(57)【要約】  核酸配列を増幅する方法を提供する。該方法は、二本鎖核酸分子の鎖を５’末端から３’末端に向かって分解することが可能なエキソヌクレアーゼと、鎖置換ポリメラーゼと、第１及び第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸分子と、第１の核酸プライマーと、必要に応じて、増幅すべき第１の核酸配列の増幅をもたらすヌクレオチドとを含む増幅混合物を準備することを含む。上記方法は、分解、エキソヌクレアーゼ分解及び鎖置換重合を可能にする条件下で増幅反応を行い、それにより増幅された量の上記第１の核酸配列を含む生成物混合物を作製することを更に含む。一方の鎖にフルオロフォアを有し、もう一方の鎖にクエンチャーを有する二本鎖プローブを使用して、標的を検出するのに変性及び再ハイブリダイゼーションを用いて、生体サンプル中の標的核酸配列の存在又は量を決定する方法も提供する。【選択図】図３ａ
2019535239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）
（ｉ）二本鎖核酸分子の鎖の５’末端から３’末端に向かう分解を行うことが可能なエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉ）鎖置換ポリメラーゼと、
（ｉｉｉ）互いにハイブリダイズした第１及び第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸分子であって、該第１の鎖が増幅すべき第１の核酸配列を組み込み、その５’末端から離れて、（ｉ）として規定されるエキソヌクレアーゼによる分解（該方法の条件下での）に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第１の５’末端領域を有する、二本鎖核酸分子と、
（ｉｖ）前記第１の核酸の前記第１の末端領域と同じヌクレオチド配列を有し、同じ耐分解性領域を組み込む第１の核酸プライマーと、
（ｖ）必要に応じて、前記増幅すべき第１の核酸配列の増幅をもたらすヌクレオチドと、
を含む増幅混合物を準備することと、
（ｂ）分解、エキソヌクレアーゼ分解及び鎖置換重合を可能にする条件下で増幅反応を行い、それにより増幅された量の前記第１の核酸配列を含む生成物混合物を作製することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端が共に前記二本鎖核酸分子の平滑末端をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の鎖の５’末端が５’リン酸基を有し、前記エキソヌクレアーゼが、前記増幅混合物中で、リン酸（ＰＯ4）基をその５’末端に有する二本鎖核酸分子の鎖を、該鎖の５’末端からその３’末端に向かって選択的に分解するエキソヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エキソヌクレアーゼがλ−エキソヌクレアーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の末端領域及び前記第１のプライマーの前記耐分解性領域が各々、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の末端領域及び前記第１のプライマーの前記耐分解性領域が各々、複数のホスホロチオエートヌクレオチドの連続配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１の末端領域の前記耐分解性領域が、その末端の間にあり、それに応じて、前記第１のプライマーの耐分解性領域が、その末端の間にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の核酸鎖が、その５’末端から離れて、（ｉ）として規定されるエキソヌクレアーゼによる分解（前記方法の条件下での）に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第２の５’末端領域を有し、前記増幅混合物が、該第２の核酸鎖の該第２の末端領域と同一の第２のプライマーを組み込む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記二本鎖核酸分子が平滑末端を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の鎖の各々の５’末端が５’リン酸基を有し、前記エキソヌクレアーゼが、前記増幅混合物中で、リン酸（ＰＯ4）基をその５’末端に有する二本鎖核酸分子の鎖を、該鎖の５’末端からその３’末端に向かって選択的に分解するエキソヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記エキソヌクレアーゼがλ−エキソヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の末端領域、前記第１のプライマー、前記第２の末端領域及び前記第２のプライマーの前記耐分解性領域が各々、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の末端領域、前記第１のプライマー、前記第２の末端領域及び前記第２のプライマーの前記耐分解性領域が各々、複数のホスホロチオエートヌクレオチドの連続配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の末端領域及び前記第２の末端領域の前記耐分解性領域が、その末端の間にあり、それに応じて、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーの前記耐分解性領域が、その末端の間にある、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
増幅配列を検出することを付加的に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
検出が、
（ｉ）前記生成物混合物中に、（ａ）検出すべき増幅された核酸配列にハイブリダイズすることが可能である、蛍光レポーター部分が結合したレポーター鎖、及び（ｂ）該レポーター鎖にハイブリダイズすることが可能であり、前記蛍光レポーター部分の蛍光を消光するクエンチャー部分を有するクエンチャー鎖を含む核酸レポーターの組合せを供給する工程と、
（ｉｉ）前記生成物混合物を変性条件及び続く再ハイブリダイゼーション条件に供する工程と、
（ｉｉｉ）前記蛍光レポーター部分の存在を検出する工程と、
によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記二本鎖核酸分子が図８に示す塩基配列を有し、
前記第１のプライマーが塩基配列：
５’−ＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＣ−３’を有し、
前記第２のプライマーが塩基配列：
５’−ＣＣＣＧＧＴＡＣＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣ−３’を有し、
前記レポーター鎖が塩基配列：
５’−ＣＹ５ＧＣＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧ−３’を有し、
前記クエンチャー鎖が塩基配列：
５’−ＡＧＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＣ−３’を有する、
ナイセリア・ゴノレア中の核酸配列の増幅のための請求項８〜１５のいずれか一項に直接的又は間接的に従属する場合の請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生体サンプル中の標的核酸配列の有無を決定する方法であって、
（ａ）前記標的核酸が前記生体サンプル中に存在する場合、誘導体サンプル中で、互いにハイブリダイズした第１及び第２の核酸鎖を含み、該第１の鎖が、前記生体サンプル中の標的核酸配列の存在の確認のための第１の核酸配列を組み込み、その５’末端から離れて、分解に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第１の５’末端領域を有する二本鎖核酸分子が生成するような条件下で、前記生体サンプルを処理して、該生体サンプルから誘導体サンプルを作製する工程と、
（ｂ）
