(57)【要約】種々の試料の種類中のカルボニル含有部分を検出および定量化するための方法、システムおよび試薬が提供される。試料からのカルボニル含有部分の捕捉から、カルボニル含有部分の検出までに経過した時間の量は、約２時間未満である。カルボニル含有部分の標識化および検出を容易にするための化合物が提供される。本発明は、酸化ストレスと関連付けられた分子を識別および測定しようとする試みには一般的に、採血、尿試料および組織試料を含む侵襲性の技法が伴うという従来技術の課題を解決する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも１種のアルデヒドの存在を検出するための方法であって、
前記試料を基材に曝露して、前記アルデヒドを捕捉するステップ、
前記基材から前記アルデヒドを溶離させるステップ、
前記アルデヒドを反応性標識剤と混合するステップ、
標識済みアルデヒドをカラムに注入するステップ、
前記標識済みアルデヒドを前記カラムから有機溶媒中に溶出させるステップ、および
前記標識済みアルデヒドを検出するステップ
を含み、
約２時間未満で完了する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種のアルデヒドの濃度を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のアルデヒドが、Ｃ１アルデヒド、Ｃ２アルデヒド、Ｃ３アルデヒド、Ｃ４アルデヒド、Ｃ５アルデヒド、Ｃ６アルデヒド、Ｃ７アルデヒド、Ｃ８アルデヒド、Ｃ９アルデヒド、Ｃ１０アルデヒドおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のアルデヒドが、脂肪族アルデヒド、ジアルデヒドもしくは芳香族アルデヒドまたはこれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、炭素鎖長が異なる２種またはそれよりも多いアルデヒドを含み、前記標識済みアルデヒドを検出する前記ステップが、各アルデヒドを分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、生物試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、環境試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、息試料、尿試料、血液試料、血漿試料および培養物中のヘッドスペースの試料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、息試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記基材が、シリカ、多糖、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリエステル、ポリプロピレン、シリカ、不活性化されたアルミナ、ケイ藻土、ＭｇＳＯ４、多孔性マトリックス、ビニルクロリド、ビニルクロリド−プロピレンコポリマー、ビニルクロリド−ビニルアセテートコポリマー、布、綿、ナイロン、レーヨン、多孔性ゲル、シリカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチン、ポリマーフィルムおよびポリアクリルアミドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルデヒドを捕捉する前記ステップが、少なくとも１種のアルデヒドをフィルター組立体上に収集することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応性標識剤が、フルオロフォア、リンカーおよび反応性基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フルオロフォアが、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、アミノオキシ５（６）ＴＡＭＲＡ、アミノオキシ５  ＴＡＭＲＡ、アミノオキシ６  ＴＡＭＲＡ、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）およびｃｏｕｒｍａｒｉｎからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカーが、置換アルキルジアミン（Ｃ２〜Ｃ１０）、置換アミノカルボン酸（Ｃ２〜Ｃ１０）および置換ポリエチレングリコール（Ｎ＝１〜１０）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカーが、ヘキサン酸、アミノヘキサン酸、カダベリン、ポリエチレングリコールおよびポリグリコールからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応性基が、ヒドラジン部分、カルボヒドラジド部分、ヒドロキシルアミン部分、セミカルバジド部分、アミノオキシ部分およびヒドラジド部分からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応性標識剤が、
【化２】
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およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルデヒドを検出する前記ステップが、前記フルオロフォアの励起によって生成された蛍光発光を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルデヒドを検出する前記ステップが、前記フルオロフォアの励起によって生成された蛍光吸光度を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルデヒドを検出する前記ステップが、所定の波長範囲内の光を前記標識済みアルデヒドに導き、これにより、蛍光を生成することおよび蛍光を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルデヒドの濃度が、標準曲線に対して蛍光の吸収または発光を計算することによって決定され、蛍光シグナルが、前記アルデヒドの濃度に比例する、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記カラムが、逆相カラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記有機溶媒が、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリルおよびエタノールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の少なくとも１つのカルボニル含有部分の存在を検出するための方法であって、
前記試料を基材に曝露して、前記カルボニル含有部分を捕捉するステップ、
前記カルボニル含有部分を前記基材から溶離させるステップ、
前記カルボニル含有部分を反応性標識剤と混合するステップ、
標識済みカルボニル含有部分をカラムに注入するステップ、
前記カラムから前記標識済みカルボニル含有部分を有機溶媒中に溶出させるステップ、および
前記標識済みカルボニル含有部分を検出するステップ
を含み、
約２時間未満で完了する、方法。
【請求項２５】
前記カルボニル含有部分が、アルデヒド、ケトン、カルボン酸およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
気体試料中のカルボニル含有部分を検出する方法であって、
試料からカルボニル含有部分を単離するステップ、
前記カルボニル含有部分を反応性標識剤と混合するステップであって、前記カルボニル含有部分が前記反応性標識剤と会合する、ステップ、
標識済みカルボニル含有部分をカラムに通すステップ、
前記カラムから出る前記標識済みカルボニル含有部分を励起するステップ、および
前記カルボニル含有部分と会合した前記反応性標識剤から発光されたまたはそれによって吸収された蛍光を測定することによって、前記カルボニル含有部分を検出するステップ
を含み、
前記検出するステップが、炭素鎖長に基づいて前記カルボニル含有部分を分離し、
前記試料から前記カルボニル含有部分を単離するステップから、前記カルボニル含有部分を検出するステップまでに経過した時間が、約２時間未満である、
方法。
【請求項２７】
フルオロフォア、リンカーおよび反応性基を含む化合物。
【請求項２８】
前記フルオロフォアが、ａｏ−５−ＴＡＭＲＡ、ａｏ−６−ＴＡＭＲＡおよびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
前記リンカーが、ヘキサン酸、アミノヘキサン酸、カダベリン、ポリエチレングリコールおよびポリグリコールからなる群から選択される、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３０】
前記反応性基が、ヒドラジン部分、カルボヒドラジド部分、ヒドロキシルアミン部分、セミカルバジド部分、アミノオキシ部分およびヒドラジド部分からなる群から選択される、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３１】
【化３】
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を含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３２】
【化４】
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を含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３３】
試料中の少なくとも１つのカルボニル含有部分の存在を検出するためのシステムであって、
前記カルボニル含有部分を捕捉するための基材、
前記基材から前記カルボニル含有部分を溶離させるための１種または複数の試薬、
前記カルボニル含有部分を反応性標識剤と会合させるための１種または複数の試薬、
標識済みカルボニル含有部分を分離するためのカラム、
前記カラムから前記標識済みカルボニル含有部分を溶出させるための１種または複数の溶媒、ならびに、
