(57)【要約】雄性不妊症の診断は、主に、濃度、全体的な運動性、前進運動性、体積、ｐＨ、粘度および／または形態に関する標準的な精液分析の結果に基づく。精子は、雌性生殖輸管に進入すると、卵子に受精するために、受精能獲得として知られる一連の生理学的変化を経なければならない。このプロセスは、雌性管内の刺激に応答して生じる原形質膜の変化を伴う。これらの変化には、ステロールの除去およびガングリオシドＧＭＩの再分布が含まれる。精液分析は、精子の機能的な能力に関する情報をほとんど提供しない標準的な精液分析に起因して、雄性不妊症の症例の半数しか識別しない。以前のデータは、ガングリオシドＧＭＩの局在化が、受精能獲得として知られる機能的な成熟プロセスを起こすことができる精子の部分集団を識別し、受精能と強く一致することを実証した。
2019506893.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法であって、
受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第１のサンプルを蛍光標識で処置する工程；
蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す１つまたはそれを超えるｔ０−蛍光画像を得る工程であって、前記ｔ０−蛍光画像は、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択されるインビトロ受精能獲得後時間（ｔ０）において得られる、工程；
前記ｔ０−蛍光画像において示された前記蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に対する先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測する工程であって、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める工程；
計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージに関連する受精能状態を判定する工程であって；
ここで、３５％超に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、高受精能状態を示し、３５％より１標準偏差低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、中受精能状態を示し；３５％より２標準偏差またはそれを超えて低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、低受精能状態を示す、工程；
計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の前記参照パーセンテージと比較する工程；および
受精を達成するために、受精能状態に基づいて生殖アプローチを識別する工程
を含む、方法。
【請求項２】
雄が、少なくとも正常の精子濃度を有し、
高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；
中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または
低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
雄が、正常未満の精子濃度を有し、
高受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；
中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または
低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記生殖アプローチが、体外受精前の精子の前受精能獲得に対応し、前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；（ｉｉ）前記生殖アプローチが、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；（ｉｉｉ）前記生殖アプローチが、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；または（ｉｖ）前記生殖アプローチが、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する、請求項２または３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第２のサンプルを蛍光標識で処置する工程であって、ここで、受精能を獲得したインビトロの精子細胞の前記第２のサンプルおよび受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第１のサンプルは、同じ雄に関連している、工程；
蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す１つまたはそれを超えるｔ１−蛍光画像を得る工程であって、前記ｔ１−蛍光画像は、受精能獲得後時間ｔ１において得られ、ｔ１は、ｔ０より長い時間または１８時間より長い時間から選択される、工程；
前記ｔ１−蛍光画像において示された前記蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に対する先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測する工程であって、ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める工程；
ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージをｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと比較する工程であって、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間または１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間から選択されるインビボ受精能獲得時間を判定する工程をさらに含み；
ここで、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間を示すか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間を示し、
さらに、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージとの比較に基づいて判定されるか；またはｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージまたは計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとの比較に基づいて判定され；
前記雄のｔ１−受精能状態およびインビボ受精能獲得時間に基づいて、授精のための時間および受精を達成するために用いるべき生殖アプローチを識別する、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
雄が、少なくとも正常な精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され、
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
雄が、正常未満の精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され、
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項５に記載の方法。
【請求項８】
雄が、少なくとも正常な精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項５に記載の方法。
【請求項９】
雄が、正常未満の精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）前記生殖アプローチが、体外受精前の精子の前受精能獲得に対応し、前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；（ｉｉ）前記生殖アプローチが、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；（ｉｉｉ）前記生殖アプローチが、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；または（ｉｖ）前記生殖アプローチが、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する、請求項８または９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記識別工程が、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態、精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせの１つ以上にまた基づく、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つより多いＧＭ１局在化パターンが、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精子細胞が、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたってインビトロにおいて受精能獲得条件で処置される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記受精能を獲得したインビトロの精子細胞が、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間の固定時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記精子細胞が、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置される前に、冷凍保存手順で処置され、保存された、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法であって、
受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞のサンプルを蛍光標識で処置する工程；
受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞のサンプルを蛍光標識で処置する工程；
蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す１つまたはそれを超えるｔ０−蛍光画像を得る工程、
蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す１つまたはそれを超えるｔ１−蛍光画像を得る工程であって、
前記ｔ０−蛍光画像は、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択されるインビトロ受精能獲得後時間（ｔ０）において得られ；前記ｔ１−蛍光画像は、受精能獲得後時間ｔ１において得られ、ここで、ｔ１は、ｔ０より長い、工程；
前記ｔ０−蛍光画像において示された前記蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に対する先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測する工程であって、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める工程；
前記ｔ１−蛍光画像において示された前記蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に対する先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測する工程であって、ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める工程；
ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージをｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと比較する工程であって、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間または１２時間もしくはそれ未満の標準的なインビボ受精能獲得時間から選択されるインビボ受精能獲得時間を判定する工程を含み、
ここで、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間を示すか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間を示し；
３５％超に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、高受精能状態を示し；３５％より１標準偏差低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、中受精能状態を示し；３５％より２標準偏差またはそれを超えて低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、低受精能状態を示し；
さらに、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージとの比較に基づいて判定されるか；またはｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージまたは計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとの比較に基づいて判定され；
前記雄のｔ１−受精能状態およびインビボ受精能獲得時間に基づいて、授精のための時間および受精を達成するために用いるべき生殖アプローチを識別する
を含む、方法。
【請求項１７】
雄が、少なくとも正常な精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され、
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
雄が、正常未満の精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）前の精子の前受精能獲得または子宮内授精（ＩＵＩ）前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択され、
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
雄が、少なくとも正常な精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
雄が、正常未満の精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有し；
ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；
ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチが、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または
ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチが、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）前記生殖アプローチが、体外受精前の精子の前受精能獲得に対応し、前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；（ｉｉ）前記生殖アプローチが、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；（ｉｉｉ）前記生殖アプローチが、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応するか；または（ｉｖ）前記生殖アプローチが、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応し、授精前の前受精能獲得のための時間が、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記識別工程が、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態、精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせの１つ以上にまた基づく、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つより多いＧＭ１局在化パターンが、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記精子細胞が、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたってインビトロにおいて受精能獲得条件で処置される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記受精能を獲得したインビトロの精子細胞が、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間の固定時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記精子細胞が、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置される前に、冷凍保存手順で処置され、保存された、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法であって、
受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する工程；
前記蛍光標識で処置された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示すデータを生成する工程であって、前記データは、０．１時間〜１８時間（ｔ０）または１８時間超（ｔ１）から選択されるインビトロ受精能獲得後時間において得られる、工程；
前記インビトロ受精能獲得後時間における１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンの前記データに基づいて雄の受精能状態データを特徴づける工程；および
前記インビトロ受精能獲得後時間における前記雄の受精能状態データに基づいて、授精のための時間および受精を達成するために用いるべき生殖アプローチを識別する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
前記精子細胞が、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたってインビトロにおいて受精能獲得条件で処置される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記受精能を獲得したインビトロの精子細胞が、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間の固定時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される、請求項２７または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記精子細胞が、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置される前に、冷凍保存手順で処置され、保存された、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記特徴づけ工程が、
受精能を獲得したインビトロの精子細胞のＧＭ１局在化パターンを示すデータと、既知の受精能状態を有する雄に対する受精能を獲得したインビトロの精子細胞のＧＭ１局在化パターンを示すデータを比較すること
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記特徴づけ工程が、
所定の数の前記受精能を獲得したインビトロの精子細胞に対して、標識されたＧＭ１局在化パターンの各々の数を測定すること；
