(57)【要約】抗ｃ Ｍｅｔ抗体‐細胞傷害性薬物複合体の医学的使用を開示する。特に、抗 c-Met 抗体、c-Met の抗原結合断片、抗 c-Met 抗体の CDR 領域を含むキメラ抗体及びヒト化抗体、並びにそれらの抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物、を開示し、及び抗肝がん薬としてのヒト化抗- c-Met 抗体及び抗原結合断片及びそれらの抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を含む医薬組成物の使用、を開示する。
2019534267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝がん治療用の医薬の製造における、抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用であって、ここで前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体が式（I）で示される構造を有する：
Ab-[(L2)t-L1-D)]y（I）
ここで：
D は細胞傷害性薬物である；
L1 及び L2 はリンカー単位である；
t は 0 又は 1 であり、好ましくは 1 である；
y は 1-8 であり、好ましくは 2-5 である；
Ab は、c-Met 受容体に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合断片であり、以下の配列又はそれらの変異配列から選択される少なくとも 1 つの CDR 配列を含む：
抗体重鎖可変領域 HCDR 配列：配列番号６、配列番号７又は配列番号８；及び、
抗体軽鎖可変領域 LCDR 配列：配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１；
である、使用。
【請求項２】
前記抗体重鎖可変領域が、以下：配列番号６、配列番号７若しくは配列番号８、の配列又はそれらの変異配列から選択される少なくとも 1 つの HCDR 配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抗体軽鎖可変領域が、以下：配列番号９、配列番号１０若しくは  配列番号１１、の配列又はそれらの変異配列から選択される少なくとも 1 つの LCDR 配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の重鎖可変領域配列、又はそれらの変異配列；並びに、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列、又はそれらの変異配列を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記変異配列が、抗体活性を最適化するために、CDR 領域に位置する 1-3 個のアミノ酸変異を有する配列であり、ここで、HCDR2 領域の変異配列が、好ましくは配列番号１２である、請求項１から４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６】
c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片が、マウス抗体又はその断片である、請求項１から５の何れか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記マウス抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号４として示される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記マウス抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号５として示される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記マウス抗体の重鎖可変領域が、配列番号４として示され、及び前記マウス抗体の軽鎖可変領域が配列番号５として示される、請求項６から８の何れか一項に記載の使用。
【請求項１０】
c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片が、キメラ抗体若しくはヒト化抗体又はその断片である、請求項１から５の何れか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ヒト化抗体の重鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系重鎖配列、好ましくはヒト生殖細胞系重鎖 IGHV 3-33*01、に由来する重鎖 FR 領域を含み；ここで、前記重鎖 FR 領域は、ヒト生殖細胞系重鎖 IGHV 3-33*01 の FR1、FR2、FR3 及び FR4 領域のフレームワーク配列、又はそれらの変異配列を含み、好ましくは、前記変異配列が 0-10 個のアミノ酸復帰変異を含む、を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ヒト化抗体が、配列番号１３‐１５から選択される重鎖可変領域配列又はそれらの変異体を含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系軽鎖配列、好ましくはヒト生殖細胞系軽鎖 IGKV085 又は IGKV4-1*01、に由来する軽鎖 FR 領域を含み；ここで、前記軽鎖 FR 領域は、ヒト生殖細胞系軽鎖 IGKV085 及び IGKV4-1*01 の FR1、FR2、FR3 及び FR4 領域のフレームワーク配列、又はそれらの変異配列を含み、好ましくは、前記変異配列が 0-10 個のアミノ酸復帰変異を含む、を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体が、配列番号１６‐１８から選択される軽鎖可変領域配列又はそれらの変異体を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ヒト化抗体が、配列番号１３‐１５から選択される重鎖可変領域配列、及び配列番号１６‐１８から選択される軽鎖可変領域配列を含む、請求項１０から１４の何れか一項に記載の使用。
【請求項１６】
c-Met 受容体に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合断片が、ａ）からｃ）：
ａ）配列番号１３の重鎖可変領域配列、及び配列番号１６の軽鎖可変領域配列；
ｂ）配列番号１４の重鎖可変領域配列、及び配列番号１７の軽鎖可変領域配列；又は
ｃ）配列番号１５の重鎖可変領域配列、及び配列番号１８の軽鎖可変領域配列；
の何れか一つから選択される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列の組み合わせを含む、請求項１−５及び１０‐１５の何れか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ヒト化抗体の重鎖定常領域が、ヒトIgG1 若しくはその改変体、ヒト IgG2 若しくはその改変体、ヒト IgG3 若しくはその改変体、又はヒト IgG4 若しくはその改変体、に由来する定常領域を含み、好ましくは、ヒト IgG1 若しくはその改変体、ヒト IgG2 若しくはその改変体、又はヒト IgG4 若しくはその改変体、に由来する定常領域、より好ましくはヒト IgG2 若しくはその改変体、に由来する定常領域を含む、請求項１０‐１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項１８】
c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片が、配列番号２３‐２５から選択される全長重鎖配列、又は配列番号２３‐２５と少なくとも 90 % の同一性を有する配列を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ヒト化抗体の軽鎖定常領域が、ヒトのκ若しくはλ又はそれらの改変体から選択される定常領域を含む、請求項１０‐１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項２０】
c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片が、配列番号２６‐２８から選択される全長軽鎖配列、又は配列番号２６‐２８と少なくとも 90 % の同一性を有する配列を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ヒト化抗体が、以下：
Ab-9 ：配列番号２３の重鎖配列及び配列番号２６の軽鎖配列；
Ab-10 ：配列番号２４の重鎖配列及び配列番号２７の軽鎖配列；又は
Ab-11 ：配列番号２５の重鎖配列及び配列番号２８の軽鎖配列；
から選択される全長軽鎖配列と全長重鎖との組み合わせを含む、請求項１０‐２０の何れか一項に記載の使用。
【請求項２２】
肝がん治療用の医薬の製造における、医薬組成物の使用であって、ここで前記医薬組成物が、請求項１‐２１の何れか一項で定義されるc-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片を含み、前記医薬組成物は、1 つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、使用。
【請求項２３】
前記 -L2- が、式（-L2-）で示される化合物：
【化１】
2019534267.tif 000100
ここで：
X1 は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
X2 は、C1-6 アルキル、3-8 員シクロアルキル又は 3-8 員ヘテロシクリルからなる群より選択される；
m は 0-5 であり、好ましくは 1-3 である；
S は硫黄原子である；
である、請求項１に記載の使用。
【請求項２４】
前記細胞傷害性薬物 D が、毒素、化学療法剤、抗生物質、放射性同位体又は核酸分解酵素から選択される細胞傷害剤である、請求項１に記載の使用。
【請求項２５】
D が、式（D）で示される化合物：
【化２】
2019534267.tif 000101
若しくは互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくはそれらの混合物、又はそれらの薬学的に許容される塩：
ここで：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7はそれぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
R8、R9、R10、R11はそれぞれ水素、ハロゲン、C2-6 アルケニル、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
又は、R8、R9、R10 及び R11 のうちの任意の 2 つが 3-8 員シクロアルキルを形成し、残りの 2 つがそれぞれ水素、C1-6 アルキル又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
R12 及び R13 はそれぞれ水素、C1-6 アルキル又はハロゲンからなる群より選択される；
R14 は、6-8 員のアリール又は 5-8 員のヘテロアリールから選択され、ここで、前記アリール又はヘテロアリールは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される置換基によって、任意選択的に更に置換される；
R15 は、ハロゲン、C2-6 アルケニル、C1-6 アルキル、3-8 員シクロアルキル、カルボキシル、C1-6 アルキル・カルボニル又は C1-6 アルコキシ・カルボニルから選択される；
R16 は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルから選択される；
である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
L2 が、Val-Cit、MC、PAB 及び MC-PAB から選択されるリンカ―、好ましくは MC、を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
D が、メイタンシノイド（maytansinoid）；好ましくは DM1、DM3 及び DM4；より好ましくは DM1 である、請求項１に記載の使用。
【請求項２８】
L2 が、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸又はN-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノ安息香酸；好ましくは、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート又はスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸からなる群より選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
D が、CPT、10-ヒドロキシ-CPT、イリノテカン、SN-38 又はトポテカンから選択されるカンプトテシン・アルカロイド、より好ましくは SN-38、である、請求項１に記載の使用。
【請求項３０】
前記リンカー L2が Val-Cit、MC、PAB 又は MC-PAB；好ましくは MC 又は MC-vc-PAB から選択される、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体が、式（II）の複合体薬物：
【化３】
2019534267.tif 000102
ここで：
R2-R16は請求項２５に定義の通りである；
Ab、t、y、L1 及び L2 は請求項１に定義の通りである；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３２】
前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体が、式（III）の複合体薬物：
【化４】
2019534267.tif 000103
ここで：
R2-R16は請求項２５に定義の通りである；
Ab 及び y は請求項１に定義の通りである；
n は 3-6 であり、好ましくは 5 である；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３３】
前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体が、式（IV）の複合体薬物：
【化５】
2019534267.tif 000104
ここで：
R2-R16は請求項２５に定義の通りである；
Ab 及び y は請求項１に定義の通りである；
n は請求項３２に定義の通りである；
X1、X2 及び m は請求項２３に定義の通りである；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３４】
前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体が、式（V）の複合体薬物：
【化６】
2019534267.tif 000105
ここで：
Ab、D 及び y は請求項１に定義の通りである；
n は請求項３２に記載の通りである；
X1、X2 及び m は請求項２３に定義の通りである；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３５】
前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が、以下：
【化７−１】
2019534267.tif 000106
【化７−２】
2019534267.tif 000107
式中、Ab-9、Ab-10 及び Ab-11 は請求項２１に定義の通りであり、y は 1-8、好ましくは 2-5 の範囲である、
からなる群より選択される、請求項１‐３４の何れか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記肝がんが、c-Met ポジティブ肝がん又は c-Met を過剰発現する肝がんである、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝がん治療用の医薬の製造における、c-Met 抗体‐細胞傷害性薬物複合体（c-Met antibody-cytotoxic drug conjugate）若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学及び腫瘍薬理学の研究によって、チロシン・キナーゼ（プロテイン・チロシン・キナーゼ（Protein Tyrosine Kinases）、PTKs）が関連する細胞シグナル伝達経路が腫瘍の形成及び発生において、極めて重要な役割を果たし、がん原遺伝子及びがん遺伝子産物の50 % 以上がチロシン・キナーゼ活性を有することが示されてきた。c-Met がん原遺伝子は PTKs ファミリーの Ron サブファミリーに属し、そしてその遺伝子にコードされる c-Met タンパク質は、肝細胞増殖因子／分散因子（Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor (HGF/SF)）に対する高親和性受容体である。HGF/c-Met シグナル伝達経路は血管新生及び腫瘍の成長の過程に密接に関連している。HGF/c-Met シグナル伝達経路が持続的に活性化することは、組織細胞のがん化又はがん細胞の過剰増殖の重要な原因である。この経路の阻害は、腫瘍を標的とした治療法の新しい方法になる。
【０００３】
c-Met がん原遺伝子は、ヒト第７染色体長腕（7q31）上に位置し、サイズが 120 kb を超える約 150 kD の分子量を有する c-Met タンパク質前駆体をコードする。局所グリコシル化によって 170 kD の糖タンパク質が産生される。その糖タンパク質は更に 1 つのサブユニット（50 kDa）ともう 1 つ別のサブユニット（140 kDa）に切断され、それらはジスルフィドによって結合して成熟 c-Met タンパク質受容体を形成する。そのヘテロ二量体は 2 本の鎖を含み、一方は細胞外ドメイン、膜貫通領域（膜ストレッチ断片（membrane stretch fragment）とも呼ばれる）、及び細胞内ドメイン（細胞内チロシン・キナーゼ結合部位を含む）を含む。もう 1 つ別の鎖は細胞外部分のみを有するが、それは高度にグリコシル化され、そしてジスルフィド結合により前者の鎖に結合している。2 つのサブユニットの細胞外領域は対応するリガンドの認識部位であり、そして細胞内ドメインはチロシン・キナーゼ活性を有する。
【０００４】
c-Met 活性化メカニズムは 3 つのタイプに分けられる：即ち、1 つは HGF の活性化メカニズムに依存するタイプ、2 つ目は HGF 活性化メカニズムに依存しないタイプ、3 つ目は、例えばヒアルロン酸表面受容体 CD44、アドヘシン及び RON シグナル伝達経路等、他の膜経路を介するタイプ、である。最も一般的なものの 1 つは、HGF の活性化メカニズムに依存するタイプである。HGF の N 末端は c-Met に結合して、二量体化、及び鎖上のTyr1234 及び Tyr1235 の自己リン酸化を促進する。そして C 末端付近の Tyr1349 及び Tyr1356 のリン酸化によって、次にP13K/Akt、Ras/Mapk、c-Src 及び STAT3/5 を介した下流シグナル伝達の活性化を誘導する複数のリンカー・タンパク質に対する結合部位が形成され、例えば、細胞生存及び活動（activity）（P13K/Akt 経路と密接に関連する）、腫瘍転移及び細胞増殖（主に Ras/Mapk によって仲介される）等の異なる細胞反応を引き起こす。更に、c-Met と他の膜受容体とのクロストークは、腫瘍形成及び転移を促進することが知られてきている。c-Met は、腫瘍形成及び転移をもたらす多くの経路が交差する点であるので、c-Met を標的とすることによって、多くの経路を同時に妨害することを比較的容易に達成することができ、そして c-Met は抗腫瘍形成及び転移療法のための有望な標的となっている。
【０００５】
抗体薬物複合体（Antibody drug conjugate (ADC)）は、モノクローナル抗体又は抗体断片を安定した化学リンカーを介して生物学的に活性な細胞毒素に結合することによって形成される。これは、特定の腫瘍細胞又は発現量が高い抗原に対する抗体の特異性、及び細胞毒素の高い効率性を十分に活用し、正常細胞に対する毒性の副作用を回避する。このことは、従来の化学療法剤と比較した場合、抗体薬物複合体が腫瘍細胞に正確に結合し、正常細胞に対する効果を減少させることができることを意味する。
【０００６】
ADCは、3 つの部分：抗体（標的）、リンカー、毒素、から構成される。それらの中で、良い標的（抗体部分）は ADC 薬物の特異性を決定し、それは特異的に標的へ結合することだけでなく、エンドサイトーシスを効果的にすることも含む。
【０００７】
現在、c-Met キナーゼを標的化するための 3 つの主な種類の阻害剤がある：即ち、HGF 及び c-Met の生物学的なアンタゴニスト、HGF 及び c-Met 抗体、並びに c-Met 阻害剤低分子、である。既存の臨床結果によると、HGF 及び c-Met を直接標的とする抗体、又は c-Met の低分子による阻害は理想的ではないことを示している。c-Met に対する ADC は、腫瘍を治療するための最も効果的な方法になりうる。現時点では、c-Met ADC に関する臨床研究はない。
【０００８】
PCT/CN2016/078699 において、本発明者は、ある種の c-Met ADC 薬物を開示し、そしてがん治療のためのその使用を予想する。しかしながら、肝がんの治療への使用は示唆されていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする技術的課題は、肝がん治療用の医薬の製造における、抗体‐細胞傷害性薬物複合体（ADC）若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用である。ここで、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体（ADC）は、顕著な抗腫瘍活性を有し、肝がん細胞の増殖を効果的に阻害する単一成分として作用し、従ってより良い臨床的応用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の技術的解決法を以下に記載する。
【００１１】
本発明は、肝がん治療用の医薬の製造における、抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用であって、ここで前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体が式（I）で示される構造を有する：
Ab-[(L2)t-L1-D)]y（I）
ここで：
D は細胞傷害性薬物である；
L1 及び L2 はリンカー単位である；
t は 0 又は 1 であり、好ましくは 1 である；
y は 1-8 であり、好ましくは 2-5 である；
Ab は、c-Met 受容体に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合断片であり、以下の配列又はそれらの変異配列から選択される少なくとも 1 つの CDR 配列を含む：
抗体重鎖可変領域 HCDR 配列：配列番号６、配列番号７又は配列番号８；及び、
抗体軽鎖可変領域 LCDR 配列：配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１；
である、使用、を提供する。
【００１２】
好ましくは、前記抗体重鎖可変領域は、以下：配列番号６、配列番号７及び配列番号８、の配列又はそれらの変異配列から選択される少なくとも 1 つの HCDR 領域配列を含む。
【００１３】
好ましくは、前記抗体軽鎖可変領域は、以下：配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１、の配列又はそれらの変異配列から選択される少なくとも 1 つの LCDR 領域配列を含む。
【００１４】
本発明の好ましい態様において、前記抗体は、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の重鎖可変領域配列、又はそれらの変異配列；並びに、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１の軽鎖可変領域配列、又はそれらの変異配列を含む。
