(57)【要約】  本明細書では、癌を治療する方法であって、被験体にβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を投与することを含む、方法が開示される。さらに本明細書では、治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、治療的有効量のＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と、少なくとも１種の医薬用担体とを含む医薬組成物が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のＭＥＫインヒビターと、
を投与することを含む、方法。
【請求項２】
β−カテニン関連癌の治療において使用するためのβ−カテニン核酸インヒビター分子を含む医薬組成物であって、ＭＥＫインヒビターと組み合わせて投与される、組成物。
【請求項３】
前記ＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項１に記載の方法又は請求項３に記載の組成物。
【請求項４】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と、
を投与することを含む、方法。
【請求項５】
β−カテニン関連癌の治療において使用するためのβ−カテニン核酸インヒビター分子を含む医薬組成物であって、ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と組み合わせて投与される、組成物。
【請求項６】
前記β−カテニン関連癌は、結腸直腸癌、肝細胞癌、又は黒色腫である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項７】
前記被験体はヒトである、請求項１、３、４、又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記β−カテニン核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項９】
前記β−カテニン核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、該分子の二本鎖領域の長さは、１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１０】
前記β−カテニン核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに１８ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間の二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、前記センス鎖の長さは２５ヌクレオチド〜３４ヌクレオチドであり、かつ前記アンチセンス鎖の長さは２６ヌクレオチド〜３８ヌクレオチドであり、かつ該アンチセンス鎖は、その３’末端に１個〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１１】
前記センス鎖は、配列番号１の配列を含む、請求項１０に記載の方法又は組成物。
【請求項１２】
前記アンチセンス鎖は、配列番号２の配列を含む、請求項１０又は１１に記載の方法又は組成物。
【請求項１３】
前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、請求項４〜１２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１４】
前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、該分子の二本鎖領域の長さは、１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項１５】
前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに１８ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間の二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、前記センス鎖の長さは２５ヌクレオチド〜３４ヌクレオチドであり、かつ前記アンチセンス鎖の長さは２６ヌクレオチド〜３８ヌクレオチドであり、かつ該アンチセンス鎖は、その３’末端に１個〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法又は組成物。
【請求項１６】
前記ｃ−ＭｙｃのｄｓＲＮＡｉインヒビター分子のセンス鎖は、配列番号３の配列を含む、請求項１５に記載の方法又は組成物。
【請求項１７】
前記ｃ−ＭｙｃのｄｓＲＮＡｉインヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号４の配列を含む、請求項１５又は１６に記載の方法又は組成物。
【請求項１８】
前記ｃ−ＭｙｃのｄｓＲＮＡｉインヒビター分子のセンス鎖は、配列番号５の配列を含む、請求項１５に記載の方法又は組成物。
【請求項１９】
前記ｃ−ＭｙｃのｄｓＲＮＡｉインヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号６の配列を含む、請求項１５又は１８に記載の方法又は組成物。
【請求項２０】
前記β−カテニン核酸インヒビター分子及び／又は前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、脂質ナノ粒子を用いて製剤化される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２１】
前記脂質ナノ粒子はカチオン性脂質及びペグ化脂質を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のＭＥＫインヒビターと、
を投与することを含み、前記β−カテニン核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、方法。
【請求項２３】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のＭＥＫインヒビターと、
を投与することを含み、前記β−カテニン核酸インヒビター分子は、配列番号１を含むセンス鎖及び配列番号２を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、方法。
【請求項２４】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のＭＥＫインヒビターと、
を投与することを含み、前記β−カテニン核酸インヒビター分子は、配列番号１からなるセンス鎖及び配列番号２からなるアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、方法。
【請求項２５】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と、
を投与することを含み、前記β−カテニン核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつ前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子はｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、方法。
【請求項２６】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と、
を投与することを含み、
前記β−カテニン核酸インヒビター分子は、配列番号１を含むセンス鎖及び配列番号２を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつ、
前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、配列番号３又は５を含むセンス鎖及び配列番号４又は６を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、方法。
【請求項２７】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と、
を投与することを含み、
前記β−カテニン核酸インヒビター分子は、配列番号１からなるセンス鎖及び配列番号２からなるアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつ、
前記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、配列番号３又は５からなるセンス鎖及び配列番号４又は６からなるアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、方法。
【請求項２８】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のＭＥＫインヒビターと、
を投与することを含み、前記β−カテニン核酸インヒビター分子の投与前に、前記被験体は、β−カテニン関連癌のための事前処置を受けており、その処置に対する耐性を発生している、方法。
【請求項２９】
前記事前処置はＭＥＫインヒビターの投与である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記事前処置のＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に、
治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、
治療的有効量のＭＥＫインヒビターと、
を投与することを含み、前記β−カテニン核酸インヒビター分子の投与前に、前記被験体はβ−カテニン関連癌のための事前処置の適用を少なくとも２回受けている、方法。
【請求項３４】
前記事前処置は、ＭＥＫインヒビターの投与である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記事前処置のＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記β−カテニン核酸インヒビター分子は、配列番号１を含むセンス鎖及び配列番号２を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子、又は配列番号１からなるセンス鎖及び配列番号２からなるアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である、請求項３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記β−カテニン核酸インヒビター分子を投与する前に、前記被験体はβ−カテニン関連癌のための事前処置の適用を少なくとも３回、４回、５回、又は６回受けている、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記β−カテニン関連癌は転移したものである、請求項１、２２、２３、２４、２８若しくは３３〜３９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４１】
前記β−カテニン関連癌は、結腸直腸癌である、請求項４０に記載の方法又は組成物。
【請求項４２】
前記結腸直腸癌は肝臓に転移したものである、請求項４１に記載の方法又は組成物。
【請求項４３】
前記ＭＥＫインヒビターはトラメチニブである、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項４４】
前記治療は前記被験体における転移を減らす、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年３月１６日付で出願された米国仮特許出願第６２／３０９，４４９号、２０１６年４月５日付で出願された米国仮特許出願第６２／３１８，５２９号、及び２０１６年７月２１日付で出願された米国仮特許出願第６２／３６５，１６４号の利益を主張し、その出願日に依拠し、その開示全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。２０１７年３月１０日付けで作製された上記ＡＳＣＩＩコピーの名前は０２４３＿０００５−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、１９７９キロバイトのサイズである。
【０００３】
本開示は概して、β−カテニン遺伝子の発現を低下させる核酸インヒビター分子及び下流β−カテニンエフェクター、例えばｃ−Ｍｙｃのインヒビター又はＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードの少なくとも１種のインヒビター、例えばＭＥＫインヒビターを使用する組み合わせ療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発癌遺伝子であるβ−カテニンは、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の主要なメディエーターである。β−カテニンは、形質膜（そこではβ−カテニンは細胞間接着複合体の安定化に寄与する）、細胞質（そこではβ−カテニンレベルが調節される）、及び核（そこではβ−カテニンは転写調節及びクロマチン相互作用に関与する）を含む多数の細胞部位で幾つかの細胞機能を果たす。
【０００５】
β−カテニン（ヒトにおいてはＣＴＮＮＢ１遺伝子によりコードされる）における突然変異は、具体的には結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、肝芽細胞腫、腎臓癌（ウィルムス腫瘍）、髄芽細胞腫、黒色腫、卵巣癌（類子宮内膜癌）、膵臓癌、石灰化上皮種、前立腺癌、甲状腺（未分化）癌及び子宮（子宮内膜）癌と関連している（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７）。
【０００６】
β−カテニン／Ｗｎｔ経路（例えば、図１を参照）は、８０％を超える結腸直腸癌において一貫して活性化されている。結腸直腸癌の発症におけるβ−カテニンの役割は、ＡＰＣ（結腸腺腫性ポリポーシス）遺伝子の発現産物、つまりは腫瘍サプッレサーにより調節されることが示されている（非特許文献２８、非特許文献２９）。上記ＡＰＣタンパク質は、通常はＴＣＦ／ＬＥＦと一緒にβ−カテニンに結合して、転写因子複合体を形成する。Morinら（非特許文献２９）は、ＡＰＣタンパク質が、結腸癌におけるβ−カテニン及びＴｃｆ−４により媒介される転写活性化を下方調節することを報告している。それらの結果は、β−カテニンの調節がＡＰＣの腫瘍抑制効果と関連すること、そしてこの調節がＡＰＣ又はβ−カテニンのいずれかにおける突然変異により迂回され得ることを指摘するものであった。
【０００７】
β−カテニン遺伝子における突然変異は、β−カテニンのＮ末端の一部の欠失をもたらす欠損（truncations）、又は細胞質破壊複合体の構成要素、例えばβ−カテニンのリン酸化を媒介し、プロテオソームによるその分解を対象とするＧＳＫ３α／β若しくはＣＫＩαにより標的とされるセリン残基及びトレオニン残基に作用する点突然変異のいずれかであり得る。これらの突然変異β−カテニンタンパク質は、リン酸化を受けにくいため、プロテオソーム分解を回避する。したがって、β−カテニンは罹患細胞内に蓄積する。核に局在する安定化されたβ−カテニンは、結腸癌のほぼ全ての事例の際だった特徴である（非特許文献３０）。Morinらは、リン酸化部位を改変するβ−カテニンの突然変異により、細胞がβ−カテニンのＡＰＣに媒介される下方調節の影響を受けなくなること、そしてこの機構の破壊が結腸直腸の腫瘍形成に重要であることを実証した（非特許文献２９）。
