(57)【要約】  本発明は、ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む乳癌の予防、改善、または治療用組成物に関し、より具体的に、本発明の組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）の活性を抑制することによって、乳癌の治療に優れた効果を示すので、乳癌に対する予防、改善、および治療用途に利用できるものと期待される。【選択図】図７a
2019535666.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌の予防または治療用薬学的組成物。
［化学式１］
【化１】
2019535666.tif 000010
【請求項２】
前記乳癌は、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記乳癌は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）活性を抑制させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌改善用健康機能食品組成物。
［化学式１］
【化２】
2019535666.tif 000011
【請求項６】
前記乳癌は、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記乳癌は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）活性を抑制させることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、乳癌治療方法。
【請求項１０】
前記乳癌は、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌であることを特徴とする請求項９に記載の乳癌治療方法。
【請求項１１】
前記乳癌は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌であることを特徴とする請求項９に記載の乳癌治療方法。
【請求項１２】
前記組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）活性を抑制させることを特徴とする請求項９に記載の乳癌治療方法。
【請求項１３】
ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む薬学的組成物の、乳癌治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む乳癌の予防、改善、または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  Ｃｏｍｏｓａ）は、タイとベトナムなどの東南アジアで健康機能性食品の原料として広く使用されるウコン属植物であって、特に、女性ホルモンであるエストロゲン類似作用で閉経期女性の膣萎縮や血管拡張などに効果があることが知られている。クルクマコモサの有効成分としては、ジアリールヘプタノイド（ｄｉａｒｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｄ）系が知られており、前記化合物は、肝細胞の保護（肝の保護）、メラニン生成抑制（美白）、または造骨細胞分化促進（骨粗しょう症の改善）過程に影響を及ぼすという事実が明らかにされている。また、クルクマコモサの抽出物は、血中コレステロール減少効果があることが知られており、これは、クルクマコモサの他の有効成分である２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ，ＴＨＡ，Ｐｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（フロロアセトフェノン））の作用と知られているが、前記化合物の抗癌活性に関しては、まだ知られていない。
【０００３】
一方、乳癌は、２００８年統計を基準として、米国では、女性癌のうち１位を、韓国では、２位を占める最もありふれた癌の一つである。韓国の場合、２０００年以後に乳癌発病の増加率が年６．８％と世界で最も速い増加速度を示している（２０１０年ＷＨＯ報告）。実際に乳癌は、２０１２年、２０１３年韓国保健産業振興院機関の統計によれば、全体３，２３２，４１７名の検診患者のうち約８８５，７３５名が乳癌の判定を受け、全国の癌患者のうち二番目に多くの医療費を支払っている。韓国の乳癌発病の増加率を考慮するとき、乳癌の治療は、非常に重要であり、医薬組成物の開発が要求される。
【０００４】
特に、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）のようなＳＥＲＭ系抗癌剤の投与を受けた患者は、初期に薬物に対して反応を示すが、約５０％近く薬物に対する反応が減少し、タモキシフェンに抵抗性を有するようになる。最近の研究結果によれば、タモキシフェン以外の他の信号、例えばｍＴＯＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇを阻害したり、ＨＤＡＣ阻害剤であるボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）およびタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）を同時投与したとき、タモキシフェン抵抗性乳癌に効果を示したという報告がある。しかしながら、この二つの方法は、いずれも効果が大きくなく、多様な副作用を招くと明らかにされている。したがって、現在までは、タモキシフェン抵抗性の機序自体が明確に明らかにされていないので、適当な治療薬物が開発されていないのが現状である。
【０００５】
Ｐｌｋ  ｆａｍｉｌｙの一つであるＰｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １（Ｐｌｋ１）は、増殖中の成体組織と分裂中の細胞だけで発現するキナーゼタンパク質である。Ｐｌｋ１の発現量は、細胞増殖の指標になって、多様な癌の悪性化を追跡することができる。また、癌組織においてＰｌｋ１の高い発現量は、増殖だけでなく、転移とも関連があると報告されたことがある。多様な癌組織において癌の悪性化に関与する代表的な原因であるＰ５３の変移がＰｌｋ１の発現量に関連するという報告があり、Ｐ５３の変移は、Ｐｌｋ１の活性化を起こし、これを通じて癌の悪性化が起こると説明する。
【０００６】
