(57)【要約】【課題】炎症性疾患、特に、複数のエピトープまたはタンパク質が発病に関与する疾患の治療に使用される単一の治療用組成物への複数の疾患エピトープの組込みを可能にする組成物及び方法の必要性が存在する。【解決手段】  本発明は、特異的プロテアーゼによる切断に感受性の１つ以上のリンカーによって一緒に結合させた２つ以上のエピトープを封入する生分解性粒子を含む組成物を提供する。本発明は、抗原特異的寛容及び防御免疫応答を誘導するため、ならびに自己免疫疾患、アレルギー、癌、または感染性疾患等の炎症性疾患を治療するための方法をさらに提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する、生分解性粒子。
【請求項２】
前記生分解性粒子はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）を含む、請求項１に記載の生分解性粒子。
【請求項３】
前記生分解性粒子は、約５０：５０のポリ乳酸：ポリグリコール酸のコポリマー比でＰＬＧを含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４】
前記生分解性粒子の表面はカルボキシル化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項５】
前記カルボキシル化は、ポリ（エチレン−無水マレイン酸）（ＰＥＭＡ）、ポリアクリル酸、またはコール酸ナトリウムを使用することによって達成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項６】
前記生分解性粒子は、約−１００ｍＶ〜約０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項７】
前記生分解性粒子は、約−５０ｍＶ〜約−４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項８】
前記生分解性粒子は、約−７５ｍＶ〜約−５０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項９】
前記生分解性粒子は、約−５０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１０】
前記生分解性粒子は、約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１１】
前記生分解性粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１２】
前記生分解性粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１３】
前記生分解性粒子は、約０．５μｍ〜約１μｍの直径を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１４】
前記生分解性粒子は、約０．５μｍの直径を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１５】
前記生分解性粒子は、約０．６μｍの直径を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１６】
前記リンカーの前記アミノ酸配列は、細胞のサイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の細胞または部位のファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項１７】
前記リンカーの前記アミノ酸配列は、細胞のサイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の細胞及び部位のファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位を含む、請求項１６に記載の生分解性粒子。
【請求項１８】
前記ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、フューリンまたはカテプシンプロテアーゼによる切断に感受性である、請求項１６または１７に記載の生分解性粒子。
【請求項１９】
前記ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、フューリンプロテアーゼによる切断に感受性である請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項２０】
前記ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、カテプシンプロテアーゼによる切断に感受性である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項２１】
前記ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＷ、またはカテプシンＺのうちの１つ以上である、請求項１６〜１８または２０に記載の生分解性粒子。
【請求項２２】
前記ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、カテプシンＬである、請求項２１に記載の生分解性粒子。
【請求項２３】
前記サイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、フューリンまたはカテプシンプロテアーゼによる切断に感受性である請求項１６または１７に記載の生分解性粒子。
【請求項２４】
前記サイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の前記部位は、カテプシンＳによる切断に感受性である、請求項２３に記載の生分解性粒子。
【請求項２５】
前記リンカーの前記アミノ酸配列は、カテプシンＬによる特異的切断に感受性の部位、及びカテプシンＳによる特異的切断に感受性の部位を含む、請求項１６〜１８または２０〜２４のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項２６】
前記リンカーの前記アミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号５１４１）である、請求項２５に記載の生分解性粒子。
【請求項２７】
前記２つ以上の抗原エピトープは、自己免疫抗原、対象に移植されるべき組織上に発現する抗原、酵素補充療法のための酵素由来の抗原、またはアレルゲン由来の抗原を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項２８】
前記２つ以上の抗原エピトープは、各々、タンパク質の少なくとも一部を含み、前記一部は同じタンパク質に由来する、請求項２７に記載の生分解性粒子。
【請求項２９】
前記２つ以上の抗原エピトープは、各々、タンパク質の少なくとも一部を含み、前記一部は異なるタンパク質に由来する、請求項２７に記載の生分解性粒子。
【請求項３０】
前記異なるタンパク質は、同じ自己免疫障害、対象に移植されるべき同じ組織、または同じアレルゲンに関連する、請求項２９に記載の生分解性粒子。
【請求項３１】
前記２つ以上の抗原エピトープは、各々、ミエリン塩基性タンパク質、アセチルコリン受容体、内因性抗原、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、１１型コラーゲン、ヒト軟骨ｇｐ３９、ｆｐ１３０−ＲＡＰＳ、プロテオリピドタンパク質、フィブリラリン、低分子核小体タンパク質、甲状腺刺激因子受容体、ヒストン、糖タンパク質ｇｐ７０、ピルビン酸脱水素酵素ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＰＣＤ−Ｅ２）、毛包抗原、Α−グリアデン、グリアデン、インスリン、プロインスリン、膵島特異的グルコース−６−フォスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、ヒトトロポミオシンアイソフォーム５、バヒアグラス花粉（ＢａＧＰ）、モモアレルゲンＰｒｕ  ｐ３、αＳ１−カエイン牛乳アレルゲン、Ａｐｉｇ１セロリアレルゲン、Ｂｅｒｅ１ブラジルナッツアレルゲン、Ｂ−ラクトグロブリン牛乳アレルゲン、ウシ血清アルブミン、Ｃｏｒ  ａ  １．０４ヘーゼルナッツアレルゲン、ミエリン関連糖タンパク質、アクアポリン、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖、オボアルブミン卵アレルゲン、Ａｄｖａｔｅ、抗血友病因子、Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａｔｅ、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｒｅｆａｃｔｏ、Ｎｏｖｏ  ＶＩＩａ、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子、エプタコグアルファ、Ｈｅｌｉｘａｔｅ、Ｍｏｎａｎｉｎｅ、凝固第ＩＸ因子、Ｗｉｌａｔｅ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ、アルグルセラーゼ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、イミグルセラーゼ、Ｅｌｅｌｓｏ、タリグルセラーゼアルファ、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ、アガルシダーゼベータ、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、−Ｉ−イズロニダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、酸グルコシダーゼ、エラプレース、イズロン酸−２−スルファターゼ、ＮａｇｌａｚｙｍｅアリールスルファターゼＢ、及びＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される、タンパク質の少なくとも一部を含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３２】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号２〜１２９４からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３３】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号１２９５〜１７２４、配列番号１７２６〜１７６６、配列番号４９８６〜５１４０、及び配列番号１７２５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３４】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号１７６７〜１８４０；配列番号１８４２〜１９６２；配列番号１９６４〜２０２７；配列番号２０２９〜２０７３；配列番号２０７５〜２１１３；配列番号２１１５〜２１９７；配列番号２１９９〜２２４８；配列番号２２５０〜２２５９；配列番号２２６１〜２４２０；配列番号２４２２〜２４８６；配列番号２４８９〜２５０５、ならびに配列番号１８４１、１９６３、２０２８、２０７４、２１１４、２１９８、２２６０、２２４９、２４２１、２４８７、及び２４８８に由来する不連続エピトープからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３５】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号２５０６〜３２６０；配列番号３２６２〜３６９３；及び３２６１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３６】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号３６９４〜３８５７；配列番号３８６０〜４５６５；ならびに３８５７、３８５８、及び３８５９に由来する不連続エピトープからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３７】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４５６６〜４５７６；配列番号４５７８〜４６１０；配列番号４６１２〜４６１３；及び配列番号５０１８〜５０３９；ならびに４３５７、４５７７、及び４６１１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３８】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４６１４〜４６５３からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項３９】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４６５４〜４６９４；配列番号４６９６〜４８９４；配列番号４８９６〜４９０１；ならびに４６９５及び４８９５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４０】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９０２〜４９０６からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４１】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９０７〜４９１４からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４２】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９１５〜４９１７からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４３】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９１８〜４９４１からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４４】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９４２〜４９５２からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４５】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９５３〜４９６３からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４６】
前記２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９６４〜４９７４からなる群から選択される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４７】
前記２つ以上の抗原エピトープは、治療抗体、抗原結合断片、またはそのＦｃ断片に由来する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項４８】
前記抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合断片領域（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、または一本鎖抗原結合ドメインである、請求項４７に記載の生分解性粒子。
【請求項４９】
前記抗体またはその抗原結合断片は、α４β１インテグリン、炭疽菌、Ｂ−Ｌ（γＳ）、Ｃ５、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５９、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＰＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ１２／２３、ＰＣＳＫ９、ＰＤ１、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＴＮＦα、またはＶＥＧＦ−Ａに結合する、請求項４７または４８に記載の生分解性粒子。
【請求項５０】
前記抗体またはその抗原結合断片は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エボロクマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、インフリキシマブ、モタビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、パリビズマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ−Ｉ−１３１、ウステキヌマブ、またはベドリズマブである、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項５１】
前記２つ以上の抗原エピトープは、機能的相補性決定領域（ＣＤＲ）を欠く治療抗体またはその抗原結合断片の変異体に由来する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項５２】
機能的ＣＤＲを欠く前記抗体またはその抗原結合断片の変異体は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合断片領域（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、または一本鎖抗原結合ドメインである、請求項５１に記載の生分解性粒子
【請求項５３】
前記１つ以上の融合タンパク質のうちの１つは、抗原エピトープ  ＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及びＭＢＰ８３−９９を含む、請求項の１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項５４】
前記１つ以上の融合タンパク質のうちの１つは、抗原エピトープ配列番号１３５０、配列番号４９８６、及び配列番号４９８７を含む、請求項の１〜２７のいずれか一項に記載の生分解性粒子。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれか一項に記載の生分解性粒子を含む、薬学的組成物。
【請求項５６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５５に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項５５または５６に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
有効量の請求項１〜５４のいずれか一項に記載の生分解性粒子を投与することを含む、対象において抗原特異的寛容を誘導する方法。
【請求項５９】
対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、前記対象において抗原特異的寛容を誘導する方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する、方法。
【請求項６０】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に、経口、静脈内、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（すなわち、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に静脈内または皮下投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に静脈内投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に皮下投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記有効量の前記生分解性粒子は、疾患または状態を治療または予防するために対象に投与される、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患または状態は、自己免疫疾患、リソソーム蓄積症、酵素欠損症、炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶反応、及び過免疫応答からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記疾患または状態は、多発性硬化症、１型糖尿病、喘息、食物アレルギー、環境アレルギー、セリアック病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、ムコ多糖蓄積症、ガングリオシドーシス、低アルカリホスファターゼ、コレステロールエステル蓄積症、高尿酸血症、成長ホルモン欠乏症、腎性貧血、血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィルブランド病、ゴーシェ病、ファブリー病、ハーラー病、ポンペ病、ハンター病、マロトー・ラミー病、及び抗原に対する過剰反応をもたらすように対象の抗原によって引き起こされる状態からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患または状態は、多発性硬化症であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号２〜１２９４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患または状態は、セリアック病であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号１２９５〜１７２４；配列番号１７２６〜１７６６；配列番号４９８６〜５１４０；及び配列番号１７２５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患または状態は、１型糖尿病であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号１７６７〜１８４０；配列番号１８４２〜１９６２；配列番号１９６４〜２０２７；配列番号２０２９〜２０７３；配列番号２０７５〜２１１３；配列番号２１１５〜２１９７；配列番号２１９９〜２２４８；配列番号２２５０〜２２５９；配列番号２２６１〜２４２０；配列番号２４２２〜２４８６；配列番号２４８９〜２５０５；ならびに配列番号１８４１、１９６３、２０２８、２０７４、２１１４、２１９８、２２６０、２２４９、２４２１、２４８７、及び２４８８に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患または状態は、関節リウマチであり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号２５０６〜３２６０；配列番号３２６２〜３６９３；及び３２６１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患または状態は、全身性ループスであり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号３６９４〜３８５７；配列番号３８６０〜４５６５；ならびに３８５７、３８５８、及び３８５９に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾患または状態は、グッドパスチャー症候群であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４５６６〜４５７６；配列番号４５７８〜４６１０；配列番号４６１２〜４６１３；及び配列番号５０１８〜５０３９；ならびに４３５７、４５７７、及び４６１１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患または状態は、ぶどう膜炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４６１４〜４６５３からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患または状態は、甲状腺炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４６５４〜４６９４；配列番号４６９６〜４８９４；配列番号４８９６〜４９０１；ならびに４６９５及び４８９５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患または状態は、筋炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９０２〜４９０６からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患または状態は、血管炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９０７〜４９１４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
前記疾患または状態は、膵炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９１５〜４９１７からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７８】
前記疾患または状態は、クローン病であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９１８〜４９４１からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７９】
前記疾患または状態は、潰瘍性大腸炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９４２〜４９５２からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８０】
前記疾患または状態は、乾癬であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９５３〜４９６３からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８１】
前記疾患または状態は、反応性関節炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９６４〜４９７４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８２】
対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、前記対象において抑制性好中球蓄積を減少させるための方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する、方法。
【請求項８３】
前記対象は、癌を有する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記２つ以上の抗原エピトープは、各々、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、ＴＰＴＥ、ＨＰＵ１６、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、シクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＡＧＥファミリーのタンパク質、ＧＡＧＥファミリーのタンパク質、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３）のタンパク質、ＳＡＧＥファミリーのタンパク質、ＸＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＴ９、ＣＴ１０、ＮＹ−ＥＳＯ１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｃｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ＴＲＰ−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、及びＭＵＣ１からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、前記対象において組織再生を増加させる方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する、方法。
【請求項８６】
前記粒子は、大腸炎患者において上皮細胞の再生を増加させる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９１８〜４９４１及び配列番号４９４２〜４９５２からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記粒子は、多発性硬化症患者において再ミエリン形成を増加させる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、ミエリン塩基性タンパク質及び／またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に由来する２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号２〜１２９４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、対象において治療タンパク質に対する免疫応答の発生率及び／または程度を低下するための方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、前記治療タンパク質に由来し、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する、方法。
【請求項９２】
