(57)【要約】本開示は、植物に存在する場合、植物を、植物育種目的のための半数体インデューサー系統として使用することができる、修飾されたＣｅｎＨ３タンパク質を提供する。このような修飾されたＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子及びベクター、このようなポリヌクレオチド、キメラ遺伝子又はベクターを含む宿主細胞、及び植物も提供される。更に、このような植物を作製する方法及びこのような植物を使用して半数体又は倍加半数体植物を産生する方法が開示される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項２】
前記１つ又は複数のアクティブ変異がＣｅｎＨ３モチーフブロック１に存在する、請求項１に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項３】
前記１つ又は複数のアクティブ変異が、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、或いは
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、或いは
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、或いは
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質
に存在する、請求項１又は２に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項４】
前記アクティブ変異が、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの１０位におけるアミノ酸残基、或いは
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列の１０位におけるアミノ酸残基、或いは
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位若しくは１０位におけるアミノ酸残基、或いは
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列の９位又は１０位におけるアミノ酸残基
にある、請求項３に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項５】
９位又は１０位のそれぞれにおいて変異されているアミノ酸が、リシン又はアルギニンである、請求項４に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項６】
９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基が、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されている、請求項４又は５に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項７】
９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されている、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項８】
項目ｃ）における前記アクティブ変異が、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位におけるアミノ酸残基にある、請求項４に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項９】
項目ｄ）における前記アクティブ変異が、配列番号５のアミノ酸配列の９位におけるアミノ酸残基にある、請求項４に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１０】
配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、９位におけるアミノ酸残基が、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されている、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１１】
９位におけるアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されている、請求項１０に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１２】
配列番号６又は配列番号９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドが変異されて、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に翻訳するコドンを形成する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１３】
配列番号８のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１４】
配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１３に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１５】
アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされており、植物の内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の非存在下で前記植物に存在する場合、前記植物が生存することを可能とし、前記植物が野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１６】
生成された後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％が、半数体であるか、又は異常な倍数性を有する、請求項１５に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１７】
標的化ヌクレオチド交換を使用して又はエンドヌクレアーゼを適用することにより、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって、前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質から誘導される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１８】
前記アクティブ変異が点変異である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドであって、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列が９位若しくは１０位において変更された残基を有するか、又は配列番号３が９位において変更された残基を有する植物ＣｅｎＨ３タンパク質を、前記ポリヌクレオチドがコードするように修飾されている、ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号２のアミノ酸配列が９位において変更された残基を有する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記変更された残基が、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に変更されている、請求項２０又は２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記変更された残基が、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に変更されている、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２５】
単離されている、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
【請求項２７】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項２６に記載のキメラ遺伝子を含むベクター。
【請求項２８】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
植物細胞、好ましくはトマト植物細胞又はトマトプロトプラストである、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２７に記載のベクターを含む植物。
【請求項３１】
前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質が発現されない、請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
ナス属植物、好ましくはソラナム・リコペルシカム植物である、請求項３０又は３１に記載の植物。
【請求項３３】
アクティブ変異を含むＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドのアレルの２つのコピーを含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の植物。
【請求項３４】
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドを得るステップと、
ｂ）前記変異ポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項３５】
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、前記ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインにアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、
ｂ）アクティブ変異を有する前記ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項３６】
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞に、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２７に記載のベクターを形質転換するステップと、
ｂ）請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６に記載のキメラ遺伝子、及び／又は請求項２７に記載のベクターを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項３７】
前記植物細胞を修飾して、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を阻止するステップを更に含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドが修飾されて、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を阻止する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物を、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物へ交配するステップであって、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しない、ステップと、
ｂ）種子を採取するステップと、
ｃ）前記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと、
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物；異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物；又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項４０】
倍加半数体植物を生成する方法であって、請求項３９に記載のステップｄ）において得られた半数体実生、小植物又は植物を倍加半数体植物に転換するステップを含む、方法。
【請求項４１】
前記転換が、コルヒチンによる処理により実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する前記植物が、Ｆ１植物である、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する前記植物が、交配の花粉親である、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する前記植物が、交配の胚珠親である、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記交配が、約２４℃〜約３０℃の範囲の温度で実施される、請求項３４〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
半数体インデューサー系統を産生するための、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項４８】
そのＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を含む配列番号３のＣｅｎＨ３タンパク質を含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項４９】
前記１つ又は複数のアクティブ変異が、ＣｅｎＨ３モチーフブロック１にある、請求項４８に記載のソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５０】
９位におけるアミノ酸残基が、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されている、請求項４８又は４９に記載のソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５１】
９位におけるアミノ酸残基が、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されている、請求項５０に記載のソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５２】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２６に記載のキメラ遺伝子、又は請求項２７に記載のベクターを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５３】
配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５４】
配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５５】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５６】
前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質が、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、発現されない、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載のソラナム・リコペルシカム植物又は種子。
【請求項５７】
半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するための、請求項４８〜５６のいずれか一項に記載のソラナム・リコペルシカム植物の使用。
【請求項５８】
倍加半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するための、請求項４８〜５６のいずれか一項に記載のソラナム・リコペルシカム植物の使用。
【請求項５９】
半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物及び請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物を同定するステップを含み、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の植物が、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しない、方法。
【請求項６０】
前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は農業分野に関する。特に、本開示は、ＣｅｎＨ３タンパク質及びＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド、半数体及びそれに続く倍加半数体植物の産生方法、並びに倍加半数体植物に由来する植物及び種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
育種材料の高度なヘテロ接合性は、植物育種及び有益な形質の選択を非常に時間のかかるプロセスにする可能性がある。広範な集団のスクリーニングは、最新の分子育種ツールを用いたとしても、労力と費用の両方を要する。
【０００３】
半数体植物の創出とそれに続く化学的又は自発的ゲノム倍加は、高いヘテロ接合性の問題を解決し、育種プロセスを促進するための効率的な方法であることが証明されている。そのような技術はまた、「倍加半数体産生系」とも称される。倍加半数体産生系の使用により、育種家は、全ゲノム複製により１世代の全ての遺伝子座においてホモ接合性を達成することが可能となった。このことは、通常、少なくとも７世代の自殖又は戻し交配が、許容されるレベルまでヘテロ接合性を低減させるために必要とされる、自殖又は戻し交配の必要性を効果的に回避する。
【０００４】
半数体植物は異なる方法論に従って生成することができる。例えば、半数体植物は、「小胞子培養」と称される方法を使用することによって一部の作物において産生することができる。しかしながら、この方法は、費用と時間がかかり、全ての作物において有効ではない。一部の作物種において、（倍加）半数体植物は、卵細胞の単為生殖又は親ゲノムのうちの一方の除去によって得ることができる。しかしながら、このような方法は、少数の選択された作物種においてのみ有効であり、（倍加）半数体植物のかなり低い産生率のために最適ではない。
【０００５】
国際公開第２０１１０４４１３２号は、植物におけるセントロメア特異的Ｈ３（ＣｅｎＨ３）タンパク質を不活性化又は変更又はノックアウトすることからなる半数体植物を産生する方法を開示している。第１のステップにおいて、この方法は、植物における内在性ＣｅｎＨ３遺伝子を除去又はノックダウンすることからなる。第２のステップにおいて、変異又は変更されたＣｅｎＨ３タンパク質をコードする発現カセットが植物に導入される。変異又は変更されたＣｅｎＨ３タンパク質は、任意選択でＧＦＰタグ化された、Ｈ３．３Ｎ末端ドメインを内在性ＣｅｎＨ３ヒストンフォールドドメインに融合することによって生成される。このような方法論はまた、「ＧＦＰ−テールスワップ（ｔａｉｌｓｗａｐ）」又は「テールスワップ」としても知られている（Ｂｒｉｔｔ及びＫｕｐｐｕ、Ｆｒｏｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０１６年；７：３５７頁にも概説されている）。このような（ＧＦＰ−）テールスワップを保有する植物と野生型植物（すなわち、（ＧＦＰ−）テールスワップを有さず機能的な内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を有する）との交配は、片親ゲノムの除去を引き起こし、次に半数体植物の産生をもたらす。頻度は少ないが、一部の半数体誘導が、内在性ＣｅｎＨ３（「テールスワップ」なし）へのＧＦＰのＮ末端付加によっても見出された。しかしながら、この方法論は、多くの労力を要し、時間がかかり、トランスジェニック植物を生成する必要があるため、理想的ではない。更に、この方法は、モデル植物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においてのみ実証されており、作物植物においては実証されていない。
【０００６】
国際公開第２０１４１１０２７４号は、内在性ＣｅｎＨ３遺伝子を発現する第１の植物を、少なくとも２つの種由来のゲノムを有する半数体インデューサー植物と称される第２の植物と交配することからなる半数体植物を産生する方法を記載しており、ゲノムの大部分は第１の種由来であり、ゲノムは第２の種由来の異種ゲノム領域を含み、異種ゲノム領域は第１の種のＣｅｎＨ３とは異なるＣｅｎＨ３ポリペプチドをコードする（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．２０１５年１月２６日；１１（１）：ｅ１００４９７０にも記載されている）。しかしながら、この方法論は、上記と同じ落とし穴に悩まされる、すなわち多くの労力を要し、時間がかかり、トランスジェニック植物を生成する必要があるため、最適ではない。更に、この方法は半数体植物の低い産生に関連する。
【０００７】
他の方法は、ＣｅｎＨ３タンパク質のＣ末端ヒストンフォールドドメイン又はＣｅｎＨ３タンパク質をコードするＣｅｎＨ３遺伝子において単一のアミノ酸変化をもたらす１つ又は複数の点変異を導入することからなる。ＣｅｎＨ３タンパク質のＣ末端ヒストンフォールドドメインにおけるこのような変異の例は、Ｋａｒｉｍｉ−Ａｓｈｔｉｙａｎｉら（２０１５年）ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ：１１２、１１２１１〜１１２１６頁；Ｋｕｐｐｕら  ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１５年）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００５４９４に報告された。しかしながら、これらの変異の全てが、半数体植物を産生するための野生型植物との交配後に片親ゲノムの除去を誘導するのに十分ではないことが見出されたので、このような方法の成功はいくらか軽減される。
【０００８】
従って、ＣｅｎＨ３タンパク質又はＣｅｎＨ３タンパク質をコードするＣｅｎＨ３遺伝子におけるどの変異（複数可）又は修飾（複数可）が、半数体植物を産生するために片親ゲノムの除去を誘導することができるか、又は片親ゲノムの除去を誘導するのに十分であるかは解明されていないままである。よって、半数体植物の効率的な生成を可能にし（例えば、労働集約性がより少なく、より時間がかからず、より安価で、及び／又はトランスジェニック植物を作製することを必ずしも必要としない）、それに続いて倍加半数体植物を産生するために半数体植物を倍加することができる、代替又は改善された方法についての必要性が当該技術分野において存在したままである。倍加半数体産生系では、ホモ接合性は１世代で達成することができる。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質に関する。
【００１０】
一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異はＣｅｎＨ３モチーフブロック１に存在してもよい。
【００１１】
一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、或いは
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、或いは
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、或いは
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質
に存在してもよい。
【００１２】
一実施形態では、アクティブ変異は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの１０位におけるアミノ酸残基、或いは