標識されたＧＭ１局在化パターンの総数の合計に対する、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターンの数との合計の比を計算すること；および
ＧＭ１局在化パターンの前記比を、既知の受精能状態を有する雄に対するＧＭ１局在化パターンの参照比と比較すること
をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記雄の受精能状態データを、既知の雄性受精能状態および関連する既知の授精のための時間および関連する既知の生殖アプローチのデータと比較する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記既知の受精能状態が、３時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；１２時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態、１２〜２４時間の受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；および受精能力が無い状態を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生殖アプローチが、性交；頸管内授精（ＩＣＩ）、子宮内授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）および囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）からなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記識別工程が、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態、精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせの１つ以上にまた基づく、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つより多いＧＭ１局在化パターンが、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法であって、
受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する工程；
蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超える蛍光画像を得る工程、
前記蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子サンプルに対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する工程であって、前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値は、８時間未満（ｔ０）、８時間〜１２時間の範囲（ｔ１）または１２時間超（ｔ２）から選択されるインビトロ受精能獲得後時間において得られる、工程；
前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、前記インビトロ受精能獲得後時間における既知の受精能状態の雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する工程；および
前記インビトロ受精能獲得後時間における前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、授精のための時間および受精を達成するために用いるべき生殖アプローチを識別する工程
を含む、方法。
【請求項３９】
前記精子細胞が、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたってインビトロにおいて受精能獲得条件で処置される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記受精能を獲得したインビトロの精子細胞が、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間の固定時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される、請求項３８または３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記精子細胞が、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置される前に、冷凍保存手順で処置され、保存された、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、既知の雄性受精能状態および関連する既知の授精のための時間および関連する既知の生殖アプローチに対する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記既知の受精能状態が、３時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；１２時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態、１２〜２４時間の受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；および受精能力が無い状態を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生殖アプローチが、性交；頸管内授精（ＩＣＩ）、子宮内授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）および囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）からなる群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記識別工程が、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態  精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせの１つ以上にさらに基づく、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅが、標識されたＧＭ１局在化パターンの総数の合計に対する、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターンの数との合計の比に対応し、前記標識されたＧＭ１局在化パターンの各々は、受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対して測定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つまたはそれを超える標識されたＧＭ１局在化パターンが、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物の妊娠を成功させるために適切な機構を識別する方法であって、
受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する工程；
蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超える蛍光画像を得る工程；
前記蛍光標識された受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する工程；
前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、既知の受精能状態の雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する工程；および
前記Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、授精のための時間および受精を達成するために用いるべき生殖アプローチを識別する工程
を含む、方法。
【請求項４９】
前記判定工程が、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態  精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態のうちの１つまたはそれを超えるものにも基づく、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
精子膜の剪断を防止するのに十分な直径サイズの開口部を有する広口ピペットを用いて精液サンプルを処理する工程；および
精子膜を損傷し得る試薬を使用せずに前記精液サンプルを処理する工程
をさらに含む、請求項４８または４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
精子膜を損傷し得る試薬を使用せずに前記精液サンプルを処理する工程が、
前記処理された精液サンプルを受精能獲得培地、固定液、およびＧＭ１局在化パターンを測定するための試薬に曝露すること
を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
精子膜を損傷し得る試薬が、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ、（ｉｉｉ）粘液溶解薬；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼおよび（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅについてのパーセント変化が個体内で最小になるように、１つまたはそれを超える標識されたＧＭ１局在化パターンに対する集団サイズを決定する工程
をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つまたはそれを超える標識されたＧＭ１局在化パターンが、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、中間部（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在化パターン、先体後部原形質膜（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターン、先体頂部／先体後部（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在化パターン、赤道部（ＥＳ）ＧＭ１局在化パターンおよび散在性（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在化パターンを含む、請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１２月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／３８７，３４８号、２０１６年４月２８日に出願された米国仮出願番号第６２／３２８，８７６号、２０１６年１月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／２７９，３１５号、２０１６年４月２８日に出願された米国仮出願番号第６２／３２８，８８５号、および２０１６年１１月１５日に出願された米国仮出願番号第６２／４２２，２７９号の利益を主張しており、これら仮出願の各々は、その全体が援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して雄性受精能の分野に関し、より詳細には、受精を達成するために用いるべき生殖アプローチを識別する方法および／または受精を達成するために授精が行われる時間を変更する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
雄性不妊症の診断は、主に、濃度、全体的な運動性、前進運動性、体積、ｐＨ、粘度および／または形態に関する標準的な精液分析の結果に基づく。しかしながら、精子の形態、運動性および濃度の測定は、精子が雌性生殖輸管内に留まっている間に起こす複雑な変化を含む受精能力を評価しない。受精能力の評価に関連する難題に加えて、精子細胞を保存するため、および長期間にわたって雄性受精能を保つために、冷凍保存が用いられることが多い。残念なことに、凍結および融解は、精子の生存能および機能に悪影響を及ぼし得る。冷凍保存は、受精能獲得を変化させ、受精期間を移動させる／制限すると報告されている。
【０００４】
新たに開発される受精能検査は、精子が受精する能力ならびに妊娠を惹起し、維持する能力を測定するべきである（Ｏｅｈｎｉｎｇｅｒら、“Ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｅｓｔｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０２：１５２８−３３（２０１４）；Ｗａｎｇら、“Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｍｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ  ｎｅｅｄｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｗｅｒ  ｔｅｓｔｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０２：１５０２−０７（２０１４））。射精されたばかりの精子は、形態学的に成熟しているようにみえ、運動能力があるようにみえるが、受精能力がない。それらは、まず、精子を受精できるようにさせる「受精能獲得」として知られる成熟プロセスを経なければならない（Ａｕｓｔｉｎ，“Ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ，”Ｎａｔｕｒｅ，１７０：３２６（１９５２）；Ｃｈａｎｇ，“Ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，１６８：６９７−８（１９５１））。ほとんどの種において、受精能獲得は、精子の原形質膜からステロールが除去されること（ステロール流出）ならびに炭酸水素イオンおよびカルシウムイオンが流入することに依存する（Ｂａｌｄｉら、“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．１２：３２３−３０（１９９１）；Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら、“Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ‘ｓｗｉｔｃｈ’  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．，１１：６８３−９１（２００５）；Ｃｏｈｅｎら、“Ｌｉｐｉｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｌｕｘ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣａＶ２．３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｃｒｏｓｏｍｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２８：３１０−２１（２０１４）；Ｇａｄｅｌｌａら、“Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．８２：３０７−１９（２００４））。精子の受精能獲得中に生じるステロールの流出は、膜の流動性パターンを変化させ、特定の膜成分の再分布を可能にする（Ｃｏｈｅｎら、２０１４；Ｃｒｏｓｓ，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．５９：７−１１（１９９８）；Ｓｅｌｖａｒａｊら、“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｎ−ｓｃａｌｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｌｓ  ａｎｄ  ＧＭ１  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ，”Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙ��ｉｏｌ．２１８：５２２−３６（２００７）；Ｓｅｌｖａｒａｊら、“ＧＭ１  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．２８：５８８−９９（２００９））。
【０００５】
現在のところ、臨床応用に適した高感度かつ単純な受精能獲得バイオマーカーは、たとえあったとしても、わずかである。例えば、チロシン残基のリン酸化が、受精能獲得に関して十分詳述されている（Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｅら、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｂｏｔｈ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＫＡ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｂｙ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ，”Ｍｏｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．１９：５７０−８０（２０１３）；Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，”Ｍｏｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．５：１０１７−２６（１９９９）；Ｖｉｓｃｏｎｔｉら、“Ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｉ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１：１１２９−３７（１９９５））。しかしながら、これらの事象の評価には、何日もかかることがあり、また、半定量的評価しか提供しないため、雄性受精能の臨床評価には適していない。
【０００６】
精子は、受精できるようになるためにはステロール流出を起こさなければならないことがしばらくの間知られてきた（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９９；Ｔｒａｖｉｓら、“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１０：７３１−３６（２００２））。さらに、コレステロールおよび他の脂質（例えば、ガングリオシドＧＭ１）が、精子の原形質膜内でマイクロドメインへと組織化される（Ａｓａｎｏら、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂ−ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ，”Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２１８：５３７−４８（２００９）；Ａｓａｎｏら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔ  ｓｕｂ−ｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ，”Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０：３４９４−５０５（２０１０）；Ｔｒａｖｉｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ，ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，２４０：５９９−６１０（２００１）；Ｓｅｌｖａｒａｊら、２００９）。これらの膜ラフトは、シグナル伝達経路を強化することから、精子機能の媒介の、理にかなった候補になっている。興味深いことに、ＧＭ１局在化パターンの予測可能な変化は、受精能獲得のために刺激されたマウスの精子と雄ウシの精子の両方において測定されてきた（Ｓｅｌｖａｒａｊら、２００７）。そのうえ、ＧＭ１は、Ｒ型カルシウムチャネルの活性を制御し、先体のエキソサイトーシス、ひいては受精成功に必須の一過性のカルシウム流動を引き起こす（Ｃｏｈｅｎら、２０１４）。これらの知見は、精子の機能、ゆえに雄性受精能を評価するためにＧＭ１局在化パターンを使用できることを実証する。
