(57)【要約】  本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞およびその用途に関し、高炭水化物食に比べて高脂肪食により体内でプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞生成が増加し、正常なヒトに比べて乳癌、肝癌等の癌患者、喘息、アトピー皮膚炎等の炎症疾患、および糖尿病、肝硬変症等の代謝疾患の患者の血液に前記小胞が有意に減少している。前記小胞は、病原性小胞による炎症媒介体の分泌を抑制すると同時に、角質細胞の死滅を抑制し、体内でアンドロゲン受容体の発現を増加させることを実験的に確認し、本発明によるプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞は、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断または予測方法、薬学的組成物、食品、および化粧品等に用いることが期待される。【選択図】図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断のための情報提供方法：
（ａ）正常なヒトおよび患者由来サンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に存在するプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞検出プライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて正常なヒトに比べてプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量が低い場合、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患と判定する段階。
【請求項２】
前記患者由来サンプルは、血液または尿であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項３】
前記癌は、肝癌または乳癌であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項４】
前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎または喘息であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項５】
前記内分泌疾患は、骨粗しょう症、老衰、または脱毛であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項６】
前記代謝疾患は、糖尿病または肝硬変症であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
【請求項７】
プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記プロピオニバクテリウム属細菌は、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記小胞は、平均直径が１０〜１，０００ｎｍであることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記小胞は、プロピオニバクテリウム属細菌で自然的または人工的に分泌されることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記癌は、乳癌または肝癌であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎または喘息であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記内分泌疾患は、骨粗しょう症、老衰、または脱毛であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記代謝疾患は、糖尿病または肝硬変症であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、吸入剤であることを特徴とする、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞に含まれたタンパク質を使用することを特徴とする、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療方法。
【請求項１８】
プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む薬学的組成物の癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療用途。
【請求項１９】
プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項２０】
プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の改善用化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来ナノ小胞およびその用途に関し、より具体的には、プロピオニバクテリウム属細菌に由来するナノ小胞を利用した癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断方法、および前記小胞を含む予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀に入って、過去伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が減少するのに対し、ヒトとマイクロバイオームとの不調和により発生する免疫機能異常を伴った慢性疾患、特に癌、心血管疾患、慢性肺疾患、代謝疾患、神経−精神疾患等が、２１世紀の大きな問題となっている。
【０００３】
人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒト遺伝子数の１００倍を超えることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と疾病に大きい影響を及ぼすものと知られている。
【０００４】
人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質等の情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成する。粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが約１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通過して、人体に吸収される。人体に吸収される病原性細菌由来小胞は、アトピー皮膚炎のような炎症性皮膚疾患、慢性鼻炎、喘息、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の炎症性呼吸器疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患等のような炎症性疾患の病因に重要な因子であることが明らかにされている。また、糖尿病、肥満等の代謝疾患、肺癌、胃癌、大腸癌等の固形癌の発生とも緊密な関係があることが最近明らかにされて、注目を浴びている。
【０００５】
プロピオニバクテリウム属細菌は、嫌気性グラム陽性桿菌であって、トランスカルボキシラーゼ酵素を通じてプロピオン酸を合成する特徴を有している。前記細菌は、ヒトを含む動物と共生する細菌であって、皮膚だけでなく胃腸管にも共生することが知られており、多くの場合には、疾病を起こさないが、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）菌（にきび菌）である場合には、皮脂腺から分泌される皮脂（ｓｅｂｕｍ）に存在する脂肪酸をエネルギー源として使用し、にきびのような皮膚疾患に最も重要な原因菌として知られている。プロピオニバクテリウム属細菌は、産業的には、ビタミンＢ１２、テトラピロール化合物およびプロピオン酸合成、プロバイオティクス、チーズ生産等に用いられている。現在まで、プロピオニバクテリウム属細菌が細胞外に小胞を分泌するという事実が報告されていないし、プロピオン酸菌、好ましくはプロピオニバクテリウムアクネスの同属異種であるプロピオニバクテリウムフロイデンライシイ（Ｐ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）のアレルギー、インフルエンザワクチン、消化管機能異常の治療用途のみについて研究が進行されてきた（日本国特許公開ＪＰ２０１６−０２８０３３および韓国特許登録ＫＲ１０−１４５９１６６参照）。
【０００６】
一方、アンドロゲン受容体は、テストステロン、ジヒドロテストステロン等の男性ホルモンに結合する細胞内受容体であって、筋肉量および骨密度の増加、発毛等の男性表現型の発現および維持に重要な役割をする。また、男性ホルモンがアンドロゲン受容体を通じて骨粗しょう症、老衰等の予防に重要な役割をするものと知られている。
【０００７】
