(57)【要約】  脂肪組織を破砕装置（２）に連続的に供給する工程、細胞または細胞凝集物を、破砕装置（２）に通して移動させることでロータ（１０）の複数のブレード（１９）により機械的に脂肪組織から分離する工程、ここでブレード（１９）は、全体的な流れの方向に対して離間した配置で配置されており、ブレード（１９）は、回転軸（１８）の周囲を移動し、ここで回転軸（１８）は、前記全体的な流れの方向に対して実質的に平行に設けられている、分離された細胞を含む処理済の組織を破砕装置（２）から連続的に取り出す工程を含む、脂肪組織から治療用細胞を調製するための非酵素的方法および破砕装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織を破砕装置（２）に連続的に供給する工程、
細胞または細胞凝集物を、前記破砕装置（２）に通して移動させることで複数のブレード（１９）により機械的に前記脂肪組織から分離する工程、ここで前記ブレード（１９）は、全体的な流れの方向に対して離間した配置で配置されており、前記ブレード（１９）は、回転軸（１８）の周囲を移動し、ここで前記回転軸（１８）は、前記全体的な流れの方向に対して実質的に平行に設けられている、
分離された細胞を含む処理済の組織を前記破砕装置（２）から連続的に取り出す工程
を含む、脂肪組織から治療用細胞を調製するための非酵素的方法。
【請求項２】
動作中の前記破砕装置（２）を通る流速が、少なくとも１００ｍｌ／ｍｉｎ、好ましくは少なくとも２００ｍｌ／ｍｉｎである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
回転速度を、所定の一定の速度、好ましくは７００〜１１００ｒｐｍに制御する工程を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記破砕装置（２）の出口（６）を吸引することで、および／または前記破砕装置（２）の入口（５）に圧力をかけることで、前記細胞凝集物が分離された細胞を含む処理済の組織を前記破砕装置（２）から連続的に取り出す工程を含む、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記破砕装置（２）が、請求項６から１２までのいずれか１項記載の破砕装置（２）である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
入口（５）および出口（６）を有し、かつ動作容積（９）を画定するケーシング（４）と、
前記動作容積（９）内に収容され、かつ前記ケーシング（４）に対して回転軸（１８）の周囲を回転可能なロータ（１０）と
を備える、脂肪組織から治療用細胞を調製するための破砕装置において、
前記ロータ（１０）が、少なくとも８列のブレード（１９）を、前記ロータ（１０）の前記回転軸（１８）に対して離間した配置で有し、かつ
前記入口（５）および前記出口（６）が、前記ロータ（１０）の前記回転軸（１８）に対して平行な方向にずらして置かれていることを特徴とする、破砕装置（２）。
【請求項７】
前記ケーシングにより画定された前記動作容積が、前記ロータの前記回転軸の周囲を回転する前記ロータの各後続列の前記ブレードの半径を結んだ線により描かれる回転の中実部分に相応することを特徴とする、請求項６記載の破砕装置（２）。
【請求項８】
前記ロータ（１０）が、２０〜８０列の前記ブレード（１９）を有することを特徴とする、請求項６または７記載の破砕装置（２）。
【請求項９】
少なくとも８列の前記ブレード（１９）がそれぞれ、前記ロータ（１０）の前記回転軸（１８）に対して周りに配置された前記ブレード（１９）を２枚、３枚または４枚有することを特徴とする、請求項６から８までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１０】
少なくとも１枚の前記ブレード（１９）が、２つ以上の放射状に離間した歯（２２）、好ましくは前記回転軸（１８）に対して平行に延在した、２つ以上の放射状に離間した歯（２２）を有することを特徴とする、請求項６から９までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１１】
前記動作容積（９）の少なくとも一部は、断面積が前記入口（５）から前記出口（６）への方向で減少するテーパー型を有することを特徴とする、請求項６から１０までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１２】
前記ケーシング（４）が、固定配置で互いに接続された１つまたは複数の要素から形成されていることを特徴とする、請求項６から１１までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１３】
破砕カートリッジとして提供されることを特徴とする、請求項６から１２までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１４】
請求項６から１２までのいずれか１項記載の少なくとも１つの破砕装置（２）、および
ドライブシャフト（３７）を介して前記破砕装置（２）のロータ（１０）に接続された駆動部（３６）、ここで前記駆動部（３６）は、モータにより形成されていることが好ましい、
を備える、脂肪組織から治療用細胞を調製するための処理装置（１）。
【請求項１５】
前記破砕装置（２）が、請求項１３記載の破砕カートリッジにより形成されており、前記処理装置（１）の消耗部品として提供されることを特徴とする、請求項１４記載の処理装置（１）。
【請求項１６】
請求項６から１３までのいずれか１項記載の破砕装置（２）と、
カニューレ（４３）であって、好ましくはローラーポンプも収容するチューブ（４４）により前記破砕装置（２）の入口（５）に接続されたカニューレ（４３）と
を備える、脂肪吸引用途のセット（４２）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非酵素的方法、脂肪組織から治療用細胞を調製するための相応する破砕装置、前記方法を実施するための処理装置、および前記方法および装置の脂肪吸引用途のために提供されたセットに関する。破砕装置は、入口および出口を有し、かつ動作容積を画定するケーシングと、動作容積内に収容され、かつケーシングに対して回転軸の周囲を回転可能なロータとを備える。
【０００２】
ヒトの脂肪組織は、再生医療およびティッシュエンジニアリングにおいて応用可能な成体幹細胞の魅力的かつ豊富に入手可能な供給源である。脂肪組織、これに由来する間質血管細胞群（ＳＶＦ）、および脂肪組織中に含有される脂肪由来間質細胞／幹細胞（ＡＳＣ）は、軟組織欠損、骨欠損、胃腸障害、免疫疾患、神経損傷および心血管疾患の治療のための臨床研究および臨床試験における使用で成功を収めた。
【０００３】
治療用細胞、例えばＳＶＦに含有されている治療用細胞を細胞付加型脂肪移植（ＣＡＬ）において付加することで、豊胸手術後の萎縮を低減することができ、脂肪移植片の生存率が上がり、移植片において新血管新生がもたらされる。移植された脂肪組織の細胞と周辺組織の細胞との相互作用により、サイトカインおよび成長因子が放出されて修復機構がもたらされる。
【０００４】
臨床に転換するための前提条件は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準において脂肪組織由来の細胞を生成することである。多くの企業が、閉鎖型で、無菌式で、安全でかつ再現性があり、ドナーの変動、混入の危険およびセル材料の予測不可能性を制限する細胞単離プロセスを目的とするシステムを開発してきた。しかしながら、これらのシステムの多くは、コラゲナーゼを用いた酵素による消化に基づく。
【０００５】
国際公開第２０１５／０３５２２１号（ＷＯ２０１５／０３５２２１Ａ１）（Ｃｉｍｉｎｏ，Ｗ．Ｗ．等、Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ、２０１５、国際公開第２０１５０３５２２１号（ＷＯ２０１５０３５２２１Ａ１））およびそれよりも前の国際公開第２０１２／００６５８７号（ＷＯ２０１２／００６５８７Ａ２）（同じ発明者等のもの）のどちらにおいても、細胞調製用の持ち運び式装置内で脂肪組織を処理する方法が記載されている。装置の容器は、フィルターにより、組織保持容積とろ液容積とに分けられている。回転式ミキサーが組織保持容積内に設けられており、ミキサー操作用の手動式ハンドルに接続されている。細胞の分離は、洗浄サイクルに引き続き、保持時間の間に、酵素含有消化培地を用いて容器内で組織を消化することにより達成される。したがって、国際公開第２０１５／０３５２２１号（ＷＯ２０１５／０３５２２１Ａ１）（上記のＣｉｍｉｎｏ，Ｗ．Ｗ．等２０１５）および国際公開第２０１２／００６５８７号（ＷＯ２０１２／００６５８７Ａ２）に記載されている方法および装置は、組織のバッチ処理に限定される。どちらの例においても、回転式ミキサーによっては、組織と消化培地との混合しか達成されず、細胞を機械的に分離するための方法または装置は、これらの２つ文書のどちらにも開示されていない。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１４／０１９３８５２号明細書（ＵＳ２０１４／０１９３８５２Ａ９）（Ｖｏｓｓｍａｎ，Ｅ．等、Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ、２０１４、米国特許出願公開第２０１４０１９３８５２号明細書（ＵＳ２０１４０１９３８５２Ａ９））に記載の装置および方法には、繊維状材料を組織試料から抽出することで脂肪組織を前処理するために、細断・分離装置が使用される。細断・分離装置は、繊維状組織成分用の保持容積を形成するバスケットから成るが、その一方で、中間細胞産生組成物は、バスケット底部の篩を通過することができ、したがって、バスケットに内蔵される回転式ブレードのセットによる細断を回避することができる。その後、この篩を通過した非繊維状試料は、洗浄され、遠心分離され、コラゲナーゼのような消化酵素を添加することにより消化される。したがって、米国特許出願公開第２０１４／０１９３８５２号明細書（ＵＳ２０１４／０１９３８５２Ａ９）（上記のＶｏｓｓｍａｎ，Ｅ．等２０１４）に開示されている装置および方法は、脂肪組織を前処理するためだけに使用され、遊離細胞の懸濁液は、前記消化によってのみ得られる。
【０００７】
コラゲナーゼのような酵素を使用すると、安全および効率に関連する規制局の認可が複雑になり、費用がかかり、これが細胞産生物の費用に反映され、分化能および効率に対して不利な影響が及ぼされることがある。よって、脂肪組織由来の細胞の非酵素的単離法を幾つか開発して、閉鎖型装置に移した。しかしながら、方法またはシステムはいずれも異なる利点および欠点を有しており、継続的な開発および最適化の段階にある（Ｏｂｅｒｂａｕｅｒ，Ｅ．等、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｅｎ（Ｌｏｎｄ）、２０１５、４：７頁参照）。
【０００８】
本発明の対象は、脂肪組織における治療用細胞を増幅させるための非酵素的方法および装置を提供することである。本方法の能率は、処理期間、処理能力、および得られる細胞材料の品質に関して、少なくとも既存の方法と同等であるものとする。
【０００９】
本発明による方法は、
脂肪組織を破砕装置に連続的に供給する工程、
細胞または細胞凝集物を、破砕装置に通して移動させることで複数のブレードにより機械的に脂肪組織から分離する工程、ここでブレードは、全体的な流れの方向に対して離間した位置で配置されており、ブレードは、回転軸の周囲を移動し、ここで回転軸は、前記全体的な流れの方向に対してほぼ平行に設けられている、
分離された細胞を含む処理済の組織を破砕装置から連続的に取り出す工程
を含む。
【００１０】
動作において、脂肪組織は、連続的に流れて破砕装置内に入り、この破砕装置から出てくる。その結果、本方法により、脂肪組織は破砕装置内で制御した状態で連続的に処理される。すなわち、処理前に別個のバッチにおいて未処理の組織を回収または保持する必要がない。動作の間、供給物および得られた処理済の材料の流速を実質的に一定にして破砕装置に通す。
【００１１】
本方法は、脂肪吸引材料（本発明による脂肪組織を含むもの）を均質化する方法として実施されることが好ましい。本発明によって得られた細胞凝集物（例えば脂肪吸引材料からのもの）は、好ましくは「微小組織」と称される。このような微小組織は、均質化された組織片であり、これにより、細胞成分がその自然な微小環境内に維持される。
【００１２】
相応して、冒頭で規定した破砕装置は、
入口および出口を有し、かつ動作容積を画定するケーシングと、
動作容積内に収容され、かつケースに対して回転軸の周囲を回転可能なロータ
とを備え、
本発明によりさらに規定するならば、
ロータは、少なくとも８列のブレードを、ロータの回転軸に対して離間した配置で備え、かつ
入口および出口は、ロータの回転軸に対して平行な方向にずらして置かれている。
【００１３】
ロータに対する入口および出口の配置は、入口と出口との間の材料の流れが、ロータの回転軸に対してほぼ平行な全体的方向（すなわち、平均的または中央値的な方向）になるような配置である。破砕装置内で処理される材料は、ロータの細長いシャフトに沿って実質的に動かされる。ロータのブレードまたはパドルは、前記細長いシャフトに沿って、かつその周囲に配置されている。装置の動作において、ブレードは、シャフトの縦に対して垂直に回転する。ケーシング内の死容積を最小限に抑えるために、入口および出口は、ロータにおける向かい合った端部において、流れ方向で第一のブレード列および最終ブレード列にそれぞれ実質的に近接した状態で配置されることが好ましい。
【００１４】
したがって、上記の方法および装置を用いることで、本発明により、脂肪組織を穏やかに均質化して、引き続き、自己臨床応用、例えば組織再構築、修復または置換のために治療用細胞を濃縮するための、閉鎖型かつ無菌式の非酵素的手段が提供される。本発明は、酵素による消化またはさらなる組織処理を必要とすることなく、同じことを実施するための安全な方法および装置を提示し、短い処理時間内で処理速度が非常に高い。閉鎖型システム内での使用が可能になることで、空気が混入することなく無菌性が改善され、このことは、細胞治療法の考案における主要な基準である。
【００１５】
したがって、本方法および装置は、細胞濃縮に使用される場合、直接の臨床応用のために規定された特性を有する高品質の治療用細胞を生成することができる。本発明の非酵素的方法によって得られた細胞は、酵素的単離法および公知の非酵素的単離法によって単離した細胞に比べて、より高い細胞内外ＡＴＰ、ならびにより強い脂肪生成分化能、骨形成分化能および軟骨形成分化能を有することが判明した。本発明の非酵素的方法によって得られた細胞は、脈管形成を示す管状構造を形成することができる。さらに、本方法は、特定の部分母集団について、新血管新生および分化にとって重要であり得る単離したばかりの接着細胞組成物、例えば、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）、周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）および外膜上のＡＳＣ（ｓｕｐｒａ−ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ＡＳＣ）（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）（Ｊａｍｅｓ，Ａ．Ｗ．等、Ａｎ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１２、１（９）：６７３〜８４頁；Ｈａｇｅｒ  Ｇ．等、Ｔｈｒｅｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（１１）：１４２６〜３５頁；Ｈｏｌｎｔｈｏｎｅｒ，Ｗ．等、Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ  ｍａｔｒｉｘ、Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ、２０１５、９（２）：１２７〜３６頁）に対して影響を与えた。
【００１６】
有利には、ケーシングにより画定された動作容積は、ロータの回転軸の周囲を回転するロータの各後続列のブレードの半径（すなわち、各列の最長のブレードの先端の半径）を結んだ線により描かれる回転の中実部分に相応する。言い換えれば、動作容積は、ロータが１回転する間にブレードによりスイープされるディスクと、後続のこのようなディスク２枚の間にある円柱形または円錐形の空間とから成る参照容積に相応する。実用的な理由から、例えばブレードとケーシングの内壁との間の接触を低減するために、動作容積は、前記参照容積より、２０％、好ましくは１０％、特に５％大きくてもよい。先に規定した動作容積の形状は、破砕装置内の死容積が、流れ抵抗を低く保ちつつ最小限に抑えられ、かつ実質的に動作容積内のロータのブレードにより画定されるような形状である。
【００１７】
本発明の破砕装置の好ましい構成において、ロータは、２０〜８０列のブレードを有する。それよりもブレードの列数が少ないと、効率が著しく下がり、分離される細胞の収率が不必要に減少する。それよりもブレードの列数が多いと、一旦供給材料がすべて消費されたら、動作容積が増加し、したがって装置内に保持される組織の量も増加し、分離される細胞の処理効率および収率が著しく向上することはない。さらに、組織と装置とをより長く接触させると、細胞の損傷がより促進されてしまうことがある。
【００１８】
少なくとも８列のブレードはそれぞれ、ロータの回転軸に対して周りに配置されたブレードを２枚、３枚または４枚有することが好ましい。列あたりのブレード数により、処理される組織に対して横方向に作用する作業面が決まる。他方で、列あたりのブレードがあまりに多いと、装置の製造が複雑になり、損傷や動作中の詰まりに対する信頼性が下がる。
【００１９】
少なくとも１列のブレードが平らな板状の要素により形成されていることが最も効果的であると判明した。さらに、各ブレードの長さおよび幅は、１〜５０ｍｍの範囲にあることが好ましいとされる。ブレードの向きについては、少なくとも幾つかの列、好ましくは４〜７０列について、ロータの回転軸は、ブレードの中央平面に対して実質的に垂直であることが有利である。また、少なくとも幾つかの列、好ましくは３〜２０列について、ロータの回転軸は、ブレードの中央平面に対して実質的に平行に配置されていてもよい。双方のブレードの配置を混ぜた構成を単一の装置内で使用することが好ましい。「中央平面」という用語は、平らな板状のブレードの中央表面の平面部を指す。したがって、中央平面は、板状の要素の平面寸法が規定された平面である。ロータの上記の好ましい特性によると、本発明の装置のブレードは、２つの異なる向きで、例えば２つのグループの異なる向きで配置されていてもよい。１つ目のグループのブレード、例えば上向流グループは、回転軸に対して平行な中央平面を有するように配置されていてもよい。よって、ブレードは、組織がこのグループのブレードに沿って動く際に、組織に対して円形の推進力を実質的にもたらす。第二のグループのブレード、例えば下向流グループは、回転軸を横切る中央平面を有するように配置されていてもよい。よって、このグループのブレードは、その狭いエッジで組織に作用するため、このグループのブレードを通過する細胞構造に対して切断効果をもたらす。
【００２０】
動作容積内で比較的低い流れ抵抗を達成するためには、少なくとも幾つかの列が、同数のブレードを有し、ここでブレードが、ロータの回転軸に対して平行して円柱状に配置されていることが好ましい。
【００２１】
動作中の破砕装置を通る流速が、少なくとも１００ｍｌ／分、好ましくは少なくとも２００ｍｌ／分であることが有利である。流速により、処理される組織が動作容積内に残留する時間が求まり、かつブレードにあたる材料の流速も求まる。よって、流速をブレードの形状および移動に適合させ、かつ望ましい処理時間に調節することが有利である。
【００２２】
装置の断面全体にわたり均質な移動を実現するために、ロータは、プロペラ、好ましくはプロペラ型ブレードとして構成された少なくとも１列のブレードにより形成されたプロペラを有していてもよい。このようなプロペラ型ブレードは、その中央平面が（回転軸に対して垂直な）移動面に対して傾いた状態で配置されていてもよい。この場合には、装置は、軸流ポンプとして機能する。比較的低く正確な流速が望まれる場合、ロータは、スクリュー型プロペラをさらにまたは代替的に有していてもよい。
【００２３】
よって、本方法は、組織を破砕装置に通して、好ましくはブレードの回転により圧送する工程を含んでいてもよい。圧送とは、組織を運搬または押して装置に通し、かつ効果的に回転軸に対して平行に装置内の組織を前に移動させる圧送圧力を指す。この前への移動は、組織をブレードに向かって、ブレードの移動に対して垂直に押すため、脂肪組織からの細胞または細胞凝集物の機械的分離に関与する。
【００２４】
有利には、少なくとも１つのブレードは、２つ以上の放射状に離間した歯、好ましくは回転軸に対して平行に延在した、２つ以上の放射状に離間した歯を有する。この歯は、ロータの回転軸に対して平行な平面に対して０〜８０°の間の角度で傾いていてもよい。前記放射状に離間した歯により、歯の間に繊維状組織を一時的に保持することができる。これにより、前記繊維状組織の処理時間が、その他の非繊維状組織に比べて増加し、したがって、非繊維状組織についての処理能力を下げることなく、繊維状組織に対する分離性能が改善される。
【００２５】
好ましい実施形態において、動作容積の少なくとも一部は、断面積が入口から出口への方向で減少するテーパー型を有する。ここで部分またはテーパー部分とは、ロータの回転軸に対して平行な動作容積の全長の一部を指す。テーパー型は、円錐台型であることが好ましく、錐体の対称軸はロータの回転軸である。テーパー部分は、ケーシングの入口に隣接して位置していることが好ましく、ここで、動作容積における後続の円柱部分が、テーパー部分とケーシングの出口との間に続く。
【００２６】
ケーシングは、固定配置で互いに接続された１つまたは複数の要素から形成されていることが好ましい。特に、ケーシングは可動部を有せず、ケーシングの要素は、ケーシングにより形成される動作容積にロータを挿入した後に、一体的に溶接または接着される。ケーシング内には可動部が存在しないため、ケーシングの隙間または結合部における組織材料の堆積物を効果的に回避することができる。このことは、ケーシング内の予測不能なデッドゾーンを回避すること、および装置の取り扱いおよび洗浄を容易にすることにも役立つ。
【００２７】
基本的に、本発明の装置の処理能率および細胞の機械的分離の効率は、ブレードが回転している動作容積の長さと断面積との関数であると言える。ロータの回転軸に対して平行な動作容積の全長に対する、ロータの回転軸に対して横方向の動作容積の平均断面積の好ましい比率は、０．０２〜０．５であると判明した。これは、動作容積が、その幅の少なくとも２倍の長さからその幅の５０倍の長さまでであることを意味する（平均）。長さがより大きいと、分離結果を著しく改善することなく、著しい死容積が生じるだろう。
【００２８】
