(57)【要約】Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドが提供される。さらに、かかるリガンドを使用する治療方法、ならびにかかるリガンドを含む組成物が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する天然に存在しないペプチドを含む、リガンド。
【請求項２】
前記ペプチドが、前記ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、またはＦＺＤ１０からなる群から選択されるＦＺＤ受容体のＣＲＤに結合しない、請求項１または２に記載のリガンド。
【請求項４】
前記ペプチドが、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、またはＦＺＤ１０からなる群から選択されるＦＺＤ受容体のＣＲＤに結合しない、請求項１または２に記載のリガンド。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＦＺＤ１及びＦＺＤ２と更に結合する、請求項１〜３のいずれかに記載のリガンド。
【請求項６】
前記ペプチドが、直鎖状である、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項７】
前記ペプチドが、環状である、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項８】
前記ペプチドが、８〜１６アミノ酸長である、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項９】
前記ペプチドが、１１〜１４アミノ酸長である、請求項８に記載のリガンド。
【請求項１０】
前記ＦＺＤ７が、ｈＦＺＤ７である、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、Ｌｅｕ８１、Ｈｉｓ８４、Ｇｌｎ８５、Ｔｙｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｐｈｅ１３８、及びＰｈｅ１４０からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含むｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結合領域と特異的に結合する、請求項１０に記載のリガンド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＤＬＸ４Ｘ５ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１００）
式中、Ｘ１〜Ｘ３の各々が、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ４〜Ｘ５の各々が、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項１３】
Ｘ１が、Ｌであり、Ｘ２が、Ｐであり、Ｘ３が、Ｓであり、Ｘ４が、Ｅであり、Ｘ５が、Ｆである、請求項１２に記載のリガンド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のリガンド。
【請求項１５】
Ｘ１が、アミノ酸がなく、Ｘ２が、アミノ酸がなく、Ｘ３が、Ｓであり、Ｘ４が、Ｅであり、Ｘ５が、Ｆである、請求項１２に記載のリガンド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のリガンド。
【請求項１７】
前記ペプチドのＮ末端アミンが、アセチル化されているか、前記ペプチドのＣ末端カルボキシル基が、アミド化されているか、または前記ペプチドのＮ末端アミンが、アセチル化され、かつ前記ペプチドのＣ末端カルボキシル基が、アミド化されている、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項１８】
前記ペプチドが、前記ＦＺＤ７受容体の前記ＣＲＤへのＷｎｔの結合を強化する、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項１９】
前記ＦＺＤ７受容体が、ｈＦＺＤ７受容体である、請求項１８に記載のリガンド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＸＹ（配列番号１１４）
式中、Ｘが、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２１】
前記非天然のアミノ酸が、２−アミノ−３−デシルオキシ−プロピオン酸、イプシロンアミノ基において結合したオクタン酸を含むリジンの誘導体、２−アミノデカン酸、イプシロンアミノ基において結合したデカン酸を含むリジンの誘導体、及び６−ヒドロキシ−Ｌ−ノルロイシンからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドが、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
ＳＤＤＸＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１１５）
式中、Ｘが、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸であり、前記非天然のアミノ酸が、Ｌ−ホモロイシン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、及びイプシロンアミノ基において結合したオクタン酸を含むリジンの誘導体からなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２３】
前記ペプチドが、配列番号１〜３１及び３９〜９９のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６及び８〜１１のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２４】
前記ペプチドが、配列番号３２〜３８のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５及び７〜１１のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２５】
前記ペプチドが、１２０ｎＭ以下のＩＣ５０でＷｎｔシグナル伝達を阻害する、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２６】
前記ペプチドが、９０ｎＭ以下のＥＣ５０値を有する、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２７】
前記ペプチドが、脂質に複合されている、先行請求項のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項２８】
前記脂質が、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）である、請求項２７に記載のリガンド。
【請求項２９】
前記脂質が、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）である、請求項２７に記載のリガンド。
【請求項３０】
前記脂肪酸が、芳香族テールを含む、請求項２８または２９に記載のリガンド。
【請求項３１】
前記リガンド中の前記ペプチドが、二量体化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のリガンド。
【請求項３２】
前記ペプチドが、ジスルフィド結合によって二量体化されている、請求項３１に記載のリガンド。
【請求項３３】
前記ペプチドが、化学リンカーによって二量体化されている、請求項３１に記載のリガンド。
【請求項３４】
先行請求項のいずれか１項に記載のリガンドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項３５】
細胞中のＷｎｔシグナル伝達の阻害方法であって、前記細胞を、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のリガンドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項３６】
幹細胞増殖の阻害方法であって、幹細胞を、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のリガンドまたは請求項３４に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記幹細胞が、腸幹細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞が、がん幹細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記がん幹細胞が、結腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、非小細胞肺癌幹細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん幹細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん幹細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん幹細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
がん細胞の殺滅方法であって、前記がん細胞を、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のリガンドまたは請求項３４に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４１】
前記がん細胞が、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、非小細胞肺癌細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象におけるがんの治療方法であって、有効量の、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のリガンドまたは請求項３４に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記がんが、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
がんを治療するための薬物の製造における、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のリガンドまたは請求項３４に記載の組成物の使用。
【請求項４５】
前記がんが、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
対象におけるがんの治療に使用するための、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のリガンドまたは請求項３４に記載の組成物を含む、組成物。
【請求項４７】
前記がんが、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである、請求項４６に記載の使用するための組成物。
【請求項４８】
がんの治療用キットであって、
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のリガンドまたは請求項３４に記載の組成物と、
（ｂ）前記リガンドを、がんを有する対象に投与するための説明書と、を含む、前記キット。
【請求項４９】
前記がんが、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＳＨＶＭＹ（配列番号１１３）に記載される天然に存在しないペプチドを含む、リガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，８４８号及び２０１６年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４１９，３３１号の優先権の利益を主張するものであり、それらの内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの次の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３６９４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年９月６日、サイズ：５０ＫＢ）。
【背景技術】
【０００３】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の、発がんとの関連付けは、ある特定のマウス乳腺腫瘍における初期の観察及び実験の結果として始まった。Ｗｎｔ−１プロト−がん原遺伝子（Ｉｎｔ−１）は、ウイルスＤＮＡ配列の挿入に起因してマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）によって誘導された乳腺腫瘍から当初に特定された。Ｎｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８２；３１：９９−１０９。かかるウイルス組み込みの結果は、腫瘍の形成をもたらすＩｎｔ−１の非制御発現であった。Ｖａｎｏｏｙｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８４；３９：２３３−２４０、Ｎｕｓｓｅ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８４；３０７：１３１−１３６、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９８８；５５：６１９−６２５。後の配列分析は、Ｉｎｔ−１が、発達に関係があるとされた無翅（Ｗｇ）ショウジョウバエ遺伝子の哺乳動物ホモログであったことを示し、次いでこれらの用語を組み合わせて「Ｗｎｔ」を作成し、このタンパク質ファミリーを特定した。
【０００４】
分泌リガンドのヒトＷｎｔ遺伝子ファミリーは、ここで少なくとも１９メンバーまで増加した（例えば、Ｗｎｔ−１（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００５４３０）、Ｗｎｔ−２（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３３９１）、Ｗｎｔ−２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００４１８５）、Ｗｎｔ−３（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０３０７５３）、Ｗｎｔ３ａ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０３３１３１）、Ｗｎｔ−４（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０３０７６１）、Ｗｎｔ−５Ａ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３３９２）、Ｗｎｔ−５Ｂ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０３２６４２）、Ｗｎｔ−６（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００６５２２）、Ｗｎｔ−７Ａ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００４６２５）、Ｗｎｔ−７Ｂ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０５８２３８）、Ｗｎｔ−８Ａ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０５８２４４）、Ｗｎｔ−８Ｂ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３３９３）、Ｗｎｔ−９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３３９５）、Ｗｎｔ−９Ｂ（Ｗｎｔ−１５）（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３３９６）、Ｗｎｔ−１０Ａ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０２５２１６）、Ｗｎｔ−１０Ｂ（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００３３９４）、Ｗｎｔ−１１（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−００４６２６）、Ｗｎｔ−１６（参照配列ＮＭ．ｓｕｂ．−−０１６０８７））。各メンバーは、異なる程度の配列同一性を有するが、全てが、高度に保存された間隔を示す２３〜２４個の保存システイン残基を含有する。ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２；８：２３６−２４２、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ  Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２；３（１）：３００１．１−３００１．１５。Ｗｎｔタンパク質は、小さい（すなわち、３９〜４６ｋＤの）アシル化された分泌糖タンパク質であり、胚形成及び成熟組織の両方において重要な役割を果たす。胚発生中、Ｗｎｔタンパク質の発現は、細胞増殖の制御及び幹細胞運命の決定によるパターニングにおいて重要である。Ｗｎｔ分子はまた、パルミトイル化され、したがってそれ以外でアミノ酸配列単独の分析によって予測されるよりも疎水性が高い。Ｗｉｌｌｅｒｔ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２３：４４８−５２。パルミトイル化の１つまたは複数の部位はまた、機能に必須であると考えられている。
【０００５】
Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＲＺ）ファミリー７回膜貫通型受容体を活性化するリガンドとして作用する。Ｉｎｇｈａｍ，Ｐ．Ｗ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９６；１２：３８２−３８４、Ｙａｎｇ−Ｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９６；６：１３０２−１３０６、Ｂｈａｎｏｔ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６；３８２：２２５−２３０。ＦＲＺファミリーの既知の１０メンバー（例えば、ＦＲＺ１〜ＦＲＺ１０）が存在し、各々がシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の存在を特徴とする。Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：２３４．１−２３４．８。様々なＷｎｔ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ相互作用の間には相当の混乱があるが、Ｗｎｔ−ＦＲＺ結合はまた、活性シグナル複合体を形成するために、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ５またはＬＲＰ６）、ならびに膜及び細胞質タンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）を組み込まなければならない。
【０００６】
ＦｒｉｚｚｌｅｄへのＷｎｔの結合は、標準のＷｎｔシグナル伝達経路（それによりβ−カテニンの安定化及び増加した転写活性をもたらす）［Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９４；１２０：３６９−３８０、Ｐａｐｋｏｆｆ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６；１６：２１２８−２１３４］または例えばＷｎｔ／平面内細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）もしくはＷｎｔ−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ．ｓｕｐ．２＋）経路による非標準シグナル伝達のいずれかを介してシグナル伝達を活性化することができる。Ｖｅｅｍａｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ２００３；５：３６７−３７７。
【０００７】
ＦＲＺ受容体の１つであるＦＺＤ７は、多様なヒトがんにおいて上方調節され、下流シグナル伝達物質に対する突然変異を有するがん細胞においてもＷｎｔシグナル伝達活性を調節することができる。したがって、がんなどの様々な治療用途のためのＦＺＤ７の選択的阻害剤を開発する必要性がある。本発明は、この及び他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００８】
ある特定の実施形態では、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドが提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、またはＦＺＤ１０からなる群から選択されるＦＺＤ受容体のＣＲＤに結合しない。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＦＺＤ１及びＦＺＤ２と更に結合する。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、またはＦＺＤ１０からなる群から選択されるＦＺＤ受容体のＣＲＤに結合しない。
【０００９】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、直鎖状である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環状である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、８〜１６アミノ酸長である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、１１〜１４アミノ酸長である。
【００１０】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７は、ｈＦＺＤ７である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、Ｌｅｕ８１、Ｈｉｓ８４、Ｇｌｎ８５、Ｔｙｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｐｈｅ１３８、及びＰｈｅ１４０からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含むｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結合領域と特異的に結合する。
【００１１】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＤＬＸ４Ｘ５ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１００）
式中、Ｘ１〜Ｘ３の各々が、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ４〜Ｘ５の各々が、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｌであり、Ｘ２は、Ｐであり、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｅであり、Ｘ５は、Ｆである。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）に記載されるアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、Ｘ１は、アミノ酸がなく、Ｘ２は、アミノ酸がなく、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｅであり、Ｘ５は、Ｆである。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）に記載されるアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドのＮ末端アミンが、アセチル化されているか、天然に存在しないペプチドのＣ末端カルボキシル基が、アミド化されているか、またはペプチドのＮ末端アミンが、アセチル化され、かつペプチドのＣ末端カルボキシル基が、アミド化されている。
【００１２】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ＦＺＤ７受容体のＣＲＤへのＷｎｔの結合を強化する。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７受容体は、ｈＦＺＤ７受容体である。
【００１３】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＸＹ（配列番号１１４）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、非天然のアミノ酸は、２−アミノ−３−デシルオキシ−プロピオン酸、イプシロンアミノ基において結合したオクタン酸を含むリジンの誘導体、２−アミノデカン酸、イプシロンアミノ基において結合したデカン酸を含むリジンの誘導体、及び６−ヒドロキシ−Ｌ−ノルロイシンからなる群から選択される。
【００１４】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含み、
ＳＤＤＸＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１１５）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸であり、非天然のアミノ酸は、Ｌ−ホモロイシン、Ｌ−ホモフェニルアラニン、及びイプシロンアミノ基において結合したオクタン酸を含むリジンの誘導体からなる群から選択される。
【００１５】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、配列番号１〜３１及び３９〜９９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、配列番号３２〜３８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、１２０ｎＭ以下のＩＣ５０でＷｎｔシグナル伝達を阻害する。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、９０ｎＭ以下のＥＣ５０値を有する。
【００１７】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、脂質に複合される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、脂質は、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、脂質は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、脂肪酸は、芳香族テールを含む。
【００１８】
上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、リガンド中の天然に存在しないペプチドは、二量体化される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、ジスルフィド結合によって二量体化される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、化学リンカーによって二量体化される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンド及び薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、細胞を、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物と接触させることを含む、細胞中のＷｎｔシグナル伝達の阻害方法が提供される。
【００２１】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物と接触させることを含む、幹細胞増殖の阻害方法が提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、幹細胞は、腸幹細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、幹細胞は、がん幹細胞である。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、がん幹細胞は、結腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、非小細胞肺癌幹細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん幹細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん幹細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん幹細胞である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、がん細胞を、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物と接触させることを含む、がん細胞の殺滅方法が提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、がん細胞は、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、非小細胞肺癌細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん細胞である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、有効量の、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物を投与することを含む、対象におけるがんの治療方法が提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、がんは、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである。
【００２４】
ある特定の実施形態では、がんを治療するための薬物の製造における、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物の使用が提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、がんは、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである。
【００２５】
ある特定の実施形態では、対象におけるがんの治療に使用するための、上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物を含む組成物が提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、がんは、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、またはＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである。
【００２６】
ある特定の実施形態では、（ａ）上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）リガンドまたは組成物、及び（ｂ）がんを有する対象にリガンドを投与するための説明書を含む、がんの治療用キットが提供される。上記の実施形態のうちのいずれかによる（または適用される）ある特定の実施形態では、がんは、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんである。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＳＨＶＭＹ（配列番号１１３）に記載される天然に存在しないペプチドを含むリガンドが提供される。
【００２８】
本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てが組み合わされて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者にとって明らかとなるであろう。本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によって更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒトＦＺＤ  ＣＲＤ間の配列保存をｍＦＺＤ８  ＣＲＤの表面上に表示する、Ｗｎｔ８とマウスＦＺＤ８  ＣＲＤとの間の相互作用の構造描写を提供する。
【図２−１】Ａは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドＦｚ７−２１及びＦｚ−２１Ｓの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｂは、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａまたは２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のＷｎｔ刺激したβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドＦｚ７−２１及びＦｚ−２１Ｓの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。
【図２−２】Ｃは、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ１または２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ１でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のＷｎｔ刺激したβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドＦｚ７−２１及びＦｚ−２１Ｓの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｄは、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ１または２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のＷｎｔ刺激したβ−カテニンシグナル伝達に対する１０位にＤ−システイン立体異性体を含有するＦｚ７−２１由来ペプチドの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。
【図２−３】Ｅは、６−ＢＩＯで処理したＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中の受容体非依存性β−カテニンシグナル伝達に対するペプチドＦｚ７−２１及びＦｚ−２１Ｓの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。
【図３−１】Ａは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｈＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。Ｂは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｍＦＺＤ２  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。
【図３−２】Ｃは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。Ｄは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。
【図３−３】Ｅは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。Ｆは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｍＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。
【図３−４】Ｇは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。Ｈは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｍＦＺＤ９  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。
【図３−５】Ｉは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの、ｈＦＺＤ１０  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合についてのＥＣ５０値を決定するために行われた実験の結果を提供する。
【図４−１】Ａは、ＦＳＥＣによる分析の前に、様々なＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質でインキュベートされた５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１の代表的な蛍光トレースを提供する。Ｂは、ＦＳＥＣによる分析の前に、様々なＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質でインキュベートされた５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの代表的な蛍光トレースを提供する。
【図４−２】Ｃは、図４Ａ及び４Ｂについての蛍光強度の定量（曲線下面積、ＡＵＣ）を提供する。
【図５−１】Ａは、ＦＳＥＣによる分析の前に、様々なヒトｓＦＲＰタンパク質でインキュベートされた５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１の代表的な蛍光トレースを提供する。Ｂは、ＦＳＥＣによる分析の前に、様々なｓＦＲＰタンパク質でインキュベートされた５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの代表的な蛍光トレースを提供する。
【図５−２】Ｃは、図５Ａ及び５Ｂに対する蛍光強度の定量（曲線下面積、ＡＵＣ）を提供する。
【図６−１】Ａは、精製された組み換えｈＦＺＤ  ＣＲＤのサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを提供する。Ｂは、図６ＡからのプールされたｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６−２】Ｃは、Ｆｚ７−２１がｈＦＺＤ７  ＣＲＤの多量体化を誘導するかどうかを評価するために行われた実験の結果を提供する。Ｄは、図６Ｃのズームイン図（１．５ｍＬ〜２．０ｍＬ範囲）を提供する。
【図７】５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓ結合活性を有するヒトＦＺＤシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）間の進化的保存を示す分岐図を提供する。
【図８−１】Ａは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体の結晶構造のリボン表現を示す。図Ｂは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体界面を架橋する脂質結合空洞の表面表現を示す。
【図８−２】Ｃは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造を示す。Ｄは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの構造の上にマップされた疎水性空洞の表面表現を示す。
【図８−３】Ｅは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造の上面視表面表現を示す。Ｆは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造の側面視表面表現を示す。
【図９−１】Ａは、ｈＦＺＤ４の脂質結合溝の表面表現を示す。Ｂは、ｍＦＺＤ８の脂質結合溝の表面表現を示す。
【図９−２】Ｃは、ＦＺＤ  ＣＲＤの重畳を示す。
【図１０】Ａは、リンカー（配列番号１３６）を通してＦｚ７−２１に融合されたｈＦＺＤ７  ＣＲＤの概略図を提供する。Ｂは、精製されたｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｚ７−２１融合構築物のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す。
【図１１】Ａは、Ｆｚ７−２１二量体における分子内相互作用の図を提供する。Ｂは、個々の相互作用が線によって描写されている、Ｆｚ７−２１における分子内相互作用の図を提供する。Ｃは、Ｆｚ７−２１二量体構造上の諧調として表示される、溶媒露出表面の描写を提供する。
【図１２】Ａは、二量体界面での１６°角度を強調する、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤの構造のリボン表現を提供する。Ｂは、二量体界面での９０°角度を強調する、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの構造のリボン表現を提供する。
【図１３】Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造内の選択Ｆｚ７−２１／ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ相互作用を強調する。
【図１４】ｈＦＺＤ７（配列番号１３７）、ｈＦＺＤ２（配列番号１３８）、ｈＦＺＤ１（配列番号１３９）、ｈＦＺＤ５（配列番号１４０）、ｍＦＺＤ８（配列番号１４１）、ｈＦＺＤ４（配列番号１４２）、ｈＦＺＤ９（配列番号１４３）、ｈＦＺＤ１０（配列番号１４４）、ｈＦＺＤ６（配列番号１４５）及びｈＦＺＤ３（配列番号１４６）のＣＲＤのＣＲＤのアミノ酸配列のアラインメントを提供する。
【図１５】ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のＷｎｔ刺激したβ−カテニンシグナル伝達に対するｄＦｚ７−２１、ｄＦｚ７−２１−Ｌ６Ａ、ｄＦｚ７−２１−Ｗ９Ａ、ｄＦｚ７−２１−Ｍ１３Ａ、ｄＦｚ７−２１−Ｙ１４Ａ、及びｄＦｚ７−２１Δ２の効果を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図１６−１】Ａは、Ｆｚ７−２１のＮＯＳＥＹ接続性プロットを提供する。Ｂは、ｄＦｚ７−２１の２０最低エネルギーＮＭＲ構造の重畳に基づいて、ｄＦｚ７−２１の代表的なＮＭＲ溶液構造を示す（アミノ酸側鎖は、線として示される）。
【図１６−２】Ｃは、ｄＦｚ７−２１についての２Ｄ  ＮＯＥＳＹプロットを示す。Ｄは、Ｆｚ７−２１Ｓに対する２Ｄ  ＮＯＥＳＹプロットを示す。
【図１６−３】Ｅは、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、及びｄＦｚ７−２１ペプチドの１Ｄ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１７】Ａは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対するＤＭＳＯによる処置の効果を示す。Ｂは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対するＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を示す。Ｃは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対する抗Ｌｒｐ６遮断抗体による処置の効果を示す。Ｄは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対する２００μＭの二量体化Ｆｚ７−２１による処置の効果を示す。Ｅは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対する１００μＭの二量体化Ｆｚ７−２１による処置の効果を示す。Ｆは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対する１０μＭの二量体化Ｆｚ７−２１による処置の効果を示す。Ｇは、代表的なマウス腸オルガノイドの形態に対する１μＭの二量体化Ｆｚ７−２１による処置の効果を示す。
【図１８】ペプチド処置後のオルガノイド幹細胞（ＳＣ）ポテンシャルの定量を提供する。
【図１９−１】Ａは、マウス腸オルガノイド中のＬｒｇ５発現に対するｄＦｚ７−２１またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。Ｂは、マウス腸オルガノイド中のＡｓｃｌ２発現に対するｄＦｚ７−２１またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。
【図１９−２】Ｃは、マウス腸オルガノイド中のＡｘｉｎ２発現に対するｄＦｚ７−２１またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。
【図２０−１】Ａは、マウスから採取された腸上皮におけるＬｒｇ５発現に対するｄＦｚ７−２１またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。Ｂは、マウスから採取された腸上皮におけるＡｓｃｌ２発現に対するｄＦｚ７−２１またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。
【図２０−２】Ｃは、マウスから採取された腸上皮におけるＡｘｉｎ２発現に対するｄＦｚ７−２１またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。
【図２１−１】Ａは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ａｄｐの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｂは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｔｂｈの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｃは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ８）の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｄは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｌ６Ｈｏｆの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。
【図２１−２】Ｅは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｃ８の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｆは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ１０）の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｇは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｌ６Ｈｏｌの効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｈは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｌ６ＫＣ（８）の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。
【図２１−３】Ｉは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ１２）の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｊは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ１４）の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。Ｋは、５０ｎｇ／ｍＬの組み換えＷｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のβ−カテニンシグナル伝達に対するペプチドｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ１６）の効果を決定するために行われた実験の結果を示す。