前記対象は、血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィルブランド病、ゴーシェ病、ファブリー病、ハーラー病、ポンペ病、ハンター病、ムコ多糖蓄積症、ガングリオシドーシス、低アルカリホスファターゼ、コレステロールエステル蓄積症、高尿酸血症、成長ホルモン欠乏症、腎性貧血、及びマロトー・ラミー病からなる群から選択される疾患の治療のために酵素補充療法を受けている、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗原エピトープは、Ａｄｖａｔｅ、抗血友病因子、Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａｔｅ、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｒｅｆａｃｔｏ、Ｎｏｖｏ  ＶＩＩａ、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子、エプタコグアルファ、Ｈｅｌｉｘａｔｅ、Ｍｏｎａｎｉｎｅ、凝固第ＩＸ因子、Ｗｉｌａｔｅ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ、アルグルセラーゼ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、イミグルセラーゼ、Ｅｌｅｌｓｏ、タリグルセラーゼアルファ、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ、アガルシダーゼベータ、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、−Ｉ−イズロニダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、酸グルコシダーゼ、エラプレース、イズロン酸−２−スルファターゼ、ＮａｇｌａｚｙｍｅアリールスルファターゼＢ、及びＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗原エピトープは、インターフェロンα、インターフェロンα  ２ａ、インターフェロンβＩｂ、インターフェロンβＩａ、インスリン、ＤＮＡａｓｅ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、Ｅｐｏｇｅｎ、Ｐｒｏｃｒｉｔ（エポテインアルファ）、Ａｒａｎｅｓｐ（第二世代Ｐｒｏｃｒｉｔ）、イントロンＡ（インターフェロンα  ２ｂ）、ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、ＩＬ−Ｉ  ｒａ、ＢＭＰ−７、ＴＮＦ−α  Ｉａ、ｔＰＡ、ＰＤＧＦ、インターフェロンγ  Ｉｂ、ｕＰＡ、ＧＭＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ（インターフェロンβ  Ｉａ）、ソマトトロピン、及びＲｅｂｉｆ  （インターフェロンβ  Ｉａ）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記治療タンパク質は、抗体、抗原結合断片、またはそのＦｃ断片である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記抗体、抗原結合断片、またはそのＦｃ断片は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エボロクマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、インフリキシマブ、モタビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、パリビズマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ−Ｉ−１３１、ウステキヌマブ、またはベドリズマブである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
有効量の請求項１〜５４のいずれか一項に記載の生分解性粒子を投与することを含む、対象において防御免疫応答を増大または誘導させるための方法。
【請求項９８】
対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、前記対象において防御免疫応答を増大または誘導させるための方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する、方法。
【請求項９９】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に、経口、静脈内、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（すなわち、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜投与される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に静脈内または皮下投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に静脈内投与される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に皮下投与される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記有効量の前記生分解性粒子は、疾患または状態を治療または予防するために対象に投与される、請求項９７〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記疾患または状態は、癌または感染性疾患である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記癌は、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、例えば、脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜腫、シュワン腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ系腫瘍からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記２つ以上の抗原エピトープは、各々、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、ＴＰＴＥ、ＨＰＵ１６、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、シクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＡＧＥファミリーのタンパク質、ＧＡＧＥファミリーのタンパク質、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３）のタンパク質、ＳＡＧＥファミリーのタンパク質、ＸＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＴ９、ＣＴ１０、ＮＹ−ＥＳＯ１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｃｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ＴＲＰ−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、及びＭＵＣ１からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一部を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記感染性疾患は、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、またはウイルス感染症である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ウイルス感染症は、ヘルペスウイルス感染症、肝炎ウイルス感染症、ウエストナイルウイルス感染症、フラビウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、パピローマウイルス感染症、パラミクソウイルス感染症、パラインフルエンザウイルス感染症、及び／またはレトロウイルス感染症からなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ウイルス感染症は、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、マイコバクテリア感染症、桿菌感染症、サルモネラ感染症、ビブリオ感染症、スピロヘータ感染症、及びナイセリア感染症からなる群から選択される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、ＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及びＭＢＰ８３−９９からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有し、
前記生分解性粒子は、−３０ｍＶ未満の負のゼータ電位を有する、生分解性粒子。
【請求項１１１】
対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、前記対象において多発性硬化症を治療する方法であって、
前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、ＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及びＭＢＰ８３−９９からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含み、
前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、
前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、
前記生分解性粒子は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有し、
前記生分解性粒子は、−３０ｍＶ未満の負のゼータ電位を有する、方法。
【請求項１１２】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に、経口、静脈内、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（すなわち、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜投与される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に静脈内または皮下投与される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に静脈内投与される、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
前記有効量の前記生分解性粒子は、対象に皮下投与される、請求項１１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容全体が本明細書中に組み込まれる、２０１６年１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／２７４，７１１号の優先権を主張する。
【０００２】
電子的に提出されるテキストファイルの記載
本明細書とともに電子的に提出されるテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＣＯＵＲ−０１３＿０１ＷＯ＿Ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年１月４日、ファイルサイズ：１．１７メガバイト）。
【背景技術】
【０００３】
炎症性疾患及び障害は、異常なまたは別様に無秩序な炎症反応が疾患の病因または重症度に寄与する状態であり、自己免疫疾患、アレルギー、癌、及び感染症を含む様々な病気を包含する。
【０００４】
望ましくない免疫応答に関連する障害における一般的な長期免疫抑制のための従来の臨床ストラテジーは、広く作用する免疫抑制薬、例えば、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６（タクロリムス）、及び副腎皮質ステロイド等のシグナル１ブロッカーの長期投与に基づいている。しかしながら、これらの薬物は、所望の有効性を達成するために高用量を必要とすることが多く、長期使用は、しばしば毒性の副作用をもたらす。さらに、たとえこれらの薬物に耐容性を示す患者であっても、生涯にわたる免疫抑制薬療法が必要になると、重度の副作用、腎毒性、及び代謝障害のリスクを伴う。さらに、一般的に、非特異的免疫抑制は、病的な免疫応答（例えば、自己反応性）、及び癌細胞及び感染病原体に対して誘発される応答のような有益な免疫応答の両方を阻害する。結果として、免疫抑制治療を受けている患者は、種々の癌の発生及び重度の感染症の罹患のリスクが高い。
【０００５】
同様に、癌治療は通常、癌細胞を根絶させるための試みにおいて、幅広い非特異的免疫の活性化をもたらす。しかしながら、これらの幅広い活性化ストラテジーは、健康な非癌性または非悪性の組織の損傷及びさらには死滅をもたらす。したがって、当該技術分野には、抗原特異的な様式で免疫応答を効果的に制御することができる改善された治療薬の必要性が存在する。そのような治療薬は、自己免疫疾患及び癌等の炎症性疾患の標的化治療を可能にし、それによって免疫系の幅広く非特異的な活性化または阻害に関連する負の副作用を最低限に抑える。
【０００６】
抗原またはペプチドの細胞結合を含む、抗原特異的寛容を誘導する方法が開発されてきた。例えば、ある方法において、ペプチド誘導性の、細胞結合による寛容は、無菌状態下で疾患特異的自己抗原及びエチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）結合試薬を用いた末梢血液細胞の収集、分離、及び処理を含む。これらのペプチド結合細胞は、その後、ドナー／患者に再注入される。このプロセスは、費用が高く、熟練した実践者によって厳密に監視された条件下で行われなければならず、この手技を行うことができる施設の数には限りがある。ドナー細胞型としての赤血球の使用により、同種異系ドナーを含むように潜在的な源が拡大され、源細胞の供給が劇的に増加し、輸血が認められている任意の環境を含むように好適な送達施設の数が潜在的に増加するが、源細胞の供給限界、及びドナー細胞に対する免疫応答を最小限に抑えるための血液型一致の必要性を含む著しい欠点が依然として残る。
【０００７】
最近、源細胞の供給に関する要件を排除し、先行手法の組織型要件を回避するペプチド結合粒子が記載された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２−００７６８３１号を参照のこと）。それにもかかわらず、粒子の外側に結合した抗原の使用は、アナフィラキシーの増加と関連しており、重大な化学、製造、及び管理の問題を有する。しかしながら、抗原を粒子内に封入すると、これらの有害事象を回避することができる。驚くべきことに、サイズ及び電荷は、誘発される免疫応答の表現型を制御するように変更することができ、特異的抗原に対して増強された寛容原性応答もしくは制御性応答（例えば、自己免疫との関連において）または増強された防御免疫応答（例えば、癌との関連において）のいずれかを誘導する。
【０００８】
単一のエピトープまたはタンパク質を封入する粒子が作製されているが、病態の多くは複数のタンパク質と関連している。さらには、単一の疾患が、各抗原内にいくつかの免疫原性エピトープを有する場合もある。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）は、少なくともプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を含む、いくつかの異なる自己タンパク質の複数部位に対する炎症反応に関与すると考えられる。しかしながら、主要な標的抗原は確実には分かっていない。その上、標的抗原は患者間で異なり、異なる抗原に対するＴ細胞反応性は、エピトープスプレッディングとして知られるプロセスにおいて経時的に変化する。したがって、特定のＭＳ患者が任意の所与の時点で反応性であり得る全ての可能な抗原エピトープの範囲を確保するために、タンパク質全体の封入が必要となる。しかしながら、これらの大きなタンパク質のサイズ及び物理的特性を考慮すると、封入は極めて困難である。そのため、特定の疾患に関連する複数のエピトープを封入する粒子は、そのような粒子の治療効果を増大させる可能性が高い。しかしながら、溶解性または等電点等の異なるタンパク質の特性は、１つより多くのタンパク質またはエピトープを封入する粒子を製造する複雑性を高め、変動しやすく制御困難な封入効率をもたらすことが多い。
【０００９】
さらに、頭部及び頸部の扁平細胞細胞腫の治療におけるＭＡＧＥ３及びＨＰＶを発現する複数のエピトープ構築物の使用を含む、例えば、腫瘍抗原に対する、抗原特異的免疫活性化を誘導する方法も開発されている（米国特許第８，２６３，５６０号及び米国特許第ＵＳ７，８４２，４８０号を参照のこと］。さらに、リポソームに封入された４つの腫瘍抗原（ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、チロシナーゼ、及びＴＰＴＥ）をコードする個々のＲＮＡベクターを用いるＲＮＡ−リポプレックス（ＲＮＡ−ＬＰＸ）を使用したマルチエピトープシステムも記載されている（Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖ．５３４，ｐｐ．３９６−４０１，２０１６を参照のこと）。これらのＲＮＡ−ＬＰＸの投与は全身のＩＦＮα応答を誘導し、コードされた抗原に対するＴ細胞応答を増幅した。しかしながら、このシステムは、複数の独立した成分を単一粒子に封入することに関連する困難を克服できない。封入効率のばらつきは、一方の成分が他方の成分と比べて不均衡に組み込まれる結果となり得る。さらに、核酸ベースのワクチンの使用は、内因性転写及び翻訳経路の使用を必要とする。これらの要因の各々が、システムの変動性を増加させ、コードされたタンパク質の相対的発現を変化させ、組成物の治療効果を低下させる。そのため、当該技術分野には、炎症性疾患、特に、複数のエピトープまたはタンパク質が発病に関与する疾患の治療に使用される単一の治療用組成物への複数の疾患エピトープの組込みを可能にする組成物及び方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、１つ以上のリンカーによって一緒に結合された２つ以上のエピトープを封入する生分解性粒子を提供する。リンカーは、特異的プロテアーゼによる切断に感受性のアミノ酸配列であり、主要組織適合性（ＭＨＣ）−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩによる抗原提示の制御を可能にし、得られた免疫応答の制御をさらに強化する。単一のタンパク質中にエピトープを結合させることにより、互いに制御された比率でエピトープを送達することができる、複数のエピトープに対する寛容を誘導することができる粒子が可能となる。そのような粒子は、１つより多くのエピトープに関連する炎症性疾患、例えば、自己免疫疾患またはアレルギーを改善するために有用である。免疫調節因子及びアゴニスト、例えば、ＴＬＲアゴニストの組込みもまた、癌の治療におけるそのような粒子の使用に有用である。
【００１１】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約−１００ｍＶ〜約０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、約−５０ｍＶ〜約−４０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、約−７５ｍＶ〜約−５０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、約−５０ｍＶのゼータ電位を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）を含む。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、約５０：５０のポリ乳酸：ポリグリコール酸のコポリマー比でＰＬＧを含む。いくつかの実施形態において、生分解性粒子の表面はカルボキシル化される。さらなる実施形態において、カルボキシル化は、ポリ（エチレン−無水マレイン酸）（ＰＥＭＡ）、ポリアクリル酸、またはコール酸ナトリウムを使用することによって達成される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約０．５μｍ〜約１μｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約０．５μｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、約０．６μｍの直径を有する。
【００１４】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞のサイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の細胞または部位のファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞のサイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の細胞及び部位のファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、フューリンまたはカテプシンプロテアーゼによる切断に感受性である。さらなる実施形態において、ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、フューリンプロテアーゼによる切断に感受性である。さらなる実施形態において、ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、カテプシンプロテアーゼによる切断に感受性である。なおもさらなる実施形態において、ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＷ、またはカテプシンＺのうちの１つ以上である。なおもさらなる実施形態において、ファゴリソソームに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、カテプシンＬである。
【００１６】
さらなる実施形態において、サイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、フューリンまたはカテプシンプロテアーゼによる切断に感受性である。さらなる実施形態において、サイトゾルに位置するプロテアーゼによる特異的切断に感受性の部位は、カテプシンＳによる切断に感受性である。さらなる実施形態において、リンカーのアミノ酸配列は、カテプシンＬによる特異的切断に感受性の部位、及びカテプシンＳによる特異的切断に感受性の部位を含む。なおもさらなる実施形態において、リンカーのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号５１４１）である。
【００１７】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、自己免疫抗原、対象に移植されるべき組織上に発現する抗原、酵素補充療法のための酵素由来の抗原、またはアレルゲン由来の抗原を含む。さらなる実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、各々、タンパク質の少なくとも一部を含み、前記一部は同じタンパク質に由来する。さらなる実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、各々、タンパク質の少なくとも一部を含み、前記一部は異なるタンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、異なるタンパク質は、同じ自己免疫障害、対象に移植されるべき同じ組織、または同じアレルゲンに関連する。
【００１８】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、各々、ミエリン塩基性タンパク質、アセチルコリン受容体、内因性抗原、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、１１型コラーゲン、ヒト軟骨ｇｐ３９、ｆｐ１３０−ＲＡＰＳ、プロテオリピドタンパク質、フィブリラリン、低分子核小体タンパク質、甲状腺刺激因子受容体、ヒストン、糖タンパク質ｇｐ７０、ピルビン酸脱水素酵素ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＰＣＤ−Ｅ２）、毛包抗原、Α−グリアデン、グリアデン、インスリン、プロインスリン、膵島特異的グルコース−６−フォスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、ヒトトロポミオシンアイソフォーム５、バヒアグラス花粉（ＢａＧＰ）、モモアレルゲン  Ｐｒｕ  ｐ３、αＳ−１カエイン牛乳アレルゲン、Ａｐｉｇ１セロリアレルゲン、Ｂｅｒｅ１ブラジルナッツアレルゲン、Ｂ−ラクトグロブリン牛乳アレルゲン、ウシ血清アルブミン、Ｃｏｒ  ａ  １．０４ヘーゼルナッツアレルゲン、ミエリン関連糖タンパク質、アクアポリン、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖、オボアルブミン卵アレルゲン、Ａｄｖａｔｅ、抗血友病因子、Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａｔｅ、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｒｅｆａｃｔｏ、Ｎｏｖｏ  ＶＩＩａ、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子、エプタコグアルファ、Ｈｅｌｉｘａｔｅ、Ｍｏｎａｎｉｎｅ、凝固第ＩＸ因子、Ｗｉｌａｔｅ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ、アルグルセラーゼ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、イミグルセラーゼ、Ｅｌｅｌｓｏ、タリグルセラーゼアルファ、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ、アガルシダーゼベータ、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、−Ｉ−イズロニダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、酸グルコシダーゼ、エラプレース、イズロン酸−２−スルファターゼ、ＮａｇｌａｚｙｍｅアリールスルファターゼＢ、またはＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一部を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号２〜１２９４からなる群から選択される。さらなる実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号１２９５〜１７２４；配列番号１７２６〜１７６６；配列番号４９８６〜５１４０；及び配列番号１７２５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号１７６７〜１８４０；配列番号１８４２〜１９６２；配列番号１９６４〜２０２７；配列番号２０２９〜２０７３；配列番号２０７５〜２１１３；配列番号２１１５〜２１９７；配列番号２１９９〜２２４８；配列番号２２５０〜２２５９；配列番号２２６１〜２４２０；配列番号２４２２〜２４８６；配列番号２４８９〜２５０５、ならびに配列番号１８４１、１９６３、２０２８、２０７４、２１１４、２１９８、２２６０、２２４９、２４２１、２４８７、及び２４８８に由来する不連続エピトープからなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号２５０６〜３２６０；配列番号３２６２〜３６９３；及び３２６１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号３６９４〜３８５７；配列番号３８６０〜４５６５；ならびに３８５７、３８５８、及び３８５９に由来する不連続エピトープからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４５６６〜４５７６；配列番号４５７８〜４６１０；配列番号４６１２〜４６１３；及び配列番号５０１８〜５０３９；ならびに４３５７、４５７７、及び４６１１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４６１４〜４６５３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４６５４〜４６９４；配列番号４６９６〜４８９４；配列番号４８９６〜４９０１；ならびに４６９５及び４８９５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９０２〜４９０６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９０７〜４９１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９１５〜４９１７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９１８〜４９４１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９４２〜４９５２からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９５３〜４９６３からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、配列番号４９６４〜４９７４からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、治療抗体、またはその抗原結合断片、Ｆｃ断片に由来する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合断片領域（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、または一本鎖抗原結合ドメインである。
【００２４】
さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、α４β１インテグリン、炭疽菌、Ｂ−Ｌ（γＳ）、Ｃ５、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５９、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＰＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ１２／２３、ＰＣＳＫ９、ＰＤ１、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ−Ｆタンパク質、ＴＮＦα、またはＶＥＧＦ−Ａに結合する。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エボロクマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、インフリキシマブ、モタビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、パリビズマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ−Ｉ−１３１、ウステキヌマブ、またはベドリズマブである。
【００２５】
本発明のいくつかの態様において、２つ以上の抗原エピトープは、機能的相補性決定領域（ＣＤＲ）を欠く治療抗体またはその抗原結合断片の変異体に由来する。さらなる態様において、機能的ＣＤＲを欠く抗体またはその抗原結合断片の変異体は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合断片領域（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、または一本鎖抗原結合ドメインである。