に蛍光の励起、吸光度および／または発光を発生させて前記標識済みカルボニル含有部分を検出するための光および検出器
を含む、システム。
【請求項３４】
約２時間未満で１回のサイクルを完了する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのカルボニル含有部分の濃度を測定するための１種または複数の標準物質をさらに含む、請求項３３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この特許協力条約特許出願は、２０１６年２月１８日に出願され、そして“Ｂｒｅａｔｈ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ”と題する米国仮出願番号第６２／２９６，９４７号に基づく優先権を主張しており、その内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、カルボニル検出および定量化の分野を、特に、生物試料中のカルボニル含有部分の検出および定量化を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
背景
酸化ストレスは、反応性酸素種の生成と、反応性化合物を解毒する身体の能力との不釣り合いを示す。酸化ストレスは一般的に、酸化的プロセスと還元的（抗酸化的）プロセスとの病態生理学的不釣り合い（または酸化剤＞抗酸化剤）として規定されている。不釣り合いが細胞修復機構を上回ると、酸化的損傷が蓄積する。高レベルの反応性酸化剤種は、心血管、肺、自己免疫、神経学的、炎症性、結合組織の疾患およびがんに由来する種々の疾患の発病機序と関連付けられている。酸化ストレスは、組織損傷を起こし、報告によれば、糖尿病、難聴、血管疾患、神経疾患および腎臓疾患等々に関与する。食事による抗酸化剤の摂取は、いくつかの疾患を抑制および予防するために推奨されており、全身の健康およびウェルビーイングと関連付けられている。
【０００４】
個体または患者母集団の酸化ストレスレベルを測定することが望ましいこともあるが、酸化ストレスと関連付けられた分子を識別および測定しようとする試みには一般的に、採血、尿試料および組織試料を含む侵襲性の技法が伴う。さらに、酸化ストレスと関連付けられた反応性酸素分子は極めて反応性が高く、身体の内部および外部における短い半減期を有し、直接的な測定が極めて困難で不正確になる。現時点において、酸化ストレスの現状に関する好都合で簡便な尺度は利用可能でない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
要旨
酸化ストレスによって個体または患者母集団を識別するための効果的な方法およびデバイスが存在しないため、ヒトの健康の向上のために産業を進歩させる必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
試料中の少なくとも１種のカルボニル含有部分の存在を検出するための方法が、本明細書において提供される。この方法は、試料を基材に曝露して、カルボニル含有部分を捕捉するステップ、カルボニル含有部分を基材から溶離させるステップ、カルボニル含有部分を反応性標識剤と混合するステップ、標識済みカルボニル含有部分をカラムに注入するステップ、カラムから標識済みカルボニル含有部分を有機溶媒中に溶出させるステップおよび標識済みカルボニル含有部分を検出するステップを含む。一部の態様では、検出する方法は、約２時間未満で完了する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つのカルボニル含有部分の濃度を測定するステップをさらに含む。
【０００７】
試料中の少なくとも１種のアルデヒドの存在を検出するための方法が、本明細書において提供される。方法は、試料を基材に曝露して、アルデヒドを捕捉するステップ、基材からアルデヒドを溶離させるステップ、アルデヒドを反応性標識剤と混合するステップ、標識済みアルデヒドをカラムに注入するステップ、カラムから標識済みアルデヒドを有機溶媒中に溶出させるステップおよび標識済みアルデヒドを検出するステップを含む。一部の態様では、検出する方法は、約２時間未満で完了する。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１種のアルデヒドの濃度を測定するステップをさらに含む。
【０００８】
気体試料中のカルボニル含有部分を検出する方法が、本明細書において提供される。本方法は、試料からカルボニル含有部分を単離するステップ、カルボニル含有部分を反応性標識剤と混合するステップであって、カルボニル含有部分が反応性標識剤と会合する、ステップ、標識済みカルボニル含有部分をカラムに通すステップ、カラムから出る標識済みカルボニル含有部分を励起するステップおよびカルボニル含有部分と会合した反応性標識剤から発光されたまたはそれによって吸収された蛍光を測定することによって、カルボニル含有部分を検出するステップを含む。一部の態様では、溶出させるステップは、炭素鎖長に基づいてカルボニル含有部分を分離する。一部の態様では、試料からカルボニル含有部分を単離するステップから、カルボニル含有部分を検出するステップまでに経過した時間は、約２時間未満である。
【０００９】
フルオロフォア、リンカーおよび反応性基を含む化合物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ａｏ−５−ＴＡＭＲＡ、ａｏ−６−ＴＡＭＲＡおよびこれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ヘキサン酸、アミノヘキサン酸、カダベリン（cadavarine）、ポリエチレングリコールおよびポリグリコールからなる群から選択される。一部の実施形態では、反応性基は、ヒドラジン部分、カルボヒドラジド部分、ヒドロキシルアミン部分、セミカルバジド部分、アミノオキシ部分およびヒドラジド部分からなる群から選択される。
【００１０】
試料中の少なくとも１つのカルボニル含有部分の存在を検出するためのシステムが、本明細書において提供される。システムは、カルボニル含有部分を捕捉するための基材、カルボニル含有部分を基材から溶離させるための試薬、カルボニル含有部分を反応性標識剤と会合させるための試薬、標識済みカルボニル含有部分を分離するためのカラム、カラムから標識済みカルボニル含有部分を溶出させるための溶媒、ならびに、蛍光の励起、吸光度および／または発光を発生させて標識済みカルボニル含有部分を検出するための光および検出器を含む。一部の態様では、システムは、約２時間未満で１回のサイクルを完了する。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのカルボニル含有部分の濃度を測定するための標準物質をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、標的分子が選択反応性フルオロフォアによって標識され、分離されて、鎖長が炭素１個分だけ異なる個々のアルデヒドの識別が可能になる、システムを例示する。
【００１２】
【図２】図２は、色素、リンカーおよび反応性基を含む例示的な反応性標識剤を実証する。
【００１３】
【図３】図３は、フルオロフォアに付着したリンカーおよび反応性基を含む反応性標識剤を生成するように本明細書において提供された方法に従って改変された、ａｏ−５−ＴＡＭＲＡおよびａｏ−６−ＴＡＭＲＡの構造を提供する。
【００１４】
【図４】図４は、ａｏ−６−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤の合成概略図を提供する。
【００１５】
【図５】図５は、反応性標識剤中にリンカー、例えばＰＥＧを使用する利益を例示する。
【００１６】
【図６】図６は、室温における、触媒の非存在下での、ｐＨの関数としての反応速度を例示する。
【００１７】
【図７】図７は、反応速度に対する触媒５−ＭＡＡまたは３，５−ＤＡＢＡの使用の効果を例示する。
【００１８】
【図８】図８は、反応性内部標準物質および無反応性内部標準物質と一緒にしたａｏ−６−ＴＡＭＲＡ標識済みアルデヒドの混合物の系列希釈の蛍光クロマトグラフを示す。
【００１９】
【図９】図９は、群によるアルデヒドの単離を実証するＳＰＥ分離分析を提供する。図９は、密接に関連付けられた分子を分離するための、様々な有機溶媒またはその濃度の使用をさらに実証する。
【００２０】
【図１０】図１０は、３０ｍｍおよび５０ｍｍという長さの異なる２種の１０μｍ半分取ガードカラムによってアルデヒドが分離された、２つのクロマトグラフを比較する。
【００２１】
【図１１】図１１は、基準のＣ３〜Ｃ１０アルデヒドを含有する試料に基づいた上側と、息試料に基づいた下側の２つのクロマトグラフを比較する。上側：フルオロフォア（flurorphore）およびＣ３〜Ｃ１０アルデヒドによって形成された生成物を含有する試料が、基準として使用された。下側：生成物の割当てを確認するために標準物質と比較された息試料。標識化：６．８μＭ  ６−ａｏ−ＴＡＭＲＡ、３ｍＭ  ５−ＭＡＡ、ｐＨ４．２の７０ｍＭシトレート、４０％ＭｅＯＨ。収集  １０Ｌ  ＴＥＤＬＡＲバッグ、捕捉  ３００ｍｇ  ＣＵＣＩＬシリカ、溶出  １．２６ｍＬの４０％ＭｅＯＨ。インキュベーション  室温において１５分。分離：４．６ｍｍ×５０ｍｍ、１０μｍ  Ｃ１８  ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、４５〜１００％ＭｅＯＨ。検出：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００Ｆｌ検出器Ｇ１３２１。
【００２２】
【図１２】図１２は、異なる設計によるデバイスを使用して得られた２つのクロマトグラフを示す。デバイス検出器１：９０度の幾何学的配置、５３２ｎｍ励起、２０ｍｗレーザー、フローセル：内径１ｍｍのＴｅｆｚｅｌプラスチックチューブ、２ｍｍマスク（スリット）、集光  ２５．４ｍｍ円筒形レンズ、ｓｅｍｒｏｃｋ  ＬＰフィルター５６１ｎｍ、ファイバ  ６００μｍコア、検出器ＵＳＢ−２０００  ＣＣＤ（ｏｃｅａｎ  ｏｐｔｉｃｓ）  バンドパス  ５６０〜６１０ｎｍ、１００ｍｓｅｃの積分、矩形関数５、走査２０回、５０フェムトモルのＣ６。デバイス検出器２：９０度の幾何学的配置、５３２励起、２０ｍｗレーザー、セル  ５００μｍキャピラリー（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  ＴＳＰ５００７９４）１５ｍｍフォーカスレンズ、ビームスプリッター、１６ｍｍ集光レンズ、ｏｍｅｇａ  ＬＰフィルター５５０ｎｍ。検出器  ＵＳＢ−２０００  ＣＣＤ（ｏｃｅａｎ  ｏｐｔｉｃｓ）  バンドパス  ５６０〜６１０ｎｍ、１００ｍｓｅｃの積分、矩形関数５、走査２０回。それぞれ１フェムトモルのａｏ−６−ＴＡＭＲＡによって標識されたアルデヒドＣ４〜Ｃ１０。