【図２２Ａ】１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１の存在下、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、ＦＺＤ４  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２２Ｂ】１０μＭより下のペプチド濃度でｄＦｚ７−２１の存在下、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、ＦＺＤ４  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２２Ｃ】１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓの存在下、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、ＦＺＤ４  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２２Ｄ】１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１の存在下、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、ＦＺＤ４  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ３ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２２Ｅ】１０μＭより下のペプチド濃度でｄＦｚ７−２１の存在下、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、ＦＺＤ４  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ３ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２２Ｆ】１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓの存在下、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、ＦＺＤ４  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ３ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２３−１】Ａは、１０μＭより下のペプチド濃度でｄＦｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、またはｄＦｚ７−２１Δ２の存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｂは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＭ１３Ａｄｐの存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｃは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＭ１３Ｔｂｈの存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｄは、約０．５μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＭ１３Ｋ（Ｃ８）の存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２３−２】Ｅは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＬ６Ｈｏｆの存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｆは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＭ１３Ｃ８の存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｇは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＭ１３Ｋ（Ｃ１０）の存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｈは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＬ６Ｈｏｌの存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２３−３】Ｉは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、またはＬ６Ｋ（Ｃ８）の存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｊは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、Ｍ１３Ｋ（Ｃ８）、Ｍ１３Ｋ（Ｃ１０）、Ｍ１３Ｋ（Ｃ１２）、Ｍ１３Ｋ（Ｃ１４）、またはＭ１３Ｋ（Ｃ１６）の存在下、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２３−４】Ｋは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ａｄｐ、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｔｂｈ、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ８）、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｌ６Ｈｏｆ、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｃ８、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｍ１３Ｋ（Ｃ１０）、ｄＦｚ７−２１Δ２（Ｑ５１９）、ｄＦｚ７−２１Δ２．Ｌ６Ｈｏｌ、またはｄＦｚ７−２１Δ２．Ｌ６ＫＣ（８）の存在下、ＦＺＤ４  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。Ｌは、１０μＭより下のペプチド濃度でＦｚ７−２１Ｓ、ｄＦｚ７−２１、Ｍ１３Ｋ（Ｃ８）、Ｍ１３Ｋ（Ｃ１０）、Ｍ１３Ｋ（Ｃ１２）、Ｍ１３Ｋ（Ｃ１４）、またはＭ１３Ｋ（Ｃ１６）の存在下、ＦＺＤ４  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合を評価するために行われた実験の結果を示す。
【図２４】Ａは、ＵＶ吸収によって分析された分子量（ＭＷ）標準が、溶出量（Ｖｅ）／空隙量（Ｖｏ）の関数としてプロットされたことを示す。値は、３回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。Ｂは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１（灰色の丸）に結合したＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の観察された分子量を、予測されたＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃ四量体分子量（黒色の正方形）と比較して示す。Ｃは、使用された異なるＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（約２μｇ）の天然のＰＡＧＥ（４〜１６％）を示す。
【図２５−１】Ａは、ＦＺＤ７内のＣＲＤ配置を示す全長ＦＺＤ７の概略図と共に、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ結晶構造のリボン表現を示す。Ｂは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの構造のリボン表現を示す。
【図２５−２】Ｃは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤにおける疎水性空洞のズームイン側面図を提供する。Ｄは、Ｃの上面図を提供する。
【図２５−３】Ｅは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤのズームイン側面図を提供する。Ｆは、Ｅの上面図を示す。
【図２６】ｄＦｚ７−２１の、２０の最低エネルギーＮＭＲ構造の重畳を示す。
【図２７】Ａは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−ＧＳの分子量を決定するために使用される関連分子量標準物を示す。Ｂは、還元条件下の図１０Ｂにおける融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｃは、図１０Ｂにおける融合タンパク質から得られた結晶の明視野像を示す。
【図２８−１】Ａは、それぞれのＣ２４脂肪酸に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤプロモーターの重畳を提供する。Ｂは、Ｃ２４脂肪酸に近位の残基を表示するリボン表現なしに、Ａからの構造を示す。Ｃ２４脂肪酸炭素は、カルボン酸頭部基（Ｃ１）からω炭素（Ｃ２４）まで順次番号が付けられている。水、結晶化補因子、及びグリカンは、明確にするために隠されている。
【図２８−２】Ｃは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）の、Ｃ２４脂肪酸（球棒表現）に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）との重畳を提供する。
【図２９−１】Ａは、Ｃ２４脂肪酸（球棒表現）と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体（リボン表現）の結晶構造を提供する。Ｂは、Ｃ２４脂肪酸（黒色、球棒表現）と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）の上にマップされた疎水性空洞の表面表現を提供する。
【図２９−２】Ｃは、疎水性空洞に近位の残基を表示する、Ｂのズームイン図を提供する（灰色：鎖Ａ、白色：鎖Ｂ、Ｃ２４脂肪酸：黒色、球棒表現）。Ｃ２４脂肪酸炭素は、カルボン酸頭部基（Ｃ１）からω炭素（Ｃ２４）まで順次番号が付けられている。脂質結合空洞の塩基は、Ｃ９〜Ｃ１３の間である。Ｄは、Ｃ２４脂肪酸（黒色、空間充填モデル）に結合したアポ−ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ  ５Ｔ４４、薄灰色、棒表現）及びｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（灰色、棒表現）の脂質結合空洞の重畳を示す。水素結合相互作用が表示されている（黒色、破線）。
【図３０】Ａは、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（灰色、棒表現）に結合した平滑化ＣＲＤ（灰色、リボン表現、ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＫＺＶ）の、Ｃ２４脂肪酸（白色、棒表現、１０８原子対にわたる平均平方二乗誤差＝８．３Å）に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（白色、リボン表現）との重畳を示す。ズームイン挿入図は、リガンドヒドロキシル基の近位にある残基を強調し、水素結合相互作用が表示されている（黒色、破線）。Ｂは、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（灰色、棒表現）に結合した平滑化ＣＲＤ（灰色、リボン表現、ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＫＺＶ）の、Ｃ１６：１脂肪酸（濃灰色、棒表現、１０９原子対にわたる平均平方二乗誤差は、４．６Åである）に結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ（褐色、鎖Ａ、リボン表現）との重畳を示す。ズームイン挿入図は、リガンドヒドロキシル基の近位にある残基を強調し、水素結合相互作用が表示されている（黒色、破線）。
【図３１】Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸（黒色または濃灰色、球棒表現）に結合したヒト（ｈ）ＦＺＤ５  ＣＲＤ（鎖Ａ：薄灰色、鎖Ｂ：中灰色、リボン表現）の構造を示す。鎖Ａ内の各Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸は、対称合致平均化に起因して５０％の占有率を有する。
【図３２−１】Ａは、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸（濃灰色または黒色、球棒表現）と複合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤホモ二量体（鎖Ａ、リボン表現）の結晶構造を示す。Ｂは、各々が５０％の占有率を有する２つのＣ１６：１ｎ−７脂肪酸（黒色または灰色、球棒表現）と複合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ（リボン表現）の上にマップされたｈＦＺＤ５  ＣＲＤ鎖Ａホモ二量体疎水性空洞（灰色）の表面表現を提供する。
【図３２−２】Ｃは、リボン表現なしに、Ｂのズームイン図を示す。疎水性空洞の近位にある残基が強調されている（濃灰色、棒表現）。Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸炭素は、カルボン酸頭部基（Ｃ１）からω炭素（Ｃ１６）まで順次番号が付けられている。脂質結合空洞の塩基は、Ｃ７〜Ｃ１０の間である。
【図３３−１】Ａは、各々が５０％の占有率を有するｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＢＯＧ）の２つの分子（灰色または黒色、球棒表現）と複合したヒト（ｈ）ＦＺＤ５  ＣＲＤ二量体の結晶構造を提供する。Ｂは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（球棒表現）に結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ鎖Ａ（白色、リボン表現）の構造の上にマップされたｈＦＺＤ５  ＣＲＤ鎖Ａの疎水性空洞の表面表現を示し、約５Åのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（表現）内の残基を強調している。
【図３３−２】Ｃは、炭素骨格を表示せずに、Ｂのズームイン図を示す。ｈＦＺＤ５  ＣＲＤとｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドのグリコシドとの間の水素結合相互作用が強調されている（破線、黒色）。Ｄは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドの分子構造を示し、分子成分を強調している。
【図３４−１】Ａは、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸（リボン及び棒表現）またはｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（リボン及び棒表現）が結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ（１１９残基にわたる平均平方二乗誤差は、０．１３４Åである）の重畳を示す。鎖Ａ内の各Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドは、対称合致平均化に起因して５０％の占有率を有する。Ｂは、ＡからのｈＦＺＤ５  ＣＲＤ鎖Ｂのリボン表現を示し、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸の近くの選択残基を強調している。
【図３４−２】Ｃは、ＡからのｈＦＺＤ５  ＣＲＤ鎖Ａを示し、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸またはｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドのいずれかと接触する残基を強調している（ＶＤＷオーバーラップ＞−０．４Å）。ＦＺＤ５  ＣＲＤとｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシドとの間の水素結合相互作用を描写するズームイン図が示されている（黒色破線）。
【図３５−１】Ａは、ホモ二量体疎水性空洞の表面表現と共に、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ二量体（ＰＤＢ  ＩＤ＃１ＩＪＹ、リボン表現）の結晶構造を示す。実施例及びＤａｎｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｗｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６−９０（２００１）からの二量体界面が示される。
【図３５−２】Ｂは、疎水性空洞の表面表現と共に、鎖Ａ及び鎖Ｂの重畳を示す。Ｃは、Ｂのズームイン図を示し、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤの疎水性空洞に近位の側鎖を強調している。
【図３５−３】Ｄは、ＢＯＧが結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ（リボン表現）、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸が結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ（リボン表現）、アポ−ＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）、Ｃ２４脂肪酸が結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）、及びアポ−ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（リボン表現）の重畳を示す。
【図３５−４】Ｅは、シス−脂肪酸選択性について、Ｕ形の疎水性空洞を利用する、ＦＺＤ受容体のＣＲＤへのＷｎｔ結合のモデルを示す。ＦＺＤ５、７、及び８（恐らくはＦＺＤ１及びＦＺＤ２）受容体（ＣＲＤ：褐色または青色の楕円、７回膜貫通型ドメイン：黄色の楕円）は、それらの不活性状態にあり、疎水性空洞が連続するＵ形の空洞（赤色）を形成する二量体構成を形成することができる。Ｗｎｔ結合の際に、シス−Δ９−不飽和脂肪酸は、二量体界面を横断する「よじれ」を利用して脂質結合空洞を占有し、補因子を動員して下流Ｗｎｔシグナル伝達を刺激する。
【図３６−１】Ａは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ、及びｈＦＺＤ８  ＣＲＤの二量体相互作用界面電位エネルギーの表を示す。Ｂは、ＦＺＤ  ＣＲＤ二量体相補性スコア（Ｓｃ）の表を示す。Ｃは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのループ・ループ相互作用界面についての二量体相補性スコアの視覚化を示す。二量体相補性スコアに従い、相互作用界面の中心は、低い相補性を有し、周辺部のらせんは、高い相補性を有すると仮定される。Ｄは、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤのループ・ループ相互作用界面についての二量体相補性スコアの視覚化を示す。二量体相補性スコアに従い、相互作用界面の中心は、低い相補性を有し、周辺部のらせんは、高い相補性を有する。
【図３６−２】Ｅは、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤのループ・ループ相互作用界面についての二量体相補性スコアの視覚化を示す。二量体相補性スコアに従い、相互作用界面の中心は、低い相補性を有し、周辺部のらせんは、高い相補性を有する。Ｆは、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤのＦＺＤ７様αらせん二量体相互作用界面についての二量体相補性スコアの視覚化を示す。二量体相補性スコアに従い、相互作用界面の中心は、低い相補性を有し、周辺部のらせんは、高い相補性を有する。図３６Ｇは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＦＺＤ７様αらせん二量体相互作用界面についての二量体相補性スコアの視覚化を示す。二量体相補性スコアに従い、相互作用界面の中心は、低い相補性を有し、周辺部のらせんは、高い相補性を有する。図３６Ｈは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＦＺＤ７様αらせん二量体相互作用界面についての二量体相補性スコアの視覚化を示す。二量体相補性スコアに従い、相互作用界面の中心は、低い相補性を有し、周辺部のらせんは、高い相補性を有する。
【図３７Ａ】ヒトＦＺＤ  ＣＲＤファミリーメンバーのＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ配列アラインメントを示す。プロモーター間の結晶学的ＦＺＤ７様二量体接触を形成する残基には、下線が引かれている（ＶＤＷオーバーラップ＞−０．４オングストローム）。ＦＺＤファミリーメンバー間のＦＺＤ７様二量体界面の保存は、配列アラインメントの上の「＋」によって表示される。保存されたシステインは、青色で強調される。ＦＺＤ７（配列番号１４７）、ＦＺＤ２（配列番号１４８）、ＦＺＤ１（配列番号１４９）、ＦＺＤ５（配列番号１５０）、ＦＺＤ８（配列番号１５１）、ＦＺＤ４（配列番号１５２）、ＦＺＤ９（配列番号１５３）、ＦＺＤ１０（配列番号１５４）、ＦＺＤ６（配列番号１５５）、及びＦＺＤ３（配列番号１５６）。
【図３７Ｂ】アポ−ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）の構造を、１８０°の回転でαらせんＦＺＤ７二量体界面を強調するための代用として使用することを示す。挿入図は、二量体界面のズームイン図を表示し、残基−残基水素結合（黒色破線）を強調する。
【図３８Ａ】ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（白色、リボン表現、ＰＤＢ  ＩＤ＃４Ｆ０Ａ）と複合したＸＷｎｔ８（薄灰色、リボン表現）が、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（灰色、リボン表現、ＰＤＢ  ＩＤ＃１ＩＪＹ）のαらせん二量体の上に重畳されたことを示す。示される二量体の疎水性空洞表面は、前面透明性を有するＦＺＤ  ＣＲＤ構造の上にマップした。Ｃ１４脂肪酸（球棒表現）は、ＸＷｎｔ８Ｓ１８７において共有結合される。水、結晶化補因子、及びグリカンは、明確性のために隠されている。
【図３８Ｂ】Ｃ２４脂肪酸（黒色、球棒表現）と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（灰色、リボン表現）と複合したＸＷｎｔ８（薄灰色、リボン表現）を示す。示される二量体の疎水性空洞表面は、前面透明性を有するＦＺＤ  ＣＲＤ構造の上にマップした。Ｃ１４脂肪酸（薄灰色、球棒表現）は、ＸＷｎｔ８Ｓ１８７において共有結合される。水、結晶化補因子、及びグリカンは、明確性のために隠されている。
【図３８Ｃ】Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸（灰色または黒色、球棒表現）と複合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ鎖Ａホモ二量体（灰色、リボン表現）と複合したＸＷｎｔ８（薄灰色、リボン表現）を示す。示される二量体の疎水性空洞表面は、前面透明性を有するＦＺＤ  ＣＲＤ構造の上にマップした。Ｃ１４脂肪酸（薄灰色、球棒表現）は、ＸＷｎｔ８Ｓ１８７において共有結合される。水、結晶化補因子、及びグリカンは、明確性のために隠されている。
【図３９−１】Ａは、伸長した脂肪酸部分（Ｃ１６：１ｎ−７）がｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＵ形疎水性空洞内に結合している、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＵＲＶ）と複合したＸＷｎｔ８ａ（ＰＤＢ  ＩＤ＃４Ｆ０Ａ）のモデルを提供する。Ｂは、Ａの黒枠内の部分の拡大図を提供する。
【図３９−２】Ｃは、ペプチドＦｚ７−２１の存在下のＦＺＤ７  ＣＲＤとのＷｎｔ相互作用について、提案モデルを提供する。Ｄは、Ｃの黒枠内の部分の拡大図を提供する。
【図４０】ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ上のペプチド結合領域内の特定の残基における突然変異が、野生型ｈＦＺＤ７  ＣＲＤと比較して、Ｆｚ７−２１の結合を低減したかどうかを評価するために行われた蛍光サイズ排除（ＦＳＥＣ）クロマトグラフィー実験の結果を提供する。
【図４１】Ａは、ｄＦｚ７−２１による処理が、Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウス由来のオルガノイド中のＬｇｒ５−ＧＦＰ幹細胞の数を低減したかどうかを決定するために行われた実験の結果を提供する。Ｂは、ｄＦｚ７−２１による処理が、Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウス由来のオルガノイド中のＬｇｒ５−ＧＦＰ幹細胞の数を低減したかどうかを決定するために行われた実験の結果を提供する。Ｃは、Ａ及びＢに示される結果の定量を提供する。
【図４２−１】Ａは、Ｌｇｒ５−ＧＦＰオルガノイド中のＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡレベルに対するＤＭＳＯ、Ｆｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｓによる処置の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。Ｂは、Ｌｇｒ５−ＧＦＰオルガノイド中のＡｓｃｌ２  ｍＲＮＡレベルに対するＤＭＳＯ、Ｆｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｓによる処理の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。
【図４２−２】Ｃは、ＡＰＣｍｉｎオルガノイド中のＡｘｉｎ２  ｍＲＮＡレベルに対するＤＭＳＯ、Ｆｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｓによる処理の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。Ｄは、ＡＰＣｍｉｎオルガノイド中のＡｓｃｌ２  ｍＲＮＡレベルに対するＤＭＳＯ、Ｆｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｓによる処理の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。Ｅは、ＡＰＣｍｉｎオルガノイド中のＬｇｒ５  ｍＲＮＡレベルに対するＤＭＳＯ、Ｆｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｓによる処理の効果を評価するために行われた実験の結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドが提供される。ある特定の実施形態では、これらのリガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  １（ＦＺＤ１）及びＦｒｉｚｚｌｅｄ  ２（ＦＺＤ２）からなる群から選択されるＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と更に結合する。かかるリガンドは、以下の特性のうちの１つ以上を示す。約１００ｎＭ未満のＩＣ５０でのＷｎｔ媒介型Ｂ−カテニンシグナル伝達の阻害、９０ｎＭ未満のＥＣ５０値でのヒトＦＺＤ７  ＣＲＤ及びマウスＦＺＤ７  ＣＲＤへの結合、ならびに／または以下のアミノ酸、Ｌｅｕ８１、Ｈｉｓ８４、Ｇｌｎ８５、Ｔｙｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｐｈｅ１３８、及びＰｈｅ１４０のうちの３つ以上を含むヒトＦＺＤ７  ＣＲＤの結合領域への結合。
【００３１】
また、対象におけるがん（結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、もしくはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんなど）を治療する際の、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドを使用する方法も提供される。また、対象におけるがん（結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、もしくはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんなど）を治療する際の、ＦＺＤ１及び／またはＦＺＤ２のＣＲＤと更に結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドを使用する方法も提供される。また、眼疾患または障害の治療用薬物の製造における、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドの使用も提供される。また、眼疾患または障害の治療用薬物の製造における、ＦＺＤ１及び／またはＦＺＤ２のＣＲＤと更に結合する天然に存在しないペプチドを含む、かかるリガンドの使用も提供される。
【００３２】
本開示の実践は、別途示されない限り、細胞生物学、毒物学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組み換えＤＮＡ、及び当該技術分野の範囲内の関連分野における標準方法及び従来技法を用いる。かかる技法は、文献に記載されており、したがって当業者が利用できる。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，”５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００８、Ｖｏｅｔ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｌｉｆｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｅｖｅｌ，”３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００８、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期更新、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，２０００、ならびにシリーズ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい。
【００３３】
定義
本明細書で使用されるとき、「天然に存在しない」は、例えば、自然界で見出されないアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは例えば、自然界で見出されないヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。本明細書で提供される天然に存在しないペプチドは、遺伝子操作方法によって、または化学合成方法によって産生され得る。したがって、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドは、組み換えであってよく、すなわち、異種核酸の導入もしくはその細胞に天然でない形態への天然核酸の改変によって修飾された、または細胞がそのように修飾された細胞に由来する、細胞または核酸またはベクターによって産生されてもよい。あるいは、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドは、化学ペプチドを介して産生され得る。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸改変」は、例えば、ペプチド配列中（ＦＺＤ７のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドの配列中など）の少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、または置換を指す。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「リガンド」は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される少なくとも１つの天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）分子を指す。本明細書に記載される少なくとも１つの天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドの、ＣＲＤへの結合は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なり、例えば、タンパク質−リガンド結合を測定する結合アッセイまたはイムノアッセイによって検出され得る。
【００３６】
目的の受容体と「結合する」本発明のリガンドは、十分な親和性で受容体と結合するものであり、それによりリガンドは、該受容体を発現するタンパク質または細胞または組織を標的とする診断剤及び／または治療剤として有用である。標的分子または受容体へのリガンドの結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープの「特異的結合」、またはそれに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を対照分子の結合と比較して決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば、過剰な標識されていない標的との競合によって決定され得る。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害されると、特異的結合が示される。特定の一実施形態では、「特異的に結合する」は、他の特定のＦＺＤ  ＣＲＤドメインではなく、その特定の標的ＦＺＤ７  ＣＲＤドメインへのリガンドの結合を指す。例えば、リガンドは、ＦＺＤ７  ＣＲＤと特異的に結合するが、ＦＺＤ８  ＣＲＤには特異的に結合しない。
【００３７】
ある特定の実施形態では、「標的でない」ＦＺＤ受容体（ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、もしくはＦＺＤ１０など）へのリガンドの結合の程度は、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定して、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／またはＦＺＤ７へのリガンドの結合の約１０％未満となる。ある特定の実施形態では、本開示のリガンドは、約４℃、２５℃、３７℃、または４５℃の温度で測定して、１００ｎＭ以下、任意に１０ｎＭ未満、任意に１ｎＭ未満、任意に０．５ｎＭ未満、任意に０．１ｎＭ未満、任意に０．０１ｎＭ未満、または任意に０．００５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）またはＩＣ５０値でＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／またはＦＺＤ７に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、「標的でない」ＦＺＤ受容体（ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、もしくはＦＺＤ１０など）へのリガンドの結合の程度は、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）により決定して、ＦＺＤ７へのリガンドの結合の約１０％未満となる。ある特定の実施形態では、本開示のリガンドは、約４℃、２５℃、３７℃、または４５℃の温度で測定して、１００ｎＭ以下、任意に１０ｎＭ未満、任意に１ｎＭ未満、任意に０．５ｎＭ未満、任意に０．１ｎＭ未満、任意に０．０１ｎＭ未満、または任意に０．００５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）またはＩＣ５０値でＦＺＤ７に特異的に結合する。
【００３８】
「単離された」リガンドは、そのリガンド及び混入物または不純物を含む組成物から特定及び分離され、かつ／または回収されたリガンドである。混入物または不純物は、ＦＺＤ７のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドの診断用途または治療用途に干渉する材料である。混入物としては、例えば、宿主細胞酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質（すなわち、リガンドが組み換え的に産生される場合）、または例えば、塩、試薬、切断もしくは分解された配列、不完全に脱保護された配列等（すなわち、リガンドが化学合成を介して産生される場合）を挙げることができる。好ましい実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、次の程度まで精製される。（１）ローリー法により決定した場合にリガンドの９５重量％を上回り、最も好ましくは９９重量％を上回る、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで。単離されたリガンドは、組み換え細胞内で原位置のリガンドを含む。ＦＺＤ７のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）単離されたリガンドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００３９】
本明細書で特定されるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」または「相同性」は、いずれの保存的置換も配列同一性の一部として見なして配列を整列した後に、候補配列内のアミノ酸残基が、比較されるポリペプチド内のアミノ酸残基と同一である割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に利用可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄで使用する場合はコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており、変動しない。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「結合領域」という用語は、ペプチド（本明細書で提供されるＦＺＤ７のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）に特異的に結合する天然に存在しないペプチドなど）によって特異的に結合され得る領域を指す。結合領域は、該結合領域に固有である空間的構造で約３〜１０個のアミノ酸を含み得る。これらのアミノ酸は、タンパク質内で直鎖状であり得るか（すなわち、アミノ酸配列において保存的）、またはそれらは、タンパク質の異なる部分に位置付けられ得る（すなわち、アミノ酸配列において非保存的）。タンパク質内または２つのタンパク質の界面におけるアミノ酸の空間的構造を決定する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｘ線結晶解析及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００４１】
治療目的のための「対象」、「患者」、または「個体」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００４２】
本明細書に開示されるリガンド（またはかかるリガンドを含む組成物）の「有効量」は、具体的に記載される目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、実験的に、かつ記載される目的に関する既知の方法によって決定することができる。
【００４３】
「治療有効量」という用語は、（ヒト患者などの）哺乳動物において疾患または障害を「治療する」のに有効な、本明細書に開示されるリガンドまたは組成物の量を指す。がんの場合、本明細書に開示されるリガンドの治療有効量は、がん細胞の数を低減する、腫瘍サイズまたは重量を低減する、末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅延及び好ましくは停止させる）、瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅延及び好ましくは停止させる）、腫瘍成長をある程度阻害する、ならびに／またはがんと関連付けられた症状のうちの１つ以上をある程度緩和することができる。本明細書に開示されるリガンドが、既存のがん細胞の成長を予防する及び／またはそれらを殺滅することができる限り、それは細胞増殖抑制性及び／または細胞毒性であり得る。一実施形態では、治療有効量は、成長阻害量である。別の実施形態では、治療有効量は、患者の生存を延長する量である。別の実施形態では、治療有効量は、患者の無進行生存を改善する量である。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療する」とは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下：疾患に起因する１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の弱化、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防もしくは遅延）、疾患の拡散（例えば、転移）の予防もしくは遅延、疾患の再発の予防もしくは遅延、疾患の進行の遅延もしくは減速、病状の改善、疾患の寛解（部分的もしくは全体的）の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の低減、疾患の進行の遅延、生活の質の向上もしくは改善、体重増加の向上、及び／または生存期間の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。また、がんの病理学的帰結（例えば、腫瘍体積など）の軽減も「治療」に包含される。本発明の方法は、治療のそれらの態様のうちの任意の１つ以上を企図する。
【００４５】
「障害」は、ＦＺＤ７のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドによる、または本明細書に記載されるＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドによる治療から利益を享受する任意の病態である。例えば、異常なＷｎｔ発現または活性に罹患しているか、またはそれに対する予防を必要とする哺乳動物。これには、哺乳動物を問題の障害にかかりやすくする病理学的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患が挙げられる。本明細書で治療される障害の非限定的な例としては、本明細書の他の場所に記載されるがん及び転移性疾患が挙げられる。ある特定の実施形態では、システインリッチドメイン（ＦＺＤ７）と結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンド、またはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドを使用して、組織修復、創傷治癒、及び骨成長を促進することができる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」または「薬理学的に適合性の」とは、生物学的に望ましくないことがないか、または他の理由で望ましくないことがない材料を意味し、例えば、この材料は、いかなる重大な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の他の成分のうちのいずれとも有害な方法で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒性学的及び製造試験に必要とされる標準を満たしており、かつ／または米国食品医薬品局によって準備された不活性成分ガイドに含まれている。
【００４７】
「検出する」という用語は、存在もしくは不在を決定すること、または物質（ＦＺＤ７もしくはその受容体など）の量を定量することを含むことが意図される。したがって、この用語は、定性的及び定量的決定のための、本明細書で提供される材料、組成物、及び方法の使用を指す。一般に、検出に使用される特定の技法は、本発明の実施に重要ではない。
【００４８】
例えば、本発明による「検出する」とは、ＦＺＤ７の存在もしくは不在、ＦＺＤ７のレベルの変化、及び／またはＦＺＤ７の生物学的機能／活性の変化を観察することを含み得る。ある特定の実施形態では、「検出する」とは、ＦＺＤ７のレベル（例えば、ヒトＦＺＤ１、ヒトＦＺＤ２、及び／またはヒトＦＺＤ７のポリペプチドレベル）を検出することを含み得る。検出するとは、対照と比較して、１０％〜９０％の間の任意の値、または３０％〜６０％の間の任意の値、または１００％超の変化（増加もしくは減少）を定量することを含み得る。検出するとは、（上限、下限値を含む）２倍〜１０倍か、またはそれ以上（例えば、１００倍）の任意の値の変化を定量することを含み得る。
【００４９】
「標識」という語は、本明細書で使用されるとき、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドに直接または間接的に複合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能（例えば、放射性同位標識または蛍光標識）であり得るか、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学改変を触媒し得る。
【００５０】
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする態様を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」を指す説明には、「Ｘ」の説明を含む。
【００５１】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００５２】
特許出願及び公報を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００５３】
ＦＺＤ７のシステインリッチドメインと結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンド
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドが提供される。ある特定の実施形態では、リガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  １（ＦＺＤ１），Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２（ＦＺＤ２）、及びＦｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）からなる群から選択される１つ以上のＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体と結合する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１は、ヒトＦＺＤ１である。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１は、マウスＦＺＤ１である。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ２は、ヒトＦＺＤ２である。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ２は、マウスＦＺＤ２である。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７は、ヒトＦＺＤ７である。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７は、マウスＦＺＤ７である。特定の実施形態では、リガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ７（ＦＺＤ７）（例えば、ヒトＦＺＤ７またはマウスＦＺＤ７）のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）と特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ３（ＦＺＤ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ４（ＦＺＤ４）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ５（ＦＺＤ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ６（ＦＺＤ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ８（ＦＺＤ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ９（ＦＺＤ９）、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ  １０（ＦＺＤ１０）のＣＲＤと結合しない天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  １（ＦＺＤ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２（ＦＺＤ２）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ３（ＦＺＤ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ４（ＦＺＤ４）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ５（ＦＺＤ５）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ６（ＦＺＤ６）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ８（ＦＺＤ８）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ９（ＦＺＤ９）、またはＦｒｉｚｚｌｅｄ  １０（ＦＺＤ１０）のＣＲＤと結合しない天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。
【００５４】
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、ｈＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、ｍＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。
【００５５】
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合し、かつ１）ＦＺＤ１、２）ＦＺＤ２、またはＦＺＤ１及びＦＺＤ２のうちのいずれか１つのＣＲＤと付加的に結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、ＦＺＤ１及びＦＺＤ７のＣＲＤと結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、ＦＺＤ２及びＦＺＤ７のＣＲＤと結合する天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。
【００５６】
ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）を含むペプチドが結合するＦＺＤ７  ＣＲＤの結合領域への結合に対して競合する、天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）を含むペプチドが結合するＦＺＤ７  ＣＲＤの結合領域への結合に対して競合する、天然に存在しないペプチドから本質的になる（例えば、それからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）からなるペプチドが結合するＦＺＤ７  ＣＲＤの結合領域への結合に対して競合する、天然に存在しないペプチドから本質的になる（例えば、それからなる）。
【００５７】
ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）を含むペプチドが結合するＦＺＤ７  ＣＲＤの同じ結合領域にと特異的に結合する、天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）を含むペプチドが結合するＦＺＤ７  ＣＲＤの同じ結合領域と特異的に結合する、天然に存在しないペプチドから本質的になる（例えば、それからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）からなるペプチドが結合するＦＺＤ７  ＣＲＤの同じ結合領域と特異的に結合する、天然に存在しないペプチドから本質的になる（例えば、それからなる）。
【００５８】
ある特定の実施形態では、リガンドは、Ｌｅｕ８１、Ｈｉｓ８４、Ｇｌｎ８５、Ｔｙｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｐｈｅ１３８、及びＰｈｅ１４０からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのアミノ酸を含むＦＺＤ７の結合領域と特異的に結合するペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。
【００５９】
ある特定の実施形態では、リガンドは、Ｌｅｕ８１、Ｈｉｓ８４、Ｇｌｎ８５、Ｔｙｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｐｈｅ１３８、及びＰｈｅ１４０からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのアミノ酸を含むＦＺＤ７の結合領域と特異的に結合する、天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）。ある特定の実施形態では、リガンドは、Ｌｅｕ８１、Ｈｉｓ８４、Ｇｌｎ８５、Ｔｙｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｐｈｅ１３８、及びＰｈｅ１４０からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのアミノ酸の４Å以内の、ＦＺＤ７の結合領域と特異的に結合する、天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。
【００６０】
ある特定の実施形態では、リガンドは、１つ以上の部分に融合されたＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／またはＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む、キメラ分子である。ある特定の実施形態では、リガンドは、１つ以上の部分に融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む、キメラ分子である。ある特定の実施形態では、部分は、ペプチドのＮ末端に融合される。ある特定の実施形態では、部分は、ペプチドのＣ末端に融合される。ある特定の実施形態では、第１の部分がペプチドのＮ末端に融合され、第２の部分がペプチドのＮ末端に融合される。ある特定の実施形態では、１つ以上の部分は、ペプチドに組み換えで融合される。ある特定の実施形態では、１つ以上の部分は、リンカー（切断可能なリンカーなど）を介してペプチドに結合される。例示的な部分としては、ペプチド、ポリペプチドまたはそれらの断片、タンパク質またはそれらの断片、融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
ある特定の実施形態では、リガンドは、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に組み換えで融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−７２）のタンパク質伝達ドメインを使用して、例えば、様々な組織に、または例えば脳血管障壁を横切って送達するためにリガンドを標的とするタンパク質伝達ドメインに（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくはＮ末端及びＣ末端の両方で）融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、一次両親媒性ペプチドＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ配列番号１０４）、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ配列番号１０５）、二次両親媒性ペプチドＣＡＤＹ（Ａｃ−ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ−Ｃｙａ配列番号１０６）、またはオクタ−アルギニン（Ｒ（８）配列番号１０７）などの細胞透過性ペプチドに融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む。
【００６２】
ある特定の実施形態では、リガンドは、天然に存在しないペプチドの立体構造（αらせん構造など）を安定化するドメインまたは部分に（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端で、もしくはＮ末端及びＣ末端の両方に）融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む。
【００６３】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチド含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドは、単一特異性として単量体形態で、または（異なる標的リガンドもしくは同じ標的リガンド上の異なる結合領域に対して）二重もしくは多重特異性として多量体形態で使用され得る。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドは、ＬＲＰ６に複合される。結合は、共有または非共有であり得る。ある特定の実施形態では、二量体二重特異性リガンドは、第１の標的または結合領域に対する特異性を有する１つのサブユニット、及び第２の標的リガンドまたは結合領域に対する特異性を有する第２のサブユニットを有する。ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含むリガンドは、原子価及びしたがって結合の活性を増加させることができる多様な立体構造で接合され得る。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される２つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１０より多い）天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、核酸を、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される単一の天然に存在しないペプチドの２つ以上のコピーをコードするように操作することができ、これらのコピーは、直列で転写及び翻訳されて、同一のサブユニットの共有結合された多量体を産生する。ある特定の実施形態では、核酸は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される２つ以上の異なる天然に存在しないペプチドをコードするように操作することができ、これらのコピーは、直列で転写及び翻訳されて、異なるサブユニットの共有結合された多量体を産生する。
【００６５】
別の実施形態では、リガンドは、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドと融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、天然に存在しないペプチドを含む。エピトープタグは、一般に、リガンドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。かかるエピトープタグ形態のリガンドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供により、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含むリガンドが、抗タグ抗体またはエピトープタグに特異的に結合する別の種類の親和性マトリクスを使用して、親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。
【００６６】
様々なタグポリペプチド及びそれらそれぞれの抗体が、当該技術分野において既知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−Ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ）タグ；フルＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、及び９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，３６１０−３６１６］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，３，５４７−５５３）が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、フラッグ−ペプチド（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０４−１２１０）、ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，１９２−１９４］、α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５１６３−１５１６６）、及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６３９３−６３９７］が挙げられる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、リガンドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域に組み換えで融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む。二価形態のリガンド（例えば、「イムノアドヘシン」の場合、かかる融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。本明細書で提供されるＩｇ融合物は、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ヒトのおよそ残基９４〜２４３、残基３３〜５３、もしくは残基３３〜５２、またはそれのみを含むポリペプチドを含む。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合物の産生については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５，４２８，１３０号も参照されたい。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含むリガンドは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端で、ＩｇＧ（Ｆｃ）の定常領域に融合される。ある特定の実施形態では、リガンド／Ｆｃ融合分子は、免疫応答の補体成分を活性化する。ある特定の実施形態では、リガンド／Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含むリガンドの治療的価値を増加させる。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含むリガンドは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端で、Ｃ１ｑなどの補体タンパク質に融合される（例えば、組み換えで融合される）。様々な公報が、ＦｃＲｎ結合ポリペプチドを分子に導入することによって（ＷＯ１９９７／４３３１６、ＵＳ５８６９０４６、ＵＳ５７４７０３５、ＷＯ１９９６／３２４７８、ＷＯ１９９１／１４４３８）、またはタンパク質を、ＦｃＲｎ結合親和性が保存されるが他のＦｃ受容体の親和性が大幅に低減された抗体と融合させること（ＷＯ１９９９／４３７１３）もしくは抗体のＦｃＲｎ結合ドメインと融合させること（ＷＯ２０００／０９５６０、ＵＳ４７０３０３９）によって半減期が修飾される、天然に存在しないタンパク質を得るための方法を記載している。生理活性分子（例えば、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含むリガンド）の半減期を増加させる特定の技法及び方法はまた、ＵＳ７０８３７８４に見出され得る。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含むリガンドは、以下のアミノ酸残基突然変異（ＫａｂａｔのＥＵインデックスにより番号が付けられた）を含むＩｇＧからのＦｃ領域に融合される：Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ。
【００６８】
ある特定の実施形態では、リガンドは、インビボまたは血清半減期を増加または延長させる分子と融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのアルブミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、免疫グロブリン分子（ＩｇＧ）、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質、または血流中のその半減期及び／もしくはその組織貫通を増加させる他の因子と融合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む。
【００６９】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む追加のリガンドは、の遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、及び／またはコドンシャフリング（集合的に「ＤＮＡシャフリング」と称される）技法を通して生成され得る。ＤＮＡシャフリングを用いて、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチド（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する天然に存在しないペプチド）を含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドの活性を改変することができる。一般に、ＵＳ５６０５７９３、ＵＳ５８１１２３８、ＵＳ５８３０７２１、ＵＳ５８３４２５２、ＵＳ５８３７４５８、Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，７２４−３３、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，７６−８２、Ｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７，２６５−７６、及びＬｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４，３０８−３１３を参照されたい。
【００７０】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、組み換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法による、ランダム変異導入法に供することによって改変される。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の部分は、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、区分、部分、ドメイン、断片等で組み換えられ得る。
【００７１】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、公的に利用可能な遺伝子配列を使用して構築された組み換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現によって、または化学ペプチド合成によって生成することができる。
【００７２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、５〜４５アミノ酸長である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、７〜３０アミノ酸長である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、１０〜２０アミノ酸長である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、１１〜１４アミノ酸長である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、または５アミノ酸長未満である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。
【００７３】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＤＬＸ４Ｘ５ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１００）
式中、Ｘ１〜Ｘ３の各々は、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ４〜Ｘ５の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｌであり、Ｘ２は、Ｐであり、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｅであり、Ｘ５は、Ｆである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含み、
Ｘ１Ｘ２ＤＤＬＸ３Ｘ４ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０１）
式中、Ｘ１〜Ｘ２の各々は、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ３〜Ｘ４の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００７５】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含み、
Ｘ１ＤＤＬＸ２Ｘ３ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０２）
式中、Ｘ１は、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ２〜Ｘ３は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｅであり、Ｘ３は、Ｆである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００７６】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含み、
ＤＤＬＸ１Ｘ２ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０３）
式中、Ｘ１及びＸ２の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００７７】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＤＤＬＸ４Ｘ５ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１００）
式中、Ｘ１〜Ｘ３の各々は、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ４〜Ｘ５の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｌであり、Ｘ２は、Ｐであり、Ｘ３は、Ｓであり、Ｘ４は、Ｅであり、Ｘ５は、Ｆである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００７８】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
Ｘ１Ｘ２ＤＤＬＸ３Ｘ４ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０１）
式中、Ｘ１〜Ｘ２の各々は、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ３〜Ｘ４の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００７９】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
Ｘ１ＤＤＬＸ２Ｘ３ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０２）
式中、Ｘ１は、アミノ酸がないか、任意のアミノ酸であるか、または非天然のアミノ酸であり、Ｘ２〜Ｘ３は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｅであり、Ｘ３は、Ｆである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８０】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＤＤＬＸ１Ｘ２ＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０３）
式中、Ｘ１及びＸ２の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８１】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＸＹ（配列番号１１４）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、２−アミノデカン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−２−アミノヘキサデカン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたオクタン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたドデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたテトラデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたヘキサデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、２−アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、オキソヘキサン酸ｔ−ブトキシである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｓ−ベンジル−Ｌ−ホモシステイン（すなわち、チオエーテル結合を介してベンジル基にカップリングされたホモシステイン）である。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＣＡＳ＃３７４８９９−６０−２によって表される非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、２−アミノ−３−デシルオキシ−プロピオン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−ホモフェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、２−アミノフェニルペンタン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−α−アミノアジピン酸Δ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＣＡＳ＃１５９７５１−４７−０によって表される非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、ブチリルリジンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ペンチルリジンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、アミノ−８−（ベンジルオキシ）−８−オキソオクタン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＣＡＳ＃１８２０５９−５９−２によって表される非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−２−アミノヘプタン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−３−スチリルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、６−ヒドロキシ−Ｌ−ノルロイシンである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８２】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＳＤＤＸＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１１５）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたオクタン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたドデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、Ｘは、ホモフェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−ホモロイシンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＣＡＳ＃１８０４１４−９４−２によって表される非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、ｔ−ブチルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、シクロブチルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、シクロペンチルＬアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−スチリルフェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ビフェニルである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−２−アミノヘプタン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−２−アミノオクタン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−２−アミノデカン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−キノリル−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、４−キノリル−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、トリフルオロメチル−Ｌ−ロイシンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、シクロヘキシル−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｆ（フェニルアラニン）である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＳＤＤＸ１ＥＦＷＣＨＶＸ２Ｙ（配列番号１１６）
式中、Ｘ１及びＸ２の各々は、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｌ−ホモフェニルアラニンであり、Ｘ２は、リジンイプシロンアミノ基にカップリングされたテトラデカン酸を含むリジンの誘導体である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８４】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＸＭＹ（配列番号１１７）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｉである。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｔである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−アミノ−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＣＡＳ＃１８１９５４−３４−７によって表される非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、βヒドロキシノルバリンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ｔ−ブチルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、ｔ−ブチル−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、シクロブチル−Ｌ−グリシンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、シクロプロピル−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、シクロペンチル−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８５】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＸ（配列番号１１８）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、４−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、４−メチル−Ｌ−フェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−（３−キノリニル）−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−（２−キノリニル）−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−（２−キノキサリニル）−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３−［３，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−Ｌ−アラニンである。ある特定の実施形態では、Ｘは、３，４−ジフルオロ−Ｌ−フェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８６】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＳＤＸＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１１９）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｅ（グルタミン酸）である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｌ−α−アミノアジピン酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、ＣＡＳ＃２５０３８４−７７−１によって表される非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８７】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＬＰＳＤＸＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１２０）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｑ（グルタミン）である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８８】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＳＤＤＬＥＸＷＣＨＶＭＹ（配列番号１２１）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニンである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００８９】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＸＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１２２）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ｔ（トレオニン）である。ある特定の実施形態では、Ｘは、βヒドロキシルノルバリンである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００９０】
ある特定の実施形態では、リガンドは、以下に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドから本質的になり（例えば、それからなり）、
ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＸＨＶＭＹ（配列番号１２３）
式中、Ｘは、任意のアミノ酸または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘは、Ａ（アラニン）である。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。
【００９１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）を含む天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）からなるペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）を含む天然に存在しないペプチドからなる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）からなる天然に存在しないペプチドからなる。ある特定の実施形態では、ペプチドは、例えば、Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈ．９：ｅ５７−ｅ６２、Ｆｏｒｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：８３８−８４２、Ｋｌｅｉｎ（２０１４）Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．５：８３８−８３９、及びそれに引用される参考文献に記載されるように、そのαらせん構造を核形成または安定化するような方法で修飾される。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ステープルペプチドである。ある特定の実施形態では、ペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、ペプチドは、二量体化される。
【００９２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）を含む天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）からなる天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）を含む天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、アミノ酸配列ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）からなる天然に存在しないペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、例えば、Ｍａｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈ．９：ｅ５７−ｅ６２、Ｆｏｒｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：８３８−８４２、Ｋｌｅｉｎ（２０１４）Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．５：８３８−８３９、及びそれに引用される参考文献に記載されるように、そのαらせん構造を核形成または安定化するような方法で修飾される。ある特定の実施形態では、ペプチドは、ステープルペプチドである。ある特定の実施形態では、ペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、ペプチドは、二量体化される。
【００９３】
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）の変異形である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、かかるペプチド変異形は、配列番号１３に少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１３の位置（複数可）１、２、３、７、及び／または８におけるアミノ酸（複数可）が置換される。
【００９４】
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）の変異形である天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、かかる変異形は、配列番号９９に少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、配列番号９９の位置（複数可）１、５、及び／または６におけるアミノ酸（複数可）が置換される。
【００９５】
ある特定の実施形態では、アミノ酸置換（複数可）は、保存的アミノ酸置換（複数可）である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換（複数可）は、非天然のアミノ酸（複数可）での置換（複数可）である。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、天然に存在しないペプチドがＦＺＤ７のＣＲＤに結合する能力を実質的に低減しない。例えば、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）が行われ得る。配列番号１３または配列番号９９の変異形を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの結合親和性は、以下の実施例に記載される方法を使用して評価することができる。
【００９６】
保存的置換は、「保存的置換」という見出しで以下の表１に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載される通りである。アミノ酸置換は、配列番号１３または配列番号９９の変異形に導入されてもよく、産生物は、実施例に記載される方法を使用して、所望の活性、例えばＦＺＤ７のＣＲＤへの保持／改善された結合についてスクリーニングされ得る。
表１：保存的置換
2019534858.tif 000003
【００９７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。配列番号１３または配列番号９９の例示的な置換型変異形は、例えば、実施例に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟ペプチドである。簡潔には、本明細書に記載されるペプチド中の１つ以上の残基が改変（すなわち、付加、欠失、または置換）され、変異形ペプチドがファージ上に提示され、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合親和性についてスクリーニングされる。親和性成熟のある特定の実施形態では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲまたはオリゴヌクレオチド指向性変異導入法）のうちのいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが創出される。次いで、そのライブラリをスクリーニングして、ＦＺＤ７  ＣＲＤに対して所望の親和性を有する任意のペプチド変異形を特定する。ある特定の実施形態では、多様性の導入は、本明細書に記載されるペプチド中の１つ以上の残基をランダム化することを伴う。ある特定の実施形態では、ＦＺ７のＣＲＤへの結合に関与する本明細書に記載されるペプチド中の残基は、例えば、アラニン系統的変異導入法、セリン系統的変異導入法、バリン系統的変異導入法、アスパラギン酸系統的変異導入法、またはモデリングを使用して特定され得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＡＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１０９）、ＬＰＳＤＤＬＥＦＡＣＨＶＭＹ（配列番号１１０）、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＡＹ（配列番号１１１）、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＡ（配列番号１１２）、ＬＰＳＤＱＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３１）、またはＬＰＳＤＤＬＥＦＷＡＨＶＭＹ（配列番号１３３）に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミド化される。ある特定の実施形態では、ペプチドのＮ末端アミンは、アセチル化される。ある特定の実施形態では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミド化され、かつペプチドのＮ末端アミンは、アセチル化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、例えば、ペプチド中のＣ１０間のジスルフィド結合によって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、本明細書の別の場所に記載される化学リンカーなどの化学リンカーによって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、スペーサーペプチド（例えば、介在ペプチド）に融合される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＥＹ（配列番号１２５）、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＬＭＹ（配列番号１２６）、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＩＭＹ（配列番号１２７）、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＴＭＹ（配列番号１２８）、ＳＤＤＦＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１２９）、ＳＤＥＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３０）、またはＴＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３２）に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミド化される。ある特定の実施形態では、ペプチドのＮ末端アミンは、アセチル化される。ある特定の実施形態では、ペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミド化され、かつペプチドのＮ末端アミンは、アセチル化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、環化される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチドは、二量体化される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、例えば、ペプチド中のＣ８間のジスルフィド結合によって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、本明細書の別の場所に記載される化学リンカーなどの化学リンカーによって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、スペーサーペプチド（例えば、介在ペプチド）に融合される。
【０１００】
追加としてまたは代替として、ある特定の実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）の変異形またはＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）の変異形であるペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここで１つ以上のアミノ酸が、非天然のアミノ酸で置換される。追加としてまたは代替として、ある特定の実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）の変異形またはＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）の変異形であるペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここで１つ以上の非天然のアミノ酸残基が（例えば、Ｎ末端において、Ｃ末端において、またはＮ末端及びＣ末端の両方において）付加される。ある特定の実施形態では、非天然のアミノ酸は、本明細書の別の場所に記載される非天然のアミノ酸である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）の変異形またはＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）の変異形であるペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここでペプチドのＣ末端カルボキシル基が、アミド化される。ある特定の実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）の変異形またはＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）の変異形であるペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここでペプチドのＮ末端アミンが、アセチル化される。ある特定の実施形態では、リガンドは、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３）の変異形またはＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号９９）の変異形であるペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここでペプチドのＣ末端カルボキシル基が、アミド化され、かつペプチドのＮ末端アミンが、アセチル化される。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する二量体化された天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、二量体中の各ペプチドは、配列番号１３に記載されるアミノ酸を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、例えば、配列番号１３のＣ１０間のジスルフィド結合によって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中の各ペプチドは、配列番号９９に記載されるアミノ酸を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、例えば、配列番号９９のＣ８間のジスルフィド結合によって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、本明細書の別の場所に記載される化学リンカーなどの化学リンカーによって結合される。ある特定の実施形態では、二量体中のペプチドは、スペーサーペプチド（例えば、介在ペプチド）に融合される。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、リガンドは、２つの天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、第１の天然に存在しないペプチドは、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹＸ（配列番号１３４）に記載されるアミノ酸配列を含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、式中、Ｘは、Ｌ−ホモプロパルギルグリシンであり、第２の天然に存在しないペプチドは、ＳＤＤＬＸＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３５）に記載されるアミノ酸配列を含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、式中、Ｘは、５−アジド−Ｌ−オルニチンまたはＳ−アセトアミノメチル−Ｌ−システインである。ある特定の実施形態では、第１及び第２の天然に存在しないペプチドは、クリック化学を介して非天然のアミノ酸を反応させることによって共有結合される。ある特定の実施形態では、第１の天然に存在しないペプチドは、ＳＤＤＬＥＦＷＣＨＶＭＹＸ（配列番号１３４）に記載されるアミノ酸配列を含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、式中、Ｘは、Ｌ−ビスホモプロパルギルグリシンであり、第２の天然に存在しないペプチドは、ＳＤＤＬＸＦＷＣＨＶＭＹ（配列番号１３５）に記載されるアミノ酸配列を含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、式中、Ｘは、アジド−ホモアラニンまたはＳ−アセトアミノメチル−Ｌ−システインである。ある特定の実施形態では、第１及び第２の天然に存在しないペプチドは、クリック化学を介して非天然のアミノ酸を反応させることによって共有結合される。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＳＤＤＬＥＦＷＸＨＶＭＹ（配列番号１２４）に記載されるアミノ酸配列を含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）天然に存在しないペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、式中、Ｘは、Ｌ−セレノシステインである。ある特定の実施形態では、ペプチドは、Ｌ−セレノシステインを介して環化及び／または二量体化される。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号１〜１２、１４〜３１、及び３９〜９８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチド（直鎖状ペプチドなど）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号１〜１２、１４〜３１、及び３９〜９８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列からなる天然に存在しないペプチド（直鎖状ペプチドなど）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号１〜１２、１４〜３１、及び３９〜９８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチド（直鎖状ペプチドなど）である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号１〜１２、１４〜３１、及び３９〜９８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列からなる天然に存在しないペプチド（直鎖状ペプチドなど）である。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号３２〜３８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む天然に存在しないもの（環状ペプチドなど）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号３２〜３８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列からなる天然に存在しないペプチド（環状ペプチドなど）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号３２〜３８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチド（環状ペプチドなど）である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、配列番号３２〜３８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列からなる天然に存在しないペプチド（環状ペプチドなど）である。
