(57)【要約】  本記載は、コール酸（ＣｈＡｃ）又はその変異体を含むコンジュゲート化合物に関するものであり、細胞膜非透過性ペプチドにコンジュゲートされたＣｈＡｃは、目的の化合物にコンジュゲートされた核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。
2019512545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コール酸（ＣｈＡｃ）又はその変異体を含むコンジュゲート化合物であって、ＣｈＡｃは、目的の化合物にコンジュゲートされた核局在化配列（ＮＬＳ）を含む細胞膜非透過性ペプチドにコンジュゲートされている、前記コンジュゲート化合物。
【請求項２】
目的の化合物が、抗体、低分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンス、又はｓｉＲＮＡ分子である、請求項１のコンジュゲート化合物。
【請求項３】
抗体が、モノクローナル又はポリクローナル抗体である、請求項２のコンジュゲート化合物。
【請求項４】
抗体が、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、又はウサギ抗体である、請求項２又は３のコンジュゲート化合物。
【請求項５】
抗体がヒト化抗体である、請求項２〜４のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項６】
抗体が、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）２から成る群より選択されるエピトープ結合断片を含む、請求項２〜５のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項７】
核局在化配列が、ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来する、請求項１〜６のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項８】
細胞膜非透過性ペプチドが、少なくとも１つのスペーサー残基を含む、請求項１〜７のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項９】
細胞膜非透過性ペプチドが、ＣｈＡｃと目的の化合物へ結合するための少なくとも１つのシステインを含む、請求項１〜７のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項１０】
細胞膜非透過性ペプチドが配列番号１に規定される、請求項１〜８のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項１１】
目的の化合物が、７Ｇ３抗体又は６Ｇ７抗体である、請求項１〜８のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項１２】
目的の化合物へコンジュゲートされるＣｈＡｃＮＬＳペプチドの比が、化合物あたり１〜２１個のペプチドである、請求項１〜１１のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項１３】
コンジュゲート化合物に結合した放射性核種をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項１４】
放射性核種が、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、５８Ｃｏ、５２Ｆｅ、５６Ｎｉ、５７Ｎｉ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、９７Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１４ｍＩｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７２Ｔｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９１Ｐｔ、１９７Ｈｇ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１１Ｃ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒ、１８Ｆ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８９Ｓｒ、及び２２５Ａｃのうち少なくとも１つである、請求項１３のコンジュゲート化合物。
【請求項１５】
放射性核種が６４Ｃｕである、請求項１３のコンジュゲート化合物。
【請求項１６】
それに結合した低分子毒素をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項１７】
低分子毒素が化学療法剤である、請求項１６のコンジュゲート化合物。
【請求項１８】
低分子毒素が、微小管破壊剤又はＤＮＡアルキル化剤である、請求項１６又は１７のコンジュゲート化合物。
【請求項１９】
低分子毒素が、ビンブラスチン、エムタンシン、モノメチルアウリスタチンＥ、又は４，４−ジフルオロ−８−（４−カルボキシフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）である、請求項１６〜１８のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項２０】
前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を検出するための、請求項１〜１５のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項２１】
前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療するための、請求項１〜１２及び１６〜１９のいずれか１項のコンジュゲート化合物。
【請求項２２】
前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療するための、請求項１〜１２及び１６〜１９のいずれか１項のコンジュゲート化合物の使用。
【請求項２３】
前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療するための医薬の製造における、請求項１〜１２及び１６〜１９のいずれか１項のコンジュゲート化合物の使用。
【請求項２４】
前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を検出するための、請求項１〜１５のいずれか１項のコンジュゲート化合物の使用。
【請求項２５】
被験者の前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療する方法であって、請求項１〜１２及び１６〜１９のいずれか１項のコンジュゲート化合物を前記被験者へ投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
被験者の前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を検出する方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項のコンジュゲート化合物を前記被験者へ投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
被験者がヒト又はマウスである、請求項２５又は２６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]  本願は、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日出願の米国仮特許出願第６３／３０８，４５７号の利益を請求する。
【０００２】
技術分野
[0002]  本発明は、全細胞内蓄積を高めるコンジュゲート化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ヒトにおける療法又は造影応用のために分子を送達するための抗体コンジュゲート（ＡＣ）の設計は、ある種の悪性腫瘍において臨床効果を実証して、標準的な化学療法又は放射線療法に伴って生じる全身毒性を低下させるほどに十分進歩してきている。
【０００４】
[0004]  ＡＣでは、ヒトにおける療法又は造影応用のために薬物のペイロードを癌細胞に対して選択的に送達することの成功が実証されている。しかしながら、ＡＣ技術は、放射性同位体又は細胞傷害薬を装備した抗体の形態であっても、改善されてさらに広範に癌を管理するために、より効果的で広く適用可能な医薬品へ開発されることが依然として期待されている。
【０００５】
