(57)【要約】  ＲＣＡ産物からインビトロにおける転写および翻訳のための方法が提供される。本方法は、二本鎖ＲＣＡ産物を準備するステップであって、二本鎖ＲＣＡ産物は基本的に最小限の発現配列のタンデムリピートからなる、ステップを含む。本方法は、無細胞発現系において二本鎖ＲＣＡ産物からタンパク質を発現させるステップをさらに含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物（１６）を準備するステップであって、前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）は基本的に最小限の発現配列（１２）のタンデムリピートからなる、ステップと、
無細胞発現系において前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）からタンパク質を発現させるステップと
を含む、インビトロにおける転写および翻訳のための方法であって、前記最小限の発現配列（１２）は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位および翻訳停止配列からなる、方法。
【請求項２】
前記最小限の発現配列（１２）には、宿主細胞においてプラスミドの増殖に必要とされる外来性配列が全くない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）は、さらなる処理を全く行わずに無細胞発現系に提供される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）は、チオ化ヌクレオチドを含む、請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
前記最小限の発現配列（１２）は、基本的に転写終結配列、インスレーター配列、またはそれらの組み合わせからさらになる、上記請求項の１つ以上記載の方法。
【請求項６】
前記オープンリーディングフレームは、翻訳速度を向上させるためにコドン最適化配列を含む、上記請求項の１つ以上記載の方法。
【請求項７】
前記オープンリーディングフレームは、タンパク質の精製のためのタグ配列を含む、上記請求項の１つ以上記載の方法。
【請求項８】
前記無細胞発現系は、原核細胞抽出物、真核細胞抽出物、またはそれらの組み合わせを含む、上記請求項の１つ以上記載の方法。
【請求項９】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ミニサークル（１４）を準備するステップであって、前記ＤＮＡミニサークル（１４）は、基本的に最小限の発現配列（１２）からなる、ステップと、
前記ＤＮＡミニサークル（１４）のローリングサークル増幅により二本鎖ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物（１６）を形成するステップと、
無細胞発現系において前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）からタンパク質を発現させるステップと
を含む、インビトロにおける転写および翻訳のための方法であって、前記最小限の発現配列（１２）は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位および翻訳停止配列からなる、方法。
【請求項１０】
前記最小限の発現配列（１２）には、宿主細胞においてプラスミドの増殖に必要とされる外来性配列が全くない、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）は、さらなる処理を全く行わずに無細胞発現系に提供される、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
前記二本鎖ＲＣＡ産物（１６）は、チオ化ヌクレオチドを含む、請求項９、１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記最小限の発現配列（１２）は、基本的にインスレーター配列、転写終結配列、またはそれらの組み合わせからさらになる、請求項９乃至１２の１つ以上記載の方法。
【請求項１４】
前記オープンリーディングフレームは、発現タンパク質の精製のためのタグ配列を含む、請求項９乃至１３の１つ以上記載の方法。
【請求項１５】
前記ローリングサークル増幅は、約１０μＭから約１０ｍＭの範囲の最終濃度のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を使用して実施される、請求項９乃至１４の１つ以上記載の方法。
【請求項１６】
前記ローリングサークル増幅は、ヌクレオチドアナログを含むランダムプライマー混合物を使用して実施される、請求項９乃至１５の１つ以上記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレオチドアナログは、イノシン、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、チオ化ヌクレオチド、２−アミノ−デオキシアデノシン、２−チオ−デオキシチミジン、ポリカチオンヌクレオチド、またはＺｉｐ核酸（ＺＮＡ）ポリカチオン修飾ヌクレオチドである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ランダムプライマー混合物は、配列＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎを有する、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記無細胞発現系は、原核細胞抽出物、真核細胞抽出物、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９乃至１８の１つ以上記載の方法。
【請求項２０】
前記オープンリーディングフレームは、翻訳速度を向上させるためにコドン最適化配列を含む、請求項９乃至１９の１つ以上記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に最小限の発現配列を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ミニサークルのローリングサークル増幅によるローリングサークル増幅産物の形成に関する。本発明はさらに、ローリングサークル増幅産物のインビトロにおける転写および翻訳を含む、改善された無細胞タンパク質発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
無細胞タンパク質発現は、細胞培養の複雑化、細胞操作、または細胞トランスフェクションなしにタンパク質を形成するための単純で効率的な方法を提供する。組み換えタンパク質を発現させるための無細胞系は、タンパク質毒性、タンパク質分解、タンパク質凝集およびミスフォールディング、無制御の翻訳後修飾、または細胞装置の隔離による細胞増殖に対するタンパク質発現の悪影響などの細胞ベースの発現系のさまざまな制限に対処する。無細胞タンパク質発現系を使用して、著しく多い量のタンパク質をより短い期間に発現させることができ、これは、後のハイスループットな構造的および機能的解析のために利用することができる。そのようなインビトロにおけるタンパク質発現はまた、コスト節減、能率化された生成、より容易なスケールアップ、および簡略化された精製に関して著しい利点を有する。無細胞タンパク質発現系において、目的とするタンパク質の遺伝子をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを、転写・翻訳能力がある細胞抽出物に添加し、目的とする遺伝子の転写および／または翻訳を実施することによって目的とする所望のタンパク質を発現させる。転写および翻訳は、新しく合成されたｍＲＮＡのタンパク質への速やかな翻訳を可能にするために単一の反応と共役させてもよい（インビトロにおける転写・翻訳系と共役させるか、または無細胞系における転写・翻訳と共役させる）。共役させたインビトロにおける転写および翻訳は、一般により短時間およびより少ないインビトロ操作で、発現させるタンパク質の産生量を高める。ｍＲＮＡの速やかな翻訳は、ｍＲＮＡ分解またはミスフォールディングに関連する起こりうる有害な影響を回避する。
【０００３】
インビトロにおける転写・翻訳系の制約の１つは、大量の（一般にマイクログラム量で）ＤＮＡ鋳型を必要とすることである。一般に、十分な量のＤＮＡは、例えば、ＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）においてプラスミドを増殖させることにより、または複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）からＤＮＡを合成することにより複数のワークフローステップおよび大幅な労働努力により得ることができる。しかしながら、ＰＣＲは、部分的にＰＣＲの高い変異率のために、高品質なＤＮＡの大規模形成には適用できないことが多い。さらに、ＰＣＲ反応の熱サイクルは、大きな体積でどれだけ急速に温度を増減させることができるかに対する制約により、大きな反応にスケールアップすることが難しい。さらに、直鎖のＤＮＡ配列であるＰＣＲ産物は、無細胞転写・翻訳抽出物に存在するヌクレアーゼの作用によって急速に分解される可能性もある。さらに、目的とする遺伝子のプラスミドベクターへのサブクローニングに続く遺伝子選択によるＥ．ｃｏｌｉにおける大規模増殖は、時間がかかり、労力集約的である。
【０００４】
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などの等温ＤＮＡ増幅技術は、より少ない労力、時間、および費用で大量の高品質なＤＮＡを形成するために利用することができ、これは、環状核酸鋳型から開始する。ローリングサークル増幅反応は等温で起こり、急速な加熱および冷却を必要としないため、スケールアップを直接より大きな反応サイズにする。ローリングサークル増幅は、鋳型核酸配列のタンデムリピート単位（コンカテマー）であるＲＣＡ産物を形成する。プラスミドＤＮＡのＲＣＡに続く、共役させたインビトロにおける転写および翻訳は、目的とするタンパク質を形成することができる。ただし、これらのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞内における遺伝子選択を含む標準的なクローニング法により作製される。したがって、そのようなプラスミドは、複製開始点（例えば、ｏｒｉＣ）、抗生物質選択（例えば、ベータ−ラクタマーゼのためのａｍｐ）のための配列、およびｌａｃＺ、ベータ−ガラクトシダーゼなどの宿主細胞において選択および／またはプラスミドのスクリーニングに使用される補助的な配列を含む多くの付加的なコード配列および非コード配列を含む。これらの補助的な配列の転写および／または発現は、細心の注意を払ってプラスミドにサブクローニングされる目的とする遺伝子に対して望ましくないか、または非効率だと考えられる可能性もある。したがって、プラスミド内における目的とする遺伝子のＰＣＲ増幅が、無細胞タンパク質発現に利用される場合が多い。
【０００５】
いかなる外来性配列および宿主細胞夾雑物が、最適に排除されており、ＰＣＲ合成を必要としないＤＮＡから転写および翻訳される所望のタンパク質の容易な形成のための改善されたインビトロにおける転写および翻訳系が必要とされている。また、簡素化され、時間のかからない方法を使用して、無細胞タンパク質系の産生量を高めることが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＹＯＳＨＩＨＩＲＯ  ＳＡＫＡＴＡＮＩ  ＥＴ  ＡＬ：“Ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＲＥＰＯＲＴＳ，ｖｏｌ．５，ｎｏ．１，２７  Ｍａｙ  ２０１５（２０１５−０５−２７），ＸＰ０５５３８１１３０，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１０４０４  ｔｈｅ  ｗｈｏｌｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＲＣＡ産物を使用したインビトロにおける転写および翻訳のための方法が提供される。本方法は、（ａ）二本鎖ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物を準備するステップであって、二本鎖ＲＣＡ産物は基本的に最小限の発現配列のタンデムリピートからなる、ステップと、（ｂ）無細胞発現系において、二本鎖ＲＣＡ産物からタンパク質を発現させるステップとを含む。最小限の発現配列は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位および翻訳停止配列からなる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡミニサークルを使用したインビトロにおける転写および翻訳のための方法が提供される。本方法は、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ミニサークルを準備するステップであって、ＤＮＡミニサークルは、基本的に最小限の発現配列からなる、ステップと、（ｂ）ＤＮＡミニサークルのローリングサークル増幅により二本鎖ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物を形成するステップと、（ｃ）無細胞発現系において、二本鎖ＲＣＡ産物からタンパク質を発現させるステップとを含む。最小限の発現配列は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位および翻訳停止配列からなる。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明を添付の図を参照して読むとさらによく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ミニサークル由来のＲＣＡ産物を使用した、インビトロにおける転写および翻訳の方法の実施形態の略図である。
