(57)【要約】  本開示の主題は、一般に、組織内にエネルギー（例えば、超音波エネルギー）を印加して神経細胞と非神経細胞との間のシナプスで活性を変化させることを含む、組織の神経調節のための技術に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の組織の対象領域にエネルギーを印加するように構成されたエネルギー印加装置であって、前記組織がそれぞれのニューロンの複数の軸索終末を含み、前記軸索終末が個々の軸索終末とそれぞれの非神経細胞との間に軸索外細胞シナプスを形成する、エネルギー印加装置と、
前記組織の前記対象領域を空間的に選択し、前記対象領域は前記複数の軸索終末のサブセットと前記軸索外細胞シナプスの関連するサブセットと含み、
前記対象領域に前記エネルギーを集束させ、
前記関連するサブセットの細胞外シナプスの優先的活性化を誘導して、目標とする生理学的結果を引き起こすために、前記エネルギー印加装置を介した前記対象領域への前記エネルギーの印加を制御する
ように構成されたコントローラと
を含む調節システム。
【請求項２】
前記コントローラが、
プロセッサと、
前記組織の前記対象領域を空間的に選択する、前記対象領域に前記エネルギーを集束させる、または前記エネルギーの印加を制御する、またはそれらの組み合わせをプロセッサによって実行するように構成された命令を記憶するメモリと
を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記コントローラが、評価装置から、前記目標とする生理学的結果の特徴を示す入力を受信するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記特徴は、前記エネルギーが印加される前のベースライン濃度に対する前記被験体の血液中の１つ以上の分子の濃度である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記血液中の１つ以上の分子がグルコースおよびインスリンの一方または両方を含み、かつ前記組織が肝臓である、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
前記エネルギー印加装置に前記エネルギーを印加させるために前記プロセッサによって実行されるように構成された前記命令は、一組の調節パラメータを含み、前記コントローラは、前記ベースライン濃度に対するグルコース濃度の変化が閾値変化を上回る場合に、前記調節パラメータが有効であるという表示を提供するように構成される、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記血液中の前記１つ以上の分子は、１つ以上の参照分子を含み、前記コントローラは、前記ベースライン濃度に対する前記参照分子の濃度の変化が閾値変化を下回り、前記ベースライン濃度に対するグルコース濃度の変化が閾値変化を上回る場合に、前記調節パラメータが有効であるという表示を提供するように構成されている、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
血中グルコース濃度が３００ｍｇ／ｄＬ超であり、前記エネルギーが肝臓の対象領域に印加された後のグルコース濃度が２２０ｍｇ／ｄＬ未満である、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
前記血液中の前記１つ以上の分子は、コリン作動性抗炎症経路に関連する分子を含み、前記組織が脾臓である、請求項４に記載のシステム。
【請求項１０】
前記血液中の前記１つ以上の分子は、ＴＮＦ‐αおよびインターロイキン‐１の一方または両方を含み、前記組織が脾臓である、請求項４に記載のシステム。
【請求項１１】
前記エネルギー印加装置に前記エネルギーを印加させるために前記プロセッサによって実行されるように構成された前記命令は、一組の調節パラメータを含み、前記コントローラは、前記ベースライン濃度に対するＴＮＦ‐αまたはインターロイキン‐１の濃度の変化が閾値変化を上回る場合に、前記調節パラメータが有効であるという表示を提供するように構成される、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記調節パラメータは、前記対象領域内の超音波刺激の時間平均強度が所定の閾値以下になるように選択される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記血液中の前記１つ以上の分子は、１つ以上の参照分子を含み、前記コントローラは、前記ベースライン濃度に対する前記１つ以上の参照分子の濃度の変化が閾値変化を下回り、前記ベースライン濃度に対するＴＮＦ‐αまたはインターロイキン‐１の濃度の変化が閾値変化を上回る場合に、前記調節パラメータが有効であるという表示を提供するように構成されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記１つ以上の参照分子がノルエピネフリンおよびアセチルコリンの一方または両方を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記特徴が、前記エネルギーが印加された後３０〜９０分以内に測定される、請求項３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記特徴は、前記エネルギーが印加される前のベースライン濃度に対する脳内の１つ以上の分子の濃度であり、前記対象領域が脳内にない、請求項３に記載のシステム。
【請求項１７】
前記脳内の１つ以上の分子が、ｐＩＲＳ‐１、ＮＰＹ  ｐＡＫＴ、もしくはｐＡＭＰ‐ｋ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記特徴は、ベースライン濃度に対する脳活動の変化を表すデータであり、前記対象領域が脳内にない、請求項３に記載のシステム。
【請求項１９】
前記データがＦＭＲＩデータである、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記複数の軸索終末の追加のサブセットは前記対象領域の外側にあり、前記追加のサブセットが非活性化軸索外細胞シナプスに関連している、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記優先的活性化が、前記エネルギーの印加に応答して前記複数の軸索終末のサブセットから前記軸索外細胞シナプスの関連するサブセットに神経伝達物質または神経ペプチドが分泌されることによって達成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記軸索外細胞シナプスは、組織、血液、リンパ液、または細胞外組織のうちの１つ以上を有する感覚軸索終末間に形成され、前記目標とする生理学的結果は、求心性突出ニューロンにおける活動電位の刺激である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記求心性突出ニューロンが前記対象領域内にない、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記コントローラは、前記エネルギー印加装置に、調節パラメータに従って前記エネルギーを印加させ、前記標的生理学的結果の特徴を示す評価装置またはユーザから受信したフィードバックに基づいて前記調節パラメータを動的に変更させるように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記エネルギー印加装置は超音波プローブであり、前記コントローラは、前記エネルギーの印加前に前記組織の参照画像データを取得し、前記エネルギーの印加後に前記組織の処置後画像データを取得するように構成された撮像モードで前記超音波プローブを動作させるように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記コントローラが、前記参照画像データと前記処置後画像データとの比較に基づいて前記組織の変位測定値を決定するように構成されている、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記コントローラは、前記変位測定値に基づいて前記エネルギーの調節パラメータを修正するように構成されている、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記コントローラは、前記変位測定値が前記目標とする生理学的結果に関連する閾値変位を下回ることに基づいて前記エネルギーの前記調節パラメータを修正するように構成されている、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記組織が脾臓または肝臓である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項３０】
前記エネルギー印加装置が超音波トランスデューサを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３１】
前記エネルギー印加装置は、前記エネルギーを印加するように構成された第１の超音波トランスデューサと、前記対象領域の空間情報を取得するように構成された第２の超音波トランスデューサとを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３２】
前記組織は脾臓であり、前記コントローラは、脾臓の脾臓軸を識別することによって前記対象領域を空間的に選択するように構成され、前記対象領域は前記脾臓軸と少なくとも部分的に重なる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記コントローラは、前記組織に進入する神経または血管の部位を識別することによって前記対象領域を空間的に選択するように構成され、前記対象領域は前記進入部位と少なくとも部分的に重なる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記対象領域が、前記組織の総体積の５％以下、および／または２５ｍｍ３未満の体積を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３５】
前記エネルギー印加装置が機械的振動装置を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記エネルギー印加装置は、前記対象領域の外側にある前記組織の一部に前記エネルギーを印加しない、請求項１に記載のシステム。
【請求項３７】
神経調節の方法であって、前記方法は、
エネルギー印加装置を臓器または末梢組織に向けるステップと、
エネルギーを前記臓器または前記末梢組織の対象領域に集束させるステップであって、前記対象領域は、神経細胞と非神経細胞との間にシナプスを含む末梢組織または臓器の小領域である、ステップと、
目標とする生理学的結果を達成するために前記シナプスで前記神経細胞または前記非神経細胞の少なくとも一方に前記エネルギーを送達しそれによって活性を調節するために、前記エネルギー印加装置にパルス発生器を介してパルス電力を印加するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
前記エネルギー印加装置は超音波トランスデューサであり、前記エネルギーは超音波刺激である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記超音波刺激は、前記目標とする生理学的結果を達成するために、選択された種類の軸索外細胞シナプス内の前記非神経細胞に対して前記神経細胞を優先的に調節する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記超音波刺激は、前記目標とする生理学的結果を達成するために、ベースライン濃度に対して上昇したレベルで神経伝達物質または神経ペプチドを放出させるように選択された種類の軸索外細胞シナプスで前記神経細胞の軸索終末を優先的に調節する、請求項３８の方法。
【請求項４１】
前記超音波刺激は、求心性神経における活動電位を誘発するために、前記選択された種類の軸索外細胞シナプス内の感覚終末を優先的に調節する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記超音波刺激は、前記目標とする生理学的結果を達成するために、細胞内シグナル伝達経路の成分の活性または濃度を同じ方向に調節するように神経伝達物質／神経ペプチド放出および非神経細胞活性の両方を調節する、請求項３８の方法。
【請求項４３】
前記エネルギー印加装置によって生成された超音波トランスデューサビームが前記対象領域で交差する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記超音波刺激は約０．１ＭＨｚ〜約５ＭＨｚの範囲の超音波周波数を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記超音波刺激は約０．１Ｈｚ〜約１０ｋＨｚの範囲の超音波周波数パルス繰り返し周波数を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記超音波刺激は約１ｍＷ／ｃｍ２〜約１０００ｍＷ／ｃｍ２の範囲の時間平均強度で印加される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記エネルギーは超音波エネルギーであり、前記超音波エネルギーの１パルス当たりの超音波サイクル数が約１〜約１０００の範囲内である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記対象領域における前記超音波刺激の焦点面積は、前記臓器または前記末梢組織の総体積の約０．１％〜約９０％の範囲を表す約０．５ｍｍ３〜約５０ｍｍ３の範囲内である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記臓器は脾臓であり、前記シナプスはカテコールアミン含有神経細胞と非神経免疫細胞との間であり、前記目標とする生理学的結果はベースラインに対するサイトカイン分泌の変化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記臓器は脾臓であり、前記シナプスはカテコールアミン含有神経細胞と非神経免疫細胞との間であり、前記目標とする生理学的結果はＴＮＦ‐α分泌の変化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記脾臓は、関節リウマチ、過敏性腸疾患、および慢性炎症状態のうちの１つ以上を有する被験体内にある、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記臓器は脾臓であり、前記シナプスはカテコールアミン含有神経細胞と非神経免疫細胞との間であり、前記目標とする生理学的結果は、細胞表面マーカーの調節または特異的なタンパク質の細胞内発現である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞表面マーカーがＣＤ１１ｂを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記脾臓が慢性閉塞性肺疾患および慢性炎症状態の一方または両方を有する被験体内にある、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記臓器は肝臓であり、前記シナプスは感覚神経終末に関連し、前記目標とする生理学的結果は視床下部脳中心に突出する求心性神経の調節である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記臓器は肝臓であり、前記目標とする生理学的結果は、エネルギーが小領域に印加された後のグルコースまたはインスリンの血中濃度の変化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記肝臓は糖尿病および代謝機能不全障害の一方または両方を有する被験体内にある、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記臓器は肝臓であり、前記シナプスは感覚神経終末に関連し、前記目標とする生理学的結果は、視床下部脳中心に突出する求心性神経の活性化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５９】
