(57)【要約】  抗ＣＤ７３抗体を、免疫−腫瘍学薬剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用する、腫瘍（例えば、進行固形腫瘍）の臨床治療のための方法が、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療する方法であって、癌を有する対象に、治療上有効な量のＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含み、前記対象が、ＣＤ７３を発現する腫瘍を有する、方法。
【請求項２】
対象におけるＣＤ７３を発現する腫瘍を治療する方法であって、前記対象に、治療上有効な量のＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項３】
ＣＤ７３が、腫瘍細胞の膜に発現される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍が、前記免疫−腫瘍学薬剤の標的を発現する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌または腫瘍が、肺腺癌、甲状腺癌腫、膵臓腺癌、子宮内膜癌腫、結腸腺癌、肺扁平上皮細胞癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫および卵巣腺癌からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、前記対象の腫瘍におけるＣＤ７３のレベルを判定することを含み、前記腫瘍における高いレベルのＣＤ７３は、前記対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項７】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよびＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、前記対象において、腫瘍におけるＣＤ７３のレベルおよび前記腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＰＤ−１のレベルを判定することを含み、前記腫瘍における高いレベルのＣＤ７３およびＴＩＬにおける高いレベルのＰＤ−１は、前記対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび抗ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項８】
ＴＩＬにおけるＰＤ−１のレベルが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１のレベルを判定することによって測定され、これらの細胞型のうちの１つまたは複数におけるＰＤ−１のレベルが高い場合、前記対象は、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび抗ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ７３アンタゴニストが、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫−腫瘍学薬剤が、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストおよびＬＡＧ−３アンタゴニストからなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫−腫瘍学薬剤が、抗体またはその抗原結合部分である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫−腫瘍学薬剤が、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、配列番号３８３〜３８５に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ、配列番号３８６〜３８８に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、配列番号３８１および３８２に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分が、以下の特性：
（１）例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析によって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、ヒトＣＤ７３、例えば、ビーズ結合型（可溶性）ヒト二量体ヒトＣＤ７３アイソフォーム１および２と結合すること、
（２）例えば、１ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１ｎＭ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＣＤ７３と結合すること、
（３）例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３と結合すること、
（４）例えば、１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（５）例えば、１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（６）１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、Ｃａｌｕ６細胞における内因性（細胞性）ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（７）インビボでヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（８）例えば、１時間未満、３０分未満もしくは１０分未満のＴ１／２および／または少なくとも７０％、８０％もしくは９０％のＹｍａｘでの細胞への内部移行、例えば、抗体媒介性（または依存性）ＣＤ７３内部移行、
（９）ヒトＣＤ７３上のコンホメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）および／またはＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）のすべてまたは一部分を含む、アミノ酸配列（配列番号１）内の不連続なエピトープと結合すること、
（１０）ヒトＣＤ７３との結合について、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、および
（１１）Ｘ線結晶学によって判定される場合、ＣＤ７３．４と類似のパターンで、ヒトＣＤ７３と相互作用すること
のうちの一種または複数を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、
（ａ）配列番号４および８、
（ｂ）配列番号４および１２、
（ｃ）配列番号１６および２０、
（ｄ）配列番号１６および２４、
（ｅ）配列番号１６および２８、
（ｆ）配列番号３２および３６、
（ｇ）配列番号４０および４４、
（ｈ）配列番号４０および４８、
（ｉ）配列番号５２および５６、
（ｊ）配列番号６０および６４、
（ｋ）配列番号６８および７２、
（ｌ）配列番号６８および７６、
（ｍ）配列番号８０および８４、
（ｎ）配列番号８８および９２、
（ｏ）配列番号１３５および８、ならびに
（ｐ）配列番号１３５および１２
からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％同一である、重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗ＣＤ７３抗体が、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＣＤ７３抗体が、配列番号１３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分が、
（ａ）それぞれ、配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９、１０および１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｃ）それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２１、２２および２３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｄ）それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２５、２６および２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｅ）それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２９、３０および３１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｆ）それぞれ、配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号３７、３８および３９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｇ）それぞれ、配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号４５、４６および４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｈ）それぞれ、配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｉ）それぞれ、配列番号５３、５４および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号５７、５８および５９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｊ）それぞれ、配列番号６１、６２および６３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｋ）それぞれ、配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号７３、７４および７５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｌ）それぞれ、配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号７７、７８および７９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、
（ｍ）それぞれ、配列番号８１、８２および８３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号８５、８６および８７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または
（ｎ）それぞれ、配列番号８９、９０および９１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９３、９４および９５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９、１０および１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＣＤ７３抗体が、それぞれ、配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、
（ａ）それぞれ、配列番号１００および１０１、
（ｂ）それぞれ、配列番号１００および１０２、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０３および１０４、
（ｄ）それぞれ、配列番号１０３および１０５、
（ｅ）それぞれ、配列番号１０３および１０６、
（ｆ）それぞれ、配列番号１０７および１０８、
（ｇ）それぞれ、配列番号１０９および１１０、
（ｈ）それぞれ、配列番号１０９および１１１、
（ｉ）それぞれ、配列番号１１２および１１３、
（ｊ）それぞれ、配列番号１１４および１１５、
（ｋ）それぞれ、配列番号１１６および１１７、
（ｌ）それぞれ、配列番号１１６および１１８、
（ｍ）それぞれ、配列番号１１９および１２０、
（ｎ）それぞれ、配列番号１２１および１２２、
（ｏ）それぞれ、配列番号１３３および１０１、ならびに
（ｐ）それぞれ、配列番号１３３および１０２
からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＣＤ７３抗体が、配列番号１３３または１８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＣＤ７３抗体が、配列番号１３３または１８９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ＣＤ７３抗体が、エフェクターレスＦｃを含む、請求項９および１５から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗ＣＤ７３抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体からなる群から選択される、請求項９および１５から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＣＤ７３抗体が、Ｎ末端からＣ末端の順に、ヒトＣＨ１ドメイン、ヒトヒンジドメイン、ヒトＣＨ２ドメインおよびヒトＣＨ３ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む、請求項９および１５から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記修飾された定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなるアイソタイプ群から選択される異なるアイソタイプの少なくとも２つのドメインを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾された定常領域が、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含み、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジドメインのうちの少なくとも１つが、ＩｇＧ２アイソタイプではない、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインが、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾された定常領域が、例えば、システイン結合における不均一性を低減させる、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインを含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒンジドメインが、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号１３６）と比べて、Ｃ２１９にアミノ酸置換を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒンジドメインが、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾された定常領域が、エフェクター機能を低減または排除する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＨ２ドメインが、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（配列番号１３７）と比べて、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＨ２ドメインが、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記修飾された定常領域が、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む、請求項２７から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＨ３ドメインが、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項９および１５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＤＲ領域中のメチオニン残基が、酸化を受けないアミノ酸残基と置換される、請求項９および１５から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ヒト患者における固形腫瘍を治療する方法であって、前記患者に、
（ａ）ＣＤ７３アンタゴニスト、および
（ｂ）免疫−腫瘍学薬剤
を、それぞれの有効量で投与することを含み、
前記抗ＣＤ７３抗体および前記免疫−腫瘍学薬剤が、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回もしくは４週間に１回投与されるか、または前記抗ＣＤ７３抗体が、１週間に１回投与され、前記免疫−腫瘍学薬剤が、２週間に１回、３週間に１回もしくは４週間に１回投与される、方法。
【請求項４２】
前記ＣＤ７３アンタゴニストが、請求項１５から４０のいずれか一項に記載のＣＤ７３抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗ＣＤ７３抗体および前記免疫−腫瘍学薬剤が、同じ日に投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、静脈内投与用に製剤化される、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、別個に製剤化される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、一緒に製剤化される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗ＣＤ７３抗体が、前記免疫−腫瘍学薬剤の投与の前に投与される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗ＣＤ７３抗体が、前記免疫−腫瘍学薬剤の投与の後に投与される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、同時に投与される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫−腫瘍学薬剤が、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストおよびＬＡＧ−３アンタゴニストからなる群から選択される、請求項４１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫−腫瘍学薬剤が、ＰＤ−１アンタゴニストである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＤ−１アンタゴニストが、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗ＰＤ−１抗体が、配列番号３８３に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３８４に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３８５に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号３８６に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号３８７に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号３８８に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗ＰＤ−１抗体が、それぞれ、配列番号３８１および３８２に記載される配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療が、腫瘍サイズの低減、転移病変数の経時的な低減、完全な応答、部分的な応答および疾患の安定から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす、請求項４１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ヒト患者における固形腫瘍を治療するためのキットであって、
（ａ）配列番号１３５に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号８または１２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＣＤ７３抗体、
（ｂ）免疫−腫瘍学薬剤であって、配列番号３８１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３８２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＰＤ−１抗体である、ある用量の免疫−腫瘍学薬剤、ならびに
（ｃ）請求項４１から５５に記載の方法において前記抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤を使用するための説明書
を含む、キット。
【請求項５７】
対象の血液細胞において抗ヒトＣＤ７３抗体によるヒトＣＤ７３受容体占有率を判定するための方法であって、対象から全血サンプルを取得すること、および抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体ならびにＴ細胞および／またはＢ細胞のマーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含む、方法。
【請求項５８】
フローサイトメトリーが、直接的な検出アッセイである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｔ細胞および／またはＢ細胞のマーカーが、ＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーまたはＢ１９＋Ｂ細胞のマーカーである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記フローサイトメトリーが、前記対象から前記血液サンプルを取得してから４８時間以内に行われる、請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体が、ＩＳ１１１２Ｅ．Ｅ．２３．３０である、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
対象から全血サンプルを取得すること、および前記抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーおよび／またはＢ１９＋Ｂ細胞のマーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含み、前記フローサイトメトリーが、前記対象から前記血液サンプルを取得してから４８時間以内に行われる、請求項５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
ヒトＣＤ７３と結合し、修飾された重鎖領域を含む、抗体。
【請求項６４】
前記修飾された重鎖領域が、配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４に記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含み、前記変異体が、それぞれ、配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４におけるアミノ酸ではない、それぞれの野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４配列のものとは異なる、１つまたは複数のアミノ酸の点で異なる、請求項６３に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月９日に出願された米国仮出願第６２／４３１９８７号、２０１６年７月１８日に出願された同第６２／３６３７０３号、２０１６年５月２５日に出願された同第６２／３４１２２０号、２０１６年３月８日に出願された同第６２／３０５３７８号および２０１６年３月４日に出願された同第６２／３０３９８５号に対する優先権を主張する。本出願を通じて引用されるいずれの特許、特許出願および参考文献の内容も、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
エクト−５’−ヌクレオチダーゼ（エクト−５’ＮＴ、ＥＣ  ３．１．３．５）としても知られる分化抗原群７３（Cluster of Differentiation 73：ＣＤ７３）は、ほとんどの組織において見出されるが、特に、内皮細胞および造血細胞のサブセットにおいて発現される、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型細胞表面酵素である（Resta et al., Immunol Rev 1998;161:95-109およびColgan et al., Prinergic Signal 2006;2:351-60）。ＣＤ７３は、細胞外ヌクレオシド一リン酸を、ヌクレオシド、例えばアデノシンにする脱リン酸化を触媒することが公知である。アデノシンは、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３を含む、いくつかの受容体を通じてその生物学的効果を媒介する、広く研究されているシグナル伝達分子である。アデノシンは、多数の癌の増殖および遊走を制御し、抗腫瘍Ｔ細胞の制御を通じた免疫抑制効果を有することが示されている（Zhang et al., Cancer Res 2010;70:6407-11）。
【０００３】
ＣＤ７３は、結腸、肺、膵臓、卵巣、膀胱、白血病、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、甲状腺、食道、前立腺および乳房の癌を含む、多数の異なる癌において発現することが報告されている（Jin et al., Cancer Res 2010;70:2245-55およびStagg et al., PNAS 2010;107:1547-52）。さらに、癌におけるＣＤ７３発現は、増大した増殖、遊走、血管新生、侵襲性、転移および患者生存期間の短さと関連付けられている。ＣＤ７３活性は、甲状腺乳頭癌における診断マーカーとしても提案されている。ＣＤ７３は、腫瘍細胞における細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を制御することが示されているが、ＣＤ７３の発現および活性は、Ｔ細胞応答の低減とも関連付けられており、薬物耐性と関係している（Spychala et al., Pharmacol Ther 3000;87:161-73）。したがって、ＣＤ７３は、癌の進行を直接的および間接的の両方で制御できることから、新規な治療標的としてのＣＤ７３の可能性が強調される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌などの疾患を標的とする改善された戦略に対する継続的な必要性を考慮すると、複数の機序を通じて腫瘍の進行を制御する方法、ならびにＣＤ７３活性を制御するための方法が、大いに望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において提供される方法は、概して、癌を有する患者、例えば、ＣＤ７３を発現する固形腫瘍（例えば、進行固形腫瘍）を有する患者の治療に関する。したがって、癌を治療する方法であって、癌を有する対象に、治療上有効な量のＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含み、対象が、ＣＤ７３を発現する腫瘍を有する、方法が、本明細書において提供される。
【０００６】
対象におけるＣＤ７３を発現する腫瘍を治療する方法であって、対象に、治療上有効な量のＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、抗体）を投与することを含む、方法もまた、本明細書において提供される。
【０００７】
特定の実施形態では、治療されるべき対象は、腫瘍細胞の膜にＣＤ７３を発現する腫瘍を有する。特定の実施形態では、腫瘍は、免疫学薬剤の標的、例えば、ＰＤ−１を発現する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。特定の実施形態では、治療されるべき対象は、腫瘍細胞にＣＤ７３を発現し、ＴＩＬに免疫−腫瘍学薬剤の標的、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を発現する、腫瘍を有する。特定の実施形態では、癌または腫瘍は、肺腺癌、甲状腺癌腫、膵臓腺癌、子宮内膜癌腫、結腸腺癌、肺扁平上皮細胞癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫および卵巣腺癌からなる群から選択される。
【０００８】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象の腫瘍におけるＣＤ７３のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるＣＤ７３の存在は、対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。
【０００９】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象において、腫瘍におけるＣＤ７３のレベルおよび腫瘍のＴＩＬにおける免疫−腫瘍学薬剤（例えば、チェックポイント阻害剤または共刺激タンパク質）の標的のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるＣＤ７３の存在およびＴＩＬにおける免疫−腫瘍学薬剤の標的の存在は、対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。
【００１０】
特定の実施形態では、ＴＩＬにおける免疫腫瘍学的な標的のレベルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞における免疫−腫瘍学的な標的のレベルを判定することによって測定され、免疫−腫瘍学的な標的の発現が、これらの細胞型のうちの１つまたは複数において検出された場合、対象は、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答する可能性が高い。
【００１１】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよびＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象において、腫瘍におけるＣＤ７３のレベルおよび腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＰＤ−１のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるＣＤ７３の存在およびＴＩＬにおけるＰＤ−１の存在は、対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび抗ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。
【００１２】
特定の実施形態では、ＴＩＬにおけるＰＤ−１のレベルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１のレベルを判定することによって測定され、ＰＤ−１発現が、これらの細胞型のうちの１つまたは複数において検出された場合、対象は、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび抗ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い。
【００１３】
対象の血液細胞において抗ヒトＣＤ７３抗体によるヒトＣＤ７３受容体占有率を判定するための方法であって、対象から全血サンプルを取得すること、および抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体ならびにＴ細胞および／またはＢ細胞のマーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含む、方法もまた、本明細書において提供される。特定の実施形態では、フローサイトメトリーは、直接的な検出アッセイである。特定の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＢ細胞のマーカーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーまたはＢ１９＋Ｂ細胞のマーカーである。特定の実施形態では、フローサイトメトリーは、対象から血液サンプルを取得してから４８時間以内に行われる。特定の実施形態では、抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体は、ＩＳ１１１２Ｅ．Ｅ．２３．３０である。
【００１４】
特定の実施形態では、対象の血液細胞において抗ヒトＣＤ７３抗体によるヒトＣＤ７３受容体占有率を判定するための方法は、対象から全血サンプルを取得すること、および抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＢ１９＋Ｂ細胞のマーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含み、フローサイトメトリーは、対象から血液サンプルを取得してから４８時間以内に行われる。
【００１５】
抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤の組合せ投与など、癌のための併用治療が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのＣＤ７３アンタゴニストは、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＬＡＧ−３アンタゴニストまたは本明細書に記載されるその他のものからなる群から選択される。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、抗体またはその抗原結合部分、例えば、抗ＰＤ−１抗体（例えば、それぞれ、配列番号３８３〜３８５に記載される配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにそれぞれ、配列番号３８６〜３８８に記載される配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれぞれ、配列番号３８１および３８２に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗ＰＤ−１抗体）である。抗ＣＤ７３抗体とともに投与することができる例示的な抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８）である。
【００１６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性：（１）例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析によって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、ヒトＣＤ７３、例えば、ビーズ結合型ヒト二量体ヒトＣＤ７３アイソフォーム１および２と結合すること、（２）例えば、１ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１ｎＭ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＣＤ７３と結合すること、（３）例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３と結合すること、（４）例えば、１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、（５）例えば、１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３酵素活性を阻害すること、（６）１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、Ｃａｌｕ６細胞における内因性（細胞性）ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、（７）インビボ（in vivo）でヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、（８）例えば、１時間未満、３０分未満もしくは１０分未満のＴ１／２および／または少なくとも７０％、８０％もしくは９０％のＹｍａｘでの細胞への内部移行、例えば、抗体媒介性（または依存性）ＣＤ７３内部移行、（９）ヒトＣＤ７３上のコンホメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）および／またはＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）のすべてまたは一部分を含む、アミノ酸配列（配列番号１）内の不連続なエピトープと結合すること、（１０）ヒトＣＤ７３との結合について、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、および（１１）Ｘ線結晶学によって判定される場合、ＣＤ７３．４と類似のパターンで、ヒトＣＤ７３と相互作用することのうちの１種または複数を示す。
【００１７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ（ａ）配列番号４および８、（ｂ）配列番号４および１２、（ｃ）配列番号１６および２０、（ｄ）配列番号１６および２４、（ｅ）配列番号１６および２８、（ｆ）配列番号３２および３６、（ｇ）配列番号４０および４４、（ｈ）配列番号４０および４８、（ｉ）配列番号５２および５６、（ｊ）配列番号６０および６４、（ｋ）配列番号６８および７２、（ｌ）配列番号６８および７６、（ｍ）配列番号８０および８４、（ｎ）配列番号８８および９２、（ｏ）配列番号１３５および８ならびに（ｐ）配列番号１３５および１２からなる群から選択される、重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％同一である、重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、（ａ）それぞれ、配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９、１０および１１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｂ）それぞれ、配列番号５、６および７を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号１３、１４および１５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｃ）それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２１、２２および２３を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｄ）それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２５、２６および２７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｅ）それぞれ、配列番号１７、１８および１９を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号２９、３０および３１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｆ）それぞれ、配列番号３３、３４および３５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号３７、３８および３９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｇ）それぞれ、配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号４５、４６および４７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｈ）それぞれ、配列番号４１、４２および４３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号４９、５０および５１を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｉ）それぞれ、配列番号５３、５４および５５を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号５７、５８および５９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｊ）それぞれ、配列番号６１、６２および６３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号６５、６６および６７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｋ）それぞれ、配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号７３、７４および７５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｌ）それぞれ、配列番号６９、７０および７１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号７７、７８および７９を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、（ｍ）それぞれ、配列番号８１、８２および８３を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号８５、８６および８７を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列または（ｎ）それぞれ、配列番号８９、９０および９１を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにそれぞれ、配列番号９３、９４および９５を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ、（ａ）それぞれ、配列番号１００および１０１、（ｂ）それぞれ、配列番号１００および１０２、（ｃ）それぞれ、配列番号１０３および１０４、（ｄ）それぞれ、配列番号１０３および１０５、（ｅ）それぞれ、配列番号１０３および１０６、（ｆ）それぞれ、配列番号１０７および１０８、（ｇ）それぞれ、配列番号１０９および１１０、（ｈ）それぞれ、配列番号１０９および１１１、（ｉ）それぞれ、配列番号１１２および１１３、（ｊ）それぞれ、配列番号１１４および１１５、（ｋ）それぞれ、配列番号１１６および１１７、（ｌ）それぞれ、配列番号１１６および１１８、（ｍ）それぞれ、配列番号１１９および１２０、（ｎ）それぞれ、配列番号１２１および１２２、（ｏ）それぞれ、配列番号１３３および１０１ならびに（ｐ）それぞれ、配列番号１３３および１０２からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖および軽鎖配列を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、エフェクターレスＦｃを含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの変異体からなる群から選択される。
【００２１】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、ヒトＣＨ１ドメイン、ヒトヒンジドメイン、ヒトＣＨ２ドメインおよびヒトＣＨ３ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなるアイソタイプ群から選択される異なるアイソタイプの少なくとも２つのドメインを含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含み、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジドメインのうちの少なくとも１つが、ＩｇＧ２アイソタイプではない。特定の実施形態では、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、例えば、システイン結合における不均一性を低減させる、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号１３６）と比べて、Ｃ２１９またはＣ２２０にアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、エフェクター機能を低減または排除する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン（配列番号１３７）と比べて、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むか、または配列番号１２５のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、例えば、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【００２３】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲ領域中のメチオニン残基は、酸化を受けないアミノ酸残基と置換される。
【００２４】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、静脈内投与用に製剤化される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、別個に製剤化される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の投与の前に投与される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の投与の後に投与される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、同時に投与される。
【００２５】
ヒト患者における固形腫瘍を治療するためのキットであって、（ａ）配列番号１３５に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号８または１２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＣＤ７３抗体、（ｂ）免疫−腫瘍学薬剤であって、配列番号３８１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３８２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）である、ある用量の免疫−腫瘍学薬剤、ならびに（ｃ）本明細書に記載される方法において抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤を使用するための説明書を含む、キットもまた、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＤ７３．４−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２３７）およびアミノ酸配列（配列番号１３５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源（derivation）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤ７３．４−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＶＫ１）のヌクレオチド配列（配列番号１４０）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号９）、ＣＤＲ２（配列番号１０）およびＣＤＲ３（配列番号１１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＤ７３．４−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２３７）およびアミノ酸配列（配列番号１３５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源（derivation）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＤ７３．４−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）およびＣＤＲ３（配列番号１５）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、１１Ｆ１１−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１３９）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１１Ｆ１１−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４０）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号９）、ＣＤＲ２（配列番号１０）およびＣＤＲ３（配列番号１１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１１Ｆ１１−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１３９）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）およびＣＤＲ３（配列番号７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１１Ｆ１１−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）およびＣＤＲ３（配列番号１５）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、４Ｃ３−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４２）およびアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１８）およびＣＤＲ３（配列番号１９）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、４Ｃ３−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４３）およびアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２１）、ＣＤＲ２（配列番号２２）およびＣＤＲ３（配列番号２３）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、４Ｃ３−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４２）およびアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１８）およびＣＤＲ３（配列番号１９）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、４Ｃ３−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４４）およびアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２５）、ＣＤＲ２（配列番号２６）およびＣＤＲ３（配列番号２７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、４Ｃ３−３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４２）およびアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号１８）およびＣＤＲ３（配列番号１９）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、４Ｃ３−３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４５）およびアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３０）およびＣＤＲ３（配列番号３１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、４Ｄ４−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４６）およびアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３３）、ＣＤＲ２（配列番号３４）およびＣＤＲ３（配列番号３５）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、４Ｄ４−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４７）およびアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３７）、ＣＤＲ２（配列番号３８）およびＣＤＲ３（配列番号３９）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、１０Ｄ２−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４８）およびアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＣＤＲ２（配列番号４２）およびＣＤＲ３（配列番号４３）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、１０Ｄ２−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４９）およびアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４５）、ＣＤＲ２（配列番号４６）およびＣＤＲ３（配列番号４７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、１０Ｄ２−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１４８）およびアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＣＤＲ２（配列番号４２）およびＣＤＲ３（配列番号４３）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１０Ｄ２−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５０）およびアミノ酸配列（配列番号４８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４９）、ＣＤＲ２（配列番号５０）およびＣＤＲ３（配列番号５１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、１１Ａ６−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５１）およびアミノ酸配列（配列番号５２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号５３）、ＣＤＲ２（配列番号５４）およびＣＤＲ３（配列番号５５）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、１１Ａ６−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５２）およびアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号５７）、ＣＤＲ２（配列番号５８）およびＣＤＲ３（配列番号５９）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、２４Ｈ２−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５３）およびアミノ酸配列（配列番号６０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６１）、ＣＤＲ２（配列番号６２）およびＣＤＲ３（配列番号６３）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、２４Ｈ２−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５４）およびアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６５）、ＣＤＲ２（配列番号６６）およびＣＤＲ３（配列番号６７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、５Ｆ８−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５５）およびアミノ酸配列（配列番号６８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６９）、ＣＤＲ２（配列番号７０）およびＣＤＲ３（配列番号７１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、５Ｆ８−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５６）およびアミノ酸配列（配列番号７２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号７３）、ＣＤＲ２（配列番号７４）およびＣＤＲ３（配列番号７５）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、５Ｆ８−２ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５５）およびアミノ酸配列（配列番号６８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６９）、ＣＤＲ２（配列番号７０）およびＣＤＲ３（配列番号７１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、５Ｆ８−２ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５７）およびアミノ酸配列（配列番号７６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号７７）、ＣＤＲ２（配列番号７８）およびＣＤＲ３（配列番号７９）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、５Ｆ８−３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５５）およびアミノ酸配列（配列番号６８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号６９）、ＣＤＲ２（配列番号７０）およびＣＤＲ３（配列番号７１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、５Ｆ８−３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号２４２）およびアミノ酸配列（配列番号２３８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２３９）、ＣＤＲ２（配列番号２４０）およびＣＤＲ３（配列番号２４１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、６Ｅ１１−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５８）およびアミノ酸配列（配列番号８０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号８１）、ＣＤＲ２（配列番号８２）およびＣＤＲ３（配列番号８３）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、６Ｅ１１−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５９）およびアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号８５）、ＣＤＲ２（配列番号８６）およびＣＤＲ３（配列番号８７）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、７Ａ１１−１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１６０）およびアミノ酸配列（配列番号８８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号８９）、ＣＤＲ２（配列番号９０）およびＣＤＲ３（配列番号９１）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、７Ａ１１−１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１６１）およびアミノ酸配列（配列番号９２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号９３）、ＣＤＲ２（配列番号９４）およびＣＤＲ３（配列番号９５）領域を線で示し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示す。
【図１８】図１８は、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの重鎖、ならびにその可変領域ＣＤＲ１、２および３、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１８９）を示す。
【図１９】図１９は、６００、２００、６６．７、２２．２、７．４および２．５ｎＭのヒトＣＤ７３−ｈｉｓ（太線）またはカニクイザルＣＤ７３−ｈｉｓ（細線）の、２５℃で固定化されたプロテインＡ表面に捕捉したＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆとの結合のＳＰＲセンサグラムデータを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａ１および２０Ａ２は、示される重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０抗体の、ヒトＣＤ７３陽性Ｃａｌｕ６細胞（ヒト肺腺癌細胞株）との結合を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂ１および２０Ｂ２は、示される重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０抗体の、ヒトＣＤ７３陰性ＤＭＳ１１４細胞（肺小細胞癌腫細胞株）との結合を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃ１および２０Ｃ２は、示される重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０抗体の、カニクイザルＣＤ７３陽性ＣＨＯ細胞との結合を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄ１および２０Ｄ２は、示される重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０抗体の、カニクイザルＣＤ７３陰性ＣＨＯ−Ｋ１細胞との結合を示す。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、示される抗体のドナーＤ１およびＤ２に由来するＴ細胞の結合を示す。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、示される抗体のドナーＤ１およびＤ２に由来するＴ細胞の結合を示す。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、１２５−Ｉ標識化ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆのヒトＢ細胞との結合を示す。
【図２０Ｈ】図２０Ｈは、１２５−Ｉ標識化ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆのヒトＣａｌｕ−６細胞との結合を示す。
【図２０Ｉ】図２０Ｉは、１２５−Ｉ標識化ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆのＣＨＯ−カニクイザルＣＤ７３細胞との結合を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａ１および２１Ａ２は、示される重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０による、ビーズ結合型ヒトＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。すべての抗体が、ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害した。
【図２１Ｂ】図２１Ｂ１および２１Ｂ２は、示される重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０による、ビーズ結合型カニクイザルＣＤ７３酵素活性の阻害を示す。すべての抗体が、カニクイザルＣＤ７３酵素活性を阻害した。
【図２２Ａ】図２２Ａ１および２２Ａ２は、示される重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０抗体による、ヒトＣＤ７３陽性Ｃａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３酵素阻害を示す。すべての抗体が、これらの細胞においてＣＤ７３酵素活性を阻害した。
【図２２Ｂ】図２２Ｂ１および２２Ｂ２は、示される重鎖定常領域を有する１１Ｆ１１、ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０抗体による、ヒトＣＤ７３陰性ＤＭＳ−１１４細胞におけるＣＤ７３酵素阻害を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、Ｃａｌｕ−６およびＨＥＫ／Ａ２Ｒ細胞を使用したｃＡＭＰアッセイにおいて判定される、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１  Ｆ（ａｂ’）２断片による、内因性ＣＤ７３活性の阻害のＥＣ５０およびＹｍａｘの値を示す。図２２Ｃもまた、Ｃａｌｕ−６内部移行アッセイにおける、１１Ｆ１１および１１Ｆ１１  Ｆ（ａｂ’）２断片のＥＣ５０およびＹｍａｘの値を示す。図は、１１Ｆ１１  Ｆａｂ断片が、これらの２つのアッセイにおいて不活性であることを示す。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定される場合、１１Ｆ１１または４Ｃ３抗体で処置したＣａｌｕ６細胞からのアデノシン産生の時間過程を示し、１１Ｆ１１抗体によるＣＤ７３酵素阻害が、４Ｃ３抗体によるものよりも高速で生じることを示す。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、示される用量のＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆまたは対照抗体で処置したＣａｌｕ−６腫瘍におけるＣＤ７３酵素活性の定量化を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、以下の抗体によるＣＤ７３のＨ２２２８細胞における抗体媒介性内部移行の動態を示す：１１Ｆ１１、４Ｃ３、６Ｄ１１、４Ｃ３Ｖｋ１軽鎖を有するＣＤ７３．３−ＩｇＧ１．１ｆ（「３−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１．１ｆ／４Ｃ３Ｖｋ１」）、１１Ｆ１１  Ｖｋ２軽鎖を有するＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ（「４−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ／１１Ｆ１１−Ｖｋ２」）、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ（「ＣＤ７３．１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ」）、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（「ＣＤ７３．１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ」）およびＣＤ７３．１０−ＩｇＧ１．１ｆ（「ＣＤ７３．１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１．１ｆ」）抗体。１１Ｆ１１（ＩｇＧ２アイソタイプのもの）、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳおよびＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである試験した他の抗体よりも高速かつ高い程度で内部移行される。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、図２３Ａに示されるものと同一の抗体のＨＣＣ１５細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の動態を示し、Ｈ２２２８細胞（非小細胞肺癌種細胞株）において得られたものと類似の結果を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、図２３Ａおよび２３Ｂに示されるものと同一の抗体、ならびにＣＤ７３．１１−ＩｇＧ２ＣＳ（「１１−Ｖｈ−ｈＶＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ」）のＣａｌｕ６細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の動態を示し、Ｈ２２２８およびＨＣＣ１５細胞において得られたものと類似の結果を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、図２３Ｃに示されるものと同一の抗体のＮＣＩ−２０３０細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の動態を示し、Ｈ２２２８、ＨＣＣ１５およびＣａｌｕ６細胞において得られたものと類似の結果を示す。
【図２３Ｅ】図２３Ｅは、フローサイトメトリーによって測定される、示される抗体の、Ｃａｌｕ６細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の動態を示す。
【図２３Ｆ】図２３Ｆは、フローサイトメトリーによって測定される、示される抗体のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（粘膜表皮肺癌腫細胞株）における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の動態を示すが、抗体は、細胞の抗体との初回インキュベーションの後に洗い流さなかった。
【図２３Ｇ】図２３Ｇは、示された抗体で処置したＣａｌｕ６細胞に内部移行されたＣＤ７３の割合を示し、示される抗体のＣａｌｕ６細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を経時的に示す。
【図２３Ｈ】図２３Ｈは、示された抗体で処置したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に内部移行されたＣＤ７３の割合を経時的に示し、示される抗体のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を経時的に示す。
【図２３Ｉ】図２３Ｉは、示された抗体で処置したＳＮＵ−Ｃ１細胞（結腸癌種細胞株）に内部移行されたＣＤ７３の割合を経時的に示し、示される抗体のＳＮＵ−Ｃ１細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を経時的に示す。
【図２３Ｊ】図２３Ｊは、示された抗体で処置したＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）に内部移行されたＣＤ７３の割合を経時的に示し、示される抗体のＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を経時的に示す。
【図２３Ｋ】図２３Ｋは、示された抗体で処置したＣａｌｕ６細胞に内部移行されたＣＤ７３の割合を経時的に示し、示される抗体のＣａｌｕ６細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を経時的に示す。
【図２３Ｌ】図２３Ｌは、示された抗体で処置したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に内部移行されたＣＤ７３の割合を経時的に示し、示される抗体のＣａｌｕ６細胞における抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を経時的に示す。
【図２３Ｍ】図２３Ｍは、５μｇ／ｍｌの示される抗体で０、５、１５または３０分間処置したＣａｌｕ６細胞の表面におけるＣＤ７３のレベルを示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、動物を対照抗体で処置した４日後に採取された、動物に由来し、ＣＤ７３酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、濃い茶色を示し、ＣＤ７３酵素活性を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、動物を１１Ｆ１１抗体で処置した１日後に採取された、動物に由来し、ＣＤ７３酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示される対照腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から１日後程度の早期におけるＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによるＣＤ７３酵素活性のインビボでの阻害を示す。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、動物をＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで処置した２日後に採取された、動物に由来し、ＣＤ７３酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示される対照腫瘍切片と比べておよび動物をＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで処置した１日後の腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から少なくとも２日後におけるＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによるＣＤ７３酵素活性のインビボでの阻害を示す。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、動物をＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで処置した３日後に採取された、動物に由来し、ＣＤ７３酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示される対照腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から少なくとも３日後におけるＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによるＣＤ７３酵素活性のインビボでの阻害を示す。
【図２４Ｅ】図２４Ｅは、動物をＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで処置した７日後に採取された、動物に由来し、ＣＤ７３酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図２４Ａに示される対照腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から少なくとも７日後におけるＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆによるＣＤ７３酵素活性のインビボでの阻害を示す。
【図２４Ｆ】図２４Ｆは、対照（非ＣＤ７３）抗体または１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで処置した異種移植片マウスのＳＮＵＣ１腫瘍におけるヒトＣＤ７３の酵素活性の時間過程を示し、抗ＣＤ７３抗体が、異種移植片マウスの腫瘍において、ＣＤ７３酵素活性を効率的に低減することを示す。
【図２４Ｇ】図２４Ｇは、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＣＤ７３抗体で処置したマウスのＭＣ３８腫瘍における、抗体投与後の異なる時点でのＣＤ７３の阻害レベルを示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、同系４Ｔ１腫瘍および対照ｍＩｇＧを保持するＢａｌｂ／ｃマウスに由来する対照腫瘍切片におけるマウスＣＤ７３酵素活性のレベルを示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、抗マウスＣＤ７３抗体ＴＹ２３で皮下処置した、同系４Ｔ１腫瘍を保持するＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍切片（４Ｔ１、１日目〜７日目）を示し、ＴＹ２３が、インビボでＣＤ７３酵素活性を阻害することを示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、フローサイトメトリーによって判定される、抗ＣＤ７３抗体４Ｃ３、７Ａ１１、６Ｅ１１、５Ｆ８、４Ｃ３、１１Ｆ１１および１１Ａ６による４Ｃ３の交差遮断レベルを示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、フローサイトメトリーによって判定される、抗ＣＤ７３抗体４Ｃ３、７Ａ１１、６Ｅ１１、５Ｆ８、４Ｃ３、１１Ｆ１１および１１Ａ６による１１Ｆ１１の交差遮断レベルを示す。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ヒトＣＤ７３のアミノ酸配列（配列番号２８３）および濃い灰色で表されるＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆとの相互作用の領域を示す。相互作用が強力なほど、灰色が濃い。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、二量体ヒトＣＤ７３タンパク質およびＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの間の相互作用のモデルを示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ヒトＣＤ７３および１１Ｆ１１Ｆａｂ’断片の間の相互作用の結晶学モデルを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、２つのヒトＣＤ７３複合体の、１１Ｆ１１との複合構造のモデルを示す。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、ヒトＣＤ７３および１１Ｆ１１抗体の間の相互作用のモデルを示す。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、１１Ｆ１１およびヒトＣＤ７３の間の相互作用のモデルを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ヒトＣＤ７３および抗体複合体のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータを示す。「ＣＤ７３．４−ハイブリッド」は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆを指す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、ヒトＣＤ７３および抗体複合体のＤＬＳデータを示す。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓの異なる定常領域を含むＣＤ７３．４抗体との複合体のＳＥＣクロマトグラムデータを示し、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの効果を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓの異なる定常領域を含むＣＤ７３．４抗体との複合体のＤＬＳデータを示し、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの効果を示す。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓの異なる定常領域を含むＣＤ７３．４抗体との複合体のＭＡＬＳデータを示し、抗体／抗原複合体のサイズに対するＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの効果を示す。
【図３０Ｄ】図３０Ｄは、図３０ＣのＭＡＬＳにより判定された質量から導出したｈＣＤ７３−ｈｉｓ／ｍＡｂ複合体の図式モデルを示す。
【図３０Ｅ】図３０Ｅは、より高次な複合体が、ＣＨ１領域によって影響を受けることを示す。ヒストグラムは、各コンストラクトについて、グラフに示されるピーク１および２下の面積％を示す。
【図３１】図３１は、示される抗体のそれぞれを添加した１、４または２１時間後における、抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の割合を示す。各抗体のバーを、２１時間（左）、４時間（中央）および１時間（右）の順に示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、１：１モルのｈＣＤ７３−ｈｉｓ複合体と異なる定常領域配列を含む１６種類の異なるＣＤ７３．４抗体との複合体のＳＥＣクロマトグラムデータのオーバーレイを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、図３２Ａのクロマトグラムの１１〜１９．５分のクロマトグラムデータの拡張を示し、４種類の異なる溶出種が示される。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、１６種類の異なる抗体／ＣＤ７３−ｈｉｓ複合体についてプロットした、図３２Ｂのピーク２のＵＶクロマトグラムシグナル面積の割合を示す。データは、左から右に、ピーク面積順で分類されている。
【図３３】図３３は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質との抗体結合を示す。結合応答は、ｍＡｂ：ＦｃγＲの結合の化学量論が１：１であると仮定して、理論上のＲｍａｘの割合としてプロットする。各抗体のバーは、スライドの下部の色凡例が提供されている順で示されている。
【図３４】図３４は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質との抗体結合を示す。結合応答は、ｍＡｂ：ＦｃγＲの結合の化学量論が１：１であると仮定して、理論上のＲｍａｘの割合としてプロットする。各抗体のバーは、スライドの下部の色凡例が提供されている順で示されている。
【図３５】図３５は、種々の抗ＣＤ７３抗体のＶＨおよびＶＬ配列のアライメントを示す。ＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を、太字で示す。
【図３６Ａ】図３６Ａは、０（「４ｄｅｇ」）、１５、３０、６０および１２０分後の、Ｃａｌｕ−６細胞に内部移行された抗体１１Ｆ１１、６Ｅ１１および４Ｃ３のＥＥＡ１共局在化係数（左から右に示される）を示す。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、０（「４ｄｅｇ」）、１５、３０、６０および１２０分後の、Ｃａｌｕ−６細胞に内部移行された抗体１１Ｆ１１、６Ｅ１１および４Ｃ３のＲａｂ７共局在化係数（左から右に示される）を示す。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、０（「４ｄｅｇ」）、１５、３０、６０および１２０分後の、Ｃａｌｕ−６細胞に内部移行された抗体１１Ｆ１１、６Ｅ１１および４Ｃ３のＬａｍｐ−１共局在化係数（左から右に示される）を示す。
【図３７Ａ】図３７Ａは、ＴＭＡ切片においてモノクローナル抗体１Ｄ７を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、示される腫瘍の細胞質、細胞膜または両方におけるＣＤ７３の発現レベルを示す。グラフに列挙されている腫瘍は、左から右に、甲状腺癌腫（ｎ＝１６）、膵臓腺癌（ｎ＝１０）、子宮内膜癌腫（ｎ＝９）、肝細胞癌種または混合型（ｎ＝１７）、頭頸部扁平上皮細胞癌腫（ｎ＝１５）、腎細胞癌腫（ｎ＝１６）、結腸腺癌（ｎ＝４９）、胃癌腫（ｎ＝１７）、非小細胞肺癌腫（ｎ＝４５）、卵巣腺癌（ｎ＝１８）、前立腺癌（ｎ＝１７）、膀胱癌腫（ｎ＝２０）、食道扁平上皮細胞癌腫（ｎ＝１０）、乳房腺癌（ｎ＝５２）およびリンパ腫（ｎ＝１５）である。各癌の種類の最初のカラム（左）は、平均の組合せ腫瘍ＣＤ７３スコアを表し、各癌の種類の第２のカラム（中央）は、平均の腫瘍細胞質ＣＤ７３スコアを表し、各腫瘍型の第３のカラム（右）は、平均の腫瘍膜ＣＤ７３スコアを表す。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、示される腫瘍の細胞膜におけるＣＤ７３発現のレベルを示す。この図は、図３６Ａに対応しているが、細胞膜におけるＣＤ７３のレベルのみを示す。グラフに列挙されている腫瘍は、左から右に、甲状腺癌腫（ｎ＝１６）、肝細胞癌腫または混合型（ｎ＝１７）、頭頸部扁平上皮細胞癌腫（ｎ＝１５）、膵臓腺癌（ｎ＝１０）、結腸腺癌（ｎ＝４９）、子宮内膜癌腫（ｎ＝９）、非小細胞肺癌腫（ｎ＝４５）、腎細胞癌腫（ｎ＝１６）、胃腺癌（ｎ＝１７）、卵巣腺癌（ｎ＝１８）、前立腺癌（ｎ＝１７）、膀胱癌腫（ｎ＝２０）、食道扁平上皮細胞癌腫（ｎ＝１０）、リンパ腫（ｎ＝１５）および乳房腺癌（ｎ＝５２）である。
【図３８Ａ】図３８Ａは、全腫瘍切片においてｍＡｂ  Ｄ７Ｆ９Ａを用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、複数の腫瘍型の腫瘍の細胞質および細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、示される腫瘍の細胞膜におけるＣＤ７３発現のレベルを示す。この図は、図３７Ａに対応しているが、細胞膜におけるＣＤ７３のレベルのみを示す。
【図３９Ａ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｂ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｃ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｄ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｅ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｆ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｇ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図３９Ｈ】図３９Ａ〜３９Ｈは、全腫瘍切片における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、図３８Ａに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるＣＤ７３の発現を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａ〜４０Ｆは、フローサイトメトリーによって判定される、結腸腺癌（「結腸」）、腎細胞癌腫（「腎臓」）および肺腺癌（「肺」）を有する対象の腫瘍および血液における、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。図４０Ａ〜４０Ｆのそれぞれについて、バーは、左から右に、結腸腺癌、腎細胞癌腫および肺腺癌を有する対象に対応する。図４０Ａは、血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。