（ｉ）二本鎖核酸分子の鎖の５’末端から３’末端に向かう分解を行うことが可能なエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉ）鎖置換ポリメラーゼと、
（ｉｉｉ）前記誘導体サンプルと、
（ｉｖ）前記誘導体サンプル中に存在する場合に前記第１の核酸の前記第１の末端領域と同じヌクレオチド配列を有し、同じ耐分解性領域を組み込む第１の核酸プライマーと、
（ｖ）必要に応じて、前記増幅すべき第１の核酸配列の増幅をもたらすヌクレオチドと、
を含む、増幅組成物を調製する工程と、
（ｃ）前記生成物混合物中の前記第１の核酸の存在について分析する工程と、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記第１の鎖の５’末端及び前記第２の鎖の３’末端が共に前記二本鎖核酸分子の平滑末端をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の鎖の５’末端が５’リン酸基を有し、前記エキソヌクレアーゼが、前記増幅混合物中で、リン酸（ＰＯ4）基をその５’末端に有する二本鎖核酸分子の鎖を、該鎖の５’末端からその３’末端に向かって選択的に分解するエキソヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記エキソヌクレアーゼがλ−エキソヌクレアーゼである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の末端領域及び前記第１のプライマーの前記耐分解性領域が各々、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の末端領域及び前記第１のプライマーの前記耐分解性領域が各々、複数のホスホロチオエートヌクレオチドの連続配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
第１の末端領域の前記耐分解性領域が、その末端の間にあり、それに応じて、前記第１のプライマーの耐分解性領域が、その末端の間にある、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の核酸鎖が、その５’末端から離れて、（ｉ）として規定されるエキソヌクレアーゼによる分解（前記方法の条件下での）に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第２の５’末端領域を有し、前記増幅混合物が、該第２の核酸鎖の該第２の末端領域と同一の第２のプライマーを組み込む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記二本鎖核酸分子が平滑末端を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１及び第２の鎖の各々の５’末端が５’リン酸基を有し、前記エキソヌクレアーゼが、前記増幅混合物中で、リン酸（ＰＯ4）基をその５’末端に有する二本鎖核酸分子の鎖を、該鎖の５’末端からその３’末端に向かって選択的に分解するエキソヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記エキソヌクレアーゼがλ−エキソヌクレアーゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の末端領域、前記第１のプライマー、前記第２の末端領域及び前記第２のプライマーの前記耐分解性領域が各々、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の末端領域、前記第１のプライマー、前記第２の末端領域及び前記第２のプライマーの前記耐分解性領域が各々、複数のホスホロチオエートヌクレオチドの連続配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の末端領域及び前記第２の末端領域の前記耐分解性領域が、その末端の間にあり、それに応じて、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーの前記耐分解性領域が、その末端の間にある、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
検出が、
（ｉ）前記生成物混合物中に、（ａ）検出すべき増幅された核酸配列にハイブリダイズすることが可能である、蛍光レポーター部分が結合したレポーター鎖、及び（ｂ）該レポーター鎖にハイブリダイズし、前記蛍光レポーター部分の蛍光を消光するクエンチャー部分を有するクエンチャー鎖を含む核酸レポーター構築物を供給する工程と、
（ｉｉ）前記生成物混合物を変性条件及び続く再ハイブリダイゼーション条件に供する工程と、
（ｉｉｉ）前記蛍光レポーター部分の存在を検出する工程と、
によって行われる、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記二本鎖核酸分子が存在する場合に図８に示す塩基配列を有し、
前記第１のプライマーが塩基配列：
５’−ＧＡＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＣ−３’を有し、
前記第２のプライマーが塩基配列：
５’−ＣＣＣＧＧＴＡＣＧＴＴＣＣＧＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣ−３’を有し、
前記レポーター鎖が塩基配列：
５’−ＣＹ５ＧＣＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧ−３’を有し、
前記クエンチャー鎖が塩基配列：
５’−ＡＧＡＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＧＡＣＴＴＧＣ−３’を有する、
淋菌中の核酸配列の検出のための請求項２５〜３１のいずれか一項に直接的又は間接的に従属する場合の請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
分析すべきサンプル中の核酸を検出する方法であって、
（ｉ）前記サンプル中に、（ａ）検出すべき核酸配列にハイブリダイズすることが可能である、蛍光レポーター部分が結合したレポーター鎖、及び（ｂ）該レポーター鎖にハイブリダイズすることが可能であり、前記蛍光レポーター部分の蛍光を消光するクエンチャー部分を有するクエンチャー鎖を含む核酸レポーターの組合せを供給する工程と、
（ｉｉ）前記混合物を変性条件及び続く再ハイブリダイゼーション条件に供する工程と、
（ｉｉｉ）前記蛍光レポーター部分の存在を検出する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅に関し、特に（必ずしも限定するものではないが）医療診断法を目的とした検出のための増幅された量の特定の標的配列の作製に適用される。
【背景技術】
【０００２】
多くの医学的状態が特定のヌクレオチド配列を有する核酸の存在（患者の身体内での）を特徴とする。この核酸配列は例えば、患者の身体に「侵入し」、患者における病気の原因となる病原性の細菌、ウイルス又は他の微生物中に存在する核酸配列であり得る。そのような多くの場合、患者の身体における微生物の存在は、患者に由来する組織、血液、尿、痰等のサンプルを、微生物を特徴付ける核酸配列の存在（サンプル中での）について分析することによって診断することができる。しかしながら、多くの場合、サンプル中の特徴となる核酸配列の量は、ごく僅かであり、検出限界未満である。そのため、検出を目的として特徴的な配列（又はその特徴的な変異体、例えば特徴となるｒＲＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列）の量を増やすために増幅法が用いられる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様によれば、核酸配列を増幅する方法であって、
（ａ）
（ｉ）二本鎖核酸分子の鎖の５’末端から３’末端に向かう分解を行うことが可能なエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉ）鎖置換ポリメラーゼと、
