより緩衝液を中和した。溶出したタンパク質を、ＬＤＳ試料緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ社、４：１）と混合し、ＤＴＴ（最終濃度１００ｍＭ）により還元した。混合物を９５℃で１０分間加熱し、４〜１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏｒａｄ社）上にローディングした。ゲルを製造業者の使用説明書に従って泳動した（１８０Ｖ、３０〜４０分）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅクーマシーベースタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ社）を使用して染色した。ＤＴＥでの還元およびヨードアセトアミドでのＳ−カルバミドメチル化後に、ゲル内トリプシン消化を行った。ゲル片を、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含有する５０％（ｖ：ｖ）水性アセトニトリルで２回、その後アセトニトリルで１回洗浄し、真空濃縮器内で２０分間乾燥させた。シークエンシンググレードの改変ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を５０ｍＭ酢酸中に溶解し、その後２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムで５倍希釈して０．０２μｇ／μＬの最終トリプシン濃度を得た。ゲル片を、２５μＬのトリプシン溶液を添加することにより再水和し、１０分後、十分な２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を添加してゲル片を覆った。消化物を３７℃で一晩インキュベートした。ペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ：ｖ）を含有する５０％（ｖ：ｖ）水性アセトニトリルで３回洗浄することにより抽出し、その後真空濃縮器内で乾燥させ、水性０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ：ｖ）中に再構成した。ペプチドを、ＰｅｐＭａｐ  １００Å  Ｃ１８、５μｍトラップカラム（３００μｍ×５ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ社）およびＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  ＲＳＬＣまたはＥａｓｙ��ａｎｏカラム、２μｍ、１００Å（Ｃ１８、７５μｍ×１５０ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ社）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣナノＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ社）上にローディングした。トラップ洗浄溶媒は水性０．０５％（ｖ：ｖ）トリフルオロ酢酸であり、トラッピング流速は１５μｌ／分であった。トラップを３分間洗浄し、その後キャピラリーカラムへの流動に変えた。分離は、２つの溶媒（溶媒Ａ：水性１％（ｖ：ｖ）ギ酸；溶媒Ｂ：１％（ｖ：ｖ）ギ酸を含有する水性８０％（ｖ：ｖ）アセトニトリル）の勾配溶出を使用した。キャピラリーカラムの流速は、３００ｎｌ／分であった。カラム温度は４０℃であり、勾配プロファイルは、７分間にわたる直線３〜１０％Ｂ、３０分間にわたる直線１０〜３５％Ｂ、５分間にわたる直線３５〜９９％Ｂであり、その後９９％溶媒Ｂでの４分間の洗浄に進めた。カラムを初期条件に戻し、１５分間再平衡化し、その後続いて注入した。
【００９７】
ナノＬＣシステムは、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ  ＦｌｅｘまたはＥａｓｙＮａｎｏイオン化源（Ｔｈｅｒｍｏ社）を伴うＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎハイブリッド質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ社）とインターフェースで接続していた。陽性ＥＳＩ−ＭＳおよびＭＳ２スペクトルを、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン４．０、Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して得た。器具源設定は：イオンスプレイ電圧、１，９００〜２，４００Ｖ；スイープガス、２Ａｒｂ；イオン移行管温度、２７５℃であった。ＭＳ１スペクトルを、全ての取得の中で通常の取得パラメーター、特に：１２０，０００解像度；スキャン範囲、ｍ／ｚ  ３７５〜１，５００；ＡＧＣ標的、４ｅ５；最大充填時間、１００ミリ秒；およびデータタイプ、プロファイルによりＯｒｂｉｔｒａｐで得た。ＭＳ２スペクトルを、１秒の固定周期時間；四重極型単離ウィンドウ、ｍ／ｚ  １．６；活性化タイプ、ＨＣＤ；衝突エネルギー、３２％；第１の質量、ｍ／ｚ  １１０；およびデータタイプ、中心軌跡を維持しながら最大スピードモードで得た。ペプチド特定を最大限にするために、直線イオントラップおよびＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計の両方を用いて多ＭＳ２取得体制を行った。直線イオントラップＭＳ２取得は、スキャン速度、速い；ＡＧＣ標的、５ｅ３；および最大注入時間、１００ミリ秒を特定した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ２取得は、解像度、３０，０００；ＡＧＣ標的、５ｅ４；および最大注入時間、５４ミリ秒を使用した。データ依存的前駆体選択は、５ｅ３の閾値を超える最も強いまたは最も弱い（別々の取得）前駆体のいずれかを選択した。５０秒後の前駆体選択に動的排除を適用し、断片化の最小閾値は５ｅ３に設定した。最近では、ＭＳ２取得のために、ＡｓｎのＬｙｓへの改変を含有することが以前に特定されたペプチドについて理論的２＋および３＋  ｍ／ｚ値を含有する固定包含リストを使用する標的化アプローチが取られた。
【００９８】
