(57)【要約】抗ＰＤｌモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、その医薬組成物及びその使用。前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１１であるＣＤＲを含み、及び／または、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−１４であるＣＤＲを含む。前記モノクローナル抗体は、ＰＤｌと特異的にうまく結合でき、特異的にＰＤｌの生体に対する免疫抑制を取り除け、Ｔリンパ球を活性化させることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１１であるＣＤＲを含み、
及び／または、
前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域はアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−１４であるＣＤＲを含む、
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６からなる群から選択され、
及び／または、
前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８からなる群から選択される、
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、１本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体またはダイアボディからなる群から選択されるものである、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体のＰＤ１タンパク質と結合するＫＤが約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下であり、好ましくは、前記ＫＤがＦｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機で測定される、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体は、非−ＣＤＲ領域を含み、かつ、前記非−ＣＤＲ領域は、鼠類以外の種由来、例えばヒト抗体由来である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３から産生したモノクローナル抗体であり、前記ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３が中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体の重鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１１であるＣＤＲを含み、
好ましくは、前記抗体の重鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示すアミノ酸配列を有し、
より好ましくは、前記核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示す塩基配列を有する、単離核酸分子。
【請求項８】
抗体軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−１４であるＣＤＲを含み、
好ましくは、前記抗体軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示すアミノ酸配列を有し、
より好ましくは、前記核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示す塩基配列を有する、単離核酸分子。
【請求項９】
請求項７及び／または請求項８に記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項７及び／または請求項８に記載の単離核酸分子、あるいは、請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を適切な条件で培養する工程、および、細胞培養物から前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収する工程を含む、方法。
【請求項１２】
中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５である、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３。
【請求項１３】
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片および複合部分を含む複合体であって、前記モノクローナル抗体は請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、前記複合部分は検出可能な標識であり、好ましくは、前記複合部分が放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素である、複合体。
【請求項１４】
請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片、あるいは、請求項１３に記載の複合体を含むキットであって、
好ましくは、前記キットが前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する第２抗体をさらに含み、任意的に、前記第２抗体が検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素をさらに含む、キット。
【請求項１５】
試料中のＰＤ１の存在またはそのレベルを検出するために用いられるキットの製造における、請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体の使用。
【請求項１６】
請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体を含み、
さらに、薬学的に許容されるベクター及び／または賦形剤をに任意的に含む、医薬組成物。
【請求項１７】
腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断する薬剤の調製における、請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体の使用であって、好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、使用。
【請求項１８】
請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体の、
ＰＤ１のリガンドへのＰＤ１の結合を遮断する薬剤、
ＰＤ１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
の調製における使用であって、
好ましくは、前記ＰＤ１のリガンドがＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり、より好ましくはＰＤＬ１である、使用。
【請求項１９】
有効量の請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体を、細胞またはニーズがある被験者にインビボまたはインビトロで投与することを含む、
ＰＤ１のリガンドへのＰＤ１の結合を遮断する方法、
ＰＤ１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２の発現を増加させる方法、
からなる群から選択される方法であって、
好ましくは、前記ＰＤ１のリガンドがＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり、より好ましくは、ＰＤＬ１である、方法。
【請求項２０】
腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断するために用いられる、請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体であって、好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体。
【請求項２１】
ＰＤ１のリガンドへのＰＤ１の結合を遮断すること、
ＰＤ１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２の発現を増加させること、
に用いられる、請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体であって、
好ましくは、前記ＰＤ１のリガンドがＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり、より好ましくは、ＰＤＬ１である、請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体。
【請求項２２】
有効量の請求項１〜６の何れか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは請求項１３に記載の複合体を、ニーズがある被験者に投与することを含む、腫瘍または貧血を、予防および／または治療、あるいは、診断する方法であって、
好ましくは、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍治療および分子免疫学の分野に属し、抗ＰＤ１抗体、その医薬組成物およびその使用に関する。具体的に、本発明は抗ＰＤ１モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通受容体ＰＤ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １、プログラム細胞死因子１、ＰＤ−１とも略称される。）はＣＤ２８遺伝子ファミリーの一員であり、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄系細胞のいずれにおいても発現される。ＰＤ１の受容体ＰＤＬ１およびＰＤＬ２はいずれもＢ７スーパーファミリーに属し、そのうち、ＰＤＬ１はＴ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞および上皮細胞を含む様々な細胞において発現され、ＰＤＬ２は樹状細胞およびマクロファージなどの抗原提示細胞においてのみ発現される。
【０００３】
Ｔ細胞はウイルス感染の除去に非常に重要な役割を果たすが、Ｔ細胞の抗ウイルス反応は、通常、免疫病理学と関連している。ＰＤ１はＴ細胞の活性化に対する負的制御に非常に重要な役割を果たし、Ｔ細胞に対するＰＤ１を介した負的制御は感染によって引き起こされる組織損傷を減らすことができるが、ＰＤ１の負的制御を遮断または阻害すると、自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。例えば、ＰＤ１ノックアウトマウスは膵臓ウイルス感染の除去により効果的であるが、より重篤な肝障害を引き起こす（Ｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８：３９−５０）。また、ＰＤ１を高度に発現する腫瘍は一般的に検出が困難な癌を形成する（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：３３６０−５）。インビボで抗体を注射することによってＰＤ１の発現をコントロールする方法は、有効的な方法である。
