(57)【要約】マルチウェルデバイスの別々のサブアレイから、マルチウェル試料収集デバイスの収集ウェルへと試料をプールするための装置及び方法を提供する（たとえば９６００ウェルチップの１００ウェルサブアレイ中の試料を、９６ウェルプレートの１つの収集ウェルにプールすることを可能にする）。特定の実施形態では、この装置は、ｉ）マルチウェルデバイス、ｉｉ）抽出デバイス、及びｉｉｉ）抽出デバイスガスケットで構成されている。また、説明する抽出デバイスを用いることができる、二重バーコーディング（たとえばＸ−Ｙバーコーディング）、プーリング（たとえば二重プーリング）、ＲＮＡ増幅方法（たとえば単細胞分析のため）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試料デバイスであって、
ｉ）複数の別々のサブアレイを含む第１のマルチウェルデバイスであって、各別々のサブアレイが複数の個々の試料ウェルを含む、第１のマルチウェルデバイスであるか、または
ｉｉ）複数の孔を含むマルチウェル貫通孔デバイスであって、裏材と組み合わされると複数の別々のサブアレイを含む第２のマルチウェルデバイスを形成し、各別々のサブアレイが複数の個々の試料ウェルを含む、マルチウェル貫通孔デバイスのいずれかである、試料デバイス、
ｂ）複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含む、抽出デバイスであって、前記流体コンジット開口部はそれぞれ、前記流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化されている、抽出デバイス、ならびに
ｃ）上面と下面とを有する抽出デバイスガスケットであって、前記抽出デバイスは、前記試料デバイスの前記複数の別々のサブアレイ及び前記抽出デバイスの前記複数の流体コンジット開口部の両方と一対一で合致し整合する、複数のガスケット開口部を含む、抽出デバイスガスケット
を含んでおり、
前記抽出デバイスガスケットは、
ｉ）前記上面が前記試料デバイスと接触し整合し、かつ
ｉｉ）前記下面が前記抽出デバイスと接触し整合する場合に、
前記抽出デバイスと前記試料デバイスとの間に密封を形成する、
装置。
【請求項２】
ｄ）前記複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含む、マルチウェル試料収集デバイスであって、前記抽出デバイスと接し整合する場合に、前記収集ウェルそれぞれに前記流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入される、前記マルチウェル試料収集デバイスをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記マルチウェル試料収集デバイスは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記試料デバイス、前記抽出デバイス、及び前記抽出デバイスガスケットはそれぞれ、整合用構成要素を含み、前記整合用構成要素は、前記試料デバイスの前記複数の別々のサブアレイと、前記抽出デバイスの前記流体コンジット開口部及び前記抽出デバイスガスケットの前記複数のガスケット開口部との整合を容易にする、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記複数の別々のサブアレイは、少なくとも９６個の別々のサブアレイを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記別々のサブアレイはそれぞれ、少なくとも１００個の前記個々の試料ウェルを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記試料デバイスは、前記第１のマルチウェルデバイスを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記第１のマルチウェルデバイスは、マルチウェルチップを含む、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記試料デバイスは、前記マルチウェル貫通孔デバイスを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記裏材をさらに含み、前記裏材は前記マルチウェル貫通孔デバイスに取り付けられて前記第２のマルチウェルデバイスを形成している、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記試料デバイスは、前記第２のマルチウェルデバイスを含む、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記流体コンジットは、チューブを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記チューブは可撓性チューブである、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記複数の流体コンジットは、少なくとも９６個の流体コンジットを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記抽出デバイスガスケットは、変形可能な弾性材を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記複数のガスケット開口部は、少なくとも９６個のガスケット開口部を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
前記密封は水密である、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記試料デバイスは、前記抽出デバイスガスケットと物理的に接触し整合し、前記抽出デバイスガスケットは前記抽出デバイスと接触し整合する、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
ｄ）前記複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含む、マルチウェル試料収集デバイスをさらに含み、前記マルチウェル試料収集デバイスが前記抽出デバイスと接触し整合する場合に、前記収集ウェルそれぞれに前記流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入され、前記マルチウェル試料収集デバイスは前記抽出デバイスと接触し整合する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
ｉ）細胞からｍＲＮＡ配列を放出させる、溶解試薬、
ｉｉ）Ａ）ポリＴ領域、またはＲＮＡ特異的領域、及びＢ）第１の５’尾部領域を含む、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）鋳型乗換えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）のプールであって、前記各ＴＳＯは、Ａ）３’ポリＧ領域、Ｂ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、及びＣ）第２の５’尾部領域を含む、ＴＳＯのプール、
ｉｖ）鋳型乗換えが可能な逆転写酵素を含む、逆転写酵素試薬、
ｖ）それぞれが、Ａ）前記第２の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列、Ｂ）第１の可変バーコード配列、及びＣ）第３の５’尾部領域を含む、第１の指標プライマー、
ｖｉ）それぞれが、前記第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第１のリバースプライマー、
ｖｉｉ）ｉ）前記第１の５’尾部領域、ｉｉ）前記ポリＴ領域またはＲＮＡ特異的領域、ｉｉｉ）コードまたは機能的領域の相補配列、及びｉｖ）前記ＴＳＯのうちの１つの相補配列を含む、第１の鎖ｃＤＮＡ、
ｖｉｉｉ）バーコード化二本鎖ＤＮＡ、
ｉｘ）末端配列、第２の可変バーコード配列、及び第４の５’尾部領域を含む、第１の転位配列、
ｘ）前記末端配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２の転位配列、
ｘｉ）トランスポサーゼ酵素、
ｘｉｉ）二重バーコード化鋳型配列、
ｘｉｉｉ）前記第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有する、フォワードプライマー、
ｘｉｖ）前記第４の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有する、リバースプライマー、ならびに
ｘｖ）シークエンシング鋳型のシークエンシングライブラリーであって、前記シークエンシング鋳型はそれぞれＡ）第１及び第２の可変バーコード配列、またはその相補配列、Ｂ）ＵＭＩ配列、またはその相補配列、及びＣ）タンパク質コード領域のｃＤＮＡ、またはその相補配列を含む、前記シークエンシングライブラリー、
のうちの少なくとも１つを有する、ｄ）容器をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
細胞ライセート、細胞、ポリメラーゼ分子、核酸分子、バーコード化オリゴヌクレオチド、及び検出可能な標識分子からなる群より選択される少なくとも１つの構成要素を含む、ｄ）反応試料をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
ａ）
ｉ）抽出デバイスガスケットの第１の面を、マルチウェルデバイスのウェル面と接触させること、ここで前記マルチウェルデバイスは複数の別々のサブアレイを含み、各別々のサブアレイは反応試料を収容する複数の個々の試料ウェルを含み、前記抽出デバイスガスケットは、前記マルチウェルデバイスの前記複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を含み、
ｉｉ）前記抽出デバイスガスケットの第２の面を、抽出デバイスの第１の面と接触させること、ここで前記抽出デバイスは複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含み、前記流体コンジット開口部はそれぞれ、前記流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化され、前記複数の流体コンジット開口部は、前記抽出デバイスガスケットの前記複数のガスケット開口部と一対一で合致し整合し、及び
ｉｉｉ）前記抽出デバイスの第２の面をマルチウェル試料収集デバイスと接触させること、ここで前記マルチウェル試料収集デバイスは、前記複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含み、前記収集ウェルそれぞれに、前記流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入され、
により組立体を形成すること、ならびに
ｂ）前記個々の試料ウェル内の前記反応試料が、ｉ）前記複数のガスケット開口部、ｉｉ）前記複数の流体コンジット開口部、及びｉｉｉ）前記複数の流体コンジットを通って前記複数の収集ウェルに沈着するように、前記組立体を処理すること、ここで前記収集ウェルはそれぞれ、別々の１つのサブアレイの前記個々のウェルから前記反応試料を受け、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通孔デバイス及び裏材を含み、前記裏材は、前記マルチウェル貫通孔デバイスの片面に取り付けられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組立体を処理することには、前記組立体の遠心分離が含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応試料は、細胞ライセート、細胞、ポリメラーゼ分子、核酸分子、バーコード化オリゴヌクレオチド、及び検出可能な標識分子からなる群より選択される少なくとも１つの構成要素を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記抽出デバイスガスケットは、前記抽出デバイスと前記マルチウェルデバイスの間に密封を形成する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記マルチウェル試料収集デバイスは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
試料デバイス、前記抽出デバイス、及び前記抽出デバイスガスケットはそれぞれ、整合用構成要素を含み、前記整合用構成要素は前記組立体を形成することを促進する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の別々のサブアレイは、少なくとも９６個の別々のサブアレイを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記別々のサブアレイはそれぞれ、少なくとも１００個の前記個々の試料ウェルを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記マルチウェルデバイスは、マルチウェルチップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記流体コンジットはチューブを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記チューブは可撓性チューブである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数の流体コンジットは、少なくとも９６個の流体コンジットを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記抽出デバイスガスケットは、変形可能な弾性材を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数のガスケット開口部は、少なくとも９６個のガスケット開口部を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３７】
組立体を形成する方法であって、
ａ）抽出デバイスガスケットの第１の面を、マルチウェルデバイスのウェル面と接触させること、ここで前記マルチウェルデバイスは複数の別々のサブアレイを含み、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含み、前記抽出デバイスガスケットは、前記マルチウェルデバイスの前記複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を含み、
ｂ）前記抽出デバイスガスケットの第２の面を、抽出デバイスの第１の面と接触させること、ここで前記抽出デバイスは複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含み、前記流体コンジット開口部はそれぞれ、前記流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化され、前記複数の流体コンジット開口部は、前記抽出デバイスガスケットの前記複数のガスケット開口部と一対一で合致し整合し、ならびに
ｃ）前記抽出デバイスの第２の面をマルチウェル試料収集デバイスと接触させること、ここで前記マルチウェル試料収集デバイスは、前記複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含み、前記収集ウェルそれぞれに、前記流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入され、
を含む、方法。
【請求項３８】
抽出デバイスであって、
ａ）平坦基板の複数の流体コンジット開口部、及び
ｂ）複数の流体コンジット
を含み、
前記流体コンジット開口部はそれぞれ、前記流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化されており、
前記複数の流体コンジット開口部は、マルチウェルデバイスの複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合し、
前記マルチウェルデバイスは、複数の別々のサブアレイを含み、各別々のサブアレイは、複数の個々の試料ウェルを含み、
前記複数の流体コンジットは、マルチウェル試料収集デバイスの複数の収集ウェルと一対一で合致し整合し、前記抽出デバイスが前記マルチウェル試料収集デバイスと接し整合する場合に、前記流体コンジットはそれぞれ、前記複数の収集ウェルのうちの１つに少なくとも部分的に挿入される、
抽出デバイス。
【請求項３９】
ａ）それぞれ少なくとも２つの反応容器を含む第１及び第２のサブアレイを提供すること、
ｂ）前記第１及び第２の両方のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器それぞれに、前記反応容器それぞれに１細胞だけが存在するように、単細胞または多細胞を分注すること、
ｃ）前記第１及び第２の両方のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器それぞれに、
ｉ）ＲＮＡ配列が前記単細胞から放出されるような溶解試薬であって、前記ＲＮＡ配列はそれぞれ、コードまたは機能的領域を含む、溶解試薬、
ｉｉ）Ａ）ポリＴ領域またはＲＮＡ特異的領域、及びＢ）第１の５’尾部領域を含む、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）鋳型乗換えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）のプールであって、各ＴＳＯはＡ）３’ポリＧ領域、Ｂ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、及びＣ）第２の５’尾部領域を含む、ＴＳＯのプール、
ｉｖ）鋳型乗換え可能な逆転写酵素を含む、逆転写酵素試薬
を加えること、
ｄ）前記第１及び第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器それぞれを、前記反応容器それぞれで前記逆転写酵素によって第１の鎖ｃＤＮＡが生成されるような条件下で処理すること、ここで各第１の鎖ｃＤＮＡは、ｉ）前記第１の５’尾部領域、ｉｉ）前記ポリＴ領域またはＲＮＡ特異的領域、ｉｉｉ）前記コードまたは機能的領域の相補配列、及びｉｖ）前記ＴＳＯのうちの１つの相補配列を含み、
ｅ）前記第１及び第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器それぞれに、第１の指標プライマー及び第１のリバースプライマーを分注すること、
ここで前記第１の指標プライマーはそれぞれ、Ａ）前記第２の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列、Ｂ）第１のバーコード配列、及びＣ）第３の５’尾部領域、を含み、
前記第１のリバースプライマーはそれぞれ、前記第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、
前記第１のバーコード配列は、前記第１のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器の全部で異なっており、前記第１のバーコード配列は、前記第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器の全部で異なっており、
ｆ）前記第１及び第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器それぞれを、バーコード化二本鎖ＤＮＡが生成されるような条件下で処理すること、ここで前記第１のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器内の前記バーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能であり、前記第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器内の前記バーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能であり、ならびに
ｇ）前記バーコード化二本鎖ＤＮＡを前記第１のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器から第１のサブアレイ容器へとプールすること、及び前記バーコード化二本鎖ＤＮＡを前記第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器から第２のサブアレイ容器へとプールすること、
を含む、方法。
【請求項４０】
ｈ）転位試薬を前記第１及び第２のサブアレイ容器それぞれに分注することをさらに含み、前記転位試薬は、Ａ）トランスポゾン末端配列、第２のバーコード配列、及び第４の５’尾部領域を含む、第１の転位配列、Ｂ）前記トランスポゾン末端配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２の転位配列、及びＣ）トランスポサーゼ酵素を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡ配列はｍＲＮＡ配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｉ）前記第１及び第２のサブアレイ容器を、前記第１の転位配列が前記バーコード化二本鎖ＤＮＡの一本の鎖の末端に付加されて前記第１及び第２のサブアレイ容器それぞれで二重バーコード化鋳型配列が生成されるような条件下で処理することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ｊ）前記二重バーコード化鋳型配列を前記第１及び第２のサブアレイ容器からフルアレイ容器へとプールすることをさらに含み、前記第１のサブアレイ容器で生じた前記二重バーコード化鋳型配列は、異なる第２のバーコード配列を有することに基づいて、前記第２のサブアレイ容器で生じたものと区別可能である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｋ）増幅試薬を前記フルアレイ容器に分注することをさらに含み、前記増幅試薬は、ｉ）前記第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有するフォワードプライマー、及びｉｉ）前記第４の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｌ）前記フルアレイ容器を、増幅反応によってシークエンシング鋳型のシークエンシングライブラリーが生成されるような条件下で処理することをさらに含み、前記シークエンシング鋳型はそれぞれ、ｉ）前記第１及び第２のバーコード配列、またはその相補配列、ｉｉ）ＵＭＩ配列、またはその相補配列、及びｉｉｉ）前記コードまたは機能的領域のｃＤＮＡ、またはその相補配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｍ）前記シークエンシング鋳型の少なくとも一部のシークエンシングをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１及び第２のサブアレイは、同じ試料デバイスの一部である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料デバイスは、
ｉ）複数の別々のサブアレイを含む第１のマルチウェルデバイスであって、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、第１のマルチウェルデバイス、または
ｉｉ）複数の孔を含むマルチウェル貫通孔デバイスであって、裏材と組み合わされると複数の別々のサブアレイを含む第２のマルチウェルデバイスを形成し、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、マルチウェル貫通孔デバイス
