(57)【要約】  がんを治療するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連組成物および方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つのＴ細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む阻害セントロメアプロモーター因子１（Ｃｐｆ１）ｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
直接反復ドメインをさらに含む、請求項１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記直接反復ドメインは、１５〜２０ヌクレオチド長である、請求項２に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記直接反復ドメインは、配列番号３７０８〜３７１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２または３に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記標的ドメインは、前記Ｔ細胞発現遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記標的ドメインは、前記Ｔ細胞発現遺伝子のコード領域内にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記コード領域は、前記Ｔ細胞発現遺伝子の初期コード領域である、請求項６に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記標的化ドメインは、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に二本鎖切断を提供するように構成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列、またはこれらとは１以下、２以下、３以下、４以下、もしくは５以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記標的化ドメインは、１５〜２５ヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記標的化ドメインは、２４長である、請求項１１に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡは、ユニモジュラー阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項２０】
（ａ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つのＴ細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第１の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸組成物。
【請求項２１】
前記第１の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子である、請求項２０に記載の核酸組成物。
【請求項２２】
直接反復ドメインをさらに含む、請求項２０または２１に記載の核酸組成物。
【請求項２３】
前記直接反復ドメインは、１５〜２０ヌクレオチド長である、請求項２２に記載の核酸組成物。
【請求項２４】
前記直接反復ドメインは、配列番号３７０８〜３７１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２２または２３に記載の核酸組成物。
【請求項２５】
前記標的ドメインは、前記Ｔ細胞発現遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項２６】
前記標的ドメインは、前記Ｔ細胞発現遺伝子のコード領域内にある、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項２７】
前記コード領域は、前記Ｔ細胞発現遺伝子の初期コード領域である、請求項２６に記載の核酸組成物。
【請求項２８】
前記標的化ドメインは、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、または１０ヌクレオチド以内に二本鎖切断を提供するように構成される、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項２９】
前記標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列、またはこれらとは１以下、２以下、３以下、４以下、もしくは５以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項３０】
前記標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の核酸組成物。
【請求項３１】
前記標的化ドメインは、１５〜２５ヌクレオチド長である、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項３２】
前記標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３３】
前記標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３４】
前記標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３５】
前記標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３６】
前記標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３７】
前記標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３８】
前記標的化ドメインは、２４長である、請求項３１に記載の核酸組成物。
【請求項３９】
（ｂ）Ｃｐｆ１分子をコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２０〜３８のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項４０】
前記Ｃｐｆ１分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項３９に記載の核酸組成物。
【請求項４１】
前記Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＶ３Ｌ６株Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の核酸組成物。
【請求項４２】
前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号３７２２、配列番号３７２３、または配列番号３７２４で示される、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項４３】
（ａ）および（ｂ）は、１つの核酸分子上に存在する、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子は、ＡＡＶベクターである、請求項４３に記載の核酸組成物。
【請求項４５】
（ａ）は、第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）は、第２の核酸分子上に存在する、請求項４３または４４に記載の核酸組成物。
【請求項４６】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項４５に記載の核酸組成物。
【請求項４７】
（ｃ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択されるＴ細胞発現遺伝子の第２の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項４８】
前記第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子である、請求項４７に記載の核酸組成物。
【請求項４９】
前記第１の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子および前記第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置するように、２セットの二本鎖切断を生じさせる、請求項４７または４８に記載の核酸組成物。
【請求項５０】
前記第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列、またはこれらとは１以下、２以下、３以下、４以下、もしくは５以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項５１】
前記第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡの前記標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載の核酸組成物。
【請求項５２】
（ａ）および（ｃ）は、１つの核酸分子上に存在する、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項５３】
前記核酸分子は、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項５２に記載の核酸組成物。
【請求項５４】
（ａ）は、第１の核酸分子上に存在し；（ｃ）は、第２の核酸分子上に存在する、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項５５】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項５４に記載の核酸組成物。
【請求項５６】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、１つの核酸分子上に存在する、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項５７】
前記核酸分子は、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項５６に記載の核酸組成物。
【請求項５８】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つが、第１の核酸分子上にコードされ；第２および第３の（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、第２の核酸分子上にコードされている、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項５９】
前記第１の核酸分子および前記第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターまたはＬＶベクターである、請求項５８に記載の核酸組成物。
【請求項６０】
（ａ）は、第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ｃ）は、第２の核酸分子上に存在する、請求項５８または５９に記載の核酸組成物。
【請求項６１】
（ｂ）は、第１の核酸分子上に存在し；（ａ）および（ｃ）は、第２の核酸分子上に存在する、請求項５８または５９に記載の核酸組成物。
【請求項６２】
（ｃ）は、第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ａ）は、第２の核酸分子上に存在する、請求項５８または５９に記載の核酸組成物。
【請求項６３】
前記核酸組成物は、（ａ）に作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項２０〜６２のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項６４】
前記核酸組成物は、（ｂ）に作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項３９〜６３のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項６５】
前記核酸組成物は、（ｃ）に作動可能に連結される第２のプロモーターを含む、請求項４７〜６４のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項６６】
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項６７】
（ｂ）Ｃｐｆ１分子をさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記Ｃｐｆ１分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＶ３Ｌ６株Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される、請求項６７または６８に記載の組成物。
【請求項７０】
（ｃ）第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子をさらに含む、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
Ｃｐｆ１タンパク質、および前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子をコードするリボ核酸分子を含むリボ核タンパク質組成物である、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
細胞を改変する方法であって、前記細胞を：
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ；および
（ｂ）Ｃｐｆ１分子
と接触させることを含む方法。
【請求項７３】
前記Ｃｐｆ１分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＶ３Ｌ６株Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞を、（ｃ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択されるＴ細胞発現遺伝子の第２の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子と接触させることをさらに含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞は、がんに罹患している対象に由来する、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記がんは、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞標的位置の１つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる対象に由来する、請求項７２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項７２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
操作された前記Ｔ細胞は、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
操作された前記Ｔ細胞は、操作されたＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）Ｔ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入する前に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入した後に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入するのと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記接触は、生体外で実行される、請求項７２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
接触した前記細胞は、前記対象の体に戻される、請求項７２〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記接触は、前記細胞を、請求項２０〜６５のいずれか一項に記載の核酸組成物と接触させることを含む、請求項７２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記接触は、前記細胞を、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、請求項７２〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
対象を治療する方法であって、対象由来の細胞を：
（ａ）請求項１〜３５のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ；および
（ｂ）Ｃｐｆ１分子
と接触させることを含む方法。
【請求項９１】
前記Ｃｐｆ１分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＶ３Ｌ６株Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞を、（ｃ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択されるＴ細胞発現遺伝子の第２の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子と接触させることをさらに含む、請求項９０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記対象は、がんに罹患している、請求項９０〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記がんは、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記対象は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞標的位置の１つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる、請求項９０〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項９０〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
操作された前記Ｔ細胞は、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
操作された前記Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入する前に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入した後に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入するのと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される、請求項９７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記接触は、生体外で実行される、請求項９０〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
接触した前記細胞は、前記対象の体に戻される、請求項９０〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記接触は、前記細胞を、請求項２０〜６５のいずれか一項に記載の核酸組成物と接触させることを含む、請求項９０〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記接触は、前記細胞を、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、請求項９０〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、請求項２０〜６５のいずれか一項に記載の核酸組成物、または請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の組成物、ならびに
（ｂ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞標的ノックアウト位置の１つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる対象由来の細胞
を含む反応混合物。
【請求項１０９】
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、または阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡをコードする核酸組成物、ならびに以下の１つまたは複数：
（ｂ）Ｃｐｆ１分子；
（ｃ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択されるＴ細胞発現遺伝子の第２の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第２の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子；ならびに
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の１つまたは複数をコードする核酸組成物
を含むキット。
【請求項１１０】
前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、その５’末端にて、またはその近くに、修飾を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１１】
前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、その３’末端にて、またはその近くに、修飾を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１２】
前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、その５’末端にて、またはその近くに修飾を、そしてその３’末端にて、またはその近くに修飾を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１３】
前記修飾は、その５’末端の１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内にある、請求項１１０または１１２に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１４】
前記修飾は、その３’末端の１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内にある、請求項１１１または１１２に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１５】
前記修飾により、前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｔ細胞中に導入された場合に、ヌクレアーゼに対する安定性の増大を示す、請求項１１０〜１１４のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１６】
前記修飾により、前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｔ細胞中に導入された場合に、先天性免疫応答の低下を示す、請求項１１０〜１１４のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１７】
前記先天性免疫応答は、サイトカイン発現の誘導を伴う、請求項１１６に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１８】
対象におけるがんの治療に用いられる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１１９】
前記阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、（ｂ）Ｃｐｆ１分子と組み合わせて用いられる、請求項１１８に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子。
【請求項１２０】
対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子の使用。
【請求項１２１】
前記医薬はさらに、（ｂ）Ｃｐｆ１分子を含む、請求項１２０に記載の使用。
【請求項１２２】
対象におけるがんの治療に用いられる、請求項２０〜６５のいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項１２３】
対象におけるがんの治療に用いられる、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、請求項２０〜６５のいずれか一項に記載の核酸組成物の使用。
【請求項１２５】
対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、請求項６６〜７１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、その内容の全体が本明細書に参照により援用される、２０１６年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／３０４，０５７号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（「０８４１７７０１４０Ｓｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ」と命名された．ｔｘｔファイルとして、２０１７年３月３日に電子的に提出された）を参照する。．ｔｘｔファイルは２０１７年３月２日に作成されて、サイズは７２１，０００バイトである。配列表の内容全体は、本明細書に参照により援用される。
【０００３】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１関連方法、標的核酸配列を編集するための組成物および構成要素、または標的核酸配列の発現調節、および遺伝子操作Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の養子免疫伝達を含むがん免疫療法に関連したそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子操作Ｔ細胞の養子免疫伝達は、治療法としての臨床用試験段階に入った。典型的に、アプローチは、１）アフェレーシス療法によって対象から白血球を得るステップと；２）Ｔ細胞を選択／富化するステップと；３）サイトカイン処理によってＴ細胞を活性化するステップと；４）レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入または電気穿孔によって、クローン化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を導入するステップと；５）サイトカイン処理によってＴ細胞を増殖させるステップと；６）通常はリンパ枯渇によって対象を馴化させるステップと；７）遺伝子操作Ｔ細胞を対象に輸液するステップとからなる。
【０００５】
クローン化ＴＣＲ遺伝子（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ）起源としては、特定の悪性腫瘍がある個人から単離された稀なＴ細胞集団と、特定の腫瘍抗原または腫瘍細胞で免疫化されたＴ細胞受容体−ヒト化マウスから単離された、Ｔ細胞クローンとが挙げられる。養子免疫伝達に続いて、ＴＣＲ遺伝子操作Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示される、それらの同族の抗原ペプチドを認識する。抗原結合は、シグナルトランスダクション経路を刺激して、Ｔ細胞活性化および増殖をもたらす。次に、刺激されたＴ細胞は、典型的に、グランザイムＢ、パーフォリン、およびグラニュリシンを含む分泌複合体を伴う細胞毒性抗腫瘍細胞応答を開始して、腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。
【０００６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子は、典型的に、モノクローナル抗体の一本鎖抗体変数断片（ｓｃＦｖ）ドメインに由来して、ヒンジおよび膜貫通ドメインを通じて細胞質内エフェクタードメインに融合する、細胞外腫瘍抗原結合ドメインを含む、人工Ｔ細胞受容体をコードする。エフェクタードメインは、典型的に、Ｔ細胞共受容体複合体のＣＤ３−ζ鎖に由来して、ＣＤ２８および／またはＣＤ１３７受容体タンパク質に由来するドメインもまた含み得る。ＣＡＲ細胞外ドメインは、ＴＣＲ遺伝子操作Ｔ細胞について記載されるように、ＭＨＣ非依存性様式で腫瘍抗原に結合して、細胞毒性抗腫瘍作用に至るＴ細胞の活性化および増殖をもたらす。
【０００７】
これまでのところ、少なくとも１５種の異なる腫瘍抗原が、遺伝子操作Ｔ細胞の臨床試験で標的化されている。いくつかの試験では、抗腫瘍活性が報告されている。最大の成功は、血液悪性腫瘍で得られている。例えば、Ｂ細胞抗原であるＣＤ１９を標的化するように遺伝子操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞の養子免疫伝達は、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、およびＢ細胞急性リンパ球性白血病がある対象において、複数の部分的および完全寛解をもたらした。対照的に、その他の腫瘍型、特に腎細胞がん、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、および前立腺がんをはじめとする固形腫瘍を標的化する試験は、あまり成功していない。これらの試験の多くでは、非常に少数の患者が客観的応答を経験した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の主題の要約
本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子操作されたＴ細胞またはＴ細胞前駆体の、対象への投与を含む免疫療法アプローチを用いたがん治療を実現する。がんに罹患している対象を治療するアプローチは、対象からＴ細胞を単離して、これを、がん細胞によって発現される抗原を標的化するように遺伝的に修飾してから、対象中に再導入する、養子Ｔ細胞移入と呼ばれるプロセスである。Ｔ細胞を遺伝的に修飾する方法は、特定のがん抗原を特異的に認識する膜貫通Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質をそれぞれコードするＴＣＲまたはＣＡＲ遺伝子の導入を含む。特定の実施形態では、腫瘍が発現する抗原の、ＴＣＲまたはＣＡＲタンパク質の抗原結合ドメインとの結合が、シグナル伝達カスケードを開始して、Ｔ細胞の活性化、増殖、そして最終的には、細胞毒性免疫応答を介したがん細胞の破壊をもたらす（Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ  １３，５２５−５４１）。
【０００９】
遺伝子修飾されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞移入は、固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍の治療薬として、臨床試験段階に入っている。これまでの結果は入り交じっている。血液悪性腫瘍（とりわけリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ））では、いくつかの第１相および第２相試験において、患者の大部分が、少なくとも部分奏効を示し、一部の患者は完全奏効を示した（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｂｌｏｏｄ  １１９，２７０９−２７２０）。しかし、（メラノーマ、腎細胞がん、および結腸直腸がんをはじめとする）大多数の腫瘍型では、より少ない応答が観察されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｂｌｏｏｄ  １１４，５３５−５４６；Ｌａｍｅｒｓ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１，９０４−９１２；Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５，Ｓ１−Ｓ２）。したがって、がん治療において、修飾Ｔ細胞の養子免疫伝達有効性を改善する必要性が存在する。
【００１０】
遺伝子修飾されたＴ細胞のがん治療薬としての有効性を制限する要因としては、（１）例えば、養子免疫伝達に続くＴ細胞の限定的増殖などのＴ細胞増殖；（２）例えば、腫瘍環境内因子によるＴ細胞アポトーシス誘導などのＴ細胞生存；および（３）例えば、宿主免疫細胞およびがん細胞によって分泌される阻害因子による、細胞毒性Ｔ細胞機能の阻害などのＴ細胞機能が挙げられる。本明細書中で開示される方法および組成物は、これらの制限の１つまたは複数に、Ｔ細胞の増殖、生存、および／または機能に影響するＴ細胞発現遺伝子の発現を修飾することによって、対処する。
【００１１】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、（例えば、Ｔ細胞の増殖を阻害する遺伝子を不活性化することによって）Ｔ細胞の増殖に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、（例えば、Ｔ細胞アポトーシスを媒介する遺伝子を不活性化することによって）Ｔ細胞の生存に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、（例えば、免疫抑制シグナル伝達因子および阻害（例えばアネルギー誘導）シグナル伝達因子をコードする遺伝子を不活性化することによって）Ｔ細胞の機能に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、Ｔ細胞の持続性を向上させるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、がん治療薬として、遺伝子修飾されたＴ細胞の有効性、例えば、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞生存、Ｔ細胞機能、Ｔ細胞持続性、またはそれらのあらゆる組み合わせを制限する因子の１つまたは複数に影響を与えるのに個々に、または組み合わせて利用され得る。
