(57)【要約】本発明は概して、標準対照と比較して、インビトロアッセイにおいて生物試料中のヘプシジンのレベルを測定するためのキットに関する。キットは、使用のための説明書、使用のためのラベル、または両方をさらに含んでもよい。キットは、ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する疾患または障害を有する個体を特定するために使用されうる。2019500858.tif 000021
2019500858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 抗ヘプシジン抗体で予めコーティングした96マイクロウェルストリッププレート；
(b) ヘプシジン-25標準物質；
(c) 第1のヘプシジン-25対照；
(d) 第2のヘプシジン-25対照；
(e) ビオチン化ヘプシジン-25トレーサー；
(f) ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート；
(g) 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質；
(h) 停止液；
(i) 洗浄緩衝液；および
(j) 試料希釈液
を含む、キット。
【請求項２】
マイクロウェルストリッププレートがポリスチレンマイクロウェルストリッププレートである、請求項1記載のキット。
【請求項３】
マイクロウェルストリッププレート用の2つの接着性カバーをさらに含む、請求項1記載のキット。
【請求項４】
(a)の抗体が、SEQ ID NO：5に記載される可変重鎖およびSEQ ID NO：7に記載される可変軽鎖を有する抗体である、請求項1記載のキット。
【請求項５】
8バイアルのヘプシジン-25標準物質を含む、請求項1記載のキット。
【請求項６】
各バイアルが0.5 mLのヘプシジン-25標準物質を含む、請求項5記載のキット。
【請求項７】
1バイアルの第1のヘプシジン-25対照を含む、請求項1記載のキット。
【請求項８】
第1のヘプシジン-25対照のバイアルが0.5 mLの試薬を含む、請求項7記載のキット。
【請求項９】
1バイアルの第2のヘプシジン-25対照を含む、請求項1記載のキット。
【請求項１０】
第2のヘプシジン25対照のバイアルが0.5 mLの試薬を含む、請求項9記載のキット。
【請求項１１】
1ボトルのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含む、請求項1記載のキット。
【請求項１２】
バイアルが12 mLのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含む、請求項11記載のキット。
【請求項１３】
ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーが、(i) 酸化的に折り畳まれたヘプシジンペプチド；(ii) 2個の(2-(2-アミノ-エトキシ)エトキシ)酢酸(AEEAc)残基からなる親水性スペーサーであって、(i)のペプチドが該ペプチドのアミノ末端で該親水性スペーサーに共有結合的に連結される、親水性スペーサー；および(iii) (ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結されているビオチンからなる、請求項1記載のキット。
【請求項１４】
ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーが、SEQ ID NO：1に記載されるアミノ酸配列を有するヘプシジンペプチドを含む、請求項13記載のキット。
【請求項１５】
1ボトルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、請求項1記載のキット。
【請求項１６】
ボトルが12 mLのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
1ボトルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、請求項1記載のキット。
【請求項１８】
ボトルが12 mLのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む、請求項17記載のキット。
【請求項１９】
1ボトルのTMB基質を含む、請求項1記載のキット。
【請求項２０】
ボトルが12 mLのTMB基質を含む、請求項19記載のキット。
【請求項２１】
1ボトルの停止液を含む、請求項1記載のキット。
【請求項２２】
ボトルが12 mLの停止液を含む、請求項21記載のキット。
【請求項２３】
1ボトルの洗浄緩衝液を含む、請求項1記載のキット。
【請求項２４】
ボトルが25 mLの洗浄緩衝液を含む、請求項23記載のキット。
【請求項２５】
20×溶液の洗浄緩衝液を含む、請求項23記載のキット。
【請求項２６】
洗浄液がキットでの使用前に希釈される、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
1ボトルの試料希釈液を含む、請求項1記載のキット。
【請求項２８】
ボトルが3 mLの試料希釈液を含む、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
使用のための説明書をさらに含む、請求項1〜28のいずれか一項記載のキット。
【請求項３０】
説明書が、キットで使用するための生物試料の特定を含む、請求項29記載のキット。
【請求項３１】
生物試料の収集のための1つまたは複数の収集手段をさらに含む、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
1つまたは複数の収集手段が、シリンジ、ニードル、カップ、スワブ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項31記載のキット。
【請求項３３】
生物試料が、血液試料、組織試料または尿試料を含む、請求項30記載のキット。
【請求項３４】
ラベルをさらに含む、請求項1〜33のいずれか一項記載のキット。
【請求項３５】
ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害の検出に使用するための、請求項34記載のキット。
【請求項３６】
ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害が、アフリカ型鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌による貧血、慢性疾患による貧血、炎症による貧血、動脈硬化症もしくはアテローム動脈硬化症、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法誘発性貧血、末期腎疾患もしくは慢性腎/腎臓不全を含む慢性腎疾患、急性腎傷害(AKI)、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス(classic hemochromatosis)、コラーゲン誘発関節炎(CIA)、先天性赤血球形成異常性貧血、うっ血性心不全、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患(IBD)、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ運動失調症、索性脊髄症、グラシル（gracile）症候群、細菌感染、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体2の変異によって生じるヘモクロマトーシス、ヘモグロビン異常症、肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウイルス感染、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏症、鉄過剰症、ヘプシジン過剰による鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス(HFE2)、多発性硬化症、トランスフェリン受容体2、HFE、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、フェロポーチン、TMPRSS6(IRIDA)、もしくは鉄代謝の他の遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、仮性脳炎(pseudoencephalitis)、肺ヘモジデリン沈着症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリトマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸液鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、ウイルソン病、またはそれらの組み合わせである、請求項35記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、それらの全体が参照により組み入れられる、2015年11月25日に出願された米国特許仮出願第62/260,106号および2015年12月4日に出願された米国特許仮出願第62/263,245号の恩典を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されていて、かつその全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含有する。前記ASCIIコピーは、2016年11月18日に作成され、44546-710_601_SL.txtと名付けられ、かつ4,024バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
鉄は、生存生物の成長および発育に必要とされる必須微量元素である。哺乳動物では、鉄含量は、鉄吸収、鉄再利用、および鉄を貯蔵する細胞からの鉄の放出を制御することによって調節される。鉄は、十二指腸および空腸上部において腸細胞によって主に吸収される。鉄は、骨髄中の細網内皮マクロファージ、肝クッパー細胞および脾臓により分解した赤血球から再利用される。鉄放出は、血漿内に鉄を放出する能力を有する主要な細胞である腸細胞、マクロファージおよび肝細胞の細胞表面に位置している主要な鉄排出タンパク質、フェロポーチンによって制御される。ヘプシジンはフェロポーチンに結合し、それを細胞表面から内部移行させ、分解させることによって、その機能活性を低下させる。
