(57)【要約】  本発明は，ＦＧＦ２活性を有し，かつ配列番号：２（ＦＧＦ２ ｗｔ）の配列又はその断片に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し，かつ，少なくともアミノ酸置換Ｒ３１Ｌを含む熱安定性ポリペプチド，及び，細胞生物学研究，再生医療及び関連する医療用途又は化粧品におけるその使用を提供する。本発明はさらにヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方を含むヒト多能性幹細胞の培養に適する，ＦＧＦ２を含む培地を開示する。
2019500414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ２活性を有し，かつ配列番号：２の配列又はその断片に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し，かつ，少なくともアミノ酸置換Ｒ３１Ｌを含む熱安定性ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号：２又はその断片を有し，かつ少なくともアミノ酸置換Ｒ３１Ｌを含むことを特徴とする請求項１記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項３】
Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐから成る群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換をさらに含む請求項１又は２記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがアミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ及びＨ５９Ｆを含むことを特徴とする請求項３記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項５】
Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐから成る群から選択される少なくとも５つのアミノ酸置換をさらに含む請求項１〜４いずれか１項記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが，アミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅを含むことを特徴とする請求項５記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項７】
Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐから成る群から選択される少なくとも８個のアミノ酸置換をさらに含む請求項１〜６いずれか１項記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが，アミノ酸置換Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅを含む請求項７記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが，アミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを含む請求項７記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐから成る群から選択される少なくとも１０個のアミノ酸置換をさらに含む請求項１〜９いずれか１項記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項１１】
．前記ポリペプチドが，アミノ酸置換Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを含む請求項１０記載の熱安定性ポリペプチド。
【請求項１２】
再生医療及び他の医療用途で使用される請求項１〜１１いずれか１項による熱安定性ポリペプチド。
【請求項１３】
．  化粧品のための請求項１〜１１いずれか１項による熱安定性ポリペプチドの使用。
【請求項１４】
請求項１〜１１いずれか１項記載された有効量の熱安定性ポリペプチドを培地の１．０ng/μl〜１００ng/μlの範囲で含む未分化状態のヒト多能性幹細胞を培養するのに適する培地。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが，請求項４，６，８，９及び１１いずれか１項記載のアミノ酸置換を含む請求項１４記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は野生型に比べて改善された熱安定性を有する遺伝子操作された線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２，ｂＦＧＦ），その細胞生物学研究，再生医療及び関連する医療用途又は化粧品における使用に関する。本発明はさらにヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方を含むヒト多能性幹細胞の培養に適する，ＦＧＦ２を含む培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子２（塩基性ＦＧＦ，ｂＦＧＦとしても知られるＦＧＦ２）は，様々な細胞タイプにおける増殖，分化，移動及び生存の多機能調節因子で，それが細胞を多能性の状態に維持するのをサポートするので，ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）培養用培地の必須成分である。多能性は，細胞が無限自己複製を経て，人体の全ての細胞タイプに分化する能力である。この特性は，細胞を胚形成の研究に，創薬に，及び細胞療法に有用なものとする。医薬の使用を含むＦＧＦ２の他の重要な生物学的活性は，血管形成の促進，創傷治療，軟骨形成又は骨形成の促進及び神経新生の促進を含む。
【０００３】
しかしながら，野生型のＦＧＦ２の低い安定性と短い半減期は，ＰＳＣの培養を含むいくつかの用途には現実的ではない。野生型の分子の半減期は，ヒトＰＳＣを培養するために典型的に使用される条件下では２４時間未満であり，頻繁な交換を必要とし，それはコストの観点から産業においては重要な問題である(Lotz, et al. 2013, PLoS One 8: e56289)。維持された濃度のＦＧＦ２の存在下で哺乳類の幹細胞又は始原細胞を培養する方法は，米国特許８，４８１，３０８号に提供されている。さらに，連続的なＦＧＦ２の分解により，幹細胞はその濃度の変動にさらされ，それは，多能性にとって不可欠な適切なシグナリングの急速な減少の一因となり得る。タンパク質の変性型又は凝集型は潜在的に有毒かもしれず，免疫原性を有するかもしれないので，タンパク質の熱力学的安定性は治療用途には特に重要である。
【０００４】
伝統的にＦＧＦ２は，熱変性と酸からＦＧＦ２を保護し，その半減期を延長するヘパリンの添加によって安定化される。しかしながら，ヘパリンは体内の肥満細胞によって生産されるため，その使用はin vivoでＦＧＦ２によって調節されるほとんどの細胞／組織において生理学的ではない。さらに，ヘパリンの血液凝固阻止性及びアレルギー反応を引き起こす危険性により，医療・化粧用の目的でそのような製剤を使用することは適切ではない。従って，ヘパリンを必要とすることなく，より高い安定性及びより長い機能的な半減期を有する手頃なＦＧＦ２組成物を得ることを可能にする新しいかつ改良された方法に対する要望が当該分野で続いている。
【０００５】
特許文献ＷＯ２０１３／０８２１９６号には，その完全な増殖因子活性を保持しながらＦＧＦ２を安定化するために，ヘパリンを模したスルホン酸ポリマー（例えばポリ（スチレンスルホン酸））又はコポリマー（例えばポリ（スチレンスルホン酸−コ−ポリ（ポリエチレングリコールメタクリル酸エステル））とＦＧＦ２との複合体が記載されている。いくつかの薬剤の添加によるＦＧＦの安定化が，いくつかの特許文献，例えば米国特許７，７５４，６８６号（ＦＧＦの酸化を抑制するための還元剤の添加），米国特許５，２０２，３１１号（スクロースオクタスルファートの添加），米国特許５，１８９，１４８号（水不溶性のヒドロキシプロピルセルロースの添加），欧州特許０３４５６６０号（グルカン硫酸塩の添加）を記載する。しかしながら，そのような製剤の欠点は，ヘパリンを配合したＦＧＦ２の場合と同様に，医療及びデイケアの目的に適していない潜在的に有害な化合物の存在である。
【０００６】
プロテインエンジニアリングは，添加剤なしにタンパク質を安定化させる効果的な解決法を提供する。従って，増強された安定性及び／又は機能を有する，同じサブファミリーに属するＦＧＦ１及びＦＧＦ２の突然変異体が記載されている。ＦＧＦ１のバイオテクノロジーの用途は，主にその固有の高い不安定性のためＦＧＦ２と比較してさらに制限される。
【０００７】
米国特許出願２００８／０３８２８７号はＮ末端基の切断及び所望によりＮ−末端アミノ酸置換によって達成された改善されたレセプター特異性を有するＦＧＦ２又はＦＧＦ４ポリペプチドの設計，製造及び使用に関する。しかしながら，それらは突然変異又はＮ末端における切断がＦＧＦの熱安定性に影響するであろうことについて教示も立証もしていない。
【０００８】
米国特許出願２０１２／０２２５４７９号は，増加した熱安定性を有する遺伝子操作されたヒトＦＧＦ２突然変異体及び胚性幹細胞の培養においてそれを使用する方法に関する。この著者は，ＦＧＦ２とザクシェフスカら(Zakrzewska M，2005, J mol Biol)によって報告された安定化されたＦＧＦ１突然変異体との間の単純なアミノ酸配列アラインメントによって確認された野生のＦＧＦ２配列の置換Ｑ６５Ｉ，Ｎ１１１Ｇ及びＣ９６Ｓを使用した。記載された突然変異体は一定レベルの安定化は示すが，より高温でより長期間その生物学的活性を維持することはない。
【０００９】
米国特許出願２０１３／０２３６９５９号は特定の熱安定性ＦＧＦ２  Ｋ１２８Ｎ突然変異体について記載する。Ｋ１２８は，野生型のＦＧＦ２の場合にはヘパリン及びヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）結合に著しく寄与するアミノ酸である。従って，この位置でのアミノ酸置換は，ＦＧＦ２がＨＳＰＧを結合する能力を減少させることになり，ＨＳＰＧへのＦＧＦ２の結合はＦＧＦレセプター活性化における重大な機能的要素の１つであるので，ＦＧＦ２の特定の生物学的活性にネガティブな影響を与え得る。ＦＧＦシグナル伝達の総合的な機構は，ＦＧＦＲオリゴマー化及びＦＧＦのチロシンキナーゼレセプター（ＦＧＦＲ）への結合を促進してＦＧＦオリゴマー化及びシグナル伝達をもたらすコレセプターとして働くヘパリン又はＨＳＰＧを必要とする。ヘパリン／ＨＳＰＧ結合領域の置換は米国特許出願２０１３／０１５７３５９号にも開示されている。この出願は，３個及び４個のアミノ酸置換の導入によって増強された熱安定性を有するＦＧＦ１の２つの変異体の使用に関する。ヘパリンと無関係のＦＧＦ１の安定化は，ＨＳＰＧ結合にとって重要な残基Ｋ１１２を変異させることにより達成された。