のどちらかである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
各別々のサブアレイの前記複数の個々の試料ウェルは、少なくとも１０個の個々の試料ウェルを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
各別々のサブアレイの前記複数の個々の試料ウェルは、少なくとも１００個の個々の試料ウェルを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１のサブアレイと第２のサブアレイとは、別々のデバイスに配置されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチドの前記第１の５’尾部は、シークエンシングアダプターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＴＳＯのプールは、所与の単細胞からの大半または全部のｍＲＮＡ配列が異なるＵＭＩで標識されるほど十分に大きい、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
各ＵＭＩは、少なくとも６個のランダムヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のバーコード配列は、少なくとも５ヌクレオチド長である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１及び第２のサブアレイは、同じ試料デバイスの一部であり、ステップｇ）プールすることは、抽出デバイス及び抽出デバイスガスケットを用いて実現される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記抽出デバイスは、複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含み、前記流体コンジット開口部はそれぞれ、前記流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記抽出デバイスガスケットは上面と下面とを有し、前記抽出デバイスは、前記試料デバイスの第１及び第２のサブアレイ、及び前記抽出デバイスの前記複数のコンジット開口部の両方と一対一で合致し整合する、複数のガスケット開口部を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ステップｇ）プールする間、前記抽出デバイスガスケットは、
ｉ）前記上面が前記試料デバイスと接し整合し、かつ
ｉｉ）前記下面が前記抽出デバイスと接し整合することにより、
前記抽出デバイスと前記試料デバイスとの間に密封を形成する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のサブアレイ容器及び前記第２のサブアレイ容器は、同じ試料デバイスの一部であり、前記試料デバイスは少なくとも９６個のアレイ容器を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項６１】
前記トランスポサーゼ酵素は、Ｍｏｓ−１、ＨｙｐｅｒＭｕ（登録商標）、Ｔｎ５、Ｔｓ−Ｔｎ５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９、Ｈｅｒｍｅｓ、及びＴｎ７からなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第３の５’尾部領域と前記第１の５’尾部領域とは、同一の配列を有するか、または少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項６３】
前記シークエンシングにより、前記複数のシークエンシング鋳型からシークエンシングデータが生成され、特定のシークエンシング鋳型について、ｉ）前記第１及び第２のバーコードの決定配列、またはその相補配列、ｉｉ）ＵＭＩの決定配列、またはその相補配列、及びｉｉｉ）ＲＮＡのコードまたは機能的領域のｃＤＮＡの決定配列の組合せにより、どの特定の細胞が、前記特定のシークエンシング鋳型に対応するＲＮＡのソースであるかを決定できる、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＲＮＡのソースである前記特定の細胞は、試料デバイスの特定の列及び行を出所とし、前記特定の列及び行はまた、前記特定の細胞を識別するためにも用いられる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ａ）それぞれ少なくとも２つの反応容器を含む第１及び第２のサブアレイを提供すること、ここで前記少なくとも２つの反応容器はそれぞれバーコード化二本鎖ＤＮＡを収容し、前記第１のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器内の前記バーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能であり、前記第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器内の前記バーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能であり、
ｂ）前記バーコード化二本鎖ＤＮＡを前記第１のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器から第１のサブアレイ容器にプールすること、及び前記バーコード化二本鎖ＤＮＡを前記第２のサブアレイの前記少なくとも２つの反応容器から第２のサブアレイ容器にプールすること、
ｃ）転位試薬を前記第１及び第２のサブアレイ容器それぞれに分注すること、ここで前記転位試薬は、Ａ）トランスポゾン末端配列、第２のバーコード配列、及び第１の５’尾部領域を含む、第１の転位配列、Ｂ）前記トランスポゾン末端配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２の転位配列、及びＣ）トランスポサーゼ酵素を含み、
ｄ）前記第１及び第２のサブアレイ容器を、前記第１の転位配列が前記バーコード化二本鎖ＤＮＡの一本の鎖に付加されて、前記第１及び第２のサブアレイ容器それぞれで二重バーコード化鋳型配列が生成されるような条件下で処理すること、ならびに
ｅ）前記二重バーコード化鋳型配列を前記第１及び第２のサブアレイ容器からフルアレイ容器へとプールすること、ここで前記第１のサブアレイ容器で生じた前記二重バーコード化鋳型配列は、異なる第２のバーコード配列を有することに基づいて、前記第２のサブアレイ容器で生じたものと区別可能であり、
を含む、方法。
【請求項６６】
ｆ）増幅試薬を前記フルアレイ容器に分注することをさらに含み、前記増幅試薬は、ｉ）フォワードプライマー、及びｉｉ）前記第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ｇ）前記フルアレイ容器を、増幅反応によりシークエンシング鋳型のシークエンシングライブラリーが生成されるような条件下で処理することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記シークエンシング鋳型はそれぞれ、ｉ）第１及び第２のバーコード配列、またはその相補配列、及びｉｉ）ｍＲＮＡ配列からのコード領域の核酸配列、またはその相補配列を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ｈ）前記シークエンシングライブラリーの少なくとも一部のシークエンシングをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記トランスポゾン末端配列は、モザイク末端配列を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
前記バーコード化二本鎖ＤＮＡはそれぞれ、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１及び第２のサブアレイは、同じ試料デバイスの一部である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記試料デバイスは、
ｉ）複数の別々のサブアレイを含む第１のマルチウェルデバイスであって、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、第１のマルチウェルデバイス、または
ｉｉ）複数の孔を含むマルチウェル貫通孔デバイスであって、裏材と組み合わされると複数の別々のサブアレイを含む第２のマルチウェルデバイスを形成し、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、マルチウェル貫通孔デバイス
のどちらかである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
各別々のサブアレイの前記複数の個々の試料ウェルは、少なくとも１０個の個々の試料ウェルを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
各別々のサブアレイの前記複数の個々の試料ウェルは、少なくとも１００個の個々の試料ウェルを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のサブアレイと第２のサブアレイとは、別々のデバイスに配置されている、請求項６５に記載の方法。
【請求項７７】
マルチウェルアレイのウェルに収容された標的核酸のウェル特異的標識化の方法であって、
（ａ）前記マルチウェルアレイの各ウェルに、行特異的バーコード配列を含む行特異的プライマーを接触させること、
（ｂ）前記マルチウェルアレイの各ウェルに、列特異的バーコード配列を含む列特異的プライマーを接触させること、及び
（ｃ）前記行特異的バーコード配列及び前記列特異的バーコード配列が各ウェルの増幅された核酸に組み込まれるような条件下で前記標的核酸を増幅させて、増幅された核酸を産生すること
を含む、方法。
【請求項７８】
各列の全ウェルに、同一の列特異的バーコード配列を有する列特異的プライマーを接触させ、各列特異的プライマーは、異なる列特異的バーコード配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
異なる列の前記列特異的プライマーは、前記列特異的バーコード配列だけが異なる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記列特異的プライマーはさらに、同じ及び／または異なる列の列特異的プライマー間で異なる、ユニーク分子識別子配列または他の配列を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
各行の全ウェルに、同一の行特異的バーコード配列を有する行特異的プライマーを接触させ、各行特異的プライマーは、異なる行特異的バーコード配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
異なる行の前記行特異的プライマーは、前記行特異的バーコード配列だけが異なる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記行特異的プライマーはさらに、同じ及び／または異なる行の行特異的プライマー間で異なる、ユニーク分子識別子配列または他の配列を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記行特異的プライマー及び前記列特異的プライマーはさらに、前記標的核酸と同一のまたは相補的な配列を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
前記行特異的プライマー及び前記列特異的プライマーはさらに、増幅された核酸のシークエンシング用の配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
装置またはキットであって、
（ａ）ウェルが行及び列に配列している、マルチウェルアレイ、
（ｂ）前記マルチウェルアレイの各行の個別の配列を含む行特異的バーコード配列を有する、第１のプライマーセット、及び
（ｃ）前記マルチウェルアレイの各列の個別の配列を含む列特異的バーコード配列を有する、第２のプライマーセット
を含む、装置またはキット。
【請求項８７】
前記マルチウェルアレイの各ウェルは、
（ｉ）前記第１のプライマーセットからの第１のプライマーであって、前記マルチウェルアレイの前記ウェルの行に対応する行特異的バーコード配列を含む、第１のプライマー、及び
（ｉｉ）前記第２のプライマーセットからの第２のプライマーであって、前記マルチウェルアレイの前記ウェルの列に対応する列特異的バーコード配列を含む、第２のプライマー
を収容する、請求項８６に記載の装置またはキット。
【請求項８８】
マルチウェルプレートの各ウェルは、行特異的バーコード配列と列特異的バーコード配列のユニークな組合せを有するプライマーペアを収容する、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項８９】
前記第１のプライマーセットのプライマーは、前記行特異的バーコード配列だけが異なる、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９０】
前記第１のプライマーセットのプライマーはさらに、同じ及び／または異なる行の行特異的プライマー間で異なるユニーク分子識別子配列または他の配列を含む、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９１】
前記第２のプライマーセットのプライマーは、前記列特異的バーコード配列だけが異なる、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９２】
前記第２のプライマーセットのプライマーはさらに、同じ及び／または異なる列の列特異的プライマー間で異なるユニーク分子識別子配列または他の配列を含む、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９３】
前記第１のプライマーセットのプライマー及び前記第２のプライマーセットのプライマーはさらに、標的核酸と同一のまたは相補的な配列を含む、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９４】
前記第１のプライマーセットのプライマー及び前記第２のプライマーセットのプライマーはさらに、プライマーによって増幅された核酸のシークエンシング用の配列を含む、請求項９３に記載の装置またはキット。
【請求項９５】
核酸増幅用の追加の試薬をさらに含む、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９６】
前記核酸増幅用の追加の試薬は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、ＭｇＣｌ2 、及びホスホヌクレオチドキナーゼからなる群より選択される、請求項９５に記載の装置またはキット。
【請求項９７】
核酸分析用の追加の試薬をさらに含む、請求項８７に記載の装置またはキット。
【請求項９８】
前記核酸分析用の追加の試薬は、ハイブリダイゼーション試薬、捕捉試薬、シークエンシング試薬、及び検出試薬からなる群より選択される、請求項９７に記載の装置またはキット。
【請求項９９】
各ウェル内の単細胞または単細胞ライセートをさらに含む、請求項８６に記載の装置またはキット。
【請求項１００】
細胞集団の複数の単細胞からの標的核酸を分析する方法であって、
（ａ）単細胞または単細胞からのライセートを、マルチウェルアレイの全部または一部のウェル内に、各ウェルが異なる単細胞からの物質を収容するように、沈着させること、
（ｂ）各ウェル内に、
（ｉ）第１のプライマーセットからの第１のプライマーであって、
（Ａ）前記マルチウェルアレイのウェルの行に対応する行特異的バーコード配列、ここで前記第１のプライマーセットのプライマーは、前記行特異的バーコード配列だけが異なっており、及び
（Ｂ）前記標的核酸の一部に相補的な配列を含む、第１のプライマー、及び
（ｉｉ）第２のプライマーセットからの第２のプライマーであって、
（Ａ）前記マルチウェルアレイのウェルの列に対応する列特異的バーコード配列、ここで前記第２のプライマーセットのプライマーは、前記列特異的バーコード配列だけが異なっており、及び
（Ｂ）前記標的核酸の一部と同一の配列、前記第１のプライマーの一部に相補的な配列、または前記標的核酸上の前記第１のプライマーの伸長により産生される配列に相補的な配列を含む、第２のプライマー
を沈着させること、
（ｃ）前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーを用いて各ウェルで前記標的核酸を増幅して増幅された核酸を産生すること、ここで増幅された核酸は、増幅された核酸が増幅されたウェルの行及び列に対応する前記行特異的バーコード配列及び前記列特異的バーコード配列を含み、ならびに
（ｄ）増幅された核酸を分析すること、ここで分析の結果を増幅された核酸が増幅されたウェルと相関付けることができる
を含む、方法。
【請求項１０１】
ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）との間に、増幅された核酸を前記ウェルから１つの容器へとプールするステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ステップ（ａ）の後に、細胞を溶解するステップをさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記標的核酸はｍＲＮＡであり、前記標的核酸の一部に相補的な配列を含むプライマーを用いて前記標的核酸を逆転写するステップ（ｂ）及び（ｃ）をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
ステップ（ｄ）にて、シークエンシング、プローブハイブリダイゼーション、及び捕捉からなる群より選択される技法を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０５】
ウェルの行及び列を含むマルチウェルアレイを含む装置であって、
前記マルチウェルアレイの各ウェルは核酸を収容し、各ウェルの核酸は、ウェルの行に特異的な第１の核酸バーコードで標識され、各ウェルの核酸は、ウェルの列に特異的な第２の核酸バーコードで標識される、装置。
【請求項１０６】
前記マルチウェルアレイの各ウェルの核酸は異なる単細胞から生成されたｃＤＮＡを含み、各ウェルのｃＤＮＡはウェルの行に特異的な第１の核酸バーコードで標識され、各ウェルのｃＤＮＡはウェルの列に特異的な第２の核酸バーコードで標識される、請求項１０５に記載の装置。
【請求項１０７】
ウェルの行及び列を含むマルチウェルアレイを含む装置であって、
前記マルチウェルアレイの各ウェルは、（ｉ）ウェルの行に特異的な第１の核酸バーコードで標識された第１のプライマー、及び（ｉｉ）ウェルの列に特異的な第２の核酸バーコードで標識された第２のプライマーを収容する、装置。
【請求項１０８】
マルチウェルアレイの別々のウェルでのプライマー依存性増幅反応で産生された複数の核酸増幅産物を含む組成物であって、
各核酸増幅産物は、第１の増幅プライマーが提供する列特異的バーコード、第２の増幅プライマーが提供する行特異的バーコードを有し、前記マルチウェルアレイの同じ行のウェルで産生された各核酸増幅産物は、同じ行特異的バーコードを含み、異なる行のウェルで産生された核酸増幅産物は、異なる行特異的バーコードを含み、前記マルチウェルアレイの同じ列のウェルで産生された各核酸増幅産物は、同じ列特異的バーコードを含み、異なる列のウェルで産生された核酸増幅産物は、異なる列特異的バーコードを含む、組成物。
【請求項１０９】
前記複数の核酸増幅産物が、少なくとも第１の列、第２の列、第３の列、第４の列、第１の行、第２の行、第３の行、及び第４の行を有するグリッドとして配列されたウェルで産生され、前記複数の核酸増幅産物は、
（ａ）第１の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、
（ｂ）第１の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、
（ｃ）第１の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、
（ｄ）第１の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード、
（ｅ）第２の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、
（ｆ）第２の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、
（ｇ）第２の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、
（ｈ）第２の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード、
（ｉ）第３の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、
（ｊ）第３の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、
（ｋ）第３の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、
（ｌ）第３の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード、
（ｍ）第４の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、
（ｎ）第４の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、
（ｏ）第４の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、ならびに
（ｐ）第４の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード
を含む、請求項１０８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、マルチウェルデバイスの別々のサブアレイから、マルチウェル試料収集デバイスの収集ウェルへと試料をプールするための装置及び方法を提供する（たとえば９６００ウェルチップの１００ウェルサブアレイ中の試料を、９６ウェルプレートの１つの収集ウェルにプールすることを可能にする）。特定の実施形態では、この装置は、ｉ）マルチウェルデバイス、ｉｉ）抽出デバイス、及びｉｉｉ）抽出デバイスガスケットで構成されている。本明細書ではまた、本明細書で説明する抽出デバイスを用いることができる、二重バーコーディング（たとえばＸ−Ｙバーコーディング）、プーリング（たとえば二重プーリング）、ＲＮＡ増幅方法（たとえば単細胞分析のため）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝学者らは、癌、自己免疫疾患、及び神経疾患のような複雑な疾患の特徴付けに努力しているが、こうした疾患を引き起こす基底メカニズムの発見にはなかなか至らない。疾患の発症と再発とを引き起こす一要因は、体細胞変異、つまり一生を通じて細胞内に蓄積される自然発生バリアントである。細胞に新たな変異が蓄積されると、正常細胞と共存するポリクローナルな細胞集団を形成する。バルクな細胞集団のシークエンシングは、こうしたユニークで希少な細胞種の潜在的な異質性を隠してしまい、正常な生殖系列の変異との区別がつきにくい場合がある。
【０００３】
そのような差異を明らかにしてクローン構造を可視化する最良の方法は、集団内の個々の細胞をシークエンシングすることである。単細胞シークエンシングは複雑な疾患のメカニズムの解明に役立ち得るが、従来の手法は高価で手間もかかり、大量の試料インプットを要する。現状での全トランスクリプトームのシークエンシングは、細胞内のＲＮＡをバーコード化産物に変換するものである。産物がバーコード化されると、個々の細胞がプールされ、第２のバーコード化ライブラリーに変換される。するとＩｌｌｕｍｉｎａ社の次世代シークエンサーなどの任意の市販のシークエンサーで、このバーコード化ライブラリーの配列決定ができる。