【００１５】
前記変異配列は、抗体活性を最適化する CDRs に位置する 1-3 個のアミノ酸変異を有する配列であり、ここで、HCDR2 領域の変異配列が、好ましくは配列番号１２である。
【００１６】
c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片は、マウス抗体又はその断片である。
【００１７】
前記マウス抗体の重鎖可変領域配列は、配列番号４として示される。
【００１８】
前記マウス抗体の軽鎖可変領域配列は、配列番号５として示される。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、前記マウス抗体の重鎖可変領域は配列番号４として示され、及び前記マウス抗体の軽鎖可変領域は配列番号５として示される。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、c-Met受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片は、キメラ抗体若しくはヒト化抗体又はその断片である。
【００２１】
ヒト化抗体の重鎖可変領域は、ヒト生殖細胞系重鎖配列、好ましくはヒト生殖細胞系重鎖 IGHV 3-33*01、に由来する重鎖 FR 領域を含み；ここで、前記重鎖 FR 領域は、ヒト生殖細胞系重鎖 IGHV 3-33*01 の FR1、FR2、FR3 及び FR4 領域のフレームワーク配列、又はそれらの変異配列を含み、好ましくは、前記変異配列が 0-10 個のアミノ酸復帰変異である、を含む。
【００２２】
前記ヒト化抗体は、配列番号１３‐１５から選択される重鎖可変領域配列又はそれらの変異体を含む。
【００２３】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域は、ヒト生殖細胞系軽鎖配列、好ましくはヒト生殖細胞系軽鎖 IGKV085 又は IGKV4-1*01、に由来する軽鎖 FR 領域を含み；ここで、前記軽鎖 FR 領域は、ヒト生殖細胞系軽鎖 IGKV085 及び IGKV4-1*01 の FR1、FR2、FR3 及び FR4 領域のフレームワーク配列、又はそれらの変異配列を含み、好ましくは、前記変異配列が 0-10 個のアミノ酸復帰変異である、を含む。
【００２４】
本発明の好ましい態様において、前記ヒト化抗体は、配列番号１６‐１８から選択される軽鎖可変領域配列又はそれらの変異体を含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体は、配列番号１３‐１５から選択される重鎖可変領域配列、及び配列番号１６‐１８から選択される軽鎖可変領域配列を含む。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片は、ａ）からｃ）：
ａ）配列番号１３の重鎖可変領域配列、及び配列番号１６の軽鎖可変領域配列；
ｂ）配列番号１４の重鎖可変領域配列、及び配列番号１７の軽鎖可変領域配列；又は
ｃ）配列番号１５の重鎖可変領域配列、及び配列番号１８の軽鎖可変領域配列；
の何れか一つから選択される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列の組み合わせを含む。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体の重鎖定常領域は、ヒト IgG1 若しくはその改変体、ヒト IgG2 若しくはその改変体、ヒト IgG3 若しくはその改変体、又はヒト IgG4 若しくはその改変体、に由来する定常領域を含み、好ましくは、ヒト IgG1 若しくはその改変体、ヒト IgG2 若しくはその改変体、又はヒト IgG4 若しくはその改変体、に由来する定常領域、より好ましくはヒト IgG2 若しくはその改変体、に由来する定常領域を含む。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号２３‐２５から選択される全長重鎖配列、又は配列番号２３‐２５と少なくとも 90 % の同一性を有する配列を含む。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体の軽鎖定常領域は、ヒトのκ若しくはλ又はそれらの改変体から選択される定常領域を含む。
【００３０】
c-Met 受容体に特異的に結合する前記抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号２６‐２８から選択される全長軽鎖配列、又は配列番号２６‐２８と少なくとも 90 % の同一性を有する配列を含む。
【００３１】
前記ヒト化抗体は、以下：
Ab-9 ：配列番号２３の重鎖配列及び配列番号２６の軽鎖配列；
Ab-10 ：配列番号２４の重鎖配列及び配列番号２７の軽鎖配列；又は
Ab-11 ：配列番号２５の重鎖配列及び配列番号２８の軽鎖配列；
から選択される全長軽鎖配列と全長重鎖配列との組み合わせを含む。
【００３２】
本発明は更に、肝がん治療用の医薬の製造における、医薬組成物の使用であって、ここで前記医薬組成物が、上記の c-Met 抗体又はその抗原結合断片及び 1 つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、使用、を提供する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、前記-L2- は、式（-L2-）で示される化合物：
【化１】
2019534267.tif 000003
ここで：
X1 は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
X2 は、C1-6 アルキル、3-8 員シクロアルキル又は 3-8 員ヘテロシクリルからなる群より選択される；
m は 0-5 であり、好ましくは 1-3 である；
S は硫黄原子である；
である、
【００３４】
好ましくは、前記細胞傷害性薬物単位の D は、毒素、化学療法剤、抗生物質、放射性同位体又は核酸分解酵素から選択される細胞傷害剤である。
【００３５】
本発明の好ましい態様によれば、前記D は、式（D）で示される化合物：
【化２】
2019534267.tif 000004
若しくは互変異性体、メソマー、ラセミ体、エナンチオマー、ジアステレオマー、若しくはそれらの混合物、又はそれらの薬学的に許容される塩：
ここで：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7はそれぞれ水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
R8、R9、R10、R11はそれぞれ水素、ハロゲン、C2-6 アルケニル、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；好ましくは、少なくとも 1 つの基は、ハロゲン、C2-6 アルケニル、C1-6 アルキル又は 3-8 員シクロアルキルから選択される；残りの基は、水素である；
又は、R8、R9、R10、R11 のうちの任意の 2 つが 3-8 員シクロアルキルを形成し、残りの 2 つがそれぞれ水素、C1-6 アルキル及び 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
R12、R13 はそれぞれ水素、C1-6 アルキル及びハロゲンからなる群より選択される；
R14 は、6-14 員のアリール又は 5-15 員のヘテロアリールから選択され、ここで、前記アリール又はヘテロアリールは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ又は 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される置換基によって、任意選択的に更に置換される；
R15 は、ハロゲン、C2-6 アルケニル、C1-6 アルキル、3-8 員シクロアルキル、カルボキシル、C1-6 アルキル・カルボニル及び C1-6 アルコキシ・カルボニルからなる群より選択される；
R16 は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、C1-6 アルコキシ及び 3-8 員シクロアルキルからなる群より選択される；
である。
【００３６】
好ましくは、L2は、Val-Cit、MC、PAB 及び MC-PAB からなる群から選択されるリンカ―、好ましくは MC、を含む。
【００３７】
特に好ましくは、D は、メイタンシノイド（maytansinoid）；好ましくは DM1、DM3 及び DM4；より好ましくは DM1 である。
【００３８】
好ましくは、L2は、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート（SPP）、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸（SMCC）又は N-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノ安息香酸（SIAB）；好ましくは、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート又は N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸からなる群より選択される。
【００３９】
更に好ましくは、D は、CPT、10-ヒドロキシ-CPT、イリノテカン、SN-38 又はトポテカンからなる群より選択されるカンプトテシン・アルカロイド、より好ましくは SN-38、である。
【００４０】
特に好ましくは、前記リンカー L2は Val-Cit、MC、PAB 又は MC-PAB；好ましくは MC 又は MC-vc-PAB からなる群より選択される。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体は、式（II）の複合体薬物：
【化３】
2019534267.tif 000005
ここで：
R2-R16は式（D）に定義の通りである；
Ab、t、y、L1、L2 は式（I）に定義の通りである；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体は、式（III）の複合体薬物：
【化４】
2019534267.tif 000006
ここで：
R2-R16は式（D）に定義の通りである；
Ab、y は式（I）に定義の通りである；
n は 3-6 であり、好ましくは 5 である；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体は、式（IV）の複合体薬物：
【化５】
2019534267.tif 000007
ここで：
R2-R16は式（D）に定義の通りである；
Ab、y は式（I）に定義の通りである；
n は式（III）に定義の通りである；
X1、X2、m は式 L2 に定義の通りである；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体は、式（V）の複合体薬物：
【化６】
2019534267.tif 000008
ここで：
Ab、D、y は式（I）に定義の通りである；
n は式（III）に定義の通りである；
X1、X2、m は式 L2 に定義の通りである；
若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、以下からなる群より選択される：
【００４６】
【表１−１】
2019534267.tif 000009
【表１−２】
2019534267.tif 000010
Ab-9、Ab-10、Ab-11 は上記の c-Met 抗体であり、y は 1-8 であり、好ましくは 2-5 である。
ここで、y は 1-8、好ましくは 1-4 の範囲である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、肝がんのがん細胞は、c-Met の発現はポジティブである、又はc-Met を過剰発現していて、好ましくは≧20 % の肝がん細胞がポジティブ／弱ポジティブである；更に好ましくは、≧25 % の肝がん細胞がポジティブである；より好ましくは、≧50 % の肝がん細胞が強くポジティブである。
【００４８】
1.用語
本明細書及び特許請求の範囲において、本明細書の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書で使用される科学及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。しかしながら、本発明をより容易に理解してもらうために、ある関連用語を以下に具体的に定義及び説明する。更に、本出願によって定義及び説明される用語が、当業者によって一般的に理解される意味と矛盾する場合、本出願による用語の定義及び説明が優先されるものとする。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、アミノ酸についての 3 文字コード及び 1 文字コードは、J. biol. chem, 243, p3558 (1968). に記載の通りである。
【００５０】
用語「c-Met」又は「c-Met ポリペプチド」又は「c-Met 受容体」は、肝細胞増殖因子（HGF）に結合する受容体チロシン・キナーゼを指す。本発明において、マウス c-Met（m-c-Met）又はサル c-Met （cyno-c-Met）等のように具体的に特定されない限り、用語「c-Met」は、通常ヒト c-Met（h-c-Met）を指す。本発明で使用されるヒト、マウス及びカニクイザルの c-Met は、GenBank によって提供されるヌクレオチド配列又はポリペプチド配列によってコードされ、例えば、ヒト・ポリペプチドは、GenBank アクセッション番号 NM_000245 で提供されるヌクレオチド配列によってコードされ、ヒト・タンパク質又はその細胞外ドメインは、GenBank アクセッション番号 NP_000236 で提供されるポリペプチド配列によりコードされる。元の一本鎖前駆体タンパク質は翻訳後に切断されてアルファ及びベータ・サブユニットを生成し、これらはジスルフィド結合によって結合して成熟受容体を形成する。受容体チロシン・キナーゼ c-Met は、例えば、胚形成に関連する組織再生に関する遊走、浸潤及び形態形成の過程等を含む、細胞過程に関与する。
【００５１】
用語「c-Met 関連障害又は症状（c-Met-related disorder or condition）」は、c-Met 発現の有害な発現若しくは欠如、有害な調節若しくは調節の欠如、又は有害な活性若しくは活性の欠如から生じるあらゆる疾患、障害若しくは症状を指すか、又は、c-Met の発現若しくは活性を調節することによって、調節、治療又は治癒され得るあらゆる疾患、障害若しくは症状を指す。HGF/c-Met 経路の活性化は、例えば、ほとんどのがん患者において、又はその疾患が実際に c-Met 経路に関連する変化によって引き起こされる患者において、予想されることがある。例えば、上方制御は、HGF 及び／若しくは c-Met の過剰発現等の異なる機序、又は c-Met 変異の構成的活性化による。c-Met 関連障害又は症状には、限定されるものではないが、増殖性の疾患及び障害、並びに炎症性の疾患及び障害が含まれる。増殖性疾患としては、限定されるものではないが、例えば、胃がん、食道がん、乳がん、乳頭状腎細胞がんを含む腎臓がん、肺がん、神経膠腫、頭頸部がん、上皮がん、皮膚がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳がん、膵臓がん、大腸がん、胃腸がん、腸がん、生殖器がん、泌尿器がん、黒色腫、前立腺がん、及び当業者に公知の他の腫瘍等を含むがんが含まれる。炎症性疾患としては、限定されるものではないが、リステリア細菌（Listeria bacteria）によって引き起こされる感染症等を含む細菌感染症が含まれる。
【００５２】
本発明における「抗体」とは、免疫グロブリン（2 つの同一の重鎖及び 2 つの同一の軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって連結されることによって形成された 4 つのペプチド鎖の構造）を指す。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸の組成及び配列を示し、従って異なる種類の抗原性を示す。従って、免疫グロブリンは、免疫グロブリン・アイソタイプとも呼ばれる 5 つのカテゴリー、即ち IgM、IgD、IgG、IgA 及び IgE に分類することができる；それらの対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、ε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸の組成並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置に従って、免疫グロブリンは異なるサブカテゴリに分類することができ、例えば、IgG は、IgG1、IgG2、IgG3、及び IgG4 に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域に基づいて、κ鎖又はλ鎖に分けることができる。これら 5 つのカテゴリーのうちの各カテゴリーの Ig は、κ又はλ鎖を含む。
【００５３】
抗体重鎖及び軽鎖の N-末端付近では、約 110 個のアミノ酸が大きく異なり、可変領域（variable region（V 領域））として知られている；C-末端付近のアミノ酸配列は比較的安定しており、定常領域（constant region（C 領域））として知られている。可変領域には、3 つの超可変領域（hypervariable regions (HVR)）、及び比較的保存された配列を有する 4 つのフレームワーク領域（framework regions (FR)）が含まれる。3 つの超可変領域が抗体の特異性を決定し、これは相補性決定領域（complementarity determining region (CDR)）としても知られる。各軽鎖可変領域（light chain variable region (LCVR)）及び各重鎖可変領域（heavy chain variable region (HCVR)）は、3 つの CDR 領域及び 4 つの FR 領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端まで：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及び FR4、と並んでいる。3 つの軽鎖 CDR 領域は、LCDR1、LCDR2、及び LCDR3 を指し；3 つの重鎖 CDR 領域は、HCDR1、HCDR2 及び HCDR3 を指す。本明細書中の抗体又は抗原結合断片の LCVR 及び HCVR 領域中の CDR 領域アミノ酸残基の数及び位置は、周知の、カバット（Kabat）番号付け基準（LCDR1-3, HCDE2-3）に従うか、又はカバット及びチョッチア（chothia）番号付け基準（HCDR1）に従う。
【００５４】
本発明における用語「マウス抗体」は、当技術分野における知識及び技術に従ってマウスから調製された抗ヒト c-Met モノクローナル抗体を指す。調製の中で、被験体に c-Met 抗原を注射し、次いで所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離した。本発明の好ましい態様において、マウス c-Met 抗体又はその抗原結合断片は、マウスκ、λ鎖若しくはそれらの変異体の軽鎖定常領域を更に含むか、又はマウス IgG1、IgG2、IgG3 若しくは IgG4 若しくはそれらの変異体の重鎖定常領域を更に含む。
【００５５】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に融合することによって得られる抗体であり、前記キメラ抗体はマウス抗体誘導性免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を確立するために、特異的マウス・モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、可変領域遺伝子をマウス・ハイブリドーマからクローニングし、次いで組換え発現のためにヒト抗体の定常領域遺伝子にクローニングする。
【００５６】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト化 CDR 移植抗体としても知られていて、ヒト抗体可変領域のフレームワーク上にマウス CDR 配列を移植することによって生成された抗体、即ち、ヒト生殖細胞系抗体フレームワーク配列の異なるタイプで生成された抗体、を指す。ヒト化抗体は、多数のマウス・タンパク質成分を保有するキメラ抗体による強い免疫抗体応答を回避する。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を網羅する公共の DNA データベース、又は出版されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系 DNA 配列を、「VBase」ヒト生殖細胞系配列データベース（ウェブサイトwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseから入手可能）、並びに Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版で見つけることができる。本発明の好ましい実施形態では、c-Met ヒト化抗体のマウス CDRs 配列は、配列番号６、７、８、９、１０、１１から選択される。ヒト抗体可変領域フレームワークを設計及び選択したが、ここで、前記抗体軽鎖可変領域の軽鎖 FR 領域配列は、ヒト生殖細胞系軽鎖配列（好ましくは ヒト生殖細胞系軽鎖 IGKV085 又は IGKV 4-1*01 から選択される）に由来し、ヒト生殖細胞系軽鎖 IGKV085 及び IGKV 4-1*01 の FR1、FR2、FR3 及び FR4 領域を含み；前記抗体重鎖可変領域の重鎖 FR 領域配列は、ヒト生殖細胞系重鎖配列（好ましくは、ヒト生殖細胞系重鎖 IGHV 3-33*01 から選択される）に由来し、ヒト生殖細胞系重鎖 IGHV 3-33*01 の FR1、FR2、FR3 及び FR4 領域を含む。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、最小限の復帰変異をヒト抗体可変領域に導入して、前記活性を維持することがある。
【００５７】
ヒト化抗体を作製するために当該分野で利用可能な多数の方法がある。例えば、ヒト化抗体は、抗 c-Met 抗体（例えば、マウス抗体又はハイブリドーマによって産生された抗体）の HCVR 及び LCVR 配列を入手し、そしてそのような配列を、選択したヒト・フレームワークをコードする配列上に移植することによって、産生することができる。任意選択的に、前記 CDR 領域を前記フレームワーク領域上に移植する前に、CDR 中の 1 つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換するために、ランダム突然変異誘発又は特定の位置での突然変異誘発によって CDR 領域を最適化することがある。或いは、CDR 領域を、当業者に利用可能な方法を用いることによって、ヒト・フレームワーク領域に挿入した後に最適化することがある。好ましくは、「ヒト化抗体」は、該抗体がヒト細胞中で産生されるかどうかにかかわらず、親抗体（即ち、非ヒト抗体、好ましくはマウス・モノクローナル抗体）を起源とする、又はそれに由来する CDRs を有し、同時に、フレームワーク及び定常領域は、それが存在する範囲内（又はそれらの有意な又は実質的な部分、即ち、少なくとも約 90 %、92 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 % 又は 99 %）は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン領域に存在する核酸によって（例えば、International ImmunoGeneTics Database を参照）、又はそれらの組換え若しくは変異型としてコードされている。好ましくは、ヒト化抗体の少なくとも 2、3、4、5 又は 6 個の CDRs を、そのヒト化抗体が由来する非ヒト親抗体の CDRs から最適化して、所望の特性、例えば、改善された特異性、親和性又は中和性、を生じさせ、これをスクリーニング・アッセイ、例えば ELISA アッセイ、により同定することがある。好ましくは、本発明の抗体中の最適化した CDR は、親抗体中に存在するものと比較したとき、少なくとも 1 つのアミノ酸置換を含む。親抗体の CDRs と比較した場合、本発明のヒト化抗体の CDRs におけるあるアミノ酸置換（本明細書の実施例６参照）は、前記抗体の不安定性の可能性を減少させる（例えば、CDR からの Asn 残基の除去）、又は、ヒト対象に投与したときの抗体の免疫原性を（例えば、IMMUNOFILTER（商標）Technology によって予測されるように）減少させる。