【図２】さまざまなプライマーおよび反応条件を使用した、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物の産生量を示すグラフである。
【図３】ＰＣＲ増幅ＤＮＡ鋳型と比較した、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物をインビトロにおける転写および翻訳に使用した場合の増大した緑蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の増加した発現を示すグラフであり、ここでは、ＥＧＦＰコード領域は前後関係のコドン選択を使用して設計された。
【図４】ＰＣＲ増幅ＤＮＡ鋳型と比較した、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物をインビトロにおける転写および翻訳に使用した場合のＥＧＦＰの増大した発現を示すグラフであり、ここでは、ＥＧＦＰコード領域は、個々のコドン選択を使用して設計された。
【図５】チオ化（ｔｈｉｏａｔｅｄ）ヌクレオチドを含むか、または含まない、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物、ならびにチオ化ヌクレオチドを全く含まないＰＣＲ増幅ＤＮＡを使用した、インビトロにおける転写および翻訳によるＥＧＦＰ発現の量を示すグラフである。
【図６】チオ化ヌクレオチドを含むか、または含まない、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物、ならびにチオ化ヌクレオチドを全く含まないＰＣＲ増幅ＤＮＡを使用した、インビトロにおける転写および翻訳によるＥＧＦＰ発現の量を示すグラフである。
【図７】ＰＣＲ増幅ＤＮＡ鋳型および鋳型なし対照（ＮＴＣ）発現反応と比較した、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物を使用した、共役させたインビトロにおける転写および翻訳によるＢＯＤＩＰＹ標識ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２、約１６ｋＤ）の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す画像である。
【図８】図７の画像濃度測定によるＩＬ−２の無細胞発現量を示すグラフである。
【図９】プラスミドＤＮＡ由来のＲＣＡ産物と比較した、最小限の発現配列を有するＤＮＡミニサークルから形成されたＲＣＡ産物のインビトロにおける転写および翻訳によるＥＧＦＰの増大した発現を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の詳細な説明は、例となるものであり、本発明または本発明の使用を限定することは意図しない。明細書全体をとおして、特定の用語の例示は、非限定例と見なされるべきである。単数形「ある（ａ、ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り複数の指示対象を含む。近似を表す言い回しは、本明細書中で使用される場合、明細書および特許請求の範囲全体をとおして、それが関連する基本的な機能を変化させることなく許容される範囲で変化し得るあらゆる量的な表記を修飾するために利用されることもある。したがって、「約」などの用語によって修飾される値は、明記されている厳密な値に限定されない。別に指示がある場合を除いて、本明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表すすべての数は、すべての例において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対のことが示されていない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値的パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化する可能性がある近似値である。必要な場合、範囲が提供され、それらの範囲はそれらの間のすべての部分範囲を含む。特許請求される発明の主題をさらに明らかに簡潔に記載し、指し示すために、特定の用語に関する以下の定義を提供し、これらは、以下の説明および添付の特許請求の範囲において使用される。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語はグリコシルアミン化合物を指し、核酸塩基（ヌクレオベース）が糖部分に連結されている。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドリン酸を指す。ヌクレオチドは、表１に記載されているそのヌクレオシドと対応するアルファベット文字（文字指定）を使用して表すことができる。例えば、Ａはアデノシン（ヌクレオベース、アデニンを含むヌクレオシド）を指し、Ｃはシチジンを指し、Ｇはグアノシンを指し、Ｕはウリジンを指し、Ｔはチミジン（５−メチルウリジン）を指す。ＷはＡまたはＴ／Ｕのいずれかを指し、ＳはＧまたはＣのいずれかを指す。Ｎはランダムなヌクレオシドを表し、ｄＮＴＰはデオキシリボヌクレオシド三リン酸を指す。Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕのいずれでもよい。
【００１３】
【表１】
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本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチドアナログ」という用語は、構造的に天然に存在するヌクレオチドと類似した化合物を指す。ヌクレオチドアナログは、改変されたリン酸骨格、糖部分、ヌクレオベース、またはそれらの組み合わせを有してもよい。ヌクレオチドアナログは、天然のヌクレオチド、合成のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または代替置換部分（例えば、イノシン）であってもよい。一般に、改変されたヌクレオベースを有するヌクレオチドアナログは、特に、異なる塩基対合および塩基のスタッキング特性を与える。本明細書中で使用される場合、「ＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドアナログを指し、ヌクレオチドの糖部分が、リボ核酸（ＲＮＡ）模倣糖立体構造に固定された二環式フラノース単位を含む。デオキシリボヌクレオチド（またはリボヌクレオチド）からＬＮＡヌクレオチドへの構造変化は、化学的観点から限定され、すなわち、２位と４位にある炭素原子の間の付加的な連結の導入に限定される（例えば、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合；例えば、Singh, S. K., et. al., Chem. Comm., 4, 455-456, 1998、またはKoshkin, A. A., et. al., Tetrahedron, 54, 3607-3630, 1998.参照）。ＬＮＡヌクレオチド中の２位および４位のフラノース単位は、Ｏ−メチレン（例えば、オキシ−ＬＮＡ：２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド）、Ｓ−メチレン（チオ−ＬＮＡ）、またはＮＨ−メチレン部分（アミノ−ＬＮＡ）などによって連結されてもよい。そのような連結は、フラノース環の立体構造の自由を制限する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的な一本鎖ＲＮＡ、および相補的な一本鎖または二本鎖ＤＮＡに対する増大したハイブリダイゼーション親和性を示す。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａ型（ＲＮＡ様）二本鎖立体構造を誘導することができる。改変されたリン酸糖骨格を有するヌクレオチドアナログ（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ）は、特に、二次構造形成などの鎖の特性を改変する場合が多い。文字指定に先行するアスタリスク（＊）記号は、文字によって指定されたヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを指す。例えば、＊Ｎは、ホスホロチオエート修飾されたランダムなヌクレオチドを表す。文字指定に先行するプラス（＋）記号は、文字によって指定されたヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであることを指す。例えば、＋ＡはアデノシンＬＮＡヌクレオチドを表し、＋Ｎはランダムなロックドヌクレオチド（すなわち、ランダムなＬＮＡヌクレオチド）を表す。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのオリゴマーを指す。「核酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオチドのポリマーを指す。「配列」という用語は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたは核酸のヌクレオチド配列を指す。明細書全体をとおして、オリゴヌクレオチドまたは核酸が文字の配列によって表される場合は必ず、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序である。例えば、ｘ＝２、ｙ＝３およびｚ＝１である文字配列（Ｗ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｓ）ｚによって表されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列ＷＷＮＮＮＳを表し、Ｗは５’末端ヌクレオチドであり、Ｓは３’末端ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのアナログ（例えば、ホスホロチオエートアナログ）であってもよい。オリゴヌクレオチドまたは核酸はまた、修飾塩基および／または骨格（例えば、修飾リン酸結合または修飾糖部分）を含んでもよい。核酸に安定性および／またはその他の利点を付与する合成骨格の非限定例としては、ホスホロチオエート結合、ペプチド核酸、ロックド核酸、キシロース核酸、またはそれらのアナログを挙げることができる。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「プライマー」という用語は、核酸合成反応を刺激する標的核酸配列（例えば、増幅対象のＤＮＡ鋳型）とハイブリダイズする短い直鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列であってもよい。プライマーは、天然のヌクレオチド、合成のヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。プライマーの長さの上限および下限の両方は経験的に決定される。プライマーの長さに対する下限は、ハイブリダイゼーション時に核酸増幅反応条件において標的核酸と安定した二本鎖を形成するために必要とされる最低限の長さである。非常に短いプライマー（一般には、３未満のヌクレオチド長）は、そのようなハイブリダイゼーション条件下において標的核酸と熱力学的に安定した二本鎖を形成しない。上限は、標的核酸中の予め決められた核酸配列以外の領域において二本鎖形成をする可能性によって決定される場合が多い。一般に、適したプライマーの長さは、約３ヌクレオチド長から約４０ヌクレオチド長の範囲である。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「ランダムプライマー」という用語は、所与の位置が任意の可能なヌクレオチドまたはそのアナログからなることが可能であるように、オリゴヌクレオチド配列中の任意の所与の位置のヌクレオチドをランダム化すること（完全なランダム化）によって形成されるプライマー配列の混合物を指す。よって、ランダムプライマーは、配列内のすべての可能なヌクレオチドの組み合わせからなるオリゴヌクレオチド配列のランダムな混合物である。例えば、ヘキサマーランダムプライマーは、配列ＮＮＮＮＮＮまたは（Ｎ）６によって表されてもよい。ヘキサマーランダムＤＮＡプライマーは、４つのＤＮＡヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのすべての可能なヘキサマーの組み合わせからなり、結果として４６（４，０９６）の固有のヘキサマーＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含むランダムな混合物を生じる。ランダムプライマーは、標的核酸の配列がわからない場合または全ゲノム増幅反応を実施するために核酸合成反応を刺激するために効果的に使用することができる。