【０１０７】
配列番号１〜１２及び１４〜９８のアミノ酸配列は、以下の表２に提供される。
表２
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【０１０８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、脂質に複合されるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、脂質は、１２〜２０個の炭素原子を含む、長鎖脂肪酸（すなわち、ＬＣＦＡ）である。ある特定の実施形態では、脂質は、６個以下の炭素原子を含む、短鎖脂肪酸（すなわち、ＳＣＦＡ）である。ある特定の実施形態では、脂質は、飽和脂肪酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、不飽和脂肪酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、芳香族テールを含む。ある特定の実施形態では、脂質は、オクタン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、デカン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、ドデカン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、テトラデカン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、ヘキサデカン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、アミノ−６−ヒドロキシヘキサン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、アミノフェニルペンタン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、Ｌ−α−アミノアジピン酸Δ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルである。ある特定の実施形態では、脂質は、アミノ−８−（ベンジルオキシ）−８−オキソオクタン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、２−アミノヘプタン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、Ｌ−２−アミノデカン酸である。ある特定の実施形態では、脂質は、２−アミノオクタン酸である。脂質をペプチドに連結する方法は、当該技術分野において周知であり、典型的には、標準アミドカップリング条件下で、脂質のカルボン酸基をペプチド中のリジン側鎖のイプシロンアミンと反応させることを含む。追加の方法は、Ｇｅｒａｕｅｒ，Ｍ．，Ｋｏｃｈ，Ｓ．，Ｂｒｕｎｓｖｅｌｄ，Ｌ．ａｎｄ  Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．２００８．Ｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｗｉｌｅｙ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１−１１において概説されている。ある特定の実施形態では、脂質カップリングされたアミノ酸は、本明細書の別の場所に記載されるように、標準ペプチド合成技法を使用してペプチドに組み込まれる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここでペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミド化される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここでペプチドのＮ末端アミンは、アセチル化される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含み（例えば、それから本質的になり、またはそれからなり）、ここでペプチドのＣ末端カルボキシル基は、アミド化され、かつペプチドのＮ末端アミンは、アセチル化される。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬、無機分子、及び有機分子に（例えば、共役的または非共役的に）複合されるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、もしくは少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）に（例えば、共役的または非共役的に）複合されるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるリガンドは、化学療法剤などの細胞毒性薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）あるいは放射活性アイソトープ（すなわち、放射性複合体）に複合されるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。
【０１１２】
使用され得る酵素的に活性な毒素及びそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセンが挙げられる。他の毒素としては、マイタンシン及びマイタンシノイド、カリケアミシン、ならびに他の細胞毒性薬が挙げられる。様々な放射性核種は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／またはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）放射性複合リガンドの産生に使用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１１３】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと、例えば細胞毒性薬との複合体は、多様な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（グルタレルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素１４標識１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドへの放射性核種の複合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、複合のための反応性基を提供するように操作される。ある特定の実施形態では、Ｎ末端及びＣ末端はまた、複合のための反応性基を提供するのに役立つ。ある特定の実施形態では、Ｎ末端は、１つの部分（例えば、限定されないが、ＰＥＧ）に複合され、一方Ｃ末端は、別の部分（例えば、限定されないが、ビオチン）に複合されるか、またはその逆である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、診断剤または検出可能な剤に複合され得る。かかるリガンド複合体は、臨床試験手順の一部として疾患の発達または進行をモニタリングまたは予後診断するため、例えば特定の治療法の有効性を決定するために有用であり得る。かかる診断及び検出は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを、様々な酵素（例えば、限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコロインステラーゼ）、補欠基（例えば、限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン）、蛍光材料（例えば、限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリスリン）、発光材料（例えば、限定されないが、ルミノール）、生物発光材料（例えば、限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）、放射活性材料（例えば、限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、サリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７Ｔｎ）、様々なポジトロン放出トモグラフィーを使用するポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオン、ならびに放射標識されたまたは特定の放射性同位体に複合された分子を含むが、それらに限定されない検出可能な物質にカップリングすることによって達成され得る。
【０１１６】
また、治療部分に複合されたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドも提供される。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、細胞毒、例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療剤、または放射活性金属イオン、例えばα放出剤などの治療部分に複合され得る。細胞毒または細胞毒性薬として、細胞に有害な任意の薬剤が挙げられる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、治療部分、例えば放射活性金属イオン、例えばα放出剤、例えば１３１Ｉｎ、１３１Ｌｕ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むが、これらに限定されない、放射性金属イオンをポリペプチドに複合するのに有用な２１３Ｂｉまたは大環状キレート剤に複合される。ある特定の実施形態では、大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これはリンカー分子を介して、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドに付着され得る。かかるリンカー分子は、当該技術分野において一般に知られており、例えば、Ｄｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４，２４８３−９０、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０，５５３−５５７、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６，９４３−５０に記載されている。
【０１１８】
治療部分を抗体に複合するための技法は周知であり、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドに適用され得る（例えば、Ａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６．（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８を参照）。
【０１１９】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドに複合された治療部分または薬物は、対象における特定の障害に対する所望の予防的または治療的効果（複数可）を達成するために選択されるべきである。臨床医または他の医療従事者は、リガンドに複合するための治療部分または薬物を決定するときに、以下を考慮すべきである：疾患の性質、疾患の重症度、及び対象の状態。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドはまた固体支持体に付着され得、それは標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である。かかる固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドをコードする核酸分子、リガンドをコードする核酸分子を含む発現ベクター、及び核酸分子を含む細胞もまた企図される。また、本明細書では、かかる細胞を培養し、リガンドを発現させ、細胞培養物からリガンドを回収することによって、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを産生する方法も提供される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、本明細書の別の場所に記載されるように、インビトロ翻訳を介して産生される。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、化学ペプチド合成を介して、例えば、化学的に合成された本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを、１つ以上の部分にグラフトすることによって、またはリガンド全体を化学的に合成することによって生成される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、異常なＷｎｔシグナル伝達が関与する疾患または病態の治療において、治療剤として使用される。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、がん細胞（例えば、結腸癌細胞、膵臓癌細胞、非小細胞肺癌細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん細胞）を殺滅する方法であって、がん細胞を、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと接触させることを含む、方法が提供される。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、がん幹細胞（例えば、結腸癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、非小細胞肺癌幹細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん幹細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん幹細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん幹細胞）を殺滅する方法であって、がん細胞を、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと接触させることを含む、方法が提供される。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、細胞（結腸癌細胞、膵臓癌細胞、非小細胞肺癌細胞、ＲＮＦ４３中に突然変異を含むがん細胞、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん細胞、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん細胞など）におけるＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する方法であって、がん細胞を、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと接触させることを含む、方法が提供される。
【０１２８】
機能的特徴
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、及び最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有するが、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及び／またはＦＺＤ１０のＣＲＤに対して、ＦＺＤ７のＣＲＤに対するその結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、及び最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有するが、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及び／またはＦＺＤ１０のＣＲＤに対して、ＦＺＤ７のＣＲＤに対するその結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの、例えば、非標的ＦＺＤ受容体のＣＲＤ（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及び／またはＦＺＤ１０）への結合の程度は、当該技術分野において既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定して、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの、ＦＺＤ７のＣＲＤへの結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの、例えば、ＦＺＤタンパク質に構造的に関連するタンパク質（例えば、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質、例えば、ｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、及び／またはｓＦＲＰ５）への結合の程度は、当該技術分野において既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定して、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの、ＦＺＤ７のＣＲＤへの結合の約１０％未満である。
【０１３０】
特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば、過剰な標識されていない標的との競合によって決定され得る。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰な標識されていない標的によって競合的に阻害されると、特異的結合が示される。ＦＺＤ７のＣＲＤに「特異的に結合する」本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの結合を評価する他の方法は、実施例に記載されている。
【０１３１】
本明細書で使用される特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたは結合領域の「特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的な」という用語は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の標的のＫｄを有する分子によって呈され得る。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、分子が、いずれの他のポリペプチドまたは結合領域にも実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上の結合領域に結合する、結合を指す。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、約１ｐＭ〜約５００ｎＭのＫｄでＦＺＤ７のＣＲＤと結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、約１ｐＭ〜約５０ｐＭ、約５０ｐＭ〜約２５０ｐＭ、約２５０ｐＭ〜約５００ｐＭ、約５００ｐＭ〜７５０ｐＭ、約７５０ｐＭ〜約１ｎＭ、約１ｎＭ〜約２５ｎＭ、約２５ｎＭ〜約５０ｎＭ、５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２５０ｎＭ、または約２５０ｎＭ〜約５００ｎＭのＫｄでＦＺＤ７のＣＲＤと結合する。ある特定の実施形態では、Ｋｄは、表面プラズモン共鳴を介して決定される。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、約３００ｎＭ、２７５ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１７５ｎＭ、１５０ｎＭ、１４０ｎＭ、１３０ｎＭ、１２０ｎＭ、１１０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つより少ないＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、１０ｎＭ〜２００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、２０ｎＭ〜２００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、３０ｎＭ〜２００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、４０ｎＭ〜２００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、５０ｎＭ〜２００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、５０ｎＭ〜１８０ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、５０ｎＭ〜１６０ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、５０ｎＭ〜１４０ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、５０ｎＭ〜１２０ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、５０ｎＭ〜１００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、４０ｎＭ〜１００ｎＭのＩ���５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、３０ｎＭ〜１００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、２０ｎＭ〜１００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、１０ｎＭ〜１００ｎＭのＩＣ５０値でＷｎｔ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＩＣ５０は、実施例で更に詳細に記載されるように、デュアルルシフェラーゼアッセイにおけるルシフェラーゼ活性の尺度として決定される。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、３００ｎＭ、２７５ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１７５ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、または０．１ｎＭ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つより少ないＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、ＥＣ５０は、実施例において更に詳細に記載されるように、５ＦＡＭ標識ペプチドを使用し、ＦＳＥＣを介して決定される。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、ＦＺＤ７のＣＲＤに対するＷｎｔの動員及び結合を強化する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤへのＷｎｔの動員及び結合は、ペプチドが、約１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．９μＭ、０．８μＭ、０．７μＭ、０．６μＭ、０．５μＭ、０．４μＭ、０．３μＭ、０．２μＭ、０．１μＭ、０．００５μＭ、０．００１μＭ、または０．０００５μＭ未満の（これらの値の間の任意の範囲を含む）濃度で存在するときに強化される。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔは、Ｗｎｔ５ａである。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔは、Ｗｎｔ３ａである。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及び／もしくはＦＺＤ１０のＣＲＤに対する、またはＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及び／もしくはＦＺＤ１０のＣＲＤへの、Ｗｎｔの動員及び結合を強化しない。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔは、Ｗｎｔ５ａである。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔは、Ｗｎｔ３ａである。
【０１３７】
ＦＺＤ７のシステインリッチドメインと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを特定する方法
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する天然に存在しないペプチドを得る方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、該方法は、（ａ）天然に存在しないペプチド：ＣＲＤ複合体を形成するのを可能にする条件下で、ＦＺＤ７のＣＲＤを、天然に存在しないペプチド（直鎖状または環状ペプチド）のライブラリと接触させることと、（ｂ）複合体の形成を検出することと、（ｃ）ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを、複合体から得ることとを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、（ｄ）ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドの核酸配列を決定することを更に含む。ある特定の実施形態では、天然に存在しないペプチド及びＦＺＤ７のＣＲＤを含む複合体が提供される。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、天然に存在しないペプチドは、親和性成熟に供される。このプロセスにおいて、ＦＺＤ７のＣＲＤに結合することが見出されたペプチドは、ＦＺＤ７  ＣＲＤに対する親和性を増加させるために選択するスキームに供される（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５，６０３７−４２を参照）。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドは、ライブラリスクリーニングからの特定後に更にランダム化される。例えば、ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを得る方法は、（ｅ）更にランダム化された天然に存在しないペプチドを生成するために以前に特定されたペプチド：ＣＲＤから得られた天然に存在しないペプチドの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、または１６超のアミノ酸をランダム化することと、（ｆ）ＦＺＤ７のＣＲＤを、更にランダム化された天然に存在しないペプチドと接触させることと、（ｇ）更にランダム化されたペプチド：ＣＲＤ複合体の形成を検出することと、（ｈ）ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する更にランダム化された天然に存在しないペプチドを複合体から得ることとを更に含む。ある特定の実施形態では、該方法は、（ｉ）ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドの核酸配列を決定することを更に含む。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、またはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及びＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１またはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１及びＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ２またはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ２及びＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１またはＦＺＤ２のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１及びＦＺＤ２のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ１のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ２のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。ある特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合するペプチドを特定する。
【０１４０】
特定の実施形態では、この方法を使用して、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合するペプチドを特定する。
【０１４１】
標的ＣＲＤ（複数可）に対して十分な親和性を有する天然に存在しないペプチドが得られるまで、複数回のランダム化、スクリーニング、及び選択を行うことができる。したがって、ある特定の実施形態では、ステップ（ｅ）〜（ｈ）またはステップ（ｅ）〜（ｉ）が、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを特定するために、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多く繰り返される。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多くのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けたペプチドは、１回のランダム化、スクリーニング、及び選択を受けたペプチドと少なくとも同様に高い親和性でＦＺＤ７のＣＲＤに結合する。ある特定の実施形態では、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多くのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた天然に存在しないペプチドは、１回のランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた天然に存在しないペプチドよりも高い親和性でＦＺＤ７のＣＲＤに結合する。
【０１４３】
本明細書に記載される天然に存在しないペプチドのライブラリは、ＦＺＤ７のＣＲＤ  と結合する、または特異的に結合する、新しいペプチドまたは改善されたペプチドを進化させるために、当該技術分野において既知の任意の技法によってスクリーニングされ得る。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤは、固体支持体（カラム樹脂またはマイクロタイタープレートウェルなど）上に固定化され、ＦＺＤ７のＣＲＤは、候補の天然に存在しないペプチドのライブラリと接触される。選択技法は、例えば、ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１３１５−１３１７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：３７５０−３７５５）、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：２９−３４．）、酵母ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７７）、またはリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２及びＷＯ２００８／０６８６３７）であり得る。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、天然に存在しないペプチドを提示するファージ粒子が提供される。
【０１４５】
ファージディスプレイは、複数の天然に存在しないペプチド変異形が、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質への融合タンパク質として提示される技法である（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−７、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６、Ｓｅｒｇｅｅｖａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異形の大きいライブラリが、標的リガンドに高親和性で結合する配列のために迅速かつ効率的に選別され得るという事実にある。
【０１４６】
ファージ上のペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８）またはタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１、Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３）ライブラリの提示は、特異的結合特性を有するものの数百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｍａｙ  ９５，６０３７−４２）。多価ファージディスプレイ法は、線維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかへの融合によりランダム小ペプチド及び小タンパク質をディスプレイするために使用されている。（Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：３５５−３６２（１９９２）、及びそこで引用される参考文献）。一価ファージディスプレイにおいて、タンパク質またはペプチドライブラリは、遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で、低レベルで発現され、これにより、ファージ粒子が融合タンパク質のコピーを１つディスプレイするか、または１つもディスプレイしないようになる。結合力効果は、選別が内因性リガンド親和性に基づくように多価ファージに対して低減され、ファージミドベクターが使用され、これによりＤＮＡ操作が簡略化される。（Ｌｏｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−０２１６（１９９１）．）
【０１４７】
ＦＺＤ７のＣＲＤに結合する天然に存在しないペプチドの選別ファージライブラリは、多数の変異形の構築及び拡大、標的リガンドを使用する親和性精製のための手順、及び結合富化の結果を評価する手段を包含する（例えば、ＵＳ５２２３４０９、ＵＳ５４０３４８４、ＵＳ５５７１６８９、及びＵＳ５６６３１４３を参照）。
【０１４８】
大部分のファージディスプレイ法は、繊維性ファージ（Ｍ１３ファージなど）を使用する。ラムダ状ファージディスプレイシステム（ＷＯ１９９５／３４６８３、ＵＳ５６２７０２４を参照）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  ２１５：４３９、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８：３２０９−３２１４、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６５：４７７０−４７７７、Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ，１９５：３０３−３１１、Ｒｅｎ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，５：１８３３、Ｅｆｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，１０：１７３）、及びＴ７ファージディスプレイシステム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７：２２８−２５７、ＵＳ５７６６９０５）もまた知られている。
【０１４９】
基本的なファージディスプレイ概念の多くの他の改善及び変形が、現在開発されている。これらの改善は、ディスプレイシステムが、選択された標的リガンドに結合するためのペプチドライブラリをスクリーニングする能力、及び機能的タンパク質を提示する能力を強化し、所望の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性を有する。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発され（ＷＯ１９９８／１４２７７）、二分子相互作用（ＷＯ１９９８／２０１６９、ＷＯ１９９８／２０１５９）及び拘束性らせんペプチド（ＷＯ１９９８／２００３６）を分析し、制御するために、ファージディスプレイライブラリが使用されている。ＷＯ１９９７／３５１９６は、親和性リガンドを単離する方法を説明しており、ここでファージディスプレイライブラリは、第１の溶液（リガンドは、標的リガンドに結合する）及び第２の溶液（親和性リガンドは、標的リガンドに結合しない）と接触され、結合リガンドを選択的に単離する。ＷＯ１９９７／４６２５１は、ランダムファージディスプレイライブラリを親和性精製抗体でバイオパニングし、次いで結合ファージを単離する方法、続いて高親和性結合ファージを単離するためにマイクロプレートウェルを使用するマイクロパニングプロセスを説明している。かかる方法は、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／またはＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、本明細書で開示される天然に存在しないペプチドに適用することができる。親和性タグとしての黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａの使用もまた報告されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：１８７）。ＷＯ１９９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリであり得るコンビナトリアルライブラリを使用して酵素特異性を区別するための、基質サブトラクションライブラリの使用を説明している。特異的結合タンパク質を選択する追加の方法は、ＵＳ５４９８５３８、ＵＳ５４３２０１８、及びＷＯ１９９８／１５８３３に記載されている。ペプチドライブラリを生成しこれらのライブラリをスクリーニングする方法もまた、ＵＳ５７２３２８６、ＵＳ５４３２０１８、ＵＳ５５８０７１７、ＵＳ５４２７９０８、ＵＳ５４９８５３０、ＵＳ５７７０４３４、ＵＳ５７３４０１８、ＵＳ５６９８４２６、ＵＳ５７６３１９２、及びＵＳ５７２３３２３に開示されている。
【０１５０】
ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／またはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する天然に存在しないペプチドを含むリガンドを産生する方法
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、遺伝子操作を介して生成される。変異導入のための様々な方法は（スクリーニングまたは選択の適切な方法と共に）以前に説明されている。このような変異導入法としては、例えば、エラープローンＰＣＲ、ループシャフリング、もしくはオリゴヌクレオチド配向型変異導入、ランダムヌクレオチド挿入、または組み換え前の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法に関する更なる詳細は、例えば、Ａｂｏｕ−Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｕｇｓ  １，３３７−３４０、Ｆｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１，３３１４−３３１５、Ｃｉｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３１，３−９、Ｐｉｒａｋｉｔｉｋｕｌｒ（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １９，２３３６−２３４６、Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｔｅｃｈ  １８，１４７−１４９、及び他に記載されている。したがって、ある特定の実施形態では、遺伝子操作技法を介して生成されたＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドが提供される。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、インビトロ翻訳を介して生成される。簡潔に言えば、インビトロ翻訳は、タンパク質コード配列（複数可）をプロモーターを含有するベクターにクローン化することと、クローン化された配列（複数可）をＲＮＡポリメラーゼで転写することによってｍＲＮＡを産生することと、インビトロでのこのｍＲＮＡの翻訳によって、例えば無細胞抽出物を使用してタンパク質を合成することとを含む。所望の変異形タンパク質は、単にクローン化されたタンパク質コード配列を改変することによって生成され得る。多くのｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物中またはウサギ網状赤血球抽出液中で効率的に翻訳され得る。インビトロ翻訳に関する更なる詳細は、例えば、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４３，１７７−１８８、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６，８８５−８９４、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６，２７８１−２７８４、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，６３５−６４０、及びＭｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，７０５７−７０７０に記載されている。
【０１５２】
したがって、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドをコードする核酸分子が提供される。かかるリガンドをコードする核酸分子に操作可能に結合された発現ベクターもまた提供される。かかるリガンドをコードする核酸分子を含む宿主細胞（例えば、大腸菌などの原核宿主細胞、酵母細胞などの真核宿主細胞、哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞等）もまた提供される。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、インビトロ翻訳を介して生成される。簡潔に言えば、インビトロ翻訳は、タンパク質コード配列（複数可）をプロモーターを含有するベクターにクローン化することと、クローン化された配列（複数可）をＲＮＡポリメラーゼで転写することによってｍＲＮＡを産生することと、インビトロでのこのｍＲＮＡの翻訳によって、例えば無細胞抽出物を使用してタンパク質を合成することとを含む。所望の突然変異体タンパク質は、単にクローン化されたタンパク質コード配列を改変することによって生成され得る。多くのｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物中またはウサギ網状赤血球抽出液中で効率的に翻訳され得る。インビトロ翻訳に関する更なる詳細は、例えば、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４３，１７７−１８８、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６，８８５−８９４、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６，２７８１−２７８４、Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，６３５−６４０、及びＭｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，７０５７−７０７０に記載されている。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、化学合成を介して生成される。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドは、本明細書の別の場所に記載されるように、化学的に合成され、１つ以上の部分にグラフトされる（例えば、共有結合される）。
【０１５５】
固相及び液相ペプチド合成の方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ  Ｅｄｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９４、Ｗｅｌｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １４，１−１５；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８９，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，ａｎｄ  Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ  Ｅｄｓ），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ  Ｅｄｓ），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，（Ｓ．Ｆ．Ｋａｔｅｓ，Ｆ  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ  Ｅｄｓ），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，２０００、Ｐ．Ｓｅｎｅｃｉ，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２０００、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａ．Ｆｅｌｉｘ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ，Ｃ．Ｔｍｉｏｌｏ  Ｅｄｓ），Ｔｈｉｅｍｅ，２００２、Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９８，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｊ．Ｈｏｗｌ  Ｅｄ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５、及びＡｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｓ，Ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ａ．Ｂ．Ｈｕｇｈｓ，Ｅｄ．）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２０１１において詳細に説明されている。
【０１５６】
共有結合的修飾