【００１２】
本明細書中で開示される方法および組成物は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、１つまたは複数のＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子を改変することによって、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性、および／または機能に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＣＢＬＢおよび／またはＰＴＰＮ６遺伝子を改変することによって、Ｔ細胞の増殖に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳおよび／またはＢＩＤ遺伝子を改変することによって、Ｔ細胞の生存に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変することによって、Ｔ細胞の機能に影響を与えるのに用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、Ｂ２Ｍ遺伝子を改変することによって、Ｔ細胞の持続性を向上させるのに用いられ得る。
【００１３】
特定の実施形態では、以下に限定されないがＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子が挙げられる１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子が、標的ノックアウトとして独立して標的化されて、例えば、Ｔ細胞の増殖、生存、持続性、および／または機能に影響する。特定の実施形態では、本開示の方法は、１つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つ）をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、２つのＴ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される２つ）を独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、３つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される３つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、４つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される４つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、５つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される５つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、６つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される６つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、７つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される７つを独立してノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、本開示の方法は、８つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれを独立してノックアウトすることを含む。
【００１４】
操作されたＴ細胞の有効性に影響を与えるのに、先に記載される遺伝子に加えて、いくつかの他のＴ細胞発現遺伝子が標的化されてもよい。当該遺伝子として、以下に限定されないが、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩが挙げられる（Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ  １３，５２５−５４１）。特定の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つまたは複数が、本明細書中で開示される方法を用いて、個々に、または組み合わせて改変され得る。特定の実施形態では、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲＩＩ、およびＴＧＦＢＲＩＩＩ遺伝子の１つまたは複数が、本開示の方法を用いて、個々に、または先に記載される８つの遺伝子（すなわち、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子）のいずれか１つもしくは複数と組み合わせて、改変され得る。
【００１５】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子の位置（例えばノックアウト位置）、例えば、非コード領域（例えばプロモーター領域）内の位置もしくはコード領域内の位置を標的化することによって、または遺伝子の転写配列、例えばイントロン配列もしくはエキソン配列を標的化することによって、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変する。特定の実施形態では、遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子）のコード配列、例えばコード領域、例えば初期コード領域が、発現の改変またはノックアウトのために標的化される。特定の実施形態では、Ｔ細胞発現遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子）の非コード領域（例えばプロモーター領域）中の位置が、Ｔ細胞発現遺伝子の発現の改変およびノックアウトのために標的化される。
【００１６】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子のコード配列を標的化することによって、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変する。特定の実施形態では、コード配列は、初期コード配列である。特定の実施形態では、遺伝子のコード配列は、Ｔ細胞発現遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される。
【００１７】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される方法および組成物は、遺伝子の非コード配列を標的化することによって、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変する。特定の実施形態では、非コード配列は、プロモーター領域内の配列、エンハンサー配列、イントロン配列、３’ＵＴＲ内の配列、ポリアデニル化シグナル配列、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、遺伝子の非コード配列は、遺伝子の発現のノックアウトのために標的化される。
【００１８】
特定の実施形態では、本開示の方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の１つまたは２つの対立遺伝子を、例えば、当該遺伝子中で改変を誘導することによって、ノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、改変は、挿入、欠失、突然変異、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、標的ノックアウトアプローチは、Ｃｐｆ１酵素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される。
【００２０】
「Ｔ細胞標的ＦＡＳノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＦＡＳ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＦＡＳ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＦＡＳ遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、ＦＡＳ遺伝子のコード領域、例えば、初期コード領域にある。
【００２１】
「Ｔ細胞標的ＢＩＤノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＢＩＤ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＢＩＤ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＢＩＤ遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＢＩＤ遺伝子のコード領域にある。
【００２２】
「Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＣＴＬＡ４遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＣＴＬＡ４遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＣＴＬＡ４遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＣＴＬＡ遺伝子のコード領域にある。
【００２３】
「Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＰＤＣＤ１遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＰＤＣＤ１遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＰＤＣＤ１遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、ＰＤＣＤ１遺伝子コード領域、例えば、初期コード領域にある。
【００２４】
「Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＣＢＬＢ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＣＢＬＢ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＣＢＬＢ遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＣＢＬＢ遺伝子のコード領域にある。
【００２５】
「Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＰＴＰＮ６遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＰＴＰＮ６遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＰＴＰＮ６遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＰＴＰＮ６遺伝子のコード領域にある。
【００２６】
「Ｔ細胞標的Ｂ２Ｍノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されるならば、機能性Ｂ２Ｍ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性Ｂ２Ｍ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、Ｂ２Ｍ遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、当該位置は、Ｂ２Ｍ遺伝子のコード領域、例えば、初期コード領域にある。
【００２７】
「Ｔ細胞標的ＴＲＡＣノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＴＲＡＣ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＴＲＡＣ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＴＲＡＣ遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＴＲＡＣ遺伝子のコード領域にある。
【００２８】
「Ｔ細胞標的ＴＲＢＣノックアウト位置」は、本明細書の用法では、例えば、ＮＨＥＪ媒介改変によって改変されると、機能性ＴＲＢＣ遺伝子産物発現の低下または排除（例えば、機能性ＴＲＢＣ遺伝子産物発現のノックアウト）がもたらされる、ＴＲＢＣ遺伝子中の位置を指す。特定の実施形態では、位置は、例えば、初期コード領域などのＴＲＢＣ遺伝子のコード領域にある。
【００２９】
「Ｔ細胞標的ＦＡＳ位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＦＡＳノックアウト位置を指す。
【００３０】
「Ｔ細胞標的ＢＩＤ位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＢＩＤノックアウト位置を指す。
【００３１】
「Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックアウト位置を指す。
【００３２】
「Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックアウト位置を指す。
【００３３】
「Ｔ細胞標的ＣＢＬＢ位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＣＢＬＢノックアウト位置を指す。
【００３４】
「Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックアウト位置を指す。
【００３５】
「Ｔ細胞標的Ｂ２Ｍ位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的Ｂ２Ｍノックアウト位置を指す。
【００３６】
「Ｔ細胞標的ＴＲＡＣ位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＴＲＡＣノックアウト位置を指す。
【００３７】
「Ｔ細胞標的ＴＲＢＣ位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ＴＲＢＣノックアウト位置を指す。
【００３８】
「Ｔ細胞標的ノックアウト位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、Ｔ細胞標的ＦＡＳノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＢＩＤノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＣＴＬＡ４ノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＰＤＣＤ１ノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＣＢＬＢノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＰＴＰＮ６ノックアウト位置、Ｔ細胞標的Ｂ２Ｍノックアウト位置、Ｔ細胞標的ＴＲＡＣノックアウト位置、またはＴ細胞標的ＴＲＢＣノックアウト位置のいずれかを指す。
【００３９】
「Ｔ細胞標的位置」は、本明細書の用法では、本明細書に記載されるように、あらゆるＴ細胞標的ノックアウト位置を指す。
【００４０】
一態様において、本明細書中で開示されるのは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つのＴ細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子、例えば、単離された、または天然に存在しないｇＲＮＡ分子である。
【００４１】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、改変、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置（例えばＴ細胞標的ノックアウト位置）の、ＮＨＥＪに関連する改変を可能にするほど、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置（例えばＴ細胞標的ノックアウト位置）に十分に近い切断事象、例えば二本鎖切断を実現するように構成される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、切断事象、例えば二本鎖切断が、Ｔ細胞標的位置（例えばＴ細胞標的ノックアウト位置）の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に位置するように構成される。二本鎖切断は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞ノックアウト標的位置（例えばＴ細胞標的ノックアウト位置）の上流に位置しても、下流に位置してもよい。
【００４２】
特定の実施形態では、第２の標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子が、改変、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の、ＮＨＥＪに関連する改変を可能にするほど、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置に十分に近い切断事象、例えば二本鎖切断を、単独で、または第１のｇＲＮＡ分子によって配置される切断と組み合わせて実現するように構成される。特定の実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ｇＲＮＡ分子のそれぞれについて独立して、標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。特定の実施形態では、２セットの二本鎖切断は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置（例えば、Ｔ細胞標的ノックアウト位置）のヌクレオチドの両側に配置される。特定の実施形態では、２セットの二本鎖切断は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置（例えば、Ｔ細胞標的ノックアウト位置）のヌクレオチドの片側、例えば、上流または下流に配置される。特定の実施形態では、二本鎖切断は、以下で考察されるように、第２のｇＲＮＡ分子によって配置される追加の二本鎖切断を伴ってよい。例えば、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の上流に、例えば標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に配置されるように構成され；そして第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、二本鎖切断が、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置の下流に、例えば標的位置の１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。
【００４３】
特定の実施形態では、２つ以上のｇＲＮＡが、標的核酸中に２つ以上の切断事象、例えば、２セットの二本鎖切断を配置するのに用いられる場合、２つ以上の切断事象は、同じ、または異なるＣｐｆ１タンパク質によってもたらされる。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡが、標的核酸中に２セットの二本鎖切断を配置するのに用いられる場合、単一のＣｐｆ１ヌクレアーゼが、双方の二本鎖切断を生じさせるのに用いられる。特定の実施形態では、２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が用いられる場合、Ｃｐｆ１タンパク質は異なる種に由来する。
【００４４】
複数のＴ細胞発現遺伝子が、改変のために細胞中で標的化される場合、標的核酸は、１つまたは複数のＣｐｆ１タンパク質によって改変、例えば切断され得る。例えば、２つの遺伝子が改変のために標的化されるならば、例えば、双方のＴ細胞発現遺伝子がノックアウトのために標的化されるならば、同じ、または異なるＣｐｆ１タンパク質が、各遺伝子を標的化するのに用いられ得る。特定の実施形態では、双方のＴ細胞発現遺伝子（または、細胞中の標的化される各遺伝子）が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、双方のＴ細胞発現遺伝子（または、細胞中の標的化される各遺伝子）が、Ｃｐｆ１分子によって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、細胞中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによる切断によって改変され得る。２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が、細胞中の標的核酸、例えば異なる遺伝子を切断するのに用いられる場合、Ｃｐｆ１タンパク質は、様々な細菌種に由来してよい。例えば、細胞中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子が、１つの細菌種由来のＣｐｆ１タンパク質による切断によって改変されてよいし、同じ細胞中の１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子が、異なる細菌種由来のＣｐｆ１タンパク質による切断によって改変されてよい。特定の実施形態では、様々な種由来の２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が用いられる場合、これらは、標的核酸中の所望の位置の所望の遺伝子における切断特異性を制御するように、同時に送達されてもよいし、順次送達されてもよい。
【００４５】
特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の反対側の鎖と相補的である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側を向くように構成される。
【００４６】
特定の実施形態では、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子のコード領域、例えば初期コード領域中の位置が、例えばノックアウトのために、標的化される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列と同一の配列、またはこれらとは１以下、２以下、３以下、４以下、もしくは５以下のヌクレオチドが異なる配列を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＦＡＳコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号２３２６〜３０９４から独立して選択される。
【００４８】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＢＩＤコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号３２８４〜３３８５から独立して選択される。
【００４９】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＣＴＬＡ４コード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号６４〜３７０から独立して選択される。
【００５０】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＰＤＣＤ１コード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号１〜６３から独立して選択される。
【００５１】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＣＢＬＢコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号５０４〜２３２５から独立して選択される。
【００５２】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＰＴＰＮ６コード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号３７１〜５０３から独立して選択される。
【００５３】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＢ２Ｍコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号３０９５〜３２８３から独立して選択される。
【００５４】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＴＲＡＣコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号３３８６〜３５８８から独立して選択される。
【００５５】
特定の実施形態では、Ｔ細胞標的ノックアウト位置がＴＲＢＣコード領域、例えば初期コード領域であり、そして複数のｇＲＮＡが、標的核酸配列において切断、例えば２つの二本鎖切断を配置するのに、例えば１つまたは複数のインデルを生じさせるのに用いられる場合、各ガイドＲＮＡは、配列番号３５８９〜３７０７から独立して選択される。
【００５６】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡはさらに、直接反復ドメインを含む。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、１５〜２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号３７０８〜３７１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、ユニモジュラー（「単分子」とも呼ばれる）ｇＲＮＡである。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１５〜２５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。
【００５８】
切断事象、例えば二本鎖切断は、Ｃｐｆ１分子によって生成される。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子は、二本鎖切断を触媒する。
【００５９】
加えて、本開示の主題は、（ａ）先に記載されるような第１のｇＲＮＡ分子をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸組成物、例えば、単離された、または天然に存在しない核酸組成物、例えばＤＮＡ組成物を提供する。特定の実施形態では、核酸組成物はさらに、（ｂ）Ｃｐｆ１分子をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。Ｃｐｆ１分子は、標的核酸中に二本鎖切断を形成し得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＶ３Ｌ６株Ｃｐｆ１分子（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１分子（ＬｂＣｐｆ１）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）からなる群から選択される。特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３７２２、配列番号３７２３、または配列番号３７２４で示される。
【００６０】
特定の実施形態では、核酸組成物はさらに、（ｃ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つのＴ細胞発現遺伝子の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡ分子と同じＴ細胞標的位置を標的化する。
【００６１】
特定の実施形態では、（ａ）および（ｂ）は、１つの核酸分子、例えば１つのベクター、例えば１つのウイルスベクター、例えばＡＡＶベクター上に存在する。記載される組成物および方法のいずれかで使用されてもよい代表的ＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１ベクター、修飾ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、修飾ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、修飾ＡＡＶ５ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、修飾ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ａＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、および修飾ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターが挙げられる。特定の実施形態では、（ａ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６２】
特定の実施形態では、（ａ）および（ｃ）は、１つの核酸分子、例えば１つのベクター、例えば１つのウイルスベクター、例えば１つのＡＡＶベクター上に存在する。特定の実施形態では、（ａ）および（ｃ）は、異なるベクター上にある。例えば（ａ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在してもよく；（ｃ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在してもよい。特定の実施形態では、第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターである。
【００６３】
特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、例えば１つのベクター、例えば１つのウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターなどの１つの核酸分子上に存在する。特定の実施形態では、核酸分子はＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の１つは、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の２つめおよび３つめは、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上でコードされる。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６４】
特定の実施形態では、（ａ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ｃ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６５】
特定の実施形態では、（ｂ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ａ）および（ｃ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６６】
特定の実施形態では、（ｃ）は、例えば第１のベクター、例えば第１のウイルスベクター、例えば第１のＡＡＶベクターなどの第１の核酸分子上に存在し；（ｂ）および（ａ）は、例えば第２のベクター、例えば第２のベクター、例えば第２のＡＡＶベクターなどの第２の核酸分子上に存在する。第１および第２の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６７】
特定の実施形態では、のそれぞれ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）（ｉ）は、例えは異なるベクター、例えば異なるウイルスベクター、例えば異なるＡＡＶベクターなどの異なる核酸分子上に存在する。例えば、（ａ）は第１の核酸分子上に、（ｂ）は第２の核酸分子上に、（ｃ）（ｉ）は第３の核酸分子上にあってもよい。第１、第２、および第３の核酸分子は、ＡＡＶベクターであってもよい。
【００６８】
本明細書に記載される核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの（ａ）のｇＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターを含んでもよい。核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの（ｃ）の第２、第３および／または第４のｇＲＮＡ分子をコードする配列と作動可能に連結する第２のプロモーターをさらに含んでもよい。プロモーターおよび第２のプロモーターは、互いに異なる。特定の実施形態では、プロモーターおよび第２のプロモーターは同一である。本明細書に記載される核酸は、例えば、本明細書に記載されるプロモーターなどの（ｂ）のＣｐｆ１分子をコードする配列と作動可能に連結するプロモーターをさらに含んでもよい。
【００６９】
本開示の主題はまた、（ａ）先に記載されるようなｇＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、当該組成物はさらに、（ｂ）Ｃｐｆ１分子、例えば、先に記載されるようなＣｐｆ１分子を含む。特定の実施形態では、当該組成物はさらに、（ｃ）先に記載されるような第２のｇＲＮＡ分子を含む。特定の実施形態では、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の組成物、組成物は、Ｃｐｆ１タンパク質、およびｇＲＮＡ分子をコードするリボ核酸分子を含むリボ核タンパク質組成物である。
