(57)【要約】本発明は、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む飲料の調製方法に関し、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有する。本方法は、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性の存在下、少なくとも１０％のβ−グルカンを含み、このβ−グルカンにおけるＤＰ３／ＤＰ４比が少なくとも３であるオオムギ穀粒をマッシングすることを含む。本飲料は、良好な口当たりをもたらす粘度を有すると同時に、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる助けとなり得るβ−グルカンを含む。本飲料は、概して安定であり、β−グルカン含有量の目立った減少を起こすことなく室温で数ヶ月貯蔵可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む飲料の調製方法であって、前記β−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、前記方法は、以下のステップを含む、前記方法:
ａ）オオムギ植物の穀粒を用意し、前記穀粒は、以下の特性を有する：
ｉ．少なくとも１０％のβ−グルカンを含む。
ｉｉ．前記β−グルカンのＤＰ３／ＤＰ４比は、少なくとも３である。
ｂ）酵素組成物の存在下、前記穀粒を、水でマッシングし、それにより、水性抽出物を得、前記組成物は、α−アミラーゼ、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を含む。
ｃ）前記水性抽出物を、前記オオムギ穀粒から分離し、それにより飲料または飲料基材を得る。
ｄ）任意選択で、前記飲料基材を飲料に加工する。
【請求項２】
前記酵素組成物は、さらに、グルコアミラーゼ活性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素組成物は、さらに、プルラナーゼ活性を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記飲料は、少なくとも３ｇ／Ｌ、例えば少なくとも４ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記穀粒は、少なくとも１１％、例えば少なくとも１２％のβ−グルカンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記β−グルカンにおける前記ＤＰ３／ＤＰ４比は、少なくとも３．２、例えば少なくとも３．４、例えば、少なくとも３．６、例えば少なくとも３．７である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）は、粉砕オオムギ穀粒を、水と、１対１０〜２０の範囲の水対粉砕オオムギの比で混合することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップｄ）は、飲料を製造する目的で、ステップｃ）で得られた前記飲料基材に、１種または複数の追加化合物及び／または１種または複数の追加液体を、加えることを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の追加化合物は、風味化合物、保存剤、及び機能性成分からなる群より選択され、及び／また、少なくとも１種の追加液体は、果汁、水、及びビールからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｄ）は、前記飲料基材を１種または複数の微生物で発酵させることを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記飲料は、最大で５０ｍＰａｓ、例えば最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する飲料であって、前記β−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、かつ前記飲料は、先行請求項のいずれか１項に記載の方法により製造される、前記飲料。
【請求項１４】
前記飲料は、最大で５０ｍＰａｓ、例えば最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、請求項１３に記載の飲料。
【請求項１５】
前記飲料は、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させるためのものであり、前記病態は、冠動脈心疾患及び糖尿病からなる群より選択される、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項１６】
病態になるリスクを低下させる必要がある個体におけるそのようなリスクの低下方法であって、前記病態は、冠動脈心疾患、糖尿病、及び感染からなる群より選択され、前記方法は、前記個体に、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の飲料を、有効量で投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
トリグリセリド、コレステロール、及びＬＤＬからなる群より選択される少なくとも１種の脂質の血中濃度を低下させる必要がある個体におけるそのような血中濃度の低下方法であって、前記方法は、前記個体が、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の飲料を、摂取することを含む、前記方法。
【請求項１８】
肥満のリスクの低下または肥満の低減を必要とする個体におけるそのような低下または低減方法であって、前記方法は、前記個体が、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の飲料を、摂取することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記個体は、ヒトである、請求項１７から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体は、少なくとも３ｇのβ−グルカンを含む飲料を毎日投与される、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康飲料分野、ならびにその製造方法に関する。詳細には、本発明はオオムギβ−グルカン濃度の高い飲料及び飲料基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルカンは、心臓の健康、健全な血糖値、及び減量の促進をはじめとして、非常に幅広い健康効果を有する。β−グルカンは、穀物で見られる溶解性繊維であり、（１→３）または（１→４）β結合により連結されたグルコース単位からなる巨大な直鎖多糖類である。全穀物のうち、オオムギが、最も豊富にβ−グルカン繊維を含む原料である。
【０００３】
しかしながら、β−グルカン濃度が高い液体は、概して非常に粘度が高く、そのため飲料にあまり適さない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
このように、自然に高β−グルカン含有量を有する飲料を調製する方法及び材料に対する需要がまだ満たされていない。
【０００５】
本発明は、高いＤＰ３対ＤＰ４比を有するオオムギ粒を用いること、ならびにそのようなオオムギ粒の抽出物を、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ及び／またはプルラナーゼ活性を含む酵素混合物で処理することにより、良好な口当たりをもたらす粘度を有すると同時に、ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる助けとなり得るβ−グルカンを含む、安定な飲料を調製することが可能であることを開示する。飲料は、好ましくは安定しており、室温で、β−グルカン含有量の目立つ低下を起こさずに、数ヶ月貯蔵可能である。
【０００６】
したがって、本発明は、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む飲料の調製方法を提供し、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、本方法は、以下のステップを含む。
ａ）オオムギ植物の穀粒を用意し、この穀粒は、以下の特性を有する：
ｉ．少なくとも１０％のβ−グルカンを含む。
ｉｉ．このβ−グルカンにおけるＤＰ３／ＤＰ４比は少なくとも３である。
ｂ）酵素組成物の存在下、この穀粒を水でマッシングし、それにより、水性抽出物を得、この組成物は、α−アミラーゼ、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を含む。
ｃ）この水性抽出物を、オオムギ穀粒から分離し、それにより、飲料または飲料基材を得る。
ｄ）任意選択で、飲料基材を飲料に加工する。
【０００７】
本発明は、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む飲料も提供し、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、またこの飲料は、本発明の方法により製造される。
【０００８】
本発明は、さらに、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させるための本発明による飲料を提供し、病態は、冠動脈心疾患及び糖尿病からなる群より選択される。
【０００９】
本発明はまた、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させる方法を提供し、病態は、冠動脈心疾患、糖尿病、及び感染からなる群より選択され、本方法は、この個体に、本発明の飲料を有効量で投与することを含む。
【００１０】
本発明はまた、トリグリセリド、コレステロール、及びＬＤＬからなる群より選択される少なくとも１種の脂質の血中レベルを低下させる必要がある個体においてそのような血中レベルを低下させる方法を提供し、本方法は、その個体が本発明による飲料を摂取することを含む。
【００１１】
本発明はまた、肥満のリスクを低下させるまたは肥満を低減する必要がある個体においてそのような低下または低減をもたらす方法を提供し、本方法は、その個体が本発明による飲料を摂取することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）、及びＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣによる１８℃でのβ−グルカン分解（中粘度オオムギβ−グルカン、Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）の最終産物。
【図２】６５℃で、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘリケナーゼの副活性により部分分解された、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣで抽出されたｌｙｓ５ｆのβ−グルカンの１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル。
【図３】ｐＨ５で、グリココール酸塩濃度を上昇させながら（０、５、１５、３０、４５ｍＭ）添加した際の、β−グルカン、ｌｙｓ５ｆＴＡ（５３０ｋＤａ）及びｌｙｓ５ｆＴＡＦ（１５０ｋＤａ）のラングミュア吸着曲線。
【図４】ラットを４週間β−グルカン処置した後のトリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）におけるベースラインからの変化。平均値±ＳＥＭ、１処置あたりｎ＝１２。
【図５】ラットを４週間β−グルカン処置した後の全コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）におけるベースラインからの変化。平均値±ＳＥＭ、１処置あたりｎ＝１２
【図６】ラットを４週間β−グルカン処置した後のＬＤＬ−コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）におけるベースラインからの変化。平均値±ＳＥＭ、１処置あたりｎ＝１２
【図７】ラットを４週間β−グルカン処置した後のＨＤＬ−コレステロール（ｍｍｏｌ／Ｌ）におけるベースラインからの変化。平均値±ＳＥＭ、１処置あたりｎ＝１２
【図８】ラットを４週間β−グルカン処置した後の全ＳＣＦＡプール（ｍｍｏｌ／ｋｇ）における虫垂含有量（ｇ）による差。平均値±ＳＥＭ、１処置あたりｎ＝１２
【図９】ボトルに入れ室温で６ヶ月貯蔵した場合のβ−グルカン含有量（ｇ／Ｌ）の安定性。Ｇｌｕｃａｇｅｌ（商標）及びｌｙｓ５ｆ  ＴＡＦ懸濁液をカルコフロールで測定、平均値±ＳＤ、１月あたりｎ＝２。
【図１０】ＨｖＮＳＴ１とダイズＢＴ１の配列比較
【図１１】種々のオオムギ系統のオオムギ穀粒におけるＤＰ３／ＤＰ４比を、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ（ＴＡＦ）の混合物、またはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）（ＴＡ）もしくはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）（Ｔ）の混合物いずれかを用いた、そのオオムギ穀粒の麦汁中のβ−グルカンのＭｗと合わせて示す。
【図１２】Ｔ、ＴＡ、及びＴＡＦ酵素を用いて様々なオオムギから抽出した後の、β−グルカン麦汁粘度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書中使用される場合、「ａ」は、その語が使用される文脈に応じて、１つまたは複数を意味することができる。
【００１４】
量に関して本明細書中使用される場合、「約」という用語は、±５％、好ましくは±２％、さらにより好ましくは±１％を意味する。
【００１５】
「ビール」という用語は、本明細書中使用される場合、麦汁の発酵により調製された飲料を示す。好ましくは、この発酵は、酵母菌により行われる。
【００１６】
「混合連鎖β−グルカン」という用語は、本明細書中使用される場合、β（１→３）または（１→４）グリコシド結合で結合したＤ−グルコース単量体からなる多糖類を示す。両種のグリコシド結合が、１つの多糖内に生じる可能性がある。β−グルカン及びベータ−グルカンという用語は、本明細書中同義で使用される。「β−グルカン」という用語は、本明細書中使用される場合、どのようなβ−グルカンでも示すことができるが、好ましくは「β−グルカン」という用語は、「混合連鎖β−グルカン」を示す。
【００１７】
「飲料基材」という用語は、本明細書中使用される場合、すぐ飲める完成飲料へと加工することができる液体を示す。一般に、飲料基材は、１種または複数の追加化合物及び／または追加液体の添加により、及び／または発酵により、完成飲料へと加工することができる。
【００１８】
「穀粒」という用語は、穎果（内種とも記す）、外穎、及び内穎を含むと定義される。大部分のオオムギ種において、外穎及び内穎は、穎果と付着しており、脱穀後の穀粒の一部である。しかしながら、裸オオムギ品種も生じる。それらでは、穎果は、外穎及び内穎を有さず、小麦の場合のようにそれらを含まずに脱穀される。「穀粒」及び「グレイン」という用語は、本明細書中同義で使用される。
【００１９】
「マッシング」は、定義された温度（複数可）で水中で行う、オオムギ穀粒または麦芽のインキュベーションである。オオムギ穀粒は、水を用いたインキュベーションの前に粉砕されていることが多い。
【００２０】
「水対オオムギ穀粒／粉砕オオムギの比」が１〜Ｘであるとは、水１部対オオムギ穀粒または粉砕オオムギＸ部であることを意味する。比は、１対ＸＸ〜ＹＹの範囲として示される場合もあり、この場合は、水１部及びオオムギ穀粒または粉砕オオムギＸＸ〜ＹＹ部の範囲を意味する。比はすべて、重量あたりの重量比で与えられる。
