(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して治療学的酵素類に結合した結合体に関する。非ペプチド性重合体連結部が免疫グロブリンＦｃと特異的に連結された結合体、その製造方法及びそれを含む組成物に関する。
2019506164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された、酵素結合体。
【請求項２】
前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼＡ（arylsulfatase A）、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetylglucosaminidase, NAGLU）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（N-acetylglucosamine-6-sulfatase）、ガラクトサミン６−スルファターゼ（galactosamine 6-sulfatase, GALN）、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）、α−フコシダーゼ（α-fucosidase）、β−マンノシダーゼ（β-mannosidase）、α−ノイラミニダーゼ（α-neuraminidase, sialidase）、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase）、ムコリピン１（mucolipin-1）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α-N-acetyl-galactosaminidase）、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ（N-aspartyl-β-glucosaminidase）、ＬＡＭＰ−２（Lysosome-associated membrane protein 2）、シスチノシン（Cystinosin）、シアリン（Sialin）、セラミダーゼ（ceramidase）、酸性β−グルコシダーゼ（acid-β-glucosidase）、ガラクトシルセラミダーゼ（galactosylceramidase）、ＮＰＣ１（Niemann-Pick disease, type C1）、カテプシンＡ（cathepsin A, protective protein）、ＳＵＭＦ１（Sulfatase-modifying factor 1）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase, LIPA）、トリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl peptidase 1）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）、イズロニダーゼ（iduronidase）、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項３】
前記酵素は、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）、イズロニダーゼ（iduronidase）、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択される、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項４】
前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積症（Glycogen storage disease）及びスフィンゴ脂質症（sphingolipidosis）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項５】
前記ムコ多糖症は、ＭＰＳ Ｉ（mucopolysaccharidosis I）及びＭＰＳ ＶＩ（mucopolysaccharidosis VI）からなる群から選択される、請求項４に記載の酵素結合体。
【請求項６】
前記グリコーゲン蓄積症はポンペ病（Pompe disease）である、請求項４に記載の酵素結合体。
【請求項７】
前記スフィンゴ脂質症は、ファブリー病（Fabry disease）及びゴーシェ病（Gaucher’s disease）からなる群から選択される、請求項４に記載の酵素結合体。
【請求項８】
前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素よりトランスサイトーシス（transcytosis）及び生体利用率（bioavailability, BA）が増加したものである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項９】
前記トランスサイトーシスは、免疫グロブリンＦｃ領域とＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）との結合によるものである、請求項８に記載の酵素結合体。
【請求項１０】
前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素より組織分布性（tissue distribution）が増加したものである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１１】
前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素より骨髄標的性が増加したものである、請求項１０に記載の酵素結合体。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は非グリコシル化されたものである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなる、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１８に記載の酵素結合体。
【請求項２０】
前記酵素結合体は、酵素のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合されたものである、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素結合体。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項２２】
前記酵素結合体は、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）、イズロニダーゼ（iduronidase）、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択される、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記薬学的組成物は、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性を増加させるものである、請求項２１又は２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための治療学的酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、
（ｂ）（ａ）ステップの前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、その生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法。
【請求項２５】
前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼＡ（arylsulfatase A）、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetylglucosaminidase, NAGLU）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（N-acetylglucosamine-6-sulfatase）、ガラクトサミン６−スルファターゼ（galactosamine 6-sulfatase, GALN）、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）、α−フコシダーゼ（α-fucosidase）、β−マンノシダーゼ（β-mannosidase）、α−ノイラミニダーゼ（α-neuraminidase, sialidase）、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase）、ムコリピン１（mucolipin-1）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α-N-acetyl-galactosaminidase）、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ（N-aspartyl-β-glucosaminidase）、ＬＡＭＰ−２（Lysosome-associated membrane protein 2）、シスチノシン（Cystinosin）、シアリン（Sialin）、セラミダーゼ（ceramidase）、酸性β−グルコシダーゼ（acid-β-glucosidase）、ガラクトシルセラミダーゼ（galactosylceramidase）、ＮＰＣ１（Niemann-Pick disease, type C1）、カテプシンＡ（cathepsin A, protective protein）、ＳＵＭＦ１（Sulfatase-modifying factor 1）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase, LIPA）、トリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl peptidase 1）、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）、イズロニダーゼ（iduronidase）、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択される、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２６】
下記化学式（１）で表される、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
［化１］
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）、イズロニダーゼ（iduronidase）、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素であり、
Ｌは非ペプチド性重合体であり、
ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、
ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【請求項２７】
前記酵素は、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）、イズロニダーゼ（iduronidase）、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）及びイミグルセラーゼ（imiglucerase）からなる群から選択される、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２８】
前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン及びエラスチンからなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれかに記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２９】
前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項２８に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３０】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれかに記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３１】
前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールである、請求項３０に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３２】
前記（ａ）ステップの非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、請求項２４〜２７のいずれかに記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３３】
前記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基である、請求項３２に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３４】
前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートである、請求項３２に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３５】
前記非ペプチド性重合体は、末端にアルデヒド反応基を有するものである、請求項３２に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３６】
前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド反応基を有するものである、請求項３２に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３７】
前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド反応基を有するものである、請求項３２に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３８】
前記酵素のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合された結合体を分離するステップをさらに含む、請求項２４〜２７のいずれかに記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項３９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス（transcytosis）増加用組成物。
【請求項４０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素結合体を含む、酵素の組織分布性（tissue distribution）増加用組成物。
【請求項４１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素結合体を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス（transcytosis）の増加方法。
【請求項４２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の酵素結合体を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素の組織分布性（tissue distribution）の増加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して治療学的酵素類に結合した治療学的酵素類結合体、前記結合体の製造方法、及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療学的酵素類などのタンパク質は、一般に安定性が低いので変性しやすく、血液内のプロテアーゼにより分解され、血中濃度及び力価を維持するために患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、主に注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品において、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射することは患者に多大な苦痛をもたらす。前記問題を解決するために、治療学的酵素類の血中安定性を向上させ、血中薬物濃度を高い濃度に長期間持続して薬効を最大化するための多くの努力がなされてきた。このような治療学的酵素類の持続性製剤は、治療学的酵素類の安定性を向上させると共に、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発しないものでなければならない。
