(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの抗ＣＤ３８ドメイン及び少なくとも１つの抗ＰＤ−Ｌ１ドメインを含む二重特異性分子であって、それぞれＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１抗原に同時結合することができる二重特異性分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗ＣＤ３８ドメイン及び少なくとも１つの抗ＰＤ−Ｌ１ドメインを含む二重特異性分子であって、それぞれＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１抗原に同時結合することができる、二重特異性分子。
【請求項２】
抗体又はそのフラグメントである、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項３】
２本の重鎖及び４本の軽鎖を含む全長抗体であり、
各重鎖が、
ａ．ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域
を含み、
ｂ．このＦｃ領域が、抗体１（Ａｂ１）のＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）に連結されており、
ｃ．そしてこれが、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列によって、抗体２（Ａｂ２）のＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）に連結されており、前記ポリペプチドリンカー配列が、Ａｂ１の前記Ｆａｂ重鎖ＶＨドメインのＮ末端と、Ａｂ２の前記ＣＨ１ドメインのＣ末端とを連結し、
４本の軽鎖が、それらの同種重鎖ドメインと会合したＡｂ１のＦａｂ軽鎖（ＣＬ−ＶＬ）及びＡｂ２のＦａｂ軽鎖（ＣＬ−ＶＬ）を含み；
Ａｂ１及びＡｂ２が異なるものであり、抗ＣＤ３８抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群より選択される、請求項２に記載の二重特異性分子。
【請求項４】
Ａｂ１が抗ＣＤ３８抗体であり、Ａｂ２が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項３に記載の二重特異性分子。
【請求項５】
Ａｂ１が抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、Ａｂ２が抗ＣＤ３８抗体である、請求項３に記載の二重特異性分子。
【請求項６】
抗ＣＤ３８抗体が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ−２０２又はそれらの突然変異誘導体からなる群より選択される、請求項３〜５のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項７】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＤＸ−１１０５又はそれらの突然変異誘導体からなる群より選択される、請求項３〜６のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項８】
Ａｂ１のＣＨ１及びＣＬドメインが、Ａｂ２のＣＨ１及びＣＬドメインと異なる配列を有する、請求項３〜７のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項９】
Ａｂ１若しくはＡｂ２の一方のＦａｂ  ＣＨ１ドメインが、前記ＣＨ１ドメインの１９２位のトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインから生じる突然変異ドメインであり、同種ＣＬドメインが、前記ＣＬドメインの１３７位のアスパラギン残基をリシン残基で置換し、前記ＣＬドメインの１１４位のセリン残基をアラニン残基で置換することによって、免疫グロブリンのＣＬドメインから生じる突然変異ドメインであり、及び／又はＡｂ１若しくはＡｂ２の一方若しくは他方のＦａｂ  ＣＨ１ドメインが、前記ＣＨ１ドメインの１２４位のロイシン残基をグルタミンで置換し、前記ＣＨ１ドメインの１８８位のセリン残基をバリン残基で置換することによって、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインから生じる突然変異ドメインであり、同種ＣＬドメインが、前記ＣＬドメインの１３３位のバリン残基をトレオニン残基で置換し、前記ＣＬドメインの１７６位のセリン残基をバリン残基で置換することによって、免疫グロブリンのＣＬドメインから生じる突然変異ドメインである、請求項３〜７のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項１０】
ａ）２本の重鎖であって、それぞれが配列番号：１０を含み、好ましくは配列番号：１０からなる２本の重鎖と、ｂ）４本の軽鎖であって、２本が配列番号：１１を含み、好ましくは配列番号：１１からなり、他の２本が配列番号：１２を含み、好ましくは配列番号：１２からなる４本の軽鎖とを含み、好ましくはそれらからなる、請求項１〜９のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかで定義される二重特異性分子の重鎖を含み、好ましくはそれからなる、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリペプチドをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションされた、宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の二重特異性分子を生産するための方法であって、以下の工程：
ａ．適切な培地中及び培養条件で、請求項１〜１０のいずれかで定義される抗体重鎖及び請求項１〜１０のいずれかで定義される抗体軽鎖を発現する宿主細胞を培養すること、並びに
ｂ．培養培地から、又は前記培養細胞から前記産生抗体を回収すること
を含む、方法。
【請求項１５】
医薬として使用するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の二重特異性分子。
【請求項１６】
ガン、好ましくは多発性骨髄腫、リンパ腫又は白血病の処置において使用するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の二重特異性分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１結合分子、特にＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１をターゲティングする抗体、これらの分子の生産方法、組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多発性骨髄腫（ＭＭ）は３番目に多い血液悪性腫瘍であり、年間症例数は世界中で１１４，０００例である。処置の進歩にもかかわらず、ＭＭは依然として、医学的必要性が満たされていない少数の血液悪性腫瘍の１つである。患者が最先端の治療を受けて、再発性又は難治性（ｒ／ｒ）疾患を有するならば、処置選択肢は非常に限られている。しかしながら、近年では、抗ＭＭ腫瘍ターゲット抗原（ＴＡＡ）が開発されている。ある抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブは、再発性ＭＭを有する患者の処置について承認されており、他の抗ＣＤ３８抗体は現在開発中である（イサツキシマブ及びＭＯＲ−２０２。これは、米国特許第８，２６３，７４６号に記載されている）。しかしながら、現在のところ３０〜３５％の範囲内である応答を改善する必要がある。抗ＣＤ３８抗体の活性は、患者の免疫系を刺激する免疫調節治療薬（例えば、レナリドマイド）によって増強され得ることが実証された。加えて、抗体療法に対するＭＭ腫瘍細胞の耐性機構の１つは、チェックポイント阻害剤経路（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）のシグナリングの増加に関連することが実証された。したがって、ＭＭ腫瘍細胞に対する抗ＣＤ３８抗体の細胞傷害性を増強し、それと同時にチェックポイント阻害剤経路（例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１）を阻害することによって免疫系を活性化する機会がある。
【０００３】
生理的状態では、ＰＤ−Ｌ１は、免疫系をダウンレギュレーションすることによって、自己免疫に対する保護として主要な役割を果たす。それは、免疫「ＡＰＣ様」細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、骨髄性ＤＣ、Ｂ細胞、上皮細胞、血管内皮細胞）及び腫瘍細胞上で発現される。ＰＤ−Ｌ１は、その同種レセプターＰＤ−１及びＢ７−１に結合し、それらの増殖及び活性化を阻害することによって、免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）をネガティブにレギュレーションする。
【０００４】
病的状態では、ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞によって高度に発現され（９０％超のＭＭ患者）、予後不良に関連する。免疫チェックポイント経路をターゲティングする遮断抗体（抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−Ｌ１など）は、異なるタイプのガン（肺、黒色腫など）において顕著な活性を示した。ＭＭでは、有効性の兆候が観察されているが、しかしながら、ＭＭでは、このクラスの有望な治療薬の活性は依然として最適以下である。理由の１つは、Ｔ細胞に対する最大免疫刺激効果を誘発するためには、有益な活性／副作用プロファイルを有する分子（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１）が、それらのターゲットのほぼ化学量論的な遮断／飽和を必要とするということであり得る。
【０００５】
したがって、腫瘍部位に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の特異的ターゲッティング（例えば、ＣＤ３８＋ガン細胞のターゲティング）は、免疫刺激が必要な部位への抗ＰＤ−Ｌ１治療薬の送達を支援し得、最大免疫細胞刺激をもたらして腫瘍及び微小環境細胞上のＰＤ−Ｌ１の完全な遮断を可能にし得る。腫瘍部位におけるこのようなターゲット免疫細胞活性化はまた、免疫細胞の全身活性化を減少させ、有害な副作用を予防し、治療用抗体の大量投与を可能にし得る。
【発明の概要】
【０００６】
多発性骨髄腫（ＭＭ）及び他のガン、好ましくはＣＤ３８＋ガンの処置のためにＴ細胞、ＢＫ細胞及び他の免疫細胞の細胞傷害性能力を利用するために、（それぞれＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１に特異的な）２つの結合部位を有する二重特異性分子を設計した。本発明の二重特異性分子は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上のＰＤ−１と、腫瘍及び腫瘍微小環境細胞上で発現されるＰＤ−Ｌ１との相互作用に関連する免疫系の阻害を除去する。このような分子は、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するガンであって、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をさらに阻害するＰＤ−Ｌ１発現免疫細胞（形質細胞様樹状細胞、骨髄由来サプレッサー細胞）の微小環境において成長するガン（特に、多発性骨髄腫又は任意のＣＤ３８＋ガン）の処置において有用である。本発明の分子は、ＣＤ３８＋／ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞及び腫瘍微小環境細胞のＰＤ−Ｌ１＋細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を促進する。
【０００７】
本発明の実施態様の１つでは、抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１ドメインを含むいくつかの二重特異性ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１分子が操作される。これらの二重特異性ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１分子は、両抗原に同時結合することができる。
【０００８】
より具体的には、抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１ドメインを含む二重特異性ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１抗体が操作される。これらの二重特異性ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１抗体は、両抗原に同時結合することができる。
【０００９】
好ましい実施態様では、ＣＨＯ細胞において二重特異性ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１抗体を発現させ、プロテインＡ樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。抗体結合特性は、in vitroアッセイにおいて特性評価される。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、それらは、ＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１の両方に同時結合する。
【００１０】
図１Ａ又は１Ｂの構造を有する二重特異性四価４Ｆａｂ抗体は、BiXAb（登録商標）（Biomunex Therapeuticsの商標）という名称である。
【００１１】
