(57)【要約】以下のステップ：（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、（ｉｉ）少なくとも１のプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質を含む発現系を含むベクターを調製すること、（ｉｉｉ）原核細胞のゲノム中の特定のＤＮＡ配列を標的とするために該原核細胞中へ該ベクターを導入することを含む、原核生物のゲノムを操作する、および／または編集するための方法が提案される。
2019500036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、
（ｉｉ）少なくとも１のプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質を含む発現系を含むベクターを調製すること、
（ｉｉｉ）該原核細胞のゲノム中の特定のＤＮＡ配列を標的とするために、該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物のゲノムを操作する、および／または編集するための方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、
（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ末端に結合している少なくとも１のタンパク質、
（ｂ）ＤＮＡリガーゼ活性を有する少なくとも１のタンパク質
を含むＤＮＡ二本鎖切断修復システムのための発現カセットを含むベクターを調製すること、
（ｉｉｉ）該原核細胞のゲノム中で請求項１に記載の二本鎖ＤＮＡ切断の導入を可能にするために、該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物における再構築されたＤＮＡ末端修復のための方法。
【請求項３】
以下のステップ：
（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、
（ｉｉ）少なくとも１のタイプの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計すること、ここで、該ｓｇＲＮＡの１０〜５０ヌクレオチド（ｎｔ）ガイド配列は、該原核細胞の少なくとも１の遺伝子の翻訳開始コドンの上流の非コーディングおよび／または推定上の調節領域内の所望の範囲に対して相補的である；
（ｉｉｉ）（ａ）少なくとも１のプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質、
（ｂ）少なくとも１の修飾されていてもよいｓｇＲＮＡ；および、
（ｃ）少なくとも１のＤＮＡ末端結合性タンパク質
を含む発現カセットを含むベクターを調製すること；および、
（ｉｖ）標準的な方法（例えば、化学変換、エレクトロポレーション、接合、形質導入）により、該原核細胞の培養物を該ベクターで形質転換して、該ｓｇＲＮＡの１０〜５０ｎｔガイド配列またはＴＡＬ−もしくはＺｎ−フィンガータンパク質のようなタンパク質をベースとしたヌクレアーゼに対して相補的なＤＮＡ配列の存在についてゲノムを標的化すること
を含む、原核生物における再構築されたＤＮＡ末端修復のための方法。
【請求項４】
原核細胞が細菌に属する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ベクターがプラスミドまたはファージＤＮＡである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
形質転換、形質導入または接合によってベクターが原核細胞中へ導入される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項７】
プログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質が、Ｚｎ−フィンガー、ＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＲＮＡ依存ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項８】
プログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質が、クラス２タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムに属するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質の群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質がＣａｓ９またはＣｒｆ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ末端修復タンパク質が、その一次配列中で原核生物のタンパク質Ｋｕ、および／またはＬｉｇＤに対して少なくとも３０％同一性を示しているタンパク質からなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ末端修復タンパク質が、グラム陽性細菌によりコードされるタンパク質Ｋｕおよび／またはＬｉｇＤからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ末端修復タンパク質が、マイコバクテリアによりコードされるタンパク質Ｋｕおよび／またはＬｉｇＤからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ末端修復タンパク質が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによりコードされるタンパク質Ｋｕおよび／またはＬｉｇＤからなる群から選択される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）少なくとも１のＣａｓ９、修飾Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質、
