(57)【要約】本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステム、組成物および方法を提供する。本システム、組成物および方法は、キメラ受容体ポリペプチド、キメラアダプターポリペプチド、少なくとも1つのアクチュエータモエティおよび切断モエティを含む。2019500887.tif 000075
2019500887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムであって、
(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド;
(b) 該受容体修飾に応答して該受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド;
(c) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む遺伝子調整ポリペプチド(GMP)であって、該切断認識部位の切断の際に該アクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、GMP; および
(d) 該切断認識部位に近接している場合に該切断認識部位を切断する、切断モエティ
を含み、
ここで: 
(i) 該GMPが該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ該切断モエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する;
(ii) 該GMPが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該切断モエティが該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する; または
(iii) 該切断モエティが、該受容体修飾に応答して該キメラ受容体ポリペプチドに結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該GMPが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する、
前記システム。
【請求項２】
受容体がSEQ ID NO: 39を含まない、請求項1記載のシステム。
【請求項３】
標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項1記載のシステム。
【請求項４】
標的ポリヌクレオチドがRNAである、請求項1記載のシステム。
【請求項５】
修飾がリン酸化である、請求項1記載のシステム。
【請求項６】
アクチュエータモエティがCasタンパク質であり、かつ前記システムが、Casタンパク質と複合体を形成するために活性なガイドRNAをさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項７】
(i) アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)であり、かつ (ii) 前記システムが、該ガイドRNAと複合体を形成することができるCasタンパク質をさらに含む、請求項1記載のシステム。
【請求項８】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項6または7記載のシステム。
【請求項９】
(i) GMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) 切断認識部位の切断が、キメラアダプターポリペプチドを受容体から放出するのに有効であり、かつ (iii) 前記システムが、修飾された受容体に結合するGMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１０】
受容体修飾が複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾部位が、アダプターポリペプチドに結合するのに有効である、請求項1記載のシステム。
【請求項１１】
切断認識部位がポリペプチド配列を含み、かつ切断モエティがプロテアーゼ活性を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１２】
切断認識部位がジスルフィド結合を含み、かつ切断モエティが酸化還元酵素活性を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１３】
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１４】
受容体が膜貫通受容体である、請求項1記載のシステム。
【請求項１５】
受容体が核内受容体である、請求項1記載のシステム。
【請求項１６】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、請求項1記載のシステム。
【請求項１７】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、請求項1記載のシステム。
【請求項１８】
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、請求項1記載のシステム。
【請求項１９】
キメラ受容体ポリペプチドが、細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、請求項1記載のシステム。
【請求項２０】
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へ受容体を輸送させる、請求項19記載のシステム。
【請求項２１】
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、請求項19記載のシステム。
【請求項２２】
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、請求項19記載のシステム。
【請求項２３】
キメラアダプターポリペプチドが、細胞の特定の領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、請求項1記載のシステム。
【請求項２４】
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へキメラアダプターポリペプチドを輸送させる、請求項23記載のシステム。
【請求項２５】
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、請求項23記載のシステム。
【請求項２６】
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、請求項23記載のシステム。
【請求項２７】
受容体がポリペプチド折畳みドメインに連結される、請求項1記載のシステム。
【請求項２８】
キメラアダプターポリペプチドが、ポリペプチド折畳みドメインに連結される、請求項1記載のシステム。
【請求項２９】
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、
(a) キメラ受容体ポリペプチドを抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 抗原への曝露の際に受容体が修飾され、かつ (ii) 受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、段階;
(b) 該受容体修飾に応答してキメラアダプターポリペプチドを該キメラ受容体ポリペプチドに結合させて、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)と切断モエティとの間で複合体を形成させる段階であって、ここで該GMPは切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、段階; および
(c) 該切断認識部位を該切断モエティによって切断する段階であって、ここで該切断認識部位の切断の際に該アクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成し、それにより細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、段階
を含み;
ここで: 
