(57)【要約】本発明は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理するための方法、使用、組成物およびキットに関する。それはまた、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための方法、使用および組成物に関する。それは、硫酸アンモニウムの存在下でＲＮＡを安定化し得るという知見に基づくものである。特に、本発明は、ＲＮＡをプロセシングする方法であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡをプロセシングする方法であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む、方法。
【請求項２】
１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む、請求項１に記載のＲＮＡをプロセシングする方法。
【請求項３】
前記硫酸アンモニウムが、ＲＮＡ分解を阻害または防止することによって、処理中に使用される前記温度およびｐＨで前記ＲＮＡを安定化する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡと前記硫酸アンモニウムとを接触させて、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立することを含む、請求項１〜３の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜３の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項５】
以下の特徴：
ｉ．前記硫酸アンモニウムが、０．２５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、０．７ｍＭ〜８ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１．５ｍＭ〜６ｍＭ、１．７５ｍＭ〜５ｍＭまたは２ｍＭ〜４ｍＭ；または約２．５ｍＭの濃度で存在する；
ｉｉ．前記硫酸アンモニウムが、硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４））である；
ｉｉｉ．前記ｐＨが、９〜１４、９．２〜１３．５、９．４〜１３、９．６〜１２．５、９．８〜１２．２５、１０〜１２または１０〜１１．５の範囲内である；
ｉｖ．前記温度が、７０℃〜１００℃、７０℃〜９５℃、７５℃〜９０℃または約７５℃〜８５℃の範囲内である；
ｖ．キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの存在下で、処理を行う
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１〜４の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜４の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡの処理が、規定条件で前記ＲＮＡをインキュベートすることを含む、請求項１〜５の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜５の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項７】
以下の特徴：
ｉ．前記ＲＮＡを１分間〜２０分間、２分間〜１５分間、５分間〜１２分間または７分間〜１０分間インキュベートする；
ｉｉ．１つまたはそれを超えるタンパク質分解酵素または他の酵素化合物の存在下でインキュベーションを行い、インキュベーション中に前記１つまたはそれを超えるタンパク質分解酵素または他の酵素化合物を不活性化する、
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記硫酸アンモニウムが、前記ＲＮＡと接触される溶液に含まれる、請求項１〜７の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜７の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項９】
前記溶液が、以下の特徴：
ｉ．前記溶液が、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む；
ｉｉ．前記溶液が、０．２５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、０．７ｍＭ〜８ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１．５ｍＭ〜６ｍＭ、１．７５ｍＭ〜５ｍＭまたは２ｍＭ〜４ｍＭ；または約２．５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む；
ｉｉｉ．前記溶液が、少なくとも９のｐＨを有する；
ｉｖ．前記溶液が、９〜１４、９．２〜１３．５、９．４〜１３、９．６〜１２．５、９．８〜１２．２５、１０〜１２または１０．５〜１１．５の範囲内のｐＨを有する；
ｖ．前記溶液が水性である；
ｖｉ．前記溶液が、１つまたはそれを超えるアルカリ性水酸化物塩を含む，
ｖｉｉ．前記溶液が、水酸化ナトリウムおよび／または水酸化カリウムを含む；
ｖｉｉｉ．前記溶液が低塩溶液である；
ｉｘ．前記溶液が、＜１００ｍＭのイオン強度を有する；
ｘ．前記溶液が緩衝化されている；
ｘｉ．前記溶液がキレート化剤を含む；
ｘｉｉ．前記溶液が非錯化二価カチオンを含まないか、または二価カチオンを全く含まない；
ｘｉｉｉ．前記溶液が、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃または少なくとも８５℃の温度を有する；
ｘｉｖ．前記溶液が少なくとも９のｐＨを有し、前記ＲＮＡと前記溶液との接触後に、それを少なくとも７０℃の温度に加熱する
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させ、前記処理中にそれから前記ＲＮＡを放出させる、請求項１〜９の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜９の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡをプロセシングする方法が、前記ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる方法であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理して、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させることを含む方法である、請求項１〜１０の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜１０の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡをプロセシングする方法が、サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること
を含む方法である、請求項１〜１０の一項またはそれよりも多くに記載の、特に請求項２〜１０の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項１３】
前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させるための前記処理条件が、請求項３〜７の一項またはそれよりも多くで定義されるとおりである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡと、請求項８または９で定義される特徴の１つまたはそれよりも多くを有する溶液とを接触させて、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させる、請求項１１〜１３の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項１５】
前記アニオン交換マトリックスが、以下の特徴：
ｉ．それが、アニオン交換基を提供するアニオン交換部分を含み、前記アニオン交換部分が、モノアミン、ジアミン、ポリアミン、窒素含有芳香族または脂肪族複素環基、環状アミン、芳香族アミンおよび複素環アミンから選択される；
ｉｉ．それが、少なくとも１つの第１級、第２級および／または第３級アミノ基を含むアニオン交換部分を含む；
ｉｉｉ．それが、アニオン交換面を提供する固体支持体によって提供される；
ｉｖ．それが、磁性粒子によって提供される
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１０〜１４の一項またはそれよりも多くに記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの使用。
【請求項１７】
アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための溶液の使用であって、前記溶液が、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有し、前記溶液が、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む、使用。
【請求項１８】
ＲＮＡ含有組成物であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含み、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する、ＲＮＡ含有組成物。
【請求項１９】
以下の特徴：
ｉ．溶液である；
ｉｉ．アニオン交換マトリックスをさらに含む；
ｉｉｉ．ＲＮＡ溶出液である；
ｉｖ．前記硫酸アンモニウムが硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）である
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡをプロセシングするための方法、使用および組成物に関する。特に、それは、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための方法、使用および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの分子生物学および診断用途では、高収率で良好な品質のリボ核酸（ＲＮＡ）を単離または精製することが望ましい。しかしながら、ＲＮＡは極めて不安定であり、ＲＮＡ単離または精製の前およびその間に分解する傾向がある。ＲＮＡの分解に寄与する因子としては、ＲＮＡｓｅなどの分解酵素だけではなく、高温および高ｐＨ値を含むプロセシング条件も挙げられる。この不安定性は、ＲＮＡのプロセシングを伴う他の方法についても問題となる。
【０００３】
ＲＮＡ単離の前に組織サンプル中のＲＮＡを保存および保護するための方法および試薬は公知であり、例えば、米国特許第６，２０４，３７５Ｂ１号に記載されている。また、ＲＮＡ含有サンプルまたは混合物中に存在するＲＮＡに結合しまたはそれを切断する分子の阻害効果または破壊効果を緩和する方法は公知であり、例えば、米国特許第６，８７２，８１８Ｂ２号に記載されている。
【０００４】
ＲＮＡは、アルカリ性条件下で自然加水分解を受けることが公知である。アルカリ性条件下におけるＲＮＡ加水分解は、最終的に、モノヌクレオチドへのＲＮＡ分子の完全な配列非依存的分解をもたらす。この加水分解反応は、水溶液中、高濃度のＯＨ（−）イオン下で、リボース部分の２’−ＯＨ基の脱プロトン化によって駆動される。この現象は、以前に報告されている（例えば、Ｂｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．：Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １２，Ｐａｒｔ  Ａ，１９６７，ｐａｇｅｓ  ２２４−２２８；Ｅｌｌｉｏｔ，Ｄ．，Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ（１ｓｔ  ｅｄ．２０１１）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  ３４−６４を参照のこと）。
【０００５】
しかしながら、多くの用途では、強アルカリ性条件下でＲＮＡをプロセシングすることが望ましい。一例は、アニオン交換マトリックスを使用してサンプルからＲＮＡを単離することである。少なくとも８のアルカリ性ｐＨは、アニオン交換マトリックスから結合ＲＮＡを放出（特に、溶出）させるために使用され得る。少なくとも９のアルカリ性ｐＨは、通常、アニオン交換マトリックスから結合ＲＮＡを効率的に放出（特に、溶出）させるために必要である。これは、溶出工程中にＲＮＡの分解をもたらし得る。アルカリ性溶液を使用してアニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させるＲＮＡ単離方法は、国際公開第２００７／０６５９５０号および国際公開第２０１４／０６６３７６号に記載されている。
【０００６】
また、本実施例で実証されているように、ＲＮＡのアルカリ分解は、高温で大幅に促進される。したがって、アルカリ性水溶液中のＲＮＡ加水分解の問題は、高温（例えば、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃またはそれを超える温度など）で特に顕著である。これらの条件下では、ＲＮＡは迅速に分解される。リボース部分上の２’−ヒドロキシ基が脱プロトン化され、続いて、生じた−Ｏ（−）と３’結合リン酸基のリンとが反応し、次いで、ホスホジエステル結合が切断されることによって、ＲＮＡは単一ヌクレオチドに加水分解される。高温および特に９またはそれを超えるアルカリ性ｐＨを伴う条件では、ＲＮＡのこの分解感受性により、ＲＮＡ完全性を保証することが困難である。
【０００７】
したがって、高温および強アルカリ性ｐＨを伴う条件におけるプロセシング中に分解からＲＮＡを保護する改善された方法および組成物が必要である。理想的には、このような方法および組成物は、下流用途、例えばＲＮＡの分析または検出のための下流用途などを妨げるべきではない。
【０００８】
本発明の目的は、高温およびアルカリ性条件下におけるプロセシング中に分解からＲＮＡを保護する手段を提供することである。特に、本発明の目的は、特にアニオン交換マトリックスからの放出中に、高温および強アルカリ性条件下でＲＮＡを安定化するための方法を提供することである。さらに、目的は、アニオン交換マトリックスを使用してＲＮＡを単離するための、特に、アニオン交換マトリックスからのアルカリ溶出中に分解からＲＮＡを保護するための改善された方法および組成物を提供することである。さらに、目的は、高温および強アルカリ性条件下におけるＲＮＡのプロセシングまたは安定化のための溶液、使用および組成物を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，２０４，３７５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，８７２，８１８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／０６５９５０号
【特許文献４】国際公開第２０１４／０６６３７６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．：Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １２，Ｐａｒｔ  Ａ，１９６７，ｐａｇｅｓ  ２２４−２２８
【非特許文献２】Ｅｌｌｉｏｔ，Ｄ．，Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ（１ｓｔ  ｅｄ．２０１１）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  ３４−６４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明者らは、予想外のことに、硫酸アンモニウムの存在下、高温（≧７０℃）および高ｐＨ（≧８、好ましくは≧９）の処理条件の間に、ＲＮＡが有効に安定化されることを見出した。有利なことに、硫酸アンモニウムの存在下では、ＲＮＡ分解が有意に阻害される。驚くべきことに、≦１０ｍＭ、≦５ｍＭおよびさらに≦３．５ｍＭの非常に低濃度の硫酸アンモニウムは、顕著な安定化効果を達成するために十分かつ非常に有効である。実施例によって実証されているように、ＲＮＡを高温および高ｐＨで長期間インキュベートする場合であっても、これらの低濃度の硫酸アンモニウムの存在は、有利なことに、分解からＲＮＡを保護する。硫酸アンモニウムのこれらの有利な効果は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを伴う条件下におけるアニオン交換マトリックスからの放出（特に、溶出）中にＲＮＡを保護するために使用され得る。したがって、本発明は、ＲＮＡをプロセシングする場合にこのような過酷な条件を使用することを可能にする。得られたＲＮＡは、その品質により、高感度かつ定量的な分析および検出方法、例えばＰＣＲベースの分析および検出に適切である。さらに、本発明にしたがって使用され得る低濃度の硫酸アンモニウムは、このような下流用途を妨げず、得られたＲＮＡは、さらに精製して過剰な塩を除去せずに使用され得る。したがって、本発明は、ＲＮＡをプロセシングする方法であって、ＲＮＡの検知下流用途（例えば、ウイルスＲＮＡの検出のための診断アッセイにおけるＲＮＡの使用など）に適合する高温および強アルカリ性条件下で、ＲＮＡを処理することを含む方法を提供する。したがって、本発明は重要な利点を提供し、先行技術に対して著しい進歩を提供する。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「硫酸アンモニウム」という用語は、硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）および重硫酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ４；硫酸水素アンモニウムとも称される）を指す。したがって、一般に「硫酸アンモニウム」について本明細書に提示される任意の開示は、硫酸ジアンモニウムの実施形態および重硫酸アンモニウムの実施形態を具体的に適用し、それらを指す。硫酸アンモニウムとして硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）の使用が特に好ましい。したがって、明確な指定がない場合であっても、一般に硫酸アンモニウムについて本出願に記載されるすべての開示は、好ましい実施形態である硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）を具体的に適用し、それを特に指す。
【００１３】
第１の態様によれば、本発明は、ＲＮＡをプロセシングする方法であって、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む方法を提供する。特に、本発明は、ＲＮＡをプロセシングする方法であって、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む方法を提供する。
【００１４】
ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる方法であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理して、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させることを含む方法も提供される。特に、本発明は、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる方法であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理して、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させることを含む方法を提供する。
【００１５】
サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること
を含む方法も提供される。
【００１６】
特に、本発明は、サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること
を含む方法を提供する。
【００１７】
さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの使用を提供する。特に、本発明は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの使用を提供する。
【００１８】
さらなる態様によれば、本発明は、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための溶液の使用であって、前記溶液が、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを有し、前記溶液が、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む使用を提供する。特に、本発明は、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための溶液の使用であって、前記溶液が、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを有し、前記溶液が、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む使用を提供する。
【００１９】
さらなる態様によれば、本発明は、ＲＮＡ含有組成物であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含み、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨを有するＲＮＡ含有組成物を提供する。特に、本発明は、ＲＮＡ含有組成物であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含み、少なくとも７０℃の温度および少なくとも９のｐＨを有するＲＮＡ含有組成物を提供する。
【００２０】
本出願の他の態様、目的、特徴および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者には明らかになる。しかしながら、以下の説明、添付の特許請求の範囲および特定の実施例は、本出願の好ましい実施形態を示すが、単なる例示として示されていると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（約ｐＨ１２）を含む溶液１と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（約ｐＨ１２）を含む溶液１と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２２】
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２３】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化）を含む溶液３と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化）を含む溶液３と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２４】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（約ｐＨ１２）を含む溶液１と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（約ｐＨ１２）を含む溶液１と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２５】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２６】
【図６Ａ】図６Ａおよび図６Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化）を含む溶液３と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化）を含む溶液３と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２７】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、実施例１および２の結果を要約したものである。図７Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。７５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｂは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図７Ｃは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。８５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｄは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｄは、実施例１および２の結果を要約したものである。図７Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。７５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｂは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図７Ｃは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。８５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｄは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｄは、実施例１および２の結果を要約したものである。図７Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。７５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｂは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図７Ｃは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。８５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｄは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、実施例１および２の結果を要約したものである。図７Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。７５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｂは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図７Ｃは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。８５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｄは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【００２８】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００２９】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液４と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解が阻害され、かなり遅延する。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液４と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解が阻害され、かなり遅延する。