【０００４】
マルチウェルデバイス内のバーコード化産物を高効率にプールできるような方法及び装置が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、マルチウェルデバイスの別々のサブアレイから、マルチウェル試料収集デバイスの収集ウェルへと試料をプールするための装置及び方法を提供する（たとえば９６００ウェルチップの１００ウェルサブアレイ中の試料を、９６ウェルプレートの１つの収集ウェルにプールすることを可能にする）。特定の実施形態では、この装置は、ｉ）マルチウェルデバイス、ｉｉ）抽出デバイス、及びｉｉｉ）抽出デバイスガスケットで構成されている。本明細書ではまた、本明細書で説明する抽出デバイスを用いることができる、二重バーコーディング、プーリング（たとえば二重プーリング）すること、ＲＮＡ増幅方法（たとえば単細胞分析のため）を提供する。
【０００６】
特定の実施形態では、装置は、ｉ）別々のサブアレイとしてまとめられた複数の個々の試料ウェルを有する、マルチウェルデバイス、ｉｉ）複数の流体コンジット開口部に取り付けられた複数の流体コンジットを有する、抽出デバイス、及びｉｉｉ）複数の別々のサブアレイと複数のコンジット開口部との両方と一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を有する、抽出デバイスガスケットで構成されている。いくつかの実施形態では、装置はさらに、ｉｖ）複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを有する、マルチウェル試料収集デバイスを含んでいる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ａ）基板（たとえば平坦基板）の複数の流体コンジット開口部、及びｂ）複数の流体コンジットを含む、抽出デバイスを提供し、各流体コンジット開口部は流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化されており、複数の流体コンジット開口部はマルチウェルデバイスの複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合し、マルチウェルデバイスは複数の該別々のサブアレイを含み、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含み、複数の流体コンジットはマルチウェル試料収集デバイスの複数の収集ウェルと一対一で合致し整合し、したがって、抽出デバイスがマルチウェル試料収集デバイスと接し整合する場合に、各流体コンジットは複数の収集ウェルのうちの１つに少なくとも部分的に挿入される。
【０００８】
他の実施形態では、組立体を形成する方法を提供し、この方法は、ａ）抽出デバイスガスケットの第１の面を、マルチウェルデバイスのウェル面と接触させること（ここでマルチウェルデバイスは複数の別々のサブアレイを含み、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含み、抽出デバイスガスケットは、マルチウェルデバイスの複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を含む）、ｂ）抽出デバイスガスケットの第２の面を、抽出デバイスの第１の面と接触させること（ここで抽出デバイスは複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含み、各流体コンジット開口部は流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化され、複数の流体コンジット開口部は、抽出デバイスガスケットの複数のガスケット開口部と一対一で合致し整合する）、及びｃ）抽出デバイスの第２の面をマルチウェル試料収集デバイスと接触させること（ここでマルチウェル試料収集デバイスは、複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含み、各収集ウェルには、流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入される）、を含む。
【０００９】
特定の実施形態では、装置を提供し、この装置は、ａ）試料デバイスであって、ｉ）複数の別々のサブアレイを含む第１のマルチウェルデバイスであって、各別々のサブアレイが複数の個々の試料ウェルを含む、第１のマルチウェルデバイスであるか、またはｉｉ）複数の孔を含むマルチウェル貫通孔デバイスであって、裏材と組み合わされると複数の別々のサブアレイを含む第２のマルチウェルデバイスを形成し、各別々のサブアレイが複数の個々の試料ウェルを含む、マルチウェル貫通孔デバイスのいずれかである、試料デバイス、ｂ）複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含む、抽出デバイスであって、各流体コンジット開口部は流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化され、複数の流体コンジット開口部は試料デバイスの複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合している、抽出デバイス、及びｃ）上面と下面とを有する抽出デバイスガスケットであって、抽出デバイスは、試料デバイスの複数の別々のサブアレイ及び抽出デバイスの複数の流体コンジット開口部の両方と一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を含む、抽出デバイスガスケットを含んでおり、抽出ガスケットは、ｉ）上面が試料デバイスと接触し整合し、かつｉｉ）下面が抽出デバイスと接触し整合する場合に、抽出デバイスと試料デバイスとの間に密封を形成する。
【００１０】
他の実施形態では、装置はさらに、ｄ）複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含む、マルチウェル試料収集デバイスであって、抽出デバイスと接し整合する場合に、各収集ウェルには流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入される（または収集ウェルの真上にある）、マルチウェル試料収集デバイスを含む。特定の実施形態では、複数の収集ウェルは、少なくとも１０個・・・２５個・・・９６個・・・１８５個・・・３８４個・・・１５３６個・・・３０００個・・・５０００個以上の収集ウェルを含む。特定の実施形態では、マルチウェル試料収集デバイスは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを含む。
【００１１】
特定の実施形態では、装置はさらに、ｉ）細胞からｍＲＮＡ配列を放出させる、溶解試薬、ｉｉ）Ａ）タンパク質コード領域、Ｂ）ポリＴ領域、及びＣ）第１の５’尾部領域を含む、ｍＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド、ｉｉｉ）鋳型乗換えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）のプールであって、該各ＴＳＯは、Ａ）３’ポリＧ領域、Ｂ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、及びＣ）第２の５’尾部領域を含む、ＴＳＯのプール、ｉｖ）鋳型乗換えが可能な逆転写酵素を含む、逆転写酵素試薬、ｖ）それぞれが、Ａ）該第２の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列、Ｂ）第１の可変バーコード配列、及びＣ）第３の５’尾部領域を含む、第１の指標プライマー、ｖｉ）それぞれが、該第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第１のリバースプライマー、ｖｉｉ）ｉ）第１の５’尾部領域、ｉｉ）ポリＴ領域、ｉｉｉ）該タンパク質コード領域の相補配列、及びｉｖ）該ＴＳＯのうちの１つの相補配列を含む、第１の鎖ｃＤＮＡ、ｖｉｉｉ）バーコード化二本鎖ＤＮＡ、ｉｘ）末端配列、第２の可変バーコード配列、及び第４の５’尾部領域を含む、第１の転位配列、ｘ）該末端配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、第２の転位配列、ｘｉ）トランスポサーゼ酵素、ｘｉｉ）二重バーコード化鋳型配列、ｘｉｉｉ）該第１の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有する、フォワードプライマー、ｘｉｖ）該第４の５’尾部領域と少なくとも９０％の配列同一性を有する、リバースプライマー、及びｘｖ）シークエンシング鋳型のシークエンシングライブラリーであって、該シークエンシング鋳型はそれぞれＡ）第１及び第２の可変バーコード配列、またはその相補配列、Ｂ）ＵＭＩ配列、またはその相補配列、及びＣ）該タンパク質コード領域のｃＤＮＡ、またはその相補配列を含む、シークエンシングライブラリー、のうちの少なくとも１つを有する、ｄ）容器、を含む。
【００１２】
さらなる実施形態では、試料デバイス、抽出デバイス、及び抽出デバイスガスケットはそれぞれ、整合用構成要素（たとえば開口部、ノッチ、溝等）を含み、整合用構成要素は、試料デバイスの複数の別々のサブアレイと、抽出デバイスの流体コンジット開口部及び抽出デバイスガスケットの複数のガスケット開口部との整合を容易にする。さらなる実施形態では、複数の別々のサブアレイは、少なくとも５個・・・１５個・・・２５個・・・４０個・・・６５個・・・９６個・・・１００個・・・１５０個・・・２００個・・・３８４個・・・１５３６個・・・３０００個・・・または５０００個の別々のサブアレイを含む。
【００１３】
他の実施形態では、試料デバイスは、第１のマルチウェルデバイスを含む。他の実施形態では、第１のマルチウェルデバイスは、マルチウェルチップを含む。さらなる実施形態では、試料デバイスは、マルチウェル貫通孔デバイスを含む。さらなる実施形態では、マルチウェル貫通孔デバイスはさらに、裏材を含み、該裏材はマルチウェル貫通孔チップに取り付けられて第２のマルチウェルデバイスを形成する。特定の実施形態では、裏材は、光学透明ＰＣＲシールフィルム、固体プレート（たとえば光学透明）、透明な接着剤、または孔がウェルになるように貫通孔チップに取り付けることができる他の裏材構成要素から選択される。さらなる実施形態では、試料デバイスは、第２のマルチウェルデバイスを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、流体コンジットは、液体を運ぶことができるチューブまたは他の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、チューブは可撓性チューブまたは剛性チューブである。他の実施形態では、複数の流体コンジットは、少なくとも５個・・・１０個・・・２５個・・・４５個・・・８３個・・・９６個・・・１００個・・・２００個・・・３８４個・・・１５３６個・・・３０００個・・・または５００個の流体コンジットを含む。他の実施形態では、抽出デバイスガスケットは、変形可能な弾性材（たとえばゴム、シリコーン、変形可能なプラスチック等）を含む。特定の実施形態では、抽出ガスケットは、レーザー加工されたシリコーンを含む。他の実施形態では、複数のガスケット開口部は、少なくとも５個・・・１０個・・・２５個・・・４５個・・・８３個・・・９６個・・・１００個・・・２００個・・・３８４個・・・１５３６個・・・３０００個・・・または５００個のガスケット開口部を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、密封は水密である。いくつかの実施形態では、試料デバイスは、抽出デバイスガスケットと物理的に接触し整合し、抽出デバイスガスケットは抽出デバイスと接触し整合する。
【００１６】
さらなる実施形態では、装置はさらに、ｄ）複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含む、マルチウェル試料収集デバイスを含み、マルチウェル試料収集デバイスが抽出デバイスと接触し整合すると、各収集ウェルには流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入され、マルチウェル試料収集デバイスは抽出デバイスと接触し整合する。特定の実施形態では、複数の個々のウェルは、反応試料を収容する。特定の実施形態では、反応試料は、細胞ライセート、細胞、バッファー、ポリメラーゼ分子、核酸分子、バーコード化オリゴヌクレオチド、及び検出可能な標識分子からなる群より選択される少なくとも１つの構成要素を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、方法を提供し、この方法は、ａ）ｉ）抽出デバイスガスケットの第１の面を、マルチウェルデバイスのウェル面と接触させること（ここでマルチウェルデバイスは複数の別々のサブアレイを含み、各別々のサブアレイは反応試料を収容する複数の個々の試料ウェルを含み、抽出デバイスガスケットは、マルチウェルデバイスの複数の別々のサブアレイと一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を含む）、ｉｉ）抽出デバイスガスケットの第２の面を、抽出デバイスの第１の面と接触させること（ここで抽出デバイスは複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含み、各流体コンジット開口部は流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化され、複数の流体コンジット開口部は、抽出デバイスガスケットの複数のガスケット開口部と一対一で合致し整合する）、及びｉｉｉ）抽出デバイスの第２の面をマルチウェル試料収集デバイスと接触させること（ここでマルチウェル試料収集デバイスは、複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを含み、各収集ウェルには、流体コンジットのうちの１つが少なくとも部分的に挿入される）により、組立体を形成すること、及びｂ）個々の試料ウェル内の反応試料が、ｉ）複数のガスケット開口部、ｉｉ）複数の流体コンジット開口部、及びｉｉｉ）複数の流体コンジットを通って複数の収集ウェルに沈着するように、組立体を処理すること（ここで各収集ウェルは、別々の１つのサブアレイの個々のウェルから反応試料を受ける）を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通孔デバイス及び裏材を含み、該裏材は、該裏材がウェル底を形成して孔がウェルになるように、マルチウェル貫通孔デバイスの片面に取り付けられる。特定の実施形態では、組立体を処理することには、組立体の遠心分離が含まれる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、反応試料は、細胞ライセート、細胞、バッファー、水、ポリメラーゼ分子、核酸分子、バーコード化オリゴヌクレオチド、及び検出可能な標識分子からなる群より選択される少なくとも１つの構成要素を含む。他の実施形態では、抽出ガスケットは、抽出デバイスとマルチウェルデバイスの間に密封を形成する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、方法を提供し、この方法は、ａ）それぞれ少なくとも２つの反応容器（たとえば少なくとも２・・・１０・・・１００・・・１０００）を含む第１及び第２のサブアレイを提供すること、ｂ）第１及び第２の両方のサブアレイの少なくとも２つの反応容器それぞれに、各反応容器に（多細胞ではなく）１細胞だけが存在するように（または多細胞が各反応容器に存在するように）、単細胞（または多細胞）を分注すること、ｃ）第１及び第２の両方のサブアレイの少なくとも２つの反応容器それぞれに、ｉ）ＲＮＡ配列（たとえばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔｎｓｉＲＮＡ、またはｒａｓｉＲＮＡ）が単細胞（または多細胞）から放出される（ここで各ＲＮＡ配列はコードまたは機能的領域を含む）ような溶解試薬、ｉｉ）Ａ）ポリＴ領域またはＲＮＡ特異的領域、及びＢ）第１の５’尾部領域を含む、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド、ｉｉｉ）鋳型乗換えオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）のプールであって、各ＴＳＯはＡ）３’ポリＧ領域、Ｂ）ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、及びＣ）第２の５’尾部領域を含む、ＴＳＯのプール、及びｉｖ）鋳型乗換え可能な逆転写酵素を含む、逆転写酵素試薬を加えること、ｄ）第１及び第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器それぞれを、各反応容器内で逆転写酵素によって第１の鎖ｃＤＮＡが生成されるような条件下で処理すること（ここで各第１の鎖ｃＤＮＡは、ｉ）第１の５’尾部領域、ｉｉ）ポリＴ領域またはＲＮＡ特異的領域、ｉｉｉ）コードまたは機能的領域の相補配列、及びｉｖ）ＴＳＯのうちの１つの相補配列を含む）、ｅ）第１及び第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器内のそれぞれに第１の指標プライマー及び第１のリバースプライマーを分注すること（ここで各第１の指標プライマーは、Ａ）第２の５’尾部領域と少なくとも９０％の同一性を有する配列、Ｂ）第１のバーコード配列、及びＣ）第３の５’尾部領域を含み、各第１のリバースプライマーは、第１の５’尾部領域と少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の同一性を有する配列を含み、第１のバーコード配列は第１のサブアレイの少なくとも２つの反応容器の全部で異なっており、第１のバーコード配列は第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器の全部で異なっている）、ｆ）第１及び第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器のそれぞれを、バーコード化二本鎖ＤＮＡが生成されるような条件下で処理すること（ここで第１のサブアレイの少なくとも２つの反応容器内のバーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能であり、第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器内のバーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能である）、及びｇ）バーコード化二本鎖ＤＮＡを第１のサブアレイの少なくとも２つの反応容器から第１のサブアレイ容器へとプールすること、及びバーコード化二本鎖ＤＮＡを第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器から第２のサブアレイ容器へとプールすることを含む。特定の実施形態では、細胞から放出され増幅されるＲＮＡの代わりに、（適切なポリメラーゼ及びプライマーを用いて）ＤＮＡが放出され増幅される。
【００２１】
特定の実施形態では、方法はさらに、ｈ）転位試薬を第１及び第２のサブアレイ容器それぞれに分注することを含み、該転位試薬は、Ａ）トランスポゾン末端配列（たとえばＴＮ５モザイク末端配列）、第２のバーコード配列、及び第４の５’尾部領域を含む、第１の転位配列、Ｂ）トランスポゾン末端配列と少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の同一性を有する配列を含む、第２の転位配列、及びＣ）トランスポサーゼ酵素を含む。さらなる実施形態では、方法はさらに、ｉ）第１の転位配列がバーコード化二本鎖ＤＮＡの一本の鎖の末端に付加されて第１及び第２のサブアレイ容器それぞれで二重バーコード化鋳型配列が生成されるような条件下で第１及び第２のサブアレイ容器を処理することを含む。さらなる実施形態では、方法はさらに、ｊ）二重バーコード化鋳型配列を第１及び第２のサブアレイ容器からフルアレイ容器へとプールすることを含み、第１のサブアレイ容器で生じた二重バーコード化鋳型配列は、異なる第２のバーコード配列を有することに基づいて、第２のサブアレイ容器で生じたものと区別可能である。
【００２２】
さらなる実施形態では、方法はさらに、ｋ）増幅試薬をフルアレイ容器に分注することを含み、該増幅試薬は、ｉ）第１の５’尾部領域と少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の配列同一性を有するフォワードプライマー、及びｉｉ）第４の５’尾部領域と少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む。さらなる実施形態では、方法はさらに、ｌ）フルアレイ容器を、増幅反応によってシークエンシング鋳型のシークエンシングライブラリーが生成されるような条件下で処理することを含み、各シークエンシング鋳型は、ｉ）第１及び第２のバーコード配列、またはその相補配列、ｉｉ）ＵＭＩ配列、またはその相補配列、及びｉｉｉ）コード領域または機能的領域のｃＤＮＡ、またはその相補配列を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ｍ）シークエンシング鋳型の少なくとも一部のシークエンシングを含む。さらなる実施形態では、第１及び第２のサブアレイは、同じ試料デバイスの一部である。
【００２３】
特定の実施形態では、試料デバイスは、ｉ）複数の別々のサブアレイを含む第１のマルチウェルデバイスであって、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、第１のマルチウェルデバイス、またはｉｉ）複数の孔を含むマルチウェル貫通孔デバイスであって、裏材と組み合わされると複数の別々のサブアレイを含む第２のマルチウェルデバイスを形成し、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、マルチウェル貫通孔デバイス、のどちらかである。特定の実施形態では、各別々のサブアレイの複数の個々の試料ウェルは、少なくとも５つの個々の試料ウェル（たとえば少なくとも１０個・・・５０個・・・１００個・・・１０００個・・・またはそれ以上）を含む。他の実施形態では、第１サブアレイと第２のサブアレイとは、別々のデバイスに配置されている。
【００２４】
特定の実施形態では、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチドの第１の５’尾部は、シークエンシングアダプターである（たとえば次世代シークエンシングプロトコルで固相支持体に結合するために適している）。さらなる実施形態では、ＴＳＯのプールは、所与の単細胞からの大半または全部のＲＮＡ配列（たとえばｍＲＮＡ配列）が異なるＵＭＩで標識されるほど十分に大きい。特定の実施形態では、各ＵＭＩは、少なくとも４つ、または５つ、または６つ、または７つのランダムヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、第１のバーコード配列は、少なくとも４、５、６、または７ヌクレオチド長である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、第１及び第２のサブアレイは、同じ試料デバイスの一部であり、ステップｇ）のプールすることは、抽出デバイス及び抽出ガスケットを用いて実現される。さらなる実施形態では、抽出デバイスは、複数の流体コンジット開口部及び複数の流体コンジットを含み、各流体コンジット開口部は流体コンジットのうちの１つに取り付けられるかまたは一体化されている。さらなる実施形態では、抽出デバイスガスケットは上面と下面とを有し、抽出デバイスは、試料デバイスの第１及び第２のサブアレイ、及び抽出デバイスの複数のコンジット開口部の両方と一対一で合致し整合する、複数のガスケット開口部を含む。さらなる実施形態では、ステップｇ）のプールする間、抽出ガスケットは、ｉ）上面が試料デバイスと接し整合し、かつｉｉ）下面が抽出デバイスと接し整合することによって、抽出デバイスと試料デバイスとの間に密封を形成する。
