(57)【要約】下記の配列を有するポリペプチド。2019535703.tif 000010【選択図】図１
2019535703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列と少なくとも８０％（特に９０％）の配列類似性を有するポリペプチド：
【化１】
2019535703.tif 000007
ここで、Ｚ１又はＺ３は、同一の意味を有するか、独立して前記ポリペプチドのＮ末端を表すか、又は独立してアミノ酸Ｌｅｕ若しくはＳｅｒ若しくは下記のペプチドである：
Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、又はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ；
Ｚ２又はＺ４は、同一の意味を有するか、独立して前記ポリペプチドのＣ末端を表すか、又は独立してアミノ酸Ｇｌｙ若しくはＧｌｕ若しくは下記のペプチドである：
Ｇｌｕ−Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、又はＧｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ。
【請求項２】
前記ダイマーが、同種又は異種モノマーから形成されている、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列を有する、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド：
【化２】
2019535703.tif 000008
ここで、Ｚ１及びＺ２は請求項１に記載の意味を有する。
【請求項４】
下記の配列と少なくとも８０％（特に少なくとも９０％）の類似性を有する配列を含む、請求項１〜請求項３の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
【化３】
2019535703.tif 000009
【請求項５】
前記ポリペプチドを形成する２つのアミノ酸鎖の少なくとも１つのＮ末端が、１つ又は２つのアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基など）、アシル基（アセチル又はプロピオニル基など）からなる群から選択される化学基で修飾されているか、又はアミノ酸であるピログルタミン酸がＮ末端を形成している、請求項１〜請求項４の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチドを含有する、ウイルス沈殿補助剤。
【請求項７】
請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチドを含有する薬剤。
【請求項８】
遺伝性疾患を治療するための遺伝子治療における使用のための、請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
下記の工程を含む、ウイルスによる細胞の感染を増強する方法：
有機溶媒に溶解した請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチドを提供すること；
前記ポリペプチドを水溶液に添加して、前記ポリペプチドの不溶性凝集体を形成すること；
前工程で得られた溶液を混合すること；及び
請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチドの少なくとも一種の存在下で細胞を培養すること。
【請求項１０】
細胞のウイルス感染を増強するための、請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチドの使用、特にインビトロでの使用。
【請求項１１】
請求項１〜請求項５の少なくとも１項に記載のポリペプチドを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ポリペプチド、Ｎ末端保護ポリペプチド、該ポリペプチドを含有する薬剤、遺伝子治療に使用するための上記ポリペプチド、遺伝子操作されたウイルス構築物による細胞の感染を増強するための方法、トランスフェクション又は形質導入のための増幅のための上記ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質−ペプチド薬物の生産だけでなく、実験ツールとしての安定な遺伝子を用いた細胞のトランスフェクション、及び最終的に遺伝子欠損の代用としての細胞への遺伝子の取り込みが、多数の疾患の治療にとって非常に重要であり得ると予見されるので、適用される方法が非常に大きく進歩したため、遺伝子工学の重要性が増大している。
【０００３】
特定の細胞機能を変化させるための遺伝子材料の取り込みは、最初のヒト遺伝子のクローニング及び組換え産生以来、生物医学基礎及び応用研究の必須のツールとなっている。遺伝子導入の最適化につながる遺伝子取り込みのための方法は、絶えず進歩している。これらは、最初は非常にゆっくりと進行した歴史の長年にわたる経験である。
【０００４】