【０００４】
ＰＤ１抗体は広範囲の抗腫瘍の予想および素晴らしい効果を有するため、ＰＤ１経路を標的とする抗体が様々な腫瘍の治療において飛躍的な進歩をもたらすことは、業界で広く受け入れられており、例えば、非小細胞肺がん、腎細胞がん、卵巣がん、黒色腫の治療に用いられ（Ｈｏｍｅｔ  Ｍ．  Ｂ．，  Ｐａｒｉｓｉ  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ＰＤ１  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１５  Ｊｕｎ；４２（３）：４６６−４７３）、白血病および貧血の治療に用いられる（Ｈｅｌｄ  ＳＡ，  Ｈｅｉｎｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＣＭＬ．  Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  ２０１３  Ｓｅｐ；１３（７）：７６８−７４）。
【０００５】
２０１２年と２０１３年のアメリカ癌学会（ＡＡＣＲ）の年次総会及びアメリカ臨床腫瘍学会（ＡＳＣＯ）の年次総会で、これまでにない臨床効果データが発表された後、ＰＤ１抗体は世界の製薬業界で最も熱く研究される新薬になる。
現在、ＰＤ１のＰＤＬ１への結合を効果的に遮断するために、より良い結合効率を有する新しい抗ＰＤ１抗体を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８：３９−５０
【非特許文献２】Ｈａｍａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４：３３６０−５
【非特許文献３】Ｈｏｍｅｔ  Ｍ．  Ｂ．，  Ｐａｒｉｓｉ  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−ＰＤ１  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１５  Ｊｕｎ；４２（３）：４６６−４７３
【非特許文献４】Ｈｅｌｄ  ＳＡ，  Ｈｅｉｎｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＣＭＬ．  Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．  ２０１３  Ｓｅｐ；１３（７）：７６８−７４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究および創造的な取り組みを施した後、哺乳動物細胞発現系を用いて発現した組み換えＰＤ１を免疫マウスへの抗原として使用し、マウス脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマ細胞を得た。本発明者らは、多数の試料をスクリーニングすることによってハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３を得た（受託番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５）。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３がＰＤ１に特異的に結合する特異的モノクローナル抗体（１４Ｃ１２と命名）を分泌することができ、そして当該モノクローナル抗体がＰＤＬ１へのＰＤ１の結合を非常に有効的に遮断できることを見出した。
【０００９】
さらに、本発明者らは、創造的に、抗ＰＤ１のヒト化抗体（１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と命名）を作製した。
そして、本発明者らはまた、驚くべきことに、本発明の抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１がヒトＴ細胞に有効的に結合し、Ｔ細胞を活性化してヒトリンパ球によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を誘導できることを見出した。本発明の抗体１４Ｃ１２および１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、肺癌、黒色腫、腎臓腫瘍、卵巣癌、白血病などの癌及び貧血を予防・治療する薬物を調製するために用いられる可能性を有する。
【００１０】
したがって、次の発明を提供する。
【００１１】
本発明のある態様は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
前記のモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１１であるＣＤＲを含み、
及び／または、
前記のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−１４であるＣＤＲを含むモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６からなる群から選択され、
及び／または、
前記のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８からなる群から選択されるものである。
【００１２】
本発明の実施形態の１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体は、
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示すＶＨおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示すＶＬ；
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示すＶＨおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示すＶＬ
を含む。
【００１３】
抗原の結合は、軽鎖および重鎖の可変領域に依存し、各鎖の可変領域は、いずれも相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含む（重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み；それらはＫａｂａｔらに命名され、詳しくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１），  Ｖｏｌ．  １−３，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄを参照のこと）。
【００１４】
当業者によって周知の技術的手段によって、例えば、ＶＢＡＳＥ２データベースによって、前記の（１）−（２）のモノクローナル抗体配列におけるＣＤＲ領域のアミノ酸配列を分析した結果は、下記のとおりである。
【００１５】
本発明の抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、同じＣＤＲを有する。
その重鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、下記のとおりである。
ＨＣＤＲ１：ＧＦＡＦＳＳＹＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＧＧＲＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
ＨＣＤＲ３：ＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）；
その軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、下記のとおりである。
ＬＣＤＲ１：ＱＤＩＮＴＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、
ＬＣＤＲ２：ＲＡＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【００１６】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域断片、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体またはダイアボディからなる群から選ばれるものである。
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体は、ＰＤ１タンパク質と結合するＫＤが約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下であり、好ましくは、前記ＫＤはＦｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機で測定される。
【００１７】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体は、ＰＤ１タンパク質と結合するＥＣ５０が約１００ｎＭ未満、例えば約１０ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ未満またはそれ以下である。具体的に、前記ＥＣ５０は間接ＥＬＩＳＡ法で測定される。
【００１８】
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体は、ＰＤ１タンパク質と結合するＫＤが約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下である。
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体は、非−ＣＤＲ領域を含み、かつ、前記の非−ＣＤＲ領域は、鼠類以外の種由来、例えばヒト抗体由来である。
本発明の実施形態の何れか１つによる、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、
前記のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３から産生したモノクローナル抗体であり、前記のハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３は、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５である。
本発明の別の態様は、抗体の重鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記の抗体の重鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９−１１であるＣＤＲを含み、
具体的に、前記の抗体の重鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示すアミノ酸配列を有し、