【図４０Ｃ】図４０Ｃは、血液中のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。
【図４０Ｄ】図４０Ｄは、腫瘍内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。
【図４０Ｅ】図４０Ｅは、血液中のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。
【図４０Ｆ】図４０Ｆは、腫瘍内のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞におけるＰＤ−１の頻度を示す。
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｄは、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのサロゲートマウス抗ＣＤ７３抗体（ｍＩｇＧ１）または１０ｍｇ／ｋｇの対照マウスＩｇＧ１抗体で処置したマウスにおけるＭＣ３８腫瘍成長を示す。
【図４２】図４２Ａ〜４２Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体または５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇもしくは２０ｍｇ／ｋｇのサロゲートマウス抗ＣＤ７３抗体（ｍＩｇＧ１）と組み合わせた１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体で処置したマウスにおけるＭＣ３８腫瘍成長を示す。
【図４３】図４３は、図４２Ａ〜４２Ｄの実験により得られたマウスにおけるＭＣ３８腫瘍成長の中央値を示す。
【図４４】図４４は、図４２Ａ〜４２Ｄの実験により得られたマウスの生存グラフを示す。
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｄは、無段階ＣＴ２６癌モデルにおける抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体の組合せの抗腫瘍効果を示す。
【図４６】図４６は、直接検出受容体占有率アッセイ形式において使用するために試験した３つの異なる抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥ抗体の用量依存性を示す。
【図４７】図４７は、正常な健康志願者から採取した全血からのＣＤ７３抗体の用量応答を示す。３人の健康なドナーからの連続濃度の本明細書に記載されるＣＤ７３抗体のＢ細胞上のＣＤ７３に対する受容体占有パーセントを、示す。
【図４８】図４８は、蛍光強度アッセイ精度の結果を示す。３人の健康なドナーからの全血を、様々な濃度のＣＤ７３抗体でスパイクした。全受容体レベル（黒塗りの記号）およびＣＤ７３抗体によって結合された受容体（白抜きの記号）を示す。
【図４９】図４９は、導出された受容体占有率アッセイ精度の結果を示す。３人の健康なドナーからの全血サンプルを、様々な濃度のＣＤ７３抗体でスパイクし、３連で分析した。
【図５０】図５０は、ＣＤ７３受容体占有率アッセイのために採取された全血サンプルの採取後の安定性を示す。全血サンプルを、種々の濃度のＣＤ７３抗体で処置し、採取後０、２４、４８および７２時間で分析した。
【図５１】図５１は、品質管理の範囲および性能を示す。ＣＤ−Ｃｈｅｘ（登録商用）ＮｏｒｍａｌのＣＤ１９＋Ｂ細胞（上）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（下）におけるＣＤ７３の総発現を、５回分析して、９５％信頼区間を確立した。
【図５２】図５２Ａ〜５２Ｊは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓ定常領域を含む抗ＣＤ７３（ＣＤ７３．４）抗体を用いて形成された抗原−抗体複合体の種類の相違を示す。パネルＡ〜Ｅは、ＣＤ７３＋ＩｇＧ１を含む抗ＣＤ７３抗体の選択されたクラス平均を示し、抗体またはＣＤ７３二量体のいずれかとしてセグメントの同定が可能である（図Ａおよび図Ｂ）。拡散分岐密度（diffuse branched density）は、Ｆｃドメインであり、クラス平均では乱雑となることが多く、一方で、Ｆａｂは、それらの特徴的な二峰性形状およびサイズによって同定することができる。Ｆａｂ結合部位における残りの密度もまた、二峰性であり、およそ８５Åにわたり、それが、ＣＤ７３二量体であることを示す（図Ａおよび図Ｂ）。他の変異形の複合体もまた、サンプル中に存在しており、種々のコンホメーションを示す（Ｃ〜Ｅ）。パネルＦ〜Ｊは、ＣＤ７３およびＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓを含む抗体の選択されたクラス平均を示し、ＩｇＧ２．Ｃ２１９ＳまたはＣＤ７３二量体のいずれかとしてセグメントの同定が可能である。Ｆａｂは、それらの特徴的な二峰性形状およびサイズによって同定することができる。Ｆａｂ結合部位における残りの密度は、ＣＤ７３二量体である。線形多量体のセグメントは、明確に示すことができないが、ＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓを含む抗体およびＣＤ７３が、観察されたストリング様構造体をどのように形成するかを示唆する。パネルＨ〜Ｊは、ストリング様構造体の手作業による選択からの平均を示す。アライメントは、ＩｇＧ２．Ｃ２１９ＳのＦａｂアーム上で中央にあるように見えるが、より詳細な解釈は、可能ではない。ＩｇＧ１を含むＣＤ７３．４抗体およびＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓを含む抗体は、それぞれ、「ＩｇＧ１」および「ＩｇＧ２」と称される。
【図５３】図５３は、濃い（茶色の）染色のレベルから明らかなように、患者腫瘍サンプルにおけるヒトＣＤ７３酵素阻害を示す。「スクリーン」は、抗ＣＤ７３抗体を患者に投与する前の腫瘍サンプルを指し、「投薬後」または「投与後」は、抗ＣＤ７３抗体を患者に投与した後の腫瘍サンプルを指す。
【図５４】図５４は、示される抗体のそれぞれを添加した１、４または２１時間後における、抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の割合を示す。各抗体のバーを、２１時間（左）、４時間（中央）および１時間（右）の順に示す。上部の破線は、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジを有する抗体の平均内部移行割合を表し、下の破線は、ＩｇＧ１のＣＨ１およびヒンジを有する抗体の平均内部移行割合を表す。
【図５５】図５５ＡおよびＢは、図５４に示された内部移行パーセントを、それぞれ、１時間および４時間の時点における別個のグラフとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ＣＤ７３と特異的に結合し、それによって、ＣＤ７３活性を低減する、単離された抗体、特に、モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体が、本明細書に記載される（「アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体」）。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来し、および／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。単離された抗体、このような抗体、イムノコンジュゲート、このような抗体を含む二重特異性分子および抗体を含有するよう製剤化された医薬組成物を作製する方法が、本明細書において提供される。抗体を、腫瘍成長を低減するために、単独でかまたは他の治療剤（例えば、抗体）および／または癌治療と組み合わせて使用する方法もまた、本明細書において提供される。したがって、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、例えば、腫瘍成長の阻害、転移の阻害および腫瘍に対する免疫応答の増強を含めた、様々な治療適用における治療において使用され得る。
【００２８】
定義
本明細書において説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示されている。
【００２９】
用語「分化抗原群７３」または「ＣＤ７３」とは、本明細書において、細胞外ヌクレオシド５’一リン酸をヌクレオシドに、すなわち、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）をアデノシンに、変換することができる、酵素（ヌクレオチダーゼ）を指す。ＣＤ７３は、通常、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を通じて細胞膜と結合した二量体として見出され、エクト酵素活性を有し、シグナル伝達において役割を果たす。ＣＤ７３の主要な機能は、細胞外ヌクレオチド（例えば、５’−ＡＭＰ）から、高度に免疫抑制性の分子であるアデノシンへのその変換である。したがって、エクト−５’−ヌクレオチダーゼは、プリンおよびピリミジンリボおよびデオキシリボヌクレオシド一リン酸から対応するヌクレオシドへの脱リン酸化を触媒する。ＣＤ７３は、広範な基質特異性を有するが、プリンリボヌクレオシドが好まれる。
【００３０】
ＣＤ７３はまた、エクト−５’ヌクレアーゼ（エクト−５’ＮＴ、ＥＣ  ３．１．３．５）とも称される。用語「ＣＤ７３」は、細胞によって天然に発現される、ＣＤ７３の任意の変異体またはアイソフォームを含む。したがって、本明細書に記載される抗体は、ヒト以外の種に由来するＣＤ７３（例えば、カニクイザルＣＤ７３）と交差反応し得る。あるいは、抗体は、ヒトＣＤ７３に特異的であり得、他の種とのいずれの交差反応性も示さない可能性がある。ＣＤ７３またはその任意の変異体およびアイソフォームは、それらを天然に発現する細胞もしくは組織から単離され得るか、または当技術分野で周知の技術および／もしくは本明細書に記載されるものを使用して組換えにより産生され得るかのいずれであってもよい。
【００３１】
ヒトＣＤ７３の２種類のアイソフォームが同定されており、それらはいずれも、同一のＮ末端およびＣ末端部分を共有する。アイソフォーム１（受託番号ＮＰ＿００２５１７．１、配列番号１）は、５７４個のアミノ酸および９個のエクソンからなる、長い方のタンパク質を表す。アイソフォーム２（受託番号ＮＰ＿００１１９１７４２．１、配列番号２）は、５２４個のアミノ酸からなり、アミノ酸４０４〜４５３が欠けている、短い方のタンパク質をコードする。アイソフォーム２は、選択的インフレームエクソンが欠けており、エクソンは８つのみだが同一のＮ末端およびＣ末端配列を有する転写産物をもたらす。
【００３２】
カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ７３タンパク質配列は、配列番号３として提供される。カニクイザルおよびｃｙｎｏという用語は、いずれも、マカカ・ファシクラリス（Macaca fascicularis）種を指し、本明細書全体で互換可能に使用される。
【００３３】
本明細書において、用語「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ−１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」および「ｈＰＤ−Ｉ」は、同義的に使用され、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種間相同体（species homologs）およびＰＤ−１と共通のエピトープを少なくとも１つ有する類似体を含む。完全なＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６４８６３に見出すことができる。
【００３４】
本明細書において用語「抗体」とは、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその単一鎖を含み得る。「抗体」とは、一実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。特定の天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体では、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。特定の天然に存在する抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域と散在している超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および伝統的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）との結合を媒介し得る。
【００３５】
抗体の重鎖は、末端リシン（Ｋ）または末端グリシンおよびリシン（ＧＫ）を含んでもよくまたは含まなくてもよい。したがって、本明細書において提供される重鎖配列および重鎖定常領域配列のいずれも、ＧＫもしくはＧで終了し得るか、または配列の最後のアミノ酸が何になるかに関係なく、ＫもしくはＧＫが欠けていてもよい。これは、末端リシンならびに場合によりグリシンおよびリシンが、抗体の発現の際に切断されるためである。
【００３６】
抗体は、通常、そのコグネイト抗原と、１０−７〜１０−１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって反映される高親和性で特異的に結合する。約１０−６Ｍより大きい任意のＫＤは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において、抗原と「特異的に結合する」抗体とは、抗原および実質的に同一の抗原と、１０−７Ｍ以下、好ましくは、１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは、５×１０−９Ｍ以下、最も好ましくは、１０−８Ｍから１０−１０Ｍ以下の間のＫＤを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない抗体である。抗原は、所与の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合には、例えば、所与の抗原の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を示す場合に、所与の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＣＤ７３と特異的に結合する抗体は、特定の非ヒト霊長類種（例えば、カニクイザル）に由来するＣＤ７３とまた交差反応し得るが、その他の種に由来するＣＤ７３と、またはＣＤ７３以外の抗原とは交差反応し得ない。
【００３７】
免疫グロブリンは、それだけには限らないがＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含めた、よく知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分けられる：ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ならびにマウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１は、多くても２、３個のアミノ酸で互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。「抗体」は、例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体ならびに一本鎖抗体を含み得る。
【００３８】
本明細書において、用語、抗体の「抗原結合部分」は、抗原（例えば、ヒトＣＤ７３）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１種または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または（ｖｉｉ）適宜合成リンカーによって接続され得る２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域対が、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して接続され得る。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されるものとする。これらおよびその他の可能性あるコンストラクトは、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。
【００３９】
「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有し、異なる抗原に対して特異性を有する２つの抗原結合部位を生じさせる人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた種々の方法によって生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照のこと。
【００４０】
本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体またはすべての抗体が特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物を指す。通常、このようなモノクローナル抗体は、抗体をコードする単一細胞または核酸に由来し、任意の配列変更を意図的に導入することなく増殖され得る。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および適宜定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは導入染色体非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）から得られたＢ細胞を不死化された細胞と融合することによって得られたハイブリドーマによって産生される。
【００４１】
本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体またはそれから調製されたハイブリドーマである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用し、生殖系列遺伝子によってコードされる可変および定常領域を含むが、その後の再編成および例えば、抗体成熟の間に起こる突然変異を含む。当技術分野で公知のように（例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと）、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するよう再編成する種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。可変領域は、再配列に加えて、外来抗原に対する抗体の親和性を増大するよう、複数の単一アミノ酸変更（体細胞突然変異または高頻度突然変異とも呼ばれる）によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応じて変化する（すなわち、アイソタイプスイッチ）。したがって、抗原に応じた、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再編成され、体細胞突然変異された核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではない場合があるが、代わりに、実質的に同一または同様となる（すなわち、少なくとも８０％の同一性を有する）。
【００４２】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）とは、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかし、本明細書において、用語「ヒト抗体」はマウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むよう意図されない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
【００４３】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体のＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来するアミノ酸で置換されているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたはすべてのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入または置換または修飾は、抗体の特定の抗原と結合する能力を抑制しない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体のものと同様の抗原特異性を保持する。
【００４４】
「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。
【００４５】
「修飾された重鎖定常領域」とは、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、定常ドメインのうちの１つまたは複数が、異なるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に由来する、重鎖定常領域を指す。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインおよびヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインに融合されたヒトＩｇＧ２ヒンジおよびヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、そのような修飾された定常領域はまた、野生型アミノ酸配列と比べて、ドメインのうちの１つまたは複数内にアミノ酸修飾を含む。
【００４６】
本明細書において、定常領域の同一性を示すことなく「ＣＤ７３．３」または「ＣＤ７３．４」として抗体に言及する場合、別途示されない限り、それぞれ、ＣＤ７３．３またはＣＤ７３．４の可変領域を、本明細書に記載される任意の定常領域とともに有する抗体を指す。
【００４７】
本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体）を指す。
【００４８】
「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプ群内の天然に存在する変異体を指し、これらの変異体は、２、３個のアミノ酸で異なっている（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。本明細書に記載される抗体は、任意のアロタイプのものであり得る。
【００４９】
本明細書において別途指定されない限り、すべてのアミノ酸の番号は、カバットシステム（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）のＥＵ指数に従う。
【００５０】
語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
【００５１】
本明細書において「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、ＣＤ７３と特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ７３以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＣＤ７３のエピトープと特異的に結合する単離された抗体は、異なる種に由来するその他のＣＤ７３タンパク質と交差反応性を有し得る。
【００５２】
本明細書において、「ＣＤ７３を阻害する」抗体は、ＣＤ７３の生物学的および／または酵素的機能を阻害する抗体を指す。これらの機能としては、例えば、抗体がＣＤ７３酵素活性、例えば、ＣＤ７３により制御されるアデノシンの産生またはｃＡＭＰ産生の低減を阻害する能力が挙げられる。
【００５３】
本明細書において、「内部移行する」抗体とは、細胞表面抗原と結合すると細胞膜を越える抗体を指す。内部移行には、抗体媒介性受容体、例えば、ＣＤ７３内部移行が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０分またはそれ以下のＴ１／２の速度で、ＣＤ７３を発現する細胞に「内部移行する」。
【００５４】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドとの相互作用、またはそれにより生じる生化学的事象を指す。例示的「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能ならびに細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされるＦｃ領域を必要とする。
【００５５】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する受容体である。ＩｇＧ抗体と結合するＦｃＲは、対立遺伝子変異体およびこれらの受容体の別法としてスプライシングされた形態を含めたＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３種の活性化（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１種の阻害性（ＦｃγＲＩＩＢ）受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の特性は、表１に要約されている。先天性エフェクター細胞種の大部分は、１種または複数の活性化ＦｃγＲおよび阻害性ＦｃγＲＩＩＢを同時に発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１種の活性化Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩおよびヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体と結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に関してマウスＩｇＧ２ａと同等と考えられる。
【００５６】
【表１】
2019514844.tif 000002
【００５７】
「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」とは、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接続する、重鎖定常領域のドメインを指し、ヒンジの上部、中部および下部を含む（Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083）。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に多様なレベルの可動性をもたらし、２つの重鎖定常領域間での分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する。本明細書において、ヒンジは、すべてのＩｇＧアイソタイプについて、Ｇｌｕ２１６で開始し、Ｇｌｙ２３７で終了する（Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083）。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のヒンジの配列は、表２および３７に示されている。
【００５８】
【表２】
2019514844.tif 000003
【００５９】
用語「ヒンジ」は、野生型ヒンジ（表２および３７に記載されるものなど）、ならびにその変異体（例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾されたヒンジ）を含む。例えば、用語「ＩｇＧ２ヒンジ」は、表２に示されるような野生型ＩｇＧ２ヒンジならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。例示的ＩｇＧ２ヒンジ変異体として、１個、２個、３個または４個すべてのシステイン（Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９）が、別のアミノ酸に変化しているＩｇＧ２ヒンジが挙げられる。具体的な実施形態では、ＩｇＧ２は、Ｃ２１９Ｓ置換を含む。ＩｇＧ２ヒンジはまた、Ｃ２２０における置換またはＣ２１９およびＣ２２０の両方における置換を含み得る。ＩｇＧ２ヒンジは、置換を含み得、この置換は、単独でかまたは重鎖もしくは軽鎖の他の領域における１つもしくは複数の置換と一緒に、抗体に形態ＡまたはＢをとらせることになる（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。特定の実施形態では、ヒンジは、少なくとも２種のアイソタイプに由来する配列を含む、ハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、１種のアイソタイプに由来する上部、中部または下部ヒンジを含み、ヒンジの残りの部分が１種または複数のアイソタイプに由来してもよい。例えば、ヒンジは、ＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってもよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中部ヒンジならびにＩｇＧ１の下部ヒンジを含み得る。ヒンジは、エフェクター機能を有してもよく、またはエフェクター機能が欠けていてもよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジは、エフェクター機能を提供する。
【００６０】
用語「ＣＨ１ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいて可変ドメインをヒンジと連結する重鎖定常領域を指す。本明細書において、ＣＨ１ドメインは、Ａ１１８で開始し、Ｖ２１５で終了する。用語「ＣＨ１ドメイン」は、野生型ＣＨ１ドメイン（ＩｇＧ１については配列番号９８およびＩｇＧ２については配列番号１２４を有するものなど）ならびにそれらの変異体（例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメインまたは修飾されたＣＨ１ドメイン）を含む。例えば、用語「ＣＨ１ドメイン」は、野生型ＣＨ１ドメインならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそれらの変異体を含む。例示的ＣＨ１ドメインとして、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するＣＨ１ドメインが挙げられる。抗体の生物活性に影響を及ぼすＣＨ１ドメインへの修飾が、本明細書において提供される。ＣＨ１ドメインは、置換Ｃ１３１Ｓを含み得、この置換により、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２抗体の少なくとも一部分、例えば、ヒンジならびに／もしくはヒンジおよびＣＨ１を含む抗体は、抗体のＡ形態とは対照的なＢ形態をとることになり得る。
【００６１】
用語「ＣＨ２ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいてヒンジをＣＨ３ドメインに連結する重鎖定常領域を指す。本明細書において、ＣＨ２ドメインは、Ｐ２３８で開始し、Ｋ３４０で終了する。用語「ＣＨ２ドメイン」は、野生型ＣＨ２ドメイン（ＩｇＧ１については配列番号１３７を有するものなど；表３７）ならびにそれらの変異体（例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメインまたは修飾されたＣＨ２ドメイン）を含む。例えば、用語「ＣＨ２ドメイン」は、野生型ＣＨ２ドメインならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそれらの変異体を含む。例示的ＣＨ２ドメインとして、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するＣＨ２ドメインが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減する置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。抗体の生物活性に影響を及ぼすＣＨ２ドメインへの他の修飾が、本明細書において提供される。
【００６２】
用語「ＣＨ３ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいてＣＨ２ドメインに対してＣ末端側である、重鎖定常領域を指す。本明細書において、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１で開始し、Ｋ４４７で終了する。用語「ＣＨ３ドメイン」は、野生型ＣＨ３ドメイン（ＩｇＧ１については配列番号１３８を有するものなど；表３７）ならびにそれらの変異体（例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメインまたは修飾されたＣＨ３ドメイン）を含む。例えば、用語「ＣＨ３ドメイン」は、野生型ＣＨ３ドメインならびに１個、２個、３個、４個、５個、１〜３個、１〜５個、３〜５個および／または多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそれらの変異体を含む。例示的ＣＨ３ドメインとして、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するＣＨ３ドメインが挙げられる。抗体の生物活性に影響を及ぼすＣＨ３ドメインへの修飾が、本明細書において提供される。
【００６３】
「ＣＬドメイン」とは、軽鎖の定常ドメインを指す。用語「ＣＬドメイン」は、野生型ＣＬドメインおよびそれらの変異体、例えば、Ｃ２１４Ｓを含む変異体を含む。
【００６４】
「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域および天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含む。天然配列Ｆｃは、Ｆｃの種々のアロタイプを含む（例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと）。
【００６５】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＣＤ７３）上の部位を指す。タンパク質抗原内のエピトープは、連続アミノ酸（普通、直鎖エピトープ）またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された非連続アミノ酸（普通、コンホメーションエピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、必ずではないが、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次元フォールディングから形成されるエピトープは、通常、変性溶媒を用いる処理の際に失われる。エピトープは、通常、独特の空間コンホメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体（すなわち、エピトープマッピング）によって結合されるエピトープを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、（例えば、ＣＤ７３に由来する）重複ペプチドまたは連続ペプチドが、所与の抗体（例えば、抗ＣＤ７３抗体）との反応性について試験される、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが挙げられる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法として、当技術分野における技術および本明細書に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳ（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと）が挙げられる。
【００６６】
用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識に関与する抗原上の分子決定基の同定のプロセスを指す。
【００６７】
２種以上の抗体に関して、用語「同一エピトープと結合する」は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基の同一セグメントと結合することを意味する。本明細書に記載される抗体を用いて、抗体が「ＣＤ７３上の同一エピトープ」と結合するか否かを調べる技術として、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）などのエピトープマッピング方法が挙げられる。その他の方法は、抗体の抗原断片（例えば、タンパク質分解断片）との、または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失が、エピトープ成分の指標と考えられることが多い（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発 - Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081）。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。これらの方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。
【００６８】
「標的との結合について別の抗体と競合する」抗体とは、その他の抗体の標的との結合を阻害する（部分的にまたは完全に）抗体を指す。２種の抗体が、標的との結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、その他の抗体の標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するかは、公知の競合実験、例えば、実施例に記載されるものなどを使用して調べてもよい。特定の実施形態では、抗体は、別の抗体の標的との結合と、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％競合する、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」であるか（すなわち、標的とともに最初にインキュベートされるコールド抗体）に応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施できる。競合抗体は、同一エピトープと、重複エピトープとまたは隣接するエピトープ（例えば、立体障害によって証明されるような）と結合する。
【００６９】
その他の競合結合アッセイとして、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照のこと）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546 (1990)）；および直接標識化ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)）が挙げられる。
【００７０】
本明細書において、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープとの、その他の抗原とではない抗体結合を指す。通常、抗体は、（ｉ）例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組換えヒトＣＤ７３およびリガンドとして抗体を使用したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術または抗体の抗原陽性細胞との結合のスキャッチャード解析法によって決定される場合に、およそ１０−７Ｍ未満、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、（ｉｉ）所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合に対するその親和性よりも、少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原と結合する。したがって、別途示されない限り、「ヒトＣＤ７３と特異的に結合する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより小さいＫＤで、可溶性または細胞結合型ヒトＣＤ７３と結合する抗体を指す。「カニクイザルＣＤ７３と交差反応する」抗体とは、１０−７Ｍ以下、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにそれより低いＫＤでカニクイザルＣＤ７３と結合する抗体を指す。特定の実施形態では、非ヒト種由来のＣＤ７３と交差反応しない抗体は、標準結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。
【００７１】
本明細書において、用語「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」とは、特定の抗体抗原相互作用の会合速度定数を指すものとするのに対し、本明細書において、用語「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度定数を指すものとする。用語「ＫＤ」は、本明細書において、平衡解離定数を指すものとし、これはｋａに対するｋｄの割合（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定できる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析法を使用することによるものである。
【００７２】
用語、抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロまたはインビボアッセイに関連して「ＥＣ５０」とは、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの間の中間である応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。
【００７３】
抗体の、または抗体、例えば、抗ＣＤ７３抗体によって媒介される受容体、例えば、ＣＤ７３の「内部移行速度」は、例えば、例として、実施例に示されるように、内部移行のＴ１／２によって表され得る。抗ＣＤ７３抗体の内部移行速度は、抗体の重鎖定常領域を修飾された重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含むものに変更することによって、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強または増大され得、結果として、Ｔ１／２が少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２分の１、３分の１、５分の１またはそれよりも低減され得る。例えば、１０分間というＴ１／２を有する代わりに、修飾された重鎖定常領域は、内部移行速度を増大させ、それによって、Ｔ１／２を５分間に低減することができる（すなわち、内部移行速度を２倍に増大またはＴ１／２を２分の１に減少）。「Ｔ１／２」は、抗体が細胞に添加された時間から測定して、最大内部移行の半分が達成される時間として定義される。内部移行の最大レベルは、抗体濃度に対してプロットした内部移行を表すグラフのプラトーにおける内部移行レベルであり得る。修飾された重鎖定常領域は、抗体の内部移行の最大レベルを、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増大させ得る。異なる抗体、例えば、修飾された重鎖定常領域を有する抗体およびそれを有さない同一抗体の内部移行効力を比較する別の方法は、所与の抗体濃度（例えば、１００ｎＭ）または所与の時間（例えば、２分間、５分間、１０分間または３０分間）におけるそれらの内部移行レベルを比較することによるものである。内部移行レベルの比較は、内部移行のＥＣ５０レベルを比較することによって行うこともできる。ある抗体の内部移行レベルは、所与の（参照）抗体、例えば、本明細書に記載される抗体、例えば、１１Ｆ１１またはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１またはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのものに対して定義され得、所与の（参照）抗体で得られた値に対する割合として示され得る。内部移行の程度は、これらの方法のうちのいずれか１つによって比較した場合に、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【００７４】
用語、本明細書において対象に適用されるような「天然に存在する」とは、対象が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、実験室において人によって意図的に修飾されていない、自然界における供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。
【００７５】
「ポリペプチド」とは、少なくとも２個の連続して連結しているアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１個または複数のアミノ酸残基は、それだけには限らないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの修飾を含有し得る。「タンパク質」は、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。
【００７６】
用語「核酸分子」とは、本明細書において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであり得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ分子は、天然に存在するＤＮＡ分子を包含しない。
【００７７】
本明細書に記載される配列番号に記載される配列の「保存的配列修飾」、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるか、またはアミノ酸配列を含有する抗体の、抗原との結合を抑制しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾も提供される。このような保存的配列修飾として、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換ならびにヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失が挙げられる。例えば、修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって本明細書に記載される配列番号に導入され得る。保存的配列修飾として、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される保存的アミノ酸置換が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、抗ＣＤ７３抗体中の予想される非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換されることが好ましい。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Brummel et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと）。
【００７８】
あるいは、別の実施形態では、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって抗ＣＤ７３抗体コード配列のすべてかまたは一部に沿って無作為に導入され得、得られた修飾された抗ＣＤ７３抗体は、改善された結合活性についてスクリーニングされ得る。
【００７９】
核酸については、用語「実質的な相同性」は、２種の核酸またはその指定された配列は、最適にアラインされ、比較される場合に、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、普通、少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９．５％において適当なヌクレオチド挿入または欠失を用いて同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体とハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。
【００８０】
ポリペプチドについては、用語「実質的な相同性」は、２種のポリペプチドまたはその指定された配列が、最適にアラインされ、比較される場合に、アミノ酸の少なくとも約８０％、普通、少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、アミノ酸の少なくとも約９８％〜９９．５％において適当なアミノ酸挿入または欠失を用いて同一であることを示す。
【００８１】
２種の配列間の同一性パーセントは、配列が最適にアラインされる場合に配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）、最適アラインメントは、２種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮して決定される。２種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の限定されない例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【００８２】
２種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（CABIOS, 4:11-17 (1989)）を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定できる。さらに、２種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定できる。
【００８３】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。本明細書に記載された核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施できる。本明細書に記載されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長（wordlength）＝３を用いて実施できる。比較目的でギャップ付きアラインメント得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【００８４】
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸（例えば、染色体のその他の部分）またはタンパク質から精製された場合に「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００８５】
核酸、例えば、ｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って突然変異してもよい。コード配列については、これらの突然変異は、所望されるアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよび本明細書に記載される他のそのような配列と実質的に相同であるか、またはそれらに由来する、ＤＮＡ配列が考慮される。
【００８６】
本明細書において、用語「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すものとする。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、これでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのその他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
【００８７】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書において、細胞中に天然に存在しない核酸を含み、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の後代も指すということは理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって後世において起こり得るので、このような後代は実際、親の細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【００８８】
本明細書において、用語「抗原」とは、タンパク質、ペプチドまたはハプテンなど、任意の天然または合成の免疫原性物質を指す。抗原は、ＣＤ７３またはその断片であり得る。
【００８９】
「免疫応答」とは、外来作用物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答が、これらの作用物質およびそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用によって媒介され、これは、進入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織との選択的標的化、結合、損傷、破壊および／またはそれらの脊椎動物の身体からの排除をもたらす。免疫応答または反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞の活性化もしくは阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。
【００９０】
「免疫調節物質（immunomodulator）」または「免疫制御物質（immunoregulator）」とは、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る作用物質、例えば、シグナル伝達経路の成分を指す。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」とは、免疫系の細胞における、またはこのような細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）の活性における任意の変更を指す。このような調節は、免疫系の刺激または抑制を含み、種々の細胞型の数の増大もしくは減少、これらの細胞の活性の増大もしくは減少または免疫系内で起こり得る任意のその他の変化によって示され得る。阻害的および刺激的免疫調節物質の両方とも同定されており、その一部は、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。免疫調節物質は、Ｔ細胞の表面に位置し得る。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、作用物質、部分、化合物または分子による結合に対して標的化される免疫調節物質であり、その活性は、物質、作用物質、部分、化合物または分子の結合によって変更される。免疫調節性標的は、例えば、細胞の表面の受容体（「免疫調節性受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節性リガンド」）を含む。
【００９１】
免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および／または阻害性受容体の増強されたアンタゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性（標的細胞上で直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出を介して間接的に決定される）および増殖における変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ５０または最大活性レベルの倍増が反映され得る。免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【００９２】
「免疫療法」とは、免疫応答を誘導、増強、抑制またはそうでなければ修飾することを含む方法によって、疾患の再発に苦しむまたは、それを起こすまたは患う危険にある対象の治療を指す。
【００９３】
「免疫賦活性（immunostimulating）療法」または「免疫賦活性（immunostimulatory）療法」とは、例えば、癌を治療するための、対象における免疫応答の増大（誘導または増強）をもたらす療法を指す。
【００９４】
「内因性免疫応答を増強する」とは、対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増大することを意味する。この有効性および効力の増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって達成され得る。
【００９５】
「Ｔエフェクター」（「Ｔｅｆｆ」）細胞とは、サイトカインを分泌し、その他の免疫細胞を活性化し、指示する、細胞溶解活性を有するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞）ならびにＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を指すが、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を含まない。
【００９６】
本明細書において、用語「連結している」とは、２つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合である場合も、非共有結合である場合もある。連結はまた、遺伝的であり（すなわち、組換えによって融合され）得る。このような連結は、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質生産などの様々な当技術分野において認識される技術を使用して達成され得る。
【００９７】
本明細書において、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して、治療薬を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸性に、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与することは、例えば、１回、複数回および／または１回もしくは複数回の長期間にわたって実施され得る。
【００９８】
本明細書において、用語「Ｔ細胞媒介性応答」とは、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）を含めたＴ細胞によって媒介される応答を指す。Ｔ細胞媒介性応答は、例えば、Ｔ細胞細胞傷害性および増殖を含む。
【００９９】
本明細書において、用語「細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞によって誘導される免疫応答を指す。ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって主に媒介される。
【０１００】
本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」（例えば、ＣＤ７３結合または活性の阻害／遮断を指す）は、同義的に使用され、部分的および完全阻害／遮断の両方を包含する。
【０１０１】
本明細書において、「癌」は、身体中での異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患の広い群を指す。未制御細胞分裂は、隣接する組織へ浸潤し、リンパ系または血流によって身体の遠隔部位へ転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
【０１０２】
用語「治療する」、「治療すること」および「治療」とは、本明細書において、症状の進行、発生、重症度もしくは再発、合併症、疾病と関連している状態または生化学的兆候を逆転させ、軽減し、寛解し、阻害し、または減速することを目的とした、対象で実施される任意の種類の介入もしくはプロセスまたは対象へ活性薬剤を投与することを指す。予防とは、疾患が発生するのを防ぐため、またはそれが起こる場合にはその効果を最小化するための、疾患を有していない対象への投与を指す。
【０１０３】
「血液悪性腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。例示的リンパ腫として、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の両方が挙げられる。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。Ｂ細胞リンパ腫の限定されない例として、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫（慢性リンパ性白血病と重複する）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が挙げられる。Ｔ細胞リンパ腫の限定されない例として、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫が挙げられる。血液悪性腫瘍としてまた、それだけには限らないが、続発性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病などの白血病も挙げられる。血液悪性腫瘍として、さらにそれだけには限らないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの骨髄腫も挙げられる。その他の血液系および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連癌が、用語血液悪性腫瘍によって包含される。
【０１０４】
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止によって証明される疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こすおよび／または腫瘍の成長速度を減少させる（腫瘍成長を抑制するためなど）または他の望ましくない細胞増殖を防止もしくは遅延するのに十分な量を含む。特定の実施形態では、有効量は、腫瘍の発達を遅延するのに十分な量である。特定の実施形態では、有効量は、腫瘍の再発を防止または遅延するのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。薬物または組成物の有効量は、（ｉ）癌細胞の数を低減する、（ｉｉ）腫瘍のサイズを低減する、（ｉｉｉ）癌細胞が末梢器官に浸潤するのをある程度阻害、妨害、減速する、およびそれを停止する場合もある、（ｉｖ）腫瘍の転移をある程度阻害、すなわち減速する、およびそれを停止する場合もある、（ｖ）腫瘍成長を阻害する、（ｖｉ）腫瘍の発生および／もしくは再発を防止もしくは遅延する、ならびに／または（ｖｉｉ）癌と関連する症状のうちの１種もしくは複数をある程度緩和する。一実施例では、「有効量」は、癌の有意な減少または進行固形腫瘍などの癌の進行の有意な減速をもたらすことが臨床的に証明されている、組合せでの、抗ＣＤ７３抗体の量および免疫−腫瘍学薬剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体の量である。
【０１０５】
本明細書において、用語「固定用量」、「一定用量」および「一定固定用量」は、同義的に使用され、患者の体重または体表面積（ＢＳＡ）に関係なく、患者に投与される用量を指す。固定または一定用量は、したがって、ｍｇ／ｋｇ用量ではなく、薬剤（例えば、抗ＣＤ７３抗体および／または免疫−腫瘍学薬剤）の絶対量として提供される。
【０１０６】
本明細書において、「体表面積（ＢＳＡ）に基づく用量」とは、個々の患者の体表面積（ＢＳＡ）に合わせて調整された（例えば、抗ＣＤ７３抗体および／または抗ＰＤ−１抗体の）用量を指す。ＢＳＡに基づく用量は、ｍｇ／ｋｇ体重として提供され得る。直接的な測定を行わずにＢＳＡを得る様々な計算が公開されており、中でもＤｕ  Ｂｏｉｓの式が最も広く使用されている（Du Bois D, Du Bois EF (Jun 1916) Archives of Internal Medicine 17 (6): 863-71およびVerbraecken, J. et al. (Apr 2006). Metabolism - Clinical and Experimental 55 (4): 515-24を参照のこと）。他の例示的ＢＳＡ式として、Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒの式（Mosteller RD. N Engl J Med., 1987; 317:1098）、Ｈａｙｃｏｃｋの式（Haycock GB, et al., J Pediatr 1978, 93:62-66）、ＧｅｈａｎおよびＧｅｏｒｇｅの式（Gehan EA, George SL, Cancer Chemother Rep 1970, 54:225-235）、Ｂｏｙｄの式（Current, JD (1998), The Internet Journal of Anesthesiology 2 (2); and Boyd, Edith (1935), University of Minnesota. The Institute of Child Welfare, Monograph Series, No. x. London: Oxford University Press）、Ｆｕｊｉｍｏｔｏの式（Fujimoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50）、Ｔａｋａｈｉｒａの式（Fujimoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50）、ならびにＳｃｈｌｉｃｈの式（Schlich E, et al., Ernaehrungs Umschau 2010;57:178-183）が挙げられる。
【０１０７】
本明細書において、「免疫−腫瘍学薬剤」は、ヒト対象における免疫応答を刺激または増強または上方制御する薬剤を指し、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストおよび免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上の刺激性受容体のアゴニストが含まれる。例示的な免疫−腫瘍学薬剤は、例えば、「併用療法」と題される節において、本明細書にさらに記載されている。
【０１０８】
薬物の「予防的有効量」または「予防的有効投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて、疾患を発生するか、または疾患の再発を患うリスクにある対象に投与される場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬物の量である。治療薬または予防薬の疾患退縮を促進する能力または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、臨床治験の際にヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、インビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の種々の方法を使用して評価できる。
【０１０９】
例として、抗癌剤は、対象において、癌進行を減速するか、または癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施形態では、治療上有効な量の薬物は、癌を排除するところまで癌退縮を促進する。「癌退縮を促進すること」とは、有効量の薬物を、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与することが、患者において、腫瘍成長または大きさの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１種の疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止またはそうでなければ疾患症状の寛解をもたらすことを意味する。薬理学的有効性とは、薬物の患者において癌退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、容認できるほど低レベルの毒性または細胞、臓器および／または生物レベルでのその他の有害な生理学的効果（有害効果）を指す。
【０１１０】
腫瘍の治療の例として、薬物の治療上有効な量または投与量は、未治療の対象と比較して、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、一層より好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施形態では、薬物の治療上有効な量または投与量は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害し、すなわち好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を１００％阻害する。化合物の腫瘍成長を阻害する能力は、以下に記載されるアッセイを使用して評価できる。あるいは、この組成物の特性は、化合物の細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定され得る。本明細書に記載されるその他の好ましい実施形態では、腫瘍退縮が観察され得、少なくとも約２０日、より好ましくは、少なくとも約４０日または一層より好ましくは、少なくとも約６０日の期間継続し得る。
【０１１１】
用語「患者」および「対象」とは、予防的または治療的処置のいずれかを受ける任意のヒトまたは非ヒト動物を指す。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、進行固形腫瘍などの癌を有する対象または患者を治療するために使用され得る。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの哺乳動物および非哺乳動物、両生類、爬虫類などを含む。
【０１１２】
本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【０１１３】
Ｉ．抗ＣＤ７３抗体
特定の機能的特徴または特性を特徴とし、例えば、免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせて使用した場合に癌の治療において有用である、抗体、例えば、完全ヒト抗体が、本明細書に記載される。例えば、抗体は、ヒトＣＤ７３と特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルＣＤ７３など、１種または複数の非ヒト霊長類由来のＣＤ７３と交差反応し得る。
【０１１４】
可溶性および／または膜結合型ヒトＣＤ７３と特異的に結合することに加えて、本明細書に記載される抗体は、以下の機能的特性：
（ａ）ＣＤ７３酵素活性（可溶性または膜結合型）を阻害し、結果として、産生されるアデノシンを低減すること、
（ｂ）カニクイザルＣＤ７３と結合すること、
（ｃ）細胞、例えば、腫瘍細胞への抗体媒介性ＣＤ７３内部移行、ならびに
（ｄ）ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３および１５７〜１７２を含むコンホメーションエピトープと結合することのうちの１種または複数を示す。
【０１１５】
好ましくは、抗ＣＤ７３抗体は、高い親和性、例えば、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−８ＭのＫＤで、ヒトＣＤ７３（二量体およびいくつかの実施形態では単量体、アイソフォーム１または２）と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析によって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−７Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−８ＭのＫＤで、可溶性ヒトＣＤ７３と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、本明細書にさらに記載されるように判定される場合、１ｎＭ未満のＥＣ５０で、結合型（例えば、細胞膜結合型、例えば、Ｃａｌｕ６細胞）ヒトＣＤ７３と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ヒトＢ細胞またはヒトＣａｌｕ−６細胞において、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットによって判定される場合、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤで、結合型ヒトＣＤ７３、例えば、細胞膜結合型ヒトＣＤ７３と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍまたは１０−８Ｍ〜１０−７ＭのＫＤで、可溶性ヒトＣＤ７３と結合し、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１１Ｍ〜１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＫＤまたはＥＣ５０で、結合型ヒトＣＤ７３、例えば、細胞膜結合型ヒトＣＤ７３と結合する。
【０１１６】
抗ＣＤ７３抗体、例えば、本明細書に記載される抗体は、スキャッチャード法によって判定される場合、０．１ｎＭ以下のＫＤでヒトＢ細胞と結合し得る、１ｎＭ以下のＫＤでヒトＣａｌｕ−６細胞と結合し得る、および／または１ｎＭ以下のＫＤでカニクイザルＣＤ７３−ＣＨＯ細胞と結合し得る。
【０１１７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、高い親和性でカニクイザルＣＤ７３と結合する、例えば、それは、例えば、本明細書にさらに記載されるように判定される場合、０．１ｎＭ〜１０ｎＭのＥＣ５０、例えば、１ｎＭ未満のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３を発現するＣＨＯ細胞と結合する。
【０１１８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体はまた、例えば、実施例において測定される場合、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｎＭ〜０．０１ｎＭ、１００ｎＭ〜０．１ｎＭ、１００ｎＭ〜１ｎＭまたは１０ｎＭ〜０．１ｎＭのＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３と結合する、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３、例えば、カニクイザルＣＤ７３を発現するＣＨＯ細胞と結合する。
【０１１９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＳＥＣによって判定される場合、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％単量体である。抗ＣＤ７３抗体はまた、本明細書に記載されるものと類似であるかまたはその範囲内の生物物理学的特徴を有し得る。
【０１２０】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、実施例にさらに記載されるように、ＣＤ７３ビーズ結合アッセイにおいて判定される場合、または細胞、例えば、Ｃａｌｕ６、ＳＫＭＥＬ２４もしくはＨ２９２細胞において判定される場合またはインビボアッセイ、例えば、異種移植片腫瘍モデルにおいて判定される場合に、ヒトおよび／またはカニクイザルＣＤ７３の酵素活性を阻害する。抗ＣＤ７３抗体は、本明細書に記載される抗体のものと少なくとも類似であるかまたはその範囲内である、阻害性活性を有し得る。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、１０ｎＭ未満もしくは５ｎＭ未満または１〜１０ｎＭもしくは５〜１０ｎＭの範囲のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３（例えば、固体に結合したＣＤ７３）の酵素活性（アデノシン産生）を阻害し得る。抗ＣＤ７３抗体は、細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞において、１０ｎＭ未満もしくは１ｎＭ未満または０．１〜１０ｎＭ、０．１〜１ｎＭもしくは０．１〜０．５ｎＭの範囲のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３の活性を阻害し得る。
【０１２１】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、実施例にさらに記載されるように、ハイコンテント内部移行アッセイまたはＦＡＣＳまたはフローサイトメトリーにおいて判定される場合、それが結合する細胞によって内部移行される（およびＣＤ７３内部移行を媒介する）。抗ＣＤ７３抗体は、実施例に記載される抗体のものと少なくとも類似であるかまたはその範囲内である、内部移行特徴（ＥＣ５０、Ｔ１／２、およびＹｍａｘ）ならびにプラトーまでの時間を有し得る。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ハイコンテント内部移行アッセイ（実施例６Ａに記載される）において判定される場合、１種または複数の細胞型、例えば、実施例に記載されるものにおいて、１時間未満、例えば、３０分未満、１５分未満、１２分未満、１０分未満、７分未満またはさらには５分未満である内部移行のＴ１／２を有する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、実施例６Ａに記載されるハイコンテント内部移行アッセイを使用してまたは例えば、実施例６Ｂに記載されるフローサイトメトリーを使用して、判定される場合、１０時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１時間以下、例えば、１０分間〜１０時間、１０分間〜６時間、１時間〜１０時間または１時間〜６時間の範囲内に、最大の抗ＣＤ７３抗体媒介性内部移行に達する。抗ＣＤ７３抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の最大レベルは、細胞型に応じて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上であり得る。例えば、Ｃａｌｕ６細胞における抗ＣＤ７３抗体媒介性ＣＤ７３内部移行のＥＣ５０は、実施例に記載されるハイコンテント内部移行アッセイにおいて測定される場合、１０ｎＭ未満、例えば、０．１〜１０ｎＭまたは１〜１０ｎＭまたは１〜５ｎＭであり得、Ｙｍａｘは、少なくとも９０％または少なくとも９５％であり得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、細胞への内部移行後にエンドソームマーカーと共局在化する。例えば、抗ＣＤ７３抗体、例えば、１１Ｆ１１は、Ｃａｌｕ−６細胞において、細胞が抗ＣＤ７３抗体と接触してから１５分以内、３０分以内、６０分以内および／または１２０分以内に、エンドソームマーカーＥＥＡ１、Ｒａｂ７および／またはＬａｍｐ−１と共局在化する。
【０１２３】
抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗体は、例えば、実施例６Ａに記載されるように、ハイコンテント内部移行アッセイにおいて測定される場合、以下のＣＤ７３内部移行特徴を媒介し得る：
−Ｃａｌｕ６細胞において１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．１〜１０ｎＭまたは０．１〜１ｎＭのＥＣ５０；少なくとも９０％、９５％または９８％のＹｍａｘ（内部移行の最大の割合）ならびにＣａｌｕ６細胞において３０分未満または１０分未満のＴ１／２；
−ヒト細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞、ＨＣＣ４４細胞、Ｈ２０３０細胞、Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞、ＳＫＬＵ１細胞、ＳＫＭＥＳ１細胞またはＳＷ９００細胞において、３０分未満または１０分未満のＴ１／２。
【０１２４】
抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗体は、例えば、実施例６Ｂに記載されるように、フローサイトメトリーによって測定される場合、以下のＣＤ７３内部移行特徴を媒介し得る：
−Ｃａｌｕ６細胞において１時間以下のＴ１／２および少なくとも７０％のＹｍａｘ；
−ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において３０分以下のＴ１／２および少なくとも７０％のＹｍａｘ；
−ＳＮＵＣ１細胞において２時間以下のＴ１／２および少なくとも３０％のＹｍａｘ；ならびに／または
−ＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞において３０分以下のＴ１／２および少なくとも６０％のＹｍａｘ。
【０１２５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ｂｉｎ１抗体である、すなわち、これは、ヒトＣＤ７３との結合について、１１Ｆ１１と競合するが、４Ｃ３とは競合しない。
【０１２６】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、実施例にさらに記載されるように、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、エピトープ、例えば、ヒトＣＤ７３のＮ末端部分のコンホメーションエピトープ、例えば、ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３内に位置するエピトープ（配列番号９６）と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３のアミノ酸１５７〜１７２（配列番号９７）またはヒトＣＤ７３のアミノ酸１５７〜１７２内に位置するエピトープ（配列番号９７）と結合する。あるいは、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、エピトープ、例えば、ヒトＣＤ７３のＮ末端部分の不連続なエピトープと結合する。
【０１２７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３およびアミノ酸１５７〜１７２と結合するか、またはヒトＣＤ７３アイソフォーム１もしくは２のアミノ酸６５〜８３およびアミノ酸１５７〜１７２内のエピトープ、すなわち、アミノ酸配列ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）およびＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３のアミノ酸６５〜８３およびアミノ酸１５７〜１７２のすべてまたは一部と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、グリコシル化および非グリコシル化の両方のヒトＣＤ７３と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、グリコシル化ＣＤ７３のみと結合し、非グリコシル化ＣＤ７３とは結合しない。
【０１２８】
抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３との結合について、本明細書に記載されるＣＤＲまたは可変領域、例えば、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のものを含む抗ＣＤ７３抗体と競合し得る（またはその結合を阻害し得る）。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のヒトＣＤ７３との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。特定の実施形態では、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１は、抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のヒトＣＤ７３との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害し、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１は、抗ＣＤ７３抗体のヒトＣＤ７３との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％阻害する（例えば、両方の方向で競合する）。競合実験は、例えば、例として実施例において本明細書にさらに記載されるように、行われ得る。
【０１２９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＦｃＲ結合要件の欠如によって判定される場合、ＣＤ７３酵素活性を阻害する、および／または多価架橋を必要とすることなく細胞に内部移行する。
【０１３０】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、表３に列挙される特徴のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種または１１種を有する。
【０１３１】
表３：抗ＣＤ７３抗体の潜在的な特徴
（１）例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析によって測定される場合、例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＫＤで、ヒトＣＤ７３、例えば、ビーズ結合型ヒト二量体ヒトＣＤ７３アイソフォーム１および２と結合すること、
（２）例えば、１ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１ｎＭ）のＥＣ５０で、膜結合型ヒトＣＤ７３と結合すること、
（３）例えば、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ〜１０ｎＭ）のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルＣＤ７３と結合すること、
（４）例えば、１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（５）１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（６）１０ｎＭ以下のＥＣ５０で、Ｃａｌｕ６細胞における内因性（細胞性）ヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（７）インビボでヒトＣＤ７３酵素活性を阻害すること、
（８）例えば、１時間未満、３０分未満もしくは１０分未満のＴ１／２および／または少なくとも７０％、８０％もしくは９０％のＹｍａｘでの細胞への内部移行、例えば、抗体媒介性（または依存性）ＣＤ７３内部移行、
（９）ヒトＣＤ７３上のコンホメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）および／またはＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）のすべてまたは一部分を含む、アミノ酸配列（配列番号１）内の不連続なエピトープと結合すること、
（１０）ヒトＣＤ７３との結合について、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、および
（１１）Ｘ線結晶学によって判定される場合、ＣＤ７３．４と類似のパターンで、ヒトＣＤ７３と相互作用すること。
【０１３２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、可溶性ＣＤ７３、例えば、可溶性ヒトＣＤ７３（例えば、可溶性血清ＣＤ７３）と結合する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、可溶性ヒトＣＤ７３の酵素活性を阻害する。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、膜結合型および可溶性ＣＤ７３タンパク質と結合し、膜結合型および可溶性ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害してもよい。可溶性ヒトＣＤ７３との結合は、例えば、本明細書にさらに記載されるように、膜結合型ＣＤ７３に対するものと同じＫＤ範囲であり得る。可溶性ヒトＣＤ７３の酵素活性の阻害は、例えば、本明細書にさらに記載されるように、膜結合型ＣＤ７３に対するものと同じ活性範囲であり得る。
【０１３３】
当技術分野で公知および本明細書に記載される手法に従って判定されるこれらの機能的特性（例えば、生化学活性、免疫化学活性、細胞活性、生理学活性または他の生物活性など）のうちの１種または複数を示す抗体活性は、特定の活性において、抗体の不在時（または例えば、無関係な特異性の対照抗体が存在する場合）に見られるものと比べた統計学的に有意な相違と関連することが理解される。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体は、測定されたパラメーター（例えば、腫瘍量、腫瘍転移、アデノシンレベル、ｃＡＭＰレベル）を、測定されたパラメーターの少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％および特定の好ましい実施形態では、９２％、９４％、９５％、９７％、９８％または９９％を上回って減少させる。逆に、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体は、測定されたパラメーターを、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％（すなわち、２倍）、３倍、５倍または１０倍増大させる。