【００２６】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の融合タンパク質のうちの１つは、抗原エピトープＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及びＭＢＰ８３−９９を含む。さらなる態様において、前記１つ以上の融合タンパク質のうちの１つは、抗原エピトープ配列番号１３５０、配列番号４９８６、及び配列番号４９８７を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの態様は、本明細書に記載の生分解性粒子を含む薬学的組成物を提供する。さらなる態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含む。さらなる態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの態様は、有効量の本明細書に記載の生分解性粒子を投与することを含む、対象において抗原特異的寛容を誘導する方法を提供する。いくつかの態様において、対象において抗原特異的寛容を誘導する方法は、前記対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含み、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、有効量の生分解性粒子は、対象に、経口、静脈内、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（すなわち、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜投与される。さらなる実施形態において、有効量の生分解性粒子は、対象に静脈内または皮下投与される。さらなる実施形態において、有効量の生分解性粒子は、対象に静脈内投与される。さらなる実施形態において、有効量の生分解性粒子は、対象に皮下投与される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、有効量の本明細書に記載の生分解性粒子は、疾患または状態を治療または予防するために対象に投与される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、自己免疫疾患、リソソーム蓄積症、酵素欠損症、炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶反応、及び過免疫応答からなる群から選択される。さらなる実施形態において、疾患または状態は、多発性硬化症、１型糖尿病、喘息、食物アレルギー、環境アレルギー、セリアック病、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、ムコ多糖蓄積症、ガングリオシドーシス、低アルカリホスファターゼ、コレステロールエステル蓄積症、高尿酸血症、成長ホルモン欠乏症、腎性貧血、血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィルブランド病、ゴーシェ病、ファブリー病、ハーラー病、ポンペ病、ハンター病、マロトー・ラミー病、及び抗原に対する過剰反応をもたらすように対象の抗原によって引き起こされる状態からなる群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、多発性硬化症であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号２〜１２９４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、セリアック病であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号１２９５〜１７２４；配列番号１７２６〜１７６６；配列番号４９８６〜５１４０；及び配列番号１７２５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、１型糖尿病であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号１７６７〜１８４０；配列番号１８４２〜１９６２；配列番号１９６４〜２０２７；配列番号２０２９〜２０７３；配列番号２０７５〜２１１３；配列番号２１１５〜２１９７；配列番号２１９９〜２２４８；配列番号２２５０〜２２５９；配列番号２２６１〜２４２０；配列番号２４２２〜２４８６；配列番号２４８９〜２５０５；ならびに配列番号１８４１、１９６３、２０２８、２０７４、２１１４、２１９８、２２６０、２２４９、２４２１、２４８７、及び２４８８に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、関節リウマチであり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号２５０６〜３２６０；配列番号３２６２〜３６９３；及び３２６１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、全身性ループスであり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号３６９４〜３８５７；配列番号３８６０〜４５６５；ならびに３８５７、３８５８、及び３８５９に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、グッドパスチャー症候群であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４５６６〜４５７６；配列番号４５７８〜４６１０；配列番号４６１２〜４６１３；及び配列番号５０１８〜５０３９；ならびに４３５７、４５７７、及び４６１１に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、ぶどう膜炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４６１４〜４６５３からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、甲状腺炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４６５４〜４６９４；配列番号４６９６〜４８９４；配列番号４８９６〜４９０１；ならびに４６９５及び４８９５に由来する不連続エピトープからなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、筋炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９０２〜４９０６からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、血管炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９０７〜４９１４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、または状態は、膵炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９１５〜４９１７からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、クローン病であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９１８〜４９４１からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、潰瘍性大腸炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９４２〜４９５２からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、乾癬であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９５３〜４９６３からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は、反応性関節炎であり、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９６４〜４９７４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４５】
本発明のいくつかの態様は、対象に有効量の本明細書に記載の生分解性粒子を投与することを含む、対象において抑制性好中球蓄積を減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、各々、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、ＴＰＴＥ、ＨＰＵ１６、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、シクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＡＧＥファミリーのタンパク質、ＧＡＧＥファミリーのタンパク質、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＳＡＧＥファミリーのタンパク質、ＸＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＴ９、ＣＴ１０、ＮＹ−ＥＳＯ１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、Ｃｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ＴＲＰ−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、及びＭＵＣ１からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一部を含む。
【００４６】
本発明のいくつかの態様は、対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、対象において組織再生を増加させるための方法を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、粒子は、大腸炎患者において上皮細胞の再生を増加させる。さらなる実施形態において、粒子に封入された１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号４９１８〜４９４１及び配列番号４９４２〜４９５２からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。いくつかの実施形態において、粒子は、多発性硬化症患者において再ミエリン形成を増加させる。さらなる実施形態において、粒子に封入された１つ以上の融合タンパク質の各々は、ミエリン塩基性タンパク質及び／またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に由来する２つ以上の抗原エピトープを含む。さらなる実施形態において、粒子に封入された前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、配列番号２〜１２９４からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含む。
【００４７】
本発明のいくつかの態様は、対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、対象による治療タンパク質に対する免疫応答の発生率及び／または程度を低下するための方法を提供し、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、対象は、血友病、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィルブランド病、ゴーシェ病、ファブリー病、ハーラー病、ポンペ病、ハンター病、ムコ多糖蓄積症、ガングリオシドーシス、低アルカリホスファターゼ、コレステロールエステル蓄積症、高尿酸血症、成長ホルモン欠乏症、腎性貧血、及びマロトー・ラミー病からなる群から選択される疾患の治療のために酵素補充療法を受けている。
【００４８】
さらなる実施形態において、抗原エピトープは、Ａｄｖａｔｅ、抗血友病因子、Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａｔｅ、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｒｅｆａｃｔｏ、Ｎｏｖｏ  ＶＩＩａ、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子、エプタコグアルファ、Ｈｅｌｉｘａｔｅ、Ｍｏｎａｎｉｎｅ、凝固第ＩＸ因子、Ｗｉｌａｔｅ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ、アルグルセラーゼ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、イミグルセラーゼ、Ｅｌｅｌｓｏ、タリグルセラーゼアルファ、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ、アガルシダーゼベータ、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、−Ｉ−イズロニダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、酸グルコシダーゼ、エラプレース、イズロン酸−２−スルファターゼ、ＮａｇｌａｚｙｍｅアリールスルファターゼＢ、及びＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む。さらなる実施形態において、抗原エピトープは、インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンβＩｂ、インターフェロンβＩａ、インスリン、ＤＮＡａｓｅ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、Ｅｐｏｇｅｎ、Ｐｒｏｃｒｉｔ（エポテインアルファ）、Ａｒａｎｅｓｐ（第二世代Ｐｒｏｃｒｉｔ）、イントロンＡ（インターフェロンα−２ｂ）、ＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）、ＩＬ−Ｉ  ｒａ、ＢＭＰ−７、ＴＮＦ−α  Ｉａ、ｔＰＡ、ＰＤＧＦ、インターフェロンγ−Ｉｂ、ｕＰＡ、ＧＭＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ（インターフェロンβ−Ｉａ）、ソマトトロピン、及びＲｅｂｉｆ（インターフェロンβ−Ｉａ）からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、治療タンパク質は、抗体、またはその抗原結合断片、Ｆｃ断片である。さらなる実施形態において、抗体、またはその抗原結合断片、Ｆｃ断片は、抗体またはその抗原結合断片は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エボロクマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、インフリキシマブ、モタビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、パリビズマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ−Ｉ−１３１、ウステキヌマブ、ベドリズマブである。
【００５０】
本発明のいくつかの態様は、有効量の本明細書に記載の生分解性粒子を投与することを含む、対象において防御免疫応答を増大または誘導させるための方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含み、１つ以上の融合タンパク質の各々は、２つ以上の抗原エピトープを含み、２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、対象に、経口、静脈内、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（すなわち、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜投与される。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、対象に静脈内または皮下投与される。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、対象に静脈内投与される。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、対象に皮下投与される。
【００５１】
本発明のいくつかの態様は、有効量の本明細書に記載の生分解性粒子を投与することを含む、対象において防御免疫応答を増大または誘導させるための方法を提供し、生分解性粒子は、疾患または状態を治療または予防するために対象に投与される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、癌または感染性疾患である。いくつかの実施形態において、癌は、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、例えば、脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜腫、シュワン腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、及びリンパ系腫瘍等からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、２つ以上の抗原エピトープは、各々、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、ＴＰＴＥ、ＨＰＵ１６、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、シクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＡＧＥファミリーのタンパク質、ＧＡＧＥファミリーのタンパク質、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＳＡＧＥファミリーのタンパク質、ＸＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＴ９、ＣＴ１０、ＮＹ−ＥＳＯ１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、Ｃｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ＴＲＰ−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、及びＭＵＣ１からなる群から選択されるタンパク質の少なくとも一部を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、感染性疾患は、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、またはウイルス感染症である。いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は、ヘルペスウイルス感染症、肝炎ウイルス感染症、ウエストナイルウイルス感染症、フラビウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、パピローマウイルス感染症、パラミクソウイルス感染症、パラインフルエンザウイルス感染症、及び／またはレトロウイルス感染症からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細菌感染症は、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、マイコバクテリア感染症、桿菌感染症、サルモネラ感染症、ビブリオ感染症、スピロヘータ感染症、及びナイセリア感染症からなる群から選択される。
【００５３】
本発明のいくつかの態様は、封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を提供し、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、ＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及びＭＢＰ８３−９９からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含み、前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、約２００〜ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有し、前記生分解性粒子は、−３０ｍＶ未満の負のゼータ電位を有する。
【００５４】
本発明のいくつかの態様は、有効量の封入された１つ以上の融合タンパク質を含む生分解性粒子を投与することを含む、対象において多発性硬化症を治療する方法を提供し、前記１つ以上の融合タンパク質の各々は、ＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及びＭＢＰ８３−９９からなる群から選択される２つ以上の抗原エピトープを含み、前記２つ以上の抗原エピトープは、リンカーによって分離され、前記リンカーは、特異的切断に感受性のアミノ酸配列を含み、前記生分解性粒子は、約２００ｎｍ〜１０００ｎｍの直径を有し、前記生分解性粒子は、−３０ｍＶ未満の負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、対象に、経口、静脈内、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（すなわち、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜投与される。いくつかの実施形態において、生分解性粒子は、対象に静脈内または皮下投与されるさらなる実施形態において、生分解性粒子は、対象に静脈内投与される。さらなる実施形態において、生分解性粒子は、対象に皮下投与される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】生分解性粒子に封入された例示的な融合タンパク質を示す。
【図２】複数ペプチドの概念を例示する。寛容原性及び対照抗原、アミノ酸配列、及び部試料が示された表である（図２Ａ）。また、１つの封入ペプチド（上）と複数の封入ペプチド（下）との差を強調した図も示される（図２Ｂ）。
【図３】光散乱によって決定された、ＰＬＰ１３９−１５１を封入する粒子のサイズ分布（図３Ａ）及びゼータ電位（図３Ｂ）を含む物理的分析を示す。
【図４】ＤＯ１１．１０トランスジェニックＴ細胞を用いたＰＬＧナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイの結果を示す。図４Ａは、ナノ粒子を単独で用いた細胞の結果を示す。図４Ｂは、ナノ粒子及び１μｇのＯｖａ３２３を用いた細胞の結果を示す。
【図５】トランスジェニックＤＯ１１．１０トランスジェニックＴ細胞を用いたＰＬＧナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイの結果を示す。ナノ粒子単独（図５Ａ）、ナノ粒子のみを含む細胞（図５Ｂ）、ナノ粒子及び１μｇのＯｖａ３２３を含む細胞（図５Ｃ）、ならびにナノ粒子及び１μｇ／ｍＬのαＣＤ２８を含む細胞（図５Ｄ）の結果が示される。
【図６】寛容原性抗原を個別に（ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１、ＭＢＰ８４−１０４、及びＭＯＧ９２−１０６）または一緒に（全寛容原性）封入する粒子バッチの一覧を示す。
【図７】対照ペプチドを個別に（Ｏｖａ３２３−３３９、ＰＬＰ５６−７０、ＶＰ１２３３−２５０、及びＶＰ２７０−８６）または一緒に（全対照）封入する粒子バッチの一覧を示す。
【図８】対照（ＯＶＡ３２３−３３９−ＰＬＧ）または寛容原性（ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧ）ペプチドを封入するＰＬＧ粒子が脾臓の制御性１型制御性Ｔ細胞（ＴＲ１）集団に与える影響を示す。図８Ａは、３日目（左）及び５日目（右）に対照または寛容原性ペプチドを封入するＰＬＧ粒子を注射したマウスにおけるＬＡＧ３＋ＦｏｘＰ３−細胞の割合、及び同様にＩＦＮγ＋ＩＬ−１０＋である抗原特異的ＴＲ１細胞（ＬＡＧ３＋ＦｏｘＰ３−）の割合を示す。図８Ｂは、対照または寛容原性ペプチドを封入するペプチドで処理したマウスにおけるＬＡＧ３＋ＦｏｘＰ３−細胞の数を示す。図８Ｃは、対照または寛容原性ペプチドを封入するペプチドで処理したマウスにおけるＬＡＧ３＋ＦｏｘＰ３−ＩＦＮγ＋ＩＬ−１０＋細胞の数を示す。
【図９】図８の別個ではあるが重複する実験からのデータを示す。このグラフではＴＲ１がＦｏｘＰ３−として確認されていないという点で、これらのデータは図８に示すデータとは異なる。
【図１０】ナイーブ５Ｂ６（ＰＬＰ１３９−１５１ＴＣＲトランスジェニックマウス）リンパ球をナイーブＳＪＬマウスに移入し、ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧ粒子または対照ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ粒子のいずれかで処理した後の、脾臓の制御性Ｔ細胞集団のフローサイトメトリーの結果を示す。全ての結果は、ＣＤ９０．１／Ｔｈｙ１．１（ＰＬＰ１３９−１５１  ＴＣＲ＋）集団にゲートをかけたものである。
【図１１】５Ｂ６ドナーからのＣＤ４＋細胞をナイーブＳＪＬマウスに移入し、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧ粒子または対照ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ粒子のいずれかで処理した後のＴ細胞集団を示す（ｄ３及びｄ５）。ＥＡＥを別のコホートで誘導した（ＥＡＥ後５日目及びＥＡＥ後１７日目）。抗原特異的Ｔ細胞（図１１Ａ）、増殖する抗原特異的Ｔ細胞（図１１Ｂ）、抗原特異的制御性Ｔ細胞（図１１Ｃ）、及び非抗原特異的制御性Ｔ細胞（図１１Ｄ）の数に関するフローサイトメトリー分析が示される。別段の指示のない限り、全ての結果はＣＤ９０．１／Ｔｈｙ１．１（ＰＬＰ１３９−１５１  ＴＣＲ＋）集団にゲートをかけたものである（図１１Ｄ）。
【図１２】ＤＯ１１（ＯＶＡ３２３−３３９ＴＣＲトランスジェニックマウス）ドナーからのＣＤ４＋細胞をナイーブＢａｌｂ／ｃ  ＲＡＧ  ＫＯマウスに移入し、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ粒子または対照ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧ粒子のいずれかで処理した後の抗原特異的制御性Ｔ細胞の増加を示す。制御性ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞集団の割合（図１２Ａ）及び数（図１２Ｂ）のフローサイトメトリー分析が示される。全ての結果は、ＤＯ１１  ＴＣＲ＋集団にゲートをかけたものである。
【図１３】ＤＯ１１（ＯＶＡ３２３−３３９ＴＣＲトランスジェニックマウス）ドナーからのＣＤ４＋細胞をナイーブＢａｌｂ／ｃ  ＲＡＧ  ＫＯマウスに移入し、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ粒子または対照ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧ粒子のいずれかで処理した後のＩＦＮγを産生する抗原特異的制御性Ｔ細胞を示すＩＦＮγを産生する抗原特異的制御性Ｔ細胞の割合（図１３Ａ）及び数（図１３Ｂ）のフローサイトメトリー分析が示される。
【図１４】ＤＯ１１（ＯＶＡ３２３−３３９ＴＣＲトランスジェニックマウス）ドナーからのＣＤ４＋細胞をナイーブＢａｌｂ／ｃ  ＲＡＧ  ＫＯマウスに移入し、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ粒子または対照ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧ粒子のいずれかで処理した後のＴＲ１集団を示す。割合（図１４Ａ）及び数（図１４Ｂ）のフローサイトメトリー分析が示される。
【図１５】ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ粒子または対照ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧ粒子の注入後の抗原特異的制御性Ｔ細胞集団の増殖を示す。Ｋｉ６７＋  ＤＯ１１  ＴＣＲ＋  ＣＤ４＋細胞（図１５Ａ）、ＤＯ１１  ＴＣＲ＋  ＣＤ４＋細胞にゲートをかけたＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（図１５Ｂ）、及びＫｉ６７＋ＣＤ４９ｂ＋ＬＡＧ３＋細胞（図１５Ｃ、別の実験から、ＦｏｘＰ３−として確認されていない）のフローサイトメトリーの結果が示される。
【図１６】カテプシン特異的切断部位によって結合されたＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１７】ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチド及びＤＯ１１（図１７Ａ）または５Ｂ６（図１７Ｂ）細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイの結果を示す。
【図１８】ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドの封入における３回の試行の特徴付けを示す。
【図１９】ＰＬＧ（ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３）粒子、ＰＬＧ（Ｏｖａ３２３）粒子、またはＰＬＧ（ＰＬＰ１３９）粒子で処理したＤＯ１１．１０トランスジェニックＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイの結果を示す。ナノ粒子単独（図１９Ａ）、ナノ粒子及び１μｇのＯｖａ３２３（図１９Ｂ）、ならびにナノ粒子、１μｇのＯｖａ３２３、及び１μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（図１９Ｃ）で処理した細胞の結果が示される。
【図２０】ＰＬＧ（ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３）粒子、ＰＬＧ（Ｏｖａ３２３）粒子、またはＰＬＧ（ＰＬＰ１３９）粒子で処理した５Ｂ６トランスジェニックＴ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイの結果を示す。ナノ粒子単独（図２０Ａ）、ナノ粒子及び１μｇのＰＬＰ１３９（図２０Ｂ）、ならびにナノ粒子、１μｇのＰＬＰ１３９、及び１μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（図２０Ｃ）で処理した細胞の結果が示される。
【図２１】ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドを封入する粒子バッチの一覧を示す表である。
【図２２】疾患スコア（図２２Ａ）及び平均耳腫脹（図２２Ｂ）によって示される、ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドの投与後のＥＡＥの誘導を示す。
【図２３】４エピトープ融合ペプチド；ＥＡＥ−１結合エピトープ、ＰＬＰ１３９：ＰＬＰ１７８：ＭＯＧ９２：ＭＢＰ（図２３Ａ）、及び対照結合エピトープ、ＯＶＡ３２３：ＰＬＰ５６：ＶＰ１−２３３：ＶＰ２−７０（図２３Ｂ）のアミノ酸配列を示す。
【図２４】寛容原性抗原融合ペプチド（ＥＡＥ−１結合エピトープ）を封入するナノ粒子の特徴付けを示す。
【図２５】寛容原性融合ペプチド（ＥＡＥ−１結合エピトープ）または陰性対照融合ペプチドを封入する粒子バッチの一覧を示す表である。