さらに具体的に、前記の核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示す塩基配列を有する、単離核酸分子に関する。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、抗体の軽鎖可変領域をコードすることが可能な核酸配列を含む単離核酸分子であって、
前記の抗体の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２−１４であるＣＤＲを含み、
具体的に、前記の抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示すアミノ酸配列を有し、
さらに具体的に、前記の核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示す塩基配列を有する、単離核酸分子に関する。
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによる単離核酸分子を含むベクターに関する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによる単離核酸分子または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによる、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、および、細胞培養物から前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を回収する工程を含む方法に関する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５である、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片および複合部分を含む複合体であって、前記モノクローナル抗体は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、前記複合部分は検出可能な標識であり、具体的に、前記複合部分は、放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素である、複合体に関する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体を含むキットであって、
具体的に、前記キットは、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する第２抗体をさらに含み；任意的に、前記第２抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、発光性物質、色素または酵素をさらに含む、キットに関する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、試料中のＰＤ１の存在またはそのレベルを検出するために用いられるキットの製造における、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体の使用に関する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体を含み、さらに薬学的に許容されるベクター及び／または賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物に関する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、腫瘍または貧血を、予防および／または治療および／または補助治療および／または診断する薬剤の調製における、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体の使用であって、具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択される、使用に関する。
【００２８】
発明者らは、動物試験で１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１がＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウス右側皮下で接種したＭＣ３８腫瘍細胞の成長を効果的に抑制できることを発見した。抗体薬剤１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１を投与することによって、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭ担癌マウス腫瘍体積の増加を著しくに抑制でき、薬力学的効果が市販されているターゲットが同じである薬剤Ｎｉｖｏｌｕｍａｂモノクローナル抗体に相当すると示されている。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体の、
ＰＤ１のリガンドへのＰＤ１の結合を遮断する薬剤、
ＰＤ１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する薬剤、
ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を取り除く薬剤、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２の発現を増加させる薬剤
の調製における使用であって、
具体的に、前記ＰＤ１のリガンドがＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり、好ましくはＰＤＬ１である、使用に関する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体を、細胞またはニーズがある被験者にインビボまたはインビトロで投与することを含む、
ＰＤ１のリガンドへのＰＤ１の結合を遮断する方法、
ＰＤ１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）する方法、
ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を取り除く方法、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２の発現を増加させる方法、
からなる群から選択される方法であって、
具体的に、前記ＰＤ１のリガンドがＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり、好ましくは、ＰＤＬ１である、方法に関する。
【００３１】
本発明のある具体的な実施形態において、前記インビトロ方法は、非治療目的または診断目的の方法である。
【００３２】
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、主にナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）から自然に生成されるもの、および、ＣＤ４  Ｔｈ１細胞とＣＤ８細胞障害性Ｔリンパ球のようなエフェクターＴ細胞から特定の抗原による刺激を経った後産生したものがある。ＩＦＮγは、重要な先天性および後天性免疫サイトカインとして、ウイルス、ある細菌感染および原虫感染との戦いまたは抑制において重要な役割を果たす。同時に、ＩＦＮγは、マクロファージを活性化し、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現を誘導して、免疫反応を活性化し、腫瘍の発達を制御することができる（Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ  ＪＲ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＢ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７；  ９６：４１−１０１）。本発明のインビトロ試験において、抗体ａｎｔｉ−ＰＤ１抗体は、ＩＦＮγの分泌を誘導して免疫反応を活性化することができる。
【００３３】
インターロイキン２（ＩＬ−２）はＴ細胞から産生され、Ｔ細胞サブセットを調節する成長因子であり、また免疫応答を調節する重要な因子であり、そして活性化Ｂ細胞の増殖を促進し、抗体反応、造血および腫瘍監視に関与することができる。組換えヒトＩＬ−２は悪性腫瘍（メラノーマ、腎臓腫瘍などを含む）の治療に米国ＦＤＡによって承認されており、慢性ウイルス感染症の治療に臨床研究を受けている（Ｃｈａｖｅｚ，  Ａ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ２００９．  １１８２：ｐ．  １４−２７）。インビトロ試験において、本発明のＰＤ１抗体は、ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を特異的に取り除け、Ｔ細胞を活性化し、ＩＬ−２産生を誘導し、抗腫瘍および寄生虫症などの疾患の遺伝子治療において広い応用見通しを有する。
【００３４】
本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは複合体によれば、腫瘍または貧血を、予防および／または治療および／または補助治療および／または診断することに用いられる。具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択されるものである。
【００３５】
本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは複合体によれば、
ＰＤ１のリガンドへのＰＤ１の結合を遮断すること、
ＰＤ１の活性またはレベルを制御（例えば下方制御）すること、
ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を取り除くこと、あるいは、
Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γ及び／またはＩＬ−２の発現を増加させること、
に用いられ、
具体的に、前記ＰＤ１のリガンドはＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり、好ましくは、ＰＤＬ１である。
【００３６】
本発明のある具体的実施形態において、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは複合体は、ＰＤＬ１へのＰＤ１の結合だけを遮断する。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の実施形態の何れか１つによるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片あるいは本発明による複合体を、被験者に投与することを含む、腫瘍または貧血を、予防および／または治療及び／または補助治療及び／または診断する方法であって、具体的に、前記腫瘍が、メラノーマ、腎臓腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、消化器癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌および白血病からなる群から選択される、方法に関する。
【００３８】