Ｆ．Ｃｒｉｃｋ及びＪ．Ｗａｔｓｏｎにより１９５３年にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の機能が解明される前に、Ｆ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈは、１９２０年代の終わりに、非病原性肺炎球菌株を病原体に形質転換する実験を成功させていた。この形質転換は、肺炎球菌が珍しい天然のＤＮＡ取り込み能力を有していたため、幸運な状況によるものであった。原核生物へのＤＮＡの選択された取り込み、いわゆる形質導入は、特にＪ．Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｍ．Ｄｅｌｂｒｕｃｋ及びＳ．Ｌｕｒｉａによって、ファージを用いることにより成功した。細胞培養の確立、すなわち、インビトロ条件下での真核細胞の培養により、トランスフェクションのための多くの物理的及び化学的方法が開発された。より頻繁に使用されるが、高価な設備を必要とする物理的方法としては、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションが含まれ、これらは、より簡単に適用される化学的方法（例えば、１９８０年代から使用されているリン酸カルシウム沈殿法、又は１９９０年代初期に広く普及していたカチオン性脂質若しくはカチオン性ポリマーに基づく方法）と競合していた。しかし、このような方法の使用は、常に細胞又はＤＮＡに依存していた。また、細胞に取り込まれたＤＮＡは一般に染色体外（一過性トランスフェクション）であり、したがって娘細胞には伝わらなかった。しかし、ファージ（例えば、ラムダファージ）はまた、それらのＤＮＡを宿主ゲノム（プロファージ、溶原性感染経路）に組み込むことができることが知られていた。ここから、（１９８１／１９８２）「遺伝子ベクターとしてのレトロウイルスの確立」（Ｄｏｅｈｍｅｒら及びＴａｂｉｎらによる）まではわずかなステップでしかなかった。ウイルスは種特異的且つ器官／組織特異的であり、これが全てのウイルスが全ての（真核）細胞に感染するわけではない理由である。ウイルスエンベロープの改変（糖タンパク質の置換、いわゆる偽型ウイルス）、並びに大部分はカチオン性であるペプチドの付加は、形質導入効率を増強することを意図している。
【０００５】
ウイルス粒子の取り込みの最初のエンハンサーは、ＨＩＶの研究において注目を集めた。特異的細胞試験によるインビトロ感染の分析中に、血液濾液ペプチドによるＨＩＶの融合の阻害が観察された（Ｍｕｎｃｈら、ＶＩＲＩＰ）。
【０００６】
驚くべきことに天然に存在するタンパク質のこれらのフラグメントは、アミロイド原線維として特徴付けられるエンハンサー又は「Ｓｅｍｅｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」（ＳＥＶＩ）として、ヒト精子において繊維構造を形成することが示されている。そのようなナノフィブリルは、標的細胞へのウイルスの付着を増強し、ウイルス感染の速度を１０の数乗増加させる。
【０００７】
この事実は、基礎研究及び可能な将来の治療適用のためのレトロウイルス遺伝子導入を改善するために利用された。従って、遺伝子治療に使用されるレンチウイルスベクター及びガンマレトロウイルスベクターは、ヒトＴ細胞、子宮頸癌細胞、白血病細胞、造血幹細胞、及び胚性幹細胞等の、異なる細胞型においてＳＥＶＩタンパク質の存在下で多重に増加した遺伝子導入速度を示すことが示され得る（Ｗｕｒｍら、Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２０１０，１２，１３７−４６；Ｗｕｒｍら、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１，３９２，８８７−９５）。
【０００８】
ＳＥＶＩ及びセミノゲリン等のさらなるエンハンサーの開発に関する研究は、ウイルスエンベロープタンパク質由来のペプチドもトランスフェクションのエンハンサーとして適切であり得るという仮定につながり、これは驚くべきことに、予想外に高い成功を収めた(Ｍａｒａｌ  Ｙｏｌａｍａｎｏｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第８巻、第２号、１３０〜１３６頁）。従って、例えば、異なる濃度（１〜１００μｇ／ｍｌ）のプロトランスデューシン−Ａ（同義語：ＥＦ−Ｃ）でプレインキュベートされたＨＩＶウイルスは、レポーター細胞において１０の数乗倍高い感染率を示すことが示され得る。作用機序として、ＥＦ−Ｃは原線維構造を形成することで、結合可能となり、ウイルスを濃縮させ、よって細胞へのウイルスの侵入を増殖させることができると推定された。ウイルス粒子による感染に加えて、ＥＦ−Ｃは、遺伝子治療に適用される広範なヒト細胞型（Ｔ細胞、グリア細胞、線維芽細胞、造血幹細胞）へのレンチウイルス及びレトロウイルス粒子の形質導入を高効率で増強する(Ｍａｒａｌ  Ｙｏｌａｍａｎｏｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．８、Ｎｏ．２、ｐｐ．１３０−１３６）。また、ＥＰ２４５２９４７Ａ１は、プロトランスデューシン−Ａに関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような遺伝子工学の重要性が増大しているため、遺伝子導入のより効果的なエンハンサーが望まれている。本発明の根底にある課題は、改善された遺伝子導入エンハンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、本発明の根底にある課題は、下記の配列と少なくとも８０％又は９０％、特に少なくとも９５％の配列類似性を有するポリペプチドによって解決されることが見出された。