ＭＳＣｏｎｖｅｒｔ（ｐｒｏｔｅｏｗｉｚａｒｄ社、バージョン３．０．９９６７）を使用してＭＧＦ形式でピークリストを作成した。Ｍａｓｃｏｔプログラム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．社、バージョン２．５．１）のローカル実行コピーを使用して、ＭＧＦファイルを、予測されるタンパク質配列に対して検索し、組織内データベースに追加した。検索基準は：酵素、半トリプシン；固定改変、カルバミドメチル（Ｃ）；変動改変、酸化（Ｍ）、Ａｓｎ→Ｌｙｓ（Ｎ）；ペプチド耐性、３ｐｐｍ；ＭＳ／ＭＳ耐性、直線イオントラップについて０．５ＤａまたはＯｒｂｉｔｒａｐについて１０ｍＤａ；器具、ＥＳＩ−ＴＲＡＰまたはＥＳＩ−ＯＲＢＩＴＲＡＰ−ＨＣＤを特定した。アミノ酸置換を含有すると分類されるペプチドは、予測スコア＜０．０５を有することが必要とされ、示唆されるアミノ酸への置換の位置を位置付ける配列イオンの存在を確認するために手動で検証した。
【００９９】
Ｑｕａｌ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｘｃａｌｉｂｕｒ、バージョン４．０、Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用して、抽出したイオンクロマトグラムピーク領域を作成し、予測される前駆体ｍ／ｚ値周辺の２ｍＤａウィンドウを設定した。ＸＩＣをガウス平滑化し、ピーク取得パラメーターは：基線ウィンドウ、１００；領域ノイズ因子、５；ピークノイズ因子、１００を特定した。置換形態のペプチドＸＩＣ領域を、置換形態および予測形態の合計と比較することにより、アミノ酸置換の割合を見積もった。
【０１００】
図８は、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを有するか、または有しない対応するクローンにおけるリジン誤取り込みの頻度を示す。リジンの誤取り込みが一貫して検出された４つの部位についてデータを得る。各場合に、正しい残基、アスパラギンは、天然ＣＨＯ細胞においてはゆらぎに依存するＡＡＴコドンによりコードされるが、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮでトランスフェクトした細胞においてはｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴによりゆらぎを伴わずに解読され得る。
【０１０１】
分裂酵母ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子のｐＲＳ４２６へのクローニング
上流末端および下流末端で、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩ制限酵素部位を端部に有するｔＲＮＡ４９−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子（ｃｈｒ１：１５２７３５０−１５２７０５０）を含有する、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅの第１染色体からのゲノムＤＮＡの３００ｂｐ断片（配列番号９）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により合成した。この配列を３７℃でのＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩによる消化により放出し、ゲル精製した。このＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで切断したベクターｐＲＳ４２６（図９）に導入して、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社）を室温で２時間使用してプラスミドｐＡＵ３９を作製し、化学誘導コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に４２℃で０．５分間のヒートショックにより導入した。得られたアンピシリン抵抗性（１００μｇ／ｍｌ）コロニーからプラスミドｐＡＵ３９を続いて単離し、インサートの存在を制限酵素消化により確認した後、配列決定を行った。
【０１０２】
【化３】
2019500875.tif 000005
【０１０３】
出芽酵母における導入遺伝子発現に対する分裂酵母ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧの効果
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＯＧ８−ＴＡＰ（遺伝子型ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０、ＣＯＧ８−ＴＡＰ：：ＨＩＳ３、Ｍａｔ  ａ）を、酢酸リチウムを使用して、ｐＡＵ３９または空のｐＲＳ４２６ベクターで形質転換した。形質転換体を標準の最小限培地（ＳＤ、プラスミド選択に適切なアミノ酸を欠いている）中で生育させた。５  ＯＤ６００単位相当の細胞を対数増殖期の液体培養物から回収し、１２０μｌ溶解緩衝液中に再懸濁し、その後９５℃で２分間インキュベートし、１００μｇのガラスビーズ（４２５〜６００μｍ、酸で洗浄済み）の存在下で３分間ボルテックスした。溶解物を８％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、その後、上記のとおり、ＣＯＧ８に対する抗体およびローディング対照Ｐｇｋ１でのウェスタンブロッティングにより分析した（図１０）。
【０１０４】
また、株Ｇ１７５（ＡＤＥ２  ＭＥＴ  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ＴＡＧ＋  ＳＥ＋  Ｍａｔ  α）を、Ｍｙｃタグに結合したウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）から得たジケチド−ＣｏＡ合成酵素（ＤＣＳ；ＡＢ４９５００６．１）のコード配列を含有する導入遺伝子を有するか、または有しないベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ（図１１）と共に、ｐＡＵ３９または空のｐＲＳ４２６で形質転換した。この配列は、天然Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現についてはゆらぎに依存するが、ｐＡＵ３９上の外因性ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子の導入後はゆらぎに依存しない、１７ＣＴＧコドンを含有する。ＤＣＳの発現を、上記のように、Ｍｙｃタグに対する抗体でのウェスタンブロッティングにより測定した（図１２）。