[0005]  抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）による細胞内薬物蓄積のための普遍的な礎石は、その細胞内在化経路に依存する。ひとたび標的抗原へ結合したならば、ＡＤＣは、内在化されてエンドソーム内に捕捉され、リソソームへ輸送される。リソソームは、数々の消化酵素を含有する、膜に囲まれた細胞内小器官であって、小胞膜融合を介してエンドソームによって輸送されるタンパク質を受容して、活性のある医薬異化産物の放出を生じる。これら異化産物の細胞内蓄積は、細胞傷害性の効力に正相関する。この従属性は、ＡＤＣを現在悩ませるものであって、その全能力が発揮されることを妨げている。癌細胞は、薬物流出ポンプの発現を増加させて標的受容体の発現を減少させることによってＡＤＣへ対応する。受容体リサイクリング経路と癌細胞によるその利用増加も、内在化ＡＤＣの細胞内蓄積を低下させることに関係があるとされてきた。本質的に、この技術分野は、非効率的な細胞内蓄積プロセスに長く依拠しており、この問題に直接取り組んでいる研究はない。したがって、これら細胞内経路における捕捉を回避することは、輸送される薬物の細胞蓄積を改善してＡＤＣ活性を最大にするのに重要な技術領域なのである。
【０００６】
[0006]  細胞透過性ペプチドによるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の機能化は、細胞がこの種のＡＣで処理されると、細胞内蓄積の顕著な増加をもたらしてきた。しかしながら、ＡＣ細胞蓄積におけるこの進歩は、ほとんどが、他のやり方では抗体が標的とするのに利用し得ない細胞内の特定の分子に、ｍＡｂが接近して標的とすることを可能にするためのものである。細胞透過性ペプチドが装備されたＡＣを細胞表面の癌特異的受容体に対する治療用薬剤として利用することを試みた数少ない報告では、いずれも、標的でない細胞又は組織における高い蓄積に悩まされ、標的指向性の送達への応用には限界がある。
【０００７】
[0007]  ＡＣをｐＨ感受性ポリマーで機能化することによる最近の進歩は、標的細胞選択性を維持する一方でエンドソームを逃れて細胞質に入るという印象的な能力を示した。しかしながら、これらＡＣによるエスケープの増加が、細胞内蓄積の増加につながるかどうかは、まだ判然としていない。
【０００８】
[0008]  別の最新の進歩は、コンパートメント局在化アミノ酸を有するペプチドを付けることによって、多重選択的標的化を達成するようにＡＣを強化することであった。特に、ＳＶ−４０ラージＴ抗原由来の核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列は、以前に合成ペプチドに導入されてタンパク質へコンジュゲートされ、核内へのタンパク質の輸送を指令する能力が実証された。最適化されたＮＬＳ配列は長さ２５個のアミノ酸であるが、ｍＡｂ  ７Ｇ３は、核内移行に十分なＮＬＳのセグメント（下線部）を有する１３マーのペプチド（ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ）へコンジュゲートされた。この短い配列の利点は、それが細胞に透過せず、ｍＡｂが細胞選択性の維持を可能にすることである。７Ｇ３−ＮＬＳを使用して、放射性同位体のカーゴ（cargo）インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）を核内に送達した。１１１Ｉｎによる分子傷害は、高エネルギー性のオージェ電子の放出によるものである。それらはｎｍ〜μｍの距離しか移動しないため、核内に送達されれば、より効果的である。残念ながら、細胞傷害性は、標準の１１１Ｉｎ−７Ｇ３に比べて圧倒的ではなく、その証拠から、エンドソーム−リソソーム及び／又はリサイクリング経路における捕捉によって引き起こされる非効果的な核局在化のためであることが示唆された。
【０００９】
[0009]  したがって、エンドソーム−リソソーム及び／又はリサイクリング経路における捕捉を回避するのに有効なＡＣを提供することへのニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【００１０】
[0010]  本記載にしたがって、コール酸（ＣｈＡｃ）又はその変異体を含むコンジュゲート化合物をここに提供するものであり、ＣｈＡｃは、目的の化合物にコンジュゲートされた核局在化配列（ＮＬＳ）を含む細胞膜非透過性ペプチドにコンジュゲートされている。
【００１１】
[0011]  ある態様では、目的の化合物は、抗体、低分子、オリゴヌクレオチド、アンチセンス、薬物、又はｓｉＲＮＡ分子である。
[0012]  別の態様では、抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である。
【００１２】
[0013]  さらなる態様では、抗体は、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、又はウサギ抗体である。
[0014]  ある態様では、抗体はヒト化抗体である。
【００１３】
[0015]  別の態様では、抗体は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）２から成る群より選択されるエピトープ結合断片を含む。
[0016]  さらなる態様では、核局在化配列は、ＳＶ４０ラージＴ抗原に由来する。[0017]  別の態様では、細胞膜非透過性ペプチドは、少なくとも１つのスペーサー残基を含む。
【００１４】
[0018]  追加の態様では、細胞膜非透過性ペプチドは、ＣｈＡｃ及び目的の化合物へ結合するための少なくとも１つのシステインを含む。
[0019]  さらなる態様では、細胞膜非透過性ペプチドは配列番号１に規定される。
【００１５】
[0020]  別の態様では、目的の化合物は、７Ｇ３抗体又は６Ｇ７抗体である。
[0021]  さらなる態様では、目的の化合物へコンジュゲートされるＣｈＡｃＮＬＳペプチドの比は、化合物あたり１〜２１個のペプチドである。
【００１６】
[0022]  別の態様では、本明細書に記載されるコンジュゲート化合物は、それに結合した放射性核種をさらに含む。
[0023]  ある態様では、放射性核種は、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、５８Ｃｏ、５２Ｆｅ、５６Ｎｉ、５７Ｎｉ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、９７Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１４ｍＩｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７２Ｔｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９１Ｐｔ、１９７Ｈｇ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１１Ｃ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒ、１８Ｆ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８９Ｓｒ、及び２２５Ａｃの少なくとも１つである。
【００１７】
[0024]  さらなる態様では、放射性核種は６４Ｃｕである。
[0025]  別の態様では、本明細書に記載されるコンジュゲート化合物は、それに結合した低分子毒素をさらに含む。
【００１８】
[0026]  ある態様では、低分子毒素は化学療法剤である。
[0027]  別の態様では、低分子毒素は、微小管破壊剤又はＤＮＡアルキル化剤である。
[0028]  さらなる態様では、低分子毒素は、ビンブラスチン、エムタンシン、モノメチルアウリスタチンＥ、又は４，４−ジフルオロ−８−（４−カルボキシフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）である。
【００１９】
[0029]  追加の態様では、本明細書に記載されるコンジュゲート化合物は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を検出するためのものである。
【００２０】
[0030]  ある態様では、本明細書に記載されるコンジュゲート化合物は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療するためのものである。
【００２１】
[0031]  本発明でさらに提供されるのは、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療するための、本明細書に記載されるようなコンジュゲート化合物の使用である。
【００２２】
[0032]  さらに提供されるのは、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載されるようなコンジュゲート化合物の使用である。
【００２３】
[0033]  本発明で追加的に提供されるのは、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を検出するための、本明細書に記載されるようなコンジュゲート化合物の使用である。
【００２４】
[0034]  また提供されるのは、被験者の前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、結直腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又はランゲルハンス細胞組織球症を治療及び／又は検出する方法であって、本明細書に記載されるようなコンジュゲート化合物を前記被験者へ投与することを含む。
【００２５】
[0035]  ある態様では、被験者はヒト又はマウスである。