【０００８】
またＫＲＡＳ遺伝子は、結腸直腸癌において大抵は突然変異されている（約３０％〜４０％）。ＫＲＡＳは、発癌遺伝子のＲａｓファミリーの一員である。ＫＲＡＳは、細胞内シグナル伝達経路に関与するＧＴＰアーゼをコードする。活性化されると、ＫＲＡＳはｃ−Ｒａｆ及びＰＩ  ３−キナーゼのようなその他のシグナル伝達分子を動員する。またＫＲＡＳの突然変異は、９０％を超える膵臓癌において存在する。
【０００９】
β−カテニン／Ｗｎｔ経路は、５０％を超える肝細胞癌（ＨＣＣ）患者において一貫して活性化されている。活性化されたＷｎｔシグナル伝達及び核内β−カテニンは、疾患の再発及び予後不良と相関している（非特許文献３１）。ＨＣＣ患者の１７％〜６６％において、核内β−カテニン染色の増加が記録されている（非特許文献３２、非特許文献３３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Polakis P. Genes Dev. 14: 1837-51
【非特許文献２】Samowitz et al. Cancer Res. 59: 1442-4
【非特許文献３】Iwao et al. Cancer Res. 58: 1021-6
【非特許文献４】Mirabelli-Primdahl et al. Cancer Res. 59: 3346-51
【非特許文献５】Shitoh et al. J Clin Path. 52: 695-6
【非特許文献６】Tejpar et al. Oncogene 18: 6615-20
【非特許文献７】Kitaeva et al. Cancer Res. 57: 4478-81
【非特許文献８】Sparks et al. Cancer Res. 58: 1130-4
【非特許文献９】Miyaki et al. Cancer Res. 59: 4506-9
【非特許文献１０】Park et al. Cancer Res. 59: 4257-60
【非特許文献１１】Huang et al. Am J Pathol. 155: 1795-801
【非特許文献１２】Nhieu et al. Am J Pathol. 155: 703-10
【非特許文献１３】Legoix et al. Oncogene 18: 4044-6
【非特許文献１４】Jeng et al. Cancer Lett. 152: 45-51
【非特許文献１５】Koch et al. Cancer Res. 59: 269-73
【非特許文献１６】Wei et al. Oncogene 19: 498-504
【非特許文献１７】Koesters et al. Cancer Res. 59: 3880-2
【非特許文献１８】Maiti et al. Cancer Res. 60: 6288-92
【非特許文献１９】Zurawel et al. Cancer Res. 58: 896-9
【非特許文献２０】Gamallo et al. Am J Pathol. 155: 527-36
【非特許文献２１】Palacios and Gamallo Cancer Res. 58: 1344-7
【非特許文献２２】Wright et al. Int J Cancer 82: 625-9
【非特許文献２３】Gerdes et al. Digestion 60: 544-8
【非特許文献２４】Chan et al. Nat Genet. 21: 410-3
【非特許文献２５】Voeller et al. Cancer Res. 58: 2520-3
【非特許文献２６】Garcia-Rostan et al. Cancer Res. 59: 1811-5
【非特許文献２７】Fukuchi et al. Cancer Res. 58: 3526-8
【非特許文献２８】Korinek et al., Science, 1997, 275:1784-1787
【非特許文献２９】Morin et al., Science, 1997, 275:1787-1790
【非特許文献３０】Clevers, H., 2006, Cell 127:469-480
【非特許文献３１】Takigawa et al. 2008, Curr Drug Targets November; 9 (11):1013-24
【非特許文献３２】Zulehner et al. 2010, Am J Pathol. January; 176 (1):472-81
【非特許文献３３】Yu et al. 2009, J Hepatol. May; 50 (50):948-57
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
β−カテニンがどのようにして細胞内のＷｎｔシグナル伝達の主要なメディエーターとして機能しているか、そしてβ−カテニンの突然変異及び／又は発現の変化が腫瘍形成にどのような役割を果たし得るかの理解が進んでいるにもかかわらず、依然としてＣＴＮＮＢ１発現と関連する疾患、例えば癌を治療し得る組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、特定の治療アプローチとβ−カテニンの核酸の阻害とを組み合わせることで、腫瘍成長の相乗的阻止がもたらされ得ることを見出した。特に、β−カテニン阻害とＭＥＫ阻害との組み合わせ、又はβ−カテニン阻害とｃ−Ｍｙｃ阻害との組み合わせは、効果的な腫瘍阻止をもたらす（例えば、実施例４及び実施例５並びに図４〜図６を参照）。
【００１３】
本明細書では、β−カテニン関連疾患又は障害を治療する方法であって、被験体に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビター（例えば、トラメチニブ）又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を投与することを含む、方法が開示される。β−カテニン核酸インヒビター分子及びＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子の投与は、それぞれの作用物質の個別の投与と比較して相乗効果をもたらし得る。
【００１４】
特定の実施の形態においては、被験体はヒトである。
【００１５】
またβ−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するためのβ−カテニン核酸インヒビター分子を含む医薬組成物であって、ＭＥＫインヒビター（例えば、トラメチニブ）又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と組み合わせて投与される、組成物も提供される。特定の実施の形態においては、上記β−カテニン関連疾患又は障害は、癌、例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、又は黒色腫である。
【００１６】
β−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するための上記方法及び組成物の特定の実施の形態においては、上記β−カテニン関連疾患又は障害は、β−カテニン関連癌、例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、又は黒色腫である。特定の実施の形態においては、上記β−カテニン関連癌は転移したものである。特定の実施の形態においては、上記β−カテニン関連癌は転移した結腸直腸癌である。特定の実施の形態においては、上記結腸直腸癌は肝臓に転移したものである。β−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するための上記方法及び組成物の特定の実施の形態においては、上記ＭＥＫインヒビターは、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、コビメチニブ（ＸＬ５１８）、レファメチニブ（ＢＡＹ  ８６−９７６６）、ピマセルチブ、ＰＤ−３２５９０１、ＲＯ５０６８７６０、ＣＩ−１０４０（ＰＤ０３５９０１）、ＡＺＤ８３３０（ＡＲＲＹ−４２４７０４）、ＲＯ４９８７６５５（ＣＨ４９８７６５５）、ＲＯ５１２６７６６、ＷＸ−５５４、Ｅ６２０１、及びＴＡＫ−７３３である。１つの実施の形態においては、上記ＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。
【００１７】
β−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するための上記方法及び組成物の特定の実施の形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子又は上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、脂質ナノ粒子を用いて製剤化される。
【００１８】
さらに本明細書では、治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子と、治療的有効量のＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と、少なくとも１種の医薬用賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。
【００１９】
本発明の特定の実施の形態は、被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビターを投与することを含み、上記β−カテニン核酸インヒビター分子の投与前に、上記被験体は、β−カテニン関連癌のための事前処置を受けており、その事前処置に対する耐性を発生している、方法を提供する。特定の実施の形態において、上記事前処置はＭＥＫインヒビターの投与である。特定の実施の形態において、上記事前処置のＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。特定の実施の形態において、上記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。
【００２０】
本発明の特定の実施の形態は、被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、該被験体に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビターを投与することを含み、上記β−カテニン核酸インヒビター分子の投与前に、上記被験体はβ−カテニン関連癌のための事前処置の適用（administrations）を少なくとも２回受けている、方法を提供する。それらの実施の形態の幾つかにおいては、上記被験体は、事前処置の適用を少なくとも３回、４回、５回、６回、又は７回受けている。特定の実施の形態においては、上記事前処置は、ＭＥＫインヒビターの投与である。特定の実施の形態においては、上記事前処置のＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。特定の実施の形態においては、上記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。
【００２１】
本発明の特定の実施の形態は、被験体においてβ−カテニン関連癌を治療する方法であって、その被験体に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビターを投与することを含み、ここで上記β−カテニン関連癌（例えば、結腸直腸癌）が、例えば肝臓に転移したものである、方法を提供する。特定の実施の形態においては、上記被験体に投与されるＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。
【００２２】
上述の一般的な概要も以下の詳細な説明も両者とも例示的なものにすぎず、本開示を限定するものではない。
【００２３】
引用することにより本明細書の一部をなす添付の図面は、特定の実施形態を解説し、本明細書と共に本明細書に開示される組成物及び方法の特定の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｗｎｔシグナル伝達経路の簡略図である。左側は、Ｗｎｔリガンドがその表面受容体に結合されておらず、β−カテニンが破壊複合体中に封じ込まれ、分解に向けられており、標的遺伝子が抑制されている細胞を示す。右側は、Ｗｎｔリガンドがその表面受容体に結合した後の細胞を示しており、そこでは、破壊複合体がばらばらになり、安定化されたβ−カテニンが放出され、それが核に移動し、そして標的遺伝子が活性化される。
【図２Ａ】Ｗｎｔ活性ＬＳ４１１Ｎ腫瘍における種々の投与量及び投与頻度でのＢＣＡＴ１抗腫瘍効力を示す図である。ＢＣＡＴ１を、１．０ｍｇ／ｋｇで毎日３日間にわたり（２サイクル）投与した（図２Ａ）。
【図２Ｂ】Ｗｎｔ活性ＬＳ４１１Ｎ腫瘍における種々の投与量及び投与頻度でのＢＣＡＴ１抗腫瘍効力を示す図である。ＢＣＡＴ１を、３ｍｇ／ｋｇで毎週（２サイクル）投与した（図２Ｂ）。
【図２Ｃ】Ｗｎｔ活性ＬＳ４１１Ｎ腫瘍における種々の投与量及び投与頻度でのＢＣＡＴ１抗腫瘍効力を示す図である。ＢＣＡＴ１を、０．３ｍｇ／ｋｇで毎日３日間にわたり（２サイクル）投与した（図２Ｃ）。
【図２Ｄ】Ｗｎｔ活性ＬＳ４１１Ｎ腫瘍における種々の投与量及び投与頻度でのＢＣＡＴ１抗腫瘍効力を示す図である。ＢＣＡＴ１を、３ｍｇ／ｋｇで毎日３日間にわたり（２サイクル）投与した（図２Ｄ）。
【図３Ａ】ＢＣＡＴ１がＷｎｔシグナル伝達を選択的に標的とすることを示す図である。ＢＣＡＴ１の投与は、Ｗｎｔ活性腫瘍細胞：ＳＷ４０３（ＡＰＣ及びＫＲＡＳ突然変異；図３Ａ）において腫瘍容積を効果的に減らす。
【図３Ｂ】ＢＣＡＴ１がＷｎｔシグナル伝達を選択的に標的とすることを示す図である。ＢＣＡＴ１の投与は、Ｗｎｔ活性腫瘍細胞：ＬＳ１７４ｔ（ＣＴＮＮＢ１及びＫＲＡＳ突然変異；図３Ｂ）において腫瘍容積を効果的に減らす。
【図３Ｃ】ＢＣＡＴ１がＷｎｔシグナル伝達を選択的に標的とすることを示す図である。ＢＣＡＴ１の投与は、野生型ＡＰＣ及びβ−カテニン遺伝子を有するＲＫＯ結腸直腸腫瘍（図３Ｃ）においては腫瘍容積を効果的に減らさない。
【図４Ａ】ＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ＢＣＡＴ１又はトラメチニブのいずれかでの個別の処置と比較して抗腫瘍効力を増大させることを示す図である。
【図４Ｂ】ＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ＢＣＡＴ１又はトラメチニブのいずれかでの個別の処置と比較して抗腫瘍効力を増大させることを示す図である。
【図４Ｃ】ＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ＬＳ１７４ｔ腫瘍細胞においてｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡの大幅な下方調節を引き起こしたことを示す図である。ｃ−ＭｙｃのｍＲＮＡを、組み合わせ療法の適用から７２時間後に測定した。
【図５Ａ】より低い投与量でのＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍細胞を使用するＣＲＣのモデルにおいて相乗的な抗腫瘍効力を発揮することを示す図である。