（ｂ）少なくとも１の修飾されていてもよいｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ；および、
（ｃ）タンパク質Ｋｕおよび／またはＬｉｇＤ
を含む発現系。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現系を含む、または、からなるベクター。
【請求項１６】
請求項１、２または３に記載の方法を含む、原核生物中での遺伝子ノックアウト、欠失、置換、編集、および／またはゲノムワイドノックアウトスクリーニングのための方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ二本鎖切断の導入を介して働くプログラム可能なヌクレアーゼと組み合わせた、原核生物中での遺伝子機能の破壊（ノックアウト）、遺伝子座の欠失またはＤＮＡ要素の挿入のような、原核生物におけるゲノム操作および編集、特に原核生物ゲノムの標的修飾のための方法における、ＤＮＡ末端結合性および修復タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、原核生物におけるゲノム操作および編集、とりわけ、プログラム可能なヌクレアーゼと組み合わせて原核生物中のＤＮＡ末端修復システムを再構築するためのベクターシステムを使用し得る遺伝子機能の破壊（ノックアウト）、遺伝子座の欠失またはＤＮＡ要素の挿入のような原核生物ゲノムの標的修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
当該分野の状況
標的ゲノム操作および編集は、目的の遺伝子座で正確なＤＮＡ開裂を導入する能力および開裂部位を修復する宿主細胞の能力に依存する。該開裂部位に隣接するＤＮＡ配列を修飾するために、目的の特異的遺伝子座で二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の正確な導入を可能にする数個のプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質が開発されてきた。かかるプログラム可能なＤＮＡ切断酵素の例は、Ｚｎ−フィンガーまたはＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を包含する（１、２）。真核生物中で、ＤＳＢは、内因性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）経路のいずれかによって修復される。ＮＨＥＪ経路において、ＤＮＡ切断は、リガーゼを該開裂部位に動員するＤＮＡ末端結合性タンパク質Ｋｕを包含するタンパク質のセットにより酵素的に封じられる。ヘテロ二量体Ｋｕタンパク質は、とりわけ、ＤＮＡ末端に結合し、ＤＮＡ末端シナプスの形成およびＤＮＡリガーゼを包含する組換えタンパク質の動員を促進することによりＤＳＢの修復を仲介する。ＮＨＥＪ修復は、本質的に誤りがあり、２、３個の塩基の欠失または挿入を引き起こす。これらのｉｎｄｅｌ（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ）（挿入−欠失）変異は、修復部位がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内にある場合、フレームシフト変異を引き起こし、故に、タンパク質コーディング遺伝子をノックアウトすることができる（２）。故に、目的の遺伝子をノックアウトする簡単な方法は、誤りが発生しやすいＮＨＥＪ経路を誘導するために、プログラム可能なＤＮＡ切断タンパク質を用いてそのＯＲＦ内にＤＳＢを導入することである。
【０００３】
ほとんどの原核生物中でのＮＨＥＪ修復タンパク質の不足のため、ＤＳＢは、ＤＳＢに隣接する相同配列を含有するドナー鋳型ＤＮＡの存在を必要とする相同修復経路により修復されなければならない（３〜５）。その他の点では、ゲノムＤＮＡ中に導入されたＤＳＢ（自己標的性）は、原核生物宿主の死を引き起こす（３）。故に、原核生物中の標的遺伝子修飾のためのＣａｓ９、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガータンパク質のようなＤＮＡ切断酵素の使用は、相同組換えシステムに結びつけられ、各標的ＤＮＡ部位のための相同組換え鋳型を提供することを必要とする。これは、多重ゲノム編集およびゲノム−ワイド  ノック−アウト（ＧｅＣＫＯ）スクリーニングのようなとりわけ多用途のＣＲＩＳＰＲをベースとした方法の適用可能性を制限する（６）。実際、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術は、ゲノム操作のための今日の最も有望なツールであり、多くの真核生物モデル生物中でともに適用可能な、
単一細胞中で多重遺伝子修飾を同時に行う能力、および、
ゲノム−ワイド「機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」スクリーニングアッセイのためのＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡライブラリの適用
を提供する。
【０００４】
両方の方法は、ＮＨＥＪ経路の欠損のため、原核生物へ転用することができない。原核生物中のＤＮＡ末端修復経路を再構築する方法は、原核生物中でのＣａｓ９をベースとしたゲノム操作／編集およびゲノム−ワイドスクリーニングアッセイの適応性を可能にするだろう。