【００５８】
CDR をコードする配列を、選択したヒト・フレームワークをコードする配列に移植した後、次いで、ヒト化可変重鎖及び可変軽鎖配列をコードする得られた DNA 配列を発現させて、c-Met に結合するヒト化抗体を産生する。前記ヒト化 HCVR 及び LCVR を、抗 c-Met 抗体分子全体の一部として、即ちヒト定常領域配列との融合タンパク質として、発現させることができる。しかしながら、前記 HCVR 及び LCVR 配列を、定常配列が存在しない状態で発現させて、ヒト化抗 c-Met scFv を産生することもできる。
【００５９】
使用することがあるマウス抗体のヒト化に関する方法を更に記載する参考文献として、例えば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869, 1991、及び Winter らの方法［Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)］を挙げる。
【００６０】
本発明における「抗原結合断片（Antigen-binding fragment）」とは、抗原結合活性を有する Fab 断片、Fab’ 断片、F(ab’)2 断片、並びにヒト c-Met と結合する Fv 断片 scFv 断片をいう；それは、本発明に記載の抗体の 1 つ以上の CDR 領域を含み、配列番号３から配列番号８からなる群より選択される。Fv 断片は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及び定常領域が無い全ての抗原結合部位、を含む、最小の抗体断片である。一般に、Fv 抗体は、VH 領域と VL 領域との間にポリペプチド・リンカーを更に含み、抗原結合に必要な構造を形成することがある。また、異なるリンカーを使用して、2 本の抗体の可変領域を連結して、一本鎖抗体又は一本鎖 Fv(scFv) と呼ばれるポリペプチド鎖を形成することがある。scFvを抗 EGFR 抗体のような他の抗体と共に用いて、バイスペシフィック抗体（bispecific antibody）を構築することもある。本発明で使用される用語「c-Met と結合する（binding with c-Met）」は、ヒト c-Met と相互作用することができることを意味する。本発明における用語「抗原結合部位（antigen-binding sites）」は、本発明の抗体又は抗原結合断片によって認識される、抗原上の不連続な三次元部位を指す。本明細書中で使用される場合、用語「ADCC」、すなわち抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）は、Fc 受容体を発現する細胞が、抗体の Fc セグメントを認識することによって、抗体によって被覆された標的細胞を直接死滅させることを意味する。抗体の ADCC エフェクター機能は、IgG 中の Fc セグメントを修飾することによって減少又は排除することができる。前記修飾は、IgG1 中の N297A、L234A、L235A から選択される突然変異；IgG2/4 キメラ；IgG4 における F235E 及び L234A/E235A の変異等、抗体重鎖定常領域上に行う変異を指す。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、本発明において記載される融合タンパク質は、組換え DNA 技術によって 2 つの遺伝子を共発現することによって得られるタンパク質産物である。組換え c-Met 細胞外ドメイン Fc 融合タンパク質は、組換え DNA 技術を介して、c-Met 細胞外ドメインとヒト抗体 Fc 断片とを共発現させることによって得られる。前記 c-Met 細胞外ドメインは、c-Met タンパク質の細胞外部分を発現させたものを指す。
【００６２】
本発明の改変した抗体又は抗原結合断片は、従来の方法を用いて調製及び精製することがある。例えば、重鎖（配列番号４）及び軽鎖（配列番号５）をコードする cDNA 配列をクローニングし、pEE6.4 発現ベクター（ロンザ・バイオロジクス社（Lonza Biologics））の中へ組換えることがある。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターを、CHO 細胞に安定的にトランスフェクトすることがある。当該技術分野において周知の、より推奨される方法として、哺乳動物発現系は、典型的には FC 領域内の高度に保存された N-末端で、抗体をグリコシル化する。ヒト c-Met に特異的に結合する抗体の発現を通して、安定なクローンを得ることができる。ポジティブ・クローンを、バイオリアクターにおける抗体産生のために無血清培地中で増殖させることがある。抗体が分泌されている培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、前記培地を、都合が良いことに、適合性のある緩衝液で平衡化されているプロテイン A 又は G セファロース FF カラムに、のせることができる。前記カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合した抗体を pH 勾配により溶出し、そして抗体断片を SDS-PAGE により検出し、そして次に回収する。前記抗体は、一般的な技術を用いて濾過及び濃縮することがある。可溶性の凝集体及び多量体を、サイズ排除（size exclusion）又はイオン交換等を含む、一般的な技術によって効果的に除去することがある。得られた生成物を、例えば -70 ℃で直ちに凍結することがあり、又は凍結乾燥することがある。
【００６３】
本発明における用語「抗体」は、モノクローナル抗体を指す。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」又は「mAb」とは、単一の細胞株由来のクローンによって分泌される抗体を指す。前記細胞株は真核細胞株、原核細胞株、又はファージ・クローン細胞株に限定されない。モノクローナル抗体又は抗原結合断片を、組換え法、例えば、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージ・ディスプレイ技術、合成技術（例えば CDR 移植など）、又は当技術分野で容易に知られる他の技術によって得ることができる。
【００６４】
「投与（Administration）」及び「処置・治療（treatment）」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、又は体液に適用される場合、外因性の医薬、治療薬、診断薬、又は組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、又は体液と接触させることを指す。「投与」及び「処置・治療」は、例えば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法、及び実験方法、を指すことがある。細胞の治療は、薬剤と細胞とを接触させること、並びに薬剤と流体とを接触させることを含み、ここで流体は細胞と接触している。
【００６５】
「治療する（Treat）」とは、治療薬（例えば本発明の結合化合物の何れかを含む組成物等）を、前記治療薬が治療活性を有することが知られた 1 つ以上の疾患症状を有する患者の体内又は体外に投与することを意味する。典型的には、前記治療薬は、任意の臨床的に測定可能な程度まで、そのような症状を退行させることを誘導するか、又はそのような症状の進行を阻害することによって、治療を受ける患者又は集団における 1 つ以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与する。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の病状、年齢、及び体重、並びに患者に望ましい反応を引き出す薬物の能力等の要因によって、異なることがある。疾患の症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度又は進行状態を評価するために医師又は他の熟練したヘルスケア提供者によって典型的に使用される任意の臨床的な測定によって評価することがある。本発明の実施形態（例えば、治療方法又は製造品）は、必ずしもすべての患者において、関心のある疾患の症状を軽減するのに効果的ではないこともあるが、それは、関心のある標的の疾患の症状を、スチューデントの t 検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニー（Mann and Whitney）による U 検定、クラスカル‐ウォリス検定（Kruskal-Wallis test）（H-検定）、ヨンクヒール‐タプストラ検定（Jonckheere-Terpstra test）及びウィルコクソン検定（Wilcoxon test）等の当技術分野で公知の任意の統計的検定によって判定されるように、統計的に有意な患者数で、軽減することがある。
【００６６】
「保存的修飾（Conservative modification）」又は「保存的交換又は置換（conservative replacement or substitution）」は、タンパク質中のアミノ酸を、類似の特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格コンフォメーション及び剛性など）を有する他のアミノ酸によって置換することを指し、その変更を、タンパク質の生物学的活性を変えることなく頻繁に行うことがある。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域において、単一アミノ酸を置換することが、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (第 4 版) を参照のこと）。更に、構造的又は機能的に類似のアミノ酸に置換することは、生物学的活性を乱す可能性が低い。
【００６７】
本明細書及び特許請求の範囲を通して使用される用語「から本質的になる（consisting essentially of）」、又はその変形は、任意の前記要素又は要素の群を含むことを示し、及び任意選択的に他の要素を含むこと、列挙した要素と類似又は異なる性質を含むことを示し、これは、特定した投薬計画、方法、又は組成の基本的又は新規な性質を著しく変更することは無い。非限定的な例として、列挙したアミノ酸配列から本質的になる結合化合物はまた、結合化合物の特性に著しく影響を及すことがない 1 つ以上のアミノ酸も含むことがある。
【００６８】
「有効量（Effective amount）」は、病状の症状又は徴候を改善する、又は予防するのに十分な量を包含する。有効量はまた、診断を可能にする、又は促進するのに十分な量も指す。特定の患者又は獣医学的対象についての有効量は、治療を受ける症状、患者の全身の健康状態、投与経路及び投与量、並びに副作用の重篤度等の要因に応じて変わることがある。有効量は、重大な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投薬計画であることがある。
【００６９】
「外因性（Exogenous）」とは、状況に応じて、生物体、細胞、又は人体の外部で産生される物質を指す。「内因性（Endogenous）」とは、状況に応じて、細胞、生物、又は人体の内部で産生される物質を指す。
【００７０】
「相同性（Homology）」は、2 つのポリヌクレオチド配列間又は 2 つのポリペプチド間の配列の類似性を指す。2 つの比較した配列の両方における位置が同じ塩基の又はアミノ酸のモノマー・サブユニットによって占められている場合、例えば 2 つの DNA 分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占められている場合、その分子はその位置で相同である。2 つの配列間の相同性の割合は、2 つの配列が共有する一致する位置、又は相同な位置の数を、比較する位置の数で割って、100 を掛けた値の関数である。例えば、2 つの配列の中の 10 個の位置のうち 6 個が一致している、又は相同であるならば、その配列を最適にアラインメントすると（optimally aligned）、2 つの配列は 60 % の相同性がある。一般に、前記比較は、2 つの配列が最大の相同性パーセントを与えるようにアライメントされている場合に、行う。
【００７１】
「任意選択的の（Optional）」又は「任意選択的に（optionally）」は、続くイベント又は状況が必ずしも起こるとは限らないことを意味し、その記載はそのイベント又は状況が起こる又は起こらない場合を含む。例えば、「1-3 個の抗体重鎖可変領域を任意選択的に含む」とは、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在することがあるが、必ずしもそうではないことを意味する。
【００７２】
「医薬組成物」とは、本発明による１種以上の化合物若しくは生理学的／薬学的に許容される塩、又はそのプロドラッグと、他の化学成分、並びに生理学的／薬学的に許容される担体及び賦形剤等の追加成分との混合物を指す。前記医薬組成物は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、それによって生物学的効果を発揮することを目的としている。
【００７３】
従来の医薬組成物の調製は、中国薬局方に見出すことができる。
【００７４】
用語「担体」は本発明の薬物に適用され、薬物が人体に入る方法を変え、in vivo 分布を変え、薬物の放出速度及び標的器官への薬物の送達を制御することができる系を指す。薬物担体の放出及びターゲティング・システムによって、薬物の分解及び損失は減少し、副作用は減少し、そして生物学的利用能を改善することができる。例えば、担体として使用される高分子界面活性剤は、その独特の両親媒性構造のために、自己集合して様々な形態の凝集体を形成することがあり、好ましい例としてはミセル、エマルジョン、ゲル、液晶、小胞等が挙げられる。これらの凝集体は、薬物分子を閉じ込める能力だけでなく、膜に対して良好な透過性も示し、優れた薬物担体として使用することができる。
【００７５】
用語「希釈剤」は増量剤とも呼ばれ、その主な目的は錠剤の重量と体積を増やすことである。希釈剤の添加は、一定の体積を確保するだけでなく、主成分の用量偏差を小さくし、そして薬物の圧縮成形性を改善するためのものでもある。医薬錠剤が油性成分を含有する場合、油性物質を吸収し、「乾燥」状態を維持するために、吸収剤を添加しなければならず、これは錠剤形成を促進する。
【００７６】
用語「薬学的に許容される塩」は、本発明のリガンド‐細胞傷害性薬物複合体の塩形態を指し、前記塩は安全かつ有効であり、哺乳動物において in vivo で所望の生物学的活性を有する。本発明の抗体‐薬物複合体化合物は、少なくとも 1 つのアミノ基を含み、それによって前記抗体‐薬物複合体化合物は酸と塩（無機酸又はカルボン酸等の有機酸と形成される塩等を含む）を形成することがある。
【００７７】
用語「溶媒和物」は、本発明のリガンド‐薬物複合体と 1 つ以上の溶媒分子とによって形成される薬学的に許容される溶媒和物を指す。
【００７８】
用語「リガンド」は、標的細胞に関連した抗原又は受容体を認識し、及びそれに結合することができる高分子化合物である。リガンドの役割は、そのリガンドに結合する標的細胞集団に薬物を送達することである。前記リガンドには、限定されるものではないが、細胞に結合することができる、タンパク質性ホルモン、レクチン、成長因子、抗体及び他の分子が含まれる。
【００７９】
治療薬は、抗体若しくは抗体断片、又はそれらのサブ‐断片等の結合部分と別々に、同時に又は連続的に投与される分子又は原子であり、そして疾患の治療に有用である。治療薬の例には、限定されるものではないが、抗体、抗体断片、複合体、薬物、細胞傷害剤、アポトーシス剤、毒素、ヌクレアーゼ（DNase 及び RNase 等を含む）、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光増感剤又は色素、放射性同位元素若しくは放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉性 RNAs、ペプチド、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質若しくはペプチド、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００８０】
前記複合体は、上記のように治療剤と複合体化した抗体成分又は他の標的化部分である。本明細書中で使用される場合、用語「複合体（conjugate）」及び「免疫複合体（immunoconjugate）」は互換的に使用される。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害剤（cytotoxic agent）」は、細胞の機能を阻害する、若しくは妨げる、及び／又は細胞死若しくは破壊を引き起こす物質を指す。
【００８２】
「毒素」とは、細胞の成長又は増殖に悪影響を及ぼし得る任意の物質をいう。
【００８３】
「化学療法剤」は、がんを治療するために使用することができる化合物を指す。この定義には、がんの成長を促進するホルモンの作用を調節、軽減、阻止、又は阻害する抗ホルモン剤も含まれ、化学療法剤は全身的な治療によく使用される。それら自体がホルモンであることがある。
【００８４】
アウリスタチン（Auristatins）は、物理的性質及び薬物の特徴の最適化を容易にする比較的容易に変更される化学構造を有する、完全に合成的な薬物である。抗体の複合体化に使用されるアウリスタチン誘導体には、モノメチル・アウリスタチン E （MMAE）及びモノメチル・アウリスタチン F （MMAF）が含まれ、MMAE は、天然チューブリン・ポリメラーゼ阻害剤であるドラスタチン-10 から誘導される合成ペンタペプチドであり、2-アミノ-1-フェニルプロピル-1-オルを C 末端に付加することによって合成される。種々のヒト腫瘍細胞株に対する MMAE の阻害活性は 1 ナノモル未満である。MMAE 自体の細胞傷害活性を低下させるために、MMAF の場合には、フェニルアラニンをドラスタチン-10 の C 末端に導入する。前記構造中にカルボキシル基が導入されているため、MMAF は膜に対する透過性が乏しく、それ故に細胞に対する生物学的活性は著しく低下するが、抗体と複合体化した後には、細胞に対する阻害活性は実質的に上昇する（US7750116）。
【００８５】
用語「チューブリン阻害剤」は、チューブリンが重合することを阻害又は促進し、その結果として細胞有糸分裂の過程を妨害することによって、抗腫瘍効果を発揮する化合物のクラスを指す。非限定的な例には、メイタンシン、カリケアミシン、タキサン、ビンクリスチン、コルヒチン、及びドラスタチン／アウリスタチン、好ましくはメイタンシン又はドラスタチン／アウリスタチン；より好ましくは式 D1 又は DM の化合物、が含まれる。
【００８６】
CPT はカンプトテシンの略語であり、そして本出願において、CPT はカンプトテシン自体又はカンプトテシンの類似体若しくは誘導体を指すのに使用される。示された数、並びに文字 A-E で標識された環を有するカンプトテシン、及びそのいくつかの類似体の構造は、以下の式で提供される。
【化７】
2019534267.tif 000011
CPT: R1= R2= R3=H
10-ヒドロキシ-CPT:R1=OH; R2= R3=H
イリノテカン: R1=
【化８】
2019534267.tif 000012
; 
R2=エチル; R3=H
SN-38: R1=OH; R2= エチル; R3=H
トポテカン: R1=OH; R2=H; R3=CH-N(CH3)2
【００８７】
用語「細胞内代謝産物（intracellular metabolite）」は、細胞内代謝プロセス又は抗体‐薬物複合体（ADC）の反応によって産生される化合物を指す。前記代謝プロセス又は反応は、ADC のペプチド・リンカーのタンパク質分解的な切断、又はヒドラゾン、エステル若しくはアミド等の官能基の加水分解等の酵素的プロセスであることがある。細胞内代謝産物には、限定されるものではないが、細胞内への進入、拡散、摂取又は輸送後に細胞内切断を受ける抗体及び遊離薬物が含まれる。
【００８８】
用語「細胞内切断の（of intracellular cleavage）」及び「細胞内切断（intracellular cleavage）」は、抗体‐薬物複合体（ADC）の細胞内代謝プロセス又は反応を指し、ここで薬物部分（D）と抗体（Ab）との間の共有結合は切断されて（即ちリンカーが切断される）、その抗体から遊離薬物の細胞内解離がもたらされる。従って、ADC から切断されたモジュールは細胞内代謝物である。
【００８９】
用語「生物学的利用能（bioavailability）」は、患者に投与された所与の量の薬物の全身的な利用能（即ち、血液／血漿レベル）を指す。生物学的利用能は、投与量から、全身を循環するために、薬物が必要とする時間（速度）及び総量（程度）を示す絶対項である。
【００９０】
用語「細胞傷害活性」は、抗体‐薬物複合体の細胞内代謝産物の殺細胞効果、細胞増殖抑制効果、又は成長阻害効果を指す。細胞傷害活性は、IC50 値、即ち半数の細胞が生存する場合の、単位体積当たりの濃度（モル又は質量）として表すことがある。
【００９１】
本発明において「C1-6アルキル」とは、1 から 6 個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を指し、例えば、「C1-4 アルキル」、「C1-3 アルキル」等が含まれ、具体例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、2-メチルブチル、ネオペンチル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、イソヘキシル、3-メチルペンチル、2-メチルペンチル、1-メチルペンチル、3,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、2- エチルブチル、1,2-ジメチルプロピル等が含まれる。
【００９２】
本発明に記載の「C2-6アルケニル」とは、少なくとも 1 個の二重結合を有し、かつ 2 から 6 個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖又は環式のアルケニル基を指し、例えば、「C2-4 アルケニル基」等が含まれる。例としては、限定されるものではないが、ビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、1,3-ブタジエニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、1,3-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1,4-ヘキサジエニル、シクロペンテニル、1,3-シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、1,4-シクロヘキサジエニル等が含まれる。
【００９３】
本発明に記載の「3-8 員シクロアルキル」とは、3 から 8 個の炭素原子を有する飽和環式アルキル基を指し、例えば、「3-6 員シクロアルキル」、「5-6 員シクロアルキル」等が含まれる。具体例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が含まれる。「5-6 員シクロアルキル」とは、5 から 6 個の炭素原子を有する飽和環式アルキル基を意味する。
【００９４】
本発明に記載の「C1-6アルコキシ」とは、C1-6 アルキル-O-の形態で連結している基を意味し、ここで「C1-6 アルキル」は前記で規定したとおりである。
【００９５】
用語「結合」は、「-」として表される共有結合を指す。
【００９６】
用語「ヒドロキシ」は、-OH 基を指す。
