(57)【要約】クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと２個以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む組成物で宿主細胞を処理するステップであって、少なくとも２個のｇＲＮＡの各々が、プロウイルスＤＮＡの長末端反復（ＬＴＲ）中の異なる標的核酸配列に相補的であるステップ、及びプロウイルスＤＮＡを不活性化するステップによって、レトロウイルスに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとを含む単離核酸配列を含む、レトロウイルスに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に使用するための組成物であって、ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的である組成物。【選択図】図１
2019506156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法であって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼと２個以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む組成物で前記宿主細胞を処理するステップであって、少なくとも２個のｇＲＮＡの各々が、前記プロウイルスＤＮＡの長末端反復（ＬＴＲ）中の異なる標的核酸配列に相補的であるステップ、及び
前記プロウイルスＤＮＡを不活性化するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞を処理するステップが、
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、プロウイルスＤＮＡ中の第１の標的プロトスペーサー配列に相補的である第１のスペーサー配列を有する第１のｇＲＮＡをコードする単離核酸配列と、前記プロウイルスＤＮＡ中の第２の標的プロトスペーサー配列に相補的である第２のスペーサー配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする単離核酸とを含む組成物に前記宿主細胞を暴露するステップ、
前記宿主細胞中で前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記第１のｇＲＮＡ、及び前記第２のｇＲＮＡを発現するステップ、
前記宿主細胞中で、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと前記第１のｇＲＮＡとを含む第１の遺伝子編集複合体、及び前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと前記第２のｇＲＮＡとを含む第２の遺伝子編集複合体を構築するステップ、
前記第１のスペーサー配列と前記第１の標的プロトスペーサー配列の相補的塩基対合によって、前記第１の遺伝子編集複合体を前記第１の標的プロトスペーサー配列に誘導するステップ、
前記第２のスペーサー配列と前記第２の標的プロトスペーサー配列の相補的塩基対合によって、前記第２の遺伝子編集複合体を前記第２の標的プロトスペーサー配列に誘導するステップ、
前記プロウイルスＤＮＡを前記第１の標的プロトスペーサー配列において前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを用いて切断するステップ、
前記プロウイルスＤＮＡを前記第２の標的プロトスペーサー配列において前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを用いて切断するステップ、及び
少なくとも１個の変異を前記プロウイルスＤＮＡ中で誘導するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の標的プロトスペーサー配列及び前記第２の標的プロトスペーサー配列の少なくとも１つが前記ＬＴＲのＵ３領域に位置する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記レトロウイルスがＨＩＶ−１であり、前記第１のスペーサー配列及び前記第２のスペーサー配列が各々、配列番号９６、配列番号１２１、配列番号８７及び配列番号１１０からなる群から選択される標的プロトスペーサー配列に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記レトロウイルスがＨＩＶ−１であり、前記第１のスペーサー配列及び前記第２のスペーサー配列が、それぞれ、前記標的プロトスペーサー配列の配列番号９６及び配列番号１２１に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記レトロウイルスがＨＩＶ−１であり、前記第１のスペーサー配列及び前記第２のスペーサー配列が各々、それぞれ、前記標的プロトスペーサー配列の配列番号８７及び配列番号１１０に相補的な配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９；ヒト最適化Ｃａｓ９；ニッカーゼ変異Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｍ４９５Ａ；又はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記第１のｇＲＮＡ及び前記第２のｇＲＮＡをコードする単離核酸が、少なくとも１個の発現ベクター中でコードされる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１個の発現ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｇＲＮＡの少なくとも１個が、別々の核酸として発現される、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及び転写活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｇＲＮＡの少なくとも１個が、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む人工融合低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１個の変異をプロウイルスＲＮＡ中で誘導する前記ステップが、少なくとも１個の挿入、少なくとも１個の欠失、少なくとも１個の点変異、又はそれらの組合せを誘導するステップとして更に定義される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１個の変異をプロウイルスＲＮＡ中で誘導する前記ステップが、前記第１の標的プロトスペーサー配列と前記第２の標的プロトスペーサー配列の間に広がるプロウイルスＤＮＡ配列の切り出しを誘導するステップとして更に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞中でＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡを発現する前記ステップが、前記宿主細胞中で前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、前記第１のｇＲＮＡ及び前記第２のｇＲＮＡを安定に発現するステップとして更に定義され、前記方法が、さらに、新しいレトロウイルス感染に対して前記宿主細胞を免役するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
レトロウイルスに潜伏感染した前記宿主細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、単球、消化管関連リンパ球様細胞、小膠細胞又は星状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
レトロウイルスに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡの不活性化に使用するための組成物であって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸、
プロウイルスＤＮＡ中の第１の標的プロトスペーサー配列に相補的である第１のスペーサー配列を有する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列、及び
前記プロウイルスＤＮＡ中の第２の標的プロトスペーサー配列に相補的である第２のスペーサー配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする単離核酸配列
を含み、
前記第１の標的プロトスペーサー配列及び前記第２の標的プロトスペーサー配列が、前記プロウイルスＤＮＡの長末端反復（ＬＴＲ）に位置する、
組成物。
【請求項１８】
前記第１のスペーサー配列及び前記第２のスペーサー配列が各々、配列番号９６、配列番号１２１、配列番号８７及び配列番号１１０からなる群から選択される標的プロトスペーサー配列に相補的な配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第１のスペーサー配列及び前記第２のスペーサー配列が、それぞれ、標的プロトスペーサー配列の配列番号９６及び配列番号１２１に相補的な配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１のスペーサー配列及び前記第２のスペーサー配列が各々、それぞれ、標的プロトスペーサー配列の配列番号８７及び配列番号１１０に相補的な配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９；ヒト最適化Ｃａｓ９；ニッカーゼ変異Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｍ４９５Ａ；及びＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａから選択される、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＭＨ０９３２７１、Ｒ０１ＮＳ０８７９７１及びＰ３０ＭＨ０９２１７７の米国政府支援によって成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００２】
本発明は、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）中の標的配列を特異的に切断する組成物に関する。こうした組成物は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）関連エンドヌクレアーゼとヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ配列とをコードする核酸を含むことができ、ＨＩＶ感染症の対象、又はＨＩＶ感染症に罹患するリスクがある対象に投与することができる。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１の発見から３０年以上もの間、ＡＩＤＳは、世界中で３５３０万人を超える人が発症している主要な公衆衛生問題である。ＡＩＤＳは、ＨＩＶ−１が宿主ゲノムに恒久的に組み込まれるので、治療不能である。ＨＩＶ−１感染を抑制し、ＡＩＤＳの発症を遅らせる現在の療法（高活性抗レトロウイルス療法、すなわちＨＡＡＲＴ（ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ））は、ＨＩＶ−１感染を支援する細胞におけるウイルス複製を著しく減少させ、血漿ウイルス血症を最小レベルに抑制する。しかし、ＨＡＡＲＴは、組織における低レベルのウイルスゲノム発現及び複製を抑制することができず、ＨＩＶ−１の貯蔵器として働く潜伏感染細胞、例えば、休止メモリーＴ細胞、脳マクロファージ、小膠細胞、及び星状細胞、消化管関連リンパ球様細胞を標的にすることができない。持続的なＨＩＶ−１感染は、心疾患、腎疾患、骨減少症及び神経疾患を含めた併存症にも関連する。持続的なウイルス貯蔵器を標的にする治癒力のある治療戦略が引き続き必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で提供するのは、レトロウイルス感染症の治療及び防止に関する組成物及び方法である。レトロウイルスは、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス又はウシ免疫不全ウイルスであり得る。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２であり得る。一実施形態においては、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする配列と１個以上のガイドＲＮＡとを含む核酸配列を含み、ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的である。一部の実施形態においては、核酸は、発現ベクターに含まれる。一実施形態においては、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドと１個以上のガイドＲＮＡとを含み、ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的である。本明細書に開示された核酸、発現ベクター又はポリペプチドを含む医薬組成物も提供する。ヒト免疫不全ウイルス感染症の対象又はリスクがある対象の治療方法も本明細書で提供する。該治療方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１個以上のガイドＲＮＡとをコードするベクターを含む治療有効量の組成物を対象に投与するステップを含み、ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的である。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１個以上のガイドＲＮＡとを含む遺伝子編集複合体をコードする単離核酸を含む組成物に細胞を暴露することによってヒト細胞中のレトロウイルスを不活性化する方法も提供する。ここで、ガイドＲＮＡは、レトロウイルス中の標的核酸配列に相補的である。遺伝子編集複合体は、１つ以上の変異をプロウイルスＤＮＡに導入する。一部の実施形態においては、変異としては、プロウイルスＤＮＡ配列のすべて又は実質的にすべてを含み得る欠失が挙げられる。別の一態様においては、測定量の本明細書に開示された組成物を含むキットも提供する。
【０００５】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付図面及び以下の本文で記述する。本発明の他の特徴、目的及び利点が、本文及び図面並びに特許請求の範囲から明らかになるはずである。
【０００６】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面（単数又は複数）を含むこの特許又は特許出願の複製は、請求次第、かつ必要な手数料の支払い次第、米国特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、及び図１Ｈは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが、ＨＩＶ−１に潜伏感染したＣＨＭＥ５小膠細胞におけるＨＩＶ−１レポーターウイルス産生を抑制することを示す図である。図１Ａによれば、ＥＧＦＰフローサイトメトリーの代表的なゲーティング図は、安定発現Ｃａｓ９＋ＬＴＲ−Ａ又は−Ｂ、ｖｓ．空Ｕ６駆動ｇＲＮＡ発現ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）による、潜伏ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰレポーターウイルスのＴＳＡ誘導再活性化における劇的な減少を示す。図１Ｂによれば、選択されたＬＴＲ−Ａ又は−Ｂ発現安定クローンからのＰＣＲ産物（ＬＴＲ内の−４５３〜＋４３）のＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイは、劇的なインデル変異パターンを示す（矢印）。図１Ｃは、ＬＴＲ  ＡとＢの切断部位（図１Ｄ中の矢じり及び矢印）間の１９０ｂｐ領域の正確な欠失のＰＣＲ断片分析を示し、ＴＡクローニング及び配列決定の結果によって確認される３０６ｂｐ断片（図１Ｃ中の矢印）が残る。図１Ｄは、出現順にそれぞれ配列番号１〜３を示す。図１Ｅは、ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定クローンのサブクローニングが、ＥＧＦＰフローサイトメトリーによって測定されるレポーター再活性化の完全な損失を明らかにすることを示すグラフである。図１Ｆは、基準によって検出されるｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰプロウイルスゲノムの除去を示す。図１Ｇは、ＥＧＦＰ及びＨＩＶ−１  Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ：Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に対するゲノムＤＮＡのリアルタイム（１Ｇ）ＰＣＲ増幅を示し、β−アクチンはＤＮＡ精製及び負荷対照である。図１Ｈによれば、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３／Ｒ／Ｕ５領域（−４１１〜＋１２９）をカバーするＤＮＡ断片を増幅するプライマーを用いたＬＴＲ−Ａ／Ｂサブクローン（＃８、１３）のＰＣＲ遺伝子型同定は、インデル（ａ、欠失；ｃ、挿入）及び「完全」又は組み合わせＬＴＲ（ｂ）を示す。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが、Ｕ１単核球細胞由来の潜伏ＨＩＶ−１ウイルスを効率的に根絶することを示す図である。図２Ａは、染色体Ｘｐ１１．４におけるＨＩＶ−１全ゲノムの切り出しを示す図である。ＨＩＶ−１組み込み部位をＧｅｎｏｍｅ−ＷａｌｋｅｒリンクＰＣＲキットを用いて特定した。左、Ｘ染色体組み込み部位隣接配列を標的にするプライマー対（Ｐ１／Ｐ２）を用いたＰＣＲアンプリコン長さの分析によって、全ＨＩＶ−１ゲノム（９７０９ｂｐ）が除去され、２個の断片（８３３及び６７０ｂｐ）が残ることが明らかになった。図２Ｂは、ＬＴＲ断片（８３３ｂｐ）のＴＡクローニング及び配列決定を示し、宿主ゲノム配列（小文字、２２６ｂｐ）並びに５’−ＬＴＲ（ダッシュ下線部）及び３’−ＬＴＲ（第１下線部）の部分配列（６３４−２７＝６０７ｂｐ）、ＬＴＲ−Ａターゲティング部位（第２下線部）の周りの２７ｂｐ欠失を示す。下、１５個の配列決定されたクローンアンプリコンから特定された２個のインデル対立遺伝子。６７０ｂｐ断片は、宿主配列（２２６ｂｐ）と、ＬＴＲ−Ａ及びＢ標的部位における同時切断による１９０ｂｐ切り出し後の残りのＬＴＲ配列（６３４−１９０＝４４４ｂｐ）とからなる。下線で強調した配列は、ｇＲＮＡ  ＬＴＲ−Ａ標的部位及びＰＡＭを示す。図２Ｂは、出現順にそれぞれ配列番号４〜１３を示す。図２Ｃは、ＨＩＶ−１ゲノムのＬＴＲ−Ａ／Ｂ誘導根絶の機能解析を示し、ＴＳＡ／ＰＭＡ再活性化誘導ｐ２４ビリオン放出の実質的な阻害を示す。Ｕ１細胞にｐＸ２６０−ＬＴＲ−Ａ、−Ｂ又は−Ａ／Ｂを導入した。２週間のピューロマイシン選択後、細胞をＴＳＡ（２５０ｎＭ）／ＰＭＡで２日間処理した後、ｐ２４Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡを行った。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、及び図３Ｄは、Ｃａｓ９＋ＬＴＲ−Ａ／Ｂの安定発現が、ＴＺＭ−ｂｌ細胞において新しいＨＩＶ−１ウイルス感染のワクチンとなることを示す図である。図３Ａによれば、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫組織化学（ＩＣＣ）及びウエスタンブロット（ＷＢ）分析によって、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）で２週間選択されたＴＺＭ−ｂｌ安定クローンにおけるＦｌａｇ−Ｃａｓ９の発現を確認した。図３Ｂによれば、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定クローン（ｃ１〜ｃ７）のＰＣＲ遺伝子型同定は、ＬＴＲ切り出しとＬＴＲルシフェラーゼレポーター活性化の抑制との密接な相関を明らかにした。倍率変化は、対応する非誘導レベルに対するＴＳＡ／ＰＭＡ誘導レベルを表す。図３Ｃによれば、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ発現細胞（ｃ４）は、感染後２日目に、ＥＧＦＰフローサイトメトリーによって測定された表示された感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）及び感染効率で偽型ｐＮＬ４−３−Ｎｅｆ−ＥＧＦＰレンチウイルスに感染した。図３Ｄによれば、位相差／蛍光顕微鏡写真は、ＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定、ただし対照ではない（Ｕ６−ＣＡＧ、黒色）細胞が、ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰ  ＨＩＶ−１レポーターウイルス（灰色）による新しい感染に抵抗性であることを示している（右図）。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ヒトゲノムに対するＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂのオフターゲット効果を示す図である。図４Ａは、ヒトＴＺＭ−ｂｌ及びＵ１細胞における予測／潜在的オフターゲット領域にインデル変異がないことを示すＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイである。ＬＴＲ−Ａオンターゲット領域（Ａ）を正の対照として使用し、空Ｕ６−ＣＡＧベクター（Ｕ６）を負の対照として使用した。図４Ｂは、Ｕ６−ＣＡＧ対照及びＬＴＲ−Ａ／Ｂ試料におけるコールされたインデルの数を示すＬＴＲ−Ａ／Ｂ安定ＴＺＭ−ｂｌサブクローンの全ゲノム配列決定を示す。図４Ｃは、両方の試料におけるｇＲＮＡ標的部位近くの１０個のコールされたインデルについての詳細な情報を示す。図４Ｄは、オフターゲットなコールされたインデルの分布を示す。図４Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号１４〜１５を示す。
【図５】ヒトＴＺＭ−ｂｌ細胞のゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物（−４１１〜−１０）のＴＡクローニング及び配列決定によって特定された組み込みレンチウイルスＬＴＲホタルルシフェラーゼレポーターのＬＴＲ  Ｕ３配列を示す図である。４個のｇＲＮＡ（ＬＴＲ−Ａ〜Ｄ）のプロトスペーサー及びＰＡＭ（ＮＧＧ）配列、並びに示した転写因子の予測結合部位を強調表示した。正確な切断部位にハサミの印を付けた。＋１は、転写開始点を示す。図５は、配列番号１６を示す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃは、ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄが、ＣＨＭＥ５小膠細胞における潜伏ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰウイルスのＴＳＡ誘導再活性化を著しく抑制することを示す図である。図６Ａは、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ、Ｖｐｕ及びＮｅｆとレポーター遺伝子ｄ２ＥＧＦＰを含むｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰベクターを模式的に示す図である。図６Ｂは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ｃ導入細胞ではなくＣａｓ９／ＬＴＲ−Ｄ導入細胞のオンターゲットＬＴＲゲノムにおけるインデル変異を示すＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示す。図６Ｃは、空Ｕ６駆動ｇＲＮＡ発現ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）に比べてＣａｓ９／ＬＴＲ−Ｃ又はＬＴＲ−Ｄの安定な発現によって潜伏ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰレポーターウイルスのＴＳＡ誘導再活性化が劇的に減少することを示すＥＧＦＰフローサイトメトリーの代表的なゲーティング図を示す。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ、図７Ｆは、ＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄの両方が、ＨＩＶ−１  ＬＴＲホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に取り込んだＴＺＭ−ｂｌ細胞において、インデル変異を誘導し、恒常的なＴＳＡ／ＰＭＡ誘導ルシフェラーゼ活性を有意に減少させたことを示す図である。図７Ａは、ＬＴＲ−Ｃ、ＬＴＲ−Ｄ又は両方によるＬＴＲ再活性化の有意な減少を示す機能的ルシフェラーゼレポーターアッセイを示す。図７Ｂは、ＬＴＲ−Ｃ及びＬＴＲ−Ｄによって誘導されるＬＴＲ  ＤＮＡ（−４５３〜＋４３）中のインデル変異を示すＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを示す（上の矢印）。ＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄの組合せは、ＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄの間の３０２ｂｐ領域の欠失に起因する１９４ｂｐ断片を生成する（下の矢印）。図７Ｃは、ＬＴＲ−Ｃのインデル効率２３％及びＬＴＲ−Ｄのインデル効率１３％を証明する３０個のクローンのサンガー法、並びに挿入／欠失を示す例示的クロマトグラムを示す。図７Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号１７〜２５を示す。図７Ｄは、ＬＴＲ−Ｃのインデル効率２３％及びＬＴＲ−Ｄのインデル効率１３％を証明する３０個のクローンのサンガー法、並びに挿入／欠失を示す例示的クロマトグラムを示す。図７Ｄは、出現順にそれぞれ配列番号２６〜３０を示す。図７Ｅは、Ｕ６−ＣＡＧ対照試料における２個の主要なバンド（９６ｂｐ及び２７０ｂｐ）、９６／１０２部位におけるＬＴＲ−Ｃ誘導インデル変異後の追加の３７２ｂｐバンド（上の矢印）、３７２部位におけるＬＴＲ−Ｄ誘導変異後の２９０ｂｐバンド（中央の矢印）、及びＬＴＲ−Ｃ／Ｄ誘導切り出し後の１８０ｂｐ断片（下の矢印）を示す、ＬＴＲの−４５３〜＋４３をカバーするＰＣＲ産物の５部位（９６、１０２、３７２、３８６、４８２）を切断するＢｓａＪ  Ｉを用いたＰＣＲ制限断片長多型（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を示す。図７Ｆは、ＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄの間の３０２ｂｐ断片の欠失（上）、及び追加の１７ｂｐ欠失（下）を示すクロマトグラムを示す。赤い矢印は、接合部位を示す。＊Ｐ＜０．０５は、Ｕ６−ＣＡＧ対照に比べて、ＬＴＲ−Ｃ又はＬＴＲ−Ｄ媒介性ルシフェラーゼ活性化の有意な減少を示す。図７Ｆは、出現順にそれぞれ配列番号３１〜３２を示す。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃは、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３／Ｒ／Ｕ５領域（−４１１〜＋１２９）をカバーするプライマーを用いた、ＬＴＲ−Ａ／ＢのＣＨＭＥ５サブクローン及び空Ｕ６−ＣＡＧ対照からのＰＣＲ産物のＴＡクローニング及びサンガー法を示す図である。