【００１１】
【化１】
2019535703.tif 000003
【００１２】
ここで、Ｚ１又はＺ３は独立して、ポリペプチドのＮ末端を表すか、又は独立してアミノ酸Ｌｅｕ若しくはＳｅｒ若しくは下記のペプチドであり：
Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、又はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ、
Ｚ２又はＺ４は、独立して、ポリペプチドのＣ末端を表すか、又は独立してアミノ酸Ｇｌｙ若しくはＧｌｕ若しくは以下のペプチドである：
Ｇｌｕ−Ｖａｌ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、又はＧｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】形質導入効率の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「配列類似性」という用語は、本明細書では、タンパク質の多かれ少なかれ延長された部分セクションにおける同一の成分配列のためのタンパク質間の類似性（アミノ酸配列相同性）を意味する。配列類似性は、２つのペプチド鎖を比較したときの同一位置の割合で表され、１００％配列類似性は、比較される鎖分子間の完全な同一性を意味する。タンパク質では、５％（１００／２０）の同一位置は統計的予想に対応し、従って、関係を導出するために使用することはできない。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドによって達成され得る改善は、治療目的のために使用され得る、細胞における遺伝子導入の効率の向上に関連する。例えば、治療的使用のための細胞におけるより効率的な遺伝子導入により、遺伝子導入のために使用されるウイルス粒子の量を減少することが可能である。さらに、効率的な形質導入に必要な感染サイクル数を減少することが可能である。形質導入エンハンサーとしての本発明のポリペプチドは、遺伝子改変細胞を増殖させるためのインビトロ培養の持続時間、患者から収集される細胞の量（例えば、白血球アフェレーシス）を減少させることが可能であり、ある場合には、インビボでのウイルス負荷を減少することにより、効率的で非毒性のインビボ遺伝子導入を可能にする。さらに、効率的な形質導入エンハンサーの迅速な取り扱いにより、形質導入されるべき細胞に対する負荷が減少される。
【００１６】
本発明に係るポリペプチドは、同種又は異種モノマーから形成され得る。特に、本発明に係るポリペプチドは、ジスルフィド架橋を介して結合された２つの同一のモノマーからなるダイマーである。
【００１７】
本発明の一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記の構造を有する：
【００１８】
【化２】
2019535703.tif 000004
【００１９】
ここで、Ｚ１及びＺ２は上記と同じ意味を有する。
【００２０】
特に、本発明は、下記の配列と少なくとも４０％、特に少なくとも９０％の配列類似性を有するポリペプチドにも関する。
【００２１】
【化３】
2019535703.tif 000005
【００２２】
本発明によれば、「本発明に係るポリペプチド」という名称はまた、本発明に係るポリペプチドのポリペプチド鎖中のアミノ酸を変化させることによって形成されるが、なお同等且つ十分な有効性を有する関連ポリペプチドも意味し、これは例えば、下記のバイオアッセイにおいて決定することが可能である。
【００２３】
形質導入効率は、標的細胞として２９３  Ｔ細胞を用い、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルス及びレトロウイルスベクターを用いて試験することができる。プロトランスデューシン−Ｃは、一連の濃度、例えば０．０１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度でアッセイに使用される。特に、標的細胞は、１０３〜１０７細胞／ｍｌの濃度で使用される。バッチを８〜１６時間インキュベートした後、細胞を洗浄する。その後、形質導入効率を、フローサイトメトリーを用いてＧＦＰ陽性細胞に基づいて測定する。
【００２４】
