(57)【要約】  本発明は、対象の腎細胞癌の予後診断の方法であって、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を決定するステップを含み、前記試料が前記対象から得られている、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の腎細胞癌（ＲＣＣ）の予後診断の方法であって、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を決定するステップを含み、前記試料が前記対象から得られている、上記方法。
【請求項２】
対照レベル及び／又は化学組成と比較して変化した前記試料中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）及び／又はヘパラン硫酸（ＨＳ）のレベル及び／又は化学組成が、前記対象の腎細胞癌の予後を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学組成の前記決定が、前記試料中のＣＳ又はＨＳ二糖の具体的な硫酸化又は非硫酸化形態、存在する全ＨＳ二糖（チャージＨＳ）のうちのＨＳの硫酸化二糖の割合、存在する全ＣＳ二糖（チャージＣＳ）のうちのＣＳの硫酸化二糖の割合、ＣＳの総濃度又はＨＳの総濃度の１つ又は複数からなる群から選択されるＧＡＧ特性の１つ又は複数のレベルを決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学組成の前記決定が、前記試料中の０ｓ  ＣＳ、２ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ、トリスＣＳ、０ｓ  ＨＳ、２ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、２ｓ６ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ、トリスＨＳ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比、６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比及び４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比からなる群から選択されるＣＳ又はＨＳ二糖の具体的な硫酸化又は非硫酸化形態；存在する全ＨＳ二糖（チャージＨＳ）のうちのＨＳの硫酸化二糖の割合；存在する全ＣＳ二糖（チャージＣＳ）のうちのＣＳの硫酸化二糖の割合；ＣＳの総濃度（ＣＳ  ｔｏｔ）；及びＨＳの総濃度（ＨＳ  ｔｏｔ）からなる群から選択されるＧＡＧ特性の１つ又は複数のレベルを決定することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化学組成の前記決定が、前記試料中の６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比、チャージＨＳ及び総ＣＳからなる群から選択されるＧＡＧ特性の１つ又は複数のレベルを決定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記化学組成の前記決定が、前記試料中の６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比又は４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比からなる群から選択されるＧＡＧ特性の１つ又は複数のレベルを決定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液試料が血漿試料であり、前記化学組成の前記決定が、前記試料中のチャージＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、２ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比、６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、チャージＨＳ、ＨＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ及びＮｓ２ｓ  ＨＳからなる群から選択されるＧＡＧ特性の１つ又は複数のレベルを決定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記体液試料が血漿試料であり、前記化学組成の前記決定が、前記試料中の
（ｉ）ＧＡＧ特性：６ｓ  ＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比及びＮｓ  ＨＳの１つもしくは複数もしくは全部；又は
（ｉｉ）ＧＡＧ特性６ｓ  ＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ及び４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比の１つもしくは複数もしくは全部；又は
（ｉｉｉ）４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比；又は
（ｉｖ）ＧＡＧ特性：６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比、Ｎｓ  ＨＳ及び６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比の１つもしくは複数もしくは全部
のレベルを決定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記体液試料が尿試料であり、前記化学組成の前記決定が、前記試料中のチャージＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、トリスＣＳ、６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、チャージＨＳ、ＨＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＨＳ、２ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ及びトリスＨＳからなる群から選択されるＧＡＧ特性の１つ又は複数のレベルを決定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液試料が尿試料であり、前記化学組成の前記決定が、前記試料中の
（ｉ）ＧＡＧ特性：Ｎｓ６ｓ  ＨＳ、チャージＨＳ及び４ｓ  ＣＳの１つもしくは複数もしくは全部；又は
（ｉｉ）ＧＡＧ特性：４ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、チャージＣＳ及び０ｓ  ＨＳの１つもしくは複数もしくは全部
のレベルを決定することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＡＧ特性の２つ以上のレベルを決定するステップを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＡＧ特性の２つ以上、３つ以上、４つ以上又は全部のレベルを決定するステップを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
場合により総ＣＳ及び／又はチャージＣＳと合わせて、前記硫酸化及び非硫酸化ＣＳ形態の最大８つ又は８つ全て：０ｓ  ＣＳ、２ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ及びトリスＣＳのレベルを決定するステップを含む、及び／又は
場合により総ＨＳ及び／又はチャージＨＳと合わせて、前記硫酸化及び非硫酸化ＨＳ形態の最大８つ又は８つ全て：０ｓ  ＨＳ、２ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、２ｓ６ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ及びトリスＨＳのレベルを決定するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＣＣがステージＩＩＩもしくはＩＶ  ＲＣＣ、転移性ＲＣＣである、又は淡明細胞型ＲＣＣである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、ＲＣＣを発症するリスクがあるもしくはＲＣＣの発生のリスクがある対象である、又はＲＣＣを有するもしくは有する疑いがある対象である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記体液試料が血漿及び／又は尿である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＡＧ又はＧＡＧ特性の前記レベル又は化学組成が、電気泳動又はＨＰＬＣ及び質量分析によって決定される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記電気泳動がキャピラリー電気泳動、好ましくはレーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＳ又はＨＳ二糖の具体的な硫酸化又は非硫酸化形態の１つ又は複数の前記レベルが決定され、前記ＧＡＧが分析用の二糖単位を得るための処理ステップに供される、請求項３から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
療法又は外科手術によってＲＣＣを治療するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記予後が無増悪生存に関するものである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記予後が全生存に関するものである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腎細胞癌が転移性淡明細胞型腎細胞癌（ｍｃｃＲＣＣ）である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対照レベルがｍｃｃＲＣＣで上昇する１つ又は複数のＧＡＧ形態のレベルである場合、前記対照レベルと比較して上昇した前記対象の前記ＧＡＧ形態のレベルが、悪い又はより悪い予後を示し得る、又は前記対照レベルと比較して低下した前記対象の前記ＧＡＧ形態のレベルが、良好な又はより良好な予後を示し得る、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
対照レベルがｍｃｃＲＣＣで低下する１つ又は複数のＧＡＧ形態のレベルである場合、前記対照レベルと比較して上昇した前記対象の前記ＧＡＧ形態のレベルが、良好な又はより良好な予後を示し得る、又は前記対照レベルと比較して低下した前記対象の前記ＧＡＧ形態のレベルが、悪い又はより悪い予後を示し得る、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎細胞癌のバイオマーカー及び腎細胞癌、特に淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）をスクリーニングする方法に関する。このような方法は、対象の腎細胞癌を示すあるバイオマーカーのレベル及び／又は組成を決定するステップを含む。
【０００２】
淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）は、腎がんの最も一般的な形態である。しかしながら、現時点では、診療所で使用されている診断バイオマーカーは特定されていない。
【０００３】
したがって、当技術分野で必要とされているものは、腎細胞癌をスクリーニングする新しい方法である。腎細胞癌（ＲＣＣ）のための新規なバイオマーカーの特定は、多数の患者にとっての臨床的意味を潜在的に有し、重要な臨床的進歩となるだろう。これまで、バイオマーカーの発見及びその診療への橋渡しが損なわれていた主な難点の中に、入手可能な試料中の標的の検出及び結果の再現性がある（Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８）。ここで、本発明者らは、ｃｃＲＣＣを検出するための高度に特異的で感受性の高いアッセイに使用することができるｃｃＲＣＣの血漿及び／又は尿マーカーの証拠を提供する。そのため、有利には、このような方法は、非侵襲性であり、容易に得ることができる試料に対して行われるのと同時に、非常に正確で再現性がある。
【０００４】
このような試験の有効性は、いくつかの医学的決定のための価値を有する：外科手術又は薬物治療前後のｃｃＲＣＣを監視すること；長期間、疾患の再燃を除外し、その後患者に典型的に治癒を宣言すること；リスクがある集団、例えば遺伝的素因のある個体におけるｃｃＲＣＣの発生を評価すること；転移がｃｃＲＣＣによるのか他の新生物によるのかを確認すること；フォローアップ中の限局性ｃｃＲＣＣを有する患者における転移性再燃を予測すること；ｃｃＲＣＣの疑いのある小型腎腫瘤を非悪性疾患と識別すること。
【０００５】
これに関して、本発明者らは、一定のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、すなわちコンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）ならびに前記ＧＡＧの化学組成が、対照の対象と比較して腎細胞癌患者の体液試料において異なるレベルで見られることを特定した。ＧＡＧ  ＣＳもしくはＨＳのこれらの異なるレベル、又はＧＡＧ  ＣＳもしくはＨＳの異なる化学組成（ＧＡＧプロファイル）は、腎細胞癌のバイオマーカーとして作用することができ、よって、対象の腎細胞癌のスクリーニングに有用である。したがって、本発明者らは、入手可能な流体からのＧＡＧプロファイルが、疾患のバイオマーカーとして、特に診断バイオマーカーとして、及び予後バイオマーカーとして使用するのに適していることを決定した。
【０００６】
以前の研究（Ｂａｔｉｓｔａら、２０１２、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９：１０３６〜１０４０）は、同じ患者の非腫瘍組織に対するＲＣＣ組織のＣＳレベル上昇ならびにＨＳレベル及びデルマタン硫酸（ＤＳ）レベルの低下を見出した。しかしながら、この研究は、尿中のＧＡＧレベルがＲＣＣ試料と対照試料との間に有意差を示さなかったことを報告した。
【０００７】
驚くべきことに、また有利には、本発明者らは、ＧＡＧ  ＣＳ及びＨＳのレベルの変化がＲＣＣ患者の入手可能な体液で観察され、これらのＧＡＧプロファイルが疾患のバイオマーカーとして使用するのに適していることを見出した。本発明者らはまた、ＣＳ及びＨＳ及びＨＡの全体（総）レベル又は濃度に加えて、化学組成、例えばＣＳ及びＨＳの具体的な二糖硫酸化パターンの他の変化もがん試料と正常試料との間で観察され、ＲＣＣを診断するために極めて有効に使用することができることを示した。本発明者らは、自らがＲＣＣ患者の体液中のＨＳ及びＣＳの具体的な硫酸化パターンを分析した一番目であり、ＧＡＧの具体的な組成（例えば硫酸化）に関連するさらなるパラメータのこのような分析が改善した診断及び予後結果を提供すると信じている。
【０００８】
明らかに、対象の入手可能な体液試料、例えば血漿又は尿で診断及び／又は予後診断を行うことができるという所見は、極めて有利であり、健康な個体の血漿中のＧＡＧ組成は典型的にはいずれの組織によっても影響を受けず、健康な恒常性を反映するので通常は安定であるため、血漿試料で変化が観察されることは特に驚くべきことである。しかしながら、ここで、本発明者らは、ｃｃＲＣＣに付随するＧＡＧ組成の全身変化を観察した。
【０００９】
有利には、本発明者らはまた、ｃｃＲＣＣの発生の特色を示し、入手可能な体液の測定値に基づいて計算される特定されたマーカーが、一定の交絡因子とは無関係に臨床成績を予測し、疾患の正確で堅牢な予測因子となることを示した。予後を予測する能力も実証されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、対象の腎細胞癌をスクリーニングする方法であって、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を決定するステップを含み、前記試料が前記対象から得られている、方法を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい方法では、対照レベル及び／又は組成と比較して変化した前記試料中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）及び／又はヘパラン硫酸（ＨＳ）のレベル及び／又は組成が、前記対象の腎細胞癌を示す。
【００１２】
本発明の好ましい方法では、レベルと化学組成の両方が決定される。本発明の他の好ましい方法では、化学組成のみが決定され、又は他の好ましい方法では、ＣＳ及び／又はＨＳのレベル（総レベル又は総濃度）のみが決定される。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、ヒアルロン酸（ＨＡ）のレベル（総レベル又は総濃度）を、単独で、あるいはＨＳ及び／又はＣＳのレベル及び／又は化学組成と組み合わせて測定することができる。したがって、本発明のさらなる方法は、対象の腎細胞癌をスクリーニングする方法であって、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）の１つ又は複数のレベル及び／又は化学組成を決定するステップを含み、前記試料が前記対象から得られている、方法を提供する。
【００１４】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、セリン残基上でタンパク質に結合している、すなわちプロテオグリカンの一部を形成することができる糖含有分子である。これらは、硫酸化することができる単糖の直鎖又は非分岐鎖（すなわち、多糖）から形成される。ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びヘパリンは、ＧＡＧの一般的な型であり、その中でＨＳ及びＣＳは硫酸化ＧＡＧの例である。異なる型のＧＡＧは、異なる反復二糖単位によって識別される。しかしながら、全ての型がタンパク質のセリン残基に結合した同じ四糖コアを有する。
【００１５】
例として、例えば、ＣＳ及びＨＳは、コアタンパク質との結合において共通の生合成経路を共有するＧＡＧであるが、その後、ＣＳ反復二糖は反復Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基で構成される一方で、ＨＳの反復二糖は、典型的には反復Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＡ）残基で構成されるという点で、その重合において異なる。各単糖は、ＧＡＧ合成に対して複数のレベルの調節を可能にする特異的酵素によって結合される。
【００１６】
本明細書で言及されるＨＳ又はＣＳ又はＨＡの「レベル」は、一般に、試料中に存在するＨＳ又はＣＳ又はＨＡの総レベル又は量（例えば、濃度）を指す。試料中のＣＳ及び／又はＨＳ及び／又はＨＡのレベルは、当技術分野で周知であり、記載される任意の適切な方法によって測定又は決定することができる。好ましい方法は、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、例えば、蛍光検出、例えばレーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動を含む。他の適切な方法は、場合により質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）と組み合わせた、ゲル電気泳動、例えば、アガロースゲル電気泳動（例えば、ＦＡＣＥ、発蛍光団援用炭水化物電気泳動）又は質量分析又は液体クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣである。好都合には、これらのレベルは、例えば、１ｍｌ当たりのマイクログラム数（μｇ／ｍｌ）として、濃度として測定することができる。しかしながら、任意の適切なレベルの尺度を使用することもできる。
【００１７】
本発明の方法では、ＨＳ又はＣＳ又はＨＡのレベルが、別々に又は個別に決定される。換言すれば、この方法は、試料中の総ＧＡＧレベルの測定又は組み合わせて存在する全てのＧＡＧの総レベルの測定を含まないが、個々のＧＡＧ  ＨＳ又はＣＳ又はＨＡの１つ又は複数のレベルの測定を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、前記試料中のＣＳのレベル（又は濃度）上昇及び／又は前記試料中のＨＳのレベル（又は濃度）上昇が、前記対象のＲＣＣを示し、本明細書の他の箇所に記載されるように対象をスクリーニング、診断等するために使用することができる。
【００１９】
特定の実施形態では、ＣＳのレベル（例えば、総レベル又は濃度）を、例えば、血漿又は尿試料において決定することができる。
【００２０】
他の特定の実施形態では、ＨＳのレベル（例えば、総レベル又は濃度）を、例えば、血漿又は尿試料において決定することができる。好ましくは、前記試料が血漿試料である。
【００２１】
特に、血漿試料中のＣＳのレベル（又は濃度）上昇は、前記対象のＲＣＣを示す。
【００２２】
特に、尿試料中のＣＳのレベル（又は濃度）上昇は、前記対象のＲＣＣを示す。
【００２３】
特に、血漿試料中のＨＳのレベル（又は濃度）上昇は、前記対象のＲＣＣを示す。
【００２４】
特に、尿試料中のＨＳのレベル（又は濃度）上昇は、前記対象のＲＣＣを示す。
【００２５】
特に、尿試料中のＨＡのレベル（又は濃度）上昇は、前記対象のＲＣＣを示す。
【００２６】
特に、血漿試料中のＨＡのレベル（又は濃度）低下は、前記対象のＲＣＣを示す。
【００２７】
ＣＳ及びＨＳを構成する個々の単糖単位は、硫酸分子の位置及び硫酸分子の量／数に関して異なる硫酸化パターンを有することができる。ＣＳについては、硫酸化がＧｌｃＡの２位ならびにＧａｌＮＡｃの４位及び６位の１つ又は複数に最も一般的に生じ得る。ＨＳについては、硫酸化がＩｄｏＡ（イズロン酸）へのエピマー化後のＧｌｃＡの２位、ＧｌｃＮＡｃの３位及び６位、ならびにＧｌｃＮＡｃのＮ−硫酸化の１つ又は複数で生じ得る。したがって、ＧＡＧ鎖中の各個々の二糖は、０（すなわち、非硫酸化）、１、２、３又は４（ＨＳのみ）硫酸化形態を有することができ、これが次に硫酸化レベル及び具体的な二糖硫酸化パターンの点で異なるＧＡＧ鎖の全体化学組成を生じる。
【００２８】
本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明の好ましい実施形態は、ＣＳ及びＨＳの一方又は両方の化学組成の決定を含む。本明細書で使用される「化学組成」という用語は、ＧＡＧのレベルならびにＧＡＧの二糖硫酸化組成の両方を指すことができる。特に、この用語は、ＣＳ又はＨＳ  ＧＡＧを構成する二糖の１つ又は複数の特定の形態、例えば硫酸化形態の決定を含む。言い換えれば、「化学組成」という用語は、ＣＳ又はＨＳ二糖の種々の硫酸化及び／又は非硫酸化形態の１つ又は複数の量又はレベル、ならびに例えば存在する個々のＧＡＧのいくつかの他の特性、例えば総ＨＳもしくはＣＳもしくはＨＡ  ＧＡＧレベル、又はＧＡＧ硫酸化に関連する他の特性、例えば本明細書の他の箇所に記載されるＨＳチャージもしくはＣＳチャージを指す。本発明において分析又は決定されるこのような化学組成を、本明細書ではＧＡＧプロファイル、ＧＡＧ形態、ＧＡＧ特徴又はＧＡＧ特性とも呼ぶことができる。これに関して、以下により詳細に記載される最大２２種の異なるＧＡＧ特性を本発明の方法で測定することができ、特定の試料から採取されたこれらの測定値の収集物又は群（例えば、２つ以上）をＧＡＧプロファイルと呼ぶことができる。本発明の好ましい実施形態では、以下により詳細に記載される最大２０種の異なるＧＡＧ特性を測定することができる。
【００２９】
したがって、例えば、本明細書で使用される「化学組成」という用語は、ＣＳ及び／又はＨＳを構成する二糖の硫酸化パターン（例えば、硫酸化形態の１つ又は複数）の決定又は分析を指し得る。
【００３０】
例えば、ＣＳについては、０ｓ  ＣＳ（非硫酸化ＣＳ又はＣＳＯ単位とも呼ばれる）、２ｓ  ＣＳ（コンドロイチン−２−硫酸とも呼ばれる）、４ｓ  ＣＳ（コンドロイチン−４−硫酸又はＣＳ  Ａ単位とも呼ばれる）、６ｓ  ＣＳ（コンドロイチン−６−硫酸又はＣＳ  Ｃ単位とも呼ばれる）、２ｓ４ｓ  ＣＳ（コンドロイチン−２−４−硫酸とも呼ばれる）、２ｓ６ｓ  ＣＳ（コンドロイチン−２−６−硫酸又はＣＳ  Ｄ単位とも呼ばれる）、４ｓ６ｓ  ＣＳ（コンドロイチン−４−６−硫酸又はＣＳ  Ｅ単位とも呼ばれる）及びトリスＣＳ（コンドロイチン−２−４−６−硫酸又は三硫酸化ＣＳとも呼ばれる）である８つの主な硫酸化及び非硫酸化形態（硫酸化パターン、二糖硫酸化形態）が存在する。
【００３１】
