(57)【要約】  ヒトＩＬ−３３に結合し、それを中和する抗体、およびその使用方法が提供され、該抗体は、アトピー性皮膚炎の治療を含むアレルギー性疾患に関連する状態を治療するための薬剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−３３に結合する抗体であって、それぞれ配列番号１６の２つのＬＣＤＲ１、それぞれ配列番号１７の２つのＬＣＤＲ２、それぞれ配列番号１８の２つのＬＣＤＲ３、それぞれ配列番号１３の２つのＨＣＤＲ１、それぞれ配列番号１４の２つのＨＣＤＲ２、およびそれぞれ配列番号１５の２つのＨＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２】
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＳｅｒであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＬｅｕであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＡｌａであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＳｅｒである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＰｈｅであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＬｅｕであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＬｅｕであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＰｒｏである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＰｈｅであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＩｌｅであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＬｅｕであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＰｒｏである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
各ＬＣＶＲが、配列番号４、配列番号８、または配列番号１２であり、各ＨＣＶＲが、配列番号３、配列番号７、または配列番号１１である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
各ＬＣＶＲが配列番号４であり、各ＨＣＶＲが配列番号３である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
各ＬＣＶＲが配列番号８であり、各ＨＣＶＲが配列番号７である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
各ＬＣＶＲが配列番号１２であり、各ＨＣＶＲが配列番号１１である、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
各ＬＣが、配列番号２、配列番号６、または配列番号１０であり、各ＨＣが、配列番号１、配列番号５、または配列番号９である、請求項１または請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
各ＬＣが配列番号２であり、各ＨＣが配列番号１である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
各ＬＣが配列番号６であり、各ＨＣが配列番号５である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
各ＬＣが配列番号１０であり、各ＨＣが配列番号９である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体と、１つ以上の薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
１つ以上のアレルギー性疾患の治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アトピー性皮膚炎の治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、および慢性閉塞性肺疾患のうちの少なくとも１つの治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
クローン病の治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
療法における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
１つ以上のアレルギー性疾患の治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
アトピー性皮膚炎の治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療に使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
クローン病の治療における使用のための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
１つ以上のアレルギー性疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２８】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
アトピー性皮膚炎の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３１】
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３２】
クローン病の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野にある。より具体的には、本発明は、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）に対する抗体およびその医薬組成物に関する。本発明の抗体は、アトピー性皮膚炎の治療に有用であると期待される。
【０００２】
アトピー性皮膚炎（アトピー性湿疹としても知られている）は、再発性の赤くかゆみのある病変を特徴とする慢性炎症性アレルギー性皮膚疾患である。アトピー性皮膚炎患者には、皮膚の不適切な免疫反応ならびに表皮の構造および機能の変化による皮膚の炎症の２つの主要な病態生理学的異常が認められる。炎症性浸潤物は、細胞の混合物、特にＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を発現する免疫細胞からなる。これらのサイトカインは、喘息およびアレルギー性鼻炎を含む他のアレルギー性疾患で上昇することが多い。
【０００３】
アトピー性皮膚炎は、皮膚疾患に起因する主な致命的でない健康上の負担として説明される。それはほとんどの場合乳児期に始まり、１０人の子供のうち２人に影響を与えるが、成人にも多発している。慢性アトピー性皮膚炎に罹患している大半の成人は、ほぼ生涯にわたる疾患を有する。目に見える病変によるかゆみ、睡眠不足、および社会的困惑は、患者およびその親戚の心理社会的幸福に大きな影響を及ぼす。小児では、健康関連の生活の質に対するアトピー性皮膚炎の影響は、喘息および糖尿病などの他の主要な小児期障害のそれと同じである。アトピー性皮膚炎を有する大半の人は、アレルギーの個人歴または家族歴がある。
【０００４】
現在、アトピー性皮膚炎は治癒することができず、疾患管理の目的は、症状を制御または改善し、多段階のアプローチで長期の疾患制御を達成することである。主な原則は、皮膚軟化薬による継続的な表皮バリア修復、個々の誘発因子の回避、および局所用コルチコステロイドまたはカルシニューリン阻害薬による抗炎症療法である。重度の罹患例では、光線療法または全身性免疫抑制薬が用いられる。したがって、アトピー性皮膚炎を有する患者のための追加の有効な治療法が必要とされている。
【０００５】
ＩＬ−３３は、ＩＬ−１サイトカインスーパーファミリーのメンバーであり、主にケラチノサイト、上皮細胞、および内皮細胞によって発現される。ＩＬ−３３は、数種類の先天性および後天性免疫細胞を活性化して他の炎症誘発性メディエーターの産生を引き起こし、最も頻繁には２型またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）免疫応答を促進する上皮サイトカインとして特徴付けられる。当技術分野において公知のＩＬ−３３に結合し、それを中和する抗体がいくつかある。例えば、米国公開第２０１６／０１６８２４２Ａ１号および国際公開第ＷＯ２０１５／１０６０８０Ａ２号は、ヒトＩＬ−３３に結合するある特定の抗体を開示している。しかしながら、高い親和性でヒトＩＬ−３３に結合し、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患を治療するのに治療上有効である代替の抗体が必要とされている。改善された親和性および優れたＩＣ５０は投薬上の利益を可能にし得る。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎、および喘息などのアレルギー性疾患を有する患者のための代替の抗体療法の必要性に対処する。いくつかの実施形態では、アレルギー性疾患はアトピー性皮膚炎である。本発明はまた、好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、および慢性閉塞性肺疾患を含む持続性炎症性疾患を有する患者のための代替の抗体療法の必要性にも対処する。本発明はまた、クローン病を有する患者のための代替の抗体療法の必要性にも対処する。