【００７０】
本開示の主題はさらに、細胞を改変する、例えば、細胞の標的核酸の、構造を改変する、例えば配列を改変する方法であって：当該細胞を、（ａ）先に記載されるｇＲＮＡ分子、および（ｂ）先に記載されるＣｐｆ１分子、そして場合によっては、（ｃ）先に記載される第２のｇＲＮＡ分子と接触させることを含む方法を提供する。別の態様では、本明細書中で開示されるのは、対象（例えば、がんに罹患している対象）を治療する、例えば、対象の標的核酸の構造、例えば配列を改変する方法であって：対象（または対象由来の細胞）を、（ａ）先に記載されるｇＲＮＡ；および（ｂ）先に記載されるＣｐｆ１分子、そして場合によっては（ｃ）先に記載される第２のｇＲＮＡ分子と接触させることを含む方法である。
【００７１】
特定の実施形態では、細胞を改変する、例えば、細胞の標的核酸の、構造を改変する、例えば配列を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される２つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７２】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される２つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７３】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される３つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７４】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される４つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７５】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される５つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７６】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される６つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７７】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される７つ以上のＴ細胞発現遺伝子を改変することを含む。
【００７８】
特定の実施形態では、細胞を改変する方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれを改変することを含む。
【００７９】
特定の実施形態では、当該方法は、がんに罹患している対象由来の細胞を接触させることを含む。特定の実施形態では、がんは、以下からなる群から選択される：リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫。
【００８０】
細胞は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞標的位置に１つまたは複数の改変を有することから恩恵を被ることとなる対象由来であってよい。
【００８１】
特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。接触は、生体外で実行され得、接触した細胞は、接触工程後に対象の体に戻され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、操作されたＴ細胞、例えば、操作されたＣＡＲ（キメラ抗原受容体）Ｔ細胞または操作されたＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞発現遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置内に改変を導入する前に、そうした後に、またはそうするのと同時に、ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように操作される。
【００８２】
特定の実施形態では、接触工程は、先に記載されるように、細胞を核酸組成物と接触させることを含む。特定の実施形態では、接触工程は、先に記載されるように、細胞を組成物と接触させることを含む。特定の実施形態では、組成物は、リボ核タンパク質組成物である。
【００８３】
特定の実施形態では、接触は、細胞を、核酸分子、例えばベクター、例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ１ベクター、修飾ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、修飾ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、修飾ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、修飾ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、修飾ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、修飾ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、修飾ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、修飾ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、または修飾ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターと接触させることを含む。
【００８４】
特定の実施形態では、接触は、細胞に、タンパク質またはｍＲＮＡとして（ｂ）のＣｐｆ１分子、（ａ）をコードする核酸分子、そして場合によっては（ｃ）を送達することを含む。
【００８５】
特定の実施形態では、接触は、細胞に、タンパク質またはｍＲＮＡとして（ｂ）のＣｐｆ１分子、ＲＮＡとして（ａ）のｇＲＮＡ、そして場合によっては、ＲＮＡとして（ｃ）の第２のｇＲＮＡを送達することを含む。
【００８６】
特定の実施形態では、接触は、細胞に、ＲＮＡとして（ａ）のｇＲＮＡ、場合によってはＲＮＡとして（ｃ）の第２のｇＲＮＡ、そして（ｂ）のＣｐｆ１分子をコードする核酸組成物を送達することを含む。
【００８７】
本開示の主題はさらに、先に記載されるｇＲＮＡ分子、先に記載される核酸組成物、または先に記載される組成物、および細胞、例えば、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中の１つまたは複数のＴ細胞標的位置での１つまたは複数の改変から恩恵を被ることとなる対象に由来する細胞を含む反応混合物を提供する。
【００８８】
本開示の主題はさらに、（ａ）先に記載されるｇＲＮＡ分子、またはｇＲＮＡをコードする核酸組成物、および以下の１つまたは複数：（ｂ）先に記載されるＣｐｆ１分子；（ｃ）先に記載される第２のｇＲＮＡ分子を含むキットを提供する。
【００８９】
本開示の主題はさらに、修飾ｇＲＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、修飾ｇＲＮＡ分子は、その５’末端にて、またはその近くに、修飾を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、その３’末端にて、またはその近くに、修飾を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、その５’末端にて、またはその近くに修飾を、そしてその３’末端にて、またはその近くに修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、その５’末端の１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内にある。特定の実施形態では、修飾は、その３’末端の１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内にある。特定の実施形態では、修飾により、ｇＲＮＡ分子は、Ｔ細胞中に導入された場合に、ヌクレアーゼに対する安定性の増大を示す。特定の実施形態では、修飾により、ｇＲＮＡ分子は、Ｔ細胞中に導入された場合に、先天性免疫応答の低下を示す。特定の実施形態では、先天性免疫応答は、サイトカイン発現の誘導を伴う。
【００９０】
加えて、本開示の主題は、対象におけるがんの治療に用いられる、先に記載されるｇＲＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、（ｂ）Ｃｐｆ１分子と組み合わせて用いられる。
【００９１】
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、先に記載されるｇＲＮＡ分子の使用を提供する。特定の実施形態では、医薬はさらに、（ｂ）Ｃｐｆ１分子を含む。
【００９２】
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療に用いられる、先に記載される核酸組成物を提供する。
【００９３】
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療に用いられる、先に記載される組成物を提供する。
【００９４】
本開示の主題はさらに、対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、先に記載される核酸組成物の使用を提供する。
【００９５】
本開示の主題はさらにさらに、対象におけるがんの治療用の医薬の製造における、先に記載される組成物の使用を提供する。
【００９６】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは同等の方法および材料が、本発明でまたは本発明の試験で使用され得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照により援用する。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
【００９７】
数字およびアルファベットの見出しおよび小見出しをはじめとする見出しは、組織化と提示を目的とし、制限は意図されない。
【００９８】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本開示の主題の非限定的な特定の実施形態に従うｇＲＮＡ分子の構造を示す。
【図２】生化学切断アッセイでのＣｐｆ１  ＲＮＰの評価を示す。ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するいくつかのＲＮＰの活性を、試験管内切断アッセイで評価した。ＴＲＡＣの４５０ｂｐのエキソン１に相当するＰＣＲ産物を、同定したＴＲＡＣ  ＲＮＰと１：１の比率でインキュベートした。切断が成功して生じるはずのバンドのおおよその予想サイズを、各ＴＲＡＣ  ＲＮＰについて一覧にしている。全てのＲＮＰが活性を有するように見えたが、２つのＲＮＰ（ＧＷＥＤ５４５およびＧＷＥＤ５４６）が、より活性があるようであった。
【図３Ａ】Ｃｐｆ１  ＴＲＡＣ特異的ＲＮＰで処理したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＣＲα／β発現の分析を示す。活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するようにデザインしたＲＮＰを電気穿孔した。電気穿孔の４日後に、細胞をＴＣＲα／β抗体で染色して、ＦＣＭによって分析した。ＴＣＲα／βネガティブ細胞の頻度を、試験した各ｃｒＲＮＡについてグラフで示した。２つのＲＮＰ（ＧＷＥＤ５４５およびＧＷＥＤ５４６）による処理は、ＴＣＲα／βネガティブ細胞のかなりの頻度をもたらし、これは、ＴＲＡＣ遺伝子座を正しく編集して表面タンパク質発現の引下げをもたらすＲＮＰの能力を示している。
【図３Ｂ】Ｃｐｆ１  ＴＲＡＣ特異的ＲＮＰで処理したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＣＲα／β発現の分析を示す。このアッセイにおいて代表的なＦＣＭを、Ｃｐｆ１  ａｐｏコントロールと比較してかなりのＴＣＲα／βネガティブ細胞をもたらした２つのＲＮＰについて、そして表面ＴＣＲα／β細胞を除去できなかったＲＮＰについて、プロットした。
【図４】Ｃｐｆ１  ＲＮＰの生存度を示す。Ｃｐｆ１  ＲＮＰによる細胞の処理は、生存度の喪失をもたらさなかった。生きたリンパ球の頻度を、各ＲＮＰについての前方散乱対側方散乱の配置によって判定した。生きたリンパ球の頻度を、試験した各ＲＮＰについてグラフで示した。
【図５】ヒトＴ細胞を編集するＣｐｆ１の能力についての、Ｔ７Ｅ１による分子分析を示す。結果は、Ｃｐｆ１がヒトＴ細胞を編集することができることを確認した。ＲＮＰ処理したヒトＴ細胞由来のｇＤＮＡを、電気穿孔の４日後に収穫した。ＴＲＡＣ遺伝子座を、特異的プライマーを用いて増幅して、ＰＣＲ産物をＴ７Ｅ１アッセイにかけた。簡潔に、ＰＣＲ産物を変性させて、リアニールさせて、最後にＴ７Ｅ１酵素で処理した。当該酵素は、誤対合の部位にて、誤対合を有する二本鎖ＤＮＡを切断した。アガロースゲル上での切断産物の定量化によって評価したＴ７Ｅ１酵素による切断率は、標的遺伝子座でのゲノム編集のパーセンテージに関連した。このアッセイ由来のデータをプロットしたところ、図３においてＦＡＣＳによって観察したデータが支持される。
【図６】Ｃｐｆ１  ＴＲＡＣ特異的ＲＮＰで処理した第２の供与体由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＣＲα／β発現の分析を示す。活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＧＷＥＤ５４５およびＧＷＥＤ５４６に相当するＲＮＰを電気穿孔した。電気穿孔の４日後に、細胞をＴＣＲα／β抗体で染色して、ＦＣＭによって分析した。ＴＣＲα／βネガティブ細胞の頻度をグラフで示した。Ｃｐｆ１  ＲＮＰ  ＧＷＥＤ５４５およびＧＷＥＤ５４６で処理した細胞におけるＴＣＲα／βの損失は、Ｃｐｆ１が複数の供与体にわたってヒトＴ細胞を再現的に編集することができることを実証している。
【図７】真核生物ｍＲＮＡキャップ構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
定義
本明細書中で用いられる用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値が許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、これは部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の制限事項（ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）によって決まることとなる。例えば、「約」は、当該技術における実行につき、３標準偏差以内にある、または３標準偏差を超えることを意味し得る。これ以外にも、「約」は、所定の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。これ以外にも、特に生体系または生体プロセスに関して、当該用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内にあることを意味し得る。
【０１０１】
「ドメイン」は、本明細書の用法では、タンパク質または核酸部分を記述するために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、任意の特定の機能特性を有する必要はない。
【０１０２】
２つの配列間の相同性または配列同一性（用語は本明細書で同義的に使用される）の計算は、次のようにして実施される。配列は、最適な比較目的で整列され（例えば、最適アライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または双方にギャップが装入され得て、非相同配列は比較目的で無視され得る）。最適アライメントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２重み行列による、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、最高スコアとして評価される。次に対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド配列部位にある、アミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性百分率は、配列によって共有される同一の位置数の関数である。
【０１０３】
本明細書中で用いられる「阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子」は、細胞または対象中に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの構成要素をコードする配列を含む核酸上の標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を指す。阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡは、内在性細胞または対象配列を標的化しない。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は：（ａ）Ｃｐｆ１分子をコードする核酸分子；（ｂ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／もしくはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する標的化ドメインを含むｇＲＮＡ（標的遺伝子ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子上に；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１構成要素、例えば（ａ）および（ｂ）の双方をコードする複数の核酸分子上に、標的配列と相補的である標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１構成要素をコードする、例えば、Ｃｐｆ１分子または標的遺伝子ｇＲＮＡをコードする核酸分子は、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ標的化ドメインと相補的である複数の標的ドメインを含む。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｃｐｆ１分子と複合体形成して、例えば、切断によって、または核酸分子への結合によって、標的核酸分子のＣｐｆ１媒介不活性化をもたらし、そしてＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム構成要素の生成の停止または縮小をもたらす。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子は、２つの複合体：Ｃｐｆ１分子を含む、標的遺伝子ｇＲＮＡとの複合体であって、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変する複合体；ならびにＣｐｆ１分子を含む、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子との複合体であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム構成要素、例えば、Ｃｐｆ１分子または標的遺伝子ｇＲＮＡ分子のさらなる生成を妨げるように作用する複合体を形成する。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子／Ｃｐｆ１分子複合体は、Ｃｐｆ１分子についての制御領域配列、例えば、Ｃｐｆ１分子をコードする配列に作動可能に連結するプロモーター、転写領域をコードする配列、エキソン、またはイントロンに結合し、またはその切断を促進する。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子／Ｃｐｆ１分子複合体は、制御領域配列、例えば、ｇＲＮＡ分子に作動可能に連結するプロモーター、またはｇＲＮＡ分子をコードする配列に結合し、またはその切断を促進する。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、例えば、Ｃｐｆ１−標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｃｐｆ１分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体媒介遺伝子標的化の効果を制限する。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡは、時間的、発現レベル、または他の制限を、Ｃｐｆ１分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に課す。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡは、オフターゲットまたは他の不所望な活性を引き下げる。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｃｐｆ１システムの構成要素の生成を阻害する、例えば、完全にまたは実質的に完全に阻害することによって、その活性��制限する。
【０１０４】
「修飾物質」は、本明細書の用法では、例えば、対象分子または遺伝子配列の活性（例えば、酵素活性、転写活性、または翻訳活性）、量、分布、または構造を改変し得る薬剤などの実体を指す。特定の実施形態では、調節は、例えば、共有結合または非共有結合の破壊などの切断、または例えば、部分の対象分子への付着などの共有結合または非共有結合の形成を含む。特定の実施形態では、修飾物質は、対象分子の三次元、二次、三次、または四次構造を変化させる。修飾物質は、対象活性を増大させ、低下させ、開始し、または排除し得る。
【０１０５】
「大分子」は、本明細書の用法では、少なくとも２、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｋＤの分子量を有する分子を指す。大分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、生物製剤、および炭水化物が挙げられる。
【０１０６】
「ポリペプチド」は、本明細書の用法では、１００個未満のアミノ酸残基を有するアミノ酸のポリマーを指す。特定の実施形態では、それは５０、２０、または１０個未満のアミノ酸残基を有する。
【０１０７】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、本明細書の用法では、例えば、正順ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、および合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）をはじめとする、ライゲーション媒介修復および／または非テンプレート媒介修復を指す。
【０１０８】
例えば、参照Ｃｐｆ１分子または参照ｇＲＮＡなどの「参照分子」は、本明細書の用法では、例えば、修飾または候補Ｃｐｆ１分子などである対象Ｃｐｆ１分子または対象ｇＲＮＡ分子などの対象分子が、それに対して比較される分子を指す。例えば、Ｃｐｆ１分子は、参照Ｃｐｆ１分子のヌクレアーゼ活性の１０％以下を有するとして特徴付けられ得る。基準Ｃｐｆ１分子の例として、天然に存在する未修飾のＣｐｆ１分子、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）；１６３：７５９−７７１に記載されるように、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６（「ＬｂＣｐｆ１」株またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１分子等の天然に存在するＣｐｆ１分子が挙げられる。特定の実施形態では、参照Ｃｐｆ１分子は、それが比較されるＣｐｆ１分子と、最も近い配列同一性または相同性を有する天然起源Ｃｐｆ１分子である。特定の実施形態では、参照Ｃｐｆ１分子は、例えば、変異などの変化がその上で起こった親形態である、天然起源または既知の配列などの配列である。
【０１０９】
「置換」または「交換された」は、分子修飾に関連した本明細書の用法では、プロセスの制限は必要でなく、置換実体が存在することのみを示唆する。
【０１１０】
「小分子」は、本明細書の用法では、例えば、約２ｋＤ未満、約１．５ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．７５ｋＤ未満などの約２ｋＤ未満の分子量を有する化合物を指す。
【０１１１】
「対象」は、本明細書の用法では、ヒトまたは非ヒト動物のどちらを意味してもよい。用語は、哺乳類（例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類（例えば、マウスおよびラットまたはハムスター）、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギ）を含むが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は家禽である。
【０１１２】
「治療する（Ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書の用法では、例えば、（ａ）疾患を阻害し、すなわち、その進行を抑止または予防し；（ｂ）疾患を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こし；および（ｃ）疾患を治癒させることをはじめとする、例えば、ヒトなどの哺乳類の疾患の治療を意味する。
【０１１３】
「Ｘ」は、アミノ酸配列の文脈で、本明細書の用法では、特に断りのない限り、任意のアミノ酸（例えば、２０個の天然アミノ酸のいずれか）を指す。
【０１１４】
がん免疫療法を改善する
一態様では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。遺伝子操作Ｔ細胞が効果的な抗腫瘍応答をするためには、それらは、１）対象への移入に続いて適切に増殖し、十分な数の特異的腫瘍標的化Ｔ細胞を提供し；２）対象において必要な抗腫瘍活性を維持するのに十分な時間生存し；３）遺伝子操作Ｔ細胞が機能性抗腫瘍表現型を維持するように、腫瘍環境内で免疫細胞、腫瘍細胞、およびその他の細胞によって産生される抑制因子の影響を回避する必要がある。不十分な増殖および／または生存、ならびに阻害因子感受性は、がんに罹患している対象における、遺伝子操作Ｔ細胞の有効性の欠如の一因たり得る。本明細書で開示される方法および組成物は、がん治療法としての遺伝子操作Ｔ細胞の有効性を改善するために、これらの問題に対処する。
【０１１５】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＣＢＬＢ遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Ｃａｓｉｔａｓ  Ｂ系統リンパ腫ｂタンパク質（ＣＢＬＢによってコードされる）発現の低下または不在は、対象への移入に続く、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖を促進するための外来性インターロイキンシグナル伝達に対する必要性を低下させると考えられる（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０，３７２２−３７３４）。
【０１１６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＰＴＰＮ６遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１タンパク質（ＰＴＰＮ６によってコードされる）の発現低下または不在は、移入されたＴ細胞の短期蓄積の増大をもたらし、それは引き続いて抗腫瘍活性を改善すると考えられる（Ｓｔｒｏｍｎｅｓ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９，１８１２−１８２５）。
【０１１７】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＦＡＳ遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Ｆａｓタンパク質発現の低下または不在が、多くのがん型によって発現される因子であるＦａｓリガンドによるＴ細胞アポトーシスの誘導を阻害すると考えられる（Ｄｏｔｔｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｂｌｏｏｄ  １０５，４６７７−４６８４）。
【０１１８】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＢＩＤ遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼし得る。特定の実施形態では、Ｂｉｄタンパク質発現の低下または不在が、Ｆａｓ経路活性化に続くＴ細胞アポトーシスの誘導を妨げると考えられる（Ｌｅｉ，Ｘ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２２，３０−３６）。
【０１１９】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＣＴＬＡ４遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞に対する免疫抑制性因子の効果を低下させ得る。特定の実施形態では、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４によってコードされる）発現の低下または不在が、腫瘍環境内で抗原提示細胞によって発現されるＣＤ８０またはＣＤ８６の結合に続く、非応答性状態（「アネルギー」）の誘導を抑止すると考えられる（Ｓｈｒｉｋａｎｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，１９９９  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，４８３−４９３）。
【０１２０】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＰＤＣＤ１遺伝子を改変することで、遺伝子操作Ｔ細胞に対する免疫抑制性因子の効果を低下させ得る。特定の実施形態では、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤＣＤ１によってコードされる）発現の低下または不在が、腫瘍環境内で腫瘍細胞または細胞によって発現されるＰＤ１リガンドの結合によって、Ｔ細胞アポトーシス誘導を妨げると考えられる（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６，２４４３−２４５４）。
【０１２１】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用して、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子を改変することで、Ｔ細胞特異性および安全性が改善され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣによってコードされる）発現の低下または不在が、Ｔ細胞受容体認識および宿主組織応答を排除することで、移植片対宿主病を妨げると考えられる。したがってこのアプローチを使用して、「汎用」Ｔ細胞が生成され得る（Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｂｌｏｏｄ  １１９，５６９７−５７０５）。特定の実施形態では、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現の低下または不在により、内在性Ｔ細胞受容体の、外来から導入された、操作されたＴ細胞受容体との誤対形成が低下し、または除外されるので、治療有効性が向上する（Ｐｒｏｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８，８０７−８１５）。
【０１２２】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物および方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子を改変することによってＴ細胞持続性を向上させるのに用いることができる。特定の実施形態では、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍによってコードされる）の発現の低下または不在により、Ｔ細胞上でのＭＨＣＩ表面発現が減少する。導入ＣＡＲまたは操作ＴＣＲに由来する「外来の」ペプチドが、操作されたＴ細胞の表面上でクラスＩ  ＭＨＣによって示され得るので、特定の実施形態では、ベータ−２ミクログロブリンの除去により、養子免疫療法について低免疫原性（ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）細胞をもたらす、注入された操作されたＴ細胞の宿主拒絶反応の可能性が低下し得る（Ｍａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０１４）。特定の実施形態では、ベータ−２−ミクログロブリンの発現の低下または不在が、同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）用の「容易に入手できる」操作されたＴ細胞の生成に用いられる（Ｒｉｏｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１３）。
【０１２３】
特定の実施形態では、本明細書中で開示される組成物および方法は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を低下させて、操作されたＴ細胞を用いたがん免疫療法の治療を向上させるのに用いることができる。
【０１２４】
本明細書中で開示されるのは、本明細書中で記載される組成物および方法を用いて、免疫療法を介してがんを治療するアプローチである。
【０１２５】