【図２６】単一のＥＡＥ特異的エピトープ及び結合したＥＡＥ特異的エピトープの封入効率を示す。
【図２７】封入された対照結合エピトープ（対照結合エピトープ寛容）、ＯＶＡ、及びＰＬＰ１３９と比較した、封入されたＥＡＥ−１結合エピトープ（ＥＡＥ−１寛容処理）がＥＡＥ疾患スコアに与える影響を示す。
【図２８】ＦＡＬＫペプチドがＥＡＥを誘導すること（図２８Ａ）及びＴ細胞増殖を誘導すること（図２８Ｂ）を示す。
【図２９】ネオエピトープ、免疫調節因子、及びＴＬＲアゴニストを含む潜在的な融合ペプチドを示す。
【図３０】結合腫瘍エピトープタンパク質の開発、その後のナノ粒子封入、及び患者への投与プロトコルの概要を示す。
【図３１】抗ＰＤ１を用いてまたは用いずに封入されたＮｙＥｓｏ１で末梢血単球を処理した機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの予想される結果を示す。Ｔ細胞増殖（図３１Ａ）、ＩＦＮγ産生（図３１Ｂ）、及びＩＦＮα産生（図３１Ｃ）に与える影響についてのアッセイが示される。
【図３２】黒色腫のマウスモデルにおいて、抗ＰＤ１を用いてまたは用いずに封入されたＮｙＥｓｏ１で処理したマウスの予想される生存曲線を示す。
【図３３】封入された、結合ＮＹ−ＥＳＯ−１：Ｍａｇｅ−Ａ３：ＴＰＴＥ：チロシナーゼ融合タンパクで処理したＰＢＭＣの例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを示す。Ｔ細胞増殖アッセイ（図３３Ａ）及びＩＦＮγ産生（図３３Ｂ）の予想される結果を示す。
【図３４】多数の疾患及び障害に見られるエピトープを含む潜在的な融合ペプチドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明の発明者は、特異的プロテアーゼ部位を有する切断可能なリンカーによって接続された複数のペプチドエピトープからなる融合タンパク質を封入するナノ粒子が、抗原特異的免疫寛容を誘導することができ、したがって、多数の疾患モデルにおいて免疫応答を制御することを発見した。一実施形態において、そのような粒子は、融合タンパク質のペプチドエピトープのうちの１つ以上に対する免疫応答を低減することができ、１つより多くの抗原エピトープに関連する過剰な炎症性免疫応答によって特徴付けられる疾患または状態、例えば、自己免疫疾患またはアレルギーの治療において特に有用である。別の実施形態において、そのような粒子は、融合タンパク質のペプチドエピトープのうちの１つ以上に対する防御免疫応答を誘導することが可能であり、免疫原性応答の非存在によって特徴付けられる疾患または状態、例えば、癌の治療において特に有用である。
【００５７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示のない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「及び／または」は、文脈上別段の指示のない限り、「及び」または「または」のいずれかを意味するために本開示において使用される。
【００５９】
本明細書を通して、文脈上別段の要求のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語またはその変形例、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、記載される要素または整数または要素もしくは整数の群の包含を意味するが、他のあらゆる要素または整数または要素もしくは整数の群の排除を意味するものではないことを理解されたい。
【００６０】
本出願に記載される及び／または後に列挙される全ての刊行物及び特許は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００６１】
融合タンパク質
本発明の特定の実施形態は、複数の抗原またはエピトープを封入する粒子が、切断可能なリンカーによって融合タンパク質中で抗原が一緒に結合される場合、これらの抗原の各々に対して寛容を誘導することができるという新規発見に少なくとも一部基づいている。いくつかの実施形態において、リンカーは、特異的プロテアーゼ部位を含有するアミノ酸配列であり、クラスＩ経路またはクラスＩＩ経路によるプロセシングを可能にするように設計することができる。そのような実施形態において、同じ融合タンパク質上で結合した粒子に封入されたエピトープは、クラスＩ経路及びクラスＩＩ経路の両方によってプロセシングされ得る。したがって、クラスＩ経路によってプロセシングされるエピトープは、封入された融合タンパク質中でクラスＩＩ経路によってプロセシングされるエピトープと結合され得る。
【００６２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は生分解性粒子によって封入される。「融合タンパク質」、「融合ペプチド」、「融合ポリペプチド」、及び「キメラペプチド」は、本明細書において交換可能に使用され、本来は異なるタンパク質または同じタンパク質の異なる部分をコードする２つ以上のヌクレオチド配列の結合によって作製されるポリペプチド鎖を指す。本明細書に記載の融合タンパク質への組込みに好適な抗原の断片は、本発明の所望の抗原特異的寛容機能を生じる機能を保持する全長ペプチドの任意の断片を含む。「断片」は、タンパク質の一部を指す。この一部は、好ましくは、タンパク質の参照配列の全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含有する。
【００６３】
融合タンパク質は、当該技術分野で理解される種々の手段（例えば、遺伝子融合、化学的結合等）によって作製され得る。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的にはＣ末端とＮ末端で結合するが、それらはまた、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端で結合してもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得る。２つのタンパク質は、直接的に、またはアミノ酸リンカーを介してのいずれかで融合され得る。ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造及び三次構造に折り畳むことを確実にするのに十分な距離だけ第１のポリペプチド成分と第２のポリペプチドとを分離するために用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６（１９８５）；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２（１９８６）；米国特許第４，９３５，２３３号、及び米国特許第４，７５１，１８０号に記載されるものを含み、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。リンカー配列は、一般的に、１〜約５０アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、第１及び第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体障害を防止するために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は必要ではなく、かつ／または用いられない。
【００６４】
好ましい実施形態において、個々の抗原またはエピトープは、細胞内プロテアーゼ（例えば、細胞のファゴリソソームまたはサイトゾルに存在するプロテアーゼ）に特異的なプロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸リンカーを介して結合する。いくつかの実施形態において、個々の抗原またはエピトープは、同じプロテアーゼ切断部位を含むリンカーによって結合される。いくつかの実施形態において、個々の抗原またはエピトープは、異なるプロテアーゼ切断部位を含むリンカーによって結合される。さらなる実施形態において、融合タンパク質中のリンカー配列のうちの１つ以上は、１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含み得る。
【００６５】
ファゴリソソームまたはサイトゾルに位置するプロテアーゼによる融合タンパク質の切断は、クラスＩまたはクラスＩＩ抗原の提示のために切断産物（例えば、個々のペプチドエピトープ）を誘導する。クラスＩ抗原の提示は、サイトゾルプロテアーゼ及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）−Ｉによって媒介され、細胞内タンパク質の提示を促進する。そのため、ＭＨＣＩ分子は、典型的には、細胞内感染の結果として、自己抗原または異種タンパク質として提示する。ＭＨＣＩに関連して提示される抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され、典型的には細胞傷害性応答を引き起こす。クラスＩＩ抗原の提示は、ファゴリソソームに存在するプロテアーゼによって分解される細胞外抗原の食作用によって媒介される。細胞外抗原は、ＭＨＣＩＩに関連して提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。この認識は、抗原の性質、抗原提示細胞の活性化状態、及び局所的なサイトカイン微小環境に依存して、複数の下流の免疫応答、例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、または制御性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる。
【００６６】
そのため、特異的切断部位の導入は、下流の免疫応答表現型の制御を可能にする。例えば、自己免疫に関連して、融合タンパク質に存在するエピトープがＭＨＣＩＩに存在する可能性を増加させ、制御応答または寛容原性応答を引き起こすために、ファゴリソソームに存在するプロテアーゼのための切断部位を導入することが望ましい場合がある。代替として、癌治療薬に関連して、融合タンパク質に存在するエピトープがＭＨＣＩに存在する可能性を増加させ、癌細胞を死滅させる細胞傷害性応答をもたらすために、サイトゾルに存在するプロテアーゼのための切断部位を導入することが望ましい場合がある。
【００６７】
切断部位は、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ（例えば、カテプシン）、メタロプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及び他等の任意の種類のプロテアーゼに特異的であり得る。いくつかの実施形態において、ファゴリソソームに位置するカテプシン及び／またはフューリンプロテアーゼに特異的である。いくつかの実施形態において、切断部位は、ファゴリソソームに位置するカテプシンプロテアーゼのいずれかうちの１つ以上、例えば、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＷ、またはカテプシンＺに特異的である。特定の実施形態において、切断部位は、カテプシンＬに特異的である。いくつかの実施形態において、切断部位は、サイトゾルに位置するカテプシン及び／またはフューリンプロテアーゼに特異的である。特定の実施形態において、切断部位は、カテプシンＳに特異的である。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、カテプシンＳ及びカテプシンＬに特異的な切断部位を含む。特定の実施形態において、リンカー配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号５１４１）である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「抗原」または「抗原部分」は、任意の部分、例えば、宿主の免疫系によって認識されるペプチドを指す。抗原部分の例として、限定されないが、自己抗原、酵素、及び／または細菌性もしくはウイルス性タンパク質、ペプチド、薬物、または成分が挙げられる。抗原は、１つ以上のエピトープを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「エピトープ」は、抗体またはＴ細胞受容体によって認識される抗原の一部を指す。全てのエピトープが線形エピトープではなく、エピトープは、不連続な、立体構造的なエピトープであってもよい。自己免疫疾患もしくは炎症性疾患及び／または障害に関連する不連続なエピトープの数は未知である。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１５／０２３７９６号、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２８３２１８号、及び米国特許公開第ＵＳ２０１５−０１９０４８５号によって以前に記載されたエピトープまたは抗原を含み、それらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される配列識別子は、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０１９０４８５号の配列識別子とそれらの番号が一致している。
【００６９】
本発明のある特定の実施形態において、抗原またはエピトープは、治療を受ける対象に発現されるのと同じ形態ではないが、その断片または誘導体である。本発明の誘導性抗原は、適切な特異性の分子に基づいているが、断片化、残基置換、標識、コンジュゲーション、及び／または他の機能特性を有するペプチドとの融合によって適合されるペプチドを含む。適合は、限定されないが、毒性もしくは免疫原性等の任意の望ましくない特性の排除；または粘膜結合、粘膜浸透、もしくは免疫応答の寛容原性アームの刺激等の任意の望ましい特性を増強することを含む、任意の望ましい目的のために行われ得る。インスリンペプチド、コラーゲンペプチド、及びミエリン塩基性タンパク質ペプチド等の用語は、本明細書で使用される場合、無傷なサブユニットのみでなく、アロタイプ及び合成の変異体、断片、融合ペプチド、コンジュゲート、ならびに類似体であるそれぞれの分子の少なくとも１０個、また好ましくは２０個の連続的なアミノ酸と相同（アミノ酸レベルで好ましくは、７０％同一、より好ましくは８０％同一、またさらにより好ましくは９０％同一）な領域を含有する他の誘導体も指し、誘導体の相同領域は、それぞれの親分子と、標的抗原に対する寛容を誘導する能力を共有する。
【００７０】
誘導性抗原の寛容原性領域は、例えば、抗体応答及び／またはＴ細胞応答の刺激のための、免疫優勢エピトープとはしばしば異なることを認識されたい。寛容原性領域は、一般的に、Ｔ細胞に関与する特定の細胞相互作用において提示され得る領域である。寛容原性領域は、存在してもよく、無傷な抗原が提示されると寛容を誘導することができる。天然抗原のプロセシング及び提示は、通常、寛容を引き起こさないという点において、いくつかの抗原は、潜在性の寛容原性領域を含有する。潜在性抗原及びそれらの同定の詳細については、国際特許公開第ＷＯ９４／２７６３４号に見出される。
【００７１】
本発明のある特定の実施形態において、融合タンパク質は、２つ、３つ、またはそれより多くの複数の抗原またはエピトープからなる。複数の標的抗原が存在する場合にこれらの実施形態を実行することが望ましいかもしれない。
【００７２】
抗原は、分子の性質に応じて、当該技術分野で既知の多数の技術によって調製することができる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び炭水化物抗原は、それらが豊富に含まれた処理される種の細胞から単離することができる。短ペプチドは、アミノ酸合成によって都合よく調製される。既知の配列のより長いタンパク質は、コード配列を合成するか、または天然の源もしくはベクターからコード配列をＰＣＲ増幅し、次いで、好適な細菌性または真核性宿主細胞中でコード配列を発現させることよって調製することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、抗原またはエピトープは、治療抗体、またはその抗原結合断片、Ｆｃ断片に由来する。いくつかの実施形態において、抗原は、機能的相補性決定領域（ＣＤＲ）を欠く変異治療抗体またはその抗原結合断片に由来する。そのような実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗原結合断片領域（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、または一本鎖抗原結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、治療抗体またはその抗原結合断片は、α４β１インテグリン、炭疽菌、Ｂ−Ｌ（γＳ）、Ｃ５、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５９、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＰＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＨＥＲ２、ＩｇＥ、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ１２／２３、ＰＣＳＫ９、ＰＤ１、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ−Ｆタンパク質、ＴＮＦα、またはＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、抗原は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴール、ダクリズマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エボロクマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イピリムマブ、インフリキシマブ、モタビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、パリビズマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ−Ｉ−１３１、ウステキヌマブ、またはベドリズマブ等の治療抗体に由来する。
【００７５】
本発明のある特定の実施形態において、組み合せは、細胞または組織から得られた抗原の複雑な混合物を含み、そのうちの１つ以上が誘導性抗原の役割を果たす。抗原は、無傷であるか、またはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、もしくはアルコール等の固定液で処理されているかのいずれかの、全細胞の形態であってもよい。抗原は、細胞もしくは組織の界面活性剤による可溶化または機械的破裂の後に清澄化することによって作製される細胞可溶化物の形態であってもよい。抗原はまた、細胞成分分画、特に、分画遠心法等の技術により形質膜を濃縮した後、任意選択的に界面活性剤による可溶化及び透析によって得ることもできる。可溶化した膜タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー等の他の分離技術もまた好適である。
【００７６】
一実施形態において、抗原ペプチドまたはタンパク質は、自己抗原、同種抗原、ネオ抗原、癌抗原、または移植抗原である。さらに別の特定の実施形態において、自己抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、コラーゲンまたはその断片、ＤＮＡ、核及び核タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、及び膵β細胞タンパク質からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つ以上の融合タンパク質は、抗原エピトープＭＯＧ１−２０、ＭＢＰ１３−３２、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１４６−１７０、ＰＬＰ１３９−１５４、ＭＢＰ１１１−１２９、及び／またはＭＢＰ８３−９９を含む。いくつかの実施形態において、抗原ペプチドまたはタンパク質は、グリアジンまたはグリアデンエピトープである。いくつかの実施形態において、抗原は、配列番号１２９５〜１７２４、配列番号１７２６〜１７６６、及び配列番号４９８６〜５１４０からなる群から選択される１つ以上の抗原である。
【００７７】
本発明は、寛容が所望される抗原を投与することによる、自己免疫疾患の治療のための自己抗原に対する寛容の誘導を提供する。例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する自己抗体が多発性硬化症を有する患者において観察されており、したがって、多発性硬化症を治療及び予防するために、本発明の組成物を用いて送達されるＭＢＰ抗原ペプチドまたはタンパク質が、本発明において使用され得る。
【００７８】
別の非限定的な例として、二卵性双生児からの移植の候補である対象は、移植される抗原がレシピエントにとって外来性であるため、移植された細胞、組織または臓器の拒絶反応に苦しむ可能性がある。意図される移植片に対するレシピエント対象の事前の寛容が、後の拒絶反応を抑制または低減する。長期の抗拒絶反応療法の削減または排除は、本発明の実施によって達成され得る。別の例において、多くの自己免疫疾患が、内因性または自己抗原に対する細胞の免疫応答によって特徴付けられる。内因性抗原に対する免疫系の寛容は、疾患の制御に望ましい。
【００７９】
さらなる例において、仕事中に遭遇し得るような産業汚染物質または化学物質に対する対象の感作は、免疫応答の危険を提示する。特に、対象の内因性タンパク質と反応する化学物質／汚染物質の形態の化学物質／汚染物質に対して対象の免疫系を事前に寛容にすることは、後の職業的な免疫応答の発生の予防に望ましい場合がある。
【００８０】
アレルゲンは、それに対する免疫応答の寛容も望ましい他の抗原である。一実施形態において、抗原は、グリアデンまたはグリアデンエピトープである。さらなる実施形態において、抗原は、Α−グリアデンまたはΑ−グリアデンエピトープである。いくつかの実施形態において、抗原は、グリアデンまたはグリアデンエピトープの混合物である。さらなる実施形態において、グリアデンまたはグリアデンエピトープは、配列番号４９８３〜４９８５のうちの１つ以上を含む。
【００８１】
特に、病原性自己抗原が不明である疾患であっても、解剖学的に近接して存在する抗原を用いてバイスタンダー抑制を誘導することができる。例えば、コラーゲンに対する自己抗体が関節リウマチにおいて観察されており、したがって、コラーゲンをコードする遺伝子が、関節リウマチを治療するために抗原を発現する遺伝子モジュールとして用いられてもよい（例えば、Ｃｈｏｙ（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  １：５８−６２を参照のこと）。さらに、β細胞自己抗原に対する寛容は、１型糖尿病の発症を予防するために用いられ得る（例えば、Ｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ（２００１）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：１３１−１６１を参照のこと）。
【００８２】
別の例として、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に対する自己抗体が、自己免疫性脳脊髄炎において、また多くの他のＣＮＳ疾患及び多発性硬化症において観察されている（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｌｉａ  ３６：２２−３４を参照のこと）。したがって、本発明におけるＭＯＧ抗原を発現する構築物の使用は、多発性硬化症及び関連する中枢神経系の自己免疫障害の治療を可能にする。
【００８３】
自己免疫疾患の治療に使用される候補自己抗原のさらなる他の例として、ミエリン塩基性タンパク質、アセチルコリン受容体、内因性抗原、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、膵β細胞抗原、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）、１１型コラーゲン、ヒト軟骨ｇｐ３９、ｆｐ１３０−ＲＡＰＳ、プロテオリピドタンパク質、フィブリラリン、低分子核小体タンパク質、甲状腺刺激因子受容体、ヒストン、糖タンパク質ｇｐ７０、ピルビン酸脱水素酵素ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＰＣＤ−Ｅ２）、毛包抗原、Α−グリアデン、グリアデン、インスリン、プロインスリン、膵島特異的グルコース−６−フォスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、ヒトトロポミオシンアイソフォーム５、バヒアグラス花粉（ＢａＧＰ）、モモアレルゲンＰｒｕ  ｐ３、αＳ−１カエイン牛乳アレルゲン、Ａｐｉｇ１セロリアレルゲン、Ｂｅｒｅ１ブラジルナッツアレルゲン、Ｂ−ラクトグロブリン牛乳アレルゲン、ウシ血清アルブミン、Ｃｏｒ  ａ  １．０４ヘーゼルナッツアレルゲン、ミエリン関連糖タンパク質、アクアポリン、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖、オボアルブミン卵アレルゲン、Ａｄｖａｔｅ、抗血友病因子、Ｋｏｇｅｎａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａｔｅ、遺伝子組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、Ｒｅｆａｃｔｏ、Ｎｏｖｏ  ＶＩＩａ、遺伝子組換え第ＶＩＩ因子、エプタコグアルファ、Ｈｅｌｉｘａｔｅ、Ｍｏｎａｎｉｎｅ、凝固第ＩＸ因子、Ｗｉｌａｔｅ、Ｃｅｒｅｄａｓｅ、アルグルセラーゼ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ、イミグルセラーゼ、Ｅｌｅｌｓｏ、タリグルセラーゼアルファ、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ、アガルシダーゼベータ、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ、−Ｉ−イズロニダーゼ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、酸グルコシダーゼ、エラプレース、イズロン酸−２−スルファターゼ、ＮａｇｌａｚｙｍｅアリールスルファターゼＢ、またはＮ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ膵β細胞抗原、インスリン、及びインスリン依存性糖尿病を治療するためのＧＡＤ；１１型コラーゲン、ヒト軟骨３９（ＨＣｇｐ３９）、及び関節リウマチの治療に使用されるｇｐｌ３０−ＲＡＰＳ；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、及び多発性硬化症を治療するためのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ、上記参照）；フィブリラリン、及び強皮症を治療するための低分子核小体タンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）；グレーブス病の治療に使用される甲状腺刺激因子受容体（ＴＳＨ−Ｒ）；核内抗原、ヒストン、糖タンパク質ｇｐ７０、及び全身性エリテマトーデスの治療に使用されるリボソームタンパク質；原発性胆汁性肝硬変の治療に使用されるピルビン酸脱水素酵素ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ＰＣＤ−Ｅ２）；円形脱毛症の治療に使用される毛包抗原；ならびに潰瘍性大腸炎の治療に使用されるヒトトロポミオシンアイソフォーム５（ｈＴＭ５）が挙げられる。いくつかの実施形態において、抗原は、配列番号２〜１２９４から選択される。
【００８４】
単離された細胞を用いてまたは動物モデルにおいて実験を行うことによって寛容を促進する能力のために組み合わせをヒト化することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明の寛容誘導性組成物は、（例えば、融合タンパク質に加えて）アポトーシスシグナル伝達分子を含有する。いくつかの実施形態において、アポトーシスシグナル伝達分子は、担体の表面と結合及び／または会合する。いくつかの実施形態において、アポトーシスシグナル分子は、担体が、宿主の抗原提示細胞、例えば、宿主の細網内皮系細胞によって、アポトーシス小体として認識されることを可能にする：これにより、関連ペプチドエピトープを寛容を誘導する様式で提示することが可能となる。理論に束縛されるものではないが、これは、免疫細胞刺激に関与する分子、例えば、ＭＨＣクラスＩ／ＩＩ、及び共刺激分子の上方制御を防止すると推定される。これらのアポトーシスシグナル伝達分子は、食作用マーカーとしての役割も果たし得る。例えば、本発明に好適なアポトーシスシグナル伝達分子は、米国特許第８，１９８，０２０号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明に好適な分子は、食細胞を標的とする分子を含み、それらはマクロファージ、樹状細胞、単球、及び好中球を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、アポトーシスシグナル伝達分子として好適な分子は、関連ペプチドの寛容を増強するように作用する。さらに、アポトーシスシグナル伝達分子に結合した担体は、アポトーシス細胞認識においてＣｌｑによって結合され得る（Ｐａｉｄａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：２３２９−２３３８；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、アポトーシスシグナル伝達分子として有用であり得る分子は、ラパマイシン、ホスファチジルセリン、アネキシン−１、アネキシン−５、乳脂肪球−ＥＧＦ−因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）、またはトロンボスポンジンのファミリー（例えば、トロンボスポンジン−（ＴＳＰ−１））を含む。本発明とともにアポトーシスシグナル伝達分子として使用するのに好適な種々の分子は、例えば、米国特許公開第２０１２／００７６８３１号に論じられており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、１つ以上の免疫アゴニストを含む。免疫アゴニストは、本明細書で使用される場合、特定の免疫シグナル伝達経路、特に免疫原性シグナル伝達経路を活性化する分子を指す。いくつかの実施形態において、免役アゴニストは、パターン認識受容体、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、ＮＯＤ様受容体、ＲＩＧ様受容体、またはその他を活性化する。特定の実施形態において、アゴニストは、ＴＬＲアゴニスト、例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、またはＴＬＲ１０アゴニストである。そのような実施形態において、免疫アゴニストは、融合タンパク質内に含まれるエピトープのうちの１つ以上に対する免疫原性応答の生成を促進する。そのような実施形態は、ワクチン及び癌免疫療法に関連して特に有用である。
【００８８】