【０００３】
特に、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）は、特定酵素の遺伝的欠陥により生じ、死に至る致命的な疾患であり、欠陥のある酵素の補充治療が必須である（非特許文献１）。酵素補充治療はリソソーム蓄積症において標準となる治療であり、不足した酵素を補充することにより既存の症状を緩和したり、疾患の進行を遅らせる効果を発揮する。しかし、継続して１〜２週間ごとに２〜６時間かけて薬物を静脈に投与しなければならず、患者及びその家族の日常生活が制限される。リソソーム蓄積症の治療に用いられる組換え酵素のヒトにおける半減期は、短い場合は１０分から３時間未満であり、その持続時間が非常に短いので、生涯酵素を投与しなければならない患者に不便をかけており、その半減期の延長が強く求められている。
【０００４】
また、リソソーム蓄積症治療に用いられる酵素の生体内蓄積位置が異なるという問題や、治療酵素が骨髄に到達しないなどという問題があるので、リソソーム蓄積症治療剤の開発の必要性が高まっている状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献２】国際公開第９６／０３２４７８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26;199(5):723-34
【非特許文献２】H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して連結された酵素結合体を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、前記酵素結合体を含むリソソーム蓄積症の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、前記酵素結合体を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
具体的な一態様として、前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼＡ（arylsulfatase A）、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetyl-glucosaminidase, NAGLU）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（N-acetylglucosamine-6-sulfatase）、ガラクトサミン−６−スルファターゼ（galactosamine 6-sulfatase, GALN）、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）、α−フコシダーゼ（α-fucosidase）、β−マンノシダーゼ（β-mannosidase）、α−ノイラミニダーゼ（α-neuraminidase, sialidase）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase）、ムコリピン１（mucolipin-1）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α-N-acetyl-galactosaminidase）、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ（N-aspartyl-β-glucosaminidase）、ＬＡＭＰ−２、シスチノシン（Cystinosin）、シアリン（Sialin）、セラミダーゼ（ceramidase）、酸性β−グルコシダーゼ（acid-β-glucosidase）、ガラクトシルセラミダーゼ（galactosylceramidase）、ＮＰＣ１、カテプシンＡ（cathepsin A, protective protein）、ＳＵＭＦ１、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase, LIPA）及びトリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl peptidase 1）からなる群から選択される酵素結合体を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００１４】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００１５】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００１６】
具体的な一態様として、前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）、グリコーゲン蓄積症（Glycogen storage disease）及びスフィンゴ脂質症（sphingolipidosis）からなる群から選択される酵素結合体を提供する。
【００１７】
具体的な他の態様として、前記ムコ多糖症は、ＭＰＳ（mucopolysaccharidosis）Ｉ及びＭＰＳ（mucopolysaccharidosis）ＶＩからなる群から選択される酵素結合体を提供する。
【００１８】
具体的なさらに他の態様として、前記グリコーゲン蓄積症はポンペ病（Pompe disease）である酵素結合体を提供する。
【００１９】
具体的なさらに他の態様として、前記スフィンゴ脂質症は、ファブリー病（Fabry disease）及びゴーシェ病（Gaucher’s disease）からなる群から選択される酵素結合体を提供する。
【００２０】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素よりトランスサイトーシス（transcytosis）及び生体利用率（bioavailability, BA）が増加したものである酵素結合体を提供する。
【００２１】
具体的なさらに他の態様として、前記トランスサイトーシスは、免疫グロブリンＦｃ領域とＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）との結合によるものである酵素結合体を提供する。
【００２２】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素より組織分布性（tissue distribution）が増加したものである酵素結合体を提供する。
【００２３】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素より骨髄標的性が増加したものである酵素結合体を提供する。
【００２４】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は非グリコシル化されたものである酵素結合体を提供する。
【００２５】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなる酵素結合体を提供する。
【００２６】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域をさらに含む酵素結合体を提供する。
【００２７】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントである酵素結合体を提供する。
【００２８】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである酵素結合体を提供する。
【００２９】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である酵素結合体を提供する。
【００３０】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである酵素結合体を提供する。
【００３１】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである酵素結合体を提供する。
【００３２】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、酵素又はその誘導体のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合されたものである酵素結合体を提供する。
【００３３】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム治療のための酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００３４】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００３５】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００３６】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００３７】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００３８】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
具体的な一態様として、前記薬学的組成物は、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性を増加させるものである薬学的組成物を提供する。
【００４０】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための治療学的酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４１】
具体的な一態様として、前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼＡ（arylsulfatase A）、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetylglucosaminidase, NAGLU）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（N-acetylglucosamine-6-sulfatase）、ガラクトサミン６−スルファターゼ（galactosamine 6-sulfatase, GALN）、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）、α−フコシダーゼ（α-fucosidase）、β−マンノシダーゼ（β-mannosidase）、α−ノイラミニダーゼ（α-neuraminidase, sialidase）、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase）、ムコリピン１（mucolipin-1）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α-N-acetyl-galactosaminidase）、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ（N-aspartyl-β-glucosaminidase）、ＬＡＭＰ−２、シスチノシン（Cystinosin）、シアリン（Sialin）、セラミダーゼ（ceramidase）、酸性β−グルコシダーゼ（acid-β-glucosidase）、ガラクトシルセラミダーゼ（galactosylceramidase）、ＮＰＣ１（Cholesterol trafficking）、カテプシンＡ（cathepsin A, protective protein）、ＳＵＭＦ１、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase, LIPA）及びトリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl peptidase 1）からなる群から選択される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４２】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記α−ガラクトシダーゼＡと非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４３】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記アリールスルファターゼＢと非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４４】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記イズロニダーゼと非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４５】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記α−グルコシダーゼと非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４６】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記イミグルセラーゼと非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４７】
具体的な一態様として、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４８】
具体的な他の態様として、前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールである、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４９】
具体的なさらに他の態様として、前記（ａ）ステップの非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００５０】
具体的なさらに他の態様として、前記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基である、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００５１】
具体的なさらに他の態様として、前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートである、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００５２】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体は、末端にアルデヒド反応基を有する酵素結合体を提供する。
【００５３】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド反応基を有する酵素結合体を提供する。
【００５４】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド反応基を有する酵素結合体を提供する。
【００５５】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合された結合体を分離するステップをさらに含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００５６】
本発明は、持続型治療学的酵素結合体に関し、特に、治療学的酵素、非ペプチド性重合体連結部及び免疫グロブリンＦｃが相互に共有結合により連結されているので、前記酵素の生体内持続性が向上するだけでなく、トランスサイトーシス（transcytosis）、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性が向上する酵素結合体に関する。本発明により製造された酵素結合体は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】アガルシダーゼβ持続型結合体のＰＫ実験結果を示す図である。
【図２】アガルシダーゼβ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を示す図である。
【図３】アガルシダーゼβ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞内吸収活性を示す図である。
【図４】イミグルセラーゼ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を示す図である。
【図５】ガルスルファーゼ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を示す図である。
【図６】イズロニダーゼ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。一方、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００５９】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための治療学的酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００６０】
