(57)【要約】  変異α−アミラーゼに関連する組成物および方法が開示される。変異α−アミラーゼは、例えば、デンプンの液化および糖化のため、洗濯、食器洗浄および他の用途におけるデンプン質の染みを洗浄するため、繊維加工（例えば、糊抜き）のため、消化性を改善するための動物飼料において、ならびに製パンおよび醸造のために有用である。【選択図】図１
2019500058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ３７５および任意選択的にＳ３６０に対応するアミノ酸残基での突然変異と、
Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｔ１８０、Ｅ１８７およびＩ２０３からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異および任意選択的に少なくとも２つの突然変異と
を含む、親α−アミラーゼの組み換え変異体であって、
前記変異α−アミラーゼまたは前記親α−アミラーゼは、ナンバリングのために使用される配列番号１に対して少なくとも６０％、任意選択的に７０％、任意選択的に８０％、任意選択的に８５％、任意選択的に９０％または任意選択的に９５％のアミノ酸配列同一性を有し、
前記変異体は、前記親α−アミラーゼまたは前記突然変異の非存在によってのみ前記変異α−アミラーゼと異なる参照α−アミラーゼと比較して増加した低ｐＨ安定性および／またはデンプン液化活性を有する、組み換え変異体。
【請求項２】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｒ３７５Ｙおよび任意選択的にＳ３６０Ａと、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０Ｈ、Ｔ１８０Ｄ、Ｅ１８７ＰおよびＩ２０３Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異および任意選択的に少なくとも２つの突然変異とを含む、請求項１に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項３】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、前記突然変異Ｒ３７５ＹおよびＳ３６０Ａを含む、請求項１または２に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項４】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、前記突然変異Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０ＨおよびＥ１８７Ｐをさらに含む、請求項３に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項５】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ａ２７５、Ｔ８９、Ｓ９２およびＹ３０１からなる群から選択される位置での突然変異をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項６】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０およびＧ１８１に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項７】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８およびＧ１７９またはＴ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基の欠失をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項８】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｇ４７６、Ｇ４７７、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９および／またはＤ４６０に対応するアミノ酸残基での突然変異をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項９】
前記親α−アミラーゼは、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種由来であるか、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来ではない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１０】
デンプンをオリゴ糖へ変換するための方法であって、デンプンを、有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異アミラーゼと接触させる工程を含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の変異アミラーゼを含む、デンプンを液化するための組成物。
【請求項１２】
Ｔ３８、Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｅ１８７、Ｉ２０３、Ｇ４７６およびＧ４７７位に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つおよび任意選択的に複数での突然変異と、任意選択的にＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異とを含む、親α−アミラーゼの組み換え変異体であって、
前記変異α−アミラーゼまたは前記親α−アミラーゼは、ナンバリングのために使用される配列番号１に対して少なくとも６０％、任意選択的に７０％、任意選択的に８０％、任意選択的に８５％、任意選択的に９０％または任意選択的に９５％のアミノ酸配列同一性を有し、
前記変異体は、前記親α−アミラーゼまたは前記突然変異の非存在によってのみ前記変異α−アミラーゼと異なる参照α−アミラーゼと比較して増加した洗剤安定性および／または洗浄性能を有する、組み換え変異体。
【請求項１３】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｔ３８Ｎ、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｅ１８７Ｐ、Ｉ２０３Ｙ、Ｇ４７６ＫおよびＧ４７７Ｅの少なくとも１つおよび任意選択的に複数を含む、請求項１２に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１４】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｔ１２９位での突然変異をさらに含む、請求項１２または１３に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１５】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｔ１２９Ｉをさらに含む、請求項１４に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１６】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８およびＧ１７９またはＴ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基の欠失をさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１７】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９および／またはＤ４６０に対応するアミノ酸残基での突然変異をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１８】
ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｎ８８、Ｎ１３４および／またはＬ１７１位に対応するアミノ酸残基での突然変異を欠如している、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項１９】
前記親α−アミラーゼは、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種由来であるか、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来ではない、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の変異α−アミラーゼ。
【請求項２０】
表面からデンプン質の染みまたは汚れを除去するための方法であって、前記表面を、有効量の請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の変異アミラーゼと接触させる工程と、水性組成物中で溶解するより小さいデンプン由来分子を生成し、それにより前記表面から前記デンプン質の染みを除去するために、ポリペプチドが、前記デンプン質の染み中に存在するデンプン成分を加水分解することを可能にする工程とを含む方法。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の変異アミラーゼを含む洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，３０１号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
複数の組み合わせ可能な突然変異を含有する変異α−アミラーゼに関連する組成物および方法が開示される。変異α−アミラーゼは、例えば、デンプンの液化および糖化、デンプン質の染みの洗浄、布地の糊抜き、製パンおよび醸造のために有用である。
【背景技術】
【０００３】
デンプンは、アミロース（１５〜３０重量／重量％）およびアミロペクチン（７０〜８５重量／重量％）の混合物からなる。アミロースは、約６０，０００〜約８００，０００の分子量（ＭＷ）を有するα−１，４−結合グルコース単位の直鎖からなる。アミロペクチンは、各２４〜３０グルコース単位毎にα−１，６分岐点を含有する分岐状ポリマーであり、そのＭＷは１００，０００，０００の高さであり得る。
【０００４】
濃縮デキストロースシロップの形態のデンプン由来の糖は、現在、（１）α−アミラーゼを用いた固体デンプンの約７〜１０の平均重合度を有するデキストリンへのゼラチン化および液化（または粘度低下）と、（２）生じた液化デンプン（すなわち、デンプン加水分解物）のアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼまたはＧＡとも呼ばれる）を用いた糖化とを含む酵素触媒プロセスによって製造されている。生じたシロップは、グルコース含量が高い。商業的に製造されるグルコースシロップの多くは、引き続きイソシロップとして公知のデキストロース／フルクトース混合物へ酵素的に異性化される。結果として生じるシロップは、例えば、エタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、イタコン酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸塩、リシン、他の有機酸、他のアミノ酸および他の生化学物質を含む市販の製品を製造するために、例えば酵母などの微生物を用いて発酵させることもできる。発酵および糖化は、より大きい経済性および効率を達成するために同時に実施することができる（すなわち、ＳＳＦプロセス）。
【０００５】
α−アミラーゼは、無作為に内部α−１，４−グルコシド結合を切断することによってデンプン、グリコーゲンおよび関連する多糖類を加水分解する。特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）由来のα−アミラーゼは、デンプンの液化および糖化、布地の糊抜き、紙パルプ産業におけるデンプン改質、醸造、製パン、食品工業のためのシロップの製造、発酵プロセスのための供給原料の製造ならびに消化性を上昇させるための動物用飼料を含む、広範囲の様々な目的のために使用されてきた。これらの酵素は、食器洗浄および洗濯洗浄中にデンプン質の汚れおよび染みを除去するために使用することもできる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多くの刊行物がα−アミラーゼにおける突然変異について記載してきた。しかし、全ての突然変異が異なる分子において同一の作用を生成するわけではなく、全ての突然変異が組み合わされ得るわけでもない。さらに、多くの突然変異は、他の特性を犠牲にして所定の望ましい性質を有する分子を生成する。強固な改変α−アミラーゼ分子に対する必要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本組成物および方法は、変異アミラーゼポリペプチドおよびそれらの使用方法に関する。本組成物および方法の態様および実施形態は、以下の個別に番号を付した段落で要約される。
【０００８】
１．第１の態様では、Ｒ３７５および任意選択的にＳ３６０に対応するアミノ酸残基での突然変異と、Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｔ１８０、Ｅ１８７およびＩ２０３からなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異および任意選択的に少なくとも２つの突然変異とを含む、親α−アミラーゼの組換え変異体であって、その変異α−アミラーゼまたは親α−アミラーゼは、ナンバリングのために使用される配列番号１に対して少なくとも６０％、任意選択的に７０％、任意選択的に８０％、任意選択的に８５％、任意選択的に９０％または任意選択的に９５％のアミノ酸配列同一性を有し、その変異体は、親α−アミラーゼまたは突然変異の非存在によってのみ変異α−アミラーゼと異なる参照α−アミラーゼと比較して増加した低ｐＨ安定性および／またはデンプン液化活性を有する、組み換え変異体が提供される。
【０００９】
２．一部の実施形態では、段落１の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｒ３７５Ｙおよび任意選択的にＳ３６０Ａと、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０Ｈ、Ｔ１８０Ｄ、Ｅ１８７ＰおよびＩ２０３Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異および任意選択的に少なくとも２つの突然変異とを含む。特定の実施形態では、段落１の変異α−アミラーゼは、詳細にはＦ１５３位での突然変異を含まない。
【００１０】
３．一部の実施形態では、段落１または２の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｒ３７５ＹおよびＳ３６０Ａを含む。
【００１１】
４．一部の実施形態では、段落３の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０ＨおよびＥ１８７Ｐをさらに含む。
【００１２】
５．一部の実施形態では、上記の段落のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ａ２７５、Ｔ８９、Ｓ９２およびＹ３０１からなる群から選択される位置での突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、特異的突然変異は、Ａ２７５ＤもしくはＡ２７５Ｅ、Ｔ８９Ｅ、Ｓ９２Ｒおよび／またはＹ３０１Ａである。
【００１３】
６．一部の実施形態では、上記の段落のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０およびＧ１８１に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失をさらに含む。
【００１４】
７．一部の実施形態では、上記の段落のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８およびＧ１７９またはＴ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基の欠失をさらに含む。
【００１５】
８．一部の実施形態では、上記の段落のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｇ４７６、Ｇ４７７、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９および／またはＤ４６０に対応するアミノ酸残基での突然変異をさらに含む。
【００１６】
９．一部の実施形態では、上記の段落のいずれかの変異α−アミラーゼは、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種由来であるか、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来ではない。
【００１７】
１０．別の態様では、デンプンをオリゴ糖へ変換するための方法であって、デンプンを、有効量の段落１〜９のいずれかの変異アミラーゼと接触させる工程を含む方法が提供される。
【００１８】
１１．別の態様では、段落１〜９のいずれかの変異アミラーゼを含む、デンプンを液化するための組成物が提供される。
【００１９】
１２．別の態様では、Ｔ３８、Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｅ１８７、Ｉ２０３、Ｇ４７６およびＧ４７７位に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つおよび任意選択的に複数での突然変異と、任意選択的にＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異とを含む、親α−アミラーゼの組み換え変異体であって、変異α−アミラーゼまたは親α−アミラーゼは、ナンバリングのために使用される配列番号１に対して少なくとも６０％、任意選択的に７０％、任意選択的に８０％、任意選択的に８５％、任意選択的に９０％または任意選択的に９５％のアミノ酸配列同一性を有し、その変異体は、親α−アミラーゼまたは突然変異の非存在によってのみ変異α−アミラーゼと異なる参照α−アミラーゼと比較して増加した洗剤安定性および／または洗浄性能を有する、組み換え変異体が提供される。
【００２０】
１３．一部の実施形態では、段落１２の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｔ３８Ｎ、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｅ１８７Ｐ、Ｉ２０３Ｙ、Ｇ４７６ＫおよびＧ４７７Ｅの少なくとも１つおよび任意選択的に複数を含む。特定の実施形態では、段落１２の変異α−アミラーゼは、詳細にはＦ１５３位での突然変異を含まない。
【００２１】
１４．一部の実施形態では、段落１２または１３の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｔ１２９位での突然変異をさらに含む。
【００２２】
１５．一部の実施形態では、段落１４の変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、突然変異Ｔ１２９Ｉをさらに含む。
【００２３】
１６．一部の実施形態では、段落１２〜１５のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８およびＧ１７９またはＴ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基の欠失をさらに含む。
【００２４】
１７．一部の実施形態では、段落１２〜１６のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９および／またはＤ４６０に対応するアミノ酸残基での突然変異をさらに含む。
【００２５】
１８．一部の実施形態では、段落１２〜１７のいずれかの変異α−アミラーゼは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｎ８８、Ｎ１３４および／またはＬ１７１に対応するアミノ酸残基での突然変異を欠如している。
【００２６】
１９．一部の実施形態では、段落１２〜１８のいずれかの変異α−アミラーゼは、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種由来であるか、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来ではない。
【００２７】
２０．別の態様では、表面からデンプン質の染みまたは汚れを除去するための方法であって、その表面を、有効量の段落１２〜１９のいずれかの変異アミラーゼと接触させる工程と、水性組成物中で溶解するより小さいデンプン由来分子を生成し、それにより表面からデンプン質の染みを除去するために、ポリペプチドが、デンプン質の染み中に存在するデンプン成分を加水分解することを可能にする工程とを含む方法が提供される。
【００２８】
２１．別の態様では、段落１２〜２０のいずれかの変異アミラーゼを含む洗剤組成物が提供される。
【００２９】
本組成物および方法のこれらおよび他の態様および実施形態は、本明細書の説明および図面から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】デンプン基質と、α−アミラーゼ変異体Ｃ１６ＥおよびＣ１６Ｅ−ＡＹとのインキュベーションの結果として生じる酵素１ｍｇ当たりのピーク流動性値を示すグラフである。
【図２】デンプン基質と、α−アミラーゼ変異体Ｃ１６ＥおよびＣ１６Ｅ−ＡＹとのインキュベーションの結果として生じる酵素１ｍｇ当たりの最終流動性値を示すグラフである。
【図３】デンプン基質と、Ｃ１６Ｅをベースとするα−アミラーゼ変異体とのインキュベーションの結果として生じる酵素１ｍｇ当たりのピーク流動性値を示すグラフである。
【図４】デンプン基質と、Ｃ１６Ｅをベースとするα−アミラーゼ変異体とのインキュベーションの結果として生じる酵素１ｍｇ当たりの最終流動性値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
変異α−アミラーゼ酵素に関する組成物および方法について記載する。変異アミラーゼ酵素の典型的な用途は、デンプンの液化および糖化のため、洗濯、食器洗浄および他の用途におけるデンプン質の染みを洗浄するため、繊維加工産業（例えば、糊抜き）のため、消化性を改善するための動物飼料において、ならびに製パンおよび醸造のためである。以下では、本組成物および方法のこれらおよび他の態様について詳細に記載する。
【００３２】
本組成物および方法の様々な態様および実施形態について説明する前に、以下の定義および略語について説明する。
【００３３】
１．定義および略語
この詳細な説明によると、以下の略語および定義が適用される。文脈が明白に他のことを指示していない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素」という言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量」という言及は、１つ以上の用量および当業者であれば公知であるその均等物を含む。
【００３４】
本明細書は、読みやすくするために多くのセクションで編成されている。しかしながら、読者は、１つのセクションでなされた記載を他のセクションに適用できることを理解できるであろう。このように、本開示の異なるセクションで使用された見出しを限定的であると解釈すべきではない。
【００３５】
他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。下記では、以下の用語を提供する。
【００３６】
１．１．略語および頭字語
以下の略語／頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
ＡＢＴＳ  ２，２−アジノ−ビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
ＡＥまたはＡＥＯ  アルコールエトキシレート
ＡＥＳまたはＡＥＯＳ  アルコールエトキシスルフェート
ＡｋＡＡ  アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）α−アミラーゼ
ＡｎＧＡ  アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ
ＡＯＳ  α−オレフィンスルホネート
ＡＳ  アルキル硫酸塩
ｃＤＮＡ  相補的ＤＮＡ
ｃｔ／ｋｇ  セント／ｋｇ（米国で通用）
ＣＭＣ  カルボキシメチルセルロース
ＤＥ  デキストロース当量
ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
ＤＰｎ  ｎ個のサブユニットを有する糖重合度
ｄｓまたはＤＳ  乾燥固体
ＤＴＭＰＡ  ジエチレントリアミン五酢酸
ＥＣ  酵素委員会
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＥＯ  エチレンオキシド（ポリマー断片）
ＥＯＦ  発酵の終了
ＦＨ  フランス硬度
ＧＡ  グルコアミラーゼ
ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）  グルコアミラーゼ活性単位／ｇ（乾燥固体含量）
ＧＨ  一般硬度
ＨＤＬ  高密度液体洗剤
ＨＤＤ  強力粉末洗剤
ＨＳＧ  高泡立ち顆粒洗剤
ＨＦＣＳ  高フルクトースコーンシロップ
ＨｇＧＡ  フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ
ＩＰＴＧ  イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
ＩＲＳ  不溶性残留デンプン
ｋＤａ  キロダルトン
ＬＡＳ  直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩
ＬＡＴ、ＢＬＡ  Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ
ＭＷ  分子量
ＭＷＵ  修正ウォルゲムート単位；１．６×１０−５ｍｇ／ＭＷＵ＝活性の単位
ＮＣＢＩ  全米バイオテクノロジー情報センター
ＮＯＢＳ  ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩
ＮＴＡ  ニトリロ酢酸
ＯｘＡｍ  Ｐｕｒａｓｔａｒ  ＨＰＡＭ  ５０００Ｌ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）
ＰＡＨＢＡＨ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ｐＩ  等電点
ＰＩ  性能指数
ｐｐｍ  百万分の１、例えば乾燥固体１ｇ当たりのタンパク質（μｇ）
ＰＶＡ  ポリ（ビニルアルコール）
ＰＶＰ  ポリ（ビニルピロリドン）
ＲＣＦ  相対遠心力／求心力（すなわち、ｘ重力）
ＲＮＡ  リボ核酸
ＳＡＳ  アルカンスルホン酸塩
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法
ＳＳＦ  同時の糖化および発酵
ＳＳＵ／固体（ｇ）  可溶性デンプン単位／乾燥固体（ｇ）
ｓｐ．  種
ＴＡＥＤ  テトラアセチルエチレンジアミン
Ｔｍ  融解温度
ＴｒＧＡ  トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ
ｗ／ｖ  重量／体積
ｗ／ｗ  重量／重量
ｖ／ｖ  体積／体積
ｗｔ％  重量％
℃  摂氏温度
Ｈ２Ｏ  水
ｄＨ２ＯまたはＤＩ  脱イオン水
ｄＩＨ２Ｏ  脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ濾過
ｇまたはｇｍ  グラム
μｇ  マイクログラム
ｍｇ  ミリグラム
ｋｇ  キログラム
μＬおよびμｌ  マイクロリットル
ｍＬおよびｍｌ  ミリリットル
ｍｍ  ミリメートル
μｍ  マイクロメートル
Ｍ  モル
ｍＭ  ミリモル
μＭ  マイクロモル
Ｕ  単位
ｓｅｃ  秒
ｍｉｎ（ｓ）  分
ｈｒ（ｓ）  時間
ＤＯ  溶存酸素
Ｎｃｍ  ニュートン・センチメートル
ＥＴＯＨ  エタノール
ｅｑ．  当量
Ｎ  規定の
ｕＰＷＡ  ピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）に由来する変異α−アミラーゼ
ＰＷＡ  ピロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）に由来するα−アミラーゼ
ＭＷＣＯ  分子量カットオフ
ＳＳＲＬ  スタンフォード大学シンクロトン放射光源研究所
ＰＤＢ  タンパク質データベース
ＣＡＺｙ  糖質関連酵素データベース
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
【００３７】
１．２．用語の定義
用語「アミラーゼ」または「デンプン分解酵素」は、特にデンプンの分解を触媒することができる酵素を指す。α−アミラーゼは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断するヒドロラーゼである。一般に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、無作為方法でデンプン分子内のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断して、３つ以上の（１−４）−α−結合Ｄ−グルコース単位を含有する多糖類を生成するエンド作用性酵素であると定義される。これとは対照的に、エキソ作用性デンプン分解酵素、例えばβ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２；α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）およびマルトジェニックα−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）のような一部の生成物特異的アミラーゼは、基質の非還元末端から多糖分子を切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）ならびにマルトテトラオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）およびマルトヘキサオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９８）のような生成物特異的アミラーゼは、特定の長さのマルトオリゴ糖または特定のマルトオリゴ糖の濃縮シロップを生成することができる。
【００３８】
用語「デンプン」は、植物の複合多糖炭水化物からなる、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘ（式中、Ｘは任意の数であり得る）を備えるアミロースおよびアミロペクチンからなる任意の物質を指す。この用語には、植物系物質、例えば穀物、穀草類、草類、塊茎および根ならびにより詳細には小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、ソルガム、フスマ、キャッサバ、キビ、ミロ、ジャガイモ、サツマイモおよびタピオカから得られた物質が含まれる。用語「デンプン」には、粒状デンプンが含まれる。用語「粒状デンプン」は、生の、すなわち未調理デンプン、例えば糊化を受けていないデンプンを指す。
【００３９】
ポリペプチドに関連する「野生型」、「親」または「参照」という用語は、１つ以上のアミノ酸の位置での人為的な置換、挿入または欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連する「野生型」、「親」または「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親または参照のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親または参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
【００４０】