（ｉｉｉ）互いにハイブリダイズした第１及び第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸分子であって、該第１の鎖が増幅すべき第１の核酸配列を組み込み、その５’末端から離れて、（ｉ）として規定されるエキソヌクレアーゼによる分解（該方法の条件下での）に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第１の５’末端領域を有する、二本鎖核酸分子と、
（ｉｖ）第１の核酸の上記第１の末端領域と同じヌクレオチド配列を有し、同じ耐分解性領域を組み込む第１の核酸プライマーと、
（ｖ）必要に応じて、増幅すべき第１の核酸配列の増幅をもたらすヌクレオチドと、
を含む増幅混合物を準備することと、
（ｂ）分解、エキソヌクレアーゼ分解及び鎖置換重合を可能にする条件下で増幅反応を行い、それにより増幅された量の上記第１の核酸配列を含む生成物混合物を作製することと、
を含む、方法が提供される。
【０００４】
本発明の第１の態様の増幅方法は、多数の特徴の組合せに基づく。特に、該方法は、（ａ）その５’末端から離れた耐分解性領域を有する第１の核酸プライマーと、（ｂ）互いにハイブリダイズした第１及び第２の核酸鎖を含み、第１の鎖が増幅すべき核酸配列を組み込む二本鎖核酸との相互に関連する組合せを利用する。この組合せは、第１の核酸鎖が、その５’末端から伸びた、耐分解性配列を含む第１のプライマーと同じヌクレオチド配列を有する５’末端領域を有するようなものである。
【０００５】
増幅方法では、エキソヌクレアーゼが第１の鎖の５’末端領域を、鎖の５’末端領域中の耐分解性領域まで（耐分解性領域の内部までではない）分解する。結果として、第２の鎖の３’末端が露出し、第２の鎖の３’末端にハイブリダイズして、第１の鎖の５’末端領域の未分解部分を置換する第１のプライマーのハイブリダイゼーションのための部位をもたらす。次いで、第１のプライマーが鎖置換ポリメラーゼの作用により伸長し、第１の鎖のコピーが生じる。次いで、新たに合成された第１の鎖の５’末端領域を分解させる（エキソヌクレアーゼによって）ことができ、記載のプロセスが実質的に繰り返される。
【０００６】
本発明の増幅方法は等温条件下、例えば４５℃〜５５℃の温度で行われるものであるのが好ましい。そのため、鎖置換ポリメラーゼは、鋳型鎖を等温条件下でコピーすることが可能なものである。同様に、エキソヌクレアーゼは、好ましい等温条件下で分解を行うことが可能なものである。本発明に使用される好ましい鎖置換ポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたものである。鎖置換ポリメラーゼは、Ｂｓｔ系のものであり得るが、下記で論考するような他の可能性もある。エキソヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の平滑末端を認識するものであるのが好ましい。エキソヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を５’−３’方向に、二本鎖構造の末端の構成について以下の選好順位、すなわち５’陥凹（recessed）＞平滑＞＞５’オーバーハングで、ヒドロキシル化末端よりもリン酸化末端を１０倍選好して徐々に分解するλ−エキソヌクレアーゼであることが特に好ましい。
【０００７】
本発明の一実施の形態では、二本鎖核酸分子の第２の鎖は、耐分解性領域を有しないという点で「正常」であってもよい。この実施の形態に従うプロセスを、下記に図１を参照してより詳細に説明する。本発明のこの実施の形態では、第１の鎖の５’末端及び第２の鎖の３’末端が共に二本鎖核酸分子の平滑末端をもたらすことが好ましい。さらに、第１の鎖の５’末端が５’リン酸基を有し、エキソヌクレアーゼが増幅混合物中で５’末端にリン酸（ＰＯ4）基を有する二本鎖核酸分子の鎖を選択的に分解するものであり、分解が鎖の５’末端からその３’末端に向かい、第２の鎖の３’末端をそれに対するプライマーのハイブリダイゼーションのために遊離させることが好ましい。かかる実施の形態では、エキソヌクレアーゼがλ−エキソヌクレアーゼであることが好ましい。
【０００８】
本発明の更なる実施の形態では、上記方法は、その５’末端から離れた耐分解性領域を有する（第１のプライマーと同様）第２の核酸プライマーを利用する。さらに、この実施の形態では、第２の鎖は、第２のプライマーと同じヌクレオチド配列（耐分解性配列を含む）を有する、その５’末端から伸びる５’末端領域を有する。この実施の形態を下記に図面の図３を参照してより詳細に説明する。本実施の形態では、二本鎖核酸分子が平滑末端を有することが好ましい。また、第１及び第２の鎖の各々の５’末端が５’リン酸基を有し、エキソヌクレアーゼが、増幅混合物中で、リン酸（ＰＯ4）基をその５’末端に有する二本鎖核酸分子の鎖を、該鎖の５’末端からその３’末端に向かって選択的に分解するエキソヌクレアーゼであるのが好ましい。エキソヌクレアーゼがλ−エキソヌクレアーゼであるのが好ましい。
【０００９】
本発明の全ての実施の形態について、増幅すべき配列（複数の場合もある）を含有する二本鎖ＤＮＡ分子は、対象の配列を含有する天然の核酸鎖から合成することができる。天然の鎖は例えば、細菌又はウイルス中に存在するものであり得る。天然の鎖は例えば、ｒＲＮＡ鎖であってもよい。本発明の方法に使用される二本鎖核酸構築物をｒＲＮＡ鎖から得る手順を、下記に図面の図５を参照して説明する。代替的には、天然の鎖はＤＮＡ鎖であってもよい。この場合、本発明の方法に従って増幅される二本鎖核酸分子は、変性させたゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡに由来し得る（例えば、図６に関連する下記の説明を参照されたい）。
【００１０】
本発明の全ての実施の形態について、第１のプライマー（利用される場合には第２のプライマーも）は、２０個〜３０個のヌクレオチドを含むことが好ましい。それに応じて、第１の鎖の５’末端領域（利用される場合には第２の鎖の５’末端領域も）は、２０ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００１１】
第１のプライマー（利用される場合には第２のプライマーも）の耐分解性領域は、プライマーの長さのほぼ中間に設けられるのが好ましい。このため、プライマーが２０個のヌクレオチドを含む場合、耐分解性領域は、プライマーの５’末端から約８ヌクレオチド〜１０ヌクレオチドで開始するのが好ましい。プライマーが３０個のヌクレオチドを含む場合、耐分解性領域は、５’末端から約１３ヌクレオチド〜１５ヌクレオチドで開始するのが好ましい。
【００１２】
耐分解性領域は、エキソヌクレアーゼによる分解に耐性を示す少なくとも１つのヌクレオチドによってもたらされ得る。耐分解性領域は、複数（例えば、３個〜６個）の修飾ヌクレオチドの連続配列を含むのが好ましい。修飾ヌクレオチドは例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド（すなわち、非架橋酸素原子が硫黄に置換されたヌクレオチド）であり得る。
【００１３】
前述のように、耐分解性領域（例えば、３個〜６個の修飾ヌクレオチドの連続配列を含む）は、１’プライマー（利用される場合には２’も）のほぼ中間に存在することが好ましい。このような場合、鎖置換ポリメラーゼが３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたものであることが特に好ましい。しかしながら、耐分解性領域がプライマーの３’末端にまで及ぶ可能性は排除されず、この場合、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鎖置換ポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９）の使用を採用することができる。
【００１４】
本発明の方法に従って作製された増幅配列は例えば、鎖１本当たり５０塩基〜１５０塩基の長さを有し得る。
【００１５】
本発明の方法は、増幅配列を検出する工程を更に含み得る。本発明の好ましい実施の形態では、検出が、
（ｉ）生成物混合物中に、（ａ）検出すべき増幅された核酸配列にハイブリダイズすることが可能である、蛍光レポーター部分が結合したレポーター鎖、及び（ｂ）該レポーター鎖にハイブリダイズすることが可能であり、蛍光レポーター部分の蛍光を消光するクエンチャー部分を有するクエンチャー鎖を含む核酸レポーターの組合せを供給する工程と、
（ｉｉ）生成物混合物を変性条件及び続く再ハイブリダイゼーション条件に供する工程と、
（ｉｉｉ）蛍光レポーター部分の存在を検出する工程と、