【図５Ｂ】より低い投与量でのＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍細胞を使用するＣＲＣのモデルにおいて相乗的な抗腫瘍効力を発揮することを示す図である。
【図５Ｃ】より低い投与量でのＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ヒトＳＷ４０３腫瘍細胞を使用するＣＲＣのモデルにおいて相乗的な抗腫瘍効力を発揮することを示す図である。
【図５Ｄ】より低い投与量でのＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法が、ヒトＳＷ４０３腫瘍細胞を使用するＣＲＣのモデルにおいて相乗的な抗腫瘍効力を発揮することを示す図である。
【図５Ｅ】ＳＷ４０３腫瘍細胞を使用するＣＲＣのモデルにおけるトラメチニブに対する耐性は、トラメチニブとＢＣＡＴ１とを組み合わせて投与することにより克服されることを示す図である。該データは、処置群全体の平均腫瘍容積（図５Ｅ）を表す。
【図５Ｆ】ＳＷ４０３腫瘍細胞を使用するＣＲＣのモデルにおけるトラメチニブに対する耐性は、トラメチニブとＢＣＡＴ１とを組み合わせて投与することにより克服されることを示す図である。該データは、該処置群におけるそれぞれの個々のマウスの平均腫瘍容積（図５Ｆ）を表す。
【図６Ａ】ＢＣＡＴ１及びＭＹＣ１による組み合わせ療法が、ＢＣＡＴ１又はＭＹＣ１のいずれかでの個別の処置と比較して抗腫瘍効力を増大させることを示す図である。ＢＣＡＴ１とＭＹＣ１とを組み合わせて投与する場合に、それらの用量は、それぞれが個々に投与される場合に使用される用量の１／２であることに留意する。
【図６Ｂ】ＢＣＡＴ１及びＭＹＣ１による組み合わせ療法が、ＢＣＡＴ１又はＭＹＣ１のいずれかでの個別の処置と比較して抗腫瘍効力を増大させることを示す図である。ＢＣＡＴ１とＭＹＣ１とを組み合わせて投与する場合に、それらの用量は、それぞれが個々に投与される場合に使用される用量の１／２であることに留意する。
【図６Ｃ】ＢＣＡＴ１及びＭＹＣ１による組み合わせ療法が、ＢＣＡＴ１又はＭＹＣ１のいずれかでの個別の処置と比較して抗腫瘍効力を増大させることを示す図である。ＢＣＡＴ１とＭＹＣ１とを組み合わせて投与する場合に、それらの用量は、それぞれが個々に投与される場合に使用される用量の１／２であることに留意する。
【図７】センス（又はパッセンジャー）鎖（配列番号１）及びアンチセンス（ガイド）鎖（配列番号２）を有する、二本鎖のβ−カテニン核酸インヒビター分子の１つの非限定的な実施形態を示す図である。このβ−カテニン核酸インヒビター分子は、本明細書ではＢＣＡＴ１と呼ばれる。
【図８】センス（又はパッセンジャー）鎖（配列番号３）及びアンチセンス（ガイド）鎖（配列番号４）を有する、二本鎖のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子の１つの非限定的な実施形態を示す図である。このｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、本明細書ではＭＹＣ２と呼ばれる。
【図９】センス（又はパッセンジャー）鎖（配列番号５）及びアンチセンス（ガイド）鎖（配列番号６）を有する、二本鎖のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子の１つの非限定的な実施形態を示す図である。このｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、本明細書ではＭＹＣ１と呼ばれる。
【図１０】β−カテニン核酸インヒビター分子又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を製剤化するために使用することができる脂質ナノ粒子の１つの非限定的な実施形態を示す図である。ＬＮＰは、以下のコア脂質：ＤＬ−０４８（カチオン性脂質）及びＤＳＧ−ＭＰＥＧ（ペグ化脂質）、並びに以下のエンベロープ脂質：ＤＬ−１０３（カチオン性脂質）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ−ＭＰＥＧ（ペグ化脂質）を含む。
【図１１Ａ】ＢＣＡＴ１の投与（ｑｄｘ３、３ｍｇ／ｋｇ／投与、３サイクル）が、Ｌｓ１７４ｔのＣＲＣ肝臓転移モデル（図１１Ａ）においてＰＢＳ又はプラセボと比較して生存を改善することを示している。
【図１１Ｂ】ＢＣＡＴ１の投与（ｑｄｘ３、３ｍｇ／ｋｇ／投与、３サイクル）が、ＬＳ４１１ＮのＣＲＣ肝臓転移モデル（図１１Ｂ）においてＰＢＳ又はプラセボと比較して生存を改善することを示している。
【図１１Ｃ】トラメチニブの投与（ｑｄｘ３、１ｍｇ／ｋｇ／投与又は３ｍｇ／ｋｇ／投与、３サイクル）が、Ｌｓ１７４ｔのＣＲＣ肝臓転移モデルにおいてＰＢＳと比較して生存を改善することを示す図である。
【図１１Ｄ】ＢＣＡＴ１及びトラメチニブによる組み合わせ療法（ｑｄｘ３、２ｍｇ／ｋｇ／用量、３サイクル）とＢＣＡＴ１又はトラメチニブによる個別処置とを、Ｌｓ１７４ｔのＣＲＣ肝臓転移モデルにおいて比較しており、該組み合わせ療法に関する相乗的応答を示唆している図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
本開示のより容易な理解のために、幾つかの用語を初めに下記に規定する。以下の用語及び他の用語の付加的な定義は本明細書を通して示され得る。以下に示される用語の定義が、引用することにより本出願の一部をなす出願又は特許における定義と一致していない場合には、本出願に示される定義を使用して、その用語の意味を理解するべきである。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合に、文脈上他に明らかに指示されない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the"）は複数の指示対象を含む。このため、例えば「方法（a method）」への言及には１つ以上の方法、及び／又は本明細書に記載される及び／又は本開示を読むことで当業者に明らかとなるタイプの工程等が含まれる。
【００２７】
投与する：本明細書で使用される場合に、組成物を被験体に「投与する」ことは、被験体に組成物を与える、適用する又は被験体を組成物と接触させることを意味する。投与は例えば局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内及び皮内を含む多数の経路のいずれかによって達成することができる。
【００２８】
およそ：本明細書で使用される場合に、「およそ」又は「約」という用語は対象の１つ以上の値に適用される場合、述べられる参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、他に指定のない限り又は文脈から明らかでない限りにおいて（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、述べられる参照値のいずれかの方向で（それを上回る又は下回る）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ以下に含まれる値の範囲を指す。
【００２９】
β−カテニン：本明細書で使用される場合に、「β−カテニン」は、ポリペプチド、又はそのようなβ−カテニンタンパク質をコードする核酸配列のいずれかを指す。ポリペプチドに関する場合に、「β−カテニン」は、β−カテニン遺伝子／転写物（ＣＴＮＮＢ１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１９０４．３（ヒトβ−カテニン転写変異体１）、ＮＭ＿００１０９８２０９．１（ヒトβ−カテニン転写変異体２）、ＮＭ＿００１０９８２１０．１（ヒトβ−カテニン転写変異体３）、並びにＮＭ＿００７６１４．２及びＮＭ＿００７６１４．３（マウスβ−カテニン）のポリペプチド遺伝子産物を指す。
【００３０】
β−カテニン関連：本明細書で使用される場合に、「β−カテニン関連」疾患又は障害は、変化したβ−カテニン発現、濃度及び／又は活性と関連する疾患又は障害を指す。「β−カテニン関連」疾患又は障害には、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、肝芽細胞腫、腎臓癌（ウィルムス腫瘍）、髄芽細胞腫、黒色腫、卵巣癌（類子宮内膜癌）、膵臓癌、石灰化上皮種、前立腺癌、甲状腺（未分化）癌及び子宮（子宮内膜）癌を含む癌及び／又は増殖性疾患、状態若しくは障害が含まれる。１つの実施形態においては、上記β−カテニン関連疾患又は障害は、結腸直腸癌、肝細胞癌、又は黒色腫である。
【００３１】
ＢＣＡＴ１：本明細書で使用される場合に、「ＢＣＡＴ１」は、β−カテニン遺伝子を標的とし、配列番号１からなる核酸配列を有するセンス鎖及び配列番号２からなる核酸配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸インヒビター分子を指す。
【００３２】
ｃ−Ｍｙｃ：本明細書で使用される場合に、「ｃ−Ｍｙｃ」は、ポリペプチド、又はそのようなｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする核酸配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２４５８．２及びＮＰ＿０３４９７９．３）のいずれかを指す。ｃ−Ｍｙｃ転写物には、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２４６７．４及びＮＭ＿０１０８４９．４の配列が含まれる。
【００３３】
ＭＹＣ１：本明細書で使用される場合に、「ＭＹＣ１」は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を標的とし、配列番号５からなる核酸配列を有するセンス鎖及び配列番号６からなる核酸配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸インヒビター分子を指す。
【００３４】
ＭＹＣ２：本明細書で使用される場合に、「ＭＹＣ２」は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を標的とし、配列番号３からなる核酸配列を有するセンス鎖及び配列番号４からなる核酸配列を有するアンチセンス鎖を有する核酸インヒビター分子を指す。
【００３５】
ＭＥＫインヒビター：本明細書で使用される場合に、用語「ＭＥＫインヒビター」は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼキナーゼ酵素ＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２の活性を低下させる化合物又は作用物質を指す。
【００３６】
賦形剤：本明細書で使用される場合に、用語「賦形剤」は、例えば所望の粘稠度又は安定化効果をもたらす又はそれに寄与する、組成物中に含まれ得る非治療剤を指す。
【００３７】
核酸インヒビター分子：本明細書で使用される場合に、用語「核酸インヒビター分子」は、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の配列を特異的に標的とする領域を含む、標的遺伝子の発現を低下させる又は無くすオリゴヌクレオチド分子を指す。一般的に、核酸インヒビター分子の標的領域は、該核酸インヒビター分子の効果を特定された標的遺伝子に向けるために、標的遺伝子のｍＲＮＡ上の配列に十分に相補的である配列を含む。例えば、「β−カテニン核酸インヒビター分子」は、ＣＴＮＮＢ１遺伝子の発現を低下させるか又は無くし、そして「ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子」は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現を低下させるか又は無くす。上記核酸インヒビター分子には、天然のリボヌクレオチド、天然のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は修飾ヌクレオチドが含まれ得る。修飾ヌクレオチドは、修飾、例えば糖環上の位置の置換、ヌクレオチド間のホスホエステル結合の修飾、非天然の塩基、及び非天然の代替炭素構造、例えばロックド核酸（「ＬＮＡ」）（以下参照）及びアンロックド核酸（「ＵＮＡ」）（以下参照）を含む。
【００３８】
低下させる：本明細書で使用される用語「低下させる」（"reduce" or "reduces"）は、当該技術分野で一般的に認められるその意味を指す。例示的な核酸インヒビター分子（例えば、β−カテニン及びｃ−ＭｙｃのｓｉＲＮＡ分子）又は例示的なインヒビター（例えば、ＭＥＫインヒビター）に関しては、上記用語は概して、核酸インヒビター分子又はインヒビターの不存在下に観察されるものを下回る、遺伝子の発現の低下、又はＲＮＡ分子若しくは１種以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子の濃度の低下、又は１種以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性の低下を指す。
【００３９】
耐性：本明細書で使用される用語「耐性」は、被験体において腫瘍成長を事前に低下又は阻止した処置が、その被験体における腫瘍成長をもはや低下又は阻止しない場合に生ずる状態を指す。
【００４０】
ＲＮＡｉインヒビター分子：本明細書で使用される用語「ＲＮＡｉインヒビター分子」は、（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有し、該アンチセンス鎖がアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより標的ｍＲＮＡの開裂において使用される二本鎖核酸インヒビター分子（「ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子」）、又は（ｂ）Ａｇｏ２により使用される単一アンチセンス鎖を有する一本鎖核酸インヒビター分子（「ｓｓＲＮＡｉインヒビター分子」）のいずれかを指し、ここでＲＮＡｉインヒビター分子は、標的遺伝子の発現を低下させるか又は無くすための細胞のＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）装置の少なくとも一部を利用する。
【００４１】
被験体：本明細書で使用される場合に、用語「被験体」は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。１つの実施形態においては、被験体はヒトである。用語「個体」又は「患者」は、「被験体」と置き換え可能であると解釈される。
【００４２】
核酸インヒビター分子