前記目標とする生理学的結果が肥満または摂食障害の軽減である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記肝臓は肥満および摂食障害の一方または両方を有する被験体内にある、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記臓器は肝臓であり、前記シナプスは感覚神経終末に関連し、前記目標とする生理学的結果は前記視床下部脳中心に突出する求心性神経の活性化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項６２】
前記目標とする生理学的結果が海馬の活性化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
機能的磁気共鳴イメージング、拡散テンソル磁気共鳴イメージング、ポジティブエミッショントモグラフィ、音響モニタリング、熱モニタリング、血液試料から得られたタンパク質または細胞の測定、および他の生体体液または組織から得られたタンパク質または細胞の測定のうちの少なくとも１つからフィードバックを受け取るステップと、
前記フィードバックに基づいて、パルス電力の１つ以上のパラメータを変更するステップと
を含む、請求項３７の方法。
【請求項６４】
被験体における組織調節の方法であって、
エネルギー印加装置が組織を調節することができる位置に前記エネルギー印加装置を配置するステップと、
前記エネルギー印加装置を前記組織内の対象領域に集束させるステップと、
１つ以上のエネルギーパルスに応答して前記１つ以上のエネルギーパルスを印加する前のベースライン活性に対して神経細胞と非神経細胞との間のシナプスにおける活性に変化を引き起こすために、前記対象領域内に１つ以上のエネルギーパルスを印加するステップと
を含む方法。
【請求項６５】
前記１つ以上のエネルギーパルスが印加された後の時間は時間ゼロとして示され、前記ベースライン活性は時間ゼロでの活性を示す、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記組織内の前記対象領域は約２５ｍｍ３未満の体積を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記組織内の前記対象領域の外側の別の神経細胞と別の非神経細胞との間の別のシナプスにおける活性は、前記１つ以上のエネルギーパルスに応答して変化しない、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象領域は前記組織の総体積の約５％以下の体積を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記組織が肝臓または脾臓である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記活性の前記変化の特徴を測定することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記特徴が前記活性の変化が閾値未満であることを示している場合に、前記エネルギー印加装置を再配置するステップ、または前記対象領域を変更するステップを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記特徴が前記活性の変化が閾値を上回ることを示している場合に、前記１つ以上のエネルギーパルスの１つ以上のパラメータを変更するステップを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
糖尿病の診断に基づいて前記被験体を選択するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
測定された海馬活動の欠乏に基づいて前記被験体を選択することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
前記被験体が認知症および／または糖尿病関連認知症を有する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記１つ以上のエネルギーパルスを印加する前後に海馬活動の特徴を測定するステップを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記測定するステップは、前記被験体の脳の画像を取得するステップを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項７８】
前記特徴が前記海馬または視床下部の活動の変化が調節の成功に関連していないことを示すという入力を受け取ると、前記エネルギー印加装置を再配置するステップ、または焦点領域を変更するステップとをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記再配置するステップまたは前記変更するステップの後に、後続の１つ以上のエネルギーパルスを印加するステップと、前記特徴を測定するステップとを含む、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４１５，２１２号の優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【政府支援の表明】
【０００２】
本発明は、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）により授与された助成金番号Ｗ９１１ＮＦ‐０９‐１‐０１２５の下で政府の支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に開示される主題は、神経調節に関し、より具体的には、エネルギー源から印加されるエネルギーを使用して生理学的反応を調節するための技術に関する。
【０００４】
神経調節は、様々な臨床状態を治療するために使用されてきた。例えば、脊髄に沿った様々な場所での電気刺激は、慢性的な背中の痛みを治療するために使用されてきた。そのような治療は、特定の神経線維を活性化させるために組織に印加される電気エネルギーを周期的に発生させる埋め込み型装置によって実行されてもよく、その結果として痛みの感覚の減少をもたらすことができる。脊髄刺激の場合、刺激電極は一般に硬膜外腔に配置されるが、パルス発生器は電極から幾分離れて、例えば腹部または臀部領域に配置することができ、ただし導線を介して電極に接続される。他の実装形態では、深部脳刺激を使用して、脳の特定の領域を刺激して運動障害を治療することができ、刺激位置は神経画像処理によって案内され得る。そのような中枢神経系刺激は、一般に、局所神経または脳細胞機能を標的とし、電気パルスを送達し、かつ標的神経またはその近くに配置される電極によって媒介される。しかしながら、標的神経にまたはその近くに電極を配置することは困難である。例えば、そのような技術は、エネルギーを送達する電極の外科的配置を含み得る。さらに、神経調節を介した特定の組織標的化は困難である。特定の標的神経またはその近くに配置される電極は、神経線維内の活動電位を誘発することによって神経調節を媒介し、その結果として神経シナプスでの神経伝達物質放出および次の神経とのシナプス連絡をもたらす。このような伝播は、埋め込まれた電極の現在の実装形態が一度に多くの神経または軸索を刺激するため、望まれるよりも比較的大きいまたはより拡散した生理学的効果をもたらし得る。神経経路は複雑であり相互接続されているため、より標的化された調節効果がより臨床的に有用であり得る。
【発明の概要】
【０００５】
当初請求された主題と範囲が等しい特定の実施形態を以下に要約する。これらの実施形態は特許請求される主題の範囲を限定することを意図するものではなく、むしろこれらの実施形態は可能な実施形態の簡単な要約を提供することのみを意図するものである。実際に、本開示は、以下に記載される実施形態と同様であり得るかまたは異なり得る様々な形態を包含し得る。
【０００６】
一実施形態では、被験体の組織の対象領域にエネルギーを印加するように構成されたエネルギー印加装置を含むシステムが提供され、組織は、それぞれのニューロンの複数の軸索終末を含み、軸索終末は個々の軸索終末とそれぞれの非神経細胞との間にシナプス（例えば、軸索外細胞または他のシナプス型）を形成する。このシステムはまた、組織の対象領域を空間的に選択し、この対象領域は複数の軸索終末のサブセットと関連するシナプスのサブセットとを含み；対象領域にエネルギーを集束させ；関連するシナプスのサブセットの優先的活性化を誘導して目標とする生理学的結果を引き起こすためにエネルギー印加装置を介して対象領域へのエネルギーの印加を制御するように構成されたコントローラを含む。
【０００７】
別の実施形態では、エネルギー印加装置を臓器または末梢組織に向けるステップと、エネルギーを臓器または末梢組織の対象領域に集束させるステップであって、この対象領域は、神経細胞と非神経細胞との間にシナプスを含む末梢組織または臓器の小領域である、ステップと、目標とする生理学的結果を達成するために選択された種類のシナプスで神経細胞または非神経細胞の少なくとも一方にエネルギーを送達しそれによって活性を調節するために、エネルギー印加装置にパルス発生器を介してパルス電力を印加するステップとを含む方法が提供される。
【０００８】
別の実施形態では、エネルギー印加装置が組織を調節することができる位置にエネルギー印加装置を配置するステップと、エネルギー印加装置を組織内の対象領域に集束させるステップと、１つ以上のエネルギーパルスに応答して１つ以上のエネルギーパルスを印加する前のベースライン活性に対して神経細胞と非神経細胞との間のシナプスにおける活性を変化させるために対象領域内に１つ以上のエネルギーパルスを印加するステップとを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、図面を通して同じ文字が同じ部分を表す添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されよう。
【００１０】
【図１】本開示の実施形態によるパルス発生器を用いた神経調節システムの概略図である。
【００１１】
【図２】本開示の実施形態による神経調節システムのブロック図である。
【００１２】
【図３】本開示の実施形態による、動作中の超音波エネルギー印加装置の概略図である。
【００１３】
【図４】本開示の実施形態による、脾臓内の対象領域に焦点を合わせるために空間情報として使用することができる脾臓の超音波視覚化図である。
【００１４】
【図５】本開示の実施形態による神経調節技術のフロー図である。
【００１５】
【図６】体外装置として構成され、超音波トランスデューサを含むエネルギー印加装置の概略図である。
【００１６】
【図７】高密度集束超音波を印加するように構成されたエネルギー印加装置およびパルス発生器の概略図である。
【００１７】
【図８】図７のシステムと共に使用することができるエネルギー印加装置の一例である。
【００１８】
【図９】目標とする生理学的結果を達成するための超音波エネルギー印加用の実験設定の概略図である。
【００１９】
【図１０】超音波エネルギー印加の実験的タイムラインである。
【００２０】
【図１１】印加された超音波エネルギーパルスのパルス特性を示す図である。
【００２１】
【図１２】ハイドロフォン測定設定を示す図である。
【００２２】
【図１３】ｘ‐ｙ平面における超音波圧力場の一例を示す図である。
【００２３】
【図１４】炎症および／または高血糖症／高インスリン血症および超音波処置のモデルを生成するためのＬＰＳ注射の実験ワークフローを示す図である。
【００２４】
【図１５】ラットにおけるＴ１／ＤＷＩ画像の例をスライス毎の相互相関係数と共に示す図である。
【００２５】
【図１６】直接および対側膝窩リンパ節ならびに遠位腋窩リンパ節に対する標準電極刺激の結果を示す図である。
【００２６】
【図１７】超音波刺激後の直接刺激膝窩リンパ節に対する非刺激膝窩リンパ節におけるリンパ球数の比較の結果を示す図である。
【００２７】
【図１８】超音波刺激後のリンパ節解離組織中のノルエピネフリン、エピネフリン、およびドーパミンの濃度を示す図である。
【００２８】
【図１９】超音波刺激後の脾臓中のノルエピネフリン、エピネフリン、アセチルコリン、およびドーパミンの濃度を示す図である。
【００２９】
【図２０】ピーク超音波圧力に対するＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００３０】
【図２１Ａ】ピーク超音波圧力に対するノルエピネフリンの脾臓濃度を示す図である。
【００３１】
【図２１Ｂ】ピーク超音波圧力に対するアセチルコリンの脾臓濃度を示す図である。
【００３２】
【図２１Ｃ】ピーク超音波圧力に対するＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００３３】
【図２２】ピーク超音波圧力に対するＴＮＦ‐αの循環濃度を示す図である。
【００３４】
【図２３】刺激されていないがＬＰＳ処置された動物の対照群と比較した、刺激されＬＰＳ処置された動物の群についての肝臓中のＴＮＦ‐αの濃度を示す図である。
【００３５】
【図２４】治療部位における超音波処置の異なる時間平均強度について、対照と比較したサイトカイン変化を示す表である。
【００３６】
【図２５】脾臓の超音波処置の異なるピーク圧力について、ＬＰＳ処置対照と比較した二次メッセンジャー分子のリン酸化状態の百分率変化を示す図である。
【００３７】
【図２６】経路遮断処置の状況における、刺激されたＬＰＳ処置動物群についてのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００３８】
【図２７】経路遮断処置の状況における、刺激されたＬＰＳ処置動物群についてのノルエピネフリンの脾臓濃度を示す図である。
【００３９】
【図２８】迷走神経切断または経路遮断で処置した動物と比較した、刺激したＬＰＳ処置動物群についてのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００４０】
【図２９】ＬＰＳ処置と組み合わせた超音波処置後の様々な時点でのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００４１】
【図３０】超音波処置後のＬＰＳ処置についての実験的タイムラインである。
【００４２】