【００３０】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。
【００３１】
【図１１Ａ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液４と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解が阻害され、かなり遅延する。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび図１１Ｂは、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液４と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像および電気泳動図）を示す。硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解が阻害され、かなり遅延する。
【００３２】
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、実施例１〜３の結果を要約したものである。図１２Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、および２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下、７５℃、ｐＨ１１で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図１２Ｂは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、および２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下、８５℃、ｐＨ１１で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、実施例１〜３の結果を要約したものである。図１２Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、および２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下、７５℃、ｐＨ１１で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図１２Ｂは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、および２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下、８５℃、ｐＨ１１で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【００３３】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、実施例４にさらに記載されている異なる溶液と共に８５℃、ｐＨ１１でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１３Ａは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例４のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｂは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ（実施例４のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｃは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋１ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｄは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー４）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、実施例４にさらに記載されている異なる溶液と共に８５℃、ｐＨ１１でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１３Ａは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例４のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｂは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ（実施例４のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｃは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋１ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｄは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー４）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｄは、実施例４にさらに記載されている異なる溶液と共に８５℃、ｐＨ１１でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１３Ａは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例４のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｂは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ（実施例４のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｃは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋１ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｄは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー４）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、実施例４にさらに記載されている異なる溶液と共に８５℃、ｐＨ１１でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１３Ａは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例４のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｂは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ（実施例４のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｃは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋１ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｄは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例４のバッファー４）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【００３４】
【図１４ＡＢ】図１４Ａ〜１４Ｄは、それぞれ実施例４で試験したバッファー１〜４について、１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【図１４ＣＤ】図１４Ａ〜１４Ｄは、それぞれ実施例４で試験したバッファー１〜４について、１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【００３５】
【図１５ＡＢ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、それぞれ実施例４で試験したバッファー１〜４について、２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【図１５ＣＤ】図１５Ａ〜図１５Ｄは、それぞれ実施例４で試験したバッファー１〜４について、２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【００３６】
【図１６ＡＢ】図１６Ａ〜図１６Ｄは、それぞれ実施例４で試験したバッファー１〜４について、ＲＩＮ対時間を示す。ＲＩＮ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はｘ軸に示されている。
【図１６ＣＤ】図１６Ａ〜図１６Ｄは、それぞれ実施例４で試験したバッファー１〜４について、ＲＩＮ対時間を示す。ＲＩＮ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はｘ軸に示されている。
【００３７】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｄは、それぞれバッファー１〜４を用いて得られた６６ｂｐアンプリコン（上パネル）および５００ｂｐアンプリコン（下パネル）の平均Ｃｔ値を示す。平均ＣＴ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はＸ軸に示されている。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｄは、それぞれバッファー１〜４を用いて得られた６６ｂｐアンプリコン（上パネル）および５００ｂｐアンプリコン（下パネル）の平均Ｃｔ値を示す。平均ＣＴ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はＸ軸に示されている。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｄは、それぞれバッファー１〜４を用いて得られた６６ｂｐアンプリコン（上パネル）および５００ｂｐアンプリコン（下パネル）の平均Ｃｔ値を示す。平均ＣＴ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はＸ軸に示されている。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜１７Ｄは、それぞれバッファー１〜４を用いて得られた６６ｂｐアンプリコン（上パネル）および５００ｂｐアンプリコン（下パネル）の平均Ｃｔ値を示す。平均ＣＴ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はＸ軸に示されている。
【００３８】
【図１８Ａ】図１８Ａ〜図１８Ｃは、実施例５にさらに記載されている異なる溶液と共に７５℃、ｐＨ１０でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１８Ａは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例５のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｂは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例５のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｃは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（実施例５のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜図１８Ｃは、実施例５にさらに記載されている異なる溶液と共に７５℃、ｐＨ１０でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１８Ａは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例５のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｂは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例５のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｃは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（実施例５のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜図１８Ｃは、実施例５にさらに記載されている異なる溶液と共に７５℃、ｐＨ１０でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１８Ａは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（実施例５のバッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｂは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（実施例５のバッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｃは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（実施例５のバッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【００３９】
【図１９ＡＢ】図１９Ａ〜１９Ｃは、それぞれ実施例５で試験したバッファー１〜３について、１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｃは、それぞれ実施例５で試験したバッファー１〜３について、１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【００４０】
【図２０ＡＢ】図２０Ａ〜２０Ｃは、それぞれ実施例５で試験したバッファー１〜３について、２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｃは、それぞれ実施例５で試験したバッファー１〜３について、２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量対インキュベーション時間を示す。ｙ軸は、全長２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
とりわけ、本発明は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件におけるＲＮＡのプロセシングを可能にする方法、使用および組成物に関する。特に、それは、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための方法、使用および組成物に関する。それは、硫酸アンモニウムが、非常に低濃度であっても、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを伴う処理条件で分解からＲＮＡを保護するという知見に基づく。異なる態様および非限定的な実施形態が以下に記載されている。
【００４２】
上記で説明されているように、本明細書で使用される場合、「硫酸アンモニウム」という用語は、硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）および重硫酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ４）を指す。同様に上記で説明されているように、明確な指定がない場合であっても、一般に硫酸アンモニウムについて本出願に記載されるすべての開示は、好ましい実施形態である硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）を具体的に適用し、それを特に指す。
【００４３】
高温および高ＰＨでＲＮＡをプロセシングする方法
第１の態様によれば、本発明は、ＲＮＡをプロセシングする方法であって、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理する工程を含む方法を提供する。驚くべきことに、および有利なことに、硫酸アンモニウムの存在は、ＲＮＡが効率的に安定化され、過酷な温度およびｐＨ条件下で分解から保護されることを保証する。より驚くべきことに、実施例によって実証されているように、硫酸アンモニウムは、例えば１０ｍＭまたはそれ未満の非常に低濃度で各ＲＮＡ安定化効果を発揮する。硫酸アンモニウムは、ＲＮＡ分解を阻害または防止することによって、使用される温度およびｐＨでＲＮＡを安定化し得る。それにより、ＲＮＡ完全性が維持され得、例えばＲＴ−ＰＣＲなどの標準的な方法を使用したその後のＲＮＡ分析が可能になる。実施例によって実証されているように、硫酸アンモニウムの存在下、高温および高ｐＨ条件下でＲＮＡを処理した場合、ＲＮＡ完全性はかなり改善される。
【００４４】
前記方法は、ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させて、所望の硫酸アンモニウム濃度、例えば１０ｍＭまたはそれ未満を確立することを含み得る。ＲＮＡをプロセシングする方法は、ＲＮＡと、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムとを接触させることによって、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む処理条件でＲＮＡを安定化することを含み得る。前記方法は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを伴う条件でＲＮＡを安定化することを含み得、前記方法は、ＲＮＡと、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムとを接触させることを含む。
【００４５】
硫酸アンモニウムは、処理中に使用される温度およびｐＨでＲＮＡを安定化し得る。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡの安定化」は、ＲＮＡ分解を阻害または防止することを含み得る。特に、「ＲＮＡの安定化」は、モノヌクレオチドへのＲＮＡ分子の分解を阻害または防止することを含み得る。ＲＮＡは、特に、温度誘導性分解から、または温度およびｐＨ誘導性分解から保護され得る。「ＲＮＡの安定化」は、特に、加水分解から、より具体的には自然加水分解からＲＮＡを保護することを含み得る。「ＲＮＡの安定化」は、ホスホジエステル結合の切断からＲＮＡを保護することを含み得る。実施例によって実証されているように、ＲＮＡ完全性は、硫酸アンモニウムの存在下で実質的に改善される。硫酸アンモニウムがこれらの驚くべき保護効果を発揮する正確な機構は理解されていない。硫酸アンモニウムによる安定化は、直接的または間接的な相互作用を介して、例えば、ＲＮＡと直接的に相互作用することによって、またはこのような相互作用がなければＲＮＡを分解しもしくはＲＮＡの分解を促進し得る異なる成分と相互作用することによって行われ得る。
【００４６】
一実施形態によれば、「ＲＮＡの安定化」は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のＲＮＡ分解の減少、好ましくは加水分解によるＲＮＡ分解の減少をもたらす。減少は、硫酸アンモニウムの非存在下である以外は同一の条件下で処理されたＲＮＡについて観察された分解と比較した減少であり得る。
【００４７】
一実施形態によれば、「ＲＮＡの安定化」は、ＲＮＡ完全性の少なくとも１００％、少なくとも１５０％または少なくとも２００％の改善をもたらす。実施例によって実証されているように、ＲＮＡ完全性は、２００〜３００％改善され得る。改善は、硫酸アンモニウムの非存在下である以外は同一の条件下で処理されたＲＮＡについて観察された完全性と比較した改善であり得る。
【００４８】
ＲＮＡ分解およびＲＮＡ完全性を決定する方法は周知であり、変性条件下におけるゲル電気泳動の使用、およびマイクロ流体機器（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用に基づく方法が挙げられる。一実施形態によれば、ＲＮＡ分解およびＲＮＡ完全性は、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）を決定することによって決定され得る。ＲＩＮは、完全性の値をＲＮＡ測定結果に割り当てるためのアルゴリズムである。ＲＩＮ値は、１０（インタクト）〜１（完全に分解）の範囲である。ＲＩＮは、例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、“Ｔｈｅ  ＲＩＮ：ａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｆｏｒ  ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｖａｌｕｅｓ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”（ＢＭＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６；７：３）で議論されている。典型的には、少なくとも５のＲＩＮ値を有するＲＮＡは、例えば、ｑＰＣＲ用途を含むＲＴ−ＰＣＲ用途などの標準的な方法に適切であると考えられる（例えば、Ｓ．Ｆｌｅｉｇｅ，Ｍ．Ｗ．Ｐｆａｆｆｌ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２７（２００６）１２６−１３９を参照のこと）。
【００４９】
本明細書で定義される硫酸アンモニウムの存在下、高温および高ｐＨにおけるＲＮＡの処理後に、少なくとも５、少なくとも６または少なくとも７のＲＩＮを有するＲＮＡが得られ得る。実施例によって実証されているように、これは、例えば、使用される温度およびｐＨならびにインキュベーション時間によって影響を受け得る。実施例から分かるように、少なくとも８または少なくとも９などのさらにより高いＲＩＮ値が達成され得る。一実施形態によれば、「ＲＮＡの安定化」は、硫酸アンモニウムの非存在下である以外は同一の条件下でプロセシングされたＲＮＡについて得られたＲＩＮよりも少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または２００〜４００％高いＲＩＮをもたらす。
【００５０】
硫酸アンモニウム
処理中の硫酸アンモニウム濃度は、５０ｍＭまたはそれ未満、４０ｍＭまたはそれ未満、３０ｍＭまたはそれ未満、２５ｍＭまたはそれ未満、２０ｍＭまたはそれ未満、１５ｍＭまたはそれ未満、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満であり得る。上記で言及されているように、本発明の硫酸アンモニウムは、硫酸ジアンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）および／または重硫酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＳＯ４）であり得、硫酸ジアンモニウムが好ましい。驚くべきことに、非常に低濃度の硫酸アンモニウムが、安定化効果を達成するために十分かつ効率的である。一実施形態によれば、高温および高ｐＨにおける処理中の硫酸アンモニウムの濃度は、９ｍＭもしくはそれ未満、８ｍＭもしくはそれ未満、７ｍＭもしくはそれ未満、６ｍＭもしくはそれ未満、５ｍＭもしくはそれ未満、４ｍｍもしくはそれ未満、３．５ｍＭもしくはそれ未満または３ｍＭもしくはそれ未満である。実施例によって実証されているように、２．５ｍＭまたはそれ未満の濃度であっても、顕著な安定化効果を達成するために十分である。ＲＮＡの処理は、硫酸アンモニウムの存在下で行われるので、濃度は０ｍＭを超える。一実施形態によれば、硫酸アンモニウムの濃度は、少なくとも０．２５ｍＭ、好ましくは少なくとも０．５ｍＭ、少なくとも０．７５ｍＭまたは少なくとも１ｍＭである。議論されているように、硫酸ジアンモニウムが好ましい。
【００５１】
本明細書に記載される硫酸アンモニウムの濃度は、通常、処理の間のＲＮＡを含む液体組成物中の濃度である。前記液体組成物は、少なくとも処理中に、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨおよび少なくとも７０℃の温度を有する。このような液体組成物を提供するための様々な選択肢は、本明細書に記載されている。一実施形態では、例えば、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させるために、ＲＮＡを処理する場合に実施形態において存在し得る固相、例えばアニオン交換マトリックスの体積および／または重量を考慮せずに、濃度を計算する。
【００５２】
一実施形態によれば、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理する場合、硫酸アンモニウムは、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．２５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、０．７ｍＭ〜８ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１．５ｍＭ〜６ｍＭ、１．７５ｍＭ〜５ｍＭまたは２ｍＭ〜４ｍＭの濃度で存在する。実施例で実証されているように、このような高温および強アルカリ性条件における長期インキュベーション後であっても、ＲＮＡの強力な安定化が観察された。硫酸アンモニウムの例示的な濃度は、２ｍＭ〜３．５ｍＭの範囲内であり得る。
【００５３】
したがって、前記方法は、硫酸アンモニウムの存在下、したがって硫酸ジアンモニウムおよび／または重硫酸アンモニウム、好ましくは上記濃度値または濃度範囲の硫酸ジアンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理することを含み得る。
【００５４】
実施例から分かるように、このような非常に低濃度の硫酸アンモニウムは、例えば、７５℃、さらには８５℃の温度および強アルカリ性条件下でＲＮＡ安定化を保証した。この効果は、長期インキュベーション中であっても観察された。特にこのような低濃度の硫酸アンモニウムは、本発明の方法において使用され得るように、有利なことに、ＰＣＲまたはｑＰＣＲ用途などのプロセシングＲＮＡの典型的かつ重要な下流用途を妨げない。
【００５５】
ＰＨ
硫酸アンモニウムは強力なＲＮＡ保護効果を付与するので、ＲＮＡは、少なくとも７０℃の温度および強アルカリ性条件下で処理され得る。前記方法は、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理することを含む。実施形態では、処理中のｐＨは、少なくとも８．２、少なくとも８．５または少なくとも８．７であり得る。実施形態では、処理中のｐＨは、少なくとも９、少なくとも９．２、少なくとも９．５、少なくとも９．８、少なくとも１０、少なくとも１０．２または少なくとも１０．５であり得る。実施形態によれば、ｐＨは、１４もしくはそれ未満、１３．５もしくはそれ未満、好ましくは１３もしくはそれ未満、１２．８もしくはそれ未満、１２．５もしくはそれ未満、１２．２もしくはそれ未満、１２もしくはそれ未満または１１．７５もしくはそれ未満である。
【００５６】
ｐＨは、８〜１４、８．２〜１３．５、８．５〜１３または８．７〜１２．５の範囲内であり得る。ｐＨは、９〜１４、９．２〜１３．５、９．４〜１３、９．６〜１２．５、９．８〜１２．２５または約１０〜約１２の範囲内であり得る。約１０〜約１２のｐＨ値は、特に、約１０．５、約１１および約１１．５のｐＨ値を含む。例えば、実施例では１１のｐＨを試験し、硫酸アンモニウムは、この高ｐＨ値で強力な安定化効果を発揮する。特に好ましいｐＨ範囲は、１０〜１１．５である。
【００５７】
したがって、前記方法は、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および上記ｐＨ値または範囲を含む条件でＲＮＡを処理することを含み得る。好ましい硫酸ジアンモニウムを含む硫酸アンモニウムの好ましい濃度範囲および値は上記に記載されており、好ましいｐＨ範囲および値のいずれかと組み合わされ得る。