(i) 該GMPが該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ該切断モエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する;
(ii) 該切断モエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該GMPが該キメラ受容体の細胞内領域の一部分を形成する; または
(iii) 該切断モエティが、該受容体修飾に応答して該受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該GMPが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する、
前記方法。
【請求項３０】
受容体がSEQ ID NO: 39を含まない、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
標的ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
標的ポリヌクレオチドがRNAである、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
修飾がリン酸化である、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
アクチュエータモエティが、Casタンパク質と複合体を形成するガイドRNAと複合体形成したRNA結合タンパク質(RBP)である、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項34または35記載の方法。
【請求項３７】
(i) GMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) 該キメラアダプターポリペプチドが、切断認識部位の切断後に受容体から放出され、かつ (iii) GMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドが、修飾された受容体に結合する、請求項29記載の方法。
【請求項３８】
受容体修飾が複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾部位が、キメラアダプターポリペプチドに結合するのに有効である、請求項29記載の方法。
【請求項３９】
切断認識部位がポリペプチド配列を含み、かつ切断モエティがプロテアーゼ活性を含む、請求項29記載の方法。
【請求項４０】
切断認識部位がジスルフィド結合を含み、かつ切断モエティが酸化還元酵素活性を含む、請求項29記載の方法。
【請求項４１】
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、請求項29記載の方法。
【請求項４２】
受容体が膜貫通受容体である、請求項29記載の方法。
【請求項４３】
受容体が核内受容体である、請求項29記載の方法。
【請求項４４】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、請求項29記載の方法。
【請求項４５】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、請求項29記載の方法。
【請求項４６】
キメラ細胞内受容体であって、
(a) 抗原に特異的に結合する抗原相互作用ドメイン; および
(b) 抗原相互作用ドメインに連結されたアクチュエータモエティ
を含み、
ここで: 
(i) キメラ細胞内受容体が抗原結合に応答して修飾され; 
(ii) キメラ受容体ポリペプチドが、修飾に応答して細胞の核に移動し; かつ
(iii) アクチュエータモエティが、核内の標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、
前記受容体。
【請求項４７】
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、請求項46記載のシステム。
【請求項４８】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項47記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項４９】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、請求項46記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５０】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、請求項46記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５１】
抗原がホルモンである、請求項46記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５２】
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、請求項46記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５３】
細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、請求項46記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５４】
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、またはペルオキシソームへ受容体を輸送させる、請求項53記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５５】
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、請求項53記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５６】
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、請求項53記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５７】
受容体がポリペプチド折畳みドメインに連結される、請求項46記載のキメラ細胞内受容体。
【請求項５８】
核を含む細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法であって、
(a) キメラ細胞内受容体を抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 該受容体が抗原相互作用ドメインおよびアクチュエータモエティを含み、かつ (ii) 該抗原への曝露の際に該受容体が修飾される、段階;
(b) 該修飾された受容体を核に移動させる段階; ならびに
(c) アクチュエータモエティと標的ポリヌクレオチドとの間で複合体を形成する段階
を含む、前記方法。
【請求項５９】
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６３】
抗原がホルモンである、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
(a) 抗原相互作用ドメイン; および
(b) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む遺伝子調整ポリペプチド(GMP)
を含み、
ここで: 
(i) キメラ受容体ポリペプチドが抗原結合に応答して修飾され; 
(ii) 切断認識部位が、キメラ受容体ポリペプチドの修飾に応答して切断モエティにより切断され; 
(iii) アクチュエータモエティが切断認識部位でキメラ受容体ポリペプチドから切断された後に、標的ポリヌクレオチドと複合体形成し; かつ
(iv) キメラ受容体ポリペプチドが、SEQ ID NO: 39を含まない、
キメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６５】
切断認識部位が、抗原相互作用ドメインとアクチュエータモエティとに挟まれている、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６６】
抗原相互作用ドメインが、キメラ受容体ポリペプチドの細胞外領域の一部分を形成し、かつGMPが、該キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６７】