【００９７】
用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード原子などを指す。
【００９８】
用語「アミノ」は、-NH2基を指す。
【００９９】
用語「シアノ」は、-CN 基を指す。
【０１００】
用語「ニトロ」は、-NO2基を指す。
【０１０１】
用語「オキソ基」は、=O 基を指す。
【０１０２】
本発明に記載の「3-8 員複素環基」とは、3 から 8 個の環原子（そのうちの少なくとも 1 つは窒素原子、酸素原子又は硫黄原子などのヘテロ原子である）を有する環基を指す。任意選択的に、環式構造中の環原子（例えば、炭素原子、窒素原子、又は硫黄原子）は酸化されることがある。「5-6 員複素環基」が好ましい。具体例としては、限定されるものではないが、アザシクロプロピル、2H-アザシクロプロピル、ジアザシクロプロピル、3H-ジアザシクロプロペニル、アザシクロブチル、1,4-ジオキソヘテロシクロヘキシル、1,3-ジオキソヘテロシクロヘキシル、1,3-ジオキソヘテロシクロペンチル、1,4-ジオキソヘテロシクロジアリル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロピロリル、ピロリジニル、ピロリジン-2,5-ジオン、イミダゾリジニル、4,5-ジヒドロイミダゾリル、ピラゾリジニル、4,5-ジヒドロピラゾリル、2,5-ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、4,5-ジヒドロチアゾリル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピリジル、ピペリジノン、テトラヒドロピリジノン、ジヒドロピリジノン、ピペラジニル、モルホリニル、4,5-ジヒドロオキサゾリル、4,5-ジヒドロイソオキサゾリル、2,3-ジヒドロイソオキサゾリル、オキサゾリジニル、2H-1,2-オキサジニル、6H-1,3-オキサジニル、4H-1,3-チアジニル、6H-1,3-チアジニル、2H-ピラニル、2H-ピラニル-2-オン、3,4-ジヒドロ-2H-ピラニル等が含まれる。「5-6 員複素環基」は、5 から 6 個の環原子を含む 3-8 員複素環基の特定の例を指す。
【０１０３】
本発明において「6-8 員アリール」とは、6 から 8 個の環形成炭素原子を有する単環のアリール基を指し、例えば、限定されるものではないが、フェニル、シクロオクタテトラエニル等が含まれる。
【０１０４】
本発明に記載の「6-15 員縮合アリール」とは、6 から 15 個の環形成炭素原子を有する不飽和芳香族環基を指し、隣接する 2 個の原子を共有する 2 個以上の環式構造によって形成される。具体例としては、限定されるものではないが、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が含まれる。「6-10 員縮合アリール」とは、6 から 10 個の環原子を有する 6-14 員縮合アリールの具体例を指す。
【０１０５】
本発明に記載の「5-8 員ヘテロアリール」とは、5 から 8 個の環原子（ここで、少なくとも 1 個の環原子は、窒素原子、酸素原子又は硫黄原子等のヘテロ原子である）を有する芳香族環基を指す。任意選択的に、環式構造中の環原子（例えば、炭素原子、窒素原子又は硫黄原子）は酸化されることがある。「5-6 員ヘテロアリール」が好ましい。具体例としては、限定されるものではないが、フリル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、ピリジル、2-ピリジノン、4-ピリジノン、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、1,2,3-トリアジニル、1,3,5-トリアジニル、1,2,4,5-テトラジニル、アザシクロヘプタトリエニル、1,3-ジアザシクロヘプタトリエニル、アザシクロオクタテトラエニル等が含まれる。「5-6 員ヘテロアリール」は、5 から 6 個の環原子を有する 5-8 員ヘテロアリールの具体例を指す。
【０１０６】
本発明でいう「炭素原子、窒素原子又は硫黄原子が酸化されている」とは、C=O、N=O、S=O 又は SO2 が形成されている構造を指す。
【０１０７】
「任意選択的の（optional）」又は「任意選択的に（optionally）」という用語は、必ずしもそうとは限らないが、後に説明されるイベント又は状況が起こる可能性があることを意味し、その説明はその事象又は状況が起こる又は起こらない事例を含む。例えば、「アルキルで任意選択的に置換されている複素環基」とは、アルキル基が存在することがあるが、必ずしもそうではないことを意味し、前記複素環基がアルキルで置換されている場合、及び前記複素環基がアルキルで置換されていない場合が含まれる。
【０１０８】
「置換された（Substituted）」とは、それぞれ独立して、対応する数の置換基で置換されている、その基中の 1 個以上の水素原子、好ましくは 5 個まで、より好ましくは 1 から 3 個の水素原子を指す。置換は、それらが可能な化学的位置にのみ起こることは明らかである。当業者は、実験又は理論による過度の努力を払うことなく、置換が可能であるか不可能であるかを決定することができる。例えば、遊離水素を有するアミノ基又はヒドロキシ基と不飽和結合を有する炭素原子（例えばアルケン）との間の結合は不安定であることがある。
【０１０９】
「リンカー又はリンカー単位」は、抗体を薬物モジュールに共有結合させる共有鎖又は原子鎖を含む化学モジュールを指す。様々な実施形態において、前記リンカーは：アルキルジイル、アリーレン、例えば -(CR2)nO (CR2)n- のような単位、ヒドロカルビルオキシ繰り返し単位（例えば、ポリエチレンアミノ、PEG、ポリメチレンオキシ）及びアミノアルキル（例えば、ポリビニルアミノ、Jeffamine（登録商標））等のヘテロアリーレン；コハク酸エステル、コハク酸アミド、ビス‐グリコール酸エステル、マロン酸エステル及びカプロアミド等を含むジエステル及びアミド、を含む。
【０１１０】
略語
リンカー単位
MC ＝ 6-マレイミド-カプロイル
Val-Cit 又は「vc」 ＝ バリン‐シトルリン（プロテアーゼによって切断可能なリンカーに関する例示的なジペプチド）
シトルリン ＝ 2-アミノ-5-ウレイド・ペンタン酸
PAB ＝ p-アミノベンジルオキシカルボニル（「自壊性（self-immolative）」リンカー単位の例）
Me-Val-Cit ＝ N-メチル-バリン-シトルリン（ここで、前記リンカー・ペプチド結合はカテプシン B によって切断されるのを防ぐために修飾されている）
MC(PEG)6-OH ＝ マレイミド‐カプロイル‐ポリエチレン・グリコール（これは抗体のシステインに結合することができる）
SPP ＝ N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート
SPDP＝ N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸
SMCC ＝ スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸
IT ＝ イミノスルファン
細胞傷害性薬物：
MMAE ＝ モノメチル・オーランタチン E（Monomethyl aurantatin E）（MW 718）
MMAF ＝ オーランタチン E の改変体（MMAE）、これは前記薬物の C 末端にフェニルアラニンを有する（MW731.5）
MMAF-DMAEA ＝ アミドを介して MMAF の C 末端のフェニルアラニンに結合した DMAEA（ジメチルアミノエチルアミン）（MW 801.5）
MMAF-TEG ＝ テトラエチレン・グリコールが MMAF のフェニルアラニンにエステル化されている
MMAF-NtBu ＝ MMAF の C 末端に結合したアミドとしての N-tert-ブチル
DM1 ＝ N(2’)-デアセチル-N(2’)-(3-メルカプト-1-オキソプロピル)-メイタンシン
DM3 ＝ N(2’)-デアセチル-N2-(4-メルカプト-1-オキソペンチル)-メイタンシン
DM4 ＝ N(2’)-デアセチル-N2-(4-メルカプト-4-メチル-1-オキソペンチル)-メイタンシン
【０１１１】
本発明はまた、1 種以上の細胞傷害剤に複合体した、本発明の任意の抗 c-Met 抗体又はエンドサイトーシス活性を示す他の c-Met 抗体（例えば、LY-2875358）を含む抗体‐細胞傷害性薬物複合体、若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物（「抗体‐薬物複合体」又は「ADC」として互換的である）も提供する。ここで、前記細胞傷害剤は、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片）、又は放射性同位元素（即ち放射性複合体）を含む。
【０１１２】
ある実施形態において、抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、抗 c-Met 抗体及び化学療法剤又は他の毒素を含む。抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を製造するために使用することができる化学療法剤は、本明細書に記載されている（上記）。酵素活性毒素及びその断片も使用され、本明細書に記載されている。
【０１１３】
ある実施形態では、抗体 - 細胞傷害薬複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、抗 c-Met 抗体、及び 1 種以上の低分子毒素（限定されるものではないが、カンプトテシン誘導体、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オリコチン、トリコテセン及び CC1065、並びにこれらの薬物の細胞傷害性断片等の低分子薬等を含む）を含む。
【０１１４】
例示的なリンカー L2としては、6-マレイミドカプロイル（「MC」）、マレイミドプロピオニル（「MP」）、バリン‐シトルリン（「val-cit」又は「vc」）、アラニン‐フェニルアラニン（ala-phe）、p-アミノベンジルオキシカルボニル（「PAB」）、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタン酸（「SPP」）、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1 カルボン酸（「SMCC」）、及びN-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノ安息香酸（「SIAB」）が含まれる。様々なリンカーが当該分野で公知であり、そして以下に記載される。
【０１１５】
前記リンカーは、細胞内での薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」であることがある。例えば、酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン）、プロテアーゼに感受性がある（例えば、ペプチダーゼに感受性がある）リンカー、光に不安定なリンカー、ジメチル・リンカー、又はジスルフィド含有リンカーを使用することがある（Chari et al, Cancer Research 52: 127-131(1992)；米国特許第 5,208,020 号）。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、前記リンカー要素は、前記抗体を別のリンカー要素又は薬物モジュールに接続する「ストレッチャー単位（stretcher unit）」であることがある。例示的なストレッチャー単位を以下に示す（波線は抗体が共有結合する部位を示す）：
【化９】
2019534267.tif 000013
【０１１７】
いくつかの実施形態では、前記リンカー単位はアミノ酸単位であることがある。そのような一実施形態では、前記アミノ酸単位は、前記リンカーをプロテアーゼが切断できるようにし、それによってリソソーム酵素等の細胞内プロテアーゼに曝露された後に、抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物から薬物が放出されやすくなる。例えば、Doronina et al (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784 を参照のこと。例示的なアミノ酸単位としては、限定されるものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びペンタペプチドが含まれる。例示的なジペプチドとしては：バリン‐シトルリン（VC 又は val-cit）；アラニン‐フェニルアラニン（AF 又は ala-phe）；フェニルアラニン‐リジン（FK 又は phe-lys）；又は N-メチル‐バリン‐シトルリン（Me-val-cit）、が含まれる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン‐バリン‐シトルリン（gly-val-cit）及びグリシン‐グリシン‐グリシン（gly-gly-gly）が含まれる。前記アミノ酸単位は、天然アミノ酸残基、並びに微量アミノ酸及びシトルリン等の非天然アミノ酸類似体を含み得る。アミノ酸単位を、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシン B、C及び D、又は血漿プロテアーゼ等の、特定の酵素により酵素的に切断されることに対するそれらの選択性のために、設計及び最適化することがある。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、前記リンカー単位は、前記抗体を（直接、又はストレッチャー単位（stretcher unit）及び／若しくはアミノ酸単位を介して）前記薬物モジュールに接続する「スペーサー」単位であることがある。前記スペーサー単位は、「自壊性（self-immolative）」又は「非自壊性（non-self immolative）」であることがある。「非自壊性」スペーサー単位とは、ADC が酵素的に切断された（タンパク質加水分解）後に、その一部又は全体が薬物モジュールに結合したままであるスペーサー単位を指す。非自壊性スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、グリシン・スペーサー単位及びグリシン‐グリシンスペーサー単位が含まれる。配列特異的酵素的切断を受けやすいペプチド・スペーサーの他の組み合わせもまた考えられる。例えば、腫瘍細胞関連プロテアーゼによって、グリシン‐グリシン・スペーサー単位を含む ADC が酵素的に切断されると、ADC の残りの部分から、グリシン‐グリシン‐薬物モジュールが放出されるようになるだろう。そのような一実施形態では、次いで、グリシン‐グリシン‐薬物モジュールは、腫瘍細胞中で、別の加水分解工程に供せられ、それによってグリシン‐グリシン・スペーサー単位は、薬物モジュールから切断される。
【０１１９】
「自壊性（self-immolative）」スペーサー単位によって、別の加水分解工程が無くても薬物モジュールの放出が可能になる。ある実施形態では、前記リンカーのスペーサー単位は、p-アミノベンジル単位を含む。そのような一実施形態では、p-アミノベンジル・アルコールはアミド結合を介してアミノ酸単位に結合し、それによってベンジルアルコールと細胞傷害剤との間にカルバメート、メチルカルバメート、又は炭酸が形成される。例えば、Hamann et al, (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15: 1087-1103 を参照のこと。一実施形態では、前記スペーサー単位は、p-アミノベンジルオキシカルボニル（PAB）である。
【０１２０】
本発明における例示的なリンカーは以下の通りである：
【化１０】
2019534267.tif 000014
【０１２１】
ストレッチャー、スペーサー、及びアミノ酸単位等を含むリンカーは、US 2005-0238649 A1 に記載されているもの等の、当技術分野で公知の方法によって合成することができる。
【０１２２】
＜例示的な薬物モジュール＞：
メイタンシンとメイタンシノイド。
いくつかの実施形態において、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、1 種以上のメイタンシノイド分子と複合体化した本発明の抗体を含む。前記メイタンシノイドは、チューブリン多量体化を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンはもともと東アフリカの低木のメイタンシンの木（メイテヌス・セラタ（Maytenus serrata））から単離された（米国特許第 3,896,111 号）。その後、ある微生物も又、メイタンシノール及び C-3 メイタンシノール・エステル等のメイタンシノイドを生成することも見出された（米国特許第 4,151,042 号）。
【０１２３】
前記メイタンシノイド薬物モジュールは、抗体‐薬物複合体において魅力的な薬物モジュールであるが、それは以下の理由による：（i）発酵から調製するのが比較的容易である、又は発酵生成物の修飾体若しくは誘導体から調製するのが比較的容易である；（ii）非ジスルフィド・リンカーを介して抗体に結合するのに適した官能基で容易に誘導体化される；（iii）血漿中で安定である；及び（iv）様々な腫瘍細胞株に有効である。
【０１２４】
メイタンシノイド薬物モジュールとしての使用に適したメイタンシン化合物は、当技術分野において周知であり、既知の方法に従って天然の供給源から単離するか、又は遺伝子工学技術を使用して製造することができる（Yu et al（2002）PNAS 99：7968-7973 を参照のこと）。前記メイタンシノール及びメイタンシノール類似体もまた、既知の方法に従って調製することができる。
【０１２５】
前記メイタンシノイド薬物モジュールの例示的な実施形態には、本明細書に開示されるように：DM1、DM3 及び DM4 が含まれる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、前記抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、ドラスタチン若しくはドラスタチンペプチド類似体又は誘導体（例えば、アウリスタチン）と複合体化した本発明の抗体を含む（米国特許第 5,635,483 号；第 5,780,588 号）。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP 加水分解、並びに核分裂及び細胞分裂を妨害すること（Woyke et al。（2001）Antimicrob。Agents and Chemother。45（12）：3580-3584）、並びに抗がん活性（米国特許第 5,663,149 号）及び抗真菌活性（Pettit et al. (1998) Antimicrob。Agents Chemother. 42: 2961-2965）が示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物モジュールは、ペプチド薬物モジュールの N（アミノ）末端又は C（カルボキシ）末端を介して、前記抗体に結合していることがある（WO02/088172）。
【０１２７】
アウリスタチンの例示的な実施形態には、Senterら、Proceedings of the American Association for CancerResearch、第45巻、要約番号623、2004年3月28日に開示されている N-末端結合モノメチル・アウリスタチン薬物モジュール DE 及び DF が含まれる。その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる。前記ペプチド薬物モジュールを、以下の一般式 DE 及び DF から選択することがある：
【化１１】
2019534267.tif 000015
【化１２】
2019534267.tif 000016
式中、DE 及び DF の波線は抗体又は抗体‐リンカーの共有結合部位を示し、各部位は互いに独立している:
R2 は、H 及び C1-C8 ヒドロカルビルから選択される；
R3 は、H、C1-C8 ヒドロカルビル、C3-C8 炭素環、アリール、C1-C8 ヒドロカルビル‐アリール、C1-C8 ヒドロカルビル-(C3-C8 炭素環)、C3-C8 複素環及び C1-C8 ヒドロカルビル-(C3-C8 複素環) からなる群より選択される；
R4 は、H、C1-C8 ヒドロカルビル、C3-C8 炭素環、アリール、C1-C8 ヒドロカルビル‐アリール、C1-C8 ヒドロカルビル-(C3-C8 炭素環）、C3-C8 複素環及び C1-C8 ヒドロカルビル-(C3-C8 複素環) からなる群より選択される；
R5 は、H 又はメチルから選択される；
又は、R4 及び R5 は式 -(CRaRb)n- の炭素環を形成し、ここで Ra 及び Rb はそれぞれ独立して H、C1-C8 ヒドロカルビル及び C3-C8 炭素環からなる群より選択され、n は 2、3、4、5 及び 6 から選択される； 
R6 は H 又は C1-C8 ヒドロカルビルから選択される；
R7 は、H、C1-C8 ヒドロカルビル、C3-C8 炭素環、アリール、C1-C8 ヒドロカルビル‐アリール、C1-C8 ヒドロカルビル-(C3-C8 炭素環)、C3-C8 複素環及び C1-C8 ヒドロカルビル-(C3-C8 複素環) からなる群より選択される；
各 R8 は、H、OH、C1-C8 ヒドロカルビル、C3-C8 炭素環及び O-(C1-C8 ヒドロカルビル) からなる群より独立して選択される；
R9 は H 又は C1-C8 ヒドロカルビルから選択される；
R10 は、アリール又は C3-C8 複素環から選択される；
Z は O、S、NH 又は NR12 から選択され、ここでR12 は C1-C8 ヒドロカルビルである；
R11 は、H、C1-C20 ヒドロカルビル、アリール、C3-C8 複素環、-(R13O)m-R14及び -(R13O)m-CH(R15)2からなる群より選択される；
m は 1-1000 から選択される整数である；
R13 は C2-C8 ヒドロカルビルである；
R14 は H 又は C1-C8 ヒドロカルビルである；
R15 は、H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H 及び -(CH2)n-SO3-C1-C8 ヒドロカルビルからなる群より独立して選択される；
R16 は、H、C1-C8 ヒドロカルビル及び -(CH2)n-COOH からなる群より独立して選択される；
R18 は、-C(R8)2-C(R8)2-アリール、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 複素環) 及び -C(R8)2-C(R8)2-2-(C3-C8 炭素環) からなる群より選択される；並びに
n は 0 から 6 までで選択される整数である。
【０１２８】
MMAE は式 DE のアウリスタチンの例であり、ここで波線は抗体‐薬物複合体に共有結合しているリンカー（L）を示す：
【化１３】
2019534267.tif 000017
MMAE
【０１２９】
MMAF は式 DF のアウリスタチン例であり、ここで波線は抗体‐薬物複合体に共有結合しているリンカー（L）を示す（US2005/0238649 及び Doronina et al (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124 を参照）。
【化１４】
2019534267.tif 000018
MMAF
【０１３０】
他の薬物モジュールは、以下から選択される MMAF 誘導体を含み、ここで波線は抗体‐薬物複合体に共有結合しているリンカー（L）を示す：
【化１５】
2019534267.tif 000019
【化１６】
2019534267.tif 000020
【化１７】
2019534267.tif 000021
【化１８】
2019534267.tif 000022
及び
【化１９】
2019534267.tif 000023
。
【０１３１】