【００２３】
【図１３】図１３は、標識剤の反応性を実証する。
【００２４】
【図１４】図１４は、ａｏ−５，６−ＴＡＭＲＡの混合異性体を含む反応性標識剤によって標識された、アルデヒドのクロマトグラフを示す。
【００２５】
【図１５】図１５は、ａｏ−５−ＴＡＭＲＡまたはａｏ−６−ＴＡＭＲＡのいずれかを含む反応性標識剤によって標識されたアルデヒドの２つのクロマトグラフを比較する。
【００２６】
【図１６】図１６は、温度および時間の関数としての標識化の効率を示す。
【００２７】
【図１７】図１７は、反応速度に対する触媒の効果を示す。触媒なしで低い分析物濃度において、標識化反応は遅い。反応速度は、触媒の存在下において１０倍に上昇し得る。反応条件は、１：１．２の反応性標識剤（ａｏ−５，６−ＴＡＭＲＡを含む）：ヘキサナール、１、１００および１０００のモル比の５−ＭＭＡ、ｐＨ４．１６の６．５ｍＭシトレート、室温であった。
【００２８】
【図１８】図１８は、等しい濃度のアルデヒドの系列希釈を使用して、検出限界（ＬＯＤ）曲線を提供した。反応性内部標準物質（Ｃ１２アルデヒド）および無反応性内部標準物質（Ｃ１６アミド）を一定の濃度において、希釈系列中の各試料に加えた。反応を１５分間インキュベートし、次いでクエンチした。混合物を、標準条件下、ＨＰＬＣ、４×２０ｍｍ、５μｍ、Ｃ１８カラムによって分析した。
【００２９】
【図１９】図１９は、反応性標識剤がａｏ−６−ＴＡＭＲＡを含む、標準試料と息試料を比較したクロマトグラフを提供する。ピーク高さを使用したとき、合計としてのＣ３〜Ｃ１０の推定値は、およそ８０ｐモル／Ｌまたは２．２ｐｐｂである。Ｃ４〜Ｃ１０の合計は、４８ｐモル／Ｌまたは１．２ｐｐｂにおいて推定されている。標識化：６．８μＭ  ６−ａｏ−ＴＡＭＲＡ、３ｍＭ  ５−ＭＡＡ、ｐＨ４．２の７０ｍＭシトレート、４０％ＭｅＯＨ、収集  １０Ｌ  ＴＥＤＬＡＲバッグ、捕捉  ３００ｍｇ  ＣＵＣＩＬシリカ、溶出  １．２６ｍＬ  ４０％ＭｅＯＨ。インキュベーション  室温において１５分。分離：４．６ｍｍ×５０ｍｍ、１０μｍ  Ｃ１８  ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ。４５〜１００％ＭｅＯＨ。検出：デバイス検出器１（図１２を参照されたい）。
【００３０】
【図２０】図２０は、ａｏ−６−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤の濃度の関数としての標識化反応を実証する。反応性標識剤濃度は、０．５μＭ〜２０μＭまで変化した。最大のシグナルは、およそ１０μＭにおいて観察された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
図１２および図１９を除いて、すべてのクロマトグラフィーデータは、ダイオードアレイを装着したＡｇｉｌｅｎｔ（Ｈｅｗｉｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）モデル１１００ＨＰＬＣシステムおよび蛍光検出を使用して取得した。ＴＡＭＲＡの場合、励起５５０ｎｍ（２０ｎｍ、すなわち、５４０〜５６０ｎｍのバンド幅で）および発光５８０ｎｍ（２０ｎｍ、すなわち、５７０〜５９０ｎｍのバンド幅で）。代表的な分離法、移動相  メタノール、ｐＨ７の１０ｍＭ  ＴＥＡＡ水溶液。直線状グラジエント  ４５％〜１００％メタノール、流量１ｍｌ／分。
【００３２】
詳細な説明
本明細書において提供された説明、実験および図面は例示的なものであり、限定するものとして解釈すべきでない。数多くの具体的な詳細が、本開示の徹底的な理解をもたらすために記述されている。しかしながら、ある特定の場合では、周知のまたは従来の詳細は、不明瞭な説明を回避するために記述されていない。本開示における一実施形態または別の実施形態への言及は、同じ実施形態への言及であってもよいが、必ずしも同じ実施形態への言及であるとは限らず、このような言及は、実施形態の少なくとも１つを意味する。
【００３３】
本明細書における「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、実施形態に関して記述された特定の特色、構造または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書の様々な場所における「一実施形態では」という語句の出現は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないし、別々のまたは代替的な実施形態が、相互に他の実施形態を排除するわけでもない。さらに、一部の実施形態によって示され得るが他の実施形態によって示されないこともあり得る様々な特色が、記述されている。同様に、一部の実施形態の要件であり得るが他の実施形態の要件ではないこともあり得る様々な要件が、記述されている。
【００３４】
本明細書において使用されている用語は一般に、本開示と文脈において、各用語が使用されている具体的な文脈中では、当技術分野における通常の意味を有する。本開示を記述するために使用されるある特定の用語は、下または本明細書中の他の場所において、本開示の説明に関するさらなる手引きを実施者に提供するために論述されている。便宜上、ある特定の用語は、例えばイタリック体および／または引用符を使用して強調されていてもよく、強調表示の使用は、用語の範囲および意味に影響を与えず、用語の範囲および意味は、同じ文脈においては、強調されているか否かに関わらず同じである。同じ事柄が１つより多い仕方で言い表され得ることは、理解されよう。
【００３５】
したがって、代替的な文言および同義語が、本明細書において論述された用語のいずれか１つまたは複数に関して使用され得る。用語が本明細書において詳述または論述されているか否かには、いかなる特別な重要性も置かれていない。ある特定の用語の同義語が提供されている。１つまたは複数の同義語に関する詳しい説明は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書において論述された任意の用語の例を含む、本明細書中のいずれかの場所における例の使用は、例示的なものにすぎず、本開示または例証された任意の用語の範囲および意味をさらに限定するように意図されていない。同様に、本開示は、本明細書において与えられた様々な実施形態に限定されない。
【００３６】
本開示の範囲をさらに限定する意図はないが、本開示の実施形態による方法、システム、試薬および化合物の例が、下において与えられている。読者にとっての便宜上、表題または副題が例において使用されてもよいが、これらの例は、本開示の範囲を決して限定すべきでないことに留意されたい。そうではないと規定されていない限り、本明細書において使用されているすべての専門用語および科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、規定を含めて本明細書が優先される。
【００３７】
アルデヒド、ケトンおよびカルボン酸を含むカルボニル含有部分（「ＣＣＭ」）の検出、定量化およびアッセイのために有用な方法、システム、試薬および化合物が、本明細書において提供される。ＣＣＭは、少なくとも１つのカルボニル基を有する化合物である。カルボニル基は、＞Ｃ＝Ｏという二価基であり、多種多様な化学化合物中に存在する。この基は、酸素原子に二重結合した炭素原子からなる。カルボニル官能性は、有機化合物の３種の主要なクラス、アルデヒド、ケトンおよびカルボン酸において、最も頻繁に見られる。開示された方法、試薬およびシステムは、ＣＣＭの混合物の分離、検出および定量化において有用であることが、本明細書において企図されている。
【００３８】
本明細書において提供された方法、試薬、化合物およびシステムは、種々の試料中のアルデヒドの存在および／または濃度の検出において有用である。例証的なアルデヒドには、限定なしに、１−ヘキサナール、マロンジアルデヒド、４−ヒドロキシノネナール、アセトアルデヒド、１−プロパナール、２−メチルプロパナール、２，２−ジメチルプロパナール、１−ブタナールおよび１−ペンタナールが挙げられる。例証的なアルデヒドには、Ｃ１アルデヒド、Ｃ２アルデヒド、Ｃ３アルデヒド、Ｃ４アルデヒド、Ｃ５アルデヒド、Ｃ６アルデヒド、Ｃ７アルデヒド、Ｃ８アルデヒド、Ｃ９アルデヒド、Ｃ１０アルデヒド、Ｃ１１アルデヒド、Ｃ１２アルデヒドおよびＣ１３アルデヒドが挙げられる。例証的なアルデヒドには、脂肪族アルデヒド、ジアルデヒドおよび芳香族アルデヒドが挙げられる。開示された方法、試薬およびシステムは、アルデヒドの混合物の分離、検出および定量化において有用であることが、本明細書において企図されている。一部の実施形態では、試料は、炭素鎖長が異なる２種またはそれよりも多いアルデヒドを含み、標識済みアルデヒドを溶出させるステップは、炭素鎖長に基づいて各アルデヒドを分離する。
【００３９】
本明細書において提供された方法、試薬、化合物およびシステムは、アルデヒド、ケトンまたはカルボン酸等のＣＣＭの濃度の存在および／または推定評価を示すことが有用である種々の用途において、多種多様な実用性を有する。
【００４０】
本明細書において使用されているとき、「あるアルデヒド」という用語は、１つまたは複数のアルデヒド官能基を含有するものとして化学的に特徴付けることができる、任意の化合物を指すように意図されている。一部の実施形態では、合否方式で示すことにより、何らかの最低濃度の具体的なアルデヒドまたはアルデヒドの群が存在することを示す。一部の実施形態では、濃度の推定評価が行われる。様々な実施形態は、具体的なアルデヒド、目的のアルデヒドの群または試料中のすべてのアルデヒドに対して特異的であるように設計されている。
【００４１】