【０００７】
様々なＧＭ１局在化パターンが識別されており、それらは、受精能獲得または受精能未獲得に関連している。特に、先体頂部（ａｐｉｃａｌ  ａｃｒｏｓｏｍｅ）（ＡＡ）のＧＭ１局在化パターンおよび先体原形質膜（ＡＰＭ）のＧＭ１局在化パターンが、ウシおよびヒトの精子において受精能獲得に関連している。精子の受精能獲得は、Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ精子機能検査（「Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ検査」または「Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ」）によって生成されるＣａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ値として定量的に表現でき、（［先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数＋先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数］／標識されたＧＭ１局在化パターンの総数）として定義され、ここで、各局在化パターンの数が計測され、次いで、最終的にパーセンテージスコアに変換される。ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターンおよびＡＡ  ＧＭ１局在化パターンに加えて、他の標識された局在化パターンには、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、中間部（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在化パターン、先体後部（ｐｏｓｔ  ａｃｒｏｓｏｍａｌ）原形質膜（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターン、先体頂部／先体後部（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在化パターン、赤道部（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ）（ＥＳ）ＧＭ１局在化パターンおよび散在性（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在化パターンが含まれた（Ｔｒａｖｉｓら、“Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｍｅｎ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１９５（４），ｅ９０９（２０１６））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｏｅｈｎｉｎｇｅｒら、“Ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｅｓｔｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０２：１５２８−３３（２０１４）
【非特許文献２】Ｗａｎｇら、“Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｍｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ  ｎｅｅｄｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｗｅｒ  ｔｅｓｔｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０２：１５０２−０７（２０１４）
【非特許文献３】Ａｕｓｔｉｎ，“Ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ，”Ｎａｔｕｒｅ，１７０：３２６（１９５２）
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ，“Ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｆａｌｌｏｐｉａｎ  ｔｕｂｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，１６８：６９７−８（１９５１）
【非特許文献５】Ｂａｌｄｉら、“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．１２：３２３−３０（１９９１）
【非特許文献６】Ｂｅｄｕ−Ａｄｄｏら、“Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ  ‘ｓｗｉｔｃｈ’  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．，１１：６８３−９１（２００５）
【非特許文献７】Ｃｏｈｅｎら、“Ｌｉｐｉｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｌｕｘ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣａＶ２．３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｃｒｏｓｏｍｅ  ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２８：３１０−２１（２０１４）
【非特許文献８】Ｇａｄｅｌｌａら、“Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ａｎｉｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．８２：３０７−１９（２００４）
【非特許文献９】Ｃｏｈｅｎら、２０１４；Ｃｒｏｓｓ，“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．５９：７−１１（１９９８）
【非特許文献１０】Ｓｅｌｖａｒａｊら、“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｎ−ｓｃａｌｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｌｓ  ａｎｄ  ＧＭ１  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍ，”Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１８：５２２−３６（２００７）
【非特許文献１１】Ｓｅｌｖａｒａｊら、“ＧＭ１  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．２８：５８８−９９（２００９）
【非特許文献１２】Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｅら、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｂｏｔｈ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＫＡ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｂｙ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ，”Ｍｏｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．１９：５７０−８０（２０１３）
【非特許文献１３】Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，”Ｍｏｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．５：１０１７−２６（１９９９）
【非特許文献１４】Ｖｉｓｃｏｎｔｉら、“Ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ．Ｉ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１：１１２９−３７（１９９５）
【非特許文献１５】Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９９；Ｔｒａｖｉｓら、“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１０：７３１−３６（２００２））
【非特許文献１６】Ａｓａｎｏら、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｕｂ−ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ，”Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２１８：５３７−４８（２００９）
【非特許文献１７】Ａｓａｎｏら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔ  ｓｕｂ−ｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ，”Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０：３４９４−５０５（２０１０）
【非特許文献１８】Ｔｒａｖｉｓら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｖｅｏｌｉｎ−１，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ，ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ，”Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．，２４０：５９９−６１０（２００１）；Ｓｅｌｖａｒａｊら、２００９）
【非特許文献１９】Ｔｒａｖｉｓら、“Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｍｅｎ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１９５（４），ｅ９０９（２０１６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
ある実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第１のサンプルを蛍光標識で処置する。１つまたはそれを超えるｔ０−蛍光画像を得る。それらの画像は、蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す。ｔ０−蛍光画像は、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択されるインビトロ受精能獲得後時間（ｔ０）において得られる。ｔ０−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に対して、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージに関連する受精能状態を判定し、ここで、３５％超に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、高受精能状態を示し；３５％より１標準偏差低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、中受精能状態を示し；３５％より２標準偏差またはそれを超えて低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、低受精能状態を示す。計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと比較する。受精能状態に基づいて受精を達成するために生殖アプローチを識別する。
【００１０】
雄が少なくとも正常な精子濃度を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得（ｐｒｅ−ｃａｐａｃｉｔａｔｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ）、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１１】
雄が正常未満の精子濃度を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）高受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１２】
前述の各実施形態の一例では、受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第２のサンプルを蛍光標識で処置し、ここで、その受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第２のサンプルおよび受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第１のサンプルは、同じ雄に関連する。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示している１つまたはそれを超えるｔ１−蛍光画像が得られ、ここで、ｔ１−蛍光画像は、受精能獲得後時間ｔ１において得られ、ここで、ｔ１は、ｔ０より長い時間または１８時間より長い時間から選択される。ｔ１−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に対する先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとを比較して、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間（ｌａｔｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）または１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間から選択されるインビボ受精能獲得時間を判定する。３５％という標準から１標準偏差超の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間を示すか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間を示す。さらに、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージとの比較に基づいて判定されるか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージまたは計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとの比較に基づいて判定される。雄のｔ１−受精能状態およびインビボ受精能獲得時間に基づいて、授精のための時間および用いるべき生殖アプローチが、��精を達成するために識別される。
【００１３】
雄が少なくとも正常な精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１４】
雄が正常未満の精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態のための生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１５】
雄が少なくとも正常な精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１６】
雄が正常未満の精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１７】
ある実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞のサンプルを蛍光標識で処置し、受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞のサンプルを蛍光標識で処置する。１つまたはそれを超えるｔ０−蛍光画像を得る。それらのｔ０−蛍光画像は、蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す。また、１つまたはそれを超えるｔ１−蛍光画像を得る。そのｔ１−蛍光は、蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す。ｔ０−蛍光画像は、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択されるインビトロ受精能獲得後時間（ｔ０）に得られ；ｔ１−蛍光画像は、受精能獲得後時間ｔ１において得られ、ここで、ｔ１は、ｔ０より長い。ｔ０−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に対して、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。また、ｔ１−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に対して、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージをｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと比較して、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間または１２時間もしくはそれ未満の標準的なインビボ受精能獲得時間から選択されるインビボ受精能獲得時間を判定する。３５％という標準から１標準偏差超の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間を示すか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間を示す。３５％超に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、高受精能状態を示し；３５％より１標準偏差低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、中受精能状態を示し；３５％より２標準偏差またはそれを超えて低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局���化パターン］の参照パーセンテージは、低受精能状態を示す。さらに、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージとの比較に基づいて判定されるか；またはｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージまたは計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとの比較に基づいて判定される。雄のｔ１−受精能状態およびインビボ受精能獲得時間に基づいて、受精を達成するために用いるべき授精のための時間および生殖アプローチが識別される。
【００１８】
雄が少なくとも正常な精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００１９】
雄が正常未満の精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態のための生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）前の精子の前受精能獲得または子宮内授精（ＩＵＩ）前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００２０】
雄が少なくとも正常な精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００２１】
雄が正常未満の精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００２２】