【発明の概要】
【０００４】
Intrinsicヘプシジン IDx(商標)ELISAキットは、ヒト血清および血漿中のヘプシジンの定量的測定のためのELISA試験である。
【０００５】
本明細書において、(a) 抗ヘプシジン抗体で予めコーティングした96マイクロウェルプレート；(b) ヘプシジン-25標準物質；(c)第1のヘプシジン-25対照；(d) 第2のヘプシジン-25対照；(e) ビオチン化ヘプシジン-25トレーサー；(f) ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート；(g) TMB基質；(h) 停止液；(i) 洗浄緩衝液；および(j) 試料希釈液を含む、キットが提供される。
【０００６】
マイクロウェルプレートは、例えば、ポリプロピレンまたはポリスチレンマイクロウェルプレートであってもよい。いくつかの場合において、マイクロウェルストリッププレートはポリスチレンマイクロウェルプレートである。マイクロウェルプレートはストリッププレートまたは一体型プレートであってもよい。
【０００７】
いくつかの場合において、キットは、マイクロウェルプレートストリッププレート用の2つの接着性カバーをさらに含む。
【０００８】
いくつかの場合において、(a)の抗体は、SEQ ID NO：5に記載される可変重鎖およびSEQ ID NO：7に記載される可変軽鎖を有するモノクローナル抗体である。
【０００９】
キットは、8バイアルまでのヘプシジン-25標準物質を含みうる。いくつかの場合において、キットは8バイアルのヘプシジン-25標準物質を含む。例えば、各バイアルは0.5 mLのヘプシジン-25標準物質を含むことができる。
【００１０】
いくつかの場合において、キットは1バイアルの第1のヘプシジン-25対照を含む。例えば、第1のヘプシジン-25対照の各バイアルは0.5 mLの試薬を含むことができる。
【００１１】
いくつかの場合において、キットは1バイアルの第2のヘプシジン-25対照を含む。例えば、第2のヘプシジン-25対照の各バイアルは0.5 mLの試薬を含むことができる。
【００１２】
キットは、1ボトルのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含みうる。例えば、各バイアルは、12 mLのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを含みうる。いくつかの場合において、ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーは、(i) 酸化的に折り畳まれたヘプシジンペプチド；(ii) 2個の(2-(2-アミノ-エトキシ)エトキシ)酢酸(AEEAc)残基からなる親水性スペーサー、ここで、(i)のペプチドは該ペプチドのアミノ末端で該親水性スペーサーに共有結合的に連結される；および(iii) (ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結されているビオチンからなる。いくつかの場合において、ヘプシジンペプチドはSEQ ID NO：1に記載されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
いくつかの場合において、キットは1ボトルのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含む。例えば、ボトルは12 mLのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを含むことができる。
【００１４】
いくつかの場合において、キットは1ボトルのTMB基質を含む。例えば、ボトルは12 mLのTMB基質を含むことができる。
【００１５】
いくつかの場合において、キットは1ボトルの停止液を含む。例えば、ボトルは12 mLの停止液を含むことができる。
【００１６】
いくつかの場合において、キットは1ボトルの洗浄緩衝液を含む。例えば、ボトルは25 mLの洗浄緩衝液を含むことができる。ある特定の場合において、キットは、20×溶液の洗浄緩衝液を含むことができ、ここで、洗浄液はキットで使用する前に希釈される。
【００１７】
いくつかの場合において、キットは1ボトルの試料希釈液を含む。例えば、ボトルは3 mLの試料希釈液を含むことができる。
【００１８】
いくつかの局面において、キットは使用のための説明書をさらに含む。
【００１９】
説明書には、例えば、キットで使用するための生物試料の特定が含まれうる。
【００２０】
キットは、生物試料の収集のための1つまたは複数の収集手段をさらに含むことができる。例えば、1つまたは複数の収集手段は、シリンジ、ニードル、カップ、スワブ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。他の収集手段は当技術分野において公知であり、本明細書において企図される。
【００２１】
いくつかの局面において、生物試料は、血液試料、組織試料または尿酸試料を含む。説明書はまた、キットで使用する前に生物試料を処理するための説明書も含みうる。血液は通常の方法を用いて処理することができる。例えば、ヘパリンまたはEDTAが血液試料に添加されうる。血清もまた血液試料から得られ、記載のアッセイキットにおいて使用されうる。血液は細胞成分を取り除くために遠心分離されうる。
【００２２】
いくつかの局面において、キットはラベルをさらに含む。
【００２３】
キットは、ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する1つまたは複数の疾患または障害を検出するために用いることができる。ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する疾患または障害の非限定的な例には、これらに限定されないが、アフリカ型鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌による貧血、慢性疾患による貧血、炎症による貧血、動脈硬化症もしくはアテローム動脈硬化症、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法誘発性貧血、末期腎疾患もしくは慢性腎/腎臓不全を含む慢性腎疾患、急性腎傷害(AKI)、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス(classic hemochromatosis)、コラーゲン誘発関節炎(CIA)、先天性赤血球形成異常性貧血、うっ血性心不全、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患(IBD)、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ運動失調症、索性脊髄症、グラシル（gracile）症候群、細菌感染、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体2の変異によって生じるヘモクロマトーシス、ヘモグロビン異常症、肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウイルス感染、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏症、鉄過剰症、ヘプシジン過剰による鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス(HFE2)、多発性硬化症、トランスフェリン受容体2、HFE、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、フェロポーチン、TMPRSS6(IRIDA)もしくは他の鉄代謝の遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、仮性脳炎(pseudoencephalitis)、肺ヘモジデリン沈着症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリトマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸液鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、ウイルソン病、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００２４】
参照による援用
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み入れられると具体的かつ個別に指示されている場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本発明の新規な特徴は添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本開示の特徴および利点のよりよい理解は、開示の原則が用いられる、例示的態様を示す以下の詳細な説明、およびその添付の図面への参照によって得られる：
【図１】リチウムヘパリン(Li-ヘパリン)として収集および調製し、Intrinsic LifeSciences(ILS)ヘプシジンIDx(商標)ELISAキットおよびDRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキットを用いて測定したヒト血液試料(n＝8)のヘプシジン濃度間の関連性を図示する。
【図２】DRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキット標準物質のヘプシジン濃度とILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキット中の標準物質のヘプシジン濃度との間の関連性を図示する。ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキットによって、DRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキット中に含まれるDRG（登録商標）ヘプシジン標準物質は、DRG（登録商標)の製造者による説明書に記載されているものよりおよそ10倍少ないヘプシジンを含有することが決定された。