[0036]  以下、添付の図面について言及する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】[0037]  図１Ａは、１つの態様によるＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３の概略図を例解し、ここで下線を施した残基は、核局在化配列ＮＬＳに対応し、スペーサー残基は、破線を施し、そしてＣｈＡｃと７Ｇ３への結合に使用されるシステイン（２重下線）についても示す。図１Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質バンドの移動変化を例証しており、抗体あたりのペプチド数を示す。
【図２】[0039]  図２は、７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３へ曝露された、（Ａ）ＴＦ−１ａ細胞及び（Ｂ）Ｒａｊｉ細胞における、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３の核内移行を例証しており、有意性は黒色の星印で示し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色された単離核、抗マウスＦｃ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（抗ｍＦｃ−ＡＦ６４７）で染色された単離核、及び重ね合わせた単離核の対応する共焦点顕微鏡画像も示し、抗体蓄積のある核は、白色の星印で画像に直接示す。
【図３】[0040]  図３は、被験化合物の核内蓄積を例証するものであり、７Ｇ３及びｍＩｇＧ２ａ免疫コンジュゲートへ曝露された、（Ａ）ＴＦ−１ａ細胞及び（Ｂ）Ｒａｊｉ細胞由来の核において平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定しており、（Ｃ）ウェスタンブロットでは、７Ｇ３（レーン１）、ＮＬＳ２１−７Ｇ３（レーン２）、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３（レーン３）とともにインキュベートしたＴＦ−１ａ細胞由来の単離核溶解液を、抗マウスＦｃ抗体（上）又は抗ラミニン抗体（下）でプローブしており、あるいは（Ｄ）核マーカーＬａｍｐ１で染色し、免疫コンジュゲートでチャレンジされた全ＴＦ−１ａ細胞由来の溶解液についてもＬａｍｐ−１をプローブしている。
【図４】[0041]  図４は、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３の細胞内及び全細胞の蓄積を例証するものであり、（Ａ）は、抗体コンジュゲートに曝露し、ＰＩ、抗ｍＦｃ−ＡＦ６４７で染色し、重ね合わせた、トリプシン処理ＴＦ−１ａ細胞の共焦点顕微鏡画像を示し、陽性の細胞内蓄積は、白色の星印で画像に直接示す；（Ｂ）は、７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３とともにインキュベートしたＴＦ−１ａ細胞の、ＡＦ６４７のみで染色した細胞に対する細胞内ＭＦＩ増加（％）を示す；（Ｃ）は、７Ｇ３（レーン１）、ＮＬＳ２１−７Ｇ３（レーン２）、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３（レーン３）とともにインキュベートした、トリプシン処理全ＴＦ−１ａ細胞のウェスタンブロットを示し、下図は、アクチン染色である；そして（Ｄ）は、７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３に曝露されたＴＦ−１ａ細胞の全細胞ＭＦＩレベルを示し、有意性を星印で示す。
【図５】[0042]  図５は、ＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３内在化を例証しており、（Ａ）は、ＴＦ−１ａ細胞を７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３とともにインキュベートした後の短い時点で表面に結合した７Ｇ３の（％）を示し、（Ｂ）は、インキュベーションに先立ってフィリピンへ曝露した場合のその（％）を示す。
【図６】[0043]  図６は、ＩＬ−３Ｒαの内在化及びリサイクリングに対する効果を例証しており、ＴＦ−１ａ細胞でのＩＬ−３Ｒαの細胞表面発現について、７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３とのインキュベーションの後で、早期（左パネル）と後期（右パネル）の時点で、ＰＥ−Ｃｙ７−抗ＩＬ−３Ｒα抗体（クローン６Ｈ６）を用いて評価し、相対的な７Ｇ３存在量は、新鮮培地においてのみインキュベートした細胞に対して正規化した蛍光の幾何平均強度として計算した。
【図７】[0044]  図７は、６４Ｃｕ−ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３がＴＦ−１ａ細胞において放射活性を蓄積することを例証しており、６４Ｃｕ−７Ｇ３によって送達される放射活性の量に対して正規化した、６４Ｃｕ−ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３及び６４Ｃｕ−ＮＬＳ３−７Ｇ３によって核（左）及び全細胞（右）へ送達される放射活性の相対増加を示す。
【図８】[0045]  図８は、６Ｇ７あたりのＣｈＡｃＮＬＳの増加量で、ＣｈＡｃＮＬＳで機能化されたｍＡｂ  ６Ｇ７の核内及び細胞蓄積を、非修飾６Ｇ７と比較して例証しており、（Ａ）は、ＣｈＡｃＮＬＳ３−６Ｇ７の核内蓄積が見られ、（Ｂ）は、フローサイトメトリーによって測定される、非コンジュゲート抗体と比較した、全細胞蓄積が見られる。
【図９】[0046]  図９は、コンジュゲート７Ｇ３抗体及び非コンジュゲート７Ｇ３抗体の細胞局在化パターンを例証する。
【図１０】[0047]  図１０は、コンジュゲート７Ｇ３抗体及び非コンジュゲート７Ｇ３抗体のＩＬ−３Ｒαへの結合を例証する。
【図１１】[0048]  図１１は、ＣＤ１２３陰性白血病細胞及びＣＤ１２３陽性白血病細胞における、非コンジュゲート７Ｇ３抗体の免疫蛍光追跡を例証する。
【図１２】[0049]  図１２は、ｖｉｎＡＣ設計のための構造利用解析を例証しており、（Ａ）は、ビンブラスチン作用の分子機序を示す；（Ｂ）は、ビンブラスチン−Ｃ１０−ＳＭＣＣウェッジのあるα及びβ−チューブリンモノマーのタンパク質２次構造の側面図を示す；（Ｃ）は、１５ｎｍ結合ポケットに挿入されたビンブラスチンを示す；そして（Ｄ）は、α及びβ−チューブリン遮断性ビンブラスチンドッキング由来の残基が除去されることを示す。
【図１３】[0050]  図１３は、ＸＴＴ細胞増殖アッセイによって定量されるＭＩＢＣ細胞の生存率（％）、ビンブラスチン及びＣｈＡｃＮＬＳとの反応より産生されるＶｉｎＡＣで処理された細胞の生存率（％）を例証する。
【図１４】[0051]  図１４は、ＭＣＣ架橋剤を介してＣｈＡｃＮＬＳとコンジュゲートしたＴ−ＤＭ１が、ＡＤＣ濃度の増加に伴い、そしてＴ−ＤＭ１あたりのＣｈＡｃＮＬＳ数の増加に伴って、用量依存的な殺傷を示したことを例証する。この実証には、非常に高レベルのＨｅｒ２を発現するＳＫＢＲ細胞を使用した。
【図１５】[0052]  図１５は、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１のＩＣ５０が、Ｔ−ＤＭ１に対して、ＳＫＢＲ３細胞、ＯＥ１９細胞、及びＪＩＭＴ１細胞においてそれぞれ１００倍、５０倍、及び１０倍増加したことを例証する。
【図１６】[0053]  図１６は、Ｈｅｒ２陰性乳癌細胞株のＭＣＦ７において、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１が、標的を発現しない細胞に対しては望まれない細胞傷害性を示さないことを例証する。
【図１７】[0054]  図１７は、８％非還元ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、増加するＭＣＣ対Ｔ−ＤＭ１比に続くＣｈＡｃＮＬＳとの２モルの反応が、Ｔ−ＤＭ１あたりのＣｈＡｃＮＬＳ部分の数の増加をもたらすことを例証しており、レーン１にＴ−ＤＭ１；レーン２にＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１（１０×ＭＣＣ）；レーン３にＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１（２５×ＭＣＣ）；レーン４にＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１（５０×ＭＣＣ）；及びレーン５にＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１（１００×ＭＣＣ）を示す。
【図１８】[0055]  図１８は、ＳＭ（ＰＥＧ）２コンジュゲーションによりＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１の望まれない凝集が消失されることを示すヒストグラムであり、構築体を、ＵＶ／可視光学密度（５５０ｎｍ／２８０ｎｍ）によって凝集について評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
[0056]  エンドソームエスケープと細胞内取込みの亢進を連結させるための、急速に内在化する受容体に対して特異的な化合物コンジュゲートの新規設計が提供される。より具体的には、目的の化合物にコンジュゲートされた核局在化配列（ＮＬＳ）を含む細胞膜非透過性ペプチドにコンジュゲートされたコール酸を含む、コンジュゲート化合物が提供される。