【００２６】
特定の実施形態では、第１のアレイ容器及び第２のアレイ容器は、同じ試料デバイスの一部であり、該試料デバイスは、少なくとも１０個・・・５０個・・・９６個・・・３１２個以上のアレイ容器を含む。特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素は、Ｍｏｓ−１、ＨｙｐｅｒＭｕ（登録商標）、Ｔｎ５、Ｔｓ−Ｔｎ５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９、Ｈｅｒｍｅｓ、及びＴｎ７からなる群より選択される。他の実施形態では、第３の５’尾部領域と第１の５’尾部領域とは、同一の配列を有するか、または少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の配列同一性を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、ｍ）シークエンシング鋳型の少なくとも一部のシークエンシングを含む。特定の実施形態では、該シークエンシングにより、複数のシークエンシング鋳型からシークエンシングデータが生成され、特定のシークエンシング鋳型について、ｉ）第１及び第２のバーコードの決定配列、またはその相補配列、ｉｉ）ＵＭＩの決定配列、またはその相補配列、及びｉｉｉ）ｍＲＮＡのコード領域のｃＤＮＡの決定配列の組合せにより、どの特定の細胞が、該特定のシークエンシング鋳型に対応するｍＲＮＡのソースであるかを決定できる。他の実施形態では、ｍＲＮＡのソースである特定の細胞は、試料デバイスの特定の列及び行を出所とし、この特定の行及び列はまた、この特定の細胞を識別するためにも用いられる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ａ）それぞれ少なくとも２つの反応容器を含む第１及び第２のサブアレイを提供すること（ここで少なくとも２つの反応容器はそれぞれバーコード化二本鎖ＤＮＡを収容し、第１のサブアレイの少なくとも２つの反応容器内のバーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能であり、第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器内のバーコード化二本鎖ＤＮＡは、異なる第１のバーコード配列を有することに基づいて互いに区別可能である）、ｂ）バーコード化二本鎖ＤＮＡを第１のサブアレイの少なくとも２つの反応容器から第１のサブアレイ容器へとプールすること、及びバーコード化二本鎖ＤＮＡを第２のサブアレイの少なくとも２つの反応容器から第２のサブアレイ容器へとプールすること、ｃ）転位試薬を第１及び第２のサブアレイ容器それぞれに分注すること（ここで転位試薬は、Ａ）トランスポゾン末端配列、第２のバーコード配列、及び第１の５’尾部領域を含む、第１の転位配列、Ｂ）トランスポゾン末端配列と少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の同一性を有する配列を含む、第２の転位配列、及びＣ）トランスポサーゼ酵素を含む）、ｄ）第１の転位配列がバーコード化二本鎖ＤＮＡの一本の鎖に付加されて第１及び第２のサブアレイ容器それぞれで二重バーコード化鋳型配列が生成されるような条件下で第１及び第２のサブアレイ容器を処理すること、及びｅ）二重バーコード化鋳型配列を第１及び第２のサブアレイ容器からフルアレイ容器へとプールすること（ここで第１のサブアレイ容器で生じた二重バーコード化鋳型配列は、異なる第２のバーコード配列を有することに基づいて、第２のサブアレイ容器で生じたものと区別可能である）を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、プールすることは、本明細書で説明するマルチウェルデバイス及びマルチウェルガスケットを用いて実現される。
【００２９】
特定の実施形態では、方法はさらに、ｆ）増幅試薬をフルアレイ容器に分注することを含み、該増幅試薬は、ｉ）フォワードプライマー、及びｉｉ）第１の５’尾部領域と少なくとも８０％・・・８５％・・・９０％・・・または９５％の配列同一性を有するリバースプライマーを含む。他の実施形態では、方法はさらに、ｇ）フルアレイ容器を、増幅反応によりシークエンシング鋳型のシークエンシングライブラリーが生成されるような条件下で処理することを含む。さらなる実施形態では、各シークエンシング鋳型は、ｉ）第１及び第２のバーコード配列、またはその相補配列、及びｉｉ）ＲＮＡ配列（たとえばｍＲＮＡ配列）からのコードまたは機能的領域の核酸配列、またはその相補配列を含む。他の実施形態では、方法はさらに、ｈ）シークエンシングライブラリーの少なくとも一部のシークエンシングを含む。さらなる実施形態では、各バーコード化二本鎖ＤＮＡは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む。
【００３０】
さらなる実施形態では、第１及び第２のサブアレイは、同じ試料デバイスの一部である。特定の実施形態では、試料デバイスは、ｉ）複数の別々のサブアレイを含む第１のマルチウェルデバイスであって、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、第１のマルチウェルデバイス、またはｉｉ）複数の孔を含むマルチウェル貫通孔デバイスであって、裏材と組み合わされると複数の別々のサブアレイを含む第２のマルチウェルデバイスを形成し、各別々のサブアレイは複数の個々の試料ウェルを含む、マルチウェル貫通孔デバイス、のどちらかである。特定の実施形態では、各別々のサブアレイの複数の個々の試料ウェルは、少なくとも１０個・・・５０個・・・１００個または１０００個の個々の試料ウェルを含む。いくつかの実施形態では、第１サブアレイと第２のサブアレイとは、別々のデバイスに配置されている。
【００３１】
特定の実施形態では、多数の個々のウェルに収容された核酸のウェル特異的バーコーディング、ならびにそのようなバーコーディングを用いる装置及び方法を提供する。具体的には、核酸は、マルチウェルアレイのウェルの行及び列を示す少なくとも第１及び第２のバーコード配列を受ける。
【００３２】
本明細書で説明する実施形態の用途は、たとえば、多数の個別の試料容量中の核酸をユニーク標識して、核酸の追跡、モニタリング、結果の相関決定等、及びそれを使って実施される実験やアッセイを可能にすることである。たとえば、いくつかの実施形態では、核酸を含む試料をマルチウェルアレイの各ウェル（またはウェルのサブセット）に沈着させる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明する方法及び組成物を用いて核酸を標識する前か後に、各ウェルの試料を試薬及び／または条件（たとえば同じかもしくは異なる条件）に曝露する。次に各ウェルからの試料を合わせてバッチ処理及び／または分析することができる。各核酸はソース標識されているので、どの特定の核酸の結果でも、それが由来するウェルと相関付けることができる。本明細書の実施形態は、プレートの各ウェルにユニーク標識を提供するために必要な核酸標識の数を減少させる。たとえば、３８４ウェルプレートの各ウェルの核酸をユニーク標識するには、３８４個のユニーク核酸標識を生成しなければならない。それを既存の標識ストラテジーを用いる核酸増幅技法により行うには、それぞれがユニークバーコード配列を含む３８４個の異なるプライマーが必要になり得る。しかし、本明細書で説明する実施形態を用いれば、各ウェルの核酸は、ウェルの行を識別する第１のプライマー及びウェルの列を識別する第２のプライマーにより増幅されるので、各ウェルにユニーク標識を提供するためのユニークプライマーの数は３８４から４０に減少する。このストラテジーの有用性は、フォーマットが拡大されるほど重大になる。たとえば、本明細書の実施形態を５１８４ウェルチップ（たとえば７２×７２）の核酸の標識に用いる場合、ユニークバーコーディングプライマーの数は５１８４から１４４に減少する。いくつかの実施形態では、複数のアレイ（たとえば複数の表面にあるアレイ）が用いられる場合、追加のアレイ特異的（または表面特異的）バーコード（たとえば第１または第２のプライマー上にある）を含むことができる。いくつかの実施形態では、追加のウェル（たとえば３８４、５１８４等）のアレイ全体が、たった１つの追加のプライマーまたはバーコードの含有により、ユニーク標識される。本明細書の実施形態は、多数の核酸収容ウェルのウェル特異的標識化のコストと労力とを大幅に軽減するものである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ウェルの行及び列を含むマルチウェルアレイを含む装置を提供し、該マルチウェルアレイの各ウェルは核酸を収容し、各ウェルの核酸は該ウェルの行に特異的な第１の核酸バーコードで標識され、各ウェルの核酸は該ウェルの列に特異的な第２の核酸バーコードで標識される。いくつかの実施形態では、該マルチウェルアレイの各ウェルの核酸は、異なる単細胞から生成されたｃＤＮＡを含み、各ウェルのｃＤＮＡは該ウェルの行に特異的な第１の核酸バーコードで標識され、各ウェルのｃＤＮＡは該ウェルの列に特異的な第２の核酸バーコードで標識される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ウェルの行及び列を含むマルチウェルアレイを含む装置を提供し、該マルチウェルアレイの各ウェルは、（ｉ）該ウェルの行に特異的な第１の核酸バーコードで標識された第１のプライマー、及び（ｉｉ）該ウェルの列に特異的な第２の核酸バーコードで標識された第２のプライマーを収容する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、（ａ）マルチウェルアレイであって、該マルチウェルアレイのウェルが行と列とに配列されている、マルチウェルアレイ、（ｂ）第１のプライマーセットであって、該第１のプライマーセットのプライマーは、マルチウェルアレイの各行の個別の配列を含む行特異的バーコード配列を有する、第１のプライマーセット、及び（ｃ）第２のプライマーセットであって、該第２のプライマーセットのプライマーは、マルチウェルアレイの各行の個別の配列を含む列特異的バーコード配列を有する、第２のプライマーセットを含む、装置またはキットを提供する。いくつかの実施形態では、マルチウェルアレイの各ウェルは、（ｉ）第１のプライマーセットからの第１のプライマーであって、マルチウェルアレイのウェルの行に対応する行特異的バーコード配列を含む、第１のプライマー、（ｉｉ）第２のプライマーセットからの第２のプライマーであって、マルチウェルアレイのウェルの列に対応する列特異的バーコード配列を含む、第２のプライマーを収容する。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートの各ウェルは、行特異的バーコード配列と列特異的バーコード配列とのユニークな組合せを有するプライマーペアを収容する。いくつかの実施形態では、第１のプライマーセットのプライマーは、行特異的バーコード配列だけが異なる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーセットのプライマーは、列特異的バーコード配列だけが異なる。いくつかの実施形態では、第１のプライマーセットのプライマー及び第２のプライマーセットのプライマーはさらに、標的核酸と同一のまたは相補的配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のプライマーセットのプライマー及び第２のプライマーセットのプライマーはさらに、該プライマーにより増幅された核酸のシークエンシング用配列を含む。いくつかの実施形態では、装置またはキットはさらに、核酸増幅用の追加の試薬を含む。いくつかの実施形態では、核酸増幅用の追加の試薬は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー、ＭｇＣｌ2 、及びホスホヌクレオチドキナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、装置またはキットはさらに、核酸分析用の追加の試薬を含む。いくつかの実施形態では、核酸分析用の追加の試薬は、ハイブリダイゼーション試薬、捕捉試薬、シークエンシング試薬、及び検出試薬からなる群より選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、マルチウェルアレイのウェルに収容された標的核酸のウェル特異的標識化の方法を提供し、この方法は、（ａ）マルチウェルアレイの各ウェルに、行特異的バーコード配列を含む行特異的プライマーを接触させること、（ｂ）マルチウェルアレイの各ウェルに、列特異的バーコード配列を含む列特異的プライマーを接触させること、（ｃ）行特異的バーコード配列及び列特異的バーコード配列が各ウェルの増幅された核酸に組み込まれるような条件下で標的核酸を増幅させて、増幅された核酸を産生することを含む。いくつかの実施形態では、各列の全ウェルに、同一の列特異的バーコード配列を有する列特異的プライマーを接触させるが、各列特異的プライマーは、異なる列特異的バーコード配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、異なる列の列特異的プライマーは、列特異的バーコード配列だけが異なる。いくつかの実施形態では、各行の全ウェルに、同じ行特異的プライマーを接触させるが、各行特異的プライマーは異なる行特異的バーコード配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、異なる行の行特異的プライマーは、行特異的バーコード配列だけが異なる。いくつかの実施形態では、行特異的プライマー及び列特異的プライマーはさらに、標的核酸と同一のまたは相補的配列を含む。いくつかの実施形態では、行特異的プライマー及び列特異的プライマーはさらに、増幅された核酸のシークエンシング用の配列を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、細胞集団中の複数の単細胞中の標的核酸を分析する方法を提供し、この方法は、（ａ）単細胞または単細胞からのライセートを、マルチウェルアレイの全部または一部のウェル内に沈着させることであって、その結果として各ウェルは異なる単細胞からの物質を収容する、沈着させること、（ｂ）各ウェル内に、（ｉ）第１のプライマーセットからの第１のプライマーであって、マルチウェルアレイのウェルの行に対応する行特異的バーコード配列を含み、第１のプライマーセットのプライマーは行特異的バーコード配列だけが異なっている、第１のプライマー、及び（ｉｉ）第２のプライマーセットからの第２のプライマーであって、マルチウェルアレイのウェルの列に対応する列特異的バーコード配列を含み、第２のプライマーセットのプライマーは列特異的バーコード配列だけが異なっている、第２のプライマーを沈着させること（ここで第１のプライマーセットまたは第２のプライマーセットのプライマーはさらに、複数の単細胞の標的核酸の一部に相補的な配列を含み、第１のまたは第２のプライマーセットの他方はさらに、複数の単細胞の標的核酸の一部と同一の配列を含む）、（ｃ）第１のプライマー及び第２のプライマーを用いて各ウェルで標的核酸を増幅して増幅された核酸を産生すること（ここで増幅された核酸は、増幅された核酸が増幅されたウェルの行及び列に対応する行特異的バーコード配列及び列特異的バーコード配列を含む）、及び（ｄ）増幅された核酸を分析すること（ここで分析の結果を増幅された核酸が増幅されたウェルと相関付けることができる）を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）との間に、増幅された核酸をウェルから１つの容器へとプールするステップを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ステップ（ａ）の後に、細胞を溶解するステップを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸はｍＲＮＡであり、さらに、標的核酸の一部に相補的な配列を含むプライマーを用いて標的核酸を逆転写するステップ（ｂ）及び（ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、分析することは、シークエンシング、プローブハイブリダイゼーション、及び捕捉からなる群より選択される技法を含む。
【００３８】
特定の実施形態では、マルチウェルアレイの別々のウェルでのプライマー依存性増幅反応で産生された複数の核酸増幅産物を含む組成物を提供し、各核酸増幅産物は、第１の増幅プライマーが提供する列特異的バーコード、第２の増幅プライマーが提供する行特異的バーコードを有し、マルチウェルアレイの同じ行のウェルで産生された各核酸増幅産物は、同じ行特異的バーコードを含み、異なる行のウェルで産生された核酸増幅産物は、異なる行特異的バーコードを含み、マルチウェルアレイの同じ列のウェルで産生された各核酸増幅産物は、同じ列特異的バーコードを含み、異なる列のウェルで産生された核酸増幅産物は、異なる列特異的バーコードを含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、複数の核酸増幅産物が、少なくとも第１の列、第２の列、第３の列、第４の列、第１の行、第２の行、第３の行、及び第４の行を有するグリッドとして配列されたウェルで産生され、該複数の核酸増幅産物は、（ａ）第１の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、（ｂ）第１の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、（ｃ）第１の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、（ｄ）第１の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード、（ｅ）第２の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、（ｆ）第２の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、（ｇ）第２の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、（ｈ）第２の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード、（ｉ）第３の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、（ｊ）第３の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、（ｋ）第３の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、（ｌ）第３の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコード、（ｍ）第４の列特異的バーコード及び第１の行特異的バーコード、（ｎ）第４の列特異的バーコード及び第２の行特異的バーコード、（ｏ）第４の列特異的バーコード及び第３の行特異的バーコード、ならびに（ｐ）第４の列特異的バーコード及び第４の行特異的バーコードを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】複数の個々のウェル２８を有する、複数の別々のサブアレイ（１つのサブアレイ２６に目印をつけている）を有する、マルチウェルデバイス２５（たとえばマルチウェルチップ）の図である。あるいは、ウェルの代わりに貫通孔２８とされる場合は、図１はマルチウェル貫通孔デバイス２８を示すことになる。整合用構成要素７０を有するマルチウェルデバイス２５を図示する。図１はまた、複数の表面分割部２９も示しており、これらは一緒に各サブアレイを他のサブアレイから物理的に隔離し、またガスケットにマルチウェルチップと係合する場所を提供するので、液体反応試料が個々のアレイから移動する際に各サブアレイが他のサブアレイから流体隔離される。
【図２】マルチウェル貫通孔デバイス３０、抽出デバイスガスケット４０、抽出デバイス５０、及びマルチウェル試料収集デバイス６０（収集ウェル６５を有する標準９６ウェルプレートを図示する）で構成される、例示的マルチウェルプーリング組立体１０の頂面側斜視図である。マルチウェル貫通孔デバイス３０に裏材２０を取り付けてウェルを形成することができ、そうすることでマルチウェルデバイスを作製できる。抽出デバイスガスケット４０は、複数のガスケット開口部４５を有する（９６個の開口部が図面では例示されている）。抽出デバイス５０は、複数の流体コンジット開口部５５を有する（９６個の流体コンジット開口部が図面では例示されている）。また、各主要構成要素に存在し、そのような構成要素が互いに接続した際に適切に整合することを可能にする連結構成要素７０も図示している。
【図３】マルチウェル貫通孔デバイス３０、抽出デバイスガスケット４０、抽出デバイス５０、及びマルチウェル試料収集デバイス６０（標準９６ウェルプレートを図示する）で構成される、例示的マルチウェルプーリング組立体１０の底面側斜視図である。マルチウェル貫通孔デバイス３０に裏材２０を取り付けてウェルを形成することができ、そうすることでマルチウェルデバイスを作製できる。抽出デバイス５０は、複数の流体コンジット５６を有しており、これらはマルチウェル試料収集デバイス６０の複数の収集ウェルに部分的に挿入されてもよい。
【図４−１】たとえば特定の元のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえばｍＲＮＡ配列または他のＲＮＡ配列）のウェル／単細胞起源を決定するためのシークエンシング方法で用いることができる、二重バーコーディング、二重プーリング、及び増幅方法の例示的ワークフローである。
【図４−２】たとえば特定の元のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえばｍＲＮＡ配列または他のＲＮＡ配列）のウェル／単細胞起源を決定するためのシークエンシング方法で用いることができる、二重バーコーディング、二重プーリング、及び増幅方法の例示的ワークフローである。
【図５】単細胞の全トランスクリプトーム分析用の単細胞ＲＮＡバーコーディング及びシークエンシング（ＳＣＲＢ−Ｓｅｑ）の例示的方法の模式図である。この方法では、細胞は、ＦＡＣＳ機器により３８４ウェルプレートの個々のウェルに分別された後、細胞溶解培地中で直ちに凍結される。細胞をプロテイナーゼＫで溶解してから、メッセージのポリＡ末端から逆転写させる（３’プライマー）。５’プライマーは、１０４８５７６通りのユニークな組合せを生む１０個のランダムヌクレオチドのユニーク分子識別子（ＵＭＩ）、及び６ヌクレオチドのウェルバーコード配列を有する。６ヌクレオチドのウェルバーコード配列は、各細胞の識別性を提供する。ＵＭＩは、各試料の多様性の尺度を提供する。第２のプライマー（５’プライマー−転写物の５’）が、合成された第１の鎖の３’末端にＣＣＣを付加するトランスクリプターゼの能力を利用して、ワンステップで試料に加えられる。これは鋳型乗換え法である。第２の鎖が合成されると、３８４ウェルプレートの全ウェルからの産物がプールされ、１つの試料として処理される。片側トランスポゾンベースのライブラリー（Ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ）のＮｅｘｔｅｒａライブラリー調製物は、３８４ウェルプレートのプール試料の各セットの識別性を提供する。