によって行われる。
【００１６】
この検出方法の工程２（ｉｉ）では、生成物混合物を変性条件及び続く再ハイブリダイゼーション条件に連続して供する。変性条件下で、レポーター鎖及びクエンチャー鎖は、生成物混合物中の別個の鎖である。再ハイブリダイゼーション条件下で、レポーター鎖は、クエンチャー鎖ではなく、増幅核酸配列にハイブリダイズすることが可能である。このため、再ハイブリダイゼーション工程後の蛍光により増幅配列の存在が確認される。概して、クエンチャー鎖は、レポーター鎖と比較してモル過剰で存在する。クエンチャー鎖とレポーター鎖とのモル比は、例えば（１．３〜１．５）：１であり得る。この検出方法の実施の形態を図７と併せて下記により十分に説明する。
【００１７】
本発明の方法は、決して限定するものではないが、特に生体サンプル、例えば組織、血液、尿、痰等における特定の標的核酸配列の存在の確認に適用可能である。標的核酸は例えば、組織サンプル中に存在し、患者の病気の原因となる病原性の細菌に存在するものであり得る。上記に概説し、下記により詳細に説明するように、サンプルから抽出したｒＲＮＡは、互いにハイブリダイズした第１及び第２の核酸鎖を含み、該第１の鎖が生体サンプル中の標的核酸配列の存在の確認のための第１の核酸配列を組み込み、その５’末端から離れて、分解に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第１の５’末端領域を有するｃＤＮＡの作製に用いることができる。次いで、ｃＤＮＡを、上記により十分に説明した手順を用いて増幅することができる。
【００１８】
これにより、生体サンプル中の標的核酸配列の有無を決定する方法であって、
（ａ）標的核酸が生体サンプル中に存在する場合、誘導体サンプル中で、互いにハイブリダイズした第１及び第２の核酸鎖を含み、該第１の鎖が、生体サンプル中の標的核酸配列の存在の確認のための第１の核酸配列を組み込み、その５’末端から離れて、分解に耐性を示すヌクレオチド配列を有する第１の５’末端領域を有する二本鎖核酸分子が生成するような条件下で、生体サンプルを処理して、該生体サンプルから誘導体サンプルを作製する工程と、
（ｂ）
（ｉ）二本鎖核酸分子の鎖の５’末端から３’末端に向かう分解を行うことが可能なエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉ）鎖置換ポリメラーゼと、
（ｉｉｉ）誘導体サンプルと、
（ｉｖ）誘導体サンプル中に存在する場合に第１の核酸の上記第１の末端領域と同じヌクレオチド配列を有し、同じ耐分解性領域を組み込む第１の核酸プライマーと、
（ｖ）必要に応じて、増幅すべき第１の核酸配列の増幅をもたらすヌクレオチドと、
を含む、増幅組成物を調製する工程と、
（ｃ）生成物混合物中の第１の核酸の存在について分析する工程と、
を含む、方法が提供される第２の態様が導かれる。
【００１９】
上記の本発明の第１の態様の全ての特徴が、変更すべき点を変更して本発明の第２の態様の方法にも当てはまる。
【００２０】
誘導体サンプルは例えば、生体サンプルから抽出されたｒＲＮＡから調製したｃＤＮＡを含み得る。
【００２１】
ここで、ほんの一例として添付の図面を参照して本発明を更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に従う増幅方法の基本概念を説明するための該方法の一実施形態を概略的に示す図である。
【図２】図１の方法に使用されるプライマーを概略的に示す図である。
【図３ａ】本発明に従う増幅方法の更なる実施形態を示す図である。
【図３ｂ】本発明に従う増幅方法の更なる実施形態を示す図である。
【図３ｃ】本発明に従う増幅方法の更なる実施形態を示す図である。
【図４】図３に示す方法に使用されるフォワードプライマー及びリバースプライマーを概略的に示す図である。
【図５】図３に図示される手順に従う増幅のためのｒＲＮＡからの二本鎖核酸分子の作製を示す図である。
【図６】図３に図示される手順に従う増幅のためのゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ分子の作製を示す図である。
【図７】核酸分子を検出する手順の一実施形態を示す図である。
【図８】実施例１の手順に従って合成された二本鎖ＤＮＡ分子の配列を示す図である。
【図９】実施例１の結果を示す図である。
【図１０】実施例２の結果を示す図である。
【図１１】実施例３の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
初めに、本発明の一実施形態に適用される、本発明に従う増幅方法の基本概念を説明する働きをする図１を参照する。センス鎖２及びアンチセンス鎖３をそれぞれ有する二本鎖ＤＮＡ分子１を図１に示す。図１に示す方法のために、センス鎖２に増幅すべき配列を組み込む。図１の方法は、この配列の線形増幅のためのものである。
【００２４】
図１に示されるように、センス鎖２及びアンチセンス鎖３は互いにハイブリダイズし、長さが等しいため、核酸分子１は平滑末端を有する。説明のために、センス鎖２は、４として参照される５’末端領域を有すると考える。この末端領域４は、センス鎖２の５’末端から線５によって表される点（重要性が後の説明から理解される位置）にまで及ぶ。末端領域は例えば、１０ヌクレオチド長〜１５ヌクレオチド長であり得る。センス鎖２は５’末端が、図１に明らかに図示されるリン酸基（ＰＯ4）によって示されるように、リン酸化されている。その末端の間に、センス鎖２の５’末端領域４は、線６によって表される耐分解性領域を有する。この耐分解性領域６は、ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド（すなわち、非架橋酸素原子の１つが硫黄原子で置換されたヌクレオチド）を含み得る。耐分解性領域６は単一の線のみによって表されるが、概して、幾つかの（例えば、３つの）連続した修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド）を含む。耐分解性領域６は、末端領域４のほぼ中間に位置し得る。
【００２５】
次にアンチセンス鎖３を見てみると、アンチセンス鎖３は、耐分解性領域を有しない「単純な」鎖である。付加的に、アンチセンス鎖３の５’末端は、（センス鎖２の場合と同様にリン酸化されるのではなく）ヒドロキシル化されている。
【００２６】
ここで、図１の方法に使用されるプライマー１０を示す図２を参照する。プライマー１０は、センス鎖２の５’末端領域４と同じ長さであり、同一の配列を有する。したがって、プライマー１０は、５’末端にリン酸基（ＰＯ4）を有し、その末端の間に同じ耐分解性領域を有する。便宜上、プライマー１０の耐分解性領域は、参照符号６（すなわち、センス鎖２の耐分解性領域を識別するのと同じ参照符号）によって表される。このため、要約すると、プライマー１０は、センス鎖２の５’末端領域と実質的に同一である。
【００２７】
図１の方法を行うために、二本鎖核酸分子１、プライマー１０、ｄＮＴＰ、λ−エキソヌクレアーゼ、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、ＢＳＴ  ３．０）、及び必要に応じてバッファーを含む増幅混合物を調製する。
【００２８】
反応の最初の工程では、λ−エキソヌクレアーゼは、センス鎖２の５’末端領域４を耐分解性領域６まで（これを越えない）分解する。これは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を５’−３’方向に、二本鎖構造の末端の構成について以下の選好順位、すなわち５’陥凹＞平滑＞＞５’オーバーハングで、ヒドロキシル化末端よりもリン酸化末端を１０倍選好して分解するλ−エキソヌクレアーゼの「能力」による。しかしながら、λ−エキソヌクレアーゼは、その耐分解性領域６を越えたセンス鎖２の分解を行うことができない。便宜上、部分的に分解されたセンス鎖は、参照符号２ｄによって表される。この分解により、アンチセンス鎖３が、その３’末端からセンス鎖２の現在分解されている部分がそれまでハイブリダイズしていた領域にわたって一本鎖となる。これは図１の工程（ｉｉ）に明らかに示される。参照符号１２によりアンチセンス鎖３の遊離（すなわち、一本鎖）３’末端領域を図示する、アンチセンス鎖３の左側の端を参照されたい。
【００２９】