これより、本発明者らは、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が正常なヒトに比べて癌、慢性炎症疾患、内分泌疾患、そして代謝疾患患者の血液で減少していることを確認し、それに基づいて本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、プロピオニバクテリウム属細菌から小胞を最初に分離し、その特性を確認することにより、前記小胞を癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療用組成物として用いることができることを確認した。
【０００９】
具体的には、メタゲノム分析を通じて正常なヒトに比べて肝癌、乳癌等の癌患者、およびアトピー皮膚炎、喘息、糖尿病、肝硬変等の炎症または代謝疾患患者由来サンプルでプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量が顕著に減少していることを確認し、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を体外で分離して、治療効能を評価した結果、抗炎症および角質細胞死滅抑制効果を示し、また前記小胞の作用機序を評価した結果、男性ホルモン受容体の発現を増加させることを確認したため、これに基づいて本発明を完成した。
【００１０】
これより、本発明らは、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防、改善または治療用組成物を提供することをもう一つの目的とする。
【００１２】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）正常なヒトおよび患者由来サンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に存在するプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞検出プライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて正常なヒトに比べてプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量が低い場合、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患として判定する段階。
【００１４】
本発明の一具現例において、前記患者由来サンプルは、血液または尿であってもよい。
【００１５】
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明の一具現例において、前記プロピオニバクテリウム属細菌は、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）であってもよい。
【００１７】
本発明の他の具現例において、前記小胞は、平均直径が１０〜１，０００ｎｍであってもよい。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例において、前記小胞は、プロピオニバクテリウム属細菌から自然的または人工的に分泌されるものであってもよい。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例において、前記患者由来サンプルは、尿または血液であってもよい。
【００２０】
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、吸入剤であってもよい。
【００２１】
本発明のさらに他の具現例において、前記組成物は、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞に含まれたタンパク質を使用することができる。
【００２２】
本発明のさらに他の具現例において、前記癌は、肝癌または乳癌であってもよい。
【００２３】
本発明のさらに他の具現例において、前記炎症疾患は、アトピー皮膚炎、喘息、糖尿病、または肝硬変症であってもよい。
【００２４】
本発明のさらに他の具現例において、前記内分泌疾患は、骨粗しょう症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、老衰（ｆｒａｉｌｔｙ）、脱毛（ｈａｉｒ  ｌｏｓｓ）であってもよい。
【００２５】
本発明のさらに他の具現例において、前記代謝疾患は、糖尿病または肝硬変症であってもよい。
【００２６】
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００２７】
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患改善用化粧料組成物を提供する。
【００２８】
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療方法を提供する。
【００２９】
また、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む薬学的組成物の癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明者らは、高脂肪食摂取マウス由来糞便サンプルにおいて高炭水化物食摂取マウスに比べてプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量が増加していることを通じて、脂肪によりプロピオニバクテリウム属細菌の活性が増加することを確認した。患者の血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を通じて肝癌、乳癌、喘息、アトピー皮膚炎、糖尿病、および肝硬変症患者の血液に存在するプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が正常なヒトに比べて有意に減少していることを確認した。また、プロピオニバクテリウム属細菌の一種であるプロピオニバクテリウムアクネスを体外で培養して小胞を分離した後、これをマウス投与すると、前立腺組織でアンドロゲン受容体の発現を増加させることを実験的に確認した。前記小胞を炎症細胞に前処理したとき、抗炎症および免疫調節機能を有する効果を観察したところ、本発明によるプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞は、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断または予測方法、薬学的組成物、食品、および化粧品などに有用に用いられるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】高炭水化物食（ＲＣＤ）と高脂肪食（ＨＦＤ）摂取マウスの糞便から小胞を分離し、メタゲノム分析のためのプロトコルを図示したものである。
【図２】高炭水化物食（ＲＣＤ）と１２週間高脂肪食（ＨＦＤ）摂取マウスの糞便から細菌と小胞を分離して、それぞれでメタゲノム分析を行った結果である。
【図３ａ】マウスに腸内細菌と細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真である。
【図３ｂ】口腔で投与してから１２時間後に、血液、腎臓、および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。
【図４】人体由来物で細菌由来小胞メタゲノム分析方法を模式化した図である。
【図５ａ】肝癌患者および年齢と性別がマッチングされた正常なヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図５ｂ】乳癌患者および年齢と性別がマッチングされた正常なヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図６ａ】喘息患者および年齢と性別がマッチングされた正常なヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図６ｂ】アトピー皮膚炎患者および年齢と性別がマッチングされた正常なヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図７ａ】糖尿病患者および年齢と性別がマッチングされた正常なヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図７ｂ】肝硬変患者および年齢と性別がマッチングされた正常なヒトの血液に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図８ａ】プロピオニバクテリウムアクネスを体外で培養した後、培養液から小胞を分離して電子顕微鏡で小胞の形態を観察した結果である。
【図８ｂ】プロピオニバクテリウムアクネス培養液から分離した小胞のサイズを動的光散乱法で測定した結果である。
【図９ａ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞に含有されたプロテオームを分析した結果、同定されたタンパク質を細胞構成物質に分類して示す図である。
【図９ｂ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞に含有されたプロテオームを分析した結果、同定されたタンパク質を機能に分類して示す図である。