例示として、本明細書において提供された方法およびシステムは、生体試料（息、尿、血液、唾液等）または環境試料（水、空気等）から、２つのアルデヒド官能基を有する不飽和分子であるマロンジアルデヒドの存在および／または濃度を厳密に測定することができる。生体試料中のアルデヒドの検出は、生物の酸化ストレスを示すために有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書において提供された方法、試薬、化合物およびシステムは、飽和および／または不飽和分子を含めて、１つまたは複数のアルデヒド基を含有する他の様々な化合物を、様々な疾患および状態に関するバイオマーカーとして測定するために有用である。ヒトの息中のアルデヒド濃度は、肺がんの存在についてスクリーニングするために有用なバイオマーカーとして機能し得る。
【００４２】
他の実施形態は、食品および農業関連の検査において有用な用途を含む。油の酸化は、油分が多い食品の品質に対して重要な効果を有する。このような酸化は、不飽和アルデヒド２−ヘプテナール、２−オクテナール、２−デセナール、２−ウンデセナールおよび２，４−デカジエナールならびに／またはこれらの化合物のトランス型分子を含む、アルデヒドを生成する。同様に、魚およびシーフード中におけるホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒドのレベルは、品質を示すことができる。食品中に存在する脂質は、酸素および他の物質と反応して、アルデヒドを生成し、脂質酸化のレベル（したがって、アルデヒドの濃度）は、食品品質を示すことができる。他の用途には、気体または液体中のアルデヒドの存在が気体もしくは液体の品質またはそれらの汚染を示すことができる、環境的用途等が挙げられる。
【００４３】
アルデヒドは、対象、例えば患者の全体的健康およびウェルネスに関する情報を提供するために、検出および／または定量化することができる。一部の実施形態では、この情報は、患者の酸化ストレスのレベルを示すことができる。一部の実施形態では、アルデヒドは、患者の医療診断を補助するために測定または分析されてもよい。例えば、息（または尿、血液、血漿もしくは培養された生検細胞のヘッドスペース）中のアルデヒドは、患者の総合的健康を決定するため、および／または患者がある特定の医学的状態に罹患しているかどうかを決定するために試料採取されてもよい。アルデヒド試料採取は、患者が、がん、例えば、食道腺癌および／もしくは胃腺癌、肺がん、結腸直腸がん、肝臓がん、頭部がん、頸部がん、膀胱がんまたは膵臓がんを有するかどうかを示すことができ、患者が、肺疾患（ぜんそく、急性呼吸窮迫症候群、結核、ＣＯＰＤ／気腫および嚢胞性線維症等を含む）、神経変性疾患、心血管疾患に罹患しているかどうか、または、急性心血管事象、感染性疾患（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ等を含む）、胃腸感染症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＨ．ｐｙｌｏｒｉ等を含む）、尿路感染症、副鼻腔炎および他の状態の危険にさらされているかどうかを示すことができる。アルデヒド試料採取は、特定の疾患または状態の重症度または段階分けも示すことができる。
【００４４】
アルデヒド、ケトンおよびカルボン酸を含むＣＣＭを検出および定量化するための試薬、化合物、システムおよび方法が、本明細書において提供される。例示として、酸化ストレスおよび酸化的生物学的プロセスに関連付けられた脂質過酸化の副生成物であるアルキルアルデヒドの検出および定量化は、対象の酸化ストレスの現状に関してケアの提供者または実施者に情報提供することができる。本開示の興味深い属性は、所望の標的、例えばアルデヒド等のＣＣＭの選択反応性「ペイント」ならびに標識済み標的の特異的な単離および検出を含む（図１を参照されたい）。
【００４５】
一実施形態によれば、試料を基材に曝露して、アルデヒドを捕捉するステップ、基材からアルデヒドを溶離させるステップ、アルデヒドを反応性標識剤と混合するステップ、所望の標識済みアルデヒドを単離、検出および任意選択で定量化するステップを含む方法およびシステムが提供される。プロセスは、オンサイトで測定および結果の報告を提供するのに十分に迅速である。例えば、一部の実施形態では、アルデヒドの捕捉からアルデヒドの検出までのプロセスは、約２時間未満または約１．５時間未満または約７５分未満または約１時間未満で完了することができる。
試料供給源
【００４６】
本明細書において使用されているとき、「生物試料」は、最も広義の意味において言及されており、個体、体液、細胞株、組織培養物または任意の他の供給源を含む自然から得られた固体、気体および液体または任意の生物試料を含む。示したように、生物試料は、息、血液、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液、髄液、喀痰、膿、汗等の体液または身体に関する気体、ならびに、植物抽出物および池の水等の環境からの気体または液体試料を含む。固体試料は、毛髪、手の指の爪および葉等を含むがこれらに限定されるわけではない、動物または植物の身体の部分を含み得る。本明細書において提供された一実施形態のための生物試料は、ヒトの息である。
【００４７】
本明細書において提供された方法、試薬、化合物およびシステムは、種々の試料の種類に適用できるが、医学的使用との関連においては、息分析は、血清生化学検査の有望な非侵襲性の代替法に相当する。比較的低い分子量を有する揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の概要は、病態生理学的な処理および代謝の改変の結果としての明瞭な即時の変化を反映する。息中のＶＯＣの状況および集団の変化は、代謝および疾患状況の変化を反映する。呼気からの疾患の検出および区別のための方法およびシステムが、本明細書において提供される。
例示的な方法およびシステム
【００４８】
酸化ストレスの現状の定量化のための非侵襲性のシステムが、本明細書において提供される。酸化ストレスは一般的に、酸化的プロセスと、還元的（抗酸化的）プロセスとの病態生理学的不釣り合い（または酸化剤＞抗酸化剤）として規定されている。不釣り合いが細胞修復機構を上回ると、酸化的損傷が蓄積する。高レベルの反応性酸化剤種は、心血管、肺、自己免疫、神経性、炎症性、結合組織の疾患およびがんに由来する種々の疾患の発病機序と関連付けられている。しかしながら、息および他の生物試料中における脂質酸化の副生成物は、従来のデバイスおよび方法の検出限界を超えるような少量で存在する。さらに、これらの同じ副生成物は、試料中において、長期的には安定でなく、このような分子を識別または定量化しようとする試みは、分析の前またはその間の劣化のため、うまくいかない。
【００４９】
酸化ストレスを測定するための方法、試薬およびシステムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法およびシステムは、脂質酸化の副生成物、例えばアルキルアルデヒドおよびケトンを検出および／または定量化する。一部の実施形態では、これらの副生成物は、呼気の試料中で測定される。本方法は、所望の化学的クラスの標的の選択反応性「ペイント」、ならびに、「所望の」サブクラスの「ペイント済み」または標識済み標的の特異的な単離および検出を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、試料中のアルデヒドを識別および／または測定するための方法であって、生物試料を捕捉するためのデバイスを提供するステップを含み、デバイスが、アルデヒドを捕捉するための基材を含み、アルデヒドを標識するための反応性標識剤を含み、アルデヒドのクラスを分離するためのカラムを含み、蛍光を誘導するための光を含み、蛍光の発光、励起または吸光度を測定するための検出器を含む、方法が提供される。
【００５１】
一部の実施形態では、デバイスは、対象からアルデヒドを含有する息試料を受け入れ、試料を基材上に加え、試料に溶出プロセスを実施して、アルデヒドを捕捉し、アルデヒドを反応性標識剤と混合し、インキュベートし、標識済みアルデヒドを分離し、測定し、測定結果を提示する。
【００５２】
一部の実施形態では、アルデヒド、ケトンまたはカルボン酸等のＣＣＭを識別および／または測定するための方法が提供される。一部の実施形態では、反応性標識剤は、試料中に存在するアルデヒドに付着し、試料中の残りの構成成分は、結合していない反応性標識剤と同様に除去される。一部の実施形態では、逆相マトリックスまたは積層型マトリックスを使用して、測定のために標識済みアルデヒドを分離することができる。
【００５３】
一部の態様では、方法は、生物試料からアルデヒドを基材上に捕捉するステップ、基材からアルデヒドを溶出させるステップおよびアルデヒドを標識するステップを含み得る。一部の態様では、方法は、生物試料からアルデヒドを基材上に捕捉するステップ、捕捉されたアルデヒドを標識するステップおよび標識済みアルデヒドを溶出させるステップを含み得る。一部の態様では、基材に、反応性標識剤が組み込まれる。
【００５４】
一部の実施形態では、デバイスは、エミッターと、検出器と、光チャンバーと、蛍光チャンバーおよびウェルと、エミッターから伸びて光チャンバーを通りウェルを通る光経路と、ウェルから伸びて蛍光チャンバーを通り検出器に至る蛍光経路とを含む蛍光検出組立体を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、蛍光を検出する方法は、蛍光標識済みカルボニル含有部分を含有する溶液を励起するステップを含む。光が溶液を通過し、蛍光標識済み部分を励起し、蛍光を生成すると、蛍光の吸光度または発光が検出される。
【００５６】
一部の実施形態では、息中のカルボニル含有部分を検出および定量化するための方法は、（ａ）生物試料を得るステップ、（ｂ）試料からカルボニル含有部分を基材上に捕捉するステップ、（ｃ）標識済み溶液を提供するためにカルボニル含有部分を標識するステップ、（ｄ）標識済み溶液中を通って所定の波長範囲内の光を導くステップであって、これにより、蛍光を生成するステップおよび（ｅ）蛍光を検出するステップを含む。
【００５７】
一部の実施形態では、標識するステップ（ｃ）は、（ｉ）ＣＣＭを（ｉｉ）緩衝液と混合すること、次いで（ｉｉｉ）触媒、および最後に（ｉｖ）反応性標識剤を加えることを含む。一部の実施形態では、（ｉｉ）緩衝液は、（ｉ）緩衝液がカルボニル含有部分と一緒に溶液中に存在するように溶出溶液中に存在し得る。一部の実施形態では、内部標準物質は、触媒の添加前に溶液に加えられる。最後に触媒および反応性標識剤を加えることは、予備インキュベーションおよび反応性の喪失の防止に役立つことがある。