一アプローチでは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子が、標的ノックアウトとして標的化されて、例えば、Ｔ細胞の増殖、生存、機能、および／または持続性に影響を与える。特定の実施形態では、前記アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される２つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される３つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される４つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される５つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される６つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される７つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。特定の実施形態では、当該アプローチは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される８つのＴ細胞発現遺伝子をノックアウトすることを含む。
【０１２６】
特定の実施形態では、方法は、疾患発症後に対象の治療を開始するステップを含む。特定の実施形態では、方法は、例えば、がんの発症後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、または３６ヶ月間などの疾患発症の十分後に、対象への治療を開始するステップを含む。
【０１２７】
特定の実施形態では、方法は、進行した病期にある対象の治療開始を含む。
【０１２８】
全体的に、全ての病期における対象の治療開始は、対象に恩恵をもたらすことが期待される。
【０１２９】
本明細書で開示される組成物および方法を使用して治療されてもよいがんとしては、血液のがんおよび固形腫瘍が挙げられる。例えば、本明細書で開示される組成物および方法を使用して治療されてもよいがんとしては、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＥＬＬ）、多発性骨髄腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、メラノーマ、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん、肝細胞がん、膵臓がん、星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１３０】
１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子を改変する方法
本明細書中で開示されるように、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数が、例えば本明細書中で記載されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１媒介方法を用いて、遺伝子編集によって標的化（例えば改変）され得る。
【０１３１】
本明細書中で開示される方法および組成物は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数におけるＴ細胞標的位置の標的化（例えば改変）を実現する。Ｔ細胞標的位置は、例えば、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中を標的化（例えば改変）するＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１媒介方法を用いて、遺伝子編集によって標的化（例えば改変）され得る。
【０１３２】
本明細書中で開示されるのは、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的位置を標的化する（例えば改変する）方法である。
【０１３３】
Ｔ細胞標的位置の標的化（例えば改変）は、例えば、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子をノックアウトすること：
（ａ）１つもしくは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／もしくはＴＲＢＣ遺伝子のコード領域（例えば初期コード領域）の近傍もしくはその内部での１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失（例えば、ＮＨＥＪ媒介挿入または欠失）、または
（ｂ）１つもしくは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／もしくはＴＲＢＣ遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失（例えばＮＨＥＪ媒介欠失）によって達成される。
【０１３４】
全てのアプローチが、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の標的化（例えば改変）を引き起こす。
【０１３５】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中のコード領域の近くに１つまたは複数の切断を導入する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の少なくとも一部の側面に位置するように、２つ以上の切断を導入する。２つ以上の切断により、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列が除去される（例えば欠失する）。本明細書中に記載される全ての方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の標的化（例えば改変）をもたらす。
【０１３６】
１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の標的化（例えば改変）は、あらゆる機構によって媒介され得る。１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の改変と関連し得る例示的な機構として、以下に限定されないが、非相同末端結合（例えば、古典的または代替）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同指向修復（例えば、内在性供与体テンプレート媒介性）、およびＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）が挙げられる。
【０１３７】
挿入または欠失を導入することによる、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のノックアウト
特定の実施形態では、当該方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子のＴ細胞標的ノックアウト位置の近傍（例えば初期コード領域）に、もう１つのヌクレオチドの挿入または欠失を導入することを含む。本明細書中で記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、Ｔ細胞標的ノックアウト位置、例えば、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子のコード領域（例えば、例えば開始コドンから５００ｂｐ以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の５００ｂｐの下流の、残りのコード配列）への、１つまたは複数の切断（例えば二重鎖切断）の導入を含む。特定の実施形態では、切断のＮＨＥＪ媒介修復により、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の近傍またはその内部での、インデルのＮＨＥＪ媒介導入が可能となる。
【０１３８】
特定の実施形態では、二本鎖切断が、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に導入される（例えば、１つのｇＲＮＡ分子によって配置される）。特定の実施形態では、単一ｇＲＮＡ分子（例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼがある）が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置、例えば、コード領域（例えば、例えば開始コドンから５００ｂｐ以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の５００ｂｐの下流の、残りのコード配列）に、またはその近傍に二本鎖切断を生じさせるのに用いられる。特定の実施形態では、切断は、不所望の標的染色体要素、例えば反復要素、例えばＡｌｕ反復を回避するように配置される。
【０１３９】
特定の実施形態では、２つの切断セット（例えば、２つの二本鎖切断）が、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に導入される（例えば、２つのｇＲＮＡ分子によって配置される）。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ分子（例えば、１つまたは２つのＣｐｆ１ヌクレアーゼがある）が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置、例えば、コード領域（例えば、例えば開始コドンから５００ｂｐ以内の、初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の５００ｂｐの下流の、残りのコード配列）の側面に位置するように、２つの二本鎖切断を生じさせるのに用いられる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、切断セットの双方が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流または下流に配置されるように構成される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットが、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流に配置され、そして第２の切断セットがその下流に配置されるように構成される。特定の実施形態では、切断は、不所望の標的染色体要素、例えば反復要素、例えばＡｌｕ反復を回避するように配置される。
【０１４０】
特定の実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子が、１つのＣｐｆ１分子と共に用いられる。特定の実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡが、２つ以上のＣｐｆ１分子と共に用いられる場合、少なくとも１つのＣｐｆ１分子は、他のＣｐｆ１分子と異なる種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子が２つのＣｐｆ１分子と共に用いられる場合、１つのＣｐｆ１分子は、ある一種に由来して、他のＣｐｆ１分子は、異なる種に由来してよい。所望の場合には、二本鎖切断を生じさせるのに、双方のＣｐｆ１種が用いられる。
【０１４１】
細胞内で複数の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化される核酸は、１つまたは複数のＣｐｆ１タンパク質（例えばＣｐｆ１ヌクレアーゼ）によって、改変、例えば切断され得る。例えば、２つの遺伝子が改変のために標的化される、例えば、双方の遺伝子がノックアウトのために標的化されるならば、同じ、または異なるＣｐｆ１タンパク質が、各遺伝子を標的化するのに用いられてよい。特定の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、細胞中の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによる切断によって改変され得る。２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が、細胞中の標的核酸、例えば、異なる遺伝子を切断するのに用いられる場合、Ｃｐｆ１タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞中の１つまたは複数の遺伝子が、１つの細菌種由来のＣｐｆ１タンパク質による切断によって改変されてもよい。そして、同細胞中の１つまたは複数の遺伝子が、異なる細菌種由来のＣｐｆ１タンパク質による切断によって改変されてもよい。特定の実施形態では、異なる種由来の２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が用いられる場合、これらは、標的核酸中の所望の位置の所望の遺伝子中で切断特異性を制御するように、同時に送達されても順次送達されてもよい。
【０１４２】
特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向する鎖と相補的である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側を向くように構成される。
【０１４３】
１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失（例えばＮＨＥＪ媒介欠失）による、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子のノックアウト
特定の実施形態では、当該方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失を導入することを含む。本明細書中に記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、２つの二本鎖切断を、一方をＴ細胞標的ノックアウト位置の５’側に、そして他方を３’側に導入する（すなわち、側面に位置させる）ことを含む。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡ、例えば、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子が、２つの切断セット（例えば２つの二本鎖切断）を、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置の対向する側に配置するように構成される。
【０１４４】
特定の実施形態では、当該方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列を欠失（例えばＮＨＥＪ媒介欠失）させることを含む。本明細書中に記載されるように、特定の実施形態では、当該方法は、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中の領域（例えば、コード領域（例えば初期コード領域））または非コード領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、３’ＵＴＲ、および／またはポリアデニル化シグナル配列）の側面に位置するように、２つの切断セット（例えば一対の二本鎖切断）を導入することを含む。特定の実施形態では、切断のＮＨＥＪ媒介修復により、本明細書中で記載されるように、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の改変が可能となり、これは例えば、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子の一方または双方の対立遺伝子をノックアウトするように、遺伝子の発現を引き下げ、または除外する。
【０１４５】
特定の実施形態では、２つの切断セット（例えば、２つの二本鎖切断）が、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子中のＴ細胞標的ノックアウト位置に、またはその近傍に導入される（例えば、２つのｇＲＮＡ分子によって配置される）。特定の実施形態では、（例えば、１つまたは２つのＣｐｆ１ヌクレアーゼと共に）２つのｇＲＮＡ分子が、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の側面に位置するように２つの切断セットを生じさせるのに用いられ、例えば、ｇＲＮＡ分子は、１つの切断セットが、Ｔ細胞標的ノックアウト位置の上流に配置され、そして第２の切断セットがその下流に配置されるように構成される。特定の実施形態では、切断は、不所望の標的染色体要素、例えば反復要素、例えばＡｌｕ反復を回避するように配置される。
【０１４６】
特定の実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡ分子が、１つのＣｐｆ１分子と共に用いられる。特定の実施形態では、２つ以上（例えば、３つまたは４つ）のｇＲＮＡが、２つ以上のＣｐｆ１分子と共に用いられる場合、少なくとも１つのＣｐｆ１分子は、他のＣｐｆ１分子と異なる種に由来する。例えば、２つのｇＲＮＡ分子が２つのＣｐｆ１分子と共に用いられる場合、１つのＣｐｆ１分子は、ある一種に由来して、他のＣｐｆ１分子は、異なる種に由来してよい。所望の場合には、二本鎖切断を生じさせるのに、双方のＣｐｆ１種が用いられる。
【０１４７】
細胞内で複数の遺伝子が改変のために標的化される場合、標的化される核酸は、１つまたは複数のＣｐｆ１タンパク質（例えばＣｐｆ１ヌクレアーゼ）によって、改変、例えば切断され得る。例えば、２つの遺伝子が改変のために標的化される、例えば、双方の遺伝子がノックアウトのために標的化されるならば、同じ、または異なるＣｐｆ１タンパク質が、各遺伝子を標的化するのに用いられてよい。特定の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、双方の遺伝子（または細胞内で標的化される各遺伝子）が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによって切断されて、二本鎖切断が生じる。特定の実施形態では、細胞中の１つまたは複数の遺伝子が、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼによる切断によって改変され得る。２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が、細胞中の標的核酸、例えば、異なる遺伝子を切断するのに用いられる場合、Ｃｐｆ１タンパク質は、異なる細菌種に由来してもよい。例えば、細胞中の１つまたは複数の遺伝子が、１つの細菌種由来のＣｐｆ１タンパク質による切断によって改変されてもよい。そして、同細胞中の１つまたは複数の遺伝子が、異なる細菌種由来のＣｐｆ１タンパク質による切断によって改変されてもよい。特定の実施形態では、異なる種由来の２つ以上のＣｐｆ１タンパク質が用いられる場合、これらは、標的核酸中の所望の位置の所望の遺伝子中で切断特異性を制御するように、同時に送達されても連続して送達されてもよい。
【０１４８】
特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインおよび第２のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは、標的核酸分子の対向する鎖と相補的である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、ＰＡＭが外側を向くように構成される。
【０１４９】
特定の実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞の養子移入が、がんの可能な治療を実現し得る。細胞表面受容体をコードする遺伝子が、Ｔ細胞中に挿入される。遺伝子操作されたＴ細胞は、腫瘍関連抗原を検出することができ、これが用いられて、腫瘍細胞をほとんどの正常組織から識別することができる。
【０１５０】
標的遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子）の１つまたは２つの対立遺伝子のノックアウトが、疾患発症後に実行されてもよいが、好ましくは疾患経過の早期に実行される。
【０１５１】
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
本明細書中で用いられる用語ｇＲＮＡ分子は、標的核酸に対するｇＲＮＡ分子／Ｃｐｆ１分子複合体の特異的標的化または自動誘導（ｈｏｍｉｎｇ）を促進する核酸を指す。ｇＲＮＡ分子は、ユニモジュラー（「単分子」とも呼ばれる単一ＲＮＡ分子、例えばキメラｇＲＮＡを有する）、またはモジュラー（複数、典型的には２つの、別々のＲＮＡ分子を含む）であり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、ユニモジュラーｇＲＮＡである。
【０１５２】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’に：図１に示す直接反復ドメインおよび標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、１５〜１００（例えば、１５〜３０、３０〜５０、５０〜７０、７０〜８０、または８０〜１００）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３０〜５０（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、３９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、４０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、４１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、４２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、４３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、４４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、４５ヌクレオチド長である。
【０１５３】
直接反復ドメイン
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、１０〜３０（例えば、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、または２０〜３０）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、１５〜２５（例えば、１５〜２０、または２０〜２５）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、１５〜２０（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、２０〜２５（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、２１ヌクレオチド長である。
【０１５４】
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ［配列番号３７０８］
【０１５５】
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号３７０９で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＡＧＵＧＵＡＧＡＵ［配列番号３７０９］
【０１５６】
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号３７１０で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＧＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＡＵＵＧＵＡＧＡＵ［配列番号３７１０］
【０１５７】
ｇＲＮＡ分子ＡｓＣｐｆ１は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を含む直接反復ドメインを含む。
【０１５８】
ｇＲＮＡ分子ＬｂＣｐｆ１は、配列番号３７０９で示されるヌクレオチド配列を含む直接反復ドメインを含む。
【０１５９】
ｇＲＮＡ分子Ｌｂ２Ｃｐｆ１は、配列番号３７１０で示されるヌクレオチド配列を含む直接反復ドメインを含む。
【０１６０】
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、１つの単一ステムループを含む。
【０１６１】
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号３７０８、配列番号３７０９、または配列番号３７１０で示される配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相同なヌクレオチド配列を含む。
【０１６２】
特定の実施形態では、直接反復ドメインは、配列番号３７０８、配列番号３７０９、または配列番号３７１０で示される配列の少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチド配列を含む。修飾は、ｇＲＮＡ分子の切断活性に実質的に干渉しない、もしくは干渉しない、またはｇＲＮＡ分子の切断活性をもたらさない。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、挿入、欠失、突然変異、およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、ＲＮＡ二重鎖を保存するステムループ中にある。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、少なくとも１つの突然変異を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、ステムループ二重鎖構造を破壊しない。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、配列番号３７０８、配列番号３７０９、または配列番号３７１０で示される配列の３’末端の最後の３ヌクレオチド以内にない。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、配列番号３７０８、配列番号３７０９、または配列番号３７１０で示される配列の３’末端の最後の２ヌクレオチド以内にない。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、配列番号３７０８、配列番号３７０９、または配列番号３７１０で示される配列の３’末端の最後の１つのヌクレオチドにない。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、５つ以下の修飾、４つ以下の修飾、３つ以下の修飾、２つ以下の修飾、または１つの修飾を含むか有する。特定の実施形態では、直接反復ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの修飾を含むか有する。
【０１６３】
標的化ドメイン
本開示のｇＲＮＡの標的化ドメインは、標的核酸上の標的ドメインと相補的である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子中の標的核酸と相補的であり、例えば、標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。標的化ドメインの選択に関する指針が、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）；１６３：７５９−７７１において見出され得る。
【０１６４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列と、相補的である、例えば、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％相補的である、例えば完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。標的化ドメインは、ＲＮＡ分子の一部であるので、塩基ウラシル（Ｕ）を含むこととなる一方、当該ｇＲＮＡ分子をコードするいかなるＤＮＡも、塩基チミン（Ｔ）を含むこととなる。特定の実施形態では、標的化ドメインの、標的配列との相補性は、ｇＲＮＡ分子／Ｃｐｆ１分子複合体の、標的核酸との相互作用の特異性に寄与する。特定の実施形態では、標的化ドメインおよび標的配列対において、標的化ドメイン中のウラシル塩基が、標的配列中のアデニン塩基と対形成する。特定の実施形態では、標的化ドメインは、５〜５０（例えば、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０〜５０）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１５〜３０（例えば、１５〜２５または２５〜３０）ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１５〜２５（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。
【０１６５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、１８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１９ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、２４ヌクレオチド長である。
【０１６６】
典型的に標的化ドメインは、標的配列との完全相補性を有する。特定の実施形態では標的化ドメインは、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３、４、５、６、７または８ヌクレオチドを有し、またはそれを含む。
【０１６７】
特定の実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な１、２、３、４または５ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的な１、２、３、４または５ヌクレオチドを含む。
【０１６８】
特定の実施形態では、標的ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３または４ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、標的化ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、１、２、３または４ヌクレオチドを含む。
【０１６９】
特定の実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡのその他の性質と合わせて、Ｃｐｆ１分子の標的核酸への標的化を可能にするのに十分である。
【０１７０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた、２つの連続する非相補的ヌクレオチドなどの標的ドメインと相補的でない２連続ヌクレオチド（「非相補的ヌクレオチド」）を含む。
【０１７１】
特定の実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある２連続ヌクレオチドは、いずれも標的化ドメインと相補的でない。
【０１７２】
特定の実施形態では、非相補的ヌクレオチドが、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内に、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内に、または標的化ドメインの片方もしくは双方の末端から５ヌクレオチド超離れた領域内に、存在する。
【０１７３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０１７４】
配列番号１〜６３で示される標的化ドメインはいずれも、ＰＤＣＤ１遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１７５】
配列番号６４〜３７０で示される標的化ドメインはいずれも、ＣＴＬＡ４遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１７６】
配列番号３７１〜５０３で示される標的化ドメインはいずれも、ＰＴＰＮ６遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１７７】
配列番号５０４〜２３２５で示される標的化ドメインはいずれも、ＣＢＬＢ遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１７８】
配列番号２３２６〜３０９４で示される標的化ドメインはいずれも、ＦＡＳ遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１７９】
配列番号３０９５〜３２８３で示される標的化ドメインはいずれも、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」））またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１８０】
配列番号３２８４〜３３８５で示される標的化ドメインはいずれも、ＢＩＤ遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１８１】
配列番号３３８６〜３５８８で示される標的化ドメインはいずれも、ＴＲＡＣ遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１８２】
配列番号３５８９〜３７０７で示される標的化ドメインはいずれも、ＴＲＢＣ遺伝子をノックアウトするのに、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、ＢＶ３Ｌ６株（「ＡｓＣｐｆ１」））、またはラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＮＤ２００６株（「ＬｂＣｐｆ１」）またはＭＡ２０２０株（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」））のＣｐｆ１と共に用いられ得る。
【０１８３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３４３３で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＡＧＡＡＵＣＡＡＡＡＵＣＧＧＵＧＡＡＵＡＧＧＣ（配列番号３４３３）
【０１８４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５８７で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＵＵＵＧＡＧＡＡＵＣＡＡＡＡＵＣＧＧＵＧＡＡＵ（配列番号３５８７）