【図３】ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキット標準品のヘプシジン濃度とDRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキット中に含まれる標準物質のヘプシジン濃度との間の関連性を図示する。DRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキットはILSヘプシジンIDx(商標) ELISAキット標準物質においてDRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキットの標準物質よりおよそ10倍多いヘプシジンを測定することから、これらの結果は図2のデータを確定する。
【図４】図4Aは、EDTA血漿(破線)またはリチウムヘパリン(Li-ヘパリン、実線)または血清として収集および調製され、ILSヘプシジンIDx(商標) ELISAキットによって測定されたヒト血液試料(n＝8)中のヘプシジン濃度間の関連性を図示する。図4Bは、EDTA血漿(破線)またはリチウムヘパリン(Li-ヘパリン、実線)または血清として収集および調製され、DRG（登録商標）ヘプシジン-25 Bioactive ELISAキットによって測定されたヒト血液試料(n＝8)中のヘプシジン濃度間の関連性を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
精度および正確度は、いかなるアッセイでも最も重要な機能的特徴の中に入る。正確度は、アッセイが乏しい再現性である場合および/または標準物質がキットに開示された濃度でなかった場合には評価することが難しい。1回のアッセイでのウェル毎の試料測定およびアッセイ毎の試料測定を再現する能力は、アッセイの実行可能性を理解するための第1段階である。市販のイムノアッセイは一般に、20％を下回るアッセイ内およびアッセイ間変動係数(CV)を有する。本願に記載されるアッセイおよびキットは、このパーセンテージと比較し有意に改善される。
【００２７】
ヘプシジンは、25アミノ酸のホルモンであり、ヒトにおける鉄恒常性(代謝)の主要制御因子である。ヘプシジンは、十二指腸からの食餌鉄の吸収を調節し、マクロファージによる老化赤血球鉄の再利用を制御し、かつ血液の生産のための肝細胞から血漿内への鉄輸送を管理する。ヘプシジンは、血漿鉄およびIL-6(炎症、感染)によって正に調節され、エリスロフェロンを介する赤血球生成によって抑制される。異常に低い血清ヘプシジンは、鉄欠乏性貧血(IDA)および遺伝性ヘモクロマトーシスに関連し、高い血清ヘプシジンは、慢性腎臓病(CKD)、関節リウマチ(RA)、癌、および鉄不応性鉄欠乏性貧血(IRIDA)において観察される鉄ゼクエストレーション(iron sequestration)および炎症による貧血(慢性疾患による貧血)をもたらす可能性がある。最近、ヘプシジンは、ヘプシジンレベルに基づき経口鉄療法に対する反応を予測するのに有用であることが示され、この適用について、フェリチンおよびパーセント(％)トランスフェリン飽和度(％Tsat)の両方より優れている。
【００２８】
ヘプシジンは、鉄恒常性の調節に関与する。ヘプシジンはフェロポーチンに結合し、それを細胞表面から内部移行させ分解させることによってその機能的活性を低減させる。
【００２９】
高レベルのヒトヘプシジンは鉄レベルの低減をもたらす可能性があり、その逆も同様である。ヘプシジン活性の欠如をもたらすヘプシジン遺伝子の変異は、若年性ヘモクロマトーシス、重篤な鉄過剰症に関連する。マウスにおける研究は、正常な鉄恒常性の制御におけるヘプシジンの役割を明らかにしている。
【００３０】
ヘプシジンは、炎症時の鉄ゼクエストレーションにも関与する可能性がある。ヘプシジン遺伝子発現は、感染などの炎症性刺激後に強く上方制御され、脊椎動物の自然免疫系の急性期応答を誘導することが観察されている。ヘプシジン遺伝子発現は、リポ多糖(LPS)、テルペンチン、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、アデノウイルス感染および炎症性サイトカインインターロイキン-6(IL-6)によって上方制御される可能性がある。ヘプシジン発現と炎症による貧血との強い相関関係は、細菌感染、真菌感染およびウイルス感染を含む、慢性炎症性疾患を有する患者においても認められた。
【００３１】
ヒトヘプシジンは、抗菌活性および鉄調節活性を有する25アミノ酸ペプチドである。それはLEAP-1(肝臓発現抗菌ペプチド)とも呼ばれている。その後に、マウスでは83アミノ酸プレプロペプチドならびにラットおよびヒトでは84アミノ酸プレプロペプチドをコードするヘプシジンcDNAが、鉄によって調節された肝臓特異的遺伝子の探索において特定された。24残基N末端シグナルペプチドは最初に切断され、プロヘプシジンを生成し、次いで、さらにプロセシングされ、血液および尿の両方で認められる成熟ヘプシジンを生成する。ヒトの尿では、主な形態は25アミノ酸を含有するが、ある特定の疾患では、より短い22および20アミノ酸ペプチドもまた検出不能なまたは非常に低い濃度で存在する。
【００３２】
本明細書において記載されるキットは、生物試料中の成熟ヒトヘプシジンのレベルを検出するために用いることができる。
【００３３】
本明細書で用いられる「約」は概して、表示値の±0.5％、±1％、±1.5％、±2％、±2.5％、±3％、±3.5％、±4％、±5.5％、±6％、±6.5％、±7％、±7.5％、±8％、±8.5％、±9％、±9.5％、±10％、±11％、±12％、±13％、±14％、±15％、±16％、±17％、±18％、±19％、もしくは±20％までの表示値にわたる範囲、またはそれらの間の任意の値を意味する。
【００３４】
抗体
1つの局面において、本明細書において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ヘプシジンまたは成熟ヒトヘプシジンペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。いくつかの態様において、抗体は、成熟ヒトヘプシジン25アミノ酸ペプチドのN末端に結合する。
【００３５】
1つの例において、本明細書で提供されるキットで使用するための抗体は、SEQ ID NO：5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO：7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
1つの局面において、本明細書において提供される抗体は、IgG1またはIgG4可変重鎖および可変軽鎖を含む。
【００３７】
本明細書において記載される抗体は、約1から約500 pM、約1から約10 pM、約10から約20 pM、約1から約29 pM、約30から約40 pM、約10から約100 pM、または約20から約500 pMの解離定数(Kd)を有しうる。
【００３８】
本明細書において記載される抗体は、約500 pM未満、約450 pM未満、約400 pM未満、約350 pM未満、約300 pM未満、約250 pM未満、約200 pM未満、約150 pM未満、約100 pM未満、約75 pM未満、約50 pM未満、約30 pM未満、約25 pM未満、約20 pM未満、約18 pM未満、約15 pM未満、約10 pM未満、約7.5 pM未満、約5 pM未満、約2.5 pM未満、または約1 pM未満の解離定数(Kd)を有しうる。
【００３９】
本明細書において記載される抗体は、約10-9から約10-14、約10-10から約10-14、約10-11から約10-14、約10-12から約10-14、約10-13から約10-14、約10-10から約10-11、約10-11から約10-12、約10-12から約10-13、または10-13から約10-14のヘプシジンペプチドに対する親和性を有しうる。
【００４０】
IntrinsicヘプシジンIDx(商標)ELISAキットは、生物活性およびフェロポーチンへの結合に必要とされる、ヘプシジン-25のN末端に高い親和性で結合する(およそ5.16×10-11)モノクローナル抗体(mAb)に基づく競合結合アッセイである。この抗体は、低含量のヘプシジン-25のN末端アイソマーにも低い親和性で結合する。Intrinsic LifeSciencesは、重要な臨床上の鉄障害においてヘプシジンの臨床レベルを測定する能力を有する、記載のヘプシジン用ELISA試験を開発した。
【００４１】
本明細書において、本明細書に記載の抗体および許容される緩衝液を含む組成物が提供される。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語「超可変領域」および「CDR」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。CDRは、抗原に相補的に結合しかつVH鎖およびVL鎖それぞれのCDR1、CDR2、およびCDR3として知られる、3つの配列領域からのアミノ酸残基を含む。軽鎖可変ドメインでは、CDRは典型的には、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)による、おおよそ残基24〜34(CDRL1)、50〜56(CDRL2)および89〜97(CDRL3)に対応し、重鎖可変ドメインでは、CDRは典型的には、おおよそ残基31〜35(CDRH1)、50〜65(CDRH2)および95〜102(CDRH3)に対応する。異なる抗体のCDRは挿入を含む可能性があり、よってアミノ酸番号付けが異なる可能性があることが理解される。Kabatナンバリングシステムは、特定の残基につけた文字(例えば、軽鎖のCDRL1の27A、27B、27C、27D、27E、および27F)を利用して、異なる抗体間のナンバリングにおける任意の挿入を反映するナンバリングスキームによって、そのような挿入を説明する。あるいは、軽鎖可変ドメインでは、CDRは典型的には、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917(1987)による、おおよそ残基26〜32(CDRL1)、50〜52(CDRL2)および91〜96(CDRL3)に対応し、かつ重鎖可変ドメインでは、CDRは典型的には、おおよそ残基26〜32(CDRH1)、53〜55(CDRH2)および96〜101(CDRH3)に対応する。
【００４３】