図８Ａは、示した潜在的断片ａ〜ｃを生成する５’−ＬＴＲと３’−ＬＴＲの両方の上のＬＴＲ−Ａ切断とＬＴＲ−Ｂ切断の可能な組合せを示す。図８Ｂは、ＬＴＲ−Ａ切断部位とＬＴＲ−Ｂ切断部位の間の１９０ｂｐ欠失を示す断片ａ（３５１ｂｐ）のブラストを示す。図８Ｃは、ＬＴＲ−Ａ切断部位における１７５ｂｐ挿入、及びＬＴＲ−Ｂ切断部位における２７ｂｐ欠失を示す断片ｃ（６８２ｂｐ）のブラストを示す。図８Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号３３〜３４を示す。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、及び図９Ｄは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが、Ｕ１単核球細胞由来の潜伏ＨＩＶ−１ウイルスを効率的に根絶することを示す図である。図９Ａによれば、第２染色体組み込み部位隣接配列（小文字、４６７ｂｐ）を標的にするプライマー対（Ｔ４９２／Ｔ４９３）を用いた長距離ＰＣＲからの１．１ｋｂ断片のサンガー法によって、全ＨＩＶ−１ゲノム（９７０９ｂｐ）が除去されて、５’−ＬＴＲ（ダッシュ下線部）及び３’−ＬＴＲとＰＡＭ（ＴＧＧ）ＬＴＲ−Ａターゲティング部位（下線部）から正確に３番目のヌクレオチドにおける６ｂｐ挿入（枠内）及び４ｂｐ欠失（ｎｎｎｎ）の組み合わせが残ることが明らかになった。図９Ａは、配列番号３５を示す。図９Ｂは、ＨＩＶ−１ゲノムの特異的根絶を示す代表的なＤＮＡゲル図である。ＮＳ、非特異的バンド。図９Ｃ及び図９Ｄは、Ｇａｇ遺伝子を標的にするプライマー対（Ｔ４５７／Ｔ４５８）を用いた定量的ＰＣＲ分析が、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ発現Ｕ１細胞において全ＨＩＶ−１ゲノム根絶の効率８５％であることを示すグラフである。Ｕ１細胞にｐＸ２６０空ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）又はＬＴＲ−Ａ／Ｂコードベクターを導入した。２週間のピューロマイシン選択後、添加されたｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰヒトゲノムＤＮＡを標準として用いた絶対的定量的ｑＰＣＲ分析に細胞ゲノムＤＮＡを使用した。＊＊Ｐ＜０．０１は、Ｕ６−ＣＡＧ対照に比べて有意な減少を示す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１０Ｃは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ  ｇＲＮＡが、Ｊ−Ｌａｔ潜伏感染Ｔ細胞においてＨＩＶ−１プロウイルスを効果的に根絶することを示す図である。図１０Ａによれば、ＥＧＦＰフローサイトメトリーによる機能解析によって、ＥＧＦＰレポーターウイルスのＰＭＡ及びＴＮＦα誘導再活性化の約５０％の減少が明らかになった。図１０Ｂは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ導入細胞のオンターゲットＬＴＲゲノムにおけるインデル変異（矢印）を示すＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイである。Ｊ−Ｌａｔ細胞にｐＸ２６０空ベクター又はＬＴＲ−Ａ及び−Ｂを導入した。２週間のピューロマイシン選択後、細胞をＰＭＡ又はＴＮＦαで２４時間処理した。ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３／Ｒ／Ｕ５領域（−４１１〜＋１２９）をカバーするプライマーを用いたＰＣＲにゲノムＤＮＡを供し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを行った。＊＊Ｐ＜０．０１は、Ｕ６−ＣＡＧ対照に比べて有意な減少を示す。図１０Ｃによれば、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ（−３７４〜＋４３）をカバーするプライマーを用いたＰＣＲ断片分析は、２２７ｂｐ断片（矢印）が残る、ＬＴＲ  Ａ切断部位とＬＴＲ  Ｂ切断部位の間の１９０ｂｐ領域の正確な欠失を示す。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンは、ＤＮＡ精製及び負荷対照として役立つ。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、及び図１１Ｄは、ゲノム編集効率がＣａｓ９及びｇＲＮＡの存在に依存することを示す図である。図１１Ａによれば、ＰＣＲ遺伝子型同定によって、Ｕ６駆動ＬＴＲ−Ａ又はＬＴＲ−Ｂ発現カセットの欠如が明らかになった。図１１Ｂは、ゲノム編集の徴候のない、ピューロマイシン選択ＴＺＭ−ｂｌサブクローンにおけるＣＭＶ駆動Ｃａｓ９ＤＮＡの欠如／減少を示す。示したサブクローン由来のゲノムＤＮＡを、Ｕ６プロモーター（Ｔ３５１）及びＬＴＲ−Ａ（Ｔ３５４）又は−Ｂ（Ｔ３５６）をカバーしＣａｓ９（Ｔ４７７／Ｔ４９１）を標的にするプライマー対を用いた従来の（図１１Ａ）又はリアルタイム（図１１Ｂ）ＰＣＲ分析に供した。図１１Ｃ及び図１１Ｄは、Ｃａｓ９タンパク質発現が、無効なＴＺＭ−ｂｌサブクローンでは欠如していることを示す。図１１Ｃによれば、Ｆｌａｇ標識Ｃａｓ９融合タンパク質が、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット（ＷＢ）及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって検出された。Ｆｌａｇ−Ｃａｓ９を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系をＷＢの正の対照として使用した。ＧＡＰＤＨは、タンパク質負荷対照として役立つ。クローンｃ６は、Ｃａｓ９ＤＮＡを含むが、Ｃａｓ９タンパク質発現を含まず、ピューロマイシン選択後のエピジェネティック抑制の潜在的機序を示唆している。クローンｃ５及びｃ３は、切断型Ｆｌａｇ−Ｃａｓ９（ｔＣａｓ９）であり得る。図１１Ｄによれば、核はヘキスト３３２５８で染色された。
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、及び図１２Ｄは、ＴＺＭ−ｂｌ細胞におけるＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡの安定な発現が、偽型又は天然ＨＩＶ−１ウイルスのワクチンとなることを示す図である。図１２によれば、フローサイトメトリーは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ発現ＴＺＭ−ｂｌサブクローンにおける天然ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰレポーターウイルス感染効率の有意な減少を示した。リアルタイムＰＣＲ分析によって、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡによる、図１２Ｂに示すウイルスＲＮＡの抑制又は除去が明らかになった。リアルタイムＰＣＲ分析によって、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡによる、図１２Ｃに示すＤＮＡの抑制又は除去が明らかになった。図１２Ｄによれば、ホタルルシフェラーゼ発光アッセイは、ウイルス感染によって刺激されるＬＴＲプロモーター活性のＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡによる劇的な阻害を示した。安定Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡ発現ＴＺＭ−ｂｌ細胞を、示した天然ＨＩＶ−１ウイルスに２時間感染させ、ＰＢＳで２回洗浄した。感染後２日目に、細胞を収集し、固定し、フローサイトメトリーでＥＧＦＰ発現を分析し（図１２Ａ）、又は全ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ｑＰＣＲ（図１２Ｂ）、ｑＰＣＲのためのゲノムＤＮＡ精製（図１２Ｃ）並びに発光測定（図１２Ｄ）のために溶解した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１は、Ｕ６−ＣＡＧ対照に比べて有意な減少を示す。
【図１３】予測ＬＴＲ  ｇＲＮＡ及びそれらのオフターゲット数（１００％一致）を示す図である。ｐＨＲ’−ＣＭＶ−ＬａｃＺレンチウイルスベクター（ＡＦ１０５２２９）の５’−ＬＴＲセンス及びアンチセンス配列（それぞれ配列番号７９〜１１１及び１１２〜１４１）（６３４ｂｐ）を利用して、２０ｂｐガイド配列（プロトスペーサー）＋プロトスペーサー隣接モチーフ配列（ＮＧＧ）を含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的部位をＪａｃｋ  ＬｉｎのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇＲＮＡファインダーツール（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｏｔ．ｃｏｌｏｒａｄｏ．ｅｄｕ／〜ｓｌｉｎ／ｃａｓ９．ｈｔｍｌ）を用いて検索した。各ｇＲＮＡ＋ＮＧＧ（ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧ、ＣＧＧ）を、利用可能なヒトゲノム及び転写物配列に対してブラストし、１０００個の整列配列を表示した。Ｃｏｎｔｒｏｌ＋Ｆを押した後、標的配列（１〜２３から９〜２３ヌクレオチド）をコピー／ペーストし、１００％一致のゲノム標的の数を見つける。ゲノムライブラリの繰り返しのために、各検索のオフターゲット数を３で割る。示した数は、４つの検索（ＮＧＧ）の合計を示す。最上部の数（例えば、ｇＲＮＡ配列（センス）の場合：２０、１９、１９、１７、１６、１５、１４、１３、１２）は、ＮＧＧから最も遠いｇＲＮＡ標的配列を示す。選択されたＬＴＲ−Ａ／Ｂ及びＬＴＲ−Ｃ／Ｄの配列及びオフターゲット数をそれぞれ赤及び緑で強調する。
【図１４−１】ｇＲＮＡターゲティング部位のオリゴヌクレオチド、並びにＰＣＲ及び配列決定に用いたプライマー（出現順にそれぞれ配列番号３６〜７８）を示す図である。
【図１４−２】ｇＲＮＡターゲティング部位のオリゴヌクレオチド、並びにＰＣＲ及び配列決定に用いたプライマー（出現順にそれぞれ配列番号３６〜７８）を示す図である。
【図１５−１】ＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの予測ｇＲＮＡターゲティング部位の場所を示し、すべて出現順にそれぞれ、「問合せ配列」配列を配列番号１４２〜２５２として示し、「参照配列」配列を配列番号２５３〜３６３として示す。
【図１５−２】ＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの予測ｇＲＮＡターゲティング部位の場所を示し、すべて出現順にそれぞれ、「問合せ配列」配列を配列番号１４２〜２５２として示し、「参照配列」配列を配列番号２５３〜３６３として示す。
【図１５−３】ＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの予測ｇＲＮＡターゲティング部位の場所を示し、すべて出現順にそれぞれ、「問合せ配列」配列を配列番号１４２〜２５２として示し、「参照配列」配列を配列番号２５３〜３６３として示す。
【図１５−４】ＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの予測ｇＲＮＡターゲティング部位の場所を示し、すべて出現順にそれぞれ、「問合せ配列」配列を配列番号１４２〜２５２として示し、「参照配列」配列を配列番号２５３〜３６３として示す。
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ、及び図１６Ｈは、ＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄの両方が、ＨＩＶ−１  ＬＴＲホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定に取り込んだＴＺＭＢｌ細胞において恒常的なＴＳＡ／ＰＭＡ誘導ルシフェラーゼ活性を減少させ、組合せが、正確なゲノム切り出しを誘導したことを示す図である。図１６Ａによれば、６個のｇＲＮＡ標的がＨＩＶ−ＬＴＲのプロモーター領域に対して設計された。図１６Ａは、配列番号１６を示す。ＴＺＭＢｌ細胞に、Ｃａｓ９−ＥＧＦＰとキメラｇＲＮＡ発現カセット（ＰＣＲ産物）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００によって同時導入した。図１６Ｂは、３日後に、ＥＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳによって選別し、１グループ当たり２０００個の細胞をルシフェラーゼアッセイ用に収集したことを示すグラフである。図１６Ｂは、配列番号３１を示す。図１６Ｃは、集団選別細胞を２日間培養し、ルシフェラーゼアッセイ前にＴＳＡ／ＰＭＡを用いて１日処理したことを示すグラフである。単細胞を９６ウェルプレートに選別し、ＴＳＡ／ＰＭＡの非存在下で１日、ルシフェラーゼアッセイのためにコンフルエントまで培養した（図１６Ｄのグラフに示す）。単細胞を９６ウェルプレートに選別し、ＴＳＡ／ＰＭＡの存在下で１日、ルシフェラーゼアッセイのためにコンフルエントまで培養した（図１Ｅのグラフに示す）。図１６Ｆおよび図１６Ｇによれば、集団選別細胞からのＰＣＲ産物を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイ及びＢｓａｊＩを用いた制限断片長多型（図１６Ｇ）によって分析し、変異（図１６Ｆ）又は非切断（図１６Ｇ）バンド（赤矢印）を示した。予測されたＬＴＲ−ＣとＬＴＲ−Ｄの間の３２１ｂｐ領域（図１６Ａ、赤矢じり）の欠失に起因する２００ｂｐ断片（図１６Ｆ、図１６Ｇ、黒矢印）が、ＴＡクローニング及び配列決定によって確認され、正確なゲノムの切り出しを示した（図１６Ｈ）。個々のＬＴＲ−Ｃ及び−ＤからのＰＣＲ産物のサンガー法によって、それぞれ％及び％インデル変異効率を特定した。＊ｐ＜０．０５は、対応するＵ６−ＣＡＧ対照に比べて、スチューデントのｔ検定による統計的に有意な減少を示す。プロトスペース（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅ）（Ｅ）、プロトスペース（Ｃ）、プロトスペース（Ａ）、プロトスペース（Ｂ）、プロトスペース（Ｄ）及びプロトスペース（Ｆ）は、出現順にそれぞれ配列番号３６５、３６７、３６９、３７１、３７３及び３７５に対応する。
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｅ、図１７Ｆ、図１７Ｇ、及び図１７Ｈは、Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡが、ＨＩＶ−１潜伏感染ＣＨＭＥ５小膠細胞系において、ＥＧＦＰフローサイトメトリーによって測定されるＨＩＶ−１ウイルスの恒常的な誘導性の産生を阻害したことを示す図である。Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ、Ｖｐｕ及びＮｅｆと報告された遺伝子ｄ２ＥＧＦＰを含むｐＨＲ’レンチウイルスベクターを、ヒト胎児小膠細胞系ＣＨＭＥ５に導入し、３’−ＬＴＲのＵ３領域における４００ｂｐ欠失を図示する（図１７Ａに示す）。図１７Ｂは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ヒトＨＩＶ−１  ＬＴＲ−Ａ、Ｂ単独又は組合せの一過性導入が、ＬＴＲプロモーター活性の抑制のために、ＥＧＦＰの強度を減少させたが、その割合を減少させなかったことを示すグラフである。図１７Ｃは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ヒトＨＩＶ−１  ＬＴＲ−Ｃ、Ｄ単独又は組合せの一過性導入が、ＬＴＲプロモーター活性の抑制のために、ＥＧＦＰの強度を減少させたが、その割合を減少させなかったことを示すグラフである。図１７Ｄ及び図１８は、１〜２週間の抗生物質選択後に、ＥＧＦＰ細胞の割合も減少したことを示すグラフである。図１７Ｆ及び図１７Ｇによれば、安定な選択クローンからのＰＣＲ産物がＳｕｒｖｅｙｏｒ  Ｃｅｌ−Ｉヌクレアーゼアッセイによって分析され、ＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂではインデル変異が劇的であるが、ＬＴＲ−Ａ／Ｂの組合せでは弱いことを示した（赤矢印）。予測されたＬＴＲ−ＡとＬＴＲ−Ｂとの間の１９０ｂｐ領域（図１７Ｈ、赤矢じり）の欠失に起因する３３１ｂｐ断片（図１７Ｆ及び図１７Ｇ、黒矢印で示す）が、ＴＡクローニング及び配列決定によって確認され、正確なゲノムの切り出しを示した（図１７Ｈ）。図１７Ｈは、出現順にそれぞれ配列番号１〜３を示す。
【図１８】代表的なＨＩＶ−１配列のＬＴＲ（配列番号３７６）を示す図である。Ｕ３領域はヌクレオチド１〜ヌクレオチド４３２（配列番号３７７）に広がり、Ｒ領域はヌクレオチド４３２〜ヌクレオチド５５９（配列番号３７８）に広がり、Ｕ５領域は５６０〜ヌクレオチド６３４（配列番号３７９）に広がる。
【図１９】代表的なＳＩＶ配列のＬＴＲ（配列番号３８０）を示す図である。Ｕ３領域はヌクレオチド１〜ヌクレオチド５１７（配列番号３８１）に広がり、Ｒ領域はヌクレオチド５１８〜ヌクレオチド６９３（配列番号３８２）に広がり、Ｕ５領域は６９４〜ヌクレオチド８１８（配列番号３８３）に広がる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、本発明者らが単一及び多重構成のＲＮＡ誘導型のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系（Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）を用いることによって、組み込みＨＩＶ−１ゲノムをＨＩＶ−１感染細胞から除去することができるという本発明者らの発見に部分的に基づく。本発明者らは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡによって効率的に編集され、潜伏感染小膠細胞、前単球細胞及びＴ細胞におけるウイルス遺伝子発現及び複製を不活性化する、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３領域内の極めて特異的な標的を特定した。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡは、宿主細胞に対して遺伝毒性もオフターゲット編集も生じず、その５’−ＬＴＲから３’−ＬＴＲに及ぶ組み込みプロウイルスＤＮＡの９７０９ｂｐ断片を完全に切り出した。さらに、Ｃａｓ９発現細胞内の多重ｇＲＮＡの存在は、ＨＩＶ−１感染を防止した。本発明者らの結果は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを操作して、ＡＩＤＳに対する特異的で有効な予防及び治療手法を提供できることを示唆している。
【０００９】
したがって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとレトロウイルス、例えばＨＩＶ中の標的配列に相補的であるガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む組成物、及びＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとＨＩＶ中の標的配列に相補的であるガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む医薬製剤を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドとＨＩＶ中の標的配列に相補的であるガイドＲＮＡとを含む組成物、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドとＨＩＶ中の標的配列に相補的であるガイドＲＮＡとを含む医薬製剤も特徴とする。
【００１０】
レトロウイルス感染症、例えば、ＨＩＶ感染症を治療する組成物を投与する方法、ウイルス複製をなくす方法、及びＨＩＶ感染を防止する方法も特徴とする。本明細書に記載の治療方法は、別の抗レトロウイルス療法（例えば、ＨＡＡＲＴ）に関連して行うことができる。
【００１１】
ＨＩＶ感染症の臨床経過は、対象の遺伝的背景、年齢、全般的健康状態、栄養、受ける治療、及びＨＩＶサブタイプを含めて、幾つかの要因に応じて変わり得る。一般に、大部分の個体は、感染の数週間又は数か月以内にインフルエンザ様症状を発する。症状としては、発熱、頭痛、筋痛、発疹、悪寒、咽頭炎、口腔内潰瘍又は陰部潰瘍、リンパ腺腫大、関節痛、寝汗、下痢などが挙げられる。症状の強度は、個体によって軽度から重度まで変わり得る。急性期中、ＨＩＶウイルス粒子は、適切なＣＤ４受容体分子を発現する細胞に誘引され、該細胞に入る。ウイルスが宿主細胞に入ると、ＨＩＶによってコードされた逆転写酵素が、ＨＩＶ  ＲＮＡのプロウイルスＤＮＡコピーを生成し、プロウイルスＤＮＡが宿主細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれる。宿主細胞によって複製されるのはこのＨＩＶプロウイルスであり、その結果、新しいＨＩＶビリオンが放出され、次いで別の細胞に感染し得る。本発明の方法及び組成物は、組み込みＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切り出しに全般的に様々に有用であるが、本発明は、そのように限定されず、組成物は、対象に任意の感染段階で投与することができ、又はＨＩＶ感染のリスクがある非感染対象に投与することができる。
【００１２】
初期ＨＩＶ感染は、数週間から数か月で沈静化し、その後、一般に、最高１０年持続し得る長い臨床「潜伏」期間が続く。潜伏期は、無症候性ＨＩＶ感染又は慢性ＨＩＶ感染とも称される。対象のＣＤ４リンパ球数は、回復するが、感染前レベルではなく、感染の２〜４週間以内に、大部分の対象は抗体陽転を起こし、すなわち、その血液中に検出可能なレベルの抗ＨＩＶ抗体を有する。この潜伏期中、末梢血単核球における検出可能なウイルス複製がなく、末梢血中に培養可能なウイルスがほとんど又は全くない可能性がある。臨床潜伏期とも称される潜伏期中、ＨＩＶ感染者は、ＨＩＶ関連症状がない場合もあり、軽度の症状しかない場合もある。しかし、ＨＩＶウイルスは、極低レベルで再生し続ける。抗レトロウイルス療法で処置された対象では、この潜伏期が数十年以上にわたる場合もある。しかし、この期の対象は、抗レトロウイルス療法を受けている場合でも、依然としてＨＩＶを他の対象に伝染する可能性がある。ただし、抗レトロウイルス療法は、伝染のリスクを低下させはする。上述したように、抗レトロウイルス療法は、低レベルのウイルスゲノム発現を抑制せず、休止メモリーＴ細胞、脳マクロファージ、小膠細胞、星状細胞、消化管関連リンパ球様細胞などの潜伏感染細胞を効率的に標的にすることもない。
【００１３】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の臨床徴候及び症状は、ＣＤ４リンパ球数減少として現れ、不可逆的損傷を免疫系にもたらす。多くの患者は、例えば、結核、サルモネラ症、サイトメガロウイルス、カンジダ症、クリプトコッカス髄膜炎、トキソプラズマ症、クリプトスポリジウム症などの日和見感染、並びに例えばカポジ肉腫及びリンパ腫を含めたある種の癌、並びに消耗性症候群、神経合併症及びＨＩＶ関連腎症を含めて、ＡＩＤＳ関連合併症も呈する。
【００１４】
組成物
本発明の組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９と、レトロウイルス、例えばＨＩＶ中の標的配列に相補的であるガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む。細菌においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝要素（ウイルス、転移因子及び接合性プラスミド）に対するＲＮＡ誘導型適応免疫系をコードする。３タイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が確認されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、先行する可動要素に相補的な配列であるスペーサーを含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写され、処理されて、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に属し、標的ＤＮＡを切断する強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、（スペーサーと称する）独特の標的配列の約２０塩基対（ｂｐ：ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）を含む成熟ｃｒＲＮＡ、及びプレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ支援プロセシング用ガイドとして働く転写活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によってガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の（プロトスペーサーと称する）相補配列との間の相補的塩基対合によって、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）を認識して、切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現することができ、又は天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するように合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工融合低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）中に操作することができる。ｓｈＲＮＡのようなこうしたｓｇＲＮＡは、合成することができ、又は直接ＲＮＡ導入のためにインビトロで転写することができ、又はＵ６若しくはＨ１促進ＲＮＡ発現ベクターから発現することができる。ただし、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現される系よりも低い。
【００１５】