【０１３４】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡを含む、種々の種のＣＤ７３に対する抗体の結合能力を評価するための標準アッセイは、当技術分野で公知である。好適なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）もまた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析などの当技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。ＣＤ７３の機能的特性（例えば、アデノシン産生、腫瘍成長および転移、Ｔ細胞阻害）に対する抗体の効果を評価するためのアッセイは、以下および実施例においてさらに詳細に記載されている。
【０１３５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、天然の抗体ではない、または天然に存在する抗体ではない。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、より多い、より少ないもしくは異なる種類の翻訳後修飾を有するなど、天然に存在する抗体のものとは異なる翻訳後修飾を有する。
【０１３６】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＣＤ７３をＴ細胞表面から除去することによって、および／またはその酵素活性を阻害することによって、Ｔｅｆｆ（Ｔエフェクター）機能を刺激する、および／またはＴｒｅｇ機能を低減させる。
【０１３７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、適宜、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはヒンジおよび／もしくはＣＨ１ドメインの断片もしくは誘導体も含み、抗体は、アイソフォームＡをとっている（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、適宜、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはヒンジおよび／もしくはＣＨ１ドメインの断片もしくは誘導体も含み、抗体は、アイソフォームＢをとっている（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。特定の実施形態では、組成物は、アイソフォームＡの抗ＣＤ７３抗体およびアイソフォームＢの抗ＣＤ７３抗体の混合物を含む。
【０１３８】
（ｉ）１１Ｆ１１によって結合されるものと類似のヒトＣＤ７３上の領域と結合するが、４Ｃ３によって結合されるものと類似の領域とは結合しない、可変領域を含み（すなわち、ｂｉｎ１抗体である）、（ｉｉ）１０ｎＭ以下のＫｄで、二量体ヒトＣＤ７３（例えば、可溶性ＣＤ７３）と結合し、（ｉｉｉ）例えば、細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞において、１０ｎＭ未満のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３の酵素活性（ＡＭＰからアデノシンへの変換）を阻害し、（ｉｖ）ヒト細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞、Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞、Ｈ２０３０細胞、ＳＮＵＣ１細胞において、１時間以下（または３０分以下または１０分以下）のＴ１／２、５０％以上（または６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上）のＹｍａｘで、細胞における抗体依存性ＣＤ７３内部移行を媒介する、抗ヒトＣＤ７３抗体が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２ヒンジまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む。（ｉ）１１Ｆ１１によって結合されるものと類似のヒトＣＤ７３上の領域と結合するが、４Ｃ３によって結合されるものと類似の領域とは結合しない、可変領域を含み（すなわち、ｂｉｎ１抗体である）、（ｉｉ）ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって判定される場合、１０ｎＭ以下のＫｄで、二量体ヒトＣＤ７３（例えば、可溶性ＣＤ７３）と結合し、（ｉｉｉ）例えば、細胞、例えば、Ｃａｌｕ６細胞において、１０ｎＭ未満のＥＣ５０で、ヒトＣＤ７３の酵素活性（ＡＭＰからアデノシンへの変換）を阻害し、（ｉｖ）実施例６Ａに記載されるハイコンテント内部移行アッセイを使用して判定される場合、ヒトＣａｌｕ６細胞、Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞またはＨ２０３０細胞において、例えば、３０分以下のＴ１／２、８０％以上のＹｍａｘで、細胞における抗体依存性ＣＤ７３内部移行を媒介する、抗ヒトＣＤ７３抗体が、本明細書において提供される。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、著しく毒性ではない。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、臨床試験において判定される場合、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓のうちの１種または複数に対して、著しく毒性ではない。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫性または炎症を著しく引き起こすことはない。
【０１４０】
ＩＩ．例示的な抗ＣＤ７３抗体
抗ＣＤ７３抗体の可変領域
本明細書に記載される特定の抗体は、抗体１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３−１、−２もしくは−３、ＣＤ７３．４−１および−２、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．５−１および−２、ＣＤ７３．６−１および−２、ＣＤ７３．７−１および−２、ＣＤ７３．８−１および−２、ＣＤ７３．９−１および−２、ＣＤ７３．１０−１および−２ならびにＣＤ７３．１１のＣＤＲおよび／または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ならびにそれらの可変領域またはＣＤＲ配列と少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性）を有する抗体である。表４は、各抗体のＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲの配列番号、ならびにＶＨおよびＶＬ領域のものを記載する。実施例においてさらに記載されるように、特定の重鎖は、１種を上回る軽鎖を伴って存在し得、代替的な軽鎖の配列番号もまた、以下の表に提供される。
【０１４１】
【表３】
2019514844.tif 000004
【０１４２】
重鎖可変領域が配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０〜１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０１４３】
また、軽鎖可変領域が配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２および２３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、提供される。
【０１４４】
（ａ）それぞれ、配列番号１３５および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｂ）それぞれ、配列番号１３５および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｃ）それぞれ、配列番号４および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｄ）それぞれ、配列番号４および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｅ）それぞれ、配列番号１６および２０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｆ）それぞれ、配列番号１６および２４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｇ）それぞれ、配列番号１６および２８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｈ）それぞれ、配列番号３２および３６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｉ）それぞれ、配列番号４０および４４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｊ）それぞれ、配列番号４０および４８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｋ）それぞれ、配列番号５２および５６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｌ）それぞれ、配列番号６０および６４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｍ）それぞれ、配列番号６８および７２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｎ）それぞれ、配列番号６８および７６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｏ）それぞれ、配列番号６８および２３８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｐ）それぞれ、配列番号８０および８４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｑ）それぞれ、配列番号８８および９２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｒ）それぞれ、配列番号１７０および２０を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｓ）それぞれ、配列番号１７０および２４を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｔ）それぞれ、配列番号１７０および２８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｕ）それぞれ、配列番号１７１および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｖ）それぞれ、配列番号１７１および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｗ）それぞれ、配列番号１７２および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｘ）それぞれ、配列番号１７２および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｙ）それぞれ、配列番号１７３および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｚ）それぞれ、配列番号１７３および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ａ２）それぞれ、配列番号１７４および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｂ２）それぞれ、配列番号１７４および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｃ２）それぞれ、配列番号１７５および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｄ２）それぞれ、配列番号１７５および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｅ２）それぞれ、配列番号１７６および８を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
（ｆ２）それぞれ、配列番号１７６および１２を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、または
（ｇ２）それぞれ、配列番号１７７および３６を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０１４５】
抗ＣＤ７３抗体は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、１１Ｆ１１、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、５Ｆ８−３、６Ｅ１１および７Ａ１１の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組合せを含み得る。
【０１４６】
これらの抗体のそれぞれがＣＤ７３と結合すること、および抗原結合特異性が、主に、ＣＤＲ１、２および３領域によって提供されることを考慮すると、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、本明細書に記載される他の抗ＣＤ７３結合分子を作製するために、「混合および対応させる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合および対応させることができるが、各抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３を含有しなければならい）。このような「混合および対応させた」抗体のＣＤ７３結合は、上記および実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。好ましくは、ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合および対応させる場合、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列が、構造的に類似のＣＤＲ配列と置換されている。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合および対応させる場合、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列が、好ましくは、構造的に類似のＣＤＲ配列と置換されている。新規なＶＨおよびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列をモノクローナル抗体ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１に関して本明細書に開示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似の配列と置換することによって作製できることが、当業者には容易に明らかであると予想される。本明細書において開示される特定の抗体と同等またはそれより優れた、結合親和性、生理活性および／またはその他の特性を有する「混合および対応させた」抗体が、本発明の方法において使用するために選択され得る。
【０１４７】
（ａ）配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、ならびに
（ｆ）配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供され、
ここで、抗体は、ヒトＣＤ７３と特異的に結合する。
【０１４８】
特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、それぞれ、配列番号５〜７、１７〜１９、３３〜３５、４１〜４３、５３〜５５、６１〜６３、６９〜７１、８１〜８３または８９〜９１を含み、
ここで、抗体は、ヒトＣＤ７３と特異的に結合する。
【０１４９】
特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、それぞれ、（ａ）配列番号９〜１１、１３〜１５、２１〜２３、２５〜２７、２９〜３１、３７〜３９、４５〜４７、４９〜５１、５７〜５９、６５〜６７、７３〜７５、７７〜７９、８５〜８７または９３〜９５を含み、
ここで、抗体は、ヒトＣＤ７３と特異的に結合する。
【０１５０】
特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５〜７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９〜１１を含む、
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５〜７を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３〜１５を含む、
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７〜１９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２１〜２３を含む、
（ｄ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７〜１９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５〜２７を含む、
（ｅ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７〜１９を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２９〜３１を含む、
（ｆ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３３〜３５を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３７〜３９を含む、
（ｇ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４１〜４３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４５〜４７を含む、
（ｈ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４１〜４３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９〜５１を含む、
（ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５３〜５５を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５７〜５９を含む、
（ｊ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６１〜６３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６５〜６７を含む、
（ｋ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６９〜７１を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７３〜７５を含む、
（ｌ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６９〜７１を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７７〜７９を含む、
（ｍ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８１〜８３を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８５〜８７を含む、または
（ｎ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８９〜９１を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９３〜９５を含み、
ここで、抗体は、ヒトＣＤ７３と特異的に結合し、表３に列挙された特徴のうちの１種または複数、例えば、ＡＭＰの脱リン酸化を阻害し、受容体依存性ＣＤ７３内部移行を媒介する能力を有してもよい。
【０１５１】
特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５〜７からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９〜１１からなる、
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５〜７からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１３〜１５からなる、
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７〜１９からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２１〜２３からなる、
（ｄ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７〜１９からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２５〜２７からなる、
（ｅ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１７〜１９からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２９〜３１からなる、
（ｆ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３３〜３５からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３７〜３９からなる、
（ｇ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４１〜４３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４５〜４７からなる、
（ｈ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４１〜４３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４９〜５１からなる、
（ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５３〜５５からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５７〜５９からなる、
（ｊ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６１〜６３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６５〜６７からなる、
（ｋ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６９〜７１からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７３〜７５からなる、
（ｌ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６９〜７１からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７７〜７９からなる、
（ｍ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８１〜８３からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８５〜８７からなる、または
（ｎ）重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８９〜９１からなり、軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９３〜９５からなり、
ここで、抗体は、ヒトＣＤ７３と特異的に結合し、表３に列挙された特徴のうちの１種または複数、例えば、ＡＭＰの脱リン酸化を阻害し、受容体依存性ＣＤ７３内部移行を媒介する能力を有してもよい。
【０１５２】
抗ＣＤ７３抗体の重鎖定常ドメイン
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、またはそれらの組合せおよび／もしくはそれらの修飾形のものであり得る。抗ＣＤ７３抗体は、エフェクター機能を有してもよく、または低減されたエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有さなくてもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、増強された特性を抗体に提供する修飾された重鎖定常領域を含む。実施例に示されるように、ＩｇＧ２ヒンジを有し、適宜ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗ＣＤ７３抗体、例えば、１１Ｆ１１抗体の可変領域を有するものは、同一の可変領域を有するが、非ＩｇＧ２ヒンジまたはＣＨ１を有する抗体と比べて、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ１  ＣＨ１を有する抗体と比べて、より良好かつ迅速に内部移行される。例えば、１１Ｆ１１抗体の可変領域を含み、ＩｇＧ２ヒンジならびに適宜ＩｇＧ２  ＣＨ１およびＩｇＧ１  ＣＨ２およびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む抗体は、エフェクター機能の有無に関係なく、同一抗体であるがＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを有するものと比べて、細胞膜上のＣＤ７３と結合したときに、より効率的に細胞に内部移行される。本明細書にさらに示されるように、ＩｇＧ２ヒンジを有し、残りがＩｇＧ１アイソタイプの抗体のものであるＣＤ７３抗体は、ヒンジがＩｇＧ１アイソタイプのものである同一抗体よりも効率的に内部移行する。ＩｇＧ２ヒンジに加えて、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＣＨ１ドメインがＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである同一抗体よりもさらにより効率的に内部移行する。本明細書にさらに示されるように、ＩｇＧ２ヒンジおよび適宜ＩｇＧ２  ＣＨ１を有する抗ＣＤ７３抗体はまた、ＩｇＧ１ヒンジまたはＩｇＧ１ヒンジおよびＩｇＧ１  ＣＨ１を有する抗体よりも大きな抗体／抗原複合体を形成する。内部移行の増大は、抗体／抗原複合体サイズの増大と相関性があるとみられる。実施例にさらに記載されるように、増強された内部移行は、抗体の親和性の高さまたは低さと関連するとは考えられない。したがって、抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を媒介する修飾された重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体が、本明細書において提供され、ここで、修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、同一抗体であるが異なる重鎖定常領域を有するものと類似の親和性でＣＤ７３と結合する。
【０１５３】
特定の実施形態では、ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ（「ＩｇＧ２ヒンジ」）ならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジならびにＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ２アイソタイプのものではない。特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１を含み、ここで、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのうちの少なくとも１つは、ＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ＩｇＧ２ヒンジは、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ（例えば、配列番号１３６を有する）またはその変異体であってもよいが、ただし、ＩｇＧ２ヒンジが、非ＩｇＧ２ヒンジおよび適宜非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む同一抗体のものと比べて、増強された活性（例えば、細胞による内部移行の増大、酵素活性の阻害の増強、アンタゴニストもしくは遮断活性の増大、大きな抗体／抗原架橋複合体を形成する能力、免疫応答を刺激もしくは増強する能力の増大、ならびに／または抗増殖もしくは抗腫瘍効果の増大）を抗体に付与する能力を保持することを条件とする。特定の実施形態では、ＩｇＧ２ヒンジ変異体は、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものと類似の強度または剛性を保持する。ヒンジまたは抗体の強度は、例えば、コンピュータモデリング、電子顕微鏡法、分析法、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶学（Ｂ因子）または沈降速度解析超遠心分離（ＡＵＣ）によってヒンジを含む抗体の旋回の半径を測定または比較することによって判定することができる。ヒンジまたは抗体は、ヒンジを含む抗体が、異なるヒンジ、例えば、ＩｇＧ１ヒンジを有する同一抗体の値と、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％以内で異なる、前の文章に記載される試験のうちの１つにより得られた値を有する場合、別のヒンジと比べて類似または高い強度を有し得る。当業者であれば、これらの試験の結果を解釈することにより、ヒンジまたは抗体が、それぞれ、別のヒンジまたは抗体のものに少なくとも類似する強度を有するかどうかを、これらの試験から判定することができると予想される。例示的ヒトＩｇＧ２ヒンジ変異体は、４つのシステイン残基（すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９）のうちの１つまたは複数と、別のアミノ酸との置換を含む、ＩｇＧ２ヒンジである。システインは、セリンと置換され得る。例示的ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９Ｘ突然変異またはＣ２２０Ｘ突然変異を含む、ヒトＩｇＧ２ヒンジであり、ここで、Ｘは、システイン以外の任意のアミノ酸である。特定の実施形態では、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９ＸおよびＣ２２０Ｘ置換の両方は含まない。特定の実施形態では、ＩｇＧ２ヒンジは、Ｃ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを含むが、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両方は含まない。使用され得る他のＩｇＧ２ヒンジとして、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ突然変異（Ｃ２１９Ｓ突然変異との組合せであってもよ���）を含むヒトＩｇＧ２ヒンジが挙げられる。ＩｇＧ２ヒンジはまた、ヒンジの一部分が、別のアイソタイプのものであるＩｇＧ２ヒンジであってもよい（すなわち、これは、キメラまたはハイブリッドヒンジである）が、ただし、キメラヒンジの強度が、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものと少なくとも類似することを条件とする。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ（表２に定義される）が、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジである、ＩｇＧ２ヒンジであってもよい。
【０１５４】
「ハイブリッド」または「キメラ」ヒンジは、ヒンジの連続したアミノ酸のうちの半分を上回るものが、特定のアイソタイプに由来する場合、そのアイソタイプのものであると呼ばれる。例えば、ＩｇＧ２の上部ヒンジおよび中部ヒンジならびにＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ハイブリッドヒンジと見なされる。
【０１５５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、以下のヒンジのうちの１つ、
ERKCCVECPPCPAPPVAG（配列番号３４８）；
ERKSCVECPPCPAPPVAG（配列番号３４９）；
ERKCSVECPPCPAPPVAG（配列番号３５０）；
ERKXCVECPPCPAPPVAG（配列番号３５１）；
ERKCXVECPPCPAPPVAG（配列番号３５２）；
ERKCCVECPPCPAPPVAGX（配列番号３５３）；
ERKSCVECPPCPAPPVAGX（配列番号３５４）；
ERKCSVECPPCPAPPVAGX（配列番号３５５）；
ERKXCVECPPCPAPPVAGX（配列番号３５６）；
ERKCXVECPPCPAPPVAGX（配列番号３５７）；
ERKCCVECPPCPAPELLGG（配列番号３５８）；
ERKSCVECPPCPAPELLGG（配列番号３５９）；
ERKCCSVECPPCPAPELLGG（配列番号３６０）；
ERKXCVECPPCPAPELLGG（配列番号３６１）；
ERKCXVECPPCPAPELLGG（配列番号３６２）；
ERKCCVECPPCPAPELLG（配列番号３６３）；
ERKSCVECPPCPAPELLG（配列番号３６４）；
ERKCCSVECPPCPAPELLG（配列番号３６５）；
ERKXCVECPPCPAPELLG（配列番号３６６）；
ERKCXVECPPCPAPELLG（配列番号３６７）；
ERKCCVECPPCPAP（配列番号３６８）；
ERKSCVECPPCPAP（配列番号３６９）；
ERKCSVECPPCPAP（配列番号３７０）；
ERKXCVECPPCPAP（配列番号３７１）；または
ERKCXVECPPCPAP（配列番号３７２）、
（式中、Ｘは、システイン以外の任意のアミノ酸である）
または１〜５個、１〜３個、１〜２個もしくは１個のアミノ酸が、アミノ酸残基ＣＶＥおよびＣＰＰの間に挿入されている、上記配列のうちのいずれかを含むＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、ＴＨＴまたはＧＧＧが挿入されている。
【０１５６】
特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、１個、２個、３個または４個すべてのアミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７（Ｃ末端の４個のアミノ酸「ＰＶＡＧ」（配列番号３７３に対応する）が、欠失しているか、または別のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１ヒンジのＣ末端のアミノ酸（ＥＬＬＧ（配列番号３７４）もしくはＥＬＬＧＧ（配列番号３７５）と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ａ２３５およびＧ２３７が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ｇ２３７が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号３４８、３４９、３５０、３５１または３５２を含み、ここで、Ｖ２３４およびＡ２３５が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。例えば上記で示したようなハイブリッドヒンジを得るための、ＩｇＧ２のＰＶＡＧ（配列番号３７３）の、ＩｇＧ１ヒンジの対応するアミノ酸での置換、すなわち（ＥＬＬＧ（配列番号３７４）またはＥＬＬＧＧ（配列番号３７５））での置換は、例えば、ＩｇＧ２ヒンジの利点およびＩｇＧ１ヒンジのエフェクター機能を有するヒンジを提供する。
【０１５７】
特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、上記の配列のうちの１つ、例えば、配列番号３４８〜３７２のうちのいずれかからなるかまたは本質的になるヒンジを含み、例えば、さらなるヒンジアミノ酸残基を含まない。
【０１５８】
特定の実施形態では、１個または１〜２個または１〜３個のアミノ酸が、ヒンジとＣＨ２ドメインとの間に挿入されており、例えば、追加のグリシンが付加され得る。
【０１５９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域を含む修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、ヒンジは、１〜１０個のアミノ酸の欠失を含む。実施例に示されるように、アミノ酸残基ＳＣＤＫＴＨＴ（Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５、配列番号３７６）を欠くＩｇＧ１抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同一抗体よりも効率的な抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を、抗体に付与した。同様に、ＩｇＧ２抗体の文脈において、アミノ酸残基ＣＣＶＥ（Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４、配列番号３７７）を欠くＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同一抗体よりも効率的な抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を、抗体に付与した。したがって、ヒンジが、ＩｇＧ１抗体については残基Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５、ならびにＩｇＧ２抗体については残基Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４から選択される、１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個のアミノ酸残基の欠失を含む、修飾された重鎖定常領域が、本明細書において提供される。
【０１６０】
特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメイン（それぞれ、「ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン」または「ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン」）である、ＣＨ１ドメインを含む。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン（それぞれ、「ＩｇＧ３  ＣＨ１ドメイン」および「ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン」）もまた、使用され得る。ＣＨ１ドメインはまた、野生型ＣＨ１ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインの変異体であってもよい。ＣＨ１ドメインの例示的変異体として、Ａ１１４Ｃ、Ｔ１７３Ｃおよび／またはＣ１３１、例えば、Ｃ１３１Ｓが挙げられる。
【０１６１】
ＣＨ１ドメイン、例えば、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインは、置換Ｃ１３１Ｓを含み得、この置換により、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジを有する抗体に、Ｂ形態（またはコンホメーション）が付与される。
【０１６２】
特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのものであるＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、野生型ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン、例えば、アミノ酸配列：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶ（配列番号３７８）を有するものである。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、配列番号３７８の変異体であり、配列番号３７８と比べて、１〜１０個、１〜５個、１〜２個または１個のアミノ酸置換または欠失を含む。実施例にさらに記載されるように、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはその変異体は、ＩｇＧ１抗体と比べて増強または変更された内部移行特性、ならびに抗体がＩｇＧ２ヒンジも含む場合にはさらにより増強または変更された内部移行を、抗ＣＤ７３抗体に付与することが、本明細書に示されている。特定の実施形態では、ＩｇＧ２  ＣＨ１変異体は、以下のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換または欠失を含まず：Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８、これらのアミノ酸残基は、上記に示された配列番号３７８において、太字と下線で示されている。例えば、修飾された重鎖定常領域は、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８のいずれも別のアミノ酸と置換されることも欠失していることもないか、またはＣ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８のいずれも別のアミノ酸と置換されることも欠失していることもない、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含み得る。特定の実施形態では、Ｃ１３１は、別のアミノ酸、例えば、Ｃ１３１Ｓと置換され、この置換がトリガーとなって、抗体がコンホメーションＢをとるようになる。修飾された重鎖定常領域を有するコンホメーションＡおよびコンホメーションＢのいずれの抗体も、ＩｇＧ１定常領域を有する同一抗体と比べて、増強された活性を有することが本明細書に示されている。
【０１６３】
特定の実施形態では、Ｎ１９２および／またはＦ１９３（上記に示される配列番号３７８において斜体と下線の残基として示される）は、別のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１における対応するアミノ酸、すなわち、Ｎ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌと置換される。
【０１６４】
特定の実施形態では、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの１つまたは複数のアミノ酸残基は、ＩｇＧ４における対応するアミノ酸残基と置換される。例えば、Ｎ１９２は、Ｎ１９２Ｓとなってもよく、Ｆ１９３は、Ｆ１９３Ｌとなってもよく、Ｃ１３１は、Ｃ１３１Ｋとなってもよく、および／またはＴ２１４は、Ｔ２１４Ｒとなってもよい。
【０１６５】
抗体は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはその変異体およびＩｇＧ２ヒンジまたはその変異体を含む修飾された重鎖定常領域を含み得る。ヒンジおよびＣＨ１ドメインは、本明細書に記載される任意のＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの組合せであり得る。特定の実施形態では、ＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジは、以下のアミノ酸配列ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号３７９）または多くとも１〜１０個のアミノ酸がそれとは異なるアミノ酸配列を含む。アミノ酸変異体は、上記のヒンジおよびＣＨ１ドメインについて記載される通りである。
【０１６６】
特定の実施形態では、抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、適宜ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはヒンジの断片もしくは誘導体および／またはＣＨ１ドメインも含み、抗体は、形態（コンホメーションの）Ａをとっている（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、適宜ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはヒンジの断片もしくは誘導体および／またはＣＨ１ドメインも含み、抗体は、形態Ｂをとっている（例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと）。
【０１６７】
特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメイン（それぞれ、「ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン」、「ＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン」、「ＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン」または「ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン」）である、ＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインはまた、野生型ＣＨ２ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインの変異体であってもよい。ＣＨ２ドメインの例示的変異体として、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣなど、抗体のＦｃ領域の生物活性を調節するか、または抗体の半減期もしくはその安定性を調節する、変異体が挙げられる。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ突然変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは、突然変異を有さない同一のＣＨ２突然変異体と比べて、低減されたエフェクター機能を有する。ＣＨ２ドメインは、増強されたエフェクター機能を有し得る。ＣＨ２ドメインは、以下の突然変異：ＳＥ（Ｓ２６７Ｅ）、ＳＥＬＦ（Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ）、ＳＤＩＥ（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ）、ＳＥＦＦおよびＧＡＳＤＡＬＩＥ（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）ならびに／または以下のアミノ酸：Ｅ２３３、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ｐ２７１、Ｌ３２８およびＡ３３０における１つもしくは複数の突然変異のうちの１つまたは複数を含み得る。他の突然変異が、本明細書の他の箇所にさらに記載されている。
【０１６８】
特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメイン（それぞれ、「ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン」、「ＩｇＧ２  ＣＨ３ドメイン」、「ＩｇＧ３  ＣＨ３ドメイン」または「ＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン」）である、ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインはまた、野生型ＣＨ３ドメインの変異体、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの変異体であってもよい。ＣＨ３ドメインの例示的変異体として、ＡＤＣＣもしくはＣＤＣなど、抗体のＦｃ領域の生物活性を調節するか、または抗体の半減期もしくはその安定性を調節する、変異体が挙げられる。
【０１６９】
特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１領域を含む。ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１は、野生型ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１またはそれらの変異体であってもよいが、ただし、それらが、所望される生物活性を有することを条件とする。特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、Ｃ２１９Ｓ突然変異を含むＩｇＧ２ヒンジならびに野生型であり得るかまたは多くとも１〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個もしくは１個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含み得るＩｇＧ２  ＣＨ１を含む。修飾された重鎖定常領域は、野生型または突然変異型ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをさらに含み得る。例えば、ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン、Ｃ２１９Ｓを含み得るＩｇＧ２ヒンジならびＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常ドメインを含み得、ここで、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、突然変異Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含むなど、エフェクターレスであってもよい。
【０１７０】
一般に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの変異体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上の突然変異ならびに／または多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個の突然変異または１〜１０個もしくは１〜５個の突然変異を含み得るか、あるいは対応する野生型ドメイン（それぞれ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）のものと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み得るが、ただし、特定の変異体を含む重鎖定常領域が、必要な生物活性を保持することを条件とする。
【０１７１】
表５は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む例示的ヒト重鎖定常領域を記載しており、ここで、各ドメインは、野生型ドメインまたは重鎖定常領域に所望される生物活性を提供するその変異体のいずれかである。表５内の空白のセルは、そのドメインが存在するかまたは存在しないことを示し、存在する場合には、どのアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであってもよいことを示す。例えば、表５において重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインも含んでもよい重鎖定常領域を含む抗体であり、これらのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、存在する場合には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。表５を理解するための別の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ３ドメインも含んでも含まなくてもよい重鎖定常領域を含む抗体であり、ＣＨ３ドメインは、存在する場合には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る。
【０１７２】
【表４】
2019514844.tif 000005
【０１７３】
特定の実施形態では、表５に示される重鎖定常領域を含む抗体は、その特定の重鎖定常領域を含まない重鎖定常領域を含む同一抗体と比べて、またはＩｇＧ１定常領域を含む同一抗体と比べて、増強された生物活性を有する。
【０１７４】
特定の実施形態では、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含むＣＤ７３抗体の生物活性を改善するための方法は、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗ＣＤ７３抗体を提供し、非ＩｇＧ２ヒンジおよび非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを、それぞれ、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインと置換することを含む。修飾された重鎖定常領域を含まないＣＤ７３抗体の生物活性を改善するための方法は、修飾された重鎖定常領域を含まない抗ＣＤ７３抗体を提供し、その重鎖定常領域を修飾された重鎖定常領域と置換することを含み得る。
【０１７５】
抗ＣＤ７３可変領域、例えば、本明細書に記載されるものに連結され得る例示的な修飾された重鎖定常領域は、表６に提供されており、この表は、ドメインのそれぞれの同一性について記載している。
【０１７６】
【表５】
2019514844.tif 000006
【０１７７】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１２３、１３６、１７８、１７９または３４８〜３７２を含むＩｇＧ２ヒンジまたはその変異体、例えば、（ｉ）配列番号１２３、１３６、１７８、１７９もしくは３４８〜３７２とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉ）配列番号１２３、１３６、１７８、１７９もしくは３４８〜３７２とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉｉ）配列番号１２３、１３６、１７８、１７９もしくは３４８〜３７２とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、ならびに／または（ｉｖ）配列番号１２３、１３６、１７８、１７９もしくは３４８〜３７２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を含むＩｇＧ２を含む、修飾された重鎖定常領域を含み、ここで、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちのいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、増強された生物活性を有する。例えば、ヒンジは、野生型であってもよく、またはＣ２１９Ｓ、Ｃ２２０ＳもしくはＣ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓ置換を含んでもよい。
【０１７８】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号９８を含むＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインもしくは配列番号１２４を含むＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン、または配列番号９８もしくは１２４の変異体を含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、（ｉ）配列番号９８もしくは１２４とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉ）配列番号９８もしくは１２４とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉｉ）配列番号９８もしくは１２４とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または（ｉｖ）配列番号９８もしくは１２４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちのいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジもしくは非ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジまたは非ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、増強された生物活性を有する。ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインは、Ｃ１３１ＳまたはＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を含む抗体にＡもしくはＢのいずれかの形態をとらせる別の突然変異を含み得る。
【０１７９】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３７もしくは１２５または配列番号１３７もしくは１２５の変異体を含むＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、（ｉ）配列番号１３７もしくは１２５とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉ）配列番号１３７もしくは１２５とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉｉ）配列番号１３７もしくは１２５とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または（ｉｖ）配列番号１３７もしくは１２５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、増強された生物活性を有する。
【０１８０】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３８または配列番号１３８の変異体を含むＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、（ｉ）配列番号１３８とは、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉ）配列番号１３８とは、多くとも５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉｉ）配列番号１３８とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個もしくは３〜５個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または（ｉｖ）配列番号１３８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、増強された生物活性を有する。
【０１８１】
修飾された重鎖定常領域はまた、上記のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組合せを含んでもよい。
【０１８２】
特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含むＣＤ７３抗体、は、配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つまたは配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つの変異体を含む修飾された重鎖定常領域を含み、この変異体は、（ｉ）配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つとは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉ）配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つとは、多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉｉ）配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つとは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個、３〜５個、１〜１０個もしくは５〜１０個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、ならびに／または（ｉｖ）配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、それぞれ、配列番号１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つにおけるものとは異なるアミノ酸は、対応する野生型免疫グロブリン配列（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）におけるものとは異なるアミノ酸残基ではなく（変異は、これらの配列において特定の修飾されたアミノ酸には生じない）、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちのいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよく、修飾された重鎖定常領域は、別の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジまたは非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常領域のものと比べて、または非ＩｇＧ２ヒンジおよび／もしくは非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む同一の修飾された重鎖定常領域と比べて、増強された生物活性を有する。
【０１８３】
修飾された重鎖定常領域は、（ｉ）野生型重鎖定常領域と比べて類似、低減されたもしくは増大したエフェクター機能（例えば、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＢとの結合）、ならびに／または（ｉｉ）野生型重鎖定常領域と比べて、類似、低減されたもしくは増大した半減期（もしくはＦｃＲｎ受容体との結合）を有し得る。
【０１８４】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体のＶＨドメインは、本明細書に記載される重鎖定常領域と連結され得る。例えば、図１８は、抗体ＣＤ７３．４のアミノ酸配列を示し、ここで、重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３または１８９）である。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３もしくは１８９）のものとは、多くとも１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個もしくは１個のアミノ酸が（置換、付加もしくは欠失により）異なる、および／またはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３もしくは１８９）の重鎖のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、アミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体もまた、本明細書において包含される。例えば、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３または１８９）の重鎖を含む抗体が、本明細書において包含され、ここで、Ｃ末端ＫまたはＧＫまたはＰＧＫは、欠失しているかまたは存在している。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３または１８９）の他の変異体としては、異なるアロタイプのものである重鎖を有するものが挙げられ、ここで、例えば、アミノ酸３５６および３５８は、それぞれ、ＤおよびＬである。変異体には、ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、Ｃ２２０においてさらなるシステインが突然変異したもの（またはＣ２１９Ｓの代わりにＣ２２０Ｓを有するもの）ならびに突然変異Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓを有さないものが含まれる。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３または１８９）の変異体は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号１３３または１８９）と比べて、少なくとも類似の生化学特性および／または生物活性、例えば、内部移行の効率性、ＣＤ７３酵素活性の阻害、ヒトＣＤ７３に対する親和性および同じかもしくは類似のエピトープとの結合を有することが好ましい。
【０１８５】
特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、本明細書に記載される定常領域、例えば、配列番号１２６、１２７、１２９、１３０、１６２〜１６９、１８０〜１８３、２６７〜２８２、３００〜３４７および３９１〜４５４のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む定常領域のうちのいずれか１つを含む。
【０１８６】
抗ＣＤ７３抗体の軽鎖は、配列番号１３１または配列番号１３１の変異体を含む軽鎖定常領域を含み得、この変異体は、（ｉ）配列番号１３１とは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉ）配列番号１３１とは、多くとも１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、（ｉｉｉ）配列番号１３１とは、１〜５個、１〜３個、１〜２個、２〜５個、３〜５個、１〜１０個もしくは５〜１０個のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が異なる、および／または（ｉｖ）配列番号１３１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）〜（ｉｖ）のうちのいずれにおいても、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。例示的なＣＬ突然変異には、Ｃ１２４Ｓが含まれる。
【０１８７】
本明細書に詳述されるように、表３７に記載される重鎖または軽鎖（またはそれらの可変領域）のうちのいずれかと少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖は、所望される特徴、例えば、本明細書にさらに記載されるものを有する抗ヒトＣＤ７３抗体を形成するために使用され得る。例示的な変異体は、例えば、定常ドメインにアロタイプ変異を含むものである。本明細書に記載されるように、表３７に記載される重鎖または軽鎖（またはそれらの可変領域）のいずれかと多くとも１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸が（置換、付加または欠失により）異なるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖は、所望される特徴、例えば、本明細書にさらに記載されるものを有する抗ヒトＣＤ７３抗体を形成するために使用され得る。
【０１８８】
種々の実施形態では、上記の抗体は、本明細書に記載される機能的特性、例えば、表３に列挙されるもののうちの１種もしくは複数、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種またはすべてを示す。
【０１８９】
このような抗体には、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体が含まれる。
【０１９０】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、グリコシル化（例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化）および非グリコシル化の両方のヒトＣＤ７３と結合する。特定の抗ＣＤ７３抗体は、グリコシル化ＣＤ７３とは結合するが非グリコシル化ＣＤ７３とは結合しないか、または非グリコシル化ＣＤ７３とは結合するがグリコシル化ＣＤ７３とは結合しない場合がある。
【０１９１】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、コンホメーションエピトープと結合する。
【０１９２】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３の以下の領域：
ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）内のアミノ酸残基と結合し、
これは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）のアミノ酸残基６５〜８３に対応する。
【０１９３】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３における以下のアミノ酸残基：ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）のすべてまたは一部分と結合し、これは、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）のアミノ酸残基６５〜８３に対応する。
【０１９４】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３の以下の領域：
ＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）内のアミノ酸残基と結合し、
これは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）のアミノ酸残基１５７〜１７２に対応する。
【０１９５】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３における以下のアミノ酸残基：ＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）のすべてまたは一部分と結合し、これは、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）のアミノ酸残基１５７〜１７２に対応する。
【０１９６】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）の以下の領域内の不連続なアミノ酸残基と結合する：
ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）およびＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）。
【０１９７】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）の以下の領域内の不連続なアミノ酸残基：ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）およびＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）のすべてまたは一部分と結合し、これは、例えば、ＨＤＸ−ＭＳによって判定される場合、ヒトＣＤ７３（配列番号１または２）のアミノ酸残基６５〜８３および１５７〜１７２に対応する。
【０１９８】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、Ｘ線結晶学によって判定される場合、表３０に示されるものに対応するヒトＣＤ７３との相互作用を有する。抗体は、表３１に示されるヒトＣＤ７３との相互作用の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％を共有し得る。
【０１９９】
ＩＩＩ．特定の生殖系列配列を有する抗体
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む。
【０２００】
本明細書に示されるように、ヒト生殖系列ＶＨ  ３−３３遺伝子、ＶＨ  ３−１０遺伝子、ＶＨ  ３−１５遺伝子、ＶＨ  ３−１６遺伝子、ＪＨ６ｂ遺伝子、ＶＨ  ６−１９遺伝子、ＶＨ  ４−３４遺伝子および／またはＪＨ３ｂ遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、ＣＤ７３に特異的なヒト抗体を調製した。したがって、ＶＨ  ３−３３、ＶＨ  ３−１０、ＶＨ  ３−１５、ＶＨ  ３−１６、ＶＨ  ６−１９およびＶＨ  ４−３４からなる群から選択されるヒトＶＨ生殖系列遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する重鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ７３に特異的な単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０２０１】
ヒト生殖系列ＶＫ  Ｌ６遺伝子、ＶＫ  Ｌ１８遺伝子、ＶＫ  Ｌ１５遺伝子、ＶＫ  Ｌ２０遺伝子、ＶＫ  Ａ２７遺伝子、ＪＫ５遺伝子、ＪＫ４遺伝子、ＪＫ２遺伝子およびＪＫ１遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、ＣＤ７３に特異的なヒト抗体を、調製した。したがって、ＶＫ  Ｌ６遺伝子、ＶＫ  Ｌ１８遺伝子、ＶＫ  Ｌ１５遺伝子、ＶＫ  Ｌ２０遺伝子およびＶＫ  Ａ２７遺伝子からなる群から選択されるヒトＶＫ生殖系列遺伝子の産物であるかまたはそれらに由来する軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ７３に特異的な単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。
【０２０２】
本明細書に記載される好ましい抗体は、上記に列挙されたヒト生殖系列ＶＨ遺伝子のうちの１つの産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、上記に列挙されたヒト生殖系列ＶＫ遺伝子のうちの１つの産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域も含むものである。
【０２０３】
抗体の可変領域が、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合には、本明細書において、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるまたはそれに「由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを、対象の抗原を用いて免疫処置することまたは対象の抗原を用いてファージ上にディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物である」またはそれに「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することおよびヒト抗体の配列に対して配列が最も近い（すなわち、最大同一性パーセント）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することなどによって同定できる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「産物である」またはそれに「由来する」ヒト抗体は、生殖系列配列と比較した場合に、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な誘導によるアミノ酸の相違を含有し得る。しかし、選択されたヒト抗体は、通常、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、その他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合に、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。通常、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から１０個以下のアミノ酸の相違を示す。特定の場合には、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、またはさらに４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を示し得る。
【０２０４】
ＩＶ．相同な抗体
本明細書に記載される好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体が、本明細書において包含され、ここで、この抗体は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の所望される機能的特性を保持する。
【０２０５】
例えば、単離された抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み得、ここで、
（ａ）重鎖可変領域は、それぞれ、配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０〜１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０〜１７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、それぞれ、配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２および１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２および２３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体は、ＣＤ７３と特異的に結合し、
（ｄ）抗体は、表３に列挙される機能的特性のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種またはすべてを示す。
【０２０６】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、上記で論じられた同一性パーセントおよび／またはアミノ酸の変更ならびに機能（すなわち、（ａ）〜（ｄ））を有する重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２０７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、上記で論じられた同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化ならびに機能（すなわち、（ａ）〜（ｄ））を有する重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２０８】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、上記で論じられた同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化ならびに機能（すなわち、（ａ）〜（ｄ））を有する重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２０９】
種々の実施形態では、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０２１０】
単離された抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、重鎖および軽鎖を含み得、ここで、
（ａ）重鎖は、配列番号１００、１０３、１０７、１０９、１１２、１１４、１１６、１１９、１２１、１３３、１８４〜２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、またはそれぞれ、配列番号１００、１０３、１０７、１０９、１１２、１１４、１１６、１１９、１２１、１３３および１８４〜２１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含む、
（ｂ）軽鎖は、配列番号１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、またはそれぞれ、配列番号１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個もしくは１〜５０個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）を含む、アミノ酸配列を含む、
（ｃ）抗体は、ＣＤ７３と特異的に結合する、ならびに
（ｄ）抗体は、表３において列挙された機能的特性のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種またはすべてを示す。
【０２１１】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、上記で論じられた同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化ならびに機能（すなわち、（ａ）〜（ｄ））を有する重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１２】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、上記で論じられた同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化ならびに機能（すなわち、（ａ）〜（ｄ））を有する重鎖および軽鎖を含み、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９，からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１３】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、上記で論じられた同一性パーセントおよび／またはアミノ酸変化ならびに機能（すなわち、（ａ）〜（ｄ））を有する重鎖および軽鎖を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、重鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７、９５および２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ１は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５、９３および２３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖可変領域のＣＤＲ２は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６、９４および２４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２１４】
ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１の対応するＣＤＲとは、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個のアミノ酸の変更（すなわち、アミノ酸置換、付加もしくは欠失）が異なるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２および／またはＶＬＣＤＲ３を含む抗ＣＤ７３抗体もまた、提供される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、１１Ｆ１１、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１における対応する配列と比べて、ＣＤＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのそれぞれに、１〜５個のアミノ酸の変更を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１におけるＣＤＲと比べて、すべてのＣＤＲにわたり、合計で１〜５個のアミノ酸の変更を含む。
【０２１５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３．４−１またはＣＤ７３．４−２のものからなるＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを含み、ここで、１つまたは複数のＣＤＲにおけるアミノ酸のうちの１つまたは複数は、本明細書に開示されるその他の抗ＣＤ７３抗体のうちの１つのものである。
【０２１６】
抗ＣＤ７３抗体の可変領域配列に行われ得る突然変異（例えば、置換、付加、欠失）は、以下の：（ｉ）実施例に記載されるように、抗体に導入された突然変異および（ｉｉ）本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体（表３７および図３５を参照のこと）の可変ドメイン内の各位置におけるアミノ酸残基の比較に基づいて判定することができ、抗ＣＤ７３抗体の特定の位置における異なるアミノ酸は、この位置におけるアミノ酸残基が、抗体の活性に著しく影響を及ぼすことなく別のアミノ酸残基に変更され得ることを示し得、一方で、同じアミノ酸残基が、いくつかまたはすべての抗ＣＤ７３抗体の同じ位置に見出される場合、これは、この特定のアミノ酸が、保存され、別の残基に変更されるべきではないことを示し得る。例示的な実施形態を、以下に提供する。
【０２１７】
特定の実施形態では、フレームワーク置換が、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の重鎖可変領域の２５位（１１Ｆ１１の…ＲＬＳＣＡＴＳＧＦＴＦ…）に導入され得る（例えば、保存的置換、例えば、ＳまたはＡへの）。例えば、この位置におけるアミノ酸がＴである場合、ＡまたはＳへの置換が導入され得、この位置におけるアミノ酸がＡである場合、ＳまたはＴへの置換が導入され得、この位置におけるアミノ酸がＳである場合、ＴまたはＡへの置換が導入され得る。抗体２４Ｈ２、４Ｄ４、１０Ｄ２、６Ｅ１１、７Ａ１１、１１Ａ６および４Ｃ３は、この位置にＡを有し、１１Ｆ１１は、この位置にＴを有し、７３．５、７３．７および７３．９は、この位置にＳを有する。
【０２１８】
同様に、特定の実施形態では、フレームワーク置換が、重鎖可変領域のアミノ酸９４位（１１Ｆ１１の…ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ…）に導入され得る（例えば、ＶからＬまたはＬからＶ）。例えば、抗体１１Ｆ１１、７３．３−７３．１０、２４Ｈ２、４Ｄ４、５Ｆ８および１０Ｄ２は、この位置にＶを有し、６Ｅ１１、７Ａ１１、１１Ａ６および４Ｃ３は、この位置にＬを有する。
【０２１９】
特定の実施形態では、アミノ酸置換は、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２に行われてもよい。例えば、５２位のアミノ酸（１１Ｆ１１の…ＷＶＡＶＩＬＹＤＧＳＮ…）が、Ｗと置換され得るか、またはこの位置におけるアミノ酸が、Ｗである場合、アミノ酸は、Ｌと置換され得る（抗体１１Ｆ１１および７３．４−７３．７は、この位置にＬを有し、抗体７３．８〜７３．１０、２４Ｈ２および４Ｄ４は、この位置にＷを有する）。
【０２２０】
同様に、特定の実施形態では、５４位のアミノ酸（１１Ｆ１１の…ＶＩＬＹＤＧＳＮＫＹＹ…）は、ＳもしくはＥと置換され得るか、またはこの位置におけるアミノ酸が、Ｓである場合、アミノ酸は、Ｅと置換され得る。抗体１１Ｆ１１、７３．４、７３．５、２４Ｈ２、１０Ｄ２および５Ｆ８は、この位置にＧを有し、抗体７３．６〜７３．９、６Ｅ１１、７Ａ１１、４Ｃ３および７３．３は、この位置にＳを有し、抗体７３．１０および４Ｄ４は、この位置にＥを有する。
【０２２１】
可変領域における他の許容される置換は、上記のものと類似の論拠を使用して、図３５における重鎖および軽鎖可変領域配列のアライメントに基づいて、判定され得る。
【０２２２】