【０００７】
本発明は、ヒトＩＬ−３３に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本抗体は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１６であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１７であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１５である。いくつかのそのような実施形態では、配列番号１３の６位のＸａａはＳｅｒであり、配列番号１５の２位のＸａａはＬｅｕであり、配列番号１７の６位のＸａａはａｌａであり、配列番号１８の６位のＸａａはＳｅｒである。他のそのような実施形態では、配列番号１３の６位のＸａａはＰｈｅであり、配列番号１５の２位のＸａａはＬｅｕであり、配列番号１７の６位のＸａａはＬｅｕであり、配列番号１８の６位のＸａａはＰｒｏである。他のそのような実施形態では、配列番号１３の６位のＸａａはＰｈｅであり、配列番号１５の２位のＸａａはＩｌｅであり、配列番号１７の６位のＸａａはＬｅｕであり、配列番号１８の６位のＸａａはＰｒｏである。
【０００８】
本発明はまた、ヒトＩＬ−３３に結合する抗体も提供し、本抗体は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号８、または配列番号１２であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号３、配列番号７、または配列番号１１である。特定の実施形態では、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号４であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号３である。別の特定の実施形態では、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号８であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７である。別の特定の実施形態では、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号１１である。
【０００９】
本発明はまた、ヒトＩＬ−３３に結合する抗体も提供し、本抗体は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６、または配列番号１０であり、ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号５、または配列番号９である。特定の実施形態では、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号２であり、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号１である。別の特定の実施形態では、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号６であり、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号５である。別の特定の実施形態では、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９である。
【００１０】
本発明はまた、ヒトＩＬ−３３に結合する抗体も提供し、本抗体は、２つのＬＣおよび２つのＨＣを含み、各ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号６、または配列番号１０であり、各ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号５、または配列番号９である。特定の実施形態では、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号２であり、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号１である。特定の実施形態では、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号６であり、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号５である。別の特定の実施形態では、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０であり、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９である。
【００１１】
本発明はまた、本発明の抗体、および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、アレルギー性疾患の治療に使用することができ、そのような治療は、治療を必要とする患者に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの特定の実施形態では、アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、クローン病の治療に使用することができる。
【００１２】
本発明は、アレルギー性疾患の治療方法も提供し、これには、治療を必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む。いくつかのそのような実施形態では、アレルギー性疾患はアトピー性皮膚炎である。他のそのような実施形態では、アレルギー性疾患は喘息である。他のそのような実施形態では、アレルギー性疾患は食物アレルギーである。他のそのような実施形態では、アレルギー性疾患はアレルギー性鼻炎である。本発明は、アトピー性皮膚炎の治療方法も提供し、これには、治療を必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、および慢性閉塞性肺疾患のうちの少なくとも１つの治療方法も提供し、これには、治療を必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明はまた、クローン病の治療方法も提供する。
【００１３】
本発明はまた、療法で使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アレルギー性疾患の治療に使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供し、アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである。特定の実施形態では、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療に使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療に使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、クローン病の治療に使用するための、本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。
【００１４】
ある実施形態では、本発明は、アレルギー性疾患の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物の使用も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アレルギー性疾患の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物の使用を提供し、アレルギー性疾患は、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである。特定の実施形態では、本発明は、アトピー性皮膚炎の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、クローン病の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物の使用を提供する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の抗体をコードする核酸分子にも関する。ある実施形態では、本発明は、ＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、ＨＣのアミノ酸配列は、配列番号９である。いくつかのそのような実施形態によると、ＤＮＡ分子は、配列番号２０によって示されるポリヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