アンチセンス鎖３の遊離３’末端領域は、プライマー１０のハイブリダイゼーション（図１の工程（ｉｉｉ）を参照されたい）のための標的をもたらすオーバーハング１２を形成する。鎖置換ポリメラーゼは、ハイブリダイズしたプライマー１０を伸長させ、新たなセンス鎖２を形成し（アンチセンス鎖３を鋳型として用いる）、それにより部分的に分解されたセンス鎖２ｄを置換し、アンチセンス鎖３にハイブリダイズした完全長の新たなセンス鎖２を再生する（図１の工程（ｉｖ）を参照されたい）。
【００３０】
図１の工程（ｉｖ）の結果として図示される二本鎖分子１が工程（ｉ）に示されるものと同一であることが、（プライマー１０が図１の工程（ｉ）に示されるセンス鎖２の末端領域４と全く同じ配列（及び長さ）を有することから）理解される。したがって、図１の工程（ｉｖ）の生成物は、工程（ｉ）に効果的に再利用され、この方法が連続的に繰り返すことで、付加的な置換鎖２ｄが得られ、これによりセンス鎖２の配列の増幅が起こる。
【００３１】
簡略化を目的として、次の工程が開始する前に各工程が「完了する」段階的機構を図１に示す。このため、例えば、工程（ｉｉｉ）から工程（ｉｖ）に進む際に、工程（ｉｖ）において新たに形成された二本鎖核酸分子１がλ−エキソヌクレアーゼにより少しでも分解を受ける前に、新たなセンス鎖２を形成するプライマー１０の伸長が完了することが図１に示される。しかしながら、プライマー１０が完全には伸長されず、完全なセンス鎖２が生じずに、新たに形成される鎖２の分解（λ−エキソヌクレアーゼによる）が始まる可能性は排除されない。
【００３２】
標的分子がもはや完全に二本鎖ではないため、陥凹５’末端鎖がアンチセンス鎖から解離し、元のλ−エキソヌクレアーゼによる遊離配列よりも長いアンチセンス配列が遊離する可能性もある。証明することはできないが、酵素標的が完全には二本鎖でないことを考えると、本発明の方法の反応を理論的には更なる解離を誘導し得る比較的高温（例えば４５℃〜５５℃）で行うことができると推定することができる。
【００３３】
ここで、本発明に従う増幅方法の第２の実施形態を説明する図３を参照する。図３の方法は、指数関数的増幅をもたらす。便宜上、図３は、本発明の説明を容易にするために図３（ａ）、図３（ｂ）及び図３（ｃ）に分けられる。初めに図３（ａ）を参照すると、ハイブリダイズしたセンス鎖１０２及びアンチセンス鎖１０３のそれぞれから構成される二本鎖核酸分子１０１が示される。上記に図１を参照して説明した二本鎖核酸分子１の場合と同様、核酸分子１０１のセンス鎖及びアンチセンス鎖は同じ長さであり、分子１０１は平滑末端を有する。センス鎖１０２は、センス鎖１０２のリン酸化５’末端から線１０５によって図示される点にまで及ぶ５’末端領域１０４を有するという点でセンス鎖２（核酸分子１の）と同様である。その末端の間に（そのほぼ中間に）、５’末端領域１０４は修飾オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートヌクレオチドから形成される耐分解性領域１０６を有する。
【００３４】
核酸分子１０１は、（図３ａに図示されるように）アンチセンス鎖１０３が鎖１０３の５’末端（リン酸基（ＰＯ4）が存在する）から線１０８によって表される位置にまで及ぶ５’末端領域１０７を有するという点で核酸分子１とは区別される。その末端の間に、５’末端領域１０７（アンチセンス鎖１０３の）は、線１０９によって図示される耐分解性領域を有する。この耐分解性領域は、（他の耐分解性領域について記載されるように）修飾オリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【００３５】
図３の反応は、図４に図示されるようにプライマー１１０及び１１１を用いて行われる。プライマー１１０は、センス鎖１０２の５’末端領域１０４の配列に対応する配列を有し、プライマー１１１は、アンチセンス鎖１０３の５’末端領域１０７の配列に対応する配列を有する。そのため、プライマー１１０及び１１１の両方が（それらの末端の間に）参照符号１０６及び１０９のそれぞれによって識別される（図４中で）耐分解性領域を有する。
【００３６】
図３の反応を行うために、二本鎖核酸分子１０１、プライマー１１０及び１１１、λ−エキソヌクレアーゼ、鎖置換ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、並びに必要に応じてバッファーを含む増幅混合物を調製する。反応は、鎖１０２及び１０３をそれぞれ、その５’末端から耐分解性領域１０６及び１０９まで（これを越えない）部分的に分解し、１０２ｄ及び１０３ｄとして参照される部分的に分解された鎖を生じるλ−エキソヌクレアーゼによって進行する。この作用により、センス鎖及びアンチセンス鎖の遊離３’末端がそれぞれオーバーハング１１３及び１１２を形成する二本鎖分子が得られる。
【００３７】
この方法の次の工程では、プライマー１１０がオーバーハング１１２にハイブリダイズし、プライマー１１１がオーバーハング１１３にハイブリダイズする。鎖置換ポリメラーゼによるハイブリダイズしたプライマー１１０及び１１１の伸長により、１１４及び１１５として参照される２つの二本鎖分子が作製される。二本鎖生成物１１４は、プライマー１１１の伸長によって生成する新たな鎖１１６にハイブリダイズしたセンス鎖１０２の残余１０２ｄを含む。ボックス６の生成物は、プライマー１１０から生成する新たな鎖１１７にハイブリダイズしたアンチセンス鎖１０３の残余１０３ｄを含む。
【００３８】
二本鎖核酸分子１１４の更なるプロセシングを図３ｂに示し、二本鎖分子１１７の更なるプロセシングを図３ｃに示す。
【００３９】
初めに図３ｂを参照すると、鎖１１６がその５’末端からλ−エキソヌクレアーゼによる分解を受け、鎖１１６の残基が１１６ｄとして図示され、鎖１０２ｄの３’末端が、プライマー１１１がハイブリダイズすることが可能なオーバーハング１１８を形成した生成物が得られる。
【００４０】
プライマー１１１は、ここで鎖１１６ｄの同時置換により伸長する。この段階の２つの生成物が存在する。一方は二本鎖分子１１４（鎖１０２ｄを鋳型として用いたプライマー１１１の伸長によって生成する）である。この二本鎖分子はここで、矢印１１９によって図示されるように、図３ｂのプロセスにおいて効果的に再利用される。反応のもう一方の生成物は置換鎖１１６ｄであり、これがここでプライマー１１０にハイブリダイズする。続いて、プライマー１１０が鎖１１６ｄを鋳型として用いて伸長する。この伸長は、図３ｂに見られるように左から右へのものである。また、鎖１１６ｄがプライマー１１０を鋳型として用いて伸長する（図３ｂにおいて右から左に）。生じる生成物は、１２１（プライマー１１０の伸長によって形成される）及び１２２（鎖１１６ｄの伸長によって形成される）から構成されるものとして示される、ハイブリダイズした鎖１２０として図示される二本鎖分子である。
【００４１】
次いで、二本鎖分子１２０の鎖１２１が、その５’末端から耐分解性領域１０６まで（これを越えない）の分解（λ−エキソヌクレアーゼの作用による）を受けて鎖１２１ｄを生じ、鎖１２２の３’末端がオーバーハング１２３として露出する。図３ｂに図示されるように、プライマー１１０は、オーバーハング１２３にハイブリダイズし、鎖１２１ｄの置換により鎖１２２を鋳型として用いて伸長することが可能である。この工程の生成物は、第一に二本鎖分子１２０、及び置換鎖１２１ｄである。前者（すなわち、二本鎖分子１２０）は、矢印１２４によって図示されるように効果的に再利用され、後者（すなわち、鎖１２１ｄ）は、（下記のように）図３ｃに示すスキームの一部に導かれる矢印１２５を伴って示される。図３ｂの反応スキームに導入される鎖１１６ｄ（図３ｃに示すスキームにおいても生じる；下記を参照されたい）を図示することを意図した矢印１２６も図３ｂに示される。増幅プロセスのこの態様の更なる説明を下記に示す。
【００４２】
ここで、図３ｂの反応スキームとの関連で上記に十分に説明した二本鎖分子１１４のプロセシングの方法での二本鎖分子１１５（図３ａを参照されたい）のプロセシングを実質的に説明する図３ｃを参照する。
【００４３】
これにより、鎖１１７は、その５’末端からλ−エキソヌクレアーゼによる分解を受け、図３ｂとの関連で上記に説明した鎖１２１ｄと同一の部分的に分解された鎖を生じる。生じる二本鎖生成物は、鎖１０３ｄにハイブリダイズした鎖１２１ｄを含み、鎖１０３ｄは、プライマー１１０がハイブリダイズすることが可能なオーバーハング１３０を有する。
【００４４】
