(57)【要約】  本発明は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の（１５９）位、（１２１）位、（１２３）位、（１７９）位、（１５７）位、または（１５９、１２１、１２３、１７９）、及び（１５７）位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換を含むアポイクオリン変異タンパク質、ならびにそのアポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子、その核酸を含む組換えベクター、宿主細胞、非ヒトトランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物、これらの使用、そのアポイクオリン変異タンパク質を含むキット、及び再構成変異イクオリン複合体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位、１２１位、１２３位、１７９位、１５７位、または１５９、１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換を含むアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項２】
参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項３】
参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位、１２３位、１７９位、１５７位、または１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換をさらに含む、請求項２に記載のアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項４】
ａ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１２１位におけるアミノ酸置換、
ｂ）野生参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１２３位におけるアミノ酸置換、
ｃ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１７９位におけるアミノ酸置換、または
ｄ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１５７位におけるアミノ酸置換を含む、請求項３に記載のアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質であって、
ａ）野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基が負電荷帯電または非正電荷帯電親水性アミノ酸により置換され、好ましくは参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グリシン（Ｇ）残基、またはグルタミン酸（Ｅ）残基により置換され、
ｂ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）残基が負電荷帯電アミノ酸により置換され、好ましくは参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換され、
ｃ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基が負電荷帯電アミノ酸により置換され、好ましくは参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換され、
ｄ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基が負電荷帯電親水性アミノ酸により置換され、好ましくは参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換され、
ｅ）参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基が負電荷帯電アミノ酸により置換され、好ましくは参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換される、アポイクオリン変異タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質であって、前記アポイクオリン変異タンパク質が、セレンテラジンｆ（ＣＬＺ−ｆ）補因子で再構成される場合、カルシウムについて４９２ｎＭ以下、好ましくは２１６ｎＭ以下のＥＣ５０値を有し、天然セレンテラジン（ＣＬＺ）補因子で再構成される場合、カルシウムについて６８０ｎＭ以下、好ましくは４７０ｎＭ以下のＥＣ５０値を有する、アポイクオリン変異タンパク質。
【請求項７】
参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）と比較して追加の変異をさらに含み、特に前記追加の変異が、
ａ）蛍光タンパク質との融合であって、好ましくは前記蛍光タンパク質が、
ｉ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、
ｉｉ）ｃｉｔｒｉｎｅタンパク質、または
ｉｉｉ）ｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質から選択される、融合と、
ｂ）
ｉ）イクオリンの相対輝度を増加させる、
ｉｉ）イクオリンの減衰速度を増加させる、
ｉｉｉ）イクオリンの熱安定性を増加させる、及び／または
ｉｖ）イクオリンの発光波長λを増加させる、アミノ酸置換とから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項８】
配列番号：２〜配列番号：２５から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項９】
標的分子に特異的に結合することができる別の分子にさらに共有結合され、優先的に抗体に共有結合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載の組換えベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載の組換えベクター、請求項１２に記載の宿主細胞、または請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック動物の、
ａ）細胞小器官、細胞、組織、もしくは非ヒト動物における、特に生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、定量的イメージング用途のための、
ｂ）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を活性化する能力について化合物をスクリーニングするための、
ｃ）毒物及び遺伝毒性試験における、または
ｄ）環境汚染試験の検出における、または
ｅ）発光タンパク質ベースの生物発光免疫測定のための、使用。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質及び野生型または修飾セレンテラジン（ＣＬＺ）補因子を含むキット。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のアポイクオリン変異タンパク質、天然または修飾セレンテラジン（ＣＬＺ）補因子、及び分子酸素を含む再構成変異イクオリン複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学アッセイシステム、及びより具体的には、インビトロ及びインビボ両方での使用のための、変異バイオセンサ（修飾発光タンパク質）を組み込む細胞内カルシウム流動の検出のためのアッセイシステムの分野に含まれる。これは、向上したカルシウム親和性及び向上した生物発光を有する変異アポイクオリン、ならびに細胞ベースのアッセイ及びマウス脳切片におけるカルシウムバイオセンサとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムは、多くの重要な生理学的応答及び病態生理学的状態のモジュレーターとして作用し、無数の細胞プロセスの制御においてセカンドメッセンジャーとして関与していることが知られている。したがって、細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、細胞内プロセス及び細胞タンパク質の調節を理解するには不可欠である。イクオリン、オベリン、ベロビン、及びミトロコミンを含む、様々な生物から単離された、いくつかのＣａ２＋制御発光タンパク質が、細胞内カルシウム研究に一般的に使用されている。中でも、バイオセンサであるイクオリンは、その優れた柔軟性ならびに入手可能な詳細な構造的及び生化学的情報、またカルシウムイオンに対するその比較的高い選択性及び感受性によって多数の用途において好まれ、広範なダイナミックレンジを有する、Ｃａ２＋センサである。
【０００３】
イクオリンは、アポイクオリン（１８９アミノ酸）と称されるアポタンパク質、非共有結合発色団単位（セレンテラジン（ＣＬＺ））、及び分子酸素からなる。アポイクオリンは、ＥＦハンドと称される３つのカルシウム結合部位を含有する。カルシウムのアポイクオリンＥＦハンドとの結合は、発光タンパク質の立体構造変化を引き起こし、青色閃光（４６５ｎｍ）の放出を伴うＣＬＺ（補因子）の酸化をもたらす。このプロセスは、カルシウムに対して敏感な他の発光タンパク質と同様である。
【０００４】
イクオリンのような、カルシウム活性化発光タンパク質は、ＧＰＣＲにより刺激されたカルシウム流動を検出するために（非特許文献１:Ｓｔａｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７））、及び薬物スクリーニング（非特許文献２:Ｕｎｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９））において使用されている。これらの例のほとんどでは、細胞外シグナルは、受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）及びイオンチャネル）を通して受信され、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化に変換され、これは、これらに限定されないが、Ｃａ２＋感受性キナーゼ、プロテアーゼ、及び転写因子の調節を含む、細胞内部でのＣａ２＋感受性変化をもたらす。
【０００５】
しかしながら、野生型（ｗｔ）イクオリンからの発光は、他の発光タンパク質と同様に、その比較的低いカルシウム感受性に比例する本質的に低い量子収率により特徴付けられる。特に、イクオリンのカルシウム親和性は、受容体に起因するカルシウムの細胞質基質濃度（例えば、０．１μＭ〜０．５μＭの範囲内）に対して、低め（すなわち、約１μＭ）である。例えば、オベリンのような、他のカルシウム活性化発光タンパク質は、より低いカルシウム親和性及び／または低レベルの発光を有することが報告された（非特許文献３:Ｍａｌｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００３、非特許文献４:Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｓａｈａｒａ、２００７、非特許文献５:Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、非特許文献６:Ｅｒｅｍｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３ａ、及び非特許文献７:Ｅｒｅｍｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３ｂ）。
【０００６】
したがって、典型的な細胞質変化（アゴニスト刺激後の数百ｎＭ）のイメージングは、結果的に少量の放出光子により制限される。実際に、これは、野生型イクオリンを使用する時空間解像度を著しく制限する主要な問題である。
【０００７】
この問題を回避するために、異なるＣＬＺ類似体の組み込み及び遺伝子変異導入が、カルシウム感受性、減衰速度、スペクトル放出、及び熱安定性を変更するのに使用されている（非特許文献８:Ｄｉｋｉｃｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ、２００９ａ）。
【０００８】
研究は、ＣＬＺ類似体が、イクオリンを修飾する迅速かつ簡単な方法となる傾向があるが、それらが異なる細胞膜透過性及び生体内分布を有することを示した（非特許文献９:Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、１９９７）。加えて、マルチカラーイメージング時に使用することができるのは、１つのＣＬＺ類似体のみである。実践的には、イクオリン光出力を増加させることは、通常、天然以外のＣＬＺ類似体（例えば、ＣＬＺ−ｈ、ＣＬＺ−ｆ、及びＣＬＺ−ｈｃｐ）を使用し、すなわち、より高いカルシウム親和性をもたらすことにより達成される。
【０００９】
同様に、変異導入戦略は、アポイクオリンを遺伝子レベルで本質的に修飾するのに使用され、特に、ＣＬＺ類似体生体内分布が重要である生細胞またはトランスジェニック生物における、より多くの制御を可能にしている。低カルシウム親和性を有するアポイクオリンの遺伝子修飾変異体は、高カルシウム含有培地（例えば、小胞体）中のカルシウムを測定するために使用されることが報告された（非特許文献１０:Ｋｅｎｄａｌｌ  ＪＭ、ｅｔ  ａｌ  １９９２、非特許文献１１:ｄｅ  ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅ  Ｓ、ｅｔ  ａｌ  ２０１２）。しかしながら、増加したカルシウム親和性を有するアポイクオリン変異体については、これまで記載されていない。
【００１０】
よって、周知の野生型イクオリンと比較して高いカルシウム親和性を示す、新世代のアポイクオリンベースのカルシウムバイオセンサが必要とされており、これはシグナル対ノイズ比を著しく向上させるだろう。こうした特性は、非常に望ましく、その濃度は約数百ナノモルである細胞カルシウムの微細な変化を実際に測定するのに不可欠な補完的資産である。
【００１１】
加えて、細胞内カルシウムレベルのモニタリングには、細胞内カルシウムレベルの急速な変化を検出するために、速い生物発光速度が望ましい。結果として、増加したカルシウム親和性を有するアポイクオリン変異体はまた、好ましくは少なくとも野生型イクオリンと同様の減衰速度、及び好ましくは野生型イクオリンより速い減衰速度を有するべきである。
【００１２】
細胞またはインビボアッセイには、アッセイを細胞にとって許容可能な、すなわち、３７℃に近い温度で行うことがさらに好ましい。これは、増加したカルシウム親和性を有するイクオリン変異体がまた好ましくは、この目的にとって十分に熱安定であるべきであり、よって好ましくは、野生型イクオリンと比較して減少しすぎた熱安定性を有するべきでないことを意味する。いくつかのイクオリン点変異（例えば、Ｅ１２８Ｇ及びＤ１５３Ｇ）は、その熱安定性を増加させることが既に報告されている（非特許文献１２:Ｔｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。イクオリン、ＧＡ、及びレッドクオリン（ｒｅｄｑｕｏｒｉｎ）のような、バイオセンサは、一般的には生きた培養細胞またはインビボにおける基質変異を報告するのに使用され、よって特定の温度下でのそれらの安定性は、それらの性能に影響を及ぼし得る。
【００１３】
インビボイメージングには、赤色発光バイオセンサが非常に有利であり、生体組織（例えば、深部組織及び血液細胞）における赤色波長の低吸光度及び散乱をもたらす。したがって、近年では、いくつかの研究が、ｗｔ−ａｅｑの発光の青色からより長い波長へのレッドシフトに注目した。こうした波長調整は、変異Ｙ８２Ｆの場合、部位特異的変異導入（非特許文献１３:Ｓｔｅｐａｎｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５）、または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）の原理下でイクオリンを蛍光タンパク質と融合させることのいずれかにより達成された。後者の方法は、増加したイクオリン安定性、イクオリンが検出可能な蛍光タンパク質に標識されること、及び向上した生物発光のような、いくつかの特性の組み込みによって、好ましい。イクオリンの第１の分子融合体は、ＧＦＰとのもの（ＧＦＰ−ａｅｑ、またはＧＡ）であり、イクオリン発光の緑色（５０９ｎｍピーク）へのシフトをもたらし、イクオリンの発光及びタンパク質安定性を増加させた（非特許文献１４:Ｂａｕｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＧＦＰは、非常に安定なタンパク質であることが知られており、よっておそらくイクオリンを安定させる。同じ研究において、ＢＲＥＴ融合体、ＧＡは、同じカルシウム用量の存在下、イクオリン単独と比較してほぼ２０倍高い光シグナルを生成することにより、より高いカルシウム感受性を示した。今日では、イクオリンベースのＢＲＥＴ融合体、例えば、ＧＦＰに融合させたイクオリン（ＧＡ）、Ｖｅｎｕｓ（ＶＡ）、Ｃｉｔｒｉｎｅ（ＣｉｔＡ）、またはｔｄＴｏｍａｔｏ（レッドクオリン）を構成することは、イクオリン発光のレッドシフトに使用されている（非特許文献１５:Ｃｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７、非特許文献１６:Ｂａｋａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、非特許文献１７:Ｂａｋａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。それにもかかわらず、イクオリン融合体であるレッドクオリンは、野生型イクオリンに類似しているため、ＧＡ及びＣｉｔＡのような、こうしたより高いカルシウム親和性を共有しない。結果的に、レッドクオリンが興味深く異なるレッドシフト発光（５８２ｎｍでピーク）を有する場合でも、これはＧＡ及びＣｉｔＡのシグナル強度と一致する感受性が不足している。
【００１４】
よって、カルシウムバイオセンサであるレッドクオリンは、野生型イクオリン（青色波長発光）の潜在的な代替物である。したがって、増加したカルシウム親和性を有し、赤色光を放出する変異アポレッドクオリンは、よって、インビボ、血液細胞中、及びまた二色用途にとっても非常に望ましいだろう。
【００１５】
結果的に、野生型イクオリンと比較して、
●増加したカルシウム親和性と、
●増加した輝度と、
●少なくとも同様の、及び好ましくはより速い減衰速度と、
●あまりない／または著しく低減した、及び好ましくは同様の熱安定性と、を有するイクオリン変異タンパク質の必要性がある。
しかしながら、１つの機能特性を向上させる変異が、別の機能特性をさらに変更し得ることは周知であり、単一変異体においていくつかの有利な特性を組み合わせることは、よって非常に困難な目標である。例えば、非特許文献１２:Ｔｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）によると、研究されたイクオリン変異体すべてについて、特定の機能で確認された利得は、安定性、見かけのＣａ２＋親和性、または減衰速度の変更において存在した他の機能の損失と関連していた。例えば、変異Ｑ１６８Ｒ及び／またはＬ１７０Ｉを表す変異体は向上した熱安定性を示したが、Ｃａ２＋親和性は野生型イクオリンと比較して低減した。よって、特定のイクオリン変異体は、独立して向上または低減し得る、異なる機能変更を示し得る。これらの機能変更は予測することができず、それらのメカニズムはまだ不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Stables,J.,Green,A.,Marshall,F.,Fraser,N.,Knight,E.,Sautel,M.,Milligan,G.,Lee,M.and Rees,S.(1997). A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein-coupled receptor.Anal.Biochem.252,115-126.
