(57)【要約】  本発明は、活性化可能なプロモーター、並びに前記活性化可能なプロモーターを含む発現システム、ベクター、送達システム、反応容器、水性物体及び組成物に関する。本発明は、前記活性化可能なプロモーターを含む水性物体の集合体及びネットワークを含む、組成物も提供する。本発明は、本発明の活性化可能なプロモーターを使用した、転写産物の発現方法及びポリペプチドの発現方法を更に提供する。本発明は、リン脂質混合物、並びに前記リン脂質の混合物を含む水性物体及び組成物を更に提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチドプロモーター配列及び活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素に結合した１以上の転写阻害成分を含む、活性化可能なプロモーターであって、１以上の転写阻害成分が、活性化可能なプロモーターから引き離されている場合に、該ヌクレオチドプロモーター配列が活性化するように構成されている、プロモーター。
【請求項２】
前記活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素がヌクレオチドの構成要素である、請求項１に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項３】
前記活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素が、１以上のヌクレオチド塩基又はヌクレオチド塩基類似体である、請求項２に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項４】
前記活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素が、１以上のヌクレオチド糖基である、請求項２に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項５】
前記活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素が、１以上のヌクレオチドリン酸基である、請求項２に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項６】
前記１以上の転写阻害成分が、１以上の分解性成分を介して、活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素に結合している、上記請求項のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項７】
前記１以上の分解性成分が光分解性成分である、請求項６に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項８】
前記１以上の分解性成分が、２−ニトロベンジルを含む光分解性成分である、請求項７に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項９】
前記１以上の分解性成分がリンカーを更に含み、前記１以上の転写阻害成分及び前記１以上の分解性成分がリンカーを介して活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素に結合している、請求項６〜８のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１０】
前記リンカーがジアミンリンカーである、請求項９に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１１】
前記ジアミンリンカーが、式─Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）─（前記式中、ｎが１〜２０、任意選択で、１〜１２である）のリンカーから選択される、アルキルジアミンリンカーである、請求項１０に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１２】
前記ジアミンリンカーが、式─Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）─（前記式中、ｎが１〜８である）のリンカーから選択される、アルキルジアミンリンカーである、請求項１１に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１３】
前記ジアミンリンカーが、１，６−ジアミノヘキサンである、請求項１２に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１４】
前記活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素が、１以上のヌクレオチド塩基又はヌクレオチド塩基類似体である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１５】
前記１以上のヌクレオチド塩基がプリン塩基であり、リンカーがプリン環に結合している、請求項１４に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１６】
前記1以上のヌクレオチド塩基がアデニン及び／又はグアニンである、請求項１５に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１７】
前記リンカーがプリン環に、好ましくは、８位で結合している、請求項１５又は請求項１６に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１８】
前記１以上のヌクレオチド塩基がピリミジン塩基であり、リンカーがピリミジン環に結合している、請求項１４に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項１９】
前記１以上のヌクレオチド塩基がチミン及び／又はシトシン及び／又はウラシルである、請求項１８に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項２０】
前記リンカーがピリミジン環に、好ましくは、５位で結合している、請求項１８又は請求項１９に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項２１】
前記１以上の転写阻害成分がビオチン：ストレプトアビジン複合体を含み、該複合体のビオチン成分が1以上の分解性成分に結合している、請求項２〜２０のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項２２】
前記１以上の転写阻害成分が、ヌクレオチドプロモーター配列の１以上の構成要素に結合している、上記請求項のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーター。
【請求項２３】
オープンリーディングフレームに作動可能に連結された、上記請求項のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーターを含む、発現システム。
【請求項２４】
遺伝子に作動可能に連結された、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーターを含む、発現システム。
【請求項２５】
前記オープンリーディングフレーム又は遺伝子が、膜タンパク質をコードし；任意選択で、該膜タンパク質が、ポンプ、チャネル、孔、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、又は細胞認識若しくは細胞間相互作用に影響するタンパク質を含む、請求項２３又は２４に記載の発現システム。
【請求項２６】
前記膜タンパク質がα−ヘモリシン（αＨＬ）孔タンパク質である、請求項２５に記載の発現システム。
【請求項２７】
前記システムが、バクテリオファージ転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成されている、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項２８】
前記ヌクレオチドプロモーター配列がＴ７プロモーターを含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項２９】
前記システムが、原核転写構成要素、任意選択で、細菌の転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成されている、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項３０】
前記システムが、真核転写構成要素、任意選択で、昆虫又は哺乳動物の転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成されている、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項３１】
１以上の更なる転写要素を更に含み、任意選択で、該転写要素がエンハンサーである、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項３２】
請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の発現システムを含む、ベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子又は繋がった二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ベクターがウイルスベクター、任意選択で、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項３２又は請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
請求項３２又は請求項３３に記載のベクターを含む送達システムであって、前記送達システムが、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、バイオリスティックシステム、ヴィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸複合体又は人工ウイルス粒子を含む、送達システム。
【請求項３６】
前記送達システムがウイルス送達システムを含む、請求項３４に記載のベクターを含む、送達システム。
【請求項３７】
水性媒体、及び請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の発現システム、又は請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のベクターを含む反応容器であって；該水性媒体が転写試薬を含み；該反応容器が脱結合剤を受容するように構成され、該剤が発現システム又はベクターの活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素から、１以上の転写阻害成分を引き離すことができ、転写産物が引き離し後に発現され得る、反応容器。
【請求項３８】
前記容器が試験管である、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項３９】
前記容器がマイクロタイタープレートのウェルである、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４０】
前記容器が基板の領域、任意選択で、該領域がアレイを含む基板の複数の領域の一つである、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４１】
前記容器がマイクロ流体構造のセルである、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４２】
前記容器が生物学的な細胞である、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４３】
前記容器が合成細胞である、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４４】
前記容器が水性液滴を含む水性物体である、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４５】
前記容器がヒドロゲル物体を含む水性物体である、請求項３７に記載の反応容器。
【請求項４６】
水性液滴又はヒドロゲル物体の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を含む、請求項４４又は請求項４５に記載の反応容器。
【請求項４７】
前記両親媒性分子の外層が水性液滴又はヒドロゲル物体を封入している、請求項４６に記載の反応容器。
【請求項４８】
前記両親媒性分子が脂質分子を含む、請求項４７に記載の反応容器。
【請求項４９】
前記両親媒性分子がリン脂質分子を含む、請求項４８に記載の反応容器。
【請求項５０】
前記リン脂質が非ＰＥＧ化リン脂質及びＰＥＧ化リン脂質を含み、２．５〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、請求項４９に記載の反応容器。
【請求項５１】
５〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質、任意選択で、７．５〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、請求項５０に記載の反応容器。
【請求項５２】
１０〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、請求項５１に記載の反応容器。
【請求項５３】
前記ＰＥＧ化リン脂質が１５００〜５０００ｇ／モルの分子量を有するＰＥＧ基を含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項５４】
前記ＰＥＧ化リン脂質が１８００〜２２００ｇ／モルの分子量を有するＰＥＧ基を含む、請求項５３に記載の反応容器。
【請求項５５】
前記非ＰＥＧ化リン脂質がグリセロリン脂質であり、及び／又は前記ＰＥＧ化リン脂質がグリセロリン脂質である、請求項５０〜５４のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項５６】
前記非ＰＥＧ化リン脂質が以下の式（Ｉ）：
【化１】
2019507598.tif 000014
（前記式中：
Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、Ｃ１０−Ｃ２５アルキル基及びＣ１０−Ｃ２５アルケニル基から選択され；
ＯＲ３がＯ−であるように、Ｒ３は存在しないか、又はＲ３は存在し、Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｒ４）３＋、糖基若しくはアミノ酸基であり；並びに
各Ｒ４は、同じであるか又は異なり、Ｈ及び置換されていないＣ１−Ｃ４アルキルから独立して選択される）
のリン脂質である、請求項５５に記載の反応容器。
【請求項５７】
前記ＰＥＧ化リン脂質が以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2019507598.tif 000015
（前記式中：
Ｒ１及びＲ２は、式(I)のリン脂質について上記で定義された通りであり、Ｒ５はポリ（エチレングリコール）を含む基である）
のリン脂質である、請求項５５又は５６に記載の反応容器。
【請求項５８】
Ｒ５が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＨ又は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＨであり、ｑが５〜１０，０００の整数である、請求項５７に記載の反応容器。
【請求項５９】
前記非ＰＥＧ化リン脂質がＤＰｈＰＣを含む、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項６０】
前記ＰＥＧ化リン脂質がＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含む、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項６１】
前記リン脂質がＤＰｈＰＣ及びＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含み、該リン脂質が２．５〜１５モル％のＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００、任意選択で、５〜１５モル％のＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含む、請求項５９又は請求項６０に記載の反応容器。
【請求項６２】
前記水性媒体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムを含む、請求項３７〜４１及び４３〜６１のいずれか１項に記載の反応容器。
【請求項６３】
前記水性媒体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システム及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムを含む、請求項６２に記載の反応容器。
【請求項６４】
請求項４６〜６３のいずれか１項に記載の１以上の反応容器、及び疎水性媒体を含む組成物であって、該1以上の反応容器が疎水性媒体中に配置されている、組成物。
【請求項６５】
前記疎水性媒体がオイルを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記オイルがシリコーン油、炭化水素若しくはフルオロカーボン、又はそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記疎水性媒体が炭化水素及びシリコーン油の混合物を含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
５０：５０〜２０：８０の体積比又は５０：５０〜８０：２０の体積比、好ましくは、５０：５０〜４０：６０の体積比の炭化水素：シリコーン油を含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記炭化水素がＣ１０−Ｃ２０アルカンであり、好ましくは、前記炭化水素がヘキサデカンである、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記１以上の反応容器が、集合体を形成する複数の反応容器を含む、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
集合体中の１以上の反応容器が、集合体中の少なくとも1つの他の反応容器と接触している、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
接触している反応容器の間に接触面が形成される、請求項７０又は請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記接触面が両親媒性分子の層、好ましくは、両親媒性分子の二重層を含むか；又は前記接触面が両親媒性分子の層を含まない、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
反応容器のネットワークを形成するために、複数の反応容器が接続されている、請求項７２又は７３に記載の組成物。
【請求項７５】
両親媒性分子の二重層を含む接触面を介して、少なくとも２つの反応容器が接続され、前記の少なくとも２つの反応容器の水性媒体が二重層内の孔を介して、流体をやりとりする、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記孔がα−ヘモリシン（αＨＬ）で構成される、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の組成物を含む、電気化学回路。
【請求項７８】
転写産物の発現方法であって、該方法が以下：請求項３７〜７６のいずれか１項に記載の反応容器又は組成物を提供すること、及び該容器に脱結合剤を提供すること（該剤は、活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素から１以上の転写阻害成分を引き離すことができる）ことを含み；該転写産物が引き離し後に発現する、方法。
【請求項７９】
転写産物の発現方法であって、該方法が以下：請求項１〜２２のいずれか１項に記載の活性化可能なプロモーターを脱結合剤と接触させること（該剤は、活性化可能なプロモーターの１以上の構成要素から１以上の転写阻害成分を引き離すことができる）ことを含み；該転写産物が引き離し後に発現する、方法。
【請求項８０】
前記活性化可能なプロモーターが請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の発現システム中に含まれるか、又は前記活性化可能なプロモーターが請求項３２〜３４のいずれか１項に記載のベクター中に含まれる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記活性化可能なプロモーターの分解性成分が光分解性成分であり、前記脱結合剤が電磁放射線である、任意選択で、該電磁放射線が赤外線（ＩＲ）であり、好ましくは、該電磁放射線が紫外線（ＵＶ）である、請求項７８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記光分解性成分が２−ニトロベンジルを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の製造方法であって、該方法が請求項７８〜８２のいずれか１項に記載の方法によって転写産物を発現させること、及び該転写産物をペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳することを含む、方法。
【請求項８４】
前記反応容器が、請求項３７〜４１及び４３〜６１のいずれか１項に記載の容器であるか、又は請求項６４〜７６のいずれか１項に記載の組成物であり、前記水性媒体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳システムを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
リン脂質混合物であって、該混合物が非ＰＥＧ化リン脂質及びＰＥＧ化リン脂質を含むリン脂質を含み、２．５〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、混合物。
【請求項８６】
５〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、任意選択で、７．５〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、請求項８５に記載の混合物。
【請求項８７】
１０〜１５モル％のリン脂質がＰＥＧ化リン脂質である、請求項８６に記載の混合物。
【請求項８８】
前記ＰＥＧ化リン脂質が１５００〜５０００ｇ／モルの分子量を有するＰＥＧ基を含む、請求項８７に記載の混合物。
【請求項８９】
前記ＰＥＧ化リン脂質が１８００〜２２００ｇ／モルの分子量を有するＰＥＧ基を含む、請求項８８に記載の混合物。
【請求項９０】
前記非ＰＥＧ化リン脂質がグリセロリン脂質である、及び／又は前記ＰＥＧ化リン脂質がグリセロリン脂質である、請求項８５〜８９のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項９１】
前記非ＰＥＧ化リン脂質が以下の式（Ｉ）：
【化３】
2019507598.tif 000016
（前記式中：
Ｒ１及びＲ２は、同じであるか又は異なり、Ｃ１０−Ｃ２５アルキル基及びＣ１０−Ｃ２５アルケニル基から選択され；
ＯＲ３がＯ−であるように、Ｒ３は存在しないか、又はＲ３は存在しＨ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｒ４）３＋、糖基若しくはアミノ酸基であり；及び
各Ｒ４は、同じであるか又は異なり、Ｈ及び置換されていないＣ１−Ｃ４アルキルから独立して選択される）
のリン脂質である、請求項９０に記載の混合物。
【請求項９２】
前記ＰＥＧ化リン脂質が以下の式（ＩＩ）
【化４】
2019507598.tif 000017
（前記式中：
Ｒ１及びＲ２は、式（Ｉ）のリン脂質について上記で定義された通りであり、Ｒ５はポリ（エチレングリコール）を含む基である）
のリン脂質である、請求項９０又は請求項９１に記載の混合物。
【請求項９３】
Ｒ５が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２)３Ｃ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＨ又は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｑＯＨであり、ｑは５〜１０，０００の整数である、請求項９２に記載の混合物。
【請求項９４】
前記非ＰＥＧ化リン脂質がＤＰｈＰＣを含む、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項９５】
前記ＰＥＧ化リン脂質がＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含む、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の混合物。
【請求項９６】
前記リン脂質がＤＰｈＰＣ及びＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含み、前記リン脂質が２．５〜１５モル％のＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００、任意選択で、５〜１５モル％のＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００を含む、請求項９４又は請求項９５に記載の混合物。
【請求項９７】
水性媒体を含み、表面の少なくとも一部においてリン脂質分子の混合物の外層を更に含む、水性物体であって、該リン脂質分子の混合物が請求項８５〜９６のいずれか１項に記載の混合物である、水性物体。
【請求項９８】
前記リン脂質分子の外層が水性物体を封入している、請求項９７に記載の物体。
【請求項９９】
前記物体が水性液滴である、請求項９７又は９８に記載の物体。
【請求項１００】
前記物体がヒドロゲル物体である、請求項９７又は９８に記載の物体。
【請求項１０１】
請求項９７〜１００のいずれか１項に記載の１以上の水性物体、及び疎水性媒体を含む組成物であって、該１以上の水性物体が疎水性媒体中に配置されている、組成物。
【請求項１０２】
前記疎水性媒体がオイルを含む、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記オイルがシリコーン油、炭化水素若しくはフルオロカーボン、又はそれらの２つ以上の混合物を含む、請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記疎水性媒体が炭化水素及びシリコーン油の混合物を含む、請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
５０：５０〜２０：８０の体積比又は５０：５０〜８０：２０の体積比、好ましくは、５０：５０〜４０：６０の体積比で、炭化水素：シリコーン油を含む、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記炭化水素がＣ１０−Ｃ２０アルカンであり、好ましくは、前記炭化水素がヘキサデカンである、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記１以上の水性物体が集合体を形成する複数の水性物体を含む、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０８】
集合体中の１以上の水性物体が、集合体中の少なくとも１つの他の水性物体と接触している、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
接触している水性物体の間に接触面が形成されている、請求項１０７又は請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記接触面がリン脂質分子の層、好ましくは、リン脂質分子の二重層を含むか；又は前記接触面がリン脂質分子の層を含まない、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
水性物体のネットワークを形成するために、複数の水性物体が接続されている、請求項１０９又は１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
リン脂質分子の二重層を含む接触面を介して、少なくとも２つの水性物体が接続され、前記の少なくとも２つの水性物体の水性媒体が二重層内の孔を介して流体をやりとりする、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記孔がα−ヘモリシン（αＨＬ）で構成される、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
請求項１１１〜１１３のいずれか１項に記載の組成物を含む、電気化学回路。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化可能なプロモーター、並びに前記活性化可能なプロモーターを含む発現システム、ベクター、送達システム、反応容器、水性物体及び組成物に関する。本発明はまた、前記活性化可能なプロモーターを含む水性物体の集合体及びネットワークを含む組成物も提供する。更に、本発明は、本発明の活性化可能なプロモーターを使用した、転写産物の発現方法及びポリペプチドの発現方法を提供する。本発明は、リン脂質混合物、並びに前記リン脂質混合物を含む水性物体及び組成物を更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
誘導性の転写及び／又は翻訳システムは、調節RNAからタンパク質及びペプチドまで幅広い生物学的な分子の産生の調節において、重要な汎用性を提供する。
in vivo及びin vitroでの使用のために、多くの種類の誘導性転写システムが開発されている。
無細胞転写及び／又は翻訳システムは、哺乳動物細胞様の環境中において、機能的なタンパク質を発現し得るシステムを作製するための合成生物学において、広く使用されている (1-3)。これらのシステムは、タンパク質のin vitroでの選択及び進化 (4-7)、並びに哺乳動物 (8)及び細菌細胞 (9)の調節のために使用されている。以前の研究は、例、単一の脂質二重層有界区画（合成細胞）内に無細胞発現システムを封入することによって、行われている。
【０００３】
光活性化転写及び／又は翻訳は、高度な柔軟性及び調節性を提供する。そのようなシステムは既に得られているが、これらのシステムは、オフ状態における転写を完全に抑制できない (12)か、又はそれらは、ある種の合成細胞内部に容易に封入できない (13、14)かのいずれかである。
それゆえ、活性化状態及び抑制状態の間のより厳密な制御を提供する、改良された誘導性の転写及び／又は翻訳システムに対する継続した要求がある。また、生物学的な分子の発現において、特に合成生物学的システムの文脈において、有用である改善されたシステム及び構造体についての継続した要求もある。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要約
本発明は、活性化可能なプロモーター、並びに前記活性化可能なプロモーターを含む発現システム、ベクター、送達システム、反応容器、水性物体及び組成物に関する。本発明はまた、前記活性化可能なプロモーターを含む水性物体の集合体及びネットワークを含む組成物も提供する。更に、本発明は、本発明の活性化可能なプロモーターを使用した、転写産物の発現方法及びポリペプチドの発現方法を提供する。本発明は、リン脂質混合物、並びに前記リン脂質混合物を含む水性物体及び組成物を更に提供する。
【０００５】
従って、本発明は、ヌクレオチドプロモーター配列を含む活性化可能なプロモーター、及び活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素に結合した1以上の転写阻害成分であって、該1以上の転写阻害成分が活性化可能なプロモーターから引き離された場合に、ヌクレオチドプロモーター配列が活性化するように構成された、プロモーター及び成分を提供する。
【０００６】
本発明の任意の活性化可能なプロモーターにおいては、活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素は、ヌクレオチドの構成要素であり得る。ヌクレオチドの1以上の構成要素は、1以上のヌクレオチド塩基又は1以上のヌクレオチド塩基類似体であり得る。ヌクレオチドの1以上の構成要素は、1以上のヌクレオチド糖基（sugar groups）、又は1以上の（or more）ヌクレオチドリン酸基であり得る。
【０００７】
本発明の任意の活性化可能なプロモーターにおいては、1以上の転写阻害成分は、1以上の分解性成分を介して、活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素に結合し得る。好ましくは、1以上の分解性成分は光分解性成分である。1以上の光分解性成分は、電磁放射線と接触して分解され得る成分であり得、任意選択で、該電磁放射線は赤外線 (IR)であり、好ましくは、該電磁放射線は紫外線 (UV)である。1以上の分解性成分は、2-ニトロベンジルを含む光分解性成分であり得る。
【０００８】
1以上の分解性成分を含む、本発明の任意の活性化可能なプロモーターにおいては、1以上の分解性成分はリンカーを更に含み得、1以上の転写阻害成分及び1以上の分解性成分は、リンカーを介して活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素に結合する。
【０００９】
リンカーはジアミンリンカーであり得る。該ジアミンリンカーは、式−N(H)(CH2)nN(H)−（式中、nは1〜20、任意選択で、1〜12、好ましくは、1〜8である）から選択される、アルキルジアミンリンカーであり得る。該ジアミンリンカーは、1,6-ジアミノヘキサンであり得る。
【００１０】
好ましい実施形態においては、活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素は、1以上のヌクレオチド塩基又はヌクレオチド塩基類似体であり、1以上の分解性成分は、上記で定義されたリンカーを更に含む。
【００１１】
1以上のヌクレオチド塩基はプリン塩基であり得る。1以上のヌクレオチド塩基はアデニン及び／又はグアニンであり得る。任意のそのようなプリン塩基においては、リンカーは、プリン環に結合し得る。リンカーは、プリン環に8位で結合し得る。
【００１２】
1以上のヌクレオチド塩基はピリミジン塩基であり得る。1以上のヌクレオチド塩基は、チミン及び／又はシトシン及び／又はウラシルであり得る。任意のそのようなピリミジン塩基においては、リンカーはピリミジン環に結合し得る。リンカーはピリミジン環に5位で結合し得る。本発明の任意の活性化可能なプロモーターにおいては、1以上の転写阻害成分は、小分子：タンパク質複合体（該複合体の小分子は、本明細書で定義された、任意の1以上の分解性成分に結合している）を含み得る。小分子：タンパク質複合体は、ビオチン:ストレプトアビジン複合体（該複合体のビオチン成分は、本明細書で定義された、任意の1以上の分解性成分に結合している）であり得る。
【００１３】
本発明の活性化可能なプロモーターのいずれかにおいては、1以上の転写阻害成分は、ヌクレオチドプロモーター配列の1以上の構成要素に結合し得る。
【００１４】
一実施形態においては、活性化可能なプロモーターは、ヌクレオチドプロモーター配列、及び活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素に結合した1以上の転写阻害成分を含む、活性化可能なプロモーターであり、1以上の転写阻害成分が、活性化可能なプロモーターから引き離された場合に、該ヌクレオチドプロモーター配列が活性化するように構成され；活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素は1以上のヌクレオチド塩基であり；該1以上の転写阻害成分は、2-ニトロベンジルを含む1以上の光分解性成分を介して、活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素に結合し；該1以上の光分解性成分は、リンカーを更に含み、1以上の転写阻害成分及び1以上の分解性成分は、該リンカーを介して、活性化可能なプロモーターのヌクレオチド塩基に結合し；該（the the）リンカーは、式−N(H)(CH2)nN(H)−（式中、nは1〜8である）から選択される、アルキルジアミンリンカーであり、任意選択で、該ジアミンリンカーは1,6-ジアミノヘキサンであり；1以上のヌクレオチド塩基はチミンであり、該リンカーはピリミジン環に5位で結合し；該1以上の転写阻害成分はビオチン：ストレプトアビジン複合体を含み、該複合体のビオチン成分は1以上の光分解性成分に連結されている。
【００１５】
本発明はまた、オープンリーディングフレーム又は遺伝子に作動可能に連結された、本明細書において定義又は記載された、本発明の活性化可能なプロモーターのいずれかを含む、発現システムを提供する。オープンリーディングフレーム又は遺伝子は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードし得る。オープンリーディングフレーム又は遺伝子は膜タンパク質；例えば、ポンプ、チャネル、孔、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、又は細胞認識若しくは細胞間相互作用に影響するタンパク質をコードし得る。膜タンパク質は、α-ヘモリシン (αHL)孔タンパク質であり得る。オープンリーディングフレーム又は遺伝子は、例えばsiRNA又はmiRNA等の翻訳されないRNAをコードし得る。
【００１６】
本発明の発現システムのいずれかは、バクテリオファージ又はバクテリオファージ関連の転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成され得る。例えば、プロモーターは、バクテリオファージプロモーター又はバクテリオファージ関連のプロモーターであり得る。ヌクレオチドプロモーター配列は、T7プロモーターを含み得る。
本発明の発現システムのいずれかは、原核転写構成要素、例えば、細菌の転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成され得る。
本発明の発現システムのいずれかは、真核転写構成要素、任意選択で、昆虫 (例、バキュロウイルス)又は哺乳動物の転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成され得る。
本発明の発現システムのいずれかは、1以上の追加的な転写要素、例えば、エンハンサーを更に含み得る。
【００１７】
本発明はまた、本明細書において定義又は記載された、本発明の発現システムのいずれかを含むベクターも提供する。
該ベクターは、直鎖状の二本鎖DNA分子であり得るか、又はそれは繋がった（例、環状の）二本鎖DNA分子であり得る。
該ベクターは、ウイルスベクター、任意選択で、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。
【００１８】
本発明はまた、本明細書において定義又は記載された本発明のベクターのいずれかを含む、送達システムも提供する。そのような送達システムは、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、バイオリスティック（biolistic）システム、ヴィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸コンジュゲート、又は人工ウイルス粒子を含み得る。
【００１９】
送達システムは、ウイルス送達システムであって、該システムが、本明細書において定義又は記載された本発明のウイルスベクターのいずれかを含む、システムであり得る。
【００２０】
本発明はまた、本明細書において定義又は記載された本発明の、水性媒体、及び発現システム又はベクターのいずれかを含む、反応容器であって；該水性媒体が転写試薬を含み；該反応容器が、脱結合剤を受容するよう構成され、該剤は発現システム又はベクターの活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素から、1以上の転写阻害成分を引き離すことができ、転写産物が引き離し後に発現し得る、容器も提供する。
本明細書で定義された反応容器は、例、本明細書において定義又は記載された本発明の発現システム又はベクターを介して、本発明の活性化可能なプロモーターを含む（contains）、運ぶ（carries）又は含む（harbours）任意の容器である。
【００２１】
反応容器は、転写産物を発現するために、本明細書において定義又は記載された、任意の好適な構造体であり得る。反応容器は、例えば、任意の好適な試験管、又はマイクロタイタープレートのウェルであっても良い。反応容器は、例えば、基板の任意の好適な領域であり得る。反応容器は、例えば、アレイを含む基板の複数の領域の1つである領域であり得る。反応容器は、マイクロ流体構造の任意の好適なセルであり得る。反応容器は、封止されるか、又は封止可能であり得る。反応容器は、試薬の導入のための1以上のアクセスチャネルを含み得る。反応容器は、生物学的な細胞又は合成細胞であり得る。反応容器は、水性液滴又はヒドロゲル物体を含む、水性物体であり得る。反応容器は、明細書において定義又は記載された、任意のそのような水性液滴又はヒドロゲル物体であり得る。
【００２２】
本明細書において定義又は記載された、例えば水性液滴又はヒドロゲル物体等の、水性物体である反応容器に関して、該水性物体は、水性液滴又はヒドロゲル物体の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を含み得る。両親媒性分子の外層は、水性液滴又はヒドロゲル物体を封入し得る。
【００２３】
両親媒性分子の外層を含み得る任意の反応容器は、脂質分子である両親媒性分子を含み得る。両親媒性分子は、リン脂質分子を含み得る。リン脂質分子は、非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質を含み得る。リン脂質分子が、非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質を含む場合、2.5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。代替的に、7.5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。代替的に、5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質である。好ましくは、10〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。
【００２４】
PEG化リン脂質を含む両親媒性分子の外層を含み得る任意の反応容器は、1500〜5000 g／モル、任意選択で、1800〜2200 g／モルの分子量を有するPEG基を有するリン脂質を含み得る。
【００２５】
非PEG化リン脂質分子及びPEG化リン脂質分子を含む、両親媒性分子の外層を含み得る任意の反応容器においては、非PEG化リン脂質分子は、グリセロリン脂質であり得、及び／又はPEG化リン脂質はグリセロリン脂質であり得る。
【００２６】
非PEG化グリセロリン脂質を含む、両親媒性分子の外層を含み得る任意の反応容器においては、非PEG化リン脂質は、以下の式(I)：
【００２７】
【化１】
2019507598.tif 000002
【００２８】
（前記式中：
R1及びR2は、同じであるか又は異なり、C10-C25アルキル基及びC10-C25アルケニル基から選択され；
OR3がO-であるように、R3は存在しないか、又はR3は存在し、H、CH2CH2N(R4)3+、糖基若しくはアミノ酸基（amino acid group）であり；並びに
各R4は、同じであるか又は異なり、H及び置換されていないC1-C4アルキルから独立して選択される。）
のリン脂質であり得る。
【００２９】
PEG化グリセロリン脂質を含む、両親媒性分子の外層を含み得る、任意の反応容器においては、PEG化リン脂質は、以下の式(II)：
【００３０】
【化２】
2019507598.tif 000003
【００３１】
（前記式中：
R1及びR2は、式(I)のリン脂質について上記で定義された通りであり、R5は、ポリ（エチレングリコール）を含む基である。R5は、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、又は-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（qは5〜10,000の整数である）であり得る。）
のリン脂質であり得る。
【００３２】
グリセロリン脂質である非PEG化リン脂質を含む、両親媒性分子の外層を含み得る、任意の反応容器においては、非PEG化リン脂質はDPhPCを含み得る。
【００３３】
グリセロリン脂質であるPEG化リン脂質を含む両親媒性分子の外層を含み得る、任意の反応容器においては、PEG化リン脂質はDPPE-mPEG2000を含み得る。PEG化リン脂質は5〜15モル％のDPPE-mPEG2000を含み得る。
【００３４】
グリセロリン脂質であるPEG化リン脂質、及びグリセロリン脂質である非PEG化リン脂質を含む、両親媒性分子の外層を含み得る、任意の反応容器においては、非PEG化リン脂質はDPhPCを含み得、PEG化リン脂質はDPPE-mPEG2000を含み得る。そのようなケースにおいては、リン脂質は、例えば、2.5〜15モル％のDPPE-mPEG2000、好ましくは、5〜15モル％のDPPE-mPEG2000を含み得る。
【００３５】
本明細書において定義又は記載された任意の反応容器においては、水性媒体はin vitro転写システムを含み得る。
本明細書において定義又は記載された任意の反応容器においては、水性媒体はin vitro転写システム及びin vitro翻訳システムを含み得る。
【００３６】