野生型ポリペプチドへの言及は、ポリペプチドの成熟形を含むと理解される。「成熟」ポリペプチドまたはその変異体は、例えば、そのポリペプチドの発現中または発現後のポリペプチドの未熟系から切断されて、その中にシグナル配列が非存在であるポリペプチドまたは変異体である。
【００４１】
ポリペプチドに関する用語「変異体」は、アミノ酸の１つ以上の天然型または人為的置換、挿入または欠失を含むという点で特定の野生型、親または参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する用語「変異体」は、ヌクレオチド配列において特定の野生型、親または参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親または参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかになるであろう。
【００４２】
本α−アミラーゼの場合、「活性」は、本明細書で記載するように測定できるα−アミラーゼ活性を指す。
【００４３】
用語「性能の利点」は、分子の望ましい特性における改良を意味する。典型的な性能の利点には、デンプン基質の増加した加水分解、増加した穀物、穀草類または他のデンプン基質の液化性能、増加した洗浄性能、増加した耐熱性、増加した洗剤安定性、増加した貯蔵安定性、増加した溶解性、変化したｐＨプロファイル、減少したカルシウム依存性、増加した比活性、改質された基質特異性、改質された基質結合、改質されたｐＨ依存性活性、改質されたｐＨ依存性安定性、増加した酸化安定性および増加した発現が含まれるがそれらに限定されない。一部の場合、性能利点は、相当に低い温度で実現される。一部の場合、性能利点は、相当に高い温度で実現される。
【００４４】
用語「プロテアーゼ」および「プロテイナーゼ」は、タンパク質を形成するペプチドまたはポリペプチド鎖内でアミノ酸を一緒に結合するペプチド結合の加水分解を意味する、「タンパク質分解」または「タンパク質分解的切断」を実施する能力を有する酵素タンパク質を指す。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性を測定するために多数の周知の手法が存在する（例えば、Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）におけるＫａｌｉｓｚ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ”を参照されたい）。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を分析する比較アッセイによって解明することができる。プロテアーゼまたはタンパク質分解活性の分析において有用な典型的な基質には、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、ウシのコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシのエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）およびウシのケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）が含まれるがそれらに限定されない。これらの基質を利用する比色アッセイは、当技術分野において周知である（例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９９／３４０１１号パンフレット；および米国特許第６，３７６，４５０号明細書を参照されたい）。ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６−３２０［１９７９］を参照されたい）も、勾配溶出中に収集される分画についての活性酵素濃度を決定する際に利用される。本アッセイは、酵素が可溶性合成ペプチド基質、例えばスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解し、Ｃ末端アミノ酸（フェニルアラニン）とｐ−ＮＡとの間で切断が発生するにつれてｐ−ニトロアニリンが遊離されて、加水分解反応から黄色の生成を誘発する、分光計上で４１０ｎｍにおいて測定され、活性酵素濃度に比例する速度を測定する。色変化の測定は、反応速度の計算を可能にする。さらに、２８０ｎｍ（ナノメートル）での吸光度測定値を使用すると、総タンパク質濃度を決定することができる。活性酵素／総タンパク質比は、参照標準物質が使用された場合に酵素純度を生じさせる。
【００４５】
用語「セリンプロテアーゼ」は、それらの酵素中でセリンが酵素活性部位で求核性アミノ酸として機能するタンパク質中のペプチド結合を切断する酵素を指す。セリンプロテアーゼは、それらの構造に基づいて、キモトリプシン様（トリプシン様）またはサブチリシン様の２つの広義のカテゴリーに分類される。洗濯用洗剤および食器洗浄用洗剤中で最も一般的に使用されるのは、セリンプロテアーゼ、特にサブチリシン類である。
【００４６】
用語「ＴＩＭバレル」は、ペプチド骨格に沿って交互に入れ替わる８本のαヘリックスおよび８本の平行なβストランドを含む三次元ポリペプチド構造を指す。
【００４７】
ポリペプチド内のアミノ酸残基に関連する用語「表面が露出した」は、ポリペプチドが無傷で適正に折り畳まれている、すなわち変性も断片化もしていない場合にポリペプチドの外面上にある残基を指す。α−アミラーゼの場合、この構造がＴＩＭバレルと呼ばれる。
【００４８】
ポリペプチド内のアミノ酸残基に関連する用語「非標準」は、デフォルトパラメーターを使用してＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて、類似の分子のアミノ酸配列アラインメントに基づいて所定の位置で通常見いだされない残基を指す。一部の場合、特定の残基は、類似の分子１０個中の１個、２０個中の１個、３０個中の１個、５０個中の１個または１００個中の１個の位置でのみ見いだされる。
【００４９】
「組み合わせ変異体」は、２つ以上の突然変異、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれを超える置換、欠失および／または挿入を含む変異体である。
【００５０】
「結合可能な突然変異」は、組み合わせ変異体を作成するために使用できる任意のアミノ酸位置での突然変異である。結合可能な突然変異は、発現、活性または安定性のいずれも有意には減少させずに、分子（この場合にはアミラーゼ）の少なくとも１つの所望の特性を改良する。
【００５１】
「カルシウム結合ループ内の残留している非Ｇ残基」、「カルシウム結合ループ内の残留している非Ｇアミノ酸残基」などの用語および類似の用語は、親α−アミラーゼのカルシウム結合ループ内の少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失後に変異体内に残留しており、かつグリシン残基ではない、変異α−アミラーゼのカルシウム結合ループ内のアミノ酸残基を指す。非Ｇ残基は、大多数のα−アミラーゼ内に２つが存在し、かつ親α−アミラーゼのカルシウム結合ループ内の２つのＸＧ残基対の１つのペアワイズ欠失後に残留している非Ｇ残基であり得る「ＸＧ」対のメンバーであり得る。
【００５２】
Ｘ１Ｇ／Ｓ１Ｘ２Ｇ２モチーフ（配列番号１の１７８〜１８１位にある残基に対応する）内の（ナンバリングのために配列番号１を使用して）１３２位での残基と残留している非Ｇ残基との間の「安定化相互作用」は、主題アミノ酸残基の側鎖間で形成される水素結合または塩橋を指す。安定化は、例えば１つの残基が事前に選択されたｐＨで正荷電している場合、他方は負荷電していて、総荷電はゼロであるように、相互作用する残基を平衡させる荷電の結果として生じる。
【００５３】
用語「組換え」は、主題細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用した場合、主題がその自然状態から修飾されていることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形内で見いだされない遺伝子を発現するか、または異なるレベルでもしくは自然で見いだされる条件と異なる条件下で天然遺伝子を発現する。組換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが相違し、および／または例えば発現ベクター内の異種プロモーターなどの異種配列と機能的に連結している。組換えタンパク質は、天然配列と１つ以上のアミノ酸が異なり得、および／または異種配列と融合している。アミラーゼをコードする核酸を含むベクターは、組換えベクターである。
【００５４】
用語「回収された」、「単離された」および「分離された」は、自然に見いだされるようにそれが自然に結び付いている少なくとも１つの他の物質もしくは構成成分から回収されている化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸または他の特定の物質もしくは構成成分を指す。それらの「単離された」ポリペプチドには、異種宿主細胞内で発現した分泌ポリペプチドを含有する細胞培養ブロスが含まれるが、それに限定されない。
【００５５】
用語「精製された」は、相当に純粋な状態、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋または少なくとも約９９％純粋でさえある物質（例えば、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を指す。
【００５６】
用語「濃縮された」は、約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋または少なくとも約７０％純粋でさえある物質（例えば、単離ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を指す。
【００５７】
酵素に関連する用語「熱安定性の」および「熱安定性」は、酵素が高温への曝露後に活性を保持する能力を指す。酵素、例えばアミラーゼ酵素の熱安定性は、その時間中に規定条件下で酵素活性の半分が失われる、分、時間または日数で与えられるその半減期（ｔ１／２）によって測定できる。半減期は、高温への曝露（すなわち、高温によるチャレンジ）後の残留α−アミラーゼ活性を測定することによって計算できる。
【００５８】
酵素に関連する「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【００５９】
酵素に関連する用語「ｐＨ安定性の」および「ｐＨ安定性」は、酵素が規定の時間（例えば、１５分間、３０分間、１時間）にわたる広範囲のｐＨ範囲にわたり活性を保持する能力に関する。
【００６０】
用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」と同義語であり、互換的に使用される。そのようなアミノ酸配列が活性を示す場合、それらは「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸残基に対して従来型の１文字コードまたは３文字コードが使用され、アミノ酸配列は、標準のアミノからカルボキシ末端方向（すなわち、Ｎ→Ｃ）で表示する。
【００６１】
用語「核酸」は、ポリペプチドをコードできるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖および合成分子を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、化学修飾を含有することができる。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用される。遺伝コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードするために２個以上のコドンを使用することができ、本組成物および方法は、特定アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。他に規定しない限り、核酸配列は、５’−から３’−の方向に表示される。
【００６２】
「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術およびＰＣＲ技術中に発生するように、核酸の１本の鎖が相補鎖と二本鎖とを形成する、すなわち塩基対形成するプロセスを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、次の条件：６５℃および０．１×ＳＳＣ（式中、１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸三ナトリウム（ｐＨ７．０）である）下でのハイブリダイゼーションによって例示される。ハイブリダイズした二本鎖核酸は、ハイブリダイズした核酸の２分の１が相補的鎖と対にならない融解温度（Ｔｍ）を特徴とする。二本鎖内のミスマッチヌクレオチドはＴｍを低下させる。変異α−アミラーゼをコードする核酸は、配列番号２のヌクレオチドとその同一相補体との間で形成された二本鎖と比較して１℃〜３℃以上低いＴｍを有する可能性がある。
【００６３】
「合成」分子は、生物によるのではなく。むしろｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成または酵素合成によって生成される。
【００６４】
細胞に関して使用される用語「形質転換された」、「安定性で形質転換された」および「トランスジェニック」は、細胞が、そのゲノム内に組み込まれた非天然の（例えば、異種の）核酸配列を含有するか、または複数世代を通して維持されるエピソームとして運ばれることを意味する。
【００６５】
細胞内への核酸配列の挿入に関連して、用語「導入された」は、当技術分野において公知であるように「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」を意味する。
【００６６】
「宿主株」または「宿主細胞」は、その中に関心対象のポリペプチド（例えば、アミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター、ファージ、ウイルスまたは他のＤＮＡ構築物が導入されている生物である。典型的な宿主株は、関心対象のポリペプチドを発現でき、および／または糖類を発酵できる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌および酵母）である。用語「宿主細胞」には、細胞から作成されたプロトプラストが含まれる。
【００６７】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関連した用語「異種の」は、宿主細胞中で自然には発生しないポリヌクレオチドまたはタンパク質に関する。
【００６８】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関連した用語「内因性の」は、宿主細胞中で自然に発生するポリヌクレオチドまたはタンパク質に関する。
【００６９】
用語「発現」は、それによりポリペプチドが核酸配列に基づいて生成されるプロセスに関する。このプロセスには、転写および翻訳の両方が含まれる。
【００７０】
「選択的マーカー」または「選択可能なマーカー」は、遺伝子を運んでいる宿主細胞の選択を容易にするために宿主内で発現させることのできる遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例としては、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシンもしくはクロラムフェニコール）および／または宿主細胞に代謝上の利点、例えば栄養上の利点を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
「ベクター」は、核酸を１種以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが含まれる。
【００７２】
「発現ベクター」は、関心対象のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味するが、そのコーディング配列は、好適な宿主内のＤＮＡの発現を実施できる好適な制御配列に機能的に連結している。そのような制御配列としては、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的オペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサーならびに転写および翻訳の終了を制御する配列を含むことができる。
【００７３】
用語「機能的に連結した」は、特定の構成成分が意図された方法で機能することを許容する関係（並列を含むがそれに限定されない）にあることを指す。例えば、調節配列は、コーディング配列の発現が調節配列の制御下にあるようにコーディング配列に機能的に連結している。
【００７４】
「シグナル配列」は、細胞外部へのタンパク質の分泌を容易にする、タンパク質のＮ末端部分に付着しているアミノ酸の配列である。細胞外タンパク質の成熟形は、分泌プロセス中に切断して除かれるシグナル配列を欠如している。
【００７５】
「生物活性」は、例えば酵素活性などの特定の生物活性を有する配列を指す。
【００７６】
用語「比活性」は、特定条件下で単位時間当たりの酵素または酵素調製物によって生成物に変化させることのできる基質のモル数を指す。比活性は、一般に単位（Ｕ）／ｍｇ（タンパク質）として表示される。
【００７７】
本明細書で使用する「水の硬度」は、水中に存在する無機質（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）の尺度である。
【００７８】
「材料見本」は、そこに適用された染みを有する織物などの一片の材料である。材料は、例えば、綿、ポリエステルまたは天然繊維と合成繊維との混合物から製造された織物であり得る。材料見本は、さらに、紙、例えば濾紙もしくはニトロセルロース、または例えば陶器、金属もしくはガラスなどの一片の硬質材料であってもよい。アミラーゼについて、染みは、デンプンベースであるが、血液、牛乳、インク、草、茶、ワイン、ホウレンソウ、グレイビー、チョコレート、卵、チーズ、粘土、顔料、油またはこれらの化合物の混合物を含むことができる。
【００７９】
「小さい材料見本」は、単一孔穿孔機を用いて切断された、または注文製造された９６孔穿孔装置を用いて切断された１切片の材料見本であり、ここで、多孔パンチのパターンは、標準９６ウエルマイクロタイタープレートに適合さているか、またはその切片が別の方法で材料見本から取り除かれている。材料見本は、布地、紙、金属または他の好適な材料の材料見本であり得る。小さい材料見本は、それが２４ウエル、４８ウエルもしくは９６ウエルマイクロタイタープレートのウエル内に配置される前または配置された後のいずれかに付着された染みを有する可能性がある。小さい材料見本は、材料の小片に染みを適用することによって作成することもできる。例えば、小さい材料見本は、直径が５／８’’または０．２５’’の染み付き片であり得る。注文製造された穿孔機は、９６ウエルプレートの全ウエルに９６片の材料見本を同時に送達する方法で設計される。この装置は、同一の９６ウエルプレートに単純に複数回装填することによって１ウエル当たり２個以上の材料見本の送達を可能にする。多孔穿孔機は、２４ウエル、４８ウエルまたは９６ウエルプレートを含むがそれらに限定されない任意のフォーマットプレートに材料見本を同時に送達することを想定され得る。別の想定可能な方法では、汚れ試験プラットフォームは、金属、プラスチック、ガラス、陶器または固体基質でコーティングされている他の好適な材料から製造されたビーズであり得る。１つ以上のコーティングされたビーズは、次に好適なバッファーおよび酵素を含有する、９６ウエル、４８ウエルまたは２４ウエルプレート以上の大きいフォーマットのウエル内に配置される。
【００８０】
「アミラーゼを含む培養細胞材料」または類似の用語は、構成成分としてアミラーゼを含む細胞溶解物または上清（培地を含む）を指す。細胞材料は、アミラーゼを生成する目的のために培養中で増殖される異種宿主由来であり得る。
【００８１】
「配列同一性率（％）」は、特定配列が、デフォルトパラメーターを備えるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを使用して整列させた場合、特定参照配列内のアミノ酸残基と同一である少なくとも所定のパーセンテージのアミノ酸残基を有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターは、次の通りである。
ギャップオープニングペナルティー：１０．０
ギャップエクステンションペナルティー：０．０５
タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭシリーズ
ＤＮＡ重量マトリックス：ＩＵＢ
ディレイ発散配列（％）：４０
ギャップ分離距離：８
ＤＮＡ遷移重量：０．５０
親水性残基のリスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
負のマトリックスの使用：ＯＦＦ
トグル残基トクイテキペナルティ：ＯＮ
トグルシンスイセイペナルティ：ＯＮ
トグル末端ギャップペナルティ：ＯＦＦ
【００８２】
欠失は、参照配列と比較して非同一の残基として計数される。いずれかの末端で発生している欠失が含まれる。例えば、配列番号１の成熟ＣｓｐＡｍｙ２ポリペプチドのＣ末端の５つのアミノ酸欠失を有する変異体は、成熟ポリペプチドに対して９９％の配列同一性率（６１２／６１７個の同一残基×１００、最も近い整数に丸めた）を有するであろう。そのような変異体は、成熟アミラーゼポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
【００８３】
「融合」ポリペプチド配列は、２つの主題ポリペプチド配列間のペプチド結合によって接続されており、すなわち機能的に連結されている。
【００８４】
用語「糸状菌」は、ユウミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状体、特にペジゾミコチナ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）種を指す。
【００８５】
用語「重合度」（ＤＰ）は、所定の糖中のアンヒドログルコピラノース単位の数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例は、単糖類のグルコースおよびフルクトースである。ＤＰ２の例は、二糖類のマルトースおよびスクロースである。用語「ＤＥ」または「デキストロース当量」は、シロップ中の全炭水化物の分画としての還元糖、すなわちＤ−グルコースのパーセンテージであると定義される。
【００８６】
用語「乾燥固体含量」（ｄｓ）は、乾燥重量％ベースでのスラリーの総固体に関する。用語「スラリー」は、不溶性固体を含有する水性混合物を指す。
【００８７】
語句「同時の糖化および発酵（ＳＳＦ）」は、例えばエタノール産生微生物などの微生物有機体およびアミラーゼなどの少なくとも１種の酵素が同一プロセス工程中に存在する生化学薬品の製造におけるプロセスを指す。ＳＳＦには、（顆粒状、液化または可溶化）デンプン基質のグルコースを含む糖類への同時の加水分解、および同一反応容器内でのアルコールまたは他の生化学材料または生体材料への糖類の発酵が含まれる。
【００８８】
「エタノール産生微生物」は、糖またはオリゴ糖をエタノールに変換させる能力を備える微生物を指す。
【００８９】
用語「発酵飲料」は、発酵プロセス、例えば微生物発酵、例えば細菌および／または真菌発酵などを含む方法によって生成された任意の飲料を指す。「ビール」は、そのような発酵飲料の一例であり、用語「ビール」は、デンプン含有植物材料の発酵／醸造によって製造された任意の発酵麦芽汁を含むことが意図されている。ビールは、麦芽もしくは添加剤または麦芽および添加剤の任意の組み合わせからのみ製造されることが多い。ビールの例としては、フルモルトビール、「ビール純粋令」の下で醸造されたビール、エール、インディアペイルエール、ラガー、ピルスナー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボック、ドップルボック、スタウト、ポーター、麦芽酒、ノンアルコールビール、ノンアルコール麦芽酒などが挙げられるが、また別の穀物飲料および麦芽飲料、例えばフルーツ風味の麦芽飲料、例えばシトラス系風味の、例えばレモン風味、オレンジ風味、ライム風味もしくはベリー風味の麦芽飲料、酒風味の麦芽飲料、例えばウォッカ風味、ラム風味もしくはテキーラ風味の麦芽酒またはコーヒー風味の麦芽飲料、例えばカフェイン風味の麦芽酒なども挙げられる。
【００９０】
用語「麦芽」は、任意の麦芽入り穀物、例えば麦芽入り大麦または小麦を指す。
【００９１】
用語「添加剤」は、例えば大麦麦芽または小麦麦芽などの麦芽ではない植物材料を含有する任意のデンプンおよび／または糖を指す。添加剤の例としては、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンスターチ、大麦、大麦デンプン、脱穀大麦、小麦、小麦デンプン、焙焼穀物、穀物フレーク、ライ麦、オート麦、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバおよび例えばコーンシロップ、サトウキビシロップ、転化糖、大麦および／または小麦シロップなどのシロップが挙げられる。
【００９２】
用語「マッシュ」は、後に麦芽汁と使用済み穀物とに分離される、水と混和された植物材料、例えば製粉用穀物、例えば破砕大麦麦芽、破砕大麦および／もしくは他の添加剤またはそれらの組み合わせを含有する任意のデンプンおよび／または糖の水性スラリーを指す。
【００９３】
用語「麦芽汁」は、マッシュ化中に挽いた穀物を抽出した後に放出される未発酵酒を指す。
【００９４】
「ヨウ素陽性デンプン」または「ＩＰＳ」は、（１）液化および糖化後に加水分解されないアミロース、または（２）老化デンプンポリマーを指す。糖化デンプンまたは糖蒸留酒がヨウ素を用いて試験されると、高ＤＰｎアミロースまたは老化デンプンポリマーは、ヨウ素に結合し、特徴的な青色を生成する。したがって、糖蒸留酒は、「ヨウ素陽性糖」、「青色糖」または「ブルー糖」と呼ばれる。
【００９５】
用語「老化デンプン」または「デンプン老化」は、デンプンペーストまたはゲルにおいて老化すると自然に発生する変化を意味する。
【００９６】
用語「約」は、参照値の±１５％を指す。
【００９７】
２．α−アミラーゼ変異体
本組成物および方法の１つの態様は、工業用途におけるそれらの性能を改良する突然変異の組み合わせを含む変異α−アミラーゼ酵素である。組み合わせ変異体は、Ｊｅａｎｇ，Ｃ−Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（（２００２）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６８：３６５１−５４）によって以前に記載された、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種由来のα−アミラーゼ（本明細書では「ＣｓｐＡｍｙ２アミラーゼ」）を使用して最初に見いだされた。ＣｓｐＡｍｙ２  α−アミラーゼポリペプチドの成熟形のアミノ酸配列は、下記に配列番号１として示した。
【化１】
2019500058.tif 000003
【００９８】
配列番号１では、Ｒ１７８およびＧ１７９に下線を付した。Ｒ１７８およびＧ１７９の両方の欠失を有するサイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種α−アミラーゼの変異体（本明細書では「ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ１」）についても記載されている（Ｓｈｉａｕ，Ｒ−Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６９：２３８３−８５）。成熟ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ１  α−アミラーゼポリペプチドのアミノ酸配列は、下記に配列番号２として示した。
【化２】
2019500058.tif 000004
【００９９】
出発点としての配列番号２を使用して、多数の組み合わせＣｓｐＡｍｙ２変異体が以前に作成され、試験された（例えば、参照により組み込まれる国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットを参照されたい）。最高に機能する変異体は、望ましい特性を改良した追加の突然変異と一緒に、一般に、Ｅ１８７またはＳ２４１のいずれかに対応するアミノ酸位置で安定化突然変異を含んでいた。
【０１００】
本明細書では、選択された用途における高レベルの性能を提供するように特別仕立てされているＣｓｐＡｍｙ２のさらに改良された変異体について記載する。本組成物および方法の全実施形態は、ナンバリングのために配列番号１を参照して記載する。しかし、本組成物および方法は、ＣｓｐＡｍｙ２変異体に限定されない。
【０１０１】
一部の実施形態では、本組成物および方法には、Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｔ１８０、Ｅ１８７およびＩ２０３位で以前に同定された突然変異の１つ、複数または全部と組み合わせて、Ｒ３７５に対応するアミノ酸残基および任意選択的にＳ３６０に対応するアミノ酸残基での突然変異を有する変異組み換えα−アミラーゼが含まれる。Ｓ２４１位（特にＳ２４１ＱまたはＳ２４１Ａ位）での突然変異は、Ｅ１８７位での突然変異に対して置換すると予想されるが、これら２つの突然変異は組み合わされてはならない。
【０１０２】
一部の実施形態では、本変異α−アミラーゼは、突然変異Ｒ３７５Ｙおよび任意選択的にＳ３６０Ａと、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｔ１８０Ｈ、Ｔ１８０Ｄ、Ｅ１８７ＰおよびＩ２０３Ｙからなる群に対応する１つまたは複数のアミノ酸残基での少なくとも１つの突然変異および任意選択的に少なくとも２つの突然変異、複数の突然変異または全突然変異を含む。特定の実施形態では、本変異α−アミラーゼは、突然変異Ｒ３７５ＹおよびＳ３６０Ａの両方を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、本変異α−アミラーゼは、Ｇ４７６、Ｇ４７７、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９および／またはＤ４６０に対応するアミノ酸残基での１つ以上の以前に記載された突然変異をさらに含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、本変異体は、親α−アミラーゼまたは突然変異の非存在によってのみ変異α−アミラーゼと異なる参照α−アミラーゼと比較して増加した低ｐＨ安定性および／またはデンプン液化活性を有する。
【０１０５】
一部の実施形態では、親α−アミラーゼの組み換え変異体は、Ｔ３８、Ｎ１２６、Ｆ１５３、Ｅ１８７、Ｉ２０３、Ｇ４７６およびＧ４７７位に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つ、複数または全部でさえのアミノ酸残基での突然変異を含む。上述のように、Ｓ２４１位（特にＳ２４１ＱまたはＳ２４１Ａ位）での突然変異は、Ｅ１８７位での突然変異に対して置換すると予想されるが、これら２つの突然変異は組み合わされてはならない。特定の実施形態では、本変異α−アミラーゼは、突然変異Ｔ３８Ｎ、Ｎ１２６Ｙ、Ｆ１５３Ｗ、Ｅ１８７Ｐ、Ｉ２０３Ｙ、Ｇ４７６ＫおよびＧ４７７Ｅの少なくとも１つ、複数または全部さえを含む。一部の実施形態では、本変異体は、Ｔ１２９での突然変異をさらに含む。特定の実施形態では、本突然変異は、Ｔ１２９Ｉである。
【０１０６】
一部の実施形態では、本変異α−アミラーゼは、Ｇ４７６、Ｇ４７７、Ｅ１３２、Ｑ１６７、Ａ２７７、Ｒ４５８、Ｔ４５９および／またはＤ４６０に対応するアミノ酸残基での１つ以上の以前に記載された突然変異をさらに含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、本変異体は、Ｎ８８、Ｎ１３４および／またはＬ１７１位に対応する１つ、２つまたは全アミノ酸残基での突然変異を欠如している。
【０１０８】
一部の実施形態では、本変異体は、親α−アミラーゼまたは突然変異の非存在によってのみ変異α−アミラーゼと異なる参照α−アミラーゼと比較して増加した洗剤安定性および／または洗浄性能を有する。
【０１０９】