アクチュエータモエティが、切断認識配列の切断後に細胞核に移動する、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６８】
抗原結合に応答して細胞核に移動する核内受容体である、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項６９】
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７０】
アクチュエータモエティが、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)である、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７１】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項69または70記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７２】
切断認識部位が、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含む、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７３】
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７４】
切断認識部位がジスルフィド結合を含む、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７５】
膜貫通受容体である、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７６】
核内受容体である、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７７】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７８】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項７９】
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８０】
細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８１】
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へ受容体を輸送させる、請求項80記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８２】
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、請求項80記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８３】
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、請求項80記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８４】
ポリペプチド折畳みドメインに連結される、請求項64記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項８５】
(a) 抗原に結合する際に修飾を受けた受容体に結合する受容体結合モエティ; および
(b) 該受容体結合モエティに連結された遺伝子調整ポリペプチド(GMP)であり、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、GMP
を含み、
ここで: 
(i) 該切断認識部位が、受容体結合に応答して切断モエティにより切断可能であり; かつ
(ii) 該アクチュエータモエティが、該切断認識部位の切断に応答して標的ポリヌクレオチドと複合体形成するように作動可能である、
キメラアダプターポリペプチド。
【請求項８６】
アクチュエータモエティが、切断認識配列の切断後に細胞核に移動するように作動可能である、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項８７】
アクチュエータモエティが、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項８８】
アクチュエータモエティが、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)である、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項８９】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項87または88記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９０】
切断認識部位が、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含む、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９１】
切断認識部位が、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、該インテイン配列の第1部分を含む、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９２】
切断認識部位がジスルフィド結合を含む、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９３】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９４】
アクチュエータモエティが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９５】
アクチュエータモエティが、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９６】
アダプターポリペプチドが、細胞の特定の領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、請求項85記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９７】
標的指向配列が、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へアダプターを輸送させる、請求項96記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９８】
標的指向配列が、核外移行シグナル(NES)を含む、請求項96記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項９９】
標的指向配列が、形質膜を標的とするペプチドを含む、請求項96記載のキメラアダプターポリペプチド。
【請求項１００】
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムであって、
(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド;
(b) 該受容体修飾に応答して該受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド;
(c) ペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティであって、該ペプチド切断ドメインの切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて該標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティ; および
(d) 該ペプチド切断ドメインに近接している場合に該ペプチド切断ドメインを切断する切断モエティ
を含み、
ここで: 
(i) 該切断モエティが該受容体の細胞内部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; 
(ii) 該切断モエティが、該受容体修飾に応答して該受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; または