本発明は、1以上の反応容器が疎水性媒体中に配置されている、本明細書において定義又は記載された反応容器の1以上又はいずれか及び疎水性媒体を含む組成物を更に提供する。任意のそのような組成物においては、疎水性媒体はオイルを含み得る。疎水性媒体は、シリコーン油、炭化水素若しくはフルオロカーボン、又はそれらの2つ以上の混合物を含むオイルを含み得る。
【００３７】
疎水性媒体は、炭化水素及びシリコーン油の混合物を含み得る。そのような組成物においては、炭化水素：シリコーン油の体積比は、例えば、50：50〜20：80の体積比又は50：50〜80：20の体積比、好ましくは、50：50〜40：60の体積比であり得る。
【００３８】
炭化水素を含む、任意のそのような組成物においては、炭化水素は、C10-C20アルカン、好ましくは、ヘキサデカンであり得る。
任意のそのような組成物においては、1以上の反応容器は、集合体を形成している複数の反応容器を含み得る。任意のそのような組成物においては、集合体における1以上の反応容器は、集合体中において、少なくとも1つの他の反応容器と接触し得る。
【００３９】
反応容器の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を含む、任意のそのような組成物においては、接触面は、接触している反応容器の間に形成され得る。任意のそのような組成物においては、接触面は、両親媒性分子の層、好ましくは、両親媒性分子の二重層を含み得る。代替的に、接触面は、両親媒性分子の層を含まない場合がある。
【００４０】
任意のそのような組成物においては、複数の反応容器は、反応容器のネットワークを形成するよう接続され得る。任意のそのような組成物においては、少なくとも2つの反応容器は、両親媒性分子の二重層を含む接触面を介して、接続され得、前記の少なくとも2つの反応容器の水性媒体は、二重層内の孔を介して、流体をやりとりする。孔は、α-ヘモリシン（αHL）で構成され得る。
【００４１】
本発明はまた、本明細書において定義又は記載された、反応容器を含有する組成物のいずれかを含む、電気化学回路も提供する。
【００４２】
本発明はまた、転写産物の発現方法であって、該方法が以下：本明細書において定義又は記載された、反応容器又は組成物のいずれかを提供すること、及び該容器に対して脱結合剤を提供すること（該剤は、活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素から1以上の転写阻害成分を引き離すことができる）を含み；該転写産物が引き離し後に発現する、方法も提供する。
【００４３】
本発明はまた、転写産物の発現方法であって、該方法が以下：本明細書において定義又は記載された、活性化可能なプロモーターのいずれかを、脱結合剤と接触させること（該剤は、活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素から1以上の転写阻害成分を引き離すことができる）を含み；該転写産物が引き離し後に発現する、方法も提供する。
【００４４】
任意のそのような方法においては、活性化可能なプロモーターは、本明細書において定義又は記載された、発現システム又はベクターのいずれかに含まれ得る。
【００４５】
任意のそのような方法においては、活性化可能なプロモーターの分解性成分は、光分解性成分であり得、脱結合剤は、電磁放射線あり得、任意選択で、電磁放射線は赤外線 (IR)であり、好ましくは、電磁放射線は紫外線（UV）である。
【００４６】
活性化可能なプロモーターの分解性成分を含む、任意のそのような方法においては、分解性成分はリンカーを含み得る。分解性成分は光分解性成分であり得る。光分解性成分は2-ニトロベンジルを含み得る。光分解性成分は、2-ニトロベンジルを含む、リンカーを含み得る。
【００４７】
本発明はまた、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の製造方法であって、該方法が、本明細書において定義又は記載された、転写産物の発現方法のいずれかによって転写産物を発現することを含み、該転写産物をペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳することを更に含む、方法も提供する。
【００４８】
ポリペプチドを製造する、任意のそのような方法においては、反応容器は、本明細書において定義又は記載された、任意の好適な反応容器であり得、そのようなケースにおいては、水性媒体はin vitro転写及び翻訳システムを含み得る。
【００４９】
本発明はまた、リン脂質混合物であって、混合物が、非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質を含むリン脂質を含む、混合物を提供する。
任意のそのようなリン脂質混合物は、2.5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質である、混合物であり得る。
【００５０】
任意のそのような混合物においては、5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得るか、又は7.5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得、好ましくは、10〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。
【００５１】
任意のそのような混合物においては、PEG化リン脂質は1500〜5000 g／モル、任意選択で、1800〜2200 g／モルの分子量を有するPEG基を含み得る。
任意のそのような混合物においては、非PEG化リン脂質はグリセロリン脂質であり得及び／又はPEG化リン脂質はグリセロリン脂質であり得る。
非PEG化グリセロリン脂質を含む、任意のそのような混合物においては、非PEG化グリセロリン脂質は以下の式(I)：
【００５２】
【化３】
2019507598.tif 000004
【００５３】
（前記式中：
R1及びR2は、同じであるか又は異なり、C10-C25アルキル基及びC10-C25アルケニル基から選択され；
OR3がO-であるように、R3は存在しないか、又はR3は存在し、H、CH2CH2N(R4)3+、糖基若しくはアミノ酸基であり；並びに
各R4は、同じであるか又は異なり、H及び置換されていないC1-C4アルキルから独立して選択される。）
のグリセロリン脂質である。
【００５４】
PEG化グリセロリン脂質を含む、任意のそのような混合物においては、グリセロリン脂質は、以下の式(II)：
【００５５】
【化４】
2019507598.tif 000005
【００５６】
（前記式中：
R1及びR2は、式(I)のリン脂質について上記で定義された通りであり、R5は、ポリ（エチレングリコール）を含む基である。R5は、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、又は-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（qは5〜10,000の整数である）であり得る。）
のグリセロリン脂質である。
【００５７】
グリセロリン脂質である非PEG化リン脂質を含む、任意のそのような混合物においては、非PEG化グリセロリン脂質はDPhPCを含み得る。
グリセロリン脂質であるPEG化リン脂質を含む、任意のそのような混合物においては、PEG化グリセロリン脂質はDPPE-mPEG2000を含み得る。PEG化グリセロリン脂質は、2.5〜15モル％のDPPE-mPEG2000、好ましくは、5〜15モル％のDPPE-mPEG2000を含み得る。
グリセロリン脂質であるPEG化リン脂質及びグリセロリン脂質である非PEG化リン脂質を含む、任意のそのような混合物においては、非PEG化リン脂質はDPhPCを含み得、PEG化リン脂質はDPPE-mPEG2000を含み得る。そのようなケースにおいては、リン脂質は、例えば、5〜15モル％のDPPE-mPEG2000を含み得る。
【００５８】
本発明はまた、水性媒体を含み、水性物体の表面の少なくとも一部において、リン脂質（phosholipid）分子の混合物の外層を更に含む、水性物体であって、リン脂質（phosholipid）分子の混合物が、本明細書において定義又は記載された、任意の混合物である、水性物体を提供する。そのような水性物体は、本明細書において定義又は記載された、活性化可能なプロモーターを含まない（contain）、運ばない（carry）又は含まない（harbour）場合があり、例、本明細書において定義又は記載された、発現システム又はベクターを含まない（contain）、運ばない（carry）又は含まない（harbour）場合がある。
そのような水性物体においては、リン脂質（phosholipid）分子の外層は水性物体を封入し得る。そのような水性物体においては、物体は本明細書において定義又は記載された、任意の水性液滴であり得る。そのような水性物体においては、物体は本明細書において定義又は記載された、任意のヒドロゲル物体であり得る。
任意のそのような水性物体は、1以上の任意のそのような水性物体及び疎水性媒体を含む組成物中に含まれ得、1以上の水性物体は、疎水性媒体中に配置される。そのような組成物においては、疎水性媒体はオイルを含み得る。疎水性媒体はシリコーン油、炭化水素若しくはフルオロカーボン、又はそれらの2つ以上の混合物を含む、オイルを含み得る。
【００５９】
疎水性媒体は、炭化水素及びシリコーン油の混合物を含み得る。そのような組成物においては、炭化水素：シリコーン油の体積比は、例えば、50：50〜20：80又は50：50〜80：20の体積比、好ましくは、50：50〜40：60の体積比であり得る。
炭化水素を含む、任意のそのような組成物においては、炭化水素はC10-C20アルカン、好ましくは、ヘキサデカンであり得る。
任意のそのような組成物においては、1以上の水性物体は、集合体を形成する複数の水性物体を含み得る。任意のそのような組成物においては、集合体中における1以上の水性物体は、集合体中において少なくとも1つの他の水性物体と接触し得る。
【００６０】
水性物体の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を含むそのような組成物においては、接触面は、接触している水性物体の間に形成され得る。任意のそのような組成物においては、接触面は両親媒性分子の層、好ましくは、両親媒性分子の二重層を含み得る。代替的に、接触面は両親媒性分子の層を含まない場合がある。
【００６１】
任意のそのような組成物においては、複数のそのような水性物体は、水性物体のネットワークを形成するよう接続され得る。任意のそのような組成物においては、少なくとも2つのそのような水性物体は、両親媒性分子の二重層を含む接触面を介して接続され得、前記の少なくとも2つの水性物体の水性媒体は、二重層内において、孔を介して流体をやりとりする。孔は、α-ヘモリシン（αHL）で構成され得る。
【００６２】
本発明はまた、任意のそのような組成物を含む、電気化学回路も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1は、光活性化プロモーターの構築及び評価について示す。(A)ビオチン化された光分解性のリンカーによって、DNAに結合した、複数の一価のストレプトアビジンが存在するために、T7 RNAポリメラーゼはLA-T7プロモーターに結合することからブロックされる。リンカーのUV光分解に続いて、T7 RNAポリメラーゼは、下流の遺伝子を転写することができる。(B) LA-T7プロモーター配列。ライトグレー色のT (チミン)は、アミノ-C6-dT修飾及びPCビオチン基に結合した、核酸塩基の第一級アミンによって置換される。(C) mVenusをコードする、光活性化したDNAは、UV照射によってのみ発現される。アミンのみのDNAコンストラクトからの発現と比較して、LA-DNA (+UV)からの発現との間には、有意差はない。1時間で、蛍光強度が最も低い方から最も高い方への線のラベルは以下の通り：DNAなし；LA-DNA (-UV)；LA-DNA (+UV)；及びアミノDNA (+UV)。
【図２】図2は、アミノ-T7プライマーからのLA-DNAの合成を示す。7つのC6-アミノ-dT修飾を含むオリゴを、NHS-エステルPCビオチンと反応させ、HPLCによって精製した。オリゴPCビオチンコンジュゲートを、PCRプライマーとして使用し、目的の遺伝子を発現させるためのDNAテンプレートを作製した。HPLCのシグナルは、260 nmの吸収である。
【図３】図3は、一価のストレプトアビジンの結合、及びLA-DNAの光分解を示す。アミンのみのDNA及びLA-DNAの両方を、一価のストレプトアビジンと共にインキュベートした。ゲルシフトにおいてみられるように、一価のストレプトアビジンはLA-DNAにのみ結合した。UV照射によって、LA-DNAは、DNAからのPC／ビオチン／ストレプトアビジンの光分解によって、アミンのみのDNAと同じ見かけの質量に減少した。
【図４】図4は、LA-DNAからのT7 RNA転写を示す。アミンのみのDNA及びLA-DNAを、一価のストレプトアビジンと共にプレインキュベートした。各DNAをT7 RNA転写用のテンプレートとして使用した。UV光無しでは、RNAはLA-DNAから生成されなかった。UV光有りでは、LA-DNA及びアミンのみのDNAで、類似した量のRNAが観察された。
【図５−１】図5は、合成細胞及び合成組織におけるLA-mVenusの光活性化発現を示す。(A) 光活性化によってmVenusタンパク質を発現する合成細胞の模式図。そこでは、一ヶ所の二重層によって、合成細胞は、隣接する合成細胞に接続されている。(B) LA-mVenus DNAを含む合成細胞は、光活性化によって、mVenusタンパクを発現する(白色／ライトグレー)。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。上部の線は＋UVであり、X軸の隣の下部の線は−UVである。
【図５−２】図5は、合成細胞及び合成組織におけるLA-mVenusの光活性化発現を示す。(D) 数百の合成細胞を含む、3Dプリントされた合成組織の模式図。Aに示されるように、一ヶ所の脂質二重層が、各細胞を、その隣の細胞と接続している。(E) 光活性化によって、mVenusタンパク質を発現するLA-mVenus DNAを含む合成組織(白色／ライトグレー)。(F) Eの蛍光強度ラインプロファイル。上部の線は＋UVであり、X軸の隣の下部の線は−UVである。
【図６】図6は、合成細胞におけるLA-mCherryタンパク質の光活性化された発現を示す。(A) 光活性化によって、mCherryタンパク質を発現する合成細胞(白色／ライトグレー)の模式図。−UV細胞は、mCherryを発現しない。(B) 光活性化によって、LA-mCherry DNAを含む合成細胞はmCherryを発現した。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。上部の線は＋UVであり、X軸の隣の下部の線は−UVである。
【図７−１】図7は、合成細胞における、mVenus DNA（アミンのみ）及びLA-mVenus DNAからの発現を示す。(A) mVenus DNA（アミンのみ）を含む合成細胞の模式図。(B) 光活性化有り又は無しで、タンパク質を発現する、アミンのみのDNAを含む合成細胞。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。＋UV線は、400 μmを超える所で右側である。
【図７−２】図7は、合成細胞における、mVenus DNA（アミンのみ）及びLA-mVenus DNAからの発現を示す。(D) LA-mVenus DNAを含む合成細胞の模式図。(E) LA-mVenus DNAを含む合成細胞は、光活性化によって、mVenusを発現した(白色／ライトグレー)。(F) Eの蛍光強度ラインプロファイル。上部の線は＋UVであり、X軸の隣の下部の線は−UVである。
【図８】図8は、DIBを形成する一対の合成細胞における、LA-αHL-GFP DNAからの光活性化発現を示す。(A) 合成細胞対の模式図。一方の細胞は、LA-αHL-GFP DNAを含み、もう一方の細胞はDNAを含まない。αHL-GFP融合タンパク質孔タンパク質は、発現した場合に、二重層に局在する。(B) DNAを含まない別の細胞に隣接する合成細胞においてLA-αHL-GFP DNAが活性化される場合、αHL-GFP融合膜孔タンパク質は、二重層に局在する。光活性化なしでは、発現は観察されない。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。上部の線は＋UVであり、下部の線は−UVである。(D) Bにおいて発現されたαHL-GFP DNAのzスタック（z-stack）の回転させた3D投影は、αHL-GFPが二重層の接触平面全体に位置するようになることを示す。
【図９】図9は、合成細胞間の小分子フルオロフォアの光活性化移動を示す。(A) 合成細胞対の模式図。一方の細胞は、LA-αHL DNAを含み、もう一方の細胞は、小分子フルオロフォアTAMRAを含んでいた。αHLが発現して、膜を透過性にした場合のみ、TAMRAは二重層を横切って拡散した。(B) 二重層を横切ってのTAMRAの拡散は、光活性化後にのみ観察される。−UVについては、左の合成細胞がTAMRA陽性で、右の合成細胞がTAMRA陰性である。＋UVについては、TAMRAは、左の合成細胞から右の合成細胞に拡散しており、そのため両方がTAMRA陽性である。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。−UV線は、約400 μmまではより高い蛍光強度を有し、次いでX軸近くになる。＋UV線は、約400 μmまではより低い蛍光強度を有し、次いで該より高い線が、Y軸で約50超に位置する。
【図１０】図10は、合成細胞間の光活性化電気的シグナルを示す。(A) 合成細胞対の模式図。一方の細胞はLA-αHL DNAを含み、もう一方はDNAを含まない。両方の液滴は、電位を印加してイオン電流を測定するために、それらの内部に電極が挿入されている。下は、実験設定の画像である。(B) 光活性化に続くαHLの発現の後にのみ、電流が検出される。(C) Bにおいて使用した電圧プロトコール。
【図１１】図11は、合成組織における、LA-mCherry DNAからの光活性化発現を示す。(A) 光活性化後にmCherryを発現する合成細胞の模式図。(B) LA-mCherry DNAを含む3Dプリントされた合成組織は、光活性化によって、mCherryを発現する(白色／ライトグレー)。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。上部の線は＋UVであり、X軸の隣の下部の線は−UVである。
【図１２】図12は、合成組織における、mVenus DNA（アミンのみ）からの発現を示す。(A) 光活性化有り又は無しで、mVenusタンパク質を発現する合成細胞の模式図。(B) mVenus DNA（アミンのみ）を含む合成組織は、光活性化有り又は無しで、mVenusを発現する(白色／ライトグレー)。(C) Bの蛍光強度ラインプロファイル。＋UVの線は、約200 μm未満では、より高い蛍光強度を有し、約800 μm超では、より高い蛍光強度を有する線である。
【図１３】図13は、合成細胞間で二重層のサイズを変更することによって、合成組織内での合成細胞のパッキングを調整することを示す。DPPE-mPEG2000脂質の割合又はシリコーン油の割合を増加させることによって、二重層のサイズが増加し、それにより、合成組織中の液滴が互いにより近くに引き寄せられる。密なパッキングが観察され、プリント中の毛細管からの溶液の漏れがより少なかったので、左下のパネルに示される条件 (10%PEG、40：60のヘキサデカン：シリコーン油)を全ての更なる実験のために選択した。
【図１４】図14は、LA-αHL DNAによって媒介された、3Dプリントされた合成組織中における電気的な情報伝達の記録を示す。(A) LA-αHL DNAを含む、3Dプリントされた合成組織の模式図であり、光活性化によってαHL膜孔を発現する。(B) 3Dプリントされたネットワークからの電気的記録は、合成組織を流れる電流が、光活性化によってのみ検出されることを示す。二重層へのαHLの挿入を検出するために使用した電圧プロトコールも示す。
【図１５】図15は、3Dプリントされた合成組織中におけるLA-mVenus DNAからのmVenusの光活性化によりパターン化した発現を示す。(A) LA-mVenus DNAを含む液滴(ダークグレー)、及びDNAを含まない液滴(ライトグレー)を用いて、プリントされた組織を示す模式図。(B) 光活性化後、mVenusを含有する液滴は可視化される（黄色蛍光は白色／ライトグレーで示される）。
【図１６−１】図16は、3Dプリントされた合成組織中における、LA-αHL DNAからの発現によって形成されるL字型経路からの電気的記録を示す。(A)DNAを含まない液滴(黒枠内の透明な領域)とともにプリントされた、LA-αHL DNAを含む液滴(グレー)を含む、プリントされた組織の模式図。数字は、電極が導電性経路を検出するために置かれた直方体の側面を表す。電気的記録は、電極が1と2とに位置する場合に、下の電圧プロトコールに基づいて電流を検出する（B）が、電極が経路の側面1と、3（C）、4（D）若しくは5（E）とに位置する場合、又は両方の電極が経路から離れた、3と5（F）とに位置する場合には、電流を検出しない。
【図１６−２】図16は、3Dプリントされた合成組織中における、LA-αHL DNAからの発現によって形成されるL字型経路からの電気的記録を示す。(A)DNAを含まない液滴(黒枠内の透明な領域)とともにプリントされた、LA-αHL DNAを含む液滴(グレー)を含む、プリントされた組織の模式図。数字は、電極が導電性経路を検出するために置かれた直方体の側面を表す。電気的記録は、電極が1と2とに位置する場合に、下の電圧プロトコールに基づいて電流を検出する（B）が、電極が経路の側面1と、3（C）、4（D）若しくは5（E）とに位置する場合、又は両方の電極が経路から離れた、3と5（F）とに位置する場合には、電流を検出しない。
【図１６−３】図16は、3Dプリントされた合成組織中における、LA-αHL DNAからの発現によって形成されるL字型経路からの電気的記録を示す。(A)DNAを含まない液滴(黒枠内の透明な領域)とともにプリントされた、LA-αHL DNAを含む液滴(グレー)を含む、プリントされた組織の模式図。数字は、電極が導電性経路を検出するために置かれた直方体の側面を表す。電気的記録は、電極が1と2とに位置する場合に、下の電圧プロトコールに基づいて電流を検出する（B）が、電極が経路の側面1と、3（C）、4（D）若しくは5（E）とに位置する場合、又は両方の電極が経路から離れた、3と5（F）とに位置する場合には、電流を検出しない。
【図１７】図17は、合成組織の限局された顕微鏡照射を示す。視野絞りを備えた蛍光顕微鏡（方法を参照）を使用して、全液滴がmVenusタンパク質を含む、合成組織内の広い面積 (照射視野設定3)、狭い面積 (照射視野設定2)及び単一の液滴 (照射視野設定1)を照射した。
【図１８】図18は、光パターン化経路内における、光活性化mVenusタンパク質発現を示す。(A)は、全ての液滴がLA-mVenus DNAを含む、プリントされた組織を示す模式図であるが、顕微鏡を用いて照射された液滴のみがタンパク質を発現する (ダークグレー)一方、その残りは発現しない (ライトグレー)。(B)mVenusは、顕微鏡によって照射された、光活性化液滴 (黄色蛍光は白色／ライトグレーで示される)中においてのみ発現する。
【図１９−１】図19は、LA-αHL DNAの3Dプリントされた合成組織の光によるパターニングで形成された、L字型の2D経路からの電気的記録を示す。(A)全ての液滴がLA-αHL DNAを含む、プリントされた組織の模式図であるが、顕微鏡を用いて照射されたもののみがタンパク質を発現する (グレー)一方、その残りは発現しない (黒枠内の透明な領域)。数字は、導電路を検出するために電極が置かれた、直方体の側面を示す。電気的記録は、電極が1と2とに位置する場合（B）、並びに1と4とに位置する場合（D）に、下の電圧プロトコールに基づいて、電流を検出する。電極が、経路の側面1と、3（C）若しくは5（E）とにある場合、又は両方の電極が経路から離れた、3と5とに位置する場合（F）、電気的なシグナルは観察されない。
【図１９−２】図19は、LA-αHL DNAの3Dプリントされた合成組織の光によるパターニングで形成された、L字型の2D経路からの電気的記録を示す。(A)全ての液滴がLA-αHL DNAを含む、プリントされた組織の模式図であるが、顕微鏡を用いて照射されたもののみがタンパク質を発現する (グレー)一方、その残りは発現しない (黒枠内の透明な領域)。数字は、導電路を検出するために電極が置かれた、直方体の側面を示す。電気的記録は、電極が1と2とに位置する場合 (B)、並びに1と4とに位置する場合 (D)に、下の電圧プロトコールに基づいて、電流を検出する。電極が、経路の側面1と、3 (C)若しくは5 (E)とにある場合、又は両方の電極が経路から離れた、3と5とに位置する場合 (F)、電気的なシグナルは観察されない。
【図１９−３】図19は、LA-αHL DNAの3Dプリントされた合成組織の光によるパターニングで形成された、L字型の2D経路からの電気的記録を示す。(A)全ての液滴がLA-αHL DNAを含む、プリントされた組織の模式図であるが、顕微鏡を用いて照射されたもののみがタンパク質を発現する (グレー)一方、その残りは発現しない (黒枠内の透明な領域)。数字は、導電路を検出するために電極が置かれた、直方体の側面を示す。電気的記録は、電極が1と2とに位置する場合 (B)、並びに1と4とに位置する場合 (D)に、下の電圧プロトコールに基づいて、電流を検出する。電極が、経路の側面1と、3 (C)若しくは5 (E)とにある場合、又は両方の電極が経路から離れた、3と5とに位置する場合 (F)、電気的なシグナルは観察されない。
【図２０】図20は、LA-Venusの3Dプリントされた経路実験、及びLA-αHLでパターン化した3Dチャネル実験についてのマップを示す。(A)チャネル (マップA)：10液滴の長さ及び3液滴の幅（白線で囲まれている）。(B)チャネルの外側 (マップB)：5×5液滴の小さい四角に沿った、3液滴の幅及び13液滴の長さ（それらの両方が白線で囲まれている）。チャネル構造体がプリントされた、両方の構造体の間に5液滴のギャップが残っている。(C)ネットワークの上部 (マップC)：11×11液滴の四角（白線で囲まれている）。外側の周囲のギャップは、これらの液滴が、構造体の上部にのみ載ることを確実にするためのものである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
発明の詳細な説明
開示された産物及び方法の異なる適用が、当該技術分野における特定のニーズにあわせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、限定されることを意図していないことも理解されるべきである。
【００６５】
更に、本明細書中及びそれに付属する特許請求の範囲で使用される場合、その内容が明確に別段の指示がない限り、単数の形態「a」「an」及び「the」は複数の指示対象を含む。従って、例えば、「a phospholipid」についての言及は、そのようなリン脂質の2つ以上の例若しくはバージョンを含むか、又は「a moeity」についての言及は、2つ以上のそのような成分を含むか、又は「a nucleotide」についての言及は、2つ以上のそのようなヌクレオチド等を含む。
【００６６】
本明細書で定義された任意の数値パラメーターは、大まかな数値で表現され得、前記数値は、文脈上明確に別段の指示がない限り、前記数値の10%プラス又はマイナスであり得る。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記であるか又は下記であるかに関わらず、参照することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００６７】
本発明は、活性化可能なプロモーターに関する。本発明の活性化可能なプロモーターはまた、文脈上明確に別段の指示がない限り、本明細書においてプロモーターとして言及される。プロモーターは、プロモーターの1以上の構成要素に結合した、1以上の転写阻害成分を含む。1以上の転写阻害成分は、プロモーターからの転写を阻害する。それゆえ、1以上の転写阻害成分がプロモーターから引き離される場合、プロモーターからの転写が開始され得る。必要とする転写機構が存在する場合、引き離し後直ぐに、転写の開始が起こり得る。代替的に、転写機構の1以上の構成要素が存在しない場合に、1以上の転写阻害成分が引き離される場合、更なる転写の構成要素が提供された時より後に、転写が開始され得る。例えば、プロモーターは、1以上の誘導性の要素を含み得、従って、誘導性のプロモーターであり得、1以上の転写阻害成分が引き離される場合に、プロモーターが誘導されない場合がある。
【００６８】
プロモーターは、任意の型のプロモーターであり得る。プロモーターは、単離又は精製された形態で提供され得る。プロモーターは、ポリヌクレオチド配列、典型的にはDNAを含み、転写を開始及び制御する。プロモーターは、転写が、例えば、被検物質、補因子、調節タンパク質によって誘導される誘導性プロモーター、転写が、例えば、被検物質、補因子、調節タンパク質によって抑制される抑制性プロモーター、又は構成的プロモーターであり得る。
【００６９】
本明細書で定義された場合、本発明の「活性化可能なプロモーター」、又は本発明の単なる「プロモーター」は、転写を促進するヌクレオチドプロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド配列のストレッチ（stretch）を指す。そのようなヌクレオチドプロモーター配列は、例えば、転写に必要である1以上のタンパク質の1以上の結合部位を含み得る。従って、本発明の活性化可能なプロモーターは、転写を促進するヌクレオチドプロモーター配列に加えて、ポリヌクレオチド配列を含み得る。代替的に、本発明の活性化可能なプロモーターは、転写を促進するヌクレオチドプロモーター配列からなり得る。結果として、転写阻害成分は、転写に必要である1以上のタンパク質の1以上の結合部位を含む、ヌクレオチドプロモーター配列の構成要素に直接、結合し得る。代替的に、転写阻害成分は、転写に必要であるタンパク質の結合部位の外側である、ヌクレオチド配列の構成要素に結合し得るが、それにもかかわらず、そのような結合は、例、転写に必要である1以上のタンパク質の結合を構造的に妨げることによって、転写を阻害する。本発明の活性化可能なプロモーターは、プロモーターの機能的な部分であり得る。
【００７０】
本発明のプロモーターは、原核生物又は真核生物又は他の生物に由来するプロモーター配列を含み得るか、又はそれからなり得る。例えば、プロモーターは、細菌、古細菌、真菌、例、酵母、ウイルス、例、バクテリオファージ、動物、例、哺乳動物、若しくは植物に由来する若しくは導出されるか、又は関連するシステムに由来する、プロモーター配列を含み得るか、又はそれからなり得る。本発明のプロモーターは、T7、trc、lac、ara又はλLプロモーターを含み得るか、又はそれからなり得る。T7プロモーター配列、例、T7プロモーターが好ましい。プロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス (CMV)即時早期、単純ヘルペスウイルス (HSV) チミジンキナーゼ、早期及び後期SV40、レトロウイルス由来の長い末端反復 (LTR)、又はマウスメタロチオネイン-I由来のプロモーター配列を含み得るか、又はそれからなり得る。プロモーターは、pol I、pol II又はpol II プロモーター配列を含み得るか、又はそれからなり得る。好適なpol IIIプロモーター配列の例としては、U6及びH1プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。好適なpol IIプロモーター配列の例としては、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス (RSV) LTRプロモーター、サイトメガロウイルス (CMV)プロモーター [例、Boshartら、Cell、41:521-530 (1985)を参照]、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ (PGK)プロモーター及びEF1αプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７１】
例えば核酸等のポリヌクレオチドは、2つ以上のヌクレオチドを含むポリマーである。ヌクレオチドは、天然で生じ得るか、又は人工であり得るか、又はそれらの類似体であり得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、及び、例えば、リン酸、2’O-メチル、2’メトキシエチル、ホスホロアミダート、メチルホスホネート又はホスホロチオエート基等の少なくとも1つの結合基を含む。核典型的には、酸塩基は複素環式である。核酸塩基としては、プリン及びピリミジン、並びにより具体的にはアデニン (A)、グアニン (G) 、チミン (T)、ウラシル(U)及びシトシン (C)が挙げられるが、それらに限定されない。核酸塩基としては、他の天然及び非天然の塩基も挙げられるが、それらに限定されない。用語「ヌクレオチド塩基」及び「核酸塩基」は、本明細書において交換可能に使用される。糖は、典型的には、ペントース糖である。ヌクレオチドの糖としては、リボース及びデオキシリボースが挙げられるが、それらに限定されない。典型的には、ヌクレオチドはリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。典型的には、ヌクレオチドは一リン酸、二リン酸又は三リン酸を含み、ヌクレオチドリン酸として、本明細書において言及される場合がある。リン酸は、ヌクレオチドの5’又は3’側に結合され得る。
【００７２】
ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸 (AMP)、アデノシン二リン酸 (ADP) 、アデノシン三リン酸 (ATP)、グアノシン一リン酸 (GMP)、グアノシン二リン酸 (GDP)、グアノシン三リン酸 (GTP)、チミジン一リン酸 (TMP)、チミジン二リン酸 (TDP)、チミジン三リン酸 (TTP)、ウリジン一リン酸 (UMP)、ウリジン二リン酸 (UDP)、ウリジン三リン酸 (UTP)、シチジン一リン酸 (CMP)、シチジン二リン酸 (CDP)、シチジン三リン酸 (CTP)、5-メチルシチジン一リン酸、5-メチルシチジン二リン酸、5-メチルシチジン三リン酸、5-ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、5-ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、5-ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸 (cAMP)、環状グアノシン一リン酸 (cGMP)、デオキシアデノシン一リン酸 (dAMP)、デオキシアデノシン二リン酸 (dADP)、デオキシアデノシン三リン酸 (dATP)、デオキシグアノシン一リン酸 (dGMP)、デオキシグアノシン二リン酸 (dGDP)、デオキシグアノシン三リン酸 (dGTP)、デオキシチミジン一リン酸 (dTMP)、デオキシチミジン二リン酸 (dTDP)、デオキシチミジン三リン酸 (dTTP)、デオキシウリジン一リン酸 (dUMP)、デオキシウリジン二リン酸 (dUDP)、デオキシウリジン三リン酸 (dUTP)、デオキシシチジン一リン酸 (dCMP)、デオキシシチジン二リン酸 (dCDP)及びデオキシシチジン三リン酸 (dCTP)、5-メチル-2’-デオキシシチジン一リン酸、5-メチル-2’-デオキシシチジン二リン酸、5-メチル-2’-デオキシシチジン三リン酸、5-ヒドロキシメチル-2’-デオキシシチジン一リン酸、5-ヒドロキシメチル-2’-デオキシシチジン二リン酸及び5-ヒドロキシメチル-2’-デオキシシチジン三リン酸が挙げられるが、それらに限定されない。ヌクレオチドは、AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP又はdCMPから選択され得る。
【００７３】
ヌクレオチドは、更なる修飾を含んでも良い。ヌクレオチド塩基類似体を形成するよう、核酸塩基が修飾され得る。修飾は、化学的若しくは生化学的であっても良く、又はヌクレオチド若しくは核酸塩基を誘導体化しても良い。特に、修飾ヌクレオチドとしては、2’アミノピリミジン (例えば、2’-アミノシチジン及び2’-アミノウリジン等)、2’-ヒドロキシルプリン (例えば、2’-フルオロピリミジン (例えば、2’-フルオロシチジン及び2’フルオロウリジン等)等、ヒドロキシル ピリミジン (例えば、5’-α-P-ボラノウリジン等)、2’-O-メチルヌクレオチド (例えば、2’-O-メチルアデノシン、2’-O-メチルグアノシン、2’-O-メチルシチジン及び2’-O-メチルウリジン等)、4’-チオピリミジン (例えば、4’-チオウリジン及び4’-チオシチジン等)が挙げられるが、それらに限定されない。修飾ヌクレオチドとしてはまた、5-ペンチニル-2’-デオキシウリジン、5-(3-アミノプロピル)-ウリジン及び1,6-ジアミノヘキシル-N-5-カルバモイルメチルウリジンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７４】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で互いに結合され得る。ヌクレオチドは、リン酸結合、2’O-メチル結合、2’メトキシ-エチル結合、ホスホロアミダート結合、メチルホスホネート結合又はホスホロチオエート結合によって結合され得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸中におけるように、糖及びリン酸基によって結合する。ヌクレオチドは、ピリミジンダイマーのように、核酸塩基を介して連結され得る。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、例えば、デオキシリボ核酸 (DNA)又はリボ核酸 (RNA)等の核酸を含み得る。ポリヌクレオチドは、当該分野において公知である任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸 (PNA)、グリセロール核酸 (GNA)、トレオース核酸 (TNA)、ロック核酸 (LNA)、モルフォリノ核酸、又はヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマー等を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖又は多重鎖を含み得る。ポリヌクレオチドは、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ゲノムDNA、DNA-RNAハイブリッド、メッセンジャーRNA (mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマーを含み得る。ポリヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームを含み得る。
【００７６】
Sambrookら (1989、Molecular Cloning - a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)において例として記載されているように、当該分野において周知である方法に従って、ポリヌクレオチドを合成し得る。
【００７７】
本発明のプロモーターは、プロモーターの1以上の構成要素に結合した1以上の転写阻害成分を含む。プロモーターの1以上の構成要素は、本明細書に記載されたプロモーターのいずれかの特性であり得る。例えば、1以上の構成要素は、例えば本明細書に記載されたヌクレオチド、核酸塩基、リン酸又は糖等であり得る。好ましくは、プロモーターの1以上の構成要素は、ヌクレオチドの塩基である。好ましくは、複数の転写阻害成分に結合する複数のプロモーター構成要素がある。
【００７８】
転写阻害成分に結合したプロモーターの1超の、即ち、複数の構成要素があっても良い。例えば、2〜500、2〜250、2〜150、2〜50、又は2〜10であっても良い。2、3、4、5、6、7、8、9又は10であっても良い。転写阻害成分に結合するプロモーターの1の構成要素があっても良い。
【００７９】
1以上の転写阻害成分は、プロモーターからの転写を阻害することができる。それらは、転写を低減し得るか、又は転写を完全に抑制し得る。プロモーターの1以上の構成要素に結合する場合、転写阻害成分は、例えば、転写機構の1以上の構成要素が結合すること、及び／又はその機能を発揮することを抑制することによって、転写を阻害する。結合は、プロモーターに直接的若しくは間接的であっても良く、又はプロモーターの上流若しくは下流の領域に直接的若しくは間接的であっても良い。転写阻害成分は、転写機構の1以上の構成要素を構造的に阻害することによって、転写を阻害しても良い。例えば、転写阻害成分は、プロモーター、又はプロモーター上流若しくは下流の領域へのタンパク質の結合を抑制しても良い。代替的に又は追加的に、例えば、転写阻害成分は、タンパク質-タンパク質相互作用を抑制しても良い。
【００８０】
プロモーター中に、1超の、即ち、複数の転写阻害部分があっても良い。例えば、2〜500、2〜250、2〜150、2〜50、又は2〜10であっても良い。2、3、4、5、6、7、8、9又は10であっても良い。プロモーター中に、1の転写阻害部分があっても良い。
【００８１】
複数の転写阻害成分がある場合、転写阻害成分に結合したプロモーターの複数の構成要素もあっても良い。同数の、転写阻害成分及び転写阻害成分に結合したプロモーターの構成要素があっても良い。
【００８２】
任意の好適な分子、又は分子の複合体が、転写阻害成分として作用しても良い。好適には、転写阻害成分は、当業者に公知である標準的な技術を使用して、プロモーターの構成要素に容易に結合される。好適には、転写阻害成分は、転写を阻害するために、転写機構の1以上の構成要素と干渉することができる十分に大きいものでなければならない。典型的には、成分は、タンパク質、又はタンパク質及び小分子の複合体を含み得る。しかしながら成分は、例えば、転写を阻害するため、分子（又は前記組合せの1つ）が標準的な技術を使用してプロモーターの構成要素に結合し得るという条件で、また分子又は分子の組合せが転写機構の1以上の構成要素と干渉し得るという条件で、任意の好適な分子又は分子の組合せを含み得る。好ましくは、転写阻害成分はビオチン：ストレプトアビジン複合体を含む。ストレプトアビジンは一価であり得る。好ましくは、ビオチンは、プロモーターの1以上の構成要素に結合する。転写阻害成分は、アップコンバーティングナノ粒子（upconverting nanoparticle）(UCNP)を含み得る。転写阻害成分は、DIG抗体との複合体中に、ジゴキシゲニン (DIG)を含み得る。転写阻害成分は、DIG抗体との複合体中に、ビオチン：ストレプトアビジン複合体及びジゴキシゲニン(DIG)の両方を含み得る。
【００８３】
1以上の転写阻害成分に「結合した」1以上の転写阻害成分とは、1以上の転写阻害成分が、ある様式で、1以上の転写阻害成分に結合されていることを意味する。この結合は、共有結合又は非共有結合によるものであっても良い。結合の結果、プロモーターが阻害される。逆に、1以上の転写阻害成分が、1以上の転写阻害成分から「引き離」される場合、このことは、転写の阻害が低減するか又は解除されるよう、1以上の転写阻害成分が、1以上の転写阻害成分から十分引き離されることを意味する。
【００８４】
1以上の転写阻害成分がプロモーターから引き離される場合に、「活性化するよう構成」されたプロモーターは、1以上の転写阻害成分が一旦、引き離されると、阻害された状態と比較して、プロモーターからの転写が促進され得、開始され得、又は増大し得ることを意味する。従って、転写は、130倍超、例えば、200倍まで増大し得る。転写は、例えば、2〜200倍、10〜180倍、50〜150倍、又は100〜150倍増大し得る。
【００８５】
引き離しは、例えば光分解等の分解の結果であり得る。従って、好ましくは、転写阻害成分は、1以上の分解性成分を介して、プロモーターの1以上の構成要素に結合し得る。好ましくは、1以上の分解性成分は、光分解可能であり得る。活性化可能なプロモーター中において、1超の、即ち、複数の分解性成分があっても良い。例えば、2〜500、2〜250、2〜150、2〜50、又は2〜10であっても良い。2、3、4、5、6、7、8、9又は10であっても良い。プロモーター中に、1の分解性成分が存在しても良い。複数の転写阻害成分がある場合、複数の分解性成分もまた存在しても良い。同数の、転写阻害成分及び分解性成分が存在しても良い。同数の、転写阻害成分に結合したプロモーターの構成要素、転写阻害成分及び分解性成分が存在し得る。
【００８６】
分解性成分の分解によって、プロモーターの阻害が解除又は低減され、それゆえ、プロモーターからの転写が開始又は増大し得る。例えば、光等の電磁放射線、例、赤外線、紫外線等を光分解性成分と接触させるか、又は光分解性成分に照射するか若しくは供給するかによって、光分解が起こる。従って、用語「光活性化DNAプロモーター」（LA-DNAプロモーター）は、任意の光分解性成分を含む本発明のプロモーターを指す。
【００８７】
本明細書において定義又は記載された活性化可能なプロモーターのいずれかは、任意の好適な光分解性成分を含み得る。例えば、光分解性成分は、ニトロアリール基を含み得る。光分解性成分は、ニトロベンジル基、好ましくは、2-ニトロベンジルを含み得る。光分解性成分は、例えばStanton-Humphreysら、2012；“Wavelength-orthogonal photolysis of neurotransmitters in vitro”；Chem. Commun.；48；657-659に記載されたもの等の4-メトキシフェナシル基、4,5-ジメトキシ-2-ニトロベンジル基又は3,5-ジメトキシ-ベンゾイン基を含み得る。
【００８８】
光分解性成分は、C4’-ジアルキル-アミン-置換ヘプタメチンシアニン(Gorkaら、2014；“A Near-IR Uncaging Strategy Based on Cyanine Photochemistry”；Journal of the American Chemical Society；136；14153-14159に記載された通り)、例えば、以下(Gorkaら、2014から改変)を含み得る：
【００８９】
【化５】
2019507598.tif 000006
【００９０】
Rはn-プロピル (-CH2CH2CH3)又は-(CH2)4SO3-である。転写阻害成分を、C4’-ジアルキル-アミン-置換ヘプタメチンシアニン成分上の任意の好適な基に結合し得る。