ある実施形態では、本発明は、ＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、ＬＣのアミノ酸配列は、配列番号１０である。いくつかのそのような実施形態によると、ＤＮＡ分子は、配列番号２１によって示されるポリヌクレオチド配列を有する。
【００１７】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２０によって示され、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２１によって示される。
【００１８】
本発明はまた、ＤＮＡ分子（複数可）で形質転換された哺乳動物細胞も提供し、その細胞は、本発明のＨＣおよびＬＣを含む化合物を発現することができ、ＨＣは配列番号９によって示され、ＬＣは配列番号１０によって示される。また、本発明は、ＨＣおよびＬＣを含む化合物を産生するためのプロセスを提供し、これには、本発明の抗体が発現されるような条件下で哺乳動物細胞を培養することが含まれる。本発明はまた、該プロセスによって産生される抗体も提供する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、新規エピトープにおいてヒトＩＬ−３３と接触する抗体を提供し、エピトープは、配列番号１９の以下の残基：２３位にＳｅｒ、２４位にＰｒｏ、２５位にＩｌｅ、２６位にＴｈｒ、２７位にＧｌｕ、２８位にＴｙｒ、２９位にＬｅｕ、６９位にＴｙｒ、７１位にＧｌｕ、８３位にＶａｌ、８４位にＡｓｐ、８６位にＬｙｓ、８８位にＬｅｕ、１２６位にＬｅｕ、１２８位にＡｓｎ、１２９位にＭｅｔ、１３２位にＡｓｎ、１３３位にＣｙｓ、１３４位にＶａｌ、１７５位にＧｌｕ、および１７６位にＴｈｒを有する。そのような実施形態では、エピトープはＸ線結晶学によって決定され、結合Ｆａｂ上の別の残基の４．５Å以内のＩＬ−３３上の任意の残基が接触部位と見なされる。したがって、本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体の可変領域と接触している抗原の部位を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分は、その中に含有されるＣＤＲを介した抗原認識を主に担う約１００〜１２０個のアミノ酸の可変領域を含む。ＣＤＲは、フレーム領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域とともに点散している。各ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。ＬＣの３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と呼ばれ、ＨＣの３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。すなわち、ＣＤＲは、抗原の残基と（４．５Å以内で）接触している残基の大部分を含有する。したがって、抗体が特定の抗原に結合する機能的能力は、６つのＣＤＲ内のアミノ酸残基によって大きく影響される。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規則（Ｋａｂａｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、Ｎｏｒｔｈ番号付け規則（Ｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＤＲ  Ｌｏｏｐ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８−２５６（２０１１））、およびＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１−１７．Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，Ｌｅｖｉｔｔ  Ｍ，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ＳＪ，Ａｉｒ  Ｇ，Ｓｈｅｒｉｆｆ  Ｓ，Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｄ，Ｔｕｌｉｐ  ＷＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８３）に基づく。本発明の抗体のＣＤＲは、表１に従って定義される。
【表１】
2019534282.tif 000002
【００２１】
本発明の抗体は、既知の方法を用いて調製および精製することができる。例えば、ＨＣ（例えば、配列番号９によって示されるアミノ酸配列）およびＬＣ（例えば、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列がクローニングされ、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）発現ベクター内に遺伝子操作され得る。次いで、遺伝子操作を受けた免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞中に安定してトランスフェクトすることができる。当業者であれば理解されるように、抗体の哺乳類動物発現は、典型的には、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位においてグリコシル化をもたらす。安定なクローンは、ＩＬ−３３に特異的に結合する抗体の発現について確認することができる。陽性クローンは、バイオリアクターにおける抗体産生のために無血清培地中で増殖させることができる。抗体が分泌された培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水のような適合する緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  ＡまたはＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに便利に適用され得る。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗体は、例えばｐＨ勾配により溶出され、抗体分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され、その後プールされる。抗体は、一般的な技法を用いて濃縮および／または滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技法によって効率的に除去することができる。産物は、例えば−７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。
【００２２】
本発明の抗体は、当技術分野において周知の方法によって調製することができ、本発明の抗体、および１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物に組み込むことができる。
【００２３】
有効量の本発明の抗体を含む医薬組成物は、本明細書に記載される疾患もしくは障害の危険性がある、またはそれを呈する患者に、非経口経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）によって投与することができる。「有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに（投薬量で、ならびに投与の期間および手段に）必要な量を指す。有効量の抗体は、個人の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個人における所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて変動し得る。有効量はまた、本発明の抗体の任意の毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果が上回る量でもある。
【００２４】
本発明の抗体は、患者の治療に使用することができる。より詳細には、本発明の抗体は、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、および食物アレルギーなどのアレルギー性疾患を治療することが期待される。アレルギー疾患は、通常大半の人に無害である物質に対する異常な免疫応答を伴う一連の慢性状態である。本発明の抗体はまた、好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、および慢性閉塞性肺疾患を治療することも期待される。本発明の抗体はまた、クローン病を治療することも期待される。
【００２５】
本明細書で互換的に使用される場合、「治療」および／または「治療すること」および／または「治療する」は、本明細書に記載される障害の進行の緩徐化、妨害、抑止、制御、停止、または反転が存在し得る全てのプロセスを指すことが意図されるが、全ての障害症状の完全な消失を必ずしも示さない。治療は、ＩＬ−３３活性の低下から利益を得るであろうヒトにおける疾患または状態の治療のための本発明の抗体の投与を含み、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、および（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくは障害の退行を引き起こすか、またはその症状もしくは合併症を緩和することを含む。
【００２６】
抗体遺伝子操作