脂肪吸引により除去される組織の処理における好ましい用途に適合させた絶対数の観点で、ロータの回転軸に対して平行な動作容積の長さは、５００ｍｍ未満である。
【００２９】
清浄性および無菌性の観点で可能な限り高い標準を達成するために、破砕装置を破砕カートリッジとして提供してもよい。言い換えれば、破砕装置を単独使用型の装置として提供することができる。この場合、装置は基本的に、１人の患者の組織または１回の治療セッションの間に１人の患者から取り出される組織を処理するために使用される。所定の治療セッションに関係する全組織容積を処理したら、破砕カートリッジを廃棄する。
【００３０】
本方法において用いられる破砕装置は、先に論じたより詳細な構造の変形例および実施形態のいずれか１つ記載の破砕装置であることが好ましい。
【００３１】
さらに、本発明は、（例えば、脂肪吸引材料を均質化することにより）脂肪組織から治療用細胞または微小組織を調製するための処理装置の一部としての本破砕装置の全体的な使用に関し、前記処理装置は以下のものを備える：先に規定した少なくとも１つの破砕装置、およびドライブシャフトを介して破砕装置のロータに接続された駆動部、ここで駆動部は、モータにより形成されていることが好ましい。すなわち、処理装置は、ロータを駆動させるための駆動部を有する破砕装置を効果的に補完し、よって、望ましい処理および分離が自動的に実施される。
【００３２】
このような処理装置が予定されている場合、駆動部は、磁気結合により破砕装置のロータに結合されていることが好ましいであろう。磁気結合には、ケーシングの可動部を必要とすることなく、ロータに駆動トルクが付与されるという利点がある。また、磁気結合により、最大伝達トルクが制限され、それによりロータの損傷が回避されることは当然のことである。磁気結合は、（例えば、駆動の開始および停止において）駆動部により付与されるトルクの意図的ではないピークによる細胞の損傷を回避するのにも役立つ。
【００３３】
改善された処理効率は、本方法が以下の工程を含む場合に観察された：回転速度を、所定の一定の速度、好ましくは７００〜１１００ｒｐｍに制御する工程。所定の一定の速度の使用は、流が連続的であり、かつ流速が実質的に一定であるために可能である。実際の回転速度は、ロータのブレードの長さおよび最大半径に応じて選択可能である。先に規定した処理装置に関して、駆動部は、回転速度を、一定の速度、好ましくは７００〜１１００ｒｐｍに制御するための制御装置に相応して接続されていてもよい。
【００３４】
破砕装置内における望ましい連続的な流および処理を達成するために、本方法は、以下の工程を含んでいてもよい：破砕装置の出口を吸引することで、または破砕装置の入口に圧力をかけることで、分離された細胞を含む処理済の組織を破砕装置から連続的に取り出す工程。
【００３５】
さらに、処理装置の破砕装置は、先に規定した破砕カートリッジにより形成されていてもよく、処理装置の消耗部品として提供される。この場合、使用後に毎回、例えば脂肪組織の処理を含む治療セッション後に毎回、破砕カートリッジを廃棄してもよい。使用済の破砕カートリッジは、処理装置の駆動部から取り外して切り離し、新しい未使用の破砕カートリッジと交換することができる。
【００３６】
本方法の好ましい用途において、本方法は、以下の工程を含む：カニューレ、すなわち、脂肪吸引に使用される針に接続されたホースを通して脂肪組織を受け取り、それから、脂肪組織を破砕装置に連続的に供給する工程。この好ましい使用事例において、破砕装置は、脂肪吸引の間に除去された脂肪組織を処理するために、すなわち、「吸引脂肪」を処理するために使用される。
【００３７】
この用途に関する本願のさらなる好ましい実施形態は、以下のものを備える脂肪吸引用途のためのセットである：先に規定した破砕装置（または破砕カートリッジ）および破砕装置の入口に接続されたカニューレ。このセットには、カニューレと破砕装置との間で即時使用可能かつ信頼性のある接続が可能になるという利点がある。同じインターフェースを使用して、既存の脂肪吸引設備（ポンプ、回収容器など）を、カニューレに直接接続する代わりに破砕装置に接続することができる。したがって、さらなる設備は必要とされない。
【００３８】
以下の本方法の好ましい実施形態において、本発明による破砕装置、処理装置およびセットを規定し、同様に、これらの好ましい組み合わせも規定する。
【００３９】
１．  脂肪組織を破砕装置に連続的に供給する工程、
細胞または細胞凝集物を、破砕装置に通して移動させることで複数のブレードにより機械的に脂肪組織から分離する工程、ここでブレードは、全体的な流れの方向に対して離間した配置で配置されており、ブレードは、回転軸の周囲を移動し、ここで回転軸は、前記全体的な流れの方向に対して実質的に平行に設けられている、
分離された細胞を含む処理済の組織を破砕装置から連続的に取り出す工程
を含む、脂肪組織から治療用細胞を調製するための非酵素的方法。
【００４０】
２．  動作中の破砕装置を通る流速が、少なくとも１００ｍｌ／ｍｉｎ、好ましくは少なくとも２００ｍｌ／ｍｉｎである、実施形態１記載の方法。
【００４１】
３．  回転速度を、所定の一定の速度、好ましくは７００〜１１００ｒｐｍに制御する工程を含む、実施形態１または２記載の方法。
【００４２】
４．  組織を破砕装置に通して、好ましくはブレードの回転により圧送する工程を含む、実施形態１から３までのいずれか１つ記載の方法。
【００４３】
５．  破砕組織の出口を吸引することで、細胞凝集物が分離された細胞を含む処理済の組織を破砕装置から連続的に取り出す工程を含む、実施形態１から４までのいずれか１つ記載の方法。
【００４４】
６．  カニューレに接続されたホースを通して脂肪組織を受け取り、それから、脂肪組織を破砕装置に連続的に供給する工程を含む、実施形態１から５までのいずれか１つ記載の方法。
【００４５】
７．  破砕装置が、実施形態９から２３までのいずれか１つ記載の破砕装置である、実施形態１から６までのいずれか１つ記載の方法。
【００４６】
８．  入口および出口を有し、かつ動作容積を画定するケーシングと、
動作容積内に収容され、かつケーシングに対して回転軸の周囲を回転可能なロータと
を備える、脂肪組織から治療用細胞を調製するための破砕装置において、
ロータが、少なくとも８列のブレードを、ロータの回転軸に対して離間した配置で有し、かつ
入口および出口が、ロータの回転軸に対して平行な方向にずらして置かれていることを特徴とする、破砕装置。
【００４７】
９．  ケーシングにより画定された動作容積が、ロータの回転軸の周囲を回転するロータの各後続列のブレードの半径を結んだ線により描かれる回転の中実部分に相応することを特徴とする、実施形態８記載の破砕装置。
【００４８】
１０．  ロータが、２０〜８０列のブレードを有することを特徴とする、実施形態８または９記載の破砕装置。
【００４９】
１１．  少なくとも８列のブレードがそれぞれ、ロータの回転軸に対して周りに配置されたブレードを２枚、３枚または４枚有することを特徴とする、実施形態８から１０までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５０】
１２．  少なくとも１列のブレードが平らな板状の要素により形成されていることを特徴とする、実施形態８から１１までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５１】
１３．  各ブレードの長さおよび幅が１〜５０ｍｍの範囲にあることを特徴とする、実施形態１２記載の破砕装置。
【００５２】
１４．  少なくとも幾つかの列、好ましくは４〜７０列について、ロータの回転軸が、ブレードの中央平面に対して実質的に垂直であることを特徴とする、実施形態１２または１３記載の破砕装置。
【００５３】
１５．  少なくとも幾つかの列、好ましくは３〜２０列について、ロータの回転軸が、ブレードの中央平面に対して実質的に平行であることを特徴とする、実施形態１２から１４までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５４】
１６．  少なくとも幾つかの列が、同数のブレードを有し、ここでブレードが、ロータの回転軸に対して平行して円柱状に配置されていることを特徴とする、実施形態８から１５までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５５】
１７．  ロータが、プロペラ、好ましくはプロペラ型ブレードとして構成された少なくとも１列のブレードにより形成されたプロペラを備えることを特徴とする、実施形態８から１６までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５６】
１８．  少なくとも１枚のブレードが、２つ以上の放射状に離間した歯、好ましくは回転軸に対して平行に延在した、２つ以上の放射状に離間した歯を有することを特徴とする、実施形態８から１７までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５７】
１９．  動作容積の少なくとも一部は、断面積が入口から出口への方向で減少するテーパー型を有することを特徴とする、実施形態８から１８までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５８】
２０．  ケーシングが、固定配置で互いに接続された１つまたは複数の要素から形成されていることを特徴とする、実施形態８から１９までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００５９】
２１．  ロータの回転軸に対して平行な動作容積の全長に対する、ロータの回転軸に対して横方向の動作容積の平均断面積の好ましい比率が、０．０２〜０．５であることを特徴とする、実施形態８から２０までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００６０】
２２．  ロータの回転軸に対して平行な動作容積の長さが、５００ｍｍ未満であることを特徴とする、実施形態８から２１までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００６１】
２３．  破砕カートリッジとして提供されることを特徴とする、実施形態８から２２までのいずれか１つ記載の破砕装置。
【００６２】
２４．  実施形態８から２３までのいずれか１つ記載の少なくとも１つの破砕装置、および
ドライブシャフトを介して破砕装置のロータに接続された駆動部、ここで駆動部は、モータにより形成されていることが好ましい、
を備える、脂肪組織から治療用細胞を調製するための処理装置。
【００６３】
２５．  駆動部が、磁気結合により破砕装置のロータに結合されていることを特徴とする、実施形態２４記載の処理装置。
【００６４】
２６．  駆動部が、回転速度を、好ましくは一定の速度、特に７００〜１１００ｒｐｍの一定の速度に制御するための制御装置に接続されていることを特徴とする、実施形態２４または２５記載の処理装置。
【００６５】
２７．  破砕装置が、実施形態２２記載の破砕カートリッジにより形成されており、処理装置の消耗部品として提供されることを特徴とする、実施形態２４から２６までのいずれか１つ記載の処理装置。
【００６６】
２８．  実施形態８から２３までのいずれか１つ記載の破砕装置と、
好ましくはローラーポンプも収容するチューブにより破砕装置の入口に接続されたカニューレと
を備える、脂肪吸引用途のセット。
【００６７】
以下で、好ましい例示的な実施形態を用い、かつ図面を参照して、本発明をより詳細に規定するが、本発明は、これらの実施形態に限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明による破砕装置を備える処理装置の分解図を図示する。
【図２】図１に示した破砕装置のロータを図示する。
【図３】図２のロータの側面図を示す。
【図４】図２のロータの上面図を示す。
【図５】図１に示した破砕装置のケーシングの断面図を示す。
【図６】図１に示した破砕装置のケーシングの上面図を示す。
【図７】図３に記載のロータと図５に記載のケーシングとを備える組み立て後の破砕装置の部分的な断面図を示す。
【図８】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞収率を示し、ここで酵素的単離法によって得られた微小組織は、本発明の方法または振とう法および切断法を実施した後に単離された細胞に比べて、著しく高い細胞収率を示した（＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５〜７）。
【図９】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞生存率を示し、ここで酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた単離したばかりの生存細胞のパーセンテージについて、アクリジンオレンジ／ＤＡＰＩ蛍光染色により調べた。適用した酵素的単離法と非酵素的単離法との間の細胞生存率における著しい差は存在しなかった（ｎ＝７）。
【図１０ａ】単離したばかりの細胞のコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイの代表的な写真を示す。酵素的単離（右側）によって得られた単離したばかりの細胞および本発明（左側）によって単離したばかりの細胞を、６ウェルプレートの各ウェル内に規定の細胞数で播種し、培養１４日後に、形成されたコロニーをヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【図１０ｂ】本発明によって単離した細胞が、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、より高いコロニー形成能を示すことを明らかにした定量分析の結果を示す（ｎ＝５）。
【図１１】接着細胞の細胞内／細胞外ＡＴＰのグラフを示す。酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を調べた。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、著しく高い細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝５）。
【図１２ａ】接着細胞の増殖能を示す。酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、３日後および７日後に膨張培地中で光学顕微鏡法により調べた。どの単離法によって得られた細胞も、７日目にスピンドル状の細胞形態を示した。スケールバー＝１００μｍ。
【図１２ｂ】接着細胞の増殖能を示す。酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、７日後、１４日後および２１日後に膨張培地中で、その増殖能を集団倍加レベル（ＰＤＬ）により調べた。本発明による処理後に単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、または非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、類似したＰＤＬを示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝５）。
【図１３ａ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図１３ａ）、ＣＤ９０（図１３ｂ）およびＣＤ１０５（図１３ｃ）において差がなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図１３ｄ）および周皮細胞状の細胞（図１３ｅ）については、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用すると、ＳＡ−ＡＳＣの数も酵素的単離に比べて増加した（図１３ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図１３ｂ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図１３ａ）、ＣＤ９０（図１３ｂ）およびＣＤ１０５（図１３ｃ）において差がなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図１３ｄ）および周皮細胞状の細胞（図１３ｅ）については、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用すると、ＳＡ−ＡＳＣの数も酵素的単離に比べて増加した（図１３ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図１３ｃ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図１３ａ）、ＣＤ９０（図１３ｂ）およびＣＤ１０５（図１３ｃ）において差がなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図１３ｄ）および周皮細胞状の細胞（図１３ｅ）については、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用すると、ＳＡ−ＡＳＣの数も酵素的単離に比べて増加した（図１３ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図１３ｄ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図１３ａ）、ＣＤ９０（図１３ｂ）およびＣＤ１０５（図１３ｃ）において差がなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図１３ｄ）および周皮細胞状の細胞（図１３ｅ）については、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用すると、ＳＡ−ＡＳＣの数も酵素的単離に比べて増加した（図１３ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図１３ｅ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図１３ａ）、ＣＤ９０（図１３ｂ）およびＣＤ１０５（図１３ｃ）において差がなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図１３ｄ）および周皮細胞状の細胞（図１３ｅ）については、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用すると、ＳＡ−ＡＳＣの数も酵素的単離に比べて増加した（図１３ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図１３ｆ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図１３ａ）、ＣＤ９０（図１３ｂ）およびＣＤ１０５（図１３ｃ）において差がなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図１３ｄ）および周皮細胞状の細胞（図１３ｅ）については、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用すると、ＳＡ−ＡＳＣの数も酵素的単離に比べて増加した（図１３ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図１４ａ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５、ならびに内皮細胞マーカー／周皮細胞マーカーＣＤ１４６において差がなかった一方で、本発明により、造血細胞マーカーＣＤ４５、ならびに内皮細胞マーカーＣＤ３１およびＣＤ３４において上昇が見られた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図１４ｂ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）は、酵素的単離に比べて、本発明により著しく増加した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図１４ｃ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）の数も、本発明により有利な影響を受けた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図１４ｄ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。本発明による培養において、ＳＡ−ＡＳＣの数は、６日後も依然として多いが、酵素的単離よりは少ない（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図１５】単離したばかりの細胞の細胞毒性（ＬＤＨ放出）を比較したグラフを示す。膨張培地中で２４時間後にＬＤＨが放出されたら細胞死と評価した。本発明および酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）を使用して得られた細胞を、１００％の細胞が死んでいるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した対照物と比較した。本発明の方法によって得られた細胞は、酵素的単離法に比べて、著しく低いＬＤＨ放出を示した（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝３）。
【図１６ａ】アリザリンレッドでの染色で分析した接着細胞の骨形成分化能の比較を示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その骨形成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、マトリックスの無機化および石灰化用のアリザリンレッドにより染色することで調べた。アリザリンレッドでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞、および非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、それほど無機化していないが、本発明によって得られた細胞については、強く染色されていることが証明された。スケールバー＝１００μｍ。
【図１６ｂ】定量化で分析した接着細胞の骨形成分化能の比較を示す。定量分析により、本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断および振とうによって得られた細胞に比べて、著しく高いアリザリンレッドの吸光度を示すことが判明した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝５）。