【００９１】
光照射によって、直接的又は間接的に分解が生じ得る。例えば、光分解性成分がニトロベンジル基を含み、UV光を用いて処理される場合、UV光はニトロベンジル基に対して作用し得、結果として光分解性成分の分解を生じる。代替的に、光照射は、光分解性成分の一部であるか又はそうでない場合もある構成要素に、UV〜可視光波長の範囲で光を放出させる場合がある。好適な構成要素は、アップコンバーティングナノ粒子（upconverting nanoparticle）(UCNP)である。UV〜可視光波長の範囲における光は、次いで、光分解性成分、例えば、ニトロベンジル基の分解を引き起こし得る。UCNPは赤外線光を取り込み、2-ニトロベンゼンを光分解する。
【００９２】
電磁放射線の波長は、光分解される成分、及び成分が電磁放射線を施した後に直接的又は間接的に光分解されるか否かによって決定される。電磁放射線は、UV〜可視光波長の範囲、好ましくは、UV光であり得る。波長は、10〜400 nm、100〜400 nm、200〜400 nm、300〜400 nm又は350〜380 nmであり得る。好ましくは、波長は365 nmである。光はまた、近赤外線ウィンドウであり得る。波長は、650〜900 nm、650〜800 nm、650〜750 nm又は680〜720 nmであり得る。
【００９３】
本明細書において定義又は記載された活性化可能なプロモーターのいずれかにおいては、分解性成分はリンカーを更に含み得る。リンカーは、1以上の転写阻害成分及び1以上の分解性成分を、プロモーターの1以上の構成要素に結合し得る。典型的には、1以上の転写阻害成分が分解性成分に結合され、分解性成分はリンカーを更に含み、リンカーはプロモーターの1以上の構成要素に、直接的又は間接的にのいずれかで連結され得る。直接の連結は、例えば、本明細書で記載されるように、ヌクレオチドのプリン塩基又はピリミジン塩基の環に、リンカーを結合することにより得る。
【００９４】
リンカーはジアミンリンカーであり得る。ジアミンリンカーは、式-N(H)(CH2)nN(H)-（式中、nは正の整数、例えば、1〜20又は1〜12、好ましくは、1〜8である）のリンカーから選択される、アルキルジアミンリンカーであり得る。好ましくは、ジアミンリンカーは1,6-ジアミノヘキサン(-N(H)(CH2)6N(H)-)である。例えば、チミンに結合する場合、リンカー及びチミンは、C6-アミノ-dT又はC6-アミノ-Tを形成する。リンカーはアルキレン基-(CH2)n-（式中、nは正の整数、例えば、1〜20又は1〜12、好ましくは、1〜8である）であり得る。リンカーは-C(H)=C(H)C(O)N(H)(CH2)nN(H)-（式中、nは正の整数、例えば、1〜20又は1〜12、好ましくは、1〜8である）であり得る。
【００９５】
リンカーは、例えば、ビオチンNHSエステル等のN-ヒドロキシスルホスクシンイミド(NHS)エステルを使用して形成し得る。リンカーは、イソシアネート、マレイミド（malimide）、二亜硫酸（disulfite）、ヒドラジン又はヒドラジンを使用して形成し得る。
【００９６】
プロモーター中には、1超の、即ち、複数のリンカーが存在し得る。例えば、2〜500、2〜250、2〜150、2〜50、又は2〜10であっても良い。2、3、4、5、6、7、8、9又は10であっても良い。プロモーター中には、1のリンカーが存在し得る。典型的には、転写阻害成分及び分解性成分と同数のリンカーが存在する。従って、同数の、転写阻害成分、分解性成分及びリンカーが存在し得る。同数の、転写阻害成分に結合したプロモーター構成要素、転写阻害成分、分解性成分及びリンカーが存在し得る。
【００９７】
活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素に結合した1以上の転写阻害成分は、式COMP-L-PC-Xを有し得る（式中、COMPは、1以上の転写阻害成分に結合した活性化可能なプロモーターの1以上の構成要素であり、Lはリンカーであり、PCは1以上の分解性成分（好ましくは、光分解性成分）であり、Xは1以上の転写阻害成分である）。
【００９８】
典型的には、リンカーは、塩基中の環の位置の一つに結合される。塩基がプリン塩基である場合、典型的には、リンカーはプリン環上の8位に結合される。塩基がピリミジン塩基である場合、典型的には、リンカーはピリミジン環上の5位に結合される。
【００９９】
本発明はまた、本発明のプロモーターを含む発現システムも提供する。発現システムは、転写可能なオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、遺伝子又は遺伝子フラグメント (例、エキソン又はcDNA)に作動可能に連結され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は翻訳されないRNA、例えば、非コードRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、マイクロRNA、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA、shRNA、scaRNAs若しく長鎖ncRNAをコードし得る。ポリヌクレオチドは、例えば、複数のペプチド、タンパク質、非コードRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、マイクロRNA、siRNA、snRNA、exRNA、piRNA、shRNA、scaRNAs及び／又は長鎖ncRNAの複数をコードし得る。
【０１００】
オープンリーディングフレーム若しくは遺伝子、又は遺伝子フラグメント (例、cDNA)は、例えば膜タンパク質等のタンパク質をコードし得；任意選択で、膜タンパク質はポンプ、チャネル、孔、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、又は細胞認識若しくは細胞間相互作用に影響するタンパク質を含む。好ましくは、膜タンパク質は、α-ヘモリシン (αHL)孔タンパク質である。
【０１０１】
「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が、通常の機能を発揮するよう構成された、要素の配置を指す。従って、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された、例えばプロモーター等の所定の調節要素は、適切な酵素が存在する場合、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現に向かわせるよう機能する限り、配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写されたが翻訳されない介在配列は、プロモーター配列と核酸配列との間に存在し得、それでも、プロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結され」ているとみなし得る。
【０１０２】
発現システムは、プロモーターからの発現を制御する転写調節エレメントを更に含み得る。調節エレメントとしては、追加的なプロモーター、エンハンサー、開始部位、内部リボソーム進入部位 (IRES)、及び例えばポリアデニル化シグナル及びポリ-U配列等の転写終結シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel、GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990)に記載されている。エンハンサーの例としては、WPRE、CMVエンハンサー、RSVエンハンサー、HTLV-IのLTR中のR-U5'セグメント(Mol. Cell. Biol.、Vol. 8(1)、p. 466-472、1988)、SV40エンハンサー、ウサギβ-グロビンのエキソン2と3の間のイントロン配列 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、Vol. 78(3)、p. 1527-31、1981)が挙げられる。調節エレメントは、例、例えば宿主細胞等の任意の反応容器 (本明細書で記載された)において本発明のプロモーターからの転写産物の発現を管理し得るか、又は例えばある宿主細胞等の、ある反応容器において発現を管理し得る(例、組織特異的な調節配列)。
【０１０３】
転写機構には、プロモーターからの転写を可能にする及び／又は促進する構成要素が含まれる。転写構成要素は当業者に周知である。本明細書に記載されたプロモーター、発現システム及び／又はベクターは、転写構成要素と共に使用するために、作動可能に構成され得る。転写構成要素と共に「使用するために作動可能に構成された」発現システムによって、発現システムは、例えば、本明細書に記載されたもの等の当業者に周知である転写構成要素を使用して、発現し得る。
【０１０４】
転写構成要素は、真核又は原核転写構成要素であり得る。例えば、転写構成要素は、細菌、古細菌、真菌、例、酵母、ウイルス、例、バクテリオファージ、動物、例、哺乳動物、若しくは植物に由来する若しくはそれらから導出されたか、又は関連するシステム由来であっても良い。転写構成要素としては、例えば、開始前複合体、ポリメラーゼ (例えばRNAポリメラーゼ等、例、細菌のRNAポリメラーゼ (RNAP)、又はRNAポリメラーゼI、II若しくはIII)、TATA-結合タンパク質 (TBP)、転写因子IIA (TFIIA)、転写因子IIB (TFIIB)、転写因子IID (TFIID)、転写因子IIE (TFIIE)、転写因子IIF (TFIIF)及び転写因子IIH (TFIIH)が挙げられる。
転写試薬は、本明細書に記載された、転写構成要素又は転写調節エレメントのいずれかを含む。
【０１０５】
本発明のベクターは、本発明の発現システムを含む。典型的には、ベクターは、直鎖状の二本鎖DNA分子又は繋がった（例、環状の）二本鎖DNA分子である。ベクターは、例えば、複製起点、任意選択で、1以上の調節エレメントを有するプラスミド、ウイルス若しくはファージベクターであっても良い。ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス又は単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。ベクターは、pXTl、pSG5 (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG及びpSVLSV40 (Pharmacia)であり得る。他の好適なベクターは、当業者に明白である。これに関するさらなる例として、Sambrookらが参照される。ベクターは、1以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含み得る。
【０１０６】
ベクターは、in vitro、例えば、DNA若しくはRNAの生成のために使用され得るか、又は宿主細胞、例えば、哺乳動物若しくは細菌の宿主細胞をトランスフェクト若しくは形質転換するために使用され得る。ベクターは、ペプチド若しくはタンパク質、又は例えばsiRNA又はmiRNA等の非コードRNAのin vitro発現を可能にするよう使用され得る。ベクターはまた、例えば、ペプチド若しくはタンパク質、又は例えばsiRNA又はmiRNA等の非コードRNAのin vivo発現を可能にするために、in vivoでの使用に適合され得る。形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用されるベクターと適合するよう選択される。宿主細胞は、例えば大腸菌（E. coli）等の細菌であり得る。λ DE3溶原、例えば、C41 (DE3)、BL21 (DE3)、JM109 (DE3)、B834 (DE3)、TUNER、Origami及びOrigami Bを有する任意の細胞は、T7プロモーターを含むベクターを発現し得る。宿主細胞は、例えばSf9細胞等の昆虫細胞であり得る。宿主細胞は、CHO、HEK293、HeLa、3T3、HaCaT又はA549細胞であり得る。
【０１０７】
ベクター (例、クローニングベクター)は、適合する宿主細胞中において、発現システムを複製するために使用し得る。従って、発現システムは、発現システムを複製可能なベクターに導入すること、ベクターを適合する宿主細胞に導入すること、及びベクターの複製がもたらされる条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製し得る。ベクターは、宿主細胞から回収され得る。クローニングのために好適な宿主細胞は、当該分野において公知である。
【０１０８】
ベクターは、任意の好適な発現ベクターであり得る。次いで、発現ベクターは、好適な宿主細胞に導入され得る。従って、発現システムは、好適な宿主細胞中で発現され得る。宿主細胞は、高レベルで発現システムを発現し得る。発現のために好適な宿主細胞は、当該分野において公知である。
【０１０９】
発現システム又はベクターは、シグナルペプチド配列を更に含み得る。シグナルペプチドが発現され、やはりプロモーターと作動可能に連結したコード配列によって、コードされるペプチド又はタンパク質の膜（例えば脂質二重層等）へのターゲティング、又はそれらの分泌を促進するよう、シグナルペプチド配列は、一般的に、プロモーターと作動可能に連結して挿入される。
【０１１０】
プロモーター及び／又は他の調節エレメントは、プロモーター、発現システム又はベクターが導入され発現される環境と適合するよう選択され得る。例えば、プロモーター、発現システム又はベクターは、in vitro、ex vivo又はin vivo、例えば、本明細書で記載される反応容器中、例えば、生物学的宿主細胞、合成細胞、試験管（text tube）、マイクロタイタープレート又はマルチウェルプレート等に導入され得、発現させられ得る。
【０１１１】
本発明はまた、本発明のベクターを含む送達システムも提供する。ベクターは、例えば、ウイルス若しくはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、結合、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)-媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム-媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接のマイクロインジェクション、又はナノ粒子媒介核酸送達 (例、Panyamら、Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii：S0169409X(l2)00283-9. doi：1O.1016/j.addr.2012.09.023を参照)によって、送達され得る。送達システムは、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、バイオリスティック（biolistic）システム、ヴィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質：核酸複合体又は人工ウイルス粒子を含み得る。送達システムはウイルス送達システムを含み得る。送達システムの選択は、一般的に送達されるベクター（例、形質転換される細胞の種類）及び送達が起こる環境 (例、in vitro、ex vivo、又はin vivo)に依存する。そのような方法についての一般的な検討は、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology（第3版）、Wiley & Sons、1995において見出し得る。
【０１１２】
本発明はまた、転写産物の発現方法も提供する。発現を、促進し得るか、増大し得るか、又は開始し得る。該方法は、例、本明細書で定義された水性物体を含む本発明の反応容器を提供すること、又は、例、本明細書で定義された水性物体を含む本発明の組成物を提供すること、及び容器若しくは組成物に脱結合剤を提供することを含む。脱結合剤は、プロモーターの1以上の構成要素から、1以上の転写阻害成分を引き離すことができ、転写産物は引き離し後に発現される。脱結合剤は、プロモーターの1以上の構成要素から1以上の転写阻害成分を引き離すことができる任意の剤であり得る。脱結合剤は、1以上の分解性成分を分解することができる剤であり得る。好ましくは、脱結合剤を提供することによって、結果として1以上の光分解性成分の光分解が起こり得る。例えば、剤は、直接的又は間接的に光分解性成分を光分解し得る。従って、剤は、例えば、本明細書に記載された種類及び波長等の電磁放射線であり得る。
【０１１３】
剤は、任意の好適な方法によって提供され得る。剤が提供される方法は、また提供される反応容器又は組成物にも部分的に依存する。例えば、反応容器が、例えば、in vitro、in vivo又はex vivoであるかどうかは、剤をどのように提供し得るかに影響する。当業者は、剤をどのように提供し得るかを容易に決定することができる。例えば、剤が電磁放射線である場合、電磁放射線は、例えば、光学顕微鏡（例、蛍光）、光ファイバー、LED駆動光送達システム（LED driven light delivery systems）、固定スポット照明装置、ガルボ駆動型スポット照明装置（galvo-driven spot illuminators）、柔軟なアレイベースのパターン照明装置、又はポリゴングリッドスキャニング（polygon grid scanning）等の任意の好適な方法又は装置によって提供され得る。
【０１１４】
本発明はまた、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の製造方法であって、該方法が、本発明の転写産物を発現させること、及び該転写産物をペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳することを含む、方法も提供する。
当業者は、コードするヌクレオチドの翻訳に必要な機構を容易に理解する。
【０１１５】
転写に必要な構成要素は当業者に周知である。典型的には、構成要素は、ポリメラーゼ酵素、好適なバッファー、例えばリボヌクレオチド三リン酸等の三リン酸分子、及び例えばマグネシウムイオン等の補因子を含む。必要とされる正確な構成要素及び条件は、環境に依存するが、当業者によって容易に突き止められ得る。
【０１１６】
典型的には、転写に必要な構成要素は、反応容器の水性媒体、或いは水性物体の水性媒体、又は反応容器若しくは水性物体を含む組成物、集合体若しくはネットワークの水性媒体内で提供される。
【０１１７】
転写に必要な構成要素は、「無細胞」システム、又はin vitro転写システムとして提供され得る。多くのそのようなシステムは当業者に周知である (総説については、例、Beckert、Bら、Synthesis of RNA by in vitro transcription.  Methods Mol. Biol. 2011; 703: pp29-41; doi: 10.1007/978-1-59745-248-9_3を参照)。例えば、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚抽出物、細菌若しくは昆虫の溶解物若しくは抽出物に基づくシステムが通常利用される。例、T7、T3又はSP6 RNAファージポリメラーゼに基づくシステムが利用可能である。そのようなシステムは、商業的供給者から広く入手可能である。そのような構成要素は、本発明の反応容器の水性媒体、又は本発明の水性物体の水性媒体、又は本発明の反応容器若しくは水性物体を含む組成物、集合体若しくはネットワークの水性媒体内で、直接的に提供され得る。
【０１１８】
同様に、関連する転写産物の翻訳が必要とされる状況においては、翻訳に必要な構成要素が更に供給され得る。in vitro翻訳のための無細胞システムは、広く利用可能であり、in vitro転写のための無細胞システムと組合せ得る。そのようなシステムは、in vitro転写及びin vitro翻訳の両方のための構成要素を含み得る。
【０１１９】
そのような無細胞システムは、カスタムメイドであっても良く、又は、例、New England Biolabs社のPURExpress（登録商標）システム(https://www.neb.com/products/e6800-purexpress-invitro-protein-synthesis-kit)、及びThermo Fisher Scientific社の1-Step Human IVT(https://www.thermofisher.com/uk/en/home/life-science/protein-biology/protein-expression/cell-free-protein-expression/mammalian-cell-free-protein-expression/overview-thermo-scientific-1-step-ivt-systems.html)が市販されている。
【０１２０】
反応容器が生物学的な細胞である場合、転写及び翻訳に必要な構成要素は、細胞内で発現されても、予め含まれても良く、例えば、構成要素は、細胞に内在的であっても良く、例えば、ポリメラーゼ酵素は細胞のゲノム内に取り込まれたDNAにコードされていても良い。
【０１２１】
マイクロ流体構造は、当業者に公知な任意のマイクロ流体構造である。マイクロ流体は、Whitesides G. M. (2006), "The origins and the future of microfluidics", Nature 442 (7101): 368-373；Seemann Ralf, Brinkmann Martin, Pfohl Thomas, Herminghaus Stephan (2012), "Droplet based microfluidics", Reports on Progress in Physics 75: 016601; Squires T. M., Quake S. R. (2005), "Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale", Reviews of Modern Physics 77: 977-1026；及びDahlら(2015) “Microfluidic Strategies for Understanding the Mechanics of Cells and Cell-Mimetic Systems”, Annu Rev Chem Biomol Eng. 2015;6:293-317において、更に検討されている。
【０１２２】
合成細胞は当業者に周知である。合成細胞は、最小細胞、人工細胞、細胞様システム、半合成細胞又は細胞模倣物であり得る。例えば、合成細胞は、脂質、例、リン脂質、単層又は二重層を含み得る。合成細胞は、Dahlら、(2015) “Microfluidic Strategies for Understanding the Mechanics of Cells and Cell-Mimetic Systems”、Annu Rev Chem Biomol Eng. 2015;6:293-317；Murtas (2009) “Artificial assembly of a minimal cell”, Mol Biosyst. 2009 Nov;5(11):1292-7; Stano (2011) “Minimal cells: relevance and interplay of physical and biochemical factors” Biotechnol J. 2011 Jul;6(7):850-9；及びArkin (2001) “Synthetic cell biology”; Curr Opin Biotechnol. 2001 Dec;12(6):638-44において更に検討されている、任意の合成細胞であり得る。
【０１２３】
試薬、例、本明細書で定義された本発明のプロモーター、発現システム及びベクターを含む溶液は、本明細書において容器（vessel）若しくは容器（vessels）、又は反応容器（vessel）若しくは反応容器（vessels）として言及される1以上の構造体内に含まれ得る。本明細書で言及される容器又は反応容器は、本発明のプロモーター、発現システム及びベクターを含む試薬を、受容するための任意の好適な容器であり得る。従って、容器又は反応容器は、例、試験管、マイクロタイタープレートのウェル、アレイの領域、基板の領域、マイクロ流体構造等の内部の細胞／区画等であっても良い。従って、容器は、本発明のプロモーターが、その内部又はその上で作動可能であり得る任意の構造体であっても良い。
【０１２４】
容器又は反応容器は、本明細書で更に定義された水性物体であり得る。本明細書で言及される水性物体は、ある体積の水性媒体を含む任意の好適な構造体であっても良い。典型的には、本明細書で記載された水性物体は、本明細書で定義され、記載された水性媒体を含む水性液滴である。典型的には、明細書で記載された水性物体はまた、本明細書で定義され、記載されたヒドロゲル物体であっても良い。
【０１２５】
本明細書で記載された水性物体、例えば、本明細書で定義され、記載された水性液滴又はヒドロゲル物体等は、代替的に、本明細書で定義された通り、本発明のプロモーター、発現システム及びベクターを含まない場合がある。
【０１２６】
水性物体内の水性媒体は、任意の好適な水性媒体であり得る。例えば、水性媒体は、純水、又は水性バッファー溶液、又は1以上の塩の水溶液であっても良い。代替的に、水性媒体はヒドロゲルを含み得る。水性媒体が、ヒドロゲルを含み得る場合、例えば、水性媒体はアガロース及び水を含み得る。特定のヒドロゲルが本明細書においてより詳細に記載されている。水中のアガロースの濃度は、10% w/vアガロース未満か又は同等であっても良い。例えば、前記水中のアガロースの濃度は、0.25〜5% w/vアガロースであっても良い。アガロース以外のヒドロゲルをまた使用しても良い。例えば、該水性媒体は、メチルセルロース、ポリエチレングリコール ジアクリレート、ポリアクリルアミド、マトリゲル、ヒアルロナン、ポリエチレンオキサイド、ポリAMPS (ポリ(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸))、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー又はポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を含み得る。代替的に、水性媒体はシリコーンヒドロゲル又はLB (Luriaブロス)寒天を含み得る。
【０１２７】
水性媒体は、上記の組合せを含み得る。例えば、水性媒体は、溶液及びヒドロゲルマトリクスを含み得る。溶液は、本明細書で定義された通りであり得る。そのような実施形態においては、溶液は、例、ヒドロゲルマトリクス内に配置され得る。例えば、溶液は、例、純水、又は水性バッファー溶液、又は1以上の塩の水溶液であっても良い。
【０１２８】
本明細書で定義された通り、例えば水性液滴又はヒドロゲル物体等の水性物体が、本発明の活性化可能なプロモーター、発現システム及び／又はベクターを含む、ある実施形態においては、水性媒体は、活性化可能なプロモーター、発現システム及び／又はベクターに機能的な影響を与えるために必要な追加的な試薬を含んでも良い。そのような追加的な試薬は、本明細書で検討されている。当業者は、本発明の活性化可能なプロモーター、発現システム及び／又はベクターが、従来の手段によって作動され得ることを理解する。従って、当業者は、必要とされる文脈において、活性化可能なプロモーター、発現システム及び／又はベクターに機能的な影響を与えるために必要な追加的な試薬の性質を容易に理解する。
【０１２９】
水性媒体の一つの重要な特性は、pHであり、これは広い範囲に亘って変動し得る。幾つかの実施形態においては、例えば、水性物体又は物体内の水性媒体のpHは、5〜9の範囲 (又は例えば、6〜8の範囲)であっても良いが、より高い及びより低いpHでも可能である。水性媒体は、それゆえ、水性バッファー溶液であっても良い。任意の好適なバッファーは、所望のpHに依存して使用し得る。バッファー溶液は、例えば、Tris HCl及びKClを含み得る。幾つかの実施形態においては、水性バッファー溶液のpHは、5〜9、又は、例えば、6〜8である。溶質の性質及び濃度は、溶液の特性を変化させるよう、変動させ得る。
【０１３０】
本明細書で定義された水性物体が、本発明の活性化可能なプロモーター、発現システム及び／又はベクターを含む状況においては、当業者は、必要とされる文脈において、活性化可能なプロモーター、発現システム及び／又はベクターに機能的な影響を与えるために必要なpHパラメーターを容易に理解する。
【０１３１】
通常、両親媒性分子は、本明細書において定義された通りである。
幾つかの実施形態においては、水性物体は、水性媒体の表面の周りに両親媒性分子の外層を含む。
【０１３２】
両親媒性分子は、任意の好適な両親媒性分子であり得る。通常、両親媒性分子は、十分に高い濃度で存在する場合、本明細書で定義された通り、前記接触面のいずれか一つで二重層を形成することができるものである。二重層を形成することできる両親媒性分子の種類は、例えば、接触している水性物体の追加的な構成要素に依存し得る。二重層を形成することできる両親媒性分子の種類は、例えば、水性物体の構造体がネットワークであるかどうか、ネットワークがヒドロゲルで構成されるかどうか、及び水性物体ネットワークの任意の追加的な構成要素の存在及び性質に依存し得る。例えば、水性物体が疎水性媒体中に配置される場合、両親媒性分子は、例えば、疎水性媒体内で接触している水性構造体の間に二重層を形成することができる任意の好適な両親媒性分子であり得る。疎水性媒体内で、二重層を形成することできる両親媒性分子の種類は、典型的には、水性構造体の疎水性媒体及び水性媒体の性質に依存するが、広い範囲の両親媒性分子が考えられる。同様に、ネットワークが疎水性媒体を更に含む場合、両親媒性分子は、例えば、疎水性媒体内で、二重層を形成することできる任意の好適な両親媒性分子であり得る。疎水性媒体内で、二重層を形成することできる両親媒性分子の種類は、典型的には、ヒドロゲル体の疎水性媒体及びヒドロゲルの性質に依存するが、広い範囲の両親媒性分子が考えられる。
【０１３３】
両親媒性分子は、疎水基及び親水基の両方を有する分子である。水性物体の表面の少なくとも一部において形成された両親媒性分子の外層は、通常、前記の水性物体の表面の少なくとも一部において、単層の両親媒性分子を含む。典型的には、親水基を水性媒体の方に内側に向け、例えば疎水基を疎水性媒体の方に外側に向けて、水性物体の表面上に分子が、整列するよう、疎水基及び親水基と、水性媒体との相互作用によって、単層が自然に形成され維持される。同様に、複数の水性物体を囲み得る両親媒性分子の層は、通常、疎水基及び親水基の相互作用によって自然に形成され維持される両親媒性分子の単層を含む。
両親媒性分子は、例えば、非ポリマー性の両親媒性分子であっても良い。代替的に、両親媒性分子は、ポリマー性の両親媒性分子であっても良い。
【０１３４】
水性物体中において使用され得る両親媒性分子の重要な種類は、脂質分子である。脂質分子は、リン脂質、脂肪酸、脂肪アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール脂質、プレノール脂質、サッカロ脂質及びポリケチドを含む主要な種類の脂質のいずれかであり得る。幾つかの重要な例としては、リン脂質及び脂肪酸、例えば、リン脂質が挙げられる。脂質分子は、天然で生じたか又は合成された物であっても良い。脂質分子からの二重層の形成が実証されているものの、該方法は任意の両親媒性分子に適切であることが期待される。
【０１３５】
両親媒性分子中に存在し得る、通常の種類の疎水基は、例えば、殆んどの脂質中のように炭化水素基である。しかしながら、使用され得る疎水基の別の好適な種類は、フルオロカーボン基である。従って、両親媒性分子の更に重要な種類は、少なくとも1つのフルオロカーボン基を含む両親媒性分子である。そのような分子の例は、疎水性フルオロカーボン尾部及び親水性頭部の基を含む、脂質様分子である。
【０１３６】
水性物体の両親媒性分子は、全てが同じ種類である必要はない。むしろ、両親媒性分子は、幾つかの実施形態においては、2つ以上の異なる種類の両親媒性分子の混合物であっても良い。別の例としては、二重層が形成される場合、異なる水性物体間に形成される二重層（複数可）は非対称形であり得るように、水性構造体の集合体における異なる水性物体の各外層中の両親媒性分子は異なる種類であっても良い。
【０１３７】
それゆえ、典型的には、両親媒性分子は脂質分子を含む。脂質分子は全てが同じ種類である必要はない。従って、両親媒性分子は、単一の種類の脂質又は2つ以上の異なる脂質分子の混合物を含み得る。同様に、水性物体が別の水性物体と接触している場合、個々の水性物体の外層の脂質組成物は、互いに同じか又は異なっても良い。両親媒性分子の脂質二重層、又はより一般的には二重層は、細胞膜のモデルであり、その（tan）水性物体ネットワーク又は集合体は、それゆえ、例えば、膜タンパク質の基礎的研究のための新規プラットフォームとして、又は「ボトムアップ」合成生物学の複数の区画のプロトセルシャーシ（chassis）としてを含む、様々な実験的研究用の優れたプラットフォームとして役立ち得るので、脂質分子は特に好都合である。
【０１３８】
特に、リン脂質は、上記で概説した理由のために好ましく、またそれらは全ての細胞膜の主要な構成要素であるので、リン脂質を含む水性物体が、合成生物学の用途並びにドラッグの送達に特に好適なものとなる。以下で記載されるリン脂質は、非PEG化リン脂質であっても良い。
【０１３９】
従って、水性物体の水性媒体の表面の少なくとも一部における外層を形成する両親媒性分子は、典型的には、リン脂質分子を含む。リン脂質分子は、同じか、又は異なっていても良く、即ち、両親媒性分子は、単一の種類のリン脂質又は2つ以上の異なるリン脂質の混合物を含む。リン脂質は当業者に周知であり、多くが、例えばAvanti Polar Lipids等の供給元から市販されている。リン脂質分子は、グリセロリン脂質若しくはスフィンゴリン脂質、又はその2つの混合物であっても良い。リン脂質分子は、アニオン性リン脂質、第一級アミンを含むリン脂質、コリン含有リン脂質及び／又はスフィンゴ糖脂質を含み得る。通常、両親媒性分子は1以上のグリセロリン脂質を含む。当業者が理解するように、グリセロリン脂質としては、以下の式(I)で定義される構造を有するグリセロリン脂質が挙げられるが、それらに限定されない：
【０１４０】
【化６】
2019507598.tif 000007
【０１４１】
（前記式中：
R1及びR2は、同じであるか又は異なり、C10-C25アルキル基及びC10-C25アルケニル基から選択され；
OR3がO-であるように、R3は存在しないか、又はR3は存在し、H、CH2CH2N(R4)3+、糖基又はアミノ酸基であり；並びに
各R4は、同じであるか又は異なり、H及び置換されていないC1-C4アルキルから独立して選択される。）
【０１４２】
典型的には、R3がCH2CH2N(R4)3+である場合、各R4は、同じであるか又は異なり、H及びメチルから選択される。当業者が理解するように、各々及び全てのR4がメチルである場合、R3基はコリン基であり、各々及び全てのR4がHである場合、R3基はエタノールアミン基である。
【０１４３】
R3がアミノ酸基である場合、例えば、セリン基、即ち、-CH2CH(NH2)(COOH)であっても良い。R3が糖基である場合、例えば、グリセロール、即ち、-CH2CHOHCH2OH、又は、例えば、イノシトール、即ち、-CH(CHOH)5であっても良い。
【０１４４】
R1及びR2基の典型的な例は、例えば、例、CH3(CH2)10-、CH3(CH2)12-、CH3(CH2)14-、CH3(CH2)16-、CH3(CH2)18-、CH3(CH2)22-等の直鎖状のC10-C25アルキル基、及び例えば、例、-CH2-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)2等の分枝状のC10-C25アルキル基が挙げられるが、それらに限定されない、C10-C25アルキル基である。
【０１４５】
R1及びR2基の更に典型的な例は、CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3CH=CH(CH2)3-及びCH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-を含むが、それらに限定されない、置換されていないC10-C25アルケニル基である。
【０１４６】
当業者が理解するように、OR3基に隣接するリン酸基中のO-基は、幾つかの実施形態においては、プロトン化されても良く、又は好適なカチオン、例、例えばNa+等の金属カチオンと結合させても良い。
従って、両親媒性分子は、上記で定義された式(I)の構造を有する、1以上のグリセロリン脂質を含み得る。
【０１４７】
例えば、両親媒性分子は、水性物体若しくはネットワーク若しくは集合体、又はそれらの1以上の混合物中において、両親媒性分子として使用され得る、以下のグリセロリン脂質：ジフィタノイルホスファチジルコリン、ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphacholine）(DPhPC)、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (DPPE)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-リン酸、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホセリン、卵-PC、硬化卵PC、硬化大豆PC、1-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ 3-ホスホコリン、1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン、1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1-ステアロイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン及び1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPhPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPPC)又は1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-[リン-rac-(1-グリセロール)] (DPPG)の任意の1以上を含み得る。グリセロリン脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (DOPE)もまた使用され得、pH感受性の脂質、例えば、脂肪酸との組合せで使用され得る。
【０１４８】
追加的に又は代替的に、両親媒性分子はステロイドを含み得、ステロイドはアルキル側鎖を含む。両親媒性分子は、例えば、コレステロール、β-シトステロール及びラノステロールを含み得る。
幾つかの実施形態においては、両親媒性分子はリン脂質の誘導体を含む。例えば、両親媒性分子は、例えばPOPC (1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)若しくはDPPC (1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)等のホスファチジルコリン、又は例えばPOPG (1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール)等のホスファチジルグリセロールを含み得る。
好ましくは、両親媒性分子はDPhPCを含む。
【０１４９】
両親媒性分子は、例えば、1以上の脂肪酸、例、オレイン酸を含み得る。脂肪酸は、当然、当業者に周知であり、これらの多くは市販されている。
両親媒性分子は、例えば、以下：(a)1以上のリン脂質、及び(b)1以上の脂肪酸を含む、混合物を含み得る。
【０１５０】
アルケニル基は、1個以上の二重結合を含む、直鎖状又は分枝状鎖の炭化水素基である。アルケニル基はC10-25アルケニル基であり得る。C10-25アルケニル基の例としては、1個以上の二重結合の挿入によって、C10-25アルキル基の類縁物が挙げられる。典型的には、アルケニル基は、1、2、3又は4個の二重結合を含む。幾つかのケースにおいては、アルケニル基は、直鎖状のアルケニル基であり得る。
【０１５１】
PEG基を含むリン脂質はまた、PEG化リン脂質として本明細書において言及される場合がある。PEG化リン脂質は、PEG基、例えば、R5基を含む基を用いて、非PEG化リン脂質の誘導体化によって、上記の非PEG化リン脂質から誘導されたリン脂質であり得る。
【０１５２】
両親媒性分子に加えて、水性物体、又は水性物体の集合体若しくは水性物体のネットワークがPEG化脂質を更に含み得る。水性物体又はネットワーク／集合体が、水性物体又はネットワーク／集合体の封入体の一部を形成する場合、PEG化脂質は特に有用であり得る。本明細書で用いられる場合、用語「PEG化脂質」は、ポリ（エチレングリコール）を用いて誘導体化されている脂質を指す。例えば、複数の水性物体を含む水性物体又はネットワーク／集合体が、両親媒性分子の層によって囲まれている場合、層はPEG化脂質を更に含み得る。
【０１５３】
水性物体又は水性物体ネットワーク若しくは集合体中における1以上のPEG化脂質の包含は、典型的には、in vivoでの安定化を提供し、特に水性物体又は水性物体ネットワーク若しくは集合体の血漿半減期を延長する。このことは、水性物体又は水性物体ネットワーク若しくは集合体が、1以上の治療薬又は診断薬を含む場合、例えば、薬剤送達ビヒクルとして使用される場合、1以上のPEG化脂質を包含することも、水性物体又は水性物体の集合体内の剤の血漿半減期を延長する有用な効果を有し得ることを意味する。そのような効果は、PEG化脂質をリポソーム製剤中で使用する場合に、既に観察されている。PEG化脂質は当該分野において公知であり、例えば、NOF株式会社（日本）等の供給者から市販されている（http://www.phospholipid.jp/phospholipid_2-3.htmlを参照）。PEG-リン脂質、ジアシルグリセロール-PEG、コレステロール-PEG誘導体及びそれらの混合物を含むが、それらに限定されない、任意の好適なPEG化脂質が使用され得る。
【０１５４】
一実施形態においては、本発明のヒドロゲルネットワークの、例えばヒドロゲル物体等の、複数の水性物体を囲む層はPEG化脂質を更に含む。外層は、両親媒性分子、例えば、複数コピーの同じPEG化脂質、又は2つ以上の異なる種類のPEG化脂質の混合物に加えて、1以上のPEG化脂質を含み得る。好適なPEG化脂質としては、PEG-リン脂質、ジアシルグリセロール-PEG、コレステロール-PEG誘導体及びそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１５５】
PEG化脂質のポリ（エチレングリコール）(PEG)成分は、幾つかの異なる配置のいずれか1つを有し得る。従って、それは実質的に直鎖状のPEG又は分枝状のPEGであり得る。分枝状のPEGは、例えば、セントラルコア（central core）基から延びる、3〜10のPEG鎖を有し得る。代替的に、分枝状のPEGは、セントラルコア基から延びる、10〜100のPEG鎖を有する、星型PEGであり得る。代替的に、PEGは、ポリマー骨格に結合した複数のPEG鎖を有する、櫛型PEGであり得る。
【０１５６】
使用される1以上のPEG化脂質は、例えば、以下の式(II)：
【０１５７】
【化７】
2019507598.tif 000008
【０１５８】
（前記式中、R1及びR2は、式(I)のグリセロリン脂質について上記で定義された通りであり、R5はポリ（エチレングリコール）を含む基である。）
のPEG-リン脂質を含み得る。
【０１５９】
好ましくは、R5は、式-Y-PEGの基であり、前記式中：
−  Yは、-alk-、-alk-N(RN)-、-C(O)-alk-、-alk-C(O)-、-alk-N(RN)-C(O)-、-C(O)-O-alk-、-alk-O-C(O)-から選択され；
−  -alk-は直鎖状のC1〜C6アルケニル、好ましくは、エテニルであり；
−  RNはH又はメチルであり；及び
−  PEGはポリ（エチレングリコール）基である。
好ましくは、Yは-CH2CH2-NH-C(O)-である。
【０１６０】
ポリ（エチレングリコール）を含む基は、例えば、式-CH2CH2NHC(O)-X、又は、例えば、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-Xを有し得る（式中、Xは前記ポリ（エチレングリコール）を含む）。基Xは、例えば、実質的に直鎖状のPEG、又は、例えば、セントラルコア基から延びる、例えば、3〜10のPEG鎖を有する分枝状のPEGを含み得る。代替的に、それはセントラルコア基から延びる、例えば、10〜100のPEG鎖を有する星型PEGであり得る。又は、例えば、それは、ポリマー骨格に結合した複数のPEG鎖を有する櫛型PEGであり得る。
【０１６１】
従って、R5は、例えば、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH又は-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（qは正の整数である）であり得る。整数qは、例えば、5〜10,000、又は、例えば、10〜1,000であり得る。典型的には、qは10〜1,000、好ましくは、30〜60である。
【０１６２】
代替的に、R5は、-(CH2CH2O)qCH3又は-(CH2CH2O)qH（qは正の整数である）であり得る。整数qは、例えば、5〜10,000、又は、例えば、10〜1,000、好ましくは、10〜1,000、より好ましくは、30〜60であり得る。
【０１６３】
PEG化リン脂質は、PEG基を含み得、PEG基は、式-(O-CH2CH2)q-O-R基（RはH又はメチルであり、qは正の整数である）を有し得る。整数qは、例えば、5〜10,000、又は、例えば、10〜1,000、好ましくは、10〜1,000、より好ましくは、30〜60であり得る。典型的には、PEG基はmPEG基である。mPEG基において、Rはメチルである。
【０１６４】
典型的には、PEG基の分子量についての言及は、PEG基を含むリン脂質の全体での数平均分子量についての言及である。例えば、リン脂質中におけるPEG基の数平均分子量は、1500〜5000 g／モル、好ましくは、1800〜2200 g／モル、例えば、約2000 g／モルである。
【０１６５】