本発明の抗体は、ＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１に対して二重特異性及び二価のものである。本発明の抗原結合二重特異性抗体は、（ｍＡｂ１のＩｇＧの天然重鎖と、それに続いてリンカーと、ｍＡｂ２のＦａｂ重鎖とから作られた）連続「複合重鎖」からなる全長二重特異性抗体であり、これは、Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）と、それに続いて抗体１のＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）及び抗体２の連続Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（後者は、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列によって接続されている）とから構築され、得られた複合重鎖は、タンパク質発現中に同一の第２の複合重鎖と会合し、抗体２及び抗体１の同時発現されたＦａｂ軽鎖（ＬＣ）は、最終的なタンデム型Ｆ（ａｂ’）２−Ｆｃ分子を形成するために、それらの同種重鎖ドメインと会合する；抗体１（Ａｂ１）及び抗体２（Ａｂ２）は異なるものであり、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ−２０２又は任意の他の抗ＣＤ３８抗体）又はそれらの突然変異誘導体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＤＸ−１１０５又は任意の他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体）又はそれらの突然変異誘導体からなる群より選択される。
【００１２】
BiXAb（登録商標）抗体はＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１の両方に二価結合することができる。
【００１３】
上記で定義される二重特異性抗体の重鎖からなるポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドがさらに記載される。
【００１４】
前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞も記載される。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、本発明の二重特異性抗体を調製するための方法である。
【００１６】
したがって、本発明の二重特異性抗体を生産するための方法であって、以下の工程：ａ）適切な培地中及び培養条件で、上記で定義される抗体重鎖及び上記で定義される抗体軽鎖を発現する宿主細胞を培養すること；並びにｂ）培養培地から、又は前記培養細胞から前記産生抗体を回収することを含む方法が提供される。
【００１７】
本発明は、本明細書で定義される重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドであって、選択された宿主細胞において活性な転写及び翻訳コントロールエレメントに結合されたポリヌクレオチドを含むリコンビナントベクター、特に発現ベクターを使用する。本発明にしたがって発現ベクターを構築するために使用され得るベクターはそれ自体が公知であり、特に使用しようとする宿主細胞の機能に応じて選択されるであろう。好ましくは、前記宿主細胞は、重鎖をコードするポリヌクレオチドと、２本の異なる軽鎖をコードする２つのポリヌクレオチドとでトランスフォーメーションされる。前記ポリヌクレオチドは、同じ発現ベクター又は別個の発現ベクターに挿入され得る。本発明の抗体を生産するための方法は、このような宿主細胞を培養すること、及び前記培養物から前記抗原結合フラグメント又は抗体を回収することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａ及び１Ｂは、２本の重鎖及び４本の軽鎖を含む本発明の二重特異性抗体の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ａ及び１Ｂは、２本の重鎖及び４本の軽鎖を含む本発明の二重特異性抗体の概略図である。
【図２】図２は、還元条件下における二重特異性抗体BiXAb 4218、4219及び5104のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図３】図３は、非還元条件下におけるBiXAb 4218、4219及び5104のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図４】図４は、BiXAb 4218及び4219のＥＬＩＳＡ結合アッセイを示す。
【図５】図５は、還元条件及び非還元条件下におけるBiXAb-6567のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。レーン１：還元条件下におけるBiXAb-6567の移動；レーン２：各バンドの重量を示す分子量マーカー；レーン３：非還元条件下におけるBiXAb-6567の移動。
【図６】図６は、BiXAb-6567のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す。
【図７】図７は、デジタル走査熱量測定によって決定した２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）及びBiXAb-6567の融解プロファイルを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、直接ＣＤ３８抗原結合ＥＬＩＳＡにおける２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）及びBiXAb-6567の結合プロファイルを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、直接ＰＤ−Ｌ１抗原結合ＥＬＩＳＡにおける２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）及びBiXAb-6567の結合プロファイルを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、二重抗原（ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ３８）結合ＥＬＩＳＡにおけるBiXAb-6567の結合プロファイルを示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、３つの異なる細胞株における２つの親ｍＡｂ（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）及びBiXAb-6567の蛍光活性化細胞選別プロファイルを示す。９Ａ：多発性骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６、９Ｂ：全長ＣＤ３８で安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞、及び９Ｃ：卵巣ガン細胞株ＳＫＯＶ−３
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｃは、３つの異なる細胞株における２つの親ｍＡｂ（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）及びBiXAb-6567の蛍光活性化細胞選別プロファイルを示す。９Ａ：多発性骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６、９Ｂ：全長ＣＤ３８で安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞、及び９Ｃ：卵巣ガン細胞株ＳＫＯＶ−３
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、３つの異なる細胞株における２つの親ｍＡｂ（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）及びBiXAb-6567の蛍光活性化細胞選別プロファイルを示す。９Ａ：多発性骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６、９Ｂ：全長ＣＤ３８で安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞、及び９Ｃ：卵巣ガン細胞株ＳＫＯＶ−３
【図１０】図１０は、ＣＨＯ−ＣＤ３８細胞株における２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）、BiXAb-6567及びネガティブコントロール抗ＣＤ２０抗体の力価測定結合プロファイルを示す。
【図１１】図１１は、ターゲット細胞として多発性骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６を用い、エフェクター細胞として非分画非プレ活性化単核細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）、BiXAb-6567並びに２つのネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２の細胞傷害活性プロファイルを示す。
【図１２】図１２は、ターゲット細胞としてＣＨＯ−ＣＤ３８細胞株を用い、エフェクター細胞として非分画非プレ活性化単核細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）、BiXAb-6567並びに２つのネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２の細胞傷害活性プロファイルを示す。
【図１３】図１３は、ターゲット細胞としてＳＫＯＶ−３細胞株を用い、エフェクター細胞として濃縮ＩＬ−１２プレ活性化ＮＫ細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）、BiXAb-6567並びに２つのネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２の細胞傷害活性プロファイルを示す。
【図１４】図１４は、ターゲット細胞としてＳＫＯＶ−３細胞株を用い、エフェクター細胞として濃縮ＩＬ−１５プレ活性化ＮＫ細胞を用いたＡＤＣＣアッセイにおける２つの親抗体（抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１）、BiXAb-6567並びに２つのネガティブコントロール抗体抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２の細胞傷害活性プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
定義：
天然に存在する抗体分子の基本構造は、非共有結合的相互作用及び鎖間ジスルフィド結合によって互いに保持される２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖からなるＹ字型テトラマ−四次構造である。
【００２０】
哺乳動物種では、免疫グロブリンのクラス（アイソタイプ）：それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを決定する５つのタイプの重鎖：α、δ、ε、γ及びμがある。重鎖Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続いて、重鎖γ、α及びδにおいて（Ｎ末端からＣ末端へＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とナンバリングされる）３つのドメインを含有する定常領域とがあり、重鎖μ及びεの定常領域は、（Ｎ末端からＣ末端へＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４とナンバリングされる）４つのドメインから構成される。ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＤのＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、異なるクラス間で並びにＩｇＡ及びＩｇＧの場合には異なるサブタイプ間で長さが異なるフレキシブルヒンジによって分離されている：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４は、それぞれ１５、１２、６２（又は７７）及び１２アミノ酸のヒンジを有し、ＩｇＡｌ及びＩｇＡ２は、それぞれ２０及び７アミノ酸のヒンジを有する。
【００２１】
重鎖アイソタイプのいずれかと会合し得る２つのタイプの軽鎖：λ及びκがあるが、所定の抗体分子では両方とも同じタイプのものである。両軽鎖は、機能的に同一であると思われる。Ｎ末端可変ドメイン（ＶＬ）と、それに続いて、ＣＬと称される単一ドメインからなる定常領域とがある。
【００２２】
重鎖及び軽鎖は、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のタンパク質／タンパク質相互作用によって、並びにＶＨ／ＶＬ相互作用を介して対合し、２本の重鎖は、それらのＣＨ３ドメイン間のタンパク質／タンパク質相互作用によって会合する。免疫グロブリン分子の構造は、一般に、ＣＨ１及びＣＬドメイン間並びにヒンジ間の鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。
【００２３】
抗原結合領域は、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対合した各完全軽鎖からなるＹ字型構造のアームに対応し、Ｆａｂフラグメント（Fragment antigen bindingの略）と称される。最初、Ｆａｂフラグメントは、ヒンジ領域において鎖間ジスルフィド結合のアミノ末端側で抗体分子を切断して２つの同一の抗原結合アームを放出させるパパイン消化によって、ネイティブな免疫グロブリン分子から生成された。ペプシンなどの他のプロテアーゼもまた、ヒンジ領域においてただし鎖間ジスルフィド結合のカルボキシ末端側で抗体分子を切断して、２つの同一のＦａｂフラグメントからなるフラグメントであって、ジスルフィド結合によって依然として連結されたフラグメントを放出させる；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントにおけるジスルフィド結合の還元により、Ｆａｂ’フラグメントが生成される。