【図３１】図３０のタイムラインに従った、超音波およびＬＰＳ処置後の様々な時点でのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００４３】
【図３２】非侵襲的超音波刺激動物対電極刺激動物のＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図である。
【００４４】
【図３３】図３５Ａおよび図３５Ｂの超音波処置について対象領域および超音波配置を識別するために使用される超音波画像である。
【００４５】
【図３４】制御電気刺激実験設定を示す図である。
【００４６】
【図３５Ａ】ＬＰＳ処置の状況における、非侵襲的超音波刺激動物対電極刺激対照動物のＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す図であり、電極刺激は図３４の設定に従って行われた。
【００４７】
【図３５Ｂ】ＬＰＳ処置の状況における、非侵襲的超音波刺激動物対電極刺激対照動物の循環グルコース濃度を示す図であり、電極刺激は図３４の設定に従って行われた。
【００４８】
【図３６】非刺激動物と比較した、心拍数に対するＶＮＳ電極刺激対超音波脾臓神経調節の効果を示す図である。
【００４９】
【図３７Ａ】対照と比較した、血糖に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す図である。
【００５０】
【図３７Ｂ】様々な分子の肝臓濃度に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す図である。
【００５１】
【図３７Ｃ】様々な分子の肝臓濃度に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す図である。
【００５２】
【図３８Ａ】様々な分子の脳内濃度に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す図である。
【００５３】
【図３８Ｂ】様々な分子の脳内濃度に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す図である。
【００５４】
【図３８Ｃ】様々な分子の脳内濃度に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す図である。
【００５５】
【図３９Ａ】グルコース濃度に対する様々な位置での超音波肝調節の効果を示す図である。
【００５６】
【図３９Ｂ】図３９Ａの対象領域の調節位置を示す図である。
【００５７】
【図４０】ＬＰＳ処置動物における脾臓超音波刺激が肝臓で見られる効果をもたらさないことを示す図である。
【００５８】
【図４１Ａ】対照対ＬＰＳ処置動物刺激動物における視床下部ＮＰＹ濃度を示す図である。
【００５９】
【図４１Ｂ】対照対ＬＰＳ処置刺激動物における視床下部ＰＯＭＣ濃度を示す図である。
【００６０】
【図４２Ａ】非刺激ＬＰＳ偽動物からの冠状切片を示す図である。
【００６１】
【図４２Ｂ】刺激ＬＰＳ処置動物からの冠状切片を示す図である。
【００６２】
【図４３】刺激ＬＰＳ処置動物からのＤｆＭＲＩデータを示す図である。
【００６３】
【図４４】非刺激ＬＰＳ偽動物からのＤｆＭＲＩデータを示す図である。
【００６４】
【図４５Ａ】対照海馬におけるｃＦＯＳおよびＧｌｕｔ１染色を示す図である。
【００６５】
【図４５Ｂ】刺激海馬におけるｃＦＯＳおよびＧｌｕｔ１染色を示す図である。
【００６６】
【図４５Ｃ】図４５Ｂの画像に対する図４５Ａの画像の蛍光染色ＲＦＵを示す図である。
【００６７】
【図４６】経路遮断薬で処置したＬＰＳ処置動物における肝臓での刺激後の海馬ノルエピネフリンを示す図である。
【００６８】
【図４７】ＬＰＳ処置動物における糖尿病薬標的に対するアゴニストで処置後の海馬ノルエピネフリンを示す図である。
【００６９】
【図４８】基準超音波信号で追跡した組織変位を示す図である。
【００７０】
【図４９】脾臓刺激部位から得られたせん断波測定を示す図である。
【００７１】
【図５０】脾臓刺激部位から得られた変位測定値を示す図である。
【００７２】
【図５１】低減された超音波臨床効力で処置した動物における脾臓ノルエピネフリン濃度を示す図である。
【００７３】
【図５２】低減された超音波臨床効力で処置した動物における脾臓ＴＮＦ‐α濃度を示す図である。
【００７４】
【図５３】低減された超音波臨床効力で処置した動物における血中ノルエピネフリン濃度を示す図である。
【００７５】
【図５４】低減された超音波臨床効力で処置した動物における血中ＴＮＦ‐α濃度を示す図である。
【００７６】
【図５５】修正パルスシーケンスで処置した動物における脾臓ＴＮＦ‐α濃度を示す図である。
【００７７】
【図５６】修正パルスシーケンスで処置した動物における脾臓ノルエピネフリン濃度を示す図である。
【００７８】
【図５７】修正パルスシーケンスで処置した動物における血中ＴＮＦ‐α濃度を示す図である。
【００７９】
【図５８】修正パルスシーケンスで処置した動物における血中ノルエピネフリン濃度を示す図である。
【００８０】
【図５９】脾臓の直接機械的振動後の対照と比較した脾臓ノルエピネフリン濃度を示す図である。
【００８１】
【図６０】脾臓の直接機械的振動後の対照と比較した脾臓ＴＮＦ‐α濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
１つ以上の特定の実施形態を以下に説明する。これらの実施形態の簡潔な説明を提供するための努力において、実際の実装形態の全ての特徴が本明細書に記載されているわけではない。当然のことながら、そのような実際の実装形態の開発においては、エンジニアリングまたは設計プロジェクトの場合と同様に、システム関連およびビジネス関連の制約の遵守など、開発者固有の目標を達成するために実装形態固有の多数の決定がなされなければならず、それは実装形態毎に異なる。さらに、そのような開発努力は複雑で時間がかかる可能性があるが、それにもかかわらず、本開示の恩恵を受ける当業者にとっては設計、製作、および製造の日常的な仕事であることを理解されたい。
【００８３】
本明細書に示されるいかなる実施例または例示も、それに利用されるいずれかの用語に対する制約、制限、またはその定義を表すものとして決して見なされるべきではない。代わりに、これらの実施例または例示は、様々な特定の実施形態に関して説明されていると見なされるべきであり、単に例示として見なされるべきである。当業者は、これらの実施例または例示に利用される用語は、それと共にまたは明細書の他の場所に与えられても与えられなくてもよい他の実施形態を包含し、全てのそのような実施形態はその用語の範囲内に含まれるように意図されることを認識するであろう。そのような非限定的な実施例および例示を指定する言葉は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｆｏｒ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など」、「例えば（ｅ．ｇ．）」、「含む」、および「一実施形態では」を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
本技法は、エネルギー源によるエネルギーの印加を介した組織内の軸索終末におけるシナプスの調節に関する。例えば、これは、シナプス前軸索終末とシナプス後非神経細胞との間に形成された軸索外細胞シナプスを含み得る。さらに、開示される特定の実施形態は軸索外細胞シナプスの文脈で論じられているが、軸索終末は軸索分泌性、軸索シナプス性、軸索細胞体間または軸索外細胞シナプスを形成する場合があり、加えて、またはその代わりに、これらのシナプス型は本明細書で提供されるように選択的に調節されているものとして企図されることを理解されたい。さらに、特定の軸索終末は間質液中または体液中で終結することがあり、調節の結果として神経伝達物質の放出も発生し得る。開示されているシナプスは、シナプス内の活性、例えばシナプス前軸索終末からの神経伝達物質の放出を変化させるように調節することができる。言い換えると、変化した活性は、局所的効果および／または非局所的（例えば、全身的）効果をもたらすことができる。本技術は、所望の結果を達成するために標的軸索終末を優先的に直接活性化するために特定の軸索終末を含む組織の体積にエネルギーを標的化する方法で集束させることを可能にする。このようにして、対象領域内の標的軸索終末は活性化されるが、特定の実施形態では、同じ臓器または組織構造内にあるが対象領域の外側にある軸索終末は活性化されない。臓器および組織構造は、異なる種類のシナプス後非神経細胞とシナプスを形成する異なる種類の軸索終末を含み得るため、活性化されると所望の目標とする生理学的結果を生じる軸索終末を含む対象領域が選択され得る。したがって、調節は、シナプス前ニューロン型、シナプス後細胞型、またはその両方に基づいて特定の種類の軸索終末を標的とすることができる。
【００８５】
例えば、一実施形態では、軸索終末の種類は、内在性（すなわち、組織内在性または非循環性）免疫細胞と軸索外細胞シナプスを形成する軸索終末であり得る。すなわち、軸索外細胞シナプスは、軸索終末と非神経細胞または間質液もしくは体液との間の接合部に形成される。したがって、エネルギーの印加は、対象領域における免疫機能の調節をもたらす。しかしながら、軸索終末型の集団および軸索外細胞シナプスのシナプス前ニューロン型およびシナプス後細胞（例えば、免疫細胞、リンパ球、粘膜細胞、筋肉細胞など）の特徴に基づいて、異なる目標とする生理学的効果が達成され得ることを理解されたい。したがって、被験体の組織内の対象領域にエネルギーを印加することは、対象領域内の軸索終末およびそれらに関連する軸索外細胞シナプスを活性化し得るが、対象領域の外側の非標的軸索終末（および関連シナプス）は影響を受けないであろう。しかしながら、調節は全身的効果をもたらし得るため、対象領域の外側の非標的軸索終末には、対象領域内の軸索終末の活性化の結果としてある一定の全身的変化が発生し得る。本明細書で記載される場合、優先的活性化または直接活性化は、対象領域内でエネルギーの直接印加を経験する細胞または構造を指すことがある。すなわち、軸索終末、軸索外細胞シナプス、および／またはシナプス後非神経細胞、あるいは本明細書で提供されるような印加エネルギーを直接経験する間質液もしくは体液である。
【００８６】
ヒトの神経系は、脳と脊髄の中枢、そして体の様々な神経内に末梢性に見出される神経細胞、つまりニューロンの複雑なネットワークである。ニューロンは細胞体、樹状突起および軸索を有する。神経は、体の特定の部分に作用するニューロンの群である。神経は、数百のニューロンから数十万のニューロンを含み得る。神経は、求心性ニューロンと遠心性ニューロンの両方を含むことが多い。求心性ニューロンは中枢神経系にシグナルを運び、遠心性ニューロンは末梢にシグナルを運ぶ。ある場所にある神経細胞体群は、神経節として知られている。（例えば、内因性または外部から印加され得る刺激を介して）神経内で生成された電気信号は、ニューロンおよび神経を介して伝導される。ニューロンは、電気信号の継続および調節を可能にするために、受容細胞に隣接するシナプス（接続部）で神経伝達物質を放出する。末梢では、シナプス伝達はしばしば神経節で起こる。
【００８７】
ニューロンの電気信号は活動電位として知られている。細胞膜を横切る電位が特定の閾値を超えると活動電位が開始される。この活動電位は、次にニューロンの長さに沿って伝播される。神経の活動電位は複雑であり、その中の個々のニューロンの活動電位の合計を表す。ニューロンの軸索終末と受容細胞との間の接合部はシナプスと呼ばれる。活動電位は、ニューロンの軸索を下ってその軸索終末、すなわちシナプス前端部を形成する軸索神経の分岐の遠位末端部、または神経線維のシナプス瘤へと移動する。活動電位の電気的インパルスは、シナプス前軸索終末のシナプス前膜への神経伝達物質を含む小胞の遊走を誘発し、最終的にはシナプス間隙（例えばシナプス前細胞とシナプス後細胞との間に形成される空間）または軸索外細胞空間への神経伝達物質の放出を誘発する。活動電位の電気信号を神経伝達物質放出の化学信号に変換するためにシナプス瘤に達するシナプスは、化学シナプスである。化学シナプスは、シナプス前軸索終末に流れ込むイオン電流が２つの細胞膜の障壁を越えてシナプス後細胞に進入することができる電気シナプスとは対照的であり得る。
【００８８】
活動電位の生理学的効果は、細胞膜を横切るイオンの移動によって媒介される。ニューロンは、ニューロン膜を通るＮａ＋、Ｋ＋、およびＣｌ‐などのイオンの移動を容易にするイオンポンプを介して静止膜電位を能動的に維持する。異なる種類のニューロンは、異なる静止電位、例えば‐７５ｍＶから‐５５ｍＶを維持し得る。活動電位は、イオンの流入、すなわち、膜を横切る電圧の一時的な上昇（例えば、３０〜６０ｍＶの範囲内の膜電位への上昇）に関連する膜電位の大きな偏差を生じる電荷の移動によって発生する。個々のニューロンにおける活動電位は、シナプス前（例えば上流）ニューロンからの神経伝達物質の放出に応答して開始され得、その結果としてシナプス後細胞における受容体結合、ならびにイオンの流入および神経を介して伝播される活動電位をもたらす膜脱分極につながる事象のカスケードをもたらす。
【００８９】
シナプスは２つのニューロン間の接合部に位置することがあり、それによって活動電位が神経線維を伝って伝播することが可能になる。しかしながら、軸索終末は、神経細胞と非神経細胞との間の接合部でシナプスを形成することもあり、または間質液もしくは体液で終結することもある。シナプス型の例には、神経免疫接合部に免疫細胞を有するシナプス、臓器内に存在する感覚細胞を有するシナプス、または腺細胞を有するシナプスが挙げられる。シナプス間隙への神経伝達物質の放出およびシナプス後細胞のシナプス後膜における受容体への結合は、シナプス前ニューロンの性質および放出された特定の神経伝達物質ならびにシナプス後細胞の性質（例えばシナプス後細胞の利用可能な受容体の種類）に依存する下流効果をもたらす。さらに、活動電位は興奮性または抑制性であり得る。興奮性シナプス後活動電位はシナプス後ニューロンが次の活動電位を発射または放出する可能性をより高くするシナプス後電位であり、抑制性シナプス後活動電位はシナプス後ニューロンが次の活動電位を発射または放出しにくくするシナプス後電位である。さらに、いくつかのニューロンが協調して下流の活動電位を誘発するかまたは下流の活動電位を阻害する神経伝達物質を放出することがある。
【００９０】
神経調節は、外部エネルギー源からのエネルギーが神経系の特定の領域に印加されて神経または神経機能を活性化または増大させ、かつ／または神経または神経機能を遮断または減少させる技術である。特定の神経調節技術では、１つ以上の電極を標的神経にまたはその近くに印加し、エネルギーの印加が神経を通して（例えば活動電位として）運ばれて、エネルギー印加部位の下流の領域に生理学的応答を引き起こす。しかしながら、神経系は複雑であるため、所与のエネルギー印加部位についての生理学的反応の範囲および最終的な終点を予測することは困難である。
【００９１】
