(57)【要約】  水、アルギネート、グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）、および無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクルを含むハイドロゲル。該ハイドロゲルは骨修復および／または再生に使用され得る。【選択図】図１
2019535444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、
アルギネート、
グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）、および
無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクル
を含むハイドロゲル。
【請求項２】
請求項１に記載の注入可能ハイドロゲル。
【請求項３】
マイクロパーティクルが、マイクロパーティクルの重量に対して０．１重量％未満のＧＤＬを平均して含有する、請求項１または請求項２に記載のハイドロゲル。
【請求項４】
マイクロパーティクルが、マイクロパーティクルの重量に対して０．０１重量％未満のＧＤＬを平均して含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項５】
６５〜９７．５重量％の水を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項６】
０．５〜５ｗ／ｖ％のアルギネートを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項７】
０．００１〜１ｗ／ｖ％のＧＤＬを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項８】
１〜２０ｗ／ｖ％のマイクロパーティクルを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項９】
全体で１〜２０ｗ／ｖ％の組換えゼラチンを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１０】
全体で０．０１〜１０ｗ／ｖ％の無機カルシウム化合物を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１１】
撹拌時に流動状になり静止時に再凝固する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１２】
ａ．１〜２０ｗ／ｖ％のマイクロパーティクル、
ｂ．０．０１〜１０ｗ／ｖ％の無機カルシウム化合物、
ｃ．０．０１〜１ｗ／ｖ％のＧＤＬ、および
ｄ．０．５〜５ｗ／ｖ％のアルギネート
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１３】
ゼラチンがアミノ酸を含み、組換えゼラチンの６０アミノ酸の各組の少なくとも８％がグルタミン酸および／またはアスパラギン酸である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１４】
ゼラチンが少なくとも５の等電点を有する組換えゼラチンである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１５】
ゼラチンが少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む組換えゼラチンである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１６】
ゼラチンが少なくとも２個のリシン残基を含む組換えゼラチンであり、前記リシン残基が末端リシン残基であり、第１の末端リシン残基がゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の末端リシン残基がゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記末端リシン残基がゼラチンのアミノ酸残基の全数の少なくとも２５パーセントで隔てられている、請求項１から１５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１７】
ゼラチンが少なくとも２個のアミノ酸残基を含む組換えゼラチンであり、前記２個のアミノ酸残基がアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から独立に選択される末端アミノ酸残基であり、第１のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基がポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、第２の末端アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基がポリペプチドのＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、前記末端アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基が組換えゼラチンポリペプチド中のアミノ酸の全数の少なくとも２５パーセントで隔てられている、請求項１から１５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１８】
ゼラチンが２重量％未満のグリコシル化を含む組換えゼラチンである、請求項１から１７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項１９】
ゼラチンが架橋組換えゼラチンである、請求項１から１８のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２０】
ゼラチンがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、カルボジイミド、シアナミドで、および／または脱水素熱処理によって架橋されている、請求項１９に記載のハイドロゲル。
【請求項２１】
アルギネートがアルギン酸ナトリウムである、請求項１から２０のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２２】
滅菌状態である、請求項１から２１のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２３】
グルコン酸をさらに含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２４】
マイクロパーティクルが１μｍ〜１０００μｍの平均径を有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２５】
マイクロパーティクルが実質的に球形である、請求項１から２４のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２６】
無機カルシウム化合物が炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、フッ化カルシウム、フルオロリン酸カルシウム、クロロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、セラミックス、酸化カルシウム、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸カルシウム、珪化カルシウム、酢酸カルシウム、二相性リン酸カルシウム、またはこれらの２個以上の組合せを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２７】