【００５８】
本明細書に記載されるｐＨは、通常、処理中にＲＮＡを含む液体組成物中のｐＨである。前記液体組成物は、少なくとも処理中に、記載されているｐＨおよび少なくとも７０℃の温度を有する。このような液体組成物を提供するための様々な選択肢は、本明細書に記載されている。
【００５９】
温度
記載されているように、前記方法は、少なくとも７０℃の温度を含む条件でＲＮＡを処理することを含む。温度は、少なくとも７０℃、少なくとも７２℃、少なくとも７４℃、少なくとも７５℃、少なくとも７７℃、少なくとも７８℃、少なくとも８０℃、少なくとも８２℃または少なくとも８５℃であり得る。一実施形態によれば、温度は、９５℃もしくはそれ未満または９０℃もしくはそれ未満である。
【００６０】
温度は、７０℃〜１００℃、７０℃〜９５℃、７３℃〜９３℃、７５℃〜９０℃または約７５℃〜８５℃の範囲内であり得る（７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃および８４℃の値が含まれる）。さらに適切な範囲は、７２℃〜８８℃である。実施例から分かるように、硫酸アンモニウムは、非常に低濃度であっても、例えば７５℃または８５℃の高温でＲＮＡの優れた安定化を提供する。
【００６１】
したがって、前記方法は、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、上記温度または温度範囲および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理することを含み得る。好ましい硫酸ジアンモニウムを含む硫酸アンモニウムの好ましい濃度範囲および値ならびにｐＨは上記に記載されており、好ましい温度範囲および値のいずれかと組み合わされ得る。
【００６２】
本明細書に記載される温度は、通常、処理中にＲＮＡを含む液体組成物中の温度である。前記液体組成物は、少なくとも処理中に、記載されている温度を有する。このような液体組成物およびこのような温度を提供するための様々な選択肢は、本明細書に記載されている。
【００６３】
キレート化剤
一実施形態では、加えて、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件における処理は、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの存在下で行われる。高温およびｐＨ処理条件の確立前に、その確立中にまたはその確立後に、キレート化剤とＲＮＡとを接触させ得る。キレート化剤は、二価カチオンを錯化するための薬剤であり得る。驚くべきことに、高温および高ｐＨにおける処理中に、キレート化剤は、ＲＮＡ安定化を支援およびさらに改善し得ることが見出された。さらに、本発明者らによって実施例で実証されているように、キレート化剤は、安定化効果を維持しながら、例えば２ｍＭまたはそれ未満などの特に低濃度の硫酸アンモニウムを使用することを可能にする。一実施形態によれば、キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ’，Ｎ’，−Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラアセトキシ−メチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）、ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。キレート剤のさらなる例は、アセチルアセトン、エチレンジアミン、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、ジエチレントリアミン、イミノジアセテート、トリエチレンテトラミン、トリアミノトリエチルアミン、ニトリロトリアセテート、ビス（サリチリデン）エチレンジアミン、エチレンジアミノトリアセテート、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタアセテート、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラアセテート、カルボン酸塩、例えばシュウ酸塩、酒石酸塩およびクエン酸塩、ジメチルグリオキシム、８−ヒドロキシキノリン、２，２’−ビピリジン、１，１０−フェナントロリン、ジメルカプトコハク酸ならびに１，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタンである。有利な実施形態では、キレート化剤は、ＥＤＴＡである。好ましくは、ＥＤＴＡまたは他のキレート化剤は、例えばＰＣＲなどのＲＮＡの下流用途における特定の酵素反応を潜在的に妨げることを回避するために、比較的低濃度で使用される。一実施形態によれば、処理中の１つまたはそれを超えるキレート化剤の濃度は、５ｍＭもしくはそれ未満、３ｍＭもしくはそれ未満、２ｍＭもしくはそれ未満、１ｍＭもしくはそれ未満、０．８ｍＭもしくはそれ未満、０．５ｍＭもしくはそれ未満、０．２５ｍＭもしくはそれ未満または０．１ｍＭもしくはそれ未満である。ＥＤＴＡの濃度は、好ましくは、１ｍＭまたはそれ未満である。キレート化剤は、それが硫酸アンモニウム、例えば特に硫酸ジアンモニウムの保護効果を支援する濃度で使用される。個々のキレート化剤の適切な濃度は、当業者によって決定され得る。濃度は、０．００１ｍＭ〜１ｍＭ、０．００５ｍＭ〜０．８ｍＭ、０．００７５ｍＭ〜０．７ｍＭまたは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの範囲内であり得る。本発明者らが実験で見出したように、これらの濃度は、ＥＤＴＡに特に適切である。一実施形態によれば、ＥＤＴＡなどのキレート化剤の濃度は、０．００５ｍＭ〜０．０１５ｍＭである。一実施形態によれば、濃度は、処理中に存在するさらなるキレート化剤の総濃度である。
【００６４】
処理用組成物およびさらなる実施形態の調製
上記で説明されているように、第１態様のＲＮＡをプロセシングする方法は、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理することを含む。ＲＮＡプロセシング中のいくつかの時点において、硫酸アンモニウムが、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む処理条件において所望の濃度で組成物中に存在する限り、硫酸アンモニウム濃度、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを提供／達成する順序は限定されないと理解されよう。
【００６５】
最初に、例えば１０ｍＭまたはそれ未満の硫酸アンモニウム濃度を提供し得るかまたはそれが存在し得、続いて、少なくとも７０℃の温度および／または少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを確立し得る（同時にまたはその後に温度およびｐＨを提供し、温度の前または後にｐＨを提供する）。また、最初に（同時にまたは次々に）、硫酸アンモニウム濃度およびｐＨを提供し得るかまたはそれが存在し得、続いて、温度を確立し得る。当然のことながら、最初に（同時にまたは次々に）、硫酸アンモニウム濃度および温度を提供するかまたはそれが存在し、続いて、ｐＨを提供することも可能である。想定される用途に応じて、最初にｐＨを提供し得るかもしくはそれが存在するか、または最初に温度を提供し得るかもしくはそれが存在し、続いて、（同時にまたは次々に）他の２つの条件を提供することも望ましい場合がある。
【００６６】
前記方法は、硫酸アンモニウム濃度の確立前に、その確立と同時にまたはその確立後に、温度を少なくとも７０℃または上記適切な温度値または範囲のいずれか１つに調整することを含み得る。これは、本方法における能動的な工程であり得る。本明細書に記載される温度を達成または調整するための手段および方法は当業者に公知であり、本明細書では詳細な説明を必要としない。それらは、加熱デバイス、例えば限定されないが、加熱プレート（撹拌手段の有無にかかわらず）、加熱マントル、水浴、加熱ブロック、サーモサイクラーなどを使用することを含む。
【００６７】
前記方法は、硫酸アンモニウム濃度の確立前に、その確立と同時にまたはその確立後に、ｐＨを少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨまたは上記適切なｐＨ値または範囲のいずれか１つに調整することを含み得る。これは、本方法における能動的な工程であり得る。ｐＨを調整するための手段および方法は当業者に公知であり、本明細書では詳細な説明を必要としない。それらは、特に、強塩基、例えば限定されないが、水酸化アルカリ塩基、緩衝系またはアルカリ性有機化合物を使用して、所望のｐＨを提供することを含む。また、アルカリ性緩衝剤が使用され得る；例としては、限定されないが、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳおよびＣＡＢＳが挙げられる。
【００６８】
前記方法は、例えば≦１０ｍＭの所望の濃度を確立するように硫酸アンモニウムの濃度を調整すること、および／または上記適切なｐＨ値または範囲のいずれか１つを調整することを含み得る。前記方法は、ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させて、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立することを含み得る。
【００６９】
一実施形態によれば、適用処理条件でＲＮＡを安定化するために有効な濃度で、ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させる。例えば、ＲＮＡと、高温およびｐＨ処理条件中にＲＮＡを安定化するために有効な濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液（これは、好ましくは水溶液である）とを接触させ得る。
【００７０】
一実施形態によれば、ＲＮＡと、タンパク質を沈殿させない濃度の硫酸アンモニウム（例えば、硫酸アンモニウムを含む溶液）とを接触させる。
【００７１】
好ましくは、前記方法は、硫酸アンモニウムを追加して、例えば１０ｍＭまたはそれ未満の所望の濃度を確立することを含む。これは、固体硫酸アンモニウムを、ＲＮＡを含む液体組成物に追加することによって行われ得る。
【００７２】
しかしながら、好ましくは、硫酸アンモニウムを含む溶液とＲＮＡとを接触させて、所望の硫酸アンモニウム濃度を確立する。例示的な好ましい溶液は、以下にさらに詳細に記載されており、このような溶液を参照のこと。それらは、有利なことに、例えば１０ｍＭまたはそれ未満の所望の硫酸アンモニウム濃度を確立するために使用され得る。
【００７３】
一実施形態によれば、硫酸アンモニウムを追加して硫酸アンモニウム濃度を確立し、硫酸アンモニウムの追加前に、硫酸アンモニウムは存在しないか、またはごく微量の硫酸アンモニウムが存在する。一実施形態によれば、硫酸アンモニウムを追加し、硫酸アンモニウムの追加前に、ＲＮＡは硫酸アンモニウムと接触していないか、または微量の硫酸アンモニウムとのみ接触している。好ましくは、硫酸アンモニウム含有溶液を使用して、硫酸アンモニウムを追加する。
【００７４】
本明細書で使用される場合、硫酸アンモニウムは、好ましい硫酸ジアンモニウムおよび重硫酸アンモニウムを指すので、一実施形態によれば、硫酸ジアンモニウムの追加前に、硫酸ジアンモニウムは存在しないか、またはごく微量の硫酸ジアンモニウムが存在することを理解されたい。一実施形態によれば、硫酸ジアンモニウムの追加前に、硫酸ジアンモニウムおよび重硫酸アンモニウムは存在しないか、または微量でのみ存在する。
【００７５】
１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立するためのＲＮＡと硫酸アンモニウムとの接触は、ＲＮＡと、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液とを接触させることを含み得、一実施形態では、ＲＮＡと溶液との接触前にまたはその接触後に、ｐＨを少なくとも８、好ましくは少なくとも９に調整し、ＲＮＡと溶液との接触前にまたはその接触後に、温度を少なくとも７０℃に調整する。ＲＮＡの分解をもたらし得る条件が生じる場合、硫酸アンモニウムはその安定化効果を直ぐに発揮し得るので、ＲＮＡを少なくとも７０℃の高温およびｐＨ条件に曝露する場合、硫酸アンモニウムは既に存在することが好ましい。他の硫酸アンモニウム濃度を使用する場合も同様である。
【００７６】
１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立するためのＲＮＡと硫酸アンモニウムとの接触は、ＲＮＡと、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液であって、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する溶液とを接触させることを含み得、ＲＮＡと溶液との接触前にまたはその接触後に、温度を少なくとも７０℃に調整する。これは、本方法の好ましい実施形態であり、例えば、ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させ、前記処理条件を使用して、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる場合に非常に有用である。特に、ＲＮＡと、好ましくは少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する硫酸アンモニウム含有溶液との接触後に、温度を少なくとも７０℃に上昇させ得る。しかしながら、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立するためのＲＮＡと硫酸アンモニウムとの接触は、ＲＮＡと、少なくとも７０℃の温度、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する溶液であって、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液とを接触させること、およびＲＮＡと加熱溶液とを接触させることを含み得る。これも本方法の好ましい実施形態であり、例えば、カラムベースのアニオン交換マトリックスを使用して、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるためにも特に適切である。他の硫酸アンモニウム濃度を使用する場合も同様である。
【００７７】
１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立するためのＲＮＡと硫酸アンモニウムとの接触は、ＲＮＡと、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液であって、少なくとも７０℃の温度を有する溶液とを接触させることを含み得、ＲＮＡと溶液との接触前にまたはその接触後に、ｐＨを少なくとも８、好ましくは少なくとも９に調整する。ＲＮＡと溶液との接触後に、ｐＨを少なくとも８、好ましくは少なくとも９に調整し得る。また、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立するためのＲＮＡと硫酸アンモニウムとの接触は、ＲＮＡと、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液とを接触させることを含み得、ＲＮＡと溶液との接触後に、ｐＨを少なくとも８、好ましくは少なくとも９に調整し、ＲＮＡと溶液との接触後に、温度を少なくとも７０℃に調整する。他の硫酸アンモニウム濃度を使用する場合も同様である。例えば、アニオン交換マトリックスに結合したＤＮＡおよびＲＮＡの両方を放出させることを目的とする場合、ＲＮＡと溶液との接触後に、ｐＨを少なくとも８、好ましくは少なくとも９に調整することが望ましい場合がある。
【００７８】
例えば１０ｍＭまたはそれ未満の濃度を確立するためのＲＮＡと硫酸アンモニウムとの接触はまた、ＲＮＡと、少なくとも７０℃の温度、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨまたは両方を有する溶液とを接触させ、続いて、ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させて、例えば１０ｍＭまたはそれ未満の所望の濃度を提供することを含み得ると理解されよう。この実施形態では、硫酸アンモニウムが存在したら、ＲＮＡ安定化が達成される。最初に、硫酸アンモニウムの非存在下で、ＲＮＡを高温および／または高ｐＨ条件に曝露するが、硫酸アンモニウムを追加したら、それは効率的に安定化される。実施例から分かるように、１分間または２分間の初期インキュベーション期間後に、ＲＮＡ分解が特に顕著であるので、温度および／またはｐＨ条件が既に確立された後に、ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させる場合であっても、ＲＮＡは硫酸アンモニウムから利益を得る。この接触は、好ましくは、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを伴う条件下でＲＮＡを処理して２分もしくはそれ未満、１分もしくはそれ未満、４５秒もしくはそれ未満または３０秒もしくはそれ未満以内に行われる。このような実施形態は、例えば、前記処理条件を使用してアニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させる場合に使用され得る。溶出は、少なくとも２つの工程を含み得、最初に、結合ＲＮＡとアルカリ溶出溶液とを接触させ、続いて、（好ましくは、溶液に含まれる）硫酸アンモニウムとを接触させて、ＲＮＡを保護する。
【００７９】
一実施形態によれば、少なくとも７０℃の温度を含む条件で処理されるＲＮＡ含有組成物は、９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを有し、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む。実施形態では、少なくとも７０℃の温度を含む条件で処理されるＲＮＡ含有組成物は、１０〜１２のｐＨを有し、０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む。上記のように、ＲＮＡ含有組成物はまた、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含み得る。したがって、実施形態では、少なくとも７０℃の温度を含む条件で処理されるＲＮＡ含有組成物は、９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを有し、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含み、ＥＤＴＡをさらに含む。実施形態では、ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度で含まれる。ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜０．０１５ｍＭの濃度で含まれ得る。実施形態では、処理温度は、７０℃〜９０℃、７２℃〜８８℃または７５℃〜８５℃の範囲内である。本明細書に記載されるように、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出／溶出させるために、本発明の技術を使用する場合、前記組成物は、例えば磁性粒子の形態のアニオン交換マトリックスを含み得る。
【００８０】
インキュベーション
一実施形態によれば、ＲＮＡの処理は、ＲＮＡをインキュベートする工程を含む。特に、ＲＮＡの処理は、上記に詳細に記載されている温度およびｐＨ条件でＲＮＡをインキュベートすることを含み得る。
【００８１】
ＲＮＡを少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも５分間、少なくとも７分間または少なくとも１０分間インキュベートし得る。それを最大６０分間、最大３０分間、最大２０分間、最大１８分間、最大１５分間、最大１２分間、最大１０分間、最大７分間、最大５分間、最大３分間または最大２分間インキュベートし得る。好ましい実施形態によれば、ＲＮＡを１分間〜２０分間、２分間〜１５分間、５分間〜１２分間または７分間〜１０分間インキュベートする。
【００８２】
ＲＮＡインキュベーション中に、上記に詳細に記載されている濃度の硫酸アンモニウムが存在する場合、それは分解からＲＮＡを保護する。これは、既に１０ｍＭまたはそれ未満の濃度のＲＮＡ硫酸アンモニウムが、上記で定義される温度およびｐＨ条件でＲＮＡの安定化を付与するためである。しかしながら、記載されているように、最初に、硫酸アンモニウムの非存在下でＲＮＡを短時間インキュベートし、続いて、硫酸アンモニウムを追加して分解を防止することも企図される。
【００８３】
上記で定義される温度およびｐＨ条件におけるインキュベーションの後に、７０℃未満の温度、例えば特に室温におけるインキュベーション期間が続き得る。本明細書で使用される場合、「室温」は、特に、１５℃〜２８℃の温度を意味し得る。さらに、７０℃またはそれを超える処理条件の適用後に、例えば０℃〜２０℃または２℃〜１０℃の温度でＲＮＡ含有組成物を冷却し得る。例えば、上記で定義される温度およびｐＨ条件におけるインキュベーションの後に、７０℃未満の温度、例えば特に室温またはそれ未満における最大６０分間、最大５０分間、最大４０分間、最大３０分間、最大２０分間または少なくとも１０分間のインキュベーション期間が続き得る。この場合、好ましくは、上記で定義される濃度の硫酸アンモニウムが存在する。
【００８４】
上記で示されているように、好ましくは、ＲＮＡインキュベーションの全期間中に、上記で定義される濃度の硫酸アンモニウムが存在するが、ＲＮＡの処理は、最初に、硫酸アンモニウムの非存在下でＲＮＡを短時間インキュベートし、続いて、インキュベーション中にまたはその後に、硫酸アンモニウムを追加することを含むことも企図される。したがって、最初に、上記で定義される温度およびｐＨ条件でＲＮＡをインキュベートし、続いて、１０ｍＭまたはそれ未満の硫酸アンモニウム濃度を確立することが企図される。例えば、２分間、１分間または４５秒間もしくはそれ未満の短いインキュベーション後に、硫酸アンモニウム濃度を確立し得る。実施例から分かるように、この期間後に、高温およびｐＨのＲＮＡ分解効果は特に顕著である。したがって、また、高温およびｐＨにおける短いインキュベーション後に、硫酸アンモニウム濃度を確立する場合、ＲＮＡは、硫酸アンモニウムの安定化効果から利益を得ることができる。しかしながら、ＲＮＡを少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨに曝露する場合、全期間中に硫酸アンモニウムが存在することが好ましい。
【００８５】
一実施形態によれば、１つまたはそれを超えるタンパク質分解酵素または他の酵素化合物の存在下でインキュベーションを行い、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを伴う処理条件におけるインキュベーション中に、１つまたはそれを超えるタンパク質分解酵素または他の酵素化合物を不活性化する。熱、アルカリ性ｐＨまたはその両方によって、１つまたはそれを超えるタンパク質分解酵素または他の酵素化合物を不活性化し得る。サンプル、特に生物学的サンプルからＲＮＡを単離する場合、このような酵素および酵素化合物の１つまたはそれよりも多くを使用することが多い。単離プロセス中に、それらは、精製ＲＮＡ中に持ち越され得る。本明細書に記載されるように、本発明の方法において使用される温度およびｐＨ処理条件は、有利なことに、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出（特に、溶出）させるために利用され得る。前記放出プロセス中に、硫酸アンモニウムの存在は、ＲＮＡを保護および安定化する。したがって、これらの条件は、ＲＮＡ単離方法において有利に使用され得る。前記単離プロセス中に、タンパク質分解酵素または他の酵素化合物を使用する場合、上記で定義される高い温度およびｐＨ条件におけるインキュベーションは、有利なことに、例えばアニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させるためにＲＮＡを処理またはインキュベートする際に依然として存在し得る持ち越された任意のプロテアーゼまたは他の酵素化合物を不活性化し得る。硫酸アンモニウムの存在はＲＮＡを保護するので、プロテイナーゼＫなどの特にロバストな酵素の不活性化に必要とされるような過酷な条件（これは、約７５℃またはそれを超える温度を含み得る）を適用することを可能にする。
【００８６】
タンパク質分解酵素は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドにおけるペプチド結合の切断を触媒する酵素である。例示的なタンパク質分解酵素としては、限定されないが、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、特にズブチリシン、サブチラーゼ、アルカリセリンプロテアーゼなどが挙げられる。例示的なズブチリシンとしては、限定されないが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、ズブチリシン、ズブチリシンＡ、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼなどが挙げられる。サブチラーゼ、サブチリシン、プロテイナーゼＫおよび他のプロテアーゼについての議論は、他の場所ではＧｅｎｏｖら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５：３９１−４００，１９９５に見られ得る。好ましくは、タンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫである。
【００８７】
タンパク質分解酵素、例えば特にプロテイナーゼＫは、ＲＮＡプロセシング方法において、例えばＲＮＡ含有サンプルの溶解または消化に頻繁に使用される。下流用途を妨げ得るので、いくつかの時点において、このような方法における精製中に（例えば、アニオン交換マトリックスからのＲＮＡの放出中に）除去されなかったタンパク質分解酵素、例えばプロテイナーゼＫを不活性化することが望ましい。例えば、プロテイナーゼＫは５０℃で活性であるので、ＲＮＡの逆転写または酵素の使用を伴う他の下流用途を妨げ得る。
【００８８】
存在し得る他の酵素化合物であって、不活性化され得る他の酵素化合物は、ヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼの例は、ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅ、特にＲＮＡｓｅｓである。
【００８９】
硫酸アンモニウム含有溶液
上記のように、硫酸アンモニウムは、好ましくは、ＲＮＡと接触される溶液に含まれる。したがって、前記溶液は、処理条件に供されるＲＮＡ含有組成物中の硫酸アンモニウム濃度を確立するために使用され得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、硫酸アンモニウムは、硫酸ジアンモニウムおよび重硫酸アンモニウムを指すという上記開示と一致して、硫酸アンモニウム含有溶液は、硫酸ジアンモニウム、重硫酸アンモニウムまたはその両方を含む溶液であり得、硫酸ジアンモニウムが好ましい。
【００９１】
したがって、一実施形態によれば、ＲＮＡをプロセシングする方法であって、前記ＲＮＡと、硫酸アンモニウムを含む溶液とを接触させること、ならびに硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む方法が提供される。適切な硫酸アンモニウム濃度は、上記に記載されている。好ましくは、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下で、ＲＮＡを処理する。
【００９２】