【実施例１】
【０１０５】
ＣＨＯ細胞は、ｔＲＮＡ−ＩｌｅＧＡＴ、ｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴまたはｔＲＮＡ−ＴｙｒＡＴＡの遺伝子を有さず、それゆえ、ＴＡＴ、ＡＡＴおよびＡＴＣコドンを解読するためにゆらぎに依存する。これらのコドンのゆらぎ非依存的解読を可能にするために、本発明者らは、ヒトｔＲＮＡ−ＩｌｅＧＡＴ、ｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴおよびｔＲＮＡ−ＴｙｒＡＴＡ遺伝子を有する構築物ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを作製および導入した。ヒト第２染色体からのｔＲＮＡ１４−ＴｙｒＡＴＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を合成し、クローニングした（図１）。構築物をＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトし、ＲＴ−ＰＣＲ分析により導入遺伝子の発現を確認した（図２）。同じアプローチを、ヒトｔＲＮＡ−ＴｙｒＡＴＡ、ｔＲＮＡ−ＡｓｎＡＴＴおよびｔＲＮＡ−ＩｌｅＧＡＴを発現する合成アセンブリ（図３）を、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮに導入するために使用した。レシピエントＣＨＯ細胞における３つの全てのヒトｔＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図４）。ｐＣＥＴ １００６Ｌ＋Ｈ発現ベクターで安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞におけるハーセプチン（トラスツズマブ）の発現に対するこれらのｔＲＮＡの効果を試験した（図５）。これらの細胞を空のベクター、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮおよび／またはｐＳＵＰＥＲ−７ＳＬでトランスフェクトし、分泌されたハーセプチン（トラスツズマブ）を回収および定量した（図６）。ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮの一過性トランスフェクションは、ハーセプチン発現を約２０％上昇させることが分かった。この向上は、７ＳＬ ＲＮＡをコードするヒトＲＮ７ＳＬ１遺伝子を含有する構築物であるｐＳＵＰＥＲ−７ＳＬの共トランスフェクションにより約４９％まで高められた。安定なトランスフェクタントでは、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮのゲノムへの組込みが、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを有しない親クローンと比較して、ハーセプチン（トラスツズマブ）の発現を約５９％上昇させることが分かった（図７）。アスパラギンについてのゆらぎ依存性ＡＡＴコドンの誤読み取りのための分泌抗体におけるリジン誤取り込み率を確認するために、質量分析を使用した。かかるエラーは４つの位置で検出され、頻度は最大約０．２８％であった。これらのエラーは、ｐｃＤＮＡ．ＹＩＮを有する対応する細胞では４〜３２分の１に抑制され、外因性ｔＲＮＡ  Ａｓｎ−ＡＴＴは、ゆらぎを伴わないＡＡＴコドンの直接的な解読を可能にした（図８）。全体として、治療用抗体でのこれらの実験は、ゆらぎへの依存を低減する外因性ｔＲＮＡのＣＨＯ細胞への導入後に、生成の増大および誤取り込みの減少を示す。
【実施例２】
【０１０６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧを有しないので、ロイシンについてＣＴＧコドンを解読するためにゆらぎに依存する。このコドンのゆらぎ依存性を除去するために、本発明者らは、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅからの外因性ｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を作製した。ＣＴＧコドンが豊富な遺伝子の発現に対するこのｔＲＮＡの効果を測定した。Ｓ．ｐｏｍｂｅの第１染色体からのｔｒｎａ４９−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を合成し、ｐＲＳ４２６にクローニングして（図９）プラスミドｐＡＵ３９を作製した。ＣＯＧ８（図１０）およびＤＣＳ（図１２）のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に対するｐＡＵ３９の効果を決定するためにウェスタンブロッティングを使用した。ＣＯＧ８中に１０個のＣＴＧコドンおよびＤＣＳ中に１７個があるが、対照として使用された内因性タンパク質であるＰｇｋ１中にはない。ＣＯＧ８およびＤＣＳの両方について、発現は、空のベクター対照と比較してｐＡＵ３９上のｔＲＮＡ−ＬｅｕＣＡＧ遺伝子により向上した。本発明者らは、導入遺伝子を発現するためのプラットフォームとしてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの効率は、ゆらぎに対する依存を低減させるための外因性ｔＲＮＡの導入により改善され得ることを結論付けた。
【図１】
2019500875.tif 000006
【図２】
2019500875.tif 000007
【図３】
2019500875.tif 000008
【図４】
2019500875.tif 000009
【図５】
2019500875.tif 000010
【図６】
2019500875.tif 000011
【図７】
2019500875.tif 000012
【図８】
2019500875.tif 000013
【図９】
2019500875.tif 000014
【図１０】
2019500875.tif 000015
【図１１】
2019500875.tif 000016
【図１２】
2019500875.tif 000017
【配列表】
2019500875000001.app
【国際調査報告】
2019500875.tif 000018
2019500875.tif 000019
2019500875.tif 000020
2019500875.tif 000021
2019500875.tif 000022