(57)【要約】本特許出願は、例えば、薬物候補のハイスループットスクリーニングに適した、標準化されたロバストな神経細胞培養アッセイを霊長類種から作製する方法に関する。本方法は、ヒトおよび/または非ヒト霊長類の神経前駆細胞（NPC）を神経細胞（NC）に分化させる工程、ならびに分化NCに対して行われる解離および再播種工程に基づいて一様なNC培養物を作製することで、特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための、ハイスループット薬物スクリーニングアッセイに適したロバストな培養物をもたらす工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一様に分布した分化神経系細胞（NC）の標準化された細胞培養物を異なる霊長類種から作製するためのインビトロ法であって、以下を含む方法：
（a）神経前駆細胞（NPC）を用意する工程;
（b）NPCを神経系細胞（NC）に分化させる工程であって、以下を含む、工程：
（i）約20日〜約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
（ii）前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日〜約15日にわたってNCの分化を継続する工程。
【請求項２】
霊長類種が、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens））、カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Macaca fascicularis））およびアカゲザル（マカカ・ムラタ（Macaca mulatta））からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
分化NCの標準化された細胞培養物が2つの霊長類種について個別に作製され、第1の霊長類種がヒト（ホモ・サピエンス）であり、第2の霊長類種がカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
NPCが人工多能性幹細胞（IPSC）に由来する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
工程（b）（i）が、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞を約5〜約10日間にわたって培養した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞をさらに約15日〜約35日間にわたって培養してから、分化NCをその支持体から解離することを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程（b）（i）が、細胞剥離溶液で細胞を解離することを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
細胞剥離溶液がAccutaseである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに再播種される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程（b）（ii）が、前記細胞を再播種した後に、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で細胞を培養することによって、分化を継続することを含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
分化NCが、細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に本質的に一様に分布している、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
薬物候補の毒性のインビトロ試験のための、請求項1〜10のいずれか一項に従って得られた細胞培養物の使用。
【請求項１２】
薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、請求項1〜10のいずれか一項に従って得られた細胞培養物の使用。
【請求項１３】
薬物候補を選択するための、特に、さらなる開発のために薬物候補を選択するための、請求項1〜10のいずれか一項に従って得られた細胞培養物の使用。
【請求項１４】
薬物候補がポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする、請求項11〜13のいずれか一項記載の使用のための細胞培養物。
【請求項１５】
薬物候補が少なくとも1種類の核酸分子、例えばRNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項11〜13のいずれか一項記載の使用のための細胞培養物。
【請求項１６】
本質的に、本明細書に記載するとおりである、方法および使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この特許出願は、例えば薬物候補のハイスループットスクリーニングに適した、標準化されたロバストな神経細胞培養アッセイを霊長類種から作るための方法に関する。本方法は、ヒトおよび/または非ヒト霊長類の神経前駆細胞（NPC）を神経細胞（NC）に分化させる工程、ならびに分化NCに対して行われる解離および再播種工程に基づいて一様なNC培養物を作製することで、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための、ハイスループット薬物スクリーニングアッセイに適したロバストな培養物をもたらす工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
中枢神経系（CNS）の疾患を含むさまざまな疾患の病態生理を呈する多様な細胞タイプまたは細胞培養モデルに基づくハイスループットスクリーニングアッセイは、開発の初期に薬物候補の有効性プロファイルおよび毒性プロファイルを評価するために、広く使用されている。限られたタイプの細胞への制約または胚性幹細胞に由来する細胞への制約は、体細胞から多能性細胞を生成させるプロトコールの確立により、過去十年間で克服された。山中ら（Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell. 2006; 126:663-676（非特許文献1））が体細胞を人工多能性幹細胞（IPSC）へとリプログラムできることを実証して以来、さまざまな細胞供給源から多能性細胞を生成させることが可能になった。線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞および血球を含む、異なるタイプの体細胞がIPSC多能性状態へとリプログラムされている。さらに最近になって、特別な体細胞タイプを、ニューロンなどの全く異なる体細胞タイプへと分化転換することができた。Vierbuchenらは、3つの決定的な遺伝子: Mash1、Brn2およびMyt1lの形質導入による、機能的ニューロンへのマウス線維芽細胞の直接変換を実証した（Vierbuchen et al. Nature. 2010; 463:1035-41（非特許文献2））。注目すべきことに、US2010/0021437（特許文献1）には、線維芽細胞から人工多能性幹細胞を作製し、それらの細胞をNPCに分化誘導するための方法が開示されている。さらに最近になって、NPCへの分化体細胞の直接変換が記載されている（WO2012/022725（特許文献2））。そのような神経細胞は、さまざまなCNS疾患の病態生理をモデル化するための貴重なツールであると考えられる。
【０００３】
NPCは複能性幹細胞であり、特別な条件下で増殖する。NPCは単層接着培養物として成長するか、非接着細胞培養プレート中で浮遊ニューロスフェアとして成長することができる。これら2タイプのNPC培養物（ニューロスフェア、接着培養物）は、完全に相互変換可能であると思われる。NPCは無限に成長させることができ、依然として真に複能性のままであることができる。特殊な条件では、NPCは、成人脳を構成する神経細胞タイプ（分化NCを含む）に分化する。分化NC培養物は、効果的で安全な薬物をスクリーニングするための貴重な疾患モデルである。事実、薬物開発の場において薬物候補の毒性および有効性を評価するために、NC培養物は重要である。
【０００４】
薬物候補は、ヒト患者に初めて投与されるまでに、まずインビトロ細胞培養系において、次に齧歯類および非ヒト霊長類（NHP）種でのインビボ試験において、十分に評価される必要がある。現在、新規薬物候補の毒性評価および有効性評価は、異なる種に異なるプロトコールを使用して、異なるアッセイフォーマットで行われている。薬物候補のインビトロ試験は、薬物試験のために犠牲にされる実験動物の数を減らすことを可能にするが、結果をインビトロからインビボへ、そしてヒト生理へ変換できるかという課題も提起した。事実、齧歯類種からヒトへ薬物候補の有効性プロファイルおよび毒性プロファイルを変換する能力は、種と種の間の遺伝的関連が近くないことから、難題になりうる。注目すべきことに、マウスゲノムおよびヒトゲノムのタンパク質コーディング領域は約85％同一である。遺伝子構成の相違は、薬物に対する生理学的反応が異なる理由、および毒素または突然変異原に対する耐性が異なる理由になりうる。現在、種と種の間で変換する能力は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、または遺伝子もしくは遺伝子産物の遺伝子変異体のように、特定のDNA配列もしくはRNA配列をターゲットとする新規薬物クラスでは、その重要性を増している。それゆえに、遺伝的関連性の近さ（＞90％）という観点から見て、ヒトにおける奏効率および有害事象率を予測するための有効性データおよび毒性データを生成させるには、NHP種が最も意味のあるモデル系になる。理論に束縛されることは望まないが、最初のヒト治験に先だって行われるNHP種、例えばカニクイザルにおけるインビボ試験は、どの薬物クラスにとっても好ましいものの、所定のヒト遺伝子構成を標的とする薬物クラスにとっては、とりわけ好ましいと考えられる。その反面、創薬におけるNHP種の使用は、依然として、物議を醸す問題である。NHP種が遺伝学的にヒトに近いというまさにその事実が、倫理的問題を生じさせる。それゆえに、カニクイザルなどのNHP実験動物の数は、可能な限り減らすべきである。
【０００５】
したがって、新規薬物候補の有効性スクリーニングおよび毒性スクリーニングのための理解しやすい仕組みは、NHP種でのインビトロ試験およびインビボ試験の両方、ならびにIPSC由来ヒト細胞を使った並行インビトロ試験を含むべきである。この試験シーケンスは、カニクイザルなどのNHP種におけるインビボ試験に先だつ、NHP種細胞とヒト細胞の両方における並行インビトロ試験を含むべきである。有効性プロファイルおよび/または毒性プロファイルがよくない薬物候補は、NHP種におけるインビボ試験を開始する前に、NHP細胞および/またはヒト細胞でのインビトロ評価後の初期段階で、もはや除外されるべきである。事実、このシーケンスは、NHP実験動物の数が可能な限り低く保たれうることを保証する。
【０００６】
しかしながら、そのような霊長類種間で移行可能な有効性データおよび毒性データを幹細胞由来分化NCからインビトロで得るには、侮りがたいハードル、すなわち第1に、種特異的な細胞培養プロトコールおよび霊長類種間で細胞培養条件を移行できないこと、そして第2に、分化中のNPCの不均一な分布（これは、細胞の局所濃度ならびにオートクリンおよびパラクリンシグナリングゆえに、最適でない生存条件または分化効果の妨害につながり、それが、薬物効果の表現型評価を困難にする）がある。これは、細胞の所望の分化状態を得るために長期間にわたって培養物を分化させる必要がある場合に、最も顕著になる。最も注目すべきことに、分化霊長類NCは細胞培養条件に対して本質的に感受性であり、苛酷な処理には耐性がなく、それが、これらの細胞で標準化されたアッセイを作製する際についてまわる障害である。
【０００７】
したがって、ヒトを含む異なる霊長類種から一様なNCアッセイを実現するための、容易に利用することができて再現性のある技術が、今も必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US2010/0021437
【特許文献２】WO2012/022725
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell. 2006; 126:663-676
【非特許文献２】Vierbuchen et al. Nature. 2010; 463:1035-41
【発明の概要】
【００１０】
本明細書に、一様に分布した分化神経細胞（NC）の標準化された細胞培養物を異なる霊長類種から作製するためのインビトロ法が提供され、該方法は、以下を含む：
（a）神経前駆細胞（NPC）を用意する工程;
（b）NPCをNCに分化させる工程であって、以下を含む、工程：
（i）約20日〜約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
（ii）前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日〜約15日にわたってNCの分化を継続する工程。
【００１１】
一態様において、霊長類種は、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens））、カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス（Macaca fascicularis））およびアカゲザル（マカカ・ムラタ（Macaca mulatta））からなる群より選択される。
【００１２】
一態様において、霊長類種は、ヒト（ホモ・サピエンス）およびカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）からなる群より選択される。
【００１３】
一態様において、分化NCの標準化された細胞培養物は、2つの霊長類種について個別に作製され、第1の霊長類種はヒト（ホモ・サピエンス）であり、第2の霊長類種はカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）である。
【００１４】
一態様において、NPCは人工多能性幹細胞（IPSC）に由来する。
【００１５】
一態様において、工程（b）は、Shh、FGF8、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルからなる群より選択される1種類または複数種類の分化作用物質と共にNPCを培養することを含む。
【００１６】
一態様において、工程（b）（i）は、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞を約5〜約10日間にわたって培養した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞をさらに約15日〜約35日間にわたって培養してから、分化NCをその支持体から解離することを含む。
【００１７】
一態様において、基本培地中の前記1種類または複数種類の分化作用物質の濃度は、Shhについて50〜500ng/ml、FGF8について25〜250ng/ml、BDNFについて1〜50ng/ml、GDNFについて1 50ng/ml、cAMPについて0.1〜10mM、アスコルビン酸リン酸エステルについて20〜200μMである。
【００１８】
一態様において、基本培地中の前記1種類または複数種類の分化作用物質の濃度は、Shhについて200ng/ml、FGF8について100ng/ml、BDNFについて20ng/ml、GDNFについて10ng/ml、cAMPについて0.5mM、アスコルビン酸リン酸エステルについて100μMである。
【００１９】
一態様において、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルとの培養期間は約7日であり、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルとの培養期間は約20〜約40日である。
【００２０】
一態様において、NPCはラミニン521支持体上に用意される。
【００２１】
一態様において、工程（b）（i）は、細胞剥離溶液で細胞を解離することを含む。
【００２２】
一態様において、細胞剥離溶液はAccutaseである。
【００２３】
一態様において、工程（b）（ii）は、ラミニン521支持体上に200000細胞/cm2で細胞を再播種することを含む。
【００２４】
一態様において、細胞は96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに再播種される。
【００２５】
一態様において、工程（b）（ii）はROCK阻害剤の存在下で細胞を再播種することを含む。
【００２６】
一態様において、ROCK阻害剤はY-27632である。
【００２７】
一態様において、工程（b）（ii）は、細胞を再播種した後に、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で細胞を培養することにより、分化を継続することを含む。
【００２８】
一態様において、分化NCはMAP2を発現する。
【００２９】
一態様において、分化NCはMAP2陽性神経突起を含む。
【００３０】
一態様において、NPCはニューロン障害を持つ個体に由来する。
【００３１】
一態様において、NPCは、健常個体に由来する。
【００３２】
一態様において、細胞培養物は異なる種について逐次的に作製される。
【００３３】
一態様において、細胞は、細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に本質的に一様に分布している。
【００３４】
一態様において、細胞の分布は、DNA染色、特にヘキスト（Hoechst）染色によって評価される。
【００３５】
一態様では、本明細書に記載する方法によって得られる細胞培養系が提供される。
【００３６】
一態様では、薬物候補の毒性のインビトロ試験のための、本明細書記載の方法によって得られる細胞培養物の使用が提供される。
【００３７】
一態様では、薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、本明細書記載の方法によって得られる細胞培養物の使用が提供される。
【００３８】
一態様では、ニューロン障害を持つ個体由来の細胞培養物および健常個体由来の細胞培養物において有効性が試験される、薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、本明細書記載の方法によって得られる細胞培養物の使用が提供される。
【００３９】
一態様では、薬物候補を選択するための、特に、さらなる開発のために薬物候補を選択するための、本明細書記載の方法によって得られる細胞培養物の使用が提供される。
【００４０】
一態様では、薬物候補がポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４１】
一態様では、薬物候補が少なくとも1種類の核酸分子、例えばRNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４２】
一態様では、核酸分子が、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４３】
一態様では、前記1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４４】
一態様では、LNAヌクレオシドが、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA、アルファ-L-アミノ-LNA、ベータ-D-チオ-LNA、アルファ-L-チオ-LNA、（S）cET、（R）cET、ベータ-D-ENAまたはアルファ-L-ENAから選択される、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４５】
一態様では、核酸分子が少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４６】
一態様では、連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４７】
一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがRNase Hを動員する能力を有する、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４８】
一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドがギャップマーである、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００４９】
一態様では、オリゴヌクレオチドが式5'-F-G-F'-3'のギャップマーであり、領域FおよびF'は、独立して1〜7個の修飾ヌクレオシドを含み、Gは、RNaseHを動員する能力を有する6〜16ヌクレオシドの領域である、本明細書記載の使用のための細胞培養物が提供される。
【００５０】
一態様において、本質的に、本明細書に記載するとおりである、方法および使用、が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
（図１）上側の鎖は、SNHG14転写産物（UBE3A-ATS）のうち、SNORD109B下流の領域を図解しており、黒いボックスは試験したマウスオリゴヌクレオチドの位置を示している。下側の鎖は、UBE3Aコーディング領域を図解しており、黒いボックスはエクソンを示している。エクソン1は160kb付近に位置する。オリゴヌクレオチドは、エクソン9（約97kbに位置する）。エクソン10（約92kbに位置する）、エクソン13（約77kbに位置する）、およびエクソン16の5'端（約60kbに位置する）のアンチセンス領域に配置されている。
（図２）実施例2で試験したオリゴヌクレオチドの、ヒト神経細胞培養物におけるUBE3Aの再発現を誘発する能力を図示している。ヒトSNHG14長鎖ノンコーディングRNAのうち、SNORD109BとUBE3Aコーディング領域上流の領域との間にある領域（SEQ ID NO:1の位置1〜55318）に相補的なオリゴヌクレオチドは、
2019500851.tif 000002
非オーバーラップで示されている。UBE3AプレmRNAに対してアンチセンスであるヒトSNHG14長鎖ノンコーディングRNAの領域（SEQ ID NO:1の位置55319〜141053）に相補的なオリゴヌクレオチドは、
2019500851.tif 000003
オーバーラップで示されている。ヒトおよびアカゲザルに保存されている表3のオリゴヌクレオチドは、各プロットの下に
2019500851.tif 000004
で示されている。ヒト:アカゲザル:マウス間での保存は
2019500851.tif 000005
で示されている。オリゴヌクレオチド濃度は、各プロットの右側に示されているとおり、0.2、1および5μMであった。
（図３）ヒトで薬物有効性を評価する前に、まず霊長類インビトロ細胞培養モデルで、次に霊長類種でのインビボ研究で、薬物候補の有効性を評価するための、スクリーニング戦略の模式図。カニクイザルとヒトのIPSC由来ニューロンを、UBE3Aアンチセンスを標的とするオリゴヌクレオチドのターゲット・エンゲージメントおよび有効性を評価するためのインビトロモデルとして使用する。インビボ研究に先だって、好ましい有効性プロファイルを持つ候補に優先順位を付ける。
（図４）カニクイザルIPSCから神経系始原細胞を誘導するために実行されるさまざまな工程の概観。霊長類IPSC株の神経化には二重SMAD阻害プロトコールの変法を使用する。MTはMT培地を指し、N2B27＋SB＋LDNはSB-431542およびLDN-193189を補足したN2B27培地を指し、N2B27＋FEBはFGF、EGFおよびBDNFを補足したN2B27培地を指す。
