(57)【要約】  本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合することができる第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができる第２の結合ドメインとを含む、二重特異性抗体などの多重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、当該二重特異性ポリペプチドの組成物、ならびにその方法および使用を提供する。
2019535282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＴＲに特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、多重特異性ポリペプチド。
【請求項２】
前記第１および／または第２の結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原結合断片が、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、およびドメイン抗体からなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）Ｂ１が、ＩｇＧ１抗体を含むまたはそれからなり、Ｂ２が、ｓｃＦｖを含むまたはそれからなる、またはその逆である、あるいは
（ｂ）Ｂ１が、少なくとも１つのｓｃＦｖを含むまたはそれらからなり、Ｂ２が、少なくとも１つのｓｃＦｖを含むまたはそれらからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第１および／または第２の結合ドメインが、非抗体ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｂ１が、ＩｇＧ１抗体を含むまたはそれからなり、Ｂ２が、非免疫グロブリンポリペプチドを含むまたはそれからなる、またはその逆である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に結合することができるＣＤ８６ドメインまたはその変異型を含むまたはそれからなる、請求項６または７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
Ｂ１が、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に付着している、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｂ１が、
（ａ）少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、前記重鎖もしくは前記軽鎖のいずれかに付着している、または
（ｂ）２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）を含み、Ｂ２が、両方の重鎖もしくは両方の軽鎖に付着している、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｎ−Ｃ方向に書かれている以下の式、
（ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、または
（ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
のうちのいずれか１つに従って配置され、式中、Ｘがリンカーであり、ｎが０または１である、ポリペプチド鎖を含むまたはそれからなる、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
Ｘが、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、またはｍ＝１〜７である（ＳＧ）ｍを有するペプチドである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ヒトＦｃ領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記Ｆｃ領域が、天然に存在する（すなわち野生型）ヒトＦｃ領域である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｆｃ領域が、天然に存在しない（例えば、突然変異した）ヒトＦｃ領域である、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域が、アフコシル化されている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスを誘導することができる、請求項１〜１６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、腫瘍免疫を誘導することができる、請求項１〜１７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
１０×１０−９Ｍ、４×１０−９Ｍ、もしくは１×１０−９Ｍ未満のＫｄでヒトＧＩＴＲに結合している、および／または６０×１０−９Ｍ、２５×１０−９Ｍ、もしくは１０×１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＣＴＬＡ−４に結合している、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
エフェクターＴ細胞の活性の増大を誘導し、任意選択に前記増大が、別々の分子として前記Ｔ細胞に投与された前記第１および第２の結合ドメインの組み合わせによって誘導されたエフェクターＴ細胞の活性の増大よりも、少なくとも１．５倍、４．５倍、または７倍高い、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、
ｉ）ＧＩＴＲ発現腫瘍細胞を殺滅することができる、および
ｉｉ）エフェクターＴ細胞の活性化を介して免疫系を活性化することができる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞活性における増大が、前記Ｔ細胞による増殖の増加、および／またはＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生の増加である、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
Ｂ１が、ＧＩＴＲに対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり、Ｂ２が、ＣＴＬＡ−４に特異的なポリペプチド結合ドメインであって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列、または
（ｂ）前記結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むまたはそれからなる、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインである、請求項１〜２２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２４】
Ｂ２（ｉｉ）の前記アミノ酸配列中の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸が、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較すると置換されており、任意選択に、前記配列番号３のアミノ酸配列と比較して挿入または欠失が存在しない、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｂ２のアミノ酸配列中の前記アミノ酸置換のうちの少なくとも１つが１２２位にあり、任意選択に、前記アミノ酸配列が、１０７位、１２１位、および１２５位のうちの少なくとも１つにおいても置換されている、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｂ２のアミノ酸配列が、配列番号６〜２４のうちのいずれか１つから選択されたアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＧＩＴＲ結合ドメイン（Ｂ１）が、配列番号６１、６３、６５、および６７からなる群から選択された軽鎖可変領域アミノ酸配列と、配列番号５２、５４、５６、および５８からなる群から選択された重鎖可変領域アミノ酸配列とを含む抗体のヒトＧＩＴＲへの結合を競合的に阻害することができる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
Ｂ１が、配列番号８８、８９、および９０のＣＤＲを含む軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号７６、７７、および７８のＣＤＲを含む重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
Ｂ１が、配列番号９１、９２、および９３のＣＤＲを含む軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号７９、８０、および８１のＣＤＲを含む重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
Ｂ１が、配列番号９４、８９、および９５のＣＤＲを含む軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号８２、８３、および８４のＣＤＲを含む重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
Ｂ１が、配列番号９４、８９、および９６のＣＤＲを含む軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号８５、８６、および８７のＣＤＲを含む重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ＧＩＴＲ結合ドメイン（Ｂ１）が、配列番号６１、６３、６５、および６７からなる群から選択された軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号５２、５４、５６、および５８からなる群から選択された重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
Ｂ１が、配列番号６１の軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号５２の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
Ｂ１が、配列番号６３の軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号５４の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
Ｂ１が、配列番号６５の軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号５６の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
Ｂ１が、配列番号６７の軽鎖可変領域アミノ酸配列、および／または配列番号５８の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
Ｂ１が、
（ａ）配列番号６１の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号５２の重鎖可変領域アミノ酸配列、
（ｂ）配列番号６３の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号５４の重鎖可変領域アミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６５の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号５６の重鎖可変領域アミノ酸配列、または
（ｄ）配列番号６７の軽鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号５８の重鎖可変領域アミノ酸配列、を含むまたはそれらからなる、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＧＩＴＲ結合ドメインが、ヒトＦｃ領域または前記領域の変異型を含み、前記領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
（ａ）配列番号６９、７１、７３、および７５から選択された軽鎖アミノ酸配列と、
（ｂ）５２、５４、５６、および５８からなる群から選択された重鎖可変領域アミノ酸配列と、を含むまたはそれらからなる、請求項１〜３８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４０】
（ａ）配列番号５２および６９、または
（ｂ）配列番号５４および７１、または
（ｃ）配列番号５６および７３、または
（ｄ）配列番号５８および７５、の前記アミノ酸配列を含むまたはそれらからなる、請求項１〜３９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４１】
少なくとも１つのさらなる結合ドメインをさらに含む、請求項１〜４０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのさらなる結合ドメインが、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、およびドメイン抗体からなる群から選択された抗原結合断片である、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのさらなる結合ドメインが、請求項４０または４１に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
追加の治療部分をさらに含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む、組成物。
【請求項４６】
請求項２６〜３７のいずれか一項に定義されるＧＩＴＲに対し特異的な、抗体。
【請求項４７】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチドまたはその構成要素ポリペプチド鎖をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
個体における腫瘍性疾患または状態を治療または予防するための方法に使用するための、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項４９】
前記疾患または状態が癌である、請求項４８に記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項５０】
前記癌が、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、および膠芽腫からなる群から選択される、請求項４９に記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項５１】
個体における腫瘍性疾患または状態を治療または予防するための薬剤の調製における、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチドの使用。
【請求項５２】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体における腫瘍性疾患または状態を治療または予防する方法。
【請求項５３】
前記方法が、前記二重特異性抗体を、全身に、または腫瘍の部位もしくは腫瘍流入領域リンパ節などの局所に投与することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
本明細書を参照して請求の範囲に実質的に記載される通りである、二重特異性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４に特異的に結合する多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチド、ならびに癌の治療および予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、先進国における早死の主な原因である。癌の免疫療法は、腫瘍細胞に対して有効な免疫応答を組織することを目的とする。これは、例えば、腫瘍抗原に対する寛容性を破壊すること、抗腫瘍免疫応答を増強すること、および腫瘍部位における局所的なサイトカイン応答を刺激することによって達成され得る。長期的な抗腫瘍免疫応答の重要なエフェクター細胞は、活性化された腫瘍特異的エフェクターＴ細胞（Ｔ  ｅｆｆ）である。活性化エフェクターＴ細胞の強力な拡張は、免疫応答を腫瘍に再指向することができる。これに関連して、制御性Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇ）は、抗腫瘍免疫を阻害する役割を果たす。したがって、Ｔｒｅｇを枯渇、阻害／元に戻す、または不活性化することは、抗腫瘍効果を提供し、腫瘍微小環境における免疫抑制を元に戻すことができる。さらに、例えば樹状細胞によるエフェクターＴ細胞の不完全な活性化はＴ細胞アネルギーを引き起こす可能性があり、それは不十分な抗腫瘍応答をもたらすのに対し、樹状細胞による適切な誘導は活性化エフェクターＴ細胞の強力な拡張を生じて、腫瘍に対する免疫応答を再指向することができる。加えて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、下方制御されたヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を発現して腫瘍細胞を攻撃することによって、および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することによって、腫瘍免疫学的に重要な役割を果たす。したがって、ＮＫ細胞を刺激することにより、腫瘍の成長をも低下させ得る。
【０００３】
グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ、ＣＤ３５７、またはＴＮＦＲＳＦ１８）は、ナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ細胞プライミング、Ｔ細胞エフェクター（Ｔｅｆｆ）分化および記憶Ｔ細胞の応答中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を増強することができる、Ｔ細胞の重要な共刺激受容体である。ヒトでは、ＧＩＴＲ発現は、一般にナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞では低く、活性化Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に限定されている。ＧＩＴＲの上方制御は、ＴＣＲ活性化の６時間後に起こり、２４時間以内にピークに達する（Ｋａｎａｍｕｒｕ、２００４年）。ＧＩＴＲの活性化は、主に抗原提示細胞（ＡＰＣ）および内皮細胞に発現するそのリガンドＧＩＴＲＬによって引き起こされる。他のＴＮＦＲファミリーメンバーと同様に、ＴＣＲシグナル伝達と一緒になったＧＩＴＲ共刺激は、ＮＦκＢ経路の活性化を誘導し、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、さらにはＩＬ−１０などのサイトカイン放出の向上をもたらし（Ｋａｎａｍｕｒｕ、２００４年）、ＣＤ３誘導性アポトーシスを阻害し（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ、１９９７年）、Ｔ細胞の生存期間、増殖および拡張を促進する。それにより、ＧＩＴＲ刺激はＣＤ４エフェクターＴ細胞の拡張、記憶表現型への成熟および分化、ならびにＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を支援する。重要なことに、ＧＩＴＲは、末梢および胸腺のＴｒｅｇ、特にその活性化Ｔｒｅｇに高度に発現し、それらの制御性機能において重要であるが矛盾する役割も果たす（Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ、２０１５年）：
１）マウスモデルでは、ＧＩＴＲは、Ｔｒｅｇの分化および拡張に極めて重要である。
【０００４】
２）逆に、ＧＩＴＲ刺激は、例えばＦＯＸＰ３の分解を介してＴｒｅｇ免疫抑制機能を無効にすることができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ、２００２年）（ＭｃＨｕｇｈ、２００２年）（Ｃｏｈｅｎ、２０１０年）。これは、非生理学的条件でのＧＩＴＲの過剰刺激に起因する一過性の薬理学的効果によって部分的に説明することができる。
【０００５】
３）ＧＩＴＲ誘導性シグナル伝達はまた、Ｔｒｅｇによって誘導される免疫抑制に対してより耐性になるようにＴ細胞を促進して、免疫原性の弱い腫瘍関連抗原に対するＴ細胞の応答性を向上し、腫瘍に指向された免疫および腫瘍拒絶を生じ得る。
【０００６】
４）活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのＧＩＴＲ抗体Ｆｃ部分の結合、およびナイーブＴ細胞またはＴｅｆｆよりもＴｒｅｇでより高いＧＩＴＲの発現によって引き起こされる、ＴｒｅｇでのＧＩＴＲ抗体の別の抑制効果は、特にＴｒｅｇの枯渇に依存する。この効果は、ＦｃγＲを発現するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）および腫瘍に浸潤する骨髄細胞の高浸潤に起因して腫瘍領域に限定されることが示唆されている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ、２０１３年）。
【０００７】
ＧＩＴＲ抗体の治療効果に対するこれらのメカニズムの相対的重要性は状況に依存し得る。
【０００８】
現在、８個のＧＩＴＲ  ｍＡｂが臨床開発の第Ｉ相にある。これらは、従来の二価のモノクローナル抗体のみならず、最適なＴ細胞活性化および／またはＴｒｅｇ枯渇のためにＧＩＴＲ多量体化を最大限にするために、Ｆｃドメインにカップリングした多価（六量体）ＧＩＴＲＬ融合タンパク質であるＭＥＤＩ−１８７３（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）も含む。ヒト化アグリコシル化ＩｇＧ１  ＧＩＴＲ抗体であるＴＲＸ−５１８（Ｌｅａｐ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、黒色腫に対して２０１０年に最初に臨床に入った非枯渇抗体である。最初の単回用量漸増研究は、低い有効性または毒性を示した。ＴＲＸ−５１８の反復投与による新たな用量漸増研究は、２０１５年に開始された。ＩＮＣＡＧＮ０１８７６（Ａｇｅｎｕｓ／Ｉｎｃｙｔｅ）およびＧＷＮ３２３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は両方とも、ＦｃγＲを結合および活性化し、Ｔｒｅｇなどの標的細胞のＡＤＣＣを誘導することができるＩｇＧ１抗体である。ＢＭＳ、ＡｍｇｅｎおよびＭｅｒｃｋからの少なくともさらに４つのＧＩＴＲ抗体が、臨床開発に達している。抗体のアイソタイプおよびそれらがＡＤＣＣを誘導する能力は、異なるＧＩＴＲを標的とする化合物の作用機序としてのＴｒｅｇ枯渇とＴ細胞エフェクター機能とのバランスに影響を与える可能性がある。
【０００９】
Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化の負の調節因子として機能し、最初の活性化に続いてＴ細胞表面上で上方制御される。抗原提示細胞によって発現されるＣＴＬＡ−４受容体のリガンドは、Ｂ７タンパク質、ＣＤ８０、およびＣＤ８６である。Ｔ細胞活性化の上方制御を担う対応するリガンド受容体対は、ＣＤ２８−Ｂ７である。ＣＤ２８を介したシグナル伝達は共刺激経路を構成し、続いてＭＨＣ複合体によって提示されるＴ細胞受容体認識抗原ペプチドを通じてＴ細胞を活性化する。ＣＤ８０／ＣＤ８６に対するＣＴＬＡ−４の相互作用を遮断することによって、免疫応答の正常なチェックポイントのうちの１つを取り除くことができる。正味の結果として、抗腫瘍免疫に寄与し得るエフェクターＴ細胞の活性を向上する。これは、エフェクターＴ細胞の直接活性化に起因し得るが、例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣＰを介したＴｒｅｇ細胞の活性および／または数の低下にも起因し得る。
【００１０】
ＣＴＬＡ−４のチェックポイント遮断は、Ｔ細胞活性化および抗腫瘍効果の改善をもたらすが、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与は毒性副作用と関連している。ＣＴＬＡ−４は、黒色腫肺癌、腎臓癌、および頭頸部癌などの多くの固形腫瘍における制御性Ｔ細胞に過剰発現する（Ｋｗｉｅｃｉｅｎ、２０１７年）（Ｍｏｎｔｌｅｒ、２０１６年）（Ｒｏｓｓ，Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１７年）。
【００１１】
ＣＴＬＡ−４抗体（イピリムマブ）を用いたメラノーマ治療の臨床研究は、生存期間における利点を実証している（Ｈｏｄｉら、２０１０年）。ＩｇＧ１抗体であるイピリムマブの効果のメカニズムは完全には解明されていない。現在のデータは、ＣＴＬＡ−４抗体の二重活性、末梢Ｔｅｆｆの活性化、および腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を裏付けている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ、２０１３年）（Ｆｕｒｎｅｓｓ、２０１４年）。
【００１２】
ＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０／ＣＤ８６の相互作用を遮断することによって、免疫応答における正常なチェックポイントのうちの１つが取り除かれる。これは望ましくない免疫活性化をもたらす可能性を有し、たとえそれが抗腫瘍効果をもたらしたとしても、それは毒性副作用とも関連している。他のものは、（腫瘍細胞による）抗ＣＴＬＡ−４抗体の局所産生が、全身投与に関連する自己免疫反応なしに抗腫瘍効果をもたらすことを実証している（Ｆｒａｎｓｅｎ、２０１３年）。
【００１３】
ＩｇＧ１フォーマットの抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂであるイピリムマブ（ＢＭＳ）は、黒色腫の治療用に承認されており、現在、例えば非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、および前立腺癌に対して臨床第ＩＩＩ相にある。加えて、ＢＭＳは臨床第Ｉ相にあるイピリムマブの非フコシル化バージョンを有する。トレメリムマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）は、例えば中皮腫、ＮＳＣＬＣ、および膀胱癌に対して臨床第ＩＩＩ相にある抗ＣＴＬＡ−４  ＩｇＧ２  ｍＡｂである。ＡＧＥＮ−１８８４（Ａｇｅｎｕｓ  Ｉｎｃ．）は、最近登録された、進行性固形腫瘍に対して第Ｉ相にある抗ＣＴＬＡ−４抗体である。
ＧＩＴＲまたはＣＴＬＡ−４を標的とする単一特異性抗体は、一般に、例えば他の細胞上のＦｃγ受容体を介した架橋に依存して、それぞれの受容体を発現する細胞への強いシグナル伝達を誘導する。したがって、そのような架橋が提供されていないとき、それらは効率的にシグナルを伝達しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｂａｅｓｓｌｅｒ  Ｔ、Ｃｈａｒｔｏｎ  ＪＥ、Ｓｃｈｍｉｅｄｅｌ  ＢＪ、Ｇｒｕｎｅｂａｃｈ  Ｆ、Ｋｒｕｓｃｈ  Ｍ、Ｗａｃｋｅｒ  Ａ、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ、Ｓａｌｉｈ  ＨＲＣＤ１３７  ｌｉｇａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｓ  ＮＫ−ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０  Ａｐｒ  １５；１１５（１５）：３０５８−６９．ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００９−０６−２２７９３４．Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：Ｂｌｏｏｄ．２０１０  Ｄｅｃ  ２３；１１６（２６）：６１５２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２０００８７９１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ＧＩＴＲまたはＣＴＬＡ−４のいずれかなど、１つのＴ細胞標的のみを標的とする既存の単一特異性薬物の代替物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様は、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができるＢ１と称される第１の結合ドメインと、ＧＩＴＲに特異的に結合することができるＢ２と称される第２の結合ドメインとを含む、多重特異性ポリペプチドを提供する。
【００１７】
「多重特異性」ポリペプチドとは、典型的には異なる抗原上の、２つ以上の標的エピトープに結合することができるポリペプチドを含む。そのようなポリペプチドの例としては、二重特異性抗体、および三重特異性抗体、ならびにそれらのポリペプチド誘導体が挙げられる（下記参照）。
【００１８】
したがって、二重特異性抗体は、同じまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープに結合する能力を有する分子である。二重特異性抗体は、２つの細胞表面受容体の同時阻害、または２つのリガンドの遮断、２つの受容体の架橋、またはＴ細胞の腫瘍細胞近位への動員を可能にするように開発されている（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、２０１３年）。
【００１９】
ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲなどの２つ以上の異なるＴ細胞標的を標的とする多重特異性抗体は、全ての標的が過剰発現されている場所で免疫系を特異的に活性化する可能性を有する。例えば、ＣＴＬＡ−４は、腫瘍微小環境において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で過剰発現するのに対し、エフェクターＴ細胞でのその発現はより低い。したがって、本発明の多重特異性抗体は、腫瘍微小環境において制御性Ｔ細胞を選択的に標的とする可能性を有する。
【００２０】