【図１７】アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で分析した接着細胞の骨形成分化能のグラフを示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その骨形成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、活性骨芽細胞中に発現するＡＬＰにより染色することで調べた。本発明を使用して単離した細胞は、その他すべての方法に比べて、著しく高いＡＬＰ活性を示した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、統計的分析については、一元配置分散分析後のテューキーの事後検定（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）を実施した、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。
【図１８ａ】オイルレッドＯでの染色で分析した接着細胞の脂肪生成分化能の比較を示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その脂肪生成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、脂肪滴を形成するためのオイルレッドＯにより染色することで調べた。オイルレッドＯでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞について、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、脂肪滴の形成がより少ないことが示されたが、本発明によって得られた細胞については、脂肪滴の形成が著しいことが示された。スケールバー＝１００μｍ。
【図１８ｂ】定量化で分析した接着細胞の脂肪生成分化能の比較を示す。定量分析により、本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断および振とうによって得られた細胞に比べて、著しく高いオイルレッドＯの吸光度を示すことが分かった（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：脂肪生成分化培地中の細胞、＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。
【図１９ａ】アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンでの染色で分析した３Ｄマイクロマスペレットの軟骨形成分化能の比較を示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞を、３Ｄマイクロマスペレットとして１週間後に膨張培地中に、さらに５週間後に軟骨形成分化培地中に移した。３Ｄマイクロマスペレットについて、その断面積を毎週測定し、その軟骨形成分化能のために、５週間後に、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンで、この３Ｄマイクロマスペレットを染色した。アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞について、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、染色が弱いか、または起こらないことが示されたが、本発明によって得られた細胞については、染色が濃いことが示された。スケールバー＝１００μｍ。
【図１９ｂ】経時的に上昇するペレットサイズの比較を示す。本発明によって得られた細胞は、その他すべての単離法に比べて、軟骨形成分化培地中でのペレットサイズの成長が速いことを示したが、その上昇は、統計的有意性に達しなかった（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５）。
【図２０】３Ｄフィブリンマトリックス中で分析した単離したばかりの細胞の血管新生能を示す。酵素的単離および本発明によって得られた単離したばかりの細胞を、フィブリンクロット形成のためにフィブリノゲンおよびトロンビンと混合した。これらについて、アプロチニンを含む膨張培地中で２週間後に、その血管新生能を内皮細胞マーカーＣＤ３１（グリーン）で分析した。染色により、酵素的単離および本発明によって得られた細胞について、管状形態の発達が示された。スケールバー＝２００μｍ（上段）、１００μｍ（下段）（ｎ＝１）。
【図２１】図１に記載の破砕装置とカニューレとを備える脂肪吸引用途セットを示す。
【図２２】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞収率を示し、ここで酵素的単離法によって得られた微小組織は、本発明の方法または振とう法および切断法の実施後に単離した細胞に比べて、著しく高い細胞収率を示した（＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５〜９）。
【図２３】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞生存率を示し、ここで酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた単離したばかりの生存細胞のパーセンテージをＤＡＰＩ蛍光染色により調べた。適用した酵素的単離法および非酵素的単離法の間で、細胞生存率における著しい差は存在しなかった（ｎ＝５〜９）。
【図２４ａ】単離したばかりの細胞のコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイの代表的な写真を示す。酵素的単離（右側）および本発明（左側）によって単離したばかりの細胞を、６ウェルプレートの各ウェル内に規定の細胞数で播種し、培養１４日後に、形成されたコロニーをヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【図２４ｂ】本発明によって単離した細胞が酵素的単離法によって得られた細胞に比べて高いコロニー形成能を示すことを明らかにした定量分析の結果を表す（ｎ＝５）。
【図２５】接着細胞の細胞内／細胞外ＡＴＰのグラフを示す。酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を調べた。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、著しく高い細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ＝５）。
【図２６ａ】接着細胞の増殖能を示す。酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その増殖能を、３日後および７日後に膨張培地中で光学顕微鏡法により調べた。すべての単離法によって得られた細胞が、７日目にスピンドル状の細胞形態を示した。スケールバー＝１００μｍ。
【図２６ｂ】接着細胞の増殖能を示す。酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その増殖能を、７日後、１４日後および２１日後に膨張培地中で集団倍加レベル（ＰＤＬ）により調べた。本発明による処理後に単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、または非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、類似したＰＤＬを示した（ｎ＝５）。
【図２７ａ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図２７ａ）、ＣＤ９０（図２７ｂ）およびＣＤ１０５（図２７ｃ）においては差が存在しなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図２７ｄ）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６＋）（図２７ｅ）は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。ＳＡ−ＡＳＣ（４５−／３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて増加した（図２７ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図２７ｂ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図２７ａ）、ＣＤ９０（図２７ｂ）およびＣＤ１０５（図２７ｃ）においては差が存在しなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図２７ｄ）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６＋）（図２７ｅ）は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。ＳＡ−ＡＳＣ（４５−／３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて増加した（図２７ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図２７ｃ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図２７ａ）、ＣＤ９０（図２７ｂ）およびＣＤ１０５（図２７ｃ）においては差が存在しなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図２７ｄ）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６＋）（図２７ｅ）は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。ＳＡ−ＡＳＣ（４５−／３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて増加した（図２７ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図２７ｄ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図２７ａ）、ＣＤ９０（図２７ｂ）およびＣＤ１０５（図２７ｃ）においては差が存在しなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図２７ｄ）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６＋）（図２７ｅ）は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。ＳＡ−ＡＳＣ（４５−／３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて増加した（図２７ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図２７ｅ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図２７ａ）、ＣＤ９０（図２７ｂ）およびＣＤ１０５（図２７ｃ）においては差が存在しなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図２７ｄ）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６＋）（図２７ｅ）は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。ＳＡ−ＡＳＣ（４５−／３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて増加した（図２７ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図２７ｆ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（図２７ａ）、ＣＤ９０（図２７ｂ）およびＣＤ１０５（図２７ｃ）においては差が存在しなかった一方で、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図２７ｄ）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６＋）（図２７ｅ）は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。ＳＡ−ＡＳＣ（４５−／３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて増加した（図２７ｆ）（ｎ＝３〜４）。
【図２８ａ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５、ならびに内皮細胞マーカー／周皮細胞マーカーＣＤ１４６においては差が存在しなかった一方で、造血細胞マーカーＣＤ４５、ならびに内皮細胞マーカーＣＤ３１およびＣＤ３４においては、本発明により増加が見られた。
【図２８ｂ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）は、酵素的単離に比べて、本発明により著しく増加した。
【図２８ｃ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）の数も本発明により有利な影響を受けた。
【図２８ｄ】接着細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。本発明または酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）によって得られた接着細胞について、細胞構成を調べた。ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／１４６−／３４＋）の数は、本発明による培養において、６日後も依然として多いが、酵素的単離よりは少ない（＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図２９】単離したばかりの細胞の細胞毒性（ＬＤＨ放出）を比較したグラフを示す。２４時間後の膨張培地中におけるＬＤＨ放出により細胞死を評価した。本発明および酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）を使用することで得られた細胞を、１００％の細胞が死んでいるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した対照物と比較した。本発明の方法によって得られた細胞は、酵素的単離に比べて著しく低いＬＤＨ放出を示した（＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝３）。
【図３０ａ】アリザリンレッドでの染色で分析した接着細胞の骨形成分化能の比較を示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その骨形成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、マトリックスの無機化および石灰化用のアリザリンレッドにより染色することで調べた。アリザリンレッドでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞、および非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、それほど無機化していないが、本発明によって得られた細胞については、強く染色されていることが示された。スケールバー＝１００μｍ。
【図３０ｂ】アリザリンレッドでの染色で分析した接着細胞の骨形成分化能の定量化を示す。定量分析により、本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断および振とうによって得られた細胞に比べて、著しく高いアリザリンレッドの吸光度を示すことが判明した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝５）。
【図３１】アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で分析した接着細胞の骨形成分化能のグラフを示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その骨形成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、活性骨芽細胞中で発現するＡＬＰにより染色することで調べた。本発明を使用して単離した細胞は、その他すべての方法に比べて、著しく高いＡＬＰ活性を示した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。
【図３２ａ】オイルレッドＯでの染色で分析した接着細胞の脂肪生成分化能の比較を示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その脂肪生成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に脂肪生成分化培地中で、脂肪滴形成用のオイルレッドＯにより染色することで調べた。オイルレッドＯでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞、および非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、それほど脂肪滴が形成されないが、本発明によって得られた細胞については、脂肪滴形成が著しいことが示された。スケールバー＝１００μｍ。
【図３２ｂ】定量化で分析した接着細胞の脂肪生成分化能を示す。定量分析により、本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断および振とうによって得られた細胞に比べて、著しく高いオイルレッドＯの吸光度を示すことが判明した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：脂肪生成分化培地中の細胞、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝５）。
【図３３ａ】アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンでの染色で分析した３Ｄマイクロマスペレットの軟骨形成分化能の比較を示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞を、３Ｄマイクロマスペレットとして１週間後に膨張培地中に、さらに５週間後に軟骨形成分化培地中に移した。３Ｄマイクロマスペレットについて、その断面積を毎週測定し、その軟骨形成分化能のために、５週間後に、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンで、この３Ｄマイクロマスペレットを染色した。アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞について、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、染色が弱いか、または起こらないことが示されたが、本発明によって得られた細胞については、染色が濃いことが示された。スケールバー＝１００μｍ。
【図３３ｂ】経時的に上昇するペレットサイズの比較を示す。本発明によって得られた細胞は、その他すべての単離法に比べて、軟骨形成分化培地中でのペレットサイズの成長が早いことを示した。アスタリスクは、本発明とコラゲナーゼとの間の著しい差を示し、プラス記号は、本発明と振とうとの間の著しい差を示し、ハッシュは、本発明と切断との間の著しい差を示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝４）。
【図３４】３Ｄフィブリンマトリックス中で分析した単離したばかりの細胞の血管新生能を示す。酵素的単離および本発明によって得られた単離したばかりの細胞を、フィブリンクロット形成のためにフィブリノゲンおよびトロンビンと混合した。これらについて、アプロチニンを含む膨張培地中で２週間後に、その血管新生能を内皮細胞マーカーＣＤ３１（グリーン）で分析した。染色により、酵素的単離および本発明によって得られた細胞について、管状形態の発達が示された。スケールバー＝２００μｍ（上段）、１００μｍ（下段）（ｎ＝１）。
【図３５】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞収率を示し、ここで酵素的単離法によって得られた微小組織は、本発明の方法によって単離した細胞に比べて、かつ本発明の方法の変法（すなわち、以下で論じる変形例１〜４）に比べて、著しく高い細胞収率を示した（＊ｐ＜０．００１、ｎ＝５〜８）。
【図３６】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞生存率を示し、ここで酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた単離したばかりの生存細胞のパーセンテージをＤＡＰＩ蛍光染色により調べた。適用した酵素的単離法、本発明の方法および本発明の方法の変法（すなわち、以下で論じる変形例１〜４）の間で、細胞生存率における著しい差は存在しなかった（ｎ＝５〜１０）。
【図３７】単離したばかりの細胞のコロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイの代表的な写真を示す。酵素的単離法および本発明によって単離したばかりの細胞を、６ウェルプレートの各ウェル内に規定数で播種し、培養１４日後に、形成されたコロニーをヘマトキシリン／エオシンで染色した。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、高いコロニー形成能を示した（ｎ＝９〜１６）。
【図３８ａ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図３８ａ）の数において差が存在しなかった一方で、周皮細胞状の細胞（図３８ｂ）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用した場合、ＳＡ−ＡＳＣの数は、増加してはいるものの、酵素的単離に比べて著しくはなかった（図３８ｃ）（ｎ＝４）。
【図３８ｂ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図３８ａ）の数において差が存在しなかった一方で、周皮細胞状の細胞（図３８ｂ）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用した場合、ＳＡ−ＡＳＣの数は、増加してはいるものの、酵素的単離に比べて著しくはなかった（図３８ｃ）（ｎ＝４）。