溶液は、５０ｍＭもしくはそれ未満、４０ｍＭもしくはそれ未満、３０ｍＭもしくはそれ未満、２５ｍＭもしくはそれ未満、２０ｍＭもしくはそれ未満、１５ｍＭもしくはそれ未満または好ましくは１０ｍＭもしくはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムを含み得る。少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨでＲＮＡを処理する場合に存在し得る硫酸アンモニウム濃度を議論する際、それは、上記濃度値または範囲の硫酸アンモニウムを含み得る。ここでも適用される上記開示を参照のこと。一実施形態によれば、溶液は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．２５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、０．７ｍＭ〜８ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１．５ｍＭ〜６ｍＭ、１．７５ｍＭ〜５ｍＭまたは２ｍＭ〜４ｍＭ、２ｍＭ〜３．５ｍＭまたは約２．５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む。好ましくは、それは、前記濃度の１つの硫酸ジアンモニウムを含む。
【００９３】
一実施形態によれば、溶液は、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する。溶液は、有利なことに、処理条件に望ましいアルカリ性ｐＨ値を確立するために使用され得る。少なくとも７０℃の温度でＲＮＡを処理する場合に存在し得るｐＨ条件を議論する際、それは、上記ｐＨ値またはｐＨ範囲を有し得る。ここでも適用される上記開示を参照のこと。溶液は、８〜１４、８．２〜１３．５、８．５〜１３または８．７〜１２．５の範囲内のｐＨを有し得る。一実施形態によれば、溶液は、９〜１４、９．２〜１３．５、９．４〜１３、９．６〜１２．５、９．８〜１２．２５または１０〜１２の範囲内のｐＨを有する。特に好ましいｐＨ範囲は、１０〜１１．５である。
【００９４】
溶液のアルカリ性ｐＨは、少なくとも１つの塩基を含めることによって達成され得る。一実施形態によれば、溶液は、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを提供するために、１つまたはそれを超える塩および／または他の化合物を含む。アルカリ性ｐＨを提供するために溶液に含められ得る典型的な塩は、１つまたはそれを超えるアルカリ性水酸化物塩、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および／または水酸化カリウム（ＫＯＨ）である。したがって、一実施形態によれば、溶液は、１つまたはそれを超えるアルカリ性水酸化物塩を含み得る。溶液は、ＮａＯＨ、ＫＯＨまたはその両方を含み得る。
【００９５】
例えば、溶液は、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨまたは上記ｐＨ値および範囲のいずれか、特に９〜１４、９．２〜１３．５、９．４〜１３、９．６〜１２．５、９．８〜１２．２５または１０〜１２の範囲内のｐＨを提供するために十分な濃度のＮａＯＨおよび／またはＫＯＨを含み得る。
【００９６】
一実施形態によれば、溶液は、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、１２ｍＭ〜４０ｍＭ、１５ｍＭ〜３５ｍＭまたは約２０ｍＭ〜３０ｍＭのＮａＯＨ、ＫＯＨまたはその両方を含む。一実施形態によれば、示されている濃度は、溶液に含まれるアルカリ性水酸化物塩の総濃度である。
【００９７】
好ましくは、溶液は水性である。一実施形態によれば、溶液は、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための溶液である。したがって、溶液は、溶出溶液、特に溶出バッファーであり得る。
【００９８】
溶液は、さらなる成分、例えば１つまたはそれを超える塩を含み得る。塩は、例えば、それぞれ１００ｍＭもしくはそれ未満（例えば、９０ｍＭもしくはそれ未満、８０、７０、６０もしくは５０ｍＭもしくはそれ未満または１０〜１００ｍＭ、２０〜８０ｍＭまたは３０〜７０ｍＭ）の濃度で含まれ得る。溶液は、１つまたはそれを超えるアルカリ金属ハロゲン化物、例えばＮａＣｌおよび／またはＫＣｌを含み得る。それは、それぞれ１００ｍＭもしくはそれ未満（例えば、９０ｍＭもしくはそれ未満、８０、７０、６０もしくは５０ｍＭもしくはそれ未満または１０〜１００ｍＭ、２０〜８０ｍＭまたは３０〜７０ｍＭ）の濃度の１つまたはそれを超えるアルカリ金属ハロゲン化物、特にＫＣｌを含み得る。一実施形態によれば、アルカリ金属ハロゲン化物の総濃度またはイオン強度は、１００ｍＭもしくはそれ未満（例えば、９０ｍＭもしくはそれ未満、８０、７０、６０もしくは５０ｍＭもしくはそれ未満または１０〜１００ｍＭ、２０〜８０ｍＭまたは３０〜７０ｍＭ）である。一実施形態によれば、塩は、１００ｍＭもしくはそれ未満（例えば、９０ｍＭもしくはそれ未満、８０、７０、６０もしくは５０ｍＭもしくはそれ未満または１０〜１００ｍＭ、２０〜８０ｍＭまたは３０〜７０ｍＭ）の総濃度またはイオン強度で含まれる。
【００９９】
溶液は、低塩溶液であり得る。高塩濃度または高イオン強度は、ＲＮＡの下流用途を妨げ得るので、溶液は低塩溶液であることが好ましい。低塩溶液は、特に、＜１００ｍＭのイオン強度を有する溶液であり得る。
【０１００】
したがって、一実施形態によれば、溶液は、≦１００ｍＭ、≦８０ｍＭまたは≦５０ｍＭのイオン強度を有する溶液である。
【０１０１】
一実施形態によれば、溶液は緩衝化されている。溶液は、１つまたはそれを超える緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ  ＰＩＰＥＳおよびＭＥＳから選択される緩衝剤を含み得る。したがって、硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件におけるＲＮＡの処理は、緩衝剤の存在下で行われ得る。適切なアルカリ性緩衝剤も上記に記載されており、上記開示を参照のこと。記載されているように、緩衝剤は、ＲＮＡと接触される溶液に含まれ得る。しかしながら、緩衝剤はまた、緩衝化または部分緩衝化ＲＮＡ含有組成物をもたらす前工程、例えば洗浄工程から持ち越され得、次いで、本発明の条件を使用してこれを処理する。
【０１０２】
一実施形態によれば、溶液は、キレート化剤を含む。詳細および利点は上記に記載されており、上記開示を参照のこと。一実施形態によれば、キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ’，Ｎ’，−Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラアセトキシ−メチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）、ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＤＴＣ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミンジコハク酸（ＥＤＤＳ）およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。さらなる適切なキレート化剤も上記に記載されている。有利な実施形態では、溶液は、キレート化剤としてＥＤＴＡを含む。一実施形態によれば、溶液は、５ｍＭもしくはそれ未満、３ｍＭもしくはそれ未満、２ｍＭもしくはそれ未満、１ｍＭもしくはそれ未満、０．８ｍＭもしくはそれ未満、０．５ｍＭもしくはそれ未満、０．２５ｍＭもしくはそれ未満または０．１ｍＭもしくはそれ未満の濃度の１つまたはそれを超えるキレート化剤を含む。ＥＤＴＡの濃度は、好ましくは１ｍＭまたはそれ未満である。溶液は、例えば、０．００１ｍＭ〜１ｍＭ、０．００５ｍＭ〜０．８ｍＭ、０．００７５ｍＭ〜０．７ｍＭまたは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡまたは他のキレート化剤を含み得る。これらの濃度は、ＥＤＴＡに特に適切である。一実施形態によれば、ＥＤＴＡなどのキレート化剤の濃度は、０．００５ｍＭ〜０．０１５ｍＭである。一実施形態によれば、濃度は、溶液中に存在するキレート化剤の総濃度である。
【０１０３】
溶液は、ＰＣＲ用途などのＲＮＡの下流用途を支援する成分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。
【０１０４】
溶液は、ＰＣＲにおいて、例えばバッファーとしての適用に適切な溶液であり得る。溶液は、直接的にＰＣＲにおいて、またはＰＣＲ中に使用される酵素が活性なｐＨに溶液のｐＨを低下させた後に、例えばバッファーとしての適用に適切な溶液であり得る。
【０１０５】
一実施形態によれば、溶液は非錯化Ｍｇ２＋を含まず、および／または非錯化Ｃａ２＋を含まない。一実施形態によれば、溶液は、非錯化二価カチオンを含まない。一実施形態によれば、溶液はＭｇ２＋を含まず、および／またはＣａ２＋を含まない。一実施形態によれば、溶液は、二価カチオンを全く含まない。
【０１０６】
一実施形態によれば、溶液は、有機溶媒を含まない。
【０１０７】
硫酸アンモニウム含有溶液とＲＮＡとの接触後に、得られた組成物を少なくとも７０℃の温度に加熱し得る。上記のように、ｐＨ値を少なくとも８に、好ましくはｐＨを少なくとも９に調整するためのさらなる工程を回避するので、溶液は、好ましくは、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する（他の適切な好ましいｐＨ値および範囲は上記に記載されている）。したがって、硫酸アンモニウム含有溶液は、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有し得、ＲＮＡと溶液との接触後に、温度を少なくとも７０℃の温度に調整する。
【０１０８】
しかしながら、加熱硫酸アンモニウム含有溶液とＲＮＡとを接触させる実施形態も企図される。溶液は、少なくとも７０℃、少なくとも７５℃、少なくとも８０℃または少なくとも８５℃の温度を有し得る。ＲＮＡを処理する場合に存在し得る温度条件を議論する際、それは、上記温度値または範囲を有し得る。溶液は、７０℃〜１００℃、７０℃〜９５℃、７５℃〜９０℃または約７５℃〜８５℃の範囲内の温度を有し得る。
【０１０９】
一実施形態によれば、溶液は、９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを有し、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む。実施形態では、溶液は、１０〜１２のｐＨを有し、０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含む。上記のように、溶液は、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含み得る。したがって、実施形態では、溶液は、９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを有し、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムを含み、ＥＤＴＡをさらに含む。実施形態では、ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度で溶液に含まれる。一実施形態によれば、ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜０．０１５ｍＭの濃度で溶液に含まれる。議論されているように、溶液は、好ましくは水溶液である。それは、高ｐＨ値を達成するために、１つまたはそれを超えるアルカリ性水酸化物塩、例えばＮａＯＨを含み得る。記載されているように、このような溶液は、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるために使用され得る。
【０１１０】
アニオン交換マトリックスに結合したＲＮＡの放出
一実施形態によれば、ＲＮＡは、アニオン交換マトリックスに結合して存在し、ＲＮＡは、処理中に前記アニオン交換マトリックスから放出される。したがって、本発明の方法において使用される処理条件は、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるために特に有用である。したがって、これらの条件は、有利なことに、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させるために使用され得る。好ましくは、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出／溶出させるために、上記に詳細に記載されている硫酸アンモニウム含有溶液と、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスとを接触させ、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨおよび少なくとも７０℃の温度で放出／溶出を行う。上記のように、好ましくは、少なくとも８、好ましくは少なくとも９の所望のｐＨ値を有する溶液を使用する。溶出のために、溶液とアニオン交換マトリックスとの接触前に、溶液を少なくとも７０℃に加熱し得、および／または溶液と、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスとの接触後に、少なくとも７０℃への加熱を行い得る。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、アニオン交換マトリックスからのＲＮＡの「放出」は、特に、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを遊離させるプロセスを指す。アニオン交換マトリックスから溶液中にＲＮＡを遊離させ得る。ＲＮＡの「放出」は、特に、好ましくは上記に詳細に記載されているように硫酸アンモニウム含有溶液を使用して、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させることを指す。ＲＮＡ含有溶液からアニオン交換マトリックス（例えば、アニオン交換面を含む粒子）を分離して、アニオン交換マトリックスを含有しない溶出液を提供し得る。
【０１１２】
少なくとも８のｐＨでアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させ得る。典型的には、少なくとも９またはそれを超えるｐＨでアニオン交換マトリックスからＲＮＡを非常に速やかに放出させ、少なくとも７０℃の温度を適用することによって、放出をさらに促進する。高い温度およびｐＨ条件は、アニオン交換マトリックスからのＲＮＡの放出に寄与し、それを促進する。また、上記のように、それらはまた、存在し得る任意の望ましくない酵素、例えば特にＲＮＡｓｅおよびプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫを不活性化（例えば、変性）する。上記のように、硫酸アンモニウムは、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを伴う過酷な溶出条件中にＲＮＡを安定化して保護し、それにより、ＲＮＡ分解を阻害する。したがって、硫酸アンモニウムの存在は、高い温度およびｐＨ条件を適用し得、それと同時にＲＮＡ品質を保存し得ることを保証する。
【０１１３】
したがって、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる方法であって、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理して、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させることを含む方法も提供される。
【０１１４】
アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための処理条件は、上記に詳細に記載されているとおりであり得る。したがって、特に、温度およびｐＨ条件ならびに硫酸アンモニウムの濃度は上記のとおりであり得、簡潔性のために、前記説明を参照のこと。好ましくは、ＲＮＡの放出を達成するために、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスと（上記に詳細に記載されている）硫酸アンモニウム含有溶液とを接触させる。上記のように、前記溶液は、好ましくは、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有し、さらなる適切な好ましいｐＨ値および範囲も上記に記載されている。溶液を少なくとも７０℃の温度に予熱し得るか、または好ましくは少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する硫酸アンモニウム含有溶液と、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスとの接触後に、少なくとも７０℃への加熱を行い得る。
【０１１５】
硫酸アンモニウムは、特に、ＲＮＡの放出中に、５０ｍＭまたはそれ未満、４０ｍＭまたはそれ未満、３０ｍＭまたはそれ未満、２５ｍＭまたはそれ未満、２０ｍＭまたはそれ未満、１５ｍＭまたはそれ未満、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満、の濃度で存在し得る。それは、ＲＮＡの放出中に、０．２５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜９ｍＭ、０．７ｍＭ〜８ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１．５ｍＭ〜６ｍＭ、１．７５ｍＭ〜５ｍＭ、２ｍＭ〜４ｍＭ、２ｍＭ〜３．５ｍＭまたは約２．５ｍＭの濃度で存在し得る。
【０１１６】
一実施形態によれば、アニオン交換マトリックスからのＲＮＡの放出（これは、好ましくは、上記に詳細に記載されている硫酸アンモニウム含有溶液を使用して行われる）前に、ＲＮＡは、硫酸アンモニウム含有試薬に曝露または接触されていない。
【０１１７】
ＲＮＡを放出／溶出させるために使用されるｐＨは、８〜１４、８．２〜１３．５、８．５〜１３または８．７〜１２．５の範囲内であり得る。ＲＮＡを放出／溶出させるために使用されるｐＨは、特に、９〜１４、９．２〜１３．５、９．４〜１３、９．６〜１２．５、９．８〜１２．２５または１０〜１２の範囲内であり得る。特に好ましいｐＨ範囲は、１０〜１１．５である。
【０１１８】
ＲＮＡを放出／溶出させるために使用される温度は、特に、７０℃〜１００℃、７０℃〜９５℃、７５℃〜９０℃または約７５℃〜８５℃の範囲内であり得る。
【０１１９】
ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスと溶液とを接触させて、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させ得る。溶液は、好ましくは、上記のように硫酸アンモニウム溶液であり、簡潔性のために、前記説明を再度参照のこと。したがって、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための方法であって、前記ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスと、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムを含む溶液とを接触させること、ならびに（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理して、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させることを含む方法も提供される。好ましくは、硫酸アンモニウム含有溶液は、上記溶液である。ＲＮＡと溶液との接触前にまたはその接触後に、ｐＨを少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨに調整し得る。しかしながら、好ましくは、調整工程を回避するために、放出／溶出中に使用されるｐＨは、硫酸アンモニウム含有溶液によって確立される。したがって、一実施形態では、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスと、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムを含む溶液であって、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する溶液とを接触させる。ＲＮＡと溶液との接触前にもしくはその接触後に、または加熱溶液をアニオン交換マトリックスに追加することによって、温度を少なくとも７０℃に調整し得る。
【０１２０】
アニオン交換面を含む粒子（例えば、磁性粒子）をアニオン交換マトリックスとして使用する場合、ＲＮＡと硫酸アンモニウム含有溶液との接触後に、温度を少なくとも７０℃に調整することが特に好ましい。このような粒子を使用して、溶液の追加後に、粒子の存在下で、温度を非常に好都合に調整し得る。所望により、温度を調整しながら、粒子をかき混ぜるかまたは撹拌し得る。あるいは、ＲＮＡと接触される溶液は、少なくとも７０℃の温度を有し得る。したがって、予熱溶液を使用し得る。ＲＮＡが樹脂もしくは膜に、またはカラムに含まれるアニオン交換マトリックスに結合している場合、予熱溶液の使用が特に実行可能である。
【０１２１】
例えば、アニオン交換マトリックスに結合したＤＮＡおよびＲＮＡの両方を放出させることを目的とする場合、ＲＮＡと、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムを含む溶液であって、場合により少なくとも７０℃の温度を有する溶液との接触後に、ｐＨを少なくとも８、好ましくは少なくとも９に調整することが望ましい場合がある。この場合、最初に、８未満の第１のｐＨ、好ましくは９未満のｐＨでアニオン交換マトリックスからＤＮＡを放出させ得、次いで、ｐＨを少なくとも８の第２のｐＨに、好ましくは少なくとも９の第２のｐＨに上昇させて、その後、第２のｐＨでアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させ得る。
【０１２２】
一実施形態によれば、前記方法は、好ましくは硫酸アンモニウムとの接触時に、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨでＲＮＡを処理して、アニオン交換マトリックスに結合したＲＮＡを放出させることを含む。記載されているように、このような過酷な条件を使用して、マトリックスからＲＮＡを放出または分離させる場合、硫酸アンモニウムが存在することが有利である。しかしながら、本明細書に記載される高温条件およびｐＨ条件を使用すると、ＲＮＡは、典型的には、非常に速やかに放出される。したがって、また、最初に、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させ得、次いでその後、得られたＲＮＡ含有溶液または溶出液を硫酸アンモニウムで安定化し得る。硫酸アンモニウムの非存在下で、最初の短い処理後に、硫酸アンモニウムを追加することも上記に記載されており、この説明を参照のこと。上記のように、硫酸アンモニウムを速やかに追加して、ＲＮＡ分解を回避すべきである。
【０１２３】
アニオン交換マトリックス
使用されるアニオン交換マトリックスは、適切な条件下でＲＮＡに結合することができる。ＲＮＡが結合するアニオン交換マトリックスの種類は、特に限定されない。適切なアニオン交換マトリックスおよびＲＮＡ結合条件は、当業者に公知である。それは、樹脂、膜または粒子であり得る。アニオン交換マトリックスは、アニオン交換面を含む固体支持体であり得る。本明細書で使用される場合、「面」という用語は、特に、固体支持体が液体と接触する際に、それと接触する固体支持体の一部を指す。固体支持体は、アニオン交換部分を提供（例えば、担持）する面を提供する。
【０１２４】
固体支持体の適切な形式としては、限定されないが、粒子、例えばビーズ、膜、フィルタ、プレート、カラム、容器およびディップスティックが挙げられる。一実施形態によれば、アニオン交換部分を含む面は、容器、例えば容器の内面によって提供される。面またはその一部の内面は、アニオン交換部分で官能化（例えば、コーティング）され得る。アニオン交換部分で官能化され得る各容器の例としては、限定されないが、マイクロチューブおよびマイクロプレートのウェルが挙げられる。アニオン交換面は、アニオン交換基を提供するコーティングの形態、例えば、容器または他のデバイス上のコーティング、例えば、マイクロ流体チャネル上のコーティング、または粒子もしくは他の固体支持体上のコーティングとして提供され得る。アニオン交換マトリックスはまた、カラムに含まれ得る。粒子が使用される場合、一実施形態によれば、粒子は、溶液中における粒子の移動を防止するカラムまたは他のデバイスに含まれない。好ましくは、粒子は、例えばかき混ぜられると移動し得る。
【０１２５】
アニオン交換マトリックスは、特に、アニオン交換面を提供する磁性粒子によって提供され得る。多くの用途では、アニオン交換面を含む粒子（特に、磁性粒子）が好都合であるので、本明細書で好ましい。磁性粒子はプロセシングされ得、特に、自動化に有利な磁石の助けによって分離され得るので、磁性粒子の使用は、粒子のプロセシングを簡略化する。粒子は、フェリ磁性特性、強磁性特性、常磁性特性または超常磁性特性を有し得、好ましくは超常磁性である。このような特性は、適切な磁性材料を粒子に組み込むことによって達成され得る。適切な方法は、当業者に公知である。好ましくは、磁性材料は、例えば、粒子の基材として使用されるシリカ、ポリケイ酸、ガラスまたはポリマー材料によって完全に封入される。
【０１２６】
特に、例えば反応容器、ビーカーまたは類似のデバイス中で、粒子、特に磁性粒子を非常に容易かつ好都合に７０℃を超える高温に曝露し得、７０℃を超える高温でインキュベートし得る。特に、粒子が、粒子の移動を防止するカラムまたは他のデバイスに含まれない場合、有利なことに、粒子をかき混ぜることも可能であり、これは、熱に対する均一な曝露を支援し得る。
【０１２７】
アニオン交換マトリックスは、ＲＮＡと相互作用し得るアニオン交換基を提供するアニオン交換部分を含む。アニオン交換部分は、アニオン交換をすることができる１つまたはそれを超える基、例えばアミン基などを含む。適切な条件下、特に適切なｐＨ条件下で、アニオン交換部分は、アニオンに結合することができる。しかしながら、それらは、アニオンとの会合を必要としない。アニオン交換基は、同じ種類のものであり得るが、しかしながら、異なる種類のアニオン交換基も使用され得る。アニオン交換部分は、モノアミン、ジアミン、ポリアミン、窒素含有芳香族または脂肪族複素環基、環状アミン、芳香族アミンおよび複素環アミンから選択され得る。一実施形態によれば、アニオン交換部分は、少なくとも１つの第１級、第２級および／または第３級アミノ基を含む。第４級アミンは、アニオン交換部分としても公知である。
【０１２８】
好ましい実施形態では、アニオン交換基は、第１級、第２級および第３級アミンからなる群より選択されるアミノ基を含む。一実施形態では、前記アミンは、式
Ｒ３Ｎ、Ｒ２ＮＨ、ＲＮＨ２および／またはＸ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ
（式中、
Ｘは、Ｒ２Ｎ、ＲＮＨまたはＮＨ２であり、
Ｙは、Ｒ２Ｎ、ＲＮＨまたはＮＨ２であり、
Ｒは互いに独立して、好ましくはＯ、Ｎ、ＳおよびＰから選択される１個またはそれを超えるヘテロ原子を含み得る直鎖状、分岐状または環状アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール置換基であり、ならびに
ｎは、０〜２０、好ましくは０〜１８の範囲内の整数である）を有する。
【０１２９】
したがって、アニオン交換基はプロトン化可能な基を有し得、場合により、１個を超えるプロトン化可能な基（これは同じものでもよいし、または異なるものでもよい）を有し得る。プロトン化可能な基は、好ましくは、高ｐＨ値では中性または非荷電性の化学基であって、低ｐＨ値ではプロトン化され、それにより正電荷を有する化学基である。特に、プロトン化可能な基は、ＲＮＡの結合が起こる結合ｐＨで正に帯電する。好ましくは、（プロトン化された）プロトン化可能な基のｐＫａ値は、約８〜約１３、より好ましくは約８．５〜約１２または約９〜約１１．５の範囲内である。
【０１３０】