ＧＩＴＲ発現は、腫瘍微小環境に浸潤することが知られている活性化ＴｒｅｇでのＣＴＬＡ−４発現と関連し、Ｔｒｅｇの抑制活性は、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４発現と相関している（Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ、２０１５年）（Ｆｕｒｎｅｓｓ、２０１４年）（Ｂｕｌｌｉａｒｄ、２０１３年）（Ｌｅｖｉｎｇ、２００２年）。したがって、二重特異性抗体は、腫瘍における抑制性Ｔｒｅｇを選択的に標的とし、Ｔｒｅｇを特異的に枯渇させる、またはＴｒｅｇの免疫抑制を逆転させる可能性を有する。この効果は、二重特異性抗体のＦｃ部分を介したＡＤＣＣもしくはＡＤＣＰ誘導によって（Ｆｕｒｎｅｓｓ、２０１４年）、またはＧＩＴＲ刺激を介して誘導されたシグナル伝達によって、および／またはＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路を遮断することによって（Ｗａｌｋｅｒ、２０１１年）、媒介することができる。Ｔｅｆｆｓに対しては、二重特異性抗体は、ＧＩＴＲ刺激を介して、およびＣＴＬＡ−４チェックポイント遮断を通じての両方で活性化を誘導し、エフェクター機能を増大する可能性を有する。エクスビボで単離された癌患者からのＴｒｅｇのＧＩＴＲ刺激およびＣＴＬＡ−４遮断の併用研究は、免疫抑制を無効にし、Ｔ細胞抗腫瘍免疫を回復させることができることを示している（Ｇｏｎｚａｌｅｓ、２０１５年）。さらに、マウスモデルにおける研究は、ＧＩＴＲ刺激およびＣＴＬＡ−４遮断を組み合わせたときの有益な抗腫瘍効果を示唆している（Ｐｒｕｉｔｔ、２０１１年）。
【００２１】
要約すると、理論に束縛されることを望むものではないが、本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）抗体ポリペプチドの主な作用機序は、イピリムマブなどのＣＴＬＡ−４抗体と比較してより許容可能な安全性プロファイルを有しながら、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇを枯渇および抑制して、単一特異性ＧＩＴＲ抗体と比較して向上した効果を提供することである、と考えられる。
【００２２】
多重特異性抗体として、本発明のＧＩＴＲ−ＣＴＬＡ−４抗体は、単一特異性抗体の組み合わせと比較して、潜在的な治療有効性の増大、ならびに薬物開発、製造、臨床試験、および規制当局の承認のためのコストを低下させる機会を提供する。フォーマットそれ自体はまた、２つの細胞または２つの異なる細胞受容体を物理的に連結することによって相乗効果を与え得る（Ｍａｙ、２０１２）。これらなどの多重特異性抗体は、これらの特色により、癌治療における治療薬として非常に魅力的である。
【００２３】
特に、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を標的とする多重特異的（例えば二重特異性）抗体は、免疫系を腫瘍内で局所的に活性化する可能性を有する。先に述べたように、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の発現は、腫瘍に浸潤することが知られている活性化Ｔｒｅｇと関連している。したがって、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ＡＤＣＣを介して）腫瘍中のＴｒｅｇを選択的に標的とし、特異的に抑制または枯渇させる可能性を有する。結果として、単一特異性ＧＩＴＲまたはＣＴＬＡ−４抗体の二価結合と比較して、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４への二重の結合によって治療有効性が向上し、その単一特異性の競合阻害物質（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）と比較して多重特異性（例えば二重特異性）抗体の有益な抗腫瘍効果を提供する。さらに、多重特異性（例えば二重特異性）抗体の全身用量は、単一特異性抗体の場合よりも低い場合があり、これは毒性を低下させ、同時にコストを低下させながら患者の安全性を増大することができる。
【００２４】
ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の細胞表面発現パターンは、部分的に重複している。したがって、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を標的とする多重特異的（例えば二特異的）抗体は、シスおよびトランスの両方で、両方の標的に結合する可能性を有する。そのような二重特異性抗体は、同じ細胞上のシスでの受容体クラスタリングのレベルを増大することによってか、または２つの細胞間に人工的な免疫学的シナプスを作成することによってかのいずれかで、ＦｃγＲ−架橋とは独立した様式で、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を通じて刺激する能力を潜在的に有し、ひいては両方の細胞において受容体クラスタリングの向上およびシグナル伝達の増大を生じ得る。そのような細胞間相互作用は、別々の単一特異性抗体の組み合わせによっては達成されない免疫活性化の増大を生じる。
【００２５】
したがって、例示的な実施形態では、本発明の多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドは、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４に特異的に結合することができ、それによって以下を誘導する：
１．単一特異性抗体と比較して、より高い程度の免疫活性化。免疫活性化は、ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲ単一特異性抗体の組み合わせよりも顕著に高い。
【００２６】
２．Ｆｃガンマ受容体を発現する他の細胞などの架橋試薬の存在下でのみ活性化する単一特異性抗体とは対照的に、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４結合実体によって提供される架橋を除いて、いかなる架橋の不在下でも活性化すること、すなわち抗体をウェル表面などの表面に接着させることによって物理的に架橋すること、または単一特異性抗体のＦｃ部分に結合する抗体を架橋すること。
【００２７】
３．より指向的／局所的な免疫活性化。免疫活性化は、高いＧＩＴＲ発現とＣＴＬＡ−４発現の両方を包括する環境でのみ起こる。腫瘍微小環境は、そのような環境である。これは効果を増大し、また有毒な副作用を最小限にする可能性を有する。したがって、治療域が増加し得る。
【００２８】
「ポリペプチド」とは、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣物の化合物を指すために、本明細書においてその最も広い意味で使用される。したがって、「ポリペプチド」という用語は、短いペプチド配列、ならびにより長いポリペプチドおよびタンパク質も含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ光学異性体、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物の両方を含む、天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかを指す。
【００２９】
本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、ポリペプチドが少なくとも２つの異なる標的実体、この場合はＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を特異的に結合することができることを意味する。有利には、本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドは、ＧＩＴＲの細胞外ドメインおよびＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに結合することができる。このような結合特異性は、インビボで、すなわち患者への二重特異性ポリペプチドの投与後に明らかになるであろうことが理解されるであろう。
【００３０】
一実施形態では、第１および／または第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されてもよい。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「抗体」または「抗体（複数）」という用語は、抗原結合部位を含有する分子、例えば、免疫グロブリン分子、および抗原結合部位を含有する免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を指す。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、組み換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ（例えば、単一特異的および二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のもののうちのいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
「指向された」抗体または「再指向された」抗体という用語は、本明細書では互換的に使用され、ある特定の標的／マーカー／エピトープ／抗原にその結合特異性（複数可）を指向するように構成された抗体、すなわち標的／マーカー／エピトープ／抗原に免疫特異的に（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）結合する抗体を指す。また、「指向された」または「再指向された」と同じ定義を有する、ある特定の標的／マーカー／エピトープに「選択的」な発現抗体が、使用され得る。（選択的に）少なくとも２つの異なる標的／マーカー／エピトープ／抗原に指向された多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、標的／マーカー／エピトープ／抗原の両方に免疫特異的に結合する。抗体がＧＩＴＲなどのある特定の標的抗原に指向される場合、当該抗体は、当該標的抗原構造上に存在する任意の好適なエピトープに指向され得ると考えられる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆ（ａｂ）．ｓｕｂ．２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部分である。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体断片は、ＧＩＴＲに結合する。「抗体断片」という用語はまた、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）によって連結している組み換え単一鎖ポリペプチド分子などの、可変領域からなる単離された断片を含む。本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、Ｆｃ断片または単一アミノ酸残基などの、抗原結合活性を有さない抗体の部分を含まない。
ＳｃＦｖドメインは、本発明の多重特異性（例えば二重特異性）抗体に含めるのに特に好ましい。
【００３４】
したがって、一実施形態では、ポリペプチドは、多重特異性（例えば二重特異性）抗体である。
【００３５】
本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドは、いくつかの異なる構造的フォーマットのもの（例えば、Ｃｈａｎ＆Ｃａｒｔｅｒ、２０１６年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０、３０１−３１６参照、これらの開示は参照により本明細書に援用される）であり得ることが、当業者には理解されるであろう。
【００３６】
例示的な実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）抗体は以下からなる群から選択される：
ｉ）ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体などの二価の二重特異性抗体（例えば、Ｂ１がインタクトなＩｇＧであり、Ｂ２が、ＩｇＧの軽鎖のＮ末端で、および／または軽鎖のＣ末端で、および／または重鎖のＮ末端で、および／または重鎖のＣ末端でＢ１に付着したｓｃＦｖである、またはその逆）、
ｉｉ）ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ  ＡＳ、コペンハーゲン、デンマーク）などの一価の二重特異性抗体、または「ノブインホール」二重特異性抗体（例えば、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、ｓｃＦｖ−ＫＩＨｒ、ＢｉＴＥ−ＫＩＨ、またはＢｉＴＥ−ＫＩＨｒ（Ｘｕら、２０１５年、ｍＡｂｓ７（１）：２３１−２４２参照）、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ２−Ｆｃ二重特異性抗体（例えば、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＩｎｃからのＡＤＡＰＴＩＲ（商標）二重特異性抗体など）、
ｉｖ）ＢｉＴＥ／ｓｃＦｖ２二重特異性抗体、
ｖ）ＤＶＤ−Ｉｇ二重特異性抗体、
ｖｉ）ＤＡＲＴ系二重特異性抗体（例えば、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、ＤＡＲＴ２−Ｆｃ、またはＤＡＲＴ）、
ｖｉｉ）ＤＮＬ−Ｆａｂ３二重特異性抗体、ならびに
ｖｉｉｉ）ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体。
【００３７】
したがって、本発明の多重特異性（例えば二重特異性）抗体の例示的な実施形態では、
（ａ）結合ドメインＢ１および／または結合ドメインＢ２は、インタクトなＩｇＧ抗体である（または一緒になってインタクトなＩｇＧ抗体を形成する）、
（ｂ）結合ドメインＢ１および／または結合ドメインＢ２は、Ｆｖ断片（例えばｓｃＦｖ）である、
（ｃ）結合ドメインＢ１および／または結合ドメインＢ２は、Ｆａｂ断片である、および／または
（ｄ）結合ドメインＢ１および／または結合ドメインＢ２は、単一ドメイン抗体（例えばドメイン抗体およびナノボディ）である。
【００３８】
例えば、多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体であってもよい。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ抗体は、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨのいずれかの配向でもよい。一実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬとの間のＳ−Ｓブリッジによって安定化させてもよい。
【００３９】
代替的な実施形態では、本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドは、抗体可変ドメインまたはその一部を含むまたはそれからなる第１の結合ドメインと、抗体可変ドメインまたはその一部ではない第２の結合ドメインとを含み得る。したがって、第１および／または第２の結合ドメインは、非抗体ポリペプチドであり得る。例えば、Ｂ１は、ＩｇＧ１抗体を含み得るまたはそれからなり得、Ｂ２は、非免疫グロブリンポリペプチドを含み得るまたはそれからなり得る、またはその逆である。
【００４０】
一実施形態では、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に結合することができるＣＤ８６ドメインまたはその変異型を含むまたはそれからなる。
【００４１】
結合ドメインＢ１および結合ドメインＢ２が互いに直接融合していることが当業者には理解されるであろう。
【００４２】
代替的な実施形態では、結合ドメインＢ１と結合ドメインＢ２は、ポリペプチドリンカーを介して接合している。例えば、ポリペプチドリンカーは、約１０〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドであり得る。リンカーは通常、グリシンに富み柔軟であり、ならびにセリンまたはトレオニンに富み溶解性であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結することができる、またはその逆のいずれかであってもよい。例示的なリンカーとしては、配列番号４７〜５１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列のペプチドが挙げられる。
【００４３】
本発明の多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドは、当該技術分野において使用されている任意の既知の好適な方法によって製造され得る。本発明の二重特異性抗体を調製する方法としては、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＦｃａｂおよびＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ改変ＩｇＧ１（Ｘｅｎｃｏｒ）、またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。二重特異性抗体を調製するのに有用な他のプラットフォームの例としては、ＷＯ２００８／１１９３５３（Ｇｅｎｍａｂ）、ＷＯ２０１１／１３１７４６（Ｇｅｎｍａｂ）に記載され、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ−Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎらによって報告されたもの（２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７（５８４４）：１５５４−７）が挙げられるが、これに限定されない。ハイブリッドハイブリドーマおよび化学的共役法（ＭａｒｖｉｎおよびＺｈｕ（２００５年）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２６：６４９）などの従来の方法もまた使用することができる。異なる重鎖および軽鎖からなる２つの抗体の宿主細胞中での共発現は、所望の二重特異性抗体に加えて可能性のある抗体生成物の混合物を生じ、これは次いで例えば親和性クロマトグラフィまたは同様の方法によって単離することができる。
【００４４】
多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、ヒトＦｃ領域、または当該領域の変異型を含み得、その領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であることが、当業者には理解されるであろう。
【００４５】
抗体の定常（Ｆｃ）領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への、免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Ｆｃ領域は、好ましくはヒトＦｃ領域、または当該領域の変異型である。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４領域、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４領域であり得る。Ｆｃ領域の変異型は、典型的には、親和性が変更されたＦｃγＲおよび／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）などのＦｃ受容体に結合し、ポリペプチドの機能および／または半減期の改善を提供する。生物学的機能および／または半減期は、天然Ｆｃ領域を含むポリペプチドの半減期と比較して、延長するかまたは減少するかのいずれかであり得る。変異型Ｆｃ領域の存在によって調節され得るそのような生物学的機能の例としては、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および／またはアポトーシスが挙げられる。
【００４６】
したがって、Ｆｃ領域は、天然に存在するもの（例えば、内因的に産生されたヒト抗体の一部）であり得る、または人工的なもの（例えば、天然に存在するヒトＦｃ領域と比較して１つ以上の点突然変異を含む）であり得る。
【００４７】
当該技術分野において十分に実証されているように、抗体のＦｃ領域は、その血清半減期、およびＣＤＣ、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰなどのエフェクター機能を媒介する。
【００４８】
治療用モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域を改変することは、それらに要求される薬理活性に、より良好に適した分子の生成を可能にする（Ｓｔｒｏｈｌ、２００９年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０（６）：６８５−９１、この開示は参照により本明細書に援用される）。
【００４９】
（ａ）半減期を延長するための改変Ｆｃ領域
治療用抗体の有効性を改善するための１つのアプローチは、その血清持続性を増大することであり、それによってより高い循環レベル、より少ない投与頻度、およびより低下した用量を可能にする。
【００５０】
ＩｇＧの半減期は、新生児受容体ＦｃＲｎへのそのｐＨ依存性結合に依存する。内皮細胞の表面に発現するＦｃＲｎは、ｐＨ依存的様式でＩｇＧを結合し、それを分解から保護する。
【００５１】
ｐＨ７．４ではなくｐＨ６．０でＦｃＲｎを選択的に結合するいくつかの抗体は、種々の動物モデルにおいて、より長い半減期を呈する。
【００５２】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎら、２００４年、Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６、これらの開示は参照により本明細書に援用される）、およびＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏら、２００５年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３−８、この開示は参照により本明細書に援用される）などの、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間の界面に位置するいくつかの突然変異は、ＦｃＲｎに対する結合親和性、およびインビボでのＩｇＧ１の半減期を増加することが示されている。
【００５３】
（ｂ）エフェクター機能変更のための改変Ｆｃ領域
治療用抗体またはＦｃ融合タンパク質の用途に応じて、（ＡＤＣＣなどの）エフェクター機能を低下または増大するかのいずれかであることが望ましい場合がある。
【００５４】
細胞表面分子、特に免疫細胞上のものを標的とする抗体では、ある特定の臨床的適応のためにエフェクター機能を無効にすることが必要とされ得る。
【００５５】
逆に、腫瘍学的使用を意図した抗体（白血病および固形腫瘍の治療におけるような；下記参照）では、エフェクター機能を増大することによって治療活性を改善し得る。
【００５６】
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、および補体の第１成分（Ｃ１ｑ）を異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６−２５、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。
【００５７】
ＦｃγＲまたはＣ１ｑへのＩｇＧの結合は、ヒンジ領域およびＣＨ２ドメインに位置する残基に依存する。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲおよびＣ１ｑ結合にとって重要であり、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４において独特な配列を有する。２３３〜２３６位でのＩｇＧ２残基および３２７、３３０および３３１位でのＩｇＧ４残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを大きく低下させることが示された（Ａｒｍｏｕｒら、１９９９年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が、補体活性化を顕著に低下させることを実証した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメインにおける突然変異は、ＦｃγＲＩおよびＣ１ｑへの結合を低下させることが示された（Ｓｔｅｕｒｅｒら、１９９５年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５−７４、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。
【００５８】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインに多数の突然変異がなされており、ＡＤＣＣおよびＣＤＣに及ぼすそれらの影響がインビトロで試験されている（上記引用文献参照）。特に、３３３位でのアラニン置換は、ＡＤＣＣとＣＤＣとの両方を増大することが報告されている（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１年、前出；Ｓｔｅｕｒｅｒら、１９９５年、前出）。Ｌａｚａｒらは、向上したＡＤＣＣをもたらす、ＦｃγＲＩＩＩａに対するより高い親和性およびＦｃγＲＩＩｂに対するより低い親和性を有する三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）について記載している（Ｌａｚａｒら、２００６年、ＰＮＡＳ  １０３（１１）：４００５−４０１０、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。ＡＤＣＣが増大した抗体を生成するために同じ突然変異が使用された（Ｒｙａｎら、２００７、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．６：３００９−３０１８、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、マクロファージによる標的細胞の貪食の向上を媒介する、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ親和性およびＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を有する、わずかに異なる三重突然変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）について調査した（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、２００８年、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７−２７、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。
【００５９】
それらのエフェクター機能の欠如に起因して、ＩｇＧ４抗体は、細胞枯渇せずに受容体を調節するのに好ましいＩｇＧサブクラスの代表である。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂアーム交換と呼ばれる動的プロセスで分子の半分を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間でもインビボで起こり得る。
【００６０】
Ｓ２２８Ｐ突然変異は、この組み換えプロセスを妨げることにより、より予測可能な治療的ＩｇＧ４抗体の設計を可能にすることが示されている（Ｌａｂｒｉｊｎら、２００９年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７−７１、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。
【００６１】
改変Ｆｃ領域の例を、以下の表Ｉに示す。
【表Ｉ１】
2019535282.tif 000003
【表Ｉ２】
2019535282.tif 000004
【００６２】
表Ｉの参考文献
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１１．Ｓｔｅｕｒｅｒ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５−７４
１２．Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒｅ．７（８）：２５１７−２７
１３．ＵＳ  ７，９６０，５１２  Ｂ２
１４．ＥＰ  ２  ２１３  ６８３
１５．Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ．ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７−７１
【００６３】
さらなる実施形態では、Ｆｃ領域のエフェクター機能は、その中のＣＨ２ドメイン内の炭水化物部分の修飾を通じて、例えば生成中にフコース、ガラクトース、二分枝Ｎ−アセチルグルコサミン、および／またはシアル酸の相対レベルを調整することによって変更され得る（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、２００９年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８（３）：２２６−３４、およびＲａｊｕ、２００８年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０（４）：４７１−８参照；これらの開示は参照により本明細書に援用される）。
【００６４】
したがって、Ｆｃ領域中のフコース残基が欠如しているまたは少ない治療用抗体は、ヒトにおいて向上したＡＤＣＣ活性を呈し得ることが知られている（例えば、Ｐｅｉｐｐら、２００８年、Ｂｌｏｏｄ  １１２（６）：２３９０−９、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ＆Ｓａｔｏｈ、２００９年、ＭＡｂｓ  １（３）：２３０−２６，Ｉｉｄａら、２００９年、ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ９；５８、これらの開示は参照により本明細書に援用される）。低フコース抗体ポリペプチドは、キンフネンシンなどのマンノシダーゼ阻害剤を含有する培地中で培養された細胞中に発現させることによって産生され得る。低フコース抗体ポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩＩＡなどのＦｃγＲを含むＦｃ受容体への結合の増加を呈する。
【００６５】
抗体を低フコースフォーマットへとグリコシル化修飾する他の方法としては、（例えば、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ  ＡＧ（ドイツ、ベルリン）のＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）技術を使用する）ＧＤＰ−マンノース（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース）を、ＧＤＰ−フコースに代わってＧＤＰ−ラムノースへの変換するための、細胞中の細菌酵素ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼの使用が挙げられる。
【００６６】