親のヒト抗ＩＬ−３３抗体をヒトＩＬ−３３への結合について最適化した。これを達成するために、単離されたＶＨおよびＶＬのＣＤＲを突然変異誘発によって無作為化し、得られた抗体を、ＥＬＩＳＡを用いてヒトＩＬ−３３への結合についてスクリーニングした。次いで、親和性増強変異を組み合わせて抗体２３を得、次いでこれを、フレームワークライブラリーアプローチを用いて最適化した。フレームワークライブラリーについては、抗体２３ＣＤＲを含有する１２のヒトＶＨフレームワーク生殖系列遺伝子（１−２４、１−４６、１−６９、２−５、３−１５、３−２３、３−５３、３−７２、４−０４、４−３９、５−５１、および６−０１）ならびに８つのヒトＶＬフレームワーク遺伝子（Ａ−１９、Ａ−２６、Ａ−２７、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｌ−２、Ｌ−１２、およびＯ−２）を合成し、重鎖および軽鎖のヒトＩｇＧ４発現ベクターにクローニングした。９６の重鎖および軽鎖の組み合わせ全ての２９３ＨＥＫ一過性トランスフェクションの後、上清を、プレート上に直接コーティングしたヒトＩＬ−３３への結合、および抗ヒトカッパ抗体を有する上清からヒトＩｇＧを捕捉した後の溶液中のビオチン化ＩＬ−３３への結合についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。３−５３重鎖ヒトフレームワークおよびＡ２７ヒト軽鎖フレームワークを利用する、抗体抗体２３由来のＣＤＲを有するヒト抗体をさらなる開発のために選択した（抗体７５）。一過性ＣＨＯにおける抗体７５の発現は、抗体２３と比較して高い発現力価をもたらした。さらに、抗体７５の精製は、抗体２３よりも高い精製収率をもたらした。抗体２３と比較して、抗体７５でもヘパリンへの非特異的結合の減少が観察された。全体として、抗体７５は抗体２３と比較して好ましい特性を有していた。抗体７５は１４．５ｐＭの親和性でヒトＩＬ−３３に結合し、１２，４００ｐＭの親和性でカニクイザルＩＬ−３３に結合し、これは種交差反応性において約８５０倍の差を表す。
【００２７】
次いで、抗体７５をカニクイザルＩＬ−３３への結合について最適化した。これを達成するために、抗体７５の単離されたＶＨおよびＶＬのＣＤＲを突然変異誘発によって無作為化し、得られた抗体をＥＬＩＳＡによってヒトＩＬ−３３およびカニクイザルＩＬ−３３への結合についてスクリーニングした。次いで、ヒトＩＬ−３３に対する親和性に有意な影響を与えなかったカニクイザルに対する親和性増強変異を組み合わせて抗体５４を得た。抗体５４は４６ｐＭの親和性でヒトＩＬ−３３に結合し、２１７ｐＭの親和性でカニクイザルＩＬ−３３に結合し、これは種交差反応性において５倍の差を表す。次いで、抗体５４をさらに遺伝子操作して潜在的な免疫原性を低下させ、それにより抗体４３が得られた。アミノ酸配列識別番号は、抗体４３、５４、および７５について以下に提供される。
【表２】
2019534282.tif 000003
【実施例】
【００２８】
実施例１：例示の抗体の発現および精製
本発明の抗体は、周知の方法により生合成、精製、および投与用に製剤化することができる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、２つのベクターが使用される場合、所定のＨＣ：ＬＣベクター比を用いて抗体を分泌するための発現系、または重鎖および軽鎖の両方をコードする単一ベクター系を、一過性または安定のいずれかでトランスフェクトされる。これらの一般的に使用される宿主細胞からの抗体の発現および分泌に適したベクターは周知である。
【００２９】
抗体の発現および分泌後、培地を清澄化して細胞を除去し、多くの一般的に使用される技法のうちのいずれかを用いて清澄化した培地を精製する。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  ＡまたはＧカラムに適用され得る。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合された抗体は、例えばｐＨ勾配（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８〜０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５など）によって溶出される。抗体断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により検出し、次いでプールする。意図する使用に応じて、さらなる精製は任意選択的である。抗体は、一般的な技法を用いて濃縮および／または滅菌濾過され得る。宿主細胞および成長培地構成成分、ならびに抗体の可溶性凝集体および多量体などの抗体以外の他の材料は、サイズ排除、疎水性相互作用、陽イオン交換、陰イオン交換、親和性、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に減少または除去され得る。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、典型的には、９５％を超える。産物は、−７０°Ｃで凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。
【００３０】
例示の抗体４３は、それぞれ配列番号２０および配列番号２１のＤＮＡ配列を組み込んだ別個の重鎖および軽鎖発現ＤＮＡベクターの同時トランスフェクション後にＣＨＯ細胞において一過性に発現されたか、またはそれぞれ重鎖および軽鎖をコードする、配列番号２０および配列番号２１の両方のＤＮＡ配列を組み込んだ単一のＤＮＡベクターのトランスフェクション後にＣＨＯ細胞において安定に発現されたかのいずれかであった。７日間の一過性ＣＨＯ培養または１４日間のＣＨＯバルク培養のいずれかから採取した培地を清澄化し、得られた粗上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィーによって精製した。抗体４３は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂に結合し、低ｐＨ緩衝液を用いて溶出された。一過性ＣＨＯから産生された物質については分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用するか、または安定なＣＨＯから産生された物質についての研磨ステップとして陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するいずれかで溶出した抗体をさらに精製した。抗体４３の最終純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析用ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳ分析によって評価した。Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ分析を使用して、エンドトキシンレベルは、＜１ＥＵ／ｍｇであることが示された。精製した抗体４３をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．２中に４℃で保存した。
【００３１】
インビトロ結合親和性および速度論
【００３２】
ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびウサギのＩＬ−３３に対する抗体４３の結合速度論および親和性は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）泳動緩衝液でプライミングされ、分析温度を３７ｏＣに設定したＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００またはＴ２００機器のいずれかで表面プラズモン共鳴アッセイを用いて決定される。４つ全てのフローセル（Ｆｃ）上の固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを含有するＣＭ４チップ（標準ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成された）を使用して、捕捉方法を用いる。抗体試料を泳動緩衝液中１０μｇ／ｍＬで調製する。マウス、ラット、およびウサギのＩＬ−３３試料を、泳動緩衝液中１０００、５００、２５０、１２５、６３、３１、１６、および０ｎＭの最終濃度で調製する。ヒトおよびカニクイザルＩＬ−３３試料を、泳動緩衝液中２５０、１２５、６３、３１、１６、８、４、２、１、および０ｎＭの最終濃度で調製する。各分析サイクルは、（１）抗体試料を別個のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３、またはＦｃ４）上に捕捉するステップ、（２）全てのフローセルに２００μＬのＩＬ−３３を１００μＬ／分で注入するステップ、（３）複合体の解離を監視するために１００μＬ／分で最低１０分間緩衝液フローに戻るステップ、（４）７．５マイクロリットルのグリシン、ｐＨ１．５を２回連続して注入してチップ表面を再生するステップ、および（５）サイクルを繰り返す前に５分間チップ表面を平衡化するステップを伴う。各ＩＬ−３３濃度を二つ組で注入する。データを、標準的な二重参照を用いて処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン２．０．１を用いて１：１結合モデルに適合させて、会合速度（ｏｎ速度、ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）および解離速度（ｏｆｆ速度、ｋｏｆｆ、ｓ−１単位）を決定する。ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎの関係から平衡解離定数（ＫＤ）を計算し、これはモル単位によるものである。ヒトおよびカニクイザルＩＬ−３３への抗体４３の結合について、３回の実験的反復（ｎ）を実施する。