すなわち、Ｐｌｋ１は、セリン／スレオニンリン酸化酵素であって、中心体の形成、陽極紡錘糸の形成、染色体骨格、および分裂溝の形成を調節する細胞分裂を介した癌細胞増殖の核心信号に該当する。癌細胞増殖過程でＰｌｋ１は、活性化し、ｃｄｃ２５ｃを作動させ、作動したｃｄｃ２５ｃは、ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１を脱リン酸化させて、癌細胞の有糸分裂を誘導するようになる。これは、結局癌細胞増殖を起こすことになり、このような理由から、Ｐｌｋ１の抑制剤であるボラセルチブ（Ｖｏｌａｓｅｒｔｉｂ）が最近希少疾病用医薬品（ｏｒｐｈａｎ  ｄｒｕｇ）血液癌治療剤として承認を受けるなど多くの合成Ｐｌｋ１抑制剤が抗癌薬物として臨床試験に進入した。また、最近Ｐｌｋ１は、多様な種類の血液癌と固形癌において治療標的として関心を集めると共に、アンドロゲン（ａｎｄｒｏｇｅｎ）抵抗性前立腺癌細胞、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）抵抗性すい臓癌細胞、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）抵抗性慢性骨髓性白血病、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）抵抗性肺癌細胞などの抗癌剤抵抗性癌腫において薬物ターゲットとして適用可能性が提示されたことがある。しかしながら、Ｐｌｋ１のホルモン抵抗性乳癌治療可能性の評価は、現在全くないのが現状である（韓国特許公開第１０−２０１４−００８６３５５号公報参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたものであって、本発明者らは、Ｐｌｋ１活性を抑制する薬物開発のために研究努力した結果、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）の主成分であるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）がＰｌｋ１活性抑制を起こして、ホルモン抵抗性乳癌の進行を抑制することを最初に確認し、本発明を完成した。
【０００８】
これより、本発明の目的は、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物を有効成分として含む乳癌の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【０００９】
また、本発明の他の目的は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１０】
［化学式１］
【化１】
2019535666.tif 000003
【００１１】
本発明の他の目的は、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物を有効成分として含む乳癌改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
【００１２】
また、本発明のさらに他の目的は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌改善用健康機能食品組成物を提供することにある。
【００１３】
［化学式１］
【化２】
2019535666.tif 000004
【００１４】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために、本発明は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１６】
［化学式１］
【化３】
2019535666.tif 000005
【００１７】
本発明の一具現例として、前記乳癌は、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌であってもよく、またはＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌であってもよいが、これらに制限されない。
【００１８】
本発明の他の具現例として、前記組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）活性を抑制させることができる。
【００１９】
また、本発明は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌改善用健康機能食品組成物を提供する。
【００２０】
［化学式１］
【化４】
2019535666.tif 000006
【００２１】
本発明の一具現例として、前記乳癌は、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌であってもよく、またはＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌であってもよいが、これらに制限されない。
【００２２】
本発明の他の具現例として、前記組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）活性を抑制させることができる。
【００２３】
また、本発明は、乳癌の治療を必要とする個体にＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む薬学的組成物を投与する段階を含む乳癌の治療方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む薬学的組成物の乳癌の治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む乳癌の予防、改善、または治療用組成物に関し、より具体的に、本発明のＴＨＡは、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）から抽出され、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌細胞株に処理したとき、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）の活性を抑制して、乳癌細胞の増殖を抑制するにあたって優れた効果を示すので、今後タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌またはＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌に対する予防、改善、および治療用途に有用に活用され得るものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞においてＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）の処理時にＰｌｋ１下位のＣｄｃ２５Ｃ発現減少およびｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１の補償的増加をウェスタンブロットおよび免疫染色法で確認した図である。
【図２】図２は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）および対照乳癌細胞（ＭＣＦ−７）においてＴＨＡを処理後、Ｐｌｋ１活性抑制による細胞増殖抑制を確認した結果を示した図である。