本発明において、別段の指定のない限り、本明細書中で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、本明細書中で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学の試験室操作の手順は、いずれも関連技術分野で広く利用される一般的なものである。同時に、本発明をより良く理解する目的のために、関連用語の定義および説明を以下で提供する。
本明細書中で使用される場合、ＰＤ１タンパク質（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００５００９．２）のアミノ酸配列を言うと、ＰＤ１タンパク質の全長、又はＰＤ１の細胞外断片ＰＤ１ＥＣＤ、または、ＰＤ１ＥＣＤを含有する断片を含み、さらにＰＤ１ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウスまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）と融合した断片を含む。しかし、当業者は、ＰＤ１タンパク質のアミノ酸配列において突然変異または変形（置換、欠失、および／または付加を含むがこれらに限定されない）が、それらの生物学的機能に影響を及ぼすことなく、自然にまたは人工的に起こり得ると理解できる。したがって、本発明において、「ＰＤ１タンパク質」という用語には、そのような配列のすべて、ならびに、それらの天然または人工の変異体が含まれるべきである。また、ＰＤ１タンパク質の配列断片を記載するとき、それは配列断片だけでなくその天然または人工の変異体における対応配列断片も含む。
本明細書中で使用される場合、ＰＤＬ１タンパク質（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１）のアミノ酸配列を言うと、ＰＤＬ１タンパク質の全長、又はＰＤＬ１の細胞外断片ＰＤＬ１ＥＣＤ、または、ＰＤＬ１ＥＣＤを含有する断片を含み、さらに、ＰＤＬ１ＥＣＤの融合タンパク質、例えばマウスまたはヒトＩｇＧのＦｃタンパク質断片（ｍＦｃまたはｈＦｃ）と融合した断片を含む。しかし、当業者は、ＰＤＬ１タンパク質のアミノ酸配列において突然変異または変形（置換、欠失、および／または付加を含むがこれらに限定されない）は、それらの生物学的機能に影響を及ぼすことなく、自然にまたは人工的に起こり得ると理解できる。したがって、本発明において、「ＰＤＬ１タンパク質」という用語には、そのような配列のすべて、ならびに、それらの天然または人工の変異体が含まれるべきである。また、ＰＤＬ１タンパク質の配列断片を記載するとき、それはＰＤＬ１配列断片だけでなくその天然または人工の変異体における対応する配列断片も含む。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、ＥＣ５０という用語は、最大効果の５０％に対する濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ５０％  ｏｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）、すなわち最大効果の５０％を引き起こす濃度を指す。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、一般的に２対のポリペプチド鎖（各対は「軽」（Ｌ）鎖および「重」（Ｈ）鎖を有する。）からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類され得る。重鎖はμ、δ、γ、αまたはεとして分類され得、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定められる。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２つ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結され、重鎖は約３つ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域はＣＬドメインからなる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的な補体系の第一の構成成分（Ｃ１ｑ）を含め、宿主組織また因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。ＶＨおよびＶＬ領域は、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に散在する高い可変性を有する領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。）にさらに細かく分けられ得る。各ＶＨまたはＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んでいる、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖／軽鎖の各対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は抗体結合部位をそれぞれ形成する。各領域またはドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３で提供される定義に従う。「抗体」という用語は、抗体を産生させるための何らかの具体的な方法に限定されない。例えば、これは、特に、組み換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、異なるアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」という用語は、全長抗体が結合する抗原と同じ抗原に特異的に結合する能力を保持する、および／または抗原への特異的な結合について全長抗体と競合する全長抗体の断片を含むポリペプチドを指す。これは、「抗原結合部分」とも呼ばれる。全般的には、全ての目的に対してその全体において引用により本明細書中に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．ｅｄ．，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。抗体の抗原結合断片は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により作製され得る。いくつかの場合において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）および、特異的抗原結合能を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【００４２】
いくつかの場合において、抗体の抗原結合断片は、ダイアボディ（２価抗体）であり、ここでＶＨおよびＶＬドメインは、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、利用されるリンカーは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインが互いに対形成できないので、別の鎖上の相補的なドメインと対形成せざるを得ず、２つの抗原結合部位が形成される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３（１９９４）を参照のこと。）。
【００４３】
抗体の抗原結合断片（例えば、上記の抗体断片）は、当業者にとって公知の通常技術（例えば、組み換えＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的切断法）を用いて、所定の抗体（例えば本発明において提供されるモノクローナル抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１）から得ることができ、インタクト抗体の場合と同じように特異性についてスクリーニングし得る。
【００４４】
本明細書中で、文脈において明らかに指定されない限り、「抗体」という用語について申し述べる場合、インタクトな抗体を含むだけでなく、抗体の抗原結合断片も含む。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「単抗」または「モノクローナル抗体」という用語は、高度に相同性を有する抗体分子の集団からの抗体または抗体断片を指し、すなわち、可能性のある天然の突然変異を除き、完全に同一の抗体分子の集団である。単抗は、抗原上の単一のエピトープに非常に高い特異性を有する。モノクローナル抗体とは対照的に、ポリクローナル抗体は、一般的には、抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。モノクローナル抗体は、一般的に、最初にＫｏｈｌｅｒらにより報告されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）を用いて得ることができるが、組み換えＤＮＡ技術（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。）を使用して得ることもできる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の全てのまたは一部のＣＤＲを非ヒト抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置き換えた後に得られた抗体または抗体断片を指し、そのうち、ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または反応性を有する非ヒト（例えばマウス、ラットまたはウサギ）抗体であり得る。さらに、レシピエント抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）の一部のアミノ酸残基も、抗体の性能をさらに向上させるかまたは最適化するように対応する非ヒト抗体のアミノ酸残基または他の抗体のアミノ酸残基で置き換えられ得る。ヒト化抗体に関するより詳細な説明については、例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）；およびＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２（２０００）を参照のこと。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「単離されている」又は「単離される」という用語は、人工的手段によってネイティブ状態から得られていることを意味する。自然界にある「単離されている」物質または構成成分が生じる場合、それが位置する天然の環境が変化しているか、または当該物質が天然の環境から単離されているか、またはその両方であると考えられる。例えば、ある単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある生きている動物の体に天然に存在し、このような天然の状態から単離される高純度の同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されている」ものとされる。「単離されている」又は「単離される」という用語は、人工的または合成物質との混合物を排除せず、物質の活性に影響を与えない他の不純物の存在も排除しない。