(57)【要約】  本発明は、１型糖尿病患者の治療のために自己由来間質血管細胞群と一緒にヒトの膵島を肝外で輸送するための頑丈で多孔質な三次元装置の作製および利用、ならびに生体適合性ヒドロゲルインクを用いる３Ｄバイオプリンティングを用いた個別患者用装置の製造工程に関する。特に、本発明は、３Ｄバイオプリンティング技術を用いて、患者自身の脂肪由来の幹細胞によって移植された膵島の生存能および効能が向上される３Ｄ装置を製造する。脂肪組織由来の間充織幹細胞は、細胞ストレスを予防し膵島の生存能を結果として向上させる膵島のための微環境を提供する成分を分泌する。膵島の肝外移植を可能にするこのような頑丈な構造の埋め込み型装置の利点は、異物反応を取り除く生体親和性と、結果としてインシュリン生成を増加させる膵島の強化された生存能力である。自己由来間質血管細胞群を取り込むことによって、本装置の機能性にとって重要な特徴である血管新生が促進される。
2019535345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵島と、自己由来間質血管細胞群と、生体適合性ヒドロゲルと、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項２】
多孔質の足場構造を備えることを特徴とする請求項１に記載の３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３】
前記３Ｄバイオプリントされた装置は多孔質の足場構造を備え、該多孔質の足場構造はインシュリンの生産性を増やし、孔に形成された脈管構造を介してインシュリンを輸送することを特徴とする請求項１に記載の３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項４】
請求項１に記載の３Ｄバイオプリントされた装置を移植することによって、１型糖尿病を患う動物および／または人間を治療することを特徴とする方法。
【請求項５】
１型糖尿病の動物および／または人間の治療のために自己由来間質血管細胞群と一緒に膵島を肝外で輸送するための埋め込み型装置を用いる工程を含むことを特徴とする３Ｄバイオプリンティング方法。
【請求項６】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島および自己由来間質血管細胞群を用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記自己由来間質血管細胞群は、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島および血管内皮前駆細胞を用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記血管内皮前駆細胞は、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島および前脂肪細胞を用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記前脂肪細胞は、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島および脂肪由来の間充織幹細胞を用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪由来の間充織幹細胞は、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞を用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒトの膵島、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞は、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島および脂肪組織マクロファージを用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂肪組織マクロファージは、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
３Ｄバイオプリンティングを用いて、ヒトの膵島ならびにロイコトリエン、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ−１およびＶＥＧＦといった治癒因子を用いた個別患者用装置を作ることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ロイコトリエン、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ−１およびＶＥＧＦといった治癒因子は、脂肪吸引を用いて分離されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
