(57)【要約】  ここでは、遺伝子摂動カセットを含む遺伝子コンストラクト、および遺伝子発現のタイミングおよび順序を評価するためにそれを使用する方法が提供される。
2019514377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の遺伝子摂動カセットを含む遺伝子コンストラクトであって、複数の遺伝子摂動カセットが、
（ａ）
そのリコンビナーゼ活性は第１のインデューサによって誘導される、第１の誘導可能リコンビナーゼ、
第１の遺伝子要素、
第１のターミネータ、および
リコンビナーゼ、第１の遺伝子要素、および第１のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第１の対、ここで、第１のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第１の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第１の核酸に結合することおよび第１の核酸を切断することが可能である、
をコードする第１の核酸を含む、第１の種の遺伝子摂動カセット；および
（ｂ）
そのリコンビナーゼ活性は第２のインデューサによって誘導される第２の誘導可能リコンビナーゼ、
第２の遺伝子要素、
第２のターミネータ、および
第２のリコンビナーゼ、第２の遺伝子要素、および第２のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第２の対、ここで、第２のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第２の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第２の核酸に結合することおよび第２の核酸を切断することが可能である、
をコードする第２の核酸を含む、第２の種の遺伝子摂動カセット、
を含む、前記遺伝子コンストラクト。
【請求項２】
第１の種の遺伝子摂動カセットの上流に位置するプロモータをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項３】
第１の遺伝子要素をコードする核酸が、第１の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸の３’非翻訳領域内に位置し、および／または、第２の遺伝子要素をコードする核酸が、第２の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸の３’非翻訳領域内に位置する、請求項１または２に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項４】
第１の遺伝子要素をコードする核酸が、第１の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸のイントロン内に位置し、および／または、第２の遺伝子要素をコードする核酸が、第２の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸のイントロン内に位置する、請求項１または２に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項５】
遺伝子要素が、タンパク質、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする核酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
第１の誘導可能リコンビナーゼおよび／または第２の誘導可能リコンビナーゼが、チロシンリコンビナーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
第１の誘導可能リコンビナーゼおよび／または第２の誘導可能リコンビナーゼが、セリンリコンビナーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
第１の誘導可能リコンビナーゼおよび／または第２の誘導可能リコンビナーゼが、スプリットリコンビナーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項９】
スプリットリコンビナーゼが、スプリットリコンビナーゼの第１の部分および第２の部分を含む、請求項８に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１０】
複数の遺伝子摂動カセットのうち１以上の遺伝子摂動カセットが、１以上のリボザイム配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１１】
複数の遺伝子摂動カセットのうち１以上の遺伝子摂動カセットが、１以上のリボヌクレアーゼ認識配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１２】
１以上のリボヌクレアーゼ認識配列が、Ｃａｓ６／Ｃｓｙ４認識配列である、請求項１１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１３】
複数の遺伝子摂動カセットのうち１以上の遺伝子摂動カセットが、１以上の自己切断ペプチド配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１４】
１以上の自己切断ペプチド配列がＰ２Ａ配列である、請求項１３に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１５】
複数の遺伝子摂動カセットが、第２の種の遺伝子摂動カセットの１以上と交互する１以上の第１の種の遺伝子摂動カセットを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１６】
複数の遺伝子摂動カセットが、
（ｃ）
そのリコンビナーゼ活性が第３のインデューサによって誘導される、第３の誘導可能リコンビナーゼ；
第３の遺伝子要素；
第３のターミネータ；および
リコンビナーゼ、第３の遺伝子要素、および第３のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第３の部分、ここで、第３のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第３の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第３の核酸に結合することおよび第３の核酸を切断することが可能である、
をコードする第３の核酸を含む第３の種の遺伝子摂動カセットをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１７】
プロモータが、細胞特異的なプロモータまたは細胞状態特異的なプロモータである、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１８】
第１および／または第２のインデューサが、低分子インデューサである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１９】
低分子インデューサがホルモンである、請求項１８に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２０】
ホルモンが、ジベレリン（ＧＩＢ）またはアブシジン酸（ＡＢＡ）である、請求項１９に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２１】
低分子インデューサが抗生物質である、請求項１８に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２２】
抗生物質がトリメトプリムである、請求項２１に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２３】
低分子インデューサが合成リガンドである、請求項１９に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２４】
合成リガンドが、Ｓｈｉｅｌｄ−１または４−ヒドロキシタモキシフェンである、請求項２３に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトを含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子コンストラクトまたは請求項２５に記載のベクターを含む、組み換え細胞。
【請求項２７】
Ｃａｓ６／Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼをさらに含む、請求項２６に記載の組み換え細胞。
【請求項２８】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをさらに含む、請求項２６または２７に記載の組み換え細胞。
【請求項２９】
細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、またはヒト細胞である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の組み換え細胞。
【請求項３０】
幹細胞である、請求項２９に記載の組み換え細胞。
【請求項３１】
幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）である、請求項３０に記載の組み換え細胞。
【請求項３２】
請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の組み換え細胞を含む、遺伝子導入生物。
【請求項３３】
細胞において遺伝子発現を評価するための方法であって、
（ｉ）細胞に複数の遺伝子摂動カセットを含む遺伝子コンストラクト提供すること、
ここで、複数の遺伝子摂動カセットは、
（ａ）
そのリコンビナーゼ活性は第１のインデューサによって誘導される、第１の誘導可能リコンビナーゼ、
遺伝子要素、
ターミネータ、および
第１のリコンビナーゼ、第１の遺伝子要素、および第１のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第１の対、ここで、第１のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第１の対の各リコンビナーゼ認識部位で、核酸に結合することおよび核酸を切断することが可能である、
をコードする核酸を含む第１の種の遺伝子摂動カセット；および
（ｂ）
そのリコンビナーゼ活性は第２のインデューサによって誘導される、第２の誘導可能リコンビナーゼ、
第２の遺伝子要素、
第２のターミネータ、および
第２のリコンビナーゼ、第２の遺伝子要素、および第２のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第２の対、ここで、第２のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第２の対の各リコンビナーゼ認識部位で、核酸に結合することおよび核酸を切断することが可能である、
をコードする核酸を含む第２の種の遺伝子摂動カセット
を含む；
（ｉｉ）第１の遺伝子摂動カセットが発現され、および遺伝子要素が核酸から切断される条件下で、（ｉ）の細胞をインキュベートすること；および
（ｉｉｉ）遺伝子要素の１以上の標的のアウトプットを評価すること、
を含む、前記方法。
【請求項３４】
複数の遺伝子摂動カセットが、
（ｃ）
そのリコンビナーゼ活性が第１のインデューサによって誘導される、第３の誘導可能リコンビナーゼ、
第３の遺伝子要素、
第３のターミネータ、および
第３のリコンビナーゼ、第３の遺伝子要素、および第３のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第３の対、ここで、第３のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第３の対の各リコンビナーゼ認識部位で、核酸に結合することおよび核酸を切断することが可能である、
をコードする核酸を含む第３の種の遺伝子摂動カセット
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１、第２、および／または第３の遺伝子要素の１以上の標的のアウトプットが、１以上の標的の発現を評価することを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、35 U.S.C. §119（e）の下で２０１６年４月２６日に出願された米国仮出願番号62/327,479の利益を主張し、これは参照によりその全体がここに組み込まれる。
発明の分野
この発明は、連続的な、多重化された、および拡張可能な遺伝子摂動のための方法および遺伝子コンストラクトに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
誘導可能成分を含む従来の遺伝子ツールは、誘導可能システムおよびインデューサ分子の限定された数のため、複雑さが制限されている。さらに、かかるツールは、遺伝子制御の限定された見通ししか提供せず、遺伝子制御の時空間的動態およびこれが細胞における生物学的機能にどのように変わるかについての認識が不足している。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明の側面は、複数の遺伝子摂動カセットを含む遺伝子コンストラクトを提供し、ここで、複数の遺伝子摂動カセットは、そのリコンビナーゼ活性が第１のインデューサによって誘導される第１の誘導可能リコンビナーゼ、第１の遺伝子要素、第１のターミネータ、および第１のリコンビナーゼ、第１の遺伝子要素、および第１のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第１の対をコードする第１の核酸、ここで、第１のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第１の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第１の核酸に結合することおよび第１の核酸を切断することが可能である、を含む第１の種の遺伝子摂動カセット；および、そのリコンビナーゼ活性が第２のインデューサによって誘導される第２の誘導可能リコンビナーゼ、第２の遺伝子要素、第２のターミネータ、および第２のリコンビナーゼ、第２の遺伝子要素、および第２のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をコードする第２の核酸、ここで、第２のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第２の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第２の核酸に結合することおよび第２の核酸を切断することが可能である、を含む第２の種の遺伝子摂動カセットを含む。いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットは、第２の種の遺伝子摂動カセットの１以上と交互する第１の種の遺伝子摂動カセットの１以上を含む。