本発明の組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含むことができる。一部の実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとすることができる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る。一部の実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、別の種、例えば、サーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの別のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、緑膿菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、又は別の配列決定された細菌ゲノム及び古細菌、又は別の原核微生物由来の配列とすることができる。あるいは、野生型化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列を改変することができる。核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的発現に対して最適化された、すなわち「ヒト化」コドンとすることができる。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７、ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１、又はＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５に記載された発現ベクターのいずれかによってコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列とすることができる。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（ケンブリッジ、ＭＡ）製ＰＸ３３０、ＰＸ２６０などの市販ベクターに含まれる配列とすることができる。一部の実施形態においては、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７、ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１、若しくはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列、又はＰＸ３３０若しくはＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ、ケンブリッジ、ＭＡ）のＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかの変異体又は断片であるアミノ酸配列を有することができる。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物活性変異体をコードするように修飾することができ、これらの変異体は、例えば、１つ以上の変異（例えば、付加、欠失若しくは置換変異又はこうした変異の組合せ）を含むことによって、野生型Ｃａｓ９とは異なるアミノ酸配列を有する、又は含むことができる。１つ以上の置換変異は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）とすることができる。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物活性変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも又は約５０％の配列相同性（例えば、少なくとも又は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％配列相同性）を有するアミノ酸配列を有することができる。保存的アミノ酸置換としては、一般に、以下の群内の置換が挙げられる：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン；リジン、ヒスチジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。Ｃａｓ９アミノ酸配列におけるアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基とすることができる。天然アミノ酸残基としては、遺伝コードによって天然にコードされるもの、及び非標準アミノ酸（例えば、Ｌ配置の代わりにＤ配置を有するアミノ酸）が挙げられる。本発明のペプチドは、標準残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基を含むこともできる（例えば、ピロールリジンをリジンの代わりに使用することができ、セレノシステインをシステインの代わりに使用することができる）。非天然アミノ酸残基は、天然に見られないが、アミノ酸の基本式に適合し、ペプチドに組み込むことができるものである。これらとしては、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸及びＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸が挙げられる。別の例については、教科書やワールドワイドウェブを調べることができる（あるサイトは、現在、カリフォルニア工科大学によって維持され、機能タンパク質に組み込むことに成功した非天然アミノ酸の構造を掲載している）。
【００１６】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、変異配列とすることができる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する保存ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインにおいて変異させることができる。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異によって、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）は、ＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡに切れ目を入れて、一本鎖切断することができ、ＨＤＲによる後続の優先的な修復によって、オフターゲット二本鎖切断からの不要なインデル変異の頻度を潜在的に減少させることができる。
【００１７】
前述の野生型及び変異Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに加えて、本発明は、オフターゲット切断を劇的に減少させる「高特異性」化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体（ｅＳｐＣａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲ系も包含する。これらの変異体は、アラニン置換によって操作されて、ＤＮＡの非標的鎖と相互作用する溝における正電荷部位を中和する。この修飾は、Ｃａｓ９と非標的鎖の相互作用を弱め、それによって標的鎖と非標的鎖の再ハイブリダイゼーションを促進する。この修飾の効果は、切断が、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖のより厳密なワトソン−クリック対形成を必要とし、したがってオフターゲット切断を制限するということである（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、２０１５）。
【００１８】
本発明は、別のタイプの高特異性Ｃａｓ９変異体である、Ｊｏｕｎｇ及び同僚によって開示された原理に従って設計された「高忠実度」ｓｐＣａｓ９変異体（ＨＦ−Ｃａｓ９）も含む（その全体を本明細書に援用するＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、２０１６）。ＨＦ−Ｃａｓ９変異体の一部は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（２００９）によって開示された。本発明は、ウイルスＤＮＡを不活性化し、ウイルス感染を除去する目的で、これらの変異体を初めて利用するものである。本発明は、これまで開示されなかったＨＦ−Ｃａｓ９変異体も含む。
【００１９】
Ｃａｓ９と標的ＤＮＡのｇＲＮＡ媒介性複合体は、水素結合及び疎水性塩基スタッキングを含めて、Ｃａｓ９と標的ＤＮＡの多数の接触を含む。本発明のＨＦ−Ｃａｓ９変異体は、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断のために複合体を安定化するのに必要なエネルギーよりも高いエネルギーをこれらの接触が有するという概念から生まれる。これによって、ミスマッチがｇＲＮＡとその標的配列の結合を部分的に妨げるときでも、安定な複合体を形成することができる。ＨＦ−Ｃａｓ９変異体は、Ｃａｓ９と標的ＤＮＡの接触の一部を撹乱するアミノ酸置換を含む。撹乱は、安定な複合体がｇＲＮＡとその標的配列の完全又はほぼ完全な一致からのみ得られるという点まで、接触エネルギーを減少させる。
【００２０】
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらによって開示されたＨＦ−Ｃａｓ９変異体の１種は、４つのアラニン置換、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａを含む。これらの置換はすべて残基と塩基の水素結合を弱め、Ｎ４９７Ａは、ペプチド骨格を介した水素結合にも影響を及ぼす。この変異体は、培養ヒト骨肉腫細胞を用いた実験において、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット切断活性を有することが判明したが、計画的ミスマッチ部位におけるオフターゲット切断を著しく減少させた。この変異体は、本発明においては、変異体１（表１のＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａとして含まれる。３種の追加の変異体を試験した。それらはすべて、ｓｐＣａｓ９−ＨＦ−１の上記４つの置換Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａを含み、さらに、第５の置換Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ又はＹ４５０Ａを含んだ。追加の置換は、塩基対スタッキングに関与するアミノ酸のすべてであった。これらの変異体は、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット活性を示し、オフターゲット切断は、変異体１で認められたレベルよりもさらに低いレベルに減少した。本発明は、抗ウイルスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関連してこれらの変異体を含む。表１においては、これらを変異体２（ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ）、変異体３（ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ）及び変異体４（ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ）と称する。
【００２１】
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらは、変異体１の置換の３つ、すなわちＲ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａのみを含む変異体も開示した。この変異体は、野生型Ｃａｓ９に見られるものに匹敵するオンターゲット切断を生じたが、オフターゲット効果については試験されなかった。オフターゲット効果を抑制すると予測されるので、この３置換変異体は、表１の変異体１３（ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ）として本発明に含まれる。
【００２２】
本発明は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらによって開示されていないＣａｓ９変異体も含む。これらの変異体はすべて、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット活性を有し、野生型Ｃａｓ９に比べてオフターゲット活性が低下すると予測される。
【００２３】
以前に開示されていない変異体の３種１４、１５及び１６は、第４の置換を変異体１３に追加したものである。変異体１４は、Ｄ１１３Ｅ置換を含み、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅと命名される。変異体１５は、Ｌ１６９Ａ置換を含み、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａと命名される。Ｌ１６９Ａ変異は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。変異体１６は、Ｙ４５０Ａ置換を含み、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａと命名される。Ｙ５４０Ａ置換は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。
【００２４】
２種の変異体５及び１７は、置換Ｍ４９５Ａをそれぞれ変異体１及び１３に追加したものである。したがって、変異体５はＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ４９５Ａと命名され、変異体１７はＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ４９５Ａと命名される。Ｍ４９５Ａ置換は、残基塩基水素結合、及びペプチド骨格を介した水素結合に影響を及ぼす。
【００２５】
２種の変異体６及び１８は、置換Ｍ６９５Ａをそれぞれ変異体１及び１３に追加したものである。したがって、変異体６はＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ６９５Ａと命名され、変異体１８はＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ６９４Ａと命名される。Ｍ６９４Ａ置換は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。
【００２６】
２種の変異体７及び１９は、置換Ｈ６９８Ａをそれぞれ変異体１及び１３に追加したものである。したがって、変異体７はＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａと命名され、変異体１９はＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａと命名される。Ｈ６９８Ａ置換は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。
【００２７】
５種の変異体８〜１２は、第６の置換を５置換変異体２に追加したものである。追加された置換は、それぞれ、Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａ及びＭ６９８Ａである。したがって、変異体８は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａと命名され、変異体９は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａと命名され、変異体１０は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４９５Ａと命名され、変異体１１は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａと命名され、変異体１２は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａと命名される。
【００２８】
４種の変異体２０〜２３は、第５の置換を４置換変異体１３に追加したものである。追加された置換は、それぞれ、Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｍ４９５Ａ及びＭ６９４Ａである。したがって、変異体２０は、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａと命名され、変異体２１は、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａと命名され、変異体２２は、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａと命名され、変異体２３は、ＳｐＣａｓ９Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａと命名される。
【００２９】
【表１】
2019506156.tif 000003
【００３０】
表１に示した変異体は、それ自体、更なるアミノ酸置換、及びそれらの機能を更に変更する別の変異を含み得ることを理解されたい。例えば、Ｃａｓ９配列は、ＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡに切れ目を入れて、一本鎖切断する「ニッカーゼ」として挙動するように変異させることができる。Ｃａｓ９においては、ニッカーゼ活性は、鎖特異的切断に関与する保存ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインにおける変異によって得られる。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異によって、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）は、ＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡに切れ目を入れて、一本鎖切断することができる（Ｓａｎｄｅｒ及びＪｏｕｎｇ、２０１４）。ＨＦ−Ｃａｓ９のいずれか又はすべての核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的発現に対して最適化された、すなわち「ヒト化」コドンとすることができる。
【００３１】
一部の実施形態においては、本発明の組成物は、上記核酸配列のいずれかによってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドを含むことができる。「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で区別なく使用されるが、一般に、それらは、様々なサイズのペプチド配列を指す。本発明者らは、本発明のアミノ酸組成物を「ポリペプチド」と呼び、それらがアミノ酸残基の線状ポリマーであることを示し、それらを完全長タンパク質から区別する助けとする場合もある。本発明のポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの断片を「構成する」又は「含む」ことができ、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物活性変異体を構成する又は含むポリペプチドを包含する。ポリペプチドは、したがって、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（又はその生物活性変異体）の断片のみを含むことができるが、追加の残基も含むことができることを理解されたい。生物活性変異体は、標的ＤＮＡを切断する十分な活性を保持する。
【００３２】
アミノ酸残基間の結合は、従来のペプチド結合又は別の共有結合（エステル、エーテル結合など）とすることができ、ポリペプチドは、アミド化、リン酸化又はグリコシル化によって修飾することができる。修飾は、ポリペプチド骨格及び／又は１個以上の側鎖に影響を及ぼし得る。化学的修飾は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳後に生体内でなされる天然の修飾（例えば、細菌宿主におけるグリコシル化）とすることができ、又はインビトロでなされる合成修飾とすることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物活性変異体は、天然修飾（すなわち、生体内で自然になされる）と合成修飾（すなわち、インビトロでなされる天然又は非天然修飾）の任意の組合せに起因する１つ以上の構造上の修飾を含むことができる。修飾の例としては、アミド化（例えば、Ｃ末端の遊離カルボキシル基のアミノ基による交換）、ビオチン化（例えば、リジン又は別の反応性アミノ酸残基のビオチン分子によるアシル化）、グリコシル化（例えば、糖タンパク質又は糖ペプチドを生成するアスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン又はスレオニン残基へのグリコシル基の付加）、アセチル化（例えば、一般にはポリペプチドのＮ末端における、アセチル基の付加）、アルキル化（例えば、アルキル基の付加）、イソプレニル化（例えば、イソプレノイド基の付加）、リポイル化（例えば、リポアート部分の付着）、及びリン酸化（例えば、セリン、チロシン、スレオニン又はヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３３】
生物活性変異体のアミノ酸残基の１個以上を非天然アミノ酸残基とすることができる。天然アミノ酸残基としては、遺伝コードによって天然にコードされるもの、及び非標準アミノ酸（例えば、Ｌ配置の代わりにＤ配置を有するアミノ酸）が挙げられる。本発明のペプチドは、標準残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基を含むこともできる（例えば、ピロールリジンをリジンの代わりに使用することができ、セレノシステインをシステインの代わりに使用することができる）。非天然アミノ酸残基は、天然に見られないが、アミノ酸の基本式に適合し、ペプチドに組み込むことができるものである。これらとしては、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸及びＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸が挙げられる。別の例については、教科書やワールドワイドウェブを調べることができる（あるサイトは、現在、カリフォルニア工科大学によって維持され、機能タンパク質に組み込むことに成功した非天然アミノ酸の構造を掲載している）。
【００３４】
あるいは、又はさらに、生物活性変異体のアミノ酸残基の１個以上を、野生型配列の対応する位置に見られる天然の残基とは異なる天然の残基とすることができる。換言すれば、生物活性変異体は、１個以上のアミノ酸置換を含むことができる。本発明者らは、アミノ酸残基の置換、付加又は欠失を野生型配列の変異と呼ぶことがある。上述したように、置換は、天然アミノ酸残基を非天然の残基又は単に異なる天然の残基と交換することができる。さらに、置換は、保存的又は非保存的置換とすることができる。保存的アミノ酸置換としては、一般に、以下の群内の置換が挙げられる：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン；リジン、ヒスチジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。
【００３５】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物活性変異体であるポリペプチドは、その配列が、対応する野生型ポリペプチドに類似している程度又は同一である程度に関して特徴づけることができる。例えば、生物活性変異体の配列は、野生型ポリペプチドの対応する残基と少なくとも又は約８０％同一とすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物活性変異体は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ又はそのホモログ若しくはオルソログと少なくとも又は約８０％配列相同性（例えば、少なくとも又は約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％配列相同性）を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００３６】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物活性変異体ポリペプチドは、本発明の方法に有用である十分な生物活性を保持する。生物活性変異体は、標的ＤＮＡ切断において機能するのに十分な活性を保持する。生物活性は、当業者に既知の方法で評価することができ、インビトロ切断分析アッセイ又は機能アッセイを含むが、それらに限定されない。
【００３７】
ポリペプチドは、例えば、組換え技術又は化学合成を含めて、種々の方法によって生成することができる。生成後、ポリペプチドを当該技術分野で周知の手段によって、単離し、任意の所望の程度に精製することができる。例えば、逆相（好ましくは）若しくは順相ＨＰＬＣ、又はセファデックスＧ−２５などの多糖ゲル媒体上のサイズ排除若しくは分配クロマトグラフィ後に、例えば、凍結乾燥を使用することができる。最終ポリペプチドの組成は、標準手段によるペプチドの分解後のアミノ酸分析によって、アミノ酸配列決定によって、又はＦＡＢ−ＭＳ技術によって、確認することができる。ポリペプチドのアミノ基の酸性塩を含めた塩、エステル、アミド及びＮ−アシル誘導体を、当該技術分野で公知の方法によって調製することができ、こうしたペプチドは、本発明の状況において有用である。
【００３８】
本発明の組成物は、レトロウイルス中の標的配列に相補的である配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含む。レトロウイルスは、レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス又はウシ免疫不全ウイルスであり得る。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２であり得る。標的配列は、任意のＨＩＶ、例えば、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、並びにそれらの任意の組換え型流行株由来の配列を含むことができる。ＨＩＶの遺伝的変異性は、記述された複数のグループ及びサブタイプに反映されている。ＨＩＶ配列の集団は、ロスアラモスＨＩＶデータベース及び一覧表に収集されている。本発明の方法及び組成物は、それらの種々のグループ、サブタイプ及び組換え型流行株のいずれかに由来するＨＩＶに適用することができる。これらには、例えば、ＨＩＶ−１主要グループ（しばしばグループＭと称される）及び副グループ、グループＮ、Ｏ及びＰ、並びにそれらに限定されないが、ＨＩＶの以下のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＫのいずれか、又はグループ（例えば、それらに限定されないが、以下のグループＮ、Ｏ及びＰのいずれか）が含まれる。該方法及び組成物は、ＨＩＶ−２及びＡ、Ｂ、Ｃ、Ｆ又はＧクレード（「サブタイプ」又は「グループ」とも称される）のいずれか、並びにＨＩＶ−２の任意の組換え型流行株にも適用することができる。
【００３９】
ガイドＲＮＡは、コード配列又は非コード配列に相補的な配列とすることができる。例えば、ガイドＲＮＡは、長末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）配列などのＨＩＶ配列、タンパク質コード配列、制御配列とすることができる。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）領域に相補的である配列を含む。ＨＩＶ−１  ＬＴＲは、約６４０ｂｐ長である。例示的なＨＩＶ−１  ＬＴＲは、配列番号３７６の配列である。例示的なＳＩＶ  ＬＴＲは、配列番号３８０の配列である。ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域に分割される。例示的なＨＩＶ−１  ＬＴＲ  Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域は、それぞれ配列番号３７７、３７８及び３７９である。例示的なＳＩＶ  ＬＴＲ  Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域は、それぞれ配列番号３８１、３８２及び３８３である。例示的なＨＩＶ−１及びＳＩＶ配列のＵ１、Ｒ、Ｕ５領域の構成をそれぞれ図１８及び１９に示す。ＬＴＲは、遺伝子発現に必要なシグナルのすべてを含み、宿主細胞のゲノムへのプロウイルスの組み込みに関与する。例えば、基本又はコアプロモーター、コアエンハンサー及び調節領域は、Ｕ３内に存在し、トランス活性化応答配列はＲ内に存在する。ＨＩＶ−１においては、Ｕ５領域は、幾つかの小領域、例えば、転写活性化に関与するＴＡＲ、すなわちトランス作用性応答配列、二量体化及びゲノムパッケージングに関与するポリＡ、ＰＢＳ、すなわちプライマー結合部位、Ｐｓｉ、すなわちパッケージングシグナル、ＤＩＳ、すなわち二量体開始部位を含む。
【００４０】
有用なガイド配列は、ＬＴＲのＵ３、Ｒ又はＵ５領域に相補的である。ＨＩＶ−１のＵ３領域を標的にする例示的なガイドＲＮＡ配列を図１３に示す。ガイドＲＮＡ配列は、例えば、以下の標的プロトスペーサー配列に相補的な配列を含むことができる。
ＬＴＲ  Ａ：ＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号９６）、
ＬＴＲ  Ｂ：ＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ（配列番号１２１）、
ＬＴＲ  Ｃ：ＧＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号８７）、又は