３Ｄバイオプリンティングは、生体適合性ヒドロゲルインク、具体的には、アルギン酸塩、ＲＧＤペプチド結合アルギン酸塩、チラミン結合アルギン酸塩、アルギン酸硫酸塩、カラギーン、ヘパリン、繊維素、ヘパリン硫酸、エラスチン、ヒアルロン酸、チラミン結合ヒアルロン酸、セルロース、カルボキシメチル化セルロース、小繊維としてのナノセルロース、デキストラン、シルク、コラーゲン、ゼラチン、ポリエルリジン、キトサンからなる群から選択される生体高分子を用いて行われることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記膵島は、１つの流体として、前記膵島が、バイオプリントされるか配置されて、ヒドロゲルにカプセル化されるかバイオインクに分散されるとともに、別の流体として、間質血管細胞群または間質血管細胞由来の成分がバイオプリントされ、両方の流体が相互に接触されることを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２２】
両方の成分が接触しており、前記３Ｄバイオプリントされた構造体が、血管新生を可能に多孔質構造を有していることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記膵島は、中心部の要素として、同軸ニードルでバイオプリントされ、間質血管細胞群または間質血管細胞由来の成分は、外殻として、同軸ニードルでバイオプリントされることを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２４】
前記膵島は、間質血管細胞群または間質血管細胞由来の成分および生体適合性ヒドロゲルと混合されていることを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２５】
前記間質血管細胞群または間質血管細胞由来の成分の分離は、Ｃｙｔｏｒｉ社のＣｅｌｕｔｉｏｎ／ＰｕｒｅＧｒａｆｔ／ＳｔｅｍＳｏｕｒｃｅ（酵素系）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ社のＩｎｃｅｌｌａｔｏｒ（酵素系）、Ｍｅｄｉ−Ｋｈａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＬｉｐｏｋｉｔ（酵素系）、  ＭｉｃｒｏＡｉｒｅ社のＳｔｒｏｍａＣｅｌｌ（機械系）、Ｔｈｅ  ＧＩＤ  Ｇｒｏｕｐ社のＧＩＤ７００／ＧＩＤ  ＳＶＦ−１（酵素系）、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のＬｉｐｏｇｅｍｓ（機械系）、Ｓｔｅｍｐｅｕｔｉｃｓ社のＳｔｅｍｐｅｕｔｒｏｎ（酵素系）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｇｒｏｕｐ社のＡ−Ｓｔｒｏｍａｌ／ＰｒｏＣｅｌｌｅｒ（酵素系）、ＳｙｎＧｅｎ社のＳｙｎＧｅｎＸ−１０００（酵素系）、ＢｉｏＳａｆｅ社のＳｅｐａｘ−２（酵素系）といった機器、または手術室での使用を認可された機器を用いて実行されることを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２６】
前記間質血管細胞群または間質血管細胞由来の成分と生体適合性ヒドロゲルインクの混合は、自動無菌操作で行われることを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２７】
３Ｄバイオプリンティングは、手術室で行われることを特徴とする前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２８】
前記いずれかの請求項に記載の装置を、動物および／または人間に移植することを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記いずれかの請求項に記載の装置を移植することによって、１型糖尿病を患う動物および／または人間を治療することを特徴とする方法。
【請求項３０】
膵島と、自己由来間質血管細胞群と、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３１】
膵島と、血管内皮前駆細胞と、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３２】
膵島と、前脂肪細胞と、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３３】