【０００４】
いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、そのリコンビナーゼ活性が第３のインデューサによって誘導される第３の誘導可能リコンビナーゼ、第３の遺伝子要素、第３のターミネータ、および第３のリコンビナーゼ、第３の遺伝子要素、および第３のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第３の対をコードする第３の核酸、ここで、第３のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第３の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第３の核酸に結合することおよび第３の核酸を切断することが可能である、を含む第３の種の遺伝子摂動カセットをさらに含む。
【０００５】
いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、第１の種の遺伝子摂動カセットの上流に位置するプロモータをさらに含む。いくつかの態様において、プロモータは細胞特異的なプロモータまたは細胞状態特異的なプロモータである。
いくつかの態様において、第１の遺伝子要素をコードする核酸は、第１の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸の３’非翻訳領域内に位置し、および／または、第２の遺伝子要素をコードする核酸は、第２の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸の３’非翻訳領域内に位置する。いくつかの態様において、第１の遺伝子要素をコードする核酸は第１の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸のイントロン内に位置し、および／または、第２の遺伝子要素をコードする核酸は、第２の誘導可能リコンビナーゼをコードする核酸のイントロン内に位置する。いくつかの態様において、遺伝子要素は、タンパク質、ＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡをコードする核酸である。
いくつかの態様において、第１の誘導可能リコンビナーゼおよび／または第２の誘導可能リコンビナーゼは、チロシンリコンビナーゼである。いくつかの態様において、第１の誘導可能リコンビナーゼおよび／または第２の誘導可能リコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼである。いくつかの態様において、第１の誘導可能リコンビナーゼおよび／または第２の誘導可能リコンビナーゼはスプリットリコンビナーゼである。いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼは、スプリットリコンビナーゼの第１の部分および第２の部分を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットのうち１以上の遺伝子摂動カセットは、１以上のリボザイム配列を含む。いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットの各々の遺伝子摂動カセットは、１以上のリボザイム配列を含む。いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットのうち１以上の遺伝子摂動カセットは、１以上のリボヌクレアーゼ認識配列を含む。いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットの各々の遺伝子摂動カセットは、１以上のリボヌクレアーゼ認識配列を含む。いくつかの態様において、１以上のリボヌクレアーゼ認識配列は、Ｃａｓ６／Ｃｓｙ４認識配列である。
いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットのうち１以上の遺伝子摂動カセットが、１以上の自己切断ペプチド配列を含む。いくつかの態様において、１以上の自己切断ペプチド配列はＰ２Ａ配列である。
【０００７】
いくつかの態様において、任意のインデューサは低分子インデューサである。いくつかの態様において、低分子インデューサはホルモンである。いくつかの態様において、ホルモンはジベレリン（ＧＩＢ）またはアブシジン酸（ＡＢＡ）である。いくつかの態様において、低分子インデューサは抗生物質である。いくつかの態様において、抗生物質はトリメトプリムである。いくつかの態様において、低分子インデューサは合成リガンドである。いくつかの態様において、合成リガンドは４−ヒドロキシタモキシフェンまたはＳｈｉｅｌｄ−１リガンドである。
本発明の側面は、ここに記載の任意の遺伝子コンストラクトを含むベクターを提供する。本発明の他の側面は、ここに記載の任意の遺伝子コンストラクトまたはここに記載の任意の遺伝子コンストラクトを含むベクターを含む組み換え細胞を提供する。いくつかの態様において、組み換え細胞は、Ｃａｓ６／Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの態様において、組み換え細胞はＣａｓ９エンドヌクレアーゼをさらに含む。
いくつかの態様において、組み換え細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、またはヒト細胞である。いくつかの態様において、組み換え細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）である。
ここに記載の任意の組み換え細胞を含む遺伝子導入生物もまたここで提供される。いくつかの態様において、遺伝子導入生物は遺伝子導入非ヒト生物である。
【０００８】
本発明の他の側面は、（ｉ）細胞に複数の遺伝子摂動カセットを含む遺伝子コンストラクトを提供すること、ここで、複数の遺伝子摂動カセットは、（ａ）そのリコンビナーゼ活性が第１のインデューサによって誘導される第１の誘導可能リコンビナーゼ、第１の遺伝子要素、第１のターミネータ、および第１のリコンビナーゼ、第１の遺伝子要素、および第１のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第１の対をコードする核酸、ここで、第１のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第１の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第１の核酸に結合することおよび第１の核酸を切断することが可能である、を含む第１の種の遺伝子摂動カセット；および（ｂ）そのリコンビナーゼ活性が第２のインデューサによって誘導される第２の誘導可能リコンビナーゼ、第２の遺伝子要素、第２のターミネータ、および第２のリコンビナーゼ、第２の遺伝子要素、および第２のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第２の対をコードする第２の核酸、ここで、第２のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第２の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第２の核酸に結合することおよび第２の核酸を切断することが可能である、を含む第２の種の遺伝子摂動カセットを含む；（ｉｉ）（ｉ）の細胞を、第１の遺伝子摂動カセットが発現され、遺伝子要素が核酸から切断される条件下でインキュベートすること；および（ｉｉｉ）遺伝子要素の１以上の標的のアウトプットを評価することを含む、細胞における遺伝子発現を評価するための方法を提供する。
【０００９】
いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットは、そのリコンビナーゼ活性が第３のインデューサによって誘導される第３の誘導可能リコンビナーゼ、第３の遺伝子要素、第３のターミネータ、および第３のリコンビナーゼ、第３の遺伝子要素、および第３のターミネータに隣接するリコンビナーゼ認識部位の第３の対をコードする第３の核酸、ここで、第３のリコンビナーゼは、組み換え認識部位の第３の対の各リコンビナーゼ認識部位で、第３の核酸に結合することおよび第３の核酸を切断することが可能である、を含む第３の種の遺伝子摂動カセットをさらに含む。
いくつかの態様において、第１、第２、および／または第３の遺伝子要素の１以上の標的のアウトプットは、１以上の標的の発現を評価することを含む。
発明のこれらおよび他の側面、ならびにその様々な態様は、図面および発明の詳細な説明への参照においてより明らかになるであろう。
【００１０】
発明の各々の限定は、発明の様々な態様を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む発明の各々の限定は、発明の各側面に含まれ得ることが予期される。この発明は、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される成分の構成および配置の詳細へのその適用において限定されない。発明は、他の態様があり得、様々な方法で実行または実施され得る。
図面の簡潔な説明
添付の図面は、一定の縮尺で描かれることを意図されていない。明確性の目的のために、すべての成分はすべての図面において標識され得るというわけではない。図面において：
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】図１Ａは、in situでの連続的な、多重化された、および拡張可能な遺伝子摂動の時空間的に制御されたカスケードの例の概略図を示す。図１Ａは、細胞種に特異的なプロモータ（Ｐ特異的）および３つの遺伝子摂動カセット（ＧＰＣ）を含む時空間的に制御されたカスケードを示し、各々が誘導可能リコンビナーゼ（ｒｅｃ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子とともに使用されるときに下流の標的を多重様式で調節し得るｇＲＮＡ、および転写ターミネータ（Term）からなり、これらはすべて同種のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）の間に隣接する。ｇＲＮＡ１を含むリコンビナーゼ１（Ｒｅｃ１）は、Ｐ特異的の制御下で発現される。インデューサ１は、Ｒｅｃ１活性を活性化し、対応するリコンビナーゼ部位（Ｒ１、括弧で示す）を使用して第１のＧＰＣを自己切除する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、in situでの連続的な、多重化された、および拡張可能な遺伝子摂動の時空間的に制御されたカスケードの例の概略図を示す。図１Ｂは、ｇＲＮＡ２を含むリコンビナーゼ２（Ｒｅｃ２）の発現を示す。ｇＲＮＡ２は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子を使用して下流の標的を調節する。インデューサ２は、Ｒｅｃ２活性を活性化し、対応するリコンビナーゼ部位（Ｒ２、三角で示す）を使用して第２のＧＰＣを自己切除する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、in situでの連続的な、多重化された、および拡張可能な遺伝子摂動の時空間的に制御されたカスケードの例の概略図を示す。図１Ｃは、ｇＲＮＡ３を含むリコンビナーゼ３（Ｒｅｃ３）の発現を示す。ｇＲＮＡ３は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子を使用して下流の標的を調節する。インデューサ１は、Ｒｅｃ３活性を活性化し、対応するリコンビナーゼ部位（Ｒ３、矢印で示す）を使用して第３のＧＰＣを自己切除する。
【００１２】
【図２】図２は、スプリットリコンビナーゼを使用するカセットの例の概略図を示す。インデューサであるジベレリン（ＧＩＢ）またはアブシジン酸（ＡＢＡ）およびレポーターである蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の結合ドメインと融合したリコンビナーゼのＮ末端およびＣ末端フラグメント（スプリット−Ｎおよびスプリット−Ｃ）は、三角によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。インデューサ（ＧＩＢまたはＡＢＡ）の添加は、スプリットリコンビナーゼカセットの二量体化および活性化を誘導して、遺伝子摂動カセットを切除し、下流の遺伝子（ＢＦＰ）の発現を引き起こす。
【００１３】
【図３Ａ】図３Ａは、細胞培養におけるスプリットリコンビナーゼを含有する遺伝子摂動カセットの使用の確認を示す。２９３Ｔ細胞は、示されたスプリットリコンビナーゼカセットで一過的に遺伝子導入され、ビヒクル（エタノール、ＥｔＯＨ）またはインデューサ（ＧＩＢまたはＡＢＡ）のいずれかで処理した。カセットのリコンビナーゼで媒介された切除は、フローサイトメトリー（ｙ軸）によって検出されたＢＦＰ発現によって評価される。図３Ａは、ビヒクルまたは薬物での処理の９６時間後の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、細胞培養におけるスプリットリコンビナーゼを含有する遺伝子摂動カセットの使用の確認を示す。２９３Ｔ細胞は、示されたスプリットリコンビナーゼカセットで一過的に遺伝子導入され、ビヒクル（エタノール、ＥｔＯＨ）またはインデューサ（ＧＩＢまたはＡＢＡ）のいずれかで処理した。カセットのリコンビナーゼで媒介された切除は、フローサイトメトリー（ｙ軸）によって検出されたＢＦＰ発現によって評価される。図３Ｂは、図３Ａで分析された試料の切除効率の定量のプロットを示す。切除効率は、（％ＢＦＰ陽性）／（％ＢＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ陽性）として計算される。
【００１４】
【図４Ａ】図４Ａは、腫瘍形成モデルを確立するためのここに記載の拡張可能なリコンビナーゼカスケードの例示的な使用を示す。図４Ａは、ＡＰＣ、ＫＲＳ、ｐ５３、およびＳｍａｄ４の連続的な変異を通じた正常上皮からの結腸直腸がんの発生の概略図を示す（Walther et al. Nat. Rev. Cancer. (2009)9(7): 489-99より改変）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、腫瘍形成モデルを確立するためのここに記載の拡張可能なリコンビナーゼカスケードの例示的な使用を示す。図４Ｂは、４つの遺伝子摂動カセットを含む拡張可能なリコンビナーゼカスケードの概略図を示す。第１の遺伝子摂動カセットは、ＡＰＣの変異をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ１）およびｇＲＮＡをコードし、括弧によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。第２の遺伝子摂動カセットは、リコンビナーゼ（ｒｅｃ２）をコードし、三角によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。第３の遺伝子摂動カセットは、Ｓｍａｄ４の変異をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ３）およびｇＲＮＡをコードし、矢印によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。第４の遺伝子摂動カセットは、ｐ５３の変異をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ４）およびｇＲＮＡをコードし、半円によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。