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの共有結合的修飾もまた企図される。共有結合的修飾の１つの種類は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの標的アミノ酸残基を、リガンドの選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応させることができる有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性剤による誘導体化は、例えば、ＦＺＤ７を精製するための方法において使用するために、リガンドを水不溶性支持体マトリクスまたは表面に架橋するために有用であり、逆もまた同様である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３′−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオン酸塩）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダートなどの薬剤が挙げられる。
【０１５７】
他の修飾としては、グルタミニル及びアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１５８】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの共有結合的修飾の別の種類は、リガンドを、ＵＳ４６４０８３５、ＵＳ４４９６６８９、ＵＳ４３０１１４４、ＵＳ４６７０４１７、ＵＳ４７９１１９２、またはＵＳ４１７９３３７に記載されるように、様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンのうちの１つに結合することを含む。
【０１５９】
「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ］という用語は、カップリング剤の有無にかかわらず、部分を（例えば、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジルジン、オキシラン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、もしくはマレイミド部分と）カップリングまたは活性化する、ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。「ＰＥＧ」という用語は、５００〜１５０，０００Ｄａの分子量のポリエチレングリコール（その類似体を含む）を示すことが意図され、例えば、末端ＯＲ基は、メトキシ基によって置き換えられている（ｍＰＥＧと称される）。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化される。ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンオキシド反復単位の直鎖状水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、典型的に約５００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの範囲である、それらの分子量によって分類される。現在の好ましい実施形態では、用いられるＰＥＧは、５，０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドにカップリングされたＰＥＧは、分岐状または非分岐状のいずれかであり得る。例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９５Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ６：６２−６９）を参照されたい。ＰＥＧは、Ｎｅｋｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．及び他の企業から商業的に入手可能である。かかるＰＥＧとしては、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸塩（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルコハク酸塩（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシレート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、用いられる親水性ポリマー、例えばＰＥＧは、メトキシ基またはエトキシ基などの非反応性基によって一端でキャップされる。その後、ポリマーは、ハロゲン化シアヌル（例えば、塩化、臭化、もしくはフッ化シアヌル）、ジイミダゾ−ル、無水物試薬（例えば、無水ジハロコハク酸、無水ジブロモコハク酸など）、アシルアジド、ｐ−ジアゾイウムベンジルエーテル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエーテル）等、などの好適な活性化剤との反応によって他端で活性化される。次いで、活性化ポリマーを、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと反応させて、ポリマーで誘導体化されるリガンドを産生する。あるいは、ＦＺＤ７のＣＲＤに結合する、もしくは特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンド中の官能基は、ポリマーとの反応のために活性化され得るか、または２つの基は、既知のカップリング方法を使用して、協奏的カップリング反応において接合され得る。ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドが、当業者に既知であり、当業者によって使用される無数の他の反応スキームを使用して、ＰＥＧで誘導体化され得ることは容易に理解されるであろう。
【０１６２】
リポソーム
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドはまた、リポソームとして製剤化され得る。かかるリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載される、当該技術分野において既知の方法によって調製され得る。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１６３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所定の細孔サイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。第２の治療剤がまた、任意にリポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０１６４】
薬学的組成物及び製剤
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンド、及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、組成物はまた、組成物を患者への眼性投与に好適にして、所望の効果または結果を達成するために、緩衝剤、担体、安定剤、保存剤、及び／またはバルク剤を含有してもよい。
【０１６５】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、それらが投与に好適であるように、好適な担体または賦形剤と共に製剤化され得る。本明細書に開示されるリガンドの好適な製剤は、所望の程度の純度を有する本明細書に開示されるリガンドを、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって得られる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエントに対し、用いられる投与量及び濃度で無毒であり、緩衝剤（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、ならびに／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含む。ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及び／もしくはＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドに、またはＦＺＤ７のＣＲＤに特異的結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、もしくはそれからなる）リガンドに適用され得る例示的な抗体製剤は、参照により本明細書に明示的に組み込まれるＷＯ９８／５６４１８に記載されている。皮下投与のために適合された凍結乾燥製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されている。かかる凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤により高タンパク質濃度に再構成されてもよく、この再構成された製剤は、本明細書で治療される哺乳動物に皮下投与され得る。
【０１６６】
本明細書における製剤は、治療されている特定の適応症に対する必要に応じて、１つよりも多くの活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有し得る。例えば、抗新生物剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、または化学療法剤を更に提供することが望ましい場合がある。かかる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせで好適に存在する。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中の量、疾患または障害または治療の種類、及び上で考察される他の要因に左右される。これらは、概して、本明細書に記載されるのと同じ投与量及び投与経路で、またはそれまでに用いられた投与量の約１〜９９％で使用される。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及び名のカプセル）中、またはマクロ乳濁液中に取り込まれ得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１６７】
リポフェクチンまたはリポソームを使用して、本明細書で提供されるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを細胞に送達することができる。
【０１６８】
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル内に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及び名のカプセル）中、またはマクロ乳濁液中に取り込まれ得る。かかる技法は、上記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳに開示される。
【０１６９】
持続放出調製物が調製され得る。持続放出調製物の好適な例としては、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーが、１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、ある特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。ＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）カプセル化されたリガンドが、長期間にわたって体内に残存する場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の損失、及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が講じられ得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると見出されたならば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１７０】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０１７１】
ＦＺＤ７のシステインリッチドメインと結合する、または特異的に結合する、天然に存在しないペプチドを含むリガンドを使用する方法
幹細胞は、多様な器官内での連続的な組織維持に必要である。Ｗｎｔシグナル伝達は、いくつかの器官（例えば、消化管、乳房、皮膚、腎臓、及び卵巣を含む）において幹細胞を調節するとして特定されている。Ｃｌｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４８０１２を参照されたい。幹細胞は、それらが組織内のニッチ環境に位置する場合、自己再生し、自律的に増殖することができ、それ故にがん細胞のいくつかの特徴を既に有している（Ｐｈｅｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １００，２２１−２２７）。結果として、幹細胞は、腸、胃、前立腺、及び肺を含むいくつかの異なるがんの細胞起源として特定されている（Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４６９，３１４−３２２）。Ｗｎｔシグナル伝達は、いくつかの器官内で幹細胞を調節することが示されており、したがって、幹細胞内で調節解除されたＷｎｔシグナル伝達は、これらの器官及び組織内で腫瘍形成を誘導することができる（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ．４５７，６０８−６１１）。Ｆｚｄ７は、最近、Ｌｇｒ５＋腸幹細胞に重要なＷｎｔシグナルを伝達する主な受容体であることが示されている（Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，７５９−７６７）。Ｆｚｄ受容体ターンオーバーを負に調節するＥ３ファミリーリガーゼＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３への機能喪失（ＬＯＦ）突然変異は、ヒト結腸腫瘍検体において一般的に観察される（ＴＣＧＡ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２，４８７，３３０−３３７）。ＲＮＦ４３の不活性化突然変異はまた、膵管腺癌においてＷｎｔ依存性を付与する  （Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０，１２６４９−１２６５４）。Ｒ−スポンジン（ＲＳＰＯ）融合産物は、結腸癌においてＷｎｔシグナル伝達を活性化することが示されている（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）″Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．″Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，６６０−６６４）。加えて、ＵＳＰ６がん原遺伝子は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄを脱ユビキチン化することによってＷｎｔシグナル伝達を促進する（Ｍａｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１３，Ｅ２９４５−２９５４（２０１６）。かかる腫瘍は、Ｗｎｔシグナル伝達に過敏であることが予測される。
【０１７２】
したがって、ある特定の実施形態では、幹細胞増殖を阻害する方法であって、幹細胞を、ＦＺＤ７のＣＲＤドメインに結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと接触させることを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、幹細胞増殖を阻害する方法であって、幹細胞を、ＦＺＤ７のＣＲＤドメインに特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドと接触させることを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、腸幹細胞である。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、対象におけるがん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）を治療する方法であって、有効量の、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを投与することを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、対象におけるがん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）を治療する方法であって、有効量の、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを投与することを含む、方法が提供される。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、がん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）の治療用薬物の製造に使用するための、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドが提供される。ある特定の実施形態では、がん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）の治療用薬物の製造に使用するための、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドが提供される。ある特定の実施形態では、対象におけるがん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）の治療に使用するための、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドが提供される。ある特定の実施形態では、対象におけるがん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）の治療に使用するための、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドが提供される。ある特定の実施形態では、対象におけるがん、例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんの治療に使用するための、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含む、組成物（薬学的組成物など）が提供される。ある特定の実施形態では、対象におけるがん、例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんの治療に使用するための、ＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含む、組成物（薬学的組成物など）が提供される。ある特定の実施形態では、リガンドは、配列番号１３または配列番号９９に記載されるアミノ酸配列を含む天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）。ある特定の実施形態では、治療される対象は、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等）である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。患者は、臨床患者、臨床試験志願者、実験動物等である。ある特定の実施形態では、対象は、がん（例えば、結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがん）を有することが疑われるか、または有する危険性がある。
【０１７５】
投与及び用量
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドの投与は、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下を含む任意の好適な経路によってであり得る。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合するもののＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、例えば、異常なＷｎｔ活性を伴う疾患または障害を治療するために、第２、第３、または第４の薬剤（例えば、抗体新生物剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、もしくは化学療法剤）と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、追加の薬剤に複合される。このような薬剤としては、例えば、化学療法剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、追加の薬剤に複合される。
【０１７６】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、静脈内（例えば、注入ポンプ）、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所、吸入（例えば、スプレーの噴霧）、粘膜（例えば、鼻粘膜を介して）、皮下、経皮、胃腸、関節内、槽内、脳室内、直腸（すなわち、坐薬を介して）、膣（すなわち、ペッサリーを介して）、頭蓋内、尿道内、肝臓内、及び腫瘍内を含むが、これらに限定されない任意の経路を介して個体に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、全身投与される（例えば、静脈内注射によって）。いくつかの実施形態では、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、局所投与される（例えば、動脈内または眼内注射によって）。
【０１７７】
治療される適応症及び当該分野における熟練医師が精通している投薬に関連する因子に応じて、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、毒性及び副作用を最小限に抑えながら、その適応症の治療に有効である投与量で投与される。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲内であり得るが、この例示的な範囲より下または上の用量は、本発明の範囲内である。日用量は、総体重の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、好ましくは総体重の約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、より好ましくは総体重の約１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）、及び更により好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または前述の値のうちのいずれか２つによって定義される範囲）であり得る。上記のように、治療的または予防的有効性は、治療された患者の定期的な評価によってモニタリングされ得る。数日間以上にわたる反復投与の場合、病態に応じて、治療は、疾患症状の所望される抑制が生じるまで反復される。しかしながら、他の投薬量レジメンも有用であり得、本発明の範囲内である。所望の投薬量は、組成物の単一ボーラス投与によって、組成物の複数ボーラス投与によって、または組成物の持続注入投与によって送達され得る。
【０１７８】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含む薬学的組成物は、１日１回、２回、３回、または４回投与され得る。組成物はまた、１日１回よりも低い頻度で、例えば週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、または６ヶ月毎に１回投与され得る。組成物はまた、持続放出製剤中で、例えば一定期間にわたって使用するための組成物を徐々に放出し、組成物がより低い頻度で（例えば、月１回、２〜６ヶ月毎に１回、年１回、または更に単一投与で）投与されるのを可能にする埋め込み物中で投与されてもよい。持続放出デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフィア、マイクロスフィア等）が、注入によって投与されてもよい。
【０１７９】
ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドは、単一日用量で投与され得るか、または一日総用量が、１日２回、３回、もしくは４回の分割投薬量で投与され得る。組成物はまた、１日１回よりも低い頻度で、例えば週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、月１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、または６ヶ月毎に１回投与され得る。組成物はまた、持続放出製剤中で、例えば一定期間にわたって使用するための組成物を徐々に放出し、組成物がより低い頻度で（例えば、月１回、２〜６ヶ月毎に１回、年１回、または更に単一投与で）投与されるのを可能にする埋め込み物中で投与されてもよい。持続放出デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフィア、マイクロスフィア等）が、様々な位置に注入によって投与され得るか、または外科的に移植され得る。
【０１８０】
製品及びキット
ある特定の実施形態では、本明細書におけるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンド及び／または、かかるリガンドを含む薬学的組成物、ならびにがん（結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんなど）の治療に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器、及び容器上または容器に伴ってラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。ある特定の実施形態では、容器は、無菌単位用量パッケージを収容する。ラベルまたは添付文書は、がん（結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんなど）を治療するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを、患者に投与するための説明書を更に含む。本明細書に記載の併用治療薬を含む製品及びキットもまた企図される。
【０１８１】
添付文書とは、かかる治療薬の適応症、使用、投薬量、投与、禁忌及び／またはその使用に関する警告についての情報を含む、治療薬の商業用パッケージに通例含まれる説明書を指す。ある特定の実施形態では、添付文書は、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンド（またはかかるリガンドを含む薬学的組成物）は、がん（結腸癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、ＲＮＦ４３中の突然変異を特徴とするがん、ＵＳＰ６過剰発現を特徴とするがん、またはＲ−スポンジン（ＲＳＰＯ）ファミリーメンバーを伴う遺伝子融合を特徴とするがんなど）を治療するために使用されることを示す。さらに、製品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を更に含み得る。製品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含み得る。
【０１８２】
任意に製品と組み合わせて、様々な目的、例えば患者におけるＦＺＤ７の単離または検出に有用なキットもまた提供される。ＦＺＤ７の単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされたＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含有し得る。ＦＺＤ７の単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされたＦＺＤ７のＣＲＤと特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含有し得る。インビトロでの（例えば、ＥＬＩＳＡまたはブロットでの）ＦＺＤ７の検出及び定量のための、ＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書に記載される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）リガンドを含有するキットが提供される。製品と同様に、キットは、容器、及び容器上、または容器に伴ってラベルまたは添付文書を含む。例えば、容器は、本明細書に記載されるＦＺＤ７のＣＲＤと結合する、または特異的に結合する、本明細書で提供される天然に存在しないペプチドを含む（例えば、それから本質的になる、またはそれからなる）少なくとも１つのリガンドを含む組成物を収容する。例えば、希釈剤及び緩衝液、対照抗体等を含む追加の容器が含まれてもよい。そのラベルまたは添付文書は、その組成物の説明ならびに意図されているインビトロまたは検出用途についての説明を提供してもよい。
【実施例】
【０１８３】
実施例１：材料及び実施例２〜５の方法
試薬、プラスミド、抗体及び組み換えタンパク質
マウスＷｎｔ３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ／ＣＦ）タンパク質を、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃ及びｓＦＲＰタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＢＳ中に１０μＭまで溶解し、ｈＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号５９８８−ＦＺ）、ｍＦＺＤ２  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号１３０７−ＦＣ）、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号５８４７−ＦＺ）、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号１６１７−ＦＺ）、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号６１７８−ＦＺ）、ｍＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号１９８−ＦＺ）、ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号６１２９−ＦＺ）、ｍＦＺＤ９  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号２４４０−ＦＺ）、ｈＦＺＤ１０  ＣＲＤ−Ｆｃ（カタログ番号３４５９−ＦＺ）、ｈｓＦＲＰ１（カタログ番号５３９６−ＳＦ）、ｈｓＦＲＰ２（カタログ番号６８３８−ＦＲ）、ｈｓＦＲＰ−３（カタログ番号１９２−ＳＦ）、ｈｓＦＲＰ−４（カタログ番号１８２７−ＳＦ）及びｈｓＦＲＰ−５（カタログ番号６２６６−ＳＦ）を含む。ビオチニル化Ｗｎｔ３ａ（Ｂｉｏ−Ｗｎｔ３ａ）及びＷｎｔ５ａ（Ｂｉｏ−Ｗｎｔ５ａ）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓによって生成された（現在はカタログアイテムではない）。要するに、Ｗｎｔ３ａまたはＷｎｔ５ａを、０．５％  ＣＨＡＰＳを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）に透析し、製造者の推奨に従いビオチニル化した（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２１３３８）。ｐｃＤＮＡ３．２Ｗｎｔ１及びＷｎｔ３ａ構築体は、Ｏｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｗｎｔプロジェクトから得た（Ｎａｊｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８４，２０３−２１３）。抗Ｌｒｐ６及び抗ブタクサ抗体は、以前に記載されているように生成した（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １１、３３−４２）。ペプチドは、標準Ｆｍｏｃ化学によって合成した。他の試薬は、ビオチニル化ペルオキシダーゼ（カタログ番号４３２０４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（カタログ番号Ａ１８８１７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ２６５０、Ｓｉｇｍａ）及びＦｕＧＥＮＥ−ＨＤ（カタログ番号Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んでいた。
【０１８４】
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓは、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅで処置したＥｎｄｏＨを発現するＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞中の分泌タンパク質として発現され、次いで別の場所に記載されているように、標準Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された（Ｂｏｕｒｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，９１７２−９１７９）。親和性ビーズを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。単量体のサイズに対応する主要ピークを、同じ緩衝液中０．５ｍＬ／分でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを使用して、複数回のサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。Ｆｚ７−２１に融合されたｈＦＺＤ７  ＣＲＤは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞中の分泌タンパク質として発現され、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって精製された。ビーズを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。主要二量体ピークを、同じ緩衝液中７ｍＬ／分でＳＲＴ−１０  ２１．２×３００ｍｍ  ＳＥＣ３００カラムを使用して、複数回のサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＦＺＤ３及びＦＺＤ６に対する複数の構築体設計を、分泌タンパク質としてのＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉまたはＳＦ９昆虫細胞において試験し、それらの発現を、還元条件または非還元条件のいずれかでＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングした。いずれの試験した条件も、下流分析に十分な品質のタンパク質を提供しなかった。
【０１８５】
以下のＵｎｉｐｒｏｔ  ＩＤを使用して、配列アラインメントを行った：ＦＺＤ１：Ｑ９ＵＰ３８、ＦＺＤ２：Ｑ１４３３２、ＦＺＤ３：Ｑ９ＮＰＧ１、ＦＺＤ４：Ｑ９ＵＬＶ１、ＦＺＤ５：Ｑ１３４６７、ＦＺＤ６：Ｏ６０３５３、ＦＺＤ７：Ｏ７５０８４、ＦＺＤ８：Ｑ９Ｈ４６１、ＦＺＤ９：Ｏ００１４４、ＦＺＤ１０：Ｑ９ＵＬＷ２、ｈｓＦＲＰ１：Ｑ８Ｎ４７４、ｈｓＦＲＰ２：Ｑ９６ＨＦ１、ｈｓＦＲＰ３：Ｑ９２７６５、ｈｓＦＲＰ４：Ｑ６ＦＨＪ７、及びｈｓＦＲＰ５：Ｑ５Ｔ４Ｆ７。
【０１８６】
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃに対するファージ選別
直鎖状ペプチドライブラリのファージプール（Ｓｔａｎｇｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｉｎｄ  ａ  ｃａｓｐａｓｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８，６５５−６６０（２０１２））を、標準プロトコルに従い、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃにより複数回の結合選別を通して環化した（Ｔｏｎｉｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２，１３６８−１３８６）。ハーセプチン（１０μＭ）を選別溶液に含めて、全ての選別中に潜在的Ｆｃ結合剤を遮断した。４回の結合選別後、個々のファージクローンを、特異性試験の標的または非標的としてプレート固定化ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃを使用し、高スループットスポットファージＥＬＩＳＡにおいて分析した（ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃ及びハーセプチン）。非標的親和性を測定するために、二重ファージ粒子をＢＳＡに対してアッセイし、非特異性結合を測定した。０．５超のファージ結合シグナル及び１０超のシグナル対ノイズ比を有するクローンは、陽性クローンであるとみなされ、ＤＮＡ配列分析に供された。一般データ処理は、別途記載がない限り、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を使用して行った。
【０１８７】
ペプチド合成
全てのペプチドは、別の場所に記載されているように、標準９−フルオレニルメトキシカルボニルプロトコルを使用して合成し（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５，２１７−２１９）、Ｎ末端はアセトアミドとして保護し、Ｃ末端は、カルボキシアミドとして保護して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ペプチド品質（９０％超純度）をＬＣ−ＭＳによってチェックし、ペプチド識別をＭＳによって確認した。
【０１８８】
細胞培養及びトランスフェクション
ホタルルシフェラーゼＷｎｔレポーター（ＴＯＰｂｒｉｔｅ、ＴＢ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５，２１７−２１９）及びｐＲＬ−ＳＶ４０  Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（カタログ番号Ｅ２２３１、Ｐｒｏｍｅｇａ）と安定して統合されたＨＥＫ２９３を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０６１、Ｇｉｂｃｏ）及び４０μｇ／ｍＬヒグロマイシン（カタログ番号３０−２４０−ＣＲ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（５０：５０）中で成長させた。細胞を、いかなる実験の前にも、５％  ＣＯ２加湿インキュベータ中、３７℃で２４時間インキュベートした。ルシフェラーゼレポーターアッセイのために、５０μＬのＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞（２０，０００細胞／ウェル）を、透明底の白色ポリスチレン９６ウェルプレートの各ウェルに播種した（カタログ番号３５３３７７、Ｆａｌｃｏｎ）。２４時間後、細胞を、示されたＷｎｔ構築体及びＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（カタログ番号Ｅ２３１２；Ｐｒｏｍｅｇａ；ｃＤＮＡ及びＦｕｇｅｎｅは、１０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ［カタログ番号３１９８５−０７０；Ｇｉｂｃｏ］中で混合した）で２４時間トランスフェクトし、次いで示されたペプチドで６時間処理し、５０μＬのＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（カタログ番号Ｅ２９４０；Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。ペプチドでの処理のために、全てのペプチドをＤＭＳＯ中に希釈し、１％の最終ＤＭＳＯ濃度で細胞に添加した。組み換えＷｎｔタンパク質での処理のために、全てのＷｎｔをＰＢＳ中に希釈し、同時にペプチドと共に細胞に添加した後、上記のように処理した。ホタル及びウミシイタケ発光を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）マルチラベルリーダー上で測定した。ホタル発光とウミシイタケ発光との比を計算し、バックグラウンド除去し、Ｗｎｔ３ａのみ（５０ｎｇ／ｍＬ）で処理した対照細胞中の比に正規化した。細胞株をＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  ｇＣｅｌｌラボラトリーから入手し、マイコプラズマ汚染について試験し、ＳＮＰ分析によって認証された。
【０１８９】
ＦＡＣＳ分析
ｇＤ−ＦＺＤを安定して発現する細胞株を、１０％  ＦＢＳ（カタログ番号１５００−１００；Ｓｅｒａｄｉｇｍ）、１Ｘ  ＧｌｕｔＭＡＸ（カタログ番号３５０５０−０６１；Ｇｉｂｃｏ）、及びＧ４１８（２００μｇ／ｍＬ；カタログ番号Ａ１７２０；Ｓｉｇｍａ）で補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（５０：５０）培地中で約８０％コンフルエンスまで成長させ、ＰＢＳ（カタログ番号１５４００−０５４；Ｇｉｂｃｏ）中０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで遊離させ、氷上で収集し、緩衝液を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．５％  ＢＳＡ及び０．０５％  ＮａＡｚ）に交換した。１００，０００細胞／ウェルを、氷冷Ｕ底プレート（カタログ番号３７９９；Ｃｏｓｔａｒ）にプレートに播き、細胞を１２００ｒｐｍで３分間、遠心分離によってペレット化した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中のマウス抗ｇＤ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ｇＤ：９５２；５００ｎｇ／ｍＬ）で補充された５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１（１２．５μＭ）またはＤＭＳＯ（カタログ番号Ｄ２６５０；Ｓｉｇｍａ）で１時間、暗所、氷上で処理した。５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓで処理した細胞は、著しい非特異的結合を呈し、分析から除外された。細胞を、氷上の氷冷ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％  ＢＳＡ及び０．１％  ＮａＡｚ）で３回洗浄した。次いで細胞を、Ａｌｅｘａ  ６４７複合ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（５００ｎｇ／ｍＬ；カタログ番号Ａ−３１５７１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、暗所で１時間、氷上で処理した。細胞を、氷上の氷冷ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで１５分間、ＳＹＴＯＸ（カタログ番号Ｓ３４８５７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートした後、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ器具上で分析した。データをＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ；バージョン８．０．１）で収集し、ＦＬｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ；ｖ１０．１）を使用して分析した。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡ
３８４−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（カタログ番号４６４７１８；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、３０μＬのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（カタログ番号３１０００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ）で一晩、４℃でインキュベートした。次いでプレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで１時間、室温で遮断した後、更なる処理前にＰＢＳＴで洗浄した。結合アッセイを、ＰＢＳ／１％  ＢＳＡで、一晩４℃で遮断された９６ウェルプレート（カタログ番号８３００７−３７４；ＶＷＲ）で行った。ｈＦＺＤ４  ＣＲＤ−ＦｃまたはｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ（６３ｎｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳ中の示されたペプチドの４倍段階希釈の存在下、Ｂｉｏ−Ｗｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍＬ）またはＢｉｏ−Ｗｎｔ５ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかで一晩４℃でインキュベートした。全てのアッセイは、陰性対照としてｈＦＺＤ９  ＣＲＤ−ｍｌｇＧ２Ａタンパク質を含んでいた。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中にｐＨ７．５で懸濁し、アッセイで使用されるとき、等量の同じ緩衝液対照を使用した。結合アッセイ混合物を、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングしたプレートに移し、室温で約１時間インキュベートした。次いでウェルを、ＰＢＳＴで洗浄し、抗ｈＩｇＧ１−ＨＲＰでインキュベートし（１％  ＢＳＡで補充したＰＢＳ中に懸濁された１：１０，０００、カタログ番号Ａ１８８１７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＢＳＴで再度洗浄した。等量の１Ｍリン酸を１０分間添加する前に、１５分間ＴＭＢ試薬を添加して（製造業者の推奨に従い、ＫＰＬ、５０−７６−００）シグナルを発生させた。Ｔｅｋａｎ  Ｍ１０００プレートリーダーを使用し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。値を収集し、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してプロットした。ペプチドを使用する全てのアッセイ条件は、１％  ＤＭＳＯの最終濃度であった。
【０１９１】
蛍光サイズ排除クロマトグラフィー
蛍光サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）実験を、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアパッケージ（バージョン５．３１）と共にＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して実行した。リン酸緩衝液中０．５ｍＬ／分でＳＥＣ３０００またはＳＥＣ２０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）カラムを使用して、試料を分離した。ＦＰ−２０２０  Ｐｌｕｓ蛍光検出器（Ｊａｓｃｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）を通常モード（励起／放出、５５０／４９４ｎｍ；利得＝１００；ＳＴＤ＝３２）で使用して、蛍光をモニタリングした。１％の最終ＤＭＳＯ濃度で全ての試料を調製し、試料分離前に４℃で一晩インキュベートした。ＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃ試料を、過剰５ＦＡＭ標識ペプチド（１μＭ）の存在下、約２５０ｎＭで保持した。ヒト分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質を、過剰５ＦＡＭ標識ペプチド（１０μＭ）の存在下、約２５０ｎＭで維持した。
【０１９２】
多角度光散乱と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（１５．８μＭ）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析及び多角度静的光散乱（ＭＡＬＳ）による検出前に、タンパク質対ペプチドの示された比で２時間、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、またはＤＭＳＯとともにインキュベートした。試料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ３．２／３００カラム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ；カタログ番号２８９９０９４６）により、０．１５ｍＬ／分で１％  ＤＭＳＯ最終濃度の１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中に溶解した。Ｄａｗｎ  Ｈｅｌｅｏｓ−ＩＩ多角度静的光散乱（ＭＡＬＳ）検出器及びＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ示差屈折率（ｄＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に接続された１２６０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で実行を行った。
【０１９３】
Ｘ線結晶学