一部の実施形態では、上述の変異α−アミラーゼのいずれかは、ナンバリングのために配列番号１を使用して、Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０およびＧ１８１に対応するカルシウム結合ループに隣接するＸ１Ｇ／Ｓ１Ｘ２Ｇ２モチーフ内に１つの欠失をさらに含む。一部の実施形態では、本変異α−アミラーゼは、Ｒ１７８およびＧ１７９またはＴ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基の隣接するペアワイズ欠失を含む。Ｒ１７８およびＧ１７９に対応するアミノ酸残基内の欠失は、「ΔＲＧ」と呼ばれるが、他方では、Ｔ１８０およびＧ１８１に対応するアミノ酸残基内の欠失は、「ΔＴＧ」と呼ぶことができる。この命名は、親分子内に最初に存在するアミノ酸残基に依存して自然に変化するであろう。
【０１１０】
突然変異の典型的な組み合わせを（ナンバリングのために配列番号１を使用して）、以下に示す。
Ｎ１２６Ｙ＋Ｆ１５３Ｗ＋Ｔ１８０Ｈ＋Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｒ３７５Ｙ
Ｎ１２６Ｙ＋Ｆ１５３Ｗ＋Ｔ１８０Ｈ＋Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｓ３６０Ａ＋Ｒ３７５Ｙ
Ｔ３８Ｎ＋Ｎ１２６Ｙ＋Ｆ１５３Ｗ＋Ｔ１８０Ｄ＋Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｅ
Ｔ３８Ｎ＋Ｎ１２６Ｙ＋Ｔ１２９Ｉ＋Ｆ１５３Ｗ＋Ｔ１８０Ｄ＋Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ＋Ｇ４７７Ｅ
【０１１１】
上記の突然変異の組み合わせの全部は、Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０および／またはＧ１８１に対応する位置での上記の欠失と結び付けて使用することが企図されている。そのような欠失は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの場合のように天然型であり得る。
【０１１２】
多数の細菌（および他の）α−アミラーゼは、同一の折り畳みを共有し、多くの場合、有意なアミノ酸配列同一性および場合により同一の突然変異からの利点を共有することが知られており、このため、突然変異は、他の親アミラーゼに転移可能であると予想される。アミノ酸配列によって同定される他のα−アミラーゼ内の対応するアミノ酸位置は、デフォルトパラメーターを用いてＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用して、ＣｓｐＡｍｙ２（配列番号１）を使用してアラインメントする。上記の突然変異が性能利点を生成する可能性が高いα−アミラーゼには、類似の折り畳みを有し、および／または周知のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のアミラーゼ（例えば、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ）（すなわち、ＢＬＡおよびＬＡＴ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（すなわち、ＢＳＧ）およびＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）（すなわち、Ｐ００６９２、ＢＡＣＡＭおよびＢＡＡ））、糖質関連酵素データベース（ＣＡＺｙ）ファミリー１３アミラーゼ、または以下では記述用語「Ｔｅｒｍａｍｙｌ様」によって呼ぶ任意のアミラーゼのいずれかとの６０％以上のアミノ酸配列同一性を有するα−アミラーゼが含まれる。典型的なα−アミラーゼには、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＳＧ−１、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）７０７、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＤＳＭ１２３６８（すなわち、Ａ７−７）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９（すなわち、ＡＡ５６０）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＳＰ７２２、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＤＳＭ９０１４）およびＫＳＭＡＰ１３７８由来のα−アミラーゼが含まれるがそれらに限定されない。
【０１１３】
読者は、α−アミラーゼが、上記に列挙した突然変異を自然に有する場合（すなわち、野生型α−アミラーゼが、既に突然変異であると同定された残基を含む場合）、特定の突然変異がそのα−アミラーゼに当てはまらないことを理解するであろう。しかし、他の記載された突然変異は、その位置での天然型残基と組み合せて機能することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、本α−アミラーゼ変異体は、突然変異の指示された組み合わせおよび配列番号１との規定の程度のアミノ酸配列相同性／同一性、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％さえのアミノ酸配列相同性／同一性を有する。
【０１１５】
一部の実施形態では、本α−アミラーゼ変異体は、突然変異の指示された組み合わせを有し、配列番号１との規定の程度のアミノ酸配列相同性／同一性、例えば、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％さえのアミノ酸配列相同性／同一性を有する親アミラーゼに由来する。
【０１１６】
さらに、本アミラーゼは、任意の数の保存的アミノ酸置換を含むことができる。典型的な保存的アミノ酸置換を表１に列挙した。
【０１１７】
【表１】
2019500058.tif 000005
【０１１８】
読者は、上述の保存的突然変異の一部を遺伝子操作によって生成することができ、他の保存的突然変異が、遺伝的または他の手段によって合成アミノ酸をポリペプチド内に導入することによって生成されることを理解するであろう。
【０１１９】
本アミラーゼは、その場合にはシグナル配列を含む「前駆体」、「未成熟」もしくは「全長」、またはその場合にはシグナル配列を欠如している「成熟」である可能性がある。一般に、ポリペプチドの成熟形態が最も有用である。他に特に規定されていない限り、本明細書で使用するアミノ酸残基のナンバリングは、各アミラーゼポリペプチドの成熟形態を指す。本アミラーゼポリペプチドは、結果として生じたポリペプチドがアミラーゼ活性を保持する限り、Ｎ末端またはＣ末端を除去するために先端が切断されてもよい。
【０１２０】
本アミラーゼは、それが第１アミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分および第２アミラーゼポリペプチドの少なくとも一部分を含むという点で「キメラ」または「ハイブリッド」ポリペプチドであり得る（そのようなキメラアミラーゼは、近年、ドメイン−スワップアミラーゼとして「再発見」されている）。本アミラーゼは、異種シグナル配列、トラッキングまたは精製を可能にするエピトープなどをさらに含んでいてもよい。典型的な異種シグナル配列は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ（ＬＡＴ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡｍｙＥまたはＡｐｒＥ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属ＣｅｌＡ由来である。
【０１２１】
２．５．変異アミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド
別の態様では、変異アミラーゼポリペプチドをコードする核酸が提供される。この核酸は、特定のアミラーゼポリペプチド、または特定のアミラーゼとの規定の程度のアミノ酸配列同一性を有するアミラーゼをコードする可能性がある。
【０１２２】
１つの例では、核酸は、配列番号１（シグナル配列をコードする核酸の部分を除く）との少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％さえの相同性／同一性を有するアミラーゼをコードする。遺伝子コードの縮重に起因して、複数の核酸が同一ポリペプチドをコードする可能性があることは理解されるであろう。
【０１２３】
別の例では、核酸は、配列番号１（シグナル配列をコードする核酸の部分を除く）との少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％さえの相同性／同一性を有するアミラーゼをコードする（またはコードする核酸に相補的である）核酸にとってストリンジェントまたは極めてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１２４】
一部の実施形態では、核酸は、配列番号７の核酸にとって、またはこの核酸に相補的な核酸にとってストリンジェントまたは極めてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１２５】
核酸は、シグナル配列を含む「全長」（「ｆｌ」または「ＦＬ」）アミラーゼ、シグナル配列を欠如しているアミラーゼの成熟形のみ、または成熟形のＮ末端またはＣ末端を欠如しているアミラーゼの切断型をコードする可能性がある。
【０１２６】
α−アミラーゼをコードする核酸は、宿主細胞中でα−アミラーゼを発現するために好適なベクター内の様々なプロモーターおよびレギュレーターと機能的に連結していてよい。典型的なプロモーターは、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ（ＬＡＴ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡｍｙＥまたはＡｐｒＥ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属ＣｅｌＡ由来である。そのような核酸は、例えばキメラポリペプチドをコードするために他のコーディング配列と連結していてもよい。
【０１２７】
３．変異アミラーゼの生成
本変異アミラーゼは、宿主細胞中において、例えば当技術分野で周知の方法を使用して、分泌または細胞内発現によって生成することができる。試料中のアミラーゼ活性を監視するために、例えば、培養培地中のグルコースなどの還元糖を直接測定するアッセイによるなど、好適なアッセイを使用できる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キットＮｏ．１５−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）またはＴｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒなどの機器を使用して決定できる。α−アミラーゼ活性は、例えば、下記に記載するＰＡＨＢＡＨまたはＡＢＴＳアッセイなどの任意の公知の方法によって測定することもできる。
【０１２８】
発酵、分離および濃縮技術は当技術分野において周知であり、濃縮した変異α−アミラーゼポリペプチド含有溶液を調製するために従来型の方法を使用できる。
【０１２９】
発酵後に発酵ブロスが得られ、アミラーゼ溶液を得るために、微生物細胞および残留生発酵材料を含む様々な懸濁固体が従来型分離技術によって除去される。濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心分離後に行われる限外濾過、抽出またはクロマトグラフィーなどが一般に使用される。
【０１３０】
回収率を最適化するために、変異α−アミラーゼポリペプチド含有溶液を濃縮することが望ましい。未濃縮溶液の使用は、典型的には、濃縮または精製酵素沈殿物を収集するための増加した培養時間を必要とする。
【０１３１】
酵素含有溶液は、所望の酵素レベルが得られるまで、従来型の濃縮技術を使用して濃縮される。酵素含有溶液の濃縮は、本明細書において考察した技術のいずれかによって達成することができる。濃縮および精製の典型的な方法には、回転真空濾過および／または限外濾過が含まれるがそれらに限定されない。
【０１３２】
酵素溶液は、濃縮変異α−アミラーゼポリペプチド含有溶液の酵素活性が所望のレベルになるまで、濃縮酵素溶液に濃縮させる。
【０１３３】
濃縮は、例えば、金属ハロゲン化物沈殿剤などの沈殿剤を使用して実施され得る。金属ハロゲン化物沈殿剤には、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物およびこれらの金属ハロゲン化物の２種以上のブレンドが含まれるがそれらに限定されない。典型的な金属ハロゲン化物には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウムおよびこれらの金属ハロゲン化物の２種以上のブレンドが含まれる。金属ハロゲン化物沈殿剤である塩化ナトリウムは、保存料としても使用できる。
【０１３４】
金属ハロゲン化物沈殿剤は、アミラーゼを沈殿させるための有効量で使用される。酵素の沈殿を誘発するために有効な最小有効量および最適有効量の金属ハロゲン化物の選択ならびにインキュベーション時間、ｐＨ、温度および酵素の濃度を含む最高回収のための沈殿条件の選択は、ルーチンの試験を実施した後、当業者に容易に明白になるであろう。
【０１３５】
一般に、少なくとも約５重量／体積％（％ｗ／ｖ）〜２５重量／体積％、通常、少なくとも８重量／体積％の金属ハロゲン化物が濃縮酵素溶液に添加される。一般に、約２５重量／体積％以下、通常、約２０重量／体積％以下の金属ハロゲン化物が濃縮酵素溶液に添加される。金属ハロゲン化物沈殿剤の最適濃度は、特に、特定の変異α−アミラーゼポリペプチドの性質および濃縮酵素溶液中の特定の変異α−アミラーゼポリペプチドの濃度に依存するであろう。
【０１３６】
酵素を沈殿させるための別の代替法は、有機化合物を使用することである。典型的な有機化合物沈殿剤には、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルおよびこれらの有機化合物の２種以上のブレンドが含まれる。有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン化物沈殿剤の添加前、それと同時またはそれに引き続いて実施することができ、両方の沈殿剤である有機化合物および金属ハロゲン化物の添加は、連続的または同時に実施することができる。
【０１３７】
一般に、有機沈殿剤は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、例えばナトリウム塩またはカリウム塩、および４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖状または分枝状アルキルエステル（ここで、アルキル基は１〜１２個の炭素原子を含有する）、およびこれらの有機化合物の２種以上のブレンドからなる群から選択される。有機化合物沈殿剤は、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖状または分枝状アルキルエステル（ここで、アルキル基は１〜１０個の炭素原子を含有する）およびこれらの有機化合物の２種以上のブレンドであり得る。典型的な有機化合物は、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖状アルキルエステル（ここで、アルキル基は１〜６個の炭素原子を含有する）およびこれらの有機化合物の２種以上のブレンドである。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステルおよびこれらの有機化合物の２種以上のブレンドも使用できる。追加の有機化合物には、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルパラベンと呼ばれる）、４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルパラベンと呼ばれる）も含まれるがそれらに限定されず、これらは、いずれもアミラーゼ防腐剤でもある。詳細な説明については、例えば、米国特許第５，２８１，５２６号明細書を参照されたい。
【０１３８】
有機化合物沈殿剤の添加は、ｐＨ、温度、変異アミラーゼ濃度、沈殿剤濃度およびインキュベーション時間に関する沈殿条件の高い柔軟性という利点を提供する。
【０１３９】
有機化合物沈殿剤は、金属ハロゲン化物沈殿剤による酵素の沈殿を改良するための有効量で使用される。有機化合物沈殿剤の最小有効量および最適有効量の選択ならびにインキュベーション時間、ｐＨ、温度および酵素の濃度を含む最高回収のための沈殿条件の選択は、ルーチンの試験を実施した後、本開示に照らして当業者に容易に明白になるであろう。
【０１４０】
一般に、少なくとも約０．０１重量／体積％、通常、少なくとも０．０２重量／体積％の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素溶液に添加される。一般に、約０．３重量／体積％以下、通常、約０．２重量／体積％以下の有機化合物沈殿剤が濃縮酵素溶液に添加される。
【０１４１】
金属ハロゲン化物沈殿剤および有機化合物沈殿剤を含有する濃縮ポリペプチド溶液は、必然的に、濃縮または精製される酵素に依存するｐＨに調整することができる。一般に、ｐＨはアミラーゼの等電点に近いレベルで調整される。ｐＨは、等電点（ｐＩ）より約２．５ｐＨ単位だけ下から、等電点の約２．５ｐＨ単位だけ上までの範囲内のｐＨで調整できる。
【０１４２】
濃縮または精製酵素沈殿物を得るために必要なインキュベーション時間は、特定酵素の性質、酵素の濃縮および特定沈殿剤およびその濃度に依存する。一般に、酵素を沈殿させるための有効時間は、約１〜約３０時間であり、通常、この時間は約２５時間を超えない。有機化合物沈殿剤の存在下において、インキュベーション時間は、約１０時間未満、およびほとんどの場合に約６時間にさえ短縮することができる。
【０１４３】
一般に、インキュベーション中の温度は、約４℃〜約５０℃である。通常、本方法は、約１０℃〜約４５℃（例えば、約２０℃〜約４０℃）の温度で実施される。沈殿を誘導するための最適温度は、溶液条件および使用される酵素または沈殿剤に従って変動する。
【０１４４】
濃縮または精製酵素沈殿物の総回収率および本プロセスが実施される効率は、酵素、添加された金属ハロゲン化物および添加された有機化合物を含む溶液をかき混ぜることによって改良される。かき混ぜ工程は、金属ハロゲン化物および有機化合物の添加中およびその後のインキュベーション期間中の両方で実施される。好適なかき混ぜ方法には、機械的撹拌もしくは振とう、強力なエアレーションまたは任意の類似の技術が含まれる。
【０１４５】
インキュベーション期間後、濃縮または精製酵素は、次に分離性顔料および他の不純物から分離され、従来型分離技術、例えば濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空濾過、限外濾過、圧縮濾過、膜貫通精密濾過、クロスフロー精密濾過などによって収集される。酵素沈殿物の別の濃縮または精製は、沈殿物を水で洗浄することによって得ることができる。例えば、濃縮または精製酵素沈殿物は、金属ハロゲン化物沈殿剤を含有する水または金属ハロゲン化物および有機化合物沈殿剤を含有する水で洗浄される。
【０１４６】
発酵中、変異アミラーゼポリペプチドは、培養ブロス中に蓄積する。所望の変異α−アミラーゼを単離、濃縮または精製するため、培養ブロスは、細胞を除去するために遠心または濾過され、生じた無細胞液体が酵素の濃縮または精製のために使用される。１つの実施形態では、無細胞ブロスは、約７０％の飽和度の硫酸アンモニウムを使用して塩析される。７０％の飽和−沈殿分画が次にバッファー中に溶解され、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラムなどのカラムに適用され、酵素活性分画を回収するために溶出される。さらなる濃縮または精製のために、例えばイオン交換クロマトグラフィーなどの従来型手法を使用することができる。
【０１４７】
濃縮または精製酵素は、洗濯および洗浄用途のために有用である。例えば、それらは、洗濯用洗剤および染み取りに使用できる。それらは、液体（溶液、スラリー）または固体（顆粒、粉末）のいずれかである最終製品に製造することができる。
【０１４８】
濃縮または精製のより特定の例は、Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）“Ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．１９５  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｗ  ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７−４８４に記載されているが、本明細書に手短に要約する。４リットルのストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４培養上清から入手した酵素を、８０％の飽和度にある（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて処理した。沈殿物を１０，０００ｇでの遠心分離（２０分間および４℃）によって回収し、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中に再溶解させた。可溶化沈殿物を次に同一バッファーに対して透析した。透析した試料を、次に、事前に２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＣａＣｌ２を用いて平衡化させたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラムに適用し、同一バッファーを用いて７ｍＬ／時の線流速で溶出させた。カラムからの分画を収集し、酵素アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定した活性について評価した。タンパク質は、下記のようにさらに精製した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ；製品番号Ｎｏ．１９８１２）は、５ｍＭのＣａＣｌ２および１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）を用いて平衡化させた。この酵素は、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＬバッファー（ｐＨ７．０）中の１．５〜０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の線形勾配を用いて溶出させた。活性分画を収集し、酵素を、８０％の飽和度で（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて沈殿させた。沈殿物を上述したように回収し、再溶解させ、透析した。次に、透析した試料は、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）を用いて事前に平衡化させたＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ；製品番号Ｎｏ．１７−５１６７−０１）に６０ｍＬ／時の流速で適用した。活性分画を収集し、１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液に加えた。活性酵素分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された均質な酵素を産生させるために、上記のＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５カラム上で再びクロマトグラフィーにかけた。本方法の一般的考察およびその変形については、例えば、Ｓｕｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７−４８４を参照されたい。
【０１４９】
生産規模を回復するために、変異α−アミラーゼポリペプチドは、ポリマーを用いた綿状沈殿を介して細胞を除去することによって一般に上記に記載したように濃縮または部分的に精製することができる。代替的に、酵素は、精密濾過と、その後に利用可能な膜および装置を使用する限外濾過による濃縮とによって濃縮または精製することができる。しかし、一部の用途では、酵素は濃縮または精製する必要がなく、全ブロス培養を溶解させ、それ以上の処理を行わずに使用することができる。酵素は、次に、例えば顆粒に加工処理することができる。
【０１５０】
４．変異アミラーゼの組成物および使用
変異アミラーゼは、様々な工業用途のために有用である。例えば、変異アミラーゼは、デンプン変換プロセスにおいて、特に液化を受けているデンプンの糖化プロセスにおいて有用である。所望の最終生成物は、デンプン基質の酵素的変換によって生成できる任意の製品であり得る。例えば、所望の生成物は、例えばＨＦＣＳの調製などの他のプロセスにおいて使用でき、または例えばアスコルビン酸中間物（例えば、グルコン酸塩；２−ケト−Ｌ−グロン酸；５−ケト−グルコン酸；および２，５−ジケトグルコン酸塩）；１，３−プロパンジオール；芳香族アミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）；有機酸（例えば、乳酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、イソクエン酸塩およびオキサロ酢酸塩）；アミノ酸（例えば、セリンおよびグリシン）；抗生物質；抗菌剤；酵素；ビタミン剤；およびホルモン剤などの多数の有用な製品に変換させることができるグルコースおよびマルトースが豊富なシロップであり得る。
【０１５１】
デンプン変換プロセスは、燃料用または飲料用のアルコール（飲用アルコール）のためのアルコールを生成するために設計された発酵プロセスの前またはそれと同時に行われてよい。当業者であれば、これらの最終生成物の製造において使用することができる様々な発酵条件を認識している。変異アミラーゼは、食品調製物の組成物および方法でも有用である。以下では、変異アミラーゼのこれらの様々な使用についてより詳細に説明する。
【０１５２】
４．１．デンプン基質の調製
当業者であれば、本明細書に開示したプロセスで使用するためのデンプン基質を調製するために使用できる利用可能な方法を明確に認識している。例えば、有用なデンプン基質は、塊茎、根、茎、豆果、穀草類または全穀物から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシ穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、ミロ、サゴ、キビ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、エンドウマメ、マメ、バナナまたはジャガイモから得ることができる。トウモロコシは、約６０〜６８％のデンプンを含有し、大麦は、約５５〜６５％のデンプンを含有し、キビは、約７５〜８０％のデンプンを含有し、小麦は、約６０〜６５％のデンプンを含有し、および精白米は、７０〜７２％のデンプンを含有する。特に企図されるデンプン基質は、コーンスターチおよび小麦デンプンである。穀物からのデンプンは、粉砕されているかまたは全粒であり得、例えば核種、フスマおよび／または穂軸などのトウモロコシ固体が含まれる。デンプンは、デンプン精製プロセスからの高度に生成された生デンプンまたは供給原料でもあり得る。様々なデンプンも市販で入手できる。例えば、コーンスターチは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａおよび片山化学工業株式会社（日本）から入手でき、小麦デンプンは、Ｓｉｇｍａから入手でき、サツマイモデンプンは、和光純薬化学工業株式会社（日本）から入手でき、およびジャガイモデンプンは、Ｎａｋａａｒｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．（日本）から入手できる。
【０１５３】
デンプン基質は、非デンプン分画、例えば胚残渣および繊維を含有する粉砕全穀物からの粗デンプンであり得る。製粉工程は、湿式製粉または乾式製粉または粉砕のいずれかを含むことができる。湿式製粉では、全穀物は、穀粒をその構成成分、例えばデンプン、タンパク質、胚、油、核繊維に分離するために水または希酸中に浸漬される。湿式製粉は、胚と粉（すなわち、デンプン顆粒およびタンパク質）を効率的に分離し、シロップを製造するために特に好適である。コーン油の約９０％は、胚内に含まれる。乾式製粉または粉砕では、全核は、微粉末に粉砕され、穀物は、その構成成分に分画せずに加工処理されることが多い。一部の場合、核由来の油および／または繊維が回収される。したがって、乾式粉砕穀物は、デンプンに加えて、有意な量の非デンプン炭水化物化合物を含むであろう。デンプン基質の乾式粉砕は、エタノールおよび他の生化学物質の製造のために使用できる。加工処理すべきデンプンは、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９．５％純粋の高度に精製されたデンプン品質であり得る。
【０１５４】
４．２．デンプンのゼラチン化および液化
本明細書で使用する用語「液化」または「液化する」は、それによってデンプンが低粘性およびより短鎖のデキストリンに変換されるプロセスを意味する。一般に、このプロセスは、α−アミラーゼの添加と同時のまたはそれが後に続くデンプンのゼラチン化を含むが、追加の液化誘導酵素を場合により添加することができる。一部の実施形態では、上述したように調製したデンプン基質は、水を用いてスラリー化される。デンプンスラリーは、約１０〜５５％、約２０〜４５％、約３０〜４５％、約３０〜４０％または約３０〜３５％の重量％の乾燥固体としてデンプンを含有することができる。α−アミラーゼは、例えば、計量型ポンプを用いてスラリーに添加され得る。この用途のために典型的に使用されるα−アミラーゼは、熱安定性の細菌α−アミラーゼ、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼである。α−アミラーゼは、通常、例えば約１，５００単位／ｋｇ（デンプンの乾燥物質）で供給される。α−アミラーゼの安定性および活性を最適化するために、スラリーのｐＨは、典型的には約ｐＨ４．５〜６．５に調整され、約１ｍＭのカルシウム（約４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）も、使用するアミラーゼの特性に依存して添加することができる。液化後にスラリー内に残留している細菌α−アミラーゼは、その後の反応工程においてｐＨを低下させる工程、または酵素がカルシウム依存性である場合、スラリーからカルシウムを除去する工程を含む多数の方法によって非活性化することができる。
【０１５５】
デンプン＋α−アミラーゼのスラリーは、１０５℃へスチーム加熱されるジェットクッカーを通して連続的にポンプ送達することができる。ゼラチン化は、これらの条件下で迅速に発生し、有意な剪断力と組み合わされた酵素活性は、デンプン基質の加水分解を開始する。ジェットクッカー内の滞留時間は短い。部分的にゼラチン化されたデンプンを１０５〜１１０℃に維持された一連の保持管内に通過させ、５〜８分間保持するとゼラチン化プロセスを完了することができる（「一次液化」）。必要とされるＤＥの加水分解は、約１〜２時間にわたり８５〜９５℃以上の高温において保持タンク内で完了する（「二次液化」）。これらのタンクは、逆混和を防止するためにバッフルを含有していてよい。本明細書で使用する用語「二次液化の分数」は、二次液化の開始からデキストロース当量（ＤＥ）が測定される時間まで経過した時間を指す。スラリーは、次に室温に冷却される。この冷却工程は、３０分間〜１８０分間、例えば９０分間〜１２０分間であり得る。液化デンプンは、典型的には、約１０〜５０％；約１０〜４５％；約１５〜４０％；約２０〜４０％；約２５〜４０％；または約２５〜３５％の乾燥固体含量（重量／重量）を有するスラリーの形態である。
【０１５６】
変異アミラーゼを用いた液化は、有利には、ｐＨを約ｐＨ５．５〜６．５に調整するための要件を排除する低ｐＨで実施することができる。変異アミラーゼは、２〜７のｐＨ範囲、例えばｐＨ３．０〜７．５、ｐＨ４．０〜６．０またはｐＨ４．５〜５．８での液化のために使用できる。変異アミラーゼは、約８５℃〜９５℃、例えば８５℃、９０℃または９５℃の温度範囲で液化活性を維持することができる。例えば、液化は、２５％のＤＳコーンスターチ溶液中の８００μｇのアミラーゼを用いて、例えばｐＨ５．８および８５℃、またはｐＨ４．５および９５℃で１０分間にわたり実施することができる。液化活性は、当技術分野における公知の多数の粘度アッセイのいずれかを使用してアッセイすることができる。