上記の各々が、本発明の方法において測定され得るＣＳ  ＧＡＧの形態（ＣＳ  ＧＡＧ形態又は特性）である。これらの形態の１つ又は複数を測定することができ、例えばこれらの硫酸化形態の最大８つ、例えば１、２、３、４、５、６、７又は８つ全てを測定することができる。いくつかの実施形態では、これらの硫酸化形態の８つ全ての測定が好ましい。本発明の方法において測定され得るＣＳについての別のＧＡＧ特性は、ＣＳの総濃度（本明細書ではＣＳ  ｔｏｔ又はＴｏｔ  ＣＳとも呼ばれる）又はＣＳの総レベルである。これは、典型的には本明細書の他の箇所に記載されるように、例えばμｇ／ｍｌの濃度として測定される。ＣＳの総濃度がＧＡＧ特性の１つとして測定される本発明の実施形態では、少なくとも１つの他のＧＡＧ特性又はＣＳ特性、例えば存在する他の個々のＧＡＧの総レベル（例えば、総ＨＳでも総ＨＡでもない）に基づかない特性が測定されることが好ましい。いくつかの実施形態では、ＣＳの総濃度が測定されない。いくつかの実施形態では、特に試料が尿試料である場合に、１つ又は複数のＣＳ  ＧＡＧ特性の測定が好ましい。
【００３２】
「チャージＣＳ」は、例えば、ＧＡＧプロファイルの一部として、本発明で測定され得る別のＧＡＧ形態又は特性である。「チャージＣＳ」は、ＣＳの硫酸化二糖の総割合、すなわち、試料中に存在する又は測定される全ＣＳ二糖の中の試料中に存在する又は測定されるＣＳの硫酸化二糖の割合（すなわち、硫酸化ＣＳ二糖／硫酸化＋非硫酸化ＣＳ二糖）を指す。例として、試料が血漿試料である場合、ＣＳ（０ｓ  ＣＳ）の非硫酸化形態に加えて、チャージＣＳ（４ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ＋０ｓ  ＣＳ）を計算するために、４ｓ  ＣＳを主な硫酸化形態として測定することもできる。あるいは、試料が尿試料である場合、ＣＳ（０ｓ  ＣＳ）の非硫酸化形態に加えて、チャージＣＳ（４ｓ  ＣＳ＋６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ＋６ｓ  ＣＳ＋０ｓ  ＣＳ）を計算するために、４ｓ  ＣＳ及び６ｓ  ＣＳ主な硫酸化形態として測定することもできる。
【００３３】
「チャージＣＳ」の測定値は他の特性、すなわち硫酸化及び非硫酸化ＣＳ二糖のレベルの測定値に依存するので、この特性は本明細書では独立したＧＡＧ特性又はＣＳ特性と呼ばれない。したがって、総ＣＳと合わせて、上で列挙される８つの硫酸化形態及び非硫酸化形態である最大９つの独立したＣＳ特性を本発明の方法で測定することができる。いくつかの実施形態では、これらの独立したＣＳ特性の９つ全てが測定される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、総ＣＳ及びチャージＣＳと合わせて、ＣＳ硫酸化形態（すなわち、硫酸化及び非硫酸化形態）の最大８つ又は８つ全てを測定することが好ましい。
【００３５】
例えば、ＨＳについては、０ｓ  ＨＳ（非硫酸化ＨＳとも呼ばれる）、２ｓ  ＨＳ（ＧｌｃＡの２位で硫酸化されている）、Ｎｓ  ＨＳ（ＧｌｃＮＡｃのＮ位で硫酸化されている）、６ｓ  ＨＳ（ＧｌｃＮＡｃの６位で硫酸化されている）、２ｓ６ｓ  ＨＳ（ＧｌｃＡの２位及びＧｌｃＮＡｃの６位で硫酸化されている）、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ（ＧｌｃＮＡｃの６位及びＮ位で硫酸化されている）、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ（ＧｌｃＡの２位及びＧｌｃＮＡｃのＮ位で硫酸化されている）、トリスＨＳ（ＧｌｃＡの２位ならびにＧｌｃＮＡｃの６位及びＮ位で硫酸化されている、三硫酸化ＨＳとも呼ばれる）である８つの主な硫酸化及び非硫酸化形態（硫酸化パターン、二糖硫酸化形態）が存在する。ＧｌｃＮＡｃの３位の硫酸化も可能であるが、めったに観察されないことに留意されたい。
【００３６】
上記の各々が、本発明の方法において測定又は決定され得るＨＳ  ＧＡＧの形態（ＨＳ  ＧＡＧ形態又は特性）である。しかし、その希少性ゆえに、本発明の好ましい実施形態では、ＧｌｃＮＡｃの３位に硫酸化を有する硫酸化形態が測定されない。したがって、本発明の方法では、これらの９つ（又は好ましくは８つ）の形態の１つ又は複数を測定することができ、例えばこれらの硫酸化形態の最大９つ（又は好ましくは最大８つ）、例えば１、２、３、４、５、６、７、８又は９つ全てを測定することができる。いくつかの実施形態では、これらの硫酸化形態の８つ全て（ＧｌｃＮＡｃの３位に硫酸化を有する硫酸化形態を除く）の測定が好ましい。本発明の方法において測定され得るＨＳについての別のＧＡＧ特性は、ＨＳの総濃度（本明細書ではＨＳ  ｔｏｔ又はＴｏｔ  ＨＳとも呼ばれる）又はＨＳの総レベルである。これは、典型的には本明細書の他の箇所に記載されるように、例えばμｇ／ｍｌの濃度として測定される。ＨＳの総濃度がＧＡＧ特性の１つとして測定される本発明の実施形態では、少なくとも１つの他のＧＡＧ特性又はＨＳ特性、例えば存在する他の個々のＧＡＧの総レベル（例えば、総ＣＳでも総ＨＡでもない）に基づかない特性が測定されることが好ましい。いくつかの実施形態では、ＨＳの総濃度が測定されない。例えば、試料が血漿又は尿である場合、特に試料が尿試料である場合には、１つ又は複数のＨＳ  ＧＡＧ特性の測定が本発明の方法において好ましい。
【００３７】
「チャージＨＳ」は、例えば、ＧＡＧプロファイルの一部として、本発明で測定され得る別のＧＡＧ形態又は特性である。チャージＨＳは、ＨＳの硫酸化二糖の総割合、すなわち、試料中に存在する又は測定される全ＨＳ二糖の中の試料中に存在する又は測定されるＨＳの硫酸化二糖の割合（すなわち、硫酸化ＨＳ二糖／硫酸化＋非硫酸化ＨＳ二糖）を指す。例えば、試料が血漿又は尿試料である場合、ＨＳ（０ｓ  ＨＳ）の非硫酸化形態に加えて、チャージＨＳ（例えば、Ｎｓ  ＨＳ＋６ｓ  ＨＳ＋２ｓ  ＨＳ／Ｎｓ  ＨＳ＋６ｓ  ＨＳ＋２ｓ  ＨＳ＋０ｓ  ＨＳ）を計算するために、Ｎｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ及び／又は２ｓ  ＨＳを主な硫酸化形態として測定することもできる。
【００３８】
「チャージＨＳ」の測定値は他の特性、すなわち硫酸化及び非硫酸化ＨＳ二糖の測定値に依存するので、この特性は本明細書では独立したＧＡＧ特性又はＨＳ特性と呼ばれない。したがって、総ＨＳと合わせて、上で列挙される９つの硫酸化及び非硫酸化形態（好ましくはＧｌｃＮＡｃの３位に硫酸化を有する硫酸化形態を除く）である最大１０個の独立したＨＳ特性を本発明の方法で測定することができる。したがって、いくつかの実施形態では、９つの独立したＨＳ特性が測定される（８つの主な硫酸化及び非硫酸化ＨＳ形態＋総ＨＳ）。
【００３９】
いくつかの実施形態では、総ＨＳ及びチャージＨＳと合わせて、ＨＳ主硫酸化形態（すなわち、ＧｌｃＮＡｃの３位に硫酸化を有する硫酸化形態を除く、上で列挙される硫酸化及び非硫酸化形態）の最大８つ又は８つ全てを測定することが好ましい。
【００４０】
いくつかの実施形態では、９つの独立したＨＳ特性が測定され（８つの主な硫酸化及び非硫酸化ＨＳ形態＋総ＨＳ）、９つの独立したＣＳ特性が測定される、すなわち１８個の独立したＧＡＧ特性が測定される。
【００４１】
これらのＧＡＧ特性又はＧＡＧ形態、例えば、二糖硫酸化形態（総ＣＳ又は総ＨＳを除く）は、典型的には、絶対レベル又は濃度としてではなく、分割数又は分数もしくは割合又は相対測定値として測定され、例えば、試料中で測定される全ての硫酸化形態（又は全ての主な硫酸化形態）のレベルに応じて１未満の値が与えられる、又は１に正規化される。換言すれば、所望の各硫酸化形態のレベルを独立して測定し、次いで１に正規化する。このような分数を計算する場合、特定の個々の硫酸化形態の割合を１に正規化することができるように、少なくともＣＳ又はＨＳの主な硫酸化形態を測定することが好ましい。いくつかの実施形態では、好ましくは、少なくともＨＳ又はＣＳの非硫酸化形態が主な硫酸化形態として測定される。試料が血漿試料である場合、ＣＳの非硫酸化形態に加えて、４ｓ  ＣＳも主要な硫酸化形態として測定することができる。試料が尿試料である場合、ＣＳの非硫酸化形態に加えて、４ｓ  ＣＳ及び６ｓ  ＣＳも主な硫酸化形態として測定することができる。試料が血漿又は尿試料である場合、ＨＳの非硫酸化形態に加えて、Ｎｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ及び／又は２ｓ  ＨＳも主な硫酸化形態として測定することができる。
【００４２】
一例として、分数の測定値を得るために、０ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ及び６ｓ  Ｃｓのレベルを試料で個々に測定し、次いで、３つの測定値の合計で割る。相対的測定値がより解釈し易いために一般的に好ましく、例えば、０．６の０ｓ  ＣＳの測定値は、ＣＳ二糖の６０％が硫酸化されていないことを示す。しかしながら、絶対レベルも測定することができる。
【００４３】
本発明の方法において測定され得る別のＧＡＧ特性は、ＨＡの総濃度（本明細書ではＨＡ  ｔｏｔ又はＴｏｔ  ＨＡとも呼ばれる）又はＨＡの総レベルである。これは、典型的には本明細書の他の箇所に記載されるように、例えばμｇ／ｍｌの濃度として測定される。ＨＡの総濃度がＧＡＧ特性の１つとして測定される本発明の実施形態では、少なくとも１つの他のＧＡＧ特性、例えば存在する他の個々のＧＡＧの総レベル（例えば、総ＣＳでも総ＨＳでもない）に基づかない特性が測定されることが好ましい。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、総ＨＡが測定されない、言い換えれば、ＣＳ形態／特性及び／又はＨＳ形態／特性のみが測定される。
【００４５】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、ＣＳ及び／又はＨＳを構成する二糖の１つ又は複数の二糖組成（例えば、具体的硫酸化パターン（例えば、硫酸化形態））が測定又は決定される。より好ましい実施形態では、ＣＳ及び／又はＨＳの１つ又は複数の硫酸化特性又は形態、例えば上で概説されるもの（例えば、０Ｓ  ＣＳ、２Ｓ  ＣＳ等）が測定又は決定される。これを行うための適切な方法は、当業者に周知であり、これらのいずれも使用することができるだろう。しかしながら、二糖組成又は適切な特性又はＣＳもしくはＨＳの形態のこのような定量化（及び二糖形態の分離）を達成する簡便な方法は、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、好ましくは蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動、例えばレーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＬＩＦ）を使用するものである。別の方法は、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、例えばＳＡＸ  ＨＰＬＣである。好ましくは、質量分析法（例えば、ＨＰＬＣ−ＭＳ）、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）も使用される。あるいは、質量分析は、クロマトグラフィー、例えば液体クロマトグラフィーを用いないで使用され得る。特に好ましい方法を例で概説する。特に好ましい方法の一例は、レーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動である。特に好ましい方法の別の例は、ＨＰＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳである。
【００４６】
１つ又は複数の個々の二糖形態のレベルが測定される本発明のいくつかの方法では、ＧＡＧを処理ステップ、例えば化学的消化又は例えばコンドロイチナーゼＡＢＣもしくはコンドロイチナーゼＢによる酵素処理による、例えば断片化又は切断又は消化のステップに供して二糖単位を得て、次いで、これを分析する。
【００４７】
本発明のいくつかの方法では、試料中のＧＡＧを抽出（例えば、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼを使用する）及び／又は精製（例えば、陰イオン交換樹脂を使用する）のステップに供する。
【００４８】
本発明のいくつかの方法では、試料中のＧＡＧ（例えば、試料中の種々の異なるＧＡＧ形態）を、本明細書の他の箇所に記載される分離及び／又は定量化のステップに供する。
【００４９】
使用され得る他の方法は、当技術分野で公知である。しかしながら、例には、種々のＧＡＧ形態に対する抗体の使用を伴う分析技術、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳなどの技術、又はアガロースゲル電気泳動（例えば、発蛍光団援用炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ））もしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を含む方法がある。
【００５０】
したがって、本発明の好ましい方法は、対象の腎細胞癌をスクリーニングする方法であって、体液試料中のＣＳ又はＨＳ二糖の種々の硫酸化及び／又は非硫酸化形態の量又はレベル（換言すれば、ＧＡＧ硫酸化パターンを決定する）、ＨＳ又はＣＳの硫酸化二糖の総割合（すなわち、チャージＨＳ又はチャージＣＳ）、あるいはＣＳ又はＨＳ又はＨＡの総濃度を決定又は測定するステップを含む方法を提供する。ＣＳについては、これは、チャージＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＣＳ、２ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ及びトリスＣＳからなる群から選択されるＣＳの形態の１つ又は複数を決定することを含み得る。ＨＳについては、これは、チャージＨＳ、ＨＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＨＳ、２ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、２ｓ６ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ及びトリスＨＳからなる群から選択されるＨＳの形態の１つ又は複数を決定することを含み得る。ＨＡの場合、これは、ＨＡの総濃度、すなわちＨＡｔｏｔを決定することを含み得る。
【００５１】
本明細書で論じられるように、本発明の方法は、本明細書示される一定の具体的なＧＡＧ形態（又はＧＡＧ形態の群）「からなる群から選択される」１つ又は複数の具体的なＧＡＧ形態（又はＧＡＧ形態の群）を決定又は測定することを含み得る。疑義を避けるために、本明細書で論じられる具体的なＧＡＧ形態（又はＧＡＧ形態の群）が測定又は決定されるいくつかの実施形態では、１つもしくは複数の他の（又は別個の）ＧＡＧ形態及び／又は１つもしくは複数の他のバイオマーカーをさらに測定又は決定することができる。したがって、「からなる群から選択される」は、「オープンな」用語であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられる具体的なＧＡＧ形態（又はＧＡＧ形態の群）の１つ又は複数のみが測定又は決定される（例えば、他のＧＡＧ形態も他のバイオマーカーも測定も決定もされない）。
【００５２】
いくつかの実施形態では、２ｓ６ｓ  ＨＳが決定されない。
【００５３】
いくつかの実施形態では、例えば対照レベルと比較して、前記試料中のＮｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ及びトリスＨＳの１つ又は複数のレベル上昇が、前記対象のＲＣＣを示す。
【００５４】
本発明の方法で測定又は決定される特に好ましいＧＡＧ形態は、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ又は逆比６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）、チャージＨＳ及びＣＳ合計の１つ又は複数である。本発明の方法で測定される他の好ましいＧＡＧ形態は、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）又は０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）の１つ又は複数である。
【００５５】
血漿試料については、本発明の好ましい実施形態では、本方法が、チャージＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、２ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ又は逆比４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）又は０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）の１つ又は複数の決定を含み得る。
【００５６】
血漿試料については、ＣＳの硫酸化形態の１つもしくは複数又は総ＣＳの増加がＲＣＣを示す。特に、チャージＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、２ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ）又は０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ）の１つ又は複数の増加が、前記対象のＲＣＣを示す。あるいは、チャージＣＳ、２ｓ  ＣＳ、２ｓ６ｓ  ＣＳ、２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ）又は０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ）の１つ又は複数の増加が、前記対象のＲＣＣを示す。
【００５７】
血漿試料については、６ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）の低下が、前記対象のＲＣＣを示す。６ｓ  ＣＳに対する０ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比０ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）又は４ｓ  ＣＳに対する０ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば比率０ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）の低下が、前記対象のＲＣＣを示す。
【００５８】
したがって、これらのマーカーは、本発明の方法で個別に使用することができるが、これらを組み合わせて、例えばマルチマーカーアッセイの形態で使用することもできる。これらの比は特に好ましいマーカーであり、最も特に、６ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ又は６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）を反映するマーカーが好ましい。
【００５９】
血漿試料については、本発明の好ましい実施形態では、本方法が、チャージＨＳ、ＨＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ及びＮｓ２ｓ  ＨＳの１つ又は複数の決定を含む。本発明の他の好ましい実施形態では、本方法が、チャージＨＳ、０ｓ  ＨＳ及びＮｓ  ＨＳの１つ又は複数の決定を含む。特に、例えば対照レベルと比較して、ＨＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＨＳ及びＮｓ  ２ｓ  ＨＳの１つ又は複数のレベルの上昇が、前記対象のＲＣＣを示す。あるいは、例えば対照レベルと比較して、チャージＨＳ及びＮｓ  ＨＳの１つ又は複数のレベルの低下が、前記対象のＲＣＣを示す。したがって、これらのマーカーは、本発明の方法で個別に使用することができるが、これらを組み合わせて、例えばマルチマーカーアッセイの形態で使用することもできる。
【００６０】
血漿試料については、いくつかの実施形態では、ＨＡ  ｔｏｔを測定することができる。例えば対照レベルと比較して、ＨＡ  ｔｏｔのレベルの低下が、前記対象のＲＣＣを示す。
【００６１】
尿試料については、本発明の好ましい実施形態では、本方法が、チャージＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、トリスＣＳ、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）、０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）の１つ又は複数の決定を含み得る。本発明の他の好ましい実施形態では、チャージＣＳ、０ｓ  ＣＳ、トリスＣＳ、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）又は０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ又は逆比０ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）の１つ又は複数が決定される。
【００６２】
特に、尿試料については、例えば対照レベルと比較して、ＣＳ  ｔｏｔ及び０ｓ  ＣＳ（非硫酸化ＣＳ）の１つ又は複数のレベルの上昇が、前記対象のＲＣＣを示す。特定の実施形態では、例えば対照レベルと比較して、０ｓ  ＣＳのレベルの上昇が、前記対象のＲＣＣを示す。あるいは、例えば対照レベルと比較して、ＣＳの硫酸化形態の１つ又は複数のレベルの低下が、前記対象のＲＣＣを示す。特に、例えば対照レベルと比較して、チャージＣＳ、６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、トリスＣＳ、０ｓ  ＣＳに対する６ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比６ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ）及び０ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ）の１つ又は複数のレベルの低下が、前記対象のＲＣＣを示す。
【００６３】
したがって、これらのマーカーは、本発明の方法で個別に使用することができるが、これらを組み合わせて、例えばマルチマーカーアッセイの形態で使用することもできる。これらの比は特に好ましいマーカーである。
【００６４】
尿試料については、本発明の好ましい実施形態では、本方法が、チャージＨＳ、ＨＳ  ｔｏｔ、０ｓ  ＨＳ、２ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ及びトリスＨＳの１つ又は複数の決定を含む。他の好ましい実施形態では、チャージＨＳ、０ｓ  ＨＳ、２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ及びトリスＨＳの１つ又は複数が決定される。例えば、尿試料では、例えば対照レベルと比較して、ＨＳの硫酸化形態又は総ＨＳの１つ又は複数のレベルの上昇が、ＲＣＣを示す。特に、例えば対照レベルと比較して、チャージＨＳ、ＨＳ  ｔｏｔ、２ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、Ｎｓ  ＨＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ及びトリスＨＳの１つ又は複数のレベルの上昇が、前記対象のＲＣＣを示す。あるいは、例えば対照レベルと比較して、０ｓ  ＨＳ（非硫酸化ＨＳ）のレベルの低下が、前記対象のＲＣＣを示す。したがって、これらのマーカーは、本発明の方法で個別に使用することができるが、これらを組み合わせて、例えばマルチマーカーアッセイの形態で使用することもできる。
【００６５】
尿試料については、いくつかの実施形態では、ＨＡ  ｔｏｔを測定することができる。例えば対照レベルと比較して、ＨＡ  ｔｏｔのレベルの上昇が、前記対象のＲＣＣを示す。
【００６６】
したがって、いくつかの実施形態では、単一のＧＡＧ形態のレベル（ＧＡＧ特性）が決定される。例えば、一実施形態では、本方法が、ＲＣＣと健康な試料との間で有意に変化するものとして本明細書の表Ａで特定される１つ又は複数のＧＡＧ特徴（ＧＡＧ特性）、すなわち、５．００未満の「ＲＯＰＥ％」（実質的に等価な範囲）を有する特徴の試料中のレベルを決定するステップを含む。
【００６７】
他の実施形態では、ＧＡＧ形態の２つ以上のレベル（ＧＡＧ特性）が決定される（例えば、２つ以上のＧＡＧ形態、又は３つ以上のＧＡＧ形態、又は４つ以上のＧＡＧ形態、又は５つ以上のＧＡＧ形態のレベルが決定される）。「２つ以上の」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等．．．２０又は２２（２〜２０の間の全ての整数又は２及び２２を含む）を意味する。本明細書で提供されるマーカー又はＧＡＧ特性の任意のリストにおいて、全てが測定されるのが好ましい実施形態である。また、ＧＡＧ形態の各々の及び全ての可能な組合せのレベルの決定を行うことができる。