【００１５】
【図５Ａ】図５Ａは、前駆細胞を特定の細胞種に分化させるためのここに記載の拡張可能なリコンビナーゼカスケードの例示的な使用を示す。図５Ａは、プロセスに関与する転写因子のサブセットを含む細胞分化の概略図を示す（Pagliuca and Melton, Development (2013) 140(12): 2472-83より改変）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、前駆細胞を特定の細胞種に分化させるためのここに記載の拡張可能なリコンビナーゼカスケードの例示的な使用を示す。図５Ｂは、４つの遺伝子摂動カセットを含む拡張可能なリコンビナーゼカスケードの概略図を示す。第１の遺伝子摂動カセットは、細胞の胚体内胚葉への分化をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ１）およびｇＲＮＡをコードし、括弧によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。第２の遺伝子摂動カセットは、細胞の膵臓内胚葉への分化をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ２）およびｇＲＮＡをコードし、三角によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。第３の遺伝子摂動カセットは、細胞の内分泌前駆細胞への分化をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ３）およびｇＲＮＡをコードし、矢印によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。第４の遺伝子摂動カセットは、細胞の膵臓ベータ細胞への分化をもたらすリコンビナーゼ（ｒｅｃ４）およびｇＲＮＡをコードし、半円によって示されるリコンビナーゼの認識配列に隣接する。
【００１６】
詳細な説明
従来の組み換え発現ツールは、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子および特定の組織または特定の時間における遺伝子変化の誘導を使用して、例えばＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなリコンビナーゼシステムを使用して、複数の遺伝子の誘導可能制御を並行して可能にする。互いに対して直交方向に使用され得る誘導可能システムの限定された利用可能性は、単一の細胞で達成され得る遺伝子摂動の時間的な複雑さを制限する。複数セットの内因性遺伝子のスケーラブルな、連続的な、および制御可能な摂動のための一連の遺伝子摂動カセットを含む合成遺伝子コンストラクトがここに提供される。ここに記載のものなどの遺伝子摂動コンストラクトは、遺伝子発現の時空間的な制御、例えば、時空間的な遺伝子発現が、がんモデル、代謝性疾患、および神経変性疾患などの発生および／または疾患の進行にどのように影響を及ぼすかを評価するのに有用であり得る。
【００１７】
ここに記載の遺伝子コンストラクトの設計は、少なくとも２つの異なるリコンビナーゼを誘導する２つの異なるインデューサの間でトグルすること（交互すること）を可能にし、広範囲の連続的かつコンビナトリアルな遺伝子プログラムを誘導する可能性を提供する。ここに記載の遺伝子コンストラクトは、各々がリコンビナーゼ、遺伝子要素、ターミネータ、およびリコンビナーゼ認識部位の対を含む、少なくとも２種の遺伝子摂動カセットを含む。かかる遺伝子コンストラクトは、インデューサの数を最小限にする（例えば、２つのインデューサのみを使用して）細胞における遺伝子の複数のセットの摂動の連続的かつ制御された制御を可能にする。さらに、遺伝子摂動カセットの各々の３’末端のターミネータ配列の存在は、一度に１つのリコンビナーゼの発現を可能にし、インデューサによる活性化を利用可能にする。ここに記載される場合、リコンビナーゼの活性化は、リコンビナーゼ認識部位の対への結合、対応する遺伝子摂動カセットの切除、次の遺伝子摂動カセットの発現を可能にするＤＮＡバックボーンの組み換えをもたらす。
【００１８】
本開示の側面は、遺伝子コンストラクト、遺伝子コンストラクトを含むベクター、遺伝子コンストラクトをコードする組み換え細胞、および当該遺伝子コンストラクトを使用する方法に関する。ここで使用される場合、「遺伝子コンストラクト」は、２以上の遺伝子摂動カセットを含む１以上のＤＮＡ要素（単数または複数）を指す。「遺伝子摂動カセット」（ＧＰＣ）という用語は、誘導可能リコンビナーゼ、遺伝子要素、ターミネータ、およびリコンビナーゼ認識部位の対を含む核酸配列を指す。遺伝子コンストラクトはまた、連続的な様式で遺伝子摂動カセットの発現を可能にする第１の遺伝子摂動カセットの上流にプロモータをコードし得る。ここに記載される遺伝子コンストラクトは、遺伝子コンストラクト内の遺伝子摂動カセットの種の順序を交互にすることによって、２つのインデューサの間でトグルすること（交互すること）を可能にする。例えば、図１Ａに示されるように、遺伝子コンストラクトの第１のＧＰＣ（最も５’のＧＰＣ）は、第１のインデューサ（インデューサ１）によって誘導される第１の種のＧＰＣであり得、続いて、第２の種のＧＰＣのものであり、第２のインデューサ（インデューサ２）によって誘導される第２のＧＰＣであり得、続いて、第１の種のＧＰＣのものであり、第１のインデューサ（インデューサ１）によって誘導される第３のＧＰＣであり得る。いくつかの態様において、第１のインデューサは、リコンビナーゼ１、３、５等を活性化するために使用され得るが、第２のインデューサは、リコンビナーゼ２、４、６等を活性化するために使用され得る。いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の遺伝子摂動カセットを含有する。
【００１９】
いくつかの態様において、ここに記載の任意の遺伝子コンストラクトは、誘導可能リコンビナーゼ、遺伝子要素、ターミネータ、およびリコンビナーゼ認識部位の対を含有する第３の種の遺伝子摂動カセットを含み得る。いくつかの態様において、第３の種の遺伝子摂動カセットのリコンビナーゼは、第１および第２のインデューサとは異なるインデューサによって誘導される。
本開示の側面は、遺伝子コンストラクトからのそれらの対応する遺伝子摂動カセットの切除を活性化するときに誘導可能リコンビナーゼを提供する。その自己切除を媒介するかかるリコンビナーゼをコードするかかるリコンビナーゼまたはカセットは、自殺リコンビナーゼまたは自殺カセットと呼ぶことができる。
【００２０】
ここで使用されるように、「誘導可能リコンビナーゼ」は、誘導可能であるリコンビナーゼ活性を有する（すなわち、２本鎖ＤＮＡの組み換えを触媒することが可能な）タンパク質を指す。「インデューサ」という用語は、リコンビナーゼの活性化を引き起こすかまたは誘導する分子またはシグナルを指す。いくつかの態様において、リコンビナーゼ活性のインデューサは、低分子の存在および／または結合である。いくつかの態様において、インデューサは、低分子の不在または除去である。代替的または追加的に、リコンビナーゼの活性は、宿主細胞内のシグナルによって誘導される。いくつかの態様において、インデューサは、タンパク質二量体化を誘導することによってリコンビナーゼ活性の活性化を促進する。いくつかの態様において、インデューサは、タンパク質の移行によるリコンビナーゼ活性の活性化を促進する。
【００２１】
当該技術分野において公知の任意のインデューサは、ここに記載の遺伝子摂動カセットと適合性であり得る。インデューサの例は、限定なしで、メタノール、ＩＰＴＧ、銅、テトラサイクリンまたはトリメトプリムなどの抗生物質、炭素源、光およびホルモンを含む。いくつかの態様において、ここに記載の任意のインデューサは、低分子阻害剤または低分子活性化剤などの低分子であり得る。ここで使用される場合、「低分子」は、低分子量（すなわち、９００ダルトン未満）を有する化合物を指す。いくつかの態様において、インデューサはホルモンである。ホルモンインデューサの例は、ジベレリン（ＧＩＢ）およびアブシジン酸（ＡＢＡ）を含む。いくつかの態様において、インデューサは外因性分子である。いくつかの態様においてインデューサは抗生物質である。いくつかの態様において、インデューサは、例えば特定の発生段階の間に細胞によって産生される内因性分子である。
【００２２】
いくつかの態様において、インデューサは合成リガンドである。ここで使用される場合、「合成リガンド」という用語は、リコンビナーゼを直接的または間接的に誘導または活性化し得る任意の非天然リガンドを指す。いくつかの態様において、合成リガンドは、リコンビナーゼと相互作用（結合）し、その酵素活性を活性化する。いくつかの態様において、合成リガンドは、結合ドメインまたはその部分と相互作用して、リコンビナーゼの酵素活性を活性化する。いくつかの態様において、合成リガンドは４−ヒドロキシタモキシフェンである。いくつかの態様において、合成リガンドはＳｈｉｅｌｄ−１リガンドである。
【００２３】
リコンビナーゼの活性を制御するインデューサの濃度は、誘導可能システムの任意の成分および所望のリコンビナーゼ活性のレベルなどの因子に依存するであろう。いくつかの態様において、インデューサの濃度は、０．００１〜５０μＭ、０．０５〜１０μＭ、０．０１〜５μＭ、０．０５〜１μＭ、または０．１〜１μＭである。いくつかの態様において、インデューサの濃度は、少なくとも０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４  ２５μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．１μＭ、１．２μＭ、１．３μＭ、１．４μＭ、１．５μＭまたはそれ以上である。
いくつかのリコンビナーゼは、遺伝子コンストラクトの組み換えを媒介するために、１以上の追加の補因子および／またはアクセサリータンパク質を必要とし得ることが理解されるであろう。いくつかの態様において、誘導可能リコンビナーゼは、細菌リコンビナーゼ、真菌リコンビナーゼ、酵母リコンビナーゼ、またはバクテリオファージリコンビナーゼから得られるかまたはそれに由来する。様々なリコンビナーゼの組み合わせは、ここに記載の遺伝子コンストラクトにおいて使用され得る。
【００２４】
一般に、リコンビナーゼは、タンパク質の保存された求核性アミノ酸残基に基づいて、チロシンリコンビナーゼまたはセリンリコンビナーゼとして分類され得る。いくつかの態様において、任意の１以上の誘導可能リコンビナーゼは、チロシンリコンビナーゼであり得る。当該技術分野において公知のチロシンリコンビナーゼの例は、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＸｅｒＣリコンビナーゼ、ＸｅｒＤリコンビナーゼ、ラムダインテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、またはそれらの誘導体もしくは変異体を含む。いくつかの態様において、任意の１以上の誘導可能リコンビナーゼはセリンリコンビナーゼであり得る。当該技術分野において公知のセリンリコンビナーゼの例は、γδ、ＰａｒＡ、Ｔｎ３、Ｇｉｎ、φＣ３１、ＢｘｂＩ、およびＲ４を含む。ここに記載の遺伝子コンストラクトは、チロシンリコンビナーゼ、セリンリコンビナーゼ、またはチロシンリコンビナーゼおよびセリンリコンビナーゼの両方の組み合わせから構成され得る。ここに記載の遺伝子コンストラクトにおける使用のためのリコンビナーゼの追加の例は、限定なしで、ＫＤ、Ｂ２、Ｂ３、ＲおよびＤｒｅリコンビナーゼ、および大きなセリン型ファージインテグラーゼを含む。
【００２５】
リコンビナーゼをコードする核酸配列において１以上の変異が作られたリコンビナーゼの誘導体または変異体もまた本開示の範囲内にある。欠失、挿入および／または置換の変異を含むかかる変異は、例えば、リコンビナーゼの活性を変えるため、リコンビナーゼの活性が誘導される機序を変えるため、および／またはリコンビナーゼの発現を改善するためになされ得る。いくつかの態様において、リコンビナーゼをコードする核酸配列において、リコンビナーゼの活性を誘導可能にするために、１以上の変異がなされる。いくつかの態様において、リコンビナーゼは合成または人工リコンビナーゼである。
いくつかの態様において、リコンビナーゼは、インデューサ分子と相互作用する結合ドメインに融合され、それによってリコンビナーゼの酵素活性を制御する。
いくつかの態様において、インデューサ分子結合ドメインとリコンビナーゼとの融合は、インデューサの存在によるリコンビナーゼの安定性の制御を可能にする。リコンビナーゼを安定化させ、それによりリコンビナーゼ活性を増加させるインデューサの例は、限定なしで、４−ヒドロキシタモキシフェン、Ｓｈｉｅｌｄ−１リガンド、およびトリメトプリムを含む。
【００２６】
４−ヒドロキシタモキシフェンの結合ドメインは、エストロゲン受容体リガンド結合ドメインの点変異体であるＥＲＴ２である。いくつかの態様において、ＥＲＴ２またはその部分は、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼの部分（リコンビナーゼ活性またはスプリットリコンビナーゼのＮ末端もしくはＣ末端部分を有するリコンビナーゼタンパク質の部分など）に融合される。Ｓｈｉｅｌｄ−１の結合ドメインは、ＦＫＢＰ１２ドメインの点変異体である不安定化ドメイン（ＤＤ）である。いくつかの態様において、ＤＤまたはその部分は、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼの部分に融合される。トリメトプリムの結合ドメインは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸レダクターゼの点変異体である。いくつかの態様において、トリメトプリム結合ドメインまたはその部分は、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼの部分に融合される。
いくつかの態様において、インデューサ結合ドメインは全長リコンビナーゼのＮ末端に融合される。いくつかの態様において、インデューサ結合ドメインは全長リコンビナーゼのＣ末端に融合される。
【００２７】