【００５８】
したがって、試料、緩衝液および触媒から捕捉されたアルデヒド等のＣＣＭを含む、組成物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、組成物は、反応性標識剤をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１種の無反応性内部標準物質をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１種の反応性内部標準物質をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、試料、緩衝液、触媒、反応性標識剤および任意選択で少なくとも１種の内部標準物質から捕捉されたアルデヒド等のＣＣＭから本質的になる。
【００５９】
システムを使用して任意の生物試料を分析できることは、理解されよう。所望に応じて、ＣＣＭまたはアルデヒド以外の息成分を捕捉および分析することもできる。米国特許出願公開第２００３／０２０８１３３号および第２０１１／０００３３９５号は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
標的の捕捉
【００６０】
本明細書において提供されたシステムおよび方法は、ＣＣＭの検出のための「リアルタイム」アッセイフォーマットに適合するが、一次的な（基材上への）捕捉および放出（ロードされた基材からの溶出）プロセスを加えることによって、溶液中のＣＣＭの検出および／または気相中の微量のＣＣＭの検出に適用され得る。方法の一ステップでは、気相ＣＣＭ、例えば、ヒトの息からのアルデヒドが基材上に捕捉される。
【００６１】
本明細書において有用であると企図されている捕捉基材は望ましくは、固体であるが必ずしも剛直であるとは限らない材料から形成される。固体基材は、フィルム、紙、不織ウェブ、編物、織物、発泡体、ガラス等の種々の材料のいずれかから形成され得る。例えば、固体基材を形成するために使用される材料は、多糖（例えば、紙等のセルロース材料ならびにセルロースアセテートおよびニトロセルロース等のセルロース誘導体）等の合成改質された天然、合成または天然由来材料；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；不活性化されたアルミナ、ケイ藻土、ＭｇＳＯ４、または、ビニルクロリド、ビニルクロリドプロピレンコポリマーおよびビニルクロリド−ビニルアセテートコポリマー等のポリマーと一緒に多孔性マトリックス中に一様に分散された他の微粉化された無機材料等の無機材料；天然由来（例えば、綿）と合成（例えば、ナイロンまたはレーヨン）の両方の布；シリカゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチン等の多孔性ゲル；ならびにポリアクリルアミド等のポリマーフィルム等を含み得るが、これらに限定されるわけではない。一部の態様では、基材は、任意選択でフリット間に間隔を空けた、シリカの固相マトリックスである。基材のサイズは、測定可能な量のＣＣＭが基材によって捕捉されるように選択される。サイズは変化し得るが、一般に、約２ｍＬまたは約１ｍＬまたは約０．２５ｍＬである。
【００６２】
基材は一般的に、５０〜２７０メッシュ（３００〜５０μｍ）および７５〜３００ｍｇの質量、または６０〜１２０メッシュ（２５０〜１２５μｍ）および１００〜２００ｍｇの質量、または５０〜１２０メッシュ（２１０〜１２５μｍ）および１２５〜３００ｍｇの質量、または２００〜３２５メッシュ（８０〜４４μｍ）と７５〜５００ｍｇの質量を有し、５０〜６０オングストロームの細孔を有する、粒子の塔（ｂｅｄ）からなる。
【００６３】
基材によって捕捉されるＣＣＭの量は変化し得るが、一般的に、１２．５ｍｍの塔径を有する２００ｍｇの５０〜２７０メッシュ（３００〜５００μｍ）粒子からなる基材の場合は、呼気分析計のようなチューブ内に息を吹き込んだ後のヒトの息中における量と同等である。一部の態様では、７５〜０．１ｐｐｂ（４００〜４ｐモル）または２０ｐｐｂ〜０．０１ｐｐｂ（８０〜０．４ｐモル）である。
【００６４】
一般に、捕捉マトリックスからの捕捉されたアルデヒドの溶出溶液は、緩衝液および／または有機溶媒を含む。有機溶媒は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよび／またはアセトニトリルを含み得、約３４％〜５０％または約３５％、約３８％、約４０％、約４５％等の量で存在し得る。緩衝液の濃度は、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり得る。一部の実施形態では、界面活性剤が、溶媒の代わりに用いられる。
【００６５】
塩は任意選択で含まれてもよく、蛍光を発する溶液に悪影響を有さず、溶出溶液中における塩効果を制御する、任意の塩であってよい。本明細書において企図された塩は、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、硫酸塩およびリン酸塩ならびにこれらの混合物を含み得る。塩の濃度は、５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり得る。
【００６６】
緩衝液は、溶出溶液を弱酸性および２〜６の間または約２．５または約４または約４．２のｐＨに維持するために用いられる。緩衝液は、ＨＣｌ、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸／アセテートおよびシトレート／ホスフェートであってよい。
【００６７】
本明細書において提供された方法を実施するための温度は、１５〜３５℃、例えば２５〜３０℃の範囲であり得る。
標識および分離のプロセスおよびシステム
【００６８】
このプロセスでは、標的、アルデヒドおよびケトンは、カルボニル選択反応性の蛍光性「ペイント」によって標識される。
【００６９】
標識は、１）「透明な」アルキルアルデヒド標的を、吸収または蛍光発光のいずれかによる検出によって観察および定量化され得る種に変換すること、ならびに２）所望の標的の選択的な単離を可能にし、向上することという、２つの目的を提供する。
【００７０】
標識および分離マトリックスは、本明細書において提供された実施形態では有用な反応性、シグナルおよび分離特性の組合せを提供し、鎖長が単一の炭素分だけ異なる個別のアルデヒドを分離および識別する能力を提供する。
【００７１】
一部の実施形態では、標識済みアルデヒドのクラスは、通常ＳＰＥカラムにおいて見られる低解像能６０〜２００μｍ粒子を使用して、「バルク」クラスに単離することができる。この実施形態では、鎖長が類似したアルデヒドの群、すなわち、Ｃ１〜Ｃ３、Ｃ５〜Ｃ１０をバルクで単離および検出し、選択されたアルデヒドの群の迅速な分析を行うことができる。
【００７２】
標識済みアルデヒドは、順相、逆相およびＨＩＬＩＣ分離法を使用して、バルクで、または単一の種として単離することができる。本明細書において記述された逆相法において、標識済み標的は、分離基材（マトリックス）であるＣ２〜Ｃ１８への疎水性引力によって分離される。疎水性がより大きい標識済み標的がより保持され、溶出溶液の有機物含量の増大に伴って溶出する。遊離した未反応の標識は極性がより大きく、出発条件の適切な選択によって最初に溶出し、遊離した標識およびより小さなアルデヒドは、分離マトリックスによって自由に通過する。ＨＩＬＩＣ分離の場合、引力の機構が反転され、疎水性がより大きい標識済み標的は先に溶出し、疎水性がより小さいより小さなアルデヒドおよび遊離した色素はより長く保持される。一部の実施形態では、標識剤、標的、分離マトリックスおよび分離条件（溶媒、ｐＨ、緩衝液（イオン対形成剤））の慎重な選択および整合は、有用であり得る。
【００７３】
試料中の少なくとも１つのカルボニル含有部分の存在を検出するためのシステムが、本明細書において提供される。システムは、カルボニル含有部分を捕捉するための基材、カルボニル含有部分を基材から溶離させるための試薬、カルボニル含有部分を反応性標識剤と会合させるための試薬、標識済みカルボニル含有部分を分離するためのカラム、カラムから標識済みカルボニル含有部分を溶出させるための溶媒、ならびに、蛍光の励起、吸光度および／または発光を発生させて標識済みカルボニル含有部分を検出するための光および検出器を含む。一部の態様では、システムは、約２時間未満で１回のサイクルを完了する。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのカルボニル含有部分の濃度を測定するための標準物質をさらに含む。
反応性標識剤
【００７４】
例証的な反応性標識剤は、選択的かつ迅速な標識化および単一の炭素の分離の両方を行うように構築された（図２）。ａｏ−６−ＴＡＭＲＡおよびカダベリンを含む例示的な１種の反応性標識剤は、カルボニル基への迅速で選択的なカップリングをもたらし、このとき、反応性は、アルデヒド＞＞ケトンである（図２、３および４）。得られたオキシム結合は、安定性を増大させるために第二級アミン連結への還元を必要とする、ヒドラジンおよびヒドラジドの化学反応によって形成された相補的なヒドロゾン（hydrozone）結合より安定である。ヒドロゾンは、再平衡化によるスクランブリングを受けやすい。
【００７５】
反応性標識剤は、所与の用途のために変更される３種の態様を内包する。母体であるフルオロフォア、例えばＴＡＭＲＡは、検出様式および一次的分離機構を規定する。リンカーは、分離機構および量子収量を調節する。例えば、ジアミンアルキルリンカーをより極性の大きい水溶性ポリエチレン（ＰＥＧ）リンカーの代わりに用いることにより、逆相疎水性分離において保持される度合いが低下する。ＰＥＧリンカーは、アルキルジアミンリンカーに比較して分離マトリックスへのアフィニティーがより低い結果としてバンドが幅広化するため、ロードされ得る体積を制限する（図５）。最後の要素である反応性基は、特異性、速度および標識安定性を調節する。
【００７６】
一般的に、反応性標識剤は、標的カルボニルを選択的かつ効率的に（迅速に）標識することが可能であり、未反応の試薬からのバルクおよび個別の分離を行うことができ、分光学的検出のための十分な検出特性を提供し得る。