プライマー１１０は、ここで鎖１２１ｄの同時置換により伸長する。この段階の２つの生成物が存在する。一方は二本鎖分子１１５（鎖１０３ｄを鋳型として用いたプライマー１１０の伸長によって生成する）である。この二本鎖分子はここで、矢印１３１によって図示されるように、図３ｃのプロセスにおいて効果的に再利用される。反応のもう一方の生成物は置換鎖１２１ｄであり、これがここでプライマー１１１にハイブリダイズする。続いて、プライマー１１１が鎖１２１ｄを鋳型として用いて伸長する。この伸長は、図３ｃに見られるように右から左へのものである。また、鎖１２１ｄがプライマー１１１を鋳型として用いて伸長する（図３ｃにおいて左から右に）。生じる生成物は、１３３（プライマー１１１の伸長によって形成される）及び１３４（鎖１２１ｄの伸長によって形成される）から構成されるものとして示される、ハイブリダイズした鎖１３２として図示される二本鎖分子である。
【００４５】
次いで、二本鎖分子１３２の鎖１３３が、その５’末端から耐分解性領域１０９まで（これを越えない）の分解（λ−エキソヌクレアーゼの作用による）を受け、図３ｂ（上記を参照されたい）において生じる鎖１１６ｄと同一の部分的に分解された鎖を生じ、鎖１３４の３’末端がオーバーハング１３５として露出する。図３ｃに図示されるように、プライマー１１１は、オーバーハング１３５にハイブリダイズし、鎖１１６ｄの置換により鎖１３４を鋳型として用いて伸長することが可能である。この工程の生成物は、第一に二本鎖分子１３２、及び置換鎖１１６ｄである。前者（すなわち、二本鎖分子１３２）は、矢印１３６によって図示されるように効果的に再利用され、後者（すなわち、鎖１１６ｄ）は、（下記のように）図３ｂに示すスキームの一部に導かれる矢印１２６を伴って示される。図３ｃの反応スキームに導入される鎖１２１ｄ（図３ｂに示すスキームにおいて生じる）を図示することを意図した矢印１２５も図３ｃに示される。増幅プロセスのこの態様の更なる説明を下記に示す。
【００４６】
上記の説明から、図３ｂの手順により一本鎖分子１２１ｄが生成し、これが図３ｃの反応スキームにおいても生成することが理解される。このため、図３ｂには、矢印１２５によって図示されるように図３ｃの反応スキームに「送られる」一本鎖分子１２１ｄが示される。同様に、図３ｃでは、図３ｂの反応スキームにおいても生成する一本鎖分子１１６ｄが作製される。このため、図３ｃでは、矢印１２６によって図示されるように図３ｂの反応スキームに「送られる」一本鎖分子１１６ｄが示される。
【００４７】
図３ａ〜図３ｃを参照して説明した全手順が、増幅された核酸生成物（サンプル中に存在する元の核酸１０１の量と比較して）をもたらす。
【００４８】
ここで、ｒＲＮＡ鎖３０１から図３（ａ）に示すタイプの二本鎖核酸分子１０１を作製する手順の一実施形態を示す図５を参照する。図５のボックス１に示されるように、示される反応は、プライマー１１０及び１１１（図３（ａ）及び図４を参照されたい）によって行われる。プライマー１１１は、ｒＲＮＡ鎖３０１にハイブリダイズすることが可能であり、プライマー１１０は、ｒＲＮＡ鎖３０１から生じるｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる。ｃＤＮＡを作製するための反応混合物には、ＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写（ＲＴ）酵素、更にはｄＮＴＰ、及び必要に応じてバッファーが組み込まれる。反応は、熱サイクル条件下で行われる。
【００４９】
上記方法では、プライマー１１１がＲＮＡ鎖３０１にハイブリダイズし、ＲＴ酵素が相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）３０２をプライマー１１１の伸長によって合成する（図５のボックス２及び３を参照されたい）。ＲＴ酵素がＲＮＡ鋳型鎖３０１の末端に到達すると、ＲＴ酵素の方向が逆になり（矢印３０３によって表される）、酵素のＲＮアーゼＨ活性の結果としてｒＲＮＡ鋳型３０１が分解される（ボックス３を参照されたい）。次の工程では、ボックス４に示されるように、プライマー１１０がｃＤＮＡ配列を認識し、それにハイブリダイズする。鎖置換ポリメラーゼによるプライマー１１０の伸長は、ｃＤＮＡ鎖３０２にハイブリダイズした核酸鎖１０２を含む、ボックス５に示される二本鎖構築物３０４をもたらす（図３（ａ）を参照されたい）。二本鎖構築物３０４は、対象のアンプリコン配列＋３’ｃＤＮＡオーバーハング３０５を含む。図３に記載される反応を目的として用いられる２つの酵素（すなわち、λ−エキソヌクレアーゼ、及びＢＳＴ  ３．０等の鎖置換酵素）を、ここで添加する。図３を参照して説明した機構を検討することによって理解されるように、ｃＤＮＡ鎖３０２の５’末端の分解（耐分解性領域１０９の範囲まで）により鎖１０２の遊離３’末端へのプライマー１１１のハイブリダイゼーションが可能となり、プライマー１１１の伸長が、ｃＤＮＡ鎖３０２の置換により二本鎖核酸分子１０１の作製をもたらす（ボックス６を参照されたい）。次いで、合成された核酸構築物１０１が、図３との関連で上記に十分に説明したような方法で増幅を受ける。
【００５０】
１１０等のプライマーがハイブリダイズし、重合したとしても、陥凹しているために（長いｃＤＮＡ鋳型の３’末端オーバーハング）、その５’末端に平滑末端を生じないことから、放出されるｃＤＮＡ鎖がＬＥＡ反応において更なる役割を果たす可能性は低い。
【００５１】
ここで、一本鎖ＤＮＡ３５０（例えば、ゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡの変性によって得られる）から、本発明の増幅手順に使用される二本鎖核酸分子を作製する手順の一実施形態を示す図６を参照する。図６のスキームでは、３つのプライマー３５１、３５２及び３５３（点線、長い一点鎖線及び中破線でそれぞれ図示される）が使用される。長い一点鎖線の一例は、図６中の「プライマー」という語の真下にあり、参照符号３５２で示される。点線の一例は、図６中の「プライマー」という語の下の３つの線の中央に示され、参照符号３５１で示される。図６中の「プライマー」という語の最も下の線は、中破線であり、参照符号３５３で示される。プライマー３５１（点線）及び３５３（中破線）はどちらも、それぞれ長さの途中に耐分解性領域を有する。
【００５２】
２つのリバースプライマー３５１及び３５２（点線及び長い一点鎖線）は、鎖３５０にハイブリダイズし、重合して、それぞれ合成鎖３５４及び３５５（点線及び長い一点鎖線）を生じる。合成鎖３５５（長い一点鎖線）は合成鎖３５４（点線）を置換し、このようにしてプライマー３５３（中破線）の鋳型が伸長して合成鎖３５６を生じ、それにより二本鎖分子３５７が生じる。この二本鎖分子３５７は、合成鎖３５４（点線）のヌクレアーゼ感受性部分を分解するλ−エキソヌクレアーゼの標的となる。これにより鋳型鎖の３’末端の配列３５６（中破線）が遊離することで、プライマー３５１（点線）がハイブリダイズし、重合して、図５の最終工程と同様にアンプリコンが生じる。次いで、このアンプリコンが増幅プロセスに入ることができる。同じ系を、逆転写（ＲＴ）酵素の使用を回避するためにｒＲＮＡ標的にも用いることができる。例えば、ＢＳＴ  ３．０ポリメラーゼが逆転写作用を有することから、２つのリバースプライマー３５１及び３５２をＲＮＡに直接付加することができ、これが続いて２つの鎖を生じることができ、鎖３５５（長い一点鎖線）が鎖３５４（点線）を置換する。したがって、鎖３５４（点線）が置換される場合、これはプライマー３５３（中破線）の鋳型として働くことができる。この場合、ＲＴ酵素のＲＮアーゼＨ活性は、ｃＤＮＡ鎖を遊離させるためのＲＮＡ鋳型の分解にもはや必要とされない。
【００５３】
ここで、図３との関連で上記に説明した方法に従って作製される二本鎖アンプリコンの存在を検出する方法の一実施形態を示す図７を参照する。
【００５４】
図７に、図３の方法によって作製されるアンプリコンが参照符号４０１によって図示され、ハイブリダイズした鎖４０２及び４０３（点線で示される）から構成されるものとして示される。増幅手順の終了時に、互いにハイブリダイズした核酸配列４０５（一点鎖線で示される）及び４０６（実線として示される）から構成される二本鎖核酸レポーター構築物４０４を生成物混合物に添加する。配列４０５及び４０６は、アンプリコン４０１の配列４０２及び４０３のそれぞれにハイブリダイズすることが可能である。
【００５５】
図７に示されるように、配列４０５の５’末端にＣｙ５分子が設けられ、配列４０６の３’末端にＣｙ５レポーターの蛍光を消光するＢＨＱ２分子が設けられる（他の蛍光の消光の組合せが用いられ得ることが理解される）。