【００２１】
「麦汁」という用語は、マッシングにより調製されたオオムギ穀粒の液状抽出物を意味する。麦汁に達する目的で、他の添加物をオオムギ穀粒と混合してマッシングする場合がある。添加物は、麦汁に加えることもできる。添加物は、任意のデンプン含有材料が可能であり、例えば、オオムギ以外の穀物、麦芽、またはシロップなどである。
【００２２】
飲料の調製方法
本発明は、自然に高β−グルカン含有量を有する飲料を調製する方法を提供する。この飲料は、本明細書中以下の「飲料」のセクションに記載される飲料のいずれであってもよい。
【００２３】
本方法は、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ及び／またはプルラナーゼ活性も含む酵素組成物の存在下、オオムギ植物のグレインを水でマッシングすることを含む。本発明の１つの実施形態において、オオムギ植物のこの穀粒は、好ましくは、マッシング前にどのような熱処理も施されていない。詳細には、穀粒は麦芽になっていないことが好ましい場合がある。オオムギ植物のこの穀粒は、マッシング前に粉砕されていることが一般に好ましい。この穀粒は、β−グルカン濃度が高く（好ましくは少なくとも１０％）、このβ−グルカンにおけるＤＰ３／ＤＰ４比が高い（好ましくは少なくとも３）。オオムギ植物は、本明細書中以下の「オオムギ植物」のセクションに記載されるオオムギ植物のいずれであってもよい。マッシングは、オオムギ穀粒、好ましくは粉砕オオムギ穀粒を、水とともに規定温度（複数可）でインキュベートすることを含む。マッシングは、本明細書中以下の「マッシング」のセクションに記載されるやり方のいずれで行われてもよい。酵素組成物は、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ及び／またはプルラナーゼ活性も含む。これらの活性は、１種または複数の酵素に由来する場合がある。したがって、酵素のあるものが複数の活性を有するならば、酵素組成物が３または４種の異なる酵素を含むことは必要ではない。しかしながら、一般に、酵素組成物は、α−アミラーゼ活性を持つ酵素、プルラナーゼ活性を持つ酵素、ならびにエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を持つ酵素、及びグルコアミラーゼ活性を持つ酵素を含む。この酵素組成物は、本明細書中以下の「酵素組成物」のセクションに記載される酵素組成物のいずれであってもよい。
【００２４】
マッシング後、水性抽出物をオオムギ穀粒から分離させる。この水性抽出物は、本明細書中「麦汁」とも示す場合がある。水性抽出物は、本発明に従って飲料としてすぐに消費することができる。しかしながら、水性抽出物は、さらに加工して飲料にする必要がある場合が多い。そのような場合、水性抽出物は、本明細書中「飲料基材」とも示す場合がある。飲料基材は、本明細書中以下の「飲料基材の飲料への加工」のセクションに記載される方法のいずれで飲料へと加工されてもよい。
【００２５】
したがって、本発明の１つの目的は、本明細書中以下の「飲料」のセクションに記載される飲料のいずれかを調製する方法を提供することであり、本方法は、以下のステップを含む。
ａ）オオムギ植物の穀粒を用意する。この穀粒は、本明細書中以下の「オオムギ植物」のセクションに記載されるオオムギ植物のいずれでもよい。
ｂ）酵素組成物の存在下、この穀粒を、本明細書中以下の「マッシング」のセクションに記載されるやり方のいずれでマッシングし、それにより、水性抽出物を得る。酵素組成物は、本明細書中以下の「酵素組成物」のセクションに記載される酵素組成物のいずれでもよい。
ｃ）この水性抽出物をオオムギ穀粒から分離し、それにより、飲料または飲料基材を得る。
ｄ）任意選択で、本明細書中以下の「飲料基材の飲料への加工」のセクションに記載される方法のいずれかにより、飲料基材を飲料に加工する。
【００２６】
飲料
本発明は、β−グルカン含有量が高く、しかし同時に粘度が十分に低くて飲料に良好な口当たりを与える、飲料の調製方法に関する。
【００２７】
オオムギβ−グルカンは、血液コレステロールを低下／減少させることが示されている。欧州食品安全機関ＥＦＳＡによれば、オオムギβ−グルカン３ｇを毎日摂取することで、有益な効果を得られる可能性がある。有益な効果は、定量化された部分あたり少なくとも１ｇのβ−グルカンを含有する食品の摂取によっても得られる可能性がある。したがって、本発明の飲料は、毎日少なくとも３ｇ摂取することが可能であるように十分なβ−グルカンを含有することが好ましい。したがって、１つの実施形態において、本発明の飲料は、０．５〜２ｇの範囲で、例えば０．５〜１．５ｇの範囲、例えば、約１ｇ、例えば１杯あたり１ｇのβ−グルカンなどを含有する。本発明の飲料の文脈において、１杯は、典型的には、２５０または３３０ｍｌである。したがって、本発明の飲料は、好ましくは、２５０〜３３０ｍｌあたり、例えば、２５０ｍｌあたり及び／または３３０ｍｌあたり、上記濃度のβ−グルカンを含有する。
【００２８】
したがって、本発明により調製された飲料は、好ましくは、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む。より好ましくは、飲料は、３ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する。さらにより好ましくは、飲料は、少なくとも４ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する。飲料が、より多くのβ−グルカンを、例えば４〜２０ｇ／Ｌの範囲、４〜１５ｇ／Ｌの範囲、例えば、４〜１０ｇ／Ｌの範囲で含む場合があることも、本発明に含まれる。飲料は、非常に多量のβ−グルカン、例えば８ｇ／Ｌ超、例えば、８〜２０ｇ／Ｌを含有する飲料濃縮物でもあり得る。そのような濃縮物は、摂取前に希釈される可能性があい得る。
【００２９】
完成飲料のβ−グルカン濃度は、いくつかの方法で調整することができる。飲料のβ−グルカン濃度を調整する１つの方法は、マッシング中のオオムギ穀粒対水の比を調整することによるものである。本発明の方法で使用可能な、オオムギ穀粒対水の有用な比は、本明細書中以下の「マッシング」のセクションに記載される。β−グルカンの含有量を低下させる目的で、飲料基材を、追加の液体で希釈することもできる。
【００３０】
本発明は、低分子量のβ−グルカンが、健康上有益な効果を有する、すなわち低分子量のβ−グルカンが、血液コレステロールを低下させることができ、特に、血中ＬＤＬレベルを低下させることができることを開示する。
【００３１】
そのうえさらに、本発明は、低分子量β−グルカンを含有する飲料は、低粘度を有することも示す。
【００３２】
したがって、本発明の方法により調製された飲料は、８０〜２００ｋＤａの範囲の低い平均分子量を有するβ−グルカンを含むことが好ましい。例えば、このβ−グルカンは、１１０〜１９０の範囲、例えば、１２０〜１８０の範囲、例えば、１３０〜１７０の範囲、例えば、１４０〜１６０の範囲の平均分子量を有することができる。１つの実施形態において、本発明の方法により調製された飲料は、平均分子量約１５０を有するβ−グルカンを含む。
【００３３】
平均分子量は、好ましくは、β−グルカン標準物質との比較で特定される。そのようなβ−グルカン標準物質は、市販されており、例えばＭｅｇａｚｙｍｅ、Ｉｒｅｌａｎｄから入手することができる。分子量は、任意の有用な方法により、例えば従来のサイズ排除クロマトグラフィーにより、β−グルカン標準物質を用いて、例えば、Ｓｈｏｄｅｘ、ＵＳ製のａｓａｈｉｐａｋを用いて、特定することができる。分子量を特定する好適な方法は、本明細書中以下の実施例５ａで概要を記載する。
【００３４】
本発明の飲料に含まれる低分子量β−グルカンは、同様な条件下で抽出される中規模のβ−グルカン（５３０ｋＤａ）と同程度に、健康上有益な効果を有する。例えば、このβ−グルカンは、好ましくは、胆汁酸塩、例えばグリココール酸塩と結合することができる。好ましくは、このβ−グルカンは、胆汁酸塩、例えばグリココール酸塩と、直接の分子相互作用を通じて結合することができる。胆汁酸塩との結合は、例えば、２つのβ−グルカン共鳴間のシグナル変化（Δδ）を測定することにより測定することができ、変化は、本明細書中以下の実施例６に記載されるとおり、溶液中のβ−グルカンと胆汁酸塩との間の直接相互作用を示す。したがって、飲料に含まれるβ−グルカンは、実施例６に記載されるとおりに測定した場合、５０ｍＭのグリココール酸塩を添加した際に、少なくとも５ｐｐｂ、例えば、少なくとも７ｐｐｂのΔδ１３Ｃの上昇を有し得る。
【００３５】
上記のとおり、飲料の口当たりを良好にする目的で、飲料は十分に低い粘度を有することも好ましい。すなわち、飲料は、最大で５５ｍＰａｓ、例えば、最大で５０ｍＰａｓ、例えば、最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有することが好ましい。粘度は、任意の標準粘度計を用いて測定することができる。詳細には、粘度は、実施例５ａに記載されるとおりに測定することができる。
【００３６】
本発明による飲料は、好ましくは安定である、すなわち、β−グルカン含有量は、貯蔵に際して目立って減少しない。したがって、本発明の飲料のβ−グルカン含有量は、室温で６ヶ月間貯蔵した際、５％を超えて減少することがない、例えば、３％を超えて減少することがないことが好ましい。この飲料は、β−グルカン沈殿を防ぐために、安定剤を、例えば０．０１〜０．０５０％の範囲の安定剤を、例えば以下に記載されるとおり０．０２５％のゲランガムを含むことができる。
【００３７】
本発明の飲料は、酵素組成物の存在下でオオムギ穀粒をマッシングした後に得られる水性抽出物であり得る。この水性抽出物は、本明細書中、麦汁とも称する場合がある。しかしながら、飲料は、水性抽出物を微生物で、例えば酵母菌で発酵させることにより調製した、ビール様飲料でもあり得る。飲料は、水性抽出物と１種または複数の追加液体との混合物でもあり得る。飲料は、１種または複数の追加化合物が加えられた水性抽出物でもあり得る。
【００３８】
マッシング
本発明の方法は、酵素組成物の存在下、オオムギ穀粒をマッシングするステップを含む。
【００３９】
マッシングは、オオムギ穀粒を、水とともに規定温度（複数可）でインキュベートすることである。すなわち、マッシングは、オオムギ穀粒の水性抽出物を調製する方法とみなすことができる。水性抽出を可能な限り効率的にするため、マッシング前にオオムギ穀粒を破壊することが好ましい。マッシング前にオオムギ穀粒を粉砕して、オオムギ粉を調製すること、及びこのオオムギ粉を用いてマッシングを行うことが好ましい。粉砕したオオムギ穀粒は、本明細書中、「粉砕オオムギ」、「粉砕オオムギ穀粒」、または「オオムギ粉」と示す場合がある。
【００４０】
オオムギ穀粒、例えば、粉砕オオムギ穀粒を、次いで、水とともにインキュベートする。すなわち、本方法のステップｂ）は、粉砕オオムギ穀粒を水と混合することを含む場合がある。オオムギ穀粒対水の比は、水性抽出物中のβ−グルカンが所望の濃度に達するように選択することができる。一般に、オオムギ穀粒対水の比が高いほど、飲料中のβ−グルカン濃度は高くなる。
【００４１】
飲料中のβ−グルカン濃度は少なくとも２ｇ／Ｌであることが好ましいため、オオムギ穀粒対水の比は、そのようなβ−グルカン濃度を得るのに十分な高さであることが好ましい。
【００４２】
したがって、水対オオムギ穀粒の比は、１対少なくとも１０、例えば、１対少なくとも１２、例えば、１対少なくとも１５であることが好ましい。詳細には、水対オオムギ穀粒の比は、１対１０〜２０の範囲、例えば、１対１２〜１８の範囲が可能である。本発明の１つの実施形態において、水対オオムギ穀粒の比は、１対約１５である。この比は、好ましくは、水対このオオムギ穀粒の乾燥重量のｗ／ｗ比である。
【００４３】
マッシングが粉砕オオムギを水とともにインキュベートすることを含む本発明の実施形態では、水対粉砕オオムギの比は、１対少なくとも１０、例えば、１対少なくとも１２、例えば、１対少なくとも１５であることが好ましい。特に、水対粉砕オオムギの比は、１対１０〜２０の範囲、例えば、１対１２〜１８の範囲が可能である。本発明の１つの実施形態において、水対粉砕オオムギの比は、１対約１５である。
【００４４】
オオムギ穀粒（例えば粉砕オオムギ）を水とともにインキュベートすることは、好ましくは、特定温度で行われる。温度は、酵素活性に影響を及ぼす可能性があることから、重要となる可能性がある。
【００４５】
マッシングは、添加物の存在下で行うことが可能であり、このことは、オオムギ穀粒以外の任意の炭水化物源を含むと理解され、炭水化物源として、例えば、オオムギ、オオムギシロップ、トウモロコシ、コメ、ソルガム、ライ、オーツ、またはコムギなどがあるが、これらに限定されず、これらは、全穀粒または粗挽き、シロップ、もしくはデンプンなどの加工製品いずれかである。上記添加物は全て、主に、追加の抽出物源として使用される可能性がある（シロップは、典型的には、マッシング後に添加される）。
【００４６】
マッシング水は、１種または複数の追加化合物、例えば、塩、またはｐＨ調節剤を含むことができる。非限定のｐＨ調節剤の例として、緩衝剤及び酸、例えばリン酸緩衝剤またはリン酸が挙げられる。非限定の塩の例として、塩化カルシウムが挙げられる。
【００４７】
典型的には、マッシングは、６０〜７２℃の範囲の温度、例えば、６０〜７０℃の範囲の温度、例えば、６２〜６８℃の範囲の温度、例えば、６４〜６６℃の範囲の温度、例えば、約６５℃の温度でのインキュベーションを含む、またはそのようなインキュベーションからなることさえある。オオムギ穀粒、例えば、粉砕オオムギは、任意の特定段階で水と混合することができるが、水が上記温度に到達したところで水に加えられる場合が多い。
【００４８】
この温度でのインキュベーションは、任意の所望の長さの時間であることが可能であり、典型的には、３０〜１２０分間の範囲、好ましくは３０〜６０分間の範囲、例えば、約４５分間である。
【００４９】
インキュベーション前またはインキュベーション中、ｐＨは調整することができる。例えば、ｐＨは、５〜７の範囲、例えば、５〜６の範囲、例えば、約５．４８に調整することができる。
【００５０】
本発明による方法では、マッシングは、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ及び／またはプルラナーゼも含む酵素組成物の存在下で行われ、酵素組成物は、本明細書中以下の「酵素組成物」のセクションに記載される酵素組成物のいずれでもよい。この酵素組成物は、マッシング前またはマッシング中に加えることができる。典型的には、これは、マッシュまたはマッシング用の水が上記の温度レベルに調整されたら、加えられる。本発明に従って調製された飲料は、特定分子量のβ−グルカンを含有する。本発明による酵素組成物を用いたマッシングは、分子量に影響を及ぼす可能性がある。したがって、８０〜２００ｋＤａの範囲の平均分子量を有するβ−グルカンをもたらす、ある長さの時間及び温度での酵素組成物の存在下でのマッシングを行うことが好ましい。これは、マッシング中、様々な温度条件下の特定時点で水性抽出物の試料を採取し、続いて試料中のβ−グルカンの平均分子量を測定することにより、確実にすることができる。そのようにして、当業者は、マッシングに適切な時間及び温度を選択することができる。１つの実施形態において、時間及び温度は、上記のとおり選択される。
【００５１】
マッシング手順の最後に、水／オオムギ穀粒／酵素組成物の混合物を少なくとも７５℃に加熱することが望ましい場合が多い。加熱は、酵素組成物の不活性化を含めて複数の効果を有い得る。この加熱は、好ましくは、少なくとも７５℃の温度、好ましくは少なくとも８５℃、より好ましくは少なくとも９０℃、例えば、８５〜１００℃の範囲、例えば、９０〜１００℃の範囲で行われる。加熱は、任意の適切な長さの時間、例えば１５〜１２０分の範囲、例えば、１５〜６０分の範囲、例えば、約３０分間行うことができる。
【００５２】
したがって、１つの実施形態において、マッシングは、上記のとおり温度６０〜７２℃でのインキュベーション、続いて上記のとおり少なくとも８５℃の温度、例えば少なくとも９０℃でのインキュベーションからなる場合がある。