【０１５７】
本アミラーゼ変異体を使用する特定の実施形態では、デンプンの液化は、例えば、高純度グルコースシロップ、ＨＦＣＳ、マルトデキストリンなどを生成するために９０〜１１５℃の温度範囲で実施される。
【０１５８】
４．３．糖化
液化デンプンは、任意選択的に別の酵素の存在下で変異アミラーゼを使用して、低ＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）糖が富裕なシロップに糖化することができる。糖化の生成物の正確な組成は、使用する酵素の組合せおよび加工処理される粒状デンプンのタイプに依存する。有利には、本明細書で提供する変異アミラーゼを使用して入手できるシロップは、糖化デンプン中の全オリゴ糖の３０％を超える、例えば４５％〜６５％または５５％〜６５％の重量％のＤＰ２を含有する可能性がある。糖化デンプン中の（ＤＰ１＋ＤＰ２）の重量％は、約７０％、例えば７５％〜８５％または８０％〜８５％を超える可能性がある。本アミラーゼは、シロップ生成物中でグルコースの相当に高い、例えば２０％を超えるＤＰ１の収率も生じさせる。
【０１５９】
液化は、一般に連続プロセスとして実施されるが、糖化は、バッチプロセスとして実施されることが多い。糖化は、典型的には約６０〜６５℃の温度および約４．０〜４．５のｐＨ、例えばｐＨ４．３で最も効果的であるため、液化デンプンを冷却してｐＨを調整することが必要になる。温度およびｐＨ範囲は、酵素の特性に依存して変動する可能性がある。糖化は、例えば、約４０℃、約５０℃または約５５℃〜約６０℃または約６５℃の温度で実施することができる。糖化は、通常、充填するかまたは空にするために数時間を要する可能性がある撹拌槽中で実施される。酵素は、典型的には、タンクに充填される場合の乾燥固体に対する固定比率において、または充填段階の開始時に１回量として添加される場合のいずれかで添加される。シロップを製造するための糖化反応は、典型的には約２４〜７２時間、例えば２４〜４８時間にわたり実施される。最高または所望のＤＥに達すると、反応は、例えば、５分間にわたり８５℃に加熱することによって停止される。その後のインキュベーションは、蓄積されたグルコースが、イソマルトースおよび／または酵素的復帰反応および／または熱力学的平衡のアプローチを用いた他の復帰生成物へ再重合するにつれて、より低いＤＥ、最終的には約９０ＤＥまでを生じさせるであろう。アミラーゼを使用する場合、糖化は、最適には約３０℃〜約７５℃、例えば４５℃〜７５℃または４７℃〜７４℃の温度範囲で実施される。糖化は、約ｐＨ３〜約ｐＨ７、例えばｐＨ３．０〜ｐＨ７．５、ｐＨ３．５〜ｐＨ５．５、ｐＨ３．５、ｐＨ３．８またはｐＨ４．５のｐＨ範囲にわたって実施することができる。
【０１６０】
α−アミラーゼは、組成物の形態でスラリーに添加され得る。α−アミラーゼは、約０．６〜１０ｐｐｍ（ｄｓ）、例えば２ｐｐｍ（ｄｓ）の量で粒状デンプン基質のスラリーに添加することができる。α−アミラーゼは、全ブロス、浄化、濃縮、部分精製または精製酵素として添加することができる。アミラーゼの比活性は、例えば、ＰＡＨＢＡＨアッセイを用いて測定して約３００Ｕ／ｍｇ（酵素）であり得る。α−アミラーゼは、全プロス生成物として添加することもできる。
【０１６１】
α−アミラーゼは、単離酵素溶液としてスラリーに添加され得る。例えば、α−アミラーゼは、アミラーゼを発現する宿主細胞によって生成された培養細胞材料の形態で添加することができる。α−アミラーゼは、この酵素が反応内に連続的に提供されるように、発酵またはＳＳＦプロセス中の反応培地中に宿主細胞によって分泌されてもよい。アミラーゼを生成および分泌する宿主細胞は、例えば、グルコアミラーゼなどの追加の酵素を発現することもできる。例えば、米国特許第５，４２２，２６７号明細書は、アルコール飲料の製造における酵母中のグルコアミラーゼの使用について開示している。例えば、宿主細胞、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）は、糖化中にα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ、例えばＨｇＧＡ、ＴｒＧＡまたはＴｒＧＡ変異体を共発現するように改変することができる。宿主細胞は、その内因性グルコアミラーゼおよび／または他の酵素、タンパク質もしくは他の物質を発現しないように遺伝子操作することができる。宿主細胞は、広範囲の様々な糖分解酵素を発現するように改変することができる。例えば、組み換え酵母宿主細胞は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、ペントース糖を利用する酵素、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼおよび／またはイソプルラナーゼをコードする核酸を含むことができる。例えば、国際公開第２０１１／１５３５１６Ａ２号パンフレットを参照されたい。
【０１６２】
４．４．異性化
アミラーゼを用いた処理により生成される可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースデンプン系シロップ（ＨＦＳＳ）、例えば高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）に変換され得る。この変換は、グルコースイソメラーゼ、特に固体担体上に固定されたグルコースイソメラーゼを使用して達成できる。ｐＨは、（イソメラーゼに依存して）約６．０〜約８．０、例えばｐＨ７．５に上昇され、Ｃａ２＋は、イオン交換によって除去される。好適なイソメラーゼには、ＳＷＥＥＴＺＹＭＥ（登録商標）、ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）；Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）ＩＭＧＩならびにＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９３、ＫＥＴＯＭＡＸ（登録商標）、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９３、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９３液およびＧＥＮＳＷＥＥＴ（登録商標）ＩＧＩが含まれる。異性化後、混合物は、典型的には約４０〜４５％のフルクトース、例えば４２％のフルクトースを含有する。
【０１６３】
４．５．発酵
可溶性デンプン加水分解物、特に高グルコースシロップは、デンプン加水分解物を発酵生物と、典型的には約３２℃、例えばアルコール産生酵母のために、３０℃〜３５℃の温度で接触させることによって発酵させることができる。発酵の温度およびｐＨは、発酵生物に依存するであろう。ＥＯＦ生成物には、代謝産物、例えばクエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸および他のカルボン酸、グルコノΔ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、リシンおよび他のアミノ酸、Ω３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオールならびに他の生体材料が含まれる。
【０１６４】
エタノール生産微生物としては、酵母、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および細菌、例えばアルコールデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられる。エタノール生産微生物は、キシロースをキシルロースに変換させるキシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼを発現することができる。例えば、高温に抵抗できるエタノール生産微生物の改良株は、当技術分野において公知であり、使用できる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ２７（７）：１０４９−５６を参照されたい。酵母の商業的供給源には、ＥＴＨＡＮＯＬ  ＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）；Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）；ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（登録商標）（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ）；ＦＥＲＭＩＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）；およびＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ）が含まれる。発酵によって例えばクエン酸および乳酸などの他の代謝産物を生産する微生物も当技術分野において公知である。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ，ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５（３）：２４４−６３；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）“Ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７（２）：１４５−５２を参照されたい。
【０１６５】
糖化および発酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実施され得る。発酵は、例えば、その後のエタノールの濃縮、生成および回収を含むことができる。発酵中、ブロスまたは「ビール」のエタノール含量は、約８〜１８体積／体積％、例えば１４〜１５体積／体積％に達する場合がある。ブロスは、エタノールの濃縮された、例えば９６％純粋の溶液を生成するために蒸留され得る。さらに、発酵によって生成したＣＯ２は、ＣＯ２スクラバーを用いて収集し、圧縮し、例えば、炭酸飲料またはドライアイスの製造などの他の使用のために市場に出すことができる。発酵プロセスからの固形廃棄物は、高タンパク質生成物、例えば家畜の飼料として使用できる。
【０１６６】
上述のように、ＳＳＦプロセスは、ＳＳＦを通してアミラーゼを連続的に発現して分泌する真菌細胞を用いて実施することができる。アミラーゼを発現する真菌細胞は、発酵微生物、例えばエタノール生産微生物でもあり得る。したがって、エタノールの製造は、外部から酵素を添加する必要がほとんどないように十分なアミラーゼを発現する真菌細胞を使用して実施することができる。真菌宿主細胞は、適切に改変された真菌株由来であり得る。アミラーゼに加えて、他の酵素を発現および分泌する真菌宿主細胞も使用できる。そのような細胞は、グルコアミラーゼおよび／またはプルラナーゼ、フィターゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、β−グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼまたは他の酵素を発現する場合がある。
【０１６７】
このプロセスの変形は、基質が発酵の進行につれて少しずつ添加される「フェドバッチ発酵」システムである。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制できる場合、および培地中で限定量の基質を有することが所望である場合に有用である。フェドバッチシステム内での実際の基質濃度は、例えばｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気ガスの部分圧などの測定可能な因子の変化よって推定される。バッチおよびフェドバッチ発酵は、当技術分野において一般的でありかつ周知である。
【０１６８】
連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、加工処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放型システムである。連続発酵は、一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵は、細胞増殖および／または生成物濃度の調節を許容する。例えば、炭素源または窒素源などの制限栄養因子は、一定比率に維持され、他の全てのパラメーターは調節することが許容される。増殖は定常状態で維持されるため、除去される培地に起因する細胞消失は、発酵中の細胞増殖率に対してバランスが取られなければならない。連続発酵プロセスを最適化して生成物形成速度を最大化するための方法は、工業微生物学の分野において周知である。
【０１６９】
４．６．変異アミラーゼを含む組成物
変異アミラーゼは、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属グルコアミラーゼまたはその変異体と組み合わせることができる。典型的なグルコアミラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）および優れた比活性および熱安定性を有するその変異体である。米国特許出願公開第２００６／００９４０８０号明細書、同第２００７／０００４０１８号明細書および同第２００７／００１５２６６号明細書（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）を参照されたい。ＴｒＧＡの好適な変異体には、グルコアミラーゼ活性および野生型ＴｒＧＡとの少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を備える変異体が含まれる。変異アミラーゼは、有利には、ＴｒＧＡによって触媒された糖化プロセスにおいて生成されるグルコースの収率を増加させる。
【０１７０】
代替的に、グルコアミラーゼは、植物（藻類を含む）、真菌または細菌に由来する別のグルコアミラーゼであり得る。例えば、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｇ１もしくはＧ２グルコアミラーゼまたはその変異体（例えば、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２；国際公開第９２／００３８１号パンフレット；同第００／０４１３６号パンフレット（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ））；およびＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（例えば、国際公開第８４／０２９２１号パンフレット（Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐ．）を参照されたい）であり得る。他の企図されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属グルコアミラーゼには、強化された熱安定性を備える変異体、例えばＧ１３７ＡおよびＧ１３９Ａ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５）；Ｄ２５７ＥおよびＤ２９３Ｅ／Ｑ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５−５８２）；Ｎ１８２（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０１：２７５−２８１）；Ａ２４６Ｃ（Ｆｉｅｒｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：８６９８−８７０４）；ならびにＡ４３５およびＳ４３６位にＰｒｏ残基を備える変異体（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１１９９−１２０４）が含まれる。他の企図されるグルコアミラーゼには、特に、Ｔ．エメルソニイ（Ｔ．Ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（例えば、国際公開第９９／２８４４８号パンフレット（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）、Ｔ．レイセタヌス（Ｔ．ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）（例えば、米国再発行特許第３２，１５３号明細書（ＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．））、Ｔ．デュポンティ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ）またはＴ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、米国特許第４，５８７，２１５号明細書）に由来するタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼが含まれる。企図された細菌グルコアミラーゼには、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、特にＣ．サーモアミロリチクム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（例えば、欧州特許第１３５，１３８号明細書）（ＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）およびＣ．サーモヒドロスルフリクム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｍ）（例えば、国際公開第８６／０１８３１号パンフレット（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））由来のグルコアミラーゼが含まれる。好適なグルコアミラーゼには、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来するグルコアミラーゼ、例えば国際公開第００／０４１３６号パンフレット（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ）に記載の配列番号２に示されたグルコアミラーゼが含まれる。また好適であるのは、市販のグルコアミラーゼ、例えばＡＭＧ  ２００Ｌ；ＡＭＧ  ３００Ｌ；ＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲおよびＡＭＧ（商標）Ｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）３００およびＯ��ＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）；ＡＭＩＧＡＳＥ（商標）およびＡＭＩＧＡＳＥ（商標）ＰＬＵＳ（ＤＳＭ）；Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９００（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ならびにＧ−ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９０  ＺＲ（低プロテアーゼ含量を備えるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ）である。さらに他の好適なグルコアミラーゼには、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）グルコアミラーゼ、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼ、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属グルコアミラーゼ、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属グルコアミラーゼ、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）グルコアミラーゼ、アテリア（Ａｔｈｅｌｉａ）属グルコアミラーゼ、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属グルコアミラーゼ（例えば、ＨｇＧＡ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属グルコアミラーゼ、アルトミセス（Ａｒｔｏｍｙｃｅｓ）属グルコアミラーゼ、グレエオフィルム（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属グルコアミラーゼ、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属グルコアミラーゼまたはステチェリナム（Ｓｔｅｃｃｈｅｒｉｎｕｍ）属グルコアミラーゼが含まれる。グルコアミラーゼは、典型的には、約０．１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇ（ｄｓ）、例えば約０．１６ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）、０．２３ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）または０．３３ＧＡＵ／ｇ（ｄｓ）の量で添加される。
【０１７１】
アミラーゼとともに使用できる他の好適な酵素には、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、異なるα−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素またはそれらの組み合わせが含まれる。例えば、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）などの脱分枝酵素は、当業者に周知の有効量で添加することができる。プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、例えばＰＲＯＭＯＺＹＭＥ（登録商標）も好適である。プルラナーゼは、典型的には１００Ｕ／ｋｇ（ｄｓ）で添加される。別の好適な酵素には、プロテアーゼ、例えば真菌プロテアーゼおよび細菌プロテアーゼが含まれる。真菌プロテアーゼには、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、Ｍ．ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ））；リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属；およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属から得られた真菌プロテアーゼが含まれる。
【０１７２】
β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２）は、アミロペクチンおよび関連グルコースポリマー内の１，４−α−グルコシド結合の加水分解を触媒し、それによりマルトースを放出するエキソ作用性麦芽生産アミラーゼである。β−アミラーゼは、様々な植物および微生物から単離されている。Ｆｏｇａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）ｉｎ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２−１１５を参照されたい。これらのβ−アミラーゼの最適温度は、４０℃〜６５℃の範囲内であり、および最適ｐＨは、約４．５〜約７．０の範囲内である。企図されたα−アミラーゼには、大麦ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＢＢＡ  １５００、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＤＢＡ、ＯＰＴＩＭＡＬＴ（商標）ＭＥ、ＯＰＴＩＭＡＬＴ（商標）ＢＢＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）；およびＮＯＶＯＺＹＭ（商標）ＷＢＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）由来のβ−アミラーゼが含まれるがそれらに限定されない。
【０１７３】
本アミラーゼを含む組成物は、バッファー、塩、保存料、水、共溶媒、界面活性剤などと一緒に、本明細書に列挙した追加の酵素の任意の１つ以上をさらに含んでいてよい水性または非水性製剤、顆粒、粉末、ゲル、スラリー、ペーストなどであり得る。そのような組成物は、スラリー、水浴、洗濯機、食品または飲料製品などの中に既に存在する内因性酵素または他の成分、例えば、内因性植物（藻類を含む）酵素、先行する加工処理工程からの残留酵素などと組み合わせて機能することができる。
【０１７４】
５．製パンおよび食品調製のための組成物および方法
本発明は、アミラーゼを含む食品、動物飼料および／または食品／飼料添加物を含むがそれらに限定されない「食品組成物」および変異アミラーゼを１つ以上の食品成分と混和する工程を含む、そのような食品組成物を調製するための方法またはそれらの使用にも関する。
【０１７５】
さらに、本発明は、食品組成物の調製におけるアミラーゼの使用であって、その食品組成物は、本発明のポリペプチドの添加に続いて焼成される、使用に関する。本明細書で使用する用語「製パン組成物」は、パン用粉、ドウ、製パン用添加物および／またはベークド製品を含むがそれらに限定されない焼成食品を提供するプロセスにおいて調製される組成物および／または添加物を意味する。食品組成物または添加物は、液体または固体であり得る。
【０１７６】
本明細書で使用する用語「粉」は、製粉または粉砕穀物を意味する。用語「粉」は、粉砕またはマッシュ化されている「サゴ」または塊茎生成物を意味する場合もある。一部の実施形態では、粉は、製粉またはマッシュ化された穀物または植物に加えて構成成分も含有する場合がある。追加の構成成分の例は、限定することは意図されていないが、膨張剤である。穀物には、小麦、オート麦、ライ麦および大麦が含まれる。塊茎生成物には、タピオカ粉、キャッサバ粉およびカスタード粉末が含まれる。用語「粉」には、粉砕トウモロコシ粉、トウモロコシ粗挽き粉、米糠、全粒小麦粉、ベーキングパウダー入りの粉、タピオカ粉、キャッサバ粉、米粉、濃縮フラワーおよびカスタード粉末も含まれる。
【０１７７】
製パンおよび食品製造のための粉の商業的および家庭用使用のために、粉内の適切なレベルのα−アミラーゼ活性を維持することが重要である。高過ぎる活性のレベルは、粘着性および／または餅状の製品を生じさせる可能性があり、このために市場向きではない。不十分なα−アミラーゼ活性を備える粉は、適正な酵母機能のために十分な糖を含有していない可能性があり、結果として乾燥した砕けやすいパンまたはベークド製品を生じさせる。したがって、アミラーゼは、単独でまたは別のα−アミラーゼと組み合わせて、粉中の内因性α−アミラーゼ活性のレベルを強化するために粉に添加することができる。
【０１７８】
アミラーゼは、ベークド製品の老化、すなわちクラムの固化を防止または遅延させるために、単独でまたは他のアミラーゼと組み合わせてさらに添加することができる。抗老化性アミラーゼの量は、典型的には、粉１ｋｇ当たり酵素タンパク質０．０１〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ／ｋｇ（ｄｓ）の範囲内であろう。１種のアミラーゼと組み合わせて使用できる追加の抗老化性アミラーゼには、エンドアミラーゼ、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の細菌エンドアミラーゼが含まれる。追加のアミラーゼは、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の別の麦芽生産α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）であり得る。ＮＯＶＡＭＹＬ（登録商標）は、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｓ）株ＮＣＩＢ  １１８３７由来の典型的な麦芽生産α−アミラーゼであり、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｔａｒｃｈ  ５０：３９−４５に記載されている。抗老化性エンドアミラーゼの他の例には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、例えばＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の細菌α−アミラーゼが含まれる。抗老化性アミラーゼは、例えば大豆などの植物起源または例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの微生物起源由来のβ−アミラーゼなどのエキソアミラーゼであり得る。
【０１７９】
アミラーゼを含む製パン組成物は、ホスホリパーゼまたはホスホリパーゼ活性を備える酵素をさらに含む可能性がある。ホスホリパーゼ活性を備える酵素は、リパーゼ単位（ＬＵ）で測定できる活性を有する。ホスホリパーゼは、リン脂質から脂肪酸を除去してリソリン脂質を形成するためのＡ１またはＡ２活性を有する可能性がある。ホスホリパーゼは、リパーゼ活性、すなわちトリグリセリド基質への活性を有している場合があり、または有していない場合がある。ホスホリパーゼは、典型的には３０〜９０℃、例えば３０〜７０℃の範囲内にある最適温度を有する。添加されたホスホリパーゼは、動物起源、例えば膵臓由来、例えばウシまたはブタの膵臓由来、ヘビ毒またはハチ毒由来であり得る。代替的に、ホスホリパーゼは、微生物起源、例えば糸状菌、酵母または細菌由来であり得る。
【０１８０】
ホスホリパーゼは、製パン後の初期の期間中、特に最初の２４時間中のパンの柔らかさを改良する量で添加される。ホスホリパーゼの量は、典型的には、粉１ｋｇ当たり酵素タンパク質０．０１〜１０ｍｇ、例えば０．１〜５ｍｇ／ｋｇ（ｄｓ）の範囲内であろう。すなわち、ホスホリパーゼ活性は、一般に２０〜１，０００ＬＵ／ｋｇ（粉）の範囲内であり、ここで、リパーゼ単位は、乳化剤としてのアラビアガムおよび基質としてのトリブチリンを用いて、３０℃、ｐＨ７．０で１分間当たり１μｍｏｌの酪酸を遊離させるために必要とされる酵素の量であると規定されている。
【０１８１】
ドウの組成物は、一般に小麦ミールもしくは小麦粉および／または他のタイプのミール、粉もしくはデンプン、例えばトウモロコシ粉、コーンスターチ、ライ麦ミール、ライ麦粉、オート麦粉、オートミール、大豆粉、ソルガムミール、ソルガム粉、ジャガイモミール、ジャガイモ粉もしくはジャガイモデンプンを含む。ドウは、新鮮、凍結もしくは半焼成（ｐａｒ−ｂａｋｅｄ）されていてよい。ドウは、発酵させて膨らませたドウまたは発酵を受けるドウであり得る。ドウは、様々な方法で、例えば化学膨張剤、例えば重炭酸ナトリウムを添加すること、またはパン種、すなわち発酵中のドウを添加させることによって発酵させることができる。ドウは、好適な酵母培養、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母）の培養、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の市販で入手できる株を添加することによって発酵させることもできる。
【０１８２】
ドウは、他の従来型のドウ成分、例えばタンパク質、例えば粉ミルク、グルテン、および大豆；卵（例えば、全卵、卵黄または卵白）；酸化剤、例えばアスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカルボンアミド（ＡＤＡ）または過硫酸アンモニウム；アミノ酸、例えばＬ−システイン；砂糖：または塩、例えば塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウムもしくは硫酸カルシウムを含むこともできる。ドウは、脂肪、例えばトリグリセリド、例えば粒状脂肪またはショートニングをさらに含むことができる。ドウは、乳化剤、例えばモノグリセリドまたはジグリセリド、モノグリセリドまたはジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレートまたはリソレシチンをさらに含むことができる。特に、ドウは、乳化剤を添加せずに製造することができる。