ＬＴＲ  Ｄ：ＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧ（配列番号１１０）。
【００４１】
Ｕ３（配列番号１６）領域内のＬＴＲ  Ａ（配列番号９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列番号１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列番号８７）及びＬＴＲ  Ｄ（配列番号１１０）の場所を図５に示す。Ｕ３領域を標的にする追加の例示的なガイドＲＮＡ配列は、図１３に示した表に記載されており、配列番号７９〜１１１及び配列番号１１１〜１４１のいずれかの配列を有することができる。一部の実施形態においては、ガイド配列は、配列番号７９〜１１１及び配列番号１１１〜１４１のいずれかに９５％同一である配列を含むことができる。したがって、ガイドＲＮＡ配列は、例えば、以下の標的プロトスペーサー配列に相補的な配列に９５％同一である配列を含むことができる。
ＬＴＲ  Ａ：ＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号９６）、
ＬＴＲ  Ｂ：ＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧ（配列番号１２１）、
ＬＴＲ  Ｃ  ＧＡＴＴＧＧＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号８７）、又は
ＬＴＲ  Ｄ：ＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧ（配列番号１１０）。
【００４２】
本発明者らは、ガイドＲＮＡ配列をスペーサー、例えば、スペーサー（Ａ）、スペーサー（Ｂ）、スペーサー（Ｃ）及びスペーサー（Ｄ）と呼ぶこともある。
【００４３】
ガイドＲＮＡ配列は、ＨＩＶ−１  Ｕ３、Ｒ又はＵ５領域参照配列又はコンセンサス配列内に見られる配列に相補的であり得る。本発明はそのように限定されないが、ガイドＲＮＡ配列は、任意の変異体又は変異ＨＩＶ配列を標的にするように選択することができる。一部の実施形態においては、１つを超えるガイドＲＮＡ配列、例えば、第１のガイドＲＮＡ配列及び第２のガイドＲＮＡ配列が採用され、第１及び第２のガイドＲＮＡ配列は、上記レトロウイルス領域のいずれかにおける標的配列に相補的である。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、変異体配列又は疑似種配列を含むことができる。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、治療を受ける対象が内部に有するウイルスのゲノム中の配列に対応する配列とすることができる。したがって、例えば、対象が内部に有するＨＩＶウイルス中の特定のＵ３、Ｒ又はＵ５領域の配列を得ることができ、患者の特定の配列に相補的なガイドＲＮＡを使用することができる。
【００４４】
一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、タンパク質コード配列、例えば、１種以上のウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及びｔａｔ）をコードする配列に相補的な配列とすることができる。したがって、配列は、ｇａｇポリタンパク質、例えば、ＭＡ（基質タンパク質、ｐ１７）；ＣＡ（カプシドタンパク質、ｐ２４）；ＳＰ１（スペーサーペプチド１、ｐ２）；ＮＣ（ヌクレオカプシドタンパク質、ｐ７）；ＳＰ２（スペーサーペプチド２、ｐ１）及びＰ６タンパク質；ｐｏｌ、例えば、逆転写酵素（ＲＴ）及びＲＮａｓｅＨ、インテグラーゼ（ＩＮ）、及びＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ）；ｅｎｖ、例えば、ｇｐ１６０、若しくはｇｐ１６０の分解産物、例えば、ｇｐ１２０若しくはＳＵ、及びｇｐ４１若しくはＴＭ；又はｔａｔ、例えば、７２アミノ酸１エキソンＴａｔ若しくは８６〜１０１アミノ酸２エキソンＴａｔ内の配列に相補的であり得る。一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡは、例えば、ｖｉｆ、ｎｅｆ（ネガティブ因子）ｖｐｕ（ウイルスタンパク質Ｕ）及びｔｅｖを含めて、アクセサリータンパク質をコードする配列に相補的な配列とすることができる。
【００４５】
一部の実施形態においては、配列は、構造又は調節エレメントに相補的な配列、例えば、上述したように、ＬＴＲ；ＴＡＲ（ウイルストランス活性化の標的配列）、Ｔａｔタンパク質及び細胞タンパク質の結合部位は、ＨＩＶ−１中のウイルスｍＲＮＡのほぼ最初の４５ヌクレオチド（又はＨＩＶ−２における最初の１００ヌクレオチド）からなり、ヘアピンステムループ構造を形成する；ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答配列）、約２００ヌクレオチド（ｇｐ１２０及びｇｐ４１の境界にまたがる、ＨＩＶ−１における転写開始から位置７７１０〜８０６１）からなる、ＨＩＶ−１のｅｎｖ領域内でコードされたＲＮＡ要素；ＰＥ（Ｐｓｉ要素）、Ｇａｇ開始コドンに先行し、重複する、１セットの４つのステムループ構造；ＳＬＩＰ、ＴＴＴＴＴＴ「滑りやすい部位」、続いてステムループ構造；ＣＲＳ（シス作用性抑圧的配列）；例えば、ＨＩＶ−１のｇａｇ領域のヌクレオチド４１４〜６３１に見られる、ＩＮＳ抑制性／不安定性ＲＮＡ配列）とすることができる。
【００４６】
ガイドＲＮＡ配列は、センス又はアンチセンス配列とすることができる。ガイドＲＮＡ配列は、一般に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。ＰＡＭの配列は、使用するＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異性要件に応じて変わり得る。化膿レンサ球菌由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系においては、標的ＤＮＡは、一般に、５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前にある。したがって、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭ配列はＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ又はＧＧＧであり得る。別のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ特異性を有し得る。例えば、Ｓ．サーモフィラス由来のＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１に５’−ＮＮＡＧＡＡ及びＣＲＩＳＰＲ３に５’−ＮＧＧＮＧ）を必要とし、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｄｉｔｉｓ）は５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ）を必要とする。ガイドＲＮＡの特異的配列は変わり得るが、配列にかかわらず、有用なガイドＲＮＡ配列は、ゲノム組み込みＨＩＶ−１プロウイルスの高効率で完全な除去を実現しながら、オフターゲット効果を最小限にするものである。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０〜約６０ヌクレオチド以上、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０ヌクレオチド以上であり得る。有用な選択方法は、潜在的オフターゲット効果を特定し、除外するために、外来性ウイルスゲノムと内在性レトロウイルスＤＮＡを含む宿主細胞ゲノムとの相同性が極めて低い領域を特定し、オフターゲットヒトトランスクリプトーム又は（さらにまれではあるが）非翻訳ゲノム部位を除外する１２ｂｐ＋ＮＧＧ標的選択基準を用いた生物情報スクリーニング、（宿主ゲノムに潜在的に保存された）ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーター内の転写因子結合部位を回避すること、ＬＴＲ−Ａ及び−Ｂ指向、３０ｂｐ  ｇＲＮＡ、並びに特異性／効率を高める独自の細菌免疫機構を反映したプレｃｒＲＮＡ系ｖｓ．２０ｂｐ  ｇＲＮＡ−、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃＲＮＡベースの系の選択、並びにＷＧＳ、サンガー法及びＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを含む。
【００４７】
ガイドＲＮＡ配列は、単一配列として構成することができ、又は１個以上の異なる配列の組合せ、例えば、多重構成として構成することができる。多重構成は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なるガイドＲＮＡの組合せ、例えば、Ｕ３、Ｒ又はＵ５中の配列の任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態においては、ＬＴＲ  Ａ、ＬＴＲ  Ｂ、ＬＴＲ  Ｃ及びＬＴＲ  Ｄの組合せを使用することができる。一部の実施形態においては、配列ＬＴＲ  Ａ（配列番号９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列番号１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列番号８７）及びＬＴＲ  Ｄ（配列番号１１０）のいずれかの組合せを使用することができる。一部の実施形態においては、配列番号７９〜１１１及び配列番号１１１〜１４１の配列を有する配列の任意の組合せを使用することができる。組成物を発現ベクター中で投与するときには、ガイドＲＮＡを単一のベクターによってコードすることができる。あるいは、複数のベクターを操作して、各々が２個以上の異なるガイドＲＮＡを含むようにすることができる。有用な構成は、ＨＩＶゲノム又はＨＩＶタンパク質発現の除去を招く、切断部位間のウイルス配列の切り出しをもたらす。したがって、２個以上の異なるガイドＲＮＡの使用は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって認識される切断部位間のウイルス配列の切り出しを促進する。切り出し領域は、単一ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまでサイズが変わり得る。例示的な切り出し領域を実施例に記載する。
【００４８】
組成物が核酸として投与されるとき、又は発現ベクターに含まれるときには、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをガイドＲＮＡ配列と同じ核酸又はベクターによってコードすることができる。その代わりに、又はそれに加えて、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼをガイドＲＮＡ配列から物理的に分離した核酸中に、又は分離したベクター中にコードすることができる。
【００４９】
一部の実施形態においては、ＲＮＡ分子、例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡは、１個以上の修飾核酸塩基を含むように操作される。例えば、ＲＮＡ分子の公知の修飾は、例えば、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩ、９章（「Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」）、Ｌｅｗｉｓ編（１９９７、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）、並びにＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｇｒｏｓｊｅａｎ及びＢｅｎｎｅ編（１９９８、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントン特別区）に見ることができる。修飾ＲＮＡ成分としては以下が挙げられる：２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４−２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；５−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−ホルミルシチジン；２’−Ｏ−メチル−５−ホルミルシチジン（ｆｏｒｍａｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）；３−メチルシチジン；２−チオシチジン；ライシジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；４−チオウリジン；リボシルチミン；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メトキシウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；５−カルボキシメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−チオウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２’−メチルアデノシン；２−メチルアデノシン；Ｎ６Ｎ−メチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６Ｎ−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスファート）；イノシン；２’Ｏ−メチルイノシン；１−メチルイノシン；１；２’−Ｏ−ジメチ��イノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスファート）；７−メチルグアノシン；Ｎ２；７−ジメチルグアノシン；Ｎ２；Ｎ２；７−トリメチルグアノシン；ウイオシン；メチルウイオシン；不完全修飾（ｕｎｄｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；キューオシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル−キューオシン；マンノシル−キューオシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アルカエオシン［７−ホルムアミド−７−デアザグアノシンとも称する］；及び７−アミノメチル−７−デアザグアノシン。
【００５０】
本発明者らは、「核酸」と「ポリヌクレオチド」という用語を区別なく使用して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含むＤＮＡ（又はＲＮＡ）を含めて、ＲＮＡとＤＮＡの両方を指すことがあり、そのいずれも本発明のポリペプチドをコードすることができ、そのすべてが本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、本質的に任意の３次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス鎖又はアンチセンス鎖）とすることができる。ポリヌクレオチドの非限定的例としては、遺伝子、遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びその一部、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー、並びに核酸類似体が挙げられる。本発明の状況においては、核酸は、天然Ｃａｓ９の断片又はその生物活性変異体及びガイドＲＮＡをコードすることができ、ガイドＲＮＡは、ＨＩＶ中の配列に相補的である。
【００５１】
「単離」核酸は、例えば、天然ＤＮＡ分子又はその断片とすることができる。ただし、天然ゲノム中の該ＤＮＡ分子に通常は直接隣接して見られる核酸配列の少なくとも１個が除去され、又は欠如している。したがって、単離核酸としては、他の配列とは無関係に、分離した分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学合成核酸、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ断片）が挙げられるが、それらに限定されない。単離核酸とは、ベクター、自己複製プラスミド、ウイルス中に、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み入れられるＤＮＡ分子も指す。さらに、単離核酸としては、ハイブリッド又は融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの操作された核酸も挙げられる。例えば、ｃＤＮＡライブラリ若しくはゲノムライブラリ、又はゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライス内の多数（例えば、数十、又は数百〜数百万）の別の核酸中に存在する核酸は、単離核酸ではない。
【００５２】
単離核酸分子は、標準技術によって製造することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含めて、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸を得ることができる。ＰＣＲを使用して、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡ由来の配列を含めて、ＤＮＡ及びＲＮＡ由来の特定の配列を増幅することができる。種々のＰＣＲ法が、例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載されている。一般に、目的領域又はそれを越える領域の末端からの配列情報を使用して、増幅されるテンプレートの相対する鎖と配列が同一である、又は類似しているオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。部位特異的なヌクレオチド配列修飾をテンプレート核酸に導入することができる種々のＰＣＲ戦略も利用可能である。
【００５３】
単離核酸は、（例えば、ホスホルアミダイト技術を用いた３’から５’方向の自動ＤＮＡ合成によって）単一核酸分子として、又は一連のオリゴヌクレオチドとして、化学合成することもできる。例えば、所望の配列を含む１対以上の長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、＞５０〜１００ヌクレオチド）を合成することができ、各対は、オリゴヌクレオチド対をアニールすると二重鎖が形成されるように、相補性の短いセグメント（例えば、約１５ヌクレオチド）を含む。ＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドを延長し、１つのオリゴヌクレオチド対当たり単一の二本鎖核酸分子を生成し、次いでそれをベクター中に連結することができる。本発明の単離核酸は、例えば、（例えば、上の式に従って）Ｃａｓ９コードＤＮＡの天然部分の変異誘発によって得ることもできる。
【００５４】
２種の核酸、又はそれらがコードするポリペプチドは、互いにある程度の同一性を有すると記述することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質とその生物活性変異体は、ある程度の同一性を示すと記述することができる。アラインメントは、短いＣａｓ９配列をタンパク質情報研究（ＰＩＲ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）部位に置くことによって構築することができ、続いて「短いほぼ同一の配列」を用いて分析することができる。ＮＣＢＩウェブサイト上の配列相同性検索ツール（ブラスト（ＢＬＡＳＴ：Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））アルゴリズム。
【００５５】
本明細書では「パーセント配列相同性」という用語は、任意の所与の問合せ配列と対象配列の同一性の程度を指す。例えば、天然Ｃａｓ９を問合せ配列とし、Ｃａｓ９タンパク質の断片を対象配列とすることができる。同様に、Ｃａｓ９タンパク質の断片を問合せ配列とし、その生物活性変異体を対象配列とすることができる。
【００５６】
配列相同性を求めるために、問合せ核酸又はアミノ酸配列を、コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．８３、初期設定パラメータ）を用いて、それぞれ、１つ以上の対象核酸又はアミノ酸配列と整列させることができる。該コンピュータプログラムは、核酸又はタンパク質配列のアラインメントをそれらの全長にわたって行うことができる（全体的アラインメント）。Ｃｈｅｎｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３４９７〜３５００、２００３を参照されたい。
【００５７】
ＣｌｕｓｔａｌＷは、問合せと１つ以上の対象配列の最良の一致を計算し、同一性、類似性及び相違が求められるようにそれらを整列させる。１個以上の残基のギャップを問合せ配列、対象配列又は両方に挿入して、配列アラインメントを最大にすることができる。核酸配列の高速対アラインメントでは、以下の初期設定パラメータを使用する：ワードサイズ：２、ウィンドウサイズ：４、スコアリング法：百分率、最適な対角線の数：４、及びギャップペナルティ：５。核酸配列の複数のアラインメントでは、以下のパラメータを使用する：ギャップ開始ペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：５．０、及び重み移行：イエス。タンパク質配列の高速対アラインメントでは、以下のパラメータを使用する：ワードサイズ：１、ウィンドウサイズ：５、スコアリング法：百分率、最適な対角線の数：５、ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の複数のアラインメントでは、以下のパラメータを使用する：重み行列：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップ開始ペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、残基特異的ギャップペナルティ：オン。結果は、配列間の関係を反映した配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒサイト（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）及びワールドワイドウェブ上のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサイト（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）で実行することができる。
【００５８】
問合せ配列と対象配列の同一性パーセントを求めるために、ＣｌｕｓｔａｌＷは、最良アラインメントにおける同一性の数を比較する残基の数（ギャップ位置を除外する）で割り、結果に１００を掛ける。結果は、問合せ配列に対する対象配列の同一性パーセントである。なお、同一性パーセント値は、最も近い小数第１位に四捨五入することができる。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３及び７８．１４は７８．１に切り捨てられ、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８及び７８．１９は７８．２に切り上げられる。
【００５９】
本明細書に記載の核酸及びポリペプチドを「外来」と称する場合がある。「外来」という用語は、核酸又はポリペプチドが組換え核酸構築物の一部である、又は組換え核酸構築物によってコードされる、又はその自然環境にないことを示す。例えば、外来核酸は、別の種に導入された１種由来の配列、すなわち、異種核酸とすることができる。一般に、こうした外来核酸は、組換え核酸構築物を介して別の種に導入される。外来核酸は、生物固有の配列であり、その生物の細胞に再導入された配列とすることもできる。固有の配列を含む外来核酸は、しばしば、外来核酸に連結された非天然配列、例えば、組換え核酸構築物中の固有の配列に隣接する非固有制御配列の存在によって天然配列から区別することができる。さらに、安定に形質転換された外来核酸は、一般に、固有の配列が見られる位置以外の位置に組み込まれる。
【００６０】
組換え構築物も本明細書で提供され、Ｃａｓ９、及び／又はＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現するために、細胞を形質転換するのに使用することができる。組換え核酸構築物は、Ｃａｓ９及び／又は細胞中のＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現するのに適切な調節領域に作動可能に結合した、本明細書に記載のＣａｓ９及び／又はＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。幾つかの核酸は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得ることを理解されたい。遺伝コードの縮重は、当該技術分野でよく知られている。多くのアミノ酸では、アミノ酸のコドンとして働く１個を超えるヌクレオチドトリプレットが存在する。例えば、Ｃａｓ９のコード配列中のコドンは、特定の生物の適切なコドンバイアス表を用いて、該生物における最適な発現が得られるように修飾することができる。
【００６１】
本明細書に記載のものなどの核酸を含むベクターも提供する。「ベクター」は、プラスミド、ファージ、コスミドなどのレプリコンであり、その中に、挿入セグメントを複製するように別のＤＮＡセグメントを挿入することができる。一般に、ベクターは、適切な調節領域に付随すると、複製能力がある。適切なベクター骨格としては、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣなどの当該技術分野において常法に従って使用されるものが挙げられる。「ベクター」という用語は、クローニング及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組込み型ベクターを含む。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを使用して、本明細書に記載の核酸配列を発現することができる。適切な発現ベクターとしては、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス及びレトロウイルスに由来するプラスミド及びウイルスベクターが挙げられるが、それらに限定されない。多数のベクター及び発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（マディソン、ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラ  ホーヤ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カールズバッド、ＣＡ）などの会社から市販されている。
【００６２】
本明細書で提供するベクターは、例えば、複製開始点、足場付着領域（ＳＡＲ：ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）及び／又はマーカーを含むこともできる。マーカー遺伝子は、選択可能な表現型を宿主細胞に与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン又はハイグロマイシン）耐性などの殺生物剤耐性を与えることができる。上述したように、発現ベクターは、発現ポリペプチドの操作又は検出（例えば、精製又は局在化）を容易にするように設計されたタグ配列を含むことができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ、ニューヘブン、ＣＴ）配列などのタグ配列は、一般に、コードされたポリペプチドとの融合物として発現される。こうしたタグは、カルボキシル又はアミノ末端を含めて、ポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。
【００６３】