【００２４】
ＶＨ及びＶＬドメインに対応する抗原結合領域の部分は、Ｆｖフラグメント（Fragment variableの略）と称される；それは、抗原結合部位（パラトープとも称される）を形成するＣＤＲ（相補性決定領域）を含有する。
【００２５】
エフェクター分子又は細胞に対する結合に関与する抗体のエフェクター領域は、Ｙ字型構造のステムに対応し、重鎖の対合したＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（又は、抗体のクラスに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメイン）を含有し、Ｆｃ（Fragment crystallisableの略）領域と称される。
【００２６】
２本の重鎖及び２本の軽鎖の同一性により、天然に存在する抗体分子は、２つの同一の抗原結合部位を有し、それにより、２つの同一のエピトープに同時結合する。
【００２７】
抗体は、それが他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、及び／又は長い持続時間で結合する場合に、ターゲット抗原に「特異的に結合する」。「特異的結合」又は「優先的結合」は、排他的結合（を含み得るが）を必ずしも必要としない。一般に、必ずではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。
【００２８】
「被験体」、「個体」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、処置について評価されている及び／又は処置されている哺乳動物を指す。被験体はヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒト疾患のための研究室モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌなども挙げられ得る。
【００２９】
「処置」又は「処置する」という用語は、被験体の症状を直接的又は間接的に改善することを目的として、ヒトを含む被験体を医学的支援に供する行為、適用又は治療を指す。特に、この用語は、いくつかの実施態様では発生率の減少、症候の緩和、再発の排除、再発の予防、発生の予防、症候の改善、予後の改善又はそれらの組み合わせを指す。当業者であれば、処置が症候の完全な非存在又は除去を必ずしももたらさないことを理解するであろう。例えば、ガンに関して「処置」又は「処置する」は、新生物若しくは悪性細胞成長、増殖若しくは転移の減速、新生物若しくは悪性細胞成長、増殖若しくは転移の発症の予防若しくは遅延、又はそれらのいくつかの組み合わせを指し得る。
【００３０】
好ましい二重特異性抗体の設計：
本発明は、それらの各ターゲットに対する２つの結合部位と、抗体依存性細胞性傷害（ＡＤＣＣ）、食作用及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の活性化を可能にする機能的Ｆｃドメインとを含む二重特異性四価抗体を提供する。
【００３１】
本発明の抗体は、全長抗体である。それらは、好ましくは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、さらに好ましくはＩｇＧ１由来の重鎖及び軽鎖を含む。
【００３２】
軽鎖は、好ましくは、κ軽鎖である。
【００３３】
好ましい実施態様では、本発明のリンカーは、テトラ−Ｆａｂ二重特異性抗体フォーマットで２組のＩｇＧ  Ｆａｂドメインを接続し、このアミノ酸配列は、リンカーによって接続された少なくとも２つのＦａｂの重鎖配列と、それに続いてネイティブなヒンジ配列と、それに続いて適切なＩｇＧ軽鎖配列と共に同時発現されたＩｇＧ  Ｆｃ配列とを含む。
【００３４】
ＩｇＧ様構造を有する本発明の抗体の例は、図１Ａ及び１Ｂに示されている。
【００３５】
本発明の二重特異性抗体は、典型的には、
−Ｆｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）から構築される連続重鎖
−それに続いて、抗体１のＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）及び抗体２の連続Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（後者は、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列によって接続されている）
を含み、
−タンパク質発現中に、得られた重鎖はダイマーにアセンブルし、同時発現された抗体１及び抗体２軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、最終的なタンデム型Ｆ（ａｂ）’２−Ｆｃ分子を形成するために、それらの同種重鎖と会合し、
抗体１（Ａｂ１）及び抗体２（Ａｂ２）は異なるものである。
【００３６】
Ａｂ１及びＡｂ２は異なるものであり、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）からなる群より独立して選択される。
【００３７】
ダラツムマブは、ヒトＣＤ３８のＣ末端領域（アミノ酸２３３〜２４６及び２６７〜２８０。２７２位及び２７４位のアミノ酸は、結合に特に重要である）において、ユニークなＣＤ３８エピトープに結合する。有利には、Ａｂ１及び／又はＡｂ２は、ダラツムマブと同じエピトープ又は重複エピトープ（例えば、少なくとも４アミノ酸の重複）に結合する抗体であり得る。
【００３８】
別の実施態様では、Ａｂ１及び／又はＡｂ２は、アテゾリズマブと同じエピトープ又は重複エピトープに結合する抗体であり得る。
【００３９】
特定の実施態様では、二重特異性分子は、ａ）２本の重鎖であって、それぞれが配列番号：１を含み、好ましくは配列番号：１からなる２本の重鎖と、ｂ）４本の軽鎖であって、２本が配列番号：２を含み、好ましくは配列番号：２からなり、他の２本が配列番号：３を含み、好ましくは配列番号：３からなる４本の軽鎖とを含み、好ましくはそれらからなる二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体は、BiXAb-4218という名称である。
【００４０】
別の特定の実施態様では、二重特異性分子は、ａ）２本の重鎖であって、それぞれが配列番号：４を含み、好ましくは配列番号：４からなる２本の重鎖と、ｂ）４本の軽鎖であって、２本が配列番号：５を含み、好ましくは配列番号：５からなり、他の２本が配列番号：６を含み、好ましくは配列番号：６からなる４本の軽鎖とを含み、好ましくはそれらからなる二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体は、BiXAb-4219という名称である。
【００４１】
別の特定の実施態様では、二重特異性分子は、ａ）２本の重鎖であって、それぞれが配列番号：７を含み、好ましくは配列番号：７からなる２本の重鎖と、ｂ）４本の軽鎖であって、２本が配列番号：８を含み、好ましくは配列番号：８からなり、他の２本が配列番号：９を含み、好ましくは配列番号：９からなる４本の軽鎖とを含み、好ましくはそれらからなる二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体は、BiXAb-5104という名称である。
【００４２】
好ましい実施態様では、二重特異性分子は、ａ）２本の重鎖であって、それぞれが配列番号：１０を含み、好ましくは配列番号：１０からなる２本の重鎖と、ｂ）４本の軽鎖であって、２本が配列番号：１１を含み、好ましくは配列番号：１１からなり、他の２本が配列番号：１２を含み、好ましくは配列番号：１２からなる４本の軽鎖とを含み、好ましくはそれらからなる二重特異性抗体である。このような二重特異性抗体は、BiXAb-6567という名称である。
【００４３】
重鎖（配列番号：１０）は、
−ダラツムマブのＶＨ（配列番号：２２）
−ダラツムマブＦａｂのＣＨ１ドメイン（突然変異Ｌ１２４Ｑ及びＳ１８８Ｖを有するＧ１ｍ（３）アロタイプのヒトＩｇＧ１）（配列番号：２３）
−ＡＰリンカー（配列番号：１５）
−アテゾリズマブのＶＨ（配列番号：２４）
−アテゾリズマブＦａｂのＣＨ１ドメイン（突然Ｔ１９２Ｄを有するＧ１ｍ（３）アロタイプのヒトＩｇＧ１）（配列番号：２５）
−ヒトＩｇＧ１のヒンジ（配列番号：２６）
−ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン（配列番号：２７）
−Ｇ１ｍ（３）アロタイプのヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（配列番号：２８）
を含む。
【００４４】
配列番号：１１の軽鎖は、
−ダラツムマブのＶＬ（配列番号：２９）
−突然変異Ｖ１３３Ｔ及びＳ１７６Ｖを有するダラツムマブのＣκドメイン（配列番号：３０）
を含む。
【００４５】
配列番号：１２の軽鎖は、
−アテゾリズマブのＶＬ（配列番号：３１）
−突然変異Ｓ１１４Ａ及びＮ１３７Ｋを有するアテゾリズマブのＣκドメイン（配列番号：３２）
を含む。
【００４６】
改善された特性を有する二重特異性抗体であって、ＣＤ３８及び／又はＰＤ−Ｌ１に対するより高い結合親和性を示す二重特異性抗体も記載される。例えば、このような二重特異性抗体は、ＣＤ３８及び／又はＰＤ−Ｌ１に対して、１×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ、好ましくは１×１０−９未満又は１×１０−１０ＭのＫｄを示し得る。
【００４７】
リンカーの設計
「ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列」又は「シュードヒンジリンカー」とも称されるポリペプチドリンカーは、好ましくはヒト起源のＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＤから選択される１つ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含む。前記ポリペプチドリンカーは、ただ１つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含み得る。この場合、前記免疫グロブリンは、隣接ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属し得るか、又は異なるアイソタイプ若しくはサブクラスに属し得る。あるいは、前記ポリペプチドリンカーは、異なるアイソタイプ又はサブクラスの少なくとも２つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全部又は一部を含み得る。この場合、ＣＨ１ドメインの直後にあるポリペプチドリンカーのＮ末端部分は、好ましくは、前記ＣＨ１ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属する免疫グロブリンのヒンジ領域の全部又は一部からなる。
【００４８】
場合により、前記ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンのＣＨ２ドメインの２〜１５個、好ましくは５〜１０個のＮ末端アミノ酸の配列をさらに含み得る。
【００４９】
ポリペプチドリンカー配列は、典型的には、８０個未満のアミノ酸、好ましくは６０個未満のアミノ酸、さらに好ましくは４０個未満のアミノ酸からなる。
【００５０】
いくつかの場合では、ネイティブなヒンジ領域由来の配列が使用され得る；他の場合では、望ましくない鎖内又は鎖間ジスルフィド結合を回避するために、点突然変異（特に、アラニン又はセリンによるネイティブなＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３ヒンジ配列中の１つ以上のシステイン残基の置換）がこれらの配列にもたらされ得る。
【００５１】
特定の実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、アミノ酸配列ＥＰＫＸ１ＣＤＫＸ２ＨＸ３Ｘ４ＰＰＸ５ＰＡＰＥＬＬＧＧＰＸ６Ｘ７ＰＰＸ８ＰＸ９ＰＸ１０ＧＧ（配列番号：１３）（同一の又は異なるＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、任意のアミノ酸である）を含むか、又はそれからなる。特に、ポリペプチドリンカー配列は、
【化１】
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からなる群より選択される配列を含み得るか、又はそれからなり得る。
【００５２】
本発明の多重特異性抗原結合フラグメントにおいて使用され得るヒンジ由来ポリペプチドリンカーの非限定的な例は、配列番号：１７を有するポリペプチドである。前記ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１ヒンジの全長配列と、それに続いてヒトＩｇＧ１  ＣＨ２の９個のＮ末端アミノ酸（ＡＰＥＬＬＧＧＰＳ、配列番号：１９）と、ヒトＩｇＡ１ヒンジの配列の一部（ＴＰＰＴＰＳＰＳ、配列番号：２０）と、補足的なフレキシビリティをリンカーに提供するために付加されたジペプチドＧＧとからなる。別の好ましい実施態様では、ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：１５又は配列番号：１８である。
【００５３】
特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）である。
【００５４】
別の特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択され、さらに好ましくは、同一の又は異なるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり得る。
【００５５】