配列類似性を有するポリペプチド（相同ポリペプチド）は特に、アミノ酸の置換又は欠失が、言及される程度までアミノ酸鎖において行われた、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に関連するポリペプチドである。特に、類似の特性（例えば類似の極性）を有するアミノ酸の置換が可能である。したがって、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；グルタミン、アスパラギン及びトレオニン；グリシン、アラニン及びプロリン；ロイシン、イソロイシン及びバリン；チロシン、フェニルアラニン及びトリプトファン；並びにセリン及びトレオニンの間の置換が広く行われている。
【００２５】
本明細書中の「配列相同性」は以下も意味する：本発明によるポリペプチドは、配列類似性を有する又は同一のモノマーを有する２つのモノマーからなり、各モノマーがアミノ酸であるシステインを含み、それを介して２つのモノマーがジスルフィド架橋を介して連結されている。特に、アミノ酸であるシステインはモノマーの２位を占める。あるいは、２つのアミノ酸間の他の共有結合もまた、モノマーを架橋するために使用されていてもよい。
【００２６】
配列の１位には、アミノ酸であるグルタミンがあることが好ましい。３位及び５位には、塩基性アミノ酸があることが好ましく、リジンであることがより好ましい。１位、４位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位及び１２位には、中性アミノ酸であることがほとんどである。この配列は、Ｎ末端及び／又はＣ末端を伸長又は切断してもよい。Ｎ末端側では、モノマーの配列を、アミノ酸配列ＮＨ２−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨのＣ末端部分又は全アミノ酸配列によって伸長してもよい。Ｃ末端側では、モノマーの配列を、ＮＨ２−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨのＮ末端部分又は全アミノ酸配列によって伸長してもよい。ペプチドダイマーは、水溶液中で不溶性凝集体を形成するという共通点を有する。モノマーは、４〜２５アミノ酸、好ましくは１０〜２０アミノ酸からなる。
【００２７】
配列類似性を有するポリペプチドは、少なくとも４０％、好ましくは５０％、より好ましくは６０％〜７０％又は８０％、特に９０％又は９５％の配列類似性を示す。構造的には、配列類似性を有する分子中に、二量体化及び少なくとも２つの塩基性アミノ酸を見出すことができる。さらに、配列類似性を有する分子は、水溶液中で不溶性凝集体を形成し、且つレンチウイルス又はレトロウイルスベクターによる標的細胞の形質導入を増強するという共通点を有する。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、本発明に係るポリペプチドを形成する２つのアミノ酸鎖の少なくとも１つのＮ末端が、１つ又は２つのアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基又はブチル基など）及びアシル基（アセチル基又はプロピオニル基など）からなる群から選択される化学基で修飾されている。あるいは、Ｎ末端アミノ酸が、ピログルタミン酸によって置換されて、ピログルタミン酸がＮ末端を形成していてもよい。
【００２９】
【化４】
2019535703.tif 000006
【００３０】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドを少なくとも１つ含む、ウイルスの沈殿のための補助剤に関する。本発明に係るポリペプチドを沈殿助剤として使用することにより、適用される遠心分離時間を有意に短縮することができるので、遠心分離によるウイルスの単離を有意に促進することが可能である。
【００３１】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドを少なくとも１つ含む薬剤に関する。
【００３２】
本発明はまた、遺伝性疾患を処置するための遺伝子治療における、本発明に係るポリペプチドの使用に関する。医学において、「遺伝子治療」とは、遺伝性疾患又は遺伝子欠損を治療するために、ヒトの細胞又は組織に遺伝子を導入することを意味する。
【００３３】
本発明はまた、ウイルスによる細胞の感染を促進する方法に関し、該方法は下記の工程を含む:
有機溶媒に溶解した請求項１又は請求項２に記載のポリペプチドを提供すること；
上記ポリペプチドを水溶液に添加して、上記ポリペプチドの不溶性凝集体を形成すること；
前工程で得られた溶液を混合すること；及び
本発明に係るポリペプチドの少なくとも一種の存在下で細胞を培養すること。
【００３４】
本発明はまた、ウイルスによる細胞の感染を促進するための、少なくとも１つの本発明に係るポリペプチドの使用に関する。
【００３５】
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドを少なくとも１つ含む組成物に関する。
【００３６】
本発明に係るポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を用いるＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる方法によって合成することが可能である。