【非特許文献２】Ungrin MD,Singh LMR,Stocco R,Sas DE,Abramovitz M(1999)An automated aequorin luminescence-based functional calcium.
【非特許文献３】Malikova NP,Stepanyuk GA,Frank LA,Markova SV,Vysotski ES,Lee J.(2003)Spectral tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92.FEBS Lett 554:184-188.
【非特許文献４】Inouye and Sahara, Protein Express.Purif.,53:384-389(2007);
【非特許文献５】Bovolenta,S.,Foti,M.,Lohmer,S.and Corazza,S.(2007).Development of a Ca(2+)-activated photoprotein, Photina, and its application to high-throughput screening. J.Biomol.Screen 12,694-704.).
【非特許文献６】Eremeeva EV,Markova SV,Frank LA,Visser AJ,van Berkel WJ,Vysotski ES.(2013a)Bioluminescence and spectroscopic properties of His-Trp-Tyr triad mutants of obelin and aequorin. Photochem Photobiol Sci 12:1016-1024.
【非特許文献７】Eremeeva EV,Markova SV,van Berkel WJ,Vysotski ES.(2013b),Role of key residues of obelin in coelenterazine binding and conversion into 2-hydroperoxy adduct, Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology 127(2013)133-139.
【非特許文献８】Dikici E.,X.Qu,L.Rowe,L.Millner,C.Logue,S.K.Deo,M.Ensor,and S.Daunert,Aequorin variants with improved bioluminescence properties(2009a),Protein Eng Des Sel.2009 Apr;22(4):243-248.
【非特許文献９】Shimomura O,Membrane permeability of coelenterazine analogues measured with fish eggs Biochem.J.(1997)326,297-298 Springer Protocols. Edition  by Preston B.Rich,Christelle Douillet.
【非特許文献１０】Kendall JM,Dormer RL,Campbell AK(1992)Targeting aequorin to the endoplasmic reticulum of living cells.Biochem Biophys Res Commun 189:1008-1016
【非特許文献１１】de la Fuente S,Fonteriz Rl,de la Cruz PJ,Montero M,Alvarez J.,Mitochondrial free[Ca(2+)]dynamics measured with a novel low-Ca(2+)affinity aequorin probe(2012).
【非特許文献１２】Tsuzuki K,et al(2005)Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution.J Biol Chem.280,34324-31.
【非特許文献１３】Stepanyuk,G.A.,S.Golz,et al.(2005).“Interchange of aequorin and obelin bioluminescence color is determined by substitution of one active site residue of each photoprotein.”FEBS Lett 579(5):1008-1014.
【非特許文献１４】Baubet V,Le Mouellic H,Campbell AK,Lucas-Meunier E,Fossier P,Brulet P.2000.Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca21 reporters at the single-cell level.PNAS USA.97:7260-7265.
【非特許文献１５】Curie,T.,K.L.Rogers,et al.(2007).“Red-shifted aequorin-based bioluminescent reporters for in vivo imaging of Ca2+ signaling.”Mol.Imaging 6(1):30-42.
【非特許文献１６】Bakayan,A.,C.F.Vaquero,et al.(2011).“Red fluorescent protein-aequorin fusions as improved bioluminescent Ca2+ reporters in single cells and mice.”PLoS One 6(5):e19520.
【非特許文献１７】Bakayan,A.,B.Domingo,et al.(2015).“Imaging Ca(2+)activity in mammalian cells and zebrafish with a novel red-emitting aequorin variant.”Pflugers Arch 467(9):2031-2042.
【発明の概要】
【００１７】
本発明の文脈において、本発明者らは、驚くべきことに、特定の特異的点変異を有するアポイクオリンが、向上したカルシウム感受性、及びしたがって増加した生物発光出力を有することを見出した。変異体は、野生型イクオリンと比較して少なくとも同様の減衰速度を有し、いくつかは野生型イクオリンと比較して著しく速い減衰速度を有する。それらの熱安定性及びピーク発光波長は、野生型イクオリンと比較して著しく変更されなかった。また、イクオリン感受性の遺伝子制御は、特に二色カルシウム測定のための、他のイクオリンベースのカルシウムセンサ、変更された発光色を有する、蛍光タンパク質との融合体（例えば、ＧＦＰ−イクオリン、レッドクオリン、等）に対するその使用を可能にする。
【００１８】
本発明はよって、既知の発光タンパク質と比較して、及び特に野生型アポイクオリンと比較して増加した細胞内カルシウム親和性を有する、ならびに／または野生型イクオリンに対して向上した生物発光を示す、ならびに／またはインビトロ及びインセルロアッセイ両方において野生型イクオリンと比較してより速い減衰速度を有する、アポイクオリンの修飾形態を提供する。
【００１９】
第１の態様では、本発明はよって、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位、１２１位、１２３位、１７９位、もしくは１５７位、または１５９、１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換を含むアポイクオリン変異タンパク質に関する。
【００２０】
第２の態様では、本発明のアポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子が提供される。
【００２１】
第３の態様では、本発明のアポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子を含む組換えベクターが提供される。
【００２２】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子または組換えベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明の核酸分子または組換えベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物が提供される。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、本発明のアポイクオリン変異タンパク質、核酸分子、組換えベクター、宿主細胞、または非ヒトトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物の、
ａ）細胞小器官、細胞、組織、もしくは非ヒト動物における、及び特に生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、定量的カルシウムイメージング用途ための、
ｂ）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を活性化する能力について化合物をスクリーニングするための、
ｃ）毒物及び遺伝毒性試験における、または
ｄ）環境汚染試験の検出における、使用に関する。
【００２５】
また、さらなる態様では、本発明のアポイクオリン変異タンパク質及び野生型または修飾ＣＬＺ補因子を含むキットが提供される。
【００２６】
さらなる態様では、本発明のアポイクオリン変異タンパク質、天然または修飾合成ＣＬＺ補因子、及び分子酸素を含む再構成変異イクオリン複合体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】向上したカルシウム感受性についてスクリーニングされた変異部位を強調するアポイクオリンアミノ酸構造の図式表現。アポイクオリン配列は、イクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する１９８アミノ酸長である（ＰＤＢコード：１ＥＪ３）。四角の中のアミノ酸は、そのカルシウム親和性を変更するためにイクオリンタンパク質配列に対して行われた変異の要約を表す。ＣＬＺ及びカルシウムアミノ酸接触部位は、それぞれ、Ｃｌｚ及びＣａとして示される。カルシウム結合ＥＦハンドは、二次構造として矢印で示される（ＥＦ−１、ＥＦ−２、ＥＦ−３領域）。
【図２】イクオリン変異タンパク質のカルシウム親和性曲線の結果の図式表現。カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）と分数の生物発光強度（Ｌ／Ｌｍａｘ）との間の関係は、リニアスケール上のＬｏｇ値で示される。Ｌ及びＬｍａｘは、それぞれ、同じ試料について所定の［Ｃａ２＋］でのピーク発光強度及び飽和［Ｃａ２＋］での全発光強度を表す。イクオリン再構成はＣＬＺ−ｆで行った。パネルＡは親和性の顕著な変化をもたらさなかったアミノ酸変異を表し、ｎは少なくとも２であった。パネルＢはカルシウム親和性を増加または減少させた単一アミノ酸変異を示し、分類する。ｐＣａ６．５で、及びＡｅｑ−ｗｔに対して、低（例えば、Ｑ１４０Ｒ）、中低（例えば、Ｓ１５７Ｔ）、中高（例えば、Ａ１２３Ｄ）、または高（例えば、Ｑ１５９Ｄ）カルシウム親和性を有する４つの群が確認され、ｎは少なくとも３であった。Ａｅｑ−ｗｔについて、シグモイド曲線あてはめは比較のために追跡される。適合度のＲ二乗は０．９９４より高かった。
【図３】二重変異を有するイクオリン変異タンパク質のカルシウム親和性曲線の結果の図式表現。カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）と分数の生物発光強度（Ｌ／Ｌｍａｘ）との間の関係は、リニアスケール上のＬｏｇ値で示される。イクオリン再構成はＣＬＺ−ｆで行った。グラフは、特別な感受性を有するイクオリン変異体の群をもたらした、いくつかの単一変異の組み合わせの親和性曲線を示し、ｎは少なくとも４であった。Ａｅｑ−ｗｔについて、シグモイド曲線あてはめは比較のために追跡される。適合度のＲ二乗は０．９９４より高かった。明瞭性のために、ＱＤ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＤ＋ＮＤ（Ｑ１５９Ｄ＋Ｎ１２１Ｄ）、ＱＤ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１２３Ｄ）、ＱＴ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＴ＋ＮＤ（Ｑ１５９Ｔ＋Ｎ１２１Ｄ）、ＱＴ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄ）という略語が使用される。
【図４】レッドクオリン変異タンパク質、レッドクオリン−野生型（Ｒｅｄｑ）、及びＧＦＰ−イクオリン融合体（ＧＡ）についてのカルシウム親和性曲線の親和性の結果の図式表現。カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）と分数の生物発光強度（Ｌ／Ｌｍａｘ）との間の関係は、リニアスケール上のＬｏｇ値で示される。パネルＡ及びＢは、それぞれ、ＣＬＺ−天然またはＣＬＺ−ｆ使用後のカルシウム親和性曲線における相違を強調する（ｎは少なくとも４であった）。Ａｅｑ−ｗｔについて、シグモイド曲線あてはめは比較のために追跡される。適合度のＲ二乗は０．９９４より高かった。明瞭性のために、ＱＤ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＴ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＤ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１２３Ｄ）、ＱＴ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄ）という略語が使用される。詳細は図２及び図３の凡例を参照されたい。
【図５】２つの異なる温度、３０及び４０℃での、イクオリン変異タンパク質、ＧＦＰ−イクオリン（ＧＡ）、Ｃｉｔｒｉｎｅ−イクオリン（ＣｉｔＡ）、レッドクオリン（Ｒｅｄｑ）、及びＲｅｄｑ変異タンパク質についての熱安定性の結果の図式表現を示す。各温度での相対生物発光活性は、第２の計数／第１の計数の比に１００を掛けることにより計算された。グラフ値は平均±ＳＤ（エラーバー）であり、ｎは３〜５である。
【図６】Ｃａ２＋センサ多様体を安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＡＴＰでの内在性Ｐ２Ｙ２受容体の活性化についての用量応答曲線。光強度は、生物発光シグナルを３０秒間集積することにより測定された後、最大及び最小強度について正規化された。各点は８つの実験の平均±ＳＤである。
【図７】レッドクオリンＱ１５９Ｔを有するマウス新皮質ネットワークのＣａ２＋イメージング。蛍光画像（画像「Ｆｌｕｏ」、左）は、新皮質切片における変異レッドクオリンの発現パターンを強調する。発現はレッドクオリンＷＴ及びＧＡと同等であった。センサを発現する錐体ニューロンは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光（画像「Ｆｌｕｏ」、左）により確認され、新皮質層ＩＩ／ＩＩＩ及びＶに優先的に局在化した。イメージングは、切片にマグネシウム（Ｍｇ２＋）フリーＡＣＳＦを浸み込ませる前に、２５Ｈｚで開始した。グラフは、自発及びニューロン同期閃光で開始するＣａ２＋活性に関連した生物発光強度を示す。番号１、２、及びそれらの対応する画像は、これらの時点での集団応答のピーク生物発光強度の例を示す。閃光後、究極的には、イメージング領域全体にわたる持続的皮質拡延性抑制波が続いた（時点３及びその対応する画像）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の文脈において、本発明者らは、驚くべきことに、特定の特異的点変異を有するアポイクオリンが、向上したカルシウム感受性、及びしたがって増加した生物発光出力を有することを見出した。変異体は、野生型イクオリンと比較して少なくとも同様の減衰速度を有し、いくつかは野生型イクオリンと比較して著しく速い減衰速度を有する。それらの熱安定性及びピーク発光波長は、野生型イクオリンと比較して著しく変更されなかった。また、イクオリン感受性の遺伝子制御は、特に二色カルシウム測定のための、他のイクオリンベースのカルシウムセンサ、変更された発光色を有する、蛍光タンパク質との融合体（例えば、ＧＦＰ−イクオリン、レッドクオリン、等）に対するその使用を可能にする。
【００２９】
本発明はよって、既知の発光タンパク質と比較して、及び特に野生型アポイクオリンと比較して増加した細胞内カルシウム親和性を有する、ならびに／または野生型イクオリンに対して向上した生物発光を示す、ならびに／またはインビトロ及びインセルロアッセイ両方において野生型イクオリンと比較してより速い減衰速度を有する、アポイクオリンの修飾形態を提供する。本発明のアポイクオリン変異体を含むイクオリンは、細胞カルシウムの微細な変化（数百ナノモル）を測定するために不可欠な補完的資産を表す。
【００３０】
アポイクオリン変異タンパク質
第１の態様では、本発明はよって、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位、１２１位、１２３位、１７９位、もしくは１５７位、または１５９、１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換を含むアポイクオリン変異タンパク質に関する。