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列の１０位におけるアミノ酸残基、或いは
ｃ）配列番号２若しくは配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位若しくは１０位におけるアミノ酸残基、或いは
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列の９位若しくは１０位におけるアミノ酸残基
にあってもよい。
【００１３】
好ましい実施形態では、９位又は１０位のそれぞれにおいて変異されているアミノ酸は、リシン又はアルギニン又はバリンである。
【００１４】
好ましい実施形態では、９位又は１０位のそれぞれにおいて変異されているアミノ酸は、リシン又はアルギニンである。
【００１５】
一実施形態では、９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジン又はバリンを除く任意のアミノ酸に修飾されてもよい。
【００１６】
一実施形態では、９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されてもよい。
【００１７】
好ましい実施形態では、９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸に修飾されてもよい。
【００１８】
好ましい実施形態では、９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されてもよい。
【００１９】
好ましい実施形態では、項目（ｓｕｂ）ｃ）におけるアクティブ変異は、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位におけるアミノ酸残基にある。
【００２０】
更に好ましい実施形態では、項目ｄ）におけるアクティブ変異は、配列番号５のアミノ酸配列の９位におけるアミノ酸残基にある。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含み、９位におけるアミノ酸残基が、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されている、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質に関する。
【００２２】
配列番号３のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む植物起源のタンパク質に関する好ましい実施形態では、９位におけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されている。
【００２３】
一実施形態では、本明細書に教示されている配列番号３のアミノ酸配列又はそのバリアントは、配列番号６又は配列番号９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよく、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドが変異されて、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に翻訳するコドンを形成する。
【００２４】
更なる態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質に関する。
【００２５】
一実施形態では、本明細書に教示されている配列番号８のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００２６】
更なる態様では、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。前記ＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントのアミノ酸配列の９位、１２位若しくは２２位、又はそれらの組合せにおいてアクティブ変異を含むことが好ましい。
【００２７】
一実施形態では、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【００２８】
前記ＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントのアミノ酸配列の９位、１６位若しくは２６位、又はそれらの組合せにおいてアクティブ変異を含むことが好ましい。
【００２９】
本明細書に定義されている配列番号１１若しくは１２、又はそれらのバリアントの９位における示したアクティブ変異は、前記アミノ酸残基が、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはメチオニンに修飾されている変異であることが好ましい。
【００３０】
本明細書に定義されている配列番号１１若しくは１２、又はそれらのバリアントの１２位及び／若しくは１６位における示したアクティブ変異は、前記アミノ酸残基が、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはセリンに修飾されている変異であることが好ましい。
【００３１】
本明細書に定義されている配列番号１１若しくは１２、又はそれらのバリアントの２２位及び／若しくは２６位における示したアクティブ変異は、前記アミノ酸残基が、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはロイシンに修飾されている変異であることが好ましい。
【００３２】
一実施形態では、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
一実施形態では、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
一実施形態では、植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
一実施形態では、本明細書に教示されている配列番号１３のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１７又は配列番号２１の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００３６】
一実施形態では、本明細書に教示されている配列番号１４のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１８又は配列番号２２の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００３７】
一実施形態では、本明細書に教示されている配列番号１５のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１９又は配列番号２３の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされる、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、植物の内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の非存在下で植物に存在する場合、前記植物が生存することを可能とし、前記植物が野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質のいずれか一つの使用により、生成された後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％が、半数体であるか、又は異常な倍数性を有するようになる。
【００４０】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、標的化ヌクレオチド交換を使用して又はエンドヌクレアーゼを適用することにより、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって、前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質から誘導されてもよい。
【００４１】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されているアクティブ変異は点変異である。
【００４２】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４３】
一実施形態では、本明細書に教示されているポリヌクレオチドは、配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドであって、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドが、配列番号２のアミノ酸配列が９位若しくは１０位において変更された残基を有するか、又は配列番号３が好ましくは９位において変更された残基を有する植物ＣｅｎＨ３タンパク質を、ポリヌクレオチドがコードするように修飾されている、ポリヌクレオチドである。
【００４４】
配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又はそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドに関する好ましい実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列は９位において変更された残基を有する。
【００４５】
配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又はそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドに関する実施形態では、変更された残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に変更されてもよい。
【００４６】
配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又はそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドに関する好ましい実施形態では、変更された残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に変更されてもよい。
【００４７】
更なる態様では、本発明は、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００４８】
一実施形態では、本明細書に教示されているポリヌクレオチドは、配列番号１６若しくは配列番号２０の核酸配列、又は配列番号１６若しくは配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドであって、配列番号１６の核酸配列の２５〜２７位、４６〜４８位及び７６〜７８位又は配列番号２０の核酸配列の２５〜２７位、４６〜４８位及び７６〜７８位における１つ又は複数のヌクレオチドが、配列番号１１のアミノ酸配列が９位、１２位及び／若しくは２２位において１つ若しくは複数の変更された残基を有する植物ＣｅｎＨ３タンパク質、又は配列番号１２のアミノ酸配列が９位、１６位及び／若しくは２６位において１つ若しくは複数の変更された残基を有する植物ＣｅｎＨ３タンパク質を、ポリヌクレオチドがコードするように修飾されている、ポリヌクレオチドである。
【００４９】
配列番号１６若しくは配列番号２０の核酸配列、又はそれらのバリアントを含むポリヌクレオチドに関する実施形態では、９位における変更された残基は、メチオニン、セリン又はトレオニン、好ましくはメチオニンに変更されてもよく、１６位における変更された残基は、メチオニン、セリン又はトレオニン、好ましくはセリンに変更されてもよく、２６位における変更された残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、好ましくはロイシンに変更されてもよい。
【００５０】
更なる態様では、本発明は、配列番号１７又は配列番号２１の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００５１】
更なる態様では、本発明は、配列番号１８又は配列番号２２の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００５２】
更なる態様では、本発明は、配列番号１９又は配列番号２３の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００５３】
一実施形態では、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか一つは単離される。
【００５４】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか一つを含むキメラ遺伝子に関する。
【００５５】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているポリヌクレオチド又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子のいずれか一つを含むベクターに関する。
【００５６】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているポリヌクレオチド、本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターのいずれか一つを含む宿主細胞に関する。
【００５７】
一実施形態では、本明細書に教示されている宿主細胞は、植物細胞、好ましくはトマト植物細胞又はトマトプロトプラスト、好ましくはナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）植物細胞又はナス属プロトプラスト、より好ましくはソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ・ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物細胞又はソラナム・リコペルシカムプロトプラストであってもよい。
【００５８】
一実施形態では、本明細書に教示されている宿主細胞は、植物細胞、好ましくはコメ植物細胞又はコメプロトプラスト、好ましくはイネ属（Ｏｒｙｚａ）植物細胞又はイネ属プロトプラスト、更により好ましくはオリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）植物細胞又はオリザ・サティバプロトプラスト、更により好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ（Ｊａｐｏｎｉｃａ）植物細胞又はオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物プロトプラストであってもよい。
【００５９】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているポリヌクレオチド、本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターのいずれか一つを含む植物に関する。
【００６０】
本明細書に教示されている植物に関する実施形態では、前記植物における内在性ＣｅｎＨ３タンパク質は発現されない。
【００６１】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されている植物は、ナス属植物、より好ましくはソラナム・リコペルシカム植物であってもよい。
【００６２】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されている植物は、イネ属植物、より好ましくはオリザ・サティバ植物、更により好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物であってもよい。
【００６３】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物は、アクティブ変異を含むＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドのアレルの２つのコピーを含んでもよい。
【００６４】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されている植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドを得るステップと、
ｂ）変異ポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法に関する。
【００６５】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されている植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインにアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、
ｂ）アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法に関する。
【００６６】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されている植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞に、本明細書に教示されているポリヌクレオチド、本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターを形質転換するステップと、
ｂ）本明細書に教示されているポリヌクレオチド、本明細書に教示されているキメラ遺伝子、及び／又は本明細書に教示されているベクターを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法に関する。
【００６７】
一実施形態では、本明細書に教示されている方法は、
前記植物細胞を修飾して、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を阻止するステップ
を更に含んでもよい。
【００６８】
一実施形態では、前記植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは修飾されて、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を阻止する。
【００６９】
更なる態様では、本発明は、半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物を、本明細書に教示されている植物へ交配するステップであって、本明細書に教示されている植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しない、ステップと、
ｂ）種子を採取するステップと、
ｃ）前記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと、
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物；異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物；又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
を含む、方法に関する。
【００７０】
更なる態様では、本発明は、倍加半数体植物を生成する方法であって、
上記のステップｄ）において得られた半数体実生、小植物又は植物を倍加半数体植物に転換するステップ
を含む、方法に関する。
【００７１】
一実施形態では、転換は、コルヒチンによる処理により実施されてもよい。
【００７２】
一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、Ｆ１植物であってもよい。
【００７３】
一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、交配の花粉親であってもよい。
【００７４】
一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、交配の胚珠親であってもよい。
【００７５】
一実施形態では、交配は、約２４℃〜約３０℃の範囲の温度で実施されてもよい。
【００７６】
一実施形態では、本明細書に教示されている方法は、前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。
【００７７】
更なる態様では、本発明は、半数体インデューサー系統を産生するための、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか一つの使用に関する。
【００７８】
更なる態様では、本発明は、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を含む配列番号３のＣｅｎＨ３タンパク質を含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する。
【００７９】
本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、ＣｅｎＨ３モチーフブロック１にある。
【００８０】
本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する一実施形態では、９位におけるアミノ酸残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されてもよい。
【００８１】
本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する好ましい実施形態では、９位におけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されてもよい。
【００８２】
一実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子は、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか１つ、本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターを含んでもよい。
【００８３】
更なる態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する。
【００８４】
更なる態様では、本発明は、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する。
【００８５】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する。
【００８６】
本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質は、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、発現されない。
【００８７】
更なる態様では、本発明は、半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するための、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物の使用に関する。
【００８８】
更なる態様では、本発明は、倍加半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するための、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物の使用に関する。
【００８９】
更なる態様では、本発明は、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を含む、配列番号１２のＣｅｎＨ３タンパク質を含む、オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する。
【００９０】