一態様では、親水性基が R11で薬物モジュールに結合していることがあり、ここで前記親水性基には、限定されるものではないが、上記のように、トリエチレン・グリコール・エステル（TEG）が含まれる。いかなる特定の理論にも限定されないが、前記親水性基は薬物モジュールの細胞への内在化及び非凝集化に寄与する。アウリスタチン／ドラスタチン又はそれらの誘導体を含む一般式 I の ADC の例示的な実施形態は、US2005-0238649A1 及び Doronina et al (2006) Bioconjugate Chem.17:114-124 に記載されていて、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。MMAE 又は MMAF 及び種々のリンカーを含む一般式 I の ADC の例示的実施形態は、以下の構造及び略語を有する（式中、「Ab」は抗体であり；p は 1 から約 8 の範囲であり；「Val-Cit」はバリン‐シトルリン・ジペプチドであり；そして「S」は硫黄原子である）： 
【化２０】
2019534267.tif 000024
Ab-リンカー 1-MC-vc-PAB-MMAF
【化２１】
2019534267.tif 000025
Ab-リンカー 1-MC-vc-PAB-MMAE
【化２２】
2019534267.tif 000026
Ab-リンカー 1-MC-MMAE
【化２３】
2019534267.tif 000027
Ab-リンカー 1-MC-MMAF
【０１３２】
典型的には、ペプチドベースの薬物モジュールは、2 つ以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片の間にペプチド結合を形成することによって調製することがある。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野でよく知られている液相合成法に従って調製することがある（E. Schroder 及び K.Lubke、The Peptides、第1巻、76-136頁、1965年、Academic Press を参照）。前記アウリスタチン／ドラスタチン薬物モジュールは、以下の文献に記載されている方法に従って調製することがある：US20050238649A1；米国特許第 5635483 号；米国特許第 5780588 号；Pettit et al(1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277；Pettit, G. R. et al, Synthesis, 1996, 719-725；Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863；及び Doronina(2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784。
【０１３３】
特に、MMAF 及びその誘導体などの一般式 DF のアウリスタチン／ドラスタチン薬物モジュールは、US20050238649A1 及び Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17: 114-124 に記載されている方法を使用して調製することがある。MMAE 及びその誘導体などの一般式 DE のアウリスタチン／ドラスタチン薬物モジュールは、Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21: 778-784 に記載されている方法を使用して調製することがある。MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF 及びMC-vc-PAB-MMAE の薬物‐リンカー・モジュールは、Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21: 778-784 及び米国特許出願公開番号 US2005/0238649A1 に記載されている従来の方法によって、簡便に合成することができ、その後、目的の抗体と複合体化させる。
【０１３４】
本発明の免疫組織化学 IHC を、c-Met ポジティブ腫瘍細胞における c-Met タンパク質の過剰発現を検出するために使用し、その発現量はがん細胞の染色に基づいて反映され、グレー密度解析をパーセプ試験（percep test）のスコアリングを参照して、又はソフトウェアを使用して行った。
【０１３５】
c-Met の発現を 2 つのタイプに分ける：即ち、高発現と低発現であり、3+（≧50 % の腫瘍細胞が強くポジティブ）、2+（≧50 % の腫瘍細胞がポジティブ／弱ポジティブ、及び腫瘍細胞の <50 % は強くポジティブである）、1+（≧50 % の腫瘍細胞が弱いポジティブであり、そして細胞の <50 % はポジティブである）、0（染色なし又は <50 % の強度の腫瘍細胞）、2+ 又は 3+ を高発現として定義する。
【０１３６】
c-Met ポジティブ・マーカーのスコアリング基準は以下の通りである：
（1）細胞のポジティブ染色の程度（抗原含有量）に従って、それを以下に分ける：弱ポジティブ（+）、1 スコア；中ポジティブ（++）、2 スコア；強ポジティブ（+++）、3 スコア；
（2）ポジティブ細胞の数に応じて、それを以下に分ける：弱ポジティブ（+、ポジティブ細胞の総数が 25 % 未満を指す）；中ポジティブ（++、ポジティブ細胞の総数が 25-49 % の間を指す）；強ポジティブ（+++、ポジティブ細胞の総数が 50 % を超えるを指す）。
【０１３７】
現在のところ、重みを付けた積分測定を使用する。その計算式は：(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3 であり；0-0.3 のスコアは弱ポジティブであり、0.3-1.5 は中ポジティブであり、及び 1.5-3 は強ポジティブである。
【０１３８】
本発明に記載される c-Met ポジティブ又は c-Met の過剰発現は、≧20 % の肝がん細胞がポジティブ／弱ポジティブ、好ましくは ≧25 % の肝がん細胞がポジティブ、より好ましくは ≧50 % の肝がん細胞が強ポジティブであることを意味する。
【０１３９】
薬物搭載（Drug loading）
薬物搭載を y として表す、即ち、式 I の分子中の抗体あたりの薬物モジュールの平均個数である。薬物搭載は、抗体あたり 1 から 20 個の薬物モジュール（D）の範囲であることがある。式 I の ADC には、ある範囲（1-20）の薬物モジュールと複合体化した抗体のコレクションが含まれる。カップリング反応から得られる ADC 調製物中の抗体あたりの薬物モジュールの平均個数を、質量分析、ELISA アッセイ、及び HPLC 等の従来の方法によって、明らかにすることができる。y に関して、ADCs の量的分布を測定することも可能である。いくつかの場合では、ある p 値を有する均質な ADCs を他の薬物を搭載した ADCs から単離し、次いで精製してその特徴を明らかにするが、これは逆相 HPLC 又は電気泳動等の手段によって行うことがある。
【０１４０】
いくつかの抗体‐薬物複合体については、y は抗体上の付着部位の数によって制限されることがある。例えば、上記の例示的な実施形態におけるように、システイン・チオールが結合している場合、前記抗体は、1 個のみ若しくはいくつかのシステイン・チオール基を有することがあり、又はリンカーに結合することがある 1 個以上の反応性チオール基を有するだけのことがある。ある実施形態において、y>5 等のより高い薬物搭載によって、ある抗体‐薬物複合体では、凝集、不溶性、毒性、又は細胞透過性の喪失が引き起こされることがある。ある実施形態では、本発明の ADC の薬物搭載量は 1 から約 8 まで；約 2 から約 6 まで；約 3 から約 5 まで；約 3 から約 4 まで；約 3.1 から約 3.9 まで；約 3.2 から約 3.8 まで；約 3.2 から約 3.7 まで；約 3.2 から約 3.6 ；約 3.3 から約 3.8 まで；又は約 3.3 から約 3.7 まで、の範囲である。実際、いくつかの ADCs については、各抗体薬物モジュールの最適比は 8 未満であることがあり、約 2 から約 5 までであることがある、ことが示されてきている。US20050238649A1 を参照されたい（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１４１】
ある実施形態において、理論的最大値未満の薬物モジュールが、カップリング反応において、抗体にカップリングする。前記抗体は、以下に論じるように、例えば、薬物‐リンカー中間体又はリンカー剤と反応しないリジン残基を含むことがある。最も反応性の高いリジン基だけがアミン反応性リンカー剤と反応することができる。一般に、前記抗体は、薬物モジュールに結合することができる、遊離の及び反応性のシステイン・チオール基を多数含むわけではない；事実、抗体中のほとんどのシステイン・チオール基はジスルフィド架橋の形で存在する。ある実施形態では、前記抗体を、ジチオトレイトール（DTT）又はトリカルボニル・エチル・ホスフィン（TCEP）等の還元剤で、部分的又は完全な還元条件下で還元して、反応性システイン・チオール基を生成させることがある。ある実施形態では、前記抗体を変性条件下に置き、リジン又はシステイン等の反応性求核基を露出させる。
【０１４２】
ADC の薬物搭載（薬物／抗体比、DAR）を、例えば以下のようにして、様々な方法で制御することがある：（i）薬物‐リンカー中間体又はリンカー剤のモル過剰を制限する；（ii）カップリング反応の時間又は温度を制限する；（iii）システインのチオール修飾を制限する、又は還元条件を制限する；（iv）リンカー‐薬物結合の数及び／又は位置を制御するために、システイン残基の数及び位置が変更されるように、組換え技術によって抗体のアミノ酸配列を操作する（例えば、本発明及び WO2006/034488（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されたものとして調製される thioMab 又は thioFab）。
【０１４３】
2 つ以上の求核基が薬物‐リンカー中間体又はリンカー及びその後の薬物モジュール剤と反応する場合、得られる生成物は、抗体に結合した 1 つ以上の薬物モジュールを有する ADC 化合物混合物であることを理解されたい。抗体あたりの薬物の平均個数を、抗体特異的な抗体及び薬物特異的な抗体を含む ELISA アッセイによって混合物から計算することがある。混合物中の様々な ADC 分子を、質量分析法によって同定することがあり、HPLC、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離することがある。ある実施形態では、単一の搭載値を有する均質な ADC を、電気泳動又はクロマトグラフィーによって前記カップリング混合物から単離することがある。
【０１４４】
＜抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を調製するための方法＞
一般式 I の ADC は、当業者に知られている有機化学反応、条件及び薬剤を使用するいくつかの経路によって調製することがあり、以下を含む：（1）抗体の求核基を二価リンカー剤と反応させて、共有結合を介して Ab-L を形成させ、続いて薬物モジュール D と反応させる；及び（2）前記薬物モジュールの求核基を二価リンカ―剤と反応させて、共有結合を介して D-L を形成させ、続いて前記抗体の求核基と反応させる。後者の経路を介して式 I の ADC を調製するための例示的な方法は、US2005-0238649A1 に記載されていて、これは参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
抗体の求核基としては、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：（i）N-末端アミン基；（ii）リジン等の側鎖アミン基；（iii）システイン等の側鎖チオール基；及び（iv）グリコシル化抗体中の糖類のヒドロキシル基又はアミノ基。アミン、チオール及びヒドロキシル基は求核性であり、リンカー・モジュール上の求電子基と反応して共有結合を形成することがあるが、前記リンカー剤には以下が含まれる：（i）例えば NHS エステル、HOBt エステル、ハロホルメート（haloformates）及び酸ハロゲン化物等のような活性エステル；（ii）例えばハロアセトアミド等のようなヒドロカルビル及びハロゲン化ベンジル；（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル基及びマレイミド基。いくつかの抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、即ちシステイン架橋を有する。前記抗体を、リンカーとのカップリング反応ができるように、DTT（ジチオトレイトール）又はトリカルボニル・エチルホスフィン（TCEP）等の還元剤で処理することによって完全に、又は部分的に還元することがある。各システイン架橋は理論的には 2 つの反応性チオール求核基を形成するであろう。或いは、例えば、リジン残基を 2-イミン・スルファン（Traut 試薬）と反応させることによって、スルフヒドリル基を、リジン残基の修飾を介して抗体に導入することがあり、その結果、アミンがチオールに変換される。
【０１４６】
本発明の抗体‐薬物複合体は、抗体上の求電子基（アルデヒド又はケトン・カルボニル基等）とリンカ―又は薬物上の求核基との間の反応によっても製造することがある。リンカー上の有用な求核基としては、限定されるものではないが：ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジン・カルボン酸及びアリール・ヒドラジドが含まれる。一実施形態では、グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤で酸化して、リンカー又は薬物モジュールのアミン基と反応することができるアルデヒド又はケトン基を形成させることがある。得られたイミン・シッフ塩基が安定な結合を形成することがあるが、又は、例えば水素化ホウ素剤で還元して、安定なアミン結合を形成させてもよい。一実施形態では、グリコシル化抗体の糖質部分とガラクトース・オキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって、抗体中にカルボニル基（アルデヒド基及びケト基）を生成させることがあり、これは薬物上の適切な基と反応することがある（Hermanson, Bioconjugate Techniques）。別の実施形態では、N-末端セリン残基又はスレオニン残基を含む抗体は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、その最初のアミノ酸でアルデヒドが形成されることがある（Geoghegan and Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US5362852）。そのようなアルデヒドは薬物モジュール又はリンカー求核剤と反応することがある。
【０１４７】
前記薬物モジュール上の求核基としては、限定されるものではないが：アミン、チオール、ヒドロキシ、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジン・カルボン酸及びアリールヒドラジド基が含まれ、これらは前記リンカー・モジュール上の求電子基と反応して共有結合を形成することがある。そして、前記リンカー剤としては、以下のものが含まれる：（i）NHS エステル、HOBt エステル、ハロホルメート、酸ハロゲン化物等の活性エステル；（ii）ハロアセトアミド等のヒドロカルビル及びハロゲン化ベンジル；（iii）アルデヒド、ケトン、カルボキシル基、及びマレイミド基。
【０１４８】
本発明の化合物は、限定されるものではないが、以下の架橋剤によって調製する ADC を明確に網羅する：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、スルホ-SMPB 及び SVSB（スクシニミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸）、これらは市販されている（例えば、ピアス・バイオテクノロジー社（Pierce Biotechnology, Inc.）、ロックフォード、イリノイ、米国、2003-2004 Application Manual and product catalog (2003-2004 Applications Handbook and Catalog) 頁 467-498 を参照）。
【０１４９】
抗体と細胞傷害剤を含む抗体‐細胞傷害性薬物複合体若しくは薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物はまた、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸（SPDP）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸（SMCC）、アミノスルファン（IT）、イミデート（ジメチル・アジパミド HCl 等）、活性エステル（ジスクシンイミジル・スベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス・アジド化合物（ビス(p-アジド・ベンゾイル)ヘキサメチレン・ジアミン等）、ビス・ジアゾ誘導体（ビス(p-ジアゾ・ベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソチオシアネート（トルエン 2,6-ジイソシアネート等）及び二重活性フッ素化合物（1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等）等の様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて調製することもある。例えば、リシン免疫毒素（リシン・イムノトキシン）を、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987) に記載されているように調製することがある。炭素-14 標識 1-イソチオシアネート・ベンジル-3-メチル・ジエチレン・トリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合させるための例示的なキレート剤である。WO 94/11026 を参照のこと。
【０１５０】
或いは、抗体と細胞傷害剤とを含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術又はペプチド合成によって調製することがある。組換え DNA 分子は、複合体の抗体をコードする領域及び細胞傷害性部分をそれぞれ含むことがあり、これらはお互いに隣接するか、又はリンカ―・ペプチドをコードする領域によって分けられている（ここで前記リンカー・ペプチドは複合体の所望の特性を損なわない）。
【０１５１】
更に別の実施形態では、抗体を「受容体」と複合体させることがある；「受容体」（ストレプトアビジン等を）腫瘍にプレ‐ターゲッティング（pre-targeting）させるために、前記抗体‐受容体複合体を患者に投与し、続いてスカベンジャーを使用して、結合していない複合体を体循環から除去する。次いで、細胞傷害剤（例えば放射性ヌクレオチド等）に結合した「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。以下の実施例は、説明を目的にするためだけに提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【発明の効果】
【０１５２】
先行技術と比較した場合、本発明の技術的解決策には以下の利点が存在する：
（１）本発明の抗 c-Met 抗体‐細胞傷害性薬物複合体（ADC）は、単一成分として、肝がん細胞に対して有意な阻害効果を有し、その増殖を効果的に阻害し、肝がん細胞の成長及び体積を長期間、阻害することができる。一方、抗体単独では肝がん細胞に対する抑制効果が乏しく、両者の違いは顕著である。従って、本発明の ADC 薬物を、医薬活性成分として好適に用いることができる。
（２）研究によって、本発明の抗c-Met 抗体‐細胞傷害性薬物複合体（ADC）が、動物において良好に忍容性であること、及び本発明の技術的解決法によって得られる抗 c-Met 抗体‐細胞傷害性薬物複合体を工業生産に適用することができること、が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、腫瘍体積を追った曲線であり、LI-03-0022 HCC PDX 腫瘍モデルにおいて、本発明の ADC 分子が肝がん細胞を阻害することを示す。その結果は、前記 ADC 分子は、導入した毒素によって、腫瘍を完全に抑制することができるが、抗体単独では抑制できないことを示している。本発明の ADC 薬物は、担がん動物において良好な忍容性を示す；データは群の平均値を表し、エラー・バーは平均値の標準誤差（SEM）を表す。
【図２】図２は、LI-03-0022 HCC PDX 腫瘍モデルにおける、LI-03-0010（ネガティブ対照）の IHC（免疫組織化学染色）スコアである。
【図３】図３は、LI-03-0022 HCC PDX 腫瘍モデルにおける、LI-03-0022 組織の IHC（免疫組織化学染色）スコアである。
【図４】図４は、腫瘍体積を追った曲線であり、LI-03-0240 HCC PDX 腫瘍モデルにおいて、本発明の ADC 分子が肝がん細胞を阻害することを示す。
【図５】図５は、LI-03-0240 HCC PDX 腫瘍モデルにおける、LI-03-0010（ネガティブ対照）の IHC（免疫組織化学染色）スコアである。
【図６】図６は、LI-03-0240 HCC PDX 腫瘍モデルにおける、LI-03-0240 組織の IHC（免疫組織化学染色）スコアである。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。本発明の実施例は、単に本発明の技術的解決策を例示するために使用するものであり、本発明の利点及び範囲はそれらに限定されない。
【０１５５】
具体的な条件が記載されていない本発明の実施例又は試験例において、その実験は一般に従来の条件下で、又は材料若しくは製品の製造業者によって提案された条件下で行われる。Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, Greene Publishing Associates, Wiley Interscience, NY を参照のこと。薬剤の供給源が具体的に示されていない場合、その薬剤は市販されている。
【実施例】
【０１５６】
実施例１．抗原及び抗体のクローン発現
本発明において使用する抗体（軽鎖及び重鎖）及び抗原は、当該分野において公知の、重複伸長 PCR 法（overlapping extension PCR methods）によって構築する。重複伸長 PCR によって得られた DNA 断片を、HindIII/BstBI 制限酵素部位を用いて発現ベクター pEE6.4（ロンザ・バイオロジクス社（Lonza Biologics））に挿入し、293F 細胞（Invitrogen、カタログ番号R790-07）で発現させた。得られた組換えタンパク質を、免疫又はスクリーニングに使用する。c-Met 遺伝子テンプレートは、オリジーン社（origene Corporation）（番号 RC217003）から入手する。クローニング及び発現させる DNA 配列は以下の通りである：
【０１５７】
ヒト c-Met の細胞外領域（ECD）とマウス Fc 領域の融合タンパク質（ヒト c-Met ECD-mFc）の DNA 配列：
【化２４】
2019534267.tif 000028
2019534267.tif 000029
2019534267.tif 000030
2019534267.tif 000031
2019534267.tif 000032
2019534267.tif 000033
（配列番号１）
【０１５８】
ヒト c-Met 細胞外 Sema 領域及び Flag-His タグ（ヒト c-Met Sema-Flis）のDNA配列：
【化２５】
2019534267.tif 000034
2019534267.tif 000035
2019534267.tif 000036
（配列番号２）
【０１５９】
ヒト c-Met ECD his タグ（ヒト c-Met ECD-His）組換えタンパク質の DNA 配列：
【化２６】
2019534267.tif 000037
2019534267.tif 000038
2019534267.tif 000039
2019534267.tif 000040
（配列番号３）
【０１６０】
実施例２．抗体と抗原の結合アッセイ（ELISA）