典型的には、R1及びR2は、式R1COOH及びR2COOHの化合物が、カプリル酸(C8)、ペラルゴン酸 (C9)、カプリン酸 (C10)、ウンデシル酸 (C11)、ラウリン酸 (C12)、トリデシル酸 (C13)、ミリスチン酸 (C14)、ペンタデカン酸 (C15)、パルミチン酸 (C16)、マルガリン酸 (C17)、ステアリン酸 (C18)、ノナデシル酸 (C19)、アラキジン酸 (C20)、ヘンイコシル酸 (C21)、ベヘン酸 (C22)、トリコシル酸 (C23)、リグノセリン酸 (C24)、ペンタコシル酸 (C25)、α-リノレン酸 (C18:3)、ステアリドン酸 (C18:4)、エイコサペンタエン酸 (C20:5)、ドコサヘキサエン酸 (C22:6)、リノール酸 (C18:2)、γ-リノレン酸 (C18:3)、ジホモ-γ-リノレン酸 (C20:3)、アラキドン酸 (C20:4)、アドレン酸 (C22:4)、パルミトレイン酸 (C16:1)、バクセン酸 (C18:1)、パウリン酸 (C20:1)、オレイン酸 (C18:1)、エライジン酸 (Cトランス-18:1)、ゴンド酸（gondoic acid）(C20:1)、エルカ酸 (C22:1)、ネルボン酸 (C24:1)、ミード酸 (20:3)、フィタン酸 (3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカン酸)から選択される脂肪酸であるように、各々独立した基である。
【０１６６】
追加的に又は代替的に、1以上のPEG化脂質は式(III)のジアシルグリセロール-PEGを含み得る。
【０１６７】
【化８】
2019507598.tif 000009
【０１６８】
（前記式中、R1及びR2は、式(I)のグリセロリン脂質について上記で定義された通りであり、R6はポリ（エチレングリコール）を含む基である。）
【０１６９】
ポリ（エチレングリコール）は、例えば、実質的に直鎖状のPEG、又は、例えば、セントラルコア基から延びる、例えば、3〜10のPEG鎖を有する分枝状のPEGを含み得る。代替的に、それはセントラルコア基から延びる、例えば、10〜100のPEG鎖を有する、星型PEGであり得る。又は、例えば、それはポリマー骨格に結合した複数のPEG鎖を有する、櫛型PEGであり得る。
【０１７０】
R6は、例えば、-(CH2CH2O)qCH3、-(CH2CH2O)qH、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3又は-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（qは正の整数である）であり得る。整数qは、例えば、5〜10,000、又は、例えば、10〜1,000であり得る。
【０１７１】
追加的に又は代替的に、1以上のPEG化脂質は式(IV)のコレステロール-PEG誘導体を含み得る。
【０１７２】
【化９】
2019507598.tif 000010
【０１７３】
（前記式中、R7はポリ（エチレングリコール）を含む基である。）
【０１７４】
また、ポリ（エチレングリコール）は、実質的に直鎖状のPEG、又は、例えば、セントラルコア基から延びる、例えば、3〜10のPEG鎖を有する分枝状のPEGを含み得る。代替的に、それはセントラルコア基から延びる、例えば、10〜100のPEG鎖を有する、星型PEGであり得る。又は、例えば、それはポリマー骨格に結合した複数のPEG鎖を有する、櫛型PEGであり得る。
【０１７５】
R7は、例えば、-(OCH2CH2)qOH又は-(OCH2CH2)qOCH3（qは正の整数である）であり得る。整数qは、例えば、5〜10,000、又は、例えば、10〜1,000であり得る。
【０１７６】
ポリグリセリンは、ポリ（エチレングリコール）の代わりに使用し得る。
ある好ましい実施形態においては、本発明の両親媒性分子は、非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質の混合物を含み得る。非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質は、本明細書に記載された非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質のいずれかであり得る。
【０１７７】
そのような混合物は、非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質を含むリン脂質を含み得、2.5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質である。好ましくは、5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。より好ましくは、7.5〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。更により好ましくは、10〜15モル％のリン脂質がPEG化リン脂質であり得る。
【０１７８】
そのような混合物においては、PEG化リン脂質は、1500〜5000 g／モルの分子量、任意選択で、1800〜2200 g／モルの分子量を有するPEG基を含み得る。
そのような混合物においては、非PEG化リン脂質はグリセロリン脂質であっても良く、及び／又はPEG化リン脂質はグリセロリン脂質であっても良い。
【０１７９】
そのような混合物においては、非PEG化リン脂質は、以下の式(I)：
【０１８０】
【化１０】
2019507598.tif 000011
【０１８１】
（前記式中：
R1及びR2は、同じであるか又は異なり、C10-C25アルキル基及びC10-C25アルケニル基から選択され；
OR3がO-であるように、R3は存在しないか、又はR3は存在し、H、CH2CH2N(R4)3+、糖基若しくはアミノ酸基であり；並びに
各R4は、同じであるか又は異なり、H及び置換されていないC1-C4アルキルから独立して選択される。）
のリン脂質である。
【０１８２】
そのような混合物においては、PEG化リン脂質は、以下の式(II)：
【０１８３】
【化１１】
2019507598.tif 000012
【０１８４】
（前記式中：
R1及びR2は、式(I)のリン脂質について上記で定義された通りであり、R5はポリ（エチレングリコール）を含む基である。
R5は、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH又は-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH（qは5〜10,000の整数である）であり得る。）
のリン脂質であり得る。
【０１８５】
PEG化リン脂質は、PEG基を含み得、PEG基は、式-(O-CH2CH2)q-O-R基（RはH又はメチルであり、qは正の整数である）を有し得る。整数qは、例えば、5〜10,000、又は、例えば、10〜1,000、好ましくは、10〜1,000、より好ましくは、30〜60であり得る。
【０１８６】
任意のそのような混合物においては、非PEG化リン脂質はDPhPCを含み得る。
任意のそのような混合物においては、PEG化リン脂質はDPPE-mPEG2000を含み得る。
任意のそのような混合物においては、リン脂質はDPhPC及びDPPE-mPEG2000を含み得、リン脂質は2.5〜15モル％のDPPE-mPEG2000を含む。好ましくは、5〜15モル％のリン脂質がDPPE-mPEG2000であり得る。より好ましくは、7.5〜15モル％のリン脂質がDPPE-mPEG2000であり得る。更により好ましくは、10〜15モル％のリン脂質がDPPE-mPEG2000であり得、例えば、10又は15モル％のリン脂質がDPPE-mPEG2000であり得る。
【０１８７】
本明細書で定義された、水性媒体を含む水性物体は、水性物体の表面の少なくとも一部において、リン脂質（phosholipid）分子の混合物の外層を更に含み得、リン脂質（phosholipid）分子の混合物は、上記で定義された非PEG化リン脂質及びPEG化リン脂質の混合物である。リン脂質（phosholipid）分子の外層は、水性物体を封入し得る。水性物体又は反応容器は、本明細書で定義された任意の水性液滴、又は本明細書で定義された任意のヒドロゲル物体であり得る。
【０１８８】
任意のそのような水性物体（複数可）又は反応容器（複数可）は、疎水性媒体中に配置され得る。疎水性媒体は、オイルを含み得る。オイルはシリコーン油、炭化水素若しくはフルオロカーボン、又はそれらの2つ以上の混合物を含み得る。疎水性媒体は、炭化水素及びシリコーン油の混合物を含み得る。疎水性媒体は、80：20〜20：80、又は70：30〜30：70の体積比の炭化水素：シリコーン油を含む、炭化水素及びシリコーン油の混合物を含み得る。好ましくは、炭化水素：シリコーン油の比は、60：40〜40：60の体積比、例えば、50：50〜40：60の体積比である。好ましくは、体積比は、50：50、40：60又は45：55である。炭化水素は、C10-C20アルカン、好ましくは、ヘキサデカンであり得る。
【０１８９】
両親媒性分子の濃度は、任意の好適な濃度であり得る。
典型的には、両親媒性分子の濃度は、15 mg mL-1未満か又は同等である。例えば、両親媒性分子の濃度は、0〜10 mg mL-1より大きくても良い。通常、両親媒性分子の濃度は、0.25 mg mL-1〜10 mg mL-1、例えば、0.25 mg mL-1〜5 mg mL-1である。より典型的には、両親媒性分子の濃度は、0.25 mg mL-1〜2.5 mg mL-1、例えば、0.25 mg mL-1〜1.5 mg mL-1である。
【０１９０】
幾つかの実施形態においては、両親媒性分子の濃度は約1 mg mL-1である。
本発明者等は、水性物体間の接触面が両親媒性分子の二重層を含むか否かを調節するために、両親媒性分子の濃度を変化させ得ることを更に見出している。高い濃度では、接触面が両親媒性分子の二重層を含むことが保証される。それゆえ、両親媒性分子の濃度を増加させることは、両親媒性分子の二重層を含む、接触面の数を増加させるため、及び両親媒性分子の二重層を含まない接触面の数を減少させるために使用し得る。両親媒性分子の濃度の低下させることは、両親媒性分子の二重層を含む、接触面の数を低下させるために使用し得る。例えば、両親媒性分子の濃度を低下させることは、2つの水性物体、例、ヒドロゲル体が直接接触する、接触面の数を増加させるために使用し得る。
【０１９１】
当業者が理解するように、接触面での二重層の形成のために必要な両親媒性分子の濃度は、水性物体、例、ヒドロゲル体のサイズ及び形状に依存し得る。
更に、両親媒性分子の濃度を変化させることは、接触面が両親媒性分子の二重層を含むか否かを調節するための唯一の方法ではない。例えば、ネットワーク中の2つの水性物体、例、ヒドロゲル物体間の両親媒性分子の二重層は、2つの物体間から二重層を「絞り出す」ため、及び／又は物体間に二重層が形成されることを抑制するために、2つの物体を接触させることによって除去し得る。従って、両親媒性分子の濃度は、二重層が形成されるかどうかを決定づける唯一の要因でない場合がある。
【０１９２】
典型的には、両親媒性分子の濃度は15 mg mL-1未満か又は同等である。例えば、両親媒性分子の濃度は、0〜10 mg mL-1であり得る。
幾つかの実施形態においては、両親媒性分子の濃度は、通常、0.5 mg mL-1と同等であるか又はそれ超である。例えば、両親媒性分子の濃度は、5 mg mL-1と同等であるか又はそれより大きくても良い。通常、両親媒性分子の濃度は、0.5 mg mL-1〜15 mg mL-1、例えば、5 mg mL-1〜15 mg mL-1である。二重層が接触面で形成されるようにするために、両親媒性分子の濃度は、通常、1 mg mL-1と同等であるか又はそれより大きく、例えば、5 mg mL-1と同等であるか又はそれ超である必要がある。
【０１９３】
他の実施形態においては、両親媒性分子の濃度は0.5〜10 mg mL-1である。通常、両親媒性分子の濃度は5〜10 mg mL-1である。本発明者等は、これらの濃度範囲が、両親媒性分子の二重層を含む少なくとも1つの接触面と、両親媒性分子の二重層を含まない少なくとも1つの他の接触面とを含む、水性物体ネットワーク、特にヒドロゲルネットワークを安定化するために好ましいことを見出している。同様に、これらの濃度範囲は、両親媒性分子の二重層を含む少なくとも1つの接触面、及び1つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体が、別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接直接する少なくとも1つの他の接触面を含む、水性物体ネットワーク、特にヒドロゲルネットワークに好都合なことが見出されている。それゆえ、このケースにおいては、両親媒性分子の濃度は、5〜10 mg mL-1であり得る。
【０１９４】
更なる実施形態においては、両親媒性分子の濃度は、5 mg mL-1未満か又は同等であり、例えば、2 mg mL-1未満か又は同等である。これらの濃度範囲は、しばしば、接触面が二重層を含まないネットワークを好む。
上記段落において言及された両親媒性分子の濃度は、典型的には、疎水性媒体中、即ち、複数の水性の、例、ヒドロゲルの物体が配置された疎水性媒体中の両親媒性分子の濃度である。
【０１９５】
親水性材料が両親媒性分子を含む媒体中に配置される場合、両親媒性分子の親水性成分は、親水性材料に引き付けられる。従って、両親媒性分子の層は、親水性材料の表面の少なくとも一部に形成される。典型的には、媒体は疎水性媒体である。媒体中の両親媒性分子の濃度が十分高い場合、通常、層は親水性材料の表面全体を覆う単層である。単層を形成するために必要な両親媒性分子の濃度は、例えば、親水性材料の表面領域及び同じ媒体中に他の親水性材料があるか否か等の要因に依存する。両親媒性分子の単層が形成されるかどうかに影響する他の要因があっても良い。例えば、親水性材料が、特に複雑な形状を有する場合にのみ、親水性材料の表面の一部に層が形成されることが可能である場合がある。
【０１９６】
本発明においては、例えば液滴及びヒドロゲル物体等の個々の水性物体は疎水性材料を含む。以下で検討する通り、水性物体及びそれらのネットワークは、通常、疎水性媒体中に配置され、典型的には、この疎水性媒体は両親媒性分子を含む。もしそうである場合、バルクの疎水性の相中における両親媒性分子は、水性物体の、例、ヒドロゲル物体の表面の少なくとも一部において両親媒性分子の外層を形成する。水性物体がヒドロゲル物体を含む場合、ヒドロゲル物体の本体の表面全体又は表面の少なくとも一部は、両親媒性分子の外層を含み得る。他の実施形態においては、ヒドロゲル物体の本体は、両親媒性分子の外層を含まない場合がある。典型的には、水性物体が水性液滴を含む場合、水性液滴の表面全体が両親媒性分子の外層を含み得る。
【０１９７】
典型的には、水性物体、又は水性物体ネットワーク若しくは集合体は、疎水性媒体中に配置され、両親媒性分子の濃度は、疎水性媒体中の両親媒性分子の濃度である。
追加的に又は代替的に、水性物体、又は水性物体ネットワーク若しくは集合体が形成される場合、水性物体、又はネットワーク若しくは集合体の水性媒体は、両親媒性分子を含み得る。それゆえ、両親媒性分子の濃度は、水性媒体中の両親媒性分子の濃度であり得る。
【０１９８】
疎水性媒体は、広範囲の材料から選択され得る。疎水性媒体は、単一の疎水性化合物を含み得る。代替的に、それは2つ以上の異なる疎水性化合物の混合物を含み得る。疎水性媒体は、例えば、ネットワーク又は集合体を調製する場合に、最初に水性物体を疎水性媒体に、又はネットワーク若しくは集合体中の各水性物体の少なくとも一部の周りに導入した後、水性物体又は（or or）水性物体ネットワーク若しくは集合体の浮力、及び水性物体の少なくとも一部の周りの両親媒性分子の層の形成速度に影響するよう選択され得る。
【０１９９】
典型的には、疎水性媒体はオイルである。オイルは、単一で純粋な化合物であっても良く、又はオイルは2つ以上の化合物の混合物を含んでも良い。通常、オイルは、形成されたいずれの二重層も有意に不安定化しないことが望ましい。
【０２００】
オイルは、例えば、シリコーン油 (例えば、ポリフェニルメチルシロキサン)を含み得る。オイルは、単一のシリコーン油、例えば、ポリフェニルメチルシロキサンからなり得る。代替的に、オイルは、2つ以上の異なるシリコーン油の混合物を含み得る。
【０２０１】
任意の好適なシリコーン油を使用し得る。例えば、オイルはシリコーン油DC200 (-O-Si(CH3)2-のモノマー単位を含むポリマー)、ポリ(ジメチルシロキサン) (PDMS)、ヒドロキシ終端、又はPDMS 200を含み得る。
追加的に又は代替的に、オイルは炭化水素を含み得る。オイルが炭化水素を含む場合、それは単一の炭化水素化合物又は2つ以上の炭化水素の混合物を含み得る。
【０２０２】
幾つかの実施形態においては、オイルは、以下：(a) 1以上の炭化水素、及び(b) 1以上のシリコーン油を含む混合物である。炭化水素は、例えば、任意の好適な液体炭化水素であり得る。特定の炭化水素が液体であるかは、疎水性媒体の温度に依存する。従って、用語、液体炭化水素は、疎水性媒体の温度で、液体である炭化水素を指す。典型的には、疎水性媒体は室温である。しかしながら、幾つかの実施形態においては、疎水性媒体は、室温より高いか又は低い場合がある。
【０２０３】
幾つかの実施形態においては、オイルは固体を含み得る。固体の炭化水素は、例えば、シリコーン油との組合せで使用し得る。オイルは、例えば、溶解し液体を形成する固体の混合物であり得る。
【０２０４】
オイルが炭化水素を含む場合、炭化水素は、分枝状又は非分枝状、（より低分子量の炭化水素は蒸発の調節が必要となるが）例えば、5〜40の炭素原子、又は5〜30の炭素原子を有する炭化水素であり得る。好ましくは、炭化水素は、本発明で使用される水性物体、ネットワーク又は集合体の操作温度で液体である。好適な例としては、例えばヘキサデカン、デカン、ペンタン又はスクアレン等のアルカン又はアルケンが挙げられる。通常、オイルは炭化水素を含む。
【０２０５】
典型的には、炭化水素は、置換されていないC10-C20アルカン、例えば、ヘキサデカンである。
例えば、浮力の影響がより重要でない集合体中においては、より短いアルカンが好適であり得、水性物体、ネットワーク又は集合体の表面の少なくとも一部において、それらの両親媒性分子の外層がより速く形成され得る。
【０２０６】
幾つかの実施形態においては、炭化水素は、例えば置換されていないC15-C40アルカン等のより長鎖の炭化水素である。例えばスクアレン等の、例えば、置換されていないC16-C30アルカン鎖である。
一実施形態においては、疎水性媒体は、置換されていないC10-C20アルカンを含み、両親媒性分子は1以上のグリセロリン脂質を含む。例えば、疎水性媒体は、ヘキサデカンを含み得、両親媒性分子の外層はDPhPCを含み得る。
【０２０７】
他の種類のオイルが見込まれる。例えば、オイルはフルオロカーボンであり得る。これは、例えば、水性物体、ネットワーク若しくは集合体からの特定の膜タンパク質若しくは被検物質の喪失を最小化するため、又は例えば酸素等のガス含有量を調節するための幾つかのシステムの研究にとって有用であり得る。フルオロカーボンは、疎水性及び疎油性の両方であり得るため、フルオロカーボンを含むオイル相は表面に対する水性物体、ネットワーク又は集合体の接着を有効に防ぎ得る。
【０２０８】
別の実施形態においては、炭化水素はブロモ置換されたC10-C30アルカンであるか、又は、例えば、ブロモ置換されたC10-C20アルカン、例、ブロモドデカンである。ブロモドデカンは、水性物体、ネットワーク又は集合体の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を形成するために長時間のインキュベーションを必要とすることが見出されたが、このオイルは、水性物体、ネットワーク又は集合体の表面の少なくとも一部において、その両親媒性分子の外層がより速く生じ得る、他の水性物体、ネットワーク又は集合体にとってより好適なはずである。
【０２０９】
典型的には、オイルはシリコーン油又は炭化水素を含む。任意の好適なシリコーン油が使用され得る。通常、シリコーン油は、本明細書において定義された通りである。
シリコーン油は、水の密度に近い密度であることから有利であり、例えば液滴等の水性物体が水中においてほぼ中立的な浮揚性であることを保証する。シリコーン油は、例えば、約1 g.cm-3の密度を有する、ポリフェニルメチルシロキサンであり得る。
【０２１０】
炭化水素は、典型的には、5〜30の炭素原子 (C5-C30炭化水素)、より典型的には、10〜30の炭素原子 (C10-C30炭化水素)を有する。典型的には、それはアルカン又はアルケンである。従って、炭化水素はC5-C30アルカン又はC10-C20アルカンであり得る。別の実施形態においては、炭化水素はC5-C20アルケン又はC10-C20アルケンであり得る。典型的には、炭化水素は置換されていない。一実施形態においては、それはスクアレンである。好ましい実施形態においては、炭化水素は置換されていないC5-C20アルカン、好ましくは、置換されていないC10-C20アルカンである。炭化水素は、例えば、スクアレン、ヘキサデカン又はデカンであり得る。しかしながら、幾つかの実施形態においては、炭化水素は、ハロゲン原子、例えば、臭素で置換され得る。
【０２１１】
幾つかの実施形態においては、疎水性媒体はシリコーン油及び炭化水素の混合物を含む。そのような混合物は、例えば液滴等の安定な物体が形成されるために、短いインキュベーション時間を有利に提供することが見出されている。混合物中のシリコーン油及び炭化水素は、上記で更に定義されるものであり得る。典型的には、炭化水素は、置換されていないC10-C20アルカン、好ましくは、ヘキサデカンである。シリコーン油及び炭化水素の混合物は、典型的には、例えば液滴等の水性物体が水性媒体中において、ほぼ中立的な浮力を有することを保証するよう、水の密度に近い密度を有し；それは例えば、ポリフェニルメチルシロキサンであり得る。通常、炭化水素に対するシリコーン油の体積比は、0.5：1と同等であるか又はそれ超である。炭化水素に対するシリコーン油の体積比は、例えば、0.5：1〜5：1、例えば、約1：1であり得る。幾つかの実施形態においては、炭化水素に対するシリコーン油の体積比は5：1と同等であるか又はそれ超である。
【０２１２】
使用される疎水性媒体は、例えば液滴等の水性物体が水中においてほぼ中立的な浮揚性であるように、水の密度に近い密度、例えば、約1 g.cm-3の密度を有し得る。
一実施形態においては、疎水性媒体はシリコーン油及びヘキサデカンの両方を含む。典型的には、シリコーン油はポリフェニルメチルシロキサンである。ヘキサデカンに対するシリコーン油の体積比は、典型的には、0.5：1と同等であるか又はそれより大きく、例えば、0.5：1〜5：1である。それは、例えば、約1：1である。幾つかの実施形態においては、炭化水素に対するシリコーン油の体積比は、5：1と同等であるか又はそれ超である。
【０２１３】
好ましくは、疎水性媒体はヘキサデカンを含む。幾つかの実施形態においては、疎水性媒体はシリコーン油を更に含む。
典型的には、疎水性媒体はヘキサデカンを含み、両親媒性分子はDPhPCを含む。より典型的には、疎水性媒体はヘキサデカンを含み、両親媒性分子はDPhPCを含み、水性媒体は水性バッファー溶液を含む。
【０２１４】
通常、疎水性媒体はヘキサデカンを含み、両親媒性分子はDPhPCを含み、水性媒体は水性バッファー溶液及び（含まれている場合はニッケルを含む）磁性材料を含む。
幾つかのヒドロゲルの実施形態においては、疎水性媒体はヘキサデカンを含み、両親媒性分子はDPhPCを含み、ヒドロゲル体中のヒドロゲルはアガロースを含む。典型的には、ヒドロゲルはアガロース及び水を含む。水中のアガロースの濃度は、典型的には、10% w/vアガロース未満か又はそれと同等である。例えば、前記水中のアガロースの濃度は、0.25〜5% w/vアガロースであり得る。より典型的には、前記水中のアガロースの濃度は、0.5〜4% w/v、例えば、約1% w/v〜3% w/vである。通常、前記水中のアガロースの濃度は約1% w/v又は3% w/vである。
【０２１５】
水性物体はヒドロゲル物体を含み得る。ヒドロゲル物体はヒドロゲル体を有する。
ヒドロゲル物体の本体は、大量のヒドロゲルを含み、任意の形状であり得る。従って、ヒドロゲル体は、任意の規則的な形状若しくは不規則的な形状、又は任意の多角形であり得る。ヒドロゲル体が多角形である場合、それは凸状又は非凸状であり得る。
【０２１６】
通常、ヒドロゲル体は三次元形状である。従って、それは任意の三次元形状であり得る。当業者が理解するように、三次元形状は、全てが同じ程度の大きさである3つの寸法を有しても良く、少なくとも1つの大きさの程度が、他の2つの寸法よりも大きいか又は小さい一つの寸法を有しても良く、又は形状の3つの寸法全てが異なる程度の大きさであっても良い。
【０２１７】
ヒドロゲル体の形状は、例えば、球形又は2つ以上の側面を含む形状であっても良い。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルの形状は、1〜50の側面、例えば、1〜15の側面を含む。ヒドロゲルの形状は、例えば半球等の、例えば、2面形状；例えば円柱、曲がった円柱若しくは3面ワイヤ等の3面形状；例えば三角柱等の5面形状；例えば直方体等の6面形状；又は例えば十字形等の14面形状であり得る。
【０２１８】
典型的には、ヒドロゲル体は球形、十字形、直方体、三日月形、プリズム形、円柱形、ワイヤ形状、又は3角形、5角形、6角形、7角形、8角形、9角形、10角形、11角形、12角形、4角形若しくは長方形の面を有する形状である。
その結果、ヒドロゲル物体は任意の形状であり得る。
【０２１９】
2つ以上の個々のヒドロゲル物体が、ヒドロゲルネットワーク中に含まれ得る。ヒドロゲルネットワーク中の個々のヒドロゲル体は、任意の形状であり得る。従って、その結果、本発明のヒドロゲルネットワーク中の異なるヒドロゲル物体は、全てが同じ形状であり得、又はヒドロゲルネットワークは多様な異なる形状であるヒドロゲル物体を含み得る。ヒドロゲルネットワークが異なる形状のヒドロゲル物体を含む場合、該ヒドロゲル物体は、全てが異なる形状を有している必要はない。従って、例えば、5つのヒドロゲル物体を含むネットワーク中においては、ヒドロゲル物体の1つは十字形であっても良く、ヒドロゲル物体の4つは三日月形であっても良い。
【０２２０】
ヒドロゲル体のヒドロゲルは、任意の好適なヒドロゲルを含み得る。典型的には、ヒドロゲルは高重量パーセントの水を含む。
通常、ヒドロゲルはアガロースを含む。典型的には、ヒドロゲルはアガロース及び水を含む。典型的には、水中のアガロースの濃度は、10% w/vアガロース未満か又はそれと同等である。例えば、前記水中のアガロースの濃度は、0.25〜5% w/vアガロースであり得る。より典型的には、前記水中のアガロースの濃度は、0.5〜4% w/v、例えば、約1% w/v〜3% w/vである。通常、前記水中のアガロースの濃度は約1% w/v又は3% w/vである。
【０２２１】
アガロース以外のヒドロゲルもまた使用し得る。例えば、ヒドロゲル体は、メチルセルロース、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリアクリルアミド、マトリゲル、ヒアルロナン、ポリエチレンオキサイド、ポリAMPS (ポリ(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸))、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー又はポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を含み得る。代替的に、ヒドロゲル体はシリコーンヒドロゲル又はLB (Luriaブロス)寒天を含み得る。
【０２２２】
水性物体がヒドロゲル物体を含む幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも1つは親水性材料及び疎水性材料を含む。典型的には、親水性材料はアガロースである。親水性材料及び疎水性材料を含むヒドロゲル体は、例えば、親水性材料の半球及び疎水性材料の半球からなる球形のヒドロゲル体であり得、それゆえ、2つの面を有するとみなし得る。親水性材料及び疎水性材料を含むヒドロゲル体を含むヒドロゲル物体は、それゆえ「ヤヌス粒子」と呼ばれている。
【０２２３】
例、水性液滴のネットワーク又はヒドロゲル物体のネットワークであり得る、水性物体のネットワーク内では、前記水性物体の各々は、別の前記水性物体と接触し得る。物体間の接触点で、接触している水性物体間で共有されている境界は、接触面として、本明細書において言及される。従って、ネットワーク中の前記水性物体の各々は、別の前記水性物体と接触して、水性物体と他の水性物体間の接触面を形成し得る。従って、1つの水性物体の外層の一部が、別の水性物体の外層の一部と接触する場合、接触面が形成される。
【０２２４】
当業者が理解するように、2つの水性物体は、単一の接触面又は2つ以上の接触面を共有し得る。例えば、水性物体ネットワークが、ヒドロゲルワイヤを含むヒドロゲルネットワークを含む場合、ヒドロゲルワイヤは2点で別のヒドロゲル物体と接触し得、2つの離れた接触面を形成する（例、国際特許出願公開番号第WO2014/064459号の図10aにおいて示される；参照によりその内容が本明細書に取り込まれる)。同様に、水性物体ネットワークが三日月形のヒドロゲル物体を含むヒドロゲルネットワークを含む場合、三日月形は、2点で別のヒドロゲル物体と接触し得、2つの離れた接触面を形成する（例、国際公開第WO2014/064459号の図5cにおいて示される）。2つのヒドロゲル物体の相補的な領域は、例えば、2つのヒドロゲル物体間で形成される1超の接触面と、鍵と鍵穴の配置で整合し得る。例えば、2つの十字形のヒドロゲル物体は、鍵と鍵穴の配置で整合し得る（例、国際公開第WO2014064459号の図5eにおいて示される）。
【０２２５】
典型的には、例えばヒドロゲル物体等の別の水性物体と接触していない、例えばヒドロゲル物体等の水性物体は、両親媒性分子の完全な単層を含む。両親媒性分子の単層を含むそのような2つの水性物体が接触する場合、両親媒性分子の二重層が、2つの水性物体間の接触面に速やかに形成される。両親媒性分子がエネルギー的により好ましい配置を取るように、二重層が形成される。形成される二重層の形状は、最も低い表面自由エネルギーを有する形状である。以下で検討する通り、二重層のサイズは、水性物体と接触させるか、又は水性物体と解離させることによって、調整され得る。更に、二重層は、例えば、水性物体と接触させること、及び二重層を効果的に絞り出すことによって除去し得る。
【０２２６】
従って、2つの水性物体が接触する場合、二重層が形成され得る。水性物体は、例えば、マイクロマニピュレーターを使用して、接触させても良い。各水性物体は、水性物体の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を含む。両親媒性分子の濃度が十分に高ければ、2つの水性物体が接触する場合、両親媒性分子は、接触面で、二重層を自然に形成する。本発明者等は、例えば、2つの水性物体を接触させるか若しくはそれらを解離させることによって、及び／又は水性体を囲んでいる両親媒性分子の濃度を増加若しくは減少させることによって、任意の2つの水性物体間の二重層の存在又は非存在を調節し得ることを見出した。同様に、二重層の領域は、例えば、2つの水性物体を接触させるか若しくはそれらを解離させることによって、及び／又は水性物体を囲んでいる両親媒性分子の濃度を増加若しくは減少させることによって、調節し得る。典型的には、例えば水性液滴又はヒドロゲル物体等の複数の水性物体が、疎水性媒体中に配置され、従って、両親媒性分子の濃度は、典型的には、疎水性媒体中の両親媒性分子の濃度である。
【０２２７】
水性物体のネットワークが、ヤヌス粒子を含むヒドロゲルネットワークを含む場合、ヤヌス粒子の親水性材料と接触している両親媒性分子のみが、隣接しているヒドロゲル物体と共に両親媒性分子の二重層を形成することができる。これは、ヤヌス粒子のヒドロゲル体の表面の周りの両親媒性分子の配向性のためである。ヤヌス粒子の親水性材料に引き付けられた両親媒性分子は、頭部基を親水性表面に最も近付けて配向する。ヤヌス粒子の疎水性材料に引き付けられた両親媒性分子は、頭部基を親水性表面から離して配向する。従って、ヤヌス粒子の疎水性材料に引き付けられた両親媒性分子は、隣接しているヒドロゲル物体と共に、両親媒性分子の二重層を形成することができない。
【０２２８】
接触面で、特異的な静電容量を測定することによって、二重層の形成を検出することができる。標準的な電圧プロトコールを使用し得る。
【０２２９】
水性物体ネットワークは1つの接触面を含み得るか、又は2つ以上の接触面を含み得る。水性物体ネットワーク中の接触面のいずれかは、両親媒性分子の二重層を含み得る。二重層は、上記で検討したように形成され得る。同様に、ネットワーク中の接触面のいずれも両親媒性分子の二重層を含まない場合がある。接触面の2つの水性物体が、接触面で両親媒性分子を効果的に絞り出すよう、十分な力で接触させられる場合、又は両親媒性分子の濃度が低くて二重層を形成できない場合、二重層は形成されない。従って、水性物体ネットワークが2つ以上の接触面を含む場合、例えば、以下の可能性がある：(i)ネットワーク中の接触面の全てが両親媒性分子の二重層を含み；(ii)ネットワーク中の接触面は両親媒性分子の二重層を含まない；又は(iii)少なくとも1つの接触面が両親媒性分子の二重層を含み、少なくとも1つの接触面が両親媒性分子の二重層を含まない。
【０２３０】
2つの水性物体間の接触面に、両親媒性分子の二重層がない場合、2つの物体は、接触面で互いに直接接触している場合も、していない場合もある。接触面は、例えば、両親媒性分子の二重層の他の、材料又は化合物の層を含み得る。例えば、2つの物体間に水性媒体の薄い層（例、水の薄い層、又は水溶液の薄い層）があっても良い。
【０２３１】
水性物体がヒドロゲル物体である場合、典型的には、分子レベルでのヒドロゲル物体の表面は完全に滑らかではない。例えば、アガロースヒドロゲル物体のアガロースポリマー鎖は、通常、ヒドロゲル体の縁に沿って平坦に並ぶのではなく、むしろヒドロゲル体に「曖昧な縁」を作る。従って、2つの接触しているヒドロゲル物体間の接触面に両親媒性分子の二重層がない場合、2つのヒドロゲル物体は接触面で互いに直接接触しても良く、1つのヒドロゲル体の縁のアガロースポリマー鎖は、隣接するヒドロゲル体の縁で、アガロースポリマー鎖とある程度相互作用する。異なる物体由来の鎖は、例えば、ある程度互いに混ざっていても良く、絡まっていても良い。しかしながら、当業者が理解するように、そのようなポリマー鎖が互いに混ざり合うか、又は絡まり合い、接触面で相互作用する程度は、バルクのヒドロゲル物体内の鎖の絡まり合い、結合及び相互作用の程度よりも有意に小さい。バルクのヒドロゲル物体内のアガロースポリマー鎖は、互いに有意により強い分子間相互作用を形成し、物体間の接触面で2つの異なるヒドロゲル物体の鎖よりも、有意に絡まり合う。相互作用は、2つの異なるヒドロゲル物体間よりも、バルクのヒドロゲル物体における方がより強いという事実は、ヒドロゲル物体の強度の一因となり、それらが形状を維持することを助ける。それはまた、2つ以上の異なるヒドロゲル物体が、混じり合って単一の物体を形成することなく、互いに直接接触して、互いに隣接して配置され得る理由も説明している。それはまた、2つ以上の直接接触しているヒドロゲル物体が、容易に再び解離し得る理由も説明しており、それらを解離させる場合、それらは通常、元の接触面で再び解離する理由も説明している。
【０２３２】
従って、2つのヒドロゲル物体間の接触面に両親媒性分子の二重層がない場合、2つのヒドロゲル物体は、接触面で互いに直接接触し得る。幾つかの実施形態においては、接触面のヒドロゲル物体は、接触面の数点で互いに直接接触し得、その他の点では接触し得ない。このことは、例えば、ヒドロゲル物体の一方又は両方が平坦でない表面を有する場合、及び／又はヒドロゲル物体間の水性媒体の薄い層が接触面の一部にのみある場合に、起こり得る。
【０２３３】
本発明者等は、2つのヒドロゲル物体間に二重層が存在することによって、個々のヒドロゲル物体の境界がより確かな程度に定められることを見出している。例えば、この境界は、ヒドロゲルネットワークを通る色素の輸送を研究することによって観察し得る。通常、色素は、両親媒性分子の二重層を含む接触面を横切って輸送されない。
【０２３４】
ヒドロゲルネットワークは、両親媒性分子の外層を有していない、1以上のヒドロゲル物体を更に含み得る。例えば、それは、ヒドロゲル体のみからなるヒドロゲル物体を更に含み得る。更なるヒドロゲル物体は、複数のヒドロゲル物体と接触していない場合がある。更なるヒドロゲル物体は、複数のヒドロゲル物体から離れて位置しても良く、従って、「独立型」ヒドロゲル物体であっても良い。複数のヒドロゲル物体から離れて位置する、更なるヒドロゲル物体の例は、例えば、国際公開第WO2014/064459号の図7cに示されている。例えば、更なるヒドロゲル物体は、複数のヒドロゲル物体と一緒に、スイッチを形成するために使用されても良く、又はスイッチの一部として使用されても良い。代替的に、更なるヒドロゲル物体（複数可）は、複数のヒドロゲル物体と接触しても良い。例えば、更なるヒドロゲル物体の各表面がヒドロゲルネットワークのヒドロゲル物体と接触するように、及び更なるヒドロゲル物体がヒドロゲルネットワークのヒドロゲル物体と共に形成する各接触面が、両親媒性分子の二重層を含まない接触面であるように、更なるヒドロゲル物体は、ヒドロゲルネットワークのヒドロゲル物体に囲まれていても良い。
【０２３５】
接触面が両親媒性分子の二重層を含むか否かとは独立して、接触しているヒドロゲル物体間の接触面の領域は、典型的には、前記接触面のヒドロゲル体の形状に依存する。従って、接触面が2つの異なるヒドロゲル物体の平坦な面の間に形成される場合、該領域は、通常、球形であるヒドロゲル物体と別のヒドロゲル物体の平坦な表面との間に接触面が形成される場合よりも、大きい。
【０２３６】
典型的には、本発明によるヒドロゲルネットワークにおいては、前記複数のヒドロゲル物体は、第一のヒドロゲル物体及び第二のヒドロゲル物体であって、第一及び第二のヒドロゲル物体の各々が、ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部において、ヒドロゲル体及び両親媒性分子の外層を含み、第一のヒドロゲル物体が第二のヒドロゲル物体と接触して、第一及び第二の物体間に前記接触面を形成する、ヒドロゲル物体を含む。ヒドロゲルネットワークが3つ以上のヒドロゲル物体を含む場合、第一のヒドロゲル物体が第二のヒドロゲル物体と接触するという条件に従い、第一及び第二のヒドロゲル物体は、ヒドロゲルネットワーク内のどこにあっても良い。
【０２３７】
幾つかの実施形態においては、第一及び第二の物体間の接触面は、両親媒性分子の二重層を含む。二重層は、それらが接触面で互いに直接接触しないように、2つのヒドロゲル物体を隔てる。
代替的に、第一及び第二の物体間の接触面は、両親媒性分子の二重層を含んでいない場合がある。第一及び第二の物体のヒドロゲル体は、例えば、それらの間の接触面で互いに直接接触しても良い。代替的に、接触面は、例えば、2つのヒドロゲル物体間に、疎水性又は親水性媒体、又は別のポリマーの薄い層を含み得る。
【０２３８】
第一及び第二の物体間の接触面が両親媒性分子の二重層を含まない場合、第一の物体又は第二の物体は、例えば、ヤヌス粒子であり得る。上記で検討した通り、ヤヌス粒子の疎水性材料の表面上の両親媒性分子は、両親媒性分子の二重層を形成することができない。
【０２３９】
幾つかの実施形態においては、第一のヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、第一及び第二の物体間の接触面で、第二の物体のヒドロゲル体と直接接触する。
通常、本発明によるヒドロゲルネットワークにおいては、前記複数のヒドロゲル物体は、第三のヒドロゲル物体であって、第三のヒドロゲル物体は、ヒドロゲル体、及びヒドロゲル体の表面の少なくとも一部において、両親媒性分子の外層を含み、第一又は第二のヒドロゲル物体が、第一又は第二のヒドロゲル物体と、第三のヒドロゲル物体との間で、第三のヒドロゲル物体と接触し、接触しているヒドロゲル物体間の前記接触面を形成する、ヒドロゲル物体を更に含む。
【０２４０】
典型的には、第一のヒドロゲル物体は第三のヒドロゲル物体と接触して、第一及び第三のヒドロゲル物体の間の前記接触面を形成し、第二のヒドロゲル物体は第三のヒドロゲル物体と接触して、第二及び第三のヒドロゲル物体の間の前記接触面を形成する。
従って、幾つかの実施形態においては、ネットワークは、3つ以上の前記ヒドロゲル物体、及び接触しているヒドロゲル物体間の複数の前記接触面を含む。
【０２４１】
上記の通り、ヒドロゲルネットワークは1つの接触面を含み得るか、又は2つ以上の接触面を含み得る。典型的には、ヒドロゲルネットワークは、少なくともn個の前記ヒドロゲル物体、及び接触しているヒドロゲル物体間に少なくともn-1個の前記接触面を含む（nは2と同等であるか又はそれより大きい）。整数nは3と同等であるか又はそれより大きくても良い。より典型的には、nは4と同等であるか又はそれより大きい。
【０２４２】
ヒドロゲルネットワークは、三次元ネットワークであり得る。
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワークは、少なくともn個の前記ヒドロゲル物体を含む場合、ネットワークはn個以上の接触面を含み得（nは本明細書において定義された通りである）、幾つかの実施形態においては、2つのヒドロゲル物体が1超の接触面を共有し、ヒドロゲル物体のいずれか1つが1超の他のヒドロゲル物体と接触し得る（それゆえ、それらと共に接触面を形成する）ことが理解される。
【０２４３】
整数nは、原則、非常に大きい、例えば、数百万のオーダーであり得る。これは、ヒドロゲル体が非常に小さい場合があり、ヒドロゲルネットワークのサイズに上限がないためである。原則、数百万のヒドロゲル体を含み得る、そのようなネットワークは、例えば、プロトティシュー（即ち、最小の組織としても知られる、プロトセルの集合体）を調製するために有用であり得る。幾つかの実施形態においては、それゆえ、整数nは、数百万程度、例えば、約10,000,000まで、又は、例えば、約5,000,000までであり得る。
【０２４４】
他の実施形態においては、nは数百、例えば、約500まで、又は、例えば、約400までであっても良い。整数nは、例えば、2〜500の整数、又は3〜500の整数であっても良い。nは2〜400の整数であっても良い。他の実施形態においては、nは2〜300の整数、又は3〜200の整数であっても良い。より典型的には、nは2〜200である。しかしながら、他の実施形態においては、nは2〜50の整数、又は3〜50の整数である。nは、例えば、2〜20、又は2〜10であっても良い。
【０２４５】
幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の少なくとも1つの接触面は、両親媒性分子の二重層を含む。典型的には、接触しているヒドロゲル物体間の少なくとも2つの接触面は、両親媒性分子の二重層を含む。
一実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面の各々が、両親媒性分子の二重層を含む。
【０２４６】
代替的に、幾つかの実施形態、例、ヒドロゲルの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の少なくとも1つの接触面は、両親媒性分子の二重層を含まない。これは、例えば、接触しているヒドロゲル物体の接触面に存在する二重層の除去によって達成され得る。通常、接触しているヒドロゲル物体間の少なくとも2つの接触面は、両親媒性分子の二重層を含まない。幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面の少なくとも半分は、両親媒性分子の二重層を含まない。本明細書で記載された本発明によるヒドロゲルネットワークにおいては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面が両親媒性分子の二重層を含まない場合、ヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、接触面で互いに直接接触しても良く、又は接触面は2つのヒドロゲル物体間で、例えば疎水性若しくは親水性媒体、又は別のポリマー等の薄い層、二重層の両親媒性分子以外の材料又は化合物の層を含んでも良い。疎水性媒体は、本明細書で更に定義された通りであり得る。
【０２４７】
従って、幾つかの実施形態においては、1つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、接触しているヒドロゲル物体間の少なくとも1つの前記接触面で、別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触する。
例えば、ヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、接触しているヒドロゲル物体間の少なくとも2つの前記接触面で、別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触し得る。
【０２４８】
幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面は、両親媒性分子の二重層を含まない。これらの実施形態においては、ヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、互いに直接接触しても良く、又は接触面は、幾つかの他の材料又は化合物の薄い層、例えばオイル等の、例えば、疎水性媒体の薄い層を含んでも良い。疎水性媒体又はオイルは本明細書で更に定義された通りであり得る。
従って、幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面の各々で、1つの前記ヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、別の前記ヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触し得る。
【０２４９】
幾つかの例においては、本発明のヒドロゲルネットワークにおける、接触しているヒドロゲル物体間の全ての接触面が、両親媒性分子の二重層を含むことが有利であっても良い。二重層は、1つのヒドロゲル体から隣のヒドロゲル体への物質の拡散を抑制する障壁として作用し得、それゆえ、特定のヒドロゲル体内に特定の化学物質が含まれる又は「保存される」ことを有利に助け得る。他方、二重層は、ネットワークが多様な様式で機能的になるよう改変され得る。例えば、膜タンパク質が二重層に挿入されても良く、それによりネットワークを横切って情報が流れることが可能となる。代替的に、接触しているヒドロゲル物体間の接触面が、両親媒性分子の二重層を含まないことが有利であっても良い。二重層が存在しないことによって、例えばネットワークを通るイオンの改善された（より速い）輸送等の利点が提供される。ヒドロゲルネットワークが、両親媒性分子の二重層を含む接触面の少なくとも1つ、及び両親媒性分子の二重層を含まない接触面の少なくとも1つを含むことが有利である例があっても良い。そのようなシステムは、それらが二重層を含むシステム及び二重層を含まないシステムについて上述された利点の組合せを提供し得るので、特に有利である。幾つかの接触面が二重層を含み、また他の接触面が二重層を含まないネットワークは、実施例において記載されているように、電気化学回路として及び合成生物学において特に有用であり得る。