【００７７】
反応性標識剤の上記３種の構造的態様は、溶媒、反応時間および温度ならびにカラム長を変更したときに、標識化のための選択肢を提供するために変更され得る。
【００７８】
フルオロフォアは、標的カルボニルの検出および分離に影響し得る。
【００７９】
リンカーは、分離機構および量子収量に影響し得る。
【００８０】
反応性基は、特異性、反応速度および標識安定性に影響し得る。
【００８１】
したがって、一部の実施形態では、反応性標識剤は、フルオロフォア、リンカーおよび反応性基を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、フルオロフォアは、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）またはローダミン１１０（Ｒ１１０）である。一部の実施形態では、フルオロフォアは、アミノオキシ５（６）ＴＡＭＲＡまたはアミノオキシ５  ＴＡＭＲＡまたはアミノオキシ６  ＴＡＭＲＡである。一部の実施形態では、フルオロフォアは、蛍光性ヒドラジンまたはアミノオキシ化合物である。
【００８３】
一部の実施形態では、標識化反応は、カルボニル官能基、すなわち、アルデヒドおよびケトンに対して選択的であり、アルデヒドの反応性は、ケトンの反応性より格段に大きい（アルデヒド＞＞ケトン）。反応は、安定なオキシム結合を形成する。ヒドラジン反応性基およびヒドラジド反応性基は、カルボニルの選択的標識化も提供する。
【００８４】
フルオロフォア、ＴＡＭＲＡ異性体、リンカーおよび反応性基の性質は、反応性標識剤の反応性および分離特性を調節することができる。しかしながら、例えば緩衝液（ｐＨ）、触媒、フルオロフォア濃度または有機溶媒を含む反応および分離プロセスの他の態様は、望ましい反応速度および効率を達成するために調節することができる。図１３を参照されたい。
【００８５】
反応性標識剤は、本明細書において提供された説明に従って改質されたａｏ−ＴＡＭＲＡ異性体の混合物、例えばａｏ−５−ＴＡＭＲＡおよびａｏ−６−ＴＡＭＲＡの混合物を含み得る。両方の異性体を使用した例証的な反応性標識剤に関しては、図３を参照されたい。この混合物は、使用された合成法および精製法に応じて、異性体比が変化し得る。混合異性体配合物の使用は、各異性体に関して１つのバンドの、各アルデヒドに関して２つのバンドという、複雑なクロマトグラフを生じさせる。個別のアルデヒド間の分離は、異性体の重複のため、より困難であり得る。しかしながら、溶媒系またはカラムの特徴の修正は、異性体分離を減少させる可能性があるが、アルデヒド分離を可能にし得る。図１４を参照されたい。単一の異性体配合物の使用は、混合異性体配合物より複雑さが減じたクロマトグラフを生じさせる。ａｏ−６−ＴＡＭＲＡ異性体を含む反応性標識剤は、この方法において、保持される度合いがより小さく、ａｏ−５−ＴＡＭＲＡ異性体を含む反応性標識剤（１５分超）の場合に比べて、より短い運転時間（１５分未満）およびより長鎖のアルデヒドのより良好な分離を可能にする。図１５を参照されたい。
【００８６】
アミノオキシ−５（６）−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤は、穏やかな条件下において、アルデヒドまたはケトンと反応して、安定なオキシム化合物を形成することができる。図２および１３を参照されたい。
【００８７】
反応性標識剤の濃度を変更して、所望の蛍光を達成することができる。一実験では、反応性標識剤濃度は、０．５μＭ〜２０μＭまで変化しており、最大シグナルは、およそ１０μＭにおいて観察された。図２０を参照されたい。
リンカーおよび反応性基
【００８８】
上記のように、リンカーは、分離機構および量子収量に影響し得る。例えば、ジアミンアルキルリンカーをより極性の大きい水溶性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーの代わりに用いることにより、逆相疎水性分離において保持される度合いが低下し得る。例示として、ａｏ−ＰＥＧ−５−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤は、疎水性リンカーと一緒にａｏ−ＴＡＭＲＡを含む対応する反応性標識剤に比べて、逆相クロマトグラフィーにおいて保持される度合いがより低い：それぞれ６分対１１分（初期４０％ＭｅＯＨ）。
【００８９】
十分な分離は、５％〜１００％メタノールグラジエントを使用して達成できるが、ＰＥＧリンカーは、アルキルジアミンリンカーに比較して分離マトリックスへのアフィニティーがより低い結果としてバンドが幅広化するため、逆相カラム上にロードされ得る体積を制限する。注入量を１０μＬから１００μＬに増大させると、感知可能なバンド拡張が観察される。図５を参照されたい。
【００９０】
ａｏ−６−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤は、１０〜９００μＭの注入量で存在し得、依然として、バンド幅広化がない最小限の適切な分離をもたらすことができる。図５を参照されたい。
【００９１】
例証的なリンカーには、置換アルキルジアミン（Ｃ２〜Ｃ１０）、置換アミノカルボン酸（Ｃ２〜Ｃ１０）および置換ポリエチレングリコール（Ｎ＝１〜１０）が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、ヘキサン酸、アミノヘキサン酸、カダベリン、ポリエチレングリコールおよびポリグリコールからなる群から選択される。
【００９２】
反応性基は、特異性、反応速度および標識安定性を提供する。例えば、アミノキシ反応性基は、カルボニル官能基との安定なオキシム結合を迅速に形成する。周囲の室温における反応は、同様の変換のために数時間から終夜かかる可能性があるヒドラジドカップリングとは対照的に、６０分で９０％超の変換を示す。初期速度は、高温において加速され得る（４０℃において２倍）。反応は、反応速度をｐＨ５〜ｐＨ２．４の間に増大させながら、ｐＨプロファイルを示す。図６を参照されたい。ｐＨ４．２における速度は、ｐＨ７における速度のおよそ１０倍である。
【００９３】
一部の実施形態では、反応性基は、ヒドラジン部分、カルボヒドラジド部分、ヒドロキシルアミン部分、セミカルバジド部分、アミノオキシ部分およびヒドラジド部分からなる群から選択することができる。
化合物
【００９４】
フルオロフォア、リンカーおよび反応性基を含む化合物が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、フルオロフォアは、ＴＡＭＲＡであり、アミノオキシ−５−ＴＡＭＲＡであり、アミノオキシ−６−ＴＡＭＲＡであり、または、アミノオキシ−５−ＴＡＭＲＡとアミノオキシ−６−ＴＡＭＲＡの混合物である。一部の実施形態では、リンカーは、ヘキサン酸、アミノヘキサン酸、カダベリン、ポリエチレングリコールおよびポリグリコールからなる群から選択される。一部の実施形態では、反応性基は、ヒドラジン部分、カルボヒドラジド部分、ヒドロキシルアミン部分、セミカルバジド部分、アミノオキシ部分およびヒドラジド部分からなる群から選択される。
【００９５】
一部の実施形態では、化合物は、
【化１】
2019512673.tif 000003
およびこれらの混合物からなる群から選択される。
触媒および他の反応条件
【００９６】
反応速度は、３，５−ジアミン安息香酸（3,5  diamine  benzoic  acid）（３，５−ＤＡＢＡ（3,5  DABA））および５−メトキシアントラニル酸（２−アミノ−５−メトキシ−安息香酸）（５−ＭＡＡ）等の芳香族アミン化合物の添加によってさらに高めることができる。図７を参照されたい。反応速度は、触媒なしの反応に対して１０倍超に高まった。３，５−ＤＡＢＡは、所望のｐＨにおいて限定的な溶解度を有し、用いられた条件下においてかなり迅速な酸化を受けるが、適切な状況下において利用され得る。酸性ｐＨ（ｐＨ４．２の３０〜７０ｍＭシトレート）と一緒に触媒５−ＭＡＡを使用することにより、ａｏ−６−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤へのアルデヒドの迅速なカップリングが生じた。図７を参照されたい。わずか１ｐモルのアルデヒドは、これらの条件下において周囲温度にて１５分で標識することができる。図１７を参照されたい。そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるCrisalliおよびKoolによって記述された触媒を含む、さらなる触媒が、本明細書において企図されている：CrisalliおよびKool、Organic  Letters  ２０１３年、１５巻（７号）：１６４６〜１６４９頁；CrisalliおよびKool、Journal  of  Organic  Chemistry  ２０１３年、７８巻：１１８４〜１１８９頁；Koolら、Journal  of  American  Chemical  Society  ２０１３年、１３５巻：１７６６３〜１７６６６頁。
【００９７】
一部の実施形態では、捕捉および標識化は、５−メトキシアントラニル酸（5-methoxyanthanlic  acid）（５−ＭＡＡ）、３，５−ジアミノ−安息香酸（3,5  diamino-benzoic  acid）（３，５−ＤＡＢＡ）等の触媒または同様の触媒、温度およびｐＨの存在によって加速され得る。一部の実施形態では、ｐＨは、２〜５の間であり、または約５未満である。
【００９８】
図７は、標準溶液による方法の場合、反応速度に対する異なる２種の触媒の影響の例を提供する。見て分かるように、標識化反応は、触媒なしの場合で低い分析物濃度において、極めて遅い。触媒を用いた場合、反応速度は、格段に速く、例えば約１０倍速くなり得る。反応は、ヘキサナール：触媒のモル比が約１：９００〜１０００であり、色素：触媒の比が約１：１２００である、５−ＭＡＡ（５−メトキシアントラニル酸または２−アミノ−５−メトキシ−安息香酸）または３，５−ＤＡＢＡ（３，５−ジアミノ安息香酸）の関数としての、約１：１．２の比の５，６−ａｏ−ＴＡＭＲＡ（5,6  ao-TAMRA）：ヘキサナールを提供する。条件：６．２μＭ  ５，６−ａｏ−ＴＡＭＲＡ、７．５μＭヘキサナール。緩衝液は、触媒によってｐＨを緩衝したため、加えられなかった。図７を参照されたい。