無機カルシウム化合物と組換えゼラチンの重量比が１００：１と１：１００の間である、請求項１から２６のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２８】
無機カルシウム化合物と組換えゼラチンの重量比が３：２と２：３の間である、請求項１から２７のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項２９】
ＳＯ３２−、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｓｒ２＋、Ｓｉ４＋、Ｚｎ２＋、ＳｉＯ４４−および／またはＨＰＯ４２−イオンをさらに含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３０】
合成ポリマー、天然ポリマー、薬学的に活性がある化合物、増殖因子、タンパク質、架橋剤および天然骨成分などの１つまたは複数の成分をさらに含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３１】
ゼラチンがグルタミン酸およびアスパラギン酸を含み、前記組換えゼラチンの各連続する６０アミノ酸におけるグルタミン酸およびアスパラギン酸の合計量の標準偏差（ＳＤＥＤ）分布が最大１．３０である、請求項１から３０のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３２】
注入可能ハイドロゲルである、請求項１から３１のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３３】
マイクロパーティクルがＧＤＬを実質的に含まない、請求項１から３２のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３４】
無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクルが、無機カルシウム化合物の粒子を含有する組換えゼラチンマイクロパーティクルの形態である、請求項１から３３のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３５】
無機カルシウム化合物が粒子の形態であり、無機カルシウム化合物の粒子が組換えゼラチン粒子内にランダムに分布している、請求項１から３４のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３６】
ヒトまたは動物の体の骨の中に請求項１から３５のいずれか一項に記載のハイドロゲルを注入することを含む、ヒトまたは動物の体の処置方法。
【請求項３７】
医薬品としておよび／または治療において使用するための請求項１から３５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３８】
骨修復および／または再生において使用するための請求項１から３５のいずれか一項に記載のハイドロゲル。
【請求項３９】
骨修復および／または再生において使用するための医薬品を製造するための、請求項１から３５のいずれか一項に記載のハイドロゲルの使用。
【請求項４０】
組換えゼラチンの存在下で無機カルシウム化合物を沈殿させ、無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクルを形成させるステップ、およびこのように形成されたマイクロパーティクルを水、アルギネート、およびＧＤＬを含む組成物と混合するステップを含む、ハイドロゲルの調製方法。
【請求項４１】
ＧＤＬの少なくとも一部分を加水分解して、グルコン酸を形成させるステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
密閉容器またはアンプルおよび請求項１から３５、３７または３８のいずれか一項に記載のハイドロゲルを含む医薬品であって、ハイドロゲルが密閉容器またはアンプル中に存在する、前記医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に骨修復または骨再生に使用することができるハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ２０１３／０７７７３９（‘７３９）は、５０μｍと３００μｍの間のサイズを有するリン酸カルシウムマイクロパーティクルを含むセメントを記載する。これらのマイクロパーティクルはグルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）を含有する。セメントが生理的環境中に存在するとき、リン酸カルシウムマイクロパーティクル内のＧＤＬは加水分解し、マイクロパーティクルから出て、マイクロパーティクル中に隙間を残す。このように形成された多孔質マイクロパーティクルは、その後、骨再生において使用され得る。Ｙａｎらは、Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｅｎｇ  Ｃ  Ｂｉｏｌ  Ａｐｐｌ、２０１６に、ゼラチンマイクロスフェアと組み合わせた注入可能アルギネート／ハイドロキシアパタイトゲル足場を記載している。これらの足場はＣａＣＯ３およびＧＤＬを使用して架橋される。Ｙａｎらにおいて記載されたマイクロスフェアは無機カルシウム化合物を含まない。その代わり、Ｙａｎらにおいては、ゼラチン粒子と無機化合物粒子とは別個の実体である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第一の態様によれば、
水、
アルギネート、
グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）、および
無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクル
を含むハイドロゲルが提供される。
【０００４】
本明細書中で使用される用語「含む」は、言及されるパーツ、ステップまたは構成成分の存在を指定するものとして解釈されるべきであるが、１つまたは複数の他のパーツ、ステップまたは構成成分の存在を排除するわけではない。
【０００５】
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、文脈が１個および唯一の要素が存在することを明らかに必要としない限り、２個以上の要素が存在する可能性を排除するわけではない。したがって不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通常「少なくとも１個」を意味する。
【０００６】
好ましくは、ハイドロゲルは注入可能ハイドロゲルである。
ハイドロゲルは、アルギネート由来の親水性ポリマー鎖のネットワークを典型的に含む。ハイドロゲルはゼリー様として記載され得、’７３９中に記載されたセメントとは非常に異なる。典型的にハイドロゲルは、水、ＧＤＬおよびマイクロパーティクルを三次元ゲルネットワーク中に取り込む。ハイドロゲルは、一部分はその著しい含水率のため、天然組織と非常に類似した一定の柔軟性を有することが好ましい。任意選択でハイドロゲルはチキソトロピーハイドロゲルである、すなわち、それは撹拌時に流動状になり静止時に再凝固する。
【０００７】
ハイドロゲルは、６５〜９７．５重量％、より好ましくは７５〜９７重量％、特に８５〜９７重量％の量の水を含むことが好ましい。含水率は、既知の重量のハイドロゲルを乾燥させ、ハイドロゲルの初期重量に対する重量消失を測定することによって簡単に測定され得る。