核酸インヒビター分子のために様々な構造が使用されている。例えば、初期の研究では、各々の鎖が１９ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドのサイズを有し、１ヌクレオチド〜５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’突出を有する二本鎖核酸分子に着目されていた（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照）。その後に、ダイサー酵素によりｉｎ  ｖｉｖｏでプロセシングされて活性ｓｉＲＮＡ分子となるより長い二本鎖ＲＮＡ分子が開発された（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照）。近年の研究では、少なくとも一方の鎖の少なくとも一方の端部が該分子の二本鎖標的領域を超えて伸長されており、一方の鎖が熱力学的に安定しているテトラループ構造を含む構造を有する伸長された二本鎖核酸インヒビター分子が開発された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号、米国特許第８，９２７，７０５号、及び国際公開第２０１０／０３３２２５号を参照、それらの上記二本鎖核酸インヒビター分子の開示は、引用することにより本出願の一部をなす）。それらの構造は、一本鎖伸長（分子の片側又は両側での）及び二本鎖伸長を含む。さらに、最近の取り組みでは、一本鎖ＲＮＡｉ分子の活性が実証された（例えばMatsui et al. (2016), Molecular Therapy, accepted article preview online February 23 2016; doi: 10.1038/mt.2016.39を参照）。そして、アンチセンス分子は、何十年にもわたり特定の標的遺伝子の発現を低下させるために使用されている。これらの構造の共通のテーマにおける多数の変形形態が、様々な標的に関して開発されている。本発明のβ−カテニン及びｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、上記構造のいずれか及び文献に記載されるそれらの変形形態を基礎とするものであり得る。またβ−カテニン及びｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、例えば米国特許出願公開第２００９／００９９１１５号に記載される分子も含まれる。
【００４３】
一般的に、核酸インヒビター分子のヌクレオチドサブユニットの多くは、ヌクレアーゼに対する耐性又は免疫原性の低下のような分子の様々な特性を改善するように修飾される（例えば、Bramsen et al. (2009), Nucleic Acids Res., 37, 2867-2881を参照）。特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子の全てのヌクレオチドが修飾されている。特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子のほぼ全てのヌクレオチドが修飾されている。特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子の半分より多くのヌクレオチドが修飾されている。特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子の半分より少ないヌクレオチドが修飾されている。特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子のどのヌクレオチドも修飾されていない。修飾はオリゴヌクレオチド鎖上に群をなして存在していてもよく、又は種々の修飾されたヌクレオチドが散在していてもよい。
【００４４】
多くのヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドの分野で使用されている。糖部、ホスホエステル結合、及び核酸塩基を含むヌクレオチドの任意の部分で修飾がなされ得る。ヌクレオチド修飾の一般的な例には、限定されるものではないが、２’−フルオロシトシン、２’−Ｏメチルシトシン、及び５−メチルシトシンが含まれる。特定の実施形態においては、本発明の核酸インヒビター分子は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。一般的に、該核酸インヒビター分子は、４つ以下のデオキシリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、本発明の核酸インヒビター分子は、１つ以上のリボヌクレオチドを含む。
【００４５】
特定の実施形態においては、糖部の環構造が修飾されており、限定されるものではないが、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Koshkin et al. (1998), Tetrahedron 54, 3607-3630を参照）及びアンロックド核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Snead et al. (2013), Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2, e103 (doi: 10.1038/mtna.2013.36)を参照）が含まれる。
【００４６】
上記オリゴヌクレオチドの５’末端は、しばしば修飾された位置である。特定の実施形態においては、本発明の核酸インヒビター分子のオリゴヌクレオチドの５’末端にはヒドロキシル基が結合されている。特定の実施形態においては、本発明の核酸インヒビター分子のオリゴヌクレオチドの５’末端にはリン酸基が結合されている。特定の実施形態においては、その５’末端は、リン酸基の静電特性及び立体特性を模倣する化学的部分（「リン酸模倣体」）に結合されている（例えば、Prakash et al. (2015), Nucleic Acids Res., advance access published March 9, 2015 (doi: 10.1093/narlgkv162）を参照）。５’末端に結合され得る多くのリン酸模倣体が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号を参照）。オリゴヌクレオチドの５’末端のためにその他の修飾が開発されている（例えば、国際公開第２０１１／１３３８７１号を参照）。
【００４７】
β−カテニン核酸インヒビター分子
本明細書に開示されるように、β−カテニン核酸インヒビター分子は、β−カテニン関連疾患又は障害、例えば癌の治療のためにＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と組み合わされ得る。本発明者らは、これらの組み合わせがそれぞれの作用物質の個別の投与と比較して相乗効果を奏し得ることを実証した。
【００４８】
β−カテニン核酸インヒビター分子は、例えば米国特許出願公開第２０１５／０２９１９５４号及び同第２０１５／０２９１９５６号、並びに米国特許第６，０６６，５００号、同第８，１９８，４２７号、同第８，８３５，６２３号又は同第９，２４３，２４４号に開示されるように知られており、それらの上記β−カテニン核酸インヒビター分子の開示は、引用することにより本出願の一部をなす。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、米国特許第９，２４３，２４４号に開示される分子である。
【００４９】
特定の実施形態においては、本発明のβ−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、該分子の二本鎖領域の長さが１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記二本鎖領域の長さは、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記二本鎖領域の長さは、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、又は２６ヌクレオチドである。
【００５０】
特定の実施形態においては、本発明のβ−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、そのセンス鎖の長さが１８ヌクレオチドから６６ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記センス鎖の長さは、２５ヌクレオチドから４５ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記センス鎖の長さは、３０ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記センス鎖の長さは、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、又は４０ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、上記センス鎖の長さは、２５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記センス鎖の長さは、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、又は２７ヌクレオチドである。
【００５１】
特定の実施形態においては、本発明のβ−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、そのアンチセンス鎖の長さが１８ヌクレオチドから６６ヌクレオチドの間である。一般的に、上記アンチセンス鎖は、上記核酸インヒビター分子の効果を標的遺伝子に向けるために、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的である配列を含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、上記標的遺伝子のｍＲＮＡ中に含まれる配列と完全に相補的である配列であって、その完全に相補的な配列の長さが１８ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である、配列を含む。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記アンチセンス鎖の長さは、２０ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖の長さは、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖の長さは、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、又は２８ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖の長さは、３５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記アンチセンス鎖の長さは、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、又は３９ヌクレオチドである。
【００５２】
特定の実施形態において、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに１８ヌクレオチドから３４ヌクレオチドの間の二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖の長さは２５ヌクレオチド〜３４ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖の長さは２６ヌクレオチド〜３８ヌクレオチドであり、かつ該アンチセンス鎖は、その３’末端に１個〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に１個〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、かつその５’末端に５個〜１２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含み、かつその５’末端に１０個の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００５３】
特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに２６ヌクレオチドの二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖の長さが２６ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖の長さが３８ヌクレオチドであり、かつその３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含み、かつその５’末端に１０個の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００５４】
特定の実施形態においては、本発明のβ−カテニン核酸インヒビター分子は、ｓｓＲＮＡｉインヒビター分子である。
【００５５】
特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号２の配列を含む。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号２の配列からなる。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号１の配列を含む。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号１の配列からなる。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号１の配列を含み、かつそのアンチセンス鎖は、配列番号２の配列を含む。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖は、配列番号１の配列からなり、かつ上記アンチセンス鎖は、配列番号２の配列からなる。
【００５６】
β−カテニンＲＮＡの濃度又は活性は、当該技術分野で現在知られる適切な方法又は後に開発される適切な方法によって測定することができる。標的ＲＮＡ及び／又は標的遺伝子の「発現」の測定のために使用される方法は、標的遺伝子及びそのコードされるＲＮＡの性質に依存し得るものと認識され得る。例えば、標的β−カテニンＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合には、用語「発現」は、β−カテニン遺伝子（ゲノム由来又は外来由来のいずれか）から得られるタンパク質又はβ−カテニンのＲＮＡ／転写物を指し得る。そのような場合に、標的β−カテニンＲＮＡの発現は、β−カテニンＲＮＡ／転写物の量を直接計測するか、又はβ−カテニンタンパク質の量を計測することにより測定することができる。タンパク質は、タンパク質アッセイにおいて、例えば染色若しくはイムノブロッティングによって、又は該タンパク質が計測可能な反応を触媒する場合には、反応速度を計測することにより計測することができる。全てのそのような方法は、当該技術分野で知られており、使用することができる。標的β−カテニンＲＮＡ濃度が測定される場合、当該技術分野で認識されるＲＮＡ濃度の検出方法を使用することができる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等）。β−カテニンＲＮＡのターゲティングにおいて、被験体、組織、細胞中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの、又は細胞抽出物中のβ−カテニンＲＮＡ又はタンパク質の濃度の低下における上記核酸インヒビター分子の効力の測定を使用して、β−カテニン関連表現型（例えば、疾患又は障害、例えば癌又は腫瘍形成、成長、転移、伝播等）の低下の程度を測定することができることも認識される。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、又はその他の適切な起源の材料に対して行われ得る。
【００５７】
ＭＥＫインヒビター