ランダムプライマーはまた、プライマーの濃度に応じて、一本鎖ＲＣＡ産物ではなく、二本鎖ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）産物を刺激し、作製する際に効果的である場合もある。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）」という用語は、ローリングサークルメカニズムにより環状核酸鋳型（例えば、一本鎖／二本鎖ＤＮＡサークル）を増幅する核酸増幅反応を指す。ローリングサークル増幅反応は、環状の一本鎖であることが多い核酸鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションによって開始される。その後、核酸ポリメラーゼが、環状核酸鋳型の周りを囲んで連続的に進行して、何度も繰り返して核酸鋳型の配列を複製すること（ローリングサークルメカニズム）によって環状核酸鋳型とハイブリダイズするプライマーを伸長する。ローリングサークル増幅は、一般に環状核酸鋳型配列のタンデムリピート単位を含むコンカテマーを生成する。ローリングサークル増幅は、直線的な増幅動態（例えば、単一の特異的なプライマーを使用するＲＣＡ）を示す直線的ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）であってもよく、または指数関数的な増幅動態を示す指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）であってもよい。ローリングサークル増幅はまた、複数のプライマーを使用して実施されてもよく（複合的に刺激されるローリングサークル増幅またはＭＰＲＣＡ）、これは、超分岐コンカテマーをもたらす。例えば、二重に刺激されるＲＣＡにおいて、一方のプライマーは直線的ＲＣＡにおいてのように、環状核酸鋳型と相補的であってもよいのに対して、他方はＲＣＡ産物のタンデムリピート単位核酸配列と相補的であってもよい。したがって、二重に刺激されるＲＣＡは、一連の複数のハイブリダイゼーション、プライマー伸長、およびプライマーおよび両鎖の両方が関係する鎖置換事象のカスケードを特徴とする指数関数的な増幅動態を伴う連鎖反応として進行することができる。これは、コンカテマーの二本鎖核酸増幅産物の分離したセットを形成する場合が多い。ＲＣＡは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼなどの適した核酸ポリメラーゼを使用して等温条件下でインビトロにおいて実施することができる。適したポリメラーゼは、鎖置換型ＤＮＡ合成能力を持つ。
【００１８】
１つ以上の実施形態は、無細胞発現系（例えば、インビトロにおける転写および翻訳系）においてタンパク質を発現させるための方法を対象とする。一実施形態において、タンパク質は、ローリングサークル増幅によって形成されたＲＣＡ産物のインビトロにおける転写および翻訳によって発現させる。これらのインビトロにおける転写および翻訳反応は、無傷細胞が全くないタンパク質をもたらす。そのようなタンパク質の形成は、構造的および機能的プロテオミクスを含む無数の用途において望ましい場合もある。そのようなタンパク質の無細胞発現は、特に治療用途に望ましい可能性がある。
【００１９】
無細胞発現は、一般に（１）単一の反応においてｍＲＮＡおよびタンパク質が生成されるか、または（２）第１の反応においてｍＲＮＡが生成され、得られたｍＲＮＡ産物が第２の別個の翻訳反応に加えられる２つの様式を包含する。ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物は、様式（１）または（２）のいずれにも利用することができる。例えば、一実施形態において、ＲＣＡ産物は、「共役させたインビトロ転写・翻訳反応」に提供されてもよく、ここで、ＲＣＡ産物ＤＮＡはｍＲＮＡに変換され、１つの反応混合物においてｍＲＮＡが同時にタンパク質へと発現される。この１つの反応混合物は、ＲＮＡおよびタンパク質の両方を生成する能力を包含する。別の実施形態において、ＲＣＡ産物は、「連結された転写・翻訳反応」に提供されてもよく、ここで、ＲＣＡ産物ＤＮＡはまずｍＲＮＡに変換され、ｍＲＮＡが別に翻訳反応混合物に添加されて、タンパク質を発現する。
【００２０】
二本鎖ＲＣＡ産物からのインビトロにおける転写および翻訳のための方法の１つ以上の実施形態が提供される。例となる一実施形態において、本方法は、二本鎖ＲＣＡ産物を準備するステップと、無細胞発現系において二本鎖ＲＣＡ産物からタンパク質を発現させるステップとを含む。二本鎖ＲＣＡ産物は基本的に最小限の発現配列のタンデムリピートからなり、ここで、最小限の発現配列は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位および翻訳停止配列からなる。
【００２１】
述べたとおり、二本鎖ＲＣＡ産物は基本的に最小限の発現配列のタンデムリピートからなる。最小限の発現配列は、最小限に、プロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位、および翻訳停止配列を含む。これは、ＲＣＡ産物のインビトロにおける転写および／または翻訳に実質的に影響を与えない配列をさらに含んでもよい。例えば、これは、翻訳エンハンサー配列、インスレーター配列、または転写終結配列などの配列をさらに含んでもよい。ただし、最小限の発現配列および得られる二本鎖のＲＣＡ産物は、ＲＣＡ産物のインビトロにおける転写および翻訳におもわしくない影響を与える可能性があるいかなる付加的な配列も含まない。例えば、ＲＣＡ産物は、複製開始点、抗生物質選択遺伝子、あるいはクローニング、選択、スクリーニングおよび／または宿主細胞における複製に必要とされる任意のその他の補助的な配列などのあらゆる外来性配列も排除する。ＲＣＡ産物中のそのような外来性配列の存在は、無細胞タンパク質発現における転写および／または翻訳に実質的に影響を及ぼすであろう。
【００２２】
最小限の発現配列とは、特定の目的とする遺伝子を含む核酸配列である。最小限の発現配列はまた、特に目的とする遺伝子の発現に必要とされる最小限の遺伝要素または配列（例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列）を含むことが可能である。１つ以上の実施形態において、最小限の発現配列は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位および翻訳停止配列からなる。適したプロモーターの多数の例が当該技術分野において知られており、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が挙げられる。同様に、適したリボソーム結合部位の多数の例が当該技術分野において知られており、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ポリＡトラクト、種に依存しない翻訳リーダー（ＳＩＴＳ）、Ｋｏｚａｋ共通配列、およびＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列が挙げられる。上述のとおり、最小限の発現配列は、ＲＣＡ産物のインビトロにおける転写および翻訳に実質的に影響を与えない要素をさらに含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、最小限の発現配列は、翻訳エンハンサー配列、インスレーター配列、転写終結配列、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。本方法の一実施形態において、最小限の発現配列は、基本的にプロモーター、オープンリーディングフレーム、リボソーム結合部位、翻訳停止配列、およびインスレーター配列からなる。インスレーター配列は、一般にリボソームの結合または翻訳開始の効率を向上させる。適したインスレーター配列の多数の例が当該技術分野に存在し、例えば、ポリヒスチジントラクトをコードする配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、インスレーター配列は、リボソーム結合部位の周囲にスペーサー配列を挿入することによって、または発現タンパク質のＮ末端内においてコドンの最適化もしくは挿入を行うことによって経験的に決定することができる。最小限の発現配列は、プレプロモーター配列、プロテアーゼ切断もしくはヌクレオチド切断のための配列、タンパク質精製のための配列、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。最小限の発現配列は、所望のタンパク質産物の転写および／または翻訳のいずれかを妨害または阻害するか、あるいは別の方法でタンパク質生成をさらに厄介にする配列を全く含まないよう選択される。
【００２３】
１つ以上の実施形態において、ＲＣＡ産物は、鋳型としてのＤＮＡミニサークルから形成され、ここで、ＤＮＡミニサークルは、基本的に最小限の発現配列からなる。ＲＣＡ産物は、直鎖または分岐鎖コンカテマーであってもよく、このコンカテマーは、ＤＮＡミニサークル由来の最小限の発現配列のタンデムリピートを含む。好適な実施形態において、ＲＣＡ直鎖コンカテマーは二本鎖である。述べたとおり、ＤＮＡミニサークルは、基本的に最小限の発現配列からなり、これは、ＤＮＡミニサークルが最小限の発現配列のみを含み、あらゆる外来性配列などの最小限の発現配列以外のいかなる配列も排除することを意味する。したがって、最小限の発現配列を含むＤＮＡミニサークルの増幅は、細胞外でのみ達成することができる。
【００２４】
「外来性配列」は、所望のタンパク質のコードまたは発現に必要な配列を含む。外来性配列は、ｌａｃＺ、ベータ−ガラクトシダーゼなどの選択、スクリーニング、および／または宿主細胞におけるプラスミドの増殖に使用される補助的な配列を含む場合もある。外来性配列は、複製開始点、抗生物質選択遺伝子、複数のクローニングサイトなどの遺伝子の挿入のための適した制限部位、またはそれらの組み合わせのための配列を含む場合もある。外来性配列は、宿主細胞へのクローニングまたは宿主細胞における検出のために必要とされる任意のその他の配列をさらに含む場合もある。
【００２５】
１つ以上の実施形態において、最小限の発現配列のオープンリーディングフレームは、コドン最適化配列、精製タグ配列、プロテアーゼ切断部位またはそれらの組み合わせを含む。コドン最適化配列をもたらすために、コドンバイアス、前後関係のコドン選択、および／または個々のコドン選択が、一般に考慮される要素である。
【００２６】
オープンリーディングフレームのコドン最適化配列は、ＲＣＡ産物の翻訳率または品質を向上させる場合もある。コドン最適化は、一般に目的とする遺伝子の翻訳効率を高めることによってタンパク質発現を向上させる。遺伝子の機能性も、特別設計の遺伝子内のコドン使用頻度を最適化することによって高めることができる。コドン最適化実施形態において、種における低頻度のコドンは、高頻度のコドンによって置換されてもよく、例えば、ロイシンに対する低頻度のコドンＵＵＡは、高頻度のコドンＣＵＧで置換されてもよい。コドン最適化はｍＲＮＡの安定性を高め、ひいては、タンパク質翻訳率またはタンパク質フォールディングを変えることもある。さらに、コドン最適化は、転写および翻訳制御をカスタマイズする、リボソーム結合部位を改変する、またはｍＲＮＡ分解部位を安定させることができる。
【００２７】
一例において、（転写終結配列および個々のコドンのそれぞれに関して最適化されたコドンを有するヒトＩＬ−２をコードする配列番号８のＤＮＡミニサークル由来の）ＲＣＡ産物５４のコドン最適化後に予想外に高分子量のタンパク質の発現（２６ｋＤ〜７２ｋＤ）が観察された（図７）。図７に示される例において、ＲＣＡ産物またはＰＣＲ増幅対照ＤＮＡ（配列番号７および配列番号８由来）の最小限のＩＬ２発現配列は、ＩＬ−２オープンリーディングフレーム内のコドン使用頻度を除いて実質的に同一であった。配列番号８は、ＪＣａｔツールに従ってコドンが最適化され［Grote et al., Nucleic Acids Res. Jul 1, 2005; 33(Web Server issue: W526-531). JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host.］、これは、発現宿主のコドン選択に対して標的遺伝子の個々のコドン使用頻度を最大にする。対照的に、配列番号７は、ヒトＩＬ−２の天然のコード配列から開始するコドン最適化プロセスに基づいて前後関係によって適合され、ここで、特定の部位のみが再コード化された。ＩＬ−２のコード配列は、２つのジ−リジンリピートを含み、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡＡＡコドンがＡＡＧよりも著しく好ましいため、ＪＣａｔツールによってポリＡトラクトに再コード化された。これらのジ−リジンリピートは、前後関係のコドン最適化プロセスにより配列番号７では実質的に再コード化されなかった。ＡＡＡＡＡＡトラクトは、リボソーム滑り配列として知られている場合が多く、これは、翻訳産物のフレームシフトを起こさせ（Yan et al., Cell.160:870-81, 2015）、リボソームの停止により付加的な翻訳制御を加えることがある（Arthur et al., Sci Adv.1: e1500154, 2015）。ＩＬ２をコードする直鎖ＤＮＡ鋳型に関して、そのようなフレームシフトは、下流の翻訳停止コドンがリードスルーされるよう翻訳産物を変える場合もある。しかしながら、直鎖ＤＮＡ鋳型は有限であるため、対応するｍＲＮＡ転写物も有限であり、リボソームは最終的に（フレームシフト後の）メッセージの末端に達し、翻訳産物を放出することなく停止する。この例において、ＡＡＡＡＡＡリボソーム滑り配列を含むＩＬ２タンデムリピート配列のコンカテマーであるＲＣＡ産物である、配列番号８から形成されるＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物。転写終結配列のリードスルーによってＲＣＡ産物から多シストロン性ランオフ産物が転写される場合、その結果、対応する多シストロン性メッセージにおけるリボソーム滑り配列が翻訳停止コドンのさらなるリードスルーに寄与する。したがって、多シストロン性メッセージは、ＩＬ−２ではなく、むしろオフターゲットの、高分子量で望ましくない高分子量の翻訳産物を形成する。実際、ＲＮＡポリメラーゼによる転写終結は、ＲＮＡフォールディングに影響を与える配列固有の要素および環境要素を含むさまざまな要因のために極めて非効率である。一般に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｎＢオペロン由来のクラスＩ／ＩＩ転写終結配列でわずか５２％の効率で終了し、ｄＮＴＰの濃度の増加に応じて転写終結の効率が低下する。したがって、図８および９に示されるデータは、シストロン性または多シストロン性ｍＲＮＡのタンデムリピートが、（転写終結配列の存在にもか���わらず）共役させた転写・翻訳反応においてＲＣＡ産物鋳型から広範囲にわたって形成され、対応するｍＲＮＡが、部分的にコドン使用頻度に応じてリボソームによって効果的にまたは効果的でなくプロセシングされる場合もあり、これは、メッセージの下流のシストロンが適切に設計されているかどうかに応じて、最終的に無細胞タンパク質産生量を増大または低下させることを示している。