１つの実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識で処置された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示すデータを生成する。前記データは、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間（ｔ０）；およびｔ０より長い時間（ｔ１）から選択されるインビトロ受精能獲得後時間において得られる。次いで、それらの時点における１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンのデータを用いて、雄の受精能状態データを特徴づける。その雄の受精能状態データに基づいて、受精を達成するために用いるべき授精のための時間および生殖アプローチを識別する。１つの実施形態において、精子細胞を、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置する前に冷凍保存し、保管した。別の実施形態では、精子細胞をインビトロにおいて受精能獲得条件で処置し、それらの時点における１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンのデータを用いて受精能状態を評価し、次いで、精子を冷凍保存し、保管した。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超える蛍光画像を得る。精子細胞をインビトロにおいて様々な長さの時間にわたって受精能獲得条件で処置した後、蛍光標識された受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、それらの時点おける受精能状態が既知の雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、授精のための時間および受精を達成するために用いる生殖アプローチを識別する。１つの実施形態では、精子細胞を、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置する前に冷凍保存し、保管した。別の実施形態では、精子細胞をインビトロにおいて受精能獲得条件で処置し、それらの時点における１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンのデータを用いて受精能状態を評価し、次いで、精子を冷凍保存し、保管した。
【００２４】
さらに別の実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超える蛍光画像を得る。精子細胞を冷凍保存手順で処置し、インビトロにおいて様々な長さの時間にわたって受精能獲得条件で処置した後、蛍光標識された受精能獲得したインビトロの精子サンプル対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、それらの時点おける受精能状態が既知の雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する。それらの時点におけるＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、受精を達成するために用いるための、授精のための時間および生殖アプローチを識別する。
【００２５】
なおもさらに別の実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。それらの精子細胞を冷凍保存手順で処置し、インビトロにおいて様々な長さの時間にわたって受精能獲得条件で処置した後、受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示すデータを生成する。次いで、それらの時点における１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンのデータを用いて、雄の受精能状態データを特徴づける。その雄の受精能状態データに基づいて、受精を達成するために用いるべき授精のための時間および生殖アプローチを識別する。
【００２６】
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物の妊娠を成功させるために適切な方法を識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超える蛍光画像を得る。蛍光標識された受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、受精能力のある雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、妊娠を成功させるのに適切な機構を明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
前述の要旨ならびに以下の発明の詳細な説明は、添付の図面とともに読むと、よりよく理解される。
【００２８】
【図１Ａ】図１Ａは、ｘ軸に示されている平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅおよびｙ軸に示されている対応する標準偏差のプロットを示している。すべての画像に対する平均ＳＤが３であることが見出され、それは横実線によって示されている。点線は、ＳＤの一次従属性を示している（ｙ＝０．０６ｘ＋０．０２；ｒ＝０．６９；ｐ＝０．００）。
【００２９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｘ軸に示されている平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅおよびｙ軸に示されている変動係数のプロットを示している。すべての画像に対するＣｏＶが１３であることが見出され、それは横実線によって示されている。点線は、平均Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅに対するＣｏＶの一次従属性を示している（ｙ＝−０．３２ｘ＋０．２２；ｒ＝−０．８４；ｐ＝０．００）。
【００３０】
【図２Ａ】図２Ａは、操作者間のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値の再現性を示している。各々最大５，０００個の精子を含む１０枚のつなぎあわされた画像を、「正常未満」（正常な雄の集団に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値の結果より１ＳＤ超低い）に対して得た。２人の異なる判読者が、各画像を２０回ランダムにリサンプリングし、各回１５０個の細胞をカウントすることによってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した（判読者１が白色バー、判読者２が灰色バー）。
【００３１】
【図２Ｂ】図２Ｂは、操作者間のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値の再現性を示している。各々最大５，０００個の精子を含む１０枚のつなぎあわされた画像を、正常な雄の集団に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値の結果より１ＳＤ低いと上記のように分類される「推定正常」に対して得た。２人の異なる判読者が、各画像を２０回ランダムにリサンプリングし、各回１５０個の細胞をカウントすることによってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した（判読者１が白色バー、判読者２が灰色バー）。
【００３２】
【図３Ａ】図３Ａは、操作者間のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ分散の再現性を示している。各々最大５，０００個の精子を含む１０枚のつなぎあわされた画像を、「正常未満」（正常な雄の集団に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値の結果より１ＳＤ超低い）に対して得た。２人の異なる判読者が、各画像を２０回ランダムにリサンプリングし、各回１５０個の細胞をカウントすることによってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した（判読者１が白色バー、判読者２が灰色バー）。
【００３３】
【図３Ｂ】図３Ｂは、操作者間のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ分散の再現性を示している。各々最大５，０００個の精子を含む１０枚のつなぎあわされた画像を、正常な雄の集団に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値の結果より１ＳＤ低いと上記のように分類される「推定正常」に対して得た。２人の異なる判読者が、各画像を２０回ランダムにリサンプリングし、各回１５０個の細胞をカウントすることによってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した（判読者１が白色バー、判読者２が灰色バー）。
【００３４】
【図４】図４は、正常なヒト精子、およびインビトロ受精能獲得条件下で形成する不妊雄の精子におけるＧＭ１の様々な局在化パターンを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
詳細な説明
本明細書中に記載されるように、精子が受精能獲得するための時間は、異なる雄の間および異なる雄の中で異なる。雄の精子受精能獲得のための時間を判定することを用いることにより、授精のための時間、および受精を達成するためにその授精の時間の間に用いるべき生殖アプローチを識別することができることが発見された。
【００３６】
ＧＭ１は、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドのことを指し、ガングリオシドのガングリオシリーズのメンバーである。
【００３７】
ヒトの精子の場合、精子がインビトロの受精能獲得条件下に置かれたとき、図４に示されているような８つの異なるＧＭ１局在化パターンが報告されている。位置パターンを可視化するために、受精能を獲得した精子を、検出可能な蛍光標識を有する、ＧＭ１に対する標識分子（例えば、コレラ毒素ｂ）で処置した。
【００３８】
ＩＮＴＥＲは、蛍光シグナルの大部分が赤道部の周りに帯として存在し、先体を覆っている原形質膜にいくらかのシグナルがある、精子細胞を特徴とする。通常、その蛍光シグナルには勾配があり、大部分が赤道部にあり、先端に向かって徐々に少なくなっていく。精子頭部の縁において赤道部を横断する帯で蛍光シグナル強度が高まっていることが多い。
【００３９】
先体頂部「ＡＡ」は、頂端に向かって蛍光シグナルが濃縮されており、明るさが強く、シグナルを有する面積が減少している、精子細胞を特徴とする。
【００４０】
先体原形質膜「ＡＰＭ」は、先体を覆っている原形質膜に、分散した蛍光シグナルを示す精子細胞を特徴とする。ＡＰＭのシグナルは、赤道の明るいＩＮＴＥＲ帯から先端に向かって頂端に移動して見られるか、またはＡＡとの連続体であるように、さらに上から始まり先端に向かって、より小さい領域で見られる。
【００４１】
先体後部原形質膜「ＰＡＰＭ」は、蛍光シグナルがもっぱら先体後部の原形質膜に存在する精子細胞を特徴とする。
【００４２】
先体頂部先体後部「ＡＡ／ＰＡ」は、蛍光シグナルが、先体を覆っている原形質膜と先体後部の原形質膜の両方に位置する精子細胞を特徴とする。赤道部は、蛍光シグナルを示さない。
【００４３】
赤道部「ＥＳ」は、明るい蛍光シグナルがもっぱら赤道部に位置する精子細胞を特徴とする。赤道部「ＥＳ」は、赤道領域を横断する精子頭部の肥厚を伴うことがある。
【００４４】
散在性「ＤＩＦＦ」は、散在した蛍光シグナルが精子頭部全体にわたって位置する精子細胞を特徴とする。
【００４５】
Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌは、先体後部領域および先体を覆っている原形質膜の上部ならびに赤道部の下部に散在性の蛍光シグナル（すなわち、先体後部／赤道の帯）を有する精子細胞を特徴とする。蛍光シグナルは、赤道部の周囲には見られない。
【００４６】
検出可能な蛍光標識を有する、ＧＭ１に対する標識分子（例えば、コレラ毒素ｂ）で精子細胞を処置することによって、様々なＧＭ１局在化パターンが識別される。次いで、標識された精子細胞は、当業者に公知のように蛍光顕微鏡を用いて可視化される。
【００４７】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、［先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数＋先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数］を［標識されたＧＭ１局在化パターンの総数］で除算した比と定義される（Ｔｒａｖｉｓら、“Ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｅｍｅｎ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１９５（４），ｅ９０９（２０１６））。異なるＧＭ１局在化パターンの数に到達するために、少なくとも１００個の精子細胞に対して、局在化パターンの数を数える。
【００４８】
本願の目的で、「ｔ０」は、インビトロの受精能獲得条件で精子細胞を処置した後の時間の長さに対応し、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択される。
【００４９】
本願の目的で、「ｔ１」は、インビトロの受精能獲得条件で精子細胞を処置した後の時間の長さに対応し、１８時間より長いかまたはｔ０より長い。
【００５０】
本願の目的で、画像は、（ｉ）デジタル画像；（ｉｉ）操作者が接眼レンズを通して直接見たＧＭ１パターン；または（ｉｉｉ）フローサイトメトリーによって識別されたＧＭ１パターンを意味すると理解される。
【００５１】
本願の目的で、「授精」は、生殖アプローチに依存した意味を有すると理解される。例えば、「性交」の場合、授精は、精子が雌の生殖管に入っていくことを意味すると理解される。例えば、「頸管内授精（ＩＣＩ）」の場合、授精は、精子が雌の子宮頸部に入っていくことを意味すると理解される。「子宮内授精（ＩＵＩ）」の場合、授精は、精子が雌の子宮に入ったときのことを意味すると理解される。「体外受精（ＩＶＦ）」の場合、授精は、卵細胞（卵母細胞）を含む培地の液滴に精子を入れて、精子と卵細胞との同時のインキュベーションが可能になったときのことを意味すると理解される。「体外受精前の精子の前受精能獲得」の場合、授精は、卵細胞（卵母細胞）を含む培地の液滴に精子を入れて、精子と卵細胞との同時のインキュベーションが可能になったときのことを意味すると理解される。「卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）」の場合、授精は、精子または事前に受精能を獲得した精子を卵細胞内に注入することを意味すると理解される。「配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）」の場合、授精は、精子または事前に受精能を獲得した精子および卵細胞を雌のファロピウス管に注入することを意味すると理解される。「囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）」の場合、授精は、単一の精子細胞または単一の事前に受精能を獲得した精子細胞を透明帯の直下に注入することを意味すると理解される。本願の目的で、用語「冷凍保存」とは、使用するために細胞を凍結、保管および解凍するプロセス全体のことを指す。
【００５２】
下記の本明細書中で使用されるとき、雄は、哺乳動物である。ある実施形態において、雄は、ヒトである。別の実施形態において、雄は、非ヒト哺乳動物である。１つのそのような実施形態において、雄は、コンパニオンアニマルである。別の実施形態において、雄は、農業用動物である。１つのそのような実施形態において、雄は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ科動物（ｃａｍｅｌｌｉｄ）またはスイギュウである。
【００５３】
ある実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第１のサンプルを蛍光標識で処置する。１つまたはそれを超えるｔ０−蛍光画像を得る。それらの画像は、蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す。それらのｔ０−蛍光画像は、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択されるインビトロ受精能獲得後時間（ｔ０）において得られる。ｔ０−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に対して、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージに関連する受精能状態を判定し、ここで、３５％超に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、高受精能状態を示し；３５％より１標準偏差低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、中受精能状態を示し；３５％より２標準偏差またはそれを超えて低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、低受精能状態を示す。計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターンおよびＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと比較する。受精を達成するために、受精能状態に基づいて生殖アプローチを識別する。
【００５４】
雄が少なくとも正常な精子濃度を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００５５】
雄が正常未満の精子濃度を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）高受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００５６】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが体外受精前の精子の前受精能獲得に対応する前述の実施形態の場合、前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００５７】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００５８】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００５９】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００６０】
前述の各実施形態の一例において、受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第２のサンプルを蛍光標識で処置する（ここで、その受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第２のサンプルおよび受精能を獲得したインビトロの精子細胞の第１のサンプルは、同じ雄に関連する）。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示している１つまたはそれを超えるｔ１−蛍光画像を得る。ｔ１−蛍光画像は、受精能獲得後時間ｔ１において得られ、ここで、ｔ１は、ｔ０より長い時間または１８時間より長い時間から選択される。ｔ１−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に対する先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと比較することにより、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間または１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間から選択されるインビボ受精能獲得時間を判定する。３５％という標準から１標準偏差超の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間を示すか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間を示す。さらに、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージとの比較に基づいて判定されるか；またはｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージまたは計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとの比較に基づいて判定さ��る。雄のｔ１−受精能状態およびインビボ受精能獲得時間に基づいて、受精を達成するために、授精のための時間および用いるべき生殖アプローチが識別される。