膵島と、脂肪由来の間充織幹細胞と、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３４】
膵島、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３５】
膵島と、脂肪組織マクロファージと、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３６】
膵島と、ロイコトリエン、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ−１およびＶＥＧＦといった治癒因子と、を備えることを特徴とする３Ｄバイオプリントされた装置。
【請求項３７】
前記生体適合性ヒドロゲルはインクであることを特徴とする請求項１に記載の３Ｄバイオプリントされた装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１型糖尿病患者の治療のために自己由来間質血管細胞群と一緒に膵島を肝外で輸送するための頑丈で多孔質な三次元装置の作製および利用、ならびに生体適合性ヒドロゲルインクを用いる３Ｄバイオプリンティングを用いた個別患者用装置の製造工程に関する。リポジェムス（登録商標）工程を用いれば、脂肪細胞とともに自己幹細胞も得られる。
【０００２】
ここに開示される新しい方法は、３Ｄバイオプリントされた多孔質構造を用いて膵島の生存能を向上させるものである。脂肪吸引によって間質血管細胞群として分離された自己細胞の存在によって、膵島の生存能が強化され、炎症性免疫応答が減少し、インシュリンの生産性が増加し、３Ｄバイオプリントされた足場装置の孔で発達した脈管構造を介した前記インシュリンの輸送が増加する。
【背景技術】
【０００３】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、慢性疾患である。例えばスウェーデンだけでも、糖尿病と診断された２０〜７９歳の患者は約４５０，０００人おり、未診断の糖尿病患者はもっといる。毎年、７８，０００人の子供が、世界中で新たにＴ１Ｄと診断されている。Ｔ１Ｄは治療せずに放っておくと、患者の死につながる。膵臓が、作るとしてもごく僅かにしかインシュリンを作らない場合に、Ｔ１Ｄと診断される。この診断は、過去２〜３か月の患者の平均血糖値の指標となる糖化ヘモグロビン（ＡＩＣ）テストを行うことによってなされる。インシュリンは、体細胞の血糖値を調整するホルモンのことである。インシュリンの存在がなくては、ブドウ糖は体細胞に入ることができず、その結果、体細胞はエネルギーが不足し、最終的には体細胞が死んでしまう。インシュリンの製造を担う細胞はベータ細胞であるが、糖尿病患者の場合には、体の免疫反応システムによってそれが破壊されてしまう。
【０００４】
Ｔ１Ｄの今日最も一般的な治療は、インシュリンを注射針またはポンプで注入するものであり、一般的には毎食事の前に行う必要がある（３〜６回／日）。追加の注入（例えば、１〜２回／日）が必要な場合もある。しかしながら、この種の治療は、ブドウ糖価の変動につながるため最適とは程遠く、しばしば、心臓血管疾患や、神経、腎臓、目、足の障害の危険が増加するといった合併症につながる。これは、高血糖とも呼ばれるインシュリン不足で引き起こされる糖尿病ケトアシドーシスによるものである。血液中の低ｐＨ値のせいで、毒性産物が形成され集まるが、これは適切に治療されないと最終的には命にかかわることとなる。糖尿病患者が直面するまた別の重症合併症には、糖尿病性昏睡があるが、これは、持続性低血糖と呼ばれる脳のブドウ糖不足によるものである。これは、脳障害につながり、場合によっては死に至る。さらに、注射針による注入には、患者の薬剤服用順守に関する問題も出てくる。
【０００５】
別の形式の治療法である膵島移植は本分野において比較的新しいが、あるＴ１Ｄ患者の選抜グループにおいて実施された。Ｍａｌｌｅｔｔ，Ａ．Ｇ．およびＫｏｒｂｕｔｔ，Ｇ．Ｓ．（２００９）による、膵島をヒドロゲルの中にカプセル化することによる別の方法も近年評価されている。ヒドロゲルは、細胞のカプセル化および様々な再生医療への応用に用いられている。ヒドロゲルのカプセル化は、カプセル化された細胞の免疫防御にもまた用いられている。
【０００６】
ベータ細胞生産をもたらす膵島移植および幹細胞治療がＴ１Ｄの将来的な治療への望みを証明することを示す研究もある。しかしながら、大きな課題は、患者の免疫システムが、特に治療の初期段階においてそのような治療にどのように反応するのかを、予測し観察する必要があるということである。
【０００７】