本明細書において用いられる「フレームワーク領域」または「FR」は、抗原結合ポケットまたは抗原結合溝の一部を形成するフレームワークアミノ酸残基を指す。いくつかの態様において、フレームワーク残基は、抗原結合ポケットまたは抗原結合溝の一部であるループを形成し、ループ中のアミノ酸残基は抗原に接触してもしなくてもよい。フレームワーク領域は概して、CDR間の領域を含む。軽鎖可変ドメインでは、FRは典型的には、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)による、おおよそ残基0〜23(FRL1)、35〜49(FRL2)、57〜88(FRL3)、および98〜109に対応し、重鎖可変ドメインでは、FRは典型的には、およそ残基0〜30(FRH1)、36〜49(FRH2)、66〜94(FRH3)、および103〜133に対応する。軽鎖のKabatナンバリングによって上述したように、重鎖も同様の方法 (例えば、重鎖のCDRH1の35A、35B) で挿入を説明する。あるいは、軽鎖可変ドメインでは、FRは典型的には、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901〜917(1987)による、おおよそ残基0〜25(FRL1)、33〜49(FRL2)、53〜90(FRL3)、および97〜109(FRL4)に対応し、重鎖可変ドメインでは、FRは典型的には、おおよそ残基0〜25(FRH1)、33〜52(FRH2)、56〜95(FRH3)、および102〜113(FRH4)に対応する。
【００４４】
FRのループアミノ酸は、抗体重鎖および/または抗体軽鎖の三次元構造の検分によって評価および決定することができる。溶媒接触可能なアミノ酸の位置は抗体可変ドメインにおいてループを形成するおよび/または抗原接触をもたらす可能性があることから、三次元構造は、溶媒接触可能なアミノ酸の位置について分析されうる。溶媒接触可能な位置の一部はアミノ酸配列多様性を容認することができ、その他(例えば、構造的位置)は概して多様性は低い。抗体可変ドメインの三次元構造は、結晶構造またはタンパク質モデリングから導き出すことができる。
【００４５】
抗体の定常ドメイン(Fc)は、抗体を抗原に結合させるのに直接関与しないが、むしろ、例えばFc受容体(FcR)等との相互作用を介する抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を呈する。Fcドメインはまた、対象への投与後の循環における抗体の生物学的利用能を増大させることができる。
【００４６】
用語「特異的」は、抗体が該抗体によって認識されるエピトープを含む抗原以外の分子に対していかなる有意な結合も示さない状況を指す。該用語はまた、例えば、抗原結合ドメインがいくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを保有する抗体またはその抗原結合断片は、該エピトープを保有するさまざまな抗原に結合する能力を有する。用語「優先的に結合する」または「特異的に結合する」は、抗体またはその断片が、それが無関係のアミノ酸配列に結合するよりも高い親和性でエピトープに結合し、エピトープを含む他のポリペプチドへの交差反応性を有する場合、それらがヒト用途への投与用に製剤化されるレベルでは毒性を有さないことを意味する。1つの局面において、そのような親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体またはその断片の親和性より少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも3倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも6倍高い、少なくとも7倍高い、少なくとも8倍高い、少なくとも9倍高い、10倍高い、少なくとも20倍高い、少なくとも30倍高い、少なくとも40倍高い、少なくとも50倍高い、少なくとも60倍高い、少なくとも70倍高い、少なくとも80倍高い、少なくとも90倍高い、少なくとも100倍高い、または少なくとも1000倍高い。用語「免疫反応性を有する」、「結合する」、「優先的に結合する」および「特異的に結合する」は、本明細書において互換的に用いられる。用語「結合」は、例えば、生理的条件下での共有結合性相互作用、静電気的相互作用、疎水性相互作用、ならびにイオン性および/または水素結合相互作用による、2つの分子間の直接的会合を指し、塩橋および水架橋などの相互作用、ならびに任意の他の結合の通常手段を含む。
【００４７】
抗体に適用される場合、「単離された」(「実質的に純粋な」または「精製された」と互換的に用いられる)は、化学的に合成されるかまたは宿主細胞中に発現され、付随タンパク質および混入タンパク質を取り去るよう精製される抗体を意味する。該用語は概して、それと一緒に天然に生じる他のタンパク質および核酸、ならびに/またはそれを精製するために用いられる物質から分離されているポリペプチドを意味する。いくつかの場合において、本明細書に記載のキットにおいて提供される抗体は、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％またはそれを上回って純粋である。
【００４８】
トレーサー
本明細書において、(i) 酸化的にフォールディングされるヘプシジンペプチド；(ii) 2個の(2-(2-アミノ-エトキシ)エトキシ)酢酸(AEEAc)残基からなる親水性スペーサー、ここで、(i)のペプチドは該ペプチドのアミノ末端(N末端)で該親水性スペーサーに共有結合的に連結される；および(iii) (ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結されたビオチンからなるイムノアッセイトレーサー試薬が提供される。いくつかの場合において、ヘプシジンペプチドは、(ii)の親水性スペーサーに共有結合的に連結される前に酸化的にフォールディングされる。いくつかの場合において、酸化的にフォールディングされるヘプシジンペプチドは、
2019500858.tif 000003
のアミノ酸配列を有する。酸化的にフォールディングされるヘプシジンペプチドはヒトヘプシジン25のアミノ酸配列を有しうる。
【００４９】
ヘプシジンペプチドは、(a) 酢酸溶液でヘプシジンを可溶化し、第1の溶液を生成する工程；(b) カオトロピック試薬、有機アルコール、および酸化試薬を含む水性緩衝溶液で第1の溶液を希釈し、第2の溶液を生成する工程；および(c) 第2の溶液のpHをおよそ5から7の間のレベルに調整する工程を含む工程によって、酸化的にフォールディングさせることができる。有機アルコールはおよそ10％イソプロピルアルコールであってもよく；(ii) pHは水酸化アンモニウムの添加によって調整されてもよく；または(iii) 酸化は室温で行われうる。
【００５０】
キット
本明細書において、抗体、許容される担体および賦形剤を含む本明細書に記載の組成物、およびキットの使用のための工程を説明するラベルを含むキットが提供される。いくつかの場合において、キットは、キットでの使用前に試料を入手および加工するための説明書も含みうる。1つの局面において、本明細書において、本明細書に記載されたような抗体でコーティングされかつブロッキング剤でブロッキングされる96ウェルマイクロウェルプレート、ビオチン化トレーサー分子、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ、基質溶液、停止液、洗浄緩衝液、試料希釈液、および標準物質(すなわち、正の対照)を含む、ヘプシジンレベルの上昇または鉄恒常性の異常に関連する障害を診断するためのキットが提供される。標準物質を含まない希釈液は、負の対照として使用されうる。
【００５１】
本明細書において、本明細書に記載の組成物を含む容器手段が提供される。容器手段は、これらに限定されないが、バイアル、シリンジ、ボトル、静注(IV)バッグまたはアンプルを含む、液体または凍結乾燥組成物を収容しうる任意の適した容器でありうる。容器手段は、キット内容物を保存するのに適切な任意の材料で製造されうる。容器手段は、これらに限定されないが、約0.1 mlから約50 mlまたはそれより多く；例えば、約0.5 ml、約1 ml、約2 ml、約5 ml、約10 ml、約15 ml、約20 ml、約25 ml、約30 ml、約35 ml、約40 ml、約45 mlもしくはそれより多く、またはそれらの間の任意の整数を含む、本明細書に記載の方法で使用するのに適した液体の任意の体積を保持する能力を有しうる。いくつかの場合において、容器手段は、固体組成物または液体組成物を保持する。容器手段が固体組成物を保持する場合、容器手段は、これらに限定されないが、約0.01 mgから約50 gまたはそれより多く；例えば、約0.5 mg、約1 mg、約2 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mgもしくはそれより多く、またはそれらの間の任意の整数を含む、本明細書に記載の方法で使用するための組成物の任意の量を保持する能力を有しうる。
【００５２】
キットは、商業的販売のために密閉管理下で試薬を含有するための手段も含みうる。そのような容器は、注射および/またはその中に所望のバイアルが保持されるブロー成形したプラスチック容器を含みうる。キットはまた、キット中の物質の使用のための印刷物を含むことができる。
【００５３】
パッケージまたはキット中に含まれる製剤/調製物は追加的に、緩衝化剤、保存剤、安定化剤、またはそれらの組み合わせを含みうる。キットの各構成要素は個別の容器内に封入することができかつ、さまざまな容器の全ては1つのパッケージ内にありうる。本発明のキットは、冷蔵保存または室温保存用に設計することができる。
【００５４】
加えて、試薬製剤/調製物は、キットの保存可能期間を増大させるための安定化剤を含有する可能性があり、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)を含む可能性がある。組成物が凍結乾燥されている場合、キットは、凍結乾燥した調製物を再構成するための溶液の調製物をさらに含有しうる。許容される再構成溶液は当技術分野において周知であり、例えば、薬学的に許容されるリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。
【００５５】