【０１８３】
ドウ生成物は、例えば、蒸しパンおよび餅などの揚げた、たっぷりの油で揚げた、ローストした、焼いた、蒸した、および茹でたドウを含む、任意の加工処理ドウ製品であり得る。１つの実施形態では、食品は、ベーカリー製品である。典型的なベーカリー（ベークド）製品には、パン  −  例えば、ローフパン、ロールパン、バンズ、ベーグル、ピザベースなど、ペストリー、プレッツェル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカーなどが含まれる。
【０１８４】
任意選択的に、追加の酵素は、抗老化性アミラーゼおよびホスホリパーゼと一緒に使用することができる。追加の酵素は、第２アミラーゼ、例えばアミログルコシダーゼ、β−アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼであり得るか、または追加の酵素は、ペプチダーゼ、特にエキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば国際公開第９５／００６３６号パンフレットに開示されたタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、分枝状酵素（１，４−α−グルカン分枝状酵素）、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（デキストリングリコシルトランスフェラーゼ）またはオキシドレダクターゼ、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アマドリアーゼ、メタロプロテイナーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リポオキシゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼまたは炭水化物オキシダーゼであり得る。追加の酵素は、哺乳動物および植物を含む任意の起源、および特に微生物（細菌、酵母または真菌）起源の酵素であり得、当技術分野において従来より使用されている技術によって入手され得る。
【０１８５】
キシラナーゼは、典型的には微生物起源、例えば細菌または真菌由来、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の菌株である。キシラナーゼには、例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）から生成された市販で入手できるキシラナーゼ製剤である、ＰＥＮＴＯＰＡＮ（登録商標）およびＮＯＶＯＺＹＭ  ３８４（登録商標）が含まれる。アミログルコシダーゼは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アミログルコシダーゼ（例えば、ＡＭＧ（登録商標））であり得る。他の有用なアミラーゼ生成物には、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ（登録商標）Ａ  １０００またはＡ  ５０００（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＡＭＹＬＡＳＥ  Ｈ（商標）またはＡＭＹＬＡＳＥ  Ｐ（商標）（ＤＳＭ）が含まれる。グルコースオキシダーゼは、真菌グルコースオキシダーゼ、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ（例えば、ＧＬＵＺＹＭＥ（登録商標））であり得る。典型的なプロテアーゼは、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）である。
【０１８６】
本プロセスは、柔らかいまたは堅い性質のいずれかである、白色型、明色型または暗色型のいずれかのドウから調製される任意の種類のベークド製品のために使用できる。例は、例えばフランスのバケット型のパン、ピタパン、トルティーヤ、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、パイクラスト、クリスプブレッド、蒸しパン、ピザなどであるがそれらに限定されない、典型的にはローフパンまたはロールパンの形態のパン、特に精白パン、全粒パンまたはライ麦パンである。
【０１８７】
アミラーゼは、抗老化性アミラーゼ、ホスホリパーゼおよび／またはリン脂質と一緒に粉を含むプレミックスで使用することができる。プレミックスは、他のドウ改良添加物および／またはパン改良添加物、例えば上述の酵素を含む添加物のいずれかを含有することができる。アミラーゼは、製パン用添加物として使用するための抗老化性アミラーゼおよびホスホリパーゼを含む酵素調製物の構成成分であり得る。
【０１８８】
酵素調製物は、任意選択的に顆粒または凝集粉末の形態である。調製物は、２５〜５００μｍの範囲内の９５重量％超の粒子の狭い孔径分布を有することができる。顆粒および凝集粉末は、従来方法により、例えばアミラーゼを流動層造粒機内の担体上に噴霧する工程により調製することができる。担体は、好適な粒径を有する粒子コアから構成され得る。担体は、可溶性または不溶性、例えば塩（例えば、ＮａＣｌまたは硫酸ナトリウム）、糖（例えば、スクロースまたはラクトース）、糖アルコール（例えば、ソルビトール）、デンプン、米、コーングリッツまたは大豆であり得る。
【０１８９】
封入粒子、すなわちα−アミラーゼ粒子は、アミラーゼを含むことができる。封入α−アミラーゼ粒子を調製するため、酵素は、α−アミラーゼ粒子の全部を懸濁させるのに十分な品質である食品用脂質と接触される。本明細書で使用する食品用脂質は、水に不溶性であるが、例えば炭化水素またはジエチルエーテルなどの非極性有機溶媒中には可溶性である任意の天然有機化合物であり得る。好適な食品用脂質には、飽和または不飽和のいずれかである脂肪または油のいずれかの形態のトリグリセリドが含まれるがそれらに限定されない。脂肪酸および飽和トリグリセリドを作り上げるそれらの組み合わせの例としては、（乳脂由来の）酪酸、（動物性および植物性脂肪に由来する）パルミチン酸、および／または（動物性および植物性脂肪に由来する）ステアリン酸が挙げられるがそれらに限定されない。脂肪酸および不飽和トリグリセリドを作り上げるそれらの組み合わせの例としては、（動物性および植物性脂肪に由来する）パルミトレイン酸、（動物性および植物性脂肪に由来する）オレイン酸、（植物油に由来する）リノール酸および／または（亜麻仁油に由来する）リノレン酸が挙げられるがそれらに限定されない。他の好適な食品用脂質には、上記で考察したトリグリセリドに由来するモノグリセリドおよびジグリセリド、リン脂質およびグリコ脂質が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９０】
特に液体形にある食品用脂質は、脂質物質がα−アミラーゼ粒子の少なくとも大部分、例えば１００％の表面の少なくとも一部分を被覆するような方法でα−アミラーゼ粒子の粉末形と接触される。したがって、各α−アミラーゼ粒子は、個別に脂質中に封入される。例えば、α−アミラーゼ粒子の全部または実質的に全部には、脂質の薄くて連続する封入フィルムが提供される。これは、最初にある量の脂質を容器内に注入し、その後、脂質が各α−アミラーゼ粒子の表面を完全に湿らせるようにα−アミラーゼ粒子をスラリー化する工程によって実施できる。短期間の撹拌後、それらの表面上に実質的量の脂質を有している封入α−アミラーゼ粒子が回収される。α−アミラーゼの粒子にそのように塗布されたコーティングの厚さは、使用する脂質のタイプの選択および必要に応じてより厚いフィルムを作り上げるために作業を繰り返すことによって制御できる。
【０１９１】
装填された送達賦形剤の保管、取り扱いおよび練り込みは、包装済みミックスによって実施することができる。包装済みミックスは、封入α−アミラーゼを含むことができる。しかし、包装済みミックスは、製造業者またはパン職人の要求に応じて追加の成分をさらに含有することができる。封入α−アミラーゼがドウ内に練り込まれた後、パン職人は、その製品のための通常の製造プロセスを実施し続ける。
【０１９２】
α−アミラーゼ粒子を封入することの利点は、２つの要素からなる。第一に、食品用脂質は、非耐熱性であるそれらの酵素のための製パンプロセス中の熱変成から酵素を保護する。結果として、α−アミラーゼが発酵段階および焼成段階中に安定化および保護されている間、α−アミラーゼは、最終ベークド製品内の保護コーティングから遊離され、製品内でポリグルカン内のグルコシド結合を加水分解する。装填された送達賦形剤は、活性酵素のベークド製品中への持続的遊離も提供する。すなわち、製パンプロセス後、活性α−アミラーゼは、老化機序に対抗する速度で保護コーティングから連続的に遊離されるため、老化機序の速度を低下させる。
【０１９３】
一般に、α−アミラーゼ粒子に適用される脂質の量は、脂質の性質、それがα−アミラーゼ粒子に適用される方法、処理対象のドウ混合物の組成および改良されるドウ混和作業の重度に依存して、α−アミラーゼの総重量の数％からその重量に数倍にまで変動する可能性がある。
【０１９４】
装填された送達賦形剤、すなわち脂質封入酵素は、ベークド製品の保管寿命を延ばすための有効量でベークド製品を調製するために使用される成分に添加される。パン職人は、所望の抗老化作用を達成するために必要とされるであろう、上記で考察したように調製される封入α−アミラーゼの量を計算する。必要とされる封入α−アミラーゼの量は、封入された酵素の濃度およびα−アミラーゼ対規定の粉の比率に基づいて計算される。広範囲の濃度が有効であることが見いだされているが、上記で考察したように、抗老化性において観察可能な改良はα−アミラーゼ濃度と直線的に対応せず、所定の最小レベルを超えると、α−アミラーゼ濃度の大きい増加は追加の改良をほとんど生じさせない。特定のベーカリー製造において実際的に使用されるα−アミラーゼ濃度は、パン職人による不注意による測定不足の誤差に対してパン職人にある程度の保険を提供するために、必要な最小値よりはるかに高くてよいであろう。酵素濃度の下限は、パン職人が達成することを望む最小の抗老化作用によって決定される。
【０１９５】
ベークド製品を調製する方法は、ａ）脂質コーティングα−アミラーゼ粒子を調製する工程であって、α−アミラーゼ粒子の実質的に全部がコーティングされる工程と、ｂ）粉を含有するドウを混和する工程と、ｃ）この混和が完了する前に脂質コーティングα−アミラーゼをドウに添加し、この混和を、脂質コーティングがα−アミラーゼから除去する前に終了する工程と、ｄ）ドウを最終発酵させる工程と、ｅ）ベークド製品を提供するためにドウを焼成する工程であって、α−アミラーゼは、混和、最終発酵および焼成段階中に不活性であり、ベークド製品中で活性である、工程とを含むことができる。
【０１９６】
封入α−アミラーゼは、混和サイクル中、例えば混和サイクルの終了時近くにドウに添加することができる。封入α−アミラーゼは、ドウ全体への封入α−アミラーゼの十分な分布を可能にする混和段階におけるある時点に添加される。しかし、混和段階は、保護コーティングがα−アミラーゼ粒子から滑り落ち始める前に終了される。ドウのタイプおよび体積ならびにミキサーの作用および速度に依存して、どこでも封入α−アミラーゼをドウ内に混和するために１〜６分間以上が必要とされるであろうが、２〜４分間が平均である。したがって、正確な手順を決定するのは数種の変量である可能性がある。第一に、封入α−アミラーゼの量は、ドウミックス全体に封入α−アミラーゼが散らばることを許容するために十分な総容積を有していなければならない。封入α−アミラーゼの調製物が高度に濃縮されている場合、封入α−アミラーゼがドウに添加される前にプレミックスに油を添加することが必要になる場合がある。レシピおよび製造プロセスは、特定の変更を必要とする場合がある。しかし、パンドウ製法において規定された油の２５％がドウから持ち出され、混和サイクルの終了時近くに加えられる場合、濃縮封入α−アミラーゼのための担体として使用されると、一般に優れた結果を達成することができる。パンまたは他のベークド製品、特に低脂肪含量を有するパンまたは他のベークド製品、例えばフランスパン中において、封入α−アミラーゼをドウと混ぜるには乾燥粉重量のおよそ１％の封入α−アミラーゼ混合物で十分である。好適なパーセンテージの範囲は広く、製法、最終製品および個別パン職人の製造方法要件に左右される。第二に、封入α−アミラーゼ懸濁液は、ドウ内への完全な混和のために十分であるが、過剰な機械的作用が封入α−アミラーゼ粒子から保護脂質コーティングを剥ぎ取ることのない時間にわたりミックスに添加されなければならない。
【０１９７】
本発明の別の態様では、食品組成物は、油、肉、ラード、アミラーゼを含む組成物である。これに関連して、用語「［油／肉／ラード］組成物」は、それぞれ油、肉またはラードに基づく、それらから製造された、およびそれらを含有する任意の組成物を意味する。本発明の別の態様は、油もしくは肉もしくはラード組成物および／またはアミラーゼを含む添加剤を調製する方法であって、本発明のポリペプチドを油／肉／ラード組成物および／または添加物成分と混和する工程を含む方法に関する。
【０１９８】
本発明の別の態様では、食品組成物は、アミラーゼおよびその変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加物および／またはペットフードである。本発明は、そのような動物飼料組成物、動物飼料添加物組成物、および／またはペットフードを調製する方法であって、アミラーゼおよびその変異体を１つ以上の動物飼料成分、および／または動物飼料添加物成分、および／またはペットフード成分と混和する工程を含む方法にさらに関する。さらに、本発明は、動物飼料組成物、および／または動物飼料添加物組成物、および／またはペットフードの調製におけるアミラーゼの使用に関する。
【０１９９】
用語「動物」には、全ての非反芻動物および反芻動物が含まれる。特定の実施形態では、動物は、例えばウマおよび単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、子ブタ、成長ブタ、雌ブタなどのブタ；ダチョウ、アヒル、ニワトリ、ブロイラー、産卵ニワトリなどの家禽類；サケ、マス、テラピア、ナマズ、コイなどの魚類；ならびにエビおよびクルマエビなどの甲殻類が挙げられるが、それらに限定されない。別の実施形態では、動物は、ウシ、幼ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーンおよびニルガイを含むがそれらに限定されない反芻動物である。
【０２００】
本明細書に関連して、用語「ペットフード」は、例えば、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット；鳥類ペット、例えばカナリア、インコおよびオウム；爬虫類ペット、例えばカメ、トカゲおよびヘビ；水生動物、例えば熱帯魚およびカエルなどであるがそれらに限定されない家庭用動物の食品を意味すると理解されることが意図されている。
【０２０１】
用語「動物飼料組成物」、「飼料」および「飼い葉」は、互換的に使用され、ａ）穀草類、例えば小穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、カラス麦およびそれらの組み合わせ）および／または大穀物、例えばトウモロコシもしくはソルガム；ｂ）穀草類からの副産物、例えばコーングルテンミール、穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特にトウモロコシをベースとした穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、ふすま、小麦ミドリングス、小麦ショーツ（ｗｈｅａｔ  ｓｈｏｒｔｓ）、米ヌカ、籾殻、カラス麦の殻、パーム核、およびシトラスパルプ；ｃ）大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ハウチワマメ、エンドウマメ、ソラマメ、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエイ、コプラ、ゴマなどの供給源から得られたタンパク質；ｄ）植物起源および動物起源から得られた油脂類；ｅ）ミネラル類およびビタミン類を含む群から選択される１種以上の供給材料を含むことができる。
【０２０２】
６．布地の糊抜き組成物および使用
また、企図されているのは、アミラーゼを使用して織物を処理する（例えば、布地を糊抜きする）組成物および方法である。織物の処理方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照されたい）。例えば、織物の感触および外観は、布地を溶液中のアミラーゼと接触させる工程を含む方法によって改良することができる。織物は、加圧下で溶液を用いて処理することができる。
【０２０３】
アミラーゼは、織物の機織り中または機織り後、糊抜き段階または１つ以上の追加の織物加工処理工程中に適用することができる。布地の機織り中、糸は、相当に強い機械的歪みに曝される。織機で織る前に、縦糸は、それらの引張強度を増加させるため、および破壊を防止するために糊付けデンプンまたはデンプン誘導体でコーティングされることが多い。アミラーゼは、これらの糊付けデンプンまたはデンプン誘導体を除去するために機織り中または機織り後に適用することができる。製織後、均質で抗洗濯性の結果を保証するために、織物のさらなる加工処理前に、糊付けコーティングを除去するためにアミラーゼを使用することができる。
【０２０４】
アミラーゼは、単独でまたは他の糊抜き化学試薬および／または糊抜き酵素とともに使用して、洗剤添加物として綿含有織物を含む織物を、例えば水性組成物中で糊抜きすることができる。アミラーゼは、インジゴ染色デニム織物および衣服上にストーンウォッシュ外観を作り出すための組成物および方法に使用することもできる。衣類を製造するために、織物を裁断して衣類または衣服に縫製することができ、それらは後に仕上げ処理される。特にデニムのジーンズを製造するために、様々な酵素による仕上げ法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による糊抜きで開始され、その間に衣服は織物に柔らかさを提供し、綿にその後の酵素による仕上げ工程をより受けやすくさせるためにタンパク質分解酵素の作用を受けさせる。アミラーゼは、デニムの衣服を仕上げ（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜きおよび織物への柔らかさの付与および／または仕上げプロセスの方法において使用することができる。
【０２０５】
７．洗浄組成物
本組成物および方法の１つの態様は、構成成分としてアミラーゼを含む洗浄組成物である。アミラーゼポリペプチドは、例えば、手洗い洗浄、洗濯機洗浄、食器洗浄および他の硬質表面を洗浄するための洗剤組成物中の構成成分として使用できる。そのような組成物には、単位用量フォーマットの洗濯用洗剤組成物を含む強力液体（ＨＤＬ）、強力乾燥（ＨＤＤ）および手洗い（手作業）洗濯用洗剤組成物ならびに単位用量フォーマットの食器洗浄組成物を含む自動食器洗浄（ＡＤＷ）および手洗い（手作業）食器洗浄組成物が含まれる。
【０２０６】
７．１．概説
好ましくは、アミラーゼは、洗剤中のアミラーゼのために従来より使用される濃度またはそれに近い濃度で洗剤に組み込まれる。例えば、アミラーゼポリペプチドは、洗液／食器洗浄洗液１Ｌ当たり（純粋酵素タンパク質として計算して）０．００００１〜１ｍｇのアミラーゼに相当する量で添加され得る。下記に例示するように、本明細書では、典型的な調製物を提供する。
【０２０７】
アミラーゼポリペプチドは、唯一の酵素として、または他のデンプン分解活性酵素を含む他の酵素とともに洗剤組成物の構成成分であり得る。したがって、アミラーゼポリペプチドは、非粉化顆粒、安定化液または保護酵素の形態の洗剤組成物中に含まれてよい。非粉化顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書に開示されたように製造することができ、任意選択的に当技術分野において公知の方法によってコーティングすることができる。ワックス状コーティング物質の例は、１，０００〜２０，０００の平均分子量を備えるポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、かつ１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドおよびトリグリセリドである。流動層技術による塗布のために好適なフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従ってプロピレングリコールなどのポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することによって安定化させることができる。他の酵素安定剤は、当技術分野において公知である。保護酵素は、例えば欧州特許第２３８２１６号明細書に開示された方法に従って調製することができる。ポリオールは、長年にわたりタンパク質の安定剤として、かつタンパク質溶解性を改良すると認識されてきた。
【０２０８】
本洗剤組成物は、例えば、粉末、顆粒、ペースト、バーまたは液体などの任意の有用な形態であり得る。液体洗剤は、典型的には、約７０％までの水および０％〜３０％の有機溶媒を含有する水性であり得る。液体洗剤は、水を約３０％のみ含有するコンパクトゲルタイプの形態であってもよい。
【０２０９】
洗剤組成物は、それらの各々がアニオン性、非イオン性、カチオン性または両性イオン性であり得る１種以上の界面活性剤を含む。洗剤は、通常、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）；α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）；アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）（ＡＳ）；アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＯＳもしくはＡＥＳ）；第２級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）；α−スルホ脂肪酸メチルエステル；アルキルコハク酸もしくはアルケニルコハク酸；または石鹸などのアニオン性界面活性剤を０％〜約５０％含有するであろう。組成物は、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯまたはＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミドまたはポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０６１５４号パンフレットに記載されている）などの非イオン性界面活性剤を０％〜約４０％含有することもできる。
【０２１０】
洗剤組成物は、追加して１種以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、別のデンプン分解酵素、クチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼおよび／またはラッカーゼを任意の組み合わせで含むことができる。
【０２１１】
洗剤は、例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキルコハク酸およびアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩、または層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）などの洗剤ビルダーまたは錯化剤を約１％〜約６５％含有することができる。洗剤は、アンビルト、すなわち洗剤ビルダーを実質的に含んでいなくてもよい。酵素は、酵素の安定性と適合する任意の組成物中で使用することができる。酵素は、一般には、公知のカプセル化の形態により、例えば顆粒化またはヒドロゲル内への隔離により、有害な構成成分から保護することができる。酵素および特にアミラーゼは、デンプン結合ドメインとともに、またはデンプン結合ドメインを伴わずに、洗濯および食器洗浄用途、表面清浄剤を含む様々な組成物中、ならびにデンプンまたはバイオマスからのエタノール生産のための組成物中で使用できる。
【０２１２】
洗剤は、１種以上のポリマーを含むことができる。例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびメタクリル酸／アクリル酸ラウリルコポリマーが挙げられる。
【０２１３】
洗剤は、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）またはノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）などの過酸形成漂白活性剤と組み合わされ得、例えば、過ホウ酸塩または過炭酸塩などのＨ２Ｏ２源を含むことのできる漂白系を含有することができる。代替的に、漂白系は、ペルオキシ酸（例えば、アミド型、イミド型またはスルホン型ペルオキシ酸）を含んでいてもよい。漂白系は、酵素漂白系、例えば、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２００５／０５６７８３号パンフレットに記載されたようなペルヒドロラーゼでもあり得る。
【０２１４】
洗剤組成物の酵素は、従来型の安定剤、例えばプロピレングリコールまたはグリセロールなどのポリオール；糖または糖アルコール；乳酸；ホウ酸または芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体を使用して安定化させることができ、および組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび同第９２／１９７０８号パンフレットに記載されたように調製することができる。
【０２１５】
洗剤は、他の従来型の洗剤成分、例えば粘土、発泡増強剤、起泡抑制剤、抗腐食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、蛍光増白剤または香料を含む柔軟剤なども含有することができる。
【０２１６】
ｐＨ（使用濃度の水溶液中で測定）は、通常、中性またはアルカリ性、例えば約７．０〜約１１．０のｐＨである。
【０２１７】
以下では、本α−アミラーゼを包含するための洗剤組成物の特定の形態について記載する。これらの組成物の多くは、使用の容易さのために単位用量フォーマットで提供することができる。単位用量調製物および包装については、例えば、米国特許出願公開第２００９０２０９４４５Ａ１号明細書、同第２０１０００８１５９８Ａ１号明細書、米国特許第７００１８７８Ｂ２号明細書、欧州特許第１５０４９９４Ｂ１号明細書、国際公開第２００１０８５８８８Ａ２号パンフレット、同第２００３０８９５６２Ａ１号パンフレット、同第２００９０９８６５９Ａ１号パンフレット、同第２００９０９８６６０Ａ１号パンフレット、同第２００９１１２９９２Ａ１号パンフレット、同第２００９１２４１６０Ａ１号パンフレット、同第２００９１５２０３１Ａ１号パンフレット、同第２０１００５９４８３Ａ１号パンフレット、同第２０１００８８１１２Ａ１号パンフレット、同第２０１００９０９１５Ａ１号パンフレット、同第２０１０１３５２３８Ａ１号パンフレット、同第２０１１０９４６８７Ａ１号パンフレット、同第２０１１０９４６９０Ａ１号パンフレット、同第２０１１１２７１０２Ａ１号パンフレット、同第２０１１１６３４２８Ａ１号パンフレット、同第２００８０００５６７Ａ１号パンフレット、同第２００６０４５３９１Ａ１号パンフレット、同第２００６００７９１１Ａ１号パンフレット、同第２０１２０２７４０４Ａ１号パンフレット、欧州特許第１７４０６９０Ｂ１号明細書、国際公開第２０１２０５９３３６Ａ１号パンフレット、米国特許第６７３０６４６Ｂ１号明細書、国際公開第２００８０８７４２６Ａ１号パンフレット、同第２０１０１１６１３９Ａ１号パンフレットおよび同第２０１２１０４６１３Ａ１号パンフレットに記載されている。
【０２１８】
７．２．強力液体（ＨＤＬ）洗濯用洗剤組成物
典型的なＨＤＬ洗濯用洗剤組成物は、アニオン性洗浄性界面活性剤（直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルコキシル化アルキル硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩および／またはそれらの混合物の群から選択される）、および任意選択的に、非イオン性界面活性剤（直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換アルコキシル化アルキルアルコール、例えばＣ８〜Ｃ１８エトキシル化アルキルアルコールおよび／またはＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートの群から選択される）を含む洗浄性界面活性剤（１０重量／重量％〜４０重量／重量％）を含み、ここで、洗浄性アニオン性界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）対洗浄性非イオン性界面活性剤の重量比は１：１より大きい。好適な洗浄性界面活性剤には、カチオン性洗浄性界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルキル第４級ホスホニウム化合物、アルキル三元スルホニウム化合物および／またはそれらの混合物の群から選択される）；両性イオン性および／または両性洗浄性界面活性剤（アルカノールアミンスルホ−ベタインの群から選択される）；両性界面活性剤；半極性非イオン性界面活性剤ならびにそれらの混合物も含まれる。
【０２１９】
本組成物は、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（分岐鎖親水性および疎水性を有するアルコキシル化ポリマー、例えば０．０５重量％〜１０重量％の範囲内にあるアルコキシル化ポリアルキレンイミンの群から選択される）および／またはランダムグラフトポリマー（典型的には不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、マレイン酸無水物、飽和ポリアルコール、例えばグリセロールならびにそれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖；ならびにＣ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノ−カルボン酸のビニルエステル、アクリル酸またはメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステルおよびそれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖を含む）からなる界面活性増強性ポリマーを含んでいてよい。
【０２２０】
本組成物は、例えば、防汚ポリマー（非イオン性末端キャップ化ポリエステル、例えばＳＲＰ１、ランダムもしくはブロック構造にある糖、ジカルボン酸、ポリオールおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー、ランダムまたはブロック構造にあるエチレンテレフタレート系ポリマーおよびそれらのコポリマー、例えばＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ  ＳＦ、ＳＦ−２およびＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ  ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００およびＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ  ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（０．１重量％〜１０重量％、５００〜１００，０００Ｄａの範囲内の分子量において、ボン酸ポリマー、例えばアクリル酸、マレイン酸（またはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸およびそれらの任意の混合物、ビニルピロリドンホモポリマーおよび／またはポリエチレングリコールなどから選択される少なくとも１つのモノマーを含むポリマーなどのカルボン酸ポリマーを含む）；セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、その例にはカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロースおよびそれらの混合物が含まれるアルキルカルボキシアルキルセルロースから選択されるポリマーを含む）ならびにポリマーカルボキシレート（例えば、マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマーまたはポリアクリレートホモポリマー）などの追加のポリマーを含むことができる。