野生型アポイクオリンとは、下記のアミノ酸配列である配列番号：１を有するタンパク質を指し、下線の配列はＥＦハンド配列（ＥＦハンドＩ、ＥＦハンドＩＩ、及びＥＦハンドＩＩＩ）に対応する。
【配列番号：１】
【００３１】
2019500849.tif 000002
【００３２】
「アポイクオリン変異タンパク質」とは、そのアミノ酸配列が野生型アポイクオリンのアミノ酸と比較して少なくとも１つの変異を含む、野生型アポイクオリンに由来するアポイクオリンタンパク質を意味する。「変異」とは、そのタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の修飾後の、参照野生型アポイクオリンのアミノ酸配列である配列番号：１における変更を意味する。変異は、元の野生型アミノ酸配列に対する別のアミノ酸によるアミノ酸の付加、欠失、または置換であってもよい。本発明のアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換、１２１位におけるアミノ酸置換、１２３位におけるアミノ酸置換、１７９位におけるアミノ酸置換、もしくは１５７位におけるアミノ酸置換、または１５９、１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換を含む。それらは任意で、野生型アポイクオリンアミノ酸配列である配列番号：１と比較して追加の変異（付加、欠失、及び／または置換）をさらに含む。
【００３３】
「アミノ酸」とは、本発明の文脈において、天然ａ−アミノ酸のすべての残基（例えば、ＤまたはＬ型のアラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ））、ならびに非天然アミノ酸を意味する。ヌクレオチド配列における変異の導入を可能にする方法は、当業者に知られている。例えば、ランダムもしくは特異的変異導入により、縮重プライマーを使用することによるＰＣＲにより、放射線により、または変異誘発剤を使用することにより、変異を導入することが可能である。その技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）により、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）により特に記載されている。好ましくは、本発明に従った変異は、部位特異的変異導入により導入される。その変異を導入するために、当業者が機能的に同等のコドン（またはヌクレオチド三重項）、すなわち同じアミノ酸、または生物学的に同等のアミノ酸をコードするコドンを使用することができることは理解されている。また、当業者が本発明のアポイクオリン変異タンパク質の発現を最適化することを望む場合は、様々な生物及び小器官におけるコドンの最適な使用を記録する、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／上のデータベースを参照することができる。
【００３４】
本発明者らにより決定されているもの以外のさらなる変異は、本発明のアポイクオリン変異タンパク質中に存在し、カルシウム親和性を増加、輝度を向上、及び任意で減衰速度を増加させ得るが、イクオリン生物発光活性を維持するためには、本発明のアポイクオリン変異タンパク質は、好ましくは、野生型アポイクオリンとの顕著な配列同一性を有する。特に、本発明のアポイクオリン変異タンパク質のアミノ酸配列は、よって、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列である配列番号：１との少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を示してもよい。
【００３５】
上述の同一性パーセントは、比較するアミノ酸配列の（ここでは配列番号：１配列との）最適なアラインメントを実施することにより決定することができ、このパーセントは純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたって分布される（グローバルアラインメント）。このアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）のグローバルアラインメントのような、当業者に知られているアルゴリズム及びコンピュータ化アプリケーションを使用して、または単なる検査により、実施することができる。最良のアラインメント（すなわち最も高い同一性パーセントを生成するもの）が次に選択される。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、最適な方法で全体的に整列された、これらの２つの配列を比較することにより決定され、比較するアミノ酸配列は、これらの２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（ここでは配列番号：１配列）との比較による付加または欠失を含むことができる。同一性パーセントは、２つの配列間でアミノ酸残基が同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛けることにより計算され、これらの２つの配列間の同一性パーセントが得られる。
【００３６】
野生型アポイクオリンと比較して増加したカルシウム親和性を保持するためには、本発明のアポイクオリン変異タンパク質のアミノ酸配列はまた、好ましくは、アポイクオリンの３つのＥＦハンド（カルシウム結合部位）において野生型アポイクオリンとの顕著な配列同一性を示すべきである。
【００３７】
「ＥＦハンド」とは、野生型アポイクオリンの参照アミノ酸配列である配列番号：１中、２４〜３５位（ＥＦハンドＩ）、１１７〜１２８位（ＥＦハンドＩＩ）、及び１５３〜１６４位（ＥＦハンドＩＩＩ）に位置する、アポイクオリンの３つのカルシウム結合部位を意味する。野生型アポイクオリンの３つのＥＦハンドのアミノ酸配列及び位置を下の表１にまとめる。
【表１】
2019500849.tif 000003
【００３８】
ＥＦハンドに位置する、１２１、１２３、１５９、及び／または１５７位における置換を除き、本発明のアポイクオリン変異タンパク質はよって、好ましくは、野生型アポイクオリンと比較してＥＦハンドＩ、ＩＩ、及びＩＩＩにおける他の変異をまったく、またはほとんど（好ましくはまったく）有さない。特に、ＥＦハンドに位置する、１２１、１２３、１５９、及び／または１５７位における置換を除き、本発明のアポイクオリン変異タンパク質は、好ましくは、野生型アポイクオリンと比較してＥＦハンドＩ、ＩＩ、及びＩＩＩにおける他の変異を最大３、好ましくは０、１、または２、より好ましくは０または１、及び最も好ましくは０個有する。
【００３９】
いかなる場合も、本発明のイクオリン変異タンパク質は、野生型イクオリンと比較して増加したカルシウム親和性を示すべきである。本明細書において使用されている「増加したカルシウム親和性」という用語は、野生型イクオリンに対する、本発明に従ったイクオリン変異タンパク質（例えば、１５９位でのアミノ酸置換を有する配列番号：１で示されるアポイクオリン）のカルシウム親和性のいくらかの増加を指す。例えば、カルシウム親和性は、野生型イクオリンに対して、約１．５％、または約２％、または約３％、または約３．５％、または約４％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％以上増加してもよい。いくつかの実施形態では、増加したカルシウム親和性とは、野生型イクオリンに対する、本発明に従ったイクオリン変異タンパク質のＥＣ５０値の減少を指す。発光タンパク質のカルシウム親和性は、これらに限定されないが、本明細書において記載されているものを含む、周知の技術及びアッセイを使用して測定することができる。本明細書において記載されている、例となる生化学アッセイでは、カルシウム親和性は、発光タンパク質発現細胞の溶解、当該技術分野において知られている方法による発光タンパク質の精製、次にＣＬＺ補因子（天然または修飾、例えばＣＬＺ−ｆ）での再構成、続いて可変濃度のカルシウムの添加後に放出された生物発光の測定により、インビトロで測定することができる。
【００４０】
本明細書において使用されている「カルシウムＥＣ５０値」という用語は、発光シグナル（すなわち、生物発光）を、飽和量のカルシウム（すなわち、これを超えるとカルシウム濃度のさらなる増加が発光シグナルのいかなる顕著な増加ももたらさない濃度のカルシウム）の存在下で発光シグナルについて観察されるシグナルの５０％であるレベルまでインビトロで引き出す、遊離カルシウムの濃度を指す。本明細書において使用されている、カルシウムＥＣ５０値とは、アポイクオリン変異タンパク質のカルシウム親和性の尺度である。ＥＣ５０値は、本明細書において記載されている生化学アッセイのような、当該技術分野において知られている１つ以上のインビトロアッセイを使用して測定することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明に従ったイクオリン変異タンパク質のカルシウムＥＣ５０値は、同じ細胞中の野生型イクオリンのＥＣ５０値に対して、約１．５％、または２％、または３％、または４％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％、または２５％、または３０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％、または９５％超減少している。いくつかの実施形態では、本発明のイクオリン変異タンパク質のＥＣ５０値は、野生型イクオリンのＥＣ５０値に対して、約１０ｎＭ、または２０ｎＭ、またはｎＭ、または４０ｎＭ、または５０ｎＭ、または６０ｎＭ、または７０ｎＭ、または８０ｎＭ、または９０ｎＭ、または１００ｎＭ、または１１０ｎＭ、または１２０ｎＭ、または１３０ｎＭ、または１４０ｎＭ、または１５０ｎＭ、または１６０ｎＭ、または１７０ｎＭ、または１８０ｎＭ、または１９０ｎＭ、または２００ｎＭ、または２１０ｎＭ、または２２０ｎＭ、または２３０ｎＭ、または２４０ｎＭ、または２５０ｎＭ、または２６０ｎＭ、または２７０ｎＭ、または２８０ｎＭ、または２９０ｎＭ、または３００ｎＭ、または３１０ｎＭ、または３２０ｎＭ、または３３０ｎＭ、または３４０ｎＭ、または３５０ｎＭ、または３６０ｎＭ、または３７０ｎＭ、または３８０ｎＭ、または３９０ｎＭ、または４００ｎＭ、または４１０ｎＭ、または４２０ｎＭ、または４３０ｎＭ、または４４０ｎＭ、または４５０ｎＭ減少しているか、４５０ｎＭ超減少している。
【００４２】
例となる実施形態では、本発明に従ってＣＬＺ−ｆで再構成されたイクオリン変異タンパク質は、好ましくは４９２ｎＭ以下、好ましくは２１６ｎＭ以下のＥＣ５０値を有する。別の好ましい実施形態では、ＣＬＺ−天然で再構成されたイクオリン変異タンパク質は、６８０ｎＭ以下、好ましくは４７０ｎＭ以下のカルシウムＥＣ５０値を有する。
【００４３】
好ましくは、本発明のイクオリン変異タンパク質は、野生型イクオリンと比較して増加した輝度を示す。本明細書において使用されている「増加した輝度」という用語は、同じＣａ２＋濃度の存在下での野生型発光タンパク質に対するイクオリン変異タンパク質の輝度のいくらかの増加を指す。例えば、例となる実施形態では、本明細書において記載されている修飾イクオリン（例えば、１５９位でのアミノ酸修飾を有するアポイクオリン）の輝度は、可変濃度のＣａ２＋を含有する溶液中で測定されるように、野生型イクオリンの輝度に対して向上している。カルシウムの存在下でのイクオリン変異タンパク質の輝度は、野生型イクオリンのそれに対して、約１．５％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９０％超増加してもよい。いくつかの実施形態では、カルシウムの存在下でのイクオリン変異タンパク質の生物発光は、野生型イクオリンに対して、約１．５倍、または２倍、または５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または２５倍、または３０倍、または３５倍、または４０倍、または４５倍、または５０倍、または５５倍、または６０倍、または６５倍、または７０倍、または７５倍、または８０倍、または８５倍、または９０倍、または９０倍超増加している。
【００４４】
本発明は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位、１２１位、１２３位、１７９位、もしくは１５７位、または１５９、１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換を含むアポイクオリン変異タンパク質を提供する。
【００４５】
第１の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００４６】
配列番号：１の１５９位のグルタミン（Ｑ）を置換するのに適したアミノ酸としては、リジン（Ｋ）以外のいずれかの自然発生または非自然発生アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、１５９位のグルタミンを置換するのに適したアミノ酸としては、負電荷帯電アミノ酸または非正電荷帯電親水性アミノ酸、好ましくはアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、及びグルタミン（Ｑ）から選択される自然発生アミノ酸のうちの１つが挙げられる。別の実施形態では、配列番号：１の１５９位のグルタミン（Ｑ）を置換するアミノ酸は、正電荷帯電アミノ酸以外の自然発生または非自然発生アミノ酸から選択される。
【００４７】
参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換を含む好ましい変異体としては、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基（配列番号：５）、トレオニン（Ｔ）残基（配列番号：６）、グリシン（Ｇ）残基（配列番号：７）、またはグルタミン酸（Ｅ）残基（配列番号：８）により置換されるものが挙げられる。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換を含む特に好ましい変異体は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基（配列番号：５）またはトレオニン（Ｔ）残基（配列番号：６）により置換されるものである。
【００４８】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換を含む。
【００４９】
配列番号：１の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）を置換するのに適したアミノ酸としては、セリン（Ｓ）以外のいずれかの自然発生または非自然発生アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、１２１位におけるアスパラギン残基を置換するのに適したアミノ酸としては、負電荷帯電アミノ酸から選択される自然発生アミノ酸のうちの１つが挙げられる。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換を含む好ましい変異体は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換される変異体（配列番号：９）である。別の実施形態では、配列番号：１の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）残基を置換するアミノ酸は、非帯電親水性アミノ酸以外の自然発生または非自然発生アミノ酸から選択される。
【００５０】
「負電荷帯電」とは、全体的な負電荷を有するいずれかのアミノ酸を意味する。天然アミノ酸の中でも、これとしてはアスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。
【００５１】
「親水性アミノ酸」という用語は、親水性であるいずれかのアミノ酸を指す。親水性アミノ酸は、負電荷帯電（Ｄ、Ｅ）、正電荷帯電（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、または非帯電（Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｑ）とすることができる。こうしたアミノ酸の例としては、アスパラギン酸（Ｄ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、及びヒスチジン（Ｈ）が挙げられる。
【００５２】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換を含む。
【００５３】
配列番号：１の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基を置換するのに適したアミノ酸としては、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）以外のいずれかの自然発生または非自然発生アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、１２３位におけるアラニン残基を置換するのに適したアミノ酸としては、負電荷帯電アミノ酸から選択される自然発生アミノ酸のうちの１つが挙げられる。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換を含む好ましい変異体は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換される変異体（配列番号：１０）である。別の実施形態では、配列番号：１の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基を置換するアミノ酸は、非帯電親水性アミノ酸以外の自然発生または非自然発生アミノ酸から選択される。