【００１０】
米国特許８，４６１，１１１号は，コアパッケージング突然変異の導入により機能的半減期を改善した，遺伝子操作されたＦＧＦ１に関する。
【００１１】
米国特許８，１１９，７７６号は，残基１２及び１３４の置換により熱安定性及び細胞分裂促進性の性能を増加させた，遺伝子操作されたＦＧＦ１に関する。
【００１２】
発明の開示
本発明は，培養のコストを著しく下げ，培養された細胞の改良された品質，及び，より少ない操作の要求につながる熱安定性を有するＦＧＦ２を提供することを目的とする。さらに，これは再生医療，関連する医療用途又は化粧品に使用することができるであろう。
【００１３】
最新技術の解決法による欠点は，ＦＧＦ２活性を有し，かつ配列番号：２の配列又はその断片に対して８５％の配列同一性を有するＦＧＦ２ポリペプチドから成る熱安定性の単離されたポリペプチドを提供する本発明によって克服される。同時に，該ＦＧＦ２ポリペプチドは，Ｒ３１Ｌ又はＨ５９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換；又は少なくとも二つの置換Ｒ３１Ｌ及びＨ５９Ｆの組み合わせを含む。それは，本発明によるポリペプチドが少なくともＲ３１Ｌ又はＨ５９Ｆ置換を，又は少なくとも二つの置換Ｒ３１Ｌ及びＨ５９Ｆの組み合わせを常に示すことを意味する。
【００１４】
本発明により有利に提示されたＦＧＦ−２ポリペプチド又はその断片は，高温で長期間安定で不変の生物学的活性を示す（例えば図１１を参照）。
【００１５】
本発明による熱安定性ＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片は，特に，野生型のＦＧＦ２と比較して著しく安定性が高いという事実により有利である。この安定性は該ＦＧＦ２に固有であり，ヘパリンのような添加化合物を追加する必要はない。ＦＧＦ２の生物学的活性にとって不可欠なアミノ酸の部位はいずれも置換も切断もされない。提示されたＦＧＦ２突然変異体及びその断片は，臨床及び研究プラクティスに使用することができる。
【００１６】
本発明による熱安定性のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片は，ＦＧＦ２活性を有し，野生型のＦＧＦ２ポリペプチドと比較して１〜２０℃，好ましくは８〜２０℃，より好ましくは１４〜２０℃高い融解温度を有する。全部で１３個の単一点突然変異体が構築され，発現ベクターｐＥＴ２８ｂにサブクローン化され，精製されて（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で判定された純度≧９５％），続いて融解温度について特徴づけられた。
【００１７】
更なる態様では，本発明は，配列番号：２又はその断片に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し，かつ，少なくともアミノ酸置換Ｒ３１Ｌを含むＦＧＦ２ポリペプチドを提供する。
【００１８】
本発明のより好ましい実施態様は，配列番号：２又はその断片を有し，かつ，少なくともアミノ酸置換Ｒ３１Ｌを含む熱安定性ＦＧＦ２ポリペプチドを開示する。
【００１９】
より好ましいのは，配列番号：４，配列番号：６，配列番号：８，配列番号：１０，配列番号：１２，配列番号：１４，配列番号：１６，配列番号：１８，配列番号：２０，配列番号：２２，配列番号：２４，配列番号：２６又は配列番号：２８から選択される配列を含むポリペプチドである。
【００２０】
本発明のより好ましい実施態様は，ＦＧＦ２ポリペプチドにおける必須の置換がＲ３１Ｌである場合，Ｒ３１Ｗ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐからなる群から選択される，少なくとも２個又は少なくとも５個又は少なくとも８個又は少なくとも１０個のアミノ酸の置換をさらに含む熱安定性のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を開示する。
【００２１】
本発明のより好ましい実施態様は，ＦＧＦ２ポリペプチドにおける必須の置換がＨ５９Ｆである場合，Ｒ３１Ｗ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐからなる群から選択される，少なくとも２個又は少なくとも５個又は少なくとも８個又は少なくとも１０個のアミノ酸置換をさらに含む熱安定性のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を開示する。
【００２２】
本発明のより好ましい実施態様は，ＦＧＦ２ポリペプチドにおける必須の置換がＲ３１ＬとＨ５９Ｆの組み合わせである場合，Ｒ３１Ｗ，Ｖ５２Ｔ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｔ１２１Ｐからなる群から選択される少なくとも１個又は少なくとも４個又は少なくとも７個又は少なくとも９個のアミノ酸置換をさらに含む熱安定性のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を開示する。
【００２３】
本発明のより好ましい実施態様は：（ａ）３個のアミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆを含むポリペプチド，最も好ましくは，配列番号：３０を有するポリペプチド，又は（ｂ）６個のアミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅを含むポリペプチド，最も好ましくは，配列番号：３２を有するポリペプチド，又は（ｃ）９個のアミノ酸置換Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅを含むポリペプチド，最も好ましくは，配列番号：３４を有するポリペプチド，又は（ｄ）９個のアミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを含むポリペプチド，最も好ましくは，配列番号：３６を有するポリペプチド，及び（ｅ）１１個のアミノ酸置換Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを含むポリペプチド，最も好ましくは，配列番号：３８を有するポリペプチドである。
【００２４】
さらに，下記の突然変異タンパク質は本発明の範囲の一部と見なされるべきである。
【００２５】
本発明によるＦＧＦ２ポリペプチド，その断片，又は突然変異タンパク質の生物学的活性は，０．１〜５ng/mL，好ましくは０．５〜３ng/mLの範囲のＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖に対するＥＣ５０によって定量的に表すことができる。ＦＧＦ２の生物学的活性は既に記載された培養された繊維芽細胞の増殖アッセイ(Dubey, et al. 2007 J Mol Biol)によって評価することができる。
【００２６】
第二の観点において，本発明は，再生医療（例えば創傷及び潰瘍の治療，骨折治療及び歯周組織再生）に，及び他の医療用途（例えば癌治療，心疾患治療及び気分障害の治療）に，又は美容（例えば毛髪刺激，コラーゲン合成及び老化防止治療のサポート）に使用することができる本発明による熱安定性ＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を提供する。
【００２７】
第３の観点において，本発明は，有効量の本発明による熱安定性のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を培地に対して１．０ng/μl〜１００ng/μlの範囲の量で含む，未分化の状態のヒト多能性幹細胞を培養するのに適する培地を提供する。好ましくは，提示された培地は，本発明による提示されたＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片であって，アミノ酸置換（ａ）Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆを含むもの，最も好ましくは，配列番号：３０を有するポリペプチド，又は（ｂ）６個のアミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅを含むもの，最も好ましくは，配列番号：３２を有するポリペプチド，又は（ｃ）９個のアミノ酸置換Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅを含むもの，最も好ましくは，配列番号：３４を有するポリペプチド，又は（ｄ）９個のアミノ酸置換Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを含むもの，最も好ましくは，配列番号：３６を有するポリペプチド，及び（ｅ）１１個のアミノ酸置換Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを含むもの，最も好ましくは，配列番号：３８を有するポリペプチドを含む。
【００２８】
本発明のこれら及び他の特徴，目的及び利点は，続いての詳細な説明から一層よく理解されるであろう。詳細な説明においては，添付の図面が参照されるが，これは本明細書の一部を構成するものであり，説明のために示されるのであって，制限するものではなく，本発明の実施態様である。
【００２９】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用されるいくつかの用語の定義を下記に示す。特記しない限り，ここに使用される技術及び科学用語は全て本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
ここで使用される限り，用語「熱安定性(thermostability)」はタンパク質の「熱安定性(thermal stability)」の用語と同義で，熱力学的及び動力学的安定性を包含する。熱力学的安定性は，タンパク質の折り畳まれた状態（天然）と広がった状態の間の平衡に関し，これらの２つのタンパク質状態の間のギブズの自由エネルギーの差として定義される。
【００３１】
ここで使用される限り，用語ＦＧＦ２タンパク質の「融解温度」（Ｔｍ）は，タンパク質の５０％が折り畳まれ，タンパク質の５０％が広げられる温度を意味する。融解温度は熱力学的安定性の直接的な基準である。
【００３２】
ここで使用される限り，用語ＦＧＦ２タンパク質の「半減期」はＦＧＦ２タンパク質の生物学的機能が定められた工程条件において半分に減少する時の量を意味する。例えば機能的な半減期は，細胞の成長，増殖及び／又は生存を誘導する時間にわたってのＦＧＦ２タンパク質の生物学的活性に基づいてもよい。半減期は，機能を持たないタンパク質形（広がった状態及び不可逆的に変性したタンパク質）から天然の状態を分けるエネルギー障壁と関係のある動力学的安定性の直接的な基準である。