【０００５】
故に、原核生物中でのゲノム操作および編集技術の適用を可能にし得る、原核宿主細胞中のＤＮＡ末端修復経路を再構築するベクターシステムおよび方法を開発するための緊急の要望がある。
【０００６】
本発明の目的は、原核生物中のＤＮＡ末端修復システムを再構築するために、ＮＨＥＪおよびＮＨＥＪ様修復経路の利用により原核生物におけるこの制限を克服すること、
ＤＳＢにより引き起こされる細胞死を防ぐこと、および、
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のようなプログラム可能なＤＮＡ開裂性タンパク質により生み出されるＤＳＢの（誤りのある）修復を可能にすること
にある。
【発明の概要】
【０００７】
発明の説明
本発明の客体は、以下のステップ：
（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、
（ｉｉ）少なくとも１のプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質を含む発現系を含むベクターを調製すること、
（ｉｉｉ）該原核細胞のゲノム中の特定のＤＮＡ配列を標的とするために該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物（細菌または古細菌）のゲノムを操作する、および／または編集するための方法である。
【０００８】
より詳細には、該方法は、以下のステップ：
（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、
（ｉｉ）（ａ）ＤＮＡ末端に結合している少なくとも１のタンパク質、
（ｂ）ＤＮＡリガーゼ活性を有する少なくとも１のタンパク質
を含むＤＮＡ二本鎖切断修復システムのための発現カセットを含むベクターを提供すること、
（ｉｉｉ）該原核細胞のゲノム中で請求項１に記載の二本鎖ＤＮＡ切断の導入を可能にするために、該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む。
【０００９】
さらにより好ましい実施形態は、以下のステップ：
（ｉ）原核細胞の培養物を提供すること、
（ｉｉ）少なくとも１のタイプの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計すること、ここで、該ｓｇＲＮＡの１０〜５０ヌクレオチド（ｎｔ）ガイド配列は、該原核細胞の少なくとも１の遺伝子の翻訳開始コドンの上流の非コーディングおよび／または推定上の調節領域内の所望の範囲に対して相補的である；
（ｉｉｉ）（ａ）少なくとも１のプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質、
（ｂ）少なくとも１の修飾されていてもよいｓｇＲＮＡ；および、
（ｃ）少なくとも１のＤＮＡ末端結合性タンパク質
を含む発現カセットを含むベクターを調製すること；および、
（ｉｖ）標準的な方法（例えば、化学変換、エレクトロポレーション、接合または形質導入）により、該原核細胞の培養物を該ベクターで形質転換して、該ｓｇＲＮＡの１０〜５０ｎｔガイド配列またはＴＡＬ−もしくはＺｎ−フィンガータンパク質のようなタンパク質をベースとしたヌクレアーゼに対して相補的なＤＮＡ配列の存在についてゲノムを標的化すること
を含む方法である。
【００１０】
この関連で、本願の優先日後である２０１６年１１月２４日に発行された、Ｔ．Ｓｕらによる「Ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｎｄ−Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ」という題名の論文（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６：３７８９５／ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３７８９５）が引用される。著者らは、相同組換え独立様式における、選択的マーカーを用いることのない、細菌遺伝子の迅速かつ効率的な不活性化のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アシスト非相同末端結合（ＣＡ−ＮＨＥＪ）戦略を記載する。本研究によると、相同ＤＮＡ鋳型を必要とすることなく、単一工程で大きい染色体ＤＮＡフラグメントを欠失させるために、ＣＡ−ＮＨＥＪを使用することができる。明らかに、該論文は、同じ課題に言及し、類似の解決法を提供し、故に、提案された技術的教示は有効であるという追加の証明を提供する。
【００１１】
本発明の簡単な説明
【００１２】
原核細胞の培養物をプラスミドベクターで形質転換するために、化学変換、エレクトロポレーション、接合または形質導入のような当該分野において既知の一般的な方法を適用することができる。該ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミドまたはウイルスであることができる。
【００１３】