低フコース抗体を作成するための別の方法は、（例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｌｔｄ（スイス、バーゼル）およびＢｉｏＷａ（米国、ニュージャージー州、プリンストン）のＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ技術を使用する）抗体産生細胞中のアルファ−（１，６）−フコシルトランスフェラーゼの阻害または枯渇による。
【００６７】
したがって、一実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然のヒト抗体と比較して、フコースが減少したＦｃ領域を有する。
【００６８】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、アフコシル化（または脱フコシル化）されているＦｃ領域を有する。
【００６９】
「アフコシル化」、「脱フコシル化」または「非フコシル化」抗体とは、抗体のＦｃ領域に、フコース糖単位が全く付着していない、またはフコース糖単位の減少した含有量を有することを意味する。減少した含有量とは、フコシル化「野生型」抗体と比較した修飾抗体でのフコースの相対量、例えば、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で、および／またはＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼの存在下で、発現される同等の抗体と比較して、免疫グロブリン１分子当たりのフコース糖単位が少ないことによって定義することができる。
【００７０】
（完全な重鎖を形成するために）本明細書に開示の任意のＶＨ領域配列と組み合わせられ得る例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列は、本明細書で再現されるＩｇＧ１重鎖定常領域配列である。
【化１】
2019535282.tif 000005
【００７１】
他の重鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示の任意のＶＨ領域と組み合わせることもできる。例えば、好ましい定常領域は、本明細書で再現されるものなどの修飾ＩｇＧ４定常領域である。
【化２】
2019535282.tif 000006
【００７２】
この修飾ＩｇＧ４配列は、ＦｃＲｎ結合の低下を呈し、したがって野生型ＩｇＧ４と比較して血清半減期の低下をもたらす。加えて、ＩｇＧ４をより安定にしＦａｂアーム交換を妨げて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化を呈する。
【００７３】
別の好ましい定常領域は、本明細書で再現されるものなどの修飾ＩｇＧ４定常領域である。
【化３】
2019535282.tif 000007
【００７４】
この修飾ＩｇＧ４配列は、ＩｇＧ４をより安定にしＦａｂアーム交換を妨げて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
【００７５】
本明細書で再現されるものなどの野生型ＩｇＧ４定常領域もまた好ましい。
【化４】
2019535282.tif 000008
【００７６】
（完全な軽鎖を形成するために）本明細書に開示の任意のＶＬ領域配列と組み合わせられ得る例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列は、本明細書で再現されるカッパ鎖定常領域配列である。
【化５】
2019535282.tif 000009
【００７７】
他の軽鎖定常領域配列は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示の任意のＶＬ領域と組み合わせることもできる。
【００７８】
抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される、ある特定の好ましい結合特徴および機能的効果を有する。当該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性ポリペプチドの一部として組み込まれているとき、好ましくは、これらの結合特徴および機能的効果を保持する。
【００７９】
一実施形態では、抗原結合断片は、Ｆｖ断片（一本鎖Ｆｖ断片、またはジスルフィド結合Ｆｖ断片など）、Ｆａｂ様断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ）２断片など）、およびドメイン抗体からなる群から選択され得る。
【００８０】
一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、カッパ鎖のＣ末端部分に融合した非免疫グロブリンポリペプチド（ＣＴＬＡ−４結合ドメイン、例えばＣＤ８６、または配列番号１７などのその突然変異型など；以下参照）を有するＩｇＧ１抗体であり得る。
【００８１】
一実施形態では、多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドは、重鎖ガンマ１のＣ末端に融合したｓｃＦｖ断片を有するＩｇＧ１抗体であり得る。
【００８２】
一実施形態では、多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドは、２つの異なる標的（この場合はＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４）への２〜４個のｓｃＦｖ結合を含有し得る。
【００８３】
標的とは、活性化または不活性状態でＣＤ３＋Ｔ細胞の細胞膜に位置するポリペプチド受容体を含む。そのような膜結合受容体は、投与後にそれらに本発明の二重特異性ポリペプチドが近接するように細胞外に露出されていてもよい。
【００８４】
標的（ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４）が細胞の表面に局在し得ることが、当業者には理解されるであろう。「細胞の表面に局在する」とは、標的の１つ以上の領域が細胞表面の外面に存在するように、標的が細胞と会合していることを意味する。例えば、標的は、細胞外表面上に存在する１つ以上の領域で、細胞原形質膜に挿入され得る（すなわち、膜貫通タンパク質として配向される）。これは、細胞による標的の発現の過程で起こり得る。したがって、一実施形態では、「細胞の表面に局在する」とは、「細胞の表面に発現する」ことを意味し得る。あるいは、標的は、共有結合性相互作用および／またはイオン性相互作用で細胞の外側に存在して、細胞表面の特定の領域または複数の領域に局在し得る。
【００８５】
本発明の多重特異性（例えば二重特異性）抗体が、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、および／またはアポトーシスを誘導することができ得ることが、当業者には理解されるであろう。
【００８６】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、ＧＩＴＲ発現腫瘍細胞を標的とすることと、免疫系を活性化することとの両方が可能である。
【００８７】
例えば、ポリペプチドは、任意選択にＡＤＣＣを介して、ＧＩＴＲ発現腫瘍細胞を殺滅することができてもよい。
【００８８】
免疫系の活性化は、エフェクターＴ細胞の活性化を含み得ることが理解されるであろう。
【００８９】
さらなる態様では、ポリペプチドは腫瘍免疫を誘導することができる。これは、例えば測定によって、インビトロでのＴ細胞活性化アッセイで試験することができる。ＩＬ−２およびＩＦＮγの産生。エフェクターＴ細胞の活性化は、腫瘍特異性Ｔ細胞応答がインビボで達成され得ることを意味するであろう。さらに、マウスモデルなどのインビボモデルにおける抗腫瘍応答は、腫瘍に対する免疫応答が成功したことを意味するであろう。
【００９０】
多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、Ｔ細胞標的を発現する細胞の活性を調節することができ、当該調節とは、当該細胞の活性の増大または減少である。細胞は、典型的にはＴ細胞である。抗体は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増大する、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性を減少することができる。いずれの場合でも、抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞の活性の増大であろう。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は周知であり、例えば、対照の存在下でのＴ細胞ＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生および／またはＴ細胞増殖のレベルと比較した、抗体の存在下でのＴ細胞ＩＦＮγまたはＩＬ−２産生のレベルの増加、またはＴ細胞増殖の増加についての測定が挙げられる。細胞増殖および／またはＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生についてのアッセイは周知であり、実施例に例示されている。
【００９１】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対するリガンドの結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当該技術分野において周知である。ポリペプチドの結合動態（例えば、結合親和性）はまた、表面プラズモン共鳴分析（ＳＰＲ）またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）などの、当該技術分野において既知の標準的なアッセイによって評価することができる。
【００９２】
用語「結合活性」および「結合親和性」は、ポリペプチド分子が標的に結合する、または結合しない傾向を指すことを意図する。結合親和性は、ポリペプチドおよびその標的の解離定数（Ｋｄ）を決定することによって定量化され得る。より低いＫｄは、標的に対するより高い親和性を示す。同様に、ポリペプチドのその標的への結合の特異性は、ポリペプチドおよび別の非標的分子に関する解離定数と比較した、その標的に対するポリペプチドの解離定数（Ｋｄ）を比較した観点で定義され得る。
【００９３】
この解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができ、例えばＣａｃｅｃｉら（Ｂｙｔｅ  ９：３４０−３６２，１９８４年；これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載のものなどの方法によって、複合体混合物に対してでさえも算出することができる。例えば、Ｋｄは、Ｗｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５４２８−５４３２，１９９３年）によって開示されているものなどの、二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立され得る。例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するための他の標準的なアッセイは、当該技術分野において既知である。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）はまた、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）またはＯｃｔｅｔ（商標）システム分析などの、当該技術分野において既知の標準的なアッセイによっても評価することができる。
【００９４】
標的への抗体の結合が、別の抗体などのその標的の別の既知のリガンドによる標的の結合と比較される、競合的結合アッセイを行うことができる。５０％阻害が起こる濃度はＫｉとして知られている。理想的な条件下では、ＫｉはＫｄと等価である。Ｋｉ値はＫｄより小さくなることはないので、Ｋｉの測定値はＫｄの上限を提供するために都合よく代用することができる。
【００９５】
結合親和性の代替的な尺度としては、ＥＣ５０またはＩＣ５０が挙げられる。これに関連して、ＥＣ５０は、ポリペプチドが一定量の標的に結合する最大値の５０％を達成する濃度を示す。ＩＣ５０は、ポリペプチドが一定量の競合物の一定量の標的に結合する最大値の５０％を阻害する濃度を示す。両方の場合において、より低いレベルのＥＣ５０またはＩＣ５０は、標的に対するより高い親和性を示す。その標的に対するリガンドのＥＣ５０およびＩＣ５０の値は両方とも、周知の方法、例えばＥＬＩＳＡによって決定することができる。ＥＣ５０およびＩＣ５０を評価するための好適なアッセイは、当該技術分野において既知である。
【００９６】
本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドは、好ましくは、別の非標的分子に結合するその親和性の少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍以上の親和性で、その標的の各々に結合することができる。
【００９７】
本発明の多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドは、任意の好適な手段により産生され得る。例えば、ポリペプチドの全てまたは一部は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む細胞によって融合タンパク質として発現され得る。
【００９８】
あるいは、部分Ｂ１およびＢ２を別々に産生し、次いで続いて一緒に接合してもよい。接合は、任意の好適な手段によって、例えば上に概説した化学的共役法およびリンカーを使用して達成され得る。部分Ｂ１およびＢ２の別々の産生は、任意の好適な手段によって達成され得る。例えば、以下により詳細に説明されるように、任意選択に別々の細胞中の別々のヌクレオチドからの発現による。
【００９９】
本発明の多重特異性抗体が、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４に加えて標的抗原に結合し得る、言い換えれば、本発明は、３つ以上の標的に結合する多重特異性抗体を包含することが、当業者には理解されるであろう。
【０１００】
例えば、多重特異性ポリペプチドは、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、およびさらなる標的抗原を結合することができる三重特異性抗体であり得る。したがって、さらなる標的抗原は、さらなるＴ細胞標的であり得る。
【０１０１】
一実施形態では、さらなるＴ細胞標的は、共刺激分子または共阻害分子などのチェックポイント分子である。「共刺激的」とは、Ｔ細胞活性化を促進することができる共シグナル伝達分子を含む。「共阻害」とは、Ｔ細胞活性化を抑制することができる共シグナル伝達分子を含む。
【０１０２】
したがって、さらなるＴ細胞標的は、刺激チェックポイント分子（ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０など）であり得る。有利には、本発明の多重特異性ポリペプチドは、刺激チェックポイント分子におけるアゴニストである。
【０１０３】
あるいは、または加えて、さらなるＴ細胞標的は、阻害性チェックポイント分子（ＰＤ−１、Ｔｉｍ３、Ｌａｇ３、Ｔｉｇｉｔ、またはＶＩＳＴＡなど）であり得る。有利には、本発明の多重特異性ポリペプチドは、阻害性チェックポイント分子におけるアンタゴニストである。
【０１０４】
一実施形態では、さらなるＴ細胞標的は、ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）スーパーファミリーメンバーである。ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーとしては、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体が挙げられる。ＴＮＦＲの例としては、ＯＸ４０およびＣＤ１３７が挙げられる。
【０１０５】
さらなる実施形態では、さらなるＴ細胞標的は、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、およびＣＤ２８からなる群から選択され得る。例えば、第１および／または第２のＴ細胞標的は、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ１３７からなる群から選択され得る。
【０１０６】
したがって、ポリペプチドは、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、およびＯＸ４０を結合することができる三重特異性抗体であり得る。
【０１０７】
変異型
本明細書に記載の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドまたはその構成要素結合ドメイン（ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４結合ドメインなど）は、ポリペプチドまたは結合ドメインが標的への結合を保持することを条件に、本明細書に列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の変異型は、本明細書に列挙されている配列のＣＤＲ配列を保持し得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、抗体がその標的への結合を保持することを条件に、表Ｃに列挙されている特定のアミノ酸配列のうちのいずれかの変異型または断片を含み得る。そのような変異型または断片は、典型的には表Ｃの当該配列のＣＤＲ配列を保持し得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、結合ドメインがその標的への結合を保持することを条件に、表Ａの配列のうちのいずれかの変異型を含み得る。
【０１０８】
本明細書中に列挙されている重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか１つの断片は、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、または少なくとも１００個の、当該アミノ酸配列からの連続アミノ酸を含み得る。
【０１０９】
本明細書に列挙されている重鎖または軽鎖アミノ酸配列のうちのいずれか１つの変異型は、当該配列の置換、欠失または付加変異型であり得る。変異型は、１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個、最大３０個以上の、当該配列からのアミノ酸置換および／または欠失を含み得る。「欠失」変異型は、個々のアミノ酸の欠失、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸などのアミノ酸の小さな群の欠失、または特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特色の欠失などのより大きなアミノ酸領域の欠失を含み得る。「置換」変異型は、好ましくは、１つ以上のアミノ酸を同数のアミノ酸で置き換え、アミノ酸の保存的置換をすることを含む。例えば、アミノ酸は、同様の特性を有する代替的なアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸で置換され得る。好適な置換基を選択するために使用することができる２０種の主なアミノ酸のうちのいくつかの特性は、以下の通りである。
【表ＩＩ】
2019535282.tif 000010
【０１１０】
本明細書でのアミノ酸は、フルネーム、３文字コード、または１文字コードで称され得る。
【０１１１】
好ましい「誘導体」または「変異型」としては、天然に存在するアミノ酸の代わりに、その構造的類似体が配列中に現れるアミノ酸が挙げられる。配列中に使用されるアミノ酸はまた、抗体の機能が顕著に悪影響を受けないことを条件に、誘導体化または修飾、例えば標識され得る。
【０１１２】
上述のような誘導体および変異型は、抗体の合成中もしくは産生後の修飾によって、または抗体が部位指向性突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、もしくは酵素的切断および／または核酸のライゲーションの既知の技術を使用した組み換え形態であるときに調製され得る。
【０１１３】
好ましくは、変異型は、本明細書に開示の配列に示されるような配列に対して、６０％超、または７０％超、例えば７５もしくは８０％、好ましくは８５％超、例えば９０もしくは９５％超のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する。このレベルのアミノ酸同一性は、関連する配列番号の配列の全長にわたって、または完全長ポリペプチドのサイズに応じて２０個、３０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個以上のアミノ酸にわたってなど、配列の一部にわたって見られ得る。
【０１１４】
アミノ酸配列に関連して、「配列同一性」とは、以下のパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌＷを使用して評価したときに、記載の値を有する配列を指す（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２２）：４６７３−８０、これらの開示は参照により本明細書に援用される）：
ペアワイズアラインメントパラメーター−方法：正確、マトリックス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、ギャップエクステンションペナルティ：０．１０、
マルチプルアラインメントパラメータ−マトリックス：ＰＡＭ、ギャップオープンペナルティ：１０．００、遅延の同一性％：３０、エンドギャップのペナルティ：オン、ギャップ分離距離：０、ネガティブマトリクス：なし、ギャップエクステンションペナルティ：０．２０、残基特有ギャップペナルティ：オン、親水性ギャップペナルティ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ。特定の残基での配列同一性は、単に誘導体化されている同一の残基を含むことを意図する。
【０１１５】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のポリペプチド、またはＢ１の全てもしくは一部、またはＢ２の全てもしくは一部をコードし得る。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態、または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されているとは、任意の周囲の媒体から、ポリペプチドが、実質的にしかし全体的ではなく単離され得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、それらの意図される用途を妨害しないであろう担体または希釈剤と混合され得、それでもなお実質的に単離されていると見なされる。
【０１１６】
選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下に置かれたときにインビボでポリペプチドへと転写され（ＤＮＡの場合）翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的のために、そのような核酸配列は、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡまたはＲＮＡからのゲノム配列、さらには合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’に位置し得る。
【０１１７】
抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、本明細書に開示のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つ、例えば表Ｃに記載の配列を含み得るまたはそれからなり得る。表Ｃに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｃにも示されている対応するヌクレオチド配列を含み得るまたはそれからなり得る（イントロン配列は小文字で示されている）。ＣＴＬＡ−４結合ドメインの例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｂに示されるような配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含み得るまたはそれからなり得る。
【０１１８】
あるいは、好適なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列のうちの１つの変異型であり得る。例えば、変異型は、上記の核酸配列のうちのいずれかの置換、欠失、または付加変異型であり得る。変異型ポリヌクレオチドは、配列表に示されている配列から、１個、２個、３個、４個、５個、最大１０個、最大２０個、最大３０個、最大４０個、最大５０個、最大７５個以上の、核酸置換および／または欠失を含み得る。
【０１１９】
好適な変異型は、本明細書に開示の核酸配列のうちのいずれか１つのポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％相同、好ましくは少なくとも８０または９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％相同であり得る。好ましくは、これらのレベルでの相同性および同一性は、少なくともポリヌクレオチドのコード領域に関して存在する。相同性を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、本状況において、相同性は核酸同一性に基づいて計算されることが、当業者には理解されるであろう。そのような相同性は、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、１００個、２００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって存在し得る。そのような相同性は、未修飾ポリヌクレオチド配列の全長にわたって存在し得る。
【０１２０】
ポリヌクレオチドの相同性または同一性を測定する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７−３９５；これらの開示は参照により本明細書に援用される）。
【０１２１】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、（典型的にはそれらのデフォルト設定で）例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０、これらの開示は参照により本明細書に援用される）に記載のように、相同性または配列の並びを計算するために使用することができる。
【０１２２】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときに、何らかの正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかの検索配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。累積的アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットは各配列に沿って両方向に伸長される。各方向でのワードヒットのための拡張は、次の場合に停止される：残基アラインメントの１つ以上の負のスコア累積に起因して累積的アラインメントスコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の最後に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９参照；これらの開示は参照により本明細書に援用される）アラインメント（Ｂ）、１０の予測値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方のストランドの比較を使用する。
【０１２３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照；これらの開示は参照により本明細書に援用される）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、その配列は別の配列と同様であるとみなされる。
【０１２４】
相同体は、関連するポリヌクレオチド中の配列と３つ未満、５個、１０個、１５個、２０個以上の（各々が置換、欠失、または挿入であり得る）突然変異によって異なり得る。これらの突然変異は、相同体の少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、または１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって測定され得る。
【０１２５】
一実施形態では、変異型配列は、遺伝コードの重複性により、配列表に記載の特定の配列とは異なり得る。ＤＮＡコードは、４つの主な核酸残基（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）を有し、これらを使用して生物の遺伝子にコードされているタンパク質のアミノ酸を表す３文字のコドンを「綴る」。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの線状配列は、それらの遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）中のアミノ酸の線状配列へと翻訳される。コードは、６１個のコドンが２０個の天然アミノ酸をコードし、３つのコドンが「終止」シグナルを表して、高度に縮重している。したがって、ほとんどのアミノ酸は、２つ以上のコドンによってコードされ、実際いくつかは、５つ以上の異なるコドンによってコードされている。したがって、本発明の変異型ポリヌクレオチドは、本発明の別のポリヌクレオチドと同じポリペプチド配列をコードし得るが、異なるコドンを使用して同じアミノ酸をコードすることに起因して異なる核酸配列を有し得る。
【０１２６】
したがって、本発明のポリペプチドは、それをコードし発現することができるポリヌクレオチドの形態から産生され得る、またはその形態で送達され得る。
【０１２７】
本発明のポリヌクレオチドは、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ（２０１２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−実験室マニュアル、第４版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；これらの開示は参照により本明細書に援用される）に例として記載されているように、当該技術分野において周知の方法に従って合成することができる。
【０１２８】
本発明の核酸分子は、挿入された配列に作動可能に連結している制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得、したがってインビボで本発明のポリペプチドの発現を可能にする。ひいては、これらの発現カセットは、典型的にはベクター（例えば、プラスミドまたは組み換えウイルスベクター）内に提供される。そのような発現カセットは、宿主対象に直接投与されてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが、宿主対象に投与されてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製および／または投与される。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を担持し、本発明のポリペプチドの発現を可能にすることができる任意のベクターであり得る。