Ｄｅ  Ｖｏｓ等（２００６）およびＪａｃｏｂｓ−Ｔｕｌｌｅｎｅｅｒｓ−Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ等（２０１３）が新しい治療法を研究している。この研究者たちは、豚およびヒトの膵島をアルギン酸ナトリウム溶液と混ぜて、この混合物を液滴として塩化カルシウム溶液中に落として球体を作るとともに架橋結合を生じさせて、膵島をアルギン酸の球体にカプセル化した。膵島を囲む網目構造は、栄養および酸素が拡散されるのに十分透過可能である一方、Ｔ細胞の通過を妨げるため、膵島を宿主の免疫システムから防御する。残念ながら、この細胞分配システムは、球体が体内において容認できない免疫反応を開始したため、生体不適合であると分かった。また、球体のサイズが大き過ぎたり、十分な膵島を含有していないといった問題もあった。
【０００８】
本発明によると、患者へのインシュリン生成細胞の移植に関する課題に対する解決法として、生体適合性材料の中に細胞や膵島を収容することを教示する。より具体的には、目新しい方法として、Ｔ１Ｄ治療用の移植可能細胞分配システムとして働く構造を作るために、３Ｄバイオプリンティングと共に生体適合性生体材料を用いることである。
【０００９】
３Ｄバイオプリンティングは、医学に大変革をもたらすだろうと期待される新たな技術である。３Ｄバイオプリンティングは、生物学版の三次元印刷であると説明でき、また積層造形技術にも分類される。三次元印刷は、ＣＡＤファイルから、積層方式で三次元の物体を製造する。一方、３Ｄバイオプリンティングでは、液体生体材料（バイオインク）と生きた細胞を用いる。３Ｄバイオプリンティングは、積層方式で生物由来物質を構築することで、どんな組織や臓器も再現することが潜在的には可能である。３Ｄバイオプリンティングでは一般的に、高解像度で細胞を積層することができ、シグナリング分子を加えることができるバイオプリンターが必要とされる。しかし、大部分では、細胞だけでは積層することできない。細胞には、バイオインクと呼ばれる支持材料が必要である。バイオインクの作用により、所定パターンでの生存細胞の積層が容易になり、そして細胞が体外または体内で培養される際の足場になる。印刷適性は、レオロジー特性に関する生体材料がバイオインクとして成功裏に用いられるかどうかが、生体材料の臨界パラメータとなる。
【００１０】
高分子溶液は、剪断減粘性である、つまり剪断速度が上がると粘度が下がる。多孔質構造を作る必要がある場合に一般的に必要とされる高い印刷忠実性を提供する目的では、高分子溶液は十分な剪断減粘性を有していない場合もある。高分子溶液とは対照的に、ナノファイバー分散液は剪断減粘性バイオインクとしてより良く機能することができるが、これはその微小繊維が流れに沿った方向に向けられることができ、そのため高い剪断速度で低粘度を示すためである。剪断力が取り除かると、ナノフィブリル分散液は、高い印刷忠実性が得られる高粘度まで戻ることができる。
【００１１】
バクテリアによって作られる、または植物の一次もしくは二次細胞壁から分離され作られるセルロースナノフィブリル（ＣＮＦ）は、通常直径約８〜１０ｎｍであって、１マイクロメータ以上の長さに及んでいてもよい。セルロースナノフィブリルは親水性であるため、その表面には水が結合する。セルロースナノフィブリルは、既に非常に低い固形成分含有量（０．５〜４重量％）でヒドロゲルを形成している。水で覆われたＣＮＦの表面の親水性によって、ＣＮＦの表面はタンパク質を吸着することが妨げられ、生体不活性となっており、このことは、生体親和性に関連するものである（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ等（２００８））。ナノセルロース生体材料は、人体において生分解性ではなく、これは、長もちし長く機能できる生物医学装置用の永久的に輸送を行う細胞ビヒクルとして用いられるのに前提条件となる特性である。
【００１２】
アルギン酸塩は、膵島をカプセル化するために一般的に用いられる生体高分子である。アルギン酸塩は、移植後の免疫反応攻撃から、移植された同種異系の膵島を免疫保護するために用いられている。しかしながら、この膵島のカプセル化工程と輸送工程は、まだ適切に設計されてはいない。膵島は通常、アルギン酸塩ビーズの中に埋め込まれるか、大量のアルギン酸塩ヒドロゲルに混入され、皮下または腹膜腔に注射される（Ｒｙａｎ  Ｅ．Ａ．等（２００１））。ヒトの膵島の移植は、ある男性患者の体内に、酸素注入された免疫防御性のアルギン酸塩系マクロチャンバーを作ることで行われた（Ｌｕｄｗｉｇ等（２０１３））。  
【００１３】