【００３３】
本質的に上述のような手順に従って、抗体４３は、ヒトＩＬ−３３およびカニクイザルＩＬ−３３に対して濃度依存的な結合応答を有した。注射されたマウス、ラット、およびウサギのＩＬ−３３の最高濃度（１０００ｎＭ）で、結合応答シグナルは理論上の最大値の半分の応答シグナルに達しなかった。その結果、マウス、ラットおよびウサギのＩＬ−３３に対する抗体４３のＫＤは、＞１０００ｎＭであると推定された。上述と同様の方法を使用して、抗体７５および抗体５４の結合速度論および親和性を決定した。同様の方法を使用して、ＡＰＥ４９０９のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列を有する抗ＩＬ−３３ＩｇＧ４抗体（本発明ではない）（ＷＯ１５１０６０８０に開示されており、本明細書では「抗体６」と呼ぶ）の結合速度論および親和性も決定した。これらの結果を、表２に示す。
【表３】
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【００３４】
ヒトＩＬ−３３および他のＩＬ−１ファミリーメンバーへの結合のインビトロでの特徴付け。
【００３５】
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー２０００を使用して、抗体４３のヒトＩＬ−３３に対する結合特異性を示し、例示の抗体がヒトＩＬ−１タンパク質ファミリーの他のメンバーに結合しないことを示す。
【００３６】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、Ｎ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合物を使用して、遊離アミン基を介してＣＭ５バイオセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフローセル１および２上のカルボキシル基にカップリングさせる。陽性対照抗体を捕捉するために、ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｆｃ特異的）をフローセル３にカップリングさせ、ウサギ抗ラットＩｇＧ（Ｆｃ特異的）をフローセル４にカップリングさせる（両方ともＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから）。フローセルを、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０を含有する緩衝液を使用して３０μＬ／分の流速で監視する。抗体４３をフローセル２上に捕捉して、合計３００〜８００応答単位を得る（ＲＵ；結果はフローセル２からフローセル１を引いたものを反映する）。結合試験の後に、各サイクルの間にグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を使用した再生ステップが続く。フローセル１は、試験した分析物の非特異的結合を監視するための対照として使用される。例示の抗体は、５００ｎＭの濃度で、列挙されているヒトＩＬ−１タンパク質ファミリーの全ての分析物で試験される。
【００３７】
本質的に上述のような手順に従って、表３の結果は、抗体４３がヒトＩＬ−３３にのみ結合し、ＩＬ−１ファミリーの他のメンバーには結合しないことを示す。
【表４】
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【００３８】
インビトロでのＧＥＣ  ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＩＬ−３３の中和。
【００３９】
ＮＦκＢ−ルシフェラーゼ構築物で安定的にトランスフェクトされたヒト糸球体内皮細胞（ＧＥＣ）を使用して、抗体４３がＩＬ−３３誘導ＮＦκＢ活性を阻害する能力を決定する。ＧＥＣ株は、ＳＴ２受容体およびその共受容体ＩＬ１ＲＡＰを天然に発現する。ヒトＩＬ−３３に応答して、ＮＦκＢ経路はＧＥＣにおいて活性化される。
【００４０】
ＧＥＣ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞をアッセイ培地（ＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ培地（ＬＯＮＺＡ）およびピューロマイシン）中で培養する。アッセイの前日に、ＧＥＣ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞を、白壁コラーゲンＩ処理プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ）の５０μｌ／ウェルに５，０００細胞で平板培養し、プレートを一晩インキュベートする。
【００４１】
翌日、細胞をＩＬ−３３の存在下、抗体４３で処理した。各試験について、１ウェルあたり０〜１３３．３ｎＭの用量範囲で、１ウェルあたり２５μｌの例示の抗体を添加する。次いで、２５μｌのヒトＩＬ−３３を各ウェルに１２６ｐＭの最終濃度（ＭＷ＝２０ｋＤａに基づく）で添加する。ヒト単量体ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１）をアッセイにおける陽性対照として０〜１４２．９ｎＭ（ＭＷに基づく最終濃度＝３５ｋＤａ）の用量範囲で使用し、アイソタイプ対照抗体をアッセイにおける陰性対照として０〜１３３．３ｎＭ（ＭＷに基づく最終濃度＝７５ｋＤａ）の用量範囲で使用する。すべての試料は三つ組で実行される。９６ウェルプレートを３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２で４時間インキュベートし、その後１００μｌ／ウェルのＯｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼ溶液を添加してルシフェラーゼ活性を測定し、プレートをルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３）で読み取る。結果を、以下の表４に示す。
【表５】
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【００４２】
本質的に上述のような手順に従って、抗体４３は、ヒトＩＬ−３３およびｃｙｎｏ  ＩＬ−３３を阻害するが、マウス、ラット、またはウサギのＩＬ−３３誘導ＮＦκＢ活性を用量依存様式で阻害しない。ヒトおよびｃｙｎｏ中和についての３つの独立した実験からの平均ＩＣ５０を表４に要約する。陰性対照抗体は、試験したいずれの濃度でもＧＥＣ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ細胞におけるＮＦκＢ活性を阻害しなかった。
【００４３】
インビトロでのヒト肥満細胞からのＩＬ−３３誘導ＧＭ−ＣＳＦ分泌の中和
【００４４】
抗体４３での処理によるヒト肥満細胞におけるＩＬ−３３誘導ＧＭ−ＣＳＦ放出の阻害を測定する。ＳＴ２（ＩＬ１ＲＬ１）受容体およびその共受容体ＩＬ１ＲＡＰを天然に発現するヒト肥満細胞は、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）およびＳＣＦ／ＩＬ−６を使用して培養においてヒト臍帯血幹細胞から分化される。アッセイの日に、肥満細胞を、培養培地中の９６ウェル組織培養プレートに５０μｌ／ウェルの５０，０００細胞で平板培養する。細胞を、抗体の存在下または不在下で、ＩＬ−３３で処理する。各試験について、０〜３０ｎＭの用量範囲で、１ウェルあたり２５μｌの４×の例示の抗体を添加する。２５μｌの４×ヒトＩＬ−３３を各ウェルに０．５ｎＭの最終濃度まで添加する。アッセイ培地単独を無処置対照として使用し、ヒト単量体ＳＴ２を０〜３０ｎＭの用量範囲で陽性対照として使用する。３０ｎＭで試験したアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用する。テストは三つ組で行われる。９６ウェルプレートを組織培養インキュベーター（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）内に１６時間置く。１００μｌ／ウェルの上清を回収して、市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＧＭ−ＣＳＦレベルを測定する。
【００４５】
本質的に上述のような手順に従って、抗体４３は、用量依存様式でヒト肥満細胞からのヒトＩＬ３３誘導ＧＭ−ＣＳＦ分泌を完全に阻害し、ＩＣ５０は、０．３ｎＭであり、これは陽性対照の可溶性受容体の７．６ｎＭのＩＣ５０よりも大きかった。別の同様の実験では、抗体５４は、０．２６５ｎＭのＩＣ５０でヒト肥満細胞からのヒトＩＬ３３誘導ＧＭ−ＣＳＦ分泌を阻害し、抗体６は、０．８１１ｎＭのＩＣ５０でヒト肥満細胞からのヒトＩＬ３３誘導ＧＭ−ＣＳＦ分泌を阻害した。アイソタイプ対照抗体は、ＩＬ−３３誘導ＧＭ−ＣＳＦ分泌を阻害しなかった。結果は、２つの独立した実験を代表するものである。
【００４６】
インビボでのＩＬ−３３誘導ＩＬ−５産生の阻害。
【００４７】