【図３】図３は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）においてクルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）懸濁液を処理後、細胞増殖抑制を確認した結果を示した図である。
【図４】図４は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）にＴＨＡを処理後、フローサイトメーターを用いて細胞周期遮断を確認した結果を示した図である。
【図５】図５は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）にクルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）懸濁液を処理後、フローサイトメーターを用いて細胞周期遮断を確認した結果を示した図である。
【図６】図６は、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）にＴＨＡを処理後、ｃａｓｐａｓｅ−３／７蛍光基質を利用して細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を確認した結果を示した図である。
【図７】図７ａ〜図７ｆは、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）を移植した異種移植マウスモデルにおいてＴＨＡを腹腔内投薬したとき、腫瘍成長抑制を確認した結果を示した図であり、図７ｇ〜図７ｉは、ＴＨＡを経口投薬したとき、抗癌効果を確認した結果を示した図である。
【図８】図８は、ヒト乳癌患者組織においてＰｌｋ１発現分布様相を確認した結果を示した図である。
【図９】図９は、ヒト乳癌細胞株パネルにおいてのＰｌｋ１発現をウェスタンブロットおよび免疫蛍光イメージング技法で確認した結果を示した図である。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｃは、ヒト乳癌細胞株別のＢＩ−２５３６およびＴＨＡの処理による細胞増殖抑制活性を確認した結果を示した図である。
【図１１】図１１ａおよび図１１ｂは、ヒト乳癌細胞株別のＰｌｋ１発現差異によるＴＨＡ反応性変化を確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明者は、実施例においてクルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物およびその有効成分であるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）化合物が、乳癌、特にホルモン抵抗性乳癌の増殖を抑制する効果的な抗癌剤であることを糾明し、この作用は、Ｐｌｋ１の抑制剤に起因するという事実を確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２９】
本発明の一実施例では、ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）がｐｌｋ１活性抑制が細胞増殖の抑制を起こすか否かを確認した結果、ＴＨＡ処理時に、ｐｌｋ１下位信号であるｃｄｃ２５ｃ発現減少およびｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１発現増加を通じて、ｐｌｋ１活性を抑制すると同時に、ホルモン抵抗性乳癌の選択的増殖を抑制することを確認した（実施例２参照）。
【００３０】
本発明の他の実施例では、ＴＨＡ腹腔内投薬によるタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌異種移植マウスモデルにおいて腫瘍増殖抑制を確認した結果、ＴＨＡ  ６ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した群において、腫瘍増殖を抑制し、実際細胞増殖指標であるＰＣＮＡの有意的な減少および細胞死滅指標であるＴＵＮＥＬの有意的な増加を確認し、また、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞移植マウスモデルにＴＨＡを各１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投薬時に、優れた抗癌活性を示すことを観察したところ、ＴＨＡは、経口で有効な薬物であることを確認した（実施例３参照）。
【００３１】
本発明のさらに他の実施例では、ヒト乳癌患者組織および細胞においてのＰｌｋ１発現様相を確認し（実施例４参照）、ヒト乳癌細胞株別のＴＨＡ反応性を確認した（実施例５参照）。
【００３２】
したがって、本発明によるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を利用して乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の予防または治療が要求される多様な目的および用途に使用され得る。
【００３３】
これより、本発明は、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物、または下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の改善、予防または治療用組成物を含む関連製品および／または適用方法を提供する。
【００３４】
［化学式１］
【化５】
2019535666.tif 000007
【００３５】
本発明は、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３６】
［化学式１］
【化６】
2019535666.tif 000008
【００３７】
本発明で使用される用語「予防」とは、本発明の組成物の投与により乳癌またはホルモン抵抗性乳癌を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００３８】
本発明で使用される用語「治療」とは、本発明の組成物の投与により乳癌またはホルモン抵抗性乳癌による症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００３９】
本発明で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、過度な毒性、刺激、アレルギー反応またはその他問題点または合併症なしに利得／危険の比が合理的であるので、対象体（例：ヒト）の組織と接触して使用するに適合であり、健全な医学的判断の範疇以内である化合物または組成物を意味する。
【００４０】