例として、限定的であることを意図するものではないが、仮説上の例示的融合タンパク質が、図１に示され、多発性硬化症（ＭＳ）に関連するエピトープＭＯＧ１−２０、ＭＯＧ３５−５５、ＭＢＰ１３−３２、ＭＢＰ８３−９９、ＭＢＰ１１１−１２９、ＭＢＰ１４６−１７０、及びＰＬＰ１３９−１５４を含有する。融合タンパク質は、これら７つのポリペプチドエピトープを特異的リンカーを用いて一緒に結合させることによって構築される。これらのリンカーは、特異的プロテアーゼによる切断を受けやすい反復アミノ酸配列である。このタンパク質は、一般的な等電点（ＰＩ）及び溶解性を有する。粒子に封入されると、粒子は、互いに等しい比率でポリペプチドエピトープを封入する。
【００８９】
生分解性粒子
ある特定の実施形態は、特異的プロテアーゼ部位を含むアミノ酸リンカー配列によって接続された２つ以上のペプチド、抗原、またはエピトープを含む融合タンパク質を封入する生分解性粒子を対象とする。特定の実施形態は、これらの粒子が、融合タンパク質の結合したペプチド、抗原、またはエピトープのうちのいくつかまたは全てに対する寛容を誘導するのに驚くほど効果的であることを企図する。ある特定の実施形態は、これらの生分解性粒子の製造が、融合タンパク質中の結合していない１つより多くのペプチド、抗原、及び／またはエピトープを封入する生分解性粒子と比較して改善されることを企図する。
【００９０】
本明細書で使用される「粒子」は、組織由来ではない任意の組成物を指し、それは、球体もしくは球状の実態、ビーズ、またはリポソームであり得る。用語「粒子」、用語「免疫修飾粒子」、用語「担体粒子」、及び用語「ビーズ」は、文脈に応じて交換可能に使用されてもよい。さらに、「粒子」という用語は、ビーズ及び球体を包含するために使用されてもよい。粒子は、任意の粒子形状または立体構造を有してもよい。しかしながら、いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏで凝集しにくい粒子を使用することが好ましい。これらの実施形態内の粒子の例は、球形状を有するものである。
【００９１】
本明細書で使用される「負電荷を帯びた粒子」は、ゼロ未満の正味表面電荷を有するように修飾された粒子を指す。
【００９２】
「カルボキシル化粒子」または「カルボキシル化ビーズ」または「カルボキシル化球体」は、その表面上にカルボキシル基を含有するように修飾された任意の粒子を含む。いくつかの実施形態において、カルボキシル基の付加は、例えば、ＭＡＲＣＯ等のスカベンジャー受容体との相互作用を通して、循環からの粒子の貪食細胞／単球による取り込みを増強する。粒子のカルボキシル化は、限定されないが、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−無水マレイン酸）（ＰＥＭＡ）、ポリ（ビニルアルコール）及びコール酸ナトリウムを含む、カルボキシル基を付加する任意の化合物を用いて達成することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、抗原ペプチド分子は、コンジュゲート分子及び／またはリンカー基によって担体粒子（例えば、免疫修飾粒子）に結合される。いくつかの実施形態において、抗原ペプチド及び／またはアポトーシスシグナル分子の担体粒子（例えば、ＰＬＧ粒子）への結合は、１つ以上の共有結合的及び／または非共有結合的な相互作用を含む。いくつかの実施形態において、抗原ペプチドは、負のゼータ電位を有する担体粒子の表面に付着する。いくつかの実施形態において、抗原ペプチドは、負のゼータ電位を有する担体粒子内に封入される。いくつかの実施形態において、抗原ペプチドは、抗原にコンジュゲートされた粒子を生成するように担体粒子にコンジュゲートまたは結合される（参照によりその内容全体が本明細書中に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８４２３号を参照のこと）。
【００９４】
一実施形態において、免疫修飾粒子と接触する緩衝液は塩基性ｐＨを有し得る。塩基性溶液に好適な塩基性ｐＨは、７．１、７．５、８．０、８．５、９．５、１０．０  １０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、及び１３．５を含む。また緩衝液は、任意の好適な塩基及びそのコンジュゲートで作られてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、緩衝液は、限定されないが、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素リチウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、またはリン酸二水素リチウム、及びそれらのコンジュゲートを含んでもよい。
【００９５】
一実施形態において、免疫修飾粒子と接触する緩衝液は酸性ｐＨを有し得る。酸性溶液に好適な酸性ｐＨは、４、４．１、４．２、４．５、５、５．５、６及び６．５を含む。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態において、免疫修飾粒子はコポリマーを含有する。これらのコポリマーは、様々なモル比を有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の担体粒子の好適なコポリマーの比率は、５０：５０である。さらなる実施形態において、本明細書に記載の担体粒子の好適なコポリマーの比率は、８０：２０、８１：１９、８２：１８、８３：１７、８４：１６、８５：１５、８６：１４、８７：１３、８８：１２、８９：１１、９０：１０、９１：９、９２：８、９３：７、９４：６、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１、または１００：０であり得る。別の実施形態において、コポリマーは、周期的、統計的、直線状、分岐状（星形、ブラシ型、または櫛形コポリマーを含む）のコポリマーであり得る。いくつかの実施形態において、コポリマー比は、限定されないが、ポリスチレン：ポリ（カルボン酸ビニル）／８０：２０、ポリスチレン：ポリ（カルボン酸ビニル）／９０：１０、ポリ（カルボン酸ビニル）：ポリスチレン／８０：２０、ポリ（カルボン酸ビニル）：ポリスチレン／９０：１０、ポリ乳酸：ポリグリコール酸／８０：２０、またはポリ乳酸：ポリグリコール酸／９０：１０であり得る。
【００９７】
一実施形態において、粒子はリポソームである。さらなる実施形態において、粒子は、以下のモル比で以下の脂質からなるリポソームである：３０：３０：４０のホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロール：コレステロール。なおもさならる実施形態において、粒子は、リポソーム内に封入される。
【００９８】
各粒子が均一なサイズである必要はないが、粒子は、一般的に、抗原提示細胞または他のＭＰＳ細胞において食作用を引き起こすのに十分なサイズでなければならない。好ましくは、溶解性を高め、ｉｎ  ｖｉｖｏでの凝集によって引き起こされる可能性のある合併症を回避し、飲作用を促進するために、粒子は顕微鏡スケールまたはナノスケールのサイズである。粒径は、間質腔からリンパ球成熟の領域への取り込みの要因であり得る。約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有する粒子は、食作用を引き起こすことができる。したがって、一実施形態において、粒子はこれらの限度内の直径を有する。別の実施形態において、粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する。さらに別の実施形態において、粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する。さらなる実施形態において、粒子は、約０．２μｍ〜約１μｍの直径を有する。さらなる実施形態において、粒子は、約０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３．０μｍ、３．５μｍ、４．０μｍ、４．５μｍ、または約５．０μｍの直径を有する。特定の実施形態において、粒子は、約０．５μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、粒子の全重量は、約１０，０００ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態において、粒子の全量は、約５，０００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ、４００ｋＤａ、３００ｋＤａ、２００ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ、２０ｋＤａ未満、または約１０ｋＤａ未満である。組成物中の粒子が均一の直径である必要はない。例として、薬学的製剤は、複数の粒子を含有してもよく、それらのうちのあるものは約０．５μｍであり、あるものは約１．０μｍである。これらの所与の範囲内の粒径のいずれの混合物も有用である。
【００９９】
本発明の粒子は、特定のゼータ電位を有することができる。ある特定の実施形態において、ゼータ電位は負である。一実施形態において、ゼータ電位は、約−１００ｍＶ未満である。一実施形態において、ゼータ電位は、約−５０ｍＶ未満である。ある特定の実施形態において、粒子は、−１００ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−７５ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−６０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−５０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。なおもさらなる実施形態において、粒子は、−４０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−３０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−２０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−１０ｍＶ〜０ｍＶのゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、粒子は、−８０ｍＶ〜−３０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−８０ｍＶ〜−２０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−８０ｍＶ〜−１０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−７０ｍＶ〜−３０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−７０ｍＶ〜−２０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−−７０ｍＶ〜−１０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−６０ｍＶ〜−３０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−６０ｍＶ〜−２０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−−６０ｍＶ〜−１０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−５０ｍＶ〜−３０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−５０ｍＶ〜−２０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−５０ｍＶ〜−１０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、粒子は、−５０ｍＶ〜−４０ｍＶのゼータ電位を有する。さらなる実施形態において、ゼータ電位は−約３０ｍＶ未満である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、担体粒子の電荷（例えば、正、負、中性）は、用途に固有の利益（例えば、生理的適合性、有益な表面−ペプチド相互作用等）を付与するように選択される。いくつかの実施形態において、担体粒子は、（例えば、概して正味の負電荷を帯びた細胞表面への非特異的結合を低減するために）正味の中性電荷または負電荷を有する。ある特定の実施形態において、担体粒子は、寛容が所望される抗原（本明細書において、抗原特異的ペプチド、抗原ペプチド、自己抗原、誘導性抗原、または寛容化抗原とも称される）に、直接的または間接的のいずれかでコンジュゲートされ得る。いくつかの場合において、担体粒子は、（例えば、寛容応答の可能性を高めるために）抗原特異的ペプチドの複数のコピーまたは複数の異なるペプチドを表面上で曝露するために、複数の結合部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、またはそれ以上）を有する。いくつかの実施形態において、担体粒子は、単一の種類の抗原ペプチドを提示する。いくつかの実施形態において、担体粒子は、表面上で複数の異なる抗原ペプチドを提示する。いくつかの実施形態において、担体粒子表面は、選択された部分（例えば、抗原ペプチド）の共有結合的付着のために官能基を提示する。いくつかの実施形態において、担体粒子表面の官能基は、選択された部分（例えば、抗原ペプチド）との非共有結合的な相互作用のための部位を提供する。いくつかの実施形態において、担体粒子は、コンジュゲート部分が化学結合を形成することなく吸着され得る表面を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、粒子は非金属性である。それらの実施形態において、粒子は、ポリマーから形成されてもよい。好ましい実施形態において、粒子は、対象において生分解性である。この実施形態では、対象において粒子が蓄積することなく、粒子が複数回投与にわたって対象に提供され得る。好適な粒子の例として、ポリスチレン粒子、ＰＬＧＡ粒子、クエン酸粒子、及びダイアモンド粒子が挙げられる。
【０１０２】
好ましくは、粒子表面は、非特異的または望ましくない生物学的相互作用を最小限に抑える材料からなる。粒子表面と間質との間の相互作用は、リンパ取り込みにおいて役割を果たす要因であり得る。粒子表面は、非特異的相互作用を防止するかまたは減少させるための材料でコーティングされてもよい。皮下注射後に改善されるリンパの取り込みによって実証されるように、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びそのコポリマー、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（ポリ（エチレングリコール）−ｂｌ−ポリ（プロピレングリコール）−ｂｌ−ポリ（エチレングリコール）のコポリマーを含む）等の親水性層で粒子をコーティングすることによる立体安定化は、間質のタンパク質との非特異的相互作用を低減し得る。これらの事実の全てが、リンパの取り込みに関連して粒子の物理的特性の有意性を示している。生分解性ポリマーは、ポリマー及び／または粒子及び／または層の全てまたは一部を構成するように使用され得る。生分解性ポリマーは、例えば、官能基が水溶液中で水と反応した結果によって、分解を受け得る。本明細書で使用される「分解」という用語は、分子量の減少によって、または疎水性基の親水性基への変換によって可溶性になることを指す。エステル基を有するポリマー、例えば、ポリ乳酸及びポリグリコリドは、概して自発的加水分解に供される。
【０１０３】
本発明の粒子は、追加の成分を含有してもよい。例えば、担体は、担体に組み込まれるかまたはコンジュゲートされた造影剤を有してもよい。現在市販されている、造影剤を有する担体ナノスフェアの例は、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｓｉｇｈｔナノスフェアである。量子ドット（ＱＤ）として知られる無機量子閉じ込め発光ナノ結晶が、ＦＲＥＴ用途における理想的なドナーとして浮上してきた：それらの高い量子収率及び調整可能なサイズ依存性ストークスシフトは、単一の紫外線波長で励起されたときに青色から赤外までの異なるサイズが放出することを可能にする。（Ｂｒｕｃｈｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８１，２０１３；Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００３，４２，５７９６；Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９５，２４６，３６２；Ｂｒｕｓ，Ｌ．Ｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９３，７９，５５６６）デンドリマーとして知られるポリマーのクラスに基づく、ハイブリッド有機／無機量子ドット等の量子ドットは、生物学的標識、撮像、及び光学的バイオセンシングシステムにおいて使用され得る。（Ｌｅｍｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２，１２８８６）従来の無機量子ドットの合成とは異なり、これらのハイブリッド量子ドットナノ粒子の合成は、高温、または毒性の高い不安定な試薬を必要としない。（Ｅｔｉｅｎｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８７，１８１９１３，２００５）
【０１０４】
粒子は、幅広い材料から形成することができる。粒子は、好ましくは、生物学的使用に好適な材料からなる。例えば、粒子は、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、またはヒドロキシカルボン酸及びジカルボン酸のコポリマーからなってもよい。より一般的には、担体粒子は、直鎖もしくは分枝鎖、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、線形もしくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、へテロアリール、もしくはアルコキシヒドロキシ酸のポリエステル、または直鎖もしくは分枝鎖、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、線形もしくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、もしくはアルコキシジカルボン酸のポリ無水物からなってもよい。さらに、担体粒子は、量子ドットであり得るか、または量子ドットポリスチレン粒子等の量子ドットからなり得る（Ｊｏｕｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２２：１８１０−６）。エステル及び無水物結合の混合物を含む担体粒子（例えば、グリコール酸及びセバシン酸のコポリマー）も用いられ得る。例えば、担体粒子は、ポリグリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、ポリセバシン酸ポリマー（ＰＳＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸コポリマー（ＰＬＧＡまたはＰＬＧ、これらの用語は交換可能である）、［ｒｈｏ］ｏｌｙ（乳酸−コ−セバシン）酸コポリマー（ＰＬＳＡ）、ポリ（グリコール−コ−セバシン）酸コポリマー（ＰＧＳＡ）等を含む材料を含んでもよい。
【０１０５】
本発明において有用な他の生体適合性、生分解性ポリマーは、カプロラクトン、カーボネート、アミド、アミノ酸、オルトエステル、アセタール、シアノアクリレート、及び分解性ウレタンのポリマーまたはコポリマー、ならびに直鎖または分岐、置換または非置換の、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、または芳香族ヒドロキシカルボン酸もしくはジカルボン酸とのこれらのコポリマーを含む。さらに、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン及びシステイン、またはそれらの鏡像異性体等の反応性側鎖基を有する生物学的に重要なアミノ酸が、抗原ペプチド及びタンパク質またはコンジュゲート部分にコンジュゲートするための反応基を提供するように、前述の材料のうちのいずれかとのコポリマーに含まれてもよい。本発明に好適な生分解性材料は、ダイアモンド、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＧＡポリマーを含む。生体適合性であるが非生分解性である材料も、本発明の担体粒子に使用され得る。例えば、アクリレート、エチレン−酢酸ビニル、アシル置換酢酸セルロース、非分解性ウレタン、スチレン、塩化ビニル、フッ化ビニル、ビニルイミダゾール、クロロスルホン化オレフィン、エチレンオキシド、ビニルアルコール、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、及びナイロンの非生分解性ポリマーが用いられてもよい。
【０１０６】
現在市販されている好適なビーズは、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）等のポリスチレンビーズを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）化学的薬剤及び／または生物学的薬剤の対象への送達のために構成される送達用足場と、（ｂ）抗原特異的寛容の誘導のために抗原に結合したポリ（ラクチド−コ−グリコリド）粒子とを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態において、前記送達用足場の少なくとも一部は微孔性である。いくつかの実施形態において、抗原に結合したポリ（ラクチド−コ−グリコリド）粒子は、前記足場内に封入される。いくつかの実施形態において、化学的薬剤及び／または生物学的薬剤は、タンパク質、ペプチド、小分子、核酸、細胞、及び粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、化学的薬剤及び／または生物学的薬剤は細胞を含み、前記細胞は膵臓の膵島細胞を含む。
【０１０８】
物理的特性もまた、未成熟なリンパ球を有する領域における取り込み及び保留後のナノ粒子の有用性に関連する。これらは、剛性またはゴム性（ｒｕｂｂｅｒｉｎｅｓｓ）等の機械的特性を含む。いくつかの実施形態は、最近、（標的または免疫ではなく）全身送達のために開発され、特徴付けられたＰＰＳ−ＰＥＧ系におけるように、上層、例えば、ＰＥＧにおけるような親水性上層を有するゴム状コア、例えば、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）コアに基づいている。ゴム状コアは、ポリスチレンまたは金属ナノ粒子系におけるような実質的に剛性のコアとは対照的である。ゴム状という用語は、天然または合成ゴム以外の特定の弾性材料を指し、ゴム状とは、ポリマー技術分野の当業者によく知られた用語である。例えば、架橋されたＰＰＳは、疎水性ゴム状コアを形成するために使用することができる。ＰＰＳは、酸化条件下でポリスルホキシド及び最終的にはポリスルホンに分解し、疎水性ゴムから親水性、水溶性ポリマーに推移するポリマーである。他の硫化物ポリマーを使用のために適合させてもよく、硫化物ポリマーという用語は、ポリマーの骨格に硫黄を有するポリマーを指す。使用され得る他のゴム状ポリマーは、水和条件下で約３７℃未満のガラス転移温度を有するポリエステルである。コア及び上層は、混合する傾向がなく、そのため上層がコアから離れて立体的に拡大する傾向があるため、疎水性コアは、親水性上層とともに有利に使用することができる。コアは、その上に層を有する粒子を指す。層は、コアの少なくとも一部を覆う材料を指す。層は、吸着されてもよいか、または共有結合的に結合されてもよい。粒子またはコアは、中実または中空であり得る。ゴム状疎水性コアは、ゴム状疎水性コアを有する粒子によってより多くの疎水性薬物の充填を行うことができるという点において、結晶性またはガラス状（ポリスチレンの場合のように）コア等の剛性疎水性コアよりも有利である。
【０１０９】
別の物理的特性は、表面の親水性である。親水性材料は、架橋されていないとき、１リットル当たり少なくとも１グラムの水溶性を有し得る。親水性ポリマーによる粒子の立体安定化は、非特異的相互作用を低減することによって間質からの取り込みを改善することができる：しかしながら、粒子の高いステルス性が、未成熟なリンパ球を有する領域で食細胞による内部移行を低下させる可能性もある。これらの競合する特徴の均衡を保つという課題は満たされたが、本出願は、リンパ節におけるＤＣ及び他のＡＰＣへの効果的なリンパ送達のためのナノ粒子の創出を実証する。いくつかの実施形態は、親水性成分、例えば、親水性材料の層を含む。好適な親水性材料の例は、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリサッカリド、ポリアクリル酸、及びポリエーテルのうちの１つ以上である。層中のポリマーの分子量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで有用な程度の立体障害を提供するように、例えば、約１，０００から約１００，０００またはさらにそれ以上に調整することができる：当業者は、明示的に記載される範囲内の全ての範囲及び値、例えば、１０，０００〜５０，０００が企図されることを直ちに理解するであろう。
【０１１０】
ナノ粒子は、さらなる反応のために官能基を組み込んでもよい。さらなる反応のための官能基は、求電子剤または求核剤を含み、これらは他の分子と反応させるのに好都合である。求核剤の例は、第１級アミン、チオール、及びヒドロキシルである。求電子剤の例は、スクシンイミジルエステル、アルデヒド、イソシアネート、及びマレイミドである。
【０１１１】
当該技術分野で周知の多様な手段が、抗原ペプチド及びタンパク質を担体にコンジュゲートさせるために用いられ得る。これらの方法は、抗原ペプチド及びタンパク質の生物学的活性を破壊しないかまたは大幅に制限せず、かつ、十分な数の抗原ペプチド及びタンパク質を、抗原ペプチドまたはタンパク質と同族のＴ細胞受容体との相互作用を可能にする配向で担体にコンジュゲートさせることができる、任意の標準的な化学を含む。一般的に、抗原ペプチドもしくはタンパク質のＣ末端領域、または抗原ペプチドもしくはタンパク質融合タンパク質のＣ末端領域を担体にコンジュゲートさせる方法が好ましい。正確な化学は、当然のことながら、担体材料の性質、抗原ペプチドもしくはタンパク質へのＣ末端融合の有無、及び／またはコンジュゲート部分の有無に依存する。
【０１１２】
官能基は、利用可能性のために、必要に応じて粒子上に位置してもよい。１つの位置は、コアポリマー、またはコア上の層であるポリマー、または別様に粒子に繋ぎ止められたポリマー上の、側基または終端であり得る。例えば、特定の細胞標的化、またはタンパク質及びペプチド薬物送達のために容易に官能化され得るナノ粒子を安定化するＰＥＧについて記載する例が本明細書に含まれる。
【０１１３】
エチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）、ヘキサメチレンジイソシアネート、２つのエポキシ残基を含有するプロピレングリコールジグリシリジルエーテル、及びエピクロロヒドリン等のコンジュゲートが、ペプチドまたはタンパク質を担体表面に固定するために使用され得る。理論に束縛されるものではないが、ＥＣＤＩは、寛容を誘導するための２つの主要な機能を果たすと考えられる：（ａ）遊離アミノ基と遊離カルボキシル基との間のペプチド結合形成の触媒作用を介してタンパク質／ペプチドを細胞表面に化学的に結合させる、及び、（ｂ）アポトーシス細胞死を模倣するように担体を誘導し、そうすることでそれらが脾臓内の宿主抗原提示細胞によって選択され、寛容を誘導する。自己反応性細胞におけるアネルギーの直接的な誘導をもたらすのは、この非免疫原性の様式における宿主Ｔ細胞への提示である。さらに、ＥＣＤＩは、特異的制御性Ｔ細胞を誘導するための強力な刺激としての役割を果たす。
【０１１４】
一連の実施形態において、抗原ペプチド及びタンパク質は、共有化学結合を介して担体に結合する。例えば、抗原のＣ末端近くの反応基または部分（例えば、Ｃ末端カルボキシル基、またはアミノ酸側鎖のヒドロキシル基、チオール基、もしくはアミン基）は、直接的な化学反応によって担体の表面上の反応基または部分（例えば、ＰＬＡもしくはＰＧＡのヒドロキシルもしくはカルボキシル基、デンドリマーの末端アミンもしくはカルボキシル基、またはリン脂質のヒドロキシル基、カルボキシル基、もしくはリン酸基）に直接コンジュゲートされてもよい。代替として、抗原ペプチド及びタンパク質の両方を担体に共有結合的にコンジュゲートさせ、それによってそれらを一緒に結合させるコンジュゲート部分が存在してもよい。
【０１１５】
担体の表面上の反応性カルボキシル基は、例えば、１−エチル−３−［３，９−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）とそれらを反応させることによって、抗原ペプチドまたはタンパク質上の（例えば、Ｌｙｓ残基からの）遊離アミンに結合させてもよい。同様に、担体の表面上の遊離アミンを、抗原ペプチドまたはタンパク質上の（例えば、Ｃ末端、またはＡｓｐもしくはＧＩｕ残基からの）遊離カルボキシルとコンジュゲートさせるために同じ化学が用いられてもよい。代替として、担体の表面上の遊離アミンは、Ａｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．２：７１−６に本質的に記載されるようなｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ化学を用いて、抗原ペプチド及びタンパク質、または抗原ペプチドもしくはタンパク質融合タンパク質に共有結合的に結合されてもよい。
【０１１６】
別の実施形態において、抗原ペプチドまたはタンパク質に結合したリガンドと、担体に付着した抗リガンドとの間の非共有結合的な結合によって、抗原を担体にコンジュゲートさせてもよい。例えば、ビオチンリガーゼ認識配列タグが抗原ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に結合されてもよく、このタグは、ビオチンリガーゼによってビオチン化されてもよい。ビオチンは、次いで、抗原ペプチドまたはタンパク質を、抗リガンドとして担体の表面に吸着されるかまたは別様に結合したアビジンまたはストレプトアビジンに非共有結合的にコンジュゲートさせるためのリガンドとしての役割を果たし得る。代替として、抗原ペプチド及びタンパク質が、Ｆｃ領域を担持する免疫グロブリンドメインと融合される場合、上述のように、Ｆｃドメインはリガンドとして作用することができ、担体の表面に共有結合的にまたは非共有結合的に結合したプロテインＡは、抗原ペプチドまたはタンパク質を担体に非共有結合的にコンジュゲートさせるための抗リガンドとしての役割を果たし得る。金属イオンキレート化技術（例えば、抗原ペプチドもしくはタンパク質または抗原ペプチドもしくはタンパク質融合タンパク質のＣ末端のポリ−Ｈｉｓタグ、及びＮｉ＋でコーティングした担体を使用）を含む、抗原ペプチド及びタンパク質を担体に非共有結合的にコンジュゲートさせるために用いられ得る他の手段は、当該技術分野で周知であり、これらの方法は、本明細書に記載の方法と置き換えられてもよい。
【０１１７】
核酸部分のプラットホーム分子へのコンジュゲーションは、任意の数の方法で達成され得るが、典型的には、１つ以上の架橋剤、ならびに核酸部分及びプラットホーム分子上の官能基が必要である。結合基は、標準的な合成化学技術を用いてプラットホームに付加される。結合基は、標準的な合成化学技術を用いて核酸部分に付加され得る。実施者は、本発明の組み合わせに使用される抗原について多数の選択肢を有する。組み合せに存在する誘導性抗原は、誘導される寛容原性応答の特異性に寄与する。それは、標的抗原と同じでもまたは同じでなくでもよく、不要な免疫学的応答の標的であり、寛容が所望される治療を受ける対象に存在するかまたは与えられる抗原である。