【００５４】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００５５】
配列番号：１の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基を置換するのに適したアミノ酸としては、グルタミン酸（Ｅ）及びバリン（Ｖ）以外のいずれかの自然発生または非自然発生アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、１７９位におけるアラニン残基を置換するのに適したアミノ酸としては、親水性アミノ酸から、好ましくは非負電荷帯電親水性アミノ酸から、より好ましくは非帯電親水性アミノ酸から選択される自然発生アミノ酸のうちの１つが挙げられる。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換を含む好ましい変異体は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換される変異体（配列番号：１１）である。別の実施形態では、配列番号：１の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基を置換するアミノ酸は、疎水性アミノ酸及び負電荷帯電アミノ酸以外の自然発生または非自然発生アミノ酸から選択される。
【００５６】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換を含む。
【００５７】
配列番号：１の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基を置換するのに適したアミノ酸としては、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、及びアラニン（Ａ）以外のいずれかの自然発生または非自然発生アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、１５７位におけるセリン残基を置換するのに適したアミノ酸としては、負電荷帯電アミノ酸から選択される自然発生アミノ酸のうちの１つが挙げられる。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換を含む好ましい変異体は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換される変異体（配列番号：１２）である。別の実施形態では、配列番号：１の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基を置換するアミノ酸は、疎水性アミノ酸、正電荷帯電及び非帯電親水性アミノ酸以外の自然発生または非自然発生アミノ酸から選択される。
【００５８】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９、１２１、１３、１７９、及び１５７位のうちの少なくとも２つにおける置換を含む。
【００５９】
この場合、アポイクオリン変異タンパク質は、好ましくは、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換を含み、１２１位、１２３位、１７９位、１５７位、または１２１、１２３、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換をさらに含む。
【００６０】
この場合、１５９位におけるそのアミノ酸置換は、好ましくは、１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基の、アスパラギン酸（Ｄ）残基、トレオニン（Ｔ）残基、グリシン（Ｇ）残基、またはグルタミン酸（Ｅ）残基による置換にある。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１２１位におけるアミノ酸置換を含む。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１２１位におけるアミノ酸置換を含む、本発明に従った好ましい変異体としては、
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換されるもの（配列番号：１３）、及び
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアスパラギン（Ｎ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換されるもの（配列番号：１４）が挙げられる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１２３位におけるアミノ酸置換を含む。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１２３位におけるアミノ酸置換を含む、本発明に従った好ましい変異体としては、
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換されるもの（配列番号：１５）、及び
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアラニン（Ａ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換されるもの（配列番号：１６）が挙げられる。
【００６３】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１７９位におけるアミノ酸置換を含む。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１７９位におけるアミノ酸置換を含む、本発明に従った好ましい変異体としては、
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換されるもの（配列番号：１７）、及び
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアラニン（Ａ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換されるもの（配列番号：１８）が挙げられる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１５７位におけるアミノ酸置換を含む。参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるアミノ酸置換及び１５７位におけるアミノ酸置換を含む、本発明に従った好ましい変異体としては、
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換されるもの（配列番号：１９）、及び
●参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５９位におけるグルタミン（Ｑ）残基がトレオニン（Ｔ）残基により置換され、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるセリン（Ｓ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基により置換されるもの（配列番号：２０）が挙げられる。
【００６５】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換を含み、１２３位、１５９位、１７９位、１５７位、または１２３、１５９、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換をさらに含む。
【００６６】
ある実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換及び１２３位におけるアミノ酸置換を含む。
【００６７】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換及び１７９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００６８】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換及び１５７位におけるアミノ酸置換を含む。
【００６９】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２１位におけるアミノ酸置換及び１５９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７０】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換を含み、１２１位、１５９位、１７９位、１５７位、または１２１、１５９、１７９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換をさらに含む。
【００７１】
ある実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換及び１２１位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７２】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換及び１７９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７３】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換及び１５７位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７４】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１２３位におけるアミノ酸置換及び１５９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７５】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換を含み、１２１位、１２３位、１５９位、１５７位、または１２１、１２３、１５９、及び１５７位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換をさらに含む。
【００７６】
ある実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換及び１２１位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７７】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換及び１２３位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７８】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換及び１５７位におけるアミノ酸置換を含む。
【００７９】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１７９位におけるアミノ酸置換及び１５９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００８０】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換を含み、１２１位、１２３位、１７９位、１５９位、または１２１、１５３、１７９、及び１５９位のうちのいくつかにおけるアミノ酸置換をさらに含む。
【００８１】
ある実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換及び１２１位におけるアミノ酸置換を含む。
【００８２】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換及び１２３位におけるアミノ酸置換を含む。
【００８３】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換及び１７９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００８４】
別の実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）の１５７位におけるアミノ酸置換及び１５９位におけるアミノ酸置換を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、参照野生型アポイクオリンアミノ酸配列（配列番号：１）と比較して追加の変異を含む。特に、その追加の変異は、
ａ）蛍光タンパク質との融合と、
ｂ）
ｉ）イクオリンの相対輝度を増加させる、
ｉｉ）イクオリンの減衰速度を増加させる、
ｉｉｉ）イクオリンの熱安定性を増加させる、及び／または
ｉｖ）イクオリンの発光波長λを増加させる、アミノ酸置換と、から選択してもよい。
【００８６】
「蛍光タンパク質との融合」とは、本明細書では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質が、そのＮまたはＣ末端位置、好ましくはＮ末端に蛍光タンパク質を含むことを意味する。
【００８７】
本発明の融合アポイクオリン変異タンパク質は、リンカーを含んでもよい。「リンカー」という用語は、本明細書では、その蛍光タンパク質及びアポイクオリン変異タンパク質を結合するのに適したいずれかの種類の化合物を指す。リンカーは、好ましくは体内で開裂されない。こうしたリンカーの例は、ＳＧＧＳＧＳ及びその誘導体である。
【００８８】
この方法で本発明のアポイクオリン変異タンパク質に融合することができる蛍光タンパク質の例としては、限定なく、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、及びそれらの誘導体のような、緑色蛍光タンパク質と、ＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、ＥＹＦＰ、ＹＰＥＴ、ＳＹＦＰ２、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ−Ｖｅｎｕｓ、およびそれらの誘導体のような、黄色蛍光タンパク質と、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ及びその多様体（ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍａｘ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）、ＴａｇＲＦＰ及びＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ならびにそれらの誘導体のような、橙色蛍光タンパク質と、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｅｑＦＰ６１１、ｔｄＲＦＰ６１１、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、及びそれらの誘導体のような、赤色蛍光タンパク質と、ｔｄＲＦＰ６３９、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、Ｋａｔｕｓｈｋａ、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、及びＡＱ１４３（Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）、ならびにそれらの誘導体のような、遠赤色に発光する蛍光タンパク質とが挙げられる。好ましくは、本発明の蛍光タンパク質は、上述のようなＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅタンパク質、またはｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質の中から選択される。
【００８９】
生物発光活性を維持する、アポイクオリンのＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、及びｔｄＴｏｍａｔｏとの融合体は、ＷＯ２０１４／０１６４５５、ＷＯ２００１／０９２３００、及びＷＯ２００８／１０４８３０において記載されている。本発明の文脈において、野生型イクオリンについて上で開示されている置換を、融合体の対応する位置に挿入し、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質の利点と融合体の波長特性とを組み合わせる変異融合体を得てもよい。
【００９０】
この点において、本発明に従った特に好ましい融合体は、上述のような本発明に従った置換を含む変異アポイクオリン、及びとりわけ配列番号：２１〜配列番号：２５から選択される配列のアポイクオリン変異体である。
【００９１】
本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質はまた、またはあるいは、
ｉ）イクオリンの相対輝度を増加させる、
ｉｉ）イクオリンの減衰速度を増加させる、
ｉｉｉ）イクオリンの熱安定性を増加させる、及び／または
ｉｖ）イクオリンの発光波長λを増加させる、アミノ酸置換をさらに含有してもよい。
【００９２】
適切な「イクオリンの相対輝度を増加させるアミノ酸置換」としては、３４位のグルタミン酸（Ｅ）のグリシン（Ｇ）による置換（Ｅ３４Ｇ）、及び４４位のバリン（Ｖ）のアラニン（Ａ）による置換（Ｖ４４Ａ）が挙げられる。例となる実施形態では、これらのイクオリン変異タンパク質は、野生型イクオリンタンパク質と比較して、最大１．９倍大きい相対光強度を示した（Ｔｒｉｃｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【００９３】