【００３３】
ここで使用される限り，用語「野生型」は種のメンバー中の最も一般的なアミノ酸配列を有している天然のＦＧＦ２を意味する。ここで，野生型のＦＧＦ２は，１５５のアミノ酸長の１８kDaのタンパク質であるヒトＦＧＦ２（配列番号：２）である。
【００３４】
ここで使用される限り，用語「ＦＧＦ２ポリペプチド」は，配列番号；２と少なくとも８５％の配列同一性を有するか又は好ましくは配列番号：２を有し，かつＲ３１Ｌ又はＨ５９Ｆから成る群から選択される少なくとも一個のアミノ酸置換を含むか又は２つの置換Ｒ３１Ｌ及びＨ５９Ｆの組み合わせを少なくとも含み，野生型のＦＧＦ２タンパク質と比較して，少なくとも１℃，好ましくは少なくとも８℃，さらに好ましくは少なくとも１４℃上昇したＴｍを有するＦＧＦ２活性を有するポリペプチドを意味する。Ｔｍは円偏光二色性分光法，示差走査熱量測定法及び蛍光サーマルシフトアッセイのような融解温度の測定に適している任意の方法によって測定することができる。
【００３５】
ここで使用される限り，用語「３点（3-point)ＦＧＦ２突然変異体」又は「ＦＧＦ２ＣＳ１」は下記のアミノ酸置換：Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆを有する配列番号：２のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片，好ましくは配列番号：３０のポリペプチドである。
【００３６】
ここで使用される限り，用語「６点(6-point)ＦＧＦ２突然変異体」又は「ＦＧＦ２ＣＳ２」は下記のアミノ酸置換：Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅを有する配列番号：２のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を意味する。好ましくは配列番号：３２のポリペプチドである。
【００３７】
ここで使用される限り，用語「９点(9-point)ＦＧＦ２突然変異体」又は「ＦＧＦ２ＣＳ３」は下記のアミノ酸置換：Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅを有する配列番号：２のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を意味する。好ましくは配列番号：３４のポリペプチドである。
【００３８】
ここで使用される限り，用語「９点(9-point)ＦＧＦ２突然変異体」又は「ＦＧＦ２ＣＳ４」は下記のアミノ酸置換：Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを有する配列番号：２のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を意味する。好ましくは配列番号：３６のポリペプチドである。
【００３９】
ここで使用される限り，用語「１１点(11-point)ＦＧＦ２突然変異体」又は「ＦＧＦ２ＣＳ５」は下記のアミノ酸置換：Ｋ３０Ｉ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｅ５４Ｄ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ，Ｓ１０９Ｅ，Ｔ１２１Ｐを有する配列番号：２のＦＧＦ２ポリペプチド又はその断片を意味する。好ましくは配列番号：３８のポリペプチドである。
【００４０】
ここで使用される限り，用語「ＦＧＦ２ポリペプチド」は「ＦＧＦ２突然変異体」と同義であり，野生型の配列のＦＧＦ２配列番号：２と比較して，本発明による置換のうちのいずれかを示す少なくとも一つの異なるアミノ酸配列を有している変異させたポリペプチド配列を意味する。
【００４１】
ここで使用される限り，用語「ポリペプチド」は「タンパク質」と同義である。
【００４２】
ここで使用される限り，用語「ＦＧＦ２活性」は用語「ＦＧＦ２の生物学的活性」と同義である。それは，本発明によるＦＧＦ２ポリペプチド，その断片，又はその突然変異タンパク質の生物学的活性を意図する。それらは，本発明による提示されたＦＧＦ２タンパク質の細胞接着部位及びヘパリン結合セグメントを保持する。それらは，細胞の表面に存在する少なくとも１つのＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）に結合することができ，細胞内部へのシグナル伝達のために，そして未処理のコントロール細胞に関連して培養細胞の成長，増殖又は生存を引き起こすのに必要である。そのような細胞は，例えば１つ以上のＦＧＦＲを発現するか又はＦＧＦタンパク質に応答することが当該分野で知られている，間葉由来の細胞全般，繊維芽細胞，神経芽細胞，膠細胞，神経由来の他の細胞，平滑筋細胞，内皮細胞などを含んでいてもよい。ＦＧＦＲは細胞外領域からなり膜貫通及びキナーゼ領域を欠く可溶バージョンを含む，レセプターの様々なアイソタイプを含む。生物学的活性は，例えば細胞増殖及び／又は基質リン酸化として当該分野で知られている方法によって測定することができる。
【００４３】
ここで使用される限り，用語「断片」はＦＧＦ２活性を有する本発明によるＦＧＦ２ポリペプチドの機能性断片を意味する。更に，それは，配列番号：２の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＦＧＦ２ポリペプチドの機能性断片を意味する。該ＦＧＦ２ポリペプチドの断片は本発明による少なくとも１つ以上の置換を示す。好ましいのは，少なくとも９６％，９７％，９８％，９９％又は１００％の配列同一性である。該断片は，完全なポリペプチド配列及び構造の一部だけから成るポリペプチドを意図し，変異体のＣ末端欠失又はＮ末端欠失があってもよい。そのような機能性断片は，本発明により提示されたＦＧＦ２タンパク質の細胞接着部位及びヘパリン結合セグメントを保持する。本発明による提示されたＦＧＦ２タンパク質の断片は望ましい性質を保持し，従ってそれらのＴｍは，野生型ＦＧＦ２と比較して，少なくとも１℃，好ましくは少なくとも８℃，さらに好ましくは少なくとも１４℃高く，また，細胞の表面に存在する少なくとも一つのＦＧＦレセプターに結合することができ，未処理のコントロール細胞に関連して培養細胞の成長，増殖又は生存を引き起こすことができる。
【００４４】
ここで使用される限り，用語「突然変異タンパク質」は本発明によるＦＧＦ２タンパク質の機能性突然変異タンパク質又はその断片を意味する。更に，それは，配列番号：２の配列に少なくとも８５％の配列同一性を有し，本発明による置換のうちのいずれかを示すポリペプチドの機能性突然変異タンパク質を意味する。好ましいのは，少なくとも９６％，９７％，９８％，９９％又は１００％の配列同一性である。それは本発明によるＦＧＦ２タンパク質のための上記のアミノ酸の可能な置換のいずれかと，配列番号：２の配列の残基の少なくとも８５％以上を保持する，それらの突然変異型を意味する。そのような機能性突然変異タンパク質は，この参照配列のＦＧＦ２の生物学的活性を保持する。好ましくは，該突然変異はＬアミノ酸を使用する置換であり，そこにおいては１つのアミノ酸が別の生物学的に類似のアミノ酸と取り替えられる。保存的置換の例は，１つの疎水性残基による別の残基の置換，又は１つの荷電又は極性の残基による別の残基の置換を含む。好ましくは，置換は生物学的活性に関係していないＦＧＦ２  Ｎ末端基で導入される。
【００４５】
ここで使用される限り，用語「配列同一性」は上に定義されるような本発明によるＦＧＦ２タンパク質内に同じアミノ酸残基が見出されることを意図する。ＦＧＦ２タンパク質のアミノ酸配列の特定の連続したセグメントを特定の対応する参照分子のアミノ酸配列と並べて比較した場合，参照として寄与するＦＧＦ２タンパク質。配列同一性のパーセンテージは，両方の配列に同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を出し，この一致する位置の数を参照分子への比較を行ったセグメント中の位置の総数で割り，結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことにより計算される。配列アラインメントの方法は当該分野でよく知られている。ここに使用される参照配列は，本発明による特定の対応するヒトＦＧＦ２タンパク質を意味する。哺乳類，例えば．マウス，ラット，ウサギ，霊長類動物，ブタ，イヌ，雌牛，ウマ及びヒトの中で，ＦＧＦ２は高度に保存され，広範囲の種にわたって少なくとも８５％の配列同一性を示す。好ましいのは，少なくとも９６％，９７％，９８％又は９９％又は１００％の配列同一性である。当業者は，例えば異なる由来のＦＧＦ２種の使用又は当該分野で一般に知られている適切な非ＦＧＦペプチド配列又はタグの添加により，本発明によるＦＧＦ２タンパク質の長さに沿って１５％以下のアミノ酸が可変であることを理解するであろう。ＦＧＦファミリーの他のメンバーは一般にはるかに低い配列同一性を有するので，野生型のＦＧＦ２に対して少なくとも８５％の同一性を有する本発明の実施態様によるＦＧＦ２タンパク質は，ＦＧＦ２に似ているもの以外のタンパク質を含まないであろう。
【００４６】
ここで使用される限り，用語「有効量」は少なくとも５継代の間，未分化の形態を有する多能性幹細胞を維持するのに必要な量を意図する。
【００４７】
ここで使用される限り，ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方に関する用語「ヒト多能性幹細胞」は，それらの自己複製能−それら自身の同一の後代（progeny）を形成する能力と，及びそれらが実質的に人体の全ての細胞タイプを生成することを可能にする多能性とによって特徴づけられる。
【００４８】
ここで使用される限り，用語「多能性の状態で幹細胞を維持する」は実質的に全ての細胞タイプに分化する能力を有する未分化の状態で細胞を維持することを意味する。多能性の状態は，ＦＧＦ２が主に重要である増殖因子の幹細胞サポートカクテルに依存する。ＦＧＦ２は，いくつかの方法により自己複製をサポートする：それは直接ＭＡＰキナーゼ経路を活性化し，形質転換増殖因子ベータ１及びアクチビンのシグナルを間接的に促進する（Greber, et al. 2008, Stem Cells 25, 455‐464）。細胞接着と生存におけるその役割によって，ＦＧＦ２は複合的にヒトのＰＳＣの多能性に寄与する（Eisellova, et al. 2009, Stem Cells 27, 1847‐1857）。
【００４９】
詳細な説明
ＦＧＦタンパク質の不安定さを克服する最も興味深いアプローチは，突然変異生成によってタンパク質の特性を変えることである。そのアミノ酸配列の変更によって，ＦＧＦタンパク質はより高い熱安定性，増加した半減期，さらにタンパク質分解を生ずる劣化に対する増加した抵抗性を有し得る。それらの特性を最適化するためにタンパク質を変異させることは，ヒトの治療用途にさえ実現可能である。タンパク質のいくつかの突然変異形はＦＤＡによってヒトの医薬として使用を承認された。