スプリットリコンビナーゼもまた本発明の範囲内である。一般に、スプリットリコンビナーゼは、酵素の２以上の別々の部分として発現されたリコンビナーゼである。例えば、リコンビナーゼは、２以上（例えば、２、３、４またはそれ以上）の部分として発現され得る。いくつかの態様において、リコンビナーゼの別々の部分の各々は、各々、結合ドメインの部分（例えば、インデューサ結合ドメイン）に融合される。いくつかの態様において、結合ドメインの部分とインデューサとの相互作用は、酵素活性を再構成するためのリコンビナーゼの部分の相互作用（例えば、二量体化）をもたらし、それによってリコンビナーゼの活性を制御する。当該技術分野で公知の任意のリコンビナーゼは、スプリットリコンビナーゼとしてここに記載の遺伝子摂動カセットにおいて使用され得る。
【００２８】
いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼは、リコンビナーゼのＮ末端部分およびＣ末端部分として発現される。「Ｎ末端部分」という用語は、ここでは、タンパク質の第１のアミノ酸残基であるＮ末端から伸びるリコンビナーゼの部分を指すために使用される。いくつかの態様において、Ｎ末端部分は、全長リコンビナーゼの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である。ここでも使用されるように、「Ｃ末端部分」という用語は、タンパク質の最後のアミノ酸残基であるＣ末端を含むリコンビナーゼの部分を指す。いくつかの態様において、Ｃ末端部分は、全長リコンビナーゼのの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である。
【００２９】
いくつかの態様において、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼであり、Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含むスプリットリコンビナーゼとして発現される。いくつかの態様において、リコンビナーゼはスプリットＣｒｅリコンビナーゼであり、全長Ｃｒｅリコンビナーゼの７５％であるＮ末端部分および全長Ｃｒｅリコンビナーゼの２５％であるＣ末端部分を含む。
いくつかの態様において、リコンビナーゼはＦｌｐＯリコンビナーゼであり、Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含むスプリットリコンビナーゼとして発現される。いくつかの態様において、リコンビナーゼはスプリットＦｌｐＯリコンビナーゼであり、全長ＦｌｐＯリコンビナーゼの９５％であるＮ末端部分および全長ＦｌｐＯリコンビナーゼの５％であるＣ末端部分を含む。
いくつかの態様において、リコンビナーゼはφＣ３１リコンビナーゼであり、Ｎ末端部分およびＣ末端部分を含むスプリットリコンビナーゼとして発現される。いくつかの態様において、スプリットφＣ３１リコンビナーゼは、全長φＣ３１リコンビナーゼの４０％であるＮ末端部分および全長φＣ３１リコンビナーゼの６０％であるＣ末端部分を含む。
【００３０】
ここに記載される場合、スプリットリコンビナーゼの部分の各々は、対応するインデューサとの相互作用がリコンビナーゼの部分間の相互作用を可能にするように、結合ドメインの部分（例えば、インデューサ結合ドメイン）に融合され得る。いくつかの態様において、インデューサ結合ドメインは、２つの部分（例えば、結合ドメインのＮ末端部分およびＣ末端部分）に分離され得る。いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼのＮ末端部分は、インデューサ結合ドメインのＮ末端部分に融合され得る。いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼのＮ末端部分は、インデューサ結合ドメインのＣ末端部分に融合され得る。いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼのＣ末端部分は、インデューサ結合ドメインのＣ末端部分に融合され得る。いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼのＣ末端部分は、インデューサ結合ドメインのＮ末端部分に融合され得る。
【００３１】
ここで使用される場合、インデューサ結合ドメインへの参照において「Ｎ末端部分」は、ドメインの第１のアミノ酸残基であるＮ末端から伸びるインデューサ結合ドメインの部分を意味する。いくつかの態様において、Ｎ末端部分は、全長結合ドメインの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である。ここでも使用されるように、インデューサ結合ドメインへの参照において「Ｃ末端部分」という用語は、ドメインの最後のアミノ酸残基であるＣ末端を含むインデューサ結合ドメインの部分を意味する。いくつかの態様において、Ｃ末端部分は、全長結合ドメインの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上である。
【００３２】
対応するインデューサと相互作用する任意の結合ドメインは、ここに記載のコンストラクトにおいて使用され得る。例えば、いくつかの態様において、インデューサはジベレリンであり、結合ドメインはジベレリンと相互作用するタンパク質ドメインである。いくつかの態様において、インデューサはジベレリンであり、結合ドメインは、ジベレリン非感受性Ｄｗａｒｆ１（ＧＩＤ１）、またはジベレリンに結合し得るその部分、およびジベレリン非感受性（ＧＡＩ）、またはジベレリンに結合し得るその部分である。いくつかの態様において、インデューサはアブシジン酸であり、結合ドメインはアブシジン酸と相互作用するタンパク質ドメインである。いくつかの態様において、インデューサはアブシジン酸であり、結合ドメインは、アブシジン酸非感受性（ＡＢＩ）、またはアブシジン酸に結合し得るその部分、およびＰＹＬ ＡＢＩ受容体、またはアブシジン酸に結合し得るその部分である。
【００３３】
いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼの部分と結合ドメインの部分との間にリンカー配列が存在し得る。当業者によって理解されるように、リンカー配列は、適切なタンパク質フォールディング、酵素活性、および／またはリガンド（インデューサ）および／またはスプリットリコンビナーゼの他の部分との相互作用を可能にするために有用であり得る。
ここに記載の遺伝子摂動カセットは、各々、リコンビナーゼに隣接するリコンビナーゼ認識部位の対、遺伝子要素および遺伝子摂動カセットのプロモータ成分を含む。リコンビナーゼの活性化に際して、リコンビナーゼは、その同種のリコンビナーゼ認識部位を認識して結合することができ、リコンビナーゼ認識部位（例えば、リコンビナーゼ、遺伝子要素およびターミネータをコードする核酸）の間に位置する遺伝子材料の切除をもたらす。リコンビナーゼ認識部位は、一般に、同種のリコンビナーゼによって認識される短い（すなわち、およそ３０〜４０ヌクレオチド）ＤＮＡ配列である。リコンビナーゼ認識部位は、パリンドローム配列またはパリンドロームである領域を含み得る。
【００３４】
ここに記載の遺伝子コンストラクトのリコンビナーゼ認識部位の各対は、リコンビナーゼの活性化がそのリコンビナーゼをコードする遺伝子摂動カセットの切除をもたらすように、別個のものである。例えば、遺伝子コンストラクトの第１の遺伝子摂動カセットのリコンビナーゼの活性化は、リコンビナーゼが、第１の遺伝子摂動カセットに隣接する同種のリコンビナーゼ認識部位を認識し、同部位に結合するが、他の遺伝子摂動カセット（すなわち、第２の遺伝子摂動カセット、第３の遺伝子摂動カセットなど）に隣接するリコンビナーゼ認識部位を認識せず、同部位に結合しないことを可能にする。
第１の成分が他の遺伝子要素の間に位置し、すぐ近傍にあるとき、遺伝子コンストラクトの成分（単数）または成分（複数）は、他の遺伝子要素に「隣接」しているといわれる。例えば、図１Ａは、３つの遺伝子摂動カセットを含む遺伝子コンストラクトの概略図を示し、その各々は、リコンビナーゼ認識部位の対、遺伝子摂動カセットの各々の１つの５’および遺伝子摂動カセットの各々の１つの３’に隣接する。
【００３５】
開示の側面は、遺伝子要素を含む遺伝子摂動カセットに関する。ここで使用される場合、「遺伝子要素」は、発現および／または活性が評価され得る任意の核酸配列を指す。遺伝子要素は、限定なしで、タンパク質コード配列（遺伝子）、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｇＲＮＡを含み得る。遺伝子摂動カセットの各々は、同じまたは異なる種の遺伝子要素を有し得ることが理解されるだろう。例えば、複数の遺伝子摂動カセットの１つの遺伝子摂動カセットは、ｇＲＮＡを含有し得、１以上の他の遺伝子摂動カセットは、他の種の遺伝子要素（例えば、遺伝子、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの態様において、複数の遺伝子摂動カセットの遺伝子摂動カセットの各々は、同じ種の遺伝子要素を含有し得、例えば、複数の遺伝子摂動カセットのすべてがｇＲＮＡを含有し得る。
【００３６】
いくつかの態様において、遺伝子要素は、タンパク質コード配列などの遺伝子である。遺伝子摂動カセットの発現を決定するために、当該技術分野において公知の任意の遺伝子は、その発現または活性について評価され得る。いくつかの態様において、遺伝子摂動カセットの発現を決定するために、遺伝子によってコードされた産物の活性は評価され得る。いくつかの態様において、遺伝子は、細胞運命を制御する細胞分化ネットワークに関与する転写因子などの転写因子をコードする。いくつかの態様において、遺伝子は、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ、蛍光、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）などのレポータータンパク質をコードする。いくつかの態様において、遺伝子は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする。
【００３７】
いくつかの態様において、遺伝子要素はマイクロＲＮＡである。「マイクロＲＮＡ」および「ｍｉＲＮＡ」という用語は、全体にわたって互換的に使用され得、短い非コード１本鎖ＲＮＡ分子を指す。本開示のｍｉＲＮＡは、天然または合成（例えば、人工）であり得る。ｍｉＲＮＡは、通常、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（非翻訳領域）内に見出される標的部位に結合することによって遺伝子サイレンシングを誘導する。この相互作用は、タンパク質合成を抑制し、および／またはｍＲＮＡ分解を開始することによって、タンパク質産生を妨げる。ｍＲＮＡ上のほとんどの標的部位は、それらの対応するマイクロＲＮＡとの部分的な塩基相補性しか有さないため、個々のマイクロＲＮＡは１００以上の異なるｍＲＮＡを標的とし得る。さらに、個々のｍＲＮＡは、異なるｍｉＲＮＡに対する複数の結合部位を含有し得、複雑な制御ネットワークをもたらす。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、１０〜５０ヌクレオチド長である。例えば、ｍｉＲＮＡは、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは２２ヌクレオチド長である。
【００３８】
いくつかの態様において、遺伝子要素はｓｈＲＮＡである。一般に、ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造を形成するかまたは形成することが可能な短いＲＮＡ分子である。本開示のｓｈＲＮＡは、天然または合成（例えば、人工）であり得る。ｓｈＲＮＡの標的ｍＲＮＡへの結合は、典型的にｍＲＮＡの分解をもたらす。いくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは５０〜１２０ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡは、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、６０〜１２０、６０〜１００または７０〜９０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、０１８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０ヌクレオチド長である。
【００３９】
いくつかの態様において、遺伝子要素はｇＲＮＡである。「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」および「ＣＲＩＳＰＲガイド配列」という用語は、全体にわたって互換的に使用され得、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓＤＮＡ結合タンパク質の特異性を決定する配列を含む核酸を指す。いくつかの態様において、ｇＲＮＡをコードする遺伝子摂動カセットは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで１以上の遺伝子をノックアウトするため、ＣＲＩＳＰＲ活性化システムで１以上の遺伝子を活性化するため、またはＣＲＩＳＰＲ阻害システムで１以上の遺伝子を阻害するためのものである。ｇＲＮＡは、宿主細胞における標的核酸配列に相補的である。標的核酸に相補的であるｇＲＮＡまたはその部分は、１５〜２５ヌクレオチド長、１８〜２２ヌクレオチド長、または１９〜２１ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、標的核酸に相補的であるｇＲＮＡ配列は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、標的核酸に相補的であるｇＲＮＡ配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、標的核酸に相補的である配列に加えて、ｇＲＮＡは足場配列も含む。標的核酸および足場配列に相補的な配列の両方をコードするｇＲＮＡの発現は、標的核酸への結合（ハイブリダイゼーション）および標的核酸へのエンドヌクレアーゼのリクルートの両方の二重の機能を有し、これは部位特異的なＣＲＩＳＰＲ活性をもたらし得る。いくつかの態様において、かかるキメラｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれ得る。
【００４０】
ここで使用される場合、「足場配列」は、ｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれ、相補的なｇＲＮＡ配列に結合（ハイブリダイゼーション）した標的核酸にエンドヌクレアーゼをリクルートする核酸配列を指す。少なくとも１つのステムループ構造を含み、エンドヌクレアーゼをリクルートする任意の足場配列は、ここに記載の遺伝子要素およびベクターにおいて使用され得る。例示的な足場配列は、当業者に明らかであろうし、例えば、Jinek, et al. Science (2012) 337(6096):816-821、Ran, et al. Nature Protocols (2013) 8:2281-2308、PCT出願番号WO2014/093694、およびPCT出願番号WO2013/176772に見出され得る。
いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は足場配列を含まず、足場配列は別々の転写物として発現される。いくつかの態様において、遺伝子摂動カセットは足場配列もコードする。かかる態様において、ｇＲＮＡ配列は、足場配列の部分に相補的であり、足場配列に結合（ハイブリダイゼーション）し、エンドヌクレアーゼを標的核酸にリクルートするように機能する追加の配列をさらに含む。
【００４１】
ｇＲＮＡ配列が標的核酸にハイブリダイゼーションすることが可能である場合、ｇＲＮＡ配列またはその部分は、宿主細胞中の標的核酸に相補的であることが理解されるであろう。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は、標的核酸に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または少なくとも１００％相補的である（標的ポリヌクレオチド配列によるｇＲＮＡ配列の相補性の教示について、参照によって組み込まれる米国特許8,697,359も参照）。ＣＲＩＳＰＲガイド配列と標的核酸の３’末端近くの標的核酸との間のミスマッチがヌクレアーゼ切断活性を無効にし得ることが実証されている（Upadhyay, et al. Genes Genome Genetics (2013) 3(12):2233-2238）。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は、標的核酸の３’末端（例えば、標的核酸の３’末端の最後の５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド）に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも約１００％相補的である。
【００４２】
ｇＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られた任意の源から得られ得る。例えば、ｇＲＮＡ配列は、宿主細胞の核酸中に存在する示された長さの任意の核酸配列（例えば、ゲノム核酸および／または外部ゲノム（extra-genomic）核酸）であり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ配列は、転写因子、シグナル伝達タンパク質、トランスポーターなどをコードする核酸などの所望の核酸を標的とするように設計および合成され得る。
【００４３】
いくつかの態様において、本開示のｇＲＮＡは、１０〜５００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１０〜２０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜７０ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜９０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜７０ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜９０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、３０〜７０ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜９０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、４０〜６０ヌクレオチド、４０〜７０ヌクレオチド、４０〜８０ヌクレオチド、４０〜９０ヌクレオチド、４０〜１００ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、５０〜７０ヌクレオチド、５０〜８０ヌクレオチド、５０〜９０ヌクレオチドまたは５０〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１０〜２００ヌクレオチド、１０〜２５０ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１０〜３５０ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチドまたは１０〜４５０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、５００ヌクレオチド超の長さを有する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、１０、１５、２０、１５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００またはこれを超えるヌクレオチドの長さを有する。
【００４４】
用語「標的核酸」、「標的部位」および「標的配列」は、全体にわたって互換的に使用され得、ここに記載のｇＲＮＡ配列によって標的とされ得る宿主細胞中の任意の核酸配列を指す。標的部位（単数または複数）はまた、ｇＲＮＡの「下流の標的」と呼ばれ得る。標的核酸は、エンドヌクレアーゼと相互作用し、さらに標的核酸へのエンドヌクレアーゼ活性を標的とすることに関与し得る、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）によって３’側に隣接される。一般に、標的核酸に隣接するＰＡＭ配列は、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼが由来する源に依存すると考えられている。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴである。ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴである。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡである。トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼについては、ＰＡＭ配列はＴＴＮである。
【００４５】
他の態様において、リコンビナーゼおよび遺伝子要素は別々のｍＲＮＡ転写物として転写される。いくつかの態様において、リコンビナーゼおよび遺伝子摂動カセットの遺伝子要素は、単一のｍＲＮＡ転写物として転写される。いくつかの態様において、遺伝子要素をコードする核酸は、リコンビナーゼをコードする核酸内にある。ここで使用される場合、核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列の２つのヌクレオチド間に挿入される場合、または第１の核酸配列が第２の核酸の隣接するヌクレオチドのストレッチを置換する場合、他の核酸配列内にあると考えられる。いくつかの態様において、遺伝子要素をコードする核酸は、リコンビナーゼの非翻訳領域などのリコンビナーゼの非タンパク質コード部分内にある。いくつかの態様において、遺伝子要素をコードする核酸は、リコンビナーゼの３’ＵＴＲ配列内にある。いくつかの態様において、遺伝子要素は、リコンビナーゼ核酸配列のイントロン内でコードされる。ここに記載のリコンビナーゼなどの他の遺伝子の部分の中から遺伝子要素をコードし、除去するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Nissim et al. Mol. Cell (2014) 54: 1-13を参照されたい。
【００４６】
いくつかの態様において、遺伝子要素をコードする核酸は、リコンビナーゼの３’ＵＴＲ配列内にあり、遺伝子要素は、転写後にリコンビナーゼの配列から除去される。いくつかの態様において、本開示の遺伝子要素は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接している。リボヌクレアーゼ（略してＲＮａｓｅ）は、ＲＮＡの加水分解を触媒するヌクレアーゼである。リボヌクレアーゼは、エンドリボヌクレアーゼまたはエキソリボヌクレアーゼであり得る。エンドリボヌクレアーゼは、１本鎖または２本鎖ＲＮＡのいずれかを切断する。エキソリボヌクレアーゼは、ＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかから末端ヌクレオチドを除去することによってＲＮＡを分解する。いくつかの態様において、ｇＲＮＡなどの本開示の遺伝子要素は、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ認識部位）に隣接している。Ｃｓｙ４は、特定のＲＮＡ配列を認識し、ＲＮＡを切断し、上流フラグメントに結合したままであるエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの態様において、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ）を使用して、核酸転写物から遺伝子要素を放出させる。したがって、いくつかの態様において、Ｃｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する遺伝子要素を含む、ここに記載の任意の遺伝子コンストラクトを含む細胞は、Ｃｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼをコードする核酸をも含有する。いくつかの態様において、Ｃｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼの活性は、リボヌクレアーゼ認識部位に隣接する遺伝子要素が、リボヌクレアーゼがインデューサの存在下でのみ切断されるように、１以上のインデューサ分子の存在によって誘導可能または制御可能である。遺伝子要素の切除のためのＣｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼの使用は、当該技術分野において知られており、例えば、ＰＣＴ出願番号WO2015/153940を参照されたい。
【００４７】
いくつかの態様において、細胞は、Ｃｓｙ４または他のＣａｓ６リボヌクレアーゼを安定に発現し得るか、または安定に発現するように改変され得る。いくつかの態様において、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ）は、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、スタフィロコッカス・エピデルミデス（Staphylococcus epidermidis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）またはスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来である。他のリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ認識部位がここに企図されている（例えば、Mojica, F.J.M. et al., CRISPR-Cas Systems, RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea, Barrangou, Rodolphe, van der Oost, John (Eds.), 2013, ISBN 978-3-642-34657-6を参照されたい。そのリボヌクレアーゼ／認識部位に関する主題は参照によってここに組み込まれる。）。
【００４８】
いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｃｙｓ４リボヌクレアーゼ認識部位）は、１０〜５０ヌクレオチド長である。例えば、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位は、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、Ｃｙｓリボヌクレアーゼ認識部位は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、Ｃｓｙリボヌクレアーゼ認識部位（例えば、Ｃｓｙ４リボヌクレアーゼ認識部位）は２８ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１（ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ）を含む。Ｃｓｙホモログもまたここで企図されている（例えば、Mojica, F.J.M. et al., CRISPR-Cas Systems, RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea, Barrangou, Rodolphe, van der Oost, John (Eds.), 2013, ISBN 978-3-642-34657-6を参照されたい。そのリボヌクレアーゼ／認識部位に関する主題は参照によってここに組み込まれる。）。
【００４９】
本開示のいくつかの側面は、リボザイムに隣接する遺伝子要素をコードする配列を含む遺伝子摂動カセットに関する。リボザイムは、タンパク質酵素の作用と同様に、特定の生化学反応を触媒することが可能であるＲＮＡ分子である。シス作用性リボザイムは、典型的に自己形成性であり、自己切断することが可能である。シス作用性リボザイムは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモータからのｇＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡなどの遺伝子要素の機能的発現を媒介し得る。これに対して、トランス作用性リボザイムは、自己切断を行わない。自己切断は、リボザイムを含有するＲＮＡ分子自体が切断される分子内触媒のプロセスを指す。本開示に従って使用するためのシス作用性リボザイムの例は、限定なしで、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよびデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムを含む。本開示に従って使用するためのトランス作用性リボザイムの例は、限定なしで、タバコ輪斑ウイルス（ｓＴＲＳＶ）、チコリー黄斑ウイルス（ｓＣＹＭＶ）およびアラビス−モザイクウイルス（ｓＡＲＭＶ）のサテライトＲＮＡで見出されるヘアピンリボザイムの天然および人工バージョンを含む。いくつかの態様において、リボザイムの活性は構成的である。
【００５０】