中枢神経系（すなわち、脳組織）の超音波調節のための戦略は神経活動の調節の成功を実証したが、末梢神経を調節する試みは遅れている。例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の超音波調節は、シナプス構造が豊富である脳の皮質領域の刺激を含み、一方、末梢神経の超音波刺激の試みは、シナプス構造がそれほど多くないまたは欠けている神経幹を標的とする。本技術において、末梢神経の調節は、１つ以上の末梢軸索終末を標的とすることを含む。さらに、刺激が神経生成活動電位の伝播をもたらす末梢組織における伝統的なニューロン‐ニューロンシナプスを標的とする代わりに、本技術では、軸索外細胞シナプス、または例えば神経免疫シナプスにおける他の細胞型、間質液、または体液とのニューロン接合部を含む軸索終末を含む被験体の内部組織に１つ以上のエネルギーパルスを印加し、ここで、軸索終末の刺激は、神経伝達物質／神経ペプチドを放出するか、または免疫細胞または他の細胞などの隣接非神経細胞の近傍で変化した神経伝達物質の放出を誘導し、細胞活性を調節する。さらに、そのような調節を介して、直接の刺激なしに他の組織構造または臓器の調節を達成することができる。一実施形態では、臓器の比較的小さい領域（例えば、全臓器体積の２５％未満の体積）への直接的なエネルギー印加は、脳の異なる領域（例えば視床下部）に突出する求心性突出ニューロンにおける活動電位の刺激をもたらし得る。しかしながら、この結果は、シナプスに富む領域の直接的な脳刺激なしに達成され得る。直接的な脳刺激は、所望の生理学的結果を妨害し、またはそれを圧倒し得る他の経路の望ましくない活性化をもたらすことがある。したがって、本技法は、直接的な脳刺激または電気的末梢神経刺激よりもより標的化されかつより特異的な方法で、脳活動または臓器内活動のいずれかの粒状活性化を可能にする。
【００９２】
本技法の利点には、局所的および／または全身的効果を達成するための組織の対象領域における局所的調節が含まれる。さらに、局所的調節は、これらの効果を達成するために、組織の比較的小さい領域（例えば、全組織体積の２５％未満）の直接的な活性化を含み得る。このようにして、所望の生理学的結果を達成するために、合計の印加エネルギーは比較的小さい。特定の実施形態では、印加エネルギーは、非侵襲体外エネルギー源（例えば超音波エネルギー源）からのものであり得る。例えば、集束エネルギープローブは、被験体の皮膚を通してエネルギーを印加することができ、内部組織の対象領域に焦点を合わせる。そのような実施形態は、侵襲的処置なしに、または他の種類の処置もしくは治療に関連し得る副作用なしに所望の生理学的結果を達成する。
【００９３】
開示されている技術の局所調節は、電極を介した電気刺激などの他の調節技術と比較して実証された。例えば、全身性炎症を調節する神経経路の刺激は、代謝制御に関与する経路の標的外刺激なしに示された（末梢神経に対する以前の電気刺激実験はこれらの標的外効果を切り離すことができなかった）。さらに、本技法は、局所的および全身的の両方の、臨床的に有用な様々な生理学的結果を誘導することが実証された。
【００９４】
本明細書で提供されるのは、エネルギー印加の焦点部位、例えば軸索終末で放出される神経伝達物質が、活動電位に応答してではなく、エネルギーの印加に応答して誘発されるような方法で、エネルギー源（例えば、外部または体外エネルギー源）からのエネルギーが軸索終末に印加される神経調節のための技術である。すなわち、軸索終末への直接のエネルギーの印加が活動電位の代わりに作用して、神経免疫接合部または非神経細胞との他のニューロン接合部への神経伝達物質の放出を促進する。軸索終末への直接的なエネルギーの印加はさらに、軸索外細胞シナプス内の軸索終末から隣接する非神経細胞の近傍への変化した神経伝達物質放出を誘導する。一実施形態では、エネルギー源は、超音波エネルギー源または機械的振動子などの体外エネルギー源である。このようにして、非侵襲的で標的化された神経調節は、上流部位での調節を介しそれが次に下流の標的を活性化する活動電位を誘発するのではなく、エネルギー焦点の部位で直接達成することができる。
【００９５】
本技術は、任意の神経免疫界面（例えば、軸索終末と免疫細胞との間の接合部またはシナプス）の調節に加えて、リンパ節神経調節またはリンパ球滞留神経免疫反射の調節と共に使用され得る。さらに、例えばニューロンとの接合部の一部ではない免疫細胞など、免疫細胞自体の直接的な調節も企図される。本開示の特定の実施形態は神経免疫調節の状況で提示されているが、開示されている技術は他の標的組織および他の種類の非神経細胞と共に使用されてもよいことを理解されたい。本明細書で記載される場合、非神経細胞は免疫細胞、内皮細胞、分泌細胞などを含み得る。
【００９６】
特定の実施形態では、標的組織は、電気刺激技術を用いてアクセスすることが困難である内部組織または臓器である。他の企図される組織標的としては、胃腸組織（胃、腸）、筋肉組織（心臓、平滑および骨格）、上皮組織（表皮、臓器／胃腸内層）、結合組織、腺組織（外分泌／内分泌）などが挙げられる。一例では、神経筋接合部でのエネルギーの集中的な印加は、上流の活動電位なしに神経筋接合部での神経伝達物質放出を促進する。企図される調節標的は、マクロファージからのＴＮＦ‐α放出を制御することに関与する脾臓の一部、ドーパミン放出を制御するための副腎内の部位、または腸内の炎症およびマクロファージ機能を制御する腸間膜叢内の局所部位を含み得る。さらに、抗体産生またはリンパ球の機能状態を制御し得る神経免疫界面が超音波エネルギーを介して調節され得る。
【００９７】
そのために、開示されている神経調節技術は、神経調節システムと共に使用されてもよい。図１は、エネルギーの印加に応答して神経伝達物質の放出を達成し、および／または軸索外細胞シナプス内の成分を活性化するための、神経調節のためのシステム１０の概略図である。図示のシステムは、エネルギー印加装置１２（例えば超音波トランスデューサ）に結合されたパルス発生器１４を含む。エネルギー印加装置１２は、例えば導線または無線接続を介して、エネルギーパルスを受信するように構成されており、使用時には被験体の内部組織または臓器の対象領域に向けられ、その結果、目標とする生理学的結果がもたらされる。特定の実施形態では、パルス発生器１４および／またはエネルギー印加装置１２は生体適合性部位（例えば腹部）に埋め込まれてもよく、１つまたは複数の導線はエネルギー印加装置１２とパルス発生器１４とを内部で結合する。例えば、エネルギー印加装置１２は、容量性マイクロマシン超音波トランスデューサなどのＭＥＭＳトランスデューサであってもよい。
【００９８】
特定の実施形態では、エネルギー印加装置１２および／またはパルス発生器１４は、例えばパルス発生器１４に命令を順番に提供することができるコントローラ１６と、無線で通信することができる。他の実施形態では、パルス発生器１４は体外装置であってもよく、例えば、被験体の体外の位置から経皮的または非侵襲的にエネルギーを印加するように動作させることができ、また特定の実施形態ではコントローラ１６内に統合することができる。パルス発生器１４が体外である実施形態では、エネルギー印加装置１２は、介護者によって操作され、エネルギーパルスが所望の内部組織に経皮的に送達されるように被験体の皮膚の上または上方の箇所に配置され得る。所望の部位にエネルギーパルスを印加するように配置されると、システム１０は、目標とする生理学的結果または臨床効果を達成するために神経調節を開始することができる。
【００９９】
特定の実施形態では、システム１０は評価装置２０を含んでもよく、評価装置２０は、コントローラ１６に結合され、調節の目標となる生理学的結果が達成されたかどうかを示す特徴を評価する。一実施形態では、目標とする生理学的結果は局所的であり得る。例えば、調節は、組織構造の変化、特定の分子の濃度の局所的な上昇、組織の変位、および流体の動きの増加などの局所的な組織または機能の変化をもたらし得る。調節は、全身的または非局所的変化をもたらす可能性があり、目標とする生理学的結果は、循環する分子の濃度の変化、またはエネルギーが直接印加された対象領域を含まない組織の特徴の変化に関連し得る。一例では、変位は、調節の成功のための代理測定値であり得、期待される変位値未満の変位測定値は、期待される変位値が観察されるまで調節パラメータの修正をもたらすことができる。
【０１００】
エネルギーが神経免疫接合部に印加される実施形態では、調節はまた、免疫細胞の集団の変化、またはリンパ組織内の化合物の存在もしくは濃度の変化など、免疫機能の変化をもたらすことができる。評価に基づいて、コントローラ１６の調節パラメータを変更することができる。例えば、成功した調節が、処置の開始と比較した規定の時間枠内（例えば、処置開始後５分、３０分）でのノルエピネフリンまたは腫瘍壊死因子濃度の減少に関連している場合、頻度または他のパラメータの変更が望まれる場合があり、これは、パルス発生器１４のエネルギーパルスを規定または調整するために操作者によってコントローラ１６に提供されてもよい。
【０１０１】
本明細書で提供されるシステム１０は、様々な調節パラメータに従ってエネルギーパルスを供給することができる。例えば、調節パラメータは、連続的なものから断続的なものまでの範囲の様々な刺激時間パターンを含み得る。断続的な刺激では、信号オン時間の間にエネルギーが一定の周波数で一定期間供給される。信号オン時間の後には、信号オフ時間と呼ばれる、エネルギー供給がない期間が続く。調節パラメータはまた、刺激印加の頻度および持続時間を含み得る。印加頻度は連続的であってもよく、または例えば１日以内または１週間以内の様々な期間に送達されてもよい。治療の持続時間は、数分から数時間までを含むがこれらに限定されない様々な期間にわたって持続し得る。特定の実施形態では、指定された刺激パターンを用いた治療の持続時間は１時間続き、例えば７２時間間隔で繰り返されてもよい。特定の実施形態では、治療は、より高い頻度、例えば３時間毎に、より短い持続時間で、例えば３０分間送達され得る。治療の持続時間および頻度は、所望の結果を達成するために調節可能に制御され得る。
【０１０２】
図２は、システム１０の特定の構成要素のブロック図である。本明細書で提供されるように、神経調節のためのシステム１０は、被験体の組織に印加するために複数のエネルギーパルスを発生させるように適合されているパルス発生器１４を含み得る。パルス発生器１４は別個でもよく、またはコントローラ１６などの外部装置に統合されてもよい。コントローラ１６は、装置を制御するためのプロセッサ３０を含む。ソフトウェアコードまたは命令は、コントローラ１６のメモリ３２に記憶され、プロセッサ３０によって実行されて装置の様々な構成要素を制御する。コントローラ１６および／またはパルス発生器１４は、１つ以上の導線３３を介してエネルギー印加装置１２に接続することができる。
【０１０３】
コントローラ１６はまた、臨床医が選択入力または調節パラメータを調節プログラムに提供することを可能にするように適合された入出力回路３４およびディスプレイ３６を有するユーザインターフェースを含む。各調節プログラムは、パルス振幅、パルス幅、パルス周波数などを含む１組以上の調節パラメータを含むことができる。パルス発生器１４は、制御装置１６からの制御信号に応答してその内部パラメータを修正して、導線３３を介して被験体に伝達されるエネルギーパルスの刺激特性を変える。定電流、定電圧、多重独立電流または電圧源などを含む任意の適切な種類のパルス発生回路を使用することができる。印加されるエネルギーは、電流振幅とパルス幅持続時間の関数である。
【０１０４】
一実施形態では、メモリ３２は、操作者によって選択可能な異なる動作モードを記憶する。例えば、記憶された動作モードは、特定の治療部位に関連した一組の調節パラメータを実行するための命令を含み得る。部位が異なれば、関連付けられている調節パラメータも異なり得る。操作者に手動でモードを入力させるのではなく、コントローラ１６は、選択に基づいて適切な命令を実行するように構成されてもよい。別の実施形態では、メモリ３２は異なる種類の治療のための動作モードを記憶する。例えば、活性化は、組織機能の低下または遮断に関連するものに対して異なる刺激圧力または周波数範囲に関連し得る。具体例では、エネルギー印加装置が超音波トランスデューサである場合、時間平均電力およびピーク陽圧は、１ｍＷ／ｃｍ２〜３０，０００ｍＷ／ｃｍ２および０．１ＭＰａ〜７ＭＰａの範囲内である。別の特定の例では、エネルギー印加装置が機械的アクチュエータである場合、振動の振幅は０．１〜１０ｍｍの範囲内である。選択された周波数は、エネルギー印加のモード、例えば超音波または機械的アクチュエータに依存し得る。
【０１０５】
別の実施形態では、メモリ３２は、所望の結果を達成するために調節パラメータの調整または修正を可能にする較正または設定モードを記憶する。一例では、刺激は、より低いエネルギーパラメータで始まり、自動的にまたは操作者入力の受信時に徐々に増加する。このようにして、操作者は、調節パラメータが変更されているときの効果を観察することができる。
【０１０６】
システムはまた、エネルギー印加装置１２の集束を容易にする撮像装置を含むことができる。一実施形態では、撮像装置は、異なる超音波パラメータ（周波数、開口、またはエネルギー）が標的化およびその後の神経調節のために印加されるように、エネルギー印加装置１２と一体化されてもよく、またはエネルギー印加装置１２と同じ装置でもよい。別の実施形態では、メモリ３２は、臓器または組織構造内の対象領域を空間的に選択するために使用されるターゲティングモードまたはフォーカシングモードを記憶する。例えば、エネルギー印加装置１２は、対象領域を識別するために使用される画像データを取込むために使用されるエネルギーを印加するために、最初にターゲティングモードで動作するように構成されてもよい。ターゲティングモードのエネルギーは、優先的活性化に適した調節パラメータが適用されていない、および／またはそのレベルではない。しかしながら、一旦対象領域が識別されると、コントローラ１６は優先的活性化に関連する調節パラメータに従って治療モードで動作することができる。
【０１０７】
コントローラ１６はまた、調節パラメータの選択への入力として、目標とする生理学的結果に関する入力を受け取るように構成されてもよい。例えば、撮像モダリティが組織の特徴を評価するために使用される場合、コントローラ１６は、特徴の計算された指数またはパラメータを受け取るように構成されてもよい。指数またはパラメータが閾値を上回るか下回るかに基づいて、調節パラメータを修正することができる。一実施形態では、パラメータは罹患組織の組織変位の尺度または罹患組織の深さの尺度であり得る。さらに、エネルギー印加装置１２（例えば、超音波トランスデューサ）は、コントローラ１６の制御下で動作して、ａ）標的組織内の対象領域を空間的に選択するために画像データを取得する、ｂ）対象領域に調節エネルギーを印加する、およびｃ）（例えば、変位測定によって）目標とする生理学的結果が生じたことを決定するために画像を取得する。そのような実施形態では、撮像装置、評価装置２０およびエネルギー印加装置１２は同じ装置であり得る。
【０１０８】
別の実装形態では、成功した調節パラメータセットもコントローラ１６によって記憶することができる。このようにして、被験体特有のパラメータを決定することができる。さらに、そのようなパラメータの有効性を経時的に評価することができる。特定のパラメータのセットが経時的にあまり効果的ではない場合、被験体は活性化経路に対して感受性の欠如を発生している可能性がある。システム１０が評価装置２０を含む場合、評価装置はコントローラ１６にフィードバックを提供してもよい。特定の実施形態では、フィードバックは、目標とする生理学的結果の特徴を示すユーザまたは評価装置２０から受け取ることができる。コントローラ１６は、エネルギー印加装置に調節パラメータに従ってエネルギーを印加させ、フィードバックに基づいて調節パラメータを動的に変化させるように構成することができる。例えば、フィードバックに基づいて、プロセッサ１６は、調節パラメータ（例えば、超音波ビームまたは機械的振動の周波数、振幅、またはパルス幅）を自動的に変更することができる。