【００２８】
[0057]  本発明において実証されるように、例えば、エンドソーム−リソソーム系内での捕捉から逃れて核内へ移行し、例えば、標的とされるＩＬ−３Ｒα＋ＴＦ−１ａ白血病細胞内への該化合物の蓄積を増加させる、コンジュゲート化合物が提供される。
【００２９】
[0058]  コンジュゲートされる化合物の例としては、限定されるものではないが、抗体、オリゴヌクレオチド、アンチセンス、薬物、又はｓｉＲＮＡ分子が挙げられ、それへの細胞内標的を有し、哺乳動物の生体膜を透過し得ない、低分子又は生体分子も排除されない。
【００３０】
[0059]  ある態様では、抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体である。
[0060]  別の態様では、抗体は、マウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体、又はウサギ抗体、又はヒト化抗体である。
【００３１】
[0061]  また、例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、及び／又はＦ（ａｂ’）２のようなエピトープ結合断片を含み得る抗体が包含される。
[0062]  細胞膜非透過性であって、ＳＶ−４０ラージＴ抗原由来の典型的なＮＬＳ（下線部）のセグメントを有する１３マーのペプチド（ＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ；配列番号１）は、以前、抗ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα）抗体（７Ｇ３）とそのキメラバージョン（ＣＳＬ３６０）にコンジュゲートされたことがある（Leyton et al., 2011, J Nucl Med, 52: 1465-1473）。コンジュゲートされた１１１Ｉｎを輸送するＮＬＳ−７Ｇ３及びＮＬＳ−ＣＳＬ３６０を使用して、核移行能が評価された。ＮＬＳ配列が存在しても、核へ送達される放射活性の比率はきわめて低く、その一方で、大多数の放射活性は細胞表面又は細胞質に留まった（Zerashkian et al., 2014, Nucl Med Biol, 41: 377-383）。したがって、１１１Ｉｎ−ＮＬＳＣＳＬ３６０は、エンドソーム内に捕捉されたままであった。
【００３２】
[0063]  本開示を限定するものではないが、本発明において使用される抗体の１つである７Ｇ３抗体は、ＩＬ−３Ｒのα鎖へ結合して、その機能を完全に無効にする。７Ｇ３抗体は、骨髄性白血病、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫のようなリンパ腫を治療すること、又はアレルギーの軽減のために使用し得ると記載されている（ＷＯ１９９７／０２４３７３）。
【００３３】
[0064]  本発明において提供されるのは、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来の核局在化配列（ＮＬＳ）のセグメントを含有するペプチドＣＧＹＧＰＫＫＫＲＫＶＧＧ（配列番号１）に結合した、コール酸（ＣｈＡｃ）の付加物（ＣｈＡｃＮＬＳ）である。ある態様では、抗ＩＬ−３Ｒαモノクローナル抗体（ｍＡｂ）７Ｇ３は、ＣｈＡｃＮＬＳへのコンジュゲーションによって機能化された。液性腫瘍及び固形腫瘍のモデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施して、抗体のような様々な分子カーゴへ結合させるＣｈＡｃＮＬＳ技術が、ＣｈＡｃ成分を欠く類似の修飾Ａｂと比べて、細胞及び腫瘍での保持を高めることが可能であることを実証した。
【００３４】
[0065]  したがって、限定されるものではないが、例えば白血病系における７Ｇ３のような抗体、又は本明細書に記載されるようにコンジュゲートされる低分子が提供される。
[0066]  また、本発明に含まれるのは、限定されるものではないが、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、５８Ｃｏ、５２Ｆｅ、５６Ｎｉ、５７Ｎｉ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、９７Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１４ｍＩｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７２Ｔｍ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９１Ｐｔ、１９７Ｈｇ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１１Ｃ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８２Ｂｒ、１８Ｆ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８９Ｓｒ、及び２２５Ａｃより選択される放射性核種へコンジュゲートされる、本明細書に記載される化合物である。加えて、例えばビンブラスチンのような化学療法剤へコンジュゲートされる、本明細書に記載される化合物も包含される。
【００３５】
[0067]  したがって、ある態様では、７Ｇ３へコンジュゲートされる、新規のコール酸（ＣｈＡｃ）−ＮＬＳ融合ペプチド（ＣｈＡｃＮＬＳ）（図１Ａ）が提供されるものであり、これは、エンドソーム捕捉を逃れて核へ移行し、それをリザーバとして利用して細胞内蓄積を高めるように、この複合体を機能化する。胆汁酸は、食物脂質への界面活性特性を有しており、これら脂質の腸吸収を促進することが長い間知られているが、それらが細胞膜の標的指向された破壊に適用されたことは一度もなかった。本発明では、ＣｈＡｃＮＬＳが、ｍＡｂ（例えば、限定されるものではないが、７Ｇ３及び６Ｇ７など）に受容体介在性の内在化を操作する能力を付与し、エンドソーム捕捉と分解を細胞特異的な様式で効果的に逃れることができることが実証される。重要なのは、核内での蓄積は、全細胞内蓄積を高めるためのリザーバへ変換されることである。最後に、ＣｈＡｃＮＬＳがｍＡｂへコンジュゲートされ、この複合体が６４Ｃｕで放射性標識されてｉｎ  ｖｉｖｏで注射される場合、例えば腫瘍へ送達される放射活性の量は、エンドソーム捕捉を逃れることができないバージョンより優れている。図９〜図１１においてさらに見られるように、ＣｈＡｃＮＬＳの能力は、明瞭に確立された抗体の細胞内蓄積を高めるように変化させることだけでなく、ＣｈＡｃＮＬＳは、抗体の親和性及び選択性に影響を及ぼさない。
【００３６】
[0068]  一般に、ＣｈＡｃＮＬＳのｍＡｂへの結合は制御することができる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのタンパク質バンドの移動変化を使用して、抗体あたりのペプチド数を定量した。７Ｇ３の重鎖は、予測される５０ｋＤａ±２ｋＤａに移動した。５０倍モル過剰のスルホ−ＳＭＣＣと反応した７Ｇ３は、７Ｇ３（ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３）の重鎖（図１Ｂ）及び軽鎖あたり、それぞれ８．５±１．８個及び２．６±０．６個のＣｈＡｃＮＬＳペプチドをもたらした。２５：１のスルホ−ＳＭＣＣ：７Ｇ３比では、ＣｈＡｃＮＬＳペプチドは７Ｇ３（ＣｈＡｃＮＬＳ１２−７Ｇ３）に、重鎖及び軽鎖あたり、それぞれ４．３±１．０個及び１．９±０．６個のペプチドが組み込まれた。スルホ−ＳＭＣＣ：７Ｇ３比が１０：１では、７Ｇ３（ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３）あたり３．５±１．５個のＣｈＡｃＮＬＳのコンジュゲーションをもたらした。７Ｇ３あたりの参照ＮＬＳペプチドの数が同等であったため、参照ＮＬＳ−７Ｇ３コンジュゲートも産生した。
【００３７】
[0069]  ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３は、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３と比較して、より高い比率のＴＦ−１ａ核内に局在化することができた。ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３へ曝露されたＴＦ−１ａ細胞の陽性核の平均比率は、ＮＬＳ２１−７Ｇ３及び７Ｇ３と比較して、それぞれ３．６倍及び１２．７倍増加した（ｐ≦０．０００１；図２Ａ）。ＡＦ６４７陽性核の比率は、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、及び７Ｇ３について、１００個の核あたり、それぞれ６０．３±６．７、１７．０±１．７、及び５．０±３．０個であった。逆に、ＩＬ−３Ｒα陰性Ｒａｊｉ細胞をＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理すると、ＮＬＳ２１−７Ｇ３及び７Ｇ３と比べて、陽性核数の増加は＜２〜３％であった。これらの結果は、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３が、核内移行をＴＦ−１ａ細胞において特異的に改善することを示す（図２Ｂ）。