【０１８５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５３８で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＧＵＣＵＧＵＧＡＵＡＵＡＣＡＣＡＵＣＡＧＡＡＵ（配列番号３５３８）
【０１８６】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３４６１で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＣＡＣＡＵＧＣＡＡＡＧＵＣＡＧＡＵＵＵＧＵＵＧ（配列番号３４６１）
【０１８７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３４７５で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＣＡＵＧＵＧＣＡＡＡＣＧＣＣＵＵＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号３４７５）
【０１８８】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５２４で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＧＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＡＡＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡ（配列番号３５２４）
【０１８９】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５６６で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＵＣＵＧＵＧＡＵＡＵＡＣＡＣＡＵＣＡＧＡＡＵＣ（配列番号３５６６）
【０１９０】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５１７で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡＣＧＧＣ（配列番号３５１７）
【０１９１】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５７３で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＵＧＡＣＡＣＡＵＵＵＧＵＵＵＧＡＧＡＡＵＣＡＡ（配列番号３５７３）
【０１９２】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３５８０で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＵＵＧＣＵＣＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＵＧＵＵ（配列番号３５８０）
【０１９３】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号３４５４で示されるヌクレオチド配列を含み、これは、以下に記載される。
ＡＵＵＣＵＣＡＡＡＣＡＡＡＵＧＵＧＵＣＡＣＡＡ（配列番号３４５４）
【０１９４】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７からなる群から選択される１つの配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相同なヌクレオチド配列を含む。
【０１９５】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、配列番号１〜３７０７からなる群から選択される１つの配列の少なくとも１つの修飾を含むヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、当該修飾は、セクションＶＩＩＩに開示される１つまたは複数の修飾である。特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾が、標的化ドメインについて、分解に対する感受性をより低くし、またはより生体適合性にし、例えば免疫原性をより低くする。一例として、標的化ドメインの骨格は、ホスホロチオエートで修飾されていてもよいし、セクションＶＩＩＩの他の修飾で修飾されていてもよい。特定の実施形態では、標的化ドメインのヌクレオチドは、２’修飾、例えば、２−アセチル化、例えば、２’メチル化、またはセクションＶＩＩＩの他の修飾を含み得る。
【０１９６】
特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾は、挿入、欠失、突然変異、およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つ以上の修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、その５’末端の５ヌクレオチド以内にある、１、２、３、または４つの修飾を含む。特定の実施形態では、標的化ドメインは、その３’末端の５ヌクレオチド以内にある、１、２、３、または４程度の数の修飾を含む。
【０１９７】
特定の実施形態では、標的化ドメインは、例えば、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた２連続ヌクレオチドなどの２連続ヌクレオチドの修飾を含む。
【０１９８】
特定の実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にある２連続ヌクレオチドは、いずれも修飾されていない。特定の実施形態では、標的化ドメインの５’末端の５ヌクレオチド以内にあり、標的化ドメインの３’末端の５ヌクレオチド以内にあり、または標的化ドメインの片方または双方の末端から５ヌクレオチドを超えて離れた領域内にあるヌクレオチドは、いずれも修飾されていない。
【０１９９】
標的化ドメイン中の修飾は、セクションＩＶに記載されるシステム中で候補修飾を試験することで評価され得る標的化効率を妨げないように、選択され得る。選択された長さ、配列、相補性程度、または修飾程度を有する候補標的化ドメインを有するｇＲＮＡは、セクションＩＶのシステム中で評価され得る。候補標的化ドメインは、選択された標的について機能的であることが知られているｇＲＮＡ分子／Ｃｐｆ１分子システム中に、単独で配置され、または１つまたは複数のその他の候補変化と共に配置されて、評価され得る。
【０２００】
特定の実施形態では、全ての修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的であり、ハイブリダイズできる。特定の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７または８つ以上の修飾ヌクレオチドは、標的ドメイン中に存在する対応するヌクレオチドと相補的でなくまたはハイブリダイズできない。
【０２０１】
ＩＩ．ｇＲＮＡをデザインする方法
本明細書中に記載されるｇＲＮＡに用いる標的化ドメインを選択し、デザインし、かつ実証する方法が提供される。ｇＲＮＡ中への組込みのための例示的な標的化ドメインもまた、本明細書中で提供される。
【０２０２】
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法が、例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ＳＣＩＥＮＣＥ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７−３２；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＮＡＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  １１（２）：１２２−３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４３８９６６２；およびＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）；１６３：７５９−７７１に記載されている。
【０２０３】
特定の実施形態では、使用者の標的配列内でのｇＲＮＡの標的化ドメインの選択を最適化するのに、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性を最小にするのに、ソフトウェアツールが用いられてよい。オフターゲット活性は、切断以外であり得る。例えば、Ｃｐｆ１分子（例えば、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、またはＬｂ２Ｃｐｆ１）と共に用いられることとなるｇＲＮＡ分子の可能な各標的化ドメインについて、ソフトウェアツールは、特定の最大数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のミスマッチ塩基対を含有するゲノム全体にわたって、全ての可能なオフターゲット配列を同定することができる。各オフターゲット配列での切断効率は、例えば、実験的に誘導される重みづけスキームを用いて予測され得る。例えば、ｇＲＮＡベクター構築のための自動化された試薬デザイン、オンターゲットサーベイヤーアッセイ用のプライマー設計、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット切断のハイスループット検出と定量化のためのプライマーデザインなどのその他の機能もまた、ツールに包含され得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって、またはセクションＩＶに記載されようにして、評価され得る。
【０２０４】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子と共に使用されるｇＲＮＡが、例えば、公共ツールｃａｓ−ｏｆｆｉｎｄｅｒに基づく特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアを使用するなど、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して同定される（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４；３０（１０）：１４７３−１４７５）。前記特定用途向けｇＲＮＡ設計ソフトウェアは、それらの全ゲノムでのオフターゲット性向を計算した後に、ガイドをスコアする。典型的に、完全な一致から７つのミスマッチに至るマッチが、１７〜２４の長さに至るガイドのために検討される。ひとたびオフターゲット部位が計算的に判定されたら、各ガイドについて集約スコアが計算されて、ウェブインタフェースを使用して、表形式の出力に要約された。ＰＡＭ配列（例えば、（Ｔ）ｘＮ  ＰＡＭ、例えば、ＴＴＴＮ  ＰＡＭ）に隣接する可能なｇＲＮＡ部位を同定するのに加えて、ソフトウェアはまた、選択されたｇＲＮＡ部位と、１、２、３つ以上のヌクレオチドが異なる、全てのＰＡＭ隣接配列も同定する。各遺伝子のゲノムのＤＮＡ配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザから得られ、配列は、公的に利用可能なＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、反復要素についてスクリーニングされる。ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒは、反復要素および低複雑度領域について、供試ＤＮＡ配列を検索する。結果は、所与のクエリー配列中に存在する反復の詳細な注釈である。
【０２０５】
同定に続いて、ｇＲＮＡは、標的部位までの距離に基づいて（妥当な（ｒｅｌａｖａｎｔ）ＰＡＭを含有するヒトゲノム中の近いマッチの同定に基づいて）階層に格付けされた。特定の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、またはＬｂ２Ｃｐｆ１について、ＰＡＭは、ＴＴＴＮ  ＰＡＭである。第１の階層ｇＲＮＡ分子についての標的化ドメインは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子中の開始コドンの下流のコード配列の最初の５００ｂｐ以内を標的化する。第２の階層ｇＲＮＡ分子についての標的化ドメインは、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子のコード配列の残りを標的化する。特定の筋書きでは、遺伝子のコード配列が５００ｂｐよりも短い場合、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインは全て、第１の階層に含まれた。階層は、非包括的であることに留意されたい（各ｇＲＮＡは、ストラテジーについて１回のみ列挙される）。
【０２０６】
表１は、第１のデザインおよび階層化ストラテジーに従う例示的な標的化ドメインを提供する。一例として、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、または２４量体の標的化ドメインがデザインされた。ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現のノックアウトに関して、この階層化ベースのアプローチを用いて同定された、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ−１、またはＬｂ２Ｃｐｆ１分子と共に用いられるように設計された例示的なｇＲＮＡ（配列番号によって言及される）が、表１に記載される。特定の実施形態では、標的化ドメインは、相補的な塩基の対形成により、標的ドメインにハイブリダイズする。表１の配列番号１〜３７０７で示されるいずれの標的化ドメインも、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、またはＬｂ２Ｃｐｆ１分子と共に用いられて、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／またはＴＲＢＣ遺伝子の発現を低下させ、減少させ、または抑制することができる。
【０２０７】
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【０２０８】
ＩＩＩ．Ｃｐｆ１分子
様々な種のＣｐｆ１分子が、本明細書中で開示される方法および組成物に用いられ得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子は、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えばＢＶ３Ｌ６株）分子（「ＡｓＣｐｆ１」）、ラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えばＮＤ２００６株）分子（「ＬｂＣｐｆ１」）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えばＭＡ２０２０株）分子（「Ｌｂ２Ｃｐｆ１」）から選択される。
【０２０９】
本明細書中で用いられる用語Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、そしてｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含む部位に復帰（ｈｏｍｅ）または局在することができる分子またはポリペプチドを指す。本明細書中で用いられる用語Ｃｐｆ１分子およびＣｐｆ１ポリペプチドは、天然に存在するＣｐｆ１分子、および、例えば、基準配列、例えば、天然に存在する最も類似したＣｐｆ１分子から、少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる、操作された、改変された、または修飾されたＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドを含む。
【０２１０】
フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２  Ｃｐｆ１（「ＦｎＣｐｆ１」）分子の構造が決定されている（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）；１６３：７５９−７７１）。Ｃｐｆ１は、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を欠く単一ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。その全体が参照により援用されるＺｅｔｓｃｈｅ（２０１５）参照。Ｃｐｆ１は、標的ＤＮＡを切断するために、短いＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）を利用する。同文献参照。Ｃｐｆ１は、スタガーＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断して、４ｎｔまたは５ｎｔの５’突出部を付与する。同文献参照。５’突出部は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構を介した遺伝子挿入を容易にすることができる。ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１は、ヒト細胞においてヌクレアーゼ活性を示すことが示されている。同文献参照。天然に存在するＣｐｆ１分子は、Ｎ末端混合アルファ／ベータドメインおよびＣ末端ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメイン（「ＲｕｖＣドメイン」）を含む。ＲｕｖＣドメインは、３つの分離したＲｕｖＣモチーフ：ＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩを含む。Ｃａｓ９と異なり、Ｃｐｆ１は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いている。また、天然に存在するＣｐｆ１分子は、ＲｕｖＣ  ＩとＲｕｖＣ  ＩＩの間にらせん形の領域を、そしてＲｕｖＣ  ＩＩとＲｕｖＣ  ＩＩＩの間にジンクフィンガー様ドメインを含む。天然に存在するＣｐｆ１分子の構造は、Ｚｅｔｓｃｈｅ（２０１５）に記載されている。
【０２１１】
ＲｕｖＣドメインは、ＦｎＣｐｆ１の全ての触媒残基、例えば、Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５を保持する。ＲｕｖＣドメインは、標的ＤＮＡ、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣの双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生じさせる。
【０２１２】
本開示のＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子と相互作用し、そしてｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインおよびＰＡＭ配列を含む部位に局在する。特定の実施形態では、標的核酸と相互作用して、これを切断するＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドの能力は、ＰＡＭ配列依存的である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。特定の実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。特定の実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の下流で起こる。異なる細菌種由来のＣｐｆ１分子は、異なる配列モチーフ（例えばＰＡＭ配列）を認識することができる。特定の実施形態では、ＰＡＭは、ＴリッチＰＡＭである。特定の実施形態では、ＰＡＭは、ヌクレオチド配列（Ｔ）ｘＮを有し、式中、Ｘは、１〜１０であり、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴである。特定の実施形態では、Ｘは２であるので、ＰＡＭはＴＴＮである。特定の実施形態では、Ｘは３であるので、ＰＡＭはＴＴＴＮである。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子（例えば、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、またはＬｂ２Ｃｐｆ１）は、配列モチーフＴＴＴＮを認識して、当該配列から１〜２４（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４）ｂｐ下流の標的核酸配列の切断を導く。ＰＡＭ配列を認識するＣｐｆ１分子の能力は、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（２０１３）；３１（９）：８３９−８４３に記載される生体外選択アッセイによって判定され得る。
【０２１３】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは：
以下に対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％相同であり；
以下と比較した場合にアミノ酸残基の約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、もしくは約４０％以下が異なり；
以下と少なくとも１、２、５、１０、もしくは２０個のアミノ酸が、しかし１００、８０、７０、６０、５０、４０、もしくは３０個以下のアミノ酸が異なり；または
以下と同一であるアミノ酸配列を含む；
本明細書中で開示されるあらゆるＣｐｆ１分子配列、または天然に存在するＣｐｆ１分子配列、例えば、本明細書中で列挙され、もしくはＺｅｔｓｃｈｅ（２０１５）に記載される種由来のＣｐｆ１分子。
【０２１４】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、基準Ｃｐｆ１分子または基準Ｃｐｆ１ポリペプチドと異なる、操作されたＣｐｆ１分子または操作されたＣｐｆ１ポリペプチドである。特定の実施形態では、基準Ｃｐｆ１分子または基準Ｃｐｆ１ポリペプチドは、天然に存在するＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドである。特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子または操作されたＣｐｆ１ポリペプチドは、基準Ｃｐｆ１分子または基準Ｃｐｆ１ポリペプチドのヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ）活性を保持し、または実質的に保持する。特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子または操作されたＣｐｆ１ポリペプチドは、基準Ｃｐｆ１分子または基準Ｃｐｆ１ポリペプチドの少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％のヌクレアーゼ活性を保持する。
【０２１５】
基準Ｃｐｆ１分子、例えば、天然に存在するＣｐｆ１分子に対する１つまたは複数の突然変異または改変が、導入され得る。そのような突然変異または改変は、置換（例えば、保存的置換または非必須アミノ酸の置換）；挿入；および／または欠失を含み得る。本明細書中で用いられる用語「非必須」アミノ酸残基は、Ｃｐｆ１活性（例えば、ヌクレアーゼ／切断活性）を無効にすることなく、または実質的に改変することなく、Ｃｐｆ１分子、例えば、天然に存在するＣｐｆ１分子の野生型配列から改変され得る残基を指す。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、基準Ｃｐｆ１分子、例えば、天然に存在するＣｐｆ１分子に対して、１つまたは複数の突然変異または改変、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０個の突然変異または改変であるが、２００、１００、または８０個未満の突然変異または改変を含む。突然変異および改変は、混合アルファ／ベータドメイン、ＲｕｖＣドメイン、またはアルファ／ベータドメインおよびＲｕｖＣドメインの混合中に存在し得る。
【０２１６】
特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子または操作されたＣｐｆ１ポリペプチドは、天然に存在するＣｐｆ１分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する、天然に存在するＣｐｆ１分子と異なる、切断特性を含む。例えば、Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、以下のように、天然に存在するＣｐｆ１分子と異なり得る：例えば、二本鎖核酸の切断（エンドヌクレアーゼ活性）の、例えば、天然に存在するＣｐｆ１分子（例えば、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ−１、またはＬｂ２Ｃｐｆ１）と比較した軽減もしくは増大を調節する能力；または核酸分子、例えば、二本鎖核酸分子を切断する能力が、除外されていてよい。
【０２１７】
特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、例えば、２つ以上の異なるＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドの、例えば、異なる種の２つ以上の、天然に存在するＣｐｆ１分子の、融合である。例えば、一種の天然に存在するＣｐｆ１分子のフラグメントが、第２の種のＣｐｆ１分子のフラグメントに融合されてよい。
【０２１８】
天然に存在するＣｐｆ１分子は、特定のＰＡＭ配列、例えば、例えばＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ−１、およびＬｂ２Ｃｐｆ１について先で記載された、５’−ＴＴＴＮ  ＰＡＭ配列を認識することができる。特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子または操作されたＣｐｆ１ポリペプチドは、基準Ｃｐｆ１分子と比較して、ＰＡＭ特異性を改変している（例えば、ＰＡＭ認識に影響を与える）。例えば、天然に存在するＣｐｆ１分子は、例えば、ＰＡＭ配列を改変して、例えば、Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドが認識するＰＡＭ認識を改変して、オフターゲット部位を減少させ、かつ／または特異性を向上させ；またはＰＡＭ認識要件を排除するように、改変されていてよい。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子は改変され得て、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さが増大され、および／またはＣｐｆ１特異性が高い同一性レベルに改善されて、例えば、オフターゲット部位が減少されて特異性が増大される。特定の実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。
【０２１９】
異なるＰＡＭ配列を認識しおよび／またはオフターゲット活性の低下を有するＣｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドは、指向性進化を使用して作成され得る。Ｃｐｆ１分子の指向性進化のために使用され得る代表的な方法およびシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載される。候補Ｃｐｆ１分子は、例えば、セクションＩＶに記載される方法によって評価され得る。
【０２２０】
特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子および操作されたＣｐｆ１ポリペプチドは、分子のサイズを引き下げる１つまたは複数の欠失を含む一方、所望されるＣｐｆ１特性、例えば、本質的に固有の構造、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性；すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生じさせる能力）、および／または核酸分子、例えば、標的核酸もしくはｇＲＮＡの認識活性を保持し、または実質的に保持する（例えば、実質的に影響を与えない、または低下させない）。操作されたＣｐｆ１分子のサイズが小さいほど、送達方法の融通性を増大させることができ、これによって、ゲノム編集の有用性が増す。特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１分子および操作されたＣｐｆ１ポリペプチドはさらに、１つまたは複数のリンカーを含み、リンカーは、欠失の側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。
【０２２１】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子またはＣｐｆ１ポリペプチドをコードする核酸組成物は、合成核酸配列を含む。例えば、合成核酸配列は、化学的に修飾されていてよい。特定の実施形態では、配列ｍＲＮＡは、以下の特性の１つまたは複数、例えば全てを有する：キャッピング、ポリアデニル化、５−メチルシチジンおよび／またはシュードウリジンによる置換。
【０２２２】
加えて、または代わりに、合成核酸配列は、コドン最適化されていてよく、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンまたはあまり一般的でないコドンが、一般的なコドンによって置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、例えば本明細書中に記載される哺乳類発現系における発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。
【０２２３】
加えて、または代わりに、配列分子または配列ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでよい。核局在化配列は、当該技術において知られている。
【０２２４】
ＡｓＣｐｆ１をコードする例示的なヒトコドン最適化核酸配列が、配列番号３７２２で示されており、これは、以下に記載される。
2019507599.tif 000004
2019507599.tif 000005
2019507599.tif 000006
【０２２５】
配列番号３７２２で示されるヌクレオチド配列によってコードされる、対応するアミノ酸配列が、配列番号３７２５で示されており、これは、以下に記載される。
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【０２２６】
ＬｂＣｐｆ１をコードする例示的なヒトコドン最適化核酸配列が、配列番号３７２３で示されており、これは、以下に記載される。
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2019507599.tif 000009
2019507599.tif 000010
【０２２７】
配列番号３７２３で示されるヌクレオチド配列によってコードされる、対応するアミノ酸配列が、配列番号３７２６で示されており、これは、以下に記載される。
2019507599.tif 000011
【０２２８】
Ｌｂ２Ｃｐｆ１をコードする例示的なヒトコドン最適化核酸配列が、配列番号３７２４で示されており、これは、以下に記載される。
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2019507599.tif 000013
2019507599.tif 000014
【０２２９】
配列番号３７２４で示されるヌクレオチド配列によってコードされる、対応するアミノ酸配列が、配列番号３７２７で示されており、これは、以下に記載される。
2019507599.tif 000015
【０２３０】
Ｃｐｆ１活性に関与する領域、例えば、標的核酸分子および／またはｇＲＮＡとの境界面から空間的に遠位に位置する低保存領域または非保存領域は、Ｃｐｆ１活性に実質的に影響を与えない、またはこれを低下させない欠失の候補領域または候補ドメインを表す。
【０２３１】
配列比較のために、典型的に１つの配列が参照配列の役割を果たし、それと試験配列とが比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力されて、必要ならば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータが使用され得てまたは代案のパラメータが指定され得る。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、標準配列と比較して、試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列アラインメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アライメントおよび目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって、実施され得る。
【０２３２】
配列同一性百分率および配列類似性を判定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に利用可能である。
【０２３３】
２つのアミノ酸配列間の同一性百分率はまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、評価され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのどちらか、およびギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み付け１、２、３、４、５、または６を使用して、判定され得る。
【０２３４】
ＩＶ．候補分子の機能解析
候補Ｃｐｆ１分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃｐｆ１分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例えば、Ｃｐｆ１分子のエンドヌクレアーゼ活性評価する代表的な方法は、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）；１６３：７５９−７７１に記載される。
【０２３５】
結合および切断アッセイ：Ｃｐｆ１分子のエンドヌクレアーゼ活性を試験する