具体的には、前記酵素結合体は、前記非ペプチド性重合体連結部が免疫グロブリンＦｃ領域及び前記酵素に結合された酵素結合体であってもよい。
【００６１】
本発明の一具体例においては、前記酵素結合体が非ペプチド性重合体を遊離Ｆｃ領域と遊離酵素に反応させて得たものであり、ここで、前記非ペプチド性重合体は前記非ペプチド性重合体連結部と繰り返し単位の種類、数、位置の面で同じ物質である。前記遊離Ｆｃ領域及び遊離酵素反応に用いられる非ペプチド性重合体は、その繰り返し単位の両端に前記繰り返し単位とは化学的構造が異なる末端反応基を有する物質であってもよい。このような酵素結合体の製造過程においては、その非ペプチド性重合体の両末端反応基を介して遊離酵素及び遊離免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ化学反応を起こし、その化学反応により末端反応基が変換されて生じる共有結合により非ペプチド性重合体の繰り返し単位が酵素及びＦｃ領域に連結された酵素結合体が得られる。すなわち、本発明の前記具体例においては、非ペプチド性重合体が製造過程を経て酵素結合体内の非ペプチド性重合体連結部に変換される。
【００６２】
本発明の酵素結合体に含まれる酵素は、特に限定されるものではなく、本発明の酵素結合体に製造することにより、非結合体形態の酵素より生体内持続時間を延長させるという利点を有する酵素であればよい。本発明の一実施形態において、その酵素結合体は治療学的酵素の結合体である。
【００６３】
具体的には、前記酵素は、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）、ガラクトース−６−スルファターゼ（Galactose-6-sulfatase）、酸性セラミダーゼ（acid ceramidase）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（acid sphingomyelinase）、ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）、アリールスルファターゼＡ（arylsulfatase A）、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ａ、β−ヘキソサミニダーゼ（beta-hexosaminidase）Ｂ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（heparin N-sulfatase）、α−Ｄ−マンノシダーゼ（alpha-D-mannosidase）、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（N-acetylgalactosamine-6 sulfatase）、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase）、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（alpha-N-acetylglucosaminidase, NAGLU）、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）、ブチリルコリンエステラーゼ（butyrylcholinesterase）、キチナーゼ（Chitinase）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（glutamate decarboxylase）、リパーゼ（lipase）、ウリカーゼ（Uricase）、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase）、中性エンドペプチダーゼ（neutral endopeptidase）、ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA-glucosaminide N-acetyltransferse）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（N-acetylglucosamine-6-sulfatase）、ガラクトサミン６−スルファターゼ（galactosamine 6-sulfatase, GALN）、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）、α−フコシダーゼ（α-fucosidase）、β−マンノシダーゼ（β-mannosidase）、α−ノイラミニダーゼ（α-neuraminidase, sialidase）、Ｎ−アセチル−グルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（N-acetyl-glucosamine-1-phosphotransferase）、ムコリピン１（mucolipin-1）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（α-N-acetyl-galactosaminidase）、Ｎ−アスパルチル−β−グルコサミニダーゼ（N-aspartyl-β-glucosaminidase）、ＬＡＭＰ−２、シスチノシン（Cystinosin）、シアリン（Sialin）、セラミダーゼ（ceramidase）、酸性β−グルコシダーゼ（acid-β-glucosidase）、ガラクトシルセラミダーゼ（galactosylceramidase）、ＮＰＣ１、カテプシンＡ（cathepsin A, protective protein）、ＳＵＭＦ１、リソソーム酸性リパーゼ（lysosomal acid lipase, LIPA）及びトリペプチジルペプチダーゼ１（Tripeptidyl peptidase 1）からなる群から選択される酵素結合体であってもよく、リソソーム蓄積症を治療できる酵素であれば、酵素の由来や種類に制限なく本発明に用いることができる。
【００６４】
本発明の他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００６５】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００６６】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００６７】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された、酵素結合体を提供する。
【００６８】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００６９】
本発明における「治療学的酵素」又は「酵素」とは、酵素の不足、欠乏、機能異常などにより発生する疾患を治療するための酵素であり、酵素補充療法（enzyme replacement therapy）、投与などにより前記疾患を有する個体を治療できる酵素を意味する。具体的には、リソソーム酵素の不足、欠乏などにより発生するリソソーム蓄積症の治療のための酵素であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７０】
本発明における「リソソーム（lysosome）」とは、細胞質に存在する小器官の一つであり、加水分解酵素を多く含んでおり、体内で巨大分子、細菌などの異物を分解し、前記分解された産物が細胞の他の部分でリサイクルされるように助ける小器官である。前記リソソームの機能は複数の酵素により行われるが、変異や不足などにより特定酵素が機能を喪失すると、リソソームの分解機能が喪失されることとなり、結局は分解されなければならない巨大分子などが細胞内に蓄積されて細胞の損傷などが誘発され、それによる疾患が発症する。
【００７１】
本発明における「リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）」とは、このようなリソソーム機能の喪失による希少遺伝性疾患を意味し、欠陥のある酵素を補充する酵素補充療法（enzymatic replacement therapy）が必須である。本発明においては、「リソソーム蓄積病」と混用される。前記リソソーム蓄積症は欠損した酵素によって分類され、（ｉ）スフィンゴ脂質症（sphingolipidosis）、（ｉｉ）ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis）（ｉｉｉ）グリコーゲン蓄積症（glycogen storage disease）、（ｉｖ）ムコリピド症（mucolipidosis）、（ｖ）オリゴ糖症（oligosaccharidosis）、（ｖｉ）脂質症（lipidosis）、（ｖｉｉ）リソソーム輸送疾患（lysosomal transport disease）などに分類される。
【００７２】
以下、リソソーム蓄積症をその分類に応じて詳細に説明する。
【００７３】
本発明における「スフィンゴ脂質症」とは、スフィンゴ脂質の糖側鎖又はコリン側鎖を加水分解するリソソーム酵素の遺伝性欠乏症である。ガラクトセレブロシダーゼ（galactocerebrosidsase）の欠乏によるクラッベ（Krabbe）病、α−ガラクトシダーゼＡ（alpha-galactosidase A）の欠乏によるファブリー病（Fabry disease）、スフィンゴミエリナーゼ（Sphingomyelinase）の欠乏によるニーマン・ピック（Niemann-pick）病、グルコセレブロシダーゼ（Glucocerebrosidase）の欠乏によるゴーシェ（Gaucher’s disease）病、ヘキソサミニダーゼ（Hexosaminidase A）の欠乏によるテイ・サックス病（Tay-Sachs disease）、ファーバー（Farber）病などそれぞれの蓄積脂質分布による疾患が含まれる。Ｘ染色体遺伝性疾患であるファブリー病を除いて、常染色体劣性遺伝性疾患に該当する。
【００７４】
本発明における「ファブリー病（Fabry disease, (Fabry’s disease)）」とは、リソソームにある加水分解酵素（α−ガラクトシダーゼＡ）の活性不足による糖脂質の先天性代謝異常を示す疾患であり、Ｘ染色体劣性で遺伝する遺伝性疾患である。幼児期は無症状であるが、児童期以降は四肢疼痛、皮膚発疹などが現れ、思春期以降は心血管病変、腎臓障害が現れる。治療方法としては、酵素補充療法や遺伝子治療などが研究されている。
【００７５】
本発明における「ゴーシェ病（Gaucher’s disease）」とは、グルコセレブロシダーゼ（glucocerebrosidase）酵素が遺伝子異常により欠乏して生じる先天性脂質代謝異常症であり、常染色体性（１番染色体）劣性遺伝性疾患である。古い細胞が肝臓、脾臓、骨髄に蓄積されて問題を引き起こす。酷い場合は肺、目、腎臓、心臓及び神経系にまで転移して深刻な合併症を引き起こすことが知られている。治療方法としては、酵素補充療法や遺伝子治療などが研究されている。
【００７６】
本発明における「ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）」とは、粘液性多糖の遺伝性分解酵素欠乏症であり、糖鎖分解酵素、スルファターゼ、アセチルトランスフェラーゼの欠乏などが原因として知られている。ガルゴイリズム（gargoylism）ともいう。主症状は、尿に粘液性多糖が過剰排泄されることである。現在は６つの病型に分類されており、Ｉ型はハーラー症候群（Hurler syndrome）、シャイエ症候群（Scheie syndrome）であり、ＩＩ型はハンター症候群（Hunter syndrome）であり、ＩＩＩ型はサンフィリッポ症候群（Sanfilippo syndrome）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型であり、ＩＶ型はモルキオ症候群（Morquio syndrome）Ａ、Ｂ型であり、ＶＩ型はマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）であり、ＶＩＩ型はスライ症候群（Sly syndrome）である。
【００７７】
本発明における「ハーラー症候群（Hurler syndrome）」とは、ムコ多糖分解酵素（α-L-iduronidase）の欠乏により発生するＭＰＳ（mucopolysaccharidosis）Ｉ型疾患であり、常染色体劣性遺伝性疾患であると共に希少遺伝性疾患である。ハンター症候群と似た症状を示すが、症状がより深刻に現れ、ほとんどが１０才以前に死亡する。知能障害、難聴、肝臓肥大、脾臓肥大、低い鼻、厚い唇、大きい舌などの外形的特徴、重度の骨格奇形などのハンター症候群と同様の症状に角膜混濁症状を伴う。
【００７８】
本発明における「マロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）」とは、ＭＰＳ（mucopolysaccharidosis）ＶＩ型疾患であり、グリコサミノグリカン（glycosaminoglycan）の分解に必要なアリールスルファターゼＢ（Arylsulfatase B, N-acetylgalactosamine-4-sulfatase）の不足により発生する常染色体劣性遺伝性疾患である。骨、心臓弁膜、脾臓、肝臓、角膜などに前記酵素の不足により分解されないデルマタン硫酸が沈着して現れる疾患である。
【００７９】
本発明における「グリコーゲン蓄積症（糖原病，glycogen storage disease）」とは、グリコーゲンが蓄積される炭水化物の先天性代謝異常疾患であり、Ｉ〜ＶＩＩ型があることが知られている。リソソーム蓄積症と関係のあるグリコーゲン蓄積症は第ＩＩ型（ポンペ病，Pompe disease）及びＩＩＩｂ型（ダノン病，Danon disease）である。
【００８０】
グリコーゲン蓄積症第ＩＩ型は、酸性マルターゼ欠損症（acid maltase deficiency）又はポンペ病（Pompe disease, Pompe’s disease）ともいい、リソソーム酵素の一つであるα−グルコシダーゼ（α-1, 4-glucosidase, acid alpha-glucosidase）の欠乏により生じる疾患であり、肝臓、腎臓の肥大、筋力低下、舌肥大、心臓肥大、呼吸困難などを引き起こし、数カ月以内に死亡することが知られている。
【００８１】
本発明における「リソソーム蓄積症治療のための治療学的酵素結合体（conjugate）」又は「酵素結合体」とは、前記リソソーム蓄積症の治療効果を有する酵素が非ペプチド性重合体連結部を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものであり、前記酵素によるリソソーム蓄積症の予防又は治療効果が得られる。
【００８２】
本発明の酵素結合体は、治療学的酵素の半減期を延長させることのできる物質を前記酵素に連結するので、持続性が増加するという効果を有する。よって、本発明の「酵素結合体」は「持続型結合体」と混用される。
【００８３】
また、本発明の酵素結合体は、酵素補充療法（enzymatic replacement therapy, ERT）の薬物として用いられてもよい。前記酵素補充療法は、疾患の原因となる欠乏又は不足酵素を補充することにより、低下した酵素機能を回復させて疾患を予防又は治療することができる。
【００８４】
具体的には、本発明のＦｃ領域に連結された酵素結合体は、前記Ｆｃ領域がＦｃＲｎに結合されるので、Ｆｃ領域が連結されていない酵素よりトランスサイトーシス（transcytosis）が増加するという効果を有する。
【００８５】
ＦｃＲｎを媒介とする増加したトランスサイトーシスは、酵素がＦｃ領域に連結されているため大きい分子を形成するにもかかわらず、細胞内吸収率を維持するように助けるだけでなく、治療酵素が酵素活性を長く維持しつつ体内に吸収され、酵素自体の機能が行えるようにすることにより、リソソーム蓄積症の治療を可能にする。
【００８６】
一方、治療学的酵素類、特にリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）に用いられるＥＲＴ酵素類は、生体内利用率（BA, bioavailability）が低いので静脈注射（iv, intravenous）で投与しなければならないという欠点があり、このような静脈注射は毎回患者が病院に行かなければならないという不便さがある。また、このような静脈注射は、アレルギータイプの過敏性反応を誘発し、高頻度により薬物注入に伴う反応（infusion reaction）をもたらす。
【００８７】
本発明の酵素結合体は、ＦｃＲｎ結合部位によるトランスサイトーシス（transcytosis）により生体内利用率を高めるので、静脈注射ではなく皮下注射を可能にし、このような投与方法の変化は、自己注射を可能にして患者の利便性を向上させ、薬物注入に伴う反応を減少させて副作用を最小限に抑えることができる。
【００８８】
また、治療学的酵素類、特にリソソーム蓄積症に用いられる酵素補充療法（ＥＲＴ）のための酵素は、特定組織に蓄積された老廃物を除去しなければならないので、各組織への均一な分布が非常に重要である。しかし、現在用いられているＥＲＴ酵素類は主に肝臓に多く分布しているので、様々な臓器に分布する薬物の開発が必須である。
【００８９】