本特許出願が取り組むのは、この膵島移植に関する依然解決されていない問題である。一つ目の問題は、移植された膵島の大部分が、免疫システムの攻撃により失われることである。二つ目の問題は、膵島の生存に悪影響を与える、酸素供給不足と栄養物の輸送が不足するということである。全般的に、移植された膵島を効率的に首尾よく生体適合できるよう用いることを可能にする革新的な解決が早急に必要とされている。事実上の二つの大きな挑戦は、つまり、免疫反応および血管新生の欠如である。  
【００１４】
間質血管細胞群（ＳＶＦ）は、一般的には外科手技を介して、脂肪吸引を受ける患者から自律型機器を用いて分離することができる。ＳＶＦは、前脂肪細胞、間充織幹細胞（ＭＳＣ）、血管内皮前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、脂肪組織マクロファージ、ならびに、ロイコトリエン、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ−１およびＶＥＧＦといった治癒因子等を豊富に含む。例えば、ＭＳＣは、積極的な免疫調節効果と、血管新生促進効果と、抗アポトーシス効果とを発揮することが証明されており、動物モデルにおいて膵島と同時移植した場合、これらの効果によって糖尿病の結果が改善された。（Ｉｔｏ等（２０１０））。または、ＳＶＦ分離工程を適用したり、または酵素を全く用いずに幹細胞と一緒に脂肪細胞を分離することもできる（いわゆるリポジェムス（登録商標）工程）。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、３Ｄバイオプリンティング技術および生体適合性ヒドロゲルインクを用いた、間質血管細胞群と一緒に膵島を肝外で輸送するための、肝外移植に適した頑丈で多孔質な埋め込み型装置の作製および利用である。ここで教示される装置は、移植されると、効率的かつ安全にインシュリンを生成し、それによってＴ１Ｄ患者を治療するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の実施形態のいくつかの態様は、添付図面の図において図示されるが、これは本発明を限定するものではない。本図面は書面による明細書とともに、本発明の原理を説明するものである。
【００１７】
【図１】図１は、埋め込み型装置の設計および３Ｄバイオプリント例を概略的に示す図である。
【００１８】
【図２】図２は、アルギン酸塩ヒドロゲルおよび添加バクテリアセルロースから成り膵島と混合された、ＳＶＦを含むバイオインクを示す図である。この混合物は、十分な印刷忠実性を有しており、十分な細胞生存能力を示した。これは、構造体中の細胞に栄養および酸素を運ぶのに重要である。
【００１９】
【図３】図３は、プリントされた要素間の多孔質空間内において、血管新生がどのように発達するのかを示す概略図である。赤い細胞群は膵島を示し、緑色の細胞群はＳＶＦ細胞群を示す。
【００２０】
【図４】図４は、７日間培養後の、プリントされた構造体における膵島の形態を示す。
【００２１】
【図５】図５は、実験において用いられる同軸ニードルの概略写真であって、ヒドロゲルバイオインク中で膵島は中心に置かれ、ＳＶＦまたはＡＳＣ細胞によって囲まれている。これらの実験で用いられる３Ｄバイオプリンターは、同軸ニードルを備えている。
【００２２】
【図６】図６は、３Ｄバイオプリンティングによって作成された、ヒドロゲルバイオインク中でＳＶＦまたはＡＳＣ細胞によって囲まれたベータ膵島を含む埋め込み型装置の概略図を示す。前記装置は、細胞用のコンテナとして機能する、十分な機械的安定性を有する生体適合性かつ透水性の生体材料からなる上下部と、バイオプリント後に取り除かれる犠牲材となるバイオインクを用いて３Ｄバイオプリンティングによって作成された血管網とを備える。前記血管網は、膵島によって囲まれている。
【００２３】
【図７】図７は、ベータ膵島およびＡＳＣを含む、血管新生化された３Ｄバイオプリントされた埋め込み型装置を示す。前記装置は、同軸ニードルを用いて３Ｄバイオプリントされており、中心部はスウェーデンのＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ製の犠牲材となるバイオインクＣＥＬＬＩＮＫ  ＳＴＡＲＴであり、外殻は膵島およびＡＣＳであった。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明を、様々な特徴を有する特定の実施態様を参照して説明している。本発明の精神と範囲を逸脱することなく、様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。当業者であれば、所定の適用要件や設計要件および仕様に基づき、これらの特徴を単独でまたは組み合わせて用いてもよいことは認識するであろう。様々な特徴を備える実施態様はまた、そういった様々な特徴から成るか、基本的にはそういった様々な特徴から成ってもよい。本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された本発明の明細書および実施を考慮すれば、当業者にとって明らかであろう。ここで述べる本発明の説明は、本質的に単なる例示に過ぎず、したがって、本発明の本質から逸脱することのない変形例は、本発明の範囲の内に含まれることが意図されている。  