適切なアニオン交換基の例は、特にアミノ基、例えば第１級、第２級および第３級アミノ基ならびに環状アミン、芳香族アミンおよび複素環アミン、好ましくは第３級アミノ基である。アミノ基は、好ましくは、環状置換基、および窒素原子と一緒に複素環または複素芳香環を形成する置換基を含むアルキル、アルケニル、アルキニルおよび／または芳香族置換基を有する。置換基は、好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１２個、１〜８個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１個もしくは２個の炭素原子を含む。それらは、直鎖状または分岐状であり得、ヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、ケイ素およびハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）原子を含み得る。好ましくは、置換基は、４個以下のヘテロ原子、より好ましくは３個以下のヘテロ原子、２個以下のヘテロ原子または１個以下のヘテロ原子を含む。一実施形態では、アニオン交換基は、好ましくは、１〜１０個のアミノ基を有する。より好ましくは、アニオン交換基は２〜８個のアミノ基を有し、特に、アニオン交換基は２〜６個のアミノ基を有する。
【０１３１】
適切なアミン官能基の例は、第１級アミン、例えばアミノメチル（ＡＭ）、アミノエチル（ＡＥ）、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、トリメチルアミノ（ＴＭＡ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、直鎖状または分岐状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カルボキシル化またはヒドロキシアルキル化ポリエチレンイミン、ジェファーミン、スペルミン、スペルミジン、３−（プロピルアミノ）プロピルアミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、Ｎ−モルホリノエチル、ポリリシンおよびテトラアザシクロアルカンである。一実施形態によれば、第１級アミンは、ポリアリルアミンである。さらに、ポリプロピレンイミンテトラミンデンドリマー（ＤＡＢＡＭ）が使用され得る。
【０１３２】
適切なアニオン交換マトリックスおよびアニオン交換基、特にアニオン交換粒子はまた、欧州特許出願公開第ＥＰ１５１７１４６６．４号に開示されており、これを参照のこと。適切な粒子およびアニオン交換基の例はまた、国際公開第２０１０／０７２８３４Ａ１号、独国特許出願公開第１０２００８０６３００１Ａ１号、国際公開第２０１００７２８２１Ａ１号、独国特許出願公開第１０２００８０６３００３号および国際公開第９９／２９７０３号に記載されており、これらを参照のこと。ＲＮＡの結合に使用され得る適切なアニオン交換マトリックスは、電荷スイッチ材料としても公知である。
【０１３３】
適切なアニオン交換マトリックスおよびアニオン交換基、特にポリ（アリルアミン）はまた、国際公開第２０１４／０６６３７６Ａ１号に開示されており、これを参照のこと。
【０１３４】
サンプルからＲＮＡを単離するための方法
本発明のＲＮＡをプロセシングする方法は、有利なことに、サンプルからＲＮＡを単離するために使用され得る。したがって、サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記ＲＮＡを放出させること；
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること
を含む方法が提供される。
【０１３５】
したがって、前記方法は、硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる工程を含む。上記で言及されているように、本明細書で使用される場合、硫酸アンモニウムは、硫酸ジアンモニウムおよび重硫酸アンモニウムを指す。一般に硫酸アンモニウムについて本出願に記載されるすべての開示は、好ましい実施形態である硫酸ジアンモニウムを具体的におよび特に適用するので、特に、本発明のＲＮＡを単離する方法では、硫酸ジアンモニウムでもＲＮＡを処理し得る。
【０１３６】
適切な好ましい硫酸アンモニウム濃度は、上記に記載されている。硫酸アンモニウム濃度は、好ましくは、１０ｍＭまたはそれ未満である。１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理して、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させ得る。したがって、本明細書に記載される処理条件は、有利なことに、ＲＮＡ単離方法において、アニオン交換マトリックスに結合したＲＮＡを溶出させるために使用され得る。放出条件、アニオン交換マトリックスおよび関連する利点に関する詳細は上記に記載されており、各開示を参照のこと。
【０１３７】
一実施形態によれば、前記方法は、
−サンプル、好ましくは生物学的サンプルから、
ｉ）ＲＮＡ；
ｉｉ）アニオン交換面を提供するアニオン交換マトリックス、好ましくは粒子（例えば、磁性粒子）；
ｉｉｉ）場合により、少なくとも１つの塩
を含む結合混合物であって、ＲＮＡが前記アニオン交換マトリックスに結合するようなｐＨを有する結合混合物を調製すること、
−残りの結合混合物から、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスを分離すること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；ならびに
−好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度で存在する硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させること
を含む。
【０１３８】
一実施形態によれば、タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムと接触されていないサンプルから、ＲＮＡを単離する。一実施形態によれば、硫酸アンモニウムを含む溶液と接触されていないか、または硫酸アンモニウムを含む溶液中に保存されていないサンプルから、ＲＮＡを単離する。一実施形態によれば、硫酸アンモニウムと接触されていないサンプルから、ＲＮＡを単離する。
【０１３９】
次に、個々の工程をより詳細に説明する。
【０１４０】
ＲＮＡを放出させるかまたは不純物を除去するために、ＲＮＡを含有するサンプルを処理し得る。このような方法は当技術分野で公知であり、本明細書ではさらに詳細な説明を必要としない。サンプルからのＲＮＡの放出は、サンプルを溶解すること、サンプルをホモジナイズすること、サンプルを消化すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。適切なサンプル種類は、以下に記載されている。特に、サンプルは、生物学的サンプルであり得る。一実施形態によれば、前記処理工程は、１つまたはそれを超える酵素、特にタンパク質分解酵素、例えばヒドロラーゼまたはプロテアーゼの使用を伴う。タンパク質分解酵素の使用は、得られた溶出液の純度を改善することが見出された。特に、タンパク質混入の量が有意に減少する。例示的なタンパク質分解酵素は上記に記載されており、限定されないが、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、例えば特にズブチリシン、サブチラーゼおよびアルカリセリンプロテアーゼが挙げられる。ＲＮＡ単離方法において一般に使用されるタンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫである。例えば、ＤＮＡｓｅなどの１つまたはそれを超えるヌクレアーゼでサンプル由来のＤＮＡを消化することが望ましい場合もある。
【０１４１】
上記のように、このような酵素は、ＲＮＡの調製中に利点を有するとしても、純粋なＲＮＡを提供するための単離プロセスの過程で、それらを除去することが望ましい。特に、活性酵素が精製ＲＮＡに含まれないことを保証することが有利である。本方法は、有利なことに、依然として存在する場合にはこのような酵素を効率的に不活性化することを可能にする。特に、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む処理条件で、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる場合、本方法は、有利なことに、このような酵素を不活性化（例えば、変性）することを可能にする。硫酸アンモニウムの存在により、ＲＮＡは、これらの過酷な条件で保存される。本発明の方法では、かなりの高温で活性な酵素であって、かなりの高温に耐性の酵素、例えばプロテイナーゼＫも効率的に不活性化し得るが、それと同時にＲＮＡを安定化して分解から保護する。
【０１４２】
アニオン交換マトリックスの存在下または非存在下で、サンプルからＲＮＡを放出させ得る。ＲＮＡの放出およびアニオン交換マトリックスに対するＲＮＡの結合は、同時に起こり得る。
【０１４３】
前記方法は、ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させることを含む。前記方法が、サンプルからＲＮＡを放出させることを含む場合、ＲＮＡの放出に続いてまたはそれと同時に、ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させ得る。一実施形態によれば、サンプルからのＲＮＡの放出後に、ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させる。
【０１４４】
ＲＮＡを結合させるための例示的な好ましいアニオン交換マトリックスは上記に記載されており、この説明を参照のこと。特に、アニオン交換マトリックスは、アニオン交換面を含むかまたはアニオン交換面でコーティングされた粒子（例えば、磁性粒子）によって提供され得る。例示的なアニオン交換面およびアニオン交換基も上記に記載されており、それを参照のこと。
【０１４５】
一実施形態によれば、アニオン交換マトリックスに対するＲＮＡの結合は、放出されたＲＮＡを含有するサンプルから結合混合物を調製することを含む。結合混合物は、ＲＮＡを結合させるためのアニオン交換マトリックス、例えばアニオン交換粒子を含む。本明細書で使用される場合、「結合混合物」という用語は、ＲＮＡ結合工程のために調製された組成物であって、サンプルに含まれるＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させる組成物を指す。結合混合物を調製することによって、結合混合物に含まれるＲＮＡがアニオン交換マトリックスに結合するように、条件を確立する。アニオン交換面に対するＲＮＡ結合を達成するための適切な条件は、当業者に周知である。
【０１４６】
結合混合物は、粒子のアニオン交換面に対するＲＮＡの結合を可能にするｐＨを有する。結合に適切なｐＨは、特に、アニオン交換基の性質に依存する。結合ｐＨのための適切なｐＨ値は、当業者によって決定され得る。結合混合物は、≦８、≦７．５、≦７、≦６．５、≦６．２５および≦６から選択されるｐＨを有し得る。一実施形態によれば、結合ｐＨは３〜≦８の範囲内であり、より好ましくは、３．５〜７．５；３．７５〜７；４〜６．５および４．２５〜６および４．５〜５．７５から選択される範囲内である。
【０１４７】
結合混合物は、塩を含み得る。結合混合物への塩の組み込みは、単離結果を改善する。一実施形態によれば、塩は、アルカリ金属塩である。一実施形態によれば、アルカリ金属塩は、アルカリ金属ハロゲン化物である。適切な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムが挙げられ、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが好ましい。一実施形態によれば、結合混合物は、５００ｍＭもしくはそれを超える、２００ｍＭもしくはそれを超えるまたは１００ｍＭもしくはそれを超える濃度のカオトロピック塩、例えばグアニジニウム塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、過塩素酸塩または同等もしくはより強力な性質の他のカオトロピック塩を含まない。好ましくは、結合混合物は、このようなカオトロピック塩を欠く。
【０１４８】
一実施形態によれば、アニオン交換マトリックスに対するＲＮＡの結合前にまたはその結合中に、ＲＮＡは、硫酸アンモニウムに曝露または接触されていない。一実施形態によれば、結合混合物は、硫酸アンモニウムを含まない。
【０１４９】
ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させたら、残りの結合混合物から、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスを分離し得る。分離のための適切な手段は、当業者に公知である。
【０１５０】
場合により、ＲＮＡの結合後に、１回またはそれを超える洗浄工程を実施することによって、結合ＲＮＡを洗浄し得る。一実施形態によれば、少なくとも１つの洗浄溶液、好ましくは洗浄バッファーと、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックス（例えば、粒子）とを接触させる。結合ＲＮＡの最大回収を保証するために、洗浄条件は、アニオン交換マトリックスに結合した相当量のＲＮＡが洗浄中にそこから除去されないように選択されるべきである。
【０１５１】
単離されたＲＮＡをさらに精製せずに、例えば診断アッセイにおいて直接的に分析および／または検出することになる場合、洗浄が特に推奨される。例えば、潜在的不純物に感受性の方法（例えば、ＰＣＲ法など）を使用して、単離されたＲＮＡを直接的に分析することになる場合、少なくとも２回の洗浄工程を実施することが推奨される。一実施形態によれば、好ましくは、２つの異なる体積の洗浄溶液が使用される。本明細書では、第１の洗浄溶液の体積は、好ましくは、第２の洗浄溶液の体積よりも大きい。しかしながら、続いて、不純物に対して比較的非感受性の検出および／または分析方法が使用される場合、洗浄は必ずしも必要ではない。
【０１５２】
洗浄溶液は、界面活性剤を含有し得る。適切な界面活性剤としては、限定されないが、非イオン界面活性剤、例えばポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤が挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーからなる群より選択される。好ましい例は、例えば約０．０１％〜１％の濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＢｒｉｊ５８である。
【０１５３】
適切な洗浄溶液およびバッファーも先行技術で公知であるので（例えば、国際公開第２０１３／０４５４３２号を参照のこと）、本明細書ではさらに詳細な説明を必要としない。
【０１５４】
一実施形態によれば、洗浄溶液またはバッファーは、硫酸アンモニウムを含まない。一実施形態によれば、洗浄溶液またはバッファーは、硫酸ジアンモニウムを含まない。
【０１５５】
（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で、アニオン交換マトリックスから結合ＲＮＡを放出させる工程は上記に詳細に記載されており、簡潔性のために、前記説明を参照のこと。特に、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるために適切な処理条件は、上記のとおりであり得る。そこに、適切な好ましい硫酸アンモニウム濃度、ｐＨ値および温度は詳細に記載されている。議論されているように、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの存在下で、ＲＮＡを放出させるための処理を行い得る。詳細は上記に記載されており、各開示を参照のこと。一実施形態によれば、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを含む条件で、アニオン交換マトリックスから結合ＲＮＡを放出させる工程を行う。一実施形態によれば、０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および１０〜１２のｐＨを含む条件で、アニオン交換マトリックスから結合ＲＮＡを放出させる工程を行う。上記のように、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの存在下で、放出を行い得る。したがって、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムの存在下およびさらにＥＤＴＡの存在下、少なくとも７０℃の温度および９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを含む条件で、アニオン交換マトリックスから結合ＲＮＡを放出させる工程を行い得る。実施形態では、ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態によれば、ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜０．０１５ｍＭの濃度で存在する。実施形態では、処理温度は、７０℃〜９０℃、７２℃〜８８℃または７５℃〜８５℃の範囲内である。
【０１５６】
上記のように、好ましくは、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスと、上記に詳細に記載されている特徴の１つまたはそれよりも多くを有する硫酸アンモニウム含有溶液とを接触させる。上記開示を参照し、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出／溶出させるために、上記溶液を使用し得る。
【０１５７】
一実施形態によれば、アニオン交換マトリックスからのＲＮＡの放出前に、ＲＮＡは、硫酸アンモニウムに曝露または接触されていない。一実施形態によれば、アニオン交換マトリックスからのＲＮＡの放出前に、ＲＮＡは、硫酸ジアンモニウムに曝露または接触されていない。
【０１５８】
放出されたＲＮＡは、さらに分析および／または検出され得る。ＲＮＡは、本発明の方法を用いて硫酸アンモニウムによって効率的に安定化され、それにより、さもなければ少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨで処理条件を使用した場合に生じる分解効果が低減される。実施例から分かるように、１０ｍＭまたはそれ未満、例えば約２．５ｍＭの非常に低い硫酸アンモニウム濃度であっても、この効果が観察された。有利なことに、使用される硫酸アンモニウム濃度は非常に低いものであり得、このような低濃度は、検知用途をも妨げない。また、このような低濃度であっても、硫酸アンモニウムは、ＲＮＡに対する強力な安定化効果を発揮するので、そうでなければ下流用途を妨げ得る酵素を効率的に不活性化することも可能である。したがって、本方法は、優れた品質を有するＲＮＡであって、高感度かつ定量的な検出、例えば診断アッセイにおけるウイルスＲＮＡ（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶ）のｑＰＣＲベースの検出にも適切なＲＮＡを生じさせる。
【０１５９】
適切なアッセイおよび／または分析方法を使用して、単離されたＲＮＡを分析および／または検出し得る。したがって、一実施形態によれば、放出または単離されたＲＮＡを分析およびまたは検出する。この分析は、疾患、感染症および／または少なくとも１つの胎児特徴を同定し、検出し、スクリーニングし、モニタリングし、または排除するために実施され得る。
【０１６０】
例えば、各中性ｐＨ値が目的の下流用途に有益である場合、放出または単離されたＲＮＡを含む溶出液を場合により中和し得る。
【０１６１】
単離されたＲＮＡおよび／または単離されたＲＮＡに含まれるもしくは含まれると疑われる特定の標的ＲＮＡを同定し、定量し、改変し、少なくとも１つの酵素と接触させ、増幅し、逆転写し、クローニングし、配列決定し、プローブと接触させ、および／または検出し得る。各方法は先行技術で周知であり、全ＲＮＡまたは細胞外ＲＮＡなどのＲＮＡを分析するために、医学的、診断的および／または予後的分野で一般に適用される。
【０１６２】
ＲＮＡの分析／さらなるプロセシングは、限定されないが、増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、蛍光検出、紫外線分光法、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定、制限分析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、ライゲーション媒介性ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の核酸分析／プロセシング方法を使用して実施され得る。各技術は当業者に周知であるので、本明細書ではさらなる説明を必要としない。
【０１６３】
例示的な好ましい方法は、以下にさらに記載されている。
【０１６４】
サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記ＲＮＡを放出させること；
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること
を含む方法が提供される。
【０１６５】
サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記ＲＮＡを放出させること；
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜５ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および９．５〜１２．５、好ましくは１０〜１２のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること
を含む方法が提供される。
【０１６６】
サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記ＲＮＡを放出させること；
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出するために、０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．７５ｍＭ〜３ｍＭの濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および１０〜１２のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること、
を含む方法が提供される。
【０１６７】
上記のように、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの存在下で、処理を行い得る。実施形態では、ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度で存在する。ＥＤＴＡは、０．００５ｍＭ〜０．０１５ｍＭの濃度で存在し得る。実施形態では、処理温度は、７０℃〜９０℃、７２℃〜８８℃または７５℃〜８５℃の範囲内である。
【０１６８】
サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記ＲＮＡを放出させること；
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；
−少なくとも７０℃の温度の処理で、前記ＲＮＡと、硫酸アンモニウムを含む溶液であって、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する溶液とを接触させることによって、前記アニオン交換マトリックスから前記結合ＲＮＡを放出することであって、前記ＲＮＡと前記溶液との接触前にまたはその接触後に、温度を少なくとも７０℃に調整すること
を含む方法が提供される。
【０１６９】
上記のように、溶液中で、ＲＮＡをインキュベートし得る；詳細は上記に記載されている。結合ＲＮＡを放出させるために使用され得る適切な好ましい硫酸アンモニウム含有溶液も上記に詳細に記載されており、上記開示を参照のこと。一実施形態では、アニオン交換マトリックスは、粒子、好ましくは磁性粒子によって提供される。磁気粒子などの粒子の使用は、ＲＮＡと溶液との接触後に、７０℃の温度を好都合に提供することを可能にする。しかしながら、ＲＮＡと溶液との接触後にのみ温度を７０℃に調整することに代えて、少なくとも７０℃に予熱された溶液を使用し、結合ＲＮＡとこのような予熱溶液とを接触させることも可能である。例えば、樹脂またはカラムの形態で提供されるアニオン交換マトリックスにＲＮＡが結合している場合、ＲＮＡと溶液との接触前に、溶液の温度を少なくとも７０℃に調整することが好ましい。この方法では、樹脂またはカラムの加熱（これは、使用されるカラムの形式および／または材料により不都合または困難な場合がある）が必要とされないので、この場合、予熱溶液を提供することが好都合である。
【０１７０】
好ましくは、アニオン交換マトリックスから、溶出されたＲＮＡを分離する。
【０１７１】
さらに、サンプルからＲＮＡを単離する本発明の方法はまた、サンプルからＲＮＡを単離して、その後の精製プロトコールのために濃縮するための前処理プロトコールとして使用され得る。これは、大きなサンプル体積から小さなサンプル体積にＲＮＡを濃縮し得るという利点を有する。それは、例えば、既存の自動システム（これは、それらが取り扱い得るサンプル体積に関して限界を有する）によって行われ得るそれぞれその後の標準的な核酸単離精製プロトコールの使用を可能にする。より大きな初期サンプル体積をプロセシングし得るので、時間およびコストを節約し得、ＲＮＡの収量を増加させ得る。
【０１７２】
したがって、サンプルからＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記ＲＮＡを放出させること；
−前記ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合ＲＮＡを洗浄すること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを溶出するために、硫酸アンモニウムの存在下、特に１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理すること；
−前記溶出液から前記ＲＮＡを単離すること
を含む方法が提供される。
【０１７３】
ＲＮＡを放出／溶出させるためのＲＮＡの任意選択の放出、結合、任意選択の洗浄および処理に関する詳細は上記に開示されており、上記開示を参照のこと。したがって、アニオン交換マトリックスは、特に、アニオン交換面を提供する粒子（例えば、磁性粒子）によって提供され得るか、またはカラムに含まれ得る。好ましい実施形態によれば、ＲＮＡを処理する場合、ＥＤＴＡなどのキレート化剤がさらに存在する。ＥＤＴＡなどのキレート化剤の特に好ましい濃度は上記に提供されており、適用される。（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを処理して、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを溶出させる場合、酵素、例えばプロテアーゼ、特にプロテイナーゼＫおよび／またはヌクレアーゼ、特にＲＮＡｓｅは、有利なことに、存在する場合には変性されて不活性化され得る。ＲＮＡを処理する場合に存在し得るヌクレアーゼ、例えばＲＮＡｓｅの不活性化は、有利なことに、ＲＮＡ完全性の維持に寄与する。同様に、存在し得るプロテアーゼおよび他の酵素の不活性化は、不活性化酵素が、例えばＰＣＲなどの下流用途において望ましくない酵素活性を示さないという有利な効果を有する。
【０１７４】
続いて、サンプルからＲＮＡを単離する本発明の方法を前処理プロトコールとして使用して濃縮された溶出液からＲＮＡをさらに単離または精製するために、基本的には任意の標準的な核酸単離または精製プロトコールが使用され得る。溶出液からＲＮＡを単離するために使用され得る各単離または精製方法の例としては、限定されないが、抽出、固相抽出、ポリケイ酸ベースの精製、磁性粒子ベースの精製、フェノール−クロロホルム抽出、（アニオン交換面を使用する）アニオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、沈殿およびそれらの組み合わせが挙げられる。また、当業者に公知の任意の他の核酸単離技術が使用され得る。一実施形態によれば、少なくとも１つのカオトロピック剤および／または少なくとも１つのアルコールを使用して、溶出液からＲＮＡ、例えば特に細胞外ＲＮＡを単離してさらに精製する。好ましくは、固相、好ましくは、ケイ素、好ましくはポリケイ酸を含む固相に結合させることによって、ＲＮＡを単離する。
【０１７５】
前処理プロトコールは、手動でまたは自動化方法で実施され得る。同様に、溶出液からの単離は、手動でまたは自動化方法で、特にロボットシステムで実施され得る。一実施形態によれば、前処理プロトコールは手動で実施され、溶出液からの単離は自動化方法で実施される。
【０１７６】