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは、発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、ベクターにより保有される遺伝物質構成要素が宿主細胞で発現されるように、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。ベクターは、当業者にとって周知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１−由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；例えばλファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージならびに動物ウイルスなどが含まれるがこれらに限定されない。ベクターとして使用し得る動物ウイルスは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む。）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれるががこれらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択構成要素およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を調節するための複数の構成要素を含み得る。さらに、ベクターは、複製開始サイトも含み得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターの導入のために使用し得る細胞を指し、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核細胞、例えば酵母細胞またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９などの昆虫細胞、または、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞などの動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「特異的な結合」という用語は、２つの分子間の非無作為結合反応、例えば抗体とその標的抗原との間の反応を指す。いくつかの実施形態において、ある抗原に特異的に結合する抗体（またはある抗原に特異的な抗体）は、抗体が約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを意味する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、抗体と抗原との間の結合親和性を表現する特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。解離平衡定数が小さいほど、抗体−抗原結合が堅固であり、抗体と抗原との間の親和性が高くなる。一般的に、抗体（例えば、本発明のモノクローナル抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１）は、約１０−５Ｍ未満、例えば約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原（例えば、ＰＤ１タンパク質）と結合する。ＫＤは、当業者が周知した方法、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機で測定される。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」および「単抗」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリクローナル抗体」および「マルチ抗体」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。また、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、交換可能に使用され得る。さらに、本発明において、アミノ酸は一般的に、本分野で周知の、１文字または３文字略号により表される。例えば、アラニンはＡまたはＡｌａで表し得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞株」という用語は、交換可能に使用され得る。さらに、「ハイブリドーマ」または「ハイブリドーマ細胞株」という用語について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマのサブクローンおよび子孫細胞も含む。例えば、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３について申し述べる場合、これは、ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３のサブクローンおよび子孫細胞も指す。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能なベクターおよび／または賦形剤」という用語は、薬理学および／または生理学において被験者および活性のある構成要素と相溶性を有するベクターおよび／または賦形剤を指し、これらは当技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編，１９ｔｈ  ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照のこと。）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度促進剤が含まれるがこれらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としてはリン酸緩衝液が含まれるがそれに限定されず；界面活性剤としては陽イオン性、陰イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０が含まれるがこれらに限定されず；イオン強度促進剤としては塩化ナトリウムが含まれるがそれに限定されない。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果を達成するかまたは少なくとも一部達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば腫瘍）に対する予防的有効量は、疾患（例えば腫瘍）の発症を防ぐか、抑止するかまたは遅延させるのに十分である量を指し；疾患に対する治療的有効量は、疾患に罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒させるか少なくとも部分的に抑止するのに十分な量を指す。このような有効量を測定することは十分に当業者の技術の範囲内である。例えば、治療用途の有効量は、治療しようとする疾患の重症度、患者の自己免疫系の全般的状況、患者の全般的状況、例えば年齢、体重および性別、薬剤の投与形式、同時に行われる他の治療などに依存する。
【００５６】
【発明の効果】
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体、特に１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、ＰＤ１と特異的によく結合でき、かつ、ＰＤ１のＰＤＬ１との結合を非常に効果的に遮断でき、ＰＤ１の生体に対する免疫抑制を特異的に取り除け、Ｔリンパ球を活性化させることができる。そのうち、ＰＤ１抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、ＩＦＮ−γとＩＬ−２の分泌を誘導する効果が対照抗体５Ｃ４（５Ｃ４：ＰＤ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｅｄａｒｅｘ会社から入手したものである。Ａｌａｎ  Ｊ．  Ｋｏｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  １（ＰＤ１）  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＰＤ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ，  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．ＵＳ  ８００８４４９  Ｂ２）より著しく強い。本発明のモノクローナル抗体、特に１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、抗腫瘍作用が市販されているターゲットが同じである薬剤Ｎｉｖｏｌｕｍａｂの効果に相当する。本発明の抗体は、非小細胞肺癌、腎細胞癌、卵巣癌、黒色腫、白血病または貧血を予防・治療する薬剤を調製するために用いられる、あるいはこれらの薬剤とする可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】モノクローナルヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出結果である。試料およびそれらのローディング量は、左から右への４つのレーンで次のとおりであった：１．非還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；２．還元型タンパク質電気泳動ローディング緩衝液サンプル抗体、１μｇ；マーカー、５μｌ；３．ＢＳＡ、１μｇ。
【図２】抗体１４Ｃ１２の動的特性パラメーターの検出結果である。
【図３】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の動的特性パラメーターの検出結果である。
【図４】抗体５Ｃ４の動的特性パラメーターの検出結果である。
【図５】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４のＰＤ１との結合を間接ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図６】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４のＰＤＬ１と競合して結合したＰＤ１を競合ＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図７】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の、２９３Ｔ−ＰＤ１細胞表面のターゲットＰＤ１タンパク質との結合ＥＣ５０である。
【図８】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の、Ｔ細胞表面抗原ＰＤ１との結合活性である。
【図９】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の混合リンパ球のＩＦＮ−γ分泌への影響である。
【図１０】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の混合リンパ球のＩＬ−２分泌への影響である。
【図１１】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＢＭＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＲａｊｉ細胞を混合し共培養して誘導したサイトカインＩＬ−２の分泌への影響である。