【００２５】
本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、理解すべきであるのは、本発明は、明細書において、以下の説明または図面に示される構成要素の構成および配置の詳細に限定されないということである。本発明は、別の実施態様が可能であり、または様々な方法で実践や実行することが可能である。また、ここで用いられている表現や専門用語は、説明を目的とするものであって、限定するものとみなすべきではないことを理解すべきである。
【００２６】
本発明では、Ｔ１Ｄ患者を治療するための埋め込み型装置を作製する方法について述べられる。ここで述べる前記埋め込み型装置は、３Ｄバイオプリンティング技術を用いて製造される。以下は、前記装置の作成工程の一実施態様における工程である。  
・  ドナーからの膵島、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の膵島または遺伝子組み換え細胞由来の膵島を、好ましくは製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）設備において移植用に作成し、生体高分子ヒドロゲルインクと混合するか、またはヒドロゲル中に粒子としてカプセル化する工程、
・  前記装置が移植される患者に、リポジェムス（登録商標）技術（マイクロフラグメント化された脂肪組織）を用いて、脂肪吸引または脂肪除去を施す工程（あるいは、適切なドナーを活用してもよい）、
・  細胞の間質血管細胞群もしくはその間質血管細胞群由来の成分、またはマイクロフラグメント化された脂肪組織を、患者がまだ手術室にいる間に、好ましくは脂肪吸引またはリポジェムス（登録商標）工程が行われたのと同じ手術室で、分離する工程、
・  好ましくは前記手術室において、間質血管細胞群もしくは間質血管細胞由来の成分、またはマイクロフラグメント化された脂肪組織を、好ましくは自動無菌装置において生体適合性生体高分子ヒドロゲルインクと混合し、前記手術室にて３Ｄバイオプリンターに移す工程、
・  装置の構造、サイズ、構成、機械的特性および他の関連する特徴を、好ましくはＣＡＤファイルを用いて設計し、移植に関するサイズ、場所、位置および他の関連要因を考慮して、作成する工程
・  好ましくは前記ＧＭＰ設備で作られた膵島を、生体適合性ヒドロゲルまたはカプセル化ヒドロゲルと混合する工程、
・  好ましくは患者が待っている間に前記手術室において、埋め込み型装置の３Ｄバイオプリンティングを、ここに記載のパラメータに従って実施する工程、
・  本装置の構造、設計および構成要素によって、頑丈で安定した構造、生体親和性および血管新生化能力が与えられる工程、および／または
・  患者に、肝外の場所（もしくは体内または体外のどこか）に移植される十分に機能的なインシュリン生成装置を提供する工程。
【００２７】
本発明をより良く容易に理解するために、下記にいくつかの実施態様例を述べる。下記の例を、本発明の範囲を限定したりするよう解釈してはならない。
【実施例１】
【００２８】
間質血管細胞群および膵島を用いた３Ｄバイオプリンティング  
【００２９】
この例の目的は、３Ｄバイオプリントされた構造体内に、完全に機能する膵島を収容する方法を評価することであって、その構造体の中に酸素および栄養が拡散され、その構造体からインシュリンが拡散される。一実施態様においては、３Ｄ構造体は免疫反応が生じないように設計される。酸素および栄養は、３Ｄバイオプリントされた装置内の孔で発達した自己脈管構造によって、簡単に移送される。脂肪ＳＶＦは、腹部の脂肪吸引で得られたヒトの脂肪組織由来のものである。ＳＶＦ間質血管は、米国Ｃｙｔｏｒｉ社のＣｅｌｕｔｉｏｎを用いて分離される。ＳＶＦ細胞群は、遠心分離によってペレット状にされ、浮遊性含脂肪細胞は捨てられる。その後、前記ペレットは、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液で洗浄される。膵島とＳＶＦ細胞群とを混合するにはいくつかの実行可能な方法がある。一実施態様においては、ＳＶＦ細胞群は、スウェーデンのＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ製のＣＥＬＬＭＩＸＥＲを用いて、アルギン酸塩系ヒドロゲルと一緒に混合され、その後、膵島が加えられる。