【０１２９】
したがって本発明は、そのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。そのような発現ベクターは、分子生物学の技術分野で一般的に構築されており、例えばプラスミドＤＮＡおよび適切な開始剤、プロモータ、エンハンサ、および他の要素、例えば本発明のペプチドの発現を可能にするために必要であり得、かつ正しい配向で位置するポリアデニル化シグナルなどの使用を含み得る。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう（Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏ参照、前出）。
【０１３０】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを発現するように修飾されている細胞も含む。そのような細胞としては、一過性または好ましくは安定な、哺乳類細胞または昆虫細胞などの高等真核細胞株、酵母などの低級真核細胞、または細菌細胞などの原核細胞が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードするベクターまたは発現カセットの挿入によって修飾され得る細胞の特定の例としては、哺乳類ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定であるだけでなく、ポリペプチドの成熟グリコシル化および細胞表面発現も可能にするものであるであろう。
【０１３１】
本発明のそのような細胞株は、本発明のポリペプチドを産生するために一般的な方法を使用して培養されてもよい、または本発明の抗体を対象に送達するために治療的または予防的に使用されてもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、発現カセットまたはベクターは、エクスビボで対象由来の細胞に投与され、次いでその細胞を対象の身体に戻してもよい。
【０１３２】
医薬製剤、治療的使用および患者群
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体、多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および細胞などの本発明の分子を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１つ以上の抗体および／または二重特異性ポリペプチドなどの１つ以上の本発明の分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体とを含む組成物を提供する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」とは、生理学的に適合する、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含み得る。好ましくは、担体は、非経口投与、例えば静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与（例えば注射または点滴による）に好適である。投与経路に応じて、ポリペプチドを不活性化または変性させ得る酸および他の自然条件の作用からポリペプチドを保護するための材料で、ポリペプチドをコーティングしてもよい。
【０１３４】
好ましい薬学的に許容可能な担体は、水性担体または希釈剤を含む。本発明の組成物に用いられ得る好適な水性担体の例としては、水、緩衝水、および生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
【０１３５】
本発明の組成物はまた、薬学的に許容可能な抗酸化剤を含み得る。これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤も含有し得る。微生物の存在の防止は、前出の滅菌手順によって、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによっての両方で確保され得る。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことも望ましい場合がある。加えて、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射用剤型の長期吸収をもたらすことができる。
【０１３６】
治療用組成物は、典型的には製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。
【０１３７】
無菌注射用溶液は、必要量の活性薬剤（例えばポリペプチド）を、必要に応じて上に挙げた成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に組み込み、続いて無菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性薬剤を、基本的な分散媒および上に挙げたものから必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製する好ましい方法は、活性薬剤の粉末プラスその予め無菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分を得る、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【０１３８】
特に好ましい組成物は、全身投与用または局所投与用に調合される。局所投与は、腫瘍の部位または腫瘍流入領域リンパ節へ行われてもよい。組成物は、好ましくは一定期間にわたって徐放するように調合されてもよい。したがって、組成物は、徐放性を促進するマトリックス中にまたはマトリックスの一部として提供されてもよい。好ましい徐放性マトリックスは、モンタニド、またはγ−ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）ナノ粒子を含み得る。本発明のポリペプチドの局所的放出は、任意選択に持続期間にわたり、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの投与に関連した潜在的な自己免疫副作用を低下し得る。
【０１３９】
本発明の組成物は、追加の活性成分、ならびに本発明のポリペプチドを含み得る。上記のように、本発明の組成物は、本発明の１つ以上のポリペプチドを含み得る。それらはまた、追加の治療薬または予防薬を含み得る。
【０１４０】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物および使用説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットはさらに、上に述べたような追加の治療薬または予防薬などの１つ以上の追加の試薬を含有し得る。
【０１４１】
本発明に従ったポリペプチドは、治療または予防に使用してもよい。治療用途では、ポリペプチドまたは組成物は、すでに障害または状態を患っている対象に、その状態またはその症状のうちの１つ以上を治癒、軽減、または部分的に抑えるのに十分な量で投与される。そのような治療的処置は、疾患の症状の重篤度の減少、または頻度もしくは無症状期間の増加をもたらし得る。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。予防的適用では、ポリペプチドまたは組成物は、障害の症状または状態をまだ呈していない対象に、症状の発症を予防または遅延させるのに十分な量で投与される。そのような量は、「予防有効量」として定義される。対象は、任意の好適な手段によって疾患または状態を発症する危険性があると断定されている場合がある。
【０１４２】
特に、本発明の抗体および二重特異性ポリペプチドは、癌の治療または予防に有用であり得る。したがって、本発明は、癌の治療または予防に使用するための本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。本発明はまた、個体に本発明のポリペプチドを投与することを含む、癌を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、癌の治療または予防用の薬剤の製造に使用するための、本発明の抗体または二重特異性ポリペプチドを提供する。
【０１４３】
癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、または膠芽腫であり得る。
【０１４４】
本発明の抗体もしくは二重特異性ポリペプチド、または当該抗体もしくは当該ポリペプチドを含む組成物は、当該技術分野において既知の種々の方法のうちの１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与され得る。当業者には理解されるであろうように、投与経路および／または方式は、所望の結果に応じて異なるであろう。全身投与または局所投与が好ましい。局所投与は、腫瘍の部位または腫瘍流入領域リンパ節へ行われてもよい。本発明のポリペプチドまたは組成物に好ましい投与方式としては、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与方式が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与方式を意味する。あるいは、本発明のポリペプチドまたは組成物は、局所投与方式、表皮投与方式、または粘膜投与方式などの非経腸（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与方式を介して投与することができる。
【０１４５】
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な用量は、熟練した医療施術者によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成、および投与方式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である、患者に対して有毒でない活性成分の量を得るように異なり得る。選択される用量レベルは、用いられる特定のポリペプチドの活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの排泄速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および以前の病歴などの医薬技術分野で周知の要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
【０１４６】
本発明の抗体またはポリペプチドの好適な用量は、例えば、治療される患者の体重の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、好適な用量は、１日当たり体重の約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり体重の約１０ｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１４７】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整してもよい。例えば、単回ボーラスを投与してもよい、数回に分けた用量を経時的に投与してもよい、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に低下または増加してもよい。投与の容易さおよび用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象用の単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０１４８】
抗体またはポリペプチドは、単回用量または複数回用量で投与してもよい。複数回用量は、同じまたは異なる経路を介して、同じまたは異なる位置に投与してもよい。あるいは、抗体またはポリペプチドは、上述のように徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要である。用量および頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期、および所望の治療期間に応じて異なり得る。投与の用量および頻度もまた、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて異なり得る。予防的用途では、比較的低用量を比較的不定期な間隔で、長期間にわたって投与してもよい。治療的用途では、例えば患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高用量を投与してもよい。
【０１４９】
２つ以上の薬剤の併用投与は、多数の異なる方法で達成され得る。一実施形態では、抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を、単一の組成物中で一緒に投与してもよい。別の実施形態では、抗体またはポリペプチドおよび他の薬剤を、併用療法の一部として別々の組成物中で投与してもよい。例えば、モジュレータは、他の薬剤の前、後、または同時に投与してもよい。
【０１５０】
本発明の抗体、ポリペプチド、または組成物はまた、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を発現する細胞集団の活性化を増大する方法において使用され得、方法は、当該細胞と本発明のポリペプチドとの間の相互作用を可能にするのに好適な条件下で、本発明のポリペプチドまたは組成物を当該細胞集団に投与することを含む。細胞集団は、典型的にはＧＩＴＲを発現する少なくともいくつかの細胞、典型的にはＴ細胞、およびＣＴＬＡ−４を発現する少なくともいくつかの細胞を含む。方法は、典型的にはエクスビボで実行される。
【０１５１】
ＧＩＴＲに対する結合ドメイン
本発明の二重特異性ポリペプチドは、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８［ＴＮＦＲＳＦ１８］および活性化誘導性ＴＮＦＲファミリー受容体［ＡＩＴＲ］としても知られる）に対して特異的な結合ドメインを含む。
【０１５２】
ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、以下により詳細に説明される、ある特定の好ましい結合特徴および機能的効果を有する。当該抗体またはその抗原結合断片は、本発明の二重特異性抗体の一部として組み込まれているとき、好ましくは、これらの結合特徴および機能的効果を保持する。本発明はまた、単離された形態、すなわち本発明の二重特異性抗体から独立した形態の抗体またはその抗原結合断片として、当該抗体を提供する。
【０１５３】
抗ＧＩＴＲドメイン（Ｂ１）は、好ましくはＧＩＴＲに特異的に結合する、すなわち、ＧＩＴＲに結合するが、他の分子には結合しない、またはより低い親和性で結合する。本明細書で使用される「ＧＩＴＲ」という用語は、典型的にはヒトＧＩＴＲを指す。ヒトＧＩＴＲのアミノ酸配列は、配列番号１１１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ５２３８２．１に対応）に記載されている。Ｂ１ドメインは、ヒトではない霊長類、例えばＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）からのＧＩＴＲなどの他の哺乳類からのＧＩＴＲに対していくらか結合親和性を有し得る。Ｂ１ドメインは、好ましくは、マウスＧＩＴＲに結合しない、および／または他のヒトＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、例えばヒトＣＤ１３７、ＯＸ４０、もしくはＣＤ４０に結合しない。
【０１５４】
Ｂ１ドメインは、その天然の状態でＧＩＴＲに、特に細胞の表面に局在するＧＩＴＲに結合する能力を有する。「細胞の表面に局在する」は、前に定義された通りである。好ましくは、Ｂ１ドメインは、ＧＩＴＲに特異的に結合するであろう。すなわち、Ｂ１ドメインは、好ましくは、それが別の分子に結合する場合よりも大きな結合親和性でＧＩＴＲに結合する。
【０１５５】
好ましくは、Ｂ１ドメインの上記の結合特性は、本発明の二重特異性抗体において実質的に維持されている。
【０１５６】
したがって、二重特異性抗体は、ＧＩＴＲを発現する細胞の活性を調節することができ、当該調節とは、当該細胞の活性の増大または減少である。細胞は、典型的にはＴ細胞である。抗体は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増大することができる、またはＴｒｅｇ細胞の活性を減少する、またはＴｒｅｇ細胞を枯渇させることができる。いずれの場合でも、抗体の正味の効果は、Ｔｅｆｆ細胞、特にＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＮＫエフェクターＴ細胞の活性の増大であろう。エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は、周知であり、先に記載された通りである。
【０１５７】
抗体は、好ましくは、インビトロでＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の増大を引き起こし、任意選択に、活性の当該増大は、Ｔ細胞による増殖、ＩＦＮ−γ産生、および／またはＩＬ−２産生の増加である。増大は、同じアッセイで測定されたアイソタイプ対照抗体によって引き起こされる活性の変化よりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも１０倍、およびさらにより好ましくは少なくとも２５倍高い。
【０１５８】
抗体は、好ましくは、１０ｘ１０−９Ｍ未満、または７ｘ１０−９Ｍ未満、より好ましくは４未満、または２ｘ１０−９Ｍ、最も好ましくは１ｘ１０−９Ｍ未満であるＫｄ値でヒトＧＩＴＲに結合する。
【０１５９】
例えば、抗体は、好ましくは、マウスＧＩＴＲ、またはＯＸ４０もしくはＣＤ４０などの任意の他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに結合しない。したがって、典型的には、ヒトＧＩＴＲに対する抗体のＫｄは、マウスＧＩＴＲ、他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー、または任意の他の無関係な物質もしくは環境中の付随する物質などの他の非標的分子に対するＫｄの２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍未満であろう。より好ましくは、Ｋｄは、５０倍未満、さらにより好ましくは１００倍未満、およびさらにより好ましくは２００倍未満であろう。
【０１６０】
この解離定数の値は、先に記載されたように、周知の方法によって直接決定することができる。先に記載されたように、競合的結合アッセイも行うことができる。
【０１６１】
本発明の抗体は、好ましくは、別の非標的分子に結合するその親和性の少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍以上の親和性で、その標的に結合することができる。
【０１６２】
したがって、要約すると、抗ＧＩＴＲ抗体は、好ましくは以下の機能的特徴のうちの少なくとも１つを呈する：
Ｉ．１０ｘ１０−９Ｍ未満、より好ましくは１．２ｘ１０−９Ｍ未満のＫＤ値でヒトＧＩＴＲに結合すること、ならびに
ＩＩ．インビトロでＣＤ３＋Ｔ細胞の活性の増大を引き起こすことができ、任意選択に、活性の当該増大は、Ｔ細胞による増殖、ＩＦＮ−γ産生、および／またはＩＬ−２産生の増加である。増大は、同じアッセイで測定されたアイソタイプ対照抗体によって引き起こされる活性の変化よりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも１０倍、およびさらにより好ましくは少なくとも２５倍高い。
【０１６３】
抗体は、ＧＩＴＲ、典型的にはヒトＧＩＴＲに特異的であり、表Ｄ（１）およびＤ（２）の任意の対応する行の対の例示的なＣＤＲ配列のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み得る。
【０１６４】
例えば、抗体は、表Ｄ（１）および表Ｄ（２）の最初の行の例示的なＣＤＲ配列のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全て（配列番号７６、７７、７８、８８、８９、９０）を含み得る。
あるいは、抗体は、表Ｄ（１）およびＤ（２）の第２、第３、または第４行の例示的なＣＤＲ配列のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを含み得る。
【０１６５】
好ましい抗ＧＩＴＲ抗体は、表Ｄ（１）の任意の個々の行に定義される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ３、および／または表Ｄ（２）の任意の個々の行に定義される軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。抗体は、表Ｄ（１）の個々の行に示される３つ全ての重鎖ＣＤＲ配列（すなわち、所与の「ＶＨ数」の３つ全ての重鎖ＣＤＲ）、および／または表Ｄ（２）の個々の行に示される３つ全ての軽鎖ＣＤＲ配列（すなわち、所与の「ＶＬ番号」の３つ全ての軽鎖ＣＤＲ）を含み得る。
【０１６６】
抗ＧＩＴＲ抗体の完全な重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列の例を、表Ｃに示す。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列も示す。配列番号５２〜６７は、抗ＧＩＴＲ抗体の関連するアミノ酸およびヌクレオチド配列を指す。表Ｃの当該ＶＨおよびＶＬ領域の番号付けは、表Ｄ（１）および（２）で使用されている番号付けシステムに対応する。したがって、例えば、「２３４９、軽鎖ＶＬ」のアミノ酸配列は、表Ｄ（２）に示されるＶＬ番号２３４９の３つ全てのＣＤＲを含む完全なＶＬ領域配列の例であり、「２３４８、重鎖ＶＨ」のアミノ酸配列は、表Ｄ（１）に示されるＶＨ番号２３４８の３つ全てのＣＤＲを含む完全なＶＨ領域配列の例である。
【０１６７】
本発明の好ましい抗ＧＩＴＲ抗体は、特定のＶＨ番号の３つ全てのＣＤＲを含むＶＨ領域、および特定のＶＬ番号の３つ全てのＣＤＲを含むＶＬ領域を含む。例えば、抗体は、ＶＨ番号２３４８の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号２３４９の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｃ（配列番号５２および６１）に示されるように、２３４８および２３４９の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列（ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含まないｍＡｂ）を含み得る。
【０１６８】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号２３７２の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号２３７３の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｃ（配列番号５４および６３）に示されるように、２３７２および２３７３の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列（ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含まないｍＡｂ）を含み得る。
【０１６９】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号２３９６の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号２３９７の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｃ（配列番号５６および６５）に示されるように、２３９６および２３９７の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列（ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含まないｍＡｂ）を含み得る。
【０１７０】
あるいは、抗体は、ＶＨ番号２４０４の３つ全てのＣＤＲ、およびＶＬ番号２４０５の３つ全てのＣＤＲを含み得る。そのような抗体は、好ましくは、表Ｃ（配列番号５８および６７）に示されるように、２４０４および２４０５の対応する完全なＶＨおよびＶＬ配列（ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含まないｍＡｂ）を含み得る。
【０１７１】
抗ＧＩＴＲ抗体は、本明細書に記載の特定の抗ＧＩＴＲ抗体のうちのいずれかと同じエピトープに結合し得る。
【０１７２】
代替的な実施形態では、結合ドメイン（Ｂ１）は、例えば配列番号６１、６３、６５、および６７からなる群から選択された軽鎖可変領域アミノ酸配列、ならびに配列番号５２、５４、５６、および５８からなる群から選択された重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、抗体またはその断片、またはその変異型などの、本明細書に記載の例示的なＧＩＴＲ結合ドメインのうちの１つ以上のヒトＧＩＴＲへの結合を競合的に阻害することができ得る。
【０１７３】
競合的結合は、典型的には、試験抗体が参照抗体と結合する抗原上のエピトープ（この場合は１６３０／１６３１）で、または少なくともその近位で結合することにより生じる。しかしながら、競合的結合が立体障害によっても生じ得、したがって、試験抗体は、参照抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープで結合し得るが、それでもなお抗原への参照抗体の結合を妨げるのに十分なサイズまたは立体配置であり得ることが当業者には理解されるであろう。
【０１７４】
標的への参照ポリペプチドの結合を競合的に阻害することができるポリペプチドを同定するための方法は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＬＩ、またはＳＰＲが当該技術分野において周知知である。
【０１７５】
ＣＴＬＡ−４に対する結合ドメイン
本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドはまた、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる）に対して特異的な結合ドメインも含む。
【０１７６】
ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列は、配列番号１に提供されている。
【０１７７】
ＣＤ８６およびＣＤ８０は、本明細書においてＢ７タンパク質（それぞれＢ７−２およびＢ７−１）と称され得る。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上に発現され、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４と相互作用する。ＣＤ２８へのＢ７分子の結合はＴ細胞活性化を促進する一方で、ＣＴＬＡ−４へのＢ７分子の結合はＴ細胞の活性化を止める。Ｂ７タンパク質とＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４との間の相互作用は、免疫活性化および調節において重要な役割を果たす共刺激シグナル伝達経路を構成する。したがって、Ｂ７分子は、経路の一部であり、免疫阻害を切り離すための操作を受けやすく、それによって患者の免疫を向上する。
【０１７８】
ＣＤ８６タンパク質は単量体であり、２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインからなる。ＣＤ８６の受容体結合ドメインは、典型的なＩｇＶセット構造を有するのに対し、膜近位ドメインは、Ｃ１セット様構造を有する。ＣＤ８０およびＣＤ８６の構造は、それ自体で、またはＣＴＬＡ−４との複合体で決定されている。ＣＤ８０およびＣＤ８６分子上の接触残基は、可溶性細胞外ドメインにあり、大部分はベータシート中に位置し、（ＣＤＲ様）ループ中には位置しない。
【０１７９】
配列番号３は、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列である。この野生型配列は、任意選択に、Ｎ末端、すなわち２４位および２５位にアラニンおよびプロリンを欠いていてもよい。これらのアミノ酸は、本明細書においてそれぞれＡ２４およびＰ２５と称され得る。
【０１８０】
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ポリペプチド結合ドメインとして、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なドメイン、「ＣＴＬＡ−４結合ドメイン」を組み込んでもよい。そのような結合ドメインの好適な例は、その内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１４／２０７０６３に開示されている。ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインはまた、ＣＤ２８にも結合し得る。本明細書で使用されるＣＴＬＡ−４という用語は、典型的には、ヒトＣＴＬＡ−４を指し、本明細書で使用されるＣＤ２８という用語は、典型的にはヒトＣＤ２８を指す。ヒトＣＴＬＡ−４およびヒトＣＤ２８の配列は、それぞれ配列番号１および２に記載されている。本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、他の哺乳類、例えば霊長類またはマウスのＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８からのＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８にいくらか結合親和性を有し得る。
【０１８１】
ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、その天然の状態でＣＴＬＡ−４に、特に細胞の表面に局在するＣＴＬＡ−４に結合する能力を有する。「細胞の表面に局在する」は、上記に定義した通りである。
【０１８２】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメイン部分は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
（ｉｉ）当該結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含み得るまたはそれからなり得る。
【０１８３】
言い換えれば、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）当該ポリペプチド変異型が野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、当該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型、を含むまたはそれからなる、ヒトＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインである。