【００６８】
したがって、いくつかの実施形態では、マルチマーカー法が行われる。ＧＡＧ形態の複数のレベル（バイオマーカー多重化）の決定は、スクリーニング（例えば、診断）精度を改善し得る。
【００６９】
好ましい実施形態では、明言されるＧＡＧ形態の２つのレベルが決定される。別の好ましい実施形態では、明言されるＧＡＧ形態の３つのレベルが決定される。さらに別の好ましい実施形態では、明言されるＧＡＧ形態の４つ又は５つのレベルが決定される。
【００７０】
血漿の場合、決定される特に好ましいマーカーは、６ｓ  ＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比（例えば、６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ又は４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）及びＮｓ  ＨＳの１つもしくは複数もしくは全部；６ｓ  ＣＳ、ＣＳ  ｔｏｔ及び４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比（例えば、６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ又は４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）の１つもしくは複数もしくは全部；又は４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比（例えば、６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ又は４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）である。したがって、これらのＧＡＧ形態の１つ以上、２つ以上、３つ以上又は好ましくは全てが、本発明の方法において測定され得る。
【００７１】
血漿の場合、精度でランク付けされた以下のＧＡＧ形態（特性）のレベルを決定することによって、最高精度に達した：６ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比（例えば４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ）、Ｎｓ  ＨＳ、６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比（例えば、６ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ）。したがって、これらのＧＡＧ形態の１つ以上、２つ以上、３つ以上又は好ましくは全てが、本発明の方法において測定され得る。好ましい実施形態では、最も正確な形態、すなわち６ｓ  ＣＳが最初に使用される。他の形態を追加する場合、リストに示される順序でこれらを追加する、すなわち次に４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比等である。他の実施形態では、６ｓ  ＣＳが測定されない。
【００７２】
血漿中の他の好ましいＧＡＧ形態は、表Ａで５．００未満、例えば４．００、３．００、２．００もしくは１．００未満又はさらには０．００の値のＲＯＰＥ値を有するとして特定することができる。
【００７３】
尿の場合、決定される特に好ましいマーカーは、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ、チャージＨＳ及び４ｓ  ＣＳの１つ又は複数又は全部である。したがって、これらのＧＡＧ形態の１つ以上、２つ以上又は好ましくは全てが、本発明の方法において測定され得る。
【００７４】
尿の場合、精度でランク付けされた以下のＧＡＧ形態（特性）のレベルを決定することによって、最高精度に達した：４ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比（例えば４ｓ  ＣＳ／０ｓ  ＣＳ）、ＣＳチャージ、０ｓ  ＨＳ。したがって、これらのＧＡＧ形態の１つ以上、２つ以上、３つ以上又は好ましくは全てが、本発明の方法において測定され得る。好ましい実施形態では、最も正確な形態、すなわち４ｓ  ＣＳが最初に使用される。他の形態を追加する場合、リストに示される順序でこれらを追加する、すなわち次に４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比等である。他の実施形態では、４ｓ  ＣＳが測定されない。
【００７５】
いくつかの実施形態では、６ｓ  ＣＳに対する４ｓ  ＣＳの相対レベル（例えば、比４ｓ  ＣＳ／６ｓ  ＣＳ又は６ｓ  ＣＳ／４ｓ  ＣＳ）が、本発明の方法（例えば、診断又は予後診断方法）で測定又は決定される（例えば、血漿試料において）。
【００７６】
ＲＣＣ患者対健康な患者の種々のＧＡＧ形態のレベルで観察された変化に基づいて、所望であれば、例えば、値又はスコアの形態で、後に診断に使用することができる指標に達するために、このような種々のＧＡＧ形態のレベルを使用するスコアリング方法、スコアリングシステム、マーカー又は式を設計することができる。測定される適切なスコアリングシステム及びパラメータ（例えば、ＧＡＧ形態）は、例えば、表Ａに記載されるデータに基づいて、例えば、表Ａに示される特定の試料（血漿又は尿）で有意な差を示す個々のＧＡＧ特徴又は特性の１つ又は複数に基づいて容易に設計することができる。特に、ＲＣＣ試料と健康な試料との間で最も異なる表ＡのＧＡＧ特性（例えば、好ましくは、ＲＯＰＥ値％が０．００又は０．００に近い１つ又は複数又は全部の特性、例えば、ＲＯＰＥ値％が５．００又は４．００又は３．００又は２．００又は１．００に等しい又は未満である１つ又は複数又は全部の特性）が選択される。
【００７７】
例えば、表Ａを参照すると、ｍｃｃＲＣＣ対健康な対象で最も差次的な血漿ＧＡＧ特性の２つの例はＣＳ  ４ｓ及びＣＳ  ６ｓである。本発明の方法に使用するための単純な式は、これらの２つの特性の比に基づく：
【数１】
2019512690.tif 000002
【００７８】
本明細書の他の箇所に記載されるように、この式で使用するための適切な閾値又はカットオフ値（試料が陽性又は陰性であると宣言するために使用される）は、当業者によって設計され得る。例えば、本発明者はカットオフ値０．０１４６を使用し、このカットオフを上回るスコアは、試料を８５％の精度及び０．９６９のＡＵＣでＲＣＣとして分類する。
【００７９】
添付の例では、スコアリングシステム（式）が、高いスコアが陽性診断（すなわち、ＲＣＣの存在の発見）をもたらすように複数のＧＡＧ形態の測定値を用いて設計されているが、同等に当業者であれば、低いスコアが陽性診断をもたらすようにスコアリング方法及びこのようなスコアリング方法に使用されるパラメータを容易に設計及び選択することができるだろう。このようなスコアリングシステムで分析される関連する特徴も、例えば表Ａに提示されるデータを用いて、分析される試料型に基づいて選択することができる。
【００８０】
いくつかの好ましい及び代表的なスコアリングシステム又は方法（式）が本明細書で提供される。
【００８１】
例えば、対象の血漿試料を分析する場合にスコアをもたらす好ましいスコアリングシステムは、
【数２】
2019512690.tif 000003
である。
【００８２】
対象の尿を分析する場合の好ましいスコアリングシステムは、
【数３】
2019512690.tif 000004
である。
【００８３】
血漿と尿試料の両方を分析する場合に使用される好ましいスコアリングシステムは、
【数４】
2019512690.tif 000005
である。
【００８４】
上記スコアリングシステムにおいて、括弧内の用語は、（本明細書の他の箇所で記載される）関連する特定のＧＡＧ形態の割合を表し、ＣＳｔｏｔはＣＳの総濃度（μｇ／ｍｌ）であり、チャージＨＳはＨＳの硫酸化二糖の総割合である。他の実施形態では、これらの具体的な式が使用されない。
【００８５】
これらの好ましいスコアリングシステムが好ましい例として与えられ、高いスコアはＲＣＣの存在の診断等についての陽性スクリーニングをもたらすことに留意すべきである。しかしながら、スコアにも診断結果にも有意な影響を及ぼさずに、特定の試料で測定されたこれらの式及び／又はパラメータ（ＧＡＧ特性、ＧＡＧ形態）に対する小さな変化をもたらすことができることが明らかである。
【００８６】
例えば、血漿スコアを与える式を参照すると、小さな変化は項
【数５】
2019512690.tif 000006
の係数の変化及び項
【数６】
2019512690.tif 000007
の除去であり得る。
【００８７】
このような修正された式の例は、
【数７】
2019512690.tif 000008
であり得る。
【００８８】
本明細書の他の箇所に記載されるように、この式で使用するための適切な閾値又はカットオフ値（試料が陽性又は陰性であると宣言するために使用される）は、当業者によって設計され得る。例えば、本発明者はカットオフ値０．０８０を使用し、このカットオフを上回るスコアは、試料を８２％の精度及び０．９８１のＡＵＣでＲＣＣとして分類する。
【００８９】
高いスコアががんの存在を示すスコアリングシステムを提供することが目的である場合、好都合には、前記スコアリングシステムを比又は分数として設計することができ、ここで分子はＲＣＣに関連する１つ又は複数のＧＡＧ特性（ＧＡＧ形態）に関連する値の和であり、分母は健康な状態に関連する１つ又は複数のＧＡＧ特性（ＧＡＧ形態）に関連する値の和である。
【００９０】
当然、上に論じられるように、例えば、分子が健康状態に関連する１つ又は複数のＧＡＧ特性（ＧＡＧ形態）に関連する値の和であり、分母がＲＣＣに関連する１つ又は複数のＧＡＧ特性（ＧＡＧ形態）に関連する値の和であり、低いスコアがＲＣＣの存在を示す代替スコアリングシステム（式）を等しく設計することができるだろう。
【００９１】
値又はスコアの形態で、後に診断に使用することができる指標に達するために、ＧＡＧ特性の任意の適切な組合せを含む代替スコアリング方法、スコアリングシステム、マーカー又は式を使用することができる。例えば、前記方法等は、値又はスコアの形態で、後に診断に使用することができる指標に達するために、試料のパターン認識を行うための入力としてのＧＡＧ特性の任意の適切な組合せを含むアルゴリズムであり得る。このようなアルゴリズムの非限定的な例としては、分類を実施する機械学習アルゴリズム（アルゴリズム分類器）、例えば線形分類器（例えば、フィッシャー線形判別、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類器、パーセプトロン）；サポートベクターマシン（例えば、最小二乗サポートベクターマシン）；二次分類器；カーネル推定（例えば、ｋ近傍法）；ブースティング；決定木（例えば、ランダムフォレスト）；ニューラル・ネットワーク；学習ベクトル量子化が挙げられる。
【００９２】
このような分類器、例えば機械学習分類器、例えばランダムフォレスト分類器の使用は当業者の技能の範囲内であるだろう。例えば、このような分類器を、試料の訓練セットからのＧＡＧ特性について簡便に訓練し、次いで、試料の試験セットに対する精度に関して試験することができる。分類器は、最も重要なＧＡＧ特性について訓練されたブラックボックスモデルを作成し、よって、これを使用して、正確な診断に達するために使用することができる最も重要なＧＡＧ特性を特定することができる。
【００９３】
ランダムフォレスト分類器を使用することにより、血漿中の正確な診断のための５つの最も重要なＧＡＧ特性は、（順に）：４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比、Ｎｓ  ＨＳ、６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、６ｓ  ＣＳ及び０ｓ  ＨＳとなった。次の７つの最も重要なＧＡＧ特性は、（順に）２ｓ４ｓ  ＣＳ、４ｓ６ｓ  ＣＳ、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、０ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳ、チャージＨＳ及び６ｓ  ＨＳ（図７参照）となった。したがって、これらのＧＡＧ形態の１つ以上、２つ以上、３つ以上等又は５つ全て又は１２個全てが、本発明の方法において測定され得る。好ましい実施形態では、最も正確な形態、すなわち４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比が最初に使用される。他の形態を追加する場合、リストに示される順序でこれらを追加する、すなわち次にＮｓ  ＨＳ等である。
【００９４】
ランダムフォレスト分類器を使用することにより、尿中の正確な診断のための５つの最も重要なＧＡＧ特性は、（順に）：４ｓ  ＣＳ、４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、０ｓ  ＣＳ、チャージＣＳ、０ｓ  ＨＳとなった。次の７つの最も重要なＧＡＧ特性は、（順に）チャージＨＳ、６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比、Ｎｓ２ｓ  ＨＳ、Ｎｓ６ｓ  ＨＳ、６ｓ  ＨＳ、総ＣＳ及び総ＨＳ（図８参照）となった。したがって、これらのＧＡＧ形態の１つ以上、２つ以上、３つ以上等又は５つ全て又は１２個全てが、本発明の方法において測定され得る。好ましい実施形態では、最も正確な形態、すなわち４ｓ  ＣＳが最初に使用される。他の形態を追加する場合、リストに示される順序でこれらを追加する、すなわち次に４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳの比等である。
【００９５】
上に示される３つの具体的な疾患スコア（血漿、尿及び組合せスコア）の性能を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて評価し、曲線下面積（ＡＵＣ）が、組合せスコア及び血漿スコアの場合には、１．０００（すなわち、完全な分類器）であり、尿スコアについては０．９６６であることが分かった。これを図４Ｂ及び表Ｂに示す。まとめると、これらの所見は、ＲＣＣで起こる血漿及び尿ＧＡＧ化学組成の変化をスコアに要約することができることを示している。同様に、これらのスコアは疾患個体を健康な個体と正確に識別し、よって、スクリーニング、診断等に使用することができる。これらのスコアを、独立したコホートでも検証したところ、適切な閾値又はカットオフ値（試料を陽性又は陰性であると宣言するために使用）を使用すると、３つのマーカースコア全てについて１００％の特異性ならびに１００％（組合せマーカースコアについて）、７７．８％（血漿マーカースコアについて）及び８５．７％（尿マーカースコアについて）の感度で優れた結果（１．０００のＡＵＣ）を示す。図４Ｄ及び表Ｂを参照されたい。よって、これらの結果は、上記発明が、個体におけるＲＣＣの存在の正確な診断を可能にする単純で利用可能な試験を提供することを示した。
【００９６】
本発明の方法では、適切な閾値又はカットオフスコアを、本発明の方法に使用するために、当技術分野で公知の方法、例えばＲＯＣ曲線から計算することができる。したがって、例では、上に論じされる３つの具体的なマーカーシステムについて、マーカーの陽性予測値（ＰＰＶ）を最大にする最適な閾値（カットオフ）スコアを決定／選択した（例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｒａｔｏｎら、２０１４、Ｊ．Ｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗ  ６１、１〜３６）、すなわち、マーカースコアがこの閾値（カットオフ）値未満である試料は、ＲＣＣでない可能性が最大である、又は言い換えると、マーカースコアがこのカットオフ値より上である試料はＲＣＣである確率が最大である。これらのカットオフスコアは０．６１６（組合せマーカースコアについて）、０．２３４（血漿マーカースコアについて）及び１．１３３（尿マーカースコアについて）であった。図４Ｂ及び図４Ｄならびに表Ｂを参照されたい。閾値を決定するこの方法は、本明細書に記載されるマーカーのいずれにも使用することができるだろう。そのため、このような閾値（カットオフ）スコアを好都合に使用して対象の適切な試料を評価し、診断に達することができる。
【００９７】
比較のために、診療所で現在使用されているバイオマーカーのＡＵＣ値は０．６０〜０．７０の範囲である。したがって、本発明の方法は、これに対して有意な進歩をもたらし（ＡＵＣ値１を達成することができる）、臨床的に有用であることが分かる。さらに、９０〜９５％が診療所での使用に望ましいＰＰＶレベルであり、これもまた本発明の方法によって達成される（ＰＰＶ値１００％を達成することができる）。
【００９８】
上に論じられるように、本発明は、対象のＲＣＣをスクリーニングする方法を提供する。あるいは、本発明は、対象のＲＣＣを診断する方法を提供する。あるいは、本発明は、対象のＲＣＣの予後診断（ＲＣＣの将来の重症度、経過及び／又は成績の予後診断）の方法を提供する。あるいは、本発明は、リスクがある対象のＲＣＣの発生を監視する方法を提供する。あるいは、本発明は、対象のＲＣＣの進行を監視する方法を提供する。あるいは、本発明は、対象のＲＣＣの臨床的重症度を決定する方法を提供する。あるいは、本発明は、ＲＣＣの療法に対する対象の応答を予測する方法を提供する。あるいは、本発明は、対象のＲＣＣのための治療的又は外科的レジームの有効性を決定する方法を提供する。あるいは、本発明は、ＲＣＣの再発を検出する方法を提供する。あるいは、本発明は、例えば、それがＲＣＣではない、例えば悪性でない、良性の又は低悪性度腫瘤である（ただし、いくらかの問題のある腎症状を示し、ＲＣＣであると疑われ得る）小型腎腫瘤を有する患者をＲＣＣを有する患者と識別する手段を提供するので、患者選択又は治療選択の方法を提供する。よって、あるいは、本発明は、ＲＣＣを非悪性疾患と識別する方法を提供する。
【００９９】
よって、本発明によるＲＣＣをスクリーニングする方法を、例えば、ＲＣＣを診断する、ＲＣＣを予後診断する、リスクがある対象のＲＣＣの発生を監視する、ＲＣＣの進行を監視する、ＲＣＣの臨床的重症度を決定する、ＲＣＣの療法に対する対象の応答を予測する、ＲＣＣを治療するために使用されている治療的又は外科的レジームの有効性を決定する、ＲＣＣの再発を検出する、患者選択もしくは治療選択、又はＲＣＣの疑いのある小型腎腫瘤を他の非悪性疾患と識別するために使用することができる。ＲＣＣを診断する方法及びＲＣＣの予後診断の方法が好ましい。
【０１００】
よって、一態様では、本発明は、対象のＲＣＣを診断する方法を提供する。いくつかの実施形態では、試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルが対照レベルと比較して変化している（場合によって上昇又は低下している）場合、陽性診断（すなわち、ＲＣＣの存在）が行われる。上昇したレベルがＲＣＣを示す（例えば、診断する）ＧＡＧ形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。低下したレベルがＲＣＣを示す（例えば、診断する）ＧＡＧ形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。あるいは、いくつかの異なるＧＡＧ形態又は特性を、例えばスコアリングシステム又は方法を用いて、本明細書の他の箇所に記載されるように分析して、診断に到達する。本発明の方法を使用して、転移がＲＣＣ、例えばｃｃＲＣＣによるのか他の新生物によるのかを確認することもできる。
【０１０１】
別の態様では、本発明は、対象のＲＣＣの予後診断の方法を提供する。このような方法では、試料中の上に論じられるＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルが、ＲＣＣの将来の重症度、経過及び／又は成績、例えば生存確率を示す。例えば、対照レベルと比較した試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルの変化（場合により上昇又は低下）が予後不良を示し得る。例えば対照レベル（又はスコア）と比較して高度に変化したレベル（又はスコア）は、特に予後不良を示し得る。
【０１０２】
したがって、いくつかの実施形態では、上昇したレベルがＲＣＣを示すＧＡＧ形態の１つ又は複数の上昇したレベルが予後不良を示唆する（すなわち、示す）。いくつかの実施形態では、低下したレベルがＲＣＣを示すＧＡＧ形態の１つ又は複数の低下したレベルが予後不良を示唆する（すなわち、示す）。逆に、１つ又は複数のＧＡＧ形態が変化しないレベル（又は本質的に変化しないレベル）を有する場合、それは良好な予後を示し得る。
【０１０３】
本発明によるＧＡＧ形態（バイオマーカー）の１つ又は複数のレベルの連続的（周期的）測定を、経時的に上昇又は低下するレベル（又はスコア）を探す予後診断目的に使用することもできる。いくつかの実施形態では、（対照レベルと比較した、例えば対照レベルからさらに遠ざかるレベル）経時的なＧＡＧ形態の１つ又は複数の変化するレベル（適宜、上昇又は低下）は、悪化する予後を示し得る。いくつかの実施形態では、（対照レベルと比較した、例えば対照レベルに近づくレベル）経時的なＧＡＧ形態の１つ又は複数の変化するレベル（適宜、上昇又は低下）は、改善する予後を示し得る。
【０１０４】
１つの局面において一態様では、本発明は、ＲＣＣを発症するリスクがある対象のＲＣＣの発生を監視する方法を提供する。このような方法及び測定されるＧＡＧ形態は、本明細書に記載される診断方法に類似であるが、ＲＣＣを発症する特定のリスクがある対象に対して行われ、よって、より注意深い監視から利益を得ることができる。このような「リスクがある」対象は、当業者によって容易に特定されるが、例えば、ＲＣＣの家族歴もしくはＲＣＣへの遺伝的素因を有する対象、又はＲＣＣから寛解した対象、又はＲＣＣの認識される危険因子を有する対象（例えば、慢性腎疾患を有する対象）を含むだろう。
【０１０５】
このように、本発明のいくつかの実施形態では、本方法を「健康な」患者（対象）又は少なくともＲＣＣの臨床症状を示さない患者（対象）、例えば非常に初期もしくは前臨床段階のＲＣＣを有する患者、例えば原発腫瘍が非常に小さいために評価も検出できない患者、又は細胞がＲＣＣに関連する前がん変化を受けているが、まだ悪性になっていない患者に対して行うことができる。
【０１０６】
よって、本発明の方法を使用して疾患進行を監視することもできる。このような監視は、外科手術又は療法、例えば薬学的療法によるＲＣＣの治療前、治療中又は治療後に行うことができる。よって、別の態様では、本発明は、対象のＲＣＣの進行を監視する方法を提供する。
【０１０７】
本発明の方法は、外科手術にも療法にも供されていない患者の能動的監視、例えば未治療患者のＲＣＣの進行を監視するために使用することができる。繰り返しになるが、連続測定により、ＲＣＣが悪化しているか否か、又はその程度の評価が可能になり、例えば、治療的又は外科的介入が必要であるか賢明であるかについてのより筋の通った決定を行うことが可能になり得る。
【０１０８】
上に論じられるように、ＲＣＣの初期の、理想的には前臨床的な指標を得るために、監視を例えば個体、例えばＲＣＣを発症するリスクがあると考えられる健康な個体で行うこともできる。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、対象のＲＣＣの臨床的重症度を決定する方法を提供する。このような方法では、試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルが、ＲＣＣの重症度との関連を示す。よって、ＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルは、ＲＣＣの重症度を示す。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベル（又はスコア）が対照レベルと比較して変化する（場合により、上昇又は低下）ほど、ＲＣＣの重症型の可能性が高くなる。よって、いくつかの実施形態では、本発明の方法を、療法のための患者の選択に使用することができる。
【０１１０】
経時的に上昇又は低下するレベルを探す、ＧＡＧ形態（バイオマーカー）の１つ又は複数のレベル（又はスコア）の連続的（周期的）測定を、ＲＣＣの重症度を監視するために使用することもできる。変化したレベル（場合により上昇又は低下）の観察を使用して、無症状性疾患の設定、すなわち治療もしくは外科手術前、例えば薬学的療法もしくは外科手術の開始前の「注意深い経過観察」の状況においても、又は療法の失敗のサインを探すために治療中もしくは治療後においても療法を導き、監視することができる。
【０１１１】
よって、本発明はまた、療法又は外科手術に対する対象の応答を予測する方法を提供する。例えば、本発明による試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルによって決定される、ＲＣＣのあまり重症でない形態又は初期段階を有する対象は、一般に、療法又は外科手術、特に外科手術に応答性である可能性が高い。このような方法では、療法又は外科手術の選択は、試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルの知識によって導かれ得る。