【０００８】
アルギネートは、アルギン酸、アルギン酸の誘導体、またはその塩、例えばアルギン酸、アルギン酸の誘導体のカリウム、カルシウム、アンモニウム、リチウムもしくは好ましくはナトリウム塩、またはこれらの２個以上を含む混合物であることが好ましい。アルギネートは商業的供給元から入手可能であり、典型的には海藻に由来する。アルギネートは生体適合性であり、低い毒性を有し、水を吸収することによって容易にハイドロゲルを形成する。
【０００９】
好ましくは、アルギネートは、３２，０００〜４００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは５０，０００〜３００，０００ｇ／ｍｏｌ、特に７５，０００〜２２０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量（Ｍｗ）を有する。
【００１０】
アルギン酸の誘導体は、アルギネート中に存在するカルボン酸基で脂肪族アルコールをエステル化することによって典型的に形成される、アルキル基、好ましくは長鎖アルキル基（例えば、ドデシルまたはオクタデシル基）を含むことが好ましい。これらのアルギネート誘導体は、半希釈状態において、物理的に架橋された、ゲル様ネットワークの典型的なレオロジー特性を示すことが多い。
【００１１】
アルギネートは、異なる配列またはブロック中で一緒に共有結合した、それぞれ（１−４）結合β−Ｄ−マンヌロネート（Ｍ）およびそのＣ−５エピマーα−Ｌ−グルロネート（Ｇ）残基のホモポリマーブロックを有する直鎖状コポリマーを含む、アニオン性多糖を典型的に含む。モノマーは、連続Ｇ−残基（Ｇ−ブロック）、連続Ｍ−残基（Ｍ−ブロック）または交互ＭおよびＧ−残基（ＭＧ−ブロック）のホモポリマーブロックで現れ得る。
【００１２】
アルギネートは非常に細胞適合性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでゆっくりと再吸収され、カルシウムおよびバリウムなどのイオン部分の存在下でゲル化する注入可能材料として充分機能する。カルシウムにより架橋されたアルギネートを含む本発明のハイドロゲルは、ｉｎ  ｖｉｖｏでゆっくりと分解する。
【００１３】
ハイドロゲルの粘度は、ポリマーの分子量、ゲル中のカルシウムの濃度、またはアルギネートポリマー中に存在するグルロン酸（Ｇ−残基）のパーセンテージによって制御され得る。
【００１４】
本発明のハイドロゲルは、０．５〜５ｗ／ｖ％、より好ましくは１％〜３％の量のアルギネートを含むことが好ましい。
ハイドロゲルの粘度は、ｐＨが低下するにつれて典型的に増大し、アルギネート中のカルボキシレート基がプロトン化された状態になり水素結合を形成するとき、約ｐＨ３〜３．５で最大値に達する。好ましくは、ハイドロゲルは５〜１０、特に６〜８のｐＨを有する。
【００１５】
任意選択で、ハイドロゲルは１種または複数種の水溶性有機溶媒、例えばエタノールを含有する。存在する有機溶媒の量は、ハイドロゲル形成を妨げないように選択される。しかしながら、好ましくは、ハイドロゲルは有機溶媒を含まない。
【００１６】
ＧＤＬはグルコン酸の環状エステルであり、以下の構造を有する：
【００１７】
【化１】
2019535444.tif 000003
【００１８】
水に溶けると、ＧＤＬは加水分解を経てグルコン酸の生成をもたらす。グルコン酸はカルシウムイオンを放出し、次いでアルギネート中の酸性基と架橋してハイドロゲルの形成をもたらす。放出されるカルシウムイオンの量は、ハイドロゲル中のＧＤＬ濃度を含めた幾つかの要因に依存する。
【００１９】
典型的には、水の存在下に放置すると、約５５〜６６％のＧＤＬがｉｎ  ｓｉｔｕで加水分解してグルコン酸を形成する。ハイドロゲルは、０．００１〜１ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜０．８および特に０．０１〜０．５ｗ／ｖ％の合計量でＧＤＬとグルコン酸を含むことが好ましい。したがって、ＧＤＬの一部がｉｎ  ｓｉｔｕで加水分解してグルコン酸を形成する事実を考慮すると、ハイドロゲル中に存在するＧＤＬの量は、好ましくは０．００００１〜０．５ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０００５〜０．４ｗ／ｖ％および特に０．００４〜０．２ｗ／ｖ％である。さらに、ハイドロゲル中に存在するグルコン酸の量は、好ましくは０．００００２〜０．７ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０００５〜０．５ｗ／ｖ％および特に０．００５〜０．４ｗ／ｖ％である（遊離酸として計算、マイクロパーティクル由来の如何なるカルシウムカウンターイオンも無視）。
【００２０】
ハイドロゲル中に存在するＧＤＬの好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、特に少なくとも９５％、および最も好ましくは全てが、水中に溶解されている。
【００２１】
好ましくは、ハイドロゲルは、ハイドロゲルの全ての構成成分と同様に、滅菌状態である。
マイクロパーティクルの好ましいサイズは、それらの目的とする用途、例えば骨領域にマイクロパーティクルを注入するために使用されるニードルのサイズにある程度依存する。しかしながら、典型的には、マイクロパーティクルは１μｍ〜２，０００μｍ、より好ましくは１μｍ〜１，０００μｍ、特に５μｍ〜５００μｍ、とりわけ１０μｍ〜１００μｍの平均径を有する。またマイクロパーティクルは、多孔質足場またはスポンジを小さなパーツに粉砕することによって形成され得、または乳化のような特異的プロセスもしくはマイクロフルイダイザーの使用によって直接形成され得る。好ましくは、マイクロパーティクルは実質的に球形（例えば、マイクロスフェア）であるが、卵形状またはポテト形状を含めた他の形状が可能である。
【００２２】
ハイドロゲルは、好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは２〜１０ｗ／ｖ％、最も好ましくは３〜８ｗ／ｖ％の量のマイクロパーティクルを含む。ハイドロゲルが治療用（例えば、修復および／または再生用）に使用されることを目的とする場合、好ましくは、マイクロパーティクルは、天然の骨のミネラル組成と類似した、またはそれと同じミネラル組成を有する。
【００２３】
好ましくは、マイクロパーティクルは、１００：１と１：１００の間、より好ましくは１０：１と１：１０の間、およびさらにより好ましくは５：１と１：５の間の、無機カルシウム化合物と組換えゼラチンの比を有する。最も好ましい無機カルシウム化合物と組換えゼラチンの比は３：２〜２：３である。無機カルシウム化合物と組換えゼラチンの比を選択することによって、無機カルシウム化合物によって与えられる骨再生の化学的な手がかりを犠牲にせず、優れたマイクロパーティクルの安定性が達成され得る。
【００２４】
好ましくは、マイクロパーティクルは、マイクロパーティクルの全重量に対して、０．１ｗｔ％未満、より好ましくは０．０５ｗｔ％未満、特に０．０１ｗｔ％未満の平均ＧＤＬ含有率を有する。最も好ましくは、マイクロパーティクルは、ＧＤＬを含まない。
【００２５】
無機カルシウム化合物は、任意選択で、ゼラチンに加えられてもよく、または例えばカルシウムとカルボネート、スルホネートもしくはホスフェート源を組み合わせ、組換えゼラチンの存在下で沈殿させることによって、組換えゼラチンの存在下で形成させてもよい。
【００２６】