本発明の酵素結合体は、延長された血中半減期とＦｃＲｎ結合部位によるトランスサイトーシス（transcytosis）により肝臓以外の様々な組織、特に骨髄、脾臓、腎臓などでも生体内濃度が高い優れた分布を示すので、治療学的効率を最大化させることができる。特に、本発明の酵素結合体は高い骨髄標的性を示す。骨髄組織は骨の内部に存在する柔軟な構造の組織であるので、骨髄組織への標的性を増大させることにより、酵素補充療法による骨髄での薬理作用によりさらなる効果を期待することができ、リソソーム蓄積症を効果的に治療することができる。
【００９０】
特に、前記リソソーム蓄積症は様々な臓器で発生し、特に骨髄における疾患は、骨の異常症状又は骨の生成抑制、骨髄で必ず生成されなければならない赤血球生成ホルモンと血小板生成ホルモンの生成抑制により貧血など様々な副作用を引き起こすが、現在商用化されている酵素治療剤は骨髄の分布が非常に低いので、これらの副作用が頻繁に発生する。このような面から、本発明の酵素結合体は、高い骨髄標的性を示すことにより、酵素補充療法の優れた治療剤となる。
【００９１】
よって、本発明の酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域とＦｃＲｎとの結合により、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素よりトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性が増加したものであってもよい。
【００９２】
本発明の酵素結合体に含まれる治療学的酵素は、リソソーム蓄積症に対する治療効果を有するものであれば限定されるものではないが、具体的には次の酵素であってもよい。
【００９３】
本発明における「α−ガラクトシダーゼＡ（alpha-galactosidase A）」とは、アガルシダーゼ（aglasidase）ともいい、ファブリー病（Fabry disease）に関係する酵素であり、糖脂質又は糖タンパク質の末端α−ガラクトシル部分（terminal alpha-galactosyl moieties）をガラクトース及びグルコースに加水分解する酵素である。本発明における前記α−ガラクトシダーゼＡは、α−ガラクトシダーゼ又はアガルシダーゼ（agalsidase）と混用される。前記α−ガラクトシダーゼ又はアガルシダーゼは、アガルシダーゼα又はアガルシダーゼβであってもよい。
【００９４】
本発明における「イミグルセラーゼ（imiglucerase）」とは、グルコシルセラミド加水分解酵素の活性を有する酵素であり、糖脂質の代謝過程の中間体であるグルコセレブロシドのβ−グリコシド結合（β-glucosidic linkage）を加水分解する酵素であり、ヒトβ−グルコセレブロシダーゼ（beta-glucocerebrosidase）の組換え形態である。ゴーシェ病（Gaucher’s disease）に関係することが知られている。
【００９５】
本発明における「イズロニダーゼ（iduronidase）」とは、Ｌ−イズロニダーゼ（L-iduronidase）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（alpha-L-iduronidase, IDUA）、ラロニダーゼ（laronidase）ともいい、デルマタン硫酸やヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカンの加水分解に関与する。本発明における前記イズロニダーゼはラロニダーゼ（laronidase）と混用される。
【００９６】
本発明における「アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）」とは、肝臓、膵臓、腎臓のリソソームに存在するアリールスルファターゼ酵素であり、グリコサミノグリカンを分解することにより、サルフェートを加水分解する役割を果たす。前記アリールスルファターゼＢは、ムコ多糖症ＶＩ型（Maroteaux-Lamy syndrome）に関係することが知られている。本発明におけるアリールスルファターゼＢはガルスルファーゼ（galsulfase）と混用される。
【００９７】
本発明における「α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）」とは、デンプン又は二糖類をグルコースに分解するグルコシダーゼの一種であり、この酵素の欠乏によりポンペ病が発生する。本発明における前記α−グルコシダーゼは、アルグルコシダーゼ（alglucosidase）又は酸性α−グルコシダーゼ（Acid alpha-glucosidase, GAA）と混用される。
【００９８】
本発明の一実施例においては、リソソーム蓄積症治療のための酵素である、アガルシダーゼ、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ及びラロニダーゼをそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び非ペプチド性重合体に連結した結合体を製造し（実施例３）、各酵素結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認した（実施例４〜８）。
【００９９】
その結果、各酵素結合体の酵素は、Ｆｃ領域との結合にもかかわらず、酵素活性を保持しながらも、半減期、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性が全て増加することが確認された。
【０１００】
本発明の酵素結合体に含まれる前記治療学的酵素は、天然のものを用いてもよく、一部で構成されたフラグメント、又は一部のアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた酵素の誘導体（analog）も天然酵素と同等の活性を有するものであれば本発明に用いられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
前記酵素誘導体には当該酵素のバイオシミラーやバイオベターの形態が含まれるが、例えば、公知酵素と発現宿主の差異、グリコシル化の様相と程度の差異、特定位置の残基が当該酵素の基準配列に対して１００％の置換でない場合はその置換の程度の差異も、本発明の酵素結合体に用いることができるバイオシミラー酵素に該当する。前記酵素は、遺伝子組換えにより動物細胞、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、生きている動物などから生産することができ、生産方法はこれらに限定されるものではなく、商業的に利用可能な酵素であってもよい。
【０１０２】
また、前記酵素又はその誘導体と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれてもよく、前記酵素は組換え技術により微生物から得られるか、商業的に利用可能なものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明における「相同性（homology）」とは、野生型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列と類似する程度を示すものであり、本発明のアミノ酸配列又は塩基配列と前記パーセント以上同一である配列を有する配列を含む。このような相同性は、２つの配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析するバイオインフォマティクスアルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定することもできる。前記２つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表すことができる。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group, Madison, W, USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで用いることができる。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ及びＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アルゴリズムが含まれる。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬ Ｗが含まれるソフトウェアで自動化されている。
【０１０４】
前記酵素又はその誘導体の配列及びそれをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどの公知のデータベースから得られる。
【０１０５】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を除いた残りの部分を意味し、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）領域をさらに含むこともある。特に、免疫グロブリンＦｃ領域全体及びその一部を含むフラグメントであってもよく、本発明における免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンフラグメントと混用されてもよい。
【０１０６】
天然Ｆｃは重鎖定常領域１においてＡｓｎ２９７部位に糖鎖が存在するが、大腸菌由来の組換えＦｃは糖鎖が存在しない形態で発現する。Ｆｃから糖鎖が除去されると、重鎖定常領域１に結合するＦｃγ受容体１、２、３と補体（ｃ１ｑ）の結合力が低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去される。
【０１０７】
本発明における「免疫グロブリン定常領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）（又は重鎖定常領域４(ＣＨ４)を含む）部分を含むＦｃフラグメントを意味するものであり、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリン定常領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域のみを除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む拡張された免疫グロブリン定常領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン定常領域は、（１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（５）１つ又は２つ以上の定常領域ドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、（６）重鎖定常領域各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。免疫グロブリンＦｃフラグメントをはじめとする定常領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に用いることができる。また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が少ないので、結合体の作製、精製及び収率面で有利なだけでなく、アミノ酸配列が抗体毎に異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性が低くなるという効果も期待することができる。
【０１０８】
一方、免疫グロブリン定常領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、ヒト起源であることが好ましい。また、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）による定常領域からなる群から選択されてもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。本発明における免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体であってもよい。
【０１０９】
本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリン定常領域（好ましくはＦｃ領域）をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
【０１１０】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖免疫グロブリン定常領域（好ましくはＦｃ領域）内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリン定常領域に相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域をさらに含んでもよい。
【０１１１】
ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリダイゼーションも可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、より具体的には、補体依存性細胞傷害（CDC, Complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよい。
【０１１２】
また、免疫グロブリン定常領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリン定常領域糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的手法などの通常の方法が用いられてもよい。ここで、免疫グロブリン定常領域から糖鎖が除去された免疫グロブリン定常領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリン定常領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。よって、より具体的には、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域、すなわちヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を用いることができる。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【０１１３】
また、本発明の免疫グロブリン定常領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられてもよい。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が欠失された誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など様々な種類の誘導体が用いられてもよい。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリン定常領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献１、２などに開示されている。
【０１１４】
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（非特許文献２）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミル化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【０１１５】
前述した免疫グロブリン定常領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン定常領域と同じ生物学的活性を示すが、免疫グロブリン定常領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させた誘導体であってもよい。また、このような免疫グロブリン定常領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから取得する方法においては、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得ることができる。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。
【０１１６】
ヒト由来の免疫グロブリン定常領域、微生物から得られた組換え免疫グロブリン定常領域であることが好ましい。
【０１１７】
本発明における「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性重合体を含み、「非ペプチド性リンカー」と混用される。前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。本発明における非ペプチド性重合体は、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素との反応により結合体を形成することができる。
【０１１８】
本発明における「非ペプチド性重合体連結部（linkage moiety）」とは、両末端に反応基を有する非ペプチド性重合体が各反応基を介して免疫グロブリンＦｃ領域及び治療学的酵素に結合して形成した結合体内の一構成要素を意味する。
【０１１９】