【０１１２】
本発明はまた、ＲＣＣを治療するために使用されている治療的レジームの有効性を決定する（又は監視する）、換言すれば治療に対する応答をフォロー又は監視する方法を提供する。このような方法では、本発明によるＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベル（又はスコア）の変化（場合により上昇又は低下）が、使用されている治療的レジームの有効性を示す。例えば、上昇したレベル（又はスコア）がＲＣＣを示すＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルが療法中（又は後）に低下した場合、これは有効な治療的レジームを示す。逆に、例えば、低下したレベル（又はスコア）がＲＣＣを示すＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルが療法中（又は後）に上昇した場合、これは有効な治療的レジームを示す。このような方法では、経時的なＧＡＧ形態（バイオマーカー）の１つ又は複数のレベルの連続（周期的）測定を使用して、使用されている治療的レジームの有効性を決定することもできる。同様の方法を用いて、ＲＣＣを治療するために使用されている外科的レジームの有効性を決定（又は監視）する方法を提供することができる。
【０１１３】
本発明はまた、例えばＲＣＣを以前に有していたが、例えば外科手術又は療法（例えば、薬学的療法）によってうまく治療された対象のＲＣＣの再発（再燃）を検出して、結果として彼らが寛解もしくは治癒していると判断する、又は例えばフォローアップ中に限局性ｃｃＲＣＣを有する患者における転移性再発を予測する方法を提供する。このような対象は「リスクがある」カテゴリーを形成し、ＲＣＣの定期的な監視から十分に利益を得ることができる。ＲＣＣの再発（又は再燃）を検出するこのような方法は、ＲＣＣの存在又は非存在を検出するために、本明細書に記載される診断方法を使用する。
【０１１４】
本発明はまた、ＲＣＣを有する患者を、非悪性疾患、例えば非悪性腎疾患（例えば、ＲＣＣではない、例えば悪性でないが、いくらかの問題のある腎症状を示し、ＲＣＣであると疑われ得る小型腎腫瘤の形態である）を有する患者と識別する手段を提供するので、患者選択又は治療選択の方法を提供する。よって、あるいは、本発明の方法は、ＲＣＣを非悪性疾患と識別する方法を提供する。
【０１１５】
このような患者選択もしくは治療選択の方法又はＲＣＣを非悪性疾患と識別する方法は、ＲＣＣの存在又は非存在を検出するために、本明細書に記載される診断方法を使用する。
【０１１６】
ＲＣＣをスクリーニングする方法（例えば、測定するための好ましいＧＡＧ形態又はそれらの組合せ）に関連する本明細書の特徴及び議論を、本発明の他の関連する方法（例えば、ＲＣＣを診断する方法等）に準用する。
【０１１７】
一実施形態では、本発明は、ＲＣＣの他の既知のスクリーニング、診断又は予後診断方法（例えば、放射線イメージング（例えば、放射線イメージング）、又は他の方法）と組み合わせて、本発明の方法（例えば、本明細書に記載のスクリーニング、診断又は予後診断方法など）コンピュータ断層撮影、ＣＴ、スキャン）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩスキャン）、又は組織学的評価、例えば、腫瘍生検を用いた。よって、例えば、本発明の方法を使用して、対象のＲＣＣの診断を確認することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法を単独で使用する。
【０１１８】
当のＧＡＧ形態のレベルは、適切な手段によって対象から得られた、又は取り出された試料を分析することによって決定又は測定することができる。この決定は、典型的にはインビトロで行われる。
【０１１９】
試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルは、そのいくつかが周知であり、当技術分野で文書化されている任意の適切なアッセイによって測定（決定）することができる。本明細書の他の箇所に記載されるように、電気泳動、例えば、質量分析法（ＭＳ）と組み合わせたアガロースゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動（特に、ＣＥ−ＬＩＦなどの蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動）又は液体クロマトグラフィー、特にＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が、本発明によるＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルを測定（決定）するための好ましい技術である。
【０１２０】
適切な電気泳動、例えば、適切な質量分析法（及び関連するデータ処理技術）と合わせたキャピラリー電気泳動、及び液体クロマトグラフィー、例えば、ＧＡＧ形態分析のためのＨＰＬＣ技術は、当技術分野で周知であり、文書化されている。
【０１２１】
試料中のＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルを決定するための特に好ましい方法は、本明細書の例に記載されている。例えば、本発明で使用される好ましい方法は、レーザー誘起蛍光検出、ＣＥ−ＬＩＦ（例えば、Ｇａｌｅｏｔｔｉら、２０１４、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ３５：８１１〜８１８；及びＫｏｔｔｌｅｒら、２０１３、電気泳動３４：２３２３〜２３３６）を伴うキャピラリー電気泳動である。例えば、Ｖｏｌｐｉ  ２００６、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １２：６３９〜６５８に記載されるように、ポストカラム誘導体化及び蛍光検出法と組み合わせたＨＰＬＣも使用することができ、例えばＶｏｌｐｉ及びＬｉｎｈａｒｄｔ、２０１０、Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５：９９３〜１００４に記載されるように、ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化−質量分析）と組み合わせたＨＰＬＣも使用することができ、例えばＧａｌｅｏｔｔｉ及びＶｏｌｐｉ、２０１１、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８３：６７７０〜６７７７又はＶｏｌｐｉら、２０１４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９：５４１〜５５８に記載されるように、蛍光検出法と組み合わせたものも使用することができる。アガロースゲル電気泳動、例えばＶｏｌｐｉ及びＭａｃｃａｒｉ、２００６、Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、８３４：１〜１３；ならびにＶｏｌｐｉ及びＭａｃｃａｒｉ、２００２、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３：４０６０〜４０６６に記載されるＦＡＣＥ（発蛍光団援用炭水化物電気泳動）を使用することもできる。
【０１２２】
試料調製のための適切な方法、例えば、ＧＡＧの抽出及び精製はまた、公知であり、当技術分野、例えばＶｏｌｐｉ及びＭａｃｃａｒｉ、２００５、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ６：３１７４〜３１８０ならびにＣｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３５６：１２５〜１３３、Ｃｏｐｐａら、２０１１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：２９５〜３０３．に記載されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ及び質量分析（及び関連するデータ処理技術）を使用して、総量と比較した、試料中の１つ又は複数の特定のＧＡＧ形態（例えば、硫酸化又は非硫酸化二糖形態）のレベルの分数を得る。例えば、試料調製後、ＧＡＧを酵素を用いて消化し、ＨＰＬＣカラムで分離し、ＭＳを用いて特徴付けることができる。本明細書の他の箇所に記載されるように、１つ又は複数の個々のＧＡＧ形態（例えば、特に硫酸化又は非硫酸化二糖形態）の量を、測定される個々のＧＡＧ形態の全量の和によって好都合に正規化し（すなわち、割り）、分数を得る。
【０１２４】
本発明によると、ＧＡＧ形態の１つ又は複数のレベルの定量的、半定量的又は定性的評価（決定）を行うことができる。
【０１２５】
これを行うための適切な方法は、当業者に周知であり、これらのいずれも使用することができるだろう。しかしながら、二糖組成又は適切な特性又はＣＳもしくはＨＳの形態のこのような定量化（及び二糖形態の分離）を達成する簡便な方法は、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、好ましくは蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動、例えばレーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＬＩＦ）を使用するものである（例えば、Ｇａｌｅｏｔｔｉ  ２０１４、上記又はＫｏｔｔｌｅｒ  ２０１３、上記に記載される）。代替方法は、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、例えばＳＡＸ  ＨＰＬＣを使用すること、又は例えばＶｏｌｐｉ  ２００６、上記、Ｇａｌｅｏｔｔｉ及びＶｏｌｐｉ  ２０１１、上記、Ｖｏｌｐｉら、２０１４、上記もしくはＶｏｌｐｉ及びＬｉｎｈａｒｄｔ、２０１０、上記に記載される通りである。好ましくは、質量分析法（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、例えばＨＰＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳも使用される。特に好ましい方法を例で概説する。よって、特に好ましい方法の一例は、キャピラリー電気泳動（例えば、レーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動）である。別の例は、ＨＰＬＣ、引き続いてＭＳ（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、例えば、ＨＰＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳであるだろう。あるいは、質量分析は、クロマトグラフィー、例えば液体クロマトグラフィーを用いないで使用され得る。
【０１２６】
一般に、本発明によるＧＡＧ特性又は形態の決定は、対象の体液中に見られるのと正確に同じ形態のＧＡＧ分子の測定を含まない（例えば、ＧＡＧの天然形態の測定を含まない）。例えば、このような野生型又は天然ＧＡＧ分子は、通常、タンパク質に結合した長い糖鎖の形態で見られるが、本発明により決定されるレベルについては、一般に、このようなＧＡＧ分子は、これらが結合しているタンパク質から少なくとも分離又は抽出され、さらに処理されなければならない。したがって、一般に、本発明の方法は、何らかの方法で処理された試料（例えば、野生型試料ではなく人工）に実施される。
【０１２７】
よって、いくつかの実施形態では、本発明の方法が、試料を処理するステップを含み得る。よって、いくつかの実施形態では、本発明の方法が、このような処理された試料又はこのような処理された試料に由来する材料に行われ得る。処理ステップには、それだけに限らないが、試料からのＧＡＧの抽出又は精製、例えばプロテアーゼ（プロテイナーゼＫなど）の使用を通した、例えばＧＡＧが結合しているタンパク質からＧＡＧを分離又は抽出又は除去する手段としての、試料中に存在するタンパク質の断片化又は切断又は消化のステップ、例えば陰イオン交換樹脂を用いたＧＡＧの精製、試料からの細胞の単離、試料からの細胞成分の単離、試料からのタンパク質／ペプチド及び／又は核酸分子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）の抽出が含まれる。よって、前記処理ステップを体液試料に行って、分析のためにこれを調製することができ、例えば、血液試料の場合、このようなステップは、分析に適した血液成分、例えば血漿又は血清を調製するステップを含み得る、又は尿試料の場合、細胞又は他の不純物の除去を含み得る。処理ステップは、消化、抽出、精製、沸騰、濾過、凍結乾燥、分画、遠心分離、濃縮、希釈、干渉成分の不活性化、試薬の添加、誘導体化、錯化などのうちの１つ又は複数を含み得る。代表的な処理ステップは例に記載される。
【０１２８】
一定の個々の二糖形態のレベルが測定される本発明のいくつかの方法では、ＧＡＧ、例えば全長ＧＡＧ分子又はセリン残基上でタンパク質に結合しているＧＡＧ分子、又はＧＡＧの重合化多糖鎖、又はＧＡＧの反復二糖単位の鎖を処理ステップ、例えば化学的消化又は例えばコンドロイチナーゼＡＢＣもしくはコンドロイチナーゼＢによる酵素処理による、例えば断片化又は切断又は消化のステップに供して二糖単位を得て、次いで、これを分析する。
【０１２９】
使用され得るＧＡＧのレベル又は組成を決定するための他の方法は、当技術分野で公知である。しかしながら、例には、種々のＧＡＧ形態に対する抗体の使用を伴う分析技術、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳなどの技術、又はアガロースゲル電気泳動（例えば、発蛍光団援用炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ））もしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を含む方法がある。
【０１３０】
したがって、いくつかの実施形態では、ＧＡＧ形態を検出するために使用されている試薬と会合した（例えば、物理的会合又は複合体化又は誘導体化した）１つ又は複数のＧＡＧ形態（例えば、断片化、切断もしくは消化によって全長ＧＡＧ分子又はＧＡＧ分子の反復二糖単位の鎖から得られたＣＳ又はＨＳ二糖の具体的な硫酸化又は非硫酸化形態）のレベルが決定される。よって、いくつかの実施形態では、ＧＡＧ形態と、ＧＡＧ形態を検出するために使用される試薬の複合体のレベルが決定される。特定のＧＡＧ形態を検出するのに適した試薬は、本明細書の他の箇所で議論されるが、抗体、又は例えば、ＧＡＧ形態を蛍光光度計（又は他の検出装置）によって検出可能にするための、当のＧＡＧ形態に結合した（又は誘導体化するために使用される）ある種の発蛍光団（又は他の検出可能な標識又は色素）を含む。よって、純粋に一例として、いくつかの実施形態では、抗体又は発蛍光団などと会合した（例えば、複合体化又は誘導体化した）ＧＡＧ形態のレベルを決定することができる。
【０１３１】
本明細書に記載されるＧＡＧ形態（ＧＡＧ特性）の１つ又は複数の変化したレベル（又は組成）には、当のＧＡＧ形態を対照レベルと比較した場合の、当のＧＡＧ形態（バイオマーカー）の任意の測定可能な変更又は変化が含まれる。変化したレベルには、上昇又は低下したレベルが含まれる。好ましくは、レベルが、適切な対照試料又は対象で見られるレベルと比較して、有意に変化する。より好ましくは、有意に変化したレベルが統計的に有意であり、好ましくはｐ値＜０．０５である。
【０１３２】
本明細書に記載されるＧＡＧ形態（ＧＡＧ特性）の１つ又は複数のレベルの「上昇」又は「上昇した」レベルには、当のＧＡＧ形態を対照レベルと比較した場合の、当のＧＡＧ形態（バイオマーカー）の任意の測定可能な増加又は上昇が含まれる。好ましくは、レベルが、適切な対照試料又は対象で見られるレベルと比較して、有意に上昇する。より好ましくは、有意に上昇したレベルが統計的に有意であり、好ましくはｐ値＜０．０５である。
【０１３３】
本明細書に記載されるＧＡＧ形態（ＧＡＧ特性）の１つ又は複数のレベルの「低下」又は「低下した」レベルには、当のＧＡＧ形態を対照レベルと比較した場合の、当のＧＡＧ形態（バイオマーカー）の任意の測定可能な低下又は減少が含まれる。好ましくは、レベルが、適切な対照試料又は対象で見られるレベルと比較して、有意に低下する。より好ましくは、有意に低下したレベルは、統計的に有意であり、好ましくは、ｐ値＜０．０５満である。
【０１３４】
「対照レベル」は、対照の対象又は集団中（例えば、対照の対象又は集団から得られた試料中）のＧＡＧ形態（ＧＡＧ特性）のレベルである。本発明の方法に使用するための適切な対照の対象又は試料は、当業者によって容易に特定され、例えば適切な対照群が例に記載される。このような対象は、「正常な」対象又は参照集団と呼ぶこともできる。対照の対象の適切な集団の例としては、健康な対象、例えば、腎疾患（例えば、ＲＣＣ）の任意の形態の病歴を有しておらず、他の併発症も有さない個体、又は腎疾患の任意の形態をラズらっておらず、好ましくは患った病歴を有さない対象、特に腎がん又はＲＣＣを患っておらず、好ましくは患った病歴を有さない個体が挙げられる。好ましくは、このような対照の対象はまた、肝がんを患っておらず、より好ましくは患った病歴を有さない。好ましくは、このような対照の対象はまた、炎症病状に罹患していない。好ましくは、対照の対象は、任意の薬物の愛用者でない。好ましい実施形態では、対照の対象が健康な対象である。
【０１３５】
対照レベルは、適切な対照の対象又は試料中の同等のＧＡＧ形態のレベルに対応し得る、例えば対照又は参照集団に見られるカットオフレベル又は範囲に対応し得る。あるいは、前記対照レベルは、（例えば、その対象の「ベースライン」レベルと比較して）より早い時点で測定された同じ個々の対象又は前記対象からの試料中の当のマーカー（ＧＡＧ形態）のレベルに対応し得る。この種の対照レベル（すなわち、個々の対象からの対照レベル）は、健康又は病気の、個体の１つ又は複数のＧＡＧ形態の連続又は周期的測定をして、１つ又は複数のＧＡＧ形態のレベルの変化を探す本発明の実施形態に特に有用である。これに関して、適切な対照レベルは、一般対照集団に見られる対照又はカットオフレベルと対照的に、個体自身のベースライン、安定値、無、以前の値又はありのままの値（適宜）である。対照レベルはまた、「正常」レベル又は「参照」レベルとも呼ばれ得る。対照レベルは、離散的な数字又は範囲であってもよい。
【０１３６】
比較のための対照レベルは、対照の対象の適切なセットを試験することによって導き出すことができるが、本発明の方法は、本発明の方法の一部として対照の対照に対する能動試験を行うことを必ずしも含まず、一般的に対照の対象から以前決定された、本発明の方法を行う者に知られている対照レベルとの比較を含むだろう。
【０１３７】
本発明のスクリーニング、診断等の方法は、腎細胞癌（ＲＣＣ）に関するものである。好ましい実施形態では、腎細胞癌サブタイプが淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）である。本発明の方法は、ＲＣＣ又はｃｃＲＣＣの任意のステージで行うことができ、例えば、ＲＣＣの早期もしくは初期ステージ（例えば、臨床ステージＩ及びステージＩＩのＲＣＣ）、又は進行もしくは後期ステージのＲＣＣ疾患（例えば、典型的にはリンパ節への疾患の拡散を含む臨床ステージＩＩＩ及び遠隔転移を有する患者を含むステージＩＶのＲＣＣ、すなわち転移性ＲＣＣ）に使用することができる。早期又は初期ステージも検出することができるが、ＲＣＣの進行ステージ（ステージＩＩＩ又はＩＶ）のスクリーニング等の方法が本発明の好ましい実施形態である。
【０１３８】
ステージＩ〜ＩＶでのＲＣＣの分類は、任意の当技術分野で認識され、受け入れている定義によって行うことができる。しかしながら、参照のために、好ましい分類システムは、米国がん合同委員会のＴＮＭ（Ｔ＝原発腫瘍；Ｎ＝所属リンパ節；Ｍ＝遠隔転移）ステージＩ〜ＩＶ分類システムである（ＡＪＣＣ：Ｋｉｄｎｅｙ．Ｉｎ：Ｅｄｇｅ  ＳＢら、編：ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ．第７版ニューヨーク、ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１０、４７９〜４８９）。
【０１３９】
他の好ましい実施形態では、腎細胞癌がステージＩＶのＲＣＣであり、より好ましくは、腎細胞癌の転移形態（局在性又は限局性ＲＣＣと対照的）である。実際、転移性淡明細胞型腎細胞癌（ｍｃｃＲＣＣ）が特に好ましく、進行性又は後期ステージＲＣＣも好ましい。本発明の方法を使用してスクリーニングすることができるＲＣＣの他のサブタイプは、乳頭、集合管又は肉腫様である。
【０１４０】
本発明の方法は、任意の適切な体液試料に対して行うことができる。この点に関して、本発明は血漿及び尿で例示されているが、他の型の体液試料で測定される適切なＧＡＧ形態が、本明細書に提供される教示に従って当業者によって決定され得るだろう。典型的には、試料は、対象、好ましくはヒト対象から得られる（取り出される）。他の態様では、本方法が、対象から試料を得るステップをさらに含む。
【０１４１】
本明細書における「体液」への言及は、対象の身体から得られる全ての流体への言及を含む。代表的な流体には、血液（全ての血液由来成分、例えば血漿、血清等を含む）、尿、唾液、涙、気管支分泌物又は粘液が含まれる。好ましくは、体液が循環液（特に血液又は血液成分）又は尿である。特に好ましい体液は、血漿もしくは尿又はその両方である。いくつかの好ましい実施形態では、試料が血液試料である。いくつかの好ましい実施形態では、試料が尿である。
【０１４２】
「試料」という用語は、体液試料を処理することによって得られる（例えば、血液又は尿試料を処理することによって得られる）任意の材料も包含する。試験試料を得るための生物学的試料の処理は、以下の１つ又は複数を含み得る：例えば、本明細書の他の箇所に記載される、消化、沸騰、濾過、蒸留、遠心分離、凍結乾燥、分画、抽出、濃縮、希釈、精製、干渉成分の不活性化、試薬の添加、誘導体化、錯体化など。
【０１４３】
尿又は血液／血漿試料を単離する任意の適切な方法を使用することができる。
【０１４４】
試料を直ちに使用することも、後で使用するために保存することもできる（例えば、−８０℃で）。
【０１４５】
本明細書中に記載される本発明の方法は、ＲＣＣに罹患し得る任意のタイプの対象に対して行うことができる。本方法は、一般に、哺乳動物、例えばヒト、霊長類（例えば、サル）、実験室哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、家畜哺乳動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ）又は家庭用ペット（例えば、ネコ、イヌ）に対して行われる。好ましくは、対象がヒトである。
【０１４６】
一実施形態では、対象（例えば、ヒト）が、ＲＣＣを発症するリスクがあるもしくはＲＣＣの発生のリスクがある対象、例えば健康な対象又は腎疾患のいかなる症状も示していない対象又は本明細書の他の箇所に記載される任意の他の適切な「リスクがある」対象である。別の実施形態では、対象が、ＲＣＣを有する、又は有する（もしくは発症する）疑いがある、又はＲＣＣを潜在的に有する（もしくは発症する）対象である。
【０１４７】
いくつかの態様では、本発明の方法は、ＲＣＣを発症するリスクがあるもしくはＲＣＣの発生のリスクがある、又はＲＣＣを有するもしくは有する（もしくは発症する）疑いがある、又はＲＣＣを潜在的に有する（もしくは発症する）対象（例えば、ヒト対象）を選択する最初のステップをさらに含み得る。その後の方法ステップを、このような選択された対象の試料に対して行うことができる。
【０１４８】
いくつかの態様では、療法（例えば、薬学的療法）又は外科手術によってＲＣＣを治療するステップをさらに含む、本発明の方法が提供される。例えば、本発明の方法の結果が対象のＲＣＣを示す（例えば、ＲＣＣの陽性診断が行われる）場合、療法又は外科手術によってＲＣＣを治療するさらなるステップを行うことができる。本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、療法又は外科手術によってＲＣＣを治療する追加のステップを行うことができる（例えば、予後不良である場合）。療法又は外科手術によってＲＣＣを治療する方法は、当技術分野で公知である。例えば、１つの外科的選択肢は、腫瘍の根絶を目的とする腎摘出術であり、根治的（全除去）又は部分的（ネフロン温存）のいずれかであり得る。薬学的治療は、進行中の臨床試験を受ける療法に加えて、標準的化学療法（例えば、ゲムシタビン、ビンブラスチン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル又はカペシタビン）、標的療法（チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ経路阻害剤、ＶＥＧＦ経路阻害剤、又はより具体的な例、例えばソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、ベバシズマブ、パゾパニブもしくはアキシチニブを含む）及び免疫療法（インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターフェロン−α又はＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１ブロッカー、例えばニボルマブ）を含むことができる。あるいは、追加の診断又は予後処置、例えばＣＴスキャンを行うステップをさらに含む、本発明の方法が提供される。