ＣＤ７３．３、ＣＤ７３．４、ＣＤ７３．５、ＣＤ７３．６、ＣＤ７３．７、ＣＤ７３．８、ＣＤ７３．９、ＣＤ７３．１０、ＣＤ７３．１１、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１のもの、例えば、それぞれ、配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５、１７０〜１７７および配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４、９２のＶＨおよびＶＬ領域、またはそれぞれ、配列番号１００、１０３、１０７、１０９、１１２、１１４、１１６、１１９、１２１、１３３および１８４〜２１０ならびに配列番号１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０８、１１０、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２の重鎖および軽鎖またはＣＤＲと相同性を有する配列を有する抗体は、核酸分子、例えば、配列番号１３９、１４２、１４６、１４８、１５１、１５３、１５５、１５８、１６０、２３７および／もしくは配列番号１４０、１４１、１４３、１４４、１４５、１４７、１４９、１５０、１５２、１５４、１５６、１５７、１５９、１６１または配列番号１３４、２４３、２４６、２５０、２５２、２５５、２５７、２５９、２６２、２６４および／もしくは配列番号２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５１、２５３、２５４、２５６、２５８、２６０、２６１、２６３、２６５、２６６の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発もしくはＰＣＲ媒介突然変異誘発）、続いて、本明細書に記載される機能性アッセイを使用して、コードされた変更された抗体を保持機能に関して試験することによって、得ることができる。
【０２２３】
Ｖ．保存的修飾を有する抗体
抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載される好ましい抗体、例えば、ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および／または７Ａ１１に基づく指定のアミノ酸配列またはそれらの保存的修飾形態を含み、抗体は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の所望される機能的特性を保持する。したがって、単離された抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
（ｃ）抗体は、ＣＤ７３と特異的に結合する、ならびに
（ｄ）抗体は、表３において列挙された機能的特性のうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種またはすべてを示す。
【０２２４】
好ましい実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個もしくは１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的修飾、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３のアミノ酸配列ならびにそれらの保存的置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個または１〜５個の保存的アミノ酸置換からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２２５】
種々の実施形態では、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０２２６】
保存的アミノ酸置換は、ＣＤＲ以外の抗体の部分に行われてもよく、またはＣＤＲに加えて行われてもよい。例えば、保存的アミノ酸修飾は、フレームワーク領域または定常領域、例えば、Ｆｃ領域に行われてもよい。本明細書に記載される置換のいずれも、保存的置換であり得る。可変領域または重鎖もしくは軽鎖は、本明細書に提供される抗ＣＤ７３抗体配列と比べて、１個、２個、３個、４個、５個、１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜２５個または１〜５０個の保存的アミノ酸置換を含み得る。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、保存的アミノ酸修飾および非保存的アミノ修飾の組合せを含む。
【０２２７】
ＶＩ．ＣＤ７３上の同一のエピトープと結合するかまたはＣＤ７３との結合に関して、本明細書に記載される抗体と競合する、抗体
ＣＤ７３との結合について、本明細書に記載される特定の抗ＣＤ７３抗体（例えば、抗体ＣＤ７３．４、ＣＤ７３．３、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および７Ａ１１）と競合する抗体もまた、本明細書において提供される。このような競合抗体は、標準ＣＤ７３結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１および／またはＣＤ７３．３もしくはＣＤ７３．４（これらの抗体について本明細書に記載される任意の定常領域および軽鎖を有する）のうちの１種または複数のＣＤ７３との結合を競合的に阻害するそれらの能力に基づいて、同定することができる。例えば、標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合的ＥＬＩＳＡアッセイを使用でき、これでは、組換えヒトＣＤ７３タンパク質を、プレート上に固定化し、種々の濃度の非標識試験抗体を添加し、プレートを洗浄し、標識された参照抗体を添加し、洗浄し、結合している標識の量を測定する。増大する濃度の非標識（第１の）抗体（「遮断抗体」とも呼ばれる）が、標識された（第２の）抗体の結合を阻害する場合には、第１の抗体は、第２の抗体のプレート上の標的との結合を阻害するといわれるか、または第２の抗体の結合と競合するといわれる。さらに、またはあるいは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析を実施して、抗体の競合する能力を評価してもよい。試験抗体の、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体のＣＤ７３との結合を阻害する能力は、試験抗体がＣＤ７３との結合について抗体と競合し得ることを実証する。
【０２２８】
例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって、例えば、前述の段落に記載されるアッセイを使用して、測定される場合、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の、細胞、例えば、腫瘍細胞上のＣＤ７３との結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％阻害する、および／または細胞、例えば、腫瘍細胞上のＣＤ７３とのその結合が、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％阻害される、抗ＣＤ７３抗体もまた、本明細書において提供される。
【０２２９】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体との結合について競合する抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して同定され得る。例えば、本明細書に記載されるヒトＣＤ７３を用いてマウスを免疫処置し、ハイブリドーマを産生し、得られたモノクローナル抗体を、ＣＤ７３との結合について本明細書に記載される抗体と競合する能力についてスクリーニングしてもよい。マウスは、抗体が結合するエピトープを含有するＣＤ７３の小断片を用いることによっても免疫処置され得る。エピトープまたはエピトープを含む領域は、例えば、ＣＤ７３に広がる一連の重複するペプチドとの結合についてスクリーニングすることによって同定できる。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994の方法を使用して、同一エピトープを有する、したがって、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体に対して同様の特性を有する抗体の選択を導いてもよい。ファージディスプレイを使用して、まず、抗ＣＤ７３抗体の重鎖を、（好ましくは、ヒト）軽鎖のレパートリーと対形成して、ＣＤ７３結合性抗体を選択し、次いで、新規軽鎖を（好ましくは、ヒト）重鎖のレパートリーと対形成して、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体と同一エピトープまたはエピトープ領域を有する（好ましくは、ヒト）ＣＤ７３結合性抗体を選択する。あるいは、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発によって、本明細書に記載される抗体の変異体を得ることができる。
【０２３０】
本明細書に記載される抗体を用いて「ＣＤ７３上の同一エピトープ」と結合する抗体を調べる技術として、例えば、エピトープマッピング方法、例えば、抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析が挙げられ、これは、エピトープの原子分解を提供する。その他の方法は、抗体の抗原断片または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、この場合、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失は、エピトープ成分を示すと考えられることが多い。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。方法はまた、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから、特異的な短いペプチド（天然の三次元形態または変性された形態のいずれか）を親和性単離する能力に頼る可能性がある。そこで、ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングのために、コンホメーション的に不連続なエピトープをマッピングするために示されてきた計算アルゴリズムも開発された。
【０２３１】
Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085によって記載されるようなアラニンスキャニング突然変異誘発またはＣＤ７３中のアミノ酸残基の点突然変異誘発のいくつかのその他の形態を使用して、抗ＣＤ７３抗体の機能的エピトープを調べてもよい。しかしながら、突然変異誘発研究では、ＣＤ７３の全体的な三次元構造に重要であるアミノ酸残基も判明し得るが、抗体−抗原の接触には直接的に関与しないアミノ酸残基は判明せず、したがって、この方法を使用して判定される機能性エピトープを確認するためには、他の方法が必要となり得る。
【０２３２】
特異的抗体によって結合されたエピトープまたはエピトープ領域（「エピトープ領域」は、エピトープを含むか、またはエピトープと重複する領域である）はまた、抗体の、ＣＤ７３の断片、例えば、非変性断片または変性断片を含むペプチドとの結合を評価することによって決定してもよい。ＣＤ７３（例えば、ヒトＣＤ７３）の配列を包含する一連の重複するペプチドは、合成し、例えば、直接ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ法（ペプチドが、抗体の、マイクロタイタープレートのウェルと結合しているＣＤ７３との結合を防ぐその能力について評価される）においてまたはチップ上で結合についてスクリーニングしてもよい。このようなペプチドスクリーニング方法は、いくつかの不連続な機能的なエピトープ、すなわち、ＣＤ７３ポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む機能的エピトープを検出可能でない場合もある。
【０２３３】
エピトープはまた、水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）およびタンパク質の迅速光化学酸化（Fast Photochemical Oxidation of Proteins）（ＦＰＯＰ）などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法によって同定してもよい。ＨＤＸ−ＭＳは、例えば、実施例およびWei et al.(2014) Drug Discovery Today 19:95でさらに記載されるように実施でき、その方法は、参照によって本明細書に具体的に組み込まれる。ＦＰＯＰは、例えば、Hambley and Gross (2005) J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057に記載されるように実施でき、その方法は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【０２３４】
抗ＣＤ７３抗体によって結合されるエピトープはまた、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリングおよび遊離している場合および対象の抗体との複合体中に結合されている場合には、ＣＤ７３中の不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含めた核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などの構造的方法によって決定してもよい（Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistry 31:11335-11347、Zinn-Justin et al.(1993) Biochemistry 32:6884-6891）。
【０２３５】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ（例えば、Chayen (1997) Structure 5:1269-1274）、懸滴蒸気拡散（例えば、McPherson (1976) J.Biol.Chem.251:6300-6303）、シーディングおよび透析を含めた当技術分野で公知の方法のいずれかを使用して達成され得る（例えば、Giege et al.(1994) Acta Crystallogr.D50:339-350;McPherson (1990) Eur.J.Biochem.189:1-23）。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度を有する、ポリエチレングリコール１０００〜２０，０００（ＰＥＧ；約１０００〜約２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量）、好ましくは、約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは、約６０００Ｄａを含有する沈殿剤溶液中で最良に達成され得る。タンパク質分解防止剤、例えば、グリセロールを約０．５％〜約２０％の範囲の濃度で含むことが望ましいものであり得る。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適した塩はまた、好ましくは、約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの範囲の濃度の沈殿剤溶液中にあることが望ましいものであり得る。沈殿剤は、好ましくは、約３．０〜約５．０、好ましくは、約４．０のｐＨに緩衝される。沈殿剤溶液において有用な特定のバッファーは、変わり得、当技術分野で周知である（Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, New York）。有用なバッファーの例として、それだけには限らないが、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸が挙げられる。結晶は２℃、４℃、８℃および２６℃を含めた様々な温度で成長させてもよい。
【０２３６】
抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ−ＰＬＯＲ（Yale University、1992、Molecular Simulations、Inc.によって配布された;例えば、Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４号を参照のこと）およびＢＵＳＴＥＲ（Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth Enzymol. 276A:361-423; Carter & Sweet, eds.;Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323）、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
抗ＣＤ７３抗体は、エピトープマッピング技法、例えば、本明細書に記載される技法によって判定される場合、本明細書に記載されるアミノ酸配列を有する抗ＣＤ７３抗体のいずれかと同一のエピトープと結合し得る。抗ＣＤ７３抗体はまた、ヒトＣＤ７３との類似の相互作用、例えば、Ｘ線結晶学によって判定される場合、表３１に示される相互作用のうちの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を有し得る。
【０２３８】
ＶＩＩ．遺伝子操作された、および修飾された抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
修飾された抗体を遺伝子操作するために、出発材料として本明細書において開示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうち１種または複数を有する抗体を使用して調製され得る、遺伝子操作された、および修飾された抗体もまた提供され、この修飾された抗体は、出発抗体から変更された特性を有し得る。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の、および／または１つまたは複数のフレームワーク領域内の１個または複数の残基を修飾することによって、遺伝子操作され得る。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能（単数または複数）を変更するために、定常領域（単数または複数）内の残基を修飾することによって遺伝子操作され得る。
【０２３９】
実施され得る１種の可変領域遺伝子操作として、ＣＤＲグラフティングがある。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上にグラフトされた特定の参照抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の参照抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033;Winterの米国特許第５，２２５，５３９号およびQueen et alの米国特許第５，５３０，１０１号；同５，５８５，０８９号；同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと）。
【０２４０】
したがって、本明細書において記載される別の実施形態は、それぞれ、配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０、および配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域、ならびに配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４、および配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体ＣＤ７３．４−１、ＣＤ７３．４−２、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１および７Ａ１１のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲ配列を含み、異なるフレームワーク配列をさらに含み得る。
【０２４１】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上でｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいて利用可能）に、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836に見出すことができ、それらの各々の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０２４２】
本明細書において記載される抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本明細書に記載される抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に同様であるものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子において見られるものと同一配列を有するフレームワーク領域上にグラフトされ得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較した場合に最大２０個の好ましくは保存的なアミノ酸置換を含有するフレームワーク領域上にグラフトされ得る。例えば、特定の場合には、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を突然変異させることが有益であることがわかっている（例えば、Queen et alの米国特許第５，５３０，１０１号；同５，５８５，０８９号；同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと）。
【０２４３】
本明細書に記載された遺伝子操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が行われているものを含む。通常、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるよう行われる。例えば、１つのアプローチとして、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」することがある。より詳しくは、体細胞突然変異を起こしている抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列に対して比較することによって同定できる。フレームワーク領域配列をその生殖系列立体配置に戻すために、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発によって、体細胞突然変異を生殖系列配列に「復帰突然変異する」ことができる。このような「復帰突然変異された」抗体も包含されるものとする。別の種類のフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の免疫原性の可能性を低減するために、フレームワーク領域内の、またはさらには１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基を突然変異することを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」と呼ばれ、Carr et alによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【０２４４】
別の種類の可変領域修飾は、対象の抗体の１種または複数の結合特性（例えば、親和性）を改善するためにＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を突然変異することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、抗体結合または対象のその他の機能的特性に対して突然変異（単数または複数）および効果を導入でき、本明細書に記載され実施例において提供されるインビトロまたはインビボでのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（上記で論じられるような）が導入されることが好ましい。突然変異は、アミノ酸付加、欠失または好ましくは、置換であり得る。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５個以下の残基が変更される。
【０２４５】
したがって、（ａ）配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、（ｃ）配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨ  ＣＤＲ３領域、（ｄ）配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４と比較して１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、ならびに（ｆ）配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５と比較して、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸配列、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含む、ＶＬ  ＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域を含む、単離された抗ＣＤ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部分もまた、提供される。
【０２４６】
抗体のＣＤＲ中のメチオニン残基は、酸化され、その結果、化学的分解の可能性および結果としての抗体の効力の低減をもたらし得る。したがって、重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ中の１個または複数のメチオニン残基は、酸化分解を受けないアミノ酸残基と置換されている抗ＣＤ７３抗体もまた、提供される。
【０２４７】
同様に、抗ＣＤ７３抗体から、特に、ＣＤＲ中の脱アミド化部位も除去され得る。
【０２４８】
抗原結合を干渉し得るグリコシル化を防ぐために、抗原結合ドメイン内の可能性あるグリコシル化部位が排除されることが好ましい。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号を参照のこと。
【０２４９】
標的化される抗原結合
種々の実施形態では、本発明の抗体は、抗原結合が有害であろう組織および環境において抗原結合を選択的に遮断するが、有益であろう場合には抗原結合を可能にするよう修飾される。一実施形態では、抗体の抗原結合表面と特異的に結合し、抗原結合を干渉する遮断ペプチド「マスク」が生じ、このマスクは、ペプチダーゼ切断可能リンカーによって抗体の結合アームの各々と連結している。例えば、ＣｙｔｏｍＸの米国特許第８，５１８，４０４号を参照のこと。このようなコンストラクトは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、マスキング／遮断ペプチドの解離が可能となり、これが、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
【０２５０】
あるいは、関連実施形態では、（二価）抗体の両方の抗原結合表面と結合し、抗原結合を干渉する、２つの抗原結合ドメインを含む二価結合化合物（「マスキングリガンド」）が開発され、これでは、２つの結合ドメインマスクは、切断可能なリンカー、例えば、ペプチダーゼによって切断可能なリンカーによって互いに（抗体ではなく）連結される。例えば、Ｔｅｇｏｐｈａｒｍ  Ｃｏｒｐの国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３を参照のこと。マスキングリガンドは、抗体が結合するよう意図される抗原を含み得るか、もしくはそれに由来し得るか、または独立に作製され得る。このようなマスキングリガンドは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが大幅に増大されている癌の治療にとって有用である。腫瘍微小環境における切断可能なリンカーの選択的切断によって、２つの結合ドメインの互いからの解離が可能となり、抗体の抗原結合表面の結合力を低下させる。結果として生じる、抗体からのマスキングリガンドの解離が、抗原結合が不要な副作用を引き起こし得る末梢組織においてではなく腫瘍における抗原結合選択性を可能にする。
【０２５１】
Ｆｃおよび修飾されたＦｃ
抗原結合ドメインの抗原との結合（例えば、アンタゴニスト抗体の場合には、同族リガンドもしくは受容体タンパク質またはアゴニスト抗体の場合には、誘導されるシグナル伝達の遮断）に起因する治療用抗体の活性に加えて、抗体のＦｃ部分は、複雑な方法で全体的に免疫系と相互作用して、任意の数の生物学的効果を誘発する。免疫グロブリンのＦｃ領域などのエフェクター機能は、抗原依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）などの多数の重要な抗体機能に関与しており、異なる機序によってではあるが、標的細胞の死滅をもたらす。
【０２５２】
抗ＣＤ７３抗体は、意図される使用のために抗体の生物活性（あるとすれば）に基づいて選択された、異なるＦｃ領域を含む定常ドメインを有する本明細書に記載される抗体の可変ドメインを含み得る。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。例えば、ヒトＩｇＧは、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類され得、これらの各々は、１種または複数のＦｃγ受容体（活性化受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２）；ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６）ならびに阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ）との結合について、ならびに補体の第１の成分（Ｃ１ｑ）について独特のプロフィールを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、すべてのＦｃγ受容体と結合し；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１と結合し、ＦｃγＲＩＩＡＲ１３１  ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８に対してより低い親和性を有し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８と結合し；阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に対して、すべてのその他のＦｃγ受容体よりも低い親和性を有する。Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716。研究によって、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ２と結合せず、ＦｃγＲＩＩＩＢは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４と結合しないことが示された。同著。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３≫ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２。結果として、例えば、ＡＤＣＣが望まれる薬物における使用のためには、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択され得；ＦｃγＲＩＩＩＡ発現ＮＫ細胞、マクロファージの単球の活性化の場合には、ＩｇＧ３が選択され得；アレルギー患者を脱感作するために抗体が使用されるべきである場合にはＩｇＧ４が選択され得る。抗体がすべてのエフェクター機能を欠くことが望まれる場合にも、ＩｇＧ４が選択され得る。
【０２５３】
したがって、本明細書に記載される抗ＣＤ７３可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃと連結され得（例えば、共有結合によって連結されるか、または融合される）、これは、例えば、ＩｇＧ１の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１（ａ）、Ｇ１ｍ２（ｘ）、Ｇ１ｍ３（ｆ）、Ｇ１ｍ１７（ｚ）；ＩｇＧ２の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３（ｎ）；ＩｇＧ３の任意のアロタイプまたはイソアロタイプ：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１（ｇ１）、Ｇ３ｍ２８（ｇ５）、Ｇ３ｍ１１（ｂ０）、Ｇ３ｍ５（ｂ１）、Ｇ３ｍ１３（ｂ３）、Ｇ３ｍ１４（ｂ４）、Ｇ３ｍ１０（ｂ５）、Ｇ３ｍ１５（ｓ）、Ｇ３ｍ１６（ｔ）、Ｇ３ｍ６（ｃ３）、Ｇ３ｍ２４（ｃ５）、Ｇ３ｍ２６（ｕ）、Ｇ３ｍ２７（ｖ）であり得る；例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1）を参照のこと。アロタイプの選択は、例えば、抗薬物抗体の形成を最小化するために、可能性ある免疫原性の懸念によって影響を受け得る。
【０２５４】
本明細書に記載される可変領域は、通常、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性などの、抗体の１種または複数の機能的特性を変更するために、１つまたは複数の修飾を含むＦｃと連結され得る。さらに、本明細書に記載される抗体は、化学的に修飾され得る（例えば、１種または複数の化学部分は、抗体と結合され得る）か、またはそのグリコシル化を変更するよう、抗体の１種または複数の機能的特性を変更するよう修飾され得る。これらの実施形態の各々は、以下に詳細に記載される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、カバットのＥＵ指数のものである。本明細書において開示される配列変異体は、残基番号と、それに続く、天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されるアミノ酸に関連して、任意選択で、その位置の天然に存在する残基が先行して提供される。所与の位置に複数のアミノ酸が存在し得る場合、例えば、配列が天然に存在するアイソタイプ間で異なる場合、または複数の突然変異がその位置で置換され得る場合には、それらは／によって分けられる（例えば、「Ｘ／Ｙ／Ｚ」）。
【０２５５】
例えば、親のＦｃに対して、（ａ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増大もしくは減少した、（ｂ）補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）が増大もしくは減少した、（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性が増大もしくは減少した、および／または（ｄ）Ｆｃ受容体に対する親和性が増大もしくは減少したＦｃ変異体を作製するために、Ｆｃ領域中に修飾を行ってもよい。このようなＦｃ領域変異体は、一般に、Ｆｃ領域中に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることは、特に望ましいと考えられる。例えば、変異体Ｆｃ領域は、中に、本明細書において同定される特定のＦｃ領域位置の２、３、４、５つなどの置換を含み得る。例示的Ｆｃ配列変異対は、本明細書において開示されており、また、米国特許第５，６２４，８２１号、同６，２７７，３７５号、同６，７３７，０５６号、同６，１９４，５５１号、同７，３１７，０９１号、同８，１０１，７２０号、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０１／５８９５７、ＷＯ０４／０１６７５０、ＷＯ０４／０２９２０７、ＷＯ０４／０３５７５２、ＷＯ０４／０７４４５５、ＷＯ０４／０９９２４９、ＷＯ０４／０６３３５１、ＷＯ０５／０７０９６３、ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４で提供されている。
【０２５６】
エフェクター機能を低減すること
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域を修飾することによって低減され得る。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体との結合に影響を及ぼす部位、好ましくは、サルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するよう修飾され得る。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野で公知である、例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関しては、Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9を参照のこと。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ変異体は、ＦｃγＲ結合を効率的に排除する。Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:4223およびChu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926。その他の実施形態では、ＦｃγＲとの結合が低減されているＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含んでいた。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
【０２５７】
ＣＤＣ活性はまた、Ｆｃ領域を修飾することによって低減され得る。ＩｇＧ１位置での突然変異、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１、具体的には、アラニン突然変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、対応する抗体の、Ｃ１ｑと結合し、補体を活性化する能力を大幅に低減する。Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178；ＷＯ９９／５１６４２。ＩｇＧ１の位置３３１の修飾（例えば、Ｐ３３１Ｓ）は、補体結合を低減すると示されている。Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661およびCanfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。別の例では、アミノ酸位置２３１〜２３９内の１個または複数のアミノ酸残基が変更され、それによって、抗体の補体を固定する能力を低減する。ＷＯ９４／２９３５１。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、補体結合が低減したＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
【０２５９】
エフェクター機能が完全に避けられるべき使用のために、例えば、所望の治療的利益を生じさせるのに抗原結合単独で十分である場合およびエフェクター機能が、望ましくない副作用につながる（そのリスクを増大する）だけである場合には、ＩｇＧ４抗体を使用してもよく、またはＦｃ領域もしくはそのかなりの部分を欠く抗体もしくは断片を考案することができ、またはＦｃを、グリコシル化を完全に排除するよう突然変異してもよい（例えば、Ｎ２９７Ａ）。あるいは、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲと結合する能力を欠き（ＩｇＧ２のように）、補体を活性化することができない（ＩｇＧ４のように）、ヒトＩｇＧ２のハイブリッドコンストラクト（ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域）およびヒトＩｇＧ４（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）が作製されてきた。Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441;Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479（エフェクター機能を全般的に低減するためのＦｃ修飾を論じる）も参照のこと。
【０２６０】
その他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のすべてのエフェクター機能を低減するよう、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することによって変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対して低減した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力は保持するよう、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１個または複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基と置換され得る。それに対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体（残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７）または補体のＣ１成分（残基２９７、３１８、３２０、３２２）であり得る。両方ともWinter et alによる米国特許第５，６２４，８２１号および同５，６４８，２６０号。
【０２６１】
ＷＯ８８／００７０８９は、ＦｃγＲＩとの結合を低減して、ＡＤＣＣを低減するため（２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ）または補体成分Ｃ１ｑとの結合を遮断して、ＣＤＣを排除するために（Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ）、ＩｇＧ  Ｆｃ領域中の修飾を提案した。Duncan & Winter (1988) Nature 332:563;Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036;およびSondermann et al. (2000) Nature 406:267（ＦｃγＲＩＩＩ結合に対するこれらの突然変異の効果を論じる）も参照のこと。
【０２６２】
エフェクター機能を低減するＦｃ修飾はまた、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位、２６７位、２６９位、３２５位および３２８位における置換、挿入および欠失、例えば、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒを含む。Ｆｃ変異体は、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減するためのその他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖを含む。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。ＩｇＧ１中、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、適宜、Ｇ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４中、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、適宜、Ｇ２３６Δ；およびＩｇＧ２中、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓなど、位置２３３〜２３６および３２７〜３３１のうち１つまたは複数でＩｇＧ残基を突然変異することによって、エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび補体活性化の両方）は、新生児ＦｃＲ結合を維持しながら（半減期を維持しながら）低減され得る。Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613；ＷＯ９９／５８５７２を参照のこと。エフェクター機能を低減するその他の突然変異として、ＩｇＧ１中のＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537）；ＩｇＧ２中のＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ（Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613；米国特許第５，８３４，５９７号も参照のこと）；ならびにＩｇＧ４のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ（Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925）が挙げられる。ヒトＩｇＧ１においてエフェクター機能を低減するための突然変異の別の組合せとして、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓが挙げられる。Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。全般的に、Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479を参照のこと。Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質（アバタセプト）に関連してエフェクター機能を減少させるとわかっているさらなる突然変異として、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ（ＥＵ残基番号付け）がある。Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204。
【０２６３】
ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを低減させたその他のＦｃ変異体は、Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287（ＩｇＧ４においてＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを減少させるためのＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）；Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980（ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ）；An et al. (2009) MAbs 1:572および米国特許出願公開第２００７／０１４８１６７号（ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）；McEarchern et al. (2007) Blood 109:1185（ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ）；Vafa et al. (2014) Methods 65:114（ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）に開示されている。
【０２６４】
特定の実施形態では、本質的にエフェクター機能を有さない、すなわち、ＦｃγＲとの結合が低減され、補体結合が低減されたＦｃが、選択される。エフェクターレスである例示的Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の５つの突然変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。これらの突然変異を含む例示的重鎖は、表３７に詳細に示されるように、配列表に記載されている。これらの５つの置換は、同様にグリコシル化を排除するためのＮ２９７Ａと組み合わされ得る。
【０２６５】
エフェクター機能を増強すること
あるいは、Ｆｃ領域を修飾することによって、ＡＤＣＣ活性は増大され得る。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、そのため、ＡＤＣＣが望まれる薬物における使用のためには、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが選択され得る。あるいは、Ｆｃ領域は、以下の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９で１個または複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増大するよう、および／またはＦｃγ受容体に対する親和性を増大するよう修飾され得る。ＷＯ２０１２／１４２５１５を参照のこと；ＷＯ００／４２０７２も参照のこと。例示的置換として、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的変異体として、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが挙げられる。例えば、任意選択で、Ｉ３３２Ｅと組み合わされ得る、Ｇ２３６Ａ変異体を含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγＩＩＡ／ＦｃγＩＩＢ結合親和性比をおよそ１５倍増大するとわかった。Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517;Moore et al. (2010) mAbs 2:181。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強するためのその他の修飾として、それだけには限らないが、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌが挙げられる。これらおよびその他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691に概説されている。具体的には、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方は、ＩｇＧ１の位置Ｅ３３３の変更、例えば、Ｅ３３３Ａによって増強され得る。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591。ＩｇＧ１においてエフェクター機能を増強するためのＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ突然変異の使用は、ＷＯ２００６／０２０１１４に開示されており、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／Ｖは、ＷＯ２００４／０７４４５５に開示されている。ヒトＩｇＧ１におけるＫ３２６Ａ／ＷおよびＥ３３３Ａ／Ｓ変異体およびＩｇＧ２におけるＥ３３３Ｓは、エフェクター機能を増大するとわかっている。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。
【０２６６】
具体的には、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604。組合せ突然変異体Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ結合およびＡＤＣＣ活性が増強されている）を含めた、位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩとの結合を改善すると示された。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ突然変異を有する変異体を含めた、ＦｃγＲＩＩＩａとの結合が強力に増強されたその他のＩｇＧ１変異体が同定されており、これは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の最大の増大、ＦｃγＲＩＩｂ結合の減少およびカニクイザルにおける強力な細胞傷害性活性を示した。Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005;Awan et al. (2010) Blood 115:1204;Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。アレムツズマブ（ＣＤ５２特異的）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的）、リツキシマブ（ＣＤ２０特異的）およびセツキシマブ（ＥＧＦＲ特異的）などの抗体中への三重突然変異の導入は、インビトロで大きく増強されたＡＤＣＣ活性に変換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体は、サルにおいてＢ細胞を枯渇させる増強された能力を示した。Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおいてヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するトランスジェニックマウスにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａとの増強された結合および同時に増強されたＡＤＣＣ活性を示した、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ突然変異を含有するＩｇＧ１突然変異体が同定された。Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882；米国特許第８，６５２，４６６号；Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。
【０２６７】
種々のＩｇＧアイソタイプはまた、差次的ＣＤＣ活性を示す（ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４）。Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989。増強されたＣＤＣが望まれる使用のためには、Ｃ１ｑとの結合を増大する突然変異を導入することも可能である。補体（ＣＤＣ）を補充する能力は、Ｃ１ｑ、補体カスケードの第１の成分との結合を増大するための、ＩｇＧ２におけるＫ３２６および／またはＥ３３３での突然変異、例えば、Ｋ３２６Ｗ（ＡＤＣＣ活性を低減する）およびＥ３３３Ｓによって増強され得る。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。ヒトＩｇＧ１へのＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ（単独または任意の組合せの）導入は、Ｃ１ｑ結合を増強する。Moore et al. (2010) mAbs 2:181。Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863（その中の図１）のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体のＦｃ領域「１１３Ｆ」は、増強されたＣＤＣを与える。Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553およびRedpath et al. (1998) Immunology 93:595も参照のこと。
【０２６８】
エフェクター機能を増大または減少し得るさらなる突然変異は、Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129に開示されている。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343;Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460も参照のこと。
【０２６９】
阻害性受容体ＦｃｙＲＩＩｂに対する親和性を増強するＦｃ変異体は、例えば、アポトーシス誘導またはアジュバント活性を増強するためにも使用され得る。Li & Ravetch (2011) Science 333:1030;Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966；米国特許出願公開第２０１４／００１０８１２号。このような変異体は、例えば、Ｂ細胞および単球を含めたＦｃｙＲＩＩｂ＋細胞と関連する免疫調節性活性を有する抗体を提供し得る。一実施形態では、Ｆｃ変異体は、１種または複数の活性化受容体と相対的に、ＦｃｙＲＩＩｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃｙＲＩＩｂに対する結合を変更するための修飾として、ＥＵ指数に従って、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１つまたは複数の修飾が挙げられる。ＦｃｙＲＩＩｂ親和性を増強するための例示的置換として、それだけには限らないが、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅが挙げられる。例示的置換として、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙが挙げられる。ＦｃｙＲＩＩｂとの結合を増強するためのその他のＦｃ変異体として、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆが挙げられる。具体的には、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ＋Ｌ３２８Ｆ二重変異体を含めたＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅ変異体は、具体的には、阻害性ＦｃｙＲＩＩｂ受容体に対する親和性の増強において特に価値がある。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開第２００６／０２４２９８号；ＷＯ２０１２／０８７９２８。ＦｃγＲＩＩｂに対する増強された特異性（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１とは区別されるような）は、Ｐ２３８Ｄ置換を付加することによって得ることができる。Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１。
【０２７０】
特定の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増大するよう修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増大することによって行うことができる。一実施形態では、抗体は、Presta et alによって米国特許第５，８６９，０４６号および同６，１２１，０２２号に記載されるようにＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループからとられるサルベージ受容体結合エピトープを含有するようＣＨ１またはＣＬ領域内で変更される。ＦｃＲｎとの結合を増大し、および／または薬物動態特性を改善するその他の例示的Ｆｃ変異体は、位置２５９、３０８および４３４での置換を含み、例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍが挙げられる。ＦｃＲｎとのＦｃ結合を増大するその他の変異体として、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Hinton et al., 2004、J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216、Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356）、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604）、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ（Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524）が挙げられる。米国特許第８，３６７，８０５号を参照のこと。
【０２７１】
Ｎ４３４Ａ変異体（Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663）などの、ＩｇＧ  Ｆｃ中の特定の保存された残基（Ｉ２５３／Ｈ３１０／Ｑ３１１／Ｈ４３３／Ｎ４３４）の修飾は、ＦｃＲｎ親和性を増大し、したがって、循環における抗体の半減期を増大する方法として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組合せＦｃ変異体は、ＦｃＲｎ結合を増大し、血清半減期を最大５倍まで増大すると示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組合せＦｃ変異体もまた、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含む組合せＦｃ変異体もまた、半減期を延長すると示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０。
【０２７２】
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組合せＦｃ変異体は、半減期を４倍近く増大する。Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。増大したＦｃＲｎ親和性を提供するが、ｐＨ依存が低下した関連ＩｇＧ１修飾（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ）を使用して、その他の抗体のＦｃＲｎとの結合を防ぎ、その結果、そのその他の抗体、内因性ＩｇＧ（例えば、自己免疫状況における）または別の外因性（治療用）ｍＡｂのいずれかのクリアランスの増大をもたらすための競合物質として使用するためのＩｇＧ１コンストラクト（「ＭＳＴ−ＨＮ  Ａｂｄｅｇ」）を作製した。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４。
【０２７３】
ＦｃＲｎ結合を増大するためのその他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；第６，２７７，３７５号；同６，８２１，５０５号；ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
【０２７４】
特定の実施形態では、ＦｃＲｎ結合を増大し、半減期を潜在的に増大するためにハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ１位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ３に由来するアミノ酸と置換することによって構築され得る。このようにして、１つまたは複数の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が、構築され得る。本明細書に記載されるその他の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域中のＩｇＧ２位置を、２種のアイソタイプが異なる位置でＩｇＧ１に由来するアミノ酸と置換することによって、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体が構築され得る。このようにして、１つまたは複数の置換、例えば、以下のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（位置２３６でのグリシンの挿入を指す）および３２７Ａのうち１つまたは複数を含むハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体が構築され得る。米国特許第８，６２９，１１３号を参照のこと。血清半減期に増大し、発現を改善するといわれているＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが作製された。米国特許第７，８６７，４９１号（その中の配列番号１８）。
【０２７５】
本発明の抗体の血清半減期はまた、ペグ化によって増大され得る。抗体を、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増大するようペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、通常、抗体またはその断片を、１つまたは複数のＰＥＧ基が、抗体または抗体断片と結合するようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施される。本明細書において、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの、その他のタンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの任意の形態を包含するものとする。特定の実施形態では、ペグ化されるべき抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、技術分野で公知であり、本明細書に記載される抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６およびIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照のこと。
【０２７６】
あるいは、いくつかの状況下では、本発明の抗体の半減期を増大するのではなく、減少することが望ましい場合がある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ（Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355）およびＨ４３５Ａ／Ｒ  Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ（Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819）などの修飾は、医用画像のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を減少させ、ひいては、半減期を減少（クリアランスを増大）させ得る。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照のこと。クリアランスを増強するためのその他の手段として、本発明の抗原結合ドメインを、Ｆａｂ断片などのＦｃＲｎと結合する能力を欠く抗体断片としてフォーマットすることが挙げられる。このような修飾は、抗体の循環半減期を２、３週間から数時間に減少させ得る。次いで、抗体断片の選択的ペグ化を使用して、必要に応じて、抗体断片の半減期を微調整（増大）できる。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。半減期を増大するために、抗体断片をまた、ヒト血清アルブミンと融合して、例えば、融合タンパク質コンストラクトにしてもよい。Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する、本発明の第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを用いて、二重特異性抗体を構築してもよい。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびその中で引用される特許参考文献を参照のこと。あるいは、半減期を増大するために、特殊化ポリペプチド配列、例えば、「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列を抗体断片に添加することができる。Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186;国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２。
【０２７７】
さらなるＦｃ変異体
ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合には、ＩｇＧ１中のヒンジ配列を模倣し、それによって、例えば、治療されている患者において、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４の間のＦａｂアーム交換を低減しながら、ＩｇＧ４分子を安定化する置換Ｓ２２８Ｐを含むことが通常は好ましい。Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767;Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925。
【０２７８】
ＩｇＧ１コンストラクトのヒンジ中の可能性あるプロテアーゼ切断部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾によって排除し、抗体の安定性を増大することができる。ＷＯ２０１４／０４３３４４。
【０２７９】
Ｆｃ変異体のそのリガンド（Ｆｃ受容体）に対する親和性および結合特性は、それだけには限らないが、平衡方法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または速度論（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ分析）および間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）などのその他の方法を含めた、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ法（生化学または免疫学ベースのアッセイ）によって決定され得る。これらおよびその他の方法は、調べられている１種もしくは複数の成分上の標識を利用してもよく、および／またはそれだけには限らないが、クロマトグラフィー、蛍光、発光もしくは同位体標識を含めた種々の検出方法を使用してもよい。結合親和性および速度論の詳細な説明は、抗体免疫原相互作用に焦点を当てる、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見出すことができる。
【０２８０】
さらにその他の実施形態では、抗体のグリコシル化は、エフェクター機能を増大または低減するよう修飾される。例えば、位置２９７の保存されたアスパラギン残基を突然変異し（例えば、Ｎ２９７Ａ）、ひいては、補体およびＦｃγＲＩ結合を消滅させることによって、すべてのエフェクター機能を欠く非グリコシル化抗体を作製できる。Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595（ＩｇＧ１中のＮ２９７Ｑを使用して、位置２９７でのグリコシル化を排除する）も参照のこと。
【０２８１】
非グリコシル化抗体は、一般に、エフェクター機能を欠くが、その機能を回復させるよう、突然変異を導入することができる。非グリコシル化抗体、例えば、Ｎ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ突然変異に起因するものか、またはタンパク質をグリコシル化しない系（例えば、大腸菌）において産生されたものを、ＦｃγＲ結合を回復させるよう、さらに突然変異することができる、例えば、Ｓ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／もしくはＨ（ＷＯ２００９／０７９２４２）またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ（Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604）。
【０２８２】
さらに、グリコシル化を変更することによって、ＡＤＣＣが増強された抗体を製造できる。例えば、重鎖Ａｓｎ２９７が連結したオリゴ糖からのフコースの除去は、ＦｃγＲＩＩＩａとの改善された結合に基づいてＡＤＣＣを増強すると示された。Shields et al. (2002) JBC 277:26733;Niwa et al. (2005) J. Immunol. Methods 306:151;Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res.15:3376 (MDX-1401);Cardarelli et al. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257(MDX-1342）。このような低フコース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において（Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614）、または非フコシル化抗体を生成するその他の細胞において産生され得る。例えば、Zhang et al. (2011) mAbs 3:289およびLi et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210（両方とも、糖鎖操作されたピキア・パストリス（Pichia pastoris）における抗体産生を説明する）；Mossner et al. (2010) Blood 115:4393;Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466;EP1176195B1を参照のこと。ＡＤＣＣはまた、フコースの、Ａｓｎ（２９７）が連結した炭化水素と結合する能力が低下した変異体ＣＨＯ細胞系統、Ｌｅｃ１３の使用を開示する、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５に記載されるように増強され得、また、宿主細胞において発現された抗体の低フコシル化をもたらした（Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。あるいは、フコース類似体を、フコースが抗体上の炭水化物中に組み込まれることを阻害するために抗体産生の際に培養培地に添加してもよい。ＷＯ２００９／１３５１８１。
【０２８３】
抗体が連結したオリゴ糖における二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大もまた、ＡＤＣＣを増強する。Umana et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するよう遺伝子操作された細胞系統を記載し、その結果、遺伝子操作された細胞系統において発現された抗体は、二分ＧｌｃＮａｃ構造の増大を示し、これは、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす（Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照のこと）。
【０２８４】
ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰの増強を示すが、ＣＤＣを減少する、ガラクトース、シアル酸、フコースおよびキシロース残基（いわゆるＧＮＧＮグリコフォーム）を欠くさらなるグリコシル化変異体ならびにＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣの増強を示す、シアル酸、フコースおよびキシロース（いわゆるＧ１／Ｇ２グリコフォーム）を欠くその他のものが開発されている。米国特許出願公開第２０１３／０１４９３００号。これらのグリコシル化パターンを有する抗体は、任意選択で、内因性キシロシルおよびフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされている、遺伝子修飾されたベンサミアナタバコ（N. benthamiana）植物において産生される。
【０２８５】
糖鎖操作はまた、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７で結合している炭水化物鎖のα２，６シアリル含量を変更することによって、ＩｇＧコンストラクトの抗炎症特性を修飾するために使用され得、これでは、α２，６シアリル化形態の割合の増加が、抗炎症効果の増強をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513を参照のこと。逆に、α２，６シアリル化炭化水素を有する抗体の割合の減少は、抗炎症特性が望まれない場合には有用であり得る。例えば、α２，６シアリル化形態の選択的精製によって、または酵素的修飾によって、抗体のα２，６シアリル化含量を修飾する方法は、米国特許出願公開第２００８／０２０６２４６号に提供されている。その他の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾を含めることによって、α２，６シアリル化の効果を模倣するよう修飾され得る。ＷＯ２０１３／０９５９６６。
【０２８６】
ＶＩＩＩ．抗体物理的特性
本明細書に記載される抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１つまたは複数のグリコシル化部位を含有し得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の免疫原性の増大または変更された抗原結合による抗体のｐＫの変更をもたらし得る（Marshall et al (1972) Annu. Rev Biochem 41:673-702;Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172:5489-94;Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7;Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こると知られている。いくつかの場合には、可変領域グリコシル化を含有しない抗ＣＤ７３抗体を有することが好ましい。これは、可変領域中にグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによってか、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによって達成され得る。
【０２８７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で起こり得、その結果、ポリペプチド鎖中にねじれを導入し、その安定性を低減し得る（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基を生成し得る。例えば、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙが、抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ配列中に存在している場合、この配列は、異性化を受けていないアミノ酸配列と置換されている。一実施形態では、抗体は、配列番号６に記載される重鎖可変領域ＣＤＲ２配列を含むが、ここで、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列（ＶＩＬＹＤＧＳＮＫＹＹＰＤＳＶＫＧ、配列番号６）中のＡｓｐまたはＧｌｙは、異性化を受けていないアミノ酸配列、例えば、Ａｓｐ−ＳｅｒまたはＳｅｒ−Ｇｌｙ配列と置換されている。
【０２８８】
各抗体は、独特の等電点（ｐＩ）を有し、これは、一般に、６から９．５の間のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、通常、７〜９．５のｐＨ範囲内に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、通常、６〜８のｐＨ範囲内に入る。正常範囲の外側のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下で幾分かのアンフォールディングおよび不安定性を有し得るという推測がある。したがって、正常範囲内に入るｐＩ値を含有する抗ＣＤ７３抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体を選択することによってか、または電荷を有する表面残基を突然変異させることによって達成され得る。
【０２８９】
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボで全体的な安定性が大きいことを示す（Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。一般に、ＴＭ１（最初のアンフォールディングの温度）は、６０℃超、好ましくは、６５℃超、さらにより好ましくは、７０℃超であることが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52）または円偏光二色性（Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を使用して測定できる。好ましい実施形態では、迅速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32）を使用して測定できる。
【０２９０】
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択され、凝集効果は、不要な免疫応答および／または変更されたか、もしくは不都合な薬物動態特性の誘発につながり得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは、２０％以下、さらにより好ましくは、１５％以下、さらにより好ましくは、１０％以下およびさらにより好ましくは、５％以下の凝集を有しても許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含めた、いくつかの技術によって測定できる。
【０２９１】
ＩＸ．抗体を遺伝子操作する方法
上記に論じられるように、本明細書に開示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する抗ＣＤ７３抗体を使用して、ＶＨおよび／もしくはＶＬ配列またはそこに結合した定常領域を修飾することによって、新しい抗ＣＤ７３抗体を作製することができる。したがって、本明細書に記載される別の態様では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３．４、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／または７Ａ１１の構造的特徴を使用して、ヒトＣＤ７３およびカニクイザルＣＤ７３との結合など、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの機能的特徴を保持する、構造的に関連する抗ＣＤ７３抗体を作製する。例えば、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１および／もしくは７Ａ１１またはそれらの突然変異体の１つまたは複数のＣＤＲ領域は、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換えにより組み合わされて、上記で論じたように、本明細書に記載される、組換えにより遺伝子操作されたさらなる抗ＣＤ７３抗体が作製される。他の種類の修飾として、前述の節に記載されているものが挙げられる。遺伝子操作方法の出発材料は、本明細書に提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。遺伝子操作された抗体を作製するために、必ずしも、本明細書に提供されるＶＨおよび／またはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質を発現させる）必要はない。むしろ、配列に含まれる情報は、元の配列に由来する「第２世代」の配列を作製するために出発材料として使用され、次に、この「第２世代」の配列が、調製され、タンパク質として発現される。
【０２９２】
したがって、抗ＣＤ７３抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号５、１７、３３、４１、５３、６１、６９、８１および８９からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号６、１８、３４、４２、５４、６２、７０、８２および９０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに／または配列番号７、１９、３５、４３、５５、６３、７１、８３および９１からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、重鎖可変領域抗体配列、ならびに（ｉｉ）配列番号９、１３、２１、２５、２９、３７、４５、４９、５７、６５、７３、７７、８５および９３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１０、１４、２２、２６、３０、３８、４６、５０、５８、６６、７４、７８、８６および９４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列ならびに／または配列番号１１、１５、２３、２７、３１、３９、４７、５１、５９、６７、７５、７９、８７および９５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む、軽鎖可変領域抗体配列を提供すること、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも１つの変更された抗体配列を作製すること、ならびに
（ｃ）変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む、方法が本明細書において提供される。
【０２９３】
標準分子生物学技術を使用して、変更された抗体配列を調製し、発現することができる。
【０２９４】
好ましくは、変更された抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の機能的特性のうちの１種、いくつかまたはすべてを保持するものであり、この特性としては、表３において列挙されたものが挙げられる。
【０２９５】
変更された抗体は、本明細書に記載される機能性アッセイを使用して、機能的特性のうちの１種もしくは複数、２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、１０種またはすべてを示し得る。変更された抗体の機能的特性は、当技術分野で利用可能であるおよび／または本明細書に記載される標準アッセイ、例えば実施例に記載されるもの（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）を使用して評価することができる。
【０２９６】
本明細書に記載される抗体を遺伝子操作する方法の特定の実施形態では、突然変異を、抗ＣＤ７３抗体コード配列のすべてまたは一部に沿って無作為または選択的に導入することができ、得られた修飾された抗ＣＤ７３抗体を、結合活性および／または本明細書に記載される他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。突然変異の方法は、当技術分野で説明されている。例えば、ShortによるＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリまたはこれらの組合せを使用した抗体突然変異体の作製およびスクリーニング方法について記載している。あるいは、Lazar et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９は、コンピュータによるスクリーニング方法を使用して抗体の生理化学特性を最適化する方法について記載している。
【０２９７】
Ｘ．核酸分子
本明細書に記載される別の態様は、本明細書に記載される抗体をコードする核酸分子に関係する。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸（例えば、その他の染色体ＤＮＡ、例えば、自然界では単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から精製された場合に、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。本明細書に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有する場合も、含有しない場合もある。特定の実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０２９８】
本明細書に記載される核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるようなヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体については、ハイブリドーマによって作製された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）から得られる抗体については、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
【０２９９】
本明細書に記載される好ましい核酸分子は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３．４  １１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３および／またはＣＤ７３．４モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。ＣＤ７３．４（ＣＤ７３．４−１およびＣＤ７３．４−２）、１１Ｆ１１（１１Ｆ１１−１および１１Ｆ１１−２）、４Ｃ３（４Ｃ３−１、４Ｃ３−２および４Ｃ３−３）、４Ｄ４、１０Ｄ２（１０Ｄ２−１および１０Ｄ２−２）、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８（５Ｆ８−１および５Ｆ８−２）、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３ならびにＣＤ７３．４のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号４、１６、３２、４０、５２、６０、６８、８０、８８、１３５および１７０に記載されている。１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３および／またはＣＤ７３．４のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号８、１２、２０、２４、２８、３６、４４、４８、５６、６４、７２、７６、８４および９２に記載されている。