【００５６】
図７に示されるように、レポーター構築物４０４は、配列４０５及び４０６のそれぞれの５’末端及び３’末端に設けられる１つの平滑末端を有し、配列４０５の３’末端がオーバーハングを生じる。例としては、配列４０５が５５ｎｔの長さを有し得る一方で、配列４０６は３５ｎｔの長さを有し得る。この配置の利点を下記で論考する。
【００５７】
レポーター構築物４０４を増幅反応の生成物に添加し、混合物を高温（例えば沸点）にして、二本鎖アンプリコン４０１及び二本鎖レポーター構築物４０４の両方を変性させる。次いで、混合物を冷却（例えば室温まで）することで、配列４０５が配列４０２にハイブリダイズすることが可能となり、配列４０６が配列４０３にハイブリダイズすることができる。配列４０２にハイブリダイズした配列４０５を含む二本鎖構築物中では、Ｃｙ５はもはや消光されず、したがって蛍光シグナルを生じ、増幅生成物の存在を確認することができることが理解される。他のハイブリダイゼーション生成物が可能であるが（例えば、配列４０２及び４０３を共に類似性配列４０５及び４０６に再ハイブリダイズすることができる）、配列４０２及び４０５のハイブリダイゼーションが検出目的で重要であることが理解される。
【００５８】
図７に示す検出手順の利点は、２０ｎｔ〜３０ｎｔの認識配列を有する分子指標とは異なり、鎖４０５（レポーター構築物４０４中）によって生じる認識配列を合成的に可能な限り長くすることができることである。図７に示す手順の分子指標に対する更なる利点は、分子指標のループ領域が二重鎖４０４中のように競合オリゴ（すなわち、配列４０６）を有しないことである。これにより系がより正確なものとなる。より具体的には、レポーター配列４０４は、不正確な分析物配列ではなく、正確な分析物配列にハイブリダイズする可能性が熱力学的に高い。これは、レポーター配列４０５（仮定される長さは５５ｎｔ）が、（より短い）鎖４０５（３５ｎｔと仮定される）ではなく、分析物鎖中の同じ長さの配列に選択的にハイブリダイズするためである。３５ｎｔ（配列４０６にハイブリダイズする配列４０５の部分）の代わりにハイブリダイズされる配列４０５の全５５ｎｔのエネルギー必要量は、配列４０６ではなく配列４０５の分析物配列４０２へのハイブリダイゼーションに有利である。一方、標的配列が増幅混合物中に存在しない場合、配列４０５と４０６との間の３５ｎｔの相同性が、非特異的分析物と配列４０６との間の「より緩い結合」の代わりに、これら２つの配列間のハイブリダイゼーションに有利となる。
【００５９】
本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００６０】
全般
本実施例では、本発明に従う手順を用いたナイセリア・ゴノレア（Neisseria Gonorrhoeae：淋菌）（ＮＧ）の検出を実証する。より具体的には、本実施例では、図５に従う手順を用いたＮＧ細胞のｒＲＮＡ抽出物からの二本鎖ＤＮＡ分子の作製、図３に従う手順を用いたＤＮＡ分子の増幅、及び図７に従う手順を用いた検出を実証する。特異度及び感度を説明するために、ＤＮＡ分子の生成、増幅及び検出は全て、エシェリキア・コリ（Escherichia Coli：大腸菌）（ＥＣ）に由来する過剰なｒＲＮＡのバックグラウンドに対して行った。
【００６１】
二本鎖ＤＮＡ分子（ＮＧから抽出されたｒＲＮＡから作製される）は図８に示され、符号６０１によって参照される。図３との比較のために、ＤＮＡ分子６０１の２つの鎖は、１０２（配列番号５）及び１０３として参照される。
【００６２】
表１に、本実施例に使用するオリゴヌクレオチド配列を示す。説明としては、「フォワードプライマー」配列は、図３中のプライマー１１０に対応し、「リバースプライマー」は、図２中のプライマー１１１に対応する。「アッセイレポーター」は、図７中の配列４０５に対応し、「アッセイクエンチャー」は、配列４０６（図７中）に対応する。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
本実施例の目的上、ｒＲＮＡを１００×１０6個のＮＧ細胞（生菌数（total viable count；ＴＶＣ）によって決定される）から英国特許出願公開第１６０９１１５．９号に記載の手順を用いて抽出し、２００μＬの溶出液（溶出バッファー（ＥＢ）:１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を得た。同じ手順を用いて、１００×１０6個のＥＣ細胞（光学密度（ｏｄ）測定によって決定される）の２００μＬの溶出液を得た。
【００６５】
本実施例の目的上、ＮＧ細胞及びＥＣ細胞の両方に由来する全てのｒＲＮＡが溶出液中に回収される（すなわち、１００％の抽出効率）と仮定される。
【００６６】
手順
１×１０6個のＥＣ細胞に由来するＲＮＡを２５０個、５００個、１０００個及び２０００個のＮＧ細胞に由来するＲＮＡと混合し、容量を１００μＬとした。詳細には、１００×１０6個のＥＣ細胞から抽出した２００μＬの溶出液のうち２μＬが、１×１０6個のＥＣ細胞に由来するＲＮＡを含有する（上記の仮定に基づく、すなわち１００％の抽出効率）。ＥＣ溶出液の２μＬアリコートを、２００μＬのＮＧ  ＲＮＡの溶出液の４０００倍、２０００倍、１０００倍及び５００倍希釈の２μＬアリコートと別個に混合した（希釈物は、１００×１０6個のＮＧ細胞出発物質から抽出した、それぞれ２５０個、５００個、１０００個及び２０００個のＮＧ細胞に由来するＲＮＡを含有し、この場合も１００％の抽出効率と仮定される）。最終容量を、最終濃度５０μＭの２つのプライマー（ＦＷ及びＲＶ）の各々、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（２５℃でｐＨ８．８）＋０．３μＬ（４．５Ｕ）のＷａｒｍ  Ｓｔａｒｔ逆転写酵素（New England Biolabs、Ｍ０３８０）を含有するＨ2Ｏ中で１００μＬとした。
【００６７】
一方が２μＬのＥＢ、一方の条件が２μＬのＥＣ  ＲＮＡのみ（１×１０6個のＥＣバックグラウンド対照）による２つの陰性対照条件を含めた。各条件を三連とした。
【００６８】
サンプルを４８℃で１０分間放置し、その後５μＬの酵素混合物（１μＬ（８Ｕ）のＢＳＴ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Ｍ０３７４）＋０．３μＬ（１．５Ｕ）のλ−エキソヌクレアーゼ（New England Biolabs、Ｍ０２６２）＋３．７μＬのＨ2Ｏ）を各サンプルに添加し、最終ミックスを再度４８℃で１０分間放置してインキュベートした。
【００６９】
このインキュベーションの終了後に、１０μＬのアッセイミックス（１５．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７．６ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１１４ｍＭ  ＫＣｌ、０．０７６％Ｔｗｅｅｎ  ２０（２５℃でｐＨ８．８）を含有するＨ2Ｏ中で１０μＬにしたレポーターオリゴ（１μＬ、１０ｐｍｏｌ）＋クエンチャーオリゴ（１．４μＬ、１４ｐｍｏｌ））を各反復試験試料に添加した。最終ミックスを９５℃で５分間インキュベートした後、室温で２分間放置し、黒色ポリカーボネートウェルに移し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）測定を蛍光プレートリーダーで各サンプルについて３回行った。
【００７０】
３回の読取りの値を各反復試験試料について平均し、これらの読み取り平均値を統計分析に用いた。この実験を独立して９回行った。一元配置分散分析を、対応のないスチューデントのｔ検定を用いた事後分散分析と共に一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。非特異的１０6  ＥＣシグナルに対するＮＧ特異的シグナルは、全てのＮＧ力価点について有意である（***ｐ≦０．００１）。データ点は、三連で行った９回の独立実験の平均±ＳＥＭである（図９ａ）。図９ｂにＥＢバックグラウンド蛍光対照を減算した後の全ての平均を示す。
【００７１】