【０１８４】
したがって、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６と同じ標的結合特性を有し得る、またはヒト野生型ＣＤ８６の標的結合特性と比較して異なる標的結合特性を有し得る。そのような特性を比較する目的のために、「ヒト野生型ＣＤ８６」は、典型的には、前段落に記載されているようなヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインを指す。
【０１８５】
ヒト野生型ＣＤ８６は、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の２つの標的に特異的に結合する。したがって、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドがこれらの標的の各々に結合する能力の個々の尺度として表すことができる。例えば、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのポリペプチド変異型は、好ましくは、ＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のものよりも高い結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合する。そのようなポリペプチドはまた、任意選択に、ＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のものよりも低い結合親和性でＣＤ２８にも結合し得る。
【０１８６】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインである。これは、好ましくは、別の分子に結合するよりも大きな結合親和性でＣＴＬＡ−４に結合することを意味する。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、好ましくは、ＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のものと同じまたはより高い親和性で、ＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１８７】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄの、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍未満であろう。最も好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄの、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍未満であろう。ＣＴＬＡ−４に対するポリペプチドのＫｄを決定するための好ましい方法は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ分析である。ポリペプチドのＳＰＲ分析のための好適なプロトコルは、当該技術分野において既知である。
【０１８８】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対する本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＥＣ５０は、同じ条件下でのヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＥＣ５０の、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍未満であろう。最も好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＥＣ５０は、同じ条件下でのヒトＣＴＬＡ−４に対する野生型ヒトＣＤ８６のＥＣ５０の、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍未満であろう。ＣＴＬＡ−４に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介したものである。ポリペプチドのＥＣ５０の評価への使用に好適なＥＬＩＳＡアッセイは、当該技術分野において既知である。
【０１８９】
好ましくは、ヒトＣＴＬＡ−４に結合するために野生型ヒトＣＤ８６に競合するとき、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＩＣ５０は、同じ条件下での野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１３倍、少なくとも１５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも３００倍未満であろう。最も好ましくは、ＣＴＬＡ−４結合ドメインのＩＣ５０は、同じ条件下での野生型ヒトＣＤ８６のＩＣ５０の、少なくとも１０倍、または少なくとも３００倍未満であろう。本発明のポリペプチドのＩＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介したものである。本発明のポリペプチドのＩＣ５０の評価への使用に好適なＥＬＩＳＡアッセイは、当該技術分野において既知である。
【０１９０】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインはまた、ＣＤ２８に特異的に結合し得る。すなわち、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４を除いて、それが別の分子に結合する場合よりも大きな結合親和性でＣＤ２８に結合し得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒトＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のものよりも低い親和性でヒトＣＤ２８に結合し得る。好ましくは、ヒトＣＤ２８に対するＣＴＬＡ−４結合ドメインのＫｄは、ヒトＣＤ２８に対する野生型ヒトＣＤ８６のＫｄよりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍高いであろう。
【０１９１】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性はまた、ポリペプチドが２つの標的、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８に結合する能力の相対的な尺度として表すこともできる。すなわち、ＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合特性は、ポリペプチドの、ＣＴＬＡ−４に結合する能力対ＣＤ２８に結合する能力の、相対的な尺度として表すことができる。好ましくは、ヒト野生型ＣＤ８６の、ＣＴＬＡ−４に結合する能力対ＣＤ２８に結合する能力の対応する相対的な能力と比較すると、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、相対的に増大した、ＣＴＬＡ−４に結合する能力対ＣＤ２８に結合する能力を有する。
【０１９２】
ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８の両方に対するポリペプチドの結合親和性が同じパラメーター（例えば、Ｋｄ、ＥＣ５０）を使用して評価されると、各標的に対するポリペプチドの相対的結合能力は、各標的に対するパラメーターの値の単純な比として表すことができる。この比は、ポリペプチドの結合比または結合強度比と称され得る。結合親和性を評価するために使用される多くのパラメータ（例えば、Ｋｄ、ＥＣ５０）では、より低い値は、より高い親和性を示す。これにあたるとき、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性対ＣＤ２８に対する結合親和性の比は、好ましくは、以下の式：
結合比＝［ＣＤ２８に対する結合親和性］÷［ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性］、に従って計算された単一の数値として表される。
【０１９３】
あるいは、より高い値がより高い親和性を示すパラメーターを使用して結合親和性が評価される場合、上記の式の逆が好ましい。いずれの状況においても、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、好ましくはヒト野生型ＣＤ８６よりも高い結合比を有する。所与のポリペプチドの結合比対別のポリペプチドの結合比を直接比較するには、典型的には、同じパラメータを使用して、結合親和性を評価し、両方のポリペプチドの結合比を計算することが必要であることが理解されるであろう。
【０１９４】
好ましくは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのＫｄを決定し、次いで式［ＣＤ２８に対するＫｄ］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＫｄ］に従って比を計算することによって計算される。この比は、ポリペプチドのＫｄ結合比と称され得る。標的に対するポリペプチドのＫｄを決定するための好ましい方法は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いたＳＰＲ分析である。本発明のポリペプチドのＳＰＲ分析のための好適なプロトコルは、実施例に記載されている。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合比は、好ましくは、同じ方法に従って計算された野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも、少なくとも２倍、または少なくとも４倍高い。
【０１９５】
あるいは、ポリペプチドの結合比は、各標的に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定し、次いで式［ＣＤ２８に対するＥＣ５０］÷［ＣＴＬＡ−４に対するＥＣ５０］に従ってその比を計算することによって計算することができる。この比は、ポリペプチドのＥＣ５０結合比と称され得る。標的に対するポリペプチドのＥＣ５０を決定するための好ましい方法は、ＥＬＩＳＡを介したものである。本発明のポリペプチドのＥＣ５０の評価への使用に好適なＥＬＩＳＡアッセイは、当該技術分野において既知である。この方法に従って計算された本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインの結合比は、同じ方法に従って計算された野生型ヒトＣＤ８６の結合比よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。
【０１９６】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４に結合するために、別のポリペプチドと交差競合（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｅ）する能力を有し得る。例えば、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＣＴＬＡ−４に結合するために、配列番号６〜２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと交差競合し得る。そのような交差競合性ポリペプチドは、標準的な結合アッセイで同定することができる。例えば、（例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いた）ＳＰＲ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して交差競合を実証することができる。
【０１９７】
上記の機能的特徴に加えて、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ある特定の好ましい構造的特徴を有する。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、（ｉ）ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメイン、または（ｉｉ）当該ポリペプチド変異型が野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、当該可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型、のいずれかを含むまたはそれからなる。
【０１９８】
ヒト野生型ＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのポリペプチド変異型は、ヒト野生型ＣＤ８６のものに由来するアミノ酸配列、具体的には任意選択にＡ２４およびＰ２５を欠いている、ヒト野生型ＣＤ８６（配列番号３）の可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。特に、変異型は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を含む。「変化している」とは、少なくとも１つのアミノ酸が、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、欠失、挿入または置換されていることを意味する。「欠失している」とは、アミノ酸配列が１つのアミノ酸だけ短くなるように、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）中に存在する少なくとも１つのアミノ酸が除去されていることを意味する。「挿入されている」とは、アミノ酸配列が１つのアミノ酸だけ長くなるように、少なくとも１つの追加のアミノ酸が配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）に導入されていることを意味する。「置換されている」とは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）中の少なくとも１つのアミノ酸が、代替的なアミノ酸で置き換えられていることを意味する。
【０１９９】
典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個のアミノ酸が、変化している。典型的には、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、２個、または１個以下のアミノ酸が、変化している。これらの下限のうちのいずれかをこれらの上限のうちのいずれかと組み合わせて、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、許容可能な変化の数の範囲を定義することができることが理解されるであろう。したがって、例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、許容可能なアミノ酸の変化の数が、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６などの範囲内であるアミノ酸配列を含み得る。
【０２００】
配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較すると、少なくとも２つのアミノ酸が変化していることが特に好ましい。好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、許容可能なアミノ酸の変化の数は、２〜９、２〜８または２〜７の範囲である。
【０２０１】
上記の数および範囲は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、欠失、挿入、または置換の任意の組み合わせで達成してもよい。例えば、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、欠失のみ、挿入のみ、もしくは置換のみ、または欠失、挿入、もしくは置換の任意の混合があり得る。好ましくは、変異型は、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、変化の全てが置換であるアミノ酸配列を含む。すなわち、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、アミノ酸が欠失または挿入されていない配列である。好ましい変異型のアミノ酸配列において、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４を欠いている当該配列）と比較すると、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのアミノ酸が置換されており、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、アミノ酸が欠失または挿入されていない。
【０２０２】
好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、変化は、配列番号３のＦＧループ領域（１１４〜１２１位）および／またはベータシート領域にある。ベータシート領域のストランドは、以下の位置、配列番号３：Ａ：２７〜３１、Ｂ：３６〜３７、Ｃ：５４〜５８、Ｃ’：６４〜６９、Ｃ’’：７２〜７４、Ｄ：８６〜８８、Ｅ：９５〜９７、Ｆ：１０７〜１１３、Ｇ：１２２〜１３３を有する。
【０２０３】
最も好ましくは、配列番号３の配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、変化は、３２、４８、４９、５４、７４、７７、７９、１０３、１０７、１１１、１１８、１２０、１２１、１２２、１２５、１２７、または１３４から選択された１つ以上の位置にある。本明細書におけるアミノ酸の位置の全ての番号付けは、配列番号４のアミノ酸をＮ末端から始めて数えたものに基づく。したがって、配列番号３のＮ末端の最初の位置は、２４と番号付けされている（図２３の概略図参照）。
【０２０４】
特に好ましい挿入としては、１１６位と１１７位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸、および／または１１８位と１１９位との間に挿入された単一の追加のアミノ酸が挙げられる。挿入されるアミノ酸は、好ましくはチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）である。
【０２０５】
特に好ましい置換は、１２２位であり、これはアルギニン（Ｒ）である。配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、本発明のポリペプチドは、好ましくは、少なくとも１２２位が置換されているアミノ酸配列を含む。１２２位での最も好ましい置換は、アルギニン（Ｒ）を、優先順にリシン（Ｋ）またはアスパラギン（Ｎ）で置き換えることである。この置換は、Ｒ１２２Ｋ／Ｎと称され得る。
【０２０６】
他の好ましい置換は、１０７位、１２１位、および１２５位にあり、それぞれロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、およびグルタミン酸（Ｑ）である。１２２位での置換に加えて、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列（またはＡ２４およびＰ２５を欠いている当該配列）と比較して、１０７位、１２１位、および１２５位のアミノ酸のうちの少なくとも１つもまた置換されている、アミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列はまた、３２位、４８位、４９位、５４位、６４位、７４位、７７位、７９位、１０３位、１１１位、１１８位、１２０位、１２７位、および１３４位のうちの１つ以上で置換されていてもよい。
【０２０７】
１０７位での最も好ましい置換は、ロイシン（Ｌ）を、優先順にイソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはアルギニン（Ｒ）で置き換えることである。この置換は、Ｌ１０７Ｉ／Ｆ／Ｒと称され得る。本明細書に記載の他の置換についても、同様の表記法が使用される。１２１位での最も好ましい置換は、イソロイシン（Ｉ）をバリン（Ｖ）で置き換えることである。この置換は、Ｉ１２１Ｖと称され得る。
【０２０８】
１２５位での最も好ましい置換は、グルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）で置き換えることである。この置換は、Ｑ１２５Ｅと称され得る。
【０２０９】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に好ましい場合のある他の置換としては、Ｆ３２Ｉ、Ｑ４８Ｌ、Ｓ４９Ｔ、Ｖ５４Ｉ、Ｖ６４Ｉ、Ｋ７４Ｉ／Ｒ、Ｓ７７Ａ、Ｈ７９Ｄ／Ｓ／Ａ、Ｋ１０３Ｅ、Ｉ１１１Ｖ、Ｔ１１８Ｓ、Ｍ１２０Ｌ、Ｎ１２７Ｓ／Ｄ、およびＡ１３４Ｔが挙げられる。
【０２１０】
ヒト野生型ＣＤ８６の当該可溶性細胞外ドメインの特に好ましい変異型は、表Ａに示されている配列番号６〜２４のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むまたはそれからなる。
【０２１１】
配列番号６〜１４に示されているアミノ酸配列は、任意選択に、Ｎ末端に追加の残基ＡＰを含み得る。配列番号１５〜２４に示されているアミノ酸配列は、任意選択に、Ｎ末端に残基ＡＰを欠いていてもよい。いずれの場合も、これらの残基は、配列番号３のＡ２４およびＰ２５に対応する。
【０２１２】
本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ヒト野生型ＣＤ８６の当該可溶性細胞外ドメインの上述の変異型のうちのいずれかを含み得るまたはそれからなり得る。すなわち、本発明のポリペプチドのＣＴＬＡ−４結合ドメインは、表Ａに示されている配列番号６〜２４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。
【０２１３】
結合ドメインは、例えばＴ細胞などのＣＴＬＡ−４を発現する細胞に投与すると、ＣＴＬＡ−４からのシグナル伝達を調節し得る。好ましくは、結合ドメインは、当該シグナル伝達を低下させる、すなわち阻害または遮断し、それによって当該細胞の活性化を増大する。試験剤（結合ドメインなど）の投与の結果としてのＣＴＬＡ−４シグナル伝達および細胞活性化の変化は、任意の好適な方法によって決定され得る。好適な方法としては、試験剤の存在下または好適な対照の存在下にあるとき、Ｔ細胞の表面に発現されたＣＴＬＡ−４を通じて膜結合ＣＤ８６（例えばＲａｊｉ細胞上の）が結合しシグナル伝達する能力をアッセイすることが挙げられる。対照の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生および／またはＴ細胞増殖のレベルと比較した、試験剤の存在下でのＴ細胞ＩＬ−２産生レベルの増加またはＴ細胞増殖の増加は、ＣＴＬＡ−４を通じたシグナル伝達の低下および細胞活性化の増大を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。
【０２１４】
他のＴ細胞標的に対する結合ドメイン
本発明の多重特異性（例えば、二重特異性）ポリペプチドはまた、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４以外のＴ細胞標的に対して特異的な結合ドメインを含む（上記参照）。
【０２１５】
（ａ）ＯＸ４０結合ドメイン
一実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドは、ＯＸ４０に対して特異的な結合ドメインをさらに含む。
【０２１６】
ＯＸ４０結合ドメインの例示的なＶＨおよびＶＬ領域は、ＷＯ２０１６／１８５０１６に開示されており、その開示は参照により援用される。
【０２１７】
（ｂ）ＣＤ４０結合ドメイン
一実施形態では、多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドは、ＣＤ４０に対して特異的な結合ドメインをさらに含む。
【０２１８】
ＣＤ４０結合ドメインの例示的なＶＨおよびＶＬ領域は、ＷＯ２０１５／０９１８５３およびＷＯ２０１３／０３４９０４に示されており、それらの開示は参照により本明細書に援用される。
【０２１９】
本発明の多重特異性（例えば二特異性）ポリペプチドの実施形態
本発明の第１の態様の一実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４に特異的である、例えばＢ１は、ＧＩＴＲに対して特異的であり、Ｂ２はＣＴＬＡ−４に特異的である結合ドメインを有する。
【０２２０】
これらの結合ドメインは、上記に定義した通りである。
【０２２１】
実施形態部分Ｂ１−ＧＩＴＲに対して特異的な結合ドメインの二重特異性ポリペプチド
ＧＩＴＲに対して特異的な結合ドメインは、上記に定義した通りである。
【０２２２】
実施形態部分Ｂ２−ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインの二重特異性ポリペプチド
ＣＴＬＡ−４に対して特異的な結合ドメインは、上記に定義した通りである。
【０２２３】
実施形態の二重特異性ポリペプチド
本発明の二重特異性ポリペプチドは、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＣＴＬＡ−４の両方に特異的に結合することができる。「ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の両方に特異的に結合することができる」とは、上記の各部分について提供されている定義に従って、抗ＣＴＬＡ−４部分がＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、抗ＧＩＴＲ部分がＧＩＴＲに特異的に結合することを意味する。二重特異性ポリペプチドは、本明細書に記載の任意のＣＴＬＡ−４結合ドメインに連結している本明細書に記載の任意のＧＩＴＲ結合ドメインを含み得る。好ましくは、それらのそれぞれの標的に対する異なる部分の結合特徴は、それらが本発明の二重特異性抗体の一部として存在するとき、別々の実体として存在するときの個々の部分についての当該特徴と比較すると、変化していないまたは実質的に変化していない。
【０２２４】
典型的には、これは、二重特異性分子が、単独で存在するときにＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４に対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有することを意味する。あるいは、二重特異性分子が単独で存在するときのＣＴＬＡ−４結合ドメインのＣＴＬＡ−４に対するＫｄと比較して、増加したＣＴＬＡ−４に対するＫｄを有する場合、その増加は１０倍以下、好ましくは、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。加えて、二重特異性分子は、単独で存在するとき、ＧＩＴＲ結合ドメインのＧＩＴＲに対するＫｄ値と好ましくは実質的に同じであるＧＩＴＲに対するＫｄを独立して有するであろう。あるいは、二重特異性分子が単独で存在するときの抗ＧＩＴＲ抗体のＧＩＴＲに対するＫｄと比較して、増加したＧＩＴＲに対するＫｄを有する場合、その増加は１０倍以下、好ましくは、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、または２倍以下である。個々の結合ドメインの好ましいＫｄ値は、上述の通りである。
【０２２５】
所与の二重特異性分子の結合特徴を説明するために、ＣＴＬＡ−４結合における倍率変化のうちのいずれかを、独立してＧＩＴＲ結合における列挙されている倍率変化のうちのいずれかと組み合わせてもよいことが理解されるであろう。
【０２２６】
本発明の任意の二重特異性ポリペプチドのＧＩＴＲまたはＣＴＬＡ−４に対する結合特徴は、任意の好適なアッセイによって評価してもよい。特に、各別々の部分について上に記載のアッセイを二重特異性抗体に適用してもよい、または組み合わせたアッセイを使用して両方の標的への結合を同時に評価してもよい。本発明の二重特異性ポリペプチドの結合特徴を評価するための好適なアッセイもまた、実施例に記載されており、当該技術分野において既知である。
【０２２７】
実施形態の二重特異性ポリペプチドは、免疫系の細胞の活性を、ＧＩＴＲもしくはＣＴＬＡ−４単独の個々のアゴニストよりも、またはそのような個々のアゴニストの組み合わせよりも、大幅に調節することができる。特に、二重特異性ポリペプチドの投与は、より高いレベルのＴ細胞活性、特にエフェクターＴ細胞活性、例えばＣＤ４＋エフェクターＴ細胞活性を生じる。二重特異性ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲが両方ともより高度に発現される微小環境においてのみ最大の効果を発揮するので、エフェクターＴ細胞活性の増大はまた、個々のＧＩＴＲまたはＣＴＬＡ−４アゴニスト単独（またはそれらの組み合わせ）の投与から生じるものよりも、局在する。腫瘍は、そのような微小環境である。ＧＩＴＲはＣＤ８  Ｔ細胞で高レベルで発現され、したがってそれらを特に活性化し得る。ＣＤ８  Ｔ細胞は、有効な腫瘍応答の主なエフェクター構成要素のうちの１つである。
【０２２８】
エフェクターＴ細胞活性の増大は、ＧＩＴＲ経路の活性化を介した、またはＣＴＬＡ−４阻害経路の遮断を介したエフェクターＴ細胞の刺激から直接生じ得る、またはＴｒｅｇの枯渇または下方制御から間接的に生じ得、それによってそれらの免疫抑制効果を低下させる。Ｔｒｅｇの枯渇／下方制御は、ＡＤＣＰまたはＡＤＣＣメカニズムによって媒介され得る。全体として、殺腫瘍活性を直ちに生じるために、非常に強力な、局所化された免疫活性化を結果としてもたらすであろう。
【０２２９】
ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲの細胞表面発現パターンは部分的に重複しており、したがって本発明の二重特異性抗体は、シスおよびトランスの両方で両方の標的に結合し得る。これは、同じ細胞上のシスでの受容体クラスタリングのレベルを増大することによってか、またはトランスで２つの細胞間に人工的な免疫学的シナプスを作成することによってかのいずれかで、ＦｃγＲ−架橋とは独立した様式で、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を通じて刺激をもたらし、ひいては両方の細胞において受容体クラスタリングの向上およびシグナル伝達の増大を生じ得る。全体として、殺腫瘍活性を生じるために、非常に強力な、腫瘍に指向された免疫活性化を結果としてもたらすであろう。
【０２３０】
免疫系の細胞での本発明の二重特異性ポリペプチドの効果の測定は、任意の好適なアッセイで達成され得る。例えば、エフェクターＴ細胞の活性増大は、二重特異性ポリペプチドの個々の構成要素Ｂ１およびＢ２に関して上述のようなアッセイによって測定され得、二重特異性ポリペプチドの存在下で対照と比較した、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞による増殖またはＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生の測定が挙げられる。対照と比較した増殖またはＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生の増加は、細胞活性化の増大を示す。この種類の典型的なアッセイは、ＵＳ２００８／０２３３１２２の実施例９に開示されている。細胞増殖および／またはＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生についてのアッセイは周知知であり、実施例にも例示されている。同じアッセイで評価するとき、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増大よりも、少なくとも１．５倍高い、または少なくとも２倍高い、より好ましくは３倍高い、最も好ましくは５倍高いエフェクターＴ細胞の活性の増大を誘導するであろう。