本発明で使用される用語「塩」は、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル−置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得る。このような薬学的に無毒な塩類としては、サルフェート、ピロサルフェート、バイサルフェート、サルファイト、バイサルファイト、ニトラート、ホスフェート、モノヒドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロリド、ブロミド、ヨーダイド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、フォーメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、スクシネート、スベレート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキサン−１，６−ジオエート、ベンゾアート、クロロベンゾアート、メチルベンゾアート、ジニトロベンゾアート、ヒドロキシベンゾアート、メトキシベンゾアート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホネート、トルエンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β−ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレート、タルトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン−１−スルホナート、ナフタレン−２−スルホナートまたはマンデレートを含む。
【００４１】
本発明による酸付加塩は、通常の方法、例えば、化学式１で表される化合物を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈殿させて製造することができる。また、この混合物で溶媒や過量の酸を蒸発させた後、乾燥させたりまたは析出された塩を吸入濾過させて製造することもできる。
【００４２】
また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることもできる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩を濾過し、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この際、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上適している。これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例、硝酸銀）と反応させて得る。
【００４３】
本発明の薬学的組成物は、有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。この際、薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。また、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適切に選択され得る。
【００４５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による薬学的組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次的または同時に投与さ得、単一または多重投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【００４６】
具体的に、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内に活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、疾病の種類、併用される薬物によって異なり、一般的には、体重１ｋｇ当り０．００１〜１５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１〜３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、 乳癌の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
本発明の組成物による予防、治療対象疾病である「癌」は、正常な組織細胞がどんな原因で無制限増殖して、その生体の生活現象や周囲の組織状態などに関係なく急速な発育を継続する疾患に区分され、本発明においての癌は、乳癌であってもよく、好ましくはホルモン抵抗性乳癌であってもよく、前記用語「ホルモン抵抗性」は、性ホルモンの存在有無と関係なく、乳癌細胞の増殖が起こることを意味する。
【００４８】
本発明の化合物は、ＰＬＫ１抑制活性を通じて癌細胞の増殖を抑制することによって、癌の予防、改善または治療に効果がある。
【００４９】
本発明で、前記ＴＨＡは、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）から抽出され得、当業界に公知となった天然から抽出物を収得する方法であれば、いずれも使用することができ、好ましくは水または有機溶媒を添加して可溶抽出する方法を通じて収得することができる。
【００５０】
前記クルクマコモサに水や有機溶媒を添加して抽出する過程は、撹拌または放置などの方法で行われ得るが、熱水抽出法、冷浸抽出法、還流冷却抽出法または超音波抽出法などを１回または数回繰り返して抽出することができ、この際、添加できる前記有機溶媒としては、これらに制限されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、エーテル、ベンゼン、クロロホルム、エチルアセテート、またはメチレンクロリドなどを使用することができる。
【００５１】
本発明は、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物、または下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む乳癌またはホルモン抵抗性乳癌改善用健康機能食品組成物を提供する。
【００５２】
［化学式１］
【化７】
2019535666.tif 000009
【００５３】
本発明による健康機能食品組成物は、乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の改善のために、乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の治療のための薬剤と同時にまたは別個として使用され得る。
【００５４】
同様に、本発明の組成物による改善対象疾病である「癌」は、正常な組織細胞がどんな原因で無制限増殖して、その生体の生活現象や周囲の組織状態などに関係なく、急速な発育を継続する疾患に区分され、本発明においての癌は、乳癌であってもよく、好ましくはホルモン抵抗性乳癌であってもよく、前記用語「ホルモン抵抗性」は、性ホルモンの存在有無と関係なく、乳癌細胞の増殖が起こることを意味する。
【００５５】
本発明で使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