【０１４９】
よって、いくつかの実施形態では、ＲＣＣを治療するステップをさらに含む本発明の方法（例えば、スクリーニング又は診断又は予後診断方法）が、治療上有効量の、例えばゲムシタビン、ビンブラスチン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル又はカペシタビンから選択される化学療法剤；例えばチロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ経路阻害剤、ＶＥＧＦ経路阻害剤、又はより具体的な例、例えばソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、ベバシズマブ、パゾパニブもしくはアキシチニブから選択される標的療法剤；あるいはインターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターフェロン−α又はＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１ブロッカー、例えばニボルマブから選択される免疫療法剤からなる群から選択される１種又は複数の薬剤を対象に投与するステップを含み得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、試料中の１つ又は複数のＧＡＧ特性のレベル又はこれらのレベルに基づくスコアが、対照レベル又はスコアと比較して特定の程度変化した場合、治療上有効量の医薬品（例えば、上記の化学療法剤等）を患者に投与するさらなるステップが行われる、及び／又は外科手術が行われる。好ましい変化の程度は、本明細書の他の箇所で議論される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、対象が既に薬学的療法（例えば、上記の化学療法又は他の療法）を受けており、試料中の１つ又は複数のＧＡＧ特性のレベル又はこれらのレベルに基づくスコアが、対照レベルと比較して（例えば、同じ対象について以前記録したレベル又はスコアと比較して）特定の程度変化した（又は実際変化しなかった）場合、これは、現治療薬が有効ではなく、前の治療薬以外の治療薬を使用すべきであることを示し得る。したがって、治療上有効量の対象に前に投与された治療薬以外の治療薬（例えば、上記の化学療法剤等）を投与するステップを行うことができる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法が、現治療レジメンが無効であることを明らかにした場合、例えば、試料中の１つ又は複数のＧＡＧ特性の連続又は周期的測定値、又はこれらのレベルに基づくスコアが、治療が無効であることを明らかにしている場合、治療剤の投与量を変更（例えば、増加）するステップを行うことができる。
【０１５３】
より具体的には、例えば、本発明のいくつかのこのような態様では、試料中の１つ又は複数のＧＡＧ特性のレベルを決定するステップを含む方法が提供され、１つ又は複数のレベル、又はこれらのレベルに基づくスコアが、適切なカットオフレベル、例えばＲＣＣの陽性診断についての予測値を最大化するよう予め指定されたカットオフレベル又は予後診断（例えば、予後不良）についての予測値を最大化するよう予め指定されたカットオフレベルよりも大きいと決定された場合、前記方法は外科手術（例えば、腎摘出術）を行う、又は追加の診断もしくは予後診断処置（例えば、ＣＴスキャン）を行う、又は治療上有効量のＲＣＣを治療するために推奨される薬剤を投与するさらなるステップを含むことができ、このような薬剤は、例えば標的療法剤、例えばソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、ベバシズマブ、パゾパニブ又はアキシチニブ、免疫療法剤、例えばインターロイキン−２、インターフェロン−α又はＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１ブロッカー、例えばニボルマブ、あるいは化学療法剤、例えばビンブラスチン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、カペシタビン又はゲムシタビンを含む。
【０１５４】
逆に、試料中の１つ又は複数のＧＡＧ特性のレベルを決定するステップを含む方法が提供され、１つ又は複数のレベル、又はこれらのレベルに基づくスコアが、適切なカットオフレベル、例えばＲＣＣの陰性診断についての予測値を最大化するよう予め指定されたカットオフレベル又は予後診断（例えば、良好な予後）についての予測値を最大化するよう予め指定されたカットオフレベルよりも低いと決定された場合、前記方法は外科手術（例えば、腎摘出術）を行わない、又は追加の診断もしくは予後診断処置（例えば、ＣＴスキャン）を行う、又は１種もしくは複数の薬剤の現投与量を変更する、又は治療上有効量の既に使用されているものと別個のＲＣＣのために推奨される薬剤を投与するさらなるステップを含むことができ、このような薬剤は、例えば標的療法剤、例えばソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、ベバシズマブ、パゾパニブ又はアキシチニブ、免疫療法剤、例えばインターロイキン−２、インターフェロン−α又はＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１ブロッカー、例えばニボルマブ、あるいは化学療法剤、例えばビンブラスチン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、カペシタビン及びゲムシタビンを含む。
【０１５５】
上に示されるように、一態様では、本発明は、対象のＲＣＣの予後診断の方法であって、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を決定するステップを含み、前記試料が前記対象から得られている、方法を提供する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、（例えば、対照レベル又はスコアと比較した）体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成の変化（場合により上昇又は低下）が、予後を示し得る。
【０１５７】
したがって、本発明の予後診断方法は、予後、例えば対象が良好な（又はより良好な）予後を有するかどうか、又は対象が悪い（又はより悪い）予後を有するかどうかを予測（又は推定）するために使用され得る。いくつかの実施形態では、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成の変化（場合により上昇又は低下）が、対象レベル（又はスコア）を得た（又は導出した）対照の対象又は対照集団（又は対照もしくは参照集団中の平均（例えば、中央）の対照の対象又はレベル）についての予後に対して良好な（又はより良好な）予後を示し得る。いくつかの実施形態では、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成の変化（場合により上昇又は低下）が、対象レベル（又はスコア）を得た（又は導出した）対照の対象又は対照集団（又は対照もしくは参照集団中の平均（例えば、中央）の対照の対象又はレベル）についての予後に対して悪い（又はより悪い）予後を示し得る。
【０１５８】
予後は、対象についての生存見込みの評価とみなされ得る（例えば、所与の期間にわたる、例えば３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３ヶ月、又は例えば５年生存率）。よって、わうりは、本発明は、ＲＣＣを有する対象についての生存見込みを予測（又は決定）する方法を提供する。いくつかの実施形態では、「生存」は、サンプリング日（試料を対象から得た日）と「イベント」時との間の時間（例えば、日数）として計算され得る。いくつかの実施形態では、「生存」がＲＣＣ治療の開始、例えば、薬学的療法の開始又は外科手術の日から計算され得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、「生存」が、「全生存」（ＯＳ）又は「無増悪生存」（ＰＦＳ）又は「無再発生存」（ＲＦＳ）である。したがって、本発明は、対象の全生存（ＯＳ）見込み又は無増悪生存（ＰＦＳ）もしくは無再発生存（ＲＦＳ）見込みの見込みを予測する（又は決定する）方法を提供する。いくつかの実施形態では、「生存」が、「全生存」（ＯＳ）又は「無増悪生存」（ＰＦＳ）である。
【０１６０】
一実施形態では、「生存」が「全生存」（ＯＳ）である。このような実施形態では、「イベント」が死亡日である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の予後診断方法を使用して、特定の将来の期間（例えば、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３ヶ月、又は例えば５年生存）で起こる死の確率を予測（又は推定）ことができる。いくつかの実施形態では、本発明の予後診断方法を使用して、死亡前の時間量を予測又は推定することができる。
【０１６１】
一実施形態では、「生存」が「無増悪生存」（ＰＦＳ）である。このような実施形態では、「イベント」が進行日（すなわち、疾患進行の日）である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の予後診断方法を使用して、特定の将来の期間（例えば、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３ヶ月、又は例えば５年生存）の疾患進行の確率を予測（又は推定）ことができる。いくつかの実施形態では、本発明の予後診断方法を使用して、疾患が進行する（又は悪化する）前の時間量を予測（又は推定）することができる。
【０１６２】
一実施形態では、「生存」が「無再発生存」（ＲＦＳ）である。このような実施形態では、「イベント」が再発又は再燃の日（すなわち、疾患再発又は再燃の日）である。いくつかの実施形態では、再発が転移性再発又は転移性再燃である。いくつかの実施形態では、再発が局所再発又は局所再燃である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の予後診断方法を使用して、特定の将来の期間（例えば、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３ヶ月、又は例えば５年生存）の疾患再発又は再燃の確率を予測（又は推定）ことができる。いくつかの実施形態では、本発明の予後診断方法を使用して、疾患が再発又は再燃する前の時間量を予測（又は推定）することができる。
【０１６３】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、体液が血漿及び／又は尿である。好ましい実施形態では、体液が尿である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、体液試料（例えば、尿及び／又は血漿）が対象から１回だけ（単回）得られる。
【０１６５】
上で論じられるように、種々のＧＡＧ特性（又はＧＡＧ形態）及びそれらの組合せを測定に使用することができ、これらは本発明の予後診断方法に関して適宜使用することができる。
【０１６６】
ＲＣＣ患者（例えば、ｃｃＲＣＣ又は転移性ｃｃＲＣＣ）の種々のＧＡＧ形態のレベルで観察された変化に基づいて、例えば、値又はスコアの形態で、後に予後に使用することができる指標に達するために、このような種々のＧＡＧ形態のレベルを使用するスコアリング方法、スコアリングシステム、マーカー又は式を設計することができる。スコアリング方法及びシステムは、本明細書の他の箇所で論じられており、任意の適切なスコアリングシステムを使用することができる。本発明の予後診断方法の一定の好ましい実施形態では、スコアが導出され、スコアが予後（例えば、全生存見込み及び／又は無増悪生存見込みの指標を提供するため）に使用される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、尿スコアが得られる（又は計算される）。好ましい実施形態では、尿スコアが以下の式に従って得られる：
【数８】
2019512690.tif 000009
【０１６８】
いくつかの実施形態では、血漿スコアが得られる（又は計算される）。好ましい実施形態では、血漿スコアが以下の式に従って得られる：
【数９】
2019512690.tif 000010
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されるように、組み合わせられた血漿及び尿スコアを使用することができる（組合せスコア＝平均（血漿スコア、尿スコア））。
【０１７０】
本発明の予後診断方法は、ＲＣＣの予後に関するものであり、したがって、いくつかの実施形態では、対象がＲＣＣを有する（ＲＣＣの現在の診断を有する）、又はＲＣＣを有していたことが知られている（ＲＣＣの以前の診断を有する）又は生涯にわたってＲＣＣを発症するリスクがある。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、対象がＲＣＣを有する（ＲＣＣの現在の診断を有する）、又はＲＣＣを有していたことが知られている（ＲＣＣの以前の診断を有する）。
【０１７２】
本発明の予後診断方法の好ましい実施形態では、本方法が、淡明細胞型ＲＣＣ（ｃｃＲＣＣ）の予後のための方法である。したがって、いくつかの実施形態では、対象がｃｃＲＣＣを有することが知られている（ｃｃＲＣＣの現在の診断を有する）又はｃｃＲＣＣを有していたことが知られている（ｃｃＲＣＣの以前の診断を有する）。
【０１７３】
本発明の予後診断方法の特に好ましい実施形態では、本方法が、転移性ｃｃＲＣＣ（ｍｃｃＲＣＣ）の予後に関するものである。したがって、いくつかの実施形態では、対象がｍｃｃＲＣＣを有することが知られている（ｍｃｃＲＣＣの現在の診断を有する）又はｍｃｃＲＣＣを有していたことが知られている（ｍｃｃＲＣＣの以前の診断を有する）。好ましい実施形態では、対象がｍｃｃＲＣＣを有することが知られている（ｍｃｃＲＣＣの現在の診断を有する）。これに関して、対象が転移性ｃｃＲＣＣを有することが既に知られている場合でさえ、本発明の予後診断方法はなお、ｍｃｃＲＣＣを有する対象についての生存見込み（例えば、全生存見込み又は無増悪生存見込み）に関して有用な予後情報を提供する。したがって、転移性ｃｃＲＣＣを有する対象の群内で、試料中のコンドロチン硫酸（ＣＳ）又はヘパラン硫酸のレベル及び／又は組成（例えば、対照レベル又は組成と比較して）を使用して、どのｍｃｃＲＣＣ対象が良好な（又はより良好な）予後を有する（例えば、全生存見込み又は無増悪生存見込みの点から）か、及びどのｍｃｃＲＣＣ対象が悪い（又はより悪い）予後を有する（例えば、全生存見込み又は無増悪生存見込みの点から）かを予測することができる。例えば、本明細書に記載される好ましいスコアリングシステム（例えば、血漿スコア及び／又は尿スコア）を使用する場合、高い（又はより高い）バイオマーカースコアを有するｍｃｃＲＣＣ対象は、低い（又はより低い）バイオマーカースコアを有するｍｃｃＲＣＣ対象よりも悪い予後（例えば、有意に悪い予後）を有する。
【０１７４】
上記パラグラフで言及される現在の又は以前の診断は、いくつかの実施形態では、臨床検査及びコンピュータトモグラフィ又はフォローアップ時の他の放射線学的評価に基づくことができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、予後診断方法が、より高いリスクの患者を特定し、その後治療選択を導くことができる。したがって、治療レジメンは、対象が良好な予後（低リスク）又は悪い予後（高リスク）を有するかどうかに応じて決定され得る。
【０１７６】
好ましい実施形態では、予後が、非淡明細胞型ＲＣＣについてのものではない。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、対象が、転移性疾患のための全身治療（例えば、スニチニブ又はエベロリムスもしくはニボルマブ）を受けている、又はフォローアップ観察中であり得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、対象が、転移性疾患の全身治療を受けていなくてもよい（又は決して受けなかったかもしれない）。
【０１７９】
ＲＣＣ（例えば、転移性ｃｃＲＣＣ）の予後のための１つの好ましい方法では、体液が尿であり、予後が無増悪生存に関する。
【０１８０】
ＲＣＣ（例えば、転移性ｃｃＲＣＣ）の予後のための１つの好ましい方法では、体液が尿であり、予後が全生存に関する。
【０１８１】
ＲＣＣ（例えば、転移性ｃｃＲＣＣ）の予後のための１つの好ましい方法では、体液が血漿であり、予後が全生存に関する。
【０１８２】
１つの好ましい実施形態では、予後がｍｃｃＲＣＣのものであり（例えば、ｍｃＲＣＣの現在の診断を有することが知られている患者）、体液が尿である。
【０１８３】
特に好ましい方法では、予後がｍｃｃＲＣＣのものであり（例えば、ｍｃＲＣＣの現在の診断を有することが知られている患者）、体液が尿であり、予後が無増悪生存に関するものである。
【０１８４】
上述のように、本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、対照（又はカットオフ又は閾値）レベル及び／又は組成と比較して変化した前記試料中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）及び／又はヘパラン硫酸（ＨＳ）のレベル及び／又は組成が、前記対象の腎細胞癌（例えば、ｃｃＲＣＣ又は転移性ｃｃＲＣＣ）の予後を示す。対照レベルは、本明細書の他の箇所で論じられ、本発明の予後診断方法に使用するために適した対照レベルは、当業者によって容易に決定され得る。
【０１８５】
変化したレベル（又はスコア）、例えば上昇又は低下したレベルは本明細書の他の箇所で論じられる。ＧＡＧ形態（ＧＡＧ特性）の１つ又は複数の変化したレベル（又はスコア）が予後の良好な又は悪い予後を示すかどうかは、分析されているＧＡＧ形態に依存し得る。純粋に、例として、対照レベルがｍｃｃＲＣＣで上昇する所与のＧＡＧ形態のレベルである場合、対照レベルと比較して上昇した対象のＧＡＧ形態のレベルは悪い（又はより悪い）予後を示し得る、又は逆に、対照レベルと比較して低下した対象のＧＡＧ形態のレベルは、良好である（又はより良好な予後）を示し得る。別の例として、対照レベルがｍｃｃＲＣＣで低下する所与のＧＡＧ形態のレベルである場合、対照レベルと比較して上昇した対象のＧＡＧ形態のレベルは良好な（又はより良好な）予後を示し得る、又は逆に、対照レベルと比較して低下した対象のＧＡＧ形態のレベルは、悪い（又はより悪い予後）を示し得る。レベルがｍｃｃＲＣＣで変化する（場合によって上昇又は低下する）ＧＡＧ形態は、本明細書の他の箇所、例えば本明細書の表Ａに記載される。
【０１８６】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、ＲＣＣ（例えば、ｃｃＲＣＣもしくはｍｃｃＲＣＣ）を有する及び／又はＲＣＣの以前の診断を有していた（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）及び／又はＲＣＣの現在の診断を有さない（例えば、健康な対象）、対照（もしくは参照）の対象もしくは試料、又は対照（もしくは参照）の対象もしくは試料集団（例えば、対照集団の平均値、例えば中央値）のマーカー（ＧＡＧ形態もしくはスコア）のレベルである。好ましくは、前記対照の対象又は集団は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１８７】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、ＲＣＣ（例えば、ｃｃＲＣＣもしくはｍｃｃＲＣＣ）を有する及び／又はＲＣＣの以前の診断を有していた（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）、対照（もしくは参照）の対象もしくは試料、又は対照（もしくは参照）の対象もしくは試料集団（例えば、対照集団の平均値、例えば中央値）のマーカー（ＧＡＧ形態もしくはスコア）のレベルである。好ましくは、前記対照の対象又は集団は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１８８】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、ｃｃＲＣＣを有する及び／又はｃｃＲＣＣの以前の診断を有していた（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）、対照（もしくは参照）の対象もしくは試料、又は対照（もしくは参照）の対象もしくは試料集団（例えば、対照集団の平均値、例えば中央値）のマーカー（ＧＡＧ形態もしくはスコア）のレベルである。好ましくは、前記対照の対象又は集団は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１８９】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、ｍｃｃＲＣＣを有する及び／又はｃｃＲＣＣの以前の診断を有していた（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）、対照（もしくは参照）の対象もしくは試料、又は対照（もしくは参照）の対象もしくは試料集団（例えば、対照集団の平均値、例えば中央値）のマーカー（ＧＡＧ形態もしくはスコア）のレベルである。好ましくは、前記対照の対象又は集団は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１９０】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、対照集団、例えばＲＣＣ（好ましくはｃｃＲＣＣ、より好ましくはｍｃｃＲＣＣ）を有する対象（又は試料）及び／又はＲＣＣ、ｃｃＲＣＣもしくはｍｃｃＲＣＣの以前の診断を有していた（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）対象の集団のマーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の中央（又は他の統計学的平均）レベルである。好ましくは、前記対照集団（集団内の個体）は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１９１】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、対照集団、例えばＲＣＣ（好ましくはｃｃＲＣＣ、より好ましくはｍｃｃＲＣＣ）を有する対象（又は試料）及びＲＣＣ、ｃｃＲＣＣもしくはｍｃｃＲＣＣの以前の診断を有していた（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）対象の集団のマーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の中央（又は他の統計学的平均）レベルである。好ましくは、前記対照集団（集団内の個体）は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１９２】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、対照集団、例えばＲＣＣ（好ましくはｃｃＲＣＣ、より好ましくはｍｃｃＲＣＣ）を有する対象（又は試料）の集団のマーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の中央（又は他の統計学的平均）レベルである。好ましくは、前記対照集団（集団内の個体）は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１９３】
本発明の予後診断方法のいくつかの実施形態では、マーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の対照レベルが、対照集団、例えばＲＣＣの現在の診断を有さない対象（又は試料）（好ましくは健康な対象）の集団のマーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）の中央（又は他の統計学的平均）レベルである。好ましくは、前記対照集団（集団内の個体）は、生存（例えば、全生存又は無増悪生存）の点で公知の成績を有する。
【０１９４】
転移性ｃｃＲＣＣ（ｍｃｃＲＣＣ）の予後のための方法のいくつかの実施形態では、対照レベル（又はスコア）が、転移性がん（例えば、スニチニブもしくはエベロリムス又はＲＣＣの他の療法で治療されている）を有する対象及びｃｃＲＣＣの以前の診断を有していた対象（例えば、試料取得時には疾患の証拠がない）を含む対照の対象（又は試料）集団の中央レベル（又はスコア）である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、対照集団の中央レベル（又は他の平均）（又はスコア）を対照レベルとして使用する場合、集団が少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０又は少なくとも１００人の個別の対象を含む。１つの好ましい実施形態では、対照集団が少なくとも２０人の個別の対象を有する。１つの好ましい実施形態では、対照集団が少なくとも３０人の個別の対象を有する。