本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、好ましくは９位において、メチオニン、セリン又はトレオニン、好ましくはメチオニンに修飾されてもよい、ＣｅｎＨ３モチーフブロック１にある。
【００９１】
本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、好ましくは１６位において、メチオニン、セリン又はトレオニン、好ましくはセリンに修飾されてもよい、ＣｅｎＨ３  Ｎ末端テールドメインにある。
【００９２】
本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、好ましくは２６位において、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、好ましくはロイシンに修飾されてもよい、ＣｅｎＨ３  Ｎ末端テールドメインにある。
【００９３】
一実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子は、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか１つ、本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターを含んでもよい。
【００９４】
更なる態様では、本発明は、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する。
【００９５】
更なる態様では、本発明は、配列番号１７又は配列番号２１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する。
【００９６】
更なる態様では、本発明は、配列番号１８又は配列番号２２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する。
【００９７】
更なる態様では、本発明は、配列番号１９又は配列番号２３の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する。
【００９８】
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する。
【００９９】
本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物又は種子に関する一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質は、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、発現されない。
【０１００】
更なる態様では、本発明は、半数体オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物を産生するための、本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物の使用に関する。
【０１０１】
更なる態様では、本発明は、倍加半数体オリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物を産生するための、本明細書に教示されているオリザ・サティバ、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物の使用に関する。
【０１０２】
更なる態様では、本発明は、半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、本明細書に教示されている内在性ＣｅｎＨ３タンパク質及び植物を発現する植物を同定するステップを含み、本明細書に教示されている植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しない、方法に関する。
【０１０３】
一実施形態では、本明細書に教示されている方法は、前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ、ＤＡＰＩ染色の花粉四分子における微小核（矢印）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
［定義］
本明細書に使用されている場合、「ヒストンＨ３タンパク質のセントロメア特異的バリアント（「ＣｅｎＨ３」タンパク質と略される）」という用語は、キネトコア複合体のメンバーであるタンパク質を指す。ＣｅｎＨ３タンパク質は、「ＣＥＮＰ−Ａ」タンパク質としても知られている。キネトコア複合体は染色分体に位置し、そこで紡錘糸が細胞分裂の間に付着して姉妹染色分体を引き離す。ＣｅｎＨ３タンパク質は、Ｈ３ヒストンタンパク質のバリアントであるタンパク質の十分に特徴付けられたクラスに属する。これらのタンパク質は、キネトコアの適切な形成及び機能に必須であり、キネトコアがＤＮＡと会合するのに役立つ。ＣｅｎＨ３を欠損している細胞は、染色分体にキネトコアタンパク質を局在化することができず、強力な染色体分離の欠陥を示す（すなわち、欠損ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物由来の全ての染色体は除去又は喪失され、体細胞の倍数性の変化（例えば、２倍体から半数体のような染色体組の数の減少）を引き起こす）。従って、ＣｅｎＨ３タンパク質は、倍加半数体産生系におけるそれらの潜在的使用についての集中的な研究の対象となっている。ＣｅｎＨ３タンパク質は、可変テールドメイン（「Ｎ末端ドメイン」又は「Ｎ末端テールドメイン」とも称される）及びループセクションによって連結された３つのアルファヘリックス領域から構成される保存されたヒストンフォールドドメイン（Ｃ末端ドメインとも称される）によって特徴付けられる。ＣｅｎＨ３ヒストンフォールドドメインは、異なる種由来のＣｅｎＨ３タンパク質間で比較的よく保存されている。ヒストンフォールドドメインは内在性ＣｅｎＨ３タンパク質のカルボキシル末端に位置する。ヒストンフォールドドメインとは対照的に、ＣｅｎＨ３のＮ末端テールドメインは、密接に関連した種間でさえも非常に変動しやすい。
【０１０６】
本明細書に使用されている場合、「コンセンサス配列」という用語は、配列アラインメントにおける各位置で見出される、ヌクレオチド又はアミノ酸のいずれかの最も頻度の高い残基の計算された順序を指す。コンセンサス配列は、関連配列（例えば、異なる植物から得られたＣｅｎＨ３タンパク質のＮ−テールドメインの配列）が互いに比較され、類似の配列モチーフが計算される（例えば、モチーフ検索プログラム（例えば、ＭＥＭＥ）を使用して）、複数の配列アラインメント（例えば、ＣｅｎＨ３配列）の結果を表す。当業者は、「コンセンサス配列」の概念並びに異なる植物（例えば、作物植物）にわたるタンパク質におけるコンセンサス配列を同定するのに適した方法論に十分に精通している。
【０１０７】
本明細書に使用されている場合、「半数体インデューサー系統」という用語は、非インデューサー系統と少なくとも１つの一塩基多型において異なる植物系統を指す。雌株又は花粉ドナーのいずれかとして使用される半数体インデューサー系統が交配される場合、半数体インデューサー系統は、半数体インデューサー系統のゲノムの片親ゲノムの除去をもたらす。
【０１０８】
「１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド」とは、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードする非内在性又は内在性変異ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドを指し、これは、植物の内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の非存在下で植物に存在する場合、前記植物が生存することを可能とし、前記植物が野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、半数体後代又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドを含む植物は、「修飾植物」と称することができる。野生型植物との交配に際して生成される半数体後代又は異常な倍数性を有する後代のパーセンテージは、例えば、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上であることができる。内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドから、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドへの移行を引き起こす変異は、本明細書において「アクティブ変異」と称される。ＣｅｎＨ３タンパク質の関係におけるアクティブ変異は、中でも、細胞分裂の間の染色体の分離において、低減されたセントロメア負荷、より少ない機能的ＣｅｎＨ３タンパク質及び／又は低減された機能性をもたらすことがある。１つ又は複数のアクティブ変異は、当業者に周知のいくつかの方法のいずれかにより、例えば、化学物質若しくは放射線による種子若しくは植物細胞の処理により誘発されるような、ランダム変異誘発、標的化変異誘発、エンドヌクレアーゼの適用により、部分的若しくは完全なタンパク質ドメインの欠失を生じることにより、又は異種配列との融合により、ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドに導入することができる。
【０１０９】
「１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質」は、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドによりコードされる。内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードする。
【０１１０】
植物は、内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドをノックアウトするか、又は不活性化することによって、前記内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドを欠如させることができる。或いは、前記内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、不活性の又は非機能的ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするように修飾されてもよい。
【０１１１】
本明細書に教示されている１つ又は複数のアクティブ変異を有する、ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドを含む修飾植物は、花粉親又は胚珠親のいずれかとして、野生型植物へ交配することができる。一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質は、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０又はそれ以上のアミノ酸の変化を含むことができる。一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドに対して、好ましくは全長にわたって、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５％の配列同一性を有する。
【０１１２】
当業者は、本明細書に教示されている修飾植物が、１つ又は複数のアクティブ変異を含むか否かを容易に確認することができる。例えば、当業者は、そのようなアクティブ変異を提案するために、ＳＩＦＴ（Ｋｕｍａｒ  Ｐ、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ、Ｎｇ  ＰＣ．（２００９年）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｉｎｇ  ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＩＦＴ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ；４（７）；１０７３〜８１頁．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．８６）のような予測ツールを使用することができる。次いで、植物において１つ又は複数のアクティブ変異を行うことができ、前記植物における内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現がノックアウトされるはずである。植物は、野生型植物との交配に際して生成される半数体後代又は異常な倍数性を有する後代のパーセンテージが少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上である場合に、１つ又は複数のアクティブ変異を含むと考えることができる。
【０１１３】
花粉又は胚珠親のいずれかとしての、内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドを欠く又は内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を欠き、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物と、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物を交配することは、ある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上）の、半数体であるか又は異常な倍数性を示す後代をもたらす。そのような植物は、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する親の染色体のみを含み、１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物の染色体を含まない。
【０１１４】
交配される２つの植物は、同じ属又は同じ種のものであってもよい。本明細書に教示されている交配方法は、前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。代わりに、１組の染色体が除去されている。
【０１１５】
本明細書に使用されている場合、「異常な倍数性」という用語は、細胞が異常な又は正常でない数の組の染色体を含む状況を指す。例えば、通常の数が２である場合、１つの細胞当たり１又は３組の染色体を有する細胞は、異常な倍数性を有する細胞である。本発明において、本明細書に教示されているアクティブ変異ＣｅｎＨ３タンパク質及びそれらを使用する方法は、異常な倍数性を有する変異体植物を生成するために、例えば、非変異体植物が２倍体である間に半数体植物を生成するために使用することができる。半数体植物は、ホモ接合系統を作製し、同系交配の必要性を回避するための育種プログラムを促進するために使用することができる。
【０１１６】
タンパク質又は遺伝子と組み合わせて本発明の文脈において使用されている場合、「内在性」という用語は、前記タンパク質又は遺伝子が、それらが今もなお含有される植物に由来することを意味する。内在性遺伝子は、植物におけるその正常な遺伝学的状況に存在することが多い。
【０１１７】
本明細書に使用されている場合、「片親ゲノムの除去」という用語は、交配後に、交配の方向に関わりなく一方の親の全ての染色体を意味する、全ての遺伝情報を喪失する効果を指す。これは、そのような交配の子孫が、除去されていない親ゲノムの染色体のみを含有するように起こる。除去されるゲノムは、常に半数体インデューサーである親に起源を有する。
【０１１８】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書において交換可能に使用されている。
【０１１９】
「キメラ遺伝子」（又は組換え遺伝子）とは、通常、ある種において自然界で見られない任意の遺伝子、特に、自然界で互いに関連し合わない核酸配列の１つ又は複数の部分が存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、自然界で転写領域の一部若しくは全て、又は別の調節領域とは関連し合わない。「キメラ遺伝子」という用語は、プロモーター又は転写調節配列が、１つ若しくは複数のコード配列又はアンチセンス（センス鎖の逆相補体）若しくは逆位反復配列（センス及びアンチセンス、それによって、転写に際してＲＮＡ転写産物が二本鎖ＲＮＡを形成する）に作動可能に連結されている、発現構築物を含むと理解される。
【０１２０】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用する２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアライメントにより決定することができる。その結果、配列は、それらが（例えばデフォルトパラメータを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適に整列化された場合に）少なくとも（以下に定義される）ある特定の最小限のパーセンテージの配列同一性を共有する場合に、「実質的に同一」又は「本質的に類似する」と称することができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小としつつ、２つの配列をそれらの長さ全体にわたって整列化する。一般に、ギャップクリエーションペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップエクステンションペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）でＧＡＰデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９頁）。配列アライメント及び配列同一性パーセンテージのためのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから利用可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３又は（「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用する）ＥｍｂｏｓｓＷｉｎ  バージョン２．１０．０のようなコンピュータプログラムを使用して決定することができる。或いは、類似性又は同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等のようなアルゴリズムを使用してデータベースを検索することによって決定することができる。
【０１２１】
「宿主細胞」又は「組換え宿主細胞」又は「形質転換細胞」は、特に所望のタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む、少なくとも１つの核酸分子の導入の結果として生じる新しい個別の細胞（又は生物）を指す用語である。宿主細胞は、植物細胞又は細菌細胞であることが好ましい。宿主細胞は、染色体外で（エピソームの）複製する分子として核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含有してもよいか、又は宿主細胞の核若しくはプラスチドゲノムに組み込まれた核酸分子若しくはキメラ遺伝子を含むことがより好ましい。
【０１２２】
本明細書に使用されている場合、「植物」という用語は、植物細胞、植物組織又は器官、植物プロトプラスト、植物を再生することができる植物細胞組織培養、植物カルス、植物細胞凝集塊、及び植物中で無傷である植物細胞、又は胚、花粉、胚珠、果実（例えば、収穫されたトマト）、花、葉、種子、根、毛根等のような植物の部分を含む。
【０１２３】
本明細書に使用されている場合、「倍加半数体植物」という用語は、半数体細胞が染色体倍加を受ける場合に形成される遺伝子型を指す。倍加半数体の人工産生は植物育種において重要である。倍加半数体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。半数体胚は、単為生殖、偽受精、又は広範な交配後の染色体除去によってｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。半数体生物から倍加半数体生物を生成するための多種多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法が知られている。当業者はこのような方法に精通している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで倍加半数体を生成するための方法の非限定的な例は、コルヒチンのような染色体倍加剤を用いて、半数体種子から産生された体細胞半数体細胞、半数体胚、半数体種子、又は半数体植物を処理することからなる。本発明において、ホモ接合性倍加半数体植物は、半数体細胞を、コルヒチン、抗微小管除草剤、又は亜酸化窒素のような染色体倍加剤と接触させて、ホモ接合性倍加半数体細胞を作製することによって、半数体細胞から再生することができる。染色体倍加の方法は、例えば、米国特許第５，７７０，７８８号；同第７，１３５，６１５号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２１０９５９号及び同第２００５／０２８９６７３号；Ａｎｔｏｉｎｅ−Ｍｉｃｈａｒｄ，Ｓ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔ．、Ｃｏｒｄｒｅｃｈｔ、オランダ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ４８（３）：２０３〜２０７頁（１９９７年）；Ｋａｔｏ，Ａ．、Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  １９９７年、３６〜３７頁；及びＷａｎ，Ｙ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７７：８８９〜８９２頁（１９８９年）．  Ｗａｎ，Ｙ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８１：２０５〜２１１頁（１９９１年）に開示されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。倍加半数体植物を他の植物へ更に交配して、Ｆ１、Ｆ２を生成することができるか、又はそれに続く所望の形質を有する植物を生成することができる。従来の同系交配手順は、ほぼ完全なホモ接合性を達成するために６世代を要するが、倍加半数性は１世代でそれを達成する。
【０１２４】
本発明の文脈において、「野生型植物」という用語の使用は、変異体ＣｅｎＨ３タンパク質又は遺伝子を保有せず（すなわち、本明細書に教示されている１つ又は複数のアクティブ変異を含まない）、機能的ＣｅｎＨ３遺伝子及びタンパク質を内在的に発現又は産生する植物を指す。
【０１２５】
この文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味で使用されて、この単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が除外されないことを意味する。これは、動詞「から本質的になる」及び「からなる」を包含する。
【０１２６】
加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、要素のうちの１つ及び１つのみが存在することを文脈が明らかに要求しない限り、要素のうちの１つより多くが存在する可能性を排除しない。よって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。更に、本明細書において「配列」に言及する場合、一般に、サブユニット（例えば、アミノ酸）のある特定の配列を含む実際の物理的な分子が言及されることが理解される。
【０１２７】
［発明の詳細な説明］