【０１０９】
図３は、エネルギー印加装置１２が、例として脾臓として示されている標的組織にエネルギーを印加することができる超音波トランスデューサ４２を含む、特定の例である。エネルギー印加装置１２は、超音波トランスデューサ４２を制御するための制御回路を含み得る。超音波トランスデューサ４２はまた、印加されたエネルギーを所望の標的位置に集束させるのを助けるために画像データを取得するように構成され得る。
【０１１０】
所望の標的組織４３は、シナプス空間４９に放出するために標的組織４３の対象領域４４に集束された超音波トランスデューサ４２の焦点領域内で軸索終末にエネルギーを直接印加することによって刺激され得る軸索終末４６のシナプスと非神経細胞４８とを含む、内部組織または臓器であり得る。図示の実施形態では、軸索終末４６は免疫細胞とシナプスを形成し、神経伝達物質の放出は、マクロファージまたは他の内在するもしくは遊走する免疫細胞の活性化などの下流効果を引き起こす。対象領域は、特定のニューロン型の軸索終末４６および／または特定の種類の非神経細胞４８（例えば、図示のような脾臓Ｔ細胞）を有するシナプスを形成するものなど、特定の種類の軸索終末４６（例えば、図示のような白色脾髄内の脾臓軸索）を含むように選択することができる。したがって、対象領域４４は、所望の軸索終末４６（および関連する非神経細胞４８）を有する標的組織４３の一部に対応するように選択され得る。エネルギーの印加は、シナプス内の神経からのニューロン伝達物質の放出を優先的に引き出すか、または直接的なエネルギー伝達（すなわち、非神経細胞内のメカノトランスダクションまたは電位活性化タンパク質）を介して非神経細胞自体を直接活性化させるか、または所望の生理学的効果を引き出す神経細胞および非神経細胞の両方の中で活性化を引き起こすように選択することができる。図示の例では、対象領域は脾臓神経から延出する神経支配された赤色および／または白色の脾髄組織を含む。本明細書で記載される場合、脾臓の刺激または調節は、神経支配された白色脾髄組織を含む対象領域４４の調節を指すことがある。
【０１１１】
エネルギーは、対象領域４４、および内部組織４３の一部のみ、例えば組織４３の総体積の約５０％未満、約２５％未満、約１０％未満、または約５％未満に集束または実質的に集中させることができる。一実施形態では、標的組織４３内の２つ以上の対象領域４４にエネルギーを印加することができ、対象領域４４の総体積は、組織４３の総体積の約９０％未満、約５０％未満、約２５％未満、約１０％未満、または約５％未満であり得る。一実施形態では、エネルギーは、組織４３の総体積の約１％〜５０％のみ、組織４３の総体積の約１％〜２５％のみ、組織４３の総体積の約１％〜１０％のみ、または組織４３の総体積の約１％〜５％のみに印加される。特定の実施形態では、標的組織４３の対象領域４４内の軸索終末４６のみが直接エネルギーを受け取り、神経伝達物質を放出するが、対象領域４４の外側の刺激されていない軸索終末は実質的なエネルギーを受け取らず、したがって同様に活性化／刺激されない。いくつかの実施形態では、エネルギーを直接受け取る組織の部分の軸索終末４６は、変更された神経伝達物質放出を誘導するであろう。このようにして、組織区画は、粒状に神経調節の標的となり得る。いくつかの実施形態では、エネルギー印加パラメータは、エネルギーを直接受け取る組織内の神経成分または非神経成分のいずれかの優先的活性化を誘導して、所望の複合生理学的効果を誘導するように選択することができる。特定の実施形態では、エネルギーを約２５ｍｍ３未満の体積内に集束または集中させることができる。特定の実施形態では、エネルギーを約０．５ｍｍ３〜５０ｍｍ３の体積内に集束または集中させることができる。対象領域４４内にエネルギーを集束または集中させるための焦点体積および焦点深度は、エネルギー印加装置１２のサイズ／構成によって影響を受ける可能性がある。エネルギー印加の焦点体積は、エネルギー印加装置１２の焦点領域によって定義されてもよい。
【０１１２】
本明細書で提供されるように、エネルギーは、目標とする生理学的結果を達成するために標的化された方法でシナプスを優先的に活性化するために、対象領域４２のみに実質的に印加することができ、全体的または組織４３全体にわたる不特定なやり方では実質的に印加されない。したがって、組織４３内の複数の異なる種類の軸索終末４６のサブセットのみが直接的なエネルギー印加に曝される。図４は、脾臓の対象領域を選択するための空間情報として役立ち得る、脾臓内の血流（ドップラー超音波）の画像である。例えば、血管、神経、または他の解剖学的ランドマークのいずれかを含む臓器内の対象領域を選択し、特定の軸索終末およびシナプスを有する領域を識別するために使用することができる。一実施形態では、対象領域は、脾動脈を識別し、脾動脈に近いまたは平行な領域を空間的に選択することによって選択される。臓器構造は、典型的には、下位臓器組織機能、血管、および神経支配に基づいてセグメント化され、軸索終末のサブセットは、エネルギーが直接印加される対象領域に含まれるように選択され得る。他の軸索終末は対象領域の外側にあり、直接の印加エネルギーに曝されない。対象領域に含める個々の軸索終末は、履歴データまたは実験データに基づいてもよい（例えば、所望の目標とする生理学的結果に対する特定の位置の関連付けに基づく）。別の実施形態では、軸索終末およびそれらの隣接する組織または構造の位置は、優先的活性化のために軸索終末の全セットから個々の軸索終末を選択するために使用され得る。代替的または追加的に、システム１０は、所望の目標とする生理学的効果が達成されるまで、個々の軸索終末にエネルギーを印加してもよい。脾臓画像は単なる例示であることを理解されたい。視覚化された神経の空間情報を用いて対象領域に直接エネルギーを印加することによる優先的活性化のための軸索終末の開示された選択は、他の臓器または構造（例えば、肝臓、リンパ節）と共に使用することができる。
【０１１３】
開示された技術は神経調節効果の評価に使用することができ、ひいては神経調節パラメータを選択または修正するための入力またはフィードバックとして使用することができる。開示された技術は、目標とする生理学的結果として組織状態または機能の直接的な評価を使用することができる。評価は、神経調節の前（すなわちベースライン評価）、間、および／または後に起こり得る。例えば、リンパ排液の増加を必要とする被験体については、選択されたパラメータが排液の十分な増加を達成したかどうかを判定するために、神経調節の前、間および／または後にそのような排液を監視してもよい。したがって、リンパ排液は、リンパ排液を判定する１つ以上のインビボ技術によって評価することができる。一実施形態では、外因性造影剤は、リンパ組織内に直接投与されるか、または皮内注射を介して間接的に投与される。例えば、ガドリニウムベースの造影剤を使用することができる。所望の臨床結果に応じて、局所的または全身的な流れのいずれかに対処することができる。例えば、ＭＲリンパ管造影法を用いて四肢のリンパ排液を評価することができる。別の実施形態では、蛍光性微小リンパ管造影法（ＦＭＬ）もリンパ排液を評価するために使用され得る。ＦＭＬは、蛍光染料、デキストランに結合したＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ‐デキストラン）の皮内投与、および高解像度画像を取得するためのビデオ蛍光顕微鏡技術を使用する。さらに別の実施形態では、撮像は、ＬＹＶＥ‐１、Ｐｒｏｘ‐１、ポドプラニン、およびＶＥＧＦＲ３などの、リンパ特異的マーカーを標的とする染料または指標を含み得る。
【０１１４】
評価技法は、機能的磁気共鳴イメージング、拡散テンソル磁気共鳴イメージング、ポジティブエミッショントモグラフィ、または音響モニタリング、熱モニタリングのうちの少なくとも１つを含み得る。評価技術はまた、タンパク質および／またはマーカー濃度評価を含み得る。
【０１１５】
評価技術からの画像は、自動評価または手動評価のためにシステムによって受信してもよい。画像データに基づいて、調節パラメータも修正することができる。例えば、安定したバイタルサインおよび他の健康指標の存在下でリンパ排液が増加した場合、刺激は、所望の増加したリンパ排液を維持する最低エネルギーまでステップバックされてもよい。他の実施形態では、リンパ排液の変化を局所神経伝達物質濃度のマーカーとして利用し、局所免疫（免疫相互作用）細胞を表現型調節神経伝達物質に曝露するための代理マーカーとして、および免疫機能への予測効果のマーカーとして効果的に使用することができる。局所濃度は、エネルギー印加の焦点領域内の濃度を指すことがある。
【０１１６】
追加的または代替的に、システムはリンパ組織、リンパ液中または血液中の神経伝達物質または細胞の存在または濃度を評価することができる。リンパ液または組織は、細針吸引によって取得することができ、神経伝達物質（例えば、ペプチド伝達物質、カテコールアミン）の存在またはレベルの評価は、当業者に公知の任意の適切な技術によって実施することができる。
【０１１７】
別の実施形態では、リンパ節またはリンパ組織中の細胞の種類および／または数の変化は、リンパ組織機能の表示であり得る。細胞集団は、フローサイトメトリーなどのエクスビボ技術によって評価することができる。別の実施形態では、リンパ管細胞集団は、内因性造影剤を用いたレーザー走査型インビボ共焦点顕微鏡法（ＩＶＣＭ）によって評価することができる。
【０１１８】
他の実施形態では、目標とする生理学的結果は、組織変位、組織サイズの変化、１つ以上の分子の濃度の変化（局所的、非局所的、または循環的）、遺伝子の変化、またはマーカー発現、求心性活性、および細胞遊走などを含み得るがこれらに限定されない。
【０１１９】
図５は、標的組織の対象領域を刺激するための方法５０の流れ図である。この方法では、ステップ５４でエネルギーパルスが所望の対象領域に集束するようにエネルギー印加装置を配置し、ステップ５６でパルス発生器が標的組織に複数のエネルギーパルスを印加して、標的組織のシナプスのサブセットを作動させ、例えば、軸索終末を刺激して神経伝達物質を放出させる、および／または神経伝達物質放出の変更を誘導する、および／または（シナプス内の）非神経細胞において活動の変更を誘導して、ステップ５８で目標とする生理学的結果を引き起こす。特定の実施形態では、方法は刺激の効果を評価するステップを含み得る。例えば、組織機能または状態の状況の１つ以上の直接的または間接的な評価を使用することができる。評価した組織機能に基づいて、目標とする生理学的結果を達成するために１つ以上のエネルギーパルスの調節パラメータを（例えば、動的にまたは調整可能に制御して）修正することができる。
【０１２０】
一実施形態では、調節の結果としてのリンパ機能の変化を評価するために、調節の前後に評価を行うことができる。リンパ機能の評価された特徴の状態における所望の変化が閾値より上または下である場合、調節パラメータに適切な修正を加えることができる。例えば、閾値に対する特徴の変化がリンパ組織の活性化の成功と関連している場合、神経調節の間に印加されるエネルギーを、所望の結果を支持する最小レベルにステップバックすることができる。閾値に対する特徴の変化がリンパ組織の不十分な活性化に関連する場合、調節振幅または周波数、パルス形状、刺激パターン、および／または刺激場所を含むがこれらに限定されない特定の調節パラメータを変更することができる。特定の所望の臨床結果がその代わりに活性化の遮断と関連している可能性があることも理解されたい。そのような実施形態では、神経機能および／またはリンパ機能の低下の評価は、調節パラメータを維持することに関連しており、望ましくないレベルのリンパ活性が持続する場合は、調節パラメータを修正することができる。
【０１２１】
さらに、評価された特徴または状態は、値または指標、例えば、流速、濃度、細胞集団、またはそれらの任意の組み合わせであり得、それは次に適切な技術によって分析され得る。例えば、閾値を超える相対変化を用いて、調節パラメータが修正されているかどうかを判定することができる。調節の成功は、組織構造サイズ（例えば、リンパ節サイズ）の増加の有無、または放出分子の濃度の変化（例えば、神経調節前のベースライン濃度に対する）などの、測定された臨床結果によって評価することができる。一実施形態では、調節の成功は、閾値を超える濃度の上昇、例えばベースラインと比較して濃度の約５０％、１００％、２００％、４００％、１０００％の上昇を含み得る。遮断治療では、評価は、経時的な分子濃度の減少、例えば対象分子の少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、または７５％の減少を追跡することを含み得る。さらに、特定の被験体にとって、遮断治療の成功は、分子濃度を上昇させる傾向があり得る他の臨床的事象の状況において、特定の分子が比較的安定した濃度を維持することを含み得る。つまり、遮断が成功すると潜在的な上昇が阻止される可能性がある。上昇、低下または他の観察可能な効果は、治療の開始から一定の時間枠内、例えば、約５分以内、約３０分以内に測定され得る。特定の実施形態では、神経調節が成功したと判定された場合、神経調節の変化はエネルギーパルスの印加を停止するための命令である。別の実施形態では、神経調節が成功しなかった場合、神経調節の１つ以上のパラメータが変更される。例えば、調節パラメータの変化は、１０〜１００Ｈｚの周波数の段階的な増加などのパルス繰り返し周波数の増加および神経調節の成功が達成されるまでの所望の特徴の評価であり得る。他の実装形態では、パルス幅を変更することができる。他の実施形態では、２つ以上のパラメータを共に変更することができる。複数のパラメータを変更した後に神経調節が成功しない場合は、エネルギー印加の焦点を変更することができる。
【０１２２】
エネルギー印加装置１２は、体外の非侵襲的装置または内部装置、例えば最小侵襲的装置として構成することができる。述べたように、エネルギー印加装置１２は体外非侵襲性超音波トランスデューサまたは機械的作動装置であり得る。例えば、図６は、超音波トランスデューサ７４を含むハンドヘルド超音波プローブとして構成されたエネルギー印加装置の一実施形態を示す。しかしながら、解剖学的標的上に超音波トランスデューサプローブを構成する、付着させる、または配置するための他の方法を含む、他の非侵襲的実装形態も企図されることを理解されたい。さらに、ハンドヘルド構成に加えて、エネルギー印加装置１２は、コントローラ１６からの命令に応答する操縦機構を含み得る。操縦機構は、エネルギー印加装置１２を標的組織４３（または構造）に向けて配向または方向付けることができ、次いで、コントローラ１６は、エネルギー印加を対象領域４４に集束させることができる。
【実施例】
【０１２３】
１．実験方法