【０２３１】
二重特異性分子は、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の両方が高度に発現されている微小環境にあるとき、免疫系を強力に活性化する。典型的には、二重特異性分子は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の活性を増大する、またはＴｒｅｇ細胞の活性を減少することができる。いずれの場合でも、抗体の正味の効果は、エフェクターＴ細胞の活性の増大であろう。同じアッセイで評価するとき、二重特異性分子は、典型的には、同じ標的に結合する単一特異性薬剤の組み合わせによって誘導されるエフェクターＴ細胞の活性の増大よりも、少なくとも１．５倍高い、または少なくとも１．７倍高い、より好ましくは４．５倍高い、最も好ましくは７倍高いエフェクターＴ細胞の活性の増大を誘導するであろう。
【０２３２】
エフェクターＴ細胞の活性の変化を決定するための方法は、周知であり、先に記載された通りである。細胞増殖および／またはＩＦＮγもしくはＩＬ−２産生についてのアッセイは周知であり、実施例に例示されている。
【０２３３】
例えば、ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４およびＧＩＴＲの両方に特異的に結合することができ得、Ｂ１は、ＧＩＴＲに対して特異的な抗体またはその抗原結合断片であり得、Ｂ２は、ＣＴＬＡ−４に対して特異的なポリペプチド結合ドメインであり得、これは、
ｉ）配列番号３のアミノ酸配列、または
ｉｉ）当該結合ドメインが野生型ヒトＣＤ８６よりも高い親和性でヒトＣＴＬＡ−４に結合することを条件に、配列番号３のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸が変化しているアミノ酸配列、を含むまたはそれからなる。
【０２３４】
ポリペプチドによって特異的に結合されているＣＴＬＡ−４は、霊長類またはマウス、好ましくはヒトのＣＴＬＡ−４であり得、および／またはポリペプチドによって特異的に結合されているＧＩＴＲは、霊長類、好ましくはヒトのＧＩＴＲであり得る。
【０２３５】
本発明のポリペプチドの部分Ｂ１は、抗体またはその抗原結合断片であり、典型的には、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および／または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含む。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、Ｂ１の任意の部分に付着し得るが、典型的には、当該少なくとも１つの重鎖（Ｈ）または少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）に、好ましくはＮ末端またはＣ末端のいずれかで付着し得る。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、直接的にまたは任意の好適な連結分子（リンカー）を介して間接的にかのいずれかでそのように付着してもよい。
【０２３６】
部分Ｂ１は、好ましくは少なくとも１つの重鎖（Ｈ）および少なくとも１つの軽鎖（Ｌ）を含み、部分Ｂ２は、好ましくは当該重鎖（Ｈ）または当該軽鎖（Ｌ）のいずれかのＮ末端またはＣ末端に付着している。Ｂ１の例示的な抗体は、２つの同一の重鎖（Ｈ）および２つの同一の軽鎖（Ｌ）からなる。そのような抗体は、典型的には２つのアームとして配置され、アームの各々はヘテロ二量体として接合している１つのＨおよび１つのＬを有し、２つのアームは、Ｈ鎖間のジスルフィド結合によって接合している。したがって、抗体は、事実上、２つのＨ−Ｌヘテロ二量体で形成されたホモ二量体である。本発明のポリペプチドの部分Ｂ２は、そのような抗体の両方のＨ鎖もしくは両方のＬ鎖、またはただ１つのＨ鎖もしくはただ１つのＬ鎖に付着し得る。
【０２３７】
したがって、本発明のポリペプチドは、あるいは、ヒト野生型ＣＤ８６またはその変異型の単量体可溶性細胞外ドメインを含むまたはそれからなる、ＣＴＬＡ−４に対して特異的な少なくとも１つのポリペプチド結合ドメインが付着している抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合断片として説明され得る。Ｂ１およびＢ２の結合ドメインは、本発明のポリペプチド中の唯一の結合ドメインであり得る。
【０２３８】
本発明のポリペプチドは、Ｎ−Ｃの方向に書かれている以下の式：
（Ａ）Ｌ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、
（Ｂ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｌ、
（Ｃ）Ｂ２−（Ｘ）ｎ−Ｈ、
（Ｄ）Ｈ−（Ｘ）ｎ−Ｂ２、のうちのいずれか１つに従って配置されているポリペプチドを含み得、
式中、Ｈが抗体（すなわちＢ１）の重鎖であり、Ｌが抗体（すなわちＢ１）の軽鎖であり、Ｘがリンカーであり、ｎが０または１である。リンカー（Ｘ）がペプチドである場合、リンカーは、典型的には、アミノ酸配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＰ（配列番号４８）、ＮＦＳＱＰ（配列番号４９）、ＫＲＴＶＡ（配列番号５０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５１）、またはｍ＝１〜７である（ＳＧ）ｍを有する。式（Ａ）〜（Ｄ）の略図を、図２４に示す。
【０２３９】
本発明はまた、式（Ａ）〜（Ｄ）のうちのいずれかに従って配置されているポリペプチドからなるポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドは、単量体として提供されてもよい、または抗体などの多量体タンパク質の構成要素として存在してもよい。当該ポリペプチドは、単離されていてもよい。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列の例を表Ｃに示す。各アミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列もまた示す。例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号６８〜７５に列挙されている。
【０２４０】
部分Ｂ２は、任意の好適な手段によって、本発明のポリペプチドの任意の部分に、またはリンカーに付着し得る。例えば、ポリペプチドの様々な部分は、ペプチド結合などの化学的共役によって接合されてもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、任意選択に、ペプチドリンカーによって接合している、Ｂ１（またはその構成要素部分）およびＢ２を含む融合タンパク質を含み得るまたはそれからなり得る。そのような融合タンパク質では、ＧＩＴＲ結合ドメインまたはＢ１のドメイン、およびＣＴＬＡ−４結合ドメインまたはＢ２のドメインが、唯一の結合ドメインであり得る。
【０２４１】
分子をポリペプチドに共役するための他の方法は、当該技術分野において既知である。例えば、カルボジイミド共役（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ＆Ｗｉｌｃｈｅｋ、１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：１５１−１５９参照；それらの開示は参照により本明細書に援用される）を使用して、ドキソルビシンを含む種々の薬剤を抗体またはペプチドに共役することができる。水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、官能部分を結合部分に共役するのに特に有用である。さらなる例として、共役は、過ヨウ素酸ナトリウム酸化、続いて適切な反応物の還元アルキル化によって、またはグルタルアルデヒド架橋によって達成され得る。しかしながら、どの方法が選択されるかにかかわらず、本発明のポリペプチドの一部として存在するとき、部分Ｂ１およびＢ２がそれらの標的結合特性を保持するまたは実質的に保持するという決定がなされるべきであることが好ましいと認識されている。
【０２４２】
本発明のポリペプチドを別の分子に（直接的にまたは間接的に）連結するために、同じ技術を使用してもよい。他の分子は、治療薬または検出可能な標識であり得る。好適な治療薬としては、細胞傷害性部分または薬物が挙げられる。
【０２４３】
本発明のポリペプチドは、単離された形態、または実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されているとは、任意の周囲の媒体から、ポリペプチドが、実質的にしかし全体的ではなく単離され得ることを意味する。ポリペプチドは、それらの意図される用途を妨害しないであろう担体または希釈剤と混合され得、それでもなお実質的に単離されていると見なされる。
【０２４４】
本発明の例示的なポリペプチドは、表Ｃに示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み得るまたはそれからなり得る。
【０２４５】
抗体の重鎖または軽鎖アミノ酸配列の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｃに配列番号５３、５５、５７、５９、６０、６２、６４、または６６として記載されているヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含み得るまたはそれからなり得る。表Ｃに示されるポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｃにも示される対応するヌクレオチド配列を含み得るまたはそれらからなり得る（イントロン配列は小文字で示される）（例えば、配列番号６８、７０、７２および７４）。部分Ｂ２の例をコードする代表的なポリヌクレオチドは、表Ｂに示されるような配列番号２５〜４３のうちのいずれか１つを含み得るまたはそれからなり得る。
【０２４６】
本発明のさらなる態様
本発明の第２の態様は、上述のように、個体における疾患または状態を治療または予防するための方法に使用するための、本発明の第１の態様に従った多重特異的（例えば二重特異性）ポリペプチドを含む。
【０２４７】
本発明の第３の態様は、上述のように、本発明の第１または第２の態様に従った多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドを個体に投与することを含む、個体における疾患または状態を治療または予防する方法である。
【０２４８】
本発明の一実施形態は、疾患または状態が癌であり、任意選択に、個体がヒトである、本発明の第２の態様に従った多重特異的（例えば二重特異性）ポリペプチド、または本発明の第３の態様に従った方法である。
【０２４９】
さらなる実施形態では、方法は、上述のように、多重特異的（例えば、二重特異性）抗体を、全身に、または腫瘍の部位もしくは腫瘍流入領域リンパ節などの局所に投与することを含む。
【０２５０】
癌は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸癌、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、黒色腫、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、皮膚癌、リンパ腫、または膠芽腫であり得る。
【０２５１】
本発明の第４の態様は、上述のように、本発明の第１または第２の態様に従った多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドの、少なくとも１つのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドである。
【０２５２】
本発明の第５の態様は、本発明の第１または第２の態様に従った多重特異性（例えば二重特異性）ポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤または担体とを含む組成物である。
【０２５３】
本発明の一実施形態では、実施形態の第１または第２の態様のいずれかに従ったポリペプチドは、追加の治療部分に共役している。
【０２５４】
本発明の医薬組成物は、単独で、または代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリンおよび他の細胞傷害性抗生物質、ビンカアルキロイド、エトポシド、白金化合物、タキサン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、抗増殖性免疫抑制剤、コルチコステロイド、性ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、ならびに他の免疫療法用抗体（トラスツズマブなど）などの癌の治療に使用される他の治療薬と組み合わせて投与され得ることも当業者には理解されるであろう。
【０２５５】
本発明の併用療法は、加えて、ＧＩＴＲおよび／またはＣＴＬＡ−４以外の免疫チェックポイント分子に特異的に結合する、癌の治療に有効なさらなる免疫療法剤を含み得る。さらなる免疫療法剤の治療上の利益は、阻害性免疫チェックポイント分子の機能を減弱することによって、および／または刺激性免疫チェックポイント分子の機能を活性化することによって媒介され得ることが理解されるであろう。
【０２５６】
別の実施形態では、追加の治療部分は、
（ａ）ＰＤ−１を結合する免疫療法剤、
（ｂ）ＯＸ４０を結合する免疫療法剤、および
（ｃ）ＣＤ１３７を結合する免疫療法剤からなる群から選択された、免疫療法剤である。
【０２５７】
したがって、さらなる免疫療法剤は、ＰＤ１機能を阻害することができる、抗ＰＤ１抗体またはその抗原結合断片などのＰＤ１阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ、ピジルズマブ、およびＡＭＰ−２２４）であり得る。あるいは、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１機能を阻害することができる、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＭＥＤＩ−４７３６およびＭＰＤＬ３２８０Ａ）を含み得るまたはそれらからなり得る。
【０２５８】
本発明の第６の態様は、先に定義された通りである、ＧＩＴＲに対して特異的な抗体である。
【０２５９】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】広範囲の異なる二重特異性抗体による二重抗原結合を示す。ヒトＧＩＴＲをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、二重特異性抗体を異なる濃度で添加した。二次抗原としてビオチン化ＣＴＬＡ−４を添加し、検出試薬としてストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した。
【図２】野生型およびアフコシル化フォーマットでのＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体２３７２／２３７３による二重抗原結合を示す。ヒトＧＩＴＲをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、抗体を異なる濃度で添加した。二次抗原としてビオチン化ＣＴＬＡ−４を添加し、検出試薬としてストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した。
【図３】ヒトＧＩＴＲと相互作用する二重特異性抗体の動態プロファイルを示す。１．２５〜８０ｎＭの範囲の濃度でセンサーチップ表面に固定化されたＧＩＴＲに対して、二重特異性抗体をアッセイした（３００秒会合および９００秒解離）。
【図４】ヒトＣＴＬＡ−４と相互作用する二重特異性抗体２３７２／２３７３の動態プロファイルを示す。二重特異性抗体をセンサーチップ上に固定化し、１０〜８０ｎＭの範囲の濃度でｈＣＴＬＡ−４に対してアッセイした（１８０秒会合および６００秒解離）。
【図５】二重特異性抗体の、ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲリガンド相互作用を遮断する能力を示す。上の４つのグラフは、各二重特異性抗体に使用された２つのセンサーチップ（アッセイセンサーおよび参照センサー）からのセンサーグラムを示し、下のグラフは、二重特異性抗体が全く存在しないＧＩＴＲへのＧＩＴＲリガンドの結合を示す。図に含まれる異なる段差は、ａ）固定化ＧＩＴＲへの二重特異性抗体の結合、ｂ）固定化ＧＩＴＲへのＧＩＴＲリガンドの結合（アッセイセンサー）、または速動性緩衝液中で結合している二重特異性抗体の解離（参照センサー）かのいずれか、およびｃ）形成されたＧＩＴＲ−ＧＩＴＲリガンド複合体の解離である。
【図６】二重特異性抗体２３７２／２３７３が、二次抗体（二重特異性または単一特異性）のＧＩＴＲとの相互作用を遮断する能力を示す。上の４つのグラフは、各二次二重特異性抗体に使用するための２つのセンサーチップ（アッセイセンサーおよび参照センサー）からのセンサーグラムを示し、左下のグラフは、対照ｍＡｂに使用するためのセンサーチップを示し、右下のグラフは、二次抗体を全く含まない２３７２／２３７３の会合および解離プロファイルを示す。図に含まれる異なる段差は、ａ）固定化ＧＩＴＲへの二重特異性抗体２３７２／２３７３の結合、ｂ）２３７２／２３７３で遮断する前の、（アッセイセンサー、上部センサーグラム）を用いた、または用いない（参照センサー、下部センサーグラム）固定化ＧＩＴＲへの二次抗体の結合である。
【図７】フローサイトメトリーによって測定した、野生型およびアフコシル化フォーマットでのＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体２３７２／２３７３の標的発現細胞への結合を示す。ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ−４ｈｉ細胞を、連続希釈した抗体、続いて二次ＰＥ共役抗ｈＦｃ抗体で染色した。
【図８】フローサイトメトリーで測定した、野生型およびアフコシル化フォーマットでのＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体２３７２／２３７３のＦｃγＲＩＩＩａ発現細胞への結合を示す。ＣＨＯ−ＦｃγＲＩＩＩａ細胞を、連続希釈した抗体、続いて二次ＰＥ共役抗ｈＦｃ抗体で染色した。
【図９】ＥＬＩＳＡを使用して評価した、野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のＣ１ｑへの結合を示す。ヒトＣ１ｑをプレート上にコーティングし、抗体を異なる濃度で添加した。検出抗体としてヒツジ抗ヒトＣ１ｑ−ＨＲＰ、続いてペルオキシダーゼ基質を使用した。リツキシマブを陽性対照として、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ対照を陰性対照として含んだ。
【図１０】可溶性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体、または可溶性単一特異性対照（ＭｉｌｔｅｎｙｉからのＧＩＴＲ  ｍＡｂ、およびＣＴＬＡ−４結合部分を含むアイソタイプ対照ｉｓｏ／ＣＴＬＡ−４）の組み合わせのいずれかで刺激したヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞のインビトロ刺激後のＩＦＮγ産生を示す。実験は、ＣＴＬＡ−４を含むまたは含まないＣＤ３でコーティングしたプレートで実行した。Ａ）ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体：２３７２／２３７３の全用量応答曲線。Ｂ）二重特異性抗体：２３４８／２３４９、２３７２／２３７３、２３９６／２３９７、および２４０４／２４０５、または単一特異性対照の単一抗体濃度（１６ｎＭ）。アッセイは、合計４人のドナーで２回実行した。１つの代表的な実験（２人のドナーの平均）を示す。
【図１１】野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３変異型のアゴニスト効果を示す。αＣＤ３およびＣＴＬＡ−４でコーティングしたプレート中で、ＣＤ３＋Ｔ細胞を野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体で７２時間刺激した。上清中での（Ａ）ＩＦＮ−γおよび（Ｂ）ＩＬ−２の分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。１つの代表的な実験（４人のドナーの平均）を示す。
【図１２】Ａ）ＦｃγＲＩＩＩａ発現細胞の不在下での、およびＢ）ＦｃγＲＩＩＩａ発現ＣＨＯ細胞（１００，０００細胞／ウェル）の存在下での、野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体２３７２／２３７３、ならびにアイソタイプ対照に応答したＧＩＴＲ活性化を示す。ＧＩＴＲ発現ジャーカット細胞をレポーター細胞として使用した。データは、培地対照に対する誘導倍率として提示する。
【図１３】ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体２３７２／２３７３、単一特異性対応物の組み合わせ（ｉｓｏ／ＣＴＬＡ−４＋αＧＩＴＲ  ｍＡｂ）、およびアイソタイプ対照に応答したＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）エフェクター細胞の活性化を示す。ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｌｏＣＨＯ細胞を、標的細胞として使用した。データは、培地対照に対する誘導倍率として提示する。２回の実験のうちの１回を示す。
【図１４】野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体、ならびにアイソタイプ対照に応答したＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）エフェクター細胞の活性化を示す。標的細胞として、Ａ）ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｌｏ細胞、およびＢ）ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｈｉ細胞を使用した。データは、培地対照に対する誘導倍率として提示する。２回の実験のうちの１回を示す。
【図１５】野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体２３７２／２３７３、ならびにアイソタイプ対照に応答したＡＤＣＣを示す。ＰＢＭＣエフェクター細胞および標的細胞としてのＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｈｉ細胞を、上清中でＬＤＨの測定前に試験化合物と５０：１の比で４時間共培養した。４人のドナーの平均を示す。
【図１６】野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体に応答したＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）エフェクター細胞の活性化を示す。標的細胞として、（Ａ）そのままで単離したＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ）、および（Ｂ）αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで４８時間活性化したＴｒｅｇを、使用した。データは、培地対照に対する誘導倍率として提示する。（Ｃ）活性化前後のＰＢＭＣおよびＴｒｅｇでのＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の発現を、フローサイトメトリーによって決定した。２人のドナーの平均を示す。
【図１７】脾臓細胞アッセイにおける代替二重特異性抗体のアゴニスト効果を示す。αＣＤ３およびＣＴＬＡ−４でコーティングしたプレート中でＣＤ３ＣＤ３＋Ｔ細胞を野生型またはアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体で４８時間刺激し、Ｔ細胞の活性化をＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ分泌の形式で測定した。
【図１８】代替野生型またはアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体によるＡＤＣＣ応答の指標として、ｍＦｃγＲＩＶレポーター細胞の活性化を示す。データは、培地対照に対する誘導倍率として提示する。
【図１９】ＣＴ２６大腸癌腫モデルでの二重特異性代替ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍効果を示す。７、１０および１３日目に腹腔内治療を行った。（Ａ）ビヒクルおよびＤＴＡ−１と比較した、２７７６／２７７７による、腫瘍体積の抑制。（Ｂ）ビヒクルと比較した２７７６／２７７７ＡＦの生存期間の延長。平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ、またはカプラン−マイヤー生存期間の例示的なグラフを示すグラフ（ｎ＝１０／実験）。
【図２０】ＭＣ３８大腸癌腫モデルでの二重特異性代替ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍効果を示す。確立された皮下腫瘍を担持するマウスに、７、１０および１３日目に腹腔内で治療を行った。（Ａ）２７７６／２７７７による腫瘍体積の抑制、（Ｂ）ビヒクルと比較した２７７６／２７７７ＡＦで治療したマウスの生存期間の延長。グラフは、平均腫瘍体積＋／−ＳＥＭ、またはカプラン−マイヤー生存期間の例示的なグラフを示す（ｎ＝１０／実験）。
【図２１】Ｔｒｅｇでの二重特異性代替抗体の抗腫瘍効果を示す。皮下ＭＣ３８大腸癌腫を担持するマウスを、１０、１３および１６日目に２７７６／２７７７または２７７６／２７７７ＡＦ（２００μｇ）を用いて腹腔内注射で治療した。最後の注射の２４時間後に、腫瘍および脾臓を採取し、Ｔｒｅｇおよびエフェクター細胞を染色した。（Ａ）腫瘍中のＴｒｅｇパーセント、（Ｂ）腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比、および（Ｃ）脾臓中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比。グラフは平均＋ＳＤを示す。
【図２２】二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の抗腫瘍有効性を示す。ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫（１０ｘ１０６）を０日目に右後側腹部／背中に皮下接種した。５日目に、ヒトＰＢＭＣ細胞（５ｘ１０６）を腹腔内投与した。５、１１および１８日目に腹腔内注射（およそ５００ｎｍｏｌ／用量）によって治療を行った。（Ａ）ｈＰＢＭＣの存在下での腫瘍体積の抑制（ｎ＝５／ドナー、ｎ（ドナー）＝２）、（Ｂ）ｈＰＢＭＣなしの腫瘍体積の抑制（ｎ＝１０／群）。グラフは平均＋／−ＳＥＭを示す。
【図２３】本明細書に開示のヒト野生型ＣＤ８６アミノ酸配列の略図を提供する。（Ａ）は、Ｎ末端シグナル配列を含まないヒトＣＤ８６の単量体可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）であり、（Ｂ）は、Ｎ末端シグナル配列を含むヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）であり、（Ｃ）は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢＫ４１９３１．１；配列番号４４）である。Ａの配列は、任意選択に、Ｎ末端、すなわち、太字で示されている２４位および２５位にアラニンおよびプロリンを欠いていてもよい。ＢおよびＣのシグナル配列には下線が引かれている。アミノ酸の位置の番号付けは、Ｎ末端から始まる配列番号４および４４に基づく。
【図２４】本発明の二重特異性ポリペプチドの例示的な配置の構造の略図を示す。抗ＧＩＴＲ抗体可変ドメインは黒で、定常ドメインは白で塗りつぶされている。ＣＴＬＡ−Ａ結合ドメインは斜線で網掛けされている。
【０２６１】
配列の説明
配列番号１は、ヒトＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ００６９８．１に対応）である。
配列番号２は、ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１９４４．１に対応）である。
配列番号３は、Ｎ末端から２３個のアミノ酸シグナル配列を除いた、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｎ末端シグナル配列を含む、ヒト野生型ＣＤ８６の単量体細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列である（図２３参照）。本明細書におけるアミノ酸の位置の全ての番号付けは、Ｎ末端から始まる配列番号４の位置に基づく。したがって、配列番号３のＮ末端のアラニンは２４と番号付けされている。
配列番号５は、Ｐｅａｃｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５、ｖｏｌ２７０（３６）、２１１８１−２１１８７）に開示の、ヒトＣＤ８６の細胞外ドメインの突然変異体形態のアミノ酸配列である。野生型配列の７９位のＨは、配列番号５の配列の対応する位置でＡに置換されている。この変化を、本明細書ではＨ７９Ａと称する。本明細書で言及される他のアミノ酸置換については、全体を通して同等の命名法が使用されている。位置の番号付けは、上に概説したように配列番号４に基づく。
配列番号６〜２４は、本発明の特定のタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２５〜４３はそれぞれ、配列番号６〜２４の各々のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、ヒトＣＤ８６の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＫ４１９３１．１に対応）である。
配列番号４５は、マウスＣＴＬＡ−４のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０９７９３．１に対応）である。
配列番号４６は、マウスＣＤ２８のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３７３９５．１に対応）である。
配列番号４７〜５１は、本発明の二重特異性ポリペプチドに使用され得る様々なリンカーである。