【００３８】
[0070]  抗体あたり３、１２、又は２１個のＣｈＡｃＮＬＳペプチドを有するＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３コンジュゲートはいずれも、その同等のＮＬＳ−７Ｇ３対照物と比べて、その核内蓄積を少なくとも３倍高めることができた（図３Ａ；ｐ≦０．０５）。ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３の核内蓄積も、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−ｍＩｇＧ２ａと比較して、３倍より高かった（ｐ≦０．０００１）。ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３は、非修飾７Ｇ３と比べて、ＴＦ−１ａ細胞の核内に２５倍以上高く蓄積した。ＩＬ−３Ｒα陰性Ｒａｊｉ細胞における試験では、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３及び７Ｇ３と比較して、核内蓄積の明らかな増加をもたらさなかった（図３Ｂ）。ＮＬＳ２１−７Ｇ３及びＣｈＡｃＮＬＳ２１−ｍＩｇＧ２ａは、非修飾の７Ｇ３及びｍＩｇＧ２ａと比べて、ＴＦ−１ａ細胞の核内に約５．０倍高く蓄積する。単離核についてのウェスタンブロットも、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３と比べて、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理されたＴＦ−１ａ細胞における７Ｇ３タンパク質の増加量が５倍以上であることを明らかにした（ｐ≦０．０５；図３Ｃ）。これらの細胞由来の核は、Ｌａｍｐ１陰性であって、核内でのＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３蓄積の増加が、形質膜上あるいは後期エンドソーム又はリソソーム内にある７Ｇ３の混在によるものではないことを示した（図３Ｄ）。
【００３９】
[0071]  ＴＦ−１ａ細胞をＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理すると、細胞内ＡＦ６４７陽性細胞の比率を、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３と比べて、それぞれ３．１倍及び１．７倍増加させた（図４Ａ；ｐ≦０．０００１）。アイソタイプ対照のＩｇＧ２ａ及びＮＬＳ２１−ＩｇＧ２ａと比較すると、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３は、その細胞内蓄積をそれぞれ８．６倍及び１．６倍改善した（ｐ≦０．００１）。さらに、細胞あたりの細胞内ＡＦ６４７蛍光強度は、他の抗体コンジュゲートより産生される低下した蛍光強度と比較すると、ＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理されたＴＦ−１ａ細胞において視覚的に優っていた（図４Ａ）。２次抗体ＡＦ６４７のみとインキュベートした細胞に対して、平均ＭＦＩの増加は、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３で、それぞれ２６％及び３８％であった。それに対して、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理された細胞では、細胞内ＭＦＩが６９％増加した（図４Ｂ）。
【００４０】
[0072]  ウェスタンブロットは、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理されたＴＦ−１ａ細胞において、７Ｇ３の量が、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３と比べて、それぞれ４．１倍及び３．１倍増加したことを明らかにした（ｐ≦０．０５；図４Ｃ）。細胞全体の取込みについては、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３とともにインキュベートした細胞からの全ＭＦＩレベル（核−細胞質−細胞表面）も、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３と比べて優れていた（図４Ｄ；ｐ≦０．０５）。非修飾７Ｇ３へ曝露されたＴＦ−１ａ細胞のＭＦＩレベルは、２次抗体ＡＦ６４７のみで染色した無処理細胞と比べて、５２％増加した。しかしながら、ＮＬＳ２１−７Ｇ３は、７Ｇ３に対して何ら改善をもたらさなかった。逆に、ＴＦ−１ａ細胞のＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３処理は、無処理ＴＦ−１ａ細胞と比べて７７％増加し、エンドソームエスケープと核内蓄積との送達リンクを生じさせるためのコール酸の中心的な役割をさらに裏付け、全細胞取込みの増強をもたらす。加えて、固定化及び透過処理されたＴＦ−１ａ細胞をＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理すると、細胞表面のＩＬ−３Ｒαへの結合のみをもたらした（図４Ｄ、右パネル）。また、その輸送とは無関係に、荷電ペプチドが固定細胞の核に蓄積する傾向を考慮すれば、上記の結果は、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３が、きわめてＩＬ−３Ｒα特異的な細胞蓄積を保有することを支持する。
【００４１】
[0073]  ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理されたＴＦ−１ａ細胞における内在化の動態は、７Ｇ３コンジュゲート及びＮＬＳ２１−７Ｇ３コンジュゲートとは異なり、ＣｈＡｃＮＬＳがその細胞蓄積をどのように高めるかについて機構的な洞察を提供する。予測されたように、ＴＦ−１ａ細胞の表面の７Ｇ３（％）は、５分で１２５．２％±９．１％から６０分で４２．３％±６．５％へ急速に減少した（図５Ａ）。ＮＬＳ２１−７Ｇ３及びＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３についても、免疫コンジュゲート代謝の類似したパターンが観測された。７Ｇ３コンジュゲートへ長時間曝露されたＴＦ−１ａ細胞でも、ＴＦ−１ａ細胞の表面での７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、及びＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３の着実な低下をもたらした。しかしながら、ＴＦ−１ａ細胞をフィリピンとともにプレインキュベートすると、抗体コンジュゲートの表面レベル（％）において、はっきりした違いが観測された（図５Ｂ）。ＴＦ−１ａ細胞表面の７Ｇ３（％）は、５分から１０分までに、９７．２％±１．９％から６８．４％±１２．１％へ減少した。ＮＬＳ２１−７Ｇ３（％）も、時間時存的な様式で減少した。しかしながら、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３の量は、全時点を通して比較的安定したままであって、５分で最大値の１１６．９％±８．２％に、６０分で最小値の７．６％±２．８％に達した。
【００４２】
[0074]  ＣｈＡｃ介在性のエンドソームエスケープは、ＩＬ−３Ｒαリサイクリングパターンにも変化を引き起こした。７Ｇ３、ＮＬＳ２１−７Ｇ３、又はＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３とインキュベーション後のＴＦ−１ａ細胞表面には、ＩＬ−３Ｒαの３つの異なるレベルがある（図６）。７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３による結合は、最初の５分で、ＩＬ−３Ｒα（％）をそれぞれ６７．３％±１５．２％及び８５．４％±１３．４％まで減少させた。ＩＬ−３Ｒαレベルは、１０分〜６０分で、それぞれ約７５％及び約９０％で安定した。対照的に、ＴＦ−１ａ細胞とＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３とのインキュベーションは、６０分に至っても、約１００％のＩＬ−３Ｒαが細胞表面に存在した。インキュベーション後１〜４時間というより長い時点でも、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３で処理された細胞において、細胞表面のＩＬ−３Ｒα（％）は、より高いままであった（図６）。しかしながら、インキュベーション後１６時間までに、細胞表面ＩＬ−３Ｒαのレベルは、いずれの７Ｇ３コンジュゲートへ曝露されたＴＦ−１ａ細胞においても増加する。図５は、すべての７Ｇ３コンジュゲートは内在化され、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３内在化はコレステロール依存性の機序を介して生じることを示した。しかしながら、細胞表面のＩＬ−３Ｒαの存在は、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３による結合後も変化しないままであって（図６）、このことは、ＣｈＡｃＮＬＳが、細胞内輸送動態におけるスイッチを誘導することを意味する。このスイッチは、分解よりむしろリサイクリングを促進するように思われる。