（図５）カニクイザルおよびヒトの神経系前駆体は、Sox2およびネスチンに関して陽性のよく似た染色、およびMap2に関して陽性の各分化ニューロン染色を呈する。
（図６）適用された定方向分化方法は、同等な、異種間でのニューロン分化を誘発する。（図5A）カニクイザルIPSCを、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステル（BGAA）を補足した基本培地中で、14日間分化させた。カニクイザルIPSCおよび14日目のNCからRNAを単離し、表示したマーカーの発現をqPCRによって分析した。データをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対応させて正規化し、カニクイザルIPSCにおける発現レベルとの比として表す。（図5B）ヒトPSCと、BGAAを補足した基本培地中で14日にわたって分化させたヒトNCとから、RNAを単離し、表示したマーカーの発現をRNAシーケンシングによって分析した。データをRPKM値として表す。（図5C）ヒトPSCと、BGAAを補足した基本培地中で14日間分化させたヒトNCとから、RNAを単離し、表示したマーカーの発現をqPCRによって分析した。データをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対応させて正規化し、ヒトPSCにおける発現レベルとの比として表す。（図5D）BGAAを補足した基本培地中で14日間分化させたカニクイザルNC（左パネル）およびヒトNC（右パネル）からRNAを単離し、UBE3A転写産物およびUBE3A-ATS転写産物の発現をqPCRによって分析した。左パネル:データをハウスキーピング遺伝子TBPに対応させて正規化し、カニクイザルIPSCとの比として表す。右パネル:データをハウスキーピング遺伝子GAPDHに対応させて正規化し、ヒトPSCとの比として表す。
（図７）化合物スクリーニングに適する、カニクイザル神経系前駆体からロバストなニューロン培養物を得るための4つの分化方法（A〜D）を比較するための実験レイアウトの模式的描写。MIは有糸分裂阻害剤を指す。
（図８）図7に記載する4つのニューロン分化方法の画像ベースの比較。分化の35日目にNCを固定し、マゼンタで描写されるSox2（グリアおよびNSCのマーカー）および緑色で描写されるMap2（NCのマーカー）について染色した。
（図９）ヒトiPSC由来分化NCの解離および再播種の実行可能性を試験するために、2つの細胞株を並行して分化させた。それぞれについて、細胞を6週間にわたって直接（すなわち再プレーティングなしで）分化させるか、21日目に解離し、再播種してから、さらに3週間にわたって培養した。ニューロンマーカー（MAP2）およびグリアマーカー（GFAP）に関する免疫蛍光染色は、解離および再播種（再プレーティング）が、細胞の分化能を妨害しないことを示している。
（図１０）解離および再播種（再プレーティング）ありならびになしでの、2つの異なるiPSC由来細胞株における分化の程度の定量。HuC/Dは、ニューロンによって発現されるマーカーであり、これを、合計6週にわたって分化させた培養物において、免疫蛍光染色によって検出し、ハイコンテントイメージングによって定量した。このデータは、再プレーティングがニューロン分化の程度を有意に変化させないことを示している。
（図１１）微小管関連タンパク質タウおよびそのリン酸化型のうちの2つの発現を分析した。2つの細胞株における発現およびリン酸化の程度が再プレーティングの有無によって変化しないことは、再プレーティング（解離および再播種）がヒトiPSC由来NCの細胞骨格特徴を破壊しないことを証明しており、生理学的特徴はNCを解離し再播種することによって改変されないことが示唆される。
（図１２）ハイスループットフォーマットにおけるスクリーニングのためのロバストな霊長類ニューロン培養物の安定的な供給を可能にするワークフローの模式的図解。SFAは、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地を指し、BGAAは、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地を指し、矢印は解離および再播種（再プレーティング）を表す。
（図１３）ヒトおよびカニクイザルに由来する一様に分布した神経系細胞（NC）の標準化された細胞培養物での、試験した化合物のターゲット・エンゲージメント。ヒトでのターゲット・エンゲージメントが知られているUBE3Aアンチセンス転写産物（アンチセンス）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、2つの濃度（低: 0.02μM; 高: 2μM）で試験した。AおよびBにおけるカニクイザルに由来するNC培養物は、CおよびDにおけるヒトに由来するNC培養物と比較して同等なターゲット・エンゲージメントを呈する。カニクイザルNCおよびヒトNCを表示の濃度で処理すると、UBE3A転写産物（センス）のアップレギュレーションを伴って、UBE3Aアンチセンス転写産物の低減が起こる。細胞培養物は図12に含まれるワークフローに従って作製した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸にハイブリダイズすることによって、特に標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節する能力を有するオリゴヌクレオチドと定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、それゆえにsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００５３】
本明細書において使用される場合、用語「基本培地」は、1×B27（Gibco, Invitrogen）、1×N2（Gibco, Invitrogen）、0.1mMベータ-メルカプトエタノール（Gibco, Invitrogen）を補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地（Gibco, Invitrogen）で構成される合成培地を指す。用語「BGAA」は、20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地を指す。用語「SFA」は、200ng/ml Shh、100ng/ml FGF8および100μMアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地を指す。
【００５４】
本明細書において使用される用語「連続したヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書においては、用語「連続した核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と可換的に使用される。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドがすべて、連続したヌクレオチド配列中に存在する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドが連続したヌクレオチド配列を含み、任意で、さらなるヌクレオチド、例えば連続したヌクレオチド配列に機能性基を取り付けるために使用することができるヌクレオチドリンカー領域を含みうる。ヌクレオチドリンカー領域は標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「合成培地」または「既知組成培地」は、個々の構成成分とそれぞれの濃度とがすべてわかっている細胞培養培地を指す。合成培地は、既知組成の組換え構成成分を含有しうる。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「分化する」および「分化」は、分化度の低い細胞を分化度の高い細胞、特に分裂終了後の組織特異的細胞タイプに変換するための、例えばNPCをNCに変換するための、1つまたは複数の工程を指す。NCへのNPCの分化は、とりわけ、細胞培養培地に1種または数種の分化作用物質を加えることによって、誘発することができる。
【００５７】
本明細書において使用される場合、用語「有効性プロファイル」または「有効性」は、当業者に広く理解されているとおり、薬物候補への、特に異なる濃度および/または異なる投与経路での、試験系、例えば細胞培養物または生物の曝露と、それに続く、薬物候補の所望の効果と相関する、結果として生じる細胞効果および/または生理学的効果の決定とに基づく、薬物候補の有効性の評価を含むと定義される。細胞効果および/または生理学的効果を決定するためのパラメータは、各薬物候補との関連において定義され、試験系または生物に対する薬物候補の所望の表現型効果と相関するパラメータを含む。好ましくは、薬物候補の有効性プロファイルを確立するために、限定するわけではないが、生存、細胞生存能力、形態、特別な遺伝子の発現および/または発現レベル、ならびにタンパク質合成を含む、2つ以上のパラメータが記録される。本発明の一局面において、有効性プロファイルを確立する工程は、ターゲット・エンゲージメントを評価する工程を含む。
【００５８】
「発現マーカー」または「マーカー」は、細胞タイプのアイデンティティを決定するために使用することができる。ある特定の、細胞特異的遺伝子のうちの情報価値があるDNA配列は、mRNAに転写され、通常は続いて、細胞中である特定の機能を発揮するタンパク質（その遺伝子産物）へと翻訳される。マーカーの発現は、当技術分野において公知の方法により、RNAレベルまたはタンパク質レベルで検出し、定量することができる。IPSC細胞マーカーは当技術分野において公知であり、TRA-1-60、TRA-1-81、Ecat1、Nanog、Oct4/POU5F1、Sox2、Rex1/Zfp-42およびUTF1、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。NPC細胞マーカーは当技術分野において公知であり、Sox2、ネスチン、Sox1、Pax6、Dach1が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。NC細胞マーカーは当技術分野において公知であり、MAP2、β-III-チューブリン、DCX/ダブルコルチン、SYN1/シナプシン1およびGPHN/ゲフィリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝的距離」は、2つの種、2つのゲノムまたは2つの集団間の遺伝的多様性の尺度と理解されるものとする。遺伝的距離は、例えば異なる種間であれば、当技術分野において公知の方法によって、例えば限定するわけではないが、Neiの標準遺伝的距離、Goldstein距離またはRynolds/Weir/Cockerhamの遺伝的距離を決定することなどによって、決定することができる。遺伝的距離は、当技術分野公知のソフトウェア、例えば限定するわけではないが、POPTREE2またはDISPANなどによって計算することができる。遺伝的距離が小さい場合、「遺伝的類似性」は高い。
【００６０】
本明細書では以下の略号が使用される。線維芽細胞成長因子（FGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、上皮成長因子（EGF）、ソニックヘッジホッグ（shh）、線維芽細胞成長因子8（FGF8）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、環状アデノシン一リン酸（cAMP）、Rho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ（ROCK）。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「成長因子」は、細胞増殖を引き起こす生物学的に活性なポリペプチドまたは小分子化合物を意味し、成長因子とそれらの類似体との両方を包含する。
【００６２】
本明細書にいう「ハイスループットスクリーニング」は、本明細書に記載する新規アッセイを使用して、比較的多数の異なる疾患モデル条件および/または化学的化合物を分析し、比較できることを表すと理解されるものとする。典型的には、そのようなハイスループットスクリーニングは、マルチウェルマイクロタイタープレート、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレートまたは1536ウェルもしくは3456ウェルのプレートで行われる。
【００６３】
「LNAヌクレオシド」は、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'の間にリンカー基（ビラジカルまたはブリッジという）を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献では架橋核酸または二環式核酸（BNA）とも呼ばれている。
【００６４】
本明細書において使用される場合、用語「一様に分布した」、「一様な分布」または「均一な分布」は、当業者に広く理解されているとおり、一次元空間、二次元空間、または多次元空間における実体の分布、特に、細胞培養支持体の二次元表面での細胞の分布を指す。単位面積あたりの平均細胞数が全細胞培養表面の全体にわたって本質的に不変であるなら、二次元細胞培養表面上で一様な分布が確立される。細胞の分布は、例えば核染色を行い、蛍光顕微鏡を使用して単位面積あたりの細胞核の数を決定することによって、評価することができる。不均一な細胞分布の指標には、例えば細胞塊、有意な数のオーバーラップした細胞核、または細胞培養エリアの有意な部分が細胞を欠くことが含まれる。細胞が一様に分布している1つまたは複数の細胞タイプの細胞培養物を、本明細書では「標準化された」という。「標準化された細胞培養物」または「標準化されたNC培養物」は、本発明に従って作製された細胞培養物を指し、ここでは、細胞の分布が本質的に一様であり、すなわち細胞が一様に分布しており、細胞培養物は一様な分布を特徴とし、細胞培養物は、1つまたは複数の細胞タイプを含みうる。したがって、例えば核染色を行い、単位面積あたりの細胞核の数を決定することによって評価した場合に、細胞が均一な分布を呈するのであれば、細胞培養物は標準化されているとみなされる。
【００６５】
本明細書において使用される用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、当業者に広く理解されているとおり、2つのヌクレオシドを共有結合で互いにカップリングする、ホスホジエステル（PO）連結以外の連結と定義される。修飾ヌクレオシド間連結を持つヌクレオチドも「修飾ヌクレオチド」と呼ばれる。修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然オリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間連結は、隣接ヌクレオシド間にホスホジエステル結合を作り出すリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボ使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのにとりわけ有用であり、修飾ヌクレオシドの領域内のみならず、本発明のオリゴヌクレオチド中のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの領域において、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で、ヌクレアーゼ切断から保護するのにも役立ちうる。
【００６６】
本明細書において使用される場合、用語「MT培地」は、2.5mM GlutaMAX（商標）、7μg/mlインスリン、450μMモノチオグリセロール、1×脂質濃縮物、5mg/ml BSA、14ng/ml亜セレン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、2mg/mlヘパリン、15μg/mlトランスフェリン、および220μMアスコルビン酸-2-リン酸を含む、ハムのF12栄養混合物を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM/F12）を含有する合成培地を指す。
【００６７】
本明細書にいう「神経前駆細胞」または「NPC」は、IPSCに由来し、例えばネスチンを含むいくつかの神経系始原細胞マーカーを発現する、複能性細胞のサブセットを指す。NPCは、とりわけ、参照によりそのまま本明細書に組み入れられるCosta et al. Cell Rep 2016; 15:86-95およびDunkley et al. Proteomics Clin Appl 2015;7-8:684-94に記載の方法に従って、または本明細書に記載の方法に従って、作製することができる。NPCは無限に拡大培養することができ、ニューロンまたはグリア細胞（例えばアストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）に分化しうる。用語「患者特異的NPC」は、患者の体細胞からリプログラムされた患者IPSCから得られるNPCを指す。本明細書にいう「健常個体から得たNPC」は、見たところ健康であって何らかの障害または疾患を患っている疑いのない個体の体細胞から得られたIPSCから分化したNPCを指す。
【００６８】
本明細書にいう「神経細胞」または「NC」は、ニューロン系譜由来の組織特異的細胞を指す。NCは、特別な細胞培養条件を使用して、例えば、本明細書に記載するように、成長因子の退薬によって、または1つもしくは複数の分化作用物質の添加によって、NPCからインビトロで分化させることができる。
【００６９】
本明細書において使用される用語「非ヒト霊長類」または「NHP」は、ホモ・サピエンスを除く、霊長類目に属する種を指す。特に、本発明において開示される方法でのNHP種としては、チンパンジー（Pan troglodytes）、ボノボ（Pan paniscus）、シロテナガザル（Hylobates lar）、ゴリラ（Gorilla gorilla）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）、ボルネオオランウータン（Pongo pygmaeus）、ブルーモンキー（Cercopithecus mitis）、ブラッザモンキー（Cercopithicus neglectus）、サバンナザル（Chlorocebus aethiops）、ミドリザル（Chlorocebus sabaeus）、アビシニアコロブス（Colobus guereza）、ロフォセブス・アテリム（Lophocebus aterrimus）、ベニガオザル（Macaca arctoides）、アッサムモンキー（Macaca assamensis）、マカカ・ファシキュラリス（カニクイザル）、ニホンザル（Macaca fuscata）、マカカ・ムラタ（アカゲザル）、ブタオザル（Macaca nemestrina）、シシオザル（Macaca silenus）、ドリル（Mandrillus leucophaeus）、マンドリル（Mandrillus sphinx）、チベットモンキー（Macaca thibetana）、アヌビスヒヒ（Papio anubis）、キイロヒヒ（Papio cynocephalus）、マントヒヒ（Papio hamadryas）、ギニアヒヒ（Papio papio）、チャクマヒヒ（Papio ursinus）、ハヌマンラングール（Presbytis entellus）、ゲラダヒヒ（Theropithecus gelada）、アオタス・アザレ（Aotus azarae）、アオタス・ナンシマエ（Aotus nancymaae）、アオタス・ニグリセプス（Aotus nigriceps）、ヨザル（Aotus trivirgatus）、アオタス・ボシフェランス（Aotus vociferans）、ケナガクモザル（Ateles belzebuth）、ブラウンクモザル（Ateles fusciceps）、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ダスキーティティ（Callicebus moloch）、ピグミーマーモセット（Cebuella pygmaea）、フサオマキザル（Cebus apella）、ゴールデンライオンタマリン（Leontopithecus rosalia）、シロガオサキ（Pithecia pithecia）、セマダラタマリン（Saguinus fuscicollis）、ジョフロイタマリン（Saguinus geoffroyi）、シロクチタマリン（Saguinus labiatus）、クチヒゲタマリン（Saguinus mystax）、ワタボウシタマリン（Saguinus Oedipus）およびリスザル（Saimiri sciureus）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００７０】
本明細書において使用される用語「cyno」はカニクイザルの略号であり、かつ/またはカニクイザルに由来する材料、例えば限定するわけではないが、細胞、組織、器官、血液またはそれらに由来する細胞を指す。
【００７１】
「ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのビルディングブロックであり、本明細書の目的には天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの両方を包含する。自然界において、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および1つまたは複数のリン酸基（これはヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、可換的に、「単位」または「モノマー」ということもできる。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「ヒトゲノムに由来するヌクレオチド配列」は、各ヌクレオチド配列がヒトゲノムリファレンスに由来すること、すなわち世界人口の少なくとも部分集団がゲノム中に各ヌクレオチド配列を含むことを意味する。さらにまた、本明細書において使用される用語「ヒトゲノムに由来するヌクレオチド配列」は、NCBI/Blastデータベースおよびアルゴリズムを使用して最も高い最大スコアでヒトゲノムに割り当てられた配列に使用される（Zheng Zhang, Scott Schwartz, Lukas Wagner, and Webb Miller（2000）「A greedy algorithm for aligning DNA sequences」J Comput Biol 2000;7（1-2）:203-14）。理論に束縛されることは望まないが、クエリ配列がヒトゲノムに由来するのであれば、クエリ配列のアラインメントスコアは、非ヒトリファレンス配列と比較して、ヒトリファレンス配列の場合の方が高いと考えられる。
【００７３】
本明細書において使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、糖部分または（核酸）塩基部分への1つまたは複数の修飾の導入により、等価なDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと比較して修飾されているヌクレオシドを指す。好ましい一態様において、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語は、本明細書では、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と可換的に使用することもできる。
【００７４】