図７は、高密度集束超音波（ＨＩＦＵ）を印加するように構成されたエネルギー印加装置１２およびパルス発生器１４を含むシステム１０のブロック図である。一実施形態では、システム１０は、例えば、関数発生器８０、電力増幅器８２、および整合ネットワーク８４を含むパルス発生器を含む。本明細書で提供される実験結果を生成するために使用される一実施形態では、パルス発生器は、１．１ＭＨｚの高密度集束超音波（ＨＩＦＵ）トランスデューサ（Ｓｏｎｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｈ１０６）、整合ネットワーク（Ｓｏｎｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ）、ＲＦ電力増幅器（ＥＮＩ３５０Ｌ）、および関数発生器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ３３１２０Ａ）を含む。ＨＩＦＵトランスデューサ１２を、脱気水で満たされた高さ６ｃｍのプラスチックコーンを通して動物被験体に連結した。図８は、図７のシステム１０と共に使用され得るエネルギー印加装置の一例であり、本明細書で提供されるようにエネルギーを印加し、かつ標的組織を撮像するために、例えばコントローラ１６によって制御され得る単一のエネルギー印加装置１２内に配置されたＨＩＦＵトランスデューサ７４Ａと撮像用超音波トランスデューサ７４Ｂとを含む。
【０１２４】
図９は、本明細書で提供されるような特定の脾臓調節実験を実施するために使用される実験設定を示す。図示の実施形態は脾臓標的組織４３を示しているが、実験設定の特定の要素は異なる標的組織４３間で共通であり得ることを理解されたい。例えば、エネルギー印加装置１２は、標的組織４３内の対象領域にエネルギーを印加するために、コントローラ１６によって設定されたパラメータに従って動作してもよい。
【０１２５】
図１０は、本明細書で提供されるような特定の調節実験を実行するために使用される超音波エネルギー印加のための実験的タイムラインを示す。図示の実施形態では、超音波の印加は、リポ多糖注射の前後１分間行われる。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、強い免疫反応または炎症反応を引き出す細菌膜分子である。したがって、ＬＰＳ処置動物は、免疫応答が活性である疾患または状態のモデルとして役立ち得る。実験的タイムラインでは、臓器採取および様々な目標とする生理学的結果の測定は、治療後一定期間が経過した後に起こり得る。
【０１２６】
関数発生器８０は、図１１に示すパルス状の正弦波形を発生させる。このパルス正弦波形は、ＲＦ電力増幅器によって増幅され、ＨＩＦＵトランスデューサの整合ネットワークに送信される。動物実験中に、パルス振幅、パルス長、パルス繰り返し周波数の３つの超音波パラメータを調整することができる。パルス振幅は０．５Ｖピークから６２Ｖピークの範囲である。１８．２ｕｓ、１３６．４ｕｓ、３６３．６ｕｓの３つのパルス長を使用する。パルス繰り返し周波数（１／Ｔ）は２ｋＨｚである。治療時間は１分である。表１は、ＨＩＦＵ超音波パラメータを要約している。超音波調節パラメータは一例である。一実施形態では、調節は、約０．１ＭＨｚ〜約５ＭＨｚの範囲の超音波トランスデューサ周波数を有する超音波刺激を用いて提供され、超音波刺激は、約０．１Ｈｚ〜約１０ｋＨｚの範囲の超音波周波数パルス繰り返し周波数を有する。超音波エネルギーのパルス当たりの超音波サイクルは、約１〜約１０００の範囲内であり得る。
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【０１２７】
圧力測定は、Ｏｎｄａ  Ｃｏｒｐ．製のＨＩＦＵハイドロフォン（ＨＮＡ‐０４００）を使用して脱気水中で行った。ＨＩＦＵトランスデューサは、１００サイクルの正弦波形によって駆動された。ハイドロフォンでｘ‐ｙ平面における０．１ｍｍのグリッドサイズおよびｚ軸に沿って０．２ｍｍのステップサイズで焦点を通してスキャンした。図１２はハイドロフォンの設定を示し、図１３はスキャン結果を示す。ピーク正（負）圧力は、ｘ‐ｙ平面内のトランスデューサ焦点における最大正（負）圧力として定義される。入力電圧は、非線形性の影響を排除するのに十分な低さであった。したがって、ピーク正圧力の値はピーク負圧力の値と同一であった。全動作電圧でのピーク圧力を推定するために、キャビテーションが発生し曲線適合を行う前に、ピーク圧力をいくつかの異なる駆動電圧で測定した。計算されたピーク圧力を表１に示す。
臓器特異的神経調節のための超音波標的化
【０１２８】
神経調節が始まる前に、ＧＥ  Ｖｉｖｉｄ  Ｅ９超音波システムおよび１１Ｌプローブを使用して超音波スキャンを行った。対象領域は動物の皮膚上に標識した。ＨＩＦＵトランスデューサを標識領域上に配置した。より小型の撮像プローブ（３Ｓ）を使用して別の超音波スキャンも行い、このプローブはＨＩＦＵトランスデューサの開口部に配置した。３Ｓプローブの撮像ビームをＨＩＦＵビームと整列させた。したがって、（超音波スキャナー上に可視化された）標的臓器の画像を用いて、ＨＩＦＵビームが対象領域を標的としていることを確認できた。
動物プロトコル
【０１２９】
実験を行う前に、８〜１２週齢の成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１２時間の明／暗サイクルで２５℃で飼育し、１週間馴化した。水と通常のげっ歯類の餌は自由に摂取できた。
【０１３０】
内毒素（大腸菌由来のＬＰＳ、０１１１：Ｂ４；Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、未処置の成体Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットに有意な状態の炎症および代謝機能不全（例えば高血糖症および高インスリン血症）を生じさせた。動物に腹腔内（ＩＰ）注射でＬＰＳを投与したところ（１０ｍｇ／ｋｇ；Ｒｏｓａ‐Ｂａｌｌｉｎａｓ  ＰＮＡＳ、２００８）、ＴＮＦ、循環グルコースおよびインスリン濃度の有意な上昇を引き起こし、上昇は４時間でピークに達したが、対照群と比較して注射の８時間後まで上昇したままであった。脾臓、肝臓、視床下部、海馬および血液の試料を、ＬＰＳ投与から６０分後（効力研究用）および３０、６０、１２０、２４０または４８０分後（持続時間および動態研究用）に採取した。ホスファターゼ（０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、５μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのベンズアミジン、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、および２μＭのカンタリジン）およびプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる組織１μＬ〜２０ｍｇ）阻害剤を含むＰＢＳ溶液中で脾臓および肝臓の試料をホモジナイズした。ＰＢＳ溶液１ｍＬ当たり組織０．２ｇの目標最終濃度を全ての試料に適用した。血液試料は、試料の凝固を防ぐために抗凝固剤（二ナトリウム）ＥＤＴＡと共に保存した。試料をサイトカイン（Ｂｉｏ‐Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ；Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）、ＴＮＦ（Ｌｉｆｅｓｐａｎ）およびアセチルコリン（Ｌｉｆｅｓｐａｎ）濃度の変化についてＥＬＩＳＡアッセイで分析した。カテコールアミン濃度は、ＨＰＬＣ検出またはＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）分析を用いて評価した。
【０１３１】
血糖値およびインスリンレベルに対するＬＰＳの影響を調べた。ＬＰＳ注射の０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、および２４０分後に尾静脈から血液試料を採取し、グルコースおよびインスリンレベルを測定した。循環血中グルコース濃度は、ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｅｌｉｔｅグルコメーター（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）によって測定した。血液から得られた血漿中のインスリン濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して決定し、全身性インスリン抵抗性に対するＬＰＳおよびその後の超音波刺激の影響を決定した。シグナル伝達の変化は、肝臓、筋肉、心臓および視床下部組織試料におけるＩＲＳ‐１／２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴａｍａｔｅ、ＧＡＢＡおよびＡＭＰＫを含む重要なバイオマーカーの評価によって測定した。
超音波神経調節に使用したプロトコルは以下の通りであった。
動物を２〜４％イソフルランで麻酔する。
処置中の温熱療法を防ぐために、動物は水循環温暖パッドの上にうつぶせに置く。
刺激の前に、超音波刺激の指定箇所（対象神経）上の領域を、使い捨てかみそりと動物用バリカンで剃毛してもよい。
診断イメージング超音波を用いて対象領域を識別する。
肝臓は、肝門脈のドップラー同定によって示される肝門部とする。
脾臓は、診断用超音波によって脾臓を視覚的に識別する。刺激の位置は、識別された脾臓軸に沿って維持する。
後で識別できるように領域に永久マーカーを付けてもよい。
ＦＵＳ超音波プローブまたはＬｏｇｉＱ  Ｅ９プローブのいずれかを、診断用超音波で先に識別した指定の対象領域に配置する。
次に、単一の１分のパルスを超えない単一の刺激の総持続時間で超音波パルスを実施する。どの時点でも、エネルギーが熱損傷やアブレーション／キャビテーションに関連するレベルに達することはない。
その後、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してもよい（急性／動態研究用）。あるいは、効果の持続時間の間、ＬＰＳはここで注射せず、代わりに後に指定された時点で注射する。
２回目の１分の超音波刺激を印加する。
次いで、急性（１時間）および動態（ＬＰＳ後最大３時間まで変動する）研究用に麻酔下で動物をインキュベートすることが可能になる。その後、動物を屠殺して組織、血液試料を採取する。
効果の持続時間の研究のために、ＬＰＳは超音波刺激時には注射せず、むしろ超音波刺激印加後の指定された時点（例えば０．５、１、２、４または８時間）で注射する。その後、動物を麻酔薬保持チャンバーに入れ、安楽死および組織／体液採取までモニターする。
腹膜腔の基部から延長して胸膜腔まで切開を行う。臓器（脾臓および肝臓を含む）を速やかに取り出し、ホスファターゼ（０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、５μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのベンズアミジン、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、および２μＭのカンタリジン）およびプロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる組織１μＬ〜２０ｍｇ）阻害剤を含むＰＢＳ溶液中でホモジナイズする。ＰＢＳ溶液１ｍＬ当たり組織０．２ｇの目標最終濃度を全ての試料に適用した。血液試料は、試料の凝固を防ぐために抗凝固剤（二ナトリウム）ＥＤＴＡと共に保存した。次いで試料を分析まで‐８０℃で保存する。試料をサイトカイン（Ｂｉｏ‐Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ；Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）、ＴＮＦ（Ｌｉｆｅｓｐａｎ／Ａｂｃａｍ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびアセチルコリン（Ｌｉｆｅｓｐａｎ）濃度の変化についてＥＬＩＳＡアッセイで分析した。カテコールアミン濃度は、ＨＰＬＣ検出またはＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）分析を用いて評価した。
電極に基づく迷走神経刺激制御実験プロトコル
【０１３２】
雄のＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙラットを２％イソフルランで麻酔した。頸部に沿って単一の切開を行って僧帽筋、胸鎖乳突筋および咬筋を露出させ、左頸部迷走神経を露出させる鈍的切開を行った。露出した頸部迷走神経の主幹部に沿って微小電極を配置した。電気刺激（５Ｖ、３０Ｈｚ、２ｍｓ；５Ｖ、５Ｈｚ、２ｍｓ；１Ｖ、５Ｈｚ、２ｍｓ）を、ＡｃｑＫｎｏｗｌｅｄｇｅソフトウェア（Ｂｉｏｐａｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の制御下でＢＩＯＰＡＣ  ＭＰ１５０モジュールを使用して発生させた。ＬＰＳ１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ注射の前後に、ラットに３分間の迷走神経刺激を与えた。ＬＰＳ注射の６０分後にラットを安楽死させ、ＴＮＦ測定のために脾臓および血液試料を採取した。偽手術を行ったラットでは、迷走神経を露出させたが、触れたり操作したりしなかった。
ＨＰＬＣ分析
【０１３３】
血清試料を前処理なしで機械に直接注入した。組織ホモジネートを最初に０．１Ｍ過塩素酸でホモジナイズし、１５分間遠心分離した後、上清を分離し、試料をＨＰＬＣに注入した（Ｄｈｉｒ＆Ｋｕｌｋａｒｎｉ、２００７）。
【０１３４】
カテコールアミン（ノルエピネフリン／エピネフリン）を、インライン紫外線検出器を備えた高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析した。この分析に使用した試験カラムは、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８（内径１５ｃｍ×４．６ｍｍ、粒径５μｍ）であった。二相移動相は［Ａ］アセトニトリル：［Ｂ］５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含み、（リン酸を用いて）ｐＨ３に設定した。次いで溶液を１００ｍｇ／ＬのＥＤＴＡおよび２００ｍｇ／Ｌの１‐オクタンスルホン酸で緩衝した。移動相混合物の最終濃度は５：９５、Ａ：Ｂに設定した。１ｍＬ／分の流速を用いて全体のピーク分離能を改善しながら、カラムを一定の２０℃に保持して、利用した移動相の粘度から生じるカラムの圧力圧縮を最小限にした。ＵＶ検出器は、ノルエピネフリン、エピネフリンおよびドーパミンを含むカテコールアミンに対する吸収を捕捉することが知られている波長２５４ｎｍに維持した。
超音波調節分子シグナル伝達経路の化学的阻害
【０１３５】
上記の超音波刺激手順を実行する前に、機械対直接神経刺激（および軸索外細胞シナプスの神経対非神経成分の優先的調節）、ＳＲＣ阻害剤（直接機械受容器の共通マーカー）またはＰＩ３Ｋ阻害剤（神経シグナル伝達の共通マーカー）の影響をさらに調査する。
組織抽出とパラフィンブロック変換：
【０１３６】
組織（ラットの脳）を直ちに固定液に入れ、１０％ホルマリン中４℃で約２４時間固定する。
次のプロトコルで（各インキュベーション中に真空と圧力で）組織を処理する。
ａ．７０％エタノール、３７℃、４０分
ｂ．８０％エタノール、３７℃、４０分
ｃ．９５％エタノール、３７℃、４０分
ｄ．９５％エタノール、３７℃、４０分
ｅ．１００％エタノール、３７℃、４０分
ｆ．１００％エタノール、３７℃、４０分
ｇ．キシレン、３７℃、４０分
ｈ．キシレン、３７℃、４０分
ｉ．パラフィン、６５℃、４０分
ｊ．パラフィン、６５℃、４０分