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓを精製し、緩衝液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に交換した後、遠心分離によって約２５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（カタログ番号ＵＦＣ９００３２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５）。タンパク質を、ＭＥＳ  ｐＨ６．５（カタログ番号１３４３１２；Ｑｉａｇｅｎ）と共に２５％  ＰＥＧ２０００  ＭＭＥ（ｗ／ｖ）で希釈し、蒸気拡散によって１９℃で成長させた。十分な品質の結晶が１０日以内に成長し、３０％  ＰＥＧ２０００  ＭＭＥで補充された母液中で低温保護し、液体窒素中で急速冷凍した。データセットを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）１２−２において収集し、２．００Å分離度での分子置換によって解析した。（Ｎｉｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）″Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．″Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１４，４１４７−４１５２  ＬＩＤ  −４１１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８２９３１１４［ｄｏｉ］）。Ｆｚ７−２１に融合されたｈＦＺＤ７  ＣＲＤ［Ｇｌｎ３３−Ｇｌｙ１６８］は、ＥｎｄｏＨを発現するＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞中の分泌タンパク質として発現され、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅで処理した。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤを、分泌タンパク質としてｐＡＣＧＰ６７−Ａベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に挿入した。Ｆｚ７−２１に融合されたｈＦＺＤ７  ＣＲＤを、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上を通過させ（Ｑｉａｇｅｎ；１０１８４０１）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ＨＣｌ  ｐＨ７．５で洗浄した後、３００ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液で溶出した。溶出液を収集し、濃縮して、緩衝液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５に交換し、二量体プールを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中のゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって収集した。二量体断片を遠心分離によって約２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、タンパク質を１−プロパノール１４％（ｖ／ｖ；カタログ番号０９１５８；Ｆｌｕｋａ）、９％  ＰＥＧ５０００  ＭＭＥ（カタログ番号ＨＲ−２−６１５；Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、及びｐＨ６．９の０．１Ｍ  ＭＥＳ（カタログ番号ＨＲ２−２４３；Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で１：１混合まで希釈し、蒸気拡散によって４℃で成長させた。Ｘ線回折データを、画素アレイ検出器（Ｐｉｌａｔｕｓ，Ｄｅｃｔｒｉｓ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ビームライン１７ＩＤで収集した。Ｘ線波長は、１．０００００Åに設定した。
【０１９４】
極低温度（−１８０℃）下で単結晶を用いて、完全なデータセットを収集した。回折データは、プログラムＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｓｃａｌｉｎｇ，ｓｐａｃｅ−ｇｒｏｕｐ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，１３３−１４４（２０１０））を使用して統合し、ＣＣＰ４パッケージの無目的プログラム（Ｂｌｅｓｓｉｎｇ，Ｒ．Ｈ．Ａｎ  ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ａ  ５１（Ｐｔ  １），３３−３８（１９９５））（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｖａｇｉｎ，Ａ．Ａ．＆Ｄｏｄｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５３，２４０−２５５（１９９７））を使用してスケーリングした。（構造は、プログラムＰｈａｓｅｒを使用し（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ４０，６５８−６７４（２００７））、分子置換（ＭＲ）によって相分析した。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ構造を、ＭＲサーチモデル（ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＵＲＶ）として使用した（Ｎｉｌｅ，Ａ．Ｈ．，Ｍｕｋｕｎｄ，Ｓ．，Ｓｔａｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．＆Ｈａｎｎｏｕｓｈ，Ｒ．Ｎ．Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１４，４１４７−４１５２  ＬＩＤ  −４１１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８２９３１１４［ｄｏｉ］（２０１７））。この構造は、後にグラフィックプログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．＆Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，４８６−５０１（２０１０））及びプログラムＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ＰＨＥＮＩＸ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  ６６，２１３−２２１（２０１０））においてコードされた最大尤度最小二乗精製プロトコルを用いた反復モデル構成に供された。最終構造を２．８８Å分離度まで精密化し、残基の８８．３％がラマチャンドランプロットの好ましい領域内、１１．１％が許容される領域内、０．３％が一般に許容される領域内、０．２％が許容されない領域内に含まれた。ランダム���子密度は、ＦＺＤ７  ＣＲＤ疎水性空洞内で観察されたが、確信的な割り当てを行うことはできなかった。より詳細な回折データ処理及び構造精密化統計は、表１０にみることができる。Ｘ線回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ビームラインで収集した。Ｆｚ７−２１と複合したＦＺＤ７  ＣＲＤの構造は、コード５ＷＢＳでＰＤＢデータベースに寄託した。
【０１９５】
構造分析
ＦＺＤ分子の保存を計算し、表示するために、ヒト（ｈ）ＦＺＤ８の表面を代理として使用して、１０  ｈＦＺＤ  ＣＲＤ間の保存を提示した（ｈＦＺＤ１〜ｈＦＺＤ１０
、青緑色：低保存、栗色、高保存）。ｈＦＺＤ  ＣＲＤ配列をＵｎｉｐｒｏｔから取得し、ＵＧＥＮＥ４６（ｖ１．１４．１）で集約し（Ｏｋｏｎｅｃｈｎｉｋｏｖ，Ｋ．，Ｇｏｌｏｓｏｖａ，Ｏ．，Ｆｕｒｓｏｖ，Ｍ．＆ｔｅａｍ，ｔ．Ｕ．Ｕｎｉｐｒｏ  ＵＧＥＮＥ：ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｔｏｏｌｋｉｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８，１１６６−１１６７（２０１２）、及びＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ３３を用いて整列させた。ＣＲＤ境界の基準として絶対的に保存されたシステイン残基に多く依存するガイドとしてｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（Ｙ３５〜Ｄ１６７）を使用する反復アラインメントに従い、配列をトリミングした。アラインメントファイルをＵＣＳＦキメラ（ｖ１．１０．２）にエクスポートし（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａ−ａ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  ２５，１６０５−１６１２（２００４））、ＡＬ２ＣＯアルゴリズムを使用し（Ｐｅｉ，Ｊ．＆Ｇｒｉｓｈｉｎ，Ｎ．Ｖ．ＡＬ２ＣＯ：ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７，７００−７１２（２００１））、独立したカウントによる頻度推定を使用して計算し、エントロピーに基づくアプローチ及び０．５のギャップ比率を有する平均ウィンドウ１によって保存を測定した。ＡＬ２ＣＯから計算された保存値は、平均からの標準偏差を表し、色勾配にわたって＋１．６７８（最大保存：栗色）〜−１．５３９（最小保存：青緑色）の範囲であり、この諧調は、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ＃４Ｆ０Ａ）中の分子表面として表示された。
【０１９６】
ｄＦｚ７−２１間の分子間相互作用を計算するために、ＵＣＳＦキメラ４７内の検索クラッシュ／接触ユーティリティを使用して、ＶＤＷ半径の総和−２つの原子間の距離−潜在的に水素結合された対の許容範囲［ｏｖｅｒｌａｐｉｊ＝ｒＶＤＷｉ＋ｒＶＤＷｊ−ｄｉｊ−ａｌｌｏｗａｎｃｅｉｊ］として定義された２つの原子間のオーバーラップを特定した。この計算は、極性及び非極性の好ましい及び好ましくない（クラッシュを含む）全ての直接相互作用を特定し、ＶＤＷオーバーラップは−０．４Å超であり、潜在的水素結合対について控除されたオーバーラップはない。単離されたｄＦｚ７−２１分子（鎖Ａ及び鎖Ｂ）の溶媒露出表面（ＳＡＳ）分子表面は、ＵＣＳＦキメラパッケージ内のＭＳＭＳパッケージ（Ｓａｎｎｅｒ，Ｍ．Ｆ．，Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．＆Ｓｐｅｈｎｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｗａｙ  ｔｏ  ｃｏｍｐｕｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３８，３０５−３２０（１９９６））（プローブ半径１．４Å）を使用して計算した。
【０１９７】
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ疎水性空洞表現
Ｆｚ７−２１と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ内の疎水性空洞を視覚化するために、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ＃Ｆ４０Ａ）と複合した２つのＸＷｎｔ８分子を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズム及びＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを用い、ＵＣＳＦキメラにおけるＭａｔｃｈＭａｋｅｒユーティリティを使用してｈＦＺＤ７  ＣＲＤ構造の上に重畳した。連続疎水性表面を、約５Åの脂肪アシル部分内で特定した。Ｆ４０ＡとのアポｈＦＺＤ７  ＣＲＤの重畳において、脂肪酸をそれらのω炭素から切断して、疎水性空洞内の脂肪酸間のクラッシュを排除し、次いで上記のように疎水性空洞検索を行い、約５Åの脂肪アシル基内の疎水性表面を特定した。
【０１９８】
インシリコ分析
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＵ形疎水性空洞内で結合する伸長した脂肪アシル部分（Ｃ１６：ｎ−７）を有するｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＵＲＶ）と複合したＸＷｎｔ８ａ（ＰＤＢ  ＩＤ＃４Ｆ０Ａ）の図３９Ａ及び３９Ｂに提示されたモデルは、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，バージョン２０１７．０５）において構築した。ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ＃４Ｆ０Ａ）をガイドとして使用して、Ｃ２４に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ構造（ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＵＲＶ）の上にＸＷｎｔ８を重畳した。プロトン化３Ｄ及び構造調製ユーティリティを、デフォルト設定を使用して適用して、水素置換を最適化した。ＸＷｎｔ８  Ｓｅｒ１８７において共有結合されたＣ１４脂肪酸を切り取り、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ疎水性空洞内のＣ２４脂肪酸の輪郭に沿って伸長させた。次いで、近位の脂肪酸及び残基を、剛性水及び０．１ＲＭＳｋｃａｌ／ｍｏｌ／Ａ２勾配を有するＭＭＦＦ９４ｘ力場（ｅｐｓ＝ｒ、カットオフ［８，１０］）を使用して、エネルギー最小化した。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤの疎水性空洞内で結合する伸長した脂肪アシル部分（Ｃ１６：ｎ−７）を有するＦｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤと複合したＸＷｎｔ８ａ（ＰＤＢ  ＩＤ＃４Ｆ０Ａ）の図３９Ｃ及び３９Ｄに見出されるモデルは、上記のように、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，バージョン２０１７．０５）において構築した。各構造表示について、それぞれのリガンドを使用して疎水性空洞を定義した。連続疎水性表面を、約５Åの結合したリガンド内で特定し、空洞の疎水性に従って視覚化した。アミノ酸疎水性による分子表面を、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスコアリングメトリックに基づいてスケーリングする（Ｋｙｔｅ，Ｊ．＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５７，１０５−１３２（１９８２））。図生成のために、座標をＵＣＳＦキメラ（バージョン１．１１）にエクスポートした。
【０１９９】
ＮＭＲ分光法
全てのＮＭＲ実験は、クライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄプラス６００ＭＨｚ分光計上で行った。溶液中のＮＭＲ構造の決定のために、ペプチドを１ｍＭで、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）及び１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル−ｄ３（ＩＳＯＴＥＣ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｔ８２−０５０１３−ＭＬ）（Ｈ２Ｏ中）に再懸濁した。ペプチドの全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）及び核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）を、２７℃でそれぞれ７０ｍｓ及び３５０ｍｓの混合時間で記録した。Ｔｏｐｓｐｉｎ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ）及びＣＣＰＮ分析を、スペクトル処理、視覚化、及びピークピッキングに使用した（Ｖｒａｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５９，６８７−６９６）。等核ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹスペクトルに基づいて、ペプチドの残基を割り当てた。スピンシステム特定及び逐次帰属に基づいて、プロトンのほぼ完全な共鳴帰属を得た（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６）。プロトン間の距離拘束は、ＮＯＥＳＹスペクトルから得た。ｄＦｚ７−２１の３次元構造を、ＣＹＡＮＡ  ３．９７パッケージを使用して最初に計算した（Ｇｕｎｔｅｒｔ＆Ｂｕｃｈｎｅｒ（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ６２，４５３−４７１；Ｇｕｎｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３，２８３−２９８）。単一の共鳴の組のみが観察されたため、ｄＦｚ７−２１は、重複配列及び対称距離拘束を用いて、ＣＹＡＮＡ計算において対称二量体として扱った。表１６を参照されたい。
【０２００】
次いで、構造をＣＮＳで精密化した（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ＆ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｎｅｗ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ５４，９０５−９２１（１９９８）、Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２，２７２８−２７３３（２００７））。合計５０構造を生成し、最低エネルギーを有する２０構造を選別した。Ｐｒｏｃｈｅｃｋによる順序残基（残基６〜１４）のラマチャンドラン分析は、６３．１％の残基が最も好ましい領域内にあり、２７．２％の残基が、追加として許容される領域内にあり、９．７％の残基が、寛大に許容される領域内にあり、０％の残基が許容されない領域内にある。目的のペプチドは、同位体標識されていないため、骨格核の帰属は得られなかった（Ｃａ、Ｃｂ、Ｈａ、ＣＯ）。骨格帰属がなく、二面角拘束は、構造計算に含まれなかった。構造計算に使用された化学シフト帰属及びＮＯＥ拘束は、コード３０３１１でＢＭＲＢに寄託された。構造は、コード５Ｗ９６でＰＤＢデータベースに寄託された。
【０２０１】
オルガノイド培養
マウスオルガノイドを、小腸の全長から収集された単離陰窩から確立し、以前に記載されたように維持した（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−２６５（２００９）。全てのマウス由来組織は、カリフォルニア州法及び倫理綱領に準拠する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅグループのメンバー、及びＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（動物実験委員会）の動物使用ガイドラインに従って収集を行った。マウスの性別は選別しなかった。オルガノイドを、少なくとも週２回継代し、ＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ成長培地（カタログ番号０６００５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して成長させた。ペプチドをＤＭＳＯ中に懸濁し、培地中に１％  ＤＭＳＯ最終濃度まで溶解した後、オルガノイドに添加して、薬物処理を開始した。抗体を１０μｇ／ｍＬ濃度まで添加した。オルガノイドは、Ａｎｄｏｒ  Ｎｅｏカメラ（１×１ビニング、２００ｍｓ露光）を使用し、Ｎｉｋｏｎ  Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ  １０Ｘ  Ｐｈ１  ＤＬＬ対物レンズを有するＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉスコープを用いて撮像し、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（ｖ４．５０  ６４ビット、Ｎｉｋｏｎ）を使用して取得した。ＡＰＣｍｉｎオルガノイドは、以前に記載されたように生成した（Ｍｅｌｏ，Ｆ．ｄ．Ｓ．ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｌｇｒ５＋  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４３，６７６−６８０（２０１７））。ＣＨＩＲ９９０２１（５μＭ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理されたオルガノイドについて、オルガノイドを分裂させ、ＤＭＳＯまたはＣＨＩＲ９９０２１（５μＭ）で２４時間、ペプチドまたはＤＭＳＯの添加前に２４時間処理した。
【０２０２】
補足図２２に見出される共焦点像について、ＬＥＩＣＡ  ＳＰ５レーザー走査共焦点顕微鏡を使用し、青色（ＤＡＰＩ）及び緑色（ＧＦＰ）チャネル内で４０倍油浸レンズ（ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ  ＣＳ  ＵＶ，１．２５ＮＡ）を用いて画像を収集した。全ての画像は、同一条件下、逐次モードで以下のように取得した：シーケンス１（青色チャネル）：ＵＶレーザー（４０５ｎｍ）：８５％励起力、ＰＭＴ設定：４２５〜４７０ｎｍ放射、活性利得：９００、オフセット：−１５；シーケンス２（緑色チャネル）：アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、２０％出力、５５％励起力、ＰＭＴ設定：５００〜５５０ｎｍ放射、活性利得７００、オフセット：−５。２０４８×２０４８画素解像度（１．５倍ズーム）の画像を、１  Ａｉｒｙユニットピンホールにより４００Ｈｚの一方向走査速度で収集した。１０〜２０光切片のスタック（０．９６８マイクロメートル厚）を収集し、最大強度投影の画像を図面に使用した。
【０２０３】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
オルガノイド試料からのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（カタログ番号７４００４；Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造者の指示に従って単離した。マウス小腸ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（カタログ番号７４１０４；Ｑｉａｇｅｎ）を使用して収集した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、５０ｎｇの総ＲＮＡを含む１０μＬ反応液中で、ワンステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（カタログ番号４３９２９３８；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造者の指示に従って行った。Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＴａｑｍａｎプローブを使用した：Ａｃｔｂ（Ｍｍ０１２０５６４７＿ｇ１）、Ｌｇｒ５（Ｍｍ０１２５１８０１＿ｍ１）、Ａｘｉｎ２（Ｍｍ００４４３６１０＿ｍ１）、Ａｓｃｌ２（Ｍｍ０１２６８８９１＿ｇ１）、Ｏｌｆｍ４（Ｍｍ０１３２０２６０＿ｍ１）、Ｍｕｃ２（Ｍｍ０１２７６６９６＿ｍ１）、ＡＣＴＢ（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）、ＡＣＴＢ（Ｍｍ００６０７９３９＿ｓ１）、ＧＡＰＤＨ（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）、及びＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、７９００ＨＴ  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）を使用して、以下の熱循環条件で実行した：４８℃で３０分の保持ステップ、続いて９５℃で１０分の保持ステップ、ならびに９５℃で１０秒及び６０℃で１分の４０サイクル。値をアクチン転写レベルに対して正規化し、次いで図面の凡例に記載されているように、対照に対して正規化した。
【０２０４】
ＲＮＡシーケンシング
ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリは、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ）を使用して調製した。ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００シーケンサー上でシーケンシングして、１試料当たり平均３４００万のシングルエンドリード（５０ｂｐ）を得た。ＲＮＡｓｅｑリードを最初に、リボソームＲＮＡ配列に対して整列させて、リボソームリードを除去した。残りのリードは、ＧＳＮＡＰ（バージョン２０１３−１０−１０）を使用してマウス参照ゲノム（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３８）に対して整列させ（Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．＆Ｎａｃｕ，Ｓ．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ＳＮＰ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，８７３−８８１（２０１０））、５０塩基配列当たり最大２つのミスマッチを許容する（パラメータ：‘−Ｍ２−ｎ１０−Ｂ２−ｉ１−Ｎ１−ｗ２０００００−Ｅ１−−ｐａｉｒｍａｘ−ｒｎａ＝２０００００−−クリップ−オーバーラップ’）。転写注釈は、ＲｅｆＳｅｑデータベースに基づいた（ＮＣＢＩ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０４）。遺伝子発現レベルを定量するために、各ＲｅｆＳｅｑ遺伝子のエクソンにマップされたリードの数を計算した。リードカウントは、ライブラリサイズ、正規化された分位数、及び“ｖｏｏｍ”Ｒパッケージを使用して計算された精密重量によってスケーリングした（Ｌａｗ，Ｃ．Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｓｈｉ，Ｗ．＆Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．ｖｏｏｍ：ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｗｅｉｇｈｔｓ  ｕｎｌｏｃｋ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，Ｒ２９（２０１４））。後に、正規化されたカウントデータでの示差発現分析を、ｄＦｚ７−２１で処理した試料をＤＭＳＯまたはＦｚ７−２１のいずれかで処理した試料と、それぞれ６時間及び２４時間で対比させることにより、“ｌｉｍｍａ”Ｒパッケージを使用して行った（Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ｌｉｍｍａ  ｐｏｗｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４３，ｅ４７−ｅ４７（２０１５））。更に、遺伝子発現は、以前に記載されているように、１００万総リード当たりの正規化されたＲｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ遺伝子モデル（ｎＲＰＫＭ）の形態で得られた（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ′ｓ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７，１１２９５（２０１６））。収集されたＲＮＡｓｅｑデータは、ＮＣＢＩの遺伝子発現オムニバスを通して受託番号ＧＳＥ９４１５９で入手可能である。
【０２０５】
遺伝子セット分析
遺伝子発現についての定量的セット分析（ＱｕＳＡＧＥ）を行い（Ｙａａｒｉ，Ｇ．，Ｂｏｌｅｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｔｈａｋａｒ，Ｊ．＆Ｋｌｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ−ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１，ｅ１７０−ｅ１７０（２０１３））、Ｗｎｔ阻害と関連した関連生物学的プロセスを特定した。その目的で、ｄＦｚ７−２１で処理した試料を、６時間または２４時間のいずれかにおいて、ＤＭＳＯ試料と対比させた。各対比について、選別されたセットの遺伝子セット活性（すなわち、そのセットを構成する個々の遺伝子のｌｏｇ２発現の平均差）を、腸内生物学に関連するＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｌｇｒ５＋  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６，２０５３−２０６０（２０１６）において定義されるように計算した。
【０２０６】
動物試験
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（８週齢）は、示されたペプチド用量に到達するまで、１時間当たり１回（５回の注入で約１５０〜２００μＬの注入量）腹腔内注入を受けた。対照抗Ｌｒｐ６または抗Ｒａｇｗｅｅｄ抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）の両方を実験開始時に腹腔内投与し、６時間後に小腸を採取した。ｄＦｚ７−２１ペプチドを、９０．９ｍＭの重炭酸アンモニウム、１８．２ｍＭの酢酸ヒスチジン、２１８．２ｍＭのスクロース、及び０．０１８％のポリソルベート−２０、ならびにｐＨ７．５〜８中に２０ｍｇ／ｍＬ（１６０ｍｇ／ｋｇ注入の場合）または１０ｍｇ／ｍＬ（８０ｍｇ／ｋｇ注入の場合）まで懸濁した。抗体を、２０ｍＭの酢酸ヒスチジン、２４０ｍＭのスクロース、０．０２％のポリソルベート−２０、ｐＨ５．５中に再懸濁した。６時間後、マウスを犠牲死させ、ｍＲＮＡ抽出のために小腸を採取した。動物を伴う全ての研究は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの動物実験委員会により承認され、実験動物のケア及び使用についてのＮＲＣガイドラインに従った。
【０２０７】
実施例２：ＦＺＤ７  ＣＲＤと選択的に結合するペプチドの特定
ＦＺＤ７は、複数の組織特異的幹細胞において上方調節されるため、広範な幹細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている（Ｖｉｎｃａｎ＆Ｂａｒｋｅｒ（２００８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２５，６５７−６６３、Ｐｈｅｓｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒｓ  ８）。１０哺乳動物Ｆｒｉｚｚｌｅｄの中で、ＦＺＤ１、２、及び７（ＦＺＤ７サブクラスに属する）は、哺乳動物成体腸陰窩の基部で富化され、そこでは多能性幹細胞が存在することが知られている（Ｍａｒｉａｄａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８，１０８１−１０８８、Ｇｒｅｇｏｒｉｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２９，６２６−６３８）。最近では、ＦＺＤ７が、Ｌｇｒ５＋腸幹細胞（ＩＳＣ）内で富化され、ガンマ線照射後の腸上皮の幹細胞媒介型再生に必要であることが示され、腸幹細胞内のＷｎｔ活性を媒介することを担う重要なＦＺＤ受容体として意味付けられる（Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ４，７５９−７６７）。ＦＺＤ７遺伝子ノックダウン実験は、ＦＺＤ７がまた、ヒト胚幹細胞をそれらの未分化状態で維持するために必須でることを確定した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１１，１４０９−１４１４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３２３６９７１１１）。更に、最近のデータは、ＦＺＤ７が、結腸、膵臓、及び胃腫瘍のサブセットにおいて上方調節されることを示した（Ｖｉｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２５，６５７−６６３；Ｐｈｅｓｓｅ（２０１６）Ｃａｎｃｅｒｓ  ８）。追加として、ＦＺＤ７は、黒色腫の腫瘍開始及び転移性成長ならびにＢＲＡＦ阻害剤に対するそれらの薬物耐性と関係があるとされている（Ｔｉｗａｒｙ＆Ｘｕ（２０１６）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１，ｅ０１４７６３８）、Ａｎａｓｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２４，２８７７−２８９０）。これらの発見は、ＦＺＤ７受容体を、幹細胞の重要な調節因子、及び幹細胞不全と関連した疾患の魅力的薬理学的標的として強調している。
【０２０８】
Ｗｎｔシグナル伝達は、分泌Ｗｎｔ糖タンパク質とＦＺＤ受容体との相互作用時に細胞表面において開始される。Ｗｎｔタンパク質上に存在する共有結合されたシス−不飽和脂肪アシル基（パルミトレイン酸）は、ＦＺＤ受容体の細胞外Ｎ末端ＣＲＤ内の脂質結合溝に結合し（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）″Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．″Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４、Ｎｉｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｎｏｕｓｈ（２０１６）“Ｆａｔｔｙ  ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，６０−６９）、核β−カテニンの安定化及び下流Ｗｎｔシグナル伝達の開始につながる。結腸直腸癌において、Ｗｎｔ経路突然変異の大半は、β−カテニンのレベルで起こる（Ｐｏｌａｋｉｓ，Ｐ．（２０１２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４）。しかしながら、Ｗｎｔ経路の異常活性はまた、胆管細胞癌中で観察されているように、受容体のレベルで起こり得（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５，１２６９−１２８５  ＬＩＤ−１２１０．１１７２／ＪＣＩ７６４５２［ｄｏｉ］ＬＩＤ−７６４５２［ｐｉｉ］）、経路内の上流突然変異によって駆動される。例えば、結腸直腸癌及び子宮内膜癌における頻繁に突然変異した遺伝子である（Ｇｉａｎｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４６，１２６４−１２６６）、腫瘍抑制因子Ｅ３ユビキチンリガーゼＺＮＲＦ３及びＲＮＦ４３における突然変異を不活性化することは、細胞表面における安定化及びより高いレベルのｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体につながる（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５８，５２２−５３３）。グローバルＷｎｔパルミトイル化及び分泌の小分子阻害剤であるＣ５９での処置は、マウスにおけるＲｎｆ４３−／−（ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３の不足）及びＺｎｆ３−／−（亜鉛／ＲＩＮＧフィンガータンパク質３の不足）腸新生物の成長を防止し、これらの腫瘍における上流Ｗｎｔシグナル伝達に対する役割を強調する（Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１２，７５４８−７５５０）。Ｃ５９での処置時に、隣接した腸陰窩に対する重大な有害作用が観察されなかったことは特筆に値する。これらの発見は、Ｗｎｔ／ＦＺＤ相互作用の上流阻害剤が、胃などの高度に増殖する幹細胞コンパートメント内で耐えられ得ることを示唆しているが、今後の研究においてるＷｎｔ経路阻害の一般的な毒性副作用を詳細に評価することが依然として重要である。要するに、上記の発見は、がんにおけるＦＺＤの生物学的役割を強調し、ＦＺＤ受容体の薬理学的標的が、細胞表面の上流でＷｎｔ経路を阻害するために魅力的なアプローチであり得ることを示す。
【０２０９】
ＦＺＤ受容体タンパク質ファミリーの分子理解は、ヒト（ｈ）ＦＺＤ４、５、及び７  ＣＲＤならびにマウス（ｍ）ＦＺＤ８  ＣＲＤのＸ線結晶構造に限定されている。ｍＦＺＤ８  ＣＲＤと複合したＸｅｎｏｐｕｓ  Ｗｎｔ８の第１のＸ線共結晶構造が報告されたが、Ｗｎｔ−ＦＺＤ相互作用の特異性の構造基盤（Ｄｉｊｋｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９０，６７８９−６７９８）は、依然として十分に理解されていない。Ｗｎｔ−ＦＺＤ相互作用の良好な構造理解にもかかわらず、脂質結合溝において結合し、ＦＺＤ依存性シグナル伝達を中断させる高親和性小リガンドを開発することは困難である。特異的ＦＺＤ受容体の選択的標的もまた、高度の配列類似性に起因して困難である。図１、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９０，３０５９６−３０６０６、Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，１１７１７−１１７２２を参照されたい。図１は、マウス（ｍ）ＦＺＤ８  ＣＲＤ（表面表現）と複合したＸｅｎｏｐｕｓ（Ｘ）Ｗｎｔ８（リボン表現、矢印で示された脂肪酸）の結晶構造を示す。ＸＷｎｔ８は、２つの別個の部位でｍＦＺＤ８  ＣＲＤと相互作用する。部位１（「親指」）は、主にｍＦＺＤ８  ＣＲＤ上のＷｎｔ脂肪アシル基と疎水性溝との間の脂質−タンパク質界面であるが、部位２（「人差し指」）は、タンパク質−タンパク質相互作用界面で構成される。ｍＦＺＤ８  ＣＲＤは、ＸＷｎｔ８と複合した単量体として結晶化した。全てのヒトＦＺＤ  ＣＲＤのＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｆａｓｔ，ｓｃａｌａｂｌｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ．Ｍｏｌ．Ｓｙｓ．Ｂｉｏｌ．７，５３９（２０１１））配列アラインメントを、それらの保存率についてスコアリングし、模擬構造としてｍＦＺＤ８  ＣＲＤの表面上の色勾配として適用した（濃灰色：高保存、薄灰色：低保存）。グリコシル化基は、明確性のために隠されている。
【０２１０】
腸幹細胞機能におけるＦＺＤ７の役割を調査するために、実験を行い、ＦＺＤ７  ＣＲＤと選択的に結合するリガンドを特定した。ナイーブ直鎖状ペプチドライブラリ（４〜１６アミノ酸長）及び環状ペプチドライブラリを、ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃに対するファージディスプレイを介してスクリーニングした。次いで、ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃと結合することが見出されたペプチドをＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ、ＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃ、及びハーセプチンに対するスポットファージＥＬＩＳＡを介してスクリーニングして、ＦＺＤ７  ＣＲＤと結合するが、ＦＺＤ８  ＣＲＤまたはハーセプチンとは結合しない候補を特定した。候補ＦＺＤ７  ＣＲＤと結合する直鎖状ペプチドのアミノ酸配列を以下の表３に示し、候補ＦＺＤ７  ＣＲＤと結合する環状ペプチドのアミノ酸配列を表４に示す。
表３
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Ａ「Ｎ」は、各ペプチドの発生を指す。
Ｂ「シグナル：ノイズ比」について、「シグナル」は、ＦＺＤ７  ＣＲＤ、ハーセプチン、またはＦＺＤ８  ＣＲＤに対して検出されたスポットファージＥＬＩＳＡシグナルである。「ノイズ」は、ＢＳＡに対するＥＬＩＳＡシグナルである。
表４
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Ａ下線が引かれたシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成し得る。
Ｂ「Ｎ」は、各ペプチドの発生を指す。
Ｃ「シグナル：ノイズ比」について、「シグナル」は、ＦＺＤ７  ＣＲＤ、ハーセプチン、またはＦＺＤ８  ＣＲＤに対して検出されたスポットファージＥＬＩＳＡであり、「ノイズ」は、ＢＳＡに対するＥＬＩＳＡシグナルである。
【０２１１】
５つのペプチド、ＦＺ７−０６、ＦＺ７−０７、ＦＺ７−１７、ＦＺ７−２０、及びＦＺ７−２１が、化学合成及び更なる特徴付けのために選別された。
【０２１２】
ショットガンアラニン走査を、ＦＺ７−２１上で行い、ＦＺＤ７  ＣＲＤに結合するために重要なペプチド中のアミノ酸残基を特定した。要するに、各々が少なくとも１つのランダムアラニン及び／またはバリン及び／またはアスパラギン酸及び／またはセリン置換を含有する６０のＦＺ７−２１由来のペプチド（表５を参照）を生成し、ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ及びハーセプチンに対するスポットファージＥＬＩＳＡを介して（すなわち、上記のように）スクリーニングした。表５に示すように、アラニン、アスパラギン酸、セリン、またはバリン置換Ｆｚ７−２１由来のペプチドのほとんどは、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合活性を示した。
表５
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2019534858.tif 000008
Ａ「Ｓ／Ｗ」値は、シグナル−ノイズであり、「シグナル」は、３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定化されたＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃまたはハーセプチンに対して検出されたスポットファージＥＬＩＳＡシグナルを指し、「ノイズ」は、同じプレート上のＢＳＡに対するＥＬＩＳＡシグナルを指す。
Ｂ「Ｓ／Ｎ」値は、シグナル対ノイズ比である。
Ｃ「Ｎ」は、各ペプチドの発生を指す。
【０２１３】
次に、「Ｗ／Ａ」値を、ペプチドＦｚ７−２１中の各アミノ酸位置について決定した。「Ｗ／Ａ」は、特定の酸位置に野生型（ＷＴ）残基を有するＦｚ７−２１由来ペプチドの数を、その位置に置換を有するＦｚ７−２１由来ペプチドの数で除算することによって計算した。（置換がある特定のアミノ酸位置に見出されない場合、Ａ＝１である。）データは、６０ペプチド変異形から収集した。「Ｗ／Ａ」値は、ＦＺＤ７  ＣＲＤとの相互作用について、各野生型Ｆｚ７−２１残基のペプチド結合依存性を表す。ＦＺ７  ＣＲＤへのＦｚ７−２１の結合において重要な役割を果たす残基は、２５以上のＷ／Ａを有すると定義され、「クラス２」残基として分類された。ＦＺ７  ＣＲＤへのＦｚ７−２１の結合において重要な役割を果たす残基は、６〜１９のＷ／Ａ値（すなわち、５≦Ｗ／Ａ＜２５）を有すると定義され、「クラス１」残基として分類された。不要な残基は、Ｗ／Ａ＜５を有すると定義され、「クラス０」残基として分類された。以下の表６に示されるように、Ｆｚ７−２１中のＤ５、Ｌ６、Ｗ９、Ｃ１０、Ｍ１３、及びＹ１４は、ＦＺ７  ＣＲＤへの結合に重要であると決定され、Ｆｚ７−２１中のＤ４、Ｈ１１、及びＶ１２は、Ｆｚ７  ＣＲＤへの結合に重要であると決定され、Ｆｚ７−２１中のＬ１、Ｐ２、Ｓ３、Ｅ７、及びＦ８は、不要であることが見出された。
表６
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【０２１４】
Ｄ５Ｎ置換を含有するＦｚ７−２１ペプチドの誘導体、すなわちＦｚ７−２１Ｎを合成して、Ｆｚ７−２１中のアミノ酸位置５における電荷アスパラギン酸残基の、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合に対する寄与を調査した。
【０２１５】
ペプチドの機能的活性は、イチレンの細胞ベースアッセイにおいて特徴付けられた。一組のアッセイでは、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＦｚ７−０６、Ｆｚ７−０７、Ｆｚ７−１７、Ｆｚ７−２０、Ｆｚ７−２１、及びＦｚ７−２１Ｎの効果を、ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中で試験した。要するに、ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞（すなわち、ＴＣＦ／ＬＥＦ応答性ホタルルシフェラーゼ構築体及び構成的に発現されたウミシイタケルシフェラーゼ構築体で安定してトランスフェクトされた細胞）を、Ｆｚ７−０６、Ｆｚ７−０７、Ｆｚ７−１７、Ｆｚ７−２０、Ｆｚ７−２１、及びＦｚ７−２１Ｎの３倍段階希釈で６時間、組み換えｍＷｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。ＤＭＳＯ対照を並行して行った。β−カテニンシグナル伝達は、ＤＭＳＯ対照に対して正規化されたホタルルシフェラーゼのウミシイタケルシフェラーゼに対する比として測定した。結果を表７に示す。表７の値は、少なくとも３つの独立した繰り返しの平均、±標準偏差である。最も効力のあるペプチド、Ｆｚ７−２１（配列番号１３）は、約９０〜１００ｎＭのＩＣ５０でＨＥＫ２９３細胞中のＷｎｔ３ａ媒介型β−カテニンシグナル伝達を障害した（表７を参照）。Ｆｚ７−２１Ｎは、外因性Ｗｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３細胞中のＷｎｔ３ａ媒介型β−カテニンシグナル伝達を障害した（ＩＣ５０＝１００ｎＭ）。
【０２１６】
補足的な実験の組では、マウスＬ細胞中のβ−カテニンタンパク質のＷｎｔ媒介型安定化に対するＦｚ７−０６、Ｆｚ７−０７、Ｆｚ７−１７、Ｆｚ７−２０、Ｆｚ７−２１、及びＦｚ７−２１Ｎの効果（Ｈａｎｎｏｕｓｈ（２００８）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３，ｅ３４９８に記載される）である。Ｌ細胞を、Ｗｎｔ３ａ（２．５ｎＭ）により、Ｆｚ７−０６、Ｆｚ７−０７、Ｆｚ７−１７、Ｆｚ７−２０、Ｆｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｎの３倍段階希釈で５時間処理した。ＤＭＳＯ対照を並行して行った。処理に続いて、Ｌ細胞を固定し、透過処理し、蛍光標識された抗β−カテニン抗体で探索して、細胞内ウェスタンアッセイを介して（すなわち、Ｈａｎｎｏｕｓｈ（２００８）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３，ｅ３４９８に記載されるように）観察して、β−カテニンタンパク質レベルを評価した。結果を表７に示す。表７の値は、少なくとも３つの独立した繰り返しの平均、±標準偏差である。Ｆｚ７−２１は、マウスＬ細胞におけるβ−カテニンのＷｎｔ３ａ媒介型安定化を遮断し、このペプチドが、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。Ｆｚ７−２１Ｎは、マウスＬ細胞におけるβ−カテニンのＷｎｔ３ａ媒介型安定化を遮断し、このペプチドが、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することを示す。
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＞１００μＭは、ペプチドが、試験したペプチドの最高濃度（１００μＭ）における部分阻害を示したことを示す。
ＡＴＣＦのβ−カテニン領域を含有するＴＯＰｂｒｉｔｅレポーターからの読み出しによって測定した
Ｂ免疫蛍光を介して検出されたβ−カテニンの量によって測定した
Ｃ１００μＭのペプチドで測定した
Ｄ値は、少なくとも２つの繰り返しの平均、±標準偏差である
Ｅ値は、少なくとも３つの繰り返しの平均、±標準偏差である
Ｆβ−カテニン活性は、１１．１１μＭのペプチドで約５０％阻害のプラトーに到達する
Ｇ１１．１１μＭのペプチドで測定した
【０２１７】
理論に束縛されるものではないが、それぞれＴＯＰｂｒｉｔｅルシフェラーゼレポーター及びβ−カテニン撮像アッセイにより測定した、ＨＥＫ２９３とマウスＬ細胞との間の最大Ｗｎｔ経路阻害における観察された差は、２つの細胞株間の様々なＦＺＤレポーターの細胞表面発現レベルの差に起因する可能性があり得る（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ３１，２４８−２５６  ＬＩＤ−２１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２０１４．１００８．１０１８［ｄｏｉ］ＬＩＤ−Ｓ１５３４−５８０７（１０１４）００５４８−００５４６［ｐｉｉ］）。
【０２１８】
Ｆｚ７−２１、すなわちＣ１０Ｓ置換を含有するＦｚ７−２１の誘導体を合成して、Ｆｚ７−２１中のアミノ酸位置１０におけるシステイン残基の、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合に対する寄与を調査した。Ｆｚ７−２１のアミノ酸配列は、ＬＰＳＤＤＬＥＦＷＳＨＶＭＹ（配列番号１１３）である。第１のアッセイでは、ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞を、組み換えｍＷｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）により、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、またはＤＭＳＯ対照の３倍段階希釈で６時間刺激した。図２Ａに示すように、Ｆｚ７−２１は、９３．７ｎＭ±２７．９ｎＭのＩＣ５０でＷｎｔ３ａ刺激型β−カテニンシグナル伝達を阻害した。Ｆｚ７−２１Ｓが、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達を阻害することは見出されなかった。
【０２１９】
後のアッセイでは、ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞を、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａまたは２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２  Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞を、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、またはＤＭＳＯの３倍段階希釈で６時間処理した。図２Ｂに示すように、Ｆｚ７−２１は、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトした細胞中３２９．８ｎＭ±１５７ｎＭのＩＣ５０、及び２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトした細胞中４１９．３ｎＭ±１６８．６ｎＭのＩＣ５０でＷｎｔ３ａ刺激型β−カテニンシグナル伝達を阻害した。Ｆｚ７−２１Ｓが、Ｗｎｔ３ａシグナル伝達を阻害することは見出されなかった。