本明細書で記載される場合に、用語「ＭＥＫ」は、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼキナーゼ酵素ＭＥＫ１及び／又はＭＥＫ２を指す。ＭＥＫはまた、ＭＡＰ２Ｋ及びＭＡＰＫＫとしても知られる。ＭＥＫは、特定の癌、例えば黒色腫において活性化されているＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードの一員である。その経路は、多数の成長因子及びサイトカインの細胞表面上の受容体への結合により活性化され、それらは受容体チロシンキナーゼを活性化する。受容体チロシンキナーゼの活性化は、ＲＡＳの活性化をもたらし、それは次いでＲＡＦを動員し、ＲＡＦはまた多数のリン酸化イベントにより活性化される。
【００５８】
活性化されたＲＡＦは、ＭＥＫキナーゼをリン酸化及び活性化させ、そのＭＥＫキナーゼはまたＥＲＫキナーゼ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ「ＭＡＰＫ」としても知られる）をリン酸化及び活性化する。次いで、リン酸化されたＥＲＫは核に移動することができ、そこで該ＥＲＫは、様々な転写因子、例えばｃ−Ｍｙｃ及びＣＲＥＢを直接的又は間接的にリン酸化及び活性化する。この過程は、細胞成長及び増殖のために重要な遺伝子の遺伝子転写の改変をもたらす。
【００５９】
ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードにおける関連として、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２は、腫瘍形成、細胞増殖、及びアポトーシスの阻害において重要な役割を担う。ＭＥＫ１／２自体はめったに突然変異されないが、試験された原発腫瘍細胞系統の３０％超において構成的に活性なＭＥＫが見出される。このカスケードを止める方法の１つは、ＭＥＫの阻害である。ＭＥＫが阻害されると、細胞増殖は妨げられ、アポトーシスが誘導される。したがって、ＭＥＫの阻害は、薬物療法の開発のための魅力的な標的である。
【００６０】
ＭＥＫインヒビターには、限定されるものではないが、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、セルメチニブ、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、コビメチニブ（ＸＬ５１８）、レファメチニブ（ＢＡＹ  ８６−９７６６）、ピマセルチブ、ＰＤ−３２５９０１、ＲＯ５０６８７６０、ＣＩ−１０４０（ＰＤ０３５９０１）、ＡＺＤ８３３０（ＡＲＲＹ−４２４７０４）、ＲＯ４９８７６５５（ＣＨ４９８７６５５）、ＲＯ５１２６７６６、ＷＸ−５５４、Ｅ６２０１、及びＴＡＫ−７３３が含まれる。１つの実施形態においては、上記ＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。
【００６１】
トラメチニブは、小分子キナーゼインヒビターであり、単独の作用物質として、又はダブラフェニブと組み合わせて、ＢＲＡＦ遺伝子にＶ６００Ｅ突然変異又はＶ６００Ｋ突然変異を有する切除不可能な又は転移性の黒色腫を伴う被験体の治療に使用するために承認されている。ＢＲＡＦは、Ｂ−Ｒａｆと呼ばれる、細胞内シグナル伝達に関与するセリン／トレオニンキナーゼをコードする。
【００６２】
ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子
上記ｃ−Ｍｙｃ遺伝子は、細胞成長及び分化の主要な分子調節因子である。ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、コンセンサス配列（エンハンサーボックス配列（Ｅ−ボックス））の結合及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の動員により多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子である。ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、転写リプレッサーとしても作用し得る。Ｍｉｚ−１転写因子に結合し、ｐ３００コアクチベーターを追い出すことにより、Ｍｙｃは、Ｍｉｚ−１標的遺伝子の発現を阻害する。さらに、ＭｙｃはＤＮＡ複製の制御において直接的な役割を果たす（Dominguez-Sola et al. Nature 448 (7152): 445-51）。
【００６３】
Ｗｎｔ、Ｓｈｈ及びＥＧＦを含む様々なマイトジェンシグナル伝達経路（ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を介する）は、ｃ−Ｍｙｃを活性化すると実証されている。ｃ−Ｍｙｃのその標的遺伝子の発現の調節における役割は、多くの生物学的効果を引き起こすことであると示されている。最初に見つけられたのは、その細胞増殖を駆動する能力（サイクリンを上方調節し、ｐ２１を下方調節する）であったが、ｃ−Ｍｙｃはまた、細胞成長（リボソームＲＮＡ及びタンパク質を上方調節する）、アポトーシス（ＢｃＩ−２を下方調節する）、分化、及び幹細胞自己再生の調節に重要な役割も担っている。ｃ−Ｍｙｃは、強力な癌原遺伝子であり、その上方調節は、多くの癌の型において記載されている。ｃ−Ｍｙｃ過剰発現は、ＤＮＡ過剰複製を伴うと考えられる機構を介して、遺伝子増幅を刺激する（Denis et al. Oncogene 6 (8): 1453-7）。
【００６４】
本明細書に開示されるように、β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と組み合わされ得る。先で論じられたように、様々なオリゴヌクレオチド構造が核酸インヒビター分子として使用されており、それらは当該技術分野で知られている。特定のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、例えば米国特許出願公開第２０１４／０１０７１７８号及び同第２００９／００９９１１５号に開示されるように知られており、それらの上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子の開示は、引用することにより本出願の一部をなす。
【００６５】
特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、米国特許出願公開第２０１４／０１０７１７８号に開示される分子である。
【００６６】
特定の実施形態においては、本発明のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、該分子の二本鎖領域の長さが１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記二本鎖領域の長さは、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記二本鎖領域の長さは、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、又は２６ヌクレオチドである。
【００６７】
特定の実施形態においては、本発明のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、そのセンス鎖の長さが１８ヌクレオチドから６６ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記センス鎖の長さは、２５ヌクレオチドから４５ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記センス鎖の長さは、３０ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記センス鎖の長さは、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、又は４０ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、上記センス鎖の長さは、２５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記センス鎖の長さは、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、又は２７ヌクレオチドである。
【００６８】
特定の実施形態においては、本発明のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、そのアンチセンス鎖の長さが１８ヌクレオチドから６６ヌクレオチドの間である。一般的に、上記アンチセンス鎖は、上記核酸インヒビター分子の効果を標的遺伝子に向けるために、標的遺伝子のｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的である配列を含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、上記標的遺伝子のｍＲＮＡ中に含まれる配列と完全に相補的であり、その完全に相補的な配列の長さが１８ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である配列を含む。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記アンチセンス鎖の長さは、２０ヌクレオチドから５０ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖の長さは、２０ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの間である。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖の長さは、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、又は２８ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖の長さは、３５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間である。それらの実施形態の幾つかにおいては、上記アンチセンス鎖の長さは、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、又は３９ヌクレオチドである。
【００６９】
特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに１８ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間の二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖の長さは２５ヌクレオチド〜３４ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖の長さは２６ヌクレオチド〜３８ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖は、その３’末端に１個〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に１個〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、かつその５’末端に５個〜１２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含み、かつその５’末端に１０個の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００７０】
特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに２６ヌクレオチドの二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖の長さが２６ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖の長さが３８ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖は、その３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含み、かつ上記アンチセンス鎖は、その５’末端に１０個の一本鎖ヌクレオチドを含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖並びに２５ヌクレオチドの二本鎖領域を含むｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖の長さが２５ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖の長さが２７ヌクレオチドであり、かつ上記アンチセンス鎖は、その３’末端に２個の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００７１】
特定の実施形態においては、本発明のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｓｓＲＮＡｉインヒビター分子である。
【００７２】
特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号４の配列を含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号４の配列からなる。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号３の配列を含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号３の配列からなる。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号３の配列を含み、かつそのアンチセンス鎖は、配列番号４の配列を含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、上記センス鎖は、配列番号３の配列からなり、かつ上記アンチセンス鎖は、配列番号４の配列からなる。図８を参照のこと。
【００７３】
その他の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号６の配列を含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子のアンチセンス鎖は、配列番号６の配列からなる。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号５の配列を含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号５の配列からなる。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号５の配列を含み、かつそのアンチセンス鎖は、配列番号６の配列を含む。特定の実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、かつそのセンス鎖は、配列番号５の配列からなり、かつそのアンチセンス鎖は、配列番号６の配列からなる。図９を参照のこと。
【００７４】