【図３８ｃ】単離したばかりの細胞の免疫表現型を比較したグラフを示す。酵素的単離法（０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ）および本発明による非酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞について、細胞構成を調べた。内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（図３８ａ）の数において差が存在しなかった一方で、周皮細胞状の細胞（図３８ｂ）の数は、本発明を使用すると、酵素的単離に比べて僅かに減少した。本発明を使用した場合、ＳＡ−ＡＳＣの数は、増加してはいるものの、酵素的単離に比べて著しくはなかった（図３８ｃ）（ｎ＝４）。
【図３９】アリザリンレッドでの染色で分析した接着細胞の骨形成分化能を比較したグラフを示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その骨形成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、マトリックスの無機化および石灰化用のアリザリンレッドにより染色することで調べた。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、著しく高いアリザリンレッドの吸光度を示した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝７）。
【図４０】アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で分析した接着細胞の骨形成分化能を比較したグラフを示す。本発明および酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その骨形成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に骨形成分化培地中で、活性骨芽細胞中で発現するＡＬＰにより染色することで調べた。本発明を使用して単離した細胞は、酵素的方法に比べて、著しく高いＡＬＰ活性を示した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、ｎ＝５〜８）。
【図４１】オイルレッドＯでの染色で分析した接着細胞の脂肪生成分化能を比較したグラフを示す。本発明、酵素的単離法および非酵素的単離法によって得られた接着細胞について、その脂肪生成分化能を、１週間後に膨張培地中で、さらに３週間後に脂肪生成分化培地中で、脂肪滴形成用のオイルレッドＯにより染色することで調べた。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法によって得られた細胞に比べて、著しく高いオイルレッドＯの吸光度を示した（対照：成長因子および刺激なしでの対照培地中の細胞、差：骨形成分化培地中の細胞、＊＊＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝８）。
【図４２ａ】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞収率を示し、ここで本発明の方法は、本発明の１列、３列、６列、１１列のブレードで単離した細胞に比べて、高い細胞収率を示した。
【図４２ｂ】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞収率を示し、ここで本発明の方法は、１列、３列、６列、１１列の本発明のブレードで単離した細胞に比べて、高い細胞収率を示した。図４２ｂは、図４２ａと比較した変形例１〜４（以下で論じる）を含む（ｎ＝２〜６）。
【図４３ａ】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞生存率を示し、ここで非酵素的単離法によって得られた単離したばかりの生存細胞のパーセンテージをＤＡＰＩ蛍光染色により調べた。適用した本発明の方法および本発明の間で、細胞生存率における著しい差は存在しなかった（ｎ＝２〜６）。
【図４３ｂ】１００ｍｌの脂肪吸引材料から単離したばかりの治療用細胞／微小組織の細胞生存率を示し、ここで非酵素的単離法によって得られた単離したばかりの生存細胞のパーセンテージをＤＡＰＩ蛍光染色により調べた。適用した本発明の方法および本発明の間で、細胞生存率における著しい差は存在しなかった。図４３ｂは、図４３ａと比較した変形例１〜４（以下で論じる）を含む（ｎ＝２〜６）。
【００６９】
図１〜７および２１について
図１は、破砕装置２と駆動装置３とを備える処理装置１を示す。破砕装置は、脂肪組織から治療用細胞を調製するために構成されている。破砕装置２は、入口５および出口６を有するケーシング４を備える。ケーシング４は、入口５に近接したテーパー部分７を有する。テーパー部分７は、ケーシング４の円柱部分８に繋がり、この円柱部分８から、出口６が放射状に延在する。ケーシング４は、その内部に動作容積９を画定しており（図５参照）、この動作容積９は、ケーシング４の各部分７、８に合わせて、部分的にテーパー型および部分的に円柱形の形状を有する。破砕装置２は、ロータ１０をさらに備える。ロータ１０は、ケーシング４の動作容積９内で回転するように収容されるよう適合されている。ロータ１０は、その狭い端部１２に、ケーシング４内のロータ１０を支持するための軸ピン１１を有し、その幅広い端部１４に連結ディスク１３を有する。動作容積９内に収容されている場合、狭い端部１２が、出口６の近くに設けられている一方で、幅広い端部１４は、ケーシング４の入口５の近くに設けられている。動作において、軸ピン１１は、ケーシング４の端板１６における軸受凹部１５に収容され（図５参照）、連結ディスク１３は、端板１６の反対側にあるケーシングの開口部１７と実質的に同一平面上にある。軸ピン１１の軸長は、例えば０．９ｍｍである。連結ディスク１３の直径は、例えば全高７ｍｍで３３ｍｍである。ロータ１０は、ケーシング４に対して回転軸１８の周囲を回転可能である。ロータ１０は、２８列のブレード１９を、回転軸１８に対して離間した配置で備える（図３参照）。軸方向（すなわち、回転軸１８に対して平行）におけるロータの全長は、約１８６ｍｍである。入口５および出口６は、ロータ１０の回転軸１８に対して平行な方向にずらして置かれている。
【００７０】
入口から辿ると、第一のブレード列２０は、ロータ１０の幅広い端部１４において連結ディスク１３と接触している。連結ディスク１３は、ロータ１０の中央の細長いシャフト２１から外側に向かって放射状にそれぞれ延在する４枚型ブレードを備え、中央平面が、回転軸１８に対して実質的に平行であり、すなわち、外縁が、シャフト２１の周囲に円柱状に配置されている。ブレードは、異なる方位角、すなわち、０°、９０°、１８０°および２７０°で回転軸１８に対して周りに配置されている（図４参照）。シャフト２１の直径は、例えば７ｍｍであり、第一のブレード列２０の幅は、例えば７．５ｍｍである。第一のブレード列２０の４枚型ブレードは、放射状に離間した４つの歯２２をそれぞれ備え、これらの歯は、回転軸１８に対して実質的に平行に延在する。放射方向における歯２２の幅は、１．４〜１．８ｍｍの間で変化する。
【００７１】
第二、第三および第四のブレード列２３は、第一のブレード列２０のブレードに対して実質的に平行な周囲に配置された４枚型ブレードをそれぞれ有する。第二、第三および第四のブレード列２３のブレードの放射状の外端は、ケーシング４のテーパー部分７の内壁と実質的に同一平面上にあり、すなわち、前記放射状の外縁は、ロータ１０の回転軸１８に対して傾いている。言い換えれば、外縁は、軸方向に対して円錐状に配置されている。第一の４枚型ブレード列２０、２３は、各ブレード列２０、２３のブレードの幅よりも小さな隙間２４により軸方向に分離されている。例えば、第二、第三および第四のブレード列２３のブレード幅は５ｍｍであってもよく、これらのブレード間の隙間２４の幅は１．７ｍｍであってもよい。第一の４枚型ブレード列２０、２３のブレードは、一緒になって第一群２５のブレードを形成する。第一群２５のブレードは主に、入口５を通して導入される組織を均質化するため、かつ組織を回転させるために使用される。
【００７２】
第５列〜第２７列までのブレードは、第二群２６のブレードを形成する。この第二群２６のブレードは、回転軸１８がブレードの中央平面に対して実質的に垂直になるように、すなわち、中央平面がブレードの運動面に対して平行になるように、回転軸１８に対して垂直に向けられている。第二群２６のブレードは、おおよそ楕円形の断面を有し、放射方向にテーパー型になっている。ブレードは、中央平面に対して垂直なその最大幅を、シャフト２１に接続された端部において有する。この最大幅が約１．３ｍｍであるのに対して、ブレードの放射方向の外側端部における最小幅は０．４ｍｍである。第二群２６のブレードの距離は約６ｍｍであり、これにより、ブレード間の隙間２７の幅は４〜５ｍｍになる。
【００７３】
ロータ１０の狭い端部１２において、最終ブレード列２８がシャフト２１に接続されている。この最終ブレード列２８の４枚型ブレードは、その中央平面が回転軸１８に対して平行になるように、すなわち、第一群２５のブレードと同じように向けられている。この向きにより、処理済の細胞および組織を前記最終ブレード列２８に隣接した出口６に通して遠心力により排出することが促進される。放射方向に測定したシャフト２１からの第二群２６および最終ブレード列２８のブレード長は、約６．３ｍｍであるため、この領域におけるロータの合計直径は、約１９．５ｍｍである。
【００７４】
ロータ１０の連結ディスク１３は、その外面、すなわち、シャフト２１とは反対向きに、環状の凹部２９を有する（図３および４参照）。環状の凹部２９は、駆動装置３へのロータ１０の磁気結合部の一部である磁気リング３０を収容するように構成されている（図１参照）。磁気リング３０は、連結ディスク１３に結合したディスクカバー３１により、かつ凹部２９を密閉することで所定の位置に保持されている。連結ディスク１３は、ディスクカバー３１における中央開口部を通るシーリングワッシャ３４の軸ピン３３を収容する中央凹部３２をさらに有する。シーリングワッシャ３４は、ケーシング４に結合および固定されて、動作容積９を限定および密閉する。この構造により、無菌式閉鎖型システムが保証される。シーリングワッシャ３４の軸ピン３３およびケーシング４の軸受凹部１５は、一緒になってロータ１０の両端にピボット軸受を形成する。したがって、本実施例において、破砕装置２は、ケーシング４、ロータ１０およびシーリングワッシャ３４が、ロータ１０を駆動させるための適切な結合をもたらすための磁気リング３０およびディスクカバー３１と任意で一体化されることで形成される。
【００７５】
シーリングワッシャ３４の外側、すなわち動作容積９の反対側において、破砕装置２は駆動装置３に接続している。具体的には、ケーシング４は、例えば電気モータにより形成された駆動部３６を収納した駆動部ケーシング３５に固定されている。駆動部３６の駆動シャフト３７は、軸方向においてロータ１０の磁気リング３０の反対に配置された第二の磁気リング３８に固定されている。磁気リング３０、３８は、例えばシーリングワッシャ３４およびディスクカバー３１を横切って磁気結合を生み出すように構成されており、ここで磁気結合によって、駆動部３６により付加されたトルクがロータ１０に伝達される。処理済の組織の液体成分が駆動部ケーシング３５内に入ることを回避するために、さらなるシールリング３９が、シーリングワッシャ３４と駆動部ケーシング３５との間に配置されている。破砕装置２とは反対に向けられた駆動部ケーシング３５の背面は、駆動部ケーシング３５に結合した端部キャップ４０により閉じられている。
【００７６】
上記の破砕装置２は、外すことが可能な固定手段４１、例えばねじにより駆動装置３に取り外し式に結合した破砕カートリッジを効果的に形成する。
【００７７】
図６では、回転軸１８に対する入口７および出口６の配置が明らかとなる。具体的には、導入された組織がロータ１０の第一列２０のブレードに接線方向の経路で導かれるように、入口５を部分的な接線方向の配置で設け、すなわち、ケーシング４および回転軸１８の中心からずらして設ける。他方で、出口は、ケーシング４の動作容積９に対して中央に位置しており、回転軸１８から外側に向かって放射状に延在している。この配置は、回転が最終列２８のブレードによりもたらされるため、処理済の組織および細胞に作用する遠心力を利用するのに最も能率的である。
【００７８】
図７は、ケーシング４の動作容積９内に収容されたロータ１０と一体化したケーシング４を示す。この図から明らかであるように、ロータ１０におけるすべての列のブレードの外縁は、組織とブレードとの接触が回避される経路が存在しないように動作容積９の範囲を定めるケーシング４の内壁と実質的に同一平面上にある。最終ブレード列２８の位置および幅は、出口６の開口部が基本的に最終ブレード列２８のブレードにより拭われるように、出口６の位置および幅に適合している。
【００７９】
上記の好ましい実施形態は、限定するものではない。当業者であれば、上記の説明から、ブレードが、異なる形状および配置、例えば、実質的に一定の断面または放射方向に対して曲がった配置を有し得ること、並びに軸方向に対して平行な配置、垂直な配置および／または傾斜した配置を有する様々な数および列のブレードが使用可能であることが容易に想定されるだろう。
【００８０】
図２１は、脂肪吸引用途のためのセット４２を示す。セット４２は、破砕装置２（部分的に示すのみ）およびカニューレ４３を備える。カニューレ４３は、チューブ４４により破砕装置２の入口５に接続されている。チューブ４４は、ローラーポンプまたはペリスタルティックポンプ（図示せず）を収容している。カニューレ４３は、脂肪吸引における使用のための針４５と一緒に図示されている。
【００８１】
先に論じた元々の変形例（変形例０、「本発明」とも称されるが、本発明はこの変形例に限定されることはない）の４つのさらなる変形例について、試験を実施して以下で論じる：本発明の変形例１は、元々の変形例よりも、シャフト直径が長く、かつブレードが短い：シャフト２１の直径は、約１３ｍｍ（第一の実施形態に比べて、ロータのキャスティングが単純になる）であり、放射方向にシャフト２１から測定した第二群２６のブレードおよび最終ブレード列２８の長さは、約３ｍｍであるため、この領域におけるロータの合計直径は、約１９ｍｍである。変形例２は、変形例１と同じ仕様を有するが、その他の各ブレード列は、ロータの回転軸の周囲を４５度シフトしている。変形例３は、元々の変形例よりもシャフト直径が長く、かつ元々の変形例とブレード長が同じである：シャフト２１の直径は、約１３ｍｍであり、ブレードはすべて、長さが類似しており、放射方向にシャフト２１から測定して約６ｍｍであるため、ロータの合計直径は、長さ全体にわたりおよそ一定であり、約２５ｍｍになる。変形例４は、変形例３と仕様が同じであるが、その他の各ブレード列は、ロータの回転軸の周囲を４５度シフトしている。元々の変形例の死容積は、約７１ｍｌであり、変形例１および２の死容積は、約５５ｍｌ（シャフトが占める容積がより大きいことに起因）であり、変形例３および４の死容積は、約１３６ｍｌ（ケーシング内の動作容積がより大きいことに起因）である。
【００８２】
概論
本方法および装置の性能を評価するために、比較研究を実施して、本発明の装置を使用して本方法によって得られた細胞と、従来技術による方法および装置を使用して得られた細胞とを、品質について比較した。以下でより詳細に説明される工程は、比較研究を説明するため、および示された結果を理解するために記載されている。これらの工程は、本発明の方法に限定するものではない。実践で使用可能な細胞を得るには、本発明による破砕装置から取り出された処理済の組織を遠心分離すれば十分である。
【００８３】
ヒトの脂肪組織の収集は、患者の同意のもと、現地の倫理委員会により承認された。外来患者用の決められた脂肪吸引手順においてＴＬＡ麻酔を用いて、皮下脂肪組織を得た。１００ｍｌの脂肪組織に引き続き、１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ；Ｌｏｎｚａ、オーストリア）を、図１〜７に関連して記載した破砕装置２を単独で使用することで輸送した。均質な脂肪組織と、分離した細胞と、ＰＢＳとの懸濁液を破砕装置２の出口６から抜き取り、無菌容器中に回収した。
【００８４】
細胞単離の間に、全プロセスを無菌の作業台において実施した。本方法を使用して得られた均質化された脂肪組織を無菌の５０ｍｌの管に移した。１２００ｇで７分にわたり遠心分離した後に、蒸留水に入れた１００ｍｌの赤血球溶解緩衝液（１５４ｍＭの塩化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、オーストリア）、１０ｍＭの重炭酸カリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、オーストリア））を用いて、３７℃で５分にわたり細胞ペレットを定温培養して、赤血球を除去した。５００ｇで５分にわたり遠心分離した後に、上澄液を吸引した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、１００μｍのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、オーストリア）に通して濾過した。５分にわたる３００ｇでの別の遠心分離工程の後に、上澄液を除去し、さらなる分析のために、単離した細胞を、内皮細胞成長培地（ＥＧＭ−２；Ｌｏｎｚａ）中において、３７℃、５％のＣＯ２および９５％の気湿で培養するか、またはＥＧＭ−２中において再懸濁した。
【００８５】
比較のために、米国特許出願公開第２０１４／００１７７８３号明細書（ＵＳ２０１４／００１７７８３Ａ１）からの、振とう法を使用した非酵素的細胞単離を修正した（Ｇｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等、Ｎｏｎ−Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０１４、米国特許出願公開第２０１４００１７７８３号明細書（ＵＳ２０１４００１７７８３Ａ１）、Ｓｈａｈ，Ｆ．Ｓ．等、Ａ  ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（８）：９７９〜８５頁）。１００ｍｌの脂肪吸引材料を２５０ｍｌの瓶に移し、手動で瓶を振とうすることで５０ｍｌのＰＢＳにより全体的に洗浄した。このプロセスを、各回５０ｍｌのＰＢＳで３回繰り返した。その後、処理済の吸引脂肪およびＰＢＳを５０ｍｌの管に移し、本発明による方法を使用して得られた均質化された脂肪組織について先に記載したように処理した。
【００８６】
さらに、切断法を使用した非酵素的細胞単離を比較のために実施した。脂肪注入法（Ｃａｐｕｒｒｏ，Ｓ．、Ａｄｉｐｏｆｉｌｌｉｎｇ、２００７；ｗｗｗ．ａｄｉｐｏｆｉｌｌｉｎｇ．ｃｏｍに掲載）に基づき、１００ｍｌの脂肪吸引材料をビーカーに移し、手動ブレンダーを用いて２分にわたり切断した。その後、手動ブレンダーを５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、このＰＢＳを同じビーカー内に回収した。処理済の吸引脂肪を５０ｍｌの管に移し、本発明による方法を使用して得られた均質化された脂肪組織について先に記載したように処理した。
【００８７】
細胞の酵素的単離を、Ｗｏｌｂａｎｋ等を修正して実施した（Ｗｏｌｂａｎｋ，Ｓ．等、Ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、２００７、１３（６）：１１７３〜８３頁）。手短に言えば、１００ｍｌの脂肪吸引材料を同体積のＰＢＳで洗浄し、血液およびチューメセント液を除去した。その後、組織を、０．２Ｕ／ｍｌの濃度で１００ｍｌのコラゲナーゼＮＢ４（Ｓｅｒｖａ、オーストリア）により消化させ、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋および２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ０−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳに、３７℃で１時間にわたり適度に振とう（１８０ｒｐｍ）させながら溶解させた。消化された組織を５０ｍｌの管に移し、本発明による方法を使用して得られた均質化された脂肪組織について先に記載したように処理した。
【００８８】
膨張培地（ＥＧＭ−２）中のプラスチック表面に細胞を播種した後に、ＡＳＣを含む接着細胞画分は、接着単一層として成長することができ、培養されてサブコンフルエント状態になり、それから継代させる。３〜４日毎に培地を変えた。継代培養のために、ＥＧＭ−２培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１×トリプシン／ＥＤＴＡを用いて３７℃で定温培養した。２〜５分にわたり培養フラスコを穏やかにタッピングした後に、細胞を剥がし、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＰＡＡ、オーストリア）を有する培地を添加することでトリプシンの活性を停止させた。解離された細胞を管内に回収して遠心分離した。その後、ペレットをＥＧＭ−２培地中に再懸濁し、細胞をトリパンブルー排除により細胞計数装置（ＴＣ−２０、Ｂｉｏｒａｄ、オーストリア）内で定量化した。継代０から得られた接着細胞をＡＴＰ、フローサイトメトリー分析および分化能のために使用する一方で、単離したばかりの細胞をその他の実験すべてに使用した。
【００８９】
図８〜２０について
アクリジンオレンジ／ＤＡＰＩ蛍光染色を使用して、細胞数および生存率を求め、統合型蛍光顕微鏡を用いて細胞計数装置（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−２００（商標）、Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、デンマーク）内で定量化した。不均一な細胞組成物は、細胞外マトリックスストランド上に残留する凝集細胞からも成るため、「Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｓｓａｙ」の手順を選択した。各試料をＶｉａ１−Ｃａｓｓｅｔｔｅ（商標）に移し、アクリジンオレンジおよびＤＡＰＩで被覆し、２つの測定を実施した：一方では、細胞溶解溶液を用いて試料中のすべての細胞核を染色し、もう一方では、溶解溶液を用いることなく非生存細胞のみを染色した。
【００９０】
規定の細胞数（４個、２０個、１００個、５００個、２５００個、１２５００個）を、６ウェルプレートの各ウェル内に播種し、ＥＧＭ−２中において１４日にわたり培養し、ここで７日目に、培地を１回変えた。培養１４日後、単一の細胞によりコロニーが形成された。細胞を４％のホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで染色した。その後、細胞を水道水で洗浄し、エオシン溶液で染色した。（５００個の細胞を播種したウェル内において）目視可能なコロニーを形成した細胞のパーセンテージを計算し、播種された細胞の合計と比較した。
【００９１】