具体的な一実施形態において、前記酵素結合体は、両末端に免疫グロブリンＦｃ領域及び治療学的酵素に結合される反応基を含む非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域及び治療学的酵素が互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。
【０１２０】
具体的には、特にこれらに限定されるものではないが、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（polylactic acid）やＰＬＧＡ（polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。より具体的な実施形態において、前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールであってもよいが、これに限定されるものではない。また、当該分野に公知のこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【０１２１】
本発明に用いられる非ペプチド性重合体の分子量は、０超〜２００ｋＤａの範囲、具体的には１〜１００ｋＤａの範囲、より具体的には１〜５０ｋＤａの範囲、さらに具体的には１〜２０ｋＤａの範囲、さらに具体的には３．４ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲、さらに具体的には約３．４ｋＤａであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
具体的な一実施形態において、前記非ペプチド性重合体の両末端は、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ基又はチオール基、及び治療学的酵素のアミノ基又はチオール基に結合することができる。
【０１２３】
具体的には、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｃ及び治療学的酵素に結合される反応基、例えば治療学的酵素又は免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端もしくはリシンに位置するアミノ基、又はシステインのチオール基に結合される反応基を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
より具体的には、前記非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
前記アルデヒド基の例として、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２６】
前記スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
前記非ペプチド性重合体は、前記反応基を介して免疫グロブリンＦｃ及び治療学的酵素に連結され、非ペプチド性重合体連結部に変換されてもよい。
【０１２８】
また、アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
【０１２９】
本発明の非ペプチド性重合体の末端反応基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。前記非ペプチド性重合体は、末端にアルデヒド反応基を有するものであってもよく、また前記非ペプチド性重合体は、末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド反応基を有するものであってもよく、末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド反応基を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１３０】
一例として、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。他の例として、一末端にはスクシンイミジル基、他の末端にはプロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。
【０１３１】
プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリ（エチレングリコール）を非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応基として活性化するか、商業的に入手可能な修飾された反応基を有するポリ（エチレングリコール）を用いることにより、本発明の酵素結合体を製造することができる。
【０１３２】
具体的な一実施形態において、前記非ペプチド性重合体の反応基が治療学的酵素のシステイン残基、より具体的にはシステインの−ＳＨ基に連結されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
マレイミド−ＰＥＧ−アルデヒドを用いる場合、マレイミド基は治療学的酵素の−ＳＨ基にチオエーテル（thioether）結合により連結することができ、アルデヒド基は免疫グロブリンＦｃの−ＮＨ2基に還元的アルキル化反応により連結することができるが、これに限定されるものではなく、これは一例にすぎない。
【０１３４】
このような還元的アルキル化により、ＰＥＧの一末端に位置する酸素原子に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端アミノ基が−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−の構造を有するリンカー官能基を介して互いに連結され、−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−免疫グロブリンＦｃのような構造を形成することができ、チオエーテル結合により、ＰＥＧの一末端が治療学的酵素のシステインに位置する硫黄原子に連結された構造を形成することができる。前記チオエーテル結合は化学式（２）の構造を有するものであってもよい。
【０１３５】
2019506164.tif 000003
・・・・（２）
【０１３６】
しかし、前記例に特に限定されるものではなく、これは一例にすぎない。
【０１３７】
また、前記結合体において、非ペプチド性重合体の反応基が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置する−ＮＨ2に連結されたものであってもよいが、これは一例にすぎない。具体的には、本発明の治療学的酵素は、反応基を有する非ペプチド性重合体にＮ末端を介して連結されてもよい。
【０１３８】
本発明における「Ｎ末端」とは、ペプチドのアミノ末端を意味し、本発明の目的上、非ペプチド性重合体に結合することができる位置を意味する。例えば、これに限定されるものではないが、Ｎ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端周辺のアミノ酸残基が全て含まれてもよく、具体的には最末端から１〜２０番目のアミノ酸残基が含まれてもよい。
【０１３９】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症治療のための治療学的酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１４０】
具体的には、前記酵素は前述した通りである。
【０１４１】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１４２】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１４３】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１４４】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１４５】
本発明のさらに他の態様は、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を含むリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１４６】
本発明における「リソソーム」、「リソソーム蓄積症」、「α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ」、「アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）」、「イズロニダーゼ（iduronidase）」、「α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）」、「イミグルセラーゼ（imiglucerase）」、「免疫グロブリンＦｃ領域」、「非ペプチド性重合体連結部」、「酵素結合体」は前述した通りである。
【０１４７】
本発明における「予防」とは、前記リソソーム蓄積症治療のための治療学的酵素又はそれを含む組成物の投与によりリソソーム蓄積症の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記酵素又はそれを含む組成物の投与によりリソソーム蓄積症の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【０１４８】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記組成物を生体内標的に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。
【０１４９】
本発明のリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）予防又は治療用薬学的組成物は、リソソーム蓄積症の原因となる欠乏又は不足酵素をリソソーム蓄積症の個体に投与することにより、リソソーム酵素の機能を回復させてリソソーム蓄積症を治療する効果を有する。
【０１５０】
本発明の具体的な一態様は、トランスサイトーシス（transcytosis）、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性を増加させる薬学的組成物を提供する。
【０１５１】
本発明の薬学的組成物は、治療学的酵素がＦｃ領域に連結された酵素結合体とＦｃＲｎ受容体の固有結合により前記酵素結合体が細胞膜を容易に通過できるようにすると共に、血管から組織へより効果的に到達できるようにする。
【０１５２】
よって、トランスサイトーシス（transcytosis）、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性が増加するという効果を有し、優れたリソソーム蓄積症治療効果を発揮する。
【０１５３】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。このような薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、非自然的に発生したものであってもよい。前記担体は、特にこれらに限定されるものではないが、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。
【０１５４】
本発明における「薬学的に許容」とは、治療効果を示す程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
【０１５５】
本発明の組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
【０１５６】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【０１５７】
さらに、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
【０１５８】
さらに、前記組成物は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単位投与型の製剤、具体的にはタンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当業界で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路を含む非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１５９】
さらに、前記結合体は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容された様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（stabilizers）などを薬剤として用いることができる。
【０１６０】
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。
【０１６１】
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の結合体の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
【０１６２】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１６３】
具体的な態様として、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１６４】
また、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１６５】
さらに、イズロニダーゼ（iduronidase）酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１６６】
さらに、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１６７】
さらに、イミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、リソソーム蓄積症の予防又は治療方法を提供する。
【０１６８】
前記酵素結合体、それを含む組成物、リソソーム蓄積症、予防及び治療は前述した通りである。
【０１６９】
本発明における「個体」とは、リソソーム蓄積症の疑いのある個体であり、前記リソソーム蓄積症の疑いのある個体は、当該疾患が発症したか、発症する可能性のある、ヒトをはじめとしてマウス、家畜などが含まれる哺乳動物を意味するが、本発明の結合体又はそれを含む前記組成物で治療可能な個体は限定されることなく含まれる。
【０１７０】
本発明の方法は、前記結合体を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。適切な総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。
【０１７１】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１７２】
具体的な態様として、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１７３】
また、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１７４】
さらに、イズロニダーゼ（iduronidase）酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１７５】
さらに、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１７６】
さらに、イミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１７７】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１７８】
具体的な態様として、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１７９】
また、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１８０】
さらに、イズロニダーゼ（iduronidase）酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１８１】
さらに、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１８２】
さらに、イミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１８３】
前記酵素結合体、それを含む組成物、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性は前述した通りである。
【０１８４】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体における、リソソーム蓄積症の予防又は治療用途を提供する。
【０１８５】
具体的な態様として、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素結合体における、リソソーム蓄積症の予防又は治療用途を提供する。
【０１８６】
また、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素結合体における、リソソーム蓄積症の予防又は治療用途を提供する。