【００６１】
雄が少なくとも正常な精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００６２】
雄が正常未満の精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態のための生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００６３】
雄が少なくとも正常な精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００６４】
雄が正常未満の精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００６５】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが体外受精前の精子の前受精能獲得に対応する前述の実施形態の場合、前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００６６】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応する実施形態の場合、授精の前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００６７】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）に対応する実施形態の場合、授精の前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００６８】
精子が事前に受精能を獲得し、生殖アプローチが囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応する実施形態の場合、授精の前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間インキュベートすることに対応する。
【００６９】
前述の各実施形態の一例において、識別する工程は、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態、精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせの１つ以上にまた基づく。
【００７０】
前述の各実施形態の一例において、１つより多いＧＭ１局在化パターンは、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンを含む。
【００７１】
前述の各実施形態の一例において、精子細胞は、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間という受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたってインビトロにおいて受精能獲得条件で処置される。
【００７２】
前述の各実施形態の一例において、受精能を獲得したインビトロの精子細胞は、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間という固定時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される。
【００７３】
前述の各実施形態の一例において、精子細胞は、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置する前に冷凍保存手順で処置され、保管された。
【００７４】
ある実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞のサンプルを蛍光標識で処置し、受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞のサンプルを蛍光標識で処置する。１つまたはそれを超えるｔ０−蛍光画像を得る。それらのｔ０−蛍光画像は、蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す。また、１つまたはそれを超えるｔ１−蛍光画像を得る。そのｔ１−蛍光は、蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に関連する１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示す。ｔ０−蛍光画像は、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間から選択されるインビトロ受精能獲得後時間（ｔ０）において得られ；ｔ１−蛍光画像は、受精能獲得後時間ｔ１において得られ、ここで、ｔ１は、ｔ０より長い。ｔ０−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ０−精子細胞に対して、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。また、ｔ１−蛍光画像において示された蛍光標識された受精能を獲得したインビトロのｔ１−精子細胞に対して、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数およびＧＭ１局在化パターンの総数を計測して、ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージを求める。ｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージをｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと比較して、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間または１２時間もしくはそれ未満の標準的なインビボ受精能獲得時間から選択されるインビボ受精能獲得時間を判定する。３５％という標準から１標準偏差超の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間超の遅いインビボ受精能獲得時間を示すか；または３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応する、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差は、１２時間未満の標準的なインビボ受精能獲得時間を示す。３５％超に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、高受精能状態を示し；３５％より１標準偏差低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージは、中受精能状態を示し；３５％より２標準偏差またはそれを超えて低い値に対応する［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  Ｇ���１局在化パターン］の参照パーセンテージは、低受精能状態を示す。さらに、ｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差超の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージと［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージとの比較に基づいて判定されるか；またはｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージの差が、３５％という標準から１標準偏差未満の値に対応するとき、ｔ１−受精能状態は、［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］の参照パーセンテージと、計測されたｔ１−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージまたは計測されたｔ０−［ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン＋ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン］のパーセンテージとの比較に基づいて判定される。雄のｔ１−受精能状態およびインビボ受精能獲得時間に基づいて、受精を達成するために用いるべき授精のための時間および生殖アプローチが識別される。
【００７５】
雄が少なくとも正常な精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の一例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００７６】
雄が正常未満の精子濃度および遅いインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態のための生殖アプローチは、性交のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精（ＩＣＩ）前の精子の前受精能獲得または子宮内授精（ＩＵＩ）前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；子宮内授精（ＩＵＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること；囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）のタイミングを遅いインビボ受精能獲得時間に変更すること、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００７７】
雄が少なくとも正常な精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、性交、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得；子宮内授精（ＩＵＩ）；子宮内授精前の精子の前受精能獲得；または体外受精（ＩＶＦ）もしくは体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００７８】
雄が正常未満の精子濃度および標準的なインビボ受精能獲得時間を有する前述の実施形態の別の例において、（ｉ）ｔ１−高受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか；（ｉｉ）ｔ１−中受精能状態に対する生殖アプローチは、頸管内授精（ＩＣＩ）、頸管内授精前の精子の前受精能獲得、子宮内授精（ＩＵＩ）または子宮内授精前の精子の前受精能獲得；体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得からなる群より選択されるか、または（ｉｉｉ）ｔ１−低受精能状態に対する生殖アプローチは、体外受精（ＩＶＦ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、卵細胞質内精子注入法の前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）、配偶子卵管内移植法の前の精子の前受精能獲得、囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）または囲卵腔内精子注入法の前の精子の前受精能獲得からなる群より選択される。
【００７９】
前述の各実施形態の一例において、識別する工程は、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態、精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせの１つ以上にまた基づく。
【００８０】
前述の各実施形態の一例において、１つより多いＧＭ１局在化パターンは、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンを含む。
【００８１】
前述の各実施形態の一例において、精子細胞は、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間という受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたってインビトロにおいて受精能獲得条件で処置される。
【００８２】
前述の各実施形態の一例において、受精能を獲得したインビトロの精子細胞は、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間という固定時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される。
【００８３】
前述の各実施形態の一例において、精子細胞は、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置する前に冷凍保存手順で処置され、保管された。
【００８４】
１つの実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識で処置された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンを示すデータを生成する。前記データは、０．１時間〜５時間；０．１時間〜８時間；０．１〜１２時間；または０．１時間〜１８時間（ｔ０）；およびｔ０より長い時間（ｔ１）から選択されるインビトロ受精能獲得後時間において得られる。次いで、それらの時点における１つまたはそれを超えるＧＭ１局在化パターンのデータを用いて、雄の受精能状態データを特徴づける。その雄の受精能状態データに基づいて、受精を達成するために用いるべき授精のための時間および生殖アプローチを識別する。１つの実施形態において、精子細胞は、インビトロにおいて受精能獲得条件で処置する前に冷凍保存され、保管された。
【００８５】
１つのそのような実施形態において、精子細胞は、インビトロにおいて、少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたって受精能獲得条件で処置される。１つの実施形態において、受精能獲得条件は、インビトロにおける２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンへの曝露を含む。別の実施形態において、非受精能獲得条件は、インビトロにおいて様々な長さの時間にわたって炭酸水素イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーター（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）のいずれへの曝露も行わないことを含む。
【００８６】
１つのそのような他の実施形態において、受精能を獲得したインビトロの精子細胞は、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の固定時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたって固定液で処置される。１つの実施形態において、固定液は、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを含む。
【００８７】
前述の実施形態の一例において、雄の受精能状態データは、受精能を獲得したインビトロの精子細胞のＧＭ１局在化パターンを示すデータを、受精能状態が既知である雄に対する受精能を獲得したインビトロの精子細胞のＧＭ１局在化パターンを示す参照データと比較することによって特徴づけられる。１つのそのような実施形態において、所定の数の受精能を獲得したインビトロの精子細胞に対して、標識された各ＧＭ１局在化パターンの数が測定される。次いで、標識されたＧＭ１局在化パターンの総数の合計に対する、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターンの数と先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターンの数との合計の比が計算される。次いで、そのＧＭ１局在化パターンの比は、受精能状態が既知である雄に対する局在化パターンの参照比と比較される。そのような実施形態において、その１つより多いＧＭ１局在化パターンは、先体頂部（ＡＡ）ＧＭ１局在化パターン、先体原形質膜（ＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、中間部（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在化パターン、先体後部原形質膜（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターン、先体頂部／先体後部（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在化パターン、赤道部（ＥＳ）ＧＭ１局在化パターンおよび散在性（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在化パターンに対応する。
【００８８】
前述の実施形態の別の例において、雄の受精能状態データは、既知の授精のための時間に関連しかつ既知の生殖アプローチに関連する既知の雄性受精能状態のデータと比較される。そのような実施形態において、既知の受精能状態には、３時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；１２時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態、１２〜２４時間の受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；および受精能力が無い状態が含まれる。
【００８９】
前述の実施形態において、生殖アプローチは、自然な授精アプローチおよび当該分野で公知のような人工の授精アプローチに対応し得る。１つの実施形態において、生殖アプローチには、性交；頸管内授精（ＩＣＩ）、子宮内授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）および囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）が含まれる。
【００９０】
生殖アプローチが性交に対応する実施形態の場合、性交のための時間は、超音波検査によって可視化されるとき、雌の排卵のタイミングに対して決定され、かつ／あるいは月経周期のタイミング、排卵タイミングキットの使用、体温の変化、または卵胞成長および排卵を誘導するためにデザインされた１種もしくはそれを超えるホルモンの１回もしくはそれを超える注射に対するタイミングに基づいて予測される。例えば、授精時間は、排卵時間の９６時間前；排卵時間の７２時間前；排卵時間の４８時間前；排卵時間の２４時間前；排卵時間の１２時間前；排卵時間の６時間前；または排卵時間に対応し得る。
【００９１】
生殖アプローチがＩＣＩまたはＩＵＩに対応する実施形態の場合、授精のための時間は、超音波検査によって可視化されるとき、雌の排卵のタイミングに対して決定され、かつ／あるいは月経周期のタイミング、排卵タイミングキットの使用、体温の変化、または卵胞成長および排卵を誘導するためにデザインされた１種もしくはそれを超えるホルモンの１回もしくはそれを超える注射に対するタイミングに基づいて予測される。例えば、授精時間は、排卵時間の９６時間前；排卵時間の７２時間前；排卵時間の４８時間前；排卵時間の２４時間前；排卵時間の１２時間前；排卵時間の６時間前；または排卵時間に対応し得る。
【００９２】
生殖アプローチがＩＶＦに対応する実施形態の場合、授精のための時間は、前核形成の判定の３時間前；前核形成の判定の４時間前；前核形成の判定の６時間前；前核形成の判定の１２時間前；前核形成の判定の１８時間前；前核形成の判定の２４時間前；または前核形成の判定の３０時間前に対応する。
【００９３】
生殖アプローチが体外受精前の精子の前受精能獲得に対応する実施形態の場合、前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【００９４】
生殖アプローチが卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【００９５】