【図１０ａ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を大食細胞株に処理した後、細胞死滅程度を測定した結果である。
【図１０ｂ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を大食細胞株に処理した後、炎症媒介体であるＩＬ−６の分泌量を測定した結果である。
【図１１ａ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を大食細胞株に多様な濃度で前処理した後、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）処理時に、大腸菌小胞による炎症媒介体であるＩＬ−６の分泌に及ぼす影響を評価した結果である。
【図１１ｂ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞をマウス大食細胞株に多様な濃度で前処理した後、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）処理時に、大腸菌小胞による炎症媒介体であるＴＮＦ−αの分泌に及ぼす影響を評価した結果である。
【図１２ａ】黄色ブドウ球菌由来小胞（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＶ）を皮膚角質細胞に多様な濃度で処理した後、黄色ブドウ球菌由来小胞による角質細胞の死滅程度を評価した結果である。
【図１２ｂ】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞（Ｐ．ａｃｎｅｓ  ＥＶ）を皮膚角質細胞に多様な濃度で処理した後、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞による角質細胞の死滅程度を評価した結果である。
【図１３】皮膚疾患の病原性小胞である黄色ブドウ球菌由来小胞（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＶ）による皮膚死滅に対するプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞（Ｐ．ａｃｎｅｓ  ＥＶ）の抑制効果を評価するために、多様な濃度のプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を角質細胞に前処理した後、高濃度の黄色ブドウ球菌由来小胞を処理して角質細胞の細胞死滅を測定した結果である。
【図１４】プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞をマウス腹腔で４週間８回投与した後、前立腺組織でアンドロゲン受容体の発現様相をウェスタンブロットで評価した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞およびその用途に関する。
【００３３】
本発明者らは、メタゲノム分析を通じて正常なヒトに比べて肝癌、乳癌等の癌、アトピー皮膚炎、喘息等の炎症性疾患、糖尿、肝硬変等の内分泌−代謝疾患の患者由来サンプルでプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量が顕著に減少していることを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【００３４】
これにより、本発明は、下記の段階を含む癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）正常なヒトおよび患者由来サンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に存在するプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞検出プライマー対を用いてＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて正常なヒトに比べてプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量が低い場合、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患と判定する段階。
【００３５】
本発明で使用される用語「診断」とは、広い意味では、患者の病の実態をすべての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病床の詳細な様態、合併症の有無、および予後などである。本発明で診断は、癌、炎症疾患、または代謝疾患の発病の有無および疾患の水準などを判断することである。
【００３６】
本発明の診断対象疾病である「癌」は、周囲組織に浸潤しつつ速く成長し、身体各部位に拡散したり、転移して、生命をおびやかす悪性腫瘍を意味する。身体を構成する最も小さい単位である細胞は、正常的には細胞自体の調節機能により分裂および成長し、寿命が尽きるか、損傷すると、自ら死滅して全般的な数の均衡を維持するが、様々な原因によってこのような細胞自らの調節機能に問題が生ずると、正常的には死滅しなければならない非正常細胞が過多増殖することになり、周囲組織および臓器に侵入して腫塊を形成し、既存の構造を破壊したり変形させることになる。本発明において、癌は、好ましくは肝癌または乳癌であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００３７】
本発明で使用される用語「炎症疾患」は、哺乳動物体内の炎症反応により誘発される疾患を意味し、代表的な例としては、喘息、慢性閉鎖性肺疾患、鼻炎等の呼吸器系炎症疾患；アトピー皮膚炎、乾癬、にきび、接触皮膚炎等の皮膚炎症疾患；胃炎、消化器潰瘍、炎症性腸炎等の消化器炎症疾患；およびその合併症等を含む。また、前記炎症性疾患は、一般的な炎症性疾患以外にも、炎症反応に関連した癌を含む意味に使用され、例えば、肺癌、胃癌、大腸癌等を含む。本発明において、炎症疾患は、好ましくは喘息またはアトピー皮膚炎を意味するが、これらに制限されるのではない。
【００３８】
本発明で使用される用語「内分泌疾患」は、哺乳動物の体内でホルモンの過多あるいは欠乏による障害が現れることを意味し、例えば、女性ホルモンの過多による乳癌、男性ホルモンの減少による骨粗しょう症、老衰、脱毛等を含み、本発明において、内分泌疾患は、好ましくは骨粗しょう症、老衰、または脱毛を含むが、これらに制限されるものではない。
【００３９】
本発明で使用される用語「代謝疾患」は、哺乳動物の体内で代謝障害およびその合併症で発生する疾患を意味し、例えば、脂質代謝異常による高脂血症、炭水化物代謝異常による糖尿病、または代謝異常の合併症で現れる肝硬変症等を含み、本発明において、代謝疾患は、好ましくは糖尿または肝硬変症を含むが、これらに制限されるものではない。
【００４０】
本発明で使用される用語「ナノ小胞」あるいは「小胞」とは、多様な細菌で分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。グラム陰性細菌由来小胞、または外膜小胞体（ＯＭＶｓ）は、内毒素（リポ多糖）だけでなく、毒性タンパク質および細菌ＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性細菌由来小胞は、タンパク質と核酸の他にも、細菌の細胞壁構成成分であるペプチドグリカンとリポタイコ酸も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、プロピオニバクテリウム属細菌で自然的に分泌されるか、または人工的に生産するものであり、球形の形態で、１０〜１，０００ｎｍの平均直径を有している。
【００４１】
前記小胞は、プロピオニバクテリウム属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、および毛細管電気泳動よりなる群から選ばれる一つ以上の方法を使用して分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮等の過程をさらに含むことができる。
【００４２】
本発明で使用される用語「メタゲノム」とは、「群遺伝体」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かび等を含む遺伝体の総合を意味するものであり、主に培養できない微生物を分析するために配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念として使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノム、遺伝体を指すものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって、一種の混合遺伝体をいう。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、高速配列分析法を用いて、種に関係なくすべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を究明する技法の対象である。
【００４３】
本発明において、前記患者由来サンプルは、血液または尿であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００４４】