無機カルシウム化合物は１つまたは複数のカルシウム化合物を含み得る。例えば、有用なカルシウム化合物としては、非限定的に、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、フッ化カルシウム、フルオロリン酸カルシウム、クロロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、セラミックス、酸化カルシウム、第一リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸カルシウム、珪化カルシウム、酢酸カルシウム、および二相性リン酸カルシウム、ならびにこれらの２個以上の組合せが挙げられる。
【００２７】
無機カルシウム化合物は微粒子の形態、例えば結晶の形態であることが好ましい。無機カルシウム化合物の粒子は、１ｎｍ〜５０μｍの平均粒径を有することが好ましい。核形成が溶液中でランダムに起こる均質な核形成とは対照的に、不均質に核形成される無機カルシウム化合物は、組換えゼラチンのアスパラギン酸基および／またはグルタミン酸基由来のカルボン酸基とカルシウムイオンの初期会合によって形成され得る。生成する粒子は典型的には結晶であり、これらの結晶はｉｎ  ｖｉｖｏで骨内でさらに成長し、それによってコラーゲンと無機カルシウム化合物とが密接に結合されるヒトの骨を模倣し得る。
【００２８】
マイクロパーティクルおよび／またはハイドロゲルは、他の賦形剤を任意選択でさらに含む。このようなさらなる賦形剤の例としては、合成および天然ポリマー、薬学的に活性がある化合物、増殖因子（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ））、他のタンパク質（例えば、フォリスタチン）、架橋剤および天然骨成分がある。
【００２９】
無機カルシウム化合物はＣａＣＯ３、特に組換えゼラチンの存在下での炭酸カルシウムの沈殿または混合によって得られたＣａＣＯ３であることが好ましい。好ましい実施形態では、マイクロパーティクルは、ＣａＣＯ３と組換えゼラチンとを含む混合物の共沈殿を含む方法によって得られる。
【００３０】
好ましくは、無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクルは、無機カルシウム化合物の粒子を含有する組換えゼラチンマイクロパーティクルの形態である。例えば、無機カルシウム化合物は粒子の形態であり、無機カルシウム化合物の粒子は組換えゼラチン粒子内にランダムに分布する。
【００３１】
ハイドロゲル中に存在する無機カルシウム化合物の量は、好ましくは０．０１１〜１０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜９ｗ／ｖ％、特に０．１〜８．５ｗ／ｖ％、さらに特に０．５〜８．４ｗ／ｖ％、およびとりわけ０．５〜８．３ｗ／ｖ％である。好ましくは、カルシウムの少なくとも一部分は、アルギネート中に存在するカルボキシ基と架橋する。
【００３２】
マイクロパーティクル中に存在する賦形剤の量は、ハイドロゲルの体積に対して、好ましくは０．０００１および１０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．００１〜９ｗ／ｖ％、特に０．００５〜８ｗ／ｖ％である。
【００３３】
組換えゼラチンは、後で定義されるように最大８％の標準偏差（ＳＤＥＤ）で、連続する（in row）６０アミノ酸あたり少なくとも８％のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸を含むことが好ましい。
【００３４】
連続する６０アミノ酸あたりのグルタミン酸および／またはアスパラギン酸量の％は、それぞれ６０アミノ酸を含有しＮ末端で始まるセグメントに組換えゼラチンを分け、残りは無視して、グルタミン酸（Ｅ）残基および／または（好ましくは「および」）アスパラギン酸（Ｄ）残基の数を６０で割り、結果として得られた数字に１００％を掛け、次いで組換えゼラチンにおける全ての完全な６０の行に関する平均を計算することによって計算され得る。例えば、以下に示される配列番号１の第１行には、３個のＥ（グルタミン酸残基）および３個のＤ（アスパラギン酸残基）が存在し、合計６個のＥおよびＤ残基となり、連続する６０アミノ酸あたりのグルタミン酸およびアスパラギン酸の合計（５％のＥ＋５％のＤ）で（６／６０）×１００＝１０％となる。配列番号１中の全ての完全な６０の行に関してこの計算を反復する場合、以下の表１中に示されるように、連続する６０アミノ酸あたり９．８％ＧＬＵ＋ＡＳＰ量という数字を得る。
【００３５】
好ましくは、組換えゼラチンは、連続する６０アミノ酸あたり少なくとも合計８％のグルタミン酸とアスパラギン酸、より好ましくは、組換えゼラチンのＮ末端で始まる組換えゼラチンの完全な６０アミノ酸の行それぞれにおいて、６０アミノ酸あたり少なくとも合計８％のグルタミン酸とアスパラギン酸を含む。
【００３６】
標準偏差（ＳＤＥＤ）は以下のように決定され得る：ゼラチン鎖は、Ｎ末端で始まりそれぞれ６０アミノ酸を含有するセグメントに分けられ、残りを無視する。これらのセグメントそれぞれに関して、グルタミン酸（Ｅ）とアスパラギン酸（Ｄ）の合計量（一括してｘｉ）が決定され、標準偏差は以下のように計算される：
【００３７】
【数１】
2019535444.tif 000004
【００３８】
ここで
ｎはゼラチン中の６０アミノ酸を含有するセグメントの合計数である；および
ｘｉはそれぞれのセグメントに関するグルタミン酸（Ｅ）とアスパラギン酸（Ｄ）の合計量である；
【００３９】
【数２】
2019535444.tif 000005
【００４０】
好ましくは、標準偏差（ＳＤＥＤ）分布は最大１．３０であり、より好ましくは最大１．１０である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明のハイドロゲル中で使用されるマイクロパーティクルの形態を示す。
【図２−１】図２ａ〜２ｅは、異なるひずみ下でのハイドロゲルのレオロジー挙動およびハイドロゲルの破断を示す。図２ａ〜２ｅにおいて、Ｇ’（四角形のドット）は貯蔵弾性（または弾性）率であり、Ｇｉｉ（三角形のドット）は損失弾性（または粘性）率である。さらなる情報は以下の実施例セクションにおいて提供される。
【図２−２】図２ａ〜２ｅは、異なるひずみ下でのハイドロゲルのレオロジー挙動およびハイドロゲルの破断を示す。図２ａ〜２ｅにおいて、Ｇ’（四角形のドット）は貯蔵弾性（または弾性）率であり、Ｇｉｉ（三角形のドット）は損失弾性（または粘性）率である。さらなる情報は以下の実施例セクションにおいて提供される。
【図２−３】図２ａ〜２ｅは、異なるひずみ下でのハイドロゲルのレオロジー挙動およびハイドロゲルの破断を示す。図２ａ〜２ｅにおいて、Ｇ’（四角形のドット）は貯蔵弾性（または弾性）率であり、Ｇｉｉ（三角形のドット）は損失弾性（または粘性）率である。さらなる情報は以下の実施例セクションにおいて提供される。
【図３−１】図３ａおよび３ｂは、アルギネート、マイクロスフェアおよびＧＤＬで構成されるハイドロゲルのチキソトロピー挙動（ストレス下およびストレス除去後の自己回復下での粘性状態）を示す。図３ａおよび３ｂにおいて、Ｇ’（四角形のドット）は貯蔵弾性（または弾性）率であり、Ｇｉｉ（三角形のドット）は損失弾性（または粘性）率である。さらなる情報は以下の実施例セクションにおいて提供される。
【図３−２】図３ａおよび３ｂは、アルギネート、マイクロスフェアおよびＧＤＬで構成されるハイドロゲルのチキソトロピー挙動（ストレス下およびストレス除去後の自己回復下での粘性状態）を示す。図３ａおよび３ｂにおいて、Ｇ’（四角形のドット）は貯蔵弾性（または弾性）率であり、Ｇｉｉ（三角形のドット）は損失弾性（または粘性）率である。さらなる情報は以下の実施例セクションにおいて提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