【０３００】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するよう、標準組換えＤＮＡ技術によってこれらのＤＮＡ断片をさらに操作できる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と作動可能に連結している。この文脈において使用されるような、用語「作動可能に連結された」は、２種のＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるよう、２種のＤＮＡ断片が接続されることを意味するものとする。
【０３０１】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結され得る。
【０３０２】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【０３０３】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列が、可動性リンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得る（例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照のこと）。
【０３０４】
さらに、本明細書に記載される抗体、例えば、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３および／またはＣＤ７３．４モノクローナル抗体のものに相同であるＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖をコードする核酸分子が、本明細書において提供される。例示的核酸分子は、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３および／またはＣＤ７３．４モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列または全長重鎖および軽鎖、例えば、表３７に記載される配列をコードする核酸分子と少なくとも７０％同一である、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である、ＶＨおよびＶＬ配列をコードする。例えば、配列番号１３９および配列番号１４０または１４１、配列番号２３７および配列番号１４０または１４１、配列番号１４２および配列番号１４３、１４４または１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、配列番号１４８および配列番号１４９または１５０、配列番号１５１および配列番号１５２、配列番号１５３および配列番号１５４、配列番号１５５および配列番号１５６または１５７または２４２、配列番号１５８および配列番号１５９、配列番号１６０および配列番号１６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、ヌクレオチド配列によってコードされる、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む抗ＣＤ７３抗体が、本明細書において提供される。さらに、配列番号１３４、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２４３、２６６（重鎖）および配列番号２４４または２４５（軽鎖）、配列番号２１１、２１２、２１３または２４６および配列番号２４７、２４８または２４９、配列番号２３５、２３６または２５０および２５１、配列番号２５２および配列番号２５３または２５４、配列番号２５５および配列番号２５６、配列番号２５７および配列番号２５８、配列番号２５９および配列番号２６０または２６１、配列番号２６２および配列番号２６３、配列番号２６４および配列番号２６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、ヌクレオチド配列によってコードされる、重鎖および軽鎖を含む、抗ＣＤ７３抗体が、提供される。さらに、例えば、コドン最適化のために、サイレント突然変異（すなわち、核酸分子の翻訳時に得られるアミノ酸配列を変更しない塩基の変更）を有する核酸分子が、本明細書において提供される。
【０３０５】
ＸＩ．抗体作製
本発明の種々の抗体、例えば、本明細書に開示される抗ヒトＣＤ７３抗体と同一のエピトープと競合するものまたはそれと結合するものは、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)によって記載される標準体細胞ハイブリダイゼーション技術などの種々の公知の技術を使用して産生できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は好ましいが、原理上、モノクローナル抗体を産生するためのその他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
【０３０６】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系として、マウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、極めて十分に確立された手順である。免疫処置プロトコールおよび技術および融合のために免疫処置された脾細胞を単離するための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０３０７】
本明細書に記載されるキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、対象のマウスハイブリドーマから得、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよう遺伝子操作できる。例えば、当技術分野で公知の方法を使用して、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域をヒト定常領域に連結できる（例えば、Cabilly et al.の米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中にマウスＣＤＲ領域を挿入できる（例えば、Winterの米国特許第５，２２５，５３９号およびQueen et al.の米国特許第５，５３０，１０１号；同５，５８５，０８９号；同５，６９３，７６２号および同６，１８０，３７０号を参照のこと）。
【０３０８】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなＣＤ７３に対して向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の部分を保持する、トランスジェニックまたはトランスクロモソミック（transchromosomic）マウスを使用して作製できる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミック（transchromosomic）マウスは、本明細書において、それぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書において、まとめて「ヒトＩｇマウス」と呼ばれる。
【０３０９】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（miniloci）を、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された突然変異とともに含有する（例えば、Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照のこと）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫処置に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖 導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する（Lonberg, N. et al. (1994)、前掲; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説されている）。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用ならびにこのようなマウスによって保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656;Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724;Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830;Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591;およびFishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、それらの開示内容は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、すべてLonbergおよびKayの米国特許第５，５４５，８０６号；同５，５６９，８２５号；同５，６２５，１２６号；同５，６３３，４２５号；同５，７８９，６５０号；同５，８７７，３９７号；同５，６６１，０１６号；同５，８１４，３１８号；同５，８７４，２９９号；および同５，７７０，４２９号；Surani et al.の米国特許第５，５４５，８０７号；すべてLonbergおよびKayのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ  ９９／４５９６２ならびにKorman et al.のＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと。
【０３１０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウス、例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスを使用して作製される。本明細書において「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ishida et al.のＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。
【０３１１】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系が、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を作製するために使用できる。例えば、Xenomouse（Abgenix、Inc.）と呼ばれる代替トランスジェニック系を使用でき、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第５，９３９，５９８号；同６，０７５，１８１号；同６，１１４，５９８号；同６、１５０，５８４号および同６，１６２，９６３号に記載されている。
【０３１２】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスクロモソミック（transchromosomic）動物系は、当技術分野で利用可能であり、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を作製するために使用できる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体（transchromosome）およびヒト軽鎖導入染色体の両方を保持するマウスを使用でき、このようなマウスは、Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体（transchromosome）を保持するウシが、当技術分野で記載されており（Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894）、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を作製するために使用できる。
【０３１３】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＣＤ７３抗体を作製するための当技術分野において記載されるさらなるマウス系として、（ｉ）内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体（ヒトＶ／マウスＣ）が作製され、次いで、その後、標準組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）ならびに（ｉｉ）マウスが再編成されていないヒト重鎖可変領域、しかし単一の再変性されたヒト共通軽鎖可変領域を含有するＭｅＭｏ（登録商標）マウス（Ｍｅｒｕｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載されている。
【０３１４】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号；同５，４０３，４８４号；および同５，５７１，６９８号；Dower et al.の米国特許第５，４２７，９０８号および同５，５８０，７１７号； McCafferty et al.の米国特許第５，９６９，１０８号および同６，１７２，１９７号；ならびにGriffiths et al.の米国特許第５，８８５，７９３号；同６，５２１，４０４号；同６，５４４，７３１号；同６，５５５，３１３号；同６，５８２，９１５号および同６，５９３，０８１号を参照のこと。
【０３１５】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製できる。このようなマウスは、例えば、Wilson et alの米国特許第５，４７６，９９６号および同５，６９８，７６７号に記載されている。
【０３１６】
免疫処置
ＣＤ７３に対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856−859;Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス（例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス）を、ＣＤ７３抗原および／またはＣＤ７３を発現する細胞の精製または濃縮された調製物を用いて免疫処置できる。あるいは、マウスをヒトＣＤ７３をコードするＤＮＡを用いて免疫処置できる。好ましくは、マウスは、第１の注入の際に６〜１６週齢とする。例えば、ＨｕＭＡｂマウスを腹膜内に免疫処置するために、組換えＣＤ７３抗原の精製または濃縮された調製物（５〜５０μｇ）を使用できる。ＣＤ７３抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫処置が抗体をもたらさない事象では、ＣＤ７３を発現する細胞、例えば、細胞系統を用いてマウスを免疫処置して、免疫応答を促進することもできる。例示的細胞系統として、ＣＤ７３過剰発現性安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞系統が挙げられる。
【０３１７】
種々の抗原を用いる累積的経験は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる最初に腹膜内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）免疫処置と、それに続く、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる隔週でのＩＰ／ＳＣ免疫処置（最大合計１０）の際に最良に応答することを示した。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿サンプルを用いて、免疫処置プロトコールの過程にわたってモニタリングできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき（以下に記載されるように）、抗ＣＤ７３ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫処置のために２〜３回の融合が実施されることが必要であり得ると予測される。各抗原について、６から２４匹の間のマウスが、通常免疫処置される。普通、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は両方とも、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）単一マウスに一緒に育種され得る。
【０３１８】
ＣＤ７３に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫処置されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、５０％  ＰＥＧを用いて、免疫処置マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１）と融合できる。細胞を、およそ２×１０５で平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」コンディショニング培地、５％オリゲン（origen）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１Ｘ  ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する選択培地で２週間インキュベートする。およそ２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置換されている培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、１０〜１４日後に普通に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
【０３１９】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。次いで、モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
【０３２０】
ＸＩＩ．抗体製造
ＣＤ７３に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
配列が提供される特異的抗体およびその他の関連抗ＣＤ７３抗体の両方を含めた、本発明の抗体を、当技術分野で周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生できる（Morrison, S.(1985) Science 229:1202）。
【０３２１】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすよう、抗体遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって、発現ベクター（単数または複数）中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数または複数）と作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結されるように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０３２２】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得る当業者には明らかである。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲαプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる調節エレメント（Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
【０３２３】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製の起点）などのさらなる配列および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてAxel et al.による米国特許第４，３９９，２１６号、同４，６３４，６６５号および同５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のための）が挙げられる。
【０３２４】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単数または複数）を、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のためによく使用される様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記載される抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高効率の産生にとっては有効ではないと報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。本発明の抗体はまた、酵母ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の糖鎖操作された株においても産生できる。Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210。
【０３２５】
本明細書に記載される組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の好ましい発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞中に導入され、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
【０３２６】
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、よく観察される翻訳後修飾によって予測される配列とは異なることもある。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖から失われていることが多い。Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。N末端グルタミン残基およびより少ない程度であるが、グルタミン酸残基は、治療用抗体の軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換されることが頻繁にある。Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544;Liu et al. (2011) JBC 28611211;Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211。
【０３２７】
ＸＩＩＩ．アッセイ
本明細書に記載される抗体は、ＣＤ７３との結合について、例えば、標準ＥＬＩＳＡによって試験できる。手短には、マイクロタイタープレートを精製されたＣＤ７３を、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍＬで用いてコーティングし、次いで、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物（例えば、ＣＤ７３免疫処置マウスから得た血漿の希釈物）を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次試薬（例えば、ヒト抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄した後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、ｐｒｏｄｕｃｔ：ＡＢＴＳ−１０００）を用いて発色させ、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計によって分析する。次いで、免疫処置されたマウスから得た血清を、ＣＤ７３を発現しない対照細胞株とではなく、ヒトＣＤ７３を発現する細胞株との結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。手短には、抗ＣＤ７３抗体の結合を、ＣＤ７３発現性ＣＨＯ細胞を１：２０希釈の抗ＣＤ７３抗体とともにインキュベートすることによって評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて検出する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施する。最高の力価を発生するマウスが、融合に使用されることが好ましい。
【０３２８】
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、ひいては、ＣＤ７３免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングできる。好ましくは、高親和性でＣＤ７３と結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。細胞バンクを作製するために、抗体精製のために、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによって）各ハイブリドーマから１つのクローンを選択できる。
【０３２９】
抗ＣＤ７３抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを成長させることができる。プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
【０３３０】
選択された抗ＣＤ７３モノクローナル抗体が独特のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ｍＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＣＤ７３コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
【０３３１】
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩コーティングできる。１％  ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
【０３３２】
モノクローナル抗体の、ＣＤ７３を発現する生存細胞との結合を調べるために、実施例に記載されるようにフローサイトメトリーを使用できる。手短には、膜結合性ＣＤ７３を発現する細胞株（標準成長条件下で成長させた）を、０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフルオレセイン標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析して、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、または代わりに）、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて減少した感受性を有し得る。
【０３３３】
抗ＣＤ７３抗体は、ウエスタンブロッティングによってＣＤ７３抗原との反応性についてさらに試験できる。手短には、ＣＤ７３を発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランにトランスファーし、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いてプロービングする。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０３３４】
種々の抗ＣＤ７３抗体の結合親和性、交差反応性および結合動態を解析する方法は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００ＳＰＲ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を含む。
【０３３５】
ＸＩＶ．イムノコンジュゲートおよび抗体誘導体
本明細書に記載される抗体は、サンプルの試験およびインビボ撮像を含む診断目的で使用することができ、この目的で、抗体（またはその結合断片）は、適当な検出可能な薬剤とコンジュゲートして、イムノコンジュゲートを形成することができる。診断目的では、適当な薬剤は、全身撮像のための放射性同位体ならびにサンプルの試験のための放射性同位体、酵素、蛍光標識および他の好適な抗体タグを含む、検出可能な標識である。
【０３３６】
検出可能な標識は、コロイド金などの金属ゾルを含む粒子標識、例えばＮ２Ｓ２、Ｎ３ＳもしくはＮ４型のペプチド性キレート剤とともに提示されるＩ１２５またはＴｃ９９などの同位体、蛍光マーカー、ビオチン、発光マーカー、リン光マーカーなどを含む発色団ならびに所与の基質を検出可能なマーカーに変換する酵素標識およびポリメラーゼ連鎖反応などの増幅後に示されるポリヌクレオチドタグを含め、インビトロ診断の分野において現在使用されている様々な種類のうちのいずれかであり得る。ビオチン化抗体は、次いで、アビジンまたはストレプトアビジンの結合によって検出可能となる。好適な酵素標識として、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどが挙げられる。例えば、標識は、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、ジナトリウム３−（４−（メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ｛３．３．１．１  ３，７｝デカン｝−４−イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）などの１，２ジオキセタン基質ならびにＣＤＰおよびＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）または当業者に周知の他の発光性基質、例えば、テルビウム（ＩＩＩ）およびユーロピウム（ＩＩＩ）などの好適なランタニドのキレートの変換後の化学発光の存在または形成を測定することによって検出される、酵素アルカリホスファターゼであり得る。検出手段は、選択された標識によって決定される。標識またはその反応産物の出現は、標識が粒子であり、適当なレベルで蓄積する場合には、裸眼で、または分光光度計、ルミノメーター、蛍光光度計などの機器を使用して、達成され得るが、すべて標準的な慣例に従う。
【０３３７】
好ましくは、コンジュゲーション法は、実質的に（またはほぼ）非免疫原性である結合、例えば、ペプチド（すなわち、アミド）結合、スルフィド結合（立体障害）、ジスルフィド結合、ヒドラゾン結合およびエーテル結合を生じる。これらの結合は、ほぼ非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す（例えば、Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244、ＷＯ２００９／０５９２７８、ＷＯ９５／１７８８６を参照のこと）。
【０３３８】
部分および抗体の生化学的性質に応じて、異なるコンジュゲーション戦略を用いることができる。部分が、５０〜５００個のアミノ酸の天然に存在するポリペプチドまたは組換えポリペプチドである場合、標準的な手順は、タンパク質コンジュゲートの合成のための化学反応について記載した教則本にあり、当業者であれば容易に従うことができる（例えば、Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074を参照のこと）。一実施形態では、抗体または部分内のマレイミド部分とシステイン残基との反応が使用される。これは、例えば、抗体のＦａｂまたはＦａｂ’断片が使用される場合に、特に好適なカップリング化学反応である。あるいは、一実施形態では、抗体または部分のＣ末端へのカップリングが行われる。タンパク質、例えば、Ｆａｂ断片のＣ末端修飾は、記載されるように行われ得る（Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371）。
【０３３９】
一般に、部位特異的反応および共有結合カップリングは、天然のアミノ酸を、存在する他の官能基の反応性に直交性である反応性を有するアミノ酸に変換することに基づく。例えば、稀な配列構成内の特定のシステインは、アルデヒドに酵素変換され得る（Frese, M. A., and Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427を参照のこと）。所与の配列構成における特定の酵素の、天然のアミノ酸との特異的酵素反応性を利用することによって、所望されるアミノ酸修飾を得ることもまた可能である（例えば、Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126、Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136を参照のこと）。プロテアーゼに触媒されるＣ−−Ｎ結合の形成は、Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403に記載される。
【０３４０】
部位特異的反応および共有結合カップリングはまた、末端アミノ酸の、適当な修飾試薬との選択的反応によっても達成され得る。Ｎ末端システインの、ベンゾニトリルとの反応性（Ren. H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662を参照のこと）を使用して、部位特異的共有結合カップリングを達成することができる。天然の化学的ライゲーションはまた、Ｃ末端システイン残基に依存し得る（Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96）。ＥＰ１  ０７４  ５６３は、負に荷電したアミノ酸のストレッチ内のシステインの、正に荷電したアミノ酸のストレッチ内に位置するシステインよりも早い反応に基づくコンジュゲーション法について記載している。
【０３４１】
部分はまた、合成ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学合成される場合、直交性化学反応性を有するアミノ酸は、このような合成中に組み込まれ得る（例えば、de Graaf. A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295を参照のこと）。多種多様な直交性官能基が問題となっており、合成ペプチドに導入され得るため、このようなペプチドの、リンカーとのコンジュゲーションは、標準化学反応である。
【０３４２】
単一標識ポリペプチドを得るために、１：１の化学量論のコンジュゲートを、他のコンジュゲーション副産物からクロマトグラフィーによって分離してもよい。この手順は、色素標識した結合対メンバーおよび荷電リンカーを使用することにより容易となり得る。この種類の標識および高度に負に荷電した結合対メンバーを使用することにより、モノコンジュゲートしたポリペプチドは、非標識ポリペプチドおよび１種を上回るリンカーを有するポリペプチドから容易に分離されるが、これは、電荷および分子量における相違を分離に使用できるためである。蛍光色素は、標識した一価結合剤などの未結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。
【０３４３】
一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体と結合する部分は、結合部分、標識部分および生物学的に活性な部分からなる群から選択される。
【０３４４】
本明細書に記載される抗体はまた、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などのイムノコンジュゲートを形成するように、治療剤とコンジュゲートされ得る。好適な治療剤として、抗代謝剤、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質および抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号２１９）、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号、同第６，９８９，４５２号および同第７，１２９，２６１号、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９６９１０、ＷＯ０７／０３８６５８、ＷＯ０７／０５１０８１、ＷＯ０７／０５９４０４、ＷＯ０８／０８３３１２およびＷＯ０８／１０３６９３、米国特許公開第２００６００２４３１７号、同第２００６０００４０８１号および同第２００６０２４７２９５号に記載されるように調製することができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、単剤治療としての抗ＣＤ７３抗体の他の使用は、本明細書の他の箇所、例えば、併用治療に関する節において提供される。
【０３４５】
より具体的には、ＡＤＣにおいて、抗体は、薬物とコンジュゲートされ、抗体が、ＡＤＣを癌細胞などのその抗原を発現する標的細胞へ指向するための標的化剤として機能する。好ましくは、抗原は、腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞によって固有に発現されるかまたは過剰発現されるものである。そこに到達すると、標的細胞の内部またはその付近のいずれかで、薬物が放出されて、治療剤として作用する。癌治療法におけるＡＤＣの作用および使用の機序に関する考察については、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147を参照のこと。
【０３４６】
癌の治療のために、薬物は、標的とされる癌細胞の死を引き起こす細胞傷害性薬物であることが好ましい。ＡＤＣにおいて使用することができる細胞傷害性薬物として、以下の種類の化合物ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられる：
（ａ）カリケアマイシン（例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 and 3466を参照のこと）およびアンキアラマイシン（uncialamycin）（例えば、Davies et al.のＷＯ２００７／０３８８６８Ａ２（２００７）およびChowdari et al.のＵＳ８，７０９，４３１Ｂ２（２０１２）を参照のこと）などのエンジイン、
（ｂ）チューブリシン（例えば、Domling et al.のＵＳ７，７７８，８１４Ｂ２（２０１０）、Cheng et al.のＵＳ８，３９４，９２２Ｂ２（２０１３）およびCong et al.のＵＳ２０１４／０２２７２９５Ａ１を参照のこと）、
（ｃ）ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン（例えば、BogerのＵＳ６，５４５８，５３０Ｂ１（２００３）、Sufi et al.のＵＳ８，４６１，１１７Ｂ２（２０１３）およびZhang et al.のＵＳ２０１２／０３０１４９０Ａ１（２０１２）を参照のこと）、
（ｄ）エポチロン（例えば、Vite et al.のＵＳ２００７／０２７５９０４Ａ１（２００７年）およびＵＳＲＥ４２９３０Ｅ（２０１１年）を参照のこと）、
（ｅ）オーリスタチン（例えば、Senter et al.のＵＳ６，８４４，８６９Ｂ２（２００５）およびDoronina et al.のＵＳ７，４９８，２９８Ｂ２（２００９）を参照のこと）、
（ｆ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体（例えば、Howard et al.のＵＳ２０１３／００５９８００Ａ１（２０１３）、ＵＳ２０１３／００２８９１９Ａ１（２０１３）およびＷＯ２０１３／０４１６０６Ａ１（２０１３）を参照のこと）、ならびに
（ｇ）ＤＭ１およびＤＭ４などのマイタンシノイド（例えば、Chari et al.のＵＳ５，２０８，０２０（１９９３）およびAmphlett et al.のＵＳ７，３７４，７６２Ｂ２（２００８）を参照のこと）。
【０３４７】
ＸＶ．二重特異性分子
本明細書に記載される抗体は、二重特異性分子の形成のために使用され得る。抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化されるか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体のリガンド）と連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を生成し得る。本明細書に記載される抗体は、実際、誘導体化されるか、２種以上のその他の機能的分子と連結されて、３種以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を生成し得；このような多重特異性分子もまた、本明細書において、用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本明細書に記載される二重特異性分子を作製するために、本明細書に記載される抗体を、二重特異性分子が結果として生じるような別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１種または複数のその他の結合分子と機能的に連結することができる（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による結合または別の方法で）。
【０３４８】
したがって、少なくとも１つのＣＤ７３に対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が本明細書において提供される。二重特異性分子が多重特異性である本明細書に記載される一実施形態では、分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【０３４９】
一実施形態では、本明細書に記載される二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１種の抗体または例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは一本鎖Ｆｖを含めたその抗体断片を含む。参照によりその開示内容が明確に組み込まれるLadner et al.米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるように、抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体またはＦｖもしくは一本鎖コンストラクトなどのその任意の最小断片であり得る。
【０３５０】
二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定法（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイなどの当技術分野で認識される方法を使用して確認され得る。これらのアッセイは各々、一般に、対象の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に対象とされるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０３５１】
ＸＶＩ．組成物
医薬上許容される担体と一緒に製剤化された、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分（単数または複数）のうちの１種または組合せを含有する組成物、例えば、医薬組成物がさらに提供される。このような組成物は、（例えば、２種以上の異なる）本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性分子のうち１種または組合せを含み得る。例えば、本明細書に記載される医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープと結合するか、または補完的活性を有する抗体（またはイムノコンジュゲートまたは二重特異性）の組合せを含み得る。
【０３５２】
特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、１〜３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＣＤ７３抗体を含む。
【０３５３】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、その他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激（例えば、活性化）剤と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を含み得る。併用療法において使用され得る治療薬の例は、本明細書に記載される抗体の使用に関する節において以下により詳細に記載される。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される治療用組成物は、癌の治療のために使用されるその他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤として、例えば、所与の癌に対する免疫応答を刺激する化学療法薬、小分子薬または抗体が挙げられる。いくつかの事例では、治療用組成物は、例えば、併用療法に関する節において列挙される薬剤のうちの１種または複数を含み得る。
【０３５５】
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、化合物を、酸および化合物を不活性化し得るその他の天然条件作用から保護するために、材料において、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子をコーティングしてもよい。
【０３５６】
本明細書に記載される医薬化合物は、１種または複数の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、何らかの望ましくない毒物学的影響を付与しない塩を指す（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照のこと）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などといった非毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などといった非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといったアルカリ土類金属に由来するものならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどといった非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【０３５７】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどといった水溶性抗酸化物質、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどといった油溶性抗酸化物質および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などといった金属キレート化剤が挙げられる。
【０３５８】
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどといった）およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０３５９】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌法手順、前掲によって、また種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
【０３６０】
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が考慮される。補足活性化合物はまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０３６１】
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含めることが好ましいであろう。組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射用組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
【０３６２】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込むことと、それに続く、滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法として、その前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
【０３６３】
単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与様式に応じて変わる。単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生産する組成物の量となる。一般に、医薬上許容される担体との組合せにおいて、この量は、１００パーセントのうち、有効成分の約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは、約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、有効成分の約１パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
【０３６４】
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に低減または増大してもよい。投与の容易性および投与形の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療されている対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生産するよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記載される投与単位形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。
【０３６５】
抗ＣＤ７３抗体の投与のために、投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通常は、０．０１〜５ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、０．５ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的治療計画は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３〜６カ月に１回の投与を必要とする。
【０３６６】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、固定用量で投与される。したがって、特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆまたはＭＥＤＩ１９４４７は、約２５〜約１６００ｍｇ、例えば、約５０〜約１６００ｍｇ、約１００〜約１６００ｍｇ、約１５０〜約１６００ｍｇ、約３００〜約１６００ｍｇ、約４００〜約１６００ｍｇ、約６００〜約１６００ｍｇ、約１２００〜約１６００ｍｇ、約５０〜約１２００ｍｇ、約５０〜約６００ｍｇ、約５０〜約４００ｍｇ、約５０〜約３００ｍｇ、約５０〜約１５０ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約６００ｍｇ、約１５０〜約４００ｍｇ、約１５０〜約３００ｍｇ、約３００〜約１２００ｍｇ、約３００〜約６００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約４００〜約６００ｍｇまたは約６００〜約１２００ｍｇの固定用量で投与される。例えば、抗ＣＤ７３抗体の投与量は、約１５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約６００ｍｇ、約１２００ｍｇまたは約１６００ｍｇであり得る。
【０３６７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、約２５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約３００ｎＭ〜約１ｍＭ、約３５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約４００ｎＭ〜約１ｍＭ、約４５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約５００ｎＭ〜約１ｍＭ、約５５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約６００ｎＭ〜約１ｍＭ、約６５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約７００ｎＭ〜約１ｍＭ、約７５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約８００ｎＭ〜約１ｍＭ、約８５０ｎＭ〜約１ｍＭ、約９００ｍＭ〜約１ｍＭまたは約５００ｎＭ〜約８００ｎＭの定常状態トラフ濃度を達成するのに十分な用量で、患者に投与される。
【０３６８】
特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブもしくはペンブロリズマブもしくは本明細書に記載されるその他のもの、またはＰＤ−Ｌ１抗体）は、約５０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約４００ｍｇ、約１００〜約３００ｍｇまたは約３００ｍｇ〜約４００ｍｇの固定用量で投与される。例えば、免疫−腫瘍学薬剤の投与量は、約２４０ｍｇまたは約３６０ｍｇであり得る。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤の用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／体重１ｋｇ、１ｍｇ／体重１ｋｇ、３ｍｇ／体重１ｋｇ、５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。
【０３６９】
特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブまたはペンブロリズマブの投与量は、２４０ｍｇが２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される。この投与量は、より長期または短期に合わせて比例で（１週間に１２０ｍｇ）調整され得、例えば、３６０ｍｇが３週間に１回（Ｑ３Ｗ）投与されるかまたは４８０ｍｇが４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与されてもよい。
【０３７０】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、１５０〜８００ｍｇの用量については約４５分間〜７５分間（例えば、約１時間）および８００ｍｇを上回る用量については約１００分間〜１４０分間（例えば、約２時間）の注入期間で、患者に投与される。
【０３７１】
特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される場合、約１５分間〜４５分間、例えば、３０分間の注入期間で、患者に投与される。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される場合、約４５分間〜７５分間、例えば、６０分間の注入期間で、患者に投与される。
【０３７２】
特定の実施形態では、同日に投与される場合、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の前に投与される。特定の実施形態では、同日に投与される場合、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の後に投与される。特定の実施形態では、同日に投与される場合、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤と同時に投与される。特定の実施形態では、同日に投与される場合、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の約１５〜４５分（例えば、約３０分）前に投与される。特定の実施形態では、同日に投与される場合、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の約１５〜４５分（例えば、約３０分）後に投与される。
【０３７３】
ヒト患者における固形腫瘍を治療するのに好適な治療プロトコールは、例えば、患者に、
（ａ）本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体、および
（ｂ）免疫−腫瘍学薬剤
を、それぞれの有効量で投与することを含み、
ここで、抗ＣＤ７３抗体は、免疫−腫瘍学薬剤と同日に投与され、それらは、１週間毎、２週間毎、３週間毎または４週間毎に１回投与される。例えば、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、癌（例えば、進行癌）を有する対象に、抗ＣＤ７３抗体が約１００〜２０００ｍｇ（例えば、１５０〜１６００ｍｇ、例えば、約１００、１５０、２００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００または１６００ｍｇ）の固定用量および免疫−腫瘍学薬剤が５０〜２０００ｍｇ（例えば、１５０〜１６００ｍｇ、例えば、約１００、１５０、２００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００または１６００ｍｇ）の固定用量で、２週間毎に投与され得る。免疫−腫瘍学薬剤がニボルマブである場合、これは、約２４０ｍｇの固定用量で投与され得る。一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆ（重鎖については配列番号１３３および１８９ならびに軽鎖については配列番号１０２）は、癌を有する対象に、１５０〜１６００ｍｇの固定用量で２週間毎に投与され、ニボルマブは、２４０ｍｇの固定用量で２週間毎に（抗ＣＤ７３抗体と同日に）対象に投与される。併用治療は、１〜１０サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６、７、８、９または１０サイクル投与され得、ここで、各サイクルは、２８日の期間であり、各サイクルについて、各抗体の２回の用量が投与される。例えば、組合せは、４〜６サイクル投与され得、ここで、各サイクルは、２８日の期間であり、各サイクルについて、各抗体の２回の用量が投与される。さらなるサイクルが、例えば、休薬期間の後に投与されてもよい。
【０３７４】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、１週間に１回投与され、ここで、例えば、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、同日に投与される。
【０３７５】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、１週間に１回投与され、免疫−腫瘍学薬剤は、２または３週間毎に投与される。例えば、抗ＣＤ７３抗体は、癌（例えば、進行癌）を有する対象に、約１００〜２０００ｍｇ（例えば、１５０〜１６００ｍｇ、例えば、約１００、１５０、２００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００または１６００ｍｇ）の固定用量で、１週間毎に投与されてもよく、免疫−腫瘍学薬剤は、５０〜２０００ｍｇ（例えば、１５０〜１６００ｍｇ、例えば、約１００、１５０、２００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００または１６００ｍｇ）の固定用量で、２または３週間毎に投与される。免疫−腫瘍学薬剤がニボルマブである場合、約２４０ｍｇの固定用量で２週間毎に投与されるかまたは３６０ｍｇの固定用量で３週間毎に投与され得る。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、２週間毎に同日に提供され、抗ＣＤ７３抗体は、１週間毎に共投与ではなく単独で投与される。併用治療は、１〜１０サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６、７、８、９または１０サイクル投与され得、ここで、各サイクルは、２８日の期間であり、各サイクルについて、抗ＣＤ７３抗体の４回の用量および免疫−腫瘍学薬剤の２回の用量が投与される。例えば、組合せは、４〜６サイクル投与され得る。さらなるサイクルが、例えば、休薬期間の後に投与されてもよい。
【０３７６】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、癌（例えば、進行癌）を有する対象に、抗ＣＤ７３抗体が約１００〜２０００ｍｇ（例えば、１５０〜１６００ｍｇ、例えば、約１００、１５０、２００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００または１６００ｍｇ）の固定用量および免疫−腫瘍学薬剤が５０〜２０００ｍｇ（例えば、１５０〜１６００ｍｇ、例えば、約１００、１５０、２００、３００、５００、６００、８００、１０００、１２００または１６００ｍｇ）の固定用量で、３週間毎に投与される。免疫−腫瘍学薬剤がニボルマブである場合、これは、約３６０ｍｇの固定用量で３週間毎に投与され得る。一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆは、癌を有する対象に、１５０〜１６００ｍｇの固定用量で３週間毎に投与され、ニボルマブは、対象に３６０ｍｇの固定用量で３週間毎に（抗ＣＤ７３抗体と同日に）投与される。両方の薬剤が、同日に投与されてもよい。併用治療は、１〜１０サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６、７、８、９または１０サイクル投与され得、ここで、各サイクルは、４２日の期間であり、各サイクルについて、各抗体の２回の用量が、３週間毎に投与される。例えば、組合せは、４〜６サイクル投与され得、ここで、各サイクルは、４２日の期間であり、各サイクルについて、各抗体の２回の用量が、同日に投与される。さらなるサイクルが、例えば、休薬期間の後に投与されてもよい。
【０３７７】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆおよびニボルマブは、以下の組合せ用量のうちのいずれかで投与される：２週間毎に５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；２週間毎に１５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に１５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；２週間毎に３００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に３００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；２週間毎に６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；２週間毎に１２００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に１２００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；２週間毎に１６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に１６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；２週間毎に２０００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２４０ｍｇのニボルマブ；３週間毎に２０００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に１５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に１５０ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に３００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に３００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に１２００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に１２００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に１６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に１６００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に２０００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および２週間毎に２４０ｍｇのニボルマブ；１週間毎に２０００ｍｇの抗ＣＤ７３抗体および３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ。治療には、抗ＣＤ７３および／または免疫−腫瘍学薬剤のいずれか単独での治療期間が先行してもよく、またはそれが続いてもよい。例えば、抗ＣＤ７３は、併用治療を開始する前に、１週間、２週間、３週間または４週間単独で投与されてもよい。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、併用治療後に、１週間、２週間、３週間、４週間またはそれ以上単独で投与される。
【０３７８】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合には、投与される各抗体の投与量は、示される範囲内に入る。抗体は、通常、複の機会で投与される。単一投与量の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月毎または毎年であり得る。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルを測定することによって示されるように、不規則である場合もある。いくつかの方法において、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍＬ、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するよう調整される。
【０３７９】
本明細書に記載されるかまたは本明細書に参照されるすべての抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＷＯ２０１６／０７５０９９に記載されるＭＥＤＩ９４４７またはＰｈｅｎ  ０２０３ｈＩｇＧ１およびＷＯ２０１６／０５５６０９に記載される抗ＣＤ７３抗体）は、本明細書に記載されるように、組み合わされ得るおよび／または投与され得るおよび／または使用され得る。
【０３８０】
抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、治療が予防的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。予防的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時には必要である。その後、患者は、予防的投与計画を投与されることがある。
【０３８１】
本明細書に記載される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者とって毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るよう変えてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴および医薬の技術分野において周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に応じて変わる。
【０３８２】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の「治療上有効な投与量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらす。癌に関連して、治療上有効な用量は、好ましくは、癌と関連する身体症状のさらなる増悪を防ぐ。癌の症状は、当技術分野で周知であり、例えば、普通ではない黒子の特徴、非対称、境界、色および／または直径を含めた黒子の外観の変化、新規に着色した皮膚領域、異常な黒子、爪の下の黒くなった領域、乳房のしこり、乳頭の変化、乳房嚢胞、乳房疼痛、死亡、体重減少、脱力感、過度の疲労、摂食障害、食欲の喪失、慢性の咳、息切れの悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹膜腔中の流体、膣出血、便秘、腹部膨隆、結腸の穿孔、急性腹膜炎（感染、発熱、疼痛）、疼痛、吐血、多量の発汗、発熱、高血圧症、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などが挙げられる。
【０３８３】
疾患の早期または先行する徴候が存在する場合に望まれ得るような治療上有効な用量は、癌の発生を防ぐかまたは遅延し得る。癌の診断において使用される実験室試験は、化学（ＣＤ７３レベルの測定を含む）、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のうちいずれかをモニタリングする任意の臨床または生化学アッセイを使用して、特定の治療が、癌を治療するための治療上有効な用量であるか否かを調べてもよい。当業者ならば、対象の大きさ、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択された投与経路のような因子に基づいてこのような量を決定できるであろう。
【０３８４】
本明細書に記載される組成物は、当技術分野で公知の１種または複数の種々の方法を使用して、１種または複数の投与経路によって投与できる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【０３８５】
あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸性、舌下にまたは局所になど、非経口ではない経路によって投与できる。
【０３８６】
留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など、活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０３８７】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同５，３８３，８５１号；同５，３１２，３３５号；同５，０６４，４１３号；同４，９４１，８８０号；同４，７９０，８２４号；または同４，５９６，５５６号に開示される装置などの注射針無し皮下注射装置を用いて投与できる。本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体とともに使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として、制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する同４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する同４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋め込み可能注入器具を開示する同４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
【０３８８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするよう製剤化できる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多数の高親水性化合物を排除する。本明細書に記載される治療用化合物が、ＢＢＢを通過することを確実にするために（必要に応じて）、それらを例えば、リポソーム中に製剤化できる。リポソームを作製する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同５，３７４，５４８号；および同５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器中に選択的に輸送され、したがって、標的化された薬物送達を増強する１つまたは複数の部分を含み得る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと）。例示的標的化部分として、葉酸またはビオチン（例えば、Low et al.の米国特許第５，４１６，０１６号を参照のこと）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が挙げられ、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
【０３８９】
ＸＶＩＩ．使用および方法
本明細書に記載される抗体、抗体組成物および方法は、多数のインビトロおよびインビボ用途、例えば、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍転移を阻害すること、例えばアデノシンシグナル伝達を低減することによる免疫応答の増強またはＣＤ７３の検出を有する。好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体である。例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、インビトロもしくはエキソビボで培養細胞に、または腫瘍細胞増殖を阻害するために、例えば、インビボでヒト対象に、投与することができる。したがって、対象において腫瘍成長が低減されるように、対象に、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象において腫瘍成長を修飾する方法が、本明細書において提供される。
【０３９０】
特定の実施形態では、方法は、インビボでの癌の治療のために特に適している。腫瘍成長の抗原特異的阻害を達成するために、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を、対象の抗原と一緒に投与してもよく、または抗原が、治療されるべき対象においてすでに存在していてもよい（例えば、腫瘍を有する対象）。ＣＤ７３に対する抗体を、別の薬剤と一緒に投与する場合には、２種は、別個に投与することも、同時に投与することもできる。
【０３９１】
また、サンプルおよび対照サンプルを、ヒトＣＤ７３と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその部分とヒトＣＤ７３との複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、サンプルにおけるヒトＣＤ７３抗原の存在を検出するか、またはヒトＣＤ７３抗原の量を測定するための方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、この場合、対照サンプルと比較した、サンプル間の複合体形成の相違が、サンプルにおけるヒトＣＤ７３抗原の存在を示す。さらに、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＣＤ７３を精製するために使用できる。
【０３９２】
一実施形態では、対象、例えば、癌を有する対象の血液または血清中の可溶性ＣＤ７３のレベルを判定するための方法が、提供される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体で治療されている患者の血液または血清中の可溶性ＣＤ７３抗体のレベルが、判定される。例えば、方法は、抗ＣＤ７３アンタゴニスト剤、例えば、ＣＤ７３抗体（本明細書に記載される抗体など）での治療の前、最中、または前および最中の両方に、対象からサンプルを取得すること、およびサンプルを可溶性ＣＤ７３を検出することができる薬剤、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体と接触させることならびに血液または血清中の可溶性ＣＤ７３のレベルを判定することを含んでもよい。特定の実施形態では、可溶性ＣＤ７３抗原を検出する薬剤は、治療のために対象に投与された抗体ではない（または同一の可変領域を含まない）。
【０３９３】
特定の実施形態では、方法は、ＣＤ７３アンタゴニスト、例えば、本明細書に記載される抗体で治療されている対象の血清中のＣＤ７３アンタゴニストのレベルを判定することならびに抗体のレベルが対象へのそれの投与の後の抗体のレベルよりも低い場合、さらなるＣＤ７３アンタゴニストを対象に投与することを含む。実施例に記載されるように、抗ＣＤ７３抗体を注射した動物の血清中のＣＤ７３抗体の低いレベルは、腫瘍におけるＣＤ７３の阻害の程度と相関性があることが示されている。
【０３９４】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象の腫瘍におけるＣＤ７３のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるＣＤ７３の存在は、対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。
【０３９５】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象において、腫瘍におけるＣＤ７３のレベルおよび腫瘍のＴＩＬにおける免疫−腫瘍学薬剤（例えば、チェックポイント阻害剤または共刺激タンパク質）の標的のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるＣＤ７３の存在およびＴＩＬにおける免疫−腫瘍学薬剤の標的の存在は、対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。免疫−腫瘍学薬剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニストであり得る。
【０３９６】
特定の実施形態では、ＴＩＬにおける免疫−腫瘍学的な標的のレベルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞における免疫−腫瘍学的な標的のレベルを判定することによって測定され、免疫−腫瘍学的な標的の発現が、これらの細胞型のうちの１つまたは複数において検出された場合、対象は、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答する可能性が高い。
【０３９７】
癌を有する対象が、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよびＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象において、腫瘍におけるＣＤ７３のレベルおよび腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＰＤ−１のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるＣＤ７３の存在およびＴＩＬにおけるＰＤ−１の存在は、対象が抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび抗ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。
【０３９８】
特定の実施形態では、ＴＩＬにおけるＰＤ−１のレベルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１のレベルを判定することによって測定され、ＰＤ−１発現が、これらの細胞型のうちの１つまたは複数において検出された場合、対象は、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび抗ＰＤ−１アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い。
【０３９９】
さらに、癌（または腫瘍）を有する対象を治療する方法であって、（ｉ）腫瘍細胞におけるＣＤ７３の発現レベルを判定すること、およびＣＤ７３が腫瘍細胞に存在する場合に、（ｉｉ）対象に、治療上有効な量のＣＤ７３のアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載される抗体を投与することを含む、方法が、提供される。方法は、癌を有する患者から腫瘍サンプルを取得すること、腫瘍細胞におけるＣＤ７３のレベルを判定することならびにＣＤ７３が腫瘍細胞において検出された場合、対象に、ＣＤ７３アンタゴニストおよび適宜別の免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含み得る。
【０４００】
さらに、癌（または腫瘍）を有する対象を治療するための方法であって、（ｉ）腫瘍細胞におけるＣＤ７３の発現レベルを判定すること、（ｉｉ）ＴＩＬにおける免疫−腫瘍学薬剤（例えば、ＰＤ−１）の標的のレベルを判定すること、およびＣＤ７３が腫瘍細胞に存在し、免疫−腫瘍学薬剤の標的がＴＩＬに存在する場合、（ｉｉｉ）対象に、治療上有効な量のＣＤ７３のアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載される抗体およびその標的を標的とする免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含む、方法が、提供される。方法は、癌を有する患者から腫瘍サンプルを取得すること、腫瘍細胞におけるＣＤ７３のレベルを判定すること、ＴＩＬにおけるＰＤ−１のレベルを判定することならびにＣＤ７３が腫瘍細胞において検出され、ＰＤ−１がＴＩＬにおいて検出された場合、対象に、ＣＤ７３アンタゴニストおよびＰＤ−１アンタゴニストに投与することを含み得る。
【０４０１】
特定の実施形態では、癌を有する対象を治療するための方法は、ＣＤ７３を発現する腫瘍細胞を有する対象に、抗ＣＤ７３アンタゴニストを投与し、それによって対象を治療することを含む。癌を有する対象を治療するための方法はまた、ＣＤ７３を発現する腫瘍細胞および免疫−腫瘍学薬剤の標的（例えば、ＰＤ−１）を発現するＴＩＬを有する対象に、抗ＣＤ７３アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）を投与することを含み得る。
【０４０２】
対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）が刺激されるように、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を対象に投与することを含む、対象において免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する方法が、さらに包含される。好ましい実施形態では、対象は、腫瘍を有する対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は、固形腫瘍または液体腫瘍、例えば、血液悪性腫瘍であり得る。特定の実施形態では、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、非免疫原性である。
【０４０３】
本明細書に記載されるこれらおよびその他の方法は、以下にさらに詳述される。
【０４０４】
癌
免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体での患者の治療により、患者における腫瘍成長および転移を低減することができる。抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３の阻害はまた、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。対象が治療される、例えば、その結果、癌性腫瘍の成長が阻害もしくは低減される、および／または腫瘍が退縮するように、対象に、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）と組み合わせて投与することを含む、癌を有する対象を治療するための方法が、本明細書において提供される。抗ＣＤ７３抗体は、別の薬剤、例えば、以下に記載されるような、その他の免疫原性剤、標準癌治療またはその他の抗体とともに使用できる。
【０４０５】
したがって、対象に、治療上有効な量の本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体（例えば、ヒト抗ＣＤ７３抗体）またはその抗原結合部分および免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含む、例えば、対象において腫瘍細胞の成長を阻害することによって癌を治療する方法、例えば、臨床方法が、本明細書において提供される。さらに、またはあるいは、抗体は、キメラまたはヒト化抗ＣＤ７３抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分から構成される、キメラまたはヒト化抗ＣＤ７３抗体であり得る。
【０４０６】
本明細書において提供される併用療法は、腫瘍（例えば、進行固形腫瘍）を有する対象を治療するために、抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤、例えば、阻害性免疫受容体と結合する抗体、特に、抗ＰＤ−１抗体の投与を含む。
【０４０７】
特定の実施形態では、癌を治療する方法であって、抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体が、規定の臨床投与計画に従って、腫瘍（例えば、進行固形腫瘍）を有する患者に投与される、方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆ（重鎖については配列番号１３３または１８９および軽鎖については配列番号１０２）である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ）である。特定の実施形態では、投与計画は、最適な所望の応答（例えば、有効な応答）を提供するように調整される。
【０４０８】
本明細書において、補助的投与または組合せ投与（共投与）には、同じかもしくは異なる剤形での化合物の同時投与または化合物の別個の投与（例えば、逐次投与）が含まれる。したがって、抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体は、単一の製剤において同時に投与され得る。あるいは、抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体は、別個の投与のために製剤化でき、同時または逐次的に投与される（例えば、１つの抗体が、第２の抗体の投与の約３０分前に投与される）。
【０４０９】
例えば、抗ＰＤ１抗体がまず投与され、続いて（例えば、直後に続いて）抗ＣＤ７３抗体の投与が行われてもよく、またはその逆であってもよい。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、抗ＣＤ７３抗体の投与の前に投与される。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、抗ＣＤ７３抗体の投与の後に投与される。別の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体は、同時に投与される。このような同時投与または逐次投与は、好ましくは、治療される患者に、両方の抗体が同時に存在することをもたらす。