ほとんどの原核生物種は、ＮＨＥＪ経路に関与する真核性タンパク質に対して機能的類似性を示す遺伝子を含有しない。よく知られた例は、２つのタンパク質Ｋｕ（ＭｔＫｕ）およびＬｉｇＤ（ＭｔＬｉｇＤ）により仲介される、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおけるＮＨＥＪ様経路である。プログラム可能なＤＮＡ切断酵素を用いる場合、原核生物中でのＤＮＡ末端の修復を誘導する意図を証明するために、発明者らは、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ中の自己標的性Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質の毒性に対するＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤの効果を分析した。この目的のために、発明者らは、２つのベクター、１つは、Ｃａｓ９タンパク質をコードするもの（ｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ、図１Ａ）および、もう１つは、Ｃａｓ９、ＭｔＬｉｇＤおよびＭｔＫｕタンパク質をコードするもの（ｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ、図１Ｂ）を設計した。両方のベクターは、プロモーターＰｓａｃＢ由来のｓｇＲＮＡの転写のための発現カセットも含む。制限酵素Ｂｂｓｌを用いて、Ｃａｓ９タンパク質による開裂部位を決定する、両方のベクター上のｓｇＲＮＡの最初の２０ヌクレオチドを修飾することができる。
【００１４】
本発明の基礎をなす課題を解決するために、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉのｕｐｐ遺伝子に誘導するベクターｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡおよびｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ中へ、ガイド配列は挿入された（７）。ｕｐｐ遺伝子は不可欠ではないため、ｕｐｐ標的性Ｃａｓ９の毒性は、細胞生存能力それ自体に対するＤＳＢの有害な効果を示すであろう。実際、ｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡベクター由来のｕｐｐ標的Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の発現は、生存能力のあるＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉのほとんど完全な欠如をもたらす（図２Ａと２Ｂを比較）。観察された毒性効果のＣａｓ９特異性を証明するために、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を不活性化することが知られるＣａｓ９の２つのアミノ酸（ｄＣａｓ９、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を置換した。図２Ｃで見られるように、ｄＣａｓ９−ｕｐｐ−ｓｇＲＮＡの発現は生存能力に何ら影響を有さず、該毒性が、ｕｐｐ標的性ｓｇＲＮＡを搭載された野生型Ｃａｓ９により誘導されたＤＳＢに基づくことを裏付ける。次に、自己標的性野生型Ｃａｓ９−ｕｐｐ−ｓｇＲＮＡを有する修復タンパク質ＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤは共発現された。該結果は、ＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤの存在下で、生存細胞数は有意に増加することを明確に示し（図２Ｂと図２Ｄを比較）、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ中のＣａｓ９誘導ＤＮＡ開裂の修復に対するＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤの促進効果を示す。真核生物において、ＮＨＥＪ経路による修復事象の１０％までは、修復部位での変異をもたらす。Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ中でのＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤを用いた修復が標的領域での変異をもたらすかをテストするために、成長培地中でのその存在は無傷ｕｐｐ遺伝子を含有する細胞にとって有毒なだけである５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を補足した寒天プレート上で、生存能力のあるクローンが選択された。実際、ｕｐｐ遺伝子を標的としている単一ガイド配列を含有するｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ＿ｕｐｐＳ５ベクターを用いて形質転換された５−ＦＵ耐性クローンを単離することは可能であった。５−ＦＵ耐性クローン由来のゲノムＤＮＡを調製し、該ｕｐｐ遺伝子を覆う領域をＰＣＲにより増幅し、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシングにより分析した。
【００１５】
図３に示すように、ｕｐｐ遺伝子でのＣａｓ９誘導ＤＳＢの毒性を回避したクローンは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）５´−ＮＧＧ−３´のすぐ３ｂｐ上流に大きい欠失を含有する。Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体は、ＰＡＭの３’上流の標的領域内にＤＳＢを正確に導入することが知られる。故に、シークエンシング結果は、該ｕｐｐ遺伝子が期待される部位でＣａｓ９ヌクレアーゼにより開裂され、エキソヌクレアーゼによる分解およびその結果生じるＤＮＡ末端の封鎖がされたことを強く示唆する。
【００１６】