本発明の他の様態として、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００４５】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００４６】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞を有効成分として含む、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の改善用化粧料組成物を提供する。
【００４７】
本発明で使用される用語「予防」とは、本発明による食品、吸入剤、または薬学的組成物の投与により癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００４８】
本発明で使用される用語「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患に対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００４９】
本発明で使用される用語「改善」とは、本発明による食品、化粧料組成物の投与により癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患が治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
【００５０】
本発明の実施例では、高脂肪食動物モデルを用いて、プロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が、高脂肪食摂取マウスの糞便では、高炭水化物食摂取マウスの糞便に比べて増加していることを確認した（実施例１参照）。
【００５１】
本発明の一実施例では、乳癌患者、肝癌患者、および正常なヒトの血液から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常なヒトの血液に比べて、乳癌および肝癌患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（実施例３参照）。
【００５２】
本発明の一実施例では、喘息患者、アトピー皮膚炎患者、および正常なヒトの血液から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常なヒトの血液に比べて、喘息およびアトピー皮膚炎患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（実施例４参照）。
【００５３】
本発明の一実施例では、糖尿病患者、肝硬変症患者、および正常なヒトの血液から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常なヒトの血液に比べて、糖尿病および肝硬変症患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（実施例５参照）。
【００５４】
本発明の他の実施例では、前記実施例３〜５の結果を基にプロピオニバクテリウム属細菌に属するプロピオニバクテリウムアクネス種細菌由来小胞の特性を分析するために、さらに研究した結果、前記小胞は、平均直径が２００ｎｍより小さく、好ましくはサイズが３７．８±１３．５ｎｍの円形であることを確認した（実施例６参照）。
【００５５】
本発明のさらに他の実施例では、プロテオーム分析を通じてプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞内に存在する２５２個のタンパク質を同定し、細胞構成物質およびタンパク質機能別に分類して示した（実施例７参照）。
【００５６】
本発明のさらに他の実施例では、プロピオニバクテリウムアクネス菌株を培養して、これから分泌された小胞が炎症媒介体の分泌にどんな影響を及ぼすかを評価した結果、大食細胞株でプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞によるＩＬ−６分泌能が病原性小胞である大腸菌由来小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）に比べて顕著に低かった。また、多様な濃度のプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を大食細胞に処理した後、炎症および代謝疾患の原因因子である大腸菌小胞を処理して炎症媒介体分泌を評価した結果、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が、大腸菌由来小胞によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌を効率的に抑制することを確認した（実施例８参照）。
【００５７】
本発明のさらに他の実施例では、プロピオニバクテリウムアクネス菌株を培養して、これから分泌された小胞がアトピー皮膚炎の治療効果を評価するために、アトピー皮膚炎の重要な原因因子である黄色ブドウ球菌由来小胞（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＥＶ）を角質細胞に処理する前に、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を皮膚角質細胞に前処理したとき、黄色ブドウ球菌小胞による角質細胞の死滅がプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞により抑制されることを確認した（実施例９参照）。
【００５８】
本発明のさらに他の実施例では、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の内分泌疾患に対する治療機序中の一つで男性ホルモン受容体の発現に及ぼす影響を評価するために、前記プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞をマウスに投与した後、前立腺組織を摘出して分析した結果、前記小胞を投与した場合に、前立腺組織にアンドロゲン受容体の発現が増加していることを確認した（実施例１０参照）。
【００５９】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
［実施例１．高炭水化物食および高脂肪食摂取マウスの糞便内細菌および細菌由来小胞メタゲノム分析］
高炭水化物食（Ｒｅｇｕｌａｒ  ＣＨＯ  ｄｉｅｔ；ＲＣＤ）を１２週間食べさせた正常マウスと、高脂肪食（Ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ；ＨＦＤ）を２か月間食べさせて肥満を誘導したマウスにおいて図１に示した方法によって糞便を収集した。その後、収集したマウスの糞便の重さ（グラム）を測定し、ＰＢＳに分散させた。異物を除去するために、５００×ｇで５分、３，０００×ｇで５分、４，３５０ｒｐｍで５分ずつ連続的に遠心分離を行って上層液を分離した後、１０，０００×ｇで２０分間超高速遠心分離を行うことにより、糞便に含まれている細菌を分離した。また、小胞を分離するために、細菌が除去された上層液を０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した後、タンパク質の定量を行った。その後、０．８Ｍと２．５Ｍのスクロースクッションを作って、２８，５００ｒｐｍで４℃で２時間の間超高速遠心分離を２回繰り返して行った後、糞便由来小胞を得るために、４℃で４０，２００ｒｐｍで２時間超高速遠心分離を行い、収得した小胞は、ＰＢＳに分散させて保管した。
【００６１】
前記方法で分離した細菌と小胞１００μｌを１００℃で沸かして、内部のＤＮＡを脂質の外に出るようにし、その後、氷に５分間冷ました。そして、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液のみを集めた。そして、ナノドロップを用いてＤＮＡ量を定量した。その後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ  ｒＲＮＡプライマーでＰＣＲを行うことにより、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【００６２】
【表１】
2019535231.tif 000003
【００６３】