あるいは、同一の又は異なるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｔ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、好ましくはＬｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり得る。
【００５６】
特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ４及びＸ５は、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸である。
【００５７】
好ましい実施態様では、Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）である。
【００５８】
好ましい態様では、Ｘ５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）である。
【００５９】
特定の実施態様では、同一の又は異なるＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸である。好ましくは、同一の又は異なるＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）及びＩｌｅ（Ｉ）からなる群より選択される。
【００６０】
あるいは、同一の又は異なるＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｔ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、好ましくはＬｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり得る。
【００６１】
好ましい実施態様では、同一の又は異なるＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。
【００６２】
さらに好ましい実施態様では、Ｘ６及びＸ７は同一のものであり、好ましくは、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される。
【００６３】
好ましい実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：１３の配列
（同一の又は異なるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）であり；
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり；
同一の又は異なるＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される）を含むか、又はそれからなる。
【００６４】
別の好ましい実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は、配列番号：１３の配列
（同一の又は異なるＸ１、Ｘ２及びＸ３は、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり；
Ｘ５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり；
同一の又は異なるＸ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０は、Ａｌａ（Ａ）及びＧｌｙ（Ｇ）からなる群より選択される）を含むか、又はそれからなる。
【００６５】
二重特異性抗体の生産：
当業者であれば、多重特異性抗体を発現させる一般的な技術について、国際公開公報第２０１３／００５１９４号（これは、参照により本明細書に組み入れられる）を参照し得る。
【００６６】
本発明の分子又は抗体のタンパク質鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドも本明細書に記載される。前記ポリヌクレオチドはまた、さらなる配列を含み得る；特に、それは、有利には、前記タンパク質鎖の分泌を可能にするリーダー配列又はシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。前記ポリヌクレオチドでトランスフォーメーションされた宿主細胞も開示される。
【００６７】
典型的には、異なる抗ＣＤ３８及び抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体のアミノ酸配列は、場合により哺乳動物発現のためのコドン最適化後に、ＤＮＡ配列を設計するために使用される。重鎖については、制限酵素消化のための隣接配列と共に、シグナルペプチドと、Ｆａｂ１の可変領域及び定常ＣＨ１ドメインと、それに続いてヒンジリンカーと、Ｆａｂ２の可変領域及び定常ＣＨ１ドメインとをコードするＤＮＡが合成される。軽鎖については、シグナルペプチドと、可変及び定常κ領域とをコードするＤＮＡが合成される。
【００６８】
本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、発現ベクターに挿入される。軽鎖及び重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を保証する発現ベクター中のコントロール配列に作動可能に連結される。このようなコントロール配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及び転写終結配列を含む。発現ベクターは、典型的には、宿主生物において、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの必須部分として複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列でトランスフォーメーションされた細胞の検出を可能にするための選択マーカー、例えばテトラサイクリン又はネオマイシンを含有するであろう。
【００６９】
一例では、重鎖コード配列及び軽鎖コード配列（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨ−ＣＨ１及びＶＬ−ＣＬ、又は全長重鎖及び全長軽鎖をコードする配列）は両方とも、１つの発現ベクターに含まれる。別の例では、抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ個々のベクターにクローニングする。後者の場合、両鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを１つの宿主細胞にコトランスフェクションし得、これらをin vivo又はin vitroでアセンブルして、インタクトな抗体を形成し得る。あるいは、重鎖及び軽鎖それぞれの発現のために、重鎖をコードする発現ベクター及び軽鎖をコードするものを異なる宿主細胞に導入し得、次いで、これらを精製及びアセンブルして、in vitroでインタクトな抗体を形成し得る。
【００７０】
特定の実施態様では、宿主細胞は、プラスミドなどの３つの独立した発現ベクターでコトランスフェクションされ、３本の鎖の全て（すなわち、それぞれ重鎖ＨＣ並びに２本の軽鎖ＬＣ１及びＬＣ２）が同時産生され、二重特異性抗体が分泌される。
【００７１】
より具体的には、３つのベクターは、有利には、以下の分子比２：１：１（ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２）で使用され得る。
【００７２】
本明細書に記載される抗体の発現のためのリコンビナントベクターは、典型的には、構成的又は誘導性のいずれかのプロモーターに作動可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含有する。ベクターは、原核生物、真核生物又はその両方における複製及び統合に適切であり得る。典型的なベクターは、転写及び翻訳終結と、開始配列と、抗体をコードする核酸の発現のレギュレーションに有用なプロモーターとを含有する。ベクターは、少なくとも１つの独立した終結配列と、原核生物及び真核生物の両方においてカセットの複製を可能にする配列（すなわち、シャトルベクター）と、原核生物系及び真核生物系の両方のための選択マーカーとを含有する遺伝子発現カセットを場合により含有する。
【００７３】
本明細書に記載される二重特異性抗体は、原核生物及び真核生物発現系、例えば細菌、酵母、糸状菌、植物、昆虫（例えば、バキュロウイルスベクターを使用）及び哺乳動物細胞において産生され得る。本発明のリコンビナント抗体は、真核細胞においてグリコシル化又は発現される必要はない；しかしながら、一般に、哺乳動物細胞における発現が好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト胎性腎臓細胞株（２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−又は＋ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、Ｆｌｐ−ｉｎ  ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ細胞）及びヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２細胞）である。
【００７４】
インタクトな免疫グロブリンを分泌することができる多くの適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０）又はトランスフォーメーションＢ細胞若しくはハイブリドーマが挙げられるので、哺乳動物組織細胞培養は、ポリペプチドを発現及び生産するために好ましい。
【００７５】
最も好ましい実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、ＣＨＯ細胞株、最も有利にはＣＨＯ−Ｓ又はＣＨＯ−ＤＧ−４４細胞株又はそれらの誘導体を使用することによって生産される。
【００７６】
これらの細胞の発現ベクターは、発現コントロール配列、例えば複製起点、プロモーター及びエンハンサー、並びに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列を含み得る。好ましい発現コントロール配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。
【００７７】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、重鎖コード配列及び軽鎖コード配列並びに発現コントロール配列）を含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて異なる周知の方法によって、宿主細胞に移入され得る。例えば、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは、他の細胞宿主に使用され得る。（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989を参照のこと）。重鎖及び軽鎖が別個の発現ベクターにクローニングされる場合、ベクターは、インタクトな免疫グロブリンの発現及びアセンブリを得るためにコトランスフェクションされる。宿主細胞は、（例えば、化学的トランスフェクション法又はエレクトロポレーション法によって）ベクターでトランスフォーメーション又はトランスフェクションされ、プロモーターを誘導し、トランスフォーマントを選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、従来の（又は、必要に応じて改変された）栄養培地中で培養される。
【００７８】
抗体の発現は、一過性又は安定であり得る。
【００７９】
好ましくは、二重特異性抗体は、安定発現方法によって生産され、BiXAb-6567などの二重特異性抗体の全てのポリペプチド鎖をコードするＤＮＡで安定にトランスフェクションされた細胞株は、持続的な発現が可能であり、治療薬の製造を可能にする。例えば、ＣＨＯ細胞株における安定発現が特に有利である。
【００８０】
発現させたら、本発明の全抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖又は他の免疫グロブリン形態をさらに単離又は精製して、さらなるアッセイ及び適用のために実質的に均一な調製物を得ることができる。当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法が使用され得る。例えば、適切な精製手順としては、免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、硫酸アンモニウム沈殿及びゲルろ過が挙げられ得る（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照のこと）。医薬用途では、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均一性が最も好ましい。
【００８１】
in vitro生産は、本発明の所望の二重特異性抗体を大量に得るスケールアップを可能にする。このような方法は、例えばエアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器における均一懸濁培養、又は例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジにおける固定化若しくは封入細胞培養を用い得る。
【００８２】
突然変異誘導体及び突然変異：
ＣＤ３８に結合するポリペプチド配列は、例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ−２０２又はそれらの突然変異誘導体からなる群より選択される任意の抗ＣＤ３８抗体に由来し得る。
【００８３】
ＰＤ−Ｌ１に結合するポリペプチド配列は、例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、ＭＤＸ−１１０５又はそれらの突然変異誘導体からなる群より選択される任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体に由来し得る。
【００８４】