【００３７】
この方法は、Ｆｍｏｃ保護誘導体（すなわち、（９−フルオレニルメトキシカルボニル）保護アミノ酸）を用いて、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ原理による段階的固相合成において、特に、ＡＢＩ−４３３シンセサイザー上の固体支持体としてＦｍｏｃ−Ｌ−グルタミン（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ）をプレロードしたＷａｎｇ樹脂上で行う。
【００３８】
Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸（典型的には１０倍モル過剰で用いられる）の活性化は、［（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＨＢＴＵ、１００ｍｍｏｌ／ｌ）を用いて、室温でＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）に０．５Ｍの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と２Ｍのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて行われる。
【００３９】
アシル化反応は、４５分の個々の持続時間を有し、２０％ピペリジンによるＦｍｏｃ保護基の開裂は、１５分の持続時間を有する。
【００４０】
合成には、下記のアミノ酸誘導体及び関連する直交酸感受性側鎖保護基を使用する:
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｌ−ｐＧｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ、及びＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）。
【００４１】
９４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、３％エタンジチオール（ＥＤＴ）及び３％脱イオン水でペプチジル樹脂から樹脂支持体を切断した後、原ペプチドを冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中で沈殿させ、原ペプチドをペレットとして遠心分離し、上清を廃棄する。
【００４２】
その後の原ペプチドのクロマトグラフィー精製は、グラジエント溶出による分取法によって行われる。
【００４３】
ＥＰ  ２４５２９４７  Ａ１によるプロトランスデューシン−Ａ及びＷＯ  ２０１４／１７７６３５  Ａ１によるプロトランスデューシン−Ｂと、プロトランスデューシン−Ｃとの違いは、プロトランスデューシン−Ｃは、本発明に係る２つのペプチドモノマーからなり、それらがジスルフィド架橋を介してペプチドダイマーとして共有結合しているという事実にある。
【００４４】
実施例：
プロトランスデューシン−Ｃによる２９３  Ｔ細胞の形質導入
２９３  Ｔ細胞を１２ウェル培養プレートに播種し、１６時間培養する。ウェル当たり、２００，０００個の２９３  Ｔ細胞を使用する。１６時間後、１．０ｍｇのプロトランスデューシン−Ｃを含むバイアル及び１．０ｍｇのプロトランスデューシン−Ａを含むバイアルに、それぞれ１００μｌのＤＭＳＯを混合し、プロトランスデューシン−Ｓ及びプロトランスデューシン−Ａを完全に溶解する。その後、９００μｌのＰＢＳを各バイアルに添加する。フィブリルが３分以内に形成する。続いて、プロトランスデューシン−Ｃ又はプロトランスデューシン−Ａを、２５μｇ／ｍｌの最終濃度で培養ウェルに添加する。次いで、異なる量のＲＤ１１４ウイルスストック（１０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、１００μｌ）を添加し、残りの容量をＤＭＥＭで５００μｌになるまで充填する。使用されるＲＤ１１４ウイルスは、緑色蛍光タンパク質をコードする。形質導入速度を高めるために、バッチを６００ｇ、２５℃で１時間遠心分離する。６時間後、５００μｌの細胞培養培地を添加する。形質導入の２４時間後に、細胞培養培地を交換する。形質導入効率は、形質導入の４８時間後に、２９３  Ｔ細胞における緑色蛍光タンパク質の発現を決定することによって、フローサイトメトリーにより決定される。実験において、プロトランスデューシン−Ａ及びコントロールと比較して、プロトランスデューシン−Ｃは有意に高い形質導入増強能を示す（図１）。
【００４５】
プロトランスデューシン−Ｂはプロトランスデューシン−Ａと同様の形質導入効率を有するので、図１による結果と同様に、プロトランスデューシン−Ｃの形質導入効率もプロトランスデューシン−Ｂと比較して有意に向上する。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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