ｋ．パラフィン、６５℃、４０分
ｌ．パラフィン、６５℃、４０分は、包埋の準備ができるまでこのパラフィンに入れたままにする。ただし、１２〜１８時間を超えないこと。
切出しのためにパラフィンブロックに包埋し、切出し前にブロックを冷却／固化させる。厚さ５ミクロンに切出し、採取のために５０℃の水浴上に浮遊させる。正電荷を帯びたスライドガラスを使用し、全てのスライドガラスについて同じ向きに組織を配置するように努める。スライドガラスを風乾させる。一晩室温におくことが乾燥させるのに最善のようであるが、スライドガラスを４０℃のスライドウォーマーの上に置いて乾燥工程を早めることができる。ただし、スライドガラスをウォーマー上に１時間以上放置しないこと。スライドガラスを４℃で保存する。
ＩＨＣプロセス
【０１３７】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料（ラット脳）を６５℃で１時間焼成した。スライドガラスをキシレンで脱パラフィン化し、低下したエタノール濃度で洗浄することによって再水和し、次いで抗原検索のために処理した。特にＦＦＰＥ組織との多重化のために２段階の抗原検索法を開発し、同じ試料（２）に対して異なる抗原検索条件を有する抗体を共に使用することを可能にした。次に試料を０．３％トリトンＸ‐１００を含むＰＢＳ中で周囲温度で１０分間インキュベートした後、１×ＰＢＳ中１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ロバ血清および３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡを用いて４５分間室温で非特異的結合をブロックした。一次抗体ｃＦＯＳ（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ‐ＳＣ５２）を最適濃度（５μｇ／ｍＬ）に希釈し、ＰＢＳ／３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＢＳＡ中、室温で１時間適用した。次に、試料をＰＢＳ、ＰＢＳ‐ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、その後再びＰＢＳで、１０分間、それぞれ撹拌しながら洗浄した。二次抗体検出の場合、Ｃｙ３またはＣｙ５のいずれかに結合した一次抗体種特異的二次ロバＩｇＧと共に試料をインキュベートした。次にスライドガラスを上記のように洗浄し、５分間ＤＡＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）中で染色し、ＰＢＳ中で再度すすぎ、次いで画像取得のために退色防止媒体を載せた。全組織像を蛍光Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡で１０倍の倍率で得た。
画像処理
【０１３８】
ＦＦＰＥ組織に典型的な自己蛍光は、自家蛍光除去プロセスを用いて標的フルオロフォアシグナルから特徴付け分離するべきであり、染色画像に加えて未染色試料の画像が得られる。未染色画像および染色画像を、それらの露光時間および暗いピクセル値（ゼロ露光時間におけるピクセル強度値）に関して正規化する。次いで、各正規化自己蛍光画像を対応する正規化染色画像から差し引く。登録されているＤＡＰＩ画像とマージしたＡＦ除去画像を写真に示す。刺激試料および対照試料中の同じ領域を画像化し、画像をｃＦＯＳ発現について定性的に評価して神経活性化関連遺伝子発現の変化を検出した。
【０１３９】
脾臓の組織学的評価：刺激ラットおよび対照ラットからの脾臓を上記のようにパラフィンブロックに加工した。文献に報告されている標準プロトコルに従ってパラフィン包埋切片を透明にし、Ｈ＆Ｅについて染色し、明視野オリンパススキャナーでスキャンした。Ｈ＆Ｅ画像を形態学的差異について定性的に評価したところ、刺激試料と対照試料との間に有意な差異は見られなかった。
心拍数のモニタリングと分析
【０１４０】
（超音波または電極刺激実験中の）心拍数は、市販の赤外線オキシメーターおよび生理学的モニタリングシステム（Ｓｔａｒｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し製造業者の説明書を用いてモニターした。刺激プロトコルの間、フットクリップセンサー（製造業者によって提供された）を動物の足蹠に設置した。動物は、測定前に少なくとも５分間馴化し、動物が正常な心拍数活動まで回復するのに十分な時点および対照における生理学的読み取り値を見出した。電気微小電極または超音波プローブのいずれかを用いた刺激の前（２分の記録期間）、刺激の間、および刺激の後（２分の記録期間）の測定値をそれぞれ記録した。
超音波誘導性活性化の拡散機能的ＭＲＩ測定
【０１４１】
神経活性化は通常、血中酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）ｆＭＲＩを用いて検出し、代謝要求が増加した脳領域は、脳血流の増加、酸素化血液供給の増加、および勾配エコー信号の減少をもたらす。ＢＯＬＤ効果に対する感度には、高速勾配エコーの取得を用いる必要があるが、これは、副鼻腔や外耳道など、空気溜りの隣の脳領域で望ましくない信号損失を引き起こし、これらの特定の脳領域付近で神経活性化の検出を妨げる。あるいは、大きな磁場不均一性を特徴とする領域における信号損失を最小限に抑えるために、スピンエコー（またはダブルスピンエコー）拡散強調イメージング（ＤＷＩ）を使用することができる。ＤＷＩ‐ｆＭＲＩでは、遅拡散性の（おそらくは細胞内の）水プールの体積増加、または水拡散（または見かけの拡散係数（ＡＤＣ））の増加の両方が、神経活性化による細胞の膨潤および膜の拡大に起因していた。
【０１４２】
図１４のパラダイムを用いて１０匹のラットに脳のＭＲＩスキャンを行った。このうち６匹にＬＰＳ注射（上記の通り）および超音波処置の両方を行い、４匹にはＬＰＳ注射のみを行った。
【０１４３】
スキャンは、Ｄｏｔｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの直角位相鳥かご型コイルを使用して、３Ｔ  ＧＥ  ＤＶスキャナー（Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ）で行った。スキャンは、Ｔ１取得で開始し、スポイル勾配エコーシーケンスを用い、０．４／１ｍｍの面内／面外空間分解能で、１０／１４７５ｍｓのＴＥ／ＴＲを用い、総取得時間は３：２２分であった。６ブロックのダブルスピンエコーＤＷＩ画像（前方極性勾配、またはＦＰＧと呼ばれる）を取得し、それぞれ、０．６／１ｍｍの面内／面外空間分解能、８２／３４００ｍｓのＴＥ／ＴＲで、ｂ＝０／ｂ＝１０００ｓ／ｍｍ２について３／４の平均を用い、ブロック当たりの総取得時間は１：４９分であった。６回の注射前ＤＷＩ取得の完了時に、歪み補正の目的で、勾配の方向を逆にして別のＤＷＩ取得を実施し、この取得は逆極性勾配（ＲＰＧ）取得と呼ばれる。ＬＰＳ注射、１回目の超音波処置、５分間の待機時間、および２回目の超音波処置の後、他の６ブロックのＦＰＧ  ＤＷＩ画像を取得した。ＬＰＳ注射のみを受けている対照ラットについては、最後の６つのＤＷＩブロックがＬＰＳ注射の直後に続いた。
【０１４４】
超音波処置は、水で満たされた円錐体を使用して肝臓の肝門部領域（求心性神経を含む；上記の通り）に結合されたＭＲ適合１．４７ＭＨｚ集束超音波トランスデューサを使用して実施した。各超音波処置は６０秒間続き、その間にパルス状の正弦波超音波波形を印加した。パルスオン時間は１５０μｓであり、パルスオフ時間は３５０μｓであった。ラットの腹部は撮像コイルの外側にあり、動物の配置は仰向けで、カップリングゲルを使用して皮膚を通して肝臓への超音波プローブの容易なカップリングを確実にした。
データ分析と結果
【０１４５】
反対方向へのｋ空間の横断は歪みの逆転をもたらす（すなわち、圧縮が拡大に変換される）という観察に基づいて、ＦＰＧ画像とＲＰＧ画像とをオーバーラップさせるフィールドマップが推定され得る。このフィールドマップ推定は、全てのボクセル変位に明示的に依存する最小二乗コスト関数を設定することによって行い、変形場の滑らかさは、各ボクセルにおける変位の勾配の二乗和を制限する正則化パラメータの導入によって制御する。このコスト関数を効率的に最小化するという数値タスクは、大きくぼやけているＦＰＧおよびＲＰＧ画像から始めて、ぼけているガウスカーネルの幅を徐々に狭くすることによって達成される。この作業で本発明者らが行った全ての歪み補正では、このぼかしのスケジュールは２５ピクセルのカーネル幅から始まり、２段階で入力イメージの本来の解像度まで減少し、合計１３回繰り返し、正則化パラメータはλ１＝０、λ２＝１１００であった。要約すると、推定されたフィールドマップは、１２個のＦＰＧおよび単一のＲＰＧ取得の各々のｂ＝０取得を用いて最初に取得され、１２個の補正されたＦＰＧ  ＤＷＩ画像は、ＦＰＧシリーズの歪んだＤＷＩ画像にシフトを適用することによって得られる。
【０１４６】
歪み補正作業の成果は、Ｔ１画像用の脳境界ボックスを設定し、解剖学的Ｔ１画像と機能的ＤＷＩ画像との間のスライス毎に相互相関係数を推定することによって評価した。相互相関係数が０．５を超える脳切片のみを活性化領域分析に残した。
【０１４７】
図１５は、ラットのうち１匹における補正後のＴ１／ＤＷＩ画像の例をスライス毎の相互相関係数と共に表示し、活性化分析のために保持されるスライスは赤で強調表示されている。
【０１４８】
１２個の補正されたＤＷＩデータセットのそれぞれについて、見かけの拡散係数は以下のようにピクセル毎に決定した。
2019534090.tif 000004
ここで、ｂ１＝０、ｂ２＝１０００ｓ／ｍｍ２であり、Ｓ（ｂｉ）はｉ番目のｂ値における信号強度を表す。
【０１４９】
２つの条件（処置前および処置後）の各々について、６つのＡＤＣマップをまとめてビン化し、ｔ検定をピクセル毎に行って、超音波エネルギー印加の結果として平均シグナルが有意に増加または減少した（神経活性化の非活性化変化に対応する）領域を同定した。
【０１５０】
解剖学的活性化領域を識別するために、並進、回転およびスケーリング（９自由度）のみを使用して、脳の境界を整列させるＩＴＫＳｎａｐ登録ツールを使用して、各ラットの解剖学的Ｔ１画像とラット脳アトラスとの手動登録を行った。次いで、これらの補正され解剖学的に整列された画像を使用して、ＬＰＳ処置ラットにおいて肝超音波神経調節に応答して活性化された脳の領域を決定した。
２．実験結果
【０１５１】
対照として、膝窩リンパ節に進入する坐骨神経からの神経をラットで刺激した。双極電極を使用して、２００マイクロ秒の２０Ｈｚの刺激周波数（平衡二相パルス）を用いた一定範囲の印加電流で５分間刺激した。刺激後、リンパ節を摘出し、単一細胞懸濁液に解離させ、次いでＨｅｍａｖｅｔ細胞計数器を使用して分析した。直接刺激した膝窩リンパ節、反対側の膝窩リンパ節、および腋窩リンパ節について、解離組織の１立方ミリリットル当たりのリンパ球細胞数をプロットした。リンパ球数は刺激したリンパ節においてのみ統計的に増加した。結果を図１６に示す。本明細書で提供されるように、標的化された方法で組織内の対象領域にエネルギー、例えば超音波エネルギーを印加することは、図１６に示すように直接電気刺激と比較してより標的化された結果を達成し得る。
【０１５２】
電気刺激とは対照的に、膝窩リンパ節内の細胞および神経終末は、リンパ節をパルス正弦波形の形態の超音波エネルギーに曝露することによって刺激した。使用した超音波パラメータは以下の通りであった。
周波数：１．１ＭＨｚ
パルス長：１３６μｓ
パルス繰り返し間隔：５００μｓ（２７％デューティサイクル）
総超音波照射時間：１分
焦点での推定陽圧：５ＭＰａ
焦点での推定負圧：‐２ＭＰａ
トランスデューサの幾何学形状：中心開口部を使って球状に焦点を合わせる
トランスデューサ外径：約７０ｍｍ
トランスデューサ中央開口部直径：約２０ｍｍ
焦点距離：約５４．８ｍｍ（Ｆナンバー約１）
焦点スポット領域：直径１．８ｍｍ、長さ１１．７ｍｍのほぼ楕円形
【０１５３】
刺激後、刺激された（および他の）リンパ節を切除し、細胞計数器を使用して調べた。図１７に示すように、刺激されたリンパ節のみがリンパ球の増加を示した。超音波刺激リンパ節における神経伝達物質レベルは、電気刺激リンパ節と比較して異なっていた。しかしながら、リンパ球についての細胞計数データは、超音波刺激リンパ節および電気刺激リンパ節の両方で類似していた。リンパ球流出の局所的な調節（遠心性神経線維を介する）に加えて、リンパ節に進入する神経の電気刺激は、肝臓および脾臓の免疫細胞濃度に遠位効果を及ぼすことが見出された。
【０１５４】
図１８は、超音波刺激リンパ節における神経伝達物質濃度の結果を示す。エピネフリンとドーパミンは超音波刺激リンパ節で上昇した。
【０１５５】
図１９は、リンパ節超音波刺激の遠位効果としての脾臓中のノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミンおよびアセチルコリン濃度の結果を示す。
【０１５６】
図２０は、未刺激動物の対照群と比較した、超音波刺激動物の脾臓中のサイトカイン（ＴＮＦ）濃度の結果を示す。図２１Ａはノルエピネフリン濃度を示し、図２１Ｂはアセチルコリン濃度を示し、図２１Ｃは超音波刺激後の脾臓中のＴＮＦ‐α濃度を用量依存的に示す。図２２は、脾臓の超音波刺激後の循環（すなわち、血液）ＴＮＦ‐α濃度を示す。
【０１５７】
図２３は、ＬＰＳ処置動物の対照群対超音波刺激およびＬＰＳ処置動物の肝臓からの結果を示す。
【０１５８】
図２４は、脾臓超音波処置の異なる時間平均強度について、対照と比較した脾臓サイトカインの変化を示す表である。評価したサイトカインは、コリン作動性抗炎症経路の指標となり得るサイトカイン、およびその他の関連性のないサイトカインである。ＴＮＦ‐α（コリン作動性抗炎症経路（ＣＡＰ）関連サイトカイン）については、偽対照と比較した変化の減少が全ての時間平均強度にわたって観察された。対照的に、ＩＦＮ‐γ（ＣＡＰとは無関係のサイトカイン）は、より高い時間平均強度で観察された減少を示した。結果は、ある範囲の時間平均強度での脾臓の超音波調節が、ＣＡＰ活性化ｂに特異的に関連するサイトカイン濃度の対応する減少をもたらし得ることを示す。したがって、本明細書で提供されるように、目標とする生理学的結果は、サイトカイン濃度の減少、例えば、少なくとも１ｍＷ／ｃｍ２の時間平均強度から３０，０００ｍＷ／ｃｍ２の時間的強度への調節の結果としてのＴＮＦ‐α濃度またはＩＬ‐１濃度の減少であり得る。特定の実施形態では、ＴＮＦ‐α濃度またはＩＬ‐１濃度の対応する減少に関連して脾臓の対象領域に印加されるエネルギーを使用して、慢性炎症、例えば関節炎を治療することができる。
【０１５９】
図２５は、脾臓の超音波処置の異なるピーク圧力についてＬＰＳ処置対照と比較した、二次メッセンジャー分子のリン酸化状態の変化率を示す。結果は、脾臓における超音波処置が組織内の異なる細胞型にわたる複数の経路を調節することを示している。それにもかかわらず、経路のうちの１つ（または異なるセット）に対してより標的化された効果を有する調節パラメータが見出され得る。示されるように、脾臓の超音波調節については、異なるピーク圧力にわたるｐ‐ｐ３８リン酸化は応答におけるｔＴＮＦ濃度の変化と共に変化し、一方、他の経路は印加される超音波圧力に関して単調に増加または減少する傾向を示す。
【０１６０】