本発明者らは、植物における１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば点変異）を有する非内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現と組み合わせた内在性ＣｅｎＨ３の除去又は破壊が、育種のために有用な性質を有する植物をもたらすことを見出した。そのような植物は半数体インデューサー系統として機能することができることが見出された。そのような半数体インデューサー系統が、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を有する植物と交配される場合、結果として生じる後代の一部は、半数体インデューサー系統由来の染色体を欠いており、それによって半数体後代又は異常な倍数性（すなわち体細胞における正常でない数の染色体組）を有する後代の産生を可能とする。半数体植物は育種を改善するために有用である。
【０１２８】
有糸分裂におけるＤＮＡの等しい分配は、キネトコアと呼ばれる、大きなタンパク質性集合体のセントロメアＤＮＡへの構築を必要とする。キネトコアは、セントロメアに集合して、紡錘体微小管を結合し、細胞分裂の間の正確な染色体分離を促進するマルチサブユニットの複合体である。構成的セントロメア関連ネットワーク（ＣＣＡＮ）と名付けられた１６サブユニットの複合体が、セントロメア−キネトコア界面を作り出す。ＣＣＡＮサブユニットであるＣｅｎＨ３は、セントロメアをキネトコアの微小管結合界面と連結するため、キネトコアの構築にとって極めて重要である。ＣＣＡＮ機構におけるＣｅｎＨ３の正確な役割はいまだ完全に理解されていない。ＣｅｎＨ３が枯渇しているか、又は不在であるか、又は機能不全である場合、セントロメア及びキネトコアの両方の適切な形成が阻止される。
【０１２９】
より詳細には、本発明者らは、驚くべきことに、修飾されたＣｅｎＨ３タンパク質を有する、すなわち、本明細書に教示されているＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば、点変異）を含む植物が、ＣｅｎＨ３タンパク質においてこれらの特定の変異を欠く野生型植物への交配又はそれとの交配の後、半数体子孫を誘導できることを見出した。
【０１３０】
任意の数のアクティブ変異（例えば、点変異）は、半数体植物を生成することができるアクティブ変異ＣｅｎＨ３タンパク質を生成するためにＣｅｎＨ３タンパク質又はＣｅｎＨ３タンパク質をコードする遺伝子に導入することができると考えられた。しかしながら、このことは、ＣｅｎＨ３タンパク質又は遺伝子における全ての変異がアクティブ変異になる、すなわち半数体植物の産生をもたらすとは限らないので、当てはまらない。このことは、ＣｅｎＨ３タンパク質又はＣｅｎＨ３タンパク質をコードする遺伝子のＮ末端テールドメインにおける変異又は変更に特に当てはまる。今まで、植物におけるＣｅｎＨ３タンパク質の全Ｎ末端テールの不活性化（例えば、テールスワップを使用する）は、半数体植物を生成する目的で、片親ゲノムの除去を引き起こすために使用されてきた。ＣｅｎＨ３タンパク質又はそれをコードするＣｅｎＨ３遺伝子のＮ末端テールドメインにおける１つのアクティブ特異的変異（例えば、点変異）が、半数体植物を生成するのに十分であるかどうかは知られていなかった。このことは、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインが、（密接に関連したものでさえ）種間で非常に変動しやすく、Ｎ末端テールのどの部分又はどの種類の変異が所望の効果をもたらすか、すなわち半数体植物を生成するかについての指標がなかったためである。全体として、このことは、所与の変異、特にアミノ酸の単一の変化を引き起こす点変異が、所与の植物において何らかの効果を有するかどうか、すなわち、半数体植物の産生をもたらすかどうかを特定及び／又は予測することを困難で、労働集約的で、時間のかかるものにした。
【０１３１】
本発明者らは、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ−テールドメインの特定の領域における特定の点変異の導入が半数体植物を生成するのに十分であることを見出した。詳細には、本発明者らは、このような修飾されたＣｅｎＨ３タンパク質を含み、機能的（例えば、内在性）ＣｅｎＨ３タンパク質を欠く植物を、半数体インデューサー植物を、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を含む植物と交配することによって半数体後代を生成するために１つの親ゲノムの除去を効果的に引き起こすための「半数体インデューサー植物」として使用することができることを見出した。
【０１３２】
言い換えれば、本発明者らは、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質において単一のアミノ酸の変化を引き起こす、本明細書に教示されている１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば点変異）を単に導入することによって、天然の２倍体植物細胞を半数体細胞に変換するための信頼でき、効率的で、迅速な手段を見出した。本発明の方法は、本明細書に教示されている１つ又は複数のアクティブ特異的変異を組み込むために使用されるＣｅｎＨ３のＮ−テールドメインにおける領域が、全ての植物にわたって普遍的であるので、多種多様な作物植物に適用可能である。
【０１３３】
アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質
第１の態様では、本発明は、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異、例えば、単一のアミノ酸の変化を引き起こす点変異を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質に関する。
【０１３４】
１つ又は複数のアクティブ変異を有し、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を欠く又はその発現が抑制されている、このようなＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物が、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質又は機能的ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する野生型植物へ交配された場合、比較的高い頻度で半数体植物（又は異常な倍数性を有する植物）が形成される。本明細書に教示されているＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質は、当業者に公知の様々な手段によって創出することができる。それらの手段には、限定されないが、ランダム変異誘発、単一又は複数のアミノ酸標的化変異誘発、完全又は部分的なタンパク質ドメイン欠失の生成、異種アミノ酸配列との融合等が含まれる。典型的に、このような植物において、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ノックアウトされるか、又は不活性化される。半数体植物は、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、２０％又はそれ以上のような、正常な頻度を超えて形成される。１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質及びそのバリアントは、例えば、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を欠く植物における１つ又は複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質の組換え発現、トランスジェニック植物を内在性ＣｅｎＨ３タンパク質又は機能的ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物へ交配すること、次いで、半数体後代の産生についてスクリーニングすることによって試験することができる。
【０１３５】
本明細書に教示されている植物ＣｅｎＨ３タンパク質及びそのバリアントは、任意の植物ＣｅｎＨ３タンパク質であってもよい。好ましい実施形態では、植物ＣｅｎＨ３タンパク質は、ナス科、より好ましくはナス属、更により好ましくはソラナム・リコペルシカム種に属する。
【０１３６】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、Ｎ末端テールドメインにおける植物コンセンサスＣｅｎＨ３モチーフブロック１ドメインに位置する１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば、単一のアミノ酸の変化を引き起こす点変異）を含んでもよい。本明細書に使用されている場合、「植物ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１ドメインタンパク質配列」という用語は、全ての植物種の間で高度に保存されているＣｅｎＨ３タンパク質のＮ−テールドメインに位置する配列保存のモジュラーパターン（すなわち、コンセンサス配列）を指す。そのアミノ酸配列は配列番号４に示されている。ＣｅｎＨ３遺伝子及びタンパク質のＮ−テールドメインのアミノ酸配列及び長さの両方における超可変性にも関わらず、保存されたタンパク質配列の７つのストレッチ（「モチーフブロック１〜７」と称される）が、種々の植物のＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールにおいて同定された（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉら、（２０１５年）ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００４９７０、１〜２０頁）。モチーフブロック１は、ほぼ全ての植物ＣｅｎＨ３タンパク質において同定されている。従って、一実施形態では、植物ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１ドメインタンパク質配列（配列番号４）は、植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサーモチーフブロック１ドメインタンパク質配列として使用することができる。本明細書に使用されている場合、「植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサーモチーフブロック１ドメインタンパク質配列」という用語は、配列番号４のアミノ酸配列に１つ又は複数のアクティブ変異（例えば点変異）を含む、上記に教示されている「植物ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１ドメインタンパク質配列」を指す。植物に存在する場合、１つ又は複数のアクティブ変異を有する植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサーモチーフブロック１ドメインタンパク質配列は、前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【０１３７】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列に１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば、単一のアミノ酸の変化を引き起こす点変異）を含んでもよい。本明細書に使用されている場合、「植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列」という用語は、全ての植物種の間で高度に保存されているＣｅｎＨ３タンパク質の特定の領域を指し、そのアミノ酸配列は配列番号１に示されている。従って、一実施形態では、植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列（配列番号１）を、植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列として使用することができる。本明細書に使用されている場合、「植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列」という用語は、配列番号１のアミノ酸配列に１つ又は複数のアクティブ変異（例えば点変異）を含む、上記に教示されている植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列を指す。植物に存在する場合、１つ又は複数のアクティブ変異を有する植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列は、前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【０１３８】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、ナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列に位置する１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば、単一のアミノ酸の変化を引き起こす点変異）を含んでもよい。本明細書に使用されている場合、「ナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列」という用語は、ナス種（例えば、ソラナム・リコペルシカム、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・トメントシホルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びソラナム・フルテスケンス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｃｅ））の間で高度に保存されているナス植物科に属する種由来のＣｅｎＨ３タンパク質を指し、そのアミノ酸配列は配列番号２に示されている。従って、一実施形態では、ナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列（配列番号２）は、ナス科ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列として使用することができる。本明細書に使用されている場合、「ナス科ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列に１つ又は複数のアクティブ変異（例えば点変異）を含む、上記に教示されているナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列を指す。植物に存在する場合、１つ又は複数のアクティブ変異を有するナス科ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列は、前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【０１３９】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、ナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１タンパク質配列に位置する１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば、単一のアミノ酸の変化を引き起こす点変異）を含んでもよい。本明細書に使用されている場合、「ナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１タンパク質配列」という用語は、ナス植物属に属する種由来のＣｅｎＨ３タンパク質のＮ−テールドメインに位置する配列保存のモジュラーパターン（すなわちコンセンサス配列）を指す。それは、ナス種（例えば、ソラナム・リコペルシカム、タバコ、ニコチアナ・トメントシホルミス、トウガラシ、ジャガイモ及びソラナム・フルテスケンス）の間で高度に保存されており、そのアミノ酸配列は配列番号５として示されている。従って、一実施形態では、ナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１タンパク質配列（配列番号５）は、ナス科ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサーモチーフブロック１タンパク質配列として使用することができる。本明細書に使用されている場合、「ナス科ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサーモチーフブロック１タンパク質配列」という用語は、配列番号５のアミノ酸配列に１つ又は複数のアクティブ変異（例えば点変異）を含む、上記に教示されているナス科ＣｅｎＨ３コンセンサスモチーフブロック１タンパク質配列を指す。植物に存在する場合、１つ又は複数のアクティブ変異を有する「ナス科ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサーモチーフブロック１タンパク質配列」は、前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【０１４０】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、１つ又は複数のアクティブ変異を含んでもよく、１つ又は複数のアクティブ変異は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、或いは
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質
に存在する。
【０１４１】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの１０位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列の１０位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位若しくは１０位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、或いは
ｄ）配列番号５のアミノ酸配列の９位若しくは１０位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異
からなる１つのアクティブ変異を含んでもよい。
【０１４２】
好ましい実施形態では、選択肢ｃ）におけるアクティブ変異は、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位におけるアミノ酸残基にある。
【０１４３】
更なる好ましい実施形態では、選択肢ｄ）におけるアクティブ変異は、配列番号５のアミノ酸配列の９位におけるアミノ酸残基にある。
【０１４４】
一実施形態では、上記に教示されている９位又は１０位のそれぞれにおいて変異されているアミノ酸は、リシン又はアルギニンであってもよい。
【０１４５】
一実施形態では、上記に教示されている９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されてもよい。
【０１４６】
好ましい実施形態では、上記に教示されている９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基に修飾されてもよい。
【０１４７】
更なる好ましい実施形態では、上記に教示されている９位又は１０位のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基に修飾されてもよい。そのような修飾は、この位置におけるアミノ酸残基の電荷を（正から負に）変化させ、高度に適した、すなわち半数体又は倍加半数体植物の生成に適したアクティブ変異であることが見出された。
【０１４８】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、９位におけるアミノ酸残基が、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されている、配列番号３のアミノ酸配列（すなわちソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３タンパク質アミノ酸配列）又は配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含んでもよい。そのようなタンパク質はまた、本明細書において「ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３変異体」としても表示されている。
【０１４９】
好ましい実施形態では、９位におけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基に修飾されている。
【０１５０】
更なる好ましい実施形態では、９位におけるアミノ酸残基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基から選択されるアミノ酸残基に修飾されている。そのような修飾は、この位置におけるアミノ酸残基の電荷を（正から負に）変化させ、高度に適したアクティブ変異、すなわち半数体又は倍加半数体植物の生成に適したアクティブ変異であることが見出された。
【０１５１】
一実施形態では、本明細書に教示されており、９位におけるアミノ酸残基が上記に教示されている異なるアミノ酸に修飾されている、配列番号３のアミノ酸配列又はそのバリアントを含むＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドが変異されて、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に翻訳するコドンを形成している、配列番号６又は配列番号９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【０１５２】
一実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号１２のアミノ酸配列に対する配列同一性のパーセンテージは、好ましくは、全長にわたっている。アミノ酸配列同一性は、任意の公知の方法によって、例えば、上記に定義されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム並びにＧＡＰデフォルトパラメータを使用したペアワイズアラインメントによって決定することができる。
【０１５３】
一実施形態では、配列番号６、配列番号９、配列番号１６又は配列番号２０のヌクレオチド配列に対する配列同一性のパーセンテージは、好ましくは、全長にわたっている。ヌクレオチド配列同一性は、任意の公知の方法によって、例えば、上記に定義されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム並びにＧＡＰデフォルトパラメータを使用したペアワイズアラインメントによって決定することができる。
【０１５４】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１５５】
本明細書に使用されている場合、「ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅアミノ酸配列」という用語は、リシンのグルタミン酸塩への修飾を引き起こす、配列番号８の９位におけるアミノ酸残基に単一の点変異を含む変異体ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３タンパク質アミノ酸配列を指す。本発明者らは、変異体ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅアミノ酸配列（配列番号８）が、例えば植物育種プログラムにおいてソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ  ＤＨ−インデューサータンパク質配列としての使用に特に有益であることを見出した。植物に存在する場合、ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ  ＤＨ−インデューサータンパク質配列は、前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、従来の方法によって達成される割合より特に高い割合で、半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とすることが見出された。
【０１５６】