【図６】７２×７２ウェル配置での例示的標識スキームである。（Ａ）ウェルの列によりそれぞれ個別にバーコード化された第１のプライマー、及びウェルの行によりそれぞれ個別にバーコード化された第２のプライマーを各ウェルに分注する。（Ｂ）（Ａ）のグリッドの例示的１０×６マトリックスである。わずか１６個のプライマー（Ａ〜Ｆ及び１〜１０）を用いてマトリックスの全６０個のウェルをユニーク標識する（たとえばＣ７、Ｆ６等）。
【図７】本発明の実施形態で用いられる例示的プライマーの設計スキームである。プライマー１（たとえば行または列特異的プライマー）は、２０〜３０オリゴｄＴのストリング、ランダムな１０ヌクレオチドのユニーク分子識別子配列、その行または列のユニークな６〜８ヌクレオチドのバーコード配列、及びシークエンシング用プライマー配列を有する。プライマー２（たとえば列または行特異的プライマー）は、３’末端にランダムな６ヌクレオチドの配列を有し、続いてその行または列のユニークな６〜８塩基のバーコード配列、及びもう一方のシークエンシング用プライマー配列を有する。この実施形態では、プライマー２の３’末端は、プライマー１とプライマー２とが逆転写中の反応初期に加えられる場合、ＰＯ4 分子によりブロックされる。プライマー２上のブロックは、該プライマーが逆転写反応に加わることを防止する。第１の鎖の合成が完了すると、逆転写酵素が不活化され、プライマー２のブロックが外れ、第２の鎖の合成に利用できるようになる。プライマー２を第１の鎖の合成後に加える場合は、プライマー２はブロックされていない。
【図８】列及び行特異的バーコード化プライマーを用いて単細胞から全トランスクリプトームライブラリーを調製するための例示的スキームである。
【図９】Ｕ９３７細胞と図３に示すプライマー１及びプライマー２とのセットから生成された産物核酸の高感受性バイオ分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
定義
本明細書では、「別々のサブアレイ」は、個別のウェルで構成される、マルチウェルデバイスのサブアレイを指し、該サブアレイは互いに離間しているので、ガスケットがマルチウェルデバイスと係合すると、ガスケットはマルチウェルデバイスと密封を形成することができ、液体が個々のアレイから移動する際に各サブアレイは他のサブアレイから流体隔離される。図１は、１００個の個々のウェルで構成されるサブアレイ２６の一例を提示している。サブアレイ２６は、マルチウェルデバイスの９６個のサブアレイのうちの１つであり、比較的広いウェル無し表面分割部２９がサブアレイ２６を他のサブアレイから分離しているので、他のサブアレイからは離間しているのがわかる。様々なサブアレイを分離している表面分割部は、ガスケットに、係合して各サブアレイを他のサブアレイから流体隔離するための表面を提供している。
【００４２】
本明細書では、「表面」という用語は、あらゆる表面または基板（たとえばプレート、チップ、ビーズ等）を広く指す。本明細書では、「マルチウェル表面」は、別々の試料容量を収容し混合を防止できる複数の別々に画定されたもしくは仕切られたチャンバまたはつながっていないスペースを有する、あらゆる表面を指す。チャンバ、すなわち「ウェル」は、一般には外環境に対して開口している（たとえば「開口ウェル」）が、スリップ、スライド、カバー、ブリスター等で覆われることもできる。
【００４３】
本明細書では、「バーコード」という用語は、該バーコードが関連付けられているポリヌクレオチドの何らかの特徴の識別を可能にする核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、識別されるポリヌクレオチドの特徴は、該ポリヌクレオチドが由来する試料（たとえば細胞）または（たとえばマルチウェルデバイスの）ウェルである。いくつかの実施形態では、バーコードは、約または少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、バーコードのヌクレオチド長は、１０、９、８、７、６、または５ヌクレオチドよりも短い。いくつかの実施形態では、いくつかのポリヌクレオチドと関連付けられたバーコードは、他のポリヌクレオチドと関連付けられたバーコードと長さが異なっている。一般に、バーコードは、関連付けられたバーコードに基づき試料の識別ができるように、十分な長さであり、十分に異なる配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、複数のバーコードのうちの各バーコードは、該複数の他のどのバーコードとも（たとえば、少なくとも１つのヌクレオチド位置、たとえば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド位置が）異なる。試料プール中、複数のバーコードが提示されることもあり、各試料は、該プールの他の試料に由来するポリヌクレオチドに含まれるバーコードとは異なる１つ以上のバーコードを含むポリヌクレオチドを含んでいる。１つ以上のバーコードを含むポリヌクレオチドの試料をプールすることができ、次いでこれらに結合しているバーコード配列に基づき識別することができる。一般に、バーコードは、標的ポリヌクレオチドに結合すると該標的ポリヌクレオチドが由来する試料またはウェル及び／またはサブアレイの識別子として働く核酸配列を含む。
【００４４】
本明細書では、「プライマー」という用語は、ヌクレオチド配列を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法で用いることができる、オリゴヌクレオチドを指す。一般に、ポリヌクレオチド配列の増幅用のＰＣＲプライマーのうちの少なくとも１つは、そのポリヌクレオチド配列に対して配列特異的である。プライマーの実際の長さは、温度、プライマーのソース、及び用いられる方法といった多くの要因による。たとえば、診断及び予防の用途では、標的配列の複雑さによって、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に少なくとも１０個、または１５個、または２０個、または２５個以上のヌクレオチドを含むが、それよりも多いか少ないヌクレオチドを含む場合もある。プライマーの適切な長さの決定に関する要因は、当業者であれば容易にわかる。
【００４５】
本明細書では、「プライマーペア」または「プライマーのペア」という用語は、２つのプライマー、つまりフォワードプライマーとリバースプライマーとを指し、適切な条件下で適切な標的核酸に曝露すると、標的核酸の一部を増幅するために用いることができる。
【００４６】
本明細書では、「プライマーセット」または「プライマーのセット」という用語は２つ以上のプライマーを指し、これらは全長にわたって配列が同一というわけではなく（たとえば異なるバーコード配列またはＵＭＩを含む）、増幅反応で標的核酸の同じハイブリダイゼーション部位に結合し、同じ役割を果たす（たとえばフォワードプライマー、リバースプライマー等）。
【００４７】
本明細書では、「アレイ」という用語は、複数の同じものの整列を指す。たとえば、「マルチウェルアレイ」は、複数のウェルの整列を指す。本明細書の実施形態では、マルチウェルアレイのウェルは、ある数の列（Ｘ）と行（Ｙ）に配列されて、ウェルのＸ／Ｙグリッドをなしている。
【００４８】
詳細な説明
本明細書では、マルチウェルデバイスの別々のサブアレイから、マルチウェル試料収集デバイスの収集ウェルへと試料をプールするための装置及び方法を提供する（たとえば９６００ウェルチップの１００ウェルサブアレイ中の試料を、９６ウェルプレートの１つの収集ウェルにプールすることを可能にする）。特定の実施形態では、この装置は、ｉ）マルチウェルデバイス、ｉｉ）抽出デバイス、及びｉｉｉ）抽出デバイスガスケットで構成されている。本明細書ではまた、本明細書で説明する抽出デバイスを用いることができる、二重バーコーディング、プーリング（たとえば二重プーリング）、ＲＮＡ増幅方法（たとえば単細胞分析のため）を提供する。
【００４９】
特定の実施形態では、装置は、ｉ）別々のサブアレイとしてまとめられた複数の個々の試料ウェルを有する、マルチウェルデバイス、ｉｉ）複数の流体コンジット開口部に取り付けられた複数の流体コンジットを有する、抽出デバイス、及びｉｉｉ）複数の別々のサブアレイと複数のコンジット開口部との両方と一対一で合致し整合する複数のガスケット開口部を有する、抽出デバイスガスケットで構成されている。いくつかの実施形態では、装置はさらに、ｉｖ）該複数の流体コンジットと一対一で合致し整合する複数の収集ウェルを有する、マルチウェル試料収集デバイスを含んでいる。
【００５０】
Ｉ．例示的装置
いくつかの実施形態では、マルチウェルデバイスの別々のサブアレイから、マルチウェル試料収集デバイスの収集ウェルへと試料をプールするための装置を提供する。例示的な装置の構成要素を図１〜図３に示す。図では、マルチウェルデバイスの９６個のサブアレイ、及びマルチウェル試料収集デバイスの９６個の収集ウェルが用いられている。あらゆる他の数の、たとえば５・・・１５・・・１００・・・５００・・・１０００・・・５０００個以上のサブアレイ及び対応する収集ウェルを用いてもよい。
【００５１】
図１は、複数の個々のウェル２８を有する、複数の別々のサブアレイ（１つのサブアレイ２６に目印をつけている）を有する、マルチウェルデバイス２５（たとえばマルチウェルチップ）を示す。これらの図では、各サブアレイ２６は、１０×１０の試料ウェルのアレイ（全部で１００個の試料ウェル）として図示されている。サブアレイは、他の数の、たとえば５・・・２５・・・２５０・・・５００・・・１０００個、またはそれ以上の試料ウェルを有していてもよい。サブアレイ２６は四角形として図示している。サブアレイは、四角形、円形、星形、三角形、またはその他の形状など、あらゆるタイプの形状を有することができる。ウェルの代わりに貫通孔２８とされる場合は、図１はマルチウェル貫通孔デバイス２８を示すことになる。貫通孔デバイスは、ＰＣＲフィルムなどの裏材と組み合わせて、複数の個々の孔を有するマルチウェルデバイスを作製することもできる。マルチウェルデバイス（及びマルチウェル貫通孔デバイス）は、アルミニウム、アルミニウム合金、または他のタイプの金属などの任意の好適な基板で構成することができ、図１に示すように平坦なチップとすることができる。図１では、マルチウェルデバイス２５は、マルチウェルチップと装置の他の構成要素との整合を可能にする整合用構成要素７０を有して図示されている。図１はまた、複数の表面分割部２９も示しており、これらは一緒に各サブアレイを他のサブアレイから物理的に隔離し、またガスケットにマルチウェルチップと係合する場所を提供するので、液体反応試料が個々のアレイから移動する際に各サブアレイが他のサブアレイから流体隔離される。そのような表面分割部２９は、マルチウェルデバイスの表面と面一であってもよいし、またはガスケットがそれらに対して密封できて各サブアレイの周囲に水密な環境を作ることができるならば、隆起していてもよい。
【００５２】
図２は、マルチウェル貫通孔デバイス３０、抽出デバイスガスケット４０、抽出デバイス５０、及びマルチウェル試料収集デバイス６０（収集ウェル６５を有する標準９６ウェルプレートを図示する）で構成される、例示的マルチウェルプーリング組立体１０の頂面側斜視図である。マルチウェル貫通孔デバイス３０に裏材２０を取り付けてウェルを形成することができ、そうすることでマルチウェルデバイスを作製できる。抽出デバイスガスケット４０は、複数のガスケット開口部４５を有する（９６個の開口部が図面では例示されている）。抽出デバイス開口部は、マルチウェルデバイスのサブアレイの形状に概ね合致するあらゆるタイプの形状を有することができる。抽出デバイス５０はプラスチックでも他の好適な材料でできていてもよく、複数の流体コンジット開口部５５（９６個の流体コンジット開口部が図面では例示されている）を有する。抽出デバイスは、５個・・・１０個・・・２５個・・・９６個・・・３５４個・・・１５３６個・・・２０００個またはそれ以上などの、マルチウェルデバイスのサブアレイの数と概ね合致する、様々な流体コンジット開口部を有してもよい。また、各主要構成要素に存在し、そのような構成要素が互いに接続した際に適切に整合することを可能にする連結構成要素７０も図示している。
【００５３】
図３は、マルチウェル貫通孔デバイス３０、抽出デバイスガスケット４０、抽出デバイス５０、及びマルチウェル試料収集デバイス６０（標準９６ウェルプレートを図示する）で構成される、例示的マルチウェルプーリング組立体１０の底面側斜視図である。マルチウェル試料収集デバイスは、あらゆる数の、たとえば５個・・・１０個・・・１５個・・・３６個・・・９６個・・・３５０個・・・１０００個・・・４０００個またはそれ以上のウェルを有することができ、プラスチックでも他の好適な材料でできていてもよい。マルチウェル貫通孔デバイス３０に裏材２０を取り付けてウェルを形成することができ、そうすることでマルチウェルデバイスを作製できる。抽出デバイス５０は、複数の流体コンジット５６を有しており、これらはマルチウェル試料収集デバイス６０の複数の収集ウェルに部分的に挿入されてもよい。流体コンジットは、円形でも丸形でも、または何か他の形状を有していてもよく、可撓性でも剛性でもよい。
【００５４】
ＩＩ．表面／アレイ
本明細書で用いるマルチウェルデバイス（たとえばチップ、プレート等）は、いくつかの実施形態では、貫通孔チップとＰＣＲに使えるフィルムとで作製することができる。マルチウェル貫通孔チップは、たとえば、本明細書で説明する当業界で知られているような（たとえば何百個または何千個のウェルのナノウェルまたはマイクロウェルの）マルチウェルデバイスと同じものであるが、違いは、「ウェル」の開口部が基板を貫通して、ウェルの代わりに孔を形成していることである。マルチウェルデバイスは、マルチウェル貫通孔チップの片面の少なくとも一部または全部の孔をＰＣＲに使えるフィルム（たとえばＴｅｍｐＰｌａｔｅ（登録商標）ＰＣＲシールフィルム；ＶＷＲ  ＰＣＲシールフィルム；ＬＡＢＮＥＴヒートシールフィルム；ＢＲＡＮＤＴＥＣＨ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣシールフィルム；ＡＸＹＧＥＮ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＣＲ−ＳＰシールフィルム等）で覆うことによって、マルチウェル貫通孔チップから形成することができる。
【００５５】
実施形態は、用いられるマルチウェルデバイス（たとえばプレートまたはチップ）のタイプにより限定されない。一般に、そのようなデバイスは、液体を収容する、または収容するような寸法の、複数のウェルを有している（たとえば液体は、重力だけでは流出させることができないようにウェル内に閉じ込められる）。そのようなマルチウェルデバイスは、特定の実施形態では、別々のサブアレイとしてまとめられたウェルを有する。
【００５６】
マルチウェルデバイスの全体的なサイズは様々であり得、たとえば、厚さ数ミクロン〜数センチメートル、幅または長さ数ミリメートル〜５０センチメートルの範囲であり得る。一般に、デバイス全体のサイズは、幅及び／または長さ約１０ｍｍ〜約２００ｍｍ、厚さ約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲である。いくつかの実施形態では、デバイス（たとえばチップ）は、幅約４０ｍｍ×長さ約４０ｍｍ×厚さ約３ｍｍである。
【００５７】
マルチウェルデバイスのウェル（たとえばナノウェルまたはマイクロウェル）の総数は、デバイスが用いられる具体的用途によって変わり得る。アレイのウェル密度は、具体的用途によって変わり得、いくつかの実施形態では、別々のサブアレイを形成する。ウェルの密度、ならびにウェルのサイズ及び体積は、所望の用途、及び諸要因、（たとえば細胞をウェル内に沈着させる実施形態では）たとえば本発明の方法が適用される生物種、ウェル内で実施される反応の種類、検出技法等によって、変わり得る。
【００５８】
本発明は、マルチウェルデバイスのウェル数により限定されない。多数のウェルをデバイスに組み込むことができる。様々な実施形態では、デバイスのウェルの総数は、約１００〜約２０００００、または約５０００〜約１００００（たとえば９６００個のウェル、３５４００個のウェル、または１５３６００個のウェル）である。他の実施形態では、デバイスは小型のチップを含み、それぞれ約５０００〜約２００００個のウェルを含んでいる。たとえば、四角形のチップが、直径０．１ｍｍの、１２５×１２５のナノウェルを含む場合もある。いくつかの実施形態では、マルチウェルデバイスのサブアレイは列と行とに配列されている。マルチウェルデバイスは、任意の好適な数のサブアレイ列、たとえば：２、４、８、１２、１６、２４、３６、４８、６４、７２、９６、１００、１２０、１９６、＞２５０、またはあらゆる数の列（たとえば５０）またはそのなかの範囲（たとえば１６〜９６、４８〜１９６等）を含むことができる。マルチウェルデバイスは、任意の好適な数のサブアレイの行、たとえば：２、４、８、１２、１６、２４、３６、４８、６４、７２、９６、１００、１２０、１９６、＞２５０、または任意の数の行（たとえば５０）またはそのなかの範囲（たとえば１６〜９６、４８〜１９６等）を含むことができる。いくつかの実施形態では、サブアレイの列及び／または行は、行が列に対し直角であるＸ／Ｙグリッドを形成するように配列される。他の実施形態では、行及び／または列は、オフセットしている。そのような実施形態では、列と行とは互いに対し非直角の方向であってもよい（たとえば＜９０°）。他のそのような実施形態では、列及び／または行は、直線ではなくジグザグを形成する場合もある。
【００５９】
マルチウェルデバイスの試料ウェル（たとえばナノウェル）は、任意の便利なサイズ、形状、または体積として作製することができる。ウェルは、長さ約１００μｍ〜約１ｍｍ、幅約１００μｍ〜約１ｍｍ、深さ約１００μｍ〜約１ｍｍの場合もある。様々な実施形態では、各ナノウェルは、アスペクト比（深さ対幅の比）が約１〜約４である。一実施形態では、各ナノウェルは、アスペクト比が約２である。横断面は円形、長円形、卵形、円錐形、長方形、三角形、多角形、または任意の他の形状であってもよい。ウェルの任意所与の深さの横断面は、サイズ及び形状が異なっている場合もある。
【００６０】
特定の実施形態では、試料ウェルの体積は、約０．１ｎｌ〜約１０μｌである。ナノウェルの体積は一般に、１μｌ未満、好ましくは５００ｎｌ未満である。体積は２００ｎｌ未満、または１００ｎｌ未満の場合もある。一実施形態では、ナノウェルの体積は約１００ｎｌである。所望であれば、ナノウェルは、表面積対体積比が大きくなるように作製することができ、そうすることでユニット全体の熱伝導が促進され、それによって熱サイクルのランプ時間を短縮できる。各ウェル（たとえばナノウェル）のキャビティは、様々な構成をとり得る。たとえば、ウェル内のキャビティは、直線または曲線の壁で分割されて、隔離されているが隣接しているコンパートメントを形成することもできるし、または円形の壁で分割されて、内側と外側の環状コンパートメントを形成することもできる。
【００６１】
大きい内表面積対体積比をもつウェルは、所望であれば、該ウェルに収容されている反応物がウェルの内表面と相互作用する可能性を減じるような材料でコーティングすることができる。コーティングは、試薬が内表面と不要に相互作用または付着しやすい場合に特に有用である。反応物の特性によって、疎水性または親水性のコーティングを選択することができる。当業界では様々な適切なコーティング材が利用可能である。そうしたコーティング材には、共有結合的に表面に付着できるものもあるし、非共有結合的な相互作用により表面に結合できるものもある。コーティング材の非限定的な例としては、シリル化試薬、たとえばジメチクロロシラン（ｄｉｍｅｔｈｙｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ）、ジメチジクロロシラン（ｄｉｍｅｔｈｙｄｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ）、ヘキサメチルジシラザンまたはトリメチルクロロシラン、ポリマレイミド、及びシリコーン処理試薬、たとえば酸化ケイ素、ＡＱＵＡＳＩＬ、及びＳＵＲＦＡＳＩＬが挙げられる。追加の好適なコーティング材は、アミノ酸などのブロック剤、またはポリマー、たとえば限定ではないがポリビニルピロリドン、ポリアデニル酸、及びポリマレイミドである。特定のコーティング材は、加熱、照射、及び化学反応により、表面に架橋される場合もある。当業者であれば、マルチウェルデバイスのナノウェルにコーティングするための他の好適な手段を知っており、または過度に実験をしなくてもそれを確認できる。
【００６２】
例示的なマルチウェルデバイス（たとえばチップ）は、厚さ約３．５ｍｍで、ウェルの直径は約６５０μｍ、体積は１μｌの場合がある。マルチウェルデバイス（たとえばチップ）の長さと幅は、ＳＢＳ準拠プレート（たとえば９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレート）と同じかまたはだいたい同じサイズであってもよい。ナノウェルの開口部は、あらゆる形状、たとえば丸形、四角形、長方形、または任意の他の所望の幾何学形状とすることができる。例として、ナノウェルは、約１００μｍ〜約１ｍｍの直径または幅、約１５０μｍ〜約１ｍｍのピッチまたは長さ、及び約１０μｍ〜約１ｍｍの深さを含むことができる。各ウェルのキャビティは、様々な構成をとり得る。たとえば、ナノウェル内のキャビティは、直線または曲線の壁で分割されて、隔離されているが隣接しているコンパートメントを形成することもできる。
【００６３】
マルチウェルデバイスのウェル（たとえばナノウェル）は、たとえば、一般に知られるフォトリソグラフィー技法で形成することができる。ナノウェルは、たとえばウェットＫＯＨエッチング技法、異方性ドライエッチング技法、機械的穴開け、射出成型、及び／または熱形成（たとえばホットエンボス加工）で形成することができる。
【００６４】
特定の実施形態では、試料ウェルの直径は約６５０μｍ、ウェルの体積は約１μｌ、ウェルのピッチは約７５０μｍ（ＳＢＳ準拠）であり、マルチウェルデバイスの厚さは約３．５ｍｍであり、ＳＢＳプレートとだいたい同じサイズである。
【００６５】
ＩＩＩ．試料