生殖アプローチが配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【００９６】
生殖アプローチが囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【００９７】
前述の実施形態のいくつかの場合において、授精のため時間および生殖アプローチを識別するために他のパラメータを使用してもよい。その他のパラメータとしては、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態、精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態ならびにそれらの組み合わせのうちの１つまたはそれを超えるものが挙げられ得る。
【００９８】
別の実施形態において、本開示は、哺乳動物の受精を達成するためのアプローチを識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞１つまたはそれを超える蛍光画像を得る。精子細胞をインビトロにおいて様々な長さの時間にわたって受精能獲得条件で処置した後、蛍光標識された受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、それらの時点おける、受精能状態が既知の雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、受精を達成するために用いるための授精のための時間および生殖アプローチを識別する。
【００９９】
１つのそのような実施形態において、精子細胞は、インビトロにおいて少なくとも１時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間の受精能獲得時間；０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜２４時間；１２時間〜２４時間；または１８時間〜２４時間の範囲の受精能獲得時間にわたって受精能獲得条件で処置される。別の実施形態において、非受精能獲得条件は、インビトロにおいて様々な長さの時間にわたって、炭酸水素イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーター（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）のいずれへの曝露も行わないことを含む。
【０１００】
１つの他のそのような実施形態において、受精能を獲得したインビトロの精子細胞は、少なくとも０．５時間；少なくとも３時間；少なくとも１２時間；少なくとも１８時間；少なくとも２４時間；少なくとも３０時間；少なくとも３６時間；または少なくとも４８時間の時間、０．５時間〜３時間；３時間〜１２時間；６時間〜１２時間；３時間〜１８時間；６〜１８時間；６〜２４時間；１２時間〜２４時間；１８時間〜２４時間；１８〜３０時間；１８〜３６時間；２４〜３０時間；２４〜２６時間；１８〜４８時間；２４〜４８時間；または３６〜４８時間の範囲の固定時間にわたって固定液で処置される。１つの実施形態において、固定液は、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを含む。
【０１０１】
前述の実施形態の一例において、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値は、既知の授精のための時間に関連しかつ既知の生殖アプローチに関連する既知の雄性受精能状態に対する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較される。そのような実施形態において、既知の受精能状態には、３時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；１２時間以内の精子受精能獲得によって受精能力ありとなる状態、１２〜２４時間の受精能獲得によって受精能力ありとなる状態；および受精能力が無い状態が含まれる。
【０１０２】
前述の（ｆｏｒｇｏｉｎｇ）実施形態の場合において、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、標識されたＧＭ１局在化パターンの総数の合計に対する、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターンの数とＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターンの数の合計（各々が、受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対して測定される）の比に対応する。そのような実施形態において、１つまたはそれを超える標識されたＧＭ１局在化パターンは、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、ＩＮＴＥＲ  ＧＭ１局在化パターン、ＰＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＡ／ＰＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＥＳ  ＧＭ１局在化パターンおよびＤＩＦＦ  ＧＭ１局在化パターンを含む。
【０１０３】
前述の実施形態において、生殖アプローチは、自然な授精アプローチおよび当該分野で公知のような人工の授精アプローチに対応し得る。１つの実施形態において、生殖アプローチには、性交；頸管内授精（ＩＣＩ）、子宮内授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、体外受精前の精子の前受精能獲得、配偶子卵管内移植法（ＧＩＦＴ）および囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）が含まれる。
【０１０４】
生殖アプローチが性交に対応する実施形態の場合、性交のための時間は、超音波検査によって可視化されるとき、雌の排卵のタイミングに対して決定され、かつ／あるいは月経周期のタイミング、排卵タイミングキットの使用、体温の変化、または卵胞成長および排卵を誘導するためにデザインされた１種もしくはそれを超えるホルモンの１回もしくはそれを超える注射に対するタイミングに基づいて予測される。例えば、授精時間は、排卵時間の９６時間前；排卵時間の７２時間前；排卵時間の４８時間前；排卵時間の２４時間前；排卵時間の１２時間前；排卵時間の６時間前；または排卵時間に対応し得る。
【０１０５】
生殖アプローチがＩＣＩまたはＩＵＩに対応する実施形態の場合、授精のための時間は、超音波検査によって可視化されるとき、雌の排卵のタイミングに対して決定され、かつ／あるいは月経周期のタイミング、排卵タイミングキットの使用、体温の変化、または卵胞成長および排卵を誘導するためにデザインされた１種もしくはそれを超えるホルモンの１回もしくはそれを超える注射に対するタイミングに基づいて予測される。例えば、授精時間は、排卵時間の９６時間前；排卵時間の７２時間前；排卵時間の４８時間前；排卵時間の２４時間前；排卵時間の１２時間前；排卵時間の６時間前；または排卵時間に対応し得る。
【０１０６】
生殖アプローチがＩＶＦに対応する実施形態の場合、授精のための時間は、前核形成の判定の３時間前；前核形成の判定の４時間前；前核形成の判定の６時間前；前核形成の判定の１２時間前；前核形成の判定の１８時間前；前核形成の判定の２４時間前；または前核形成の判定の３０時間前に対応する。
【０１０７】
生殖アプローチが体外受精前の精子の前受精能獲得に対応する実施形態の場合、前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【０１０８】
生殖アプローチが卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【０１０９】
生殖アプローチが配偶子卵管内移植法（「ＧＩＦＴ」）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【０１１０】
生殖アプローチが囲卵腔内精子注入法（ＳＵＺＩ）に対応する実施形態の場合、授精前の前受精能獲得のための時間は、受精能獲得のための１つまたはそれを超える刺激を含む培地中で精子を、授精前に２４時間；授精前に１８時間；授精前に１２時間；授精前に６時間；授精前に４時間；授精前に３時間；または授精前に１時間にわたってインキュベートすることに対応する。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、本開示は、哺乳動物の妊娠を成功させるために適切な機構を識別する方法を提供する。受精能を獲得したインビトロの精子細胞を蛍光標識で処置する。蛍光標識された受精能を獲得したインビトロの精子細胞の１つまたはそれを超える蛍光画像を得る。精子細胞をインビトロにおいて様々な長さの時間にわたって受精能獲得条件で処置した後、蛍光標識された受精能獲得したインビトロの精子サンプルに対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を計測する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、受精能力のある雄に関連する参照Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較する。そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に基づいて、妊娠を成功させるために適切な機構を明らかにする。１つの実施形態において、その決定は、以下：患者の人口統計的データ、雌性パートナーの生殖状態  精子の濃度、全体的な運動性、前進運動性、精液の体積、精液のｐＨ、精液の粘度および／または精子の形態の１つ以上にまた基づく。
【０１１２】
前述の実施形態のいずれかの例において、精液サンプルは、精子膜の剪断を防止するのに十分な直径サイズの開口部を有する広口ピペットを用いて処理され、かつ精液サンプルは、精子膜を損傷し得る試薬を使用せずに処理される。１つのそのような実施形態において、処理された精液サンプルは、受精能獲得培地、固定液、およびＧＭ１局在化パターンを判定するための試薬に曝露される。
【０１１３】
ある実施形態において、精子膜を損傷し得る試薬は、（ｉ）プロテアーゼ；（ｉｉ）ヌクレアーゼ（ｉｉｉ）粘液溶解薬；（ｉｖ）リパーゼ；（ｖ）エステラーゼおよび（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼからなる群より選択される。同様に精子が受精能獲得刺激に応答する能力を干渉し得る化合物の例としては、（ｉ）プロテアーゼ（キモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、ブロメラインを含むがこれらに限定されない）；（ｉｉ）ヌクレアーゼ（ドルナーゼ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩを含むこれらに限定されない）；（ｉｉｉ）粘液溶解薬（エルドステイン、アセチルシステイン、グアイフェネシン（Ｇｕｉａｆｅｎｅｓｉｎ）を含むがこれらに限定されない）；（ｉｖ）リパーゼ（ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＣ、リポタンパク質リパーゼを含むがこれらに限定されない）；（ｖ）エステラーゼ（コリンエステラーゼ、チオエステラーゼ、アルカリホスファターゼを含むがこれらに限定されない）；および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼ（アルファ−アミラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｏｒｍｉｎｏｄａｓｅｓ）およびリゾチームを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
【０１１４】
前述の実施形態のいずれかの例において、１つまたはそれを超える標識されたＧＭ１局在化パターンに対する集団サイズは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅに関するパーセント変化が個体内で最小になるように決定される。いくつかのそのような実施形態において、１つまたはそれを超える標識されたＧＭ１局在化パターンは、ＡＡ  ＧＭ１局在化パターン、ＡＰＭ  ＧＭ１局在化パターン、Ｌｉｎｅｄ−Ｃｅｌｌ  ＧＭ１局在化パターン、中間部（ＩＮＴＥＲ）ＧＭ１局在化パターン、先体後部原形質膜（ＰＡＰＭ）ＧＭ１局在化パターン、先体頂部／先体後部（ＡＡ／ＰＡ）ＧＭ１局在化パターン、赤道部（ＥＳ）ＧＭ１局在化パターンおよび散在性（ＤＩＦＦ）ＧＭ１局在化パターンを含む。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例は、本発明の範囲内の例証的な実施形態をさらに説明し、実証する。本発明の真意および範囲から逸脱することなく多くのバリエーションが可能であるので、実施例は、もっぱら例証のために与えられ、本発明の限定と解釈されるべきでない。
【０１１６】
実施例１
精子取扱い方法
粘度を低下させる３つの一般的な方法を評価した。射精液を：１）０．２５、１．２５または２時間インキュベートした。２）改変ヒト卵管液（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｓａｎｔａ  Ａｎｎａ，ＣＡ）で１：１希釈し、次いで、広口ホールピペット（「ＷＯＴＰ」）またはパスツールピペット（「ＰＰ」）に通した。３）キモトリプシン（「ｃｈｙｍｏ」）で酵素的に消化した。パイロット研究によって、皮下針通過が、運動性および膜完全性に悪影響を及ぼし、さらに研究できないことが明らかになった。液化のあと、サンプルを洗浄し、受精能獲得（ＣＡＰ）条件および非受精能獲得（ＮＣ）条件下でインキュベートした。蛍光顕微鏡法によって、上に記載された計算に従ってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を得た。
【０１１７】
Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭの信頼性および再現性
同意雄からの精液サンプルを液化した後、精子を洗浄し、インキュベートし、固定し、次いで、蛍光顕微鏡法によってＧＭ１局在化パターンについて評価した。１つのサンプル内のスコアリングの精度と、同じサンプルをスコアリングする判読者間のばらつきの両方を評価した。不等分散を用いるスチューデントのｔ検定を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（２０１３）を使用して行った。
【０１１８】
従来の精液分析パラメータとのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの相関関係
同意患者からの精液サンプルを液化し、洗浄し、非受精能獲得条件下と受精能獲得条件下の両方においてインキュベートした。ＷＨＯガイドラインに従って、精液分析を行った。蛍光顕微鏡法によってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を得た。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（２０１３）およびＸＬＳＴＡＴ（２０１５）を使用して統計分析を行った。
【０１１９】
受精能が実証された男性と、受精能について評価されている男性とを比較した、Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭを用いた受精能獲得の評価
２つのコホート：１）受精能が判明している（妊娠中のパートナーがいるかまたは３歳未満の子をもうけた）コホートおよび２）初めて精液分析を受けようとしている患者の同意男性に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を測定した。液化の後、精子を洗浄し、３００万個を非受精能獲得（ＮＣ）条件および受精能獲得（ＣＡＰ）条件下において３時間インキュベートした。精子を一晩固定し、ＧＭ１局在化パターンを蛍光顕微鏡法によって評価した。
【０１２０】
結果
液化時間、希釈およびピペッティングは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を変化させなかった。コントロール（インキュベーションのみ）サンプル、ＷＯＴＰ処理サンプルおよびＰＰ処理サンプルは、４１±４、４０±５および４１±６というＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を有した（ｎ＝５；ＣＡＰ）。ｃｈｙｍｏを用いてサンプルを液化したとき、受精能獲得刺激に対する応答の低下が観察された（Ｐ＝０．０３）。コントロールサンプルは、４０±６というＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を有した（ｎ＝５；ＣＡＰ）のに対して、酵素的に液化されたサンプルは、３１±４というＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を有した（ｎ＝５；ＣＡＰ）。ｃｈｙｍｏは、膜タンパク質を切断できるプロテアーゼであるので、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値の低下が標識の変化に起因するかを判定するために調べた。受精能獲得刺激に曝露されなかったサンプルを比較したところ、差は観察されなかった。コントロールサンプルおよび酵素的に液化したサンプルは、２２±４および２１±５というＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を有した（ｎ＝５；ＮＣ）。これらのデータは、ｃｈｙｍｏによる精液の処理は、臨床行為において広く用いられているが、精子が受精能獲得刺激に応答する能力を阻害し得るという認識を裏付ける。
【０１２１】
同様に精子が受精能獲得刺激に応答する能力を干渉し得る化合物のクラスとしては、（ｉ）プロテアーゼ（キモトリプシン、トリプシン、コラゲナーゼ、ブロメラインを含むがこれらに限定されない）；（ｉｉ）ヌクレアーゼ（ドルナーゼ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩを含むこれらに限定されない）；（ｉｉｉ）粘液溶解薬（エルドステイン、アセチルシステイン、グアイフェネシンを含むがこれらに限定されない）；（ｉｖ）リパーゼ（ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＣ、リポタンパク質リパーゼを含むがこれらに限定されない）；（ｖ）エステラーゼ（コリンエステラーゼ、チオエステラーゼ、アルカリホスファターゼを含むがこれらに限定されない）；および（ｖｉ）グリコシドヒドロラーゼ（アルファ−アミラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼおよびリゾチームを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
【０１２２】
最大２時間の液化時間、ならびにＷＯＴＰおよび／またはＰＰを用いた機械的液化は、受精能獲得に影響しなかった。対照的に、ｃｈｙｍｏなどの酵素の使用は、Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ検査によって計測したとき、精子が受精能を獲得する能力を低下させた。これらの結果は、精液処理方法がどのように精子の機能に影響するかを知ることの重要性を示している。
【０１２３】
５０、１００、１５０および２００個の精子を評価したときのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に関するパーセント変化（％Δ＝（ｙ２−ｙ１）／ｙ２）を比較することによって、精度を評価した。精子が５０個増加する毎に、１１、６および５％という値の変化が、観察された（ｎ≧２３）。保守的であるために、少なくとも１５０個の細胞のＧＭ１局在化パターンをカウントすることによって、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を測定した。判読者内および判読者間のばらつきを評価するために、複数の視野から取り出した画像を合わせることによって、最大５，０００個の精子を含む８つの大きな画像ファイルを生成した。２人の異なる判読者を訓練し、それらの判読者が、各画像を２０回、ランダムにリサンプリングし、各回１５０個の細胞をカウントすることによって、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を測定した。同じサンプルをスコアリングしたとき、個々の判読者は、３Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ単位という平均ＳＤを報告した。同じサンプルをスコアリングしたときの判読者間の差は、０．００〜１．５２であり、任意の所与のサンプルに対する判読者間の差の平均は、１であった。多重比較のためにボンフェローニの補正を適用すると、判読者間の差は、いずれの画像ファイルについても観察されなかった（ｐ値は０．０２〜０．９９の範囲であった）。