追加の発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むこともできる。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び別のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミド又はその誘導体などの酵母プラスミド、昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクターなどの真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は別の発現制御配列を使用するように修飾されたプラスミドなどのプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターが挙げられる。
【００６４】
酵母発現系を使用することもできる。例えば、ほんの２種を挙げれば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製され、エンテロキナーゼを用いて切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を本発明に従って採用することができる。酵母二重ハイブリッド発現系を本発明に従って調製することもできる。
【００６５】
ベクターは、調節領域を含むこともできる。「調節領域」という用語は、転写又は翻訳開始及び効率、並びに転写又は翻訳産物の安定性及び／又は易動度に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導性要素、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始点、終結配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、並びにイントロンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６６】
本明細書では「作動可能に結合した」という用語は、調節領域及び配列の転写又は翻訳に影響するように核酸中で転写された配列の位置取りを指す。例えば、コード配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳読み枠の翻訳開始部位は、一般に、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。しかし、プロモーターは、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチド上流でも、又は転写開始点の約２，０００ヌクレオチド上流でも位置することができる。プロモーターは、一般に、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターは、エンハンサー配列、上流要素、上流活性化領域（ＵＡＲ：ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）などの少なくとも１個の調節領域を含むこともできる。含むべきプロモーターの選択は、効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベル、及び細胞又は組織優先発現を含めて、ただしそれらに限定されない、幾つかの要因に依存する。プロモーター及び別の調節領域をコード配列に対して適切に選択し、位置決めすることによってコード配列の発現を調節することは当業者には通常のことである。
【００６７】
ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルス（「Ａｄ」）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルスなど）、リポソーム及び他の脂質含有複合体、並びにポリヌクレオチドを宿主細胞に送達するのを媒介することができる他の巨大分子複合体が挙げられる。ベクターは、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現を更に調節する、又は有益な性質を標的細胞に付与する、別の成分又は官能基を含むこともできる。以下でより詳細に記述及び説明するように、こうした別の成分としては、例えば、細胞への結合又はターゲティングに影響する成分（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含めて）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響する成分、取り込み後に細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響する成分（核局在化を媒介する剤など）、及びポリヌクレオチドの発現に影響する成分が挙げられる。こうした成分は、ベクターによって送達される核酸を取り込み、発現している細胞を検出又は選択するのに使用することができる検出可能及び／又は選択可能なマーカーなどのマーカーを含むこともできる。こうした成分は、ベクターの自然な特徴（結合及び取り込みを媒介する成分又は官能基を有するある種のウイルスベクターの使用など）として付与することができ、又はベクターを修飾して、こうした官能基を付与することができる。別のベクターとしては、Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４：１６７〜１７１（２００３）に記載のものが挙げられる。多様なこうしたベクターが当該技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【００６８】
「組換えウイルスベクター」とは、１種以上の異種遺伝子産物又は配列を含むウイルスベクターを指す。多くのウイルスベクターは、パッケージングに関連したサイズの制約があるので、異種遺伝子産物又は配列は、一般に、ウイルスゲノムの１個以上の部分を置換することによって導入される。こうしたウイルスは、複製欠損になることがあり、（例えば、複製及び／又はカプシド形成に必要な遺伝子産物を保有するヘルパーウイルス又はパッケージング細胞系を使用することによって）失われた機能（単数又は複数）をウイルス複製及びカプシド形成中に途中で付与する必要がある。送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側で輸送される改変ウイルスベクターも記述されている（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，ＤＴらＰＮＡＳ８８：８８５０〜８８５４、１９９１参照）。
【００６９】
適切な核酸送達系としては、組換えウイルスベクター、一般にアデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、又はセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）複合体の少なくとも１種由来の配列が挙げられる。こうした場合には、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に結合した強力な真核生物プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、１個以上のポリヌクレオチド、好ましくは約１個のポリヌクレオチドをその中に含むことができる。一部の実施形態においては、本発明の方法に使用されるウイルスベクターは、約１０８〜約５×１０１０ｐｆｕの疫病形成単位（ｐｆｕ：ｐｌａｇｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を有する。ポリヌクレオチドが非ウイルスベクターを用いて投与される実施形態においては、約０．１ナノグラム〜約４０００マイクログラム、例えば、約１ナノグラム〜約１００マイクログラムの使用がしばしば有用である。
【００７０】
追加のベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質及び化学複合物が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶ系ウイルスが挙げられる。１種のＨＩＶ系ウイルスベクターは、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルスに由来する、少なくとも２種のベクターを含む。ＤＮＡウイルスベクターとしては、オルソポックス、トリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｖｉｒｕｓ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター［Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，Ｆ．ら、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、英国オックスフォード）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．：９０  ７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８７：１１４９（１９９０）］、アデノウイルスベクター［ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）］、及びアデノ随伴ウイルスベクター［Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）］が挙げられる。
【００７１】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期発現しかもたらさない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、幾つかの発明実施形態のための指標となり得る。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期の発現（例えば、約１か月未満）をもたらし、一部の実施形態においては、はるかに長い発現を示す場合もある。選択される特定のベクターは、標的細胞及び処置される症状に依存する。適切なプロモーターの選択は、容易に行うことができる。適切なプロモーターの一例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。遺伝子発現に使用することができる他の適切なプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ４：１５１（１９９３））、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ＭＭＴ）遺伝子の制御配列、β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター、ｔａｃプロモーター、Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母又は別の真菌由来のプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用される動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ球様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ球及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域が挙げられるが、それらに限定されない。ある種のタンパク質は、それらの天然プロモーターを用いて発現され得る。ｔａｔ遺伝子、ｔａｒエレメントなどの高レベルの発現をもたらすエンハンサー又は系などの発現を高めることができる別のエレメントを含むこともできる。次いで、このカセットをベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクター、又は例えば大腸菌複製開始点を含む、別の公知のプラスミドベクターに挿入することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。プラスミドベクターは、マーカーポリペプチドが処置する生物の代謝に悪影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択マーカーを含むこともできる。���セットは、国際公開第９５／２２６１８号に開示された系などの合成送達系における核酸結合部分に結合することもできる。
【００７２】
所望であれば、本発明のポリヌクレオチドは、カチオン性リポソーム、アデノウイルスベクターなどのマイクロ送達ビヒクルと一緒に使用することもできる。リポソーム調製、ターゲティング及び内容物送達の手順の総説としては、Ｍａｎｎｉｎｏ及びＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６８２（１９８８）を参照されたい。Ｆｅｌｇｎｅｒ及びＨｏｌｍ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ、１１（２）：２１（１９８９）及びＭａｕｒｅｒ、Ｒ．Ａ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ、１１（２）：２５（１９８９）も参照されたい。
【００７３】
複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知技術に従って製造することができる。Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１〜２５８４（１９９２）、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：６２６〜６３０（１９９２）、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２）を参照されたい。
【００７４】
別の送達方法は、発現産物を細胞内で産生することができる一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを使用することである。例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する、Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４：１６７〜１７１（２００３）を参照されたい。
【００７５】
ベクターの送達は、エキソソームによって媒介することもできる。エキソソームは、多数の細胞型によって放出される脂質ナノベシクルである。それらは、核酸及びタンパク質を細胞間で輸送することによって、細胞間情報伝達を媒介する。エキソソームは、エンドサイトーシス経路に由来するＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びタンパク質を含む。それらは、エンドサイトーシス、融合又は両方によって標的細胞に取り込むことができる。一般に、エンドソーム内容物の受け取りは、受け取り細胞の機能を変える（Ｌｅｅら、２０１２）。
【００７６】
エキソソームを利用して、核酸を標的細胞に送達することができる。好ましい一方法においては、エキソソームは、産生細胞によってインビトロで産生され、精製され、核酸カーゴを電気穿孔法によって、又は脂質導入剤によって積載される（Ｍａｒｃｕｓ及びＬｅｏｎａｒｄ、２０１３、Ｓｈｔａｍら、２０１３）。カーゴは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び１個以上のｇＲＮＡのための発現構築物を含むことができる。適切な技術は、Ｋｏｏｉｊｍａｎｓら（２０１２）、Ｌｅｅら（２０１２）、Ｍａｒｃｕｓ及びＬｅｏｎａｒｄ（２０１３）、Ｓｈｔａｍら（２０１３）、又はその中の参考文献に見つけることができる。エキソソームを生成し、装填するための例示的なキットは、ＥｘｏＦｅｃｔ（商標）キット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、ＣＡ）である。
【００７７】
エキソソームは、特定の細胞型による優先的な取り込みの標的にすることもできる。本発明に特に有用なターゲティング戦略は、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｔｉら（２０１１）によって開示されている。その中に開示された技術を使用して、エキソソームに狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ：ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ペプチドを付けることができる。ＲＶＧを保有するエキソソームは、脳、特にニューロン、乏突起膠細胞及び小膠細胞に特異的に帰り、他の組織に非特異的に蓄積することがほとんどない。
【００７８】
本発明の発現構築物は、ナノクリュー（ｎａｎｏｃｌｅｗｓ）によって送達することもできる。ナノクリューは、繭状のＤＮＡナノコンポジットである（Ｓｕｎら、２０１４）。それらは、標的細胞による取り込み及び標的細胞の細胞質における放出のために核酸を積載することができる。ナノクリューを構築し、それを積載し、放出分子を設計する方法は、Ｓｕｎら（２０１４）及びＳｕｎら（２０１５）に見つけることができる。
【００７９】
本発明の遺伝子編集構築物は、宿主細胞による誘導発現ではなく、直接送達、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓヌクレアーゼタンパク質＋１個以上のｇＲＮＡの送達によって送達することもできる。エキソソームは、タンパク質とＲＮＡの両方を積載することができるので、直接送達に好ましいビヒクルである（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｔｉら、２０１１；Ｍａｒｃｕｓ及びＬｅｏｎａｒｄ、２０１３）。エキソソームにタンパク質を積載する例示的な方法は、エキソソーム産生細胞における、ラクトアドヘリンなどのエンドソームタンパク質との融合物としてのタンパク質の発現による。エキソソームの別の好都合な特徴は、前述のように、脳などの特定の部位をそれらの標的にし得ることである。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質として、好ましくは、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体の形で、同じエキソソームに積載することができる。あるいは、ＣａｓエンドヌクレアーゼとｇＲＮＡは、同時又は段階的送達のために、別々のエキソソームに積載することができる。
【００８０】
遺伝子編集複合体の直接送達は、ナノクリューによって行うこともできる。Ｓｕｎら（２０１５）は、受け取り細胞への取り込み及び放出のためにＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体をナノクリューに積載する技術を開示している。
【００８１】
直接送達ビヒクルは、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ、直腸、髄腔内、頭蓋内、吸入、及び錠剤を含めた経口を含めて、ただしそれらに限定されない、任意の適切な経路によって投与することができる。
【００８２】
医薬組成物
上述したように、本発明の組成物は、当業者に既知の種々の方法で調製することができる。本発明の組成物は、それらの本来の供給源又はそれらが得られる様式にかかわらず、それらの使用に応じて処方することができる。例えば、上記核酸及びベクターは、組織培養において細胞に適用するために、又は患者若しくは対象に投与するために、組成物内で処方することができる。本発明の医薬組成物のいずれかを、医薬品の調製に使用するために処方することができ、特定の使用は、治療、例えば、ＨＩＶ感染症の対象、又はＨＩＶ感染症に罹患するリスクがある対象の治療に関連して以下に示される。核酸及びベクターのいずれかは、医薬品として使用するときには、医薬組成物の形で投与することができる。これらの組成物は、医薬品技術分野で周知の様式で調製することができ、局所療法と全身療法のどちらが所望か、及び処置すべき領域に応じて、種々の経路で投与することができる。投与は、局所（眼、並びに鼻腔内、膣及び直腸送達を含めた粘膜）、肺（例えば、噴霧器によるものを含めて、粉体又はエアロゾルの吸入又は吹送、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮）、眼球、経口又は非経口とすることができる。眼球送達方法としては、局所投与（点眼剤）、結膜下、眼周囲若しくは硝子体内注射、又はバルーンカテーテルによる導入、又は結膜嚢に手術によって置かれた眼挿入物が挙げられる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射若しくは注入、又は頭蓋内、例えば、髄腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。非経口投与は、単一大量瞬時投与の形とすることができ、又は例えば、連続潅流ポンプによることができる。局所投与用医薬組成物及び製剤としては、皮膚貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤などが挙げられる。従来の薬剤担体、水性、粉体又は油性基剤、増粘剤などが必要な場合もあり、又は望ましい場合もある。
【００８３】
本発明は、活性成分として本明細書に記載の核酸及びベクターを１種以上の薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も含む。本発明者らは、「薬学的に許容される」（又は「薬理学的に許容される」）という用語を、動物又はヒトに適宜投与したときに、副作用も、アレルギー反応も、他の有害反応も生じない分子的実体及び組成物を指すのに使用する。本明細書では「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される物質の媒体として使用することができる、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル剤、界面活性剤などを含む。本発明の組成物を製造する際には、活性成分は、一般に、賦形剤と混合され、賦形剤によって希釈され、又は、例えば、カプセル、錠剤、サシェ、紙又は別の容器の形でこうした担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として働くときには、それは、活性成分のビヒクル、担体又は媒体として作用する、固体、半固体又は液体材料（例えば、生理食塩水）とすることができる。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液剤、乳濁液剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、又は液体媒体中の）、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、軟及び硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌注射液剤、並びに無菌包装散剤の形とすることができる。当該技術分野で知られているように、希釈剤のタイプは、意図された投与経路に応じて変わり得る。得られる組成物は、防腐剤などの追加の薬剤を含むことができる。一部の実施形態においては、担体は、脂質ベース若しくはポリマーベースのコロイドとすることができ、又は該コロイドを含むことができる。一部の実施形態においては、担体材料は、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、又はブロックコポリマーミセルとして処方されるコロイドとすることができる。上述したように、担体材料はカプセル剤を形成することができ、該材料は、ポリマーベースのコロイドとすることができる。
【００８４】
本発明の核酸配列は、対象の適切な細胞に送達することができる。これは、例えば、マクロファージなどの食細胞による食作用を最適化するサイズのポリマー生分解性微粒子又はマイクロカプセル送達ビヒクルの使用によって行うことができる。例えば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微粒子を使用することができる。ポリヌクレオチドは、これらの微粒子に封入され、微粒子は、マクロファージによって取り込まれ、細胞内で徐々に生物分解され、それによってポリヌクレオチドを放出する。放出後、ＤＮＡが細胞内で発現される。第２のタイプの微粒子は、細胞によって直接取り込まれることを意図せず、生分解による微粒子からの放出によってのみ細胞に取り込まれる核酸の徐放貯蔵器として主に働くことを意図している。これらのポリマー粒子は、したがって、食作用を防止するのに十分な大きさであるべきである（すなわち、５μｍを超え、好ましくは２０μｍを超える）。核酸を取り込む別の方法は、標準の方法によって調製されたリポソームを使用することである。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で取り込むことができ、又は組織特異抗体、例えば、一般に、ＨＩＶ感染の潜伏感染貯蔵器である細胞型、例えば、脳マクロファージ、小膠細胞、星状細胞及び消化管関連リンパ球様細胞を標的にする抗体と一緒に取り込むことができる。あるいは、プラスミド、又は静電気力若しくは共有結合力によってポリＬ−リジンに付着した別のベクターで構成される分子複合体を調製することができる。ポリＬ−リジンは、標的細胞の受容体に結合することができるリガンドに結合する。「裸ＤＮＡ」（すなわち、送達ビヒクルなし）の筋肉内、皮内又は皮下部位への送達は、生体内発現を実現する別の手段である。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする配列とガイドＲＮＡとを含む単離核酸配列をコードする核酸配列は、プロモーター又はエンハンサー−プロモーターの組合せに作用可能に結合する。プロモーター及びエンハンサーについては上述した。
【００８５】
一部の実施形態においては、本発明の組成物は、ナノ粒子、例えば、ＤＮＡと複合化され、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量ＬＰＥＩのシェルで包囲された高分子量線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のコアを含むナノ粒子として処方することができる。エキソソーム及びナノクリューを、前述のように、本発明に係る医薬組成物に利用することもできる。
【００８６】
核酸及びベクターは、装置（例えば、カテーテル）の表面に適用することもでき、又はポンプ、パッチ若しくは他の薬物送達装置に含むこともできる。本発明の核酸及びベクターは、薬学的に許容される賦形剤若しくは担体（例えば、生理食塩水）の存在下で、単独で、又は混合物で投与することができる。賦形剤又は担体は、投与の方法及び経路に基づいて選択される。適切な薬剤担体、及び医薬製剤に使用される医薬必需品は、この分野で周知の参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）、並びに米国薬局方及び国民医薬品集（ＵＳＰ／ＮＦ）に記載されている。
【００８７】
一部の実施形態においては、組成物は、ＨＩＶの性行為感染を阻止する局所ゲル剤として処方することができる。局所ゲル剤は、性行為前に男性又は女性の生殖器部の皮膚又は粘膜に直接塗布することができる。その代わりに、又はそれに加えて、局所ゲル剤は、男性若しくは女性のコンドーム若しくはペッサリーの表面に塗布することができ、又は内部に含むことができる。
【００８８】
一部の実施形態においては、組成物は、Ｃａｓ９若しくは変異Ｃａｓ９と標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列とをコードする核酸を封入したナノ粒子、又はＣａｓ９と標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列とをコードする核酸を含むベクターとして処方することができる。あるいは、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチド、例えば、Ｃａｓ９又は変異Ｃａｓ９と標的に相補的なガイドＲＮＡ配列とを封入したナノ粒子として処方することができる。
【００８９】
本発明の製剤は、Ｃａｓ９と標的ＨＩＶに相補的なガイドＲＮＡ配列とをコードするベクターを含むことができる。ガイドＲＮＡ配列は、単一の領域、例えば、ＬＴＲ  Ａ、Ｂ、Ｃ若しくはＤに相補的な配列を含むことができ、又はＬＴＲ  Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに相補的な配列の任意の組合せを含むことができる。あるいは、Ｃａｓ９をコードする配列とガイドＲＮＡ配列をコードする配列は、別々のベクター上とすることができる。