Ｃｐｆ１分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写ｇＲＮＡ分子が、９５℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））が、１０ｍＭのＭｇＣｌ２存在下または不在下において、Ｃｐｆ１プラスミド切断緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中の精製Ｃｐｆ１タンパク質分子（５０〜５００ｎＭ）およびｇＲＮＡ（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に、３７℃で６０分間インキュベートされる。反応は、５×ＤＮＡローディングバッファー（３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）によって停止され、０．８または１％アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Ｃｐｆ１分子が、双方のＤＮＡ鎖を切断するか、または二本鎖の１本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖ＤＮＡ生成物は、双方のＤＮＡ鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の１本のみが切断されていることを示す。
【０２３６】
代案としては、Ｃｐｆ１分子／ｇＲＮＡ分子複合体が、標的核酸に結合して切断する能力は、オリゴヌクレオチドＤＮＡ切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド（１０ｐｍｏｌ）が、１×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液中の５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび約３〜６ｐｍｏｌ（約２０〜４０ｍＣｉ）の［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰと、５０μＬの反応物中で３７℃で３０分間インキュベートすることで、放射性標識される。加熱不活性化（６５℃で２０分間）後、カラムに通して反応物が精製され、組み込まれていない標識が除去される。標識オリゴヌクレオチドと、等モル量の未標識相補的オリゴヌクレオチドとの９５℃で３分間のアニーリングによって、二本鎖基質（１００ｎＭ）が生成され、室温への緩慢な冷却がそれに続く。切断アッセイでは、９５℃で３０秒間加熱することでｇＲＮＡ分子がアニールされ、室温への緩慢な冷却がそれに続く。Ｃｐｆ１（５００ｎＭ最終濃度）が、切断アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール）中のアニールされたｇＲＮＡ分子（５００ｎＭ）と共に、総容積９μｌでプレインキュベートされる。１μｌの標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の添加によって反応が開始され、３７℃で１時間インキュベートされる。２０μｌのローディング色素（ホルムアミド中の５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２５％ＳＤＳ、５％グリセロール）の添加によって反応物がクエンチされ、９５℃で５分間加熱される。分解産物は、７Ｍ尿素を含有する１２％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ホスホロイメージングによって視覚化される。得られた分解産物は、相補鎖、非相補鎖、またはその双方が切断されたかどうかを示す。
【０２３７】
これらのアッセイの片方または双方を使用して、候補ｇＲＮＡ分子または候補Ｃｐｆ１分子の適合性が評価され得る。
【０２３８】
結合アッセイ：Ｃｐｆ１分子の標的ＤＮＡへの結合を試験する
Ｃｐｆ１分子の標的ＤＮＡへの結合を評価する代表的な方法は、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１５）；１６３：７５９−７７１に記載される。
【０２３９】
例えば、電気泳動移動度シフト解析では、脱イオン水中で各鎖（１０ｎｍｏｌ）を混合して、９５℃で３分間加熱し、室温に緩慢に冷却することで、標的ＤＮＡ二本鎖が形成される。全てのＤＮＡは、１×ＴＢＥを含有する８％天然ゲル上で精製される。ＤＮＡバンドは、ＵＶシャドーイングによって視覚化され、切除されて、ゲル小片をＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに浸漬することで溶出される。溶出されＤＮＡは、エタノール沈殿されて、ＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解される。ＤＮＡサンプルは、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを使用して、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃で３０分間にわたり５’末端標識される。ポリヌクレオチドキナーゼは、６５℃で２０分間加熱変性され、カラムを使用して、組み込まれていない放射性標識が除去される。結合アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、および１０％グリセロールを含有する緩衝液中で、総容積１０μｌで実施される。Ｃｐｆ１タンパク質分子は、等モル量のプレアニールｇＲＮＡ分子でプログラムされて、１００ｐＭから１μＭに滴定される。放射性標識ＤＮＡが、２０ｐＭの最終濃度に添加される。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートされ、１×ＴＢＥおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する８％天然ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で分離される。ゲルは乾燥されて、ＤＮＡはホスホロイメージングによって視覚化される。
【０２４０】
示差走査型蛍光定量法（Ｆｌｏｕｒｉｍｅｔｒｙ）（ＤＳＦ）
Ｃｐｆ１−ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦによって測定され得る。この技術は、例えば、ｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る、タンパク質の熱安定性を測定する。
【０２４１】
アッセイは、１つはｇＲＮＡ：Ｃｐｆ１タンパク質の最良の化学量論比を試験し、もう１つはＲＮＰ形成のための最良の溶液条件を判定する、２つの異なるプロトコルを使用して実施される。
【０２４２】
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Ｃｐｆ１の２ｕＭ水溶液＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が３８４ウェルプレート内に分注される。次に、様々なｐＨの溶液中で希釈された等モル量のｇＲＮＡ、および塩が添加される。室温で１０秒間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０２４３】
第２のアッセイは、上記アッセイ１からの最適緩衝液中で、様々な濃度のｇＲＮＡと２ｕＭ  Ｃｐｆ１を混合して、３８４ウェルプレート内で、室温で１０秒間インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液＋１０×ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｓ−６６５０）が添加され、プレートはＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ粘着剤（ＭＳＢ−１００１）で密封される。あらゆる気泡を除去するための短時間遠心分離に続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアと共に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ３８４（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、１０秒毎に１℃の温度増大で２０℃から９０℃への勾配が実行される。
【０２４４】
Ｖ．ゲノム編集アプローチ
一般に、本明細書に記載される方法に従った任意の遺伝子の改変は、任意の機序によって媒介され得て、任意の方法は特定の機序に限定されないものと理解される。遺伝子改変に関連し得る代表的機序としては、非相同末端結合（例えば、古典的または代替）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同指向修復（例えば、内在性供与体テンプレート媒介性）、およびＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載されるのは、ＮＨＥＪを使用して、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢまたは、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子の対立遺伝子の片方または双方を標的ノックアウトする代表的方法である（セクションＶ．１を参照されたい）。特定の実施形態では、ノックアウトのために、開示される方法が、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、またはＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子の２つ以上を標的化してもよいことがさらに検討される。
【０２４５】
Ｖ．１  遺伝子ターゲッティングのためのＮＨＥＪアプローチ
本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して、標的遺伝子特異的ノックアウトが実施され得る。ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪはまた、対象遺伝子中の配列挿入を除去す（例えば、欠失させ）るのにも使用され得る。
【０２４６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に関連するゲノムの改変は、ヌクレアーゼ誘導ＮＨＥＪと、ＮＨＥＪ修復経路の誤りがちな性質とに依存すると考えられる。ＮＨＥＪは、２つの末端を共に連結することで、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する；しかし、通常、元の配列は、それらが二本鎖切断によって形成された真にその通りの２つの適合性末端が、完璧にライゲートされた場合に限り、復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は、しばしば酵素的プロセッシングの対象であり、末端の再結合に先だって、片方または双方の鎖に、ヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。これは、ＮＨＥＪ修復部位におけるＤＮＡ配列の挿入および／または欠失（インデル）変異の存在をもたらす。これらの変異の３分の２は、典型的に、読み枠を改変し、したがって、非機能性タンパク質が生じる。それに加えて、読み枠を維持するが、顕著な量の配列を挿入または欠失させる変異は、タンパク質の機能性を破壊し得る。タンパク質の重要な機能ドメインの変異は、重要でない領域の変異よりもおそらく許容性が低いので、これは遺伝子座依存性である。
【０２４７】
ＮＨＥＪによって生成されるインデル変異は、自然界では予測不可能である；しかし、所与の切断部位では、おそらく小規模なマイクロホモロジー領域のために、特定のインデル配列が好まれ、母集団中で大きな比率を占める。欠失の長さは、幅広く変動し得て；最も一般的には、１〜５０ｂｐの範囲であるが、それらは１００〜２００ｂｐを超える範囲に容易に達し得る。挿入はより短い傾向があり、多くの場合、切断部位に隣接して取り囲む、短い配列重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、多くの場合、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡにトレースされている。
【０２４８】
ＮＨＥＪは変異原性過程であるので、特定の最終配列の生成が要求されない限り、それはまた小規模な配列モチーフを欠失させるのにも使用され得る。二本鎖切断が、短い標的配列の近くで標的化される場合、ＮＨＥＪによって引き起こされる修復欠失変異は、頻繁に望まれないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大型のＤＮＡ断片の欠失では、配列の両側に１つずつ２つの二本鎖切断が導入されて、介在配列全体が除去され、末端の間にＮＨＥＪがもたらされ得る。これらのアプローチの双方を使用して、特定のＤＮＡ配列が欠失され得る；しかし、ＮＨＥＪの誤りがちな性質は、修復部位に、インデル変異をなおも生成してもよい。
【０２４９】
例えば、対象遺伝子の早期コード領域のようなコード領域などの遺伝子に標的化されるＮＨＥＪ媒介インデルを使用して、対象遺伝子がノックアウト（すなわち発現排除）され得る。例えば、対象遺伝子の早期コード領域は、コード配列の第１のエクソン内の、または転写開始部位の５００ｂｐ以内（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の転写開始部位直後の配列を含む。
【０２５０】
特定の実施形態では、ＮＨＥＪ媒介インデルが、１つまたは複数のＴ細胞発現遺伝子中に導入される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を２つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のいずれか２つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、双方の遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと一緒に提供される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を３つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のいずれか３つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、３つ全ての遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を４つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のいずれか４つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、４つ全ての遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を５つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のいずれか５つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、５つ全ての遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を６つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のいずれか６つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、６つ全ての遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を７つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のいずれか７つの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、７つ全ての遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼが、突然変異を８つのＴ細胞発現遺伝子、例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、およびＴＲＢＣ遺伝子のそれぞれの中に導入するのに用いられる特定の実施形態では、８つ全ての遺伝子を標的化する個々のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対が、Ｃｐｆ１二本鎖ヌクレアーゼと共に提供される。
【０２５１】
標的位置に対する二本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介インデルを誘導する目的で、ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じさせる特定の実施形態では、ｇＲＮＡ、例えば、ユニモジュラーｇＲＮＡ分子が、標的位置のヌクレオチドの近傍に、１つの二本鎖切断を配置するように構成されている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０ｂｐ未満、２５ｂｐ未満、２０ｂｐ未満、１５ｂｐ未満、１０ｂｐ未満、９ｂｐ未満、８ｂｐ未満、７ｂｐ未満、６ｂｐ未満、５ｂｐ未満、４ｂｐ未満、３ｂｐ未満、２ｂｐ未満、または１ｂｐ）離れている。特定の実施形態では、切断部位は、標的位置から１〜２４ｂｐ離れている。
【０２５２】
二本鎖切断Ｃｐｆ１分子は、標的位置の両側切断を生じさせるのに、本明細書中に記載される方法および組成物に用いられ得る。二本鎖切断は、２つの切断間の核酸配列を除去する（例えば、２つの切断間の領域を欠失させる）のに、標的位置の両側で生じ得る。特定の実施形態では、２つのｇＲＮＡは、標的位置の両側に二本鎖切断を配置するように構成されている。
【０２５３】
Ｖ．２  ゲノム編集方法におけるｇＲＮＡおよびＣｐｆ１分子
本明細書中で開示されるｇＲＮＡ分子（例えば、セクションＩで開示されるもの）は、二本鎖切断を生じさせて標的核酸の配列、例えば、標的位置または標的遺伝的シグネチャを改変する、本明細書中で開示されるＣｐｆ１分子（例えば、セクションＩＩＩで開示されるもの）に用いられ得る。特定の実施形態では、例えば、Ｃｐｆ１分子を標的化して二本鎖切断をもたらす場合に、ｇＲＮＡは、二本鎖切断を、（ｉ）標的位置の５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは５００ヌクレオチド以内に、または（ｉｉ）標的位置が末端切除の領域内にあるほど十分に近くに、配置する。
【０２５４】
ＶＩ．標的細胞
例えば、Ｃｐｆ１分子／ｇＲＮＡ分子複合体などのＣｐｆ１分子およびｇＲＮＡ分子を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するなど、細胞が操作され得る。
【０２５５】
特定の実施形態では、細胞は、例えば、本明細書に記載されるような１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異を誘導する）ことで操作される。特定の実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子）の発現が調節される。特定の実施形態では、細胞は、１つまたは複数の標的遺伝子を編集する（例えば、変異を誘導する）ことで、および／または例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節することで、生体外で操作されて、対象に投与される。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。生体外操作のための標的細胞の起源としては、例えば、異種供与者血液、臍帯血、または骨髄もまた挙げられる。
【０２５６】
分子本明細書に記載されるＣｐｆ１およびｇＲＮＡは、標的細胞に送達され得る。特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、中枢記憶Ｔ細胞、またはエフェクター記憶Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞記憶Ｔ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）または樹状細胞などのＴ細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、対象から作成されて、操作され、改変された（例えば、変異誘導された）、または例えば、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣおよび／またはＴＲＢＣ遺伝子などの１つまたは複数の標的遺伝子の発現が操作されて、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋未感作Ｔ細胞、中枢記憶Ｔ細胞、またはエフェクター記憶Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、幹細胞記憶Ｔ細胞などのＴ細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化した、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞に由来する細胞である。
【０２５７】
特定の実施形態では、標的細胞は、特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ遺伝子）を含有するように改変されている。特定の実施形態では、ＴＣＲは、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＰ１００、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ１）、メラノーマ抗原Ａ３（ＭＡＧＥＡ３）、ＮＹＥＳＯ１またはｐ５３などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【０２５８】
特定の実施形態では、標的細胞は、特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有するように改変されている。特定の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＲＢＢ２、ＧＤ２、α−葉酸受容体、ルイスＹ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）または腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。
【０２５９】
特定の実施形態では、標的細胞は、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲなどによって、以下の腫瘍抗原の１つまたは複数に結合するように改変されている。腫瘍抗原としては、ＡＤ０３４、ＡＫＴ１、ＢＲＡＰ、ＣＡＧＥ、ＣＤＸ２、ＣＬＰ、ＣＴ−７、ＣＴ８／ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ｃＴＡＧＥ−１、フィビュリン−１、ＨＡＧＥ、ＨＣＡ５８７／ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｈＣＡＰ−Ｇ、ＨＣＥ６６１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ｃｗ、ＨＯＭ−ＨＤ−２１／ガレクチン９、ＨＯＭ−ＭＥＥＬ−４０／ＳＳＸ２、ＨＯＭ−ＲＣＣ−３．１．３／ＣＡＸＩＩ、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＢ６、Ｈｕ、ＨＵＢ１、ＫＭ−ＨＮ−３、ＫＭ−ＫＮ−１、ＫＯＣ１、ＫＯＣ２、ＫＯＣ３、ＫＯＣ３、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＰＰ１１、ＭＳＬＮ、ＮＮＰ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＮＹ−ＢＲ−８５、ＮＹ−ＣＯ−３７、ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−５、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＮＹ−ＲＥＮ−１０、ＮＹ−ＲＥＮ−１９／ＬＫＢ／ＳＴＫ１１、ＮＹ−ＲＥＮ−２１、ＮＹ−ＲＥＮ−２６／ＢＣＲ、ＮＹ−ＲＥＮ−３／ＮＹ−ＣＯ−３８、ＮＹ−ＲＥＮ−３３／ＳＮＣ６、ＮＹ−ＲＥＮ−４３、ＮＹ−ＲＥＮ−６５、ＮＹ−ＲＥＮ−９、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＯＧＦｒ、ＰＬＵ−１、Ｒａｂ３８、ＲＢＰＪκ、ＲＨＡＭＭ、ＳＣＰ１、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ３、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＴＯＰ２Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、またはチロシナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６０】
ＶＩＩ．送達、調合物、および投与経路
構成要素、例えば、Ｃｐｆ１分子およびｇＲＮＡ分子は、種々の送達方法および調合物を用いて、種々の形態で標的細胞中に導入され得る。例えば、表２および表３参照。Ｃｐｆ１またはｇＲＮＡ構成要素が送達のためにＤＮＡとしてコードされる場合、ＤＮＡは、必須ではないが典型的に、発現をもたらすための制御領域を含んでもよく、例えば、プロモーターを含む。Ｃｐｆ１分子配列に有用なプロモーターとして、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＣＡＧプロモーター、骨格アルファアクチンプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター、ジストロフィンプロモーター、アルファミオシン重鎖プロモーター、および平滑筋アクチンプロモーターが挙げられる。ｇＲＮＡに有用なプロモーターとして、例えば、Ｈ１、７ＳＪ、ＥＦ−１ａ、ｔＲＮＡ、またはＵ６プロモーターが挙げられる。強度が同程度の、または異なるプロモーターが、構成要素の発現を調整するのに選択されてよい。Ｃｐｆ１分子をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳを含んでもよい。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子をコードする配列は、少なくとも２つの核局在化シグナルを含む。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子またはｇＲＮＡ分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
【０２６１】
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【０２６２】
表３は、本明細書中に記載される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の構成要素、例えば、Ｃｐｆ１分子構成要素およびｇＲＮＡ分子構成要素についての種々の送達方法を要約する。
【０２６３】
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【０２６４】
Ｃｐｆ１分子および／または１つもしくは複数のｇＲＮＡ分子の、ＤＮＡベースの送達
Ｃｐｆ１分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸組成物は、当該技術分野で既知の方法によって、または本明細書中に記載されるようにして、対象に投与され得、または細胞中に送達され得る。例えば、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を用いる）、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０２６５】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。
【０２６６】
特定の実施形態では、ベクターは、Ｃｐｆ１分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む。特定の実施形態では、ベクターはさらに、例えば、Ｃｐｆ１分子配列と融合した、（例えば、核局在化、核小体局在化、ミトコンドリア局在化のための）シグナルペプチドをコードする配列を含む。例えば、ベクターは、Ｃｐｆ１分子をコードする配列に融合された、核局在化配列（例えばＳＶ４０由来）を含んでよい。
【０２６７】
例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライス受容体またはドナーなどの１つまたは複数の調節的／制御要素が、ベクターに包含され得る。特定の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶプロモーター）によって認識される。特定の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えば、Ｕ６プロモーター）によって認識される。特定の実施形態では、プロモーターは、調節プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。
【０２６８】
特定の実施形態では、ベクターまたは送達ビヒクルは、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルス生成のための）である。特定の実施形態では、ウイルスは、ＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。特定の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。代表的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。
【０２６９】
特定の実施形態では、ウイルスは、分裂細胞に感染する。特定の実施形態では、ウイルスは、非分裂細胞に感染する。特定の実施形態では、ウイルスは、分裂および非分裂細胞の双方に感染する。特定の実施形態では、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。特定の実施形態では、ウイルスは、複製能力がある。特定の実施形態では、ウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。特定の実施形態では、ウイルスは、Ｃｐｆ１分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性の発現を引き起こす。特定の実施形態では、ウイルスは、Ｃｐｆ１分子および／またはｇＲＮＡ分子の例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、２年間、または恒久的などの持続性の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング容量は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂ、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂなどで変動してもよい。
【０２７０】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、特定の細胞型または組織を認識する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替のウイルス外被糖タンパク質で偽型化され得；細胞型特異的受容体で操作され得（例えば、標的化リガンド、例えばペプチドリガンド、一本鎖抗体、または成長因子を組み込むための、１つまたは複数のウイルス外被糖タンパク質の遺伝的修飾）；かつ／または一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識して、他方の末端が標的細胞表面の部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有するように操作され得る（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【０２７１】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えレトロウイルスによって送達される。特定の実施形態では、レトロウイルス（例えばモローニマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノム中への統合を可能にする、逆転写酵素を含む。特定の実施形態では、レトロウイルスは、複製能力がある。特定の実施形態では、レトロウイルスは複製欠陥であり、例えば、ビリオン複製およびパッケージングの追加的なラウンドに必要な遺伝子のための１つまたは複数のコード領域が、その他の遺伝子で置換されまたは欠失される。
【０２７２】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、例えば、ウイルス複製に必要な１つまたは複数の遺伝子を含まないなど、複製欠陥である。
【０２７３】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えアデノウイルスによって送達される。特定の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトにおいて免疫低下を有するように改変される。
【０２７４】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、組換えＡＡＶによって送達される。特定の実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを、本明細書中に記載されるように、宿主細胞、例えば標的細胞のゲノム中に組み込まない。特定の実施形態では、ＡＡＶは、そのゲノムを、本明細書中に記載されるように、宿主細胞、例えば標的細胞のゲノム中に組み込み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、共にアニールして二本鎖ＤＮＡを形成する双方の鎖をパッケージするｓｃＡＡＶである。開示される方法に用いられ得るＡＡＶ血清型として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、および／またはＳ６６２Ｖにて修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、および／またはＴ４９２Ｖにて修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにて修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈｌ０が挙げられ、偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、およびＡＡＶ２／６もまた、開示された方法に用いられ得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法に用いられ得るＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１、またはＡＡＶ７ｍ８由来のカプシド配列である。