【００５０】
本開示はプロテインエンジニアリングにより安定化させた本発明によるＦＧＦ２ポリペプチドを提供する。安定化させる突然変異は，バイオインフォマティクス分析及びコンピューターによるタンパク質設計によって合理的に予想される。進化解析及びフォースフィールド計算からの情報を組み合わせるハイブリッド方法は，スマートフィルタ及び専門家の判断によって向上する。このアプローチは，非常に信頼性の高い安定化置換インシリコ(in silico)予測となる。従って，突然変異体は部位特異的突然変異によって製造されるか，又は新規な増殖阻害アッセイによって大きな飽和ライブラリーからスクリーニングされる。最終的な突然変異体はコンピューター分析によって再結合され，遺伝子合成又は突然変異誘発によって製造される。
【００５１】
一般に，ＦＧＦ２をコードする遺伝子はクローン化され，形質転換された生物，好ましくは微生物中で発現される。宿主生物は発現条件下でその外来性遺伝子を発現させ，ＦＧＦ２を生産する。合成組み換えＦＧＦ２を真核生物，例えば酵母又はヒト細胞中で作ることもできる。ＦＧＦ２は組換え体の製造方法に依存して（米国特許５，１４３，８２９号参照）１４６のアミノ酸型，１５３−１５５のアミノ酸型又はその混合物であり得る。
【００５２】
融解温度は熱力学的安定性の直接的な基準である。融解温度の測定に使用される技術の例は，円偏光二色性分光法（ＣＤ），示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）及び蛍光サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）である。ＣＤ分光法は，タンパク質の二次構造及び構造変化をモニターするのにふさわしいラベルフリーの方法である。ＤＳＣは，タンパク質の熱容量が熱変性中にどのように変化するかを見る熱分析技術である。ＴＳＡは，タンパク質凝集を検知する蛍光タンパク質結合性プローブを使用して，タンパク質三次構造の熱安定性を測定する生産性の高い方法である。これらの技術はタンパク質の変性に伴う異なる結果を検出するが，野生型ＦＧＦ２と本発明によるＦＧＦ２ポリペプチドの間のＴｍの差として計算される相対値は，０．５℃未満の変化で比較可能である。
【００５３】
ここに提示された開示は，野生型ＦＧＦ２の一定の変化が，野生型のタンパク質に対してヒト細胞培養液中でのより高い熱安定性及びより長い半減期を有するＦＧＦ２突然変異体に帰着することを初めて実証するものである。
【００５４】
ここに記載された置換の挿入に使用される本発明によるＦＧＦ２タンパク質は，それらがここに特定した基準に適合する限り，すなわち，それらが野生型のＦＧＦ２の望ましい生物学的活性を保持しながら熱安定化される限り，任意の哺乳類由来，例えばマウス，ラット，ウサギ，霊長類動物，ブタ，イヌ，雌牛，ウマ及びヒト由来であり得る。好ましくは，提示されたＦＧＦ２タンパク質はヒト由来である。しかしながら，比較の根拠として寄与する配列番号：２のヒトのＦＧＦ２タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％，そして，最も好ましくは，約９６％，９７％，９８％又は９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意の哺乳類ＦＧＦ２の生物学的に活性な変異体が本発明において使用され得る。
【００５５】
いくつかの実施態様によると，ここに記載された本発明による安定化したＦＧＦ２ポリペプチドはさらに，その検出，精製，特別の組織又は細胞へのタグ付け，改善された溶解度，保持された活性，改善された発現などを容易にするために使用される当該分野で広く知られている任意の付加的な非ＦＧＦペプチド配列又はタグを含んでいてもよい。
【００５６】
本開示はさらに，遺伝子操作された提示されたＦＧＦ２の特性解析，該タンパク質上の置換の影響のデモンストレーション，ヒトのＰＳＣの培養液中で該タンパク質を使用する方法，また，ここに記載した熱安定性のＦＧＦ２タンパク質を少なくとも一つ含む未分化の状態のヒトのＰＳＣを培養するのに適した培地を提供する。これとともに提供される実施例において使用されたヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）は，ドナーのインフォームドコンセントで得られた胚盤胞段階の胚に由来した。２９−４１継代の良好に特徴付けられたヒトＥＳＣライン（Adewumi, et al. 2007, Nat Biotechnol 25, 803‐816)ＣＣＴＬ１４ (Centre of Cell Therapy Line）が使用された。ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関しては，山中カクテル及びセンダイウィルストランスフェクションによって皮膚繊維芽細胞の再プログラムを使用して誘導されたＡＭ１３ラインが，３４−４１継代で使用された（Kruta, et al. 2014, Stem Cells and Development 23, 2443‐2454）。
【００５７】
ここに記載された技術と手続きは，この文献の全体にわたって提供される従来方式によって一般的に行なわれる。一般的に，ここで使用した命名法，並びに分子生物学，生化学，分析化学及び細胞培養の検査法は，周知のものであり，当外部において広く使用される。
【００５８】
本発明の他の特徴，目的及び利点は詳細な説明と請求項から明白であろう。
【００５９】
下記の詳細な説明を考慮すると，本発明は一層よく理解され，また，上に述べられたもの以外の観点及び利点が明白になるであろう。その詳細な説明は，下記の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】野生型のＦＧＦ２のポリペプチド（配列番号：２）。
【図２】ｐＥＴ２８ｂベクター中の上流配列を伴う野生型のＦｇｆ２のヌクレオチド配列。開始コドンは灰色にしてあり，Ｈｉｓ−タグは太い下線が付されている。トロンビン切断認識部位は黒で，ＥＴ２８ｂ発現ベクターにクローン化するための制限部位ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩは肉太の下線が付されている。野生型Ｆｇｆ２コード配列はＡＴＧで始まる。また，終止コドンはＴＡＧである。
【図３】単一点ＦＧＦ２突然変異体（Ｒ３１Ｗ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｃ７８Ｙ，Ｎ８０Ｇ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｒ１１８Ｗ，Ｔ１２１Ｋ，Ｖ１２５Ｌ）の発現及び精製に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質マーカー：１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa。６ｘＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位を含む組み換えＦＧＦ２突然変異体は，約１９．１kDaの分子量を有する。
【図４】示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって測定された，個々の単一点ＦＧＦ２突然変異体（Ｒ３１Ｗ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｃ７８Ｙ，Ｎ８０Ｇ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｒ１１８Ｗ，Ｔ１２１Ｋ，Ｖ１２５Ｌ）の熱安定性の比較を示す。組み合わせた突然変異体の構築に選択された突然変異は，灰色のハイライトを付した中で強調した。
【図５】精製されたＦＧＦ２ＣＳ１及びＣＳ２突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１：タンパク質マーカー（１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa），レーン２：精製された６ｘＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有する分子量１９．１kDaのＦＧＦ２ＣＳ１，レーン３：精製された６ｘＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有する分子量１９．１kDaのＦＧＦ２ＣＳ２。
【図６】ＦＧＦ２ＣＳ１及びＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体と野生型ＦＧＦ２との熱安定性の比較を示す。融解温度（Ｔｍ）はＤＳＣを使用して決定された。
【図７】野生型のＦＧＦ２，ＦＧＦ２ＣＳ１及びＦＧＦ２ＣＳ２が３６．５と４１．５℃で２日間のインキュベーションの後にＲＣＳ細胞増殖を抑制する能力を示す。ＲＣＳ細胞は９６−ウェルプレート中に接種された。データは６つのウェルの平均と示された標準偏差を表わす。
【図８】ＦＧＦ２ＣＳ２がヒトのＰＳＣの未分化の形態を維持することを実証する。ヒトのＰＳＣ，ＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）及びｉＰＳＣ（ＡＭ１３）の両方を，フィーダー層を含むコロニーとして（Ａ），又はマトリゲル（Matrigel）上の単層として（Ｂ）増殖させた。外因性のＦＧＦ２の使用中止は著しい増殖遅延を引き起こしたが，野生型のＦＧＦ２及びＦＧＦ２ＣＳ２は両方とも未分化の形態で，コロニー（Ａ）及び単層（Ｂ）を生じさせることができた。スケールバー（１００μm）。
【図９】ＦＧＦ２ＣＳ２がヒトのＰＳＣの多能性マーカー発現を維持することを実証する。ヒトのＰＳＣ，ＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）及びｉＰＳＣ（ＡＭ１３）の両方を，フィーダー層を含むコロニーとして（Ａ），又はマトリゲル上の単層として（Ｂ）増殖させた。試験条件の各々について５継代の後，細胞を多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇについて免疫染色した。ネガティブコントロールは主要な抗体なしでインキュベートした。野生型のＦＧＦ２及びＦＧＦ２ＣＳ２は，Ｏｃｔ４とＮａｎｏｇの発現を等しくサポートした。スケールバー（１００μm）。
【図１０】ＦＧＦ２ＣＳ２がヒトのＥＳＣの増殖をサポートすることを実証する。（Ａ）ヒトのＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）を各々の試験ＦＧＦ２において増殖させ，細胞の数を４日連続して数えた。２つの実験の代表的結果を示す。各データポイントは３つのウェルの平均±ＳＥＭを示す。（Ｂ，Ｃ）ヒトのＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）のフィーダーフリー単層を５継代の間，試験ＦＧＦ２の各々に適合させた。その後，プレーティングの３日後に細胞を数え，相対的な細胞数（Ｂ；ｎ＝２）としてプロットした。さもなければ，プレーティングから６日後に細胞をクリスタルバイオレットで逆染色し，結果を相対的な光学濃度（Ｃ  ｎ＝３）としてプロットした。柱は手段を，エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５。