特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子がリガンドに結合されると、標的となる腫瘍への該核酸インヒビター分子の送達に向けられる。使用され得るリガンドには、限定されるものではないが、抗体、ペプチド、小分子、及び炭水化物が含まれる。特定の実施形態においては、上記リガンドは、葉酸塩、ＲＧＤペプチド、ＰＳＭＡ結合性リガンド（例えば、国際公開第２０１０／０４５５９８号を参照）、トランスフェリン（例えば、Yhee et al. (2013), Bioconjugate Chem., 24, 1850-1860を参照）、又はアプタマー（例えば、Dassie (2013), Ther Deliv, 4(12): 1527-1546を参照）であり得る。
【００７５】
特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子は、核酸ターゲティング分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーに共有結合されることで、腫瘍ターゲティングが達成される。特定の実施形態においては、核酸インヒビター分子は、上記ターゲティング核酸分子に、核酸リンカーにより結合される。特定の実施形態においては、上記核酸インヒビター分子及び上記ターゲティング核酸分子の１つの鎖は、連続的なオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態においては、上記ターゲティング核酸分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子の２つの鎖を連結する。
【００７６】
ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡの濃度又は活性は、当該技術分野で現在知られる適切な方法又は後に開発される適切な方法によって測定することができる。標的ＲＮＡ及び／又は標的遺伝子の「発現」の測定のために使用される方法は、標的遺伝子及びそのコードされるＲＮＡの性質に依存し得るものと認識され得る。例えば、標的ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合には、用語「発現」は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子（ゲノム由来又は外来由来のいずれか）から得られるタンパク質又はｃ−ＭｙｃのＲＮＡ／転写物を指し得る。そのような場合に、標的ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡの発現は、ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡ／転写物の量を直接計測するか、又はｃ−Ｍｙｃタンパク質の量を計測することにより測定することができる。タンパク質は、タンパク質アッセイにおいて、例えば染色若しくはイムノブロッティングによって、又は該タンパク質が計測可能な反応を触媒する場合には、反応速度を計測することにより計測することができる。全てのそのような方法は、当該技術分野で知られており、使用することができる。標的ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡ濃度が測定される場合、当該技術分野で認識されるＲＮＡ濃度の検出方法を使用することができる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等）。ｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡのターゲティングにおいて、被験体、組織、細胞中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの、又は細胞抽出物中のｃ−Ｍｙｃ  ＲＮＡ又はタンパク質の濃度の低下における上記核酸インヒビター分子の効力の測定を使用して、ｃ−Ｍｙｃ関連表現型（例えば、疾患又は障害、例えば癌又は腫瘍形成、成長、転移、伝播等）の低下の程度を測定することができることも認識される。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、又はその他の適切な起源の材料に対して行われ得る。
【００７７】
医薬組成物
本開示は、β−カテニン核酸インヒビター分子及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態においては、β−カテニン核酸インヒビター分子及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物は、ＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現を低下させる核酸インヒビター分子を更に含む。
【００７８】
本開示において有用な薬学的に許容可能な賦形剤は、慣用の賦形剤である。Remington's Pharmaceutical Sciences、E. W. Martin著、Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、ワクチンを含む１種以上の治療用組成物及び追加の医薬品作用物質の医薬品送達のために適した組成物及び製剤を記載している。適切な医薬品用賦形剤には、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。一般に、上記賦形剤の性質は、使用される特定の投与様式に依存することとなる。例えば、非経口用製剤は、通常は、薬学的に及び生理学的に許容可能な流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩溶液、バッファー、水性デキストロース、グリセロール等をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固形組成物（例えば、粉剤、丸剤、錠剤又はカプセル剤の形）のためには、慣用の非毒性の固形賦形剤には、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、表面活性剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含み得る。特定の実施形態においては、上記薬学的に許容可能な賦形剤は、天然に存在しない賦形剤である。
【００７９】
本明細書に開示される特定の実施形態による医薬組成物は、少なくとも１種の崩壊剤、少なくとも１種の希釈剤、及び／又は少なくとも１種の結合剤を含む、同じ又は異なる賦形剤のカテゴリーに属し得る少なくとも１種の成分を含み得る。
【００８０】
本明細書に開示される実施形態による医薬組成物に添加され得る少なくとも１種の崩壊剤の典型的な非限定的な例には、限定されるものではないが、ポビドン、クロスポビドン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、ホルムアルデヒド−カゼイン、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８１】
本明細書に開示される実施形態による医薬組成物に添加され得る少なくとも１種の希釈剤の典型的な非限定的な例には、限定されるものではないが、マルトース、マルトデキストリン、ラクトース、フルクトース、デキストリン、微結晶セルロース、アルファ化デンプン、ソルビトール、スクロース、ケイ化微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、マンニトール、リン酸カルシウム、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８２】
本明細書に開示される実施形態による医薬組成物に添加され得る少なくとも１種の結合剤の典型的な非限定的な例には、限定されるものではないが、アラビアゴム（acacia：アカシア）、デキストリン、デンプン、ポビドン、カルボキシメチルセルロース、グァーガム、グルコース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリメタクリレート、マルトデキストリン、ヒドロキシエチルセルロース、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００８３】
本明細書に開示される医薬組成物の好適な調製形態としては、例えば錠剤、カプセル、軟カプセル、顆粒、粉末、懸濁液、エアロゾル、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、単位投薬形態、リング、フィルム、坐剤、溶液、クリーム、シロップ、経皮パッチ、軟膏又はゲルが挙げられる。
【００８４】
上記β−カテニン核酸インヒビター分子及び／又は上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、例えばリポソーム及び脂質、例えば米国特許第６，８１５，４３２号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８５８，２２５号、同第７，８１１，６０２号、同第７，２４４，４４８号、及び同第８，１５８，６０１号に開示されるもの、ポリマー材料、例えば米国特許第６，８３５，３９３号、同第７，３７４，７７８号、同第７，７３７，１０８号、同第７，７１８，１９３号、同第８，１３７，６９５号、及び米国特許出願公開第２０１１／０１４３４３４号、同第２０１１／０１２９９２１号、同第２０１１／０１２３６３６号、同第２０１１／０１４３４３５号、同第２０１１／０１４２９５１号、同第２０１２／００２１５１４号、同第２０１１／０２８１９３４号、同第２０１１／０２８６９５７号、及び同第２００８／０１５２６６１号に開示されるもの、カプシド、カプソイド、又は摂取、分配若しくは吸収を補助するための受容体を標的とする分子を含む、その他の分子、分子構造物、又は化合物の混合物と混合され、それらでカプセル化され、それらと結合され、さもなければそれらと会合され得る。
【００８５】
特定の実施形態においては、上記核酸インヒビター分子は、脂質ナノ粒子中で製剤化される。脂質−核酸ナノ粒子は一般的に、脂質と核酸とを混合して複合体が形成されることで自然形成する。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、任意にポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通じて、例えばサーモバレル押出機、例えばＬｉｐｅｘ押出機（Northern Lipids, Inc社）を使用して押し出され得る。治療用途の脂質ナノ粒子を調製するためには、ナノ粒子の形成に使用される溶剤（例えば、エタノール）及び／又は交換バッファーを除去することが望ましい場合があり、それは、例えば透析若しくはタンジェンシャルフロー濾過により達成することができる。核酸インヒビター分子を含む脂質ナノ粒子の製造方法は、例えば米国特許出願公開第２０１５／０３７４８４２号及び同第２０１４／０１０７１７８号に開示されているように、当該技術分野で知られている。
【００８６】
特定の実施形態においては、ＬＮＰは、カチオン性リポソーム及びペグ化脂質を含むリポソームを含む。ＬＮＰは、１種以上のエンベロープ脂質、例えばカチオン性脂質、構造脂質、ステロール、ペグ化脂質、又はそれらの混合物を更に含み得る。
【００８７】
ＬＮＰにおいて使用するためのカチオン性脂質は、例えば米国特許出願公開第２０１５／０３７４８４２号及び同第２０１４／０１０７１７８号で論じられているように、当該技術分野で知られている。一般的に、上記カチオン性脂質は、生理学的ｐＨで正味正電荷を有する脂質である。特定の実施形態においては、上記カチオン性リポソームは、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＬ−０４８、又はＤＬ−１０３である。特定の実施形態においては、上記構造脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、又はＤＯＰＣである。特定の実施形態においては、上記ステロールは、コレステロールである。特定の実施形態においては、上記ペグ化脂質は、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＧ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＧ−ＰＥＧ２Ｋ、又はＤＳＧ−ＭＰＥＧである。１つの実施形態においては、上記カチオン性脂質はＤＬ−０４８であり、上記ペグ化脂質はＤＳＧ−ＭＰＥＧであり、かつ上記１種以上のエンベロープ脂質は、ＤＬ−１０３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ−ＭＰＥＧである。
【００８８】
これらの医薬組成物は、慣用の滅菌技術により滅菌され得るか、又は濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、又は凍結乾燥され得て、凍結乾燥された調剤は、投与前に滅菌水性担体と合わされる。該調剤のｐＨは一般に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間、又は６から８の間であり、最も好ましくは７から８の間であり、例えば７〜７．５であるものとする。固体形で得られる組成物は、固定量の上述の１種以上の作用物質をそれぞれ含む複数の単一投与単位で、例えば錠剤又はカプセル剤の密封包装において包装され得る。固体形の組成物はまた、フレキシブルな量のための容器中で、例えば局所適用可能なクリーム剤又は軟膏剤のために設計された絞り出し可能なチューブ中に包装され得る。
【００８９】
特定の実施形態においては、本明細書に記載される医薬組成物は、β−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するための医薬組成物である。特定の実施形態においては、β−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するための医薬組成物は、β−カテニン核酸インヒビター分子を含み、その際、該組成物は、ＭＥＫインヒビター（例えば、トラメチニブ）と組み合わせて投与される。その他の実施形態においては、β−カテニン関連疾患又は障害の治療において使用するための医薬組成物は、β−カテニン核酸インヒビター分子を含み、その際、該組成物は、ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と組み合わせて投与される。特定の実施形態においては、上記β−カテニン関連疾患又は障害は、癌、例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、又は黒色腫である。特定の実施形態においては、上記β−カテニン関連癌は転移したものである。特定の実施形態においては、上記β−カテニン関連癌は転移した結腸直腸癌である。特定の実施形態においては、上記結腸直腸癌は肝臓に転移したものである。
【００９０】
投与／処置の方法
一般的に、本発明の核酸インヒビター分子は、静脈内投与又は皮下投与される。しかしながら、本明細書に開示される医薬組成物はまた、当該技術分野で既知の、例えば経口、頬粘膜、舌下、直腸、経膣、尿道内、局所、眼内、鼻内、及び／又は耳介内を含むあらゆる方法により投与され得て、その投与には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁液剤、ゲル剤、スプレー剤、坐剤、膏剤、軟膏剤等が含まれ得る。また投与は、注射を介して、例えば腹腔内、筋内、皮内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内等での注射を介して行われ得る。
【００９１】