パッケージおよびキットは、例えばELISAアッセイなどのアッセイ向けの1つまたは複数の構成要素をさらに含むことができる。例えば、キットは、96ウェルマイクルウェルプレートなどのマイクロウェルプレートを含みうる。いくつかの場合において、本明細書において提供されるキットのマイクロウェルプレートは、パッケージング前に抗ヘプシジン抗体でコーティングされかつブロッキング剤でブロッキングされる。そのようなプレートは、滅菌したプラスチックの包装で密封され、真空密封されうる。プレートは混入を避けるために滅菌条件で調製される。
【００５６】
パッケージおよびキットは、試料の収集向けの1つまたは複数の構成要素をさらに含むことができる(例えば、シリンジ、ニードル、カップ、バイアル、ボトル、スワブ等)。
【００５７】
パッケージおよびキットは、例えば製品説明書きを明記するラベルをさらに含むことができる。
【００５８】
用語「包装材料」は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装材料は、構成要素を滅菌して維持することができ、そのような目的で通常用いられる材料(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル等)で製造することができる。ラベルまたは包装封入物は適切な記載説明書を含むことができる。そのため、キットは、本発明のいずれかの方法においてキット構成要素を使用するためのラベルまたは説明書を追加的に含むことができる。キットは、本明細書に記載の方法において化合物を投与するための説明書と一緒にパックまたはディスペンサー中の化合物を含むことができる。
【００５９】
説明書は、診断方法を含む本明細書に記載の方法のいずれかを実行するための説明書を含むことができる。
【００６０】
説明書は、「印刷物」上、例えば、キット内のもしくはキットに貼り付けられた紙またはボード紙上、またはキットもしくは包装材料に貼り付けられたまたはキットの構成要素を含有するバイアルもしくはチューブに付されたラベル上にありうる。説明書は、コンピュータで読み取り可能な媒体、たとえば、フラッシュ/クラウドドライブ、ディスク(フロッピーディスクまたはハードディスク)、CD-ROM/RAMまたはDVD- ROM/RAMなどの光学CD、磁気テープ、RAMおよびROMなどの電気的記憶媒体(electrical storage media)、ICチップ、および磁気/光学記憶媒体などこれらのハイブリッドに追加的に含まれうる。
【００６１】
診断方法
1つの態様において、抗体または抗原結合断片は、検出可能な成分をさらに含む。検出はインビトロで行うことができる。本明細書に記載の抗体によるヘプシジンの検出および/または判定(定量、定性等)のためのインビトロアッセイは、例えば、競合的酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を含む。インビトロでのヘプシジンの検出、診断またはモニタリングは、対象から試料(例えば、血液試料、組織試料または尿試料)を得ること、および、例えば以下の実施例に記載されるような競合的ELISAアッセイなどで試料を試験することによって行うことができる。
【００６２】
本明細書において、(a) 抗体またはその抗原結合断片のヘプシジンへの結合を可能にする条件下で、ヘプシジン関連障害を有する疑いがある対象からの生物試料を、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および(b) 抗体またはその抗原結合断片に結合したヘプシジンを検出および/または定量化する工程であって、閾値レベルを上回る(b)で定量化された試料中のヘプシジンの量がヘプシジン関連障害の存在を示し、閾値レベルを下回る量がヘプシジン関連障害の非存在を示す、工程を含む、ヘプシジン関連障害を診断する方法が提供される。いくつかの場合において、生物試料は、記載されたキットアッセイでの使用前に処理/加工される。例えば、EDTAまたはヘパリンが試料に添加されうる。血液はまた、試験用の血清を得るために遠心分離されうる。
【００６３】
(a) 抗体またはその抗原結合断片のヘプシジンへの結合を可能にする条件下で、炎症性疾患を有する疑いがあるヒトからの生物試料を、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および(b) 抗体またはその抗原結合断片に結合したヘプシジンを検出および/または定量化する工程であって、閾値レベルを上回る(b)で定量化されたヘプシジンの量が炎症性疾患の存在を示し、閾値レベルを下回る量が炎症性疾患の非存在を示す、工程を含む、炎症性疾患を非炎症性疾患と区別する方法。いくつかの場合において、生物試料は記載されたキットアッセイでの使用前に処理/加工される。例えば、EDTAまたはヘパリンが試料に添加されうる。血液はまた、試験用の血清を得るために遠心分離されうる。
【００６４】
本出願の1つの態様による「対象」(例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、霊長類、齧歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの哺乳動物)は、本明細書に記載された疾患または障害の1つまたは複数の臨床症状および/または徴候を呈する哺乳動物である。
【００６５】
本明細書において、本明細書に記載の抗体を利用して、ヘプシジン関連疾患もしくは障害または鉄関連疾患もしくは障害を検出する診断方法も提供される。ある特定の例において、方法は、ヘプシジンのレベルの上昇、ヘプシジンのレベルの低下、鉄のレベルの上昇、鉄のレベルの低下、またはそれらの組み合わせに関連する疾患または障害を検出する。該方法が適用されうるヘプシジン関連障害、炎症性疾患、および鉄恒常性の疾患または障害には、これらに限定されないが、アフリカ型鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌による貧血、慢性疾患による貧血、炎症による貧血、動脈硬化症もしくはアテローム動脈硬化症(冠動脈疾患、脳血管疾患もしくは末梢閉塞性動脈疾患を含む)、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法誘発性貧血、末期腎疾患もしくは慢性腎/腎臓不全を含む慢性腎/腎臓疾患(ステージI、II、III、IVもしくはV)、急性腎傷害(AKI)、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発関節炎(CIA)、ヘプシジン過剰を伴う状態(ヘプシジン上昇)、先天性赤血球形成異常性貧血、うっ血性心不全、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患(IBD)、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ運動失調症、索性脊髄症、グラシル症候群、ピロリ菌(H. pylori)感染もしくは他の細菌感染、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体2の変異によって生じるヘモクロマトーシス、ヘモグロビン異常症、肝炎、肝炎(Brock)、C型肝炎、肝細胞癌、ヘプシジン欠乏症、遺伝性ヘモクロマトーシス、HIVもしくは他のウイルス性疾病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏症、鉄過剰症、ヘプシジン過剰による鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス(HFE2)、多発性硬化症、トランスフェリン受容体2、HFE、ヘモジュベリン、フェロポーチン、TMPRSS6(IRIDA)もしくは鉄代謝の他の遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、仮性脳炎、肺ヘモジデリン沈着症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリトマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸液鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、および/またはウイルソン病が含まれる。
【００６６】
配列
ヒトヘプシジンペプチド(ヘプシジン-25、hep-25、Hep-25、hヘプシジン-25)：(25aa)
2019500858.tif 000004
ヒトヘプシジン-20ペプチド(ヘプシジン-20、hep-20、Hep-25、hヘプシジン-20)：(20aa)
2019500858.tif 000005
ヒトヘプシジン22ペプチド(ヘプシジン-22、hep-22、Hep-22、hヘプシジン-22):(22aa)
2019500858.tif 000006
【００６７】
ヘプシジンMAb 583の可変重鎖および可変軽鎖の核酸配列およびアミノ酸配列。
583VH核酸配列：
2019500858.tif 000007
583 VHアミノ酸配列：
2019500858.tif 000008
583 VL核酸配列：
2019500858.tif 000009
583 VLアミノ酸配列：
2019500858.tif 000010
【００６８】
ヘプシジンMAb 583の可変重鎖および可変軽鎖のCDR-1、CDR-2、およびCDR-3ポリヌクレオチド配列。
可変重鎖CDR
2019500858.tif 000011
可変軽鎖CDR
2019500858.tif 000012
【実施例】
【００６９】
本出願は、本出願の例示的態様として提供される、以下の非限定的な実施例への参照によってより良く理解されうる。以下の実施例は、態様をより十分に例示するために提示されるが、本出願の広範な範囲を限定するとして一切解釈されるべきではない。
【００７０】
実施例1：IntrinsicヘプシジンIDx(商標)ELISA