本発明に従って、「減衰速度を増加させる」という用語は、時間に伴う発光減衰の割合の増加を指し、減衰率は、放出λ光子の数が最大半量に到達した時間に対応する。適切な「イクオリンの減衰速度を増加させるアミノ酸置換」としては、１９位におけるメチオニン（Ｍ）のシステイン（Ｃ）による置換（Ｍ１９Ｃ）及び１１３位のフェニルアラニン（Ｆ）のチロシン（Ｙ）による置換（Ｆ１１３Ｙ）が挙げられる。例となる実施形態では、これらのイクオリン変異タンパク質は、野生型イクオリンタンパク質と比較して最大１．４倍速い減衰率を示した（Ｄｉｋｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９ｂ）。
【００９４】
本明細書では、「増加した熱安定性」とは、対応する野生型タンパク質と比較して、上昇した温度への曝露後に機能を保持する変異タンパク質の向上した能力に関する。イクオリン変異タンパク質の熱安定性は、４０℃で回収可能な総発光量を計算することにより、測定することができる。適切な「イクオリンの熱安定性を増加させるアミノ酸置換」としては、１２８位のグルタミン酸（Ｅ）のグリシン（Ｇ）による置換（Ｅ１２８Ｇ）及び１５３位のアスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）による置換（Ｄ１５３Ｇ）が挙げられる。例となる実施形態では、これらのイクオリン変異タンパク質は、野生型イクオリンタンパク質と比較して最大１．２倍大きい４０℃での相対総発光量を示した（Ｔｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【００９５】
「発光波長λを増加させる」とは、発光波長λがより長い光の波長にシフトされることを意味し、これはレッドシフトに対応する。適切な「イクオリンの発光波長λを増加させるアミノ酸置換」としては、８２位のチロシン（Ｙ）のフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）による置換（Ｙ８２ＦまたはＹ８２Ｗ）が挙げられる。例となる実施形態では、これらのイクオリン変異タンパク質は、野生型イクオリンタンパク質と比較して最大３０ｎｍの発光レッドシフトを示した（Ｓｔｅｐａｎｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【００９６】
しかしながら、本発明の変異イクオリンタンパク質が、野生型イクオリンと比較して少なくとも同等のＣａ２＋親和性を示すべきであることは理解されている。好ましくは、本発明の変異イクオリンタンパク質のＣａ２＋親和性は、野生型イクオリンと比較して向上している。当業者であれば、通常の実験を使用して、イクオリンＣａ２＋親和性を測定することができるだろう。
【００９７】
様々な実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質はまた、またはあるいは、アポイクオリン変異タンパク質の検出及び／または精製のために、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部領域のいずれかに、標識または融合を含んでもよい。
【００９８】
有利には、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、下の表２（表２−１から表２−４）に示されているような配列番号：５〜配列番号：２５から選択される。
【表２−１】
2019500849.tif 000004
【表２−２】
2019500849.tif 000005
【表２−３】
2019500849.tif 000006
【表２−４】
2019500849.tif 000007
【００９９】
本発明のアポイクオリン変異タンパク質は、当該技術分野において知られているいずれかの適切な方法を使用して調製することができる。例えば、核酸の部位特異的変異導入のための標準的な技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  ＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇと題された実験室マニュアルにおいて記載されているものを使用してもよい。加えて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異導入を含む標準的な分子生物学技術を使用してもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、アポイクオリン変異タンパク質は、標準的な遺伝子工学技術を使用して産生される。例えば、野生型発光タンパク質またはその一部分をコード化する核酸分子は、適切な宿主細胞中での発現に適したベクターにクローニングすることができる。適切な発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、典型的には、修飾発光タンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含む。
【０１０１】
本明細書において記載されている修飾アポイクオリン変異タンパク質はまた、ペプチド固相合成法を含む、当該技術分野において周知の方法を使用して、アミノ酸前駆体から化学的に合成してもよい。
【０１０２】
本発明のバイオセンサの構成のためのアポイクオリン変異タンパク質と蛍光タンパク質との融合は、当業者に知られている遺伝子工学、酵素または化学共役技術を使用して実施される。こうした技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）において記載されている。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、標的分子を特異的に結合することができる別の分子とさらに共有結合的に共役し、優先的には、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、抗体とさらに共有結合的に共役している。
【０１０４】
本発明に従って、その標的分子は次のいずれかとすることができる。
−その後直接検出され得る、対象の分析物。分析物を特異的に結合する分子はそこで、抗体もしくは受容体（分析物が受容体の配位子である場合）または配位子（分析物が配位子の受容体である場合）であってもよい。
−間接検出のために対象の分析物を特異的に結合する第２の分子を特異的に結合することができる分子。例えば、標的分子はビオチンであってもよく、この場合、本発明のアポイクオリン変異体はアビジンと共役してもよい。対象の分析物はそこで、本発明に従ったアポイクオリン変異体−アビジン共役体でさらに検出される、ビオチン化抗体、受容体、または配位子を使用して検出してもよい。別の例では、標的分子は一次抗体であってもよく、この場合、本発明のアポイクオリン変異体は一次抗体に特異的に結合する二次抗体と共役してもよい。対象の分析物はそこで、本発明に従ったアポイクオリン変異体−二次抗体共役体でさらに検出される、一次抗体を使用して検出してもよい。
【０１０５】
結果として、好ましい実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、抗体、受容体、配位子と共有結合的に共役してもよい。特に好ましい実施形態では、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質は、抗体、ビオチン、またはアビジンと共有結合的に共役してもよい。
【０１０６】
上で定義されているような別の分子との共役アポイクオリン変異タンパク質は、当該技術分野において知られているいずれかの適切な方法を使用して調製することができる。
【０１０７】
核酸分子、ベクター、宿主細胞、非ヒトトランスジェニック動物、トランスジェニック植物
本発明はまた、本発明のアポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子及びアポイクオリン変異タンパク質をコード化するこうした核酸分子を含む組換えベクターを包含する。
【０１０８】
本発明のアポイクオリン変異タンパク質をコード化するいずれかの核酸分子を使用してもよい。特に、遺伝コード縮重によって、本発明の特定のアポイクオリン変異タンパク質は、多くの異なる核酸分子によりコード化され得る。本発明のアポイクオリン変異タンパク質をコード化するその核酸分子は、当業者が、機能的に同等のコドン（またはヌクレオチド三重項）、すなわち同じアミノ酸、または生物学的に同等のアミノ酸についてコードするコドンを使用して、修飾することができることが理解されるべきである。また、当業者が本発明のアポイクオリン変異タンパク質の発現を最適化することを望む場合は、様々な生物及び小器官におけるコドンの最適な使用を記録する、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／上のデータベースを参照することができる。
【０１０９】
本明細書において使用されている「組換えベクター」とは、対象のポリヌクレオチド配列を標的細胞に移動するベクターを指す。こうしたベクターは、自己複製または宿主細胞（例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、個別動物、及び個別植物、等）中の染色体への組み込みが可能であり、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した部位にプロモーターを含有する。組換えベクターは、構造遺伝子及びその発現を制御するためのプロモーター、ならびに加えて、宿主細胞内で作用することが可能な状態の様々な制御エレメントを含んでもよい。使用される制御エレメントの動物及び種のような生物の組換えベクターのタイプが、使用される宿主細胞のタイプに応じて異なり得ることは、当該技術分野において周知である。
【０１１０】
本明細書において使用されている「ベクター」という用語は、「プラスミドベクター」または「ウイルスベクター」を指す。
【０１１１】
「プラスミド」という用語は、ｐｃＤＮＡ３、ｐＴｒｉＥｘ、ブルースクリプト、等のような、細胞中での複製が可能な環状染色体外核酸分子を指す。
【０１１２】
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルスゲノムの少なくとも１つのエレメントを含む核酸ベクターを指し、ウイルス粒子にパッケージングしてもよい（例えば、ｐＳｉｎＲｅｐ５）。「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」、及び「ウイルスベクター粒子」という用語は、ウイルス粒子の産生を可能にする適切な条件に従って核酸ベクターが適切な細胞または細胞株に形質導入される場合に形成されるウイルス粒子を指すのに、相互互換的に使用されている。本発明の文脈において、「ウイルスベクター」という用語は、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）及びそれから産生されるウイルス粒子を含むものとして広く理解されなければならない。「ウイルスベクター」は、本明細書では、当該技術分野において認識されている意味に従って使用されている。これは、完全ウイルスゲノム、その一部分、または後述のような修飾ウイルスゲノム、及びそれから産生されるウイルス粒子（例えば、感染性ウイルス粒子を生成するウイルスキャプシドにパッケージングされたウイルスベクター）を含む、ウイルス由来の少なくとも１つのエレメントを含むいずれかのベクターを指す。本発明のウイルスベクターは、複製可能とすることができ、または複製欠損もしくは複製欠陥となるように遺伝的に無効化することができる。本明細書において使用されている「複製可能」という用語は、特定の宿主細胞（例えば、神経及び腫瘍細胞）中で良好または選択的に複製するように操作される複製選択的及び条件付きで複製可能なウイルスベクターを包含する。ウイルスベクターは、様々な異なるウイルス、及び特にレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、及び泡沫状ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来してもよい。
【０１１３】
好ましい実施形態では、その組換えベクターは、アポイクオリン変異タンパク質をコード化するその核酸分子の発現を制御する「制御エレメント」または「制御配列」を含む。
【０１１４】
本明細書において使用されている「制御エレメント」または「制御配列」という用語は、複製、複写、転写、スプライシング、翻訳、核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の安定性及び／または輸送を含む、所定の宿主細胞または対象中での核酸分子の発現を可能にする、これに寄与する、またはこれを調節する、いずれかのエレメントを指す。ベクターは、当該技術分野において知られている従来の方法により、例えば、ＰＣＲ増幅により上で開示されているような核酸配列を有するアポイクオリン変異遺伝子を入手し、増幅産物を対象の適切なベクターに連結することにより、調製してもよい。
【０１１５】
本発明はまた、本発明に従った核酸分子または本発明に従った組換えベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１６】
「宿主細胞」とは、本明細書では、本発明に従った変異生物発光タンパク質をコードする核酸または前述のような組換えベクターを複製することができ、よって本発明の変異生物発光タンパク質を発現することができる、原核または真核細胞を指す。宿主細胞は、当業者に知られているプロセスに従って、その核酸またはそのベクターを宿主細胞中に移動または導入する方法により、「トランスフェクト」または「トランスフォーム」することができる。こうした方法の例としては、限定なく、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、マイクロインジェクション、及び微粒子銃が挙げられる。
【０１１７】
宿主細胞としては、限定なく、細菌、酵母、真菌、またはいずれかの他の高等真核細胞が挙げられる。当業者であれば、したがって、特に米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（ｗｗｗ．ＡＴＣＣ．ｏｒｇ）によって、入手可能な多数の細胞株の中から適切な宿主細胞を選択することができる。宿主細胞の例としては、限定なく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、Ｅ・コリ（ｃｏｌｉ）ＲＲ１、ＬＥ３９２、Ｂ、Ｘ１７７６、Ｗ３１１０、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＫＣ８）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロードバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、またはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属のグラム陰性菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のグラム陽性菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の真菌由来の細胞、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＥＦ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、Ｃ１２７、Ｓａｏｓ、ＰＣ１２、ＨＫＧを含む動物細胞、ならびに昆虫細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ  Ｆｉｖｅ（商標）、またはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉが挙げられる。昆虫細胞の使用は、特に、Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｏ´Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．によるマニュアル「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ、（１９９２）において記載されている。
【０１１８】
宿主細胞が上述のように本発明の組換えベクターによりトランスフォームされる場合、その宿主細胞の選択は、そのベクターの選択により、及び選択される使用、すなわち、核酸のクローニングまたは本発明の変異シアン蛍光タンパク質の発現に応じて決まり得る。
【０１１９】
本発明はまた、アポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子またはアポイクオリン変異タンパク質をコード化する核酸分子を含む組換えベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物に関する。本明細書において使用されている「トランスジェニック動物」という用語は、そのゲノム中に組み込まれた非相同組換え遺伝子によって特徴が変化した、上述のような導入遺伝子を有する非ヒト動物を指す。非ヒト動物の例としては、脊椎動物、特に哺乳類、特に、対象の疾患の病因及び病原を研究するためのモデルとして使用することができるようにヒトにおいて見られるものと同様の疾患を発症し得る哺乳類が挙げられる。適切な動物としては、ヒトと同様の内部構造、免疫系、及び／または体温を有し、高血圧、癌、または免疫不全を発症し得る脊椎動物が挙げられる。例として、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、レイヨウ（アンテロープ）、イヌ、ウサギ、モルモット、またはハムスターのような脊椎動物を使用してもよい。