【０２５０】
従って、幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面の少なくとも1つは、両親媒性分子の二重層を含み、接触しているヒドロゲル物体間の他の接触面の少なくとも1つは、両親媒性分子の二重層を含まない。幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の2つ以上の接触面が、両親媒性分子の二重層を含み、及び／又は接触しているヒドロゲル物体間の2つ以上の他の接触面が両親媒性分子の二重層を含まない。
【０２５１】
例えば、本発明によるヒドロゲルネットワークにおいては、接触しているヒドロゲル物体間の接触面の少なくとも1つは、両親媒性分子の二重層を含んでも良く、接触しているヒドロゲル物体間の他の接触面の少なくとも1つで、1つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触し得る。幾つかの実施形態においては、接触しているヒドロゲル物体間の2つ以上の接触面が両親媒性分子の二重層を含み、及び／又は接触しているヒドロゲル物体間の他の接触面の2つ以上で、それらの接触面のヒドロゲル体が互いに直接接触する。
【０２５２】
本発明によるヒドロゲルネットワークにおいては、複数のヒドロゲル物体は、典型的には、両親媒性分子の層によって囲まれている。
複数のヒドロゲル物体を囲んでいる両親媒性分子の層は、通常、ネットワーク中のヒドロゲル物体の両親媒性分子の外層で構成される。両親媒性分子の外層は、1種類の両親媒性分子を含んでも良く、又は2つ以上の異なる種類の両親媒性分子を含んでも良い。従って、複数のヒドロゲル物体を囲んでいる両親媒性分子の層は、1種類の両親媒性分子を含んでも良く、又は2つ以上の異なる種類の両親媒性分子を含んでも良い。
【０２５３】
本発明のヒドロゲルネットワークの幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル物体の1以上は、以下：(a)前記ヒドロゲル体、及び(b)ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部の周りの前記両親媒性分子の外層を含み、該両親媒性分子の外層はヒドロゲル体の表面の少なくとも50%の領域を覆っている。
【０２５４】
ヒドロゲル物体両親媒性分子の外層は、ヒドロゲル物体の表面の全体を覆う必要はない。例えば、1つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体が、別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触する場合、いずれかのヒドロゲル体の表面全体を覆う両親媒性分子の外層は存在しない。これは、そのような両親媒性分子の外層が、接触しているヒドロゲル体間の接触面に存在しないためである。同様に、2つのヒドロゲル体が、それらの間の両親媒性分子の二重層を絞り出すために、接触させられる場合、物体間の接触面に両親媒性分子が存在しない場合があり、それゆえ、両親媒性分子の外層は、いずれかのヒドロゲル体の表面全体を覆ってはいない。従って、両親媒性分子の外層によって覆われている、ヒドロゲル体の表面領域の部分は、ヒドロゲル物体がネットワーク中で他のヒドロゲル物体と共に形成する接触面（複数可）によって、及び例えばヒドロゲル体の形状等の他の要因によって、影響される場合がある。
【０２５５】
典型的には、ヒドロゲルネットワーク中の各ヒドロゲル物体が以下：(a)前記ヒドロゲル体、及び(b)ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部の周りの前記両親媒性分子の外層を含み、該両親媒性分子の外層はヒドロゲル体の表面の少なくとも50%の領域を覆っている。
【０２５６】
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワーク中の1以上のヒドロゲル物体は、以下：(a)前記ヒドロゲル体、及び(b)ヒドロゲル体の表面全体の周りの前記両親媒性分子の外層を含む。例えば、ヒドロゲル物体の全てが互いに直接接触して接触面で二重層を形成するヒドロゲルネットワークにおいては、典型的には、ヒドロゲル物体の全てがヒドロゲル体の表面全体の周りの両親媒性分子の外層を含む。
【０２５７】
従って、幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワーク中のヒドロゲル物体の全ては、以下：(a)前記ヒドロゲル体、及び(b)ヒドロゲル体の表面全体の周りの前記両親媒性分子の外層を含む。
【０２５８】
例えば、ネットワーク中の接触面のみが、両親媒性分子の二重層を含む接触面である場合、ネットワーク中のヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、典型的には、ヒドロゲル体の表面全体の周りの前記両親媒性分子の外層を含む。従って、前記接触面の全てが両親媒性分子の二重層を含むヒドロゲルネットワークにおいては、通常、ヒドロゲルネットワーク中のヒドロゲル物体の全てが、前記ヒドロゲル体、及びヒドロゲル体の表面全体の周りの前記両親媒性分子の外層を含む。
【０２５９】
通常、本発明によるヒドロゲルネットワークにおいては、前記ヒドロゲル物体の少なくとも1つのヒドロゲル体が成形される。典型的には、2つ以上の前記ヒドロゲル物体のヒドロゲル体が成形され、例えば、少なくとも3つが成形され得る。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも半分が成形される。例えば、ヒドロゲル体の全てが成形され得る。
ヒドロゲル体が成形される場合、任意の好適な方法によって成形され得る。典型的には、鋳型を用いて成形されたヒドロゲル体を生成する。例えば、PMMA (ポリ(メチルメタクリレート))モールドが使用され得る。
【０２６０】
典型的には、前記ヒドロゲル物体の少なくとも1つのヒドロゲル体は、成形された三次元のヒドロゲル形状である。通常、2つ以上の前記ヒドロゲル体は、成形された三次元のヒドロゲル形状である。例えば、少なくとも3つの前記ヒドロゲル体は、成形された三次元のヒドロゲル形状であり得る。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも半分は、成形された三次元のヒドロゲル形状である。例えば、前記ヒドロゲル物体の各々のヒドロゲル体は、三次元のヒドロゲルの形状であり得る。
ヒドロゲル体は、本明細書において定義された通りであり得る。
【０２６１】
上記の通り、ヒドロゲル体は、任意の三次元形状であり得る。典型的には、三次元形状は、球形、十字形、直方体、三日月形、プリズム形、円柱形、ワイヤ形状、又は3角形、5角形、6角形、4角形若しくは長方形の面を有する形状である。
【０２６２】
ヒドロゲルネットワーク中のヒドロゲル物体の集合体は、任意の好適な方法によって調節し得る。集合体を調節するために、形状、表面エネルギー又は分子認識が使用され得る。追加的に又は代替的に、例えば、ヒドロゲルネットワーク中のヒドロゲル物体の集合体は、例えば温度、pH、光、化学物質、イオン、並びに磁場及び電場等の刺激の使用によって、切り替え可能な特性を有する表面の使用によって、又は手動での操作によって、調節し得る。
【０２６３】
ネットワーク中のヒドロゲル体は、形状の任意の好適な組合せであり得る。更に、ネットワーク中のヒドロゲル物体の配置は、ヒドロゲル物体の集合体を調節するために、配置及び／又は再配置され得る。例えば、配置は、操作され得、例えば手動で操作される。配置が手動で操作される場合、針、例えば、鋼製の針が、典型的には、使用される。
【０２６４】
幾つかの実施形態においては、前記ヒドロゲル物体の少なくとも1つのヒドロゲル体がワイヤの形状である。例えば、2つ以上の前記ヒドロゲル物体がワイヤの形状である。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも半分がワイヤの形状であり、例えば、全てのヒドロゲル体がワイヤの形状であり得る。
【０２６５】
幾つかの実施形態においては、ワイヤ形状のヒドロゲル物体は、10 mm未満か又はそれと同等の直径、例えば、5 mm未満か又はそれと同等の直径を有し得る。例えば、ワイヤ形状のヒドロゲル物体は、0.005 mm〜2 mm、例えば、0.5 mm〜2mmの直径を有し得る。例えば、ワイヤ形状のヒドロゲル物体は、約0.5 mmの直径を有し得る。代替的に、それは約1 mm〜約2 mmの直径を有し得る。
【０２６６】
幾つかの実施形態においては、ワイヤ形状のヒドロゲル物体は、0.5 mmと同等であるか又はそれ超、例えば、2 mmと同等であるか又はそれ超の長さを有する。ワイヤ形状のヒドロゲル物体の長さは、通常、最大寸法である。最大寸法は、通常、本明細書で以下に定義される通りである。
ワイヤ形状のヒドロゲル物体の直径は、通常、ヒドロゲル物体の長さよりも短い。典型的には、当然、それは、実質的により短い、例えば、ヒドロゲル物体の長さの4分の1より短いか、又はヒドロゲル物体の長さの10分の1より短い。
【０２６７】
上記の通り、ヒドロゲル体は任意の形状であり得る。ヒドロゲル体はまた、任意の好適なサイズであり得る。ヒドロゲルネットワーク中の異なるヒドロゲル体は、同じサイズ又は多様な異なるサイズであっても良い。典型的には、ヒドロゲル体の少なくとも1つは、50 mm未満か又はそれと同等の直径を有する。
【０２６８】
ヒドロゲル物体が球形である場合、ヒドロゲル物体の直径は球形の直径である。ヒドロゲル物体が円柱形である場合、直径は、円柱の円状の面のいずれかの直径と等しい。ヒドロゲル物体がワイヤ形状である場合、直径はワイヤ形状の断面の直径と同じであって、断面はワイヤ形状の長さに対して直角に取る。ヒドロゲル物体が球形、円柱又はワイヤ形状以外の形状である場合、ヒドロゲル物体の直径は、ヒドロゲル物体と同じ体積を有する球形の直径である。
【０２６９】
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも1つは、20 mm未満か又はそれと同等、好ましくは、5 mm未満か又はそれと同等の直径を有する。典型的には、ヒドロゲル体の少なくとも1つは、0.1 mm〜50 mm、例えば、0.5 mm〜20 mmの直径を有する。通常、2つ以上のヒドロゲル体は、20 mm未満か又はそれと同等、好ましくは、5 mm未満か又はそれと同等の直径を有する。典型的には、2つ以上のヒドロゲル体は、0.1 mm〜50 mm、例えば、0.5 mm〜20 mmの直径を有する。例えば、ヒドロゲル体の少なくとも半分は、20 mm未満か又はそれと同等、好ましくは、5 mm未満か又はそれと同等の直径の直径を有し得る。典型的には、ヒドロゲル体の少なくとも半分は、0.1 mm〜50 mm、例えば、0.5 mm〜20 mmの直径を有する。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の各々は、20 mm未満か又はそれと同等、好ましくは、5 mm未満か又はそれと同等の直径の直径を有する。典型的には、ヒドロゲル体の各々は、0.1 mm〜50 mm、例えば、0.5 mm〜20 mmの直径を有する。
【０２７０】
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも1つの最大寸法は、100 mm未満か又はそれと同等、例えば、50 mm未満か又はそれと同等である。通常、ヒドロゲル体の少なくとも1つの最大寸法は、25 mm未満か又はそれと同等、例えば、5 mm未満である。ヒドロゲル体の少なくとも1つの最大寸法は、例えば、0.1〜100 mmであり得る。通常、ヒドロゲル体の少なくとも1つの最大寸法は、0.5〜50 mm、例えば、0.5〜25 mmである。ヒドロゲル体の少なくとも1つの最大寸法は、例えば、0.5〜5 mmであり得る。例えば、ヒドロゲルネットワークが少なくとも1つのワイヤ形状のヒドロゲル体を含む場合、ネットワーク中のワイヤ形状のヒドロゲル体又はヒドロゲル体（複数）の最大寸法は、上記で定義された通りであり得る。ワイヤ形状のヒドロゲル体のケースにおいては、最大寸法は、典型的には、直線に置かれた場合の、ワイヤ形状の長さである。同様に、円柱形のヒドロゲル体の最大寸法は、通常、円柱の長さ、即ち、円柱の2つの円形の面の間の距離である。幾つかの実施形態においては、ネットワーク中に存在する2つ以上の（2 or more or）ヒドロゲル体の最大寸法は、上記で定義された最大寸法である。例えば、ネットワーク中のヒドロゲル体の少なくとも半分の最大寸法は、上記で定義された通りであり得る。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワーク中の各々及び各1つのヒドロゲル体の最大寸法は、上記で定義された通りである。
【０２７１】
ヒドロゲル体がワイヤ形状以外に成形される場合、ヒドロゲル体の体積は典型的には、少なくとも0.001 mm3、例えば、少なくとも0.005 mm3である。より典型的には、ヒドロゲル体の体積は、典型的には、少なくとも0.008 mm3である。ヒドロゲル体は、通常、少なくとも0.1 mm×少なくとも0.1 mm×少なくとも0.1 mmの寸法 (長さ、幅及び高さ)を有する。例えば、ヒドロゲル体は、少なくとも0.175 mm (長さ)×少なくとも0.175 mm (幅)×少なくとも0.175 mm (高さ)の寸法、例えば、少なくとも0.2 mm (長さ)×少なくとも0.2 mm (幅)×少なくとも0.2 mm (高さ)の寸法を有し得る。
【０２７２】
典型的には、ヒドロゲル体は、アガロースを含むヒドロゲルを含む。従って、典型的には、ヒドロゲルは、前記アガロース及び水を含む。水中でのアガロース濃度は、通常、10% w/vアガロース未満か又はそれと同等である。例えば、アガロース濃度は、5% w/vアガロース未満か又はそれと同等であっても良い。通常、水中でのアガロース濃度は、約1% w/vアガロースである。
【０２７３】
アガロース以外のヒドロゲルも使用し得る。例えば、ヒドロゲル体は、メチルセルロース、ポリエチレングリコール ジアクリレート、ポリアクリルアミド、マトリゲル、ヒアルロナン、ポリエチレンオキサイド、ポリAMPS (ポリ(2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸))、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー又はポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を含み得る。代替的に、ヒドロゲル体はシリコーンヒドロゲル又はLB (Luriaブロス)寒天を含み得る。
【０２７４】
ヒドロゲルネットワーク中の個々のヒドロゲル体は、同じヒドロゲル又は異なるヒドロゲルを含み得る。従って、ヒドロゲルネットワーク中の各ヒドロゲル体のヒドロゲルは、同じか又は異なっていても良い。
通常、前記水中のアガロースの濃度は0.25〜5% w/vアガロースである。例えば、前記水中のアガロースの濃度は0.5〜2% w/vアガロースであっても良い。
アガロースは、例えば、低融点アガロースであっても良い。
【０２７５】
幾つかの実施形態においては、本発明のヒドロゲルネットワークの前記複数のヒドロゲル物体の少なくとも1つは、以下：(a)親水性材料及び疎水性材料を含むヒドロゲル体、並びに(b)ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含むヤヌス粒子である。
【０２７６】
ヤヌス粒子の親水性材料は、例えば、アガロースを含み得る。例えば、ヤヌス粒子の親水性材料は、アガロース及び水を含み得る。水中でのアガロース濃度は、10% w/vアガロース未満か又はそれと同等であっても良い。例えば、アガロース濃度は、5% w/vアガロース未満か又はそれと同等であっても良い。水中でのアガロース濃度は、例えば、約1% w/vアガロースであっても良い。
【０２７７】
典型的には、本発明のヒドロゲルネットワークがヤヌス粒子を含む場合、ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層は、ヒドロゲル体の親水性材料上の外層である。
【０２７８】
ヤヌス粒子は、任意の形状であり得る。ヤヌス粒子のヒドロゲル体は、例えば、任意の規則的な形状若しくは不規則的な形状、又は任意の多角形であっても良い。ヒドロゲル体が多角形である場合、それは凸状又は非凸状であっても良い。ヤヌス粒子のヒドロゲル体は、例えば、成形された三次元ヒドロゲルの形状であっても良い。典型的には、三次元形状は球形、十字形、直方体、三日月形、プリズム形、円柱形、ワイヤ形状、又は3角形、5角形、6角形、4角形若しくは長方形の面を有する形状である。
【０２７９】
親水性材料及び疎水性材料を含むヒドロゲル体は、例えば、親水性材料の半球及び疎水性材料の半球から構成される球形のヒドロゲル体であっても良い。代替的に、疎水性材料は、ヤヌス粒子の中心にあっても良く、親水性材料によって囲まれていても良い。しかしながら、少なくとも1つの親水性材料及び少なくとも1つの疎水性材料の任意の好適な配置を使用し得る。ヤヌス粒子は、例えば、第一の親水性材料、疎水性材料及び第二の親水性材料を含み得、(i)第一及び第二の親水性材料は同じか又は異なっていても良く；並びに(ii)第一及び第二の親水性材料は互いに接触していない。同様に、ヤヌス粒子は、例えば、第一の疎水性材料、親水性材料及び第二の疎水性材料を含み得、(i)第一及び第二の疎水性材料は同じか又は異なっていても良く；並びに(ii)第一及び第二の疎水性材料は互いに接触していない。
【０２８０】
ヤヌス粒子は、それゆえ、ヒドロゲル体内に区画が形成されることを可能にする。個々の区画は、例えば、例えば色素等の小分子、又は磁石、センサー分子、治療剤又は診断薬の貯蔵所として使用し得る。これにより、例えば、ヒドロゲル体内に濃度勾配が形成されることが許容され得る。濃度勾配が形成される場合、これによって、例えば色素等の小分子、又は磁石、センサー分子、治療剤又は診断薬の拡散が導かれ得、ヤヌス粒子内の1つの区画からヤヌス粒子内の別の区画に拡散する。
【０２８１】
一実施形態においては、ヒドロゲルネットワークがヤヌス粒子を含む場合、親水性材料はヒドロゲル体の一方の側にあり、疎水性材料はヒドロゲル体の他方の側にある。
【０２８２】
ヒドロゲルネットワークは、2つ以上のヤヌス粒子を含み得る。従って、ヒドロゲルネットワークは、以下：(a)親水性材料及び疎水性材料を含むヒドロゲル体、並びに(b)ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含む、2つ以上のヒドロゲル物体を含み得る。例えば、ヒドロゲルネットワークは、以下：(a)親水性材料及び疎水性材料を含むヒドロゲル体、並びに(b)ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含む、2、3又は4つのヒドロゲル物体を含み得る。
【０２８３】
上記の通り、ヒドロゲル体はアガロースを含み得る。幾つかの実施形態においては、アガロースを、例えば、バッファー溶液中に溶解しても良い。ヒドロゲルネットワークを使用する目的のために（for the purpose or use of）、又はヒドロゲルネットワークを使用して実験を実施するために、ヒドロゲル体を自由に選択しても良い。ヒドロゲルネットワーク中の各ヒドロゲル体のヒドロゲルは、同じか又は異なっていても良い。1つの重要な特性はpHであり、これは広い範囲で変動し得る。幾つかの実施形態においては、例えば、ヒドロゲル物体内の水性媒体のpHは、3〜9の範囲(又は、例えば、5〜9の範囲)であっても良いが、より高い及びより低いpHも可能である。一実施形態においては、ヒドロゲル物体内の水性媒体のpHは、6〜8の範囲であっても良い。ヒドロゲル体は、それゆえ、水性バッファー溶液を含み得る。所望のpHに依存して、任意の好適なバッファーを使用し得る。バッファー溶液は、例えば、KClと共にTris HClを含み得る。幾つかの実施形態においては、水性バッファー溶液のpHは3〜9、又は、例えば、5〜9である。幾つかの実施形態においては、水性バッファー溶液のpHは6〜8である。溶液の性質を変化させるために、溶質の性質及び濃度を変動し得る。既に述べた通り、ヒドロゲル体が、本発明のプロモーター、発現システム及び／又はベクターを支持し得る場合、それに応じて、当業者は容易にpHを調整する。
【０２８４】
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワークは、1以上の更なるヒドロゲル物体を更に含み、更なるヒドロゲル物体はヒドロゲル体を含む。
そのような更なるヒドロゲル物体は両親媒性分子の外層を含む必要がない。また、更なるヒドロゲル物体は、ヒドロゲルネットワーク中で、他のヒドロゲル物体のいずれかと接触していている場合も、接触していない場合もある。更なるヒドロゲル物体は、例えば、ヒドロゲルネットワーク中の他のヒドロゲル物体の少なくとも1つと接触していても良いが、如何なる両親媒性分子と接触していない場合もある。例えば、更なるヒドロゲル物体が他のヒドロゲル物体によって囲まれており、更なるヒドロゲル物体と他の物体との間の接触面が如何なる両親媒性分子も含まない場合、この状況が起こり得る。例えば、ネットワークは、中心位置を占める「更なるヒドロゲル物体」と共に、27個の球形のヒドロゲル物体の立方体（3層の3×3）を含み得、更なるヒドロゲル物体と他のヒドロゲル物体との間の接触面は、両親媒性分子の如何なる層を含んでいない場合がある。
【０２８５】
代替的に、「更なるヒドロゲル物体」は、ネットワーク中の他のヒドロゲル物体のいずれとも実際に接触していない、「独立型」のヒドロゲル物体であり得る。例えば、そのような「独立型」の物体が提示されている、国際公開第WO2014064459号の図7b〜eを参照のこと。
【０２８６】
特に小さい寸法を有する例えば液滴及びヒドロゲル物体等の水性物体を生成するために、例えばソフトリソグラフィ等の技術を使用し得る。
例えば、非常に小さい水性物体は、シリンジ又は針から、例えば、水性の液体、又は液体若しくは融解したヒドロゲルを排出することによって生成し得る。
【０２８７】
本明細書に記載された水性物体、又は水性物体のネットワーク若しくは集合体は、例えば液滴封入体といった、封入体の一部を形成し得る。そのような封入体、例、液滴封入体は「マルチソーム」として言及され得る。一般的に、封入体は以下：ある体積（例えば、一滴）の疎水性媒体；該体積の疎水性媒体の表面の周りの両親媒性分子の外層；及び外層内側の水性物体 (例、液滴又はヒドロゲル物体)、水性物体ネットワーク又は集合体（該水性物体、水性物体のネットワーク又は水性物体の集合体は、本明細書で定義された通りである）を含む。典型的には、封入体がバルクの親水性媒体中に配置され、両親媒性分子の外層が、バルクの親水性媒体と親水性媒体との間の接触面にある。幾つかの実施形態においては、液滴、又は液滴の集合体中の液滴の少なくとも1つは磁性材料を含む。封入体の外層を形成する両親媒性分子は、例えば、疎水性媒体中又はバルクの親水性媒体中で提供され得る。
【０２８８】
封入体又は「マルチソーム」は、例えば、外層中の膜タンパク質を介して外部環境と情報交換を行う。更に、膜タンパク質によって、同じマルチソーム内の、例えば液滴又はヒドロゲル物体等の構造体が、互いに情報交換することが可能になる。原則、これによって、マルチソームが環境を感知し、情報を処理し、偶発的に周辺に材料を送達することが可能となる。封入体は、英国特許出願番号第1119032.9号及び米国特許出願番号第61/592,062号に記載されている方法によって生成し得る。英国第1119032.9号及び米国第61/592,062号における開示は、参照によって本明細書に取り込まれる。
【０２８９】
本発明による方法は、例えば、例えば液滴等の水性物体を、例えば別の液滴等の水性物体と接触させるために使用し得る。典型的には、他の構造体は、(a)水性媒体、及び(b)水性媒体の表面の周りの両親媒性分子の外層を含む。幾つかの実施形態においては、他の構造体は、水性媒体中に配置された磁性材料を更に含み得る。典型的には、液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、常磁性若しくは超常磁性の材料、又は例えば鉄等の常磁性若しくは超常磁性の金属を含む。幾つかの実施形態においては、水性物体（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、磁気ビーズを含む。磁気ビーズは、例えば、磁性粒子を含み得る。通常、水性物体（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、例えば生体適合性の磁気ビーズ等の生体適合性の磁性材料を含む。任意の好適な磁気ビーズを使用し得る。例えば、Clontech、Promega、Invitrogen及びNEBから市販されている、例えば、磁気ビーズを使用し得る。
【０２９０】
物体間の接触点で、例えば液滴等の接触している水性物体間で共有されている境界は、接触面として本明細書で言及される。水性物体の外層の部分が、別の水性物体の外層の部分と接触している場合、接触面が形成される。水性物体が他の水性物体と接触する場合、2つの物体間の接触面から両親媒性分子の二重層が速やかに形成される（from）。二重層は、接触面で、各水性物体の水性媒体の表面の周りの両親媒性分子の外層に由来する、両親媒性分子を含む。二重層は、それが両親媒質性分子にとってエネルギー的により好ましい配置であるので、形成される。形成された二重層の形状は、最も低い表面自由エネルギーを有する形状である。
【０２９１】
他の水性物体の水性媒体は、典型的には、本明細書で定義された水性媒体である。
他の水性物体の両親媒性分子は、通常、本明細書で定義された両親媒性分子である。
典型的には、水性物体が別の水性物体と接触する場合、接触している水性物体の各々の間の接触面に、両親媒性分子の二重層が形成される。それゆえ、一度、第二の位置に置かれると、水性物体は、別の水性物体と接触し得、2つの水性物体を含む水性物体の集合体が形成されている。
【０２９２】
幾つかの実施形態においては、他の水性物体は、1以上の更なる水性物体と接触しても良い。例えば、接触している水性物体の各々の間の各接触面に、両親媒性分子の二重層があっても良い。
【０２９３】
例えば液滴又はヒドロゲル物体等の水性物体の間に配置された、前記二重層の少なくとも1つは、膜タンパク質を更に含み得る。膜タンパク質は、任意の種類の物であり得る。取り込まれている（integral）膜タンパク質の使用が示されているが、末梢の膜タンパク質を使用し得ることが同等に期待される。膜タンパク質は、水性物体ネットワーク又は集合体中の水性物体間で、材料の交換及び電気的な情報伝達を正確に調節できるようにするために、例えば、膜ポンプ、チャネル及び／又は孔であっても良い。水性物体の集合体が封入体の一部を形成する場合、膜タンパク質によって、集合体と外部溶液との間での材料の交換及び電気的な情報伝達を正確に調節することが可能になる。膜タンパク質は、例えば、αHL孔であり得る。しかしながら、β-バレル又はα-ヘリックス束という2つの主要なクラスを含む、任意の好適な膜タンパク質を使用し得る。重要な有用性があるのは、孔又はチャネルである膜タンパク質である。タンパク質の孔又はチャネルの他に、更なる可能な膜タンパク質としては、受容体、トランスポーター又は細胞認識若しくは細胞間相互作用に影響するタンパク質が挙げられるが、これらに限られない。接触している水性物体間の接触面の二重層は、1超の膜タンパク質を含み得る。例えば、特定の二重層は、複数コピーの同じ膜タンパク質、又は2つ以上の異なる種類の膜タンパク質を含み得る。1超の種類が存在する場合、二重層が各々異なる種類の複数コピーを含み得る。
【０２９４】
材料の交換及び電気的な情報伝達を可能にする好適な膜タンパク質が公知であり、当業者は容易に入手できる；多くのそのようなタンパク質は、市販されているか、又は公知の方法によって調製され得るかのいずれかである。例えば、WT αHL単量体は、in vitro転写-翻訳 (IVTT)によって調製し得、ウサギ赤血球の細胞膜と共にインキュベーションすることによって7量体化し得る。7量体は、典型的には、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)によって精製される (Maglia, G.ら、Method. Enzymol. 475、591-623、2010)。また、Bayley, H.ら、Droplet interface bilayers. Mol. BioSyst. 4, 1191-1208 (2008)は、バルク油脂中で作製された液滴接触面の二重層への挿入についてテストされた幾つかのタンパク質を列記している。
【０２９５】
二重層が膜タンパク質を含む場合、前記二重層は、2つ以上の膜タンパク質を含み得る。膜タンパク質は、同じか又は異なっていても良い。水性物体の集合体内の導電性を分析することによって、二重層中の膜タンパク質数を決定し得る。
2つ以上の二重層がある場合、各二重層は膜タンパク質を更に含み得、前記膜タンパク質の各々は本明細書において定義された通りである。例えば、各二重層は、膜タンパク質を更に含み得、前記膜タンパク質の各々は本明細書において定義された通りである。
【０２９６】
水性物体は、物体間の二重層に取り込まれた膜タンパク質を介して、互いに化学種を交換し得る。好適な膜タンパク質としては、ポンプ、チャネル及び／又は孔、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、例えば、α-ヘモリシン(αHL)孔が挙げられるが、それらに限定されない。従って、水性物体の集合体は、物体から物体へ、並びに外部環境に及び外部環境から、ネットワークを介して、例えば化学化合物等の材料を輸送することができる。複合体の輸送システムは、この様にして構築し得る。輸送システムは、例えば液滴の集合体等の水性物体の集合体を含む。
【０２９７】
水性物体の集合体は、例えば、センサーモジュールとして作用し得、例えば、外部環境中の特定の化学物質の存在を感知することができるか、又は光を感知することができる。従って、水性物体は、センサー分子を含み得る。センサー分子は、水性物体の水性媒体中、又は二重層中に（in the aqueous medium of the aqueous objector in the bilayer）存在し得る。ヒドロゲル物体のケースにおいては、センサー分子はヒドロゲル体中に存在し得る。センサー分子は、特定の化学物質 (例えば、標的被検物質)の存在に感受性である分子であっても良く、又はそれは光感受性分子であっても良い。
【０２９８】
通常、膜タンパク質の濃度は10 ng mL-1と同等であるか又はそれ超である。例えば、膜タンパク質の濃度は50 ng mL-1と同等であるか又はそれ超である。典型的には、膜タンパク質の濃度は10 ng mL-1〜2000 μg mL-1、例えば、50 ng mL-1〜1000 μg mL-1である。より典型的には、膜タンパク質の濃度は75 ng mL-1〜900 μg mL-1、例えば、80 ng mL-1〜85 μg mL-1である。幾つかの実施形態においては、膜タンパク質の濃度は約83 μg mL-1である。他の実施形態においては、膜タンパク質の濃度は約830 ng mL-1である。更なる実施形態においては、膜タンパク質の濃度は約83 ng mL-1である。
【０２９９】
典型的には、膜タンパク質の濃度は、水性物体が形成される場合は、水性物体の水性媒体中の膜タンパク質の濃度である。膜タンパク質を含む、例えば液滴等の水性物体が、（膜タンパク質を含んでいる場合、含まない場合がある）別の液滴と接触する場合、もし形成されれば、両親媒性分子の二重層は接触面で形成される。典型的には、二重層は膜タンパク質を含む。それゆえ、最初は水性媒体中の膜タンパク質が、二重層に移動し得る。
【０３００】
例えば液滴等の水性物体が、例えば液滴等の別の水性物体と接触している場合、液滴及び他の液滴中の膜タンパク質の濃度は、同じか又は異なっていても良い。更に、水性物体が水性物体の集合体の一部である場合、集合体の各物体中の膜タンパク質の濃度は同じか又は異なっていても良い。
【０３０１】
膜タンパク質がαHLを含む場合、二重層の少なくとも1つは、例えばγ-シクロデキストリン (γCD)等のαHLのブロッカーを含み得る。
典型的には、αHLのブロッカーの濃度は、10 μMと同等であるか又はそれより大きく、例えば、25 μMと同等であるか又はそれ超である。通常、αHLのブロッカーの濃度は、10 μM〜50 μM、例えば、25 μM〜40 μMである。
【０３０２】
幾つかの実施形態においては、例えば液滴等の水性物体は、他の材料、化合物又は物質を含み得る。例えば、水性物体は、例えば色素等の小分子又は磁石を含み得る。好適な色素としては、キシレンシアノールFF、オレンジG、ピラニン、フルオレセイン及び5-cTAMRA (5-カルボキシテトラメチルローダミン)が挙げられるが、それらに限定されない。代替的に、水性物体は、センサー分子、例えば、特定の化学物質に感受性である（that it sensitive）か、又は光感受性分子である、センサー分子を含み得る。更に代替的なものとして、水性物体は、例えばプロドラッグ等の治療剤、又は例えば造影剤等の診断薬を含み得る。
【０３０３】
水性物体が液滴を含む場合、典型的には、液滴は、1500 nL未満か又はそれと同等である体積を有する。より典型的には、液滴は100 nL〜1500 nLの体積を有する。例えば、液滴は、300 nL〜900 nLの体積を有し得る。通常、液滴は300 nL〜900 nL、例えば、400 nL〜800 nLの体積を有する。例えば、液滴は約400 nL又は約800 nLの体積を有し得る。
【０３０４】
液滴が別の液滴と接触する場合、液滴及び他の液滴の体積は、同じか又は異なっていても良い。例えば、各液滴は1500 nL未満か又はそれと同等である体積を有し得る。典型的には、各液滴は、100 nL〜1500 nLの体積を有する。例えば、各液滴は300 nL〜900 nLの体積を有し得る。通常、各液滴は300 nL〜900 nL、例えば、400 nL〜800 nLの体積を有する。例えば、各液滴は約400 nL又は約800 nLの体積を有し得る。
【０３０５】
液滴が液滴の集合体の一部を形成する場合、液滴の集合体中の液滴は、同じ体積であっても良く、又は異なる体積であっても良い。典型的には、各液滴は1500 nL未満か又はそれと同等である体積を有する。より典型的には、各液滴は100 nL〜1500 nLの体積を有する。例えば、各液滴は300 nL〜900 nLの体積を有し得る。通常、各液滴は300 nL〜900 nL、例えば、400 nL〜800 nLの体積を有する。例えば、各液滴は約400 nL又は約800 nL、好ましくは、約50〜約100 pLの体積を有し得る。
【０３０６】
明細書で記載された水性物体、特に水性液滴及びヒドロゲル物体は、磁性材料を使用して、互いに対して移動され得る。典型的には、磁性材料は、水性物体の水性媒体中に配置され、次いで水性物体は磁石を使用して移動され得る。
磁石は任意の好適な磁性材料であり得る。通常、磁性材料は永久磁石、例えば、強磁性体又はフェリ磁性体である。代替的に、磁石は電磁石であり得る。
典型的には、磁石は例えばニッケル、鉄若しくはコバルト等の遷移金属、又は例えばネオジム若しくはサマリウム等の希土類金属を含む。より典型的には、磁石はネオジムを含む。
【０３０７】
磁石のサイズは、例えば液滴中の磁性材料、及び磁力が必要な距離等の多くの要因に依存する。磁石は、例えば、0.5 mm3〜10 mm3の体積を有し得る。典型的には、磁石は1 mm3〜5 mm3、例えば、1 mm3〜2 mm3の体積を有する。通常、磁石は1〜2 mmの寸法を有する立方体、例えば、約1.2 mmの寸法を有する立方体である。
【０３０８】
典型的には、水性物体（複数可）、典型的には、液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、例えば、常磁性又は超常磁性の材料、例えば鉄等の常磁性又は超常磁性金属を含む。
幾つかの実施形態においては、物体（複数可）／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は磁気ビーズを含む。磁気ビーズは、例えば、磁性粒子を含み得る。
通常、物体（複数可）／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、例えば生体適合性の磁気ビーズ等の生体適合性の磁性材料を含む。
任意の好適な磁気ビーズを使用し得る。例えば、Clontech、Promega、Invitrogen及びNEBから市販されている、例えば、磁気ビーズを使用し得る。
【０３０９】
幾つかの実施形態においては、磁気ビーズは、例えばニトリロ三酢酸(NTA)等の、例えば金属キレーティング基等の有機基を結合した磁性粒子を含む。有機構成要素は、例えば、-C(=O)O-、-C-O-C-、-C(=O)、-NH-、-C(=O)-NH、-C(=O)-CH2-I、-S(=O)2-及び-S-から選択される基を含み得る。有機構成要素は、例えばNTA (ニトリロ三酢酸)等の金属キレーティング基を含み得る。通常、例えばニッケル又はコバルト等の金属も、金属キレーティング基に結合される。この類に用いる磁気ビーズは、Hisタグ付タンパク質を捕捉するために通常用いられるが、本発明の方法及び生成物（produce）における用途にも好適である。
従って、幾つかの実施形態においては、磁気ビーズは、Ni-NTA又はCo-NTAを更に含み得、例えば、Ni-NTA磁気ビーズ又はCo-NTA磁気ビーズを使用し得る。
【０３１０】
当業者が理解するように、磁石を第一の位置に対して移動させることは、以下：(a)物体／液滴を静止状態に保ちながら、磁石を物体／液滴に向かって移動させること；(b)磁石を静止状態に保ちながら、物体／液滴を磁石に向かって移動させること；又は(c)磁石を物体／液滴に向かって移動させ、物体／液滴を磁石に向かって移動させることを含み得る。
【０３１１】
任意の好適な方法を使用して、磁石が配置され、調節され得る。典型的には、磁石を棒、例えば、ガラス棒に連結する。
典型的には、液滴を移動させることは棒を動かすことを含む。例えば、棒をマイクロマニピュレーターによって動かしても良い。
磁石の移動は自動化され得る。例えば、磁石が電磁石である場合、磁石の移動を自動化し得る。
【０３１２】
典型的には、物体／液滴は疎水性媒体中に配置される。
物体／液滴を移動させることは、疎水性媒体を移動させることを含み得る。通常、疎水性媒体は容器中に含まれるので、通常、このことは疎水性媒体を含む容器を移動させることを含む。疎水性媒体は、例えば、本明細書で定義された通りであり得る。
【０３１３】
前記磁力を維持しながら、磁石を第一の位置に対して移動させる(ii)の工程においては、該工程の間中、物体／液滴と磁石との間に磁力がなければならない。しかしながら、磁力の強度は変動し得る。例えば、物体／液滴と磁石との間の距離が低減され得、結果として、磁力が増加する。代替的に、物体／液滴と磁石との間の距離が増加され得、従って、磁力が低減する。
【０３１４】
典型的には、磁石を第一の位置に対して移動させる(ii)の工程は、前記磁力を維持しながら、第一の位置から離れる方向に磁石を移動させ、それにより前記第一の位置から第二の位置への物体／液滴の移動を引き起こす。磁力が維持され、物体／液滴が前記第一の位置から離れ第二の位置に向かって移動するならば、磁石は第一の位置から離れる任意の方向に移動し得る。
【０３１５】
磁性材料は、任意の好適な磁性材料であり得る。通常、磁性材料は永久磁石、例えば、強磁性体又はフェリ磁性体である。典型的には、磁石は、例えばニッケル、鉄若しくはコバルト等の遷移金属、又は例えばネオジム若しくはサマリウム等の希土類金属を含む。より典型的には、磁石はネオジムを含む。
代替的に、磁石は電磁石であり得る。磁石が電磁石である場合、該方法は、典型的には、電磁石の電線を通って電流が流れることを可能にすることによって、電磁石における切替えの工程を更に含む。
【０３１６】
例、国際特許出願公開第WO2014/064461号に示されるように、本発明者等は、2つの一般的な方法を使用しており、それらは両方とも、液滴を移動させるために特に効果的である、水性媒体中に配置された磁性材料を含む水性物体の例として、液滴を使用している。該方法は、浮上法及び運搬法と呼ばれている。特許出願公開第WO2014/064461号の内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
該2つの方法は、幾つかの重複する特徴を有するが、それらの間には相違がある。
【０３１７】
運搬法においては、磁気ビーズを含む第一の液滴は、典型的には、磁石に引き付けられる。第一の液滴の移動は、相対的な磁石の移動によって調節される。通常、第一の液滴が第二の液滴と接触する場合、両親媒性分子の二重層が、第一及び第二の液滴の接触面で同時に形成され、二重層が液滴同士を連結する。第二の液滴は磁性材料を含んでいる必要がない。第一の液滴を移動させることによっても、第二の液滴が移動する。それゆえ、第二の液滴が磁性材料を含んでいない場合があるとしても、第二の液滴の移動も磁石の移動によって調節され得る。一旦、第二の液滴が再配置されると、それは磁性材料を含む液滴から切り離され得る。2つ以上の液滴同士が連結され、同時に移動し得る。
【０３１８】
典型的には、浮上法においては、液滴は任意の方向(例、左又は右、後方又は前方、上方又は下方)に移動し得、液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、前記第一の位置から離れ磁石に向かう、液滴の移動が引き起こされる。典型的には、浮上法を使用して移動させた各液滴は、磁性材料を含む。
【０３１９】
幾つかの実施形態においては、液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程は、前記磁石を、第一の位置にある液滴に対して、液滴に向かう方向に移動させることを含み、それにより、液滴が磁力によって前記磁石に引き寄せられる。例えば、浮上法及び運搬法の両方において、液滴は、典型的には、磁力によって前記磁石に引き寄せられる。
【０３２０】
当業者は、それらの間に磁力が生じるために必要な、液滴と磁石との間の距離は、例えば液滴の水性媒体中に配置された磁石及び磁性材料の磁場のサイズ等の要因に依存することを、当然理解する。
【０３２１】
通常、浮上法は、磁石に対する液滴の磁力を使用し、液滴を、第一の位置から離れて磁石に向かって移動させる。それゆえ、本発明の方法の幾つかの実施形態においては、液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、液滴の、前記第一の位置から離れ磁石に向かって移動する。
【０３２２】
前記第一の位置から離れ磁石に向かって移動するために必要な磁力は、例えば、液滴が移動する培体の密度、及び液滴の重量に依存する。例えば、液滴が、水の密度の約0.75倍の密度を有する培体を垂直に移動する場合、通常、空気中における液滴の重量の約0.25倍の力を加えなければならない。
【０３２３】
典型的には、液滴は疎水性媒体中に配置され、磁石は疎水性媒体の上にある。磁石が永久磁石である場合、典型的には、磁石は疎水性媒体の上にある。
代替的に、液滴は疎水性媒体中に配置されても良く、磁石も疎水性媒体中にあっても良い。例えば、磁石が電磁石である場合、磁石は疎水性媒体の上又は疎水性媒体の中にあっても良い。疎水性媒体は、例えば、本明細書で更に定義された通りであり得る。
【０３２４】
幾つかの実施形態においては、磁気ビーズは、例えばニトリロ三酢酸(NTA)等の、例えば金属キレーティング基等の有機基を結合した磁性粒子を含む。有機構成要素は、例えば、-C(=O)O-、-C-O-C-、-C(=O)、-NH-、-C(=O)-NH、-C(=O)-CH2-I、-S(=O)2-及び-S-から選択される基を含み得る。有機構成要素は、例えばNTA (ニトリロ三酢酸)等の金属キレーティング基を含み得る。通常、例えばニッケル又はコバルト等の金属も、金属キレーティング基に結合される。この類の磁気ビーズは、通常、Hisタグ付タンパク質を捕捉するために使用されるが、本発明の方法及び生成物（produce）における用途にも好適である。典型的には、磁気ビーズは、Ni-NTA又はCo-NTA磁気ビーズ、例えば、Ni-NTA磁気ビーズを含み得る。
【０３２５】
従って、本発明の方法においては、液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、接触している液滴間の接触面で両親媒性分子の二重層が形成されるよう、液滴を別の液滴に接触させることを含む。
【０３２６】
当業者は、磁性材料を使用するこれらの方法のいずれかを、液滴の形態でない水性構造体に適用し得ることを理解する。
通常、疎水性媒体は容器によって収容される。オイルと接触している容器の表面は、粗い表面又は滑らかな表面であり得る。
【０３２７】
典型的には、第一の位置にある水性物体／液滴は、表面上に配置される。表面は、粗い表面又は滑らかな表面であり得る。表面が粗い表面又は滑らかな表面であるかは、典型的には、例えば、水性物体／液滴が表面の至る所で容易に移動することができるか否か等の要因に依存する。例えば、運搬法においては、水性物体／液滴は、通常、単一の平面内の水性物体／液滴を移動させるのみである。このことは、典型的には、水性物体／液滴が、容器の底面の至る所で、任意の方向に移動することを意味する。滑らかな表面は、この移動を容易にする。しかしながら、浮上法では、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、前記第一の位置から離れ磁石に向かう、水性物体／液滴の移動が引き起こされる。典型的には、水性物体／液滴は、表面の至る所で移動しないので、滑らかな表面である必要はない。滑らかな表面の代替として、本発明者等は、パターン化された（patterned）表面が有利であり得ることを見出している。例えば、パターン化された表面の使用は、特定の位置に、水性物体／液滴が位置することを助け得る。また、パターン化された表面の使用は、元々、第一の位置にある水性物体／液滴ではない他の水性構造体／液滴の位置を維持することも助け得る。例えば、パターン化された表面の使用は、水性物体／液滴の集合体の解離を容易にし得る。そのような解離については、以下において検討する。
【０３２８】
従って、第一の位置にある水性物体／液滴は、パターン化された表面又は滑らかな表面上に配置される。典型的には、パターン化された表面は凹凸のある表面である。
【０３２９】
上記で検討した通り、水性物体／液滴は、通常、疎水性媒体中に配置され、疎水性媒体は容器によって収容される。それゆえ、水性物体／液滴と接触する容器の表面は、通常、パターン化された表面又は滑らかな表面である。