【００９０】
治療方法
本明細書に開示された組成物は、レトロウイルス感染症、例えば、ＨＩＶ感染症の対象の治療に全般的に様々に有用である。本発明者らは、対象、患者又は個体を区別なく呼ぶことがある。方法は、任意のＨＩＶ、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びそれらの任意の組換え型流行株のターゲティングに有用である。対象は、臨床的に有益な結果が生じる時はいつでも効果的に治療される。これは、例えば、疾患の症状の完全な消散、疾患の症状の重症度の減少、又は疾患の進行の減速を意味し得る。これらの方法は、更に、ａ）ＨＩＶ感染症の対象（例えば、患者、より具体的にはヒト患者）を特定するステップ、及びｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と、ＨＩＶ標的配列、例えば、ＨＩＶ  ＬＴＲに相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む組成物を対象に供給するステップも含むことができる。対象は、標準臨床試験、例えば、対象の血清中のＨＩＶ抗体若しくはＨＩＶポリペプチドｐ２４の存在を検出する免疫測定法を用いて、又はＨＩＶ核酸増幅アッセイによって、特定することができる。感染の症状の完全な消散、感染の症状の重症度の減少、又は感染の進行の減速をもたらす、対象に供給されたこうした組成物の量は、治療有効量と考えられる。本発明の方法は、投与及び計画の最適化を助け、成果の予測を助けるモニタリングステップを含むこともできる。本発明の幾つかの方法においては、患者が潜伏ＨＩＶ−１感染症を有するかどうかをまず判定し、次いで本明細書に記載の組成物の１種以上で患者を治療するかどうかを決定することができる。モニタリングは、薬剤耐性の発生を検出し、反応性患者を非反応性患者から迅速に区別するのに使用することもできる。一部の実施形態においては、方法は、更に、患者が内部に有する特定のＨＩＶの核酸配列を決定するステップと、次いで、これら特定の配列に相補的であるガイドＲＮＡを設計するステップも含むことができる。例えば、対象のＬＴＲ  Ｕ３、Ｒ又はＵ５領域の核酸配列を決定し、次いで１個以上のガイドＲＮＡを患者の配列に正確に相補的であるように設計することができる。
【００９１】
組成物は、レトロウイルス感染症、例えば、ＨＩＶ感染症を有するリスクがある対象の、例えば、予防的治療としての、治療にも有用である。これらの方法は、更に、ａ）ＨＩＶ感染症を有するリスクがある対象を特定するステップ、ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と、ＨＩＶ標的配列、例えば、ＨＩＶ  ＬＴＲに相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む組成物を対象に供給するステップも含むことができる。ＨＩＶ感染症を有するリスクがある対象は、例えば、無防備性交に関与する、すなわち、コンドームを使用しない性行為に関与する、任意の性行動の活発な個体、別の性感染症を有する性行動の活発な個体、静脈注射薬使用者、又は割礼を受けていない男性であり得る。ＨＩＶ感染症を有するリスクがある対象は、例えば、その職業が彼又は彼女をＨＩＶ感染集団に接触させ得る個体、例えば、医療従事者又は第一応答者であり得る。ＨＩＶ感染症を有するリスクがある対象は、例えば、矯正状況にある被収容者、又は性労働者、すなわち、収入雇用、若しくは食品、薬物、避難などの非金銭的物品のために性行為を利用する個体であり得る。
【００９２】
組成物は、母から子へのＨＩＶ伝染の可能性を低下させるために、ＨＩＶ感染症を有する妊娠中又は授乳中の女性に投与することもできる。ＨＩＶに感染した妊婦は、子宮内で胎盤を通して、分娩時に産道を通して、又は分娩後、母乳を通して、子にウイルスを伝染する可能性がある。本明細書に開示された組成物は、ＨＩＶ感染した母に、出生前に、出生時に、若しくは出生後授乳期間中に、又は出生前、出生時及び出生後の投与の任意の組合せで、投与することができる。組成物は、後述するように標準抗レトロウイルス療法と一緒に母に投与することができる。一部の実施形態においては、本発明の組成物は、分娩直後に、一部の実施形態においては、その後間をおいて、乳児にも投与される。乳児は、標準抗レトロウイルス療法を受けることもできる。
【００９３】
本明細書に開示された方法及び組成物は、レトロウイルス感染症の治療に有用である。例示的なレトロウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ：ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ：ｂｏｖｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ：ｅｑｕｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｎｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）、及びヤギ関節炎／脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ：ｃａｐｒｉｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ／ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。本明細書に開示された方法は、広範囲の種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウマ若しくは他の家畜、イヌ、ネコ、フェレット若しくはペットとして飼われる他の哺乳動物、ラット、マウス、又は他の実験動物に適用することができる。
【００９４】
本発明の方法は、医薬品の調製に関して記述することができる。したがって、本発明は、医薬品の調製における本明細書に記載の薬剤及び組成物の使用を包含する。本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の疾患又は症状の治療用医薬品の治療用組成物及び投与計画又は製造に有用である。
【００９５】
本明細書に記載の任意の組成物を、その後に標的細胞に送達するために、宿主の体の任意の部分に投与することができる。組成物は、哺乳動物の脳、脳脊髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋組織、皮膚又は腹腔に送達することができるが、それらに限定されない。送達の経路に関して、組成物は、静脈内、頭蓋内、腹腔内、筋肉内、皮下、筋肉内、直腸内、膣内、髄腔内、気管内、皮内若しくは経皮注射によって、経口若しくは経鼻投与によって、又は経時的にゆっくりとした潅流によって、投与することができる。更なる一例においては、組成物のエアロゾル製剤を宿主に吸入によって投与することができる。
【００９６】
必要な投与量は、投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、患者のサイズ、体重、表面積、年齢及び性別、投与される他の薬物、並びに主治医の判断に依存する。必要な投与量は、細胞標的の多様性及び個々の投与経路の効率が異なることを考慮すると、大きく変動すると予想される。これらの投与量レベルの変動は、当該技術分野において十分理解されているように、標準の経験的最適化ルーチンによって調節することができる。投与は、単回又は複数回（例えば、２又は３、４、６、８、１０、２０、５０、１００、１５０倍以上）とすることができる。化合物を適切な送達ビヒクル（例えば、ポリマー微粒子又は移植可能な装置）に封入すると、送達効率を増加させることができる。
【００９７】
本明細書で提供する任意の組成物による治療の期間は、１日という短いものから長くは宿主の寿命まで（例えば、長年）、任意の時間とすることができる。例えば、化合物を週１回（例えば、４週間から多数の年月）、月１回（例えば、３〜１２か月又は長年）、又は年１回５年間、１０年間若しくはそれ以上投与することができる。なお、治療回数も変わり得る。例えば、本発明の化合物は、毎日、毎週、毎月又は毎年１回（又は２回、３回など）投与することができる。
【００９８】
本明細書で提供する任意の組成物の有効量を、治療を必要とする個体に投与することができる。本明細書では「有効」という用語は、患者において著しい毒性を誘起せずに、所望の反応を誘導する任意の量を指す。こうした量は、既知の量の特定の組成物の投与後に患者の反応を検査することによって決定することができる。さらに、毒性レベルは、もしあれば、既知の量の特定の組成物の投与前後の患者の臨床症状を見ることによって判定することができる。なお、患者に投与する特定の組成物の有効量は、所望の成果並びに患者の反応及び毒性レベルに応じて調節することができる。著しい毒性は、個々の患者で異なり得るものであり、患者の病態、年齢、及び副作用に対する耐性を含めて、ただしそれらに限定されない、複数の要因に依存する。
【００９９】
当業者に既知の任意の方法を使用して、特別な反応が誘導されるかどうか判定することができる。特定の病態の程度を評価することができる臨床方法を使用して、反応が誘導されるかどうか判定することができる。反応を評価するのに使用される特別な方法は、患者の障害の性質、患者の年齢及び性別、投与される他の薬物、並びに主治医の判断に依存する。
【０１００】
組成物は、ＨＡＡＲＴに使用される別の治療薬、例えば、抗レトロウイルス剤と一緒に投与することもできる。例示的な抗レトロウイルス剤としては、逆転写酵素阻害剤（例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、ジドブジン、エムトリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ラミブジン及びテノホビル（ｔｅｎｏｆｉｖｉｒ）、並びにエファビレンツ（ｅｆａｖａｒｅｎｚ）、ネビラピン、リルピビリンなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）、プロテアーゼ阻害剤、例えば、チプラナビル（ｔｉｐｉｒａｖｉｒ）、ダルナビル、インジナビル、侵入阻害剤、例えば、マラビロク、融合阻害剤、例えば、エンフューヴィルタイド（ｅｎｆｕｖｉｒｉｔｉｄｅ）、又はインテグラーゼ阻害剤、例えば、ラルテグラビル（ｒａｌｔｅｇｒｉｖｉｒ）、ドルテグラビルが挙げられる。例示的な抗レトロウイルス剤としては、マルチクラス組合せ薬剤、例えば、エムトリシタビン、エファビレンツ及びテノホビルの組合せ；エムトリシタビンの組合せ；リルピビリン及びテノホビル；又はエルビテグラビル、コビシスタット、エムトリシタビン及びテノホビルの組合せも挙げられる。
【０１０１】
２種以上の治療薬の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮する期間が重複する限り、薬剤が同時に又は同じ経路で投与される必要はない。同時又は逐次的な投与が企図され、異なる日又は週の投与も同様である。治療薬は、規則正しい投薬計画、例えば、連続低用量の治療薬で投与することができる。
【０１０２】
こうした組成物の投与量、毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を求める、細胞培養物又は実験動物における標準の薬学手順によって決定することができる。毒作用と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。
【０１０３】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用されるある範囲の投与量を処方するのに使用することができる。こうした組成物の投与量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性がない、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、使用剤形及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意の組成物では、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿中濃度範囲が得られるように、動物モデルにおいて処方することができる。こうした情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【０１０４】
上述したように、治療有効量の組成物（すなわち、有効投与量）とは、治療上（例えば、臨床的に）望ましい結果を生じるのに十分な量を意味する。組成物は、隔日１回を含めて、１日１回以上から週１回以上まで投与することができる。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全般的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含めて、ただしそれらに限定されない、ある種の要因が、対象を有効に治療するのに必要な投与量及びタイミングに影響し得ることを理解されたい。さらに、治療有効量の本発明の組成物を用いた対象の治療は、単一の治療又は一連の治療を含むことができる。
【０１０５】
本明細書に記載の組成物は、上記種々の薬物送達システムにおける使用に適している。さらに、投与化合物の生体内血清中半減期を延長するために、組成物を封入することができ、リポソームの管腔に導入することができ、コロイドとして調製することができ、又は組成物の血清中半減期を延長する他の従来の技術を採用することができる。例えば、その各々を参照により本明細書に援用する、Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，２３５，８７１号、同４，５０１，７２８号及び同４，８３７，０２８号に記載のように、種々の方法をリポソームの調製に利用することができる。さらに、標的薬物送達システム中で、例えば、組織特異抗体で被覆されたリポソーム中で、薬物を投与することができる。リポソームは、器官を標的にし、器官によって選択的に取り込まれる。
【０１０６】
レトロウイルス、例えば、哺乳動物細胞におけるヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルスなどのレンチウイルスを不活性化する方法も提供する。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２であり得る。ヒト免疫不全ウイルスは、染色体に組み込まれたプロウイルスであり得る。哺乳動物細胞は、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ランゲルハンス細胞、濾胞樹状細胞などの樹状細胞、造血幹細胞、内皮細胞、脳小膠細胞、及び胃腸管上皮細胞を含めて、ただしそれらに限定されない、ＨＩＶに感染した任意の細胞型であり得る。こうした細胞型としては、一般に一次感染中に感染する細胞型、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ又はランゲルハンス細胞、及び潜伏ＨＩＶ貯蔵器を構成する細胞型、すなわち、潜伏感染細胞が挙げられる。
【０１０７】
方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと１個以上のガイドＲＮＡとを含む遺伝子編集複合体をコードする単離核酸を含む組成物に細胞を暴露するステップを含むことができ、ガイドＲＮＡは、レトロウイルス中の標的核酸配列に相補的である。好ましい一実施形態においては、前述のように、レトロウイルスに潜伏感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと２個以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む組成物で宿主細胞を処理するステップであって、少なくとも２個のｇＲＮＡの各々が、プロウイルスＤＮＡ中の異なる標的核酸配列に相補的であるステップ、及びプロウイルスＤＮＡを不活性化するステップを含む。少なくとも２個のｇＲＮＡは、単一配列として構成することができ、又は１個以上の異なる配列の組合せ、例えば、多重構成として構成することができる。多重構成は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なるｇＲＮＡの組合せ、例えば、Ｕ３、Ｒ又はＵ５中の配列の任意の組合せを含むことができる。一部の実施形態においては、ＬＴＲ  Ａ、ＬＴＲ  Ｂ、ＬＴＲ  Ｃ及びＬＴＲ  Ｄの組合せを使用することができる。一部の実施形態においては、配列ＬＴＲ  Ａ（配列番号９６）、ＬＴＲ  Ｂ（配列番号１２１）、ＬＴＲ  Ｃ（配列番号８７）及びＬＴＲ  Ｄ（配列番号１１０）のいずれかの組合せを使用することができる。実施例に記載の実験においては、２個の異なるｇＲＮＡを使用すると、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって認識される切断部位間のウイルス配列が切り出された。切り出し領域は、全ＨＩＶ−１ゲノムを含む可能性がある。処理ステップは生体内で行うことができ、すなわち、組成物をＨＩＶ感染症の対象に直接投与することができる。方法はそのように限定されないが、処理ステップは生体外で行うこともできる。例えば、１個の細胞若しくは複数の細胞又は組織外植片をＨＩＶ感染症の対象から取り出し、培養し、次いでＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡを含む組成物で処理することができ、ガイドＲＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス中の核酸配列に相補的である。上述したように、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとをコードする核酸とすることができ、ガイドＲＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス中の核酸配列に相補的である、又は組成物は、核酸配列を含む発現ベクターとすることができ、又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む医薬組成物とすることができ、ガイドＲＮＡはヒト免疫不全ウイルス中の核酸配列に相補的であり、又は組成物は、核酸配列を含む発現ベクターとすることができる。一部の実施形態においては、遺伝子編集複合体は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチド及びガイドＲＮＡを含むことができ、ガイドＲＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス中の核酸配列に相補的である。
【０１０８】
組成物が核酸又はポリペプチドとして投与されるかどうかにかかわらず、それらは、哺乳動物細胞による取り込みを促進するような方法で処方される。有用なベクター系及び処方については上述した。一部の実施形態においては、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。本発明はそのように限定されないが、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤及びペルフルオロ化学液体を用いた化学的導入などの別のＤＮＡ送達方法も企図され、電気穿孔法、微量注入、弾道粒子、「遺伝子銃」システムなどの物理的送達方法も同様である。
【０１０９】
標準の方法、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを検出する免疫測定法、又はｇＲＮＡを検出するＰＣＲなどの核酸ベースのアッセイを使用して、複合体が取り込まれ、それが導入された細胞によって発現されることを確認することができる。次いで、操作された細胞は、それらが後述するように誘導された対象に再導入することがでる。
【０１１０】
遺伝子編集複合体は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９と、レトロウイルス標的配列、例えばＨＩＶ標的配列に相補的なガイドＲＮＡとを含む。遺伝子編集複合体は、種々の変異をプロウイルスＤＮＡに導入することができる。こうした変異がウイルスを不活性化する機序は様々であり、例えば、変異は、プロウイルス複製、ウイルス遺伝子発現又はプロウイルス切り出しに影響を及ぼし得る。変異は、制御配列又は構造遺伝子配列中に位置することができ、ＨＩＶの不完全な産生をもたらし得る。変異は、欠失を含み得る。欠失のサイズは、単一ヌクレオチド塩基対〜約１０，０００塩基対であり得る。一部の実施形態においては、欠失は、プロウイルス配列のすべて又は実質的にすべてを含み得る。一部の実施形態においては、欠失は、全プロウイルス配列を含み得る。変異は、挿入、すなわち、プロウイルス配列への１個以上のヌクレオチド塩基対の追加を含み得る。挿入配列のサイズも、例えば、約１塩基対〜約３００ヌクレオチド塩基対で変動し得る。変異は、点変異、すなわち、別のヌクレオチドによる単一ヌクレオチドの置換を含み得る。有用な点変異は、機能的結果を有するもの、例えば、アミノ酸コドンの終止コドンへの変換をもたらす変異、又は非機能タンパク質の産生をもたらす変異である。
【０１１１】
宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する例示的な多重方法においては、実施例２〜５に示されるように、２つの異なるｇＲＮＡ配列が配置され、各ｇＲＮＡ配列は、プロウイルスＤＮＡ中の異なる部位を標的にする。すなわち、方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、プロウイルスＤＮＡ中の第１の標的プロトスペーサー配列に相補的である第１のスペーサー配列を有する第１のｇＲＮＡをコードする単離核酸配列と、プロウイルスＤＮＡ中の第２の標的プロトスペーサー配列に相補的である第２のスペーサー配列を有する第２のｇＲＮＡをコードする単離核酸とを含む組成物に宿主細胞を暴露するステップ、宿主細胞中でＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、第１のｇＲＮＡ、及び第２のｇＲＮＡを発現するステップ、宿主細胞中で、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと第１のｇＲＮＡとを含む第１の遺伝子編集複合体、及びＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと第２のｇＲＮＡとを含む第２の遺伝子編集複合体を構築するステップ、第１のスペーサー配列と第１の標的プロトスペーサー配列の相補的塩基対合によって、第１の遺伝子編集複合体を第１の標的プロトスペーサー配列に誘導するステップ、第２のスペーサー配列と第２の標的プロトスペーサー配列の相補的塩基対合によって、第２の遺伝子編集複合体を第２の標的プロトスペーサー配列に誘導するステップ、プロウイルスＤＮＡを第１の標的プロトスペーサー配列においてＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを用いて切断するステップ、プロウイルスＤＮＡを第２の標的プロトスペーサー配列においてＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを用いて切断するステップ、及び少なくとも１個の変異をプロウイルスＤＮＡ中で誘導するステップを含む。同じ多重方法は、ヒト免疫不全ウイルスを有する対象を治療する方法、及びヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを低減する方法に容易に導入される。「組成物」という用語は、成分の混合物だけでなく、必ずしも同時に投与されない別々の成分を含むことができることを理解されたい。非限定的一例として、本発明に係る組成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡをコードする核酸配列の別々の成分調製物を含むことができ、各成分は、宿主細胞が全３成分に暴露される期間に、順次注入投与される。
【０１１２】
別の実施形態においては、組成物は、１個以上のＣａｓ／ｇＲＮＡベクターを形質転換又は導入された細胞を含む。一部の実施形態においては、本発明の方法は、生体外で適用することができる。すなわち、対象の細胞を体から取り出し、培養中に組成物で処理して、ＨＩＶ配列を切り出し、処理細胞を対象の体に戻すことができる。細胞は、対象の細胞とすることができ、又はそれらは、ハプロタイプが一致したもの、又は細胞系とすることができる。細胞を照射して複製を防止することができる。一部の実施形態においては、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）が一致した自己の細胞系、又はそれらの組合せである。別の実施形態においては、細胞は幹細胞とすることができる。例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含めた多数の動物種から樹立されている。これらのタイプの多能性幹細胞は、最も有用な再生医療用細胞源であろう。なぜなら、これらの細胞は、それらの分化の適切な誘導によってほぼすべての器官に分化可能であり、それらの多能性を維持しながら、活発に分裂する能力を保持するからである。ｉＰＳ細胞は、特に、自己由来の体細胞から樹立することができ、したがって胚の破壊によって生成されるＥＳ細胞に比べて、倫理的及び社会的問題を引き起こしそうにない。さらに、ｉＰＳ細胞は、自己由来の細胞であり、再生医療又は移植療法の最大の障壁である拒絶反応を回避することができる。
【０１１３】
ｇＲＮＡ発現カセットは、当該技術分野で公知の方法、例えば、ｓｉＲＮＡを送達する方法によって対象に容易に送達することができる。一部の態様においては、Ｃａｓは、断片とすることができ、Ｃａｓ分子の活性なドメインが含まれ、それによって分子のサイズを削減することができる。したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子は、現在の遺伝子療法による手法と同様に、臨床的に使用することができる。特に、細胞移植療法及びＨＩＶ−１ワクチン接種用のＣａｓ９／多重ｇＲＮＡ安定発現幹細胞又はｉＰＳ細胞が、対象における使用のために開発されるであろう。
【０１１４】
導入細胞は、確立された方法に従って再注入用に調製される。約２〜４週間の培養後、細胞は、数が１×１０６〜１×１０１０になり得る。この点で、細胞の増殖特性は、患者ごとに、また、細胞型ごとに異なる。導入細胞の再注入の約７２時間前に、表現型、及び治療薬を発現する細胞の割合の分析のために一定分量を採取する。投与の場合、本発明の細胞は、患者の体重（ｍａｓｓ）及び健康全般に適用して、細胞型のＬＤ５０及び種々の濃度における細胞型の副作用で決まる速度で投与することができる。投与は単一又は分割用量で行うことができる。成体幹細胞は、それらの生成を刺激する体外から投与された因子を用いて動員することもでき、骨髄又は脂肪組織を含めて、ただしそれらに限定されない、組織又は空間から出てくる場合もある。
【０１１５】
製品
本明細書に記載の組成物は、例えば、レトロウイルス感染症、例えば、ＨＩＶ感染症を有する対象、又はレトロウイルス感染症、例えば、ＨＩＶ感染症に罹患する対象を治療する療法として使用するために、標識された適切な容器にパッケージすることができる。容器は、意図した用途に適宜、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、又は該核酸をコードするベクター、及び適切な安定剤、担体分子、香味剤などの１種以上を含む組成物を含むことができる。したがって、少なくとも１種の本発明の組成物、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、又は該核酸をコードするベクター、及び使用説明書を含む、パッケージ製品（例えば、本明細書に記載の組成物の１種以上を含み、濃縮又はすぐ使用できる濃度で貯蔵、出荷又は販売のためにパッケージされた、無菌容器）及びキットも本発明の範囲内である。製品は、１種以上の本発明の組成物を含む容器（例えば、バイアル、広口瓶、瓶、袋など）を含むことができる。さらに、製品は、例えば、パッケージング材料、使用説明書、シリンジ、送達装置、緩衝剤、又は予防若しくは治療が必要な症状を治療若しくは監視するための他の管理試薬を更に含むことができる。
【０１１６】