この実験は、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme linked immunosorbent assay）を使用して、in vitro で c-Met 抗原に対する c-Met 抗体（ハイブリドーマの上清、又は組換え発現をさせたモノクローナル抗体等を含む）の親和性を検出する。
【０１６１】
実験手順：コーティング緩衝液（PBS；ハイクローン社（Hyclone）、カタログ番号：SH30256.01B）を用いて抗原（ヒト c-Met-His、実施例１）を 2 μg/mL に希釈し、これを 100 μL/ウェル（well） で 96-ウェル・マイクロプレート（コースター社（Costar） 9018、カタログ番号：03113024）に添加し、4 ℃で一晩インキュベートした。翌日、抗体でコートした 96-ウェル・マイクロプレートを室温に戻し、洗浄緩衝液（PBS+0.05 % Tween 20（シグマ社（Sigma）、カタログ番号：P1379））で 3 回洗浄した。ブロッキング緩衝液（PBS+1 % BSA（ロシュ社（Roche）、カタログ番号：738328））を 200 μL/ウェルで添加し、及びプレートを 37 ℃で 1 時間インキュベートした。そして、そのプレートを洗浄緩衝液で 3 回洗浄した。試験対象の抗 c-Met 抗体を前記 96-ウェル・マイクロプレートに添加し、室温で 1 時間インキュベートした。そして、そのプレートを洗浄用緩衝液で 3 回洗浄した。ブロッキング緩衝液で希釈した二次抗体（ヤギ抗マウス IgG(H+L)(HRP)（サーモ社（Thermo）、番号：31432）（10000 倍希釈）を、100 μL/ウェルで前記 96-ウェル・マイクロプレートに添加し、そのプレートを室温で 1 時間インキュベートした。そして、前記プレートを 3 回洗浄し、TMB 発色基質（イーバイオサイエンス社（eBioscience） 参照番号：00-4201-56）を前記 96-ウェル・マイクロプレートに 100 μL/ウェルで添加した。100 μL/ウェルで、2N H2SO4の停止液を前記 96-ウェル・マイクロプレートに添加した。プレートリーダーを使って、450 nm でプレートを測定する。
【０１６２】
実施例３．ヒト c-Met に対するマウス・モノクローナル抗体細胞株の産生
本発明では、マウスを免疫し、脾臓細胞を融合し、そしてハイブリドーマをスクリーニングすることにより、マウス抗ヒト c-Met モノクローナル細胞株を得た。この方法はこの分野ではよく知られている。組み換え発現をさせた抗原（ヒト c-Met ECD-mFc、ヒト c-Met Sema-flis、実施例１参照）を PBS（ハイクローン社、カタログ番号：SH30256.01B）で 1 mg/mL に希釈し、フロイント・アジュバント（最初の免疫はフロイントの完全アジュバントを用いて行い、そして追加免疫はフロイントの不完全アジュバントを用いて行った）で乳化した；Balb/C マウスに皮下注射し（5匹/群）（各マウスに 100 μg の抗原を接種した）、2 週間毎に追加免疫を行った。最初の追加免疫から、マウス血清を各追加免疫後 7 から 10 日の間に回収し、その力価を ELISA により検出した（方法は実施例２に記載した）。
【０１６３】
免疫後、1:105より高い血清力価を有するマウスを細胞融合のために選択した。マウス B 細胞及びミエローマ細胞（SP2/0、ATCC 番号：CRL-1581（商標））をそれぞれ無菌状態で調製し、そして数を数えた。この 2 種類の細胞を B 細胞：SP2/0 が 1:4の比で混合し、次いで遠心分離した（1500r/分、7 分）。上清を捨て、そして 1 mL の 50 % ポリエチレン・グリコール（供給者：シグマ（SIGMA）、カタログ番号 RNBB306）を添加した。次に、1 mL の無血清 RPMI1640（供給者：ギブコ（GIBCO）、カタログ番号 C22400）を停止させるために使用し、そして 10 分間遠心分離した。その後上清を捨てた。ペレットを、ハイブリドーマ細胞増殖因子（供給者：ロシュ（Roche）、カタログ番号 1363735001）、血清（供給者：ギブコ（GIBCO）、カタログ番号 C20270）及び HAT（供給者：インビトロゲン（Invitrogen）、カタログ番号 21060-017）を含む RPMI 1640 に再懸濁した。B細胞を 105 細胞/ウェルでプレートに播種し、各ウェルを 100 μL にする。前記プレートを 37 ℃の細胞インキュベーターに入れた。3 日後、ハイブリドーマ細胞増殖因子、血清及び HT（供給者：インビトロゲン、カタログ番号 11067-030）を含む 100 μL の RPMI1640を各ウェルに加えた。2 から 4 日後に、各ウェルをハイブリドーマ細胞増殖因子、血清及び HT を含む 150 μL の RPMI1640 に交換した。翌日、ポジティブ・クローンを ELISA により検出した（実施例２の方法参照）。
【０１６４】
【表２】
2019534267.tif 000041
【０１６５】
実施例４．抗 c-Met 抗体配列のクローニング
単一細胞株 Ab-5 を cDNA 配列クローニングのために選択した。mAb を組換え発現させ、そして種々の活性試験に供した。抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖の可変領域を逆転写 PCR により増幅し、そしてベクターに連結して、シークエンシングを行うことにより、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖配列を得る。まず最初に、RNA 精製キット（キアゲン社（Qiagen）、カタログ番号 74134、この手順についての指示書を参照のこと）を使用して、実施例３の活性のある単一細胞株から全 RNA を抽出した。次に、cDNA 一本鎖を cDNA 合成キット（インビトロジェン社、カタログ番号 18080-051）（即ち、オリゴ-dT プライマーによる cDNA への逆転写）によって調製した。その生成物を鋳型とし、抗体重鎖及び軽鎖の可変領域配列を PCR 法により合成した。PCR の産物を TA ベクターである pMD-18T にクローニングし、次いでシークエンシングを行った。得られた抗体の重鎖配列及び軽鎖配列を別々に発現ベクターにクローニングし（実施例１参照）、組換えモノクローナル抗体を発現させてその活性を確認し（実施例２及び３参照）、続いてヒト化した。
【０１６６】
マウス・ハイブリドーマ細胞モノクローナル抗体 Ab-5 の配列：
重鎖可変領域：
【化２７】
2019534267.tif 000042
（配列番号４）
軽鎖可変領域：
【化２８】
2019534267.tif 000043
（配列番号５）
【０１６７】
抗ヒト c-Met 抗体の VH/VL CDR のアミノ酸残基は、カバット（Kabat）番号付けシステムによって決定し、注釈が付けられている。
【０１６８】
本発明におけるマウスの CDR 配列を以下の表に示す：
【０１６９】
【表３】
2019534267.tif 000044
【０１７０】
実施例５．抗 c-Met 抗体のヒト化
実施例４から得られたマウス抗c-Met モノクローナル抗体重鎖及び軽鎖配列を、相同性を見るために抗体データベースに対してアライメントを行い、次いでヒト化抗体モデルを確立した。復帰変異のモデルに従って、最適なヒト化 c-Met モノクローナル抗体を本発明の好ましい分子として選択した。得られたマウス候補分子と類似の相同性を示す結晶構造を、公開されているデータベースのマウス Fab 結晶構造モデル（例えば、PDB データベース）から選択し、高分解能（例えば 2.5 オングストローム未満）の Fab 結晶構造を選択した；そして、マウスFab モデルを確立した。本発明のマウス抗体重鎖及び軽鎖配列を、モデル中の配列に対してアライメントを行い、一致する配列を得て、次いで本発明のマウス抗体の構造モデルが得る。一致しないアミノ酸は復帰変異の可能性がある部位であるかもしれない。Swiss-pdb ビューワー（Swiss-pdb viewer）ソフトウェアを使用してマウス抗体構造モデルを実行し、エネルギーを最適化した（最小化）。前記モデルの CDRs 中にあるもの以外の異なるアミノ酸部位で復帰変異を行い、得られたヒト化抗体とヒト化されていない抗体の活性を比較した。良好な活性を有するヒト化抗体を取った。そして次に、グリコシル化、脱アミド化、酸化部位などを回避すること等を含めて、CDR 領域を更に最適化した。最適化したヒト化抗 c-Met 抗体の CDR 領域を以下の表に示す：
【０１７１】
【表４】
2019534267.tif 000045
【０１７２】
ヒト化した重鎖及び軽鎖配列の可変領域を以下に示す：
1．重鎖可変領域
Ab-9
【化２９】
2019534267.tif 000046
（配列番号１３）
Ab-10
【化３０】
2019534267.tif 000047
（配列番号１４）
Ab-11
【化３１】
2019534267.tif 000048
（配列番号１５）
2．軽鎖可変領域
Ab-9
【化３２】
2019534267.tif 000049
（配列番号１６）
Ab-10
【化３３】
2019534267.tif 000050
（配列番号１７）
Ab-11
【化３４】
2019534267.tif 000051
（配列番号１８）
【０１７３】
ヒト化した重鎖及び軽鎖配列を、IgG Fc 領域と一緒に組換えて、本発明のヒト化抗 c-Met モノクローナル抗体を得る。使用する Fc 配列は、以下の配列から任意に選択した：
【０１７４】
重鎖定常領域：
【化３５】
2019534267.tif 000052
（配列番号１９）
【化３６】
2019534267.tif 000053
（配列番号２０）
【化３７】
2019534267.tif 000054
2019534267.tif 000055
（配列番号２１）
軽鎖定常領域：
【化３８】
2019534267.tif 000056
（配列番号２２）
【０１７５】
上記の抗体を、それぞれ遺伝子クローニング及び組換え発現により、クローニングし、発現させ、及び精製した。最高の活性を有するヒト化抗体 Ab-9、Ab-10 及び Ab-11 を、ELISA（実施例２）及び in vitro 結合活性アッセイ（実施例６）によって最終的に選択した。その配列は以下の通りである：
Ab-9 ヒト化抗体：
重鎖：
【化３９】
2019534267.tif 000057
（配列番号２３）
軽鎖：
【化４０】
2019534267.tif 000058
（配列番号２６）
【０１７６】
Ab-10 ヒト化抗体：
重鎖：
【化４１】
2019534267.tif 000059
2019534267.tif 000060
（配列番号２４）
軽鎖：
【化４２】
2019534267.tif 000061
（配列番号２７）
【０１７７】
Ab-11ヒト化抗体：
重鎖：
【化４３】
2019534267.tif 000062
（配列番号２５）
軽鎖：
【化４４】
2019534267.tif 000063
（配列番号２８）
【０１７８】
実施例６．抗 c-Met ヒト化抗体の in vitro 結合活性の検出
本発明のヒト化抗体を ELISA によりその in vitro 活性について検出し（実施例２）、更に c-Met を高発現する細胞株 MKN45 とのその結合について、及び c-Met 抗原に対するその親和性についても検出した（ビアコア（BIACore）アッセイ）。
【０１７９】
FACS 法を用いて、c-Met ヒト化抗体と c-Met を高発現している細胞株 MKN45 との結合活性を検出した。
【０１８０】
MKN45 細胞（JCRB、カタログ番号：JCRB0254）を、10 %（v/v）ウシ胎児血清（FBS GIBCO、カタログ番号：10099-141）及びペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO、カタログ番号：15070-063）を含む RPMI1640 培地（GIBCO、カタログ番号：11835-030）に再懸濁し、10000,000 細胞/mL とした。2 mL の再懸濁した MKN45 細胞を 96-ウェル・マイクロタイター・プレート（Corning、カタログ番号：3799）に 150000 細胞/ウェルで加え、8 種類の濃度の c-Met 抗体（5 倍段階希釈、20 μg/mLから開始）を対応するウェルに加え、最終容量を 100 μL とし、前記プレートを 4 ℃で 1 時間インキュベートした。FACS 緩衝液（2.5 % （v/v）FBS を含む PBS（Hyclone、カタログ番号：SH30256.01B））を加えた。これを 4 ℃、1300 rpm で 4 分間遠心した後、上清を捨てた。この手順を 3 回繰り返した。100 μL の二次抗体（1:200 希釈の蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体、Biolegend、カタログ番号 405307；1:30 希釈の蛍光標識抗ヒト二次抗体、Biolegend、カタログ番号 409304）を各ウェルに添加し、そして前記プレートを 4 ℃で 1 時間インキュベートした。FACS 緩衝液を添加し、4 ℃、1300 rpm で 4 分間遠心分離した後、上清を捨てた；この手順を 3 回繰り返した。200 μL の FACS 緩衝液を添加して細胞を再懸濁し、調製したサンプルをフロー・サイトメトリー（BD FACS アレイ）によって検出した。
【０１８１】
本発明において、c-Met 抗体の c-Met 抗原 Sema-His に対する親和性を、表面プラズモン共鳴（SPR）によって検出した。
【０１８２】
抗マウス IgG（GE Life Sciences カタログ番号 BR-1008-38）又は抗ヒト IgG（GE Life Sciences カタログ番号 BR-1008-39）抗体を、酢酸ナトリウム溶液 pH 5.0（GE Healthcare、カタログ番号 BR-1003-51）で、それぞれ 30 μg/mL 及び 50 μg/mL に希釈した。アミノ・カップリング・キット（GE Life Sciences、カタログ番号 BR100050）を CM5 チップ（GE Life Sciences カタログ番号 BR-1000-12）の試験チャンネル及び対照チャンネルに固定し、カップリング・レベルを 15000RU に設定した。c-Met 抗体をランニング緩衝液 PBS（Hyclone、カタログ番号 SH30256.01B）+0.05 % P20（GE Life Sciences、カタログ番号 BR-1000-54）で 1.5 μg/mL に希釈した。抗原 Sema-His をランニング緩衝液で 200 nM に希釈し、次に 0.78 nM になるまで同じ緩衝液を使って 1:2 希釈で希釈した。この希釈した抗体を、30 μL/分の速度で 1 分間試験チャンネルを通過させ、そして前記抗原を同じ速度で、3 分間試験チャンネル及び対照チャンネルを通過させた。解離させた 10 分後、流速を 10 μL/分に合わせ、再生緩衝液を試験チャネル及び対照チャネルに 3 分間通過させた。データは、二重控除（double deduction）後に BiaEvaluation 4.1 によって適合させたが、その適合モデルは 1：1 のラングミュア・モデル（Langmuir model）である。
【０１８３】
実験結果：
【表５】
2019534267.tif 000064
【０１８４】
【表６】
2019534267.tif 000065
【０１８５】
結論：上記の実験結果は、ヒト化抗体の抗原との結合活性は 0.13-8 nM の範囲内であり、その結果は使用する検出方法に応じて変動することがあることを示している。前記結果は、ヒト化抗 c-Met 抗体がヒト化の前の親抗体の結合活性を維持していることを示している。
【０１８６】
実施例７．抗 c-Met 抗体のエンドサイトーシス
本発明の抗体は、ヒトc-Metに結合し、そして非常に良好な in vitro 活性、及び in vivo での腫瘍活性を阻害することにおいて良好な活性を有する。更に、前記抗体はアゴニスト活性を有さないか、又は非常に弱いアゴニスト活性を有する。抗体が、一度ヒト c-Met に結合すると、ヒト c-Met と共に細胞内に取り込まれるかどうかを検出するために、c-Met を発現するヒト胃がん細胞 MKN45 （JCRB、カタログ番号：JCRB0254）を評価に使用した。
【０１８７】
MKN45 細胞を、10 % （v/v）FBS（GIBCO、カタログ番号：10099-141）及びペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO、カタログ番号：15070-063）を含有する RPMI 1640 培地（GIBCO、カタログ番号：11835-030）中に、10000,000 細胞/mL となるように再懸濁した。再懸濁した MKN45 細胞 2 ml を、250,000 細胞/ウェルで 96-ウェル・マイクロタイター・プレートに添加し、そして 10 μg/mL の c-Met 抗体を対応するウェルに添加して、最終容量を 100 μL とし、前記プレートを 4 ℃で 1 時間インキュベートした。FACS 緩衝液（2.5 % ウシ胎児血清（Hyclone、カタログ番号：SH30256.01B）を含むリン酸緩衝液）を添加し、4 ℃、1300 rpm で 4 分間遠心分離した。上清を捨て、そしてこの手順を 3 回繰り返した。100 μL の二次抗体溶液（1:200 希釈の蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体、Biolegend、カタログ番号 405307；1:30 希釈の蛍光標識抗ヒト二次抗体、Biolegend、カタログ番号 409304）を各ウェルに添加した。前記プレートを 4 ℃で 1 時間インキュベートした。 FACS 緩衝液を添加し、4 ℃、1300 rpm で 4 分間遠心分離した。上清を捨て、そしてこの手順を 3 回繰り返した。完全細胞培養培地（10 % FBS を含む RPMI 1640 培地）を添加し、そして 5 % CO2 中 37 ℃で、0、0.5、1、2、4 時間インキュベートした。5 μL の 7-AAD（Biolegend、カタログ番号：420403）を各ウェルの 100 μL の FACS 緩衝液に加え、4 ℃で 30 分間インキュベートした。FACS 緩衝液を添加し、4 ℃、1300 rpm で 4 分間遠心した。上清を捨て、そしてこの手順を 3 回繰り返した。200 μL のストリッピング緩衝液（0.05 M グリシン、pH 3.0； 0.1 M NaCl、1:1（v/v）で混合）を各ウェルに添加した。細胞を再懸濁し、そして室温で 7 分間インキュベートした。細胞を室温で 1300 rpm で、4 分間遠心し、上清を捨てた。200 μL の中和洗浄緩衝液（0.15 M トリヒドロキシメチル・アミノメタン、pH 7.4）を各ウェルに添加した。細胞を再懸濁し、そして室温で 4 分間 1300 rpm で遠心分離し、そして上清を捨てた。200 μL の FACS 緩衝液を添加し、そして細胞を再懸濁した。調製したサンプルをフロー・サイトメトリー（BD FACS Calibur）により検出した。結果を以下の表に示す。
【０１８８】
c-Met 抗体のエンドサイトーシス % ＝（各時点での蛍光強度‐時刻 0 での平均蛍光強度）／時刻 0 での平均蛍光強度。
実験結果：
【０１８９】
【表７】
2019534267.tif 000066
*対照群の -4.9 % 及び -3.6 % は、実験誤差（バックグラウンド値）によるもので、エンドサイトーシスされていないと見なされる。
【０１９０】
実験の結論：
上記の表の実験結果は、本発明の抗体が良好なエンドサイトーシス能を有する一方、アゴニスト活性を有さないことを示している。一旦標的細胞と結合すると、抗体と受容体の両方が急速に標的細胞に内在化され、そして 2-4 時間以内に最大値に達した。
【０１９１】
実施例８．抗 c-Met 抗体の生物物理学的安定性の分析
グリコシル化及び脱アミド化部位の存在、及び安定性等の、本発明の抗体の生物物理学的安定性を評価するために、LC-MS 分析を使用して、本発明の抗 c-Met 抗体を評価した。
【０１９２】
重鎖及び軽鎖の分子量を、グリコシル化の分析のための LC-MS によって直接検出した。脱アミド化は、4 ℃で長期間（少なくとも 3 ヶ月）、又は 40 ℃で 21 日間の加速条件下で、LC-MS により分析した。異なる条件で処理したサンプルを採取し、pH7.2 の Tris-HCl で 2 mg/mL に希釈した；最終濃度 10 mM の TCEP 及び 6M の尿素（AMRESCO、カタログ番号 0378）3 を添加し、次いでサンプルを 37 ℃で 20 分間インキュベートした。最終濃度 20 mM の IAA（Sigma-Aldrich、カタログ番号 I1149）を添加し、スルフヒドリル基を保護するために暗所で 15 分間インキュベートした。サンプルの pH を Tris-HCl、pH 7.2 で希釈することにより調整し、そしてプロテアーゼ（Sigma-Aldrich、カタログ番号 T6567）を 10:1（タンパク質：酵素）の重量比で添加した。このサンプルを 37 ℃で 25 分間インキュベートし、次いで最終濃度 0.1 % のギ酸（Fluca、カタログ番号 94318）を加えて前記反応を停止させた。サンプルを遠心分離し、そして LC-MS により分析した。
【０１９３】
BiopharmaLynx を用いて、脱アミド化の存在を分析した。脱アミド化部位及び修飾生成物を含む天然状態のペプチドを検索し、次いで親イオンを抽出することにより、抽出イオン・クロマトグラム（EIC）を MS データから得た。ピーク面積は積分によって得られ、そして脱アミド化及び酸化生成物の百分率を計算した。
【０１９４】
実験結果：
【表８】
2019534267.tif 000067
＊：重鎖は全てグリコシル化を伴い、分子量は予想した値と一致した。＃：脱アミノ化分子の割合（%）。0.66-1.0 % は検出のバックグラウンド内である。-：未試験。
【０１９５】
実験の結論：上記の結果は、本発明の抗体が安定であり、及び良好な物理的性質を有することを示している。
【０１９６】
実施例９．毒素 MC- MMAF と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-10 （No.1）
本発明の抗 c-Met 抗体は、受容体結合の阻害活性を有し、アゴニスト活性を伴わず、標的細胞内へのエンドサイトーシスの活性、並びに物理的安定性を示す。これらの特性により、本発明の抗体は、c-Met を発現するがんを治療するための毒素と複合体化した場合、ADC 薬物を調製するのに特に適したものになる。そのカップリング・プロセスを以下に示す：
【化４５】
2019534267.tif 000068
【０１９７】
ステップ１．チオ酢酸 S-(3-カルボニル・プロピル)エステル（0.7 mg、5.3 μmol）をアセトニトリル溶液（0.9 mL）に溶解して用いた。上記で調製したチオ酢酸 S-(3-カルボニル・プロピル)エステルのアセトニトリル溶液を、Ab-10 モノクローナル抗体を含有する pH=4.3 の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（10.35 mg/mL、9.0 mL、0.97 mmol）に添加し、そして水素化ホウ素ナトリウム水溶液（14.1 mg、224 μmol、1.0 mL）を 25 ℃で 2 時間振盪しながら滴下した。反応の終わりに、Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：0.05 M の PBS 溶液、pH 6.5）で脱塩及び精製を行い、生成物 1b 溶液を回収し、そして次の反応のために直接 10 mg/mL に濃縮した。
【０１９８】
ステップ２．塩酸ヒドロキシルアミン溶液（2.0 M、0.35 mL）を、11.0 mL の 1b 溶液に、25 ℃で 30 分間振盪させながら、加え、次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラムで行い（溶出相：0.05 M PBS 溶液（pH 6.5））、標題生成物である Ab-10 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 1c 溶液を回収した（6.17 mg/mL、14.7 mL）。
【０１９９】