【０３３０】
パターン化された表面は、表面で接触し得る水性物体／液滴、及び／又は他の水性構造体／液滴の寸法を考慮して、設計し得る。例えば、パターンは、水性物体／液滴又は構造体／液滴が表面のくぼみ内に静止することが可能となるよう設計し得る。
【０３３１】
パターン化された表面の最も高い点と最も低い点との間の高さの差は、典型的には、0.05 mmと同じか又はより高く、例えば、0.1 mmと同じか又はより高い。通常、パターン化された表面の最も高い点と最も低い点との間の高さの差は、0.05〜0.5 mm、例えば、0.1〜0.4 mmである。パターン化された表面の最も高い点と最も低い点との間の高さの差は、例えば、約0.2 mmであっても良い。
【０３３２】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴は、ピラー（pillar）又はウェルを含む表面上に配置される。典型的には、水性物体／液滴は、2つ以上のピラー又は2つ以上のウェルを含む表面上に配置される。
典型的には、ピラーの高さ又はウェルの深さは、0.05 mmと同等であるか又はそれより大きく、例えば、0.1 mmと同等であるか又はそれ超である。通常、ピラーの高さ又はウェルの深さは、0.05〜0.5 mm、例えば、0.1〜0.4 mmである。ピラーの高さ又はウェルの深さは、例えば、約0.2 mmであっても良い。
【０３３３】
表面が2つ以上のピラーを含む場合、2つのピラーの間の距離は、例えば、0.25 mm〜1.25 mm、例えば、0.5 mm〜1 mmであっても良い。典型的には、2つのピラーの間の距離は、約0.7 mmである。2つのピラーの間の距離は、1つのピラーの中心から他方の中心までで測定される。
表面が2つ以上のウェルを含む場合、2つのウェルの間の距離は、例えば、0.25 mm〜1.25 mm、例えば、0.5 mm〜1 mmであっても良い。通常、2つのウェルの間の距離は、約0.7 mmである。2つのウェルの間の距離は、1つのウェルの中心から他方の中心までで測定される。
【０３３４】
表面は、任意の好適な表面であり得る。例えば、表面は、ガラス又はプラスチックを含み得る。典型的には、表面は、例えばPDMS (ポリ(ジメチルシロキサン))等の、ポリマーを含む。
表面がパターン化された表面である場合、表面のパターニングは、任意の好適な方法によって達成され得る。例えば、表面は、エッチング（etched）又は圧延（milled）され得る。代替的に、表面は鋳型を使用して形成され得、鋳型は例えばエッチング又は圧延等の技術を含む方法を使用して生成される。例えば、モールドは、例えばPMMA (ポリ(メチルメタクリレート))等のポリマーを含み得る。
【０３３５】
一実施形態においては、PMMAチップはピラーを用いてパターニングされ、ピラーはCNC装置上で微小化される（micromachined）。通常、モールドは、表面を成形するための鋳型として使用される。
【０３３６】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴は、疎水性媒体の上部に上昇する。典型的には、水性物体／液滴は、磁石に向かって上昇する。
【０３３７】
疎水性媒体が容器中にある場合、このことは、水性物体／液滴が容器の上部に向かって上昇することを意味する。磁石が水性物体／液滴に対して移動する場合、磁石の磁場は、第一の位置から離れて磁石に向かって、水性物体／液滴を引き寄せ、水性物体／液滴を移動させるために十分であるよう、疎水性媒体の深さは調整され得る。通常、磁場の強度は、水性物体／液滴が、疎水性媒体の表面張力に打ち勝つには不十分である。それゆえ、水性物体／液滴は、通常、疎水性媒体中に浸漬された状態で留まる。
【０３３８】
第一の位置に対する磁石の移動は、例えば、マイクロマニピュレーターを使用して磁石を移動させることを含む。
第一の位置に対する磁石の移動は、自動化し得る。
代替的に、第一の位置に対する磁石の移動は、マイクロマニピュレーターを使用して、水性物体／液滴を移動させることを含み得る。水性物体／液滴が、容器中に収容された、疎水性媒体中に配置される場合、第一の位置に対する磁石の移動は、マイクロマニピュレーターを使用して容器を移動させることを含み得る。
【０３３９】
幾つかの実施形態においては、磁石を第一の位置に対して移動させる(ii)の工程によって、単一の水性物体／液滴を移動させる。例えば、浮上法及び運搬法の両方は、単一の水性物体／液滴を移動させるために使用し得る。これらの実施形態においては、第一の位置にある水性物体／液滴を磁石の磁場に曝露する(i)の工程によって、単一の水性物体／液滴が、磁力によって前記磁石に引き寄せられる。
【０３４０】
典型的には、本発明による方法においては、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置又はその近傍の前記磁場に曝露するのを止めることを含む。
例えば、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置の近傍の前記磁場に曝露するのを止めること、及び水性物体／液滴が前記第二の位置に到達できるようにすることを含み得る。
水性物体／液滴は、例えば、重力の影響で、疎水性媒体中を沈降することによって、前記第二の位置に到達し得る。
【０３４１】
上記の通り、本発明による方法の幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴が、前記第一の位置から離れ磁石に向かって移動する。典型的には、これらの実施形態においては、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置又はその近傍の前記磁場に曝露するのを止めることを含む。通常、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置の近傍の前記磁場に曝露するのを止めること、及び水性物体／液滴が前記第二の位置に到達できるようにすることを含み得る。例えば、水性物体／液滴は、重力の影響で、疎水性媒体中を沈降することによって、前記第二の位置に到達し得る。
【０３４２】
通常、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、磁石を水性物体／液滴から離れて移動させることを含む。典型的には、磁石は永久磁石であり、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止めることは、通常、水性物体／液滴がもはや磁石に引き寄せられないように、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させる必要がある。
【０３４３】
代替的に、磁石が電磁石である場合、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、電磁石の電源を切ることを含み得る。典型的には、電磁石は、電磁石の電線を流れる電流を停止することによって、電源が切られる。
【０３４４】
液滴に言及することによって、以下で例示されるように、水性構造体は任意の好適な方法によって、生成され得る。例えば、水性構造体が液滴である場合、液滴は、例えば疎水性媒体等の好適な媒体に、水性媒体を含む組成物を注入又はピペッティングすることによって生成し得る。幾つかの実施形態においては、液滴はマイクロ流体装置を使用して生成される。液滴を生成するために、例えばソフトリソグラフィ等の技術を使用し得る。液滴は、例えば、成形され得る。幾つかの実施形態においては、液滴を生成するために、PMMAモールドを使用し得る。ヒドロゲルを含む液滴を生成するために、例えば、ソフトリソグラフィを使用し得る。代替的に、液滴は、フォトリソグラフィ（photolithograph）を使用して生成し得る。光（例えばUV光等）が透過し得るパターンを定義するために、例えば、フォトマスクを使用し得る。光硬化性ポリマーを含む液滴を生成するために、例えば、フォトリソグラフィを使用し得る。ヒドロゲルを含む液滴を生成するために、例えば、フォトリソグラフィを使用し得る。
【０３４５】
当業者は、例えば上記の方法が広く適用され、液滴とは形態が異なる水性構造体の製造において使用し得ることを理解する。
【０３４６】
幾つかの実施形態においては、第一の位置にある水性物体／液滴は、別の水性物体／液滴と共に二重層を形成し、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、他の液滴から離れるよう、液滴が移動する。
【０３４７】
上記の通り、2つの水性物体／液滴が接触する場合、両親媒性分子の二重層は、2つの物体間の接触面に自然に形成される（spontaneously from）。水性物体／液滴が、他の水性物体／液滴から離れるよう移動する場合、両方の水性構造体／液滴は、水性媒体の表面の少なくとも一部において、それらの両親媒性分子の外層を保持するが、接触面に存在していた二重層は維持されない。
それゆえ、典型的には、第一の水性物体／液滴が、第二の水性物体／液滴から離れるよう移動する場合、水性物体／液滴と他の水性物体／液滴との間の二重層は分離する。
【０３４８】
他の水性物体／液滴は磁性材料を含み得る。典型的には、水性物体（複数可）／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、常磁性若しくは超常磁性の材料、又は例えば鉄等の常磁性若しくは超常磁性の金属を含む。幾つかの実施形態においては、水性物体（複数可）／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は磁気ビーズを含む。磁気ビーズは、例えば、磁性粒子を含み得る。通常、水性物体（複数可）／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、例えば生体適合性の磁気ビーズ等の生体適合性の磁性材料を含む。任意の好適な磁気ビーズを使用し得る。例えば、Clontech、Promega、Invitrogen及びNEBから市販されている、例えば、磁気ビーズを使用し得る。
【０３４９】
幾つかの実施形態においては、第一の位置にある水性物体／液滴は、2つ以上の他の水性物体（複数可）／液滴の各々と共に、二重層を形成し、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴が、他の水性物体／液滴から離れるよう移動する。例えば、第一の位置にある水性物体／液滴は、2、3又は4つの他の水性物体／液滴の各々と共に二重層を形成し得、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴が、他の水性物体／液滴から離れるよう移動する。
【０３５０】
通常、水性物体／液滴が、他の水性物体／液滴から離れるよう移動する場合、水性物体／液滴と他の水性物体／液滴との間の各二重層は分離する。
他の水性物体／液滴は、各々独立して、磁性材料を含み得る。磁性材料は、例えば、本明細書で定義された通りであり得る。
典型的には、磁石を第一の位置に対して移動させる(ii)の工程は、マイクロマニピュレーターを使用して磁石を移動することを含む。
第一の位置に対する磁石の移動は自動化し得る。
【０３５１】
代替的に、第一の位置に対する磁石の移動は、マイクロマニピュレーターを使用して液滴を移動させることを含み得る。水性物体／液滴が、容器内に収容された疎水性媒体中に配置される場合、第一の位置に対する磁石の移動は、マイクロマニピュレーターを使用して、容器を移動させることを含み得る。
【０３５２】
幾つかの実施形態においては、磁石を第一の位置に対して移動させる(ii)の工程によって、単一の水性物体／液滴が移動する。これらの実施形態においては、第一の位置にある水性物体／液滴を磁石の磁場に曝露する(i)の工程によって、単一の水性物体／液滴が、磁力によって前記磁石に引き寄せられる。
【０３５３】
通常、本発明による方法においては、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置又はその近傍の前記磁場に曝露するのを止めることを含む。
例えば、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置の近傍の前記磁場に曝露するのを止めること、及び水性物体／液滴が前記第二の位置に到達できるようにすることを含み得る。水性物体／液滴は、例えば、重力の影響で、疎水性媒体中を沈降することによって、前記第二の位置に到達し得る。
【０３５４】
上記の通り、本発明による方法の幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴が、前記第一の位置から離れ磁石に向かって移動する。典型的には、これらの実施形態においては、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置又はその近傍の前記磁場に曝露するのを止めることを含む。通常、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置の近傍の前記磁場に曝露するのを止めること、及び水性物体／液滴が前記第二の位置に到達できるようにすることを含み得る。例えば、水性物体／液滴は、重力の影響で、疎水性媒体中を沈降することによって、前記第二の位置に到達し得る。
【０３５５】
通常、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させることを含む。典型的には、磁石は永久磁石であり、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止めることは、通常、水性物体／液滴がもはや磁石に引き寄せられないよう、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させる必要がある。
【０３５６】
代替的に、磁石が電磁石である場合、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、電磁石の電源を切ることを含み得る。典型的には、電磁石の電線を流れる電流を停止することによって、電磁石は電源が切られる。
【０３５７】
水性媒体は任意の好適な水性媒体であり得る。例えば、水性媒体は本明細書で定義された通りであり得る。
【０３５８】
上記の通り、2つの水性物体／液滴が互いに接触する場合、接触している水性物体／液滴の間の接触面に、二重層が形成される。水性物体／液滴の水性媒体、及び水性物体／液滴の表面上の両親媒性分子の濃度を調節することによって、2つの接触している水性物体／液滴を融合することができる。本発明者等は、両親媒性分子の濃度が比較的低い場合に、液滴が、例えば、融合され得ることを見出している。典型的には、両親媒性分子の濃度が0.1 mg mL-1〜1 mg mL-1、例えば、0.1 mg mL-1〜0.75 mg mL-1である場合に、液滴は融合され得る。通常、両親媒性分子の濃度が約0.5 mg mL-1である場合に、液滴は融合され得る。
【０３５９】
従って、幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を第二の液滴と接触させること、及び水性物体／液滴を第二の水性物体／液滴と融合させ、第一及び第二の水性物体／液滴から新たな水性物体／液滴を形成することを含む。
【０３６０】
第二の水性物体／液滴は、磁性材料を含んでいる場合も、含んでいない場合もある。典型的には、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を第二の水性物体／液滴と接触させること、及び水性物体／液滴を第二の水性物体／液滴と融合し、第一及び第二の水性物体／液滴から、新たな水性物体／液滴を形成することを含む場合、該第二の水性物体／液滴は磁性材料を含まない。
【０３６１】
通常、新たな水性物体／液滴が形成される場合、本発明の方法が、前記磁力を維持することによって、第二の位置から離れる方向に、磁石を第二の位置に対して移動させる工程を更に含み、それにより、水性物体／液滴が、前記第二の位置から離れ、第三の位置に向かって移動する。
第三の位置は第一の位置と同じ位置であっても良く、又は異なる位置であっても良い。
【０３６２】
典型的には、水性物体／液滴を前記第二の位置から離れ、第三の位置に向かって移動させる、磁石を第二の位置に対して移動させる工程は、マイクロマニピュレーターを使用して磁石を移動することを含む。
第二の位置に対する磁石の移動は自動化し得る。
代替的に、第一の位置に対する磁石の移動は、マイクロマニピュレーターを使用して、水性物体／液滴を移動させることを含み得る。水性物体／液滴が、容器内に収容された疎水性媒体中に配置される場合、第一の位置に対する磁石の移動は、マイクロマニピュレーターを使用して、容器を移動させることを含み得る。
【０３６３】
通常、磁石を第二の位置に対して移動させる工程によって、第一及び第二の水性物体／液滴から形成された新たな水性物体／液滴が移動する。
水性物体／液滴を、第二の水性物体／液滴と融合し、新たな水性物体／液滴を形成する工程は、典型的には、運搬法において使用されるが、浮上法においても使用し得る。第二の水性物体／液滴は、例えば、1以上の他の水性物体／液滴と接触しても良い。該方法は、例えば、他の水性物体／液滴（複数可）から第二の水性物体／液滴を分離するために使用し得る。
【０３６４】
従って、典型的には、第一及び第二の水性物体／液滴から形成された新たな水性物体／液滴は、二重層を介して、第三の水性物体／液滴と接触し（即ち、第一及び第二の水性物体／液滴から形成された新たな水性物体／液滴は、第三の水性物体／液滴と二重層を形成する）、磁石を第二の位置に対して移動させる工程によって、新たな水性物体／液滴が第三の水性物体／液滴から離れるよう移動する。新たな水性物体／液滴が第三の水性物体／液滴から離れるよう移動する場合、二重層が壊れる。
【０３６５】
本発明による方法が、磁石を第二の位置に対して移動させる工程を更に含む場合、該方法はまた、通常、水性物体／液滴を前記第三の位置に配置することを更に含む。
典型的には、水性物体／液滴を前記第三の位置に配置する工程は、前記第三の位置で又はその近傍で、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止めることを含む。
【０３６６】
通常、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させることを含む。典型的には、磁石は永久磁石であり、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止めることは、通常、水性物体／液滴がもはや磁石に引き寄せられないように、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させる必要がある。
【０３６７】
代替的に、磁石が電磁石である場合、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、電磁石の電源を切ることを含み得る。典型的には、電磁石は、電磁石の電線を流れる電流を停止することによって、電源が切られる。
【０３６８】
本明細書で定義された方法によって得られ得る、水性物体／液滴の集合体もまた、本発明によって提供される。本明細書で記載された及び以下のそのような水性物体／液滴の集合体は、例、水性液滴の集合体、又は、例、ヒドロゲル物体の集合体を指す場合がある。従って、水性物体（複数可）についての言及は、ヒドロゲル物体（複数可）を包含する。
【０３６９】
上記の通り、本発明による方法は、水性物体／液滴の集合体の生成において使用し得る。水性物体／液滴の集合体は、典型的には、疎水性媒体中にある。疎水性媒体は、例えば、本明細書で定義された疎水性媒体であり得る。
【０３７０】
水性物体／液滴の集合体は、封入体、例えば、水性物体／液滴の封入体の一部を形成し得る。該方法は、水性物体／液滴の集合体を含む、封入体を形成するために使用し得る。該封入体は、例えば、以下：ある体積の疎水性媒体（例えば一滴等）；該体積の表面の周りの両親媒性分子の外層；及び外層内側の水性物体／液滴の集合体（水性物体／液滴の集合体は本明細書で定義された通りである）を含み得る。
【０３７１】
その中に配置された水性物体／液滴の集合体を含む、ある体積の前記疎水性媒体は、例、例えば水性媒体等のバルクの親水性媒体中に導入され得る。ある体積の前記疎水性媒体は、一滴の前記疎水性媒体であり得る。
【０３７２】
封入体の外層を形成する両親媒性分子は、例えば、疎水性媒体中又はバルクの親水性媒体中で提供され得る。ヒドロゲルネットワークが、生物学的システムにおいて使用するためのものである場合、例えば、封入体を使用し得る。
【０３７３】
本発明は、複数の水性物体／液滴を含む水性物体／液滴の集合体であって、水性媒体の表面の周りに各水性物体／液滴が、水性媒体及び両親媒性分子の外層を含み、複数の水性物体／液滴の少なくとも1つが、水性媒体中に配置された磁性材料を含む、集合体を更に提供する。
【０３７４】
磁性材料は、本発明の方法のために、上記において本明細書で更に定義された通りであり得る。従って、典型的には、水性物体／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、常磁性若しくは超常磁性の材料、又は例えば鉄等の常磁性若しくは超常磁性の金属を含む。
【０３７５】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、磁気ビーズを含む。磁気ビーズは、例えば、磁性粒子を含む。
通常、水性物体／液滴（複数可）の水性媒体中に配置された磁性材料は、例えば生体適合性の磁気ビーズ等の生体適合性の磁性材料を含む。
任意の好適な磁気ビーズを使用し得る。例えば、Clontech、Promega、Invitrogen及びNEBから市販されている、例えば、磁気ビーズを使用し得る。
【０３７６】
幾つかの実施形態においては、磁気ビーズは、例えばニトリロ三酢酸(NTA)等の、例えば金属キレーティング基等の有機基を結合した磁性粒子を含む。有機構成要素は、例えば、-C(=O)O-、-C-O-C-、-C(=O)、-NH-、-C(=O)-NH、-C(=O)-CH2-I、-S(=O)2-及び-S-から選択される基を含み得る。有機構成要素は、例えばNTA (ニトリロ三酢酸)等の金属キレーティング基を含み得る。通常、例えばニッケル又はコバルト等の金属もまた、金属キレーティング基に結合される。この類の磁気ビーズは、通常、Hisタグ付タンパク質を捕捉するために使用されるが、本発明の方法及び生成物（produce）における用途にも好適である。
【０３７７】
典型的には、磁気ビーズは、Ni-NTA又はCo-NTA磁気ビーズ、例えば、Ni-NTA磁気ビーズを含み得る。
幾つかの実施形態においては、磁性材料はFeCo以外である。従って、磁性材料は、Feを含まない場合がある。幾つかの実施形態においては、磁性材料はFeを含まず、Coを含まない。
【０３７８】
複数の水性物体／液滴中の各水性物体／液滴は、複数の水性物体／液滴中の少なくとも1つの他の水性物体／液滴と接触する。本発明の方法について検討されるように、物体間の接触点で接触している水性物体／液滴の間で共有される境界は、本明細書において接触面として言及される。典型的には、両親媒性分子の二重層は、接触している水性物体／液滴の間の接触面に形成される。より典型的には、両親媒性分子の二重層は、複数の水性物体／液滴中において接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成される。
【０３７９】
水性物体／液滴の集合体は、例えば、少なくともn個の前記水性物体／液滴、及び接触している水性物体／液滴の間に少なくともn-1個の前記接触面（nは2と等しいか又はそれより大きい）を含み得る。整数nは3と等しいか又はそれより大きくても良い。より典型的には、nは4と同等であるか又はそれより大きい。
【０３８０】
整数nは、原則、非常に大きい、例えば、数百万のオーダーであり得る。このことは、水性物体／液滴が非常に小さい場合があり、水性物体／液滴の集合体のサイズに上限がないためである。原則、数百万の水性物体／液滴を含み得る、そのような集合体は、例えば、プロトティシュー(即ち、プロトセルの集合体)を調製するために有用であり得る。幾つかの実施形態においては、それゆえ、整数nは数百万、例えば、約10,000,000まで、又は、例えば、約5,000,000までであり得る。
【０３８１】
他の実施形態においては、nは数百、例えば約500まで、又は例えば約400までであり得る。整数nは、例えば、2〜500の整数、又は3〜500の整数であり得る。nは2〜400の整数であり得る。他の実施形態においては、nは2〜300の整数又は3〜200の整数であり得る。より典型的には、nは2〜200である。しかしながら、他の実施形態においては、nは2〜50の整数、又は3〜50の整数である。nは、例えば、2〜20、又は2〜15であり得る。
典型的には、複数の水性物体／液滴は、3つ以上の水性物体／液滴を含む。
【０３８２】
本明細書で定義された磁石による集合プロセスは、自動化し得る。例えば、nが1000と同等であるか又はそれより大きい場合、又は5000にまで同等であるか又はそれより大きい場合等の、例えば、大きい水性物体／液滴の集合体については、典型的には、本明細書で定義された磁石による集合プロセスは自動化される。自動化の任意の好適な方法が使用され得る。例えば、磁石の移動が自動化され得る。
【０３８３】
通常、本発明の水性物体／液滴の集合体においては、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも2つは膜タンパク質を含み、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは膜タンパク質を含まない。
膜タンパク質は、例えば、本発明の方法について本明細書で定義された膜タンパク質であり得る。
【０３８４】
幾つかの実施形態においては、複数の水性物体／液滴は、5つ以上の水性物体／液滴、例えば、5〜50の水性物体／液滴を含む。複数の水性物体／液滴は、9つ以上の水性物体／液滴、例えば、9〜20の水性物体／液滴を含み得る。例えば、複数の水性物体／液滴は、9〜14の水性物体／液滴を含み得る。
【０３８５】
典型的には、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも2つは膜タンパク質を含む。例えば、前記複数の水性物体／液滴の2〜50は膜タンパク質を含む。幾つかの実施形態においては、前記複数の水性物体／液滴の2〜10は膜タンパク質を含む。例えば、前記複数の水性物体／液滴の2〜8は膜タンパク質を含む。
【０３８６】
幾つかの実施形態においては、本発明の水性物体／液滴の集合体においては、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つはαHLを含み、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つはαHLのブロッカーを含む。例えば、膜タンパク質がαHLを含む場合、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは、例えばγ-シクロデキストリン (γCD)等のαHLのブロッカーを含む。典型的には、αHLのブロッカーの濃度は10 μMと同等であるか又はそれより大きく、例えば、25 μMと同等であるか又はそれ超である。通常、αHLのブロッカーの濃度は、10 μM〜50 μM、例えば、25 μM〜40 μMである。
【０３８７】
水性物体／液滴の集合体は2Dの集合体又は3Dの集合体であり得る。従って、水性物体／液滴の集合体は1以上の層の水性物体／液滴を含み得る。例えば、水性物体／液滴の集合体は1〜10層の水性物体／液滴を含み得る。典型的には、水性物体／液滴の集合体は、1〜5層の水性物体／液滴、例えば、1、2又は3層の水性物体／液滴を含む。
【０３８８】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は3Dの集合体である。
磁石の操作プロセスが自動化される場合（例えば、磁石の移動が自動化される場合）、水性物体／液滴の層数は更により大きくなる場合がある。例えば、水性物体／液滴の集合体は、1〜10000層の水性物体／液滴、例えば、1〜1000層を含み得る。
【０３８９】
通常、本発明の水性物体／液滴の集合体は、少なくとも2層の水性物体／液滴を含む。例えば、水性物体／液滴の集合体は、2又は3層の水性物体／液滴を含み得る。
【０３９０】
典型的には、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは、1500 nL未満か又はそれと同等の体積を有する。より典型的には、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは、100 nL〜1500 nLの体積を有する。例えば、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは、300 nL〜900 nLの体積を有し得る。通常、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは、300 nL〜900 nL、例えば、400 nL〜800 nLの体積を有する。例えば、前記複数の水性物体／液滴の少なくとも1つは、約400 nL又は約800 nLの体積を有し得る。
【０３９１】
幾つかの実施形態においては、前記複数の水性物体／液滴の2つ以上は、1500 nL未満か又はそれと同等の体積を有する。典型的には、前記複数の水性物体／液滴の2つ以上は100 nL〜1500 nLの体積を有する。例えば、前記複数の水性物体／液滴の2つ以上は、300 nL〜900 nLの体積を有し得る。通常、前記複数の水性物体／液滴の2つ以上は、300 nL〜900 nL、例えば、400 nL〜800 nLの体積を有する。例えば、前記複数の水性物体／液滴の2つ以上は、約400 nL又は約800 nLの体積を有し得る。
【０３９２】
典型的には、前記複数の水性物体／液滴の各々は、1500 nL未満か又はそれと同等の体積を有する。より典型的には、前記複数の水性物体／液滴の各々は、100 nL〜1500 nLの体積を有する。例えば、前記複数の水性物体／液滴の各々は、300 nL〜900 nLの体積を有し得る。通常、前記複数の水性物体／液滴の各々は、300 nL〜900 nL、例えば、400 nL〜800 nLの体積を有する。例えば、前記複数の水性物体／液滴の各々は、約400 nL又は約800 nLの体積を有し得る。
【０３９３】
水性物体／液滴の集合体中の水性物体／液滴は、同じ体積であっても良く、又は異なる体積であっても良い。例えば、水性物体／液滴の集合体が2つ以上の層を含む場合、1層の水性物体／液滴の集合体中の水性物体／液滴は、第一の体積であり得、別の層の水性物体／液滴の集合体中の水性物体／液滴は、第二の体積であり得、該第一及び第二の体積は同じか又は異なっている。水性物体／液滴の集合体が異なる体積の水性物体／液滴を含む場合、これは隣接している水性物体／液滴が互いに接触しているか否か、従って隣接している水性物体／液滴の間に接触面があるか否かに影響を与え得る。接触面がない場合、二重層は形成されない。このことは、例、国際公開第WO2014/064461号の図13において記載されている。
【０３９４】
従って、幾つかの実施形態においては、本発明の水性物体／液滴の集合体は、第一の体積の第一の水性物体／液滴及び第二の体積の第二の水性物体／液滴を含み、該第一及び第二の体積は異なっている。典型的には、第一の水性物体／液滴は第一の層中にあり、第二の水性物体／液滴は第二の層中にある。
水性物体／液滴の集合体中の水性物体／液滴は、任意の好適なパッキング配置でパッキングされ得る。好適なパッキング配置としては、立方体の密なパッキング及びヘキサゴナル（hexagonal）の密なパッキングが挙げられるが、それらによって限定されない (例、国際公開第WO2014/064461号の図13において記載される通り)。
【０３９５】
複数の水性物体／液滴は任意の形状であり得る。例えば、複数の水性物体／液滴は、例えば直方体等の平行六面体形状、花形又はピラミッド形状を形成し得る。幾つかの実施形態においては、複数の水性物体／液滴はピラミッド形状を形成する。
【０３９６】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって：(a)第一の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は膜タンパク質を含み；及び(b)第二の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は膜タンパク質を含まない、水性物体／液滴を含む。膜タンパク質は、典型的には、本発明の方法について本明細書で定義された膜タンパク質である。
【０３９７】
第一の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴の水性媒体は、例えば、10 ng mL-1と同等であるか又はそれ超である濃度の膜タンパク質、例えば、50 ng mL-1と同等であるか又はそれ超である濃度の膜タンパク質を含み得る。典型的には、第一の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴の水性媒体は、10 ng mL-1〜2000 μg mL-1、例えば、50 ng mL-1〜1000 μg mL-1の膜タンパク質を含む。より典型的には、第一の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴の水性媒体は、75 ng mL-1〜900 μg mL-1を含む。
【０３９８】
別の実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって：(a)第一の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は第一の濃度の膜タンパク質を含み；及び(b)第二の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は第二の濃度の膜タンパク質を含み、第一の濃度が第二の濃度よりも大きい、水性物体／液滴を含む。
【０３９９】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって：(a)第一の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は、少なくとも50 ng mL-1の濃度の膜タンパク質を含み；及び(b)第二の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は、50 ng mL-1未満の濃度の膜タンパク質を含む、水性物体／液滴を含む。通常、膜タンパク質は、本発明の方法について本明細書で定義された膜タンパク質である。
【０４００】
例えば、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって：(a)第一の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は、少なくとも50 ng mL-1、例えば、少なくとも100 ng mL-1の濃度の膜タンパク質を含み；及び(b)第二の複数の水性物体／液滴の水性物体／液滴の水性媒体は、5 ng mL-1未満、例えば、1 ng mL-1未満の濃度の膜タンパク質を含む、水性物体／液滴を含み得る。
【０４０１】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって、以下：(a)両親媒性分子の二重層が、第一の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成され、第一の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の各二重層が、膜タンパク質を含み；及び(b)両親媒性分子の二重層が、第二の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成され、第二の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の二重層が、膜タンパク質を含まない、水性物体／液滴を含む。
【０４０２】
典型的には、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって：(a)両親媒性分子の二重層が、第一の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成され、第一の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の各二重層が、膜タンパク質を含み；及び(b)両親媒性分子の二重層が第二の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成され、第二の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の二重層が、膜タンパク質を含まない、水性物体／液滴を含む。
【０４０３】
別の実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって、以下：(a)両親媒性分子の二重層が第一の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成され、第一の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の間の二重層が、第一の濃度の膜タンパク質を含み；及び(b)両親媒性分子の二重層が、第二の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の各々の間の接触面に形成され、第二の複数の水性物体／液滴中の接触している水性物体／液滴の間の二重層が、第二の濃度の膜タンパク質を含み、第一の濃度が第二の濃度よりも大きい、水性物体／液滴を含む。
【０４０４】
液滴及び他の水性物体は、水性物体／液滴の間の二重層中に取り込まれた膜タンパク質を介して、互いに化学種を交換し得る。好適な膜タンパク質としては、ポンプ、チャネル及び／又は孔、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、例えば、α-ヘモリシン (αHL)孔が挙げられるが、それらに限定されない。従って、水性物体／液滴の集合体は、ネットワークを介して、物体から物体へ、並びに外部環境に及び外部環境から、例えば化学化合物等の材料を輸送することができる場合がある。複雑な輸送システムは、この方法で構築し得る。
【０４０５】
水性物体／液滴の集合体は、例えば、センサーモジュールとして動作し得、外部環境中の特定の化学物質の存在を感知することができるか、又は、例えば、光を感知することができる。従って、幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴はセンサー分子を含み得る。センサー分子は、水性物体／液滴の水性媒体中、又は二重層中に存在し得る。センサー分子は、特定の化学物質 (例えば、標的被検物質)の存在に感受性がある分子であり得、又はそれは光感受性分子であり得る。
【０４０６】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって、第一の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴が、膜タンパク質を介して互いに情報を交換する、水性物体／液滴を含む。
【０４０７】
通常、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性物体／液滴及び第二の複数の水性物体／液滴であって、第一の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴が、膜タンパク質を介して互いに情報を交換し、第二の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴が、膜タンパク質を介して互いに情報を交換しない。
【０４０８】
水性物体／液滴の集合体は、例えば、3Dの集合体であり得る。定義された経路に沿って電気的なシグナルを送信することができる、そのような機能的な3Dの集合体は、組織に類似し、神経組織を真似ている、より多くの数の水性物体／液滴を有するモデルシステムの基礎を形成し得る。
【０４０９】
第一の複数の水性物体／液滴中及び及び／又は第二の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴の少なくとも1つは、幾つかの実施形態においては、他の材料、化合物又は物質を含み得る。例えば、第一の複数の水性物体／液滴中及び／又は第二の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴の少なくとも1つは、例えば色素等の小分子、又は磁石を含み得る。好適な色素としては、キシレンシアノールFF、オレンジG、ピラニン、フルオレセイン及び5-cTAMRA (5-カルボキシテトラメチルローダミン)が挙げられるが、それらに限定されない。代替的に、水性物体／液滴は、センサー分子、例えば、特定の化学物質に対して感受性であるか又は光感受性分子であるセンサー分子を含み得る。更に代替的なものとして、第一の複数の水性物体／液滴中及び／又は第二の複数の水性物体／液滴中の水性物体／液滴の少なくとも1つは、例えばプロドラッグ等の治療剤、又は例えば造影剤等の診断薬を含み得る。
【０４１０】
生物学的な組織の分化した細胞に類似した、特定の機能を実行するための様々な分子を含む、水性物体／液滴の3Dネットワークを使用することによって、本発明の水性物体／液滴の集合体を、機能的な最小の合成組織を構築する際に使用し得る。本発明によって得られた、水性物体／液滴の配置間で急速に切り替えるための能力は、自然には発生せず、最小の合成組織の多用途性を高める。
【０４１１】
本発明の水性物体／液滴の集合体は、典型的には、少なくとも1日間、例えば、少なくとも2日間安定である。水性物体／液滴の集合体は、例えば、少なくとも3日間又は少なくとも4日間安定であり得る。
【０４１２】
水性物体／液滴の集合体の水性構造体／液滴は、任意の好適な方法又は好適な方法の組合せによって生成し得る。
例えば、水性構造体／液滴は、例えば疎水性媒体等の好適な媒体中に、水性媒体を含む組成物を注入又はピペッティングすることによって生成し得る。
【０４１３】
幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体の水性構造体／液滴は、マイクロ流体装置を使用して生成される。マイクロ流体装置は、例えば、少なくともn個（nは2と等しいか又はそれより大きい）の前記液滴を生成するために使用し得る。整数nは3と等しいか又はそれより大きくても良い。より典型的には、nは4と同等であるか又はそれより大きい。上記において検討した通り、nは原則、非常に大きいものであり得る。それゆえ、幾つかの実施形態においては、整数nは数百万、例えば、約10,000,000まで、又は、例えば、約5,000,000までであり得る。他の実施形態においては、nは数百、例えば、約500まで、又は、例えば、約400までであり得る。整数nは、例えば、2〜500の整数、又は3〜500の整数であり得る。nは2〜400の整数であり得る。他の実施形態においては、nは2〜300の整数、又は3〜200の整数であり得る。より典型的には、nは2〜200である。しかしながら、他の実施形態においては、nは2〜50の整数、又は3〜50の整数である。それは、例えば、2〜20又は2〜15であり得る。
【０４１４】
水性物体／液滴の集合体の1以上の水性構造体／液滴を生成するために、例えばソフトリソグラフィ等の技術を使用し得る。1以上の水性構造体／液滴は、例えば、成形され得る。幾つかの実施形態においては、1以上の水性構造体／液滴を生成するために、PMMAモールドを使用し得る。ヒドロゲルを含む1以上の（one of more）水性構造体／液滴を生成するために、例えば、ソフトリソグラフィを使用し得る。例えば、水性物体／液滴がヒドロゲルを含む場合に、モールドを使用し得る。
【０４１５】
水性物体／液滴の集合体の1以上の水性物体／液滴は、フォトリソグラフィ（photolithograph）を使用して生成し得る。光（例えばUV光等）が透過し得るパターンを定義するために、例えば、フォトマスクを使用し得る。光硬化性ポリマーを含む、1以上の（one of more）水性構造体／液滴を生成するために、例えば、フォトリソグラフィを使用し得る。水性物体／液滴がヒドロゲルを含む場合に、例えば、フォトリソグラフィを使用し得る。
【０４１６】
水性物体／液滴の集合体中の複数の水性構造体／液滴の少なくとも1つは、水性材料中に配置された磁性材料を含む。幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体中の水性構造体／液滴の少なくとも4分の1は、磁性材料を含み、例えば、水性物体／液滴の集合体中の水性物体／液滴の少なくとも半分は、磁性材料を含み得る。幾つかの実施形態においては、水性物体／液滴の集合体中の全ての水性構造体／液滴は、磁性材料を含む。磁性材料を含む、水性物体／液滴の集合体中の水性物体／液滴数は、例えば、水性物体／液滴の集合体を生成するために使用されるプロセスに依存し得る。例えば、水性物体／液滴の集合体を生成するために、浮上法が使用される場合、水性物体／液滴の少なくとも半分は磁性材料を含み得、例えば、全ての水性物体／液滴が磁性材料を含み得る。
【０４１７】
本発明の水性物体／液滴の集合体は、水性物体／液滴の封入体の一部を形成し得る。封入体は、例えば、以下：ある体積（例えば、一滴）の疎水性媒体；該体積の表面の周りの両親媒性分子の外層；及び外層内側の水性物体／液滴の集合体（水性物体／液滴の集合体は、本明細書で定義された水性物体／液滴の集合体である）を含み得る。その内部に配置された水性物体／液滴の集合体を含む、該体積の疎水性媒体は、例えば水性媒体等のバルクの親水性媒体中で提供され得る。該体積の疎水性媒体は、一滴の前記疎水性媒体であり得る。
典型的には、親水性媒体は水性媒体である。
【０４１８】
本発明者等は、水性物体／液滴の集合体を集合させるために、本明細書で定義された本発明の方法を使用し得ることを見出した。水性物体／液滴の集合体は、水性物体／液滴の2D又は3Dの集合体であり得る。水性物体／液滴の集合体は、例えば、本発明の水性物体／液滴の集合体について本明細書で定義された、水性物体／液滴の集合体であり得る。
【０４１９】
本発明の利点は、制御された様式で複雑な3D構造体を作製することが可能になることである。例えば、水性物体／液滴の集合体内で、例えば、膜タンパク質を介して、1つの水性物体／液滴から別の水性物体／液滴へ、情報を通過させ得る。2Dの集合体から3Dの集合体への移動によって、相互に連絡している水性構造体／液滴の数は、増大し得る。参照によりその内容が本明細書に取り込まれる、国際特許出願公開第WO2014/064461号において、液滴との関係で検討されている通り、Nの水性物体／液滴の2Dネットワーク中の最も距離が離れた水性構造体／液滴の間のマンハッタン距離は、2Dの集合体中の√Nから、3Dの集合体中の3√Nに増大し得る。