「突然変異誘導体」、「突然変異体」又は「機能的変異体」という用語は、１個又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は挿入によって、それが指す親配列と異なる配列を表す。好ましくは、突然変異誘導体は、好ましくは、ネイティブな配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列相同性を示す。特定の実施態様では、突然変異は、抗体の機能に実質的な影響を与えない。
【００８５】
突然変異誘導体又は機能的変異体は、本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖、本明細書に記載される参照配列のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）同一のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、又はその両方を含み得る。これらの変異体は、ＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１に結合することができる。いくつかの例では、変異体は、上記参照抗体と同様の抗原結合親和性を有する（例えば、１×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ、好ましくは１×１０−９未満又は１×１０−１０ＭのＫＤを有する）。
【００８６】
結合の親和性は、ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）又はＫＤ（平衡解離）という用語によって定義される。典型的には、抗体に関して使用される場合、特異的な結合は、１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ未満又は１０−１０Ｍの親和性（ＫＤ）値で、そのターゲットに特異的に結合する（「認識する」）抗体を指す。１０−９のＫＤ値は、１０−８のＫＤ値よりも高い結合親和性を示すように、より低いＫＤ値は、より高い結合親和性（すなわち、より強力な結合）を表す。
【００８７】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように改変されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３でＸＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、目的のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。
【００８８】
他の実施態様では、本明細書に記載される機能的変異体は、ＣＤＲの１つ以上と相互作用すると予測される残基において存在しないことが好ましい１つ以上の突然変異（例えば、保存的置換）を含有し得る。
【００８９】
参照抗体と実質的に同一の突然変異誘導体又は機能的変異体が本明細書に記載される。
【００９０】
「実質的に同一」又は「非実質的」という用語は、変異体が、参照抗体と比べて実質的に類似の結合活性（例えば、親和性、特異性又はその両方）及び生物活性を有するように、変異体の（例えば、フレームワーク領域（ＦＲ）、ＣＤＲ、ＶＨ又はＶＬドメインにおける）関連アミノ酸配列が、参照抗体と比較して非実質的に異なる（例えば、保存的アミノ酸置換を含む）ことを意味する。このような変異体は、指定領域の５アミノ酸の配列において軽微なアミノ酸の変化、例えば１つ又は２つの置換を含み得る。一般に、ＣＤＲ領域とは対照的に、ＦＲ領域では、抗体の結合機能に有害な影響（例えば、元の抗体と比較して結合親和性の５０％超の減少）を与えない限り、より多くの置換が行われ得る。いくつかの実施態様では、配列同一性は、元の抗体と改変抗体との間で、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上であり得る。いくつかの実施態様では、改変抗体は、元の抗体と同じ結合特異性を有し、元の抗体の親和性の少なくとも５０％を有する。
【００９１】
保存的置換は、このような改変が行われる元の分子のものと類似の機能的及び化学的な特徴を有する分子を生じさせるであろう。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷に対してほとんど又は全く効果がないように、別の残基でネイティブなアミノ酸残基を置換することを伴い得る。（保存的又は非保存的にかかわらず）所望のアミノ酸置換は、当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、分子配列の重要な残基を同定するために、又は本明細書に記載される分子の親和性を増加若しくは減少させるために使用され得る。１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む変異体は、ポリペプチド配列を変化させるための当業者に公知の方法、例えばこのような方法を集めた参考文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見られるものにしたがって調製され得る。アミノ酸の保存的置換としては、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００９２】
本開示はまた、抗体の改善された生物学的特性、例えばより高い若しくはより低い結合親和性を有する、又はＣＤ３８及び／若しくはＰＤ−Ｌ１発現細胞に対する変化したＡＤＣＣ特性を有する抗体変異体を提供する。
【００９３】
抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、又はペプチド合成を介して調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は前記残基への挿入及び／又は前記残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴を有する限り、最終構築物を達成するために、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが行われる。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製され得る。これらの方法としては、限定されないが、以前に調製された変異型又は非変異（天然）型の抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発が挙げられる。一実施態様では、本発明の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は、１０−７Ｍ未満、特に１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍである。結合親和性は、当技術分野で公知の技術、例えばＥＬＩＳＡ若しくは（例えば、表面プラズモン共鳴を使用した）生体特異的相互作用分析、又は当技術分野で公知の他の技術を使用して決定され得る。
【００９４】
本明細書に記載される分子はいずれも、ルーチンな方法にしたがって、それらの特性、例えば抗原結合活性、抗原結合特異性及び生物学的機能を決定するために検査され得る。
【００９５】
本明細書に記載される分子はいずれも、例えば、ＰＥＧ化、高度グリコシル化によって、当技術分野で公知の容易に利用可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するように改変され得る。血清半減期を増強し得る改変が興味深い。
【００９６】
本明細書を通して、アミノ酸配列は、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)にしたがって定義される。
【００９７】
突然変異は、定常領域に位置し得る。二重特異性抗体は、実際に有利には、ＣＨ１及びＣＬドメインの境界において突然変異を有するＦａｂフラグメントを含み、前記突然変異は、重鎖／軽鎖の同種対合を促進し、それらの誤対合を防止する。
【００９８】
好ましい実施態様では、二重特異性抗体であって、
・異なる突然変異ＣＨ１及び突然変異ＣＬドメインを有する２つのＦａｂフラグメントであって、
ａ）ヒトＩｇＧ１／κ由来の突然変異ＣＨ１及び突然変異Ｃ−κドメインと、Ａｂ１のＶＨ及びＶＬドメインとを有するＦａｂフラグメント、
ｂ）ヒトＩｇＧ１／κ由来の突然変異ＣＨ１及び突然変異Ｃ−κドメインと、Ａｂ２のＶＨ及びＶＬドメインとを有するＦａｂフラグメント、
ｃ）ヒトκ定常ドメイン由来の突然変異軽鎖定常ドメイン
からなる２つのＦａｂフラグメントを含み、前記Ｆａｂフラグメントが、以下の順序
−ポリペプチドリンカーを介してＡｂ２  ＦａｂフラグメントのＶＨドメインのＮ末端に連結されたＡｂ１  Ｆａｂフラグメントの突然変異ＣＨ１ドメインのＣ末端、
−Ａｂ２フラグメントの突然変異ＣＨ１ドメインのＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に連結するヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、
−ヒトＩｇＧ１の二量体化ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
でタンデムに配置されている二重特異性抗体が本明細書に記載される。
【００９９】
特定の例では、二重特異性抗体であって、Ａｂ１若しくはＡｂ２の一方のＦａｂ  ＣＨ１ドメインが、前記ＣＨ１ドメインの１９２位のトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインから生じる突然変異ドメインであり、同種ＣＬドメインが、前記ＣＬドメインの１３７位のアスパラギン残基をリシン残基で置換し、前記ＣＬドメインの１１４位のセリン残基をアラニン残基で置換することによって、免疫グロブリンのＣＬドメインから生じる突然変異ドメインであり、及び／又はＡｂ１若しくはＡｂ２の一方若しくは他方のＦａｂ  ＣＨ１ドメインが、前記ＣＨ１ドメインの１２４位のロイシン残基をグルタミンで置換し、前記ＣＨ１ドメインの１８８位のセリン残基をバリン残基で置換することによって、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインから生じる突然変異ドメインであり、同種ＣＬドメインが、前記ＣＬドメインの１３３位のバリン残基をトレオニン残基で置換し、前記ＣＬドメインの１７６位のセリン残基をバリン残基で置換することによって、免疫グロブリンのＣＬドメインから生じる突然変異ドメインである二重特異性抗体が記載される。
【０１００】
本発明の抗体はグリコシル化されていてもよいし、若しくはグリコシル化されていなくてもよく、又は様々なグリコシル化プロファイルを示してもよい。好ましい実施態様では、抗体は、重鎖の可変領域ではグリコシル化されていないが、Ｆｃ領域ではグリコシル化されている。
【０１０１】
特定の突然変異誘導体は、ヒト化形態の参照抗体を使用し得る。ヒト化アプローチでは、ドナーマウス可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び特定の他のアミノ酸をヒト可変アクセプター領域に移植し、次いで、ヒト定常領域に結合する。例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988);米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。
【０１０２】
治療用途：
本発明の二重特異性分子、好ましくは抗体は、医薬として、特にガンの処置において有用である。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「ガン」という用語は、任意のガン、特に血液悪性腫瘍、及びＣＤ３８又はＰＤ−Ｌ１発現又は過剰発現を特徴とする任意の他のガン、特にＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１の両方の同時発現を特徴とするガンを含む。
【０１０４】
ガンの例は、リンパ腫又は白血病、例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）又は多発性骨髄腫（ＭＭ）、乳ガン、卵巣ガン、頭頸部ガン、膀胱ガン、メラノーマ、結腸直腸ガン、膵臓ガン、肺ガン、平滑筋腫である。
【０１０５】
したがって、本発明の二重特異性分子を、このような処置を必要とする患者に投与することによって、ガンを患っている患者を処置する方法が記載される。したがって、本発明の別の態様は、ガンの処置のための医薬を製造するための、本発明の二重特異性分子の使用である。
【０１０６】
本発明の一態様は、本発明の二重特異性分子を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物を製造するための、本発明の二重特異性分子の使用である。本発明のさらなる態様は、本発明の二重特異性分子を含む医薬組成物を製造するための方法である。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、医薬担体と一緒に製剤化された本明細書で定義される二重特異性分子を含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「医薬担体」は、生理学的に適合性の任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適切である。
【０１０９】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって投与され得る。投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変動するであろう。
【０１１０】
特定の投与経路によって本発明の二重特異性分子又は抗体を投与するために、その不活性化を防止するための材料で本発明の二重特異性分子若しくは抗体をコーティングするか、又はその不活性化を防止するための材料と共に本発明の二重特異性分子若しくは抗体を同時投与することが必要であり得る。例えば、本発明の二重特異性分子又は抗体は、適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤で被験体に投与され得る。薬学的に許容し得る希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝溶液が挙げられる。医薬担体としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である。