一実施形態では、ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅアミノ酸配列（配列番号８）は、植物に存在する場合、及び前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、生成される後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％は半数体であるか、又は異常な倍数性を有する。
【０１５７】
上記に教示されているソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ  ＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列によってコードされてもよい。
【０１５８】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、単子葉植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列に位置する１つ又は複数のアクティブ特異的変異（例えば、単一のアミノ酸の変化を引き起こす点変異）を含んでもよい。本明細書に使用されている場合、「単子葉植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列」という用語は、単子葉植物種（例えば、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ニラ（Ａｌｌｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ホルデウム・ブルボサム（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｂｕｌｂｏｓｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ルズラ・ニヴェア（Ｌｕｚｕｌａ  ｎｉｖｅａ）、オリザ・サティバ、パニカム・バーゲータム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｒｇａｔｕｍ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））の間で高度に保存されている単子葉植物科に属する種由来のＣｅｎＨ３タンパク質を指し、そのアミノ酸配列は配列番号１１に示されている。従って、一実施形態では、単子葉植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列（配列番号１１）は、単子葉植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列として使用することができる。本明細書に使用されている場合、「単子葉植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列」という用語は、配列番号１１のアミノ酸配列に１つ又は複数のアクティブ変異（例えば点変異）を含む上記に教示されている単子葉植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列を指す。植物に存在する場合、１つ又は複数のアクティブ変異を有する単子葉植物ＣｅｎＨ３  ＤＨ−インデューサータンパク質配列は、前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【０１５９】
一実施形態では、植物ＣｅｎＨ３タンパク質及びそのバリアントは、単子葉植物ＣｅｎＨ３タンパク質及びそのバリアント、好ましくは、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、より好ましくはオリザ属、更により好ましくはオリザ・サティバ種、更により好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｐｐ．ジャポニカの亜種に属する単子葉植物ＣｅｎＨ３タンパク質であってもよい。
【０１６０】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むタンパク質、或いは
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質
に存在する、１つ又は複数のアクティブ変異を含んでもよい。
【０１６１】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、
ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの１２位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、
ｃ）配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの２２位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、或いは
ｄ）配列番号４のアミノ酸配列の９位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異
からなる１つのアクティブ変異を含んでもよい。
【０１６２】
更なる好ましい実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、
ａ）配列番号１２のアミノ酸配列、又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの９位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列、又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの１６位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異、或いは
ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列、又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントの２６位におけるアミノ酸残基におけるアクティブ変異
からなる１つのアクティブ変異を含んでもよい。
【０１６３】
この実施形態のタンパク質はまた、本明細書において「オリザ・サティバＣｅｎＨ３変異体」としても表示される。
【０１６４】
本明細書上記に教示されている配列番号１１若しくは配列番号１２のアミノ酸配列、又はそれらのバリアントの９位におけるアクティブ変異は、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基への修飾をもたらすのが好ましく、メチオニンへの修飾をもたらすのがより好ましい。
【０１６５】
本明細書上記に教示されている配列番号１１のアミノ酸配列の１２位又は配列番号１２のアミノ酸配列、若しくはそのバリアントの１６位におけるアクティブ変異は、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基への修飾をもたらすのが好ましく、セリンへの修飾をもたらすのがより好ましい。
【０１６６】
本明細書上記に教示されている配列番号１１のアミノ酸配列の２２位又は配列番号１２のアミノ酸配列、若しくはそのバリアントの２６位におけるアクティブ変異は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基への修飾をもたらすのが好ましく、ロイシンへの修飾をもたらすのがより好ましい。
【０１６７】
本明細書に教示されているアクティブ特異的変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質は、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を有してもよい。
【０１６８】
本明細書に使用されている場合、「オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍアミノ酸配列」という用語は、バリンのメチオニンへの修飾を引き起こす、配列番号１３の９位におけるアミノ酸残基に単一の点変異を含む変異体オリザ・サティバＣｅｎＨ３タンパク質アミノ酸配列を指す。
【０１６９】
本明細書に使用されている場合、「オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓアミノ酸配列」という用語は、プロリンのセリンへの修飾を引き起こす、配列番号１４の１６位におけるアミノ酸残基に単一の点変異を含む変異体オリザ・サティバＣｅｎＨ３タンパク質アミノ酸配列を指す。
【０１７０】
本明細書に使用されている場合、「オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌアミノ酸配列」という用語は、プロリンのロイシンへの修飾を引き起こす、配列番号１４の２６位におけるアミノ酸残基に単一の点変異を含む変異体オリザ・サティバＣｅｎＨ３タンパク質アミノ酸配列を指す。
【０１７１】
オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍアミノ酸配列、オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓアミノ酸配列、オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌアミノ酸配列は、半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代を生成するための、例えば植物育種プログラムにおけるＤＨ−インデューサータンパク質配列としての使用のために特に有益である。
【０１７２】
一実施形態では、オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍアミノ酸配列（配列番号１３）は、植物に存在する場合、及び前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、生成される後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％は、半数体であるか、又は異常な倍数性を有する。一実施形態では、オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓアミノ酸配列（配列番号１４）は、植物に存在する場合、及び前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、生成される後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％は、半数体であるか、又は異常な倍数性を有する。一実施形態では、オリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌアミノ酸配列（配列番号１５）は、植物に存在する場合、及び前記植物が、野生型植物、好ましくは同じ種の野生型植物と交配される場合、生成される後代の少なくとも０．１、０．５、１又は５％は、半数体であるか、又は異常な倍数性を有する。
【０１７３】
一実施形態では、上記に教示されている１つ又は複数のアクティブ特異的変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされる、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質又はそのバリアントは、植物の内在性ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及び／又は内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の非存在下で植物に存在する場合、前記植物が生存することを可能とし、前記植物が野生型植物と交配される場合、いくつかの半数体後代、又は異常な倍数性を有する後代の生成を可能とする。
【０１７４】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質又はそのバリアントのいずれか１つは、標的化ヌクレオチド交換を使用して前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに１つ又は複数のアクティブ変異を導入することによって、又は例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでエンドヌクレアーゼを適用することによって内在性ＣｅｎＨ３タンパク質に由来してもよい。このことは、例えば、標的化ヌクレオチド交換を使用して内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＣｅｎＨ３遺伝子）の１つ又は両方のアレルにおける１つ又は複数のアクティブ変異を植物細胞（例えば、プロトプラスト）に導入することによって、又はエンドヌクレアーゼを適用することによって非トランスジェニック植物を生成し、次いで植物細胞を植物内で生育させるのに特に有益であることができる。
【０１７５】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質又はＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びそのバリアントにおける１つ又は複数のアクティブ特異的変異は点変異であり、すなわちアミノ酸配列又は核酸配列における特定の位置において単一のアミノ酸の変化を引き起こす。
【０１７６】
一実施形態では、ＣｅｎＨ３タンパク質は、タンパク質の他の部分、例えばＣ末端ドメインにおける変異を更に含む。このような更なる変異は、例えば、Ｋａｒｉｍｉ−Ａｓｈｔｉｙａｎｉら、（２０１５年）ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ：１１２、１１２１１〜１１２１６頁及びＫｕｐｐｕら、ＰＬＯＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１５年）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００５４９４に記載されており、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、ベクター及び宿主細胞
更なる態様では、本発明は、上記に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質のいずれか１つをコードするＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及びそのバリアントに関する。
【０１７８】
特に、上記のＣｅｎＨ３タンパク質のいずれかをコードする、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡ分子のような核酸配列を有するポリヌクレオチド又はそのバリアントが提供される。遺伝コードの縮重に起因して、様々な核酸配列が同じアミノ酸配列をコードすることができる。本発明において、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードすることができる任意のポリヌクレオチド又はそのバリアントは、「ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド」と称される。提供されるポリヌクレオチドは、天然に存在する、人工又は合成の核酸配列を含む。配列はＤＮＡ配列として示されるが、ＲＮＡが言及される場合、ＲＮＡ分子の実際の塩基配列は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換されているという相違以外は同一であると理解される。
【０１７９】
本発明は更に、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。前記ポリヌクレオチドは、合成、組換え及び／又は単離されたポリヌクレオチドであってもよい。
【０１８０】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むポリヌクレオチドであってもよく、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするように修飾されており、配列番号２のアミノ酸配列は９位若しくは１０位、好ましくは９位において変更された残基を有するか、又は配列番号３は９位において変更された残基を有する。
【０１８１】
一実施形態では、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドの９位又は１０位における残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に変更されてもよい。好ましい実施形態では、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドの９位又は１０位における残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基に変更されてもよい。
【０１８２】
好ましい実施形態では、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドの９位又は１０位における残基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基から選択されるアミノ酸残基に変更されてもよい。
【０１８３】
一実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。
【０１８４】
植物又は植物細胞（例えば原形質）に存在する場合、１つ若しくは複数のアクティブ変異又は本明細書に教示されている前記ポリヌクレオチド若しくはそのバリアントによってコードされるタンパク質を含む本明細書に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及びそのバリアント（すなわち配列番号６、配列番号７、配列番号９及び配列番号１０）は、前記植物又は植物細胞における内在性ＣｅｎＨ３タンパク質のＣｅｎＨ３活性の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％未満まで内在性ＣｅｎＨ３活性を低減又は除去することができる。ＣｅｎＨ３活性は、例えば、蛍光のレベルがＣｅｎＨ３活性の尺度である、ＧＦＰ融合を使用して、染色体の分離の間のセントロメア局在を測定することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。或いは、酵母−２−ハイブリッド相互作用を、ＣｅｎＨ３タンパク質と相互作用する全ての公知のタンパク質及び／又はセントロメアＤＮＡを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる。相互作用が損なわれる場合、ＣｅｎＨ３の機能性は損なわれる。
【０１８５】
一実施形態では、本発明は、配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号９の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドに関するが、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ若しくは複数のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするように修飾されており、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列は、本明細書上記に教示されているように９位又は１０位、好ましくは９位において変更された残基を有し、その残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に変更されている。好ましい実施形態では、変更された残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基に変更されている。
【０１８６】
一実施形態では、本明細書上記に教示されているソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３タンパク質（配列番号３）は、配列番号６又は配列番号９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされてもよく、配列番号６の核酸配列の２５〜２７位又は配列番号９の核酸配列の２５〜２７位における１つ又は複数のヌクレオチドは変異されている。一実施形態では、前記変異は、本明細書に教示されている配列番号３又はそのバリアントの９位における対応するＣｅｎＨ３タンパク質に単一のアミノ酸変化を引き起こす。９位におけるアミノ酸残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に置換又は変更されてもよい。好ましい実施形態では、９位におけるアミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸によって、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸残基によって置換されている。
【０１８７】
一実施形態では、本発明は、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含み、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅタンパク質（配列番号８）をコードするＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドに関する。
【０１８８】
更なる実施形態では、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６若しくは配列番号２０の核酸配列、又は配列番号１６若しくは配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、なお更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するそのバリアントを含むポリヌクレオチドであってもよく、配列番号１６の核酸配列の２５〜２７位若しくは４６〜４８位若しくは７６〜７８位、又はそれらの組合せ、或いは配列番号２０の核酸配列の２５〜２７位若しくは４６〜４８位若しくは７６〜７８位、又はそれらの組合せにおける１つ又は複数のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするように修飾されており、配列番号１１のアミノ酸配列は、好ましくは、ポリヌクレオチドが植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするように、９位、１２位及び／又は２２位において変更された残基を有し、配列番号１２のアミノ酸配列は、９位、１６位若しくは２６位、又はそれらの組合せにおいて変更された残基を有する。ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドの９位における前記変更された残基は、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更されているのが好ましく、メチオニンに変更されているのがより好ましい。ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドの１２位又は１６位における前記変更された残基は、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更されているのが好ましく、セリンに変更されているのがより好ましい。ＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドの２２位又は２６位における前記変更された残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸残基に変更されているのが好ましく、ロイシンに変更されているのがより好ましい。
【０１８９】