前記細胞群は前記バイオインクと混合され、最終濃度が５百万細胞／ｍｌとなり、その後、プリンターカートリッジ内に移される。構造体は、スウェーデンのＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ製の前記３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥを用いて、一実施態様においては、６ｍｍ×６ｍｍ×１ｍｍといった寸法の三層の格子図形にプリントされる（圧力：２４ｋＰａ、供給速度：１０ｍｍ／ｓ）（図２参照）。印刷後、前記構造体は、塩化カルシウム１００ミリモル溶液を用いて、５分間架橋される。図１には、３Ｄバイオプリントされた構造体のデザインが示されている。前記格子は、１００から４００ミクロンの線からなる。前記プリントされた格子は、十分な機械的特性を有する頑丈な構造を示し、したがって効果的に移植できる。前記バイオインクにバクテリアナノセルロースを添加することで、生物分解性のない生体適合性外殻が得られる。ナノセルロース小繊維を加えることで、十分な印刷忠実性が得られる。前記細胞群は、印刷後十分な生存能力を示す（図２）。実験においては、そのような構造体をマウスに移植し、図３のように移植２週間後に血管新生を示した。膵島は、ブドウ糖をインシュリン変換することにより、生存能力（図４）と機能性があることを示した。
【実施例２】
【００３０】
中心部−外殻構造を有する脂肪由来の幹細胞および膵島の３Ｄバイオプリンティング
【００３１】
この例では、ＳＶＦ細胞群および膵島を用いた別の３Ｄバイオプリンティング工程を示す。一実施態様においては、一つのバイオインク内で全成分を混合する代わりに、図５（左）にて概略的に示される同軸ニードルを用いる。プリントされた要素の内側部分（中心部）は、ヒドロゲル中に粒子としてカプセル化されているか、ヒドロゲルバイオインクと混合されバイオプリントされて、配置された膵島からなる。また別の工程としては、媒体に浮遊する膵島を使用してもよい。要素の外側部分（外殻）は、ヒドロゲルバイオインクに混合されたＳＶＦまたはＡＳＣからなる。この実施態様においては、十分な印刷適性および機械的特性が得られるため、アルギン酸塩またはバクテリアセルロース添加アルギン酸塩が好ましい。プリントされた構造体は、ブドウ糖をインシュリンに変換することによって示されるような膵島の機能性と同様に、十分な械的特性および十分な細胞生存能力も示す。実験において、前記３Ｄバイオプリントされた構造体はマウスに移植され、血管新生および寸法安定性を示した。  
【実施例３】
【００３２】
血管新生化された埋め込み型装置の３Ｄバイオプリンティング
【００３３】
この実施例においては、３Ｄバイオプリンティング技術を用いた、インシュリンを生成する埋め込み型装置の設計およびバイオファブリケーションについて説明する。図６は、３Ｄバイオプリンティングによって作成された、ヒドロゲルバイオインク中でＳＶＦもしくはＡＳＣ細胞またはマイクロフラグメント化された脂肪組織に囲まれたベータ膵島を含む埋め込み型装置の設計の概略写真である。前記装置は、細胞用のコンテナとして機能する、機械的安定性を有する生体適合性かつ透水性の生体材料からなる上下部と、バイオプリント後に取り除かれるいわゆる犠牲材となるバイオインクを用いて３Ｄバイオプリンティングによって作成された血管網とを備える。図７は、３Ｄバイオプリントされた装置を示す。この実施態様においては、本装置の上下部として、バクテリアセルロースおよびアルギン酸塩バイオインクが用いられる。下部の支持構造をプリント後、図５で示したような同軸ニードルで、血管網がバイオプリントされる。この特定例においては、中心部（内側部分）は、スウェーデンのＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ製の犠牲材となるバイオインクのＣＥＬＬＩＮＫ  ＳＴＡＲＴまたはＣＥＬＬＩＮＫ  ＰＬＵＲＯＮＩＣＳでバイオプリントされ、外殻部は、脂肪組織由来のＡＳＣ細胞とともに膵島でバイオプリントされる。この実施態様は、一形態において、スウェーデンのＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ製の３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥを用いて実行される。プリント後、前記犠牲材となるバイオインクは、溶媒の注入によって取り除かれる。プリントされた構造体は、ブドウ糖のインシュリンへの変換に基づく膵島の機能性とともに、十分な機械的特性および十分な細胞生存能力も示す。前記３Ｄバイオプリントされた構造体は、血管新生および寸法安定性を示す。  