配列番号５２〜７５は、本発明の例示的な配列である。
配列番号７６〜９６は、本発明の例示的なＣＤＲ配列である。
配列番号９７は、例示的な重鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号９８は、例示的な軽鎖定常領域アミノ酸配列である。
配列番号９９は、ヒンジ領域（位置１０８）においてＳｅｒからＰｒｏへの、およびＣＨ３領域（位置３１５）においてＨｉｓからＡｒｇへの突然変異を有する、例示的な修飾ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。突然変異は、血清半減期の低下、およびＩｇＧ４をより安定にしＦａｂアーム交換を妨げて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
配列番号１００は、例示的な野生型ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。それは、配列番号９９の突然変異を欠く配列である。
配列番号１０１は、ヒンジ領域（位置１０８）においてＳｅｒからＰｒｏへの単一突然変異を有する、例示的な修飾ヒト重鎖ＩｇＧ４定常領域配列である。突然変異は、ＩｇＧ４をより安定にしＦａｂアーム交換を妨げて、ＩｇＧ４のコアヒンジの安定化をもたらす。
配列番号１０２は、配列番号９９のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを欠く）。
配列番号１０３は、配列番号９９のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを含む）。
配列番号１０４は、配列番号１００のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを欠く）。
配列番号１０５は、配列番号１００のＩｇＧ４定常領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを含む）。
配列番号１０６および１０７はそれぞれ、配列番号９７のＩｇＧ１定常領域をコードする例示的なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列である。
配列番号１０８は、配列番号９８の軽鎖カッパ領域をコードする例示的なＤＮＡ配列である。
配列番号１０９は、配列番号１０１のＩｇＧ４領域をコードする例示的なｃＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを欠く）。
配列番号１１０は、配列番号１０１のＩｇＧ４領域をコードする例示的なゲノムＤＮＡ配列である（すなわちイントロンを含む）。
配列番号１１１は、ヒトＧＩＴＲのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＤ００６９８．１に対応）である。
配列番号１１２〜１４３は、ＯＸ４０結合ドメインのＶＬおよびＶＨ領域の例示的なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。
【０２６２】
表（配列）
【表Ａ１】
2019535282.tif 000011
【表Ａ２】
2019535282.tif 000012
【表Ｂ１】
2019535282.tif 000013
【表Ｂ２】
2019535282.tif 000014
【表Ｂ３】
2019535282.tif 000015
【表Ｂ４】
2019535282.tif 000016
【表Ｃ１】
2019535282.tif 000017
【表Ｃ２】
2019535282.tif 000018
【表Ｃ３】
2019535282.tif 000019
【表Ｃ４】
2019535282.tif 000020
【表Ｃ５】
2019535282.tif 000021
【表Ｃ６】
2019535282.tif 000022
【表Ｃ７】
2019535282.tif 000023
【表Ｃ８】
2019535282.tif 000024
【表Ｄ１】
2019535282.tif 000025
【表Ｄ２】
2019535282.tif 000026
【０２６３】
他の配列
【化６】
2019535282.tif 000027
【化７】
2019535282.tif 000028
【化８】
2019535282.tif 000029
【化９】
2019535282.tif 000030
【化１０】
2019535282.tif 000031
【化１１】
2019535282.tif 000032
【化１２】
2019535282.tif 000033
【化１３】
2019535282.tif 000034
【化１４】
2019535282.tif 000035
【化１５】
2019535282.tif 000036
【化１６】
2019535282.tif 000037
【化１７】
2019535282.tif 000038
【化１８】
2019535282.tif 000039
【化１９】
2019535282.tif 000040
【化２０】
2019535282.tif 000041
【化２１】
2019535282.tif 000042
【化２２】
2019535282.tif 000043
【化２３】
2019535282.tif 000044
【化２４】
2019535282.tif 000045
【化２５Ａ】
2019535282.tif 000046
【化２５Ｂ】
2019535282.tif 000047
【化２６】
2019535282.tif 000048
【化２７Ａ】
2019535282.tif 000049
【化２７Ｂ】
2019535282.tif 000050
【化２８】
2019535282.tif 000051
【化２９】
2019535282.tif 000052
【化３０】
2019535282.tif 000053
【化３１】
2019535282.tif 000054
【化３２Ａ】
2019535282.tif 000055
【化３２Ｂ】
2019535282.tif 000056
【化３３】
2019535282.tif 000057
【実施例】
【０２６４】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用される全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に援用される。
【０２６５】
実施例１−二重特異性抗体ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４の二重ＥＬＩＳＡ
材料および方法
５０ｕｌ／ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃６８９−ＧＲ）をＧＩＴＲ−ｈＦｃ（０．５ｕｇ／ｍｌ）でコーティングした。次いでプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０）で３回洗浄し、室温で１時間ＰＢＳＴおよび１％ＢＳＡで遮断した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、二重特異性抗体を異なる濃度（最高濃度６６．７ｎＭ）で添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、０．１μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＴＬＡ−４−ｍＦｃ（Ａｎｃｅｌｌ、＃５０１−０３０）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｐｉｃｏ発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３７０６９）を製造元のプロトコールに従って添加し、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈ）で発光を測定した。
【０２６６】
結果および結論
二重特異性抗体は、用量依存的様式で両方の標的に同時に結合することができ（図１）、これは提言された作用機序に重要である。アフコシル化二重特異性抗体フォーマットでは、標的結合に差異は見られない（図２）。野生型抗体およびアフコシル化抗体のＥＣ５０値は、それぞれ０．６４および０．５４ｎＭである。
【０２６７】
実施例２−二重特異性抗体のＧＩＴＲとの相互作用の動態
材料および方法
動態測定は、ＡＲ２Ｇ（アミン反応性第２世代）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６プラットフォームを使用して実行した。２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）との標準的なアミンカップリングを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中でヒトＧＩＴＲ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＧＩＲ−Ｈ５２２８）をバイオセンサー表面にカップリングした。二重特異性抗体を、１×速動性緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で８０ｎＭ、４０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、および１．２５ｎＭに希釈した。結合動態を、１×速動性緩衝液中で３００秒間会合し続いて９００秒間解離して、調査した。センサーチップを１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用して再生した。生成されたデータを、平行な緩衝液ブランクを差し引いて参照し、ベースラインをｙ軸に並べ、解離に対する整列によるステップ間相関を実行し、データをデータ分析ソフトウェアのＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターによって平滑化した（ｖ．９．０．０．１４）。フィッティング精度の測定として、Ｘ２で１：１ラングミュア結合モデルを使用して処理データをフィッティングした。
【０２６８】
結果および結論
以下の表１および図３に要約されるように、二重特異性抗体は、上述のアッセイ設定を使用して、低ｎＭ〜サブｎＭの範囲のＫＤでＧＩＴＲに結合する。Χ２の値は、良好な曲線へのフィッティングを裏付ける。
【表１】
2019535282.tif 000058
【０２６９】
実施例３−二重特異性抗体のＣＴＬＡ−４との相互作用の動態
材料および方法
動態測定は、抗ｈＩｇＧ  Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６プラットフォームを使用して実行した。二重特異性抗体を１Ｘ速動性緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で２μｇ／ｍｌに希釈し、３００秒間センサーチップにロードした。次いで、固定化二重特異性抗体を、４  ２倍希釈のヒトＣＴＬＡ−４（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＣＴ４−Ｈ５２２９）に対してアッセイした。結合動態を、１×速動性緩衝液中で１８０秒間会合し続いて６００秒間解離して、調査した。センサーチップを１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用して再生した。生成されたデータを、平行な緩衝液ブランクを差し引いて参照し、ベースラインをｙ軸に並べ、解離に対する整列によるステップ間相関を実行し、データをデータ分析ソフトウェアのＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターによって平滑化した（ｖ．９．０．０．１４）。フィッティング精度の測定として、Ｘ２で１：１ラングミュア結合モデルを使用して処理データをフィッティングした。
【０２７０】
結果および結論
以下の表２および図４に要約されるように、ＣＴＬＡ−４結合剤２３７２／２３７３は、上述のアッセイ設定を使用して、ｎＭの範囲のＫＤでＣＴＬＡ−４と相互作用する。Χ２の値は、良好な曲線へのフィッティングを裏付ける。
【表２】
2019535282.tif 000059
【０２７１】
実施例４−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、ＧＩＴＲとＧＩＴＲリガンドとの間の相互作用を遮断する能力。
材料および方法
リガンド遮断実験は、ＡＲ２Ｇ（アミン反応性第２世代）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６プラットフォームを使用して実行した。２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）との標準的なアミンカップリングを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中でヒトＧＩＴＲ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＧＩＲ−Ｈ５２２８）をバイオセンサー表面にカップリングした。二重特異性抗体を８０ｎＭに希釈し、ＧＩＴＲリガンド（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＧＩＬ−Ｈ５２６ａ）を１×速動性緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で５μｇ／ｍｌに希釈した。各二重特異性抗体を、２つの平行なバイオセンサーチップに６００秒間結合させた後、１つのセンサーをＧＩＴＲリガンド溶液（アッセイセンサー）に、１つのセンサーを１ｘ速動性緩衝液（参照センサー）に３００秒間浸漬した。二重特異性抗体を含まない１ｘ速動性緩衝液中で、１対のバイオセンサーを動作させて、阻害のないＧＩＴＲリガンド結合を実証した。最後に、１×速動性緩衝液中で形成されたＧＩＴＲ−ＧＩＴＲリガンド複合体の解離を１２０秒間追跡した後、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用してセンサーチップを再生した。
【０２７２】
結果および結論
図５に示されるように、二重特異性抗体は、ＧＩＴＲがＧＩＴＲリガンドと相互作用する能力を完全にまたは部分的に遮断するな方式でＧＩＴＲに結合する。２３７２／２３７３および２４０４／２４０５は、ＧＩＴＲリガンドをほぼ完全に遮断する。
【０２７３】
実施例５−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、ＧＩＴＲとの互いの相互作用を遮断する能力。
材料および方法
遮断実験は、ＡＲ２Ｇ（アミン反応性第２世代）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６プラットフォームを使用して実行した。２０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１０ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）との標準的なアミンカップリングを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中でヒトＧＩＴＲ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＧＩＲ−Ｈ５２２８）をバイオセンサー表面にカップリングした。二重特異性抗体を、１×速動性緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で、８０ｎＭ（一次二重特異性抗体）または２０ｎＭ（二次二重特異性抗体および対照ｍＡｂ）のいずれかに希釈した。対照として、市販のＧＩＴＲ特異性の単一特異性ｍＡｂ（ＤＴ５Ｄ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した。各アッセイに２つのバイオセンサーチップを使用した。一次二重特異性抗体をこれらのセンサーのうちの１つ（アッセイセンサー）に６００秒間結合させた一方で、他のセンサーを１×速動性緩衝液（参照センサー）中でインキュベートした。次に、２つのセンサーを、二次抗体を含有するウェル中でインキュベートし、１８０秒間結合を調査した後、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用してセンサーを再生した。
【０２７４】
結果および結論
図６に例示されているように、二重特異性抗体は、分析された全ての二次抗体（二重特異性抗体ならびに対照ｍＡｂ）のＧＩＴＲへの結合を少なくとも部分的に阻害する能力を有する。一次抗体としての４つ全ての二重特異性抗体を使用してアッセイを繰り返したが、全ての設定において同様の結果であった（データは示さず）。これは、このアッセイに含まれる全ての抗体が、立体障害によってまたはＧＩＴＲの立体構造変化を誘導することによって、それらが互いのＧＩＴＲへの結合を遮断する、または受容体への結合を妨害するように、重複するまたは少なくともそのように近接するエピトープに結合することを示す。
【０２７５】
実施例６−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の標的発現細胞への結合
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の標的発現細胞への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。アフコシル化フォーマットを野生型ＩｇＧ１と比較した。標的結合能力に差異は予想されなかった。
【０２７６】
材料および方法
高レベルのＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を安定的に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ−４ｈｉ細胞）を使用した。２５０，０００細胞／ウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で連続希釈したＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体を用いて、４℃で１時間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、続いてＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈した二次ＰＥ共役抗ｈＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−１１５−０９８）を添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅで分析した。
【０２７７】
結果および結論
図７に見られるように、標的結合における差異は見られない。野生型抗体およびアフコシル化抗体のＥＣ５０値は、それぞれ１１．７および９．９ｎＭである。
【０２７８】
実施例７−アフコシル化Ｆｃドメインを有するＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のＦｃ受容体結合
抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用を通じてＦｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）を係合することができる。これらの相互作用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を媒介する。エフェクター機能活性は、ＩｇＧ１アイソタイプでは高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では低い。ＩｇＧ１抗体、特にＡＤＣＣのエフェクター機能を向上することが時に望ましい。これは、例えば突然変異の導入を通じて、またはアフコシル化を通じて達成することができる。ここで、野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、ヒトおよびマウスのＦｃγＲとのその結合について比較した。ヒトＦｃγＲＩＩＩａへの向上した結合は、アフコシル化フォーマットで予想される。
【０２７９】
材料および方法
ＦｃγＲ親和性は、抗ヒトＦａｂ−ＣＨ１（ＦＡＢ２Ｇ）センサーチップ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を備えたＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６プラットフォームを使用して決定した。二重特異性抗体を、１×速動性緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で２００ｎＭに希釈し、１セット８個の平行なセンサーに３００秒間ロードして、＞１．５ｎｍの固定化応答に達した。次いで、固定化二重特異性抗体を、ヒトＦｃγＲＩには１００ｎＭ、他の全てのアッセイされたＦｃγＲには１μＭで開始して、７  ２倍希釈のＦｃγＲに対してアッセイした。参照用に１つの固定化センサーを１×速動性緩衝液に対してアッセイし、二重参照を可能にするために二重特異性抗体を固定化せずにアッセイ全体を繰り返した。含まれるＦｃγＲは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ヒトＦｃγＲＩ、＃１２５７−ＦＣ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩａ、＃１３３０−ＣＤ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩｂ、＃１４６０−ＣＤ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）、＃４３２５−ＦＣ−０５０；ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ１５８）、＃８８９４−ＦＣ−０５０；マウスＦｃγＲＩ、＃２０７４−ＦＣ−０５０；マウスＦｃγＲＩＩｂ、＃１８７５−ＣＤ−０５０；マウスＦｃγＲＩＩＩ、＃１９６０−ＦＣ−０５０）、およびＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（マウスＦｃγＲＩＶ、＃５００３６−Ｍ２７Ｈ−５０）から入手した。ＦｃγＲへの結合を６０秒間行い、続いて１×速動性緩衝液中で６０秒間解離し、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．７を使用してセンサーチップを再生した。生成されたデータを、標準的な二重参照によって参照し、ベースラインをｙ軸に並べ、解離に対する整列によるステップ間相関を実行し、データをデータ分析ソフトウェアのＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルターによって平滑化した（ｖ．９．０．０．１４）。フィッティング精度の測定として、Ｘ２で１：１ラングミュア結合モデルを使用して処理データをフィッティングした。ＦｃγＲに対して非常に速い解離速度で生成された解離曲線の曲線フィッティング品質を改善するために、解離曲線の最初の１０秒のみを曲線フィッティングに含んだ。
【０２８０】
結果および結論
一組のＦｃγＲに対して評価した二重特異性抗体の得られた親和定数（ＫＤ）を、表３および表４に要約する。予想通り、２３７２／２３７３のアフコシル化は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８およびＦ１５８変異型の両方）の親和性の増大を生じた。これに加えて、２３７２／２３７３のアフコシル化バージョンおよび二重特異性代替抗体は、マウスＦｃγＲＩＶを、これらの二重特異性抗体の野生型バージョンと比較して２．１〜２．５倍増大した親和性で結合した。
【表３】
2019535282.tif 000060
【表４】
2019535282.tif 000061
【０２８１】
実施例８−アフコシル化Ｆｃドメインを有するＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のＦｃγＲＩＩＩａ発現細胞への結合
アフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のＦｃγＲＩＩＩａへ結合の向上を確認するために、ＦｃγＲＩＩＩａ発現細胞への結合をフローサイトメトリーによって評価した。
【０２８２】
材料および方法
高レベルのＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）を安定的に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＦｃγＲＩＩＩａ細胞）を使用した。２５０，０００細胞／ウェルを、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で連続希釈したＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体を用いて、４℃で１時間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、続いてＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈した二次ＰＥ共役抗ｈＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９−１１５−０９８）を添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅで分析した。
【０２８３】
結果および結論
予想通り、ＦｃγＲＩＩＩａ発現細胞への結合の向上は、野生型のＩｇＧ１変異型と比較して、アフコシル化二重特異性抗体で見られた（図８）。
【０２８４】
実施例９−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、ヒト補体のＣ１ｑ成分への結合
この実施例では、ヒト補体系のＣ１ｑ成分への結合を、野生型およびアフコシル化ＩｇＧ１フォーマットを用いてＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体を使用して評価した。
【０２８５】
材料および方法
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＣ１ｑタンパク質（２μｇ／ｍｌ）、５０μｌ／ウェル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、＃２０４８７６）でコーティングした。次いでプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０）で３回洗浄し、室温で１時間ＰＢＳＴおよび１％ＢＳＡで遮断した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、モノクローナル抗体または二重特異性抗体を異なる濃度で添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、５０μｌのヒツジ抗ヒトＣ１ｑ−ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ、＃２２２１−５００４Ｐ）を１：４００の希釈で加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、続いて５０μｌのペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３７０６９）を添加した。発光は、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定した。
【０２８６】
結果および結論
図９に示されるように、Ｃ１ｑへの同様の用量依存的結合が、野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３で見られ、そのレベルはＩｇＧ１アイソタイプ対照と同等であった。予想通り、ＩｇＧ４アイソタイプ対照では結合は見られなかった。一方、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））は、Ｃ１ｑを結合し、補体媒介溶解を媒介するその能力に起因して陽性対照として含まれており、強いシグナルを与えた。
【０２８７】
実施例１０−二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体のアゴニスト機能
二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体の、ＣＴＬＡ−４の存在下でＧＩＴＲを発現するＴ細胞を活性化する能力を決定した。ＩＦＮγ産生が増加したＴ細胞の活性化は、ＣＴＬＡ−４でコーティングしたウェルへの二重特異性抗体の結合を介したＧＩＴＲの架橋の存在下で予想された。その目的は、ＣＴＬＡ−４が存在するときの二重特異性抗体のより高い有効性および効力、ならびにＧＩＴＲ単一特異性抗体（ＧＩＴＲ  ｍＡｂ）とＣＴＬＡ−４結合部分にカップリングされたアイソタイプ対照（ｉｓｏ／ＣＴＬＡ−４）との組み合わせよりも高い有効性を達成することであった。さらに、野生型およびアフコシル化フォーマットで二重特異性抗体２３７２／２３７３を比較した。アフコシル化二重特異性抗体フォーマットではアゴニスト機能の変化は予想されない。
【０２８８】
材料および方法
ネガティブ選択（Ｐａｎ  Ｔ細胞単離キット、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０−０９６−５３５）を使用して、Ｆｉｃｏｌｌ分離ＰＢＭＣ（Ｌｕｎｄ大学病院の血液銀行からの白血球フィルターから得た）から、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を精製した。ＰＢＳに希釈したＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、５μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない５０μｌのα−ＣＤ３（クローン：ＯＫＴ３、ＢＤ、濃度３μｇ／ｍｌ）を、非組織培養処理したＵ字形９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ＃７３８−０１４７）の表面に、４℃で一晩コーティングした。洗浄後、Ｔ細胞を添加した（１００，０００細胞／ウェル）。二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体を連続希釈でウェルに添加し、同じモル濃度で、１）ＧＩＴＲ  ｍＡｂ、市販の単一特異性ＧＩＴＲ抗体（ＤＴ５Ｄ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と、２）ｉｓｏ／ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４結合部分にカップリングしたアイソタイプ対照との、２つの単一特異性対照の組み合わせと比較した。ＣＴＬＡ−４をコーティングしたウェルを、ＣＴＬＡ−４でコーティングしていないウェルで比較した。３７℃の湿室内で７２時間インキュベートした後、５％のＣ０２、ＩＦＮγ、および／またはＩＬ−２レベルをＥＬＩＳＡによって上清中で測定した。
【０２８９】
結果および結論