Intrinsic LifeSciences(ILS)ヘプシジンIDx(商標)ELISAキットは、一定数の高親和性抗ヘプシジン-25 N-末端特異的mAb結合部位に対する、試験検体中のヘプシジン-25と生物学的に活性なビオチン化ヒトヘプシジン-25トレーサーとの間の競合結合アッセイである。初めに、精製したヘプシジン-25標準物質、ヘプシジン-25対照(対照1および対照2)、および患者試料(全て二度繰り返す)を、mAbをコーティングしたマイクロウェルストリッププレートに加え、ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーと一緒に60分間インキュベートした。ビオチン化ヘプシジン-25トレーサーは、固定数のN末端特異的抗体結合部位についてネイティブなヘプシジンまたは参照ヘプシジンと競合する。よって、患者試料由来の結合したネイティブな血清ヘプシジンの濃度が増大するにつれ、結合したビオチン化ヘプシジン-25トレーサーの量は次第に減少する。未結合のビオチン化ヘプシジン-25トレーサーは洗い流され、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートがウェルに添加される。ウェルは30分間インキュベートされ、洗浄され、未結合のストレプトアビジン-HRPが取り除かれる。TMB基質を15分間加え、反応を停止液の添加により停止させる。マイクロウェルプレートリーダーを用いて、450 nmでの吸光度を測定し、データを記録した。
2019500858.tif 000013
【００７１】
提供されない材料
蒸留水または脱イオン水
【００７２】
精密ピペット(シングルチャンネルおよびマルチチャンネル)、使い捨てピペットチップ(100 μlおよび1000 μl)
【００７３】
450 nmでの吸光度を読み取る能力があるマイクロウェルプレートリーダー、卓上型遠心機。
【００７４】
フラットヘッドボルテックスミキサー、マイクロプレートシェーカー、吸収紙。
【００７５】
Curve fittingソフトウエア、グラフ用紙。
【００７６】
検体の収集および取扱い
血液検体は、血清、血清セパレーター、リチウムもしくはナトリウムヘパリン血漿、またはEDTA血漿チューブで収集されうる。血清および血漿検体は、採血時から最大で24時間、2〜8℃で冷蔵保存されうる。
【００７７】
24時間を上回る保存が求められる場合、血漿または血清は、-20℃から-80℃にて最大で1年まで凍結保存されうる。複数回の凍結融解サイクルは避ける。
【００７８】
アッセイ前に、冷凍した血清または血漿は室温に達するべきである。目に見える沈殿物が存在する場合、使用前に、試料を緩やかに混合し、遠心分離する。溶血させた、汚染したまたは脂肪血症の試料は使用しない。
【００７９】
試薬調製
全ての試薬および検体は、使用前に室温に達せさせなければならない。全ての試薬は、発泡することなく、緩やかに混合させなければならない。手法が開始されると、全ての工程は中断なしに完了させるべきである。ボトルの内容物(25 mL、20×)に475 mLの蒸留水または脱イオン水を添加することによって、1×洗浄緩衝液を調製する。洗浄緩衝液は室温(18〜24℃)で保存する。
【００８０】
標準的アッセイ手法
最良の結果を出すために、キット中に提供される96ウェルポリプロピレン(PP)プレート中でELISA用の試料、標準物質、対照およびトレーサーを予混合する。
【００８１】
マルチチャンネルピペットを用いて、110 μlのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーをPPプレートの必要とされるウェルに移す。
【００８２】
22 μlのヘプシジン標準物質、試料および各ヘプシジン対照のそれぞれをPPプレートに移す。患者試料がさらなる希釈を要する場合、以下に記載の試料を希釈するための説明を参照されたい。
【００８３】
マルチチャンネルピペットを用いて、溶液を注意深く混合する。120 μlのこの溶液をPPプレートから96マイクロウェルストリッププレート中の対応するウェルに移す。
【００８４】
マイクロウェルストリッププレートを攪拌(350 rpm)しながら60分間室温にてインキュベートする。ウェルの内容物を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。
【００８５】
300 μlの1×洗浄緩衝液を各ウェル内に分注し、次いで、洗浄緩衝液を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。吸収紙上にウェルを鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。さらに2回、合計3回の洗浄を繰り返す。
【００８６】
100 μlのストレプトアビジン-HRPコンジュゲートを各ウェル内に分注する。
【００８７】
攪拌(350 rpm)しながら室温にて30分インキュベートする。ウェルの内容物を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。
【００８８】
300 μlの1×洗浄緩衝液を各ウェル内に分注し、次いで、洗浄緩衝液を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。吸収紙上にウェルを鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。さらに2回、合計3回の洗浄を繰り返す。
【００８９】
マルチチャンネルピペットを用いて、100 μlのTMB基質を各ウェル内に分注する。好ましくは暗所にて、室温で15分インキュベートする。
【００９０】
50 μlの停止液を各ウェル内に分注し、酵素反応を停止させる。プレート内容物を20〜30秒間注意深く混合する。
【００９１】
停止液の添加の15分以内に450 nmで吸光度を読み取る。
【００９２】
試料を希釈するための説明
試料中のヘプシジン濃度が定量の上限(およそ250 ng/ml)に近づくまたはそれを上回る場合、試料を希釈し、ELISAを再実行する(警告および注意を参照されたい)。低タンパク質結合96マイクロウェルプレート(含まれず)または個別の低タンパク質結合微量遠心チューブ(含まれず)で試料希釈液(供給済み)での希釈を実施する。以下の表に図示する試料希釈例を参照されたい。22 μlの希釈試料を、標準的アッセイ手法(上記)に記載されているように96ウェルPPプレートに移す。
2019500858.tif 000014
【００９３】
データ計算を実施する場合、常に試料結果に試料希釈係数を掛ける。
【００９４】
任意のアッセイ手法
アッセイを実施する前に、全ての試薬を室温に導く。使用前に全ての試薬を緩やかに混合する。
【００９５】
20 μlのヘプシジン標準物質、対照および試料を各ウェル内に分注する。
【００９６】
100 μlのビオチン化ヘプシジン-25トレーサーを各ウェル内に分注する。
【００９７】
インキュベーション番号1−マイクロウェルストリッププレートを攪拌(350 rpm)しながら室温にて60分間インキュベートする。ウェルの内容物を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。
【００９８】
洗浄番号1−300 μlの1×洗浄緩衝液を各ウェル内に分注し、次いで、洗浄緩衝液を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。吸収紙上にウェルを鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。さらに2回、合計3回の洗浄を繰り返す。
【００９９】
100 μlのストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートを各ウェル内に分注する。
【０１００】
インキュベーション番号2−攪拌(350 rpm)しながら室温にて30分間インキュベートする。ウェルの内容物を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。
【０１０１】
洗浄番号2−300 μlの1×洗浄緩衝液を各ウェル内に分注し、次いで、洗浄緩衝液を廃棄リザーバー内に素早く振り落とす。吸収紙上にウェルを鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。さらに2回、合計3回の洗浄を繰り返す。
【０１０２】
マルチチャンネルピペットを用いて、100 μlのTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)基質を各ウェル内に分注する。
【０１０３】
インキュベーション番号3−好ましくは暗中で、室温にて15分間インキュベートする。
【０１０４】
停止−50 μlの停止液を各ウェル内に分注し、酵素反応を停止させる。プレート内容物を20〜30秒間注意深く混合する。
【０１０５】
停止液の添加の15分以内に450 nmにて吸光度を読み取る。
【０１０６】
結果の計算
ソフトウエア計算：
標準曲線を作成し、GRAPHPAD PRISM（登録商標）(Version 6.01)ソフトウエア(ワールドワイドウェブサイト: graphad.com)によるFour Parameterロジスティック(4PL)またはPoint-to-Point curve fittingアルゴリズムのいずれかを用いて、試料ヘプシジン濃度を決定した。この試験は、4PL curve fittingを用いて開発および検証された。どちらの方法とも非常に類似した結果を生じる。発明者らは、選択した後は一貫して一方の方法を用いることを推奨する。
【０１０７】
手動計算：
標準曲線を構築するために、線形グラフ用紙上にヘプシジン-25標準物質濃度(横軸)に対するヘプシジン-25標準物質の吸光度(OD 450 nm)(縦軸)をプロットする。点を通る最良の曲線を描く。曲線から対照および各未知試料の吸光度を読み取り、記録する。
【０１０８】
計算は、適切なコンピュータプログラムを用いて構築することもできる。
【０１０９】
ヘプシジン標準物質曲線データの例
2019500858.tif 000015
【０１１０】
血清ヘプシジンと血漿ヘプシジンとの相関性
図1のグラフは、標準的な手法を用いて血清、リチウムヘパリン血漿、およびEDTA血漿として得られかつ調製された8つのヒト血液試料(低、中、高ヘプシジン-25)からの血漿ヘプシジンに対する血清ヘプシジンの回帰分析を表す。IntrinsicヘプシジンIDx(商標)ELISAキットを用いて、ヘプシジン-25濃度を測定した。血清とEDTA血漿との間(●、y＝1.096x−1.25、R2＝0.994)、および血清とリチウムヘパリン血漿(■、y＝0.946x＋0.19、R2＝0.994)との間に強い相関性が観察された。図1を参照されたい。
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【０１１１】
保存および安定性
キットを2〜8℃で保存する。
【０１１２】
全てのマイクロウェルストリッププレートを、乾燥剤を伴うドライバッグ中での密封状態を維持する。