【００２８】
コドン最適化の別の例において、配列番号２および配列番号４は、発現宿主のコドン選択に対して標的遺伝子の個々のコドン使用頻度を最大にするＪＣａｔツールに従ってコドンが最適化されたＥＧＦＰオープンリーディングフレームを含む。さらに、配列番号１および配列番号３は、以下のプロセスに基づいて前後関係で適合されたＥＧＦＰに対するオープンリーディングフレームを含む；ＥＧＦＰの天然のコード配列から開始し、内部ＡＴＧメチオニンの上流の隠れた開始部位（ＡＴＧ）、隠れたリボソーム結合部位（例えば、ＡＧＧＡ、ＧＡＧＧ、ＧＧＡＧ）、クラスＩＩ終結配列［（Ａ、Ｃ、またはＴ）ＡＴＣＴＧＴＴ］、リボソーム滑り配列［ＮＮＮＹＹＹ、ここで、Ｙ＝（Ａ、Ｔ）］、およびリボソーム休止部位（例えば、ＡＧＧ、ＧＧＡ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＧＧＴ、ＧＴＧ）を避けるために特定の部位のみ再コード化した。図３および４に示されるデータは、ＥＧＦＰの無細胞発現量がコドン使用頻度に部分的に影響されることを示す。
【００２９】
いくつかの実施形態において、最小限の発現配列のオープンリーディングフレームは、発現タンパク質の精製のためのタグ配列を含む。タグ配列は、アフィニティタグ、プロテアーゼ切断に対するタグまたはそれらの組み合わせであってもよい。アフィニティタグは、組み換えタンパク質の迅速な精製および検出のために使用することができる。アフィニティタグとしては、ポリヒスチジンタグ（ｈｉｓ６（配列番号９））、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｍｙｃ（ｃ−ｍｙｃ遺伝子産物由来）、ＦＬＡＧ（エンテロキナーゼ切断部位を含む８つのアミノ酸Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１０）からなる）またはそれらの組み合わせを挙げることができる。融合タグは所望のタンパク質の迅速な精製または検出に役立つが、このタグは、組み換えタンパク質の永続的に取り付けられたものまたはドメインであると見なされない場合がある。したがって、組み換えタンパク質の構造および機能の極めて解析的な研究には融合タグの除去が必要とされる場合が多い。精製のためのタグは、プロテアーゼ切断タグなどの別の種類のタグを使用することによってタンパク質から除去することができる。プロテアーゼ切断タグは、特定のタンパク質またはペプチド配列内の特異なペプチド結合を切断するために使用することができる。プロテアーゼ切断タグとしては、例えば、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅタグ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはトロンビンプロテアーゼタグ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を挙げることができる。
【００３０】
述べたとおり、いくつかの実施形態において、最小限の発現配列はさらに、基本的に転写終結配列からなる。転写終結配列は、一般にＤＮＡ鋳型中の遺伝子の３’末端に位置している。転写終結配列は、新しく合成されるｍＲＮＡにおいて転写複合体からｍＲＮＡを放出するプロセスを開始するシグナルをもたらし、これも、所望のタンパク質産物の効果的な翻訳の一助となり得る。
【００３１】
ミニサークル由来のＲＣＡ産物における非効率な転写終結の影響は、プラスミドＤＮＡ由来のＲＣＡ産物と比較してほとんど取るに足りないものである。ある場合には、ＲＣＡ産物がプラスミドから誘導される場合、目的とする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡは、転写がその点を超えて進行するのを防ぐために遺伝子の直後に二本鎖ＤＮＡ切断を作り出すための制限酵素を使用して消化されなければならない。もしランオフ転写が起きれば、多くのコード配列および非コード配列を含むプラスミドの他の区画（複製開始点、抗生物質選択のための配列、ならびに選択、スクリーニングおよび／または宿主細胞におけるプラスミドの増殖のために使用される補助的な配列を含む）が転写されるであろう。プラスミドＤＮＡ由来のＲＣＡ産物は、未消化の状態で使用される場合、転写のリードスルーにより望ましくないｍＲＮＡ種をもたらす可能性もあり、それは、目的とするタンパク質とともに（またはそれより大量に）タンパク質夾雑物を生成するおそれがある。しかしながら、ミニサークル由来のＲＣＡ産物における転写終結が不十分でも依然として的確なｍＲＮＡを形成することができる。したがって、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物からの無細胞タンパク質の産生量は、プラスミド由来のＲＣＡ産物またはＰＣＲ増幅プラスミドＤＮＡのいずれと比較しても良好である。ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物に転写終結配列が完全にない場合でも、同様の発現の利益が観察され、これは予想外の結果である。これは、実施例２および３などの異なる例において示されており、その結果が図３、４および６に示されている。図３および４に示される例に関して、配列番号１および配列番号２は、ＥＧＦＰをコードし、転写終結配列を有するのに対して、配列番号３および配列番号４はＥＧＦＰをコードし、転写終結配列を有さない。（配列番号３由来の）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物２６と比較して、（配列番号３のＤＮＡミニサークル由来の）ＲＣＡ産物２２はＥＧＦＰの高い発現をもたらし、（配列番号３のＤＮＡミニサークル由来の）ＲＣＡ産物２２からの全ＥＧＦＰ産生量は（配列番号１由来の）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物２４と同等であった（図３）。ＥＧＦＰに対するさまざまなコドンの最適化法を使用して、（配列番号４のＤＮＡミニサークル由来の）ＲＣＡ産物３０は、（配列番号２のＤＮＡ由来の）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物３２または（配列番号４のＤＮＡ由来の）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物３４のいずれよりも多い量のＥＧＦＰを形成した（図４）。しかしながら、ＲＣＡ産物２０（配列番号１のＤＮＡミニサークル由来）および２８（配列番号２のＤＮＡミニサークル由来）を使用したＥＧＦＰ発現量が最高であった。これらの例は、転写終結配列が、ＰＣＲ増幅ＤＮＡからのタンパク質発現に必須であると同時に、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物からの確固としたタンパク質発現に必須でないことを示している。こうしたＲＣＡ産物は、シストロン性ｍＲＮＡ種のタンデムリピートを形成することによって無細胞タンパク質発現を向上させ、ここで、ｍＲＮＡのすべてのシストロンが所望の標的遺伝子を含む。シストロンのタンデムリピートは、特に、転写終結シグナルがない場合に、結果としてｍＲＮＡの安定性を向上させ、所望のタンパク質産物のより高い翻訳速度に寄与する可能性もある。
【００３２】
１つ以上の実施形態において、インビトロにおける転写および翻訳のための方法は、ＤＮＡ鋳型として二本鎖ＲＣＡ産物を用いる。これらの実施形態において、二本鎖ＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーションは、二本鎖ＤＮＡミニサークルを形成し、これは、ＲＣＡ反応に対する鋳型として利用される。無細胞転写反応に使用されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）は、一般にＤＮＡコード配列との効果的な結合のために二本鎖ＤＮＡプロモーター配列を必要とする。ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖ＤＮＡプロモーター配列との効果的な結合は、効率的な転写を開始する。したがって、二本鎖ＲＣＡ産物の形成を促進するＲＣＡ反応条件は、効果的なインビトロにおける転写および翻訳に望ましいものである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＣＡ産物は、さらなる処理を全く行わずに無細胞発現系に提供される。一実施形態において、ＲＣＡ産物は、増幅の直後に無細胞系に添加される。「さらなる処理」という用語は、ＲＣＡ産物の制限消化、ライゲーション、またはそれらの組み合わせの行為を含むことを意味する。ただし、いくつかの実施形態において、ＲＣＡ産物は、真核細胞抽出物を使用した無細胞発現のための手順の前に、塩またはプライマーもしくは小断片化ＤＮＡなどのあらゆるその他の夾雑物を反応媒体から除去するために（例えば、沈殿によって）分離されてもよい。
【００３４】
例となる一実施形態において、二本鎖ＲＣＡ産物は、最小限の発現配列のタンデムリピートを有する。この実施形態において、最小限の発現配列には、宿主細胞におけるＤＮＡの増殖に必要とされる外来性配列が全くない。さらに、この実施形態の二本鎖ＲＣＡ産物は、制限消化および／またはライゲーションを全く行うことなく無細胞発現系に提供される。
【００３５】
ＤＮＡミニサークルから形成されたＲＣＡ産物を使用した無細胞発現反応からのタンパク質産生量は、プラスミドＤＮＡから形成されたＲＣＡ産物のタンパク質産生量よりもはるかに高く、このことは、実施例５において詳細に記載され、図９に示されている。この実施例において、ＥＧＦＰの無細胞産生量は、（配列番号１を含むプラスミド由来の）ＲＣＡ産物７２と比較して、（ＥＧＦＰをコードし、転写終結配列を有する配列番号１のＤＮＡミニサークル由来の）ＲＣＡ産物７０を発現させた場合に増大した。さらに、転写終結配列の非存在下において、（配列番号３を含むプラスミドＤＮＡ由来の）ＲＣＡ産物７６と比較して、（配列番号３のＤＮＡミニサークル由来の）ＲＣＡ産物７４を使用したＥＧＦＰの発現も増大した。これらの例は、プラスミドＤＮＡのＲＣＡ産物内のコンカテマーとして反復される外来性配列（複製開始点、抗生物質選択配列およびｌａｃＺ選択配列など）の存在が所望のタンパク質標的の無細胞発現を妨げることを示している。
【００３６】
ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物の無細胞発現はまた、ＰＣＲによって増幅された核酸と比較して高いタンパク質産生量をもたらす。例えば、共役させたインビトロにおける転写および翻訳によるＥＧＦＰタンパク質の合成が、ＰＣＲ増幅ＤＮＡとＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物の間で比較された。ＲＣＡ産物２０、２２および２８、３０を発現させた場合、それぞれＰＣＲ増幅ＤＮＡ２４、２６および３２、３４の使用と比較してＥＧＦＰの増大した産生量が図３および４に示されている。
【００３７】