用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、当業者に広く理解されているとおり、2つのヌクレオシドを共有結合で互いにカップリングする、ホスホジエステル（PO）連結以外の連結と定義される。修飾ヌクレオシド間連結を持つヌクレオチドも「修飾ヌクレオチド」と呼ばれる。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然オリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間連結は、隣接ヌクレオシド間にホスホジエステル結合を作り出すリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボ使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのにとりわけ有用であり、修飾ヌクレオシドの領域内のみならず、本発明のオリゴヌクレオチド中のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの領域において、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で、ヌクレアーゼ切断から保護するのにも役立ちうる。
【００７５】
本明細書において使用される場合、用語「N2B27」は、N2およびB27（どちらもGibco, Invitrogen製）を補足した等体積のDMEM:F12（Gibco、Invitrogen）で構成される合成培地を指す。
【００７６】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に広く理解されているとおり、共有結合で連結された2つ以上のヌクレオシドを含む分子と定義される。共有結合されたそのようなヌクレオシドは核酸分子またはオリゴマーともいうことができる。オリゴヌクレオチドは、一般に、固相化学合成とそれに続く精製とによって作られる。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合は、共有結合で連結されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾の配列または順序に言及する。オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含みうる。本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸にハイブリダイズすることによって、特に標的核酸上の連続した配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節する能力を有するオリゴヌクレオチドと定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、それゆえにsiRNAではない。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００７７】
本明細書において使用される場合、用語「リプログラミング」は、体細胞を分化度の低い細胞に変換するのに必要な、例えば線維芽細胞、脂肪細胞、ケラチノサイトまたは白血球をNPCに変換するための、1つまたは複数の工程を指す。「リプログラムされた」細胞とは、本明細書に記載するように体細胞をリプログラムすることによって誘導された細胞をいう。
【００７８】
本明細書において使用される用語「小分子」または「小化合物」または「小分子化合物」は、一般に10,000グラム/モル未満の分子量、任意で5,000グラム/モル未満、任意で2,000グラム/モル未満の分子量を有する、合成されたまたは自然界に見いだされる、有機分子または無機分子を指す。
【００７９】
本明細書において使用される用語「体細胞」は、生殖細胞系細胞（例えば精子および卵子、生物がそこから作られる細胞（ガメトサイト））ならびに未分化幹細胞ではない、生物の身体を形成する任意の細胞を指す。
【００８０】
本明細書において使用される用語「幹細胞」は、自己複製能および分化能を有する細胞を指す。本明細書にいう「未分化幹細胞」は、分化を起こしていない幹細胞を指す。本明細書にいう「多能性幹細胞」または「PSC」は、3つの胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）ならびに生殖細胞系の細胞タイプを生じることができる幹細胞を指す。多能性幹細胞（PSC）には、「胚性幹細胞」（「ESC」）および「人工多能性幹細胞」（「IPSC」）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。用語「hIPSC」および「cIPSC」は、それぞれヒト細胞に由来するIPSCおよびカニクイザル細胞に由来するIPSCを指す。
【００８１】
本明細書において使用される場合、用語「細胞生存能力の実質的喪失」は、所定のプロセスにおける相異なる細胞培養条件の適用または細胞の操作後に起こる、特に細胞培養支持体からの細胞の解離との関連における、細胞生存能力の低減を指す。一態様において、細胞生存能力の実質的喪失とは、細胞の5％超が生存不可能になりかつ/またはアポトーシスを起こすことを意味する。さらなる態様において、細胞生存能力の実質的喪失とは、10％超、15％超、20％超、または25％超の細胞が生存不可能になりかつ/またはアポトーシスを起こすことを意味する。したがって、一態様において、用語「本質的に生存可能なままである」という用語は、95％超の細胞が生存可能なままであることを意味する。さらなる態様において、本質的に生存可能なままであるとは、90％超、85％超、80％超または75％超の細胞が生存可能なままであることを意味する。
【００８２】
本明細書にいう「適切な分化用培地」は、「分化培地」ともいい、NCへのNPCの分化に有用な任意の既知組成培地を指す。本明細書に記載の分化培地は少なくとも1つの「分化作用物質」を含有する。分化作用物質としては、細胞分化を引き起こす生物学的に活性なポリペプチドまたは小分子化合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００８３】
「標的」とは、調節することが望まれるタンパク質を指す。「標的核酸」は、本発明のオリゴヌクレオチドがそこにハイブリダイズする、意図した標的であり、例えば遺伝子、RNA、ノンコーディングRNA、長鎖ノンコーディングRNA、mRNA、およびプレmRNA、成熟mRNAまたはcDNA配列でありうる。いくつかの態様において、標的核酸はノンコーディングRNAもしくは長鎖ノンコーディングRNAまたはそれらの部分配列である。特定のインビボまたはインビトロ応用の場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、SNORD109B下流のSNHG14転写産物のレベルを減少させ、それによって、意図した標的細胞における父性UBE3A転写産物の抑制を軽減する能力を有する。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続した配列は、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定した場合に、任意で1つまたは2つのミスマッチを例外として、また任意でオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの随意の機能性基に連結しうるヌクレオチドベースのリンカー領域を除いて、標的核酸に相補的である。本オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の部分配列に相補的な、または標的核酸分子の部分配列にハイブリダイズする、連続したヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
本明細書において使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの態様において、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列に相補的な、標的核酸上の領域からなる。いくつかの態様において、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば数個の本発明のオリゴヌクレオチドの標的となりうる核酸配列の好ましい領域に相当しうる。本発明のオリゴヌクレオチドは、標的配列などの標的核酸に相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。本オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子中に存在する標的配列に相補的なまたはハイブリダイズする少なくとも8ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む。連続したヌクレオチド配列（それゆえに標的配列）は、少なくとも8個の連続したヌクレオチド、例えば9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個の連続したヌクレオチド、例えば12〜25個、例えば14〜18個の連続したヌクレオチドを含む。
【００８５】
本明細書において使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの態様において、標的細胞はインビボまたはインビトロでありうる。いくつかの態様において、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば齧歯類細胞、例えばマウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはヒト細胞である。一態様において、標的細胞は神経細胞（NC）である。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「毒性プロファイル」または「毒性」は、当技術分野において広く理解されているとおり、潜在的有害または非有害物質への、特に異なる濃度および/または異なる投与経路での、試験系、例えば細胞培養物または生物の曝露と、それに続く、結果として生じる細胞効果および/または生理学的効果、例えば細胞の生存または健康状態の決定とに基づく、潜在的有害または非有害物質の毒物学的評価を含むと定義される。細胞効果および/または生理学的効果を決定するためのパラメータは当技術分野において周知であって、生存、細胞生存能力、形態、ある特定の遺伝子の発現および/または発現レベル、ならびにタンパク質合成を含むが、それらに限定されるわけではない。好ましくは、毒性未知の物質の毒性プロファイルを確立するために、2つ以上のパラメータが記録される。薬物候補の毒性プロファイルは、当技術分野では、例えば霊長類またはヒトでのインビボ試験など、さらなる開発のための薬物候補を選択するために使用される。
【００８７】
本発明は、薬物候補のインビトロハイスループット試験に使用することができる、再現性のある標準化された分化NC培養物を、ヒトを含む異なる霊長類種から作製するための新規方法を提供する。本方法は、霊長類NPCを用意する工程、NPCをNCに分化させる工程、および分化霊長類NCを解離し、細胞生存能力の有意な喪失を伴うことなく、適切な細胞培養フォーマットで細胞を再播種し、NCの分化を続けることによって、薬物候補のハイスループットスクリーニングを行う能力を細胞培養物に与える工程を含む。霊長類NPCは、IPSCまたは分化転換細胞に由来することができ、どちらも体細胞から生成させることができる。好ましくは、該体細胞はヒト体細胞を含む霊長類細胞である。
【００８８】
一態様において、一様に分布した分化神経細胞（NC）の細胞培養物を異なる霊長類種から作製するためのインビトロ法が提供され、該方法は、以下の工程を含む：
（a）神経前駆細胞（NPC）を用意する工程、ならびに
（b）以下を含む、NPCをNCに分化させる工程：
（i）分化の20日目と45日目との間に分化NCをその支持体から解離させる工程、および
（ii）細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、4〜15日にわたってNCの分化を継続する工程。
【００８９】
本明細書に記載する本発明の方法を達成するために、NC培養物の既存の制約の一部を回避する必要があった。接着培養または浮遊培養のいずれかとして無限に拡大培養することができるNPCとは対照的に、分化中のNCが、通常は細胞培養プレートの生体高分子コーティングからなるマトリックスとの相互作用に決定的に依存することは、広く受け入れられている。さらにまた、分化NCは細胞ストレスに敏感になり、それゆえに分化細胞の継代は、該細胞にとっては有害であるとみなされている。本発明の画期的方法は、異なる霊長類種から一様なNC培養物を作製することができる細胞培養条件を開示し、ここでは、分化の10日目と40日目との間にNCが、生存能力の実質的喪失を伴わずに、その支持体から解離される。NCは、適切な細胞培養フォーマットで再播種し、分化を継続することができる。解離および再播種は、細胞培養エリア上に分化NCの均一な分布をもたらす。さらにまた、本発明の方法は、NC分化の後期において細胞培養フォーマットを変えることを可能にする。さらなる態様において、工程（b）（i）は、分化のおよそ25日目とおよそ40日目との間、およそ28日目とおよそ30日目との間、およそ28日目またはおよそ30日目に、分化NCをその支持体から解離する工程を含む。
【００９０】
したがって、本発明の一局面は、一様な分化NC培養物を作製するための、本明細書に記載する方法である。一態様において、工程（b）は、（i）分化の20日目と45日目との間に分化NCをその支持体から解離する工程、および（ii）細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、4〜10日にわたってNCの分化を継続する工程を含み、NCは本質的に生存可能なままである、NPCを神経系細胞（NC）に分化させる工程を含む。該解離および再播種工程は、細胞培養ウェルなどの細胞培養表面のエリアにわたって分化霊長類NCの一様な分布を得るため、および/または生存能力の実質的喪失を伴わずに分化霊長類NCを収集するために、重要である。結果として、本発明によって作製される分化霊長類NC培養アッセイは、解離および再播種なしで作製された細胞培養物と比較して、より均等に分布した細胞を呈し、ハイスループットアッセイにより適している。重要なことに、細胞培養フォーマットは、NC分化の後期において変化させることができる。これは、最終培養フォーマットを初期の時点で使用する必要がある当技術分野の方法とは対照的である。事実、細胞培養フォーマットを変えうることは、調達面でかなりの融通性を可能にする。
【００９１】
この再現性の高い霊長類NCの細胞培養物は十分に標準化されており、限定するわけではないが薬物候補のインビトロ有効性評価などといった化合物スクリーニングアッセイに使用することができる。さらにまた、本明細書に記載する細胞培養物は、薬物候補を選択するために、特に本明細書に記載するようにさらなる開発のための薬物候補を選択するために、使用することもできる。一態様において、本発明の細胞培養物は、本明細書に記載するように、薬物候補のインビトロ有効性プロファイルを決定するために使用される。さらなる一態様では、本明細書に記載するように、インビボ有効性プロファイルの決定に先だって、薬物候補のインビトロ有効性プロファイルが決定される。さらなる一態様において、本発明の細胞培養物は、本明細書に記載するように薬物候補のインビトロ毒性プロファイルを決定するために使用される。
【００９２】
したがって一態様では、分化霊長類NCを細胞培養容器から解離するが、この際、NCは本質的に生存可能なままである。解離したNCは、所与の細胞培養アッセイの必要性に合わせて最適化された細胞密度で、所望の細胞培養フォーマットで再播種することができる。一態様において、本発明において記載する解離および再播種条件は、異なる霊長類種に適用することができる。一態様において、本発明の方法は、薬物候補の有効性プロファイルの種間比較に使用することができ、ここで、細胞培養物は、少なくとも2つの種の細胞から個別に作製され、すべての種についての培養に本質的に同じ条件が適用され、有効性プロファイルは、すべての種について決定されて比較される。本質的に同じ細胞培養条件を使用して、少なくとも1つの霊長類種、少なくとも2つの霊長類種、または少なくとも3つの霊長類種に由来する標準化された細胞培養アッセイを作製し、少なくとも1つの薬物候補の包括的有効性プロファイルを決定するために、アッセイリードアウトによって決定される結果を比較し、統合することは、本発明の範囲内である。
【００９３】
一態様では、リプログラムされた体細胞に由来するIPSCから、NPCを作製する。IPSCへの体細胞のリプログラミングは、IPSC特性の維持に関与する特別な遺伝子を導入することによって、達成することができる。IPSCへの体細胞のリプログラミングに適した遺伝子として、Oct4、Sox2、Klf4およびC-Mycならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一態様では、リプログラミングのための遺伝子は、Oct4、Sox2、Klf4およびC-Mycである。
【００９４】
体細胞をNPCに分化転換するための遺伝子の組み合わせは、参照により本明細書に包含されるWO2012/022725に記載されている。
【００９５】
内臓、皮膚、骨、血液および結合組織はすべて体細胞で構成されている。IPSCを作製するために使用される体細胞は、例えば線維芽細胞、脂肪細胞およびケラチノサイトであるが、それらに限定されるわけではなく、皮膚生検から得ることができる。他の適切な体細胞は、血液試料から得られる白血球、赤芽球細胞、または血液もしくは尿試料から得られる上皮細胞もしくは他の細胞であり、これらは当技術分野において公知の方法より、本明細書に記載するように、IPSCにリプログラムされる。体細胞は健常個体または罹患個体から得ることができる。本明細書に記載するリプログラミングのための遺伝子は、当技術分野において公知の方法により、リプログラミングベクターによる細胞への送達によって、または小分子による該遺伝子の活性化によって、体細胞中に導入される。リプログラミングのための方法は、とりわけ、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、プラスミドおよびトランスポゾン、マイクロRNA、小分子、修飾RNAおよび組換えタンパク質を含む。一態様では、本明細書に記載する遺伝子を送達するために、レンチウイルスが使用される。別の一態様では、Oct4、Sox2、Klf4およびC-Mycが、センダイウイルス粒子を使用して体細胞に送達される。加えて、体細胞を少なくとも1つの小分子の存在下で培養することができる。一態様において、該小分子は、プロテインキナーゼのRho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ（ROCK）ファミリーの阻害剤を含む。ROCK阻害剤の非限定的な例には、ファスジル（1-（5-イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、チアゾビビン（N-ベンジル-2-（ピリミジン-4-イルアミノ）チアゾール-4-カルボキサミド）およびY-27632（（＋）-（R）-trans-4-（1-アミノエチル）-N-（4-ピリジル）シクロ-ヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）などがある。結果として生じるIPSCはNPCに分化するように誘導することができる。一態様では、NPCに分化するようにIPSCを誘導する。
【００９６】
一態様では、二重SMAD阻害によってIPSCから霊長類NPCを作製する。一態様では、細胞をSB-431542（Calbiochem）およびLDN-193189（Calbiochem）と接触させることによって、IPSCからNPCを作製する。一特定態様では、細胞を5ng/ml FGF（Peprotech）、10μM SB-431542（Calbiochem）および100nM LDN-193189（Calbiochem）と接触させることによって、IPSCからNPCを作製する。結果として生じた霊長類NPCは、FGF、EGFおよびBDNFを補足した基本培地中で拡大培養することができる。一態様では、10ng/ml FGF（Peprotech）、10ng/ml EGF（RnD）、および20ng/ml BDNF（Peprotech）を補足した基本培地中でNPCを拡大培養する。FGF、EGFおよびBDNFを補足した基本培地における継代の継続は、安定神経系始原細胞株（NPC株）をもたらす。安定NPC株は、その自己複製能ならびに発生段階特異的マーカーSox2およびネスチンの発現によって定義される。したがって、一態様において、霊長類NPCはSox2およびネスチンを発現する。
【００９７】
NPCの増殖を高めるために、成長因子類を補足した無血清培地を含む拡大培地中で細胞を成長させる。一態様において、該成長因子は、FGF、BDNFおよびEGFを含む。したがって一態様において、本方法は、工程（a）の細胞をNPCの増殖に適した条件下で、例えば単位面積あたりの細胞が所定の数に達するまで、インキュベートする工程を、さらに含む。拡大培地の非限定的な例は本明細書に記載する。一態様では、10〜50ng/ml FGF、10〜50ng/ml EGFおよび1〜20ng/ml BDNFが拡大培地に補足される。一特定態様において、NPC拡大培地は、10ng/ml FGF2、10ng/ml EGFおよび20ng/ml BDNFを補足した基本培地である。NPCは、量的には無制限に作製することができるので、多数のアッセイプレートを必要とするハイスループット細胞培養アッセイに最も適している。培養することは当業者の能力内である。
【００９８】
一態様では、分化を開始させる前に、死細胞をすべて除去するために、霊長類NPCを適切な緩衝液または培地で洗浄する。好ましくは、細胞培養プロトコールの各工程間で培地を変える。例えば、培地を吸引によって、または細胞を遠心分離して上清を捨てることによって除去した後、後続工程において使用する培地を細胞に加える。一態様では、後続工程の培地を加える前に、死細胞をすべて除去し、先の工程において適用した培地または成長因子もしくはサイトカインの残留分をすべて除去するために、適切な緩衝液または培地で細胞を洗浄する。細胞の洗浄に有用な緩衝液または培地は当技術分野において公知である。細胞を洗浄するための適切な緩衝液の一例はリン酸緩衝食塩水（PBS）である。
【００９９】
一態様では、霊長類NPC培養物が約5000細胞/cm2〜約100000細胞/cm2の密度で用意される。さらなる態様では、霊長類NPC培養物が約10000細胞/cm2〜約50000細胞/cm2の密度で用意される。一態様では、接着霊長類NPC培養物が約20000細胞/cm2〜約40000細胞/cm2の密度で用意される。一態様では、接着霊長類NPC培養物が約30000細胞/cm2の密度で用意される。一態様では、接着霊長類NPC培養物がラミニン521支持体上に用意される。
【０１００】
一態様では、当技術分野において公知の方法によって本明細書に記載するように得られる霊長類NPCは、次の工程において、細胞をShh（ソニックヘッジホッグ）、FGF8（線維芽細胞成長因子8）およびアスコルビン酸リン酸エステルと接触させることにより、NCに分化するように誘導される。一態様では、NPCを、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む本明細書に記載する既知組成培地と共にインキュベートする。一態様では、50〜1000ng/ml Shh、25〜500ng/ml FGF8および20〜200μMアスコルビン酸リン酸エステルが培地に補足される。さらなる態様では、細胞を、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日または約10日にわたって、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルと接触させる。さらなる一態様では、細胞を、約5日〜約10日にわたって、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルと接触させる。一特定態様では、200ng/ml Shh、100ng/ml FGF8および100μMアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地中で、約7日にわたって、霊長類NPCを培養する。