水性構造体／液滴の集合体を構築するために、本発明による方法を使用し得る。
【０４２０】
水性物体／液滴の集合体を集合させるために使用し得る、多くの異なる方法がある。国際特許出願公開第WO2014/064461号の開示によって、水性物体／液滴の集合体を集合させるために使用し得る方法の幾つかが示されている。
例えば、国際公開第WO2014/064461号の実施例1は、液滴の集合体を形成するための浮上法の使用について示している。該方法を繰り返すことによって、繰り返しの各々で、磁性材料を含む少なくとも1つの液滴が移動し、液滴の集合体が集合し得る。例えば、方法の該繰り返しの各々によって、単一の液滴が移動し得る。代替的に、方法の該繰り返しの少なくとも1つによって、2つ以上の液滴が移動し得る。
【０４２１】
更に、国際公開第WO2014/064461号の実施例3によって、液滴の集合体を形成するために運搬法をどのように使用し得るかが示される。例えば、液滴を前記第二の位置に配置する工程(iii)は、液滴を、別の液滴と接触させ得る。他の液滴は、磁性材料を含んでいる場合もあり、含んでいない場合もある。典型的には、液滴と他の液滴との間の接触面で、二重層が形成される。本発明の方法は繰り返しても良い。第一の繰り返しによって、例えば、二重層によって連結された2つの液滴が、第三の液滴と接触し得る。従って、方法の該繰り返しによって、1超の液滴が移動する。
【０４２２】
水性物体／液滴の集合体は、浮上法と運搬法との組合せを使用して、集合し得る。
本発明者等はまた、水性物体／液滴の集合体を解離させるために、本発明による方法を使用し得ることも見出している。水性物体／液滴の集合体を解離させるために、浮上法及び運搬法の両方を使用し得る。液滴を含む2D又は3D構造体を解離させるために、該方法を使用する場合、第一の位置の液滴は最初に別の液滴と接触する。例えば、液滴は他の液滴と二重層を形成し得る。
【０４２３】
液滴の集合体を解離させるための方法の使用は、国際公開第WO2014/064461号の実施例2及び4に示されている。
国際公開第WO2014/064461号の実施例2は、液滴の集合体を解離させるための浮上法の使用について記載している。第一の位置の液滴は、液滴の集合体中の液滴である。典型的には、上記の通り、浮上法を使用する場合、液滴が第一の位置にあるときは、パターン化された表面上に配置される。液滴の集合体中の他の液滴の少なくとも1つはまた、パターン化された表面上にも配置される。国際公開第WO2014/064461号の実施例2において検討されている通り、パターン化された表面は、液滴だけが該プロセス中において移動するように、他の液滴をその場に留めるのを補助する。当業者が理解するように、液滴の集合体中の液滴数が少なくなるにつれ、典型的には、更なる液滴を除去することがより困難になる。
【０４２４】
解離については、国際公開第WO2014/064461号の実施例4に記載されている。この方法においては、液滴は、液滴の集合体中で、液滴と融合し、その結果、第一の位置の液滴は、液滴の集合体中の液滴ではない。本発明者等は、両親媒性分子の濃度が低下した場合、典型的には、液滴と別の液滴との融合がより容易になることを見出している。例えば、融合は120秒より短いか又はそれと同等、例えば、3〜29秒かかる場合がある。
【０４２５】
水性物体／液滴の集合体は、封入体、例えば、水性物体／液滴の封入体の一部を形成し得る。一般的に、液滴の封入体は、以下：ある体積（例えば一滴等)の疎水性媒体；該体積の表面の周りの両親媒性分子の外層；及び外層内側の水性物体／液滴の集合体（該水性物体／液滴の集合体は本明細書で定義された通りである）を含む。本発明による方法において、封入体の外層を形成する両親媒性分子は、疎水性媒体中、又はバルクの親水性媒体中で提供され得る。
【０４２６】
水性物体／液滴の集合体を、集合体及び解離させるための本発明による方法の使用は、上記で検討されている。当業者が理解するように、これらの方法は、水性物体／液滴の集合体を再配置するためにも使用し得る。これは、例えば、水性物体（複数可）／液滴（複数可）が集合体内の異なる水性物体／液滴と接触するよう、集合体からの水性物体／液滴又は水性構造体／液滴の除去、水性物体（複数可）／液滴（複数可）を移動させること、及び水性物体（複数可）／液滴（複数可）を配置することを含み得る。このことは、例、国際公開第WO2014/064461号の図9において示されている。
【０４２７】
代替的に、複数の水性物体（複数可）／液滴を、同時に、第一の位置から第二の位置に移動させるために、本明細書に記載された本発明による方法を使用し得る。複数の水性物体（複数可）／液滴の移動（浮上なし）は、例、国際公開第WO2014/064461号の図11において示されている。本発明者等は、集合体全体の輸送の間に、集合体の形状及び任意の二重層の連結が維持され得ることを見出している。
【０４２８】
単一の水性物体／液滴を、第一の位置から第二の位置に移動させるために、本明細書に記載された本発明による方法を使用し得る。水性物体／液滴及び1以上の他の水性構造体／液滴を、第一の位置から第二の位置に移動させるためにも、これらの方法をまた使用し得る。典型的には、移動させられる接触している水性構造体／液滴の間の各接触面は、両親媒性分子の二重層を含む。当業者が理解するように、1超の水性物体／液滴を移動させる場合、水性物体／液滴を一緒に保持する力（例、接触面で二重層を形成している、2つの単層の間の相互作用の強度）は、水性構造体／液滴を解離させる力よりも強くなければならない。このことは、典型的には、二重層の強度が牽引力よりも強くなければならないことを意味する。国際公開第WO2014/064461号の図21は、運搬法を使用して、接触している液滴及び他の液滴に働く力について概説している。
【０４２９】
幾つかの実施形態においては、第一の位置の水性構造体／液滴は、第二の水性構造体／液滴と二重層を形成し、水性構造体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴及び第二の水性物体／液滴を、疎水性媒体の上部に上昇させ、磁石に向かって移動させる。
典型的には、第二の水性物体／液滴は磁性材料を含む。通常、磁性材料は本明細書で定義された通りである。
【０４３０】
通常、水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程によって、水性物体／液滴及び第二の水性物体／液滴が、疎水性媒体の上部に上昇し、磁石に向かって移動する場合、磁石を第一の位置に対して移動させる(ii)の工程によって、第一の水性物体／液滴及び第二の水性物体／液滴が移動する。
典型的には、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置又はその近傍の前記磁場に曝露するのを止めることを含む。
【０４３１】
水性物体／液滴を前記磁場に曝露する(i)の工程よって、水性物体／液滴及び第二の水性物体／液滴が、疎水性媒体の上部に上昇し、磁石に向かって移動する場合、通常、水性物体／液滴を前記第二の位置に配置する(iii)の工程は、水性物体／液滴を前記第二の位置の近傍の前記磁場に曝露するのを止めること、及び水性物体／液滴が前記第二の位置に到達できるようにすることを含む。
例えば、水性物体／液滴は、重力の影響で、疎水性媒体中を沈降することによって、前記第二の位置に到達し得る。
【０４３２】
通常、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させることを含む。典型的には、磁石は永久磁石であり、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止めることは、通常、水性物体／液滴がもはや磁石に引き寄せられないように、磁石を水性物体／液滴から離れるよう移動させることを要する。
【０４３３】
代替的に、磁石が電磁石である場合、水性物体／液滴を前記磁場に曝露するのを止める工程は、電磁石の電源を切ることを含み得る。典型的には、電磁石は、電磁石の電線を流れる電流を停止することによって、電源が切られる。
【０４３４】
本発明による方法は、前記水性物体／液滴を回収することを更に含み得る。
本発明は、水性物体、例、液滴又はヒドロゲル物体のネットワークを含む電気化学回路を更に提供する（ネットワークは複数の水性物体、例、液滴又はヒドロゲル物体を含む）。
【０４３５】
一実施形態においては、前記水性物体の各々は、以下：液滴、及び液滴の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含む（前記液滴の各々は、別の前記液滴と接触し、接触している液滴の間で接触面を形成する）。ヒドロゲル物体のネットワークは、本明細書で定義された通りである。
【０４３６】
一実施形態においては、前記水性物体の各々は、以下：ヒドロゲル体、及びヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含む（前記ヒドロゲル物体の各々は、別の前記ヒドロゲル物体と接触し、接触しているヒドロゲル物体の間で接触面を形成する）。ヒドロゲル物体のネットワークは本明細書で定義された通りである。
【０４３７】
本発明の電気化学回路においては、電流はイオンにより、ネットワークを介して運ばれ得る。
通常、本発明の電気化学回路は、前記水性の、例、ヒドロゲルの、物体と接触している第一の電極、及び第二の電極を含む。
典型的には、電極は電気化学的に可逆的な電極である。通常、第一の電極及び／又は第二の電極は、例えばAg／AgCl電極等の電気化学的に活性な電極を含む。
【０４３８】
代替的に、例えばフェロシアン化物等の電気化学的に活性なメディエーターと一緒に使用する場合、電極は仕事関数の高い金属（例えば、金、銀、ニッケル、パラジウム又は白金）であり得る。例えば、レドックス対、又はレドックス対を提供するために部分的に酸化又は還元され得るレドックス対のメンバーが使用され得る。好適なレドックス対としては、当該分野において公知である、例えばFe2+/Fe3+、フェロセン／フェロセニウム（ferrocium）又はRu2+/Ru3+等が挙げられる。そのようなものの例は、フェロ／フェリシアン化物、ルテニウムヘキサミン及びフェロセンカルボン酸である。
【０４３９】
幾つかの実施形態においては、第二の電極は、ネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体のいずれとも接触しない。第二の電極がヒドロゲルネットワーク中の複数のヒドロゲル物体のいずれとも接触しない電気化学回路の例は、国際公開第WO2014064459号の図7に示されている。他の実施形態においては、第二の電極は、ネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体の少なくとも1つと接触する。
【０４４０】
当業者が理解するように、ネットワーク中の水性の、例、ヒドロゲルの、物体は、様々な配置を形成するよう再構成され得る。これが起こる場合、ある構成においては、第二の電極はネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体のいずれとも接触せず、別の構成においては、第二の電極はネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体の少なくとも1つと接触する。従って、電気化学回路は、例えば、スイッチ、又はスイッチの構成部品を形成し得る。
【０４４１】
典型的には、本発明の電気化学回路は、前記水性の、例、ヒドロゲルの、物体と接触している第一の電極、及び第二の電極を含み、第二の電極は異なる水性の、例、ヒドロゲルの、物体と接触している。第二の電極と接触している異なる物体は、ネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体の一つであり得る。代替的に、第二の電極と接触している異なる水性の、例、ヒドロゲルの、物体は、ネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体の一つでない場合がある。それは、上記で記載された種類の「更なる水性の、例、ヒドロゲルの、物体」、例、「独立型」の物体であり得る。
【０４４２】
幾つかの実施形態においては、第二の電極は、ネットワーク中の前記複数の水性の、例、ヒドロゲルの、物体の、別の前記水性の、例、ヒドロゲルの、物体と接触している。
【０４４３】
幾つかの実施形態においては、本発明の電気化学回路においては、前記水性物体の少なくとも1つは、ヒドロゲルワイヤを含むヒドロゲル体である。ヒドロゲルワイヤ又はワイヤ形状のヒドロゲル体は、典型的には、本明細書において定義された通りである。幾つかの実施形態においては、前記ヒドロゲル物体の少なくとも2つはヒドロゲルワイヤである。
【０４４４】
電気化学回路は、回路内で一緒に結び付いた、多くのそのようなワイヤを含み得る。このようにして、完全な回路を構築し得る。従って、例えば、電気化学回路中の全てのヒドロゲル体はヒドロゲルワイヤであり得る。
典型的には、本発明の電気化学回路は疎水性媒体を更に含み、ネットワークが疎水性媒体と接触している。
【０４４５】
幾つかの実施形態においては、1以上の前記水性の、例、ヒドロゲルの、物体は基板上に配置される。通常、基板は非導電性である。
例えば、基板はガラス又はプラスチックを含み得る。従って、基板は、例えば、ペトリ皿であっても良い。水性物体がヒドロゲル物体である場合、ヒドロゲル物体は、本明細書で定義された任意のヒドロゲル物体であり得る。
【０４４６】
幾つかの実施形態においては、基板はポリマーを含む。ポリマーの繰り返し単位は、例えば、-C(=O)O-又は-Si(CH3)2O-基を含み得る。ポリマーは、例えば、PMMA (ポリ(メチルメタクリレート))又はPDMS (ポリジメチルシロキサン)であっても良い。
【０４４７】
本発明は、ヒドロゲルネットワークを含む電気化学回路であって、ネットワークが複数のヒドロゲル物体を含み、前記ヒドロゲル物体の各々がヒドロゲル体を含み、前記ヒドロゲル物体の各々が、別の前記ヒドロゲル物体と接触して、接触しているヒドロゲル物体間の接触面を形成する、回路を更に提供する。通常、電気化学回路は、前記ヒドロゲル物体と接触している第一の電極、及び第二の電極を更に含む。
【０４４８】
従って、電気化学回路のヒドロゲルネットワーク中のヒドロゲル物体は、ヒドロゲル体の表面上の任意の部分において、両親媒性分子の外層を含む必要がない。両親媒性分子の外層がない場合、典型的には、接触しているヒドロゲル物体間の接触面に、両親媒性分子の二重層がない。幾つかの実施形態においては、例えば、ヒドロゲル物体は疎水性媒体中にない。
【０４４９】
1つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体は、例えば、接触しているヒドロゲル物体間の前記接触面の少なくとも1つで、別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触し得る。
幾つかの実施形態においては、第二の電極は、ヒドロゲルネットワーク中の前記複数のヒドロゲル物体のいずれとも接触していない。他の実施形態においては、第二の電極は、ヒドロゲルネットワーク中の前記複数のヒドロゲル物体の少なくとも1つと接触している。
ヒドロゲル体は、本明細書中（上記）で更に定義された通りであり得る。
【０４５０】
典型的には、電気化学回路は、前記ヒドロゲル物体と接触している前記第一の電極、及び別の前記ヒドロゲル物体と接触している第二の電極を含む。
幾つかの実施形態においては、前記ヒドロゲル体の少なくとも1つは、ヒドロゲルワイヤである。通常、ワイヤ、又はワイヤ形状のヒドロゲル体は、本明細書で定義された通りである。典型的には、前記ヒドロゲル物体の少なくとも2つはヒドロゲルワイヤである。例えば、電気化学回路は、ワイヤの形状中に3つ以上のヒドロゲル物体を含み得る。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲル体の少なくとも半分はヒドロゲルワイヤであり、例えば、全てのヒドロゲル体がヒドロゲルワイヤである。
【０４５１】
電気化学回路においては、例えば、第一の電極又は第二の電極と接触している少なくとも1つのヒドロゲルワイヤがあっても良い。幾つかの実施形態においては、第一の電極又は第二の電極と接触していない、前記ヒドロゲルワイヤの少なくとも1つがあっても良い。
【０４５２】
電気化学回路は疎水性媒体を更に含み得る（疎水性媒体はヒドロゲルネットワークと接触している）。典型的には、疎水性媒体は本明細書で定義された通りである。
幾つかの実施形態においては、1以上の前記ヒドロゲル物体は基板上に配置される。基板は、本明細書で更に定義された通りであり得る。ヒドロゲル物体はまた、本明細書で更に定義された通りであり得る。
【０４５３】
一実施形態においては、前記複数のヒドロゲル物体のいずれか一つは、ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部において両親媒性分子の外層を更に含む。両親媒性分子は、本明細書で更に定義された通りであり得る。例えば、前記複数のヒドロゲル物体の各々は、ヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を更に含み得る。
通常、両親媒性分子の濃度は、本明細書中（上記）で定義された通りである。
【０４５４】
本発明はまた、機械的な装置用のヒドロゲル構成要素も提供し、ヒドロゲル構成要素がヒドロゲルネットワークを含み、ネットワークが複数のヒドロゲル物体を含み、前記ヒドロゲル物体の各々が以下：ヒドロゲル体、及びヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含む（前記ヒドロゲル物体の各々は、別の前記ヒドロゲル物体と接触し、接触しているヒドロゲル物体間の接触面を形成する）。
【０４５５】
従来型の装置及びそれらの部品（例、ギヤ、ネジ、ナット及びボルト）の骨格は、硬い構成要素から作られる。しかしながら、本発明者等は、ヒドロゲルネットワークを、機械的な装置（「軟物質の機械的な装置」）の部品として使用し得ることを見出しており、従って、機械的な装置は軟物質の構成要素を含み得ることを実証している。例えば、ヒドロゲルネットワークは、電子回路を切り替えるために必要な機械的な構成要素の少なくとも一部を形成するために使用し得る。このことは、電子回路における手動のスイッチとして使用される、単層の脂質で覆われている十字形のヒドロゲル物体を示す、例、国際公開第WO2014/064459号の図15において実証されている。
【０４５６】
典型的には、本発明のヒドロゲル構成要素においては、ヒドロゲル物体のネットワークは本明細書で更に定義された通りである。
幾つかの実施形態においては、1以上の前記ヒドロゲル物体は、可動部分であるか、又は可動部分の一部を形成する。
【０４５７】
可動部分は、前記ヒドロゲル物体の全てを含み得る。代替的に、前記の構成部分の一部を形成しないネットワーク中に、ヒドロゲル物体が更にあっても良い。2つ以上の構成部分があっても良い。その場合においては、個々の構成部分が互いに独立して移動しても良く、又は一緒に移動しても良い。
【０４５８】
幾つかの実施形態においては、1以上の前記ヒドロゲル物体は、ネットワーク中の1以上の他のヒドロゲル物体に対して移動可能である部分を形成する。1以上の前記ヒドロゲル物体が、ネットワーク中の1以上の他のヒドロゲル物体に対して移動可能である部分を形成する、ヒドロゲル構成要素の例はスイッチである。
【０４５９】
可動部分を移動させるために、様々な異なる刺激を使用し得る。
可動部分は、例えば、磁気、電磁気、機械的な力又は手動による力を印加することによって動かし得る。例えば、磁性材料が、ヒドロゲル物体に挿入され得、次いで物体が外部の磁場を印加することによって、動かされ得る（例えば、外部の磁場は、例えばネオジム磁石等の磁石をヒドロゲル物体に向かって移動させることによってか、又は電磁場上でスイッチを入れることによって、印加し得る）。ヒドロゲル物体に挿入された磁性材料は、例えば、磁気ビーズを含み得る。
【０４６０】
幾つかの実施形態においては、可動部分は、回転子又はスイッチの構成要素を含む。可動部分は、例えば、回路のスイッチを入れるか又は切るために、可動部分が動かされる、電子回路の部分を形成し得る。代替的に、可動部分は回転子の部分を形成し得る。
【０４６１】
ヒドロゲル構成要素がスイッチの構成要素を形成する場合、スイッチは少なくとも3つのヒドロゲル物体を含み得る。例えば、スイッチは、2つの球形のヒドロゲル物体及び棒状のヒドロゲル物体を含み得る。この構成においては、棒状のヒドロゲル物体は、例えば、2つの球形のヒドロゲル物体と接触するように（例えば、スイッチを入れるために）回転され得るか、又は2つの球形のヒドロゲル物体と接触しないように（例えば、スイッチを切るために）回転され得る。
【０４６２】
代替的に、スイッチは、十字形のヒドロゲル物体を含み得る。スイッチは、2つの球形のヒドロゲル物体を更に含み得る。幾つかの実施形態においては、十字形の物体は、2つの球形のヒドロゲル物体と接触するように（例えば、スイッチを入れるために）回転され得るか、又は2つの球形のヒドロゲル物体と接触しないように（例えば、スイッチを切るために）回転され得る。十字形のヒドロゲル物体が球形のヒドロゲル物体と接触する場合、少なくとも2つの接触面（各々の球形のヒドロゲル物体と十字形のヒドロゲル物体との間に1つの接触面）が形成される。両親媒性分子の二重層は、例えば、これらの接触面の少なくとも1つで形成され得る。典型的には、両親媒性分子の二重層は、これらの接触面の両方で形成される。
【０４６３】
ヒドロゲル構成要素が回転子の部分を形成する場合、回転子は、例えば、磁場を使用して回転し得る。
通常、回転子は少なくとも5つのヒドロゲル物体を含む。典型的には、回転子は少なくとも1つの十字形のヒドロゲル物体及び4つの三日月形のヒドロゲル物体を含む。より典型的には、三日月形のヒドロゲル物体と十字形のヒドロゲル物体との間の接触面は、両親媒性分子の二重層を含まない。例えば、十字形のヒドロゲル物体と三日月形のヒドロゲル物体の各々との接触面で、ヒドロゲル物体は、互いに直接接触し得る。従って、十字形のヒドロゲル物体は、4つの三日月形のヒドロゲル物体と直接接触し得る。1以上の前記ヒドロゲル物体は、例えば磁気ビーズ等の、例えば、磁石を含み得る。
【０４６４】
本発明の水性物体の、例、特にヒドロゲルの、ネットワークの更なる用途としては、膜タンパク質の基礎的な研究のための新規なプラットフォームを提供すること、及び「ボトムアップ型」合成生物学の多区画プロトセルシャーシとして作用することが挙げられるが、それらに限定されない。従って、プロトセル及びプロトティシューを作製するために、ネットワークを使用し得る。
【０４６５】
最小の合成組織に関して、ヒドロゲルの形状は、純粋な水性液滴によって保持され得ない形態を有する、頑強な生体適合性の構成要素（building blocks）である。ヒドロゲルによって、未発達な（primitive）細胞骨格を有する水性区画が与えられる。例えば、ヒドロゲル体は、構成要素（building blocks）が例えば脂質二重層等の両親媒性分子の二重層で隔てられ得る、構造体へと集合させられ得る。該構造体は容易に再配置され得、接触面の二重層を介した情報伝達が、タンパク質孔を用いて達成され得る。この方法によって、構造体を介するか、又は接触している電極への電気的なシグナル伝達が可能である。押し出された（extruded）ヒドロゲルワイヤ又はペイントされた（painted）ヒドロゲル連結の使用によって、情報伝達の多用途性が強化され得る。これらのワイヤ及び連結は、神経の類似体である。
【０４６６】
従って、本発明はまた、合成生物学における、水性物体ネットワークの、特にヒドロゲルネットワークの使用も提供する。水性物体ネットワーク、例、液滴又はヒドロゲルネットワークは、本明細書で定義された通りであり得る。
プロトセル又はプロトセルの凝集体 (プロトティシュー)の調製方法における、本明細書で定義された本発明の水性物体ネットワークの、特にヒドロゲルネットワークの、又は本明細書で定義された本発明の組成物の使用が更に提供される。
【０４６７】
本発明はまた、電気化学回路又は機械的な装置の構成要素としての、本明細書で定義された、水性物体ネットワークの、特にヒドロゲルネットワークの使用も提供する。電気化学回路又は機械的な装置は、本明細書で更に定義された通りであり得る。
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワークを、機械的な装置の構成要素として使用する場合、ヒドロゲルネットワークは可動部分を含む。可動部分は、本明細書で定義された通りであり得る。例えば、ヒドロゲルネットワークは、回転子を含み得る。ヒドロゲル回転子は、例えば、液滴回収ユニットとして使用し得る。
【０４６８】
液滴回収ユニットは、本明細書において定義された回転子を含み得る。回転子の周りの液滴を回収するために、液滴回収ユニットを使用し得る。液滴は、例えば、本明細書において定義された水性液滴又はヒドロゲル体であっても良い。液滴と、回転子の1以上の（one of more）ヒドロゲル物体との間の両親媒性分子の二重層の形成によって、液滴の回収が促進され得る。液滴は、例えば、回転子の回転によって生み出される求心力の結果として回収され得る。液滴回収ユニットは、例、国際公開第WO2014/064459号の図19及び20において示される。実験によって、二重層ネットワークのボトムアップ集合体における使用のために、軟物質の構成要素を使用して、機械的な装置を組み立てることの実現可能性が実証されている。
【０４６９】
本発明はまた、スイッチとしての、又はスイッチの構成部分としての、本明細書で定義されたヒドロゲルネットワークの使用も提供する。スイッチ、又はスイッチの構成部分は、本明細書で定義された通りであり得る。例えば、ヒドロゲルネットワークは、電気化学的なスイッチとして使用され得る。
【０４７０】
本発明のヒドロゲルネットワークは、ヒドロゲルネットワークを生成するための本発明の方法によって生成され得、ヒドロゲルネットワークは複数のヒドロゲル物体を含み、前記ヒドロゲル物体の各々は以下：ヒドロゲル体、及びヒドロゲル体の表面の少なくとも一部における両親媒性分子の外層を含み、前記ヒドロゲル物体の各々が、別の前記ヒドロゲル物体と接触し、接触しているヒドロゲル物体間の接触面を形成し；方法が、複数のヒドロゲル体を複数の両親媒性分子を含む媒体中に導入すること；及び前記ヒドロゲル体を前記ネットワーク中に集合させること、又は前記ヒドロゲル体が前記ネットワーク中に自己集合するのを可能にすることを含む。ヒドロゲルネットワークは本明細書で定義された通りである。
【０４７１】
ヒドロゲル体は本明細書において定義された通りである。通常、ヒドロゲル体は成形される。例えば、ヒドロゲル体を生成するために、所望の形状のPMMAモールドを使用し得る。典型的には、ヒドロゲルを融解し、モールド中に注ぐ。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワーク中のヒドロゲル体の少なくとも1つは、1超のヒドロゲルを含み得る。
【０４７２】
ヒドロゲルは本明細書において定義された通りであり得る。ゲル化後、ヒドロゲルは、通常、モールドから取り出され、疎水性媒体に浸漬される。ワイヤ形状のヒドロゲル体を形成するために、典型的には、温かいヒドロゲルが、毛細管作用によってチューブに引き込まれる。次いで、温かいヒドロゲルは、通常、ゲルにされる。生成されたワイヤ形状のヒドロゲル体は、典型的には、本明細書において定義された通りである。
【０４７３】
代替的に、ヒドロゲル体は、光源からの光（例えばUV光等）及びフォトマスクを使用して成形され得る。フォトマスクは、典型的には、光が透過し得るパターンを定義するために使用される。通常、ヒドロゲル体は、光硬化性ポリマー上に、フォトマスクを通して光（例えばUV光等）を照射することで成形される。光硬化性ポリマーは光によって重合化する。この実施形態においては、ヒドロゲルは光硬化性ポリマーを含む。
典型的には、媒体は、本明細書において定義された疎水性媒体である。
通常、両親媒性分子は、本明細書において定義された通りである。
【０４７４】
典型的には、複数のヒドロゲル体を複数の両親媒性分子を含む媒体中に導入する工程は、例えばヘキサデカン等の疎水性媒体中に複数のヒドロゲル体を導入することを含み、疎水性媒体は複数の両親媒性分子を含む。通常、両親媒性分子は、例えばDPhPC等の脂質を含む。
幾つかの実施形態においては、疎水性媒体はヘキサデカンを含み、両親媒性分子はDPhPCを含み、ヒドロゲル体中のヒドロゲルはアガロースを含む。
【０４７５】
典型的には、ヒドロゲルはアガロース及び水を含む。水中のアガロースの濃度は、典型的には、10% w/vアガロース未満か又はそれと同等である。例えば、前記水中のアガロースの濃度は、0.25〜5% w/vアガロースであっても良い。より典型的には、前記水中のアガロースの濃度は、0.5〜4% w/v、例えば、約1% w/v〜3% w/vである。通常、前記水中のアガロースの濃度は、約1% w/v又は3% w/vである。
【０４７６】
ヒドロゲル体は、例えばアガロース等の親水性材料、及び疎水性材料を含み得る。
通常、媒体中の両親媒性分子の濃度は、15 mg mL-1未満か又はそれと同等である。例えば、両親媒性分子の濃度は、0〜10 mg mL-1であり得る。
幾つかの実施形態においては、媒体中の両親媒性分子の濃度は、通常、0.5 mg mL-1と同等であるか又はそれ超である。例えば、両親媒性分子の濃度は、5 mg mL-1と同等であるか又はそれより大きくても良い。通常、両親媒性分子の濃度は、0.5 mg mL-1〜15 mg mL-1、例えば、5 mg mL-1〜15 mg mL-1である。接触面で二重層を形成するために、両親媒性分子の濃度は、通常、1 mg mL-1と同等であるか又はそれより大きく、例えば、5 mg mL-1と同等であるか又はそれ超である。
【０４７７】
他の実施形態においては、媒体中の両親媒性分子の濃度は、0.5〜10 mg mL-1である。通常、両親媒性分子の濃度は5〜10 mg mL-1である。本発明者等は、これらの濃度範囲が、両親媒性分子の二重層を含む少なくとも1つの接触面、及び両親媒性分子の二重層を含まない少なくとも1つの他の接触面を含む、ヒドロゲルネットワークを安定化するために好ましいことを見出した。同様に、これらの濃度範囲は、両親媒性分子の二重層を含む少なくとも1つの接触面、及び1つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体が別のヒドロゲル物体のヒドロゲル体と直接接触する少なくとも1つの他の接触面を含む、ヒドロゲルネットワークに有利に働くことが見出された。両親媒性分子の濃度は、それゆえ、5〜10 mg mL-1であり得る。
【０４７８】
更なる実施形態においては、媒体中の両親媒性分子の濃度は、5 mg mL-1未満か又はそれと同等、例えば、2 mg mL-1未満か又はそれと同等である。これらの濃度範囲は、しばしば、接触面が二重層を含まないネットワークに有利に働く。
ヒドロゲル体は、前記ネットワーク中に集合させられるか、又は前記ネットワーク中に自己集合させられる。
【０４７９】
ヒドロゲル体が前記ネットワーク中に集合させられる場合、前記ヒドロゲル体を前記ネットワーク中に集合させる工程は、通常、ヒドロゲル物体の所望の配置の集合体を形成するために、1つのヒドロゲル体又は2つ以上のヒドロゲル体を操作することを含む。操作は、通常、ニードルを使用して、1つのヒドロゲル体又は2つ以上のヒドロゲル体を操作することを含む。典型的には、ニードルは、例えば鋼製のニードル等の金属のニードルである。
【０４８０】
ヒドロゲル体が前記ネットワーク中に自己集合させられる場合、前記ヒドロゲル体を前記ネットワーク中に自己集合体させる工程は、典型的には、媒体中でヒドロゲル体を撹拌することを含む。当然、ネットワーク中へのヒドロゲル体の自己集合体速度は、媒体の粘度及び媒体中の両親媒性分子の濃度に依存する。媒体の粘度及び／又は両親媒性分子の濃度が増加するにつれ、典型的には、自己集合体速度が低下する。
【０４８１】
幾つかの実施形態においては、方法は以下：複数のヒドロゲル体を複数の両親媒性分子を含む媒体中に導入すること；前記ヒドロゲル体を前記ネットワーク中に集めること；及び前記ヒドロゲル体を前記ネットワーク中に自己集合体できるようにすることを含む。
【０４８２】
幾つかの実施形態においては、該方法は、両親媒性分子の二重層を含まない前記任意の2つのヒドロゲル物体の間に接触面を形成するために、前記複数のヒドロゲル物体のいずれか2つを接触させることを更に含む。前記複数のヒドロゲル物体のいずれか2つを接触させることによって、両親媒性分子の二重層が接触面で効果的に絞り出され、及び／又は二重層が第一の位置における接触面で形成されることが抑制されるか、若しくは二重層が接触面で再形成されることが抑制されると考えられる。従って、これらの実施形態においては、該方法によって、両親媒性分子の二重層を含まない少なくとも1つの接触面を含むネットワークが生成される。当業者は、両親媒性分子の二重層を含まない少なくとも1つの接触面を含む、本明細書で定義された任意のネットワークが、この方法によって生成され得ることを理解する。
【０４８３】
該方法は、例えば、2つのヒドロゲル物体のヒドロゲル体が互いに直接接触している、前記任意の2つのヒドロゲル物体の間の接触面を形成するために、前記複数のヒドロゲル物体のいずれか2つを接触させることを更に含む。従って、該方法は、2つのヒドロゲル体が互いに直接接触している接触面の、少なくとも1つの接触面を含むネットワークを生成するために使用し得る。当業者は、ヒドロゲル物体が互いに直接接触している接触面の、少なくとも1つの接触面を含む、本明細書中で定義された任意のネットワークは、この方法によって生成し得ることを理解する。
【０４８４】
他の実施形態においては、該方法は、前記2つの接触しているヒドロゲル物体の間の接触面で（an）両親媒性分子の二重層を形成するために、前記複数のヒドロゲル物体のいずれか2つを解離させることを更に含む。
【０４８５】
幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワークが少なくとも2つの接触面を含む場合、該方法は以下：(i) 両親媒性分子の二重層を含まない前記ヒドロゲル物体の間に接触面を形成するために、第一の接触面で2つのヒドロゲル物体を接触させること；及び(ii) 両親媒性分子の二重層を含む前記任意の2つのヒドロゲル物体の間に接触面を形成するために、第二の接触面で2つのヒドロゲル物体を解離させることを含む。例えば、該方法は、以下：(i) 2つのヒドロゲル体が直接接触している接触面を形成するために、第一の接触面で2つのヒドロゲル物体を接触させること；及び(ii) 両親媒性分子の二重層を含む前記任意の2つのヒドロゲル物体の間に接触面を形成するために、第二の接触面で2つのヒドロゲル物体を解離させることを含み得る。
【０４８６】
幾つかの実施形態においては、該方法は、前記接触面のいずれかで、二重層のサイズを調整するために、前記複数のヒドロゲル物体のいずれか2つを接触させること又は解離させることを更に含む。（国際公開第WO2014/064459号の図5は、前記複数のヒドロゲル物体のいずれか2つが接触するか又は解離する場合に、典型的に、二重層のサイズに起こることについての説明を提供する。）これらの実施形態においては、両親媒性分子の二重層は接触面で完全に絞り出されず、該方法によって、両親媒性分子の二重層を含む少なくとも1つの接触面を含むネットワークが生成される。当業者は、両親媒性分子の二重層を含む少なくとも1つの接触面を含む、本明細書で定義された任意のネットワークが、この方法によって生成され得ることを理解する。幾つかの実施形態においては、ヒドロゲルネットワークが少なくとも2つの接触面を含む場合、該方法は以下：(i) 第一の接触面で二重層のサイズを調整するために、第一の接触面で2つのヒドロゲル物体を接触させること；及び(ii) 第二の接触面で二重層のサイズを調整するために、第二の接触面で2つのヒドロゲル物体を解離させることを含む。
【０４８７】
本発明の方法は：(a) 前記の2つのヒドロゲル物体の間の接触面で両親媒性分子の二重層を形成するため；(b) 前記の2つのヒドロゲル物体の間の接触面から両親媒性分子の二重層を除去するため；又は(c) 前記の2つのヒドロゲル物体の間の接触面で二重層の面積を変化させるために、前記ヒドロゲル物体のいずれか2つの間の距離を調整することを更に含み得る。他の実施形態においては、本発明の方法は、前記の2つのヒドロゲル物体の間の接触面で二重層のサイズを調整するために、前記ヒドロゲル物体のいずれか2つの間の距離を調整することを更に含み得る。
【０４８８】
通常、前記任意の2つのヒドロゲル物体の間の距離は、マイクロマニピュレーターを使用して調整する。
幾つかの実施形態においては、その、又は各々の前記接触面での（at the or）両親媒性分子の二重層の存在又は非存在を調節するために、前記媒体中の両親媒性分子の濃度を調整する。
【０４８９】
上述の通り、接触面で二重層を形成するために必要な両親媒性分子の濃度は、ヒドロゲル体のサイズ及び形状に依存し得る。従って、前記接触面で両親媒性分子の二重層の存在又は非存在を調節するために、前記媒体中の両親媒性分子の濃度になされた調整は、通常、その接触面のヒドロゲル体のサイズ及び形状に依存する。
【０４９０】
幾つかの実施形態においては、前記接触面で両親媒性分子の二重層の存在又は非存在を調節するために、前記媒体中の両親媒性分子の濃度が調整される場合：
(i)両親媒性分子の濃度は、x超から、x未満か若しくはそれと同等であるように調整され；
(ii)両親媒性分子の濃度は、y未満から、yと同等であるか若しくはそれ超に調整され；
(iii)両親媒性分子の濃度は、x未満か若しくはそれと同等である状態から、x超であるがy未満に調整され；又は
(iv)両親媒性分子の濃度は、yと同等であるか若しくはそれ超から、x超であるがy未満に調整される（xは0.5 mg mL-1であり、yは10 mg mL-1である）。
xは例えば、1 mg mL-1又は2 mg mL-1であっても良い。幾つかの実施形態においては、xは5 mg mL-1である。
【０４９１】
本発明の方法においては、媒体は、例えば、疎水性媒体であっても良い。疎水性媒体は、例えば、本明細書（上記）で定義された疎水性媒体であっても良い。
【０４９２】
一実施形態においては、本発明の方法は、両親媒性分子の存在下で、その中に配置されたヒドロゲルネットワークを含むある体積の疎水性媒体を、バルクの親水性媒体中に導入することを更に含む。該体積は、一滴の疎水性媒体であり得る。
バルクの親水性媒体は、例えば、水性媒体であっても良い。
【０４９３】
それゆえ、本発明のヒドロゲルネットワークを含む封入体を形成するために、該方法を使用し得る。典型的には、封入体は、ある体積の疎水性媒体（例えば、一滴）；該体積の表面の周りの両親媒性分子の外層；及び外層内側のヒドロゲルネットワークを含む。本発明の方法において、封入体の外層を形成する両親媒性分子は、疎水性媒体中、又はバルクの親水性媒体中で提供され得る。
【０４９４】
ヒドロゲル物体のネットワークの製造方法は、ヒドロゲル物体の前記ネットワークを回収することを更に含み得る（ヒドロゲル物体は本明細書で定義された通りである）。
本発明はまた、本明細書で定義された方法によって得ることができるヒドロゲル物体のネットワークも提供する。
本発明はまた、合成生物学における、本明細書で定義された水性物体／液滴の集合体の使用も提供する。
【０４９５】
プロトセル又はプロトセルの凝集体の調製における、本明細書で定義された水性物体／液滴の集合体の使用が更に提供される。
本発明によって、情報伝達ネットワーク又は情報伝達ネットワークの一部としての、本明細書で定義された水性物体／液滴の集合体の使用もまた提供される。
【０４９６】
例えば、水性物体／液滴の集合体は、第一の複数の水性構造体／液滴及び第二の複数の水性構造体／液滴であって、第一の複数の水性構造体／液滴中の水性構造体／液滴が、膜タンパク質を介して互いに情報を交換する、水性構造体／液滴を含み得る。典型的には、第二の複数の水性構造体／液滴中の水性構造体／液滴は、膜タンパク質を介して互いに情報伝達しない。
【０４９７】
本発明はまた、エネルギーを貯蔵するための、本明細書で定義された水性物体／液滴の集合体の使用も提供する。
【０４９８】
液滴3Dプリンタの概要：液滴を生成するための装置（例、液滴ネットワークの3Dプリンター）の例の記述は、Villarら、Science 340、48-52 (2013)中に見出され得る。簡易には、液滴生成器（「ピエゾ（piezo）」として言及される場合がある）は、突出しているテーパ状の（tapered）毛細管ノズルを有する水性チャンバーの背面をシールする圧電性ディスクを含んでいた。先端部が、例えば油中脂質溶液等のバルクの疎水性媒体中に浸漬される場合、方形波電圧パルスの印加によって、ピエゾはノズルから液滴を吐出することができる。プリントステージ、例、オイル容器を三次元で移動させるために、電子マイクロマニピュレーターを使用した。これと、「プリントマップ」を読み取り、液滴の吐出を自動化する、ラボデザインのプリントソフトウェアとの組合せによって、空間的に配置された液滴を連続的に積層することによる、3D液滴ネットワークの構築が可能になった。
【０４９９】
本発明について、以下の実施例において更に説明する。実施例は、本発明の範囲を限定するものでない。
【実施例】
【０５００】
本発明者等は、既に、3Dプリンティングを使用し、ピコリットルの水性区画が脂質二重層によって隔てられた組織様材料を調製している。本研究においては、厳密に制御されたin vitro転写／翻訳システムを使用することによって、これらのプリントされた液滴を合成細胞へと仕上げている。合成細胞内の任意の遺伝子の発現をオンにするために使用され得る光活性化DNAプロモーターが開発されている。本発明者等は、光活性化を使用し、合成組織によって、3Dプリントされたパターン中にタンパク質孔を発現させた。孔は、特定の二重層の接触面に取り込まれ、それにより細胞を介して、方向性のある電気的な情報伝達を速やかに媒介する。従って、本発明者等は、正確な様式で調節され得る神経伝達の機能的な模倣を開発した。
【０５０１】
複数の軟物質の、封入された合成細胞が互いに情報伝達し得るシステムは作られていないが、無細胞発現媒体を含む、パターニングされた2Dの固体のマイクロ流体チャンバーは、分散によって情報伝達し得る(10)。更に、合成細胞内のタンパク質発現を調節し得る、光をベースとしない方法が開発されている。今回、本発明者等は、油中液滴3Dプリンター (11)を使用して、とりわけ、数百の合成細胞によって作り上げられた3D合成組織を作製している。更に、本発明者等は、厳密に制御された光活性化DNAプロモーターを開発した。これらの技術を組合せて使用し、神経伝達の機能的な模倣である導電路を形成するために3Dプリントされた合成細胞のサブセット中において、膜貫通孔、α-ヘモリシン (αHL)を発現させることによって、合成組織を介した光活性化による電気的な情報伝達が達成された。
【０５０２】
光活性化転写及び／又は翻訳は既に達成されているが、これらのシステムはいずれも、オフ状態で転写を完全に抑制しない(12)か、又は脂質膜が破裂するために合成細胞内に封入できない(13、14)。本発明者等は、DNAが光照射されるまで発現が起こらないように、目的の任意の遺伝子の上流に位置することができる、より有効な改良された光活性化T7プロモーター (LA-T7プロモーター) (図1A)を開発しようと試みた。タンパク質が発現しないように、有効な「オフ状態」が必要であり、それゆえ、活性化しない場合には機能は観察されない。このことを達成するために、一本鎖T7プロモーターDNA配列の至る所にC6-アミノ-dT修飾塩基を取り込んだ(図1B)。修飾したDNAをPCRプライマーとして、目的の遺伝子と共に使用した場合、PCビオチン成分がT7ポリメラーゼ結合部位の主溝（major groove）から突き出るように (図1A)、光分解性の(PC)ビオチンNHSエステルリンカー(15)を全てのアミンに連結した(図2)。PC基は、T7プロモーターの最小の傷を残し、未修飾のT7プロモーターと同様の発現を可能にするために、迅速かつ効率的に切断して元の第一級アミンに戻すことができる2-ニトロベンジル(15)である。T7プロモーター中の各ビオチンが、単一の一価のストレプトアビジン分子に結合するように (図3)、二本鎖DNAのPCR産物に一価のストレプトアビジンを付加することによって、光活性化DNA (LA-DNA)を作製した(16)。完全に「光分解された」対照として、本発明者等はアミンのみのDNAを使用した；C6-アミノ基だけがT7プロモーター中に存在し、PCビオチンを欠いており、それゆえ、ストレプトアビジンが結合しない。ゲル電気泳動によって測定されたように、本発明者等は、365 nm UV光で、一価のストレプトアビジン、ビオチン及びリンカー基が、LA-DNAから急速かつ効率良く光分解されることを観察した(図3)。アミンのみのDNAに対するストレプトアビジンの結合は観察されなかった (図3)。
【０５０３】
本発明者等は、タンパク質の無細胞発現のために、タンパク質発現に必要な最小限の細菌の構成要素を含む(18)、PUREシステム(17)を使用した。転写のためにのみT7 RNAポリメラーゼを単独で使用した。最初の実験として、LA-T7プロモーターを黄色蛍光タンパク質mVenusの上流に配置した。このLA-DNAからの、LA-mVenus DNAのRNA転写(図4)及びタンパク質発現 (図1C)は、「オフ状態」からの転写／発現が最小であったこと、及び「オンスイッチ」が非常に効果的であったことを実証した（DNAなしに対して標準化した後、オフ状態からオン状態で発現は>130倍に増大）。アミンのみのDNAと比較して、一価のストレプトアビジン又は光分解されたリンカー及びビオチンによる阻害効果は観察されなかった (図1C)。このことは、LA-DNA技術が、T7ポリメラーゼによるDNAの転写を厳密に制御することを実証している。
【０５０４】
合成細胞を作製するために、PUREシステムの構成要素をLA-DNAと混合し、該混合物を脂質でコートした油中水の液滴中に封入した (図5A及び6)。脂質でコートした油中の水性液滴を接触させ、細胞膜の二重層を模倣する、液滴の接触面の二重層 (DIB)(19)を形成することができる。DIBによって連結された液滴のネットワークは、柔軟なバイオデバイスとして既に利用されている(20〜22)。複雑な生物学的な構成要素を含む液滴の間のDIBの形成及びその安定性は、より複雑なネットワーク及びバイオデバイスの作製に対するハードルとなっている (23)。ある例においては、液滴内の高濃度のタンパク質は、液滴の融合を促進する。本発明者等は、新規な最適化された脂質組成物、例、DPhPC中の10又は15% DPPE-mPEG2000の混合物を開発し、それはmVenus (図5B及びC)及び赤色蛍光タンパク質、mCherry (図6)の光活性化発現によって実証されたように、それらの機能に影響することなく、PURE構成要素の存在下で長期間の二重層の安定性を可能にする。UV光は、合成細胞中のアミンのみmVenus DNAの発現に影響しなかった (図7)。