ＲＮＡを濃縮するために前処理プロトコールとして本方法を使用する場合、サンプルは、本明細書に記載されるサンプル、特に液体および／または生物学的サンプルであり得る。サンプルは、体液および体液由来サンプル、特に、体液から細胞を除去することによって体液から得られたサンプルであり得る。サンプルは、特に、血液、血漿または血清および尿から選択され得る。サンプルは、液体生検サンプルおよび／または液体生検試験のサンプルもしくは液体生検試験から得られたサンプルであり得る。サンプルが低濃度のＲＮＡを含む場合、本前処理プロトコールを用いて、大きなサンプル体積から小さなサンプル体積にＲＮＡを濃縮することが特に望ましい。
【０１７７】
特に、ＲＮＡは、特に液体および／または生物学的サンプル由来の細胞外ＲＮＡであり得る。したがって、一実施形態では、好ましくは血液、血漿、血清および尿から選択される体液のまたはそれに由来するサンプルから細胞外ＲＮＡを単離する方法であって、
−場合により、前記サンプルから前記細胞外ＲＮＡを放出させること；
−前記細胞外ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させること；
−場合により、前記結合細胞外ＲＮＡを洗浄すること；
−前記アニオン交換マトリックスから前記細胞外ＲＮＡを溶出するために、硫酸アンモニウム（好ましくは、１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウム）の存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記細胞外ＲＮＡを処理すること；
−前記溶出液から前記細胞外ＲＮＡを単離すること
を含む方法が提供される。
【０１７８】
例えば、配列特異的結合を可能にする適切なプローブであって、固体支持体にカップリングされた適切なプローブを使用することによって、得られた濃縮細胞外ＲＮＡから特定の標的細胞外ＲＮＡを特異的に単離することも本発明の範囲内である。
【０１７９】
また上記で説明されているように、実施形態では、アニオン交換マトリックスから、ＲＮＡに加えてＤＮＡを放出／溶出させる。したがって、本方法はまた、大きなサンプル体積からより小さなサンプル体積にＲＮＡ、特に細胞外ＲＮＡを濃縮し、さらにＤＮＡ、特に細胞外ＤＮＡを濃縮するために、前処理プロトコールとしても使用され得る。次いで、基本的には任意の標準的な核酸単離または精製プロトコール、例えば上記で言及されているプロトコールによって、溶出液からＤＮＡを単離することも可能である。
【０１８０】
次いで、上記のように、溶出液から単離された核酸、特にＲＮＡをさらに分析、検出および／またはプロセシングし得る。
【０１８１】
ＲＮＡおよびサンプル
本発明にしたがってプロセシングまたは安定化され得るＲＮＡの種類は、特に限定されない。ＲＮＡは、原核生物または真核生物ＲＮＡ、好ましくは哺乳動物ＲＮＡ、より好ましくはヒトＲＮＡであり得るか、またはそれらを含み得る。それは、真菌ＲＮＡであり得るか、またはそれを含み得る。それは、病原体および／またはウイルスＲＮＡ（例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶ  ＲＮＡ）であり得るか、またはそれらを含み得る。
【０１８２】
ＲＮＡは、全ＲＮＡであり得る。有利なことに、本発明は、分解から全ＲＮＡ（大きなサイズのＲＮＡを含む）を保護することを可能にする。硫酸アンモニウムの安定化特性は、上記で詳細に議論されている。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）または他の種類のＲＮＡであり得るか、またはそれらを含み得る。ＲＮＡは、小型ＲＮＡ、例えば３００ヌクレオチドよりも短い、特に１００ヌクレオチドよりも短い小型ＲＮＡを含み得る。小型ＲＮＡの例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）および核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）が挙げられる。ＲＮＡは、細胞外ＲＮＡであり得るか、またはそれを含み得る。本明細書で使用される場合、「細胞外ＲＮＡ」という用語は、特に、細胞に含まれないＲＮＡを指す。各細胞外ＲＮＡは、多くの場合、無細胞ＲＮＡとも称される。したがって、細胞外ＲＮＡは、通常、サンプル、好ましくは生物学的サンプル内の細胞の外部にまたは複数の細胞の外部に存在する。細胞外ＲＮＡは、例えば、エキソソームに存在し得る。好ましくは、ＲＮＡが細胞外ＲＮＡである場合、サンプルは、合成的に生産されたＲＮＡを有する人工サンプルではなく、生物学的供給源から得られたものである。細胞外ＲＮＡの例は、細胞外腫瘍関連または腫瘍由来ＲＮＡ、他の細胞外疾患関連ＲＮＡ、胎児ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどならびに非哺乳動物ＲＮＡ、例えば非哺乳動物細胞外ＲＮＡ、例えば原核生物（例えば、細菌）、ウイルスまたは真菌から放出されるウイルスＲＮＡ、病原性ＲＮＡなどを含む。
【０１８３】
プロセシングＲＮＡは、人工サンプルまたは特に生物学的サンプルなどのサンプルに由来し得るか、またはそれらから単離され得、生物学的サンプルは、生物学的供給源から得られたサンプルである。生物学的サンプルは、通常、複雑な組成を有し、多くの異なる成分を含む。生物学的サンプルは、原核生物および真核生物に由来し得る。生物学的サンプルは、組織サンプルなどのサンプルを含有する細胞であり得る。それはまた、体液、全血、血漿、血清、喀痰、涙液、リンパ液、滑液、胸水、尿、汗、髄液、脳脊髄液、腹水、ミルク、糞便、気管支洗浄液、唾液、羊水、鼻分泌物、膣分泌物、擦過生検、精子、精液／精漿、創傷分泌物および排泄物、ならびに細胞培養上清および他のスワブサンプルから得られた上清からなる群より選択され得る。一実施形態によれば、サンプルは、液体生検サンプルおよび／または液体生検試験のサンプルもしくは液体生検試験に由来するサンプルである。一実施形態によれば、サンプルは、体液、身体分泌物または身体排泄物である。一実施形態によれば、サンプルは、全血、血漿または血清である。ＲＮＡ含有サンプルの他の例としては、限定されないが、生物学的サンプル、例えば細胞懸濁液、細胞培養物、細胞培養物の上清などが挙げられる。特に、生物学的サンプルは、例えばヒトもしくは動物から得られた、または細胞培養物に由来する天然サンプルである。細胞は、元のサンプルから除去されている場合がある。それぞれ細胞枯渇サンプルまたは無細胞サンプルもまた、生物学的サンプルという用語によって、および天然サンプルという用語によっても包含される。各天然サンプルの典型的な例は、体液、例えば血液および体液由来サンプル、特に、体液から細胞を除去することによって体液に由来するサンプルである。
【０１８４】
一実施形態によれば、サンプルは、液体サンプルである。
【０１８５】
一実施形態によれば、サンプルは、タンパク質を沈殿させるために硫酸アンモニウムと接触されていないサンプルである。一実施形態によれば、サンプルは、硫酸アンモニウムを含む溶液と接触されていないか、または硫酸アンモニウムを含む溶液中に保存されていないサンプルである。一実施形態によれば、サンプルは、本発明の方法の実施前に、硫酸アンモニウムと接触されていないサンプルである。一実施形態によれば、硫酸アンモニウムは、ＲＮＡ含有サンプルの一部ではない。一実施形態によれば、本発明を実施する場合にのみ、好ましくは硫酸アンモニウム含有溶液を追加することによって、アンモニウム塩を追加する。したがって、上記で説明されているように、例えば、「硫酸アンモニウムと接触されていない」サンプルは、硫酸ジアンモニウムと接触されていないサンプル、重硫酸アンモニウムと接触されていないサンプル、または両方と接触されていないサンプルであり得る。
【０１８６】
さらなる方法
上記方法および知見に基づく本明細書に開示されるさらなる方法についても、本発明の第１の態様のＲＮＡをプロセシングする方法を議論した際に上記で提供されている詳細な開示が参照され、完全に適用される。これは、特に、温度、ｐＨ、硫酸アンモニウム濃度、インキュベーション条件、工程、溶液および材料に関する開示を含み、これらはすべて、以下で議論されているさらなる方法においても適用および使用され得る。上記に詳細に記載されている硫酸アンモニウムを含む溶液は、前記方法における処理条件を確立するために使用され得る。
【０１８７】
第１の態様のＲＮＡをプロセシングする方法を議論した際に上記で説明されているように、ＲＮＡの安定化は、ＲＮＡ分解を阻害または防止することを含み得る。ＲＮＡの安定化は、ＲＮＡ完全性の保持または実質的な保持をもたらし得る。詳細は、上記で説明されている。
【０１８８】
したがって、本発明はまた、ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させることによって、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡ分解を阻害または防止する方法を提供する。硫酸アンモニウムの適切な濃度および濃度範囲は、上記に記載されている。硫酸アンモニウムは、好ましくは、反応混合物中で１０ｍＭまたはそれ未満の濃度で存在する。
【０１８９】
ＲＮＡと硫酸アンモニウムとを接触させることによって、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡ完全性を保持する方法も提供される。硫酸アンモニウムの適切な濃度および濃度範囲は、上記に記載されている。硫酸アンモニウムは、好ましくは、反応混合物中で１０ｍＭまたはそれ未満の濃度で存在する。
【０１９０】
アニオン交換マトリックスに結合したＲＮＡを前記マトリックスから放出させる方法であって、硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む方法も本明細書で提供される。これは、結合ＲＮＡの溶出をもたらす。硫酸アンモニウムの適切な濃度および濃度範囲は、上記に記載されている。濃度は、好ましくは、１０ｍＭまたはそれ未満である。
【０１９１】
ＲＮＡを分析および／または検出する方法であって、ＲＮＡをアニオン交換マトリックスに結合させ、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理して、前記アニオン交換マトリックスから前記ＲＮＡを放出させることによって、サンプルからＲＮＡを単離すること、ならびに放出されたＲＮＡを分析および／または検出することを含む方法が本明細書でさらに提供される。前記方法は、疾患または感染症、例えばウイルス疾患または感染症を検出または診断するために使用され得る。
【０１９２】
ＲＮＡの存在下で酵素を不活性化する方法であって、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で、ＲＮＡの存在下で前記酵素を処理することを含む方法も本明細書で提供される。酵素は、上記酵素であり得る。それは、ヌクレアーゼ、例えばＤＮＡｓｅもしくはＲＮＡｓｅまたはプロテアーゼ、特にプロテイナーゼＫであり得る。処理は、上記のようにインキュベートすることを含み得る。それは、少なくとも１分間、少なくとも２分間または少なくとも５分間、１５分間もしくはそれ未満、１２分間もしくはそれ未満または１０分間もしくはそれ未満インキュベートすることを含み得る。熱、アルカリ性ｐＨまたはその両方によって、酵素を不活性化し得る。変性によって、酵素を不活性化し得る。ＲＮＡの存在下で酵素を不活性化する方法は、硫酸アンモニウムの存在下、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で、ＲＮＡの存在下で前記酵素を処理することを含み得、ＲＮＡが結合したアニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させる。硫酸アンモニウムの適切な濃度および濃度範囲は、上記に記載されている。
【０１９３】
使用
本明細書に開示される使用についても、本発明の第１の態様のＲＮＡをプロセシングする方法を議論した際に上記で提供されている詳細な開示が参照され、完全に適用される。やはり、これは、特に、温度、ｐＨ、硫酸アンモニウム濃度、インキュベーション条件、工程、硫酸アンモニウム含有溶液および材料に関する開示を含み、これらはすべて、以下で議論されている使用においても適用および使用され得る。
【０１９４】
さらなる態様によれば、本発明は、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件でＲＮＡを安定化するための、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの使用を提供する。詳細は、上記に記載されている。
【０１９５】
さらなる態様によれば、本発明は、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための溶液の使用であって、前記溶液が、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有し、前記溶液が、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムを含む使用を提供する。詳細は、上記に記載されている。
【０１９６】
さらなる態様によれば、ＲＮＡをプロセシングするための（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの使用であって、プロセシングが、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で前記ＲＮＡを処理することを含む使用が本明細書で提供される。詳細は、上記に記載されている。
【０１９７】
さらなる態様によれば、ＲＮＡの存在下で酵素を不活性化する場合における（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムの使用であって、不活性化が、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを含む条件で、ＲＮＡの存在下で前記酵素を処理することを含む使用が本明細書で提供される。詳細は、上記に記載されている。
【０１９８】
組成物およびキット
本明細書に開示される組成物についても、本発明の第１の態様のＲＮＡをプロセシングする方法を議論した際に上記で提供されている詳細な開示が参照され、完全に適用される。これは、特に、上記硫酸アンモニウム濃度、ｐＨ値および範囲ならびに温度値および範囲に適用される。上記で説明されているように、好ましい実施形態における硫酸アンモニウムは硫酸ジアンモニウムであり、本明細書に開示される組成物およびキットとの関連では、これも適用される。
【０１９９】
さらなる態様によれば、本発明は、ＲＮＡ含有組成物であって、（好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の）硫酸アンモニウムを含み、少なくとも７０℃の温度および少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有するＲＮＡ含有組成物を提供する。第１の態様の方法では、高温および高ｐＨ処理条件中に、このようなＲＮＡ含有組成物が提供され得る。詳細は、硫酸アンモニウムの存在下におけるＲＮＡの処理と併せて上記に記載されており、上記開示を参照のこと。また、好ましい実施形態によれば、硫酸アンモニウムは、硫酸ジアンモニウムである。一実施形態によれば、ＲＮＡおよび硫酸アンモニウム含有組成物は、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡをさらに含む。詳細は、上記に記載されている。しかしながら、組成物は、特に、ＲＮＡを含む上記溶液であり得るか、またはそれを含み得る。適切な好ましい溶液は上記に記載されており、それを参照のこと。組成物は、アニオン交換面を含むアニオン交換マトリックス（例えば、固体支持体）をさらに含み得る。アニオン交換マトリックスは、アニオン交換面でコーティングされたかまたはアニオン交換面を含む磁性粒子によって提供され得る。組成物は、ＲＮＡ溶出液であり得る。詳細は上記に記載されており、上記開示を参照のこと。
【０２００】
さらなる態様によれば、キットであって、アニオン交換面を提供するアニオン交換マトリックス（好ましくは、磁性粒子）と、アニオン交換マトリックスからＲＮＡを放出させるための溶液であって、少なくとも８のｐＨ、好ましくは少なくとも９のｐＨを有する溶液とを含み、前記溶液が、好ましくは１０ｍＭまたはそれ未満の濃度の硫酸アンモニウム（硫酸ジアンモニウムが好ましい）を含むことを特徴とするキットも本明細書で提供される。キットは、ＲＮＡをプロセシングまたは単離するためのさらなる成分を含み得る。それは、特に、タンパク質分解酵素、例えばプロテイナーゼＫを含み得る。特に、溶液およびアニオン交換マトリックスに関する詳細は、本発明の第１の態様のＲＮＡをプロセシングする方法およびそこで使用される溶液について説明した際に上記に記載されている。ここでも完全に適用される上記開示を参照のこと。
【０２０１】
本発明は、本明細書に開示される例示的な方法、使用、組成物、キットおよび材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の方法、使用、組成物、キットおよび材料は、本発明の実施形態の実施または試験において使用され得る。数値範囲は、範囲を規定する数字を含む。本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではなく、全体として本明細書を参照することによって読まれ得る。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「プロテアーゼ」についての言及は、単一の種類のプロテアーゼ、および２つまたはそれを超えるプロテアーゼを含む。同様に、「ａ」「塩」、「添加物」、「バッファー」などについての言及は、単一の実体およびこのような実体の２つまたはそれよりも多くの組み合わせを含む。「開示」および「本発明」などについての言及は、本明細書で教示される単一または複数の態様を含む；など。本明細書で教示される態様は、「本発明」という用語によって包含される。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は指示値±１０％を意味し得、特に、「約」という用語は指示値±５％を意味し得る。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、液体組成物、好ましくは水性組成物、特にアルカリ性ｐＨを有する水性組成物を指す。溶液は、混合物であり得る。それは、一相のみの均一な混合物であり得るが、溶液が固体添加物、例えばアニオン交換マトリックスおよび／または沈殿物などを含むことも本発明の範囲内である。したがって、溶液はまた、不均一な混合物であり得る。
【０２０５】
一実施形態によれば、方法の場合には特定の工程を含むとして、または組成物、溶液および／もしくはバッファーの場合には特定の成分を含むとして本明細書に記載される主題は、各工程または成分からなる主題を指す。一実施形態によれば、特定の工程を含むとして本明細書に記載される主題は、各工程からなる主題を指し、工程は、示されている順序で実施される。本明細書に記載される好ましい実施形態を選択および組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態の各組み合わせから生じる特定の主題もまた本開示に属する。
【０２０６】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０２０７】
本発明者らは、予想外のことに、低濃度の硫酸アンモニウムの存在が、高温、水溶液中および強アルカリ性条件下でＲＮＡを強く安定化することを見出した。ＲＮＡ分解が阻害される。理論に縛られるものではないが、以下の実施例から分かるように、これは、加水分解プロセスの阻害および遅延に起因し得る。
【０２０８】
実施例１−高温（７５℃）のアルカリ性溶液中におけるＲＮＡ分解：
キットハンドブックにしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用した精製によって、組織サンプル由来のヒト全ＲＮＡを得た。抽出したヒト全ＲＮＡの濃度を８００ｎｇ／μｌに調整した。次いで、下記のように、１μｌのこのＲＮＡ溶液と、１９μｌのアルカリ性溶液またはバッファーとを混合した。
【０２０９】
使用した溶液またはバッファーは、溶液１（２０ｍＭ  ＮａＯＨを含む。約ｐＨ１２）；溶液２（２０ｍＭ  ＮａＯＨを含み、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化されている）；および溶液３（２０ｍＭ  ＮａＯＨを含み、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化されている）であった。
【０２１０】
２μｌのアリコートを直ぐに取り出し、３μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）と混合して任意のＲＮＡ分解を停止させ、参照として使用した。次いで、混合物の残りを７５℃でインキュベートした。特定の時点において、さらなる任意の分解を停止させるために、２μｌを取り出し、３μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）と混合した。
【０２１１】
混合物からアリコートを取り出し、７５℃における１分間、２分間、３分間、５分間、７分間および１０分間のインキュベーション後に、酢酸ナトリウムと混合した。加えて、７５℃における１０分間のインキュベーション後にアリコートを取り出し、次いで、ラボベンチ上に２０〜２５℃でさらに２０分間置いた（総インキュベーション時間３０分間）。また、７５℃における１０分間のインキュベーション後にアリコートを取り出し、次いで、ラボベンチ上に２０〜２５℃でさらに５０分間置いた（総インキュベーション時間６０分間）。
【０２１２】
したがって、インキュベーション時間経過は：
＋１分｜＋２分｜＋３分｜＋５分｜＋７分｜＋１０分｜＋３０分｜＋６０分であり、＋３０分および＋６０分の時点で、ＲＮＡを７５℃で１０分間インキュベートし、続いて、室温でさらに２０分間（総インキュベーション時間３０分間）またはさらに５０分間（総インキュベーション時間６０分間）インキュベートした。
【０２１３】
時間経過の完了後に、ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ＣｈｉｐおよびＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒシステムによって、ＲＮＡ分解時点サンプル（各１μｌ）を分離した。異なるインキュベーション時間についてＲＮＡ完全性を分析し、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）を決定した。ＲＩＮは、完全性の値をＲＮＡ測定結果に割り当てるためのアルゴリズムである。ＲＩＮ値は、１０（インタクト）〜１（完全に分解）の範囲である。典型的には、５のＲＩＮ値を有するＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ用途に適切であると考えられるが、より高感度の用途のためには、より高いＲＩＮ値が望ましい場合がある。
【０２１４】
結果：
溶液１〜３について得られた結果は、以下の図１〜３および表１〜３に示されており、ゲル様画像（図１Ａ、２Ａ、３Ａ）として、電気泳動図（図１Ｂ、２Ｂおよび３Ｂ）として、および表形式（表１〜３）で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒシステムを用いて得られた結果の表示を含む。
【０２１５】
（ａ）溶液１の結果
図１は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（約ｐＨ１２）を含む溶液１と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図１Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。より大きな数字は、より大きな分子サイズを示す。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜９を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  １分
サンプル２：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ２分
サンプル３：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ３分
サンプル４：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ５分
サンプル５：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ７分
サンプル６：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  １０分
サンプル７：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ３０分
サンプル８：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ６０分
サンプル９：参照ＲＮＡ
【０２１６】
参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されており、矢印によって示されている。ゲル様画像から分かるように、サンプル１〜８については、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは容易に検出可能ではなく、これは、強いＲＮＡ分解が起こったことを示している。図１Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。やはり、参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能であるが、サンプル１〜８では容易に検出可能ではなく、これは、これらのサンプルでは強いＲＮＡ分解が起こったことを示している。
【０２１７】
以下の表１もまた、サンプル１〜８におけるＲＮＡの分解を示す。分解は、低いＲＩＮ値によって示される：
【表１−１】
2019514351.tif 000002
【表１−２】
2019514351.tif 000003
【０２１８】
（ｂ）溶液２の結果
図２は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図２Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜９を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：ｐＨ１１  １分
サンプル２：ｐＨ１１  ２分
サンプル３：ｐＨ１１  ３分
サンプル４：ｐＨ１１  ５分
サンプル５：ｐＨ１１  ７分
サンプル６：ｐＨ１１  １０分
サンプル７：ｐＨ１１  ３０分
サンプル８：ｐＨ１１  ６０分
サンプル９：参照ＲＮＡ
【０２１９】
参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されている。サンプル１〜３についても、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡのバンドは両方とも視認可能であるが、インキュベーション時間の増加と共に視認性が低下する傾向がある（ＲＮＡ分解の増加に対応する）。図２Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。やはり、参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能である。サンプル１〜３についても、対応するピークは視認可能であるが、サンプル１〜８については、インキュベーション時間の増加と共に視認性が低下する傾向がある。サンプル４〜８は、２８Ｓピークを示さない。
【０２２０】
以下の表２は、ＲＩＮ値の減少傾向によってＲＮＡの分解を示す。特に、５分間またはそれを超えるインキュベーション時間では、ＲＩＮ値は５未満である。
【表２】
2019514351.tif 000004
【０２２１】
（ｃ）溶液３の結果
図３は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化）を含む溶液３と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図３Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜９を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：ｐＨ１０  １分