【０２２０】
更なるアッセイでは、ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞を、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ１または２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２  Ｗｎｔ１でトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞を、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、またはＤＭＳＯの３倍段階希釈で６時間処理した。図２Ｃに示すように、Ｆｚ７−２１は、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトした細胞中１．０８６４μＭ±０．５０７７μＭのＩＣ５０、及び２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトした細胞中２．６６１μＭ±１．１２４μＭのＩＣ５０でＷｎｔ１刺激型β−カテニンシグナル伝達を阻害した。Ｆｚ７−２１Ｓが、Ｗｎｔ１シグナル伝達を阻害することは見出されなかった。
【０２２１】
次に、ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞を、５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ１または２５ｎｇのｐＣＤＮＡ３．２−Ｗｎｔ３ａでトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトした細胞を、Ｆｚ７−２１Ｃ、すなわち１０位にＤ−システイン立体異性体を含有するＦｚ７−２１由来ペプチドの３倍段階希釈で６時間処理した。図２Ｄに示されるように、Ｆｚ７−２１の１０位におけるＤ−システインによるＬ−システインの置換は、Ｗｎｔ１阻害の効力を１６倍低減し、Ｗｎｔ３ａ阻害の効力を３１倍低減した。
【０２２２】
まとめると、図２Ａ〜２Ｄに示す結果は、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合に対するＣｙｓ１０残基の機能的寄与を強調する。
【０２２３】
エピスタシス試験を、β−カテニンを安定化し、受容体活性化とは独立して下流Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するＧＳＫ−３α／βの阻害剤である、６−ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３′−オキシム）で処理したＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞において実行した（Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，１２５５−１２６６）。ＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞を、１０μＭの６−ＢＩＯにより、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、またはＤＭＳＯの３倍段階希釈の存在下で６時間刺激した。Ｆｚ７−２１もＦｚ７−２１Ｓも、６−ＢＩＯで処理した細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害した（図２Ｅを参照）。かかる結果は、Ｆｚ７−２１が、ＧＳＫ３α及びβ−カテニンの上流で、恐らくはＦＺＤ受容体のレベルで作用する。
【０２２４】
図２Ａ〜２Ｅにおいて、β−カテニンシグナル伝達を、ＤＭＳＯ対照に対して正規化されたホタルとウミシイタケとの比として測定した。計算値を、バックグラウンド除去し（Ｗｎｔ３ａにより刺激されていない細胞）、ＤＭＳＯで処理した試料に対して正規化し、技術的三重複による少なくとも３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ６．０５）を使用し、ｌｏｇ（阻害剤）対正規化した応答を使用して阻害曲線を生成した［可変傾斜等式（Ｙ＝１００／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））］。ＩＣ５０は、平均±９５％信頼区間を表す。全ての試料は、１％の最終ＤＭＳＯ濃度を維持した。統計的有意性は、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を使用してα＝５％で決定し、Ｐ＊＜１．１７＊１０−６である。有意性は、全ての試料が同じ分散を有する集団からのものであると想定する。
【０２２５】
次に、Ｆｚ７−２１ペプチドの５−カルボキシフルオレセイン標識バージョンである５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１を生成し、ｈＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｍＦＺＤ２  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｍＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｍＦＺＤ９  ＣＲＤ−Ｆｃ、及びｈＦＺＤ１０  ＣＲＤ−Ｆｃへの結合について試験した。５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓを使用する対照実験を、並行して行った。５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓを、前述のＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃの各々で、ＰＢＳ中４℃で一晩インキュベートし、ＳＥＣを介して分離した。５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１は、低ｎＭ範囲（３９〜１１６ｎＭ）の親和性を有する、ｈＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｈＦＺＤ２  ＣＲＤ−Ｆｃ、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃ、及びｍＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃへの選択的かつ選好的結合を示した。
【０２２６】
表８及び図３Ａ〜３Ｉを参照されたい。図３Ａ〜３Ｉにおいて、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓ（ＰＢＳ中５０ｎＭ）を、漸増濃度のＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃ（２倍段階希釈）でインキュベートし、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５またはＮＴ．１１５Ｐｉｃｏ器具（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用して測定した。ＥＣ５０値は、２回行われたｈＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃ＋５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓを除いて、少なくとも３つの独立した実験の９５％信頼区間を表す。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄを用い、Ｌｏｇ（アゴニスト）対応答を使用して計算した［可変傾斜（４パラメータ）関数：Ｙ＝底部＋（上部−底部）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））］。プロットした値は、平均±標準誤差を表す。
表８
2019534858.tif 000011
ＡＮＣ＝変化なし
【０２２７】
Ｆｚ７−２１がＦＺＤ７サブクラスのＣＲＤに特異的に結合する仮説と一致して、ＦＺＤ５、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、及びＦＺＤ１０  ＣＲＤへの５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１の結合は、ほとんどまたは全く観察されなかった。対照ペプチド５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓは、ＦＺＤ  ＣＲＤファミリーのいかなるメンバーにも検出可能な結合を示さなかった。図３Ａ〜３Ｉ及び表８を参照されたい。
【０２２８】
ＦＺＤ７受容体サブクラスの選択的標的はまた、クロマトグラフ的に観察された。５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１と、ＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ−Ｆｃ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃとの複合体は、蛍光サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）によって分離され得る。対照的に、複合体は、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓでは観察されなかった。図４Ａ及び４Ｂを参照されたい。これらは、ＦＳＥＣによる分析前に、様々なＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（２５０ｎＭ）で一晩４℃でインキュベートされた、それぞれ１μＭの５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１及び１μＭの５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの代表的な蛍光トレースを提供する。垂直点線は、分子量標準の溶出量を表す。ペプチドに対するＦＺＤ７  ＣＲＤのモル化学量論が示されている。図４Ａ及び４Ｂの蛍光強度の定量（曲線下面積、ＡＵＣ）を図４Ｃに提供する。図４Ａ〜４Ｃの結果は、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１が、ＦＺＤ７クラスＣＲＤに選好的に結合するが、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓは、いかなるＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃも結合しないことを示す。これらの実験では、ＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃ融合構築体は、２つのＦｃ断片によって一緒に保持される２つのＦＺＤ  ＣＲＤ二量体を含む四量体の形成と一致した保持プロファイルを示した。図２４Ａでは、ＵＶ吸収により分析された分子量（ＭＷ）標準を、空隙量（Ｖｏ）に対する溶出量（Ｖｅ）の関数としてプロットした。値は、３回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。。図２４Ｂは、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１（灰色の丸）と予測されたＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃ四量体ＭＷ（黒色の正方形）とに結合したＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質の観察された分子量を示す。測定値は、３つの独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を表す。図２４Ｃは、使用された異なるＦＺＤ  ＣＲＤ−Ｆｃタンパク質（約２μｇ）の天然ＰＡＧＥ（４〜１６％）を示す。ＮａｔｉｖＭａｒｋを、分子量標準物として使用した。タンパク質試料を、天然のＰＡＧＥ試料緩衝液で希釈し、濃青色カソード走行緩衝液を使用して分離し、溶解して、製造者の推奨に従い固定した。組み換えＦＺＤ３及び６  ＣＲＤへの結合は、これらのタンパク質の発現による困難に起因して評価することができなかった。しかしながら、フローサイトメトリー分析によって、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１は、ＦＺＤ７への主な結合を示し、ＨＥＫ２９３細胞中で安定して発現されたＦＺＤ４、５、または６受容体への結合は最小であり、上述のクロマトグラフィー実験と一致していた。
【０２２９】
更なるＦＳＥＣ実験を行い、５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓが、ヒトｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２、ｓＦＲＰ３、ｓＦＲＰ４、またはｓＦＲＰ５（すなわち、ＦＺＤタンパク質に構造的に関連した可溶性タンパク質のファミリーである、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質）と結合するかどうかを決定した。５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓは、試験したｓＦＲＰのうちのいずれとも結合することが見出されなかった。例えば、図５Ａ〜５Ｃを参照されたい。垂直点線は、分子量標準の溶出量を表す。
【０２３０】
図４Ｃ及び５Ｃについて、値は、３回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。図４Ｃ及び５Ｃの曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＵＮＩＣＯＲＮ（ｖ５．３１、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して統合され、３つの独立した実験からの平均±標準誤差を表す。試料は、ＳＥＣ３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を使用し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．５ｍＬ／分で分離し、ＦＰ−２０２０  Ｐｌｕｓ蛍光検出器（Ｊａｓｃｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｅａｓｔｏｎ，ＭＤ）を用い、正常モード（励起／放出５５０／４９４ｎｍ）を使用して、利得＝１００、ＳＴＤ＝３２で蛍光をモニタリングした。全ての溶液は、１％の最終ＤＭＳＯを維持した。ライントレースを、ｎ＋２０単位だけ上方調整し、トレース間の区別を可能にした。分子量は、試料走行前に標準（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１５１−１９０１）走行によって決定した。
【０２３１】
更なる実験を行い、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤの可溶性単量体形態へのペプチド結合を調べた。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂で補足されたバキュロウイルスから生成され、濃縮され、かつＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ＰＧを、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５と共に０．５ｍＬ／分で使用して分離されたＥｎｄｏＨ及びＫｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅで処理した組み換えｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。図６Ａに示されるように、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤは、約１６ｋＤａにおける単量体の２つの主要ピークとして、及びより高い分子量の多量体として溶出する。「Ｖｏ」＝空隙量  図６Ｂは、図６Ａからのプールされた単量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。試料を、１ｍＭ  ＤＴＴで補充された試料緩衝液で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析前に１０分間、９８℃まで加熱した。Ｍ：マーカー（１０μＬ、青色Ｐｌｕｓ２染色済みタンパク質スタンダード）。
【０２３２】
Ｆｚ７−２１の作用機序を更に理解するために、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓ（１５．８μＭ）を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を介した分離及び多角度光散乱（ＭＡＬＳ）及びλ２８０での吸収を介した検出前に、（ａ）１：１、１：５、もしくは１：１０の比でＦｚ７−２１とともに、（ｂ）１：１０の比でＦｚ７−２１Ｓとともに、または（ｃ）ＤＭＳＯとともに、２時間にわたってインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ３．２／３００カラム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ、２８９９０９４６）によって、１％  ＤＭＳＯ最終濃度の１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５緩衝液中０．１５ｍＬ／分で試料を分離した。カラムを、Ｄａｗｎ  Ｈｅｌｅｏｓ−ＩＩ多角度静的光散乱（ＭＡＬＳ）検出器及びＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ示唆屈折指数（ｄＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に接続された１２６０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に接続した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析の結果を図６Ｃに示す。図６Ｄは、試験した追加のペプチド濃度を有する図６Ｃのズームイン図（１．５ｍＬ〜２．０ｍＬ範囲）を示す。ＤＭＳＯ対照に対するＭＡＬＳシグナルの定量及び分子量の変化（ΔＭＷ）を表９に示す。Ｆｚ７−２１によるインキュベーションは、Ｖｅ＝１．６ｍＬ付近で多量体（複数可）の形成を促進する。図６Ｄを参照されたい。
表９
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【０２３３】
かかる結果は、ペプチドＦｚ７−２１が、単量体ｈＦＺＤ７  ＣＤＲ−Ｈｉｓに結合することを示す。表９を参照されたい。予想外に、Ｆｚ７−２１は、濃度依存的に、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓのホモ二量体化またはオリゴマー化を誘導した。表９を参照されたい。集合的に、かかる発見は、ペプチドＦｚ７−２１は、ＦＺＤ７受容体サブクラスに対する結合選択性を示すことを示す。かかる結果はまた、Ｆｚ７−２１が、単量体ＦＺＤ７  ＣＲＤの二量体化を誘導すること、及びＦｚ７−２１が、予備形成した四量体ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃに結合することを示す。（図６Ａ〜６Ｄを参照されたい。）
【０２３４】
上述の結果は、Ｆｚ７−２１が、進化的に保存されたタンパク質のＦＺＤ７サブクラス、つまりＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及びＦＺＤ７に結合することを示す。図７を参照されたい。かかる結合選択性は、ＦＺＤタンパク質間の高度の配列類似性の点から予想されない。
【０２３５】
図７において、タンパク質ＣＲＤを手動でトリミングし、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａで整列させた。図７におけるクラドグラムは、ＰＨＹＬＩＰ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇを使用し、Ｊｏｎｅｓ−Ｔａｙｌｏｒ−Ｔｈｏｒｔｏｎ距離マトリクス及び１００ブートストラップ反復及び２．０の移行／転換比を用いて生成した。図７におけるクラドグラムの右側は、各タンパク質に対する５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１または５ＦＡＭ−Ｆｚ７−２１Ｓの結合選好の要約である。「＊」は、マウスタンパク質を試験したことを示す。「＊＊」は、マウスタンパク質及びヒトタンパク質の両方を試験したことを示す。「ｓＦＲＰ」は、「分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質」を指す。以下の受託番号を、ソース配列として使用した：ｈＦＺＤ１（Ｑ９ＵＰ３８）、ｈＦＺＤ２（Ｑ１４３３２）、ｈＦＺＤ３（Ｑ９ＮＰＧ１）、ｈＦＺＤ４（Ｑ９ＵＬＶ１）、ｈＦＺＤ５（Ｑ１３４６７）、ｈＦＺＤ６（Ｏ６０３５３）、ｈＦＺＤ７（Ｏ７５０８４）、ｈＦＺＤ８（Ｑ９Ｈ４６１）、ｈＦＺＤ９（Ｏ００１４４）、ｈＦＺＤ１０（Ｑ９ＵＬＷ２）。
【０２３６】
実施例３：ＦＺＤ７  ＣＲＤとＦｚ７−２１との間の相互作用の構造的特徴付け
そのアポ形態のまたはＣ２４脂肪酸と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＸ線結晶構造は、最近報告された（Ｎｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１４，４１４７−４１５２  ＬＩＤ  −４１１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８２９３１１４［ｄｏｉ］）。両方の構造において、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤは、αらせん二量体界面及びその二量体界面を架橋するＵ形脂質結合空洞を有する二量体を含んでいた（Ｎｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１４，４１４７−４１５２  ＬＩＤ  −４１１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８２９３１１４［ｄｏｉ］）。ペプチド−ＦＺＤ  ＣＲＤ選択性の機序に対する洞察を得るために、更なる実験を行い、分子レベルでペプチド−タンパク質相互作用を特徴付けた。共結晶及び浸漬技法を含むＦｚ７−２１と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの共結晶構造を得ることを目的とした広範な努力は、不成功であった。Ｆｚ７−２１のＮ末端が、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＣ末端に融合され、両側にリンカーがある構築体を使用した。ＦＺＤ７  ＣＲＤ（アポ形態）及びペプチドＦｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＸ線結晶構造を、それぞれ２．００Å及び２．８８Åの分離度で決定した（図  ８Ａ〜８Ｆ及び以下の表１０）。アポＦＺＤ７  ＣＲＤの構造は、固有のアーキテクチャを有する二量体を明らかにした。図８Ａ〜８Ｆに示すように、ＦＺＤ７  ＣＲＤの脂質結合空洞の構造は、驚くことに、他のＦＺＤ  ＣＲＤファミリーメンバーの脂質結合空洞の報告された構造とは異なる。２つの脂質結合溝が、ＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体中に存在する。ＦＺＤ７  ＣＲＤ単量体のテールは、二量体界面において互いに面している。図８Ａ〜８Ｂを参照されたい。これは、二量体界面を架橋する連続した屈曲（Ｕ形）脂質結合空洞を創出する。図８Ｂを参照されたい。疎水性空洞に近位の残基は、図８Ｂにおいて球棒形態で表示される。図８Ｃは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造を示す。図８Ｄは、Ｆｚ７−２１（リボン表現）に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（リボン表現）の構造の上にマップされた疎水性空洞の表面表現を示す。疎水性空洞を形成する残基は、球棒表現で示される。図８Ｅは、Ｆｚ７−２１（リボン表現、ジスルフィドが示される）に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造の上面図表面表現を示す。図８Ｆは、Ｆｚ７−２１（リボン表現、ジスルフィドが示される）に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造の側面表面表現を示す。Ｆｚ７−２１（４Å距離内で定義される）の結合エピトープは丸の中である。脂質結合空洞は、矢印によって示される。全ての構造について、グリカン部分は、明確性のために隠されている。
表１０．アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ及びＦｚ７−２１が結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤについてのＸ線結晶学データ処理及び構造精密化統計
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１括弧内の値は、最高分離度シェルのものである。
２Ｒｓｙｍ＝Σ｜Ｉｈｉ−Ｉｈ｜／ΣＩｈｉ、式中、Ｉｈｉは、反射ｈのｉｔｈ対称関連観察のスケーリングした強度であり、Ｉｈは、平均値である。
３Ｒｃｒｙｓｔ＝Σｈ｜Ｆｏｈ−Ｆｃｈ｜ΣｈＦｏｈ、式中、Ｆｏｈ及びＦｃｈは、反射ｈについての観察及び計算された構造因子振幅である。
４Ｒｆｒｅｅの値は、精密化に含まれない５％のランダムに選択された反射について計算される。
５  Ｃ−コア、Ａ−追加として許容される、Ｇ−一般に許容される、Ｄ−許容されない。
【０２３７】
この配置は、ｈＦＺＤ４（図９Ａを参照）及びｍＦＺＤ８（図９Ｂを参照）のものなどの他のＦＺＤ  ＣＲＤ上の脂質結合溝の位置付けに対して著しい対照をなし、これは二量体界面から離れて反対側に位置し、それにより互いから分離される（例えば、Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４、Ｄａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６−９０、及びＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５，１０７８−１０８１を参照）。ｈＦＺＤ４（図９Ａを参照）及びｍＦＺＤ８（図９Ｂを参照）の脂質結合空洞は、諧調にわたってアミノ酸疎水性に従い影が付けられている（濃灰色＝疎水性、薄灰色＝疎水性）。さらに、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤ及びｍＦＺＤ８  ＣＲＤの脂質結合空洞はまた、それらが溶媒曝露され、「伸長された」立体構造を表示することにおいて、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのものとは異なる。図９Ｃは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤの、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ及びｈＦＺＤ４  ＣＲＤとの重畳を提供し、異なる二量体界面を強調する。共結晶及び浸漬技法を含むＦｚ７−２１と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの共結晶構造を得ることを目的とした広範な努力は、不成功であった。Ｆｚ７−２１のＮ末端がｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＣ末端に融合され、リンカーが隣接する構築体が設計され、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−ＧＳと称される（図１０Ａ及び１０Ｂ、ならびに表１０）。融合構築体は、昆虫細胞中で発現され、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってほぼ均質に精製された。図１０Ｂは、４２．７ｋＤａの決定分子量（ＭＷ）を有する精製されたｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−ＧＳのＳＥＣプロファイルを示し、二量体に対応する。図２７Ａは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−ＧＳのＭＷを決定するために使用される関連ＭＷ標準物を示す。図２７Ｂは、還元条件下の図１０Ａにおける融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、単量体に対応する。図２７Ｃは、図１０Ａにおける融合タンパク質から得られた結晶の明視野像を示す。
【０２３８】
融合構築体の結晶構造は、脂質結合溝に近位の二量体として結合されたペプチドＦｚ７−２１が、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤの二量体界面における脂質結合空洞を覆う残基と接触させることを明らかにした（図８Ｃ〜８Ｆならびに表１１及び１２）。ペプチド二量体は、互いに対して約４５°角度で配向された２つの逆平行αらせんを含んでおり、Ｃｙｓ１０及び多くの骨格における１つのジスルフィド結合、ならびに側鎖相互作用によって一緒に保持され、ジスルフィド結合を取り囲む溶媒保護されたコアを形成する（図８Ｃ〜８Ｆ及び図１１Ａ〜１１Ｃ）。非対称単位は、各々がＦｚ７−２１二量体ペプチドによって架橋された４つの構造的に同様のＣＲＤ二量体対を含んでいた。リンカー領域は、電子密度の欠如に起因して、分離することができなかった。
【０２３９】
ペプチド結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤのアーキテクチャは、固有の立体構造を示した。脂質結合空洞の幾何形状は、屈曲形態（すなわち、アポ構造）から改変され、伸長形態（すなわち、ペプチド結合した形態）に対して二量体界面において約１６°角度を示し、二量体界面において９０°を示す。したがって、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤの脂質結合空洞に対するＦｚ７−２１の結合は、二量体界面を約７５°移動させる（図８Ａ〜８Ｄ、図１２Ａ及び１２Ｂ、ならびに図２５Ａ〜２５Ｆ）。図２５Ａは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ結晶構造のリボン表現を示し（レインボーカラー、Ｎ末端、：青色；Ｃ末端：赤色）、全長ＦＺＤ７の概略は、ＦＺＤ７内のＣＲＤ配置を示し、図２５Ｂは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（レインボーカラー）の構造のリボン表現を示す。アポ構造及び結合構造の両方において、二量体界面における選別対合された残基を図２５Ａ及び２５Ｂに示す。図２５Ｃは、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤにおける疎水性空洞のズームイン側面図を提供し、図２５Ｄは、図２５Ｃからの上面図を提供する。図２５Ｅは、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤのズームイン側面図を提供し、疎水性空洞が強調されており、タンパク質骨格は１８０°の回転で、明確性のために隠されており、図２５Ｆは、図２５Ｅの上面図を示す。図２５Ｃ〜２５Ｅにおける疎水性空洞は濃灰色：疎水性、白色：中性、青色：薄灰色で描かれる。総じて、ＦＺＤ７  ＣＲＤのαらせん二量体界面を構成する残基の数は、アポ構造の単量体当たり１３（Ｐ５５、Ｅ７７、Ｇ８０、Ｌ８１、Ｈ８４、Ｑ８５、Ｙ８７、Ｐ８８、Ｋ９１、Ｖ９２、Ｌ１３４、Ｆ１３８（あるいは明細書全体でＦ１３０として特定される）、及びＦ１４０からペプチド結合構造の単量体当たり５（Ｐ８８、Ｋ９１、Ｖ９２、Ｋ１３７、及びＦ１３８（あるいは明細書全体でＦ１３０として特定される））まで減少した。（図１４を参照）。
【０２４０】
この結合構成では、ペプチドαらせん二量体は、伸長した脂質結合溝の上部に「蓋」を形成し、各らせんからの結合残基は、両方のｈＦＺＤ７  ＣＲＤ単量体上の残基と接触する（図８Ｃ〜８Ｆならびに以下の表１１及び１２）。図１３に示されるように、Ｆｚ７−２１（鎖Ｂ）上のＬｅｕ６は、Ｐｈｅ１３８（あるいは明細書全体でＰｈｅ１３０として特定される）及びｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＰｈｅ１４０（鎖Ａ）との重要な疎水性接触を形成するが、Ｆｚ７−２１（鎖Ｂ）上のＡｓｐ５の骨格カルボニルは、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＨｉｓ８４（鎖Ｂ）の側鎖との水素結合を形成する。図１３において、選別Ｆｚ７−２１−ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ相互作用は、Ｆｚ７−２１に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造（リボン及び棒表現）内で強調されている。点線は、水素結合相互作用を表す。更に、Ｆｚ７−２１上のＴｒｐ９のインドール窒素は、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ上のＧｌｎ８５の骨格カルボニルとの水素結合を形成する。図１３を参照されたい。要するに、脂質結合溝の表面を覆う主にαらせん二量体界面におけるｈＦＺＤ７  ＣＲＤとの相互作用に関与する、Ｆｚ７−２１上に１６個の残基（単量体当たり８個の残基）が存在する（表１２を参照）。
表１１：Ｆｚ７−２１の４Å以内のＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体残基
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＊Ｐｈｅ１３８は、代替として、本明細書全体でＰｈｅ１３０として特定される。
表１２：ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体の４Å以内のＦｚ７−２１残基
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【０２４１】
これらの相互作用は、ＦＺＤ  ＣＲＤファミリー内のペプチド結合エピトープの配列保存に部分的に基づいて、ＦＺＤ７受容体サブクラスに対するペプチド選択性についての根拠を提供する。ｈＦＺＤ７、ｈＦＺＤ１、ｈＦＺＤ２、ｍＦＺＤ８、ｈＦＺＤ５、ｈＦＺＤ４、ｈＦＺＤ９、ｈＦＺＤ１０、ｈＦＺＤ３、及びｈＦＺＤ６のＣＤＲのアミノ酸配列のアラインメントを提供する、図１４を参照されたい。図１４において、Ｆｚ７−２１結合エピトープ、及びそのアポ形態のまたはＦｚ７−２１（ホロ−ＦＺＤ７界面、鎖Ａ対鎖Ｂ）と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（鎖Ａ対鎖Ｂ）のαらせん二量体界面中の残基は、配列アラインメントの上の「＋」によって示される。保存システインは、灰色で強調され、保存エピトープ残基は、下線が引かれている。追加として、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ内の二量体界面及び脂質結合溝幾何形状は、ペプチド結合フットプリントに寄与し、したがってペプチド選択性に影響を及ぼし得る。ペプチドらせん二量体を安定化するのを助ける骨格及び側鎖相互作用を、表１３に示す。
表１３：Ｆｚ７−２１分子間相互作用の要約
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【０２４２】
アポＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造は、このＦＺＤサブクラス内の脂質結合空洞の固有の幾何形状について、予想外の分子像を明らかにし、これはなぜＷｎｔタンパク質上のｃｉｓ−不飽和脂肪酸が、選好的に進化してｈＦＺＤ  ＣＲＤの脂質結合空洞に結合し得るかについての説明を提供し得る。とりわけ、ペプチド結合したＦＺＤ７  ＣＲＤのアーキテクチャは、固有の立体構造を示し、約９０°角度を形成する二量体界面の７５°の実質的な変位が伴う、屈曲Ｕ形（アポ構造、図１２Ａに示す）から伸張した形態への脂質結合空洞の幾何形状の改変を伴う。ＦＺＤ７  ＣＲＤのアポ形態及びＦｚ７−２１結合形態の二量体界面におけるアミノ酸残基間の距離（Å）を、以下の表１４に提供する。
表１４：残基間距離（Å）
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【０２４３】
結晶学的モデルから観察された相互作用は、上記のいくつかの機能的分析によって支持されている。第１に、ショットガンアラニン走査は、結晶構造に則して（図１３を参照）、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃとの相互作用に重要なＦｚ７−２１上のいくつかの残基、すなわち、Ａｓｐ５、Ｌｅｕ６、Ｔｒｐ９、Ｃｙｓ１０、Ｍｅｔ１３、及びＴｙｒ１４を特定した（上記の表６を参照）。第２に、結晶構造からの観察は、Ｆｚ７−２１の二量体形態が、改善された活性を呈することを示唆した。ｄＦｚ７−２１（すなわち、Ｆｚ７の二量体形態が、Ｃｙｓ１０におけるジスルフィド結合を介して、合成的に二量体化するＦｚ７−２１を得た）は、組み換えｍＷｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中のＴＯＰｂｒｉｔｅレポーターアッセイにより測定して、ＨＥＫ２９３細胞中のＷｎｔ３ａシグナル伝達を阻害することにおいて単量体Ｆｚ７−２１と比較して、約４０倍の改善を示した（図１５）。（図１５における値は、ｄＦｚ７−２１に対して指示されたペプチドのＩＣ５０の倍率変化を表す。発現レベルを説明するために、ホタル発光シグナルを、ウミシイタケルシフェラーゼ発光に対して正規化した。計算値を、バックグラウンド除去し、模擬処置した試料に対して正規化し、各々が技術的三重複を有する少なくとも３つの独立した実験の平均を表す。）追加として、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（例えば、Ｌ６Ａ）とのその相互作用を中断することが予測されたｄＦｚ７−２１内の様々な位置におけるアラニン点突然変異は、分化能の約８００倍の低減につながった（図１５及び表１５を参照）。対照的に、Ｎ末端における切断は、ｄＦｚ７−２１活性に干渉せず（例えば、２Ｎ末端残基を欠くペプチドｄＦｚ７−２１）、結晶構造及びショットガンアラニン走査データと一致した（表６、表１５、及び図１５を参照）。Ｆｚ７−２１Ｓは、陰性対照として並行して試験した。
表１５
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【０２４４】
図１５及び表１５のデータを得るために、Ｗｎｔシグナル伝達を、組み換えｍＷｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）で刺激されたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞中、ＴＯＰｂｒｉｔｅレポーターアッセイによって測定した。図１５及び表１５における値は、ｄＦｚ７−２１に対する、示されたペプチドのＩＣ５０の倍率変化を表す。発現レベルを説明するために、ホタル発光シグナルを、ウミシイタケルシフェラーゼ発光に対して正規化した。計算値を、バックグラウンド除去し、模擬処置した試料に対して正規化し、各々が技術的三重複を有する少なくとも３つの独立した実験の平均を表す。
【０２４５】
更に、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ上のペプチド結合領域内の特定の残基において導入された突然変異（Ｈ８４Ａ、Ｙ８７Ａ、Ｆ１３８Ａ（あるいは、本明細書全体でＦ１３０Ａとして特定される）、Ｆ１４０Ａ）は、野生型ｈＦＺＤ７  ＣＲＤと比較して（図４０を参照）Ｆｚ７−２１の結合を低減し、構造的予測と一致した。更に、Ｆｚ７−２１は、ペプチド−ＣＲＤ結合の２：２立体化学を描く構造モデルに即して、溶液中のｈＦＺＤ７  ＣＲＤの単量体から二量体への移行（データ図示せず）を促進した。第５に、ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｚ７−２１融合構築体は、ペプチド配列内でＣｙｓ１０からＳｅｒへの突然変異を含有する融合構築体と比較して、溶液中で主に二量体であり（データ図示せず）、単量体及びあまり顕著でない二量体種を有するオリゴマーの混合集団を示した（データ図示せず）。ペプチド−ペプチドまたはペプチド−ＦＺＤ７相互作用に重要であることが予測されたＦｚ７−２１残基の追加のＡｌａ突然変異（すなわち、Ｌ６Ａ、Ｗ９Ａ、Ｙ１４Ａ、Ｌ６Ａ及びＷ９Ａ、Ｌ６Ａ及びＹ１４Ａ、ならびにＬ６Ａ、Ｗ９Ａ、及びＹ１４Ａ）は、ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｚ７−２１融合構築体の二量体化の低減につながった（データ図示せず）。これらの発見は、上記のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータ及び結晶学的観察と一致し、Ｆｚ７−２１の活性形態が、ＦＺＤ７  ＣＲＤの二量体形成を強化する二量体であるという考えを更に支持する。
【０２４６】
ｄＦｚ７−２１のＮＭＲ溶液構造は、ペプチド二量体が構築されたことを明らかにし、結晶構造からの観察と同様に、分子内相互作用及びαらせん特徴を呈した（図１６Ａ〜１６Ｅ及び表１６を参照）。図１６Ａは、ｄＦｚ７−２１のＮＯＥＳＹ接続性プロットを提供する。図２６は、ｄＦｚ７−２１の２０最低エネルギーＮＭＲ構造の重畳を示す（鎖Ａ及び鎖Ｂ、リボン表現；側鎖、線表現）。図１６Ｂは、ｄＦｚ７−２１の２０の最低エネルギーＮＭＲ構造の重畳に基づいて、ｄＦｚ７−２１の代表的なＮＭＲ溶液構造を示す（アミノ酸側鎖は、線として示される）。ＮＭＲ溶液構造において、２つのペプチド鎖は、互いに関して９０°角度で配向され、Ｎ末端領域は無秩序であるように思われ、ＦＺＤ７  ＣＲＤとの相互作用が、立体構造変化を誘導し、ペプチド内の二次構造形成を促進し得ることを示す。図１６Ｃは、αらせん特徴を表示するｄＦｚ７−２１の２Ｄ  ＮＯＥＳＹプロットを示す。対照的に、図１６Ｄに示されるＦｚ７−２１Ｓの２Ｄ  ＮＯＥＳＹプロットは、Ｆｚ７−２１Ｓが、限定された二次構造を有することを示す。図１６Ｅは、Ｆｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、及びｄＦｚ７−２１ペプチドの１Ｄ  ＮＭＲスペクトルを示す。図１６Ｅにおいて、Ｆｚ７−２１は、試験した緩衝条件において、Ｆｚ７−２１Ｓ及びｄＦｚ７−２１に対するピーク広がりを示し、その二次構造の帰属を困難にする。図１６Ｅにおける矢印は、ジスルフィドシステインからのアミド基のプロトンピークを示す。一緒に、提示される構造−活性関係及びＮＭＲデータは、構造モデルに対する更なる生化学的支持を提供する。
表１６．Ｆｚ７−２１二量体のＮＭＲ統計
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【０２４７】
上述のように、ｈＦＺＤ７、ｈＦＺＤ１、ｈＦＺＤ２、ｍＦＺＤ８、ｈＦＺＤ５、ｈＦＺＤ４、ｈＦＺＤ９、ｈＦＺＤ１０、ｈＦＺＤ３、及びｈＦＺＤ６  ＣＲＤの配列を、ＦＺＤ７クラスのＣＲＤに対するＦｚ７−２１の選択性についての更なる洞察を得るために整列させた。図１４を参照されたい。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａを使用してアラインメントを生成し、続いてガイドとしてジスルフィド結合システインを使用して手動で整列させた（システインが灰色で強調される）。Ｆｚ７−２１二量体と直接接触されるｈＦＺＤ７上の残基及び他のＦＺＤ  ＣＲＤ上の同一残基は、太字の下線文字で描かれている。Ｆｚ７−２１はＦＺＤ７クラスのＣＲＤ（すなわち、ＦＺＤ７  ＣＲＤ、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、及びＦＺＤ２  ＣＲＤ）のみに結合するため、図１４に示される結合部位１（すなわち、ＬＸＸＨＱＸＹＰ）及び結合部位２（すなわち、ＦＧＦ）の両方の組み合わせは、特定の選択的ＦＺＤ７クラスの結合に必要な可能性がある。
【０２４８】
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体の配置は、ｈＦＺＤ５及びｍＦＺＤ８  ＣＲＤなどの他の関連ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーメンバーと同様であるが、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤなどのより遠い関係のあるＦＺＤ  ＣＲＤファミリーメンバーに対して著しい対照をなし（Ｊａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４、Ｎｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１４，４１４７−４１５２  ＬＩＤ  −４１１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８２９３１１４［ｄｏｉ］、Ｄａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６−９０、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５，１０７８−１０８１）、そこでは脂質結合溝は、むしろ互いに分離しているように思われ、二量体界面から離れて反対側に位置する（図９Ｂ）。しかしながら、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸と複合したｈＦＺＤ４  ＣＲＤの最近報告された構造は、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ／Ｃ１６：１ｎ−７複合体において見出されたＣＲＤとｈＦＺＤ７  ＣＲＤ／Ｆｚ７−２１複合体のＣＲＤとの間の中間である構成を有する二量体ＣＲＤを明らかにした。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤと比較して、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤにおける二量体界面の異なるアーキテクチャは、ペプチド結合領域内のアミノ酸配列の差に加えて（図１４）、ｈＦＺＤ４  ＣＲＤに結合するペプチドの欠如を部分的に説明することができる。
【０２４９】
ＦＺＤ５、７、及び８  ＣＲＤは、αらせん二量体アーキテクチャを共有するが（Ｎｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１４，４１４７−４１５２  ＬＩＤ  −４１１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６１８２９３１１４［ｄｏｉ］）、二量体界面を含むアミノ酸残基のわずかな変化が存在する。特に、ＦＺＤ７  ＣＲＤのＴｙｒ８７及びＰｈｅ１３８（あるいは本明細書全体でＦ１３０として特定される）は、ＦＺＤ５／８  ＣＲＤではＴｒｐ及びＴｙｒにそれぞれ変化する。これらの２つの残基は、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ上のＦｚ７−２１ペプチド結合領域の一部を成し、ＦＺＤ７クラスＣＲＤとＦＺＤ８クラスＣＲＤとの間に保存されていないペプチドエピトープ内の（合計７個のＣＲＤ残基のうち）唯一の残基である。残基の差は、インシリコ予測に基づいて主要なアミノ酸変化を提示しないが、Ｆ１３８Ｙは、Ｌｅｕ６におけるＦｚ７−２１、ならびにＶａｌ９２及びＬｙｓ９１におけるＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体パートナーとの立体的不適合を呈する場合があり、潜在的にｈＦＺＤ７  ＣＲＤの「伸長された」脂質結合溝形態を崩壊させる。（Ｆ１３８Ｙは、代替として、本明細書全体でＦ１３０Ｙとして特定される。）これらの相互作用は、ＦＺＤ  ＣＲＤファミリー内のペプチド結合エピトープの配列保存に部分的に基づいて、ＦＺＤ７受容体サブクラスに対するペプチド選択性についての根拠を提供し得る。追加として、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ内の二量体界面及び脂質結合溝幾何形状は、ペプチド結合のフットプリントに寄与し、したがってＣＲＤタンパク質の動力学は言うまでもなく、ペプチド選択性に影響を及ぼし得る。
【０２５０】
実施例４：Ｆｚｄ７機能のインビボ特徴付け
Ｆｚ７−２１が、ＷｎｔとＦＺＤ７との相互作用を中断させることによってＦＺＤ７媒介型シグナル伝達に干渉するかどうかの問いに対処するために、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を開発して、Ｆｚ７−２１、ｄＦｚ７−２１、またはＦｚ７−２１Ｓの存在または不在下での、異なるＦＺＤ  ＣＲＤへのビオチニル化Ｗｎｔ（ｂｉｏ−Ｗｎｔ）の結合を測定した。Ｆｚ７−２１またはｄＦｚ７−２１での処理は、ＦＺＤ７クラスタンパク質へのｂｉｏ−Ｗｎｔ３ａまたはｂｉｏ−Ｗｎｔ５ａの結合を約１．５〜２倍強化したが、Ｆｚ７−２１と相互作用しないＦＺＤ４への同じＷｎｔタンパク質の結合に対するいかなる効果も示さなかった。更に、対照ペプチドＦｚ７−２１Ｓは、予想されるように、ＦＺＤ  ＣＲＤへの異なるＷｎｔの結合に対する効果を示さなかった。理論に束縛されるものではないが、脂質結合空洞の改変された幾何形状により例証されるように、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ上のｄＦｚ７−２１により誘導された実質的な立体構造変化は、２つのＷｎｔ分子をｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体の上に同時に収容するのを容易にすることができる（図４ｅ〜ｈ）。分子モデリングは、ペプチドが結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ構造内の伸長した疎水性空洞が、そうでなければアポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ構造において立体的に不適合である、潜在的に２つのＷｎｔ脂肪アシル部分を収容し得ることを示唆し、ＥＬＩＳＡシグナルにおける観察された２倍増加についての妥当な説明を提供する。実験的データ及びモデリングデータは共に、ｄＦｚ７−２１が、ＦＺＤ４  ＣＲＤではなくＦＺＤ７クラスのＣＲＤに対するＷｎｔ３ａ及びＷｎｔ５ａの動員を強化し得ることを示唆する。Ｆｚ７−２１−ＦＺＤ７  ＣＲＤ複合体において観察された劇的な立体構造変化は、Ｗｎｔシグナル伝達に対するペプチドの阻害効果により示されるように、強化されたＷｎｔ結合にもかかわらず、適切なシグナル伝達について受容体を無能にし得る。