【０１０１】
一態様では、ニューロン分化の誘導後に、約10000細胞/cm2〜約80000細胞/cm2、約20000細胞/cm2〜約70000細胞/cm2、約30000細胞/cm2〜約60000細胞/cm2、または約40000細胞/cm2〜約50000細胞/cm2の密度で、細胞を再プレーティングする。一特定態様では、ニューロン分化の誘導後に、約45000細胞/cm2の密度で、細胞を再プレーティングする。
【０１０２】
一態様では、ニューロン分化するように誘導された細胞を、次の工程では、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地中で、さらに約15日、さらに約16日、さらに約17日、さらに約18日、さらに約19日、さらに約20日、さらに約21日、さらに約22日、さらに約23日、さらに約24日、さらに約25日、さらに約26日、さらに約27日、さらに約28日、さらに約29日、さらに約30日、さらに約31日、さらに約32日、さらに約33日、さらに約34日、またはさらに約35日にわたって、分化させる。一特定態様では、20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地中で、さらに約19日〜約35日にわたって細胞を培養する。
【０１０３】
一態様において、本発明によれば、分化NCをその支持体から解離し、本明細書に記載するように適切な細胞培養フォーマットで再播種する。さらなる態様では、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で、少なくとも約10日、少なくとも約11日、少なくとも約12日、少なくとも約13日、少なくとも約14日、少なくとも約15日、少なくとも約16日、少なくとも約17日、少なくとも約18日、少なくとも約19日、少なくとも約20日、少なくとも約21日、少なくとも約22日、少なくとも約23日、少なくとも約24日、少なくとも約25日、少なくとも約26日、少なくとも約27日、または少なくとも約28日にわたって、NCを分化させてから、解離し、適切な細胞培養アッセイフォーマットで再播種する。さらなる態様では、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で、約15〜約30日、約20〜約25日、約21〜約23日にわたって、霊長類NCを分化させてから、解離し、適切な細胞培養アッセイフォーマットで再播種する。
【０１０４】
本発明の一局面では、本明細書に記載する方法によって得られた分化NCを細胞培養基質から解離するが、細胞生存能力の実質的喪失は起こらない。したがって、一態様では、細胞生存能力の実質的相違を伴うことなく分化NCが収集される。細胞数は、当技術分野において使用されている従来の方法に従って、例えば限定するわけではないが、血球計数器における細胞数の計数によって、またはフローサイトメトリーを使用して、決定することができる。細胞生存能力は、従来の方法に従って、例えば限定するわけではないが、トリパンブルー染色およびエリスロシンB染色によって、決定することができる。解離後に、NCに基づく所望のアッセイの特別な必要性または実験パラメータに応じて、適切な細胞培養ウェルに適切な細胞密度で細胞を再播種することができる。
【０１０５】
したがって一態様では、細胞剥離溶液を利用して細胞培養表面から分化NCを分離する。一態様では、分化NCをその支持体から解離し、適切な細胞培養フォーマットで再播種する。さらなる一態様では、分化のおよそ20日目とおよそ45日目との間に、分化NCをその支持体から解離する。分化の日数は、例えばShh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルと共にインキュベートする分化の開始日から数え、その場合は、Shh、FGF8およびアスコルビン酸を添加した日を0日目と数える。さらなる態様では、およそ15日目とおよそ50日目との間、およそ28日目とおよそ30日目との間、分化のおよそ25日目、分化のおよそ26日目、分化のおよそ27日目、分化のおよそ28日目、分化のおよそ29日目、分化のおよそ30日目、分化のおよそ31日目、分化のおよそ32日目、分化のおよそ33日目、または分化のおよそ34日目に分化NCをその支持体から解離する。一態様では、細胞を細胞剥離溶液と共にインキュベートすることによって、分化NCをその支持体から解離する。一態様において、細胞剥離溶液はAccutaseである。Accutaseは、タンパク質分解活性およびコラーゲン分解活性を持つ海洋由来の酵素である。一態様では、細胞剥離溶液を分化NC培養物に加え、1〜5分、2〜4分、優先的には3分にわたってインキュベートする。このインキュベーション時間の完了後に、Accutase溶液を培地、特に基本培地で希釈する。再播種前に、Accutase含有培地を除去し、本明細書に記載するように成長因子を補足した新鮮な基本培地を補充する。
【０１０６】
剥離後に、霊長類NCは、例えば細胞培養ウェルなどの新しい細胞培養格納器に、適切なプレートフォーマットで再播種することができる。NCは、低密度、中密度および高密度を含む、任意の所望の密度で再播種することができる。したがって、一様に分布した分化NCの培養物は、低密度、中密度および高密度を含む所定かつ所望の密度で生成させることができる。これは、細胞密度が培養の初めに固定され、細胞の増殖または細胞死ゆえに細胞密度がやがてはかなり変化しうる従来の細胞培養法とは、対照的である。一態様では、NCを高密度で再播種する。さらなる態様では、NCを、約50000細胞/cm2〜約500000細胞/cm2の密度、約75000細胞/cm2〜約400000細胞/cm2の密度、または約100000細胞/cm2〜約300000細胞/cm2の密度で再播種する。一特定態様では、工程（b）（ii）において、分化NCを、約200000細胞/cm2の密度で再播種する。一態様では、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルによる分化後に、細胞を解離し、約50000細胞/cm2〜約500000細胞/cm2、約75000細胞/cm2〜約400000細胞/cm2、または約100000細胞/cm2〜約300000細胞/cm2の密度で再播種する。一特定態様では、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルの分化後に、細胞を解離し、約200000細胞/cm2の密度で再播種する。解離および再播種（再プレーティング）後に、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で、さらに約1日、さらに約2日、さらに約3日、さらに約4日、さらに約5日、さらに約6日、さらに約7日、さらに約8日、さらに約9日、さらに約10日、さらに約11日、さらに約12日、さらに約13日、さらに約14日、またはさらに約15日にわたって、細胞をさらに分化させる。
【０１０７】
解離し再播種した分化NC培養物は、薬物候補の有効性を試験するために、本発明に従って使用することができる。一特定態様では、細胞を、20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地中で、約7日にわたってさらに分化させてから、細胞に薬物候補を適用する。したがってNC細胞は、約10日〜約50日、約15日〜約45日、約30〜約40日、約35日または約37日の全分化期間後に、薬物候補をスクリーニングする準備が整う。一特定態様において、NCは、約30〜約40日の全分化期間後に、オリゴヌクレオチド候補をスクリーニングする準備が整う。
【０１０８】
さらなる態様において、分化NC培養物は、約28日、約29日、約30日、約31日、約32日、約33日、約34日、約35日、約36日、約37日、約38日、約39日、約40日、約41日、約42日、約43日、約44日、約45日、約46日、約47日、約48日、約49日、約50日、約51日、約52日、約53日、約54日、または約55日の全分化期間後に、薬物候補による処理の準備が整う。さらなる一態様において、薬物候補による処理は、本明細書に記載する細胞培養プロトコールの任意の工程において行われる。
【０１０９】
一特定態様では、20ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.5mM cAMPおよび100μMアスコルビン酸リン酸エステルを含む無血清分化培地中で、約21〜約23日にわたって霊長類NPCをNCに分化させてから、解離および再播種を行う。さらなる一態様では、本明細書に記載するように再播種した後、分化NCを、本明細書に記載する分化培地と共に、さらに約1日、さらに約2日、さらに約3日、さらに約4日、さらに約5日、さらに約6日、さらに約7日、さらに約8日、さらに約9日、さらに約10日、さらに約11日、さらに約12日、さらに約13日、さらに約14日、またはさらに約15日にわたってインキュベートする。一特定態様では、再播種後に、20ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、0.5mM cAMPおよび100μMアスコルビン酸リン酸エステルを含む無血清分化培地中で、約7日にわたって分化NCをインキュベートする。その後、分化NCは、薬物候補による処理の準備が整う。
【０１１０】
本発明の一局面では、細胞培養培地に薬物候補を添加する前に、解離し再播種したNCの分化を継続する。したがって、さらなる態様では、再播種されたNCを、本明細書に記載する分化培地中で、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約11日、約12日、約13日、約14日、または約15日にわたってインキュベートしてから、薬物候補を加える。さらなる態様において、工程（b）（ii）は、再播種後、薬物候補を加える前に、1〜50ng/ml BDNF、1〜50ng/ml GDNFおよび0.1〜10mM cAMPおよび20〜200μMアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地と共に、さらに約1〜約20日、さらに約5〜約10日、約7日にわたってNCを分化させる工程を含む。一特定態様では、工程（b）（ii）は、再播種後、薬物候補を加える前に、20ng/ml BDNF、10ng/ml GDNFおよび0.5mM cAMPおよび100μMアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地と共に、さらに約7日にわたってNCを分化させる工程を含む。
【０１１１】
一態様では、分化NCを解離し再播種した後に、薬物候補を細胞培養培地に加える。さらなる態様では、分化NCを再播種した約1日〜約15日後、約5日〜約10日後、または約7日後に、薬物候補を細胞培養培地に加える。一特定態様では、分化NCを再播種した約7日後に、薬物候補を細胞培養培地に加える。
【０１１２】
一態様では、本明細書に記載する方法に従って霊長類NPCをNCに分化させる。一態様では、ニューロンの細胞機能および/または代謝機能と関連する発現マーカーにより、ニューロンアイデンティティを評価する。典型的ニューロンマーカーとしてMAP2、HuC/D、ネスチン、β-III-チューブリン、DCX/ダブルコルチン、SYN1/シナプシン1およびGPHN/ゲフィリンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ニューロンアイデンティティと関連する発現マーカーは、初代ニューロンまたは神経系組織における発現レベルと比較して、NPCに由来するNCでは低レベルに発現する場合がある。NSC由来NCにおけるニューロン発現マーカーの正規化された発現レベルは、初代ニューロンまたは神経系組織における各マーカーの発現レベルと比較して、10000分の1、または1000分の1、または100分の1、または10分の1、または2分の1である場合がある。NPC由来NCと初代ニューロンとの間でのニューロン発現マーカーの発現レベルの倍率変化は、発現マーカーが異なれば異なりうる。正規化は、所与のマーカーの絶対発現レベルを適切なハウスキーピング遺伝子、例えばGAPDHまたはTBPと関係づけることによって達成することができる。
【０１１３】
一態様において、本発明の画期的方法は、ヒト（ホモ・サピエンス）、カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）およびアカゲザル（マカカ・ムラタ）を含むがそれらに限定されるわけではない異なる霊長類種について、均一なNC分布を持つロバストな分化NC培養物を生成させるために使用される。本質的に同じ細胞培養条件をすべての霊長類種に適用することができる。
【０１１４】
理論に束縛されることは望まないが、本発明は、NPCおよび分化NCである、多能性幹細胞から完全に分化したNCまでの軸に沿った細胞の2つの異なる段階を識別する。多能性NPCは本明細書に開示するように得ることができ、例えば望ましいフォーマットの細胞培養アッセイのために、任意の適切な細胞数まで拡大培養することができる。健常個体および患者の特異的NPCアリコートは凍結融解することが可能である。したがって、該NPCを適切な細胞数まで拡大培養し、貯蔵のために凍結するか、直接分化させて、本発明のロバストな分化NC培養アッセイを作製することができる。意外なことに、本発明者らは、本願において開示する特別な条件を使用すれば、分化霊長類NCを収集し、固定されたニューロンアイデンティティを持つ細胞の供給源として使用できることを見いだした。分化霊長類NCは、分化の後期において、生存能力の実質的喪失を伴わずに、細胞培養マトリックスから剥離することができる。収集された分化霊長類NCは、所定のアッセイフォーマットで再播種することができ、そこでは、細胞が細胞培養支持体に付着し、試験しようとする薬物候補を適用する前に、またはそれと並行して、分化を継続することができる。本発明の方法は、異なる霊長類種に由来するNC培養物の非一様性という課題を解決する。したがって、本明細書に記載する方法で得られる霊長類NC培養物は、効果的で安全な薬物をスクリーニングするための、およびさまざまな神経系疾患の新しい治療薬を創出するための、有益なモデルである。
【０１１５】
したがって、本発明のさらなる一局面において、本発明に従って作製されたNC培養物は、少なくとも1つの薬物候補の有効性を試験するために使用される。薬物候補は、本発明の方法の任意の段階で、細胞培養培地に加えることができる。一態様では、薬物候補を分化NCに加える。一態様では、薬物候補の有効性プロファイルを決定するために、解離し再播種した分化NCに、薬物候補を加える。さらなる態様では、分化のおよそ1日目、およそ2日目、およそ3日目、およそ4日目、およそ5日目、およそ6日目、およそ7日目、およそ8日目、およそ9日目、およそ10日目、およそ11日目、およそ12日目、およそ13日目、およそ14日目、およそ15日目、およそ16日目、およそ17日目、およそ18日目、およそ19日目、およそ20日目、およそ21日目、およそ22日目、およそ23日目、およそ24日目、およそ25日目、およそ26日目、およそ27日目、およそ28日目、およそ29日目、およそ30日目、およそ31日目、およそ32日目、およそ33日目、およそ34日目、およそ35日目、およそ36日目、およそ37日目、およそ38日目、およそ39日目、またはおよそ40日目に、薬物候補を細胞培養培地に加える。
【０１１６】
一特定態様において、工程（b）（i）は、このシーケンスにおいて、およそ28日目〜およそ30日目の後に、分化NCをその支持体から解離する工程を含み、工程（b）（ii）は、細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、NCの分化を約7日にわたって継続し、細胞培養培地に薬物候補を加え、NCの分化をさらに約5日にわたって継続し、薬物候補の有効性プロファイルを評価する工程を含む。
【０１１７】
本発明の霊長類NC培養物は一様な細胞分布を特徴とし、それゆえに新規薬物候補の有効性の試験は、端的であり、十分に標準化されている。薬物候補の有効性は、当技術分野公知の方法によって、例えば限定するわけではないが、薬物候補の有効性と相関する表現型マーカーを測定すること、例えばマーカーの発現を測定することによって、決定することができる。一態様において、薬物候補の有効性は、疾患関連マーカーの発現を決定することによって試験される。一態様において、薬物候補の有効性は、疾患関連タンパク質の発現を決定することによって試験される。一態様において、薬物候補の有効性は、定量リアルタイムPCRによって関連タンパク質の発現を決定することによって試験される。有効性の決定は、薬物候補の添加後、所定の時点で行われる。さらなる態様において、有効性の決定は、薬物候補の添加後、およそ1日目、およそ2日目、およそ3日目、およそ4日目、およそ5日目、およそ6日目、およそ7日目、およそ8日目、およそ9日目、およそ10日目、およそ11日目、およそ12日目、およそ13日目、またはおよそ14日目に行われる。一特定態様において、工程（b）（ii）は、解離および再播種後、およそ7日目に、薬物候補を細胞培養培地に加える工程、および細胞培養培地への薬物候補の添加後、およそ5日目に、薬物候補の有効性を決定する工程を含む。本発明のロバストで一様な分化NC培養物は、異なる霊長類種について作製することができ、薬物候補の有効性プロファイルを試験するために使用することができる。一態様において、本方法は、霊長類種間での、特にNHP種とヒトとの間での、有効性の種間比較に適している。
【０１１８】
本発明のさらなる一局面は、本明細書に記載する方法によって得られる一様に分布した分化霊長類NCの使用である。好ましい一態様において、本発明の方法によって得られる分化霊長類NCは、CNS疾患の病態生理を研究するためのインビトロモデルとして使用される。例えば、本発明の方法によって得られる分化霊長類NCは、神経学的疾患を反転させ、阻害し、または防止する化合物のスクリーニングに使用することができる。一態様において、一様に分布した分化霊長類NCは、医薬、例えば糖尿病医薬の神経副作用を反転させ、阻害し、または防止する化合物のスクリーニングに使用される。
【０１１９】
一態様において、工程（a）〜（b）による一様に分布した分化霊長類NCは、小分子、タンパク質、ペプチド、および核酸からなる群より選択される化合物および/または薬物候補のハイスループットスクリーニングに使用される。さらなる一態様において、本発明の分化NCは、RNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子のハイスループットスクリーニングに使用される。
【０１２０】
一特定態様では、さらなる開発のために少なくとも1つの薬物候補を選択するためのインビトロ法であって、以下を含む方法が提供される：
一様に分布した分化ニューロンの細胞培養物をヒト（ホモ・サピエンス）およびカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）から個別に作製する工程であって、以下を含む、工程：
（a）ヒトおよびカニクイザルの両方について個別に、IPSCに由来する神経前駆細胞（NPC）を、約30000細胞/cm2の密度で用意する工程;
（b）前記NPCを神経系細胞（NC）に分化させる工程であって、以下を含む、工程：
（i）前記NPCを、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地と共に、約7日にわたってインキュベートし、前記細胞を約45000細胞/cm2の密度で再プレーティングし、再プレーティングされた細胞を、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを補足した基本培地と共に、約21日〜約23日にわたってインキュベートした後、分化NCをその支持体から解離する工程、および
（ii）前記細胞を、約200000細胞/cm2の密度で、個別に、適切な細胞培養フォーマットで再播種し、細胞をBDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地と共にインキュベートすることによりNCの分化を約7日にわたって継続した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地に加えた薬物候補と共に細胞を約5日にわたってインキュベートする工程；ならびに
ヒトおよびカニクイザルの両方で薬物候補の有効性プロファイルを確立する工程；ならびに
有効性プロファイルが好ましければ、さらなる開発のために薬物候補を選択する工程。
一態様において、有効性プロファイルを確立する工程は、ターゲット・エンゲージメントを評価する工程を含む。一態様において、さらなる開発は、NHP種における薬物候補のインビボ試験および/またはヒトにおけるインビボ試験を含む。
【０１２１】
一態様では、前記方法のいずれかによって作製される分化霊長類NCの集団が提供される。一態様では、分化霊長類NCを解離し、再播種し、さらに分化させて、分化NCの一様な標準化された培養物を得る。一態様において、霊長類NCは、健常個体に由来する。別の一態様では、患者由来霊長類NCを使用して、CNS疾患の病態生理を研究するための疾患関連インビトロモデルを作製する。患者特異的体細胞の分化NCへの変換は、疾患モデリングまたは化合物スクリーニングのためのハイスループット細胞アッセイ用に患者特異的NCの供給源を生成させるための、容易に利用できる再現性のある技術になる。
【０１２２】
一態様では、アンジェルマン症候群患者に由来する体細胞を使用してNPCを作製する。アンジェルマン症候群を患っている1人または数人の患者に由来するNPCは、アンジェルマン症候群の疾患モデルを作製するために使用することができる。ヒト単一遺伝子疾患モデルは、当技術分野公知の方法で病因遺伝子突然変異を各NHPゲノムに導入することにより、例えばNHP NPCに各突然変異を導入することにより、NHP種において再現することができる。
【０１２３】
さらなる一態様において、本発明の細胞アッセイを使用して生成するデータは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS/ルー・ゲーリッグ病）卒中、および脊髄損傷などの神経変性疾患のような神経疾患に対処することを目指す研究目的のためのデータ、または該神経学的疾患の治療のためのデータである。重要なことに、本発明は、一貫した再現性のある細胞培養アッセイをもたらす。事実、霊長類幹細胞から導かれる以前の細胞培養アッセイの大きな短所は、細胞培養エリアの表面での分化中の細胞の不均一な分布である。本発明は、解離および再播種工程を導入することによって、この問題を解決する。驚いたことに、この工程に対し、分化中の霊長類NCは耐性を示し、該細胞は依然として生存可能であり、所定の一様な細胞密度で細胞培養アッセイを播種するのに適している。所与の細胞培養格納器の表面での均一な細胞分布は、改良された、再現性の向上した、細胞培養アッセイをもたらす。したがって、標準化された霊長類NC培養アッセイを生成させるための方法が提供され、ここで、工程（a）〜（b）によって得られた分化NC培養物は、均一な細胞分布、ハイスループットプレートウェルにおける均等に分布した細胞、低減したクラスター形成および/またはクランプ形成、ならびにより等しい細胞分布を特徴とする。それゆえに、結果として得られるアッセイは、ロバストネスの向上、均一性の向上、およびアッセイレプリケート間のばらつきの減少を呈する。一態様において、細胞は、特に細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に一様に分布する。
【０１２４】
一態様は、薬物候補の有効性を決定するための、本発明の方法によって得られる標準化されたNC培養物の使用である。本発明のさらなる一局面において、標準化された霊長類NC培養物は、薬物候補の毒性のインビトロ試験に使用される。本発明のさらなる一局面において、標準化された霊長類NC培養物は薬物候補の有効性のインビトロ試験に使用される。培養物は、健常個体および/または罹患個体に由来することができ、疾患および/または治療に関連する薬物候補の生理学的効果を予測するために、有効性および/または毒性の結果が統合される。一態様では、薬物候補のインビトロ有効性プロファイルが評価され、好ましい有効性プロファイルを持つ薬物候補がさらなる開発のために選択される。さらなる開発は、NHP種における薬物候補のインビボ試験および/またはヒトにおけるインビボ試験を含みうる。