【０２７５】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、再操作されたＡＡＶカプシド中で送達され、これは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３、ＡＡＶ．ｒｈ４３、またはＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１由来のカプシド配列との配列相同性が、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上である。
【０２７６】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、キメラＡＡＶカプシドによって送達される。例示的なキメラＡＡＶカプシドとして、以下に限定されないが、ＡＡＶ９ｉ１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、またはＡＡＶ８Ｇ９が挙げられる。
【０２７７】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書中に記載されるウイルスの１つまたは複数のハイブリッドによって送達される。特定の実施形態では、ハイブリッドウイルスは、（例えば、あらゆるＡＡＶ血清型の）ＡＡＶの、ボカウイルス、Ｂ１９ウイルス、ブタＡＡＶ、ガチョウＡＡＶ、ネコＡＡＶ、イヌＡＡＶ、またはＭＶＭとのハイブリッドである。
【０２７８】
パッケージング細胞が使用されて、標的細胞を感染させる能力があるウイルス粒子が形成される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージし得る２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージし得るψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的に、パッケージングと（妥当な場合）引き続く宿主または標的細胞への組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、例えばＣｐｆ１などの発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的に、パッケージングおよび宿主または標的細胞内の遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに提供される。この後、ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列が欠如しているヘルパープラスミドを含有する、細胞株内にパッケージされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベクター複製とＡＡＶ遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のために、顕著な量でパッケージされない。アデノウイルスの混入は、例えば、それに対してアデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い、加熱処理によって低下させ得る。
【０２７９】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型および／または組織型の認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代案のウイルス外被糖タンパク質による偽型であり得て；細胞型特異的受容体によって改変され（例えば、ペプチドリガンド、一本鎖抗体、成長因子などの標的化リガンドに組み込むためのウイルス外被糖タンパク質の遺伝子修飾）；および／または改変されて、一端がウイルス糖タンパク質を認識して、もう一方の末端が標的細胞表面部分を認識する、二重特異性がある分子ブリッジを有する（例えば、リガンド受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチン、および化学的結合）。
【０２８０】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、組織特異的プロモーターが構築されて、特異的標的細胞のみで導入遺伝子（Ｃｐｆ１およびｇＲＮＡ）の発現が制限され得る。ベクターの特異性はまた、導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存性調節によって媒介され得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合効率の増大を有する。例えば、融合能力がある赤血球凝集素（ＨＡ）などのが組み込みまれて、細胞内へのウイルス取り込みが増大され得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、核局在化能力を有する。例えば、（細胞分裂中に）核膜の分解を要し、したがって非分裂細胞に感染しない特定のウイルスは、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在化ペプチドを組み込むように改変され得て、それによって非増殖性細胞への形質導入が可能になる。
【０２８１】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）非ベクターベースの方法によって送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ  ［２０１２］  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介形質移入、デンドリマー、無機ナノ粒子、カルシウムリン酸塩、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。
【０２８２】
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣｐｆ１および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、細胞がＣｐｆ１および／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡと混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０２８３】
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１をコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、不活性化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）と組み合わされたリポソームを含み、それはウイルスまたはリポソーム法単独のどちらよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【０２８４】
特定の実施形態では、送達ビヒクルは、非ウイルスベクターである。特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、無機ナノ粒子である。代表的な無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えば、Ｆｅ３ＭｎＯ２）、およびシリカが挙げられる。ナノ粒子の外面は、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）を可能にする正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、非ウイルスベクターは、有機ナノ粒子である。例示的な有機ナノ粒子として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された中性ヘルパー脂質、および脂質コーティングで被覆されたプロタミン核酸複合体と共に、カチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。遺伝子移入のための例示的な脂質が、以下で表４に示される。
【０２８５】
2019507599.tif 000018
【０２８６】
遺伝子移入のための例示的なポリマーが、以下で表５に示される。
【０２８７】
2019507599.tif 000019
【０２８８】
特定の実施形態では、ビヒクルは、標的化修飾を有して、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドなどのナノ粒子およびリポソームの標的細胞アップデート（ｕｐｄａｔｅ）が増大される。特定の実施形態では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを利用する。特定の実施形態では、ビヒクルは、酸誘発性立体構造変化を受ける（例えば、カーゴのエンドソーム漏出を加速するために）。特定の実施形態では、例えば、細胞区画内の放出のために、刺激切断可能ポリマーが使用される。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。
【０２８９】
特定の実施形態では、送達ビヒクルは、生物学的非ウイルス送達ビヒクルである。特定の実施形態では、ビヒクルは、弱毒型細菌（例えば、侵入性であるが弱毒化されて発病を予防して導入遺伝子を発現するように、天然にまたは人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、特定のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および改変大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；栄養および組織特異的親和性を有して特定細胞を標的化する細菌；修飾表面タンパク質を有して標的細胞特異性を改変する細菌）である。特定の実施形態では、ビヒクルは、遺伝子修飾されたバクテリオファージである（例えば、改変ファージは、大きなパッケージング容量を有し、免疫原性がより低く、哺乳類プラスミド維持配列を含有して、組み込まれた標的化リガンドを有する）。特定の実施形態では、ビヒクルは、哺乳類ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子が生成され得る（例えば、「空の」粒子精製と、それに続く、所望のカーゴがあるウイルスの生体外構築によって）。ビヒクルはまた改変されて、標的化リガンドが組み込まれ、標的組織特異性が改変され得る。特定の実施形態では、ビヒクルは、生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞（例えば、対象に由来する球状構造に分解された赤血球である赤血球ゴーストに由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、組織標的化が、様々な組織または細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）；またはエンドサイトーシス起源の分泌型エキソソーム−対象由来膜結合ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から生成され得て、したがってリガンド標的化の必要なしに細胞に取り込まれ得る）である。
【０２９０】
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの構成要素、例えば、本明細書中に記載されるＣｐｆ１分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素以外の１つまたは複数の核酸組成物（例えばＤＮＡ分子）が送達される。特定の実施形態では、核酸組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの構成要素の１つまたは複数と同時に送達される。特定の実施形態では、核酸組成物は、Ｃｐｆ１システムの構成要素の１つまたは複数が送達される前後（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週、または４週未満）に送達される。特定の実施形態では、核酸組成物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの構成要素、例えば、Ｃｐｆ１分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素の１つまたは複数とは異なる手段によって送達される。核酸組成物は、本明細書中に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによって送達され得、そしてＣｐｆ１分子構成要素および／またはｇＲＮＡ分子構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。特定の実施形態では、核酸組成物は、ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、またはＴＲＢＣ遺伝子をコードする。
【０２９１】
Ｃｐｆ１分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃｐｆ１分子をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子は、細胞、例えば、本明細書中に記載される標的細胞中に、当該技術分野で既知の方法によって、または本明細書中に記載されるようにして、送達され得る。例えば、Ｃｐｆ１をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ［２０１２］Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載される）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Ｃｐｆ１をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書中に記載される標的細胞）による吸収を促進する分子に結合されてよい。
【０２９２】
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣｐｆ１分子をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子と混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣｐｆ１分子をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡ分子と混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。Ｃｐｆ１をコードするＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、標的細胞（例えば、本明細書中に記載される標的細胞）による吸収を促進する分子に結合されてよい。
【０２９３】
Ｃｐｆ１分子タンパク質の送達
Ｃｐｆ１分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Ｃｐｆ１タンパク質分子は、例えば、ｂｙマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾（例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ［２０１２］Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １２：６３２２−２７に記載されるような）、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、またはｇＲＮＡを伴い得る。
【０２９４】
特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内で、細胞をＣｐｆ１分子とｇＲＮＡ分子ありまたはなしで混合し、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスを適用するステップを含む。特定の実施形態では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベットに混合物を供給する装置（例えばポンプ）と連結する容器内で、容器内で、細胞がＣｐｆ１分子とｇＲＮＡ分子ありまたはなしで混合され、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内では、規定の時間と振幅で１回または複数回の電気インパルスが適用され、その後、細胞が第２の容器に送達される、システムを使用して実施される。
【０２９５】
Ｃｐｆ１分子タンパク質およびｇＲＮＡのＲＮＰ送達
特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子およびｇＲＮＡは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達を介して、標的細胞に送達される。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子は、タンパク質として提供され、そしてｇＲＮＡ分子は、転写または合成されたＲＮＡとして提供される。ｇＲＮＡ分子は、化学合成によって生成され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的細胞への送達前に、適切な条件下で、Ｃｐｆ１分子タンパク質とのＲＮＰ複合体を形成する。特定の実施形態では、適切な条件は、室温にて少なくとも約１０分間、Ｃｐｆ１分子タンパク質およびｇＲＮＡをインキュベートすることを含む。ＲＮＰ複合体は、当該技術において知られている適切なあらゆる方法によって、例えば、電気穿孔、脂質媒介形質移入、タンパク質もしくはＤＮＡベースのシャトル、機械力、または動水力（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｆｏｒｃｅ）によって、標的細胞に送達され得る。特定の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、電気穿孔によって標的細胞に送達される。
【０２９６】
ＶＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸、例えば、特にｇＲＮＡ中に存在し得るが、Ｃｐｆ１分子をコードする核酸中にも存在し得る。このセクションで開示される修飾は、先に記載した具体的なｇＲＮＡ分子修飾のいずれかに加えて、またはその代わりになされ得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、５つの炭素砂糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体と、１つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
【０２９７】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つまたは複数を含み得る：
（ｉ）例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および／または結合リン酸酸素の１つまたは複数の置換などの改変；
（ｉｉ）例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換；
（ｉｖ）天然起源核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾；および
（ｖｉｉ）糖の修飾。
【０２９８】
上に列挙される修飾を混合して、２、３、４つ以上の修飾を有し得る、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供され得る。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの各塩基は修飾され、例えば、全ての塩基が、例えば、全てホスホロチオエート基であるなど、修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、単分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子の全ての、または実質的に全てのリン酸基は、ホスホロチオエート基で置換される。
【０２９９】
特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるような修飾を有するヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドが、例えば、「修飾核酸」などの核酸に組み込まれ得る。特定の実施形態では、修飾核酸は、１、２、３つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾核酸内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）は、修飾ヌクレオチドである。
【０３００】
未修飾核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによって分解され易くあり得る。例えば、ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載される修飾核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得て、例えば、ヌクレアーゼに安定性が導入される。
【０３０１】
特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示し得る。「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、主溝相互作用パートナーの核酸との結合を妨害し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、細胞集団内に導入されると、先天性免疫応答の低下を示して、そしてまた主溝相互作用パートナーの核酸との結合も妨害し得る。
【０３０２】
化学基の定義
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０個、２〜約２０個、１〜約１２個、１〜約８個、１〜約６個、１〜約４個、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
【０３０３】
本明細書の用法では、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなどの単環または多環（例えば、２、３または４つの融合環を有する）芳香族炭化水素を指す。特定の実施形態では、アリール基は、６〜約２０個の炭素原子を有する。
【０３０４】
本明細書の用法では、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。
【０３０５】
本明細書の用法では、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、１つまたは複数の三重結合を有することで特徴付けられる、直鎖または分枝炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３０６】
本明細書の用法では、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基で置換された、アルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基で置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
【０３０７】
本明細書の用法では、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３０８】
本明細書の用法では、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価の基を指す。典型的なヘテロシクリルとしては、制限なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
【０３０９】
本明細書の用法では、「ヘテロアリール」は、複素環式芳香族環系の一価の基を指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる、が、これに限定されるものではない。
【０３１０】
リン酸塩骨格修飾
リン酸基
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、１つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。特定の実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
【０３１１】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。特定の実施形態では、リン酸骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置換され得る：イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）。未修飾リン酸基中の亜リン酸原子は、アキラルである。しかし、上の原子または原子群の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、亜リン酸原子をキラルにし得て；すなわち、このようにして修飾されたリン酸基中の亜リン酸原子が、立体中心である。ステレオジェン亜リン酸原子は、「Ｒ」構造（本明細書のＲｐ）または「Ｓ」構造（本明細書のＳｐ）のどちらかを有し得る。
【０３１２】
ホスホロジチオエートは、双方の非架橋酸素がイオウで置換されている。ホスホロジチオエートのリン中心はアキラルであり、それは、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除する。特定の実施形態では、非架橋酸素の片方または双方の修飾はまた、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による、非架橋酸素の置換も含み得る。
【０３１３】
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、イオウ（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の置換によって修飾され得る。置換は、どちらかの連結酸素で、または双方の連結酸素で起こり得る。
【０３１４】
リン酸基の置換
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。特定の実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
【０３１５】
リン酸基を置換し得る部分の例としては、制限なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、酸化エチレンリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。
【０３１６】
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。特定の実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
【０３１７】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に１つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。特定の実施形態では、２’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、２’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
【０３１８】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択的に置換されたアルキルであり得て、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であり得る）が挙げられる。特定の実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾は、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含み得て、その中では、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同一リボース糖の４’炭素に連結され得て、代表的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ、（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。特定の実施形態では、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）が挙げられる。
【０３１９】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、例えば、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分のデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書に記載されるようであり得る）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および本明細書に記載されるようなアミノで任意選択的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。
【０３２０】
糖類は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する、１つまたは複数の炭素もまた含有し得る。したがって、修飾核酸としては、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチド「単量体」は、例えば、αヌクレオシドなど、糖の１’位にα結合を有し得る。修飾核酸としては、Ｃ−１’の核酸塩基を欠失している「脱塩基」糖もまた挙げられる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つまたは複数でさらに修飾され得る。修飾核酸はとしてはまた、例えばＬ−ヌクレオシドなどのＬ形態の１つまたは複数の糖も挙げられる。
【０３２１】
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖類リボースを含む。代表的な修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドとしては、多環形態（例えば、トリシクロ；および（例えば、リボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換されるＲ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡなどの）グリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態、トレオース核酸（ＴＮＡ、リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）が挙げられる。
【０３２２】
核酸塩基上の修飾
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。特定の実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
【０３２３】
ウラシル
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレン含有−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｎｅ）を有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ���ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【０３２４】
シトシン
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
【０３２５】
アデニン
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデノシン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシジルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデノシン、２−メチルチオ−アデノシン、２−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０３２６】
グアニン
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ウィブトシン（ｙＷ）、ペルオキシウィブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ）、低修飾ヒドロキシウィブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ’Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ’Ｉｍ）、Ｏ６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０３２７】
代表的修飾ｇＲＮＡ