【０１８７】
さらに、イズロニダーゼ（iduronidase）酵素結合体における、リソソーム蓄積症の予防又は治療用途を提供する。
【０１８８】
さらに、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素結合体における、リソソーム蓄積症の予防又は治療用途を提供する。
【０１８９】
さらに、イミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素結合体における、リソソーム蓄積症の予防又は治療用途を提供する。
【０１９０】
前記酵素結合体、リソソーム蓄積症、予防及び治療は前述した通りである。
【０１９１】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素における、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１９２】
具体的な態様として、α−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素における、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１９３】
また、アリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素における、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１９４】
さらに、イズロニダーゼ（iduronidase）酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素における、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１９５】
さらに、α−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素における、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１９６】
さらに、イミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素における、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１９７】
前記酵素結合体、それを含む組成物、トランスサイトーシス、生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性は前述した通りである。
【０１９８】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための治療学的酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０１９９】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
【０２００】
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のための酵素であり、Ｌは非ペプチド性重合体であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【０２０１】
具体的には、前記酵素は前述した通りである。
【０２０２】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０２０３】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
【０２０４】
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−ガラクトシダーゼ（alpha-galactosidase）Ａ酵素であり、Ｌは非ペプチド性重合体であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【０２０５】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０２０６】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
【０２０７】
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのアリールスルファターゼＢ（arylsulfatase B, ARSB）酵素であり、Ｌは非ペプチド性重合体であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【０２０８】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０２０９】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
【０２１０】
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイズロニダーゼ（iduronidase）酵素であり、Ｌは非ペプチド性重合体であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【０２１１】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０２１２】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
【０２１３】
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのα−グルコシダーゼ（alpha-glucosidase）酵素であり、Ｌは非ペプチド性重合体であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【０２１４】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素と非ペプチド性重合体を連結するステップと、（ｂ）前記酵素と非ペプチド性重合体が連結された連結体を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質に連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０２１５】
Ｘ−Ｌａ−Ｆ・・・（１）
【０２１６】
ここで、Ｘはリソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）治療のためのイミグルセラーゼ（imiglucerase）酵素であり、Ｌは非ペプチド性重合体であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。
【０２１７】
本発明において、前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン及びエラスチンからなる群から選択されるものであってもよく、より具体的には、前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０２１８】
前記Ｆは、Ｘに共有化学結合又は非共有化学結合により互いに結合されたものであってもよく、Ｌを介して、Ｘに共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせにより互いに結合されたものであってもよい。
【０２１９】
また、前記Ｌは、ペプチド性重合体又は非ペプチド性重合体であってもよい。
【０２２０】
前記Ｌがペプチド性重合体である場合、１つ以上のアミノ酸を含んでもよく、例えば１個〜１０００個のアミノ酸を含んでもよいが、特にこれらに限定されるものではない。本発明において、ＦとＸを連結するために、公知の様々なペプチドリンカーが本発明に用いられ、例えば［ＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＧＳ］ｘリンカーなどが挙げられ、ここで、ｘは１以上の自然数であってもよい。しかし、前記例に限定されるものではない。
【０２２１】
前記Ｌがペプチド性重合体である場合、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよく、より具体的には、ポリエチレングリコールであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０２２２】
また、前記（ａ）ステップにおける非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものであってもよく、より具体的には、前記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基であってもよく、前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０２２３】
また、前記非ペプチド性重合体は、末端にアルデヒド反応基を有するものであってもよく、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド反応基を有するものであってもよく、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド反応基を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０２２４】
また、本発明の具体的な態様は、前記酵素のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合された結合体を分離するステップをさらに含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０２２５】
本発明の製造方法により製造された酵素結合体は、治療学的酵素をＦｃ領域に連結させることにより、前記Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体の固有結合により酵素結合体が細胞膜を容易に通過できるようにすると共に、血管から組織へより効果的に到達できるようにする。
【０２２６】
このような酵素の増加したトランスサイトーシス、生体利用率及び組織分布性は、全て酵素結合体に含まれる、リソソーム蓄積症の治療のための酵素が体内で酵素活性を保持しつつ効果的な標的疾患の治療効果を発揮できるように作用する。
【０２２７】
また、本発明の酵素結合体は、酵素又はその誘導体（analog）の半減期を延長させるものであってもよい。
【０２２８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０２２９】
酵素の生産
持続型酵素を生産するために、動物細胞発現ベクターを導入した動物細胞を培養して精製した。
【０２３０】
本発明において、結合体の製造のために用いた酵素は、アガルシダーゼβ（Agalsidase beta）、イミグルセラーゼ（Imiglucerase）、ガルスルファーゼ（Galsufase）及びラロニダーゼ（Laronidase）である。
【実施例２】
【０２３１】
酵素結合体の製造−１
免疫グロブリンＦｃ領域に非ペプチド性重合体を結合して精製した。
【０２３２】
実施例１で精製した酵素のＮ末端に非ペプチド性重合体を共有結合させた。ここで、非ペプチド性重合体は、両側にアルデヒド（aldehyde, -CHO）基を有する線状（linear）重合体であり、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol, (CH2CH2O)n）骨格（backbone）を有する。骨格の数によって非ペプチド性重合体の大きさが決定され、非ペプチド性重合体の反応基であるアルデヒド（aldehyde, -CHO）は、タンパク質の構成要素であるリシン（lysine）基の−ＮＨ２又はＮ末端の−ＮＨ２と共有結合する。非ペプチド性重合体のアルデヒド（aldehyde, -CHO）基は特定反応条件下でＮ末端の−ＮＨ２と特異的に反応し、反応後の精製過程によりＮ末端に特異的に共有結合した非ペプチド性重合体酵素を得る。
【実施例３】
【０２３３】
酵素結合体の製造−２
実施例２で精製した非ペプチド性重合体に結合した免疫グロブリンＦｃ領域に実施例１で精製した酵素を結合させた。
【０２３４】
前記酵素は、非ペプチド性重合体の結合位置によって活性が異なりうる。すなわち、非ペプチド性重合体と酵素の位置特異的結合により体内半減期又は活性が向上しうる。よって、本発明の酵素の構造に応じて、非ペプチド性重合体を結合させる位置を特定して結合体を製造する。
【０２３５】
実施例３−１：アガルシダーゼ（Agalsidase）と免疫グロブリンＦｃをポリエチレングリコールで連結した結合体の製造
アガルシダーゼβを含む結合体を次のように製造した。
【０２３６】
前述したように作製したアルデヒド−ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝１００００Ｄａ）−アルデヒド（ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ）（SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan）リンカーをアガルシダーゼのＮ末端に結合させるために、アガルシダーゼβとＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤのモル比を１：５０とし、アガルシダーゼβの濃度を１０ｍｇ／ｍＬとして４℃で約２時間反応させた。ここで、反応は１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．６で行い、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応液から、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）バッファーと塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE, 米国）カラムを用いて、未反応のアガルシダーゼとモノ結合したアガルシダーゼβを精製した。
【０２３７】
次に、前述したように精製したポリエチレングリコールリンカーに結合されたアガルシダーゼβと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：１０とし、総タンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍＬとして４〜８で１２〜１６時間反応させた。ここで、反応液はリン酸カリウム（ｐＨ６．０）であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応終了後に、前記反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）バッファーと塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE, 米国）カラムと、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５％（ｖ／ｖ）グリセリンとクエン酸塩（ｐＨ４．０）、塩化ナトリウム、１０％グリセリンバッファーの濃度勾配を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（GE, 米国）に適用し、最後に塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウムバッファーを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘTM ２００（GE, 米国）に適用し、アガルシダーゼβに免疫グロブリンＦｃがポリエチレングリコールリンカーにより共有結合で連結された結合体を精製した。具体的には、実施例２で精製した非ペプチド性重合体酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体の未反応の他方のアルデヒド（aldehyde, -CHO）基と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の−ＮＨ2基に共有結合させ、共有結合反応後の精製により酵素結合体の製造を完了した。
【０２３８】
最終的に製造されたアガルシダーゼ−ポリエチレングリコールリンカー−免疫グロブリンＦｃ結合体は、アガルシダーゼが２本の鎖からなる免疫グロブリンＦｃの一方の鎖にポリエチレングリコールリンカーで連結された形態である。
【０２３９】
実施例３−２：イミグルセラーゼ（Imiglucerase）と免疫グロブリンＦｃをポリエチレングリコールで連結した結合体の製造
イミグルセラーゼを含む結合体を次のように製造した。
【０２４０】