本明細書に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７若しくは配列番号２１の核酸配列を含み、本明細書に教示されているオリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍタンパク質（配列番号１３）をコードするＣｅｎＨ３ポリヌクレオチド；又は配列番号１８若しくは配列番号２２の核酸配列を含み、本明細書に教示されているオリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓタンパク質（配列番号１４）をコードするＣｅｎＨ３ポリヌクレオチド；又は配列番号１９若しくは配列番号２３の核酸配列を含み、本明細書に教示されているオリザ・サティバＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌタンパク質（配列番号１５）をコードするＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドに関するのが好ましい。
【０１９０】
一実施形態では、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドが単離される。本明細書に使用されている場合、「単離されたＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド」という用語は、天然の植物配列又はタンパク質、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他の植物ゲノム配列及びタンパク質を天然に伴う他の細胞成分から実質的に分離されている核酸を指す。この用語は、その天然に存在している環境から除去されている核酸配列を包含し、組換え又はクローニングされた核酸単離物及び化学的に合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。
【０１９１】
更なる態様では、本発明は、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドのいずれか１つを含むキメラ遺伝子に関する。
【０１９２】
更なる態様では、本発明は、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドのいずれか１つ又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子を含むベクターに関する。
【０１９３】
更なる態様では、本発明は、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチドのいずれか１つ又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子又は本明細書に教示されているベクターを含む宿主細胞に関する。一実施形態では、宿主細胞は、植物細胞、好ましくはトマト植物細胞、又はプロトプラストである。
【０１９４】
一実施形態では、上記に教示されているＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド及び上記のそのバリアントは、ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への移入及び形質転換細胞（複数可）に由来する細胞、組織、器官又は生物のような宿主細胞におけるＣｅｎＨ３タンパク質（複数可）の産生のためのキメラ遺伝子及び／又はベクターを作製するのに特に有益であることができる。植物細胞における本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質（又はそのタンパク質断片若しくはバリアント）の産生のためのベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【０１９５】
ＣｅｎＨ３タンパク質の発現のための好適な宿主細胞には、原核生物、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８５年）に記載されている。本明細書に開示されている核酸配列に由来するＲＮＡを使用して本発明のタンパク質を産生するために、無細胞翻訳システムも利用することができる。
【０１９６】
好適な原核生物宿主細胞には、グラム陰性及びグラム陽性生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は桿菌が含まれる。別の好適な原核生物宿主細胞は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。
【０１９７】
本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））由来の酵母宿主細胞においても発現することができる。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のような他の酵母属も利用することができる。
【０１９８】
或いは、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質は、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞、任意選択で非ヒト細胞を含む、高等真核生物宿主細胞において発現されてもよい。
【０１９９】
一実施形態では、本発明は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドを含むように修飾されている非ヒト生物に関する。非ヒト生物及び／又は宿主細胞は、例えば、脂質及びウイルスベクターのような送達デバイスの使用、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、化学的方法及び粒子媒介性遺伝子移入を含む、遺伝子移入のための当該技術分野において公知の任意の方法によって修飾されてもよい。有益な実施形態では、非ヒト生物は植物である。
【０２００】
任意の植物細胞は好適な宿主細胞であってもよい。好適な植物細胞には、単子葉植物又は双子葉植物由来のものが含まれる。例えば、植物は、ナス属（トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）を含む）、タバコ属、トウガラシ属、ペチュニア属及び他の属に属してもよい。以下の宿主種：タバコ（ニコチアナ種、例えば、Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｎ．プルムバギニフォリア（Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）、Ｎ．タバクム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）等）、例えば、チェリートマト、セラシフォルム（ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）変種又はカラントトマト、ピンピネリフォリウム（ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ変種）又はツリートマト（タマリロ（Ｓ．ｂｅｔａｃｅｕｍ）、キフォマンドラ・ベタケア（Ｃｙｐｈｏｍａｎｄｒａ  ｂｅｔａｃｅａｅ）の同義語）、ジャガイモ（ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ナス（ソラナム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））、ペピーノ（ソラナム・ムリカツム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｕｒｉｃａｔｕｍ））、ココナ（ソラナム・セシリフロラム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒｕｍ））及びナランジラ（ソラナム・キトエンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｑｕｉｔｏｅｎｓｅ））、ペッパー（トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）、キダチトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、キイロトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｂａｃｃａｔｕｍ））のようなトマト（Ｌ．エスキュレンツム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ソラナム・リコペルシカムの同義語）のような野菜種、観賞用種（例えば、ニチニチアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ペチュニア・アキシラリス（Ｐｅｔｕｎｉａ  ａｘｉｌｌａｒｉｅｓ）、Ｐ．インテグリフォリア（Ｐ．ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、コーヒー（コーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ））を好適に使用することができる。
【０２０１】
或いは、植物は、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）又はイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）のような任意の他の科に属してもよい。好適な宿主植物には、例えば、トウモロコシ／コーン（ゼア（Ｚｅａ）種）、コムギ（トリティクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種）、オオムギ（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、エンバク（例えば、アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ））、モロコシ（タカキビ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ））、ダイズ（グリキーネ種（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｐｐ．）、例えば、Ｇ．マックス（Ｇ．ｍａｘ））、ワタ（ゴシピウム種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、Ｇ．ヒルスツム（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、Ｇ．バルバデンセ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、アブラナ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、芽キャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）等）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、紅花、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コメ（オリザ種（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、Ｏ．サティバ・インディカ栽培品種群（Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ｉｎｄｉｃａ  ｃｕｌｔｉｖａｒ−ｇｒｏｕｐ）、又はジャポニカ栽培品種群）、飼料草、パールミレット（ペニセツム種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）、例えば、トウジンビエ（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ））、樹木種（松果体、ポプラ、モミ、プラシテン等）、チャノキ、コーヒーノキ、油やし、ココナッツ、エンドウ、ズッキーニ、マメ（例えば、インゲンマメ種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ））、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、ニンニク、リーク、レタス、タマネギ、ラディッシュ、カブ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリ、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、フェンネル、ビーツ、生果実を含む植物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ミカン、キーウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツ等）のような野菜種、観賞用種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ（ミント、パセリ、バジル、タイム等）、木質性樹木（ｗｏｏｄｙ  ｔｒｅｅ）（例えば、ハコヤナギ、シダレヤナギ、コナラ、ユーカリの種）、繊維種、例えば、麻（アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ））及び大麻（カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））、又はシロイヌナズナのようなモデル生物が含まれる。
【０２０２】
好ましい宿主細胞は、「作物植物」又は「栽培植物」、すなわち、ヒトにより栽培され、育種される植物種に由来する。作物植物は、食品若しくは飼料目的（例えば、農作物）のため、又は鑑賞目的（例えば、切り花、芝生のための草の生産等）のために栽培することができる。本明細書に定義されている作物植物には、燃料のための油、プラスチックポリマー、医薬品、コルク、繊維（ワタのような）等のような、非食品製品が収穫される植物も含まれる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、宿主細胞は任意の植物由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ナス科、より好ましくはナス属、更により好ましくはソラナム・リコペルシカム種に属する。この実施形態では、宿主細胞内に含まれるＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドは、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３変異体であるのが好ましい。
【０２０４】
更なる好ましい実施形態では、宿主細胞は、好ましくは、イネ科、より好ましくはイネ属、更により好ましくはオリザ・サティバ種に属する単子葉植物である。この実施形態では、ＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に、本明細書に教示されているオリザ・サティバＣｅｎＨ３変異体を含むことが好ましい。
【０２０５】
本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードする核酸配列の宿主細胞のゲノムへの、好ましくは安定な、導入のためのキメラ遺伝子及びベクターの構築は、当該技術分野において一般的に公知である。キメラ遺伝子を生成するために、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードする核酸配列は、標準的な分子生物学の技術を使用して、宿主細胞における発現に好適なプロモーター配列に作動可能に連結される。ＣｅｎＨ３タンパク質をコードする核酸配列が、単純にプロモーター配列の下流のベクターに挿入されるように、プロモーター配列は既にベクターに存在してもよい。次いで、ベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用することができ、キメラ遺伝子は、核ゲノム又はプラスチド、ミトコンドリア若しくは葉緑体ゲノムに挿入されて、好適なプロモーターを使用して発現することができる（例えば、Ｍｃ  Ｂｒｉｄｅら、１９９５年  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、３６２頁；米国特許第５，６９３，５０７号）。一実施形態では、本明細書に教示されているキメラ遺伝子は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結している、植物細胞又は微生物細胞（例えば、細菌）における発現のための好適なプロモーターであって、任意選択で３’非翻訳核酸配列がその後に続く、プロモーターを含む。細菌はその後、植物の形質転換に使用されてもよい（アグロバクテリウム媒介性の植物形質転換）。
【０２０６】
アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３ポリペプチドを発現する植物
更なる態様では、本発明は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３ポリペプチドのいずれか１つ又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子又は本明細書に教示されているベクターを発現する植物又は植物細胞に関する。
【０２０７】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物又は植物細胞は任意の植物又は植物細胞であってもよい。好ましい実施形態では、植物又は植物細胞は、ナス科、より好ましくはナス属、更により好ましくはソラナム・リコペルシカム種に属してもよい。前記ソラナム・リコペルシカム植物は、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３変異体を含むことが好ましい。
【０２０８】
更なる実施形態では、本明細書に教示されている植物又は植物細胞は、任意の植物又は植物細胞であってもよい。好ましい実施形態では、植物又は植物細胞は、イネ科、より好ましくはイネ属、更により好ましくはオリザ・サティバ種、更により好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ亜種に属してもよい単子葉植物である。前記オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物は、本明細書に教示されているオリザ・サティバＣｅｎＨ３変異体を含むことが好ましい。
【０２０９】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物又は植物細胞は、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しないか、又は低減したレベル（例えば、野生型レベルの９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満）で発現することが好ましい。例えば、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の活性若しくは発現を低減させるか若しくは除去する変異を内在性ＣｅｎＨ３タンパク質に作り出すことができるか、又は内在性ＣｅｎＨ３タンパク質のノックアウトを作り出すことができる。この場合、遺伝子のノックアウト又は変異のためのヘテロ接合性植物を作り出すことができ、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質の発現のための発現ベクターを植物に導入することができる。次いで、変異又はノックアウトのためにホモ接合性であるが、アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質を含む、ヘテロ接合体由来の後代を選択することができる。
【０２１０】
従って、本明細書に教示されている植物又は植物細胞において、前記植物又は植物細胞が顕著に又は本質的に完全に、すなわち、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質の補完的発現のない胚の致死性を誘導するのに十分に、内在性ＣｅｎＨ３活性を欠くように、一方又は両方の内在性ＣｅｎＨ３アレルがノックアウトされるか、又は変異されることが好ましい。２倍体を超える染色体の組を有する植物において、全ての内在性ＣｅｎＨ３アレルは、不活性化され、変異されるか、又はノックアウトされてもよい。或いは、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現は、当該技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を低減させるか、又は除去するｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡを導入することによって、サイレンシングされてもよい。理想的には、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をサイレンシングさせるが、アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をサイレンシングさせない、サイレンシング剤が選択される。
【０２１１】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物又は植物細胞は、本明細書に教示されているアクティブ変異を含むＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドのアレルの１つ又は２つのコピーを含んでもよい。一実施形態では、本明細書に教示されている植物又は植物細胞は、本明細書に教示されているアクティブ変異を含むＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドのアレルの２つのコピーを含むことが好ましい。
【０２１２】
一実施形態では、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか１つは、例えば、植物育種に使用するための、半数体インデューサー系統を産生するために使用することができる。
【０２１３】
ＣＥＮＨ３は、細胞分裂の間に紡錘糸が付着している染色体におけるタンパク質構造であるキネトコア複合体のメンバーである。本発明の範囲を限定することを意図しないが、観察された結果は、野生型より弱く作用し、それによって機能的キネトコア複合体（例えば、有糸分裂において）を生じるが、他の親由来の野生型キネトコア複合体も含有する染色体と比較して減数分裂の間に染色体を比較的不十分に分離するキネトコアタンパク質の生成に少なくとも部分的に起因すると考えられる。これは、変更されたタンパク質が細胞における唯一のアイソフォームである場合、機能的キネトコア複合体を生じるが、変更されたキネトコアを有する親が、野生型キネトコア複合体を有する親と交配される場合、有糸分裂の間に染色体を比較的不十分に分離する。ＣＥＮＨ３に加えて、他のキネトコアタンパク質には、例えば、ＣＥＮＰＣ、ＭＣＭ２１、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０、及びＮＵＦ２が含まれる。
【０２１４】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物は、セントロメアを破壊する別の組換え変異した第２のキネトコアタンパク質（ＣＥＮＰＣ、ＭＣＭ２１、ＭＩＳ１２、ＮＤＣ８０、及びＮＵＦ２を含むが、これらに限定されない）、並びに／又はＣｅｎＨ３のアレル及び内在性の第２のキネトコアタンパク質遺伝子のうちの少なくとも一方又は両方のコピーが、ノックアウトされているか、その機能を低減させるか若しくは除去するように変異されているか、又はサイレンシングされている植物を更に発現することができる。本発明はまた、本明細書に教示されており、変異した第２のキネトコアタンパク質を更に発現し、内在性の第２のキネトコアタンパク質を発現しない植物を、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質及び内在性の第２のキネトコアタンパク質を発現する植物へ交配することによって、半数体植物を生成する方法も提供する。
【０２１５】
植物の生成のための方法
更なる態様では、本発明は、本明細書上記に教示されている植物又は植物細胞を作製する方法に関する。
【０２１６】