【０１２５】
一特定態様では、少なくとも2つの霊長類種に由来する一様に分布した分化神経系細胞（NC）の標準化された細胞培養物を使用して薬物候補のインビトロ有効性プロファイルを決定するための方法が提供され、分化NC培養物は、ハイスループットスクリーニングに適格であり、該方法は、以下の工程を含む：
（a）約20日間〜約45日間の分化後に、分化NCをその支持体から解離し、該分化NCをハイスループット細胞培養フォーマットで再播種する工程、
（b）再播種されたNCを分化培地中でインキュベートする工程;
（c）再播種されたNCを薬物候補と接触させる工程;および
（d）薬物候補のインビトロ有効性プロファイルを決定する工程。
【０１２６】
NHP種とヒトとの遺伝的距離は小さいので、ヒトでのインビボ試験に先だつNHP種でのインビトロおよび/またはインビボ有効性データの評価は、確定的である。これは、例えばNHP種と比較してヒトとの距離が遺伝学的に遠い齧歯類種とは対照的である。NHP種とヒトとの間の小さな遺伝的距離は、ヒトポリヌクレオチド配列を標的とする薬物候補を評価する場合、または薬物候補そのものがヒトゲノムに由来する配列を持つまたはそれに近いポリヌクレオチドを含む場合には、とりわけ重要である。一態様では、本明細書に記載する方法であって、薬物候補の、決定されたインビトロ有効性プロファイルが、薬物候補の有効性プロファイルの種間比較に使用され、細胞培養物が少なくとも2つの霊長類種の細胞から個別に作製され、本質的に同じ条件がすべての霊長類種についての培養に適用され、すべての霊長類種について有効性プロファイルが決定されて比較される、前記方法が提供される。一態様では、（i）本明細書に記載する方法に従って、第1の種および第2の種について、薬物候補のインビトロ有効性プロファイルを決定する工程、ならびに（ii）薬物候補の有効性プロファイルが好ましいものであれば、さらなる開発のために該薬物候補を選択する工程を含む、さらなる開発のために薬物候補を選択するための方法が提供される。一態様では、第1の種と第2の種との間のタンパク質コーディング領域の遺伝的類似性が高い。一態様では、第1の種と第2の種との間のタンパク質コーディング領域の遺伝的類似性が、ヒト（ホモ・サピエンス）とマウス（ムス・ムスキュラス（Mus musculus））との間よりも高い。さらなる態様において、第1の種と第2の種との間のタンパク質コーディング領域の遺伝的類似性は、85％超、90％超または95％超である。一態様において、第1の種と第2の種との間のタンパク質コーディング領域の遺伝的類似性は90％超である。一特定態様において、第1の種はカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）であり、第2の種はヒト（ホモ・サピエンス）である。本発明の分化NC培養物は、異なる種について逐次的に作製されうる。
【０１２７】
したがって一態様において、本発明による1つまたは複数の霊長類種に由来する分化NCの標準化された細胞培養物は、薬物候補のインビトロ有効性試験に使用され、ここで薬物候補は、ヒトゲノムに由来するポリヌクレオチドを含むか、ヒトゲノムに由来するポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする。さらなる一態様において、薬物候補は、RNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子を含む。
【０１２８】
本発明のさらなる一態様では、インビトロ有効性試験および/またはインビトロ毒性試験において評価される薬物候補が、1つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。さらなる態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトゲノムに由来する配列に対して少なくとも90％の同一性、好ましくは100％の同一性を持つ10〜30ヌクレオチド長を含むか、そのような10〜30ヌクレオチド長からなる。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（モチーフ配列）は、例えばヌクレアーゼ耐性および/または標的核酸への結合アフィニティーを増加させるために、修飾することができると理解される。一局面において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシドを含み、DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドも含みうる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドを含む。別の一局面において、オリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオチドの組込みは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのアフィニティーを高める。その場合は、その修飾ヌクレオシドをアフィニティー強化修飾ヌクレオチドということができる。
【０１２９】
一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、または少なくとも16個の修飾ヌクレオシドを含む。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、1〜10個の修飾ヌクレオシド、例えば2〜9個の修飾ヌクレオシド、例えば3〜8個の修飾ヌクレオシド、例えば4〜7個の修飾ヌクレオシド、例えば6個または7個の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも1つが、ロックト核酸（LNA）であり、例えば修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも2つ、例えば少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、または少なくとも8つが、LNAである。さらに別の一態様では、すべての修飾ヌクレオシドがLNAである。
【０１３０】
一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これら3つのタイプの修飾（修飾糖、修飾核酸塩基および修飾ヌクレオシド間連結）またはそれらの組み合わせから独立して選択される修飾を含む。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば2'糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む。より一層好ましくは、前記1つまたは複数の修飾ヌクレオシドはLNAである。
【０１３１】
さらなる一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結を含む。好ましい一態様では、連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結またはボラノホスフェートヌクレオシド間連結である。
【０１３２】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、2'-MOE-RNAである少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを含み、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-MOE-RNAヌクレオシド単位を含む。いくつかの態様では、該修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも1つが2'-フルオロDNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-フルオロ-DNAヌクレオシド単位である。
【０１３３】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのLNA単位、例えば1、2、3、4、5、6、7、または8個のLNA単位、例えば2〜6個のLNA単位、例えば3〜7個のLNA単位、4〜8個のLNA単位、または3、4、5、6もしくは7個のLNA単位を含む。いくつかの態様では、すべての修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。さらなる一態様において、オリゴヌクレオチドは、ベータ-D-オキシ-LNAと、以下のLNA単位のうちの1つまたは複数との両方を含みうる:ベータ-D立体配置またはアルファ-L立体配置のいずれかであるチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および/もしくはENA、またはそれらの組み合わせ。さらなる一態様では、すべてのLNAシトシン単位が5-メチル-シトシンである。好ましい一態様において、オリゴヌクレオチドまたは連続したヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の5'端に少なくとも1つのLNA単位を有し、3'端に少なくとも2つのLNA単位を有する。
【０１３４】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのLNA単位と少なくとも1つの2'置換修飾ヌクレオシドとを含む。
【０１３５】
本発明のいくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは2'糖修飾ヌクレオシドおよびDNA単位を含む。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドはLNA単位とDNA単位をどちらも含む。好ましくは、LNA単位とDNA単位とを合わせた総数は8〜30、例えば10〜25、好ましくは12〜22、例えば12〜18、より好ましくは11〜16である。本発明のいくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、例えば連続したヌクレオチド配列は、少なくとも1つまたは2つのLNA単位からなり、残りのヌクレオチド単位はDNA単位である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドおよび天然ヌクレオシド（RNAヌクレオシドまたはDNAヌクレオシドなど、最も好ましくはDNAヌクレオシド）だけを含み、任意でホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオシド間連結を持つ。
【０１３６】
本発明の一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNase Hを動員する能力を有する。
【０１３７】
好ましい一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書では単に「ギャップマー」ともいうギャップマーデザインまたはギャップマー構造を有する。ギャップマー構造では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、'5→3'向きに、少なくとも3つの相異なる構造領域、すなわち5'-フランク、ギャップ、および3'-フランク、F-G-F'を含む。このデザインにおいて、隣接領域FおよびF'（ウイング領域とも呼ばれる）は、標的核酸に相補的な一連の修飾ヌクレオシドを含み、一方、ギャップ領域Gは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的化核酸との二重鎖の状態にある時に、ヌクレアーゼ、好ましくはRNaseなどのエンドヌクレアーゼ、例えばRNase Hを動員する能力を有する一連のヌクレオチドを含む。ヌクレアーゼ、特にRNase Hを動員する能力を有するヌクレオシドは、DNA、アルファ-L-オキシ-LNA、2'-フルオロ-ANAおよびUNAからなる群より選択することができる。領域Gの5'端および3'端に隣接している領域FおよびF'は、好ましくは、非ヌクレアーゼ動員ヌクレオシド（3'エンド構造を持つヌクレオシド）、より好ましくは1つまたは複数のアフィニティー強化修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、3'フランクは、少なくとも1つのLNAヌクレオシド、好ましくは少なくとも2つのLNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、5'フランクは少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、5'および3'隣接領域はどちらもLNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、隣接領域中のすべてのヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。別の態様において、隣接領域はLNAヌクレオシドと、他のヌクレオシド、例えばDNAヌクレオシドおよび/または非LNA修飾ヌクレオシド、例えば2'置換ヌクレオシドとを、どちらも含みうる（混合フランク）。この場合、ギャップは、5'端および3'端にアフィニティー強化修飾ヌクレオシド、好ましくはLNA、例えばベータ-D-オキシ-LNAが隣接している、少なくとも5つのRNase H動員ヌクレオシド（2'エンド構造を持つヌクレオシド、好ましくはDNA）の連続した配列と定義される。それゆえに、ギャップ領域に隣接する5'隣接領域および3'隣接領域のヌクレオシドは、修飾ヌクレオシド、好ましくは非ヌクレアーゼ動員ヌクレオシドである。
【０１３８】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシドまたはLNAヌクレオシドは、式IまたはIIの一般構造を有する:
2019500851.tif 000006
式中、
Wは、-O-、-S-、-N（Ra）-、-C（RaRb）-から選択され、例えばいくつかの態様では-O-であり;
Bは、核酸塩基部分または修飾核酸塩基部分を示し;
Zは、隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間連結、または5'末基を示し;
Z*は、隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間連結または3'末基を示し;
Xは、-C（RaRb）-、-C（Ra）＝C（Rb）-、-（Ra）＝N-、-O-、-Si（Ra）2-、-S-、-SO2-、-N（Ra）-、および＞C＝Zからなるリストより選択される基を示す。
【０１３９】
いくつかの態様において、Xは、-O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C（＝CH2）-、および-C（＝CRaRb）-からなる群より選択される。
【０１４０】
いくつかの態様において、Xは-O-であり、Yは、-C（RaRb）-、-C（Ra）＝C（Rb）-、-C（Ra）＝N-、-O-、-Si（Ra）2-、-S-、-SO2-、-N（Ra）-、および＞C＝Zからなる群より選択される基を示す。
【０１４１】
いくつかの態様において、Yは、-CH2-、-C（RaRb）-、-CH2CH2-、-C（RaRb）-C（RaRb）-、-CH2CH2CH2-、-C（RaRb）C（RaRb）C（RaRb）-、-C（Ra）＝C（Rb）-、および-C（Ra）＝N-からなる群より選択される。
【０１４２】
いくつかの態様において、Yは、-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-からなる群より選択されるか、または-X-Y-は、全体として、二価リンカー基（ラジカルともいう）を示し、全体として、-C（RaRb）-、-C（Ra）＝C（Rb）-、-C（Ra）＝N-、-O-、-Si（Ra）2-、-S-、-SO2-、-N（Ra）-、および＞C＝Zからなる群より選択される1、2、3または4つの基/原子からなる二価リンカー基を示す。いくつかの態様において、-X-Y-は、-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C（HCH3）-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH（CH3CH3）-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-、-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C（＝CH2）-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-、および-S-CHRa-からなる群より選択されるビラジカルを示す。
【０１４３】
いくつかの態様において、-X-Y-は、-O-CH2-または-O-CH（CH3）-を示し、Zは、-O-、-S-、およびN（Ra）-から選択され、Ra、そして存在する場合のRbは、それぞれ独立して、水素、置換されてもよいC1-6-アルキル、置換されてもよいC2-6-アルケニル、置換されてもよいC2-6-アルキニル、ヒドロキシル、置換されてもよいC1-6-アルコキシ、C2-6-アルコキシアルキル、C2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-6-アルコキシカルボニル、C1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（C1-6-アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（C1-6-アルキル）-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ（C1-6-アルキル）アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲンから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されてもよく、2つのジェミナル置換基RaおよびRbは、全体として、置換されてもよいメチレン（＝CH2）を示してもよく、すべてのキラル中心について、不斉基はR配向またはS配向のいずれかで見いだされてよく、R1、R2、R3、R5およびR5*は、水素、置換されてもよいC1-6-アルキル、置換されてもよいC2-6-アルケニル、置換されてもよいC2-6-アルキニル、ヒドロキシ、C1-6-アルコキシ、C2-6-アルコキシアルキル、C2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-6-アルコキシカルボニル、C1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（C1-6-アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（C1-6-アルキル）-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ（C1-6-アルキル）アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲンからなる群より独立して選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されてもよく、2つのジェミナル置換基は、全体として、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されてもよいメチレンを示しうる。
【０１４４】
いくつかの態様において、R1、R2、R3、R5およびR5*は、C1-6アルキル、例えばメチル、および水素から独立して選択される。
【０１４５】
いくつかの態様において、R1、R2、R3、R5およびR5*はすべて水素である。
【０１４６】
いくつかの態様において、R1、R2、R3はすべて水素であり、R5およびR5*のうちのどちらか一つも水素であり、R5およびR5*のうちの他方は水素以外、例えばメチルなどのC1-6アルキルである。
【０１４７】
いくつかの態様において、Raは水素またはメチルである。いくつかの態様において、存在する場合のRbは水素またはメチルのどちらかである。
【０１４８】
いくつかの態様では、RaおよびRbの一方または両方が水素である。
【０１４９】
いくつかの態様では、RaおよびRbの一方が水素であり、他方が水素以外である。
【０１５０】
いくつかの態様では、RaおよびRbの一方がメチルであり、他方が水素である。
【０１５１】
いくつかの態様では、RaおよびRbの両方がメチルである。
【０１５２】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、いずれも参照により本明細書に組み入れられるWO99/014226、WO00/66604、WO98/039352およびWO2004/046160に開示されており、ベータ-D-オキシLNAヌクレオシドおよびアルファ-L-オキシLNAヌクレオシドとして一般に公知であるものを包含する。
【０１５３】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-S-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのようなチオLNAヌクレオシドは参照により本明細書に組み入れられるWO99/014226およびWO2004/046160に開示されている。
【０１５４】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-NH-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのようなアミノLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO99/014226およびWO2004/046160に開示されている。
【０１５５】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-CH2-または-O-CH2-CH2-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO00/047599およびMorita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76に開示されており、2'-O-4'C-エチレン架橋核酸（ENA）として一般に公知であるものを包含する。
【０１５６】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3のすべて、ならびにR5およびR5*のうちの一方が水素であり、R5およびR5*のうちの他方が水素以外、例えばメチルなどのC1-6アルキルである。そのような5'置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO2007/134181に開示されている。
【０１５７】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CRaRb-であり、ここではRaおよびRbの一方または両方が水素以外、例えばメチルであり、WはOであり、R1、R2、R3のすべて、ならびにR5およびR5*のうちの一方が水素であり、R5およびR5*のうちの他方が水素以外、例えばメチルなどのC1-6アルキルである。そのようなビス修飾LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO2010/077578に開示されている。