アルデヒド−ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝１００００Ｄａ）−アルデヒド（ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ）（SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan）リンカーをイミグルセラーゼのＮ末端に結合させるために、イミグルセラーゼとＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤのモル比を１：５０とし、イミグルセラーゼの濃度を１ｍｇ／ｍＬとして２５℃で約１時間反応させた。ここで、反応は１００ｍＭリン酸カリウム（Potassium phosphate）、ｐＨ６．０で行い、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応液から、２０ｍＭリン酸ナトリウム（Sodium phosphate）（ｐＨ６．０）、２．５％（ｖ／ｖ）グリセリンを含むバッファーと塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（GE, 米国）カラムを用いて、未反応のイミグルセラーゼとモノ結合したイミグルセラーゼを精製した。
【０２４１】
次に、前述したように精製されたポリエチレングリコールリンカーに結合されたイミグルセラーゼと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：５０とし、総タンパク質濃度を４０ｍｇ／ｍＬとして４〜８で１２〜１６時間反応させた。ここで、反応液は１００ｍＭリン酸カリウム（Potassium phosphate）（ｐＨ６．０）であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応終了後に、前記反応液を１０ｍＭクエン酸塩（Sodium citrate）（ｐＨ５．０）バッファーと塩化ナトリウム（Sodium chloride）の濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（GE, 米国）カラムと、２０ｍＭトリス（Tris）（ｐＨ７．５）、５％（ｖ／ｖ）グリセリンと１００ｍＭクエン酸ナトリウム（Sodium citrate）（ｐＨ３．７）、塩化ナトリウム、１０％グリセリンバッファーの濃度勾配を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（GE, 米国）に適用し、最後に塩化ナトリウムを含む５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．１）を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘTM ２００（GE, 米国）に適用し、イミグルセラーゼに免疫グロブリンＦｃがポリエチレングリコールリンカーにより共有結合で連結された結合体を精製した。
【０２４２】
具体的には、前述したように精製した非ペプチド性重合体酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体の未反応の他方のアルデヒド（aldehyde, -CHO）基と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の−ＮＨ2基に共有結合させ、共有結合反応後の精製により酵素結合体の製造を完了した。
【０２４３】
最終的に製造されたイミグルセラーゼ−ポリエチレングリコールリンカー−免疫グロブリンＦｃ結合体は、イミグルセラーゼ単量体が２本の鎖からなる免疫グロブリンＦｃの一方の鎖にポリエチレングリコールリンカーで連結された形態である。
【０２４４】
実施例３−３：ガルスルファーゼ（Galsulfase）と免疫グロブリンＦｃをポリエチレングリコールで連結した結合体の製造
ガルスルファーゼを含む結合体を次のように製造した。
【０２４５】
アルデヒド−ポリエチレングリコール−アルデヒド（Aldehyde-Polyethyleneglycol-Aldehdye, １０ｋＤａ）（SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan）リンカーをガルスルファーゼのＮ末端に結合させるために、ガルスルファーゼとＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤのモル比を１：２０とし、ガルスルファーゼの濃度を１ｍｇ／ｍＬとして２５℃で約２時間反応させた。ここで、反応は１２ｍＭリン酸ナトリウム（Sodium phosphate）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．８で行い、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応液から、２０ｍＭトリス（Tris, ｐＨ７．０）バッファーと塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE, 米国）カラムと、１．８Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ（GE, 米国）カラムを用いて、未反応のガルスルファーゼとモノＰＥＧガルスルファーゼを精製した。
【０２４６】
次に、前述したように精製されたポリエチレングリコールリンカーに結合されたガルスルファーゼと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：２０とし、総タンパク質濃度を５０ｍｇ／ｍＬとして４〜８で１２〜１６時間反応させた。ここで、反応液はリン酸カリウム（Potassium phosphate, ｐＨ６．０）であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応終了後に、前記反応液をトリス（Tris, ｐＨ７．０）バッファーと塩化ナトリウム（Sodium chloride）の濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE, 米国）カラムと、２０ｍＭトリス（Tris, ｐＨ７．０）、５％（ｖ／ｖ）グリセリン（Glycerol）とクエン酸塩（Sodium citrate, ｐＨ３．０）、１０％グリセリン（Glycerol）バッファーの濃度勾配を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（GE, 米国）に適用し、最後に１．８Ｍ硫酸アンモニウム（Ammonium sulfate）で平衡化されたＳｏｕｒｃｅ ＩＳＯ（GE, 米国）カラムを用いて、ガルスルファーゼに免疫グロブリンＦｃがポリエチレングリコールリンカーにより共有結合で連結された結合体を精製した。
【０２４７】
具体的には、前述したように精製した非ペプチド性重合体酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体の未反応の他方のアルデヒド（aldehyde, -CHO）基と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の−ＮＨ2基に共有結合させ、共有結合反応後の精製により酵素結合体の製造を完了した。
【０２４８】
最終的に製造されたガルスルファーゼ−ポリエチレングリコールリンカー−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ガルスルファーゼ単量体が２本の鎖からなる免疫グロブリンＦｃの一方の鎖にポリエチレングリコールリンカーで連結された形態である。
【０２４９】
実施例３−４：ラロニダーゼ（Laronidase）と免疫グロブリンＦｃをポリエチレングリコールで連結した結合体の製造
ラロニダーゼを含む結合体を次のように製造した。
【０２５０】
１０ｋＤａのアルデヒド−ポリエチレングリコール−アルデヒド（１０ｋＤａ，ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ）リンカー（SUNBRIGHT DE-100AL2, NOF CORPORATION, Japan）をラロニダーゼのＮ末端に結合させるために、ラロニダーゼと１０ｋＤａのＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤのモル比を１：１００とし、ラロニダーゼの濃度を０．５８ｍｇ／ｍＬとして４〜８℃で約１６時間反応させた。ここで、反応は１００ｍＭリン酸カリウム（Potassium phosphate）、ｐＨ６．０で行い、還元剤として１０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium cyanoborohydride, SCB）を添加した。反応液から、リン酸カリウム（ｐＨ６．０）と塩化ナトリウム（Sodium chloride）の濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（GE, 米国）カラムと、リン酸カリウム（ｐＨ６．０）と硫酸アンモニウム（Ammonium sulfate）の濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（GE, 米国）を用いて、ポリエチレングリコールリンカーにモノ結合されたラロニダーゼを精製した。
【０２５１】
次に、前述したように精製されたポリエチレングリコールリンカーに結合されたラロニダーゼと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：１０とし、総タンパク質濃度を２０ｍｇ／ｍＬとして４〜８で約１４時間反応させた。ここで、反応液は１００ｍＭリン酸カリウム（Potassium phosphate）、ｐＨ６．０であり、還元剤として１０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応終了後に、前記反応液をリン酸カリウム（ｐＨ６．０）バッファーと塩化ナトリウム（Sodium chloride）の濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（GE, 米国）カラムに適用し、最後に２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、５％（ｖ／ｖ）グリセリン（Glycerol）と１００ｍＭクエン酸塩（Citric acid monohydrate）（ｐＨ３．７）、１０％グリセリン及び１００ｍＭクエン酸塩（ｐＨ４．０）、１０％グリセリンバッファーの濃度勾配を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（GE, 米国）に適用し、ラロニダーゼに免疫グロブリンＦｃがポリエチレングリコールリンカーにより共有結合で連結された結合体を精製した。
【０２５２】
具体的には、前述したように精製した非ペプチド性重合体酵素と免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体の未反応の他方のアルデヒド（aldehyde, -CHO）基と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の−ＮＨ2基に共有結合させ、共有結合反応後の精製により酵素結合体の製造を完了した。
【０２５３】
最終的に製造されたラロニダーゼ−ポリエチレングリコールリンカー−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ラロニダーゼ単量体が２本の鎖からなる免疫グロブリンＦｃの一方の鎖にポリエチレングリコールリンカーで連結された形態である。
【実施例４】
【０２５４】
酵素結合体の薬物動力学実験
本発明者らは、前記実施例で製造した酵素結合体の薬物動力学を調査することにより結合体の効果を確認しようとした。
【０２５５】
実施例４−１：イミグルセラーゼ（imiglucerase）持続性結合体のＰＫ確認
本発明者らは、前記実施例で製造したイミグルセラーゼ持続性結合体のＰＫ活性を確認した。
【０２５６】
各群において採血時点当たり３匹のＩＣＲマウス（mouse）でイミグルセラーゼ（Imiglucerase, 対照群）と前記実施例で製造したイミグルセラーゼ持続型結合体の血液内安定性及び薬物動力学係数を比較した。
【０２５７】
具体的には、対照群と試験群にイミグルセラーゼを基準に各１．５ｍｇ／ｋｇずつ静脈内注射し、その後静脈内注射投与群において注射後０、２、５、１０、２０及び６０分後に採血し、血清中のタンパク質量をイミグルセラーゼに対する抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０２５８】
薬物動力学分析の結果、イミグルセラーゼ持続型結合体は対照群に比べて血中半減期、ＡＵＣ（area under curve）がどちらも増加し、特に血中半減期は４倍以上増加した。前記ＡＵＣは、薬物分子の体内取り込みの程度を示す。
【０２５９】
実施例４−２：アガルシダーゼ持続性結合体のＰＫ確認
各群において採血時点当たり１又は３匹のＩＣＲマウス（mouse）でアガルシダーゼβ（Agalsidase beta, 対照群）と前記実施例で製造したアガルシダーゼβ持続型結合体の血液内安定性及び薬物動力学係数を比較した。
【０２６０】
具体的には、対照群と試験群にアガルシダーゼを基準に各１．０ｍｇ／ｋｇずつ静脈内及び皮下注射した。対照群静脈内及び皮下注射投与群は注射後０、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３、４、８、２４及び４８時間後に採血した。試験群静脈内注射群は注射後０、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に採血し、皮下注射投与群は注射後０、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後に採血した。血清中のタンパク質量をアガルシダーゼに対する抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０２６１】
アガルシダーゼβ持続性結合体の場合、対照群に比べて血中半減期、Ｃmax、ＡＵＣが全て増加した。また、アガルシダーゼβのＢＡが３．３％であるのに対して、アガルシダーゼβ持続性結合体は５８．２％と約１８倍以上も高い生体利用率を示すことが確認された（図１）。
【０２６２】
Ｃmaxは最高薬物濃度を意味し、ＡＵＣ（area under curve）は薬物分子の体内取り込みの程度を意味し、ＢＡ（Bioavailability）は生体内利用率を意味する。
【０２６３】
本発明者らは、製造された各酵素結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ活性を次のように確認しようとした。
【実施例５】
【０２６４】
アガルシダーゼ酵素結合体の活性確認
実施例５−１：アガルシダーゼ持続型結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
アガルシダーゼβの持続型結合体の製造による酵素活性の変化を測定すべくｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性測定を行った。
【０２６５】
具体的には、酵素基質として知られる４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅをアガルシダーゼβ及びアガルシダーゼβ持続型結合体と３７℃で２０分間反応させ、その後最終的に生成された４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌの吸光度を測定することにより、当該物質の酵素活性を測定した。
【０２６６】
その結果、アガルシダーゼβとアガルシダーゼβ持続型結合体の酵素比活性（specific activity）がそれぞれ６３．６μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、５６．３μｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇであることが確認された。結論として、遊離アガルシダーゼβに比べて、アガルシダーゼβ持続型結合体の酵素活性は８８．６％とアガルシダーゼβ持続型結合体の製造による酵素活性の減少は僅かであることが確認された（図２）。
【０２６７】
実施例５−２：アガルシダーゼ持続型結合体の細胞内吸収活性
アガルシダーゼβはマンノース−６−リン酸受容体（M6PR, mannose-6-phosphate receptor）により細胞に吸収されて作用するので、アガルシダーゼβ持続型結合体の製造が細胞吸収活性に影響を及ぼすか否かを次のように確認した。
【０２６８】
具体的には、まずＭ６ＰＲが発現することが知られているＣＣＤ９８６ＳＫ ｃｅｌｌ（human skin fibroblast）をアガルシダーゼβ及びアガルシダーゼβ持続型結合体でそれぞれ処理し、その後３７℃で細胞内吸収を誘導した。２４時間後に、細胞内存在するアガルシダーゼβ及びアガルシダーゼβ持続型結合体を酵素活性測定法により確認した。
【０２６９】
その結果、アガルシダーゼβ持続型結合体の細胞内吸収活性（Ｋuptake＝２９．３ｎＭ）は、アガルシダーゼβの細胞内吸収活性（Ｋuptake＝１３．７ｎＭ）の約４７％であることが確認された。このようなＭ６ＰＲの結合及び細胞内吸収活性の減少（ｖｓ．アガルシダーゼβ）は持続型結合体のｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅの影響であり、持続型結合体の製造による結合（conjugation）で改善されたＰＫにより補償される（図３）。
【０２７０】
実施例５−３：アガルシダーゼ持続型結合体のＭ６Ｐ受容体結合力の確認