図１０の結果は、α−ＣＤ３およびＣＴＬＡ−４でコーティングしたプレート中で培養したときにのみＴ細胞ＩＦＮγ産生の増加を誘導する一方で、単一特異性ＧＩＴＲ抗体とＣＴＬＡ−４結合部分を有するアイソタイプ対照との組み合わせでは増加を誘導しない、可溶性二重特異性抗体の用量依存的アゴニスト効果を示す。インビトロアッセイは、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の両方が腫瘍微小環境において比較的過剰発現している状況の実験モデルを表す。したがって、結果は、二重特異性抗体が、単一特異性抗体との比較において、高レベルの活性化Ｔ細胞またはＴｒｅｇを有する環境、例えば腫瘍微小環境に存在するＣＴＬＡ−４に依存する増大したアゴニスト効果を有することを示す。さらに、図１１に示されるように、野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３変異型のアゴニスト効果に差異は見られなかった。
【０２９０】
実施例１１−ＦｃγＲＩＩＩａ架橋におけるＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のアゴニスト機能
多くの免疫調節抗体の有効性には、ＦｃγＲの関与は重要である。この実施例では、二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体のアゴニスト活性を、ＦｃγＲＩＩＩａ架橋の存在下で調べた。アフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のＦｃγＲＩＩＩａへの結合の向上に起因して、野生型ＩｇＧ１と比較してこの変異型の活性化の増大が予想される。
【０２９１】
材料および方法
ＧＩＴＲを安定的に発現するジャーカット細胞および応答要素の下流にルシフェラーゼを含有する二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体のアゴニスト機能を、ＧＩＴＲ活性化アッセイ（ＧＩＴＲ  Ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃ＣＳ１８４００６）で試験した。試験抗体によって誘導された活性化は、産生されたルシフェラーゼを通じて定量化し、発光として測定した。ＧＩＴＲ活性化の誘導は、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）を安定的に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞（１００，０００細胞／ウェル）の不在下または存在下で、連続希釈したＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体およびアイソタイプ対照に対する応答で決定した。６時間のインキュベーション期間の後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、発光を測定した。
【０２９２】
結果および結論
図１２Ａに示されるように、野生型およびアフコシル化２３７２／２３７３抗体では同様の活性化が見られる。しかしながら、ＦｃγＲＩＩＩａ架橋の存在下では、ＧＩＴＲ活性化は、アフコシル化二重特異性抗体でより高い（図１２Ｂ）。
【０２９３】
実施例１２−ＡＤＣＣレポーターアッセイにおける、ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の標的細胞枯渇を誘導する能力
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の１つの作用機序は、標的発現細胞のＡＤＣＣを誘導することである。腫瘍環境において、これらはＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の両方を高度に発現するＴｒｅｇを構成する。この環境的因子を模倣するために、高レベルのＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４（ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｈｉ細胞）ならびに高レベルのＧＩＴＲおよび低レベルのＣＴＬＡ−４（ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｌｏ細胞）を安定に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞−を生成した。野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体が標的発現細胞のＡＤＣＣを誘導する能力を、ＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して試験した。アフコシル化抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対してより高い親和性を有するので、このフォーマットの向上したＡＤＣＣが予想される。
【０２９４】
材料および方法
ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）受容体を安定的に発現するジャーカットエフェクター細胞およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答要素を含有する、Ｐｒｏｍｅｇａからのレポーターに基づくシステム（ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット、＃Ｇ７０１０）を使用した。試験抗体によって誘導されたエフェクター細胞の活性化は、産生されたルシフェラーゼを通じて定量化し、発光として測定した。標的細胞としてＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｈｉおよびＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｌｏ細胞を使用して、連続希釈したＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体、モノクローナル対応物（ｉｓｏ／ＣＴＬＡ−４＋αＧＩＴＲ  ｍＡｂ）およびアイソタイプ対照の混合物に応答するＡＤＣＣの誘導を決定した。エフェクター：標的細胞比は５：１であった。６時間のインキュベーション期間の後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、発光を測定した。
【０２９５】
結果および結論
図１３に示されるように、標的細胞としてＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｌｏ細胞を使用して、等しいモル濃度の２つのモノクローナル対応物の組み合わせと比較して、ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の優れた効果が見られる。アイソタイプ対照では効果は見られなかった。さらに、ＡＤＣＣのモデルとして優れたＦｃγＲＩＩＩａの活性化は、標的細胞としてＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｌｏ細胞（図１４Ａ）およびＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｈｉ細胞（図１４Ｂ）の両方を使用したアフコシル化二重特異性抗体で見られた。
【０２９６】
実施例１３−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、標的発現細胞のＰＢＭＣ媒介溶解を誘導する能力
材料および方法
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体が標的発現細胞の枯渇を誘導する能力を決定するために、エフェクター細胞として初代ＰＢＭＣによって媒介されるＡＤＣＣのレベルを調べた。高レベルのＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を安定的に発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＧＩＴＲｈｉ−ＣＴＬＡ４ｈｉ細胞）を標的細胞として使用した。細胞溶解を評価するためにＬＤＨ細胞傷害アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃８８９５３）を使用した。ＰＢＭＣを健康なドナーからの白血球フィルターから精製した。エフェクター細胞および標的細胞を、連続希釈したＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体またはアイソタイプ対照で、５０：１のエフェクター：標的細胞比で４時間インキュベートした。その後、上清中のＬＤＨのレベルを測定した。
【０２９７】
結果および結論
図１５に示されるように、野生型ＩｇＧ１変異型を超えるアフコシル化二重特異性抗体で、標的発現細胞の優れた枯渇が見られた。
【０２９８】
実施例１４−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、主なＴｒｅｇを枯渇させる能力
標的細胞としてＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を発現するＴｒｅｇを用いたＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して、ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を評価した。
【０２９９】
材料および方法
ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）受容体を安定的に発現するエフェクター細胞を含有するＡＤＣＣレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７０１０）を使用した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏｗＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１８０６３）を使用したネガティブ選択によって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇを単離し、標的細胞として使用した。ＴｒｅｇをＡＤＣＣレポーターアッセイにそのままで使用する、またはヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、＃１１１３１Ｄ）の存在下のいずれかで４８時間活性化した後に使用して、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の発現を上方制御した。ＡＤＣＣの誘導は、連続希釈したＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体への応答で評価した。エフェクター細胞および標的細胞を、５：１の比で６時間または１８時間の間培養した。培養の前後のＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【０３００】
結果および結論
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、そのままのＴｒｅｇではＡＤＣＣを媒介しなかった（図１６Ａ）。しかしながら、αＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで４８時間活性化した後、ＡＤＣＣを誘導した。誘導は、野生型ＩｇＧ１フォーマットと比較して、アフコシル化変異型で著しく高かった（図１６Ｂ）。結果は、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の発現レベルと相関した。そのままのＰＢＭＣおよびＴｒｅｇは、低レベルのＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を発現したのに対し、そのレベルはインビトロ活性化後に明らかに上方制御された（図１６Ｃ）。
【０３０１】
実施例１５−ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の、サイトカイン放出を誘導する能力
サイトカイン放出症候群は、抗体を用いた癌免疫療法で観察されてきた生命を脅かす可能性のある毒性である。ここで、全血中でサイトカイン放出を誘導する能力について、野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ二重特異性抗体と、ＰＢＭＣに基づいたサイトカイン放出アッセイとを比較した。
【０３０２】
材料および方法
野生型およびアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ二重特異性抗体２３７２／２３７３がサイトカイン放出を誘導する能力を、ＫＷＳ  Ｂｉｏｔｅｓｔ（Ｂｒｉｓｔｏｌ、英国）で全血およびＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）で試験した。アレムツズマブ、ムロモナブ、およびアンセル抗ＣＤ２８（ＡＮＣ２８．１）を陽性対照として、非特異性ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、およびＩｇＧ２ａを陰性対照として含んだ。全ての抗体を、０．１、１、および１０μｇ／ウェルで試験した。
【０３０３】
全血を４人の健康なドナーから採取した。試験抗体および対照を、二通り血液に添加した。４８時間培養の後にサイトカイン産生を評価した。３人の健康なドナーから収集した全血試料からＰＢＭＣを分離した。試験抗体および対照は、ＰＢＭＣを添加する前にウェルに固定化した。コーティングされていないウェルは、陰性対照として作用し、各条件は二通り試験した。７２時間の培養期間後に、サイトカイン産生を評価した。両方のアッセイについて、炎症誘発パネル１（ヒト）を、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを使用して培養上清中の、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、およびＴＮＦαの定量的決定に使用した。
【０３０４】
各サイトカインについて異なる治療群間の勾配を比較するために、線形回帰、続いてテューキーの事後検定を用いた一元配置分散分析を使用してデータ分析を行った。線形回帰分析では、一元配置分散分析を実行することを可能にしなかったサイトカインのうちのいくつかに対して、０に等しい勾配を得た。全血アッセイおよび湿潤コートアッセイでは、二元配置分散分析、続いてテューキーの事後検定を使用して、各サイトカインの異なる濃度での治療効果を比較した。
【０３０５】
結果および結論
試験した全てのドナーでは、刺激されていない細胞は、両方のＣＲＡフォーマットにおいて予想レベルのバックグラウンドサイトカイン放出を示した。陽性対照抗体は、各サイトカイン放出アッセイフォーマットで予想されたレベルで、強いサイトカイン応答をもたらした。固定化ＣＲＡフォーマットと比較して、全血ＣＲＡは、典型的にはより高いドナー変動性をもたらす。
【０３０６】
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体はいずれも、いずれのアッセイでもＩｇＧ１アイソタイプコントロールによって誘導されたレベルを上回っては、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＴＮＦα、およびＩＦＮγを誘導しなかった。両方のアッセイにおいて抗体の不在下で高レベルのＩＬ−８が誘導されたが、これはこのサイトカインについて予想外のことではない。陽性対照培養物におけるＩＬ−８レベルのわずかな上昇は、刺激がＩＬ−８産生レベルをバックグラウンドを上回って上昇させることができたことを示唆する。
【０３０７】
両方のアッセイにおいて、野生型もアフコシル化ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体も、ＩｇＧ１アイソタイプ対照によって誘導されるレベルを上回るサイトカイン分泌を誘導しなかった。
【０３０８】
実施例１６−マウス代替二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体のアゴニスト機能
インビボモデルでの二重特異性抗体を研究するために、野生型（２７７６／２７７７）およびアフコシル化変異型（２７７６／２７７７ＡＦ）のヒトＩｇＧ１フォーマットを使用して、マウスＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４を標的とする代替二重特異性抗体を生成した。代替二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体がマウスＴ細胞を活性化する能力を評価するために、脾臓細胞アッセイを利用して、ＩＦＮ−γ産生の形式でＴ細胞活性化を決定した。両方の二重特異性変異型はＴ細胞を活性化することができ、予想通り、野生型とアフコシル化変異型との間に活性化レベルの差異は観察されなかった。
【０３０９】
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ６マウスの脾臓から単離したマウスＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｐａｎ−Ｔ単離キットＩＩ）を、αＣＤ３（ＢＤ、０．８μｇ／ｍＬ）およびＣＴＬＡ−４（Ｏｒｅｎｃｉａ、５μｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェルプレートに添加した。二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体を連続希釈で添加し、アイソタイプまたはアイソタイプ／ＣＴＬＡ−４対照と比較した。４８時間後に、Ｔ細胞活性化をＩＦＮ−γ放出の形式でＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３１０】
結果および結論
代替二重特異性抗体のアゴニスト効果を、脾臓細胞アッセイで調べた。野生型およびアフコシル化変異型の両方が、アゴニストＴ細胞活性化および用量依存的ＩＦＮ−γ放出の誘導を実証した（図１７）。このＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ−４コーティングのないウェル、またはアイソタイプ対照を含有するウェルには見られなかった。予想通り、野生型とアフコシル化２７７６／２７７７変異型との間には、アゴニスト効果に差異は見られなかった。
【０３１１】
実施例１７−レポーターアッセイにおける、マウス代替ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体のＡＤＣＣを誘導する能力
腫瘍環境において、Ｔｒｅｇは、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４の両方を高度に発現する。ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、特に腫瘍環境において、標的発現細胞のＡＤＣＣを誘導すると予想される。野生型およびアフコシル化変異型としてのマウス二重特異性代替物がＡＤＣＣを誘導する能力を、マウスＦｃγＲＩＶに対して特異的なＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して調べた。二重特異性抗体の変異型の両方は、レポーター細胞の活性化を実証した。しかしながら、アフコシル化抗体は、野生型抗体よりもマウスＦｃγＲＩＶに対して高い親和性を有するので、アフコシル化変異型はＡＤＣＣ誘導の向上を実証した。
【０３１２】
材料および方法
ｍＦｃγＲＩＶ受容体については、レポーターに基づくシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット）を使用して、ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体に対する応答で、またはｍＧＩＴＲでコーティングしたウェルを使用したアイソタイプ対照に対する応答で、ＡＤＣＣを決定した。エフェクター細胞を一定濃度で添加し、ＡＤＣＣを６時間誘導した。
【０３１３】
結果および結論
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性代替抗体の野生型およびアフコシル化変異型がＡＤＣＣを誘導する能力を、ＡＤＣＣレポーターアッセイを使用して調べた。両方の変異型は、ＡＤＣＣ誘導の指標として機能するマウス特異性ＦｃγＲＩＶレポーター細胞を活性化することができた（図１８）。野生型抗体よりもマウスＦｃγＲＩＶにより高い親和性を有するアフコシル化抗体と一致して、アフコシル化二重特異性抗体変異型で、野生型を超える優れたＡＤＣＣ誘導が検出された。これらの知見は、マウスとヒトがそれらのＦｃ受容体機能において異なるという事実にもかかわらず、ヒトと比較したマウスの組織に関連する模倣を実証し、ＡＤＣＣ効果および作用機序を研究するためのモデルを提供する。
【０３１４】
実施例１８−ＣＴ２６大腸癌腫モデルにおけるマウス代替ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の抗腫瘍有効性
代替二重特異性抗体の抗腫瘍効果を、ＢａｌｂＣマウスを使用してＣＴ２６大腸癌腫モデルに対して調べた。野生型およびアフコシル化抗体変異型の両方は、腫瘍体積の抑制および生存期間の延長という形式で統計的に顕著な抗腫瘍有効性を示した。
【０３１５】
材料および方法
Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）からの週齢７〜８の雌のＢａｌｂＣマウスを実験に使用した。全ての実験はマルメ／ルンド倫理委員会によって承認された。
【０３１６】
対数期に増殖しているＣＴ２６大腸癌腫を０日目に皮下注射し（０．１×１０６細胞）、マウスを７、１０、および１３日目に２７７６／２７７７または２７７６／２７７７ＡＦ（２００μｇ）を用いて腹腔内で治療した。ラット抗マウスＧＩＴＲ抗体ＤＴＡ−１（モル当量、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、米国）を陽性対照として使用した。腫瘍をキャリパーで週に３回測定し、式（（幅／２）×（長さ／２）×（高さ／２）×π×（４／３））を使用して腫瘍体積を計算した。腫瘍増殖についてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラム、マン−ホイットニーのノンパラメトリック２−テール検定、および生存期間についてカプラン−マイヤー生存期間、ログ−ランク（マンテル−コックス）を使用して統計分析を行った。
【０３１７】
結果および結論
ＣＴ２６大腸癌腫モデルを使用して、二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４代替２７７６／２７７７の抗腫瘍有効性をＢａｌｂＣマウスで調べた。野生型変異型２７７６／２７７７は、腫瘍体積の抑制の形式でビヒクルと比較して、統計的に顕著な抗腫瘍有効性を実証した（ｐ＝０．０００２）（図１９Ａ）。この抗腫瘍有効性は、陽性対照抗体ＤＴＡ−１よりも優れていた。
【０３１８】
同様に、アフコシル化変異型２７７６／２７７７ＡＦを用いた治療は、ビヒクル治療と比較してマウスの生存期間を顕著に延長し（ｐ＝０．００２９）、治療によってマウスのおよそ３０％の定着した腫瘍が治癒した（図１９Ｂ）。
【０３１９】
実施例１９−ＭＣ３８大腸癌腫モデルにおけるマウス代替ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の抗腫瘍有効性
代替二重特異性抗体の抗腫瘍効果を、Ｃ５７ＢＬ６マウスを使用してＭＣ３８大腸癌腫モデルに対して調べた。野生型およびアフコシル化二重特異性抗体の両方は、腫瘍体積の抑制および生存期間の延長の形式で、統計的に顕著な抗腫瘍有効性を実証した。
【０３２０】
材料および方法
Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）からの週齢７〜８の雌のＣ５７ＢＬ６マウスを実験に使用した。全ての実験はマルメ／ルンド倫理委員会によって承認された。
【０３２１】
対数期に増殖しているＭＣ３８大腸癌腫を０日目に皮下注射し（１×１０６細胞）、腫瘍が定着した後７、１０、および１３日目に、マウスを２７７６／２７７７または２７７６／２７７７ＡＦ（２００μｇ）を用いて腹腔内で治療した。腫瘍をキャリパーで週に３回測定し、式（（幅／２）×（長さ／２）×（高さ／２）×π×（４／３））を使用して腫瘍体積を計算した。腫瘍増殖についてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラム、マン−ホイットニーのノンパラメトリック２−テール検定、および生存期間についてカプラン−マイヤー生存期間、ログ−ランク（マンテル−コックス）を使用して統計分析を行った。
【０３２２】
結果および結論
ＭＣ３８大腸癌腫モデルを使用して、野生型またはアフコシル化変異型としての二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４代替２７７６／２７７７の抗腫瘍有効性をＣ５７ＢＬ６マウスで調べた。２７７６／２７７７は、腫瘍体積の抑制の形式でビヒクルと比較して、統計的に顕著な抗腫瘍有効性を実証した（ｐ＝０．０００６）（図２０Ａ）。同様に、アフコシル化２７７６／２７７７ＡＦ治療は、マウスの生存期間を顕著に延長し（ｐ＝０．００１）、およそ３０％のマウスが完全応答した（図２０Ｂ）。
【０３２３】
実施例２０−ＭＣ３８大腸癌腫モデルにおけるマウス代替ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体で治療後の、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の形式での抗腫瘍有効性
腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の形式での代替二重特異性抗体の抗腫瘍効果を、Ｃ５７ＢＬ６マウスを使用してＭＣ３８大腸癌腫モデルに対して調べた。野生型２７７６／２７７７およびアフコシル化２７７６／２７７７ＡＦ二重特異性抗体は両方とも、制御性Ｔ細胞の枯渇を実証し、予想通り、アフコシル化変異型は野生型変異型を超える優れた枯渇を実証した。
【０３２４】
材料および方法
Ｊａｎｖｉｅｒ（フランス）からの週齢７〜８の雌のＣ５７ＢＬ６マウスを実験に使用した。全ての実験はマルメ／ルンド倫理委員会によって承認された。
【０３２５】
対数期に増殖しているＭＣ３８大腸癌腫を０日目に皮下注射し（１×１０６細胞）、マウスを１０、１３、および１６日目に２７７６／２７７７または２７７６／２７７７ＡＦ（２００μｇ）を用いて腹腔内で治療した。最後の注射の２４時間後、腫瘍および脾臓を採取し、生存マーカーならびに系統マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＭＨＣＩＩ、およびＮＫ１．１）、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３を染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。制御性Ｔ細胞は、生細胞／単一細胞／ＣＤ４５／ＣＤ３／ＣＤ４／Ｆｏｘｐ３／ＣＤ２５としてゲートした。
【０３２６】
結果
二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体の薬力学的効果を、ＭＣ３８大腸癌腫モデルを使用してＣ５７ＢＬ６マウスで調べた。図２１の結果は、両方の二重特異性抗体変異型による腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇を実証しているが、予想通り、アフコシル化変異型は野生型よりも優れた活性を実証した（図２１Ａ）。この効果は、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比にさらに見られた（図２１Ｂ）。ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の変化は脾臓には見ることができず、二重特異性抗体の効果が主に腫瘍の微小環境に指向されていることを示している（図２１Ｃ）。
【０３２７】
実施例２１−ヒト骨髄腫モデルにおけるヒトＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の抗腫瘍有効性
野生型およびアフコシル化変異型としてのヒト二重特異性ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の抗腫瘍効果を、ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫の皮下腫瘍モデルにｈＰＢＭＣを投与することによってヒト化した免疫不全マウスを使用して調べた。両方の二重特異性変異型（２３７２／２３７３および２３７２／２３７３ＡＦ）は、エフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣの有無にかかわらず統計的に顕著な抗腫瘍効果を実証し、二重特異性抗体が直接的および間接的の両方の抗腫瘍有効性を有する可能性があることを示している。加えて、アフコシル化抗体は、このモデルにおいて野生型変異型を超える優れた抗腫瘍有効性を実証した。
【０３２８】
材料および方法
Ｔａｃｏｎｉｃ（デンマーク）からの週齢７〜８の雌のＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスを実験に使用した。全ての実験はマルメ／ルンド倫理委員会によって承認された。
【０３２９】
白血球フィルターをルンド大学病院から入手し、ｈＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ遠心分離機によって単離した。対数期に増殖しているＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫を０日目に皮下注射し（１０×１０６細胞）、５日目にｈＰＢＭＣ（５×１０６細胞）を腹腔内注射し、５、１１、および１８日目に抗体治療（およそ５００ｎｍｏｌ）を行った。腫瘍体積をキャリパーで週に３回測定し、式（（幅／２）×（長さ／２）×（高さ／２）×π×（４／３））を使用して腫瘍体積を計算した。腫瘍増殖について、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラム、マン−ホイットニーのノンパラメトリック２−テール検定を使用して統計分析を行った。
【０３３０】
結果
ＧＩＴＲ／ＣＴＬＡ−４抗体の抗腫瘍有効性を、ＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫モデルを使用してｈＰＢＭＣヒト化マウスモデルで調べた。図２２および表５の結果は、二重特異性抗体の野生型およびアフコシル化変異型の両方が、ｈＰＢＭＣの存在下（図２２Ａ）およびｈＰＢＭＣの不在下（図２２Ｂ）で、腫瘍増殖阻害の形式で統計的に顕著な抗腫瘍有効性を実証したことを示す。アフコシル化変異型（２３７２／２３７３ＡＦ）は、腫瘍体積抑制の形式で野生型変異型（２３７２／２３７３）を超える統計的に顕著な優位性を実証した。ビヒクルと比較した腫瘍体積抑制の百分率は、表５に見出されることができる。
【表５】
2019535282.tif 000062
【０３３１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019535282.tif 000069
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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