一実施形態では、本発明は、標的化変異誘発法（標的化ヌクレオチド交換（ＴＮＥ）又はオリゴ指定変異誘発（ｏｌｉｇｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＯＤＭ）とも称される）を使用して内在性ＣｅｎＨ３遺伝子を修飾する方法に関する。標的化変異誘発法には、限定されないが、植物プロトプラストへの、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃａｓ９様、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ若しくはＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲシステムを採用するもの、又はＣｅｎＨ３遺伝子に相補的な配列により変異誘発を促進するための、化学修飾されたヌクレオチドを含有する可能性のある変異誘発性のオリゴヌクレオチドを採用する標的化変異誘発（例えば、ＫｅｙＢａｓｅ（登録商標）又はＴＡＬＥＮ）が含まれる。
【０２１７】
或いは、アクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質をコードするＣｅｎＨ３遺伝子を含む植物系統を生成するために、ＴＩＬＬＩＮＧ（どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１８：４５５頁、及びＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２３、４３９〜４４２頁）のような変異誘発システムが使用されてもよい。ＴＩＬＬＩＮＧは、伝統的な化学的変異誘発（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、その後に続く変異に関するハイスループットスクリーニングを使用する。よって、所望の変異を有するＣｅｎＨ３遺伝子を含む植物、種子及び組織を得ることができる。
【０２１８】
本明細書に教示されている方法は、植物種子に変異を起こさせるステップ（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、植物個体又はＤＮＡをプールするステップ、目的の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖の形成及びハイスループット検出、変異体植物の同定、変異体ＰＣＲ産物のシーケンシングを含むことができる。そのような修飾植物を生成するために、他の変異誘発及び選択方法を同等に使用することができることは理解される。例えば、種子は、照射されるか、又は化学処理されてもよく、植物は、修飾された表現型に関してスクリーニングされてもよい。
【０２１９】
修飾植物は、修飾されていない植物、すなわち、野生型植物から、ＤＮＡに存在する変異（複数可）のような分子的方法により、及び修飾された表現型の特徴により識別することができる。修飾植物は、変異に関してホモ接合性又はヘテロ接合性であってもよい。
【０２２０】
一実施形態では、本発明は、本明細書上記に教示されている植物又は植物細胞を作製する方法であって、ａ）植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、ＣｅｎＨ３タンパク質（すなわち、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド）をコードする変異ポリヌクレオチドを得るステップと、ｂ）ＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップとを含む、方法に関する。
【０２２１】
一実施形態では、本発明は、本明細書に教示されている植物を作製する方法であって、ａ）植物細胞内の内在性植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を有する植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、ｂ）１つ又は複数のアクティブ変異を有する植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップとを含む、方法に関する。
【０２２２】
一実施形態では、本発明は、本明細書に教示されている植物を作製する方法であって、ａ）植物細胞に、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３ポリヌクレオチドのいずれか１つ、又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターを形質転換するステップと、ｂ）前記ＣｅｎＨ３ポリヌクレオチド又はキメラ遺伝子又はベクターを含む植物細胞を選択するステップと、ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップとを含む、方法に関する。
【０２２３】
一実施形態では、本明細書に教示されている植物又は植物細胞を作製する方法は、内在性植物ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記植物細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現に関与する任意の他の内在性植物ポリヌクレオチドを修飾して、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を阻止するステップを更に含んでもよい。
【０２２４】
一実施形態では、本明細書に教示されている、ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはＣｅｎＨ３タンパク質をコードするキメラ遺伝子は、従来の方法で単一の植物細胞の核ゲノムに安定に挿入することができ、そのようにして形質転換された植物細胞は、従来の方法において使用されて、ある特定の時点におけるある特定の細胞における本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質の存在により、変更された表現型を有する形質転換された植物を産生することができる。これに関して、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにおける本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＴ−ＤＮＡベクターは、植物細胞を形質転換するために使用することができ、その後、形質転換された植物は、例えば、欧州特許第０１１６７１８号、欧州特許第０２７０８２２号、ＰＣＴ公報国際公開第８４／０２９１３号及び欧州特許出願公開第０２４２２４６号、並びにＧｏｕｌｄら、（１９９１年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５、４２６〜４３４頁）に記載されている手順を使用して形質転換された植物細胞から再生することができる。アグロバクテリウム媒介性の植物形質転換のためのＴ−ＤＮＡベクターの構築は、当該技術分野において周知である。Ｔ−ＤＮＡベクターは、欧州特許第０１２０５６１号及び欧州特許第０１２０５１５号に記載されているバイナリーベクター又は欧州特許第０１１６７１８号に記載されている相同組換えによりアグロバクテリウムＴｉプラスミドに組み込むことのできる共挿入ベクターのいずれかであってもよい。
【０２２５】
同様に、形質転換された植物細胞由来の形質転換された植物の選択及び再生は、当該技術分野において周知である。明らかに、異なる種ごとに、更には単一の種の異なる亜種又は栽培品種ごとにも、高頻度で形質転換体が再生されるように特にプロトコールを適合させる。
【０２２６】
結果として生じる形質転換された植物は、その後倍加半数体植物となることがある半数体植物を産生するために、従来の植物育種スキームに使用することができる。
【０２２７】
本発明はまた、半数体又は倍加半数体植物を生成する方法であって、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物及び本明細書に教示されている植物を同定するステップであって、本明細書に教示されている植物が、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を欠く、ステップを含む、方法に関する。内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、本明細書に教示されている植物と交配して、半数体植物を生じることができる。
【０２２８】
一実施形態では、交配は、植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。代わりに一組の染色体が除去される。
【０２２９】
半数体植物及び／又は倍加半数体植物の生成のための方法
更なる態様では、本発明は、半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を生成する方法であって、ａ）内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物を、本明細書に教示されている植物のいずれか１つへ交配するステップと、ｂ）種子を採取するステップと、ｃ）前記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと、ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物、又は異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物，又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップとを含む方法に関する。
【０２３０】
当業者は半数体植物を選択することができる。例示的な技術には、フローサイトメトリー又は特異的なＳＮＰコーリングによるバリデーションが含まれる。
【０２３１】
一実施形態では、ステップａ）における植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しない。一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物はＦ１植物であってもよい。内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は交配の花粉親であってもよいか、又は交配の胚珠親であってもよい。
【０２３２】
キネトコア複合体に関与する内在性ＣｅｎＨ３タンパク質の発現を欠き、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質を発現する本明細書に教示されている植物を、野生型植物へ交配することにより、半数体であり、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物由来の染色体のみを含む少なくともいくつかの後代が生じる。従って、本発明は、目的の植物を、本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物と交配し、得られた半数体種子を採取することによって、目的の植物由来のその染色体の全てを有する半数体植物の生成を可能とする。
【０２３３】
従って、親の遺伝子型に依存しない正確な分子変化により、ゲノムの除去を操作することができる。ＣｅｎＨ３タンパク質はいかなる植物種にも見出される。これは、半数体細胞の組織培養及び遠縁交雑のような半数体植物産生のための従来の方法が成功しない種において半数体植物を作製することを可能とする。
【０２３４】
本明細書に教示されているアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、雄親又は雌親のいずれかとして交配されてもよい。本明細書に教示されている方法は、親染色体の母系細胞質への移入を可能とする。従って、単一のステップにおいて、所望の遺伝子型を有する細胞質雄性不稔系統を生成することができる。
【０２３５】
更なる態様では、本発明は、倍加半数体植物を生成する方法であって、本明細書に教示されているステップｄ）において得られた半数体実生、小植物又は植物を倍加半数体植物に転換するステップを含む、方法に関する。
【０２３６】
一実施形態では、半数体実生、小植物又は植物を倍加半数体植物に転換するステップは、コルヒチンを使用して実施することができる。
【０２３７】
更なる態様では、本発明は、倍加半数体植物を生成する方法であって、ａ）内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物を、本明細書に教示されている修飾植物のいずれか１つと交配するステップと、半数体植物を選択するステップと、前記半数体植物を倍加半数体植物に転換するステップとを含む、方法に関する。
【０２３８】
一実施形態では、交配するステップａ）は、約２４℃〜約３０℃の範囲の温度にて実施される。
【０２３９】
従って、半数体植物は、一度生成されると、染色体の正確な二本鎖コピーを含む倍加半数体植物の生成に使用することができる。半数体生物から倍加半数体生物を生成するために多種多様な方法が公知である。半数体植物を倍加半数体植物に転換するために、例えば、コルヒチンのような化学物質が適用されてもよい。或いは、倍数体は、胚発生の間又は植物の後期発生段階において自発的に倍加することができる。
【０２４０】
一実施形態では、本明細書に教示されている半数体植物、異常な倍数性を有する植物及び／又は倍加半数体植物の生成のための方法は、前記植物の全ゲノムを有性交配するステップを含まない。代わりに、交配の間に１組の染色体が除去される。
【０２４１】
Ｆ１、Ｆ２又は所望の形質を有する次世代の植物を生成するために、倍加半数体植物を他の植物と更に交配してもよい。
【０２４２】
トランスジェニック又は変異誘発された遺伝子を保有しない倍加半数体植物を得ることができる。加えて、倍加半数体植物は、ハイブリッドＦ１から速やかにホモ接合性のＦ２を創出することができる。
【０２４３】
一実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、交配の花粉親であってもよい。更なる実施形態では、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物は、交配の胚珠親であってもよい。
【０２４４】
ソラナム・リコペルシカム植物又は種子
更なる態様では、本発明は、配列番号３のＣｅｎＨ３タンパク質配列を含み、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を更に含むソラナム・リコペルシカム植物又は種子に関する。そのような植物は本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３変異体を含んでもよい。
【０２４５】
一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、植物ＣｅｎＨ３モチーフブロック１（配列番号４）にある。
【０２４６】
好ましい実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、本明細書に教示されているコンセンサスナス科ＣｅｎＨ３モチーフブロック１（配列番号５）にある。
【０２４７】
一実施形態では、アクティブ変異は、本明細書に定義されている配列番号４若しくは配列番号５、又はそれらのバリアントの９位におけるアミノ酸残基にあり、前記アミノ酸残基は、リシン、アルギニン又はヒスチジンを除く任意のアミノ酸に修飾されている。
【０２４８】
好ましい実施形態では、アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群から選択される別のアミノ酸残基に修飾されてもよい。
【０２４９】
より好ましい実施形態では、アミノ酸残基は、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基から選択される別のアミノ酸残基に修飾されてもよい。
【０２５０】
一実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子は、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか１つ又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターを含んでもよい。
【０２５１】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子は、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５２】
更に好ましい実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子は、配列番号７又は配列番号１０の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５３】
一実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５４】
一実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子は、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しないか、又は機能的内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を有さない。
【０２５５】
本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は種子において、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質は、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、発現されない。
【０２５６】
一実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は細胞は、半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するために使用されてもよい。
【０２５７】
更なる実施形態では、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物又は細胞は、倍加半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するために使用されてもよい。
【０２５８】
オリザ・サティバ植物又は種子
更なる態様では、本発明は、配列番号１２のＣｅｎＨ３タンパク質配列を含み、ＣｅｎＨ３タンパク質のＮ末端テールドメインに１つ又は複数のアクティブ変異を更に含む、オリザ・サティバ植物又は種子、好ましくはオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカに関する。そのような植物は、本明細書に教示されているオリザ・サティバＣｅｎＨ３変異体を含んでもよい。
【０２５９】
一実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、植物ＣｅｎＨ３モチーフブロック１（配列番号４）にある。アクティブ変異は、本明細書に定義されている、配列番号４の９位におけるアミノ酸残基、又は配列番号１２若しくはそのバリアントの９位におけるアミノ酸残基にあってもよく、前記アミノ酸残基はバリンを除く任意のアミノ酸に修飾されている。アミノ酸残基は、メチオニン、セリン又はトレオニンからなる群から選択される別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニンに修飾されてもよい。
【０２６０】
更なる実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、本明細書に定義されている配列番号１２又はそのバリアントの１６位における植物ＣｅｎＨ３  Ｎ末端テールにあることが好ましく、前記アミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸に修飾されている。アミノ酸残基は、メチオニン、セリン及びトレオニンからなる群から選択される別のアミノ酸残基、より好ましくはセリンに修飾されてもよい。
【０２６１】
更なる実施形態では、１つ又は複数のアクティブ変異は、本明細書に定義されている配列番号１２又はそのバリアントの２６位における植物ＣｅｎＨ３  Ｎ末端テールにあることが好ましく、前記アミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸に修飾されている。アミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンからなる群から選択される別のアミノ酸残基、より好ましくはロイシンに修飾されてもよい。
【０２６２】
一実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は種子は、本明細書に教示されているポリヌクレオチドのいずれか１つ又は本明細書に教示されているキメラ遺伝子、又は本明細書に教示されているベクターを含んでもよい。
【０２６３】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は種子は、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２６４】
更なる好ましい実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は種子は、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９又は配列番号２１、配列番号２２又は配列番号２３の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２６５】
一実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は種子は、本明細書に教示されているＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０２６６】
一実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は種子は、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しないか、又は機能的内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を有さない。
【０２６７】
本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は種子において、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質は、少なくとも生殖部分において及び／又は胚発生の間、発現されない。
【０２６８】
一実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は細胞は、半数体オリザ・サティバ植物を産生するために使用されてもよい。
【０２６９】
更なる実施形態では、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物又は細胞は、倍加半数体オリザ・サティバ植物を産生するために使用されてもよい。
【０２７０】
使用
更なる態様では、本発明は、例えば、植物育種に使用するための半数体インデューサー系統又は植物を産生するための、１つ若しくは複数のアクティブ変異及び／又は１つ若しくは複数のアクティブ変異を有するＣｅｎＨ３をコードするポリヌクレオチド並びにそれらを含むキメラ遺伝子、ベクター及び宿主細胞を含むＣｅｎＨ３タンパク質の使用に関する。
【０２７１】
更なる態様では、本発明は、半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するための、及び／又は倍加半数体ソラナム・リコペルシカム植物を産生するための、本明細書に教示されているソラナム・リコペルシカム植物、小植物又は種子に関する。
【０２７２】