【０１５８】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は、二価リンカー基-O-CH（CH2OCH3）-（2'O-メトキシエチル二環式核酸-Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75（5）pp. 1569-81）である。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は、二価リンカー基-O-CH（CH2CH3）-（2'O-エチル二環式核酸-Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75（5）pp.1569-81）を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CHRa-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのような6'置換LNAヌクレオシドは、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO10036698およびWO07090071に開示されている。
【０１５９】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH（CH2OCH3）-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのようなLNAヌクレオシドは、当技術分野では環状MOE（cMOE）としても公知であり、WO07090071に開示されている。
【０１６０】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は、R配置またはS配置のいずれかである二価リンカー基-O-CH（CH3）-を示す。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は、全体として、二価リンカー基 -O-CH2-O-CH2-を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CH（CH3）-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのような6'メチルLNAヌクレオシドは、当技術分野ではcETヌクレオシドとして公知であり、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO07090071（ベータ-D）およびWO2010/036698（アルファ-L）に開示されているとおり、（S）cET立体異性体または（R）cET立体異性体のどちらかでありうる。
【０１６１】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-O-CRaRb-であり、ここでRaおよびRbはどちらも水素ではなく、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。いくつかの態様において、RaおよびRbはどちらもメチルである。そのような6'二置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 2009006478に開示されている。
【０１６２】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-S-CHRa-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのような6'置換チオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO11156202に開示されている。いくつかの6'置換チオLNA態様において、Raはメチルである。
【０１６３】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-C（＝CH2）-C（RaRb）-、例えば-C（＝CH2）-CH2-、または-C（＝CH2）-CH（CH3）-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。そのようなビニルカルボLNAヌクレオシドは、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO08154401およびWO09067647に開示されている。
【０１６４】
いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-N（-ORa）-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。いくつかの態様において、Raは、メチルなどのC1-6アルキルである。そのようなLNAヌクレオシドはN置換LNAとしても公知であり、参照により本明細書に組み入れられるWO2008/150729に開示されている。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は、全体として、二価リンカー基 -O-NRa-CH3-を示す（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。いくつかの態様において、ビラジカル-X-Y-は-N（Ra）-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。いくつかの態様において、Raは、メチルなどのC1-6アルキルである。
【０１６５】
いくつかの態様では、R5およびR5*の一方または両方が水素であり、置換されている場合は、R5およびR5*の他方が、メチルなどのC1-6アルキルである。そのような一態様において、R1、R2、R3はすべて水素であることができ、ビラジカル-X-Y-は-O-CH2-または-O-C（HCRa）-、例えば-O-C（HCH3）-から選択することができる。
【０１６６】
いくつかの態様において、ビラジカルは-CRaRb-O-CRaRb-、例えばCH2-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。いくつかの態様において、Raは、メチルなどのC1-6アルキルである。そのようなLNAヌクレオシドはコンフォメーションが束縛された（conformationally restricted）ヌクレオチド（CRN）としても公知であり、参照により本明細書に組み入れられるWO2013036868に開示されている。
【０１６７】
いくつかの態様において、ビラジカルは-O-CRaRb-O-CRaRb-、例えばO-CH2-O-CH2-であり、WはOであり、R1、R2、R3、R5およびR5*のすべてが、いずれも水素である。いくつかの態様において、Raは、メチルなどのC1-6アルキルである。そのようなLNAヌクレオシドはCOCヌクレオチドとしても公知であり、参照により本明細書に組み入れられるMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37（4）, 1225-1238に開示されている。
【０１６８】
指定がある場合を除き、LNAヌクレオシドはベータ-D立体異性体であってもアルファ-L立体異性体であってもよいことが、認識されるであろう。
【０１６９】
さらなるギャップマーデザインは、WO2004/046160、WO2007/146511に開示されており、参照により組み入れられる。
【０１７０】
本発明の一局面は、ブタ、霊長類またはヒトUBE3Aタンパク質発現のレベルを調節すること、特に、神経細胞における、特にヒト神経系細胞における、父性UBE3A発現の発現を増加させることである。ヒトUBE3Aタンパク質は、Uniprot番号Q05086に列挙されている数種類のアイソフォームで存在する。母性UBE3A遺伝子中のいくつかの突然変異は、アンジェルマン症候群をもたらしうる。
【０１７１】
本発明のこの局面のオリゴヌクレオチドにとっての標的核酸はRNA、特に長鎖ノンコーディングRNAである。本発明のオリゴヌクレオチドが標的とする長鎖ノンコーディングRNAはヒトSNHG14である（UBE3A-ATSとしても公知であり、Ensemblエントリー番号はENSG00000224078、バージョンGRCh38.p2である）。特に、標的核酸は、15番染色体上の位置25278410〜25419462（SEQ ID NO:1）に対応するSNORD109B下流の領域である。アカゲザル（マカカ・ムラタ）において、UBE3Aサプレッサーは、EnsemblアセンブリMMUL1.0を使用して7番染色体上の位置4222848〜4373084（フォワード鎖）（SEQ ID NO:2）に対応するSNORD109A下流の領域と定義される。
【０１７２】
いくつかの態様において、標的核酸はSEQ ID NO:1であるか、その天然変異体である。ある特定の態様において、標的核酸は、ヒト（SEQ ID NO:1）とアカゲザル（SEQ ID NO:2）との間で保存されている領域に対応する。ある特定の態様において、標的核酸は、ヒト（SEQ ID NO:1）、アカゲザル（SEQ ID NO:2）およびマウス（SEQ ID NO:3）間で保存されている領域に対応する。
【０１７３】
ある特定の態様において、標的核酸は、UBE3Aプレ-mRNAに対してアンチセンスである領域であり、この領域はSEQ ID NO:1の位置55319〜141053に対応する。
【０１７４】
いくつかの態様において、標的核酸は、哺乳動物細胞、特にインビトロまたはインビボのヒト細胞などの細胞（標的細胞）中に存在する。ある特定の態様において、標的細胞はニューロン、好ましくはヒト神経細胞である。
【０１７５】
標的配列は標的核酸の部分配列でありうる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、UBE3Aのエクソン9、エクソン10、エクソン13、エクソン14、イントロン14、エクソン15、イントロン15、およびエクソン16のアンチセンス領域からなる群より選択される部分配列を標的とする。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは連続したヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の位置55319〜76274、77483〜77573、92157〜93403、および97056〜97354からなる群より選択される一本鎖核酸分子にハイブリダイズするか、または相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは連続したヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1の位置60821〜60849、77567〜77583、92323〜92339、および97156〜97172からなる群より選択される一本鎖核酸分子にハイブリダイズするか、または相補的である。
【０１７６】
特定の態様
1．一様に分布した分化神経系細胞（NC）の標準化された細胞培養物を異なる霊長類種から作製するためのインビトロ法であって、以下を含む、方法：
（a）神経前駆細胞（NPC）を用意する工程;
（b）NPCを神経系細胞（NC）に分化させる工程であって、以下を含む、工程：
（i）約20日〜約45日の分化後に、分化NCをその支持体から解離する工程;および
（ii）前記細胞を適切な細胞培養フォーマットで再播種し、約4日〜約15日にわたってNCの分化を継続する工程。
2．霊長類種が、ヒト（ホモ・サピエンス）、カニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）およびアカゲザル（マカカ・ムラタ）からなる群より選択される、態様1の方法。
3．霊長類種が、ヒト（ホモ・サピエンス）およびカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）からなる群より選択される、態様1の方法。
4．分化NCの標準化された細胞培養物が2つの霊長類種について個別に作製され、第1の霊長類種がヒト（ホモ・サピエンス）であり、第2の霊長類種がカニクイザル（マカカ・ファシキュラリス）である、態様1の方法。
5．NPCが人工多能性幹細胞（IPSC）に由来する、態様1〜4のいずれか一態様の方法。
6．工程（b）が、Shh、FGF8、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルからなる群より選択される1種類または複数種類の分化作用物質と共にNPCを培養することを含む、態様1〜5のいずれか一態様の方法。
7．工程（b）（i）が、Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞を約5〜約10日間にわたって培養した後、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルを含む基本培地中で細胞をさらに約15日〜約35日間にわたって培養してから、分化NCをその支持体から解離することを含む、態様1〜6のいずれか一態様の方法。
8．基本培地中の前記1種類または複数種類の分化作用物質の濃度が、Shhについて50〜500ng/ml、FGF8について25〜250ng/ml、BDNFについて1〜50ng/ml、GDNFについて1〜50ng/ml、cAMPについて0.1〜10mM、およびアスコルビン酸リン酸エステルについて20〜200μMである、態様6または7の方法。
9．基本培地中の前記1種類または複数種類の分化作用物質の濃度が、Shhについて200ng/ml、FGF8について100ng/ml、BDNFについて20ng/ml、GDNFについて10ng/ml、cAMPについて0.5mM、およびアスコルビン酸リン酸エステルについて100μMである、態様6〜8のいずれか一態様の方法。
10． Shh、FGF8およびアスコルビン酸リン酸エステルとの培養期間が約7日であり、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸リン酸エステルとの培養期間が約20〜約40日である、態様6〜9のいずれか一態様の方法。
11． NPCがラミニン521支持体上に用意される、態様1〜10のいずれか一態様の方法。
12．工程（b）（i）が、細胞剥離溶液で細胞を解離することを含む、態様1〜11のいずれか一態様の方法。
13．細胞剥離溶液がAccutaseである、態様12の方法。
14．工程（b）（ii）が、ラミニン521支持体上に200000細胞/cm2で細胞を再播種することを含む、態様1〜13のいずれか一態様の方法。
15．前記細胞が96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに再播種される、態様1〜14のいずれか一態様の方法。
16．工程（b）（ii）がROCK阻害剤の存在下で細胞を再播種することを含む、態様1〜15のいずれか一態様の方法。
17．ROCK阻害剤がY-27632である、態様16の方法。
18．工程（b）（ii）が、細胞を再播種した後に、BDNF、GDNF、cAMPおよびアスコルビン酸を補足した基本培地中で細胞を培養することによって、分化を継続することを含む、態様1〜17のいずれか一態様の方法。
19．分化NCがMAP2を発現する、態様1〜18のいずれか一態様の方法。
20．分化NCがMAP2陽性神経突起を含む、態様1〜19のいずれか一態様の方法。
21．NPCがニューロン障害を持つ個体に由来する、態様1〜20のいずれか一態様の方法。
22．NPCが健常個体に由来する、態様1〜21のいずれか一態様の方法。
23．細胞培養物が異なる種から逐次的に作製される、態様1〜22のいずれか一態様の方法。
24．前記細胞が、細胞核染色で評価した場合に、細胞培養エリア上に本質的に一様に分布している、態様1〜23のいずれか一態様の方法。
25．細胞の分布がDNA染色、特にヘキスト染色によって評価される、態様1〜24のいずれか一態様の方法。
26．態様1〜25のいずれか一態様の方法によって得られる細胞培養系。
27．薬物候補の毒性のインビトロ試験のための、態様1〜26のいずれか一態様に従って得られた細胞培養物の使用。
28．薬物候補の有効性のインビトロ試験のための、態様1〜27のいずれか一態様に従って得られた細胞培養物の使用。
29．前記有効性が、態様21の方法に由来する細胞培養物および態様22の方法に由来する細胞培養物において試験される、態様28の使用。
30．薬物候補を選択するための、特に、さらなる開発のために薬物候補を選択するための、態様1〜25のいずれか一態様に従って得られた細胞培養物の使用。
31．薬物候補がポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドの特異的配列を標的とする、態様27〜30のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
32．薬物候補が少なくとも1種類の核酸分子、例えばRNAi作用物質またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、態様27〜31のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
33．前記核酸分子が、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸（ANA）、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、態様32の使用のための細胞培養物。
34．前記1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、態様33の使用のための細胞培養物。
35．LNAヌクレオシドが、ベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNA、アルファ-L-アミノ-LNA、ベータ-D-チオ-LNA、アルファ-L-チオ-LNA、（S）cET、（R）cET、ベータ-D-ENAまたはアルファ-L-ENAから選択される、態様34の使用のための細胞培養物。
36．前記核酸分子が少なくとも1つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、態様32〜35のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
37．連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、態様36の使用のための細胞培養物。
38．アンチセンスオリゴヌクレオチドがRNase Hを動員する能力を有する、態様32〜37のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
39．アンチセンスオリゴヌクレオチドがギャップマーである、態様32〜38のいずれか一態様の使用のための細胞培養物。
40．前記オリゴヌクレオチドが式5'-F-G-F'-3'のギャップマーであり、式中、領域FおよびF'は、独立して1〜7個の修飾ヌクレオシドを含み、Gは、RNaseHを動員する能力を有する6〜16ヌクレオシドの領域である、態様38または39の使用のための細胞培養物。
41．本質的に、本明細書に記載するとおりである、方法および使用。
【０１７７】
本明細書に記載する態様はいずれも、単独でまたは組み合わせて使用することができる。以下の実施例では本発明をさらに詳しく説明する。以下の調製物および実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、本発明を実施することができるように記載する。しかしながら、本発明は、本発明の単一の局面を例証する意図しかない例示の態様によって範囲を限定されることはなく、機能的に等価な方法は、本発明の範囲内である。事実、本明細書に開示するものに加えて、本発明のさまざまな変更態様は、上記の説明および添付の図面から当業者には明白になるであろう。そのような変更態様は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【実施例】
【０１７８】
材料および方法
【０１７９】
（表３）SEQ ID NO:1に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続した核酸塩基配列（SEQ ID NOで示されるモチーフ配列）、それらから作られたオリゴヌクレオチドデザイン、ならびにモチーフ配列に基づいてデザインされた具体的オリゴヌクレオチド化合物（CMP ID NOで示されるもの）
2019500851.tif 000007
2019500851.tif 000008
2019500851.tif 000009
2019500851.tif 000010
2019500851.tif 000011
2019500851.tif 000012
2019500851.tif 000013
【０１８０】
デザインは、それぞれの数字が、連続する修飾ヌクレオチド、例えば2'修飾ヌクレオシドの数（最初の数＝5'フランク）、続いてDNAヌクレオシドの数（2番目の数＝ギャップ領域）、続いて修飾ヌクレオシド、例えば2'修飾ヌクレオシドの数（3番目の数＝3'フランク）を表す、ギャップマーデザインF-G-F'を指し、これには、任意で、標的核酸に相補的である連続した配列の非必須部分であるDNAおよびLNAのさらなる繰り返し領域が前後にあってもよい。
【０１８１】
オリゴヌクレオチド化合物に関して、大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、LNA Cはすべて5-メチルシトシンであり、5-メチルDNAシトシンは"e"で表され、ヌクレオシド間連結はいずれもホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０１８２】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は当技術分野において広く公知である。以下は適用することができるプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、および濃度の点でわずかに相違する方法によって作製されたものでありうる。
【０１８３】
オリゴヌクレオチドは、MerMade12またはOligomaker DNA/RNA合成装置において、ウリジンユニバーサル支持体上、ホスホラミダイトアプローチを使用して、1〜4μmolスケールで合成される。合成の最後に、アンモニア水溶液を使用し、60℃で5〜16時間にわたって、オリゴヌクレオチドを固形支持体から切り離す。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC（RP-HPLC）または固相抽出によって精製し、UPLCによって特徴づけ、さらに分子質量をESI-MSで確認する。
【０１８４】
オリゴヌクレオチドの伸長:
β-シアノエチル-ホスホラミダイト（DNA-A（Bz）、DNA-G（ibu）、DNA-C（Bz）、DNA-T、LNA-5-メチル-C（Bz）、LNA-A（Bz）、LNA-G（dmf）、LNA-Tまたはアミノ-C6リンカー）のカップリングは、アセトニトリル中0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイト溶液および活性化剤としてのアセトニトリル中のDCI（4,5-ジシアノイミダゾール）（0.25M）を使用して行われる。最終サイクルについては、所望の修飾を持つホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を取り付けるためのC6リンカー、またはコンジュゲート基そのものを使用することができる。ホスホルチオエート連結を導入するためのチオール化はキサンタンヒドリド（アセトニトリル/ピリジン9:1中、0.01M）を使用して実行される。ホスホルジエステル連結は、THF/ピリジン/水7:2:1中の0.02Mヨウ素を使用して導入することができる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に典型的に使用されるものである。
【０１８５】
RP-HPLCによる精製:
粗化合物は、Phenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mmカラムでの分取用RP-HPLCによって精製する。0.1M酢酸アンモニウムpH8およびアセトニトリルを緩衝液として5mL/分の流速で使用する。収集したフラクションを凍結乾燥することで、精製された化合物を典型的には白色固形物として得る。
略号:
DCI: 4,5-ジシアノイミダゾール