特定の実施形態では、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。本明細書中に記載されるいずれのｇＲＮＡも、このセクションに従って修飾され得ることが理解されるべきであり、配列番号１〜３７０７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む標的化ドメインを含むあらゆるｇＲＮＡが挙げられる。本明細書中で考察されるように、一過性に発現された、または送達された核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによって、分解される傾向があり得る。したがって、一態様において、本明細書中に記載される修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、本明細書中に記載される特定の修飾ｇＲＮＡは、特定の細胞、特に本発明の細胞（例えばＴ細胞）からの先天性免疫応答の引下げを誘発することができる。上述のように「先天性免疫応答」という用語は、一般にウイルス性または細菌起源である、一本鎖核酸をはじめとする外来性核酸に対する細胞性応答を含み、それは、具体的にはインターフェロンであるサイトカインの発現と放出の誘導、および細胞死を内包する。
【０３２８】
例えば、本明細書で考察されるように、本発明者らは、ｇＲＮＡの５’末端が、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログの組み入れによって修飾された場合に、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞）における生体外遺伝子編集における改善を見た。本発明は、５’キャッピングｇＲＮＡで観察された改善が、その他の様式で修飾されたｇＲＮＡに拡張されて、同一タイプの構造的または機能的結果が達成され得るという認識を包含する（例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドの組み入れによって、３’ポリＡ配列の組み入れによっておよび／または生体外転写ｇＲＮＡが仔ウシ腸管アルカリホスファターゼなどのホスファターゼによる処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される場合など）。
【０３２９】
したがって、特定の実施形態では、本明細書で考察される方法および組成物は、ｇＲＮＡがそれらの５’末端でまたはその近く（例えば、それらの５’末端の１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内）で修飾されている、方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの５’末端は、図７に示されるように、真核生物ｍＲＮＡキャップ構造またはキャップアナログ（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ、または３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗逆転キャップアナログ（ＡＲＣＡ））の組み入れによって修飾される。キャップまたはキャップアナログは、ｇＲＮＡの化学合成または生体外転写のどちらかの間に組み入れ得る。特定の実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾され、５’三リン酸基が除去される。
【０３３０】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、その３’末端にまたはその近く（例えば、その３’末端の１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２ヌクレオチド以内）に修飾を含む。例えば、特定の実施形態では、ｇＲＮＡの３’末端は、１つまたは複数の（例えば、２５〜２００個の）アデニン（Ａ）残基の付加によって修飾される。ポリＡ配列は、ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ウイルスゲノム）に含まれ得て、または化学合成中に、またはポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用した生体外転写に続いて、ｇＲＮＡに付加され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される（下に示される）修飾ヌクレオシドをもたらす：
2019507599.tif 000020
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。特定の実施形態では、３’末端Ｕが、下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得る：
2019507599.tif 000021
式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことで、分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有してもよい。特定の実施形態では、例えば、ウリジンは、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンで、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシンおよびグアノシンは、例えば、８−ブロモグアノシンなどの８位に修飾がある修飾アデノシンまたはグアノシンによって、または本明細書に記載される修飾アデノシンおよびグアノシンのいずれかによって置換され得る。
【０３３１】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、その５’末端またはその近くの修飾と、その３’末端またはその近くの修飾との双方を含む。特定の実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、５’キャップ構造またはキャップアナログと、３’ポリＡ配列との双方を含有する。特定の実施形態では、生体外転写ｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾されて５’三リン酸基が除去され、３’ポリＡ配列を含む。
【０３３２】
前述の事項が末端修飾に焦点を合わせる一方で、本明細書で考察される方法および組成物は、ｇＲＮＡ配列中の１つまたは複数の非末端位置および／または１つまたは複数の末端位置に、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む、ｇＲＮＡを使用してもよいものと理解される。
【０３３３】
特定の実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば、２’ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、ＳＨ、ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（ＣＮ）から選択される基によって置換される。特定の実施形態では、リン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルなどの２’−糖修飾；または例えば、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、アデノシン（Ａ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、シチジン（Ｃ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、ウリジン（Ｕ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｆまたは２’−Ｏ−メチルをはじめとする２’−フルオロ修飾；グアノシン（Ｇ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、および任意のそれらの組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。
【０３３４】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡとしては「ロックド」核酸（ＬＮＡ）が挙げられ、その中では、２’ＯＨ基が、例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同一リボース糖上の４’炭素と結合し得て代表的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）が挙げられる。
【０３３５】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡとしては、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、リボースが、リン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位によって置換される、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（リボースが、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）が挙げられる。
【０３３６】
一般に、ｇＲＮＡ分子としては、酸素を有する５員環である、糖類リボースが挙げられる。代表的な修飾ｇＲＮＡｓとしては、制限なしに、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、例えば、ホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖アナログ改変の大部分は２’位置に局在するが、４’位置をはじめとするその他の部位も修飾の対象となる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、４’−Ｓ、４’−Ｓｅまたは４’−Ｃ−アミノメチル−２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。
【０３３７】
特定の実施形態では、例えば、７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンなどのＯ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。
【０３３８】
ＸＩ．阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子およびその、Ｃｐｆ１システムの活性を制限するための使用
Ｃｐｆ１分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸、例えばＤＮＡを用いる、またはこれを含む方法および組成物は、加えて、「阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子」を用い、またはこれを含むことができる。阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡは、細胞または対象中に導入される他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１構成要素の活性を制限することができる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、細胞または対象中に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの構成要素をコードする配列を含む核酸上に、標的ドメインと相補的である標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は：（ａ）Ｃｐｆ１分子をコードする核酸；（ｂ）ＦＡＳ、ＢＩＤ、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＢＬＢ、ＰＴＰＮ６、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、および／もしくはＴＲＢＣ遺伝子を標的化する標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子（標的遺伝子ｇＲＮＡ）をコードする核酸上に；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１構成要素、例えば（ａ）および（ｂ）の双方をコードする複数の核酸上に、標的配列と相補的である標的化ドメインを含む。阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、Ｃｐｆ１分子と複合体形成して、システムの構成要素を不活性化し得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子／阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子複合体は、Ｃｐｆ１分子をコードする配列を含む核酸を不活性化する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子／阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子複合体は、標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする配列を含む核酸を不活性化する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子／阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子複合体は、時間的、発現レベル、または他の制限を、Ｃｐｆ１分子／標的遺伝子ｇＲＮＡ分子複合体の活性に課す。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１分子／阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子複合体は、オフターゲットまたは他の不所望の活性を引き下げる。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、コード配列または制御領域、例えばプロモーターを標的化して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム構成要素を負に調節する。例えば、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１分子のコード配列、Ｃｐｆ１分子コード配列の発現を調節する制御領域、例えばプロモーター、または２つの間に配置される配列を標的化し得る。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子は、標的遺伝子ｇＲＮＡのコード配列、または制御領域、例えばプロモーターを標的化する。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ、例えば、Ｃｐｆ１標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子もしくは標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、またはこれをコードする核酸が、別々に、例えば、Ｃｐｆ１分子またはこれをコードする核酸よりも後に導入される。例えば、第１のベクター、例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターは、Ｃｐｆ１分子および１つまたは複数の標的遺伝子ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を導入することができ、そして第２のベクター、例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターは、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、例えばＣｐｆ１標的化ｇＲＮＡ分子または標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を導入することができる。特定の実施形態では、第２のベクターは、第１のベクターの後に導入されてよい。特定の実施形態では、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、例えば、Ｃｐｆ１標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子もしくは標的遺伝子ｇＲＮＡ標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、またはこれをコードする核酸は、Ｃｐｆ１分子またはこれをコードする核酸と共に、例えば同時に、またはこれと同じベクター内に導入されてよいが、例えば、例えばしばらくするとＣｐｆ１の転写が低下するように、後から活性化される転写制御要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーの下にある。特定の実施形態では、転写制御要素は、内因的に活性化される。特定の実施形態では、転写要素は、外部トリガーの導入を介して活性化される。
【０３３９】
典型的には、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、例えば、Ｃｐｆ１標的化ｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列は、負に調節する構成要素、例えばＣｐｆ１分子をコードする核酸とは異なる制御領域、例えばプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、「異なる制御領域」は、単純に、双方の制御配列に機能的に連結する一制御領域、例えばプロモーターの制御下にないことを指す。特定の実施形態では、異なる、は、制御領域の種類またはタイプが「異なる制御領域」を指す。例えば、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、例えば、Ｃｐｆ１標的化ｇＲＮＡ分子をコードする配列は、発現のレベルがより低い制御領域、例えばプロモーターの制御下にあり、または負に調節する構成要素をコードする配列、例えばＣｐｆ１分子をコードする核酸よりも後に発現される。
【０３４０】
一例として、阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子、例えば、Ｃｐｆ１標的化阻害Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡ分子をコードする配列は、本明細書中に記載される制御領域（例えばプロモーター）、例えば、ヒトＵ６核内低分子プロモーターまたはヒトＨ１プロモーターの制御下にあってよい。特定の実施形態では、負に調節する構成要素をコードする配列、例えばＣｐｆ１分子をコードする核酸は、本明細書中に記載される制御領域（例えばプロモーター）、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモーターの制御下にあってよい。
【実施例】
【０３４１】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。
【０３４２】
実施例１−Ｔ細胞へのＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ  ＲＮＰの送達
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣｐｆ１媒介切断を実証するために、精製したアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１（「ＡｓＣｐｆ１」）を、ＴＣＲアルファ鎖に対してデザインした１１の異なるｇＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」とも呼ぶ）と複合体形成した（表６）。ＧＷＥＤ５３９は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３４３３で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４０は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５８７で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４１は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５３８で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４２は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３４６１で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４３は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３４７５で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４４は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５２４で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４５は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５６６で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４６は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５１７で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４７は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５７３で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４８は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３５８０で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。ＧＷＥＤ５４９は、配列番号３７０８で示されるヌクレオチド配列を有する直接反復ドメイン、および配列番号３４５４で示されるヌクレオチド配列を有する標的化ドメインを含む。
【０３４３】
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【０３４４】
各ＲＮＰ複合体を電気穿孔によって送達し、そしてＴＲＡＣ遺伝子座を標的化して切断する個々のＲＮＰの能力を、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）およびＴ７Ｅ１アッセイによって評価した。
【０３４５】
ＡｓＣｐｆ１酵素の精製
ＡｓＣｐｆ１の１３０７残基に相当する３．９Ｋｂの遺伝子セグメントを、添付のＳａｐＩ  Ｅｌｅｃｔｒａクローニングアーム（ＤＮＡ  ２．０クローニングシステム）およびＣ−ｔｅｒｍヌクレオプラスミンＮＬＳによる遺伝子合成によって得た。ｐＵＣ５７ベクター中にクローニングした合成構築体を、ＳａｐＩ消化によって切り出して、ｐＤ４４１−ＮＨ、ｐＤ４４１−ＣＨ（高コピー）、およびｐＤ４２１−ＮＨ（低コピー）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター中にＥｌｅｃｔｒａクローニングした（ＤＮＡ  ２．０、Ｅｌｅｃｔｒａクローニングシステム）。
【０３４６】
ＡｓＣｐｆ１遺伝子を含有するプラスミド（Ｎ−ｔｅｒｍ  Ｈｉｓ（高コピー）、Ｃ−ｔｅｒｍ  Ｈｉｓ（高コピー）、またはＮ−ｔｅｒｍ  Ｈｉｓ（低コピー））を形質転換し、または細菌発現株中に電気穿孔した後、タンパク質を、以下の方法を用いて発現させて、精製した。また、全てのＡｓＣｐｆ１構築体が、Ｃ末端ヌクレオプラスミンＮＬＳ配列を含有するが、Ｎ末端またはＣ末端上のＳＶ４０  ＮＬＳも適用可能である。プラスミドを、タンパク質発現細菌細胞（例えばＲｏｓｅｔｔａ  ２細胞）中に形質転換し、または電気穿孔した後、生じたいくつかのコロニーを、０．５ｍＬのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ（ＢＨＬ）培地、または別の、抗生物質なしリッチ培地に加えた。３０分から１時間後に、または細胞懸濁液が濁って見えたときに、０．５ｍＬのＢＨＬ培地または他のリッチ培地および抗生物質（クロラムフェニコールおよびカナマイシン）を培養体に加えた。培養体が濁って見えるようになると（ＯＤ＝０．６）、培養容量を、容量が８ｍＬに達するまで、二倍にした。次に、培養体全部を、最大１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（Ｔｅｋｎｏｖａ）培地＋抗生物質＋１ｍＬの１０００×金属溶液（Ｔｅｋｎｏｖａ）＋２００μＬの１Ｍ硫酸マグネシウム溶液に移した。培養体を３７℃にて増殖させた。培養体ＯＤを、１〜２時間後に、または培養フラスコが僅かに濁って見えたときに、測定した。この時点では、ＯＤは、１時間毎に、または適切な場合には、ＯＤが１．０〜１．５に達するまで、測定した。ＯＤが１．０〜１．５に達すると、フラスコを低温（１８℃から２５℃）に移して、ここでもＯＤを３０分から１時間後にチェックした。培養体のＯＤが約２．０に達したときに、ＩＰＴＧを加えることによってタンパク質発現を誘導した。細胞を、１８℃にて１２〜１６時間（この時間は、必要に応じて最大３日まで変えることができる）増殖させた。次に、大きな遠心分離機を用いて培養体を収穫してペレット化させて、直ちに溶解させるか、溶解の日まで−８０℃にて凍結して維持した。
【０３４７】
ＡｓＣｐｆ１を発現する細胞ペレットを、ミクロフルイダイザーを用いて溶解させた。そこでは、１〜１０ｇの乾燥細胞ペレットを、７０ｍＬの溶解バッファ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１ｍＭ  ＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）］またはＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１０〜２０％グリセロール、および３００〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌで再懸濁させた。これ以外にも、ＢＰＥＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）化学溶解キット、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）化学溶解キット、または自社の、同じバッファを含有する化学溶解試薬を、細胞膜を破壊するための１％トリトンＸ−１００の存在下で用いて、細胞を溶解させて、混ざった（ｆｏｌｄｅｄ）ＡｓＣｐｆ１を抽出した。最後に、超音波処理器を用いて、ミクロフルイダイザー法におけるのと同じ溶解バッファを、１％トリトンＸ−１００も他のあらゆるマイルドな双性イオン洗剤も無で用いて、細胞を溶解させることができる。
【０３４８】
細胞溶解液を遠心分離機内でスピンダウンさせて、細胞残渣ペレットを破棄した。上清を、０．２μｍまたは０．４５μｍのフィルタで濾過して、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＨＩｓＰｕｒ  Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた重力カラム上にロードした。双方の場合とも、ＨｉｓＴｒａｐまたは重力カラム中のスラリーを、溶解バッファで平衡させてから、３０ｍＭイミダゾールも含有する溶解バッファによる５×〜２０×のカラム容量の何回かの洗浄に曝した。最後に、ＨｉｓＴｒａｐまたは２５０〜５００ｍＭイミダゾール入り溶解バッファを用いた重力カラムのＮｉ−ＮＴＡ樹脂から、Ｈｉｓタグの付いたＡｓＣｐｆ１を溶出した。
【０３４９】
次に、ＡｓＣｐｆ１タンパク質を、分子量カットオフが１００ｋＤａ以下のフィルタを用いておよそ５ｍＬに濃縮して、サイズ排除カラムを備えるＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＦＰＬＣ機器上にロードした。これ以外にも、６×Ｈｉｓ−ＡｓＣｐｆ１−ＮＬＳ構築体の正味の正電荷（＋８）により、ＡｓＣｐｆ１を陽イオン交換カラム上にロードして、１００ｍＭから１０００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて４０分にわたって精製することもできる。ＮａＣｌをＫＣｌで置換することもできる。これ以外にも、３×ＦＬＡＧタグ（−７正味電荷）を有し、かつＮＬＳ（＋５正味電荷）を有していないＡｓＣｐｆ１（＋３正味電荷）は、負電荷を帯びることとなり、陰イオン交換カラムに結合して、塩勾配の増大により精製され得る。サイズ排除精製法または陽イオン交換精製法用のバッファは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＴＣＥＰまたはＤＴＴ、１０％〜２０％グリセロール、および２５０ｍＭ  ＮａＣｌ一定イオン強度（サイズ排除）または１００ｍＭから１０００ｍＭ  ＮａＣｌイオン強度（陽イオン交換）である。ＨＥＰＥＳは、ｐＨ６．５〜８．５の範囲で緩衝能力を有するあらゆるバッファと置換することができる。ＡｓＣｐｆ１タンパク質を、２ｍＬの画分中に溶出して、ＵＶ吸光度によってＦＰＬＣ機器で検出して、１つの主ピークが生じた。このピークの画分をプールして、ＡｓＣｐｆ１が存在し、かつ純度が高いかをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して判定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、予想される１５０ｋＤａ分子量マーカーにて、バンドが混入することなく明確なバンドを示した。また、ＡｓＣｐｆ１吸光度スペクトルの調査は、２６０／２８０ＵＶ吸光度比によって測定して、計測可能な核酸の混入のない、明確なタンパク質を示した。
【０３５０】
ＡｓＣｐｆ１のプールした画分を、ＮＣＢＩウェブサイトのＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐｒｏｔ−ｐａｒａｍツールで示され、そして２８０の吸光度で測定されるＡｓＣｐｆ１の予測吸光係数（１４３，９４０Ｍ−１ｃｍ−１）に基づいて、５０μＭに至るまで濃縮した。これらのアリコートを、直ぐに使用するために４℃で保存し、または長期貯蔵のために液体窒素中で急速冷凍して、−８０℃にて保存した。
【０３５１】
ｃｒＲＮＡを化学合成によって生成して、細胞への送達前に、上述の精製したタンパク質に対して、タンパク質およびｃｒＲＮＡを室温にて最低でも１５分間インキュベートすることによって、複合体形成した。複合体形成されたＲＮＰを、２つの別々のアッセイに用いた。ＲＮＰを、生体外切断アッセイに用いた。そこではＲＮＰを、ＴＲＡＣ遺伝子座のエキソン１に相当するＰＣＲ産物とインキュベートした。ＲＮＰを、ＰＣＲ生成物と１：１のモル比でインキュベートし、そして３７℃にて１５分間インキュベートした。インキュベーション後、反応物を、プロテイナーゼＫと４２℃にて２０分間処理した。切断を、ＰＡＧＥゲル上で視覚化した。ほとんどのＲＮＰについて切断が観察されたが、２つが顕著な切断を示した（図２）。また、各ＲＮＰ複合体の画分を、活性化したヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５を補った完全培地中で培養した）中に、電気穿孔によって、１μｇ／１００，０００細胞の比率で導入した。ＴＣＲα／βに特異的なＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）結合抗体を用いたＦＣＭによって、電気穿孔の４日後に、細胞上でのＴＣＲα／β発現を監視した。２つのＲＮＰ（ＧＷＥＤ５４５およびＧＷＥＤ５４６）は、ＴＣＲα／βの発現に影響を与えなかった多くのＲＮＰと比較して、トランスフェクト細胞上でのＴＣＲα／βの発現を顕著に引き下げた（図３）。加えて、細胞生存度は、Ｃｐｆ１  ＲＮＰによる処理によって悪影響を受けなかった（図４）。ＴＣＲα／βネガティブ細胞の生成が、ＴＲＡＣ遺伝子座でのゲノム編集の結果であったことを確認するために、ｇＤＮＡを収穫して、Ｔ７Ｅ１アッセイを実行した。簡潔に、Ｔ７Ｅ１アッセイは、４５０ｂｐのＰＣＲ産物の増幅、精製、およびサイズ確認、ＰＣＲ産物の変性、ならびに９５℃への加熱に続く緩慢な冷却による再ハイブリダイズを含む。次に、ハイブリダイズしたＰＣＲ産物を、完全にマッチしないＤＮＡを認識してこれを切断するＴ７エンドヌクレアーゼＩ（または他のミスマッチ感受性酵素）で消化した。インデルが元の鋳型ＤＮＡ中に存在するならば、アンプリコンが変性して再アニールした場合に、異なるインデルを保有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションをもたらすので、完全にマッチしない二本鎖ＤＮＡとなった。消化産物を、ゲル電気泳動によって、またはキャピラリー電気泳動によって視覚化することができる。切断されたＤＮＡの割合（切断産物の密度を、切断および非切断の密度で割った）を用いて、以下の式によりパーセントＮＨＥＪを推定した：％ＮＨＥＪ＝（１−（１−切断された割合）１／２）。Ｔ７Ｅ１アッセイは、約２〜５％のＮＨＥＪに至るまで感受性であった。実際に、データにより、ＴＣＲα／β発現を引き下げたＲＮＰについて、ＴＲＡＣ遺伝子座でのＤＮＡ修飾の存在が確認される（図５）。
【０３５２】
Ｃｐｆ１が、複数の供与体に由来するヒトＴ細胞を切断することができるかを判定するために、ＧＷＥＤ５４５  ｃｒＲＮＡおよびＧＷＥＤ５４６  ｃｒＲＮＡからなるＲＮＰを、第２の供与体由来の活性化されたヒトＴ細胞中に電気穿孔した。ＴＣＲα／βに特異的なＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）結合抗体を用いたＦＣＭによって、電気穿孔の４日後に、編集効率をＦＡＣＳ分析によって評価した。これらの２つのＲＮＰの、２供与体にわたるヒトＴ細胞を編集する能力を、ＴＣＲα／β発現の損失によって確認した（図６）。
【０３５３】
参照による援用
全本明細書で言及される文献、特許、配列表、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、配列表、または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
【０３５４】
同等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。特定の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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