本開示のいくつかの側面は、例えば、三重らせん構造（または「三重鎖」）を形成するＲＮＡ配列などの３’ＲＮＡ安定化配列を含む、リコンビナーゼをコードする核酸を含む遺伝子摂動カセットに関する。いくつかの態様において、遺伝子要素をコードする核酸配列は、リコンビナーゼの３’ＵＴＲなどのリコンビナーゼの配列内に存在する。かかる態様において、転写物からの遺伝子要素の切除は、ポリ（Ａ）テールを欠くリコンビナーゼをコードするｍＲＮＡをもたらし得る。いくつかの態様において、転写物からの遺伝子要素の切除は、リコンビナーゼをコードする転写物の安定性を低減させる。３’ＲＮＡ安定化配列は、ポリ（Ａ）テールの欠如を補うために産物をコードする核酸配列の３’末端に付加される配列である。したがって、いくつかの態様において、三重らせん構造を形成するものなどの３’ＲＮＡ安定化配列は、ポリ（Ａ）テールを欠くｍＲＮＡの効率的な翻訳を可能にする。三重らせん構造は、例えばアデニンおよびウリジンに富むモチーフによって形成された二次または三次ＲＮＡ構造である。いくつかの態様において、３’ＲＮＡ安定化配列は、核酸の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）由来である。
【００５１】
いくつかの態様において、遺伝子摂動カセットは、２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）などの自己切断ペプチドを含有する。一般に、２Ａペプチドは、およそ１８〜２２アミノ酸長であり、単一のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からの複数のタンパク質の産生を可能にする。いくつかの態様において、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａペプチド（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２））、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号３））、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号４））、またはＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号５））である。いくつかの態様において、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列によって遺伝子要素をコードするヌクレオチド配列から分離され得る。いくつかの態様において、スプリットリコンビナーゼの第１の部分をコードするヌクレオチド配列は、２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列によってスプリットリコンビナーゼの第２の部分をコードするヌクレオチド配列から分離され得る。遺伝子摂動コンストラクトの各々は、ターミネータ配列をさらに含む。ここで使用される場合、「ターミネータ」配列は、ＲＮＡポリメラーゼにシグナルを伝達してＤＮＡの転写を停止させる核酸配列を指す。ターミネータはまた、転写機構からの新たに転写されたｍＲＮＡ分子の放出および／またはＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼの解離を引き起こし得る。適切なターミネータの選択は、例えば、遺伝子コンストラクトが使用されることが意図される細胞または細胞種に依存することが理解されるであろう。ここに記載の遺伝子摂動カセットの各々は、カセットの３’末端にターミネータ配列を含み、プロモータに最も近接した遺伝子摂動カセットのみの転写を一度に可能にし、および、インデューサによる活性化に利用可能な１つのリコンビナーゼの生産を一度に可能にする。
【００５２】
いくつかの態様において、本開示の遺伝子コンストラクトは、遺伝子摂動カセットの上流にプロモータを含む。プロモータ配列は、近傍の遺伝子摂動カセットに作動可能に連結され得る。「プロモータ」は、核酸の制御性領域であり、そこで核酸の残りの転写の開始および速度が制御される。プロモータはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの制御性タンパク質および分子が結合し得る小領域を含有し得る。プロモータおよび／または任意の追加の制御性配列は、それらがコード配列の発現または転写を制御性配列の影響または制御下におくように共有結合されているとき、他の核酸配列（遺伝子摂動カセットなど）に「作動可能に」連結されていると言われる。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、５’制御性配列中のプロモータの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および、２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）コード領域の転写を指向するプロモータ領域の能力に干渉せず、または（３）タンパク質に翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力に干渉しない場合には、２つのＤＮＡ配列が作動可能に連結されていると言われる。したがって、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るようにプロモータ領域がそのＤＮＡ配列の転写を行うことが可能である場合、プロモータ領域はコード配列に作動可能に連結されるであろう。
【００５３】
プロモータは、構成的、誘導可能、活性化可能、抑制可能、組織特異的、細胞特異的、細胞状態特異的、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様において、プロモータは、酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐＰＧＫ）由来のプロモータなどの、構成的に活性なプロモータである。いくつかの態様において、プロモータは組織特異的なプロモータであり、プロモータが特定の種の組織において活性を有することを意味する。いくつかの態様において、プロモータは細胞特異的なプロモータである。組織特異的または細胞特異的なプロモータの使用は、細胞の規定されたセット内の遺伝子コンストラクトの活性の制限を可能にする。ここで使用される場合、「細胞特異的なプロモータ」は、近傍の遺伝子摂動カセットの転写をもたらす特定の種の細胞において活性を有するプロモータ配列である。細胞特異的なプロモータの例は、限定なしで、マクロファージ、リンパ球、好中球、樹状細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、所与の組織の細胞（例えば、腎臓細胞）において活性なプロモータを含む。代替的または追加的に、プロモータは、細胞が発達状態、活性化状態または疾患状態などの特定の状態にあるときに活性である細胞状態特異的なプロモータであり得る。プロモータの例は、限定なしで、細胞発生段階に特異的なプロモータ、細胞状態特異的なプロモータ、ＮＦκＢ特異的なプロモータ、および操作された細胞特異的なプロモータを含む。
【００５４】
また、ここでは、いくつかの態様において、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータも企図される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の正確な開始を指示するプロモータは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモータと呼ばれる。本開示に従って使用するためのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモータの例は、限定なしで、ヒトサイトメガロウイルスプロモータ、ヒトユビキチンプロモータ、ヒトヒストンＨ２Ａ１プロモータおよびヒト炎症性ケモカインＣＸＣＬ１プロモータを含む。他のＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモータもここで企図される。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写の正確な開始を指示するプロモータは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータと呼ばれる。本開示に従って使用するためのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモータの例は、限定なしで、Ｕ６プロモータ、Ｈ１プロモータおよび転写ＲＮＡ、５ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、およびシグナル認識粒子７ＳＬ ＲＮＡのプロモータを含む。
当該技術分野において知られた任意のプロモータは、ここに記載の遺伝子コンストラクトにおいて使用され得、天然のプロモータ配列および合成または遺伝子改変プロモータ配列を含む。いくつかの態様において、プロモータは人工プロモータである。
【００５５】
いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、宿主細胞の「着地パッド（landing pad）」と呼ばれるＤＮＡ座に標的化され、それに挿入され得る。いくつかの態様において、着地パッドは宿主細胞のゲノム中にある。いくつかの態様において、着地パッドは、プラスミドまたはベクター上などの宿主細胞中の外部ゲノムＤＮＡ座に位置する。いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、宿主細胞中に形質導入されたベクター上に存在する。一般に、着地パッドは、ゲノム（または外部ゲノムＤＮＡ）の中立部位であると考えられる核酸の領域であり、または同領域内にあり、これは遺伝子コンストラクトの挿入が、試験された条件下で宿主細胞に対して効果（陰性または陽性）を有することが期待されないことを意味する。ここに記載の遺伝子コンストラクトの挿入のための着地パッドまたは座の例は、限定なしで、Ｈ１１、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、およびＲＯＳＡ２６座を含む。いくつかの態様において、着地パッドはヒトまたは哺乳動物の人工染色体上にある。
【００５６】
また、ここに記載の任意の遺伝子コンストラクトを含む組み換え細胞もここで提供される。細胞の例は、限定なしで、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞である。
いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞である。例えば、いくつかの態様において、遺伝子摂動カセットは、ヒト細胞、霊長類細胞（例えば、ベロ細胞）、ラット細胞（例えば、ＧＨ３細胞、ＯＣ２３細胞）またはマウス細胞（例えば、ＭＣ３Ｔ３細胞）において発現される。限定なしで、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、国立がん研究所の６０のがん細胞株（ＮＣＩ６０）由来のがん細胞、ＤＵ１４５（前立腺がん）細胞、Ｌｎｃａｐ（前立腺がん）細胞、ＭＣＦ−７（乳がん）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（乳がん）細胞、ＰＣ３（前立腺がん）細胞、Ｔ４７Ｄ（乳がん）細胞、ＴＨＰ−１（急性骨髄性白血病）細胞、Ｕ８７（神経膠芽腫）細胞、ＳＨＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞（骨髄腫からクローン化）およびＳａｏｓ−２（骨がん）細胞を含む様々なヒト細胞株が存在する。いくつかの態様において、操作されたコンストラクトは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）で発現される。いくつかの態様において、遺伝子摂動カセットは、例えば多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））などの幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）において発現される。
【００５７】
他の態様において、細胞は、酵母細胞、例えば、サッカロミセス属菌（Saccharomyces spp.）、シゾサッカロミセス属菌（Schizosaccharomyces spp.）、ピチア属菌（Pichia spp.）、ファフィア属菌（Phaffia spp.）、クルイベロミセス属菌（Kluyveromyces spp.）、カンジダ属菌（Candida spp.）、タラロマイセス属菌（Talaromyces spp.）、ブレタノマイセス属菌（Brettanomyces spp.）、パチソーレン属菌（Pachysolen spp.）、デバリオマイセス属菌（Debaryomyces spp.）、ヤロウィア属菌（Yarrowia spp.）および工業用の倍数体酵母株、などの真菌細胞である。好ましくは、酵母株はS.セレビシエ（S. cerevisiae）株である。真菌の他の例は、アスペルギルス属菌（Aspergillus spp.）、ペニシリウム属菌（Penicillium spp.）、フザリウム属菌（Fusarium spp.）、リゾプス属菌（Rhizopus spp.）、アクレモニウム属菌（Acremonium spp.）、ニューロスポラ属菌（Neurospora spp.）、ソルダリア属菌（Sordaria spp.）、マグナポルテ属菌（Magnaporthe spp.）、カワリミズカビ属菌（Allomyces spp.）、ウスチラゴ属菌（Ustilago spp.）、ボトリチス属菌（Botrytis spp.）、およびトリコデルマ属菌（Trichoderma spp.）を含む。
【００５８】
いくつかの態様において、細胞は、エシェリヒア属菌（Escherichia spp.）、ストレプトマイセス属菌（Streptomyces spp.）、ザイモナス属菌（Zymonas spp.）、アセトバクター属菌（Acetobacter spp.）、シトロバクター属菌（Citrobacter spp.）、シネコシスティス属菌（Synechocystis spp.）、リゾビウム属菌（Rhizobium spp.）、クロストリジウム属菌（Clostridium spp.）、コリネバクテリウム属菌（Corynebacterium spp.）、ストレプトコッカス属菌（Streptococcus spp.）、キサントモナス属菌（Xanthomonas spp）、ラクトバチルス属菌（Lactobacillus spp.）、ラクトコッカス属菌（Lactococcus spp.）、バチルス属菌（Bacillus spp.）、アルカリゲネス属菌（Alcaligenes spp.）、シュードモナス属菌（Pseudomonas spp.）、アエロモナス属菌（Aeromonas spp.）、アゾトバクター属菌（Azotobacter spp.）、コモモナス属菌（Comamonas spp.）、マイコバクテリウム属菌（Mycobacterium spp.）、ロドコッカス属菌（Rhodococcus spp.）、グルコノバクター属菌（Gluconobacter spp.）、ラルストニア属菌（Ralstonia spp.）、アシドチオバチルス属菌（Acidithiobacillus spp.）、マイクロルナタス属菌（Microlunatus spp.）、ジオバクター属菌（Geobacter spp.）、ジオバチルス（Geobacillus spp.）属菌、アルスロバクター属菌（Arthrobacter spp.）、フラボバクテリウム属菌（Flavobacterium spp.）、セラチア属菌（Serratia spp.）、サッカロポリスポラ属菌（Saccharopolyspora spp.）、サーマス属菌（Thermus spp）、ステノトロホモナス属菌（Stenotrophomonas spp.）、クロモバクテリウム属菌（Chromobacterium spp.）、シノリゾビウム属菌（Sinorhizobium spp.）、サッカロポリスポラ属菌（Saccharopolyspora spp.）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium spp.）、およびパントエア属菌（Pantoea spp.）などの細菌細胞である。細菌細胞は、エシェリヒア・コリ(E. coli)細胞などのグラム陰性細胞、またはバチルス属の種などのグラム陽性細胞であり得る。