【０１９６】
いくつかのこのような実施形態では、対照（又は参照）集団の個々の対象（又は試料）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は１００％が、疾患を予後診断される（ＲＣＣ、好ましくはｃｃＲＣＣ、より好ましくはｍｃｃＲＣＣ）。１つの好ましい実施形態では、対照集団の個々の対象（又は試料）の少なくとも７０％が、疾患を予後診断される。
【０１９７】
「中央値」対照（又はカットオフ）レベル（又はスコア）の確立のための対象の有用な集団（コホート）は、本明細書の例２に記載される。
【０１９８】
対照（又はカットオフ又は閾値）レベル（又はスコア）は、対照レベルもしくはスコア、及び／又は分析されるＧＡＧ形態（ＧＡＧ特性）を導出するために使用される個体又は集団の性質に応じて変化し得る。当業者は、適切な対照レベル又はスコアを容易に決定することができるだろう。
【０１９９】
本明細書の例２に記載されるように、本明細書に記載される好ましい血漿スコアの式を使用する場合、代表的なカットオフ（又は対照）スコアは０．８９である。したがって、いくつかの実施形態では、血漿スコアが０．８９未満（又は任意の他の適切なカットオフスコア未満）である対象が、例えば血漿スコアが０．８９より上（又は任意の他の適切なカットオフスコアより上）の対象と比較して、良好な予後（例えば、全生存又は無増悪生存の点で）を有する（又は有すると予測される）。逆に、いくつかの実施形態では、血漿スコアが０．８９より上（又は任意の他の適切なカットオフスコアより上）である対象が、例えば血漿スコアが０．８９未満（又は任意の他の適切なカットオフスコア未満）の対象と比較して、悪い予後（例えば、全生存又は無増悪生存の点で）を有する（又は有すると予測される）。
【０２００】
本明細書の例２に記載されるように、本明細書に記載される好ましい尿スコアの式を使用する場合、代表的なカットオフ（又は対照）スコアは１．１８である。したがって、いくつかの実施形態では、尿スコアが１．１８未満（又は任意の他の適切なカットオフスコア未満）である対象が、例えば尿スコアが１．１８より上（又は任意の他の適切なカットオフスコアより上）の対象と比較して、良好な予後（例えば、全生存又は無増悪生存の点で）を有する（又は有すると予測される）。逆に、いくつかの実施形態では、尿スコアが１．１８より上（又は任意の他の適切なカットオフスコアより上）である対象が、例えば尿スコアが１．１８未満（又は任意の他の適切なカットオフスコア未満）の対象と比較して、悪い予後（例えば、全生存又は無増悪生存の点で）を有する（又は有すると予測される）。
【０２０１】
他のカットオフ（対照）スコアは、好ましい血漿スコアリング式について約０．８、０．９又は１を含み得る。他のカットオフ（対照）スコアは、好ましい尿スコアリング式について約１．１５又は１．２を含み得る。
【０２０２】
本明細書の他の箇所で論じられるように、対照レベル又は組成（又はスコア）と比較して変化した（場合によっては上昇又は低下した）レベル又は組成（又はスコア）は、ＲＣＣ（好ましくはｃｃＲＣＣ、より好ましくはｍｃｃＲＣＣ）についての予後（例えば、全生存又は無増悪生存見込み）を示す。好ましいスコアリング式を使用する場合（血漿スコア及び／又は尿スコア）、対照（又はカットオフ）スコアと比較して（例えば、対照又は参照集団の中央スコアと比較して）高い（又はより高い）スコアは、悪い（又はより悪い）予後（例えば、ＯＳ又はＰＦＳの点で）を予測し、対照（又はカットオフ）スコアと比較して（例えば、対照又は参照集団の中央スコアと比較して）低い（又はより低い）スコアは、良好な（又はより良好な）予後（例えば、ＯＳ又はＰＦＳ又はＲＦＳの点で）を示す。
【０２０３】
良好な（又はより良好な）予後は、対照の対象又は対照集団の予後と比較して、良好な（又はより良好な）予後であり得る。悪い予後は、対照の対象又は集団の予後と比較して悪い（又はより悪い）予後であり得る。
【０２０４】
したがって、良好な（又はより良好な）予後は、対照集団についての平均（例えば、中央）予後に対して、例えばその集団についての中央生存（ＯＳ又はＰＦＳ又はＲＦＳ）に対して良好な（又はより良好な）予後であり得る。逆に、悪い（又はより悪い）予後は、対照集団についての平均（例えば、中央）予後に対して、例えばその集団についての中央生存（ＯＳ又はＰＦＳ又はＲＦＳ）に対して悪い（又はより悪い）予後であり得る。
【０２０５】
この技術分野の開業医は、例えば、対象（試験対象）についてのマーカー（ＧＡＧ形態又はスコア）のレベルを、成績（例えば、ＯＳの場合、死亡（死亡するまでの期間）などの生存成績）又は疾患進行（ＰＦＳの場合、疾患進行までの期間）の公知の成績又は公知の確率を有する対照（又は参照）の対象又は集団から得られた対照レベル又はスコアと比較することによって、良好な（又はより良好な）予後を構成するもの及び悪い（又はより悪い）予後を構成するものを確立することができ、対照レベルに対する試験対象のレベル（又はスコア）の変化（場合により上昇又は低下）は、場合により、対照の対象又は対照集団に対して良好な（又はより商工な）予後（成績又は成績の可能性）又は悪い（又はより悪い）予後（成績又は成績の可能性を示す。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、無増悪生存に関して良好な予後（例えば、ｃｃＲＣＣ対象／患者、例えばｍｃｃＲＣＣ対象／患者）が、疾患進行がサンプリング日から６ヶ月の期間内に起こらない確率が７５％以上（例えば、確率が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％）である、又は疾患進行がサンプリング日から１２ヶ月の期間内に起こらない確率が７０％以上（例えば、確率が７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％）である、又は疾患進行がサンプリング日から２４ヶ月の期間内に起こらない確率が６５％以上（例えば、確率が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％）である、又は疾患進行がサンプリング日から５年の期間内に起こらない確率が６５％以上（例えば、確率が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％）である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、無増悪生存に関して悪い予後（例えば、ｃｃＲＣＣ対象／患者、例えばｍｃｃＲＣＣ対象／患者）が、疾患進行がサンプリング日から６ヶ月の期間内に起こらない確率が７５％未満である、又は疾患進行がサンプリング日から１２ヶ月の期間内に起こらない確率が７０％未満である、又は疾患進行がサンプリング日から２４ヶ月の期間内に起こらない確率が６５％未満である、又は疾患進行がサンプリング日から５年の期間内に起こらない確率が６５％未満である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、全生存に関して良好な予後（例えば、ｃｃＲＣＣ対象／患者、例えばｍｃｃＲＣＣ対象／患者）が、死亡がサンプリング日から１２ヶ月の期間内に起こらない確率が８５％以上（例えば、確率が９０％以上、９５％以上又は１００％）である、又は死亡がサンプリング日から２４ヶ月の期間内に起こらない確率が７５％以上（例えば、確率が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％）である、又は死亡がサンプリング日から５年の期間内に起こらない確率が７５％以上（例えば、確率が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％）である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、全生存に関して悪い予後（例えば、ｃｃＲＣＣ対象／患者、例えばｍｃｃＲＣＣ対象／患者）が、死亡がサンプリング日から１２ヶ月の期間内に起こらない確率が８５％未満である、又は死亡がサンプリング日から２４ヶ月の期間内に起こらない確率が７５％未満である、又は死亡がサンプリング日から５年の期間内に起こらない確率が７５％未満である。
【０２１０】
所与の期間にわたるさらなる生存確率（ＯＳ又はＰＦＳ）は、本明細書の例２／図９〜図１２のカプラン・マイヤー曲線から導き出すことができる。いくつかのこのような実施形態では、尿試料に基づくカプラン・マイヤー曲線からさらなる確率を導き出すことができる。他のこのような実施形態では、血漿試料に基づくカプラン・マイヤー曲線からさらなる確率を導き出すことができる。
【０２１１】
いくつかの好ましい実施形態では、生存期間（及び上で論じられるものなどの関連する確率）が、サンプリング日（試料を得た日）から計算される。他の実施形態では、生存期間（及び上で論じられるものなどの関連する確率）が、治療の開始日から計算され得る。
【０２１２】
予後診断方法については、ＧＡＧの測定に任意の適切な方法を使用することができる（本明細書の他の箇所に記載されているように）。いくつかの実施形態では、レーザー誘起蛍光を伴うキャピラリー電気泳動が使用される。
【０２１３】
ＲＣＣをスクリーニングする方法（例えば、測定するための好ましいＧＡＧ形態又はそれらの組合せ）に関連する本明細書の特徴及び議論を、本発明の予後診断方法に準用することができる。
【０２１４】
一態様では、本発明は、体液試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を検出（又は決定）する方法であって、前記試料が対象から得られている、方法を提供する。
【０２１５】
一態様では、本発明は、患者のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を検出する方法であって、
（ａ）ヒト患者から体液試料を得るステップと；
（ｂ）前記試料中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）及びヘパラン硫酸（ＨＳ）の一方又は両方のレベル及び／又は化学組成を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【０２１６】
例えば、測定するための好ましいＧＡＧ形態又はそれらの組合せに関連する、ＲＣＣをスクリーニングする方法（例えば、診断方法、予後診断方法等）に関連する本明細書の特徴及び議論を、本発明の検出方法に準用することができる。
【０２１７】
本発明を、以下の図面を参照して、以下の非限定的な例を参照してさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】ｃｃＲＣＣ対腫瘍隣接正常腎組織におけるグリコサミノグリカン生合成の協調調節。Ａ）ｃｃＲＣＣにおけるグリコサミノグリカン生合成の経路図である。各ボックスは、経路において所与の反応を行う１つ又は複数の酵素を示す。明確にするために、酵素名がボックスのいくつかの横に追加で記載されている。色は酵素コード遺伝子のｃｃＲＣＣ対非腫瘍組織のｌｏｇ１０倍変化を表し、各ボックスの隣の記号は対応する遺伝子調節の有意性（偽陽性率の点で）を報告する。明確にするために、色の各々には文字識別子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦ）も与えられており、これらの識別子は必要に応じてボックスの横に記載されている。この経路は、ＫＥＧＧ遺伝子関連に従って描かれている（デルマタン硫酸生合成又はヘパラン硫酸のＣ３位の硫酸化に関する遺伝子を示していないことに留意されたい、後者はめったに観察されない）実線矢印は分子の添加を示し、破線は分子の変換を示し、点線はその時点までの最終二糖組成を示す。Ｂ）ＴＣＧＡ試料（ｙ軸）と２つの独立した試験（ＧＳＥ３６９８６及びＧＳＥ１４７６２）との間のグリコサミノグリカン生合成経路における遺伝子発現ｌｏｇ２倍変化の相関を示す図である。
【図２】ｃｃＲＣＣ対正常腎組織におけるグリコサミノグリカン生合成における３つのタンパク質の免疫組織化学的染色。Ａ）ｃｃＲＣＣ（２１〜２７組織試料）対正常腎臓（２試料）におけるＣＨＰＦ２、ＨＳ６ＳＴ２及びＥＸＴＬ１陽性試料の割合を示す図である。結果は、二連で行われた染色のコンセンサスとして提示される。Ｂ）代表的なｃｃＲＣＣ及び正常試料におけるＣＨＰＦ２、ＨＳ６ＳＴ２及びＥＸＴＬ１の染色を示す図である。
【図３】ｍｃｃＲＣＣ（灰色ボックス）及び健康な（白色ボックス）患者のグリコサミノグリカン血漿及び尿プロファイル。Ａ）各プロファイルは、ＧＡＧの１８個の独立した測定値（ＣＳに関連する９個及びＨＳに関連する９個）を含み、これらは総濃度及び二糖組成、ならびに電荷などの他の依存測定値を指すことを示す図である。Ｂ）血漿（上）又は尿（下）からの測定値を用いたｍｃｃＲＣＣ対健康なＧＡＧプロファイルの主成分分析を示す図である。
【図４】グリコサミノグリカンのプロファイルを、ｍｃｃＲＣＣの発生を正確に予測することができる３つのスコア（血漿、尿中又はその両方における測定値に基づく）で要約することができる。Ａ）発見コホートに属するｍｃｃＲＣＣ患者（灰色ボックスプロット）及び健康な個体（白いボックスプロット）（それぞれ、３４試料対１７）の血漿、尿及び組合せスコアを示す図である。Ｂ）組合せ、血漿又は尿スコアに基づいたｍｃｃＲＣＣ又は健康のいずれかとしての発見コホートの試料の分類における受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。各マーカーについて、陽性予測値を最大にする最適なカットオフスコアが示される。Ｃ）検証コホートに属するｍｃｃＲＣＣ患者（灰色ボックスプロット）及び健康な個体（白いボックスプロット）（それぞれ、１８試料対９）の血漿、尿及び組合せスコアを示す図である。Ｄ）組合せ、血漿又は尿スコアに基づいたｍｃｃＲＣＣ又は健康のいずれかとしての検証コホートの試料の分類におけるＲＯＣ曲線を示す図である。
【図５】以前にｍｃｃＲＣＣと診断されたが、サンプリング時には疾患の証拠がない対象の組合せスコア、血漿スコア及び尿スコアを示す図である。横線は、対象がｍｃｃＲＣＣ又は健康として分類される最適カットオフスコアを表す。
【図６】試料の転移状態によってビニングされる、ｃｃＲＣＣ及び腫瘍隣接正常試料におけるグリコサミノグリカン生合成に関与する遺伝子の遺伝子発現のボックスプロットを示す図である。線形回帰を使用して、ＧＡＧ遺伝子に対する転移（黒色ボックスプロット）の効果を推定した。上記のボックスプロットは、転移がコンドロイチン硫酸関連遺伝子の上方制御及びヘパラン硫酸関連遺伝子の下方制御を亢進することを示している（偽陽性率＜５％）。凡例：淡灰色−転移性（Ｍ１）又は非転移性（Ｍ０）ｃｃＲＣＣに隣接する正常組織；暗灰色−転移性ではない（Ｍ０）ｃｃＲＣＣ；黒色−転移性（Ｍ１）ｃｃＲＣＣ。
【図７】特性を除外した場合のランダムフォレスト分類器の精度低下の点からの血漿ＧＡＧ特性のランク付け（精度の低下はジニ係数の平均減少として測定される）を示す図である。分類器を血漿試料のＧＡＧ特性について訓練した。１２個の最良の特性のみを示す。
【図８】特性を除外した場合のランダムフォレスト分類器の精度低下の点からの尿ＧＡＧ特性のランク付け（精度の低下はジニ係数の平均減少として測定される）を示す図である。分類器を尿試料のＧＡＧ特性について訓練した。１２個の最良の特性のみを示す。
【図９】フォローアップ時の尿バイオマーカースコアレベルによって層別化されたｃｃＲＣＣ患者におけるＰＦＳ（上）又はＯＳ（下）についてのカプラン・マイヤー曲線を示す図である。患者の前向きコホート（Ｎ＝２９）を、サンプリング時に「低」（実線）対「高」（破線）バイオマーカースコアに分類した。打切データは、灰色の十字（垂直短線）として示される。ＰＦＳ：無増悪生存。ＯＳ：全生存。
【図１０】フォローアップ時の血漿バイオマーカースコアレベルによって層別化されたｃｃＲＣＣ患者におけるＰＦＳ（上）又はＯＳ（下）についてのカプラン・マイヤー曲線を示す図である。患者の前向きコホート（Ｎ＝３０）を、サンプリング時に「低」（実線）対「高」（破線）バイオマーカースコアに分類した。打切データは、灰色の十字（垂直短線）として示される。ＰＦＳ：無増悪生存。ＯＳ：全生存。
【図１１】フォローアップ時の尿（Ａ）又は血漿（Ｂ）バイオマーカースコアレベルによって層別化された、フォローアップ時に転移性ｃｃＲＣＣの現診断を有する患者に限定されたＰＦＳ（上）又はＯＳ（下）のカプラン・マイヤー曲線を示す図である。患者の前向きコホート（Ｎ＝２３）を、サンプリング時に「低」（実線）対「高」（破線）バイオマーカースコアに分類した。打切データは、灰色の十字（垂直短線）として示される。ＰＦＳ：無増悪生存。ＯＳ：全生存。
【図１２】フォローアップ時の尿（Ａ）又は血漿（Ｂ）バイオマーカースコアレベルによって層別化されたｃｃＲＣＣ患者の治療開始日から計算したＰＦＳ（上）又はＯＳ（下）のカプラン・マイヤー曲線を示す図である。患者の前向きコホート（Ｎ＝２３）を、サンプリング時に「低」（実線）対「高」（破線）バイオマーカースコアに分類した。打切データは、灰色の十字（垂直短線）として示される。ＰＦＳ：無増悪生存。ＯＳ：全生存。
【図１３】サンプリング時に転移性ｃｃＲＣＣの診断を有する対象から採取した４０個の試料の血漿スコアのボックスプロットを示す図である。横線は、それより上で対象が転移性ｃｃＲＣＣを有すると分類される以前定義されたカットオフスコアを定義する。
【実施例】
【０２１９】
例１
淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）は、腎がんの最も一般的な形態である。本明細書に記載される発明の一部として、本発明者らは、ゲノム規模の代謝モデルを用いて、ｃｃＲＣＣにおけるユニークな代謝リプログラミングを特定した。６つの他の試験したがんとは対照的に、本発明者らは、遺伝子発現とタンパク質レベルの両方において、ｃｃＲＣＣでのみグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）生合成の強力な協調調節を発見した。より具体的には、本発明者らは、３４人のｍｃｃＲＣＣ患者及び１６人の健康な個体の血漿及び尿試料中の１８個の独立したＧＡＧ特性を測定した。これらの前のＧＡＧプロファイルはｍｃｃＲＣＣにおいて顕著に変化した。これらのデータに基づいて、本発明者らは、８２．７％〜１００％に及ぶ精度でｍｃｃＲＣＣを健康な個体と区別する３つのＧＡＧマーカーを設計した。９０％〜１００％に及ぶ陽性予測値を、１８人のｍｃｃＲＣＣ患者及び９人の健康な個体の独立コホートにおいてさらに検証した。さらに、これらのＧＡＧバイオマーカーは、年齢、性別、ＢＭＩ又は食事摂取に関係なく予測的であった。したがって、要約すると、本明細書に記載される結果は、ＧＡＧ生合成の協調調節がｃｃＲＣＣで起こり、入手可能な体液のＧＡＧプロファイリングがｍｃｃＲＣＣの診断に適していることを実証する。
【０２２０】
実験手順
遺伝子発現解析
がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）で、４８１個のｃｃＲＣＣ原発腫瘍及び７１個の腫瘍隣接正常様試料のＲＮＡ配列遺伝子発現プロファイルを検索した。ｖｏｏｍ（Ｌａｗら、２０１４）を用いてｃｃＲＣＣ対非腫瘍の差次的遺伝子発現解析を行った。試料の１０％未満（７％）においてアノテーションなし（３％）又は１０カウント以下の２０９０個の遺伝子を廃棄した。転移の効果を、各試料の転移状態をｖｏｏｍに使用される線形モデルの共変量として加えることによって説明した。２つの独立したマイクロアレイ作成データセットをＧＥＯ（ＧＳＥ３６８９５及びＧＳＥ１４７６２）で検索し、ｃｃＲＣＣ対非腫瘍についての示差的発現解析を、ｌｉｍｍａ（Ｓｍｙｔｈ、２００４）を用いて行った。ＲＮＡｓｅｑ又はマイクロアレイデータを用いた遺伝子発現の変化の有意性を、所与の比較のための線形モデル上の経験的ベイズの推定を用いて試験した（ＲＮＡｓｅｑの場合、ｖｏｏｍで提案されるように計数分散を緩和した（Ｌａｗら、２０１４））。遺伝子セットとしてＫＥＧＧ経路又は代謝産物のいずれかを用いて、ｐｉａｎｏ（Ｖａｒｅｍｏら、２０１３）を用いたコンセンサス遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＡ）を行った（すなわち、遺伝子セットは所与の代謝産物を含む反応コード遺伝子のリストであり、遺伝子セットｐ値は以下のＧＳＡ法：フィッシャー検定、ストーファー検定、レポーター検定、テール強度検定、平均及び中央についての中央ｐ値として定義される）。各ＧＳＡ法の遺伝子セットの有意性を、遺伝子標識を１００００回シャッフリングする並べ替え検定を用いて試験した。遺伝子セット間の遺伝子セット関連性を、Ｋｉｗｉ（Ｖａｒｅｍｏら、２０１４）を用いて基礎をなすネットワークの観点から計算し、ここでは相互の最短経路長がネットワークにおいて２未満である場合、遺伝子セットを関連するとみなした（説明力を増加させるために、１０個超の遺伝子を有する遺伝子セットを無視した）。代謝産物の場合、ゲノム規模の代謝モデルＨＭＲ２から遺伝子セットネットワークを抽出した（Ａｇｒｅｎら、２０１４）。それが対象となる比較（すなわち、ｃｃＲＣＣ対非がん性隣接腎臓）において最も調節されている代謝サブネットワークを表すので、この分析からの最も有意な遺伝子セットネットワークを手動検査及びキュレーションに供した。上記の方法全てを、ＰｙｔｈｏｎモジュールであるＫｉｗｉを除いて、それぞれのＲパッケージを使用して実行した。
【０２２１】
免疫組織化学染色
２連の３２個のｃｃＲＣＣ試料及び２個の正常腎臓試料を含む組織マイクロアレイを調製し、免疫組織化学に使用した。経験豊富な泌尿器科の病理学者が全ての症例を選択した。倫理的承認は、ルンド大学の倫理委員会（ＬＵ２８９−０７）によって認められた。４μｍの組織切片を脱パラフィンし、標準的プロトコルに従って再水和させた。１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で２０分間試料を加圧調理して抗原回収を行った。免疫組織化学染色を、Ｄａｋｏ  Ｔｅｃｈｍａｔｅ  ５００ユニットを使用して、製造者の指示（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）に従って行った。使用した抗体及び希釈液は、全てスウェーデンのストックホルムのＡｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＡＢ製のＨＰＡ０２０９９２（ＣＨＰ２  １：３５）、ＨＰＡ０３４６２５（ＨＳ６ＳＴ２  １：１２５）及びＨＰＡ０３７７４９（ＥＸＴＬ１  １：３５）であった。両複製が採点できる腫瘍試料のみを分析に含めた（ＣＨＰ２については２１個、ＨＳ６ＳＴ２については３２個、ＥＸＴＬ１については２７個）。
【０２２２】
血液及び尿試料回収
発見コホートでは、２つの場所、ＩＯＶ−ＩＲＣＣＳ、Ｐａｄｏｖａ、イタリア及びＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデンの転移性淡明細胞型腎細胞癌を有する３４人の患者から、血漿及び尿試料を得た。２１人の患者については、血漿試料のみを得た。腎臓の悪性腫瘍も肝臓の悪性腫瘍も炎症性病変もない１６人の健康な個体を用いて対照群を形成した。検証コホートでは、２つの場所、ＩＯＶ−ＩＲＣＣＳ、Ｐａｄｏｖａ、イタリア及びＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデンの転移性淡明細胞型腎細胞癌を有する１８人の患者から、血漿及び尿試料を得た。１１人の患者については、血漿試料のみを得た。腎臓の悪性腫瘍も肝臓の悪性腫瘍も炎症性病変もない９人の健康な個体を用いて対照群を形成した。全ての対象が書面によるインフォームドコンセントを提供した。ベースライン特徴を表Ｃに記載する。２０１３年１月、イタリアのＰａｄｏｖａのＩＯＶ−ＩＲＣＣＳの倫理委員会に、本観察試験を通知した。Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデンで血液試料を回収及び分析することの承認を、Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｖａｓｔｒａ  Ｇｏｔａｌａｎｄ、スウェーデンから得た。全血試料をＥＤＴＡコーティング管に回収した。管を遠心分離（４℃で１５分間２５００ｇ）し、血漿を抽出し、別の管に回収した。尿をポリプロピレンチューブに回収した。試料をドライアイス中で分析するために出荷されるまで−８０℃で保存した。本試験を、イタリアのＰａｄｏｖａのＩＯＶ−ＩＲＣＣＳの地方ヒト倫理研究委員会の規制に従って行った。
【０２２３】
グリコサミノグリカンプロファイル決定
抽出及び精製ステップを含む試料調製を、（Ｖｏｌｐｉ及びＭａｃｃａｒｉ  ２００５１及び２ならびにＣｏｐｐａら、２０１１）によって以前に記載されたように行い、試料ＧＡＧ分離及び定量を、（Ｖｏｌｐｉら、２０１４；Ｖｏｌｐｉ及びＬｉｎｈａｒｄｔ、２０１０）に記載されるように行った。
【０２２４】