前記方法で抽出したＤＮＡを前記の１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマーを使用して増幅を行った後、シーケンシングを行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、結果を標準フローグラム形式（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｆｌｏｗｇｒａｍ  Ｆｏｒｍａｔ；ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ  ＦＬＸ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を用いてＳＦＦファイルをシーケンスファイル（．ｆａｓｔａ）とヌクレオチドクオリティスコアファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ウィンドウ（２０ｂｐｓ）平均ベースコール精度が９９％未満（フレッドスコア＜２０）である部分を除去した。操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ；ＯＴＵ）分析のために、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度に応じてクラスタリングを行い、属（ｇｅｎｕｓ）は、９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は、９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は、８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は、８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は、７５％シーケンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ  ＲＮＡシーケンスデータベース（１０８、４５３シーケンス）を用いて属水準で９７％以上のシーケンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。
【００６４】
前記方法によって高炭水化物食と高脂肪食を１２週間投与したマウスの糞便で細菌と細菌由来小胞のメタゲノム分析した結果、図２に示したように、プロピオニバクテリウム属細菌自体（Ｂａｃｔｅｒｉａ）の分布は、高炭水化物食と高脂肪食摂取マウスにおいて差異がなかったが、プロピオニバクテリウム由来小胞（ＥＶ）の分布は、高炭水化物食摂取マウスに比べて高脂肪食マウスの糞便で有意に増加していることを確認した。
【００６５】
［実施例２．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相分析］
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために、下記方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量にて胃腸管で投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。
【００６６】
マウス全体イメージを観察した結果、図３ａに示したように、細菌である場合には、全身的に吸収されなかったが、細菌由来小胞である場合には、投与後５分に全身的に吸収され、投与３０分には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
【００６７】
腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後、投与１２時間後に血液、心臓、肝、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。
【００６８】
採取した組織で蛍光を観察した結果、図３ｂに示したように、細菌由来小胞が血液、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は、吸収されないことが分かった。
【００６９】
［実施例３．正常なヒト、乳癌、および肝癌患者血液内細菌由来小胞メタゲノム分析］
まず、１０ｍｌのチューブに患者および正常なヒトの血液から小胞を分離するために、血液を遠心分離法（３，５００×ｇ、１０分、４℃）で浮遊物を沈殿させ、上澄み液のみを新しい１０ｍｌのチューブに移した。０．２２μｍのフィルターを使用して細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ    ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０ｋＤ）に移して、１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨てて、１０ｍｌまで濃縮させた。さらに、０．２２μｍのフィルターを使用して細菌および異物を除去した後、Ｔｙｐｅ  ９０ｔｉのローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の超高速遠心分離を用いて上澄み液を捨てて、固まったペレットを生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。
【００７０】
前記方法で乳癌患者９６人の血液と性別と年齢をマッチングした正常対照群１９１人の血液；および肝癌患者９１人の血液と性別と年齢をマッチングした正常対照群９９人の血液を対象として、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出した。
【００７１】
前記実施例１の方法でメタゲノム分析を行った後、属水準でプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を評価した結果、図５ａに示したように、正常なヒトの血液に比べて乳癌患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（正常なヒトｖｓ乳癌患者：２．２％ｖｓ０．５％；倍率変化：０．２３；ｐ＜０．０００００１）。
【００７２】
また、図５ｂに示したように、正常なヒトの血液に比べて肝癌患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（正常なヒトｖｓ肝癌患者：１．７％ｖｓ０．６％；倍率変化：０．３４，ｐ＝０．０００００１）。
【００７３】
［実施例４．正常なヒト、喘息、およびアトピー皮膚炎患者血液内細菌由来小胞メタゲノム分析］
前記実施例３の方法で喘息患者２７７人の血液と正常対照群２４６人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出した。前記実施例１の方法でメタゲノム分析を行った後、属水準でプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を評価した結果、図６ａに示したように、正常なヒトの血液に比べて喘息患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（正常なヒトｖｓ喘息患者：１．８％ｖｓ０．２％；倍率変化：０．１２、ｐ＜０．０００００１）。
【００７４】
前記実施例３の方法でアトピー皮膚炎患者２５人の血液と正常対照群１３８人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出した。前記実施例１の方法でメタゲノム分析を行った後、属水準でプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を評価した結果、図６ｂに示したように、正常なヒトの血液に比べてアトピー皮膚炎患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（正常なヒトｖｓアトピー皮膚炎患者：０．７％ｖｓ０．１％；倍率変化：０．１５、ｐ＝０．０００００３）。
【００７５】
［実施例５．正常なヒト、糖尿病、および肝硬変症患者血液内細菌由来小胞メタゲノム分析］
前記実施例３の方法で糖尿病患者７３人の血液と正常対照群１４６人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出した。前記実施例１の方法でメタゲノム分析を行った後、属水準でプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を評価した結果、図７ａに示したように、正常なヒトの血液に比べて喘息患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（正常なヒトｖｓ糖尿病患者：１．３％ｖｓ０．０１％；倍率変化：０．０１、ｐ＜０．０００００１）。
【００７６】
前記実施例３の方法で肝硬変症患者１００人の血液と正常対照群１００人の血液を対象に、血液内に存在する小胞で遺伝子を抽出した。前記実施例１の方法でメタゲノム分析を行った後、属水準でプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の分布を評価した結果、図７ｂに示したように、正常なヒトの血液に比べて肝硬変症患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（正常なヒトｖｓ肝硬変症患者：１．４％ｖｓ０．５％；倍率変化：０．４、ｐ＝０．００００４）。
【００７７】
［実施例６．プロピオニバクテリウムアクネス培養液での小胞分離および特性分析］