【００５９】
ここに記載の遺伝子コンストラクトを含有する細胞を含む遺伝子導入生物もまた本発明の範囲内である。当該技術分野において知られた常法を使用して、ここに記載の遺伝子コンストラクトを含有する細胞を含む遺伝子導入生物を作製し得る。いくつかの態様において、細胞は、多細胞生物、例えば植物または哺乳動物にある。いくつかの態様において、遺伝子導入生物は、遺伝子導入非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、マウスまたはラットなどのげっ歯類である。
いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトが発現される細胞は、エンドヌクレアーゼなどの１以上のＣＲＩＳＰＲ成分などの１以上の追加の成分を発現し得る。いくつかの態様において、組み換え細胞は天然にＣａｓ９酵素をコードする。いくつかの態様において、組み換え細胞はＣａｓ９酵素またはその変異体をコードするように操作される。いくつかの態様において、宿主細胞はまた、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを発現する。いくつかの態様において、宿主細胞は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitidis）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）またはトレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを発現する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞または生物における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ホモログまたはオルソログである。
【００６０】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質の活性を変えるためにさらに改変される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。例えば、ｄＣａｓ９は、触媒的に活性な残基（Ｄ１０およびＨ８４０）の変異を含有し、ヌクレアーゼ活性を有さない。代替的または追加的に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、別のタンパク質またはその部分に融合され得る。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、ＫＲＡＢドメインなどのリプレッサードメインに融合される。いくつかの態様において、かかるｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重化遺伝子抑制（例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ））のためのここに記載のコンストラクトと共に使用される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４またはＶＰＲなどのアクチベータードメインに融合される。転写因子またはそのドメインに融合されたｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲタンパク質は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ−ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ−転写因子と呼ばれる。変異体ＣＲＩＳＰＲ−ＴＦもまた当該技術分野において知られており、例えばｄＣａｓ９−ＶＰ６４を含むＣＲＩＳＰＲ−ＴＦと比較して、遺伝子のより強力な転写活性化をもたらし得る。例えば、Chavez et al. Nat. Methods 5 (2015) 12: 326-328; Farzadfard et al. ACS Synth. Biol. (2015) 517: 583-588; Tanenbaum Cell (2014) 159: 635-646を参照されたい。
【００６１】
いくつかの態様において、かかるｄＣａｓ９融合タンパク質は、多重化遺伝子活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ））のためのここに記載のコンストラクトと共に使用される。例えば、Gilbert et al. Cell (2014) 159(3): 647-661を参照されたい。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、ヒストンデメチラーゼドメインまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼドメインなどのエピジェネティックな調節ドメインに融合される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、ＬＳＤ１またはｐ３００、またはその部分に融合される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９融合体は、ＣＲＩＳＰＲに基づくエピジェネティックな調節のために使用される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合される。いくつかの態様において、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインに融合したＣａｓ９またはｄＣａｓ９は、多重化遺伝子編集に使用される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）に融合される。いくつかの態様において、蛍光タンパク質に融合されたＣａｓ９／ｄＣａｓ９タンパク質は、ゲノム座の多重化標識および／または可視化のために使用される。
【００６２】
代替的または追加的に、エンドヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの態様において、宿主細胞は、プロベテラ属菌（Provetella spp.）またはフランシセラ属菌（Francisella spp.）に由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼを発現する。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞または生物における発現のためにコドン最適化され得る。
いくつかの態様において、本開示の細胞は改変され、組み換え細胞と呼ばれ得る。改変された細胞または組み換え細胞は、外因性の核酸または天然に存在しない核酸を含有する細胞である。いくつかの態様において、組み換え細胞は、独立して複製する外因性の核酸（例えば、エピソームベクター上に存在する遺伝子コンストラクト）を含有する。いくつかの態様において、外来または外因性の核酸を細胞に導入することによって、組み換え細胞は作製される。核酸は、例えばエレクトロポレーション、化学的遺伝子導入、ウイルス形質導入、ファージ形質導入、組み換えプラスミドを含有する細菌プロトプラストとの融合、またはマイクロインジェクションなどの従来の方法によって細胞に導入され得る。いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、プラスミドまたはベクターで細胞に導入される。いくつかの態様において、遺伝子コンストラクトは、レンチウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスによって細胞に導入される。核酸分子を発現させることは、核酸分子をゲノムに組み込むことによっても達成され得る。
【００６３】
いくつかの態様において、ここに記載の遺伝子コンストラクトは、組み換え発現ベクターで提供される。ここで使用される場合、「ベクター」は、例えば、制限消化およびライゲーションによって、または、異なる遺伝子環境間の輸送のためまたは宿主細胞における発現のための組み換えによって、所望の配列（単数）または配列（複数）が挿入され得る任意の多数の核酸であり得る。ベクターは、典型的にはＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターは、限定なしで、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、および人工染色体を含む。いくつかの態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、２または３のマイクロＲＮＡの組み合わせをコードする遺伝子の各々が、同じ組み換え発現ベクター上で発現される。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９酵素）などのエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子はベクターで提供される。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ここに記載の遺伝子コンストラクトと同じベクターで提供される。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ここに記載の遺伝子コンストラクトを含有するベクターとは異なるベクターで提供される。
【００６４】
ベクターはさらに、ベクターで形質転換または遺伝子導入されているまたはされていない細胞の同定における使用に好適な１以上のマーカー配列を含有し得る。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当該技術分野において知られた標準的なアッセイ（例えば、ガラクトシダーゼ、蛍光、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）によって活性が検出可能である酵素をコードする遺伝子、および、形質転換または形質導入された細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に視覚的に影響を及ぼす遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）を含む。好ましいベクターは、それらが作動可能に連結されているＤＮＡセグメント中に存在する構造的な遺伝子産物の自律複製および発現が可能なものである。
【００６５】
また、細胞における遺伝子発現を評価するための方法も本開示の範囲内であり、同方法は、ここに記載の遺伝子コンストラクトを細胞に提供すること、および、第１の遺伝子摂動カセット（プロモータに最も近い遺伝子摂動カセット）が発現される細胞条件下でインキュベートすることを含む。いくつかの態様において、条件は、遺伝子要素が発現することも可能にする。遺伝子要素をコードする核酸が、リコンビナーゼをコードする核酸配列内にある態様において、細胞は、遺伝子要素がリコンビナーゼ転写物から切除されるか、または切断される条件下でインキュベートされる。例えば、本開示の遺伝子コンストラクトを含む細胞は、従来の細胞培養方法を使用して培養（例えば、細胞培養で維持）され得る。例えば、細胞は、細胞インキュベーター中で適切な温度およびガス混合物（例えば、哺乳動物細胞について３７℃、５％ＣＯ２）で増殖および維持され得る。いくつかの態様において、細胞は、発達状態、活性化または疾患状態などの細胞の所望の状態を誘導するために、特定の条件下でインキュベートされ得る。培養条件は、各細胞種で異なり得る。例えば、細胞増殖培地は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子、および他の栄養素の存在において変化し得る。培地を補うために使用される成長因子は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ胎児血清、ウマ血清および／またはブタ血清などの動物の血液の血清にしばしば由来する。いくつかの態様において、ここで提供される使用される培養培地は、市販されており、および／または十分に記載されている（例えば、Birch J. R., R.G. Spier (Ed.) Encyclopedia of Cell Technology, Wiley. 411-424, 2000; Keen M. J. Cytotechnology 17: 125-132, 1995; Zang, et al. Bio/Technology. 13: 389-392, 1995を参照されたい）。いくつかの態様において、化学的に規定された媒体が使用される。
【００６６】
遺伝子摂動カセットの各々の時間的および連続的な誘導は、遺伝子摂動カセットの各々の遺伝子要素のアウトプットを評価することによって評価され得る。いくつかの態様において、遺伝子要素のアウトプットは、遺伝子要素の発現または活性を評価することを含む。遺伝子要素の発現を評価する方法は、当業者に明らかであり、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ノーザンブロッティング、およびＲＮＡ−Ｓｅｑを含む。いくつかの態様において、遺伝子要素は遺伝子であり、遺伝子の産物の量を定量することによって遺伝子の発現は評価される。代替的または追加的に、遺伝子要素の活性は、例えば、遺伝子要素の活性から生じる産物の量を測定すること、および／または、遺伝子要素の標的遺伝子などの標的の発現を測定することによって評価され得る。
【００６７】
発明は、その用途において、構成の詳細、および、説明に記載されまたは図面に示されている成分の配置に限定されない。発明は、他の態様が可能であり、様々な方法で実行または実施されることが可能である。また、ここで使用される表現および用語は、説明の目的のためであり、限定的であると見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物ならびに追加項目を包含することを意味する。