組換えゼラチンは非繊維状組換えゼラチンであることが好ましく、天然ゼラチンより低い分子量を有することが好ましい。さらに組換えゼラチンは、鎖に沿って均一に分布したグルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基を含むことが好ましい。好ましくは、組換えゼラチンは、最大１．６の標準偏差で、例えば連続する６０アミノ酸あたり、少なくとも８％のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸の合計量を含む。全リン酸カルシウム（またはより具体的には、ハイドロキシアパタイト）結合能を増大させる目的では、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基の絶対頻度は、好ましくは少なくとも９％、より好ましくは約１０％である。
【００４３】
組換えゼラチンは、１５０ｋＤａ未満、好ましくは１００ｋＤａ未満の平均分子量を有することが好ましい。好ましくは、組換えゼラチンは、少なくとも５ｋＤａ、好ましくは少なくとも１０ｋＤａおよびより好ましくは少なくとも３０ｋＤａの平均分子量を有する。組換えゼラチンの好ましい平均分子量範囲は、５０ｋＤ〜１００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜７５ｋＤａおよび５ｋＤａ〜４０ｋＤａを含む。より低い粘度のためゼラチンのより高い質量濃度が必要とされるとき、より低い分子量が好ましい可能性がある。
【００４４】
組換えゼラチンは、例えばＦＵＪＩＦＩＬＭから商品名ＣｅｌｌｎｅｓｔＴＭの下、市販品として得られ得る。組換えゼラチンは、例えばその内容が参照により本明細書に組み込まれる特許出願ＥＰ０９２６５４３およびＥＰ１０１４１７６中に記載されているように、周知の方法によっても調製され得る。組換えゼラチンを調製するための方法は、刊行物「Ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｌａｔｉｎｓ  ｂｙ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ」、Ｍ．Ｗ．Ｔ．Ｗｅｒｔｅｎら、Ｙｅａｓｔ１５、１０８７〜１０９６頁（１９９９年）中にも記載されている。適切な組換えゼラチンはＷＯ２００４／８５４７３中にも記載されている。
【００４５】
ハイドロゲル中に存在する組換えゼラチンの量は、好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜１０ｗ／ｖ％、特に１．５〜８ｗ／ｖ％である。
一実施形態では、組換えゼラチンは少なくとも２個のリシン残基を含み、前記リシン残基は末端リシン残基であり、第１の末端リシン残基はゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の末端リシン残基はゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記末端リシン残基はゼラチン中のアミノ酸の総数の少なくとも２５パーセントで隔てられている。このような組換えゼラチンは、例えばＵＳ２００９／０２４６２８２中に記載された方法によって得られ得る。
【００４６】
別の実施形態では、ゼラチンは少なくとも２個のアミノ酸残基を含む組換えゼラチンであり、前記２個のアミノ酸残基は末端アミノ酸残基であり、それらはアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から独立に選択され、第１のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基はポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、第２の末端アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基はポリペプチドのＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、前記末端アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基は組換えゼラチンポリペプチド中のアミノ酸の総数の少なくとも２５パーセントで隔てられている。
【００４７】
好ましい実施形態では、組換えゼラチンは優れた細胞接着性を有し、如何なる健康関連リスクも示さないことが好ましい。
組換えゼラチンは、少なくとも５の等電点を有することが好ましい。
【００４８】
好ましくは、組換えゼラチンはＲＧＤ富化組換えゼラチン、例えばアミノ酸の総数に関するＲＧＤモチーフのパーセンテージが少なくとも０．４である組換えゼラチンである。ＲＧＤ富化ゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０アミノ酸の各ストレッチは少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含有することが好ましい。好ましくは、ＲＧＤモチーフのパーセンテージは、少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも１．０、より好ましくは少なくとも１．２および最も好ましくは少なくとも１．５である。０．４というＲＧＤモチーフのパーセンテージは、２５０アミノ酸あたり少なくとも１個のＲＧＤ配列に相当する。ＲＧＤモチーフの数は整数であり、したがって０．４％という特徴を満たすためには、２５１アミノ酸からなるゼラチンは少なくとも２個のＲＧＤ配列を含むはずである。好ましくは、ＲＧＤ富化組換えゼラチンは、２５０アミノ酸あたり少なくとも２個のＲＧＤ配列、より好ましくは２５０アミノ酸あたり少なくとも３個のＲＧＤ配列、最も好ましくは２５０アミノ酸あたり少なくとも４個のＲＧＤ配列を含む。
【００４９】
組換えゼラチンは、少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。さらなる実施形態では、ＲＧＤ富化ゼラチンは、少なくとも４個のＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６個、より好ましくは少なくとも８個、さらにより好ましくは、最大１６個までを含めた少なくとも１２個のＲＧＤモチーフを含む。
【００５０】