インビボでのＩＬ−３３の中和を確認するために、抗体４３がヒトＩＬ−３３機能を中和し、インビボでマウスＩＬ−５の産生を阻害することができるかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に０．９４ｍｇ／ｋｇ、０．２８２ｍｇ／ｋｇ、もしくは０．０９４ｍｇ／ｋｇの抗体、または０．９４ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体を腹腔内注射する。注射の１日後、マウスに０．０２５ｍｇ／ｋｇのヒトＩＬ−３３を腹腔内注射により投与する。ヒトＩＬ−３３投与の６時間後、マウスを屠殺し、血清を収集する。製造元の指示に従い市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してマウスＩＬ−５産生について血清を分析する。
【００４８】
結果は、抗体４３が用量依存様式でマウスＩＬ−５の産生を完全に阻害することができることを示した。０．９４ｍｇ／ｋｇ、０．２８２ｍｇ／ｋｇ、または０．０９４ｍｇ／ｋｇの例示の抗体を注射したマウスの血清中のＩＬ−５のレベルは、それぞれ０．０３±０．００４ｎｇ／ｍＬ、０．１６６±０．０３６ｎｇ／ｍＬ、および０．４３０±０．０９５ｎｇ／ｍＬであった。陰性対照抗体は、マウスＩＬ−５のヒトＩＬ−３３誘導産生を阻害しない。これらのデータは、抗体４３がインビボでヒトＩＬ−３３の中和を介してマウスＩＬ−５の産生を阻害することを示す。
【００４９】
気道炎症モデルにおける代理マウスＩＬ−３３抗体のインビボ有効性
前臨床疾患モデルで使用するための、マウスＩＬ−３３（ｍＩＬ−３３）を中和するための代理抗体が開発されている。代用物は、インビトロアッセイにおいてｍＩＬ−３３を中和するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体である。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ投与に対する気道炎症反応に影響を与える抗ｍＩＬ−３３抗体の全身投与の能力は、インビボで決定される。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたりｎ＝５）に、０日目に２５ｍｇ／ｋｇの抗ｍＩＬ−３３またはアイソタイプ対照抗体を皮下注射する。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ投与３０分前に、インビトロアッセイにおいてｍＩＬ−３３を中和することができるＩＬ−３３の共受容体のうちの１つの可溶性形態であるマウスＳＴ２−Ｆｃ（陽性対照）を、１および２日目に、１２．５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射する。Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ抽出物（２０μＬのＰＢＳ中５０μｇ）を、１および２日目に各マウスに鼻腔内投与する。マウスをＣＯ２吸入により３日目に屠殺し、血清の調製のために血液を心臓穿刺により直ちに収集する。
【００５０】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を、ＰＢＳ注射の１０回の洗浄（各５００μＬの洗浄）で肺を洗浄し、各マウスの露出した気管のカニューレを通して引き出すことによって調製する。ＢＡＬ液を２００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し凍結する。細胞を１ｍＬのＡＣＫ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁して赤血球を溶解し、洗浄し、計数のために０．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁する。好酸球は、好酸球希釈液および染色剤（ＥＮＧ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログＥＳ−３１０１）を使用して計数し、全細胞はトリパンブルーを用いて計数する。市販のマウスＩＬ−５およびキチナーゼ３様３／ＹＭ１（Ｃｈｉ３Ｌ３／ＹＭ１）ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、および抗体曝露についてＢＡＬ液をアッセイする。結果を、以下の表５に示す。
【表６】
2019534282.tif 000007
【００５１】
本質的に上述のような手順に従って、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ投与は、ＢＡＬ液中に存在する細胞、主に好酸球の数を増加させた。それはまた、ＩＬ−５およびＣｈｉ３Ｌ３／ＹＭ１などのサイトカインの産生も誘導した。抗ｍＩＬ−３３抗体の全身投与は、ＢＡＬ細胞計数によって測定されるように、好酸球および全細胞浸潤を有意に減少させ、ＢＡＬ液中のＩＬ−５およびＣｈｉ３Ｌ３／ＹＭ１レベルを減少させた。これらの結果は、この気道炎症モデルにおいて、ｍＩＬ−３３の阻害が複数の炎症マーカーを減少させることを示す。
【００５２】
Ｘ線結晶学によるエピトープマッピング
Ｘ線結晶学
ｈＩＬ３３：ＦＡＢ複合体の１０．６ｍｇ／ｍｌ溶液を、特注および市販のスクリーンを用いて結晶についてスクリーニングする。ＭＲＣ２（ＳＷＩＳＳＣＩ）シッティングドロッププレート中の５０μＬのウェル溶液（０．２Ｍの硫酸アンモニウムおよび３０％ｗ／ｖのポリエチレングリコール８，０００）とともに４００ｎＬ＋４００ｎＬ（タンパク質＋ウェル溶液）の結晶化滴として、２２℃で蒸気拡散実験を設定する。結晶化を助けるために２０ｍＭ酢酸マグネシウムをタンパク質に添加する。得られた結晶を、低温剤として添加された２０％エチレングリコールを含有するウェル溶液に素早く浸した後に液体窒素中で急速冷凍する。Ｘ線回折データは、ＬＲＬ−ＣＡＴ３１−ＩＤ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）でシンクロトロン放射を用いて収集される。１８０フレームを０．９７９３１Åの波長で１°振動で収集し、ＣＣＰ４１パッケージで処理する。
【００５３】
結晶は、単位格子定数ａ＝７０．１Åｂ＝１９４．９Åｃ＝４６．５Åα＝β＝γ＝９０°を有するＰ２１２１２空間群のものである。ｈＩＬ３３：ＦＡＢ複合体の分子置換溶液は、ＰＤＢ構造４ＫＣ３からの入力モデルおよびＭＯＥ３（ｖ２０１４．９）抗体モデリングツールを用いて生成されたＦＡＢモデルを使用して、Ｐｈａｓｅｒ２を用いて得られる。分子置換溶液は、非対称単位中に１つの複合体を含有する。続いてこの溶液は、Ｂｕｓｔｅｒ４およびＣｏｏｔ５を用いた複数回の精密化およびモデル構築を経て、１．４０ÅでのＲｗｏｒｋが１７．８％、Ｒｆｒｅｅが２０．３％の最終構造をもたらす。
【００５４】
ｈＩＬ３３エピトープは、ＭＯＥ３（ｖ２０１５．１０）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｔａｃｔｓツールを用いて、ｈＩＬ３３：ＦＡＢ複合体の高解像度結晶構造についてマッピングされる。このツールは、「距離」、「共有結合」、「アレーン」、「イオン」、および「ｈ結合」相互作用を評価するために使用される。鎖間相互作用についての出力をマイクロソフトエクセルで残基レベルまで蒸留してｈＩＬ３３エピトープ残基を特定する。最終リストは、任意のＦＡＢ残基の４．５Å以内にあるｈＩＬ３３残基を含有する。
【００５５】
本質的に上述のような手順に従って、抗体７５と同じＣＤＲを有する抗体は、配列番号１９の以下の残基：２３位のＳｅｒ、２４位のＰｒｏ、２５位のＩｌｅ、２６位のＴｈｒ、２７位のＧｌｕ、２８位のＴｙｒ、２９位のＬｅｕ、６９位のＴｙｒ、７１位のＧｌｕ、８３位のＶａｌ、８４位のＡｓｐ、８６位のＬｙｓ、８８位のＬｅｕ、１２６位のＬｅｕ、１２８位のＡｓｎ、１２９位のＭｅｔ、１３２位のＡｓｎ、１３３位のＣｙｓ、１３４位のＶａｌ、１７５位のＧｌｕ、および１７６位のＴｈｒによって示されるエピトープでヒトＩＬ−３３と接触する。抗体５４および抗体４３も、ヒトＩＬ−３３上の実質的に同様のエピトープと接触する。
【００５６】
配列
抗体７５のＨＣ（配列番号１）
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＬＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【００５７】
抗体７５のＬＣ（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＨＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＳＱＳＰＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００５８】
抗体７５のＨＣＶＲ（配列番号３）
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＬＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００５９】
抗体７５のＬＣＶＲ（配列番号４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＨＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＳＱＳＰＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【００６０】
抗体５４のＨＣ（配列番号５）