一部の実施形態においては、キットは、１種以上の追加の抗レトロウイルス剤、例えば、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤又は侵入阻害剤を含むことができる。追加の薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、若しくは該核酸をコードするベクターと同じ容器に一緒にパッケージすることができ、又はそれらを別々にパッケージすることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒト免疫不全ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、又は該核酸をコードするベクター、及び追加の薬剤は、使用直前に組み合わせることができ、又は別々に投与することができる。
【０１１７】
製品は、説明文（例えば、印刷したラベル若しくは挿入物、又は製品の使用を述べる他の媒体（例えば、音声テープ又はビデオテープ））を含むこともできる。説明文は、容器に添える（例えば、容器に貼る）ことができ、その中の組成物を投与すべき方法（例えば、投与の回数及び経路）、そのための指示、及び他の用途を記載することができる。組成物は、すぐに投与することができ（例えば、用量の適切な単位で存在）、１種以上の追加の薬学的に許容されるアジュバント、担体若しくは他の希釈剤及び／又は追加の治療薬を含むことができる。あるいは、組成物は、希釈剤及び希釈説明書と一緒に、濃縮形態で提供することができる。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：材料及び方法
プラスミド調製：ヒトＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現カセットを含むベクター、ｐＸ２６０、並びにｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ）を利用して、種々の構築物ＬＴＲ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを調製する。
【０１１９】
細胞培養及び安定細胞系：ＴＺＭ−ｂｌレポーター及びＵ１細胞系をＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから得た。ＣＨＭＥ５小膠細胞は、当該技術分野で既知である。
【０１２０】
免疫組織化学及びウエスタンブロット：細胞の免疫細胞化学的観察及びウエスタンブロットによるタンパク質発現の評価のための標準法を利用した。
【０１２１】
ホタルルシフェラーゼアッセイ：細胞を受動溶解緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて処置後２４時間溶解し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造者の手順に従って分析した。ルシフェラーゼ活性を並行ＭＴＴアッセイ（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で測定した細胞数に対して規準化した。
【０１２２】
ｐ２４ＥＬＩＳＡ：感染又は再活性化後、上清中のＨＩＶ−１ウイルス量のレベルをｐ２４Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）によって製造者の手順に従って定量化した。処理による細胞生存率を評価するために、ＭＴＴアッセイを製造者のマニュアル（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って並行して行った。
【０１２３】
ＥＧＦＰフローサイトメトリー：細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉフローサイトメータ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。
【０１２４】
ＨＩＶ−１レポーターウイルス調製及び感染：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を導入した。４８時間後、上清を収集し、０．４５μｍ濾過し、ＨｅＬａ細胞中でＥＧＦＰを感染マーカーとして用いて滴定した。ウイルス感染のために、安定Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＴＺＭ−ｂｌ細胞を希釈ウイルスストックと一緒に２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。感染後２及び４日目に、細胞を収集し、固定し、フローサイトメトリーによってＥＧＦＰ発現を分析し、又はゲノムＤＮＡ精製をＰＣＲ及び全ゲノム配列決定のために行った。
【０１２５】
ゲノムＤＮＡ増幅、ＰＣＲ、ＴＡクローニング、及びサンガー法、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒリンクＰＣＲ：クローニング及び配列決定のためのＤＮＡ操作の標準法を利用した。ＨＩＶ−１の組み込み部位の特定のために、本発明者らはＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）組み込み部位分析キットを利用した。
【０１２６】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ：ＰＣＲ産物中の変異の存在をＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて製造者の手順に従って調べた。手短に述べると、不均一ＰＣＲ産物を１０分間９５℃で変性し、サーマルサイクラーを用いて徐々に冷却してハイブリッド形成した。次に、ハイブリッド形成ＤＮＡ３００ｎｇ（９μｌ）を、ＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓ０．２５μｌ及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で、ＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ０．２５μｌを用いて４２℃で４時間消化した。次いで、停止液を添加し、試料を等量の未消化ＰＣＲ産物対照と一緒に２％アガロースゲル中で分離させた。
【０１２７】
一部のＰＣＲ産物を制限断片長多型分析に使用した。等量のＰＣＲ産物をＢｓａＪＩを用いて消化した。消化ＤＮＡを臭化エチジウム含有アガロースゲル（２％）上で分離させた。配列決定のために、ＰＣＲ産物をＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ  Ｄｕａｌ  ＰｒｏｍｏｔｅｒとｐＣＲ（商標）ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローン化した。挿入をＥｃｏＲＩ消化によって確認し、陽性クローンをＧｅｎｅｗｉｚに送付し、サンガー法を行った。
【０１２８】
ＬＴＲ標的部位の選択、全ゲノム配列決定及びバイオインフォマティクス及び統計解析。本発明者らは、Ｊａｃｋ  ＬｉｎのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇＲＮＡファインダーツールをＬＴＲ内の潜在的標的部位の最初の特定に利用した。
【０１２９】
プラスミド調製。プレｃｒＲＮＡ用のＬＴＲ−Ａ又はＬＴＲ−Ｂを発現するＤＮＡセグメントを、ピューロマイシン選択遺伝子を含むｐＸ２６０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃４２２２９）中にクローン化した。キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ用のＬＴＲ−Ｃ又はＬＴＲ−Ｄを発現するＤＮＡセグメントを、ｐＸ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃４２２３０）中にクローン化した。両方のベクターは、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるヒト化Ｃａｓ９コード配列、及びヒトＵ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ発現カセットを含む。ベクターをＢｂｓＩで消化し、アンタークティックホスファターゼで処理し、線状化ベクターをＱｕｉｃｋヌクレオチド除去キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。各ターゲティング部位に対する１対のオリゴヌクレオチド（図１４、ＡｌｐｈａＤＮＡ）をアニールし、リン酸化し、線状化ベクターに連結した。ｇＲＮＡ発現カセットをＧＥＮＥＷＩＺにおいてＵ６配列決定プライマー（図１４）を用いて配列決定した。ｐＸ３３０ベクターの場合、本発明者らは、他のベクターへの直接導入又はサブクローニングのためにｇＲＮＡ発現カセット（Ｕ６−ｇＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ステム−ｔｒａｃｒＲＮＡ）を細片にすることができる、オーバーハング消化部位を有する１対のユニバーサルＰＣＲプライマー（図１４）を設計した。
【０１３０】
細胞培養。Ｄｒ  Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｋａｐｐｅｓ、Ｄｒ  Ｘｉａｏｙｕｎ  Ｗｕ及びＴｒａｎｚｙｍｅ  ＩｎｃからのＴＺＭ−ｂｌレポーター細胞系、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  ＦｏｌｋｓからのＵ１／ＨＩＶ−１細胞系、及びＤｒ．Ｅｒｉｃ  ＶｅｒｄｉｎからのＪ−Ｌａｔ完全長クローンを、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨを通して得た。ＣＨＭＥ５／ＨＩＶ胎性小膠細胞系を前述のように生成した。ＴＺＭ−ｂｌ及びＣＨＭＥ５細胞を、１０％非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ最小必須培地高グルコース中で培養した。Ｕ１及びＪ−Ｌａｔ細胞を、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
【０１３１】
安定な細胞系及びサブクローニング。ＴＺＭ−ｂｌ又はＣＨＭＥ５／ＨＩＶ細胞を６ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルで播き、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＸ２６０  １μｇ（ＬＴＲ−Ａ及びＢの場合）又はｐＸ３３０／ｐＸ２６０プラスミド１μｇ／０．１μｇ（ＬＴＲ−Ｃ及びＤの場合）を導入した。翌日、細胞を１００ｍｍ皿に移し、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む増殖培地（Ｓｉｇｍａ）と一緒にインキュベートした。２週間後、生存細胞コロニーをクローニングシリンダー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて単離した。Ｕ１細胞（１．５×１０５）にＮｅｏｎ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において１０μｌチップ、３×１０ｍｓ１４００Ｖインパルスを用いてＤＮＡ１μｇを電気穿孔導入した。細胞を０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて２週間選択した。安定なクローンを限界希釈法によって９６ウェルプレート中で継代培養し、単細胞由来のサブクローンを更なる研究のために維持した。
【０１３２】
免疫細胞化学及びウエスタンブロット。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ安定発現ＴＺＭ−ｂｌ細胞を８ウェルチャンバスライド中で２日間培養し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定した。３回リンス後、細胞を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで２０分間処理し、１０％ロバ血清中で１時間ブロックした。細胞をマウス抗Ｆｌａｇ  Ｍ２一次抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ）と一緒に４℃で終夜インキュベートした。３回リンス後、細胞をロバ抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−５９４二次抗体と一緒に１時間インキュベートし、ヘキスト３３２５８と一緒に５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回リンス後、細胞に抗退色水系封入剤（Ｂｉｏｍｅｄａ）を用いてカバーガラスを載せ、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ蛍光顕微鏡下で分析した。
【０１３３】
６ウェルプレート中で培養したＴＺＭ−ｂｌ細胞を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオトレイトール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１×核抽出プロテイナーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、アナーバー、ＭＩ）、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム及び３０ｍＭ  ＮａＦを含有するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解緩衝剤２００μｌ中で可溶化した。細胞溶解物を４℃で３０分間回転させた。２０，０００ｇで２０分間４℃で遠心分離して、細胞核及び細胞破片を除去した。等量の溶解物タンパク質（２０μｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試料緩衝剤中で５分間煮沸することによって変性し、トリス−グリシン緩衝剤中のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に移した。ＳｅｅＢｌｕｅ着色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分子量基準として使用した。ブロットを５％ＢＳＡ／トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．６）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）で１時間ブロッキングし、次いでマウス抗Ｆｌａｇ  Ｍ２モノクローナル抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）又はマウス抗ＧＡＰＤＨモノクローナル抗体（１：３０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒に４℃で終夜インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、ブロットをＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ複合抗マウス抗体と一緒に室温で１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて膜をスキャンし、分析した。
【０１３４】
ホタルルシフェラーゼアッセイ。細胞を受動溶解緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて処置後２４時間溶解し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造者の手順に従って分析した。ルシフェラーゼ活性を並行ＭＴＴアッセイ（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で測定した細胞数に対して規準化した。
【０１３５】
ｐ２４ＥＬＩＳＡ  感染又は再活性化後、上清中のＨＩＶ−１ウイルス量レベルをｐ２４Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）によって製造者の手順に従って定量化した。処理による細胞生存率を評価するために、ＭＴＴアッセイを製造者の手順（Ｖｙｂｒａｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って並行して行った。
【０１３６】
ＥＧＦＰフローサイトメトリー。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉフローサイトメータ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分析した。
【０１３７】
ＨＩＶ−１レポーターウイルス調製及び感染。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰ、ＳＦ１６２及びＪＲＦＬ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）を導入した。偽型ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰの場合、ＶＳＶＧベクターを同時導入した。４８時間後、上清を収集し、０．４５μｍ濾過し、ＨｅＬａ細胞中で発現ＥＧＦＰを感染マーカーとして用いて滴定した。ウイルス感染のために、安定Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＴＺＭ−ｂｌ細胞を希釈ウイルスストックと一緒に２時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。感染後２及び４日目に、細胞を収集し、固定し、フローサイトメトリーによってＥＧＦＰ発現を分析し、又はゲノムＤＮＡ精製をＰＣＲ及び全ゲノム配列決定のために行った。
【０１３８】
ゲノムＤＮＡ精製、ＰＣＲ、ＴＡクローニング及びサンガー法。ＡｒｃｈｉｖｅＰｕｒｅ  ＤＮＡ細胞／組織精製キット（５ＰＲＩＭＥ）を用いて製造者によって推奨された手順に従ってゲノムＤＮＡを細胞から単離した。図１４に列挙したプライマーを用いた高忠実度ＦａｉｌＳａｆｅ  ＰＣＲキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、抽出ＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲに供した。３ステップの標準ＰＣＲを５５℃アニーリング及び７２℃伸長を含む３０サイクル行った。生成物を２％アガロースゲル中で分離させた。目的のバンドをゲル精製し、ｐＣＲＩＩ  Ｔ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、個々のクローンのヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅｗｉｚにおいてユニバーサルＴ７及び／又はＳＰ６プライマーを用いた配列決定によって決定した。
【０１３９】
従来及びリアルタイム逆転写（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲ。全ＲＮＡ抽出の場合、細胞をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従って処理した。残留する可能性のあるゲノムＤＮＡをＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたオンカラムＤＮＡｓｅ消化によって除去した。各試料用のＲＮＡ１μｇを、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーとＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、グランドアイランド、ＮＹ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。従来のＰＣＲを標準手順によって行った。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）中でＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＲＴ反応物を希釈して、反応物１マイクロリットル当たり全ＲＮＡ５ｎｇとし、２μｌを２０μｌＰＣＲ反応に使用した。ＨＩＶ−１プロウイルスのｑＰＣＲ分析では、ゲノムＤＮＡ５０ｎｇを使用した。プライマーをＡｌｐｈａＤＮＡにおいて合成し、図１４に示した。ヒトハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ及びＲＰＬ１３Ａ用プライマーをＲｅａｌＴｉｍｅＰｒｉｍｅｒｓ（Ｅｌｋｉｎｓ  Ｐａｒｋ、ＰＡ）から得た。各試料を３つ組で試験した。サイクル閾値（Ｃｔ：Ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を標的遺伝子及びハウスキーピング遺伝子についてグラフから得た。ハウスキーピング遺伝子と標的遺伝子のＣｔ値の差をΔＣｔ値として表した。実験試料のΔＣｔ値から対照試料のΔＣｔ値を引くことによってΔΔＣｔ値を得た。相対倍率又は割合を２−ΔΔＣｔとして計算した。場合によっては、絶対的定量化を、ヒトゲノムＤＮＡに添加されたｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰプラスミドを標準として用いて行った。ＨＩＶ−１ウイルスコピーの数を、ハウスキーピング遺伝子を用いた規準化後に検量線に基づいて計算した。
【０１４０】
ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒリンクＰＣＲ及び長距離ＰＣＲ。宿主細胞中のＨＩＶ−１の組み込み部位をＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造者の指示に従って特定した。手短に述べると、高品質ゲノムＤＮＡをＵ１細胞からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて抽出した。ウイルス組み込みライブラリを構築するために、各ゲノムＤＮＡ試料を平滑末端生成消化酵素ＤｒａＩ、ＳｓｐＩ又はＨｐａＩを用いて別々に終夜３７℃で消化した。消化効率を０．６％アガロース上の電気泳動によって確認した。消化ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを用いて精製し、続いて消化ゲノムＤＮＡ断片をＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ａｄａｐｔｏｒに１６℃で終夜連結した。連結反応を７０℃で５分間のインキュベーションによって停止し、ＴＥ緩衝剤で５倍希釈した。一次ＰＣＲをＤＮＡセグメント上でアダプタープライマー１（ＡＰ１：ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｉｍｅｒ  １）及びＬＴＲ特異的プライマー１（ＬＳＰ１：ＬＴＲ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  １）を用い、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを用いて行い、続いて二次（ネステッド）ＰＣＲをＡＰ２及びＬＳＰ２プライマーを用いて行った（図１４）。二次ＰＣＲ産物を１．５％臭化エチジウム含有アガロースゲル上で分離させた。主要なバンドをゲル精製し、ｐＣＲＩＩ  Ｔ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、個々のクローンのヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅｗｉｚにおいてユニバーサルＴ７及びＳＰ６プライマーを用いた配列決定によって決定した。配列の読みをＮＣＢＩブラスト検索によって分析した。Ｕ１細胞中のＨＩＶ−１の２つの組み込み部位を、Ｘ染色体及び第２染色体中で特定した。各組み込み部位をカバーする１対のプライマー（図１４）をＡｌｐｈａＤＮＡにおいて合成した。Ｕ１ゲノムＤＮＡを用いた長距離ＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造者の手順に従って行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で可視化し、サンガー法によって確認した。
【０１４１】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ。ＰＣＲ産物中の変異の存在をＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて製造者の手順に従って試験した。手短に述べると、不均一ＰＣＲ産物を１０分間９５℃で変性し、サーマルサイクラーを用いて徐々に冷却してハイブリッド形成した。次に、ハイブリッド形成ＤＮＡ３００ｎｇ（９μｌ）を、ＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓ０．２５μｌ及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で、ＳＵＲＶＥＹＯＲ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ０．２５μｌを用いて４２℃で４時間消化した。次いで、停止液を添加し、試料を等量の未消化ＰＣＲ産物と一緒に２％アガロースゲル中で分離させた。
【０１４２】
一部のＰＣＲ産物を制限断片長多型分析に使用した。等量のＰＣＲ産物をＢｓａＪＩを用いて消化した。消化ＤＮＡを臭化エチジウム含有アガロースゲル（２％）上で分離させた。配列決定のために、ＰＣＲ産物をＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ  Ｄｕａｌ  ＰｒｏｍｏｔｅｒとｐＣＲ（商標）ＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローン化した。挿入をＥｃｏＲＩ消化によって確認し、陽性クローンをＧｅｎｗｉｚに送付し、サンガー法を行った。
【０１４３】
ＬＴＲ標的部位の選択、及び潜在的オフターゲット部位の予測。初期の研究のために、本発明者らは、継代中のＬＴＲの変異可能性のゆえに、ヒトＴＺＭ−ｂｌ細胞のゲノム由来のＰＣＲ産物のＴＡクローニング配列決定によって、組み込みレンチウイルスＬＴＲ−ルシフェラーゼレポーターのＬＴＲプロモーター配列（−４１１〜−１０）を得た。このプロモーター配列は、ｐＨＲ’−ＣＭＶ−ＬａｃＺレンチウイルスベクター（ＡＦ１０５２２９）の５’−ＬＴＲと１００％一致する。したがって、完全長ｐＨＲ’５’−ＬＴＲ（６３４ｂｐ）のセンス及びアンチセンス配列を利用して、２０ｂｐ  ｇＲＮＡターゲティング配列＋ＰＡＭ配列（ＮＲＧ）を含むＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的部位を、Ｊａｃｋ  ＬｉｎのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇＲＮＡファインダーツールを用いて検索した。各ｇＲＮＡターゲティング配列＋ＮＲＧ（ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＧＧＧ及びＣＧＧ；ＡＡＧ、ＴＡＧ、ＧＡＧ、ＣＡＧ）をすべての利用可能なヒトゲノム及び転写物配列に対してＮＣＢＩ／ｂｌａｓｔｎスイートを用いてＥ値カットオフ１，０００及びワードサイズ７でブラストすることによって、正確に一致する潜在的オフターゲットの数を予測した。Ｃｏｎｔｒｏｌ＋Ｆを押した後、標的配列（１〜２３から９〜２３ヌクレオチド）をコピー／ペーストし、標的配列に１００％一致するゲノム標的の数を見つける。ゲノムライブラリの繰り返しのために、各検索のオフターゲット数を３で割る。
【０１４４】