いくつかの実施形態において、インビトロ転写・翻訳反応に使用される二本鎖ＲＣＡ産物は、チオ化ヌクレオチドを含む。これらの実施形態において、ＲＣＡ反応には、増幅の間にチオ化塩基のＲＣＡ  ＤＮＡ産物へのランダムな組み込みのためにα−Ｓ−ｄＡＴＰまたはα−Ｓ−ｄＴＴＰなどのチオ化ｄＮＴＰをｄＮＴＰ混合物に加える。無細胞タンパク質発現は、インビトロにおける転写および翻訳のために、非チオ化ＲＣＡ産物と比較して、チオ化ヌクレオチドを含むＲＣＡ産物が使用される場合に向上する。例えば、（配列番号５のＤＮＡミニサークル由来の）チオ化ＲＣＡ産物３６を発現させた場合のＥＧＦＰタンパク質産生量は、図５に示されるとおり、（配列番号５のＤＮＡ由来の）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物４２または（ＡＴヘキサマーを用いた配列番号５のＤＮＡミニサークル由来の）非チオ化ＲＣＡ産物３８または（ランダムヘキサマーを用いた配列番号５のＤＮＡミニサークル由来の）非チオ化ＲＣＡ産物４０のいずれと比較しても高かった。さらに、ＥＧＦＰコード配列の下流の転写終結配列が除去された別の例において、（配列番号６のＤＮＡミニサークル由来の）チオ化ＲＣＡ産物４４を発現させた場合の無細胞ＥＧＦＰタンパク質産生量は、図６に示されるとおり、（配列番号６のＤＮＡ由来の）非チオ化ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産物４８または（ＡＴヘキサマーを用いた配列番号６のＤＮＡミニサークル由来の）非チオ化ＲＣＡ産物４６のいずれと比較してもはるかに高かった。
【００３８】
無細胞タンパク質発現のための本方法は、インビトロにおける転写およびインビトロにおける翻訳を含む。インビトロにおける転写反応は、二本鎖ＲＣＡ産物を用い、ここで、二本鎖ＲＣＡ産物は基本的に最小限の発現配列のタンデムリピートからなる。最小限の発現配列は、プロモーター配列を含む。プロモーター配列は、転写される目的とする遺伝子の上流（５’）に存在する。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡプロモーター領域に結合して、遺伝子の転写を開始する。適したさまざまなＲＮＡポリメラーゼが当該技術分野において知られており、１つのサブユニットのみを有するもの（例えば、Ｔ３およびＴ７のようなバクテリオファージ、ならびにミトコンドリアからのもの）ならびに細菌および真核生物由来の多ドメインＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼは、効率的な転写のために付加的なタンパク質補因子をさらに必要とする場合もある。
【００３９】
無細胞翻訳反応のいくつかの実施形態において、生体分子翻訳装置が細胞から抽出され、インビトロにおける翻訳に利用される。１つ以上の実施形態において、オープンリーディングフレームのコドン最適化配列は、翻訳率を向上させる。翻訳に必要とされる組成物、酵素の割合、および構成要素は無細胞抽出物によって提供されるか、または合成の構成成分が加えられてもよい。転写によって合成されるｍＲＮＡは、翻訳反応において発現し、これは、無細胞抽出物において標的タンパク質を生成する。インビトロにおける発現反応のいくつかの実施形態において、タンパク質合成は、培養細胞内ではなく無細胞抽出物中で起こる（細胞から抽出された材料は、本明細書において「無細胞抽出物」または「細胞抽出物」と呼ばれる場合もある）。細胞抽出物は、一般に細胞の細胞質および細胞小器官の構成成分を含む。無細胞抽出物は、無細胞転写および翻訳に必要とされる分子、例えば、翻訳のためのリボソーム、ｔＲＮＡおよびアミノ酸、酵素の補酵素ならびにエネルギー供給源、ならびにタンパク質フォールディングに必須の細胞の構成成分のすべてまたは大半のものを供給することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、無細胞発現系は、原核細胞抽出物、真核細胞抽出物、またはそれらの組み合わせを含む。さらに別の実施形態において、無細胞発現系は、個々に精製した構成成分から構築される。一実施形態において、無細胞タンパク質発現のために開発された細胞抽出物は原核生物由来のものである。この実施形態において、タンパク質を発現させるために、ＲＣＡ産物ＤＮＡ由来のｍＲＮＡが原核生物抽出物に添加されてもよく、またはその中で生成されてもよい。翻訳を助けることができる原核生物抽出物は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来であってもよい。一部の他の実施形態において、細胞抽出物は、真核細胞、例えば、原生動物、酵母菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞由来であってもよい。これらの実施形態において、ＲＣＡ産物ＤＮＡ由来のｍＲＮＡは、真核細胞抽出物、例えば、ウサギの網状赤血球ライセート（ＲＲＬ）、小麦胚芽抽出物、昆虫細胞のライセート（ＳＦ９またはＳＦ２１など）、哺乳動物のライセート（ＣＨＯなど）、ヒトのライセート（ＨｅＬａなど）、または原生動物のライセート（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａなど）に添加されてもよく、またはその中で生成されてもよい。真核生物系由来の無細胞抽出物は、効率的なタンパク質合成に必要とされる必須の細胞巨大分子、例えば、リボソーム、翻訳因子およびｔＲＮＡを含み、ここで、エネルギー供給源およびアミノ酸が加えられる必要がある場合もある。
【００４１】
例となる一実施形態において、ＲＣＡ反応のための核酸鋳型は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鋳型である。ＤＮＡ鋳型は、合成のＤＮＡであっても、または天然のＤＮＡであってもよい。ＤＮＡ鋳型は、環状ＤＮＡ鋳型、直鎖ＤＮＡ鋳型、またはニックの入ったＤＮＡ鋳型であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸鋳型はＤＮＡミニサークル鋳型であり、ＲＣＡは無細胞系においてＤＮＡミニサークル鋳型を増幅するために使用される。一例の実施形態において、直鎖核酸鋳型の環状化は、酵素反応によって、例えば、ＤＮＡリガーゼなどのライゲーション酵素を伴うインキュベーションによって達成される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミニサークル鋳型は、最小限の発現配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＣＡのＤＮＡミニサークル鋳型は、タンデムリピートＤＮＡ配列を生成するための最小限の発現配列を含む。生成されたタンデムリピート配列は、基本的に最小限の発現配列の複数の単位からなる。インビトロにおける転写・翻訳のために使用されるＲＣＡ産物は、インタクトな分解されていない状態であってもよい。
【００４２】
ローリングサークル増幅反応は、プライマー、ポリメラーゼ、および遊離ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）などの試薬を用いる場合が多い。いくつかの実施形態において、ＲＣＡは、二本鎖ＤＮＡミニサークルを、ランダムプライマー混合物を含むプライマー溶液と接触させて、核酸鋳型・プライマー複合体を形成し、核酸鋳型・プライマー複合体をＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸と接触させ、核酸鋳型を増幅することによって実施されてもよい。増幅反応に利用される核酸ポリメラーゼは、プルーフリーディング核酸ポリメラーゼであってもよい。ＲＣＡは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含むが、それに限定されない当該技術分野において知られている任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することによって実施されてもよい。増幅反応混合物は、適切な増幅反応バッファーなどの付加的な試薬をさらに含んでもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態において、核酸増幅反応に使用される試薬のそれぞれは、あらゆる夾雑核酸を除去するために前処理されてもよい。いくつかの実施形態において、試薬の前処理としては、紫外線の存在下において試薬をインキュベートすることが挙げられる。一部の他の実施形態において、試薬は、ヌクレアーゼおよびその補因子（例えば、金属イオン）の存在下において試薬をインキュベートすることによって汚染が除去される。適したヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ増幅反応に使用されるプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの非存在下において二価金属イオン（例えば、マグネシウムまたはマンガンイオン）とともにインキュベートすることによって汚染が除去されてもよい。
【００４４】
ＲＣＡ反応は、ランダムプライマー混合物を使用して実施されてもよい。いくつかの実施形態において、特異的なプライマーがＲＣＡ反応に使用される。１つ以上のヌクレオチドアナログを含むプライマー配列も使用されてもよい。１つ以上の実施形態において、ＲＣＡは、ヌクレオチドアナログを含むランダムプライマー混合物を使用して実施される。ヌクレオチドアナログは、イノシン、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオチド、チオ化ヌクレオチド、２−アミノ−デオキシアデノシン、２−チオ−デオキシチミジン、ポリカチオンヌクレオチド、Ｚｉｐ核酸（ＺＮＡ）ポリカチオン修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであってもよい。１つ以上の実施形態において、ランダムプライマー混合物は、配列＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎ（ＡＴヘキサマープライマー）を有する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ耐性プライマー（例えば、適切な位置にホスホロチオエート基を含むプライマー配列）が増幅反応に利用される（例えば、ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ）。いくつかの実施形態において、ＤＮＡミニサークルの増幅は、ランダムヘキサマーまたはヘキサマープライマー、＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎ（ＡＴヘキサマープライマー）を利用し、ここで、「Ｎ」は、ランダムなヌクレオチド（すなわち、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕのいずれでもよい）を表し、「ａｔＮ」は、２−アミノｄＡ、２−チオ−ｄＴ、通常のＧおよび通常のＣを含むランダムな混合物を表し、文字指定に先行するプラス（＋）記号は、文字によって指定されたヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであることを指し、文字に先行するアスタリスク（＊）記号は、文字によって指定されたヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを指す。
【００４５】
増幅反応の間、ＤＮＡミニサークル鋳型は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはそれらの修飾された同等物の存在下においてポリメラーゼによって複製される。核酸鋳型増幅に利用される遊離ヌクレオチドとしては、天然のヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰもしくはｄＴＴＰ）またはそれらの修飾アナログを挙げることができる。いくつかの実施形態において、反応混合物は、チオ化ｄＮＴＰが加えられる。チオ化ｄＮＴＰとしては、α−Ｓ−ｄＧＴＰ、α−Ｓ−ｄＣＴＰ、α−Ｓ−ｄＡＴＰ、およびα−Ｓ−ｄＴＴＰを挙げることができるが、これらに限定されない。α−Ｓ−ｄＡＴＰまたはα−Ｓ−ｄＴＴＰなどのチオ化ｄＮＴＰは、チオ化塩基のＲＣＡ産物へのランダムな組み込みのためにｄＮＴＰ混合物に添加されてもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＲＣＡは、約１０μＭから約１０ｍＭの範囲のｄＮＴＰの最終濃度を使用して実施される。ＲＣＡ反応の１つ以上の実施形態において、ｄＮＴＰ濃度は、１０ｍＭ未満である。これらの実施形態において、ｄＮＴＰの濃度は、ＲＣＡ産物からのハイドロゲル形成を避けるため、および反応バッファー中に存在する二価カチオン（例えば、マグネシウム）の量以下の濃度にとどまるよう１０ｍＭより低く維持される。ハイドロゲル形成は、高濃度のｄＮＴＰの存在下における増幅の後に生じることがあり、これは、ＲＣＡ産物のピペット操作および処理などの後の操作をさらに複雑にする可能性もある。５０ｍＭ以上のｄＮＴＰ濃度がＲＣＡ反応に使用される場合にハイドロゲル形成が観察されることがある。
【００４７】
ＲＣＡは、ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販のＲＣＡ増幅キットを使用して実施されてもよい。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉローリングサークル増幅は、修飾されたランダムプライマーを用い、これは、さらに高い感度および増幅バランスを提供する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ耐性プライマーがＲＣＡ反応に使用される。インビトロにおける転写および翻訳のための本方法には高濃度の鋳型ＤＮＡが必要とされるため、より速い反応速度およびより高い産生量のよりバランスがとれたＤＮＡ増幅がＲＣＡを使用して達成され得る。
【００４８】