【０２２１】
本組成物は、飽和または不飽和脂肪酸、好ましくは飽和または不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）；沈着助剤（それらの例には、多糖類、好ましくはセルロースポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）およびランダムまたはブロック構造にあるＤＡＤ  ＭＡＣとビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、イミダゾリニウムハロゲン化物およびそれらの混合物とのコポリマー、カチオン性グアールガム、例えばカチオン性ヒドキシエチルセルロースなどのカチオン性セルロース、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアクリルアミドおよびそれらの混合物が含まれる）をさらに含むことができる。
【０２２２】
本組成物は、その例にマンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾールおよび／またはそれらの混合物が含まれる染料移動阻害剤；その例にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシエタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）またはメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ−二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸およびそれらの任意の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）およびそれらの誘導体が含まれるキレート剤をさらに含むことができる。
【０２２３】
本組成物は、好ましくは、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リソホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、およびそれらの任意の混合物から選択される酵素（一般に、活性酵素約０．０１重量％〜活性酵素０．０３重量％）を含んでいた。本組成物は、酵素安定化剤（その例としては、プロピレングリコールもしくはグリセロールなどのポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、可逆性プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸もしくはホウ酸誘導体、例えば芳香族ホウ酸エステル、または４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）を含むことができる。
【０２２４】
本組成物は、任意選択的に、シリコーン系または脂肪酸系起泡抑制剤；色相染料（ｈｕｅｉｎｇ  ｄｙｅｓ）、カルシウムカチオンおよびマグネシウムカチオン、視覚信号成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）および／または構造化剤／増粘剤（０．０１重量％〜約５重量％、ジグリセリドおよびトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロース系材料、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガムおよびそれらの混合物からなる群から選択される）を含むことができる。
【０２２５】
本組成物は、任意の液体形態、例えば、液体もしくはゲル形態またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本組成物は、任意の単位用量形態、例えばパウチであり得る。
【０２２６】
７．３．強力乾燥／固体（ＨＤＤ）洗濯用洗剤組成物
典型的なＨＤＤ洗濯用洗剤組成物には、アニオン洗浄性界面活性剤（例えば、直鎖もしくは分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩および／またはそれらの混合物）、非イオン洗浄性界面活性剤（例えば、直鎖もしくは分岐鎖もしくはランダム鎖の置換もしくは非置換Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレートおよび／またはＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、カチオン性洗浄性界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルキル第４級ホスホニウム化合物、アルキル三元スルホニウム化合物およびこれらの混合物）、両性イオン性および／または両性洗浄性界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホベタイン）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤およびそれらの混合物を含む洗浄性界面活性剤；リン酸非含有ビルダー（例えば、その例には０重量％〜１０重量％未満の範囲内のゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰおよびゼオライトＭＡＰが含まれるゼオライトビルダー）、リン酸塩ビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲内のトリポリリン酸ナトリウム）、クエン酸、クエン酸塩およびニトリロ三酢酸、ケイ酸塩（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲内のケイ酸ナトリウムもしくはケイ酸カリウムまたはメタケイ酸ナトリウム、または層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））を含むビルダー；炭酸塩（例えば、０重量％〜８０重量％未満の範囲内の炭酸ナトリウムおよび／または重炭酸ナトリウム）；ならびに光退色剤（例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料およびそれらの混合物）、疎水性もしくは親水性漂白活性剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸もしくはその塩、３，５，５−トリメチヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩−ＮＯＢＳ、ニトリルクワットおよびそれらの混合物）；過酸化水素源（例えば、その例には、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩もしくは過ケイ酸塩のナトリウム塩一水和物もしくは四水和物が含まれる無機過水和塩）、予備形成親水性および／または疎水性過酸（例えば、過カルボン酸および塩、過炭酸および塩、ペリミド酸および塩、ペルオキシモノ硫酸および塩およびそれらの混合物）および／または漂白触媒（例えば、イミン漂白増強剤（その例にはイミニウムカチオンおよびポリイオンが含まれる）、イミニウム両性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾール二酸化物、ペルフルオロイミン、環状糖ケトンおよびそれらの混合物、ならびに金属含有漂白触媒（例えば、例えば亜鉛もしくはアルミニウムおよび封鎖剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびその水溶性塩などの補助金属カチオンと一緒に、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンもしくはマンガンカチオン）を含む漂白剤が含まれる。
【０２２７】
本組成物は、好ましくは、酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リソホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼおよびそれらの混合物を含む。
【０２２８】
本組成物は、任意選択的に、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色相剤、織物インテグリティ（ｆａｂｒｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）ポリマーおよびカチオンポリマーを含む追加のポリマー、ダイロック成分、織物柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、織物沈着助剤および／またはシクロデキストリンを含む追加の洗剤成分を含む場合がある。
【０２２９】
７．４．自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤組成物
典型的なＡＤＷ洗剤組成物には、０〜１０重量％の量で存在するエトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップ化ポリ（オキシアルキル化）アルコールもしくはアミンオキシド界面活性剤を含む非イオン性界面活性剤；リン酸塩ビルダー（例えば、一リン酸塩、二リン酸塩、三ポリリン酸塩、他のオリゴマーポリリン酸塩、トリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰ）およびリン酸非含有ビルダー（例えば、０．５重量％〜５０重量％の範囲内のメチル−グリシン−二酢酸（ＭＧＤＡ）ならびにその塩および誘導体、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）ならびにその塩および誘導体、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）ならびにその塩および誘導体、カルボキシメチルイヌリンならびにその塩および誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）およびそれらの塩、ポリ−カルボン酸のホモポリマーおよびコポリマーおよびそれらの部分的もしくは完全中和塩、モノマーのポリカルボン酸およびヒドロキシカルボン酸およびそれらの塩を含むアミノ酸をベースとする化合物）を含む５〜６０％の範囲内のビルダー；寸法安定性を提供するために約０．１重量％〜約５０重量％の範囲内のスルホン化／カルボキシル化ポリマー；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲内の乾燥助剤（例えば、ポリエステル、特にアニオン性ポリエステル、任意選択的に別の３〜６官能基を有するさらなるモノマーと一緒に  −  典型的には重縮合を促進する酸、アルコールもしくはエステル官能基、ポリカーボネート、ポリウレタンおよび／またはポリ尿素ポリオルガノシロキサン化合物もしくはそれらの、特に反応性環状炭酸塩および尿素タイプの前駆体化合物）；約１重量％〜約２０重量％の範囲内のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウムもしくはカリウム、例えば二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウムおよび結晶性フィロケイ酸塩を含む）；無機漂白剤（例えば、過水和物塩、例えば過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩および過ケイ酸塩）および有機漂白剤（例えば、ジアシルおよびテトラアシルペルオキシドを含む有機ペルオキシ酸、特にジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸およびジペルオキシヘキサデカン二酸）；漂白活性剤（すなわち、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲内の有機過酸前駆体）；漂白触媒（例えば、トリアザシクロノナンマンガンおよび関連錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、ＭｎおよびＦｅビスピリジルアミンおよび関連錯体ならびに酢酸ペンタミンコバルト（ＩＩＩ）および関連錯体）；約０．１重量％〜５重量％の範囲内の金属ケア剤（例えば、ベンザトリアゾール、金属塩および錯体および／またはケイ酸塩）；自動食器洗浄洗剤組成物１ｇ当たり約０．０１〜５．０ｍｇの活性酵素の範囲内の酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リソホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼおよびそれらの混合物）；ならびに酵素安定剤構成成分（例えば、オリゴ糖、多��および無機二価金属塩）が含まれる。
【０２３０】
７．５．追加の洗剤組成物
以下では、本アミラーゼを添加することができる追加の典型的な洗剤調製物について、番号を付した段落に記載する。
【０２３１】
１）（酸として計算して）約７％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１％〜約４％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２エチレンオキシド（ＥＯ））もしくは硫酸アルキル（例えば、Ｃ１６〜１８）；約５％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１４％〜約２０％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約２〜約６％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約１５％〜約２２％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；０％〜約６％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約０％〜約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）；約１１％〜約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約２％〜約６％のＴＡＥＤ；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸、コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素として計算して）０．０００１〜０．１％タンパク質の酵素；ならびに０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光退色剤）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２３２】
２）（酸として計算して）約６％〜約１１％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１％〜約３％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１〜２ＥＯ））または硫酸アルキル（例えば、Ｃ１６〜１８）；約５％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１５％〜約２１％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１％〜約４％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２４％〜約３４％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；約４％〜約１０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；０％〜約１５％のクエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；１〜６％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２３３】
３）（酸として計算して）約５％〜約９％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約７％〜約１４％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１〜約３％の脂肪酸（例えば、Ｃ１６〜２２脂肪酸）としての石鹸；約１０％〜約１７％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）；約３〜約９％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２３％〜約３３％のゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４として）；０％〜約４％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約８％〜約１６％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約２％〜約８％のＴＡＥＤ；０％〜約１％のホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２３４】
４）（酸として計算して）約８％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１０％〜約２５％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）；約１４％〜約２２％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）；約１％〜約５％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２５％〜約３５％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；０％〜約１０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；１〜３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２３５】
５）（酸として計算して）約１５％〜約２１％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１２％〜約１８％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；約３％〜約１３％の脂肪酸（例えば、オレイン酸）としての石鹸；０％〜約１３％のアルケニルコハク酸（Ｃ１２〜１４）；約８％〜約１８％のアミノエタノール；約２％〜約８％のクエン酸；０％〜約３％のホスホン酸塩；０％〜約３％のポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）；０％〜約２％のホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）；０％〜約３％のエタノール；約８％〜約１４％のプロピレングリコール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、分散剤、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０２３６】
６）（酸として計算して）約１５％〜約２１％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；３〜９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、またはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；約３％〜約１０％の脂肪酸（例えば、オレイン酸）としての石鹸；約１４％〜約２２％のゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４として）；約９％〜約１８％のクエン酸カリウム；０％〜約２％のホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜約３％のポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）；０％〜約３％のアンカリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、ＭＷ３８００）；０％〜約５％のグリセロール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、分散剤、起泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性構造化液体洗剤組成物。
【０２３７】
７）約５％〜約１０％の脂肪アルコール硫酸塩；約３％〜約９％のエトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド；０〜３％の脂肪酸としての石鹸；約５％〜約１０％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１％〜約４％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約２０％〜約４０％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；約２％〜約８％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約１２％〜約１８％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約２％〜約７％のＴＡＥＤ；約１％〜約５％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、起泡抑制剤、香料）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２３８】
８）（酸として計算して）約８％〜約１４％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約５％〜約１１％のエトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド；０％〜約３％の脂肪酸としての石鹸；約４％〜約１０％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１％〜約４％の可溶性ケイ酸塩（Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約３０％〜約５０％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；約３％〜約１１％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約５％〜約１２％のクエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）；約１％〜約５％のポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、起泡抑制剤、香料）を含む顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２３９】
９）（酸として計算して）約６％〜約１２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約１％〜約４％の非イオン性界面活性剤；約２％〜約６％の脂肪酸としての石鹸；約１４％〜約２２％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約１８％〜約３２％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；約５％〜約２０％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約３％〜約８％のクエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）；約４％〜約９％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）；約１％〜約５％の漂白活性剤（例えば、ＮＯＢＳまたはＴＡＥＤ）；０％〜約２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；約１％〜約５％のポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩またはＰＥＧ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、香料）を含む顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２４０】
１０）（酸として計算して）約１５％〜約２３％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；約８％〜約１５％のアルコールエトキシスルフェート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、２〜３ＥＯ）；約３％〜約９％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、またはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；０％〜約３％の脂肪酸（例えば、ラウリン酸）としての石鹸；約１％〜約５％のアミノエタノール；約５％〜約１０％のクエン酸ナトリウム；約２％〜約６％のヒドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）；０％〜約２％のホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）；０％〜約１％のカルボキシメチルセルロース；約１％〜約３％のエタノール；約２％〜約５％のプロピレングリコール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０２４１】
１１）（酸として計算して）約２０％〜約３２％の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩；６〜１２％のアルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯまたはＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）；約２％〜約６％のアミノエタノール；約８％〜約１４％のクエン酸；約１％〜約３％のホウ酸塩（例えば、Ｂ４Ｏ７）；０％〜約３％のポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、アンカリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマー）；約３％〜約８％のグリセロール；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、ヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光増白剤）を含む水性液体洗剤組成物。
【０２４２】
１２）約２５％〜約４０％のアニオン性界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、スルホン酸アルキル、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）；約１％〜約１０％の非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）；約８％〜約２５％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；約５％〜約１５％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；０％〜約５％の硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）；約１５％〜約２８％のゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４）；０％〜約２０％の過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３．４Ｈ２Ｏ）；約０％〜約５％の漂白活性剤（ＴＡＥＤまたはＮＯＢＳ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；０〜３％の微量成分（例えば、香料、蛍光増白剤）を含む少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２４３】
１３）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩の全部または一部が（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩で置換されている、上記の組成物（１）〜（１２）に記載された洗剤組成物。
【０２４４】
１４）約９％〜約１５％の（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩；約３％〜約６％のアルコールエトキシレート；約１％〜約５％のポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド；約１０％〜約２０％のゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）；約１０％〜約２０％の層状二ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫ５６）；約３％〜約１２％の炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）；０％〜約６％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約４％〜約８％のクエン酸ナトリウム；約１３％〜約２２％の過炭酸ナトリウム；約３％〜約８％のＴＡＥＤ；０％〜約５％のポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩およびＰＶＰ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜５％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、光退色剤、香料、起泡抑制剤）を含む、少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２４５】
１５）約４％〜約８％の（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩；約１１％〜約１５％のアルコールエトキシレート；約１％〜約４％の石鹸；約３５％〜約４５％のゼオライトＭＡＰまたはゼオライトＡ；約２％〜約８％の炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）；０％〜約４％の可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）；約１３％〜約２２％の過炭酸ナトリウム；１〜８％のＴＡＥＤ；０％〜約３％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；０％〜約３％のポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩およびＰＶＰ）；（純粋酵素タンパク質として計算して）０．０００１〜０．１％の酵素；および０〜３％の微量成分（例えば、蛍光増白剤、ホスホン酸塩、香料）を含む、少なくとも６００ｇ／Ｌのバルク密度を有する顆粒として調製された洗剤組成物。
【０２４６】