【０１１１】
これらの組成物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌手順によって、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって保証され得る。塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬形態の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
【０１１２】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物及び投与様式に関する所望の治療応答を達成するために有効な有効成分の量を得るように変更され得る。
【０１１３】
選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、処置継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、全般的な健康及び過去の病歴、並びに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な薬物動態要因に依存するであろう。例えば、本発明の二重特異性分子又は抗体は、投与量 ０．２〜２０mg/kgで３回／週〜１回／月投与され得る。
【０１１４】
このように上記に一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるが、以下の実施例は実例として提供されており、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１１５】
実施例１．二重特異性抗体BiXAb-4218、BiXAb-4219及びBiXAb-5104の調製
遺伝子合成
GeneScriptプログラムを使用して哺乳動物発現のためにコドン最適化した後、異なる抗ＣＤ３８及び抗ＰＤＬ−１モノクローナル抗体のアミノ酸配列を使用して、ＤＮＡ配列を設計した。重鎖については、制限酵素消化のための隣接配列と共に、シグナルペプチドと、Ｆａｂ１の可変領域及び定常ＣＨ１ドメインと、それに続いてヒンジリンカーと、Ｆａｂ２の可変領域及び定常ＣＨ１ドメインとをコードするＤＮＡをGeneScriptによって合成した。軽鎖については、シグナルペプチドと、可変及び定常κ領域とをコードするＤＮＡをGeneScriptによって合成した。
【０１１６】
PfuTurbo Hot Startを使用したＰＣＲ反応を行ってインサートを増幅し、次いで、それぞれ重鎖及び軽鎖についてＮｏｔＩ＋ＡｐａＩ及びＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩによってこれを消化した。ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３ドメインが既に挿入されたＮｏｔＩ＋ＡｐａＩ消化Evitria専用発現ベクターと二重消化重鎖フラグメントをライゲーションした。ＮｏｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ処理Evitria専用ベクターと二重消化軽鎖フラグメントをライゲーションした。二本鎖ＤＮＡ配列決定によって、プラスミドＤＮＡを検証した。
【０１１７】
発現、精製及び特性評価
５０mLスケールの発現のために、１．５mLエッペンドルフチューブ中で、Evitria専用ベクター中のプラスミドＤＮＡ 合計５０μg（重鎖 ２５μg＋軽鎖ＬＣ１及びＬＣ２ 各１２．５μg）を混合し、３mg/mL ＰＥＩ（ｐＨ７．０） ２５μLを含有するＣＨＯ  ＳＦＭ培地 １mLを追加し、室温で２０分間インキュベーションした。１２５mL振盪フラスコ中で、ＤＮＡ−ＰＥＩの混合物をFreeStyle（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞 ４９mLに細胞 １〜２×１０６個/mLでロードした。細胞をさらに６日間振盪した。細胞を３，０００rpmで１５分間遠心分離することによって、上清を採取した。プロテインＡ樹脂によって、採取した上清を精製した。Gel Biorad Stain-Free 4-15%ゲル及び対応するランニングバッファーを用いて、還元条件及び非還元条件下で電気泳動を実施した。精製BiXAb（登録商標）抗体を２×ＳＤＳサンプルバッファーと合わせ、９５℃で５分間加熱することによって、サンプルを調製した。還元サンプルの調製には、加熱前にＮｕＰＡＧＥ還元剤を追加することが含まれていた。Ladder Precision Plus Protein Unstained Standards (Biorad)を使用して、見掛けのＭＷを決定した。図２は、還元条件下におけるＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。複合重鎖及び２本の共移動軽鎖に対応する２つのバンドが観察され、予想分子量のものである。図３は、非還元条件下におけるＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。２５０kDaの主要なバンドは、予想どおり、完全ＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１  BiXAb（登録商標）分子に対応する。
【０１１８】
二重抗原結合プレートＥＬＩＳＡアッセイでは、以下の試薬を使用した：リコンビナントヒトＣＤ３８、Ｆｃタグ付（Creative BioMart）；ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１、Ａｖｉタグ（AcroBiosystems）；ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Biotechne RD-Systems）。Maxisorpプレート中で、ヒトＣＤ３８−Ｆｃ融合タンパク質を１００μL/ウェル、２μg/mL、１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、４℃で一晩コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（１×ＰＢＳＴ）を含有する１×ＰＢＳでプレートを５回洗浄し、次いで、室温で１時間振盪しながら３％脱脂乳／１×ＰＢＳＴによって２００μL/ウェルでブロッキングした。１mg/ml ストック溶液を１／５００希釈から開始して１×ＰＢＳによって１：３系列希釈したBiXAb（登録商標）4218及びBiXAb（登録商標）4219を１ウェル当たり１００μL追加した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベーションし、続いて、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。１×ＰＢＳ中の１μg/mL ビオチン−ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質を１ウェル当たり１００μL追加し、プレートを室温で１時間振盪した。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１×ＰＢＳ中の０．１μg/mL ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰを１ウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間振盪し、続いて、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。発色のために、１×ＰＢＳ中のＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μL追加した。Victor IIマルチファンクションプレートリーダーによって、０．１秒／ウェルでデータを４０５nmで収集した。図４は、２つのＣＤ３８／ＰＤ−Ｌ１  BiXAb（登録商標）の二重抗原結合プロファイルを実証する。このプロファイルは、これらの分子の両タイプの結合ドメイン（抗ＣＤ３８ドメイン及び抗ＰＤ−Ｌ１ドメイン）が、それらの同種抗原ターゲットに結合することを裏付けている。
【０１１９】
実施例２．本発明の二重特異性抗体BiXAb-6567の調製
遺伝子合成
GeneScriptプログラムを使用して哺乳動物発現のためにコドン最適化した後、抗ＣＤ３８（ダラツムマブ）及び抗ＰＤＬ１（アテゾリズマブ）のアミノ酸配列を使用して、ＤＮＡ配列を設計した。これらの抗体は、「親」抗ＣＤ３８及び「親」抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂと称される。
【０１２０】
シグナルペプチド（配列番号：２１）、それに続いて配列番号：１０の配列［これは、可変領域と、それに続いてＦａｂ１（抗ＣＤ３８）の定常ＣＨ１ドメイン（これは、Kabat位置１２４及び１８８において、ＬｅｕからＧｌｎへの突然変異及びＳｅｒからＶａｌへの突然変異をそれぞれ導入した）と、それに続いてリンカーと、それに続いて可変領域と、それに続いてＦａｂ２（抗ＰＤ−Ｌ１）の定常ＣＨ１ドメイン（これは、Kabat位置１９２において、ＴｈｒからＡｓｐへの突然変異を導入した）とからなる］のように、重鎖のＤＮＡ構築物を設計した；制限酵素消化のための隣接配列を重鎖ＤＮＡ構築物の両端に導入した。シグナルペプチド（配列番号：２１）、それに続いて可変領域、それに続いて定常κ領域のように、軽鎖のＤＮＡ構築物を設計した；抗ＣＤ３８軽鎖については、定常κドメインのKabat位置１４３（ＬｅｕからＧｌｎへ）及び１８８（ＳｅｒからＶａｌへ）において、突然変異を導入した。抗ＰＤＬ１軽鎖については、Kabat位置１３３（ＶａｌからＴｈｒへ）及び１７６（ＳｅｒからＶａｌへ）における突然変異を定常κドメインに導入した。ＤＮＡ構築物は全て、Gene Artによって合成された。
【０１２１】
PfuTurbo Hot Startを使用したＰＣＲ反応を行ってインサートを増幅し、次いで、それぞれ重鎖及び軽鎖についてＮｏｔＩ及びＡｐａＩ並びにＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでこれを消化した。ヒトＩｇＧ１ヒンジとそれに続いてＣＨ２＋ＣＨ３ドメインが既に挿入されたＮｏｔＩ及びＡｐａＩ処理ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター(Invitrogen)と二重消化重鎖フラグメントをライゲーションした。ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター(Invitrogen)と二重消化軽鎖フラグメントをライゲーションした。二本鎖ＤＮＡ配列決定によって、プラスミドＤＮＡを検証した。
【０１２２】
発現及び精製
懸濁液の無血清培地(CHO SFM-II培地、Life Technologies（商標）)に適合されたＣＨＯ−Ｓ細胞において、２：１：１＝ＨＣ：ＬＣ１：ＬＣ２の分子比で別個のベクター上でコードされる３つの遺伝子（１本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ））をコトランスフェクションすることによる一過性遺伝子発現を用いて、二重特異性抗体BiXAb-6567を生産した。典型的には、５０mLスケールの発現のために、１．５mLエッペンドルフチューブ中で、プラスミドＤＮＡ 合計５０μg（重鎖 ２５μg、抗ＣＤ３８軽鎖 １２．５μg及び抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖 １２．５μg）を混合し、次いで、３mg/mL ＰＥＩトランスフェクション試薬ｐＨ７．０(Polyplus) ２５μLを含有するＣＨＯ  ＳＦＭ培地 １mLを追加し、反応物を室温で２０分間インキュベーションした。続いて、１２５mL振盪フラスコ中で、ＤＮＡ−ＰＥＩの混合物をLife Technologies’ Invitrogen FreeStyle（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞 ４９mLに１〜２×１０６/mLで追加した。細胞を６日間振盪した。３，０００rpmで１５分間遠心分離することによって、上清を採取した。ForteBioのプロテインＡバイオセンサー(Octet（登録商標）Systems)を使用して、上清中のBiXAb-6567の発現力価を決定した。次いで、プロテインＡアフィニティー樹脂(MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences)によって、BiXAb-6567を精製した。０．１ＭグリシンｐＨ３．５を使用してプロテインＡから抗体を溶出させ、１Ｍトリスによって溶出液を中和した。ダルベッコＰＢＳ(Lonza)中の精製抗体を滅菌ろ過（０．２μM滅菌フィルタ、Techno Plastic Products AG）し、２８０nmの光学密度を読み取ることによって(Eppendorf BioSpectrometer（登録商標）)、最終濃度を決定した。
【０１２３】
BiXAab-6567は、典型的には、一過性ＣＨＯ発現において良好な発現力価（＞１８０mg/リットル）を示した。この発現レベルは、従来のモノクローナル抗体で見られる発現レベルと同程度である。
【０１２４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製BiXAb-6567の品質を評価するために、本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Experion（商標）自動電気泳動システム、BioRad)を実施した。ランニングバッファー中のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下では、抗体がゲル中で移動する速度はそのサイズに主に依存するので、分子量決定が可能になる。非還元条件下及び還元条件下で、このアッセイを実施した；後者は、ジスルフィド結合の破壊を可能にするので、個々のポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）の可視化を可能にする。