いくつかの実施形態では、試料を、マルチウェルアレイデバイスのウェルの全部または一部に収容しまたは沈着させてから、本明細書で説明する装置を用いて収集デバイスにプールする。たとえば、核酸（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ等）を含む試料をウェルに収容しまたは沈着させる。類似または同一の試料が全部または一部のウェル内にある場合もあるし、または個別の試料が異なるウェル内にある場合もある。いくつかの実施形態では、試料には細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、単細胞を各ウェル内に沈着させる。いくつかの実施形態では、ウェルは、細胞ライセートを含む。細胞（単数または複数）の溶解はウェル内で生じるか、または細胞ライセートを（たとえばＷＡＦＥＲＧＥＮ社製マルチサンプル・ディスペンサーを用いて）ウェル内に沈着させる場合もある。特定の実施形態では、単細胞を各ウェル内に沈着させ、次いで細胞をウェル内で溶解させて、各ウェル内で単細胞ライセートを産生する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明する装置及び方法には、試料中の核酸の分析、増幅、及び標識化（たとえばバーコーディング、ＸＹバーコーディング）のための２つ以上のプライマーセットの使用が含まれる。いくつかの実施形態では、プライマーは、マルチウェルデバイスのウェルに加えられる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーの片方または両方が、サブアレイ指示配列（バーコード）、及びウェル特異的指示配列（バーコード）も含んでいる。したがって、複数のサブアレイを有するマルチウェルデバイスを用いる場合、どの核酸でも、それが由来するまたは生成された個々のサブアレイ及びウェルをたどることができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書の実施形態の範囲内のプライマーは、標的ハイブリダイゼーションセグメント及び追加の非相補的セグメントを含んでいる。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイゼーションセグメントは、（１）初回核酸標的（たとえばｍＲＮＡ）内の配列、または（２）１回目の増幅産物（たとえば逆転写により産生された初回ｃＤＮＡ鎖）内の配列に、（たとえば１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、またはそれらの間のあらゆる範囲で）相補的である。いくつかの実施形態では、非相補的セグメントは、プライマーを用いての増幅により産生された核酸産物の分析、捕捉、モニタリング等のための、機能的配列（たとえばシークエンシング用）または標識化配列（たとえばバーコード配列）を含む。いくつかの実施形態では、非相補的セグメントの全部または一部が核酸増幅産物に組み込まれる。非相補的セグメントを増幅産物に組み込んだ結果として、実は、該非相補的セグメントの全部または一部が後続回の標的（たとえば増幅産物）と相補的になる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、プライマーは、シークエンシング用プライマーセグメント（たとえばＰ５（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ；配列番号１）、Ｐ７（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ；配列番号２）等）を含む。いくつかの実施形態では、増幅産物への組込み後、シークエンシング用プライマーセグメントは、（１）増幅産物の（たとえばハイブリダイゼーションによる）捕捉、及び／または（２）シークエンシング反応のプライミングに用いられるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を提供し、したがって増幅産物のシークエンシングを可能にする。シークエンシング用プライマーセグメントは、任意の好適な長さ（たとえば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、またはそれらの間の範囲）とすることができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、プライマーは、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）として働くセグメントを含んでいる。ＵＭＩはランダムな核酸配列であり、プライマーセットの各プライマーにつきユニークである。ＵＭＩは、特定の増幅産物の識別及び／または区別を、これらが同じ反応または反応条件で生成された場合でも、可能にする。ＵＭＩは一般に４〜２０ヌクレオチド長（たとえば４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれらの間の範囲）である。ＵＭＩの長さは、ウェルまたは産生される核酸産物の数に基づき選択することができ、したがって統計的には各プライマーが、及びひいては各核酸産物が、ユニークで区別可能なＵＭＩをもつことになる。単細胞からのｍＲＮＡが７２×７２マルチウェルアレイで増幅されるいくつかの実施形態では、５〜１５個、６〜１４個、７〜１３個、８〜１２個、９〜１１個、または１０個のヌクレオチドのＵＭＩが用いられる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上のバーコーディング配列を含む。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、増幅産物である核酸（たとえば本明細書で説明する装置及び方法を用いてプールされた後）のソースの識別を可能にする核酸セグメントである。たとえば、いくつかの実施形態では、バーコードは、配列決定されたｃＤＮＡを、それが生成された細胞、ウェル、サブアレイ、マルチウェルデバイス、及び／または実験と相関させることを可能にする。いくつかの実施形態では、バーコードは、核酸の１つ以上の特徴、たとえばそれが由来する細胞種、核酸または細胞の曝露条件、それが生成された日、またはそれが生成されたマルチウェルサブアレイ、それが生成されたウェルと相関している。いくつかの実施形態では、プライマー（またはプライマーペア）は、核酸標的に関する複数の情報と相関している複数のバーコード配列を含む。特定の実施形態では、プライマーペアの第１のプライマーは、少なくとも１つのバーコード（たとえばその出所のサブアレイと相関する）を含み、該プライマーペアの第２のプライマーは、少なくとも第２のバーコード（たとえばその出所の個々のウェルと相関する）を含む。特徴指示配列（たとえばバーコード）は、それに基づくソース−ウェル識別を提供するために、任意の好適な長さであってよい。たとえば、いくつかの実施形態では、特徴指示配列（たとえばバーコード）は、３〜１０ヌクレオチド長（たとえば３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれらの間のあらゆる範囲（たとえば４〜８、３〜６等））である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、プライマーは、１つ以上のバーコーディング配列を含む。いくつかの実施形態では、バーコード配列は、増幅産物核酸のソースの識別を可能にする核酸セグメントである。たとえば、いくつかの実施形態では、バーコードは、配列決定されたｃＤＮＡを、それが生成された細胞、ウェル、マルチウェルアレイ、及び／または実験と相関させることを可能にする。いくつかの実施形態では、バーコードは、核酸の１つ以上の特徴、たとえばそれが由来する細胞種、核酸または細胞の曝露条件、それが生成された日、それが生成されたマルチウェルアレイ、それが生成されたウェル、それが生成されたウェルの列、及びそれが生成されたウェルの行と相関している。いくつかの実施形態では、プライマー（またはプライマーペア）は、核酸標的に関する複数の情報と相関している複数のバーコード配列を含む。特定の実施形態では、プライマーペアの第１のプライマーは、少なくとも１つのバーコード（たとえば標的が生成されたウェルの行または列と相関する）を含み、該プライマーペアの第２のプライマーは、少なくとも第２のバーコード（たとえば標的が生成されたウェルの列または行と相関する）を含む。
【００７２】
列、行、表面／チップ／プレートまたは他の特徴の指示配列（たとえばバーコード）は、それに基づくソース−ウェル識別を提供するために、任意の好適な長さであってよい。たとえば、いくつかの実施形態では、列、行、表面／チップ／プレートまたは他の特徴の指示配列は、３〜１０ヌクレオチド長（たとえば３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれらの間のあらゆる範囲（たとえば４〜８、３〜６等））である。ウェルの識別を提供する、行や列等にしたがいバーコード配列を整えるあらゆる系（たとえばパターン、ランダム等）が、本発明の範囲内である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、プライマーペアは、バーコード配列、ＵＭＩ、及び標的ハイブリダイゼーションセグメントを含む第１のプライマーを含んでいる。いくつかの実施形態では、第１のプライマーはさらに、シークエンシング用プライマー（たとえばＰ５またはＰ７）を含んでいる。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイゼーションセグメントは、標的核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）内の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイゼーションセグメントは、標的ｍＲＮＡのポリＡ尾部に相補的なポリＴセグメント（たとえばＴ10-50 ）である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、プライマーペアは、バーコード配列（たとえばＹまたはＸ特異的バーコード）及び標的ハイブリダイゼーションセグメントを含む第２のプライマーを含んでいる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーはさらに、シークエンシング用プライマー（たとえばＰ７またはＰ５）を含んでいる。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの標的ハイブリダイゼーションセグメントは、第１のプライマーと核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）とにより生成された第１の鎖ｃＤＮＡ内の配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの標的ハイブリダイゼーションセグメントは、第１の鎖ｃＤＮＡの３’末端に付加された非鋳型配列に相補的である。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの標的ハイブリダイゼーションセグメントは、ポリＧ配列を含み、逆転写により第１の鎖ｃＤＮＡに付加された非鋳型ポリＣ尾部に相補的である。
【００７５】
図７は、本明細書の実施形態で使用される例示的なプライマー設計スキームを示す。これらの例示的プライマーは、特に、シークエンシングのための、ｍＲＮＡ配列の逆転写及び増幅に用いられる。この実施形態は、逆転写を開始させる第１のプライマーセット（『プライマー１』または『１−プライマー』）を利用する。プライマー１のプライマーセットは、Ｘ特異的標識ウェル（たとえば列特異的標識）用のユニークバーコーディング配列を含んでいる。第２のプライマーセット（『プライマー２』または『２−プライマー』）は、第２の鎖の合成に用いられる。こうしてプライマー１とプライマー２とを一緒に用いて、プライマーが結合した配列を増幅する。プライマー２のプライマーセットは、Ｙ特異的標識ウェル（たとえば行特異的標識）用のユニークバーコーディング配列を含んでいる。他の実施形態では、プライマー１はＹ特異的であり、プライマー２はＸ特異的である。マルチウェルアレイの各ウェルは、プライマー１及びプライマー２のプライマー、ならびに核酸標的を含む試料（たとえば細胞）を受ける。プライマー１及びプライマー２のプライマーのＸ特異的配列及びＹ特異的配列に基づき、各ウェルは（たとえばアレイにおけるその行及び列を識別する）ユニークなバーコード配列セットを受ける。そのようなプライマーセットが、たとえば７２×７２のＳＭＡＲＴＣＨＩＰで使用される場合、７２のプライマー１−プライマー及び７２のプライマー２−プライマーが存在する。いくつかの実施形態では、１−プライマーは、Ｘ特異的配列を除いて同一である。いくつかの実施形態では、２−プライマーは、Ｘ特異的配列を除いて同一である。いくつかの実施形態では、１−プライマー及び／または２−プライマーは、異なる行及び／または列のプライマー間で同一ではない１つ以上の追加の配列（たとえばＵＭＩ）を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、プライマー１セットの逆転写プライマー配列は、Ｘ特異的バーコード（たとえば６ヌクレオチド長）に結合させたｐｏｌｙＴ配列を３’末端に、及びユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を５’末端に有する（図７を参照）。いくつかの実施形態では、プライマー１は、シークエンシング用プライマー配列も含む。いくつかの実施形態では、プライマー２セットは、３’末端がＰＯ4 分子によりブロックされているランダムヘキサマーを含む。プライマー２の５’末端には、Ｙ特異的バーコード（たとえば６ヌクレオチド長）がある。シークエンシング用プライマー配列が、プライマー２のバーコード配列に結合されている。
【００７７】
いくつかの実施形態では、核酸増幅／分析用マルチウェルデバイスの試料ウェルに、試薬が収容され及び／または加えられる。マルチウェルデバイスにおいて液体に含まれる試薬は、該デバイスで実施される反応に依存する。一実施形態では、ウェルは、核酸増幅反応を実施するための試薬を収容する。試薬は、免疫アッセイ用、たとえば限定ではないが核酸増幅などの核酸検出アッセイ用の試薬の場合がある。試薬は、デバイスのユニットにおいて、乾燥状態でも液体状態でもよい。一実施形態では、ウェルは、プローブ、ポリメラーゼ、及びｄＮＴＰの試薬のうちの少なくとも１つを収容する。別の実施形態では、ウェルは、プローブ、プライマー、及びポリメラーゼを含む溶液を収容する。様々な実施形態では、各ウェルは、（１）標準ゲノム内のポリヌクレオチド標的のプライマー、及び（２）該プライマーが該標的と結合すると濃度依存性シグナルを発する、該プライマーと関連付けられたプローブを含む。様々な実施形態では、各ウェルは、ゲノム内のポリヌクレオチド標的のプライマー、及び該プライマーが該標的と結合すると濃度依存性シグナルを発する、該プライマーと関連付けられたプローブを含む。別の実施形態では、マルチウェルデバイスの少なくとも１つのウェルが、フォワードＰＣＲプライマー、リバースＰＣＲプライマー、及び少なくとも１つのＦＡＭ標識化ＭＧＢクエンチＰＣＲプローブを含む溶液を収容する。一実施形態では、プライマーペアはウェル内に分注され、次いで凍結などにより乾燥される。次に、ユーザーは試料、プローブ及び／またはポリメラーゼを選択的に分注、たとえばナノ分注することができる。
【００７８】
本発明の他の実施形態では、ウェルは、上述の溶液をどれでも、乾燥物として収容することができる。この実施形態では、この乾燥物は、ウェルに被覆されるか、またはウェルの底部に向けられる。ユーザーは分析前に、各ウェルに液体試料（たとえば水、バッファー、生物学的または環境学的試料、水と捕捉細胞の混合物等）を加える。この実施形態では、完全に乾燥させた反応混合物を含むマルチウェル試料デバイスをライナーで密封し、保管するかまたは別の場所に輸送することができる。
【００７９】
核酸試料を収容した（たとえば各ウェルに単細胞が入った）マルチウェルデバイスは、遺伝子型の同定、遺伝子発現、またはＰＣＲによる他のＤＮＡアッセイで用いることができる。プレートで実施されるアッセイは、ＴＡＱＭＡＮ、ＴＡＱＭＡＮゴールド、ＳＹＢＲゴールド、及びＳＹＢＲグリーンなどのＤＮＡアッセイに限定されず、受容体結合、酵素、及び他の高処理スクリーニングアッセイなどの他のアッセイも含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＯＸ標識化プローブが内部標準として用いられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、マルチウェルデバイスのウェルのいくつか、大半、または全部が、細胞ライセートを含んでいる。ライセートは、ウェルに加えるか、またはウェル内で（たとえば各ウェルに加えた複数の細胞または単細胞から）生成することができる。いくつかの実施形態では、各ウェルは、ウェル内に沈着させた異なる単細胞（たとえば各ウェルに細胞１個ずつ）からの細胞ライセートを含む。任意の好適なタイプのアッセイ用の試薬をマルチウェルデバイスのウェルに（たとえばＷＡＦＥＲＧＥＮ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製などのマルチウェルディスペンサーを用いて）加えることができる。特定の実施形態では、タンパク質検出アッセイの構成要素（たとえば抗体を用いるアッセイ）をウェルに加える。他の実施形態では、ＳＮＰ検出アッセイの構成要素をウェルに加える。他の実施形態では、核酸シークエンシングアッセイの構成要素をウェルに加える。
【００８１】
特定の実施形態では、核酸の分析、シークエンシング、増幅、検出等のための試薬を、核酸試料（たとえば各ウェルに１個ずつの単細胞からのライセート）を含むウェルに加える。いくつかの実施形態では、そのような試薬は、核酸（たとえばｍＲＮＡ分子）を標識する、及び／または細胞／ウェルソースについて標識する、及び／またはマルチウェルデバイスの特定のサブアレイソースについて標識するためのバーコーディングを用いる構成要素を含み、それによって、様々な標識化オリゴヌクレオチドをプールした後に本明細書で説明する装置を用いてそれらを区別できる。そのようなバーコーディング法及び試薬は、たとえば、米国特許公開第２００７／００２０６４０号、特許公開第２０１２／００１００９１号、米国特許第８，８３５，３５８号、米国特許第８，４８１，２９２号、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３３，４７５−４８１，２００３）、Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７  Ｏｃｔ；３５（１９）：ｅ１３０）、Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，Ｏｃｔｏｂｅｒ，５（１０）：８８７−８９３）、Ｂｏｎｔｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００８，８：４４３−４５０）、Ｅｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｕｒｏ．Ｒｅｓ．，２００８，６０：４３９−４５１）、Ｈｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｔｈｅｏｒ．，Ｂｉｏｌ．，２００３，２２１：６１５−６２４）、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，９７（５）：１９７６−１９８１；２０００）、Ｈｏｌｌａｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｅｒ（Ｌｅｃｔｕｒｅ  Ｎｏｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８１２，２００３，ｐｐ  ５５−６２）、及びＷＯ２０１４２０１２７に記載があり、核酸のバーコーディング及びシークエンシングに関する反応条件及び試薬も含め、それらの全文を参照により本明細書に援用する。
【００８２】
ＩＶ．核酸配列の分析方法
いくつかの実施形態では、本明細書で説明するプーリング装置を用いて核酸を増幅し分析する方法が提供される。本発明は、本明細書で説明する装置及び方法で用いられ得る増幅及び分析技法により限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書の方法及び装置は、マルチウェル核酸増幅及び分析アッセイ及び実験のバーコーディングに用いられる。本明細書で説明するバーコーディング装置及び方法は、多様な増幅及び分析技法で利用できる。
【００８３】
特定の実施形態では、本明細書で開示する装置は、用いられるバーコードを、普通必要とされるよりも少数とすることができる。たとえば、一般的な装置でウェル特異的バーコードを用いる場合、プールした後で各ウェルを区別するために、各ウェルにつきユニークバーコードが必要になる。したがって、そのような装置では、９６００個のウェルがあるとすると、各ウェルを区別するために（たとえば各ウェルの各単細胞を区別するために）９６００個のユニークバーコードが必要になる。本開示では、各別々のサブアレイは、同じバーコードセットを用いることができる（すなわち該バーコードセットを反復することができる）。たとえば、各図面では、別々のサブアレイを９６個有し、各サブアレイが１００個のウェルを有している、９６００マルチウェルデバイスが用いられている。各サブアレイは、ウェル内容物が９６ウェルプレートにプールされると物理的に互いに隔離されるので、１００個の同じユニークバーコードを用いることができる。こうすれば、９６００個のユニークバーコードではなく、１００個のユニークバーコードだけを設計し合成すればよいので、時間と費用とを節約できる。したがって、いくつかの実施形態では、本装置は、用いられるウェル特異的バーコード数を、たとえば１００倍少なくできる。特定の実施形態では、標準的な方法と比べて１０倍少ない・・・５０倍少ない・・・１００倍少ない・・・または１０００倍少ないウェル特異的バーコードが用いられる。
【００８４】
さらに、各バーコード試料が９６ウェルプレートにプールされると、９６ウェルプレートの各収集ウェルは二次（収集ウェル特異的）バーコードを受けることができる。たとえば、９６個のユニークバーコードプライマーを収集ウェルに加えて増幅させるか、または他の技法により収集ウェル特異的バーコードを加えることができる。こうすれば、９６ウェルプレート（またはその他用いられているサイズのプレート）の９６個のウェルにプールでき、しかも各ウェル（たとえば単細胞）は、ウェル特異的及び収集ウェル特異的バーコードに基づき、シークエンシング反応での区別が可能になる。
【００８５】
特定の実施形態では、ＷＯ２０１４２０１２７２の特定のバーコードタグ化及びシークエンシング方法（「ＳＣＲＢ−ｓｅｑ」方法）、または同様の方法を本明細書で説明する装置と一緒に用い、単細胞分析に応用する。この方法に必要な試薬（たとえば必要に応じて少量用に改変したもの）を、（別々のサブアレイを含む）マルチウェルデバイスの溶解単細胞をそれぞれが収容しているウェルに加える。簡単に説明すると、例示的実施形態では、該方法は、マルチウェルプレートの単細胞（各ウェルは単細胞を有している）からの初回ｍＲＮＡ試料を増幅する。初回ｃＤＮＡ合成では、ｉ）細胞／ウェル識別用のＮ６、ｉｉ）特定分子識別用のＮ１０、ｉｉｉ）ｍＲＮＡに結合するポリＴ区間、及びｉｖ）第２の鋳型乗換えプライマーがハイブリダイズする領域を作る領域を有する第１のプライマーを用いる。上述したように、同じウェル特異的バーコードセットを各別々のサブアレイに用いることができ、ウェルごとにユニークバーコードを生成する必要はない。第２のプライマーは、ポリＧ３’末端、及びイソ塩基を有する５’末端を有する鋳型乗換えプライマーである。ｃＤＮＡ増幅後、各別々のサブアレイからのタグ化ｃＤＮＡ単細胞／ウェル試料を抽出し、本明細書で説明するプーリング装置を用いて１つの収集ウェルにプールする。次に、２つの異なるプライマーを用いて全長ｃＤＮＡを合成し、全長ｃＤＮＡを精製する（たとえばＱｉａｇｅｎ９６ウェルプレートＤＮＡ精製により、試料を新たな９６ウェルプレートに移動させる）。次に、（たとえば収集ウェル同士を区別するための収集ウェル特異的バーコードを提供する）Ｐ７プライマーを用いてシークエンシングライブラリーを調製するが、これはＮＥＸＴＥＲＡトランスポサーゼ反応により加えることができる。シークエンシングライブラリーは、ＮＥＸＴＥＲＡシークエンシングライブラリーとすることができ、次いでＰ５プライマーも加える。全収集ウェル（たとえば９６ウェルプレートの全９６個のウェル）にプールし、合わせたシークエンシングライブラリーをゲル上で精製してから、シークエンシング（たとえばＮＥＸＴＥＲＡシークエンシング）する。あるいは、全９６個の収集ウェルにプールするのではなく、各列につき収集ウェルが１２個ある（それぞれ、１２個の特定の行特異的バーコードのうちの１つでタグ化されている）、プレートの８列それぞれにプールして、８個のシークエンシングプールを作る。こうすれば、より少数の収集ウェル特異的バーコードを用いることができる（たとえば９６ウェルプレートで１２個のバーコードを行特異的マーカーとして用いることができる）。これらの方法により、単細胞におけるｍＲＮＡ転写物の定量化が可能になり、ユーザーは転写物分子／細胞の絶対数を計測できるので、正規化からあらゆる変数を除去することができる。
【００８６】
特定の実施形態では、核酸は、それらが増幅された個々の試料ウェルまたはサブアレイの場所を示すようにバーコード化されている。いくつかの実施形態では、各ウェルに第１及び第２のプライマーを接触させ、各プライマーは個別の情報を含むバーコーディング配列を含んでいる。その情報の一部として、第１のプライマーはアレイのウェルのユニーク配列（たとえばバーコード、バーコードの一部等）を含み、第２のプライマーはサブアレイのユニーク配列（たとえばバーコード、バーコードの一部等）を含む。
【００８７】