発明者らのシステムの、他の原核生物種への適応性を示すために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＤＳＭ１２２６４）において実験が繰り返された。ゲノムｕｐｐ遺伝子を標的とするベクターｐＢ５−Ｃａｓ９とＰ．ｐｕｔｉｄａの接合および該接合体の選択的寒天プレートへの播種は、生存能力のあるコロニーの完全な欠如をもたらした（図４Ａ）。しかしながら、Ｃａｓ９およびｕｐｐ標的性ｓｇＲＮＡを有するＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤの共発現は、ＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤの存在下でＣａｓ９により誘導されるゲノムＤＮＡ切断の減少した毒性を実証する、生存可能なクローンの形成を再びもたらした。
【００１７】
次に、Ｃａｓ９をゲノムｌａｃＺ遺伝子へ誘導するスペーサー配列を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５における類似の分析を実施した。図５に示すように、修復タンパク質ＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤの共導入は、Ｅ．ｃｏｌｉ中の自己標的性Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の毒性も減少させ、これは種々の原核生物種における発明者らのシステムの広範囲の適用可能性を示す。従って、これらの結果に基づき、ヌクレアーゼ活性をＤＮＡ末端修復経路を再構築する修復タンパク質と結びつけることにより、原核生物中で、ＤＳＢを導入するＣａｓ９技術および他のプログラム可能なヌクレアーゼを適用することができると結論づけることができる。
【００１８】
ｌａｃＺ遺伝子中への変異のヌクレアーゼ介在導入をテストするために、ＰａｒａＢＡＤ−駆動Ｃａｓ９、Ｐｖｅｇ−駆動ＬｉｇＤ−ＫｕをコードするプラスミドｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−Ｐｖｅｇ−ＬｉｇＤ＿Ｋｕ（図１Ｃ）、またはＰａｒａＢＡＤ−駆動Ｃａｓ９、Ｐｖｅｇ−駆動ＬｉｇＤおよびＰｓａｃＢ−駆動Ｋｕタンパク質をコードするｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−Ｐｖｅｇ−ＬｉｇＤ＿Ｐｓａｃ＿Ｋｕのいずれかを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を形質転換した。ｌａｃＺ標的性ｓｇＲＮＡ転写ユニットを含有するプラスミドｐＵＣＰ−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｂｇａｌ（図１Ｅ）のエレクトロポレーションによる第２の形質転換ステップにより、ｌａｃＺ遺伝子の開裂を誘導した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、アラビノース（０．２％ｗ／ｖ）およびＸ−Ｇａｌ（８０μｇ／ｍｌ）を補足した寒天プレート上に、形質転換体を播種した（一例を図６に示す）。ｌａｃＺ領域の単一コロニーＰＣＲ増幅およびサンガーシークエンシングのために、最高２４個の白色コロニーを採取し、使用した（フォワードプライマー：５´−ＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＡ−３´；リバースプライマー：５´−ＧＡＴＡＡＣＴＧＣＣＧＴＣＡＣＴＣＣＡＧ−３´）。かかるクローンの５つのシークエンシング結果を図７に示し、これは、Ｃａｓ９開裂部位（ｓｇＲＮＡ標的領域は青色で、プロトスペーサー隣接モチーフは赤色で示す）の周りの８（Ｃｌｏｎｅ３＿ＳｅｑＩＤ＿４１ＨＡ１６）から２４３（Ｃｌｏｎｅ１＿ＳｅｑＩＤ＿４１ＨＡ１４）までの塩基対の欠失を実証する。本発明は、別の方法ではＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術を用いてＥ．ｃｏｌｉゲノムを修飾するのに不可欠である相同組換え鋳型を必要とすることなく、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中へ変異を導入することを可能にする（３）。
【００１９】
本発明のさらなる客体
【００２０】
典型的に、原核細胞は細菌または古細菌、好ましくは細菌に属する。
【００２１】
好ましいベクターは、形質転換、形質導入または接合により原核細胞中へ通常導入されるプラスミドまたはファージＤＮＡである。
【００２２】
プログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質は、好ましくは、Ｚｎフィンガー、ＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびＲＮＡ依存ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼからなる群から、より好ましくは、クラス２タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムに属するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質の群から選択される。
【００２３】
最も好ましいプログラム可能なＤＮＡ結合性および開裂性タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
【００２４】
一方で、好ましいＤＮＡ末端修復タンパク質は、その一次配列において原核生物のタンパク質Ｋｕ、および／またはＬｉｇＤに対して少なくとも３０％同一性を示すタンパク質からなる群から選択される。最も好ましい実施形態は、グラム陽性細菌によりコードされる、より好ましくはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、とりわけＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによりコードされるタンパク質Ｋｕおよび／またはＬｉｇＤからなる群から選択されるＤＮＡ末端修復タンパク質を示す。