１６）追加の成分または既に特定した漂白系の代替物のいずれかとして安定化またはカプセル封入過酸を含有する、上記の１）〜１５）に記載した洗剤調製物。
【０２４７】
１７）過ホウ酸が過炭酸塩と置換されている、上記の１）、３）、７）、９）および１２）に記載した洗剤組成物。
【０２４８】
１８）追加してマンガン触媒を含有する、上記の１）、３）、７）、９）、１２）、１４）および１５）に記載した洗剤組成物。マンガン触媒は、例えば、“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｇａｎｅｓｅ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｌｅａｃｈｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６３７−６３９（１９９４）に記載された化合物の１つである。
【０２４９】
１９）液体非イオン性界面活性剤、例えば直鎖アルコキシル化第１級アルコール、ビルダー系（例えば、リン酸塩）、酵素およびアルカリを含む非水性洗剤液として調製された洗剤組成物。洗剤は、アニオン性界面活性剤および／または漂白系も含むことができる。
【０２５０】
上述のように、本アミラーゼポリペプチドは、洗剤中で従来法により使用される濃度で組み込むことができる。現在は、洗剤組成物中には、酵素は洗液１リットル当たり（純粋酵素タンパク質として計算して）０．００００１〜１．０ｍｇのアミラーゼポリペプチドに相当する量で添加できることは企図されている。
【０２５１】
本洗剤組成物は、他の従来法による洗剤成分、例えば、脱凝集性物質、充填剤、泡抑制剤、抗腐食剤、汚れ懸濁化剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再付着防止剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤および香料も含有することができる。
【０２５２】
本洗剤組成物は、染みの付いた織物の前処置のために好適な洗濯用添加物組成物およびすすぎに添加される織物柔軟剤組成物を含む手洗い（手作業）もしくは機械（自動）洗濯用洗剤組成物として調製でき、または一般の家庭用硬質表面洗浄作業に使用するための洗剤組成物として調製でき、または手洗いもしくは自動食器洗浄作用のために調製できる。
【０２５３】
本明細書に記載した洗浄組成物はいずれも、任意の数の追加の酵素を含むことができる。一般に、酵素は、選択された洗剤と（例えば、最適ｐＨ、他の酵素性および非酵素性成分などとの適合性に関して）適合しなければならず、酵素は、有効量で存在しなければならない。例として、下記の酵素を挙げる。
【０２５４】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼには、動物起源、植物起源または微生物起源のプロテアーゼが含まれる。化学修飾またはタンパク質改変突然変異体ならびに自然に処理されたタンパク質が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼまたは金属プロテアーゼ、アルカリ性微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼまたはキモトリプシン様プロテアーゼであり得る。アルカリ性プロテアーゼの例は、サブチリシン、特にバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来のプロテアーゼ（例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８（例えば、国際公開第８９／０６２７９号パンフレットを参照されたい）である。追加の例には、それらの全部が参照により本明細書に組み込まれる米国再発行特許第３４６０６号明細書、米国特許第５，９５５，３４０号明細書、同第５，７００，６７６号明細書、同第６，３１２，９３６号明細書および同第６，４８２，６２８号明細書に記載されたそれらの変異プロテアーゼが含まれる。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタまたはウシ起源）およびフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属プロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号パンフレットおよび同第９４／２５５８３号パンフレットを参照されたい）である。有用なプロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、同第９８／２０１１５号パンフレット、同第９８／２０１１６号パンフレットおよび同第９８／３４９４６号パンフレットに記載された変異体も挙げられるがそれらに限定されない。市販で入手できるプロテアーゼ酵素には、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）およびＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳおよびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅ（商標）、ＦＮＡ（商標）、ＦＮ２（商標）、ＦＮ３（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）およびＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、ＢＬＡＰ（商標）およびＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ａｕｆ  Ａｋｔｉｅｎ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ならびにＫＡＰ（Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）サブチリシン；花王株式会社、東京、日本）が含まれるがそれらに限定されない。別の典型的なプロテア���ゼは、バチルス・アミロリキファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）由来のＮｐｒＥおよびセルロモナス種（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株６９Ｂ４由来のＡＳＰ（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）である。様々なプロテアーゼは、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、同第９２／２１７６０号パンフレット、同第０９／１４９２００号パンフレット、同第０９／１４９１４４号パンフレット、同第０９／１４９１４５号パンフレット、同第１１／０７２０９９号パンフレット、同第１０／０５６６４０号パンフレット、同第１０／０５６６５３号パンフレット、同第１１／１４０３６４号パンフレット、同第１２／１５１５３４号パンフレット、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号明細書および米国特許第５，８０１，０３９号明細書、同第５，３４０，７３５号明細書、同第５，５００，３６４号明細書、同第５，８５５，６２５号明細書、米国再発行特許第３４，６０６号明細書、米国特許第５，９５５，３４０号明細書、同第５，７００，６７６号明細書、同第６，３１２，９３６号明細書および同第６，４８２，６２８号明細書ならびに様々な他の特許に記載されている。一部の別の実施形態では、国際公開第０７／０４４９９３号パンフレットに記載された中性金属プロテアーゼを含むがそれらに限定されない金属プロテアーゼが本発明において使用される。好適なプロテアーゼには、天然型プロテアーゼまたは相当に低い温度で機能するように特別に選択もしくは改変された改変変異体が含まれる。
【０２５５】
リパーゼ：好適なリパーゼには、細菌起源または真菌起源のリパーゼが含まれる。化学修飾、タンパク質分解修飾またはタンパク質改変突然変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属（同義語、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属）由来の、例えば、Ｈ．ラヌギノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））由来（例えば、欧州特許第２５８０６８号明細書および同第３０５２１６号明細書を参照されたい）、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来（例えば、国際公開第９６／１３５８０号パンフレットを参照されたい）のリパーゼ；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属リパーゼ（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）もしくはＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）由来；例えば、欧州特許第２１８２７２号明細書を参照されたい）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（例えば、欧州特許第３３１３７６号明細書を参照されたい）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号明細書を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）菌株ＳＤ７０５（例えば、国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび同第９６／２７００２号パンフレットを参照されたい）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（例えば、国際公開第９６／１２０１２号パンフレットを参照されたい）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属リパーゼ（例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来；例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３６０（１９９３）を参照されたい）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、特開昭６４／７４４９９２号公報）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（例えば、国際公開第９１／１６４２２号パンフレットを参照されたい）が挙げられるがそれらに限定されない。本調製物中で使用するために企図された追加のリパーゼ変異体には、例えば、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、同第９４／０１５４１号パンフレット、同第９５／３５３８１号パンフレット、同第９６／００２９２号パンフレット、同第９５／３０７４４号パンフレット、同第９４／２５５７８号パンフレット、同第９５／１４７８３号パンフレット、同第９５／２２６１５号パンフレット、同第９７／０４０７９号パンフレット、同第９７／０７２０２号パンフレット、欧州特許第４０７２２５号明細書および同第２６０１０５号明細書に記載されたリパーゼ変異体が含まれる。一部の市販で入手できるリパーゼ酵素には、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）およびＬｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳおよびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が含まれる。
【０２５６】
ポリエステラーゼ：本組成物中には、例えば国際公開第０１／３４８９９号パンフレット、同第０１／１４６２９号パンフレットおよび米国特許第６９３３１４０号明細書に記載されたような好適なポリエステラーゼを含めることができる。
【０２５７】
アミラーゼ：本組成物は、他のα−アミラーゼを含む他のアミラーゼと組み合わせることができる。そのような組み合わせは、異なるα−アミラーゼが異なる性能特性を示し、複数の異なるα−アミラーゼの組み合わせが異なるα−アミラーゼの利点を提供する組成物を結果として生じさせる場合に特に望ましい。他のアミラーゼには、市販で入手できるアミラーゼ、例えばＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳおよびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）；ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）ならびにＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）などが含まれるがそれらに限定されない。
【０２５８】
セルラーゼ：セルラーゼは、本組成物に添加できる。好適なセルラーゼには、細菌または真菌起源のセルラーゼが含まれる。化学修飾またはタンパク質改変突然変異体が含まれる。好適なセルラーゼには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書；同第５，６４８，２６３号明細書；同第５，６９１，１７８号明細書；同第５，７７６，７５７号明細書；および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されたフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から生成された真菌セルラーゼが含まれる。使用するために企図された典型的なセルラーゼは、布地にとってカラーケア利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、例えば、欧州特許第０４９５２５７号明細書、同第０５３１３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、同第９６／２９３９７号パンフレットおよび同第９８／０８９４０号パンフレットに記載されたセルラーゼである。他の例は、例えば、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット；同第９８／１２３０７号パンフレット；同第９５／２４４７１号パンフレット；ＰＣＴ／デンマーク特許出願公開第９８／００２９９；欧州特許第５３１３１５号明細書；米国特許第５，４５７，０４６号明細書；同第５，６８６，５９３号明細書；および同第５，７６３，２５４号明細書に記載されたセルラーゼ変異体である。市販で入手できるセルラーゼには、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）およびＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳおよびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）；ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）およびＰＵＲＡＤＡＸ  ＨＡ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が含まれる。
【０２５９】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：本組成物中で使用するために企図された好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物起源、細菌起源または真菌起源のものが含まれる。化学修飾またはタンパク質改変突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、同第９５／１０６０２号パンフレットおよび同第９８／１５２５７号パンフレットに記載されたようなコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属由来、例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のペルオキシダーゼおよびその変異体が挙げられる。市販で入手できるペルオキシダーゼには、例えば、ＧＵＡＲＤＺＹＭＥ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／ＳおよびＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が含まれる。
【０２６０】
本洗剤組成物は、家庭用および／または工業用布地／洗濯物上に存在するバイオフィルムを除去／洗浄するために有効である２，６−β−Ｄ−フルクタンヒドロラーゼも含むことができる。
【０２６１】
洗剤用酵素は、１種以上の酵素を含有する別個の添加物を添加する工程、またはこれらの酵素全部を含む複合添加物を添加する工程によって洗剤組成物中に含めることができる。洗剤添加物、すなわち別個の添加物または複合添加物は、例えば、顆粒、液体、スラリーなどとして調製することができる。典型的な洗剤添加物調製物には、顆粒、特に非粉化顆粒、液体、特に安定化液体またはスラリーが含まれるがそれらに限定されない。
【０２６２】
非粉化顆粒は、例えば米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書に開示されたように製造することができ、任意選択的に当技術分野において公知の方法によってコーティングすることができる。ワックス状コーティング物質の例は、１，０００〜２０，０００の平均分子量を備えるポリ（エチレンオキシド）生成物（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０個の炭素原子を含有し、かつ１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドおよびトリグリセリドである。流動層技術による塗布のために好適なフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従ってプロピレングリコールなどのポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸またはホウ酸を添加することによって安定化させることができる。保護酵素は、欧州特許第２３８，２１６号明細書に開示された方法に従って調製することができる。
【０２６３】
本洗剤組成物は、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒、ペーストまたは液体などの任意の便宜的な形態であり得る。液体洗剤は、典型的には、約７０％までの水および０％〜約３０％の有機溶媒を含有する水性であり得る。約３０％以下の水を含有するコンパクト洗剤ジェルも企図されている。洗剤組成物は、任意選択的に、半極性、および／またはアニオン性、および／またはカチオン性、および／または両性イオン性を含む非イオン性であり得る１種以上の界面活性剤を含むことができる。界面活性剤は、約０．１重量％〜約６０重量％の広範囲で存在してよい。
【０２６４】
その中に含まれる場合、洗剤は、典型的には、約１％〜約４０％の例えば直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシスルフェート、第２級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルコハク酸もしくはアルケニルコハク酸または石鹸などのアニオン性界面活性剤を含有するであろう。
【０２６５】
その中に含まれる場合、洗剤は、通常、約０．２％〜約４０％の例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミドまたはグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）などの非イオン性界面活性剤を含有するであろう。
【０２６６】
本洗剤は、０％〜約６５％の例えばゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキルコハク酸およびアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製のＳＫＳ−６）などの洗剤ビルダーまたは錯化剤を含有することができる。
【０２６７】
本洗剤は、１種以上のポリマーを含むことができる。典型的なポリマーには、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー）およびメタクリル酸／アクリル酸ラウリルコポリマーが含まれる。
【０２６８】
洗剤組成物の酵素は、従来型の安定剤、例えばポリオール（例えば、プロピレングリコールもしくはグリセロール）、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸もしくはホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）またはフェニルボロン酸誘導体（例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸）を使用して安定化させることができる。本組成物は、例えば国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび同第９２／１９７０８号パンフレットに記載されたように調製することができる。
【０２６９】
本洗剤組成物中では、特に酵素変異体を洗液１Ｌ当たり酵素タンパク質約０．０１〜約１００ｍｇに相当する量（例えば、洗液１リットル当たり酵素タンパク質約０．０５〜約５．０ｍｇまたは洗液１リットル当たり酵素タンパク質０．１〜約１．０ｍｇ）で添加できることが企図されている。
【０２７０】
本アミラーゼを添加できる（または一部の場合にはその構成成分であると同定されている）多くの典型的な洗剤調製物は、国際公開第２０１３０６３４６０号パンフレットに記載されている。これらには、ＰＵＲＥＸ（登録商標）ＵｌｔｒａＰａｃｋｓ（Ｈｅｎｋｅｌ）、ＦＩＮＩＳＨ（登録商標）Ｑｕａｎｔｕｍ（Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ）、ＣＬＯＲＯＸ（商標）２  Ｐａｃｋｓ（Ｃｌｏｒｏｘ）、ＯｘｉＣｌｅａｎ  Ｍａｘ  Ｆｏｒｃｅ  Ｐｏｗｅｒ  Ｐａｋｓ（Ｃｈｕｒｃｈ＆Ｄｗｉｇｈｔ）、ＴＩＤＥ（登録商標）Ｓｔａｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＣＡＳＣＡＤＥ（登録商標）ＡｃｔｉｏｎＰａｃｓおよびＴＩＤＥ（登録商標）Ｐｏｄｓ（商標）（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、ＰＳなどの市販で入手できる単位用量調製物／包装が含まれる。
【０２７１】
７．６．洗剤組成物中のアミラーゼ活性を評価する方法
当技術分野では、材料見本およびミクロ材料見本アッセイを含む多くのα−アミラーゼ洗浄アッセイが公知である。添付の実施例では、ごく少数のそのようなアッセイについて記載する。
【０２７２】
本組成物および方法ならびにそれらの利点について詳細に説明するために、下記の特定の実施例は、それらが限定的ではなくむしろ例示的であるとの理解の下で提供されている。
【０２７３】
８．醸造組成物
本変異アミラーゼは、醸造のプロセスにおいて、すなわち発酵麦芽飲料を製造する際に使用される醸造組成物の構成成分であり得る。非発酵性炭水化物は、最終ビール中の溶存固形分の大半を形成する。この残渣は、麦芽アミラーゼがデンプンのα−１，６−結合を加水分解することができないために残留する。非発酵性炭水化物は、ビール１２オンス当たり約５０カロリーに寄与する。アミラーゼは、グルコアミラーゼならびに任意選択的にプルラナーゼおよび／またはイソアミラーゼと組み合わせて、デンプンをデキストリンおよび発酵性糖に変換させ、最終ビール中の残留非発酵性炭水化物を減少させることを支援する。
【０２７４】
これらの飲料において使用される主要原材料は、水、ホップおよび麦芽である。さらに、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンスターチ、大麦、大麦デンプン、脱穀大麦、小麦、小麦デンプン、焙焼穀物、穀物フレーク、ライ麦、オート麦、ジャガイモ、タピオカおよび例えばコーンシロップ、サトウキビシロップ、大麦および／または小麦シロップなどのシロップなどの添加剤をデンプン源として使用できる。
【０２７５】
多数の理由のために、主として選択された大麦の品種から製造される麦芽は、ビールの全ての特性および品質への最大の作用を有する。第一に、麦芽は、ビール中の主要香料添加剤である。第二に、麦芽は、発酵糖の主要部分を提供する。第三に、麦芽は、ビールの本体および泡の特性に寄与するであろうタンパク質を提供する。第四に、麦芽は、マッシュ化工程中に必要な酵素活性を提供する。ホップも、香り付けを含むビールの品質への有意性に寄与する。特に、ホップ（またはホップ構成成分）は、ビールに望ましい苦味物質を加える。さらに、ホップは、タンパク質沈殿剤として作用し、防腐剤を確立し、泡の形成および安定化に役立つ。
【０２７６】
穀物、例えば大麦、オート麦、小麦および植物構成成分、例えばトウモロコシ、ホップおよび米も工業用醸造および自家用醸造の両方における醸造のためにも使用される。醸造において使用される構成成分は、麦芽化されていなくても麦芽化されていてもよい、すなわち部分的に発芽され得、α−アミラーゼを含む酵素レベルの上昇を生じさせる。醸造に成功するには、発酵のための適切なレベルの糖を保証するために適正なレベルのα−アミラーゼ酵素活性が必要とされる。したがって、アミラーゼは、単独でまたは別のα−アミラーゼと組み合わせて、醸造のために使用される構成成分に添加することができる。
【０２７７】
本明細書で使用する用語「ストック」は、破砕または破壊される穀物および植物構成成分を意味する。例えば、ビール製造において使用される大麦は、発酵のためのマッシュを製造するために適切なコンシステンシーを生じさせるために粗く製粉または粉砕されている穀物である。本明細書で使用する用語「ストック」には、粉砕または粗く製粉された形態の植物および穀物の上記のタイプのいずれかが含まれる。本明細書に記載した方法は、粉およびストックの両方におけるα−アミラーゼ活性レベルを決定するために使用できる。
【０２７８】
ビールを製造するためのプロセスは、当技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ（２００４）“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ，”Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。手短には、本プロセスは、（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）麦芽汁を調製するためにマッシュを濾過する工程と、（ｃ）発酵飲料、例えばビールを得るために麦芽汁を発酵させる工程とを包含する。典型的には、ミル粉砕または破砕した麦芽は、水と混和され、麦芽中に存在する酵素が麦芽中に存在するデンプンを発酵性糖に変換させることを許容するための制御温度下において、ある期間にわたり保持される。マッシュは、次にマッシュ濾過器に移動され、そこで液体が穀物残渣から分離される。この甘い液体は「麦芽汁」と呼ばれ、残留する穀物残渣は「穀物かす」と呼ばれる。マッシュは、典型的には、穀物かすから残留可溶性抽出物を回収するためにマッシュに水を添加する工程を含む抽出にかけられる。麦芽汁は、次に麦芽汁を滅菌して、色、香味および香りが発生するのに役立つように強力に沸騰される。ホップは、沸騰中のある時点に加えられる。麦芽汁は、冷却されて発酵槽に移される。
【０２７９】
麦芽汁は、次に発酵槽内で酵母と接触される。発酵槽を冷却すると、発酵を停止させることができる。酵母は凝集して除去される。最後に、ビールは、ある期間にわたり冷却して保管され、その間にビールは透明化してその香りが発生し、ビールの外観、香りおよび貯蔵寿命を損なう可能性のある任意の物質は沈殿する。ビールは、通常、約２体積／体積％〜約１０体積／体積％のアルコールを含有するが、より高アルコール含量、例えば１８体積／体積％を備えるビールも入手できる。包装する前に、ビールは炭酸ガスで飽和され、任意選択的に濾過および低温殺菌される。
【０２８０】
アミラーゼをグルコアミラーゼならびに任意選択的にプルラナーゼおよび／またはイソアミラーゼと組み合わせて含む醸造組成物は、上記の工程（ａ）のマッシュに、すなわちマッシュの調製中に添加され得る。代替的にまたは加えて、醸造組成物は、上記の工程（ｂ）のマッシュに、すなわちマッシュの濾過中に添加され得る。代替的にまたは加えて、醸造組成物は、上記の工程（ｃ）の麦芽汁に、すなわち麦芽汁の発酵中に添加され得る。
【０２８１】
発酵飲料、例えばビールは、上記の方法の１つによって製造することができる。発酵飲料は、ビール、例えばフルモルトビール、「ビール純粋令」の下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、ノンアルコールビール、ノンアルコール麦芽酒などが挙げられるが、また別の穀物飲料および麦芽飲料、例えばフルーツ風味の麦芽飲料、例えばシトラス風味、例えばレモン風味、オレンジ風味、ライム風味もしくはベリー風味の麦芽飲料、酒風味の麦芽飲料、例えばウォッカ風味、ラム風味もしくはテキーラ風味の麦芽酒またはコーヒー風味の麦芽飲料、例えばカフェイン風味の麦芽酒なども挙げられる。
【０２８２】
９．ヨウ素陽性デンプンの減少
変異アミラーゼは、液化および／または糖化の方法において使用される場合、ヨウ素陽性デンプン（ＩＰＳ）を減少させることができる。ＩＰＳの１つの起源は、加水分解を回避するアミロースおよび／または老化デンプンポリマーである。デンプン老化は、デンプン分子に相互に結合して、その後に結晶化度の増加が続く傾向があるために、デンプンペースト中または老化進行中のゲル中で自然に発生する。低濃度の溶液は、デンプン分子のより大きい物体への進行性会合に起因してますます濁る。自然な沈殿が発生し、沈殿したデンプンは、冷水不溶性の最初の状態に復帰する傾向を示すと思われる。ゲルへの冷却硬化後のより高濃度のペーストは、老化するとデンプン分子の会合が増加するために着実に堅固さを増す。これは、隣接デンプン分子上のヒドロキシル基間で水素結合が生じる傾向が強くあるために生じる。Ｊ．Ａ．Ｒａｄｌｅｙ，ｅｄ．，Ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  １９４−２０１（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９６８））を参照されたい。
【０２８３】
糖蒸留酒中にＩＰＳが存在すると、最終製品の品質に有害な影響を及ぼし、下流での加工処理を伴う重要な問題となる。ＩＰＳは、濾過システムを詰まらせたり減速させたりし、精製に使用される炭素カラムを汚染する。ＩＰＳが十分に高濃度に達すると、ＩＰＳは炭素カラムから漏れ出るようになり、生産効率を低下させる。さらに、ＩＰＳは、貯蔵後に濁った最終製品を生じさせる可能性があり、これは最終製品の品質にとって許容されない。ＩＰＳの量は、糖化槽を分離し、内容物を戻し混合する工程によって減少させることができる。それでもＩＰＳは、特に炭素カラムおよび濾過システム内に蓄積するであろう。変異アミラーゼの使用は、ＩＰＳの量を減少させることによってプロセス全体の性能を改善すると予想される。
【０２８４】
本明細書で言及した全ての参考文献は、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。本組成物および方法ならびにそれらの利点について詳細に説明するために、下記の特定の実施例は、それらが限定的ではなくむしろ例示的であるとの理解の下で提供される。
【実施例】
【０２８５】
実施例１
アッセイ
本明細書で使用する様々なアッセイについて、読み易くするために下記に記載する。下記の実施例におけるプロトコルからの何らかの逸脱は、関連するセクションに指示した。これらの実験では、分光光度計を使用して反応の完了後に形成された生成物の吸光度を測定した。
【０２８６】
Ａ．タンパク質の精製