【０１２０】
アポイクオリン変異タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物は、当該技術分野において知られているいずれかの従来の方法により調製してもよい。
【０１２１】
本明細書において定義されている「トランスジェニック植物」とは、組換えＤＮＡ技術を使用して、そうでなければ植物中には存在しないだろう単離核酸を含有するように変更された植物である。
【０１２２】
アポイクオリン変異タンパク質を発現するトランスジェニック植物は、当該技術分野において知られているいずれかの従来の方法により調製してもよい。
【０１２３】
使用
本発明はまた、本発明に従ったアポイクオリン変異タンパク質、核酸分子、組換えベクター、宿主細胞、または非ヒトトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物の、
ａ）細胞小器官、細胞、組織、もしくは非ヒト動物における、特に生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）による、定量的イメージング用途のための、
ｂ）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を活性化する能力について化合物をスクリーニングするための、
ｃ）毒物及び遺伝毒性試験における、または
ｄ）環境汚染試験の検出における、または
ｅ）発光タンパク質ベースの生物発光免疫測定のための、使用に関する。
【０１２４】
「生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）」は、「ドナー」のエネルギーがＣＬＺのような生物発光分子に由来し、これが発光タンパク質（例えば、イクオリン）の存在下で励起され、光子を放出するという点で、ＦＲＥＴとは異なる。これらの光子の共鳴エネルギーはそこで、エネルギー移動のための近接性及び幾何構造の条件が満たされる場合、その対応する波長で発光する「アクセプター」蛍光分子（例えば、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、及び蛍光量子ドット、等）に移動される。本発明に従った蛍光分子は、したがって、このタイプのＢＲＥＴ用途では「アクセプター」として使用されなければならない。
【０１２５】
「ＧＰＣＲ」という用語は、様々な細胞シグナル伝達経路に関与する、Ｇタンパク質共役受容体を指す。自然における最大かつ最も多様なタンパク質ファミリーのうちの１つとして、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーは、発生及び増殖、神経調節、血管新生、代謝障害、炎症、ならびにウイルス感染のような、様々な生物学的及び病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。これは、今日の薬学研究において最も注目されるタンパク質ファミリーのうちの１つである。ＧＰＣＲスーパーファミリーのすべてのメンバーは、同様の７回膜貫通ドメインを共有するが、共有配列モチーフに基づいてクラスにグループ化することができる。例えば、クラスＡはロドプシン様ＧＰＣＲを含み、クラスＢはセクレチン様ＧＰＣＲを含み、クラスＣは代謝調節型グルタミン酸／フェロモンＧＰＣＲを含み、クラスＤは真菌フェロモンＧＰＣＲを含み、クラスＥはｃＡＭＰ  ＧＰＣＲを含む。追加のＧＰＣＲは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ＧＰＣＲ、鋤鼻（Ｖｏｍｅｒｏｎａｓａｌ）ＧＰＣＲ、及び未分離のままであるものとして分類することができる。
【０１２６】
「生物発光免疫測定」という用語は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、等のような、免疫学的バイオアッセイのための読取り法としての生物発光の使用を指す。免疫測定は、分析物の抗体との反応に基づき試料中の分析物を検出及び定量化する生物分析ツールのセットである。後者は通常、高度に特異的な抗分析物抗体である。分析物は、ホルモン、抗生物質、抗てんかん剤、抗うつ剤、向精神薬、ビタミン、腫瘍マーカー、抗原、抗体、等のような、様々な形態の天然または合成いずれかの化合物とすることができる。分析物が検出される試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、乳、動物組織、植物組織、食物、等であり得る。
【０１２７】
免疫測定は、競合、非競合、不均一、及び均一として分類することができる。それらはすべて、試料中に存在する分析物の量を推定するために測定される標識を識別することを目的とする。「標識」は主に、それぞれ、発光または色変化をもたらす酵素または放射性同位体のいずれかとすることができる。発光タンパク質は、容易に検出及び定量化することができる生物発光をもたらす標識のタイプである。不明の分析物濃度は、較正曲線から決定することができる。
【０１２８】
免疫測定は、疾患診断、臨床薬物動態研究、治療薬物モニタリング、及び創薬のような重要な領域に拡張適用されている。
【０１２９】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明に従った共役アポイクオリン変異タンパク質の、上述のような生物発光免疫測定により対象の分析物を直接または間接的に検出するための、使用を対象とする。
【０１３０】
本発明はまた、その産生物の、溶液中で実施される、より具体的には、試料、生物抽出物、細胞、組織、または生物からの、毒物、遺伝毒性、または環境汚染検出試験における、使用に関する。
【０１３１】
本発明はまた、アポイクオリン変異タンパク質及び野生型または修飾ＣＬＺ補因子を含むキットに関する。
【０１３２】
ＣＬＺという用語は、溶液中で所定のアポ発光タンパク質またはルシフェラーゼに結合すると発光するその能力により特徴付けられる、イミダゾピラジン構造を有する分子として定義されている。ＣＬＺは、励起反応が幅広い様々な発光原タンパク質、具体的には海洋性発光タンパク質（例えば、イクオリン、オベリン、ベロビン、等）及びルシフェラーゼ（例えば、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）ルシフェラーゼ、オプロフォラス（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ）ルシフェラーゼ、及びシプリジナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼ、等）により誘発されると発光することが知られている。ＣＬＺ類似体は、ＣＬＺ−ｅ、ＣＬＺ−ｈｃｐ、ＣＬＺ−ｈ、ＣＬＺ−ｆ、ＣＬＺ−ｖ、ＣＬＺ−ｉｐ、ＣＬＺ−ｃｐ、ＣＬＺ−ｎ、ＣＬＺ−ｆｃｐ、及びＣＬＺ−ｉから選択してもよい。
【０１３３】
生きたトランスフェクト細胞は、天然形態または化学修飾形態（例えば、ＣＬＺ−ｆ）のいずれかとすることができる、ＣＬＺ補因子でインキュベートされる。ＣＬＺは形質膜を容易に通過し、アポ発光タンパク質と複合体を形成するために細胞内に入る。ＧＰＣＲの場合、再構成発光タンパク質を含有する細胞はそこで、ＧＰＣＲの配位子（例えば、ＡＴＰ、カルバコール、医薬品、等）に曝露され、発光はルミノメータで定量化される。
【０１３４】
本発明はまた、アポイクオリン変異タンパク質、天然または修飾合成ＣＬＺ補因子、及び分子酸素を含む再構成変異イクオリン複合体に関する。こうした再構成変異イクオリン複合体は、当該技術分野において知られている方法により、インビトロ、インセルロ、またはインビボで、ＣＬＺ補因子を変異アポイクオリンにとって利用可能にすることにより得てもよい（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）２ｎｄ  ｅｄ．２００９．）。
【０１３５】
下記の実施例は、単に本発明を例示することを意図している。
【実施例】
【０１３６】
実施例１
アポイクオリン（イクオリン・ビクトリア、ＰＤＢコード：１ＥＪ３）の向上したカルシウム感受性について推定変異部位のスクリーニングを実施し、アミノ酸構造を図１に示されているように強調した。アポイクオリン配列は、１９８アミノ酸長である。四角の中のアミノ酸は、そのカルシウム親和性を変更するためにイクオリンタンパク質配列に対して行われた変異の要約を表す。ＣＬＺ及びカルシウムアミノ酸接触部位は、それぞれ、Ｃｌｚ及びＣａとして示される。カルシウム結合ＥＦハンドは、二次構造として矢印で示される（ＥＦ−１、ＥＦ−２、ＥＦ−３領域）。
【０１３７】
実施例２
材料及び方法
アポイクオリン及びレッドクオリンの部位特異的変異導入
ｐＴｒｉＥｘベクターにおいてサブクローニングされた、野生型アポイクオリン（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＥＪ３、配列番号：１）の構成体、ならびに野生型レッドクオリン（ｗｔ−Ｒｅｄｑ）及びＣｉｔｒｉｎｅ−イクオリン（ＣｉｔＡ）の融合タンパク質は、Ｐｒｏｆ．Ｊｕａｎ  Ｌｌｏｐｉｓからの気前の良い寄贈品として、産生及び入手された（Ｂａｋａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｂａｋａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ＧＦＰ−イクオリン（ＧＡ）の融合構成体は、Ｐｒｏｆ．Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｂｒｕｌｅｔの実験室において産生された（Ｂａｕｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。同定された単一及び二重点変異は、（製造業者プロトコル、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに従った）多部位特異的変異導入アプローチを使用して、野生型アポイクオリンまたはレッドクオリン構成体に直接適用された。すべての変異体のＤＮＡ配列は、サンガー配列決定法により確認された。
【０１３８】
細胞培養及びトランスフェクション
ＨＥＫ−２９３細胞（Ｄｒ．Ｈｅｌｅｎｅ  Ｆａｕｒｅからの親切な寄贈品）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｏｎｚａ）において培養した。細胞を、通常通り、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気で維持した。
【０１３９】
外来ＤＮＡベクターでのトランスフェクションのために、細胞を６×１０５／ｃｍ２の密度で播種し、翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の推奨に従ってトランスフェクトした。各実験前に、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、異なる細胞株で発現したアポイクオリンを、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁され、１％ＦＢＳで補充された３μＭのＣＬＺ−ｆまたはＣＬＺ−天然（Ｂｉｏｔｉｕｍ）に、２〜３時間、３７℃及び５％ＣＯ２で入れた。
【０１４０】
ＨＥＫ細胞からのタンパク質精製
トランスフェクション後１日目、アポイクオリン発光タンパク質を一時的に発現するＨＥＫ−２９３細胞（２〜３×１０６個）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で（２回）すすぎ、低温条件下、セルスクレーパーを使用して回収した。細胞を５００ｘｇで５分間採取した後、低温ＰＢＳバッファ中で再懸濁させ、１回洗浄した。その後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ／Ｈ２Ｏ中で調製され、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ）で補充された、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＥＧＴＡ、及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノールからなる低浸透圧バッファを使用して細胞を溶解した。細胞膜を２回の凍結−解凍サイクルにより破壊した後、２５ゲージ針に数回通した。得られた溶解物試料を次に１３．０００ｘｇで２０分間遠心分離し、細胞破片及び破壊されていない細胞を除去した。発光タンパク質を含有する５００μｌの浮遊物を回収し、分子量カットオフに通した（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  ＭＷＣＯ、１０Ｋ及び５０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）。アポイクオリン変異タンパク質には１０ｋＤａ、レッドクオリン変異タンパク質には５０ＫＤａのカラムを使用した。このステップは、溶出タンパク質試料中の望ましくないタンパク質、塩、及び異なる化合物を除去することにより、より高純度及びバッファ交換を可能にした。バッファ交換のために試料を約５００μｌから２０μｌの体積まで濃縮した。２０μｌの濃縮試料を５００μｌの体積の所望のバッファに再懸濁させ、このステップを２回繰り返し、高性能洗浄及びバッファ交換を確保した。今後のアッセイにおける再構成のために濃縮試料を４℃で保存した。
【０１４１】
Ｅ・コリからのタンパク質発現及び精製
親和性、発光寿命、及び熱安定性のいくつかの実験を、高度精製タンパク質で繰り返し、同様の結果を得た（Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｄ、Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ、Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔ、Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１７９Ｔ、及びＲｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄ）。詳細なプロトコルについては下記文献を参照されたい（Ｂａｋａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｂａｋａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。簡潔に、Ｈｉｓ標識発光タンパク質の発現は、ｐＴｒｉＥｘ−４プラスミドシステムを使用してＥ・コリにおいて実施した。発光タンパク質を発現する細菌細胞を次に溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡ  ＨｉｓＢｉｎｄレジン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して発光タンパク質をカラム精製した。以前の細胞培養の部分において記載されているように、分子量カットオフ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  ＭＷＣＯ、５０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）を使用して、追加の精製ステップを行った。ＮａｎｏＤｒｏｐ装置で、２８０ｎｍまたはＲｅｄｑにおける蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏの最大消衰係数に対応する波長（５５４ｎｍ）のいずれかでの吸光度の組み合わせを使用することにより、タンパク質試料のタンパク質定量化を行った。今後のアッセイにおける再構成のために純粋試料を４℃で保存した。
【０１４２】
アポイクオリン再構成
インビトロ再構成のために、アポイクオリン及びレッドクオリン変異タンパク質の精製及び濃縮試料を、５μＭのＣＬＺ−ｆまたはＣＬＺ−天然で補充された、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールにバッファ交換し、暗室中、４℃で一晩インキュベートした。翌日、試料を分子量カットオフ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ  ＭＷＣＯ、１０Ｋ及び５０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）に通した後、カルシウム親和性、発光減衰速度、及びスペクトル分析アッセイのために、Ｚｅｒｏ−Ｃａ２＋バッファ（３０ｍＭのＭＯＰＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、及び１０ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．２）中で再懸濁させた。インセルロ再構成について、アポイクオリン及びレッドクオリン変異体のタンパク質を一時的に発現するＨＥＫ細胞を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、暗室中、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ）に希釈された４μＭの所望のＣＬＺで、２〜３時間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞は実験前に１回洗浄し、ＨＢＳＳ中、３７℃で２０分間維持した。
【０１４３】
イクオリン変異体及び融合体の機能分析