【０４１０】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤の組合せを使用して成長が阻害され得る癌としては、典型的に免疫療法に応答する癌が挙げられる。治療のための癌の限定されない例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎癌（例えば、明細胞癌）、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌）、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、神経膠芽腫（神経膠芽腫多形）、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌腫および頭頸部癌（または癌腫）、胃癌（gastric cancer）、生殖細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば、皮膚または眼球内悪性黒色腫などの転移性悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、上皮小体腺の癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導性癌、ウイルス関連癌（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）および２種の主要な血液細胞系統のいずれか、すなわち、骨髄系細胞株（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する）またはリンパ球系細胞株（Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する）に由来する血液悪性腫瘍、例えば、すべての種類の白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（Ｍ０）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３またはＭ３変異体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４変異体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、単離された顆粒球性肉腫および緑色腫などの急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病；ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ球系組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えば、Ｋｉ  １＋）大細胞型リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ球系統の造血器腫瘍、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾��性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる）およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）などのリンパ腫；ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（低悪性度骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫などの骨髄腫；骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）を含めた間葉系起源の腫瘍；セミノーマ、奇形癌腫、星状細胞腫、シュワン腫を含めた中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）および骨肉腫を含めた間葉系起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫を含めたその他の腫瘍、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、それだけには限らないが、小細胞および大脳様細胞型を含めたＴ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）などのＴ細胞障害を含めたＴ細胞およびＢ細胞腫瘍；好ましくは、Ｔ細胞型の大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性および免疫芽球性亜種）；血管中心性（鼻腔の）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎癌、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄系リンパ腫ならびに前記の癌の任意の組合せが挙げられる。本明細書に記載される方法はまた、転移性癌、難治性癌（例えば、遮断性ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１抗体を用いる、例えば、これまでの免疫療法に対して難治性の癌）および再発性癌の治療のために使用してもよい。
【０４１１】
方法は、ＣＤ７３陽性であるかまたは高いレベルのＣＤ７３を発現する腫瘍または癌を治療するために使用され得る。方法は、まず、腫瘍または腫瘍細胞におけるＣＤ７３のレベルを判定すること、および腫瘍または細胞がＣＤ７３、例えば、高いレベルのＣＤ７３を発現する場合、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体で治療することを含み得る。
【０４１２】
特定の実施形態では、治療される患者は、肺癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、甲状腺癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、膵臓癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、子宮内膜癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、結腸癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、肺扁平上皮細胞癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、頭頸部扁平上皮細胞癌を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、卵巣癌（例えば、上皮卵巣癌、原発性腹膜癌、卵管癌）を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、胃癌（例えば、食道胃接合部の腫瘍）を有する。特定の実施形態では、治療される患者は、生検採取可能な病変部を有する。特定の実施形態では、患者は、ＣＤ７３を発現する腫瘍を有する。特定の実施形態では、患者は、高いレベルのＣＤ７３、例えば、腫瘍のものと同一の病因の健常組織におけるＣＤ７３のレベルと比べて高いレベルのＣＤ７３を発現する腫瘍を有する。
【０４１３】
特定の実施形態では、患者は、ＣＤ７３を発現する腫瘍およびＰＤ−１を発現する腫瘍内の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有する。特定の実施形態では、患者は、高いレベルのＣＤ７３を発現する腫瘍および高いレベルのＰＤ−１を発現するＴＩＬを有する。
【０４１４】
特定の実施形態では、患者は、ＣＤ７３およびＡ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）を発現する腫瘍を有する。特定の実施形態では、患者は、ＣＤ７３およびＡ２ＡＲを発現する腫瘍ならびにＰＤ−１を発現するＴＩＬを有する。特定の実施形態では、患者は、高いレベルのＣＤ７３およびＡ２ＡＲを発現する腫瘍および高いレベルのＰＤ−１を発現するＴＩＬを有する。
【０４１５】
腫瘍におけるＣＤ７３およびＡ２ＡＲの発現ならびにＴＩＬにおけるＰＤ−１の発現のレベルは、当技術分野における標準方法、例えば、免疫組織化学またはｍＲＮＡレベルの定量化を使用して判定することができる。
【０４１６】
特定の実施形態では、治療は、腫瘍サイズの低減、転移病変数の経時的な低減、完全な応答、部分的な応答および疾患の安定から選択される少なくとも１つの治療効果をもたらす。
【０４１７】
標的病変部に関して、治療法に対する応答として、以下のものを挙げることができる。
【０４１８】
【表６】
2019514844.tif 000007
【０４１９】
非標的病変部に関して、治療法に対する応答として、以下のものを挙げることができる。
【０４２０】
【表７】
2019514844.tif 000008
【０４２１】
本明細書に開示される方法により治療される患者は、好ましくは、癌の少なくとも１つの兆候における改善を経験する。特定の実施形態では、改善は、測定可能な腫瘍病変部の数および／またはサイズの低減によって測定される。特定の実施形態では、病変部は、胸部ｘ線またはＣＴもしくはＭＲＩフィルムで測定できる。特定の実施形態では、細胞学または組織学を使用して、治療法に対する応答性を評価できる。
【０４２２】
特定の実施形態では、治療される患者は、完全な応答（ＣＲ）、部分的応答（ＰＲ）、疾患の安定（ＳＤ）、免疫関連の完全な疾患（ｉｒＣＲ）、免疫関連の部分的応答（ｉｒＰＲ）または免疫関連の疾患の安定（ｉｒＳＤ）を示す。特定の実施形態では、治療される患者は、腫瘍縮小および／または成長速度の減少、すなわち、腫瘍成長の抑制を経験する。特定の実施形態では、望ましくない細胞増殖が、低減または阻害される。特定の実施形態では、以下のうちの１種または複数が生じ得る：癌細胞の数が低減され得る、腫瘍サイズが低減され得る、末梢器官への癌細胞浸潤が阻害、妨害、減速または停止され得る、腫瘍転移が減速または阻害され得る、腫瘍成長が阻害され得る、腫瘍の再発が防止または遅延され得る、癌と関連する症状のうちの１種または複数がある程度緩和され得る。
【０４２３】
特定の実施形態では、本明細書に提供される方法のうちのいずれかによる有効量の抗ＣＤ７３抗体および免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の投与は、腫瘍サイズの低減、出現する転移病変部の数の経時的な低減、完全な寛解、部分的な寛解、または疾患の安定からなる群から選択される少なくとも１種の治療効果をもたらす。特定の実施形態では、治療の方法は、抗ＣＤ７３抗体または免疫−腫瘍学薬剤単独で達成されるものよりも良好な比較臨床有用率（clinical benefit rate）（ＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋６カ月以上のＳＤ）をもたらす。特定の実施形態では、臨床有用率の改善は、抗ＣＤ７３抗体または免疫−腫瘍学薬剤単独と比較して、約２０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上である。
【０４２４】
特定の実施形態では、治療の前、最中および／または後の疾患評価は、コンピュータ断層撮影法および／または磁気共鳴画像法によって行われる。特定の実施形態では、疾患評価は、ベースラインおよび治療の開始から治療の中止または完了まで７〜１０週間毎に行われる。
【０４２５】
特定の実施形態では、抗腫瘍効果は、ＯＲＲ、ＤＯＲおよびＰＦＳＲによって測定される。ＯＲＲは、最高の全体的な応答率（ＢＯＲ）がＣＲまたはＰＲのいずれかであるすべての治療患者の比率として本明細書に定義される。ＢＯＲは、最初の投与の日から後続の治療法の前の最後の腫瘍評価までの間に記録された、研究にわたって全体として最高の応答を示すものとして本明細書に定義される。ＤＯＲは、最初の応答の日と、疾患進行または死亡のうち早く生じたものの日との間の期間として本明細書に定義される。ＰＦＳＲは、進行がないままであり、生存している治療対象の比率として本明細書に定義される。例えば、２４週でのＰＦＳＲは、進行がないままであり、２４週間生存している治療対象の比率を指す。
【０４２６】
特定の実施形態では、治療の前、最中および／または後の疾患評価は、患者から得られた生検サンプルに対して行われる。生検サンプルは、例えば、コアニードル生検、摘出生検または切開生検であり得る。
【０４２７】
特定の実施形態では、治療される患者は、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によって定義される測定可能な疾患を有する少なくとも１つの病変部を有する。
【０４２８】
特定の実施形態では、治療される患者は、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によって定義される疾患進行を有する。
【０４２９】
特定の実施形態では、治療される患者は、ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１によって定義される測定可能な疾患を有する進行した（例えば、転移性および／または切除不可能な）悪性腫瘍を有する。
【０４３０】
特定の実施形態では、治療される患者は、標準治療計画を少なくとも１回、進行または転移の状況で受けており、その後、進行したか、またはそれに対して非耐容性となっている。
【０４３１】
特定の実施形態では、治療される患者は、チェックポイント経路阻害を特異的に標的とする薬剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２、抗ＬＡＧ−３および抗ＣＴＬＡ−４抗体）で以前に治療されている。
【０４３２】
特定の実施形態では、治療される患者は、Ｔ細胞共刺激経路を特異的に標的とする薬剤（例えば、抗グルココルチコイド誘導型腫瘍壊死因子受容体、抗ＣＤ１３７および抗ＯＸ４０抗体）で以前に治療されている。
【０４３３】
特定の実施形態では、治療される患者は、以前に一時緩和の放射線療法を受けている。
【０４３４】
特定の実施形態では、治療される患者は、以下によって要約される適切な器官機能を有する：白血球数が２０００／μＬ以上、好中球が１５００／μＬ以上、血小板が１００×１０３／μＬ以上、ヘモグロビンが９ｇ／ｄＬ以上、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）正常上限（ＵＬＮ）の３倍以下、総ビリルビンがＵＬＮの１．５倍以下、アルブミンが２ｇ／ｄＬ（２０ｇ／Ｌ）を上回る、国際標準化比がＵＬＮの１．５倍未満、活性化部分トロンボプラスチン時間がＵＬＮの１．５倍未満、臨床的に正常な甲状腺機能または適切な甲状腺補給で管理されている甲状腺機能低下症ならびに血清クレアチニンがＵＬＮの１．５倍以下またはクレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）が４０ｍＬ／分以上。
【０４３５】
特定の実施形態では、治療される患者は、判明しているＣＮＳ転移もしくはその疑い、未治療のＣＮＳ転移または唯一の疾患部位としてのＣＮＳを有さない。しかしながら、特定の実施形態では、放射線および／または外科手術による治療後少なくとも４週間（または介入が臨床的に示されていない場合は４週間の観察の間）、放射線撮影による進行が確認されておらず、少なくとも２週間ステロイドを使用しておらず、新たなまたは進行性の神経学的兆候および症状がないとして定義される、制御されている脳転移の患者は、本明細書に開示される方法での治療を受け入れられる。
【０４３６】
特定の実施形態では、治療される患者は、癌性髄膜炎を有さない。
【０４３７】
特定の実施形態では、治療される患者は、臨床関連の腹水（すなわち、穿刺を必要とする腹水）または中等度の放射線撮影上の腹水を有さない。
【０４３８】
特定の実施形態では、治療される患者は、以前にニボルマブでの治療を受けていない。
【０４３９】
特定の実施形態では、治療される患者は、以前に悪性腫瘍を有していない。
【０４４０】
特定の実施形態では、治療される患者は、同時の介入を必要とする異なる活動性悪性腫瘍を有さない。
【０４４１】
特定の実施形態では、治療される患者は、以前に臓器同種移植の経験を有さない。
【０４４２】
特定の実施形態では、治療される患者は、以前に抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ３９抗体またはアデノシン２Ａ受容体阻害剤での治療を受けていない。
【０４４３】
特定の実施形態では、治療される患者は、脳血管発作、深部静脈血栓症または他の動脈血栓症の病歴を有さない。
【０４４４】
特定の実施形態では、治療される患者は、判明している活動性自己免疫疾患またはその疑いを有さない。しかしながら、特定の実施形態では、白斑症、１型真性糖尿病、ホルモン置換が必要なだけの自己免疫状態に起因する後遺症性（residual）甲状腺機能低下症、グレーブス病の病歴のある甲状腺機能正常患者、全身治療を必要としない乾癬、または外部トリガーの不在下において再発が予測されない状態を有する患者は、本明細書に開示される方法での治療を受け入れられる。
【０４４５】
特定の実施形態では、治療される患者は、症状があるか、または薬物関連の肺毒性の疑いの検出もしくは管理を妨害する可能性のある、間質性肺疾患を有さない。
【０４４６】
特定の実施形態では、治療される患者は、反復的なステロイドバーストまたは１０ｍｇ／日を上回る用量のプレドニゾンまたは同等物での慢性的なステロイドを必要とする慢性閉塞性肺疾患を有さない。
【０４４７】
特定の実施形態では、治療される患者は、活動性自己免疫疾患の不在下における１日１０ｍｇを上回るプレドニゾン同等物の副腎置換ステロイドの投与を除き、研究薬物の投与から１４日以内にコルチコステロイド（１日１０ｍｇを上回るプレドニゾン同等物）または他の免疫抑制薬での全身治療を必要とする状態を有さない。
【０４４８】
特定の実施形態では、治療される患者は、例えば、治療の開始から６カ月以内の心筋梗塞または卒中／一過的虚血性発作、治療の開始から３カ月以内の無制御な狭心症、臨床的に重篤な不整脈（例えば、心室性頻拍、心室性細動または多発性心室頻拍）の病歴、Ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａの式を使用した４８０ミリ秒を上回る心拍の補正ＱＴ間隔（ＱＴｃＦ）の延長、他の臨床的に重篤な心臓疾患（例えば、心筋症、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ［ＮＹＨＡ］の機能的分類ＩＩＩ〜ＩＶのうっ血性心不全、心膜炎、重篤な心膜液貯留）の病歴、毎日の酸素補充療法要件を含む、無制御または重篤な心臓血管疾患を有さない。
【０４４９】
特定の実施形態では、治療される患者は、活動性肝炎を有さない。
【０４５０】
特定の実施形態では、治療される患者は、治療の開始前７日以内に、活動性の細菌性、ウイルス性または真菌性感染を有さない。
【０４５１】
特定の実施形態では、治療される患者は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の試験で陽性の病歴または判明している後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有さない。
【０４５２】
特定の実施形態では、治療される患者は、活動性結核または潜伏結核の感染の兆候または病歴を有さない。
【０４５３】
特定の実施形態では、治療される患者は、治療の４週間以内に大手術を受けていない。
【０４５４】
特定の実施形態では、患者において脱毛症および疲労以外のこれまでの抗癌療法に帰属するすべての毒性は、治療の開始前に、解消されてグレード１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＮＣＩ］Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ［ＣＴＣＡＥ］バージョン４．０３）またはベースラインとなっている。しかしながら、特定の実施形態では、解消されることが予測されず、長引く続発症、例えば、白金に基づく治療法後の慢性ニューロパチーなどをもたらすこれまでの抗癌療法に帰属する毒性を有するものは、本明細書に開示される方法での治療を受け入れられる。
【０４５５】
特定の実施形態では、治療される患者は、治療の１２週間以内に感染性疾患の予防のために生ウイルスを含有する非腫瘍学ワクチンを使用していない。
【０４５６】
特定の実施形態では、治療される患者は、治療前２週間以内に、濃縮赤血球を使用していないか、または血小板輸注を受けていない。
【０４５７】
特定の実施形態では、治療される患者は、ニボルマブに対するアレルギーの病歴を有さない。
【０４５８】
特定の実施形態では、治療される患者は、これまでの抗癌免疫調節療法（例えば、チェックポイント阻害剤、Ｔ細胞共刺激抗体）に対する薬物アレルギー（例えば、アナフィラキシー）の病歴を有さない。
【０４５９】
併用療法
例えば、免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）と組み合わせた、ＣＤ７３に対する抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、免疫原性剤、例えば、癌性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞ならびに免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞と組み合わせることができる（He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28）。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／もしくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。（以下にさらに論じられる）。
【０４６０】
ヒトにおいて、黒色腫などの一部の腫瘍は、免疫原性であることが示されている。ＣＤ７３の阻害を通じてＴ細胞活性化の閾値を低下させることにより、宿主における腫瘍応答が活性化され、非免疫原性腫瘍または限定された免疫原性を有するものの治療が可能となり得る。
【０４６１】
抗ＣＤ７３抗体、例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体および適宜免疫−腫瘍学薬剤は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせることができる。腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験戦略が考案されている（Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62;Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302;Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428;Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738を参照のこと; DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition中のRestifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043も参照のこと）。これらの戦略のうちの１つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するよう形質導入される場合に最も有効であるとわかっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクチベーターであるとわかっている（Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 3539-43）。
【０４６２】
種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった（Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7）。多くの場合には、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において、また腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主における腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示され得る。これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、ＣＤ７３阻害は、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの収集物とともに使用できる。これらのタンパク質は、正常には、自己抗原として免疫系によって見なされ、したがって、それらに対して寛容である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒト癌の８５％超において、および限定された数の体細胞組織のみにおいて発現されるタンパク質テロメラーゼを含み得る（Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変更するか、または２種の無関係の配列間の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体中のｂｃｒ−ａｂｌ）もしくはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプを作製する体細胞突然変異のために癌細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
【０４６３】
その他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒト癌に関わるウイルスに由来するタンパク質を含み得る。ＣＤ７３阻害とともに使用できる腫瘍特異的抗原の別の形態として、腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）がある。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達で高度に効率的である（Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588;Tamura et al. (1997) Science 278:117-120）。
【０４６４】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答をプライムするために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エキソビボで生産され、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を搭載させることができる（Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。ＤＣはまた、同様にこれらの腫瘍抗原を発現するよう遺伝的手段によって形質導入できる。ＤＣはまた、免疫処置を目的として腫瘍細胞と直接融合されている（Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン化の方法として、より強力な抗腫瘍応答を活性化するよう、ＤＣ免疫処置を、ＣＤ７３阻害と効率的に組み合わせることができる。
【０４６５】
ＣＤ７３阻害は、適宜免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）とともに、標準癌治療（例えば、外科手術、放射線および化学療法）と組み合わせることができる。ＣＤ７３阻害は、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、投与される化学療法試薬の用量を低減することが可能であり得る（Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの一例として、黒色腫の治療のためのデカルバジン（decarbazine）と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体がある。このような組合せの別の例として、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体がある。ＣＤ７３阻害および化学療法の組合せ使用の背後の科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死による、ＣＤ７３阻害との相乗作用をもたらし得るその他の併用治療として、放射線照射、手術およびホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、ＣＤ７３阻害と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給し得る。
【０４６６】
このような組合せのさらに別の例として、抗ＣＤ３９、抗Ａ２ＡＲもしくは化学的阻害剤（例えば、ＳＣＨ５８２６１）または抗Ａ２ＢＲ抗体もしくは化学的阻害剤と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体および適宜免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）がある。ＣＤ７３阻害とＣＤ３９、Ａ２ＡＲまたはＡ２ＢＲの阻害との組合せ使用の背後にある科学的論拠は、これらのタンパク質が、ＣＤ７３生物学的機能およびシグナル伝達とも関連していることである。具体的には、ＣＤ３９は、ＡＴＰまたはＡＤＰからＡＭＰへの変換を触媒し、したがって、ＣＤ７３酵素活性（すなわち、ＡＭＰからアデノシンへの変換）の基質（ＡＭＰ）を提供する。さらに、アデノシンは、Ａ１Ｒ、Ａ２ＡＲ、Ａ２ＢＲおよびＡ３を含む、４つの公知の受容体のリガンドである。Ａ２ＡＲおよびＡ２ＢＲは、ｃＡＭＰシグナル伝達を通じて、腫瘍細胞の増殖、成長、遊走および転移、ならびに腫瘍環境におけるＴ細胞活性化を制御することが示されている。
【０４６７】
抗ＣＤ７３抗体はまた、適宜免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）とともに、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用できる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同第５，８３７，２４３号を参照のこと）。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体が、腫瘍の部位に対するマクロファージを標的とするために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答を効率的に活性化し得る。あるいは、抗原は、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用によってＤＣに直接送達され得る。
【０４６８】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β（Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、ＩＬ−１０（Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200)およびＦａｓリガンド(Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答に有利に働くよう、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用できる。
【０４６９】
宿主免疫応答性を活性化するその他の抗体を、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体は、効率的に、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ（Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478）、抗ＣＤ７３抗体とともに使用できる。ＯＸ−４０（Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169）、４−１ＢＢ（Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)およびＩＣＯＳ（Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266）などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することはまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供し得る。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）の阻害剤もまた、抗ＣＤ７３抗体とともに使用してもよい。
【０４７０】
本明細書に記載される他の方法は、特定の毒素または病原体に曝露された患者を治療するために使用される。したがって、本明細書に記載される別の態様は、対象が感染性疾患について治療されるように、対象に抗ＣＤ７３抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象において感染性疾患を治療する方法を提供する。さらに、またはあるいは、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【０４７１】
上記の方法のすべてにおいて、抗ＣＤ７３抗体および適宜免疫−腫瘍学薬剤を、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）または腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法（例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448、Poljak (1994) Structure 2:1121-1123を参照のこと）などのその他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。
【０４７２】
上記に記載される併用療法に加えて、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体および適宜免疫−腫瘍学薬剤はまた、例えば、以下に記載されるように、癌を治療するための併用療法において使用できる。
【０４７３】
さらに、抗ＣＤ７３抗体を、１種または複数のさらなる薬剤、例えば、免疫応答の刺激において有効である抗体と同時投与し、それによって、対象において免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する併用療法の方法が、本明細書において提供される。
【０４７４】
一般に、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、（ｉ）共刺激性受容体のアゴニストおよび／または（ｉｉ）Ｔ細胞での阻害シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができ、これらの両方が、抗原特異的Ｔ細胞応答（免疫チェックポイント制御因子）の増幅をもたらす。共刺激および共阻害分子のほとんどは、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とし、免疫応答を増大する薬剤とともに投与され得る。共刺激または共阻害受容体と結合する膜結合リガンドの１つの重要なファミリーとして、Ｂ７ファミリーがあり、これは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）およびＢ７−Ｈ６を含む。共刺激または共阻害受容体と結合する膜結合リガンドの別のファミリーとして、同種ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーと結合するＴＮＦファミリーの分子があり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα  １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む（例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1を参照のこと）。Ｔ細胞活性化はまた、可溶性サイトカインによって制御される。したがって、抗ＣＤ７３抗体を、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト（または阻害剤もしくは遮断剤）またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ「免疫抑制サイトカイン」）のアンタゴニストおよび／または（ｉｉ）免疫応答を刺激するための、例えば、癌などの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
【０４７５】
例えば、Ｔ細胞応答は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆおよび以下の薬剤のうちの１種または複数の組合せによって刺激できる：
（１）上記のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３、ならびに次のタンパク質：ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＣＤ３９のうちのいずれかなど、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害因子）のアンタゴニスト（阻害剤もしくは遮断剤）、
（２）Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８Ｈなど、Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
【０４７６】
上記のタンパク質のうちの１つを調節し、癌を治療するためにアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体、例えば、本明細書に記載されるものと組み合わせることができる例示的薬剤として、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）（イピリムマブ）またはトレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４に対する）、ガリキシマブ（Ｂ７．１に対する）、ＢＭＳ−９３６５５８（ＰＤ−１に対する）、ＣＴ−０１１（ＰＤ−１に対する）、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１に対する）、ＡＭＰ２２４（Ｂ７ＤＣに対する）、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｂ７−Ｈ１に対する）、ＭＥＤＩ−５７０（ＩＣＯＳに対する）、ＡＭＧ５５７（Ｂ７Ｈ２に対する）、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する）、ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ−３に対する）、ＢＭＳ−６６３５１３（ＣＤ１３７に対する）、ＰＦ−０５０８２５６６（ＣＤ１３７に対する）、ＣＤＸ−１１２７（ＣＤ２７に対する）、抗ＯＸ−４０（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ（ＯＸ４０Ｌに対する）、アタシセプト（ＴＡＣＩに対する）、ＣＰ−８７０８９３（ＣＤ４０に対する）、ルカツムマブ（ＣＤ４０に対する）、ダセツズマブ（ＣＤ４０に対する）、ムロモナブ−ＣＤ３（ＣＤ３に対する）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ−４に対する）が挙げられる。
【０４７７】
癌の治療のためにアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体と組み合わせることができるその他の分子として、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えば、リリルマブ（lirilumab））と組み合わせることができる。
【０４７８】
Ｔ細胞活性化は、可溶性サイトカインによっても制御され、抗ＣＤ７３抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカインのアンタゴニストまたはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストとともに、例えば癌を有する対象に投与され得る。
【０４７９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体を、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害する、ＩｇＳＦファミリーもしくはＢ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーのタンパク質のアンタゴニスト（または阻害剤もしくは遮断剤）またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ「免疫抑制サイトカイン」）のアンタゴニストおよび／または（ｉｉ）免疫応答を刺激するための、例えば、癌などの増殖性疾患を治療するためのＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーもしくはＴＮＦファミリーの、またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせて使用できる。
【０４８０】
併用療法のためのさらにその他の薬剤として、マクロファージまたは単球を阻害または枯渇させる薬剤、それだけには限らないが、ＲＧ７１５５（ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４）またはＦＰＡ−００８（ＷＯ１１／１４０２４９、ＷＯ１３１６９２６４、ＷＯ１４／０３６３５７）を含めたＣＳＦ−１Ｒアンタゴニスト抗体などのＣＳＦ−１Ｒアンタゴニストが挙げられる。
【０４８１】
抗ＣＤ７３抗体はまた、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する薬剤とともに投与してもよい。
【０４８２】
抗ＣＤ７３抗体と組み合わせることができるさらなる薬剤として、腫瘍抗原提示を増強する薬剤、例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびイミキモド、または腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法（例えば、アントラサイクリン）が挙げられる。
【０４８３】
抗ＣＤ７３抗体と組み合わせることができるさらなる他の治療法として、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇または遮断する治療法、例えば、ＣＤ２５に特異的に結合する薬剤が挙げられる。
【０４８４】
抗ＣＤ７３抗体と組み合わせることができる別の治療法は、インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法である。
【０４８５】
抗ＣＤ７３抗体とともに使用され得る別のクラスの薬剤として、アデノシンの形成を阻害する薬剤またはアデノシンＡ２Ａ受容体を阻害する薬剤が挙げられる。
【０４８６】
癌を治療するために抗ＣＤ７３抗体と組み合わせることができる他の治療法として、Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞消耗を逆転／防止する治療法ならびに腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療法が挙げられる。
【０４８７】
抗ＣＤ７３抗体は、１種を上回る免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせてもよく、例えば、次の：腫瘍抗原の提示を増強する治療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ−ＣＳＦ分泌細胞性ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；例えば、ＣＴＬＡ−４および／もしくはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２経路を阻害するならびに／またはＴｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞を枯渇もしくは遮断することによって、負の免疫制御を阻害する治療法；例えば、ＣＤ−１３７、ＯＸ−４０および／もしくはＧＩＴＲ経路を刺激するアゴニストならびに／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストを用いて、正の免疫調節を刺激する治療法；抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増大させる治療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用してまたはエキソビボでの抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって腫瘍におけるＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを枯渇または阻害する治療法；腫瘍における抑制骨髄系細胞の機能に影響を及ぼす治療法；腫瘍細胞の免疫原性を増強する治療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞（ＣＡＲ−Ｔ療法）を含む、養子Ｔ細胞またはＮＫ細胞移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼまたは一酸化窒素シンテターゼなどの代謝酵素を阻害する治療法；Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞消耗を逆転／防止する治療法；腫瘍部位における先天免疫活性化および／または炎症を引き起こす治療法；免疫刺激サイトカインの投与；あるいは免疫抑制サイトカインの遮断のうちの１種または複数など、免疫経路の複数の要素を標的とするコンビナトリアルアプローチと組み合わせてもよい。
【０４８８】
一般に、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体は、１種または複数の、陽性共刺激性受容体をライゲーションするアゴニスト剤、阻害性受容体によるシグナル伝達を減弱する遮断薬、アンタゴニストならびに１種または複数の、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に増大する薬剤、腫瘍微小環境内のそれぞれの免疫抑制経路に克服する（例えば阻害性受容体の関与（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用）を遮断しＴｒｅｇを枯渇または阻害し（例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ）を使用して、またはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇によって）、ＩＤＯなどの代謝酵素を阻害するか、またはＴ細胞アネルギーもしくは消耗を逆転させる／防ぐ）薬剤および先天性免疫活性化および／または腫瘍部位での炎症の引き金を引く薬剤と一緒に使用できる。阻害性受容体の内部移行の増大は、可能性のある阻害剤のレベルが低いと解釈することができる（シグナル伝達が生じないと仮定する）。
【０４８９】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、対象が、ＢＲＡＦ  Ｖ６００突然変異に関して陽性である場合、ＢＲＡＦ阻害剤と一緒に対象に投与される。
【０４９０】
例えば、腫瘍成長を阻害するよう、または抗ウイルス性応答を刺激するよう、対象において免疫応答が刺激されるように、対象に、アンタゴニスト抗ＣＤ７３分子、例えば、抗体ならびに抗ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／または抗ＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体などの１種または複数のさらなる免疫賦活性抗体を投与することを含む、対象において免疫応答を刺激するための方法が本明細書において提供される。一実施形態では、対象は、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体を投与される。一実施形態では、対象は、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与される。一実施形態では、対象は、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与される。一実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ヒト抗体、例えば、本明細書に記載される抗体である。あるいは、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗ＣＤ７３モノクローナル抗体から調製された）、例えば、本明細書にさらに記載されるものであり得る。一実施形態では、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体（例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体）は、ヒト抗体である。あるいは、少なくとも１種のさらなる免疫賦活性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＬＡＧ３抗体から調製された）であり得る。
【０４９１】
アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニストＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ−１抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。また、抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−１抗体を、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＣＤ７３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載される１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３、ＣＤ７３．４、ＣＤ７３．５、ＣＤ７３．６、ＣＤ７３．７、ＣＤ７３．８、ＣＤ７３．９、ＣＤ７３．１０もしくはＣＤ７３．１１または本明細書に記載される別のアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。
【０４９２】
本明細書に記載される方法において使用するための適したＰＤ−１アンタゴニストとして、制限するものではないが、リガンド、抗体（例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体）および多価薬剤が挙げられる。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ−２４４などのＦｃ融合タンパク質である。一実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０４９３】
例示的抗ＰＤ−１抗体として、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８）またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１種のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体がある。特定の実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＭＫ−３４７５（ランブロリズマブ）；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載されるＡＭＰ−５１４；ＰＤＲ００１；およびＣＴ−０１１（ピディリズマブ、以前のＣＴ−ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ、例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409を参照のこと）である。さらに公知のＰＤ−１抗体およびその他のＰＤ−１阻害剤として、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７，６３５，７５７号および同８，２１７，１４９号ならびに米国特許公開第２００９／０３１７３６８号に記載されるものが挙げられる。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ−１抗体のいずれかも使用してもよい。これらの抗体のうち１種と同様に、結合についてＰＤ−１上の同一エピトープと競合する、および／またはＰＤ−１上の同一エピトープと結合する抗ＰＤ−１抗体も、併用治療において使用してもよい。特定の実施形態では、抗体は、上述の抗体との少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。
【０４９４】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、それぞれ、配列番号４４９および４５０に示される配列を含む重鎖および軽鎖を含むニボルマブまたはその抗原結合断片と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、抗体は、ニボルマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する。したがって、一実施形態では、抗体は、配列番号３８１に記載される配列を有するニボルマブのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３８２に記載される配列を有するニボルマブのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３８３〜３８５に記載される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにそれぞれ、配列番号３８６〜３８８に記載される配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３８１および／または配列番号３８２に記載されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび／またはＶＬ領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３８９および／または配列番号３９０に記載される核酸配列によってコードされる重鎖可変（ＶＨ）および／または軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３８１または配列番号３８２との少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性を有する。
【０４９５】
例えば、本明細書において提供される併用療法の特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、ＷＯ２０１６／０７５０９９に記載されるＭＥＤＩ９４４７もしくはＰｈｅｎ  ０２０３ｈＩｇＧ１またはＷＯ２０１６／０５５６０９に記載される抗ＣＤ７３抗体である。例えば、ＭＥＤＩ９４４７は、本明細書において提供される計画に従って、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、ＭＥＤＩ４７３６と組み合わせることができる。例えば、それらは、１週間、２週間、３週間または４週間毎に投与され得、ここで、それらは、両方が、互いに数分または数時間以内で同日に投与される。
【０４９６】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１と結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１と結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１と結合するか、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１と結合する。
【０４９７】
アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニストＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＣＤ７３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体、例えば、本明細書に記載される１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３、ＣＤ７３．４、ＣＤ７３．５、ＣＤ７３．６、ＣＤ７３．７、ＣＤ７３．８、ＣＤ７３．９、ＣＤ７３．１０もしくはＣＤ７３．１１または本明細書に記載される別のアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。
【０４９８】
一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７，９４３，７４３号では１２Ａ４と呼ばれる）またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７，９４３，７４３号に記載される３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（また、抗Ｂ７−Ｈ１としても知られる）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６としても知られる）である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７，６３５，７５７号および同８，２１７，１４９号および米国特許公開第２００９／１４５４９３号において開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれも使用してもよい。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も、併用治療において使用してもよい。
【０４９９】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１と結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１と結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１と結合するか、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１と結合する。
【０５００】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体およびＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載されるイピリムマブまたは抗体１０Ｄ１）、トレメリムマブ（以前は、チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）、モノクローナルまたは以下の刊行物：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６，２０７，１５６；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071；Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145):Abstract No. 2505(抗体CP-675206)；およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304のいずれかに記載される抗ＣＴＬＡ−４抗体の群から選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれも、使用してよい。
【０５０１】
特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４と結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４と結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４と結合するか、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４と結合する。
【０５０２】
抗ＣＤ７３抗体および抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、過剰増殖性疾患（例えば、癌）を治療するための方法が、本明細書において提供される。さらなる実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＬＡＧ−３抗体は、治療量以下の用量で投与され、または両方が、治療量以下の用量で投与される。抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ−３抗体を対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、抗ＣＤ７３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体、例えば、１１Ｆ１１、４Ｃ３、４Ｄ４、１０Ｄ２、１１Ａ６、２４Ｈ２、５Ｆ８、６Ｅ１１、７Ａ１１、ＣＤ７３．３、ＣＤ７３．４、ＣＤ７３．５、ＣＤ７３．６、ＣＤ７３．７、ＣＤ７３．８、ＣＤ７３．９、ＣＤ７３．１０もしくはＣＤ７３．１１または本明細書に記載される別のアンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例として、米国特許公開ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲもしくは可変領域を含む抗体が挙げられる。一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６である。使用できる、その他の当技術分野で認識される抗ＬＡＧ−３抗体として、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載されるＩＭＰ７３１が挙げられる。ＩＭＰ−３２１もまた、使用され得る。これらの抗体のいずれかのものと同一のエピトープと競合する、および／またはそれと結合する抗ＬＡＧ−３抗体も、併用治療において使用してもよい。
【０５０３】
特定の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ−３と結合するか、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ−３と結合するか、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ−３と結合するか、または１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＬＡＧ−３と結合する。
【０５０４】
特定の実施形態では、抗ＣＤ７３抗体は、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有する抗体、例えば、例として、ＷＯ２００６／１０５０２１に記載される６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体；ＷＯ２０１１／０２８６８３に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＪＰ２００８２７８８１４に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；またはＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３３９９１に記載される抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体と一緒に投与される。
【０５０５】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体およびアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体の、ＬＡＧ−３および／またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１などの１種または複数の第２の標的抗原への投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強し得る。本開示の抗体を使用して成長が阻害され得る癌として、通常、免疫療法に応答性の癌が挙げられる。本開示の併用療法を用いる治療のための癌の代表例として、抗ＣＤ７３抗体を用いる単剤治療の考察において上記で具体的に列挙された癌が挙げられる。
【０５０６】
特定の実施形態では、本明細書において論じられる治療用抗体の組合せを、医薬上許容される担体中の単一組成物として同時に、または医薬上許容される担体中の各抗体を有する別個の組成物として同時に投与できる。別の実施形態では、治療用抗体の組合せを逐次投与できる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＣＤ７３抗体を、抗ＣＴＬＡ−４抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を２番目に、または抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を２番目に投与するなど、逐次投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ７３抗体、抗ＰＤ−１抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を２番目に投与するか、または抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−１抗体を２番目に投与するなど、逐次投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＤ７３抗体を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を２番目に投与するか、または抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を２番目に投与するなど、逐次投与できる。さらに、またはあるいは、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＤ７３抗体を、抗ＬＡＧ−３抗体を最初に投与し、抗ＣＤ７３抗体を２番目に投与するか、または抗ＣＤ７３抗体を最初に投与し、抗ＬＡＧ−３抗体を２番目に投与するなど、逐次投与できる。
【０５０７】
さらに、２以上の用量の併用療法が逐次投与される場合には、逐次投与の順序は、各投与時点で逆転させることができ、同一順序で維持することができ、逐次投与は、同時投与またはその任意の組合せと組み合わせることができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＣＤ７３抗体の組合せの第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＣＴＬＡ−４抗体が第１および抗ＣＤ７３抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＣＤ７３抗体が第１および抗ＣＴＬＡ−４抗体が第２で逐次であり得る、など。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ７３抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ−１抗体が第１および抗ＣＤ７３抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＣＤ７３抗体が第１で、抗ＰＤ−１抗体が第２で逐次であり得る、など。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＣＤ７３抗体の第１の投与は、同時であり得、第２の投与は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第１および抗ＣＤ７３抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＣＤ７３抗体が第１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体が第２で逐次であり得る、など。さらに、またはあるいは、組合せ抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＣＤ７３抗体の第１の投与は同時であり得、第２の投与は、抗ＬＡＧ−３抗体が第１および抗ＣＤ７３抗体が第２で逐次であり得、第３の投与は、抗ＣＤ７３抗体が第１および抗ＬＡＧ−３抗体が第２で逐次であり得る、など。別の代表的な投薬スキームは、抗ＣＤ７３が第１および抗ＣＴＬＡ−４抗体（および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体）が第２で逐次である第１の投与を含み得、その後の投与は同時であってもよい。
【０５０８】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ１３７抗体である。好適なＣＤ１３７抗体として、例えば、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６（ＷＯ１２／３２４３３）が挙げられる。
【０５０９】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＯＸ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＯＸ４０抗体である。好適なＯＸ４０抗体として、例えば、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＥＤＩ−６４６９またはＭＯＸＲ０９１６（ＲＧ７８８８、ＷＯ０６／０２９８７９）が挙げられる。
【０５１０】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ４０抗体である。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、ＣＤ４０アンタゴニスト、例えば、アンタゴニストＣＤ４０抗体である。好適なＣＤ４０抗体として、例えば、ルカツムマブ（ＨＣＤ１２２）、ダセツズマブ（ＳＧＮ−４０）、ＣＰ−８７０，８９３またはＣｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４が挙げられる。
【０５１１】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＣＤ２７アゴニスト、例えば、アゴニストＣＤ２７抗体である。好適なＣＤ２７抗体として、例えば、バルリルマブ（varlilumab）（ＣＤＸ−１１２７）が挙げられる。
【０５１２】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＭＧＡ２７１（Ｂ７Ｈ３に対する）（ＷＯ１１／１０９４００）である。
【０５１３】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＫＩＲアンタゴニスト、例えば、リリルマブである。
【０５１４】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。好適なＩＤＯアンタゴニストとして、例えば、ＩＮＣＢ−０２４３６０（ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２）、インドキシモド（indoximod）、ＮＬＧ−９１９（ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７）またはＦ００１２８７が挙げられる。
【０５１５】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、例えば、ＴＬＲ２／４アゴニスト（例えば、カルメット・ゲラン桿菌（Bacillus Calmette-Guerin））；ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ヒルトノール（Hiltonol）またはイミキモド）；ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、レシキモド）；またはＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ７９０９）である。
【０５１６】
一実施形態では、免疫系の刺激により利益を得ることができる疾患、例えば、癌または感染性疾患を有する対象は、対象への免疫−腫瘍学薬剤および抗ＣＤ７３抗体の投与によって治療され、ここで、免疫−腫瘍学薬剤は、ＴＧＦ−β阻害剤、例えば、ＧＣ１００８、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ７１９７またはＩＭＣ−ＴＲ１である。
【０５１７】
一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤の投与の前に逐次投与される。一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤と同時に投与される。さらなる一態様では、抗ＣＤ７３抗体は、第２の薬剤の投与の後に逐次投与される。２つの薬剤の投与は、例えば、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、５日間、７日間、または１週間もしくは数週間離れた時点で開始してもよく、または第２の薬剤の投与は、例えば、第１の薬剤を投与した３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後、３時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、３日後、５日後、７日後、または１週間後もしくは数週間後に開始してもよい。
【０５１８】
特定の態様では、抗ＣＤ７３抗体および第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤は、患者に、例えば、３０分間または６０分間の期間にわたって、同時に投与される、例えば、同時に注入される。抗ＣＤ７３抗体は、第２の薬剤、例えば、免疫−腫瘍学薬剤と共製剤化されてもよい。
【０５１９】
適宜、適宜１種または複数のさらなる免疫治療用抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３遮断）と組み合わせた抗ＣＤ７３を、免疫原性剤、例えば、癌性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞ならびに免疫刺激性サイトカイン（He et al.(2004) J.Immunol.173:4919-28）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞とさらに組み合わせることができる。使用できる腫瘍ワクチンの限定されない例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる（以下にさらに論じられる）。組合せＣＤ７３阻害および１種または複数さらなる抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断）はまた、標準癌治療とさらに組み合わせることができる。例えば、組合せＣＤ７３阻害および１種または複数のさらなる抗体（例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断）を、化学療法治療計画と効率的に組み合わせることができる。これらの場合には、本開示の組合せとともに投与されるその他の化学療法試薬の用量を低減することが可能である（Mokyr et al.(1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの例として、黒色腫の治療のためのデカルバジンとさらに組み合わせた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ−３抗体などのさらなる抗体を伴うか、または伴わない、抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体の組合せがある。別の例として、黒色腫の治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）とさらに組み合わせた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３抗体を伴うか、または伴わない、抗ＣＤ７３抗体の組合せがある。ＣＤ７３阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の、化学療法との組合せ使用の背後にある科学的論拠は、ほとんどの化学療法薬化合物の細胞傷害性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増大をもたらすはずであるということである。細胞死によるＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断を伴うか、または伴わない、組合せＣＤ７３阻害との相乗作用をもたらし得るその他の併用療法として、放射線照射、手術またはホルモン欠乏がある。これらのプロトコールの各々は、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生阻害剤もまた、組合せＣＤ７３阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍細胞死につながり、これが、宿主の抗原提示経路に供給される腫瘍抗原の供給源であり得る。
【０５２０】
適宜ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断抗体と組み合わせた抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体はまた、腫瘍細胞に対するＦｃαまたはＦｃγ受容体を発現するエフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号および同５，８３７，２４３号を参照のこと）。２種の別個の抗原を標的とするよう二重特異性抗体を使用できる。これらの応答のＴ細胞アームは、組合せＣＤ７３阻害およびＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断の使用によって増強される。
【０５２１】
別の実施例では、抗ＣＤ７３アンタゴニスト抗体を、適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および／または抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体と組み合わせて、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼバリン（登録商標）（イブリツモマブ）、キャンパス（登録商標）（アレムツズマブ）、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ（登録商標）（エプルツズマブ（eprtuzumab））、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）およびＴａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）などの抗腫瘍、抗新生物抗体とともに使用できる。例として、理論に捉われようとは思わないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートしている抗癌抗体を用いる治療は、癌細胞死（例えば、腫瘍細胞）につながり得、これは、免疫賦活性薬剤、例えば、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体によって免疫応答媒介性を増強する。例示的実施形態では、過剰増殖性疾患（例えば、癌腫瘍）の治療は、抗癌剤、例えば、抗体を、同時にまたは逐次またはそれらの任意の組合せで、抗ＣＤ７３抗体および適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体と組み合わせて含み得、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
【０５２２】
腫瘍は、多種多様な機序によって宿主免疫監視を回避する。これらの機序のうち多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これらは、中でも、ＴＧＦ−β（Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、ＩＬ−１０（Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびＦａｓリガンド（Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365）を含む。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果に対抗し、宿主による抗腫瘍免疫応答に有利に働くよう、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体を伴ってか、または伴わずに、抗ＣＤ７３抗体とさらに組み合わせることができる。
【０５２３】
宿主免疫応答性を活性化するために使用できるその他の薬剤、例えば、抗体を、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体などを伴ってか、または伴わずに、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせてさらに使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０抗体（Ridge et al., 前掲）は、抗ＣＤ７３抗体および適宜、さらなる免疫賦活性薬剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体とともに使用できる。Ｔ細胞共刺激分子Weinberg et al.、前掲、Melero et al.、前掲、Hutloff et al.、前掲に対するその他の活性化抗体はまた、Ｔ細胞活性化のレベルの増大を提供する。
【０５２４】
上記で論じたように、骨髄移植は現在、造血起源の種々の腫瘍を治療するために現在使用されている。抗ＣＤ７３免疫療法は、単独で、またはＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断と組み合わせて使用して、ドナーから移植された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増大することができる。
【０５２５】
いくつかの実験治療プロトコールは、抗原特異的Ｔ細胞のエキソビボ活性化および拡大および腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のための、これらの細胞のレシピエントへの養子移植を含む（Greenberg & Riddell、前掲）。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化するよう使用できる。抗ＣＤ７３の存在下でのエキソビボ活性化は、さらなる免疫賦活性療法、例えば、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を伴ってか、または伴わずに、養子導入されたＴ細胞の頻度および活性を増大すると予測することができる。
【０５２６】
抗ＣＤ７３抗体を、治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３薬剤、例えば、抗体を伴って、対象に投与することを含む、免疫賦活性薬剤を用いる過剰増殖性疾患（例えば、癌）の治療と関連する有害事象を変更するための方法が、本明細書において提供される。例えば、本明細書に記載される方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することによって、免疫賦活性治療用抗体誘導性大腸炎または下痢の罹患率を低減する方法を提供する。本明細書において、「非吸収性ステロイド」は、広範な初回通過代謝を示し、その結果、肝臓における代謝後に、ステロイドのバイオアベイラビリティが低い、すなわち、約２０％未満であるグルココルチコイドである。本明細書に記載される一実施形態では、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後に広範に、主に肝臓によって代謝される局所活性糖質コルチコイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の治療のために米国において承認されている。クローン病の治療のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）の通常の経口投与量は、６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、腸管において放出され、その後、腸粘膜において吸収され、保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）は、肝臓においてシトクロムＰ４５０系によって、無視できるほどのグルココルチコイド活性を有する代謝産物に広範に代謝される。したがって、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、あまり広範ではない初回通過代謝を有するその他のグルココルチコイドと比較して改善された治療可能比をもたらす。ブデソニドは、全身活性化コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含め、より少ない有害作用しかもたらさない。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣ（登録商標）の慢性投与は、全身性高コルチコイド症（hypercorticism）および副腎抑制などの全身グルココルチコイド作用をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610を参照のこと。
【０５２７】
なおもさらなる実施形態では、非吸収性ステロイドとともに、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断（すなわち、免疫賦活性治療用抗体抗ＣＤ７３および適宜抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体）を伴うか、または伴わないＣＤ７３阻害を、サリチル酸とさらに組み合わせることができる。サリチル酸として、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  ＵｐＪｏｈｎ）；オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  ＵｐＪｏｈｎ）；バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬ（登録商標）、Ｓａｌｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；およびメサラミン（ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ  ＵＳ；ＣＡＮＡＳＡ（登録商標）、Ａｘｃａｎ  Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．；ＲＯＷＡＳＡ（登録商標）、Ｓｏｌｖａｙ）などの５−ＡＳＡ薬剤が挙げられる。
【０５２８】
本明細書に記載される方法に従って、抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３抗体および非吸収性ステロイドを伴う、抗ＣＤ７３抗体と組み合わせて投与されるサリチル酸として、免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率の低減を目的とした、サリチル酸および非吸収性ステロイドの任意の重複または逐次投与を挙げることができる。したがって、例えば、本明細書に記載される免疫賦活性抗体によって誘発される大腸炎の発生率を低減するための方法は、サリチル酸および非吸収性を同時にまたは逐次投与すること（例えば、サリチル酸は、非吸収性ステロイドの６時間後に投与される）、またはその任意の組合せを包含する。さらに、サリチル酸および非吸収性ステロイドを、同一経路によって（例えば、両方を経口投与する）、または異なる経路によって（例えば、サリチル酸を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸に投与する）投与でき、これは、抗ＣＤ７３抗体および抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１および／または抗ＰＤ−Ｌ１および／または抗ＬＡＧ−３抗体を投与するために使用される経路（単数または複数）とは異なり得る。
【０５２９】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体および組合せ抗体療法を、治療されている適応症（例えば、癌）に対するその特定の有用性について選択されるその他の周知の療法とともに使用してもよい。本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体の組合せを、公知の医薬上許容される薬剤（単数または複数）と逐次使用してもよい。
【０５３０】
例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体および組合せ抗体療法は、放射線照射、化学療法（例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ−１１）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル（タキソール）、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ（６Ｘ  ｃｏｍｂｏ）を使用する）、１種または複数のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２）、１種または複数のＢｃｌ−２阻害剤（例えば、ＢＨ３Ｉ−２’（ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤）、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１（ＩＤＯ１）阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ２４３６０）、ＡＴ−１０１（Ｒ−（−）−ゴシポール誘導体）、ＡＢＴ−２６３（小分子）、ＧＸ−１５−０７０（オバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ））またはＭＣＬ−１（骨髄系白血病細胞分化タンパク質−１）アンタゴニスト）、ｉＡＰ（アポトーシスタンパク質の阻害剤）アンタゴニスト（例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃミメティック、合成ｓｍａｃペプチド（Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15）、ＩＳＩＳ２３７２２（ＬＹ２１８１３０８）またはＡＥＧ−３５１５６（ＧＥＭ−６４０））、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ）阻害剤、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲを標的化する抗血管新生剤（例えば、アバスチン）、合成トリテルペノイド（Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808を参照のこと）、ｃ−ＦＬＩＰ（細胞性ＦＬＩＣＥ阻害性タンパク質）モジュレーター（例えば、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００）、キナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドマイド（Lenalildomide）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物などのさらなる治療と組み合わせて（例えば、同時または別個に）使用できる。