本明細書に開示される化合物の治療的有効量は、投与経路及び患者の身体特性、例えば全身状態、体重、日常の飲食、及びその他の薬物治療に依存し得る。本明細書で使用される場合に、治療的有効量は、治療される被験体の疾患又は状態症状を予防、緩和又は改善するために有効な１種以上の化合物の量を意味する。治療的有効量の測定は、十分に当業者の能力の範囲内であり、一般的に１患者当たりの用量につき約０．５ｍｇから約３０００ｍｇまでの１種以上の小分子作用物質の範囲である。
【００９２】
１つの態様においては、本明細書に開示される医薬組成物は、β−カテニン関連疾患又は障害に関連する症状の治療又は予防のために有用であり得る。１つの実施形態は、β−カテニン関連疾患又は障害を治療する方法であって、被験体に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビターを投与することを含む、方法に関する。もう１つの実施形態は、β−カテニン関連疾患又は障害を治療する方法であって、被験体に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を投与することを含む、方法に関する。
【００９３】
一般的に、上記核酸インヒビター分子は、その核酸インヒビター分子と組み合わされる小分子治療薬とは個別に、かつそれとは異なるスケジュールで投与される。例えば、単一の作用物質として使用される場合に、トラメチニブは、１日経口用量（一般的に、約１ｍｇ／日〜２ｍｇ／日）と現在定められている。他方で、上記核酸インヒビター分子は、静脈内経路又は皮下経路を通じて、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月毎に１回、１年に２回等で与えられる用量で投与される傾向がある。上記被験体は、核酸インヒビター分子の投与開始時点で既に小分子治療薬を摂取している場合がある。その他の実施形態においては、上記被験体は、小分子治療薬及び核酸インヒビター分子の両方の投与をほぼ同時に開始し得る。その他の実施形態においては、上記被験体は、核酸インヒビター分子の投与開始後に小分子治療薬を摂取し始めてもよい。
【００９４】
本明細書に開示される治療方法のための特定の実施形態においては、一方の医薬組成物は、β−カテニン核酸インヒビター分子を含み得て、別個の医薬組成物は、ＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を含み得る。
【００９５】
その他の実施形態においては、β−カテニン核酸インヒビター分子は、ＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子と同時に投与され得る。
【００９６】
したがって、本明細書に開示される治療方法のための特定の実施形態においては、単一の医薬組成物は、β−カテニン核酸インヒビター分子、及びＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子の両方を含み得る。このように、本明細書に開示される治療方法の１つの実施形態においては、単一の医薬組成物が被験体に投与され、その際、該単一の医薬組成物は、β−カテニン核酸インヒビター分子、及びＭＥＫインヒビター、例えばトラメチニブの両方を含む。本明細書に開示される治療方法のもう１つの実施形態においては、上記単一の医薬組成物は、β−カテニン核酸インヒビター分子、及びｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子の両方を含む。
【００９７】
特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、１日につき受容者の体重１キログラム当たりに２０マイクログラム〜１０ミリグラムの、１キログラム当たりに１００マイクログラム〜５ミリグラムの、１キログラム当たりに０．２５ミリグラム〜２．０ミリグラムの、又は１キログラム当たりに０．５ミリグラム〜２．０ミリグラムの投与量で投与される。
【００９８】
特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、１日１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、四半期に１回、１年に２回、又は１年に１回で投与される。特定の実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、２日毎に、３日毎に、４日毎に、５日毎に、６日毎に、又は７日毎に１回又は２回で投与される。上記組成物（両方の作用物質又は単一の個別の作用物質を含む）は、１ヶ月に１回、１週間に１回、１日に１回（ＱＤ）、１日置きに１回で、又は１ヶ月用量、１週間用量若しくは１日用量を複数に分けて、例えば１日に２回、１日に３回、若しくは２週間毎に１回投与され得る。特定の実施形態においては、上記組成物は、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、又は少なくとも７日間にわたり１日１回で投与され得る。上記作用物質は同時に投与され得るが、一般的にそれぞれの作用物質は、特にそれらの作用物質が異なる経路で投与される場合には異なるスケジュールで投与されることとなる。
【００９９】
その一方で、血中の治療的有効な濃度を維持するのに十分な連続的な静脈内注入も検討される。当業者であれば、限定されるものではないが、疾患又は障害の重症度、前処置、該被験体の全身の健康及び／又は年齢若しくは体重、並びにその他の現症を含む特定の要素が、被験体を効果的に治療するために必要とされる投与量及びタイミングに影響を及ぼし得るものと認識するであろう。
【０１００】
治療的有効量の作用物質による被験体の治療は、単回の処置を含み得るか、又は好ましくは一連の処置を含み得る。特定の実施形態においては、その治療スケジュールは、一般的により高い投与量又は頻度である初回負荷投与又は段階に引き続き、一般的に該負荷投与／段階よりも低い投与量又は頻度である維持投与又は段階を含む。一般的に、上記処置は、疾患の進行又は許容することができない毒性が生ずるまで続ける。
【０１０１】
特定の実施形態においては、上記β−カテニン又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、発現構築物、例えばウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、又はプラスミドウイルスベクター中に、例えば当該技術分野で既知の方法を使用して挿入され得る。発現構築物は、例えば吸入により、経口的に、静脈注射により、局所投与により（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、又は定位的注入により（例えば、Chen et al.(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,3054-3057を参照）被験体に送達され得る。
【０１０２】
上記発現構築物は、適切な発現系で使用するために適した構築物であり得て、該発現構築物には、限定されるものではないが、当該技術分野で既知のレトロウイルスベクター、線状発現カセット、プラスミド、及びウイルスベクター又はウイルス由来ベクターが含まれる。そのような発現構築物には、１種以上の誘導可能なプロモーター、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターシステム、例えばＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、若しくはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又は当該技術分野で既知のその他のプロモーターが含まれ得る。該構築物は、ｓｉＲＮＡの一方の鎖又は両方の鎖を含み得る。両方の鎖を発現する発現構築物は、両方の鎖を連結するループ構造を含んでもよく、又はそれぞれの鎖は、同じ構築物内で別個のプロモーターから別々に転写されてもよい。それぞれの鎖は、別個の発現構築物から転写されてもよい（例えば、Tuschl（2002, Nature Biotechnol 20: 500-505））。
【０１０３】
１つの態様は、β−カテニン関連疾患又は障害を治療する方法であって、被験体（好ましくは、ヒト）に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビター又はｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を投与することを含む、方法に関する。
【０１０４】
１つの実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である。それらの実施形態の幾つかにおいては、そのセンス鎖は、配列番号１の配列を含むか又は該配列からなり、かつそのアンチセンス鎖は、配列番号２の配列を含むか又は該配列からなる。１つの実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、脂質ナノ粒子を用いて製剤化される。１つの実施形態においては、上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、静脈内投与される。
【０１０５】
１つの実施形態においては、上記治療方法は、被験体（好ましくは、ヒト）に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のＭＥＫインヒビターを投与することを含む。１つの実施形態においては、上記ＭＥＫインヒビターはトラメチニブである。１つの実施形態においては、トラメチニブは経口投与される。１つの実施形態においては、トラメチニブは、毎日又は一日置きに約１ｍｇ〜２ｍｇの投与量で投与される。１つの実施形態においては、トラメチニブは、毎日２ｍｇの投与量で投与される。
【０１０６】
１つの実施形態においては、上記ＭＥＫインヒビターは、経口投与されるトラメチニブであり、かつ上記β−カテニン核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子であり、ここで該分子の二本鎖領域の長さは１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチドの間であり、上記ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子は、例えばセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸を含み、ここで該センス鎖は、配列番号１の配列を含むか又は該配列からなり、かつ該アンチセンス鎖は、配列番号２の配列を含むか又は該配列からなる。上記β−カテニンｄｓＲＮＡｉインヒビター分子は、脂質ナノ粒子を用いて製剤化され得て、静脈内投与され得る。
【０１０７】
もう１つの実施形態においては、上記治療方法は、被験体（好ましくは、ヒト）に治療的有効量のβ−カテニン核酸インヒビター分子、及び治療的有効量のｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子を投与することを含む。
【０１０８】
１つの実施形態においては、上記ｃ−Ｍｙｃ核酸インヒビター分子は、ｄｓＲＮＡｉインヒビター分子である。それらの実施形態の幾つかにおいては、そのセンス鎖は、配列番号３の配列を含むか又は該配列からなり、かつそのアンチセンス鎖は、配列番号４の配列を含むか又は該配列からなる。もう１つの実施形態においては、該センス鎖は、配列番号５の配列を含むか又は該配列からなり、かつ該アンチセンス鎖は、配列番号６の配列を含むか又は該配列からなる。１つの実施形態においては、上記ｃ−ＭｙｃのｄｓＲＮＡｉインヒビター分子は、脂質ナノ粒子を用いて製剤化される。１つの実施形態においては、上記ｃ−ＭｙｃのｄｓＲＮＡｉインヒビター分子は、静脈内投与される。
【０１０９】
これらの治療方法の特定の実施形態においては、上記β−カテニン関連疾患又は障害は、癌、例えば結腸直腸癌、肝細胞癌、又は黒色腫であり、かつ上記被験体は、β−カテニン遺伝子中に突然変異を有する。その他の実施形態においては、上記被験体は、β−カテニン遺伝子（又はＷｎｔシグナル伝達経路における別の遺伝子、例えばＡＰＣ）及びＫＲＡＳ遺伝子中の突然変異を特徴とする結腸直腸癌を伴う。特定の実施形態においては、該被験体は、ＢＲＡＦ突然変異を有する。特定の実施形態においては、上記被験体は、ＢＲＡＦ突然変異及びＷｎｔシグナル伝達経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＡＰＣ）中の突然変異を有する。トラメチニブがＭＥＫインヒビターとして投与される特定の実施形態においては、上記被験体は、ＢＲＡＦ突然変異（例えば、Ｖ６００Ｅ又はＶ６００Ｆ）を有する。特定の実施形態においては、該ＢＲＡＦ突然変異を有する被験体は、黒色腫を伴う。
【０１１０】
これらの治療方法の特定の実施形態においては、上記β−カテニン関連癌は転移したものである。特定の実施形態においては、上記β−カテニン関連癌は転移した結腸直腸癌である。特定の実施形態においては、上記結腸直腸癌は肝臓に転移したものである。特定の実施形態においては、上記治療は、被験体において、限定されるものではないが肝臓における転移を含む転移を減少させる。特定の実施形態においては、β−カテニン核酸インヒビター分子、例えばｄｓＲＮＡｉインヒビター分子及びＭＥＫインヒビター、例えばトラメチニブの組み合わせによる治療は、β−カテニン核酸インヒビター分子又はＭＥＫインヒビターのいずれかで（組み合わせではなく個別に）処置を受けた転移した癌を伴う患者の平均生存を上回って、上記被験体の生存を増大させる。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：ＢＣＡＴ１構築物
β−カテニン遺伝子を標的とする核酸インヒビター分子を構築した（「ＢＣＡＴ１」）。ＢＣＡＴ１は、２６塩基対のパッセンジャー鎖と３８塩基対のガイド鎖とを有し、それらは２６塩基対からなる二本鎖領域を形成する（図７）。上記パッセンジャー鎖の５’末端は、１０塩基対の一本鎖突出からなり、かつ上記ガイド鎖の３’末端は、２塩基対の一本鎖突出からなる（図７）。
【０１１２】
ＢＣＡＴ１構築物を、ＥｎＣｏｒｅ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した。ＬＮＰで製剤化されたＢＣＡＴ１は、核酸搭載物を、皮下異種移植腫瘍、同所性異種移植腫瘍、播種性異種移植腫瘍、及び転移性異種移植腫瘍、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）、並びに遺伝子組換えモデル（ＧＥＭ）を含む多数の腫瘍型（以下の表Ｉを参照）に効果的に送達した。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
実施例２：腫瘍研究
６週齢〜８週齢のＨｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス（ここに、ヌードマウスと呼称する）に、ＬＳ４１１Ｎ（５×１０６個の細胞）、ＳＷ４０３（５×１０６個の細胞）、Ｌｓ１７４ｔ（５×１０６個の細胞）又はＨｅｐ３Ｂ（５×１０６個の細胞＋マトリゲル）を右肩下に皮下注射した。腫瘍成長／抑制を監視するために、腫瘍容積を１週間に２回測定した。投与は腫瘍が２００ｍｍ３〜２５０ｍｍ３に達したときに開始した。腫瘍成長阻止研究のために、動物を無作為化し、異なるコホートに割り当て、投与サイクルに供した。ＢＣＡＴ１又はＬＮＰを、外側尾静脈を介して１０ｍｌ／ｋｇの総容量で静脈内投与した。トラメチニブを、１０ｍｌ／ｋｇの容量で経口投与した。