【０１１３】
試薬はキットの使用期限まで安定である。
【０１１４】
試験試薬を、熱、太陽または強い光にさらさない。
【０１１５】
警告および注意
生物学的に有害である可能性がある物質：標準物質および対照は、肝炎B表面抗原ならびにHIV抗体についてFDA認可の試薬により検査され非応答性であると認められた、ヒト供給源成分を含む。しかしながら、いずれの検査方法も、HIV、肝炎Bウイルスまたは他の感染性因子が存在しないという完全な保証を与えることはできない。これらの試薬は、バイオセイフティーレベル2物質として取り扱われるべきである。
【０１１６】
口でピペット操作をしない。検体またはキット試薬が扱われる区域では、タバコなどを吸わない、または酒を飲まない。
【０１１７】
このキット中の構成要素は一体型ユニットである。異なるロットからの試薬は混合されるべきではない。標準物質、対照および患者試料は二度繰り返して実行されることが推奨される。最適な結果はこのプロトコールを厳守することによって得られる。
【０１１８】
正確度および精度の高いピペット操作、注意深い洗浄および液滴除去、ならびに指定された温度での正確なタイミングが必須である。推奨値からの逸脱は無効データを生じる可能性がある。
【０１１９】
各バイアルに対してヘプシジン-25標準物質濃度値を調べる。この値はロット間で異なる可能性がある。
【０１２０】
250 ng/mlヘプシジン-25標準物質(標準物質7)の吸光度(A) 450 nm以下のA450 nmを有する患者試料は、希釈し、再実行するべきである(試料を希釈するための説明を参照されたい)。
【０１２１】
実施例2：アッセイの変動係数(CV)およびヘプシジンの性差
精度および正確度は、いかなるアッセイでも最も重要な機能的特徴の中に入る。正確度は、アッセイの再現性が乏しい場合、評価するのが難しい。1回のアッセイでのウェル毎の試料測定およびアッセイ毎の試料測定を再現する能力は、アッセイの実行可能性を理解するための第1段階である。
【０１２２】
ヘプシジン用の市販のイムノアッセイは一般に、20％を下回るアッセイ内およびアッセイ間変動係数(CV)を有する。本発明者らの課題は、ヘプシジン検出アッセイのより高い正確度のためにより精度の高いCVを有するキットを設計することであった。より高い精度の測定は、より高い正確度でのヘプシジンのレベルの上昇または低下に関連する状態の診断を可能にする。
【０１２３】
低、中、または高レベルの内在性ヘプシジンを含む血清試料を選択した。これらの試料を3つの独立したアッセイにおいて実行した(n＝16)。CVを各アッセイにおいて各試料について計算した。アッセイ内精度をアッセイ間の平均CVとして計算し、アッセイ間精度を全ての測定値のCVとして計算した(n＝48)。低、中、および高試料の平均値はそれぞれ、22.2 ng/ml、92.8 ng/ml、および222.5 ng/mlであった。本方法によって特定された全てのアッセイ内およびアッセイ間CVは5％を下回り、非常に精度が高かった。低、中、または高レベルの内在性ヘプシジンを含む血清試料を3回のアッセイで測定した(n＝16)。平均ヘプシジン値および関連変動係数を以下の表に列記する。
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＊平均n＝16；3回のアッセイに対するCV。^3アッセイを通してn＝48。
【０１２４】
優れた精度の確認は次いで、正確度の評価を可能にする。添加回収(spike recovery)は、添加した量が分かり、「ゴールドスタンダード(gold-standard)」比較アッセイを必要としないという事実のために、正確度を評価する最も直接的な方法である。2つのマトリクス：アッセイ緩衝液および血清が添加のために選択された。アッセイ緩衝液は、妨害物質が存在しない単純マトリクスである。選択された血清試料は、内在性ヘプシジンを欠いている臨床的に関連する複合マトリクスである。添加回収の認容基準は、試験した各レベルについて相対誤差(RE)±20％を求める。ヘプシジンを分析範囲にわたるレベルで各マトリクス内に添加した。
【０１２５】
添加回収：添加回収のために選択した2つのマトリクスは、アッセイ緩衝液および内在性ヘプシジンを含まない血清試料である。ヘプシジンを分析範囲にわたってこれらのマトリクス内に添加した。相対誤差を各測定値について計算した。以下の表に示すように、緩衝液および血清の平均相対誤差(RE)はそれぞれ、−12％および−4％であった。
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【０１２６】
緩衝液および血清の平均REはそれぞれ、−12％および−4％であった。
【０１２７】
健常な初回血液ドナーデータが、参照範囲を確立するために採用されうる。男性および女性のヘプシジン値は互いに有意に異なっていることから、参照範囲は別々に計算する。女性(n＝148)および男性(n＝142)の平均ヘプシジンはそれぞれ、21.9 ng/mlおよび41.5 ng/mlであると決定された。平均、中央値および選択分位数のデータを提供する以下の表で認められるように、女性および男性の5％から95％分位数はそれぞれ、2.6から59.5 ng/mlおよび7.3から104.3 ng/mlに及んだ。
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【０１２８】
ロバストなアッセイの別の重要な特徴は、希釈直線性である。これは、アッセイ緩衝液で連続的に希釈した高ヘプシジン血清試料の測定を伴う。許容可能な直線性は、希釈しない試料測定値と比較して希釈した試料の値が相対誤差±20％をもたらす場合に生じる。2つの高ヘプシジン血清試料をアッセイ緩衝液で1:2および1:4に希釈し、未希釈の試料と並行して測定した。以下の表に示すように、1:2および1:4希釈の平均相対誤差はそれぞれ、−2％および−1％であった。
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【０１２９】
希釈直線性：2つの血清試料を1:2および1:4に希釈し、次いで、ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキット、本特許に記載の現行のキットを用いてヘプシジンを測定した。未希釈の測定値への比較から相対誤差を計算した。市販の試験は1:2および1:4希釈についてそれぞれ3％および−3％の相対誤差を生じた。
【０１３０】
上記に提示した実験およびデータは、ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキットが、遺伝性および後天性の貧血および鉄過剰症の診断のための、ヘプシジン-25についての患者試料の臨床分析およびその後の臨床試験にとって優れた技術的特徴および実用性を有することを明確に示す。
【０１３１】
実施例3：現行のキットとDRG（登録商標)市販キットとの比較
製造者の説明書を用いて、本出願に記載の現行のキットをDRG(登録商標)ヘプシジン25 bioactive ELISA(EIA-5258)、version 4.1、2014年4月28日改訂、DRG International, Inc., USAと比較した。簡単に言うと、DRG(登録商標)キットの材料およびプロトコールは以下の通りである：
【０１３２】
キットによって提供されるDRG(登録商標)試薬
マイクロタイターウェル、12×8(分断)ストリップ、96ウェル；抗ヘプシジン-25抗体(モノクローナル)でコーティングされたウェル。
【０１３３】
標準物質(標準物質0〜5)、6バイアル(凍結乾燥)、0.2 mL；濃度：0−2−6.5−25−45−80 ng/mL；換算；1 ng/mL＝0.358 nmol/L非水銀系保存剤を含む。
【０１３４】
対照 低＆高、2バイアル、(凍結乾燥)、0.2 mL、対照値および範囲についてバイアルラベルまたはQC-データシートに記載する。
【０１３５】
アッセイ緩衝液、1バイアル、14 mL、使用準備済み、非水銀系保存剤を含む。
【０１３６】
酵素コンジュゲート、1バイアル、7 mL、使用準備済み、ビオチンにコンジュゲートしたヘプシジン-25；非水銀系保存剤を含む。
【０１３７】
酵素複合体、1バイアル、14 mL、使用準備済み、HRPにコンジュゲートしたストレプトアビジン；非水銀系保存剤を含む。
【０１３８】
基質溶液、1バイアル、14 mL、使用準備済み、テトラメチルベンジジン(TMB)。
【０１３９】
停止液、1バイアル、14 mL、使用準備済み、0.5 M H2SO4を含む。
【０１４０】
洗浄液、1バイアル、30 mL(40×濃縮)。
【０１４１】
使用前に、全ての試薬および必要とされる数のストリップを室温にする。
【０１４２】
キットによって提供されるDRG(登録商標)標準物質
標準物質バイアルの凍結乾燥内容物を0.2 mL脱イオン水で再構成し、最小で10分間静置させる。使用前に標準物質を複数回混合する。
【０１４３】
DRG(登録商標)対照
凍結乾燥内容物を0.2 mL脱イオン水で再構成し、最小で10分間静置させる。使用前に対照を複数回混合する。
【０１４４】
DRG(登録商標)洗浄液
脱イオン水を40×に濃縮した洗浄液に加える。30 mLの濃縮洗浄液を1170 mL脱イオン水で1200 mLの最終体積に希釈する。
【０１４５】
DRG(登録商標)検体収集および調製
血清またはヘパリン血漿をこのアッセイで用いることができる。EDTA血漿およびクエン酸血漿は値の低下(約20％)をもたらす。
【０１４６】
検体収集
血清：静脈穿刺(例えば、血清用Sarstedt Monovette)により血液を収集し、凝固させ、室温での遠心分離によって血清を分離する。完全な凝固が生じる前に遠心分離を行わない。抗凝固剤を含む試料は凝固時間を増やす必要がある可能性がある。
血漿：抗凝固剤を含む遠心チューブ内に全血を収集し(例えば、適切な血漿調製物を伴うSarstedt Monovette)、収集後直ちに遠心分離するべきである。
【０１４７】
検体希釈
初回アッセイにおいて、検体が最高量の標準物質を上回って含むことが認められる場合、検体をアッセイ緩衝液で希釈し、アッセイ手法で記載したように再アッセイすることができる。濃度の計算に関して、この希釈係数を考慮する必要がある。例：
(a) 希釈1:10：10 μL血清＋90 μLアッセイ緩衝液(完全に混合する)
(b) 希釈1:100：10 μL希釈(a)1:10＋90 μLアッセイ緩衝液(完全に混合する)
【０１４８】
アッセイ手法