【００５３】
マッシング後、飲料または飲料基材いずれかを得る目的で、水性抽出物をオオムギ穀粒（例えば、粉砕オオムギ）から分離するが、飲料基材はさらに加工して飲料にすることができる。
【００５４】
この分離は、任意の有用な方法により、例えば、醸造所で従来採用されている、使用済みグレインから麦汁を分離する方法のいずれかを用いることにより、行うことができる。水性抽出物をオオムギ穀粒（例えば、粉砕オオムギ）から分離する方法の非制限の例として、遠心、デカンテーション、濾過、またはロータータンの使用が挙げられる。
【００５５】
オオムギ植物
本発明は、オオムギ植物の穀粒から高β−グルカン飲料を調製する方法を提供する。β−グルカンを十分に高濃度で含有すると同時に安定でありしかも低粘度である飲料に到達するため、β−グルカンの濃度が高く、かつＤＰ３／ＤＰ４比が高いことを特性とするβ−グルカンを有するオオムギ植物を使用することが好ましい。
【００５６】
オオムギ植物は、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ種の任意の植物が可能であり、これには、任意の育種系統または栽培品種または変種が含まれる。
【００５７】
したがって、本発明の方法で使用されるオオムギ植物は、以下の特性を有し得る：
ｉ．少なくとも１０％のβ−グルカンを含む
ｉｉ．このβ−グルカンにおけるＤＰ３／ＤＰ４比が少なくとも３である。
【００５８】
ビール醸造の場合、通常は、β−グルカン濃度が低いオオムギ植物を使用することが好ましく、したがって、オオムギの典型的な麦芽用品種は、β−グルカン濃度が低い。β−グルカンは、麦汁に粘度を付与し、これは通常あまり望ましくない。しかしながら、本発明で使用されるオオムギ植物は、好ましくは、β−グルカン濃度が高い。
【００５９】
したがって、本発明の方法で使用されるオオムギ植物は、少なくとも１０％のβ−グルカン、より好ましくは少なくとも１１％のβ−グルカン、さらにより好ましくは少なくとも１２％のβ−グルカン、例えば、少なくとも１３％のβ−グルカン、例えば、少なくとも１４％のβ−グルカン、例えば、少なくとも１５％のβ−グルカンを含む穀粒を有することが好ましい。このパーセンテージは、重量あたりの穀粒中の乾物に対する％で提供される。
【００６０】
オオムギ植物の穀粒中のβ−グルカンの％を特定する目的で、穀粒中のβ−グルカンの重量を測定し、穀粒中の乾物の全重量を測定する。そうすると、β−グルカンの％を計算することができる。β−グルカン含有量は、β−グルカンを抽出し、例えば本明細書中上記の「マッシング」のセクションで記載したとおりにマッシングし、水性抽出物中のβ−グルカン含有量を測定することにより、特定することができる。β−グルカンの量は、例えば、カルコフロール法を用いて測定することができる。カルコフロール法は、蛍光測定法であり、Ｂｒｅｗｉｎｇ  ＥＢＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ，  １９９４に従って行うことができる。カルコフロール色素は、溶液中に存在するβ−グルカンと結合する能力を有し、結合したβ−グルカンの含有量に直接比例してその蛍光を強める。
【００６１】
オオムギ植物の穀粒中のβ−グルカンの％を測定する有用な方法は、本明細書中以下の実施例５ａに概要を記載する。
【００６２】
このオオムギ植物は、β−グルカンを高含有量で有するだけでなく、ＤＰ３／ＤＰ４比の高いβ−グルカンを含有することも重要である。ＤＰ３／ＤＰ４比は、β−グルカンオリゴマーブロック構造を記述するものである。したがって、オオムギβ−グルカンは、セロトリオースのブロック及びセロテトラオースのブロックを含有し、ＤＰ３／ＤＰ４比は、セロトリオースブロックとセロテトラオースブロックの比を記述する。セロトリオースは、３つのグルコース単位が１，４−β結合で結合した三糖である。セロテトラオースは、４つのグルコース残基が１，４−β結合で結合した四糖である。この比は、β−グルカンをリケナーゼで消化し、放出されたＤＰ３ブロック及びＤＰ４ブロックの量を測定することにより、特定することができる。リケナーゼは、（１→３）βグルコシド結合の加水分解を触媒する酵素であり、この結合は、（１→４）βグルコシド結合の隣に位置する。ＤＰ３／ＤＰ４比を特定する１つの有用な方法を、実施例５ａに記載する。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ及び／またはプルラナーゼ活性も含む酵素組成物の存在下、オオムギ穀粒をマッシングすることを含む。酵素はβ−グルカンの適正な抽出を助けるだけでなく、８０〜２００ｋＤａの範囲で平均分子量の低いβ−グルカンを得ることも助ける。しかしながら、β−グルカンのＤＰ３／ＤＰ４比が低い場合、これは、典型的には、多少に関わらず酵素組成物によるβ−グルカンの完全な消化をもたらすことになり、したがって、本発明による自然に高β−グルカン含有量を有する飲料を調製することが困難になる。
【００６４】
したがって、本発明で使用されるオオムギ植物に含まれるβ−グルカンは、ＤＰ３／ＤＰ４比が高いことが好ましい。詳細には、使用されるオオムギ植物の穀粒は、ＤＰ３／ＤＰ４比が少なくとも３、例えば、少なくとも３．２であるβ−グルカンを含有することが好ましい。好適な実施形態において、使用されるオオムギ植物の穀粒は、ＤＰ３／ＤＰ４比が少なくとも３．４、例えば、少なくとも３．６、例えば、少なくとも３．７であるβ−グルカンを含有する。
【００６５】
本発明の１つの実施形態において、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有する。そのような変異は、少なくとも１０％のβ−グルカンを含み、かつそのβ−グルカンにおけるＤＰ３／ＤＰ４比が少なくとも３、例えば少なくとも３．４であるオオムギ植物をもたらす。
【００６６】
特に、この変異は、ＮＳＴ１機能の低下をもたらすことが好ましく、より好ましくは、この変異は、ＮＳＴ１機能の完全な喪失をもたらす。野生型オオムギＮＳＴ１の配列は、本明細書中、配列番号１として提示される。オオムギＮＳＴ１は、ＡＤＰ−Ｇｌｃ輸送体であり、「ＮＳＴ１機能の完全な喪失」という用語は、本明細書中使用される場合、以下の状況のうち１つを示す：
１）オオムギ植物が、ＮＳＴ１タンパク質を含有しない
２）オオムギ植物が、変異型ＮＳＴ１を含有し、この変異型ＮＳＴ１は、ＡＤＰ−グルコースを輸送することができない
【００６７】
すなわち、本発明の１つの実施形態において、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異はＮＳＴ１タンパク質の発現の低下をもたらす。したがって、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に、栽培品種Ｑｕｅｎｃｈなどのように、野生型オオムギ植物におけるＮＳＴ１タンパク質の発現よりも少なくとも８０％低下したレベルのＮＳＴ１タンパク質の発現をもたらす変異を保有し得る。
【００６８】
本発明の別の実施形態において、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、機能の損失した変異型ＮＳＴ１タンパク質をコードする。詳細には、この変異型ＮＳＴ１は、配列番号１と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、例えば配列番号１と比べて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する。詳細には、変異型ＮＳＴ１は、図１０で黒四角により囲まれたアミノ酸の少なくとも１つが別のアミノ酸に置換されている。
【００６９】
同じく本発明に含まるのは、オオムギ植物がＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、配列番号１と比べて少なくとも１つのアミノ酸が欠損した、例えば配列番号１と比べて少なくとも１つの保存的アミノ酸が欠損した変異型ＮＳＴ１タンパク質をコードすることである。詳細には、変異型ＮＳＴ１は、図１０で黒四角により囲まれたアミノ酸の１つまたは複数を欠いている。したがって、この変異型ＮＳＴ１は、図１０で黒四角により囲まれたアミノ酸のうち、少なくとも１０個、例えば、少なくとも２０個、例えば、少なくとも３０個、例えば、少なくとも５０個を欠いている場合がある。
【００７０】
本発明の１つの実施形態において、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、配列番号１の２２８番アミノ酸が、削除されているか、または別のアミノ酸に置換されている変異型ＮＳＴ１タンパク質をコードする。詳細には、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、２２８位のＰｒｏ残基がＳｅｒ残基に置換されている配列番号１のＮＳＴ１をコードする。
【００７１】
本発明の別の実施形態において、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、配列番号１の２７３番アミノ酸が、削除されているか、または別のアミノ酸に置換されている変異型ＮＳＴ１タンパク質をコードする。詳細には、オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、２７３位のＶａｌ残基がＧｌｕに置換されている配列番号１のＮＳＴ１をコードする。
【００７２】
ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、この変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子が、２７３位のＶａｌ残基がＧｌｕに置換されている配列番号１のＮＳＴ１をコードするオオムギ植物の非限定の一例は、ｌｙｓ５ｆとして知られるオオムギ植物であり、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから、受入番号ＮＧＢ２００３０で入手可能である。
【００７３】
酵素組成物
本発明は、酵素組成物の存在下でオオムギ穀粒（例えば粉砕オオムギ）をマッシングすることにより、オオムギ植物の穀粒から、高β−グルカン飲料を調製する方法を提供する。この酵素組成物は、α−アミラーゼ及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ及び／またはプルラナーゼ活性を含む。１種の酵素がこれらの活性のうち１種または複数を有することが可能であるが、一般に、酵素組成物は、α−アミラーゼ活性を有する１種の酵素、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を有する１種の酵素、ならびに任意選択でグルコアミラーゼ活性を有する１種の酵素及び／またはプルラナーゼ活性を有する１種の酵素を含む。
【００７４】
１つの実施形態において、酵素組成物は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を含む。
【００７５】
１つの実施形態において、酵素組成物は、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を含む。
【００７６】
α−アミラーゼ活性を有する酵素は、α−アミラーゼであり得る。本発明によるα−アミラーゼは、３つ以上の（１→４）−α結合Ｄ−グルコース単位を含有する多糖類における（１→４）−α−Ｄ−グルコース結合のエンド加水分解を触媒することができる酵素である。詳細には、本発明によるα−アミラーゼは、ＥＣ３．２．１．１に分類されるα−アミラーゼ酵素である。
【００７７】
本発明の方法で使用される特定のα−アミラーゼ酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  α−アミラーゼであり得る。周知のＢａｃｉｌｌｕｓ  α−アミラーゼとして、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、またはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株に由来するα−アミラーゼが挙げられる。本発明の１つの態様において、企図されるＢａｃｉｌｌｕｓ  α−アミラーゼは、ＷＯ９９／１９４６７の３ページ、１８行目から６ページ、２７行目に定義されるとおりのα−アミラーゼである。
【００７８】
本発明で使用されるα−アミラーゼの別の例は、ＷＯ９９／１９４６７において配列番号３で開示される酵素、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体である。α−アミラーゼは、ＷＯ９９／１９４６７において配列番号３で開示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有し、以下の変異：１１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９３Ｆを持つα−アミラーゼでもあり得る。同じく企図されるのは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能なα−アミラーゼであるＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣである。本発明の方法で使用される別の特定α−アミラーゼは、任意の真菌α−アミラーゼ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに含まれる種、好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株に由来するα−アミラーゼであり得る。特別に企図されるのは、ＷＯ２００２／０３８７８７において配列番号１で示されるα−アミラーゼ、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体である。好適な実施形態において、α−アミラーゼは、配列番号３のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体である。
【００７９】
添加されることになるα−アミラーゼの量は、様々なパラメーターに依存し、一般に当業者に既知である。１つの態様において、マッシュ中のα−アミラーゼ活性は、０．１〜１．０ＫＮＵ／ｇ、より好ましくは０．２〜０．４ＫＮＵ／ｇ、特に好ましくは０．２５〜０．３５ＫＮＵ／ｇオオムギ乾燥重量、である。別の態様において、マッシュ中のα−アミラーゼ活性は、少なくとも０．１ＫＮＵ／ｇ、例えば、少なくとも０．２〜０．４ＫＮＵ／ｇ、例えば、少なくとも０．２５ＫＮＵ／ｇオオムギ乾燥重量、である。別の態様において、マッシュ中のα−アミラーゼ活性は、０．１〜１０ＫＮＵ／ｇ、例えば、０．１〜５ＫＮＵ／ｇ、例えば、少なくとも０．２〜５ＫＮＵ／ｇオオムギ乾燥重量の範囲にある。１キロのＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  α−アミラーゼ単位（ＫＮＵ）は、１０００ＮＵに等しい。１ＫＮＵは、標準条件下（すなわち３７℃＋／−０．０５；０．０００３ＭのＣａ２＋；及びｐＨ５．６で）５．２６ｇのデンプン乾燥物Ｍｅｒｃｋ可溶性Ａｍｙｌｕｍをデキストリン化する酵素の量と定義される。
【００８０】
α−アミラーゼの機能的相同体とは、３つ以上の（１→４）α結合Ｄ−グルコース単位を含有する多糖類における（１→４）−α−Ｄ−グルコース結合のエンド加水分解を触媒することができる酵素である。
【００８１】
グルコアミラーゼ活性を有する酵素は、任意のグルコアミラーゼであり得るが、一般に、これは、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ活性を有する酵素である。詳細には、グルコアミラーゼは、鎖の非還元末端から連続して末端（１→４）−結合α−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒し、β−Ｄ−グルコースを放出させる酵素であり得る。詳細には、本発明によるグルコアミラーゼは、ＥＣ３．２．１．３に分類されるα−アミラーゼ酵素である。