【００４３】
[0075]  ６４Ｃｕ−ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３は、６４Ｃｕ−７Ｇ３や６４Ｃｕ−ＮＬＳ３−７Ｇ３よりも効果的にＴＦ−１ａ細胞の核へ放射活性を送達することができる。さらに、放射活性の全細胞取込み量は、核の放射活性蓄積に比例していた。６４Ｃｕ−ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３によってＴＦ−１ａ細胞の核へ送達される放射活性は、６４Ｃｕ−７Ｇ３及び６４Ｃｕ−ＮＬＳ３−７Ｇ３と比べて、それぞれ８．４倍及び３．２倍増加した（図７；ｐ≦０．００１）。６４Ｃｕ−ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３の全放射活性取込み量は、６４Ｃｕ−７Ｇ３及び６４Ｃｕ−ＮＬＳ３−７Ｇ３と比べて、それぞれ５．９倍及び４．３倍増加した（図７；ｐ≦０．００１）。したがって、核内にリザーバとして蓄積されてその全細胞取込みを増加させるＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３の能力と、それが結合カーゴ（即ち６４Ｃｕ）を送達して、全細胞放射活性取込みを高めるためのリザーバとなる核内への放射活性を高めることも可能であることが実証される。
【００４４】
[0076]  したがって、典型的な核局在化配列を有する、短い１３アミノ酸のペプチドへのコール酸の付加によって構築される、新規ペプチドＣｈＡｃＮＬＳが開示される。ＣｈＡｃＮＬＳは、容易に合成され、水溶性であり、抗体あたり少数でも多数でもコンジュゲートすることができ、望まれない凝集を引き起こさない。ＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３には、非修飾７Ｇ３及びＮＬＳ−７Ｇ３と比べて優る量で、ＴＦ−１ａ細胞の核内に移行して蓄積する能力がある。重要なことは、ＩＬ−３Ｒα陰性細胞のＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３による処理は、７Ｇ３バックグラウンドレベルと類似した核内移行及び蓄積のレベルを示したことである（図２Ｂと図３Ｂ）。３、１２、又は２１個のＣｈＡｃＮＬＳペプチドと結合したＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３コンジュゲートは、非修飾７Ｇ３又はＮＬＳ−同等７Ｇ３コンジュゲートと比較して、核内蓄積が有意に高い。さらに、ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３の薬物送達作用は６４Ｃｕの送達で実証され、これにより核は放射活性リザーバへ変換されて、６４Ｃｕの全細胞蓄積を高めた。したがって、ＣｈＡｃＮＬＳは、例えば７Ｇ３を、エンドソーム捕捉から逃れて、例えばＴＦ−１ａ細胞の核内へ特異的に移行して結合カーゴを蓄積するように機能化するのに強力である。
【００４５】
[0077]  ＣｈＡｃＮＬＳの７Ｇ３への付加は、非修飾７Ｇ３及びＮＬＳ修飾７Ｇ３と比べて、ＩＬ−３Ｒα内在化及びリサイクリング動態における変化を引き起こした。ＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３への結合後、およそ１００％のＩＬ−３Ｒαが細胞表面へ再循環された。逆に、ＮＬＳ２１−７Ｇ３及び７Ｇ３への結合後は、細胞表面ＩＬ−３Ｒα（％）が早い時点で低下した。インキュベーション後１６時間までに、細胞表面ＩＬ−３Ｒαの最初のレベルに戻ったが、これはおそらくは、ＩＬ−３Ｒαの内因性の再発現によるものだったろう。重要なことは、ＩＬ−３Ｒαの利用可能性は、少なくとも結合の早期の間は、限定要因になり得ないので、ＩＬ−３Ｒαリサイクリングは、細胞内取込み増加の付加的な原因であり得ることである。ＴＦ−１ａ細胞をフィリピンへ前もって曝露した場合には、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３にブロックが観測された。対照的に、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３の内在化は、フィリピンによってブロックされなかった。このことは、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３内在化が、コレステロール依存的な機序を介して生じることを示唆する。
【００４６】
[0078]  本発明では、ＣｈＡｃＮＬＳ２１−７Ｇ３が、それ自体の全細胞内取込みを、７Ｇ３及びＮＬＳ２１−７Ｇ３と比べて、２．２倍高める能力を有することが提供される（図４Ｄ）。ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３も、７Ｇ３及びＮＬＳ３−７Ｇ３と比較して、それぞれ５．９倍及び４．３倍多い６４Ｃｕを輸送して蓄積することができる（図７）。
【００４７】
[0079]  また、６４Ｃｕの細胞内取込みを高める、６４Ｃｕ−ＣｈＡｃＮＬＳ３−７Ｇ３の能力も記載される。したがって、ＣｈＡｃＮＬＳは、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態を混乱させるはずがない。本発明で提供されるコンジュゲート化合物は、腫瘍において示されるような、観測された放射活性保持の増加によって、より有効な放射毒性又はより高感度の癌細胞の検出をもたらすことができる。
【００４８】
[0080]  したがって、迅速に内在化する受容体を標的とすることによって、他の分子又は抗体に広く適用するための方法が提供される。多様な癌に関係している多くのインターロイキン受容体は、リガンド結合時に迅速なエンドサイトーシスを受ける。例えば、図８では、本発明に包含されるようなコンジュゲート抗体、主に６Ｇ７白血病抗体（ＣｈＡｃＮＬＳ３−６Ｇ７）の核内蓄積が実証された。本明細書に記載されるようなコンジュゲートの使用は、例えば標的細胞において実際の化学療法分子の蓄積を増加させることができる。
【００４９】
[0081]  ある態様では、本明細書に記載されるような抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、３種の成分−モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、架橋剤、及び細胞毒素（例えば低分子化学療法剤）から構成される。例えば、細胞毒素は、架橋剤を介してｍＡｂへコンジュゲートされる。架橋剤は、典型的には、ｍＡｂ表面のリジンに結合される。
【００５０】
[0082]  本発明には、本明細書に記載されるような抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、例えば、限定されるものではないが、微小管破壊剤（ビンブラスチン、モノメチルアウリスタチンＥ、又はＭＭＡＥ、ＤＭ１など）及び／又はＤＮＡアルキル化剤などの低分子毒素を含むことが包含される。
【００５１】
[0083]  例えば、癌における光線力学療法の適用に使用される細胞毒素分子である、４，４−ジフルオロ−８−（４−カルボキシフェニル）−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（略して、ＢＯＤＩＰＹ）のような、結合された化学療法分子と一緒にＣｈＡｃＮＬＳとコンジュゲートされた抗体は、ＣｈＡｃＮＬＳが腫瘍標的化に干渉しないので、抗体及び化学療法分子の細胞質蓄積の増加をもたらし、より速やかな血液クリアランスと同時により良好な腫瘍取込みを提供する。
【００５２】
[0084]  様々なＨＥＲ２陽性癌細胞を、増加濃度のＴ−ＤＭ１及びＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１で７２時間処理した。細胞増殖を測定するアラマーブルー（登録商標）を使用して、細胞傷害性を測定した。Ｔ−ＤＭ１は、エムタンシン（トラスツズマブ−ＤＭ１）としても知られる、Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）（ロシュ）として市販されている化学療法剤である。細胞と細胞特異的な癌、ＨＥＲ２発現のレベル、及び耐性状態について、以下のように記載する。
【００５３】
【表１】
2019512545.tif 000003
【００５４】
[0085]  図１４に見られるように、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１は、増加濃度のＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１でも、増加量のＣｈＡｃＮＬＳ／Ｔ−ＤＭ１でも、用量依存的な殺傷を有することが実証されている。
【００５５】
[0086]  図１５は、ハーセプチン感受性細胞株ＳＫＢＲ３、並びに２種のハーセプチン抵抗性細胞株ＯＥ１９及びＪＩＭＴ１において、Ｔ−ＤＭ１に比べて改善されたＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１の細胞傷害性プロフィールを図示する。
【００５６】