各実行は標準曲線を含まなければならない。
1.  フレームホルダー中に所望の数のマイクロタイターウェルを固定する。
2.  適切なウェル内に100 μLのアッセイ緩衝液を分注する。
3.  適切なウェル内に新しい使い捨てチップを用いて20 μLの標準物質、対照および試料のそれぞれを分注する。
4.  各ウェル内に50 μLの酵素コンジュゲートを分注する。10秒間完全に混合する。この工程において完全に混合することは重要である。
5.  攪拌(300〜700 rpm)下で室温にて60分間インキュベートする。
6.  ウェルの内容物を素早く振り落とす。1ウェルあたり400 μL希釈洗浄液で3回 (プレート洗浄機を用いる場合)、または手動洗浄の場合は1ウェルあたり300 μL希釈洗浄液で4回、ウェルをすすぐ。ウェルを吸収紙上に鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。
7.  適切なウェル内に100 μLの酵素複合体を分注する。
8.  攪拌なしで室温にて30分間インキュベートする。
9.   ウェルの内容物を素早く振り落とす。1ウェルあたり400 μL希釈洗浄液で3回 (プレート洗浄機を用いる場合)、または手動洗浄の場合は1ウェルあたり300 μL希釈洗浄液で4回、ウェルをすすぐ。ウェルを吸収紙上に鋭く打ち、残留している液滴を取り除く。
10.  各ウェルに100 μLの基質溶液を加える。
11.  室温にて20分間インキュベートする。
12.  各ウェルに100 μLの停止液を加えることによって酵素反応を停止させる。
13.  各ウェルの吸光度(OD)をマイクロプレートリーダーにより450±10 nmにて決定した。停止液を添加した後10分以内にウェルを読み取ることが推奨される。
【０１４９】
結果の計算
標準物質、対照および試料の各セットについて平均吸光度を計算する。片対数グラフ用紙を用いて、縦(Y)軸上に吸光度値によりその濃度に対する各標準物質から得られた平均吸光度および横(X)軸上に濃度をプロットすることによって、標準曲線を構築する。
【０１５０】
各試料の平均吸光度値を用いて、標準曲線から対応する濃度を決定する。
【０１５１】
自動化法：IFUでの結果を、4 PL(4 Parameter Logistics)曲線当てはめを用いて自動的に計算している。4 Parameter Logisticsは好適な方法である。他のデータ還元関数はわずかに異なる結果を生じ可能性がある。試料の濃度はこの標準曲線から直接読み取ることができる。最高標準物質の濃度より高い濃度を有する試料はさらに希釈されるかまたは＞80 ng/mLと報告される必要がある。
【０１５２】
現行のキットとDRG(登録商標)ヘプシジン-25 bioactiveキットとの間の結果の比較
図1は、ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキットおよびDRG(登録商標)比較キットからの血漿ヘプシジンの結果の線形回帰を示す。回帰の傾きは、DRG(登録商標)キットは、ILSヘプシジンIDx(商標)ELISAキットと比較してHIPPA準拠Li-ヘパリン試料においておよそ9倍低いヘプシジン濃度を測定することを示す。2つのキット間の相関性はR2＝0.91で良好であった。血漿ヘプシジン濃度の不一致により、発明者らは、DRG(登録商標)比較キットを用いて本キットからの参照標準物質を測定し、かつILSヘプシジンIDx(商標)ELISAを用いてDRG(登録商標)キットからの参照標準物質を測定した。
【０１５３】
図2は、本キットの標準物質によるDRG(登録商標)比較参照標準物質の測定を示す。標準物質の比較の結果を、本キットとDRG(登録商標)比較キットとの間の直線回帰として図2に示す。回帰は、式y＝0.1101x−0.1176、R2=0.9907によって説明される。結果は本キットとDRGキットとの間で高度に相関する一方で、同じ記載の濃度の標準物質の場合にDRG(登録商標)標準物質は本発明からのものよりおよそ9倍低いことを明確に示す。
【０１５４】
図3は、DRG(登録商標)比較キットを用いて測定した本キットからの参照標準物質を比較する。この比較の結果を、式y＝10.648x−4.3862、R2＝0.9989によって説明される直線回帰として図3に示す。この比較は、DRG(登録商標)参照標準物質がDRG(登録商標)キットに記載された参照標準物質上にラベルされたものより10.6倍低いことを確認する。本キットで用いられる標準物質は、ラベルされている実際の濃度のヘプシジンを含んでおり、DRG(登録商標)キットが、MALDI-TOF Mass Specアッセイと同様の結果を生じるように調整される必要がある参照標準物質を用いることを示す。
【０１５５】
図4Aおよび4Bは、本キットが既存の市販のDRG(登録商標)キットより改良されたものであること実証する。これらの図は、各々のヘプシジンELISAに対する試料マトリクスの相対的作用を示す。図4Aは、Li-ヘパリン血液チューブまたはK2-EDTAをそれぞれ用いる血漿として調製された同じ試料に対する血清として調製された同じ血液試料からの本キットの結果を示す。直線回帰式の検分によって、Li-ヘパリンまたはK2-EDTAのいずれかを用いて血漿として調製した試料は、どちらの血漿マトリクスでも非常に類似する傾きを生じ、およそ±10％の血清試料の傾きであったる。
【０１５６】
図4Bは、血清またはLi-ヘパリンまたはK2-EDTAとして調製した同じ試料を示す。Li-ヘパリンおよびK2-EDTA両方の回帰分析および式とも、本キットと比較して血清に対して試料マトリクスタイプのはるかに高い影響(±34％)を示す(Li-ヘパリン；y＝0.7915x−0.1571；K2-EDTA；y＝0.6545x−0.529)。本キットにおける血漿および血清ヘプシジン濃度間のより高い一致は、DRG(登録商標)より明らかに改良されたものである。
【０１５７】
結論として、本発明の本キットは、比較DRG(登録商標）ヘプシジン-25(Bioactive)ELISAキット(EIA-5258)およびDRG(登録商標)の新しいバージョン(EIA-5782)に含まれたデータより著しく技術的に改善されたものである。
【０１５８】
本キットは、本キット中の参照標準物質チューブ上に示された濃度で製剤化され、かつ結果がMALDI-TOF MS試験のものを再現するような人工的調整が行われない参照標準物質を利用しており、そのような人工的調製は重大な解析前エラーそのものを抱える可能性がある(図2および3)。実際、DRG(登録商標)ヘプシジン-25(Bioactive)ELISAキット(EIA-5258)およびDRG(登録商標)の新しいバージョン (EIA-5782)を用いる試料中のヘプシジンの1回の測定は、それらのキットで提供される標準物質のために、不正確な結果を得る可能性がある。
【０１５９】
加えて、本キットは、DRG(登録商標)比較キットと比較した場合、血漿を調製するのに用いられる抗凝固剤にもかかわらず、一貫した結果を生じる(図4Aおよび4B)。
【０１６０】
本キットは、発明者らが比較において用いるDRG(登録商標)比較キットならびにDRG(登録商標)比較キットの新しいバージョンの80 ng/mlに対して、ゼロから250 ng/mlの3倍広い分析測定範囲も有する。これは、慢性腎臓病(CKD)など血漿ヘプシジン濃度が増大することが知られている疾患からの試料、透析患者試料、および他の炎症性疾患のより広い範囲の測定を可能にする。
【０１６１】
本キットは、DRG(登録商標)比較キットのものより優れたアッセイ間およびアッセイ内変動係数(CV)を有する。
【０１６２】
本キットについて報告された参照範囲は、DRG(登録商標)キットを用いても観察されない女性と男性との間の明確な性差を示す。性差は、任意の優れた有効性が確認されたヘプシジンアッセイにとってヘプシジン参照範囲の予想される特徴である。
【０１６３】
IntrinsicヘプシジンIDx(商標)ELISAキットとDRG(登録商標)比較キットとの間の重要な差異は、本キットはFDA準拠の設計管理および品質システムに基づきFDA承認cGMP施設で製造されることである。本キットは、多施設共同臨床試験後のFDA許可に適している。
【０１６４】
本発明の重要な利点は、フェロポーチン、ヘプシジンの受容体およびヒトにおける主な鉄輸送体に対する生物活性がより低い、生物活性ヘプシジン-25および他のアイソフォームのN末端の高感度かつ特異的結合を可能にするよう用いられる、独自の高親和性モノクローナル抗体、mAb583である。Mab583は、ヘプシジン-25への優れた親和性を有し、Biacore結合定数は7〜8 pMと推定される。このmAb583抗体は、安定性を有しかつ標準的な技術およびバイオリアクター技術を用いて商業的量のmAbを生じる、不死化ハイブリドーマとして保存される。
【０１６５】
これに対して、比較キットにおいて用いられる抗体については、ヘプシジンのC末端に結合するもの以外はほとんど知られていない。C末端および実際にはC末端中のジスルフィド対パターンは、生物活性に対してほとんど作用を有さないことが示されていて、よって、試験は、ヘプシジンの生物活性型に特異的ではない結合エピトープに依拠する。ヘプシジン-25およびN末端の重要な役割を考慮すると、本キットで重要な試薬として用いられるmAb583抗体は、大幅に改善されたものでありかつ優れたものである。DRG(登録商標)比較キットで用いられる抗体は、ヘプシジン-25の構造および機能の公知の作用に関して信頼性が低い。
【０１６６】
まとめると、これらの実施例は、本キットが既存の市販のキットより改良されたものであることを明確に示す。
【０１６７】
本発明の好ましい態様が本明細書に示されかつ記載されているが、そのような態様は例としてのみ提供されることが当業者には明らかである。ここで、多数の変化形態、変更形態、および置換形態が、本発明から逸脱することなく当業者に思いつくであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対するさまざまな代替が本発明を実施する際に採用されうることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義すること、およびこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれらによって含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019500858.tif 000027