(iii) 該切断モエティが該アダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該受容体の細胞内部分を形成する、
前記システム。
【請求項１０１】
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムであって、
(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチド受容体であって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド;
(b) 該受容体修飾に応答して該受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド;
(c) ペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティであって、該ペプチド切断ドメインの切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて該標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティ; および
(d) 該ペプチド切断ドメインに近接している場合に該ペプチド切断ドメインを切断する組換えプロテアーゼドメイン
を含み、
ここで: 
(i) 該組換えプロテアーゼドメインが該受容体の細胞内部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; 
(ii) 該組換えプロテアーゼドメインが、該受容体修飾に応答して該受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し; または
(iii) 該組換えプロテアーゼドメインが該キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ該ペプチド切断ドメインに連結された該アクチュエータモエティが該受容体の細胞内部分を形成する、
前記システム。
【請求項１０２】
(a) 抗原に結合する細胞外抗原相互作用ドメイン;
(b) 膜貫通ドメイン; および
(c) Casタンパク質を含む細胞内遺伝子調整ドメイン
を含み、
ここで、ペプチド切断ドメインが該遺伝子調整ドメインのアミノ末端に位置し;
ここで、該抗原に該細胞外抗原相互作用ドメインが結合する際に、該遺伝子調整ドメインが、該ペプチド切断ドメインの切断によってキメラ受容体ポリペプチドから放出される、
前記キメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０３】
抗原に結合する際に受容体修飾を受ける、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０４】
膜貫通ドメインがNotch受容体タンパク質の一部分、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０５】
膜貫通ドメインが、SEQ ID NO: 39またはそのフラグメントに対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項104記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０６】
Casタンパク質がDNA切断活性を実質的に欠く、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０７】
Casタンパク質がCas9タンパク質である、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０８】
遺伝子調整ドメインが、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータドメインをさらに含む、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１０９】
遺伝子調整ドメインが、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効なリプレッサドメインをさらに含む、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１１０】
遺伝子調整ドメインが、該遺伝子調整ドメインが受容体から放出された後に細胞の特定の領域へ該遺伝子調整ドメインを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列をさらに含む、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１１１】
少なくとも1つの標的指向配列が、核局在化配列(NLS)を含む、請求項110記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１１２】
細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１１３】
ポリペプチド折畳みドメインに連結される、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【請求項１１４】
ペプチド切断ドメインが、プロテアーゼの認識配列を含む、請求項102記載のキメラ受容体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2016年1月11日付で出願された米国仮特許出願第62/277,322号、2016年6月17日付で出願された米国仮特許出願第62/351,522号、および2016年9月26日付で出願された米国仮特許出願第62/399,902号の恩典を主張するものであり、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞活性の調節は、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内(例えば、細胞質)シグナル伝達ドメインを含む膜結合受容体へのリガンドの結合を伴いうる。リガンドとリガンド結合ドメインとの間の複合体の形成は、受容体におけるコンフォメーション修飾および/または化学修飾を引き起こし、これが細胞内に伝達されるシグナルを引き起こしうる。いくつかの状況では、受容体の細胞質部分がリン酸化され(例えば、トランスリン酸化および/または自己リン酸化され)、その活性の変化を引き起こす。これらの事象は、二次メッセンジャーおよび/または補因子タンパク質の動員と連動されうる。ある場合には、細胞質部分の変化は、他のタンパク質(例えば、補因子タンパク質および/または他の受容体)への結合をもたらす。これらの他のタンパク質は、活性化され、次に細胞内でさまざまな機能を実行することができる。
【０００３】
条件付き遺伝子発現系は、1つまたは複数の標的遺伝子の条件付き調節を可能にする。薬物誘導性遺伝子発現系のような条件付き遺伝子発現系は、薬物の存在のような、刺激に応答した遺伝子発現の活性化および/または不活性化を可能にする。しかしながら、現在利用可能なシステムは、不正確な制御、不十分な誘導(例えば、遺伝子発現の活性化および/または不活性化)レベル、および特異性の欠如のために制限されうる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
上記を考慮して、例えば標的ポリヌクレオチドの発現を調節することにより、遺伝子発現の条件付き調節を行うための代替組成物および方法がかなり必要とされている。1つの局面において、本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムを提供する。いくつかの態様において、本システムは、(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド; (b) 受容体修飾に応答して受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド; (c)切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティであって、該切断認識部位の切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティを含む、遺伝子調整ポリペプチド(GMP); および(d) 切断認識部位に近接している場合に切断認識部位を切断する切断モエティを含み、ここで: (i) GMPがキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ切断モエティがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; (ii) GMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ切断モエティがキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する; または (iii) 切断モエティが、受容体修飾に応答してキメラ受容体ポリペプチドに結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつGMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。いくつかの態様において、受容体はSEQ ID NO: 39を含まない。