簡潔に述べると、ＧＡＧを抽出するために、試料５００μｌを凍結乾燥し、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌで再構成し、プロテアーゼ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ［Ｅ．Ｃ３．４．２１．６４］のプロテイナーゼＫ、＞５００単位ｍｌ＿１  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）で、６０℃で１２時間処理した。１０分間沸騰させ、遠心分離し、０．４５μｍフィルタで濾過した後、濾液を凍結乾燥した。粉末を長時間混合することによって蒸留水１ｍｌに溶解した。５０００ｇで１５分間の遠心分離の後、２０％トリクロロ酢酸０．２ｍｌを上清に添加した。４℃で２時間後、混合物を５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収し、凍結乾燥した。二回蒸留水０．４ｍｌに可溶化し、１００００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を回収し、さらに分析した。ＧＡＧを精製するために、１０ｍＭ  ＮａＣｌ５００μｌで再構成した後、試料ＧＡＧを陰イオン交換樹脂（ＱＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５）でさらに精製した。１００００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を予め１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した樹脂約３ｍｌを充填したカラム（１ｃｍ×４ｃｍ）にアプライした。樹脂を１０ｍＭ  ＮａＣｌ２０ｍｌで洗浄した後、２．５Ｍ  ＮａＣｌ１０ｍｌを添加した。エタノール５０ｍｌを溶出液（１０ｍｌ）に添加し、−２０℃で２４時間保存した。５０００×ｇで１５分間の遠心分離後、ペレットを６０℃で１２時間乾燥させた。５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ８．０  ８０μｌで再構成した後、物質をコンドロイチナーゼＡＢＣ２０μｌで、３７℃で１２時間処理した。ＧＡＧを分離及び定量するために、５分間沸騰させた後、試料を、ポストカラム誘導体化及び蛍光検出を伴うＨＰＬＣとオンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）の両方に注入した。
【０２２５】
１８個の独立したＧＡＧ特性を各試料（血漿又は尿のいずれか）で測定した：ＣＳ濃度、ＨＳ濃度、及びＣＳとＨＳの両方の二糖組成の割合。チャージは、全ての硫酸化二糖割合の合計である。主成分分析を、血漿のみ、尿のみ、又は血漿と尿の両方（組合せ）の３つの場合について、入手可能なＧＡＧ特性について実施した。主成分分析をＲ−ｐａｃｋａｇｅ  ａｄｅ４を用いて実施した（センタリングを平均によって行った）。
【０２２６】
バイオマーカー設計
血漿のみ又は尿のみの場合のマーカーを設計するために、本発明者らは、最適Ｌａｓｓｏペナルティ値で臨床成績（すなわち、ｍｃｃＲＣＣ対健康）を最も予測するＧＡＧ特性を選択するために一個抜き交差検証（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）と共にＬａｓｓｏペナルティロジスティック回帰（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、１９９６）を使用した。交差検証誤差が最小値の１標準誤差内にあるペナルティ値としてｇｌｍｎｅｔ  Ｒ−ｐａｃｋａｇｅを使用してこれを計算した。マーカーを、健康な状態を頑強に予測するＧＡＧ特性の和に対するｍｃｃＲＣＣを頑強に予測するＧＡＧ特性の和の比として構築した。各特性値を、それぞれの回帰係数（最も近い有理数に丸められた）を用いて正規化した。組み合わせた場合のマーカーを、そのように設計された血漿及び尿マーカーの平均としてとった。ｍｃｃＲＣＣ対健康の間のマーカースコアの平均差についての最高密度区間（ｈｉｇｈｅｓｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎｔｅｒｖａｌ）（ＨＤＩ）を、以下の仮定の下でベイズ推定を使用して計算した：スコアは、未知のｔ分布からサンプリングされ、推定される正規性（すなわち自由度）；事前分布における高い不確実性とされ；周辺分布は、間引きを用いず、１０００００に等しい鎖長を用いたマルコフ連鎖モンテカルロ法サンプリングによって十分近似される。ＢＥＳＴ  Ｒ−ｐａｃｋａｇｅを使用して推定を行った（上記の仮定はデフォルトパラメータによって反映される）。ベイズ推定は、２つの群の基礎をなすスコア分布の不確実性の下でさえ（試料数が限られている場合）、平均差の堅牢で信頼性の高い推定を提供するので、広く用いられているｔ検定よりも好まれた。
【０２２７】
精度メトリック
各マーカー（血漿、尿、又は組合せ）について、試料のバイナリ分類における性能を、ｍｃｃＲＣＣ又は健康のいずれかとして、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を導出することにより変化する閾値で評価した。本発明者らは、各マーカーの精度を、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）として測定した（ＡＵＣは完全分類器については１であり、ランダム分類器については０．５である）。所与のマーカーの潜在的なカットオフ値として、陽性予測値が最大であったスコア、すなわち、マーカースコアがこのカットオフ値を上回る試料がｍｃｃＲＣＣである最大確率を有するものを選択した。本発明者らは、各コホートにおけるｍｃｃＲＣＣ試料の割合に等しい有病率を仮定した。ＲＯＣ曲線はｐＲＯＣ  Ｒパッケージを用いて計算し、最適カットオフはＯｐｔｉｍａｌＣｕｔｐｏｉｎｔｓ  Ｒパッケージを用いて計算した。
【０２２８】
共分散の分析
共分散の分析を、臨床情報及び食事情報で報告されたものの中から選択された共変量で臨床成績（ｍｃｃＲＣＣ対対照）に対してロジスティック回帰を用いて行った。これらの共変量を、最適なＬａｓｓｏペナルティ値（マーカー設計に記載されるように選択される）で臨床成績を最も予測するものとして一個抜き交差検証と共にＬａｓｓｏペナルティロジスティック回帰を用いて選択した。これらの共変量は、年齢、パスタ及び米の毎週の消費量、ならびにアルコールの使用である。次に、組合せスコア及び４つの選択された共変量に基づいて、臨床成績に対するロジスティック回帰を行った。各係数の有意性を、対応するパラメータが０であるという仮説についてＷａｌｄ  ｚ−統計を用いて試験した。同じ手順に従って、ただし血漿試料のみを使用して臨床成績を退行させて（このようなサブコホートについてのみ、全身治療を受けなかった患者が十分だったため）、共変量としての全身治療の効果を確認した。この場合、１つの共変量のみを使用して受けている療法の存在もしくは非存在を示した、又はスニチニブの具体的効果を説明するための第２の共変量を加えた。ｂｒｇｌｍ  Ｒパッケージを用いたＦｉｒｔｈバイアス低減法を採用してロジスティック回帰を実施した。ロジスティック回帰のための２つの代替モデル（組合せスコア＋年齢＋パスタの毎週の消費量＋米の毎週の消費量＋アルコールの使用；又は組合せスコア）の性能を、モデルについての赤池の情報量基準（ＡＩＣ）を計算し、ＡＩＣ重みに関するモデル確率を導出することによって、最小Ｋｕｌｌｂａｃｋ−Ｌｅｉｂｌｅｒ発散基準に従って評価した。
【０２２９】
結果
代謝モデリングは、淡明細胞型腎細胞癌に特有のグリコサミノグリカン生合成の協調調節を明らかにする
本発明者らの最近の研究は、ｃｃＲＣＣにおける代謝リプログラミングが独特であり、腫瘍進行における遺伝的変化による可能性が高いことを示唆している。ｃｃＲＣＣにおける代謝調節の例外性は、潜在的な分子生物学的マーカーとして重要な臨床的意味を有する可能性がある。よって、本発明者らは、ｃｃＲＣＣの代謝調節を計算的に完全に特徴付けようとした。本発明者らは、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）から多数の遺伝子発現プロファイルを検索し（４８１個の腫瘍試料対７１個の腫瘍隣接正常試料、ここでは単に非腫瘍と呼ぶ）、Ｐｉａｎｏ（Ｖａｒｅｍｏら、２０１３）及びＫｉｗｉ（Ｖａｒｅｍｏら、２０１４）と呼ばれるゲノムスケール代謝モデリングの２つの方法を統合して、それぞれ代謝経路又はｃｃＲＣＣの代謝ネットワークにおける関連成分の下方制御を特定した。これらの方法を用いてｃｃＲＣＣ対非腫瘍試料における差示的遺伝子発現を分析したところ、分析は、コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸の前駆体を含む代謝産物の以前には報告されていないサブネットワークを報告した（図１Ａ）。コンドロイチン（ＣＳ）硫酸及びヘパラン（ＨＳ）硫酸は、コアタンパク質との結合において共通の生合成経路を共有するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるが、その後重合が異なる：ＣＳ反復二糖はＮ−アセチルガラクトサミン及びグルクロン酸残基によって構成され、ＨＳ反復二糖はＮ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸残基によって構成される。ｃｃＲＣＣにおいて、本発明者らは、ＣＳ生合成に特異的な大部分の遺伝子の実質的な上方制御（１１／１３）及びＨＳ生合成に特異的な遺伝子の同時下方制御（８／１３）によって定義されるＧＡＧ生合成の協調調節を観察し、ｃｃＲＣＣにおけるＧＡＧ二糖組成、硫酸化及び鎖長の相対的変化を指し示した（図１Ａ）。本発明者らは、ｃｃＲＣＣ対非腫瘍試料における遺伝子発現を比較した２つの独立したデータセットにおけるＧＡＧ生合成のこのような協調調節を確認し、これらの試験における発現倍数変化とＴＣＧＡ試料との間に高い有意な相関があった（ピアソン相関係数ρ＝０．８７〜０．８９、図１Ｂ）。
【０２３０】
ＧＡＧ生合成の協調調節がタンパク質発現のレベルでも表されているかどうかを評価するために、ｃｃＲＣＣ組織マイクロアレイの免疫組織化学を用いて、ｃｃＲＣＣ対正常腎臓試料において経路に特徴的な３つの代表的なタンパク質の存在を検出した（ＣＳ生合成についてはＣＨＰＦ２ならびにＨＳ生合成についてはＨＳ６ＳＴ２及びＥＸＴＬ１）（図２Ａ）。遺伝子発現変化によって、ＣＨＰＦ２は、試験した腫瘍試料全て（２１試料中２１試料）において強い染色を示し、腎臓近位尿細管細胞（０／２）においてごく弱いおそらく非特異的な染色を示した；ＨＳ６ＳＴ２は、試験した腫瘍試料全て弱い染色を示した又は染色を示さなかった（３２試料中０で陽性）が、腎糸球体の有足細胞と大血管の内皮細胞の両方（２／２）で検出され；ＥＸＴＬ１は試験した腫瘍試料の９６％で未検出であった（２７試料中１で陽性）が、集合尿細管細胞（２／２）で強力に染色された（図２Ｂの代表的な試料）。まとめると、これらの結果は、ＧＡＧ生合成の協調調節が、ｃｃＲＣＣ変化中に腎臓で精巧に起こる顕著な代謝イベントであることを示唆している。
【０２３１】
グリコサミノグリカン生合成の変化した調節は、転移で悪化し、患者の尿及び血漿で検出可能である
ＣＳ及びＨＳは、転移性カスケードの重要なステップである血管新生、接着、浸潤及び移動の調節に長い間関連付けられてきた。本発明者らは、ＧＡＧ生合成における遺伝子が転移を有するｃｃＲＣＣ患者においてさらなる調節を示したかどうかを検証するために、差次的遺伝子発現分析を拡張した。本発明者らは、ＧＡＧ生合成に関与する１１個の遺伝子が転移において差次的に調節され、ＣＳ関連遺伝子の過剰発現及びＨＳ関連遺伝子の抑制を激化させることを見出した（図６）。これは、ＧＡＧ生合成の協調調節が転移によって激化するイベントであることを示唆している。ＧＡＧ鎖の組み立ては細胞内で起こるが、完成したプロテオグリカンは細胞外マトリックス中に分泌される。したがって、全て考慮して、本発明者らは、ｃｃＲＣＣ進行に起因するＧＡＧの最終的な変化が腎臓−近位流体に反映されるだけでなく、これらの変化が転移性ｃｃＲＣＣ（ｍｃｃＲＣＣ）患者において検出し易いと推測した。
【０２３２】
ＧＡＧプロファイルの変化がｍｃｃＲＣＣで起こり、入手可能な体液で測定することができるかどうかを検証するために、本発明者らは、３４人のｍｃｃＲＣＣ患者及び１６人の健康な個体（表Ｃ）からなる５０人の対象の発見コホートを募集した。血漿試料のみが入手可能であった２１人のｍｃｃＲＣＣ患者を除いて、全ての対象から血漿試料及び尿試料を採取した。オンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を伴う液体クロマトグラフィーを用いて、ＣＳ及びＨＳ濃度ならびにそれらの二糖組成を試料で定量した。合計で、１８個の独立したＧＡＧ特性を全ての流体試料で測定した（ＧＡＧチャージは全ての硫酸化二糖割合の和であることに留意されたい）。この実験では、これらのデータポイント全ての集合がＧＡＧプロファイルを定義する。
【０２３３】
本発明者らは、血漿試料と尿試料の両方で、健康な個体（図３Ａ及び表Ａ）と比較したｍｃｃＲＣＣ患者のＧＡＧプロファイルの顕著な差及び個々のＧＡＧ特性の顕著な差を観察した。血漿又は尿ＧＡＧプロファイルの主成分分析（ＰＣＡ）は、ｍｃｃＲＣＣ患者が健康な個体と明確に異なることを明らかにした（分散の８２％及び６３％はそれぞれ第１の成分に沿って説明される、図３Ｂ）。これらの結果は、ｍｃｃＲＣＣが健康な個体のものとは著しく異なる全身ＧＡＧ組成の変化を伴うことを示している。
【０２３４】
血漿及び尿ＧＡＧプロファイルに基づくｍｃｃＲＣＣマーカーの設計
主にｍｃｃＲＣＣの発生に起因する血漿及び尿ＧＡＧ特性及びプロファイルの変化は、疾患を健康な状態と最もよく区別するＧＡＧ特性に基づいて入手可能なマーカーを設計する機会を開く。本発明者らは、臨床成績（すなわち、ｍｃｃＲＣＣ対健康）を最も予測する堅牢なＧＡＧ特性を選択するために、一個抜き交差検証と共にＬａｓｓｏペナルティロジスティック回帰（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、１９９６）を利用した。その後、マーカーを分子はｍｃｃＲＣＣに関連する特性の和であり、分母は健常な状態に関連する特性の和である比として設計した。回帰係数を用いて各項を正規化した。本発明者らは、血漿又は尿又は組合せ測定値に基づいて、３つの潜在的な疾患マーカーを導き出した：
【数１０】
2019512690.tif 000011
【数１１】
2019512690.tif 000012
【数１２】
2019512690.tif 000013
（括弧内の用語は対応するＧＡＧの二糖の割合を表す（略語は図３ＡのようにＣＳ及びＨＳの異なる硫酸化パターンを表す）、
【数１３】
2019512690.tif 000014
はＣＳの総濃度（μｇ／ｍＬ）であり、
【数１４】
2019512690.tif 000015
は、ＨＳの硫酸化二糖類の総割合である）。次いで、本発明者らは、各試料について３つのスコアを計算し、ｍｃｃＲＣＣ試料が健康な試料に対してスコアが反回性に上昇するスコアを有することを観察した（図４Ａ）。本発明者らは、頑強なベイズ推定を用いて、２つの群間の３つのスコア全てにおいて有意な非ヌル平均差を計算した。平均差は、組合せスコアで２．１５（９５％高密度区間［ＨＤＩ］１．７２〜２．６０）、血漿スコアで２．４９（９５％ＨＤＩ  １．９４〜３．０５）、尿スコアで０．７９（９５％ＨＤＩ  ０．５２〜１．０６）に等しかった。３つのマーカーの性能を、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて評価し、曲線下面積（ＡＵＣ）が、組合せスコア及び血漿スコアの場合には、１（完全な分類器）であり、尿スコアについては０．９６６であることが分かった（図４Ｂ、表Ｂ）。これらのマーカーの直接的な臨床的実施は、外科手術後のｍｃｃＲＣＣ患者を監視し、標準的な放射線検査に加えて、又はそれに代わって単純で利用可能な検査を用いて治療に対する応答を診断することであろう。したがって、各ＲＯＣ曲線から、本発明者らはマーカーの正の予測値（ＰＰＶ）を最大化するスコアカットオフを計算した（表Ｂ）。まとめると、これらの所見は、ｍｃｃＲＣＣで起こる血漿及び尿ＧＡＧ組成の変化をスコアに要約することができることを示している。同様に、これらのスコアは疾患個体を健康な個体と正確に識別した。
【０２３５】
独立コホート及び疾患の証拠がない患者におけるｍｃｃＲＣＣマーカーの検証
これらのスコアが独立コホートにおいて再現可能な精度を有するかどうかを検証するために、ｍｃｃＲＣＣを有する１８人の患者及び９人の健康な個体からなる２７人の対象を募集した（表Ｃ）。血漿試料のみが入手可能であった１１人のｍｃｃＲＣＣ患者を除いて、全ての対象から血漿試料及び尿試料を採取した。各個人の３つのマーカーを分析し、対応するスコアを計算した。スコアはまた、この検証コホートの健康な対照と比較してｍｃｃＲＣＣにおいて顕著に高かった（図４Ｃ）。本発明者らは、３つのマーカー全てについて１に等しいＡＵＣ値を計算した（図４Ｄ及び表Ｂ）。さらに、以前に決定したカットオフスコアでのＰＰＶは、血漿マーカーについては９０％、組合せ及び尿マーカーについては１００％に及んだ（表Ｂ）。この証拠は、３つのマーカーが、入手可能な分析試験によってｍｃｃＲＣＣの発生を示す可能性を有することを強く示唆している。それにもかかわらず、ｍｃｃＲＣＣを監視する試験を厳密に検証するには、以前にｍｃｃＲＣＣと診断されたが疾患の証拠がない対象のスコアの計算が必要である。そのため、本発明者らはマーカーを分析し、ｍｃｃＲＣＣと診断されたが、サンプリング時には疾患の証拠がない８人の個体のコホートにおける対応するスコアを計算した。分類の精度はスコアによって異なっていたが、ｍｃｃＲＣＣの期待値からのスコアの顕著な減少が観察された。血漿スコアと尿スコアの両方で精度が高く、計算されたスコアは８例中７例でカットオフを上回っていなかったため、対象の８７．５％がｍｃｃＲＣＣを有していないと正しく識別された（図５）。組合せスコアでは精度が低く、カットオフにより８人の対象のうち６人（７５％）が正しく分類された。臨床試験のみが腫瘍負荷とスコアとの間の正の相関関係を裏付けることができるが、これらの結果は、血漿及び尿ＧＡＧ組成をｍｃｃＲＣＣの発生についての堅牢で正確な診断バイオマーカーとして使用することができることを示している。
【０２３６】
交絡因子を考慮したｍｃｃＲＣＣマーカーの予測値の分析
本発明者らは、測定された全身ＧＡＧ変化が、基礎をなす転写調節によって示唆されるようにｃｃＲＣＣ進行に純粋に起因する程度、又はそれらが他の交絡因子にも依存するかどうかを特定しようとした。そのため、本発明者らは、３３人の個体（１７人のｍｃｃＲＣＣ及び１６人の健康）についてのスコアと臨床成績との関連を交絡させ得る臨床情報及び食事情報を収集した。表Ｃに報告されるように、いくつかのベースライン特性、例えば性別、パスタ消費量及びアルコール消費量の不均一な分布を観察した。したがって、本発明者らは、臨床成績が、マーカースコアではなく、交絡因子のいくつかによって純粋に推定できるかどうかを試験した。まず、ｍｃｃＲＣＣ群対健康な群の間で最も偏った因子を決定した。この目的のために、本発明者は、Ｌａｓｓｏペナルティロジスティック回帰を使用して、交絡因子及び組合せスコアに基づいて臨床成績を退行させた。この分析では、年齢、パスタ及び米の毎週の消費量、ならびにアルコールの使用の４つの潜在的に関連する交絡因子を選択した。次に、本発明者らは、ロジスティック回帰を用いて共分散の分析を行い、共変量としての４つの交絡因子を用いて臨床成績と組合せスコアとの間の関連の強さを試験した。注目すべきことに、共変量のどれも臨床成績の退行に有意な寄与をしていない（ｐ＝０．２７〜０．４４）。さらに、本発明者らは、最小Ｋｕｌｌｂａｃｋ−Ｌｅｉｂｌｅｒ発散基準に従って、組合せスコアのみに基づくロジスティック回帰モデルが最も可能性が高い（ｐ＝９９．２％）ことを計算した：組合せスコアにのみ基づく回帰についての赤池の情報量基準は、４つの共変量に同様に基づく回帰よりも有意に低い（それぞれ、７．８対１７．５）。血漿スコア（６．０対１７．９）についても同様の結論に達したが、パスタ消費量が臨床成績の退行に有意な効果を示した（ｐ＝０．０３）尿スコア（２３．０対１７．５）ではそうでなかった。
【０２３７】
最後に、本発明者らは、体液をプロファイリングすることによってこれらを計算するとすれば、全身治療がマーカースコアに影響を及ぼすかどうかを調べた。この群について、本発明者らは、治療（ｎ＝１９）患者及び未治療（ｎ＝３３）患者の比較できる数に注目したため、血漿試料のみを採取した患者に分析を限定した（したがって、血漿スコアに対する効果のみをチェックした）。本発明者らは、試料の治療状態（ｐ＝０．５１８）及び治療の種類（スニチニブ対他の多数、ｐ＝０．５０８）のスコアの線形回帰に基づいて、血漿スコアと全身治療の使用との間に有意な相関を認めなかった。全体として、共分散のこれらの分析は、提案されたスコアの形態でのＧＡＧ測定が、ベースライン及び患者間の治療差にもかかわらずｍｃｃＲＣＣの発生を頑強に予測することができることを示している。この堅牢性は、ｃｃＲＣＣ進行に固有のＧＡＧ生合成の協調調節に起因するようであり、これは腎臓に隣接する流体のレベルで反映される。
【０２３８】
考察
この試験は、同時のＣＳ形成につながる枝の上方制御及びＨＳ形成につながる枝の下方制御を特徴とする、ＧＡＧ生合成の協調調節が、ｃｃＲＣＣにおける顕著なイベントであることを明らかにしている。さらに、多くの経路関連遺伝子が、転移においてさらに上方制御又は下方制御される。
【０２３９】
現在、転移性ｃｃＲＣＣについて日常的実行に入った診断バイオマーカーは存在しない（Ｊｏｎａｓｃｈら、２０１２；Ｍｏｃｈら、２０１４）。同時に、転移性疾患は決まって不治であるが、転移巣切除術の有無にかかわらず、腫瘍学的標的療法と関連して稀な完全応答が報告された。そのため、ＧＡＧプロファイルの変化が疾患の発生の指標となるかどうかは、間違いなく、重要な臨床的進歩となるだろう。このような試験の有効性は、いくつかの医学的決定のための価値を有するだろう：外科手術又は全身治療前後のｃｃＲＣＣを監視すること；長期間、疾患の再燃を除外し、その後患者に典型的に治癒を宣言すること；リスクがある集団、例えば遺伝的素因のある個体におけるｃｃＲＣＣの発生を評価すること；転移がｃｃＲＣＣによるのか他の新生物によるのかを確認すること；及びｍｃｃＲＣＣの治療応答をフォローすること。これを考慮して、本発明者らは、ｍｃｃＲＣＣの発生の特色を示し、入手可能な体液の測定値に基づいて計算され、ここで考慮される交絡因子と独立に臨床成績を予測し、最も重要なことに、疾患の正確で堅牢な予測因子となる３つのマーカーを設計した。
【０２４０】
血漿及び尿のＧＡＧプロファイルは、根底にある転写調節、すなわちｃｃＲＣＣにおけるＨＳに対するＣＳの産出増加から予想されるパターンに緩やかに似ている。同時に、ＧＡＧプロファイルは、このがんタイプの発生に起因するいくつかの新規な生物学的洞察を明らかにする。健康な個体の血漿中のＧＡＧ組成は、典型的には、いかなる組織によっても影響を受けない。ここで、本発明者らは、転移性ｃｃＲＣＣに付随するＧＡＧ組成の全身変化を観察した。ｍｃｃＲＣＣ試料中の４ｓ−及び６ｓ−ＣＳならびに６ｓ−ＨＳの濃縮は、リンパ球のＧＡＧ組成を顕著に暗示する。そのため、ｍｃｃＲＣＣにおける免疫系の浸潤が、腫瘍において観察される転写調節の背後にある可能性があることを推測することが魅力的である。尿では、健康な個体におけるＧＡＧ組成は同様に特徴付けられていない。ｍｃｃＲＣＣ試料のＧＡＧプロファイルにおいてここで報告される変化は、腎臓糸球体の細胞の進行性の損傷を反映し得る。まとめると、この証拠は、ｃｃＲＣＣの進行におけるＧＡＧの変化の重要性を強調しているようである。興味深いことに、ＧＡＧ結合マラリアタンパク質（Ｓａｌａｎｔｉら、２０１５）を用いてがんを標的化した研究で最近示されたように、これらのＧＡＧ変化の特異性は、ｃｃＲＣＣに特異的に薬物を送達するために利用され得る。
【０２４１】
これまで、バイオマーカーの発見及び診療への橋渡しが損なわれていた主な難点の中に、入手可能な試料中の標的の検出及び結果の再現性がある（Ｓａｗｙｅｒｓ、２００８）。ここで、本発明者らは、ｃｃＲＣＣ試料中の強く一貫して調節された生物学的過程によって支持される転移性ｃｃＲＣＣの血漿及び／又は尿マーカーの証拠を提供する。本発明者らは、腫瘍負荷と試験スコアとの間の傾向を監視する将来の縦断的研究が、ｃｃＲＣＣの臨床管理における多様な診断ツールのためのこれらのマーカーを確立し得ることを想定する。
【０２４２】
例２
最も一般的な形態の腎臓がんである淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）の症例の約５０％が転移性疾患を発症し、これは通常不治である。早期診断されたｃｃＲＣＣとは対照的に、転移性患者の生存期間中央値は有意に悪化している。チロシンキナーゼ阻害剤（スニチニブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ）及びｍＴＯＲ阻害剤（テムシロリムス及びエベロリムス）の連続使用の導入は、全生存の大きな変動を伴うが、転移性ｃｃＲＣＣの予後を大幅に改善した。これらの違いは、ｃｃＲＣＣ侵攻性の根底にある重要な生物学的過程がより高リスクの患者を特定し、その後、治療選択肢を導くことができる分子予後マーカーの解明を可能にするために、ｃｃＲＣＣ侵攻性の根底にある重要な生物学的過程を特定する必要性を強調している。