【０１２５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデータは、図５に示されている。非還元条件下では、抗体の四次構造が維持され、観察される分子量は、異なる重鎖及び軽鎖の分子量の合計を表すはずである。本発明の二重特異性抗体（BiXAb-6567）は、６本の鎖（２本の重鎖及び４本の軽鎖）からなる。翻訳後修飾（ＰＴＭ）、例えばアスパラギン２９７におけるＦｃのＮ−グリコシル化を考慮しなければ、BiXab-6567の理論分子量は２４４．４０kDaである。既知分子量の標準の混合物を使用して、ゲルを較正した。非還元データは、主なバンドが分子量標準 ２５０kDa（これは、Ｆｃドメインにおける２９７位の２つのアスパラギンの計算分子量及び予想グリコシル化と一致する）付近にあることを示している。還元条件下では、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、ジスルフィド結合を還元して四次構造を破壊することによって、BiXAb-6567をさらに変性させるので、６本のポリペプチド鎖は、それらの分子量に応じてゲル中で別々に移動するはずである。BiXAb-6567の２本の同一の重鎖は、単一のバンドとして共に移動し、２組の軽鎖は、それらの分子量がほぼ同一であるため、第２のバンドとして共に移動した。したがって、データは、分子量標準の移動度に基づいて、約７５kDa及び２５kDaの２つの主なバンドを示している。各重鎖は、アスパラギン２９７において１つのＮ−グリコシル化部位を有していたが、これは、より高分子量のバンドの広がりと、観察された分子量が計算よりもわずかに高いこと（７５．４４kDa）とを説明している；この幅広さは、グリコシル化タンパク質に典型的である。抗ＣＤ３８（２３．４０kDa）及び抗ＰＤ−Ｌ１（２３．３６kDa）の軽鎖の計算分子量は非常に類似しているので、その結果、それらは共に移動した。
【０１２６】
結論として、BiXAb-6567のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元条件下及び還元条件下の両方における予想プロファイルを示しており、重鎖におけるＮ−グリコシル化部位の存在を考慮すると、理論上の計算分子量と一致していた。
【０１２７】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
操作されたタンパク質分子では、タンパク質凝集が頻繁に観察される。本発明者らは、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施して、一段階アフィニティー精製BiXAb-6567調製物の高分子量種含有量をアッセイした（変異体の発現及び精製を参照のこと）。本発明者らは、SEC-s3000 (300× 7.8 mm)カラム(BioSep)及びAktapurifier 10システム(GE Healthcare)を用いた；ＰＢＳバッファーｐＨ７．４を使用して、流速 １mL/分でアッセイを行った。
【０１２８】
図６に示されているＳＥＣクロマトグラムにより、主ピークは、モノマーBiXAb-6567の予想サイズに対応することが実証された；このピークは、全サンプルの９８．２％を占めていた。加えて、より高分子量の種（おそらくは、ダイマー）に対応する小さなピークが観察された；このピークは、全サンプルの１．８％を占めていた。したがって、本発明者らは、より高分子量の種の含有率がわずかであり、ＣＨＯ発現系において産生される従来のモノクローナル抗体と同様であると結論付けた。モノマーピークの狭い対称形状により、BiXAb-6567は正しくアセンブルされ、単一の種によって占められていたことが示唆された。
【０１２９】
実施例３．示差走査熱量測定によるBiXAb-6567の特性評価
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、BiXAb-6567、親抗ＣＤ３８ ｍＡｂ及び親抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの熱安定性を比較した。MicrocalTM VP-Capillary DSCシステム(Malvern Instruments)を使用して、示差走査熱量測定実験を実施した。
【０１３０】
全てのサンプルを遠心分離（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）し、ＩｇＧ分析プログラムを用いたNanodrop ND-1000分光光度計(Thermo Scientific)を使用したＤＳＣ分析の前に、それらのタンパク質含有量を定量した。アッセイのために、全てのサンプルをＰＢＳで最終濃度 １mg/mLに希釈した。
【０１３１】
予備平衡時間は３分間であり、得られたサーモグラムは、走査速度 ６０℃／時、ろ過時間 ２５秒間及びメディウムフィードバックにおいて２０〜１１０℃で取得されたものであった。サンプル分析の前に、５回のバッファー／バッファースキャンを測定して機器を安定化し、各タンパク質／バッファースキャンの間にバッファー／バッファースキャンを実施した。データを非二状態アンフォールディングモデルにフィッティングし、ベースラインを差し引くことによって遷移前及び遷移後を調整した。
【０１３２】
（５０〜１００℃の範囲をカバーする）図７に示されているＤＳＣ曲線により、個々のＦｖ領域が異なるＦａｂアンフォールディングプロファイルにつながり得る方法が実証された；また、この実験により、Ｆｖ領域がＦａｂの見掛けの安定性を決定することが実証された。抗ＣＤ３８ ｍＡｂのＤＳＣプロファイルは、２つの遷移（１７０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び７０．９℃のＴｍ１を有する大きなピーク（これは、ＣＨ２及びＦａｂドメインの両方のアンフォールディングに対応する）、並びに２０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び８１．５℃のＴｍ２を有する小さなピーク（これは、ＣＨ３ドメインのアンフォールディングに対応する））を示した。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂのＤＳＣプロファイルは、２つの遷移（２０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び６９．９℃のＴｍ１を有する小さなピーク（これは、ＣＨ２ドメインのアンフォールディングに対応する）、並びに１６０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び８３．４℃のＴｍ２を有する大きなピーク（これは、ＣＨ３ドメイン及びＦａｂドメインの両方のアンフォールディングに対応する））を示した。
【０１３３】
BiXAb-6567のＤＳＣプロファイルもまた、２つの大きなピークを有する２つの遷移を示した。第１のピークは、１３０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び７１．５℃のＴｍ１を有しており、抗ＣＤ３８ ｍＡｂのＣＨ２及びＦａｂドメインのアンフォールディングに対応していた；第２のピークは、１７０Kcal/モル/℃のＣｐ ｍａｘ及び８１．５℃のＴｍ２を有しており、抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂのＣＨ３及びＦａｂドメインのアンフォールディングに対応していた。したがって、BiXAb-6567のＤＳＣプロファイルは、２つの親ｍＡｂの２つのＤＳＣプロファイルを重ね合わせたものに似ており、BiXAb-6567の優れたアセンブリ及び安定性を示した。BiXAb-6567のＴｏｎｓｅｔ（６３．３℃）は、親ｍＡｂのもの（抗ＣＤ３８のＴｏｎｓｅｔ＝６３．５℃及び抗ＰＤ−Ｌ１のＴｏｎｓｅｔ＝６３．２℃）と同様であったが、これは、BiXAb-6567が、親抗体のものと同様の安定特性を有していたことを示している。BiXAb-6567の計算ΔＨは１５６０kcal/モルであったが、これは、二重特異性分子のサイズが、２つの親抗体（抗ＣＤ３８  ΔＨ＝９６３kcal/モル及び抗ＰＤ−Ｌ１  ΔＨ＝８２０kcal/モル）と比べて大きいことを反映している。
【０１３４】
定義：
Ｔｍ又は変性／融解温度は、アンフォールディング種及びフォールディング種の濃度が等しい点であり、アンフォールディング遷移の中間点である。パラメータとして、それは、熱変性に対するタンパク質の感受性を表すので、それは、タンパク質の安定性に関連する。Ｔｍが高いほど、タンパク質はより安定である。
【０１３５】
Ｔｏｎｓｅｔは、アンフォールディング遷移が開始する温度である。このパラメータの値は、通常、Ｔｍよりも５〜１０℃低い。それはまた、タンパク質の安定性を表すパラメータであるが、熱変性に対する耐性に関連する。
【０１３６】
ΔＨは、アンフォールディングの熱量測定エンタルピーであり、タンパク質中の分子内相互作用の破壊（すなわち、ドメイン内及びドメイン間相互作用の破壊）を反映する。熱アンフォールディングプロセスは吸熱性であるので、正のエンタルピー値が生じる。熱量測定エンタルピー（ΔＨ）は、熱アンフォールディング遷移ピーク下面積である。
【０１３７】
実施例．４BiXAb-6567の無細胞結合特性
直接ＣＤ３８抗原結合プレートＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＢＳ  ｐＨ７．４による希釈によって調製した濃度 各３μg/mLの親ｍＡｂ抗ＣＤ３８又は抗ＰＤＬ１ １００μlを使用して、Maxisorpプレートを４℃で一晩コーティングした。また、ＰＢＳ  ｐＨ７．４による希釈によって調製した濃度 ５μg/mLのBiXAb-6567を使用して、Maxisorpプレートを４℃で一晩コーティングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有する１×ＰＢＳでプレートを５回洗浄し、次いで、１ウェル当たり１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ ２００μLによって室温で２時間ブロッキングした。続いて、１×ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した。１μg/mLから開始して、７点３倍希釈系列の１×ＰＢＳ中Ｈｉｓ／Ｆｌａｇタグ付リコンビナントＣＤ３８(Creative Biomart)を調製した；各希釈段階を１アッセイウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。１×ＰＢＳで１０，０００倍希釈した抗Ｆｌａｇタグ抗体コンジュゲートＨＲＰ(Abcam)を１ウェル当たり１００μL追加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、比色読み取りのために１×ＰＢＳ中ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μL追加し、発色のためにプレートを室温で１５分間インキュベーションした。Victor2マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて、アッセイデータを６５０nmで収集した。
【０１３８】
BiXAb-6567は、親抗ＣＤ３８抗体のものと非常に類似の用量依存的結合曲線を示した（図８Ａ）。両抗体のＣＤ３８結合のＥＣ５０は、以下のとおりであった：ＥＣ５０［BiXAb-6567］＝１７１ng/mL及びＥＣ５０［抗ＣＤ３８］＝１９９ng/mL。この結果により、BiXAb-6567は、親抗ＣＤ３８ ｍＡｂのものと同様の結合を示したので、正しくアセンブルされた抗ＣＤ３８  Ｆａｂドメインを有していたことが示唆された。ネガティブコントロールとして使用した親抗ＰＤＬ１ ｍＡｂは、予想どおり、いかなる結合も示さなかった。
【０１３９】
直接ＰＤＬ１抗原結合プレートＥＬＩＳＡアッセイ。
１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４による希釈によって調製した濃度 １μg/mLのビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質(AcroBiosystems)１００μLを使用して、Maxisorpプレートを４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、次いで、１ウェル当たり１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ ２００μLによって室温で２時間ブロッキングした。その後、１×ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した。７点３倍希釈系列の１×ＰＢＳ中抗ＣＤ３８ ｍＡｂ（０．３mg/mLから開始）又は抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ（０．３mg/mLから開始）又はBiXAb-6567（０．５mg/mLから開始）を調製した；各希釈段階を１アッセイウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。１×ＰＢＳで５，０００倍希釈した抗ヒト抗体(IgG H&L)コンジュゲートＨＲＰ(Abliance)を１ウェル当たり１００μL追加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、比色読み取りのために１×ＰＢＳ中ＴＭＢ基質を１ウェル当たり１００μL追加し、発色のためにプレートを室温で１５分間インキュベーションした。Victor2マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて、アッセイデータを６５０nmで収集した。
【０１４０】