【図１１】３７℃での延長されたインキュベーションの間，ＦＧＦ２ＣＳ２の生物学的活性を保つ能力を示す。外因性のＦＧＦ２なしで調製されたマウスの胚の繊維芽細胞馴化培地（ＣＭ）に，１０ng/mLのＦＧＦ２を補充し，３７℃で１時間，３時間，６時間，１２時間，２４時間，２日間，３日間，４日又は５日間インキュベートした。その後，ＦＧＦ２が枯渇したヒトＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）を，ヒートプレンキュベーションした（heat-preincubated）ＦＧＦ２を含むＣＭで２時間処理し，リン酸化されたＥＲＫ１／２のためにイムノブロットされた。合計のＥＲＫ１／２レベルをローディングコントロールとして使用した。野生型ＦＧＦ２の生物学的活性はヒートプレンキュベーションの時間と共に低下したが，熱安定化したＦＧＦ２ＣＳ２は３７℃で５日後でも十分な生物学的活性を保持した。４つの異なる実験の代表的結果を示す。
【図１２】ＦＧＦ２ＣＳ２が毎日の培地交換の必要なしに多能性のヒトのＥＳＣを維持することを実証する。ヒトのＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）コロニーを，標準（４ng/mL）又は減少させたＦＧＦ２濃度（１ng/mL）中で，熱安定化したＦＧＦ２ＣＳ２が存在する状態で５継代の間増殖させた。培地はコロニーを分ける時にのみ（即ち３日又は４日おき）交換した。ヒトのＥＳＣコロニーは減少させたＦＧＦ２濃度でも，正常な形態（Ａ）及び多能性マーカー発現（Ｏｃｔ４，Ｂ）の両方を保った。
【図１３】馴化培地（ＣＭ）を繰り返し補充することがＦＧＦ２ＣＳ２では必要ないことを実証する。ＦＧＦ２の長期安定性をテストするために，ＣＭをフィーダー細胞によって馴化された後の追加の補充なしに調製した。フィーダーフリーヒトＰＳＣ，ＥＳＣ（ＣＣＴＬ１４）及びｉＰＳＣ（ＡＭ１３）の両方を，試験される各ＦＧＦ２を用いて５継代の間に増殖させ，多能性マーカー（Ａ）の発現及び増殖（Ｂ）をモニターした。Ｏｃｔ４の発現は両方のＦＧＦ２で高いままである（Ａ）。スケールバー（１００μｍ）。ＦＧＦ２ＣＳ２は，野生型ＦＧＦ２と比較して，増殖をサポートする優れた能力を示す（Ｂ）。柱は平均を，エラーバーはＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定，＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５。
【図１４】馴化培地（ＣＭ）の調製を示す。標準ＣＭの調製については，完全なヒトＰＳＣの培地を５−７日連続して有系分裂的に(mitotically)不活性化されたマウスの胚の繊維芽細胞（ｍＥＦ）によって馴化し，次に１０ng/mLのＦＧＦ２を補充し，その劣化による増殖因子濃度を回復させた（ＣＭ  I）。ほとんどの実験において，ＣＭはＦＧＦ２欠損ヒトＰＳＣ培地から調製し，最終生産物にだけ１０ng/mLの所望のＦＧＦ２を補充した（ＣＭ  II）。さもなければ，ＦＧＦ２の長期的な熱安定性をテストするために，ＣＭを，１０ng/mLのＦＧＦ２を含むが，その後は補充しない培地から調製する（ＣＭ  III）。
【図１５】ライブラリーＦＧＦ２−Ｓ１５２Ｘ由来の粗抽出液（ＣＥ）中の突然変異させたＦＧＦ２ポリペプチドの生物学的活性のスクリーニングからの出力データの例である。Ｘ軸上の符号付けは，もとのマイクロタイタープレートのウェルに相当する。新たに溶かされたＣＥ又は４１．５℃でプレインキュベートされたＣＥ中のＦＧＦ２を，平行マイクロタイタープレート中で増殖させたラット軟骨細胞に加え２０ng．ml−１の最終濃度にした。また，軟骨細胞の増殖の抑制を，細胞の光学濃度を測定することによりコントロールを含むサンプルと比較した。コントロール：ＮＥＧ，ネガティブコントロール（空のプラスミド）；Ｒ３１Ｌ，ポジティブコントロール（熱安定性が改善された単一点突然変異体を有するプラスミド）；ＷＴ（バックグラウンドコントロール（野生型のＦＧＦ２を有するプラスミド））。バックグラウンドコントロールに対して統計的に有意な増殖阻害を示すオリジナルのクローンＨ５からのサンプルを，ポジティブヒットとして選択した。
【図１６】ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）精製システムによる精製の後に飽和突然変異誘発ライブラリーで確認されたＦＧＦ２突然変異体のサンプルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Ｍ，タンパク質マーカー（１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa）。６ｘＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有する組換えＦＧＦ２突然変異体の約１９．１kDaのバンドがフレーム内にマークされている。
【図１７】精製されたＦＧＦ２ＣＳ３，ＣＳ４及びＣＳ５突然変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。タンパク質マーカー：１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa。６ｘＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有する組換えＦＧＦ２突然変異体は約１９．１kDaの分子量を有している。
【図１８】ＦＧＦ２ＣＳ４組換えタンパク質によって誘導されたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖。
【００６１】
実施例  
下記の実施例は本発明の実施態様を説明するために示される。示された実施例は，説明的な性質のものであり，限定することを意図してはいない。本発明の試験の中でここに記載されたものに似ているか等価である方法及び材料を使用することができるが，適切な方法及び材料を下記に述べる。
【００６２】
実施例１：エネルギーベースのアプローチによるＦＧＦ２の中の単一点突然変異の安定効果の予測
２．２０Åより高い解像度の利用可能な構造のＦＧＦ２をＲＣＳＢプロテインデータバンク(Berman et al., (2000). Nucleic Acids Res. 28, 235‐242.)からダウンロードした。該構造を配位子と水分子を除去することにより，分析のために準備した。複数の鎖構造の場合には１本の鎖が選択された。構造は全てリナンバリングされ，従って，それらは位置１からスタートする。タンパク質側鎖を最小化し，最小化が正確に進んだかどうか判断するためにスコアを付けた。あらゆる単一点突然変異の安定効果はフォースフィールド計算を使用して評価された。ΔΔＧ自由エネルギーを集め，全ての用いられている構造に関して平均し，続いて特定の位置の２０の突然変異全てについて平均した。進化の保存は同族の配列の系統発生の分析を使用して評価された。ΔΔＧ＜−１．０kcal/molであり，保存＜８である突然変異をさらなる分析のために選択した。機能領域（例えばヘパリン結合残基）に対して限られた影響のみを有する最善な位置を確認した。９つの単一点置換を実験の構築及び特性解析に選択した：Ｒ３１Ｗ，Ｒ３１Ｌ，Ｈ５９Ｆ，Ｃ７８Ｙ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｒ１１８Ｗ，Ｔ１２１Ｋ及びＶ１２５Ｌ（表１）。これらの突然変異体のナンバリングは，野生型ヒトＦＧＦ２（以下に示す配列番号：２）の配列に相当する。
表１：自由エネルギー予測，保存分析及び目視検査によって選択された，安定する突然変異
2019500414.tif 000003
ΔΔＧ：突然変異によるギブズ自由エネルギーの変化
【００６３】
実施例２：進化ベースのアプローチによるＦＧＦ２における単一点突然変異の安定効果の予測
関連するタンパク質を有するＦＧＦ２のマルチプル配列アラインメントを構築した。ＦＧＦ２タンパク質配列を，クエリとしてＮＣＢＩのｎｒデータベースに対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ(Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Res. 25, 3389‐3402)サーチに使用した。３回の反復後に集めた配列を９０％の同一性閾値でＣＤ−ＨＩＴ（(Li & Godzik, (2006). Bioinformatics 22, 1658‐1659)）によりクラスター化した。得られた５００を超える配列のデータセットを，デフォルトパラメーターを使用し，Ｐ値閾値を変えて，ＣＬＡＮＳ(Frickey & Lupas, (2004). Bioinformatics. 20, 3702‐3704)でクラスター化した。１０−３０のＰ値でＦＧＦ２でクラスター化された配列が抽出され，ＭＵＳＣＬＥプログラム(Edgar, (2004). BMC Bioinformatics. 5, 113.)でアラインメントさせた。２３８の配列からなる最終アラインメントを，単純なコンセンサスアプローチを使用するバックトゥーコンセンサス分析（back-to-consensus analysis）のインプットとして分析に使用した。この分析はコンセンサスのカットオフ値０．５を使用して行なわれ，これは与えられた残基がコンセンサス残基として割り当てられるべき全ての分析された配列の少なくとも５０％で，与えられた位置で存在するであろうことを意味する。ＦＧＦ２タンパク質中の全ての可能な単一点突然変異の安定化効果を自由エネルギー計算によって評価した。両方の方法により平均ΔΔＧ≦１ｋcal/molと予測された突然変異のみをＦＧＦ２安定化用ホットスポットと見なした。ＦＧＦ２の機能的に重要な部位は生体機能にとって潜在的に有害な突然変異として除外した。バックトゥーコンセンサス分析の結果を表２にまとめる。ナンバリングは，野生型ヒトＦＧＦ２（下記の配列番号：２）の配列に相当する。予測されたΔΔＧの高い値に基づいて，１０個の突然変異が除外され，３個の突然変異が，ヘパリン結合のための機能的に重要な位置での，そのロケーションに対する設計から放棄された。最後に，３つの単一点突然変異が全ての基準を通り，実験の構築及び特性解析に選択された：Ｖ５２Ｔ，Ｎ８０Ｇ及びＳ１０９Ｅ。
表２：５０％のコンセンサスカットオフ値を使用して，ＦＧＦ２中で識別されたバックトゥーコンセンサス突然変異
実験のコンストラクションに選択された突然変異は，灰色のハイライトが付けられている
2019500414.tif 000004
Ｆｒｅｑ：マルチプルアラインメントの与えられた位置での与えられたＦＧＦ−２の残基の頻度；