【図１２】抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおける腫瘍成長への影響である。  ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３、２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５であり、アドレスは：中国武漢、武漢大学で、郵便番号は、４３００７２である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下で実施例を組み合わせ本発明の実施形態を詳述する。当業者は、次の実施例が単に本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきものではないことを理解できる。具体的な技術または条件が記載されていない実施例は、当技術分野の文献で開示される技術または条件（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｐｅｉｔａｎｇ  ＨＵＡＮＧら訳、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、または製品とともに提供される説明書に従い、行った。用いた供給者が示されていない試薬および機器は、いずれも市販の通常製品である。
【００６０】
本発明の次の実施例において、用いられたＴ細胞は、Ａｋｅｓｏ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．，Ｚｈｏｎｇｓｈａｎから入手した。用いられたＢＡＬＢ／Ｃマウスは、Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入されたものである。用いられたＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスは、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇａｌａｘｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ｃｏ，Ｌｔｄから入手した。使用されたＭＣ３８細胞は、ＦｕＤａｎ  ＩＢＳ  Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した。使用された市販されているターゲットが同じである薬剤Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（Ｏｐｄｉｖｏ(R)）単抗は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３の取得およびモノクローナル抗体１４Ｃ１２の調製
【００６２】
１．ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３の構築
【００６３】
ＰＤ１−ｍＦｃ（ＰＤ１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿００５００９．２）を、タンパク質と融合させて抗原として使用し、免疫ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入）の脾臓細胞を、マウス骨髓瘤細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を合成し、現在確立された方法（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ｊ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，  ｉｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄｓ．  Ｇ．Ｃ．  Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｂｅｔｈｅｌｌ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００）に従った。
【００６４】
ＰＤ１−ｍＦｃを抗原としてマイクロタイタープレートを被覆し、間接ＥＬＩＳＡ法によってスクリーニングし、ＰＤ１と特異的に結合する新規な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を得た。
【００６５】
競合ＥＬＩＳＡでリガンドＰＤＬ１−ｈＦｃ融合タンパク質（ＰＤＬ１：Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １，  ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿０５４８６２．１）と競合してＰＤ１と結合するモノクローナル抗体を分泌できるハイブリドーマ細胞株をスクリーニングした。限界希釈法により安定的なハイブリドーマ細胞株を得、かつ、限界希釈法によりＬＴ００３安定細胞株（これにより分泌したモノクローナル抗体を１４Ｃ１２と命名した）を得た。
【００６６】
ハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３（ＰＤ１−１４Ｃ１２）は、２０１５年６月１６日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、受託番号は、ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１５１０５であり、アドレスは：中国武漢、武漢大学で、郵便番号は、４３００７２である。
【００６７】
２．モノクローナル抗体１４Ｃ１２の調製
【００６８】
本発明のＬＴ００３細胞株を１０％の低ＩｇＧウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で培養し、７日後に細胞培養上清を回収し、精製して抗体１４Ｃ１２を調製した。
【００６９】
実施例２：モノクローナル抗体１４Ｃ１２の軽鎖と重鎖配列の取得
培養細胞／細菌Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｉａｎｇｅｎ、カタログ番号ＤＰ４３０）の方法で、実施例１にて得られたハイブリドーマ細胞株ＬＴ００３からｍＲＮＡを抽出した。
【００７０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲキット取扱説明書に従ってｃＤＮＡを合成し、かつ、ＰＣＲにより増幅させた。
【００７１】
ＰＣＲ増幅産物を直接にＴＡクローニングに供した。具体的な操作は、ｐＥＡＳＹ−Ｔ１  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ  ＣＴ１０１）キット取扱説明書を参照し行った。
【００７２】
ＴＡクローニングの産物を直接に配列決定に供し、配列決定結果は以下のとおりである。
【００７３】
重鎖可変領域のＤＮＡ配列決定結果：（３５４ｂｐ）
ＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＧＴＣＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＧＧＴＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
【００７４】
これによりコードされるタンパク質配列：（１１８ａａ）
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
【００７５】
軽鎖可変領域のＤＮＡ配列決定結果：（３１８ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
【００７６】
これによりコードされるタンパク質配列：（１０６ａａ）
ＤＩＫＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＦＴＣＫＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
【００７７】
２．組換え抗体１４Ｃ１２（Ｒｅ）の調製
１４Ｃ１２（Ｒｅ）の重鎖ｃＤＮＡ配列（その可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示す。）と軽鎖のｃＤＮＡ配列（その可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示す）を、それぞれｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．提供）ベクターにクローニングし（酵素切断サイト：ＸｂａＩ＆ＢａｍＨＩ）、それぞれ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−１４Ｃ１２Ｈ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−１４Ｃ１２Ｌプラスミドを得た。
【００７８】
プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−１４Ｃ１２ＨとｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−１４Ｃ１２Ｌを、それぞれ、酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＥｃｏＲＩ）で切断し、電気泳動によって回収された重鎖軽鎖をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし、組み換えプラスミドを抽出し、２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクションした。
【００７９】
細胞培養７日間後、培養液を高速遠心、細孔フィルター膜を通じた真空ろ過した後、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ柱に供し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒでタンパク質を一歩で溶出させ、目的試料を回収し、かつＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇで液をＰＢＳに変更した後精製して組換え抗体１４Ｃ１２（Ｒｅ）を得た。
【００８０】
組換え抗体１４Ｃ１２（Ｒｅ）をＥＬＩＳＡ結合活性試験で抗体１４Ｃ１２に匹敵する結合活性があり、次の抗体ヒト化のデザインに用いられることが検証された。
【００８１】
実施例３：ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖と軽鎖配列のデザイン
【００８２】
１．ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の軽鎖と重鎖配列のデザイン