【０１１８】
本発明の誘導性抗原は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、糖脂質、もしくは生物学的源から単離された他の分子であってもよいか、または化学的に合成された小分子、ポリマー、もしくは生物学的材料の誘導体であってもよいが、但し、粘膜結合性成分と組み合わせたときに、本明細書による寛容を誘導する能力を有するものとする。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、及び／またはタンパク質に結合した担体（例えば、免疫修飾粒子）を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるもの等の担体（例えば、ＰＬＧ担体）は、抗原特異的寛容を誘導する、及び／または免疫関連疾患（マウスモデルにおける実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等）の発症を予防する、及び／または既存の免疫関連疾患の重症度を低減するのに効果的である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物及び方法は、Ｔ細胞にＴ細胞活性化に関連する初期事象を開始させることができるが、Ｔ細胞にエフェクター機能を獲得させることはできない。例えば、本発明の組成物の投与は、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４上方制御等の準活性化（ｑｕａｓｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）表現型を有するＴ細胞を生じさせることができるが、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１７合成の欠如によって示唆されるように、エフェクター機能は示さない。いくつかの実施形態において、本発明の組成物の投与は、ナイーブな抗原特異的Ｔ細胞を、例えば、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋表現型を有するもの等の制御性表現型に変換することなく、準活性化表現型を有するＴ細胞を生じさせる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、担体（例えば、粒子）の表面は、抗原ペプチド及び／または他の機能的要素の担体への付着（例えば、共有結合的、非共有結合的）を可能にする化学的部分及び／または官能基を含む。いくつかの実施形態において、担体（例えば、粒子）上の化学的部分及び／または官能基の数、配向、間隔等は、担体の化学、所望の用途等に従って異なる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、担体は、該担体に接着された、吸着された、封入された、及び／または全体に含有された、１つ以上の生物学的または化学的薬剤を含む。いくつかの実施形態において、化学的薬剤または生物学的薬剤は、粒子に封入される、及び／または粒子全体に含有される。本発明は、化学的薬剤または生物学的薬剤の性質によって限定されない。そのような薬剤は、限定されないが、タンパク質、核酸分子、小分子薬、脂質、炭水化物、細胞、細胞成分等を含む。いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ等）の異なる化学的薬剤または生物学的薬剤が、担体の上または中に含まれる。いくつかの実施形態において、薬剤は、特定の放出速度のために構成される。いくつかの実施形態において、複数の異なる薬剤が、異なる放出速度のために構成される。例えば、第１の薬剤は、数時間の期間にわたって放出してもよく、第２の薬剤は、より長い期間（例えば、数日、数週間、数ヶ月等）にわたって放出してもよい。いくつかの実施形態において、担体またはその一部は、生物学的薬剤または化学的薬剤の徐放のために構成される。いくつかの実施形態において、徐放は、少なくとも３０日（例えば、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１８０日等）の期間にわたって生物学的に活性な量の薬剤の放出を提供する。いくつかの実施形態において、担体またはその一部は、細胞の細孔内への内部成長を許容するのに十分多孔性であるように構成される。細孔のサイズは、対象とする特定の細胞型及び／または所望の内部成長の量のために選択され得る。
【０１２２】
驚くべきことに、本発明の粒子への抗原、生物学的薬剤、及び／または化学的薬剤の封入が、免疫寛容を誘導し、いくつかの利点を有することが分かった。第１に、封入された粒子は、より緩徐なサイトカイン応答を有する。第２に、複数の抗原、生物学的薬剤、及び／または化学的薬剤を使用する場合、粒子の表面に薬剤を付着した場合に起こる可能性があるこれらの種々の分子間の競合が、封入によってなくなる。第３に、封入により、より多くの抗原、生物学的薬剤、及び／または化学的薬剤を粒子に組み込むことができる。第４に、封入により、複合タンパク質抗原または臓器ホモジネート（例えば、１型糖尿病の場合の膵臓ホモジネートまたはピーナッツアレルギーにおけるピーナッツ抽出物）の使用をより容易にできる。最後に、粒子の表面へのコンジュゲーションの代わりに、粒子内に抗原、生物学的薬剤、及び／または化学的薬剤を封入することで、粒子の表面上の正味の負電荷を維持する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本発明の合成の生分解性粒子は、製造の容易性、治療剤の広い利用可能性、及び治療部位の増加を提供する。特定の実施形態において、界面活性剤ポリ（エチレン−ａｌｔ−無水マレイン酸）を使用して合成した高密度の表面カルボキシレート基を有する表面官能化生分解性ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）粒子は、他の担体粒子及び／または表面よりも優れた数多くの利点をもたらす担体を提供する。本発明の実施形態の開発中に実施された実験により、これらの粒子へのペプチド（ＰＬＰ１３９−１５１ペプチド）のコンジュゲーションが実証された。そのようなペプチドに結合された粒子は、それらが疾患発症の予防及び免疫学的寛容の誘導に効果的であることを示した（例えば、多発性硬化症のＳＪＬ／Ｊ  ＰＬＰ１３９−１５１／ＣＦＡで誘導したＲ−ＥＡＥマウスモデル）。本発明のペプチド結合担体は、他の寛容誘導構造よりも優れた数多くの利点を提供する。いくつかの実施形態において、粒子は生分解性であり、したがって体内では長期間存続しない。完全分解のための時間は、制御することができる。いくつかの実施形態において、粒子は、細胞を活性化することなく内部移行を促進するように官能化される（例えば、ＰＬＧ微粒子に充填されたホスファチジルセリン）。いくつかの実施形態において、粒子には、特定の細胞集団に対する標的リガンドが組み込まれる。いくつかの実施形態において、粒子を内部移行させる細胞型の活性化を制限し、かつ、エネルギーならびに／または制御性Ｔ細胞の欠失及び活性化を介して寛容の誘導を促進するように、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β等の抗炎症性サイトカインが粒子の上または中に含まれる。
【０１２４】
組成物
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の融合タンパク質を封入する生分解性粒子は、組成物に配合され得る。本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、対象及び／または細胞に投与することができる１つ以上の融合タンパク質を封入する１つ以上の粒子の配合物を指す。いくつかの実施形態において、組成物は複数の粒子からなってもよく、それらの各々が同じ融合タンパク質を封入する。いくつかの実施形態において、組成物は複数の粒子からなってもよく、それらの各々が２つ以上の異なる融合タンパク質を封入する。例えば、組成物は、各々が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の異なる融合タンパク質のうちの１つを封入する複数の粒子からなってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。代替として、本発明の粒子は、それを必要とする患者に、１つ以上の他の治療剤の投与と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の化合物との共同投与のため、または本発明の化合物を含む薬学的組成物中に包含するための追加の治療剤は、承認された抗炎症剤であり得るか、あるいは制御されない炎症性免疫応答または細菌もしくはウイルス感染によって特徴付けられる任意の障害の治療のために最終的に承認を得る、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎで承認段階にある多くの薬剤のうちのいずれか１つであり得る。また、本発明の粒子は、治療のために遊離形態で存在し得るか、または必要に応じて、その薬学的に許容される誘導体として存在し得ることも理解されたい。
【０１２５】
組成物の配合物は、本明細書に記載の粒子の誘導体、プロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体、及び／または互変異性体を、任意の許容される担体、希釈剤、及び／または賦形剤とともに含み得る。「治療用組成物」または「薬学的組成物」（本明細書において交換可能に使用される）は、患者及び／または細胞に投与することができ、特定の生理学的結果（例えば、抗原特異的寛容）をもたらすことができる、本明細書に記載の１つ以上の融合タンパク質を封入する粒子の組成物である。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、限定されないが、過度な毒性、刺激作用、アレルゲン性、または他の問題もしくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適な、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。薬学的に許容される担体の例として、限定されないが、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及びセルロースアセテート；トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター，ワックス，動物性及び植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油類、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに薬学的製剤に用いられる任意の他の適合性を示す物質が挙げられる。任意の従来の媒体及び／または薬剤が本開示の粒子及び／または融合タンパク質に不適合である限りを除いて、治療用組成物におけるその使用が企図される。
【０１２７】
「薬学的に許容されるは、酸付加塩及び塩基付加塩の両方を含む。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、及び有機酸、例えば、限定されないが、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、ショウノウ−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐトルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸等とともに形成される。遊離カルボキシル基によって形成される塩はまた、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩等の無機塩基にも由来し得る。有機塩基に由来塩は、限定されないが、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然起源の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩を含む。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン及びカフェインである。
【０１２８】
湿潤剤、乳化剤、及び滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【０１２９】
薬学的に許容される抗酸化剤の例として、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム塩、メタ亜重硫酸ナトリウム塩、亜硫酸ナトリウム等；脂溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸パルミチン酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、胆汁酸プロピル、α−トコフェロール等；及び金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。
【０１３０】
経口投与のための液体剤形は、限定されないが、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。活性化合物に加えて、液体剤形は、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有してもよい。不活性希釈剤の他にも、経口組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤、及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤、及び芳香剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の生分解性粒子または組成物を投与することを含む、対象において特定の生理学的効果（例えば、免疫応答の調節／抗原特異的寛容の誘導）を誘導する方法を提供する。したがって、一態様において、寛容原性免疫修飾粒子が提供される。そのような寛容誘導性粒子は、リンカー（例えば、プロテアーゼ特異的リンカー）によって分離された、寛容の誘導が所望される最低でも２つ以上の抗原エピトープを含む（例えば、自己抗原、アレルゲン、及び／または移植抗原）。別の態様において、活性化免疫修飾粒子が提供される。一実施形態において、そのような免疫活性化粒子は、リンカー（例えば、プロテアーゼ特異的リンカー）によって分離された、防御免疫応答が所望される２つ以上の抗原エピトープを含む（例えば、腫瘍抗原及び／または感染病原体）。特定の実施形態において、活性化免疫修飾粒子は、免役活性化剤をさらに含む。一実施形態において、免役活性化剤はＴＬＲアゴニストである。特定の実施形態において、免役活性化剤は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ３、またはＴＬＲ９アゴニストである。さらなる実施形態において、免役活性化剤はＴＬＲ７アゴニストである。
【０１３１】
組成物は、所望の投与経路に好適であり、かつ／または所望の結果を達成するのに好適な、特定の様式において配合され得る。「投与」は、生分解性粒子もしくはその組成物を対象に導入もしくは送達すること、または生分解性粒子もしくはその組成物を細胞もしくは試料と接触させることを指す。「試料」という用語は、得られる、提供される、及び／または分析に供される体積及び／または質量を指す。いくつかの実施形態において、試料は、組織試料、細胞試料、体液試料等を含む。いくつかの実施形態において、試料は対象（例えば、ヒトまたは動物対象）から採取される。いくつかの実施形態において、組織試料は、任意の内蔵、癌性、前癌性、もしくは非癌性の腫瘍、皮膚、毛髪（毛根を含む）、目、筋肉、骨髄、軟骨、白色脂肪組織、または褐色脂肪組織から採取された組織の一部を含む。いくつかの実施形態において、体液試料は、頬側スワブ、血液、臍帯血、唾液、精液、尿、腹水、胸水、髄液、肺洗浄液、涙、汗等を含む。当業者は、いくつかの実施形態において、対象から直接得られるという点において、「試料」が「一次試料」であることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、「試料」は、例えば、特定の潜在的に汚染されている成分を除去するため、ならびに／または対象とする特定の成分を単離及び／もしくは精製するための、一次試料の処理の結果である。
【０１３２】
投与は、注射、灌注、吸入、摂取、電気浸透、血液透析、イオン泳動、及び当該技術分野で既知の他の方法によって行うことができる。本発明の粒子及び組成物は、限定されないが、経口、静脈、舌下、頬側、腸内、局所、直腸、皮下、経鼻、骨内（例えば、骨内注入）、腹腔内、くも膜下腔内、経皮、または経粘膜を含む任意の許容される経路を介して投与され得る。特定の実施形態において、本発明の粒子は、静脈内にまたは皮下に投与される。
【０１３３】
投与の頻度は、所望の生理学的結果、治療及び／もしくは予防される障害の性質、障害の重症度、及び配合物に対する対象の応答に基づいて決定され得る。いくつかの態様において、組成物の投与は、少なくとも１回行われる。さらなる態様において、投与は、１回よりも多く、例えば、所与の期間内に２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、またはそれ以上の回数行われる。各投与の投与量及び／または投与の頻度は、患者の状態及び生理学的応答に基づいて、必要に応じて調整されてもよい。組成物が１回よりも多く投与される場合、各投与は、同じ行為者によって、かつ／または同じ地理的位置で行われてもよい。代替として、各投与は、異なる行為者によって、かつ／または異なる地理的位置で行われてもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、有効量の本明細書に記載の粒子及び／または組成物が対象に投与される。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、有効量の本明細書に記載の粒子及び／または組成物を用いた治療に好適な動物（例えば、哺乳動物、ブタ、魚、鳥、昆虫等）を指す。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、またはウサギ；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ等；家禽、例えば、ニワトリ、アヒル、カモ、シチメンチョウ等；飼育動物、例えば、イヌ及びネコ；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。いくつかの実施形態において、特に研究環境において、対象はマウスである。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【０１３５】
「有効量」という用語は、特定の生理学的効果を誘導するために必要な生分解性粒子または組成物の最低量を指す。例えば、有効量は、抗原特異的寛容を誘導するために、または別様に免疫応答を制御するために必要な最低量であり得る。本明細書に記載される場合、免疫応答の制御は、体液性及び／または細胞性であり得、当該技術分野における標準的な技術を用いて、本明細書に記載されるように測定される。所与の粒子または組成物の有効量は、治療される障害の性質及び障害の重症度；用いられる組成物（複数可）の特定の粒子（複数可）の活性；対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別、及び食生活；投与時間、投与経路、及び用いられる粒子（複数可）または組成物（複数可）の排泄率；治療期間；用いられる粒子（複数可）または組成物（複数可）と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；処方医師または獣医師の判断；粒子または組成物のサイズ及び物理的特性；ならびに当該技術分野で既知の同様の要因を含む様々な要因に依存する。本明細書に記載の粒子または組成物の有用な投与量範囲は、例えば、以下のうちの大体いずれかであり得る：０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜９ｍｇ／ｋｇ、２〜８ｍｇ／ｋｇ、３〜７ｍｇ／ｋｇ、４〜６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ。代替として、投与量は、粒子の数に基づいて投与されてもよい。例えば、送達される担体の量で示される有用な担体の投与量は、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、またはそれよりも多い用量当たりの粒子の数であり得る。各患者に与えられる絶対量は、バイオアベイラビリティ、クリアランス速度、及び投与経路等の薬理学的特性に依存する。薬学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤の詳細、ならびに薬学的組成物及び配合物の調製方法は、Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ．，に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の足場、マトリックス、及び／または送達系を用いる用途を見出す（例えば、米国特許出願第２００９／０２３８８７９号、米国特許第７，８４６，４６６号、米国特許第７，４２７，６０２号、米国特許第７，０２９，６９７号、米国特許第６，８９０，５５６号、米国特許第６，７９７，７３８号、米国特許第６，２８１，２５６を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、粒子は、足場、マトリックス、及び／または送達系（例えば、化学的／生物学的材料、細胞、組織、及び／または臓器の対象への送達のため）に会合する、吸着される、埋め込まれる、コンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、足場、マトリックス、及び／または送達系（例えば、化学的／生物学的材料、細胞、組織、及び／または臓器の対象への送達のため）は、本明細書に記載の材料を含み、かつ／またはそれらからできている。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、微孔性の足場（例えば、生物学的材料（例えば、細胞、組織等）を対象に移植するための）が提供される。いくつかの実施形態において、その上に薬剤（例えば、細胞外マトリックスタンパク質、エキセンディン−４）及び生物学的材料（例えば、膵臓の膵島細胞）を有する微孔性の足場が提供される。いくつかの実施形態において、足場は、疾患（例えば、１型糖尿病）の治療、及び関連方法（例えば、診断方法、研究方法、薬物スクリーニング）において使用される。いくつかの実施形態において、足場の上及び／または中に本明細書に記載の担体粒子を有する足場が提供される。いくつかの実施形態において、足場は、抗原にコンジュゲートされた材料（例えば、抗原にコンジュゲートされたＰＬＧ）から生成される。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、足場及び／または送達系は、１つ以上の層を含み、かつ／または１つ以上の化学的及び／もしくは生物学的実体／薬剤（例えば、タンパク質、ペプチドにコンジュゲートされた粒子、小分子、細胞、組織等）を有する：例えば、米国特許公開第２００９／０２３８８７９号を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、足場及び会合した材料に対する免疫学的寛容の誘導を誘発するために足場送達系と同時投与される。いくつかの実施形態において、微孔性の足場は、足場の上または中の本明細書に記載の粒子とともに対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、足場送達系に結合される。いくつかの実施形態において、足場送達系は、本明細書に記載の担体粒子のうちのいずれかを含む。
【０１３９】
また、本発明の粒子及び組成物は、併用療法において配合されて用いられ得ること、すなわち、粒子及び組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬もしくは医学的手技を用いて配合され得るか、またはそれと同時に、その前に、もしくはその後に投与され得ることも理解されたい。併用投与計画に用いるための特定の治療の組み合わせ（例えば、治療化合物及び／または手技の組み合わせ）は、所望の治療薬及び／または手技、ならびに達成される所望の治療効果の適合性を考慮に入れる。また、用いられる治療は、同じ障害に対して所望の効果を達し得る（例えば、本発明の化合物は、別の抗炎症剤と同時に投与されてもよい）か、またはそれらは、異なる効果を達成し得る（例えば、任意の有害作用の制御）ことも理解されたい。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、本発明の修飾粒子を含有する薬学的組成物は、１つ以上の追加の治療的に活性な成分（例えば、抗炎症薬及び／または緩和薬）をさらに含む。本発明の目的のために、「緩和」という用語は、疾患の症状及び／または治療計画の副作用の軽減に焦点を当てているが、治癒的ではない処置を指す。例えば、緩和療法は、鎮痛剤、制吐薬、及び鎮吐薬を包含する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、インプラント及び／または移植片に関連する免疫応答を媒介するため、無効にするため、制御するため、及び／または軽減するために、インプラント（例えば、デバイス）及び／または移植片（例えば、組織、細胞、臓器）とともに（例えば、同時に、前に、もしくは後に）投与される。
【０１４２】
使用方法
いくつかの実施形態において、本発明は、対象に本明細書に記載の粒子または組成物を投与することを含む、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて、既存の免疫応答を誘導するかまたは別様に制御するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、自然免疫応答及び獲得免疫応答の両方（例えば、Ｔ細胞媒介性及び／またはＢ細胞媒介性免疫応答）を含む。一般的に、自然及び獲得免疫応答は、抗原特異性のレベルによって区別される。例えば、獲得免疫応答に直接関与する細胞（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）は、特定の抗原に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＢ細胞受容体を発現する。したがって、獲得免疫受容体は、活性化され、特異的抗原（例えば、より大きな抗原の特異的エピトープまたは成分）に応答する。対照的に、自然免疫の細胞は、ＴＬＲ、ＣＬＲ、ＮＬＲ、ＲＬＲ、及び他の自然免疫受容体（例えば、パターン認識受容体（ＰＲＲ））を発現する。ＰＲＲは、幅広い種類の抗原を認識する生殖系列にコードされる、再編成しない受容体である（例えば、ＣＬＲは一般的に炭水化物部分を認識し、ＲＬＲはウイルス核酸を認識する）。したがって、自然免疫系の受容体は、活性化され、広い範囲の抗原に応答し、抗原特異的であるとは見なされない。
【０１４３】
免疫応答に関与する細胞は、リンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔ制御性細胞）；抗原提示細胞（ＡＰＣ）（プロフェッショナルＡＰＣ、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞、及び非プロフェッショナルＡＰＣ、例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状膠細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞を含む）；ナチュラルキラー細胞；ならびに骨髄性細胞、例えば、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び他の顆粒球を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞増加、サイトカイン産生、ケモカイン産生、及びＴ細胞媒介性細胞傷害性（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって媒介される応答）を含む。さらに、免疫応答という用語は、ＡＰＣの遊走、増殖、及び活性化、ならびに抗原提示の機構等の、Ｔ細胞活性化またはＴ細胞抑制を間接的にまたは直接的に媒介する免疫応答を含む。免疫応答という用語はまた、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）、及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージ、樹状細胞、好中球、マスト細胞、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞自体、ならびに構造細胞、例えば、上皮細胞、内皮細胞、及び／または他の間質細胞の活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答を含む。いくつかの実施形態において、本発明の粒子は、炎症性細胞の炎症部位への輸送を低減するのに効果的である。
【０１４４】