【０５３１】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体および組合せ抗体療法は、１種または複数の抗増殖性細胞傷害性薬剤と組み合わせてさらに使用できる。抗増殖性細胞傷害性薬剤として使用してもよい化合物のクラスとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる：
【０５３２】
アルキル化剤（制限するものではないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素およびトリアゼンを含む）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
【０５３３】
代謝拮抗剤（制限するものではないが、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカププリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０５３４】
当技術分野で公知のその他のマイクロチューブリン分解防止剤に加えて、アンタゴニスト抗ＣＤ７３抗体、制限するものではないが、タキサン、パクリタキセル（パクリタキセルは、ＴＡＸＯＬＴＭとして市販されている）、ドセタキセル、ディスコデルモリド（ＤＤＭ）、ジクチオスタチン（ＤＣＴ）、ペロルシド（Peloruside）Ａ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、［１７］−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、［１８］デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２，１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、トランス−９，１０−デヒドロエポチロンＤ、シス−９，１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモリド（discoderomolide）、パツピロン（patupilone）（ＥＰＯ−９０６）、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ（ディスコデルモリド（discoderomolide））、ＴＺＴ−１０２７（ソブリドチン）、ＩＬＸ−６５１（タシドチン塩酸塩（tasidotin hydrochloride）)、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシル酸塩（Eribulin mesylate）（Ｅ−７３８９）、ヘミアステリン（ＨＴＩ−２８６）、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、マイタンシノイドイムノコンジュゲート（ＤＭ−１）、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２（イスピネシブ（ispinesib））、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７β−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ホモ−エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマリド、ラウリマリド、４−エピ−７−デヒドロキシ−１４，１６−ジデメチル−（＋）−ディスコデルモリドおよびクリプトチロン（cryptothilone）１と組み合わせるための適した抗増殖性薬剤。
【０５３５】
本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体を用いる治療とともに、またはそれに先立って異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合には、１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メゲストロールアセテート、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、メドロキシプロゲステロンアセテート、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ＺＯＬＡＤＥＸＴＭなどのホルモンおよびステロイド（合成類似体を含む）も、患者に投与できる。本明細書に記載される方法または組成物を使用する場合には、鎮吐剤などの、臨床設定において腫瘍成長または転移の調節において使用されるその他の薬剤も、望まれるように投与できる。
【０５３６】
化学療法薬の安全および有効な投与のための方法は、当業者に公知である。さらに、その投与は標準的な文献に記載される。例えば、多数の化学療法薬の投与は、その開示内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Physicians' Desk Reference (PDR)、例えば、1996年版(Medical Economics Company、Montvale、N.J. 07645-1742、USA)に記載されている。
【０５３７】
化学療法薬（単数または複数）および／または放射線療法を、当技術分野で周知の治療用プロトコールに従って投与できる。化学療法薬（単数または複数）および／または放射線療法の投与は、治療されている疾患およびその疾患に対する化学療法薬（単数または複数）および／または放射線療法の公知の効果に応じて変わり得るということは、当業者には明らかであろう。また、熟練した臨床医の知識に従って、患者に対する投与された治療薬の観察された効果を考慮して、また投与された治療薬に対する疾患の観察された応答を考慮して、治療プロトコール（例えば、投与の投与量および時間）を変えることができる。
【０５３８】
ＶＩＩＩ．キットおよび単位剤形
抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２／ＩｇＧ１．１ｆ）および免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体、例えば、ニボルマブ）と、医薬上許容される担体とを、前述の方法における使用に適合された治療上有効な量で含有する医薬組成物を含むキットもまた、本明細書において提供される。キットは、適宜、従事者（例えば、医師、看護師または患者）が、癌（例えば、固形腫瘍）を有する患者に組成物を投与するために、中に含まれる組成物を投与できるように、例えば、投与スケジュールを含む説明書も含み得る。キットは、シリンジも含み得る。
【０５３９】
キットは、上記で提供された方法による単回投与のための、有効量の抗ＣＤ７３または免疫−腫瘍学薬剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）をそれぞれが含有する、単回用量の医薬組成物を複数パッケージ含んでもよい。医薬組成物の投与に必要な機器またはデバイスもまた、キットに含まれ得る。例えば、キットは、ある量の抗ＣＤ７３抗体または抗ＰＤ−１を格納した１つまたは複数の事前充填済みシリンジを提供し得る。
【０５４０】
一実施形態では、本発明は、ヒト患者における固形腫瘍を治療するためのキットであって、
（ａ）配列番号１３５に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号８または１２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＣＤ７３抗体、
（ｂ）配列番号３８１に記載される配列を有する重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびに配列番号３８２に記載される配列を有する軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む、ある用量の抗ＰＤ−１抗体、ならびに
（ｃ）本明細書に記載される方法において抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体を使用するための説明書
を含む、キットを提供する。
【０５４１】
以下の実施例によって本開示をさらに例示するが、これは、さらなる制限と解釈されてはならない。本願を通じて引用された、すべての図およびすべての参考文献の内容、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。特に、ＰＣＴ公開ＷＯ０９／０４５９５７、ＷＯ０９／０７３５３３、ＷＯ０９／０７３５４６、ＷＯ０９／０５４８６３、ＷＯ２０１６／０７５０９９、ＷＯ２０１６／０５５６０９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７２９１８、ＰＣＴ／ＵＳ１５／６１６３９ならびに米国特許公開第２０１１／０１５０８９２号および同第２０１６／１２９１０８号の開示内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【０５４２】
実施例１：ヒト抗ＣＤ７３抗体の作製
ヒト抗ＣＤ７３モノクローナル抗体を、ＨｕＭＡｂ（登録商標）トランスジェニックマウス（「ＨｕＭＡｂ」は、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙの商標である）のＨｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２株ならびにＫＭマウス（ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）株は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されているようにＳＣ２０導入染色体を含む）において、作製した。ＨＣ２／ＫＣｏ２７  ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスを、米国特許第５，７７０，４２９号および同第５，５４５，８０６号に記載されるように生成したが、これらの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５４３】
種々の遺伝子型のトランスジェニックマウス（例えば、ＫＭ、Ｈｃｏ７、Ｈｃｏ２７、Ｈｃｏ２０、Ｈｃｏ１２、Ｈｃｏ１７およびＨｃ２）を含む、マウスを、異なる免疫処置戦略（異なる抗原、異なる用量、期間、投与経路（足蹠（ｆｐ）、腹腔内（ｉｐ）および皮下（ｓｃ）ならびにアジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ、Ｒｉｂｉおよび抗体）など）を用いて免疫処置した。マウスからの融合を行い、スクリーニングし、抗体を、これらの融合体から同定した。さらなる特徴付けにより、１１Ｆ１１−１、１１Ｆ１１−２、４Ｃ３−１、４Ｃ３−２、４Ｃ３−３、４Ｄ４−１、１０Ｄ２−１、１０Ｄ２−２、１１Ａ６−１、２４Ｈ２−１、５Ｆ８−１、５Ｆ８−２、６Ｅ１１−１および７Ａ１１−１と示される抗体を含む、特に関心のある抗体の単離に至った。表７（以下）は、各抗体について、重鎖のＩｇＧアイソタイプおよびアロタイプ、ならびに軽鎖のタイプを提供する。軽鎖のみが異なる抗体は、ダッシュ記号の後に異なる数字で表す。例えば、１１Ｆ１１−１は、１１Ｆ１１−２と同一の重鎖を有するが、１１Ｆ１１−１は、軽鎖ＶＫ１を有し、一方で１１Ｆ１１−２は、軽鎖ＶＫ２を有する。別途示されない限り、表内の抗体のＶＨ領域に基づく組換え抗体は、主要な軽鎖を用いて作製した。
【０５４４】
【表８】
2019514844.tif 000009
各抗体の重鎖および軽鎖、ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの全長配列のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列表および表３７に提供される。ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列はまた、図１Ａから１７Ｂにも提供され、種々の抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列のアライメントは、図３５に提供される（ＣＤＲ配列は、太字で示される）。
【０５４５】
実施例２：可変領域におけるアミノ酸置換およびアイソタイプ変異
抗体１１Ｆ１１のＶＨ領域のフレームワーク領域は、以下のアミノ酸残基における突然変異のうちの１つまたは複数を導入することによって、突然変異させた（周囲のアミノ酸を示し、突然変異されたアミノ酸を下線で示す）：Ｔ２５（フレームワーク突然変異；…ＲＬＳＣＡＴＳＧＦＴＦ…）、Ｌ５２（ＣＤＲ２突然変異；…ＷＶＡＶＩＬＹＤＧＳＮ…）、Ｇ５４（ＣＤＲ２突然変異；…ＶＩＬＹＤＧＳＮＫＹＹ…）およびＶ９４（フレームワーク突然変異；…ＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ…）。コンストラクトの名称およびそれらのそれぞれにおける置換は、表８に記載される。
【０５４６】
【表９】
2019514844.tif 000010
【０５４７】
抗体１１Ｆ１１および４Ｄ４の定常領域はまた、それを、Ｃ２１９Ｓ置換を有するＩｇＧ２定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）（「ＩｇＧ２ＣＳ」、配列番号２６７）、置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有するエフェクターレスＩｇＧ１定常領域（「ＩｇＧ１．１ｆ」配列番号２６８）またはＩｇＧ２に由来するＣＨ１およびヒンジ（Ｃ２１９Ｓを有する）ならびにＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３（Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを有する）を含有するエフェクターレスＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド定常領域（「ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ」もしくは「ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ」、配列番号１６９）に切り替えることによって、修飾した。作製したコンストラクトは、表９に列挙されている。
【０５４８】
【表１０】
2019514844.tif 000011
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ  ＩｇＧ１．１ｆのアミノ酸配列を、図１８に示す（配列番号１８９）。
【０５４９】
抗体ＣＤ７３．３〜ＣＤ７３．１１を、以下のように作製した。軽鎖ＶＫ２（配列番号１０２）を、１１Ｆ１１由来の抗体（ＣＤ７３．４、ＣＤ７３．６、ＣＤ７３．８およびＣＤ７３．１０）に使用した。重鎖および軽鎖を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に発現させ、培養培地を、トランスフェクションの５日後に採取した。
【０５５０】
コンストラクトのヒトＦｃγＲとの結合を、ＳＰＲによって測定した。ＩｇＧ１．１およびＩｇＧ２分子のｈＣＤ６４およびｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１結合データは、異なるＦｃの予測値と一致していた。ＩｇＧ１．１ｆが、最も不活性なＦｃである。ＩｇＧ２およびＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓは、ＩｇＧ２に典型的なＦｃＲ結合を示した。予測した通り、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆのデータは、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２よりも有意に弱い結合であるが、ＩｇＧ１．１ｆと比較して増大した結合を示唆する。ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆは、弱いｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１結合（２．３μＭのＫＤ）を有し、すべての他のＦｃγＲに対する結合親和性は、５μＭ未満であった。カニクイザルＦｃγＲに対するＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆの結合親和性は、５μＭよりも高かった。ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆのヒトＦｃＲｎとの結合のＳＰＲ分析は、ｐＨ依存性結合（ｐＨ６では強く、ｐＨ７．４では解離が急速な弱い結合）を示した。
【０５５１】
組換え調製物は、重鎖のＣ末端Ｌｙｓを欠くことが多いことが見出された。例えば、抗体ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆの重鎖の９７％が、Ｃ末端リシンを欠いていた。特定の調製物は、重鎖のＮ末端Ｑ（グルタミン）にピロＱを有していた。例えば、抗体ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１．１ｆの重鎖のＮ末端グルタミンの９４％が、ピロＱであった。
【０５５２】
実施例３：抗ＣＤ７３抗体の結合特徴
Ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＣＤ７３結合動態および親和性を、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって研究した。
【０５５３】
ある実験形式により、ｈＣＤ７３のＮ末端ドメイン（ヒトＣＤ７３の残基２６〜３３６からなる；Ｎ−ｈＣＤ７３と称される）の、固定化されたプロテインＡ表面に捕捉した抗体との結合について試験した。これらの実験について、プロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ  ｔｗｅｅｎ  ２０の泳動緩衝液中で、標準的なエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応を使用して、エタノールアミン遮断を行い、３０００〜４０００ＲＵの密度まで、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフローセル１〜４に固定化した。動態実験は、まず、１０ｕｌ／分で３０秒の接触時間を使用して、抗体（５〜１０ｕｇ／ｍｌ）をプロテインＡ表面に捕捉し、３０ｕｌ／分の流速で、１８０秒の結合時間および３６０秒の解離時間を使用して、６００、２００、６６．７、２２．２、７．４および２．５ｎＭのＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓを結合させて、行った。動態実験の泳動緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．１であった。表面は、３０μｌ／分の流速で１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒のパルスを２回使用した各サイクルの後に、再生した。センサグラムデータを、二重参照した後、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアｖ２．０．４を使用して１：１ラングミュアモデルに当てはめて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）を判定した。
【０５５４】
結果を、表１０に示す。表は、異なる実験からのデータを集約する。２セット以上の数が示されている抗体について、各セットは、別個の実験で得られたデータに対応している。
【０５５５】
【表１１】
2019514844.tif 000012
【０５５６】
表内のＫＤは、一価ＫＤ、すなわち、一価である、抗体のヒトＣＤ７３のＮ末端部分との結合のＫＤである。
【０５５７】
Ｇ５４Ｓ突然変異は、耐容され、親和性をわずかに増大させ、同時に予測されるＤＧ異性化部位を除去するとみられる。Ｌ５２Ｗ突然変異は、およそ１０倍の親和性の減少を引き起こすとみられる。４Ｄ４変異体は、固有のＣＤＲ３配列および異なる動態（１１Ｆ１１分子と比較して遅い結合）を有する。
【０５５８】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆの１０回の実験の平均ＫＤは、１．１±０．４ｎＭである。１１Ｆ１１に対するＴ２５Ａ突然変異は、親和性に影響を及ぼさない。
【０５５９】
結果は、すべての抗ＣＤ７３抗体が、良好な親和性でヒトＣＤ７３と結合し、遅い解離速度を有することを示す。
【０５６０】
結合研究の結果は、結合活性が、１１Ｆ１１、４Ｃ３もしくは４Ｄ４への突然変異の導入またはアイソタイプスイッチの後に維持されたが、一部の抗体は、元の抗体（すなわち、１１Ｆ１１、４Ｃ３または４Ｄ４）と比べて低減された親和性を有したことを示す。特に、ＣＤ７３．１０（Ｔ２５Ａ、Ｌ５２Ｗ、Ｇ５４Ｅ）は、ＣＤ７３．４（Ｔ２５Ａ）またはＣＤ７３．１１（４Ｄ４）よりも速い解離速度を有する。すべてのＩｇＧ２分子の比較は、１１Ｆ１１およびＣＤ７３．４（１１Ｆ１１−Ｔ２５Ａ）が、最も高い一価ＣＤ７３親和性（ＫＤ＝１．１ｎＭ±０．４ｎＭ）を有することを示す。ＣＤ７３．１０（１１Ｆ１１−Ｔ２５Ａ、Ｌ５２Ｗ、Ｇ５４Ｅ）は、１１Ｆ１１またはＣＤ７３．４よりも約１０倍低いＣＤ７３親和性を有する。これは、Ｌ５２ＷもしくはＧ５４Ｅのいずれかまたは両方の突然変異が、他の１１Ｆ１１配列と組み合わせた場合に、ＣＤ７３親和性を低減することを示唆する。４Ｄ４およびＣＤ７３．１１は、ＣＤ７３．１０（ＫＤ約５ｎＭ）に匹敵する親和性を有するが、動態は異なる。４Ｃ３エピトープは、ＣＤ７３のＮおよびＣドメインの領域を含むと考えられ、したがって、単離されたＮドメインの測定されたＫＤは、弱い（ＫＤ＝１００〜２００ｎＭ）。
【０５６１】
Ｋ３７０Ｎ突然変異（ＣＨ３ドメインにおける…ＣＬＶＮＧＦＹ…）を有するＣＤ７３．４−ＩｇＧ２／ＩｇＧ１．１は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて判定される場合、ヒトＣＤ７３と結合することが示された。
【０５６２】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆのカニクイザルＣＤ７３との結合もまた、調査した。カニクイザルＣＤ７３との結合についてのＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆの特異性を、２５℃において、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ヒトＣＤ７３との結合のものと比較した。ヒトＣＤ７３（Ｈｉｓタグと結合したヒトＣＤ７３の残基２７〜５４７からなり、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと称される）またはカニクイザルＣＤ７３（Ｈｉｓタグと結合したカニクイザルＣＤ７３の残基２７〜５４７からなり、ｃｙ−ＣＤ７３−ｈｉｓと称される）のいずれかの全長細胞外ドメインを、固定化されたプロテインＡ表面に捕捉した抗体との結合について試験した。これらの実験について、プロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ  ｔｗｅｅｎ  ２０の泳動緩衝液中で、標準的なエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応を使用して、エタノールアミン遮断を行い、３０００〜４０００ＲＵの密度まで、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のフローセル１〜４に固定化した。実験は、まず、１０ｕｌ／分で３０秒の接触時間を使用して、抗体（５〜１０ｕｇ／ｍｌ）をプロテインＡ表面に捕捉し、３０ｕｌ／分の流速で、１８０秒の結合時間および３６０秒の解離時間を使用して、６００、２００、６６．７、２２．２、７．４および２．５ｎＭのｈＣＤ７３−ｈｉｓまたはカニクイザル−ｈＣＤ７３−ｈｉｓと結合させて、行った。これらの実験の泳動緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．１であった。表面は、３０μｌ／分の流速で１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒のパルスを２回使用した各サイクルの後に、再生した。
【０５６３】
図１９に示される結果は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆが、カニクイザルおよびヒトＣＤ７３と類似の親和性および動態で結合することを示す。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆは、１ｎＭ未満のＫＤで、全長ヒトおよびカニクイザルＣＤ７３二量体と結合する。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆのマウスまたはラットＣＤ７３との有意な交差反応性は観察されなかった。
【０５６４】
１１Ｆ１１抗体に由来する単離されたＦａｂ断片の動態および親和性もまた、ＳＰＲによって評価した。これらの実験では、マウス抗６ｘＨｉｓ抗体に由来するＦａｂドメインを、約３０００ＲＵの密度まで、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップに固定化した。全長ｈＣＤ７３−ｈｉｓを、１０ｕｌ／分で３０秒の接触時間を使用して、１０ＲＵの密度までＦｃ２（１ｕｇ／ｍｌ  ｈＣＤ７３−ｈｉｓ）に、４０ＲＵの密度までＦｃ３（５ｕｇ／ｍｌ  ｈＣＤ７３−ｈｉｓ）におよび１６０ＲＵの密度までＦｃ４（２０ｕｇ／ｍｌ  ｈＣＤ７３−ｈｉｓ）に、捕捉した。次に、１１Ｆ１１  Ｆａｂ断片（ペプシン切断Ｌ−システイン還元１１Ｆ１１抗体から精製）を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．１の泳動緩衝液において、３０ｕｌ／分で１８０秒の結合時間、６００秒の解離時間を使用して、４００、１３５、４４．４、１４．８、４，９、１．７、０．５５ｎＭでの結合に関して試験した。表面は、３０μｌ／分の流速で１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の１５秒のパルスを２回使用した各サイクルの後に、再生した。センサグラムデータを、二重参照した後、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアｖ２．０．４を使用して１：１ラングミュアモデルに当てはめて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）を判定した。結果を、表１１に示す。
【０５６５】
【表１２】
2019514844.tif 000013
【０５６６】
したがって、結果は、１１Ｆ１１  Ｆａｂ断片が、ｈＣＤ７３（ＫＤ約０．７４ｎＭ）に対して高い親和性を有することを示す。
【０５６７】
Ｂ．ＣＤ７３抗体のＣＤ７３陽性細胞との結合
以下の方法を使用して、Ｃａｌｕ６細胞（内因性ＣＤ７３発現体、ヒト肺腺癌細胞株）、ＤＭＳ１１４細胞（ＣＤ７３陰性、ヒト小細胞肺癌細胞株）、ＣＨＯ−カニクイザルＣＤ７３細胞（カニクイザルＣＤ７３トランスフェクト）およびＣＨＯ−Ｋ１細胞（カニクイザルＣＤ７３陰性）において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録投票）６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−２１４４５を二次抗体として使用し、ＣＤ７３抗体により、滴定結合曲線を生成した：
１０００００個の細胞を、１ウェル当たり１００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳで播種し、２０分間ブロッキングした。Ｕ底の９６ディープウェルプレートを使用して、多量の抗体およびＰＢＳ＋２％ＦＢＳを、以下の表１２によって示されるように合わせた。
【０５６８】
【表１３】
2019514844.tif 000014
【０５６９】
６分の１の量（９０ｕＬ）を、４５０μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に希釈することによって、８点連続希釈を行った。細胞プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降させた。希釈した抗体１００ｕＬを、プレートの１ウェル毎に添加した。１００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳを、すべての他のウェルに添加した。プレートを、氷上で４５分間染色し、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、１ウェル当たり２００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中で２回洗浄した。未コンジュゲート抗体を受容したウェルに加えて、１細胞株当たり１つの未染色ウェルを、１００ｕＬのＡＰＣ抗ヒト二次抗体（２０ｕｇ／ｍＬ）に再懸濁した。１００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳを、すべての他のウェルに添加し、氷上で４５分間染色した。プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、１ウェル当たり２００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中で洗浄した。プレートを、再度洗浄し、１ウェル当たり２００ｕＬのＰＢＳ中２％ＦＢＳに再懸濁し、サンプルを流した。
【０５７０】
図２０Ａ１、２０Ａ２、２０Ｂ１、２０Ｂ２、２０Ｃ１、２０Ｃ２、２０Ｄ１、２０Ｄ２および表１３に示されている結果は、すべてのＣＤ７３抗体が、ＣＤ７３を天然に発現する細胞（Ｃａｌｕ６細胞）およびカニクイザルＣＤ７３を発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と結合するが、抗体はＣＤ７３を発現しない細胞（ＤＭＳ１１４およびＣＨＯ−Ｋ１）とは結合しないことを示す。各抗体について取得された結合のＥＣ５０を、表１３に示す。
【０５７１】
【表１４】
2019514844.tif 000015
【０５７２】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−ＩｇＧ１．１ｆのヒト腫瘍細胞株との結合のＥＣ５０は、０．５ｎＭ（０．３〜０．６７ｎＭの範囲）であった。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−ＩｇＧ１．１ｆのカニクイザルＣＤ７３をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞との結合のＥＣ５０は、０．３ｎＭ（０．１〜０．５ｎＭの範囲）であった。
【０５７３】
ＣＤ７３．４抗体のヒトＢ細胞およびＴ細胞との結合もまた、判定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｈ細胞分離勾配培地で単離した。ＰＢＭＣを、連続希釈したＦＩＴＣ標識ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−ＩｇＧ１．１ｆまたはＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆ抗体とともにインキュベートし、Ｔ細胞およびＢ細胞を、ＣＤ３およびＣＤ２０に対する蛍光色素標識抗体を用いて同定した。両方のドナーに由来する細胞を、未染色およびＦＭＯ（蛍光マイナス１）対照サンプルのためにプールした。図２０ＥおよびＦならびに表１４に示される結果は、抗体が、ヒトＢ細胞およびＴ細胞と特異的に結合することを示す。
【０５７４】
【表１５】
2019514844.tif 000016
【０５７５】
Ｃ．スキャッチャード解析によるＣＤ７３抗体の結合親和性
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ（すなわち、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ）を、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）固相ヨウ素化試薬（１，３，４，６−テトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル、Ｐｉｅｒｃｅカタログ２８６００）を使用して、１２５Ｉ−Ｎａ（１  ｍＣｉ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒカタログＮＥＺ０３３Ｈ００１ＭＣ）で放射ヨウ素標識した。過剰なヨウ素を、脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅカタログ４３２４３）を使用して、除去した。標識した抗体の画分を採取し、Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で放射活性について分析した。各画分における１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆ濃度を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＱｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて計算した。放射性純度を、ピークタンパク質および放射活性画分（Ｐｉｎｅｓｔａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ１５１  ００５）の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確立した。
【０５７６】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのヒトＢ細胞との結合：ヒトＢ細胞との結合を、ヒトＢ細胞を１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の未標識ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、１分当たりの計数（ＣＰＭ）の合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの濃度の線形標準曲線を使用して、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
【０５７７】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのヒトＣａｌｕ−６細胞との結合。ヒト肺腫瘍細胞との結合を、Ｃａｌｕ−６細胞を、１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の未標識ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、ＣＰＭの合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの濃度の線形標準曲線を使用して、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
【０５７８】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのＣＨＯ−カニクイザルＣＤ７３トランスフェクタントとの結合。カニクイザルＣＤ７３との結合を、カニクイザルＣＤ７３を発現するＣＨＯ細胞を１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの滴定物とともにインキュベートすることによって、示した。非特異的結合を、１００倍モル過剰の未標識ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの滴定物の存在下における結合によって決定し、これを、次いで、ＣＰＭの合計から差し引いて、特異的結合を計算した。ＣＰＭに対する１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの濃度の線形標準曲線を使用して、最大のｎＭでの１２５Ｉ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆの結合を外挿し、それによって細胞１個当たりの受容体数を計算した。
【０５７９】
スキャッチャード解析の結果は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆが、０．０３ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）でヒトＢ細胞と（図２０Ｇ）、０．３０ｎＭのＫＤでＣａｌｕ−６細胞上のヒトＣＤ７３と（図２０Ｈ）および０．０４ｎＭのＫＤでＣＨＯ−カニクイザルＣＤ７３トランスフェクタントと（図２０Ｉ）、特異的に結合したことを示した。
【０５８０】
したがって、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆは、スキャッチャード法によって、細胞上に発現されるＣＤ７３と高親和性で結合することも示され、フローサイトメトリーの結果をさらに裏付けた。
【０５８１】
実施例４：抗ＣＤ７３抗体の生物物理学的特徴
Ａ．サイズ排除クロマトグラフィーと連結した直列多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
ＣＤ７３モノクローナル抗体のオリゴマー状態を、サイズ排除クロマトグラフィーと連結した直列多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって試験した。Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＦＬＣと接続したＳｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３カラムにおいて、０．５ｍＬ／分で泳動する０．０２％アジ化Ｎａ（０．１μｍ濾過済み）を含有する２００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．８を含有する緩衝液中で、無勾配分離を行った。サンプルを、ＳＩＬ−２０ＡＣ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｓｈｉｍａｄｚｕオートサンプラーを使用して、カラムに注射し、データを、直列に接続した３つのオンライン検出器から取得した：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＳＰＤ−２０ＡＤダイオードアレイＵＶ／ｖｉｓ分光光度計、続いてＷｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤＡＷＮ（商標）ＴＲＥＯＳ多角度光散乱検出器、次いでＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ屈折率検出器。データ（以下の表１５に示される）を収集し、Ａｓｔｒａ（Ｗｙａｔｔ）およびＬａｂｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ソフトウェアを使用して分析した。結果を、表１５に示す。
【０５８２】
Ｂ．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＣＤ７３モノクローナル抗体の熱安定性を、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して判定した。抗体を、ＰＢＳ  ｐＨ７．１中０．５〜０．７５ｍｇ／ｍｌの濃度で分析した。ＤＳＣ機器のベースラインを安定させ、一貫した熱履歴を得るために、サンプルおよび参照細胞の両方において緩衝液単独の走査を、複数回記録した後、サンプル分析を行った。サンプル走査は、サンプル細胞およびＰＢＳ  ｐＨ  ７．１におけるモノクローナル抗体ならびに参照細胞を含んだ。すべての走査は、１０〜１１０℃で、５分間のサイクル前サーモスタット期間を使用し、サイクル後のサーモスタット期間はなしで、６０℃／時間の走査速度で行った。データ（以下の表１５に示される）を、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ｃａｐ  ＤＳＣ分析ソフトウェアを使用して分析した。適切な緩衝液−緩衝液ブランク走査を、サンプル−緩衝液データから差し引き、転移中点温度（transition midpoint temperature）（Ｔｍ）値を、データを非２状態モデルに当てはめることによって判定した。結果を、表１５に示す。Ｔｍ１、Ｔｍ２およびＴｍ３は、抗体における異なるドメインのＴｍである。
【０５８３】
【表１６】
2019514844.tif 000017
結果は、すべての抗体が、大部分が単量体であり、安定であることを示す。
【０５８４】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの免疫原性を、ドナー血液を使用して、インビトロ免疫原性アッセイにおいて試験した。結果は、低い予測免疫原性を示す。
【０５８５】
実施例５：抗ＣＤ７３抗体による酵素活性の阻害
Ａ．ビーズ結合型ＣＤ７３酵素活性の阻害
抗ＣＤ７３抗体によるビーズ結合型ＣＤ７３酵素活性の阻害を評価するために、以下の材料および方法を使用した：
材料
ＴＭ緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２水溶液
０．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液（１０ｍＬの０．５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；１０ｍＬの５Ｍ  ＮａＣｌ；３４ｍＬの水、１０ｕＬのＴｗｅｅｎ−２０）
アデノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａカタログ番号０１９３０−％Ｇ、ＴＭ緩衝液中３００ｍＭ
アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ６４１９−１Ｇ、ＴＭ緩衝液中１００ｍＭ
ｒｈＣＤ７３、０．７８１ｍｇ／ｍＬ
カニクイザルＣＤ７３、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃカタログ番号９０１９２−Ｃ０８Ｈ
磁気ｈｉｓ−タグビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１０３Ｄ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２
ｍＡｂＯ、ＣＤ７３と結合しない無関係抗体
【０５８６】
方法
表１６に列挙される抗ＣＤ７３抗体の６点連続希釈（最大濃度１０ｕｇ／ｍＬ）を、表１６に示されるように量を混合し、３倍に希釈することによって（２２５ｕＬを４５０ｕＬのＴＭ緩衝液に移す）行った。ＩｇＧ２ヒンジを有するすべての抗体が、Ｃ２１９Ｓ突然変異を含んでいた。
【０５８７】
【表１７】
2019514844.tif 000018
【０５８８】
磁気ビーズ（１サンプル当たり２ｕｌのビーズ）を、微小遠心チューブにおいて１ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液中で洗浄した。ビーズを、磁石を用いてプルダウンし、４００ｕＬのＴＭ緩衝液中に再懸濁した。各種のＣＤ７３について：別個のチューブにおいて、ＣＤ７３（１サンプル当たり７５ｎｇ）を、ＴＭと合わせて、体積を最大４００ｕＬにした。３つ目のチューブを、ブランクビーズ（ＣＤ７３なし）用に調製した。ビーズ懸濁液を、ｒｈＣＤ７３溶液と合わせ、室温で５分間、シェーカーで混合した。ビーズを、磁石を用いてプルダウンし、ビーズを、１ｍＬの洗浄緩衝液中で洗浄した。ビーズを、磁石を用いてプルダウンし、ＴＭ緩衝液（１サンプル当たり４０ｕＬ）中に再懸濁した。ビーズを、ＰＣＲ  ９６ウェルプレートに移した（１ウェル当たり４０ｕＬ）。１ウェル当たり２００ｕＬの連続希釈したＣＤ７３  ＨｕＭａｂを、プレートに添加し、十分に混合した。プレートを、室温で３０分間インキュベートした。それぞれ７００ｕＬの４００ｕＭ  ＡＴＰ（８Ｘ）および１．２ｍＭ  ＡＭＰ（８Ｘ）を、調製した。それぞれ６５０ｕＬを合わせて、４×ＡＭＰ／ＡＴＰストックミックスを作製した。ビーズを、プルダウンし、１ウェル当たり２００ｕＬのＴＭ緩衝液で２回洗浄した。ビーズを、再度プルダウンし、３０ｕＬのＴＭ緩衝液中に再懸濁した。３０ｕＬのビーズを、黒色の９６ウェルプレートに移した。１０ｕＬの４倍ＡＭＰ／ＡＴＰストック溶液（最終濃度１５０ｕＭ  ＡＭＰ／５０ｕＭ  ＡＴＰ）を、添加し、混合した。４０ｕＬ体積の対照ウェル（最終濃度１５０ｕＭ  ＡＭＰおよび／または５０ｕＭ  ＡＴＰ）を、添加した。プレートを、３７℃で１５分間インキュベートした。
【０５８９】
結果を、図２１Ａ１、２１Ａ２、２１Ｂ１および２１Ｂ２ならびに表１７に示す。
【０５９０】
【表１８】
2019514844.tif 000019
【０５９１】
カニクイザルＣＤ７３の酵素阻害の結果を、表１８に記載する。
【０５９２】
【表１９】
2019514844.tif 000020
【０５９３】
結果は、抗体が、ヒトＣＤ７３の酵素活性を用量依存的に阻害することを示す。ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆは、組換えヒトＣＤ７３酵素阻害アッセイにおいて、２．９７（２．９〜３．１ｎＭの範囲）のＥＣ５０を有する。ＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆは、組換えカニクイザルＣＤ７３酵素阻害アッセイにおいて、３．７（１．６〜１２．６ｎＭの範囲）のＥＣ５０を有する。したがって、試験したすべてのＣＤ７３に対する抗体は、ビーズ結合型ヒトおよびカニクイザルＣＤ７３酵素活性を阻害する。
【０５９４】
Ｂ．Ｃａｌｕ６細胞におけるＣＤ７３酵素活性の阻害
この実施例は、抗ＣＤ７３抗体での処置後のＡＭＰのＣＤ７３脱リン酸化について、Ｃａｌｕ６（ＣＤ７３陽性）細胞およびＤＭＳ−１１４（ＣＤ７３陰性）細胞の評価を説明する。
材料：
ＣＤ７３抗体、以下の表を参照のこと
ＭａｂＯ対照抗体、５．３８ｍｇ／ｍＬ
ＴＭ緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２水溶液
アデノシン５’−一リン酸二ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａカタログ番号０１９３０−５Ｇ、ＴＭ緩衝液中３００ｍＭ
アデノシン５’−三リン酸二ナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ６４１９−１Ｇ、ＴＭ緩衝液中１００ｍＭ
ｒｈＣＤ７３、０．７８１ｍｇ／ｍＬ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７２
【０５９５】
方法：
抗体を、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて、精製抗体およびＰＢＳを以下の表１９によって示されるように量を混合することによって、連続希釈した。抗体の６点連続希釈（最大濃度２５ｕｇ／ｍＬ、３００ｕＬ）および６０ｕＬを２４０ｕＬのＰＢＳ中に移す５倍希釈を、行った。ＩｇＧ２ヒンジを有するすべての抗体が、Ｃ２１９Ｓ突然変異を含んでいた。
【０５９６】
【表２０】
2019514844.tif 000021
【０５９７】
細胞を、バーゼンを用いて採取し、計数した。プレートに播種し、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降させ、１００ｕＬの連続希釈抗体中に再懸濁した。すべての他のウェルを、１００ｕＬのＰＢＳ中に再懸濁した。インキュベーションは、３７℃で２０分間行った。１５ｍＬのＡＭＰの１８０ｕＭストックを、ＴＭ緩衝液中に調製した。
【０５９８】
プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降し、２００ｕＬのＰＢＳ／ウェルで１回洗浄した。プレートを、再度遠心沈降し、１００ｕＬのＡＭＰ中に再懸濁した。すべての他のウェルを、１００ｕＬのＴＭ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、３７℃で６０分間、ＡＭＰとともにインキュベートした。ＴＭ緩衝液中のＡＴＰの６０ｕＭストックを７．５ｍＬ調製した。プレートを、１５００ｒｐｍで５分間遠心沈降し、５０ｕＬの上清を、黒色９６ウェルプレートに移した。５０ｕＬのＡＴＰを、添加した。ｒｈＣＤ７３を、陽性対照として、１ウェル当たり７５ｎｇで特定のウェルに添加した。ｒｈＣＤ７３を受容しなかったウェルを、ＴＭ緩衝液で１００ｕＬにした。最終濃度は、９０ｕＭ  ＡＭＰ：３０ｕＭ  ＡＴＰであった。インキュベーションは、３７℃で１５分間行った。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ（ＡＴＰを検出する）については、１００ｕＬを、１ウェル毎に添加し、プレートを読み取った。
【０５９９】
図２２Ａ１、２２Ａ２、２２Ｂ１、２２Ｂ２および表２０に示される結果は、抗ＣＤ７３抗体が、ヒトＣＤ７３陽性Ｃａｌｕ６細胞においてはＡＭＰの脱リン酸化を阻害する（またはＡＭＰプロセシングを低減する）が、ＣＤ７３陰性ＤＭＳ１１４細胞においては影響を有さないことを示す。ヒト腫瘍細胞株Ｃａｌｕ６における、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ抗体の内因性細胞ＣＤ７３の遮断のＥＣ５０は、０．３９ｎＭ（０．３１〜０．４８ｎＭの範囲）であった。これらの実験を、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（粘液性表皮癌腫（mucoepidermoid carcinoma）細胞株）およびＳＫ−ＭＥＬ−２４細胞（ヒト黒色腫細胞株）において繰り返したが、結果は類似であった（表２０）。
【０６００】
【表２１】
2019514844.tif 000022
【０６０１】
Ｃ．二重細胞株ｃＡＭＰアッセイにおけるＣＤ７３酵素活性の阻害
均一性時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）ｃＡＭＰアッセイ
ＣＤ７３抗体を、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、５μｌ／ウェルで３８４ウェル白色底ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に播種した。Ｃａｌｕ−６細胞を採取し、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に再懸濁した後、５μｌの細胞（３００個の細胞／ウェル）を、プレートに添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で１０分間抗体とともにインキュベートした後、５μｌ／ウェルの８０ｍＭ  ＡＭＰを添加した。細胞を、さらに、３７℃で３０分間、ＡＭＰとともにインキュベートした。この時間の間に、ＨＥＫ２９３／Ａ２ＡＲ細胞を、採取し、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中４０万個／ｍｌに希釈した。これらを、５μｌ／ウェルでアッセイプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートを続けた。ＨＲＴＦアッセイは、均一性時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）ＨｉＲａｎｇｅ  ｃＡＭＰ検出キット（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用し、製造業者の説明書に従って、溶解緩衝液中の、１０μｌ／ウェルのｃＡＭＰコンジュゲートｄ２および１０μｌ／ウェルのユーロピウムクリプテートコンジュゲート抗ｃＡＭＰ抗体を添加することによって、行った。プレートを、室温で６０分間インキュベートし、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナル（６６５および６１５ｎＭ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して読み取った。ＦＲＥＴシグナルを、６６５ｎｍ（アクセプター）および６１５ｎｍ（ドナー）のチャネルからのシグナルの比として計算し、１０，０００倍した。ＩＣ５０およびＹｍａｘを、測定した。Ｙｍａｘを、内部最大値として１００ｎＭ用量の１１Ｆ１１と比較することによって判定した。すべての計算を、１００％に設定したこの対照と比較した阻害の割合として判定した。
【０６０２】
表２１に示される結果は、抗ＣＤ７３モノクローナル抗体が、細胞株共培養系を使用したこのｃＡＭＰアッセイにおいて異なる効果および効力を示したことを示す。すべての抗体は、アデノシン産生のいくらかの低減を示し、阻害の程度は、スクリーニングしたほとんどの抗体で類似であった。最も大きな阻害は、１１Ｆ１１、１１Ａ６、４Ｃ３および５Ｆ８で見られた。
【０６０３】
【表２２】
2019514844.tif 000023
【０６０４】
酵素阻害アッセイはまた、１１Ｆ１１  ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２でも行った。図２２Ｃに示される結果は、酵素阻害が、Ｆ（ａｂ’）２断片で生じたが、Ｆａｂ断片では生じなかったことを示す。したがって、Ｆｃ領域は、１１Ｆ１１酵素阻害には必要ではないが、二価は必要とされる。
【０６０５】
Ｃａｌｕ６細胞における酵素阻害は、種々の重鎖定常領域を含むＣＤ７３．４抗体についても判定し、これは、上述のｃＡＭＰアッセイを使用し、表２６に示す。結果を、ＥＣ５０およびバックグラウンドに対する阻害のレベル（「Ｓ：Ｂ」）として、表２８の最後の２列に提供する。結果は、すべてのＣＤ７３．４抗体が、Ｃａｌｕ６細胞においてヒトＣＤ７３酵素活性を阻害することを示す。
【０６０６】
Ｄ．ＣＤ７３酵素活性阻害の時間過程
酵素活性の阻害はまた、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってアデノシン生成を評価することによって、時間過程においても評価した。Ｃａｌｕ６細胞を、１１Ｆ１１または４Ｃ３とともに、３０分間、２時間または４時間インキュベートした後、５０μＭ  ＡＭＰを添加し、標準方法を使用して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってアデノシン産生の評価を行った。
質量分析の条件（Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓ）：
機器：Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓ（Ｗａｔｅｒｓ  ２７７７Ｃを備える）
【０６０７】
【表２３】
2019514844.tif 000024
【０６０８】
図２２Ｄに示される結果は、インキュベーション時間が、３０分の時点で確かに差をもたらし、１１Ｆ１１による阻害が、４Ｃ３によるものよりも早く生じることを示す。いずれの抗体も、後の時点で同等の阻害を達成したが、１１Ｆ１１抗体は、細胞におけるＣＤ７３酵素活性をより急速に阻害する。
【０６０９】
実施例６：抗体媒介性ＣＤ７３内部移行
抗ＣＤ７３抗体媒介性ＣＤ７３内部移行を、２種の異なるアッセイにおいて測定した。
【０６１０】
Ａ．高コンテント内部移行アッセイ（２時間の固定時間アッセイ）
抗ＣＤ７３抗体を使用して、２時間の抗体インキュベーションの後に、細胞発現を評価することによって、Ｃａｌｕ６細胞における抗ＣＤ７３抗体依存性ＣＤ７３内部移行を試験した。２０μｌの完全培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含むＧｉｂｃｏ  ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０）中の細胞（２，０００個の細胞／ウェル）を、３８４  ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で一晩成長させた。抗ＣＤ７３抗体を、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、５μｌ／ウェルで細胞プレートに添加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で２時間、抗体とともにインキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中最終濃度４％）を、次いで、２０ｕｌ／ウェルで細胞プレートに添加し、プレートを、室温で１０分間インキュベートした。その後、すべての液体を吸引し、細胞を、３０ｕｌのＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体（２．５μｇ／ウェルの抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．１０．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ）を、１５μｇ／ウェルで固定した細胞プレートに添加した。細胞を、４℃で一晩インキュベートした。翌日に、プレートを、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ−４８８ヤギ抗ヒトおよびＤＡＰＩを含有する二次抗体を添加し、室温で１時間染色した。ＰＢＳ緩衝液中で３回洗浄した後、プレートを、Ａｒｒａｙｓｃａｎ  Ｖｔｉ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で撮像した。ＩＣ５０およびＹｍａｘを、測定した。Ｙｍａｘを、内部最大値として１００ｎＭ用量の１１Ｆ１１と比較することによって判定した。すべての計算を、１００％に設定したこの対照と比較した内部移行の割合として判定した。
【０６１１】
結果を、表２２に提供する。
【０６１２】
【表２４】
2019514844.tif 000025
【０６１３】
したがって、結果は、ヒトＣＤ７３を発現する細胞株Ｃａｌｕ６におけるＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆによって媒介されるＣＤ７３内部移行のＥＣ５０が、１．２ｎＭであったこと、および細胞株における内部移行の最大レベルが、９７．５％であったことを示す。
【０６１４】
内部移行アッセイもまた、１１Ｆ１１  ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２を用いて行った。図２２Ｃに示される結果は、内部移行が、Ｆ（ａｂ’）２断片では生じたが、Ｆａｂ断片では生じなかったことを示す。したがって、Ｆｃ領域は、１１Ｆ１１内部移行に必要ではない。
【０６１５】
内部移行速度を評価するために、動態内部移行研究を行った。２０μｌの完全培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含むＧｉｂｃｏ  ＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０）中の細胞（２，０００個の細胞／ウェル）を、３８４  ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２および湿度９５％で一晩成長させた。ＣＤ７３抗体を、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈し、５μｌ／ウェルを細胞プレートに添加した。細胞を、３７℃で０〜２時間の時間過程で、抗体とともにインキュベートした後、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を、続いて、室温で１０分間、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中最終濃度４％）で固定した後、３０ｕｌのＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体（２．５μｇ／ウェルの抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．１０．ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ）を、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で希釈し、１５μｌ／ウェルを固定した細胞プレートに添加した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。翌日に、ＰＢＳ緩衝液中で３回洗浄した後、ＤＡＰＩを含む二次抗体Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗ヒトを添加した。細胞を、室温で６０分間染色し、３回洗浄した後、Ａｒｒａｙｓｃａｎ  Ｖｔｉ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して、画像を取得した。結果を、図２３Ａ〜２３Ｄならびに表２３および２４に提供する。表２４内の値は、図２３Ａ〜Ｄに示されるデータから導出される。
【０６１６】
【表２５】
2019514844.tif 000026
【０６１７】
【表２６】
2019514844.tif 000027
【０６１８】
結果は、ビン１の抗体（１１Ｆ１１ならびにその誘導体ＣＤ７３．４およびＣＤ７３．１０）が、良好な内部移行ＥＣ５０および最大値（９７．５％）を示したが、いくつかの抗体は、その他のものよりも多く内部移行されたことを示す。１１Ｆ１１は、最も活性であり、数分以内に内部移行され、３０分以内にプラトーに達したが、６Ｅ１１（これもビン１の抗体、ＩｇＧ１）は、内部移行がより緩徐であり、約１時間でプラトーに達した（図２３Ａ〜Ｄ）。ビン２の抗体（５Ｆ８および４Ｃ３）は、有意に内部移行しなかった。加えて、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの存在により、内部移行の速度および程度が増強された。この傾向は、複数の細胞株において観測された（図２３Ａ〜Ｄおよび表２４）。
【０６１９】
Ｂ．フローサイトメトリーによって測定される内部移行
抗ＣＤ７３抗体媒介性ＣＤ７３内部移行もまた、フローサイトメトリーによって試験した。示されている細胞を、氷上で３０分間、１０μｇ／ｍＬの示されている抗体とともにインキュベートし、数回洗浄し、示されている時間で３７℃に移した。細胞を、示されているインキュベーション時間の後、同じ時間で採取した。細胞を、一次抗体（初回インキュベーションに使用された同一抗体）で再度染色した後、抗ヒト二次抗体で染色した。細胞を、次いで、フローサイトメトリーによって、ＣＤ７３の発現についてアッセイした。
【０６２０】
図２３Ｅおよび表２５に示される結果は、上記の内部移行アッセイで得られた結果と一致しており、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を有するすべての抗体が、急速かつ完全な内部移行を誘導したことを示す。ＣＤ７３レベルは、洗浄後２２時間後以降、低いままであり、内部移行が持続性であることを示す。
【０６２１】
図２３Ｆおよび表２５に示される類似の結果が、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株において得られ、ここで、抗体は、インキュベーション時間の間、培養液中に維持された（洗浄なし）。ここでも、これらのデータは、内因性ＣＤ７３の急速かつ有意な内部移行および下方制御の維持を示す。
【０６２２】
内部移行アッセイはまた、ヒトＳＮＵ−Ｃ１細胞（結腸癌細胞株）およびＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞（非小細胞肺癌腫細胞株）を用いて行った。図２３Ｉおよび２３Ｊならびに表２５に示される結果もまた、急速な内部移行を示し、５時間以内に最大レベルに達し、ＳＮＵ−Ｃ１細胞におけるＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆでは最大内部移行レベル約５０％およびＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞については６０％であった。図２３Ｇおよび２３Ｈは、Ｃａｌｕ６細胞およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において、類似のＣＤ７３．４．ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆの内部移行動態を示す。内部移行したＣＤ７３の％を示すグラフについて、この数は、以下のように得た：
【０６２３】
【数１】
2019514844.tif 000028
各抗体について、ＭＦＩｔ＝ｘは、所与の時点におけるＭＦＩであり、ＭＦＩｔ＝０は、ｔ＝０における最大蛍光であり、ＭＦＩｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、二次抗体のみのＭＦＩである。
【０６２４】
【表２７】
2019514844.tif 000029
【０６２５】
内部移行に対するアイソタイプの役割をさらに区別するために、さらなる内部移行アッセイを、Ｃａｌｕ６細胞およびＨ２９２細胞において行った。内部移行アッセイを、上記のように行い（抗体の洗浄工程なしのプロトコール）、表２６に示される種々のハイブリッドアイソタイプの抗体は、インキュベーション時間の間、１０μｇ／ｍＬで培養物中に維持された。フローサイトメトリー実験については、実施例６Ｂの方法を、９６ウェルプレートにおいて（４８ウェルプレートとは対照的に）および１ウェル当たり５０，０００個の細胞で、高スループット分析に適合させた。
【０６２６】
【表２８】
2019514844.tif 000030
【０６２７】
ＦｃγＲ結合は、各コンストラクトについて予測した通りであることが示された。すなわち、ＦｃγＲ結合は、下部ヒンジ／ＣＨ２領域によって作動される。
【０６２８】
結果を、図２３Ｋ、Ｌ、Ｍならびに表２７および２８に示す。表２７に示されるデータは、実施例６Ｂに記載される同一のプロトコールを使用して生成した。表２８に示されるデータは、実施例６Ａに記載される同一のプロトコールを使用して生成した。
【０６２９】
【表２９】
2019514844.tif 000031
【０６３０】
【表３０】
2019514844.tif 000032
【０６３１】
図２３Ｋ、ＬおよびＭならびに表２７および２８は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体が、ＣＤ７３の内部移行を作動させるのに最も効率的であり、一方で、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、図における低い曲線、すなわち、低い程度の内部移行に対応することを示す。加えて、ＩｇＧ２由来のヒンジのみを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１ヒンジと比較して、内部移行の増大を有する。したがって、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体と比べて、優れた内部移行特徴を有する。
【０６３２】
したがって、抗ＣＤ７３抗体ｍＡｂ−ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆは、試験した細胞株に応じて急速な内部移行を誘導した。内部移行のＴ１／２は、数分から１時間未満の範囲に及んだ。試験したほとんどの細胞株が、１０分未満のＴ１／２を有した。ほぼ完全な内部移行が、いくつかの細胞株で誘導され、試験したすべてが、表面ＣＤ７３発現の少なくとも５０％の低減を有し、これは、典型的に、５時間以内、一部の場合にはこれよりはるかに短い時間で最大レベルに達した。
【０６３３】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳのデータは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１領域を含むモノクローナル抗体（ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ）との間では、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１領域を含むもの（ＩｇＧ１．１ｆ）と比較して、より大きな複合体が形成されることを示す。
【０６３４】
実施例７：異種移植片動物モデルの腫瘍におけるＣＤ７３酵素阻害
Ａ．Ｃａｌｕ−６異種移植片モデルにおける抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３酵素活性のインサイツ阻害
皮下ヒトＣａｌｕ６腫瘍を保持するマウスを、７日間の成長の後、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ１．１、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳまたはＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１で処置した。抗体は、１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投薬した。腫瘍を、抗体を投与した１日目、２日目、３日目および７日目に採取し、ＯＣＴに包埋し、低温イソペンタン中で急速凍結した。ＯＣＴ包埋腫瘍を、５〜６μｍの切片に切断し、室温で一晩乾燥させた。腫瘍切片を、２．５分間、低温１０％リン酸緩衝ホルマリンおよびアセトンの１：１混合物で固定した後、室温で１時間、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．２５Ｍスクロースを含有する５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で予備インキュベートした。１時間後に、予備インキュベーション緩衝液を除去し、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  Ｐｂ（ＮＯ３）２、２．５％デキストランＴ２００、２．５ｍＭレバミゾールおよび１ｍＭ  ＡＭＰを補充した同一の緩衝液と置き換えた。酵素反応を、３７℃で１時間行った。脱イオン水ですすいだ後、切片を、ちょうど１分間、１％（ＮＨ４）２Ｓとともにインキュベートした後、脱イオン水で即座にすすいだ。切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、キシレン系封入剤で封入した。茶色は、活性ＣＤ７３の存在を示し、一方で茶色が存在しないのは、ＣＤ７３酵素活性が抗体によって阻害されたことを示す。
【０６３５】
結果は、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ１．１、ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳおよびＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１は、インビボでＣＤ７３酵素活性を阻害することを示している。ＣＤ７３．１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１抗体で処置したマウスに由来する腫瘍の代表的な染色切片を、図２４Ａ〜２４Ｅに示す。他の２つの抗体で処置したマウスの腫瘍の染色切片は、類似であった。ＣＤ７３の阻害の程度は、抗体の血清レベルと相関性があった。したがって、３日目の実施例において観察されたわずかに高いレベルのＣＤ７３活性は、７日目の実施例よりも低い血清レベルの抗体と関連性があった。
【０６３６】
Ｂ．Ｃａｌｕ−６異種移植片モデルにおけるＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．ＣＳ．ＩｇＧ１．１ｆによるＣＤ７３酵素活性のインサイツ阻害
この実験により、Ｃａｌｕ−６異種移植片腫瘍モデルにおいて、ＣＤ７３の酵素活性を抑制するＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの能力を評価した。
【０６３７】
マウス（Ｈｓｄ無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ、６〜８週齢）に、Ｃａｌｕ−６腫瘍（２５〜５０ｍｍ３）を移植した。移植した腫瘍が、約２５０ｍｍ３に達したときに、マウスに、０．１、０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの単回用量を、対照として無関係な完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともに腹腔内投与した。腫瘍を、７２時間に採取し、最適切断温度（ＯＣＴ）培地に包埋した。
【０６３８】
ＯＣＴ包埋腫瘍を、５〜６μｍの切片に切断し、室温（ＲＴ）で一晩乾燥させた後、−８０℃で保管した。腫瘍切片を解凍し、２．５分間、低温１０％リン酸緩衝ホルマリンおよびアセトンの１：１混合物で固定した後、室温で１時間、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．２５Ｍスクロースを含有する５０ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で予備インキュベートした。１時間後に、予備インキュベーション緩衝液を除去し、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  Ｐｂ（ＮＯ３）２、２．５％デキストランＴ２００、２．５ｍＭレバミゾールおよび５’１ｍＭ  ＡＭＰを補充した同一の緩衝液と置き換えた。酵素反応を、３７℃で１時間行った。脱イオン（ＤＩ）水ですすいだ後、切片を、ちょうど１分間、１％（ＮＨ４）２Ｓとともにインキュベートした後、脱イオン水で即座にすすいだ。切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、キシレン系封入剤で封入した。自動化画像分析を行って、ＣＤ７３の酵素活性を定量化した。すべてのスライドを、３ＤＨＩＳＴＥＣＨ  ＬｔｄからのＰａｎｎｏｒａｍｉｃ  ＭＩＤＩスキャナーを使用して、スキャンした。Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏソフトウェアのＳｍａｒｔ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎアルゴリズムを使用して、全腫瘍切片（壊死部分を除く）に、分析を行った。アルゴリズムを、複数の画像にわたって訓練して、茶色の染色（酵素活性の指標）、青色の染色（酵素活性の不在の指標）およびバックグラウンドを検出した。アルゴリズムのパラメーターを設定した後に、すべてのスライドを分析した。このアプリケーションは、染色された茶色の領域および青色の領域をピクセルで計算する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、データを分析し、グラフにした。
【０６３９】
Ｃａｌｕ−６腫瘍は、ＣＤ７３の酵素活性と関連する強力な茶色の染色によって示されるように、高いレベルのＣＤ７３を発現した。３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆでの処置は、用量依存性様式で、ＣＤ７３を抑制した。腫瘍切片の画像分析は、３ｍｇ／ｋｇで投薬したＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆが、腫瘍におけるＣＤ７３活性を約２４％抑制したが、１０ｍｇ／ｋｇの用量は、ＣＤ７３活性の６７％の抑制を達成したことを示す（表２９および図２２Ｅ）。３ｍｇ／ｋｇ未満の用量では、腫瘍境界における薄茶色の染色によって示されるように、最小限のＣＤ７３阻害のみが観察され、その結果、画像分析は行わなかった。
【０６４０】
【表３１】
2019514844.tif 000033
【０６４１】
Ｃａｌｕ−６腫瘍におけるＣＤ７３活性の完全な阻害は、マウスＣＤ７３を発現するマウス間質の存在に起因して、１０ｍｇ／ｋｇの飽和用量でさえも達成されなかった。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆは、マウスＣＤ７３と交差反応しない。したがって、マウス組織（例えば、間質、血管）から生じるベースラインＣＤ７３活性は、異種移植腫瘍モデルにおいて常に存在している。
【０６４２】
これらの結果は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆが、用量依存性様式で、Ｃａｌｕ−６腫瘍においてＣＤ７３の酵素活性を阻害することを示す。しかしながら、異種移植片腫瘍内の正常なマウス組織の存在に起因して、ＣＤ７３活性の完全な抑制は達成することができない。
【０６４３】
Ｃ．ＳＮＵＣ１異種移植片モデルにおけるＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．ＣＳ．ＩｇＧ１．１ｆによるＣＤ７３酵素活性のインサイツ阻害
上記のものに類似の実験を、皮下ヒトＳＮＵＣ１結腸腺癌由来の異種移植片腫瘍を保持し、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで処置したマウスに行った。ＳＮＵＣ１腫瘍を有するマウスを、０日目に、１、３および１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆで腹腔内処置した。腫瘍を、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間および１６８時間で採取した。ＣＤ７３酵素阻害アッセイを、上記のように行った。茶色の染色の定量化を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｒｅｍｉｅｒソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて行った。
【０６４４】
図２４Ｆにグラフで示される結果は、ＣＤ７３活性が、抗ＣＤ７３抗体を投薬した動物では、対照抗体で処置したマウスと比較した場合に、有意に低減され、３種すべての濃度において抗体による強力なＣＤ７３酵素阻害を示すことを示す。したがって、抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆは、インビボでＣＤ７３酵素活性を効率的に阻害する。
【０６４５】
ＨＡＬＯ（商標）ソフトウェアを使用した全スライド画像の自動化画像分析により、４７％の低減が見られた一時点（９６時間で１ｍｇ／ｋｇ）を除き、すべての投薬群で、それぞれの対照群と比較して、７０％〜９６％の範囲の酵素活性の低減が明らかとなった。明らかな用量依存性も時間過程依存性も観察されなかった。これは、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのマウスＣＤ７３との交差反応性の不在（異種移植片系においてすべてのＣＤ７３酵素活性を完全に抑制することができない）および試験した曝露レベルにおける抑制の有効性に部分的に帰属し得る。
【０６４６】
結果は、ＣＤ７３．４ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆが、ＳＮＵ−Ｃ１腫瘍においてＣＤ７３活性の７０％〜９６％を阻害することを示す。
【０６４７】
抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３阻害の動態もまた、４Ｔ１同系腫瘍モデルにおいて判定した。ＴＹ／２３（ラット抗マウスＣＤ７３抗体）またはラットＩｇＧ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）を、４Ｔ１腫瘍細胞注射後７日目に注射した。腫瘍、膵臓、全血および血清を、抗体処置後１日目、２日目、３日目、６日目および７日目に採取した。ＣＤ７３活性の阻害を、示される日の切片において上記のように測定した。代表的な腫瘍切片を、図２５Ａおよび２５Ｂに示す。データは、ＴＹ／２３が、インビボでＣＤ７３活性を阻害することを示す。
【０６４８】
Ｄ．ＭＣ３８腫瘍における抗マウスＣＤ７３抗体によるＣＤ７３酵素活性のインサイツ阻害
１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの単回用量の抗マウスＣＤ７３抗体を投与した後の異なる時点におけるインビボでのＭＣ３８腫瘍におけるＣＤ７３酵素活性の阻害レベルもまた、判定した。
【０６４９】
ＭＣ３８腫瘍を有する動物に、抗マウスＣＤ７３抗体を０、１０、２０または３０ｍｇ／ｋｇで投薬し、酵素活性を、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、２４０時間後、３３６時間後または５０４時間後に採取した腫瘍において判定した。酵素阻害のレベルを、画像分析後に数値に変換した。図２４Ｇに示される結果は、３種すべての用量における抗ＣＤ７３抗体の酵素活性の阻害を示し、阻害が、３種すべての用量で、抗体の投与後長期間続くことを示す。抗マウスＣＤ７３抗体での処置により、試験した３種すべての用量について、投薬後最初の９６時間、ＣＤ７３活性が抑制された（図２４Ｇ）。その後の時点では用量依存性応答が観察され、高い用量の抗体は、３３６時間を上回るＣＤ７３活性の阻害を示したが、低い用量では、ＣＤ７３活性の阻害は１６８時間しか示されなかった。したがって、阻害は、抗体投与後長期間続き、ＣＤ７３酵素活性の阻害のレベルは、抗体の血清レベルと相関性があった。
【０６５０】
実施例８：エピトープビニングおよびフローサイトメトリーに基づく交差遮断
エピトープビニング研究を、２５℃で、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器（Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって行った。これらの研究について、２０〜３０μｇ／ｍｌのｈＣＤ７３−ｈｉｓを、９０〜１８０秒のローディング相を使用して、抗ペンタ−ｈｉｓセンサーで捕捉した。抗体の競合を、所与の抗体（ｍＡｂ１）をｈＣＤ７３−ｈｉｓ表面と１８０秒間結合させた後、即座に二次抗体溶液（ｍＡｂ２）に１８０秒間曝露することによって、評価した。ｍＡｂ１の予備結合後のｍＡｂ２の結合シグナルを、競合がない場合のｍＡｂ２のものと比較して、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓ表面との結合について競合するか否かを判定した。これらの実験は、多数のｍＡｂ対を両方の順序（ｍＡｂ１の後にｍＡｂ２およびｍＡｂ２の後にｍＡｂ１）で行って、競合プロファイルおよびエピトープビンを確立した（以下の表３０に要約される）。
【０６５１】
表３０に示されるように、エピトープビニング分析により、２つのエピトープビンが判明した。
【０６５２】
【表３２】
2019514844.tif 000034
【０６５３】
抗体はまた、フローサイトメトリーに基づく交差遮断にも供した。実験は、１セットの標識された蛍光標識抗体および第２のセットの未標識抗体を使用して、次のように行った：１０００００個のＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、１ウェル毎に播種した。プレートを遠心沈降させ、細胞を、１ウェル当たり１００ｕＬのＰＢＳ中２％ＦＢＳに再懸濁した。細胞を、氷上で２０分間ブロッキングした。示されるように、ＰＢＳ中２％ＦＢＳ中の未標識抗体を、各ウェルに添加した。プレートを遠心沈降させ、細胞を、１ウェル当たり１００ｕＬの、希釈し標識した抗体（１０ｕｇ／ｍＬ）、すなわち、４Ｃ３または１１Ｆ１１いずれかをＦＩＴＣとコンジュゲートさせたものに、再懸濁した。６ウェルの細胞を、抗体なしでインキュベートし、１００ｕＬのＰＢＳ中２％ＦＢＳのみに再懸濁した（対照）。細胞を、次いで、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中２％ＦＢＳで２回洗浄し、サンプルを、１４０ｕＬのＰＢＳ中２％ＦＢＳに再懸濁し、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
【０６５４】
図２６ＡおよびＢに示される、フローサイトメトリーに基づく交差遮断の結果により、上記のＳＰＲエピトープビニングデータを確認する。例えば、７Ａ１１は、１１Ｆ１１と競合するが、４Ｃ３は競合しない。
【０６５５】
実施例９：ＨＤＸによるエピトープマッピング
この実施例は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆに対するヒトＣＤ７３上のエピトープの同定のためのＨＤＸ−ＭＳの使用について記載する。
【０６５６】
水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）法により、タンパク質骨格アミドの水素原子（プロリンを除く）の重水素交換の速度および程度をモニタリングすることによって、溶液中のタンパク質のコンホメーションおよびコンホメーション動態を調べる。ＨＤＸの交換レベルは、タンパク質溶媒接触可能性および水素結合に依存し、ＨＤＸ時のタンパク質の質量増大を、ＭＳによって正確に測定することができる。この技術を酵素消化と組み合わせた場合、ペプチドレベルでの構造特性を分解することができ、表面に曝露しているペプチドを内部に折り畳まれているものと区別することが可能となる。エピトープマッピング実験では、重水素標識および続いて反応停止処理の実験を、抗原および抗原／モノクローナル抗体複合体について並行して行い、続いて、オンラインペプシン消化、ペプチド分離およびＭＳ分析を行った。
【０６５７】
ＣＤ７３におけるＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆのＨＤＸ−ＭＳによるエピトープマッピングの前に、非重水素化実験を行って、組換えヒト全長ＥＣＤ二量体ＣＤ７３（１２μＭ）ならびに組換えヒトＣＤ７３およびＣＤ７３モノクローナル抗体のタンパク質複合体（１：１のモル比、ＣＤ７３モノクローナル抗体が１２μＭ）の共通の消化性ペプチドの一覧を生成し、全長ＥＣＤ  ＣＤ７３の配列カバレッジ８８％を達成した。ＨＤＸ−ＭＳ実験では、５μＬのＣＤ７３（配列番号９９）またはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆモノクローナル抗体を伴うＣＤ７３を、５５μＬのＤ２Ｏ緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＤ７．０）中に希釈して、室温で標識反応を開始した。使用したＣＤ７３タンパク質は、以下にも示される配列番号９９を有するグリコシル化全長二量体ｈＣＤ７３であった）。反応は、異なる期間：２０秒間、１分間、１０分間および２４０分間行った。各標識反応期間の終わりに、反応停止緩衝液（４Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０．４Ｍ  ＴＣＥＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ２．５、１：１、ｖ／ｖ）を添加することによって、反応を停止させ、反応停止サンプル５０μＬを、分析のためにＷａｔｅｒｓ  ＨＤＸ−ＭＳシステムに注射した。共通の消化性ペプチドの重水素取込みレベルを、ＣＤ７３モノクローナル抗体の不在下／存在下でモニタリングした。
【０６５８】
使用したＣＤ７３タンパク質は、配列番号９９を有するアミノ酸配列を有した。
【０６５９】
ＣＤ７３におけるＣＤ７３モノクローナル抗体のＨＤＸ−ＭＳ測定は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−ＣＳ−ＩｇＧ１．１ｆモノクローナル抗体が、ＣＤ７３のＮ末端領域における２つのペプチド領域から構成される不連続エピトープを認識することを示す：
ペプチド領域１（６５〜８３）：ＦＴＫＶＱＱＩＲＲＡＥＰＮＶＬＬＬＤＡ（配列番号９６）
ペプチド領域２（１５７〜１７２）：ＬＹＬＰＹＫＶＬＰＶＧＤＥＶＶＧ（配列番号９７）
【０６６０】
相互作用の三次元ビュー（図２７Ｂ）は、これらの２つの領域が、幾何学的に近似していることを示す。相互作用の詳細なマップを、図２７Ａに示す。
【０６６１】
実施例１０：１１Ｆ１１のＣＤ７３との結合の結晶構造
この実施例は、ＣＤ７３（２６−３３６）Ｈｉｓと結合した１１Ｆ１１のＦａｂ’の結晶構造について記載する。
【０６６２】
ＣＤ７３（２６−３３６）Ｈｉｓを、標準プロトコールを使用して、一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３  Ｅ細胞から精製し、そのまま使用したかまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆ処置によって脱グリコシル化し、１．２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。抗体１１Ｆ１１  Ｆａｂ’を、標準プロトコールを使用して、１１Ｆ１１のペプシン消化によって調製し、１．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０６６３】
等体積の脱グリコシル化ｈＣＤ７３（２６−３３６）Ｈｉｓおよび１１Ｆ１１  Ｆａｂ’を４℃で一晩インキュベートすることによって複合体を形成し、ＧＥ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラムを使用して精製し、１０ｋ  ＭＷＣＯ回転濃縮装置を使用して９．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０６６４】