【０２５１】
幹細胞機能におけるＦＺＤ７の役割についての問いに薬理学的に対処するために、成体マウス腸上皮から確立されたオルガノイド培養物に対するＦｚ７−２１処理の効果を評価した（Ｆａｔｅｈｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）“Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８，２４６−２５４、Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎ  ｂｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  Ｌｇｒ５．”Ｎａｔｕｒｅ  ４４９，１００３−１００７）。オルガノイド培養系は、陰窩ウイルス形態学の存在を含む腸上皮を忠実に再現する。とりわけ、陰窩領域は、機能的腸幹細胞（ＩＳＣ）の存在の直接尺度である、連続出芽を経る。したがって、オルガノイド集団の幹細胞機能（Ｗｎｔ依存性プロセス）を、オルガノイド当たりの形成された芽の数をスコアリングすることによって定量的に評価した（Ｇｒａｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）“Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｒｙｐｔ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ．”Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｓｅａｓｅ  ５，ｅ１２２８）。腸マウスオルガノイドを、成長因子（ｎｏｇｇｉｎ、ＥＧＦ、及びＲ−スポンジン）及び（ａ）ＤＭＳＯ、（ｂ）２００μＭ  Ｆｚ７−２１Ｓ（すなわち、陰性対照）、（ｃ）抗Ｌｒｐ６遮断抗体（すなわち、陽性対照）、（ｄ）２００μＭ二量体化ｄＦｚ７−２１、（ｅ）１００μＭの二量体化ｄＦｚ７−２１、（ｆ）１０μＭの二量体化ｄＦｚ７−２１、または（ｇ）１μＭの二量体化ｄＦｚ７−２１の存在下で４８時間、マトリゲル中で成長させた。４８時間の処理後の代表的なマウス腸オルガノイドの形態を図１７Ａ〜Ｇに示す。次に、ペプチド処理後のオルガノイド幹細胞（ＳＣ）ポテンシャルを定量した。オルガノイドＳＣポテンシャルは、オルガノイド当たり１つ以上の芽を有するオルガノイドの％を示す。オルガノイドを上記のように処理し、処理の４８時間後に収集した。図１８に示すように、ｄＦｚ７−２１での処理は、濃度依存的に出芽事象を劇的に低減したが、陰性対照ペプチドＦｚ７−２１Ｓは、いかなる主要な効果も示さなかった。（図１８における値は、少なくとも３つの生物学的繰り返しからの平均±標準誤差を表す。オルガノイドの総数を各条件でスコアリングした。ｎ＝５５４（ＤＭＳＯ）、ｎ＝５４７（ｄＦｚ７−２１、２００μＭ）、ｎ＝６２７（ｄＦｚ７−２１、１００μＭ）、ｎ＝６４８（ｄＦｚ７−２１、１０μＭ）、ｎ＝２８７（ｄＦｚ７−２１、１μＭ）、ｎ＝５２８（Ｆｚ７−２１Ｓ、２００μＭ）、ｎ＝７１５（抗ＬＲＰ６  Ａｂ、１０μｇ／ｍＬ）。）
【０２５２】
ＩＳＣポテンシャルの崩壊と一致して、Ｌｇｒ５（図１９Ａ）及びＡｓｃｌ２（図１９Ｂ）などの良好に特徴付けられたＩＳＣマーカー（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（２０１２）“Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｒｙｐｔ，ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．”Ｃｅｌｌ  １５４，２７４−２８４）は、ｄＦｚ７−２１での処理の２４時間及び４８時間後に著しく下方調節された。Ｆｚ７−２１Ｓでの処理は、効果を有しなかった。図１９Ａ及び１９Ｂを参照されたい。同様に、良好に確立されたＷｎｔ標的遺伝子であるＡｘｉｎ２は、Ｆｚ７−２１Ｓ処理時ではなく、ｄＦｚ７−２１処理時に著しく低減された。図１９Ｃを参照されたい。（図１９Ａ〜１９Ｃにおける値は、各々２つの技術的繰り返しを有する６つの生物学的繰り返しの平均±標準誤差を表す。ペプチド処理した試料は、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。両方の集団が同じＳＤを有すると仮定して、パラメトリック独立ｔ検定で統計を行った。）対照的に、Ｆｚ７−２１Ｓではなく、ｄＦｚ７−２１での処理の２４時間及び４８時間後にＭｕｃ２が上方調節された。ＩＳＣポテンシャル及び幹細胞転写の両方に対するｄＦｚ７−２１の効果は、対照抗Ｌｒｐ６抗体（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達の一般的阻害剤）と同様であった。
【０２５３】
ｄＦｚ７−２１の薬理学的効果を、インビボで更に調査した。要するに、ｄＦｚ７−２１、Ｆｚ７−２１Ｓ、抗ブタクサ抗体（陰性対照）、または抗Ｌｒｐ６抗体（Ｗｎｔシグナル伝達の阻害のための陽性対照）で６時間処置した（すなわち、腹腔内投与を介して）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから腸上皮を採取した。処置に続いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、転写レベルを定量した。様々な腸幹細胞（ＩＳＣ）、ならびにＬｇｒ５（図２０Ａ）、Ａｓｃｌ２（図２０Ｂ）、及びＡｘｉｎ２（図２０Ｃ）などのＷｎｔ転写物が、ｄＦｚ７−２１処置後に著しく下方調節された（図２０Ａ〜２０Ｃにおける値は、技術的繰り返しでの５匹のマウスの平均±標準誤差を表す。両方の集団が同じＳＤを有すると仮定して、パラメトリック独立ｔ検定で統計を行った。ＲＯＵＴ外れ値排除法を使用した後、１つの値を除去した（Ｑ＝１％）。全ての値は、抗ブタクサ陰性対照に対して正規化した。）この効果はまた、抗Ｌｒｐ６抗体で処置した試料中で観察された。対照的に、Ｆｚ７−２１Ｓでの処置は、Ｌｇｒ５、Ａｓｃｌ２、及びＡｘｉｎ２転写レベルに影響を及ぼさなかった。図２０Ａ〜２０Ｃを参照されたい。これらの結果は、図１７Ａ〜１７Ｇ、図１８、及び図１９Ａ〜１９Ｃにおけるデータと一致する。
【０２５４】
ｄＦｚ７−２１の薬理学的効果を、ｄＦｚ７−２１で６時間及び２４時間処理した腸オルガノイド試料上でＲＮＡシーケンシングを行うことによって更に調査した。公平な分析は、Ｌｇｒ５＋ＩＳＣ中で発現し、時間依存的にｄＦｚ７−２１で処理する際に、ＩＳＣを保存することが知られているマーカーの実質的な下方調節を明らかにした。同時に、ｄＦｚ７−２１で処理したオルガノイドにおいて、腸細胞マーカーの上方調節（分化促進）も存在した。中でも、ｄＦｚ７−２１での処置に際して最も下方調節された遺伝子は、Ｌｇｒ５、Ｏｌｆｍ４、及びＡｓｃｌ２であった。模擬ペプチドＦｚ７−２１ＳまたはＤＭＳＯで処理された試料中で、遺伝子発現の変化はほとんどまたは全く観察されなかった。最後に、幹細胞に対するｄＦｚ７−２１の直接効果を評価するために、Ｌｇｒ５−ＧＦＰマウスに由来するオルガノイド中のＧＦＰ＋幹細胞の存在を、Ｔｉａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｒｅｎｄｅｒｓ  Ｌｇｒ５−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４７８，２５５−２５９（２０１１）に記載されているようにモニタリングした。ｄＦｚ７−２１での処理は、フローサイトメトリー（図４１Ａ〜４１Ｃを参照）及び共焦点顕微鏡（データ図示せず）によってアッセイして、腹腔内投与対照ＤＭＳＯと比較してＬｇｒ５−ＧＦＰ幹細胞の数を低減した。図４１Ａ及び４１Ｂにおいて、Ｌｇｒ５−ＧＦＰオルガノイドを解離し、ＳＹＴＯＸで処理して、フローサイトメトリーにより分析した。図４１Ａは、ＤＭＳＯで処理したＧＦＰ＋発現する生細胞の代表的なプロットを示し、図４１Ｂは、ｄＦｚ７−２１で処理したＧＦＰ＋を発現する生細胞の代表的なプロットを示す。図４１Ａ及び４１Ｂの定量を、図４１Ｃに示す。
【０２５５】
ｄＦｚ７−２１の阻害機序及びその特異性を検証するために、活発な下流Ｗｎｔシグナル伝達を呈したオルガノイドに対するペプチド処理の効果を試験した。要するに、Ｌｇｒ５−ＧＦＰオルガノイドを、ＤＭＳＯまたはＧｓｋ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（５μＭ）で２４時間前処理し、次いでＤＭＳＯ、ｄＦｚ７−２１（１００μＭ）、またはＦｚ７−２１Ｓ（１００μＭ）±ＣＨＩＲ９９０２１で処理した。転写は、Ａｘｉｎ２（図４２Ａ）及びＡｓｃｌ２（図４２Ｂ）について、ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。第２の実験の組において、ＡＰＣｍｉｎオルガノイドを培養し、ＤＭＳＯ、ｄＦｚ７−２１（１００μＭ）、Ｆｚ７−２１Ｓ（１００μＭ）で２４時間処理し、Ａｘｉｎ２（図４２Ｃ）、Ａｓｃｌ２（図４２Ｄ）、及びＬｇｒ５（図４２Ｃ）について、転写をＲＴ−ＰＣＲにより定量した。（ＡｐｃＭｉｎ（複数腸腫瘍）マウスは、単一突然変異体Ａｐｃ対立遺伝子を担持し、４〜６ヶ月齢までに小腸内に５０〜１００良性腺腫を発達させ、残留する野生型遺伝子の喪失と常に関連付けられる。）ＣＨＩＲ９９０２１（Ｇｓｋ３β阻害剤）で前処理されたか、またはＡｐｃ突然変異体バックグラウンドを有していた腸オルガノイド中の幹細胞（Ｌｇｒ５、Ａｓｃｌ２）及びＷｎｔシグナル伝達（Ａｘｉｎ２）マーカーに対する効果はほとんどまたは全く観察されなかった。これらの発見は、ｄＦｚ７−２１が、受容体のレベルにおいてβ−カテニン及びＡＰＣの上流で作用することを示し、２Ｄ細胞培養データと一致する（図２Ｅ）。
【０２５６】
全体として、実施例において考察される代表的な結果は、脂質結合溝におけるｄＦｚ７−２１によるＦＺＤ７  ＣＲＤサブクラスの選択的標的が、Ｗｎｔシグナル伝達及び幹細胞機能を障害するのに十分であることを示す。Ｆｚ７−２１−ＦＺＤ７  ＣＲＤ複合体において観察された劇的な立体構造変化は、インビトロ及びインビボでのペプチドの阻害効果によって示されるように、受容体を適切なシグナル伝達に対して無能にする可能性が高く、それによりペプチドの作用形態の機序を提供する。
【０２５７】
有力かつ選択的な小ペプチドアンタゴニスト（すなわち、Ｆｚ７−２１及びその誘導体）が記載されている。このペプチドは、ＦＺＤ受容体ファミリーの複数のサブクラスを標的とする、以前に報告された抗体または小分子系アンタゴニストから、その高い能力、選択性、及び薬理学的作用形態によって区別される。例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９０，３０５９６−３０６０６及びＧｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）“Ｗｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０９，１１７１７−１１７２２を参照されたい。
【０２５８】
Ｆｚ７−２１と複合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造は、新規のＣＲＤ立体構造を明らかにする。更に、本明細書で提供されるデータは、アイソフォーム選択的ＦＺＤ阻害の基礎として、脂質溝結合機序を定義する。ペプチドＦｚ７−２１は、ＦＺＤ７  ＣＲＤの二量体構成及びその脂質結合空洞を改変し、開いた二量体界面及びアポＦＺＤ７  ＣＲＤに対して「伸長した」脂質結合溝を有する、開状態のＦＺＤ  ＣＲＤの第１の例を提供する（図１２Ａ及び１２Ｂ）。ペプチドは、ＦＺＤ７  ＣＲＤ結合について高親和性Ｗｎｔリガンドと競合せず、これは特にインビボ設定において有益であり得る。インビトロでのＦｚ７−２１の存在下、ＦＺＤ  ＣＲＤに対するＷｎｔリガンドの追加の動員があるが、Ｆｚ７−２１−ＦＺＤ７  ＣＲＤ複合体において観察された劇的な立体構造変化は、細胞及び腸オルガノイド中のペプチドの阻害効果によって示されるように、受容体を適切なシグナル伝達に対して無能にする可能性が高く、それによりペプチドの作用形態についての妥当な説明を提供する。更に、理論に束縛されるものではないが、これらのタンパク質間の高度の配列保存及びＥＬＩＳＡからの同様の発見を考慮すると、ペプチドは、ＦＺＤ７  ＣＲＤと同様にＦＺＤ１及びＦＺＤ２  ＣＲＤに結合することが可能である。
【０２５９】
考察されたデータは、脂質結合溝におけるＦＺＤ７  ＣＲＤサブクラスの選択的標的が、Ｗｎｔ及び幹細胞機能を障害するのに十分であることを示す。Ｆｚ７−２１は、幹細胞及びがん生物学におけるＦＺＤ７の役割を更に調査するための選択的薬理学的ツールとして役立つ。かかる発見は、Ｗｎｔシグナルを媒介してＬｇｒ５＋腸幹細胞を調節することにおいて、ＦＺＤ７  ＣＲＤ脂質結合溝幾何形状に対する重要な役割があることを示唆する。ＦＺＤ７受容体サブクラスの選択的標的を示すデータと併せて、腸陰窩の底部におけるＦＺＤ７クラス受容体の機能的冗長性の明らかな欠如は、活発な上流Ｗｎｔシグナル伝達に依存する腫瘍中の小リガンドによる薬理学的にＦＺＤ７を標的とするための可能性のある経路を示唆する（Ｓｅｓｈａｇｉｒｉ（２０１２）“Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，６６０−６６４、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＦ４３  ｃｏｎｆｅｒ  Ｗｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，１２６４９−１２６５４、Ｍａｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）“ＵＳＰ６  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｎｇ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１１３，Ｅ２９４５−２９５４）。
【０２６０】
実施例５：Ｆｚ７−２１ペプチド誘導体
Ｆｚ７−２１のＭ１３及びＬ６は、ＦＺＤ７  ＣＲＤ上の開いた脂質結合溝に面する。図１３、２５Ａ、及び２５Ｂを参照されたい。更なる実験を行い、これらの位置において脂質をＦｚ７−２１に複合することが、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのペプチドの親和性を強化するかどうか、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ結合に干渉するかどうか、または両方を評価した。Ｆｚ７−２１の脂質含有誘導体（表１７に列挙される）を生成し、それらがＷｎｔ３ａ媒介型β−カテニンシグナル伝達を阻害する能力について、すなわち上記のように評価した。要するに、ＴＣＦ／ＬＥＦ応答性ホタルルシフェラーゼ構築体及び構成的に発現されたウミシイタケルシフェラーゼ構築体で安定してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−ＴＢ細胞を、以下の表１７に列挙される二量体化ペプチドの３倍段階希釈で６時間、組み換えｍＷｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。ＤＭＳＯ対照を並行して行った。β−カテニンシグナル伝達は、ＤＭＳＯ対照に対して正規化されたホタルルシフェラーゼのウミシイタケルシフェラーゼに対する比として測定した。表１７及び図２１Ａ〜２１Ｋに示すように、ｄＦｚ７−ｄ２１Δ２．Ｌ６Ｈ及びＦｚ７−２１Δ２は、ｄＦｚ７−２１に相当するＩＣ５０値で、外因性Ｗｎｔ３ａで刺激されたＨＥＫ２９３細胞中のＷｎｔ３ａ媒介型β−カテニンシグナル伝達を障害した。（表１７及び図２１Ａ〜２１Ｋにおける値は、少なくとも３つの独立した繰り返しの平均（特に指示される場合を除いて）±標準偏差である。
表１７
2019534858.tif 000021
2019534858.tif 000022
＊＊Ｃｙｓ１０において結合されたジスルフィドを介して二量体化されたペプチド。
＊Ｃｙｓ８において結合されたジスルフィドを介して二量体化されたペプチド。
§  ペプチドは、二重実験において試験した。
【０２６１】
後の実験の組において、ＥＬＩＳＡアッセイを行い、ＦＺＤ  ＣＲＤへのＷｎｔの結合に対する低濃度のＦｚ７−２１、ｄＦｚ７−２１、及びＦｚ７−２１Ｓ（例えば、約１００ｎＭの細胞性ＩＣ５０と同じ範囲内の濃度）の効果を評価した。要するに、（ａ）ＦＺＤ１  ＣＲＤ−Ｆｃ、（ｂ）ＦＺＤ２  ＣＲＤ−Ｆｃ、（ｃ）ＦＺＤ４  ＣＲＤ−Ｆｃ、または（ｄ）ＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｆｃを捕捉試薬として、及びビオチニル化Ｗｎｔ５ａを検出試薬として使用して、アッセイを行った。ペプチド（１）ｄＦｚ７−２１、（２）Ｆｚ７−２１、（３）Ｆｚ７−２１Ｓ、または（４）ＤＭＳＯ対照を、０μＭ〜１０μＭの漸増濃度で添加した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して、ビオチニル化Ｗｎｔ５ａを検出し、ＨＲＰ活性を４２８ｎｍでの化学発光検出の関数として測定した。とりわけ、ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合は、約０．５μＭを下回る濃度でＦｚ７−２１の存在下で増加し（図２２Ａ）、Ｆｚ７−２１は、ＦＺＤ１−ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの動員を濃度依存的に強化することを示す。ほとんどの結合は、０．１μＭのＦｚ７−２１の存在下で見られた。対照的に、Ｆｚ７−２１は、ＦＺＤ４、すなわち、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及びＦＺＤ７が互いに共有するよりも、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、及びＦＺＤ７との低い配列類似性を共有するＦＺＤ上のＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合に対して、かかる効果を有していなかった。ＦＺＤ１−ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合はまた、約０．５μＭを下回る濃度でｄＦｚ７−２１の存在下で増加し（図２２Ｂ）、ほとんどの結合は、０．０５μＭのｄＦｚ７−２１の存在下で見られた。ｄＦｚ７−２１は、ＦＺＤ４上のＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合に対して、かかる効果を有していなかった。Ｆｚ７−２１Ｓは、試験したＦＺＤ  ＣＲＤのうちのいずれへのＷｎｔ５ａの結合に対しても効果を有していなかった（図２２Ｃ）。
【０２６２】
同様の結果は、Ｗｎｔ３ａを使用して観察された。図２２Ｄ〜２２Ｆを参照されたい。ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ３ａの結合は、約０．５μＭを下回る濃度でＦｚ７−２１の存在下で増加し（図２２Ｄ）、ほとんどの結合は、０．０５μＭ〜０．１μＭのｄＦｚ７−２１の存在下で見られた。ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ３ａの結合は、約０．５μＭを下回る濃度でｄＦｚ７−２１の存在下で増加し（図２２Ｅ）、ほとんどの結合は、０．０１μＭ〜０．０５μＭのｄＦｚ７−２１の存在下で見られた。Ｆｚ７−２１もｄＦｚ７−２１も、ＦＺＤ４  ＣＲＤへのＷｎｔ３ａ結合に対していかなる効果も有していなかった。Ｆｚ７−２１Ｓは、試験したＦＺＤ  ＣＲＤのうちのいずれかに対するＷｎｔ３ａの結合に対する効果を有していなかった（図２２Ｆ）。
【０２６３】
図２２Ａ〜２２Ｆの値は、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。全てのアッセイは、１％  ＤＭＳＯ最終濃度で行った。
【０２６４】
ＦＺＤ１  ＣＲＤ、ＦＺＤ２  ＣＲＤ、及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔの結合に対するＦｚ７−２１及びｄＦｚ７−２１の驚くべき効果を考慮して、上記のアッセイを繰り返して、ＦＺＤ４  ＣＲＤ及びＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの結合に対する表１７に列挙されたＦｚ７−２１由来ペプチド二量体の効果を試験した。試験した全てのＦｚ７−２１由来ペプチド二量体は、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａの動員を阻害した。図２３Ａ〜２３Ｊ。Ｆｚ７−２１由来ペプチド二量体は、ＦＺＤ４  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａ結合に対する効果を有していなかった。図２３Ｋ及び２３Ｌ。Ｆｚ７−２１Ｓは、試験したＦＺＤ  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａ結合に対する効果を有していなかった。図２３Ａ〜２３Ｌ。要約すると、出願人は、驚くべきことに、各々が疎水性の非天然アミノ酸の存在によってｄＦｚ７−２１とは異なる、Ｆｚ７−２１由来ペプチド二量体が、ＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａ動員を阻害することを示した。かかる結果は、ＦＺＤ７  ＣＲＤへの表１７に列挙したＦｚ７−２１由来ペプチド二量体の結合が、アポ構造中の屈曲形態から伸長形態へとＦＺＤ７  ＣＲＤの脂質結合空洞を改変することを示唆し（図１２Ａ及び１２Ｂを参照）、これは各Ｆｚ７−２１由来ペプチド二量体中に存在する非天然のアミノ酸の疎水性部分が、伸長した脂質結合溝に浸透し、したがってＦＺＤ７  ＣＲＤへのＷｎｔ５ａ結合を遮断するのを可能にする。
【０２６５】
実施例６：実施例７の材料及び方法
試薬及び組み換えタンパク質
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓ［Ｇｌｎ３３−Ｇｌｙ１６８］を、ＥｎｄｏＨを発現するＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞中で分泌タンパク質として発現させ、Ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎで処理した。次いで、以前に記載されたように、標準Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した２０。ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ−Ｈｉｓ［Ａｌａ２７−Ａｌａ１５５］は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞中で分泌タンパク質として発現し、次いでＢｏｕｒｈｉｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ８．Ｗｎｔ３ａ．ＬＲＰ６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｗｎｔ  ａｎｄ  Ｄｋｋ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  ＬＲＰ６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，９１７２−９（２０１０）に記載されるように、標準Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０２６６】
Ｘ線結晶学
Ｃ２４結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ−Ｈｉｓを精製し、緩衝液を１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に交換した後、遠心分離によって２５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（カタログ番号ＵＦＣ９００３２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５）。タンパク質を、２．２Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）を含有するリザーバー溶液と混合し（１：１）、蒸気拡散によって１９℃でインキュベートした。回折データを、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ（ＳＳＲＬ）１２−２において収集し、２．２０Å分離度での分子置換により解析した。ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ−Ｈｉｓを精製し、緩衝液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に交換した後、遠心分離によって約８ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。タンパク質を、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム三塩基性脱水物（ｐＨ５．５）、２２％のポリエチレングリコール３３５０を含有するリザーバー溶液で、１：１で混合し、蒸気拡散によって１９℃でインキュベートした。０．１％のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＢＯＧ）を、ＦＺＤ５  ＢＯＧ共結晶のための結晶化媒質に含めた。パルミトール酸とのＦＺＤ５  ＣＲＤ共結晶のために、後者を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０％  ＤＭＳＯを含有するｐＨ８．０緩衝液中のストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）として調製し、次いでＦＺＤ５  ＣＲＤと混合した（１：１）。共結晶化は、上記のようにタンパク質−脂肪酸複合体をリザーバー溶液と混合することによって（１：１）セットアップした。リザーバー溶液はまた、０．１％のパルミトール酸を含有していた。ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ：Ｃ１６：１ｎ−７及びｈＦＺＤ５  ＣＲＤ：ＢＯＧ結晶についての回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）ビームライン５．０．１において収集し、それぞれ２．１０Å及び２．２０Å分離度での分子置換により解析した。統計は、補足表１において入手可能である。
【０２６７】
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ疎水性空洞表現
ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ内の疎水性空洞を視覚化するために、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ（ＰＤＢ  ＩＤ＃Ｆ４０Ａ）と複合した２つのＸＷｎｔ８分子を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズム及びＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを用い、ＵＣＳＦキメラにおけるＭａｔｃｈＭａｋｅｒユーティリティを使用して各ｈＦＺＤ８  ＣＲＤ二量体対の上に重畳した。ＢＯＧに結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤまたはＣ２４脂肪酸に結合したＣ１６１ｎ−７及びｈＦＺＤ７  ＣＲＤについて、それらそれぞれのリガンドを使用して、疎水性空洞を定義した。連続疎水性表面を、約５Åの結合したリガンド内で特定し、空洞の疎水性に従って視覚化した。
【０２６８】
インシリコＦＺＤ  ＣＲＤ二量体界面分析
図を、ＵＣＳＦキメラ視覚化スイート（バージョン１．１１）を使用して生成した。二量体界面エネルギー論を、Ａｍｂｅｒ１０：ＥＨＴ力場及びＢｏｒｎ溶媒和と共に位置エネルギーユーティリティを使用して、ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ；バージョン２０１７．０５）において演算した。力場からのエネルギー値は、ｋｃａｌ／ｍｏｌで報告され、実際に結合する自由エネルギーを反映するようにスケーリングしていない。Ｃｏｎｎｏｌｌｙ表面間の相補性を、Ｓｃアルゴリズムの実装を使用してランク付けし、これは１．５Åの表面の縁部内の表面を無視する（ワールドワイドウェブ−ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ／ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒｓ／ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ３９／０２＿ｓｃ．ｈｔｍｌ）。計算前に、結晶学的モデルを、Ｐｒｏｔｏｎａｔｅ  ３Ｄを使用してプロトン化し、水素置換を最適化した（ＭＯＥバージョン２０１７．０５）。ＵＣＳＦキメラスイート（バージョン１．１１）内のＭａｔｃｈＭａｋｅｒユーティリティを使用し、示された構造の整列及び重畳された各残基のα炭素を使用して、平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を計算した。
【０２６９】
実施例７：Ｆｚ７−２１ペプチド誘導体
ＦＺＤ受容体は、骨成長から幹細胞活性に至る多様なプロセスにおいて、Ｗｎｔシグナル伝達を媒介する。しかし、本明細書で報告された結晶構造が発明されるまで、ＦＺＤ受容体のＣＲＤによるＷｎｔ  ｃｉｓ不飽和脂肪アシル基の認識についての分子的基盤は、捉えられないままであった。この実施例は、Ｃ１６：１  ｃｉｓ−Δ９不飽和脂肪酸に結合したヒトＦＺＤ５  ＣＲＤの最初の結晶構造を示す。予想外に、Ｃ２４脂肪酸に結合したヒトＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造もまた得られた。両方の構造は、ＣＲＤの保存された新規二量体配置を共有する。脂質結合溝は、両方の単量体に及び、脂肪酸を収容するＵ形幾何形状を採用する。マウスＦＺＤ８  ＣＲＤ構造は、ＦＺＤ５及びＦＺＤ７  ＣＲＤと同じアーキテクチャも共有することを明らかにする。この実施例は、複数のＦＺＤ受容体によってＷｎｔ  ｃｉｓ−不飽和脂肪アシル基を認識するための一般機序を示し、特異的ＦＺＤ受容体阻害剤の開発を助ける。
【０２７０】
この実施例の実験の初期目標は、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造を決定することであった。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ（残基Ｇｌｎ３３〜Ｇｌｙ１６８）が発現され、昆虫細胞中の可溶性分泌タンパク質として精製された。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤのＸ線結晶構造は、分子置換によって解析され、２．２０Åの分離度に精密化された（表１８を参照）。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤは、結晶学的非対称単位を含む２つのプロトマー（鎖Ａ及びＢ）の間のαらせん二量体界面を有する、ホモ二量体配置を採用した。予想外に、脂質結合空洞内の追加の電子密度が観察され、遊離脂肪酸分子（Ｃ２４）の特徴に類似した伸長形状を示す。かかる脂肪酸は、恐らくは昆虫細胞発現宿主に源を発していた。観察された電子密度は、脂肪酸のカルボキシレート基が、１つの単量体中に存在するが（鎖Ａ）、炭化水素鎖のメチル末端は、他の単量体中に存在することを示した（図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、及び２９Ｄ）。ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体中の各単量体は、親油性溝を含有していた。２つの脂質結合溝は、二量体界面で遭遇し、連続する屈曲した（Ｕ形）空洞を形成する（図２９Ｂ及び２９Ｃ）。Ｃ２４に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体のほぼ厳密な非結晶学的対称（ＮＣＳ）二重配置にもかかわらず、ＣＲＤ二量体中の親油性溝の内部構造において重要な差異があり、これはＣ２４脂肪酸の内因性非対称によって誘導される可能性がある（全１１８原子対にわたって０．８４７Åの鎖Ａ対鎖Ｂ  ｒ．ｍ．ｓ偏差、図２８Ａ及び２８Ｂを参照）。とりわけ、脂質結合溝の内面を覆う２つの重要な残基であるＰｈｅ１３８及びＰｈｅ１４０は、鎖ＡとＢとの間に異なる側鎖回転体を採用し、それにより非対称脂肪酸を結合するための非対称トンネルを提示する（図２８Ｂを参照）。追加として、脂肪酸は、Ｕ形脂質結合空洞内に主に埋め込まれるように思われ、Ｃ９〜Ｃ１３は、疎水性空洞の基部に位置付けられる（図２９Ｃ及び２８Ｂ）。
表１８
2019534858.tif 000023
2019534858.tif 000024
【０２７１】
異なる結晶化条件下、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤの結晶構造も得られ、これはＣ２４結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの構造において観察されたものと同様の二量体構成及び脂質結合溝幾何形状を示した。興味深いことに、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤは今回、発現宿主から発生する任意の内因性脂肪酸の不在下で結晶化した。アポ及び脂質結合構造の両方が良好に重畳したが（全ての１１７原子対にわたって０．９７９Åのｒ．ｍ．ｓ偏差、図２８Ｃを参照）、いくつかの重要な立体構造変化があり、これらは脂質結合構造中で明らかであった。例えば、Ｔｙｒ８７及びＰｈｅ１３８（図２９Ｄ）などの疎水性空洞を覆う残基の側鎖配向が改変され、脂質結合空洞が、可撓性であり、可変鎖長の脂肪酸を収容し得ることを示唆する。これらの発見は、Ｗｎｔタンパク質が１３〜１６個の炭素鎖脂肪アシル基を組み込むことを示す、以前の生化学データと一致し、説明する。（Ｇａｏ，Ｘ．＆Ｈａｎｎｏｕｓｈ，Ｒ．Ｎ．Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １０，６１−６８（２０１４）。最後に、Ｃ２４のカルボキシレート基が、Ｔｙｒ７６への、水分子によって媒介された水素結合によって係留されたことは特筆に値する（図２９Ｄ）。ＦＺＤファミリーメンバーにわたるＴｙｒ７６の高度の配列保存を考慮して、この相互作用は、ＦＺＤ受容体による遊離脂肪酸の認識のための、潜在的分子機序を強調する。Ｔｙｒ７６がまた、細胞外ＦＺＤ様ＣＲＤを含有し（Ｓｈａｒｐｅ，Ｈ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｈａｎｎｏｕｓｈ，Ｒ．Ｎ．＆ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ，Ｆ．Ｊ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １１，２４６−５５（２０１５））、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールのヒドロキシル基との有極接点を形成する（Ｈｕａｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ  ｉｎ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １６６，１１７６−１１８７．ｅ１４（２０１６））、平滑化（ＳＭＯ）ヘッジホッグ経路受容体内に保存されることも記録に値する。注目すべきことには、後者の分子は、遊離脂肪酸がＦＺＤ７  ＣＲＤ構造内で結合し得る同じ位置でＳＭＯの疎水性溝内で結合した（図３０Ａ）。
【０２７２】
ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ：Ｃ２４複合体構造、特に二量体界面の周りの脂質結合溝のＵ形幾何形状及び脂肪酸のその非対称認識における上記の予想外の観察は、他のＦＺＤ  ＣＲＤが、Ｗｎｔタンパク質上に存在する生理学的に関連した脂質であるＣ１６：１  ｃｉｓ−Δ９不飽和脂肪酸（Ｃ１６：１ｎ−７）にどのように結合するかの更なる検討を促進した。ＦＺＤ５  ＣＲＤ、または不飽和脂肪酸と複合した任意の他のＦＺＤ  ＣＲＤに関する構造は報告されていない。ＦＺＤ５  ＣＲＤは、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８  ＣＲＤに対する進化的近位性を呈する（図７）。したがって、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ（残基Ａｌａ２７〜Ａｌａ１５５）は、昆虫細胞中の可溶性分泌タンパク質として発現され、ほぼ均質まで精製された。ｈＦＺＤ５  ＣＲＤを、Ｃ１６：１ｎ−７脂肪酸と複合して供結晶化した。複合体の得られたＸ線結晶構造は、分子置換によって解析され、２．１０Åの分離度に精密化された（表１８を参照）。結晶学的非対称単位は、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤの２つの単量体からなっていた（図３１）。
【０２７３】
ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ構造及び結晶学対称合致の検査は、アポｈＦＺＤ７  ＣＲＤ及びＣ２４に結合したｈＦＺＤ７  ＣＲＤの構造において観察されたものと同様である、追加のタンパク質−タンパク質界面（鎖Ａホモ二量体）を明らかにした（図３２Ａ及び３２Ｂ）ならびに図３１）。２つの脂質結合溝があり、各々が１つの単量体から発生し、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ二量体構造において観察されたものと同様の、連続したＵ形空洞を形成した。結合したＣ１６：１ｎ−７脂肪酸を、２倍軸上のその特別な位置に起因して、その構造において５０％占有率で精密化され、これは疎水性空洞内での１００％占有率に相当する。脂肪酸は、脂質結合溝内でいずれかの方向に結合し得、カルボキシレート頭部基は、Ｔｒｐ４６及びＧｌｎ４４残基の近位に位置付けられる（図３２Ｃ）。注目すべきことに、炭化水素鎖内の「よじれた」ｃｉｓ−Δ９不飽和部位（Ｃ９〜Ｃ１０）は、残基Ｉｌｅ５１及びＴｒｙ９８付近のＵ形脂質結合空洞の基部に位置していた（それぞれｈＦＺＤ７  ＣＲＤ内のＶａｌ９２及びＰｈｅ１３８）（図３２Ｃ）。したがって、本明細書に開示されたＣ１６：１ｎ−７と複合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤの結晶構造は、脂質結合空洞の幾何形状の先例のない原子分離度図、及び遊離不飽和脂肪酸をどのように収容するかを明らかにし、潜在的に、Ｗｎｔタンパク質上のｃｉｓ−不飽和脂肪アシルに対するＦＺＤ受容体ＣＲＤの選好的結合を説明する。
【０２７４】
最後に、アポｈＦＺＤ５  ＣＲＤの結晶構造を決定する実験を行った。しかしながら、この場合、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤは、最適な結晶化緩衝液中に存在するｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（ＢＯＧ）の存在下で結晶化した（２．２Å分離度）。興味深いことに、ＢＯＧリガンドは、５０％占有率でｈＦＺＤ５  ＣＲＤの疎水性空洞内で結合した（図３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ、及び３４Ｄ、ならびに表１８）。全体として、ＢＯＧが結合したｈＦＺＤ５  ＣＲＤ構造は、らせん−らせん二量体界面、Ｕ形脂質結合空洞、及び疎水性空洞内のリガンドの位置付けに関して、Ｃ１６：１ｎ−７と複合したＦＺＤ５  ＣＲＤ（１１９残基にわたって０．１３４のｒ．ｍ．ｓ偏差、図３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ、及び３４Ｄ）ならびにＣ２４と複合したＦＺＤ７  ＣＲＤと非常に類似していた。
【０２７５】
アポｈＦＺＤ７、ｈＦＺＤ７  ＣＲＤ：Ｃ２４、ｈＦＺＤ５  ＣＲＤ：Ｃ１６：１ｎ−７、及びｈＦＺＤ５  ＣＲＤ：ＢＯＧの間の構造的類似性、特に二量体構成及び脂質結合溝アーキテクチャ、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤの公開された結晶学的データに基づいて、最も進化的に保存されたＦＺＤ  ＣＲＤを再検討した（ＰＤＢ  ＩＤ＃１ＩＪＹ）（Ｄａｎｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｗｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６−９０（２００１）（図７）。対称合致分析は、ＦＺＤ７及びＦＺＤ５  ＣＲＤの両方と同一の二量体構成を示した（図３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、及び３５Ｄ）。Ｄａｎｎらは、分泌ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質３（ｓＦＲＰ３）に対するその類似性、及び二量体界面を媒介したループ−ループ領域間のその好ましい相補性スコアに基づいて、非対称単位を割り当てた（Ｄａｎｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｗｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６−９０（２００１）。発表時には、Ｗｎｔのｃｉｓ−不飽和脂肪アシル化状態も、ＦＺＤ  ＣＲＤへのその脂肪酸媒介型結合も知られておらず（Ｊａｎｄａ，Ｃ．Ｙ．，Ｗａｇｈｒａｙ，Ｄ．，Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．＆Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４（２０１２）、Ｔａｋａｄａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｗｎｔ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  １１，７９１−８０１（２００６）、Ｕ形脂質結合空洞についての手がかりを提供しない。エネルギー及び相補性スコアに基づいて、本明細書で開示されたインシリコ分析は（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｃ．＆Ｃｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４，９４６−９５０（１９９３））、らせん−らせん（ＦＺＤ７様）二量体界面を、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ二量体内の潜在的生物学的界面として支持する（図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ、３６Ｅ、３６Ｆ、３６Ｇ、及び３６Ｈ）。計算的に、ループ−ループ及びらせん−らせん二量体界面の両方は、それらの相補性スコアにおいて同様であるが、らせん−らせん二量体界面は、ｈＦＺＤ７及びｍＦＺＤ８  ＣＲＤの両方のループ−ループ界面と比較して、エネルギー的により好ましい（図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃ、３６Ｄ、３６Ｅ、３６Ｆ、３６Ｇ、及び３６Ｈ）。
【０２７６】
いくつかの証拠は、Ｕ形脂質結合溝を有するらせん−らせん二量体界面構成が、以下の観察に基づいて、生物学的単位である可能性があるという考えを支持する：（ａ）脂肪酸の結合モードが、２つの異なるＦＺＤ  ＣＲＤ構造（ＦＺＤ５及び７）間で一致し、異なる条件下で独立して結晶化し、炭化水素脂肪アシル鎖が、両方のＦＺＤ  ＣＲＤ単量体上の２つの脂質結合溝に同時に及ぶことを明らかにし、１つの単量体上にカルボン酸端部、及び他方の単量体上に炭化水素鎖のメチル端部がある。（ｂ）ＦＺＤ７及び８ファミリーメンバーにわたるらせん二量体界面の保存（図３７Ａ及び３７Ｂ）、ならびに（ｃ）本研究において示される複数のＦＺＤファミリーメンバーにわたる「よじれた」疎水性空洞の構造的類似性及び保存（図３５Ｄ）。追加の研究が、観察された二量体幾何形状の機能的関連、ならびにインビトロ及びインビボ両方の脂質結合空洞の調節を探究するために必要である。それにもかかわらず、本明細書で開示された構造研究は、単一脂肪酸によって占有される連続した疎水性脂質結合空洞に対する強制的支持を提供する。
【０２７７】
本研究において提示された構造データに基づいて、ＦＺＤ  ＣＲＤとのＷｎｔ相互作用についての分子モデルが提案される。Ｗｎｔ脂肪アシル基は、ＦＺＤ  ＣＲＤのＵ形脂質結合空洞を占有し、「よじれた」ｃｉｓ−Δ９不飽和部位は、空洞の基部に位置付けられる（図３５Ｅ及び図３８Ａ、３８Ｂ、及び３８Ｃ）。本研究において報告されたｈＦＺＤ５  ＣＲＤの、ＸＷｎｔ８に結合した公開済みのｍＦＺＤ８  ＣＲＤ構造との重畳は（Ｊａｎｄａ，Ｃ．Ｙ．，Ｗａｇｈｒａｙ，Ｄ．，Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．＆Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４（２０１２））、単一のＸＷｎｔ８から発生するｃｉｓ−不飽和脂肪アシル鎖が、両方の脂質結合空洞を同時に占有し得、それによりｈＦＺＤ５  ＣＲＤ二量体界面を架橋することを示す（図３８Ａ、３８Ｂ、及び３８Ｃ）。同じことは、ＦＺＤ７及びＦＺＤ８  ＣＲＤ二量体についても真であり、それによりＷｎｔ−ＦＺＤ  ＣＲＤ相互作用について１：２の化学量論を示す。これは、ＸＷｎｔ８に結合した公開済みのｍＦＺＤ８  ＣＲＤ構造で描かれる１：１の化学量論とはかなり異なる（Ｊａｎｄａ，Ｃ．Ｙ．，Ｗａｇｈｒａｙ，Ｄ．，Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．＆Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４（２０１２）。この後者の場合において、脂質結合溝は、溶媒曝露配向であり（これは好ましくない）、１６炭素脂肪アシル鎖を完全に埋め込まない（Ｊａｎｄａ，Ｃ．Ｙ．，Ｗａｇｈｒａｙ，Ｄ．，Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ．＆Ｇａｒｃｉａ，Ｋ．Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，５９−６４（２０１２））（図３８Ａ、３８Ｂ、及び３８Ｃ）。Ｆｃ断片を含有していた本研究で使用されるＸＷｎｔ８−ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ融合構築体は、好ましいＦＺＤ  ＣＲＤ二量体形成を有しない場合があると考えられ、それにより観察された矛盾についての説明を提供する。また、著者が、存在した脂質がパルミトレイン酸であったか、または飽和パルミチン酸であったかを明白に決定できなかったことに注目することは興味深い。実際に、ＸＷｎｔ８−ｍＦＺＤ８  ＣＲＤ構造においてモデル化された脂肪アシル鎖は、驚くべきことに、分離度は低いが、一不飽和脂肪酸から予想するように、よじれているのではなく直鎖状であり（図３８Ａ）、そうであるなら、かかる脂質の存在は、ＦＺＤ  ＣＲＤ二量体化を排除するであろう。それにもかかわらず、本明細書で提案されたＷｎｔ−ＦＺＤ  ＣＲＤ  １：２化学量論は、Ｗｎｔタンパク質が、その不飽和脂肪アシル基を通して、ＦＺＤ  ＣＲＤ二量体化の促進を助け得ることを示唆し、それにより細胞表面でのＦＺＤ受容体クラスタリングを強化し、後の下流シグナロソームアセンブリを促進する（Ｂｉｅｎｚ，Ｍ．Ｓｉｇｎａｌｏｓｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｈ���ａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ３９，４８７−９５（２０１４））。
【０２７８】
結論として、遊離脂肪酸と複合した２つのＦＺＤ  ＣＲＤ（ＦＺＤ５及びＦＺＤ７）の最初の結晶構造が本明細書で報告され、不飽和脂肪酸がどのようにＦＺＤ  ＣＲＤと相互作用し得るかについての長く探求されてきた構造的根拠を提供する。これらの研究は、脂質結合溝が可撓性であり、両方のＣＲＤ単量体に同時に結合する単一の脂肪酸を収容することを明らかにする。以前に公開された構造を再検討した際に（Ｄａｎｎ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｗｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６−９０（２００１））、ｍＦＺＤ８  ＣＲＤはまた、本明細書で報告されたｈＦＺＤ７及びｈＦＺＤ５  ＣＲＤと同様の、αらせん二量体界面及び連続したＵ形脂質結合空洞を含めた構造特徴を共有することが見いだされ、結果としてその構造内の二量体の解釈に立ち戻った。合わせて、本実施例で提供された実験的データは、ｃｉｓ−不飽和脂肪酸の認識のための複数のＦＺＤ  ＣＲＤの一般機序を示唆し、Ｗｎｔがｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体とどのように相互作用し、ｃｉｓ−不飽和脂肪アシル基を介したその二量体化を促進し得るかについての分子像を提供する。最後に、本明細書における発見は、新たに発見された二量体界面、ならびに脂質結合溝構成及びその可撓性を利用することによって、特異的ＦＺＤ  ＣＲＤ受容体サブクラスを標的とするための薬理学的戦略の開発を促進し得る。
【０２７９】
成体腸上皮の再生は、陰窩の基部に位置する、ロイシンリッチ反復を含有するＧ−タンパク質共役受容体５（Ｌｇｒ５）を発現する、環化幹細胞のプールによって媒介される。１０の哺乳動物ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）受容体の中で、ＦＺＤ７は、Ｌｇｒ５＋腸幹細胞内で富化され、それらの自己再生において重要な役割を果たす。最近の研究は、ＦＺＤ７が、幹細胞不全に関連した疾患に対する潜在的な薬理学的標的であり得ることを示唆するが、選択的ＦＺＤ阻害についてのアプローチ及び構造基盤は、依然として十分に定義されないままである。ＦＺＤは、ＦＺＤシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）内に位置する脂質結合溝を介して、それらの脂肪アシル基に部分的に結合することによって、Ｗｎｔタンパク質と相互作用する。ここで、ＦＺＤ７  ＣＲＤに結合し、その脂質結合溝のアーキテクチャを改変する高度に有力な選択的ペプチドを特定する。ＦＺＤ７結合ペプチドでの処理は、Ｗｎｔシグナル伝達を障害し、主に腸オルガノイドの幹細胞区画において発現される遺伝子を下方調節した。本明細書におけるデータに従い、脂質溝結合機序は、アイソフォーム選択的ＦＺＤ阻害の基礎として役立ち、腸幹細胞内のＦＺＤ７  ＣＲＤ脂質結合溝幾何形状に対する役割を果たす。
【０２８０】
前述の実施例は、例示目的のためのみに提供されており、決して、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。本明細書に示され、かつ記載される修正に加えて、本発明の様々な修正が前述の記述から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019534858.tif 000109
2019534858.tif 000110
2019534858.tif 000111