アミラーゼ変異体を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌株を２．５Ｌのフラスコ内の３７℃の培養培地（主要窒素源としての尿素、主要炭素源としてのグルコースを含み、堅固な細胞増殖のために１％のソイトンが補給されている、ＭＯＰバッファーをベースとする濃縮された半合成培地）中で６０〜７２時間、または無機塩および炭素源としてのグルコースが補給されたトウモロコシ穂軸および大豆粉の培地を用いるフェドバッチ式発酵プロセスを使用して３６℃の１４Ｌのタンク内で１００時間にわたり増殖させた。インキュベーション後、細胞は、遠心分離によって発酵培地から分離し、上清を限外濾過によって濃縮した。この濃縮物に、最終濃度が０．５Ｍとなるように硫酸アンモニウムを加えた。タンパク質は、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のフェニルセファロースカラムを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して精製した。カラムは、２ｍＭのＣａＣｌ２および０．５Ｍの硫酸アンモニウムとともに５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）を用いて平衡化させ、タンパク質は、２ｍＭのＣａＣｌ２および５０％のプロピレングリコールを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）を用いて溶出させた。各ＨＰＬＣの実行後、関心対象のピークと結合した液体分画をプールし、初期濃度を推定するためにプール分画の吸光度測定値を入手した。濃縮サンプルのタンパク質濃度は、３種の異なる測定値：２８０ｎｍでの吸光度測定値、公知の標準物質と比較した酸処理サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥデンシトメトリーおよびＨＰＬＣシステム上でタンパク質を流し、２１５ｎｍおよび２８０ｎｍで得た吸光度測定値からの結果を平均化することによって決定した。
【０２８７】
Ｂ．Ｃｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼ活性アッセイ
Ｃｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼアッセイは、Ｃｅｒａｌｐｈａキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して実施した。本アッセイは、培養上清を規定条件下で基質混合物とインキュベートする工程を包含し、この反応は、ホウ酸バッファー（２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０））の添加によって終了（および発色）させた。この基質は、規定のオリゴ糖「非還元型末端ブロック化ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド」（ＢＰＮＰＧ７）および過剰レベルのα−グルコシダーゼ（「ブロック基」の存在に起因して天然基質には作用を有していない）の混合物である。エンド作用性α−アミラーゼによりオリゴ糖が加水分解されると、混合物中に存在する過剰量のα−グルコシダーゼは、ｐ−ニトロフェニルマルト糖分画のグルコースおよび遊離ｐ−ニトロフェノールへの瞬間的および定量的加水分解を生じさせる。分析対象の試料中のアミラーゼの濃度に直接関連する４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２８８】
本アッセイのために使用した装置は、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＭＴＰリーダー（３４０型−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を含んでいた。使用した試薬および溶液は、
１）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキット）；
２）５０ｍＭのリンゴ酸塩バッファー、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ｐＨ５．６）または５０ｍＭのＭＯＰＳ、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ｐＨ７）（希釈バッファー）；および
３）２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０）（停止バッファー）
であった。
【０２８９】
５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７基質を含有するバイアルを１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に溶解させ、３０ｍＬの希釈バッファー中に希釈して４０ｍＬの作業基質（１．３６ｍｇ／ｍＬ）を作成した。アミラーゼ試料（発酵上清）は、希釈バッファーを用いて４０倍に希釈した。アッセイは、５μＬの希釈アミラーゼ溶液をＭＴＰのウエル内に添加し、次に５５μＬの希釈ＢＰＮＰＧ７作業基質溶液を添加することによって実施した。この溶液を混和し、ＭＴＰを、プレートシールを用いて密封し、インキュベーター／シェーカー（ｉＥＭＳ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に２５℃で４分間配置した。７０μＬの停止バッファーを添加することによって反応を停止させ、ＭＴＰリーダー内の４００ｎｍの波長で吸光度を読み取った。非酵素コントロールを使用して、バックグラウンド吸光度値について補正した。
【０２９０】
Ｃ．熱安定性アッセイ
ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ１および変異体の熱安定性は、Ｃｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼアッセイを使用してアミラーゼ活性を決定することによって測定した。本アッセイのために使用した装置は、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）；ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＭＴＰリーダー（３４０型−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｔｅｔｒａｄ２ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＣＲ装置（Ｂｉｏｒａｄ）およびｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んでいた。使用した試薬溶液は、（＊全アッセイ中ではない）：
１）熱応力バッファー
ａ）５０ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ４．５）（５ｐｐｍのＣａＣｌ２、５０ｐｐｍのＮａＣｌ）＊、
ｂ）５０ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ５．０）（１０ｐｐｍのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ）、
ｃ）５０ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ５．７）（５ｐｐｍのＣａＣｌ２、５０ｐｐｍのＮａＣｌ）、
ｄ）５０ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ５．７）（無塩条件）＊、
２）ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｃｅｒａｌｐｈａ  ＨＲキット）：
３）５０ｍＭのリンゴ酸塩バッファー、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ｐＨ５．６）（希釈バッファー）；および
４）２００ｍＭのホウ酸／ＮａＯＨ（ｐＨ１０）（停止バッファー）。
５）アミラーゼ培養上清：１：１０のマスター希釈酵素プレートをＰＣＲプレート内の４種の熱応力バッファーそれぞれの中に１：１０で希釈した。
【０２９１】
５μＬの希釈酵素試料は、５５μＬの希釈ＢＰＮＰＧ７作業基質溶液を含有する９６ウエルのＰＣＲプレートに加え、試料の初期アミラーゼ活性は、セクションＣに記載したＣｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼアッセイを使用して決定した。試料は、下記のようにＰＣＲサーモサイクラー内で３〜６分間にわたり熱応力を受けさせた：バッファー（ａ）５０℃、（ｂ）５９℃〜６０℃、（ｃ）６５℃〜７０℃、および（ｄ）６５℃。熱応力試料を直ちに室温に冷却し、５μＬのアリコートは、セクションＣにおいて記載したようにＣｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼアッセイを使用してアミラーゼ活性についてアッセイした。各変異体について、初期対残留アミラーゼ活性の比を使用して、下記のように熱安定性を計算した：熱安定性＝［ｔｒｅｓｉｄｕａｌ値］／［ｔｉｎｉｔｉａｌ値］。それにより、熱安定性活性比は、熱培養前の酵素活性で割った熱培養後の酵素活性に基づいて計算した。各試料（変異体）に対して、性能指数（ＰＩ）を計算する。熱安定性の安定性に関する性能指数は、変異酵素の熱安定性を、同様に処理された参照酵素の熱安定性と比較することによって決定する。
【０２９２】
Ｄ．デンプン加水分解アッセイ（トウモロコシ粉およびコーンスターチ適用アッセイ）
トウモロコシ粉およびコーンスターチのデンプン加水分解を使用して、ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ１および変異体の比活性を測定した。活性は、トウモロコシ粉またはコーンスターチの酵素的分解により生成した還元末端として測定した。いずれかの基質とのインキュベーション中に生成された還元末端は、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイを用いて定量した。本アッセイのために使用した装置は、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）；ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＭＴＰリーダー（３４０型−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、Ｔｅｔｒａｄ２ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＣＲ装置（Ｂｉｏｒａｄ）、およびｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ならびにバブルパドルリザーバーを含んでいた。
【０２９３】
Ａｚｕｒｅ  Ｆａｒｍｓ有機トウモロコシ粉（Ｎｏｒｃｏ，ＣＡ）は、消費者用コーヒー挽きを使用して微細粉末に製粉し、次に２５０ミクロン未満の分画を得るためにふるいにかけた。ふるいにかけたトウモロコシ粉は、懸濁化および遠心分離を繰り返すことによってＭｉｌｌｉＱ水を用いて徹底的に洗浄した。Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｆａｒｍｓ有機トウモロコシ粉材料も、懸濁化および遠心分離を繰り返すことによってＭｉｌｌｉＱ水を用いて徹底的に洗浄した。
【０２９４】
両方のトウモロコシ粉およびコーンスターチ洗浄分画は、２０重量／重量％ストック溶液としての０．００５％のアジ化ナトリウムを含有するＭｉｌｌｉＱ水中に懸濁させた。ストック溶液は、２０倍のストックバッファー溶液を用いて１０．９重量／体積％のトウモロコシ粉およびコーンスターチ溶液（最終バッファー濃度：５５ｍＭのＫＯＡｃ（ｐＨ５））にさらに希釈した。
【０２９５】
５５μＬの希釈トウモロコシ粉およびコーンスターチ基質を、バブルパドルリザーバーを用いて５μＬの１：１０の希釈酵素試料と一緒にＰＣＲマイクロタイタープレートに加えた。プレートを密封し、８３℃で５分間配置し、その後、４５℃へ下降させた。このデンプン加水分解反応は、７０μＬの０．１ＮのＮａＯＨの添加によって停止させた。プレートを密封し、１６１０ＲＣＦで３分間遠心した。両方の反応からのデンプン加水分解反応生成物は、下記に記載したようなＰＡＨＢＡＨアッセイによって分析した。
【０２９６】
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：８０μＬの０．５ＮのＮａＯＨのアリコートを空のＰＣＲプレート（「ＰＡＨＢＡＨ反応プレート」）の全ウエルに加え、次に２０μＬのＰＡＨＢＡＨ試薬（０．５ＮのＨＣｌ中に溶解させた５重量／体積％のｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｈ９８８２、Ｓｔ．Ｌｕｏｉｓ，ＭＯ）を加えた。この溶液を上下にピペット操作することにより混和した。２０μＬのデンプン加水分解反応上清をＰＡＨＢＡＨ反応プレートの各ウエルに加えた。これらのプレートを密閉し、発色させるために９５℃で２分間にわたりプログラミングしたサーモサイクラー内に配置し、次に２０℃へ冷却した。８０μＬの発色したＰＡＨＢＡＨ反応混合物の試料を新鮮なプレートに移し、分光光度計で４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２９７】
Ｅ．洗浄性能アッセイ
１．小規模  −  ＣＳ−２８米デンプンミクロ材料見本アッセイ
このアミラーゼアッセイの原理は、綿ミクロ材料見本に組み込まれた米デンプンの加水分解に起因するオレンジ色素の遊離である。洗液の４８８ｎｍでの吸光度を測定し、これは、所望の条件（ｐＨ、温度およびバッファー）で分析された試料中のアミラーゼ活性のレベルに関連する。
【０２９８】
本アッセイのために使用した装置は、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ＭＴＰリーダー（３４０型−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んでいた。使用した試薬および溶液は、
１）ＣＳ−２８ミクロ材料見本（米デンプン、着色）；
２）１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ  ８０バッファー（ｐＨ８．０）、導電率１ｍＳ／ｃｍ；
３）２５ｍＭのＣＡＰＳ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ  ８０バッファー（ｐＨ１０．０）；導電率５ｍＳ／ｃｍ（５ＭのＮａＣｌを用いて調整）；
４）１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ  ８０；および
５）５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．１５）、０．１ｍＭのＣａＣｌ２
であった。
【０２９９】
円径が５．５ｍｍのＣＳ−２８ミクロ材料見本は、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＣＦＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供された。２つのミクロ材料見本を９６ウエルＣｏｒｎｉｎｇ  ９０１７平底ポリスチレン製ＭＴＰの各ウエル内に配置した。培養上清は、およそ１ｐｐｍの最終酵素濃度まで５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．１５）、０．１ｍＭのＣａＣｌ２中および引き続いて１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０溶液中で８倍に希釈した。
【０３００】
インキュベーター／シェーカーは、所望の温度である２５℃（周囲温度）または５０℃に設定した。１７４μＬまたは１７７μＬのＨＥＰＥＳまたはＣＡＰＳバッファーのそれぞれを、ＭＴＰを含有するミクロ材料見本の各ウエルに添加し、引き続いて６μＬまたは３μＬの希釈酵素溶液を各ウエルに添加すると、結果として１８０μＬ／ウエルの総量が生じた。ＭＴＰをプレートシールで密閉し、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー中に配置してｐＨ８、低導電率（１ｍＳ／ｃｍ）での洗浄のために１１５０ｒｐｍ、２５℃で１５分間、またはｐＨ１０、高導電率（５ｍＳ／ｃｍ）での洗浄のために１１５０ｒｐｍ、５０℃で１５分間インキュベートした。適切な条件下でのインキュベーション後、各ウエルからの１００μＬの溶液を新規のＭＴＰに移し、ＭＴＰ分光光度計を使用して４８８ｎｍでの吸光度を測定した。バックグラウンド洗浄性能を減じるために、２つのミクロ材料見本およびバッファーを含有するが酵素を含有していないコントロールを含めた。
【０３０１】
各吸光度値は、（酵素の非存在下でのミクロ材料見本のインキュベーション後に得た）ブランクを減じることによって補正し、結果として生じた吸光度は加水分解活性の尺度を提供した。各試料について性能指数（ＰＩ）を計算した。
【０３０２】
洗浄性能指数（ＰＩ）を計算するため、参照酵素コントロールに基づくデータを当てはめるためにラングミュア方程式を使用した。変異体のタンパク質濃度を使用して、曲線当てはめに基づく予想性能を計算した。実測性能は計算性能で割った。この数値を次に参照酵素の性能で割った。
【０３０３】
２．中規模洗浄性能試験法
材料見本からの染み除去を、上記と類似であるが、しかし、中規模条件下においてかつ市販の熱不活化ＫＩＲＫＬＡＮＤ  ＳＩＧＮＡＴＵＲＥ（登録商標）洗剤を用いて試験した。洗剤の熱不活化は、非酵素構成成分の特性を保持しながら酵素的構成成分の活性を破壊するために役立つ。熱不活化は、事前に計量した液体洗剤（ガラス製ボトル入り）を９０℃の水浴中で４時間にわたり実施した。酵素不活性化のパーセンテージを正確に決定するために、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性のそれぞれを測定するためにＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡおよびＣｅｒａｌｐｈａ基質アッセイを使用して、非加熱洗剤および加熱洗剤の両方をアッセイした。
【０３０４】
洗浄処理は、Ｔｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒ内の１Ｌ中で実施した。各ポットに脱イオン水を充填し、水の硬度は１５，０００ｇｐｇの３：１のＣａ：Ｍｇ水硬度ストック液を使用して１ガロン当たり６グレイン（ｇｐｇ）に調整した。熱不活化Ｋｉｒｋｌａｎｄ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ（登録商標）洗剤（０．８ｇ／Ｌ）を加え、温度を１６℃に調整した。評価対象のアミラーゼは、０．０２、０．０５、０．１、０．３または０．５ｐｐｍの最終濃度へ添加した。３０ｇ／Ｌの総織物負荷を提供するために、各ポットに綿バラストを加えた。１３分間の１００ｒｐｍで撹拌しながらの洗浄後、材料見本を低温水道水ですすぎ洗いし、フロントローディング方式の洗濯機で１，０００ｒｐｍの脱水サイクルで７分間脱水した。洗浄後、材料見本は、低温で機械乾燥させ、上述のように光反射率を測定した。
【０３０５】
３．全規模洗浄試験法
材料見本からの染み除去を、ｐＨ８．０の緩衝条件下において、市販の熱不活化ＫＩＲＫＬＡＮＤ  ＳＩＧＮＡＴＵＲＥ  ＵＬＴＲＡ  ＣＬＥＡＮ（商標）洗剤を用いて試験した。
【０３０６】
試験材料見本のそれぞれの上の汚れの量を、処理の前後にＤ６５（６５００°Ｋ）標準光に設定したＫｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａハンドヘルド型分光光度計ＣＭ−６００Ｄを使用して光反射率によって測定した。Ｌ値、ａ値、ｂ値における差は、ＣＩＥ−ＬＡＢ色空間によって規定された全色差（ｄＥ）に転換させた。染みの洗浄は、洗浄の前後の色差間の比を入手し、それを未洗浄汚れ（洗浄前）と汚れていない織物との差と比較することにより、染み除去指数（ＳＲＩ（％））として表示した。各タイプの汚れの４つの材料見本を同一条件下での２回の洗濯機での洗浄に含めた。１つの汚れにつき計８回の測定値を得るために、各材料見本の中央領域をスキャンした。洗浄処理は、Ｍａｙｔａｇ  Ｃｅｎｔｕｒｙ洗濯機の５８Ｌ中で実施した。洗濯機に「低温自動温度」設定を使用して水を充填し、水の硬度は、１５，０００ｇｐｇの３：１のＣａ：Ｍｇ水硬度ストック液を使用して１ガロン当たり６グレイン（ｇｐｇ）に調整した。熱不活化ＫＩＲＫＬＡＮＤ  ＳＩＧＮＡＴＵＲＥ  ＵＬＴＲＡ  ＣＬＥＡＮ（登録商標）洗剤（０．７５ｇ／Ｌ）を加え、温度を１６℃に調整した。プロテアーゼＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のアリコートを、最終濃度が０．４３ｐｐｍとなるように添加し、評価対象のα−アミラーゼを、最終濃度が０．０４３ｐｐｍとなるように添加した。４０ｇ／Ｌの総織物負荷を提供するために、木綿のタオル、綿のＴシャツおよびポリエステル綿のシーツの混合物をバラストとして加えた。洗浄条件は、次の通りであった：１３分間の洗浄に２．５分間の水深の深い水でのすすぎを行い、１６℃のすすぎ温度、高速撹拌および急速脱水を実施した。洗浄後、材料見本を低温で機械乾燥させ、上述のように光反射率を測定した。
【０３０７】
Ｆ．洗剤安定性アッセイ
市販の液体洗剤ＰＥＲＳＩＬ  ＢＩＯ（登録商標）（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）を購入し、上述のように熱不活化した。試料を調製するために、プロテアーゼ（ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ  ＨＡ）およびアミラーゼは、洗浄中の最終濃度がそれぞれ０．５および０．０５ｐｐｍとなるように各洗剤試料に添加して混和した。試料を３７℃のＣＯ２インキュベーター（Ｓａｎｙｏ）中で保管し、アリコートを各反応試料から様々な時点に採取し、１％のＢＳＡを添加した５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．１５）バッファー中に希釈し、Ｃｅｒａｌｐｈａ基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｎｃ）を使用してα−アミラーゼ活性を測定した。各試料の活性は、較正標準物質を使用するＡｒｅｎａ  ２０ＸＴ光度測定分析機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。インキュベーション後の残留活性は、ゼロ時点に決定した総活性の百分率として報告した。
【０３０８】
参照アミラーゼおよびそれの変異体の安定性は、既定の条件下において、１０％の洗剤混合液（市販で購入したＰＥＲＳＩＬ  ＣＯＬＯＲ  ＧＥＬ（登録商標）洗剤、Ｈｅｎｋｅｌ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２０１１年に購入）の存在下でインキュベーション後の活性を測定することによって決定した。洗剤は使用前に熱不活化し、水で希釈し、初期および残留アミラーゼ活性は、上述のＣｅｒａｌｐｈａα−アミラーゼアッセイを使用して決定した。
【０３０９】
Ｇ．熱安定性
変異体の熱安定性について、事前に選択した温度（デフォルトは８５℃）および所望のｐＨにおいて、５０ｍＭの酢酸カリウム、０．１２５ｍＭのＣａＣｌ２および２．２ｍＭのＮａＣｌ中で試験した。各変異体のストック溶液は、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中において、最終タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように精製変異体を希釈することによって調製し、次に各変異体を上記の各バッファー（最終酵素用量は５μｇ／ｍＬである）中で（２００倍に）さらに希釈した。希釈酵素溶液を２分間にわたり適切な温度に予備加熱し、次に任意のタンパク質凝集体を崩壊させるために氷上で冷却した。５０μＬの各酵素溶液を０．２ｍＬのＰＣＲストリップチューブに移し、これを（バッファーのｐＨに基づいて）適切な温度に加熱し、２時間にわたりインキュベートした。試料は、次に、熱応力期間を終了させるために氷水浴中に配置した。
【０３１０】
各バッファーについて全時点を収集したら、実施例１で記載したように、Ｃｅｒａｌｐｈａアッセイを使用して残留活性を決定した。各変異体について、２回の独立不活化時間経過実験を実施した。崩壊速度定数（ｋ）を決定するために、残留活性対時間のプロットを、単一指数関数的崩壊方程式を用いてモデリングした。崩壊の半減期は、Ｉｎ（２）／ｋであると定義された。これらの実験は、各変異体について２回ずつ実施した。
【０３１１】
各変異体についての性能指数（ＰＩ）は、変異体の半減期対参照親分子の半減期の比率であると定義された。
【０３１２】
Ｈ．ピークおよび最終流動性／粘度計アッセイ
ラピッドビスコアナライザー（ＲＶＡ  Ｓｕｐｅｒ４，Ｐｅｒｔｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｅｇｅｒｓｔｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、酵素が高温でトウモロコシ粉スラリーの粘度を破壊する能力を測定した。ＲＶＡアルミニウム缶（試料缶および二重撹拌スカートパドル、Ｐｅｒｔｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｅｇｅｒｓｔｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）に入れる３３ｇの２５％（ｄｓ）スラリーを調製するために、トウモロコシ粉をＤＩ水と混和した。スラリーのｐＨは、１Ｎの硫酸を用いてｐＨ５．０に調整した。ラピッドビスコアナライザーのプログラムは、７０℃で開始して、直ちに９５℃へ上昇させてその温度で維持するようにローディングした。酵素添加後、二重スカートパドルを缶の上に配置し、直ちに１０分間の総ラン時間にわたりＲＶＡ内に入れた。粘度を連続的に測定し、全ランにわたりＲＶＡによって収集した。酵素は、１０、３０および５０μｇで試験した。プロットは、粘度変化のピーク時の粘度に反比例するピーク流動性（１／ｃＰ）および粘度変化の終了時の粘度に反比例する最終流動性（１／ｃＰ）のタンパク質用量依存性を示している。
【０３１３】
実施例２
ＣｓｐＡｍｙ２変異体の生成
ＣｓｐＡｍｙ２の変異体を発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌株の生成は、表２に記載の変異体と同様に、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載されており、表２ではＲ１７８位およびＧ１７９位での欠失が「ｄｅｌ（Ｒ１７８，Ｇ１７９）」として表示されており、アミノ酸位置のナンバリングは配列番号１を参照している。
【０３１４】
【表２】
2019500058.tif 000006
【０３１５】
実施例３
Ｃ１６ＥおよびＣ１６Ｆをベースとする追加のＣｓｐＡｍｙ２変異体
表３に列挙した、ＣｓｐＡｍｙ２−Ｃ１６ＥおよびＣｓｐＡｍｙ２−Ｃ１６Ｆをベースとする追加の変異体（それぞれＣ１６ＥおよびＣ１６Ｆと略記する）は、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載されたように構築した。追加の全変異体は全部がＣ１６ＥまたはＣ１６Ｆの全突然変異を含むことが理解されるであろう。上述のように、アミノ酸位置のナンバリングは、配列番号１を参照している。
【０３１６】
【表３】
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【０３１７】
上記の分子の低ｐＨ安定性（すなわち、秒数で示した半減期値）を実施例１に記載したようにｐＨ４．５、４．８および５．０で実質的に試験し、Ｃ１６ＥおよびＣ１６Ｆと比較した。全酵素は、２０分間のアッセイにおいてｐＨ５．３、９９℃で極めて安定性であった。熱不活化は、低ｐＨ値でのみ観察された。これらの低ｐＨ値では、変異体Ｃ１６Ｅ−ＡＹおよびＣ１６Ｅ−Ｙが最高熱安定性を有していた。各ｐＨでの変異体それぞれの秒数での半減期値は、表４に示した。
【０３１８】
【表４】
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【０３１９】
ピークおよび最終流動性の粘度は、実施例１に記載したように測定した。デンプン基質と変異体Ｃ１６ＥおよびＣ１６Ｅ−ＡＹとのインキュベーションの結果として生じた酵素１ｍｇ当たりのピーク流動性値は、図１に示した。最終流動性値は、図２に示した。
【０３２０】
実施例４
Ｃ１６Ｅをベースとする別の追加のＣｓｐＡｍｙ２変異体
Ｃ１６Ｅをベースとする別の追加の変異体は、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載されたように構築した。存在する変異体および突然変異の名称は、表５に示した。突然変異Ｗ１５３Ｆは、１５３位での野生型残基への復帰を表すことに留意されたい。このため、Ｃ１６Ｅ−ＡＹ−Ｗ１５３Ｆは、ＣｓｐＡｍｙ２に対して１５３位での突然変異を有していない。
【０３２１】
【表５】
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【０３２２】
ピークおよび最終流動性の粘度は、このアッセイの酵素の用量が異なる以外には、実施例１に記載したように測定した。デンプン基質と、Ｃ１６Ｅをベースとする変異体Ｃ１６Ｅとのインキュベーションの結果として生じた酵素１ｍｇ当たりのピーク流動性値は、図３に示した。最終流動性値は、図４に示した。
【０３２３】
実施例５
追加のＣｓｐＡｍｙ２−ｖ５をベースとする変異体
表６に示した追加のＣｓｐＡｍｙ２−ｖ５をベースとする変異体は、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載されたように構築した。上述のように、Ｒ１７８位およびＧ１７９位での欠失は、「ｄｅｌ（Ｒ１７８，Ｇ１７９）」と示され、アミノ酸位置のナンバリングは、配列番号１を参照している。
【０３２４】
【表６】
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【０３２５】
実施例６
ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ５をベースとする変異体の洗浄性能および洗剤安定性
精製ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ５をベースとする変異体の中規模および全規模洗浄性能を、実施例１において上述したように実施したミクロ材料見本洗浄アッセイにおいて分析した。小規模および全規模洗剤安定性についても、実施例１において上述したように実施した。結果は、表７〜９に示した。
【０３２６】
【表７】
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【０３２７】
【表８】
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【０３２８】
【表９】
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【０３２９】
変異体ｖ１９５およびｖ１９６は、様々な固体上での中規模および全規模試験において、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）およびＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ  １００を含む標準物質に対して改良された洗浄性能を示す（本明細書では３種の汚れについてデータを提示した）。同一の２つの変異体ｖ１９５およびｖ１９６も、ＣｓｐＡｍｙ２−ｖ５、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）およびＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ  １００を含む標準物質と比較して、液体洗剤における加速応力試験において優れた安定性を示した。
【０３３０】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために、および個別の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれると特にかつ個別に指示されている場合と同程度までこれにより参照して全体として本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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