【０００５】
いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAである。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNAである。いくつかの態様において、修飾はリン酸化である。
【０００６】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティはCasタンパク質であり、かつシステムは、Casタンパク質と複合体を形成するために活性なガイドRNAをさらに含む。いくつかの態様において、(i) アクチュエータモエティは、ガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)であり、かつ(ii) システムは、ガイドRNAと複合体を形成することができるCasタンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。
【０００７】
いくつかの態様において、(i) GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) 切断認識部位の切断は、キメラアダプターポリペプチドを受容体から放出するのに有効であり、かつ(iii) システムは、修飾された受容体に結合するGMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドを含む。
【０００８】
いくつかの態様において、受容体修飾は複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾部位は、アダプターポリペプチドに結合するのに有効である。
【０００９】
いくつかの態様において、切断認識部位はポリペプチド配列を含み、かつ切断モエティはプロテアーゼ活性を含む。いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含み、かつ切断モエティは酸化還元酵素活性を含む。いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、インテイン配列の第1部分を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、受容体は膜貫通受容体である。いくつかの態様において、受容体は核内受容体である。
【００１１】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される。
【００１２】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される。いくつかの態様において、標的指向配列は、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へ受容体を輸送させる。いくつかの態様において、標的指向配列は、核外移行シグナル(NES)を含む。いくつかの態様において、標的指向配列は、形質膜を標的とするペプチドを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、細胞の特定の領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される。いくつかの態様において、標的指向配列は、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へキメラアダプターポリペプチドを輸送させる。いくつかの態様において、標的指向配列は、核外移行シグナル(NES)を含む。いくつかの態様において、標的指向配列は、形質膜を標的とするペプチドを含む。
【００１４】
いくつかの態様において、受容体はポリペプチド折畳みドメインに連結される。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、ポリペプチド折畳みドメインに連結される。
【００１５】
1つの局面において、本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(a) キメラ受容体ポリペプチドを抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 抗原への曝露の際に受容体が修飾され、かつ (ii) 受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、段階; (b) 受容体修飾に応答してキメラアダプターポリペプチドをキメラ受容体ポリペプチドに結合させて、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)と切断モエティとの間で複合体を形成させる段階であって、ここでGMPは切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、段階; および (c) 切断認識部位を切断モエティによって切断する段階であって、ここで切断認識部位の切断の際にアクチュエータモエティが標的ポリヌクレオチドと複合体形成し、それにより細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する段階を含み; ここで: (i) GMPがキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ切断モエティがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; (ii) 切断モエティがキメラアダプターポリペプチドの部分を形成し、かつGMPがキメラ受容体の細胞内領域の一部分を形成する; または (iii) 切断モエティが、受容体修飾に応答して受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつGMPがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。いくつかの態様において、受容体はSEQ ID NO: 39を含まない。
【００１６】
いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAである。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNAである。いくつかの態様において、修飾はリン酸化である。
【００１７】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成するガイドRNAと複合体形成したRNA結合タンパク質(RBP)である。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。
【００１８】
いくつかの態様において、(i) GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) キメラアダプターポリペプチドは切断認識部位の切断後に受容体から放出され、かつ(iii) GMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドは修飾された受容体に結合する。
【００１９】
いくつかの態様において、受容体修飾は複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾部位は、キメラアダプターポリペプチドに結合するのに有効である。
【００２０】