アガルシダーゼβ及びアガルシダーゼβ持続型結合体のｍａｎｎｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ６受容体（Ｍ６ＰＲ）結合力の確認のために、ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（BIACORE T200, GE healthcare）を用いて分析した。
【０２７１】
具体的には、Ｍ６ＰＲをＣＭ５ ｃｈｉｐにアミンカップリングで固定化した。その後、アガルシダーゼをＨＢＳ−ＥＰバッファーで２００ｎＭ〜１２．５ｎＭになるように希釈し、Ｍ６ＰＲを固定化したチップに１０分間結合させてから６分間解離させ、その結合力をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅで計算した。アガルシダーゼβ持続型結合体の相対的な結合力をアガルシダーゼと比較して数値化した。
【０２７２】
その結果、アガルシダーゼβ持続型結合体はアガルシダーゼβの約６８％の受容体結合力を有することが確認された（表１）。アガルシダーゼβ持続型結合体のＭ６ＰＲに対する結合力が相対的に低いのは、生理活性ポリペプチドがＦｃ領域と融合タンパク質を形成すると一般的に自己受容体に対する結合力が低下する傾向を示すのと同じ原因であると考えられる。本発明の作用原理についての特定の理論に束縛されるものではなく、単に発明の理解を助けるために説明すると、免疫グロブリンＦｃとアガルシダーゼβが共有結合されることにより、アガルシダーゼ部位が立体障害（steric hindrance）を受けて受容体に対する結合速度定数（association rate constant, ka）が減少したからであると考えられる。一度結合された持続型結合体の場合、受容体における解離速度定数（dissociation rate constant, kd）は結合体を形成しない遊離アガルシダーゼと差がないことが確認された。
【０２７３】
【表１】
2019506164.tif 000004
【０２７４】
本発明のアガルシダーゼβ持続型結合体の活性を確認した結果をまとめると次の通りである。
【０２７５】
【表２】
2019506164.tif 000005
【実施例６】
【０２７６】
イミグルセラーゼ酵素結合体の活性確認
実施例６−１：イミグルセラーゼ持続型結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
イミグルセラーゼ（Imiglucerase, 対照群）と前述したように製造したイミグルセラーゼ持続型結合体（試験群）のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を比較した。
【０２７７】
具体的には、酵素活性の測定のために、ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを基質として用いて、酵素作用により生成されたｐＮＰ（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）を定量して単位時間当たりに生成される産物の量を計算することにより比活性（Specific activity）を示した。対照群と試験群をイミグルセラーゼを基準にそれぞれ０．１μｇ／ｍＬの濃度で処理した。基質は２０、１６、１２、８、４、２、１及び０ｍＭで処理し、３７℃で４５分間反応させた。最終的に生成されたｐＮＰの量は、４０５ｎｍで吸光度を測定することにより定量した。定量したｐＮＰの濃度、反応体積及び反応時間を用いてμｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇを計算し、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式のｘ値には処理した基質の濃度を代入し、ｙ値にはその計算した値を代入して最終的に酵素活性のＶmax（μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇ＝Ｕ／ｍｇ）値を算出した。
【０２７８】
その結果、イミグルセラーゼとイミグルセラーゼ持続型結合体の酵素活性がそれぞれ４８．５Ｕ／ｍｇ、４５．２Ｕ／ｍｇであることが確認された。結論として、対照群に比べて、イミグルセラーゼ持続型結合体の酵素活性は９３％であり、免疫グロブリンＦｃ結合による酵素活性の減少はないことが確認された（図４）。
【０２７９】
実施例６−２：イミグルセラーゼ持続型結合体のＭ６Ｐ受容体結合力の確認
Ｍ６ＰＲに対する結合力を確認するために、ＳＰＲ（surface Plasmon resonance, BIACORE T200）を用いて、イミグルセラーゼ（対照群）と前述したように製造したイミグルセラーゼ持続型結合体（試験群）の結合力を確認した。Ｍ６ＰＲはＲｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＣＭ５チップにアミン結合法を用いて固定化し、その後対照群は１００ｎＭ〜６．２４ｎＭ、試験群は２００ｎＭ〜１２．５ｎＭの濃度で流してその結合力を確認した。
【０２８０】
ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ）をランニングバッファー（running buffer）として用いて、全ての試験物質はランニングバッファーで希釈して欠陥を誘導し、解離もランニングバッファーで行った。チップに固定化したＭ６ＰＲに試験物質を１０分間流して結合を誘導し、その後６分間の解離過程を経た。
【０２８１】
その後、異なる濃度の対照群又は試験群を結合させるために、Ｍ６ＰＲに結合した結合体に５ｍＭ ＮａｏＨ／５０ｍＭ ＮａＣｌを約３０秒間流した。Ｍ６ＰＲとイミグルセラーゼ又はイミグルセラーゼ持続型結合体との結合力は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて分析した。Ｋa（association rate constant）、Ｋd（dissociation rate constant）及びＫD（affinity constant）は１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いて算出した。
【０２８２】
その結果、免疫グロブリンＦｃ結合による解離定数に大差はないが、結合定数に差が生じることが確認された。よって、対照群に比べて、試験群の結合力が約２２％に減少する結果を示した（表３）。イミグルセラーゼ持続型結合体のＭ６ＰＲに対する結合力が相対的に低いのは、生理活性ポリペプチドがＦｃ領域と融合タンパク質を形成すると一般的に自己受容体に対する結合力が低下する傾向を示すのと同じ原因であると考えられる。本発明の作用原理についての特定の理論に束縛されるものではなく、単に発明の理解を助けるために説明すると、免疫グロブリンＦｃとイミグルセラーゼが共有結合されることにより、イミグルセラーゼ部位が立体障害（steric hindrance）を受けて受容体に対する結合速度定数（association rate constant, ka）が減少したからであると考えられる。一度結合された持続型結合体の場合、受容体における解離速度定数（dissociation rate constant, kd）は結合体を形成しない遊離イミグルセラーゼと差がないことが確認された（表３）。
【０２８３】
【表３】
2019506164.tif 000006
【０２８４】
本発明のイミグルセラーゼ持続型結合体の活性を確認した結果をまとめると次の通りである。
【０２８５】
【表４】
2019506164.tif 000007
【実施例７】
【０２８６】
ガルスルファーゼ酵素結合体の活性確認
実施例７−１：ガルスルファーゼ持続型結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
ガルスルファーゼ（Galsulfase, 対照群）と前述したように製造したガルスルファーゼ持続型結合体（試験群）のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を比較した。
【０２８７】
具体的には、酵素活性の測定のために、４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（４−ＭＵＳ）を基質として用いて、３７℃で２０分間の酵素作用により生成された４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ（４−ＭＵ）の蛍光を測定することにより、当該物質の酵素活性を測定した。
【０２８８】
その結果、ガルスルファーゼとガルスルファーゼ持続型結合体の酵素活性がそれぞれ７２．３μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇ、８１．３μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇであることが確認された。結論として、対照群に比べて、ガルスルファーゼ持続型結合体の酵素活性は１１２％であり、免疫グロブリンＦｃ結合による酵素活性の減少はないことが確認された（図５）。
【０２８９】
実施例７−２：ガルスルファーゼ持続型結合体のＭ６Ｐ受容体結合力の確認
Ｍ６ＰＲに対する結合力を確認するために、ＳＰＲ（surface Plasmon resonance, BIACORE T200）を用いて、ガルスルファーゼ（Galsulfase, 対照群）と前述したように製造したガルスルファーゼ持続型結合体（試験群）の結合力を確認した。
【０２９０】
具体的には、Ｍ６ＰＲはＲｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＣＭ５チップにアミン結合法を用いて固定化し、その後試験物質を１００ｎＭ〜６．２４ｎＭの濃度で流してその結合力を確認した。
【０２９１】
ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ）をランニングバッファー（running buffer）として用いて、全ての試験物質はランニングバッファーで希釈して欠陥を誘導し、解離もランニングバッファーで行った。チップに固定化したＭ６ＰＲに試験物質を１０分間流して結合を誘導し、その後６分間の解離過程を経た。その後、異なる濃度の対照群又は試験群を結合させるために、Ｍ６ＰＲに結合した結合体に５ｍＭ ＮａｏＨ／５０ｍＭ ＮａＣｌを約３０秒間流した。Ｍ６ＰＲとガルスルファーゼ又はガルスルファーゼ持続型結合体との結合力は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて分析した。Ｋa（association rate constant）、Ｋd（dissociation rate constant）及びＫD（affinity constant）は１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いて算出した。
【０２９２】
その結果、免疫グロブリンＦｃ結合による解離定数に大差はないが、結合定数に差が生じることが確認された。よって、対照群に比べて、試験群の結合力が約２５％に減少する結果を示した（表５）。ガルスルファーゼ持続型結合体のＭ６ＰＲに対する結合力が相対的に低いのは、生理活性ポリペプチドがＦｃ領域と融合タンパク質を形成すると一般的に自己受容体に対する結合力が低下する傾向を示すのと同じ原因であると考えられる。本発明の作用原理についての特定の理論に束縛されるものではなく、単に発明の理解を助けるために説明すると、免疫グロブリンＦｃとガルスルファーゼが共有結合されることにより、ガルスルファーゼ部位が立体障害（steric hindrance）を受けて受容体に対する結合速度定数（association rate constant, ka）が減少したからであると考えられる。一度結合された持続型結合体の場合、受容体における解離速度定数（dissociation rate constant, kd）は結合体を形成しない遊離ガルスルファーゼと差がないことが確認された（表５）。
【０２９３】
【表５】
2019506164.tif 000008
【０２９４】
本発明のガルスルファーゼ持続型結合体の活性を確認した結果は次の通りである。
【０２９５】
【表６】
2019506164.tif 000009
【実施例８】
【０２９６】
イズロニダーゼ酵素結合体の活性確認
実施例８−１：イズロニダーゼ持続型結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
イズロニダーゼ持続型結合体の製造による酵素活性の変化を測定すべくｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性測定を行った。
【０２９７】
具体的には、酵素基質として知られる４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ａｌｐｈａ−Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｉｄｅ（４−ＭＵＩ）をイズロニダーゼ（Iduronidase）及びイズロニダーゼ持続型結合体と３７℃で３０分間反応させた。最終的に生成された４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ（４ＭＵ）の蛍光を測定することにより、当該物質の酵素活性を測定した。
【０２９８】
その結果、イズロニダーゼとイズロニダーゼ持続型結合体の酵素比活性（specific activity）がそれぞれ１２７．５±１５．８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、１３２．２±２４．３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであることが確認された。結論として、イズロニダーゼに比べて、イズロニダーゼ持続型結合体の酵素活性は１０５．７±３２．２％と持続型結合体の製造による結合（conjugation）に伴う酵素活性の減少はないことが確認された（図６）。
【０２９９】
実施例８−２：イズロニダーゼ持続型結合体のＭ６Ｐ受容体結合力の確認
Ｍ６ＰＲに対する結合力を確認するために、ＳＰＲ（surface Plasmon resonance, BIACORE T200）を用いて、イズロニダーゼ（Iduronidase, 対照群）と前述したように製造したイズロニダーゼ持続型結合体（試験群）の結合力を確認した。
【０３００】
具体的には、Ｍ６ＰＲはＲｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、ＣＭ５チップにアミン結合法を用いて固定化し、その後対照群は５０ｎＭ〜３．１２５ｎＭ、試験群は１００ｎＭ〜６．２５ｎＭの濃度で流してその結合力を確認した。
【０３０１】
ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ）をランニングバッファー（running buffer）として用いて、全ての試験物質はランニングバッファーで希釈して欠陥を誘導し、解離もランニングバッファーで行った。チップに固定化したＭ６ＰＲに試験物質を１０分間流して結合を誘導し、その後６分間の解離過程を経た。その後、異なる濃度の対照群又は試験群を結合させるために、Ｍ６ＰＲに結合した結合体に５ｍＭ ＮａｏＨ／５０ｍＭ ＮａＣｌを約３０秒間流した。Ｍ６ＰＲとイズロニダーゼ又はイズロニダーゼ持続型結合体との結合力は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを用いて分析した。Ｋa（association rate constant）、Ｋd（dissociation rate constant）及びＫD（affinity constant）は１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いて算出した。
【０３０２】
その結果、免疫グロブリンＦｃ結合による解離定数と結合定数の両方に差が生じることが確認された。よって、対照群に比べて、試験群の結合力が約１３％に減少する結果を示した。
【０３０３】
イズロニダーゼ持続型結合体のＭ６ＰＲに対する結合力が相対的に低いのは、生理活性ポリペプチドがＦｃ領域と融合タンパク質を形成すると一般的に自己受容体に対する結合力が低下する傾向を示すのと同じ原因であると考えられる。本発明の作用原理についての特定の理論に束縛されるものではなく、単に発明の理解を助けるために説明すると、免疫グロブリンＦｃとイズロニダーゼが共有結合されることにより、イズロニダーゼ部位が立体障害（steric hindrance）を受けて受容体に対する結合速度定数（association rate constant, ka）が減少したからであると考えられる（表７）
【０３０４】
【表７】
2019506164.tif 000010
【０３０５】
本発明の実施例で製造したイズロニダーゼ持続型結合体の活性を確認した結果は次の通りである。
【０３０６】
【表８】
2019506164.tif 000011
【０３０７】
前記結果は、本発明の酵素結合体が従来の他の治療的酵素に比べてトランスサイトーシス、体内生体利用率、組織分布性及び骨髄標的性に優れ、リソソーム蓄積症の画期的な治療剤として用いられることを示唆するものである。
【０３０８】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、前記詳細な説明ではなく後述する特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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