ステップ３．化合物 MC- MMAF （1.1 mg、1.2 μmol；PCT 特許 WO2005081711 に公開されている方法により調製）をアセトニトリル（0.3 mL）に溶解し、Ab-10 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 1c 溶液（6.17 mg/mL、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：0.05 M の PBS 溶液 pH 6.5）で行った。標題生成物 ADC-1 の PBS 緩衝液溶液（3.7 mg/mL、4.7 mL）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.2（MAb+0D）、149278.1（MAb+1D）、150308.1（MAb+2D）、151314.1（MAb+3D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.7 である。
【０２００】
実施例１０．毒素 MC-VC-PAB-MMAE と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-10（No.2）
【化４６】
2019534267.tif 000069
化合物MC-VC-PAB-MMAE （1.6 mg、1.2 μmol；PCT 特許 WO2004010957 に開示されている方法に従って調製した）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-10 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 1c 溶液（6.17 mg/ml、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：0.05 M の PBS 溶液、ｐH 6.5）で行った。標題生成物 ADC-2 の PBS 緩衝液溶液（3.6 mg/mL、4.8 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148118.4（MAb+0D）、149509.2（MAb+1D）、150903.1（MAb+2D）、152290.4（MAb+3D）、153680.7（MAb+4D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.8 である。
【０２０１】
実施例１１．毒素 MC-VC-PAB-MMAF と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-10（No.3）
【化４７】
2019534267.tif 000070
化合物 MC-VC-PAB-MMAF（1.6 mg、1.2 μmol ；PCT 特許 WO2005081711 に開示されている方法に従って調製した）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-10 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 1c 溶液（6.17 mg/ml、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物 ADC-3 の PBS 緩衝液溶液（3.5 mg/mL、4.9 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.1（MAb+0D）、149525.3（MAb+1D）、150930.7（MAb+2D）、152335.2（MAb+3D）、153739.8（MAb+4D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.6 である。
【０２０２】
実施例１２．毒素 MC- MMAE と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-10（No.4）
【化４８】
2019534267.tif 000071
化合物 MC- MMAE（1.2 mg、1.2 μmol ；特許出願 US7/750/116B1 に開示されている方法に従って調製した）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-10 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 1c 溶液（6.17 mg/ml、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物 ADC-4 の PBS 緩衝液溶液（3.4 mg/mL、5.0 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148118.6（MAb+0D）、149104.3（MAb+1D）、150090.1（MAb+2D）、151075.8（MAb+3D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.6 である。
【０２０３】
実施例１３．毒素 MC- MMAE と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-9（No.5）
【化４９】
2019534267.tif 000072
2019534267.tif 000073
【０２０４】
ステップ１．チオ酢酸 S-(3-カルボニル・プロピル)エステル（0.7 mg、5.3 μmol）を 0.9 ml のアセトニトリル溶液に溶解して使用した。上記で調製したチオ酢酸 S-(3-カルボニル・プロピル)エステルのアセトニトリル溶液を、Ab-9 モノクローナル抗体を含有する酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（10.85 mg/mL、9.0 ml、0.976 mmol）に添加し、25 ℃で 2 時間振盪させながら、水素化ホウ素ナトリウム水溶液（14.1 mg、224 μmol、1.0 ml）を滴下した。反応終了時に、Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：ｐH 6.5である0.05 M の PBS 溶液）で脱塩及び精製を行い、そして標題の生成物 5b の溶液を回収し、次の反応のために直接10 mg/mL に濃縮した。
【０２０５】
ステップ２．塩酸ヒドロキシルアミン溶液（2.0 M、0.35 ml）を、5b 溶液（11.0 ml）に、25 ℃で 30 分間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行い、標題生成物 Ab-9 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 5c 溶液を回収した（6.2 mg/mL、15.0 ml）。
【０２０６】
ステップ３．化合物 MC- MMAE（1.1 mg、1.2 μmol）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-9 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 5c 溶液（6.2 mg/mL、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物 ADC-5 の PBS 緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
【０２０７】
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150530.9（MAb+0D）、151915.7（MAb+1D）、153333.6（MAb+2D）、154763.4（MAb+3D）、156271.9（MAb+4D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.5 である。
【０２０８】
実施例１４．毒素 MC- MMAF と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-9（No.6）
【化５０】
2019534267.tif 000074
化合物 MC- MMAF（1.1 mg、1.2 μmol）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-9 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 5c 溶液（6.17 mg/mL、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物 ADC-6 の PBS 緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.8（MAb+0D）、152087.9（MAb+1D）、153486.5（MAb+2D）、154911.7（MAb+3D）、156499.9（MAb+4D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.7 である。
【０２０９】
実施例１５．毒素 MC-VC-PAB-MMAF と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-9（No.7）
【化５１】
2019534267.tif 000075
化合物 MC-VC-PAB-MMAF（1.6 mg、1.2 μmol）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-9 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 5c 溶液（6.2 mg/mL、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物 ADC-7 の PBS 緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.8（MAb+0D）、152087.9（MAb+1D）、153486.5（MAb+2D）、154911.7（MAb+3D）、156499.9（MAb+4D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.8 である。
【０２１０】
実施例１６．毒素 MC-VC-PAB-MMAE と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-9（No.8）
【化５２】
2019534267.tif 000076
化合物 MC-VC-PAB-MMAE（1.6 mg、1.2 μmol）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-9 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 5c 溶液（6.2 mg/mL、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物 ADC-8 の PBS 緩衝液溶液（3.8 mg/mL、4.6 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150508.6（MAb+0D）、151903.6（MAb+1D）、153314.5（MAb+2D）、154747.8（MAb+3D）、156039.5（MAb+4D）。抗体当たりに結合した毒素の量（DAR）を分析により計算したところ、その平均値は y=1.6 である。
【０２１１】
実施例１７．毒素 SN-38 と複合体化した抗 c-Met 抗体 Ab-9（No.9）
【化５３】
2019534267.tif 000077
2019534267.tif 000078
化合物 MC-VC-PAB-SN-38（1.3 mg、1.2 μmol）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解し、Ab-9 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 5c 溶液（6.2 mg/mL、3.0 ml）に、25 ℃で 4 時間振盪させながら、添加した。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物ADC-11 の PBS 緩衝液溶液（3.7 mg/mL、4.5 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：150537.1（MAb+0D）、151786.6（MAb+1D）、152948.6（MAb+2D）、154161.7（MAb+3D）、155365.9（MAb+4D）、156477.8（MAb+5D）。
平均値は y = 2.6 である。
【０２１２】
実施例１８．抗 c-Met 抗体 Ab-10 複合体毒素（No.10）
１．毒素の調製
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-
(メチル・アミノ) ブチルアミド) ブチルアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2- アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸
【化５４】
2019534267.tif 000079
【化５５】
2019534267.tif 000080
【０２１３】
ステップ１．
(S)-tert-ブチル-2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸の調製
出発物質 (S)-2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸 12a（400 mg、2.18 mmol、「Advanced Synthesis & Catalysis, 2012, 354(17), 3327-3332」に記載の既知の方法に従って調製した）を 10 ml の酢酸 tert-ブチルに溶解した。過塩素酸（300 mg （70 %）、3.3 mmol）を加え、室温で 16 時間撹拌した。反応後、水（6 ml）を加えて溶液を分離した。有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液（5 ml）で洗浄した。水相を飽和重炭酸ナトリウム溶液で pH=8 に調整し、次いでジクロロメタン（5 mL×3）で抽出し、有機相を合わせた。次いでその反応混合物を水（3 ml）及び飽和塩化ナトリウム溶液（5 ml）で続けて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した；その濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物である化合物 12b を得て（390 mg、黄色、油状）、これを精製することなく、直接次の反応に用いた。
【０２１４】
ステップ２．
(1S,3S,5S)-tert-ブチル3-((1R,2R)-3(((S)-1-(t-ブトキシ)-3-(2- フルオロフェニル)-1-カルボニルプロピル-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-カルボニル・プロピル) -2-アザビシクロ [3.1.0] ヘキサン-2-カルボン酸の調製
出発物質 (2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-(tert-ブトキシカルボニル)- 2-アザビシクロ [3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチル・プロピオン酸 12e（100 mg、0.334 mmol）を、ジクロロメタン（6 mL）とジメチルホルムアミド（V/V=5:1）の混合物に溶解し、次いで粗生成物 (S)-tert-ブチル2-アミノ-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸 12b（80 mg、0.334 mmol）を添加した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.29 ml、1.67 mmol）及び 2-(7-アザベンゾトリアゾール)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸（152.3 mg、0.40 mmol）をその混合物に添加した。その混合物をアルゴン雰囲気下、室温で 1 時間撹拌した。反応後、水（10 ml）を加えて攪拌し、層を分離した。ジクロロメタン層を飽和食塩水（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧濃縮した。その残渣を、溶出剤系 B を使用するシリカ・ゲル・カラム・クロマトグラフィーにより精製し、標題生成物化合物 12c を得た（173 mg、透明液体、収率 99.5 %）。
MS m/z (ESI): 521.2 [M+1]
【０２１５】
ステップ３．
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S),-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸の調製
出発物質 (1S,3S,5S)-tert-ブチル-3-((1R,2R)-3-(((S)-1-(t-ブトキシ)-3 (2-フルオロフェニル)-1-カルボニルプロピル-2-イル) アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-カルボニルプロピル)-2-アザビシクロ [3.1.0] ヘキサン-2-カルボン酸 12c（173 mg, 0.33 mmol）をジオキサン（2 ml）に溶解し、塩化水素ジオキサン溶液（5.6 M、0.21 ml、1.16 mmol）を加えた。その混合物をアルゴン雰囲気下、室温で 1 時間撹拌し、0 ℃の冷蔵庫に 12 時間入れた。反応後、その反応液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン（5 ml）を加えて前記反応液を希釈した。飽和重炭酸ナトリウム溶液（10 ml）を添加し、そしてその混合物を 10 分間撹拌した。その生成物を層化させ、水相をジクロロメタン（5 ml × 3）で抽出した。ジクロロメタン層を合わせて飽和塩化ナトリウム溶液（10 ml）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて、濾過した。その濾液を減圧下で濃縮した。標題化合物 12d の粗生成物を得て（77 mg、黄色液体）、精製することなく次の反応に直接用いた。
MS m/z (ESI):421.2 [M+1]
【０２１６】
ステップ４．
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2- (5S,8S,11S,12R) -11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-酸素-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-アシル)-2-アザビシクロ[3.1.0]ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸の調製
粗生成物 (S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,2S,5S)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸12d（77 mg、0.183 mmol）と (5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-フルオレン-9-イル) -5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-オキソ-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-カルボン酸12i（116.8 mg、0.183 mmol, 特許出願「WO2013072813」に公開されている方法によって調製された）をジクロロメタン（6 ml）とジメチルホルムアミドの混合液（V/V=5:1）に溶解した。N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.16 ml、0.915 mmol）及び 2-(7-アザベンゾトリアゾール)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸（84 mg、0.22 mmol）をその混合物に添加した。その反応混合物をアルゴン雰囲気下、室温で 1 時間撹拌した。反応後、水（10 ml）を加えて撹拌し、層化させた。ジクロロメタン層を飽和食塩水（10 mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。その残渣を、溶出剤系 B を使用するシリカ・ゲル・カラム・クロマトグラフィーにより精製し、標題生成物化合物 12e を、収率 100 % で得た（190.5 mg、黄色粘性）。
MS m/z (ESI): 1040.6 [M+1]
【０２１７】
ステップ５．
(S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ) ブタンアミド)ブタンアミド) -3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸の調製
出発物質 (S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-sec-ブチル)-1-(9H-
フルオレン-9-イル)-5,8-ジイソプロピル-12-メトキシ-4,10-ジメチル-3,6,9-トリカルボニル-2-オキソ-4,7,10-トリアザテトラデシル-14-アシル)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-
メチル・プロピオンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸12e（190.5 mg、0.183 mmol）をジクロロメタン（1.5 ml）に溶解し、ジエチルアミン（2 ml）を加えた。その混合物をアルゴン雰囲気下、室温で 3 時間撹拌した。反応後、その反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の標題化合物 12f を得た（150 mg、黄色粘性）。生成物は精製することなく次の反応に直接供した。
MS m/z (ESI): 818.5 [M+1]
【０２１８】
ステップ６．
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ) ブタンアミド) ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸
粗生成物化合物 (S)-tert-ブチル-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2-(メチルアミノ) ブタンアミド) ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-
アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル)プロピオン酸 12f（150 mg、0.183 mmol）をジオキサン（1 ml）に溶解し、ジオキサン中の塩化水素（5.6 M、3 ml）を添加した。その混合物をアルゴン雰囲気下、室温で 12 時間撹拌した。反応後、その反応液をエーテル溶媒とともに減圧下で濃縮した。その残渣を高速液体クロマトグラフィーで精製して、標題化合物 12g を得た（28 mg、収率 20 % の白色粉末）。
MS m/z (ESI): 762.7[M+1]
【化５６】
2019534267.tif 000081
【０２１９】
２．毒素中間体の調製
(S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-ジカルボニル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-N-メチル・ヘキサンアミド)-3-メチル・ブタンアミド)- N,3-ジメチル・ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ [3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸
【化５７】
2019534267.tif 000082