ＲＥＳ＿Ｔｏｐ：マルチプル配列アラインメントの与えられた位置で最も保存された残基；
Ｆｒｅｑ＿ＴＯＰ：マルチプル配列アラインメントの与えられた位置で最も保存された残基の頻度；
ΔΔＧ：突然変異におけるギブズ自由エネルギーの変化。
【００６４】
実施例３：ＦＧＦ２１２の単一点突然変異体の構築及びそれらのアフィニティークロマトグラフィーによる均一までの精製
突然変異体ＦＧＦ２  Ｒ３１Ｗ，Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｃ７８Ｙ，Ｎ８０Ｇ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｒ１１８Ｗ，Ｔ１２１Ｋ及びＶ１２５Ｌを商業的に合成し，ｐＥＴ２８ｂ−Ｈｉｓトロンビンの下流の誘導可能なＴ７プロモーターのＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ部位にサブクローン化した。結果として生じた構築物を大腸菌Ｄｈ５αコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg.mL−１）を含む寒天平板上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを分離し，ヌクレオチド配列を商業的なシーケンシングによって確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを含む寒天平板上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーをカナマイシン（５０μg.mL−１）を含むＬＢ培地の１０mLの接種に使用し，細胞を３７℃で一晩培養した。一晩の培養物を，カナマイシン含むＬＢ培地の２００mLに接種するために用いた。細胞を３７℃培養した。その発現を０．２５mMの終濃度までイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離によって採取し，ｐH７．５のバッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，０，５ＭのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）によって洗浄した。懸濁液内の細胞を音波処理によって破壊し，細胞ライセートを遠心分離機にかけた。タンパク質からシングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液を取り除いた。ピークフラクション中のタンパク質の存在を１５％のポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明した。タンパク質の析出は５００−７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対する透析によって最小限にされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３）で判断されるように，アフィニティークロマトグラフィーによるＦＧＦ２突然変異体の精製により，９０％を超える純度の均質なタンパク質が得られた。精製されたＦＧＦ２突然変異体の収量の範囲は１５〜９０mg.L−１であった。
【００６５】
実施例４：示差走査熱量測定法による単一のポイントのＦＧＦ２突然変異体の熱安定性の測定
エネルギーと進化に基づいたアプローチによって予測された単一点ＦＧＦ２の熱安定性を，示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）分析によって測定した。５００−７５０mMの塩化ナトリウムを含む５０mMのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中の１．０mg/mLのタンパク質溶液の熱の変性に続いて，ＶＰキャピラリーのＤＳＣシステムを使用して熱容量をモニターした。その測定は１℃／分の加熱速度で２０から８０℃までの温度で行なわれた。Ｔｍは，熱容量曲線が極大値に達した温度として決定された。結果を表４及び図４に示す。
表４：示差走査熱量測定法によって決定されたＦＧＦ２突然変異体の熱安定性。
組み合わされた３点及び６点突然変異体の構築のために選択された突然変異を，灰色のハイライトで示す（実施例５を参照）。
2019500414.tif 000005
Ｔｍ：融解温度；ΔＴｍ：突然変異による融解温度の変化；
１）３つの独立した実験からの平均を示す（標準偏差は１０％未満であった）。
この実施例は，本発明の開示のインシリコの予測方法がＦＧＦ２における安定化突然変異の予測に役立つことを実証する。Ｔｍを少なくとも２℃改善する突然変異は，各々３点（Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ及びＨ５９Ｆ）及び６点（Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ及びＳ１０９Ｅ）の突然変異体ＦＧＦＣＳ１及びＦＧＦ２ＣＳ２において，自由エネルギー計算を使用して組み合わせられた（実施例５を参照）。
【００６６】
実施例５：３点ＦＧＦ２ＣＳ１及び６点ＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体の構築，精製，熱安定性分析
ＦＧＦ２の多点突然変異体を商業的に合成し，ｐＥＴ２８ｂ−Ｈｉｓトロンビンの下流の誘導可能なＴ７プロモーターのＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位にサブクローン化した（突然変異させたヌクレオチド及びポリペプチド配列は，下記の配列番号：２９〜配列番号：３２に示されている）。結果として生じた構築物で大腸菌Ｄｈ５αコンピテント細胞を形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg.mL−１）を有する寒天平板上にプレーティングし，３７℃で一晩増殖させた。プラスミドを分離し，ヌクレオチド配列を商業的にシーケンシングによって確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，３７℃でカナマイシンを有する寒天平板上にプレーティングし，一晩増殖させた。単一のコロニーをカナマイシン（５０μg.mL−１）を含むＬＢ培地１０mLに接種するために使用し，細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩の培養物をカナマイシンを含むＬＢ培地の２００mLに接種するために使用した。細胞は３７℃で培養した。その発現を０．２５mMの終濃度までＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離によって採取し，ｐＨ７．５のバッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム及びリン酸二水素カリウム，０，５ＭのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）によって洗浄した。懸濁液での細胞を音波処理によって分裂させ，細胞ライセートを遠心分離機にかけた。タンパク質からシングルステップ・ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液を除去した。ピークフラクション中のタンパク質の存在が１５％のポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明された（図５）。タンパク質の析出は７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対する透析によって最小限にされた。両方の突然変異体の収量は約２０mg/Lの培養液であった。ＤＳＣをタンパク質の熱安定性を特徴づけるために使用した。ＦＧＦ２突然変異体をＤＳＣ実験用に１．０mg.mL−１に希釈した。ＤＳＣデータ収集は２０℃〜１００℃の温度範囲にわたって行なわれた。Ｔｍは，基線の手動設定の後にガウス曲線の頂点として評価した。ＦＧＦ２ＣＳ１及びＣＳ２突然変異体は，各々Ｔｍ６２．８℃と６８．０℃を示した（図６）。
【００６７】
実施例６：ラット軟骨肉腫増殖阻害アッセイを使用する３点及び６点ＦＧＦ２突然変異体の熱安定性測定
ラット軟骨肉腫（ＲＣＳ）細胞は，著しい形態的変化及び細胞間マトリックスの劣化を伴う強力な増殖阻害により，微少濃度のＦＧＦ類に応答する，不死化された表現型が安定な細胞系統である。ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）は，この細胞系統における細胞増殖のインヒビターとして機能する。細胞増殖を抑制するために，ＦＧＦ突然変異体は，誘導された増殖阻害の濃度依存に反映されるＦＧＦ活性の測定を可能にするＦＧＦＲシグナルトランスダクションを特異的に誘導しなければならない。ＲＣＳ分析の主な利点は，有毒化学物質及び偽陽性ヒットの排除である(Krejci, et al., 2007 Invest New Drugs, 25: 391‐395.)。ハイスループットな増殖阻害実験は，単純なクリスタルバイオレット染色によって測定される細胞の量を有する９６ウェルプレートフォーマットで行なわれた。約４０ng/mLの濃度で，突然変異させたＦＧＦ２を含む又は突然変異させたＦＧＦ２を含まない培地を，４８時間３６．５及び４１．５℃でインキュベートし，この期間内に１２時間ごとに混合した。ＦＧＦ２突然変異体の劣化を評価するために，プレインキュベートされた培地を，新鮮なコントロールとしての突然変異させたＦＧＦ２と混合した。処理の一日前に，ＲＣＳ細胞を２５０細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。細胞は各ＦＧＦ２のためにプレインキュベートされたＦＧＦ２及び新鮮なコントロールの両方で各ＦＧＦ２突然変異体について２０ng/mLの終濃度で４日間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し，４％のパラホルムアルデヒドで固定し，再び洗浄し，０．０２５％のクリスタルバイオレットで１時間染色した。着色された細胞を蒸留水で三回洗浄した。細胞からの色を３３％の酢酸に溶解させた。吸光度を５７０nmで測定した。ＲＣＳ増殖阻害アッセイの結果を図７に示す。この実施例は，６点ＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体がＲＣＳ細胞増殖を抑制する能力が，４１．５℃で２日間のインキュベーションの後でも影響されないことを実証する。対照的に，野生型のＦＧＦ２の生物学的活性は，３６．５℃でインキュベーションの後に既に減少する。
【００６８】
実施例７：熱安定化させた６点ＦＧＦ２ＣＳ２は，ヒト多能性幹細胞の未分化の増殖をサポートする
熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体が未分化のヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）の長期的な増殖をサポートする能力を評価するために，２つの培養系を使用した：