いくつかの態様において、切断認識部位はポリペプチド配列を含み、かつ切断モエティはプロテアーゼ活性を含む。いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含み、かつ切断モエティは酸化還元酵素活性を含む。いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、インテイン配列の第1部分を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、受容体は膜貫通受容体である。いくつかの態様において、受容体は核内受容体である。
【００２２】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む。
【００２３】
1つの局面において、本開示はキメラ細胞内受容体を提供する。いくつかの態様において、受容体は、(a) 抗原に特異的に結合する抗原相互作用ドメイン; および (b) 抗原相互作用ドメインに連結されたアクチュエータモエティを含み; ここで: (i) キメラ細胞内受容体が抗原結合に応答して修飾され; (ii) キメラ受容体ポリペプチドが、修飾に応答して細胞の核に移動し; かつ (iii) アクチュエータモエティが、核内の標的ポリヌクレオチドと複合体形成する。
【００２４】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。
【００２５】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む。
【００２６】
いくつかの態様において、抗原はホルモンである。
【００２７】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される。
【００２８】
いくつかの態様において、受容体は、細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される。いくつかの態様において、標的指向配列は、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、またはペルオキシソームへ受容体を輸送させる。いくつかの態様において、標的指向配列は、核外移行シグナル(NES)を含む。いくつかの態様において、標的指向配列は、形質膜を標的とするペプチドを含む。いくつかの態様において、受容体はポリペプチド折畳みドメインに連結される。
【００２９】
1つの局面において、本開示は、核を含む細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(a) キメラ細胞内受容体を抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 受容体が抗原相互作用ドメインおよびアクチュエータモエティを含み、かつ (ii)抗原への曝露の際に受容体が修飾される、段階; (b) 修飾された受容体を核に移動させる段階; ならびに (c) アクチュエータモエティと標的ポリヌクレオチドとの間で複合体を形成する段階を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。
【００３１】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む。
【００３２】
いくつかの態様において、抗原はホルモンである。
【００３３】
1つの局面において、本開示はキメラ受容体ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、(a) 抗原相互作用ドメイン; および (b) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含み; ここで: (i) キメラ受容体ポリペプチドが抗原結合に応答して修飾され; (ii) 切断認識部位が、キメラ受容体ポリペプチドの修飾に応答して切断モエティにより切断され; (iii) アクチュエータモエティが切断認識部位でキメラ受容体ポリペプチドから切断された後に、標的ポリヌクレオチドと複合体形成し; かつ (iv) キメラ受容体ポリペプチドが、SEQ ID NO: 39を含まない。
【００３４】
いくつかの態様において、切断認識部位は、抗原相互作用ドメインとアクチュエータモエティとに挟まれている。
【００３５】
いくつかの態様において、抗原相互作用ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドの細胞外領域の一部分を形成し、かつGMPは、キメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する。
【００３６】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、切断認識配列の切断後に細胞核に移動する。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、抗原結合に応答して細胞核に移動する核内受容体である。
【００３７】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)である。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。
【００３８】
いくつかの態様において、切断認識部位は、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、インテイン配列の第1部分を含む。いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、受容体は膜貫通受容体である。いくつかの態様において、受容体は核内受容体である。
【００４０】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される。
【００４１】
いくつかの態様において、受容体は、細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される。いくつかの態様において、標的指向配列は、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へ受容体を輸送させる。いくつかの態様において、標的指向配列は、核外移行シグナル(NES)を含む。いくつかの態様において、標的指向配列は、形質膜を標的とするペプチドを含む。いくつかの態様において、受容体はポリペプチド折畳みドメインに連結される。
【００４２】
1つの局面において、本開示はキメラアダプターポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、(a) 抗原に結合する際に修飾を受けた受容体に結合する受容体結合モエティ; および (b) 受容体結合モエティに連結された遺伝子調整ポリペプチド(GMP)であり、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、GMPを含み; ここで: (i) 切断認識部位が、受容体結合に応答して切断モエティにより切断可能であり; かつ (ii) アクチュエータモエティが、切断認識部位の切断に応答して標的ポリヌクレオチドと複合体形成するように作動可能である。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、切断認識配列の切断後に細胞核に移動するように作動可能である。
【００４３】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAと複合体を形成するCasタンパク質である。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成することができるガイドRNAと複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)である。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。
【００４４】
いくつかの態様において、切断認識部位は、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、インテイン配列の第1部分を含む。いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含む。
【００４５】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に連結される。