本発明の方法とともに使用するためのＤＮＡミニサークル鋳型を調製するために、さまざまな方法を使用することができる。いくつかの実施形態において、直鎖ＤＮＡ鋳型を、環状化して、ＤＮＡミニサークル鋳型を形成することができる。一例の実施形態において、直鎖ＤＮＡ鋳型の環状化は、酵素反応によって、例えば、ＤＮＡリガーゼなどのライゲーション酵素を伴うインキュベーションによってもたらされてもよい。いくつかの実施形態において、直鎖ＤＮＡ鋳型の両末端の先端は、両末端の先端が近接近するようになるよう核酸配列とハイブリダイズさせられる。ライゲーション酵素とともにインキュベートすることは、その後、ハイブリダイズした直鎖ＤＮＡ鋳型の環状化を引き起こして、ＤＮＡミニサークルを形成することができる。適したＤＮＡミニサークル鋳型はまた、適切なＰＣＲプライマーを使用したより大きなＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡライブラリーからのＤＮＡ）の一部のＰＣＲ増幅に続く、ＰＣＲ産物の環状化によって形成することができる。ＤＮＡミニサークルはまた、適した直鎖オリゴヌクレオチドの化学合成に続く、合成されたオリゴヌクレオチドの環状化によって形成することができる。いくつかの実施形態において、合成された直鎖オリゴヌクレオチドは、基本的に最小限の発現配列からなり、ＤＮＡリガーゼによる環状化を実現して、ＤＮＡミニサークルを形成することができる。
【００４９】
１つ以上の方法は、ＤＮＡミニサークルを精製するステップ、分析するステップおよび／または定量するステップをさらに含んでもよい。ｄｓＤＮＡミニサークルの単離もしくは精製および／または酵素もしくは非連結形態のＤＮＡなどの夾雑物の除去が、増幅反応に先立って実施されてもよい。核酸の精製、分析または定量に使用される任意の適した技術が利用されてもよい。非限定例としては、沈殿、ろ過、アフィニティーキャプチャー、ゲル電気泳動、シークエンシングまたはＨＰＬＣ分析が挙げられる。例えば、環状核酸の精製は、アフィニティーキャプチャーによって達成されてもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、形成されたＤＮＡミニサークルの処理をさらに含んでもよい。形成されたＤＮＡミニサークルの後処理は、意図される使用により変わる場合もある。
【実施例】
【００５０】
他に指定がない限り、実施例に記載されている成分は、一般的な化学物質供給業者から商業的に入手可能である。この実施例のセクションにおいて使用されるいくつかの略語を以下のとおり詳述する：「ｍｇ」：ミリグラム；「ｎｇ」：ナノグラム；「ｐｇ」：ピコグラム；「ｆｇ」：フェムトグラム；「ｍＬ」：ミリリットル；「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム・パー・ミリリットル；「ｍＭ」：ミリモル濃度；「ｍｍｏｌ」：ミリモル；「ｐＭ」：ピコモル濃度；「ｐｍｏｌ」：ピコモル；「μＬ」：マイクロリットル；「ｍｉｎ」：分および「ｈ」：時間。
【００５１】
図１は、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物を使用したインビトロにおける転写および翻訳の方法の一般的な実施形態の１つの略図である。基本的に最小限の発現配列１２からなるＤＮＡ発現コンストラクト１０をライゲーション反応によって環状化して、ＤＮＡミニサークル１４を形成する。ＤＮＡミニサークル１４を、ＲＣＡによって増幅する。この増幅反応は、外来性配列が全くない最小限の発現配列１２を含む発現コンストラクト１０のタンデムリピート単位を有するコンカテマーＲＣＡ産物１６を形成する。したがって、このＤＮＡミニサークルは、細胞内における増殖には適用できない。ＲＣＡ産物１６が、その後、インビトロにおける転写・翻訳反応において発現する。一部の例において、ＤＮＡミニサークル１４の最小限の発現配列は、転写終結配列を含む。そのようなＤＮＡミニサークルから形成されたＲＣＡ産物は、それぞれのタンデムリピートに転写終結配列を有することになる。その後、この実施例のＲＣＡ産物１６から生成されたｍＲＮＡ１７は、それぞれのタンデムリピート単位にある転写終結配列で終了することが可能である。ただし、任意の１つの転写終結配列のリードスルーが生じる場合（ｍＲＮＡ１８など）、下流のｍＲＮＡ配列は、依然として期待されるタンパク質標的をコードする。いくつかの他の例において、ＤＮＡ発現コンストラクト１０の最小限の発現配列は、転写終結配列を含まない。そのような例のＲＣＡ産物から生成されたｍＲＮＡ１８は、それぞれのタンデムリピート単位で終了しないため、ＲＣＡ産物の複数のタンデムリピート配列により連続的に転写される。しかしながら、いずれの場合も、ＤＮＡ発現コンストラクト１０に翻訳停止配列が存在するため、ｍＲＮＡが所望の配列を有するタンパク質１９に翻訳される。
【実施例１】
【００５２】
ＤＮＡミニサークルのローリングサークル増幅
ＤＮＡミニサークルの形成：
ＥＧＦＰおよびヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）に対する最小限の発現配列をコンピュータで設計し、インビトロにおいて合成した。これらの発現配列のすべてが、Ｔ７プロモーターおよび＋１配列（得られるｍＲＮＡの５’非翻訳領域の最初のリボ塩基位置）に続くＴ７  ｐｈｉ１０プロモーターステムループ配列を含んでいた。さまざまな付加的な非コードおよびコード要素を、Ｔ７プレプロモーター配列、リボソーム結合配列、リボソームの結合を向上させるためのインスレーター配列、リボソームの開始を向上させるためのインスレーター配列、転写終結配列、翻訳開始および終止配列、リーダー配列プロテアーゼ切断部位を含む最小限の発現配列の設計ならびにコドン最適化時に含めた。これらの要素を有する典型的な最小限の発現配列を配列番号１〜８として列挙する（表２）。これらの配列は、６５５〜９７０塩基対のサイズに及ぶ。
【００５３】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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５’末端および３’末端の両方に固有の制限部位（それぞれＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ）を有する直線の二本鎖ＤＮＡを合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，  Ｉｎｃ．）。ＤＮＡミニサークルを作製するために、両方のエンドヌクレアーゼでｄｓＤＮＡを消化して、相補的な粘着オーバーハングを作り出した。この消化したＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。制限消化およびライゲーションステップを、２０Ｕ  ＢａｍＨ１、１０Ｕ  ＢｇｌＩＩ、４００Ｕ  Ｔ４リガーゼ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む反応混合物を使用して、連続的（例えば、異なるチューブにおいて）または同時（例えば、同じチューブにおいて）のいずれかで行った。すべてのライゲーション産物（ＤＮＡミニサークル）を、その後、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩにより処理して、残りのあらゆる直鎖ＤＮＡ断片を消化した。ライゲーション産物を８０℃で２０分間インキュベートすることによって、エキソヌクレアーゼを熱失活した。エキソヌクレアーゼの熱失活後に、５μＬ（２５ｎｇのＤＮＡ）の完了したライゲーション反応を、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを使用した等温ＲＣＡ反応に直接利用した。
ＤＮＡミニサークルの増幅
ＤＮＡミニサークル鋳型のＲＣＡは、基本的に最小限の発現配列のタンデムリピートからなる高分子量の超分岐コンカテマーをもたらす。水、反応バッファー、プライマー、およびＰｈｉ２９酵素を含むＲＣＡ試薬は、オフターゲットの増幅を最小限にするために、連結される鋳型およびｄＮＴＰの添加に先立って予め浄化した。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼ耐性プライマーおよびヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含むプライマー・ヌクレオチド溶液（プライマー・ヌクレオチドミックス）は、プライマー・ヌクレオチドミックスを、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）の組み合わせとともにインキュベートすることによって汚染を除去した。（使用するＤＮＡポリメラーゼが非プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを含む場合）任意にエキソヌクレアーゼの存在下において、二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋）とともにインキュベートすることによって、ＤＮＡポリメラーゼを含む酵素ミックスの汚染を除去した。そのような汚染除去済み酵素ミックスおよびプライマー・ヌクレオチドミックスを使用して、ＤＮＡミニサークルの増幅を実施した。例えば、２００ｎｇのＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含むポリメラーゼ溶液を、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭ  ＴＣＥＰを含む５μＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ＝８．０）中の０．１単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩとともにインキュベートした。インキュベーションは、３０℃で約６０ｍｉｎまたは４℃で１２ｈのいずれかで実施した。汚染除去済みＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ溶液を氷浴に移し、その後、エキソヌクレアーゼＩＩＩを事前に失活させずに標的ＲＣＡアッセイに使用した。
【００５４】
配列＋Ｎ＋Ｎ（ａｔＮ）（ａｔＮ）（ａｔＮ）＊Ｎ（ＡＴヘキサマー）を有するランダムヘキサマーまたはヘキサマープライマーを使用してＤＮＡミニサークルの増幅を実施した。ここで、「Ｎ」は、ランダムなヌクレオチド（すなわち、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕのいずれでもよい）を表し、「ａｔＮ」は、２−アミノｄＡ、２−チオｄＴ、通常のＧおよび通常のＣを含むランダムな混合物を表し、文字指定に先行するプラス（＋）記号は、文字によって指定されたヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであることを指し、文字に先行するアスタリスク（＊）記号は、文字によって指定されたヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを指す。場合によっては、ＲＣＡ産物からの転写および翻訳の後のプロセスを複雑にする可能性がある増幅されたＲＣＡ産物ＤＮＡのハイドロゲル形成を避けるために、すべてのＲＣＡ反応に対してｄＮＴＰ濃度を１ｍＭ未満（一般に４００〜８００μＭ）に維持した。
【００５５】
汚染除去済みプライマー・ヌクレオチドミックスおよび汚染除去済み酵素ミックスを、ＤＮＡミニサークル鋳型とともに、３０℃で約４００ｍｉｎインキュベートすることによってＤＮＡ増幅反応を実施した。増幅反応混合物は、４０μＭのプライマー、４００μＭのｄＮＴＰ（４００μＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）；１ｐｇのＤＮＡミニサークル、および２００ｎｇ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼから構成された。その反応混合物を、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＴＣＥＰを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ＝８．０）中でインキュベートした。インキュベーションの終わりに、その反応混合物を６５℃で１０分加熱することによって、反応混合物中のＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。
【００５６】
表３および図２は、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ライゲーションによって環状化した配列番号６を使用して調製した、ＤＮＡミニサークルからのＲＣＡ産物の代表的な産生量の概要を示す。（ｉ）ランダムヘキサマーおよびｄＮＴＰの使用、（ｉｉ）ＡＴヘキサマープライマーおよびｄＮＴＰの使用；ならびに（ｉｉｉ）ＡＴヘキサマーおよびチオ化ｄＡＴＰと混合したｄＮＴＰの使用の３つの異なる試験条件下においてＲＣＡ反応を実施した。およそ２８ｎｇのエキソヌクレアーゼで処理したライゲーション産物（ＤＮＡミニサークル）を使用して、ＲＣＡ反応を（可能な場合）２回実施した。１回の反応に非チオ化ｄＡＴＰに対して１：４０の比でチオ化ｄＡＴＰを添加したことを除いて（０．０１ｍＭ  アルファ−Ｓ−ｄＡＴＰ）、すべてのＲＣＡ反応は、０．４ｍＭのｄＮＴＰおよび４０μＭのプライマー（ランダムヘキサマーまたはＡＴヘキサマーのいずれか）を含んでいた。