【００２５】
本発明の別の客体は、
（ａ）少なくとも１のＣａｓ９、修飾Ｃａｓ９、またはＣｐｆ１タンパク質、
（ｂ）少なくとも１の修飾されていてもよいｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ；または、
（ｃ）タンパク質Ｋｕおよび／またはＬｉｇＤ
を含む発現系を示す。
【００２６】
最後に、本発明の他の客体は：
（Ｉ）上記で説明したような発現系を含む、または、からなるベクター、
（ＩＩ）上記で説明した方法を含む、原核生物中での遺伝子ノックアウト、遺伝子または単一塩基対の欠失、置換、編集、および／またはゲノムワイドノックアウトスクリーニングのための方法、
（ＩＩＩ）原核生物中でのゲノム操作および編集のための方法、とりわけ、ＤＮＡ二本鎖切断の導入を介して働くプログラム可能なヌクレアーゼと組み合わせた原核生物中での遺伝子機能の破壊（ノックアウト）、ゲノム遺伝子座の欠失またはＤＮＡ要素の挿入のような原核生物ゲノムの標的修飾における、ＤＮＡ末端結合性および修復タンパク質の使用
をカバーする。
【００２７】
参考文献
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［５］ＳＨＡＬＥＭ  Ｏら．“Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ−９  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ”ＳＣＩＥＮＣＥ  ３４３：８４−７（２０１４）
［６］ＳＥＴＵＢＡＬ  ＪＣら．“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ，ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅ  ａｅｒｏｂｅ  ｓｐｃｉａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：４５３４−４５（２００９）
【図面の簡単な説明】
【００２８】
（原文に記載無し）
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実施例１
図２に示すように、Ｋｕ−ＬｉｇＤの存在は、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ中の自己標的性ｓｇＲＮＡを搭載されたＣａｓ９により誘導されたＤＳＢの修復を促進する。図３に示すように、クローンの単離および標的領域のシークエンシングは、ＰＡＭ配列の３ｎｔ上流の特異的Ｃａｓ９誘導ＤＮＡ切断、エキソヌクレアーゼによる分解およびＤＮＡ末端のライゲーションを示した。
【００３０】
より詳細には、図２は以下を示す。
（Ａ）特異的ガイド配列を用いずにＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｅｍｐｔｙを用いて形質転換されたＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ。該形質転換体は、カナマイシンを含有する寒天プレート上に播種された。
（Ｂ）Ｃａｓ９およびｕｐｐ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｕｐｐＳ５を用いて形質転換された以外は（Ａ）と同様。
（Ｃ）触媒的に不活性なＣａｓ９およびｕｐｐ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＢ５−Ｐａｒａ−ｄＣａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｕｐｐＳ５を用いて形質転換された以外は（Ｂ）と同様。
（Ｄ）Ｃａｓ９−ＭｔＬｉｇＤ−ＭｔＫｕおよびｕｐｐ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｕｐｐＳ５を用いて形質転換された以外は（Ｂ）と同様。
該プラスミドのＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ中への運搬は、ドナー細胞としてＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１λｐｉｒを使用する接合により達成された。
【００３１】
ｕｐｐ変異体を選択するために、ｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｕｐｐＳ５を用いて処理されたＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを、５−ＦＵを補足した寒天プレート上でインキュベートした。５−ＦＵ耐性クローンのゲノムＤＮＡを単離し、ｕｐｐ領域をＰＣＲにより増幅した。サンガーシークエンシングの結果は、ｕｐｐ遺伝子の３０８ｂｐ（配列中で赤色で示す）領域の欠失を示した（図３）。
【００３２】
実施例２
【００３３】
図４に示すように、Ｋｕ−ＬｉｇＤの存在は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ中の自己標的性ｓｇＲＮＡを搭載されたＣａｓ９により誘導されたＤＳＢの修復を促進する。
【００３４】
より詳細には、図４は以下を示す。
（Ａ）Ｃａｓ９およびｕｐｐ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｕｐｐＳ１５を用いて形質転換されたＰ．ｐｕｔｉｄａ。
（Ｂ）Ｃａｓ９−ＭｔＬｉｇＤ−ＭｔＫｕおよびｕｐｐ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｕｐｐＳ５を用いて形質転換された以外は（Ａ）と同様。