本明細書で説明する実施形態では様々な増幅及び分析技法を用いることができる。いくつかの実施形態では、（たとえば単細胞からの）ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡが、任意の好適なプライマー依存性核酸増幅技法により増幅され、該技法としては、限定ではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。当業者であれば、特定の増幅技法（たとえばＰＣＲ）では、増幅前にＲＮＡをＤＮＡに逆転写する必要があるが（たとえばＲＴ−ＰＣＲ）、他の増幅技法では直接ＲＮＡが増幅されることを知っている。ポリメラーゼ連鎖反応は一般にＰＣＲと呼ばれ、変性、プライマーペアの対向鎖とのアニーリング、そしてプライマー伸長というサイクルを複数回行って、標的の核酸配列の複製数を幾何級数的に増加させる。その一つのバリエーションであるＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素（ＲＴ）を用いてｍＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製し、次いでこのｃＤＮＡをＰＣＲで増幅して複数のＤＮＡ複製を産生する。
【００８８】
増幅産物は、標識化プローブを用いて、たとえば大半がステムループ構造を有する様々な自己ハイブリダイズプローブを用いて、検出することができる。そのような自己ハイブリダイズプローブは、該プローブが自己ハイブリダイズ状態にあるか、あるいは標的配列へのハイブリダイゼーションにより改変状態にあるかによって異なる検出可能なシグナルを発するように標識されている（たとえば米国特許第６，５３４，２７４号、米国特許第５，９２５，５１７号、米国特許第６，１５０，０９７号、米国特許第５，９２８，８６２号、米国特許公開第２００５００４２６３８号、米国特許第５，８１４，４４７号を参照。これらの全文を参照により本明細書に援用する）。
【００８９】
いくつかの実施形態では、試料からの核酸が配列決定される。いくつかの実施形態では、標的核酸の増幅に用いられるプライマーが、配列分析に有用な配列（たとえばＰ５及びＰ７）を増幅産物に挿入する。核酸シークエンシング技法の例示的かつ非限定的な例としては、限定ではないが、鎖ターミネーター（Ｓａｎｇｅｒ法）シークエンシング及び色素ターミネーター・シークエンシング、ならびに「次世代」シークエンシング技法が挙げられる。当業者であれば、ＲＮＡは細胞内での安定性が低く、ヌクレアーゼ攻撃を受けやすいので、実験的ＲＮＡは普通は（ただし必須ではないが）、ＤＮＡに逆転写してからシークエンシングを行うことを知っている。
【００９０】
特定の実施形態では、核酸は、それらが増幅されたウェル（たとえば行、列、プレート／チップ、反応、実験、日付等）の場所を示すようにバーコード化されている。いくつかの実施形態では、各ウェルに第１及び第２のプライマーを接触させ、各プライマーは個別の情報を含むバーコーディング配列を含んでいる。その情報の一部として、第１のプライマーはアレイ中のウェルの行のユニーク配列（たとえばバーコード、バーコードの一部等）を含み、第２のプライマーはそのアレイの列のユニーク配列（たとえばバーコード、バーコードの一部等）を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、同じ行の各ウェルは、同じ行指示配列を含むプライマーを含み／受け、各行はユニーク行指示配列を有する。したがって、後のどの核酸分析でも、特定の核酸が由来するまたは生成された行をたどることができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、同じ列の各ウェルは、同じ列指示配列を含むプライマーを含み／受け、各列はユニーク列指示配列を有する。したがって、後のどの核酸分析でも、特定の核酸が由来するまたは生成された列をたどることができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、同じ表面／チップ／プレートの各ウェルが、同じ表面／チップ／プレート指示配列を含むプライマーを含み／受け、各表面／チップ／プレートはユニーク表面／チップ／プレート指示配列を有する。したがって、後のどの核酸分析でも、特定の核酸が由来するまたは生成された表面／チップ／プレートをたどることができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、同じ行の各ウェルは、同じ行指示配列を含む第１のプライマーを含み／受け、各行はユニーク行指示配列を有し、同じ列の各ウェルは、同じ列指示配列を含む第２のプライマーを含み／受け、各列はユニーク列指示配列を有する。したがって、後のどの核酸分析でも、特定の核酸が由来するまたは生成された列及び行（たとえば表面／チップ／プレートのユニークなウェル）をたどることができる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーの片方または両方が、表面／チップ／プレート指示配列も含み、各表面／チップ／プレートはユニーク表面／チップ／プレート指示配列を有する。したがって、複数の表面／チップ／プレート（たとえば何万個ものウェルを含み得る）を使用する実験／アッセイでは、どの核酸でもそれが由来するまたは生成された個々の行、列、及び表面／チップ／プレートをたどることができる。
【００９５】
次に、本明細書で説明する装置及び方法を用いる核酸のウェル特異的標識化の例示的方法を説明する。核酸（たとえばｍＲＮＡ）を含む試料をマルチウェルアレイのウェル内に沈着させる。アレイのウェルはＸ行とＹ列とに配列されている。いくつかの実施形態では、試料は細胞ライセートである。いくつかの実施形態では、単細胞からの細胞ライセートを各ウェル内に沈着させる。いくつかの実施形態では、単細胞を各ウェル内に沈着させる。いくつかの実施形態では、試料を処理して増幅及び／または分析用の核酸を準備する（たとえば細胞溶解、夾雑物の除去、核酸の断片化等）。いくつかの実施形態では、プライマーをウェル内に沈着させる。プライマーは試料の後で沈着させてもよいし、または試料を沈着させる前にウェル内に収容してもよい。いくつかの実施形態では、各ウェルは、ウェル内の核酸内の配列に相補的な標的ハイブリダイゼーション配列を有する第１のプライマーを受ける。たとえば、第１のプライマーは、試料中のｍＲＮＡのポリＡ尾部に相補的なポリＴ配列を含む場合がある。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイゼーション配列は、第１のプライマーの３’最末端にある。いくつかの実施形態では、どのウェルも、同一の標的ハイブリダイゼーション配列を有する第１のプライマーを受ける。いくつかの実施形態では、第１のプライマーは、列特異的バーコード配列も含んでいる。いくつかの実施形態では、ある列の各ウェルは同一の列特異的バーコード配列を有するプライマーを受け、他の列のウェルは異なる列特異的バーコード配列を有する第１のプライマーを受ける。いくつかの実施形態では、第１のプライマーは、ＵＭＩ配列及び／またはシークエンシング用プライマー配列も含んでいる。ウェルは、標的核酸上の第１のプライマーから第１の鎖産物が合成できるような条件（たとえば温度（複数可））及び試薬（たとえばヌクレオチド、ポリメラーゼ（たとえば逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ等））に曝露される。いくつかの実施形態では、第１の鎖産物は、列特異的バーコード配列、標的ハイブリダイゼーション配列、（プライマー中に存在する場合は）ＵＭＩ、（プライマー中に存在する場合は）シークエンシング用プライマー、及び第１のプライマー結合部位から下流にある標的核酸の配列に相補的な配列を含んでいる。いくつかの実施形態では、特にｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを逆転写する際は、第１の鎖産物はさらに、非鋳型３−尾部（たとえばポリＣ）を含んでいる。いくつかの実施形態では、各ウェルはまた、第１の鎖産物内の配列に相補的な標的ハイブリダイゼーション配列を有する第２のプライマーを受ける。たとえば、第２のプライマーは、逆転写により生成された非鋳型ポリＣに相補的なポリＧ配列を含む場合がある。いくつかの実施形態では、標的ハイブリダイゼーション配列は、第２のプライマーの３’最末端にある。いくつかの実施形態では、第２のプライマーを用いての鋳型乗換えにより、第１の鎖産物がさらに伸長できる。いくつかの実施形態では、どのウェルも、同一の標的ハイブリダイゼーション配列を有する第２のプライマーを受ける。いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、行特異的バーコード配列も含んでいる。いくつかの実施形態では、ある行の各ウェルは同一の行特異的バーコード配列を有するプライマーを受け、他の行のウェルは異なる行特異的バーコード配列を有する第２のプライマーを受ける。いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、ＵＭＩ配列及び／またはシークエンシング用プライマー配列も含んでいる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマーを用いて第１の鎖産物を増幅した結果、行及び列両方の特異的バーコード配列を含む増幅産物が得られる。いくつかの実施形態では、全ウェルからの増幅産物が、次の分析（たとえばシークエンシング）のためにプールされる。いくつかの実施形態では、そのような分析の結果は、列及び行特異的バーコード配列に基づき、産物が生成された特異的ウェルと相関付けられる。
【００９６】
図８は、たとえば、核酸を含む試料（たとえば細胞）からのｍＲＮＡの逆転写、増幅、及びシークエンシングにおける、図７の例示的プライマーセットの使用を示す。そのような例示的実施形態では、これらのプライマーから生成された産物核酸は、由来するウェルによってそれぞれ標識されている。これらのプライマーセットを用いる例示的実施形態では、ＲＮＡを含む試料（たとえば単細胞）がマルチウェルアレイ（たとえばＳＭＡＲＴＣＨＩＰ）のウェル内に配置される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、細胞内から解放される。ＲＮＡを二価カチオンの存在下で加熱することにより、該ＲＮＡを断片化する。断片化の前に、プライマー１を各ウェルに加える。プライマー１は、コンストラクトの５’末端にＰ５シークエンシング用プライマーの配列を有する。プライマー１は、メッセージが断片化される際に同時に変性する。次に、断片化された混合物を冷却して、プライマー１のオリゴｄＴ末端を転写物のポリＡ末端にアニールする。次に逆転写酵素及びｄＮＴＰを反応混合物に加えて、転写を起こさせる。第１の鎖の合成が完了したら反応混合物にＲｎａｓｅＨ酵素を加えて、鋳型ＲＮＡを断片化する。反応物にプライマー２を加え、反応物を８０℃に加熱して逆転写酵素を不活化し、プライマー２の二次構造を溶解する。反応物を急冷して、第１の鎖にアニールする。第２の鎖の合成は、非ブロックランダムヘキサマー、または３’末端がＰＯ4 分子によりブロックされているランダムヘキサマーのどちらかによりトリガーされる。プライマー２は、第２のシークエンシング用プライマー（Ｐ７）の相補配列を５’末端に有する。Ｐ５及びＰ７は、シークエンシング用プライマーの全長配列、または部分配列である。ブロックされたプライマー２を用いる場合、プライマーの３’末端は、ＰＯ4 をヒドロキシルに加水分解する酵素ホスホヌクレオチドキナーゼによりブロックを外され、したがって該オリゴヌクレオチドの３’末端はＤＮＡポリメラーゼによる伸長に利用可能になる。第２の鎖の合成が完了すると、各試料を１つの試料としてプールする。次に、プールした試料を指標化Ｐ７プライマー及びユニバーサルＰ５プライマーを用いて増幅する。この処理で、各プールされた反応物がシークエンサー用に指標化される。処理終了時、産物は、シークエンサー用に準備できた産物を含んでいる。バッチ増幅したにもかかわらず、各産物核酸は、該核酸が生成されたウェルに導入された特定のプライマー１及びプライマー２からのユニークバーコード配列を担持している。図５は、プライマー１とプライマー２とのプライマーセット及び上述のプロトコルを用いてＵ９３７細胞からの全ＲＮＡから生成したＤＮＡのバイオ分析を示す。
【００９７】
本明細書の範囲の他の実施形態は、上述の方法の改変を含む。たとえば、いくつかの実施形態では、第１の鎖の合成で、全ＲＮＡはインタクトなまま（たとえば断片化無し）とされる。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーは、ポリｄＴオリゴと一緒に加えられる場合はブロックされる（たとえば図８のステップ１）。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーは、図８のステップ２の反応に加えられる場合はブロックされない。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーは、ブロックされていない場合、図８のステップ２で逆転写酵素を不活化した後から加えられて、たとえば合成された一本鎖だけが確実に増幅されるようにする。いくつかの実施形態では、Ｐ７配列は、第２の指標（たとえばプールされる試料の指標）を含む。いくつかの実施形態では、ポリｄＴプライマーは、Ｐ５の一部のみを有するように切断されている。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマー（ｈｅａｘａｍｅｒ）オリゴは、Ｐ７の一部のみを有するように切断されている。いくつかの実施形態では、第２の鎖の合成後、産物をＰ５及びＰ７プライマーを用いて増幅する。指標化Ｐ７プライマーはプールされた試料の指標を含んでおり、この指標がライブラリー増幅中に産物に付加される。上記以外の変形も本発明の範囲内である。
【００９８】
標準的なバーコーディングを用いるＳＣＲＢ−ｓｅｑ方法の例示的実施形態では、単細胞からの初回ｍＲＮＡ試料がマルチウェルプレートで増幅され、各ウェルは単細胞を有している。初回ｃＤＮＡ合成では、ｉ）細胞／ウェル識別用のＮ６、ｉｉ）特定分子識別用のＮ１０、及びｉｉｉ）ｍＲＮＡに結合するポリＴ区間を有する第１のプライマーを用いる。第２のプライマーは、ポリＧ３’末端、及びイソ塩基を有する５’末端を有する鋳型乗換えプライマーである。ｃＤＮＡ増幅後、タグ化ｃＤＮＡ単細胞／ウェル試料をプールする。次に、２つの異なるプライマーを用いて全長ｃＤＮＡ合成を行い、全長ｃＤＮＡを精製する。次に、ＮＥＸＴＥＲＡシークエンシングライブラリーを、ｉ７プライマー（特定のマルチウェルプレートを識別する、１２個のｉ７タグのうちの１つを加える）、及びＰ５タグを付加するＰ５ＮＥＸＴＰＴ５を用いて、ＮＥＸＴＥＲＡシークエンシング用に調製する（Ｐ７タグはＮＥＸＴＥＲＡの他端に付加する）。ライブラリーをゲル上で精製してから、ＮＥＸＴＥＲＡシークエンシングを行う。非限定的例として、１２個のｉ７プレートタグと、３８４個の細胞／ウェル特異的バーコードとでは、全部で４６０８個の単細胞トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｉｐｔｏｍｅｓ）が一度にできる。この方法により、単細胞におけるｍＲＮＡ転写物の定量化が可能になり、ユーザーは転写物分子／細胞の絶対数を計測できるので、正規化からあらゆる変数を除去することができる。
【００９９】
本明細書で説明するＸ／Ｙバーコーディングを用いると、上述の例示的ＳＣＲＢ−ｓｅｑ方法が次のように改変される。各ウェルでのｃＤＮＡ合成では、ｉ）細胞／ウェル識別用のＸ特異的バーコード配列（たとえば行または列特異的）、ｉｉ）特定分子識別用のＵＭＩ配列（たとえばＮ１０）、及びｉｉｉ）ｍＲＮＡに結合するポリＴ区間を有する第１のプライマーを用いる。第２のプライマーは鋳型乗換えプライマーであり、ｉ）細胞／ウェル識別用のＹ特異的バーコード配列（たとえば列または行特異的）、ｉｉ）逆転写により作製される非鋳型ポリＣに結合するポリＧ３’末端、及びイソ塩基を有する５’末端を有する。ｃＤＮＡ増幅後、タグ化ｃＤＮＡ単細胞／ウェル試料をプールする。各核酸産物は行特異的及び列特異的配列を有するプライマーを用いて増幅されているので、各核酸は、それが由来する特異的ウェル／細胞に対応してバーコード化されている。各核酸産物は、ＵＭＩを有するプライマーを用いて増幅されているので、個々の核酸分子もそれぞれユニークに非ウェル特異的に標識される。次に、２つの異なるプライマーを用いて全長ｃＤＮＡ合成を行い、全長ｃＤＮＡを精製する。次に、ＮＥＸＴＥＲＡシークエンシングライブラリーを、ｉ７プライマー（特定のマルチウェルプレートを識別する、１２個のｉ７タグのうちの１つを加える）、及びＰ５タグを付加するＰ５ＮＥＸＴＰＴ５を用いて、ＮＥＸＴＥＲＡシークエンシング用に調製する（Ｐ７タグはＮＥＸＴＥＲＡの他端に付加する）。
【０１００】
本発明の他の実施形態は、他の増幅技法で及び／または他のプライマー構成で、Ｘ／Ｙバーコーディングを利用する。本明細書で説明する組成物及び方法は、ユニーク標識が複数の位置、たとえばグリッド様配列で有用な、あらゆる核酸分析技法またはあらゆる装置で使用される。
【０１０１】
蛍光ベースのシークエンシング法を含む、多くのＤＮＡシークエンシング技法が当業界で知られている（たとえばＢｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照。その全文を参照により本明細書に援用する）。いくつかの実施形態では、その業界で把握されている自動化シークエンシング技法が用いられる。いくつかの実施形態では、装置、デバイス、及び方法は、増幅産物分割物の並列シークエンシングを用いる（Ｋｅｖｉｎ  ＭｃＫｅｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ公開ＷＯ２００６０８４１３２の全文を参照により本明細書に援用する）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡシークエンシングは、並列オリゴヌクレオチド伸長により実施される（たとえばＭａｃｅｖｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，７５０，３４１号、及びＭａｃｅｖｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，３０６，５９７号を参照。それらの全文を参照により本明細書に援用する）。シークエンシング技法のさらなる例としては、Ｃｈｕｒｃｈ  ｐｏｌｏｎｙ法（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２０，５５−６５；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１７２８−１７３２；米国特許第６，４３２，３６０号、米国特許第６，４８５，９４４号、米国特許第６，５１１，８０３号；それらの全文を参照により本明細書に援用する）、４５４ピコタイター・パイロシークエンシング法（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，３７６−３８０；ＵＳ２００５０１３０１７３；その全文を参照により本明細書に援用する）、Ｓｏｌｅｘａ単塩基付加法（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６，３７３−３８２；米国特許第６，７８７，３０８号；米国特許第６，８３３，２４６号；それらの全文を参照により本明細書に援用する）、Ｌｙｎｘ超並列シグネチャー・シークエンシング法（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：６３０−６３４；米国特許第５，６９５，９３４号；米国特許第５，７１４，３３０号；それらの全文を参照により本明細書に援用する）、及びＡｄｅｓｓｉ  ＰＣＲコロニー法（Ａｄｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８，Ｅ８７；ＷＯ０００１８９５７；それらの全文を参照により本明細書に援用する）が挙げられる。
【０１０２】
Ｓａｎｇｅｒ法や色素ターミネーター・シークエンシング方法に代わる「次世代シークエンシング」技法と呼ばれる一式の方法が登場している（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；それぞれの全文を参照により本明細書に援用する）。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）方法も、超並列、高処理ストラテジーなどの特徴は同じだが、従来のシークエンシング方法よりも低コストを目指している。ＮＧＳ方法は、鋳型増幅を要するものとそうではないものとに大きく二分される。増幅を要する方法としては、４５４技術プラットフォームとしてＲｏｃｈｅ社が商品化したパイロシークエンシング（たとえばＧＳ  ２０やＧＳ  ＦＬＸ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社が商品化したＳｏｌｅｘａプラットフォーム、及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社が商品化したＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームが挙げられる。非増幅法は、単一分子シークエンシングとしても知られており、たとえばＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社により商品化されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ＰＡＣ  ＢＩＯ  ＲＳ  ＩＩ）、及び他の商品化されたプラットフォームがある。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、増幅及び／または分析する前に、試料を処理する。たとえば、分析する前に、試料から核酸及び／またはタンパク質を抽出し、単離し、及び／または精製する場合がある。様々なＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／またはタンパク質抽出技法が当業者にはよく知られている。処理には、遠心分離、超遠心分離、エタノール沈殿、濾過、分画、再懸濁、希釈、濃縮等が含まれる場合もある。いくつかの実施形態では、方法及び装置は、（たとえば細胞溶解、核酸断片化、核酸単離等の）処理無しで、またはわずかな処理だけで、生の試料（たとえば細胞、体液（たとえば血液、血清等））の分析を提供する。
【０１０４】
Ｖ．二重バーコードタグ化のための例示的ワークフロー
本明細書では、たとえば特定の元のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（たとえばｍＲＮＡ配列または他のＲＮＡ配列）のウェル／単細胞起源を決定するためのシークエンシング方法で用いることができる、二重バーコーディング、プーリング、及び増幅方法の例示的方法を提供する。このワークフローの一例を図４−１及び図４−２に示す。
【０１０５】
図４−１及び図４−２の例示的ワークフローは、細胞から開始する（たとえば各ウェルに単細胞及び多細胞を入れる）。ウェルは、図２の部品２５または３０として示すように、マルチウェルデバイスに存在することができ、複数のウェル（たとえば５・・・２５・・・１００・・・１０００個）がある数の別々のサブアレイ（たとえば２・・・１０・・・９６・・・５００個のサブアレイ）に存在する。サブアレイは、同じデバイス（たとえばチップ）の一部であってもよいし、または別々のデバイスであってもよい。特定の実施形態では、単細胞が、それも単細胞だけが、各ウェル内に存在する。他の実施形態では、多細胞がウェル内に存在する。図４−１及び図４−２に示すように、特定の実施形態では、ウェルに沈着させる細胞は、色素で標識されており、沈着後にウェルを画像化して、各ウェル内の細胞数を決定する。たとえば、ウェルに単細胞が収容されることが望ましい場合は、ウェルは、（たとえばポアソン分布に基づき）１つのウェルがゼロまたは１個の細胞を受けるような密度で沈着される。ウェルの画像化により、どのウェルが所望の単細胞（または所望の多細胞）を有するかが判明するので、それらのウェル（陽性ウェル）だけをさらに処理することができる。