出発物質 (S)-2-((2R,3R)-3-((1S,3S,5S)-2-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-ジメチル-2-((S)-3-メチル-2- (メチルアミノ) ブタンアミド) ブタンアミド)-3-メトキシ-5-メチルヘプタノイル)-2-アザビシクロ[3.1.0] ヘキサン-3-イル)-3-メトキシ-2-メチルプロパンアミド)-3-(2-フルオロフェニル) プロピオン酸12g（25 mg、0.033 mmol）をジクロロメタン（3 ml）に溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.029 ml、0.164 mmol）を加えた。この反応系に、予めアルゴン雰囲気下、氷中で調製した 6-(2,5-ジカルボニル-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイルクロライド 4bのジクロロメタン溶液（11.3 mg、0.049 mmol）を滴加し、反応を室温で 3 時間行った。反応後、水（5 ml）を加え、その混合物を 20 分間撹拌し、層になるまで置き、その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。その残渣を高速液体クロマトグラフィーにより精製して標題化合物 12h を得た（7 mg、黄色粘性、収率 22.4 %）。
MS m/z (ESI): 955.4 [M+1]
【化５８】
2019534267.tif 000083
【０２２０】
３．抗体‐毒素複合体の調製
【化５９】
2019534267.tif 000084
【化６０】
2019534267.tif 000085
化合物 12h（1.2 mg、1.2 μmol）をアセトニトリル（0.3 ml）に溶解した。Ab-10 モノクローナル抗体‐プロピル・メルカプタン 1c 溶液（6.17 mg/mL、3.0 ml）を、25 ℃で 4 時間振盪させながら、加えた。次いで脱塩及び精製を Sephadex G25 ゲル・カラム（溶出相：pH 6.5の 0.05 M の PBS 溶液）で行った。標題生成物ADC-12 の PBS 緩衝液溶液（3.3 mg/mL、5.0 ml）を、無菌条件下で 0.2 μm フィルターを通して濾過することにより得て、次いで 4 ℃で凍結保存した。
Q-TOF LC/MS：特性ピーク：148119.6（MAb+0D）、149150.5（MAb+1D）、150221.1（MAb+2D）、151265.1（MAb+3D）、152314.3（MAb+4D）。
平均値は y = 1.6 である。
【０２２１】
実施例９‐１８を参照して、No.11-12 の ADC 化合物を調製した。
【０２２２】
【表９】
2019534267.tif 000086
【０２２３】
実施例１９．肝がん細胞の増殖に対する抗 c-Met 抗体毒素複合体（ADC）分子の阻害効果
試験サンプル：本発明の特定の抗体化合物、化学名及び調製方法は、各化合物の調製例に記載した。
【０２２４】
細胞増殖に対する本発明の分子の阻害効果を CCK 法により試験し、そして本発明の ADC 分子の in vitro 活性を IC50 に従って評価した。
【０２２５】
【表１０】
2019534267.tif 000087
【０２２６】
実験手順：
実験中、2-3 mL のトリプシンを添加して 2-3 分間処理する。細胞を完全にトリプシン処理した後、10-15 mLの完全培地を添加することによってトリプシン処理した細胞を溶出し、1000 rpmで 3 分間遠心分離し、そして上清を捨てた。その後、10-20 ml の培地を添加して細胞を再懸濁して単一の細胞懸濁液を調製し、その細胞密度を 4 × 104 細胞/mL に調整した。96-ウェル細胞培養プレートの各穴に 0.1 ml の上記細胞懸濁液を添加し、5 % CO2 インキュベーター中 37 ℃で培養し、24 時間後に培地を除去し、そして 2 %  FBS を含有する培地 90 μL を各ウェルに添加した。試験対象のサンプルを PBS で異なる濃度勾配になるように希釈し、1 ウェルあたり 10 μL を添加し、そして 5 % CO2 インキュベーター中で 37 ℃で 72 時間インキュベートした。10 μL の CCK8 を各ウェルに添加し、インキュベーター中で更に 2 時間インキュベートし続け、そして OD450 をマイクロプレート・リーダー（VICTOR 3、パーキンエルマー（PerkinElmer））によって検出し、そしてグラフパッド・プリズム（GraphPad Prism（バージョン 5.0））ソフトウェアを使用してデータ解析を実施した。
【０２２７】
【表１１】
2019534267.tif 000088
【０２２８】
実験の結論：
上記の表に基づくと、この実験結果は、本発明の ADC-1 薬物分子が、本発明の抗 c-Met 抗体よりも優れた肝がん細胞株に対する阻害効果を有することを示していて、本発明の ADC 薬物が、肝がん細胞の増殖に対してより優れた阻害効果を有することが示している。
【０２２９】
実施例２０：ヌード・マウスにおける、ヒト肝がん HCCLM3 の皮下異種移植腫瘍に対する本発明の ADC 薬物の有効性
試験サンプル：特定の抗体、本発明のADC 化合物、化学名及び調製方法は、各化合物の調製例に記載した。
実験動物：21-28 日齢のオスの BALB/cA-ヌード・マウスは、中国科学院上海薬物研究所（Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences）から購入した。生産ライセンス番号：SCXK（上海）2013-0017、No311613700000089。飼育環境：SPF レベル。
試験溶液の調製：
ADC-12 を注射用水で 20 mg/mL 溶液として溶解し、分注したもの各々を -80 ℃の冷凍庫に保存し、使用前に 0.1 % BSA 生理食塩水で対応する濃度に希釈した。
Ab-10 抗体原液（抗体濃度 16.3 mg/mL）を 0.1 % BSA 生理食塩水で希釈し、分注したもの各々を -80 ℃の冷凍庫に保存した。
実験手順：
ヌード・マウスにヒト肝がんHCCLM3細胞を皮下接種した。腫瘍が 100-150 mm3 に成長したら、動物を無作為に、各群 10 匹の群（D0）に分けた。前記腫瘍体積を週に 2-3 回測定し、そのマウスの体重を量り、そしてデータを記録した。
腫瘍体積（V）を、以下の式に従って計算する：
V=1/2 × a × b2ここで、a 及び b はそれぞれ長さ及び幅を表す；
T/C(%)=(T-T0)/(C-C0) ×100、ここで T 及び C は試験終了時の腫瘍体積である；T0 及び C0 は試験開始時の腫瘍体積である。
【０２３０】
【表１２】
2019534267.tif 000089
D0：初回投与時；  溶媒と比較した P 値；**P<0.01；全てスチューデント（Student’s）の t 検定を使用する；  試験開始時のマウスの数：n=10；  短い横線 - は、データが無いことを示す。
【０２３１】
実験の結論：
上記の表のデータに基づくと、ADC-12（1、3、10 mg/kg、iv、D0）は、用量依存的に、ヌード・マウスにおいて皮下異種移植腫瘍（c-Met 発現ヒト肝がん HCCLM3）の成長を阻害した；腫瘍抑制率はそれぞれ 36 %、87 %、及び 178 %（D21）であり、3 mg/kg の用量群では 10 匹中 1 匹が部分回帰を示し、10 mg/kg の用量群では 10 匹中 3 匹が部分的な退縮を示し、10 匹中 6 匹が完全な退縮を示した（D21）；最初の投与の 43 日後まで（D42）、10 mg/kg の用量群において、10 匹中 7 匹が完全な退縮を依然として示していた。Ab-10 抗体原液（10 mg/kg、IV、週に 2 回を 6 回）に関しては、HCCLM3 に対する腫瘍阻害率は 36 % であった；担がんマウスは上記の薬物に対して十分に忍容であり、体重減少などの症状は観察されなかった。比較すると、ADC-12 は Ab-10 抗体原液よりも HCCLM3 に対して有意により効果的であった。
【０２３２】
従って、ADC-12 はヌード・マウスにおける c-Met ヒト肝がん HCCLM3 の皮下異種移植腫瘍に対して有意な抑制効果を示し、腫瘍の成長を効果的に阻害し、腫瘍の部分的又は完全な退縮を引き起こし、腫瘍抑制率は、用量を増加させると共に増加し、抑制効果がより顕著であった； Ab-10 抗体原液は、HCCLM3 を有意に抑制し、そして腫瘍の成長を効果的に阻害した；同じ投与量で、ADC-12 は Ab-10 抗体原液よりも HCCLM3 に対して有意により効果的であった。
【０２３３】
実施例２１．BALB/c ヌード・マウスにおける、LI-03-0022 HCC 患者由来腫瘍の移植（PDX）モデルに対する本発明の ADC 薬物の抗腫瘍効果
試験サンプル：特定の抗体、本発明のADC 化合物、化学名及び調製方法は、各化合物の調製例に記載した。
実験動物：6-8 週齢、18 匹の雌の BALB/cA ヌード・マウスを上海 Sippr-BK 実験動物株式会社（Shanghai Sippr-BK Lab Animal Co. Ltd.）から購入した、生産ライセンス番号：SCXK（上海）2013-0016、動物証明書番号：2008001658891；飼育環境：SPF レベル。
試験溶液の調製：
薬物 ADC-12 を注射用水で 20 mg/mL 溶液として溶解し、分注したもの各々を -80 ℃の冷凍庫に保存し、使用前に 5 % グルコース溶液で対応する濃度に希釈した；
Ab-10 抗体原液（抗体濃度 16.3 mg/mL）を 5 % グルコース溶液で希釈し、分注したもの各々を -80 ℃の冷凍庫に保存した；使用前に 5 % グルコース溶液で対応する濃度に希釈した。
【０２３４】
【表１３】
2019534267.tif 000090
【０２３５】
LI-03-0022 HCC PDX 腫瘍モデルの確立：
LI-03-0022 HCC（肝細胞がん、肝がん）PDX 腫瘍モデル（患者由来腫瘍異種移植モデル、PDX）は、もともと肝がん患者（上海東方肝胆病院（Shanghai Oriental Hepatobiliary Hospital）から）から外科的に切除された臨床組織サンプルを基に確立された。ヌード・マウスに移植し、世代 0（P0）と定義した；世代 0（P0）の腫瘍を移植したものを世代 1（P1）と定義した；従って、前記世代は、ヌード・マウスに連続的に移植した順序に従って定義したもので、FP3 腫瘍は P2T 患者から回収し、FP5 からの次の世代は FP6 と定義し、以下同様である；この研究には FP5 の腫瘍組織を使用した。
【０２３６】
実験手順：
（１）腫瘍移植：各マウスは、右側にLI-03-0022 FP5 腫瘍切片（約 30 mm3）を皮下移植し、腫瘍を大きくさせて、腫瘍移植の 32 日後には、平均腫瘍サイズが 183.20 mm3 に近くなった。それ以降、各群 6 匹の担がんマウスに治療を開始した。マウスに対する実験手順は、以下の表の実験計画における所定のプロトコールに従って実施した：
【０２３７】
【表１４】
2019534267.tif 000091
注：a、Nは、各群の動物数である；  b、投与体積は、10 μL/g 体重に基づいて調整する；  c、BIW は週に 2 回である；  iv は静脈内投与である。
【０２３８】
2 時間後、最後の投与を行い、抗凝固処理を行わずに全マウスから血液サンプルを採取し、PK 分析のために約 50 μL の血清を採取した；試験終了時に、溶媒群からの 2 匹の動物、及びサンプル群からの 2 匹の動物について、腫瘍サンプルを採取した。動物を 2 つの群に分けた：即ち、1 つは FFPE（ホルマリン固定組織及びパラフィン包埋組織を FFPE サンプルと呼ぶ）、及び IHC（免疫組織化学）；他は、液体窒素中での凍結用とした。
【０２３９】
（２）観察及び記録：腫瘍体積を週に2-3 回測定し、そのラットの体重を量り、そしてデータを記録した。
【０２４０】
（３）腫瘍の測定と評価項目（endpoint）
評価項目は、主に、腫瘍の成長が遅くなるかどうか、又はマウスが治癒するかどうかによるものである。腫瘍体積を、二次元でノギスを用いて週に 2 回測定する（mm3）；
腫瘍体積（V）は以下のように計算する：
V=0.5 × a × b2、ここで a 及び b は、それぞれ腫瘍の長径及び短径を表す；
腫瘍体積を用いて、T-C 値、T/C 値、T（治療群の腫瘍が 1000 mm3 に達するのに要する平均時間、日数で表わす）及び C（対照群の腫瘍が同じサイズに達するのに要する平均時間、日数で表わす）による T-C 値、を計算した；T/C 値（百分率）を抗腫瘍効果の指標として用い、特に T=Ti/T0、C=Ci/C0、Ti は、ある特定の日における治療群の平均腫瘍体積、T0 は、治療開始時の治療群の平均腫瘍体積、Ci は、Ti と同時期における溶媒対照群の平均腫瘍体積、及び V0 は、治療開始時の溶媒群の平均腫瘍体積である。
【０２４１】
（４）データ解析：平均及び標準誤差（SEM）等を含む要約統計、異なる群間における腫瘍体積の差の体積分析、及び最終投与（群分け後 14 日目）後の薬物相互作用の体積分析を、最適な治療時点で得たデータによって行い、一元配置分散分析を実施して、群間の腫瘍体積及び腫瘍重量を比較した；有意でない F-統計量が得られたとき（p=0.061、治療のばらつき 対 誤差のばらつき）、ダネットの T（両側）群間比較（Dunnett's T (double-sided) inter-group comparison）を行った；全てのデータは SPSS 17.0 を用いて分析し、P<0.05 を統計的に有意と見なした。
【０２４２】
実験結果：
【表１５】
2019534267.tif 000092
a は平均値±標準誤差である；  b は治療開始後の日数である；  c は n=5 である；  短い横線「-」は、対応する群の動物がこの時点で屠殺されていたことを意味し、データは得られなかった。
【０２４３】
【表１６】
2019534267.tif 000093
a は平均値±標準誤差である；  b は腫瘍の成長の阻害であり、治療群の平均腫瘍体積を対照群の平均腫瘍体積で割ることによって計算され、T/C は 50 % 以下でなければならない；  c は腫瘍サイズに基づいて計算される p 値である；  d は各群 3-5 匹の担がん動物を意味する。
【０２４４】
【表１７】
2019534267.tif 000094
特定の染色領域を、本明細書の図２及び図３に示す。
注：0 は染色されていないことを意味し、+ は薄い染色を意味し、++ は中程度の染色を意味し、+++ は濃い染色を意味する；切片全体を顕微鏡下で読み取り、細胞での異なる染色強度の百分率を目視評価によって決定し、そして H スコアを 1 ×（+ 細胞の %）+ 2 ×（++ 細胞の %）+ 3 ×（+++ 細胞の %）として計算する；次に、我々はその数字を評価するためにスコアリング基準を使用した：即ち、0-0.3 のスコアは弱いポジティブ、0.3-1.5 は中程度のポジティブ、そして 1.5-3 は強いポジティブである。
【０２４５】
実験の結論：
上記の表の結果は、本発明の ADC 薬物が、肝がん細胞の増殖を阻害するのに、抗体よりも有意に強いことを証明している；ADC-12 注射溶液による治療は、溶媒群と比較した場合、平均腫瘍体積 52.3 mm3（T/C 値=3.25 %、p=0.001）の有意な抗腫瘍活性をもたらす；腫瘍が成長した体積は 1000 mm3 以内に制御され、32 日遅くなる；しかしながら、Ab-10 抗体溶液での治療は、最小の抗腫瘍活性しかもたらさず、平均腫瘍サイズは 1,067 mm3 以内に制御され（T/C 値=74.47 %）、そして 3 日遅くなる；溶媒群と比較した場合、統計的に有意な差はない（p=0.252）；LI-03-0022 HCC PDX モデルは、c-Met タンパク質発現について 2+ の印象スコア（impression score）を有し、これは、このモデルにおけるc-Met タンパク質の発現レベルが強くポジティブであり、そして in vivo での更なる研究に使用され得ることを示す。従って、本発明の ADC 薬物は、LI-03-0022 HCC 患者由来の腫瘍移植（PDX）モデル試験において有意な抗腫瘍活性を有し、そして腫瘍を有する動物において十分に忍容される。
【０２４６】
実施例２２．BALB/c ヌード・マウスにおけるLI-03-0240 HCC 患者由来腫瘍の移植（PDX）モデルに対する本発明の ADC 薬物の抗腫瘍効果
試験サンプル：特定の抗体、本発明のADC 化合物、化学名及び調製方法は、各化合物の調製例に記載した。
実験動物：6-8 週齢、30 匹の雌の BALB/cA ヌード・マウスを上海 Sippr-BK 実験動物株式会社（Shanghai Sippr-BK Lab Animal Co. Ltd.）から購入した、生産ライセンス番号：SCXK（上海）2013-0016、動物証明書番号：2008001658004；飼育環境：SPF レベル。
試験溶液の調製：
薬物 ADC-12 の凍結乾燥粉末を注射用水で 20 mg/mL 溶液として溶解し、分注したもの各々を -80 ℃の冷凍庫に保存し、使用前に 5 % グルコース溶液で対応する濃度に希釈した；
Ab-10 抗体原液（抗体濃度 16.3 mg/mL）を 5 % グルコース溶液で希釈し、分注したもの各々を -80 ℃の冷凍庫に保存した；使用前に 5 % グルコース溶液で対応する濃度に希釈した。
【０２４７】
【表１８】
2019534267.tif 000095
【０２４８】
LI-03-0240 HCC PDX腫瘍モデルの確立：
LI-03-0240 HCC（肝細胞がん、肝がん）PDX 腫瘍モデル（患者由来腫瘍異種移植モデル、PDX）は、もともと肝がん患者（上海東方肝胆病院（Shanghai Oriental Hepatobiliary Hospital）から）から外科的に切除された臨床組織サンプルを基に確立された。これをヌード・マウスに移植し、世代 0（P0）と定義した；世代 0（P0）の腫瘍を移植したものを世代 1（P1）と定義した；従って、前記世代は、ヌード・マウスに連続的に移植した順序に従って定義したもので、FP3 腫瘍は P2T 患者から回収し、FP5 からの次の世代は FP6 と定義し、以下同様である；この研究には FP5 の腫瘍組織を使用した。
【０２４９】
実験手順：
（１）腫瘍移植：各マウスは、右側にLI-03-0240 FP5 腫瘍切片（約 30 mm3）を皮下移植し、腫瘍を大きくさせて、腫瘍移植の 15 日後には、平均腫瘍サイズが 151.79 mm3 に近くなった。それ以降、各群 6 匹の担がんマウスに治療を開始した。マウスに対する実験手順は、以下の表の実験計画における所定のプロトコールに従って実施した：
【０２５０】
【表１９】
2019534267.tif 000096
注：a、Nは、各群の動物数である；  b、投与体積は、10 μL/g 体重に基づいて調整する；  c、BIW は週に 2 回である；  iv は静脈内投与である。
【０２５１】
2 時間後、最後の投与を行い、抗凝固処理を行わずに全マウスから血液サンプルを採取し、PK 分析のために約 50 μL の血清を採取した；試験終了時に、溶媒群からの 2 匹の動物、及びサンプル群からの 2 匹の動物について、腫瘍サンプルを採取した。動物を 2 つの群に分けた：即ち、1 つは FFPE（ホルマリン固定組織及びパラフィン包埋組織を FFPE サンプルと呼ぶ）、及び IHC（免疫組織化学）；他は、液体窒素中での凍結用とした。
【０２５２】
（２）観察及び記録：腫瘍体積を週に2-3 回測定し、そのラットの体重を量り、そしてデータを記録した。
【０２５３】
（３）腫瘍の測定と評価項目（endpoint）
評価項目は、主に、腫瘍の成長が遅くなるかどうか、又はマウスが治癒するかどうかによるものである。腫瘍体積を、二次元でノギスを用いて週に 2 回測定する（mm3）；
腫瘍体積（V）は以下のように計算する：
V=0.5 × a × b2、ここで a 及び b は、それぞれ長さ及び幅を表す；
腫瘍体積を用いて、T-C 値、T/C 値、T（治療群の腫瘍が 1000 mm3 に達するのに要する平均時間、日数で表わす）及び C（対照群の腫瘍が同じサイズに達するのに要する平均時間、日数で表わす）による T-C 値、を計算した；T/C 値（百分率）を抗腫瘍効果の指標として用い、特に T=Ti/T0、C=Ci/C0、Ti は、ある特定の日における治療群の平均腫瘍体積、T0 は、治療開始時の治療群の平均腫瘍体積、Ci は、Ti と同時期における溶媒対照群の平均腫瘍体積、及び V0 は、治療開始時の溶媒群の平均腫瘍体積である。
【０２５４】
（４）データ解析：平均及び標準誤差（SEM）等を含む要約統計、異なる群間における腫瘍体積の差の統計解析、及び最終投与（群分け後 17 日目）後の薬物相互作用のデータ解析を、最適な治療時点で得たデータによって行い、一元配置分散分析を実施して、群間の腫瘍体積及び腫瘍重量を比較した；有意でない F-統計量が得られたとき（p<0.001、治療のばらつき 対 誤差のばらつき）、ゲイムス‐ハウエル群間比較（Games-Howell inter-group comparison）を行った；全てのデータは SPSS 17.0 を用いて分析し、P<0.05 を統計的に有意と見なした。
【０２５５】
実験結果：
【表２０】
2019534267.tif 000097
a は平均値±標準誤差である；  b は治療開始後の日数である；  c は n=5 を意味する；  短い横線「-」は、対応する群の動物がこの時点で屠殺されていたことを意味し、データは得られなかった。
【０２５６】
【表２１】
2019534267.tif 000098
a は平均値±標準誤差である；  b は腫瘍の成長の阻害であり、治療群の平均腫瘍体積を対照群の平均腫瘍体積で割ることによって計算され、T/C は 50 % 以下でなければならない；  c は腫瘍サイズに基づいて計算される p 値である；  d は各群 3-5 匹の担がん動物を意味する。
【０２５７】
【表２２】
2019534267.tif 000099
特定の染色領域は、本明細書の図５及び図６に示す。
注：0 は染色されていないことを意味し、+ は薄い染色を意味し、++ は中程度の染色を意味し、+++ は濃い染色を意味する；切片全体を顕微鏡下で読み取り、細胞での異なる染色強度の百分率を目視評価によって決定し、そして H スコアを 1 ×（+ 細胞の %）+ 2 ×（++ 細胞の %）+ 3 ×（+++ 細胞の %）として計算する；次に、我々はその数字を評価するためにスコアリング基準を使用した：即ち、0-0.3 のスコアは弱いポジティブ、0.3-1.5 は中程度のポジティブ、そして 1.5-3 は強いポジティブである。
【０２５８】
実験の結論：
上記の表の結果は、本発明の ADC 薬物が、肝がん細胞の増殖を阻害するのに、抗体よりも有意に強いことを証明している；ADC-12 注射溶液による治療は、溶媒群と比較した場合、平均腫瘍体積 52.3 mm3（T/C 値=3.25 %、p=0.001）の有意な抗腫瘍活性をもたらす；腫瘍が成長した体積は 1000 mm3 以内に制御され、32 日遅くなる；しかしながら、Ab-10 抗体溶液での治療は、最小の抗腫瘍活性しかもたらさず、平均腫瘍サイズは 1,067 mm3 以内に制御され（T/C 値=74.47 %）、そして 3 日遅くなる；溶媒群と比較した場合、統計的に有意な差はない（p=0.252）；LI-03-0240 PDX モデルは、c-Met タンパク質発現について 3+ の印象スコア（impression score）を有し、これは、このモデルにおけるc-Met タンパク質の発現レベルが強くポジティブであり、そして in vivo での更なる研究に使用され得ることを示す。従って、本発明の ADC 薬物は、LI-03-0240 HCC 患者由来の腫瘍移植（PDX）モデル試験において有意な抗腫瘍活性を有し、そして腫瘍を有する動物において十分に忍容される。
【図１】
2019534267.tif 000108
【図２】
2019534267.tif 000109
【図３】
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【図４】
2019534267.tif 000111
【図５】
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【図６】
2019534267.tif 000113
【配列表】
2019534267000001.xml
【国際調査報告】
2019534267.tif 000131
2019534267.tif 000132
2019534267.tif 000133
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