細胞内／細胞外ＡＴＰの量は、細胞のエネルギー生成の指標となる。細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を求めるために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、オーストリア）を使用し、メーカーの指示書に従って実施した。黒色の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、オーストリア）内で、１００μｌのＥＧＭ−２培地中において、ウェル１個あたり１×１０４個の細胞密度で細胞を播種した。２時間後に、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェルに添加し、プレートを撹拌機内で２分にわたり穏やかに撹拌した。その後、プレートを１０分にわたり暗所で定温培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬は細胞溶解緩衝液を含むため、細胞内ＡＴＰと細胞外ＡＴＰとの組み合わせを測定することができる。ルミノメーター（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて、２０００ミリ秒の暴露時間で発光シグナルを検出し、この発光シグナルはＡＴＰ標準曲線と相関関係にあった。
【００９２】
集団倍加レベル（ＰＤＬ）を求めることで増殖能を分析した。単離したばかりの細胞を、Ｔ−２５培養フラスコ１個あたり５×１０５個の細胞密度で播種し、ＥＧＭ−２培地中において培養した。３〜４日毎に培地を変えた。細胞がサブコンフルエント状態に達したら、細胞を継代させ、上記のように細胞数を求めた。ＰＤＬのさらなる分析のために、ＡＳＣをＴ−２５培養フラスコ内において５×１０４個の密度で播種し、継代数３になるまで培養した。各継代後に、細胞数を求めた。
【００９３】
単離したばかりの細胞および培養６日目に得られた接着細胞について、以下の抗体、ＣＤ７３−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストリア）、ＣＤ９０−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１０５−Ｖ４５０Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＢＤ、オーストリア）、ＣＤ４５−Ｖ５００Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＢＤ）、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３４−ＡＰＣ（ＢＤ）およびＣＤ１４６−ＰｅｒＣＰ（Ｒ＆Ｄ、オーストリア）、ならびにＣＤ４５と、ＣＤ３１と、ＣＤ３４と、ＣＤ１４６との組み合わせを使用して、以下の特定の部分母集団、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）、周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）および外膜上のＡＳＣ（ＳＡ−ＡＳＣ）（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）を分析することで特徴付けした。
【００９４】
染色のために、１％のＦＣＳを有する５０μＬのＰＢＳ中で、２．５×１０５個の細胞を、一次標識の抗体５μｌにより暗所において室温で１５分にわたり定温培養した。細胞を１．５ｍｌの細胞洗浄液（ＢＤ）で洗浄し、４００ｇで５分にわたり遠心分離した。上澄液を廃棄して、細胞ペレットを３００μＬの１×細胞固定液（ＢＤ；蒸留水で１：１０に希釈）中に再懸濁した。ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ）での分析まで、試料を暗所において４℃で貯蔵した。マーカー陽性細胞のパーセンテージを、非特異性のアイソタイプ対照物と比較して求めた。
【００９５】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を定量化するために、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ、オーストリア）を使用して細胞の上澄液を分析した。非酵素的（本発明を使用して得られる）および酵素的（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）に単離したばかりの細胞を、９６ウェルプレート内で２００μｌのＥＧＭ−２において２×１０４個の密度で播種し、２４時間にわたり定温培養した。１００μｌのＥＧＭ−２および１００μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に播種した酵素的に単離した細胞を、１００％の死細胞用の対照物として使用した。２４時間の定温培養後に、１００μｌの各上澄液を新たなウェルに移し、１００μｌの反応混合物を０．５時間にわたり添加した。ルミノメーター（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて、４９０ｎｍで吸光度を測定し、６５０ｎｍでの参照値を引いた後に、これを、細胞を溶解する陽性対照物であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して標準化した。
【００９６】
骨形成分化のために、２４ウェルプレート内で、ＥＧＭ−２培地においてウェル１個あたり２×１０３個の細胞密度で細胞を播種し、一晩かけて定温培養した。翌日、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、１０ｎＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１５０μｍのアスコルベート−２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）および１０ｎＭのジヒドロキシ−ビタミンＤ３（Ｓｉｇｍａ）を含有する骨形成分化培地であるＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｏｎｚａ）に培地を変えるか、または１０％のＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）から成る対照培地に培地を変えた。３〜４日毎に培地を変えた。
【００９７】
２１日後、骨形成分化をアリザリンレッドでの染色および定量化で分析し、同様に、細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を求めた。
【００９８】
石灰化構造をアリザリンレッドで染色するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃の７０％エタノールで１時間にわたり固定した。固定した細胞を蒸留水で濯いだ後に、細胞を４０ｍＭのアリザリンレッド溶液（ｐＨ４．２；Ｍｅｒｃｋ、オーストリア）で１５分にわたり染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、光学顕微鏡で代表的な画像を撮影した。アリザリンレッドでの染色を定量分析するために、上澄液を廃棄して、細胞を５００μｌの２０％メタノールおよび１０％の酢酸（蒸留水中に希釈）で１５分にわたり定温培養した。再懸濁後に、細胞とメタノール／酢酸との混合物を透明な９６ウェルプレートに移した（ウェル１個あたり１００μｌ）。ルミノメーターを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９９】
骨形成分化を分析するための第二の方法は、骨芽細胞細胞の表面に位置する細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を検出することであり、これは、骨成熟、無機化および骨代謝回転の生化学的な指標であると示された。まず骨形成培地を廃棄し、１時間にわたり−２０℃で１００μｌのＰＢＳを用いて、細胞を定温培養した。その後、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有する１００μｌのＰＢＳを添加することで、１時間にわたり細胞を溶解させた。ＡＬＰ活性を定量的に検出するために、１００μｌの基質溶液（４−ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに添加し、暗所で１時間にわたり定温培養した。最後に、溶液を透明な９６ウェルプレートに移し（ウェル１個あたり１００μｌ）、ルミノメーター内で、６２０ｎｍの参照波長と併せて、４０５ｎｍで吸光度を測定した。停止液（ＰＢＳ中で１：２０に希釈した０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中に希釈した公知のｐ−ニトロフェノール濃度で標準曲線を描き、相応する吸収率を測定することで、試料のＡＬＰ活性を計算することができる。
【０１００】
脂肪生成分化のために、２４ウェルプレート内で、ＥＧＭ−２培地においてウェル１個あたり１．４×１０４個の細胞密度で細胞を播種し、一晩かけて定温培養した。翌日、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１μｍのデキサメタゾン、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）および１００μｍのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する脂肪生成分化培地であるＤＭＥＭ−高グルコース（Ｌｏｎｚａ）に培地を変えるか、または１０％のＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｌ−グルタミンから成る対照培地に培地を変えた。３〜４日毎に培地を変えた。
【０１０１】
２１日後、脂肪生成分化をオイルレッドＯでの染色および定量化により分析した。０．３ｇのオイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）を１００ｍｌのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）中に５０〜６０℃で溶解させることにより、オイルレッドＯ原液を調製した。使用液については、濾過した原液を蒸留水中に３：２で希釈した。３０分後に、使用液を利用直前にもう一度濾過した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のホルムアルデヒドで１時間にわたり固定した。蒸留水で洗浄した後に、細胞を７０％のエタノールで２分にわたり濯ぎ、オイルレッドＯ使用液で５〜１５分にわたり染色した。その後、細胞を蒸留水で洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液で１〜３分にわたり対比染色した。最後に、細胞を水道水で洗浄し、光学顕微鏡で評価した。オイルレッドＯでの染色を定量的に検出するために、上澄液を廃棄し、５００μｌのイソプロパノールを各ウェルに添加した。再懸濁後に、細胞とイソプロパノールとの混合物を透明な９６ウェルプレートに移した（ウェル１個あたり１００μｌ）。ルミノメーターを用いて５１０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０２】
軟骨細胞分化および３Ｄマイクロマスペレット培養のために、スクリューキャップ式微小管内で、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−６（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３（Ｌｏｎｚａ）を含有する軟骨形成分化培地（ｈＭＳＣ  Ｃｈｏｎｄｒｏ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ））において、３×１０５個のＡＳＣを遠心分離した。これらの管を、３７℃、５％のＣＯ２および湿度９５％で、ガス交換のために蓋を僅かに開けた状態で、インキュベーター内に置いた。２日後、新品の培地を用いて、ペレットを９６ウェルＵ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。２〜３日毎に培地を変えた。３５日にわたり軟骨形成分化培地中で定温培養した３Ｄマイクロマスペレット培養株について、その断面積を１週間に１回測定した。分化３５日後に、組織学的分析のために、マイクロマスペレットを一晩かけて４％のホスフェート緩衝ホルマリン中で固定した。翌日、ペレットを１×ＰＢＳ中で洗浄し、脱水させてアルコール濃度を上げた。ペレットをキシレン中で濯ぎ、パラフィンを浸潤させた後に、脱パラフィンした部分をアルシアンブルーで３０分にわたり染色し、マイヤーヘマトキシリンで２分にわたり対比染色した。ＩＩ型コラーゲンでの染色のために、ペプシンを用いて部分を３７℃で１０分にわたり処理した（ＡＰ−９００７  ＲＴＵ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オーストリア）。新たに調製した３％のＨ２Ｏ２を用いて、内在性ペルオキシダーゼを室温で１０分にわたりクエンチし、引き続き、正常ウマ血清２．５％（Ｖｅｃｔｏｒ  ＲＴＵ）を加えて、非特異的結合を阻害した。モノクローナル抗ＩＩ型コラーゲン（ＭＳ−３０６  Ｐ０  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１００で用いて、部分を１時間にわたり定温培養した。ＴＢＳで洗浄した後に、二次抗体（抗マウスＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ標識ポリマー、Ｄａｋｏ、オーストリア）を用いて、部分を３０分にわたり定温培養し、ＴＢＳ中で再び濯いだ。６分にわたりＮｏｖａ  Ｒｅｄ（ＳＫ４８００  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、オーストリア）を使用して、結合を可視化した。マイヤーヘマトキシリンを用いて、対比染色を２分にわたり実施した。
【０１０３】
脂肪組織由来の細胞の血管新生能を求めるために、Ｈｏｌｎｔｈｏｎｅｒ等（上記のＨｏｌｎｔｈｏｎｅｒ，Ｗ．等２０１５）に従ってフィブリンクロット培養を実施し、クロット形成のために、４×１０５個の細胞をフィブリノゲン（Ｂａｘｔｅｒ、オーストリア；２．５ｍｇ／ｍｌ）およびトロンビン（Ｂａｘｔｅｒ、０．２Ｕ／ｍｌ）と混合し、１２ウェルプレート内のカバーガラスにピペットで滴下した。クロットを３７℃で３０分にわたり重合させ、２週間にわたり、アプロチニンを含有するＥＧＭ−２（Ｂａｘｔｅｒ、１００ＫＩＵ／ｍｌ）中において培養した。３〜４日毎に培地を変えた。培養後に、クロットを４％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−共役モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＰＢＳ／１％のＢＳＡ中で１：５０に希釈）で暗所において１２時間にわたり定温培養した。クロットを再びＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
【０１０４】
平均的な±の標準偏差としてデータを示し、ＰＲＩＳＭ６（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、アメリカ合衆国）、一元配置分散分析後のテューキーの事後検定を使用して、統計分析を実施した。二元配置分散分析後のテューキーの事後検定を使用して、ペレットサイズの統計分析を実施した。対応のないｔ検定を使用して、フローサイトメトリーおよびＣＦＵ−Ｆアッセイ統計分析を実施した。Ｐ値が０．０５未満である場合、有意であると判断した。
【０１０５】
単離したばかりの細胞の細胞収率は、すべての非酵素的単離法に比べて、１００ｍｌの吸引脂肪によって得られた４．８±３．１×１０７個の細胞を用いた酵素的単離の後に著しく高かった（図８）。本発明による方法により、細胞収率が７．４±２．６×１０６個の細胞が得られた一方で、振とう法および切断法によっては、細胞数がより少なく、それぞれ１．２±０．６×１０６個および２．１±１．２×１０６個であった。しかしながら、単離したばかりの細胞の細胞生存率は、適用したすべての酵素的単離法および非酵素的単離法において類似しており、全細胞数に比べて、６８．８±１１．０％（切断）、７５．４±７．６％（振とう）、７８．０±４．２％（コラゲナーゼ）から７９．０±７．５％（本発明）の生存細胞に達した（図９）。
【０１０６】
酵素的単離および本発明によって得られた単離したばかりの細胞を、濃度を上昇させながら（４個、２０個、１００個、５００個、２５００個、１２５００個の細胞／ウェル）、６ウェルプレート内に播種し、増殖培地中において培養した。２週間後、細胞のコロニー形成能について、細胞をヘマトキシリン／エオシンで染色し（図１０ａ）、播種した細胞の合計に対するコロニーを形成した細胞のパーセンテージを計算することで分析した。定量分析により、本発明によって単離した細胞についての発生頻度１．８±０．５２％が、酵素的単離法によって得られた細胞についての発生頻度１．３±０．４３％と比較された形で明らかとなった（図１０ｂ）。
【０１０７】
ＡＴＰ生成は細胞のエネルギー生成の指標であるため、接着細胞画分の細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を分析した。興味深いことに、ＡＴＰ濃度について、本発明（１７８０±３６０ｎｍｏｌ／Ｌ）を使用して得られた細胞は、非酵素的単離法、すなわち振とう（１２３７±３５ｎｍｏｌ／Ｌ）および切断（１１１４±６９ｎｍｏｌ／Ｌ）、ならびに酵素的単離法（８５２±２９８ｎｍｏｌ／Ｌ）に比べて、著しく高かった（図１１）。
【０１０８】
すべての細胞単離法によって得られた単離した細胞は、７日目に特徴的なＡＳＣスピンドル状細胞形態を示した（図１２ａ）。
【０１０９】
集団倍加レベル（ＰＤＬ）を計算することで、単離した細胞の増殖能を３週間（７日目、１４日目、２１日目）にわたり分析した（図１２ｂ）。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、類似したＰＤＬを示した。
【０１１０】
脂肪組織由来の細胞の細胞構成に対する様々な単離法の影響を特定するために、本発明による方法および酵素的単離によって得られた単離したばかりの接着細胞画分の免疫表現型をフローサイトメトリー分析により調査した。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（４７．７±３．１％対４６．２±１９．９％）、ＣＤ９０（７０．６±７．８％対７６．０±５．９％）およびＣＤ１０５（３４．５±１９．３％対３２．２±２４．３％）において差が存在しなかった（図１３ａ、１３ｂおよび１３ｃ）一方で、特定の部分母集団を分析すると、ＥＰＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（１５．６±１２．１％対２０．７±１．７％）および周皮細胞部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）（１３．１±１１．１％対２４．８±２．９％）では、本発明を使用した場合、酵素的単離に比べて減少が少し示された（図１３ｄおよび１３ｅ）。それとは対照的に、本発明の方法および装置は、酵素的単離に比べて、ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）の数を増加させた（５２．３±４．３％対２８．９±２．４％）（図１３ｆ）。
【０１１１】
接着細胞免疫表現型に関して、間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（８８．４±１１．８％対９２．４±１３．９％）、ＣＤ９０（９４．２±９．３％対８９．４±１０．３％）、ＣＤ１０５（８９．４±１２．３％対８８．９±２０．０％）および内皮細胞マーカー／周皮細胞マーカーＣＤ１４６（１０．５±１３．１％対９．５±１．３％）においては、本発明によって得られた細胞と、酵素的単離によって得られた細胞との間には、ほとんど差が存在しなかった。それとは対照的に、本発明によって得られた細胞は、造血細胞マーカーＣＤ４５（５．７±６．０％対１．２±１．２％）、内皮細胞マーカーＣＤ３１（１１．８±１２．１％対５．６±５．８％）およびＣＤ３４（８．５±９．９％対３．９±４．１％）において上昇を示した（図１４ａ）。これに対応して、本発明の方法および装置は、内皮細胞系列を促進すると思われる。なぜなら、酵素的単離に比べて、培養６日後に、ＥＰＣ部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（２２．８±７．３％対０．３±０．１％）において明らかな上昇があったからである（図１４ｂ）。周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）の数も本発明により増加し（２０．３±１４．１％対８．４±３．９％）（図１４ｃ）、ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）の数は、酵素的単離に比べて少なかったものの、６日後に依然として増加していた（１６．０±４．８％対２３．８±９．１％）（図１４ｄ）。
【０１１２】
細胞におけるＬＤＨ放出は、細胞毒性の指標であるため、本発明を用いた後に酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）および非酵素的単離法によって得られたＳＶＦ細胞を、１００％のＳＶＦ細胞が死んでいるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した対照物に対して標準化した。本発明によって単離した細胞は、コラゲナーゼで単離した細胞（３９．１±２．７％）および対照条件Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１００％）に比べて、著しく低いＬＤＨ放出（２６．６±０．７％）を示した（図１５）。
【０１１３】
本発明によって、非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって、および酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）によって得られた接着ＳＶＦについて、分化培地で誘導させることで、その骨形成分化能、脂肪生成分化能および軟骨形成分化能を調べた。
【０１１４】
骨形成培地による定温培養３週間後に、細胞について、その骨形成分化能を、アリザリンレッドで染色して、これによりマトリックスの無機化および石灰化が示されることで、かつ活性骨芽細胞中で発現する細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することで分析した。アリザリンレッドでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞および非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、無機化はあまり生じなかったが、本発明を使用した後には無機化が強く生じたことが証明された（図１６ａ）。