【００８２】
グルコアミラーゼの一例は、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｂ０ＣＶＪ１であり、これは、Ｌａｃｃａｒｉａ  ｂｉｃｏｌｏｒ由来のポリペプチドを開示する。他の例として、ＷＯ２００６／０６９２８９に記載されるＴｒａｍｅｔｅｓ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ由来のグルコアミラーゼがある。
【００８３】
グルコアミラーゼは、Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ真菌類、例えばＧ．ａｂｉｅｔｉｎｕｍ、Ｇ．ｓｅｐｉａｒｉｕｍ、またはＧ．ｔｒａｂｅｕｍ由来のグルコアミラーゼでもあり得る。そのようなグルコアミラーゼは、例えば、ＷＯ２０１１０６８８０３の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８の成熟ポリペプチドと、好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特に好ましくは少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはさらには１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。
【００８４】
グルコアミラーゼは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ由来のグルコアミラーゼ、例えばＹｏｓｈｉｋｉ  ＹＡＭＡＳＡＫＩ，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ４１（５），  ７５５−７６２，  １９７７）に開示されるものでもあり得る。グルコアミラーゼは、ＷＯ２０１１１２７８０２の配列番号２の成熟ポリペプチドと好ましくは少なくとも６１．５％、より好ましくは少なくとも６３％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、特に好ましくは少なくとも９４％、さらに特に好ましくは少なくとも９５％、例えば、さらに少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドでもあり得る。
【００８５】
プルラナーゼ活性を有する酵素は、任意のプルラナーゼであり得る。プルラナーゼは、好ましくは、プルラン、アミロペクチン、及びグリコーゲンのα−（１→６）−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒することができる酵素である。プルランは、１→６結合したマルトトリオース単位の直鎖ポリマーである。本発明によるプルラナーゼは、好ましくは、ＥＣ３．２．１．４１に分類されるプルラナーゼである。
【００８６】
本発明によるプルラナーゼは、例えばＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ由来のプルラナーゼ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ由来、例えばＫｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １１５：９７−１０６に記載のもの、あるいはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／ＳからＰｒｏｍｏｚｙｍｅ  ４００Ｌとして入手可能なプルラナーゼであり得る。プルラナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｇａｎｏｅｎｃｉｓ由来、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ由来、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ（米国特許第５，７３６，３７５号）に由来するものなどでもあり得る。プルラナーゼは、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ株由来の改変プルラナーゼでもあり得る。プルラナーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘとして入手可能なプルラナーゼでもあり得る。他のプルラナーゼは、ＰＣＴ／ＤＫ９１／００２１９に記載されるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ由来のものであり得、またはプルラナーゼは、ＰＣＴ／ＤＫ９２／０００７９に記載されるＦｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｖｅｎ由来のものであり得、またはプルラナーゼは、ＰＣＴ／ＤＫ９５／０００９７に記載されるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ由来のものであり得、またはプルラナーゼは、ＰＣＴ／ＤＫ９５／００２１１に記載されるＰｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ａｂｙｓｓｅｉ由来のものであり得、またはプルラナーゼは、ＰＣＴ／ＤＫ９５／０００９５に記載されるＦｅｔＶｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ由来のものであり得、またはプルラナーゼは、ＰＣＴ／ＤＫ９５／０００９８に記載されるＤｅｓｕｌｆｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｃｏｓｕｓ由来のものであり得る。
【００８７】
特に好ましくは、プルラナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓに由来する。本発明の方法で使用される好適なプルラナーゼ酵素は、配列番号４のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体である。
【００８８】
プルラナーゼは、当業者に周知の有効量で添加することができる。１つの態様において、プルラナーゼは、０．１〜３ＰＵＮ／ｇオオムギ乾物、例えば、０．２〜２．９、例えば、０．３〜２．８、例えば、０．３〜２．７例えば、０．３〜２．６例えば、０．３〜２．５例えば、０．３〜２．４、例えば、０．３〜２．３、例えば、０．３〜２．２、例えば、０．３〜２．１、例えば、０．３〜２．０、例えば、０．３〜１．９、例えば、０．３〜１．８、例えば、０．３〜１．７、例えば、０．３〜１．６の投与量で添加され、特に好ましくは、プルラナーゼは、例えば、０．３〜１．５、好ましくは０．４〜１．４、より好ましくは０．５〜１．３、より好ましくは０．６〜１．２、より好ましくは０．７〜１．１、より好ましくは０．８〜１．０、より好ましくは０．９〜１．０の投与量で添加される。本発明の特定の実施形態において、酵素は、約０．３ＰＵＮ／ｇオオムギ乾物、例えば、約０．４ＰＵＮ／ｇオオムギ乾物、例えば、約０．５ＰＵＮ／ｇオオムギ乾物で添加される。
【００８９】
１プルラナーゼ単位（ＰＵＮ）は、標準条件下（すなわち、４０℃及びｐＨ５．０で３０分の反応時間後；及び基質として０．２％プルランを用いる）、プルランを加水分解し、１分あたり１マイクロモルのグルコースに等しい還元力を持つ還元炭水化物を放出する、酵素の量である。プルラナーゼ活性は、還元糖生産量の増加を検出することにより測定することができる。
【００９０】
配列番号４のポリペプチドの機能的相同体とは、プルラン、アミロペクチン、及びグリコーゲンのα−（１→６）−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒することができる酵素である。
【００９１】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を有する酵素は、任意のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼであり得る。エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、好ましくは、加水分解される結合に関与する還元基を持つグルコース残基が、それ自身Ｃ−３で置換されている場合に、β−グルカンの（１→３）または（１→４）結合のエンド加水分解を触媒することができる酵素である。
【００９２】
本発明の１つの実施形態において、本発明によるエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、エンド−１，３−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ酵素である。本発明の好適な実施形態においてエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、リケナーゼ、好ましくはＥＣ３．２．１．７３に分類されるリケナーゼである。
【００９３】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、任意の適切な生物に由来するものであり得、例えば、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のリケナーゼであり得る。例えば、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、配列番号５のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体であり得る。
【００９４】
別の実施形態において、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａのＧｌｕＢ遺伝子にコードされるリケナーゼ、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体であり得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａのＧｌｕＢ遺伝子にコードされるリケナーゼの配列は、Ｇｏｓａｌｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，  Ｄｅｃ．  １９９１，  Ｖｏｌ．  １７３，  Ｎｏ．  ２３，  ｐ．  ７７０５−７７１０の図２に示される。
【００９５】
別の実施形態において、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、米国特許第６，１０３，５１１号に記載されるリケナーゼのいずれかであり得、詳細には、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、ＵＳ６，１０３，５１１で配列番号２として示されるポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、その機能的相同体であり得る。
【００９６】
１つの実施形態において、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、Ｅ．Ｃ．３．２．１．４に分類されるβ−グルカナーゼであり得る。β−グルカナーゼは、微生物起源のもの、例えば、細菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ）株に由来、または糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ）に由来するものであり得る。好適であるのは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉまたはＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来のベータ−グルカナーゼである。エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、詳細には、ＷＯ２００６／０６６５８２で配列番号６、配列番号７、または配列番号８として示される配列のいずれかであるポリペプチド、あるいはそれらと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、それらの機能的相同体であり得る。
【００９７】
使用可能な市販のベータ−グルカナーゼ製剤として、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＥＲＥＦＬＯ（登録商標）、及びＵＬＴＲＡＦＬＯ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）、ＧＣ８８０、ＬＡＭＩＮＥＸ（商標）、及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ．から入手可能）、ならびにＲＯＨＡＭＥＮＴ（登録商標）７０６９Ｗ（Ｒｏｈｍ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）が挙げられる。
【００９８】
１つの実施形態において、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、Ｈｕｍｉｃｏｌａ種由来のエンドグルカナーゼ、例えば、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ由来のエンドグルカナーゼ、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ由来のエンドグルカナーゼ、またはＴｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ種由来のエンドグルカナーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のエンドグルカナーゼ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種由来、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のエンドグルカナーゼ、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種由来、好ましくはＴ．ｒｅｅｓｅｉ及び／またはＴ．ｖｉｒｉｄｅ由来、例えば、ファミリー５のエンドグルカナーゼ、ファミリー７のベータ−グルカナーゼ、またはファミリー１２のベータ−グルカナーゼである。エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、詳細には、ＷＯ２００５／０５９０８４で配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０として示される配列のいずれかのポリペプチド、あるいはそれらと少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％配列同一性を共有する、それらの機能的相同体であり得る。
【００９９】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、例えば、配列番号５のポリペプチドの機能的相同体とは、加水分解される結合に関与する還元基を持つグルコース残基が、それ自身Ｃ−３で置換されている場合に、β−グルカンの（１→３）または（１→４）結合のエンド加水分解を触媒することができる酵素である。
【０１００】