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMT: 4,4'-ジメトキシトリチル
THF:テトラヒドロフラン
Bz:ベンゾイル
Ibu:イソブチリル
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
【０１８６】
Tmアッセイ
オリゴヌクレオチドおよびRNA標的二重鎖を500mlのRNaseフリー水に3mMまで希釈し、500mlの2×Tm緩衝液（200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM リン酸Na、pH7.0）と混合する。その溶液を95℃に3分間加熱してから、室温で30分間アニールさせる。二重鎖融解温度（Tm）は、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して、ペルチェ温度プログラマーPTP6を装備したラムダ40UV/VIS分光測光器で測定する。260nmでの吸光を記録しながら、温度を20℃から95℃まで上昇させた後、25℃まで降下させる。融解とアニーリングの両方の一次導関数および極大を使用して、二重鎖Tmを評価する。
【０１８７】
マウス初代皮質神経細胞培養物の調製
初代皮質ニューロン培養物は、標準的手順に従って、15日齢のマウス胎児脳から調製した。簡単に述べると、培養プレートを、ポリ-L-リジン（50μg/mlポリ-L-リジン、10mM四ホウ酸塩Na、pH8緩衝液）により、室温で2〜3時間コーティングした。プレートを使用前に1×PBSで洗浄した。採取したマウス胎児脳をカミソリの刃で切離、ホモジナイズし、38mlの切離培地（HBSS、0.01M Hepes、ペニシリン/ストレプトマイシン）に浸漬した。次に、2mlトリプシンを加え、細胞を37℃で30分間インキュベートし、遠沈した。細胞を20ml DMEM（＋10％FBS）に溶解し、さらにホモジナイズするためにシリンジに通した。次に500rpmで15分間遠心分離した。細胞をDMEM（＋10％FBS）に溶解し、96ウェルプレートに播種した（100μl中に0.1×10^6細胞/ウェル）。神経細胞培養物は、播種後すぐに使用できる状態になった。
【０１８８】
マウス初代皮質神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング
96ウェルプレートにおいて、細胞を成長培地（Gibco Neurobasal培地、B27サプリメント、Glutamax、ペニシリン-ストレプトマイシン）中で培養し、所望の濃度で3日間、オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。全RNAを細胞から単離し、Quanta Bioscience製のqScript（商標）XLT One-Step RT-qPCR ToughMix（登録商標）、Low ROX（商標）キット（95134-500）を使用して、qPCR分析により、ノックダウン有効性を測定した。Thermo Fisher Scientific製の市販taqmanアッセイを使用して、正規化のためのGAPDHを含めて、Ube3a_ATSを測定した。
【０１８９】
ヒト初代神経細胞培養物の作製
記載したどの時点でも、すべての細胞株を、37℃、5％CO2濃度、相対湿度95％でインキュベートした。
【０１９０】
ヒト人工多能性幹細胞（hIPSC）培養
アンジェルマン症候群と診断された患者からヒト全血試料を得た。以後の初代末梢血単核球（PBMC）の培養では赤芽球が濃縮された。CytoTune-iPSセンダイリプログラミングキット（Thermo Fisher Scientific）で赤芽球をリプログラムすることによって、患者特異的IPSC株を作製した。誘導IPSC株は、mTESR1（STEMCELL Technologies）中、hESC-qualified Matrigel（Corning）を使用して、毎日培地交換をしながら、フィーダーフリー条件で維持した。コンフルエントになったら、Gentle Cell Dissociation Reagent（STEMCELL Technologies）を使用してコロニーを50〜200μmサイズの細胞クラスターに解離し、10μM Y-27632（Calbiochem）の存在下、1:10〜1:20の比で継代培養した。
【０１９１】
神経系始原細胞（NPC）への分化
神経系分化の誘導後は、1×B27（Gibco, Invitrogen）、1×N2（Gibco, Invitrogen）、0.1mMベータ-メルカプトエタノール（Gibco, Invitrogen）および表示のサプリメントを補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地（Gibco, Invitrogen）で構成される基本培地中で、IPSC由来細胞を維持した。
【０１９２】
神経系始原細胞（NPC）は、二重SMAD阻害により、公表された手順にわずかな変更を加えて、hIPSCから誘導した（Chambers et al. 2009 Nat Biotechnol. Vol. 3 pp.275-80、Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294）。hIPSCを、Accutase（Innovative Cell Technologies Inc.）で単一細胞懸濁液に解離し、10μM Y-27632（Calbiochem）、5ng/ml FGF（Peprotech）、10μM SB-431542（Calbiochem）および100nM LDN（Calbiochem）をさらに補足したMT培地に再懸濁した。単一細胞懸濁液をAggreWell800プレート（STEMCELL Technologies）に移して、8000細胞からなる凝集物の形成を可能にした。5日後に、神経凝集物を、ポリ-L-オルニチン（Sigma）およびラミニン（Roche）でコーティングされたプレートに移し、FGFを補足した基本培地中、二重SMAD阻害（SB-431542およびLDN）を継続しつつ、神経ロゼットを形成させた。STEMdiff（商標）神経ロゼット選択試薬（STEMCELL Technologies）を使用して神経ロゼットを選択的に単離し、ポリ-L-オルニチンおよびラミニン521（BioLamina）でコーティングしたディッシュに再プレーティングし、10ng/ml FGF（Peprotech）、10ng/ml EGF（RnD）、および20ng/ml BDNF（Peprotech）を補足した基本培地中で拡大培養した。コンフルエントになったら、細胞を0.05％トリプシン/EDTA（Gibco, Invitrogen）で酵素的に解離し、継代培養した。FGF、EGFおよびBDNFを補足した基本培地における継代の継続は、10〜20継代以内に安定神経系始原細胞株（NPC株）をもたらす。安定神経系始原細胞株は、その自己複製能ならびに発生段階特異的マーカーSox2およびネスチンの発現によって定義される。特別な刺激を受けると、NPCはニューロン子孫（MAP2＋、Tau＋、HuC/D＋）およびアストログリア子孫（GFAP＋）に分化する（Dunkley et al., 2015 Proteomics Clin Appl. Vol. 7-8 pp.684-94）。
【０１９３】
NPC培養
NPC培養の条件は以前に記載されており、それにわずかな変更を加えて使用した（Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294）。簡単に述べると、細胞をラミニン521（BioLamina）でコーティングしたディッシュに維持し、10ng/ml FGF（Peprotech）、10ng/ml EGF（RnD）、および20ng/ml BDNF（Peprotech）を補足した基本培地［1×B27（Gibco, Invitrogen）、1×N2（Gibco, Invitrogen）、0.1mMベータ-メルカプトエタノール（Gibco, Invitrogen）を補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地（Gibco, Invitrogen）で構成されるもの］中で培養した。
【０１９４】
神経細胞培養物への分化
NPCのニューロン分化を誘導するために、細胞を0.05％トリプシン/EDTA（Gibco, Invitrogen）で単一細胞懸濁液に解離し、ラミニン521（BioLamina）コートディッシュに12,000細胞/cm2の密度で播種し、200ng/ml Shh（Peprotech）、100ng/ml FGF8（Peprotech）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地中で7日間維持した。次に、20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地に、細胞を45000細胞/cm2の密度で再プレーティングし、21日間、分化させた。分化の21日目に、分化ニューロン培養物を、スクリーニングに適合したプレートフォーマットに再プレーティングした。再プレーティングは、培養をAccutase（Innovative Cell Technologies Inc.）で単一細胞懸濁液に解離することによって行った。最終オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイのために、細胞を、384ウェルマイクロタイタープレートに、10μM Y-27632（Calbiochem製の細胞透過性で可逆的なRhoキナーゼ阻害剤）の存在下、200,000細胞/cm2の密度で播種した。20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地中で、さらに7日にわたって、ニューロン培養物をさらに分化させた。分化培地は週に2回交換した。神経細胞培養物は、35日の全分化期間後に、オリゴヌクレオチド処理の準備が整った。
【０１９５】
ヒト神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング
スクリーニングのために、オリゴヌクレオチドストックを、384ウェルマイクロタイタープレート（化合物プレート）に、表示した濃度まで水で事前希釈した。このプレートレイアウトを処理テンプレートとした。化合物プレートから各培養プレートに、各ウェルから2マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を移した。液体のハンドリングはすべて、半自動実験ロボットシステム（Beckmancoulter）を使用して、層流中、滅菌条件下で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に培地を変えずに5日にわたってインキュベートした。次に、RealTime ready Cell lysisキットおよびRealTime ready RNA Virus Masterキット（Roche）を使用して、qPCRアッセイのために、ニューロン培養物を溶解し、加工した。液体のハンドリングは半自動実験ロボットシステム（Beckmancoulter）を使用して行った。Lightcycler480リアルタイムPCRシステム（Roche）によって試料を分析した。
【０１９６】
以下のプライマーおよびプローブを使用してUBE3Aの転写産物存在量をモニタリングするqPCRにより、オリゴヌクレオチドの活性を評価した。
UBE3a-センス:フォワードプライマー:
2019500851.tif 000014
リバースプライマー:
2019500851.tif 000015
色素FAMで標識された内部プローブ:
2019500851.tif 000016
【０１９７】
PPIA（ペプチジルプロリルイソメラーゼA）を正規化のためのハウスキーピング遺伝子にして、RT-qPCRをマルチプレックス化した。PPIAプライマーおよび色素VICで標識されたプローブはThermo Fisher Scientificから購入した（アッセイID Hs99999904_m1）。各プレートは、陰性対照としての非ターゲティングオリゴヌクレオチド（モック）
2019500851.tif 000017
、およびUBE3A mRNAのアップレギュレーションをもたらすリファレンスオリゴヌクレオチドCMP ID NO:41_1を含む。
【０１９８】
オリゴヌクレオチドの選択性は、15番染色体上でSNORD109Bの上流に位置するSNORD115転写産物に関する対比スクリーニング（counter screening）によって検証した。SNORD115の発現は以下のプライマーおよびプローブを使用するqPCRによってモニタリングした。
フォワードプライマー:
2019500851.tif 000018
リバースプライマー:
2019500851.tif 000019
色素FAMで標識された内部プローブ:
2019500851.tif 000020
【０１９９】
オリゴヌクレオチド処理後にPPIA（Thermo Fisher Scientific）でRT-qPCRをマルチプレックス化した。
【０２００】
以下のプライマーおよびプローブを用いるRT-qPCRにより、SNORD109B下流のSNHG14転写産物（UBE3Aサプレッサーとも呼ばれる）の低減を測定した。
フォワードプライマー:
2019500851.tif 000021
リバースプライマー:
2019500851.tif 000022
色素FAMで標識された内部プローブ:
2019500851.tif 000023
【０２０１】
PPIA（Thermo Fisher Scientific）でRT-qPCRをマルチプレックス化した。
【０２０２】
データは、すべてのプレートにわたって、モックと比較した平均％発現として表し、プレート間変動を説明するためにリファレンスオリゴヌクレオチドに対応させて正規化した。
【０２０３】
ヒト神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング - 96ウェル系
スクリーニングのために、オリゴヌクレオチドストックを、96ウェルマイクロタイタープレート（化合物プレート）に、表示した濃度まで水で事前希釈した。このプレートレイアウトを処理テンプレートとした。化合物プレートから各培養プレートに、各ウェルから2マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を移した。液体のハンドリングはすべて、半自動実験ロボットシステム（Beckman Coulter）を使用して、層流中、滅菌条件下で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に培地を変えずに5日にわたってインキュベートした。次に、ニューロン培養物を溶解し、RNA精製キットPure Link Pro96（12173011A）Life Technologiesを使用して、RNAを精製した。液体のハンドリングは半自動実験ロボットシステム（Beckmancoulter）を使用して行った。Ube3aおよびUbe3a-ATSのqPCR分析は、ViiA（商標）7リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）で、Quanta製のqScript（商標）XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX（95134-50）を使用して行った。
【０２０４】
以下のプライマーおよびプローブを使用した。
qPCR UBE3a-センス:
フォワードプライマー:
2019500851.tif 000024
リバースプライマー:
2019500851.tif 000025
色素FAMで標識された内部プローブ:
2019500851.tif 000026
【０２０５】
SNORD109B下流のqPCR SNHG14転写産物（UBE3Aサプレッサーとも呼ばれる）:
Thermo Fisher製の市販プライマーおよびプローブセット: Hs01372957_m1。これらのプライマーは、Genbank転写産物AF400500.1中の87bpエクソン-エクソンスパニング配列を増幅する。
【０２０６】
qPCR GAPDH転写産物:
Thermo Fisher製の市販プライマーおよびプローブセット:遺伝子記号:アッセイの詳細は次のとおり: RefSeq: NM_002046.3、プローブエクソン位置: 3、アンプリコンサイズ:122 bp。対応TaqManアッセイID: Hs99999905_m1。
【０２０７】
Ube3aおよびUbe3a-ATSのRT-qPCRはどちらも、GAPDHを正規化のためのハウスキーピング遺伝子として、マルチプレックス化した。各プレートは、陰性対照としての非ターゲティングオリゴヌクレオチド（モック）
2019500851.tif 000027
、およびUBE3A mRNAのアップレギュレーションをもたらすリファレンスオリゴヌクレオチドCMP ID NO:21_1を含む。さらに、アッセイノイズおよび偽陽性検出リスクをモニタリングするために、Ub3a転写産物もSNORD109B下流のSNHG14転写産物（UBE3Aサプレッサーとも呼ばれる）も標的としない対照オリゴヌクレオシドのパネルを含めた。これらはプレート上にランダムに分布させた。
【０２０８】
対照オリゴヌクレオチド:
配列
2019500851.tif 000028
2019500851.tif 000029
【０２０９】
カニクイザル初代神経細胞培養物の作製
記載したどの時点でも、すべての細胞株を、37℃、5％CO2濃度、相対湿度95％でインキュベートした。
【０２１０】
カニクイザル人工多能性幹細胞（cIPSC）培養
すべての動物実験は米国国立衛生研究所のガイドラインに従って行い、Roche（米国07110ニュージャージー州ナトリー、キングスランドストリート340（2014年に閉鎖））に所属する施設内動物実験委員会（IACUC）によって承認された。カニクイザルIPSCを、雌14歳モーリシャスカニクイザルの腎線維芽細胞から、山中因子（Oct4、Sox2、Klf4、およびC-Myc）（Takahashi, K. & Yamanaka, S., 2006）を保因するセンダイウイルス粒子（CytoTune-iPSセンダイリプログラミングキット、Thermo Fisher Scientific）を使用して樹立した。トランスフェクションの5日後に、細胞をマイトマイシンC不活化フィーダー上に、さまざまな密度で移し、hESC培地（20％ノックアウト血清代替物、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、0.1mM 2-メルカプトエタノール、および8ng/ml bFGFを補足したノックアウトDMEM:F12、いずれもLife Technologies製）中で培養した。トランスフェクションの20日後に、ES様の形態を持つクローンをさらなる継代のために選択した。3〜4日ごとに、コロニーを手作業で解離することにより、細胞を定期的に継代した。Ono et al.; 2014に基づき、細胞をMatrigel（BD Bioscience）コートプレート上で培養し、細胞が単一細胞懸濁液の状態にある場合はチアゾビビンの代わりにY-27632（Calbiochem）を使用するという変更を加えることで、少なくとも10継代後には、cIPSCは、フィーダーフリー培養条件（15ng/ml FGF2（Peprotech）および10ng/mlアクチビンA（Peprotech）を補足したMT培地）に適応した。MT培地は、2.5mM GlutaMAX（商標）、7μg/mlインスリン、450μMモノチオグリセロール、1×脂質濃縮物、5mg/ml BSA、14ng/ml亜セレン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、2mg/mlヘパリン、15μg/mlトランスフェリン、および220μMアスコルビン酸-2-リン酸を含む、ハムのF12栄養混合物を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM/F12）を含有する合成培地である。Gentle Cell Dissociation Reagent（STEMCELL Technologies）を使用して細胞を2〜4日ごとに継代した。さらなる実験のために1つのクローンを選び、以後のすべてのアッセイにそれを使用した。
【０２１１】
神経系始原細胞（NPC）への分化
神経系分化の誘導後は、1×B27（Gibco, Invitrogen）、1×N2（Gibco, Invitrogen）、0.1mMベータ-メルカプトエタノール（Gibco, Invitrogen）および表示のサプリメントを補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地（Gibco, Invitrogen）で構成される基本培地中で、cIPSC由来細胞（図4、1日目参照）を維持した。
【０２１２】
神経系始原細胞（NPC）は、二重SMAD阻害により、公表された手順にわずかな変更を加えて、cIPSCから誘導した（Chambers et al. 2009 Nat Biotechnol. Vol. 3 pp.275-80、Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294）。cynoIPSCを、Accutase（Innovative Cell Technologies Inc.）で単一細胞懸濁液に解離し、10μM Y-27632（Calbiochem）を補足したMT培地に再懸濁した。単一細胞懸濁液をAggreWell800プレート（STEMCELL Technologies）に移して、12000細胞からなる凝集物の形成を可能にした（図4: EB形成参照）。次の連続5日間は、AggreWellあたり1.5mlの培地を、5ng/ml FGF（Peprotech）、10μM SB-431542（Calbiochem）および100nM LDN-193189（Calbiochem）を補足した基本培地で置き換えた。5日後に、神経凝集物を、ポリ-L-オルニチン（Sigma）およびラミニン（Roche）でコーティングされたプレートに移し、FGFを補足した基本培地中、二重SMAD阻害（SB-431542およびLDN-193189）を継続しつつ、神経ロゼットを形成させた（図4:収集参照）。手作業による切離によって神経ロゼットを選択的に単離した後、BioLamina製のポリ-L-オルニチンおよびラミニン521でコーティングされたディッシュに再プレーティングし（図4:神経ロゼット単離参照）、10ng/ml FGF（Peprotech）、10ng/ml EGF（RnD）、および20ng/ml BDNF（Peprotech）を補足した基本培地中で拡大培養した。コンフルエントになったら、細胞を0.05％トリプシン/EDTA（Gibco, Invitrogen）で酵素的に解離し、継代培養した。FGF、EGFおよびBDNFを補足した基本培地における継代の継続は、5〜10継代以内に安定神経系始原細胞株（NPC株）をもたらす（図4、24〜45日目参照）。安定神経系始原細胞株は、その自己複製能ならびに発生段階特異的マーカーSox2およびネスチンの発現によって定義される。特別な刺激を受けると、カニクイザルNPCは神経MAP2＋細胞に分化する。
【０２１３】
NPC培養
NPC培養の条件は以前に記載されており、それにわずかな変更を加えて使用した（Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294）。簡単に述べると、細胞をラミニン521（BioLamina）でコーティングしたディッシュに維持し、10ng/ml FGF（Peprotech）、10ng/ml EGF（RnD）、および20ng/ml BDNF（Peprotech）を補足した基本培地［1×B27（Gibco, Invitrogen）、1×N2（Gibco, Invitrogen）、0.1mMベータ-メルカプトエタノール（Gibco, Invitrogen）を補足した等体積のDMEM:F12 Glutamax培地およびNeurobasal培地（Gibco, Invitrogen）で構成されるもの］中で培養した。
【０２１４】
神経細胞培養物への分化