【０１１５】
これらの観察は、アリザリンレッドでの染色を定量分析することにより確認され、酵素的単離法（１．１±０．５）に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断（０．５±０．４）および振とう（１．５±０．９）に比べて、本発明（２．６±０．４）を使用して単離した細胞について、著しく高いアリザリンレッドの吸光度を示した（図１６ｂ）。アリザリンレッドでの染色と同様に、ＡＬＰ活性は、酵素的単離法（１４８±５９μｍｏｌ／Ｌ）によって単離した細胞に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とう（１４１±７０μｍｏｌ／Ｌ）および切断（１４２±１０８μｍｏｌ／Ｌ）によって単離した細胞に比べて、本発明を使用した後に単離した細胞の方が著しく高かった（図１７）。
【０１１６】
脂肪滴形成の指標となる単離した細胞の脂肪生成分化能を、脂肪生成分化培地による定温培養３週間後に、オイルレッドＯで染色することにより分析した。オイルレッドＯでの染色により、本発明を使用して単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、脂肪滴形成が強いことが証明された（図１８ａ）。染色を定量分析すると、酵素的単離法（０．４±０．２）に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断（０．４±０．２）および振とう（０．４±０．２）に比べてオイルレッドＯの吸光度（０．８±０．２）が著しく高いと示されることで、本発明を使用して単離した細胞の脂肪生成分化能がより強いと確認された（図１８ｂ）。
【０１１７】
軟骨形成分化能を分析するために、３Ｄマイクロマスペレットを形成し、軟骨形成分化培地中において５週間にわたり定温培養した。３Ｄマイクロマスペレットについて、その断面積を毎週調べ、５週間後に、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンで染色し、これはどちらも、軟骨細胞分化の指標になる。組織学的分析により、酵素的単離法、ならびに非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞について、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンでの染色が弱いか、または起こらないことが示された。しかしながら、本発明を使用して単離した細胞により形成された３Ｄマイクロマスペレットは、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンによる染色が濃いことを示す（図１９ａ）。さらに、本発明によって得られた細胞は、ペレットサイズがその他すべての単離法に比べて明らかに大きくなっていたため、３Ｄマイクロマスペレットより速い成長を示したが、その上昇は、統計的有意性には達しなかった（図１９ｂ）。
【０１１８】
単離したばかりの細胞について、３Ｄフィブリンマトリックスにおいて、その血管新生能を調べた。フィブリンクロットの分解を防止するアプロチニンを含む膨張培地中での定温培養２週間後に、ゲルを内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。染色により、酵素的単離および本発明によって得られた細胞で、インビトロな脈管形成を示す管状形態が発達することが証明された（図２０）。
【０１１９】
細胞を脂肪組織から単離するために、高コストを伴うコラゲナーゼのような酵素を使用すると、規制局と問題を起こすことがあり（下記参照：ＥｕｄｒａＬｅｘ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、２０１０、第１０巻；Ａａｒｙａ  Ｈａｒｉ，  Ｓ．Ｇ．、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｒａｄｅ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、０３（０５）：２１５７〜７６３３頁；Ｓｅｎｓｅｂｅ，Ｌ．、Ｂｅｙｏｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（１１）：１３０７〜８頁；ＥｕｄｒａＬｅｘ、Ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）、２０１５、第４巻）、細胞の効率に影響を与え得る（Ｂｕｓｓｅｒ，Ｈ．等、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ、２０１４；Ｓｅａｍａｎ，Ｓ．Ａ．等、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  ａｎｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆａｔ  Ｇｒａｆｔｓ、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ、２０１５、１３６（２）：１８９ｅ〜１９９ｅ頁）。あるいは酵素を回避するために、物理的な力を使用した単離システムを利用することができる。これらのシステムは、酵素による消化を含まないが、機械的な力により細胞を処理済の脂肪組織から取り出す。
【０１２０】
本発明により、再生医療における再構築、修復および置換用の治療用細胞を増幅させた脂肪組織を均質化するための新たな閉鎖型の非酵素的方法が提示される。制御可能なポンプシステムを用いて、回収した脂肪組織をオンラインで専用のブレード／パドルに移し、均質化し、その後、分離および直接使用または凍結保存用の容器内に回収した。本発明の方法および装置によって得られた細胞の分析により、細胞の特性および機能性が改善されていることが証明された。
【０１２１】
本発明の非酵素的方法により、治療用細胞を増幅させた脂肪組織がもたらされることが示される。これらの細胞は、標準的な酵素的単離法（コラゲナーゼ）および非酵素的単離法（上記のＳｈａｈ，Ｆ．Ｓ．等２０１３および上記のＧｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等２０１４を修正した振とう、ならびに上記のＣａｐｕｒｒｏ，Ｓ．２００７を修正した切断法）に比べて、より高い細胞内外ＡＴＰ濃度を示し、脂肪生成系列、骨形成系列および軟骨形成系列へとより能率的に分化する。本発明による非酵素的単離は、細胞収率が、非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断よりも３〜５倍高いものの、得られた細胞収率は、酵素的単離法に比べて著しく低かった。より劣った細胞収率のような欠点を克服して、多い細胞数が必要とされ得る医療用途に用いるために、より多くの組織材料が使用され得る。というのも、脂肪組織は豊富に入手可能であり、本発明の方法および装置は、毎分の処理速度が吸引脂肪１００ｍｌまでと高いからである。振とう法により、１００ｍｌの脂肪組織あたり２．５×１０６個の細胞を単離し、これは、公表されている振とう法（上記のＧｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等２０１４）に一致する。その他の群では、「試料」の脂肪組織あたり１．８×１０１２個の間質細胞という非常に高い細胞収率が報告されている（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｓ．、Ｎｏｎ−Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｆａｔ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏ−Ａｓｐｉｒａｔｅ、２０１３、米国特許出願公開第２０１３００３４５２４号明細書（ＵＳ２０１３００３４５２４Ａ１））が、残念なことに、その方法も、その試料のサイズも、得られた細胞集団の同一性もはっきりとは規定されていない。同様に、はっきりとは同一性が規定されていない状態で、脂肪組織１グラムあたり約２００万〜１０００万個の細胞が観察された（Ｂｒｉｇｈｔ，Ｒ．等、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ、２０１４、国際公開第２０１４００００３１号（ＷＯ２０１４００００３１Ａ１））。得られた細胞の細胞同一性は、その治療上の可能性から非常に重要である。異なる作業群により使用される細胞の定量化法は、異なるか、または明白ではない。細胞数に与えられ得る影響には、ＳＶＦにおける赤血球数があるが、ＳＶＦを治療用細胞であると考えることはできない。ほぼすべての非酵素的単離法において、多くの細胞計数装置により生細胞（およそ４μｍの細胞サイズを有する）として認識される赤血球を除去する赤血球溶解工程は使用されない。本発明を使用した後に分析した細胞収率は、標準的な酵素的単離の間に通常適用される赤血球溶解後の細胞を表す。標準的な酵素的単離手順との適切な比較のためにこの工程を含めた。残念なことに、先に言及したシステムのほとんどにおいて、標準的な酵素的単離法との比較は記載されていない。使用された非酵素的単離法の細胞収率は、０．２Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼを使用した酵素的単離より１０倍低い。しかしながら、本発明によって単離した細胞は、酵素的に単離した細胞に比べて、類似した増殖能および類似またはさらにより高いコロニー形成能を示す。間質前駆細胞の発生頻度は、細胞の１％超を上回ると期待されている（Ｂｏｕｒｉｎ，Ｐ．等、Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＦＡＴＳ）  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（６）：６４１〜８頁）。しかしながら、本発明は、酵素的に単離した細胞に比べてＬＤＨ放出が１３％削減された細胞をもたらし、これは、単離物の細胞毒性がより低いことを示す。生存細胞が７０％超である場合、酵素的単離のみならず、本発明による単離によっても、期待される生存率範囲（ＩＦＡＴＳのガイドラインに準拠）にある細胞がもたらされる（上記のＢｏｕｒｉｎ，Ｐ．等２０１３）。
【０１２２】
興味深いことに、本発明の方法および装置により、潜在的な治療効果を有するより多くの数および種類の特定の細胞集団、例えば、内皮前駆細胞、周皮細胞状の細胞およびＳＡ−ＡＳＣがもたらされ、これらは、別々の細胞治療に適しているものとする。単離したばかりの細胞におけるＥＰＣおよび周皮細胞状の細胞数は、本願で提示した方法を適用した後には、酵素的単離に比べて僅かに減少しているが、本発明の装置は、培養６日後に類似した量で依然として存在していたこれらの部分母集団を保護すると思われる。本発明により内皮細胞系列が促進される。というのも、酵素的単離に比べて、ＥＰＣ部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）において２０３％の明らかな上昇があったからである。周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）の数も、培養６日後に本発明の方法により依然として影響を受け、酵素的単離に比べて１２％上昇していた。Ｌｉｐｏｇｅｍｓクラスターが成長して得られる膨張細胞により多くの数の周皮細胞状マーカー（ＣＤ１４６＋）および血管内皮細胞細胞（ＣＤ３１＋；ＣＤ３４＋）を発現させる非酵素的単離装置Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を用いることで、Ｂｉａｎｃｈｉ等は、類似した発見も示した（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｆ．等、Ａ  ｎｅｗ  ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｔｏ  ｏｂｔａｉｎ  ａ  ｆａｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｐｅｒｉｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｍｉｌｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１３、２２（１１）：２０６３〜７７頁）。Ｂｉａｎｃｈｉ等に比べて、本発明によって単離した細胞は、培養６日後に、なおもより多い数の内皮細胞細胞および周皮細胞状の細胞を示した。Ｚｉｍｍｅｒｌｉｎ等（Ｚｉｍｍｅｒｌｉｎ，Ｌ．等、Ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｐｒａｙ、  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（１）：１０２〜８頁）は、Ｌｉｐｉｖａｇｅ（商標）によって、我々の方法で得られるよりも、ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ１４−／ＣＤ３３−／ＣＤ４５−／グリコホリン−Ａ−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）の量が多いことを明らかにしたが、内皮前駆（ＣＤ１４−／ＣＤ３３−／ＣＤ４５−／グリコホリン−Ａ−／ＣＤ３４＋／ＣＤ３１＋）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ１４−／ＣＤ３３−／ＣＤ４５−／グリコホリン−Ａ−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）は、我々の方法に比べて少なかった。Ｇｉｍｂｌｅ等は、単離した細胞集団において彼らの非酵素的方法（上記のＧｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等２０１４）により、細胞を発現させる、より低水準のＣＤ３４（内皮細胞）およびＣＤ４５（造血）、ならびにより高水準のＣＤ４４（間葉）を単離した。Ｊａｍｅｓ等は、周皮細胞（ＣＤ４５−、ＣＤ１４６＋、ＣＤ３４−）および外膜細胞（ＣＤ４５−、ＣＤ１４６−、ＣＤ３４＋）が、インビボで強い骨形成能を有することを示すことができた（上記のＪａｍｅｓ  Ａ．Ｗ．等２０１２）。本発明によ��、多数の内皮細胞細胞を含有する微小組織でさえも、アリザリンレッドおよびアルカリホスファターゼで分析した骨形成分化能においてかなりの上昇を示すことを提示できた。それに加えて、これらの細胞は、強い脂肪生成（オイルレッドＯ）および軟骨形成（アルシアンブルー、ＩＩ型コラーゲン）の分化能をさらに有し、新血管新生の前提条件である管状形態を発達させることができる。これは、部分母集団が存在し、そのすべてが中胚葉系列への分化を経る能力を有していることを意味する。疑問なのは、多量の特定の集団が重要であるのか、またはより多くの部分母集団が相互作用するのか、ということである。とは言うものの、本方法および装置を適用することで、ＡＴＰ代謝回転の高い治療用細胞がもたらされる。
【０１２３】
酵素による消化またはさらなる組織の処理を必要とすることなく、本発明の方法および装置は、処理速度が非常に速い安全な方法を提示し、それにより、短時間で単純な単離が行われる。このシステムにより、自己臨床応用のために規定された特性を有する治療用細胞を増幅させた均質化した脂肪組織がもたらされる。
【０１２４】
図２２〜３４について
ＤＡＰＩ蛍光染色を使用して、細胞数および生存率を求め、統合型蛍光顕微鏡を備える細胞計数装置（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−２００（商標）、Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、デンマーク）内で定量化した。また、不均一な細胞組成物は、残留した細胞外マトリックスストランド上の凝集細胞から成るため、「Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  −  Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｓｓａｙ」手順を選択した。各試料を、Ｖｉａ１−Ｃａｓｓｅｔｔｅ（商標）内に移し、ＤＡＰＩで被覆し、２つの測定を実施した：一方では、細胞溶解溶液を用いて試料中のすべての細胞核を染色し、もう一方では、溶解溶液を用いることなく非生存細胞のみを染色した。
【０１２５】
規定の細胞数（４個、２０個、１００個、５００個、２５００個、１２５００個）を、６ウェルプレートの各ウェル内に播種し、ＥＧＭ−２中において１４日にわたり培養し、ここで７日目に培地を１回変えた。培養１４日後に、単一の細胞によりコロニーが形成された。細胞を４％のホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンで染色した。その後、細胞を水道水で洗浄し、エオシン溶液で染色した。（５００個の細胞を播種したウェル内において）目視可能なコロニーを形成した細胞のパーセンテージを計算し、播種された細胞の合計と比較した。
【０１２６】
細胞内／細胞外ＡＴＰの量は、細胞のエネルギー生成の指標となる。細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を求めるために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、オーストリア）を使用し、メーカーの指示書に従って実施した。黒色の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、オーストリア）内で、１００μｌのＥＧＭ−２培地中において、ウェル１個あたり１×１０４個の細胞密度で細胞を播種した。２時間後に、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェルに添加し、プレートを撹拌機内で２分にわたり穏やかに撹拌した。その後、プレートを１０分にわたり暗所で定温培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬は細胞溶解緩衝液を含むため、細胞内ＡＴＰと細胞外ＡＴＰとの組み合わせを測定することができる。ルミノメーター（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて、２０００ミリ秒の暴露時間で発光シグナルを検出し、この発光シグナルはＡＴＰ標準曲線と相関関係にあった。
【０１２７】
集団倍加レベル（ＰＤＬ）を求めることで増殖能を分析した。単離したばかりの細胞を、Ｔ−２５培養フラスコ１個あたり５×１０５個の細胞密度で播種し、ＥＧＭ−２培地中において培養した。３〜４日毎に培地を変えた。細胞がサブコンフルエント状態に達したら、細胞を継代させ、上記のように細胞数を求めた。ＰＤＬのさらなる分析のために、ＡＳＣをＴ−２５培養フラスコ内において５×１０４個の密度で播種し、継代数３になるまで培養した。各継代後に、細胞数を求めた。
【０１２８】
単離したばかりの細胞および培養６日目に得られた接着細胞について、以下の抗体、ＣＤ７３−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、オーストリア）、ＣＤ９０−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１０５−Ｖ４５０Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＢＤ、オーストリア）、ＣＤ４５−Ｖ５００Ｈｏｒｉｚｏｎ（ＢＤ）、ＣＤ３１−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３４−ＡＰＣ（ＢＤ）およびＣＤ１４６−ＰｅｒＣＰ（Ｒ＆Ｄ、オーストリア）、ならびにＣＤ４５と、ＣＤ３１と、ＣＤ３４と、ＣＤ１４６との組み合わせを使用して、以下の特定の部分母集団、内皮前駆細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）、周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）および外膜上のＡＳＣ（ＳＡ−ＡＳＣ）（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）を分析することで特徴付けした。
【０１２９】
染色のために、１％のＦＣＳを有する５０μＬのＰＢＳ中で、２．５×１０５個の細胞を、一次標識の抗体５μｌにより暗所において室温で１５分にわたり定温培養した。細胞を１．５ｍｌの細胞洗浄液（ＢＤ）で洗浄し、４００ｇで５分にわたり遠心分離した。上澄液を廃棄して、細胞ペレットを３００μＬの１×細胞固定液（ＢＤ；蒸留水で１：１０に希釈）中に再懸濁した。ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ）での分析まで、試料を暗所において４℃で貯蔵した。マーカー陽性細胞のパーセンテージを、非特異性のアイソタイプ対照物と比較して求めた。
【０１３０】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を定量化するために、細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ、オーストリア）を使用して細胞の上澄液を分析した。非酵素的（本発明を使用して得られる）および酵素的（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）に単離したばかりの細胞を、９６ウェルプレート内で２００μｌのＥＧＭ−２において２×１０４個の密度で播種し、２４時間にわたり定温培養した。１００μｌのＥＧＭ−２および１００μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に播種した酵素的に単離した細胞を、１００％の死細胞用の対照物として使用した。２４時間の定温培養後に、１００μｌの各上澄液を新たなウェルに移し、１００μｌの反応混合物を０．５時間にわたり添加した。ルミノメーター（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を用いて、４９０ｎｍで吸光度を測定し、６５０ｎｍでの参照値を引いた後に、これを、細胞を溶解する陽性対照物であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して標準化した。
【０１３１】