前記実施例３〜実施例５の結果を基に、プロピオニバクテリウムアクネス菌株を培養した後、その小胞を分離して、特性を分析した。プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）６９１９菌株を３７℃の嫌気性チャンバーで吸光度（ＯＤ６００）が１．０〜１．５になるまでブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ；ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地で培養した後、継代培養した。その後、菌株が含まれていないＰ．ａｃｎｅｓ  ６９１９の培地の上澄み液を回収して、１０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、０．４５μｍのフィルターに濾過した後、濾過した上澄み液を１００ｋＤａ中空フィルターメンブレンでＱｕｉｘＳｔａｎｄ  ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）を用いて限外濾過を通じて２００ｍｌの体積で濃縮した。その後、濃縮させた上澄み液をさらに０．２２μｍのフィルターでフィルタリングし、濾過した上澄み液を１５０，０００ｇ、４℃で３時間超遠心分離した後、ペレットをＤＰＢＳで懸濁した。次に１０％、４０％、および５０％オプティプレップ溶液（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて密度勾配遠心分離を行った。低密度溶液の製造のために、オプティプレップ溶液をＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に希釈して利用した。２００，０００ｇ、４℃の条件で２時間の間遠心分離を行った後、上層から１ｍｌの同じボリュームで分画された各溶液を１５０，０００ｇ、４℃の条件で３時間さらに超遠心分離を実施した。その後、ＢＣＡアッセイを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対し下記実験を実施した。
【００７８】
前記方法により培養したプロピオニバクテリウムアクネスの培養液から小胞を分離した後、電子顕微鏡を通じて形態とサイズを評価した。
【００７９】
その結果、図８ａに示したように、プロピオニバクテリウムアクネス培養液から分離した小胞の形態は、球形であり、サイズは、２００ｎｍより小さいことを観察し、図８ｂに示した動的光散乱法測定結果を通じて前記小胞のサイズは、３７．８±１３．５ｎｍであることを確認した。
【００８０】
［実施例７．プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞プロテオーム分析］
プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞内にどんなタンパク質が含まれているかを調べるために、プロテオーム分析を実施した。このために、ＦＡＳＰ（Ｆｉｌｔｅｒ−ａｉｄｅｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）分解過程を通じてトリプシンに分解されたペプチドを得た。プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞から抽出された１８μｇのタンパク質を還元溶液（４％ＳＤＳおよび０．１Ｍ  ＤＴＴ  ｉｎ  ０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６）と混ぜた後、３７℃で４５分間反応させた。７分間沸かした後、１４，０００ｇで４０分間、１６℃で遠心分離基盤フィルターを進めた。さらに、ＵＡ溶液（０．２ｍＬの８Ｍ  ｕｒｅａ  ｉｎ  ０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５）と混ぜ、前記遠心分離基盤フィルターを３回繰り返して行った後、５５ｍＭのＩＡＡ溶液を０．１ｍｌ入れ、２０分間暗室で常温反応させ、４０分間遠心分離した。同様に、ＵＡ溶液に混ぜて遠心分離基盤フィルターを３回繰り返して行った後、サンプルを１００ｍＭのＴＥＡＢ溶液０．２ｍｌに希釈させて、２回さらに遠心分離して、トリプシン処理のための溶液交換を進めた。フィルターを１．５ｍｌのチューブに配置し、高純度のトリプシンが入っている１００ｍＭのＴＥＡＢ溶液をフィルター内で３７℃で１２時間分解させた後、１４，０００ｇで２０分間１６℃で遠心分離過程を経て１００ｍＭのＴＥＡＢ溶液７５μｌを添加する過程を２回繰り返した。収集されたサンプルは、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で乾燥させた後、５％ＡＣＮが溶けている溶液（０．１％ギ酸が溶けている蒸留水が溶媒）１８０μｌを加えて、Ｃ−１８回転カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で除染させた後、真空乾燥させた。
【００８１】
乾燥されたサンプルをｎａｎｏ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ方法を用いてＥＡＳＹ  ｎＬＣ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と連結されたＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。トリプシンで切られたペプチドをＣ１８  ３μｍレジンでパッキングされたトラップカラム（７５μｍ×２ｃｍ）にロードした後、Ｂ溶媒の５％−４０％線形濃度勾配を用いて８５分間３００ｎｌ／分の速力で溶離させた。溶離されたペプチドは、Ｃ１８  ２μｍのレジンでパッキングされた分析カラム（７５μｍ×５０ｃｍ）で分離させた後、ｎａｎｏ  ＥＳＩ  ｓｏｕｒｃｅに２．０ｋＶで電気噴霧させた。Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析器は、上位１０データ従属方法（ｔｏｐ  １０  ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）で作動した。正規化衝突エネルギー（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｅｎｅｒｇｙ）を３０％に、動的排除（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）時間を３０秒に、前駆体分析窓（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）を２に設定して、高エネルギー衝突解離（ｈｉｇｈｅｒ−ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）分離のためのサーベイスキャン（ｍ／ｚ；４００−２，０００）を用いて最も豊富な前駆体イオンを選定した。サーベイＭＳスキャンは、ＨＣＤスペクトル解像度を１７，５００に設定してＯｒｂｉｔｒａｐ分析器を利用し、７０，０００の解像度で得られた。
【００８２】
３回反復で得られた質量分析（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴエンジンツール（Ｂｉｏｗｏｒｋｓ−Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｒｅｖ．３．１  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を用いてプロピオニバクテリウムアクネスＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２０１５．１１．ｒｅｖｉｅｗｅｄ）で探索した。最大２個の損失された切断部位（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）までｆｕｌｌ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙに含ませ、前駆体イオンおよび断片イオンの質量公差（ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ）は、１０ｐｐｍと０．６Ｄａに設定した。カルバミドメチルシステインの修飾は、固定し、メチオニン酸化（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の多様な修飾は、許容した。ＦＤＲ＝０．０１の遮断値でペプチドを選別した。
【００８３】
その結果、図９ａおよび図９ｂに示したように、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞で分析されたタンパク質のうち、３回反復のうち２回以上検出された信頼度が高いタンパク質を選択して、総２５２個のタンパク質を最終的に発見した。プロピオニバクテリウムアクネスのプロテオーム研究があまり進行されなかったので、分析されたタンパク質の半分以上の特性が良く知られていない。分析されたタンパク質の細胞内構成要素別の分布比率を見ると、膜関連タンパク質２７．４％、細胞質タンパク質７．１％、細胞外タンパク質１．２％、リポソームタンパク質４．４％と分析された。これは、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞はやはり、一般的に知られた細菌由来小胞のように、膜で取り囲まれており、細胞質、細胞外タンパク質全部を含むことを意味する。また、生物学的機能別のタンパク質分布比率を基準として分類してみると、代謝過程１５．９％、物質輸送７．５％、タンパク質処理過程５．２％、翻訳４．８％、病原性４％と分析された。プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞内タンパク質が代謝過程と物質輸送に非常に高い割合で構成されているという特徴から、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞がプロピオニバクテリウムアクネスの代謝過程および物質輸送に重要な役割をするものと予想される。