【００９９】
図１７は、触媒５−ＭＡＡの影響のさらなる例を提供しており、０、１００および１０００のモル比の５−ＭＡＡの関数として、５，６−ａｏ−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤がヘキサナールに対して１：１．２の比で存在する。５，６−ａｏ−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤の濃度は６．２μＭであり、ヘキサナールの濃度は７．５μＭであった。６．５ｍＭクエン酸緩衝液は、ｐＨ４．１６を有しており、実験は、室温で実施された。図１７を参照されたい。
【０１００】
さらなる例では、反応速度に対する温度の効果を検査した。図１６において見て分かるように、温度の増大は、主に、初期反応速度を高めた。実験条件は、１：１の比の反応性標識剤とヘキサナール、例えば、７μＭ  ａｏ−ＴＡＭＲＡ（a0-TAMRA）と７μＭヘキサナール、３０％エタノール、ｐＨ４．２の７５ｍＭシトレートであった。図１６を参照されたい。
標準物質（図８を参照されたい）
【０１０１】
一部の実施形態では、標準物質がアッセイに含まれる。標準物質により、コンシステンシーを確保することができ、所与のアッセイが実用的であることおよび高精度なデータを提供することを保証することができる。一部の実施形態では、少なくとも１種の反応性標準物質が含まれる。一部の実施形態では、少なくとも１種の無反応性標準物質が含まれる。
【０１０２】
内部標準物質は、クロマトグラフィーにより標的分子に干渉しないようにすべきである。
【０１０３】
反応性標準物質は、試薬の劣化（フルオロフォア、触媒、緩衝液）、分注のバラつきおよび環境の変化（温度）を含むいくつかの要因によって起こされ得る反応性のずれに対して、シグナルを補正するための機構を提供することができる。長鎖脂肪族アルデヒドは、反応性標準物質を選択およびスクリーニングすることができる。
【０１０４】
無反応性標準物質は、機器のずれまたは相違を理由としたシグナルの正規化、総合的な反応性の尺度および保持時間の登録を提供することができる。一部の実施形態では、無反応性標準物質は、用いられた条件下において安定であり、すなわち、試薬（すなわち、標識化試薬、標的、触媒）との反応性交換または受動的交換を受けない。無反応性標準物質は、アッセイの条件下において、分光学的および化学的に安定でなければならない。これにより、無反応性標準物質の選択および構築には、特別な考慮が必要とされる。無反応性標準物質の場合、アミド官能化６−ＴＡＭＲＡを調製することができる。例示的な化合物には、６−ＴＡＭＲＡ−Ｃ１４、６−ＴＡＭＲＡ−Ｃ１６および６−ＴＡＭＲＡ−Ｃ１８が挙げられる。
【０１０５】
一部の実施形態では、反応性または無反応性の標準物質化合物は、標的化合物、例えばＣ４〜Ｃ１０アルデヒドに干渉しない。一部の実施形態では、反応性または無反応性の化合物は、互いから十分に分離される。一部の実施形態では、標準的な反応性標準物質化合物は、アッセイに適した反応性を有する。一部の実施形態では、無反応性連結は、反応条件に対して安定である。
【０１０６】
標準物質を使用して、所与の方法の検出限界（ＬＯＤ）を決定することができる。図１８において、ＬＯＤ曲線は、等しい濃度のアルデヒドの混合物の系列希釈を使用して構築された。反応性内部標準物質（Ｃ１２アルデヒド）および無反応性内部標準物質（Ｃ１６アミド）を一定の濃度において、希釈系列中の各試料に加えた。
【０１０７】
反応物を１５分間インキュベートし、次いで、ｐＨ１０の１Ｍ重炭酸ナトリウムを使用してクエンチした。混合物は、４×２０ｍｍ逆相Ｃ１８カラム（５μｍ）を含む標準条件を使用するＨＰＬＣによって分析した。この例において、ＬＯＤは、０．１３ｐモル未満であった。
プロセスの説明
【０１０８】
本明細書において開示された方法および戦略は、図１に例示されている。標的の標識化ならびに所望の標識済み標的の特異的で迅速な単離および検出における選択的かつ特異的な反応性の両方を有する方法およびシステムが、本明細書において提供される。標的分子、例えばアルデヒドおよびケトンは、カルボニル選択反応性の蛍光性「ペイント」によって標識される（図１を参照されたい）。標識は、次の機能：光学的に「透明な」アルキルアルデヒド標的を、吸収または蛍光検出のいずれかによって観察および定量化され得る種に変換すること、ならびに、所望の標的の選択的単離を可能にし、向上することのうちの１つまたは複数を提供することができる。反応性標識および分離マトリックスは、反応性、シグナルおよび分離特性の適正な組合せを提供することができる。一部の実施形態では、方法は、鎖長が炭素１個分だけ異なる個別のアルデヒドを分離および識別する能力を提供する。
【０１０９】
アルデヒドはシリカ上に置かれるが、ｐＨ４．２で３０ｍＭクエン酸緩衝液中のメタノールによって洗い落すことができる。反応性アルデヒド模倣物、触媒および反応性標識剤と同様に、任意選択で、二重内部標準物質が加えられてもよい。混合物は、標識化反応が起きるのに十分な量の時間の間インキュベートされる。反応は、塩基性溶液、例えば重炭酸ナトリウム等によってクエンチすることができる。
【０１１０】
次いで、ｐＨ７の４５％ＭｅＯＨ／ＴＥＡ等、有機物含量が低〜中等度の溶媒／緩衝液混合物によって予備平衡したＣ１８逆相分離カラムに、溶液を注入する。注入後、試料を、有機溶媒含量を増大させるグラジエントに供する。グラジエントは、直線状、段階的または組合せ（ステップ＋直線状）であってよい。一般的なグラジエントプロセスは、ｐＨ７の４５％ＭｅＯＨ／ＴＥＡによって最初に予備平衡化し、続いて、２〜４分保持し、続いて、１０分にわたってｐＨ７の４５％／ＭｅＯＨから１００％ＭｅＯＨまで直線状に増大させ、続いて、初期条件（ｐＨ７の４５％ＭｅＯＨ／ＴＥＡ）に迅速に戻すことであってよい。このプロセス中に、標識済みアルデヒド（標識済み標的）が、標的／標識の組み合わせた疎水性に基づいてカラムから溶出する。ａｏ−６−ＴＡＭＲＡによって標識されたアルデヒドの場合、溶出の順番は、より短鎖のアルデヒドから、より長鎖のアルデヒド（Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５．．．．．Ｃ１０）である。ここでの説明は例示的なものであるが、他の溶媒および他の溶媒グラジエントも本明細書において企図されている。例示的な例としてＴＡＭＲＡ誘導体を含有する溶出溶液を使用したとき、標識済みＣＣＭが溶出され、ＣＣＭに付着したＴＡＭＲＡ誘導体によって吸収または発光された蛍光の測定によって検出される。図１１を参照されたい。
【０１１１】
アルデヒド含量は、各溶出種のシグナルのモニタリングによって定量化される。シグナルは、初期アルデヒド濃度の関数である。溶出グラジエントと同調させた連続フロー式検出を用いた場合、シグナルは、注入後の時間の関数としてモニタリングされる。シグナルの強度および面積は、各標識済み種（標識済みアルデヒド）の母集団を反映する。試料中の各種の定量化は、既知量の合成された標識済みアルデヒド標準物質の注入によって生成された標準曲線への参照によるものである。アルデヒドは、標識済み種が段階的に溶出され、蛍光シグナルが、標準的な蛍光光度計または同様のデバイスを使用して各群に関して測定される、非連続フロー式検出を使用して定量化することもできる。記述された定量化プロセスは、「エンドポイント」アッセイスキームの例である。このスキームでは、アッセイは、設定されたある時間の間インキュベートされ、次いで分析される。変換またはシグナルの増大は、初期カルボニル（標的）濃度の関数である。２種の一般アッセイフォーマットまたは検出モードが存在する。これらは、エンドポイントおよび速度論的なものとして、包括的に記述される。エンドポイントアッセイでは、システムが、設定されたある時間の間インキュベートされ、シグナルが読み取られる。この時点におけるシグナルは、システム中の分析物の量を反映する。陽性アッセイの場合、分析物の濃度が高くなるほど、シグナルがより大きく増大する。速度論的アッセイでは、変化の速度は、設定されたある持続期間の間モニタリングされる。変化の速度は、分析物の量に相関する。一部の態様では、エンドポイントアッセイは、本明細書において提供された方法と一緒に用いられる。
【０１１２】
さらに別の実施形態では、２種の溶液を用いる方法論が使用される。基材にＣＣＭをロードした後、ｐＨ２．５において一般に３０％エタノール、５０ｍＭシトレートおよび３０％エタノールを含む第１の溶出溶液または「すすぎ」溶液中にＣＣＭを溶出させる。作用物質をすすぎ溶液に加え、これにより、ペイント済みＣＣＭを生じさせる。次いで、この溶液を別の基材、例えばシリカフリット積層体に通して、ペイント済みＣＣＭを捕捉する。次いで、ペイント済みＣＣＭは、５０％よりも多いアセトニトリルおよび９０％エタノールを含む第２の溶出溶液または「すすぎ」溶液を使用して、その内部にペイント済みＣＣＭが捕捉された基材から溶出させる。この実施形態では、標的ＣＣＭは、クラスに群分けされる。クラスの数は、使用された異なるすすぎ液の数に依存する。ＳＰＥ型フォーマットでは、１種、２種または３種のすすぎ液を使用して、短鎖（Ｃ１〜Ｃ３）、中鎖（Ｃ４〜Ｃ７）および長鎖（Ｃ８〜Ｃ１０）標識済みアルデヒドを分離する。群は、上記の連続フロー式または非連続フロー式のいずれかの方法を使用して、蛍光シグナルに基づいて定量化することができる。この第２の実施形態の利益の１つは、総アルデヒドの迅速な査定およびアルデヒドの標的の群分けを行うことである。これにより、迅速なスクリーニングプロセスを容易にすることができる。
【０１１３】
一部の態様では、システムおよび方法は、鎖長が炭素１個分だけ異なる個別のアルデヒドを分離および識別する能力を使用者にもたらす。例示として、システム内において、第１の溶出溶液によって息試料の構成成分を溶出させて、カルボニル含有部分溶液を形成する。次いで、カルボニル含有部分溶液を反応性標識剤と混合して、その内部にペイント済みカルボニル含有部分を含む溶液を形成する。次いで、ペイント済みカルボニル含有部分が、分離フィルター組立体または第２のフィルター組立体上に捕捉される。次いで、鎖長が単一の炭素分だけ異なるカルボニル含有部分の分離および検出を可能にするようなグラジエントによって、ペイント済みカルボニル含有部分を溶出させる。
【０１１４】