【００５６】
本発明による健康機能食品組成物は、乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の改善を目的として食品、飲料などの健康補助食品に添加することができる。
【００５７】
前記食品の種類には、特別な制限はなく、前記有効成分を添加できる食品の例としては、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、モチ、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピッザ、ラメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、アルコール飲料およびビタミン複合剤、乳製品および乳加工製品などがあり、通常の意味での健康機能食品を全部含む。
【００５８】
本発明による健康機能食品組成物において有効成分を食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用され得、通常の方法によって適切に使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的によって適合に決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康および衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であってもよい。
【００５９】
本発明の健康飲料用組成物は、指示された比率で必須成分として前記有効成分を含有すること以外には、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。前述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。前述したもの以外の香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルタムなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適切に決定され得る。
【００６０】
前記以外に本発明の健康機能食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率も、当業者によって適切に選択され得る。
【００６１】
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む乳癌またはホルモン抵抗性乳癌の治療方法を提供する。本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、犬、猫、馬および牛などの哺乳類を意味する。
【００６２】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１．実験準備および実験方法
１−１．試薬および材料
Ｃｄｃ２５ｃ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入し、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１抗体およびＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ．ＵＳＡ）から購入した。β−ａｃｔｉｎ抗体は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入し、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）は、韓国ユナイテッド製薬株式会社から提供を受けて使用した。
【００６４】
１−２．細胞株の培養
ＭＣＦ−７細胞株は、５％ＣＯ２が供給される３７℃の培養器で１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含有するＨｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地で継代培養しつつ、実験に使用した。ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７細胞株は、１０％ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、３μＭの４−ＯＨ−タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含有するＨｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地を使用して培養した。
【００６５】
１−３．免疫化学的分析
ゲル電気泳動装置（Ｍｉｇｈｔｙ  Ｓｍａｌｌ  ＳＥ２５０，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。細胞の溶解分画を試料希釈緩衝溶液［６３ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００１３％ブロモフェノールブルー、５％β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）］に希釈した後、８〜１２％ゲルを使用して電極緩衝溶液（１Ｌ溶液中Ｔｒｉｓ  １５ｇ、グリセリン７２ｇ、ＳＤＳ  ５ｇ含有）内で電気泳動を行った。電気泳動が終わったゲルを転移用電気泳動装置を利用して転移緩衝溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリセリン、２０％ｖ／ｖメタノール（ｐＨ８．３））内で１９０ｍＡｍｐｓで７０分間ニトロセルロース膜にタンパク質を移転させた。１次抗体として前記ニトロセルロース膜に反応させた後、これに２次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）とホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧを６時間の間反応させ、ＥＣＬ検出システム（ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｅｒｇ，ＭＡ）を使用して発色した。
【００６６】
１−４．リアルタイム細胞増殖分析
細胞増殖を測定するために、細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈ（５×１０３細胞／ｗｅｌｌ）に播種した。薬物を処置した後、４時間間隔で生きている細胞数をＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｙｌｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を利用して測定した。
【００６７】
１−５．実験動物