本発明中で使用される組換えゼラチンは、コラーゲン様配列由来であることが好ましい。コラーゲンをコードする核酸配列は当技術分野では一般的に記載されている。（例えば、Ｆｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｄｔｋｅｒ（１９８１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０：９９６〜１００６頁；Ｓａｎｄｅｌｌら、（１９８４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２５９：７８２６〜３４頁；Ｋｏｈｎｏら、（１９８４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２５９：１３６６８〜１３６７３頁；Ｆｒｅｎｃｈら、（１９８５年）Ｇｅｎｅ３９：３１１〜３１２頁；Ｍｅｔｓａｒａｎｔａら、（１９９１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２６６：１６８６２〜１６８６９頁；Ｍｅｔｓａｒａｎｔａら、（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ１０８９：２４１〜２４３頁；Ｗｏｏｄら、（１９８７年）Ｇｅｎｅ６１：２２５〜２３０頁；Ｇｌｕｍｏｆｆら、（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ１２１７：４１〜４８頁；Ｓｈｉｒａｉら、（１９９８年）Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７：８５〜８８頁；Ｔｒｏｍｐら、（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ２５３：９１９〜９１２頁；Ｋｕｉｖａｎｉｅｍｉら、（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ２５２：６３３６４０；およびＡｌａ−Ｋｏｋｋｏら（１９８９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ２６０：５０９〜５１６頁を参照）。
【００５１】
ＲＧＤモチーフで富化された組換えゼラチンは、例えばＵＳ２００６／０２４１０３２中に記載された一般的方法によっても調製され得る。
本発明の方法において使用され得る組換えゼラチンの適切な供給源の一例は、ヒトＣＯＬ１Ａ１−１である。ＲＧＤ配列を含む２５０アミノ酸の一部がＷＯ０４／８５４７３中に与えられている。組換えゼラチン中のＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞表面上の特異的受容体に接着することができる。
【００５２】
ＲＧＤ富化ゼラチンは、例えばＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６またはＷＯ０１／３４６３６中、特に言及した最初の２つの特許公開の実施例中に記載された、組換え法によって製造され得る。ＲＧＤ富化組換えゼラチンを製造するのに好ましい方法は、ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンタンパク質の一部をコードする天然核酸配列で開始することを含む。この配列の反復によって、ＲＧＤ富化組換えゼラチンが得られ得る。したがって、組換えゼラチンは、適切な微生物によるこのようなゼラチンをコードする核酸配列の発現によって製造され得る。その方法は、真菌細胞または酵母細胞で適切に実施され得る。宿主細胞は、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のような高発現宿主細胞であることが適切である。真菌および酵母細胞は、反復配列の不適切な発現の影響を受けにくいため、それらは細菌より好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されるゼラチン構造を切断する高レベルのプロテアーゼを有していない。この点において、ピキアまたはハンゼヌラは非常に適切な発現系の一例となる。発現系としてのピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の使用は、ＥＰ０９２６５４３およびＥＰ１０１４１７６中に開示されている。微生物は、特にプロリンのヒドロキシル化およびさらにリシンのヒドロキシル化などの、活性な翻訳後プロセシング機構を有しなくてもよい。あるいは宿主系は、それによって非常に有効な方式でゼラチンがヒドロキシル化される、内在プロリンヒドロキシル化活性を有し得る。
【００５３】
さらなる実施形態では、組換えゼラチンは、天然ゼラチンより低度のグリコシル化、例えば２重量％未満、好ましくは１重量％未満、より好ましくは０．５重量％未満、特に０．２重量％未満、およびさらに特に０．１重量％未満のグリコシル化を有する。好ましい一実施形態では、組換えゼラチンはグリコシル化を有しない。
【００５４】
グリコシル化の程度または重量％は、総炭水化物重量を指す。したがって、組換えゼラチンは、適切な微生物によるそのようなゼラチンをコードする核酸配列の発現によって製造され得る。その方法は、真菌細胞または酵母細胞で適切に実施され得る。宿主細胞は、ハンゼヌラ、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウム、サッカロミセス、クルイベロミセス、ニューロスポラまたはピキアのような高発現宿主細胞であることが適切である。真菌および酵母細胞は、反復配列の不適切な発現の影響を受けにくいため、それらは細菌より好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されるゼラチン構造を切断する高レベルのプロテアーゼを有していない。この点において、ピキアまたはハンゼヌラは非常に適切な発現系の一例となる。発現系としてのピキア・パストリスの使用は、ＥＰ０９２６５４３およびＥＰ１０１４１７６中に開示されている。微生物は、特にプロリンのヒドロキシル化およびさらにリシンのヒドロキシル化などの、活性な翻訳後プロセシング機構を有しなくてもよい。あるいは宿主系は、それによって非常に有効な方式でゼラチンがヒドロキシル化される、内在プロリンヒドロキシル化活性を有し得る。
【００５５】
グリコシル化の程度または重量％は、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）によって、またはＤｕｂｏｉｓによる滴定法によって決定される、ゼラチンの単位重量あたりの総炭水化物重量を指すことが好ましい。用語「グリコシル化」は、単糖だけでなく、多糖、例えば二、三および四糖も指す。
【００５６】
グリコシル化が低度または不在であることを保証するための、様々な方法が存在する。グリコシル化は、翻訳後修飾であり、それにより炭水化物がゼラチンの特定アミノ酸と共有結合する。したがって、アミノ酸配列とアミノ酸配列が生成される宿主細胞（および酵素、特にグリコシルトランスフェラーゼ）の両方が、グリコシル化の程度を決定する。２タイプのグリコシル化が存在する：Ｎ−グリコシル化はアスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）のアミド基へのＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）の結合で始まり、Ｏ−グリコシル化は一般にＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトースアミン）をアミノ酸セリン（ＳもしくはＳｅｒ）またはスレオニン（ＴもしくはＴｈｒ）のヒドロキシル基に結合させる。
【００５７】
したがってグリコシル化は、適切な発現宿主を選択することによって、および／または宿主のグリコシルトランスフェラーゼによって認識されるコンセンサス部位を欠く配列を修飾もしくは選択することによって、制御、および特に低減または予防することができる。ゼラチンの化学合成を使用して、グリコシル化を含まないゼラチンを調製することもできる。さらに、グリコシル化を含む組換えゼラチンを製造後に処理して全部もしくは大部分の炭水化物を除去してもよく、または周知の方法を使用して、非グリコシル化ゼラチンをグリコシル化ゼラチンから分離してもよい。
【００５８】
驚くことに、上記組換えゼラチンは、効率よい核形成および低結晶性無機カルシウム化合物粒子の成長をもたらす。