サンプル２：ｐＨ１０  ２分
サンプル３：ｐＨ１０  ３分
サンプル４：ｐＨ１０  ５分
サンプル５：ｐＨ１０  ７分
サンプル６：ｐＨ１０  １０分
サンプル７：ｐＨ１０  ３０分
サンプル８：ｐＨ１０  ６０分
サンプル９：参照ＲＮＡ
【０２２２】
ゲル様画像から分かるように、すべてのサンプルについて、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されている。２８ＳリボソームＲＮＡについては、バンドは、インキュベーション時間の増加と共に薄くなる傾向がある。
【０２２３】
図３Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。やはり、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして示されている。２８Ｓ  ＲＮＡの分解は、インキュベーション時間の増加に対するピーク高さの減少によって視認可能である。
【０２２４】
以下の表３は、ＲＩＮ値の減少傾向によってＲＮＡの分解を示す。
【表３】
2019514351.tif 000005
【０２２５】
実施例２−高温（８５℃）のアルカリ性溶液中におけるＲＮＡ分解：
実験設定：
キットハンドブックにしたがってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用した精製によって、組織サンプル由来のヒト全ＲＮＡを得た。抽出したヒト全ＲＮＡの濃度を８００ｎｇ／μｌに調整した。次いで、下記のように、１μｌのこのＲＮＡ溶液と、１９μｌのアルカリ性溶液またはバッファーとを混合した。
【０２２６】
使用した溶液またはバッファーは、溶液１（２０ｍＭ  ＮａＯＨを含む。約ｐＨ１２）；溶液２（２０ｍＭ  ＮａＯＨを含み、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化されている）；および溶液３（２０ｍＭ  ＮａＯＨを含み、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化されている）であった。
【０２２７】
２μｌのアリコートを直ぐに取り出し、３μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）と混合してＲＮＡ分解を停止させた。次いで、混合物の残りを８５℃でインキュベートした。特定の時点において、２μｌを取り出し、３μｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）と混合した。
【０２２８】
混合物からアリコートを取り出し、８５℃における１分間、２分間、３分間、５分間、７分間および１０分間のインキュベーション後に、酢酸ナトリウムと混合した。加えて、８５℃における１０分間のインキュベーション後にアリコートを取り出し、次いで、ラボベンチ上に２０〜２５℃でさらに２０分間置いた（総インキュベーション時間３０分間）。また、８５℃における１０分間のインキュベーション後にアリコートを取り出し、次いで、ラボベンチ上に２０〜２５℃でさらに５０分間置いた（総インキュベーション時間６０分間）。
【０２２９】
したがって、インキュベーション時間経過は：
＋１分｜＋２分｜＋３分｜＋５分｜＋７分｜＋１０分｜＋３０分｜＋６０分であり、＋３０分および＋６０分の時点で、ＲＮＡを８５℃で１０分間インキュベートし、続いて、室温でさらに２０分間（総インキュベーション時間３０分間）またはさらに５０分間（総インキュベーション時間６０分間）インキュベートした。
【０２３０】
時間経過の完了後に、ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ＣｈｉｐおよびＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒシステムによって、ＲＮＡ分解時点サンプル（各１μｌ）を分離した。インキュベーション時間と対比して、ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ値）を分析した。
【０２３１】
結果：
溶液１〜３について得られた結果は、以下の図４〜６および表４〜６に示されており、ゲル様画像（図４Ａ、５Ａ、６Ａ）として、電気泳動図（図４Ｂ、５Ｂおよび６Ｂ）として、および表形式（表４〜６）で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒシステムを用いて得られた結果の表示を含む。
【０２３２】
（ａ）溶液１の結果
図４は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（約ｐＨ１２）を含む溶液１と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図４Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜９を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  １分
サンプル２：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ２分
サンプル３：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ３分
サンプル４：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ５分
サンプル５：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ７分
サンプル６：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  １０分
サンプル７：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ３０分
サンプル８：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ６０分
サンプル９：参照ＲＮＡ
【０２３３】
参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されている。アルカリ性溶液中におけるインキュベーションの開始直後に、ＲＮＡの分解が起こり、サンプル１〜８については、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡのバンドは容易に検出可能ではない。
【０２３４】
図４Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。やはり、参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能であるが、サンプル１〜８では容易に検出可能ではなく、これは、これらのサンプルでは強いＲＮＡ分解が起こったことを示している。
【０２３５】
以下の表４もまた、サンプル１〜８におけるＲＮＡの分解を示す。分解は、非常に低いＲＩＮ値によって示される：いくつかのサンプルについては、ＲＩＮ値の決定は不可能であった（「Ｎ／Ａ」によって示されている）。おそらくは、これは総ＲＮＡ濃度が低いためであり、これらの条件下における急速なＲＮＡ分解が原因であった可能性がある。
【表４】
2019514351.tif 000006
【０２３６】
（ｂ）溶液２の結果
図５は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図５Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜９を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：ｐＨ１１  １分
サンプル２：ｐＨ１１  ２分
サンプル３：ｐＨ１１  ３分
サンプル４：ｐＨ１１  ５分
サンプル５：ｐＨ１１  ７分
サンプル６：ｐＨ１１  １０分
サンプル７：ｐＨ１１  ３０分
サンプル８：ｐＨ１１  ６０分
サンプル９：参照ＲＮＡ
【０２３７】
参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されており、サンプル１〜３についても視認可能である。アルカリ性溶液中におけるインキュベーションの開始後に、ＲＮＡの分解が迅速に起こり、より長いインキュベーション期間については、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡのバンドはほとんど視認不可能であるかまたは全く視認不可能である。
【０２３８】
図５Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。やはり、参照サンプル９では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能であるが、サンプル４〜８については、ピークは検出不可能である。
【０２３９】
以下の表５から分かるより低いＲＩＮ値によっても示されているように、アルカリ性溶液中におけるインキュベーションの開始後に、ＲＮＡの分解が迅速に起こる。特に、すべてのＲＩＮ値が参照サンプルの値よりも低く、サンプル３〜８については、ＲＩＮ値は５未満である。
【表５】
2019514351.tif 000007
【０２４０】
（ｃ）溶液３の結果
図６は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１０に緩衝化）を含む溶液３と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図６Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜９を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：ｐＨ１０  １分
サンプル２：ｐＨ１０  ２分
サンプル３：ｐＨ１０  ３分
サンプル４：ｐＨ１０  ５分
サンプル５：ｐＨ１０  ７分
サンプル６：ｐＨ１０  １０分
サンプル７：ｐＨ１０  ３０分
サンプル８：ｐＨ１０  ６０分
サンプル９：参照ＲＮＡ
【０２４１】
ゲル様画像から分かるように、参照サンプルでは、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されており、サンプル１〜２においても視認可能である。サンプル３では、２８Ｓ  ＲＮＡのバンドがほとんど視認不可能である。インキュベーション時間の増加と共にＲＮＡ分解が増加する。
【０２４２】
図６Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。参照サンプルでは、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして示されている。
【０２４３】
インキュベーション時間の増加と共に減少するＲＩＮ値によって示されているように、アルカリ性溶液中におけるインキュベーションの開始後に、ＲＮＡの分解が迅速に起こる。これは、以下の表６からも分かる。
【表６】
2019514351.tif 000008
【０２４４】
実施例１および２の結果の要約：
図７は、実施例１および２の結果を要約したものである。図７Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。７５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｂは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図７Ｃは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。８５℃で１０分間インキュベートし、続いて室温でインキュベートしたサンプルの値も示されている。図７Ｄは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２における最初の１０分間のＲＮＡインキュベーションについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【０２４５】
分かるように：
−７５℃または８５℃におけるインキュベーション中に、すべての溶液またはバッファー（ｐＨ）条件で、ＲＮＡ分解が観察された。
−より高温およびより高ｐＨは両方とも、より急速なＲＮＡ分解に寄与する。
−重要な観察結果：
−７５℃におけるｐＨ１０のみが、５分間のインキュベーション時間で５超のＲＩＮ値をもたらす。
−８５℃では、３分間のインキュベーション後に、ｐＨ１０〜１１でＲＩＮは４〜５である。
−７５℃では、３分間のインキュベーション後に、ｐＨ１１の場合にはＲＩＮ＞６であり、ｐＨ１０の場合にはＲＩＮ≒８である。
−室温における最大１時間のさらなるインキュベーションは、測定可能なほど高いＲＮＡ分解をもたらさない。
【０２４６】
実施例３−硫酸アンモニウムを使用した、高温のアルカリ性溶液中におけるＲＮＡ安定化
−ヒト全ＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙ抽出）を異なるバッファー（これらは、溶出バッファーとしても適切である）中にスパイクした。
−バッファー条件：
−ＴｒｉｓでｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（溶液２）、
−ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）（溶液４）
−８００ｎｇのＲＮＡ（１μｌ）を１９μｌのバッファーと混合＝インキュベーションの開始
−異なる時点で、２μｌのＲＮＡを取り出し、３μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５）に直ぐに追加して、分解プロセスを停止させる。
−時間経過：＋１分｜＋２分｜＋３分｜＋５分｜＋７分｜＋１０分
−７５℃または８５℃の温度でインキュベートする（室温におけるさらなるインキュベーションなし）
−Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  Ｋｉｔ）においてＲＮＡサンプル（各１μｌ）をランする
−インキュベーション時間と対比して、ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）を分析する。
【０２４７】
結果：
溶液２および４について得られた結果は、以下の図８〜１１および表８〜１１に示されており、ゲル様画像（図８Ａ〜１１Ａ）として、電気泳動図（図８Ｂ〜１１Ｂ）として、および表形式（表８〜１１）で、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒシステムを用いて得られた結果の表示を含む。
【０２４８】
（ａ）溶液２、７５℃におけるインキュベーションの結果
図８は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図８Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜７を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：参照ＲＮＡ（ｔ＝０）
サンプル２：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  １分
サンプル３：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ２分
サンプル４：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ３分
サンプル５：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ５分
サンプル６：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ７分
サンプル７：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  １０分
【０２４９】
参照サンプルでは、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されており、矢印によって示されている。インキュベーション時間の増加と共にＲＮＡ分解が増加する。
【０２５０】
図８Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。参照サンプル１では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能である。
【０２５１】
以下の表８に示されているインキュベーション時間の増加に対するＲＩＮ値の減少からも分かるように、インキュベーション時間の増加と共にＲＮＡ分解の増加が起こる。特に、１０分間のインキュベーション時間では、ＲＩＮ値は５未満であった。
【表８】
2019514351.tif 000009
【０２５２】
（ｂ）溶液４、７５℃におけるインキュベーションの結果
図９は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液４と共に７５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図９Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜７を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：参照ＲＮＡ（ｔ＝０）
サンプル２：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  １分
サンプル３：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ２分
サンプル４：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ３分
サンプル５：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ５分
サンプル６：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ７分
サンプル７：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  １０分
【０２５３】
長期インキュベーション後であっても、すべてのサンプルにおいて、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されている。硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解がかなり遅延する。
【０２５４】
図９Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。参照サンプル１では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能である。やはり、硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解がかなり遅延し、すべてのサンプルにおいて、１８Ｓおよび２８Ｓ  ＲＮＡの明確なピークが容易に視認可能であることが分かる。
【０２５５】
硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解がかなり遅延することは、以下の表９に示されている１０分間のインキュベーション中のＲＩＮ値からも分かる。得られた値はより高く、硫酸アンモニウムの非存在下におけるインキュベーションと比較して、ＲＮＡ完全性が改善される。すべてのサンプルについて、５を大きく超えるＲＩＮ値および約７のＲＩＮ値が達成された。
【表９】
2019514351.tif 000010
【０２５６】
（ｃ）溶液２、８５℃におけるインキュベーションの結果
図１０は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）を含む溶液２と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図１０Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜７を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：参照ＲＮＡ（ｔ＝０）
サンプル２：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  １分
サンプル３：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ２分
サンプル４：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ３分
サンプル５：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ５分
サンプル６：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  ７分
サンプル７：２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１１  １０分
【０２５７】
２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されている。アルカリ性溶液中におけるインキュベーションの開始後に、ＲＮＡの分解が迅速に起こる。
【０２５８】
図１０Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。やはり、アルカリ性溶液中におけるインキュベーションの開始後に、ＲＮＡの分解が迅速に起こることが分かる。
【０２５９】
これは、以下の表１０に示されているより低いＲＩＮ値からも分かる。
【表１０】
2019514351.tif 000011
【０２６０】
（ｄ）溶液４、８５℃におけるインキュベーションの結果
図１１は、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ１１に緩衝化）＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液４と共に８５℃でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像を示す。図１１Ａは、ゲル様画像を示す。ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜７を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：参照ＲＮＡ（ｔ＝０）
サンプル２：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  １分
サンプル３：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ２分
サンプル４：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ３分
サンプル５：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ５分
サンプル６：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  ７分
サンプル７：２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２Ｓ０４  １０分
【０２６１】
２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なバンドとして示されている。８５℃のインキュベーション温度においても、硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解がかなり遅延する。
【０２６２】
図１１Ｂは、電気泳動図の形態で結果を示す。ｙ軸は、任意の所定サイズのＲＮＡ濃度に比例する蛍光シグナルの相対強度を示す。ｘ軸は、ゲルチップを通過する移動時間として、相対的なＲＮＡサイズを示す（より大きな数字＝より大きな分子サイズ）。参照サンプル１では、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡは、明確なピークとして視認可能である。やはり、硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解がかなり遅延することが分かる。
【０２６３】
硫酸アンモニウムの追加によって、ＲＮＡの分解がかなり遅延することは、８５℃における１０分間のインキュベーション中のＲＩＮ値からも分かる。得られた値はより高く、硫酸アンモニウムの非存在下におけるインキュベーションと比較して、ＲＮＡ完全性が改善される。以下の表１１も参照のこと。硫酸アンモニウムの存在下では、すべてのサンプルについて、５超のＲＩＮが達成され、サンプルの大部分について、ＲＩＮは７超であった。
【表１１】
2019514351.tif 000012
【０２６４】
実施例３の結果の要約：
−７５℃または８５℃におけるインキュベーション中に、すべての溶液またはバッファー（ｐＨ）条件で、ＲＮＡ分解が観察された。
−より高温およびより高ｐＨの両方が、より急速なＲＮＡ分解に寄与する。
−７５℃および８５℃の両方で、硫酸アンモニウム（２．５ｍｍ）の追加は、ＲＮＡ分解の阻害および遅延をもたらすので、ｐＨ１１でＲＮＡ安定化をもたらす。
【０２６５】
実施例１〜３で観察されたＲＮＡ安定性の要約
実施例１〜３の結果は、図１２Ａおよび１２Ｂに要約されている。図１２Ａは、７５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、および２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下、７５℃、ｐＨ１１で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。図１２Ｂは、８５℃、ｐＨ１０、１１または１２で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、および２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在下、８５℃、ｐＨ１１で最大１０分間インキュベートしたＲＮＡについて、ＲＮＡ完全性対時間を示す。
【０２６６】
高温条件（例えば、７０℃〜９０℃、７２℃〜８８℃、特に７５℃〜８５℃の温度範囲）および高ｐＨ条件（例えば、９またはそれを超えるｐＨ、例えば１０〜１２のｐＨ、特に１１のｐＨ）下で、低濃度（例えば、約２．５ｍＭ）の硫酸アンモニウムの存在は、ＲＮＡに対する強力な安定化効果をもたらすことが結論付けられる。特に、７５℃〜８５℃における１０分間のインキュベーション中に、ＲＮＡは効率的に安定化された；この状況は、アニオン交換樹脂からＲＮＡを溶出させるために必要な条件を模倣するので、（低濃度の硫酸アンモニウムで安定化した際に）溶出したＲＮＡは、高感度かつ定量的な検出、例えば診断アッセイにおけるウイルスＲＮＡ（例えば、ＨＣＶ、ＨＩＶ）のｑＰＣＲベースの検出に適切である。
【０２６７】
実施例４−ｐＨ１１および８５℃の溶液中における（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＥＤＴＡによるＲＮＡ安定化：
研究デザイン：
・ヒト全ＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙ抽出）を異なるバッファー（これらは、溶出バッファーとして適切である）にスパイクした。
・バッファー条件：
○バッファー１：ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ；
○バッファー２：ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ；
○バッファー３：ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋１ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）；
○バッファー４：ｐＨ１１に緩衝された２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋２．５ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）。
・８００ｎｇのＲＮＡ（１μｌ）を１９μｌのバッファーと混合＝インキュベーションの開始（総体積２０μｌ）。