骨形成分化のために、２４ウェルプレート内で、ＥＧＭ−２培地においてウェル１個あたり２×１０３個の細胞密度で細胞を播種し、一晩かけて定温培養した。翌日、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、１０ｎＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１５０μｍのアスコルベート−２−ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）および１０ｎＭのジヒドロキシ−ビタミンＤ３（Ｓｉｇｍａ）を含有する骨形成分化培地であるＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｏｎｚａ）に培地を変えるか、または１０％のＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）から成る対照培地に培地を変えた。３〜４日毎に培地を変えた。
【０１３２】
２１日後、骨形成分化をアリザリンレッドでの染色および定量化で分析し、同様に、細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を求めた。
【０１３３】
石灰化構造をアリザリンレッドで染色するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、−２０℃の７０％エタノールで１時間にわたり固定した。固定した細胞を蒸留水で濯いだ後に、細胞を４０ｍＭのアリザリンレッド溶液（ｐＨ４．２；Ｍｅｒｃｋ、オーストリア）で１５分にわたり染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、光学顕微鏡で代表的な画像を撮影した。アリザリンレッドでの染色を定量分析するために、上澄液を廃棄して、細胞を５００μｌの２０％メタノールおよび１０％の酢酸（蒸留水中に希釈）で１５分にわたり定温培養した。再懸濁後に、細胞とメタノール／酢酸との混合物を透明な９６ウェルプレートに移した（ウェル１個あたり１００μｌ）。ルミノメーターを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１３４】
骨形成分化を分析するための第二の方法は、骨芽細胞細胞の表面に位置する細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を検出することであり、これは、骨成熟、無機化および骨代謝回転の生化学的な指標であると示された。まず骨形成培地を廃棄し、１時間にわたり−２０℃で１００μｌのＰＢＳを用いて、細胞を定温培養した。その後、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含有する１００μｌのＰＢＳを添加することで、１時間にわたり細胞を溶解させた。ＡＬＰ活性を定量的に検出するために、１００μｌの基質溶液（４−ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに添加し、暗所で１時間にわたり定温培養した。最後に、溶液を透明な９６ウェルプレートに移し（ウェル１個あたり１００μｌ）、ルミノメーター内で、６２０ｎｍの参照波長と併せて、４０５ｎｍで吸光度を測定した。停止液（ＰＢＳ中で１：２０に希釈した０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中に希釈した公知のｐ−ニトロフェノール濃度で標準曲線を描き、相応する吸収率を測定することで、試料のＡＬＰ活性を計算することができる。
【０１３５】
脂肪生成分化のために、２４ウェルプレート内で、ＥＧＭ−２培地においてウェル１個あたり１．４×１０４個の細胞密度で細胞を播種し、一晩かけて定温培養した。翌日、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１μｍのデキサメタゾン、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）および１００μｍのインドメタシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する脂肪生成分化培地であるＤＭＥＭ−高グルコース（Ｌｏｎｚａ）に培地を変えるか、または１０％のＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ：Ｆ１２／Ｌ−グルタミンから成る対照培地に培地を変えた。３〜４日毎に培地を変えた。
【０１３６】
２１日後、脂肪生成分化をオイルレッドＯでの染色および定量化により分析した。０．３ｇのオイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）を１００ｍｌのイソプロパノール（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）中に５０〜６０℃で溶解させることにより、オイルレッドＯ原液を調製した。使用液については、濾過した原液を蒸留水中に３：２で希釈した。３０分後に、使用液を利用直前にもう一度濾過した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のホルムアルデヒドで１時間にわたり固定した。蒸留水で洗浄した後に、細胞を７０％のエタノールで２分にわたり濯ぎ、オイルレッドＯ使用液で５〜１５分にわたり染色した。その後、細胞を蒸留水で洗浄し、マイヤーヘマトキシリン溶液で１〜３分にわたり対比染色した。最後に、細胞を水道水で洗浄し、光学顕微鏡で評価した。オイルレッドＯでの染色を定量的に検出するために、上澄液を廃棄し、５００μｌのイソプロパノールを各ウェルに添加した。再懸濁後に、細胞とイソプロパノールとの混合物を透明な９６ウェルプレートに移した（ウェル１個あたり１００μｌ）。ルミノメーターを用いて５１０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１３７】
軟骨細胞分化および３Ｄマイクロマスペレット培養のために、スクリューキャップ式微小管内で、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−６（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３（Ｌｏｎｚａ）を含有する軟骨形成分化培地（ｈＭＳＣ  Ｃｈｏｎｄｒｏ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ））において、３×１０５個のＡＳＣを遠心分離した。これらの管を、３７℃、５％のＣＯ２および湿度９５％で、ガス交換のために蓋を僅かに開けた状態で、インキュベーター内に置いた。２日後、新品の培地を用いて、ペレットを９６ウェルＵ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移した。２〜３日毎に培地を変えた。３５日にわたり軟骨形成分化培地中で定温培養した３Ｄマイクロマスペレット培養株について、その断面積を１週間に１回測定した。分化３５日後に、組織学的分析のために、マイクロマスペレットを一晩かけて４％のホスフェート緩衝ホルマリン中で固定した。翌日、ペレットを１×ＰＢＳ中で洗浄し、脱水させてアルコール濃度を上げた。ペレットをキシレン中で濯ぎ、パラフィンを浸潤させた後に、脱パラフィンした部分をアルシアンブルーで３０分にわたり染色し、マイヤーヘマトキシリンで２分にわたり対比染色した。ＩＩ型コラーゲンでの染色のために、ペプシンを用いて部分を３７℃で１０分にわたり処理した（ＡＰ−９００７  ＲＴＵ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オーストリア）。新たに調製した３％のＨ２Ｏ２を用いて、内在性ペルオキシダーゼを室温で１０分にわたりクエンチし、引き続き、正常ウマ血清２．５％（Ｖｅｃｔｏｒ  ＲＴＵ）を加えて、非特異的結合を阻害した。モノクローナル抗ＩＩ型コラーゲン（ＭＳ−３０６  Ｐ０  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１００で用いて、部分を１時間にわたり定温培養した。ＴＢＳで洗浄した後に、二次抗体（抗マウスＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ標識ポリマー、Ｄａｋｏ、オーストリア）を用いて、部分を３０分にわたり定温培養し、ＴＢＳ中で再び濯いだ。６分にわたりＮｏｖａ  Ｒｅｄ（ＳＫ４８００  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、オーストリア）を使用して、結合を可視化した。マイヤーヘマトキシリンを用いて、対比染色を２分にわたり実施した。
【０１３８】
脂肪組織由来の細胞の血管新生能を求めるために、Ｈｏｌｎｔｈｏｎｅｒ等（上記のＨｏｌｎｔｈｏｎｅｒ，Ｗ．等２０１５）に従ってフィブリンクロット培養を実施し、クロット形成のために、４×１０５個の細胞をフィブリノゲン（Ｂａｘｔｅｒ、オーストリア；２．５ｍｇ／ｍｌ）およびトロンビン（Ｂａｘｔｅｒ、０．２Ｕ／ｍｌ）と混合し、１２ウェルプレート内のカバーガラスにピペットで滴下した。クロットを３７℃で３０分にわたり重合させ、２週間にわたり、アプロチニンを含有するＥＧＭ−２（Ｂａｘｔｅｒ、１００ＫＩＵ／ｍｌ）中において培養した。３〜４日毎に培地を変えた。培養後に、クロットを４％のＰＦＡで固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ−共役モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＰＢＳ／１％のＢＳＡ中で１：５０に希釈）で暗所において１２時間にわたり定温培養した。クロットを再びＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
【０１３９】
平均的な±の標準偏差としてデータを示し、ＰＲＩＳＭ６（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、アメリカ合衆国）、一元配置分散分析後のテューキーの事後検定を使用して、統計分析を実施した。二元配置分散分析後のテューキーの事後検定を使用して、ペレットサイズの統計分析を実施した。対応のないｔ検定を使用して、フローサイトメトリーおよびＣＦＵ−Ｆアッセイ統計分析を実施した。Ｐ値が０．０５未満である場合、有意であると判断した。
【０１４０】
単離したばかりの細胞の細胞収率は、すべての非酵素的単離法に比べて、１００ｍｌの吸引脂肪によって得られた４．８±３．１×１０７個の細胞を用いた酵素的単離の後に著しく高かった（図２２）。本発明による方法により、細胞収率が７．４±２．６×１０６個の細胞が得られた一方で、振とう法および切断法によっては、細胞数がより少なく、それぞれ１．２±０．６×１０６個および２．１±１．２×１０６個であった。しかしながら、単離したばかりの細胞の細胞生存率は、適用したすべての酵素的単離法および非酵素的単離法において類似しており、細胞数の合計に比べて、６８．８±１１．０％（切断）、７５．４±７．６％（振とう）、７８．０±４．２％（コラゲナーゼ）から７９．０±７．５％（本発明）の生存細胞に達した（図２３）。
【０１４１】
酵素的単離および本発明によって得られた単離したばかりの細胞を、濃度を上昇させながら（４個、２０個、１００個、５００個、２５００個、１２５００個の細胞／ウェル）、６ウェルプレート内に播種し、増殖培地中において培養した。２週間後、細胞のコロニー形成能について、細胞をヘマトキシリン／エオシンで染色し（図２４ａ）、播種した細胞の合計に対するコロニーを形成した細胞のパーセンテージを計算することで分析した。定量分析により、本発明によって単離した細胞についての発生頻度１．８±０．５２％が、酵素的単離法によって得られた細胞についての発生頻度１．４±０．４３％と比較された形で明らかとなった（図２４ｂ）。
【０１４２】
ＡＴＰ生成は細胞のエネルギー生成の指標であるため、接着細胞画分の細胞内／細胞外ＡＴＰ濃度を分析した。興味深いことに、ＡＴＰ濃度について、本発明（１７８０±３６０ｎｍｏｌ／Ｌ）を使用して得られた細胞は、非酵素的単離法、すなわち振とう（１２３７±３５ｎｍｏｌ／Ｌ）および切断（１１１４±６９ｎｍｏｌ／Ｌ）、ならびに酵素的単離法（８５２±２９８ｎｍｏｌ／Ｌ）に比べて、著しく高かった（図２５）。
【０１４３】
すべての細胞単離法によって得られた単離した細胞は、７日目に特徴的なＡＳＣスピンドル状細胞形態を示した（図２６ａ）。
【０１４４】
集団倍加レベル（ＰＤＬ）を計算することで、単離した細胞の増殖能を３週間（７日目、１４日目、２１日目）にわたり分析した（図２６ｂ）。本発明によって単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、類似したＰＤＬを示した。
【０１４５】
脂肪組織由来の細胞の細胞構成に対する様々な単離法の影響を特定するために、本発明による方法および酵素的単離によって得られた単離したばかりの接着細胞画分の免疫表現型をフローサイトメトリー分析により調査した。間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（３６．４±２４．２％対４７．７±３．０％）、ＣＤ９０（６４．８±２５．６％対７０．６±７．８％）およびＣＤ１０５（２５．１±２４．３％対３４．４±１９．２％）において差が存在しなかった（図２７ａ、２７ｂおよび２７ｃ）一方で、特定の部分母集団を分析すると、ＥＰＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（１５．６±１２．１％対２０．７±１．７％）および周皮細胞部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）（１３．１±１１．１％対２４．８±２．９％）では、本発明を使用した場合、酵素的単離に比べて減少が少し示された（図２７ｄおよび２７ｅ）。それとは対照的に、本発明の方法および装置は、酵素的単離に比べて、ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）の数を増加させた（３８．１±２０．４％対２７．１±３．２％）（図２７ｆ）。
【０１４６】
接着細胞免疫表現型に関して、間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３（８８．４±１１．８％対９２．４±１４．０％）、ＣＤ９０（９４．２±９．３％対８９．４±１０．３％）、ＣＤ１０５（８９．４±１２．４％対８８．９±２０．０％）および内皮細胞マーカー／周皮細胞マーカーＣＤ１４６（１０．５±１３．１％対９．５±１．３％）においては、本発明によって得られた細胞と、酵素的単離によって得られた細胞との間には、ほとんど差が存在しなかった。それとは対照的に、本発明によって得られた細胞は、造血細胞マーカーＣＤ４５（５．７±６．０％対１．２±１．２％）、内皮細胞マーカーＣＤ３１（１１．８±１２．１％対５．６±５．８％）およびＣＤ３４（８．５±９．９％対３．９±４．１％）において上昇を示した（図２８ａ）。これに対応して、本発明の方法および装置は、内皮細胞系列を促進すると思われる。なぜなら、酵素的単離に比べて、培養６日後に、ＥＰＣ部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（２２．８±７．３％対０．３±０．１％）において明らかな上昇があったからである（図２８ｂ）。周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）の数も本発明により増加し（２２．３±１４．１％対８．４±３．９％）（図２８ｃ）、ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）の数は、酵素的単離に比べて少なかったものの、６日後に依然として増加していた（１６．０±４．８％対２３．８±９．１％）（図２８ｄ）。
【０１４７】
細胞におけるＬＤＨ放出は、細胞毒性の指標であるため、本発明を用いた後に酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）および非酵素的単離法によって得られたＳＶＦ細胞を、１００％のＳＶＦ細胞が死んでいるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した対照物に対して標準化した。本発明によって単離した細胞は、コラゲナーゼで単離した細胞（３９．１±２．７％）および対照条件Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１００％）に比べて、著しく低いＬＤＨ放出（２６．６±０．７％）を示した（図２９）。
【０１４８】
本発明によって、非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって、および酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）によって得られた接着ＳＶＦについて、分化培地で誘導させることで、その骨形成分化能、脂肪生成分化能および軟骨形成分化能を調べた。
【０１４９】
骨形成培地による定温培養３週間後に、細胞について、その骨形成分化能を、アリザリンレッドで染色して、これによりマトリックスの無機化および石灰化が示されることで、かつ活性骨芽細胞中で発現する細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することで分析した。アリザリンレッドでの染色により、酵素的単離法によって単離した細胞および非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞については、無機化はあまり生じなかったが、本発明を使用した後には無機化が強く生じたことが証明された（図３０ａ）。
【０１５０】
これらの観察は、アリザリンレッドでの染色を定量分析することにより確認され、酵素的単離法（１．１±０．５）に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断（０．５±０．４）および振とう（１．５±０．９）に比べて、本発明（２．６±０．４）を使用して単離した細胞について、著しく高いアリザリンレッドの吸光度を示した（図３０ｂ）。アリザリンレッドでの染色と同様に、ＡＬＰ活性は、酵素的単離法（１４８±５９μｍｏｌ／Ｌ）によって単離した細胞に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とう（１４１±７０μｍｏｌ／Ｌ）および切断（１４２±１０８μｍｏｌ／Ｌ）によって単離した細胞に比べて、本発明を使用した後に単離した細胞の方が著しく高かった（図３１）。
【０１５１】
脂肪滴形成の指標となる単離した細胞の脂肪生成分化能を、脂肪生成分化培地による定温培養３週間後に、オイルレッドＯで染色することにより分析した。オイルレッドＯでの染色により、本発明を使用して単離した細胞は、酵素的単離法に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断に比べて、脂肪滴形成が強いことが証明された（図３２ａ）。染色を定量分析すると、酵素的単離法（０．４±０．２）に比べて、かつ非酵素的単離法、すなわち切断（０．４±０．２）および振とう（０．４±０．２）に比べてオイルレッドＯの吸光度（０．８±０．２）が著しく高いと示されることで、本発明を使用して単離した細胞の脂肪生成分化能がより強いと確認された（図３２ｂ）。
【０１５２】
軟骨形成分化能を分析するために、３Ｄマイクロマスペレットを形成し、軟骨形成分化培地中において５週間にわたり定温培養した。３Ｄマイクロマスペレットについて、その断面積を毎週調べ、５週間後に、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンで染色し、これはどちらも、軟骨細胞分化の指標になる。組織学的分析により、酵素的単離法、ならびに非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断によって単離した細胞について、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンでの染色が弱いか、または起こらないことが示された。しかしながら、本発明を使用して単離した細胞により形成された３Ｄマイクロマスペレットは、アルシアンブルーおよびＩＩ型コラーゲンによる染色が濃いことを示す（図３３ａ）。さらに、本発明によって得られた細胞は、ペレットサイズがその他すべての単離法に比べて著しく大きくなっていたため、３Ｄマイクロマスペレットより速い成長を示し、分化２１日目から開始して、振とうの場合０．８±０．２ｍｍ２および切断の場合０．４±０．１ｍｍ２であるのに対して、１．９±１．１ｍｍ２であった。２８日目には、本発明のペレットサイズは、振とうの場合１．０±０．２ｍｍ２、切断の場合０．３±０．１ｍｍ２および酵素的単離法の場合０．９±０．３ｍｍ２であるのに対して、２．４±１．３ｍｍ２であった。３５日目には、ペレットは、振とうの場合１．２±０．３ｍｍ２、切断の場合０．２±０．１ｍｍ２および酵素的単離法の場合１．１±０．５ｍｍ２であるのに対して、本発明については２．７±１．４ｍｍ２のサイズを示した（図３３ｂ）。
【０１５３】
単離したばかりの細胞について、３Ｄフィブリンマトリックスにおいて、その血管新生能を調べた。フィブリンクロットの分解を防止するアプロチニンを含む膨張培地中での定温培養２週間後に、ゲルを内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色した。染色により、酵素的単離および本発明によって得られた細胞で、インビトロな脈管形成を示す管状形態が発達することが証明された（図３４）。
【０１５４】
図３５〜４３について
単離したばかりの細胞の細胞収率は、７．５±４．９×１０６個の細胞を有する本発明および１．４±１．５×１０７個の細胞を有する本発明の変形例３に比べて、１００ｍｌの吸引脂肪によって得られた５．３±３．６×１０７個の細胞を用いた酵素的単離の後に著しく高かった（図３５）。本発明の変形例１、２および４による方法により、２．４±２．１×１０７個の細胞、１．８±１．２×１０７個の細胞および１．８±１．６×１０７個の細胞の細胞収率が得られた。しかしながら、単離したばかりの細胞の細胞生存率は、適用したすべての酵素的単離法および非酵素的単離法において類似しており、細胞数の合計に比べて、７９．０±２．５％（コラゲナーゼ）、８５．４±３．８％（本発明）、９０．６±４．９％（本発明の変形例１）、８５．６±１０．６％（本発明の変形例２）、７８．１％±１０．４（本発明の変形例３）から８２．７±１５．５％（本発明の変形例４）の生存細胞に達した（図３６）。
【０１５５】
酵素的単離および本発明によって得られた単離したばかりの細胞を、濃度を上昇させながら（４個、２０個、１００個、５００個、２５００個、１２５００個の細胞／ウェル）、６ウェルプレート内に播種し、増殖培地中において培養した。２週間後、細胞のコロニー形成能について、細胞をヘマトキシリン／エオシンで染色し、播種した細胞の合計に対するコロニーを形成した細胞のパーセンテージを計算することで分析した。定量分析により、本発明によって単離した細胞についての発生頻度２．２±０．８％が、酵素的単離法によって得られた細胞についての発生頻度１．７±０．７％と比較された形で明らかとなった（図３７）。