添加されるエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼの量は、様々なパラメーターに依存し得る。一般に、マッシング後に８０〜２００ｋＤａの範囲の平均Ｍｗを有するβ−グルカンが得られる量のβ−グルカナーゼが添加される。一般に、比較的少量のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼのみが使用されることが好ましい。したがって、１つの実施形態において、マッシュ中のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性は、最大で０．５ＥＧＵ／ｇ、特に好ましくは最大で０．３ＥＧＵ／ｇオオムギ乾燥重量、さらにより好ましくは最大で０．１ＥＧＵ／ｇ、例えば、最大で０．０５ＥＧＵ／ｇ、例えば、最大で０．０３ＥＧＵ／ｇである。別の態様において、マッシュ中のエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性は、０．０００５〜０．５ＥＧＵ／ｇの範囲、好ましくは０．００５〜０．３ＥＧＵ／ｇの範囲、例えば、０．００１〜０．１ＥＧＵ／ｇの範囲、例えば、少なくとも０．００１〜０．０５ＥＧＵ／ｇオオムギ乾燥重量の範囲にある。エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性は、エンド−グルカナーゼ単位（ＥＧＵ）で測定することができ、これは、以下のとおり、ｐＨ６．０で、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用いて測定される。ｐＨ６．０で０．１Ｍリン酸緩衝液中に３４．０ｇ／ｌのＣＭＣ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ７  ＬＦＤ）を含有する基質溶液を調製する。分析対象の酵素試料を、同一緩衝液に溶解させる。基質溶液５ｍｌ及び酵素溶液０．１５ｍｌを混合し、振動式粘度計（例えばＳｏｆｒａｓｅｒ、ＦｒａｎｃｅのＭＩＶＩ  ３０００）に移し、３０分間４０℃に維持する。１ＥＧＵは、これらの条件下で粘度を半減させる酵素の量と定義される。
【０１０１】
本明細書中使用される場合、「マッシュ中のＸ」という用語は、本明細書中記載される方法のマッシング中（例えば、ステップｂ中）に存在するＸの量を示す。マッシュ中の酵素活性は、マッシング中に存在する乾燥オオムギ１グラムあたりの単位数として示すことができる。
【０１０２】
本発明の１つの好適な実施形態において、酵素組成物は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能なＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘを含む。詳細には、酵素組成物は、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘの混合物を含む、またはこの混合物からなることさえ可能であり、これらは両方ともＮｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能である。
【０１０３】
飲料基材の飲料への加工
本発明は、飲料の調製方法に関し、本方法は、酵素組成物の存在下でオオムギ穀粒をマッシングすること、及び水性抽出物をオオムギ穀粒（例えば、粉砕オオムギ）から分離することを含む。
【０１０４】
この水性抽出物は、飲料を構成し得る。しかしながら、水性抽出物は、飲料基材である場合が多く、飲料基材はさらに加工されてから、完成飲料に到達する。
【０１０５】
飲料基材は、少なくとも７５℃の温度に加熱するステップに供される場合が多い。これは、飲料の殺菌をはじめ、複数の効果を有すし得る。この加熱は、好ましくは、少なくとも７５℃の温度、好ましくは少なくとも８５℃、より好ましくは少なくとも９０℃、例えば、８５〜１００℃の範囲、例えば、９０〜１００℃の範囲で行われる。加熱は、任意の適切な長さの時間、例えば１５〜１２０分間の範囲、例えば、１５〜６０分間の範囲、例えば、約３０分間行うことができる。したがって、本発明による飲料は、殺菌された飲料であり得る。
【０１０６】
飲料基材は、７０〜８０℃に予備加熱し、続いて、短時間、例えば、１〜５秒間、例えば、１〜２秒間、または４〜５秒間、９０℃超に加熱することにより、超高温処理（ＵＨＴ）に供することもできる。
【０１０７】
飲料基材は、ホモジナイゼーション処理、例えば、１００〜２００ｂａｒでの処理に供することもできる。
【０１０８】
多くの場合、ステップｄ）は、飲料を製造する目的で、ステップｃ）で得られた飲料基材に、１種または複数の追加化合物及び／または１種または複数の追加液体を加えることを含む。そのような場合、上記の加熱処理またはＵＨＴは、これらの追加化合物及び／または追加液体を加える前後どちらでも行うことができる。
【０１０９】
本発明の方法は、１種または複数の追加化合物（複数可）を加えるステップを含むことができる。追加化合物は、例えば、風味化合物、保存剤、または機能性成分であり得る。追加化合物は、着色剤、甘味剤、ｐＨ調整剤、または塩でもあり得る。甘味剤は、例えば、人口甘味料、低カロリー甘味料、または糖であり得る。ｐＨ調整剤は、例えば、緩衝剤または酸、例えば、乳酸またはクエン酸であり得る。
【０１１０】
機能性成分は、所定の機能を得るために添加される任意の成分であり得る。好ましくは、機能性成分は、飲料をより健康的にするものである。機能性成分の非限定の例として、可溶性繊維、タンパク質、添加ビタミン、またはミネラルが挙げられる。
【０１１１】
保存剤は、任意の食品グレードの保存剤であり得、例えば、保存剤は、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸塩（例えばソルビン酸カリウム）、亜硫酸塩、及び／またはそれらの塩であり得る。
【０１１２】
追加化合物は、ＣＯ２でもあり得る。詳細には、ＣＯ２は、炭酸飲料を得るために加えることができる。
【０１１３】
本発明で使用される風味化合物は、任意の有用な風味化合物であり得る。風味化合物は、例えば、芳香物質、植物エキス、植物濃縮物、植物の一部、及びハーブ浸出液からなる群より選択することができる。
【０１１４】
すなわち、風味化合物は、例えば、芳香物質であり得る。芳香物質とは、典型的には、有機化合物であり、例えば、それらは、植物の二次代謝産物の場合がある。芳香物質は、任意の芳香物質であり得、例えば、果物芳香物質またはバニラ芳香物質がある。
【０１１５】
植物エキスは、例えば、ハーブエキスであり得る。ハーブエキスの非限定の例として、緑茶、紅茶、ルイボス、ペパーミント、またはホップの抽出物が挙げられる。植物エキスは、花のエキスも可能である。花のエキスの非限定の例として、ハイビスカス、カモミール、ニワトコ、ラベンダー、またはシナノキの花が挙げられる。
【０１１６】
植物エキスは、果物エキスでもあり得る。植物の一部は、例えば、乾燥ハーブまたは新鮮なハーブ、例えば、ホップペレット、乾燥したまたは新鮮な、花または果実であり得る。
【０１１７】
植物濃縮物は、果物濃縮物、例えば、果汁であり得、これは水の除去により濃縮されている。
【０１１８】
果物芳香物質、果物エキス、または果物濃縮物に有用な果物の非限定の例として、オレンジ、リンゴ、バナナ、レモン、パッションフルーツ、マンゴー、パイナップル、ナシ、キンカン、またはザボンが挙げられる。
【０１１９】
風味化合物は、例えば、飲料がトニック様飲料である実施形態において、キニーネでもあり得る。
【０１２０】
少なくとも１種の追加化合物は、安定剤でもあり得る。この安定剤は、例えば、可溶性β−グルカンを安定化させることができる、例えば、弾性ゲル化マトリクス中で可溶性β−グルカンを安定化させることができる任意の成分であり得る。この安定剤は、例えば、ゲランガム、例えばＣＰ  Ｋｅｌｃｏ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能なＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ＬＴ−１００であり得る。この安定剤は、任意の適切な量、例えば、０．００１〜０．１％（ｗ／ｗ）の範囲の最終濃度で、例えば、０．０１〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の最終濃度で飲料に加えることができる。
【０１２１】
追加液体は、水であり得る。追加液体は、別の飲料、例えば、果汁、シロップ、炭酸ソフトドリンク、またはビールでもあり得る。特に、追加液体は、果汁であり得る。
【０１２２】
ステップｄ）は、１種または複数の微生物で飲料基材を発酵させることも含むことができる。特に、飲料基材は、アルコール飲料を製造する目的で、酵母菌で発酵させることができる。この酵母菌は、任意の酵母菌、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓであり得る。この微生物は、細菌、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、例えば、Ｌ．ｌａｃｔｉｓでもあり得る。例えば、飲料基材は、従来の麦汁をビール製造中に発酵させるのと同様な様式で発酵させることができる。すなわち、ビール製造の任意の従来方法を採用することができ、そのような方法において、従来の麦汁を本発明の方法により調製された飲料基材に置き換える。
【０１２３】
病態
興味深いことに、発明の方法により調製されたβ−グルカンは、ＬＤＬコレステロール及び全コレステロール両方を低下させるのに有用であることが実証されている。したがって、本発明により製造された飲料は、ＬＤＬ及びコレステロールのレベル上昇と関連した複数の病態のリスクを低下させるのに有用である。
【０１２４】
したがって、１つの態様において、本発明は、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する飲料に関し、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、この飲料は、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させるためのものであり、この病態は、冠動脈心疾患及び糖尿病からなる群より選択される。
【０１２５】
本発明はまた、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させる方法も提供し、この病態は、冠動脈心疾患、糖尿病、及び感染からなる群より選択され、本方法は、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する飲料を、有効量でこの個体に投与することを含み、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有する。
【０１２６】
この個体は、少なくとも２ｇのβ−グルカン、例えば、少なくとも３ｇのβ−グルカン、例えば、３〜５０ｇの範囲のβ−グルカン、例えば、３〜２０ｇの範囲のβ−グルカン、例えば、３〜１０ｇの範囲のβ−グルカンを毎日摂取できるようにするのに十分な、本発明の飲料の摂取を行うことが好ましい。この個体は、１杯あたり０．５〜２ｇの範囲、例えば、０．５〜１．５ｇの範囲、例えば、約１ｇ、例えば、１ｇのβ−グルカンを摂取することも、好ましい場合がある。本発明の飲料の文脈において、１杯とは、典型的には、２５０〜３３０ｍｌの範囲、例えば、約２５０ｍｌ及び／または約３３０ｍｌである。
【０１２７】
したがって、この有効量は、１日あたり、少なくとも２ｇのβ−グルカン、例えば、少なくとも３ｇのβ−グルカン、例えば３〜５０ｇの範囲のβ−グルカン、例えば、３〜２０ｇの範囲のβ−グルカン、例えば、３〜１０ｇの範囲のβ−グルカンであり得る。
【０１２８】
本発明は、さらに、トリグリセリド、コレステロール、及びＬＤＬからなる群より選択される少なくとも１種の脂質の血中レベルを低下させる必要がある個体において、そのようなレベルを低下させる方法を提供し、本方法は、この個体が、請求項２９から３１のいずれか１項に従って、少なくとも２ｇのβ−グルカン、例えば、少なくとも３ｇのβ−グルカン、例えば、３〜５０ｇの範囲のβ−グルカン、例えば、３〜２０ｇの範囲のβ−グルカン、例えば、３〜１０ｇの範囲のβ−グルカンを含有する本発明の飲料を摂取することを含む。
【０１２９】
肥満のリスクを低下させる必要がある個体において、そのようなリスクを低下させる方法を提供することも、本発明の目的である。本方法は、この個体が、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する本発明の飲料を有効量で摂取することを含み、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有する。有効量は、好ましくは、上記の有効量である。
【０１３０】
肥満を低減させる必要がある個体において、肥満を低減させる方法を提供することも、本発明の目的である。本方法は、この個体が、少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する本発明の飲料を有効量で摂取することを含み、このβ−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有する。有効量は、好ましくは、上記の有効量である。
【０１３１】
上記個体は、好ましくは、ヒトである。本発明の実施形態によっては、個体は、肥満のヒトである。
【０１３２】
【表Ａ】
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【０１３３】
条項
本発明は、さらに、以下の条項により定義することができる：
【０１３４】
１．少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む飲料の調製方法であって、前記β−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、前記方法は、以下のステップを含む。
ａ）オオムギ植物の穀粒を用意し、前記穀粒は、以下の特性を有する。
ｉ．少なくとも１０％のβ−グルカンを含む。
ｉｉ．前記β−グルカンのＤＰ３／ＤＰ４比は、少なくとも３である。
ｂ）酵素組成物の存在下、前記穀粒を、水でマッシングし、それにより、水性抽出物を得、前記組成物は、α−アミラーゼ、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を含む。
ｃ）前記水性抽出物を、前記オオムギ穀粒から分離し、それにより飲料または飲料基材を得る。
ｄ）任意選択で、前記飲料基材を飲料に加工する。
を含む、前記方法。
【０１３５】
２．前記酵素組成物は、さらに、グルコアミラーゼ活性を含む、条項１に記載の方法。
【０１３６】
３．前記酵素組成物は、さらに、プルラナーゼ活性を含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１３７】
４．前記飲料は、少なくとも３ｇ／Ｌ、例えば少なくとも４ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１３８】
５．前記穀粒は、少なくとも１１％、例えば少なくとも１２％のβ−グルカンを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１３９】
６．前記β−グルカンにおける前記ＤＰ３／ＤＰ４比は、少なくとも３．２、例えば少なくとも３．４、例えば、少なくとも３．６、例えば少なくとも３．７である、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４０】
７．前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４１】
８．前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に、ＮＳＴ１の完全な機能喪失をもたらす変異を保有する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４２】
９．前記変異は、配列番号１と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する変異型ＮＳＴ１をコードする変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子をもたらし、前記アミノ酸は、例えば、配列番号１のアミノ酸２２８及びアミノ酸２７３から選択される、条項７から８のいずれか１項に記載の方法。