本発明は、以下の例によってさらに示されるが、これは決してさらなる限定として解釈されるべきではない。この出願の全体にわたって引用されたすべての参考文献（文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）のすべての内容は、特にここで参照される教示に関して、参照により明示的にここに組み込まれる。
【００６８】
例
例１
宿主細胞中に存在するとき、遺伝子コンストラクトの第１の遺伝子摂動カセットは、コンストラクトの第１の遺伝子摂動カセットの上流に位置するプロモータの制御下で発現される（図１Ａ）。遺伝子摂動カセットの発現は、不活性リコンビナーゼ（不活性Ｒｅｃ１）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子を使用して下流の標的に効果を発揮するｇＲＮＡ遺伝子要素の産生を可能にする。不活性Ｒｅｃ１は、インデューサ１によって活性化され、同種のリコンビナーゼ部位（Ｒ１）を使用した第１の遺伝子摂動カセットの自己切除をもたらす。１対のリコンビナーゼ認識部位（Ｒ１）との組み換えは、第１の遺伝子摂動カセットの除去および単一のＲ１部位の生成を可能にする。第１の遺伝子摂動カセットの除去後、第２の遺伝子摂動カセットはプロモータに最も近く、カセットの発現および不活性リコンビナーゼ２（Ｒｅｃ２）およびｇＲＮＡ２の産生を可能にする（図１Ｂ）。ｇＲＮＡ２は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子を使用して下流の標的を調節する。インデューサ２は、Ｒｅｃ２活性を活性化し、対応するリコンビナーゼ認識部位（Ｒ２）を使用して第２の遺伝子摂動カセットを自己切断し、第３の遺伝子摂動カセットがプロモータに最も近い遺伝子摂動カセットになる。次いで、不活性リコンビナーゼ３（Ｒｅｃ３）およびｇＲＮＡ３を産生する第３の遺伝子摂動カセットが発現される（図１Ｃ）。ｇＲＮＡ３は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ転写因子を使用して下流の標的を調節する。インデューサ１はＲｅｃ３活性を活性化し、これは対応するリコンビナーゼ認識部位（Ｒ３）を使用して第３のＧＰＣを自己切除する。
ｇＲＮＡの下流の標的の摂動（活性化または阻害の程度）を評価して、遺伝子発現のタイミングおよび順序を決定する。
【００６９】
例２
遺伝子摂動カセットは、図２に示す一般的な図式に従って生成した。カセットは、Ｎ末端部分（スプリット−Ｎ）およびＣ末端部分（スプリット−Ｃ）として発現されるスプリットリコンビナーゼを含み、各々は、インデューサ（例えば、ジベレリン（ＧＩＢ）またはアブシジン酸（ＡＢＡ））に特異的に結合する結合ドメインの部分に融合する。具体的には、スプリットＣｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子摂動カセットは、全長Ｃｒｅリコンビナーゼの７５％であるＮ末端部分および全長Ｃｒｅリコンビナーゼの２５％であるＣ末端部分を含んでいた。スプリットＦｌｐＯリコンビナーゼをコードする遺伝子摂動カセットは、ＦｌｐＯリコンビナーゼの９５％であるＮ末端部分および全長ＦｌｐＯリコンビナーゼの５％であるＣ末端部分を含んでいた。
一般に、インデューサの非存在下では、スプリットリコンビナーゼおよびｍＣｈｅｒｒｙの部分が発現される。しかしながら、インデューサの存在下では、スプリットリコンビナーゼの部分が二量体化して、リコンビナーゼを再構成して活性化する。ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子摂動カセットの切除は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする遺伝子の発現を可能にする。
【００７０】
３つの例示的な遺伝子摂動カセット：ＡＢＡと相互作用する結合ドメインに融合されたスプリットリコンビナーゼとして発現したＦｌｐＯ；ＧＩＢと相互作用する結合タンパク質に融合された分裂リコンビナーゼとして発現したＣｒｅ；および、ＧＩＢと相互作用する結合ドメインに融合されたスプリットリコンビナーゼとして発現したＦｌｐＯを産生した。２９３Ｔ細胞に、例示的な遺伝子摂動カセットを一時的に遺伝子導入し、ビヒクル（エタノール）またはインデューサ（例えば、リコンビナーゼ二量体化薬物：ＧＩＢまたはＡＢＡ）で処理した。フローサイトメトリー分析による処理の９６時間後に、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰの発現を評価した（図３Ａ）。データはまた、ＢＦＰ細胞／全細胞（ＢＦＰ陽性またはｍＣｈｅｒｒｙ陽性）のパーセントとして計算した（ＢＦＰの発現をもたらす）遺伝子摂動カセットの切除の頻度としても示す（図３Ｂ）。
図３Ａおよび３Ｂに示すように、細胞を適切なインデューサで処理すると、遺伝子摂動カセットの切除の増加をもたらし、下流の遺伝子のＢＦＰの発現をもたらした。
【００７１】
例３
遺伝子摂動カセットの拡張可能なリコンビナーゼカスケードを使用して、がんの因果的な変異が連続的に蓄積される腫瘍形成モデルを確立することができる。例えば、結腸直腸がんの４段階の腫瘍形成は、図４Ａに示すように大腸ポリポーシス（ＡＰＣ）、ｐ５３、ＫＲＡＳおよびＳｍａｄ４の変異によって定義される。これは、遺伝子摂動カセットを使用してモデル化することができ、その各々は、ＡＰＣ、Ｓｍａｄ４、またはｐ５３変異などの腫瘍原性の変異を引き起こすことができるｇＲＮＡをコードするか、またはＫＲＡＳ変異体などの変異型発癌遺伝子を発現する。
図４Ｂに示されるように、第１の遺伝子摂動カセットの発現は、ＡＰＣの変異を誘導する１以上のｇＲＮＡの発現をもたらす。第１のインデューサとの接触は、第１の遺伝子摂動カセットの切除をもたらし、第２の遺伝子摂動カセットの発現を可能にする。第２のインデューサとの接触は、第２の遺伝子摂動カセットの切除をもたらし、活性ＫＲＡＳ変異体ならびにＳｍａｄ４の変異を誘導する１以上のｇＲＮＡを含む第３の遺伝子摂動カセットの発現を可能にする。第３のインデューサとの接触は、第３の摂動カセットの切除をもたらし、第４の遺伝子摂動カセット（ｐ５３の変異を誘導する１以上のｇＲＮＡを含む）の発現を可能にする。がんの発達（例えば、１以上のがんマーカー）は、１以上のインデューサとの接触の前、最中および／または後の当該技術分野において知られた方法を使用して評価することができる。
【００７２】
例４
遺伝子摂動カセットの拡張可能なリコンビナーゼカスケードは、効率的な指向性の細胞分化を確立するために使用することができる。連続的な遺伝子摂動は、治療価値の特定の細胞種の自然発生プロセスを模倣し得る。図５Ａに示すように、細胞分化は、多数の転写因子の協調した発現を含み、そのサブセットは図（Pagliuca and Melton, Development (2013) 140(12): 2472-83より）に示される。
【００７３】
細胞の胚体内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌前駆細胞、次いで膵臓ベータ細胞への分化を可能にする重要な転写因子の発現を活性化するｇＲＮＡをコードする遺伝子摂動カセットを使用して、前駆細胞のインスリン産生膵臓ベータ細胞への直接的な分化を達成することができる（図５Ｂ）。図５Ｂに示すように、第１の遺伝子摂動カセットの発現は、胚体内胚葉への細胞の分化に関与する１以上の転写因子の発現を活性化する１以上のｇＲＮＡの発現をもたらす。第１のインデューサとの接触は、細胞の膵臓内胚葉への分化に関与する１以上の転写因子の発現を活性化する１以上のｇＲＮＡを含む、第２の遺伝子摂動カセットの発現を可能にする第１の遺伝子摂動カセットの切除をもたらす。第２のインデューサとの接触は、細胞の内分泌前駆細胞への分化に関与する１以上の転写因子の発現を活性化する１以上のｇＲＮＡを含む第３の遺伝子摂動カセットの発現を可能にする、第２の遺伝子摂動カセットの切除をもたらす。第３のインデューサとの接触は、細胞の膵臓ベータ細胞への分化に関与する１以上の転写因子の発現を活性化する１以上のｇＲＮＡを含む、第４の遺伝子摂動カセットの発現を可能にする第３の摂動カセットの切除をもたらす。細胞分化または細胞状態（例えば、１以上の細胞マーカー）は、１以上のインデューサとの接触の前、最中、および／または後の当該技術分野において知られた方法を使用して評価することができる。
【００７４】
このように、この発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面を説明したので、当業者には様々な変更、修正、および改善が容易に思い付くであろうことが理解されるべきである。かかる変更、改変、および改善は、この開示の部分であることが意図されており、発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明および図面は単なる例である。
【００７５】
等価物
いくつかの発明の態様をここに記載し説明してきたが、当業者は、機能を実行し、および／または結果を得るための様々な他の手段および／または構造、および／またはここに記載の１以上の利点を容易に想起し、および、かかる変形および／または改変の各々は、ここに記載の発明の態様の範囲内にあると考えられる。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２以上の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。
ここで開示されるすべての文献、特許および特許出願は、各々が引用されている主題に関して参照によって組み込まれており、ある場合には、文書の全体が包含され得る。
【００７６】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「および／または」という語句は、そのように結合された「一方または両方」の要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離して存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合された要素の「１以上の」と解釈されるべきである。具体的に特定された要素と関連するかどうかにかかわらず、「および／または」句によって具体的に特定される要素以外に他の要素が任意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む（comprising）」などの開放型言語と併せて使用されるとき、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、一態様ではＡのみ（任意にＢ以外の要素を含む）；他の態様ではＢのみ（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに他の態様ではＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）等を指し得る。
【００７７】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、１よりも大きい数、および任意に追加のリストにない項目をも含むと解釈されるべきである。「１つのみ」または「正確に１つ」などの逆に明示された用語または特許請求の範囲において使用されるとき「からなる」という用語のみが、要素の数またはリストの正確な１つの要素を含むことを指す。一般的に、ここで使用される場合、「または」という用語は、「いずれか」、「１つ」、「１つのみ」、または「正確に１つ」などの排他性の用語が先立つとき、排他的な代替（すなわち、「１つまたは他方だが両方ではない」）を示すものとのみ解釈される。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【００７８】
ここで明細書および特許請求の範囲において使用される場合、１以上の要素のリストの参照において、「少なくとも１つの」という語句は、要素のリスト中の任意の１以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に特に列挙された各要素およびすべての要素の少なくとも１つを含むことはなく、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、それらの要素が具体的に定義されたものであるか否かに関わらず、「少なくとも１つの」という語句が指し示す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外に、要素が任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様において、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）少なくとも１つのＡ（任意に１より多いＡを含む）；他の態様において、Ａが存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）少なくとも１つのＢ（任意に１より多いＢを含む）；さらに他の態様において、少なくとも１つのＡ（任意に１より多いＡを含む）および少なくとも１つのＢ（任意に１より多いＢを含む）（および任意に他の要素を含む）；等を指し得る。
【００７９】
それとは逆に明確に示されていない限り、１よりも多いステップまたは動作を含むここでクレームされる任意の方法においても、方法のステップまたは動作の順序は、必ずしも方法のステップまたは動作が記載される順序に限定されないことが理解されるべきである。ここに開示されるすべての文献、特許および特許出願は、各々が引用されている主題に関して参照によって組み込まれ、ある場合には、文書の全体が包含され得る。
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「もつ（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」、「もつ（holding）」、「から構成される（composed of）」などのすべての移行句は開放型であること、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」および「から本質的になる」のみを、United 30 States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に記載されているように、それぞれ閉鎖型または半閉鎖型の移行句とする。
【図１ＡＢ】
2019514377.tif 000003
【図１Ｃ】
2019514377.tif 000004
【図２】
2019514377.tif 000005
【図３Ａ】
2019514377.tif 000006
【図３Ｂ】
2019514377.tif 000007
【図４ＡＢ】
2019514377.tif 000008
【図５ＡＢ】
2019514377.tif 000009
【配列表】
2019514377000001.app
【国際調査報告】
2019514377.tif 000010
2019514377.tif 000011
2019514377.tif 000012
2019514377.tif 000013