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＬＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【００６１】
抗体５４のＬＣ（配列番号６）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＨＲＬＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＳＱＰＰＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００６２】
抗体５４のＨＣＶＲ（配列番号７）
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＬＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００６３】
抗体５４のＬＣＶＲ（配列番号８）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＨＲＬＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＳＱＰＰＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【００６４】
抗体４３のＨＣ（配列番号９）
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【００６５】
抗体４３のＬＣ（配列番号１０）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＨＲＬＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＳＱＰＰＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００６６】
抗体４３のＨＣＶＲ（配列番号１１）
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＩＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＦＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００６７】
抗体４３のＬＣＶＲ（配列番号１２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＨＲＬＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＳＱＰＰＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【００６８】
ＨＣＤＲ１（配列番号１３）
ＧＦＴＦＳＸＹＡＭＳ
配列中、６位のＸは、ＳまたはＦである。
【００６９】
ＨＣＤＲ２（配列番号１４）
ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
【００７０】
ＨＣＤＲ３（配列番号１５）
ＴＸＨＧＩＲＡＡＹＤＡＦＩＩ
配列中、２位のＸは、ＬまたはＩである。
【００７１】
ＬＣＤＲ１（配列番号１６）
ＲＡＳＱＳＶＧＩＮＬＳ
【００７２】
ＬＣＤＲ２（配列番号１７）
ＧＡＳＨＲＸＴ
配列中、６位のＸは、ＡまたはＬである。
【００７３】
ＬＣＤＲ３（配列番号１８）
ＨＱＹＳＱＸＰＰＦＴ
配列中、６位のＸは、ＳまたはＰである。
【００７４】
ヒトＩＬ−３３アミノ酸９５〜２７０（配列番号１９）
ＡＦＧＩＳＧＶＱＫＹＴＲＡＬＨＤＳＳＩＴＧＩＳＰＩＴＥＹＬＡＳＬＳＴＹＮＤＱＳＩＴＦＡＬＥＤＥＳＹＥＩＹＶＥＤＬＫＫＤＥＫＫＤＫＶＬＬＳＹＹＥＳＱＨＰＳＮＥＳＧＤＧＶＤＧＫＭＬＭＶＴＬＳＰＴＫＤＦＷＬＨＡＮＮＫＥＨＳＶＥＬＨＫＣＥＫＰＬＰＤＱＡＦＦＶＬＨＮＭＨＳＮＣＶＳＦＥＣＫＴＤＰＧＶＦＩＧＶＫＤＮＨＬＡＬＩＫＶＤＳＳＥＮＬＣＴＥＮＩＬＦＫＬＳＥＴ
【００７５】
配列番号９のＨＣをコードするＤＮＡ（配列番号２０）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＴＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴ
【００７６】
配列番号１０のＬＣをコードするＤＮＡ（配列番号２１）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
【配列表】
2019534282000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月21日(2019.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−３３に結合する抗体であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１６であり、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１７であり、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１８であり、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号１３であり、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号１４であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１５であり、配列番号１３の６位のＸａａが、ＳｅｒまたはＰｈｅであり、配列番号１５の２位のＸａａが、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、配列番号１７の６位のＸａａが、ＡｌａまたはＬｅｕであり、配列番号１８の６位のＸａａが、ＳｅｒまたはＰｒｏである、抗体。
【請求項２】
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＳｅｒであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＬｅｕであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＡｌａであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＳｅｒである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＰｈｅであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＬｅｕであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＬｅｕであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＰｒｏである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＰｈｅであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＩｌｅであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＬｅｕであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＰｒｏである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号４であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号３である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号８であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号７である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号１２であり、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が配列番号１１である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号２であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号１である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号６であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号５である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１０であり、前記ＨＣのアミノ酸配列が配列番号９である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
療法における使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
１つ以上のアレルギー性疾患の治療における使用のための、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