結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散実験において成長させ、ドロップは、０．２５ｕＬのタンパク質を０．２５ｕＬリザーバ溶液と混合したものであった。７１００回を上回る結晶化実験を設定した。初回の結晶リードは、約１０μｍほどに小さかった。最適化された結晶は、サイズが２００〜３００μｍであった。結晶化の最適化にはスクリーニングが含まれた：添加剤、界面活性剤、沈降剤、ｐＨ、温度および緩衝液の種類。結晶形成を可能にした条件は次の通りであった：リザーバ溶液は３４％ポリプロピレングリコールＰ４００、０．１Ｍ  Ｎａ／Ｋ  ＰＯ４  ｐＨ６．５および１５μＭ  ＣＹＭＡＬ−７を含み、結晶化実験は、室温に設定した後、４℃においてインキュベートし、４℃で７日間インキュベートした。結晶の形成は、グリコシル化ＣＤ７３タンパク質でのみ観察された。
【０６６５】
結晶を、結晶化ドロップから直接採取し、液体Ｎ２中に直接入れた。１００個を上回る結晶を、社内で回折についてスクリーニングした。
【０６６６】
データを、Ｒａｙｏｎｉｘ  ＭＸ−３３ＨＳ高速ＣＣＤ検出器を備えるＳＥＲ−ＣＡＴビーム線２２ＩＤにおいて、小ビーム、非常に小さな減衰およびヘリックスデータ収集を使用して収集した。データセットは、４．１Å、３．８Å、３．５Åおよび最終的に３．０５Åで収集した。日常的なＨＫＬ２０００（Otwinowski Z., Minor W., Methods in Enzymology 276, 307-326 (1997)）を使用して処理およびスケーリングしたデータは、３．０４Å分解能に対して９６％完全であった。
【０６６７】
ＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1990) “Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215:403-410）検索を使用して、ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  ＢａｎｋにおいてＣＤ７３のＮ末端ドメインならびにＦｃおよびＦｖドメインに最も近いモデルを見出して、分子置換え検索で使用した：ＣＤ７３モデルは、ＰＤＢエントリー４Ｈ１Ｓからのものであった（Heuts et al. Chembiochem. 2012 Nov 5;13(16):2384-91）。
【０６６８】
これらを、ＰＨＡＳＥＲ（McCoy et al. J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674）分子置換え検索における出発モデルとして使用した。ＣＤ７３検索により、非対称単位で５種類の分子が見出された。ＣＤ７３を固定したまま保ち、重鎖検索モデルを用いた検索により、非対称単位で２種類の分子を見出した。ＣＤ７３および重鎖を固定したまま保ち、軽鎖を用いた３回目のＰＨＡＳＥＲ検索により、さらに非対称単位で２種類の分子が見出された。５種類の完全な複合体のコンポジットモデルを、５種類のＣＤ７３をオーバーレイし、重鎖および軽鎖をマッチングさせることによって、部分解から作製した。これを、ＢＵＳＴＥＲ（Bricogne et al. (2011) BUSTER version 2.11.6. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd）精錬の出発モデルとして使用した。
【０６６９】
モデルを、再度当てはめ、アミノ酸を、１１Ｆ１１配列を反映するように変更した。モデルに、さらなる手動モデル構築および精錬を行った。合計５回のＢＵＳＴＥＲ精錬サイクルを行って、精錬を完了した。最終的なＲ係数は、２７，４８４個のタンパク質原子および２４個の溶媒分子について、２０．５９％（Ｒ−ｆｒｅｅ＝２４．５８％）であった。
【０６７０】
複合体の結晶構造を表すものを、図２８Ａ〜Ｄに記載する。
【０６７１】
結晶構造は、相互作用は１つを除きすべてが、ＣＤＲ領域中の残基に由来するものであり、相互作用の大半が、ＶＨドメインに由来し、２つの追加の相互作用がＶＬドメインに由来するものであることを示す（図２８Ａ）。ヒトＣＤ７３および１１Ｆ１１  Ｆａｂ’の相互作用する残基を、表３１に示す。
【０６７２】
【表３３】
2019514844.tif 000035
【０６７３】
ＣＤ７３二量体上の重なった２つのＣＤ７３（ＮＤＴ）／１１Ｆ１１複合体の複合構造に基づくモデル（ＰＤＢエントリー４Ｈ１Ｓ）は、１１Ｆ１１が、二量体の接合部から離れたＣＤ７３上の表面と結合することを示唆し、Ｆａｂが、二量体形成を妨害しないことを示唆する。
【０６７４】
ＣＤ７３／１１Ｆ１１複合体におけるＨＤＸ−ＭＳマッピングおよびＸ線結果の比較は、それらが、ＣＤ７３上の類似のエピトープ（６５〜８３および１５７〜１７２）を示すということで基本的に一致することを示す。しかしながら、Ｘ線構造は、Ｍｅｔ−１０５からＡｓｐ−１１１（Ａｒｇ−１０９およびＴｙｒ−１１０とのＨ結合を含む）、Ｌｙｓ−１３５からＰｒｏ−１３９ならびにＡｓｐ−３１７からＩｌｅ−３２０（Ｓｅｒ−３１９とのＨ結合を含む）の領域において追加の相互作用（６Å未満）を示す。
【０６７５】
実施例１１：抗体／ＣＤ７３複合体のサイズに対する異なるヒンジ／Ｆｃの影響
上記の実施例に示されるように、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を有する抗ＣＤ７３抗体は、細胞におけるＣＤ７３酵素活性のより良好な阻害因子であり、ＩｇＧ１ヒンジを有する同一抗体よりも良好に内部移行する。この観察およびＩｇＧ２ヒンジが、ＩｇＧ１ヒンジよりも堅固であるという事実に基づいて、抗原とＩｇＧ２ヒンジを有する抗体との間には、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗体と比べて大きな複合体が形成されるという仮説を立てた。以下の実験を行って、この仮説を分析した。
【０６７６】
溶液中のＣＤ７３／抗体複合体の構造およびオリゴマー状態を、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳによって試験した。これらの研究について、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２のいずれかの定常領域を含む抗体を、様々なモル比で、Ｃ末端ポリヒスチジンタグを含有するヒトＣＤ７３の全長細胞外ドメイン（ヒトＣＤ７３のアミノ酸残基２６〜５４６、「ｈＣＤ７３−ｈｉｓ」と称される）またはヒトＣＤ７３のＮ末端ドメインに対応する断片（アミノ酸残基２６〜３３６、「Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ」と称される）のいずれかを含む組換えタンパク質と混合した。
【０６７７】
ＣＤ７３／抗体複合体のオリゴマー状態を、サイズ排除クロマトグラフィーと連結した直列多角度光散乱検出器（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）によって試験した。Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＦＬＣと接続したＳｈｏｄｅｘ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＫＷ−８０３カラムにおいて、０．５ｍＬ／分で泳動する０．０２％アジ化Ｎａ（０．１μｍ濾過済み）を含有する２００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．８を含有する緩衝液中で、無勾配分離を行った。サンプルを、ＳＩＬ−２０ＡＣ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｓｈｉｍａｄｚｕオートサンプラーを使用して、カラムに注射し、データを、直列に接続した３つのオンライン検出器から取得した：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＳＰＤ−２０ＡＤダイオードアレイＵＶ／ｖｉｓ分光光度計、続いてＷｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤＡＷＮ（商標）ＴＲＥＯＳ多角度光散乱検出器、次いでＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ屈折率検出器。データを収集し、Ａｓｔｒａ（Ｗｙａｔｔ）およびＬａｂｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ソフトウェアを使用して分析した。
【０６７８】
動的光散乱（ＤＬＳ）研究を、２５℃で、３８４ウェルプレートにおいて、Ｗｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーで行った。実験のパラメーターは、測定１回当たりそれぞれ５秒で２０回の取得であり、測定は、報告された平均および標準偏差とともに、４連で記録した。強度自己相関関数を、Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、「Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ」アルゴリズムを使用して当てはめた。
【０６７９】
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳの要約を、図２９ＡおよびＢに提供する。抗体単独の分析は、各抗体について、単量体モノクローナル抗体に典型的である保持時間（約１６〜１７分間）、質量（１４０〜１５０ｋＤａ）および流体力学半径（５．０〜５．４ｎｍ）を示す。ｈＣＤ７３−ｈｉｓタンパク質のデータは、溶液中の予測二量体構造を取るタンパク質と一致している；特に、ＳＥＣ−ＭＡＬＳデータにより判定された質量（１２０ｋＤａ）は、ＣＤ７３−ｈｉｓ二量体に予測されるもの（１１７ｋＤａ）と一致しており、ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単量体に予測されるであろうもの（５８．５ｋＤａ）とは一致しない。Ｎ−ｈＣＤ７３のデータは、溶液中で単量体である組換えＮドメインタンパク質と一致しており（ＳＥＣ−ＭＡＬＳで測定された質量＝３８ｋＤａ、予測単量体質量＝３５．０ｋＤａと比較）、これは、タンパク質の二量体化に関与する全長ＣＤ７３細胞外ドメインの領域が、Ｃ末端ドメイン内に含まれており、Ｎドメイン残基は寄与しないため、そのように予測される。
【０６８０】
所与の抗体のＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓとの等モル混合物は、ＳＥＣにおいて単一の種として、抗体またはＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独よりも短い保持時間、ならびにＤＬＳによるより大きな流体力学半径（Ｒｈ）で溶出することが見出され、これは、複合体の形成と一致する。ＭＡＬＳデータは、これらの複合体の質量がおよそ２１０ｋＤａであることを示す。これは、所与の抗体の２つのＦａｂドメインのそれぞれと結合して１：２の抗体：Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ複合体を形成した、１つのＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ分子と一致する。
【０６８１】
抗ＣＤ７３抗体とｈＣＤ７３−ｈｉｓ二量体との混合物のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータは、混合物が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓまたは抗体単独のいずれかよりも早く溶出することを示し、複合体が形成されることを示す。同じ可変領域を含むが定常ドメインは異なるモノクローナル抗体のデータを比較すると、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むモノクローナル抗体との複合体（ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ）の溶出時間が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓのＩｇＧ１．１ｆ定常ドメインを含むモノクローナル抗体との複合体のものよりも速いことを示す。加えて、ＭＡＬＳにより判定されたｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むモノクローナル抗体との複合体の質量は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むモノクローナル抗体との複合体のものよりも大きい。ＤＬＳのデータは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むモノクローナル抗体との複合体の流体力学半径が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むモノクローナル抗体との複合体のものよりも大きいことをさらに示す。例えば、３種の異なる定常領域を有するＣＤ７３．４（ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆまたはＩｇＧ１．１ｆ）のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳのデータを、図３０に示す。ここで、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むＣＤ７３．４との複合体が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆとの複合体と比較して、短い保持時間（図３０Ａ）、大きな流体力学半径（図３０Ｂ）および大きなＭＡＬＳにより判定される質量（図３０Ｃ）を有することが、理解できる。ＭＡＬＳ質量に基づいて、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと抗体との複合体の構造および化学量論の図形モデルを、図３０Ｄに示し、ここで、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆを含む複合体は、主として、より小さな２：２（ピーク１＝約５５０ｋＤａ）または４：４のモノクローナル抗体／ＣＤ７３二量体複合体（ピーク２＝約１３００ｋＤａ）を形成し、一方でＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとはるかにより大きな複合体（３０００ｋＤａを上回る）を形成し、これについては、正確な構造および化学量論は、高い信頼性でモデリングすることができない。
【０６８２】
表２７に記載される重鎖定常領域を有するＣＤ７３．４抗体もまた、複合体形成のサイズに関して試験した。図３０Ｄに示されるように、結果は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗体では、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを有するものと比べて、より高次な複合体が形成されることを示す。
【０６８３】
集合的に、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳのデータは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１領域を含むモノクローナル抗体（ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ）との間では、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１領域を含むもの（ＩｇＧ１．１ｆ）と比較して、より大きな複合体が形成されることを示す。加えて、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを有するものよりも大きな複合体を形成する。
【０６８４】
電子顕微鏡分析により、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗体では、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗体で形成されるより大きなストリング様複合体と比べて小さい複合体の形成が確認された（実施例２５および図５２を参照のこと）。
【０６８５】
実施例１２：抗体媒介性ＣＤ７３内部移行の改善におけるＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジ内の特定のアミノ酸残基の関連性
表３２に示される重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体（ＣＤ７３．４）を調製し、抗体媒介性ＣＤ７３内部移行アッセイにおいて上述のように試験した。
【０６８６】
【表３４】
2019514844.tif 000036
図３１に示される結果は、ＣＤ７３内部移行の文脈において以下の情報を提供する：
・ＣＨ２ドメインには、以下の影響はないと考えられる。
ａ）「ＡＹ」形式（ＩｇＧ２ヒンジＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧ（配列番号８）を有する修飾された重鎖定常領域を含む抗体間では、「ＫＨ」（ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号２２）のものと比べて、内部移行能力にほとんど違いが観察されなかった（セット５、６および７）；
ｂ）ＣＨ２交換は、野生型Ｇ１またはＧ２に匹敵する（セット５および６）；ならび
ｃ）残基２３７は、内部移行に影響を有さず、「Ｇ」残基のＩｇＧ２ヒンジへの付加もＩｇＧ１ヒンジにおけるＣ末端「Ｇ」の欠失も、内部移行に影響しなかった（セット９）
これは、ＣＨ２ドメインが、内部移行に影響を有さないことを示唆する（すなわち、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２に由来し得る）。
・セット３において示されるＩｇＧ１のＣＨ１領域（ＫＲＧＥＧＳＳＮＬＦ、ＫＲＧＥＧＳ、ＳＮＬＦ、ＩＴＮＤＲＴＰＲおよびＳＮＬＦＰＲ）を、ＩｇＧ２のものと交換することにより、得られる利益はほとんどない、すなわち、内部移行は、ＩｇＧ１のものと類似のままである；セット３を参照のこと）；
・セット４において示されるＩｇＧ２のＣＨ１領域（ＲＫＥＧＳＧＮＳＦＬ、ＲＫＥＧＳＧ、ＮＳＦＬ、ＴＩＤＮＴＲＲＰおよびＮＳＦＬＲＰ）を、ＩｇＧ１のものと交換することは、変動性の影響を有する：ＮＳＦＬを変更することは影響を有さないが、他の２つの領域（ＲＫＥＧＳＧおよびＲＰ）は、関与する（セット４を参照のこと）。セット３および４の結果に基づくと、ＣＨ１領域とヒンジとの相互作用が存在し、ＲＫＥＧＳＧおよびＲＰ領域が、ＮＳＦＬ領域よりも重要であると考えられる。
・ヒンジ領域は、内部移行に影響を及ぼす、すなわち、ＩｇＧ２のヒンジは、ＩｇＧ１のヒンジと比べて、良好な内部移行を提供する（セット７および８を参照のこと）。加えて、欠失を有するＩｇＧ１（Ｇ１−デルタ−ヒンジ）は、ＩｇＧ１よりも内部移行を改善する。欠失を有するＩｇＧ２（Ｇ２−デルタ−ヒンジ）は、ＩｇＧ２ヒンジのものと比べて、類似のレベルの内部移行を提供する。これは、ヒンジ領域が、内部移行に影響を及ぼし、その効果が、ＩｇＧ２  ＣＨ１によって増強されることを示唆する（Ｇ２−Ｇ１−Ｇ２−Ｇ２−ＡＹは、Ｇ１−Ｇ２−Ｇ１−Ｇ１−ＡＹに匹敵する）；
・ＩｇＧ２．４（Ｃ２２０Ｓ）は、ＩｇＧ２．３（Ｃ２１９Ｓ）と比較して、類似または低減された内部移行を有する。ＩｇＧ２．３／４（Ｃ２１９Ｓ／Ｃ２２０Ｓ）は、ＩｇＧ２．３またはＩｇＧ２．４単独と比較して、さらに低減された内部移行を有する（セット１０を参照のこと）。これは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣ２１９Ｓを有する抗体の内部移行が、Ｃ２２０Ｓを有するＩｇＧ２ヒンジのものとほぼ同じであり、これらのいずれも、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓの両方を有するＩｇＧ２ヒンジのものよりもさらに良好であることを示唆する；
・ＩｇＧ２．５（Ｃ１３１Ｓ突然変異）は、Ｃ１３１を有するコンストラクトと比較して、低減された内部移行を有する（セット１、６および７を参照のこと）。
【０６８７】
したがって、これらの結果は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジが、いずれも、抗体に媒介されるＣＤ７３の内部移行に関連すること、およびこれらのドメインに由来するＩｇＧ２配列を有する抗体が、ＩｇＧ１に由来するこれらの領域を有する抗体と比べて、より良好な有効性で内部移行されることを示す。
【０６８８】
実施例１３：ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを有する抗体は高分子量の複合体を形成する
また、表２７に記載される重鎖定常領域を有するＣＤ７３．４抗体を、実施例１１に記載されるように、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳの実験により、高分子量複合体の形成について試験した。
【０６８９】
この研究における１６種類の抗体のうちの３種を、事前に試験した：ＣＤ７３．４−ＩｇＧ１．１ｆ、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ（ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．３とも称される）およびＣＤ７３．４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１．１ｆ（ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２．３Ｇ１．１ｆ−ＫＨとも称される）。抗体単独のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータは、各抗体について、単量体モノクローナル抗体に典型的である保持時間、質量および流体力学半径を示した。各抗体（５．５ｕＭ）のｈＣＤ７３−ｈｉｓ（５．５ｕＭ）との等モル複合体は、すべての複合体について、抗体またはｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独と比較して、複合体の形成を示す緩徐な保持時間を示した。１６種類の複合体のそれぞれのＳＥＣクロマトグラムデータのオーバーレイを、図３２Ａに示す。クロマトグラムデータは、４つの異なるピークに分割することができ、これを、図３２Ｂに示す。ピーク１は、最も大きな種を含み、ＭＡＬＳにより判定した質量は、４：４のｈＣＤ７３−ｈｉｓ：モノクローナル抗体複合体を上回る質量相当の複合体を示唆する。ピーク２は、約２：２のｈＣＤ７３−ｈｉｓ：モノクローナル抗体複合体を示唆する、ＭＡＬＳにより判定される質量を有する種を含む。ピーク３は、約１：１のｈＣＤ７３−ｈｉｓ：モノクローナル抗体複合体を示唆する、低いシグナルおよびＭＡＬＳにより判定される質量を有する少量の種である。ピーク４は、遊離抗体と一致するＭＡＬＳにより判定される質量を有するモノクローナル抗体単独の溶出に対応する。各種の相対量を定量化するために、各クロマトグラムの４つのピークを、ピーク１（１２．９分未満）、ピーク２（１２．９〜１５．１分）、ピーク３（１５．１〜１６．７分）、ピーク４（１６．７〜１９．３分）として統合した。統合には、任意の低分子量種を占めるピーク５（１９．３分を上回る）と称される追加の統合範囲も含まれ、これは、無視できることが見出された（すべての複合体で３．５％未満）。この統合からの各種の割合を、表３３に要約する。すべての複合体は、類似のわずかな割合のピーク３（約６〜９％）を含んだが、他のピークは様々な量であった。ｈＣＤ７３−ｈｉｓとｈＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む抗体との複合体はすべてが、有意に多い割合でより小さな複合体（ピーク２）を有したが、ｈＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインを含むものは、より多い割合でより大きな複合体（ピーク１）を有したことが、最も顕著である（表３３および図３２Ｃ）。これは、より高次の複合体形成における、ヒンジ領域だけでなく、ＣＨ１ドメインの重要な役割を示唆する。
【０６９０】
【表３５】
2019514844.tif 000037
【０６９１】
実施例１４：遺伝子操作された定常ドメインを有する抗体のＦｃ受容体結合
この実施例は、ＩｇＧ２  のＣＨ１およびヒンジを含む修飾された重鎖定常領域を有する抗体が、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む場合に、ＦｃγＲと結合することを実証する。
【０６９２】
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用を通じてＦｃガンマ受容体（ＦｃｇＲ）と結合する。これらの相互作用は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などのエフェクター機能を媒介する。エフェクター機能活性は、ＩｇＧ１アイソタイプでは高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらのアイソタイプはＦｃｇＲに対する親和性が低いことに起因して、非常に低いかまたは存在しない。加えて、ＩｇＧ１のエフェクター機能は、定常領域内のアミノ酸残基の突然変異を通じて、ＦｃｇＲの親和性および選択性を変更するように修飾することができる。
【０６９３】
抗体のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ）との結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）およびＦｏｒｔｅｂｉｏ  Ｂｉｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を含むバイオセンサー技術を使用して研究した。ＳＰＲ研究は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において２５℃で行った。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体に由来するＦａｂ断片を、約３０００ＲＵの密度まで、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップに固定化した。種々のｈｉｓタグＦｃｇＲ（７ｕｇ／ｍｌ）を、１０ｕｌ／分で３０秒の接触時間を使用してＣ末端ｈｉｓタグにより捕捉し、１．０μＭの抗体の結合を、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ｐ２０（ＰＢＳ−Ｔ）ｐＨ７．１の泳動緩衝液において評価した。これらの実験に使用したＦｃｇＲには、ＣＤ６４（ＦｃｇＲＩ）、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｈ１３１）、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｒ１３１）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩｂ）、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８（ＦｃｇＲＩＩＩａ−Ｖ１５８）、ＣＤ１６ｂ−ＮＡ１（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ１）およびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ２）が含まれた。ＢＬＩ実験は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器（Ｐａｌｌ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）において２５℃で、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ｐ２０（ＰＢＳ−Ｔ）ｐＨ７．１において行った。抗体を、プロテインＡコーティングセンサーで未希釈の発現上清から捕捉した後、１μＭのｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８または０．１μＭのｈＣＤ６４の検体を結合させた。
【０６９４】
まず、置換Ｓ２６７Ｅ（ＳＥ）およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＳＥＬＦ）、ならびにＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と呼ばれる突然変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの種々の組合せを含む、修飾されたＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む抗体を作製した。これらの抗体の結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲによって、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２．３（ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ）およびＩｇＧ４．１（ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ）抗体、ならびにすべてのＦｃｇＲとの結合を低減させるように遺伝子操作されているＩｇＧ１．１ｆ抗体と比較して、研究した。図３３に示される結果は、ＳＥおよびＳＥＬＦについてはＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂの結合の増大、ならびにＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１と比較してＣＤ３２ｂに対するＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２突然変異体の選択性の増大、図３３を含む、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２．３およびＩｇＧ４．１、ならびに突然変異ＩｇＧ１抗体の予測されたＦｃｇＲ結合特性を示す。
【０６９５】
次のコンストラクトのセットを使用して、通常はエフェクター機能が陰性のＩｇＧ２アイソタイプにエフェクター機能を遺伝子操作した。この研究では、上記の突然変異を、ＩｇＧ２．３の定常領域またはＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹと呼ばれるＩｇＧ２．３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドに導入した（表３４）。抗体を、小規模で上清として発現させ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー技術を使用してＦｃｇＲとの結合について試験した。抗体は上清中に低濃度で存在していたため、この実験は、プロテインＡコーティングセンサーを使用して上清から抗体を捕捉した後、溶液中のＦｃｇＲ検体と結合させることによって行った。野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む精製された上清対照ＩｇＧ１ｆもまた、比較のために含まれており、これらの対照抗体のそれぞれが、予測されたＦｃｇＲ結合特性を示した（図３４）。ＩｇＧ２．３抗体はまた、予測された結合プロファイルを示し、認識できる結合がＣＤ３２ａ−Ｈ１３１とのものだけであった。しかしながら、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ突然変異をＩｇＧ２．３に導入したすべての突然変異型は、対応する遺伝子操作されたＩｇＧ１  ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性を再現することができなかった（図３４）。対照的に、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹコンストラクトは、ＩｇＧ２．３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持しながらも、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合特性を完全に保持した。加えて、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含むすべてのＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ突然変異体は、同一の突然変異を含むＩｇＧ１バージョンのｍＡｂと同程度のＦｃｇＲ結合特性を示した（図３４）。これは、野生型または突然変異型ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わせた、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を有する抗体の遺伝子操作に成功したことを示す。
【０６９６】
【表３６】
2019514844.tif 000038
【０６９７】
この遺伝子操作戦略を、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｓ２６７Ｅ（ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７）、ならびにＩｇＧ２−Ｂ形式の変異体（ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７）でフォーマットされた他の抗体、ならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの異なる組合せを含む他のハイブリッド抗体を生成し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ技術を使用してこれらの抗体の抗−ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ｈｉｓ−タグＦｃｇＲとの結合について試験することによって、さらに検討した。８連の上清データと合致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ抗体およびＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体が、Ａ−形式のＩｇＧ２抗体（ＩｇＧ２．３）のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにもかかわらず、それぞれ、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅと同程度のＦｃｇＲ結合特性を有したことを示す（表３５）。ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ抗体およびＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体を使用して同様のデータも得られ、ＩｇＧ１ｆおよび修飾されたＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有するＢ−形式のＩｇＧ２抗体（ＩｇＧ２．５と呼ばれる、Ｃ１３１Ｓ突然変異を含む）の遺伝子操作の成功が示された。ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７、ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹまたはＩｇＧ２．５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７定常領域を有するが、異なる可変領域を有するいくつかの他の抗体のデータは、この遺伝子操作戦略が、可変ドメインに関係なく他の抗体に広く適用できることを示した（表３５）。ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合特性を示す他のコンストラクトとしては、ＩｇＧ１−Ｇ２．３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ１デルタＴＨＴが含まれ、一方で、修飾された定常領域コンストラクトのうちのいくつかは、ＩｇＧ２．３Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２．５Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２．３プラスＴＨＴ、ＩｇＧ２．５プラスＴＨＴおよびＩｇＧ２．３プラスＧＧＧコンストラクトを含め、ＩｇＧ１ｆ−様ＦｃｇＲ結合特性を保持することができなかった（表３５）。
【０６９８】
【表３７】
2019514844.tif 000039
これらのデータを合わせると、ヒンジ領域における保存されたＣＰＰＣＰＡＰ（配列番号３８０）モチーフのすぐＣ末端のＩｇＧ１の配列は、ＦｃｇＲに媒介されるエフェクター機能を付与するが、抗体のＣＨ１およびヒンジの上の部分は、ＩｇＧ１および修飾されたＩｇＧ１のエフェクター機能を、ＩｇＧ２  ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む抗体の優れた内部移行またはシグナル伝達特性と組み合わせることができるように、ＩｇＧ２または修飾されたＩｇＧ２配列と置き換えることができることを示す。
【０６９９】
別個の一連の実験では、ＣＤ７３抗体ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆが、インビトロでエフェクター機能を媒介しないことが示された。初代ＮＫ細胞をエフェクターとしておよびＣＤ７３を発現するＣａｌｕ−６腫瘍細胞を標的として使用したＡＤＣＣ実験では、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆは、３μｇ／ｍＬの濃度までは標的細胞の殺滅を誘導しなかったが、対照ＩｇＧ１  ＣＤ７３モノクローナル抗体は、ＡＤＣＣを誘導した。ＣＤＣおよびＡＤＣＰ実験（ＡＤＣＰ実験では、初代マクロファージをエフェクターとしておよびＣａｌｕ−６を標的として使用した）では、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆは、それぞれ、１０μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬまで、標的の溶解を誘導しなかったが、対照ＩｇＧ１  ＣＤ７３モノクローナル抗体は、溶解を誘導した。これらの結果は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆが、Ｆｃエフェクター機能を欠いており、したがって、ヒトに投与した場合に、ＣＤ７３を発現する細胞の枯渇が見られる可能性が低いことを示す。
【０７００】
実施例１５：抗体の内部移行時における抗ＣＤ７３抗体とリソソームマーカーとの共局在化
この実験は、内部移行の詳細な機序および抗ＣＤ７３抗体のＣａｌｕ６細胞への内部移行に続く関連動態を示す。抗体は、初期エンドソームマーカーＥＥＡ１、後期エンドソームマーカーＲａｂ７およびリソソームマーカーＬａｍｐ−１と共局在化される。
【０７０１】
この実験では、Ｃａｌｕ６細胞を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６４７標識した抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１、６Ｅ１１および４Ｃ３を用いてパルスチェイス分析に供した。細胞を、まず、氷上で１５分間冷却した後、氷上で３０分間、それぞれ、２μｇ／ｍｌの１１Ｆ１１、６Ｅ１１および４Ｃ３と結合させた（パルス）。３０分間結合させた後、低温培地を使用して、未結合の抗体を洗い流し、細胞を、３７℃にして、チェイスを開始した。内部移行反応を、０分、１５分、３０分、６０分または１２０分での５つの時点に設定し、続いて、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定の際に、細胞を透過させ、室温で１時間、エンドサイトーシスマーカー抗体抗ＥＥＡ１、抗Ｒａｂ７および抗Ｌａｍｐ１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＡ）で染色した後、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＬ）で標識した。細胞を、次いで、６０倍の水浸対物レンズを用いてＯｐｅｒａ共焦点システム（Ｐｅｌｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）で撮像した。抗７３抗体およびエンドサイトーシスマーカーの両方からの蛍光を、測定し、共局在化係数としてヒストグラム形式で表した。
【０７０２】
図３６Ａ〜３６Ｃに示される結果は、抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１が、ＥＥＡ１、Ｒａｂ７およびＬａｍｐ−１と共局在化すること、初期エンドソームへの抗体局在化の順位は、機能性および受容体枯渇データと一致することを示す。
【０７０３】
実施例１６：腫瘍マイクロアレイによるヒト腫瘍におけるＣＤ７３発現プロファイリング
この実施例は、多重組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）において、モノクローナル抗体１Ｄ７を用いたＩＨＣによって判定される、ヒト腫瘍におけるＣＤ７３の発現レベルを示す。
【０７０４】
初期スクリーニングについて、市販のマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ヒトＣＤ７３クローン１Ｄ７（Ａｂｃａｍ）を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）を、複数のＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）ＴＭＡにおいて行い、これには１５種類の腫瘍型が含まれた。各腫瘍型に９〜５２個のサンプルがあった。ＴＭＡは、商業的供給源から購入した。ＣＤ７３組織結合を検出するために、Ｍａｃｈ  ３検出キット（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用した自動化ＩＨＣアッセイを、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓプラットフォームに展開した。簡単に述べると、抗原賦活を、ＨＩＥＲ（熱誘導抗原賦活）溶液ｐＨ９（Ｄａｋｏ）を用いて、９５℃で２０分間行った。モノクローナル抗体１Ｄ７を、１：７５０に希釈し、６０分間インキュベートした後、Ｍａｃｈ  ３でマウスプローブを２０分間行い、次いで、Ｍａｃｈ  ３ポリマーでさらに２０分間行った。最後に、スライドを、ＤＡＢ基質−色素体溶液と６分間反応させた。スライドを、次いで、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、清浄し、日常的な組織学手順に従って、ＤｅＰｅＸを用いてカバーガラスをかけた。Ｄａｋｏタンパク質ブロックおよびＦＬＥＸ抗体希釈剤を、それぞれ、一次抗体の非特異的ブロックおよび希釈剤として使用した。ＣＤ７３のレベルを判定するために、腫瘍細胞の表面膜または細胞質における染色強度（１〜３のスコア）および頻度（１〜４のスコア）の両方を捕捉する、半定量的スコアリング法を使用した。
【０７０５】
図３７Ａおよび３７Ｂに示される結果は、ＣＤ７３が、腫瘍細胞の細胞質および表面膜の両方に発現されることを示す。試験した腫瘍型の中でも、腫瘍細胞膜染色（図３７Ｂ）は、甲状腺癌腫、肝細胞癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、膵臓腺癌、結腸直腸腺癌および子宮内膜癌腫において高く、非小細胞癌腫、腎細胞癌腫および胃癌腫において中等度であり、卵巣腺癌、前立腺癌、膀胱癌腫、食道扁平上皮細胞癌腫およびリンパ腫において低く、ＢｒＣにおいては発現されなかった。
【０７０６】
実施例１７：完全組織切片における免疫組織化学によって判定される複数の腫瘍型におけるＣＤ７３発現
この実施例は、完全組織切片においてモノクローナル抗体Ｄ７Ｆ９Ａを用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）によって判定される、複数の腫瘍型の腫瘍細胞の表面膜および細胞質におけるＣＤ７３のレベルを示す。
【０７０７】
ウサギモノクローナル抗体抗ヒトＣＤ７３クローンＤ７Ｆ９Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたさらなるＩＨＣを、結腸直腸腺癌（ＣＲＣ）、子宮内膜癌腫（ＥＣ）、甲状腺癌腫（ＴＣ）、頭頸部扁平上皮細胞癌腫（ＨＮＳＣＣ）、非小細胞癌腫（ＮＳＣＬＣ）、卵巣腺癌（ＯｖＣ）および膵臓腺癌（ＰＣ）を含む７種の腫瘍型に由来する通常の完全サイズＦＦＰＥ切片において行った。ＮＳＣＬＣを除く各腫瘍型は３０個のサンプルがあり、ＮＳＣＬＣについては、肺腺癌（ＡＤＬＣ）および扁平上皮細胞癌腫（ＳＱＬＣ）が２０個ずつであった。
【０７０８】
ＣＤ７３組織結合を検出するために、Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｅｉｃａ）を使用して、自動化ＩＨＣアッセイを、ＢｏｎｄＲｘプラットフォームに展開した。簡単に述べると、抗原賦活を、Ｂｏｎｄエピトープ賦活溶液２（ｐＨ９）を用いた１００℃で２０分間行った。モノクローナル抗体Ｄ７Ｆ９Ａを、０．５μｇ／ｍｌに希釈し、６０分間インキュベートした後、Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔからのポリマーで３０分間行った。最後に、スライドを、ＤＡＢ基質−色素体溶液と６分間反応させた。スライドを、次いで、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、清浄し、日常的な組織学手順に従って、ＤｅＰｅＸを用いてカバーガラスをかけた。０．５％ヒトガンマグロブリンを補充したＤａｋｏタンパク質ブロックまたはＤａｋｏタンパク質ブロックを、それぞれ、一次抗体の非特異的ブロックおよび希釈剤として使用した。ＣＤ７３のレベルを判定するために、腫瘍細胞の表面膜または細胞質における染色強度（１〜３のスコア）および頻度（０〜１００のスコア）の両方を捕捉する、Ｈ−スコアを、光学顕微鏡下で評価した。
【０７０９】
図３８Ａおよび３８Ｂに示される結果は、腫瘍細胞における膜の標識化および細胞質の標識化の両方で類似の染色パターンを示す。１００および５０の膜のＨスコアを、それぞれ、高い発現および中等度の発現のカットオフ基準として使用して、ＡＤＬＣ、ＴＣ、ＰＣおよびＥＣは、高い発現を示し、ＣＲＣおよびＳＱＬＣは、中等度の発現を示し、ＨＮＳＣＣおよびＯｖＣは、低い発現を示した。わずかな割合のＴＩＬが、ＣＤ７３陽性であることも見出された。
【０７１０】
図３９Ａ〜３９Ｈは、腫瘍型のそれぞれの個々のサンプルにおけるＣＤ７３発現レベルを示す。結果は、平均して低いレベルのＣＤ７３を発現する腫瘍においてすら（図３８）、特定のサンプルが、高いレベルのＣＤ７３を含むことを示す。
【０７１１】
実施例１８：特定の腫瘍型の腫瘍浸潤リンパ球におけるＰＤ−１レベル
この実施例は、結腸腺癌、腎細胞癌種および肺腺癌を有する患者における末梢血および腫瘍微小環境に由来するＴ細胞でのＰＤ−１発現の頻度を示す。簡単に述べると、新しい腫瘍サンプルおよび対応する末梢血を、ＰＤ−１、ＣＤ８、ＣＤ４およびＦｏｘｐ３に関して染色し、フローサイトメトリーによって評価した。
【０７１２】
末梢Ｔ細胞およびＴＩＬにおけるＰＤ−１のレベルを、以下のように判定した。腫瘍組織を、計量し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９５−９２９）を使用して秤量、解離させ、一方で、末梢血細胞は、ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０３０１）中に赤血球を溶解した後に単離した。細胞懸濁液（腫瘍または末梢血に由来する）を、ＨＢＳＳ（Ｃａ不含、Ｍｇ不含）中で２回洗浄し、ＮＩＲ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、番号Ｌ３４９７６）で染色し、ダルベッコＰＢＳ（ｄＰＢＳ）においてヒトＡＢ血清でブロッキングし、抗体のカクテルを含むウェルに添加し、暗所において４５分間氷上でインキュベートした。細胞を、次いで、ｄＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化Ｎａで２回洗浄し、固定し、ＦｏｘＰ３緩衝液キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１４０３）を使用して、透過処理した。蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照を、すべての抗体について調製し、陽性細胞集団を判定するために使用した。サンプルを、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得し、データを、Ｆｌｏｗｊｏ  Ｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｌｏｗｊｏ）を使用して分析した。
【０７１３】
図４０に示される結果は、ＰＤ−１発現の頻度が、腫瘍浸潤Ｔ細胞では高く、末梢Ｔ細胞では低いことを示す。特に、ＰＤ−１は、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞では、血液中よりも高いレベルで発現され、試験した３種類の腫瘍において検出された。
【０７１４】
したがって、少なくとも、結腸腺癌、腎細胞癌種および肺腺癌における高いレベルのＣＤ７３腫瘍発現（ＩＨＣによる）およびＰＤ−１ＴＩＬ発現の存在に基づくと（フローサイトメトリーによる）、ＣＤ７３アンタゴニストおよびＰＤ−１アンタゴニストの組合せが、これらの癌を治療するのに有効であろう。
【０７１５】
実施例１９：抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体での併用治療によるインビボでの腫瘍成長の阻害
抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体での併用治療の抗腫瘍活性を試験するために、マウスＭＣ３８結腸腺癌腫瘍モデルにおいて、実験を行った。
【０７１６】
使用した投与計画を、以下の表３６に示す。腹腔内（ＩＰ）治療のための投与量は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて０．２ｍＬに調節した。
【０７１７】
【表３８】
2019514844.tif 000040
【０７１８】
雌性黒色６（Ｂ６ＮＴａｃ）マウスを使用した。マウスに、食餌および水を自由に提供した。ＭＣ３８細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を、２日毎に１：１０に分割した。各マウスの右側腹部に、１ｃｍ３シリンジおよび２５ゲージで０．５インチのニードル（０日目）を使用して、０．２ｍＬのＰＢＳ中の２×１０６個の細胞を、皮下移植した。移植の７日後に、１０４匹のマウスを、式Ｌ×Ｗ×Ｈ／２を使用して測定した腫瘍量に従って１３匹ずつ８つの群にランダム化した。ランダム化の後、すべての群は、およそ８７ｍｍ３の平均腫瘍量を有した。７日目、１１日目および１４日目に、指定された抗マウスＣＤ７３および／もしくは抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体またはアイソタイプ対照を、腹腔内投与した。腫瘍および体重を、研究が終わるまで週２回測定した。腫瘍を、Ｆｏｗｌｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｌｉｐｅｒ（モデル６２３７９−５３１、Ｆｒｅｄ  Ｖ．  Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏ．、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いて３次元で測定し、データを、Ｓｔｕｄｙｌｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒソフトウェアを使用して、電子的に記録した。動物は、姿勢、グルーミングおよび呼吸変化ならびに嗜眠状態について、毎日調べた。腫瘍が、２０００ｍｍ３のエンドポイントに達したか潰瘍化が現れた場合には、マウスを安楽死させた。
【０７１９】
図４１Ａ〜４１Ｄおよび４２Ａ〜４２Ｄに示されるように、抗ＣＤ７３抗体を、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用した場合、腫瘍成長における有意な遅延が、試験したすべての抗ＣＤ７３用量で見られた（図４２Ａ〜４２Ｄ）。研究の終了時に、抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体の組合せで処置した群では（それぞれ、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの群で、５／１３、４／１３および５／１３）、いずれかの治療剤単独で処置した群（抗ＰＤ−１抗体群では２／１３および抗ＣＤ７３抗体群では０／１３）よりも、多くのマウスが、腫瘍なし（ＴＦ）であった。
【０７２０】
平均腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は、早期潰瘍化（ほとんどが腫瘍移植後１０日目〜２０日目）およびそれに続く安楽死の高い発生率（１５％〜６９％）に起因して、直接計算することはできなかった。したがって、腫瘍成長阻害および全生存期間を評価するために、マウスが、腫瘍移植から２７日目までに腫瘍潰瘍化を示した場合には（７日目の薬物処置の発生後の腫瘍倍加時間の約３つ分）、そのマウスに関連する腫瘍成長データを除外した。結果として、抗ＣＤ７３抗体単独療法群には十分なマウスが残っておらず、一方で、ｍＩｇＧ１抗体、抗ＰＤ−１抗体単独および抗ＰＤ−１抗体＋抗ＣＤ７３抗体の群には、十分なマウス（８〜１３匹）が残っていた。したがって、ｍＩｇＧおよび抗ＰＤ−１抗体を含む群のみを、ＴＧＩおよび生存期間について分析した。これらの群の平均腫瘍量を、図４３を示す。２７日目のＴＧＩ（７日目の薬物処置の発生後の倍加時間の約３つ分）を、初期腫瘍量の補正後に、時間に対する腫瘍量の曲線下面積の平均値に基づいて計算した。ＴＧＩ値は、抗ＰＤ−１抗体群については８０％であり、５、１０および２０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ７３抗体＋抗ＰＤ−１抗体群については、それぞれ、１００％、９７％および１０５％であった。
【０７２１】
生存は、２０００ｍｍ３未満の腫瘍サイズおよび腫瘍潰瘍化がないこととして定義される。図４４に示されるように、抗ＰＤ−１抗体単独療法および抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＤ７３抗体の組合せのいずれも、ｍＩｇＧ１処置と比較して、生存利益を示した。抗ＰＤ−１抗体の、５または２０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ７３抗体との併用療法は、いずれも、抗ＰＤ−１抗体単独療法よりも良好な生存を示した。
【０７２２】
これらの結果は、段階的ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて、抗ＣＤ７３抗体処置単独が、抗腫瘍活性を促進しなかったが、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた場合に、腫瘍成長に有意な遅延が観察され、マウスのおよそ３５％が、研究の終了時に腫瘍なしとなったことを示唆する。抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた抗ＣＤ７３抗体の相乗効果が、腫瘍なしマウスの発生の増大、ＴＧＩの増大および生存の改善によって示された。
【０７２３】
抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体の組合せはまた、無段階ＣＴ２６癌モデルにおいて、抗腫瘍効果を有した。簡単に述べると、無段階ＣＴ２６腫瘍に、合計２００μｇ／マウス（約１０ｍｇ／ｋｇ）のＣＤ７３抗体ＴＹ／２３を、単独でかまたは抗ＰＤ１抗体と一緒に、４日毎に３回投薬した。図４５Ａ〜４５Ｄに示される結果は、抗ＣＤ７３抗体および抗ＰＤ−１抗体の組合せが、いずれか１種の単独よりも強力な抗腫瘍効果を有することを示す。
【０７２４】
実施例２０：前臨床代謝および薬物動態
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆは、カニクイザルにおける単回静脈内（ＩＶ）投薬後に、おそらくは標的媒介型薬物沈着に起因して、明らかな非線形ＰＫを示した。５〜４０ｍｇ／ｋｇの用量で、全身総血清クリアランス（ＣＬＴ）は、０．８５から０．２２ｍＬ／時間／ｋｇに減少した。定常状態の分布量（Ｖｓｓ）は、０．０４２〜０．０６８Ｌ／ｋｇの範囲の異なる用量レベルで類似であり、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆが、主として、血管周囲腔に存在することが示唆される。類似のＶｓｓでＣＬＴ値が異なることを考慮すると、見かけの終末期半減期（Ｔ−ＨＡＬＦ）は、５〜４０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって、２０時間から２３８時間に増大した。
【０７２５】
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆ処置は、投薬期間中、サルのほとんどにおいて、すべての用量で、２４時間以内に、無血清可溶性ＣＤ７３（ｓＣＤ７３）の薬理学的に媒介される急速な減少をもたらした。無血清ｓＣＤ７３は、１ｎＭ以上のＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの濃度で、完全に抑制された（９８％を上回る）。対照的に、血清総ｓＣＤ７３濃度は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの投与後に増大した。総血清ｓＣＤ７３の蓄積は、総ｓＣＤ７３のクリアランス機序におけるシフトに起因する可能性が高い。ベースラインレベルにおいては、総ｓＣＤ７３は、主に、遊離ｓＣＤ７３からなり、これは、独自のクリアランス経路によって排除される。しかしながら、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの投与後には、総ｓＣＤ７３の大部分が、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆ／ｓＣＤ７３複合体によって占められ、これは、おそらくは、ｓＣＤ７３単独よりも緩徐な排除を受ける。
【０７２６】
実施例２１：全血におけるサイトカイン放出に対するＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆの効果の不在
ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆによって媒介されるサイトカイン放出を、８人のドナーに由来する正常ヒト全血サンプルにおいて評価した。ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆに曝露したときの、免疫細胞活性化の可能性に対処するために、６１個のサイトカインのパネルを評価した。結果は、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆ（１０μｇ／ｍＬ）のドナー血液サンプルへの添加は、アイソタイプ対照と比較して、検出できるレベルでサイトカイン分泌を媒介しなかったことを示した。これらのデータは、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆが、全血内の細胞の活性化因子ではないことを示す予測結果を確認する。これらのデータはまた、乾燥コーティング形態を使用したＰＢＭＣでのサイトカイン放出アッセイにおいて得られたデータと一致し、全血構成要素が、ＣＤ７３．４−ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ．ＩｇＧ１．１ｆに曝露したときに活性化されないことを示す。
【０７２７】
実施例２２：抗ヒトＣＤ７３抗体によるヒトＣＤ７３受容体の占有率の判定
材料および方法
モノクローナル抗体および試薬
マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥ、クローンＩＳ１１１２Ｅ４．２３．２０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、結合した化合物の直接的な検出に使用した。ＩｇＧ１アイソタイプ−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、バックグラウンド結合を評価し、分析した各サンプルの受容体占有率を計算するための参照物を提供した。ＣＤ３−ＢＶ４２１、クローンＵＣＨＴ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、クローンＯＫＴ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＳＫ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＣＤ１９−ＡＰＣ、クローンＨＩＢ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、Ｔ細胞サブセットおよびＢ細胞の同定を補助した。マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、非特異的結合を防いだ。本明細書に記載され、ヒトＩｇＧ２ヒンジおよびヒトＩｇＧ１  ＦＣ部分を含む、ＣＤ７３抗体を、使用した。ＩｇＧ２ヒンジ領域は、抗体の内部移行を促進し、それによって、ＣＤ７３の活性レベルを低減するように設計した。全血サンプルを溶解し、固定した後、ＢＤ  ＦＡＣＳ（商標）Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリー取得を行った。
【０７２８】
末梢血サンプルおよびＱＣ材料
正常で健康なヒトドナーからの全血サンプルを、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に採取した。正常なヒト健康ドナーからのＣＤ７３発現は、発現レベルが臨床試験中に採取された患者サンプルに類似であろうことが予測された。この理由から、患者サンプル由来の全血は、開発および検証のために得られたものではなかった。アッセイ検証目的で、全血サンプルを、複数濃度のＣＤ７３抗体でスパイクした。ＣＤ７３抗体でスパイクしたサンプルを、３７℃で３０分間インキュベートした後、プロセシングされるまで室温に静置した。全血サンプルを使用して、用量応答、アッセイ内性能および採取後のサンプル安定性を評価した。アッセイ検証後に、アッセイは、臨床プロトコールに参加している対象から採取した全血サンプルを分析する目的で、ＣＲＯに移した。保存した全血サンプルであるＣＤ−Ｃｈｅｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｎｏｒｍａｌ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）を、毎日の実行でプロセシングして、アッセイ性能を評価した。
【０７２９】
ＣＤ７３受容体占有率手順
全血またはＣＤ−Ｃｈｅｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｎｏｒｍａｌを、直接的な免疫蛍光染色技術によって染色した。簡単に述べると、１００μＬの全血またはＣＤ−Ｃｈｅｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｎｏｒｍａｌを、それぞれ、３つの１２×７５ｍｍのチューブにアリコートした。２つのアリコートを、１０μＬの本明細書に記載される飽和用量のＣＤ７３抗体（５μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、残ったアリコートには、０．１％  ＮａＮ３を有するＰＢＳ１０μＬを受容させた。化合物での処置の後に、過剰な化合物を、すべてのアリコートから洗い流した。すべてのアッセイチューブを、氷上において１０分間マウス血清で処置して、蛍光色素コンジュゲート試薬の非特異的結合を最小限に抑えた。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９の蛍光色素コンジュゲートを、すべてのアッセイチューブに添加し、暗所において氷上で３０分間インキュベートした。すべてのアリコートを洗浄した後、溶解し、暗所において室温で１０分間、１ｍＬの１×ＦＡＣＳ（商標）Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで固定した。次いで、アリコートを遠心分離し、デカンテーションした後、０．１％ＮａＮ３を有するＰＢＳ中に再懸濁した。
【０７３０】
フローサイトメトリー分析
ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターの最適な性能特徴を、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＣｙｔｏｍｅｔｅｒ  Ｓｅｔｕｐ  ａｎｄ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して毎日検証した。ＢＤ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、補正を設定した。少なくとも３，０００個のＣＤ１９＋Ｂ細胞を、染色チューブ毎に得た。
【０７３１】
Ａｐｐｌ計算（ApplCalculations）
各アッセイチューブから測定された平均蛍光強度結果を使用して、ＣＤ７３抗体の標的に対するＣＤ７３対照に対する受容体占有率を、導出した。
ＲＯ％の計算：｛［結合のΔＭＦＩ（結合−アイソタイプ）］／［（合計のΔＭＦＩ（合計−アイソタイプ）］｝×１００
【０７３２】
目的に適った検証戦略
フローサイトメトリーアッセイ法を、目的に適ったバイオマーカーアッセイ開発および検証モデルに従って、検証した。検証前の検討項目には、意図されるアッセイの用途、アッセイ精度、採取後のサンプルの安定性および品質管理が含まれた。アッセイ内精度を評価するために、全血サンプルを、スパイクしなかったか、または０、０．０００５、０．００５、０．０５および５μｇ／ｍＬのＣＤ７３抗体でスパイクし、次いで、３連で処理した。全血サンプルの安全性を判定するために、サンプルを、スパイクしなかったかまたはＣＤ７３抗体でスパイクし、次いで、室温で７２時間静置した。各サンプルを、採取後０時間、２４時間、４８時間、７２時間で処理した。保存した全血サンプルであるＣＤ−Ｃｈｅｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｎｏｒｍａｌを、品質管理材料として使用して、受容体占有率アッセイの免疫表現型決定手順をモニタリングした。ＣＤ−Ｃｈｅｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｎｏｒｍａｌの各ロットを、５回分析して、９５％信頼性区間を判定し、今後の分析実行の適正判断を行った。
【０７３３】
臨床試験の実装
標的細胞集団のＣＤ７３に対するＣＤ７３抗体の受容体占有率を、例えば、臨床試験において試験的バイオマーカー法として、使用してもよい。
【０７３４】
結果
この直接検出受容体占有率アッセイについて、市販入手可能な抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥをスクリーニングした。理想的には、標的と特異的に結合する抗イディオタイプ抗体が、直接検出受容体占有率アッセイに推薦される。抗ＩｇＧ１−ＰＥのクローンを試験して、抗体が、用量依存性様式で、ヒト全血由来の細胞サブセットにおいて抗ＣＤ７３抗体を認識し得るか否かを判定した。３種の抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥ抗体（ＩＳ１１１２Ｅ．４．２３．２０、ＡＰ１０Ｄ１０およびＨＰ６０６９）を使用して、滴定を行った。総受容体発現レベルを判定するために、全血を、飽和用量の抗ＣＤ７３抗体で処置した。さらに、各抗体の非特異的結合を判定するために、全血の１アリコートは、抗ＣＤ７３抗体で処置しなかった。クローンＩＳ１１１２Ｅ．４．２３．３０は、抗ＣＤ７３抗体と結合し、他の抗体候補と比べて、最も良好なシグナル／ノイズ比を有するため、これを選択した（図４６）。
【０７３５】
クローンＩＳ１１１２Ｅ．Ｅ．２３．３０を使用し、正常な健康ドナーから採取した全血を、連続希釈濃度の抗ＣＤ７３抗体で処置することによって、用量応答曲線を生成した（図４７）。このデータを使用して、さらなる検証のための濃度を選択し、ＣＲＯ（０、０．０００５、０．００５、０．０５および５μｇ／ｍＬ）に技術移転した。測定されたアッセイ精度（図４８）および導出された結果（図４９）を、３種の正常な健康ドナーから評価した（以下の表を参照のこと）。
【０７３６】
【表３９】
2019514844.tif 000041
【０７３７】
次いで、採取した全血サンプルの安定性を評価して、臨床試験に由来するサンプルに受容体占有率手順を行うために最適な採取後の時間を判定した（図５０）。収集したデータに基づいて、この受容体占有率アッセイが、採取後２４時間〜４８時間の患者サンプルを使用して行うことが最適であることが判定された。この判定を行う際の検討事項には、標的細胞集団の受容体発現レベルにおける可変性、受容体占有結果における可変性ならびに国内および国外への輸送物流などの因子が含まれる。
【０７３８】
毎日のアッセイ性能を検証するのを補助する品質管理材料を、特定した。ＣＤ−Ｃｈｅｘ  Ｐｌｕｓは、広範な安定性を有する市販入手可能な固定化全血サンプルである。データは、標的集団における検出可能な表面ＣＤ７３発現を示し、これを、受容体占有率アッセイの染色手順をモニタリングするために使用した（図５１）。
【０７３９】
実施例２３：ＣＤ７３および抗体複合体の電子顕微鏡撮像
陰性染色透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）撮像および２Ｄクラスの平均分析を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓ定常領域を有するＣＤ７３抗体（ＣＤ７３．４）とヒトＣＤ７３との複合体に行った。簡単に述べると、可溶性全長ヒトＣＤ７３および所与の抗体を、室温で１時間、１：１のモル比で混合し、両方の成分の最終濃度は、８．２ｕＭであった。両方のサンプルを、次いで、ＦＥＩ  Ｅａｇｌｅ  ４ｋ×４ｋ  ＣＣＤカメラを備える１２０ｋｅＶで作動するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｔ１２電子顕微鏡を使用した撮像のために、緩衝液で１：２０に希釈した。陰性染色グリッドを、電子顕微鏡に移した。各グリッドの画像を、複数のスケールで取得して、標本の全体的な分布を評価した。低倍率での撮像のための可能性のある好適な標的領域を同定した後、高倍率画像を、名目上の倍率６７，０００倍（０．１６ｎｍ／ピクセル）で取得した。画像は、名目上のアンダーフォーカス−２．５μｍから−１．５μｍおよび電子線量約３０ｅ−／Å２で、取得した。
【０７４０】
画像は、例が図５２に提供されており、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓに基づく抗体で、それぞれ、異なる種類の複合体が形成されることを示す。ＩｇＧ１定常ドメインを含む抗体から作製された抗原−抗体複合体は、ＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓ定常ドメインを含むものよりも小さい。ＩｇＧ１定常ドメインを含む抗体で作製された複合体については、頻繁に観察される構造体のうちの１つは、約２２０〜３５０Åの直径を有する環形状の粒子であり、密度は、いくつかの粒子では環の両端に分岐している（図５２ＡおよびＢ）。環形状の粒子は、狭い楕円形から円形または菱形の構成まで、そのコンホメーションが多様である。環形状粒子の特異的選択および２Ｄ平均化は、それらが、４つの分子：２つのＩｇＧ１および２つのＣＤ７３二量体から構成される可能性が高いことを示す（図５２ＡおよびＢ）。ＣＤ７３単量体のそれぞれが、ＩｇＧ１のＦａｂアームのうちの一方によって結合され、それによって、２つのＩｇＧ１が同じ２つのＣＤ７３二量体と結合すると、環形状の複合体が作製されると考えられる。ＩｇＧ１ヒンジを含む抗体を含む環形状粒子の２Ｄ平均化において現れた他の主要な構造体は、先端部に１つまたは２ついずれかの円形密度部を有するフック形状を有する（図５２ＣおよびＤ）。これらの構造体は、Ｆａｂアームの末端に結合したＣＤ７３二量体のうちの１つまたは２ついずれかを有する、単一のＩｇＧ１分子であるとみられる（それぞれ、図５２ＣおよびＤ）。
【０７４１】
ＣＤ７３＋ＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓを含む抗体サンプルは、ストリング様の形成物を形成する傾向にある不均一粒子を含む（図５２Ｆ〜Ｊ）。ストリング様形成物は、１０００〜２０００Åの長さに達し得、分岐密度とともに多数のねじれおよび／または曲折を含有する不規則な構造体を有する。２Ｄ平均化のすべての粒子の選択は、ＣＤ７３二量体またはＩｇＧ２．Ｃ２１９Ｓ自体によるものであり得るいくつかの小さい構造体をもたらすが、より頻繁なものとしては、ストリング様形成物の単離および構築ブロックとしての両方で存在するとみられる細長い構造体があった（図５２）。
【０７４２】
実施例２４：患者腫瘍サンプルにおけるＣＤ７３酵素阻害
ＣＤ７３酵素活性を、抗ＣＤ７３抗体を患者に投与する前および後に、患者腫瘍サンプルにおいて測定した。ＣＤ７３酵素活性は、実施例７に記載のように測定した。
【０７４３】
図５３に示されている結果は、抗ＣＤ７３を患者に投与した後に患者から得られた腫瘍が、抗ＣＤ７３抗体投与の前に対象から得られた腫瘍サンプルのものと比べて、低いレベルの（ＣＤ７３陽性細胞の割合またはＨ−スコアによって判定される場合、少なくとも２倍）ＣＤ７３酵素活性を有したことを示す。これらの結果は、抗ＣＤ７３抗体の対象への投与が、対象の腫瘍におけるＣＤ７３酵素活性を低減することを示唆する。
【０７４４】
実施例２５：追加の定常ドメイン重鎖を有する抗ＣＤ７３抗体の内部移行
配列番号４０１〜４１２および４２１〜４５４のうちの１つとして記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む抗体を、合成した。これらの定常領域のそれぞれの説明は、本明細書の配列表に提供される。抗体は、ＣＤ７３．４の可変領域を用いて合成した。
【０７４５】
配列番号４０１〜４１２または４２１〜４５４のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体を、実施例４に記載される内部移行アッセイに供し、内部移行を０、１、４および２１時間で測定した。
【０７４６】
図５４および５５に示される結果は、ＩｇＧ２．３−Ｒ２１７Ｉ（すなわち、Ｒ２１７ＩおよびＣ２１９Ｓ突然変異を有するＩｇＧ２野生型）が、可変ドメインは同一であるが野生型ＩｇＧ２定常領域を有する抗体と比べて、３つすべての時点で、抗体の内部移行の増強をもたらすことを示す。結果はまた、ＣＤ７３抗体の内部移行におけるヒンジおよびＣＨ１の役割も確認する。Ｆｃ領域はまた、上記の実施例に記載される関連する定常領域の結合に基づいて予測されるように、ＦｃＲと結合することが示された。
【０７４７】
実施例２６：追加の重鎖定常ドメイン突然変異体の合成
実施例２５に記載される結果のフォローアップとして、配列番号４５７〜４６８を有する重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体もまた、調製および試験し、ＩｇＧ１ヒンジを有するＣＤ７３抗体と比べて、増強された内部移行を有することが見出された。
【０７４８】
等価物：
当業者ならば、本明細書において開示される具体的な実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または単に慣例的な実験を使用すれば確かめることができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
配列表の要約
【０７４９】
【表４０】
2019514844.tif 000042
【表４１】
2019514844.tif 000043
【表４２】
2019514844.tif 000044
【表４３】
2019514844.tif 000045
【表４４】
2019514844.tif 000046
【表４５】
2019514844.tif 000047
【表４６】
2019514844.tif 000048
【表４７】
2019514844.tif 000049
【表４８】
2019514844.tif 000050
【表４９】
2019514844.tif 000051
【０７５０】
【表５０】
2019514844.tif 000052
【表５１】
2019514844.tif 000053
【表５２】
2019514844.tif 000054
【表５３】
2019514844.tif 000055
【表５４】
2019514844.tif 000056
【表５５】
2019514844.tif 000057
【表５６】
2019514844.tif 000058
【表５７】
2019514844.tif 000059
【表５８】
2019514844.tif 000060
【表５９】
2019514844.tif 000061
【０７５１】
【表６０】
2019514844.tif 000062
【表６１】
2019514844.tif 000063
【表６２】
2019514844.tif 000064
【表６３】
2019514844.tif 000065
【表６４】
2019514844.tif 000066
【表６５】
2019514844.tif 000067
【表６６】
2019514844.tif 000068
【表６７】
2019514844.tif 000069
【表６８】
2019514844.tif 000070
【表６９】
2019514844.tif 000071
【０７５２】
【表７０】
2019514844.tif 000072
【表７１】
2019514844.tif 000073
【表７２】
2019514844.tif 000074
【表７３】
2019514844.tif 000075
【表７４】
2019514844.tif 000076
【表７５】
2019514844.tif 000077
【表７６】
2019514844.tif 000078
【表７７】
2019514844.tif 000079
【表７８】
2019514844.tif 000080
【表７９】
2019514844.tif 000081
【０７５３】
【表８０】
2019514844.tif 000082
【表８１】
2019514844.tif 000083
【表８２】
2019514844.tif 000084
【表８３】
2019514844.tif 000085
【表８４】
2019514844.tif 000086
【表８５】
2019514844.tif 000087
【表８６】
2019514844.tif 000088
【表８７】
2019514844.tif 000089
【表８８】
2019514844.tif 000090
【表８９】
2019514844.tif 000091
【０７５４】
【表９０】
2019514844.tif 000092
【表９１】
2019514844.tif 000093
【表９２】
2019514844.tif 000094
【表９３】
2019514844.tif 000095
【表９４】
2019514844.tif 000096
【表９５】
2019514844.tif 000097
【表９６】
2019514844.tif 000098
【表９７】
2019514844.tif 000099
【表９８】
2019514844.tif 000100
【表９９】
2019514844.tif 000101
【０７５５】
【表１００】
2019514844.tif 000102
【表１０１】
2019514844.tif 000103
【表１０２】
2019514844.tif 000104
【表１０３】
2019514844.tif 000105
【表１０４】
2019514844.tif 000106
【表１０５】
2019514844.tif 000107
【表１０６】
2019514844.tif 000108
【表１０７】
2019514844.tif 000109
【表１０８】
2019514844.tif 000110
【表１０９】
2019514844.tif 000111
【０７５６】
【表１１０】
2019514844.tif 000112
【表１１１】
2019514844.tif 000113
【表１１２】
2019514844.tif 000114
【表１１３】
2019514844.tif 000115
【表１１４】
2019514844.tif 000116
【表１１５】
2019514844.tif 000117
【表１１６】
2019514844.tif 000118
【表１１７】
2019514844.tif 000119
【表１１８】
2019514844.tif 000120
【表１１９】
2019514844.tif 000121
【０７５７】
配列表は、成熟可変領域および重鎖もしくは軽鎖の配列、すなわち、シグナルペプチドを含まない配列を提供する。Ｃ末端リシンを有する重鎖の配列はまた、そのリシン（Ｋ）またはＧＫを伴わずに使用され得る。
【図１Ａ】
2019514844.tif 000122
【図１Ｂ】
2019514844.tif 000123
【図２Ａ】
2019514844.tif 000124
【図２Ｂ】
2019514844.tif 000125
【図３Ａ】
2019514844.tif 000126
【図３Ｂ】
2019514844.tif 000127
【図４Ａ】
2019514844.tif 000128
【図４Ｂ】
2019514844.tif 000129
【図５Ａ】
2019514844.tif 000130
【図５Ｂ】
2019514844.tif 000131
【図６Ａ】
2019514844.tif 000132
【図６Ｂ】
2019514844.tif 000133
【図７Ａ】
2019514844.tif 000134
【図７Ｂ】
2019514844.tif 000135
【図８Ａ】
2019514844.tif 000136
【図８Ｂ】
2019514844.tif 000137
【図９Ａ】
2019514844.tif 000138
【図９Ｂ】
2019514844.tif 000139
【図１０Ａ】
2019514844.tif 000140
【図１０Ｂ】
2019514844.tif 000141
【図１１Ａ】
2019514844.tif 000142
【図１１Ｂ】
2019514844.tif 000143
【図１２Ａ】
2019514844.tif 000144
【図１２Ｂ】
2019514844.tif 000145
【図１３Ａ】
2019514844.tif 000146
【図１３Ｂ】
2019514844.tif 000147
【図１４Ａ】
2019514844.tif 000148
【図１４Ｂ】
2019514844.tif 000149
【図１５Ａ】
2019514844.tif 000150
【図１５Ｂ】
2019514844.tif 000151
【図１６Ａ】
2019514844.tif 000152
【図１６Ｂ】
2019514844.tif 000153
【図１７Ａ】
2019514844.tif 000154
【図１７Ｂ】
2019514844.tif 000155
【図１８】
2019514844.tif 000156
【図１９】
2019514844.tif 000157
【図２０Ａ】
2019514844.tif 000158
【図２０Ｂ】
2019514844.tif 000159
【図２０Ｃ】
2019514844.tif 000160
【図２０Ｄ】
2019514844.tif 000161
【図２０Ｅ】
2019514844.tif 000162
【図２０Ｆ】
2019514844.tif 000163
【図２０Ｇ】
2019514844.tif 000164
【図２０Ｈ】
2019514844.tif 000165
【図２０Ｉ】
2019514844.tif 000166
【図２１Ａ】
2019514844.tif 000167
【図２１Ｂ】
2019514844.tif 000168
【図２２Ａ】
2019514844.tif 000169
【図２２Ｂ】
2019514844.tif 000170
【図２２Ｃ】
2019514844.tif 000171
【図２２Ｄ】
2019514844.tif 000172
【図２２Ｅ】
2019514844.tif 000173
【図２３Ａ】
2019514844.tif 000174
【図２３Ｂ】
2019514844.tif 000175
【図２３Ｃ】
2019514844.tif 000176
【図２３Ｄ】
2019514844.tif 000177
【図２３Ｅ】
2019514844.tif 000178
【図２３Ｆ】
2019514844.tif 000179
【図２３Ｇ】
2019514844.tif 000180
【図２３Ｈ】
2019514844.tif 000181
【図２３Ｉ】
2019514844.tif 000182
【図２３Ｊ】
2019514844.tif 000183
【図２３Ｋ】
2019514844.tif 000184
【図２３Ｌ】
2019514844.tif 000185
【図２３Ｍ】
2019514844.tif 000186
【図２４Ａ】
2019514844.tif 000187
【図２４Ｂ】
2019514844.tif 000188
【図２４Ｃ】
2019514844.tif 000189
【図２４Ｄ】
2019514844.tif 000190
【図２４Ｅ】
2019514844.tif 000191
【図２４Ｆ】
2019514844.tif 000192
【図２４Ｇ】
2019514844.tif 000193
【図２５Ａ】
2019514844.tif 000194
【図２５Ｂ】
2019514844.tif 000195
【図２６Ａ】
2019514844.tif 000196
【図２６Ｂ】
2019514844.tif 000197
【図２７Ａ】
2019514844.tif 000198
【図２７Ｂ】
2019514844.tif 000199
【図２８Ａ】
2019514844.tif 000200
【図２８Ｂ】
2019514844.tif 000201
【図２８Ｃ】
2019514844.tif 000202
【図２８Ｄ】
2019514844.tif 000203
【図２９Ａ】
2019514844.tif 000204
【図２９Ｂ】
2019514844.tif 000205
【図３０Ａ】
2019514844.tif 000206
【図３０Ｂ】
2019514844.tif 000207
【図３０Ｃ】
2019514844.tif 000208
【図３０Ｄ】
2019514844.tif 000209
【図３０Ｅ】
2019514844.tif 000210
【図３１】
2019514844.tif 000211
【図３２Ａ】
2019514844.tif 000212
【図３２Ｂ】
2019514844.tif 000213
【図３２Ｃ】
2019514844.tif 000214
【図３３】
2019514844.tif 000215
【図３４】
2019514844.tif 000216
【図３５】
2019514844.tif 000217
【図３６Ａ】
2019514844.tif 000218
【図３６Ｂ】
2019514844.tif 000219
【図３６Ｃ】
2019514844.tif 000220
【図３７Ａ】
2019514844.tif 000221
【図３７Ｂ】
2019514844.tif 000222
【図３８Ａ】
2019514844.tif 000223
【図３８Ｂ】
2019514844.tif 000224
【図３９Ａ】
2019514844.tif 000225
【図３９Ｂ】
2019514844.tif 000226
【図３９Ｃ】
2019514844.tif 000227
【図３９Ｄ】
2019514844.tif 000228
【図３９Ｅ】
2019514844.tif 000229
【図３９Ｆ】
2019514844.tif 000230
【図３９Ｇ】
2019514844.tif 000231
【図３９Ｈ】
2019514844.tif 000232
【図４０Ａ】
2019514844.tif 000233
【図４０Ｂ】
2019514844.tif 000234
【図４０Ｃ】
2019514844.tif 000235
【図４０Ｄ】
2019514844.tif 000236
【図４０Ｅ】
2019514844.tif 000237
【図４０Ｆ】
2019514844.tif 000238
【図４１】
2019514844.tif 000239
【図４２】
2019514844.tif 000240
【図４３】
2019514844.tif 000241
【図４４】
2019514844.tif 000242
【図４５】
2019514844.tif 000243
【図４６】
2019514844.tif 000244
【図４７】
2019514844.tif 000245
【図４８】
2019514844.tif 000246
【図４９】
2019514844.tif 000247
【図５０】
2019514844.tif 000248
【図５１】
2019514844.tif 000249
【図５２】
2019514844.tif 000250
【図５３】
2019514844.tif 000251
【図５４】
2019514844.tif 000252
【図５５】
2019514844.tif 000253
【配列表】
2019514844000001.app
【国際調査報告】
2019514844.tif 000254
2019514844.tif 000255
2019514844.tif 000256
2019514844.tif 000257
2019514844.tif 000258