全ゲノム配列決定及びバイオインフォマティクス分析。ＴＺＭ−ｂｌ細胞の対照サブクローンＣ１及び実験サブクローンＡＢ７を、標的切断効率及びＬＴＲ−ルシフェラーゼレポーターの機能的抑制について検証した。ゲノムＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて単離した。ＤＮＡ試料をＴｅｍｐｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＮｅｘｔＧｅｎ配列決定施設に提出した。重複ゲノムＤＮＡライブラリをＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いて製造者の指示に従って各サブクローンから調製した。ＨｉＳｅｑ２５００装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上の２個のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｒａｐｉｄ  Ｒｕｎフローセル中でのペアエンド１４１ｂｐ読み取りによって全ライブラリの配列を決定した。配列決定されたライブラリからの多重分離読み取りデータをＡｃｃｕｒａＳｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣに送付して、専門のバイオインフォマティクス分析を行った。手短に述べると、生の読み取りをヒトゲノム（ｈｇ１９）及びＨＩＶ−１ゲノムに対してＢｏｗｔｉｅ２を用いてマッピングした。ゲノム分析ツールキット（ＧＡＴＫ、バージョン２．８．１）を重複読み取り除去、局所アラインメント、塩基品質再較正及びインデルコールに使用した。信頼度スコア１０及び３０を低品質（ＬｏｗＱｕａｌ）及び高信頼度コーリング（合格）の閾値とした。種々のミスマッチのＬＴＲ−Ａ及びＬＴＲ−Ｂの潜在的オフターゲット部位を上述したＮＣＢＩ／ｂｌａｓｔｎスイート及びＣＲＩＳＰＲ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌによって予測した。全潜在的ｇＲＮＡ標的部位（図１５）を使用して、ＧＡＴＫによって特定された各インデルの周囲の±３００ｂｐ領域をマッピングした。ヒトゲノム及びＨＩＶ−１ゲノムにおける重複領域の位置を対照Ｃ１と実験ＡＢ７で比較した。
【０１４５】
統計解析。定量的データは、３〜５つの独立した実験からの平均±標準偏差であり、スチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡ及びＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較試験によって評価した。＜０．０５又は０．０１であるｐ値を、統計的に有意な差とみなした。
【０１４６】
実施例２：Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡは、ＨＩＶ−１に潜伏感染したＣＨＭＥ５小膠細胞におけるＨＩＶ−１レポーターウイルス産生を抑制する
本発明者らは、ＬＴＲ転写活性を抑制し、特に難治性標的集団における、脳中のＨＩＶ−１貯蔵器として働く潜伏感染骨髄細胞のゲノムからプロウイルスＤＮＡを根絶する、ＨＩＶ−１指向ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の能力を評価した。本発明者らの戦略は、ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーターＵ３領域を標的にすることに焦点を合わせた。生物情報スクリーニング及び効率／オフターゲット予測によって、本発明者らは、保存転写因子結合部位を回避し、宿主遺伝子発現を変化させる可能性を最小限にする、４個のｇＲＮＡ標的（プロトスペーサー、ＬＴＲ  Ａ〜Ｄ）を特定した（図５及び１３）。本発明者らは、ｇＲＮＡ  Ａ〜Ｄに相補的なＤＮＡ断片をヒト化Ｃａｓ９発現ベクター（Ａ／ＢはｐＸ２６０、Ｃ／ＤはｐＸ３３０）に挿入し、組み込みＨＩＶ−１ゲノム活性を変えるそれらの個々及び組み合わせの能力を試験した。本発明者らは、まず、５’及び３’ＬＴＲを含む単回ＨＩＶ−１ベクターの組み込みコピーを内部に有する小膠細胞系ＣＨＭＥ５、並びにＧａｇを置換する高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター（ｐＮＬ４−３−ΔＧａｇ−ｄ２ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子を利用した。ＣＨＭＥ５細胞をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理すると、組み込みプロウイルスの大部分からの転写が再活性化され、ＥＧＦＰ及び残りのＨＩＶ−１プロテオームが発現した。ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ９の発現は、ＴＳＡ誘導ＥＧＦＰ陽性ＣＨＭＥ５細胞の画分を著しく減少させた（図１Ａ及び６）。本発明者らは、Ｃｅｌ  Ｉヌクレアーゼベースのヘテロ二重鎖特異的ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってＬＴＲ  Ａ〜Ｄの挿入／欠失遺伝子変異（インデル）を検出した（図１Ｂ及び６Ｂ）。同様に、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する安定に取り込まれたＨＩＶ−１ＬＴＲコピーを含む、ＨｅＬａ駆動ＴＺＭ−ｂｌ細胞におけるＬＴＲ  Ｃ及びＤを標的にするｇＲＮＡの発現は、ウイルスプロモーター活性を抑制し（図７Ａ）、ＳＵＲＶＥＹＯＲ及びサンガー法によって示されるようにＬＴＲ  Ｕ３領域内のインデルを誘発した（図７Ｂ〜Ｄ）。さらに、これらの細胞におけるＬＴＲ  Ｃ／Ｄを標的にするｇＲＮＡの組み合わせ発現は、予測３０２ｂｐウイルスＤＮＡ配列の切り出し、及び残留１９４ｂｐ断片の出現をもたらした（図７Ｅ〜Ｆ）。
【０１４７】
混合クローンＣＨＭＥ５細胞におけるＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡの多重発現は、Ａ標的部位とＢ標的部位の間の１９０ｂｐ断片の欠失を生じ、様々な程度にインデルをもたらした（図１Ｃ〜Ｄ）。２０種を超えるピューロマイシン選択安定サブクローンの中で、本発明者らは、ＥＧＦＰフローサイトメトリーで判断してＴＳＡ誘導ＨＩＶ−１プロウイルス再活性化が完全に遮断された細胞集団を見つけた（図１Ｅ）。プロウイルスゲノムにおけるＥＧＦＰ及びＨＩＶ−１Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）のＰＣＲに基づく分析によって、ＨＩＶ−１ゲノムの根絶が確認された（図１Ｆ、Ｇ）。さらに、ＰＣＲ産物の配列決定によれば、５’−３’ＬＴＲに及ぶウイルスゲノム全体が欠失し、切断部位ＡとＢの間の１９０ｂｐ切り出しによって３５１ｂｐ断片が生成し（図１Ｇ及び８）、１７５ｂｐ挿入及び２７ｂｐ欠失をそれぞれＬＴＲ−Ａ及び−Ｂ部位に有する６８２ｂｐ断片が生成した（図８Ｃ）。残留ＨＩＶ−１ゲノム（図１Ｆ〜Ｈ）は、微量のＣａｓ９／ｇＲＮＡ陰性細胞の存在を反映している可能性がある。これらの結果によれば、ＬＴＲを標的にするＣａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂは、潜伏感染小膠細胞におけるＨＩＶ−１ゲノムを根絶し、その再活性化を阻止する。
【０１４８】
実施例３：Ｃａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡは、Ｕ１単核球細胞からの潜伏ＨＩＶ−１ウイルスを効率的に根絶する
感染血管周囲マクロファージ及び単球のＨＩＶ−１潜伏モデルである前単球Ｕ−９３７細胞サブクローンＵ１は、慢性的にＨＩＶ−１に感染し、低レベルの恒常的なウイルス遺伝子発現及び複製を示す。ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒマッピングは、Ｕ１細胞の染色体Ｘｐ１１−４（図２Ａ）及び２ｐ２１（図９Ａ）に２個の組み込みプロウイルスＤＮＡコピーを検出した。全９７０９ｂｐプロウイルスＨＩＶ−１ＤＮＡ＋隣接２２６ｂｐ  Ｘ染色体由来配列を表す９９３５ｂｐ  ＤＮＡ断片（図２Ａ）、及び９７０９ｂｐ  ＨＩＶ−１ゲノム＋その隣接第２染色体由来４６７ｂｐを含む１０１７６ｂｐ断片（図９Ａ、Ｂ）が、親対照又は空ベクター（Ｕ６−ＣＡＧ）Ｕ１細胞の長距離ＰＣＲ分析によって特定された。２２６ｂｐ及び４６７ｂｐ断片は、組み込みプロウイルスＤＮＡのない、それぞれＸ染色体及び第２染色体の別のコピーからの予測セグメントである。ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡ及びＣａｓ９を発現するＵ１細胞においては、本発明者らは、８３３及び６７０ｂｐの２個の追加のＤＮＡ断片をＸ染色体に見つけ、１個の追加の１１０２ｂｐ断片を第２染色体に見つけた。したがって、ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂによって、Ｃａｓ９は、ＨＩＶ−１  ５’−３’ＬＴＲに及ぶウイルスゲノムセグメントを両方の染色体において切り出すことができた。８３３ｂｐ断片は、宿主ゲノム由来の予想２２６ｂｐと、２７ｂｐ欠失をＬＴＲ−Ａ部位周囲に有する６０７ｂｐウイルスＬＴＲ配列とを含む（図２Ａ〜Ｂ）。６７０ｂｐ断片は、２２６ｂｐ宿主配列と、両方のＬＴＲにおけるｇＲＮＡ−Ａ／Ｂ誘導切断に起因する１９０ｂｐ断片切り出し（図１Ｄ）後の残留４４４ｂｐウイルスＬＴＲ配列とを含む（図２Ａ）。追加の断片は、環状ＬＴＲ組み込みでは出現しなかった。というのは、それが、親Ｕ１細胞に欠けていたからであり、こうした環状ＬＴＲウイルスゲノム構造は、ＨＩＶ−１感染直後に生じるが、短命であり、繰り返しの継代に耐えられない。これらの細胞は、機能的ｐ２４ＥＬＩＳＡ複製アッセイ（図２Ｃ）及びリアルタイムＰＣＲ分析（図９Ｃ、図９Ｄ）で示されるように、ＨＩＶ−１ウイルス量がかなり減少した。検出可能ではあるが少ない残留ウイルス量及び再活性化は、細胞集団の不均一性及び／又は不完全なゲノム編集に起因し得る。本発明者らは、さらに、組み込みＨＩＶ−Ｒ７／Ｅ−／ＥＧＦＰを内部に有する潜伏感染Ｊ−Ｌａｔ  Ｔ細胞におけるＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡによるＨＩＶ−１ゲノムの除去を、フローサイトメトリー分析、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ及びＰＣＲ遺伝子型同定によって確認した（図１０）。これは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ及びＺＦＮによるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルス除去についての既報の結果を支持するものである。総合すると、本発明者らの結果は、多重ＬＴＲ−ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９系が、ヒト潜伏ＨＩＶ−１感染症に典型的な潜在的にＨＩＶ−１に感染した「貯蔵器」（小膠、単核球及びＴ）細胞において、また、ＨＩＶ−１転写及び再活性化の検出に高感度なＴＺＭ−ｂｌ細胞において、ＨＩＶ−１複製及び再活性化を効率的に抑制することを示唆している。５’−及び３’−ＬＴＲを標的にする単一又は多重ｇＲＮＡは、全ＨＩＶ−１ゲノムを効果的に根絶した。
【０１４９】
実施例４：Ｃａｓ９＋ＬＴＲ−Ａ／Ｂの安定発現は、ＴＺＭ−ｂｌ細胞において新しいＨＩＶ−１ウイルス感染のワクチンとなる
本発明者らは、次に、組み合わせＣａｓ９／ＬＴＲ  ｇＲＮＡが、安定なＣａｓ９／ｇＲＮＡ−Ａ及び−Ｂ発現ＴＺＭ−ｂｌベースのクローンを用いてＨＩＶ−１感染に対して細胞を免疫できるかどうか試験した（図３Ａ）。７種のピューロマイシン選択サブクローンのうち２種が、１９０ｂｐ  ＬＴＲ−Ａ／Ｂ部位に及ぶＤＮＡ断片を効率的に切り出した（図３Ｂ）。しかし、残りの５種のサブクローンは、サンガー法で確認して、切り出しがなく（図３Ｂ）、インデル変異もなかった。Ｃａｓ９及びＵ６−ＬＴＲを標的にするプライマーを用いたＰＣＲ遺伝子型同定によれば、これらの無効のサブクローンのいずれもＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡ発現カセットの組み込みコピーを保持しなかった。（図１１Ａ、図１１Ｂ）。その結果、完全長Ｃａｓ９の発現は検出されなかった（図１１Ｃ、図１１Ｄ）。Ｃａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡの長期発現は、細胞増殖又は生存率に悪影響を及ぼさず、このモデルにおける宿主ゲノムとのオフターゲット干渉又はＣａｓ９誘導毒性の低発生率を示唆している。本発明者らは、細胞をＶＳＶＧ偽型ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰレポーターウイルスに感染させることによって新規ＨＩＶ−１複製を評価した。フローサイトメトリーによるＥＧＦＰ陽性は、ＨＩＶ−１複製を示す。対照Ｕ６−ＣＡＧ細胞とは異なり、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＬＴＲ−Ａ／Ｂを安定に発現する細胞は、感染後２日目にＨＩＶ−１複製を支持することができず、それらが、新しいＨＩＶ−１感染に対して有効に免疫されたことを示している（図３Ｃ及び図３Ｄ）。ＨＩＶ−１に対する同様の免疫は、天然Ｔ細胞指向性Ｘ４系統ｐＮＬ４−３−ΔＥ−ＥＧＦＰレポーターウイルス（図１２Ａ）又はＳＦ１６２、ＪＲＦＬなどの天然マクロファージ指向性Ｒ５系統（図１２Ｂ、図１２Ｃ及び図１２Ｄ）に感染したＣａｓ／ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡ発現細胞において認められた。
【０１５０】
実施例５：ヒトゲノムに対するＣａｓ９／ＬＴＲ−Ａ／Ｂのオフターゲット効果
介入手法としてのＣａｓ９／ｇＲＮＡの魅力は、その極めて特異的なオンターゲットインデル生成切断にあるが、多重ｇＲＮＡは、宿主ゲノム変異誘発及び染色体異常、細胞毒性、遺伝毒性、又は発癌を引き起こす可能性がある。かなり低いウイルス−ヒトゲノム相同性は、このリスクを低下させるが、ヒトゲノムは、ＨＩＶ−１指向ｇＲＮＡに潜在的に影響されやすい多数の内在性レトロウイルスゲノムを含む。したがって、本発明者らは、ヒトゲノムに対する選択ＨＩＶ−１  ＬＴＲ  ｇＲＮＡのオフターゲット効果を評価した。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）領域（ＮＧＧ）に最も近い１２〜１４ｂｐシード配列は、切断特異性に重要であるので、本発明者らは＞１４ｂｐシード＋ＮＧＧを検索したが、ＬＴＲ  ｇＲＮＡ  Ａ〜Ｄによるオフターゲット候補部位は見つからなかった（図１３）。ｇＲＮＡセグメントが次第に短くなると、対応するオンターゲット配列に１００％一致するオフターゲット切断部位が増加することは驚くことではない（すなわち、ＮＧＧ＋１３ｂｐは、それぞれ６、０、２及び９個のオフターゲット部位を生成し、一方、ＮＧＧ＋１２ｂｐは、１６、５、１６及び２９個を生成した、図１３）。ヒトゲノムＤＮＡから、本発明者らは、予測オフターゲット部位の１個をカバーする５００〜８００ｂｐ配列を高忠実度ＰＣＲによって得て、潜在的変異をＳＵＲＶＥＹＯＲ及びサンガー法によって分析した。本発明者らは、変異を見いださなかった（ＴＺＭ−ｂｌ及びＵ１細胞における代表的オフターゲット部位＃１、５及び６参照、図４Ａ）。
【０１５１】
オフターゲット効果のリスクを包括的に評価するために、本発明者らは、安定Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  Ａ／Ｂ発現及び対照Ｕ６−ＣＡＧ  ＴＺＭ−ｂｌ細胞を用いて全ゲノム配列決定（ＷＧＳ：ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った（図４Ｂ、図４Ｃ及び図４Ｄ）。本発明者らは、ヒト（ｈｇ１９）及びＨＩＶ−１ゲノムを参照配列として用いたゲノム分析ツールキット（ＧＡＴＫ、ｖ．２．８．１）を用いて６７６，１０５個のインデルを特定した。インデルのうち、２４％はＵ６−ＣＡＧ対照で発生し、２６％はＬＴＲ−Ａ／Ｂサブクローンで発生し、５０％は両方で発生した（図４Ｂ）。こうした実質的な試料間のインデルコールの不一致は、ほぼ確実なオフターゲット効果を示唆しているが、その限定的な信頼度、限定的なＷＧＳカバレッジ（１５〜３０Ｘ）、及び細胞不均一性に起因する可能性が高い。ＧＡＴＫは、確実に特定されたインデルのみを報告し、一部はＵ６−ＣＡＧ対照に見られるが、ＬＴＲ−Ａ／Ｂサブクローンには見られず、他の一部はＬＴＲ−Ａ／Ｂに見られるが、Ｕ６−ＣＡＧには見られなかった。本発明者らは、限定的なＷＧＳカバレッジのために、両方の試料で多量のインデルコールが見つからないと予想した。こうした限定的なインデルコール信頼度は、インデルの見逃しがＬＴＲ−Ａ／Ｂで起こるが、Ｕ６−ＣＡＧ対照では起こらない、偽陰性の可能性も暗示する。細胞の不均一性は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ編集効率及び継代の効果の変わりやすさを反映している可能性がある。したがって、本発明者らは、各インデルがＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡによって誘導されるかどうかを、ＨＩＶ−１ゲノムのＬＴＲ−Ａ／−Ｂ標的部位及び宿主ゲノムの予測／潜在的ｇＲＮＡオフターゲット部位に対する各インデルに隣接する±３００ｂｐを分析することによって試験した（図１５）。シード（１２ｂｐ）＋ＮＲＧを含むものに１００％一致する配列の場合、本発明者らは、６７６，１０５個のインデルに対して９２個の潜在的オフターゲット部位の８つの重複領域のみを特定した：６個のインデルは両方の試料で発生するが、Ｕ６−ＣＡＧ対照では２個しか発生しない（図４Ｃ、図４Ｄ）。本発明者らは、ＬＴＲ−Ａ／Ｂサブクローンでのみ発生し、予想どおりにＵ６−ＣＡＧ対照では発生しない、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ上の２個のインデルも特定した（図４Ｃ）。結果は、ＬＴＲ−Ａ／Ｂ  ｇＲＮＡが、示したオンターゲットインデルを誘導するが、オフターゲットインデルを誘導しないことを示唆しており、予測／潜在的オフターゲット部位をカバーするＰＣＲ産物のディープシーケンシングによる先の知見と一致する。
【０１５２】
本発明者らの組み合わせ手法は、ゲノム組み込みＨＩＶ−１プロウイルスの高効率で完全な除去を実現しながら、オフターゲット効果を最小限にした。外来性ウイルスゲノムと内在性レトロウイルスＤＮＡを含む宿主細胞ゲノムとの極めて低い相同性に加えて、本発明者らの研究における重要な設計属性は、潜在的オフターゲット効果を特定し、除外するために、オフターゲットヒトトランスクリプトーム又は（さらにまれではあるが）非翻訳ゲノム部位を除外する最も厳格な１２ｂｐ＋ＮＧＧ標的選択基準を用いた生物情報スクリーニング、（宿主ゲノムに潜在的に保存された）ＨＩＶ−１ＬＴＲプロモーター内の転写因子結合部位を回避すること、ＬＴＲ−Ａ及び−Ｂ指向、３０ｂｐ  ｇＲＮＡ、並びに特異性／効率を高める独自の細菌免疫機構を反映したプレｃｒＲＮＡ系ｖｓ．２０ｂｐ  ｇＲＮＡ−、キメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃＲＮＡベースの系の選択、並びにＷＧＳ、サンガー法及びＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを含んだ。実際、新規開発されたＣａｓ９二重ニッキング及びＲＮＡ誘導型ＦｏｋＩヌクレアーゼの使用は、オフターゲット効果を抑制しながら、ＨＩＶ−１の様々な保存領域内の新しい標的の特定を更に支援することができる。
【０１５３】
本発明者らの結果によれば、ＨＩＶ−１  Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系は、異なる染色体上に位置する、ＬＴＲの１個を超えるコピーを標的にする能力を有し、このゲノム編集系が、複数のプロウイルスＤＮＡを内部に有する潜伏感染患者の細胞中のＨＩＶ−１のＤＮＡ配列を変え得ることを示唆している。本発明者らの技術の高い編集効力及び一貫性を更に確実にするために、ＨＩＶ−１ゲノムの最も安定な領域を標的とみなして、ＨＩＶ−１の１系統のみを内部に有するとは限らない患者試料におけるＨＩＶ−１を根絶することができる。あるいは、治療Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子を操作する前に、患者由来のウイルスゲノムのディープシーケンシングからのデータに基づく個別化された処置法を開発することができる。
【０１５４】
本発明者らの結果は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡゲノム編集を使用して、ＨＩＶ−１感染症に対して細胞を免疫できることも示している。系はウイルスが感染細胞に入る方法にかかわらずゲノム配列を標的にするので、予防ワクチン接種は、ＨＩＶ−１系統の多様性とは無関係である。細胞中にＣａｓ９／ｇＲＮＡ系が先在すると、新しいＨＩＶ−１は、宿主ゲノムに合体する前に、迅速に除去される。ハイリスクな対象を免役するためのＣａｓ９／ＬＴＲ−ｇＲＮＡの様々な送達系、例えば、ＨＩＶ−１感染を根絶するための遺伝子療法（ウイルスベクター及びナノ粒子）並びに自己Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ修飾骨髄幹／前駆細胞又は誘導多能性幹細胞の移植を探究することができる。
【０１５５】
ここで、本発明者らは、ＨＩＶ−１標的ゲノムを編集するＣａｓ９／ｇＲＮＡの高い特異性を示した。サブクローンデータからの結果は、ゲノム編集がＣａｓ９とｇＲＮＡの両方の存在に厳密に依存することを明らかにした。さらに、設計ｇＲＮＡ標的におけるわずか１つのヌクレオチドミスマッチが編集効力を無にする。さらに、本発明者らの４種の設計ＬＴＲ  ｇＲＮＡのすべてが、異なる細胞系で十分機能し、編集が宿主細胞ゲノムよりもＨＩＶ−１ゲノムで効率的であることが示されたが、エピジェネティック調節の違い、ゲノム利用可能性のばらつきなどの理由から、すべての設計ｇＲＮＡが機能的とは限らない。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ開発の容易性及び迅速性を考慮すると、ＨＩＶ−１変異が１つのＣａｓ９／ｇＲＮＡベースの療法に耐性を生じても、上述したように、ＨＩＶ−１変異体の遺伝子型を同定して、別の個別化された療法を個々の患者に可能にすることができる。
【０１５６】
本発明の幾つかの実施形態を記述した。それでも、種々の改変が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解されたい。したがって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
【０１５７】
参考文献
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  Ｌ，  Ｓｅｏｗ  Ｙ，  Ｙｉｎ  Ｈ，  Ｂｅｔｔｓ  Ｃ，  Ｌａｋｈａｌ  Ｓ，  ＭＪＡ  Ｗｏｏｄ．  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１１，  ２９：  ３４１−３４５．
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ＢＰ，  Ｐａｔｔａｎａｙａｋ，  Ｐｒｅｗ  ＭＳ，  Ｔｓａｉ  ＳＱ，  Ｎｇｕｙｅｎ  ＮＴ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚ，  Ｊｏｕｎｇ  ＪＫ．  Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１６）．  ＤＯＩ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１６５２６．
Ｋｏｏｉｊｍａｎｓ  ＳＡＡ，  Ｖａｄｅｒ  Ｐ，  Ｄｏｍｍｅｌｅｎ  ＳＭ，  ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅ  ＷＷ，  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｍ  Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ  ＲＭ．  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｎａｎｏｍｅｄ．  ２０１２，  ７：  １５２５−１５４１．
Ｍａｒｃｕｓ  ＭＥ，  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ  ＪＮ．  ＦｅｄＥｘｏｓｏｍｅｓ：  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｒｕｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２１０３，  ６：  ６５９−６８０．
Ｓｈｔａｍ  ＴＡ，  Ｋｏｖａｌｅｖ  ＲＡ，  Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖａ  ＥＹ，  Ｍａｋａｒｏｖ  ＥＭ，  Ｋｉｌ  ＹＶ，  Ｆｉｌａｔｏｖ  ＭＶ．  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｒｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２０１３，  １１：８８  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１１／１／８８）．
Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ＩＭ，  Ｇａｏ  Ｌ，  Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ，  Ｓｃｏｔｔ  ＤＡ，  Ｙａｎ  ＷＸ，  Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ  Ｆ．  Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１５  ［ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７］．
Ｓｕｎ  Ｗ，  Ｊｉａｎｇ  Ｔ，  Ｙｕｅ  Ｌｕ  Ｙ，  Ｒｅｉｆｆ  Ｍ，  Ｍｏ  Ｒ，  Ｚｈｅｎ  Ｇｕ  Ｚ．  Ｃｏｃｏｏｎ−ｌｉｋｅ  ｓｅｌｆ−ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｃｌｅｗ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１４，  １３６：１４７２２−１４７２５．
Ｓｕｎ  Ｗ，  Ｊｉ  Ｗ，  Ｈａｌｌ  ＪＭ，  Ｈｕ  Ｑ，  Ｗａｎｇ  Ｃ，  Ｂｅｉｓｅｌ  ＣＬ，  Ｇｕ  Ｚ．  Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ＤＮＡ  ｎａｎｏｃｌｅｗｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２０１５：  １２０２９−１２０３３．
【図１】
2019506156.tif 000004
【図２】
2019506156.tif 000005
【図３】
2019506156.tif 000006
【図４】
2019506156.tif 000007
【図５】
2019506156.tif 000008
【図６】
2019506156.tif 000009
【図７】
2019506156.tif 000010
【図８】
2019506156.tif 000011
【図９】
2019506156.tif 000012
【図１０】
2019506156.tif 000013
【図１１】
2019506156.tif 000014
【図１２】
2019506156.tif 000015
【図１３】
2019506156.tif 000016
【図１４−１】
2019506156.tif 000017
【図１４−２】
2019506156.tif 000018
【図１５−１】
2019506156.tif 000019
【図１５−２】
2019506156.tif 000020
【図１５−３】
2019506156.tif 000021
【図１５−４】
2019506156.tif 000022
【図１６】
2019506156.tif 000023
【図１７】
2019506156.tif 000024
【図１８】
2019506156.tif 000025
【図１９】
2019506156.tif 000026
【配列表】
2019506156000001.app
【国際調査報告】
2019506156.tif 000027