クローン病の治療における使用のための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
１つ以上のアレルギー性疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２２】
クローン病の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２３】
ＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号９である、ＤＮＡ分子。
【請求項２４】
ＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号１０である、ＤＮＡ分子。
【請求項２５】
配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項２６】
請求項２３に記載のＤＮＡ分子および請求項２４に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号９のアミノ酸配列によって示されるＨＣおよび配列番号１０のアミノ酸配列によって示されるＬＣを含む抗体を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項２７】
請求項２５に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記細胞が、配列番号９のアミノ酸配列によって示されるＨＣおよび配列番号１０のアミノ酸配列によって示されるＬＣを含む抗体を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項２８】
抗体を産生するためのプロセスであって、前記抗体が、２つのＨＣおよび２つのＬＣを含み、前記２つのＨＣのそれぞれのアミノ酸配列が、配列番号９のアミノ酸配列によって示され、前記２つのＬＣのそれぞれのアミノ酸配列が、配列番号１０のアミノ酸配列によって示され、前記プロセスが、
ａ．前記抗体が発現されるような条件下で、請求項２６または２７に記載の哺乳動物細胞を培養することと、
ｂ．前記発現した抗体を回収することと、を含む、プロセス。
【請求項２９】
請求項２８のプロセスによって得ることができる、抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
配列番号１０のＬＣをコードするＤＮＡ（配列番号２１）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＡＧＧＣＴＡＡＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣ
また、本発明は以下を提供する。
［１］
ヒトＩＬ−３３に結合する抗体であって、それぞれ配列番号１６の２つのＬＣＤＲ１、それぞれ配列番号１７の２つのＬＣＤＲ２、それぞれ配列番号１８の２つのＬＣＤＲ３、それぞれ配列番号１３の２つのＨＣＤＲ１、それぞれ配列番号１４の２つのＨＣＤＲ２、およびそれぞれ配列番号１５の２つのＨＣＤＲ３を含む、抗体。
［２］
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＳｅｒであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＬｅｕであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＡｌａであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＳｅｒである、［１］に記載の抗体。
［３］
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＰｈｅであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＬｅｕであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＬｅｕであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＰｒｏである、［１］に記載の抗体。
［４］
ａ．配列番号１３の６位のＸａａがＰｈｅであり、
ｂ．配列番号１５の２位のＸａａがＩｌｅであり、
ｃ．配列番号１７の６位のＸａａがＬｅｕであり、
ｄ．配列番号１８の６位のＸａａがＰｒｏである、［１］に記載の抗体。
［５］
各ＬＣＶＲが、配列番号４、配列番号８、または配列番号１２であり、各ＨＣＶＲが、配列番号３、配列番号７、または配列番号１１である、［１］に記載の抗体。
［６］
各ＬＣＶＲが配列番号４であり、各ＨＣＶＲが配列番号３である、［５］に記載の抗体。
［７］
各ＬＣＶＲが配列番号８であり、各ＨＣＶＲが配列番号７である、［５］に記載の抗体。
［８］
各ＬＣＶＲが配列番号１２であり、各ＨＣＶＲが配列番号１１である、［５］に記載の抗体。
［９］
各ＬＣが、配列番号２、配列番号６、または配列番号１０であり、各ＨＣが、配列番号１、配列番号５、または配列番号９である、［１］または［５］に記載の抗体。
［１０］
各ＬＣが配列番号２であり、各ＨＣが配列番号１である、［９］に記載の抗体。
［１１］
各ＬＣが配列番号６であり、各ＨＣが配列番号５である、［９］に記載の抗体。
［１２］
各ＬＣが配列番号１０であり、各ＨＣが配列番号９である、［９］に記載の抗体。
［１３］
［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体と、１つ以上の薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
［１４］
１つ以上のアレルギー性疾患の治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
［１５］
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、［１４］に記載の方法。
［１６］
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、［１５］に記載の方法。
［１７］
アトピー性皮膚炎の治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
［１８］
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、および慢性閉塞性肺疾患のうちの少なくとも１つの治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
［１９］
クローン病の治療方法であって、治療を必要とする患者に、有効量の、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
［２０］
療法における使用のための、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体。
［２１］
１つ以上のアレルギー性疾患の治療における使用のための、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体。
［２２］
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、［２１］に記載の抗体。
［２３］
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、［２２］に記載の抗体。
［２４］
アトピー性皮膚炎の治療における使用のための、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体。
［２５］
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療に使用するための、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体。
［２６］
クローン病の治療における使用のための、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体。
［２７］
１つ以上のアレルギー性疾患の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体の使用。
［２８］
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、または食物アレルギーである、［２７］に記載の使用。
［２９］
前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎である、［２８］に記載の使用。
［３０］
アトピー性皮膚炎の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体の使用。
［３１］
好酸球性食道炎、強皮症／全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、または慢性閉塞性肺疾患の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体の使用。
［３２］
クローン病の治療のための薬剤の製造における、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【国際調査報告】
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