すべての実験において６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕマウスを５５±５％の湿度、２２±２℃の温度および喚起が調節されたソウル大学校薬学大学動物実験研究棟で１週間飼育して環境に適応させた後、乱塊法（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｂｌｏｃｋ  ｄｅｓｉｇｎ）によって実験に使用し、１２時間周期で明暗を変えた。
【００６８】
動物実験は、実験動物倫理ガイドライン指針に基づいて行った。ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７細胞（５×１０６細胞）をヌードマウスの左側乳腺に経皮注入し、１週間に２回キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を利用して腫瘍のサイズを測定した。腫瘍体積は、次の公式を用いて算出した：腫瘍体積＝長さ×幅２。細胞を移植した後、５週後に二酸化炭素ガスを利用してマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出して重さを測定した。
【００６９】
１−６．免疫蛍光法
蛍光発現を測定するために、細胞を６−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈ（５×１０５細胞／ｗｅｌｌ）に播種した。ＳｉｔｅＣｌｉｃｋＴＭ  Ｑｄｏｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＩＬ，ＵＳＡ）を利用してｃｄｃ２５ｃおよびｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１抗体に蛍光を結合し、蛍光が結合されたｃｄｃ２５ｃおよびｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１抗体を６−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに処理した後、蛍光顕微鏡を用いて発現を観察した。
【００７０】
１−７．細胞周期の分析
細胞周期の分布を測定するために、細胞を１００ｍｍのｄｉｓｈ（５×１０５細胞／ｗｅｌｌ）に播種した。細胞を４℃  ＰＢＳで固定し、７０％ＥｔＯＨに４℃冷蔵して２４時間培養した。７０％ＥｔＯＨを除去した後、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）／Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＤＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  ＲＮＡｓｅ  Ａを利用して３７℃で１５分間染色した。ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）機械を利用して実験群当たり２０，０００個の細胞を分析した。
【００７１】
１−８．リアルタイム細胞死滅の分析
細胞死滅を測定するために、細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈ（５×１０３細胞／ｗｅｌｌ）に播種した。Ｔｈｅ  ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭＴＭ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔを３時間前処理し、薬物を処置した後、４時間間隔で蛍光発現程度をＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭＴＭ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｙｌｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を利用して測定した。
【００７２】
実施例２．ホルモン抵抗性乳癌細胞においてＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）処理によるＰｌｋ１活性抑制および細胞増殖抑制の確認
ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）をタモキシフェン抵抗性乳癌細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）および／または対照乳癌細胞（ＭＣＦ−７）に処理した後、前記実施例１の方法でＰｌｋ１活性抑制および細胞増殖抑制の可否を確認した。
【００７３】
２−１．Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）活性抑制の確認
ＴＨＡをタモキシフェン抵抗性乳癌細胞に処理した後、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光イメージング技法で確認した結果、図１に示されたように、ＴＨＡは、ｐｌｋ１の下位因子であるｃｄｃ２５ｃの発現を減少させ、補償的なｃｙｃｌｉｎ  Ｂ１の発現増加を起こして、これを介したｐｌｋ１抑制効果があることを確認した。
【００７４】
２−２．細胞増殖抑制確認
ＴＨＡをタモキシフェン抵抗性乳癌細胞および一般乳癌細胞に処理した後、細胞増殖抑制の有無を比較観察した結果、図２に示されたように、ＴＨＡは、一般乳癌細胞であるＭＣＦ−７細胞およびタモキシフェン抵抗性乳癌細胞であるＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７細胞の両方で細胞増殖を抑制し、特にタモキシフェン抵抗性乳癌細胞においてさらに強い抑制を示すことを確認した。
【００７５】
ひいては、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物をタモキシフェン抵抗性乳癌細胞に処理した後、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞の細胞増殖抑制の可否を観察した結果、図３に示されたように、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）も、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞において細胞増殖を抑制することを確認した。
【００７６】
２−３．細胞周期抑制の確認
ＴＨＡをタモキシフェン抵抗性乳癌細胞に処理した後、フローサイトメトリーを通じて細胞周期抑制の可否を確認した結果、図４に示されたように、ＴＨＡ処理時に増殖期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）の細胞数を有意的に増加させるＳ期停止（Ｓ  ｐｈａｓｅ  ａｒｒｅｓｔ）が起こることを確認した。
【００７７】