【０１４３】
１０．前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、前記変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、２２８位のＰｒｏ残基がＳｅｒ残基に置換されている、配列番号１のＮＳＴ１をコードする、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４４】
１１．前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有し、前記変異型ＨｖＮｓｔ１遺伝子は、２７３位のＶａｌ残基がＧｌｕに置換されている、配列番号１のＮＳＴ１をコードする、条項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１４５】
１２．前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に、例えば栽培品種Ｑｕｅｎｃｈのように、野生型オオムギ植物におけるＮＳＴ１タンパク質の発現と比較して少なくとも８０％低下したレベルの、ＮＳＴ１タンパク質の発現をもたらす変異を保有する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４６】
１３．ステップｂ）は、粉砕オオムギ穀粒を水と混合することを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４７】
１４．ステップｂ）は、粉砕オオムギ穀粒を、水と、１対１０〜２０の範囲の水対粉砕オオムギの比で混合することを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４８】
１５．ステップｂ）の前記マッシングは、６０〜７２℃の範囲の温度でのインキュベーションを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
１６．ステップｂ）の前記マッシングは、６０〜７２℃の範囲の温度で、３０〜６０分間の範囲のインキュベーションを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５０】
１７．前記α−アミラーゼは、ＥＣ３．２．１．１に分類される酵素である、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５１】
１８．前記α−アミラーゼは、配列番号３のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％配列相同性を共有する、その機能的相同体である、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５２】
１９．前記グルコアミラーゼは、ＥＣ３．２．１．３に分類される酵素である、条項２から１８のいずれか１項に記載の方法。
【０１５３】
２０．前記プルラナーゼは、ＥＣ３．２．１．４１に分類される酵素である、条項３から１９のいずれか１項に記載の方法。
【０１５４】
２１．前記プルラナーゼは、配列番号４のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％配列相同性を共有する、その機能的相同体である、条項３から２０のいずれか１項に記載の方法。
【０１５５】
２２．前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、リケナーゼである、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５６】
２３．前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、ＥＣ３．２．１．７３に分類される酵素である、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５７】
２４．前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、配列番号５のポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％配列相同性を共有する、その機能的相同体である、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５８】
２５．前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼは、Ｅ．Ｃ．３．２．１．４に分類される酵素である、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１５９】
２６．マッシング中に存在する前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性は、最大でｇオオムギ（乾燥重量）あたり０．５ＥＧＵ、好ましくはｇオオムギ（乾燥重量）あたり最大で０．１ＥＧＵである、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６０】
２７．マッシング中に存在する前記エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性は、ｇオオムギ（乾燥重量）あたり最大で０．０５ＥＧＵである、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６１】
２８．前記方法は、前記酵素組成物を、例えば、７５℃超の温度でインキュベートすることにより不活化するステップを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６２】
２９．ステップｃ）で得られる前記水性抽出物は、前記飲料を構成する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６３】
３０．ステップｄ）は、前記飲料基材を、少なくとも７５℃の温度に加熱することを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６４】
３１．前記ステップｄ）は、飲料を製造する目的で、ステップｃ）で得られた前記飲料基材に、１種または複数の追加化合物及び／または１種または複数の追加液体を、加えることを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６５】
３２．少なくとも１種の追加化合物は、風味化合物、保存剤、及び機能性成分からなる群より選択される、条項３１に記載の方法。
【０１６６】
３３．少なくとも１種の追加液体は、果汁、水、及びビールからなる群より選択される、条項３１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【０１６７】
３４．少なくとも１種の追加化合物は、安定剤である、条項３１から３３のいずれか１項に記載の方法。
【０１６８】
３５．ステップｄ）は、前記飲料基材を１種または複数の微生物で発酵させることを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１６９】
３６．ステップｄ）は、アルコール飲料を製造する目的で、前記飲料基材を酵母菌で発酵させることを含む、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１７０】
３７．前記飲料は、最大で５５ｍＰａｓの粘度を有する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１７１】
３８．前記飲料は、最大で５０ｍＰａｓ、例えば最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１７２】
３９．前記飲料は、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、前記条項のいずれか１項に記載の方法。
【０１７３】
４０．少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する飲料であって、前記β−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、かつ前記飲料は、前記条項のいずれか１項に記載の方法により製造される、前記飲料。
【０１７４】
４１．前記飲料は、少なくとも３ｇ／Ｌ、例えば少なくとも４ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む、条項４０に記載の飲料。
【０１７５】
４２．前記飲料は、最大で５０ｍＰａｓ、例えば最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、条項４０から４１のいずれか１項に記載の飲料。
【０１７６】
４３．前記飲料は、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させるためのものであり、前記病態は、冠動脈心疾患及び糖尿病からなる群より選択される、条項４０から４２のいずれか１項に記載の飲料。
【０１７７】
４４．病態になるリスクを低下させる必要がある個体におけるそのようなリスクの低下方法であって、前記病態は、冠動脈心疾患、糖尿病、及び感染からなる群より選択され、前記方法は、前記個体に、条項４０から４２のいずれか１項に記載の飲料を、有効量で投与することを含む、前記方法。
【０１７８】
４５．トリグリセリド、コレステロール、及びＬＤＬからなる群より選択される少なくとも１種の脂質の血中濃度を低下させる必要がある個体におけるそのような血中濃度の低下方法であって、前記方法は、前記個体が、条項４０から４２のいずれか１項に記載の飲料を、摂取することを含む、前記方法。
【０１７９】
４６．肥満のリスクの低下または肥満の低減を必要とする個体におけるそのような低下または低減方法であって、前記方法は、前記個体が、条項４０から４２のいずれか１項に記載の飲料を、摂取することを含む、前記方法。
【０１８０】
４７．前記個体は、ヒトである、条項４３４から４６のいずれか１項に記載の方法。
【０１８１】
４８．前記個体は、少なくとも３ｇのβ−グルカンを含む飲料を毎日投与される、条項４４から４７のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【０１８２】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、実施例は、本発明を限定するものとしてみなされることは決してない。
【０１８３】
実施例１
高β−グルカン麦汁の生成
高β−グルカン麦汁の生成を、Ｌｏｃｈｎｅｒ電子マッシング装置で８つのビーカーを用いて行った。高β−グルカン麦汁は、８ｇ／ｌ超で含有していた。この実施例では、オオムギ品種ｌｙｓ５ｆを使用した。Ｌｙｓ５ｆは、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから、受入番号ＮＧＢ２００３０で入手可能である。オオムギ粒は、ＥＢＣミルで粉砕した（０．５ｍｍに調整）。水：粉比は、重量で１：１５であり、これは、５００ｍｌ金属ビーカー中、６５℃で、オオムギ粉２７ｇ（乾燥重量）を標準醸造用水４００ｍＬに加えてマッシングすることに等しい。粉砕オオムギを水と混合して直ぐに、デンプンデキストリン化及びβ−グルカン抽出を促進する目的で、まとめてα−アミラーゼ、α−１，４グルコシダーゼ、プルラナーゼ、及びβ−グルカナーゼ活性を含有する２種の市販酵素製剤（０．２％濃度／湿重量−各酵素製剤４００μｌに相当）を加えた。２種の異なる酵素混合物、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘの混合物（ＴＡＦ）、またはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）の混合物（ＴＡ）いずれかを使用した。全ての酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから購入した。Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣは、１２０ＫＮＵ／ｇのα−アミラーゼ活性を有し、したがってオオムギ２７ｇあたり約４８ＫＮＵのα−アミラーゼを使用した（オオムギ乾燥重量１ｇあたり１．８ＫＮＵに相当）。この段階で、リン酸を加えてｐＨを５．５に調整した。６５℃で４５分後、２５分間かけて温度を徐々に上げて９０℃にした。マッシュを、３５００ｒｐｍ（ＲＣ５Ｃ）で１０分間遠心して、不溶性の使用済みグレイン材料を除去した。合計量３４０ｍｌの麦汁を、青栓のボトルに注ぎ、９０℃で３０分間煮沸した。カルコフロール（Ｂｒｅｗｉｎｇ  ＥＢＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ、１９９４）（β−グルカンＣａｒｌｓｂｅｒｇシステム５７００分析器、Ｔｅｃａｔｏｒ、Ｓｗｅｄｅｎ）によりβ−グルカンの定量を行ったところ、ｌｙｓ５ｆのＴＡＦ麦汁について８．４ｇ／Ｌと測定された。煮沸後、可溶性β−グルカンを軟質弾性ゲルマトリク中で安定化させる目的で、麦汁に、市販のゲランガム安定化成分（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ＬＴ−１００、ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ、Ｌｉｌｌｅ  Ｓｋｅｎｓｖｅｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を加えた。加えた安定剤の最終濃度は、０．０２５％であった。高β−グルカン麦汁は、さらなる脱醸造及び香り付けステップまで５℃に維持した。
【０１８４】
実施例２
β−グルカン麦汁の生成
本質的に実施例１に記載のとおりに行ったが、ただし、パイロット規模（５００Ｌ規模）で、デカンター（供給流７００Ｌ／ｈ）を用い、続いて遠心（４７５Ｌ／ｈ、背圧３ｂａｒ）して、不溶性オオムギ材料を分離することにより麦汁を製造した。麦汁収率は、最初の水導入量に対して８５％であり、カルコフロールによりβ−グルカンを測定したところ、４ｇ／Ｌであった。麦汁を、食品グレードの容器に充填し、ソルビン酸カリウム（２５ｍｇ／Ｌ）を加え、ｐＨをさらにクエン酸／乳酸溶液で４．０に調整し、安定化及び香り付け処理するまで５℃に維持した。５％糖、０．３％香料物質、０．１％着色料、及び０．０２５％ゲランガムからなる成分を、周辺温度で、高せん断ラボミキサーを用いて低速で５分間、高β−グルカン基材に分散させ、続いて１５分間水和させた。成分混合後、飲料にＵＨＴ及びホモジナイズ処理を施し、安定性を確保した。第一ステップは、８０℃に予備加熱し、９０℃で４秒間ＵＨＴ後、１８０ｂａｒでホモジナイズした。次いで、２０℃に冷却して、滅菌ＰＥＴボトル（２５０ｍｌ）に充填した。
【０１８５】
実施例３
本質的に実施例１に記載のとおりに行ったが、ただし、パイロット規模で醸造ケトルを用いて、麦汁を製造した。使用したオオムギは、同じくｌｙｓ５ｆであったが、ただし、異なる生育季節に収穫されたものであった。マッシング後、液体をポンプでロータータンに移し、温度を７５℃に下げて、２４時間放置沈殿させて、不溶性オオムギ材料を除去した。合計量１６０Ｌの麦汁を麦汁ケトルに移し、９０℃で３０分間煮沸した。カルコフロールによりβ−グルカンを定量したところ、６ｇ／Ｌの麦汁であると測定された。
【０１８６】
実施例４
実施例１、２、及び３で使用した酵素のβ−グルカナーゼ副活性についての記載