【００５７】
Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ（商標）Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して１００μＬの合計ＲＣＡ反応体積からのＲＣＡ産物を定量した。制限されたＤＮＡ産物のアガロースゲル電気泳動も実施し、電気泳動バンドの強度を、ＤＮＡの濃度がわかっている標準物質の強度と比較した。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して、ＡＴヘキサマー、ランダムヘキサマー、ならびにＡＴヘキサマーおよびチオ化ｄＡＴＰ（ＡＴヘキサマー＋α−Ｓ−ｄＡＴＰ）と混合したｄＮＴＰを使用することによるＲＣＡ産物ＤＮＡの産生量を表３に示す。ＡＴヘキサマーおよびα−Ｓ−ｄＡＴＰを含むＲＣＡ試験条件に対しては、２回の反応の代わりに１回の反応のみ実施した。
【００５８】
【表３】
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表３および図２に提示するとおり、ＲＣＡ産物ＤＮＡの産生量は、ランダムヘキサマーと比較してＡＴヘキサマーを使用した場合に高まる。図２に示したとおり、ＲＣＡ反応にＡＴヘキサマーを使用した場合のＲＣＡ産物の産生量はおよそ５５μｇであったが、ＲＣＡ反応にランダムヘキサマーを使用した場合のＲＣＡ産物の産生量はおよそ２８μｇであった。ＡＴヘキサマーを用いて増幅反応を刺激した後に、チオ化塩基をＲＣＡ産物にランダムに組み込んだ場合に同様の高い産生量が観察された。共役させたインビトロにおける転写および翻訳は、一般に少なくとも１マイクログラムの鋳型ＤＮＡを必要とするため、ＲＣＡ反応にＡＴヘキサマープライマーを使用したより高いＤＮＡ産生量は、続く転写および翻訳のより大きなスケールアップを可能にした。
【００５９】
表４に列挙されている次の実施例における無細胞発現の比較のために、さまざまなＤＮＡ増幅産物（サンプル）を形成した。表４はまた、各鋳型および対応する増幅された核酸に存在するさまざまな配列要素（例えば、転写終結配列の有無）および／または修飾（例えば、チオ化ＤＮＡの有無、またはコドン使用頻度）を示す。ここで、「ｃｃ」は、前後関係のコドン選択を指し、「ｉｃ」は、個々のコドン選択を指す。
【００６０】
【表４−１】
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【表４−１】
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【実施例２】
【００６１】
ＲＣＡ産物からの、共役させたインビトロにおける転写および翻訳による向上したタンパク質合成
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）、直鎖およびプラスミドＤＮＡ鋳型に適したＥ．ｃｏｌｉベースの共役させたインビトロにおける転写および翻訳反応を使用して、共役させたインビトロにおける転写および翻訳によるタンパク質発現を評価した。製造業者の仕様書によれば、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙシステムは、１マイクログラムの鋳型ＤＮＡを５０μＬの反応に添加するために、１４８ｎｇ／μＬの最小濃度のＤＮＡ鋳型を必要とする。共役させたインビトロにおける転写および翻訳によるＥＧＦＰタンパク質の合成を、ＰＣＲ増幅ＤＮＡおよび配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４由来のＤＮＡミニサークルから調製したＲＣＡ産物の間で比較した。これらの配列のすべてはＥＧＦＰをコードする遺伝子を含むが、いくつかの点で異なる。例えば、配列番号１および配列番号２は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１由来のクラスＩ／ＩＩ転写終結配列を含む一方で、配列番号３および配列番号４は転写終結配列がない。さらに、配列番号２および配列番号４は、発現宿主のコドン選択に対して標的遺伝子の個々のコドン使用頻度を最大にするＪＣａｔツールに従ってコドンが最適化されたＥＧＦＰオープンリーディングフレームを含む［Grote et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1; 33(Web Server issue:W526-531). JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host］。配列番号１および配列番号３は、以下のプロセスに基づいて前後関係で適合されたＥＧＦＰに対するオープンリーディングフレームを含む；ＥＧＦＰの天然のコード配列から開始し、内部ＡＴＧメチオニンの上流の隠れた開始部位（ＡＴＧ）、隠れたリボソーム結合部位（ＡＧＧＡ、ＧＡＧＧ、ＧＧＡＧ）、クラスＩＩ終結配列［（Ａ、Ｃ、またはＴ）ＡＴＣＴＧＴＴ］、リボソーム滑り配列［ＮＮＮＹＹＹ、ここで、Ｙ＝（Ａ、Ｔ）］、およびリボソーム休止部位（ＡＧＧ、ＧＧＡ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＧＧＴ、ＧＴＧ）を避けるために特定の部位のみ再コード化した。
【００６２】
配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４を含むＤＮＡミニサークルを、ライゲーションによって調製した後、実施例１に記載されているＡＴヘキサマーを用いたＲＣＡによって増幅した。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して、ＲＣＡ産物の産生量を定量した。ＤＮＡミニサークル鋳型由来のおよそ１マイクログラムのＲＣＡ産物は、中間の除去または精製段階を全く行わずにＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ反応に直接利用した。さらに、ＲＣＡ産物のＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ反応への添加の前に制限消化および／またはライゲーションに関するＲＣＡ産物の付加的な処理は行わなかった。個々の無細胞発現反応において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４を有する１マイクログラムのＰＣＲ増幅ＤＮＡ（オーバーラップエクステンションＰＣＲによりＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された）も鋳型なし対照（ＮＴＣ）とともに試験した。すべての無細胞発現反応は、ＥＧＦＰタンパク質を合成するために、３０℃で６時間、振盪（１２００ｒｐｍ）しながらＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒにおいてインキュベートした。合成されたＥＧＦＰタンパク質は、蛍光ベースのアッセイによる定量に先立って、それを一晩４℃でインキュベートすることによって活性型にフォールドさせた。（ＰＢＳ中の）発現抽出物サンプルの１０倍希釈物からフォールディングＥＧＦＰの蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）を使用して、精製ＥＧＦＰ基準曲線（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）に対して評価した。インビトロにおける転写および翻訳からの合計ＥＧＦＰ産生量を、μｇ／ｍＬの単位で算出した。
【００６３】
配列番号１から調製したＲＣＡ産物ＤＮＡまたは配列番号３から調製したＰＣＲ増幅ＤＮＡからのＥＧＦＰタンパク質産生量を図３に示す。図３は、ＲＣＡ産物２０および２２をインビトロにおける転写・翻訳に利用した場合に、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ２４および２６を使用したインビトロにおける転写・翻訳反応と比較してＥＧＦＰ発現が増大したことを示す。図３はまた、最小限の発現配列に転写終結配列が全くなくてもＰＣＲ増幅ＤＮＡ２６と比較した場合にＲＣＡ産物２２がより高いＥＧＦＰ発現をもたらしたことも示す。
【００６４】
配列番号２から調製したＲＣＡ産物または配列番号４から調製したＰＣＲ増幅ＤＮＡのインビトロにおける転写・翻訳からのＥＧＦＰタンパク質産生量を図４に示す。図４に示されるとおり、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ３２、３４と比較した場合、ＲＣＡ産物２８、３０を無細胞発現に使用したときＥＧＦＰ産生量がはるかに高かった。図４はまた、最小限の発現配列に転写終結配列がない場合でも、ＲＣＡ産物３０がＰＣＲ増幅ＤＮＡ３４と比較して高いＥＧＦＰの産生量をもたらしたことを示す。ＰＣＲ増幅ＤＮＡと比較して、ＲＣＡ産物を使用した無細胞タンパク質のより高い産生量は、予想外であった。一般に、ｍＲＮＡの安定性および／または放出ならびにｍＲＮＡの効果的な翻訳に転写終結シグナルが必要とされる。例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ２６（図３）および３４（図４）からのタンパク質発現は、それぞれＰＣＲ増幅ＤＮＡ２４（図３）および３２（図４）と比較して実質的に低い。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ２４および３２の最小限の発現配列は、クラスＩ／ＩＩ転写ターミネーター（図３および４に示されるとおり）を有し、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ２６および３４の最小限の発現配列は、転写ターミネーターがない。したがって、このデータは、最小限のＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物がシストロン性ｍＲＮＡ種のタンデムリピートを形成することによってタンパク質発現を向上させることを示し、ここで、それぞれのシストロンは所望の標的遺伝子に対するｍＲＮＡを含む。シストロンのタンデムリピートは、特に、転写終結シグナルがない場合に全体的なｍＲＮＡの安定性を向上させることができ、したがって、所望のタンパク質産物のより高い翻訳速度に寄与する。
【実施例３】
【００６５】
ＲＣＡ産物のチオ化は、共役させたインビトロにおける転写・翻訳系におけるタンパク質生成を向上させる
共役させたインビトロにおける転写および翻訳によるタンパク質（ＥＧＦＰ）発現を、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ）およびＰＣＲ増幅ＤＮＡまたはＲＣＡ産物を使用して評価した。これらの実験に対して、翻訳効率を高める強力なＴ７  ｇｅｎｅ１０翻訳エンハンサー配列およびＴ７  ｇｅｎｅ１０リボソーム結合配列を含む配列番号５および配列番号６を構成した。さらに、配列番号５は、反応条件および上流のＤＮＡ配列要素に応じて終結効率を高めるクラスＩ転写ターミネーター（Ｔ７  Ｔ−ｐｈｉ終結配列由来）を含む。ＥＧＦＰコード領域を、前後関係により最適化し、この領域は、配列番号５と配列番号６の間で同一であった。ＤＮＡミニサークルを、配列、配列番号５または配列番号６のそれぞれの分子内ライゲーションによって調製した。連結したＤＮＡミニサークルを、その後、実施例１に記載されているとおり、ランダムヘキサマー、ＡＴヘキサマー、またはチオ化ｄＡＴＰの存在下または非存在下におけるＡＴヘキサマーを用いたＲＣＡによって増幅した。ＲＣＡ産生量をＱｕａｎｔ−Ｉｔ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量した。０．５マイクログラムのＲＣＡ産物ＤＮＡを、中間の除去ステップを全く行わずにＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ反応に直接利用した。個々の無細胞発現反応において、配列番号５または配列番号６の０．５マイクログラムのＰＣＲ増幅ＤＮＡ（オーバーラップエクステンションＰＣＲによりＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された）も鋳型なし対照（ＮＴＣ）とともに試験した。すべての無細胞発現反応は、３０℃で６時間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（１２００ｒｐｍ）においてインキュベートし、合成されたＥＧＦＰタンパク質を蛍光定量に先立って４℃で一晩フォールドさせた。（ＰＢＳ中の）抽出物サンプルの１００倍希釈物からフォールディングＥＧＦＰの蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）を使用して、精製ＥＧＦＰ基準曲線（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）に対して評価した。合計ＥＧＦＰ産生量を、μｇ／ｍＬの単位で算出した。
【００６６】
（配列番号５から調製したミニサークル由来の通常ＤＮＡまたはチオ化ＤＮＡを含む）ＲＣＡ産物からのＥＧＦＰタンパク質産生量を、（チオ化されていない配列番号５から調製した）ＰＣＲ増幅ＤＮＡからの産生量と比較した。図５に示されるとおり、部分的にチオ化ヌクレオチドで置換したＲＣＡ産物３６からのＥＧＦＰタンパク質発現は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ４２、またはチオ化ヌクレオチドを全く含まないＲＣＡ産物３８および４０と比較してはるかに高かった。