[0087]  Ｈｅｒ２陰性乳癌細胞株ＭＣＦ７では、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１は、この標的を発現しない細胞に対しては望まれない細胞傷害性を示さない（図１６）。
[0088]  １３日齢のニワトリ胚において、非特異的な急性・胚毒性についてｅｘ  ｏｖｏで評価した。１匹のニワトリあたり１０μｇのＣｈＡｃＮＬＳ−ＳＭ（ＰＥＧ）２−Ｔ−ＤＭ１及び１０μｇのＣｈＡｃＮＬＳ−ＭＣＣ−Ｔ−ＤＭ１（２０μｇのＣｈＡｃＮＬＳ／抗体をロード）を静脈内に１回注射して、７２時間での生存を評価した。等量のＴ−ＤＭ１も注射して、比較用に評価した。結果を表２に表示する。
【００５７】
【表２】
2019512545.tif 000004
【００５８】
[0089]  ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１のいずれの製剤も、ニワトリ胚に対する急性毒性を有さない。
[0090]  本明細書に記載されるようなコンジュゲートは、抗体の送達を高める手段を提供するだけでなく、ＣｈＡｃＮＬＳは、抗体のみならず結合した分子ペイロードの送達を高めることができる。ＣｈＡｃＮＬＳは、増加量の分子ペイロードを核へ送達することができる。
【００５９】
[0091]  本発明にさらに含まれるのは、本明細書に記載されるようなコンジュゲート抗体だけでなく、ホジキンリンパ腫（ホジキン病）及び非ホジキンリンパ腫、並びに睾丸癌を治療するために、他の化学療法薬と併用して使用される、ビンブラスチンのようなさらなる薬物と抗体をコンジュゲートさせることの可能性である。それは、ランゲルハンス細胞組織球症を治療するためにも使用される。図１２Ａに見られるように、ビンブラスチンの非存在下では、湾曲したαβ−チューブリンヘテロ２量体が微小管に組み立てられて、湾曲状から直線状へのコンホメーション転移を受ける。ビンブラスチンは、その阻害部位（α−及びβ−チューブリンモノマーからの構造要素によって形成される複合部位）へ結合する。ビンブラスチンは、この微小管格子構造を組み立てるのに必要な湾曲状から直線状へのコンホメーション転移を妨げるウェッジを導入することによって、微小管を不安定にする。開示されるのは、ＣｈＡｃＮＬＳとの抗体−薬物コンジュゲートである。実証されるように、ＣｈＡｃＮＬＳは、この抗体−薬物コンジュゲートを、標準の抗体−薬物コンジュゲートより５倍以上毒性にすることができる。
【００６０】
[0092]  したがって、本明細書に記載されるコンジュゲート化合物は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、精巣癌、膠芽腫、肉腫、骨癌、頭頚部癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、又は結直腸癌を検出又は治療するために使用され得る。
【００６１】
[0093]  本開示は、その範囲を限定するためのものではなく、態様を例解するために示される以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されよう。
【実施例】
【００６２】
実施例Ｉ
ＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３の構築
[0094]  ＧＹＧスペーサー残基及びＧＧスペーサー残基をそれぞれＮ末端及びＣ末端に有するＳＶ−４０ラージＴ抗原由来の核局在化配列を用いて、ＣｈＡｃＮＬＳを設計した。Ｎ末端は、ＣｈＡｃ及び７Ｇ３へのコンジュゲーションのためにシステインでキャップした。ＣｈＡｃＮＬＳのＮ末端システインとマレイミド誘導体化７Ｇ３との反応によって、ＣｈＡｃＮＬＳとＮＬＳを７Ｇ３  ｍＡｂ又はｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂへコンジュゲートした。マレイミド基は、ＰＢＳ（ｐＨ７．６）中１０ｍｇ／ｍＬの７Ｇ３を、１０、２５、又は５０倍モル過剰のスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ；ＶＷＲ、ケベック州、カナダ）と室温で１時間反応させるによって７Ｇ３へ導入した。マレイミド誘導体化７Ｇ３は、セファデックスＧ−５０（シグマ・アルドリッチ）カラムにて、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で溶出させて精製した。マレイミド−７Ｇ３を含有する画分をセントリコンＹＭ−１００限外濾過装置（ＥＭＤ  ミリポア、オンタリオ州、カナダ）へ移し、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮してから、これを１００倍モル過剰のＣｈＡｃＮＬＳと４℃にて１８時間反応させた。過剰のＣｈＡｃＮＬＳからＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３を精製し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にて、セントリコンＹＭ−１００による限外濾過によって濃縮した。
【００６３】
実施例ＩＩ
[0095]  細胞のｍＡｂコンジュゲートへの曝露
ＴＦ−１ａ白血病細胞及びＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞を、アメリカン・タイプ・ティシュー・コレクション（バージニア州マナッサス）より入手した。ＴＦ−１ａ細胞は、フローサイトメトリーによれば、ＩＬ−３Ｒα陽性であり（７Ｇ３の１１１Ｉｎ標識キメラバージョンでは、７．８×１０３個の受容体／細胞に相当する）、Ｒａｊｉ細胞は、ＩＬ−３Ｒα陰性である。１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、１０％非働化ＦＢＳ、及び０．２％アンホテリシンＢを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｗｉｓｅｎｔ、ケベック州、カナダ）において細胞を培養した。
【００６４】
[0096]  ５×１０６個のＴＦ−１ａ細胞を、ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中２００ナノモル／Ｌの７Ｇ３又はｍＩｇＧ２ａコンジュゲートへ３７℃にて１時間曝露した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、インキュベーション後の処理としてＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳに３７℃にてさらに１時間懸濁させた。これにより、本試験において利用される方法によってモニターされる、抗体コンジュゲートの内在化と細胞内蓄積の評価が可能になった。次いで、細胞を遠心分離して、氷冷ＰＢＳで洗浄した。
【００６５】
[0097]  細胞核を単離するために、ＴＦ−１ａ細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄してから、０．０５％ＮＰ−４０、１０ミリモル／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ミリモル／Ｌ  ＮａＣｌ、３ミリモル／Ｌ  ＭｇＣｌ２緩衝液に氷上で１０分間懸濁させることによって溶解した。次いで、溶解した細胞を８０ｇで５分間遠心分離した。次いで、この核ペレットをＮＰ−４０無しで洗浄し、８０ｇでさらに５分間遠心分離した。核を氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。単離した核をＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬（ＶＷＲ）を使用して、全タンパク質濃度を定量した。１０μｇのタンパク質を１２％ＳＤＳゲルのウェルにロードして、１８０Ｖで１時間電気泳動した。このゲルをＰＶＤＦ膜へ１００Ｖで１時間転写した。次いで、このＰＶＤＦ膜を５％ミルク／ＴＢＳ／０．１％ＴｗｅｅｎＴＭ２０ブロッキング溶液に１時間入れてから、ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄を続けた。次いで、この膜を、２μｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；ライフテクノロジーズ）結合抗マウスＦｃポリクローナル２次抗体を含有する２．５％ミルク／ＰＢＳ中で室温にて１時間インキュベートした。ＨＲＰシグナルは、増強化学発光（バイオラッド）によって明らかにした。確立された核マーカーのラミンＡ／Ｃに対するポリクローナルウサギ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社、テキサス州ダラス）及び形質膜／後期エンドソーム／リソソームマーカーのＬａｍｐ１（シグマ・アルドリッチ）を、ウェスタンブロットローディング対照と濃度測定のために使用した。ラミンＡ／Ｃ及びＬａｍｐ１は、核濃縮を判定して、形質膜、後期エンドソーム、又はリソソーム由来の夾雑物が核に含まれていないことを確認するための対照でもあった。核分画効率は、フローサイトメトリーによって、無傷細胞から単離核へのＦＳＣ対ＳＳＣの変化を評価することによっても決定した。核集団が小さいほど、無傷細胞とは異なることになる。ＤＮＡへ結合するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で核を５分間染色した後で、その核集団にＤＮＡが含まれていることを確認する分析をした。