【０１５６】
脂肪組織由来の細胞の細胞構成に対する様々な単離法の影響を特定するために、本発明による方法および酵素的単離によって得られた単離したばかりの細胞の免疫表現型をフローサイトメトリー分析により調査した。特定の部分母集団を分析すると、ＥＰＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）（１１．８±１２．３％対１６．７±７．２％）および周皮細胞部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）（１０．４±１０．７％対２０．７±７．６％）では、本発明を使用した場合、酵素的単離に比べて減少が少し示された（図３８ａおよび３８ｂ）。それとは対照的に、本発明の方法および装置は、酵素的単離に比べて、ＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）の数を増加させた（３５．０±１８．４％対２７．２±２．８％）（図３８ｃ）。
【０１５７】
本発明および酵素的単離法（コラゲナーゼ０．２Ｕ／ｍｌ）によって得られた接着ＳＶＦについて、分化培地で誘導させることで、その骨形成分化能、軟骨形成分化能および脂肪生成分化能を調べた。
【０１５８】
骨形成培地による定温培養３週間後に、細胞について、その骨形成分化能を、アリザリンレッドで染色して、これによりマトリックスの無機化および石灰化が示されることで、かつ活性骨芽細胞中で発現する細胞内アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することで分析した。アリザリンレッドでの染色を定量分析することにより、本発明（２．６±０．４）を使用して単離された細胞のアリザリンレッドが酵素的単離法（１．２±０．６）に比べて著しく高いことが示される（図３９）。アリザリンレッドでの染色と同様に、ＡＬＰ活性は、酵素的単離法（２２９±１２２μｍｏｌ／Ｌ）によって単離した細胞に比べて、本発明（３６６±２４８μｍｏｌ／Ｌ）を使用した後に単離した細胞の方が著しく高かった（図４０）。
【０１５９】
脂肪滴形成の指標となる単離した細胞の脂肪生成分化能を、脂肪生成分化培地による定温培養３週間後に、オイルレッドＯで染色することにより分析した。染色を定量分析すると、酵素的単離法（０．６±０．１）に比べてオイルレッドＯの吸光度（０．８±０．１）が著しくより高いと示されることで、本発明を使用して単離した細胞の脂肪生成分化能がより強いと証明された（図４１）。
【０１６０】
単離したばかりの細胞の細胞収率は、本発明の方法後に僅かに増加し、１００ｍｌの吸引脂肪から得られた細胞は、細胞数がそれぞれ１．６±１．７×１０６個、２．２±０．８×１０６個、２．１±０．３×１０６個および１．７±０．８×１０６個とより低かった１列、３列、６列および１１列に比べて、７．５±４．９×１０６個であった（図４２ａおよび４２ｂ）。
【０１６１】
しかしながら、単離したばかりの細胞の細胞生存率は、適用したすべての非酵素的単離法において、生存細胞が、細胞数の合計に比べて、７７．１±７．７％（１列の本発明のブレード）、７５．３±５．７％（３列の本発明のブレード）、７２．９±０．９％（６列の本発明のブレード）、７８．４±８．８％（１１列の本発明のブレード）、８５．４±３．８％（本発明）と有意性を示さなかった（図４３ａおよび４３ｂ）。
【０１６２】
細胞を脂肪組織から単離するために、高コストを伴うコラゲナーゼのような酵素を使用すると、規制局と問題を起こすことがあり（下記参照：ＥｕｄｒａＬｅｘ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、２０１０、第１０巻；Ａａｒｙａ  Ｈａｒｉ，  Ｓ．Ｇ．、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｒａｄｅ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ａｄｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、０３（０５）：２１５７〜７６３３頁；Ｓｅｎｓｅｂｅ，Ｌ．、Ｂｅｙｏｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（１１）：１３０７〜８頁；ＥｕｄｒａＬｅｘ、Ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）、２０１５、第４巻）、細胞の効率に影響を与え得る（Ｂｕｓｓｅｒ，Ｈ．等、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ、２０１４；Ｓｅａｍａｎ，Ｓ．Ａ．等、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｉｍｅ  ａｎｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆａｔ  Ｇｒａｆｔｓ、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ、２０１５、１３６（２）：１８９ｅ〜１９９ｅ頁）。あるいは酵素を回避するために、物理的な力を使用した単離システムを利用することができる。これらのシステムは、酵素による消化を含まないが、機械的な力により細胞を処理済の脂肪組織から取り出す。
【０１６３】
本発明により、再生医療における再構築、修復および置換用の治療用細胞を増幅させた脂肪組織を均質化するための新たな閉鎖型の非酵素的方法が提示される。制御可能なポンプシステムを用いて、回収した脂肪組織をオンラインで専用のブレード／パドルに移し、均質化し、その後、分離および直接使用または凍結保存用の容器内に回収した。本発明の方法および装置によって得られた細胞の分析により、細胞の特性および機能性が改善されていることが証明された。
【０１６４】
本発明の非酵素的方法により、治療用細胞を増幅させた脂肪組織がもたらされることが示される。これらの細胞は、標準的な酵素的単離法（コラゲナーゼ）および非酵素的単離法（上記のＳｈａｈ，Ｆ．Ｓ．等２０１３および上記のＧｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等２０１４を修正した振とう、ならびに上記のＣａｐｕｒｒｏ，Ｓ．２００７を修正した切断法）に比べて、より高い細胞内外ＡＴＰ濃度を示し、脂肪生成系列、骨形成系列および軟骨形成系列へとより能率的に分化する。本発明による非酵素的単離は、細胞収率が、非酵素的単離法、すなわち振とうおよび切断よりも４〜６倍高いものの、得られた細胞収率は、酵素的単離法に比べて著しく低かった。より劣った細胞収率のような欠点を克服して、多い細胞数が必要とされ得る医療用途に用いるために、より多くの組織材料が使用され得る。というのも、脂肪組織は豊富に入手可能であり、本発明の方法および装置は、毎分の処理速度が吸引脂肪１００ｍｌまでと高いからである。振とう法により、１００ｍｌの脂肪組織あたり２．５×１０６個の細胞を単離し、これは、公表されている振とう法（上記のＧｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等２０１４）に一致する。その他の群では、「試料」の脂肪組織あたり１．８×１０１２個の間質細胞という非常に高い細胞収率が報告されている（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｓ．、Ｎｏｎ−Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｆａｔ  ａｎｄ  Ｌｉｐｏ−Ａｓｐｉｒａｔｅ、２０１３、米国特許出願公開第２０１３００３４５２４号明細書（ＵＳ２０１３００３４５２４Ａ１））が、残念なことに、その方法も、その試料のサイズも、得られた細胞集団の同一性もはっきりとは規定されていない。同様に、はっきりとは同一性が規定されていない状態で、脂肪組織１グラムあたり約２００万〜１０００万個の細胞が観察された（Ｂｒｉｇｈｔ，Ｒ．等、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｂｙ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ、２０１４、国際公開第２０１４００００３１号（ＷＯ２０１４００００３１Ａ１））。得られた細胞の細胞同一性は、その治療上の可能性から非常に重要である。異なる作業群により使用される細胞の定量化法は、異なるか、または明白ではない。細胞数に与えられ得る影響には、ＳＶＦにおける赤血球数があり、これを治療用細胞であると考えることはできない。細胞収率を分析する前には、ほぼすべての非酵素的単離法において、多くの細胞計数装置により生細胞（およそ４μｍの細胞サイズを有する）として認識される赤血球を除去する赤血球溶解工程は使用されない。我々の専用の細胞計数装置は、有核細胞のみを認識するため、赤血球を含まない。さらに、ＳＶＦ内の凝集細胞を、全細胞を数える溶解工程と死細胞のみを数える第二の工程とを含む２段階の手順で正確に数えることができる。本発明を使用した後に分析した細胞収率は、標準的な酵素的単離の間に通常適用される赤血球溶解後の細胞を表す。標準的な酵素的単離手順との適切な比較のためにこの工程を含めたが、この工程は臨床用途に必要ではない。残念なことに、先に言及した物品のほとんどにおいて、標準的な酵素的単離法との比較は記載されていない。本発明の方法の細胞収率が酵素的単離より７倍低い一方で、本発明の方法の最適化された変形例（すなわち、上記の変形例１〜４）は、細胞収率が本発明の方法より３倍高い。本発明によって単離した細胞は、酵素的に単離した細胞に比べて、類似した増殖能および類似またはさらにより高いコロニー形成能を示す。間質前駆細胞の発生頻度は、細胞の１％超を上回ると期待されている（Ｂｏｕｒｉｎ，Ｐ．等、Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＦＡＴＳ）  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＩＳＣＴ）、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（６）：６４１〜８頁）。生存細胞が７８％超である場合、酵素的単離のみならず、本発明による単離によっても、期待される生存率範囲（ＩＦＡＴＳのガイドラインに準拠）にある細胞がもたらされる（上記のＢｏｕｒｉｎ，Ｐ．等２０１３）。
【０１６５】
興味深いことに、本発明の方法および装置により、潜在的な治療効果を有するより多くの数および種類の特定の細胞集団、例えば、内皮前駆細胞、周皮細胞状の細胞およびＳＡ−ＡＳＣがもたらされ、これらは、別々の細胞治療に適しているものとする。単離したばかりの細胞におけるＥＰＣおよび周皮細胞状の細胞数は、本願で提示した方法を適用した後には、酵素的単離に比べて僅かに減少しているが、本発明の装置はこれらの部分母集団を保護すると思われる。というのも、これらの部分母集団の数が、培養６日後に２倍になったからである。本発明により内皮細胞系列が促進される。というのも、酵素的単離に比べて、ＥＰＣ部分母集団（ＣＤ４５−／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）において２３％の明らかな上昇があったからである。周皮細胞状の細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）の数も、培養６日後に本発明の方法により依然として影響を受け、酵素的単離に比べて１４％上昇していた。Ｌｉｐｏｇｅｍｓクラスターが成長して得られる膨張細胞により多くの数の周皮細胞状マーカー（ＣＤ１４６＋）および血管内皮細胞細胞（ＣＤ３１＋；ＣＤ３４＋）を発現させる非酵素的単離装置Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を用いることで、Ｂｉａｎｃｈｉ等は、類似した発見も示した（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｆ．等、Ａ  ｎｅｗ  ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｔｏ  ｏｂｔａｉｎ  ａ  ｆａｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｐｅｒｉｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｍｉｌｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｆｏｒｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅｓ、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１３、２２（１１）：２０６３〜７７頁）。Ｂｉａｎｃｈｉ等に比べて、本発明によって単離した細胞は、培養６日後に、なおもより多い数の内皮前駆細胞および周皮細胞状の細胞を示した。Ｚｉｍｍｅｒｌｉｎ等（Ｚｉｍｍｅｒｌｉｎ，Ｌ．等、Ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｐｒａｙ、  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、１５（１）：１０２〜８頁）は、Ｌｉｐｉｖａｇｅ（商標）によって、我々の方法よりも多くの量のＳＡ−ＡＳＣ（ＣＤ１４−／ＣＤ３３−／ＣＤ４５−／グリコホリン−Ａ−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６−／ＣＤ３４＋）が得られることを明らかにしたが、内皮前駆（ＣＤ１４−／ＣＤ３３−／ＣＤ４５−／グリコホリン−Ａ−／ＣＤ３４＋／ＣＤ３１＋）および周皮細胞状の細胞（ＣＤ１４−／ＣＤ３３−／ＣＤ４５−／グリコホリン−Ａ−／ＣＤ３１−／ＣＤ１４６＋）は、我々の方法に比べて少なかった。Ｇｉｍｂｌｅ等は、単離した細胞集団において彼らの非酵素的方法（上記のＧｉｍｂｌｅ，Ｊ．Ｍ．等２０１４）により、細胞を発現させる、より低水準のＣＤ３４（内皮細胞）およびＣＤ４５（造血）、ならびにより高水準のＣＤ４４（間葉）を単離した。Ｊａｍｅｓ等は、周皮細胞（ＣＤ４５−、ＣＤ１４６＋、ＣＤ３４−）および外膜細胞（ＣＤ４５−、ＣＤ１４６−、ＣＤ３４＋）が、インビボで強い骨形成能を有することを示すことができた（上記のＪａｍｅｓ  Ａ．Ｗ．等��０１２）。本発明により、多数の内皮前駆細胞が、アリザリンレッドおよびアルカリホスファターゼで分析した骨形成分化能においてかなりの上昇を示すことを提示することができた。それに加えて、これらの細胞は、強い脂肪生成（オイルレッドＯ）および軟骨形成（アルシアンブルー、ＩＩ型コラーゲン）の分化能をさらに有し、新血管新生の前提条件である管状形態を発達させることができる。これは、部分母集団が存在し、そのすべてが中胚葉系列への分化を経る能力を有していることを意味する。疑問なのは、多量の特定の集団が重要であるのか、またはより多くの部分母集団が相互作用するのか、ということである。
【０１６６】
酵素による消化またはさらなる組織の処理を必要とすることなく、本発明の方法および装置は、処理速度が非常に速い安全な方法を提示し、それにより、短時間で単純な単離が行われる。このシステムにより、潜在的な自己臨床応用のために規定された特性を有する治療用細胞を増幅させた均質化した脂肪組織がもたらされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２７ａ】
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【図２７ｂ】
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【図２７ｃ】
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【図２７ｄ】
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【図２７ｅ】
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【図２７ｆ】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２８ｃ】
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【図２８ｄ】
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【図２９】
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【図３０ａ】
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【図３０ｂ】
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【図３１】
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【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２ａ】
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【図４２ｂ】
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【図４３ａ】
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【図４３ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月9日(2018.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織を破砕装置（２）に連続的に供給する工程、
前記脂肪組織から細胞または細胞凝集物を、前記破砕装置（２）を介して移動させて複数のブレード（１９）により機械的に分離することによって、前記破砕装置（２）内部で前記脂肪組織を連続的に制御して加工する工程、ここで前記ブレード（１９）は、全体的な流れの方向に対して離間した位置で配置されており、前記ブレード（１９）は、回転軸（１８）の周囲を移動し、ここで前記回転軸（１８）は、前記全体的な流れの方向に対してほぼ平行に設けられている、
分離された細胞を含む処理済の組織を前記破砕装置（２）から連続的に取り出す工程
を含む、脂肪組織から治療用細胞を調製するための非酵素的方法。
【請求項２】
動作中の前記破砕装置（２）を通る流速が、少なくとも１００ｍｌ／分、好ましくは少なくとも２００ｍｌ／分である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
回転速度を、所定の一定の速度、好ましくは７００〜１１００ｒｐｍに制御する工程を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記破砕装置（２）の出口（６）を吸引することで、および／または前記破砕装置（２）の入口（５）に圧力をかけることで、前記細胞凝集物が分離された細胞を含む処理済の組織を前記破砕装置（２）から連続的に取り出す工程を含む、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記破砕装置（２）が、請求項６から１２までのいずれか１項記載の破砕装置（２）である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
入口（５）および出口（６）を有し、かつ動作容積（９）を画定するケーシング（４）と、
前記動作容積（９）内に収容され、かつ前記ケーシング（４）に対して回転軸（１８）の周囲を回転可能なロータ（１０）と
を備える、脂肪組織から治療用細胞を調製するための破砕装置において、
前記ロータ（１０）が、少なくとも８列のブレード（１９）を、前記ロータ（１０）の前記回転軸（１８）に対して離間した位置で備えており、ここで前記ケーシングにより画定された前記動作容積が、前記ロータの前記回転軸の周囲を回転する前記ロータの各後続列の前記ブレードの半径を結んだ線により描かれる回転の中実部分に相応し、かつ
前記入口（５）および前記出口（６）が、前記ロータ（１０）における向かい合った端部において、流れ方向で最初のブレード列および最終ブレード列（１９）にそれぞれほぼ近接した状態で配置されることを特徴とする、破砕装置（２）。
【請求項７】
前記ロータ（１０）が、２０〜８０列の前記ブレード（１９）を有することを特徴とする、請求項６記載の破砕装置（２）。
【請求項８】
少なくとも８列の前記ブレード（１９）がそれぞれ、前記ロータ（１０）の前記回転軸（１８）に対して周りに配置された前記ブレード（１９）を２枚、３枚または４枚有することを特徴とする、請求項６または７記載の破砕装置（２）。
【請求項９】
少なくとも１枚の前記ブレード（１９）が、２つ以上の放射状に離間した歯（２２）、好ましくは前記回転軸（１８）に対して平行に延在した、２つ以上の放射状に離間した歯（２２）を有することを特徴とする、請求項６から８までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１０】
前記動作容積（９）の少なくとも一部は、断面積が前記入口（５）から前記出口（６）への方向で減少するテーパー型を有することを特徴とする、請求項６から９までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１１】
前記ケーシング（４）が、固定配置で互いに接続された１つまたは複数の要素から形成されていることを特徴とする、請求項６から１０までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１２】
前記破砕装置（２）が、破砕カートリッジとして提供されることを特徴とする、請求項６から１１までのいずれか１項記載の破砕装置（２）。
【請求項１３】
請求項６から１１までのいずれか１項記載の少なくとも１つの破砕装置（２）、および
ドライブシャフト（３７）を介して前記破砕装置（２）のロータ（１０）に接続された駆動部（３６）、ここで前記駆動部（３６）は、モータにより形成されていることが好ましい、
を備える、脂肪組織から治療用細胞を調製するための処理装置（１）。
【請求項１４】
前記破砕装置（２）が、請求項１２記載の破砕カートリッジにより形成されており、前記処理装置（１）の消耗部品として提供されることを特徴とする、請求項１３記載の処理装置（１）。
【請求項１５】
請求項６から１２までのいずれか１項記載の破砕装置（２）と、
チューブ（４４）により、好ましくはローラーポンプも収容するチューブ（４４）により、前記破砕装置（２）の入口（５）に接続されたカニューレ（４３）と
を備える、脂肪吸引用途のセット（４２）。
【国際調査報告】
2019514389.tif 000075
2019514389.tif 000076
2019514389.tif 000077