・異なる時点で、２μｌのＲＮＡを取り出し、３μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５）に直ぐに追加して、分解プロセスを停止させる。
・インキュベーションの時間経過：
＋１分｜＋２分｜＋３分｜＋５分｜＋７分｜＋１０分｜＋１５分｜＋２０分｜＋３０分
・インキュベーション温度：８５℃。
・Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＲＮＡ  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ）においてＲＮＡサンプル（各１μｌ）をランした。
・インキュベーション時間と対比して、ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）を分析した。
・相対的な全長バンド強度に基づいて、インキュベーション時間と対比して、残りの全長１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２８Ｓ  ｒＲＮＡの量を分析した。
【０２６８】
残りの全長１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２８Ｓ  ｒＲＮＡに関するこの分析の詳細：
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲルチップ上の各ｒＲＮＡバンドの強度の濃度測定によって、全長ｒＲＮＡの量を決定した。この目的のために、ゲルキャピラリー（より高分子量の（＝より長い）ＲＮＡ分子は、より短いＲＮＡよりも遅く移動する）を通過するために必要な時間に対して、相対的なＲＮＡ強度をプロットした。強度対時間トレースにおける各ＲＮＡピーク下の面積を測定することによって、各全長ＲＮＡの量を決定した。マーカーＲＮＡに対してＲＮＡサンプルの強度を較正することができるように、すべてのキャピラリーゲルチップでサンプルと並行して、所定のマーカーＲＮＡ分子セットをランした。次いで、インキュベーション時間に対して、測定した全長ｒＲＮＡの相対量をプロットした（時点「０」におけるｒＲＮＡ量は、１００％に正規化されている）；一次分解速度をデータにフィッティングすることによって、ｒＲＮＡ半減期を決定した。
【０２６９】
・インキュベーション時間と対比して、６６ｎｔおよび５００ｎｔアンプリコンを使用して、増幅可能な１８Ｓ  ｒＲＮＡを分析した。インキュベーション時間と対比して、Ｃｔ値に基づいて半減期を計算した。
【０２７０】
増幅可能な１８Ｓ  ｒＲＮＡに関するこの分析の詳細：
製造業者の説明書にしたがってＡＢＩ  ７９００機器でＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して二重鎖リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、１８Ｓ  ｒＲＮＡを定量した。ＡＢＩ  ７９００分析ソフトウェアを使用して、すべてのＲＮＡサンプルのＣｔ値を決定した。以下のプライマーおよびプローブ配列を使用した：
【表Ａ】
2019514351.tif 000013
＊ＢＨＱ＝“ブラックホールクエンチャー”−インタクトなプローブオリゴヌクレオチド中のＦＲＥＴドナー色素の蛍光をクエンチする暗色ＦＲＥＴアクセプター色素
【０２７１】
結果１：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル画像
図１３Ａ〜１３Ｄは、異なるバッファー溶液と共に８５℃、ｐＨ１１でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１３Ａは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（バッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｂは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ（バッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｃは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋１ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（バッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１３Ｄは、ｐＨ１１に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋０．０１ｍＭ（１０μＭ）ＥＤＴＡ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（バッファー４）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。図１３Ａ〜１３Ｄのそれぞれについて、ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。各図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜１０を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：（ｔ＝０）；参照ＲＮＡ
サンプル２：１分
サンプル３：２分
サンプル４：３分
サンプル５：５分
サンプル６：７分
サンプル７：１０分
サンプル８：１５分
サンプル９：２０分
サンプル１０：３０分
【０２７２】
図１３Ａ〜１３Ｄから分かるように、ＥＤＴＡも（ＮＨ４）２ＳＯ４も含まないバッファー１では、迅速なＲＮＡ分解が起こる（図１３Ａ）。試験した濃度のキレート化剤ＥＤＴＡのみ（バッファー２、図１３Ｂ）では、安定化効果がわずかである。（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＥＤＴＡの両方を含むバッファー３および４では、有意なＲＮＡ安定化が達成される。図１３Ｃおよび１３Ｄの比較から分かるように、（ＮＨ４）２ＳＯ４があれば、試験したすべてのインキュベーション時間について、１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドが視認可能である。１ｍＭ（バッファー３）から２．５ｍＭ（バッファー４）に（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を増加させることによって、長期インキュベーション後のインタクトな２８Ｓ  ｒＲＮＡの量をさらに増加させることができる。分かるように、ＥＤＴＡなどのキレート化剤と組み合わせて（ＮＨ４）２ＳＯ４を使用した場合、（上記実施例３で議論されている）（ＮＨ４）２ＳＯ４のみの安定化効果は、驚くべきことにさらに顕著である。
【０２７３】
結果２：全長ｒＲＮＡの定量：
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｃｈｉｐにおける各バンドの強度に基づいて、全長１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量を定量した。時点「０」における量を１００％に設定した。
【０２７４】
異なるバッファーにおけるバンド強度（時点０における１８Ｓ  ｒＲＮＡの％）に基づいて検出した１８Ｓ  ｒＲＮＡは、表１２に示されている：
【表１２】
2019514351.tif 000014
【０２７５】
表１２に示されているように、ＥＤＴＡのみ（バッファー２）では、検出可能な１８Ｓ  ｒＲＮＡの％に対する効果がわずかである。検出可能なＲＮＡの％は、対照バッファー１と比較してわずかに増加する傾向がある。バッファー３および４は優れた結果をもたらし、対照バッファー１と比較してＲＮＡの良好な安定化をもたらす。特に、５分間、７分間およびさらには３０分間の長期インキュベーション後においても、バッファー４は、高度の安定化を達成する。
【０２７６】
一次減衰曲線（ｒＲＮＡの量対インキュベーション時間）をフィッティングし、全長ｒＲＮＡの半減期を決定することによって、表１２に示されている得られたデータを分析した。バッファー１〜４について得られた曲線は、それぞれ図１４Ａ〜図１４Ｄに示されている。各図について、ｙ軸は、全長１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【０２７７】
異なるバッファーにおけるバンド強度（時点０における２８Ｓ  ｒＲＮＡの％）に基づいて検出した２８Ｓ  ｒＲＮＡは、表１３に示されている：
【表１３】
2019514351.tif 000015
【０２７８】
表１３から分かるように、より長い２８Ｓ  ｒＲＮＡの安定化を分析した場合も、バッファー３および４は、対照バッファー１よりも明らかに優れており、２８Ｓ  ｒＲＮＡのより高い％を保持する。この効果は、５分またはそれを超えるインキュベーション時間で特に顕著であり、バッファー４では、バッファー３よりもさらに強力である。
【０２７９】
一次減衰曲線（ｒＲＮＡの量対インキュベーション時間）をフィッティングし、全長ｒＲＮＡの半減期を決定することによって、表１３に示されている得られたデータを分析した。バッファー１〜４について得られた曲線は、それぞれ図１５Ａ〜図１５Ｄに示されている。各図について、ｙ軸は、全長２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【０２８０】
以下のようにＲＮＡ半減期を計算した：
全長ＲＮＡは、一次反応速度にしたがって分解すると仮定すると、時間に対する測定された相対ＲＮＡ量は、
ｙ＝ｘ０・ｅ−ｋ・ｔ
（式中、
ｙ＝時点ｘにおけるＲＮＡの量
ｘ０＝時点０におけるＲＮＡの量（ここでは１００％に設定−上記を参照のこと）
ｋ＝速度定数
ｔ＝時間［分］）
のように表され得る。
【０２８１】
半減期ｔ（１／２）は、速度定数ｋから計算され得る：ｔ（１／２）＝ｌｎ（２）／ｋ
【０２８２】
結果は、以下の表１４に示されている。
【表１４】
2019514351.tif 000016
【０２８３】
表１４から分かるように、キレート化剤ＥＤＴＡのみ（バッファー２）の使用は、対照バッファー１と比較して、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡ半減期のわずかな増加をもたらす。バッファー３および４（これらは両方とも、（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む）は、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡ半減期の顕著な増加をもたらす。驚くべきことに、バッファー３中のわずか１ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４でさえ、ＲＮＡ半減期のかなりの増加をもたらすために十分であったが、（ごくわずかに多い２．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む）バッファー４では、１８Ｓ  ｒＲＮＡの増加は、バッファー３と比較して約１３倍高かった。
【０２８４】
全体として、８５℃およびｐＨ１１でインキュベートした場合、１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡは迅速に分解することが分かる（バッファー１）。
【０２８５】
１０μＭ  ＥＤＴＡの追加（バッファー２）は、全長ｒＲＮＡに対する安定化効果を有するが、半減期の増加はごくわずかである。対照的に、１ｍＭ硫酸アンモニウムのさらなる存在は、１８Ｓ  ＲＮＡの半減期のほぼ１０倍の増加および２８Ｓ  ｒＲＮＡの半減期の２倍超の増加という強力な安定化効果をもたらす。１０μＭ  ＥＤＴＡの存在下における２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの追加は、対照と比較して、１８Ｓ  ｒＲＮＡの半減期の１００倍超の増加および２８Ｓ  ｒＲＮＡの８倍の増加というさらに強力な安定化をもたらす。長いｒＲＮＡ分子におけるホスホジエステル結合に影響を与える単一加水分解事象のみが全長ＲＮＡを破壊するので、これは顕著かつ予想外である。
【０２８６】
結果３：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ＲＩＮ値分析
さらに、インキュベーション時間と対比して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒから得られたＲＩＮ値を分析して、ＲＩＮ「半減期」を決定した。「ＲＩＮ半減期」は、ＲＩＮが１０（完全にインタクトな高品質ＲＮＡ）から５（ＲＮＡサンプルがｑＰＣＲベースの分析に依然として適切であるために必要な最低ＲＩＮ）に低下するために必要な時間である。ＲＩＮの変化は、一次速度に従うインキュベーション時間の関数であると仮定して、ＲＩＮ半減期を計算した。
【０２８７】
図１６Ａ〜１６Ｄは、それぞれバッファー１〜４について、ＲＩＮ対時間を示す。ＲＩＮ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はｘ軸に示されている。結果は、以下の表１５に示されている。バッファー２〜４では、ＲＩＮ半減期は、対照バッファー１と比較して増加する。やはり、最良の結果は、バッファー４で得られる。
【表１５】
2019514351.tif 000017
【０２８８】
異なるアルカリ性バッファー中における３０分間のインキュベーション中にＲＩＮを分析した場合、上記と同様の結果（結果２を参照のこと）が得られる：ここでは、１０μＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ硫酸アンモニウムの存在は、「ＲＩＮ半減期」の３倍超の増加をもたらし（バッファー３）、１０μＭ  ＥＤＴＡおよび２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの存在は、８倍の増加をもたらす（バッファー４）。これは、本発明の教示に従った場合、ｐＨ１１および８５℃のアルカリ性バッファー中で、１０またはそれに近いＲＩＮを有する高品質ＲＮＡ調製物を約３０分間インキュベートすることができ、その後、このＲＮＡが、ｑＰＣＲ分析のために十分にインタクトであると依然として考えられることを示している。
【０２８９】
結果４：１８Ｓ  ｒＲＮＡ標的の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
６６ｎｔおよび５００ｎｔの２つの異なるアンプリコンを使用して、リボソーム１８Ｓ  ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
【０２９０】
図１７Ａ〜１７Ｄは、それぞれバッファー１〜４を用いて得られた６６ｂｐアンプリコン（上パネル）および５００ｂｐアンプリコン（下パネル）の平均Ｃｔ値（バッファー１の結果は図１７Ａに示されており、バッファー２の結果は図１７Ｂに示されており、バッファー３の結果は図１７Ｃに示されており、バッファー４の結果は図１７Ｄに示されている）を示す。平均ＣＴ値はｙ軸に示されており、インキュベーション時間はＸ軸に示されている。
【０２９１】
ＲＮＡ半減期の計算：
ＲＮＡ半減期の計算では、（効率が１００％の理想的なＰＣＲに基づいて）Ｃｔ値が１だけ増加することは、テンプレートの量が５０％減少することに等しいと仮定した。
ｙ＝ｘ０＋ｋ・ｔ
（式中、
ｙ＝時点ｘにおけるＲＮＡの量（Ｃｔ値として表される）
ｘ０＝時点０におけるＲＮＡの量（Ｃｔ値として表される）
ｋ＝適合Ｃｔ対時間曲線の傾き
ｔ＝時間［分］
【０２９２】
半減期ｔ（１／２）は、速度定数ｋから計算され得る：ｔ（１／２）＝１／ｋ
【０２９３】
６６ｂｐおよび５００ｂｐアンプリコンのｒＲＮＡ半減期は、表１６に示されている。
【表１６】
2019514351.tif 000018
【０２９４】
ｑＰＣＲによって１８Ｓ  ｒＲＮＡを分析した場合、（特に２．５ｍＭ硫酸アンモニウムおよび１０μＭ  ＥＤＴＡの存在下における）アルカリ性バッファー中および高温におけるＲＮＡの安定化は、増幅可能なＲＮＡの非常に強力な安定化をもたらすことが直接的に実証される。より短いアンプリコン（ＲＮＡ配列）と比較して、アルカリ性加水分解に対してより感受性であると考えられる長い５００ｎｔ  ＲＮＡ標的では、この効果はさらに顕著である。
【０２９５】
実施例５−ｐＨ１０および７５℃の溶液中における（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＥＤＴＡによるＲＮＡ安定化：
研究デザイン：
・ヒト全ＲＮＡ（ＲＮｅａｓｙ抽出）を異なるバッファー（これらは、溶出バッファーとして適切である）にスパイクした。
・バッファー条件：
○バッファー１：ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ；
○バッファー２：ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４；
○バッファー３：ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ。
・８００ｎｇのＲＮＡ（１μｌ）を１９μｌのバッファーと混合＝インキュベーションの開始（総体積２０μｌ）。
・異なる時点で、２μｌのＲＮＡを取り出し、３μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５）に直ぐに追加して、分解プロセスを停止させる。
・インキュベーションの時間経過：
＋１分｜＋２分｜＋３分｜＋５分｜＋７分｜＋１０分｜＋１５分｜＋２０分｜＋３０分。
・インキュベーション温度：７５℃。
・Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＲＮＡ  Ｐｉｃｏ  Ｋｉｔ）においてＲＮＡサンプル（各１μｌ）をランした。
・インキュベーション時間と対比して、ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）を分析した。
・相対的な全長バンド強度に基づいて、インキュベーション時間と対比して、残りの全長１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２８Ｓ  ｒＲＮＡの量を分析した。時点０におけるＲＮＡの量を１００％に設定した。全長ｒＲＮＡ半減期を計算した。
【０２９６】
残りの全長１８Ｓ  ｒＲＮＡ、２８Ｓ  ｒＲＮＡに関するこの分析の詳細：
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲルチップ上の各ｒＲＮＡバンドの強度の濃度測定によって、全長ｒＲＮＡの量を決定した。この目的のために、ゲルキャピラリー（より高分子量の（＝より長い）ＲＮＡ分子は、より短いＲＮＡよりも遅く移動する）を通過するために必要な時間に対して、相対的なＲＮＡ強度をプロットした。強度対時間トレースにおける各ＲＮＡピーク下の面積を測定することによって、各全長ＲＮＡの量を決定した。マーカーＲＮＡに対してＲＮＡサンプルの強度を較正することができるように、すべてのキャピラリーゲルチップでサンプルと並行して、所定のマーカーＲＮＡ分子セットをランした。次いで、インキュベーション時間に対して、測定した全長ｒＲＮＡの相対量をプロットした（時点「０」におけるｒＲＮＡ量は、１００％に正規化されている）；一次分解速度をデータにフィッティングすることによって、ｒＲＮＡ半減期を決定した。
【０２９７】
結果１：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒゲル画像
図１８Ａ〜図１８Ｃは、実施例５にさらに記載されている異なる溶液と共に７５℃、ｐＨ１０でインキュベートしたヒト全ＲＮＡのＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ画像（ゲル様画像）を示す。図１８Ａは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ（バッファー１）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｂは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４（バッファー２）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である；図１８Ｃは、ｐＨ１０に緩衝化した２０ｍＭ  ＮａＯＨ＋２．５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ（バッファー３）と共にインキュベートしたＲＮＡのゲル様画像である。
【０２９８】
図１８Ａ〜１８Ｃのそれぞれについて、ｙ軸はＲＮＡのサイズを示し、ここでは、ゲルチップを通過するために必要な時間として表されている。各図は、ラダー（Ｌ）およびサンプル１〜１０を示し、サンプルは以下に示されている：
サンプル１：（ｔ＝０）；参照ＲＮＡ
サンプル２：１分
サンプル３：２分
サンプル４：３分
サンプル５：５分
サンプル６：７分
サンプル７：１０分
サンプル８：１５分
サンプル９：２０分
サンプル１０：３０分
【０２９９】
結果２：全長ｒＲＮＡの定量：
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを使用して、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  Ｃｈｉｐにおける各バンドの強度に基づいて、全長１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量を定量した。時点「０」における量を１００％に設定した。
【０３００】
異なるバッファーにおけるバンド強度（時点０における１８Ｓ  ｒＲＮＡの％）に基づいて検出した１８Ｓ  ｒＲＮＡは、表１７に示されている：
【表１７】
2019514351.tif 000019
【０３０１】
図から分かるように、特に２０分間および３０分間の長期インキュベーション時間（バッファー２）において、（ＮＨ４）２ＳＯ４のみの安定化効果を観察することができる。特に５分間およびそれを超えるインキュベーション時間において、バッファー３は、優れた安定化をもたらす。
【０３０２】
一次減衰曲線（ｒＲＮＡの量対インキュベーション時間）をフィッティングし、全長ｒＲＮＡの半減期を決定することによって、表１７に示されている得られたデータを分析した。バッファー１〜３について得られた曲線は、それぞれ図１９Ａ〜図１９Ｃに示されている。各図について、ｙ軸は、全長１８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【０３０３】
異なるバッファーにおけるバンド強度（時点０における２８Ｓ  ｒＲＮＡの％）に基づいて検出した２８Ｓ  ｒＲＮＡは、表１８に示されている：
【表１８】
2019514351.tif 000020
【０３０４】
一次減衰曲線（ｒＲＮＡの量対インキュベーション時間）をフィッティングし、全長ｒＲＮＡの半減期を決定することによって、表１８に示されている得られたデータを分析した。バッファー１〜３について得られた曲線は、それぞれ図２０Ａ〜図２０Ｃに示されている。各図について、ｙ軸は、全長２８Ｓ  ｒＲＮＡの相対量（％）を示す；ｘ軸は、インキュベーション時間を示す。
【０３０５】
以下のようにＲＮＡ半減期を計算した：
仮定：全長ＲＮＡは、一次反応速度にしたがって分解すると仮定するので、時間に対する測定された相対ＲＮＡ量は、
ｙ＝ｘ０・ｅ−ｋ・ｔ
（式中、
ｙ＝時点ｘにおけるＲＮＡの量
ｘ０＝時点０におけるＲＮＡの量（ここでは１００％に設定−上記を参照のこと）
ｋ＝速度定数
ｔ＝時間［分］）
のように表され得る。
【０３０６】
半減期ｔ（１／２）は、速度定数ｋから計算され得る：ｔ（１／２）＝ｌｎ（２）／ｋ。結果は、表１９に示されている。
【表１９】
2019514351.tif 000021
【０３０７】
実施例５の結論：
７５℃およびｐＨ１０でインキュベートした場合、ｐＨ１１および８５℃の温度の場合（実施例４）ほど迅速ではないが、１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡは迅速に分解する。
【０３０８】
ｐＨ１０および７５℃の存在下における２．５ｍＭ硫酸アンモニウムの追加は、全長ｒＲＮＡに対する安定化効果を有する；１８Ｓ  ｒＲＮＡおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの両方について、半減期の増加はわずかである。２０分間またはそれを超えるインキュベーション後に、効果はより顕著になる。
【０３０９】
ｐＨ１０および７５℃の存在下における２．５ｍＭ硫酸アンモニウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡの追加は、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの両方について、強力な安定化効果をもたらす：１８Ｓ  ｒＲＮＡについては、３０分間のインキュベーション期間で、測定可能な分解は検出されない；２８Ｓ  ｒＲＮＡについては、全長ＲＮＡの半減期は、非安定化ＲＮＡと比較して７倍超増加する。
【図１Ａ】
2019514351.tif 000022
【図１Ｂ】
2019514351.tif 000023
【図２Ａ】
2019514351.tif 000024
【図２Ｂ】
2019514351.tif 000025
【図３Ａ】
2019514351.tif 000026
【図３Ｂ】
2019514351.tif 000027
【図４Ａ】
2019514351.tif 000028
【図４Ｂ】
2019514351.tif 000029
【図５Ａ】
2019514351.tif 000030
【図５Ｂ】
2019514351.tif 000031
【図６Ａ】
2019514351.tif 000032
【図６Ｂ】
2019514351.tif 000033
【図７Ａ】
2019514351.tif 000034
【図７Ｂ】
2019514351.tif 000035
【図７Ｃ】
2019514351.tif 000036
【図７Ｄ】
2019514351.tif 000037
【図８Ａ】
2019514351.tif 000038
【図８Ｂ】
2019514351.tif 000039
【図９Ａ】
2019514351.tif 000040
【図９Ｂ】
2019514351.tif 000041
【図１０Ａ】
2019514351.tif 000042
【図１０Ｂ】
2019514351.tif 000043
【図１１Ａ】
2019514351.tif 000044
【図１１Ｂ】
2019514351.tif 000045
【図１２Ａ】
2019514351.tif 000046
【図１２Ｂ】
2019514351.tif 000047
【図１３Ａ】
2019514351.tif 000048
【図１３Ｂ】
2019514351.tif 000049
【図１３Ｃ】
2019514351.tif 000050
【図１３Ｄ】
2019514351.tif 000051
【図１４ＡＢ】
2019514351.tif 000052
【図１４ＣＤ】
2019514351.tif 000053
【図１５ＡＢ】
2019514351.tif 000054
【図１５ＣＤ】
2019514351.tif 000055
【図１６ＡＢ】
2019514351.tif 000056
【図１６ＣＤ】
2019514351.tif 000057
【図１７Ａ】
2019514351.tif 000058
【図１７Ｂ】
2019514351.tif 000059
【図１７Ｃ】
2019514351.tif 000060
【図１７Ｄ】
2019514351.tif 000061
【図１８Ａ】
2019514351.tif 000062
【図１８Ｂ】
2019514351.tif 000063
【図１８Ｃ】
2019514351.tif 000064
【図１９ＡＢ】
2019514351.tif 000065
【図１９Ｃ】
2019514351.tif 000066
【図２０ＡＢ】
2019514351.tif 000067
【図２０Ｃ】
2019514351.tif 000068
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月15日(2018.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019514351000001.app
【国際調査報告】
2019514351.tif 000069
2019514351.tif 000070
2019514351.tif 000071