【００８４】
前記プロテオーム分析結果により明らかにされた２５２個のタンパク質の機能から、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞がプロピオニバクテリウムアクネスの生化学的ライフスタイル、生存方式、細胞付着、病原性および炎症性等の顕著な特徴を示すことが分かる。
【００８５】
プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞内タンパク質のうち、酸化的リン酸化（シトクロムｃオキシダーゼ、Ｒｉｅｓｋｅドメインタンパク質）、窒素固定（細菌性シトクロムユビキノールオキシダーゼ、シトクロムｄユビキノールオキシダーゼ）、無酸素呼吸（スクシネートデヒドロゲナーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ）、基質摂取（ＡＴＰ結合カセット）関連タンパク質が存在するが、これは、プロピオニバクテリウムアクネスが非好気性であり、嫌気性である非運動性ライフスタイルを有するという事実と符合する。それだけでなく、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞内タンパク質のうち、相当数が転写、翻訳、タンパク質輸送、タンパク質折り畳みに関連した機能を有する。これより、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞は、生化学的処理過程およびエネルギー代謝過程関連物質またはタンパク質の細胞間輸送の機能をし、非運動性プロピオニバクテリウムアクネスの代わりに、養分を輸送する巨大輸送体としての機能をするものと予想することができる。
【００８６】
また、トランスグリコシラーゼ、β−ラクタマーゼ、マルチモジュラトランスペプチターゼ−トランスグリコシラーゼ、ＦｔｓＩ等の細菌ペプチドグリカン層を結合したり、ペニシリンへの抵抗性を有するタンパク質から、プロピオニバクテリウムアクネスが多様な種類の菌が存在する環境で生存し、感染部位での抗生剤抵抗性を示すために、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を利用するものと予測することができる。
【００８７】
宿主のデルマタン硫酸に結合して免疫性を示す推定未同定タンパク質（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＰＡ２１２７）、宿主の表皮細胞に結合してバイオフィルムを形成することができるようにする推定グリコシルトランスフェラーゼ（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、細胞に付着して糖分解作用で病原性を示すグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、表皮細胞に結合してリゾチームから被害宿主の免疫反応を回避するポリサッカライドデアセチラーゼ等の細胞に付着したり、バイオフィルムを形成するのに核心的な役割をするタンパク質からプロピオニバクテリウムアクネスは、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を用いて生物学的ニッチを形成することができる。
【００８８】
宿主の細胞外基質を分解して炎症細胞で免疫反応を誘導する ヒアルロン酸リアーゼ、細胞表面のグリコスフィンゴリピドを分解して信号伝達を防ぐエンドグリコセラミダーゼ、宿主細胞由来基質を代謝として使用するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ、宿主に侵入して細胞に穴をあけて破裂させて強い病原性を示すＣｈｒｉｓｔｉｅ−Ａｔｋｉｎｓ−Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ＣＡＭＰ）因子等のタンパク質からプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が細胞内に効率的に伝達されることを予想できる。
【００８９】
ＮｌｐＣ／Ｐ６０エンドペプチダーゼファミリータンパク質、基底膜タンパク質（ｂａｓｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、６０ｋＤａシャペロニン、１０ｋＤａシャペロニン等は、プロピオニバクテリウムアクネスの生存に必須のタンパク質であり、宿主に侵入時に炎症細胞の防御機序でこれらに対する免疫反応が現れるという事実が報告されたことがある。このような事実から、プロピオニバクテリウムアクネス由来タンパク質を用いて宿主の免疫反応を刺激することにより、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を通じて免疫調節のための用途に使用できることがわかる。
【００９０】
プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞プロテオーム分析を通じて同定されたタンパク質を下記表２に示した。
【００９１】
【表２】
2019535231.tif 000004
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2019535231.tif 000006
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2019535231.tif 000013
【００９２】
［実施例８．プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の抗炎症効果］
プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が炎症細胞で炎症媒介体の分泌に対する影響を調べるために、マウス大食細胞株であるＲａｗ  ２６４．７細胞にプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞（Ｐ．ａｃｎｅｓ  ＥＶ）を多様な濃度（０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞死滅とＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）を用いてそれぞれ炎症媒介体（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α等）の分泌量を測定した。より具体的に、Ｒａｗ  ２６４．７細胞を１×１０５個ずつ２４ウェル細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ完全培地で培養させた。その後、細胞死滅は、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａｎ、米国）を行った。また、炎症媒介体の分泌能を評価するために、培地を取りはらい、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を新しいＤＭＥＭ完全培地に混ぜて処理した後、６時間から２４時間まで３７℃のインキュベーターで培養した後、培養上層液を得た。培養上層液を１．５ｍｌのチューブに集めて、３，０００ｇで５分間遠心分離して上層液を集めて、４℃に保管した後、ＥＬＩＳＡ分析を進めた。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ分析のために、キャプチャー抗体をＰＢＳに希釈させて、９６ウェルポリスチレンプレートに作用濃度に合うように５０μｌずつ分注した後、４℃でオーバーナイト反応させた。その後、ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０が入っているＰＢＳ）溶液１００μｌで２回ずつ洗浄した後、ＲＤ（１％ＢＳＡが入っているＰＢＳＴ）溶液１００μｌを分注して、常温で１時間の間ブロッキングした後、さらに、１００μｌのＰＢＳＴで２回洗浄した後、サンプルおよびスタンダードを濃度に合うように５０μｌずつ分注し、常温で２時間の間反応させた。さらに、１００μｌのＰＢＳＴで２回洗浄した後、検出抗体をＲＤに希釈させて、作用濃度に合うように５０μｌずつ分注して、常温で２時間の間反応させた。さらに、１００μｌのＰＢＳＴで２回洗浄した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰをＲＤに１／２００で希釈させて、５０μｌずつ分注して、常温で３０分間反応させた。最後に、１００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ基質と０．０４％過酸化水素水を１：１混合した溶液５０μｌを分注した後、発色を待ち、５分〜２０分後に発色が進んでから、１Ｍの硫酸溶液を５０μｌずつ分注して、反応を中止し、Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）ＨＴ  ｍｕｌｔｉ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９４】