【００６６】
[0098]  核内局在化及び蓄積を追跡するために、細胞を７Ｇ３又はｍＩｇＧ２ａとともにインキュベートした後で、洗浄と細胞分画の工程を続け、単離核を１％パラホルムアルデヒド／１％ショ糖で氷上にて３０分間固定した。次いで、この核を洗浄し、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＡＦ６４７；ライフテクノロジーズ、オンタリオ州、カナダ）結合抗マウスＦｃポリクローナル２次抗体を含有する０．５ｍＬ  ＰＢＳで暗所の室温にて１時間懸濁させた。この核を洗浄してから、１０μｇ／ｍＬのＰＩで５分間処理後に分析した。共焦点顕微鏡法のために、単離核をＳｌｏｗＦａｄｅ封入剤（ライフテクノロジーズ）でスライドガラスにマウントして、カバーガラスで覆った。６３倍の油浸対物レンズを使用する倒立顕微鏡に連結したＦＶ１０００走査型共焦点顕微鏡（オリンパス、東京、日本）ですべての画像を獲得した。ＰＩ蛍光は、４８８ｎｍのアルゴンレーザー及び５９０ｎｍ未満のフィルターで検出した。ＡＦ６４７蛍光は、６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザー及び５９０ｎｍ未満のフィルターを使用して検出した。ＰＩ及びＡＦ６４７から蛍光放射を連続的に採取した。２回のライン平均化を伴う１０２４×１０２４ピクセルの連続水平光学断面を、全細胞厚を通して０．５μｍ間隔で撮影した。画像は、同じ日に獲得して、擬似カラー化して重ね合わせた（ＦｌｕｏＶｉｅｗ；オリンパス）。７Ｇ３コンジュゲートの核移行能については、ＡＦ６４７蛍光陽性核の比率によって判定した。フローサイトメトリー評価を使用して、抗体コンジュゲート蓄積を判定したが、これは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量されるように、ＡＦ６４７のみとインキュベートした核におけるバックグラウンドＭＦＩレベルに対する、幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）として計算した。
【００６７】
[0099]  ＴＦ−１ａ細胞において特異的に蓄積されるＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３による改善について検討するために、２×１０６個の細胞を正確に同じ条件下で処理した。次いで、０．２５％トリプシン（シグマ・アルドリッチ）及び０．２５％ＥＤＴＡを含有する０．１ｍＬのＰＢＳに細胞を懸濁させ、３７℃にて３分間インキュベートし、これを使用して、表面結合性の抗体コンジュゲートを除去した。０．４ｍＬのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳの添加によりトリプシンを中和した。次いで、細胞を固定した。この細胞を洗浄してから、０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ  ＸＴＭで５分間処理して透過性にした。次いで、この細胞をＰＢＳで洗浄して懸濁させ、ＡＦ６４７及びＰＩで染色した。加えて、固定細胞上の陽電荷ペプチドによる潜在的な非特異的輸送活性を制御するために、無処理ＴＦ−１ａ細胞も固定して透過性にした。この固定化透過性ＴＦ−１ａ細胞をＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３で、３７℃にて１時間、後処理して、洗浄とＡＦ６４７抗体及びＰＩでの染色を続けた。ＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３の全細胞内取込みについては、トリプシンの添加が無いこと以外は、同じ手順であった。ＡＦ６４７陽性細胞の比率は、共焦点顕微鏡法によって計数することによってデータを獲得した。前方散乱／側方散乱分布及び陽性ＰＩ染色によって定量されるように、無傷な固定化透過性細胞集団のＭＦＩを測定することによって、細胞内及び全細胞蓄積を定量した。
【００６８】
[00100]  およそ１．５ｍｇの７Ｇ３（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ７．５）中５μｇ／μＬ）を、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ；６４Ｃｕを錯体化）と反応させた。ＤＯＴＡコンジュゲートをアミコン超遠心分離フィルター（ミリポア）で精製した。およそ５００μｇのＤＯＴＡコンジュゲートを、スルホ−ＳＭＣＣと反応させて、先の記載のようにＣｈＡｃＮＬＳ又はＮＬＳへコンジュゲートしてから、遠心分離によって精製した。５０μｇのＤＯＴＡ−ＣｈＡｃＮＬＳコンジュゲートを、８ＭＢｑの６４ＣｕＣｌ２と共に、５０μＬの０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．５）中に室温にて１時間入れた。放射免疫コンジュゲートをＰＢＣで希釈することによって精製し、アミコン遠心分離フィルターで遠心分離を続けた。１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で展開させる迅速薄層クロマトグラフィーによって、放射化学的純度を決定した。すべての放射免疫コンジュゲートの最終的な放射化学的純度は、９８％より高かった。１００ナノモル／Ｌの放射免疫コンジュゲートを、４×１０６個のＴＦ−１ａ細胞へ加えてインキュベートした。次いで、この細胞を洗浄し、全細胞放射活性をγ−カウンターで測定した。次いで、この細胞を分画し、単離核中の放射活性も定量した。
【００６９】
実施例ＩＩＩ
ＣｈＡｃＮＬＳ−７Ｇ３内在化とＩＬ−３Ｒαリサイクリング
[00101]  ＴＦ−１ａ細胞の細胞表面での７Ｇ３及びＩＬ−３Ｒαの運命をモニターするために、２４×１０６個の細胞を含有する試料を７Ｇ３コンジュゲートへ１時間曝露した。次いで、この細胞を洗浄して非結合リガンドを除去し、早期（５分、１５分、３０分、１時間）又は後期（１時間、２時間、３時間、及び４時間）の時点でのポストインキュベーションを実施した。各時点で、４×１０６個の細胞アリコートを固定して洗浄したが、透過性にはしなかった。この細胞を、氷上で１時間、ＡＦ６４７を含有するＰＢＳで染色し、細胞表面の７Ｇ３レベルについてモニターするか、又は抗ＩＬ−３Ｒα−ＰＥ−Ｃｙ７  ｍＡｂ（クローン６Ｈ６；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ＩＬ−３Ｒαの表面発現についてモニターした。６Ｈ６は７Ｇ３に干渉しない。ＴＦ−１ａ細胞は、５、１０、３０、６０、及び１２０分間の７Ｇ３コンジュゲートへの曝露に先立って、フィリピン（５μｇ／ｍＬ）にも３０分間曝露した。ＰＩ陰性細胞集団は、非透過性細胞のみが分析されることを確認するためにのみ評価した。
【００７０】
実施例ＩＶ
化学療法剤エムタンシンにコンジュゲートしたｍＡｂトラスツズマブ
[00102]  ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１を構築するために、初めに、本明細書の上記と同じ架橋剤を使用して、トラスツズマブの表面リジンへＡＣＣＵＭを架橋結合させた。
【００７１】
[00103]  しかしながら、Ｔ−ＤＭ１をＭＣＣと反応させると、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１の有意な凝集があり、「ＭＣＣ」対「Ｔ−ＤＭ１」の比が高まるにつれて、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１のサイズ増加をもたらした（図１７を参照のこと）。ＭＣＣが疎水性であるため、副次的なＭＣＣコンジュゲーションが過度の疎水性を導入してその凝集をもたらしたと考えられる。ＣｈＡｃＮＬＳ−ＭＣＣ−Ｔ−ＤＭ１を使用するために、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、可溶性モノマーを精製した。したがって、親水性のコンジュゲーション系を使用して、ＣｈＡｃＮＬＳをＴ−ＤＭ１へ組み込んだ。架橋剤のＳＭ（ＰＥＧ）２（サーモフィッシャー）は、増加比でＴ−ＤＭ１と反応させてから、ＣｈＡｃＮＬＳへ結合させた。
【００７２】
[00104]  図１８は、ＳＭ（ＰＥＧ）２コンジュゲーションにより、ＣｈＡｃＮＬＳ−Ｔ−ＤＭ１の望まれない凝集が消失することを示す。この生成物について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって凝集を、そして可視／ＵＶ（５５０ｎｍ／２８０ｎｍ）光学密度比によって沈殿を評価した。濁度については、５５０ｎｍで濁度を測定し、２８０ｎｍでタンパク質を測定する。ＣｈＡｃＮＬＳのコンジュゲーションは、凝集を劇的に低下させる。
【００７３】
[00105]  本発明について、その具体的な態様に関連して記載してきたが、それにはさらなる修飾が可能であり、本願は、本発明が関連する技術分野の公知又は通例の実践内で生じ、先に記載の本発明の本質的な特徴へ適用され得るような、そして以下のような添付の特許請求の範囲内にある、本開示からの展開を含めたあらゆる変形態様、使用、又は適用を網羅することを意図していると理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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