（i）  マウスの胚の繊維芽細胞（ｍＥＦ）フィーダー層の存在下でのコロニー増殖及び（ii）マトリゲル（商標）ｈＥＳＣ最適化マトリックス（BD Biosciences）上のフィーダーフリー単層増殖。フィーダー依存条件において，培地は１５％のノックアウト血清置換，１％のＭＥＭ非必須アミノ酸，０．５％のペニシリン−ストレプトマイシン，１００μMのβ−メルカプトエタノール及び４ng/mLの野生型のＦＧＦ２又はＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）から成るものとした。フィーダーフリー単層システムでは，ｍＥＦ−馴化培地がヒトＰＳＣの増殖に必要である。そのため，培地はフィーダー細胞によって馴化された後にのみ，試験ＦＧＦ２ｓ（１０ng/mL）を補充した（ＣＭ  II（図１４））。ヒトＰＳＣを，試験された条件の各々において５継代で増殖させ，細胞の形態及び多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの発現をモニターした。ＦＧＦ２のない培地で培養されたヒトのＰＳＣは，ヒトのＰＳＣの未分化の状態のメンテナンスにおけるＦＧＦ２の重要な役割を示した。両方の試験ＦＧＦ２が存在する状態で増殖させると，ヒトＰＳＣは典型的な形態を示し，両方の培養系でフィーダー細胞及び細胞質に対して高い比率の核と共に増殖させるとしっかりと詰まったコロニーを示す（図８）。細胞形態に関しては野生型のＦＧＦ２と６点のＦＧＦ２突然変異体に違いは見られなかった。ヒトＰＳＣの多能性状態をより詳細に調べるために，多能性マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの発現を免疫細胞化学的に試験した。いずれの試験条件においてもＯｃｔ４又はＮａｎｏｇの発現の量又はパターンの差に変化は見られなかった（図９）。
【００６９】
実施例８：熱安定化した６点ＦＧＦ２ＣＳ２は，ヒト多能性幹細胞の増殖を刺激する
増殖速度を測定するために，２つのアプローチを使用した。まず，フィーダーフリーヒトＥＳＣの数をプレーティング後に４日連続して数えた。両方の試験ＦＧＦ２は，同様の効率でヒトのＥＳＣの増殖をサポートした（図１０Ａ）。ＦＧＦ２の長期的なサポート能力を試験するために，フィーダーフリーヒトＥＳＣを５継代の間，試験ＦＧＦ２の各々に適合させた。その後，直接の細胞カウント（図１０Ｂ）又はクリスタルバイオレットカウンター染色細胞の光学濃度（図１０Ｃ）のいずれかを使用して増殖を測定した。これらの分析では，６点ＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体は，野生型のＦＧＦ２よりも良好にヒトのＥＳＣの増殖をサポートした。データは，短期及び延長した増殖のいずれにおいても，熱安定化したＦＧＦ２ＣＳ２の明瞭な増殖サポート効果を示した。
【００７０】
実施例９：熱安定化させた６点のＦＧＦ２ＣＳ２は，３７℃での延長されたインキュベーション中にその生物学的活性を維持する
ＦＧＦレセプター，及びＥＲＫ１／２を含むそれらの下流のエフェクターは，ＦＧＦ２で処理することにより活性化され，ヒトのＰＳＣの多能性に寄与する(Dvorak, et al. 2005, Stem Cells 25, 1200-1211.; Eiselleova, et al. 2009, Stem Cell 27, 1847-1857)。ＦＧＦ２の生物学的活性が３７℃で減少するので，ＥＲＫ１／２のリン酸化は低下し，ヒトＰＳＣは容易に分化を始める。野生型のＦＧＦ２及びＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体の熱安定性を試験するために，ＦＧＦ２なしで調製されたＣＭに，１０ng/mLの所望のＦＧＦ２を補充し，１時間，３時間，６時間，１２時間，２４時間，２日間，３日間，４日間又は５日間，３７℃でインキュベートした。その後，ＦＧＦ２を枯渇させたヒトＥＳＣを，ヒートプレインキュベートされたＦＧＦ２を含むＣＭで２時間処理し，リン酸化されたＥＲＫ１／２についてウェスタンブロッティングを行った。野生型のＦＧＦ２の生物学的活性はヒートプレンキュベーションの時間経過に伴い低下したが，熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体は３７℃で５日後でさえ完全な生物学的活性を保持した（図１１）。
【００７１】
実施例１０：熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ２では毎日の培地交換は必要ない
野生型のＦＧＦ２の不安定さのため，ヒトＰＳＣの多能性を維持するには，培地の交換が不可欠である。従って，我々は，熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体の使用で，この要求を回避できるかどうか試験した。そのために，ヒトのＥＳＣを，標準４ng/mL又は減少させた１ng/mLのＦＧＦ２突然変異体を含む培地中でフィーダー細胞上にプレーティングし，培地を交換せずにコロニーを引き続き３〜４日増殖させた。図１２に示される結果は，１ng/mLの濃度でさえ，熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体が，ヒトのＥＳＣの未分化の形態及び多能性マーカーＯｃｔ４の発現を維持し，培地を毎日交換する必要がないことを実証する。
【００７２】
実施例１１：熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ２では馴化培地の繰り返しの添加は必要ない
野生型のＦＧＦ２はＣＭの調製の間に不活性化されて劣化するので，フィーダー細胞による馴化の前後に培地にＦＧＦ２を補う必要がある。従って，我々は，熱安定化させた６点ＦＧＦ２ＣＳ２の，フィーダー細胞による馴化後に培地に補充しなくともヒトＰＳＣの未分化の増殖を維持する能力を試験した（ＣＭ  III（図１４））。フィーダーフリーのヒトＰＳＣを，野生型及びＦＧＦ２突然変異体の両方を用いて５継代の間に増殖させ，多能性マーカーの発現及び増殖をモニターした。多能性マーカーの発現が影響されないままであり（図１３Ａ），６点ＦＧＦ２突然変異体は野生型ＦＧＦ２と比較して優れた増殖サポート力を示す（図１３Ｂ）。
【００７３】
実施例１２：飽和突然変異誘発によるＦＧＦ２の安定な突然変異体の予測及び構築
さらなる安定化突然変異を明らかにする飽和突然変異誘発のための位置を，フォースフィールド計算を使用して提案した。突然変異は，ギブズ自由エネルギー（ΔΔＧ）の予測された変化により３つの群に分けた。ΔΔＧ＜−１．０kcal/molの突然変異を安定として，１．０＜ΔΔＧ＜−１．０を中程度として，そしてΔΔＧ＞１．０を不安定として分類した。最も高い安定化数と低い不安定化数の位置１１個（Ｋ３０，Ｅ５４，Ｅ６７，Ｃ７８，Ｒ９０，Ｓ９４，Ｃ９６，Ｅ１０８，Ｎ１１３，Ｔ１２１及びＳ１５２）の突然変異を，飽和突然変異誘発に選んだ（表５）。
表５：エネルギーベースのアプローチによって予測されたＦＧＦ２の選択された位置における安定化及び不安定化突然変異
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ＦＧＦ２の１１個の単一部位飽和突然変異誘発ライブラリー全てを遺伝子合成によって作製した。ｐＥＴ２８ｂベクターにサブクローン化した６ｘＨｉｓタグ及びトロンビン切断認識部位を含むＮ末端配列に融合した野生型のＦｇｆ２  ｃＤＮＡ（図２）を，突然変異誘発のためのテンプレートとして使用した。このライブラリーは，ヌクレオチド配列における縮退コドンに対応する位置においてタンパク質を構成するアミノ酸２０個のみが生じることを可能にする「フィックスドオリゴ（Fixed Oligo）」技術を使用して構築された。ライブラリーは凍結乾燥されたプラスミドＤＮＡとしてデリバリーされた。ＤＮＡペレットを２５０ngμL―１の終濃度で滅菌水に溶解した。各ライブラリーからの１μlの量を，新たに調製したE. coli XJb (DE3)自己融解細胞１００μlにエレクトロポレーションで入れた。細胞を終濃度５０μg.mL−１のカナマイシンを含む１１個の個々のＬＢ寒天平板に広げ，３７℃で一晩インキュベートした。１１個のＬＢ寒天平板各々からの単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg.mL−１）を含むＬＢ培地２５０μlを含む，１mL９６ディープウェルプレートの個々のウェルの接種に使用した。プレートを，高湿チャンバーで２００rpmで震盪しながら３７℃で一晩培養した。発現は，各々終濃度５０μg.mL−１，０．２５mM及び３mMのカナマイシン，ＩＰＴＧ及びＬ−アラビノースを含む新鮮なＬＢ培地の添加によってそれぞれ誘導された。プレートを，震盪しながら２０℃で一晩インキュベートした。２２時間後，プレートを遠心分離機にかけ，上澄みを排出させた。細胞ペレットを含むマイクロタイタープレート全体を−７０℃で冷凍した。その後，ライシスバッファー（２０mMリン酸ナトリウムバッファー，１５０mMＮａＣｌ，ｐＨ７．０）１００μlを加え，各々ウェルプレートを３０℃で２０分間インキュベートした。結果として生じる細胞ライセートから細胞デブリスを除去し，各プレートごとに可溶のタンパク質の総量をブラッドフォード法を使用して測定した。可溶のタンパク質の総量に対するＦＧＦ２の含有量は，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びデンシトメトリーによって測定した。個々のライブラリーの選択された粗抽出液サンプル中の全可溶のタンパク質の濃度は，０．２〜０．３mg.mL−１まで変動した。粗抽出液中のＦＧＦ２の含量は可溶のタンパク質の総量の５％〜７％まで変動した。
個々のＦＧＦ２突然変異体を含む細胞ライセートの生物学的活性を，ＲＳＣを使用して増殖阻害アッセイによって測定した。ＦＧＦ２とコントロールの突然変異体を含む粗抽出液を含むマイクロタイタープレートを室温で溶かし，４１．５℃で４８時間プレインキュベートした。プレインキュベートされた粗抽出液を，新鮮なマイクロタイタープレートの中で２０ng.mL−１の終濃度まで増殖させた軟骨細胞に加え，軟骨細胞の増殖の抑制を，細胞の光学濃度の測定によりコントロールを含むサンプルと比較した（図１５）。より安定したＦＧＦ２の突然変異体が添加された粗抽出液の中に存在するほど，増殖抑制は明白であった。生育抑制はさらに上昇した温度中でプレインキュベートしないサンプルについても測定した。野生型ＦＧＦ２を含むサンプルよりも高い生育抑制を引き起こすサンプルをポジティブヒットとした。ポジティブヒットの各々については，上に記載されるような全体のスクリーニング法を繰り返した。変異させたＦｇｆ２遺伝子は，サンガー法によって順番に並べられた。結果として生じる配列は，挿入された突然変異（表６）を証明するために野生型のＦＧＦ２の配列と並べた。