図９ａに、精製ＲＮＡにプロセスを行った３０分後のアッセイ結果を示す。相対蛍光単位（ＲＦＵ）データ点は、三連で行った９回の独立実験の平均±ＳＥＭである。サンプルはＥＢ（陰性バックグラウンド蛍光対照）、１００万個のエシェリキア・コリ（ＥＣ）非特異的細菌に由来するＲＮＡ、並びに２５０個、５００個、１０００個及び２０００個のナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）特異的細菌に由来するＲＮＡを添加した１００万個のＥＣであった。一元配置分散分析を、対応のないスチューデントのｔ検定を用いた事後分散分析と共に一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。ＥＣ非特異的シグナルに対するＮＧ特異的シグナルは、全てのＮＧ力価点について有意である（***ｐ≦０．００１）。
【００７２】
図９ｂに、ＥＢ陰性バックグラウンド対照の平均を他の全サンプルの平均から減算した後の平均の純シグナル（単位ＲＦＵ）を示す。
【００７３】
実施例２
本実施例では、本発明の増幅方法とＰＣＲとの比較を提示する。
【００７４】
１００×１０6個のＮＧ細胞から抽出したｒＲＮＡを含む２００μＬの溶出液を、実施例１に記載のように調製した。
【００７５】
５００万個のＮＧ細胞に相当する１０μＬの抽出物（１００％の抽出効率と仮定する）を、２ＵのＤＮアーゼＩ（New England Biolabs、＃Ｍ０３０３）により１倍ＤＮアーゼＩバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、２５℃でｐＨ７．６）中、３７℃で３０分間処理し、酵素を７５℃で１０分間変性させた。これは、ＰＣＲ結果に影響を及ぼす可能性があるＤＮＡがＲＮＡ抽出物中に全く存在しないことを確実にするためであった（ＰＣＲにより１６Ｓ  ｒＲＮＡから作製されるｃＤＮＡと同様に１６Ｓ遺伝子増幅され得る）。
【００７６】
この場合も１００％の抽出効率を仮定して、ＤＮアーゼＩ処理ＲＮＡ抽出物のアリコートを水で希釈し、１００００００個、２０００００個、１０００００個、５００００個及び２５０００個のＮＧ細胞を代表するサンプルを作製した。次いで、これらのサンプルを、最終濃度５０μＭの２つのプライマー（ＦＷ及びＲＶ；表１を参照されたい）の各々、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（２５℃でｐＨ８．８）＋０．３μＬ（４．５Ｕ）のＷａｒｍ  Ｓｔａｒｔ逆転写酵素（New England Biolabs、Ｍ０３８０）を含有するＨ2Ｏ中で１００μＬの最終容量とした。陰性バックグラウンド蛍光対照サンプルを、ＲＮＡ抽出手順に使用した１μＬの溶出バッファー（ＥＢ）から同様に調製した。
【００７７】
各ｃＤＮＡ含有サンプルの１μＬアリコート、更にはＥＢを下記のように、（ａ）本発明に従う増幅反応及び（ｂ）ＰＣＲによる増幅を目的として使用した。
【００７８】
本発明に従う増幅手順のために、１μＬアリコートを、最終濃度１．２μＭの２つのプライマー（ＦＷ及びＲＶ）の各々、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（２５℃でｐＨ８．８）、８ＵのＢＳＴ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ＋１．５Ｕのλ−エキソヌクレアーゼを含有するＨ2Ｏ中で１００μＬの最終容量とした。したがって、このようにして調製されたサンプルは１００００個、２００００個、１０００個、５００個及び２５０個のＮＧ細胞を代表するものであった。全てのサンプルを二連で調製した（また、試験した）。増幅反応を４８℃で１０分間行い、生成物混合物をアッセイするまで氷上に放置した。
【００７９】
ＰＣＲ反応のために、１μＬのｃＤＮＡ含有サンプル（又はＥＢ対照）を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2（２５℃でｐＨ８．３）、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（New England Biolabs、＃０２７３）、１．２μＭの２つのプライマー（ＦＷ及びＲＶ）の各々、及び０．２ｍＭ  ｄＮＴＰを含有するＨ2Ｏで１００μＬの最終容量まで希釈した。ＰＣＲ増幅プロトコルを各々が各温度３０秒間の９５℃での変性、５７℃でのアニーリング及び６８℃での重合からなる１３サイクルを用いて行った（総記録時間３３分）。生成物混合物をアッセイするまで氷上に放置した。
【００８０】
（ａ）本発明の増幅方法及び（ｂ）ＰＣＲによる増幅を用いて得られた生成物混合物を、上記の実施例１と同様にアッセイした。結果を図１０（ａ）及び図１０（ｂ）に示す。
【００８１】
図１０（ａ）に、（ａ）本発明の方法及び（ｂ）ＰＣＲによる増幅の両方を用いて増幅した様々なサンプル（及びＥＢ対照）の平均総相対蛍光単位（ＲＦＵ）±標準偏差（ＳｔＤｅｖ）を示す。データ点は、２つの増幅手順を用いたアッセイ結果（二連サンプルについて）の平均である。図１０（ｂ）に、ＥＢ陰性対照の平均を全サンプルの平均から減算することによって算出された純ＲＦＵ値を示す。
【００８２】
図１０（ａ）及び図１０（ｂ）の結果から、本発明の増幅方法がＰＣＲ増幅方法に非常によく似た結果をもたらしたことが示される。１００％のＰＣＲ効率を仮定すると、１３サイクルの増幅比は、１対８１９２（２13）である。したがって、本発明の方法は、３３分間のＰＣＲ反応（温度サイクルを必要とした）の後に得られた同様の結果と比較して、１０分間の等温増幅について約１０4の増幅比をもたらした。
【００８３】
実施例３
本実施例では、増幅収率に対するバッファーの影響を実証する。
【００８４】
実施例１に記載の手順を用いて、ＲＮＡ抽出物を実施例１に使用したものと同じ溶出バッファー（ＥＢ）（ｐＨ９）を用いて溶出させた抽出物のペレット（出発物質は、１００×１０6個のナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）研究室培養細胞のペレット）から調製した。
【００８５】
合計１０００個のＮＧ細胞に相当するＥＢ中の２μＬアリコートの溶出液の希釈物又は２μＬのＥＢを、８１．３μＬのＨ2Ｏ又はＥＢ又は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（「ＥＢ  ｐＨ８」）のいずれかに二連で添加した（１００μＬにした容量の残りは、逆転写酵素、及び１００μＬの最終容量まで希釈した場合に２０ｍＭで８．８のｐＨ値をもたらす濃縮フォーマットのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むＬＥＡ構成成分を含むＨ2Ｏとした）。
【００８６】
（したがって、８１．３μＬのＥＢ又は「ＥＢ  ｐＨ８」の添加と共に、追加の８．１３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを反応に添加して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの最終濃度を２８．１３ｍＭとした）。逆転写、増幅及びアッセイは、実施例１と同様に行った（４．５ＵのＷａｒｍ  Ｓｔａｒｔ逆転写酵素、８ＵのＢＳＴ  ３．０  ＤＮＡポリメラーゼ及び１．５Ｕのλ−エキソヌクレアーゼを使用する）。
【００８７】
結果を図１１（ａ）及び図１１（ｂ）に示す。
【００８８】
図１１（ａ）では、データ点は、アンプリコンについての二連でのアッセイ結果の平均±ＳｔＤｅｖである。鋳型は、陰性対照（ＲＮＡを含まない、２μＬのＥＢ  ｐＨ９）及び水、ＥＢ（ｐＨ９）又はＥＢ（ｐＨ８）中で混合した１０００個のナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）研究室培養細胞に由来するＲＮＡとした。ＲＦＵは、相対蛍光単位を意味する。
【００８９】
図１１（ｂ）では、データ点は、ＥＢ陰性対照の平均を全サンプルの平均から減算することによって算出した純ＲＦＵ値であり、ＥＢ（ｐＨ８）が最適なＬＥＡ収率の純ＲＦＵ値をもたらすことが明らかとなり、Ｈ2Ｏ、ＥＢ及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡミックスについての純ＲＦＵ値は、それぞれ１６２６、１７８８及び３２６９であり、ＥＢ  ｐＨ８をＲＮＡ抽出プロトコルにおいて溶出バッファーとして使用することの利点が実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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