Ｃａ２＋感受性曲線。ＣＬＺ−ｆまたはＣＬＺ−天然での精製及び再構成試料は、ゼロカルシウムバッファに既にバッファ交換され、測定に干渉し得るカルシウム汚染は確実に最小化された。１５マイクロリットルアリコートの発光タンパク質試料（濃度範囲、５０〜９０ｎｇ／μｌ）を、自家製ルミノメータに配置し、所望の濃度の遊離Ｃａ２＋を含有する３００μｌの溶液と混合した。変動する遊離Ｃａ２＋を含むＥＧＴＡ緩衝溶液は、キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の製造業者の指示に従って調製した。発光の集積（毎秒）を、既知の［遊離Ｃａ２＋］を含む溶液を注入する前に２０秒間（バックグラウンド）測定し、安定または減衰シグナルが（最終段階で）得られるまで持続させた。この点では、４００μｌの飽和カルシウム溶液（３０ｍＭのＭＯＰＳ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．２）を急速に注入（３０ｍｓ未満）し、光集積は、すべてのイクオリンが消費され、光強度がバックグラウンドシグナルに戻るまで継続した。異なる［Ｃａ２＋］での発光強度（Ｌ）は、減衰シグナルの場合には応答ピーク値とし、または安定発光の場合には安定値とした。Ｌｍａｘを、その時点（Ｌ値）から実験の終わりまで残った発光シグナルすべてを集積することにより、測定した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、シグモイド用量応答あてはめ（可変勾配）から抽出した。
【０１４４】
発光半減期。イクオリン及びレッドクオリン、ならびにＣｉｔｒｉｎｅ−イクオリン（ＣｉｔＡ）及びＧＦＰ−イクオリン（ＧＡ）の変異タンパク質の減衰速度を評価するために、発光半減期（ｔ１／２）を単一指数関数的減衰あてはめ曲線から計算した。発光シグナルの記録（３０ｍｓのサンプリング間隔）は、１５マイクロリットルアリコートのタンパク質試料への２００μｌの飽和カルシウム溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）の高速注入前に開始した。これは、すべての試料について、完全なイクオリン消費でのピーク応答及び８秒未満での発光減衰をもたらした。
【０１４５】
スペクトル測定及び分析。１５マイクロリットルアリコートの発光タンパク質試料を、ＰＣＲチューブ中の２００μｌの飽和カルシウム溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）と接触させ、発光を誘発した。放出光子を光ファイバによって回収し、スペクトロメータ（Ｓｐｅｃｉｍ）に誘導し、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ  ＤＵ−８９７背面照射型）により捕捉した。レーザポインタ（４０５及び６５０ｎｍ）を使用してスペクトル較正を行った。Ｐｒｏｆ．Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｂｒｕｌｅｔの実験室からの、この自家製装置は、１ｎｍ解像度での発光の緊急及び同期スペクトル分析（走査なし）を可能にした（Ｃｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０１４６】
結果
単一及び二重変異を有するイクオリン変異タンパク質のカルシウム親和性曲線の結果を、それぞれ図２及び図３に示す。カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）と分数の生物発光強度（Ｌ／Ｌｍａｘ）との間の関係は、リニアスケール上のＬｏｇ値で示される。Ｌ及びＬｍａｘは、それぞれ、同じ試料について所定の［Ｃａ２＋］でのピーク発光強度及び飽和［Ｃａ２＋］での全発光強度を表す。イクオリン再構成はＣＬＺ−ｆで行った。
【０１４７】
増加するカルシム用量を使用する、イクオリン変異体のカルシム滴定曲線での分析は、異なる性能を有する５つの群の識別をもたらした。野生型イクオリン（ｗｔ−ａｅｑ）と比較して、イクオリンのカルシウム親和性が著しく変化しなかった１つの大きな群（図２Ａ）、及び親和性の顕著な変化を有する４つの群（図２Ｂ）。驚くべきことに、これらの群のうちの２つは、中高から高度のカルシウム親和性をもたらした特定の変異を有した（例えば、Ａ１２３Ｄ、Ａ１７９Ｔ、Ｑ１５９Ｄ、及びＱ１５９Ｔ）。一方で、同じ位置で異なるアミノ酸ファミリーに変化したものは、親和性の予期せぬ変化をもたらした（Ｑ１５９Ｋ対Ｑ１５９Ｄ、Ｓ１５７Ｄ対Ｓ１５７Ａ、及びＡ１７９Ｔ対Ａ１７９Ｅ、図２Ｂ参照）。実際に、いくつかのアミノ酸変異は、完全に反対の低いカルシウム親和性ももたらし（例えば、Ｓ１５７Ａ及びＱ１４０Ｒ）、これはイクオリン発光反応におけるこれらの点変異の重要性及び特異性を強調した。Ａｅｑ−ｗｔについて、シグモイド曲線あてはめは比較のために追跡される。適合度のＲ二乗は０．９９４より高かった。
【０１４８】
これらの群の親和性曲線の詳細分析は、カルシウムＥＣ５０の顕著な減少を示し、変異Ｑ１５９Ｔ（３１０ｎＭ）及びＱ１５９Ｄ（３３０ｎＭ）が最も高い親和性を示し、Ｓ１５９Ｄ（３２２ｎＭ）、Ａ１７９Ｔ（３３０ｎＭ）、及びＡ１２３Ｄ（３７４ｎＭ）が続いた（表３）。これらの単一変異体のｐＣａ６．５及びｐＣａ７．２での相対強度を計算することは、Ｑ１５９Ｄ及びＱ１５９Ｔがこれらのカルシウム用量で最も高い発光出力を示し、ｗｔ−ａｅｑより２５及び１６倍高いことを明らかにした。変異体Ｑ１５９Ｄは、ｐＣａ７．２の微量のカルシウムで極端に高い発光を有し、記録された強度は、同等の濃度で、ｗｔ−ａｅｑより最大２３倍高く（表３）、これは小さなカルシウム濃度の検出でのその潜在的な有用性及び感受性を反映する。ランダム変異導入に基づき、１つの以前の研究は、いくつかの変異、Ｅ３５Ｇ及びＶ４４Ａがイクオリンにおけるカルシウム親和性を増加させることを報告している。しかしながら、こうした変異体は、ｗｔ−ａｅｑでの８００ｍｓと比較して、それぞれ４０及び３４秒の非常に長い減衰速度、発光半減期（ｔ１／２）も伴っていた（Ｔｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。この遅い減衰特性は、細胞中のカルシウムイメージング用途のためにこれらの変異を活用することを妨げた。したがって、増加した親和性（表３）を有する、本明細書において同定されているイクオリン変異体を、飽和カルシウム条件での発光減衰半減期について評価した。驚くべきことに、Ｑ１５９Ｄ及びＡ１７９Ｔ変異の半減期は、ｗｔ−ａｅｑより著しく速かった（７７９ｍｓ対９０６ｍｓ）。残りの変異は、わずかに高い減衰半減期をもたらしたイクオリン変異体Ｎ１２１Ｄを除き、比較的低い減衰率をもたらした（９５７ｍｓ対９０６ｍｓ）。
【表３】
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【０１４９】
表３．増加したカルシウム感受性を有する単一変異イクオリン変異タンパク質の特性の要約。表３からの結果は、ＣＬＺ−ｆで再構成されたイクオリン変異タンパク質で得られた。カルシウム感受度（ＥＣ５０で表される）はシグモイド曲線あてはめから計算し、ｎは少なくとも３であった。値は平均±ＳＤとして示される。発光相対強度（Ａｅｑ−ｗｔとの比較）は、２つのカルシウム濃度、ｐＣａ６．５及びｐＣａ７．２のＬ／Ｌｍａｘのデータ点から控除された。ａ、曲線あてはめの適合度のＲ二乗は、０．９９４より高かった。減衰速度は、飽和カルシウム溶液の高速フローインジェクション及び３０ｍｓのサンプリング間隔での発光シグナル減衰の記録により測定された。平均値±ＳＤは、単一指数関数的減衰曲線あてはめから計算された。ｂ、減衰曲線あてはめの適合度のＲ二乗は、０．９９９より高かった。
【０１５０】
さらに、２つの潜在的な単一変異の組み合わせは、追加の向上した特性を有するイクオリン変異体をもたらした。実に、カルシウム滴定曲線からのデータは、イクオリン変異体（Ｑ１５９Ｄ及びＱ１５９Ｔ）に適用されたすべての３つの二重変異（Ｎ１２１Ｄ、Ａ１２３Ｄ、及びＡ１７９Ｔ）が、カルシウム親和性のさらなる増加をもたらしたことを明らかにした（Ｑ１５９Ｄ、Ｑ１５９Ｔ対Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ及びＱ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄ参照）（図３及び表４）。実際に、イクオリン二重変異Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ及びＱ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄは、各カテゴリの最も低いカルシウムＥＣ５０、それぞれ２１６ｎＭ及び２７９ｎＭを示した。また、すべての二重変異体の減衰半減期はｗｔ−ａｅｑと比較して著しく向上し、特にＱ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｄ及びＱ１５９Ｄ＋Ａ１２３Ｄはすべてのうちで最も速く、それぞれ６１２ｍｓ及び６２０ｍｓであった（表４）。すべてのイクオリン変異体のうち、発光ピークにより表される、スペクトル発光の分析は、ｗｔ−ａｅｑに対するいかなる顕著な変化も強調しなかった。これは、これらの変異が特定の方法で、発光の要因であるＣＬＺ部分の安定性ではなく、カルシウム／イクオリンの反応ダイナミクスに影響を及ぼしたことを示唆し得る。
【表４】
2019500849.tif 000009
【０１５１】
表４．増加したカルシウム感受性を有する二重変異イクオリン変異タンパク質の特性の要約。明瞭性のために、ＱＤ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＤ＋ＮＤ（Ｑ１５９Ｄ＋Ｎ１２１Ｄ）、ＱＤ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１２３Ｄ）、ＱＴ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＴ＋ＮＤ（Ｑ１５９Ｔ＋Ｎ１２１Ｄ）、ＱＴ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄ）という略語が使用される。表４からの結果は、ＣＬＺ−ｆで再構成されたイクオリン変異タンパク質で得られた。カルシウム感受度（ＥＣ５０で表される）はシグモイド曲線あてはめから計算し、ｎは少なくとも３であった。値は平均±ＳＤとして示される。発光相対強度（Ａｅｑ−ｗｔとの比較）は、２つのカルシウム濃度、ｐＣａ６．５及びｐＣａ７．２のＬ／Ｌｍａｘのデータ点から控除された。ａ、曲線あてはめの適合度のＲ二乗は、０．９９４より高かった。減衰速度は、飽和カルシウム溶液の高速フローインジェクション及び３０ｍｓのサンプリング間隔での発光シグナル減衰の記録により測定された。平均値±ＳＤは、単一指数関数的減衰曲線あてはめから計算された。ｂ、減衰曲線あてはめの適合度のＲ二乗は、０．９９９より高かった。
【０１５２】
実施例３
ここでは、実施例２と同じ材料及び方法を使用した。この実施例において、我々は、そのカルシウム感受性及びよってその生物発光出力を増加させるために、レッドクオリンに対する記載されているイクオリン変異の性能を試験した。レッドクオリンの６つの変異体が作製され、ＣＬＺ−天然またはＣＬＺ−ｆのいずれかでの、それらのカルシウム感受性、相対強度、及び発光減衰について評価されている。結果として、すべてのレッドクオリン変異体は、使用されたＣＬＺ補因子とは関係なく、カルシウム親和性の顕著な増加を示した（図４）。変異Ｒｅｄｑ／ＱＤ＋ＡＴの較正曲線はＣｉｔＡに最も近く、Ｒｅｄｑ／ＱＴはＧＡに最も類似していた。
【０１５３】
レッドクオリン変異タンパク質、レッドクオリン−ｗｔ（Ｒｅｄｑ）、Ｃｉｔｒｉｎｅ−イクオリン融合体（ＣｉｔＡ）、及びＧＦＰ−イクオリン融合体（ＧＡ）の特性の結果（図４）を、下の表５に詳述する。
【０１５４】
すべてのイクオリン発光タンパク質、Ｒｅｄｑ、Ｒｅｄｑ変異体、ＧＡ、及びＣｉｔＡは、ＣＬＺ−天然（図４．Ａ、表５の上部）またはＣＬＺ−ｆ（図４．Ｂ、表５の下部）のいずれかで再構成された。カルシウム感受性（ＥＣ５０で表される）、発光相対強度、及び減衰速度についての詳細は、表３を参照されたい。ａは、曲線あてはめの適合度のＲ二乗であり、０．９９５より高かった。ｎは少なくとも３であった。ｂは、減衰曲線あてはめの適合度のＲ二乗であり、０．９９９より高かった。ｎは少なくとも３であった。
【０１５５】
レッドクオリン（ｐＣａ６．５）に対する相対強度に関して、Ｒｅｄｑ／ＱＤ＋ＡＴは、最も高い光出力、ＣＬＺ補因子のタイプに応じて、３０〜６０倍高い強度を有することを証明した（表５）。同等に、他の二重変異（Ｒｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＴ及びＲｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤ）は、レッドクオリンと比較して１４〜２５倍の、相対強度の顕著な増加を示した。興味深いことに、変異Ｑ１５９Ｔを保持するレッドクオリン変異体（Ｒｅｄｑ／ＱＴ、Ｒｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＴ、及びＲｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤ）は一般的には、ＣＬＺ補因子を変える場合、相対強度における注目すべき相違を示さなかった（値１３対１１、１８．３対２５．６、及び１４．４対１４．４、表５参照）。同様に、融合体ＧＡの相対強度値は、２つのＣＬＺ補因子を試験する場合、ＣｉｔＡとは対照的に、大幅には変化しなかった。発光半減期に関して、ほとんどの二重変異体は、レッドクオリンと比較して同様からより速い発光速度をもたらした。ＣＬＺ−天然では、レッドクオリン変異体Ｒｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤ及びＲｅｄｑ／ＱＴが最も速く、それぞれ６７０ｍｓ及び７０５ｍｓの半減期を有する。一方ＣＬＺ−ｆでは、変異体Ｒｅｄｑ／ＱＤ＋ＡＴ及びＲｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤは、それぞれ９１３ｍｓ及び９５０ｍｓの最も小さい半減期を示した（表５）。実際に、これらの特定の変異は、親和性及び発光速度に関してレッドクオリン特性を向上させ、興味深いことにＧＡ及びＣｉｔＡと同様にした。こうした発見は、二色カルシウム検出、深部組織イメージングの用途における、及び顕著な検出感度を保持しながらＣＬＺ−天然の使用を必要とするアッセイにおける、これらのレッドクオリン変異体の使用を可能にするだろう。
【表５】
2019500849.tif 000010
【０１５６】
表５．増加したカルシウム感受性を有するレッドクオリン変異タンパク質の特性の要約。明瞭性のために、ＱＤ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＤ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｄ＋Ａ１２３Ｄ）、ＱＴ＋ＡＴ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１７９Ｔ）、ＱＴ＋ＡＤ（Ｑ１５９Ｔ＋Ａ１２３Ｄ）という略語が使用される。カルシウム感受性（ＥＣ５０で表される）、発光相対強度、及び減衰速度についての詳細は、表３を参照されたい。ａ、曲線あてはめの適合度のＲ二乗は、０．９９５より高かった。ｎは少なくとも３であった。ｂ、減衰曲線あてはめの適合度のＲ二乗は、０．９９９より高かった。ｎは少なくとも３であった。
【０１５７】
実施例４
熱安定性
増加したカルシウム親和性を有するイクオリン及びレッドクオリン変異体の熱安定性を、野生型イクオリンと比較した（図５）。精製発光タンパク質試料を（前述のとおり）ＣＬＺ−ｆで再構成し、室温（２０〜２４℃）で２０分間較正させた後、飽和カルシウム溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）を使用して総計数の第１の測定を行った。試料を次に、２つの異なる温度（３０〜４０℃）で３０分間インキュベートし、室温で１５分間平衡化させた後、試料中の総計数の第２の測定を行った。各温度での相対生物発光活性は、第２の計数（標的Ｔ℃）／第１の計数（初期Ｔ℃）の比に１００を掛けることにより計算された。
【０１５８】
表６（表６−１および表６−２）は、イクオリン及びレッドクオリン変異体、ならびにＣｉｔＡ及びＧＡについての２つの温度で得られた熱安定性データの分析を強調する。値は、各温度で、ｗｔ−ａｅｑと比較した発光活性の変化度を表す。すべての値は、（各温度での）野生型イクオリンに対するものであり、各変異体／多様体について得られたデータを（参照としての）ｗｔ−ａｅｑのデータで割ることにより計算された。データは図５から取得した。
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１５９】
本明細書において報告されているイクオリン及びレッドクオリンの点変異は、イクオリンの構造及びダイナミクスに確実に影響を及ぼし、よってまた上昇した温度でのその活性にも影響を及ぼし得る。したがって、実験手順において、２つの代表的な温度でのインキュベーション後、イクオリン変異体及びその誘導体の発光活性を登録した（図５）。結果的に、点変異Ｓ１５７Ｄは、最も低い熱安定性、ｗｔ−ａｅｑと比較して最大２９％低い活性をもたらし、Ｎ１２１Ｄ及びＡ１２３Ｄ変異（１９％低い活性）が続いた（表６）。二重変異について、変異体ＱＤ＋ＮＤは、ｗｔ−ａｅｑと比較して最も低い活性（２０％低い）を保持した。一般的には、変異体のほとんどは、野生型イクオリンに対して試験された温度で同様からわずかに低い活性を維持した。
【０１６０】
すべてのこれらの発見は共に、より高い感度及び性能で生細胞中のカルシウムを検出するための、これらのイクオリン及びレッドクオリン変異多様体の潜在的な適合性を向上させる。