表６：ＦＧＦ２の１１の飽和突然変異誘発ライブラリーの検査からの結果の概観
2019500414.tif 000007
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を，発現ベクターｐＥＴ２８ｂ−Ｈｉｓ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ：：ｆｇｆ２ｘ（ｘ＝３２個の異なるＦＧＦ２突然変異体）で形質転換し，カナマイシン（５０μg.mL−１）を含む寒天平板上にプレーティングし，３７℃で一晩増殖させた。単一のコロニーを用いてカナマイシンを含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩増殖させた。その発現をＩＰＴＧで０．２５ｍＭの終濃度まで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスは遠心分離機にかけ，細胞ペレットを−７０℃で凍結させた。このペレットを解凍し，ＦａｓｔＢｒｅａｋ（商標）Cell Lysis Reagent 1X中に再懸濁した。溶解した細胞を，震動するプラットフォーム上で室温で１０〜２０分間インキュベートした。ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）Ｎｉ粒子を細胞ペレットに添加した。ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）粒子への結合を改善するために，５００mMのＮａＣｌを，ボリューム（volume）細菌培養液に添加した（ライセート１．０mLあたりＮａＣｌ０．０３ｇ）。分裂した細菌細胞を含む管を，室温で２分間インキュベートし，次に，ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）Ｎｉ粒子を捕らえるために約３０秒間磁気スタンドに配置した。上澄みを注意深く除去した。未結合の細胞タンパク質を洗い流すために，５００mMのＮａＣｌを含むＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）結合／洗浄バッファー（Bonding/Wash Buffer）を添加した。上澄みを注意深く除去した。洗浄工程を２回繰り返した。結合したタンパク質の溶出は５００mMのＮａＣｌを含むＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）溶出バッファー（Elution Buffer）１０５μlを加えることにより行なった。精製されたタンパク質を含む上澄みを除去するために，溶出混合物を室温で２分間インキュベートし，続いて管を約３０秒間適切な磁気スタンドに置いた。全てのＦＧＦ２突然変異体の存在は１５％のポリアクリルアミドゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された（図１６）。精製されたＦＧＦ２突然変異体の収量は１０〜１００mg.L−１であり，ＦＧＦ２突然変異体の大部分は野生型ＦＧＦ２と同レベルかそれより高いレベルで発現した。サーマルシフトアッセイを標的タンパク質の熱安定性の測定のために使用した。その測定は９６マイクロタイタープレート中で行なわれた。各ウェルは，２μLのサイプロオレンジ（Sypro Orange）染料（水中で４０倍に希釈）及び次の方程式を使用して計算された適切な量のＦＧＦ２突然変異体からなっていた：
ＶＦＧＦ２ｖａｒ＝（ＣＦＧＦ２ｖａｒ＊Ｖｄｖ）／Ｃｄｃ
ＶＦＧＦ２ｖａｒ＝（ＣＦＧＦ２ｖａｒ＊１）／２．５
式中，ＶＦＧＦ２ｖａｒはＦＧＦ２突然変異体の量であり，ＣＦＧＦ２ｖａｒはＦＧＦ２突然変異体の濃度であり，Ｃｄｃは決められた濃度２．５mg.mL−１であり，Ｖｄｖは１μLとして定義される。溶出バッファーは最後に，ウェル中の全量が２５μLとなるように添加された。サーマルシフトアッセイは，リアルタイムＰＣＲシステムを用いて２５℃の温度で始めて，１℃ずつ上げて最終温度９５℃まで行われた。Ｔｍ値は，ボルツマン派生法(Boltzmann-derived method,)により，蛍光溶解曲線プロット（表７）の変曲点からＴｍ値を得ることにより求めた。
表７：サーマルシフトアッセイによって測定された飽和突然変異誘発からのＦＧＦ２突然変異体の熱安定性。
サーマルシフトアッセイによって決定された野生型ＦＧＦ２のＴｍは５１℃であった。さらなるコンピューター分析（実施例１３を参照）により選択されたアミノ酸置換に灰色のハイライトを付している。
2019500414.tif 000008
Ｔｍ：融解温度
ΔＴｍ：突然変異による融解温度の変化；
ｎ．ｄ，乏しいタンパク質変性のため測定できなかった
【００７４】
実施例１３：飽和突然変異誘発からの単一点突然変異体の組み合わせ
相反する効果のない組み合わせ可能な突然変異を決定するため，及び，非常に安定したＦＧＦ２の多重部位突然変異体の設計のためにフォースフィールド計算を使用した。ライブラリースクリーニング（実施例１２を参照）から次の突然変異が詳しい分析に選択された：Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ及びＴ１２１Ｐ。これらの突然変異を，ＦＧＦ２ＣＳ２突然変異体（Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ及びＳ１０９Ｅ）からの既存の突然変異と組み合わせた。二重点突然変異体の組み合わせは全て個々の突然変異の相加性を予測するためにインシリコで構築した。予測されたΔΔＧと個々の単一点突然変異の合計との差が＞１kcal.mol−１である二重点突然変異体は相反するものと考慮した。従って，３つの異なる多重点突然変異体をさらなる特性解析のために設計した。３つの突然変異体は全て既に設計されたＦＧＦ２ＣＳ２，ＦＧＦ２ＣＳ３突然変異体（Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｃ９６Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ及びＥ１０８Ｈ）をベースとし，サーマルシフトアッセイにおいて最も高い安定効果を有する３つの追加の突然変異を含んでいた。ＦＧＦ２ＣＳ４（Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ及びＴ１２１Ｐ）を，タンパク質機能を保存する目的で設計した。ＦＧＦ２とＦＧＦＲ１又はＦＧＦＲ２のレセプターの間のインターフェース又は二量化にとって重要な位置を標的とする突然変異を全て排除し，一方，突然変異Ｃ９６Ｙを実験的に確認されたより良い安定効果のためにＣ９６Ｎに交換した。ＦＧＦ２ＣＳ５突然変異体（Ｒ３１Ｌ，Ｖ５２Ｔ，Ｈ５９Ｆ，Ｌ９２Ｙ，Ｓ１０９Ｅ，Ｋ３０Ｉ，Ｅ５４Ｄ，Ｓ９４Ｉ，Ｃ９６Ｎ，Ｅ１０８Ｈ及びＴ１２１Ｐ）が，タンパク質の熱安定性影響を最大限にするために選択され，これはサーマルシフトアッセイ（実施例１２）中にＦＧＦ２を安定させることが見出された突然変異の全てを含む。
【００７５】
実施例１４：ＦＧＦ２ＣＳ３，ＣＳ４及びＣＳ５突然変異体の構築，精製及び熱安定性分析
ＦＧＦ２の重複点突然変異体を商業的に合成し，ｐＥＴ２８ｂ−Ｈｉｓトロンビンの下流の誘導可能なＴ７プロモーターのＮｄｅＩとＸｈｏＩ部位にサブクローン化した（突然変異させたヌクレオチド及びポリペプチド配列は配列番号：３３〜配列番号：３８に示される）。得られた構築物を大腸菌Ｄｈ５αコンピテント細胞に形質転換した。細胞を３７℃でカナマイシン（５０μg.mL−１）を含む寒天平板上にプレーティングし，一晩増殖した。プラスミドを分離し，ヌクレオチド配列を商業的なシーケンシングによって確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを含む寒天平板上にプレーティングし，３７℃で一晩増殖させた。単一のコロニーを使用してカナマイシン（５０μg.mL−１）を含むＬＢ培地の１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩培養した培養液を使用してカナマイシンを含むＬＢ培地２００mLに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現はＩＰＴＧで０．２５mMの終濃度まで誘導された。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離によって採取し，バッファー（２０mMリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５及び０．５ＭのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）によって洗浄した。懸濁液中の細胞を音波処理によって破壊し，細胞ライセートを遠心分離機にかけた。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。ピークフラクションにおけるタンパク質の存在を，１５％ポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明した（図１７）。タンパク質の析出は７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対する透析によって最小限にされた。突然変異体の収量は５mg/lと１０mg/lの間であった。ＤＳＣを使用してタンパク質の熱安定性を特徴づけた。ＦＧＦ２突然変異体をＤＳＣ実験用に１．０mg.mL−１に希釈した。データ収集は１℃／分の速度で２０℃から９０℃の温度領域にわたり行なわれた。ＦＧＦ２ＣＳ３，ＦＧＦ２ＣＳ４及びＦＧＦ２ＣＳ５突然変異体は各々Ｔｍ７２．６，７２．２及び７２．７℃を示した。
【００７６】
実施例１５：熱安定化させたＦＧＦ２ＣＳ４によるＮＩＨ／３Ｔ３株細胞（NIH/3T3 cells）の増殖
ＮＩＨ／３Ｔ３株細胞を，４０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で，１ウェルあたり１９０μlの培地（ＤＭＥＭ３１９６６，Ｇｉｂｃｏ（登録商標）＋Ｐ／Ｓ＋１０％ウシ新生児血清）に接種した。２４時間後，培地を，飢餓（ＤＭＥＭ３１９６６，ＧｉｂｃｏＲ  ＋  Ｐ／Ｓ  ＋  ０．５％ウシ新生児血清）に変えた。１６時間後，細胞を滅菌水に希釈し，ＦＧＦ２ＣＳ４を０．０１〜２０ng/mLの終濃度まで添加することにより処理し，細胞を３７℃でさらに４８時間培養した。細胞増殖はＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）蛍光分析（図１８）を使用して測定された。実験は３回繰り返して行なわれた。ＦＧＦ２ＣＳ４のためのＥＣ５０，つまり，２分の１の最大応答を生じるＦＧＦ２ＣＳ４の濃度は，ＮＩＨ／３Ｔ３株細胞の増殖反応測定法により測定され，０．６−１．１ng/mLである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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