【０１１５】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝臓転移モデルを、腹部正中切開後にヌードマウスの脾臓中に１×１０６個〜２×１０６個の細胞を外科手術的に移植することにより作製した。外科手術後に、その腹部切開を５−０〜６−０の吸収性の非ブレイド縫合糸で閉じ、皮膚は単一の創傷クリップで閉じた。外科手術の開始前、そして外科手術の間に、マウスをイソフルランにより麻酔した。疼痛軽減のために手術前及び手術後に、ブプレノルフィンを０．１ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。マウスを、病原体不含環境において保持し、そして動物に関わる全ての手順は、Dicerna Pharmaceuticals社の動物実験委員会（Ｄｉｃｅｒｎａ−ＩＡＣＵＣ）により承認されたプロトコルに従って実施した。
【０１１６】
ヒト細胞系統ＬＳ４１１Ｎ及びＳＷ４０３、Ｌｓ１７４ｔ及びＨｅｐ３ＢをＡＴＣＣ（バージニア州、マナサス）から取得し、１０％ＦＢＳを補ったＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ＬＳ４１１Ｎは、結腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）及びＢＲＡＦ遺伝子中に突然変異を有するヒト結腸直腸細胞系統である。ＡＰＣは、Ｗｎｔシグナル伝達経路における破壊複合体の１構成要素である（図１を参照）。ＳＷ４０３は、ＡＰＣ及びＫＲＡＳ遺伝子中に突然変異を有するヒト結腸直腸細胞系統である。ＬＳ１７４ｔは、ＣＴＮＮＢ１及びＫＲＡＳ遺伝子中に突然変異を有するヒト結腸直腸細胞系統である。
【０１１７】
実施例３：Ｗｎｔ活性腫瘍において有効なＢＣＡＴ１
ＢＣＡＴ１の単一作用物質の効力を、種々の結腸直腸癌モデルにおいて種々の用量水準で評価した。１週間に２回の投与サイクル（ｑｄｘ３、１ｍｇ／ｋｇ）の後に、ＢＣＡＴ１は、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍において、ビヒクル処置された動物に対して８２％の腫瘍成長阻止をもたらした（図２Ａ）。投与計画を１週間に１回の投与（ｑｗｘ１、３ｍｇ／ｋｇ）に変えた場合に、腫瘍成長阻止は６０％へと僅かに低下した（図２Ｂ）。それは、これらの腫瘍を効果的に治療するために、より積極的な投与計画が必要であることを示唆している。それらのマウスをより低い用量水準（ｑｄｘ３、０．３ｍｇ／ｋｇ）で処置した場合に、腫瘍成長阻止は４７％へと更に減少した。それにより、精密な用量応答が裏付けられる（図２Ｃ）。治療が２回目のサイクル（ｑｄＸ３、３ｍｇ／ｋｇ）後に中断されたコホートにおいては、腫瘍成長は、未処置の被験体とほぼ同等の水準にまで戻った（図２Ｄ）。それは、β−カテニンの長期抑制がこのモデルにおいて効力の維持のために必要とされることを示唆している。何らかの理論により縛られることを意図するものではないが、処置が止められたときに、Ｗｎｔ経路が再活性化されているように見える。
【０１１８】
ＢＣＡＴ１は、Ｗｎｔ活性化を伴うその他のＣＲＣ腫瘍において力強い効力を裏付けた。力強い効力は、ＳＷ４０３細胞（図３Ａ）及びＬｓ１７４ｔ細胞（図３Ｂ）においてｑｄｘ３、３ｍｇ／ｋｇの用量水準（２サイクル）でも裏付けられた。β−カテニン／ＡＰＣ野生型ＲＫＯ腫瘍（図３Ｃ）においては、同じ用量水準では効力は観察されなかった。それは、その腫瘍成長阻止が活性化されたＷｎｔシグナル伝達を必要とすることを示唆し、こうして標的依存性が確認される。
【０１１９】
実施例４：ＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせは、相乗的効力を媒介する
ＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビター（トラメチニブ）による組み合わせ療法を評価した。トラメチニブ（９９％純度）をＤＭＳＯ中に溶かして、５ｍｇ／ｍｌの澄明な溶液を作製した。この溶液を、溶剤混合物（１０％のエタノール、１０％のクレモホール、８０％の水）中で希釈して、種々の希釈物を作製した。組み合わせ研究で使用されるビヒクルは、トラメチニブ用量におけるＤＭＳＯ濃度に合わせるために、ＰＢＳ中の１０％のＤＭＳＯからなる。
【０１２０】
組み合わせ療法の評価の前に、トラメチニブ単独の効力を結腸直腸癌において試験した。まずＬＳ１７４ｔ腫瘍を有するマウスを、トラメチニブを用いて３ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量水準で４日間にわたり経口処置し、腫瘍成長の監視をした（図４Ａ）。その効力データに基づき、ＢＣＡＴ１と組み合わせて使用するための用量として０．３ｍｇ／ｋｇを選んだ。これらの腫瘍における単一作用物質のＢＣＡＴ１の効力研究に基づき、トラメチニブと組み合わせて使用するための用量として３ｍｇ／ｋｇを選んだ。この組み合わせにより、ＬＳ１７４ｔ腫瘍を有するマウスは、単一作用物質の処置のどちらと比較しても効果的に治療された（９０％を超える成長阻止）（図４Ｂ）。ＢＣＡＴ１及びＭＥＫインヒビターによる組み合わせ療法は、処置された腫瘍において、単一作用物質で処置された腫瘍と比較して大幅なＭＹＣの下方調節も引き起こした（図４Ｃ）。
【０１２１】
次いで、単一作用物質のトラメチニブを、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍を有するマウスにおいて種々の用量水準（３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇ）で評価し、組み合わせ研究において使用するための用量として０．１ｍｇ／ｋｇを選んだ（図５Ａ）。ＢＣＡＴ１に関して、先の単一作用物質の効力研究から、トラメチニブと組み合わせて使用してＬＳ４１１Ｎ腫瘍を治療するために０．１ｍｇ／ｋｇの用量を選んだ。驚くべきことに、ＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせは、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍において０．１ｍｇ／ｋｇという低い用量で、単一作用物質の処置群（それぞれ約２０％の成長阻止）のどちらと比較しても相乗的な抗腫瘍効果（８０％より大きい成長阻止）をもたらす（図５Ｂ）。
【０１２２】
組み合わせ治療を、ＡＰＣ及びＫＲＡＳの突然変異を有する第３のＣＲＣモデル（ＳＷ４０３）においても評価した。その他の２つのモデルについて記載されたように、まず、これらの腫瘍において単一作用物質のトラメチニブの効力を種々の用量水準で確認し、組み合わせ研究のために最適な用量として０．３ｍｇ／ｋｇを選んだ（図５Ｃ）。ＢＣＡＴ１を同じ用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）で投与し、トラメチニブと組み合わせて使用した。再び、その合理的な組み合わせは、０．３ｍｇ／ｋｇという低い用量で、それぞれの作用物質を単独で投与した場合の２０％（ＢＣＡＴ１）及び４０％（トラメチニブ）の阻止と比較して９０％を超える腫瘍成長阻止で相乗的効力をもたらした（図５Ｄ）。
【０１２３】
これらのＣＲＣモデルにおいて、腫瘍は概して、時間の経過とともにトラメチニブに対する耐性を生ずる。この耐性を調査するために、ＳＷ４０３腫瘍を、トラメチニブにより３ｍｇ／ｋｇの用量（ｑｄｘ３、３ｍｇ／ｋｇ×３）で該腫瘍がその処置に応答しなくなるまで連続的に処置した。該腫瘍が応答しなくなり、トラメチニブ処置に対して耐性になったら、その腫瘍をＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせ（ｑｄｘ３、３ｍｐｋ＋  ｑｄｘ３、３ｍｐｋ）で処置した（およそ４２日目）。驚くべきことに、トラメチニブ処置に対して応答しなかった腫瘍は、該組み合わせ処置に対しては見事に応答し、そして結果として、処置群の平均腫瘍容積は、該組み合わせ処置後の数日以内で６０％だけ減少した。また、上記処置群におけるどの単発性腫瘍も、腫瘍容積の劇的な減少を伴って上記組み合わせ処置に応答した（図５Ｅ及び図５Ｆ）ことは興味深いことであった。これらの腫瘍が、第１回目の組み合わせ処置が適用されたときとほぼ同じサイズにまで成長してから、組み合わせ療法の第２回目を適用した（およそ６０日目）。興味深いことに、これらの腫瘍は、第１回目の組み合わせ処置後に見られたのと同じ程度まで再び応答した。それは、ＢＣＡＴ１／トラメチニブの組み合わせが、トラメチニブ単独で処置された腫瘍により発生された耐性に対処し、したがって二重の経路の活性化を伴うＣＲＣ患者においてとても大きな臨床的有益性をもたらすことを示唆している。
【０１２４】
実施例５：ＣＴＮＮＢ１及びＭＹＣの組み合わせ阻害
ＢＣＡＴ１及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子を標的とする核酸インヒビター分子（「ＭＹＣ１」）による組み合わせ療法も評価した。ＭＹＣ１は、２５塩基対のパッセンジャー鎖及び２７塩基対のガイド鎖を有し、それらの鎖は２５塩基対からなる二本鎖領域を形成し、ここで上記パッセンジャー鎖の３’末端及び上記ガイド鎖の５’末端は平滑末端を形成し、かつ上記ガイド鎖の３’末端は、一本鎖の２塩基の突出からなる（図９）。ＭＹＣ１構築物を、ＥｎＣｏｒｅ  ＬＮＰ中で製剤化した。
【０１２５】
３ｍｇ／ｋｇの投与量でのＢＣＡＴ１及びＭＹＣ１の単一作用物質の効力を、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍を有するＰＤＸマウスモデルにおいて評価した（図６Ａ及び図６Ｂ）。それぞれ１ｍｇ／ｋｇの投与量で組み合わせた場合に、ＢＣＡＴ１及びＭＹＣ１により、個別に２ｍｇ／ｋｇで投与されたＭＹＣ１及びＢＣＡＴ１（それぞれ４０％及び４７％の成長阻止）と比較して、力強い抗腫瘍効力（８６％）が裏付けられた（図６Ｃ）。
【０１２６】
実施例６：ＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせによる肝臓転移の治療
二重の経路活性化を有する皮下腫瘍におけるＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせを評価することに加えて、この組み合わせを、ＣＲＣ肝臓転移を有するマウスにおいても評価した。ＣＲＣの初発転移部位は肝臓であり、ＣＲＣ患者のほとんどは、主としてＣＲＣ肝臓転移が原因で死亡すると報告されている。
【０１２７】
Ｌｓ１７４ｔ及びＬＳ４１１Ｎ細胞を脾臓中に外科手術的に移植することにより、多数のＣＲＣ肝臓転移モデルを開発した。２×１０６個の細胞を移植してから２週間〜５週間後に、脾臓中で成長した原発Ｌｓ１７４ｔ腫瘍は、自発的に肝臓へと転移した。ＢＣＡＴ１単独療法が原発腫瘍及び転移性腫瘍の両方を治療して、生存を改善するかどうかを確認するために、腫瘍移植から２週間後に、Ｌｓ１７４ｔ腫瘍を有するマウスを、ＢＣＡＴ１又はプラセボにより３ｍｇ／ｋｇの用量（ｑｄｘ３、３ｍｇ／ｋｇ、３サイクル）で処置した。図１１Ａに示されるように、ＰＢＳ又はプラセボ処置を受けた全てのマウスは４２日目に死亡したが、ＢＣＡＴ１処置を受けたマウスは、より長い期間にわたり生存した。対照処置群の平均生存期間（「ＭＳＴ」）は３１日であるが、ＢＣＡＴ１処置群のＭＳＴは４６日である）。
【０１２８】
同様に、ＬＳ４１１Ｎ肝臓転移を有するマウスも、ＢＣＡＴ１又は対照（プラセボ又はＰＢＳ）により同じ用量水準で３週間にわたり処置した。Ｌｓ１７４ｔ腫瘍とは異なり、ＬＳ４１１Ｎ腫瘍では、脾臓中に２×１０６個の細胞を移植した後に肝臓に転移するまでにより長い時間がかかった。その処置は、脾臓中でのＬＳ４１１Ｎ細胞の移植から１８日後に開始した。対照処置されたマウスが全て死亡するまでには１１２日間かかった。しかしながら、ＢＣＡＴ１単独療法は、ＬＳ４１１Ｎ肝臓転移を有するマウスの生存を、対照処置群と比較して有意に改善した。その際、移植１１２日後にＢＣＡＴ１処置されたマウスの７５％が生存している（図１１Ｂ）。ＢＣＡＴ１処置されたマウスが全て死亡するまでには約６ヶ月間かかった。まとめると、ＢＣＡＴ処置は、ＬＳ４１１Ｎ肝臓転移を有するマウスの生存を、対照処置群と比較して２倍まで延長した（ＰＢＳ／プラセボ処置群のＭＳＴは９９日〜１０２日であるが、ＢＣＡＴ１処置群のＭＳＴは１８１日である）。
【０１２９】
これらのＣＲＣ転移モデルでの組み合わせ方略を評価する前に、Ｌｓ１７４ｔ肝臓転移モデルにおいて単一作用物質のトラメチニブの効力研究を実行した。腫瘍進行の侵襲性を低下させるために、このモデルではより少ない数のＬｓ１７４ｔ細胞（１×１０６個の細胞）を脾臓中に移植した。移植から１８日後に、マウスを無作為に３つの群に分配し、ＰＢＳ、１ｍｇ／ｋｇのトラメチニブ、又は３ｍｇ／ｋｇの用量水準のトラメチニブ（ｑｄｘ３、３サイクル）により処置した。図１１Ｃに示されるように、より低い用量のトラメチニブ（１ｍｇ／ｋｇ）は、ＰＢＳ処置群と比較して生存においてあまり大きな有益性を示さなかったが（４７日対５４日のＭＳＴ）、より高い用量のトラメチニブ（３ｍｇ／ｋｇ）は、ＰＢＳ処置群と比較して生存を有意に延長した（６５日のＭＳＴ）。
【０１３０】
次いで、Ｌｓ７１４ｔ肝臓転移を有するマウスにおいては、単一作用物質での効力研究で使用された用量に基づいて組み合わせ効力研究を実行した。今回は、その処置は、２×１０６個のＬｓ１７４ｔ細胞の腫瘍移植から３週間後に開始した。ＢＣＡＴ１、プラセボ、及びトラメチニブは、２ｍｇ／ｋｇで投与され、組み合わせ群（プラセボ＋トラメチニブ又はＢＣＡＴ１＋トラメチニブ）は、２＋２ｍｇ／ｋｇで投与された。この場合においては、上記処置が転移プロセスの開始の十分に後に開始され、かつ用量水準がわずかに減少されたので、単一作用物質処置のそれぞれは、生存において少しの改善しか示さなかった。両方の対照群（プラセボ及びＰＢＳ）におけるマウスは全て、４４日以内には死亡した（３７日の生存期間中央値）。ＢＣＡＴ１、トラメチニブ、又はプラセボ及びトラメチニブの処置のいずれかを行ったマウスの９０％は、およそ４８日目で死亡した（４５日、４４日又は４２日の生存期間中央値）。これらの群のそれぞれにおける１匹のマウスは少し長く生存し、６４日目に死亡した。際だったことに、ＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせは、劇的な生存的有益性をもたらした（７４日の生存期間中央値）。その際、２匹のマウスは、１００日間にわたり生存し、１匹のマウスは、２００日間にわたり生存した。したがって、進行した肝臓転移を有するマウスは、ＢＣＡＴ１及びトラメチニブの合理的な組み合わせにより効果的に治療された。このように、ＢＣＡＴ１及びトラメチニブの組み合わせは、二重の経路活性化を伴う転移性ＣＲＣ患者に対してとても大きな臨床的有益性をもたらす。
【０１３１】
特に指摘されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される全ての数は、示されるか否かにかかわらず、全ての場合において用語「約」により修飾されると理解されるべきである。全ての範囲及び特定された任意の端点の範囲内の部分範囲と同様に、本明細書及び特許請求の範囲で使用される正確な数値も、本開示の追加の実施形態を形成することも理解されるべきである。さらに、複数の工程が開示される場合に、明示的に述べられていない限り、それらの工程はその順序で実施される必要はないことに留意されるものとする。
【０１３２】
その他の実施形態は、本明細書及び本開示の実施を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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