ひいては、前記のような方法でクルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）抽出物をタモキシフェン抵抗性乳癌細胞に処理した後、細胞周期抑制の可否を確認した結果、図５に示されたように、クルクマコモサも、増殖期（Ｓ  ｐｈａｓｅ）の細胞数を有意的に増加させるＳ期停止（Ｓ  ｐｈａｓｅ  ａｒｒｅｓｔ）を起こすことを確認した。
【００７８】
２−４．細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）増加の確認
ＴＨＡをタモキシフェン抵抗性乳癌細胞に処理した後、カスパジェ−３／７（ｃａｓｐａｓｅ−３／７）選択的蛍光基質の定量を利用して細胞死滅を確認した結果、図６に示されたように、ＴＨＡは、細胞死滅指数を有意的に増加させることを確認した。
【００７９】
実施例３．ホルモン抵抗性乳癌細胞移植ヌードマウスにおいてＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）処理によるＰｌｋ１活性抑制および腫瘍増殖抑制の確認
ホルモン抵抗性乳癌細胞移植ヌードマウスにおいてＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）処理による腫瘍増殖抑制を確認するために、下記のように実験した。
【００８０】
タモキシフェン抵抗性乳癌細胞移植マウス  モデルにＴＨＡを既存肝で胆汁分泌に効果があると知られた用量を基準として６ｍｇ／ｋｇを設定して、２週間毎日腹腔内投薬した。投薬期間中に週２回腫瘍のサイズと体重を測定し、投薬の終了後、腫瘍摘出後に摘出された腫瘍組織の重さを確認した。腫瘍組織において免疫組織化学染色法で細胞増殖因子であるＰＣＮＡと細胞死滅因子であるＴＵＮＥＬを評価し、一部の組織は粉砕して、Ｐｌｋ１下位信号であるｃｄｃ２５ｃをＰｌｋ１活性指標として定量し、ｃｄｃ２５ｃ発現増減をウェスタンブロットで確認した。
【００８１】
その結果、図７ａ〜図７ｆに示されたように、ＴＨＡ処理時に腫瘍のサイズ（図７ａ参照）、腫瘍の重さ（図７ｃ参照）が対照群に比べて顕著に減少し、マウスの体重は、類似に維持されることを観察することができ（図７ｂ参照）、ＴＨＡ  ６ｍｇ／ｋｇ処理群において実際細胞増殖指標であるＰＣＮＡが減少し、細胞死滅指標であるＴＵＮＥＬが有意的に増加する（図７ｄおよび図７ｅ参照）ことを確認した。また、ＴＨＡ投薬群においてｃｄｃ２５ｃ発現が有意的に抑制されることを確認した（図７ｆ参照）。
【００８２】
しかも、タモキシフェン抵抗性乳癌細胞移植マウスモデルにＴＨＡを１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇで２週間毎日経口用オラルチューブを利用して投薬した。
【００８３】
その結果、図７ｇ〜図７ｉに示されたように、ＴＨＡを各１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投薬時に、腫瘍のサイズが対照群に比べて有意的に減少することを確認して（図７ｇ参照）、これを図７ｈに示されたように図式化し、ＴＨＡ投薬にもマウスの体重は、類似に維持されることを観察することができた（図７ｉ参照）。このようにＴＨＡは、経口投薬時に、優れた抗癌活性を示すところ、ＴＨＡは、経口で有効な薬物であることが分かる。
【００８４】
前記結果から、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｃｏｍｏｓａ）、特にＴＨＡは、タモキシフェン抵抗性乳癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を抑制することが分かり、これより乳癌またはホルモン抵抗性乳癌を予防または治療することができることが分かった。
【００８５】
実施例４．ヒト乳癌患者組織および細胞においてのＰｌｋ１発現様相の確認
４−１．ヒト乳癌患者組織においてのＰｌｋ１発現分布
ヒト乳癌患者組織においてＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）の発現分布を確認するために、１０％ホルマリンに固定された組織を通常の方法によりパラフィンに包埋した後、切片器を利用して４ｕｍの切片を作ってスライドに付着した後、キシレンでパラフィンを除去し、水和過程を行った。抗原復旧過程としてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ  ８．０）で４０分間恒温水槽で湯煎した。蒸留水で洗浄した後、ペルオキシダーゼブロッキングバッファーを１０分間室温で処理して、内因性ペルオキシダーゼを除去し、抗Ｐｌｋ１抗体を１：５０で希釈して３００ｕｌを加えた後、４℃で一晩中反応させた。
【００８６】
その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０が添加されたＴＢＳ緩衝液（ＴＢＳＴ）で洗浄した後、ＧＢＩ社のＰＯＬＰＯＬ  ２  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ内ｒａｂｂｉｔ  ｅｎｈｅｎｃｅｒ  ３００ｕｌで３０分間室温で反応させ、再びＴＢＳＴで洗浄し、ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＲＰ溶液３００ｕｌを加えた後、室温で３０分間反応させた。再びＴＢＳＴで洗浄した後、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で発色させた。この際、発色時間は、５分であり、洗浄が終わった後、再びＭａｙｅｒ’ｓ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎで１分間反応させた後、ＴＢＳＴに浸漬してｂｌｕｉｎｇ過程を行った。洗浄されたスライドを脱水過程のためにアルコールとキシレンを経た後、ＭＭ−２４で封入した。
【００８７】
その結果、図８に示されたように、６１％の組織が陽性であるヒト乳癌患者組織においてＰｌｋ１発現分布様相を確認することができた。
【００８８】
４−２．ヒト乳癌細胞株パネルでのＰｌｋ１発現比較
ヒト乳癌細胞株パネルにおいてのＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）の発現を比較するために、ゲル電気泳動装置（Ｍｉｇｈｔｙ  Ｓｍａｌｌ  ＳＥ２５０，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。細胞の溶解分画を試料希釈緩衝溶液［６３ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００１３％ブロモフェノールブルー、５  ％β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）］に希釈した後、８〜１２％ゲルを使用して電極緩衝溶液（１Ｌ溶液中Ｔｒｉｓ  １５ｇ、グリセリン７２ｇ、ＳＤＳ  ５ｇ含有）内で電気泳動を行った。電気泳動が終わったゲルを転移用電気泳動装置を利用して転移緩衝溶液（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１９２ｍＭのグリセリン、２０％ｖ／ｖメタノール（ｐＨ８．３））内で１９０ｍＡｍｐｓで７０分間ニトロセルロース膜にタンパク質を移転させた。