【００３４】
当業者であれば、開示された特徴は、所定の適用要件または設計要件および仕様に基づいて、単独でもしくは組み合わせで、または省略されて用いられてもよいということを認識するであろう。実施態様において特徴を「備える」と言う場合、その実施態様は、「一つまたは複数の特徴から成る」または「基本的に一つまたは複数の特徴から成る」のいずれかであること理解されたし。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書および実施を考慮すれば、当業者にとって明らかであろう。
【００３５】
なお特に、本明細書において値の範囲が記載されているところでは、その範囲の上限下限間の各値もまた、具体的に開示されている。これらの範囲の上限下限は、その範囲に単独で含まれても除外されてもどちらでもよい。文脈から明らかな別段の指示がない限り、単数形で書かれた物は複数の指示物を含む。本明細書および実施例は実際には例示に過ぎず、本発明の本質から逸脱することのない変形は本発明の範囲に含まれることが意図されている。さらに、本開示において引用された参照文献は全て、参照によりそのまま本明細書に個別に組み込まれ、それ自体が本分野における通常の知識のレベルを詳述する背景を提供するとともに、本発明の実施可能な記載を補うための効率的な工程を提供するよう意図されたものである。
【００３６】
ここに引用された全引用文献は、参照により組み込まれる。  
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Ｍａｌｌｅｔｔ，Ａ．Ｇ．およびＫｏｒｂｕｔｔ，Ｇ．Ｓ．２００９，Ａｌｇｉｎａｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｓｌｅｔｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，Ｐａｒｔ  Ａ  １５，１３０１〜９
【００３８】
【非特許文献２】ｄｅ  Ｖｏｓ，Ｐ；Ｆａａｓ，Ｍ．Ｍ．；Ｓｔｒａｎｄ，Ｂ．およびＣａｌａｆｉｏｒｅ，Ｒ．２００６，Ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７，５６０３〜１７
【００３９】
【非特許文献３】Ｊａｃｏｂｓ−Ｔｕｌｌｅｎｅｅｒｓ−Ｔｈｅｖｉｓｓｅｎ  Ｄ．等，２０１３，Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｇｉｎａｔｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ａ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔ，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．５６（７），１６０５〜１４
【００４０】
【非特許文献４】Ｈｅｌｅｎｉｕｓ，Ｇ．；Ｂａｃｋｄａｈｌ，Ｈ．；Ｂｏｄｉｎ、Ａ．等，２００６，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７６  （２），４３１〜８
【００４１】
【非特許文献５】Ｒｙａｎ  Ｅ．Ａ．等，２００１，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｅｄｏｍｏｎｔｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０（４），７１０〜９
【００４２】
【非特許文献６】Ｌｕｄｗｉｇ  Ｂ．等，２０１３，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｓｌｅｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０，１９０５４〜８
【００４３】
【非特許文献７】Ｉｔｏ，Ｔ．等，２０１０，Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｉｓｌｅｔ  ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇｒａｆｔ  ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８９，１４３８〜１４４５
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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