ＰＤ１タンパク質の三次元結晶構造（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＰＤ１  ｇｅｎｅ（ＰＤＣＤ１）．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９５，  ２３（３）：７０４−６）および実施例２にて得られた抗体１４Ｃ１２の配列に基づき、抗体モデルのコンピューターシミュレーションによって、モデルによって変異をデザインし、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の可変領域配列を得た（重鎖定常領域は、Ｉｇ  ｇａｍｍａ−１  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７であり、軽鎖定常領域は、Ｉｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である）。可変領域配列は、以下の通りである。
【００８３】
重鎖可変領域のＤＮＡ配列：（３５４ｂｐ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＣＴＣＴＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
【００８４】
これによりコードされるタンパク質配列：（１１８ａａ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＤＷＶＡＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＮＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＮＲＹＧＥＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
【００８５】
軽鎖可変領域のＤＮＡ配列：（３２１ｂｐ）
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
【００８６】
これによりコードされるタンパク質配列：（１０７ａａ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＦＴＣＲＡＳＱＤＩＮＴＹＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＮＲＬＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＭＡＴＹＹＣＬＱＹＤＥＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
【００８７】
実施例４：ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動検出
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の重鎖ｃＤＮＡ（その可変領域配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示し、重鎖定常領域はＩｇ  ｇａｍｍａ−１  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８５７である）と軽鎖のｃＤＮＡ（その可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示し、軽鎖定常領域はＩｇ  ｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ  Ｃ  ｒｅｇｉｏｎ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｐ０１８３４である）を、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．提供）ベクターにそれぞれクローニングし（酵素切断サイト：ＸｂａＩ＆ＢａｍＨＩ）、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−１４Ｃ１２Ｈ１とｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−１４Ｃ１２Ｌ１プラスミドをそれぞれ得、かつ、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにサブクローニングし（酵素切断サイト：ＸｂａＩ＆ＢａｍＨＩ）、組み換えプラスミドを抽出し、２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクションした。
【００８８】
細胞培養７日間後、培養液を高速遠心、細孔フィルター膜を通じた真空ろ過した後、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ柱に供し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒでタンパク質を一歩で溶出させ、目的試料を回収し、かつＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇで液をＰＢＳに変更した後精製して組換え抗体１４Ｃ１２  Ｈ１Ｌ１を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動測定を行った。
【００８９】
結果は、図１に示したように、還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、約２４．５ｋＤと４９ＫＤにあったが、非還元型タンパク質試料の目的タンパク質は、約１４７ｋＤにあった。
【００９０】
実施例５：抗体の動的パラメータの測定
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機で抗体１４Ｃ１２およびヒト化１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の抗原ＰＤ１との結合の動的パラメータを測定した。
【００９１】
１．ＴＥＶタンパク質酵素でＰＤ１−ｍＦｃタンパク質を切断し、かつカラム精製してＰＤ１抗原を得た。
【００９２】
２．抗原ＰＤ１（抗原濃度：１μｇ／ｍｌ）をビオチンで標識してＳＡセンサー表面に固定させ、ＰＢＳＴでバランスした後、それぞれ抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４と結合し、抗体をＰＢＳＴで２００ｎＭから３倍希釈させて、ＰＢＳＴにて解離させた。
【００９３】
抗体１４Ｃ１２、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び５Ｃ４の動的パラメータは、表１に示し、動的特性パラメーター検出結果をそれぞれ図２、図３、図４に示す。結果からわかるように、１４Ｃ１２と１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、いずれも抗原と良い親和性を有し、かつ、親和性が共に対照抗体５Ｃ４より強い。
【００９４】
【表１】
2019534034.tif 000003
【００９５】
実施例６：間接ＥＬＩＳＡ法による抗体の抗原ＰＤ１との結合活性の測定
間接ＥＬＩＳＡ法で１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び５Ｃ４のＰＤ１との結合活性をそれぞれ測定した。具体的な方法は以下の通りであった。
【００９６】
ＥＬＩＳＡプレートにＰＤ１−ｍＦｃを加えてインキュベートし、４℃で一晩置き、１％のＢＳＡで３７℃、２時間ブロッキングした後、それぞれ抗体を加え、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、ＨＲＰで標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ，１０９−０３５−０８８）を添加し、ＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，３０８１７７）で５ｍｉｎ発色反応を行い、かつ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長における吸光度を測定した。
【００９７】
抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び５Ｃ４の抗原ＰＤ１と結合した結果を図５に示す。図５からわかるように、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と５Ｃ４は、いずれも有効的にＰＤ１タンパク質と結合でき、かつその結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度を表２に示す。結合された抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４の結合效率ＥＣ５０は、それぞれ０．０３２ｎＭ、０．０４３ｎＭであった。
【００９８】
【表２】
2019534034.tif 000004
【００９９】
実施例７：競合ＥＬＩＳＡ法による抗体のＰＤＬ１と競合して抗原ＰＤ１と結合する活性の測定
【０１００】
競合ＥＬＩＳＡ法でヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４のＰＤＬ１と競合して抗原ＰＤ１と結合することをそれぞれ測定した。具体的な方法は以下の通りであった。
【０１０１】
ＰＤ１−ｍＦｃでＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩被覆し、１％ＢＳＡで２時間ブロッキングした後、異なる濃度の抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と５Ｃ４を別々にＰＤＬ１−ｍＦｃと１０ｍｉｎ混合し（希釈濃度は表３に示す。）、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、対応する抗ヒトおよび抗マウス酵素標識二次抗体を添加して３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度値を測定した。
【０１０２】
抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１及び５Ｃ４の抗原ＰＤ１との結合を測定した結果を図６に示す。図６からわかるように、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１は、ＰＤＬ１と競合してＰＤ１タンパク質と有効的に結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は表３に示す。結合された抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１と５Ｃ４に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１および５Ｃ４の結合效率ＥＣ５０は、それぞれ１．３２２ｎＭ、１．１９９ｎＭであった。
【０１０３】
【表３】
2019534034.tif 000005
【０１０４】
実施例８：フローサイトメータ法による抗体の細胞表面抗原ＰＤ１との結合活性の検出
まず、ＰＤ１抗原を発現する宿主細胞２９３Ｔを構築し、そして、本発明にて調製したヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１（実施例４を参照）を用いて当該宿主細胞を標識した。そして、フローサイトメトリー法で細胞表面の天然立体配座抗原に対する抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の特異的結合能を分析および検証する。