【０１６１】
実施例５
ＣＨＯ細胞における内在性Ｐ２Ｙ２受容体の活性化についてのレッドクオリン変異体ベースの細胞アッセイ
材料及び方法
細胞培養及びトランスフェクション
ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２培地において３７℃、５％ＣＯ２で２４時間増殖させた。
【０１６２】
外来ＤＮＡベクターでのトランスフェクションのために、細胞を６×１０５／ｃｍ２の密度で播種し、翌日Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の推奨に従ってトランスフェクトした。各実験前に、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、異なる細胞株で発現したアポイクオリンを、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁され、１％ＦＢＳで補充された３μＭのＣＬＺ−ｆまたはＣＬＺ−天然（Ｂｉｏｔｉｕｍ）に、２〜３時間、３７℃及び５％ＣＯ２で入れた。
【０１６３】
安定に調製されたＣＨＯ細胞に、１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ´−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）中の５μＭのセレンテラジン、ｐＨ７．４を、４時間、周囲温度で装填した。
【０１６４】
発光タンパク質を安定に発現するＣＨＯ細胞
安定なＣＨＯ細胞株を産生するために、ＧＡ及びレッドクオリン多様体プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、６ウェルプレート上に播種し、１ｍｇ／ｍｌでＧｅｎｅｔｉｃｉｎ硫酸塩（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ、英国）が添加された同じ培地において、２日毎に新鮮な培地により培地を置換しながら同じ条件下で増殖させた。選別の７〜１０日後、ＣＨＯ細胞を、抗生物質を含まない培地に移した。最も高い生物発光活性を有するクローンを選別するために、１回の限界希釈を行った。Ｇ４１８選別後のＣＨＯ細胞を、９６ウェルプレート上に播種し（ウェル当たり約０．５細胞）、１０％ウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において３７℃、５％ＣＯ２で、８０〜９０％コンフルエンスまで増殖させた。生物発光測定前に、対応する発光タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の単クローンを含むプレートを複製し、９０〜１００％コンフルエンスまで増殖させた。次に、培地を除去し、細胞にセレンテラジンを装填し、前述の手順に従って各ウェルにおける生物発光を測定した。結果として、最も高い生物発光活性を有するＣＨＯ細胞クローンを選別した。
【０１６５】
ＣＨＯ細胞における内在性Ｐ２Ｙ２受容体の活性化のアッセイ
各発光タンパク質を安定に発現するＣＨＯ細胞株を、ＡＴＰによる内在性Ｐ２Ｙ２の活性化のアッセイに使用した。測定の前日、対応する細胞を、１０％ウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む９６ウェルプレート上に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で、９０〜１００％コンフルエンスまで増殖させた。次に、ウェル当たり１００μｌのセレンテラジン溶液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中の５μＭのセレンテラジン、ｐＨ７．４）により培地を置換し、細胞を２３℃で４時間インキュベートした。細胞中の発光タンパク質の発光を、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０プレートイルミノメータを使用して測定した。ＡＴＰを所定の濃度で注入して細胞における細胞内Ｃａ２＋応答を誘発し、測定をすぐに開始した。生物発光を０．０５秒の時間間隔にわたって３０秒間集積した。
【０１６６】
結果
Ｃａ２＋制御発光タンパク質は主に、哺乳類細胞における細胞内Ｃａ２＋を検出するように適用される。ここで、選択された赤色Ｃａ２＋センサ変異体を、ＣＨＯ細胞中の活性発光タンパク質に発現及び変換するそれらの能力について、ならびに内在性細胞受容体の活性化のアッセイにおいて試験した。すべての赤色センサ多様体は、同様の細胞質及び均一発現パターンを示した。対応する赤色センサ変異体を安定に発現するＣＨＯ細胞を天然セレンテラジンでインキュベートし、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００での細胞溶解後、光シグナルを１０秒間集積することにより、生物発光を測定した。赤色センサ変異体は、アポ発光タンパク質の活性Ｃａ２＋感受性センサへの変換について、同等の効率で、顕著かつ同様の総生物発光活性を明らかにした。内在性Ｐ２Ｙ２プリン作動性受容体の活性化についてのアッセイを、ＧＡ、Ｒｅｄｑ、Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔ、Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｄ、Ｒｅｄｑ／ＱＤ＋ＡＴ、及びＲｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤを安定に発現する同じＣＨＯ細胞で行った。ＣＨＯ細胞において、ＡＴＰ用量の外部適用によるＰ２Ｙ２受容体の活性化は、ＩＰ３（イノシトール１，４，５−三リン酸）シグナル伝達経路の活性化及び細胞質Ｃａ２＋濃度の増加をもたらす。ＡＴＰによるＰ２Ｙ２受容体活性化後、イクオリンベースのＣａ２＋センサを安定に発現するＣＨＯ細胞は、突出した用量依存性応答を示した（図６）。ＡＴＰ応答の詳細分析を表７に示す。
【表７】
2019500849.tif 000013
【０１６７】
ＣＨＯ細胞株のほとんどで決定されたＰ２Ｙ２活性化についての半数効果濃度（ＥＣ５０）の値は、以前のレポートからの値とよく一致していた［Ｇｅａｌａｇｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４、Ｍａｌｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４］。特に、赤色発光細胞株Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔは、一般的に使用される緑色発光細胞株ＧＡ（１．５μＭ）と比較してよく一致する１．７μＭの値をもたらした。しかしながら、天然Ｒｅｄｑ及びＲｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤ変異体を有する細胞株について、ＥＣ５０値は、主により低いＡＴＰ検出限界能力によって、約２倍であった（表７）。ＡＴＰの存在について、すべてのうちで最も敏感なものは、３９８ｎＭ［ＡＴＰ］まで検出することにより、ＣＨＯ細胞株Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔであった。
【０１６８】
ハイスループットスクリーニングアッセイでは、多数の化合物が評価され、よってアッセイは、時間が経過しても堅牢かつ再現可能である必要がある。よって、システムの高品質データ及び適合性を保証する、少なくとも１つの厳しいアッセイバリデーションパラメータが必要である。このＣａ２＋センサベースのアッセイを検証するために、シグナルウィンドウが効果的な活性ＡＴＰを検出するのに適切であることを確認するため、最大及び最小応答レベルでＡＴＰ実験を行った。したがって、Ｚ因子をＣＨＯ細胞株／ＡＴＰ応答の各対について計算し、これはシグナル測定に関連したアッセイシグナルダイナミックレンジ及びデータ変動を反映する。≧０．６の値は、一般的には有益なアッセイを示すと考えられている（シグナルウィンドウ≧３と同等である）。データは、細胞株Ｒｅｄｑ／ＱＴ＋ＡＤがシグナル測定に関して最も良好（０．８２の値）であったが、このＣＨＯ細胞株は［ＡＴＰ］検出限界における感度が不足していることを示した。２番目に良好な高品質データは、細胞株ＣＨＯ／Ｒｅｄｑ／Ｑ１５９Ｔ（０．７６の値）からのものであり、これはナノモルレンジでのＡＴＰの検出において同様に良好である（表７）。したがって、これらの変異は、野生型赤色Ｃａ２＋センサレッドクオリンの特性を、細胞アッセイにおけるその使用のために著しく向上させたと結論付けられる。
【０１６９】
実施例６
急性脳切片の錐体ニューロンにおけるレッドクオリン変異体の発現
材料及び方法
組換えウイルスベクターの調製及び産生
組換えシンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスを調製及び使用し、記載のとおり脳切片のニューロンにおいてレッドクオリン変異体及びＧＡを発現させた（Ｄｒｏｂａｃ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）、（Ｔｒｉｃｏｉｒｅ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｏｌｅｚ、２０１４）。レッドクオリン変異体及びＧＡのコード配列をまず、プラスミドｐＳｉｎＲｅｐ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上流においてｐｏｌｙＡシグナルにサブクローニングした。得られた融合タンパク質センサをコード化するｐＳｉｎＲｅｐ５プラスミド及びヘルパープラスミドｐＤＨ２６Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に次に、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  ＳＰ６キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してインビトロ転写を行い、キャップＲＮＡを調製した。次に、ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓、ＣＣＬ−１０、ＡＴＣＣ）細胞に、センサコード化及びヘルパーウイルスＲＮＡで電気穿孔を行い、５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭにおいて２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。組換え偽ウイルス粒子を、細胞浮遊物を回収することにより採取し、−８０℃で保存した。
【０１７０】
新皮質切片の調製及びウイルス形質導入
すべての実験は、１９８６年１１月２４日の欧州共同体理事会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）において発表されたガイドラインに従って実施した。大脳皮質の傍矢状断面（２５０μｍ厚）を、記載のとおり若齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（出生後１０〜１４日齢）から調製した［Ｔｒｉｃｏｉｒｅ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｏｌｅｚ、２０１４］。切片を、室温で３０分間、１２６ＮａＣｌ、２．５ＫＣｌ、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、２６ＮａＨＣＯ３、２０グルコース、５ピルビン酸、１キヌレン酸（ｍＭ）を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）においてインキュベートし、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２の混合物で酸化した。切片を次に、培地（５０％ＭＥＭ、５０％ＨＢＳＳ、６．５ｇ／リットルのグルコース、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で予備平衡化されたＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＣＭメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ＤＮＡ送達ビヒクルとしてのシンドビス偽ウイルス粒子での切片の形質導入を、記載のとおり実施した（Ｄｒｏｂａｃ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｔｒｉｃｏｉｒｅ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｏｌｅｚ、２０１４）。レッドクオリン変異体及びＧＡ中のアポ発光タンパク質を、培地に１０μＭの天然セレンテラジンを補充することにより、一晩活性化させた。翌日、皮質切片を少なくとも１時間ＡＣＳＦにおいてプレインキュベートした後、イメージングチャンバに移し、そこでＡＣＳＦを１〜２ｍｌ／分の割合で断続的に浸み込ませた。
【０１７１】
生物発光イメージング手順
生物発光イメージングは、室温で、ＩＦＳ３２ソフトウェア（Ｐｈｏｔｅｋ）により制御され、水浸対物レンズ１０倍（ＮＡ＝０．３）及び２０倍（ＮＡ＝０．９５）を備えた正立顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）に取り付けられた増感ＣＤＤビデオカメラ（ＩＣＣＤ２２５、Ｐｈｏｔｅｋ）を使用して行った。生物発光イメージング前に、ＧＡまたはレッドクオリン形質導入切片の蛍光画像を、ＧＦＰ（Ｓｅｍｒｏｃｋ）またはＣｙ３ＥＴ（Ｃｈｒｏｍａ）フィルタセットを使用してカメラの「明視野」モードで取得した。生物発光イメージングは、「ビニングスライス」モードで、毎秒２５フレームの速度で、完全暗室中、光子捕捉を最大化する発光フィルタなしで行った。データは、ＩＦＳ３２ソフトウェアで回収、保存、及び可視化した。
【０１７２】
結果
動物実験の３Ｒ原則を遵守して、これらの実験のために犠牲となった動物の数は制限された。レッドクオリンＷＴ及びＧＦＰ−イクオリン（ＧＡ）に加えて、新規レッドクオリン変異体の性能は、変異体レッドクオリンＱ１５９Ｔの試験のみに限定され、方法の部分において詳述のとおり、新皮質切片は生きたまま一晩維持され、レッドクオリンＷＴ、その変異体レッドクオリンＱ１５９Ｔ、及びＧＡの発現のためにシンドビスウイルス粒子で形質導入された。シンドビスウイルスは、神経系の神経細胞に感染する向性を有し、向神経性であることが知られている。実に、蛍光により可視化されたＣａ２＋センサの発現は、錐体ニューロンにおける高く特異的な発現レベルで、新皮質を形質導入する効率の高さを示した（図７、蛍光画像）。他の遺伝的にコード化されたセンサ（Ｇｅｒｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｄｒｏｂａｃ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）及びＧＡにより得られた以前の結果と比較して、レッドクオリンＷＴ及びその変異体Ｑ１５９Ｔの発現は、細胞質において均一に分布した。
【０１７３】
脳切片における脱分極に対するＣａ２＋センサ変異体の応答
センサを発現する形質導入急性脳切片に次に、Ｍｇ２＋を含まない人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を浸み込ませた。Ｃａ２＋トランジェントに対するレッドクオリン変異体の応答を、生物発光イメージングを使用することにより調査し、レッドクオリンＷＴ及びＧＡと比較した。脱分極の閾値前、記録されたイメージング強度は、発光タンパク質の低いバックグラウンド生物発光の概念と一貫して非常に弱かった。Ｍｇ２＋の枯渇直後、ニューロンのサブセットの脱分極後のＣａ２＋活性を明らかにする自発及び同期閃光は、Ｃａ２＋センサであるＧＡ及びレッドクオリン変異体で検出及び画像化された（図７、５００〜２０００秒の時間）。両センサは、異なる発光色相を有したが、シグナル周波数及び振幅に関して同様の区別不可能なプロファイルを繰り返しもたらした。興味深いことに、Ｍｇ２＋フリーＡＣＳＦへの数分の曝露後、新皮質全体にわたる脱分極のゆっくりと自己伝播する波が頻繁に観察された（図６、２０００秒後の時間）。実際に、いくつかの臨床的及びニューロイメージングの結論は、皮質拡延性抑制として知られているこうした現象が片頭痛前兆における神経症状と相関することを支持する。変異体レッドクオリンＱ１５９Ｔは、これらの波を画像化する能力を示し、一般的に使用されている緑色発光スペクトルを有するＣａ２＋センサである、その類似ＧＡと同様に良好に作用した。レッドクオリンＷＴでの実験が、２倍低い輝度を示す同じ応答プロファイルを再現することができなかったことは、注目に値する。神経培養において以前報告されているとおり（Ｂａｕｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０００、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｄｒｏｂａｃ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）、レッドクオリンＱ１５９Ｄは、顕著なシグナル対バックグラウンド比での神経脳切片における生理学的Ｃａ２＋シグナルのイメージングを可能にした。また、これは単細胞レベルで引き起こされたＣａ２＋トランジェントを画像化するのに適したセンサとなる可能性を有する。
【０１７４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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