更なる態様では、本発明は、半数体オリザ・サティバ植物を産生するための、及び／又は倍加半数体オリザ・サティバ植物を産生するための、本明細書に教示されているオリザ・サティバ植物、小植物又は種子に関する。本発明は、半数体オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物を産生するための、及び／又は倍加半数体オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物を産生するための、本明細書に教示されているオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ植物、小植物又は種子に関することが好ましい。
【０２７３】
配列表
配列番号１：植物ＣｅｎＨ３コンセンサスタンパク質配列
配列番号２：コンセンサスナス科ＣｅｎＨ３タンパク質配列
配列番号３：ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３タンパク質配列（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ０９５６５０．２．１）
配列番号４：植物コンセンサスＣｅｎＨ３モチーフ１ドメインタンパク質配列
配列番号５：コンセンサスナス科ＣｅｎＨ３モチーフ１ドメインタンパク質配列
配列番号６：ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３コード配列（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ０９５６５０．２．１）
配列番号７：ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅコード配列
配列番号８：ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅタンパク質配列
配列番号９：ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３ゲノムＤＮＡ配列（Ｓｏｌｙｃ０１ｇ０９５６５０．２．１）
配列番号１０：ソラナム・リコペルシカムＣｅｎＨ３＿Ｋ９ＥゲノムＤＮＡ配列
配列番号１１：単子葉植物コンセンサスＣｅｎＨ３タンパク質配列
配列番号１２：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３タンパク質配列（ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ４１０８０）
配列番号１３：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍタンパク質配列
配列番号１４：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓタンパク質配列
配列番号１５：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌタンパク質配列
配列番号１６：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３コード配列（ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ４１０８０）
配列番号１７：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍコード配列
配列番号１８：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓコード配列
配列番号１９：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌコード配列
配列番号２０：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３ゲノムＤＮＡ配列（ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ４１０８０）
配列番号２１：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｖ９ＭゲノムＤＮＡ配列
配列番号２２：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｐ１６ＳゲノムＤＮＡ配列
配列番号２３：オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカＣｅｎＨ３＿Ｐ２６ＬゲノムＤＮＡ配列
【実施例】
【０２７４】
実施例１：半数体植物の生成
植物材料
３つのトマト栽培品種、すなわち、「ＭｏｎｅｙＢｅｒｇ  ＴＭＶ＋」、「ＭｉｃｒｏＴｏｍ」及び「ＲＺ５２２０１」を使用した。国際公開第２００７／０３７６７８号及び国際公開第２００９／０４１８１０号に記載されている方法に従って、トマトＲＺ５２２０１の変異体集団から、遺伝子ＣｅｎＨ３における体細胞非同義変異体、すなわちアミノ酸９位において変異されているＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅを選択した。選択した変異体植物を自家授粉させ、子孫において、変異した遺伝子座についてホモ接合性であった植物を選択した。国際公開第２００７／０３７６７８号及び国際公開第２００９／０４１８１０号に記載されている方法に従って、トマトＭｏｎｅｙＢｅｒｇ  ＴＭＶ＋の変異体集団から、遺伝子Ｍｓｉ２における体細胞同義変異体、すなわちアミノ酸３３７位において変異されている（ＣからＴ）Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄを選択した。選択した変異体植物を自家授粉させ、子孫において、変異した遺伝子座についてホモ接合性であった植物を選択した。
【０２７５】
方法
片親ゲノムの除去及び結果として生じる半数体植物の産生を、いわゆる半数体インデューサー系統と別の非半数体インデューサー系統、例えば、育種系統との間の交配を行うことによって誘発した。高い温度が、一部の場合のみではあるが、片親ゲノムの除去を起こすのに好ましい効果を及ぼす可能性があることが分かっている（Ｓａｎｅｉら、ＰＮＡＳ  １０８．３３（２０１１年）；Ｅ４９８〜Ｅ５０５）ため、片親ゲノムの除去のためのトマト系統の交配を、比較的高温（２６〜２８℃）で実施した。
【０２７６】
結果
ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体におけるＡからＧの非同義変異は、リシンからグルタミン酸塩のアミノ酸修飾（配列番号８）をもたらした。Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体におけるＣからＴの同義変異はアミノ酸修飾をもたらさなかった。ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ又はＭｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異についてホモ接合性である両方の変異体植物を、それぞれ、雌株又は花粉ドナーとして非変異野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ植物を使用して比較的高温（２６〜２８℃）での交配における花粉ドナー及び雌株として使用した。表１は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型について評価した、作製した全ての交配及び播種した種子の概要を列挙する。
【０２７７】
【表１】
2019516373.tif 000003
表１に列挙した交配から生じた種子を播種し、植物をそれらのＤＮＡ含有量についてフローサイトメトリーによって評価した。フローサイトメトリー分析により、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇＴＭＶ＋のような野生型トマト栽培品種と同様に、試験した全ての植物についての正常な２倍体倍数性レベルのみの決定がもたらされた。唯一の例外が見出された；ＭｉｃｒｏＴｏｍ（雌株）×ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ（雄株）の２０１４年の交配に関して、１つの子孫植物がフローサイトメトリー分析に基づいて異数性（すなわち、異常な倍数性を有する）であることが見出された。
【０２７８】
栽培品種ＭｉｃｒｏＴｏｍは、劣性であることが知られている矮性表現型を有する（Ｍａｒｔｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ、Ｖｏｌ．５７、Ｎｏ．９、２０３７〜２０４７頁、２００６年）。例えばＭｏｎｅｙＢｅｒｇ  ＴＭＶ＋又はＲＺ５２２０１野生型栽培品種への又はそれとのＭｉｃｒｏＴｏｍの交配後、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇ  ＴＭＶ＋又はＲＺ５２２０１野生型栽培品種の不確定な非矮性表現型を有する子孫のみを見出す。同じことが、Ｍｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ同義変異体とＭｉｃｒｏＴｏｍとの交配について見出され、ＭｉｃｒｏＴｏｍ及びＭｓｉ２＿Ｄ３３７Ｄ変異体交配の全ての子孫は、ＭｏｎｅｙＢｅｒｇ  ＴＭＶ＋親の不確定な非矮性表現型を示した。雄株親又は雌株親としてＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体を使用して、合計２０個の植物がＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示すことが見出された。これは、ＲＺ５２２０１親遺伝物質が、生じた子孫の一部ではないことを示し、これは、これらの２０個の子孫植物が半数体ＭｉｃｒｏＴｏｍ起源であることを示す。後者２０個の植物の全ての植物の倍数性は２倍体であることが見出され、トマトにとって例外的な高い出現頻度を有すると記載されている現象である、自発的な倍加が起こったことを示す（Ｔｏｍａｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２−２０１２年１２月のレポート）。
【０２７９】
片親ゲノムの除去が起こったかどうか、及びどの程度起こったかを決定するために、２０１５年の交配について合計２４の位置（１２個のトマト染色体の各々に２つのＳＮＰ）について一塩基多型（ＳＮＰ）アッセイを行った。２０１４年の交配について、ＳＮＰアッセイを合計８つの位置（第２、第７、第９及び第１２染色体に１つ、並びに第３及び第６染色体に２つ）で行った。選択した一塩基多型は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ親の１つの塩基対についてホモ接合性であり、ＲＺ５２２０１親においてＭｉｃｒｏＴｏｍ塩基対以外の全てについてホモ接合性であった。野生型ＭｉｃｒｏＴｏｍ栽培品種とＲＺ５２２０１栽培品種との間の通常の交配は、ヘテロ接合性一塩基多型スコアをもたらす。
【０２８０】
しかしながら、片親ゲノムの除去のプロセスが起こった場合、半数体インデューサー系統ゲノムの損失が予想される。一塩基多型試験は、ＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型も示す２０個の子孫植物の各々について、ＭｉｃｒｏＴｏｍ親からのホモ接合性塩基対スコアのみのコールをもたらし、ＲＺ５２２０１親のいずれもコールしなかった。一塩基多型スコアに基づいて、ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体の完全なゲノムはもはや子孫に存在しないと結論付けた。
【０２８１】
従って、ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体は、高度に効率的な半数体インデューサー系統として機能すると結論付けることができる。ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体を雌株親として使用した交配では、ＭｉｃｒｏＴｏｍの自殖は排除することができる。ＭｉｃｒｏＴｏｍを雌株親として使用した実験では、交配してから２年後にＭｉｃｒｏＴｏｍ表現型を示した子孫の数が非常に少なく（５１６個の中からわずか６個の種子及び２９７個の中から１３個）、ホモ接合性塩基対のみがスコア付けされたという事実を考慮すると、自殖が起こった可能性は非常に低い。
【０２８２】
ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体及びＲＺ５２２０１対照植物の花粉四分子を、異常の発生について調べた。
【０２８３】
２つの花から、花粉四分子を見るために、葯を押しつぶした。ＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異体について、２つの花をスコア付けすると、平均２．６０±０．２５％の微小核が全ての四分子において観察された。図１はこのような微小核の例を示す。ＲＺ５２２０１対照について、微小核を有する花粉四分子を含有する葯が稀に観察された。５つの花をスコア付けすると、平均０．５８±０．３６パーセントの微小核が全ての四分子において観察された。減数分裂の間の染色体の分離は、対照と比較してＣｅｎＨ３＿Ｋ９Ｅ変異の結果としてずっと高頻度で妨害されると結論付けられる。異常な有糸分裂、例えば微小核の観察は、作物における種間、種内ハイブリダイゼーションにおける染色体除去及び半数体産生の直接的な証拠として使用されることが多い。例えば、異常な有糸分裂並びに異常な減数分裂、例えば微小核は、トウモロコシＤＨ−インデューサー系統の研究において見出された（Ｑｉｕ、Ｆａｚｈａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１（２０１４年）：８３〜９０頁）。ＣｅｎＨ＿Ｋ９Ｅ変異体における減数分裂時の微小核の観察は、有糸分裂の間に同様のプロセスが起こることを示唆している。野生型及びＣｅｎＨ＿Ｋ９Ｅ接合体の融合後の最初の有糸分裂の間の片親ゲノムの除去のプロセスが起こり、これが観察された半数体の誘導をもたらす可能性がある。
【０２８４】
実施例２：コメにおける片親ゲノムの除去
植物材料
オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカｃｖ．ボラノ（Ｖｏｌａｎｏ）を使用して、化学的変異誘発によって変異体集団を生成する。この変異体集団から、国際公開第２００７／０３７６７８号及び国際公開第２００９／０４１８１０号に記載されている方法に従って、遺伝子ＣｅｎＨ３（ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ４１０８０；配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５）における３つの体細胞非同義変異体、すなわち、ＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍ、ＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓ及びＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌを選択する。選択した変異体植物を自家授粉させ、子孫において、変異した遺伝子座についてホモ接合性である植物を選択する。変異していないオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカ（配列番号１２をコードする）ｃｖ．ボラノ植物も同様に使用する。
【０２８５】
方法
片親ゲノムの除去及び結果として生じる半数体植物の産生を、いわゆる半数体インデューサー系統と別の非半数体インデューサー系統、例えば、変異していないオリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカｃｖ．ボラノ植物との間の交配を行うことによって誘発する。子孫の倍数性を測定して、それらが２倍体であるか、又は半数体であるかを決定する。半数体子孫植物が２倍体状態に自発的に倍加される可能性を含めるために、列挙された３つのＣｅｎＨ３変異体ＳＮＰのいずれかの完全欠損も同様に試験する。自発的に倍加が誘発された半数体植物において、３つの別個のＣｅｎＨ３変異体ＳＮＰ（配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５）のいずれも存在せず、ヘテロ接合性アレルとしてでさえ存在しない。
【０２８６】
結果
ＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍ変異体におけるＧからＡの非同義変異は、バリンのメチオニンへのアミノ酸修飾をもたらした（配列番号１３）。ＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓ変異体におけるＣからＴへの非同義変異は、プロリンのセリンへのアミノ酸修飾をもたらした（配列番号１４）。ＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌ変異体におけるＣからＴへの非同義変異は、プロリンのロイシンへのアミノ酸修飾をもたらした（配列番号１５）。ＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍ、ＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓ又はＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌ変異についてホモ接合性である３つの変異体植物の各々を、雌株として変異されていない野生型オリザ・サティバＬ．ｓｓｐ．ジャポニカｃｖ．ボラノを使用して花粉ドナーとして使用した。表２は、倍数性レベルについて評価される全ての交配及び播種される種子の概要を列挙する。正逆交配は同様の結果を生じることができる。
【０２８７】
【表２】
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表１に列挙した交配から生じた種子を播種し、植物をそれらのＤＮＡ含有量についてフローサイトメトリーによって評価する。ＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍ、ＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓ又はＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌ変異体ＳＮＰの存在を、フローサイトメトリー分析によって半数体であると決定した植物において試験する。変異体ＳＮＰが存在しないことは、変異親遺伝物質が、結果として生じた子孫の一部ではなく、これらの子孫植物が半数体野生型親起源であること、すなわち、ＣｅｎＨ３＿Ｖ９Ｍ、ＣｅｎＨ３＿Ｐ１６Ｓ又はＣｅｎＨ３＿Ｐ２６Ｌ変異体の各々が、高度に効率的な半数体インデューサー系統として機能することを示す。
【図１】
2019516373.tif 000005
【配列表】
2019516373000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月16日(2019.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列を有するＮ末端テールドメインのＣｅｎＨ３モチーフブロック１において１つ又は複数のアクティブ変異を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項２】
前記アクティブ変異が配列番号４の９位又は１０位にある、請求項１に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項３】
配列番号１、２、３、１１及び１２のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する内在性ＣｅｎＨ３タンパク質から誘導されるか、又は好ましくは、標的化ヌクレオチド交換を使用して若しくはエンドヌクレアーゼを適用することにより、前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドに変異を導入することによって、配列番号６、９、１６若しくは２０のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、好ましくは前記アクティブ変異が点変異である、請求項１又は２に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項４】
配列番号８若しくは１３のアミノ酸配列を含む植物起源のＣｅｎＨ３タンパク質、又は配列番号７、１０、１７若しくは２１の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３に記載のＣｅｎＨ３タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号７、１０、１７又は２１の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子。
【請求項８】
請求項５若しくは６に記載のポリヌクレオチド又は請求項７に記載のキメラ遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項５若しくは６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のキメラ遺伝子、又は請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは植物細胞であり、好ましくはトマト若しくはコメ植物細胞であるか、又はトマト若しくはコメプロトプラストである、宿主細胞。
【請求項１０】
好ましくは前記内在性ＣｅｎＨ３タンパク質が発現されず、好ましくは前記植物がナス属植物、好ましくはソラナム・リコペルシカム植物、又はイネ属植物、好ましくはオリザ・サティバ植物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物。
【請求項１１】
請求項５若しくは６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のキメラ遺伝子、又は請求項８に記載のベクターを含む、請求項１０に記載の植物。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の植物を作製する方法であって、
ａ）植物細胞内の内在性ＣｅｎＨ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾して、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣｅｎＨ３タンパク質をコードする変異ポリヌクレオチドを得るステップ、又は植物細胞に、請求項５若しくは６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のキメラ遺伝子、又は請求項８に記載のベクターを形質転換するステップと、
ｂ）前記変異ポリヌクレオチドを含む植物細胞を選択するステップと、
ｃ）任意選択で、前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
半数体植物、異常な倍数性を有する植物又は倍加半数体植物を生成する方法であって、
ａ）内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現する植物を、請求項１０又は１１に記載の植物へ交配するステップであって、請求項１０又は１１に記載の植物は、少なくともその生殖部分において及び／又は胚発生の間、内在性ＣｅｎＨ３タンパク質を発現しない、ステップと、
ｂ）種子を採取するステップと、
ｃ）前記種子から、少なくとも１つの実生、小植物又は植物を生育させるステップと、
ｄ）半数体実生、小植物若しくは植物；異常な倍数性を有する実生、小植物若しくは植物；又は倍加半数体実生、小植物若しくは植物を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
倍加半数体植物を生成する方法であって、
請求項１３に記載のステップｄ）において得られた半数体実生、小植物又は植物を倍加半数体植物に転換するステップを含む、方法。
【請求項１５】
半数体インデューサー系統を産生するための請求項５又は６に記載のポリヌクレオチドの使用。
【国際調査報告】
2019516373.tif 000006
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