【０１２４】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、液化時間またはＷＯＴＰもしくはＰＰによる機械的液化によって影響されなかった（ｎ＝５）が、洗浄およびインキュベーションの後、２時間の液化またはＰＰ通過を経たサンプルは、より大きな運動性の低下を示した（ｐ＝０．０２、３Ｅ−３）。針の使用は、精子を損傷したので、さらに調査しなかった。ｃｈｙｍｏによる液化は、ＣＡＰサンプルではＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを低下させた（ｐ＝０．０３）が、ＮＣサンプルでは低下させなかった（ｐ＝０．７４）。ｃｈｙｍｏとともにインキュベートされたサンプル（ｎ＝５；３ｍｇ／ｍｌ）は、膜の損傷に起因してスコアリングできなかったが、ＮＣ条件下において運動性の増加を示した（ｐ＝９Ｅ−４）。
【０１２５】
実施例２
この実施例は、受精能のある男性（コホート１、妊娠中または最近子をもうけた）と潜在的な低受精能／不妊の男性（コホート２、受精能が疑われている男性）との間のコホート比較を用いて行われた。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅと従来の精液測定との関係性も調べた。
【０１２６】
すべての研究が、ＷＩＲＢによって承認された（２０１５２２３３）。精液サンプルを液化し、洗浄し、非受精能獲得条件および受精能獲得条件下でインキュベートした。精子を一晩固定し、蛍光顕微鏡法によってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した。精液の質の測定をＷＨＯに従って評価した。Ｔ検定、ＡＮＯＶＡおよび相関分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（２０１３）およびＸＬＳＴＡＴを使用して行った。
【０１２７】
コホート１のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ平均値は、３５．３であった（ＳＤ＝７．７％；ｎ＝７６人のドナー；１８７個の収集物）。コホート２のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、それより低く（ｐ＝１．０Ｅ−０３）、３３．６％（４１／１２２）が、予想された１６％に対して、コホート１の平均値より１ＳＤより低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有した。コホート２の場合、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅと、形態（ｐ＝０．２８）、運動性（ｐ＝０．１４）または濃度（ｐ＝０．６７）との間に関係性は観察されなかった。コホート２の男性の９３．４％（１１４／１２２）が、正常な運動性を示したが、彼らの３０．７％（３５／１１４）が、平均値より１ＳＤ低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有した。同様に、１２２人中１０１人の男性（８２．７％）が、正常な濃度を示し、３２．６％（３３／１０１）が、平均値より１ＳＤ低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有した。これらの結果は、受精能獲得の欠陥が、受精が困難な男性に共通すること、およびＣａｐ−Ｓｃｏｒｅが、精液分析を補完する機能的なデータを提供することを示している。
【０１２８】
精子が受精能を獲得する能力は、受精能力のある男性と受精が困難な男性との間で異なる。受精能獲得は、受精に必要であるので、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、標準的な精液分析に対して重要な機能的補完を提供でき、最も適切な受精能処置の選択を助け得る。
【０１２９】
精液の質の一般的な測定は、主観的であり、判読者内および判読者間で異なり得ることから、雄性受精能の評価を困難にしている。Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ検査は、雄性受精能にとって不可欠な、精子が受精能を獲得する能力を評価する。本明細書中に示されるデータは、Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ検査が、判読者内および判読者間において高度に再現性があり、信頼できることを示し、このことは、雄性不妊症を診断しようとするときに重要な検討材料である。
【０１３０】
４１人の受精能力のある男性のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの平均値（μ＝３９）およびＳＤ（σ＝７）を用いて、ロバストな受精能力のある受精能獲得プロファイルを確立するために必要な、受精能力があると判明している男性の数を推定した。検出力分析のために、平均値についての許容範囲を３％に設定し、差を検出する確率を９０％として、ｐ＜０．０１レベルの両側ｔ検定を適用した。結果は、有効な基準が≧８５個体で確立され得ることを示唆した。４１人のユニークなドナーからの１２５個の観察結果を用いて、正常な受精能力のある予備的な基準を作成した。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値をドナーごとに平均し、次いで、ｚ−スコアに変換した（（Ｘ−μ）／σ；Ｘ＝観察結果、μ＝３９；σ＝７）。これにより、μが０に、σが１に変換された。変換された値は、σ（Ｓ．Ｄ．）を単位とするμ（平均値）からの距離を表す。受精能検査を受けようとしている９３人の男性のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値に対して、正常な受精能力のある基準を検査した。このコホートは、受精能力のある集団より有意に低くスコアリングされ（ｐ＝１．６Ｅ−５）、２７％および３８％が、≦−２のｚ−スコアおよび−１〜−２のｚ−スコアを有した。３５％だけが、平均値の近くにまたは平均値より高くスコアリングされた。これらのデータは、受精能検査を受けようとしている多くの男性が、受精能力のある男性と比較して、受精能獲得に欠陥があることを示唆している。
【０１３１】
実施例３
実施例１および２において用いられた手順を実施例３でも用いた。
【０１３２】
従来の精液分析は、サンプルが卵子に受精する能力に関する情報をほとんど提供しない。受精能獲得は、受精に必要であり、ＧＭ１局在化を用いて評価できる。２つの男性コホートのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を比較することによって、受精能を獲得する能力の有意差が明らかになった。ロバストな受精能獲得プロファイルが、異常を識別するために定義および使用され得る。著しいことに、１６％という予想される結果に対して、受精能が疑われている男性の３３％が、≦−１のｚ−スコアを有した。Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ検査を従来の分析と組み合わせることが、雄性不妊症の診断において役立つと判明するはずである。
【０１３３】
不妊症の専門家に問い合わせた１２２人の男性からのサンプルを分析したところ、１３〜５２％の範囲のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有した。分散分析を行って、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値および精子の形態を比較した。サンプルを、０、１、２、３または≧４％の正常形態を有するとして分類し（≧４％のスコアが、ＷＨＯで正常と見なされる）、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの平均値を群間で比較した。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と形態との関係性は、観察されなかった（Ｐ＝０．６７）。次に、精子濃度（３×１０６〜２１０×１０６／ｍＬの範囲）を、ピアソン積率相関係数を用いてＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と比較したところ、関連は見られなかった（ｒ＝０．０１、Ｐ＝０．９０）。最後に、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を、全体的な％運動性（１５〜８０％の範囲）を比較したところ、それらの２つの測定結果は、無関係であると判断された（ｒ＝０．１４  Ｐ＝０．２１）。ＷＨＯ基準によって正常と分類された複数のドナーは、正常の平均値より２ＳＤ超低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値を有したことから、正常に見える精子であっても機能の異常を有し得るという認識が裏付けられた。
【０１３４】
従来の精液分析は、雄性不妊症の症例の５０％しか識別しない。本研究は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値と標準的な精液分析パラメータとの間に関連性がほとんどないことを示す。受精能獲得は、受精に必要であるので、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ検査を従来の精液評価に加えることによって、特発性不妊症の症例を識別することと、最も適切な処置のために臨床医が夫婦に助言するのを助けることの両方が可能になるだろう。
【０１３５】
本明細書中に提示されるデータは、男性のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値が、推奨される補助生殖医療（例えば、体外受精（ＩＶＦ）または卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ））を含む、哺乳動物の妊娠の成功にとって適切な機構に対する指針を提供し得ることを実証している。その男性は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る。Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値は、精液分析の他の成分（濃度、全体的な運動性、前進運動性、体積、ｐＨ、粘度および／または形態を含む）と組み合わせて考慮され得る。例えば、同じＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを有する２人の男性の精子数または精子運動性が異なる場合、それらの男性に対して推奨される補助生殖医療は、異なり得る。さらに、雌性パートナーの受精能状態または性と生殖に関する健康も、臨床医によって考慮されるだろう。
実施例４
【０１３６】
同意男性の精液サンプルを液化し、洗浄し、アリコートを非受精能獲得（ＮＣ）条件または受精能獲得（ＣＡＰ）条件下でインキュベートした。それらの同意男性には、妊娠中のパートナーがいることに基づいて受精能力があると分類された男性、または最近、生物学的に父親になった男性が含まれた。それらの同意男性には、受精能検査を受けようとしている男性も含まれた。受精能獲得条件は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンへのインビトロ曝露を含む。非受精能獲得条件には、様々な時間にわたって、炭酸水素イオン、カルシウムイオン、およびステロール流出のメディエーター（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）のいずれにもインビトロにおいて曝露しないことが含まれる。次いで、インビトロにおいて受精能を獲得された精子およびインビトロにおいて受精能を獲得されなかった精子を固定液（例えば、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）中で固定した。次いで、固定されたインビトロにおいて受精能を獲得された精子およびインビトロにおいて受精能を獲得されなかった精子を、蛍光標識されたコレラ毒素ｂサブユニットで標識した。
【０１３７】
１つのデータセットに対しては、精子サンプルを受精能獲得条件または非受精能獲得条件において３時間インキュベートし、固定し、標識し、次いで、分析した（「０日目」）。第２のデータセットに対しては、精子サンプルを受精能獲得条件または非受精能獲得条件において３時間インキュベートし、一晩固定し、標識し、次いで、分析した（「１日目」）。第３のデータセットに対しては、精子サンプルを受精能獲得条件または非受精能獲得条件において３時間インキュベートし、固定し、標識し、次いで、分析した。第３のデータセットに対しては、精子サンプルを受精能獲得条件または非受精能獲得条件において２４時間インキュベートし、固定し、標識し、次いで、分析した。（「２４ｈｒＣａｐ」）。精子の受精能獲得を、ＧＭ１の局在化（Ｃａｐ−ＳｃｏｒｅＴＭ）を用いて評価した。
【０１３８】
３６人の受精能力のある男性からの１０２個の精子サンプルを０日目および１日目に評価した。０日目と１日目との間で、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの上昇が、８１％（８３／１０２）の精子サンプルにおいて観察され、４４％の精子サンプル（４５／１０２）が、１標準偏差超のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの上昇（７％）を有した。
【０１３９】
受精能の処置を受けようとしている１７人の男性からの精子サンプルを０日目および１日目に評価した。０日目と１日目との間で、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの上昇が、２９％（５／１７）において観察され、それらのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、１標準偏差超、上昇した（７％）。
【０１４０】
このＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの変化が、生理学的であるのか、または一晩固定液中に存在したことのアーチファクトであるのかを判定するために、９人の受精能力のある男性からの精液サンプルを、０日目、１日目、および受精能獲得培地または非受精能獲得培地中でのインビトロでの２４時間のインキュベーション後に分析し、次いで、固定した。インビトロにおいて受精能を獲得されなかったすべてのサンプルが、等しく（１９±２、２３±２および２０±１％というＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ）、インビトロにおいて受精能を獲得されたサンプル（それぞれ２８±１、３４±２および３１±２％というＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ）とは異なった。１日目のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、０日目のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅより有意に高かった（ｐ＝０．０３）。しかしながら、固定液中で一晩インキュベートされた（１日目）または受精能獲得培地中で一晩インキュベートされた（２４ｈｒＣａｐ）、インビトロにおいて受精能を獲得されたサンプルのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、同じだった（ｐ＝０．３３）。
【０１４１】
以前の文献と一致して、これらのデータは、受精能獲得に関わる精子膜の変化が、なおもある特定の固定液中で経時的に生じることを示している。これらのデータは、精子が、異なる射精液中では異なる時点において受精能獲得を達成することを示唆している。これが、個体に対して再現性があるのかを確かめるために、２５人の受精能力のある男性からの９１個のサンプルを早いまたは遅い受精能獲得サンプルとして分類した（１日目−０日目＞７）。ドナー内での変化の一致の平均値は、７６％であったことから、受精能獲得タイミングが、男性の中で高度に一致することが示された。
実施例５
【０１４２】
８人の受精能力のある男性（妊娠中のパートナーがいるかまたは最近子をもうけた男性）からの精液サンプルを用いて、受精能獲得のタイミングに対する冷凍保存の影響を調べた。液化された射精液を分割し；半分を直ちに処理し（新鮮）、もう半分を、グリセロールを含む検査用卵黄緩衝液（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で冷凍保存した。続いて、冷凍保存されたサンプルを解凍し、処理した（ＣｒｙｏＴ）。新鮮アリコートおよびＣｒｙｏＴアリコートを洗浄し、次いで、非受精能獲得（ＮＣ）条件および受精能獲得（ＣＡＰ）条件下で３時間インキュベートした。受精能獲得のタイミングは、男性の間で異なり、１日目のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（受精能獲得を促進する／可能にする条件下での一晩のインキュベーションの後）から０日目のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ（３時間のインキュベーションの後に分析された）へのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの差を比較することによって評価され得る。
【０１４３】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、０日目と１日目の両方に対してＮＣ  ＣｒｙｏＴ処置において、新鮮と比較して、上昇した。０日目の場合は、１５５％上昇し（（新鮮−ＣｒｙｏＴ）／新鮮；１１±１．６％対２８±２．４％；ｎ＝７；ｐ＝０．００）、１日目の場合は７９％上昇した（１９±２．６％対３４±２．７％；ｎ＝８；ｐ＝０．００）。逆に、ＣＡＰ処置に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅは、０日目（２６±３．１％対３０±２．５％；ｎ＝７；ｐ＝０．３１）と１日目（３４±２．９％対３４±１．７％；ｎ＝８；ｐ＝０．８６）の両方で同じままだった。ＣｒｙｏＴサンプルに対する２７±３．５％および３１±８．６％という解凍後および洗浄後の運動性の平均は、合理的な解凍後の生存率を示唆する。０日目および１日目に対するサンプルを比較したとき、受精能獲得のタイミングの差（１日目−０日目；ｎ＝７）は、ＮＣ処置（１０±２．２％対８±２．７％）またはＣＡＰ処置（８±３．８％対５±２．３％）について新鮮サンプルとＣｒｙｏＴサンプルとの間で観察されなかった。
実施例６
【０１４４】
検体の収集についてのすべての手順が、ＷＩＲＢによって承認された（プロトコル＃２０１５２２３３）。精液サンプルを、禁欲の最低２日後および最大５日後に手によるマスターベーションによって同意男性から収集した。運動性精子細胞が１０×１０６個より少ないサンプルをこの研究から外した。
【０１４５】
射精液を３７℃で少なくとも１５分間かつ２時間未満にわたって液化した。液化の後、３００×ｇでの１０分間のＥｎｈａｎｃｅ  Ｓ−Ｐｌｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：１５２３２  ＥＳＰ−１００−９０％）を介した遠心分離によって精漿から精子を取り出した。これらの細胞を回収し、約４ｍｌの改変ヒト卵管液培地（ｍＨＴＦ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ９０１２６）に再懸濁し、６００×ｇで１０分間ペレットにした。それらの精子を、受精能獲得刺激を含むおよび含まないｍＨＴＦに再懸濁し、３時間インキュベートした。インキュベーションの後、サンプルを、記載のとおり（Ｓｅｌｖａｒａｊ  Ｖ，ら、“Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｎ−ｓｃａｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｂ−ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｐｅｒｍ，”Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０６：６３６−４６（２００６））、パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）で少なくとも３０分間固定した後、標識した。