麦汁製造で使用した３種の異なる市販の酵素混合物におけるβ−グルカナーゼ副活性の存在を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｉｒｅｌａｎｄ）から入手した中粘度オオムギβ−グルカン（２００ｋＤａ）で探索した。β−グルカンを穏やかに加熱及び旋回攪拌して溶解させ、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤のＤ２Ｏ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）溶液（ｐＨ６）６００μｌ中１ｍｇの濃度とした。そのようにして３種の基質試料を作成し、酵素溶液（それぞれ、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）、またはＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ）０．５μｌと混合した。反応は、ｉｎ  ｓｉｔｕで、高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定により、１８℃で２４０分間追跡した。図１は、１８℃での、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）、及びＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣによるβ−グルカン分解の最終産物を示す。最も高いβ−グルカナーゼ副活性は、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ（図１）で見られ、続いてＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）であった。Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣでは、β−グルカナーゼ活性は観察されなかった。酵素活性は、図２に示すとおり、グルコース以外の還元末端シグナルの出現（酵素混合物に存在）により判定した。図２は、６５℃でＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘのβ−グルカナーゼ（リケナーゼ）副活性により分解されたｌｙｓ５ｆのβ−グルカンの１Ｈ−１ＨＣＯＳＹスペクトルを示す。
【０１８７】
β−グルカナーゼ活性の部位特異的作用を、現実のプロセス条件下（実施例１に記載のとおり）、すなわち６５℃で、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣのみにより抽出されたｌｙｓ５ｆのβ−グルカン試料を用いて調査した。８００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ（Ｆａｌｌａｎｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）ＮＭＲ分光計に、ＴＣＩクライオプローブ及び１８．７Ｔマグネット（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍａｇｎｅｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を装備したものを用いて、酵素分解された試料で等核１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹスペクトルを記録し、これを用いて、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ酵素混合物との接触により形成されたβ−グルカンを同定した（図２）。切断部位シグナルの中間体の同定は、先行研究（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）での同定を参照して２Ｄスペクトルの比較を通じて行った。これらの同定は、多くの優勢な切断部位シグナルが、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ製剤及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）製剤のエンド−１，３−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ（リケナーゼ、ＥＣ３．２．１．７３）活性での切断により形成された、β−（１−３）還元末端シグナルに帰属可能であることを示す。この活性の存在は、そのエンドグルカナーゼ活性のためにβ−グルカン分子量が急速に減少することを合理的に説明する。本発明によれば、市販のＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ製剤及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）製剤の副活性を利用することは有利な場合がある。というのも、この活性は、オオムギβ−グルカンの分解を制御して所望の粘度にすることを可能にするからである。
【０１８８】
実施例５ａ
β−グルカンの特性決定
本質的に実施例１に記載のとおりに調製したオオムギ麦汁由来のβ−グルカンの特性決定及び定量を、この実施例で説明する。ｌｙｓ５ｆを含む複数の異なるオオムギ品種及び様々な市販のオオムギ品種から麦汁を調製した。使用したオオムギ粒の合計β−グルカン含有量を、以下の表１に示す。
【表１】
2019514392.tif 000003
【０１８９】
蛍光測定法（Ｂｒｅｗｉｎｇ  ＥＢＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ、１９９４）を用いて、麦汁中、ならびにオオムギ粒中のβ−グルカン含有量を測定する。使用した装置は、β−グルカンＣａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５７００分析器、Ｔｅｃａｔｏｒ、Ｓｗｅｄｅｎであり、これは、カルコフロール色素のβ−グルカンとの結合能力に基づいて、その色素強度の変化を測定原理として使用するフローインジェクション分析機器である。カルコフロールは、溶液中に存在する１０〜３０ｋＤａ超のβ−グルカンと結合する能力を有し、結合したβ−グルカンの量と直接比例してその蛍光を強める。
【０１９０】
麦汁（４ｇ／Ｌのβ−グルカン）を室温で６ヶ月間貯蔵し、上記のカルコフール法を用いて定期的にβ−グルカン含有量を測定することにより、β−グルカン含有量の安定性を試験した。本質的に実施例１に記載のとおりにしてｌｙｓ５ｆから調製した麦汁及びＧｌｕｃａｇｅｌ（商標）の溶液のβ−グルカン含有量を追跡した。結果を図９に示す。
【０１９１】
麦汁の粘度は、粘度計Ｖｉｂｒｏ  ＳＶ−１０（Ａ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｔｏｋｙｏ）により、２０℃で、麦汁の遠心（実施例１に記載のとおり）から１時間以内に測定した。その後の手順として、粘度計に麦汁１０ｍｌを充填し、その値をスクリーンにｍＰａｓ単位で記録した。結果を表２に示す。
【表２】
2019514392.tif 000004
【０１９２】
また、様々なオオムギ系統から、オオムギ麦汁を、本質的に実施例１に記載のとおりにして、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘの混合物（ＴＡＦ）、またはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）（ＴＡ）もしくはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）（Ｔ）の混合物を使用して抽出し、調製した。麦汁の粘度を測定した。結果を図１２に示す。ＴＡＦを用いて調製したオオムギ麦汁は、非常に低い粘度を有する。
【０１９３】
分子量及びＤＰ３／ＤＰ４比を分析する前に、エタノールを用いて、β−グルカンを麦汁から沈殿させた。グラスビーカー中、室温で、実施例１に記載のとおりに調製した麦汁を８０％エタノールに１：１で加えて混合することにより沈殿を行った。混合物は３０分間放置して沈殿させた。得られるβ−グルカンガムを篩にかけて収集し、２４時間凍結乾燥させた。凍結乾燥からβ−グルカンガムを取り出し、重量測定し、粉砕して粉にした。
【０１９４】
従来のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、分子量分析を行った。試料を、ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ  ５２０ＨＱ（７．５＊３００ｍｍ）またはａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ  ３２０ＨＱ（７．５＊３００ｍｍ）カラム（Ｓｈｏｄｅｘ、ＵＳ）に添加した。カラムは、５種のβ−グルカン標準物質で較正した。オオムギＢＧ  ６５００００、オーツＢＧ  ３９１０００、オーツＢＧ  ２６５０００、バーレイＢＧ  ２２９０００、オーツＢＧ  ７０６００、及びオーツＢＧ  ３５６００（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｉｒｅｌａｎｄより）である。５０ｍＭのＮＨ４ＣＯＯＨ緩衝液ｐＨ５及び０．０１％ＮａＮ３を用いて、６０℃で、０．５ｍｌ／分の一定流速で溶出を行った。この分離は、ＧＰＣシステム（ｖｉｓｃｏｔｅｋ  ２７０ｍａｘ、Ｍａｌｖｅｒｎ）にオンラインデガッサ、ポンプ、及び示差屈折計を装備して、４０℃で制御して、行った。粉末試料は、５０％エタノール２０μｌで湿潤させてから、緩衝液に溶解させた。１ｍｇ／ｍｌの溶液を、最高８０℃に２時間加熱してから遠心した。試料は全て、遠心及び濾過（０．４５μｍ）してから、５０μｌを注入した。分子量測定のデータは、Ｏｍｎｉｓｅｃソフトウェア（バージョン４．７．０．４０６、Ｍａｌｖｅｒｎ）により、ホモ重合体の従来の較正に基づいて分析した。
【０１９５】
３種のβ−グルカンについて分子量分析の結果を表３に示す。
【表３】
2019514392.tif 000005
実施例４に記載のとおり、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ  Ｆｌｅｘは、エンド−１，３−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ活性を有する。
【０１９６】
ＤＰ３／ＤＰ４比（セロトリオース対セロテトラオース）は、β−グルカンオリゴマーブロック構造を記載する。ＤＰ３／ＤＰ４分析は、上記のとおりに調製した麦汁から沈殿したβ−グルカンの完全リケナーゼ分解に基づくものであった。様々なオオムギ系統から調製した麦汁のβ−グルカンならびに市販のオオムギβ−グルカンであるＧｌｕｃａｇｅｌ（商標）についてＤＰ３／ＤＰ４比を特定した。アッセイ混合物は、β−グルカン試料２．５ｍｇを加えた１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液５００μｌ及びリケナーゼのリケナーゼ懸濁液（１０Ｕ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｉｒｅｌａｎｄ）１１０μｌからなるものであった。試料は、エタノール（５０％Ｖ／Ｖ）１０μｌで湿潤させてから、緩衝液に溶解させた。溶液を、最高９６℃まで２時間加熱してから、リケナーゼを加えた。試料を６０℃で一晩インキュベートした。酵素を、沸騰水浴に入れて３０分間処理することにより不活化した。
【０１９７】
アミノベンズアミド（２−ＡＢ）は、還元アミノ化手順によりオリゴ糖の還元末端に付加される共通蛍光標識である。２−ＡＢ標識化：ＵＰＬＣ分析（Ｗａｔｅｒｓ）を行う前に、２−アミノベンズアミドを用いた蛍光標識化を、参照標準物質及び試料に対して以下のとおり行った。グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオースを、水に溶解させ、濃度１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液２００μｌを、凍結乾燥させた。各試料２００μｌを、凍結乾燥させた。これらの溶液に、２００μｌの２−ＡＢ及び２００μｌのＮａＢＨ３ＣＮを加えた。試料を旋回混合し、６０℃で一晩インキュベートし、次いで室温に冷却して、３．６ｍｌのＨ２Ｏで希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×８ｍｌ）で洗浄した。各水層から１ｍｌを収集し、５分間遠心し、１０ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）及びアセトニトリルの混合液（２２：７８）で１０分の１に希釈した。
【０１９８】
ＤＰ３／ＤＰ４比の結果を、表４に示す。
【表４】
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【０１９９】
そのうえさらに、図１１は、様々なオオムギ系統（図中に示す）のオオムギ穀粒中のＤＰ３／ＤＰ４比を、そのオオムギ穀粒から、本質的に実施例１に記載のとおりにして、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘの混合物（ＴＡＦ）、またはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）（ＴＡ）もしくはＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）混合物（Ｔ）いずれかを用いて抽出し調製した麦汁中のβ−グルカンのＭｗと合わせて示す。
【０２００】
実施例６
麦汁由来のβ−グルカンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果
この試験では、β−グルカンの分子量が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胆汁酸塩と結合する多糖類の能力にどう影響を及ぼすかを調査する。本発明者らは、β−グルカンとグリココール酸塩の間の相互作用を分子レベルで探査するため、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４に記載されるとおり、高分解能１Ｈ−１３ＣＮＭＲ（８００ＭＨｚ）実験を用いた。試験対象のβ−グルカンは、以下のとおりであった：
Ａ：低分子量ｌｙｓ５ｆ  ＴＡＦ（ＬＭｗ−１５０ｋＤａ）−実施例１に記載のとおりにＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘで抽出
Ｂ：中分子量ｌｙｓ５ｆ  ＴＡ（ＭＭｗ−５３０ｋＤａ）−実施例１に記載のとおりにＴｅｒｒｍａｍｙｌ  ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）で抽出。
【０２０１】
β−グルカン試料を、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（Ｄ２Ｏ溶液、ｐＨ５）に溶解させ（１％ｗ／ｖ）、９９℃で３０分間水和させた。ｐＨ５の酢酸緩衝液をＨ２Ｏで調製してから、凍結乾燥させ、Ｄ２Ｏに再溶解させた。胆汁酸塩を、ＢＧ溶液に、以下の濃度、すなわち０、５、１５、３０、または４５ｍＭで混合し、混合物を３７℃で１２０分間インキュベートした。このインキュベーション後、試料を５ｍｍ  ＮＭＲサンプル管に移し、１Ｈ−１３Ｃ異種核単一量子相関（ＨＳＱＣ）実験により３７℃で分析した。
【０２０２】
β−グルカンに対する胆汁酸塩の吸着を、ラングミュア吸着等温式として処理し、化学シフトの差をラングミュア吸着モデルに当てはめることで、グリココール酸塩との相互作用に対するβ−グルカン分子量の効果を定量的に探索した。結果を図３．βに示す。
【０２０３】
２つのβ−グルカン共鳴間のシグナル変化（Δδ）は、溶液中のβ−グルカンと胆汁酸塩の直接相互作用を示す。これは、グリココール酸塩と、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）処理（図３中のｌｙｓ５ｆ  ＴＡ）ならびに追加のＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ処理（図３中のｌｙｓ５ｆ  ＴＡＦ）により生成したβ−グルカンとの間の直接結合と、一致する。両方のβ−グルカンに対する胆汁酸塩吸着が検出可能であるものの、胆汁酸塩結合の強さは、製剤間で有意に異なることはなかった。したがって、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果は、１５０ｋＤａのｌｙｓ５ｆ  ＴＡＦ  β−グルカンが、５３０ｋＤａのｌｙｓ５ｆ  ＴＡ  β−グルカンの持つ、直接分子相互作用を通じて胆汁酸塩を吸着する能力を維持していたことを裏付ける。