【００８９】
その後、１次抗体として前記ニトロセルロース膜に反応させた後、これに２次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）とホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合ヤギ抗−マウス（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧを６時間の間反応させ、ＥＣＬ検出システム（ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｅｒｇ，ＭＡ）を使用して発色した。
【００９０】
その結果、ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１４２８、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９３７、およびＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７乳癌細胞においてＰｌｋ１発現をウェスタンブロットおよび免疫蛍光イメージング技法で確認したとき、図９に示されたように、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１４２８、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９３７、およびＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７乳癌細胞でＰｌｋ１の発現がＭＣＦ−７に比べて増加したことを確認することができた。図９の右側グラフは、２回の同一実験反復に対する結果の平均値である。
【００９１】
実施例５．ヒト乳癌細胞株別ＴＨＡ反応性の確認
５−１．ヒト乳癌細胞株別ＢＩ−２５３６およびＴＨＡの細胞増殖抑制活性の測定
細胞増殖を測定するために、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１４２８、ＭＤＡ−ＭＤ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、およびＨＣＣ１９３７細胞をそれぞれ９６−ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈ（５×１０３細胞／ｗｅｌｌ）に播種した。細胞の安定化のために２４時間３６．５度細胞培養器にインキュベーション後、薬物を処置した後、４時間間隔で生きている細胞数をＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｙｌｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を利用して測定した。
【００９２】
その結果、図１０ａ〜図１０ｃに示されたように、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１４２８細胞（図１０ａ参照）とＭＤＡ−ＭＤ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（図１０ｂ参照）、そしてＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９３７細胞（図１０ｃ参照）に対するＢＩ−２５３６およびＴＨＡの処理量が増加するほど細胞増殖が抑制されることを確認することができた。
【００９３】
５−２．ヒト乳癌細胞株別Ｐｌｋ１発現差異によるＴＨＡ反応性変化
ヒト乳癌細胞株別のＰｌｋ１発現差異によるＴＨＡ反応性変化を分析するために、前記実施例４−２で確認したＭＣＦ−７対比ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１４２８、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９３７、およびＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７細胞のＰｌｋ１発現程度をｌｏｗ（１〜３）、ｍｅｄｉｕｍ（３〜６）、ｈｉｇｈ（６〜９）に分類して、前記実施例５−１で確認した細胞増殖抑制グラフに基づいて、図１１ａに示されたように、ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ３、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１４２８、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＣ３８、ＨＣＣ７０、ＨＣＣ１９３７、およびＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７細胞のＩＣ５０を求めた。また、図１１ｂに示されたように、各細胞のＰｌｋ１発現とＩＣ５０の相関関係をグラフで示した。
【００９４】
上記から、Ｐｌｋ１発現が高い乳癌細胞にＴＨＡが選択的に作用すうことが分かり、したがって、Ｐｌｋ１陽性乳癌の治療においてＴＨＡを有用に活用できるものと期待される。
【００９５】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、ＴＨＡ（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む乳癌の予防、改善、または治療用組成物に関し、本発明による組成物を処理する場合、特にタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）抵抗性乳癌またはＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １）過発現乳癌を予防、改善、または治療するのに有用に活用できるものと期待される。
【図１】
2019535666.tif 000012
【図２】
2019535666.tif 000013
【図３】
2019535666.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
2019535666.tif 000018
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
2019535666.tif 000020
【図７ｄ】
2019535666.tif 000021
【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【図７ｉ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【国際調査報告】
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