BiXAb-6567は、親抗ＰＤ−Ｌ１抗体のものと非常に類似の用量依存的結合曲線を示した（図８Ｂ）。両抗体のＰＤ−Ｌ１結合のＥＣ５０は、以下のとおりであった：ＥＣ５０［BiXAb-6567］＝９３ng/mL及びＥＣ５０［抗ＰＤ−Ｌ１］＝７２ng/mL。この結果により、BiXAb-6567は、親抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂのものと同様の結合を示したので、正しくアセンブルされた抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂドメインを有していたことが示唆された。ネガティブコントロールとして使用した親抗ＣＤ３８ ｍＡｂは、予想どおり、いかなる結合も示さなかった。
【０１４１】
二重抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイ
１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４による希釈によって調製した２μg/mLのリコンビナントヒトＦｃタグ付ＣＤ３８(Creative BioMart)１００μLを使用して、Maxisorpプレートを４℃で一晩コーティングした。１×ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、次いで、１ウェル当たり１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡ ２００μLによって室温で２時間ブロッキングした。１×ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した。７点３倍希釈系列の１×ＰＢＳ中BiXAb-6567（１μg/mLから開始）を調製し、各希釈段階を１アッセイウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、続いて、１×ＰＢＳＴで５回洗浄した。１×ＰＢＳ中１μg/mL ビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１(AcroBiosystems)を１ウェル当たり１００μL追加し、プレートを室温で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１×ＰＢＳによる希釈によって調製した０．１μg/mL ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ(Biotechne)を１ウェル当たり１００μL追加した。プレートを室温で１時間インキュベーションした。１×ＰＢＳＴで５回洗浄した後、比色読み取りのために１００μL/ウェルの１×ＰＢＳ中ＴＭＢ基質を追加し、発色のためにプレートを室温で１５分間インキュベーションした。Victor2マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて、アッセイデータを６５０nmで収集した。
【０１４２】
BiXAb-6567は、二重ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて用量依存的結合曲線を示したが、これは、それが、正しくアセンブルされた抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂドメインを有していたことを示唆している（図８Ｃ）。これにより、BiXAb-6567は、ＥＣ５０＝１４４ng/mLでＣＤ３８及びＰＤ−Ｌ１に同時結合することができる二重特異性抗体であることが実証された。２つの親ｍＡｂ抗ＣＤ３８及び抗ＰＤＬ１はいずれも、予想どおり、この二重ＥＬＩＳＡフォーマットにおいていかなる結合も示さなかった。
【０１４３】
実施例５．蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による相対結合活性の決定
１００μg/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清及び５００μg/ml ジェネテシンを補充したＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ培地中で、ＣＨＯ−ＣＤ３８細胞（全長ヒトＣＤ３８で安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞）を培養した。１００μg/ml ペニシリン、１００μg/ml ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ  １６４０−Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ培地中で、ＳＫＯＶ−３細胞及びＲＰＭＩ−８２２６細胞を培養した。
【０１４４】
各サンプル当たり細胞（ＣＨＯ−ＣＤ３８又はＳＫＯＶ−３又はＲＰＭＩ−８２２６）３×１０５個を使用した。ＰＢＡ溶液（１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｎａ−アジドを補充したＰＢＳ）で細胞を１回洗浄した。ＦＡＣＳプロファイルの決定のために、容量 ３０μl中濃度 ５０μg/mlの各抗体で細胞を染色した。BiXAb-6567及び親抗ＣＤ３８抗体の力価測定並びにその後の結合パラメータの決定のために、容量 ３０μl中の示されている濃度の各抗体でＣＨＯ−ＣＤ３８細胞を染色した。氷上で細胞を３０分間インキュベーションし、次いで、ＰＢＡ溶液 １mlで２回洗浄した。暗所の氷上で、細胞を蛍光標識抗ヒトκ又は抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ特異的二次抗体と共に３０分間インキュベーションし、次いで、ＰＢＡ溶液 １mlで２回洗浄した；最後に、細胞をＰＢＡ溶液 最終容量５００μlに再懸濁した。Epics-XL又はNaviosフローサイトメーター(Beckman Coulter)のいずれかを使用して、サンプルをアッセイした。各実験において、１０．０００個の事象が得られた。
【０１４５】
BiXAb-6567並びに親抗ＣＤ３８及び抗ＰＤ−Ｌ１親抗体の結合プロファイルは、図９Ａ〜Ｃに示されている。本発明者らは、高レベルのＣＤ３８及び無視可能なレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６（図９Ａ）；安定トランスフェクションした全長ＣＤ３８により、非常に高レベルのＣＤ３８を発現するＣＨＯ−ＣＤ３８細胞株（図９Ｂ）；並びにＰＤ−Ｌ１を発現することが公知の卵巣ガン細胞株ＳＫＯＶ−３（図９Ｃ）を試験することを選択した。３つの細胞株において、これらのプロファイルは、BiXAb-6567について単一のピークを示し、これは、両親抗体のプロファイルと非常に類似していた。これにより、BiXAb-6567は正しくフォールディングされており、親抗体のものと同様の結合特性を有することが示唆された。予想どおり、ＣＨＯ−ＣＤ３８は、ＰＤ−Ｌ１を発現せずにＣＤ３８のみを発現したのに対して、ＳＫＯＶ−３は、ＣＤ３８を発現せずにＰＤ−Ｌ１のみを発現した。
【０１４６】
BiXAb-6567の結合特性が親抗ＣＤ３８抗体のものと同様であることを定量的に確認するために、図１０に示されているように、ＣＨＯ−ＣＤ３８細胞を用いて、BiXAb-6567及び抗ＣＤ３８親抗体の力価測定を実施した。BiXAb-6567のＥＣ５０は１７．１nMであると決定され、親抗ＣＤ３８のものは８．５nMであったが、これは、BiXAb-6567及び親抗ＣＤ３８抗体における抗ＣＤ３８  Ｆａｂドメインの結合特性が同様であることを裏付けている。この実験におけるネガティブコントロール抗ＰＤ−Ｌ１及び抗ＣＤ２０抗体は、予想どおり、ＣＨＯ−ＣＤ３８細胞に対する結合を示さなかった。
【０１４７】
実施例６．非分画非プレ活性化単核細胞（ＭＮＣ）を用いた抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
上記実施例５に記載されているように、ＣＨＯ−ＣＤ３８、ＳＫＯＶ−３及びＲＰＭＩ−８２２６細胞を培養した。
【０１４８】
ＭＮＣの調製では、以下の手順を用いた。新たに採血した末梢血をクエン酸塩で抗凝固処理した。続いて、抗凝固処理全血 ６mlでFicoll-Paque PLUS溶液 ５mlを層化した。その後に遠心分離破砕を伴わずに、サンプルを２，５００rpm、室温で２０分間遠心分離した。血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面からＭＮＣを収集した。ＰＢＳでＭＮＣ細胞懸濁液を１：１０希釈し、１，８００rpm、室温で５分間遠心分離した。上清を除去し、氷冷蒸留水 ４５mlを細胞懸濁液に３０秒間かけて追加することによって赤血球を溶解し、その後、１０×ＰＢＳ ５mlを追加した。細胞を１８００rpm、室温で５分間遠心分離し、１×ＰＢＳで３回洗浄して、血小板を除去した。最後に、細胞を細胞培養培地 ５mlに再懸濁した。ＡＤＣＣアッセイにおいて４０：１＝エフェクター細胞：腫瘍細胞比を達成するように、細胞数を調整した。
【０１４９】
ＡＤＣＣ５１クロム放出アッセイでは、ターゲット細胞（ＲＰＭＩ８２２６、ＳＫＯＶ−３又はＣＨＯ−ＣＤ３８）１×１０６個をＰＢＳ ２００μl中の５１クロム １００μCiと共に３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベーションした。２時間のインキュベーション後、培地 ７mlで細胞を３回洗浄し、最後に、細胞 ０．１×１０６個/mlの濃度で再懸濁した。９６ウェルマイクロタイタープレート（アッセイ容量 ２００μl）中で、抗体の存在下におけるターゲット細胞（細胞 ５，０００個/ウェル）及びＭＮＣを３７℃及び５％ＣＯ２で３時間インキュベーションした。最大ターゲット細胞溶解（＝最大ｃｐｍ）の決定のために、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を追加した。基本５１クロム放出（＝基本ｃｐｍ）を決定するために、ターゲット細胞をさらに操作しなかった。４時間のインキュベーション後、マイクロタイタープレートを２０００rpmで５分間遠心分離し、上清 ２５μlをOptiphase Supermix (Perkin Elmer) １２５μlと混合し、振盪インキュベーター中で１分間インキュベーションした。MicroBeta TriLux (Perkin Elmer)ベータカウンター機器で、サンプルをアッセイした。以下の式：
％溶解＝（実験ｃｐｍ−基本ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−基本ｃｐｍ）×１００
を使用して、ターゲット細胞溶解を計算した。
【０１５０】
全ての測定を３回反復で実施した。
【０１５１】
エフェクター細胞として非プレ活性化ＭＮＣを用いて、ＣＤ３８＋細胞（ＲＰＭＩ−８２２６及びＣＨＯ−ＣＤ３８）のＡＤＣＣアッセイを実施した（図１１及び１２）。アッセイにより、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対するBiXAb-6567及び抗ＣＤ３８抗体の細胞傷害性は強力であり、ＥＣ５０はそれぞれ０．８nM及び０．３nMであることが示された；ＣＨＯ−ＣＤ３８細胞に対しては、BiXAb-6567及び抗ＣＤ３８抗体の細胞傷害性は、それぞれ０．２nM及び０．０７nMのＥＣ５０を有していた。抗ＰＤ−Ｌ１は、両細胞株に対して最小活性を示した；２つのネガティブコントロールｍＡｂ抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２は、予想どおり、いかなる溶解も促進しなかった。これらの結果は、ＣＤ３８＋細胞に対するＢＭＸ−６５６７のＡＤＣＣ活性が強力であり、親抗ＣＤ３８抗体のものと同様であることを実証している。
【０１５２】
実施例７．濃縮プレ活性化ＮＫ細胞を用いたＡＤＣＣ
実施例５に記載されているように、ＳＫＯＶ３細胞、ＲＰＭＩ８２２６及びＣＨＯ−ＣＤ３８細胞を培養した。実施例６に記載されているように、ＭＮＣを調製した。製造業者の説明書にしたがって、“NK cell isolation kit, human” (Miltenyi)を用いて陰性選択によって、ＭＮＣからＮＫ細胞を単離した。１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ培地中で、ＮＫ細胞を細胞 ２×１０６個/mlの播種密度で一晩培養した。ＩＬ−１２又はＩＬ−１５を最終濃度 １０ng/mlまで追加した。エフェクター細胞：腫瘍細胞比を１０：１に維持し、反応時間を３時間に短縮した以外は実施例５に概説されているように、ＡＤＣＣアッセイを実施した。
【０１５３】
ＩＬ−１２又はＩＬ−１５プレ活性化濃縮ＮＫ細胞のいずれかを用いて、ＰＤ−Ｌ１＋細胞株ＳＫＯＶ−３において、BiXAb-6567の抗ＰＤ−Ｌ１部分のＡＤＣＣ特性をアッセイした。結果は、図１３及び１４に示されている。この実験では、BiXAb-6567のＡＤＣＣ特性と親抗ＰＤ−Ｌ１抗体のものとを比較した；ＳＫＯＶ−３細胞は、ＰＤ−Ｌ１＋／ＨＥＲ２＋／ＣＤ２０−／ＣＤ３８−であるので、ポジティブコントロールとして抗ＨＥＲ２抗体を用い、ネガティブコントロールとして抗ＣＤ２０抗体及び親抗ＣＤ３８抗体を用いた。図１３及び１４は、ＮＫ細胞の培養においてＩＬ−１２又はＩＬ−１５を用いたかにかかわらず、BiXAb-6567及び親抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＡＤＣＣ活性が強力であることを実証している。ＩＬ−１２を使用した場合、BiXAb-6567及び親抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＥＣ５０は、それぞれ０．００７nM及び０．０３nMであった。ＩＬ−１５を用いた場合、プロファイルはさらに類似していた；しかしながら、曲線適合は収束しなかったので、ＥＣ５０値の計算が妨げられた。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１＋細胞に対するＢＭＸ−６５６７のＡＤＣＣ活性が強力であり、親ＰＤ−Ｌ１抗体のものと同様である。ことを実証している。
【図１Ａ】
2019516396.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
2019516396.tif 000017
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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