【０１０６】
次に、図４−１及び図４−２に示すように、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチド（たとえば図４−１及び図４−２のようなオリゴＴ）と一緒に溶解混合物を陽性ウェルに沈着させる。図４−１及び図４−２の例では、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡのポリＡ尾部に結合するポリＴ領域を利用して、ＲＮＡに結合する。図示のＲＮＡ結合オリゴヌクレオチドは、第１の５’尾部領域としてＰ１アダプター配列を有する。図４−１及び図４−２に示すように、鋳型乗換えオリゴ（Ｐ１ｂ領域、ランダム６−Ｎ  ＵＭＩ領域、及びポリＧ領域を有する）、及び鋳型乗換えが可能なリバーストランスクリプターゼ酵素を含む逆転写酵素（ＲＴ）混合物を陽性ウェル内に分注する。Ｐ１ｂ領域は、第２の５’尾部領域と呼ぶことができる。ウェルは、第１の鎖ｃＤＮＡが、ＲＮＡ結合オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ鋳型に沿って伸長し、逆転写酵素により付加された非鋳型ポリＣに鋳型乗換えオリゴポリＧが結合してさらに伸長することによって生成されるような条件下で、処理される。次に、ＰＣＲ混合物を陽性ウェル内に分注し、指標化ＰＣＲプライマー及びリバースプライマーをＰＣＲ増幅条件下で陽性ウェル内に分注して、二本鎖ＤＮＡを生成する。図４−１及び図４−２の指標プライマーは、Ｐ１ｂ領域（第１の鎖ｃＤＮＡに存在するＰ１ｂの相補配列にハイブリダイズする）、第１のバーコード領域（ＢＣ２と標識されており、特定のサブアレイの各ウェルで異なる）、及びＰ１アダプター領域（第３の５’尾部領域と呼ぶことができ、図４−１及び図４−２に示す第１の５’尾部領域と同じ配列を有し得る）を有する。リバースプライマーは、図４−１及び図４−２に示すように、Ｐ１アダプター領域（第１の５’尾部領域と呼ぶことができる）と同じ配列を有することができる。
【０１０７】
次に、各サブアレイ（たとえば１０×１０サブアレイユニットの陽性ウェル）からの二本鎖ＤＮＡをそれぞれ、１つのサブアレイ容器にプールする。こうすれば、もともと５つのサブアレイまたは９６個のサブアレイがあったとすると、５つまたは９６個のサブアレイ容器にプールすることになる。そのようにプールすることは、本明細書で説明する（たとえば図２及び図３に示すような）抽出デバイスを用いてもよいし、または各サブアレイに、たとえば一度に一つずつプールするなど、他の方法でもよい。各サブアレイ容器内の二本鎖ＤＮＡは、元のウェルにより異なるバーコードを有しているので、（たとえば後に配列決定する場合に）そのような二本鎖ＤＮＡを区別することが可能になる。
【０１０８】
次に、図４−１及び図４−２では、転位反応（たとえばタグメンテーション反応）を用いて、二本鎖ＤＮＡの鎖の一方に第２のバーコードを付加する。図４−１及び図４−２では、Ｔｎ５モザイク末端配列（ＭＥ）、第２のバーコード配列（ＢＣ１と標識されている）、及びＰ２配列（第４の５’尾部配列と呼ぶことができる）を有する第１の転位配列が加えられる。トランスポサーゼ酵素及び第２の転位配列も加えられ、該配列はＭＥ配列にハイブリダイズして二本鎖領域の形成を可能にして反応を進行させ、したがって二重バーコード化鋳型配列が各サブアレイ容器で生成される。次いでサブアレイ容器の内容物を１つのフルアレイ容器にプールする（たとえば９６サブアレイ容器の内容物を１つの容器にプールする）。
【０１０９】
次に、濃縮ＰＣＲにより二重バーコード化鋳型配列を増幅し、そうすることでシークエンシング鋳型のライブラリーを作製する。次にこのライブラリーのシークエンシングができる。図４−１及び図４−２は、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＨＩＳＥＱシークエンシングを用いて、シークエンシング鋳型の配列決定をし、シークエンシングのデータを作製できることを示す。特定のシークエンシング鋳型に関するこのデータにより、第１及び第２のバーコードの決定配列、またはその相補配列は、特定の元のＲＮＡ配列に関し、元のウェルまたは単細胞を識別することを可能にする。特定の実施形態では、ＵＭＩの決定配列またはその相補配列を、第１及び第２のバーコードの決定配列と組み合わせることで、特定の元のＲＮＡ配列に関し、元のウェルまたは単細胞を識別することが可能になる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩの決定配列またはその相補配列を、第１及び第２のバーコードの決定配列と組み合わせ、さらに（元のマルチウェルデバイスの）特定の行及び列と組み合わせることで、特定の元のＲＮＡ配列に関し、元のウェルまたは単細胞を識別することが可能になる。
【０１１０】
上述したように、本明細書で説明するワークフローの実施形態では、鋳型乗換え可能な逆転写酵素が用いられる。そのような逆転写酵素の例としては、限定ではないが、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループＩＩイントロン由来逆転写酵素、及びその変異体、バリアント誘導体、または機能的断片が挙げられる。特定の実施形態では、逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ  ＲＴ）、カイコ逆転写酵素（たとえばカイコＲ２非ＬＴＲエレメント逆転写酵素）、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州マウンテンビュー）から入手できるＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ（登録商標）逆転写酵素であってもよい。また、上述したように、本明細書で説明するワークフローの実施形態では、トランスポサーゼ酵素を用いることができる。そのようなトランスポサーゼ酵素の例としては、限定ではないが、Ｍｏｓ−１、ＨｙｐｅｒＭｕ（登録商標）、Ｔｎ５、Ｔｓ−Ｔｎ５、Ｔｓ−Ｔｎ５０５９、Ｈｅｒｍｅｓ、及びＴｎ７が挙げられる。追加の逆転写酵素、及び他の試薬、反応条件、シークエンシング方法、増幅方法、核酸のタイプ、プライマー、ポリメラーゼは、Ｌｉｎｎａｒｓｏｎの米国特許公開第２０１２／００１００９１号に記載されており、上述のすべての条件、試薬、及び方法を含めて全文が本明細書で示されるかのように、参照により本明細書に援用するものとする。
【０１１１】
ＶＩ．二軸バーコード装置及び方法
特定の実施形態では、本明細書では、多数の個々のウェルに収容された核酸のウェル特異的バーコーディング、ならびにそのようなバーコーディングを用いる装置及び方法を提供する。具体的には、核酸は、たとえば、マルチウェルアレイのウェルの行及び列を示す少なくとも第１及び第２のバーコード配列を受ける。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書では、Ｘ／Ｙバーコードスキーム（たとえば方法、装置、組成物等）を提供し、ここでマルチウェルアレイの各列（Ｘ）及び行（Ｙ）はユニークバーコードにより識別される。そのようなスキームを用いることで、個々のウェルはそれぞれ、アレイにおけるその列と行とを示すユニークバーコード識別子により識別される。いくつかの実施形態では、この装置は、ウェル内の核酸にユニーク識別子が付与されることを可能にしながらも、必要なバーコード化プライマーの数を最小限化する。たとえば、１４４個のバーコード（７２個のＸバーコードと７２個のＹバーコード）により、７２×７２アレイ（たとえばＷａｆｅｒｇｅｎ社のＳＭＡＲＴＣＨＩＰ）の５１８４個のウェルのユニーク識別が可能になる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、Ｘ／Ｙバーコードに加えて、核酸を、ユニーク分子識別子配列（たとえば分子特異的タグ）や、１つ以上のシークエンシング用配列等のうちの１つ以上で、（たとえば逆転写、増幅、鋳型乗換え等により）標識することができる。
【０１１４】
図６は、わずか１４４個のバーコードを使って、７２×７２グリッド（たとえばＳＭＡＴＣＨＩＰ）の５１８４個のウェルにユニークな識別性を付与する方法を説明している。この例では、各ウェルに、ウェルの行を識別するようにユニークバーコード化された第１のプライマー、及びウェルの列を識別するようにユニークバーコード化された第２のプライマーを接触させる。この装置を用いれば、用いられるプライマーがそれ以外に同じでも違っていても、各ウェルで増幅される核酸は、それが由来する列及び行を識別する符号となるバーコード配列でユニーク識別されていることになる。そのような技法は７２×７２グリッドに限定されず、任意の好適な寸法（たとえば４×４、１２×１６、２×９６、１００×１００、３２×６４等）のあらゆるグリッドまたはグリッド様（たとえばオフセットグリッド（たとえば列と行とが整合していない、ジグザグ等）等の）配列が、本明細書の実施形態では使用できる。図６Ｂでは、列特異的バーコードが数字（たとえば実用ではヌクレオチド配列に対応する数字）で示され、行特異的バーコードは文字（たとえば実用ではヌクレオチド配列に対応する文字）で示される。ウェルの例示的６×１０の部分からわかるように、６０個のウェルはそれぞれ、列特異的及びウェル特異的バーコードを有し、１６個のバーコード配列だけでウェル特異的識別子を提供している。たとえば、行「Ｄ」のバーコードの組合せはＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ８、Ｄ９、及びＤ１０があり、列「５」のバーコードの組合せはＡ５、Ｂ５、Ｃ５、Ｄ５、Ｅ５、及びＦ５があり、ここで「Ｄ」は行特異的バーコードであり、「５」は列特異的バーコードである。
【実施例】
【０１１５】
実施例１
多重プール試料の二重指標バーコーディング
この実施例は、マルチウェルチップに存在する単細胞からのＵＭＩタグ化ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの二重バーコーディングのワークフローを説明する。マルチウェルチップは９６００個のウェルを有し、１０×１０サブアレイに分割されている。以下でさらに詳述するが、各サブアレイの１００個のウェルそれぞれに、１００個のウェルを９６個のウェルへとプールしたときに区別できるように、ユニークバーコードを与える。次に、９６個のウェルを合わせて１つのプールにしたときに９６個のウェルそれぞれが区別できるように、９６個のウェルに第２のバーコードを与える。こうすれば、最終プールの特定のｃＤＮＡの２つのバーコードの組合せにより、元の９６００ウェルチップの元のウェル（したがって単細胞）を識別することが可能になる。
【０１１６】
細胞調製及びｃＤＮＡ
細胞調製：生細胞の細胞懸濁液を調製する。細胞のソース及びサイズはどれでもよいが、概ね、しっかり分離されていて、生存率が高く、細胞デブリがないものとすべきである。細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ色素で、メーカーの使用説明にしたがって染色する。氷上で１０分インキュベートする。細胞を３００ｇで３分遠心沈殿させて２回洗浄し、新鮮培地に再懸濁させる。細胞懸濁液が準備できたら細胞数を計測し、Ｃａ2+Ｍｇ2+フリー培地で希釈して、２０細胞／μｌとする（５０ｎｌ分注でポアソンλ＝１に対応）。
【０１１７】
細胞分注、画像化、細胞選択：９６００ウェルチップをマルチサンプル・ナノディスペンサー（ＭＳＮＤ）に設置し、細胞懸濁液５０ｎｌを各ウェルに分注する（したがって、平均して各ウェルに１細胞が沈着する）。ｑＰＣＲまたは撮影用フィルムでチップを密封し、３００ｇで２分遠心沈殿する。チップを顕微鏡に設置し、（たとえばクールパックを用いて）冷却し、ＦＩＴＣチャネルで４倍対物レンズを用いて全ウェルを撮影する。撮影後すぐにチップを氷上に置く。ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔソフトウェア（Ｗａｆｅｒｇｅｎ社）で画像を分析して、単細胞を収容するウェルだけを選択する。ソフトウェアの出力は、陽性選択ウェルの位置を含む「Ｆｉｌｔｅｒファイル」である。
【０１１８】
溶解：チップを再度ＭＳＮＤに設置し、５０ｎｌの溶解混合物（５００ｎＭ  Ｃ１−Ｐ１−Ｔ３１  ５’ｂｉｏ−ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）、４．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２％トリトン−Ｘ１００、２０ｍＭ  ＤＴＴ、１．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤ＴａＫａＲａ）を陽性ウェルに分注する。配列番号３は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉｓｅｑシークエンシングで用いることができるＰ１アダプター配列を含む。チップをマイクロシールＡフィルム（ＢｉｏＲａｄ社）で密封し、最高速（＞２０００ｇ）で１分遠心沈殿する。チップを３分７２℃でインキュベートし、再び最高速で１分遠心沈殿する。
【０１１９】
逆転写：チップをＭＳＮＤに設置し、８５ｎｌのＲＴ混合物（２．１Ｘ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１２．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１．７９Ｍベタイン、１４．７Ｕ／μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素「ＳＳＩＩ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１．５８Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤ＴａＫａＲａ、１０．５ｕＭ  Ｐ１Ｂｓｖ２−ＵＭＩ６−ＴＳＯ−ＲＮＡ  ５’ｂｉｏｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＣｒＧｒＡｒＣｒＧｒＣｒＵｒＣｒＵｒＵｒＣｒＣｒＧｒＡｒＵｒＣｒＵｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＧｒＧ、配列番号４）を陽性ウェルに分注する。配列番号４は、鋳型乗換えオリゴヌクレオチドであり、一連のランダム（Ｎ）塩基としてのＵＭＩ（ユニーク分子識別子）を含む。チップをマイクロシールＡフィルムで密封し、最高速で１分遠心沈殿する。チップを９０分４２℃でインキュベートし、再び最高速で１分遠心沈殿する。
【０１２０】
ＰＣＲ：チップを再びＭＳＮＤに設置し、５６５ｎｌのＰＣＲ混合物（０．２８ｍＭ  ｄＮＴＰ、１４０ｎＭ  ４ｋＰＣＲ−Ｐ１Ａ２０  ５’ｂｉｏ−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ、配列番号５、０．２８％ｔｗｅｅｎ−２０、１．４Ｘ  ＫＡＰＡ  ｒｅａｄｙ  ｍｉｘ）を陽性ウェルに分注する。配列番号５はＰＣＲ反応でリバースプライマーとして働く。チップをマイクロシールＡフィルムで密封し、最高速で１分遠心沈殿する。チップを再びＭＳＮＤに設置し、１００ｎｌの指標プライマー（４ｋｌｏｎｇ−Ｐ１Ａ−ｉｄｘ［１−３２］−Ｐ１Ｂｓｖ２  ５’ｂｉｏ−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−ＸＸＸＸＸ−ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ、配列番号６）を各ウェルに分注する。指標プライマー配列番号６は、第１のバーコード配列（図４−１及び図４−２ではＢＣ２と標識されている）及び５’末端Ｐ１アダプター配列とともにフォワードプライマーとして働く。分注スキームは、同じ１０×１０パッチ内の各ウェルが１つのユニークＰＣＲ指標プライマーを受けるようにすべきである。１０×１０パッチあたりの陽性ウェルの最大数は、ユニーク指標ＰＣＲプライマーの数に限られる。チップをマイクロシールＡフィルムで密封し、最高速で１分遠心沈殿する。チップをサーマルサイクラーに設置し、ＰＣＲプログラムを実行する（９５℃３分。５サイクル×９８℃３０秒、６７℃１分、７２℃６分。１５サイクル×９８℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃６分。７２℃５分。１０℃ホールド）。
【０１２１】
抽出：抽出ブロック（抽出ガスケット及び抽出デバイス；図２及び図３を参照）を清潔な９６ウェルプレートに取り付ける。チップを最高速で１分遠心沈殿する。フィルムを除去し、ウェルが抽出ガスケットの開口部及び抽出デバイスの流体コンジット開口部と合致するように、チップを抽出ブロックに設置する。抽出ブロック上のチップを５分最高速（ここでは、＞３０００ｇ）で遠心沈殿して、９６００ウェルチップのウェル内の液体を抽出デバイスを通って９６ウェルプレートの９６個のウェルに流入させる。こうすれば、９６個のウェルはそれぞれ、元の９６ウェルチップの９６個のサブアレイそれぞれ１つの内容物を有することになる（たとえば全部が単細胞を収容していた場合は最高１００個のウェル）。ｃＤＮＡを収容する９６ウェルプレートを密封し、−２０℃で保管する。
【０１２２】
Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリーの調製
Ｔｎ５のローディング：９６の反応物、６．２５μＭ  ＳＴＲＴ−ＴＮ５−［１−９６］ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＹＹＹＹＹＹＹＹ−ＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号７）、６．２５μＭ  ＳＴＲＴ−ＴＮ５−ＵＰＨＯＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＧＣ（配列番号８）、６．２５μＭ  Ｔｎ５トランスポサーゼ（Ａｄｄｇｅｎｅに提出）、５０％グリセロールをアセンブルする。配列番号７は、「ＭＥ」（Ｔｎ５モザイク末端配列）、第２のバーコード（９６のユニークバーコードがあり、図４−１及び図４−２ではＢＣ１と標識されている）、及びＰ２（次世代シークエンシング用のアダプター配列）を含む。１時間３７℃でインキュベートする。Ｔｎ５の活性に応じて５０％グリセロールで希釈し、−２０℃で保管する。原液プレートを、「Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅ」９６ウェルプレートに、各ウェルにつき３μｌでアリコートする。
【０１２３】
タグメンテーション：Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅプレートのタグメンテーション反応物を２μｌのｃＤＮＡ及び１ｘ  ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（ＮＥＢ）を用いて全体積２０μｌとしてアセンブルする。２０分５５℃でインキュベートする。２０μｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズを、メーカーの使用説明にしたがって洗浄し、ＢＢバッファー（１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ）で１：２０に（原液から）希釈する。２０μｌを各タグメンテーション反応物に加え、１５分室温でインキュベートする。全ウェルを１本のチューブにプールする。ＴＮＴバッファー（２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄する。５０μｌ  ＴＮＴに再懸濁させ、１０μｌ  ＥｘｏＳａｐ  ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を加え、１５分３７℃でインキュベートする。ＴＮＴで２回洗浄し、ＥＢ中、手早く慎重に再懸濁させずに１回洗浄する。５０μｌのヌクレアーゼフリーの水に再懸濁させる。１０分７０℃でインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離させる。ビーズ結合させ上清を新しいチューブに回収する。１．５Ｘ比のＡＭＰｕｒｅビーズを用いて精製する。
【０１２４】
ライブラリーＰＣＲ及び精製：ビーズを５０μｌの第２のＰＣＲ混合物（２００ｎＭ  ｋ＿Ｐ１＿２ｎｄ＿ＰＣＲ  ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣ（配列番号９）、２００ｎＭ  Ｐ２＿４Ｋ＿２ｎｄ＿ＰＣＲ  ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号１０）、１Ｘ  ＫＡＰＡ  ｒｅａｄｙ  ｍｉｘ）に再懸濁させる。配列番号９は、Ｐ１アダプター配列の相補配列にハイブリダイズするＰ１プライマーであり、配列番号１０は、Ｐ１アダプター配列の相補配列にハイブリダイズするＰ２プライマーである。２回目のＰＣＲを実行する（９５℃２分。８サイクル×９８℃３０秒、６５℃１０秒、７２℃２０秒。７２℃５分）。ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅビーズ  ０．７Ｘを用いて精製し、５０μｌ  ＥＢ中溶離させる。
【０１２５】
０．５Ｘ  ＡＭＰｕｒｅビーズを加えることにより長断片を除去し、１０分インキュベートし、上清を回収する。最後に１Ｘ  ＡＭＰｕｒｅビーズを用いて精製し、３０μｌ  ＥＢ中溶離させる。
【０１２６】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング：ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００または２５００でＳｉｎｇｌｅ−Ｅｎｄ５０サイクルキットを用いて、Ｒｅａｄ１  ４ｋ−ＤＩ−ｒｅａｄ１−ｓｅｑ  ＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号１１）、ｉｎｄｅｘ１  ＳＴＲＴ−ＴＮ５−Ｕ  ＰＨＯ−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＡＣＧＣ（配列番号１２）、ｉｎｄｅｘ２  ４ｋ−Ｐ１Ａ−ｓｅｑ  ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（配列番号１３）を用いて配列決定することができる。あるいは、ライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００で配列決定することができる（相応のプライマーを適応する）。
【０１２７】
本願で記載したすべての出版物及び特許文献を、参照により本明細書に組み込む。本発明で説明した方法及び組成物の様々な変形や変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者には自明であろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明してきたが、特許請求する本発明は、そのような特定の実施形態に不当に制限されるものではないと理解すべきである。なお、本明細書で説明した形態の当業者には明らかな本発明を実施するための様々な変形は、以下の特許請求の範囲内とする。
【０１２８】
本願は、２０１５年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６２／２６４，５９３号の優先権を主張し、その全文を参照により本明細書に援用する。
【０１２９】
本願はまた、２０１５年１１月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／２５６，９６８号の優先権を主張し、これを参照により本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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