【０１４６】
サンプルを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８に結合体化された２μｇ／ｍＬのコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ：Ｃ３４７７５）で標識した。１０分後、５μｌの標識された精子を顕微鏡用スライドにのせ、カバーガラスで覆い、イメージングステーションに移した。
【０１４７】
イメージングステーションは、ＣＦＩ６０  Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  Ｌａｍｂｄａ  ４０×対物レンズ、Ｃ−ＦＬ  ＡＴ  ＧＦＰ／ＦＩＴＣロングパスフィルターセット、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ  ４．０カメラ、Ｈ１０１Ｆ−ＰｒｏＳｃａｎ  ＩＩＩオープンフレーム正立顕微鏡電動Ｈ１０１Ｆフラットトップステージ、およびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを実行する６４ビットイメージングワークステーションが備え付けられたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＮＩ−Ｅ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）からなった。これらのシステムを、最大５，０００個の精子を含む１５×１５個のつなぎあわされた画像セットを自動的に捕捉するようにプログラムした。
【０１４８】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ  ＳＦＴは、ガングリオシドＧＭ１の局在化パターンを検出し、分析する。２人の独立した判読者を、ヒト精子の受精能獲得に関連するＧＭ１局在化パターンを識別するように訓練した。受精能獲得を経たサンプル内の精子の割合を求め、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅとして報告した。
【０１４９】
Ｇ＊ｐｏｗｅｒ（Ｆａｕｌら、“Ｇ＊  Ｐｏｗｅｒ  ３：Ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐｏｗｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｏｃｉａｌ，ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ，ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｂｅｈａｖ  Ｒｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３９：１７５−９１（２００７））を用いて検出力分析を行った。スチューデントのｔ検定を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（２０１３）を使用して行った。線形回帰および等分散性のバートレットの検定を、ＸＬＳＴＡＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２０１５．５．０１．２２９１２において行った。
結果
【０１５０】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの精度を測定する際の最初の工程は、サンプルごとにカウントすべき細胞数を定義することであった。一般に、カウントされる細胞数が増加するにつれて、精度は高まる。しかしながら、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは、追加の観察結果によって変化するものではないので、ある点において追加の細胞のカウントは、冗長になる。追加の細胞のカウントが必要なくなる点を識別するために、５０、１００、１５０および２００個の精子のときのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅのパーセント変化を評価した（表１）。
【０１５１】
【表１】
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【０１５２】
５０または１００個の精子をカウントしたときのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅのパーセント変化は、１００または１５０および１５０または２００個の精子をカウントしたときのパーセント変化と比べて大きかった。これらの観察結果は、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの精度が、１００個超の精子をカウントすることによってわずかに改善されるという認識を裏付けた。しかしながら、５０または１００および１５０または２００をカウントしたときのパーセント変化に対する９５％信頼区間は、重複しなかったことから、少なくとも１５０個の細胞をカウントしたときのパーセント変化の有意な減少が示唆される。保守的であるために、少なくとも１５０個の細胞のＧＭ１局在化パターンをカウントすることによって、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した。
【０１５３】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの信頼性をさらに調べるため、および精液の質の客観的尺度としてのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの潜在性を評価するために、そのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの測定値を調べることにより、個々の判読者内の精度を測定した。精度は、測定値と真の値との近さとして定義される。未知集団の真の値は、その中心傾向、すなわち平均値によって推定され得る。データセットが強い中心傾向を有するかまたは弱い中心傾向を有するかは、その分散、すなわち精度の逆数に基づいて判断できる（ＪＣＧＭ／ＷＧ２  ２００８）。換言すると、分散が大きくなるにつれて、精度は低下する。標準偏差（ＳＤ）および変動係数（ＣｏＶ）が、サンプル内の分散の量を見積もる。０に近い標準偏差は、それらのデータポイントが、平均値あたりに密集する傾向があることを示す一方で、高い標準偏差は、それらのデータポイントが広がっていることを示す。同様に、ＣｏＶは、平均値に対する分散の量（ＣｏＶ＝ＳＤ／平均値）を表すので、平均値が互いに大幅に異なったとしても、１つのデータシリーズと別のデータシリーズとのばらつきの程度を比較するのに有用である。
【０１５４】
判読者内のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの精度を評価する前に、各判読者がサンプリングする画像の数を推定した。この目的を達成するために、受精能力があると推定される（妊娠中の妻または３歳未満の子がいる）男性集団に対するＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの平均値よりも１ＳＤ低いカットオフに基づいて、２つの精液ドナー群を定義した。「より低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ」を有する群のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの平均値は、２７であり、「受精能力があると推定される」群は、４０であった。各群の標準偏差は、それぞれ５．２および４．９であった。検出力分析を、差が存在する場合は差を検出する確率を９０％（１−ベータ＝０．９０）としてｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１レベルの両側検定を用いて行った。これらの分析の結果は、それぞれサンプル１０個および１４個の画像（１群あたり５および７個）がサンプリングされるべきであることを示唆した。保守的であるために、「より低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ」群および「受精能力があると推定される」群の中のそれぞれ１０個の画像を生成した。１群あたりこの数の画像をサンプリングすることによって、低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値または高いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ値のせいで生じ得る再現性の差を識別するために各画像を十分に調べることが保証された。
【０１５５】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ  ＳＦＴの精度を評価するために、２人の異なる判読者が、それぞれ最大５，０００個の精子を含む１０個の画像を「より低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ」群および「受精能力があると推定される」群からランダムにリサンプリングすることによってＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定し、各判読者が２０回リサンプリングした。ＳＤおよびＣｏＶは、各判読者に対する画像毎に基づいて計算された。画像および判読者の平均ＳＤは、３（図１Ａ）であり、平均ＣｏＶは、１３％であった（図１Ｂ）。ＳＤとＣｏＶの両方が、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅに対して直線関係を示した。したがって、より高いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを読むことに関連するより大きな分散が存在したが、これは、より大きなＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの大きさに起因するとみられた。同じ精子集団を同じまたは異なる判読者がランダムにリサンプリングしたとき、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ値は、真の値のあたりに密集したので、これらのデータは高い精度で一致した。これらの分散および（または）ばらつきの尺度は、小さく安定しているので、それらは、判読者内の高度なＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ再現性を明らかにする。
【０１５６】
一般に、分布は、その平均値および分散を用いて説明され得る。平均値は、分布の配置を示し、分散は、そのデータがどれだけ散らばっているかを説明する。平均値は同じであるが分散が異なる場合、２つの分布を想定できる。例えば、一方の分布は、通常のベル型に似ていて、他方は、もっと平らで、より多くの極値を有する。判読者の間における同様のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ分布を実証するために、「より低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ」群および「受精能力があると推定される」群の各々に対して、１０個のつなぎあわされた画像を得た。２人の異なる判読者が、各画像を２０回、ランダムにリサンプリングすることによって、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅを測定した。各画像ファイルは、サンプリングされた精子より数桁多い精子を含むので、ランダムな各リサンプリングは、個々の射精液内からの細胞の異なるサブサンプルであった。
【０１５７】
Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの平均値の１という平均差が、２０個の異なる画像に対して、判読者の間で観察された（図３）。ボンフェローニの補正を適用すると、識別可能な差は観察されなかった。同様に、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの分散は、判読者の間で異ならなかった（図３）。これらのデータは、同じ精子集団をリサンプリングするとき、独立した判読者が同様のＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ分布を得るので、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅは判読者の間で再現性のあるという認識を裏付ける。まとめると、これらのデータは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ  ＳＦＴが、判読者内および判読者間で高度に再現性があって信頼できるという強い証拠を提供する。これは、雄性生殖の適格性を評価しようとするとき、重要な検討材料である。
【０１５８】
本研究で提示されたデータは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅ  ＳＦＴが、判読者内および判読者間で高度に再現性があって信頼できることを実証する。取得されたデータおよび画像ファイルは、Ｃａｐ−Ｓｃｏｒｅの評価における研究室内および研究室間の継続した品質管理（ＱＣ）および品質保証（ＱＡ）に対する根拠として役立つはずである。例えば、判読者がＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを読む日々の能力を実証するために、２０個中２個の画像ファイル（「より低いＣａｐ−Ｓｃｏｒｅ」群および「受精能力があると推定される」群から１つずつ）がランダムに選択され、毎日スコアリングされ得る。確立された平均値から許容できる範囲の外の値が得られる場合（Ｗｅｓｔｇａｒｄら、“Ａ  ｍｕｌｔｉ−ｒｕｌｅ  Ｓｈｅｗｈａｒｔ  ｃｈａｒｔ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２７：４９３−５０（１９８１）、研究室の管理者は、改善について相談され得る。これらのデータを用いることにより、個々の判読者を経時的に追跡すること、およびＣａｐ−Ｓｃｏｒｅの測定における潜在的変化を識別することもできる。同様に、新しい人員および（または）研究室を訓練し、読む輪番に組み込むとき、複数の画像ファイルをスコアリングし、彼らのＣａｐ−Ｓｃｏｒｅを確立された値と比較することによって、彼らの読む能力を評価できる。そのようなアプローチがあれば、研究室内と研究室間の両方で比較可能なデータが保証され得る。継続した内部および外部のＱＡおよびＱＣを介するだけで、精子の機能評価の高い基準を維持できる。
【０１５９】
雄性受精能の診断は、歴史的に、精子の機能；すなわち、受精する能力を評価できないことに悩まされてきた（Ｏｅｈｎｉｎｇｅｒら、“Ｓｐｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｅｓｔｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０２：１５２８−３３（２０１４）；Ｗａｎｇら、“Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｍｅｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ  ｎｅｅｄｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｗｅｒ  ｔｅｓｔｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．１０２：１５０２−０７（２０１４））。そのような診断能力があれば、従来の精液評価の記述的判定に対する機能的な補完が提供されるだろう。受精能力が欠損している精子を識別することにより、特発性不妊症として現在カテゴリー化されているものをより具体的に診断することが可能になり得る。さらに実際的に重要であることは、この情報が、妊娠を達成するために最も適切なＡＲＴの形態について臨床医が夫婦に助言するのを助けることを可能にし得ることである。先に特定した目標を達成するために、精子機能の多くのアッセイが提案されてきた（例えば、ハムスター帯貫通（ｈａｍｓｔｅｒ  ｚｏｎａ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）アッセイ（Ｂａｒｒｏｓら、“Ｈｕｍａｎ  Ｓｐｅｒｍ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｚｏｎａ−Ｆｒｅｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｓ  ａ  Ｔｅｓｔ  ｔｏ  Ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｒｍ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ａｂｉｌｉｔｙ，”Ａｎｄｒｏｌｏｇｉａ．１１：１９７−２１０（１９７９）；Ｒｏｇｅｒｓら、“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａｌ  ｆｅｒｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｚｏｎａ−ｆｒｅｅ  ｏｖａ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．３２：６６４−７０）１９７９）、精子−ＺＰ結合検査（Ｌｉｕら、“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍ−ｏｏｃｙｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ｅｍｂｒｙｏ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．８２：１２５１−６３（２００４）および頸管粘液貫通アッセイ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ，”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．３６：２０１−８（１９８１）；Ｍｅｎｇｅら、“Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ｓｅｍｅｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ａｎｔｉｓｐｅｒｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｕｃｕｓ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｕｐｌｅｓ．”Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．５１：４８６−９２（１９８９）；Ｅｇｇｅｒｔ−Ｋｒｕｓｅら、“Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｐｅｒｍ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｕｃｕｓ，��Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ．５１：３１７−２３（１９８９）。しかしながら、それらの使用は、計画を行う上で実際的な形式で必要な材料を得ることが非常に難しいことにより限定されてきた。この現在の空白を満たすために、精子が卵母細胞に受精するために必要な生理学的変化を起こす能力を評価するための診断ツールが開発された。
【０１６０】
本開示は、本発明の真意または不可欠な属性から逸脱せずに、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の明細書ではなく、本開示の範囲を示す添付の請求項を参照するべきである。前述の説明は、本開示の好ましい実施形態に関するが、他のバリエーションおよび改変が当業者に明らかであり、本開示の真意または範囲から逸脱せずに他のバリエーションおよび改変が行われ得ることに注意する。
【図１Ａ】
2019506893.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019506893.tif 000007
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
2019506893.tif 000010
【国際調査報告】
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