「免疫応答の制御」は、免疫応答の任意の態様の調節、または複数の態様の調節を指してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるような免疫応答を制御するための方法は、（例えば、活性化免疫修飾粒子の使用によって）免疫原性、炎症促進性、または別様に活性化する免疫応答を調節することを含む。そのような実施形態において、本明細書に提供される方法は、ＴＨ１、ＴＨ２、もしくはＴＨ１７応答を特異的に誘導すること、制御性Ｔ細胞応答を低減もしくは抑制すること、またはそれらの応答の組み合わせを包含する。ＴＨ１応答の誘導は、例えば、ＩＦＮγ及び／もしくはＩＬ−１２の発現を増加させること、ならびに／またはＴＨ１細胞の集団を増加させること（例えば、ＩＦＮγ＋、ＩＬ−１２＋、及び／もしくはＴ−ｂｅｔ＋細胞の数もしくは割合を増加させること）を包含する。ＴＨ２応答の誘導は、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはそれらの任意の組み合わせの発現を増加させることを包含する。典型的には、ＴＨ２応答の増加は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも１つの発現の増加を含み；より典型的には、ＴＨ２応答の増加は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも２つの発現の増加を含み、最も典型的には、ＴＨ２応答の増加は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも３つの発現の増加を含むが、理想的には、ＴＨ２応答の増加は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３の全ての発現の増加を含む。ＴＨ２応答の誘導はまた、ＴＨ２細胞の集団を増加させること（例えば、ＩＬ−４＋、ＩＬ−５＋、ＩＬ−１０＋、ＩＬ−１３＋、及び／またはＧＡＴＡ３＋細胞の数または割合を増加させること）を含み得る。ＴＨ１７応答の誘導は、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはそれらの任意の組み合わせの発現、ならびにＩＬ−１７、ＩＬ−２１、及びＩＬ−２２の効果レベルを増加させることを包含する。ＴＨ１７応答の誘導はまた、ＴＨ１７細胞の集団を増加させること（例えば、ＩＬ−１７＋、ＩＬ−２１＋、ＩＬ−２２＋、及び／またはＲＯＲγｔ＋細胞の数または割合を増加させること）を含み得る。制御性Ｔ細胞応答の低減は、ＴＧＦβ、ＩＬ−１０、またはそれらの任意の組み合わせの発現を低減することを包含する。制御性Ｔ細胞応答の低減はまた、Ｔ制御性細胞の集団の低減（例えば、ＴＧＦβ＋、ＩＬ−１０＋、及び／またはＦｏｘＰ３＋細胞の数または割合を低減すること）を含み得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるような免疫応答を制御するための方法は、（例えば、寛容原性免疫修飾粒子の使用によって）制御性、寛容原性、または別様に抑制性の免疫応答を調節することを含む。そのような実施形態において、本明細書に提供される方法は、ＴＨ１、ＴＨ２、もしくはＴＨ１７応答を特異的に低減すること、制御性Ｔ細胞応答を増加させること、またはそれらの応答の組み合わせを包含する。ＴＨ１応答の低減は、例えば、ＩＦＮγ及び／もしくはＩＬ−１２の発現を低減すること、ならびに／またはＴＨ１細胞の集団を低減すること（例えば、ＩＦＮγ＋、ＩＬ−１２＋、及び／もしくはＴ−ｂｅｔ＋細胞の数もしくは割合を低減すること）を包含する。ＴＨ２応答の低減は、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはそれらの任意の組み合わせの発現を低減することを包含する。典型的には、ＴＨ２応答の低減は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも１つの発現の低減を含み；より典型的には、ＴＨ２応答の低減は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも２つの発現の低減を含み、最も典型的には、ＴＨ２応答の低減は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも３つの発現の低減を含むが、理想的には、ＴＨ２応答の低減は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３の全ての発現の低減を含む。ＴＨ２応答の低減はまた、ＴＨ２細胞の集団を低減すること（例えば、ＩＬ−４＋、ＩＬ−５＋、ＩＬ−１０＋、ＩＬ−１３＋、及び／またはＧＡＴＡ３＋細胞の数または割合を低減すること）を含み得る。ＴＨ１７応答の低減は、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはそれらの任意の組み合わせの発現、ならびにＩＬ−１７、ＩＬ−２１、及びＩＬ−２２の効果レベルを低減することを包含する。ＴＨ１７応答の低減はまた、ＴＨ１７細胞の集団の低減すること（例えば、ＩＬ−１７＋、ＩＬ−２１＋、ＩＬ−２２＋、及び／またはＲＯＲγｔ＋細胞の数または割合を低減すること）を含み得る。制御性Ｔ細胞応答の誘導は、ＴＧＦβ及び／またはＩＬ−１０の発現を増加させることを包含する。制御性Ｔ細胞応答の誘導はまた、Ｔ制御性細胞の集団を増加させること（例えば、ＴＧＦβ＋、ＩＬ−１０＋、及び／またはＦｏｘＰ３＋細胞の数または割合を増加させること）を含み得る。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「寛容」または「免疫学的寛容」という用語は、免疫系の不応答の状態を指す。免疫学的寛容は、異常な（例えば、自己免疫に関連して自己抗原に対する反応性）及び／または過剰な免疫応答を防止する上で必要不可欠である。「特異的な」免疫学的寛容は、免疫学的寛容が、他と比較してある特定の抗原に対して優先的に惹起されたときに生じる。「非特異的な」免疫学的寛容は、免疫学的寛容が、炎症性免疫応答を引き起こす抗原に対して無差別に惹起されたときに生じる。「準特異的な」免疫学的寛容は、免疫学的寛容が、保護免疫応答を引き起こす他の抗原ではなく、病原性免疫応答を引き起こす抗原に対して半差別的に惹起されたときに生じる。特定の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書に記載の生分解性粒子または組成物を投与することを含む、対象において抗原特異的寛容を誘導する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「抗原特異的寛容」は、特定の抗原によるＴＣＲ媒介性刺激に対するＴ細胞の非感受性及び／または不応答性を指す。
【０１４７】
免疫学的寛容は、中枢性寛容及び末梢性寛容の両方の結果である。中枢性寛容は、機能的な抗原特異的Ｔ細胞の選択（正の選択）及び自己反応性Ｔ細胞の排除（負の選択）をもたらす、胸腺におけるＴ細胞の正の選択及び負の選択を指す。末梢性寛容は、末梢（例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、及び／または粘膜表面）に存在する寛容機構を指す。末梢性寛容の機構は、胸腺欠損を逃れた自己反応性Ｔ細胞による異常な応答を防止し、異種抗原に対する免疫応答の過剰な活性化を防止する。末梢性寛容は、Ｔ細胞アネルギー、活性化誘導性のＴ細胞の細胞死を含む様々な機構、及び制御性Ｔ細胞によって媒介される免疫抑制の機構を包含する。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「アネルギー」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介性の刺激に対するＴ細胞の非感受性を指す。そのような非感受性は、抗原特異的であり、一般的に、抗原ペプチドへの曝露が終了した後も存続する。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第２のシグナル（共刺激シグナル）の非存在下で第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ３媒介性シグナル）を受け取るときに起こる。これらの条件下では、同じ抗原への細胞の再曝露によって、たとえ、共刺激分子の存在下で再曝露が行われる場合であっても、Ｔ細胞はサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を産生することができなくなり、その後、増殖することができない。したがって、サイトカインを産生できないことによって増殖が阻止される。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とともに培養されると増殖することができる。Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡによって、または指標細胞株を用いた増殖アッセイによって測定されるように、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の欠如によって観察され得る。代替として、レポーター遺伝子構築物が用いられてもよい。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下で異種プロモーターによって、またはエンハンサー内に見出すことができるＡＰＩ配列のマルチマーによって誘導されるＤＬ−２遺伝子の転写を開始することができない（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５７：１１３４）。
【０１４９】
「制御性Ｔ細胞」、「Ｔ制御性細胞」、及び「Ｔｒｅｇ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、免疫応答の誘導を抑制または防止するＴ細胞である。Ｔｒｅｇという用語は、内在性Ｔｒｅｇ（例えば、抑制性細胞として胸腺から生じるＴｒｅｇ）及び誘導性Ｔｒｅｇ（例えば、末梢刺激に応じて抑制性細胞に分化するＴｒｅｇ）の両方を指すことができる。誘導性Ｔｒｅｇは、それらの転写因子、ＦｏｘＰ３、細胞表面マーカーの発現、及びサイトカイン産生に基づいて複数の亜集団に分割され得る。いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｇは、Ｔｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋サプレッサー細胞、及びその他等の誘導性Ｔｒｅｇ集団を指してもよい。特定の実施形態において、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＬＡＧ３＋ＩＦＮγ＋ＩＬ−１０＋として定義されるＴｒ１細胞を指してもよい。いくつかの実施形態において、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制は、抗原特異的または非抗原特異的であり得る。いくつかの実施形態において、免疫応答のＴｒｅｇ媒介性抑制は、Ｔｒｅｇによるサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−１０及び／もしくはＴＧＦβの産生）の結果であり得るか、または別の免疫抑制メディエーターの産生によるものであり得る。
【０１５０】
Ｔｒｅｇは、末梢性寛容を媒介及び維持する上で重要な役割を果たす。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１−１９；Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：５８−６７を参照されたい。ある状況において、自己抗原に対する末梢性寛容が失われ（または破壊され）、自己免疫応答が結果として生じる。例えば、ＥＡＥの動物モデルにおいて、Ｔｏｌｌ様受容体等の自然免疫受容体によるＡＰＣの活性化が自己寛容を破壊し、その結果としてＥＡＥの誘導をもたらすことが示された（Ｗａｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：９９０−９９７）。さらに、Ｔｒｅｇは、ウイルス感染または細菌感染に応じて生成されるもの等の有益な免疫応答に関連して過剰な免疫活性化を防止することができる。したがって、これらの免疫応答の制御は、健康な細胞または組織片の過剰な損傷を阻止することができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、免疫学的寛容は、例えば、抗原特異的エフェクターＴリンパ球、Ｂリンパ球、抗体、もしくはそれらの均等物によって少なくとも部分的に媒介されるもの等の特異的免疫応答レベルの低減；特異的免疫応答の開始もしくは進行の遅延；または特異的免疫応答の開始もしくは進行のリスク低減によって測定することができる。免疫学的寛容は、未治療の対象と比較した治療済み対象の割合に基づいて行われる方法によって決定することができ、Ｔ細胞及び／またはＢ細胞の増殖及び／または活性化、サイトカイン産生、抗体産生は、当該技術分野で既知の方法によって例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  増殖アッセイ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット等において）決定することができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答の誘導は、寛容原性活性の増加を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、寛容原性活性の増加は、Ｔｒｅｇの増加及び／または増殖を含む。いくつかの実施形態において、寛容原性活性の増加は、ＩＬ−１０及び／またはＴＧＦβ等の制御性サイトカインの産生増加を含む。寛容原性活性の代わりとなるものは、無傷の抗原または断片が、標的部位で適切なサイトカインの産生を刺激する能力である。標的部位でＴ制御性細胞によって放出される免疫制御性サイトカインはＴＧＦ−βであると考えられる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２１，１９９２）。寛容の間に産生され得る他の因子は、サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１０、ならびにメディエーターＰＧＥである。対照的に、活性化免疫応答が生じている組織中のリンパ球は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＦＮγ等のサイトカインを分泌する。故に、寛容原性または免疫原性応答を誘導する抗原の能力は、免疫活性化サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７等）と比較して免疫制御性サイトカイン（例えば、ＴＧＦβ及び／またはＩＬ−１０）の産生を刺激するその能力を測定することによって評価することができる。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、本発明は、治療的介入によって以前に寛容化されていない対象における免疫寛容の予備刺激に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における治療タンパク質に対する異常な免疫応答の発生率及び／または重症度を軽減するための方法に関する。これらの実施形態は、一般的に、抗原と粘膜結合成分との組み合わせの複数回の投与を含む。典型的には、長期にわたる結果を達成するために、予備刺激中は、少なくとも３回の投与、頻繁に少なくとも４回の投与、また時には少なくとも６回の投与が行われるが、対象は、治療過程の早い段階で寛容の徴候を示す場合がある。ほとんどの場合、各用量はボーラス投与として投与されるが、粘膜放出が可能な持続性製剤もまた好適である。複数回投与が行われる場合、投与間の時間は、一般的に１日〜３週間、また典型的には約３日〜２週間である。一般的に、同じ抗原及び粘膜結合成分は同じ濃度で存在し、投与は同じ粘膜表面に対して行われるが、治療過程の間は、これらの変数のいずれかの変動が適応され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、標的抗原等の特定の抗原に対する防御免疫応答を誘導することを含む。そのような方法は、癌治療薬及び感染性疾患に関連して特に有用である。そのような実施形態において、方法は、プロテアーゼ特異的リンカーによって分離された２つ以上の標的抗原（腫瘍抗原等）を含む融合タンパク質を封入する粒子の投与を含む。ある特定の実施形態において、結合エピトープを封入する粒子は、免疫アゴニストをさらに含む。免疫アゴニストは、タンパク質、ハプテン、毒素、脂質、及び／または核酸のうちのいずれかを含んでもよく、標的抗原に対する抗原特異的免疫応答をもたらすためのアジュバントとして作用することができる。免疫アゴニストは、ハプテン、例えば、ビオチン、ジニトロフェノール、ウルシオール、フルオレセイン、及びその他を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫アゴニストは、一本鎖（ｓｓ）ならびに二本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡ、またそれらの修飾形態を含む核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、免疫アゴニストは毒素である。いくつかの実施形態において、免疫アゴニストは、免疫活性化サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＴＮＦα等）；Ｔ細胞、抗原提示細胞、及び／または顆粒球をリクルートすることができるケモカイン；免疫チェックポイント受容体に結合して阻害する抗体またはその断片（例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＡ２ａＲ）等のタンパク質である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、免疫アゴニストは、ＣＬＲ（例えば、ＤＥＣ−２０５、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣＩＲ、ＣＬＥＣ−１、デクチン１、デクチン２、またはＤＬＥＣ）、ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、またはＴＬＲ１３）、ＮＬＲ（例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＮＡＩＰ、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＣ３、ＮＬＰＲ１、ＮＬＰＲ３、ＮＬＲＰ１０）、ＲＬＲ（例えば、ＭＤＡまたはＲＩＧ１）、ＳＴＩＮＧ、インフラマソーム（例えば、ＮＬＰＲ３またはＡＩＭ２）のアゴニストである。さらなる実施形態において、免疫アゴニストは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ９アゴニストである。さらなる特定の実施形態において、免疫アゴニストは、ＣＤ８＋ＣＴＬの活性化をもたらす。さらなる実施形態において、免疫アゴニストは、標的抗原を発現する細胞の細胞溶解をもたらす。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＥｐｈＡ２、ＭＣＳＰ、ＡＤＡＭ１７、ＰＳＣＡ、ＴＰＴＥ、ＨＰＵ１６、未成熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化クロライドチャネル２、シクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＡＧＥファミリーのタンパク質、ＧＡＧＥファミリーのタンパク質、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３）、ＳＡＧＥファミリーのタンパク質、ＸＡＧＥファミリーのタンパク質、ＣＴ９、ＣＴ１０、ＮＹ−ＥＳＯ１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メランＡ／ＭＡＲＴ−１、Ｃｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／ＴＲＰ−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−βＲＩＩ、及びＭＵＣ１等の腫瘍抗原である。
【０１５６】
抗原特異的免疫応答の増加は、抗原特異的エフェクターＴ細胞増殖の増加、炎症促進性及び／または免疫活性化サイトカイン（例えば、ＩＦＮγもしくはＩＦＮα）の産生の増加、または標的抗原を発現する細胞の細胞溶解の増加によって測定され得る。
【０１５７】
さらなる実施形態において、特定の疾患または障害の治療のための方法が提供される。本明細書で使用される「治療すること」及び「治療」は、疾患、または疾患の症状の改善を指し、測定可能もしくは観察可能な改善、または対象の全般的な健康における改善であり得る。特定の実施形態において、特定の疾患または障害を治療することは、病的炎症（例えば、自己免疫疾患に関連する）を軽減または改善するために抗原特異的寛容を誘導することまたは別様に制御性免疫応答を増加させることを指す。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本発明は、疾患が発症する前の本明細書に記載の粒子及び組成物の使用に関する。他の実施形態において、本発明は、進行中の疾患を阻害するための本明細書に記載の粒子及び組成物の使用に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象における疾患を改善することに関する。対象における疾患を改善するとは、対象における疾患を治療、予防、または抑制することを含むことを意味する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、本発明は、疾患の再発を予防することに関する。例えば、不要な免疫応答は、ペプチドのある領域（抗原決定基等）で生じ得る。不要な免疫応答に関連する疾患の再発は、ペプチドの異なる領域で免疫応答による攻撃を受けることによって起こり得る。ＭＳ及び他のＴｈ１／１７媒介性自己免疫疾患を含むいくつかの免疫応答障害におけるＴ細胞応答は動的であり得、再発寛解型及び／または慢性進行性疾患の過程において進化する。疾患が進行するにつれて標的が変化し得るため、Ｔ細胞レパートリーの動的性質は、特定の疾患の治療に影響を与える。以前は、疾患の進行を予測するために、応答のパターンについての事前の知識が必要であった。本発明は、動的に変化する疾患の影響である「エピトープスプレッディング」の機能を妨げ得る組成物を提供する。再発の既知のモデルは、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとしてのプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に対する免疫反応である。初期の免疫応答は、ＰＬＰ１３９−１５に対する応答によって生じ得る。その後の疾患の発症は、ＰＬＰ［ｐｉ］ｓ−ｉβｉに対する再発免疫応答によって生じ得る。本発明の組成物は、疾患を引き起こすエピトープが複数のタンパク質（例えば、ＰＬＰ、ＭＢＰ、及びＭＯＧ）中に存在するか、または複数の疾患を引き起こすエピトープが単一のタンパク質上に存在し、タンパク質全体の封入がそれ以外の形では不可能である、ＭＳ及び他の自己免疫疾患の治療に特に有用である。
【０１６０】
ある特定の実施形態において、対象は、アレルギー性疾患または状態、アレルギー、及び喘息等の不要な免疫活性化に関連する疾患に罹患する。アレルギー性疾患または喘息を有する対象は、既存のアレルギー性疾患または喘息の認識可能な症状を伴う対象である。例えば、アレルギー反応を誘発する特定の食物（例えば、ピーナッツタンパク質等）、注入される物質（例えば、ハチ毒タンパク質等）、または吸入される物質（例えば、ブタクサ花粉タンパク質、ペットのふけタンパク質等）と複合化した粒子によって、そのような対象に寛容を誘導することができる。
【０１６１】
ある特定の実施形態において、対象は、自己免疫疾患及び炎症性疾患等の不要な免疫活性化に関連する疾患に罹患する。自己免疫疾患または炎症性疾患を有する対象は、既存の自己免疫疾患または炎症性疾患の認識可能な症状を伴う対象である。例えば、特定の自己免疫疾患を駆動する関連自己抗原と複合化した粒子によって、そのような対象に寛容を誘導することができる。
【０１６２】
ある特定の実施形態において、対象は、酵素補充療法に関連する疾患に罹患する。例えば、特定の欠陥を治療するために投与される組換えによって生成された酵素に対して患者が中和抗体応答を示すのを阻止するために、遺伝的欠陥を有する患者が産生することができない酵素と複合化した粒子を用いてそのような対象に寛容を誘導することができる（例えば、第ＶＩＩＩ因子を産生する能力における遺伝的欠陥に起因して血友病に罹患する患者におけるヒト第ＶＩＩＩ因子に対する寛容）。
【０１６３】
ある特定の実施形態において、対象は、疾患の治療に関連する障害に罹患する。組換え抗体の場合、例えば、患者が抗体治療薬に対する中和抗体を形成するのを防ぐために治療状況において用いられるヒト化抗体に対して、寛容が誘導される（自己免疫疾患の治療薬として使用されるヒト化免疫サブセット枯渇抗体または抗サイトカイン抗体に対する寛容）。
【０１６４】
自己免疫疾患は、臓器特異性及び全身性の２つの幅広いカテゴリーに分類することができる。自己免疫疾患は、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、２型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、早期卵巣機能不全等の免疫媒介性不妊症、強皮症、シェーグレン病、白斑、脱毛症（禿頭症）、多腺性不全、グレーブス病、甲状腺機能低下症、多発性筋炎、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関連するものを含む自己免疫肝炎、下垂体機能低下症、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）、心筋炎、アジソン病、自己免疫皮膚疾患、ぶどう膜炎、悪性貧血、セリアック病、及び副甲状腺機能低下症を含む。
【０１６５】
自己免疫疾患はまた、限定されないが、橋本甲状腺炎、多腺性自己免疫症候群１型及び２型、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、線状ＩｇＡ病、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、小児慢性水疱性疾患、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、自己免疫好中球減少症、重症筋無力症、イートン・ランバート筋無力症症候群、全身硬直症候群、急性播種性脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、単クローン性免疫グロブリン血症を伴う慢性ニューロパチー、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、小脳変性症、脳脊髄炎、網膜症、原発性胆管硬化症、硬化性胆管炎、グルテン過敏性腸疾患、強直性脊椎炎、反応性関節炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、混合性結合組織疾患、ベチェット症候群、乾癬、結節性多発動脈炎、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症（チャーグ・ストラウス病）、多発性血管炎重複症候群、過敏性血管炎、ウェーゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、高安動脈炎、川崎病、中枢神経系の孤立性血管炎、閉塞性血栓血管炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、ならびに寒冷症も含む。これらの状態は、医学分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄ．，Ｆａｕｃｉ  Ａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，１９９８に記載されている。
【０１６６】
自己免疫疾患の研究のための動物モデルは当該技術分野で既知である。自己免疫疾患の研究のための動物モデルは、当該技術分野において既知である。例えば、ヒト自己免疫疾患に最も類似していると考えられる動物モデルは、高い発生率で特定の疾患を自然に発症する動物株を含む。そのようなモデルの例として、限定されないが、１型糖尿病に類似する疾患を発症する非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、ならびに狼瘡様疾患に罹患しやすい動物、例えば、ニュージーランドハイブリッド、ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ及びＢＸＳＢマウスが挙げられる。自己免疫疾患が誘導されている動物モデルは、限定されないが、ＥＡＥ（多発性硬化症のマウスモデル）、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ、関節リウマチのマウスモデル）、及び実験的自己免疫ぶどう膜炎（ＥＡＵ、ぶどう膜炎のマウスモデル）を含む。また、自己免疫疾患の動物モデルは、遺伝子操作によっても作製されており、例えば、炎症性腸疾患のＩＬ−２／ＩＬ−１０ノックアウトマウス、ＳＬＥのＦａｓまたはＦａｓリガンドノックアウト、及び関節リウマチのＩＬ−１受容チアアンタゴニストノックアウトを含む。
【０１６７】
ある特定の実施形態において、対象は感染症に罹患する。細菌、真菌、寄生虫、またはウイルス感染症を有する対象は、既存の細菌、真菌、寄生虫、またはウイルス感染症の認識可能な症状を伴う対象である。感染病原体は、限定されないが、細菌性、真菌性、寄生虫性、及びウイルス性病原体を含む。そのような感染病原体の例として以下が挙げられる：ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、大腸菌、連鎖球菌科、ナイセリア科、球菌、腸内細菌科、腸球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、クリプトコッカス、ヒストプラスマ症、コウジカビ、シュードモナス科、ビブリオ目、カンピロバクター、パスツレラ科、ボルデテラ、フランシセラ、ブルセラ、レジオネラ科、バクテロイデス科、グラム陰性桿菌、クロストリジウム、コリネバクテリウム、プロピオン酸菌、グラム陽性桿菌、炭疽菌、アクチノマイセス、ノカルジア、マイコバクテリウム、トレポネーマ、ボレリア、レプトスピラ、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、リケッチア、クラミジア、カンジダ、全身性真菌症、日和見真菌症、原虫、線形動物、吸虫、条虫、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス及びエプスタイン・バーウイルス、ならびに帯状疱疹ウイルスを含む）、ポックスウイルス、パポーバウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む）、パピローマウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、及びＣ型インフルエンザを含む）、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、及びレトロウイルス。例示的な感染性疾患は、限定されないが、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び中咽頭疾患、グラム陽性敗血症、結核、単核球症、インフルエンザ、呼吸器多核体ウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患、マラリア、住血吸虫症、及びトリパノソーマ症を含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、ウイルス感染症は、ヘルペスウイルス感染症、肝炎ウイルス感染症、ウエストナイルウイルス感染症、フラビウイルス、インフルエンザウイルス感染症、ライノウイルス感染症、パピローマウイルス感染症、パラミクソウイルス感染症、パラインフルエンザウイルス感染症、及び／またはレトロウイルス感染症である。好ましいウイルスは、対象の中枢神経系に感染するウイルスである。最も好ましいウイルスは、脳炎または髄膜炎を引き起こすものである。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、細菌感染症は、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、マイコバクテリア感染症、桿菌感染症、サルモネラ感染症、ビブリオ感染症、スピロヘータ感染症、及びナイセリア感染症である。好ましいのは、対象の中枢神経系に感染する細菌である。最も好ましいのは、脳炎または髄膜炎を引き起こすものである。
【０１７０】
本発明の他の実施形態は、移植に関する。移植は、ドナー対象からレシピエント対象への試料または移植片の移植を指し、組織によって提供される生理学的機能を回復するために組織を必要とするヒトレシピエントに対して頻繁に行われる。移植される組織は、（限定されないが）腎臓、肝臓、心臓、肺等の全臓器；皮膚移植片及び目の角膜等の臓器構成要素；ならびに骨髄細胞、及び骨髄または循環血液から選択及び展開される細胞の培養物等の細胞懸濁液、そして全血輸血を含む。
【０１７１】
宿主レシピエントと移植された組織との間の抗原性の違いから、任意の移植の重篤な潜在的合併症が起こる。その違いの性質及び程度に応じて、宿主による移植片の、または移植片による宿主の、またはその両方の免疫学的攻撃が起こり得るリスクが存在し得る。リスクの程度は、類似する表現型を有する同様に治療を受けた対象の集団における応答パターンを追跡し、広く認められている臨床手技に従って、考えられる種々の要因を相関させることによって決定される。免疫学的攻撃は、既存の免疫学的応答（予め形成されている抗体等）、またはほぼ移植の時期に始まった応答（ＴＨ細胞の産生等）の結果であり得る。抗体、ＴＨ細胞、またはＴＣ細胞は、互いとの、ならびに種々のエフェクター分子及び細胞との任意の組合せに関与し得る。しかしながら、免疫応答に関与する抗原は概して未知であり、したがって、抗原特異的治療法の設計または抗原特異的寛容の誘導は困難をきたす。