所望のペイント済みカルボニル含有部分は、逆相（ＲＰ）、順相（ＮＰ）、イオン交換（ＩＣ）および／または親水性（ＨＩＬＩＣ）クロマトグラフィーを使用して、未反応の標識および干渉種から単離および分離することができる。所望の種は、分析および定量化のために個別に、または種の群として単離することができる。例えば、サイズが中等度のＣ１８マトリックス（公称４０〜６０μｍの粒子）を使用したとき、Ｃ４〜Ｃ１０直鎖状アルキルカルボニルは、例えば、４０％ＭｅＯＨと後続する９０％ＭｅＯＨとによる、２ステップ式溶出プロセスを使用して、未反応の標識およびより小さな直鎖状アルキルカルボニル（Ｃ１〜Ｃ３）から単離することができる。この例では、所望の種は、種の合計として群分析される。個別のアルキルアルデヒドは、直線状、ステップまたは区分的（ステップ後に直線状）グラジエントを使用する、ビーズサイズがより小さいＣ１８マトリックス（１０μｍ）を使用して、単離および分析することができる。例えば、本明細書において提供された実施形態では、個別に標識されたカルボニル部分は、中等度の圧力（≒７００ｐｓｉ）において４５％〜９０％ＭｅＯＨ区分的グラジエントを使用する１０μｍ  Ｃ１８粒子を含有するカラムを使用して、逆相分離を用いて、単離および分析される（図１９を参照されたい）。
検出
【０１１５】
ペイント済みカルボニル種は、溶液中を通るように所定の波長範囲内の光を導き、これにより、蛍光を生成することによって検出、分析および定量化される。蛍光は、所定の波長範囲内において、検出、分析および定量化される。例えば、アミノオキシ−５（６）−ＴＡＭＲＡを使用した場合、λＥｘ／λＥｍ（ＭｅＯＨ中）は５４０／５６５ｎｍであり、アミノオキシ−５（６）−ＲＯＸを使用した場合、λＥｘ／λＥｍ（ＭｅＯＨ）は５６８／５９５ｎｍである。
【０１１６】
分析は、静的モード（バルク定量化）で、もしくは溶液が分離マトリックスから溶出し、検出器のウィンドウを通過する間に時間の関数としてフローモード（個別の分析）で、または、フローおよびストップのハイブリッド型のモードによって実施されてもよい。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＣＣＭを検出するステップは、フルオロフォアの励起によって生成された蛍光発光を測定することを含む。一部の実施形態では、ＣＣＭを検出するステップは、フルオロフォアの励起によって生成された蛍光吸光度を測定することを含む。一部の態様では、ＣＣＭを検出するステップは、所定の波長範囲内の光を標識済みＣＣＭに導き、これにより、蛍光を生成することおよび蛍光を検出することを含む。一部の態様では、ＣＣＭの濃度は、標準曲線に対して蛍光吸収または蛍光発光を計算することによって決定され、蛍光シグナルは、ＣＣＭの濃度に比例する。
【０１１８】
システムは、「ストップ」溶液と一緒に使用することにも非常に適合する。重炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨを９よりも高く上昇させることにより、反応をクエンチし、遅延分析のために試料をバッチ処理する能力を提供する。
【０１１９】
記述したように、反応性標識および対応する標識済みアルデヒドは、手動式のＳＰＥフォーマットプロセスを使用して、または、半分取カラムもしくは分析用の短いカラムを使用する迅速クロマトグラフィーによって単離および分離することができる。図９に例示したＳＰＥフォーマットでは、標識済みアルデヒド標的は、標準条件付きのＳＰＥカラムにロードされる。２種のすすぎ液が用いられる。最初のすすぎ液は、未反応の標識、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３標識済みアルデヒドを１つの画分中に放出する。有機物含量が高い最後のすすぎ液により、より長鎖のアルデヒドの放出が起きる。これらは、Ｃ５〜Ｃ１０を含む。キャリーオーバーは、この例において、４％未満である。Ｃ５〜Ｃ１０を光学的に（吸光度または蛍光により）定量化して、試料中のアルデヒドの合計を提供することができる。群分けは、すすぎ液の配合の変更によって調節することができる。
【０１２０】
さらに驚くべき属性は、半分取クロマトグラフィー媒体１０〜１５μｍ粒子Ｃ１８を使用して、単一の炭素鎖長分だけ異なる微量レベルのアルデヒドを迅速に単離および定量化する能力である。単一の炭素による分離および検出は、１０μｍ材料を含有する４．６×３０ｍｍおよび４．６×５０ｍｍカラムを使用して、中等度の圧力で１５分未満であるとして、例示されている。図１０を参照されたい。
【０１２１】
方法は、微量レベルのアルキルアルデヒドの迅速な検出および定量化を提供する。１５分のインキュベーションおよび分離の後、サブピコモルのアルデヒドを定量化することができ、合計時間は、およそ３５分である。反応効率の補正のために反応性内部標準物質と無反応性内部標準物質との組を用いたとき、０．１３ピコモル未満のＬＯＤを観察することができる。図１８を参照されたい。
【０１２２】
光学的に、標識済みアルデヒドは、検出器の感度に応じて、１〜１０フェムトモルに至るまで検出することができる。図８を参照されたい。インキュベーション時間を延長し、カラム長を増大させて、さらなる分離を行うことによって、非常に微量なレベルのアルデヒドを検出することができる。
【０１２３】
緩衝液および触媒と組み合わせたａｏ−６−ＴＡＭＲＡを含む反応性標識剤は、息試料中のアルデヒドを検出および定量化することができる。（図１２および１３を参照されたい）。提供された例において、蛍光発光検出が用いられる。アルデヒド標識化および識別は、ＬＣＭＳ分析（データは図示せず）によって確認した。当然の結果として、標識化スキームは、デュアルＦｌ／ＬＣＭＳ検出様式またはシングルＦｌおよび質量分析検出様式に適合する。
【０１２４】
さらに、本明細書において提供された方法およびシステムは、目的の微量のアルデヒド標的のための生物試料と環境試料の両方に適合する。本開示は、溶液または気体（空気）に基づいた試料採取に限定されないが、リアルタイム用途または臨床現場即時用途の使用のために他の試料に適応させ、試料採取から２時間以内にデータを提供することができる。
【０１２５】
そうではないことが文脈により明確に要求されていない限り、説明および特許請求の範囲を通して、「含む」および「含んでいる」等の語句は、排他的または網羅的な意味の反対である包括的な意味、つまり、「含むがこれらに限定されるわけではない」の意味において解釈すべきである。文脈が許容する場合、単数または複数を使用した上の詳細な説明における語句は、それぞれ複数または単数も含み得る。２つまたはそれよりも多い事物の列記への言及中での「または」という語句は、語句に関する次の解釈：列記中の事物のいずれか、列記中の事物のすべておよび列記中の事物の任意の組合せのすべてを包含する。
【０１２６】
本開示の実施形態に関する上の詳細な説明は、網羅的であること、または上に開示された厳格な形態に教示を限定することを意図されていない。本開示の具体的な実施形態および例は、例示目的として上述されているが、様々な均等な修正形態が、当業者が認識するように本開示の範囲内において可能である。さらに、本明細書において記載された任意の具体的な数は例にすぎず、代替的な実用形態は、異なる値、測定値または範囲を用いてもよい。本明細書において与えられたあらゆる寸法は、例証的なものにすぎず、寸法または説明のいずれも、本開示に限定するものではないことは、理解されよう。
【０１２７】
本明細書において提供された本開示の教示は、必ずしも上記のシステムであるとは限らない他のシステムに適用することができる。上記の様々な実施形態の要素および作用を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。
【０１２８】
添付の出願書類において列挙され得るいずれをも含めて、上記の任意の特許および出願ならびに他の参考資料は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。本開示の態様は、必要に応じて、本開示のなおさらなる実施形態を提供するために、上記の様々な参考資料のシステム、機能および概念を用いるように修正することが可能である。
【０１２９】
上の説明に照らして、これらおよび他の変更を本開示に行うことができる。上の説明は、本開示のある特定の実施形態を記述し、企図される最良のモードを記述しているが、上記の事柄が文中においてどれほど詳しく見えるとしても、本教示は、数多くの仕方で実施することが可能である。システムの詳細は、その実用の詳細がかなり変化する可能性もあるが、依然として、本明細書において開示された主題によって包含される。上記のように、本開示のある特定の特色または態様を記述するときに使用された特定の術語は、術語は本明細書において、術語が関連付けられた本開示の任意の具体的な特徴、特色または態様に制限されるように再規定されていることを暗示すると解釈すべきではない。一般に、下記の特許請求の範囲において使用された用語は、上記の発明を実施するための形態のセクションがこのような用語を明示的に規定していない限り、本明細書において開示された具体的な実施形態に本開示を限定すると解釈すべきでない。したがって、本開示の実際の範囲は、開示された実施形態だけでなく、特許請求の範囲の下で本開示を実施または実用するすべての均等な仕方も包含する。
【０１３０】
したがって、例証的な実施形態が示され記述されてきたが、本明細書において使用された用語はすべて、限定するものではなく記述用のものであること、ならびに数多くの変更、修正および代用が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得ることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2019512673.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
2019512673.tif 000021
【図１６】
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【図１７】
2019512673.tif 000023
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
2019512673.tif 000027
2019512673.tif 000028
2019512673.tif 000029