好ましくは、組換えゼラチンの存在下で無機カルシウム化合物を沈殿させることによって、マイクロパーティクルが得られる。例えば、組換えゼラチンを（例えば、典型的には１％と３０％の間の濃度で）水溶液中に溶かし、（例えば、炭酸またはリン酸を使用して）該溶液を酸性化し、および結果として得られた溶液を（例えば、酸性化された組換えゼラチン溶液を水酸化カルシウムの溶液に加えることにより）水酸化カルシウムと混合することができる。最初に組換えゼラチンをカルシウム源（例えば、水酸化カルシウム溶液）と混合し、その後炭酸またはリン酸を加えることも可能である。さらに、組換えゼラチンの水溶液に微粉末として無機カルシウム化合物を加えることが可能である。
【００５９】
組換えゼラチンの存在下での無機カルシウム化合物の沈殿または混合後（典型的には、組換えゼラチンの存在下で結晶化プロセスを起こさせる）、通常コンポジットスラリーが得られる。
【００６０】
本発明のハイドロゲルの生体類似性を高めるため、無機カルシウム化合物は、ＳＯ３２−、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｓｒ２＋、Ｓｉ４＋、Ｚｎ２＋、ＳｉＯ４４−および／またはＨＰＯ４２−イオンなどの添加物をさらに含み得る。一実施形態では、本発明のハイドロゲルは、１つまたは複数のこのような添加物を０．０１％〜２５重量％の総量含む。天然の人骨におけるこのような添加物の量と似た添加物濃度が特に好ましい。架橋された組換えゼラチンはハイドロゲルの貯蔵安定性が増大し得ることから、好ましくは、ゼラチンは架橋された組換えゼラチンである。組換えゼラチン中に存在する架橋可能な基、例えばカルボキシ基またはアミノ基を使用して、架橋形成が達成されることが好ましい。ゼラチンの架橋形成に関する技法は既に文献中に記載されている。架橋形成は大抵、ゼラチンのカルボキシル基またはアミン基を介して起こる。
【００６１】
使用され得る架橋剤は特に限定されない。例えば、化学的架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、カルボジイミドおよび／またはシアナミドを使用し得る。
【００６２】
好ましくは、架橋形成はハイドロゲル中のマイクロパーティクルの生体適合性を害さず、強い免疫応答をもたらさない。その点で、架橋形成法としての脱水素熱処理の使用は好ましい。架橋剤としてのヘキサメチレンジイソシアネートの使用も好ましい。
【００６３】
好ましい実施形態では、ハイドロゲルは、
ａ．１〜２０ｗ／ｖ％のマイクロパーティクル、
ｂ．０．０１〜１０ｗ／ｖ％の無機カルシウム化合物、
ｃ．０．０１〜１ｗ／ｖ％のＧＤＬ（またはＧＤＬとグルコン酸の合計量）、および
ｄ．０．５〜５ｗ／ｖ％のアルギネートを含む。
【００６４】
本発明の第２の態様によれば、組換えゼラチンの存在下で無機カルシウム化合物を沈殿させ、無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクルを形成させるステップ、およびこのように形成されたマイクロパーティクルを水、アルギネート、およびＧＤＬを含む組成物と混合するステップを含む、ハイドロゲルの調製方法が提供される。
【００６５】
この方法は、好ましくは人体または動物の体の生物学的状態にＧＤＬを曝すことにより、ＧＤＬの少なくとも一部分を加水分解してグルコン酸を形成させることをさらに含むことが好ましい。
【００６６】
本発明の第３の態様によれば、
水、
アルギネート、
グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）、および
無機カルシウム化合物と組換えゼラチンとを含むマイクロパーティクル
を含む組成物を人体または動物の体に注入することを含む、ハイドロゲルの調製方法が提供される。
【００６７】
本発明の第２および第３の態様では、好ましい無機カルシウム化合物、組換えゼラチン、ＧＤＬおよびアルギネートは、本発明の第１の態様に関して本明細書に記載したものと同様である。
【００６８】
本発明の第４の態様によれば、密閉容器またはアンプルおよび本発明の第１の態様によるハイドロゲルを含む医薬品であって、ハイドロゲルが密閉容器またはアンプル中に存在する、前記医薬品が提供される。
【００６９】
ここで本発明は以下の非制限的実施例で例証される。
【実施例】
【００７０】
材料：
【００７１】
【表１】
2019535444.tif 000006
【００７２】
組換えゼラチンの調製
組換えゼラチン（配列番号１および２）を、ヒトＣＯＬＩＡＩ−Ｉのゼラチンアミノ酸配列の一部分をコードする核酸配列に基づいて調製し、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６およびＷＯ０１／３４６４６中に開示された方法を使用して、この核酸配列を修飾した。これらのゼラチンはハイドロキシプロリンを含有しておらず、本明細書で配列番号１または２として特定したアミノ酸配列を含んでいた。最後の不完全な行を除き、６０アミノ酸の行あたりのＧＬＵ＋ＡＳＰの総量を各行の右側に示す。
【００７３】
【化２】
2019535444.tif 000007
【００７４】
ゼラチンにおけるＧＬＵ＋ＡＳＰの分布は、行あたりの量の標準偏差によって表す（以下の表１参照）。
配列番号１および２を使用して、以下の実施例中に記載した様々なハイドロゲルを調製した。
【００７５】
【表２】
2019535444.tif 000008
【００７６】
ステップ１）ゼラチンの存在下でのＣａＣＯ３の沈殿によるマイクロパーティクルの調製
（２０ｇのゼラチン配列番号１もしくは２またはタイプＡ豚皮由来ゼラチンの）２０％水溶液を調製し、ゼラチンとＣａＣＯ３の比１：１（ｗ／ｗ）で（１μｍ未満のサイズである）ＣａＣＯ３微粉と混合した。２０分間８００ｒｐｍでエマルジョンを撹拌しながら、この懸濁液を５０℃でコーン油中に乳化した。エマルジョンを冷却した後、乳化マイクロパーティクルをアセトンで３回洗浄した。６０℃で一晩乾燥させた後、シーブ（Ｒｅｔｓｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｈａｎｎ、ドイツ）を使用してマイクロパーティクルを５０〜７２μｍのサイズに篩い分けた。以下の表２中に示したように、ヘキサメチレンジイソシアニド（ＨＭＤＩＣ）または脱水素熱処理架橋形成（ＤＨＴ）を使用して、各ゼラチンに関して粒子を架橋した。
【００７７】
ＨＭＤＩＣを用いた架橋形成：１ｇの球体と１ｍＬのＨＭＤＩＣ（＞９８．０％純度、Ｓｉｇｍａ））を１００ｍｌエタノール中で１日混合した。過剰な架橋剤を、エタノールで数回洗浄することによって除去した。
【００７８】
ＤＨＴによる架橋形成：１ｇの球体を真空（約５．１０−３ｍｂａｒ）オーブン中において４日間１６０℃で架橋した。
比較例１０では、二酸化炭素形成が終了するまで過剰な塩酸（１Ｍ、Ｍｅｒｃｋ）でマイクロパーティクルを処理することによって、マイクロパーティクルから無機カルシウム化合物（ＣａＣＯ３）を除去した。カルシウムを含まないマイクロパーティクルを次いで脱イオン水で３回洗浄し、その後６０℃での乾燥によって一晩乾燥させた。
【００７９】
その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験で使用する前に、全ての架橋粒子をＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｅｔｔｅｎ  Ｌｅｕｒ、オランダ）によりガンマ線滅菌した。
【００８０】
ステップ２）賦形剤へのマイクロパーティクルの充填
ステップ１において調製したマイクロパーティクル（６８ｍｇ）を、４℃で一晩１２２．５μｇ／ｍＬの濃度で１７０μＬのｒｈＢＭＰ−２とインキュベートした。
【００８１】
実施例１３、１４およびＣＥｘ７に関しては、１３６ｍｇを１２２．５μｇ／ｍＬの濃度で１７０μＬのｒｈＢＭＰ−２とインキュベートした。