【０１７２】
本発明のある特定の実施形態は、レシピエントによる組織移植片の拒絶反応を引き起こす宿主対移植片病のリスク軽減に関する。治療は、超急性、急性、または慢性拒絶応答の影響を阻止または低減するために行われ得る。移植片が設置されたときに寛容ができているように、治療は移植の十分前に優先的に開始されるが、これが不可能である場合、治療は、移植と同時にまたは移植後に開始されてもよい。開始の時期に関わらず、移植は、一般的に、少なくとも移植後の最初の１ヶ月は規則的な間隔で継続する。追加投与は、移植片の十分な適応が起こる場合には必要ないかもしれないが、移植片の拒絶反応または炎症の何らかの証拠が見られる場合には再開され得る。当然のことながら、さらに低いレベルのリスクを達成するために、本発明の寛容化手順を他の形態の免疫抑制と組み合わせてもよい。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象において癌を治療する方法を提供する。本明細書における「癌」は、典型的には未制御な細胞増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の例として、限定されないが、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜腫、シュワン腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病、またはリンパ系腫瘍が挙げられる。そのような癌のより具体的な例として、扁平細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎性癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、シュワン腫、及び他の細胞腫、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本発明は、対象においてアレルギーを治療する方法を提供する。「アレルギー」は、本明細書で使用される場合、ＩｇＥによって媒介される全ての免疫反応、及びＩｇＥ媒介性反応を模倣する反応を含む。アレルギーは、ＩｇＥまたはＩｇＥ様免疫応答を引き起こす、タンパク質、ペプチド、炭水化物、及びそれらの組み合わせを含むアレルゲンによって誘導される。アレルギーは、食物アレルギー（例えば、ナッツ、牛乳、卵、魚、甲殻類、コムギ、または大豆アレルギー）を含む。例示的な食物アレルゲンは、ピーナッツのＡｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、及びＡｒａ  ｈ３エピトープ；セロリの１５ｋｄ抗原；リンゴ抗原Ｍａｌ  ｄ１；桃のＰｒｕ  ｐ３；ならびにグルテンのα−グリアジン及びγ−グリアジンエピトープを含む。アレルギーはまた、他の環境アレルギー（例えば、花粉、昆虫刺傷、ほこり、カビ、真菌アレルギー等）も含む。例示的な環境アレルゲンは、ツタウルシ及びオークのウルシオール；ハウスダスト抗原；カバノキ花粉成分Ｂｅｔ  ｖ１及びＢｅｔ  ｖ２；チモシー牧草花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ１；ホソムギのＬｏｌ  ｐ３、Ｌｏｌ  ｐＩ、またはＬｏｌ  ｐＶ；バミューダグラスのＣｙｎ  ｄ１；イエダニアレルゲンイエダニＤｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、またはＤｅｒｆ１；ハチ毒ホスホリパーゼＡ２；ならびにスギ花粉を含む。
【０１７５】
当業者には、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、記載される特徴及び実施形態の種々の修正、再構成、及び改変が明白であろう。特定の実施形態について記載してきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるものではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者には明らかな記載される様式及び実施形態の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【実施例】
【０１７６】
以下の実施例は、本発明の利点及び特徴をさらに例示するために提供されるのであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１７７】
実施例１．ペプチドエピトープを封入するＰＬＧ粒子の特徴付け
異なるペプチドエピトープを封入するＰＬＧ粒子の物理的特性及び機能的特性を決定するために実験を行った。寛容原性及び対照エピトープの一覧を図２に示す。一例として、ＰＬＰ１３９−１５１を封入するＰＬＧ粒子を生成し、光散乱によってサイズ分布及びゼータ電位を決定した。ＰＬＰ１３９−１５１を封入するＰＬＧ粒子のサイズ分布のピークは７４８．９ｎｍ、Ｚ平均サイズは８８２．６ｎｍであり、より大きな種の存在も示唆された（図３Ａ）。さらに、恐らく乳化剤としてポリ（エチレン−コ−マレイン酸）（ＰＥＭＡ）を使用したために、ＰＬＰ１３９−１５１を封入するＰＬＧ粒子は非常に高い負電荷を有していた（Ｚ電位＝−９７．５ｍＶ、図３Ｂ）。
【０１７８】
次いで、異なるペプチドエピトープを封入するＰＬＧナノ粒子が細胞増殖に与える影響を決定した。ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス（Ｏｖａ３２３に特異的なＴＣＲトランスジェニックマウス）からの２ｘ１０５脾細を、ＰＬＰ１３９−１５１（０．７３７ｎｇ／μｇ）もしくはＯｖａ３２３−３３９（１．７２９ｎｇ／μｇ）を個別に封入するＰＬＧナノ粒子、またはＰＬＰ１３９−１５１及びＯｖａ３２３−３３９を一緒に封入する（０．６１５ｎｇ／μｇ）ＰＬＧナノ粒子とともにインキュベートした。Ｏｖａ３２３（１μｇ）を用いてまたは用いずにナノ粒子及び脾細胞を播種し、２日間増殖させ、次いで、チミジンでパルス処理し、さらに３日間培養した。ナノ粒子の非存在下における細胞のＯｖａ３２３への曝露は、細胞増殖の増加をもたらした（図４Ｂ）。しかしながら、Ｏｖａ３２３−３３９を個別に封入するナノ粒子、またはＰＬＰ１３９−１５１及びＯｖａ３２３−３３９を一緒に封入するナノ粒子とともにＯｖａ３２３に曝露された細胞の処理は、細胞増殖を著しく減少させた（図４Ｂ）。Ｏｖａ３２３に曝露されなかった細胞は増殖しなかった（図４Ａ、陰性対照）。
【０１７９】
異なる量のＯｖａ３２３−３３９（１．１ｎｇ／μｇ、２３．１ｎｇ／μｇ、０．２ｎｇ／μｇ）を封入するナノ粒子、または全長Ｏｖａを封入するナノ粒子を使用して同様の実験を行った（図５）。培養物にＯｖａ３２３ペプチドを添加しない場合、最も多い量のＯｖａ３２３−３３９ペプチド（２３．１ｎｇ／μｇ）または全長Ｏｖａを封入するナノ粒子とともにインキュベートした細胞のみが増殖した（図５Ｂ）。さらに、最も多い量のＯｖａ３２３−３３９ペプチドを封入するナノ粒子は、２日目にＯｖａ３２３を培養物に添加したことによって誘導された増殖を阻害しなかった（図５Ｃ）。しかしながら、より少ない量のＯｖａ３２３−３３９（１．１ｎｇ／μｇ及び０．２ｎｇ／μｇ）を封入するより高い用量のナノ粒子は、Ｏｖａ３２３によって誘導された細胞増殖のレベルを減少させた（図５Ｃ）。培養物へのαＣＤ２８の添加が細胞増殖に著しい影響を与えなかったことから、Ｏｖａ３２３に応じた増殖は抗原特異的であったことが示唆される。これらの結果は、ペプチドエピトープを封入するナノ粒子が抗原誘導性細胞増殖を調節できることを示唆するものである。
【０１８０】
さらに、様々なペプチドエピトープをナノ粒子に封入することができる。例えば、図６及び図７は、寛容原性及び対照ペプチドエピトープの封入効率をそれぞれ示す。ペプチドエピトープは、個別にまたは一緒に封入され得る。予め重量を計測した試験管にバッチを等分し、乾燥させ、重量を測定して、予め重量を計測した試験管中の粒子の質量（ｍｇ／試験管）を決定した。μｇペプチド／ｍｇ粒子を３−（４−カルボキシベンゾイル）キノリン−２−カルボキシアルデヒド（ＣＢＱＣＡ）タンパク質定量化アッセイを使用して決定した。
【０１８１】
実施例２．ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドエピトープを封入するナノ粒子は１型制御性Ｔ細胞集団を調節する
ペプチドエピトープを封入するナノ粒子が異なる細胞集団に与える影響を評価するために、ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイを使用して実験を行った。端的に述べると、−２日目に、ＰＬＰ１３９−１５１ＴＣＲトランスジェニックマウス（５Ｂ６マウス、ドナー、Ｔｈｙ１．１＋）からの３．５ｘ１０６  ＣＤ４＋細胞を、ナイーブな６〜８週齢の雌ＳＪＬレシピエントマウスの静脈内に移入した。０日目に、ＳＪＬレシピエントマウスに、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥを封入するＰＬＧナノ粒子またはＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ（対照粒子）を封入するＰＬＧナノ粒子のいずれかを注入した。注入後３日目及び５日目に、レシピエントマウスから脾臓を採取し、フローサイトメトリーにより制御性Ｔ細胞集団を分析した（図８）。全ての集団のＣＤ９０．１／Ｔｈｙ１．１＋細胞にゲートをかけてＰＬＰ１３９−１５１−ＴＣＲ＋集団を選別した。
【０１８２】
３日目（図８Ａ、左パネル）及び５日目（図８Ａ、右パネル）にＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧまたはＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧを注射したマウスにおいてＬａｇ３＋ＦｏｘＰ３−細胞に最初にゲートをかけることにより、１型制御性Ｔ細胞（ＴＲ１）の割合を決定した。３日目には、Ｌａｇ３＋ＦｏｘＰ３−集団において差は観察されなかった。しかしながら、５日目までに、ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧを注入した動物において、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ対照と比較して明らかなＬａｇ３＋  ＦｏｘＰ３−集団の増加が見られた。これらの細胞はまた、大部分がＩＦＮγ＋ＩＬ−１０＋であることから、それらがＴＲ１表現型を有することが示唆される（図８Ａ、下パネル）。Ｌａｇ３＋ＦｏｘＰ３−細胞の数の定量化により、ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧ処理マウスとＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ処理マウスとの間に差がないことが示された。しかしながら、ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧ処理マウスは、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧ処理対照と比較して、抗原特異的ＴＲ１細胞（ＬＡＧ３＋ＦｏｘＰ３−ＩＦＮγ＋ＩＬ−１０＋）の数に著しい増加を示した。ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧまたはＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧの注入後３日目、５日目、及び７日目に、採取した脾臓を用いて同様の実験を行った（図９）。図８の結果と同様に、ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧで処理したマウスにおいてＴＲ１細胞の数が著しく増加した。これらのデータは、ペプチドエピトープを封入するＰＬＧナノ粒子が制御性Ｔ細胞の数を増加させることを実証するものであり、寛容誘導における潜在的な治療的役割が示唆される。
【０１８３】
同じプロトコルに従って別の実験を行い、フローサイトメトリーにより脾臓の制御性Ｔ細胞を分析した。上述のようにＣＤ９０．１／Ｔｈｙ１．１（ＰＬＰ１３９−１５１ＴＣＲ＋）集団の細胞にゲートをかけ、制御性Ｔ細胞マーカーＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＮＰ１、及びＩＦＮγの発現について分析した。図１０に示すように、ＰＬＰ１３９−１５１−ＰＬＧの注入は、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋、Ｈｅｌｉｏｓ＋ＮＰ１＋、及びＩＦＮγ＋制御性Ｔ細胞集団の数を増加させた。これらの結果は、ペプチドエピトープを封入するＰＬＧナノ粒子が寛容誘導において潜在的な治療的役割を有するという結論をさらに支持するものである。
【０１８４】
ペプチドエピトープを封入するＰＬＧナノ粒子が疾患の活性を調節する能力を、多発性硬化症のマウスモデルであるＥＡＥにおいて試験した。端的に述べると、−２日目に、５Ｂ６ドナーからの３．５ｘ１０６  ＣＤ４＋細胞を、ナイーブな６〜８週齢の雌ＳＪＬマウスの静脈内に移入した。０日目に、ＳＪＬレシピエントマウスにＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧまたは対照ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧのいずれかを注入した。注入から＋３日目及び＋５日目に、マウスから脾臓を採取した。７日目に別のコホートでＥＡＥを誘導し、誘導後５日目及び１７日目に、分析のためにこれらのマウスから脾臓を採取した。次いで、脾臓のＴ細胞集団をフローサイトメトリーによって分析した。細胞集団はＣＤ９０．１／Ｔｈｙ１．１（ＰＬＰ１３９−１５１  ＴＣＲ＋）集団にゲートをかけた（図１１Ａ）。図示されるように、ＥＡＥ及び非ＥＡＥマウスの両方において、後の時点で、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧの注入が、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧを注入した対照と比較して抗原特異的Ｔ細胞の数を著しく増加させた（図１１Ａ）。さらに、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧの注入は、ＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧを注入した対照と比較して、増殖する抗原特異的Ｔ細胞の数（図１１Ｂ）及び抗原特異的制御性Ｔ細胞の数を著しく増加させた（図１１Ｃ）。非抗原特異的制御性Ｔ細胞の数に著しい差は見られなかった（図１１Ｄ）。これらの結果は、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧが抗原特異的Ｔ制御性細胞の増殖増加をもたらしたことを示しており、ペプチドエピトープを封入するナノ粒子が自己免疫のモデルにおいて寛容原性応答を媒介することが示唆される。
【０１８５】
実施例３．ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドエピトープを封入するナノ粒子は１型制御性Ｔ細胞集団を調節する
ＯＶＡ３２３−３３９ＴＣＲドナー（ＤＯ１１マウス）からの２．５ｘ１０６  ＣＤ４＋細胞を、６〜８週齢のナイーブなメスＢａｌｂ／ｃ  ＲＡＧ  ＫＯレシピエントマウスの静脈内に移入して、相補的実験を行った。移入の２週間後、レシピエントマウスにＯＶＡ３２３−３３９−ＳＥ  ＰＬＧまたはＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧ（対照）のいずれかを注入した。注入後にマウスから脾臓を採取し、フローサイトメトリーにより制御性Ｔ細胞集団を分析した（図１２）。細胞集団はＤＯ１１−ＴＣＲ＋集団にゲートをかけた。図示されるように、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧを注入した対照と比較して、ＯＶＡ３２３−３３９−ＰＬＧを注入した動物からのＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞の割合（図１２Ａ）及び合計数（図１２Ｂ）の両方に著しい増加が見られた。同様の実験において、ＩＦＮγを産生する抗原特異的制御性Ｔ細胞の割合（図１３Ａ）及び数（図１３Ｂ）も、ＰＬＰ１３９−１５１−ＳＥ  ＰＬＧを注入した対照と比較して、ＯＶＡ３２３−３３９−ＰＬＧを注入した動物において著しく増加した。ＩＦＮγ＋非制御性Ｔ細胞の数には、実験群と対照群との間に著しい差は見られなかった（図１３）。さらに、ＤＯ１１ドナーからのＴＲ１集団の割合（図１４Ａ）及び数（図１４Ｂ）の増加には、ＳＪＬマウスから単離した５Ｂ６  ＣＤ９０．１＋ＴＲ１細胞に見られた傾向と同様の傾向が見られた。
【０１８６】
また、増殖する抗原特異的細胞の数（図１５Ａ）、増殖する抗原特異的Ｔ制御性細胞の数（図１５Ｂ）、及び増殖する抗原特異的ＴＲ１細胞の数（図１５Ｃ、別の実験から、ＦｏｘＰ３−として確認されていない）にも増加が見られた。これらの結果は、実施例２における５Ｂ６移入実験と同様に、ペプチドエピトープを封入するＰＬＧナノ粒子が制御性Ｔ細胞集団の増加を制御することを示しており、寛容の誘導における役割を示唆するものである。
【０１８７】
実施例４．ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドを封入するナノ粒子の特徴付け
カテプシン特異的切断部位を含むペプチドリンカーによって結合されたＰＬＰ１３９−１５１及びＯＶＡ３２３−３３９エピトープの融合ペプチドを生成した（図１６、ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチド）。ＤＯ１１．１０（図１７Ａ）または５Ｂ６（図１７Ｂ）トランスジェニックマウスからの２ｘ１０５脾細胞を様々な量のＯＶＡ３２３−３３９、ＰＬＰ１３９−１５１、ＯＶＡ３２３−３３９＋ＰＬＰ１３９−１５１、またはＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチド（リンカー）とともに播種し、細胞増殖を評価した。ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドは、ＤＯ１１細胞でＯＶＡ３２３−３３９及び５Ｂ６細胞でＰＬＰ１３９−１５１によって誘導された応答に匹敵する細胞増殖を誘導した。これらの結果は、エピトープ単独または組み合わせのいずれかと同様に、融合タンパク質が細胞応答を調節することが可能であることを示唆するものである。
【０１８８】
ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドを封入するナノ粒子の物理的特性（Ｚ平均直径、ＰＤＩ、ピーク直径、及びゼータ電位）を動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した（図１８）。Ｚ平均直径は、３回の試行にわたって１２０３〜３３１６ｎｍの範囲であり、ゼータ電位は−９５〜−１１５ｍＶであった。カーボンでコーティングした銅メッシュ網上で粒子を乾燥させ、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して、ナノ粒子の画像も得た（図１８）。
【０１８９】
ナノ粒子が細胞増殖に与える影響は、２ｘ１０５  ＤＯ１１脾細胞を１〜１００μｇのナノ粒子（ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合物、ＰＬＰ１３９−１５１、またはＯＶＡ３２３−３３９を封入するナノ粒子）とともに播種することによって評価した。細胞を２日間増殖させ、次いで、チミジンでパルス処理し、さらに３日間培養した。ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合物またはＯＶＡ３２３−３３９封入ナノ粒子のいずれかを用いた細胞の処理は、未処理の対照と比較して細胞増殖の増加をもたらした（図１９Ａ）。２日目に１μｇのＯｖａ３２３（図１９Ｂ）または１μｇのＯｖａ３２３及び１μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（図１９Ｃ）を培養物に添加したときに同様の結果が観察された。
【０１９０】
５Ｂ６脾細胞を用いて相補的実験を行った（図２０）。２ｘ１０５  ５Ｂ６脾細胞を播種し、２日間増殖させ、次いで、チミジンでパルス処理し、さらに３日間培養した。ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合物またはＰＬＰ１３９−１５１のいずれかを封入するナノ粒子を用いた細胞の処理は、未処理の対照またはＯＶＡ３２３−３３９を封入するナノ粒子を用いて処理した細胞と比較して、より高い用量で細胞増殖の増加をもたらした（図２０Ａ）。２日目に１μｇのＰＬＰ１３９（図２０Ｂ）または１μｇのＰＬＰ１３９及び１μｇ／ｍＬのαＣＤ２８（図２０Ｃ）を培養物に添加したときに同様の結果が観察された。これらのデータは、結合エピトープタンパク質融合物が免疫原性であることを実証するものであり、それらが単一エピトープ単独と比較して免疫調節の可能性を増加させたことを示唆している。
【０１９１】
図２１に示すように、融合タンパク質は、ナノ粒子に効率的に封入することができる。予め重量を計測した試験管にバッチを等分し、乾燥させ、重量を測定して、予め重量を計測した試験管中の粒子の質量（ｍｇ／試験管）を決定した。μｇペプチド／ｍｇ粒子をＣＢＱＣＡタンパク質定量化アッセイを使用して決定した。
【０１９２】
実施例５．ＰＬＰ１３９−Ｏｖａ３２３融合ペプチドを封入するナノ粒子はＥＡＥにおいて寛容原性応答を媒介する
ＥＡＥのモデルにおいてＰＬＰ１３９−ＯＶＡ３２３融合タンパク質を封入するナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏでの影響を決定するために実験を行った。アジュバントに乳化したＰＬＰ１３９−１５１ペプチドエピトープまたはＰＬＰ１３９−ＯＶＡ３２３融合タンパク質を用いた免疫化によりＳＬＪマウスにおいてＥＡＥを誘導した（群当たりＮ＝５）。図２２Ａに示すように、ＰＬＰ１３９−ＯＶＡ３２３融合タンパク質を用いた免疫化は、ＥＡＥを誘導するのに十分であった。結果として得られた疾患スコアの大きさは、ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドによる免疫化によって誘導されたものに匹敵するものであった（図２２Ａ）。図２２→ＰＬＰ−ＯＶＡ結合ＥＡＥスコア。ＰＬＰ−ＯＶＡ結合ペプチドは、疾患を誘導し、ＰＬＧＡナノ粒子に封入されると寛容を誘導する。重要なのは、封入されたＰＬＰ−ＯＶＡ融合タンパク質（ＰＬＰ−ＯＶＡ）の投与がＥＡＥ疾患スコアの抑止をもたらしたということである（図２２Ａ）。さらに、封入されたＰＬＰ−ＯＶＡ融合タンパク質が、ＰＬＰで免疫化したＳＬＪマウスの免疫応答のみを低減させ、ＭＯＧペプチドによる免疫化によって誘導された免疫応答には影響を与えなかったことから、この免疫調節は抗原特異的であった（図２２Ｂ）。これらの結果は、結合エピトープ融合ペプチドを封入するナノ粒子が抗原特異的な様式で寛容原性免疫応答を誘導することを示唆するものである。
【０１９３】
実施例６．マルチエピトープ融合ペプチドを封入するナノ粒子の特徴付け
カテプシン特異的切断部位を含むペプチドリンカーによって結合されたＰＬＰ  ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１、ＭＯＧ９２−１０６、及びＭＢＰ８４−１０４エピトープの融合ペプチドを生成した（図２３Ａ、寛容原性ＥＡＥ−１融合ペプチド）。さらに、カテプシン特異的切断部位を含むペプチドリンカーによって結合されたＯＶＡ３２３−３３９、ＰＬＰ５６−７０、ＶＰ１２３３−２５０、及びＶＰ２７０−８６エピトープを含む対照融合ペプチドも生成した（図２３Ｂ、ＥＡＥ−１対照融合ペプチド）。寛容原性融合ペプチドを封入するナノ粒子の物理的特性（Ｚ平均直径、ＰＤＩ、ピーク直径、及びゼータ電位）をＤＬＳにより決定した。粒子の画像は、カーボンでコーティングした銅メッシュ網上で粒子を乾燥させ、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して得た。ＤＬＳ及びＥＭの両方のデータが、通常よりもサイズ分布が大きいことを示唆している（図２４）。
【０１９４】
寛容原性融合ペプチドまたは陰性対照融合ペプチドの封入効率を図２５に示す。予め重量を計測した試験管にバッチを等分し、乾燥させ、重量を測定して、予め重量を計測した試験管中の粒子の質量（ｍｇ／試験管）を決定した。μｇペプチド／ｍｇ粒子をＣＢＱＣＡタンパク質定量化を使用して決定した。
【０１９５】
単一エピトープ及び結合エピトープのＰＬＧＡナノ粒子への封入を図２６に示す。一方向ＡＮＯＶＡ統計検定（ｐ＜０．０００１）によって決定されるように、単一のミエリン特異的Ｔ細胞エピトープ（ＰＬＰ１３９、ＰＬＰ１７８、ＭＢＰ８４、及びＭＯＧ９２）を、結合したＥＡＥ−１ペプチド（ＰＬＰ１３９：ＰＬＰ１７８：ＭＯＧ９２：ＭＢＰ）よりも低い効率で封入した。同様に、個々の対照エピトープ（Ｏｖａ３２３、ＰＬＰ５６、ＶＰ１２３３、及びＶＰ２７０）を、結合したＥＡＥ−対照エピトープ（ＯＶＡ３２３：ＰＬＰ５６：ＶＰ１：ＶＰ２）よりも低い効率で封入した。
【０１９６】
実施例７．マルチエピトープ融合ペプチドを封入するナノ粒子の特徴付け
ＥＡＥモデルにおいて、結合したＥＡＥ−１融合ペプチド（ＰＬＰ１３９：ＰＬＰ１７８：ＭＯＧ９２：ＭＢＰ）を封入するＰＬＧＡナノ粒子の影響を決定するために実験を行ったところ、無関係な対照ペプチド（ＯＶＡ）または対照結合エピトープ（ＯＶＡ３２３：ＰＬＰ５６：ＶＰ１：ＶＰ２）と比較して、ＥＡＥ疾患において著しい低減をもたらした。封入された結合ＥＡＥ−１融合ペプチドを用いたマウスの処理は、対照融合ペプチドまたは無関係な対照ペプチド（ＯＶＡ）を用いた処理と比較してＥＡＥ疾患スコアを著しく減少させた（図２８）。これらのデータは、複数の結合した疾患エピトープを含む融合ペプチドが自己免疫モデルにおいて寛容を誘導することができることを実証するものであり、それらの治療的可能性を示唆している。図２９は、ＦＡＬＫペプチドもまたＥＡＥを誘導することができることを示しており、このタンパク質中に見られるエピトープも寛容原性ＥＡＥ融合タンパク質に組み込まれ得ることが示唆される。
【０１９７】
実施例８．癌の治療における封入された結合エピトープ融合タンパク質の使用
ネオ抗原または腫瘍抗原の結合エピトープを含む融合ペプチドも癌の治療に使用される。そのようなエピトープは、治療効果を増大するためにＰＤ１等の免疫調節因子またはＴｏｌｌ様受容体アゴニストと組み合わされる（図２９を参照のこと）。データは、抗ＰＤ１等の免疫調節因子とともに送達されるＮｙ−Ｅｓｏ１等の封入された癌抗原が、Ｔ細胞増殖（図３１Ａの例示的な結果を参照のこと）、ＩＦＮγ産生（図３１Ｂの例示的な結果を参照のこと）、及びＩＦＮα産生（図３１Ｃの例示的な結果を参照のこと）をもたらすことを示している。これらの結果は、封入された癌抗原が免疫原性応答を媒介し、炎症促進性サイトカインの産生をもたらすことを示している。
【０１９８】
さらに、封入されたＮｙ−Ｅｓｏ１は、黒色腫のマウスモデルにおいてマウスの生存率を増加させた。封入されたＮＹ−ＥＳＯ−１（ＴＩＭＰ−ＮＹ−ＥＳＯ−１）の０．０１ｍｇ／Ｋｇ輸液を１ヶ月に２回（７日間間隔を空けて）、６ヶ月間投与する。ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１の阻害は、ペンブロリズマブまたはニボルマブまたはアテゾリズマブによって達成される。ＴＩＭＰ−ＮＹ−ＥＳＯ−１処理単独は、生存期間を延長するのに十分であり、抗ＰＤ１処理と組み合わせたるとその効果が増強される（図３２の例示的な結果を参照のこと）。
【０１９９】
結合癌エピトープ（ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍａｇｅ−Ａ３、ＴＰＴＥ、チロシナーゼ、ＨＰＵ１６）を含む融合ペプチドが以前に記載されている（Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖ．５３４，ｐｐ  ３９６−４０１，２０１６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０１１−００７０２５２を参照のこと）。４つの癌エピトープ（ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍａｇｅ−Ａ３、ＴＰＴＥ、チロシナーゼ）を含む融合タンパク質を生成してＮＭＴＴ融合タンパク質を形成する。種々の濃度の封入されたＮＭＴＴ（ＴＩＭＰ−ＮＭＴＴ）を、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１処理を用いてまたは用いずに、健常な対象からの末梢血単球（ＰＢＭＣ）とともにインキュベートした。培養物を３〜５日間インキュベートし、ｃｅｌｌ−ｔｉｒｅ  ｇｌｏｗまたはトリチウム標識したチミジンの取り込みを用いてＴ細胞増殖を決定する。ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮγ濃度を決定する。抗ＰＤ１／ＰＤＬ１と組み合わせたＴＩＭＰ−ＮＭＴＴとともにＰＢＭＣをインキュベーションすることにより、対照と比較してＴ細胞増殖の増加がもたらされる（図３３Ａの例示的な結果）。さらに、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１と組み合わせたＴＩＭＰ−ＮＭＴＴは、ＰＢＭＣからＩＦＮγの産生をもたらす一方で、ＴＩＭＰ−ＮＹ−ＥＳＯ−１単独ではほとんど影響を及ぼさない。これらの結果は、癌エピトープの封入された融合タンパク質が、癌治療の状況において有益な免疫原性応答を媒介することを示している。
【０２００】
ＴＩＭＰ−ＮＭＴＴの臨床効果を決定するために、ＧＭＰの下で専用の薬局においてＧＭＰに従って製造された成分からＴＩＭＰ−ＮＭＴＴをコードする腫瘍抗原を調製する。患者に、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１４９、チロシナーゼ５０、ＭＡＧＥ−Ａ３５１、及びＴＰＴＥ５２をコードする毎週漸増する用量のＴＩＭＰ−ＮＭＴＴ（１．９、３．６、または７．２μｇの各抗原のＴＩＭＰ−ＮＭＴＴ）を静脈内注射する。ＥＬＩＳＰＯＴ及びＭＨＣクラスＩ  Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ染色分析のために、ワクチン接種の前、１日目のワクチン接種後２、６、及び２４時間、ならびにワクチン接種後８日目及び１５日目に、サイトカイン測定用の血液試料を採取する。各ワクチン接種日のワクチン投与前に、Ｔ細胞モニタリングのための血液試料を得る。臨床的に投与されたＴＩＭＰ−ＮＭＴＴワクチンは、全身のＩＮＦα及びデノボＴ細胞応答を用量依存的に誘導する。
【０２０１】
実施例９．封入された結合エピトープ融合タンパク質のさらなる使用
結合エピトープを含むさらなる融合タンパク質が生成されてもよい。例えば、複数の疾患の種類に由来するエピトープを含む融合タンパク質を生成して１つより多くの疾患の治療に使用することができる。代替として、ＴＬＲアゴニストをさらに含む疾患関連エピトープを含む融合タンパク質が生成されてもよい。そのようなアゴニストの包含は、タンパク質の免疫原性を増加させ、治療効果を増大させる。感染性ウイルス、細菌、または真菌に由来するエピトープを用いてさらなる融合タンパク質が生成されてもよい。そのような構築物に対するＴＬＲアゴニストの添加もまた、治療効果を増大させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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