【０５０５】
次いで、七量体の膜タンパク質孔αHLをコードする遺伝子をLA-T7プロモーターの下流に配置し、DIBを形成する対の1つの液滴中で発現させた。期待された通り、αHLは二重層に局在した (図8)。2つの合成細胞が今、つなぎ合わされ、膜タンパク質の発現ができたので、2つの細胞間の情報伝達が試験され、αHLが機能的であったことが実証された。天然の細胞は、小分子エフェクター又は電気的なシグナルを介して、互いに情報伝達する (24)。最初に、本発明者等は、接触面の二重層中にαHLを挿入することによって、2つの合成細胞の間の小分子フルオロフォアの光活性化による拡散についてテストした。2つの合成細胞を接触させ；1つは小分子色素（TAMRA）を含み、DNAを含まず、他方はLA-αHL DNAを含んでいた。2つの合成細胞間の小分子の輸送は、それらが照射された場合に達成されたが、照射しなければ輸送は観察されなかった (図9)。小分子色素は、αHLが接触面の二重層中に孔を形成した場合のみ、拡散によって、二重層を横切って第二の液滴中に移動することが可能であった。次いで、本発明者等は、二重層中へのαHLの挿入に続けて、電気的記録によって、2つの合成細胞間の光活性化による電気的なシグナル伝達についてテストした。LA-αHL DNAを含んだ合成細胞を形成した後に、光によって活性化し、次いでその中に電極を挿入し、細胞を、DNAを含まない別の合成細胞とつなぎ合わせた。LA-αHL DNAを含む細胞が照射された場合、2つの合成細胞間のイオン性の電流として測定された、電気的な情報伝達が得られたが、照射なしでは電気的なシグナルが検出されなかった(図10)。αHLが、膜中に機能的な孔を形成し、印加電圧下でイオンの移動が可能な場合のみ、電気的なシグナルが合成細胞間で伝達される。小分子及び電気的なシグナルによる合成細胞間の情報伝達によって、調節された様式で柔軟な生物学的な区画が互いに情報伝達し得ることが実証される。
【０５０６】
本発明者等は、既に、油中水の液滴用の3Dプリンターを作製しており、それにより数百の水性区画からなる、複雑な3Dのパターン化された、機能的で柔軟な構造体を作製することができる(11)。まさに本発明者等が個々のDIBについて見出したように、3Dネットワークを形成した液滴が、複雑な生物学的な混合物の存在下で融合した。本発明者等の最適化した脂質混合物を使用して、本発明者等は、合成組織として言及される、数百の合成細胞を含む、3Dの直方体をプリントすることができた (図5D)。一旦、プリントされると、それらが照射された場合に、LA-DNAからの発現がこれらの合成組織内で観察されたが、照射なしでは観察されなかった (図5E、F及び11)。UV光は、合成組織中においてアミンのみのDNAの発現に対して影響しなかった (図12)。3Dプリントされた合成組織の構造体を調節できることは重要である。3Dネットワーク内の液滴のパッキングは、各液滴の間の二重層の領域の機能であり、ネットワークの安定性に影響し得る。本発明者等は、脂質とオイルの組成を変更することによって、タンパク質発現に影響することなく、それらが合成組織内の合成細胞の二重層のサイズ及びパッキングを調整し得ることを見出した (図13)。
【０５０７】
合成組織を介した電気的な情報伝達を実証するために、LA-αHL DNAを含んだ合成細胞を、組織中に3Dプリントして組織にし、電気的記録によって研究した (図14A)。一旦、プリントされると、合成組織は照射されて、αHLタンパク質発現を引き起こした。次いで、電気的な情報伝達を測定するために、合成組織の直方体のいずれかの側面上に、電極を置いた。照射に引き続いて、合成組織を介した電気的な情報伝達を観察することができたが、照射しなければ電気的なシグナルは検出されなかった (図14B及びC)。
【０５０８】
本発明者等はまた、3Dプリンターのパターニング機能を活用することも目的とした。DNAを欠く細胞を含む合成組織内でのプログラムされた配置において、LA-mVenus DNAを含む合成細胞をプリントすることによって、まずパターニングを評価した (図15)。次いで、組織内の定義された3D経路において、LA-αHL DNAを含む液滴をプリントすることによって、合成組織を介した方向性のある3Dの電気的な情報伝達をテストした (図16A)。プリントに引き続き、合成組織を照射し、αHLタンパク質を発現させた。経路の2つの端に電極を設置することによって、合成組織を介した、電気的な情報伝達が観察された (図16B)。電極が合成組織の他の点に設置された場合、電気的なシグナルは検出されなかった (図16C〜F)。この様にして、急速で方向性のある神経伝達に類似する電気的な情報伝達経路が、外部刺激によってスイッチがオンになり得る、合成組織を作成するために、本発明者等の3Dプリンターの精度及び多用途性が使用された。
【０５０９】
光の使用について十分に活用するために、本発明者等は、全ての液滴中にLA-DNAを含む3Dプリントされた合成組織を介して、2D経路を光パターン化することを目的とした。蛍光光学顕微鏡の視野絞りを使用して、本発明者等は、合成組織の小さい環状の領域を照射することができた (図17)。LA-mVenus DNAを含有する合成組織の複数の結合した環状領域を照射することによって、照射された液滴中においてのみ、タンパク質の発現が活性化された (図18)。これに引き続いて、合成組織中の2Dの光パターン化経路において、LA-αHL DNAを活性化した (図19)。光パターン化経路の2つの末端を通して (図19B)、及び側面から上部へ (図19D)の両方において、3Dプリンターでパターン化した経路と同様に測定した、電気的な情報伝達が観察された。電極を、合成組織上の他の点に置いた場合、電気的なシグナルが検出されなかった (図19C〜F)。このことは、我々が合成組織中の光パターン化2D経路を通して、急速で方向性のある情報伝達を、所定の時間で開始することができたことを説明している。
【０５１０】
今回、本発明者等は、厳密に制御された光活性化DNAプロモーターの下で、タンパク質を発現する数百の合成細胞を含む、3Dプリントされ、パターン化された合成組織を作製した。合成組織中の3Dプリントされた経路を介して、光活性化した電気的な情報伝達が達成された。この効率的なLA-DNA技術は、in vitroでのタンパク質発現を調節するための正確な手段を提供する。それゆえ、3Dプリントされたパターンの相互に接続された区画であって、各々が細胞の最小の機能を有し、光によって外部から調節し得る、区画を含む合成組織を作製することができる。これらの合成組織は、細胞組織とつなぎ合わされ得る、調節可能で柔軟なバイオデバイスへと発展させ得る。
【０５１１】
材料及び方法
【０５１２】
【表１】
2019507598.tif 000013
【０５１３】
PC-ビオチンへのアミノ-T7オリゴの結合
アミノ-T7オリゴ (5 μL、100 μM、ATDBio)を、0.5 mLのLoBind Proteinチューブ (Eppendorf)中、合計50 μLの体積で、100 mM NaHCO3を含むPC-ビオチン (10 mMのDMF中、25 μL、Ambergen)と反応させた。暗黒中、穏やかにボルテックスしながら反応を室温で1時間維持し、15分毎に遠心分離し、次いで終夜4℃で放置した。350 μLの10 mM Tris.HCl pH 8.0 (Sigma)を添加して反応を停止し、誘導体化したオリゴを、製造業者のプロトコールに従って、3 kD Amicon Ultraカラムを用いて精製した（Millipore、350 μLの10 mM Tris.HCl pH 8.0を用いて、カラム上で4回洗浄した）。
【０５１４】
Agilent Polaris 5 C18カラム（5 μm、4.6×150 mm）上で、2 mL／分の流速で分離した1 μLの精製アミノ-T7-PC-ビオチンを用いて、反応の程度についての分析HPLC試験（Agilent 1260 Infinity）を行った。溶出バッファーは、バッファーA（10 mM 重炭酸トリエチルアンモニウムpH 8.5 (Sigma)）及びバッファーB（アセトニトリル）であった。勾配は、0分−2% B、10分−35% Bであった。260 nm の吸収でピークをモニターした。
【０５１５】
Amiconで精製したアミノ-T7-PC-ビオチンを、Supelco DiscoveryBio Wide Pore C18カラム（10 μm、10×250 mm）を用いて、5 mL／分の流速で、HPLC（Agilent 1260 Infinity）によって更に精製した。溶出バッファーは、バッファーA (1 M酢酸アンモニウム、pH 7)、バッファーB (アセトニトリル)及びバッファーC (H2O)であった。ラン全体を通して、バッファーAを10%に保持し、残りのバッファーの勾配は、0分−5% B、40分−40% Bであった。該方法は、文献のプロトコール(25)から適合させられている。
【０５１６】
HPLC精製したアミノ-T7-PC-ビオチンを、保存のためにLoBind Proteinチューブに移す前に、LoBind Proteinチューブ中で凍結乾燥し、10 mM Tris.HCl pH 8.0中で再懸濁し、3 kDa Amicon Ultraカラムを用いて濃縮した。
【０５１７】
PURExpressの対照鋳型へのmVenus、mCherry及びαHL-GFPをコードする遺伝子のクローニング
相同組換えを使用して、目的の遺伝子をPURExpressの対照鋳型(CT)にクローニングした(26、27)。各末端にCTの重複領域を含む直鎖状のフラグメントを形成するよう、PCRプライマーを用いて、mVenus (mVenus N1、Addgene)、mCherry (オックスフォード大学、生理学・解剖学科、Wade-Martin研究室によって提供された)、α-ヘモリシン-NN変異体 (オックスフォード大学、化学研究所、Bayley研究室)及びemGFP (pRSET-EmGFP、Invitrogen)を増幅した。CTも、各末端に目的の各遺伝子の重複領域を含む、直鎖状のPCRフラグメントへと増幅した。αHL-GFPコンストラクトについては、αHL遺伝子の終わり及びemGFP配列の始めに融合リンカー配列のオーバーラップを付加することによって、2つの遺伝子の中間にリンカー領域（融合リンカーDNA配列）を付加した（即ち、3元相同組換え(3-way recombination)）。
PCR増幅前に、NdeI (CT、mCherry)又はHindIII (emGFP、αHL及びmVenus)のいずれかを使用して、全てのプラスミドを消化して、直鎖状のフラグメントを形成した。
【０５１８】
Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ (NEB)マスターミックスを用いて、相同組換えのためのPCRを行った。製造業者のプロトコールに従って、5 μLの各プライマー (Sigma、10 μM)及び5〜15 ngの消化したプラスミドの鋳型を含む合計50 μLでPCRを行った。以下のサーマルサイクルを行った：98℃30秒間、35×（98℃10秒間、55℃30秒間、72℃30／60秒間）、72℃5分間。各PCRフラグメントの伸長時間は以下であった：CT (60秒)、αHL (60秒)、emGFP (60秒)、mVenus (30秒)及びmCherry (30秒)。
【０５１９】
要約すれば、各々がPURE CTプラスミド中の対照のジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR)遺伝子の代わりに、遺伝子（mVenus、mCherry、αHL及びαHL-GFP）を含むように、プラスミドを構築した。以下は、各プラスミドを構築するために使用したPCRフラグメントと、相同組換え用に増幅した各産物を生成するために使用したプラスミド鋳型及びプライマーとの組合せである：
PURE CTにコードされた遺伝子＝（鋳型プラスミドA：プライマー1＋プライマー2)＋（鋳型プラスミドB：プライマー3＋プライマー4）
mVenus.CT＝（mVenus N1：mV FRW＋mV REV）＋（CT：CT-FP FRW＋CT-FP REV）
mCherry.CT＝（mCherry：mC FRW＋mC REV）＋（CT：CT-FP FRW＋CT-FP REV）
αHL.CT＝（αHL：HL FRW＋HL REV）＋（CT：CT-HL FRW＋CT-HL REV）
αHL-GFP.CT＝（αHL：HL FRW＋HL-LINK REV）＋（CT：CT-emGFP FRW＋CT-HL REV）＋（emGFP：emGFP-LINK FRW＋mV REV）
【０５２０】
相同組換え前にPCR産物を精製しなかった。XL-10 GoldコンピテントE.coli細胞 (NEB)を氷上で30分間、解凍した。1〜5 μLのPCR産物 (アガロースゲル分析に基づく、100 ngのDNA)を、75 μLの細胞に添加し、氷上で更に30分間保持した。次いで、細胞を42℃で30秒間ヒートショック処理し、次いで氷上で2分間保持した。細胞に、75 μLのLuria Broth (LB)を添加し、それらをアンピシリン(100 μg／mL)を含むLB寒天プレート上にプレーティングした。アンピシリン(100 μg／mL)を含むLB中でコロニーを増殖させ、Thermo GeneJetプラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドを精製した。プライマーCT-Seq FRW及びCT-Seq REV (Sigma)を使用して、サンガーシーケンシング (Source BioScience)で配列を確認した。
【０５２１】
アミノ-T7-PC-ビオチンプライマーを用いた目的の遺伝子のPCR
クローニングしたプラスミド（上記）から、PCRによって直鎖状のDNA鋳型を構築した。直鎖状の各DNA鋳型は、PCRプライマーとしてHPLC精製したオリゴを使用して、上記で合成したアミノ-T7-PC-ビオチンオリゴの下流に、目的の遺伝子（mVenus、mCherry、αHL及びαHL-GFP）の各々を含む。造業者のプロトコールに従って、1.25 μL CT REV (Sigma、10 μM)、2.5 μL アミノ-T7-PC-ビオチン (45 ng／μL)及び10 ngのNdeI消化した目的の遺伝子を含有するCTを含む、合計50 μL中で、DreamTaq DNAポリメラーゼ (Life Technologies)マスターミックスを用いて、PCRを行った。以下のサーマルサイクルを実施した：95℃3分間、35×（95℃30秒間、52.5℃30秒間、72℃1分15秒間）、72℃5分間。αHL-GFP鋳型については、伸長時間を2分15秒に増やした。
【０５２２】
Thermo GeneJet PCRキットを用いてPCR産物を精製し、LoBind Proteinチューブ中で、酢酸ナトリウム (1／10体積、3 M)、次いでエタノール (3体積)を添加し、終夜−80℃で、DNAを沈殿させた。16000 rcfで30分間、遠心分離することによって、DNAペレットを回収し、氷冷した80％（V/V）エタノールを用いて2回洗浄した。次いで、DNAペレットをSpeed Vac Concentrator (Savant)中で乾燥し、10 mM Tris.HCl pH 8.0中で再懸濁し、新しいLoBind Proteinチューブに移した。
これらのPCR増幅した遺伝子は、今ではコード配列の上流に、アミノ-T7-PC-ビオチンプロモーターを含む。
アミノ-T7プロモーターを使用して、上記プロトコールをmVenusについて繰り返した(PC-ビオチン反応を行っていない)。この鋳型は、対照のアミン（amino）のみのDNA鋳型である。
【０５２３】
一価のストレプトアビジンの結合を用いたLA-DNAの形成
LA-DNAを作製するために、一価のストレプトアビジン (オックスフォード大学、生化学学科、Howarth研究室によって提供された)をアミノ-T7-PC-ビオチンプロモーターを含むPCR鋳型に結合させた。
LoBind Proteinチューブ中において、10 mM Tris.HCl pH 8.0中で、1 μgのPCR産物 (50 ng/μLの終濃度のDNA)を、50×のモル過剰量の一価のストレプトアビジンと共に、室温で3時間、次いで4℃で終夜、インキュベートした。アミンのみのDNAも、一価のストレプトアビジンと共にインキュベートした。
【０５２４】
標準バルク溶液でのLA-DNAのUV光分解
365 nm Collimator LED (ThorLabs、M365L2-C5)に接続したLED Driver (ThorLabs、LEDD1B、1.2 mAに設定)を使用して、LA-DNAのUV光分解を行った。10 μLの LA-DNA (50 ng／μL)を周囲光の下に置くか、又は4.5 cmの距離でLED Driver (1／3電源設定)の下に15分間置くかのいずれかにし、開口状態のチューブ中の溶液にUVを直接照射した。この手順はまた、アミンのみのDNAを用いても行った。1kbのラダー (NEB)と共に、100 ngの各試料を、1.5% w/V TAEアガロースゲル上で泳動した。
【０５２５】
LA-DNAからのT7 RNA転写
製造業者のプロトコールに従って、Murine RNAse Inhibitor (NEB、MB0314)を添加して、T7 RNA転写 (NEB、M0251)を行った。T7 RNA転写中におけるLA-DNA又はアミンのみのDNA (mVenusをコード)の終濃度は、8 ng／μL（5 μLの合計反応体積）であった。
氷上で反応ミックスをワークアップした（work up with）ことに続いて、試料を、周囲光の下に置くか、又は標準のバルク光分解として同じ条件下で光分解するかのいずれかにした。次いで、反応を37℃で1時間維持した。次いで、DNAse I (NEB、M0303)をチューブに添加し、37℃で更に20分間維持した。次いで、EDTAを添加し (終濃度5 mM)、酵素を75℃で10分間変性させた。次いで、ssRNAラダー (NEB、N0364)と共に、試料全体を2% w/V TAEアガロースゲル上で泳動した。
【０５２６】
バルクでのLA-DNAからのPURExpressタンパク質発現
Murine RNAse Inhibitor (NEB、MB0314)を添加し、製造業者のプロトコールに従って、PURExpress In Vitro Protein Synthesisキット (NEB、E6800)を用いてタンパク質発現を行った。最終反応体積は2.5〜4 μLであった。ポリ(エチレングリコール) 4,000 (Sigma)を反応液に終濃度1% w/vで添加した。LA-DNA又はアミンのみのDNA (mVenusをコードしている)を5〜10 ng／μLの終濃度（1回分のPURExpressの活性に依存する）となるように添加した。
氷上で反応ミックスを混合したことに続いて、試料を、周囲光の下に置くか、又は標準のバルク光分解と同じ条件下で光分解するかのいずれかにした。次いで、チューブを37℃で3時間維持した。0.5 μL（アリコート）を、0、1、2及び3時間で取り出し、24.4 μLの10 mM Tris.HCl pH 8.0でワークアップした。UV照射あり及びなしで、各DNAについて、3回反復で反応を行った。
Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (Varian)を使用して、30 μLの蛍光セル (Hellma-Analytics、105.252-QS)を用いて、これらのTris.HClとでワークアップしたアリコートの蛍光強度を測定した。蛍光スペクトロフォトメーターの設定は以下の通り：490 nmで励起、20 nmの励起スリットを用いて520 nm〜575 nmの蛍光、スキャン制御は低速、PMT検出器は高電圧。試料毎に3回スキャンした。3回反復試料の530 nmでの平均（mVenusについては最大）蛍光強度を、各値の標準偏差と共に、時間に対してプロットした。
【０５２７】
共焦点顕微鏡
微分干渉コントラスト偏光設定の下、10×対物レンズ (Leica、HC PL FLUOTAR)を使用して、共焦点顕微鏡 (Leica、SP5)を用いて蛍光顕微鏡観察を行った。画像の解像度を512x512ピクセル2に設定し、画像毎に4フレームの平均を取った。全体的なレーザー出力を20%に設定し、スマートオフセットを−1％に設定し、ピンホールは終始100 μmに維持した。
各フルオロフォアについては、以下の設定を使用した：
mVenus：514 nmレーザーは30%、PMT検出器は525〜575 nm及びスマートゲインは800。
mCherry：543 nmレーザーは40%、PMT検出器は600〜700 nm及びスマートゲインは1100。
emGFP：488 nmレーザーは25%、PMT検出器は500〜600 nm及びスマートゲインは900。
TAMRA：543 nmレーザーは15%、PMT検出器は560〜625 nm及びスマートゲインは725。
Fiji (ImageJ)を使用して、全ての蛍光画像を分析した。画像のラインプロファイルを同じ図中に示す。画像に対して行った任意の明るさ／コントラストの変更は、+UV及び-UVの画像セットの両方について同じであった。
【０５２８】
DPhPC及びDPPE-mPEG2000油中脂質ストックの調製
DPhPC (Avanti、4ME 16:0 PC)及びDPPE-mPEG2000 (Avanti、16:0 PEG2000 PE)を秤量し、クロロホルム中で溶解し、次いで新しいガラス製バイアルに添加し、合計で2×10-6モルの総脂質を得た。2つの脂質の2つの異なるモル分率を使用した（10%及び15% DPPE-mPEG2000）。窒素流中で、クロロホルムを蒸発させ、アルゴンガス下、-20℃で保存する前に、残渣を＞3時間乾燥した。使用前に、乾燥したフィルムをヘキサデカン (Sigma)中で溶解し、次いで、シリコーン油 (AR-20、Sigma)を2 mLの総体積（1 mMの総脂質濃度）になるよう添加した。ヘキサデカンとシリコーン油の3つの異なる体積比、50：50、55：45及び40：60（ヘキサデカン：シリコーン油）を使用した。脂質に添加する前に、Millex GP 0.22 μmフィルター (Millipore)を用いて両方のオイルを濾過した。
【０５２９】
一般的な電気的記録プロトコール
直径100 μmの2つのAg／AgClワイヤ電極 (Sigma)に接続したファラデー箱に含まれる、そのヘッドステージを備えた、パッチクランプ増幅器 (Axopatch 200B、Axon Instruments)を用いて、電気的記録を行った。両方の電極の先端を、0.5% w/vのヒドロゲル (Sigma、低融点ゲル化アガロース)で被覆した。次いで、マイクロマニピュレーター (Narishige、NMN-21)の補助ありで、電極を液滴に挿入するか、又はネットワークの側面に設置した。一時的取得によって、電流シグナルを得、2?kHzでフィルタリングした。Digidata 1440Aデジタイザー (Axon Instruments)を用いて、100 μsの間隔及び×5ゲインで、10 kHzでデータを回収した。アナログ出力を使用して、各々10秒の持続時間の、0 mV、50 mV、0 mV、-50 mV、0 mVのステップを有するエポック波形（waveform epoch）を使用して、液滴対の間又はネットワークを通った電流を検出した。Clampfit (version 10.3、Axon Instruments)によって、ローパスBessel (8-ポール)、-3 dBカットオフの40 Hzでフィルタリングし、データを分析した。電気的記録は全て、22.0±1.5℃で行った。
【０５３０】
液滴中における、LA-DNAからのPURExpressタンパク質発現
バルクでの試験（上記）で記載した通り、液滴発現のためのPURExpress反応液を調製した。液滴が形成されるまで、反応液を氷上で保持した。
CNC圧延機 (Roland、Modela MDX-40)を使用して、ポリ(メチルメタクリレート) (PMMA)チップを微小化し（micromachined）、油中脂質ストックを添加した、直径1.5 mmの環状ウェルのアレイを作製した。0.5 μLのシリンジ (Hamilton、7000.5 KH)を使用して、これらのウェルの各々に50 nLの液滴を作製し、顕微鏡 (Olympus、SZX10)によって観察した。
2つの合成細胞の液滴接触面の二重層 (DIB)を作製するために、単一の50 nLの液滴をウェル中に置いた。次いで、第二の液滴を、第一の液滴の上部又は隣に滴下し、2つの液滴をそのままにして少なくとも5分間インキュベートした。DPhPC及びDPPE-mPEG2000脂質の混合物を用いると、単層が殆んど瞬時に形成されたので、2つの液滴を接触させる前に、インキュベーションの必要はなかった。液滴及びDIBの形成に引き続き、蓋をしたペトリ皿中で、水分補給（hydration）チャンバーとして作用する水を含むより小さいペトリ皿と一緒に、全ての試料を維持した。
【０５３１】
LA-DNAの標準的な液滴／ネットワークのUV光分解
油中脂質混合物の下、全ての液滴及びネットワークを、バルク溶液と同じ設定でUV処理したが、LED Driverを、4.5 cmの距離で5分間、5／6電源設定とした。UV設定により、液滴／ネットワークに上から照射したので、液滴／ネットワークに到達する前には、UVは、油中脂質を通して伝わっただけだった。全て上からUV照射を行い、及び共焦点画像化は下から行ったので、共焦点からの蛍光シグナルは、UVがネットワーク中を最後まで透過し、ネットワークの底部にある合成細胞を活性化したこと実証した。
【０５３２】
LA-mVenus及びLA-mCherry液滴実験
両方がLA-mVenus又はLA-mCherry DNAのいずれかを含む、2つの液滴を、一緒にインキュベートし、10% DPPE-mPEG2000／DPhPC中、50：50（V：V）のヘキサデカン：シリコーン油中で、DIBを形成した。これらの液滴を、周囲光の下で維持するか、又は標準的な液滴光分解に供するかのいずれかにした。
次いで、液滴を25℃で18時間インキュベートし、各フルオロフォアについての設定下、蛍光共焦点顕微鏡を用いて蛍光シグナルを画像化した。
【０５３３】
LA-αHL-GFP液滴実験
一方がLA-αHL-GFP DNAを含み、もう一方がDNAを含まない、2つの液滴を一緒にインキュベートし、15% DPPE-mPEG2000／DPhPC中、50：50（V：V）のヘキサデカン：シリコーン油中で、DIBを形成した。液滴を、周囲光の下で維持するか、又は標準的な液滴光分解に供するかのいずれかにした。
次いで、液滴を25℃で18時間インキュベートし、次いで、各フルオロフォアについての設定下、蛍光共焦点顕微鏡を用いて蛍光シグナルを画像化した。
【０５３４】
LA-αHL及びTAMRA液滴拡散実験
一方がLA-αHL DNAを含み、もう一方がTAMRA (20 μM)を含む、2つの液滴を一緒にインキュベートし、15% DPPE-mPEG2000／DPhPC中、50：50（V：V）のヘキサデカン：シリコーン油中でDIBを形成した。液滴について、周囲光の下で維持するか、又は標準的な液滴光分解に供するかのいずれかにした。
次いで、液滴を25℃で18時間インキュベートし、次いで、各フルオロフォアについての設定下、蛍光共焦点顕微鏡を用いて蛍光シグナルを画像化した。
【０５３５】
LA-αHL液滴の電気的記録実験
一点（LA-αHLのDNA終濃度が0.5 ng／μLであったこと）を除き、既に記載したようにPURExpress反応液を作製した。
10% DPPE-mPEG2000／DPhPC中、50：50（V：V）のヘキサデカン：シリコーン油中で、LA-αHLを含む単一の液滴を作製した。これらの液滴を、周囲光の下で維持するか、又は標準的な液滴光分解に供するかのいずれかにした。これらの単一の液滴を、37℃で10分間インキュベートした。
電気的記録の分析：
マイクロマニピュレーターを使用して、ヒドロゲルでコートした電極を、油中脂質溶液中の各液滴と接触させた。液滴がヒドロゲルの被覆に自然に接着した場合はすぐに、マイクロマニピュレーターを用いてチャンバーの表面の液滴を離昇させた。結果として、液滴が電極の先端にぶら下がる。1つの液滴が各電極に付着している2つの液滴を接触させ、二重層を形成する。二重層が形成されていることを確認するために、30 ms毎に、＋15 mV〜−15 mVの間を振動する三角波を用いて、一時的な刺激の間、静電容量を測定する。≧20 pFの静電容量によって、二重層が形成されていることを実証する。二重層が得られたらすぐに、一般的な電気的記録プロトコールによって、液滴を評価する。
【０５３６】
PURExpress液滴の3Dプリンティングネットワーク
バルクでの試験（上記）について記載した通り、3Dネットワーク発現のためのPURExpress反応液を調製した。ネットワークプリンティングまで、反応液のミックスを氷上で保持した。
最適化実験は別として、40：60のヘキサデカン：シリコーン油中の10% DPPE-mPEG2000／DPhPCで、全ての3Dプリンティングを行った。
全般的に、既に記載されているように (11)、3D液滴プリントを行った。使用前に、手製のガラス製プリントノズルを8分間、酸素プラズマ処理した（5-10 SCCM）（Diener Electronic、Femto version A）。各溶液をノズル中にロードする前に、石鹸 (Bucks、Detsan中性洗剤)、水、次いでエタノールを用いて洗浄し (ノズルから各洗浄液を除去するために、窒素ガスを使用して)、次いで、使用前に、10分間空気乾燥させた。ヘキサデカンのプラグ及びPURExpress溶液を、直径1.5 mmのウェルのCNC圧延アレイから、ノズル中にロードした。最適化した油中脂質溶液を含む、カットした（truncated）ガラス製キュベット（3.1125/SOG/10、Starna）に、ネットワークをプリントした。各3Dプリントされた構造体の各層を表すマップを、各実験について記載する。ピエゾマイクロコントローラーを複製したが、エレクトロニックワークショップ(オックスフォード大学、化学学科)によって、より高電圧出力にされた。自動化プリントに先立って、電圧及びピエゾのパルスを変更することによって、液滴の直径を〜75 μmに調整した。ネットワークの形成に引き続き、蓋をしたペトリ皿中で、水分補給チャンバーとして作用する水を含むより小さいペトリ皿と一緒に、全ての試料を維持した。
【０５３７】
LA-mVenus及びLA-mCherry 3Dネットワーク実験
3Dプリントされた液滴ネットワークを、LA-mVenus又はLA-mCherry DNAのいずれかを含有する溶液から作製した。これらの構造体についてのマップは、3層 (mCherry)又は4層 (mVenus)の7×8液滴であった。プリンティング中ずっと、ノズル中のPURExpress溶液を、周囲光の下で維持した。プリンティング後、液滴ネットワークを、周囲光の下で維持するか、又は標準的な液滴光分解に供するかのいずれかにした。
次いで、液滴ネットワーを、25℃で18時間、インキュベートし、適切なフルオロフォアについての設定の下、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを画像化した。
【０５３８】
LA-αHL 3Dネットワークの電気的記録実験
LA-αHL DNA（0.5 ng／μLのDNA終濃度）を含むPURExpress反応液を用いて、3Dプリントされた液滴ネットワークを作製した。これらの構造体についてのマップは、6層の7×8液滴であった。プリンティング中ずっと、ノズル中のPURExpress溶液を周囲光の下で維持した。プリンティング後、これらの液滴ネットワークを周囲光の下で維持するか、又は標準的な液滴光分解に供するかのいずれかにした。
次いで、これらの液滴ネットワークを、37℃で10分間インキュベートした。
【０５３９】
電気的記録分析：
電極の先端を曲げ、ヒドロゲルでコートする前に、ネットワークの側面に置くことを補助した。マイクロマニピュレーターを使用して、油中脂質溶液中、電極をネットワークと接触させた。ネットワークの側面の液滴は自発的に電極に接着する。30 ms毎に、＋15 mV〜−15 mVの間を振動する三角波を用いて、一時的な刺激の間、静電容量をテストする。≧20 pFの静電容量によって、単一のネットワークの各側面で、電極を付着させた液滴が、ネットワークを介して、連続的な液滴の二重層によって接続されていることが実証される。次いで、一般的な電気的記録プロトコールによって、ネットワークを評価した。
【０５４０】
LA-Venus 3Dプリントされた経路実験
LA-mVenus DNAを含む、及びDNAを含まない、2つのPURE溶液を使用して、DNAを含まないネットワーク中を通る、mVenus経路を有する3Dプリントされたネットワークを作製した。
これらの構造体の各2Dの層についてのマップを図20中に示す。
単一のピクセルが単一の液滴と等しい、これらの3Dのプリンティング経路マップ (図20中の左の画像)をMicrosoft Paintで作製した。プリントソフトウェア中で作り直したマップ(図20中の右の画像)もまた示し、各マップの各層中の液滴の寸法及び数を示す。白線で囲まれたピクセルは、プリントされた液滴に対応する。黒色の領域のピクセルは、プリントされた液滴がないことに対応する。
最初に、LA-mVenus DNA溶液を用いて、マップA (図20(A))の5層をプリントした。次いで、既にプリントしたLチャネル構造体の周りに、DNAなしの溶液を用いて、マップB (図20(B))の4層をプリントした。これに引き続いてすぐに、ネットワーク構造体全体の上部に、DNAなしの同じ溶液を用いて、マップC (図20(C))の4層をプリントした。
プリンティング中ずっと、ノズル中のPURExpress溶液を周囲光の下で維持した。プリンティング後、液滴ネットワークを標準的な液滴光分解に供した。次いで、液滴ネットワークを、25℃で18時間、インキュベートし、次いで、適切なフルオロフォアについての設定の下、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを画像化した。
【０５４１】
LA-αHLのパターン化した3Dチャネル実験
LA-αHL DNA（0.5 ng／μLのDNA終濃度）を含む、及びDNAを含まない、2つのPURE溶液を使用して、DNAを含まないネットワーク中を通る、αHL経路を有する3Dプリントされたネットワークを作製した。
この構造体についてのマップは、LA-Venusの3Dプリントされた経路の実験についてのものと同じである (図20)。
最初に、LA-αHL DNA溶液を用いて、マップAの5層をプリントした。次いで、既にプリントしたLチャネル構造体の周りに、DNAなしの溶液を用いて、マップBの4層をプリントした。これに引き続いてすぐに、ネットワーク構造体全体の上部に、DNAなしの同じ溶液を用いて、マップCの4層をプリントした。
プリンティング中ずっと、ノズル中のPURExpress溶液を周囲光の下で維持した。プリンティング後、これらの液滴ネットワークを標準的な液滴光分解に供した。次いで、液滴ネットワークを37℃で10分間インキュベートした。
電気的記録分析：
LA-αHL 3Dネットワークの電気的記録実験と同じ様式で、これらのネットワーク上で電気的記録実験を行った。最初に、LA-αHL経路と接続したネットワークの2つの側面に亘って電気的記録を測定した。このことに引き続いて、マイクロマニピュレーターを使用して、1つの電極をネットワークから除去し、異なる側面に設置した。図16に示される全ての構成を分析するまで、これを繰り返した。
【０５４２】
光でパターン化したLA-mVenus及びLA-αHLの2Dチャネル
3Dプリントされた液滴ネットワークを、LA-mVenus (上記の濃度)又はLA-αHL DNA (0.5 ng／μLのDNA終濃度)のいずれかを含有する溶液から作製した。これらの構造体についてのマップは、4層の9×11液滴であった。プリンティング中ずっと、ノズル中のPURExpress溶液を周囲光の下で維持した。
プリンティング後、HCX PL FL L 40×レンズ及び照射視野絞りを備えた、Leica DMi8ワイドフィールド（wide-field）光学顕微鏡を使用して、ネットワーク中に形状を照射した。DAPIフィルターキューブ、1／4シャッター強度、10%照射強度及び環状の照射視野設定2を使用して、照射を1分間行った。所望の位置の複数の結合された限局円を照射することによって、経路をネットワーク中に描いた。
次いで、LA-mVenus液滴ネットワークを、25℃で18時間インキュベートし、適切なフルオロフォアについての設定の下、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、蛍光シグナルを画像化した。
LA-αHL液滴ネットワークを、37℃で10分間インキュベートした。次いで、LA-αHLでパターン化した3Dチャネル実験と同じ様式で、これらのネットワーク上で電気的記録実験を行った。
【０５４３】
参考文献
１．  D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol. 16, 652 (1998).
２．  V. Noireaux, A. Libchaber, A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17669 (2004).
３．  G. Murtas, Y. Kuruma, P. Bianchini, A. Diaspro, P. L. Luisi, Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12 (2007).
４．  T. Nishikawa, T. Sunami, T. Matsuura, N. Ichihashi, T. Yomo, Construction of a gene screening system using giant unilamellar liposomes and a fluorescence-activated cell sorter. Anal. Chem. 84, 5017 (2012).
５．  S. Fujii, T. Matsuura, T. Sunami, Y. Kazuta, T. Yomo, In vitro evolution of alpha-hemolysin using a liposome display. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 16796 (2013).
６．  N. Ichihashi et al., Darwinian evolution in a translation-coupled RNA replication system within a cell-like compartment. Nat. Commun. 4, 2494 (2013).
７．  W. C. Lu, A. D. Ellington, In vitro selection of proteins via emulsion compartments. Methods 60, 75 (2013).
８．  M. Kaneda et al., Direct formation of proteo-liposomes by in vitro synthesis and cellular cytosolic delivery with connexin-expressing liposomes. Biomaterials30, 3971 (2009).
９．  R. Lentini et al., Integrating artificial with natural cells to translate chemical messages that direct E. coli behaviour. Nat. Commun. 5, 4012 (2014).
１０．E. Karzbrun, A. M. Tayar, V. Noireaux, R. H. Bar-Ziv, Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science 345, 829 (2014).
１１．G. Villar, A. D. Graham, H. Bayley, A tissue-like printed material. Science 340, 48 (2013).
１２．M. Liu, H. Asanuma, M. Komiyama, Azobenzene-tethered T7 promoter for efficient photoregulation of transcription. J. Am. Chem. Soc. 128, 1009 (2006).
１３．A. Estevez-Torres et al., Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12219 (2009).
１４．A. Diguet et al., UV-induced bursting of cell-sized multicomponent lipid vesicles in a photosensitive surfactant solution. J. Am. Chem. Soc. 134, 4898 (2012).
１５．J. Olejnik, S. Sonar, E. Krzymanska-Olejnik, K. J. Rothschild, Photocleavable biotin derivatives: a versatile approach for the isolation of biomolecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 7590 (1995).
１６．M. Howarth et al., A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nat. Methods 3, 267 (2006).
１７．Y. Shimizu et al., Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19, 751 (2001).
１８．Y. Shimizu, T. Kanamori, T. Ueda, Protein synthesis by pure translation systems. Methods 36, 299 (2005).
１９．H. Bayley et al., Droplet interface bilayers. Mol. Biosyst. 4, 1191 (2008).
２０．M. A. Holden, D. Needham, H. Bayley, Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J. Am. Chem. Soc. 129, 8650 (2007).
２１．W. L. Hwang, M. A. Holden, S. White, H. Bayley, Electrical behavior of droplet interface bilayer networks: experimental analysis and modeling. J. Am. Chem. Soc. 129, 11854 (2007).
２２．G. Villar, A. J. Heron, H. Bayley, Formation of droplet networks that function in aqueous environments. Nat. Nanotechnol. 6, 803 (2011).
２３．R. Syeda, M. A. Holden, W. L. Hwang, H. Bayley, Screening blockers against a potassium channel with a droplet interface bilayer array. J. Am. Chem. Soc. 130, 15543 (2008).
２４．B. Alberts, Molecular biology of the cell.  (Garland Science, New York, ed. 6th, 2014), pp. 1464.
２５．A. P. Sanzone, A. H. El-Sagheer, T. Brown, A. Tavassoli, Assessing the biocompatibility of click-linked DNA in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 40, 10567 (2012).
２６．P. Bubeck, M. Winkler, W. Bautsch, Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21, 3601 (1993).
２７．Y. Zhang, J. P. Muyrers, G. Testa, A. F. Stewart, DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314 (2000).
【図１】
2019507598.tif 000018
【図２】
2019507598.tif 000019
【図３】
2019507598.tif 000020
【図４】
2019507598.tif 000021
【図５−１】
2019507598.tif 000022
【図５−２】
2019507598.tif 000023
【図６】
2019507598.tif 000024
【図７−１】
2019507598.tif 000025
【図７−２】
2019507598.tif 000026
【図８】
2019507598.tif 000027
【図９】
2019507598.tif 000028
【図１０】
2019507598.tif 000029
【図１１】
2019507598.tif 000030
【図１２】
2019507598.tif 000031
【図１３】
2019507598.tif 000032
【図１４】
2019507598.tif 000033
【図１５】
2019507598.tif 000034
【図１６−１】
2019507598.tif 000035
【図１６−２】
2019507598.tif 000036
【図１６−３】
2019507598.tif 000037
【図１７】
2019507598.tif 000038
【図１８】
2019507598.tif 000039
【図１９−１】
2019507598.tif 000040
【図１９−２】
2019507598.tif 000041
【図１９−３】
2019507598.tif 000042
【図２０】
2019507598.tif 000043
【配列表】
2019507598000001.app
【国際調査報告】
2019507598.tif 000044
2019507598.tif 000045
2019507598.tif 000046
2019507598.tif 000047
2019507598.tif 000048