ステップ３）ハイドロゲルの調製
２つのアルギネート溶液を、０．９％滅菌塩化ナトリウムの添加によりアルギネートＳＬＭ２０またはＳＬＧ２０をベースとして調製し、２％ｗ／ｖアルギネート（ＳＬＭまたはＳＬＧ）溶液を作製した。
【００８２】
ステップ２からのマイクロパーティクルを、１０１４μＬの２％ｗ／ｖのアルギネートＳＬＭ２０または１０１４μＬの２％ｗ／ｖのアルギネートＳＬＧ２０に加えた。直ちに１０６μＬの０．０６Ｍの新たなグルコノδラクトン（ＧＤＬ）溶液を加え混合した。
【００８３】
マイクロパーティクルとＢＭＰ−２を省略した比較例ＣＥｘ８およびＣＥｘ９も調製した。必要な場合、追加の０．９％滅菌塩化ナトリウムを使用して、比較例が実際の実施例と同じアルギネート濃度を有することを保証した。
【００８４】
比較例ＣＥｘ８は、１０１４μＬの２％ｗ／ｖのＳＬＭを２７６μＬの０．２５％塩化カルシウムと混合することによって調製した。
比較例ＣＥｘ９は、３４ｍｇのＣａＣＯ３、１７０μＬの０．９％塩化ナトリウム、１０１４μＬの２％ｗ／ｖのアルギネートＳＬＭ２０および１０６μＬの０．０６Ｍの新たなグルコノδラクトン（ＧＤＬ）の混合によって調製した。
【００８５】
比較例ＣＥｘ１０は、ＣａＣＯ３を含まないステップ１からのマイクロパーティクルを１０１４μＬの２％ｗ／ｖのアルギネートＳＬＭ２０に加え、３４ｍｇのＣａＣＯ３、および１０６μＬの０．０６Ｍの新たなグルコノδラクトン（ＧＤＬ）を混合することによって調製した。
【００８６】
結果として得られたハイドロゲルは以下の表２中に記載したとおりであった。
表２中：
−  ＳＬＭはＰｒｏｎｏｖａ  ＳＬＭ２０（アルギネート）を意味し、％はｗ／ｖ％、すなわち組成物の全体積に対するアルギネートの重量である。
【００８７】
−  ＳＬＧはＰｒｏｎｏｖａ  ＳＬＧ２０（アルギネート）を意味し、％はｗ／ｖ％、すなわち組成物の全体積に対するアルギネートの重量である。
−  ＭＳ％は、表２の次の２列中に示した、ゼラチン（Ｇｅｌ）およびＣａＣＯ３由来の関連するマイクロパーティクルのｗ／ｖ％（すなわち、組成物の全体積に対するマイクロパーティクルの重量）を意味する。
【００８８】
−  Ｇｅｌ  ＩＤ％は使用したゼラチンを示す（ＳＥＱ１＝配列番号１、ＳＥＱ２＝配列番号２、およびＧｅｌ＝タイプＡ豚皮（比較例）。
【００８９】
【表３】
2019535444.tif 000009
【００９０】
表２中に記載したハイドロゲルおよび比較例のハイドロゲルの評価
調製したハイドロゲルの機械的特性をＲｈｅｏｍｅｔｅｒ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ３０１、Ｇｒａｚ、オーストリア）によって測定した。２０ｍｍ径のパラレルプレート測定システムを使用した。プレートに試料を加えた後、シリコン油を端部に施して揮発を妨げた。貯蔵弾性（または弾性）率（Ｇ’）および損失弾性（または粘性）率（Ｇ’’）を、３７℃で０％と４００％の間のひずみで測定し粘弾性領域を評価した。チキソトロピー挙動を試験するため、２ステップの反復サイクルを含む異なる設定を使用した。サイクルの第１ステップでは、貯蔵弾性および損失弾性率を１％ひずみ、１Ｈｚ、３７℃で測定した。第２ステップでは、５００％ひずみ、１Ｈｚ周波数、３７℃の温度を適用した。このサイクルを数回繰り返してチキソトロピー挙動を特徴付けした。法線力は０．１Ｎに設定した。表３中に示すゼラチンマイクロパーティクルアルギネートハイドロゲルのひずみに依存する振動レオロジーは、実施例７、実施例８および比較例４のハイドロゲルに関して１５０％での高いひずみで、ネットワーク破断に加えて非常に広範囲の直線的粘弾性領域を示した。機械的特性はＧＤＬの添加によって高まり、１７０％を超えるひずみで実施例１〜４および比較例ＣＥｘ１とＣＥｘ２に関して破断が起こる（表３）。このことは組成物中のＧＤＬの重要性を示した。ネットワーク破断に関する最大ひずみは製剤実施例１１および１２で観察された。
【００９１】
ＤＨＴ架橋マイクロパーティクルを含有した比較例ＣＥｘ６は非常に高いひずみ（＞３５０）でネットワーク破断を示し、ＤＨＴ架橋マイクロパーティクルを含有する複合体はより高い機械的特性を有することを示した。
【００９２】
（マイクロパーティクルを含まない）比較例ＣＥｘ８のハイドロゲルは約１２％のひずみで壊れた。比較例ＣＥｘ９では、ハイドロゲルはマイクロパーティクルを含有していなかったが、１μｍのＣａＣＯ３結晶を含有しており、約４０％のひずみで壊れた。また、マイクロパーティクルが無機カルシウム化合物を含んでおらず（カルシウム化合物は前に記載したように除去した）、３４ｍｇのＣａＣＯ３を加えた比較例ＣＥｘ１０は、わずか３５％の低い破断ひずみを有していた。表３中に示す結果は、特許請求の範囲に記載された特徴を有する本発明のハイドロゲルの重要性を示す。
【００９３】
【表４】
2019535444.tif 000010
【００９４】
実施例１〜８および比較例ＣＥｘ１〜ＣＥｘ４および実施例１３と１４および比較例ＣＥｘ７のハイドロゲルは、ストレス下での自己薄化挙動およびストレスを除去した後のハイドロゲルの自己回復を有していた。この挙動は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入直後にゲルがｉｎ  ｓｉｔｕで再形成されることを証明する。形成されたハイドロゲルは、それらの貯蔵弾性（または弾性）率から分かるように優れた機械的特性を示した。ストレス除去時、両アルギネートゲル製剤における貯蔵弾性率は１〜２ｋＤａであり、内皮組織と間質組織のものに匹敵した。
【００９５】
ｉｎ  ｓｉｔｕゲル化ハイドロゲル上での細胞接着
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣからのマウス筋線維芽細胞ＣＲＬ−１７７２）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのダルベッコ改変イーグル培地）中において、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。ＨＧ組成物は前に記載したように調製した。これらの製剤から、２００μＬを２４ウエルプレートの各ウエルに加えた。
【００９６】
Ｃ２Ｃ１２細胞を４７５０細胞／ウエルとしてハイドロゲルに接種した。細胞接種の５日後、約４５分間Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）混合物で細胞を染色した。染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０光学顕微鏡により蛍光下で、細胞を可視化した。試料の目視検査による結果（表４参照）は、細胞が、ゲルのみよりもむしろハイドロゲル製剤の内部のマイクロパーティクルに接着することが好ましいことを示す。さらに、組換えゼラチン含有ＲＧＤはｉｎ  ｖｉｔｒｏで高い細胞接着性を有することが示される。
【００９７】
【表５】
2019535444.tif 000011
【図１】
2019535444.tif 000012
【図２−１】
2019535444.tif 000013
【図２−２】
2019535444.tif 000014
【図２−３】
2019535444.tif 000015
【図３−１】
2019535444.tif 000016
【図３−２】
2019535444.tif 000017
【国際調査報告】
2019535444.tif 000018
2019535444.tif 000019
2019535444.tif 000020