その結果、図１０ａに示したように、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の処理濃度に関係なく、炎症細胞の細胞死滅が誘導されなかった。
【００９５】
また、図１０ｂに示したように、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞処理による大食細胞炎症媒介体の分泌が、病原性小胞である大腸菌由来小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＶ）に比べて顕著に減少していることを確認した。
【００９６】
上記結果を通じてプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が体内に吸収されたとき、非常に安全であることが分かった。
【００９７】
上記結果を基に、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の抗炎症効果を評価するために、多様な濃度のプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を大食細胞株に大腸菌由来小胞（１μｇ／ｍｌの濃度）を処理する１２時間前に投与した後、大腸菌由来小胞による炎症性サイトカインの分泌をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００９８】
その結果、図１１ａおよび図１１ｂに示したように、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を前処理した場合、大腸菌由来小胞によるＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌が顕著に抑制されることを確認した。これは、大腸菌由来小胞のような病原性小胞により誘導される喘息等の炎症疾患および糖尿病等の代謝疾患をプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が効率的に抑制することができることを意味する。
【００９９】
［実施例９．黄色ブドウ球菌由来小胞による皮膚角質細胞死滅にプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の項死滅効果］
黄色ブドウ球菌由来小胞による皮膚上皮細胞の死滅に対するプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の抑制効果を評価するために、大食細胞株の代わりに、角質細胞株（ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌ）を使用して前記実施例８と同じ前処理過程を行った後、黄色ブドウ球菌由来小胞およびプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａｎ、米国）を行った。
【０１００】
その結果、図１２ａおよび図１２ｂに示したように、黄色ブドウ球菌由来小胞に比べてプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞による角質細胞の死滅が顕著に減少していることを確認した。
【０１０１】
前記結果を基に、黄色ブドウ球菌小胞による皮膚角質細胞の死滅に対するプロピオニバクテリウムアクネス小胞の死滅抑制効果を評価するために、多様な濃度のプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を角質細胞株に黄色ブドウ球菌由来小胞（１００μｇ／ｍｌの濃度）を処理する１２時間前に投与した後、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａｎ、米国）を行った。
【０１０２】
その結果、図１３に示したように、プロピオニバクテリウムアクネス小胞を前処理した場合、黄色ブドウ球菌小胞による角質細胞死滅が抑制されることを確認した。これは、黄色ブドウ球菌由来小胞のような病原性小胞により誘導される皮膚疾患を、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が効率的に抑制することができることを意味する。
【０１０３】
［実施例１０．アンドロゲン受容体発現に対するプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞の効果］
上記実施例３および実施例５を通じて正常なヒトに比べて乳癌およびアトピー皮膚炎患者の血液にプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認したため、ひいては、前記小胞のアトピー皮膚炎および乳癌などに対する治療機序を具体的に調べてみようとした。このために、図１４に示したように、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスに処理して、マウスの前立腺組織でアンドロゲン受容体の発現を評価した。各３匹から構成される実験群にプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞（ＰａＥＶ）１μｇを、対照群には、ＰＢＳまたはプロピオニバクテリウムアクネス由来小胞が有するよく知られている抗原であるペプチドグリカン（ＰＧＮ）１μｇとリポタイコ酸（ＬＴＡ）１μｇを毎週２回ずつ総４週間腹腔で注射した。最後の注射３日後、前立腺組織を摘出して取り替えて上層液を得て、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現様相をウェスタンブロットで確認してみた。
【０１０４】
ウェスタンブロット分析のために、摘出したマウスの前立腺組織を１．５ｍｌのチューブに移して入れた後、液体窒素に入れて急速冷却させた。その後、ｌｙｓｉｓ溶液を入れ、ビーズを入れて、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で組織を取り替えた。取り替えた組織溶液を新しい１．５ｍｌのチューブに移して、１７，０００ｇ、１５分間４℃で遠心分離させて、上層液を得る過程を２回繰り返した。上層液のタンパク質をＢＣＡ分析法を用いて定量した。１５０μｇのタンパク質サンプルをローディング溶液と混ぜて、４％スタッキングゲルと７．５％分離ゲルで１６０Ｖで１時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを進行した後、ＰＡゲルを１００％エタノールで５分間活性化したＰＶＤＦ膜で４００ｍＡで５０分間氷筒内でトランスファーを進めた。トランスファーされたＰＶＤＦ膜は、ＲＤ溶液（５％スキムミルクが入っているＴＢＳ−Ｔ）に常温で４０分間振盪培養させた。その後、ＴＢＳ−Ｔで３０分間３回洗浄した後、アンドロゲン受容体に対する１次抗体を１／４０００でＲＤに希釈させて、常温で１時間３０分間振盪培養させた。ＴＢＳ−Ｔで３０分間３回洗浄した後、２次抗体を１／４０００でＲＤに希釈させて、常温で１時間の間振盪培養させた。ＴＢＳ−Ｔで３０分間３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｆｅｍｔｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を１／１０で蒸留水に希釈させて、ＰＶＤＦ膜に散布して、ＬＡＳ  ４０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＫ）機器でウェスタンイメージを得た。対照群としてβ−アクチンに対するウェスタンイメージを使用した。
【０１０５】
その結果、図１４に示したように、よく知られている抗原であるペプチドグリカン（ＰＧＮ）とリポタイコ酸（ＬＴＡ）とは異なって、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞を投与した場合、前立腺組織にアンドロゲン受容体が過発現することを確認できた。乳癌の治療のためにアンドロゲン受容体を刺激し、また、アンドロゲン受容体の発現が増加する思春期の時にアトピー皮膚炎が好転する現象を通じて、プロピオニバクテリウムアクネス小胞がアンドロゲン受容体の発現を増加させて、治療効能を示すことが、治療機序の一つであることがわかる。また、アンドロゲン受容体の過発現は、プロピオニバクテリウムアクネス由来小胞内でＰＧＮとＬＴＡ等の非タンパク質成分でなく、タンパク質成分によりなされると予想できる。
【０１０６】
前記述べた本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態な容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によるプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞は、前立腺組織でアンドロゲン受容体の発現を増加させ、前記小胞を炎症細胞に前処理したとき、抗炎症および免疫調節機能を有する効果を観察したところ、癌、炎症疾患、内分泌疾患、または代謝疾患の診断または予測方法、薬学的組成物、食品、および化粧品などに有用に用いられるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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