NPCのニューロン分化を誘導するために、細胞を0.05％トリプシン/EDTA（Gibco, Invitrogen）で単一細胞懸濁液に解離し、ラミニン521（BioLamina）コートディッシュに30,000細胞/cm2の密度で播種し、200ng/ml Shh（Peprotech）、100ng/ml FGF8（Peprotech）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地中で7日間維持した。次に、20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地に、細胞を45000細胞/cm2の密度で再プレーティングし、21日間、分化させた。分化の21日目に、分化NCを解離し、スクリーニングに適合したプレートフォーマットに再プレーティングした。再プレーティングは、培養をAccutase（Innovative Cell Technologies Inc.）で単一細胞懸濁液に解離することによって行った。最終オリゴヌクレオチドスクリーニングアッセイのために、細胞を、384ウェルマイクロタイタープレートに、10μM Y-27632（Calbiochem製の細胞透過性で可逆的なRhoキナーゼ阻害剤）の存在下、200000細胞/cm2の密度で播種した。20ng/ml BDNF（Peprotech）、10ng/ml GDNF（Peprotech）、0.5mM cAMP（BIOLOG Life Science）、および100μMアスコルビン酸リン酸エステル（Sigma）を補足した基本培地中で、さらに7日にわたって、ニューロン培養物をさらに分化させた。分化培地は週に2回交換した。神経細胞培養物は、35日の全分化期間後に、オリゴヌクレオチド処理の準備が整った。
【０２１５】
カニクイザル神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング - 96ウェル系
スクリーニングのために、オリゴヌクレオチドストックを、96ウェルマイクロタイタープレート（化合物プレート）に、表示した濃度まで水で事前希釈した。このプレートレイアウトを処理テンプレートとした。化合物プレートから各培養プレートに、各ウェルから2マイクロリットルのオリゴヌクレオチド希釈液を移した。液体のハンドリングはすべて、半自動実験ロボットシステム（Beckmancoulter）を使用して、層流中、滅菌条件下で行った。神経細胞培養物をオリゴヌクレオチドと共に培地を変えずに5日にわたってインキュベートした。次に、ニューロン培養物を溶解し、PureLink（登録商標）Pro96全RNA精製キット（Thermo Fisher）を使用して精製した後、qScript XLT One-Step RT-qPCR Tough Mix, Low ROX（Quanta Biosciences）でqPCRアッセイ用に加工した。液体のハンドリングは半自動実験ロボットシステム（Integra Assist およびIntegra Viaflo）を使用して行った。Lightcycler480リアルタイムPCRシステム（Roche）によって試料を分析した。
【０２１６】
以下のプライマーおよびプローブを使用してUBE3A-センスおよびUBE3A-アンチセンスの転写産物存在量をモニタリングするqPCRにより、オリゴヌクレオチドの活性を評価した。
UBE3a-センス: HS00166580_VIC Taqmanアッセイ（Thermo Fisher）
UBE3a-アンチセンス: HS01372957_VIC Taqmanアッセイ（Thermo Fisher）
【０２１７】
TBP（TATAボックス結合タンパク質）を正規化のためのハウスキーピング遺伝子にして、RT-qPCRをマルチプレックス化した。TBPプライマーおよびFAM標識プローブはRocheから購入した（参照番号:05532957001、アッセイId.101145）。各プレートは、陰性対照としての非ターゲティングオリゴヌクレオチド（モック）
2019500851.tif 000030
を含む。
【０２１８】
データを、モック処理条件と比較した平均発現パーセンテージとして表す。
【０２１９】
免疫細胞蛍光染色
細胞を4％PFAで固定し、PBS（Ca2＋およびMg2＋含有）中の0.1％ TritonX（Sigma）で透過処理した。ブロッキングは0.1％ TritonXを補足したSuperBlock溶液（Thermo Fisher Scientific）を使用して行った。細胞を以下の一次抗体で染色した:抗SOX2（Milipore AB5603）、抗GFAP（Dako Z033401）、抗HuC/D（Invitrogen A21271）、抗ネスチン（Millipore mab5326）および抗Map2（Neuromics CH22103）。次に、細胞を染色し、Alexa488、Alexa555またはAlexa647（すべてMolecular Probes）のいずれかにコンジュゲートされた二次抗体で染色した。核をヘキスト1:1000（Molecular Probes）で染色した。Axiovert顕微鏡（Zeiss）またはOperettaハイコンテントイメージングシステム（Perkin Elmer）を使用して細胞を撮像した。ImageJソフトウェアを使用して画像を分析した。
【０２２０】
qPCR分析
miRNeasy Miniキット（QIAGEN）を使用してcIPSC、カニクイザル分化NC、hESCおよびヒト分化NCからRNAを単離し、qPCR分析を行った（ヒト細胞にはAg-Path-ID One-Step RT-PCRキット（Ambion）を使用;カニクイザル細胞については、Transcriptor第1鎖cDNA合成キット（Roche）を使用して逆転写を行い、LightCycler 480 Probes Master（Roche）を使用してqPCRを行った）。以下のプライマーおよびプローブを使用した。ヒト細胞用: NES Hs04187831_g1; MAP2 Hs00258900_m1; ASCL1 Hs00269932_m1; SOX2 Hs01053049_s1; ELAVL3 Hs00154959_m1; GAPDH 4352665、すべてThermo Fisher/Applied Biosystems製; 
UBE3A-ATS Fwプライマー:
2019500851.tif 000031
、RVプライマー:
2019500851.tif 000032
、内部オリゴ:
2019500851.tif 000033
; UBE3A Fwプライマー:
2019500851.tif 000034
、RVプライマー:
2019500851.tif 000035
、内部オリゴ
2019500851.tif 000036
。カニクイザル細胞用: NANOG アッセイID 700103、POU5F1 アッセイID 113034、SOX2 アッセイID 111867、ネスチン アッセイID 138150、PAX6 アッセイID 136139、SOX1 アッセイID 136988、ZIC1 アッセイID 112077、ASCL1 アッセイID 700027、TUBB3 アッセイID 700047、GAPDH カタログ番号04694333001、プローブ番号147; TBP アッセイID 101145、すべてRocheから購入。
UBE3A-ATS Fwプライマー:
2019500851.tif 000037
、Rvプライマー:
2019500851.tif 000038
、内部オリゴ
2019500851.tif 000039
;
UBE3A センス: Fwプライマー:
2019500851.tif 000040
Rvプライマー:
2019500851.tif 000041
内部オリゴ:
2019500851.tif 000042
【０２２１】
RNAシーケンス解析
RNA単離はmiRNeasy Miniキット（QIAGEN）を使用して行った。ライブラリー調製は、Ribo-Zero Goldによる除去を含めてTruSeq Stranded Total RNA LTキット（illumina）を使用して行った。クラスター生成はcBOT装置およびHiSeq PE Clusterキットv4を使用して行った。シーケンシングは、以下の試薬を使用し、ペアエンドシングルインデックスシーケンシングラン（2×125サイクル）として、HiSeq 2500装置で行った:HiSeq SBSキットv4 250サイクル（illumina）。
【０２２２】
ウェスタンブロット分析
タンパク質発現研究のために、スクレイピングによって細胞を収集し、瞬間凍結した。ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤およびDNAse（すべてRoche製）を補完したCytobuster（Millipore）でペレットを溶解した。抽出物中のタンパク質濃度をBCAアッセイ（Thermo Scientific）によって測定し、溶液をポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）にローディングした。電気泳動後に、iBlotシステム（Invitrogen）を使用してタンパク質をニトロセルロースメンブレンにブロットした。関心対象のタンパク質を検出するために使用した抗体は、抗hTau HT7（Pierce MN1000）、抗pTauS422（Roche）抗pTauS404（Abcam ab92676）であり、これらを適当なHRPコンジュゲート二次抗体で検出した。SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Thermo Fisher）を使用し、イメージャー（Biorad）を使用して、複合体をルミネセンスで検出した。
【０２２３】
参考文献:
Ono, T. et al. A single-cell and feeder-free culture system for monkey embryonic stem cells. PLoS One 9, e88346, doi: 10.1371/ journal.pone.0088346（2014）。
Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, doi:10.1016/j.cell.2006.07.024（2006）。
【０２２４】
実施例1 - マウス初代神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチド活性
UBE3AプレmRNA（SEQ ID NO:1の位置55319〜141053）に対してアンチセンスであるSNHG14長鎖ノンコーディングRNAの一部を標的とするオリゴヌクレオチドを、上記「材料および方法」の項で述べたように得たマウス初代皮質神経細胞培養物において、UBE3A発現を妨げるSNHG14長鎖ノンコーディングRNA転写産物（データ表ではUBE3AサプレッサーまたはUBE3A-SUPとも呼ぶ）を低減するそれらの能力、およびUBE3A mRNA再発現を誘導するそれらの能力について試験した。オリゴヌクレオチド濃度は5μMとした。「材料および方法」の項で述べたマウス皮質神経細胞培養物におけるスクリーニングのためのプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドをスクリーニングした。結果を表4に示す。
【０２２５】
（表４）初代マウス神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチド活性
2019500851.tif 000043
2019500851.tif 000044
【０２２６】
実施例2 - ヒト神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチド活性
15番染色体上の位置25278410〜25419462（SEQ ID NO:1）に対応するSNRD109B下流の領域においてヒトSNHG14を標的とするオリゴヌクレオチドを、患者由来ヒト神経細胞培養物において試験した（「材料および方法」の項のプロトコール参照）。SNORD115の発現に影響を及ぼすことなく、SNORD109B下流の領域においてSNHG14転写産物（データ表ではUBE3AサプレッサーまたはUBE3A-SUPとも呼ぶ）を低減するオリゴヌクレオチドの能力を分析した。さらにまた、UBE3A mRNA再発現を誘導する能力も分析した。
【０２２７】
上記「材料および方法」の項で述べたヒト神経細胞培養物においてオリゴヌクレオチドをスクリーニングするためのプロトコールに従って、オリゴヌクレオチドをスクリーニングした。
【０２２８】
結果を表5に示す。UBE3A mRNAの発現はすべての化合物について測定したが、UBE3AサプレッサーのノックダウンおよびSNORD1115レベルの維持はすべての化合物について分析したわけではない。
【０２２９】
（表５）患者由来ヒト神経細胞培養物におけるオリゴヌクレオチド活性
2019500851.tif 000045
2019500851.tif 000046
2019500851.tif 000047
2019500851.tif 000048
2019500851.tif 000049
2019500851.tif 000050
【０２３０】
5μM濃度では、モックオリゴヌクレオチドと比較した場合に、試験した187の化合物のうち、およそ90％がUBE3Aの再発現を示した。UBE3Aの再発現を誘導する能力を有するオリゴヌクレオチドの数は、SEQ ID NO:1の位置1〜55318間の領域（非オーバーラップ領域）において高く、次にUBE3Aコーディング領域に相補的な領域（オーバーラップ領域）において高かった。図2にオリゴヌクレオチドの分布を15番染色体上でのそれらの位置に従って、モックオリゴヌクレオチドとの比としてのUBE3A mRNA発現に対してプロットする。
【０２３１】
SNORD115を試験したオリゴヌクレオチドについては、1μMおよび5μMにおいて、モックと比較した場合に有意なダウンレギュレーションがない。
【０２３２】
実施例3 - カニクイザルニューロン分化インビトロ系の作製および検証
材料および方法の項で説明し、図4に図示するプロトコールに従って、NPCに分化するように、カニクイザルIPSCを誘導した。このプロトコールにより、FGF、EGFおよびBDNFを補足した基本培地中で維持し、拡大培養することができるNPCを得ることができる。効率のよいカニクイザルNPCの誘導を検証するために、神経系幹細胞マーカーSOX2およびネスチンの発現を免疫染色によって評価した（図5参照）。カニクイザルNPCはSOX2およびネスチンを発現し、発現パターンはヒトNPCとよく似ている。
【０２３３】
分化NCを得るために、拡大培養中のNPCを解離し、SFA培地で1週間プレーティングする。その後に、細胞を分化培地（BGAA）に曝露する。カニクイザルNPCのニューロン分化能を評価するために、転写分析を行い、結果を分化ヒトNPCの転写プロファイルと比較した（図6参照）。BGAA培地における14日間の分化後に、cyno培養物は、cIPSCと比較すると、NANOGおよびPOU5F1のような多能性マーカーの発現の減少と、PAX6、SOX1、ZIC1、ASCL1、TUBB3のような外胚葉マーカーおよびニューロンマーカーの発現増加を示す（図6A参照）。同様に、BGAA中で14日にわたって分化させたヒト多能性幹細胞由来NCの転写分析（図6BのRNAシーケンシングおよび図6CのqPCR）でも、14日目のBGAA分化NCでは、hESCと比較して、多能性マーカーの発現減少、ならびに外胚葉マーカーおよびニューロンマーカーの発現増加が認められる。重要なことに、アンジェルマン症候群と関係づけられている疾患遺伝子UBE3Aおよびニューロン中で発現すると記述されているノンコーディング転写産物UBE3A-ATSの発現の変化は、分化カニクイザルNCと分化ヒトNCとの間で同等であった（図6D参照）。これらのデータは、カニクイザルIPCがNCに分化することおよび特異的マーカーの発現プロファイルが分化ヒトNCに似ていることを実証している。
【０２３４】
実施例4 - 分化カニクイザルNCの解離および再播種
幹細胞由来細胞は、薬物スクリーニングのためのインビトロ系として、とりわけ対応する初代細胞タイプが利用できないか、ニューロンがそうであるように限られた量でしか利用できない場合に、大きな潜在的可能性を有する。しかし、薬物スクリーニングには、適切なプレートフォーマットで利用できるロバストな細胞スクリーニング系が必要になる。この目的のために、本発明者らは、NHP-IPSCに由来するNPCを神経細胞（NC）に分化させるための異なる戦略を試験した。NCが一様に分布したロバストな細胞系を同定するために、拡大培養中のNPCを解離し、2つの方法のうちの一方で分化培地に曝露した。すなわち、それらを最終アッセイフォーマットで直接プレーティングするか、あるいは、細胞を細胞培養フラスコにプレーティングし、その後、さらなる分化後に、解離して、最終アッセイフォーマットに再播種した（図7参照）。方法Aおよび方法Bでは、NPCをフラスコ中で23日にわたって分化させてから、解離し、アッセイフォーマットで再播種した。7日間のさらなる分化期間後に細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。あるいは、方法Cおよび方法Dでは、NPCを解離し、96ウェルプレートに直接プレーティングした。方法Aおよび方法Cにおける分化培地には、細胞増殖を阻害するために有糸分裂阻害剤カクテル（ウリジン35μg/mlおよび15μg/ml 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン）を補足した。35日目に、培養物を固定し、神経系始原細胞およびグリア細胞マーカーSOX2ならびにニューロンマーカーMAP2について染色した（図8参照）。方法B（再プレーティングあり、有糸分裂阻害剤なし）は、MAP2陽性細胞を含み、他の方法よりSOX2陽性細胞が少ない、より一様に分布した細胞培養物をもたらした。そのため、以後の記載するオリゴヌクレオチド処理には、ニューロン分化方法Bを選んだ。
【０２３５】
実施例5 - 分化ヒトNCの解離および再播種
実施例4で述べたように、本発明者らは、分化中のカニクイザルニューロンを再プレーティングすることは、これらの細胞をスクリーニング目的に適するようにするために必要な工程であることを立証した。そこで本発明者らは、ヒトIPSC由来ニューロンにも同様の手順を利用することが可能かどうかを検証しようと試みた。この目的のために、2つのIPSC株（ED4およびSFC808）から以前に樹立された神経系始原細胞（NPC）を、材料および方法の項に記載した手順に従って分化させた。簡単に述べると、拡大培養中のNPCを解離し、SFA培地で1週間プレーティングした。その後、細胞を2つの方法の一方で分化培地（BGAA）に曝露した。すなわち、それらをアッセイフォーマットで直接プレーティングするか、または細胞培養フラスコにプレーティングした。後者の場合は、細胞を21日にわたって分化させた後、解離し、アッセイフォーマットで再播種した。どちらの実験群も（すなわち直接分化させた群も、解離して再播種した群も）、加工前に、合計6週にわたって分化させた（それぞれ、アッセイフォーマットで6週、またはフラスコ中で3週およびアッセイフォーマットで3週）。
【０２３６】
一組目の実験では、ニューロンを免疫蛍光およびハイコンテントイメージングによって分析した。使用したマーカーは神経系始原細胞（SOX2）、グリア細胞（GFAP）またはニューロン（MAP2およびHuC/D）に特異的である。図9に例示するように、再プレーティングプロセスは、ヒトIPSC由来ニューロンの分化または形態に影響をしないようであった。これを、染色の定量によってさらに検証したところ、染色は、直接分化群と再プレーティング群との間にHuC/D陽性細胞の存在に有意差を示さなかった（図10; ED4の場合、p＝0.542、SFC808の場合、p＝0.579）。
【０２３７】
分化ヒトIPSC由来ニューロンの特徴を変化させることなくそれらを解離し、再プレーティングすることが可能であることをさらに確認するために、本発明者らは、細胞骨格関連タンパク質が解離プロセスによって破壊されないことを確認したいと考えた。本発明者らは微小管関連タンパク質タウの発現を分析した。これはニューロン機能にとって極めて重要であり、前頭側頭型認知症およびアルツハイマー病などの神経変性疾患に直接関係づけられるからである。細胞を上述のように（解離および再播種ありならびになしで）培養し、タンパク質抽出物をウェスタンブロットによって分析した。図11に示すように、タウの発現およびそのリン酸化型のうちの2つの発現に変化がないことから、再プレーティングは、意外にも、ヒトIPSC由来ニューロンの細胞骨格特徴を破壊しないことが明らかになり、このプロセスでは生理学的特徴が改変されないことが示唆される。
【０２３８】
これらの結果は、ヒトIPSC由来ニューロンが分化中に解離および再播種を受け、かつそれらの重要な特徴を維持することが可能であることを実証しており、霊長類幹細胞由来ニューロンの分化には、再プレーティング工程（解離および再播種）が実行可能であることが示唆される。
【０２３９】
実施例6 - 霊長類IPSCに由来する解離し再播種した分化NCを使ったハイスループットスクリーニング
上述の霊長類IPSC由来ニューロン培養物は、スクリーニング目的での使用に適した融通性と再現性の高い系である。本発明者らは、細胞をオリゴヌクレオチドで処理し、定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によって標的および関連遺伝子の発現を検証するためのワークフローを開発した（図12参照）。この目的のために、ヒトまたはカニクイザルの神経系始原細胞を上述のように処理した。スクリーニングのために、3週間の分化後に細胞を解離し、96ウェルプレートに200'000細胞/cm2の密度で再播種した。さらに1週間の分化後に、細胞をオリゴヌクレオチドで5日にわたって処理し、次に、材料および方法の項で述べたように、発現分析のために加工した。この方法により、試料をハイスループットで試験することが常に可能になる。
【０２４０】
この実施例の場合、本発明者らは、Ube3Aアンチセンス（Ube3A_ATS）転写産物を標的とする5つの異なるオリゴヌクレオチドを、20μMから開始して1段階ごとに3分の1に減少することで20.000、6.325、2.000、0.632、0.200、0.063、0.020および0.006μMの用量となる、8つの濃度で利用した。本発明者らは、アンジェルマン症候群患者IPSC（ヒト）またはカニクイザルIPSC（カニクイザル）から分化させたニューロンで、これらの化合物を試験した。
【０２４１】
処理後に、細胞を溶解し、RNAを抽出し、Ube3A用およびUbe3A_ATS用の市販TaqManアッセイを使用してqPCR反応を行い、ヒト細胞ではGAPDHを、またカニクイザル細胞ではTBPを、発現データを正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用した。いずれの場合も、処理はUbe3A_ATSの著しい減少をもたらし、それはセンス転写産物の発現増加と符合した。この効果は用量依存的に認められた。視覚的にわかりやすいように、本発明者らは、高用量（2μM）および低用量（0.02μM）での発現レベルを、図13に報告する。
【０２４２】
用量2μMでは、アンチセンス転写産物が媒体（PBS）処理細胞のレベルの約50％のレベルで発現した。これは、ヒト細胞とカニクイザル細胞の両方に当てはまった。Ube3A_ATSのノックダウンは、Ube3Aの発現を、ヒトおよびカニクイザルについてそれぞれ媒体の約250％および約130％のレベルまで増加させた。患者由来ニューロンは、Ube3A遺伝子のアレルの1つが欠失しているために、極めて低レベルのセンス転写産物を発現するので、この不一致は驚くべきことではない。
【０２４３】
これらの実験は、ヒトニューロンおよびカニクイザルニューロン中のUbe3A_ATSに向けられたオリゴヌクレオチドのターゲット・エンゲージメントを実証している。それゆえに、記載の方法は、霊長類IPSC由来ニューロンにおける治療用オリゴヌクレオチドのハイスループットスクリーニングに適している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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