該プラスミドのＰ．ｐｕｔｉｄａ中への運搬は、ドナー細胞としてＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１λｐｉｒを使用する接合により達成された。
【００３５】
実施例３
【００３６】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＫｕおよびＬｉｇＤの存在は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５中の自己標的性Ｃａｓ９ヌクレアーゼの毒性を減少させ（図５）、図６および７に示すように、ＮＨＥＪ変異の効率的導入を可能にする。
【００３７】
より詳細には、図５は以下を示す。
ｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｂｇａｌまたはｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｂｇａｌのいずれかを用いて、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を形質転換した。両方のベクターは、野生型Ｃａｓ９およびｌａｃＺ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードする。ベクターｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｂｇａｌは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質ＬｉｇＤおよびＫｕをも発現する。選択的寒天プレート上に該形質転換体を播種し、コロニー形成ユニット数を決定した。
【００３８】
図６は以下を示す。
ｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９＿Ｐｖｅｇ−ＬｉｇＤ＿ＫｕまたはｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９＿Ｐｖｅｇ−ＬｉｇＤ＿ＰｓａｃＢ＿Ｋｕのいずれかを用いて、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を形質転換した。両方のベクターは、野生型Ｃａｓ９およびｌａｃＺ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードし、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質ＬｉｇＤおよびＫｕを発現する。エレクトロコンピテントセルの調製のために、該形質転換体の単一コロニーを培養した。ｌａｃＺ−標的性ｓｇＲＮＡ転写ユニットを含有するプラスミドｐＵＣＰ−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ｂｇａｌのエレクトロポレーション後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、０．２％（Ｗ／Ｖ）アラビノースおよびＸ−ｇａｌ（８０μｇ／ｍｌ）を補足した選択的寒天プレート上に形質転換体を播種した。ｌａｃＺ−遺伝子のフレームシフト変異は、白色コロニーをもたらす。
【００３９】
図７は、野生型ｌａｃＺ遺伝子、ならびにＣａｓ９開裂、およびその後のＭｔＫｕおよびＭｔＬｉｇＤによる修復により得られた５つのＮＨＥＪ−変異体のシークエンシング結果を示す。Ｃａｓ９の標的部位は青色で、プロトスペーサー隣接モチーフは赤色で示す。
【００４０】
図１Ａは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａおよびＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを用いた実験のために使用されたような、Ｃａｓ９タンパク質およびＰｓａｃ−駆動ｓｇＲＮＡをコードするｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡのベクターマップを示す。
【００４１】
図１Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａおよびＡ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを用いた実験のために使用されたような、タンパク質Ｃａｓ９、ＬｉｇＤおよびＫｕ、およびＰｓａｃ−駆動ｓｇＲＮＡをコードするｐＢ５−ＣＬＫ＿ＰｓａｃＢ＿ｓｇＲＮＡのベクターマップを示す。
【００４２】
図１Ｃは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｌａｃＺ−遺伝子ノックアウトのために使用されたような、ｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９＿Ｐｖｅｇ−ＬｉｇＤ＿Ｋｕのベクターマップを示す。
【００４３】
図１Ｄは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｌａｃＺ−遺伝子ノックアウトのために使用されたような、ｐＢ５−Ｐａｒａ−Ｃａｓ９＿Ｐｖｅｇ−ＬｉｇＤ＿ＰｓａｃＢ＿Ｋｕのベクターマップを示す。
【００４４】
図１Ｅは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｌａｃＺ−遺伝子ノックアウトのために使用されたような、ｐＵＣＰ−ＰｓａｃＢ−ｓｇＲＮＡ−ＴｒｒｎＢのベクターマップを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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