図２６は、経路遮断処置の状況における、刺激されたＬＰＳ処置動物の群についてのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す。ＢＴＸはアセチルコリン受容体の化学的遮断薬であり（インテグレータ細胞で神経経路を遮断する）、ＰＰ２はＳｒｃキナーゼ阻害剤であり、ＬＹはＰＩ３キナーゼ阻害剤であり、ＰＤ９８０５９はＭＡＰＫキナーゼ阻害剤である。図２７は、経路遮断処置の状況における、刺激されたＬＰＳ処置動物群についてのノルエピネフリンの脾臓濃度を示す。図２８は、迷走神経切断または経路遮断で処置された動物と比較した、刺激されたＬＰＳ処置動物群について、ＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す。図２９は、ＬＰＳ処置と組み合わせた超音波処置後の様々な時点におけるＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す。効果は３時間後に逆転し始める。
【０１６１】
図３０は、将来の免疫／炎症傷害に対する超音波処置の保護効果を実証するために用いられた超音波処置後のＬＰＳ処置についての実験的タイムラインである。超音波処置は、ノルエピネフリンのＬＰＳ関連低下およびその後のＣＡＰの活性化に対して保護することによって、処置後数時間のＬＰＳ免疫誘発に対して少なくとも部分的な保護効果を提供するとみられ、保護効果は３０分間隔で最大であるが、１〜２時間で安定する。図３１は、図３０のタイムラインに従った、超音波およびＬＰＳ処置後の様々な時点でのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示す。ＴＮＦ‐αのＬＰＳ関連増加に対する防御による免疫傷害に対する超音波処置の保護効果は、未処置動物（すなわち、ＬＰＳまたは炎症性傷害のない動物）におけるよりも大きく、ＬＰＳ‐対照（すなわち、超音波なし）対照と比較してＴＮＦ産生が減少した。したがって、本明細書で提供されるように、脾臓への非侵襲的または低侵襲的エネルギー印加は、炎症性傷害または慢性炎症（単一の超音波調節からの保護は長期間にわたって保護的であるため）に対して保護するために使用され得る。
【０１６２】
図３２は、非侵襲的超音波刺激対侵襲的頸部迷走神経電極刺激動物についてのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示し、図３３は、ＦＵＳコーンの中に直接画像トランスデューサをセンタリングすることにより、図３２の超音波処置の対象領域および超音波配置を識別するために使用される超音波画像である。刺激およびＬＰＳ処置は、本明細書に一般的に提供されているように実施した。非侵襲的超音波刺激は、完全に非侵襲的に行われ、侵襲的超音波処置（上記の結果）または侵襲的電極処置（示す通り）と比較して同様の結果（ＬＰＳ関連ＴＮＦ‐α増加の逆転）が得られた。
【０１６３】
図３４は、制御電気刺激の実験設定を示す。図３５Ａは、ＬＰＳ処置の状況における、非侵襲的超音波刺激動物対電極刺激対照動物についてのＴＮＦ‐αの脾臓濃度を示し、電極刺激は図３４の設定に従って行った。図３５Ｂは、ＬＰＳ処置の状況における、非侵襲的超音波刺激動物対電極刺激対照動物の血糖濃度を示し、電極刺激は図３４の設定に従って行った。超音波刺激および電気刺激は、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦ濃度に同じ効果を及ぼした。ＬＰＳは高血糖症を引き起こすことも知られている（ＬＰＳ対照、図３５Ｂ参照）。ＬＰＳ誘導性高血糖は、（未知の経路によって）ＶＮＳによって無効にされることが以前に示されており、これは、ＶＮＳコリン作動性抗炎症経路刺激を試みるという観点から見れば「標的外」効果である。しかしながら、超音波コリン作動性抗炎症経路刺激はグルコースに対して標的外効果を生じない。したがって、コリン作動性抗炎症経路超音波刺激は、ＶＮＳ（または他の不正確な電気神経刺激技術）と比較して、特定の臨床状況において有益であり得、臓器に基づく軸索外細胞シナプス超音波調節はより正確に本明細書に示される。
【０１６４】
図３６は、実験中に動物の足に設置した市販の非侵襲的光心拍数プローブを使用して測定された、非刺激動物と比較した心拍数に対するＶＮＳ電極刺激対超音波脾臓神経調節の効果を示す。心拍数の変化率は、非刺激動物と比較した心拍数の変化である。やはり、電気刺激は潜在的な標的外効果（すなわち心拍数の調節）を有することが示され、臓器ベースの軸索外細胞シナプス超音波調節はこの標的外効果（すなわちＣＡＰ活性化以外の効果）を有さない。
【０１６５】
図３７Ａは、対照と比較した、血糖に対する肝門部下の超音波肝調節の効果を示す。肝門部は、グルコース感知ニューロンを有することが知られている部位であり、前述のグルコースに対する標的外ＶＮＳ効果の起点部位であると仮定された（すなわち、ＶＮＳは、ＣＡＰ経路に加えてこの領域からの求心性神経も刺激した）。図３７Ｂおよび図３７Ｃは、代謝およびグルコース利用に関与する様々な分子の肝臓濃度に対する超音波肝調節の効果を示す。肝臓ではインスリンの変化のみが観察された。しかしながら、インスリンは肝臓では産生されず、他の部位からそこに輸送され、局所肝門部肝刺激の結果としてのインスリン産生およびグルコース代謝に対する全身的影響を示している。
【０１６６】
図３８Ａ〜図３８Ｃは、様々な分子の脳内濃度に対する超音波肝門部肝調節の効果を示す。視床下部は、体全体にわたるグルコース調節に関与する領域を有することが知られている。肝臓求心性神経はこれらの部位へのＰＮＳ制御経路であるとみられ（そして感覚神経／肝臓液軸索外細胞シナプスの神経調節は神経経路を介したシグナル伝達の変化を引き起こす）。したがって、本明細書で提供されるように、肝臓へのエネルギー（例えば、超音波エネルギー）の直接の印加は、グルコース調節に関連する障害を治療するために使用され得る。そのような障害には、肥満、糖尿病関連認知症、摂食障害、糖尿病、低血糖または高血糖などが含まれ得る。特定の実施形態では、高血糖は血中３００ｍｇ／ｄＬ超のグルコース濃度であり、成功した目標とする生理学的結果は血中２２０ｍｇ／ｄＬ超のグルコース濃度である。治療は、視床下部組織に目標とする生理学的結果を誘導するために、肝臓内の対象領域にエネルギーを印加することを含み得る。一実施形態では、目標とする生理学的結果は、ベースライン（例えば、エネルギー印加前）と比較した視床下部組織におけるｐＩＲＳ‐１、ｐＡＫＴ１／２、ノルエピネフリン、エピネフリン、および／またはＮＰＹの変化である。
【０１６７】
図３９Ａは、グルコース濃度に対する肝臓内の様々な位置での超音波肝臓調節の効果を示し、図３９Ｂは、図３９Ａの対象となる標的領域の調節位置を示す。グルコース濃度に対する超音波調節効果は、対象領域、すなわち刺激部位の位置に依存する。肝門部での刺激後にグルコースの変化が最も顕著であり、左葉の刺激は最も低い観察された変化を示した。したがって、特定の実施形態では、目標とする生理学的結果を誘導するための肝臓内の対象領域にエネルギーを印加することは、肝左葉ではなく肝門部へのエネルギーの印加を含み得る。図４０は、ＬＰＳ処置動物における脾臓超音波刺激は、肝臓の超音波刺激後に見られるグルコース濃度に対して観察された効果をもたらさないことを示し、この効果が刺激部位に特異的であることを示している。
【０１６８】
図４１Ａは、対照に対するＬＰＳ処置動物および超音波刺激動物における視床下部ＮＰＹ濃度を示す。図４１Ｂは、対照に対するＬＰＳ処置動物および超音波刺激動物における視床下部ＰＯＭＣ濃度を示す。データは、肝超音波刺激が視床下部内の全ての代謝制御経路を活性化または調節するわけではなく、特定の経路およびニューロン型に特異的であることを示している。
【０１６９】
図４２Ａは、非刺激ＬＰＳ偽動物からの冠状切片および免疫組織化学／染色像を示し、図４２Ｂは、肝臓刺激ＬＰＳ処置動物からの冠状切片を示す。刺激ＬＰＳ処置動物では、非刺激ＬＰＳ偽動物と比較して、腹内側視床下部（ＶＭＨ）、弓状（ＡＲＣ）核においてｃＦｏｓ陽性細胞の有意な減少が観察され、外側視床下部（ＬＨ）において中等度の減少が観察された。刺激ＬＰＳ処置動物では、非刺激ＬＰＳ偽動物と比較して、海馬（Ｈｃ）中のｃＦｏｓ陽性細胞の有意な増加も、海馬固有（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３）領域における明確な増加を伴って観察された。拡散ＭＲＩは、海馬における超音波後のＡＤＣ信号の増加を示す（図示せず）。視床下部では反対のことが起こり、拡散は、非刺激動物（図４４）と比較して、超音波刺激の前の方が大きい（図４３）。ｃＦｏｓ染色はｄＭＲＩ研究の結論を支持するように思われる。したがって、本明細書で提供されるように、目標とする生理学的結果は、脳への神経シグナル伝達の変化、ならびに連絡および／または効果領域内の遺伝子発現の効果であり得る。図４５Ａは、対照海馬におけるｃＦＯＳおよびＧｌｕｔ１染色を示し、図４５Ｂは、刺激された海馬におけるｃＦＯＳおよびＧｌｕｔ１染色を示し、肝臓超音波刺激が視床下部を超えた上流部位に影響を及ぼし、認知への影響など、さらに（グルコース調節および代謝を超えて）影響を及ぼし得ることを示している。図４５Ｃは、図４５Ａの画像対図４５Ｂの画像の蛍光染色ＲＦＵを示す。
【０１７０】
図４６は、経路遮断薬で処置したＬＰＳ処置動物における肝臓刺激後の海馬ノルエピネフリンを示す（脾臓遮断実験とは異なり、肝超音波神経調節に対する遮断効果を示さない）。これらの結果もまた、超音波調節が異なる軸索外細胞シナプス標的において特異的な効果を有することを示す。図４７は、ＬＰＳ処置動物における糖尿病薬標的のアゴニスト（ＡＩＣＡＲ；ＡＭＰキナーゼ活性化剤）で処置した後の海馬ノルエピネフリンを示し、陽性対照として働き、肝臓超音波処置と比較して同様の効果を示している。したがって、肝臓超音波処置は、糖尿病関連経路を標的とするために使用され得る。
【０１７１】
図４８は、超音波神経調節の前後に、神経調節中の組織変位が基準超音波撮像信号でどのように追跡され得るかの概略図を示す。超音波プローブは、１）画像化、２）変位の測定、および３）刺激のために使用されてもよい。組織の変位を使用して、超音波刺激による組織の動きのレベル（したがって、標的の軸索外細胞シナプスの伸張活性化タンパク質またはイオンチャネルを活性化する確率）を評価することができる。すなわち、異なる肥満度指数（および印加する超音波エネルギーを減衰させる可能性がある超音波プローブと神経調節標的との間の組織の異なる厚さ）を有する被験体については、（神経調節部位における）組織変位の直接測定を使用して、神経調節の成功の可能性を測りそれに応じて超音波パラメータを調整することができる。例えば、基準パルスを用いて組織変位を測定することができる。
【０１７２】
図４９は、脾臓刺激部位から得られたせん断波測定値を示し、図５０は、脾臓刺激部位から得られた変位測定値を示す。Ｄ変位測定を行い、目標とする生理学的結果到達のフィードバックのために使用することができる。例えば、フィードバックは、少なくとも１つの撮像フレーム内で最小閾値に到達し、変位曲線下面積などに基づいて特定の総変位値を達成することであり得る。
【０１７３】
図５１は、低減された超音波臨床効力で処置した動物における脾臓ノルエピネフリン濃度を示す。図５２は、低減された超音波臨床効力で処置した動物における脾臓ＴＮＦ‐α濃度を示す。図５３は、低減された超音波臨床効力で処置した動物における血中ノルエピネフリン濃度を示す。図５４は、低減された超音波臨床効力で処置した動物における血中ＴＮＦ‐α濃度を示す。低減された臨床効力は１００％の臨床効力に比例している。
【０１７４】
図５５〜図５８は、一度に３０秒または１５秒実施される８００パルスの修正パルスシーケンスを用いた脾臓の超音波刺激からの結果を示し、一度に全て実施される８００サイクルと同じ効果を示している。図５５は、修正パルスシーケンスで処置した動物における脾臓ＴＮＦ‐α濃度を示す。図５６は、修正パルスシーケンスで処置した動物における脾臓ノルエピネフリン濃度を示す。図５７は、修正パルスシーケンスで処置した動物における血中ＴＮＦ‐α濃度を示す。図５８は、修正パルスシーケンスで処置した動物における血中ノルエピネフリン濃度を示す。
【０１７５】
図５９は、機械的振動エネルギーを脾臓に印加した後の対照と比較した脾臓ノルエピネフリン濃度を示し、図６０は、機械的振動エネルギーを脾臓に印加した後の対照と比較した脾臓ＴＮＦ‐α濃度を示す。機械的振動エネルギーは、シェーカー（モデルＳ５０４）および増幅器（ＢＡＡ６０）で構成されるＴＩＲＡ  ＧｍｂＨ製のＴＩＲＡ  Ｖｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＶ５００１８を使用して発生させた。シェーカーの先端は脾臓表面に直接接触させた。図５９および図６０は、機械的振動エネルギーが超音波エネルギーと同様の方法で特定の標的軸索外細胞シナプスを調節することを示す。
【０１７６】
本明細書で提供されるのは、対象となる標的領域の直接的かつ集束的な刺激に基づく神経調節のための技術である。対象となる標的領域は、非神経細胞または体液と共に軸索外細胞シナプスを形成する複数の種類の軸索終末を有する体内の任意の組織または構造であり得る。一例では、対象領域は、脾臓またはリンパ節などの免疫器官または構造内にあってもよい。リンパ組織の神経調節は、排液速度および／または排液中の細胞集団を変化させる可能性がある。免疫細胞とリンパ節のリンパ管区画を神経支配する神経が共存しているために、神経伝達物質の放出はリンパ機能と免疫機能の両方に同時に影響を及ぼす可能性があり、したがって、リンパ機能の観察可能な変化（すなわち、非侵襲的撮像技術を用いたリンパ組織の容易に観察可能なサイズおよび／または流れの変化）を、目標とする生理学的結果として、および免疫細胞神経調節の代用尺度（すなわち、局所神経伝達物質の放出による免疫細胞表現型における同時の変化）として使用することができる。
【０１７７】
本明細書で提供されるのは、「神経免疫シナプス」または「神経免疫インターフェース」に適用され得る技術である。描かれた例は、リンパ節上の出口リンパ管に近接しているリンパ節へのエネルギーの印加に関する。これらの神経は、リンパ節を通るリンパ球の通過を変化させ得、刺激されると、リンパ球保持の増加（すなわち、リンパ節におけるより多くのリンパ球）をもたらす。出口リンパ管からのリンパ球放出を減少させるための１つの分子機構は、βアドレナリン受容体を介したカップリングおよびシグナル伝達を介したｃｃｒ７化学受容器活性の調節である。
【０１７８】
本明細書では、グルコース代謝および関連障害の治療に適用され得る技術も提供される。一実施形態では、１つ以上の対象領域における肝臓調節を用いて、糖尿病、高血糖症、糖尿病関連認知症、肥満、または他の摂食障害もしくは代謝障害を治療することができる。
【０１７９】
本明細書は、本発明を開示し、また任意の装置またはシステムを製造および使用すること、ならびに任意の組み込まれた方法を実行することを含めて当業者が本発明を実施することを可能にするために実施例を使用する。本発明の特許性のある範囲は特許請求の範囲によって定義され、当業者が思い付く他の例を含み得る。そのような他の例は、それらが請求項の文字通りの言語と異ならない構造要素を有する場合、またはそれらが請求項の文字通りの言語とわずかに異なる同等の構造要素を含む場合、請求項の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【国際調査報告】
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