【０１０５】
１．ＰＤ１抗原を発現する宿主細胞２９３Ｔの構築
具体的な工程は、以下の通りであった。
【０１０６】
ＰＤ１抗原を発現する宿主細胞２９３Ｔの構築：ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した）の方法に従ってＰＤ１を含むベクターｐＬｅｎｔｉ６．３−ＰＤ１（ベクターｐＬｅｎｔｉ６．３は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した）を２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、スクリーニングによりＰＤ１を安定的に発現するクローン集団２９３Ｔ−ＰＤ１を得た。
【０１０７】
２．抗体の２９３Ｔ−ＰＤ１細胞表面抗原への結合
抗体標識とフローサイトメータ測定：通常のトリプシン消化法で前記工程にて得られたＰＤ１抗原を発現する宿主細胞２９３Ｔ−ＰＤ１を消化し、かつ各回収チュープにおける細胞数を２×１０５とし、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ）で濃度５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭのＰＤ１抗体希釈液をそれぞれ調製し、氷上でＰＤ１を発現する２９３Ｔ細胞と２時間インキュベートし、１００μＬ  ＦＩＴＣヒツジ抗ヒトＩｇＧ（１：５００）を各チュープに加え、氷上で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗った後３００μＬ  ＰＢＳを添加し、細胞を再懸させ、フローサイトメータでＦＩＴＣチャンネルを用いて蛍光シグナルを測定した。
【０１０８】
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の２９３Ｔ−ＰＤ１細胞との結合結果は、図７に示す。図７からわかるように、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体は、宿主細胞２９３Ｔ−ＰＤ１表面のターゲットＰＤ１タンパク質と有効的に結合することができ、かつ、その結合效率は、投与量に依存し、各投与量の蛍光強度は、表４に示す。結合された１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体に対して蛍光定量分析を行い、曲線シミュレーションによる１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体の結合效率ＥＣ５０は１．８９ｎＭであった。
【０１０９】
【表４】
2019534034.tif 000006
【０１１０】
実施例９：フローサイトメータ法による抗体のＴ細胞表面抗原ＰＤ１との結合活性の測定
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＯＴ  Ｎｏ．：１７１４４０−０２）を採用してＰＢＭＣを分離させ、ＰＢＭＣからＣＤ４＋細胞を分離した。ＰＨＡ（上海疾控生物科技有限公司、５０μｌ／ｍｌ）で３日間刺激した後ＰＢＳで１回洗い、異なる濃度を有する抗体を加え、氷上で１．５時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、ＰＢＳで１回洗い、ＦＩＴＣで標識された抗ヒト二次抗体ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌｏｔ．１０２１５５）を加えた。氷上でかつ遮光下で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗ってフローサイトメータで測定した。
【０１１１】
ヒト化抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＴ細胞との結合は、図８に示す。図８からわかるように、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体は、Ｔ細胞表面のターゲットＰＤ１タンパク質と効果的に結合でき、かつ、その結合效率は、投与量に依存する。
【０１１２】
実施例１０：混合リンパ球反応：サイトカイン  ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の分泌
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＯＴ  Ｎｏ．：１７１４４０−０２）を採用してＰＢＭＣを分離させ、分離したＰＢＭＣにＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｋ２５１３、１０００Ｕ／ｍｌ）とＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｈ１５１３、１０００Ｕ／ｍｌ）を添加して６日間誘導した後、ＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｇ１５１３、２００Ｕ／ｍｌ）を添加して３日間誘導し、ＤＣ細胞を得た。
【０１１３】
ＰＢＭＣからＴ細胞を分離し、得られたＤＣ細胞とＴ細胞を、１：１０の比率で混合して培養し、かつ、異なる比率の抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１、５Ｃ４およびｈＩｇＧ（ｈＩｇＧをアイソタイプ対照とする）を加えて５〜６日間培養した後、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＦＮ−γ（Ｄａｋｅｗｅ  Ｇｒｏｕｐから購入した）とＩＬ−２（Ｄａｋｅｗｅ  Ｇｒｏｕｐから購入した）の分泌量を測定した。
【０１１４】
ＤＣ細胞とＴ細胞を混合して培養した後、ＩＦＮ−γとＩＬ−２の分泌検出結果は、それぞれ図９、図１０に示す。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体は、効果的に混合リンパ球によるＩＦＮ−γとＩＬ−２の分泌を誘導することができ、かつ、その分泌量は、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の投与量に依存する。抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＩＦＮ−γとＩＬ−２の分泌を誘導する效果は共に対照抗体５Ｃ４より強い。
【０１１５】
実施例１１：ＩＬ−２分泌の誘導
（実施例１０と同じ方法で）分離して得たＰＢＭＣを、ＰＨＡ（上海疾控生物科技有限公司、５０μｌ／ｍＬ）で３日間刺激した後、９６ウェルプレートに刺激によって成熟したＰＢＭＣ（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）、Ｒａｊｉ細胞（上海中科院）（５×１０４ｃｅｌｌｓ／孔）、および、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ）（１×１０４ｃｅｌｌｓ／孔）を加え、１００ｎＭ  １４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１または対照抗体５Ｃ４またはｈＩｇＧ（ｈＩｇＧをアイソタイプ対照とする）を添加して均一になるように混合して共培養した。３日間後、ＥＬＩＳＡキットを採用してＩＬ−２（Ｄａｋｅｗｅ  Ｇｒｏｕｐから購入した）の分泌量を測定し、具体的な手順は、キットの取扱説明書に従って行った。
【０１１６】
細胞を混合して培養した後のＩＬ−２の分泌検出結果は図１１に示す。図１１からわかるように、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１抗体は、効果的にＰＢＭＣのＩＬ−２分泌を誘導でき、抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１のＩＬ−２分泌に対する誘導效果は、対照抗体５Ｃ４より著しく強い。
【０１１７】
実施例１２：抗体１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１の、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおける腫瘍成長への影響
ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウス（ヒトＰＤ−１遺伝子導入マウス）右側皮下にＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０６／匹）を接種し、平均腫瘍体積が約１１８ｍｍ３  に達すると、腫瘍体積によってマウスをランダムに４つの実験群に分け、腹腔内投与した。各群毎に、いずれも８匹のマウスであった。具体的な分類と投与量は以下の通りであった。
Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ群（投与量８ｍｇ／ｋｇ）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１高投与量群（投与量８ｍｇ／ｋｇ）
１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１低投与量群（投与量０．８ｍｇ／ｋｇ）、
Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ群（投与量８ｍｇ／ｋｇ）。
【０１１８】
前記の４つの群は、いずれも周２回、合計５回で投与した。各群に投与した後、腫瘍のサイズを周２回で測定した。
結果は、図１２に示す。
結果により、下記のことが分かる。
Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ群、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１高投与量群、１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１低投与量群の腫瘍体積は、いずれも、統計的にＩｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ群（Ｐ＜０．０１、＜０．０１、＜０．０５）より著しく小さい。１４Ｃ１２Ｈ１Ｌ１高投与量群（８ｍｇ／ｋｇ）は、ＰＤ−１  ＨｕＧＥＭＭマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、統計的に有意な抗腫瘍効果を示し、かつ、薬学効果が市販されているターゲットが同じである薬剤Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（８ｍｇ／ｋｇ）に相当する。
【０１１９】
本発明の具体的な実施形態を詳細に記載してきたが、当業者は、本明細書で開示される教示に照らして、本発明の構成に対して様々な改変および変更がなされ得、これらが全て本発明の保護範囲に包含されることを理解できる。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびその何らかの同等物において定められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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