【００６７】
同様に、配列番号６からのＥＧＦＰタンパク質の発現量を、非チオ化ＰＣＲ増幅ＤＮＡと比較してＲＣＡ産物（チオ化を含むか、または含まない）から求めた。図６は、部分的にチオ化ヌクレオチドで置換したＲＣＡ産物４４に関するＥＧＦＰの産生量が、非チオ化ＲＣＡ産物４６または非チオ化ＰＣＲ増幅鋳型４８と比較して相対的に高かったことを示す。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ４８に関しては、無細胞反応において実質的にＥＧＦＰ発現がなかった（図６）。前の実施例と同様に、このデータは、最小限の発現カセットがＲＣＡ産物に変換される場合を除いて、ｍＲＮＡの効果的な翻訳には転写終結シグナルが必要とされることを裏付ける。
【実施例４】
【００６８】
ＲＮＡポリメラーゼランオフは、前後関係に依存的な様式でＲＣＡ産物を使用したインビトロにおける転写および翻訳系においてタンパク質生成に影響を与える
ヒトＩＬ−２に関するインビトロにおける転写および翻訳アッセイにおいてＰＣＲ増幅ＤＮＡまたはＲＣＡ産物の発現を、Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して評価した。これらの実験に対して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１由来のクラスＩ／ＩＩ転写終結配列を含む配列番号７および配列番号８（ＩＬ−２をコードし、シグナルペプチドを含まない）を作製した。配列番号７および配列番号８の最小限の発現配列は、ＩＬ−２オープンリーディングフレーム内のコドン使用頻度を除いて実質的に同一であった。発現宿主のコドン選択に対して標的遺伝子の個々のコドン使用頻度を最大にするＪＣａｔツールに従い、配列番号８のコドンを最適化した。配列番号７は、以下のプロセスに基づいて前後関係で適合された；ヒトＩＬ−２の天然のコード配列から開始し、内部ＡＴＧメチオニンの上流の隠れた開始部位（ＡＴＧ）、隠れたリボソーム結合部位（ＡＧＧＡ、ＧＡＧＧ、ＧＧＡＧ）、クラスＩＩ終結配列［（Ａ、Ｃ、Ｔ）ＡＴＣＴＧＴＴ］、リボソーム滑り配列［ＮＮＮＹＹＹ、ここで、Ｙ＝（Ａ、Ｔ）］、およびリボソーム休止部位（ＡＧＧ、ＧＧＡ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＧＧＴ、ＧＴＧ）を避けるために特定の部位のみ再コード化した。ＤＮＡ配列、配列番号７および配列番号８のそれぞれの分子内ライゲーションによってＤＮＡミニサークルを調製した。そのミニサークルを、その後、実施例１に記載されているとおり、ＡＴヘキサマーを用いたＲＣＡによって増幅した。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＲＣＡ産物の産生量を定量した。１マイクログラムのＲＣＡ  ＤＮＡを、中間の除去ステップを全く行わずにＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ反応に直接利用した。個々の無細胞発現反応において、配列番号７および配列番号８の１マイクログラムのＰＣＲ増幅ＤＮＡ（オーバーラップエクステンションＰＣＲによりＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成された）も鋳型なし対照（ＮＴＣ）とともに試験した。それぞれ無細胞発現反応には、蛍光ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識により新生のリジン残基（アンチコドンＵＵＵ  ｔＲＮＡによる）をランダムに標識するために２μＬのＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬＹＳ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）がさらに含まれた。すべての無細胞発現反応は、３０℃で６時間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（１２００ｒｐｍ）においてインキュベートした後、分析に先立って４℃で一晩維持した。およそ２μＬの無細胞発現反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ゲル中の蛍光によってＢＯＤＩＰＹ−ＦＬを含むすべての翻訳産物を検出した。蛍光ＩＬ−２バンド（約１６ｋＤ）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してデジタル方式で定量した。
【００６９】
図７は、共役させたインビトロにおける転写および翻訳を使用して発現させたＩＬ−２タンパク質に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。発現タンパク質を無細胞発現反応から回収し、分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。タンパク質は、配列番号７から調製したＲＣＡ産物５０、配列番号８から調製したＲＣＡ産物５４、配列番号７から調製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ５２、および配列番号８から調製したＰＣＲ増幅ＤＮＡ５６から別々に発現させた。図７に示されるとおり、ＮＴＣ反応（レーン２）においても存在したバックグラウンドＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ  ｔＲＮＡシグナルとは別に、配列番号７から蛍光シグナルが約１６ｋＤの翻訳されたＩＬ−２タンパク質（レーン３〜４）として主に観察された。対照的に、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ５６に関してはＩＬ−２タンパク質が観察されなかった（図７、レーン５）。図７のレーン６に示されるとおり、ＲＣＡ産物５４（配列番号８）を使用して、高分子量タンパク質（２６ｋＤ〜７２ｋＤ）が予想外にも発現した。図７のレーン１は、標準タンパク質分子量マーカー（Ｍ）を表す。この理由は、ＩＬ−２配列中の２つのジ−リジンリピートの存在のためであろう。これらのジ−リジンリピートは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＡＡＡコドンがＡＡＧよりも著しく好ましいため、ＪＣａｔツールによってポリＡトラクトに再コード化された。これらのジ−リジンリピートは、配列番号７では前後関係のコドン最適化プロセスによって実質的に再コード化されなかった。ＡＡＡＡＡＡトラクトは、リボソーム滑り配列として知られている場合が多く、これは、場合によっては翻訳産物のフレームシフトを起こさせることがあり（Yan S et al.; 2015, Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways; Cell. 160: 870-81）、リボソームの停止により付加的な翻訳制御を発揮する（Arthur et al., 2015, Translational control by lysine-encoding A-rich sequences; Science Advances. Vol.1; No.6: pg 1-11; e1500154）。
【００７０】
図８は、（配列番号７から調製した）ＲＣＡ産物５０、（配列番号８から調製した）ＲＣＡ産物５４、（配列番号７から調製した）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ５２、および（配列番号８から調製した）ＰＣＲ増幅ＤＮＡ５６からの１６ｋＤのＩＬ−２タンパク質の相対的な産生量を示す。図８は、無細胞発現にＲＣＡ産物５０を使用した場合、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ５２と比較してＩＬ−２の産生量が高まったことを示す。図７および８において提示したデータはまた、シストロン性ｍＲＮＡのタンデムリピートが、転写終結配列の存在にもかかわらずＲＣＡ産物から形成されたことを示す。メッセージの下流のシストロンが適切に設計される限り、対応するメッセージはリボソームによって効果的にまたは効果的でなくプロセシングされて、無細胞タンパク質産生量に影響を与えた。
【実施例５】
【００７１】
プラスミドＤＮＡから形成されたＲＣＡ産物と比較した、ＤＮＡミニサークルから形成されたＲＣＡ産物を使用した無細胞発現系におけるタンパク質生成
無細胞系におけるＥＧＦＰの発現を、（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｒｎＢオペロンのクラスＩ／ＩＩ転写終結配列を有する）配列番号１または（転写終結配列がない）配列番号３のいずれかを使用した本質的に最小限の発現配列からなるＤＮＡミニサークルから形成されたＲＣＡ産物間で比較した。これらの実験に対して、実施例１に記載されているとおり、配列番号１または配列番号３の分子内ライゲーションによってＤＮＡミニサークルを調製した。プラスミド形成のために、配列番号１または配列番号３をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ部位に連結し、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｃ４０４０）にトランスフェクションし、アンピシリン耐性に関して選択した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＨＱ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｋ２１００−０１）を使用してＥ．ｃｏｌｉから個々のプラスミドクローンを精製し、ＢａｍＨＩ制限消化産物によって検証した。すべてのＤＮＡミニサークルおよびプラスミドＤＮＡ鋳型を、実施例１に記載されているとおり、ＡＴヘキサマーを用いたＲＣＡによって増幅した。Ｑｕａｎｔ−Ｉｔ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＲＣＡ産物を定量した。０．５マイクログラムのＲＣＡ産物ＤＮＡを、中間の除去を全く行わずにＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ反応に直接利用した。無細胞発現反応（鋳型なし対照を含む）は、３０℃で５時間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（１２００ｒｐｍ）においてインキュベートし、合成されたＥＧＦＰタンパク質を、蛍光定量に先立って４℃で一晩維持してフォールドさせた。（ＰＢＳ中の）ライセートサンプルの１０倍希釈物からフォールディングＥＧＦＰの蛍光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）を使用して、精製ＥＧＦＰ基準曲線（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，  Ｉｎｃ．）に対して評価した。合計ＥＧＦＰ産生量を、μｇ／ｍＬの単位で算出した。
【００７２】
ＤＮＡミニサークルから増幅したＲＣＡ産物（７０、７４）およびプラスミドＤＮＡのＲＣＡ産物（７２、７６）を利用した無細胞発現反応からのＥＧＦＰタンパク質の産生量を図９に示す。その結果は、プラスミドＤＮＡではなくＤＮＡミニサークルからＲＣＡ産物を形成した場合に、ＥＧＦＰの無細胞産生量が増大することを示す。さらに、ＥＧＦＰは、転写終結配列がなくても、プラスミド由来のＲＣＡ産物（７６）と比較して、ＤＮＡミニサークル由来のＲＣＡ産物（７４）を使用して発現させることができる。このデータは、プラスミドＤＮＡから形成されたＲＣＡ産物に存在する、複製開始点、抗生物質選択配列およびクローンスクリーニングに関与する外来性配列などのさまざまな介在配列が所望のタンパク質標的の無細胞発現を損なう可能性があることを示している。対照的に、ＲＣＡコンカテマーが基本的に最小限の発現配列からなるＤＮＡミニサークルから形成される場合、転写終結がなくても（一般にｍＲＮＡ転写物を不安定にする）、有益で生産的なランオフが生じる可能性がある。
【００７３】
前述の実施例は、本発明のいくつかの特徴の例となるものであり、多種多様のすべての可能な実施形態から選択された実施形態である。本発明は、その趣旨または必須の特徴から逸脱することなくその他の特定の形態で具現化されてもよい。本発明の特定の特徴のみが本明細書において例示され、記載されているが、当業者は、本開示の利益を考慮すれば、要素を最適化するために改変／変更を行うことができるであろう。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている本発明に対する限定ではなく、あらゆる点で例となるものとして見なされるべきである。必要な場合、範囲が提供され、それらの範囲はそれらの間のすべての部分範囲を含む。
【符号の説明】
【００７４】
１０  ＤＮＡ発現コンストラクト
１２  最小限の発現配列
１４  ＤＮＡミニサークル
１６  ＲＣＡ産物
１７、１８  ｍＲＮＡ
１９  所望の配列を有するタンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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