【０２０４】
実施例７
麦汁のβ−グルカンのｉｎ−ｖｉｖｏ効果
この動物実験の目的は、β−グルカンが高コレステロール血症ラットのコレステロール代謝に及ぼす影響の種類及び質を調べることであった。このｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、本発明者らは、構造及び分子量が大幅に異なる３種の異なるβ−グルカンを選択した。最大の関心は、血液コレステロールの低減効果であった。研究設計は、高コレステロール食（２％）（＋０．５％コール酸Ｎａ塩／胆汁酸塩）で３週間の追い込み期間から開始した、この高コレステロール食（２％）は、オスＷｉｓｔａｒラットで高コレステロール血症を誘導することが見つかっていた。
【０２０５】
試験用餌は、全ての処置が、同一量のタンパク質、脂肪、デンプン、及び繊維（５％）を含有するように製造された。そのうえさらに、２％のコレステロールをこの餌に添加した。β−グルカン粉末中のタンパク質、デンプン、及び食物繊維の正確な分析に基づいて、餌の組成を、種々の栄養成分の餌合計含有量が、毎日同一であるように調整した。
【０２０６】
３つの実験食群（Ａ、Ｂ、Ｃ）における餌の組成は、高脂肪食（繊維、表５を参照）に基づいており、５％の繊維が、以下の３つのβ−グルカン生成物からもたらされた：
Ａ：対照β−グルカン−Ｇｌｕｃａｇｅｌ（商標）（ＤＫＳＨ）
Ｂ：低分子量ｌｙｓ５ｆ  ＴＡＦ（ＬＭｗ）−実施例５ａに記載のとおりにＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘで抽出
Ｃ：中分子量ｌｙｓ５ｆ  ＴＡ（ＭＭｗ）−実施例５ａに記載のとおりにＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ及びＡｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）で抽出
【０２０７】
低分子量及び中分子量ｌｙｓ５ｆ  β−グルカンは、麦汁からβ−グルカンを沈殿させることにより調製した。麦汁は、オオムギｌｙｓ５ｆを用いて実施例１に記載のとおりに調製し、沈殿は、実施例５ａに記載のとおりに行った。
【表５】
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【０２０８】
実験には、５週齢のＷｉｓｔａｒラットを合計３６匹（１処置あたり１２匹）使用した。実験は、２４匹または１２匹のラットを用いて各２ラップ（ブロック）で行い、２週間の間を空けた。到着時に、ラットにチップで目印をつけ、箱に分配した（１箱あたり４／６匹）。到着後、ラットには、ＡＩＮ９３Ｇ標準餌（ペレット）を自由に食べさせ、その後、３週間、高脂肪食の試験餌を自由に食べさせた。１箱（４〜５匹の動物）あたりの餌摂取量を週ごとに記録した。
【０２０９】
３週間後、動物の体重を測定し、全身麻酔下で尾血液を採取して、血中脂質を分析した。体重を参照して（１処置あたりの平均体重が同様になるように）動物を無作為に３つの処置群に分け、１箱あたり４匹の動物を収容して（１ブロックあたり１処置あたり１箱）、自由に食べさせた。餌量及び体重を週ごとに記録した。
【０２１０】
５週間後、ラットを、代謝ケージに個別に収容した。３日間の馴化の後、２０ｇの餌／日を毎日添加する吸収率試験を行った。合計量の餌（８０ｇ）を配給し、生じた肥料を１つの袋に収集した。
【０２１１】
７週間後、ラットの体重を測定し、麻酔下で殺傷する。血液を、以下の分析のため収集する：
血漿トリグリセリド、血漿全コレステロール、血漿ＨＤＬ、血漿ＬＤＬ、固形分％に関して分析した胃内容物。揮発性脂肪酸の含有量に関して分析した虫垂内容物。
残余試験で得られた排泄物を凍結乾燥させ、乾物よび灰分に関して分析した。
【０２１２】
処置後の脂質プロファイルにおける変化についての結果を図４〜７に示す。全ての脂質は、Ｐｅｎｔｒａ  ４００で分析した。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールは、心疾患の主なリスク因子であるため、ＬＤＬレベルは、低下することが好ましい。同様に、全コレステロールレベルが低下することが好ましい。しかしながら、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールは、動脈が閉塞するのを防ぐのに役立つことから、「良い」コレステロールとして知られており、したがって、ＨＤＬのレベルは低下しないことが好ましい。
【０２１３】
全ＳＣＦＡプールにおいて、数字的変化が、処置後に観察された。図８を参照。計算は、ＳＣＦＡ合計量＝酪酸、プロピオン酸、及び酢酸（湿潤試料中のｍｍｏｌ、ｋｇ）×虫垂内容物の重量（ｇｒ）。
【０２１４】
統計分析は、実験のβ−グルカン処置群（ＬＭｗ  ｌｙｓ５ｆ、ＭＭｗ  ｌｙｓ５ｆ）、と市販のオオムギβ−グルカンＧｌｕｃａｇｅｌ（商標）の間で、全ＳＣＦＡプールに有意差を示した。β−グルカン処置後の全ＳＣＦＡにおける上昇は、ＳＣＦＡがコレステロール低下機構と関連するとされてきていること、及び結腸細胞のエネルギー源として機能し、腸の健康に重要であることから、有益であると考えられる。
【０２１５】
実施例８
以下の混合物中でオオムギ粉をマッシングすることにより、オオムギ麦汁を調製した：
【０２１６】
麦汁レシピ試作１
オオムギ品種Ｌｙｓ５ｆの粉２７ｇ
水（水道水）４００ｍｌ
２５％リン酸５３０ｕｌ
３５％塩化カルシウム１２０ｕｌ
Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）Ｓｃ  ８００ｕｌ
β−グルカナーゼ（Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）ｆｌｅｘまたはＵｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）ｍａｘ）４ｕｌ
麦汁レシピ試作２
オオムギ品種Ｌｙｓ５ｆの粉２７ｇ
水（水道水）４００ｍｌ
２５％リン酸５３０ｕｌ
３５％塩化カルシウム１２０ｕｌ
Ｔｅｒｍａｍｙｌ  Ｓｃ  ８００ｕｌ
ベータ−グルカナーゼ（Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ  ｆｌｅｘまたはＵｌｔｒａｆｌｏ  ｍａｘ）０．４ｕｌ
麦汁レシピ試作３
オオムギ品種Ｌｙｓ５ｆの粉２７ｇ
水（水道水）４００ｍｌ
２５％リン酸５３０ｕｌ
３５％塩化カルシウム１２０ｕｌ
Ｔｅｒｍａｍｙｌ  Ｓｃ  ８００ｕｌ
ベータ−グルカナーゼ（Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ  ｆｌｅｘまたはＵｌｔｒａｆｌｏ  ｍａｘ）０．０４ｕｌ
【０２１７】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）ＳＣ、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘ、またはＵｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）ｍａｘは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能である。少量で使用される酵素を調製する目的で、酵素１００ｕｌ＋水９．９ｍｌの希釈物を作成したが、示される量は、元来の酵素製剤の体積に相当する。
【０２１８】
マッシングは、５００ｍｌの金属ビーカー中、６５℃でマッシングすることにより行った。６５℃で４５分後、２５分の間に温度を徐々に上げて９０℃にし、最終的に、３０分間９０℃に維持した。マッシュを、５０００ｒｐｍで１５分間、室温（２０〜２４℃）で遠心して、不溶性の使用済みグレイン材料を除去した。
【０２１９】
ベータ−グルカンの粘度及び内容物を、本質的に本明細書中実施例５に記載のとおりに測定した。結果を表６に示す。
【表６】
2019514392.tif 000008
【０２２０】
製造元によれば、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘは、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、及びプルラナーゼを含む。しかしながら、本明細書中上記の実施例４で記載したとおり、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘは、β−グルカナーゼ副活性も含む。Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘをごく少量で使用した場合、得られる麦汁は、許容範囲の上限の粘度を有する。しかしながら、実施例５ａで示したとおり、Ａｔｔｅｎｕｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｌｅｘの使用量をそれより増やすと、より粘度の低い麦汁が得られる。
【０２２１】
製造元によれば、Ｕｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘは、β−グルカナーゼ（７００ＥＧＵ／ｇ）及びキシラナーゼ（２５０ＦＸＵ／ｇ）を含む。本明細書中使用する場合、ＥＧＵは、エンドグルカナーゼ単位の略号である。オオムギ２７ｇあたり約０．２８ＥＧＵのＵｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘを使用する場合（０．０１ＥＧＵ／ｇオオムギに相当する）、許容されるβ−グルカン濃度及び粘度の麦汁が得られる。オオムギ２７ｇあたり約２．８ＥＧＵのＵｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘを使用する場合（０．１ＥＧＵ／ｇオオムギに相当する）、それより低いが依然として許容されるβ−グルカン濃度及び粘度の麦汁が得られる。オオムギ２７ｇあたり約０．０２８ＥＧＵのＵｌｔｒａｆｌｏ（登録商標）Ｍａｘを使用する場合（０．００１ＥＧＵ／ｇオオムギに相当する）、許容されるβ−グルカン濃度の麦汁が得られるが、その粘度は、許容範囲の上限にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月2日(2018.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む飲料の調製方法であって、前記β−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、前記方法は、以下のステップを含む、前記方法:
ａ）オオムギ植物の穀粒を用意し、前記穀粒は、以下の特性を有する：
ｉ．少なくとも１０％のβ−グルカンを含む。
ｉｉ．前記β−グルカンのＤＰ３／ＤＰ４比は、少なくとも３．４である。
ｂ）酵素組成物の存在下、前記穀粒を、水でマッシングし、それにより、水性抽出物を得、前記組成物は、α−アミラーゼ、及びエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性を含む。
ｃ）前記水性抽出物を、前記オオムギ穀粒から分離し、それにより飲料または飲料基材を得る。
ｄ）任意選択で、前記飲料基材を飲料に加工する。
【請求項２】
前記酵素組成物は、さらに、グルコアミラーゼ活性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素組成物は、さらに、プルラナーゼ活性を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記飲料は、少なくとも３ｇ／Ｌ、例えば少なくとも４ｇ／Ｌのβ−グルカンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記穀粒は、少なくとも１１％、例えば少なくとも１２％のβ−グルカンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記β−グルカンにおける前記ＤＰ３／ＤＰ４比は、少なくとも３．６、例えば少なくとも３．７である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記オオムギ植物は、ＨｖＮｓｔ１遺伝子に変異を保有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）は、粉砕オオムギ穀粒を、水と、１対１０〜２０の範囲の水対粉砕オオムギの比で混合することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップｄ）は、飲料を製造する目的で、ステップｃ）で得られた前記飲料基材に、１種または複数の追加化合物及び／または１種または複数の追加液体を、加えることを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の追加化合物は、風味化合物、保存剤、及び機能性成分からなる群より選択され、及び／また、少なくとも１種の追加液体は、果汁、水、及びビールからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｄ）は、前記飲料基材を１種または複数の微生物で発酵させることを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記飲料は、最大で５０ｍＰａｓ、例えば最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２ｇ／Ｌのβ−グルカンを含有する飲料であって、前記β−グルカンは、８０〜２００ｋＤａの範囲に平均分子量を有し、かつ前記飲料は、先行請求項のいずれか１項に記載の方法により製造される、前記飲料。
【請求項１４】
前記飲料は、最大で５０ｍＰａｓ、例えば最大で４０ｍＰａｓ、例えば、最大で３５ｍＰａｓの粘度を有する、請求項１３に記載の飲料。
【請求項１５】
前記飲料は、病態になるリスクを低下させる必要がある個体においてそのようなリスクを低下させるためのものであり、前記病態は、冠動脈心疾患及び糖尿病からなる群より選択される、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項１６】
病態になるリスクを低下させる必要がある個体におけるそのようなリスクの低下方法であって、前記病態は、冠動脈心疾患、糖尿病、及び感染からなる群より選択され、前記方法は、前記個体に、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の飲料を、有効量で投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
トリグリセリド、コレステロール、及びＬＤＬからなる群より選択される少なくとも１種の脂質の血中濃度を低下させる必要がある個体におけるそのような血中濃度の低下方法であって、前記方法は、前記個体が、請求項１３から１４のいずれか１項に記載の飲料を、摂取することを含む、前記方法。
【請求項１８】
肥満のリスクの低下または肥満の低減を必要とする個体におけるそのような低下または低減方法であって、前記方法は、前記個体が、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の飲料を、摂取することを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記個体は、ヒトである、請求項１７から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体は、少なくとも３ｇのβ−グルカンを含む飲料を毎日投与される、請求項１６から１９のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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