【０２４３】
システム生物学的手法を用いて、本発明者らは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）生合成の転写調節が、転移において悪化するｃｃＲＣＣにおいて顕著なイベントであることを報告した（例１及びＧａｔｔｏら、２０１６）。本発明者らは、この調節が、尿試料と血漿試料の両方における対象のＧＡＧプロファイルの全身変化によって反映されることをさらに実証し、このＧＡＧプロファイルを利用する血漿及び／又は尿スコアを設計した。精度及び最小限の侵襲性のために、ＧＡＧプロファイリングはｃｃＲＣＣにとって魅力的で新規なバイオマーカーであり、システムバイオマーカーを例示する。
【０２４４】
この例に記載される観察試験の第一の目的は、ＧＡＧプロファイリング（例えば、新規なＧＡＧ血漿及び／又は尿バイオマーカースコア）が、例１に記載される試験に登録された患者のｃｃＲＣＣの予後と相関する（よって、これに使用され得る）かどうかを理解することであった。
【０２４５】
実験手順
試験設計と患者選択
この試験報告書は、ＲＥＭＡＲＫガイドラインに従って記載した。ｃｃＲＣＣ患者の前向きコホート及び連続コホートを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃｏ  Ｖｅｎｅｔｏ、ＩＯＶ−ＩＲＣＣＳ、Ｐａｄｏｖａ、イタリアで追跡した対象を含む本発明者らの以前のバイオマーカー試験に登録した。シリーズは２０１３年１月〜２０１５年６月に登録した（例１）。本試験で考慮した患者集団は３１人の個体が含んでおり、その包含基準は以下の通りであった：（ｉ）淡明細胞型腎細胞癌の以前又は現在の組織学的診断；（ｉｉ）任意の病期；（ｉｉｉ）転移性疾患のため又はフォローアップ観察で全身治療を受けている患者；及び（ｉｖ）書面によるインフォームドコンセント、一方除外基準は以下の通りであった：（ｉ）非淡明細胞サブタイプ。診断の評価は、臨床検査及びコンピュータ断層撮影、又はフォローアップ時の他の放射線学的評価に基づいていた。本発明者らは、バイオマーカースコアが、薬物治療の使用又は種類と独立し得ることを以前示している（Ｇａｔｔｏら、２０１６）ので、患者は入院時に様々なタイプの腫瘍学的治療を受けている可能性がある。患者フォローアップ期間は２０１５年１２月に終了し、フォローアップ期間中央値（サンプリング日〜イベント、例えば死亡又は正しい打ち切り）は２．７年であった。この試験の全患者は、同じ診療所でフォローアップ期間中３〜６ヶ月毎に日常的に検査を受けた。死亡の全てが、転移性がんに起因するものであった。２０１３年１月、イタリアのＰａｄｏｖａのＩＯＶ−ＩＲＣＣＳのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄに、本観察試験を通知した。
【０２４６】
バイオマーカー決定
バイオマーカースコアを、患者のフォローアップ中に一度採取した血漿試料及び尿試料に基づいて算出した。全血試料をＥＤＴＡコーティング管に回収した。管を遠心分離（４℃で１５分間２５００ｇ）し、血漿を抽出し、別の管に回収した。尿をポリプロピレンチューブに回収した。試料をドライアイス上で分析するために出荷されるまで−８０℃で保存した。グリコサミノグリカン測定を、以前に記載されたように（Ｇａｌｅｏｔｔｉら、２０１４；Ｋｏｔｔｌｅｒら、２０１３）、レーザー誘起蛍光を伴うキャピラリー電気泳動を用いて行った。これらの測定値に基づいて、以下の式によって、及び本明細書に報告されているように（例えば、１５頁）、血漿及び尿のバイオマーカーをスコア化した：
【数１５】
2019512690.tif 000016
【数１６】
2019512690.tif 000017
（
【数１７】
2019512690.tif 000018
は６硫酸化コンドロイチン硫酸の割合を表し、
【数１８】
2019512690.tif 000019
は４硫酸化コンドロイチン硫酸の割合を表し、
【数１９】
2019512690.tif 000020
はＮ−硫酸化６硫酸化ヘパラン硫酸の割合を表し、
【数２０】
2019512690.tif 000021
はＮ−硫酸化ヘパラン硫酸の割合を表し、
【数２１】
2019512690.tif 000022
はＣＳの総濃度（μｇ／ｍＬ）であり、
【数２２】
2019512690.tif 000023
はＨＳの硫酸化二糖の総割合である）。
【０２４７】
生存分析
生存を、サンプリング日と「イベント」時との間の時間（日数）として計算した。「イベント」時は、正しい打ち切り（イベントなしの最後のフォローアップ日）として、又は全生存の場合の死亡日及び無増悪生存の場合の進行日として定義される。単変量及び多変量生存分析を、対象となる変数及び９５％信頼区間のオッズ比を推定するためにコックス比例ハザードモデルを適合させることによって行った。ログランク統計検定を利用して、回帰の有意性を決定した。最初の候補変数は、上記の式に従って計算された連続変数としての、血漿スコア（２つの欠損データポイント）又は尿スコア（１つの欠損データポイント）のいずれかであった。各流体について、患者を２つの群、「低」対「高」スコアに二分するためにもスコアを使用したが、ここでは前者の流体の中央スコアを偏りのないカットオフとして使用した。カプラン・マイヤー生存曲線を２つの群に適合させ、ログランク検定を用いて生存差の統計的有意性を評価した。さらに、本発明者らはまた、第１に、フォローアップの際に疾患の証拠のない患者（８人の患者）を除外し、第２に、生存率を、転移性疾患のための治療開始日とイベント時との間の時間（日数）としてさらに計算することによって、上記分析を繰り返した。
【０２４８】
上記の単変量コックスモデルを用いて、生存の回帰についてさらなる変数を検討した：年齢（連続、年）、パフォーマンスステータスＥＣＯＧスコア（整数、０〜４）、Ｆｕｒｈｍａｎグレード（カテゴリー、ＩＩ未満対超、４欠損データポイント）、Ｈｅｎｇスコア（カテゴリー、良好対中間、１欠損データポイント）、及び好中球対リンパ球比（連続、２欠損データポイント）。前の解析からの欠損データを有する患者は除外した。多変量コックスモデルは、統計学的有意性に達した単変量解析からの変数を使用して予め特定した（欠損データは除外し、尿又は血漿スコアについてそれぞれ評価された２７人及び２８人の患者が得られた）。さらに、本発明者らは、検証された予後因子：年齢とパフォーマンスステータスを特徴とする他変量コックスモデルを構築した。比例ハザード仮定の妥当性を、変換生存時間とスケーリングされたシェーンフィールド残差との間の両側ｔ検定を用いて調べた。このパイロット試験の設計時には、血漿及び／又は尿スコアの予後値に関する事前知識がｃｃＲＣＣについても任意の関連する病理学についても入手可能でなかったため、症例数をこの試験のために特異的に供給しなかった。ブートストラップアルゴリズム（１０００ブートストラップ）を用いて単変量及び多変量モデルの内部検証を行い、試験セットと対照的に元のデータセットにおけるＳｏｍｅｒｓのＤランク相関統計の変化を観察することによって、厳しい過剰適合をチェックした。このように補正されたＳｏｍｅｒｓのＤランク相関統計は、個々の予め指定されたモデルの予測識別のためのメトリックとして報告される。統計解析を、Ｒプログラミング言語、ｖ．３．２．３のパッケージ生存及びｒｍｓを用いて行った。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０２４９】
結果
前向きコホートは３１人の患者を含んでいた。２３人の患者が転移性であり、スニチニブ又はエベロリムスのいずれかで治療されていた；８人の患者が、ｃｃＲＣＣの以前の診断を有していたが、血液及び尿試料の採取時に疾患の証拠はなく、よって抗腫瘍薬で治療されなかった。このコホートについて、それぞれ２９人（９３％）及び３０人（９７％）の患者で血漿スコア及び尿スコアを計算した。中央スコアは、血漿については０．８９（ＩＱＲ：０．３３〜０．９６）、尿については１．１８（ＩＱＲ：０．８８〜１．４９）であった。各流体について、バイオマーカースコアが偏りのないカットオフ（例１）として先験的に選択された中央スコアよりも低いか高いかに応じて、患者を「低」又は「高」のいずれかとして分類した。表Ｄの２つの群の間の標準臨床病理学的特徴の比較を提供する。
【０２５０】
３１人の患者全員のカプラン・マイヤー生存率プロットは、「低」スコアの患者が、尿スコアと血漿スコアの両方の場合で、「高」スコアの患者よりも無増悪生存（ＰＦＳ）と全生存（ＯＳ）の両方に関してうまくいっていることを明らかにした。特に、尿スコアの場合（ＯＳについてはログランク検定ｐ＝０．００７８、ＰＦＳについてはｐ＝３・１０−４、図９）ならびに血漿スコアについてはＯＳの場合（ＯＳについてはｐ＝０．０２０６、ＰＦＳについてはｐ＝０．０５９１、図１０）に差が統計学的に有意であった。連続変数としてモデル化した場合、尿スコアの場合にのみ（ＯＳについてはＨＲ：９．６２、９５％ＣＩ：１．６６〜５５．８２、ｐ＝０．０１１、ＰＦＳについてはＨＲ：４．２９、９５％ＣＩ：１．４９〜１２．３３、ｐ＝０．００７）有意であるにもかかわらず、両スコアはＰＦＳとＯＳの両方のリスクの線形増加を示した。単変量解析の推定値を、ＰＦＳについては表Ｅに、ＯＳについては表Ｆに報告する。
【０２５１】
本発明者らは、上記の生存分析を繰り返して、２つのさらなるシナリオを評価した：現在の転移性ｃｃＲＣＣ診断を有する患者のサブセットにおけるバイオマーカースコアと生存との間の相関（疾患の証拠がない８人の患者を除く）；及びこのサブセット内で、バイオマーカースコアと最初の全身治療の開始から計算された生存との間の相関。第１のシナリオでは、尿（図１１Ａ）又は血漿（図１１Ｂ）バイオマーカースコアによって層別化されたこれらの患者のカプラン・マイヤー曲線が、「高」スコアの患者についてＰＦＳ及びＯＳとの負の関連を強調した（図１１、尿バイオマーカーについてはＰＦＳの場合に統計学的に有意である（ログランク検定ｐ＝０．０３０６））。連続変数として、本発明者らは、尿スコアとＰＦＳ又はＯＳとの間の統計学的に有意な負の相関（ＰＦＳについてはＨＲ：３．６３、９５％ＣＩ：１．２０〜１０．９５、ｐ＝０．０２２、ＯＳについてはＨＲ：８．４０、９５％ＣＩ：１．４１〜４９．９６、ｐ＝０．０１９）を確認したが、血漿スコアについての結果は統計学的に有意でなかった（ＰＦＳについてはＨＲ：０．９４、９５％ＣＩ：０．３０〜２．９０、ｐ＝０．９１２、ＯＳについてはＨＲ：１．６４、９５％ＣＩ：０．４９〜５．４５、ｐ＝０．４２０）。第２のシナリオでは、尿又は血漿バイオマーカースコアによって層別化された患者のカプラン・マイヤー曲線が、両方の場合で、「高」スコアの患者が、治療の開始日から生存期間を計算した場合でさえ悪い予後を有する傾向があることを明らかにした（図１２；図１２Ａ−尿；図１２Ｂ−血漿）。
【０２５２】
次に、本発明者らは生存とｃｃＲＣＣにおけると他の臨床的特徴との間の相関を評価した：年齢、パフォーマンスステータス、腫瘍グレード、Ｈｅｎｇグループ分類及び好中球対リンパ球比（表Ｅ及び表Ｆ）。本発明者らは、好中球対リンパ球比が３より大きい場合、（ＰＦＳではなく）ＯＳについてのハザード比の有意な線形増加を回収した（ＨＲ：５．０３、９５％ＣＩ：１．１６〜２１．８０、ｐ＝０．０３１）。好中球対リンパ球比について調整された血漿又は尿バイオマーカースコアに関する多変量解析により、尿バイオマーカースコアがＰＦＳ（ＨＲ：４．６２、９５％ＣＩ：１．６６〜１２．８３、ｐ＝０．００３）及びＯＳ（ＨＲ：１０．１３、９５％ＣＩ：１．８０〜５７．０４、ｐ＝０．００９）の独立した予測因子であることが確認され、血漿バイオマーカースコアも同様の傾向を示した（表Ｅ及び表Ｆ）。よって、指定された多変量モデルもまた統計学的に有意であり、尿スコアの場合に生存との顕著な一致を示した（尤度比検定ＯＳについてはｐ＝０．００３及びＣ＝０．８３２、ＰＦＳについてはｐ＝０．０１５及びＣ＝０．７４５）。血漿又は尿スコアの推定された効果を分析し、ｃｃＲＣＣの予後因子（年齢及びパフォーマンスステータス）を確立した明確に予め指定された多変量コックスモデルも、尿スコアの場合に生存との統計学的関連性の証拠を提供した（尤度比検定ＯＳについてはｐ＝０．０１６、ＰＦＳについてはｐ＝０．０３１）。
【０２５３】
考察
転移性ｃｃＲＣＣは決まって不治であると考えられているが、患者は臨床予後因子によって広範に異なる生存率に達し得る。さらに、現在の抗血管新生腫瘍標的療法では、転移巣切除術の有無にかかわらず、稀な完全応答が報告されている。そのため、ｃｃＲＣＣ進行の侵攻性の基礎となる生物学的過程を決定することは、これらが高リスクの患者を区別し、治療の異なる戦略を提唱し得るために重要である。近年、いくつかの分子予後因子が、タンパク質又は小分子の発現の変化に基づいて予後不良を有効に予測することが示されている。しかしながら、これらのバイオマーカーは、典型的には、１つ又はいくつかの分子を含み、したがって、ｃｃＲＣＣ侵攻性を駆動する重要な生物学的過程の複雑さを捕らえそうもない。反対に、ｃｃＲＣＣ侵攻性を駆動する生物学的過程は、いくつかの生体分子の相互作用のネットワークから合併する。
【０２５４】
本明細書に報告されるように、本発明者らは、ｃｃＲＣＣにおけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）生合成調節の重要性を特定するためのシステム生物学的アプローチを採用した。本発明者らは、血漿及び尿中の主要なＧＡＧの同時測定がこの過程の調節を有効に捕らえることを発見し、この新規のシステムバイオマーカー（例１）に基づいてＧＡＧプロファイルスコアの診断値を検証した。前者のシステムバイオマーカーは、ｃｃＲＣＣのための新規なバイオマーカーの探索において広範に研究されている遺伝子、タンパク質又は免疫マーカーに関する生物学的情報の代替層となる代謝産物レベルでの測定を集塊する（Ｍａｒｏｔｏ及びＲｉｎｉ、２０１４；Ｍａｒｕｚｚｏら、２０１６；Ｒｏｓｓｉら、２０１２）。
【０２５５】
本明細書に報告されるように、本発明者らは、例１に記載される、以前の試験に登録されたｃｃＲＣＣ患者の前向きコホートにおける予後又は進行及び全生存とのバイオマーカースコアの相関（よって有用性）を調査した。
【０２５６】
バイオマーカースコアと生存との間の関連の強さは、中央スコアに応じて患者をグループ化した場合、血漿と尿の両方において統計学的有意性に達するのに十分であった。連続変量として、尿スコアは、唯一の転移性患者に限られた場合であっても（ＰＦＳについては単変量ＨＲ＝３．６３、ＯＳについては８．４０）、乏しい生存、特に全生存との最も強い相関に達した（ＰＦＳについては単変量ＨＲ＝４．６２、ＯＳについては１０．１３）。さらに、多変量解析で、尿スコアはＯＳ及びＰＦＳと独立に関連していた（ＰＦＳについては多変量ＨＲ＝５．３８、ＯＳについては１６．４３）。一方、血漿スコアは弱い傾向を示し、これもまた全生存の場合により強かった（ＰＦＳについては単変量ＨＲ＝１．６９、ＯＳについては２．２３）。本発明者らは、対象を中央血漿スコアに基づいて二分した場合の結果（ＰＦＳについてはログランクＨＲ＝３．２６、ＯＳについては７．７５）によって実証されるように、極端なスコアを有する患者が低スコアの患者よりも悪かったので、血漿スコアがまだ予後値を有すると推測する。まとめると、これらの結果は、サンプリング時の血漿バイオマーカースコアと尿バイオマーカースコアの両方が、ＯＳとＰＦＳの両方に関して、ｃｃＲＣＣ患者の予後を予測することができ、スコアの増加に伴うリスクの定量的線形増加が存在するという証拠を構成する。これらの所見は、本発明者らの新規なシステムバイオマーカー又はＧＡＧスコアが、診断又はスクリーニングツールとしての可能性を実証しただけでなく、予後診断においても役割を果たすことを実証している。
【０２５７】
ｃｃＲＣＣで現在使用されている予後因子は、主に臨床パラメータに基づく。これらには、腫瘍サイズ又はグレードなどの個々の因子の予後値を改善するように設計された複合スコアリングシステムが含まれる（Ｓｕｎら、２０１１）。本発明者らの試験で採用されたＨｅｎｇグループ分類が、そのようなシステムの例である。前者のシステムの固有の欠点は、予後が定量的予後変数ではなくリスク群に基づくことである。それにもかかわらず、バイオマーカーに基づく予後モデルは、日常的な臨床診療にまだ組み込まれていない。血液ベースのバイオマーカーに限定すると、血清ＶＥＧＦレベル（Ｎｅｇｒｉｅｒら、２００４）（ＰＦＳについてはＨＲ＝１．１９、ＯＳについては１．３９）、血清アミロイドＡ（Ｒａｍａｎｋｕｌｏｖら、２００８）（ＯＳについてＨＲ＝２．５１〜２．８１）、血清インスリン様増殖因子１（Ｒａｓｍｕｓｏｎら、２００４）（ＯＳについてＨＲ＝０．６２）に関して有望な結果が示された。これらのバイオマーカーは、腫瘍起源のないいくつかの交絡因子に苦しむ可能性があることが注目された（Ｓｕｎら、２０１１）。例えば、ＶＥＧＦレベルは損傷血小板に由来し、アミロイドＡは外傷及び炎症の有名なマーカーである。逆に、ｃｃＲＣＣ患者におけるＧＡＧレベルの上昇は、おそらくＧＡＧ生合成経路の上方制御（Ｇａｔｔｏら、２０１６）に起因する腫瘍自体の産物（Ｕｃａｋｔｕｒｋら、２０１６）であり得る。尿スコアについて本明細書で報告されるハザード比は、連続的な独立した様式での生存不良の予測因子であっただけでなく、上述のバイオマーカーよりもはるかに高かった（ＰＦＳについては多変量ＨＲ＝５．３８、ＯＳについては１６．４３）。
【０２５８】
ＧＡＧスコアの分布はさらに、年齢、パフォーマンススコア、腫瘍グレード、Ｈｅｎｇグループ分類及び好中球対リンパ球比などの他の予後因子から独立しているようであった。８人の非転移性ｃｃＲＣＣ患者全員が、低ＧＡＧスコアを有していた（バイオマーカーが疾患の重症度と相関するという考えと一致する）ので、したがって、本発明者らは、転移性疾患を有する２３人の患者のみを検討する追加分析を行った。改めて、ＧＡＧスコアは予後診断の有意性を保持し、このバイオマーカーの予後診断の役割が転移性疾患自体の存在の発現ではない可能性が高いことを示唆している。最後に、試料を治療の開始時ではなく、患者フォローアップ中の異なる時に採取したが、疾患進行又は予後の予測は、治療の開始からの全生存との相関も示した。
【０２５９】
本明細書に記載されるバイオマーカーは、測定が最小侵襲性であり、疾患の動的監視を可能にするため、いくつかの可能性のある臨床的利点を有する。
【０２６０】
結論として、本発明者らは、ｃｃＲＣＣを有する患者のＰＦＳ及びＯＳを含む血漿及び尿ＧＡＧの異なるプロファイル間の相関を報告し、これらの結果は、ｃｃＲＣＣを有する対象の予後バイオマーカーとしてのＧＡＧスコアの臨床的有用性を実証している。全体として、非侵襲性のシステムバイオマーカーによるグリコサミノグリカンの複雑な発現の捕捉は、ｃｃＲＣＣの待望の臨床バイオマーカーとなり得る。
【０２６１】
参考文献
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Ｊｏｎａｓｃｈ，Ｅ．、Ｆｕｔｒｅａｌ，Ｐ．Ａ．、Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｊ．、Ｂａｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．、Ｋｉｍ，Ｗ．Ｙ．、Ｂｒｕｇａｒｏｌａｓ，Ｊ．、Ｇｉａｃｃｉａ，Ａ．Ｊ．、Ｋｕｒｂａｎ，Ｇ．、Ｐａｕｓｅ，Ａ．、Ｆｒｙｄｍａｎ，Ｊ．ら（２０１２）。Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０、８５９〜８８０。
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【０２６２】
表Ａ：個々のＧＡＧ特性（ＣＳ、ＨＳ又はＨＡレベル、個々の二糖組成及びチャージＨＳ又はチャージＣＳ）が、ｍｃｃＲＣＣと健康な試料との間の有意で実質的に認識可能な変化を示すという統計的確実性のメトリックを計算した。症例と対照の間の平均の差が、測定に関連してデータに適合し得る全ての可能な統計分布の５％未満内のいわゆる実質的に等価な範囲に入る場合、変化を有意で実質的に認識可能と定義した。表Ａは、結果の要約を示し、ｍｃｃＲＣＣ対健康な対象の血漿又は尿で測定されるＧＡＧ特性についての平均値、及び平均差の統計学的有意性についてのベイズ推定（％）を示す（ＲＯＰＥ％、実質的に等価な範囲、ＲＯＰＥ％＞５は２つの群についての値のランダム分布が症例の５％超において実質的に等価な平均を有することを示し、そのため、これは有意でない）。
【０２６３】
表Ａはまた、二糖組成の個々の型の一定の比を計算した結果を示している。４ｓ．６ｓ  ＣＳは４ｓ  ＣＳと６ｓ  ＣＳの比である。６ｓ．０ｓ  ＣＳは６ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳ（非硫酸化ＣＳ）の比である。４ｓ．０ｓ  ＣＳは４ｓ  ＣＳと０ｓ  ＣＳ（非硫酸化ＣＳ）の比である。
【表１−１】
2019512690.tif 000024
【表１−２】
2019512690.tif 000025
【０２６４】
表Ｂ：最適なカットオフスコア（発見コホートで計算される）での発見コホート及び検証コホートの臨床成績（ｍｃｃＲＣＣ対健康）の予測におけるＧＡＧベースのマーカーの精度の測定。
【表２】
2019512690.tif 000026
【０２６５】
表Ｃ：発見（ｎ＝５０）及び検証（ｎ＝２７）コホートの臨床データ。全ての結果は中央値（２５、７５百分位数）又はパーセントとして提示される。欠測値は省略した。
【表３】
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【０２６６】
表Ｄ：全患者の前向きコホートにおける臨床病理学的特徴。尿又は血漿中の「低」及び「高」バイオマーカースコアにより層別化する。分布を中央値及び括弧内の分位範囲として要約する。
【表４】
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【０２６７】
表Ｅ：転移性淡明細胞型腎細胞癌の無増悪生存における臨床因子のハザード比（ＨＲ）。コホートサイズは３１人の患者であり、欠損データはこの数から除外している。
【表５】
2019512690.tif 000029
【０２６８】
表Ｆ：転移性淡明細胞型腎細胞癌の全生存における臨床因子のハザード比（ＨＲ）。コホートサイズは３１人の患者であり、欠損データはこの数から除外している。
【表６】
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【０２６９】
表Ｇ：淡明細胞型腎細胞癌の無増悪生存における個々のグリコサミノグリカン特性のハザード比（ＨＲ）。コホートサイズは３１人の患者である（欠損データは除外）。
【表７】
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【０２７０】
表Ｈ：淡明細胞型腎細胞癌の全生存における個々のグリコサミノグリカン特性のハザード比（ＨＲ）。コホートサイズは３１人の患者である（欠損データは除外）。
【表８】
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【０２７１】
例３
主要エンドポイントが、血漿スコアが転移性ｃｃＲＣＣの診断に役立つことをさらに確認することである独立した実験を設計した。以前に導出されたカットオフに基づく分類の精度が、本発明者らの以前の実験の検証コホートにおける血漿スコアについて報告された精度（９２．６％）以上である場合、主要エンドポイントを満たされたとみなした。
【０２７２】
この目的のために、本発明者らは、転移性ｃｃＲＣＣを有することが知られている対象から血漿試料を得ようとし、前記のように血漿ＧＡＧプロファイルを測定した。次に、本発明者らは各試料における血漿ＧＡＧスコアを計算した。ＧＡＧスコアが、以前に特定されたカットオフ（血漿スコアについては０．２３４に等しい）を上回った場合、試料を採取した対象が、転移性ｃｃＲＣＣを有すると分類され、スコアが以前に特定されたカットオフ未満である場合、逆もまた同様である。
【０２７３】
そのため、本発明者らは、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから血漿試料の遡及的収集を行った。適格条件は以下とした：
・淡明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）の組織学的診断；
・以下のいずれかの患者
１．転移性疾患、未治療；又は
２．転移性疾患、全身治療下。
【０２７４】
合計で、２６人のユニークな対象をこの試験のために登録し、４０個の血漿試料を全体として回収した（同じ対象から複数の試料を経時的に得たことを意味する）。転移性ｃｃＲＣＣの診断を、全ての対象についてサンプリングの各時点で確認した。
【０２７５】
血漿ＧＡＧスコアは、４０試料中３８試料で以前に誘導されたカットオフ値を上回っていた（図１３）。全ての試料が転移性ｃｃＲＣＣの診断を有する対象から採取されたことを考慮すると、血漿ＧＡＧスコアの精度は９５％であった。本発明者らは、主要エンドポイントが満たされ、その血漿ＧＡＧスコアが転移性ｃｃＲＣＣを診断するのに適していると結論づける。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019512690.tif 000040
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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