【００４６】
いくつかの態様において、アダプターポリペプチドは、細胞の特定の領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される。いくつかの態様において、標的指向配列は、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体(ER)、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは形質膜へアダプターを輸送させる。いくつかの態様において、標的指向配列は、核外移行シグナル(NES)を含む。いくつかの態様において、標的指向配列は、形質膜を標的とするペプチドを含む。
【００４７】
1つの局面において、本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムを提供する。いくつかの態様において、本システムは、(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド; (b) 受容体修飾に応答して受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド; (c) ペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティであって、ペプチド切断ドメインの切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティ; および (d) ペプチド切断ドメインに近接している場合にペプチド切断ドメインを切断する切断モエティを含み、ここで: (i) 切断モエティが受容体の細胞内部分を形成し、かつペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; (ii) 切断モエティが、受容体修飾に応答して受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; または (iii) 切断モエティがアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティが受容体の細胞内部分を形成する。
【００４８】
1つの局面において、本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムを提供する。いくつかの態様において、本システムは、(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチド受容体であって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド; (b) 受容体修飾に応答して受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド; (c) ペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティであって、ペプチド切断ドメインの切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティ; および (d) ペプチド切断ドメインに近接している場合にペプチド切断ドメインを切断する組換えプロテアーゼドメインを含み、ここで: (i) 組換えプロテアーゼドメインが受容体の細胞内部分を形成し、かつペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; (ii) 組換えプロテアーゼドメインが、受容体修飾に応答して受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する; または (iii) 組換えプロテアーゼドメインがキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつペプチド切断ドメインに連結されたアクチュエータモエティが受容体の細胞内部分を形成する。
【００４９】
1つの局面において、本開示はキメラ受容体ポリペプチドを提供する。キメラ受容体ポリペプチドは、抗原に結合する細胞外抗原相互作用ドメイン; 膜貫通ドメイン; およびCasタンパク質を含む細胞内遺伝子調整ドメインを含み、ここで、ペプチド切断ドメインが遺伝子調整ドメインのアミノ末端に位置し; ここで、抗原に細胞外抗原相互作用ドメインが結合する際に、遺伝子調整ドメインが、ペプチド切断ドメインの切断によってキメラ受容体ポリペプチドから放出される。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、抗原に結合する際に受容体修飾を受ける。いくつかの態様において、膜貫通ドメインはNotch受容体タンパク質の一部分、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO: 39またはそのフラグメントに対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89% 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Casタンパク質はDNA切断活性を実質的に欠く。いくつかの態様において、Casタンパク質はCas9タンパク質である。
【００５０】
いくつかの態様において、遺伝子調整ドメインは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効なアクチベータドメインをさらに含む。いくつかの態様において、遺伝子調整ドメインは、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効なリプレッサドメインをさらに含む。
【００５１】
いくつかの態様において、遺伝子調整ドメインは、該遺伝子調整ドメインが受容体から放出された後に細胞の特定の領域へ該遺伝子調整ドメインを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列をさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの標的指向配列は、核局在化配列(NLS)を含む。
【００５２】
いくつかの態様において、受容体は、細胞の特定の領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列に連結される。いくつかの態様において、受容体はポリペプチド折畳みドメインに連結される。
【００５３】
いくつかの態様において、ペプチド切断ドメインは、プロテアーゼの認識配列を含む。
【００５４】
参照による組み入れ
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み入れられるものと具体的かつ個別的に示されているのと同じ程度まで参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な態様を説明する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【００５６】
【図１】抗原相互作用ドメインおよび遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含む例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。
【図２】例示的なキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを示す。
【図３】図3Aは、ガイド核酸(例えば、sgRNA)と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質を含むアクチュエータモエティを含む例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。図3Bは、キメラ受容体ポリペプチドおよび切断モエティを含むキメラアダプターポリペプチドを含む例示的なシステムを示す。
【図４】図4A〜Dは、リン酸化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す; 図4E〜H: コンフォメーション変化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図５】少なくとも1つの標的指向配列を含む例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。
【図６】図6Aは、受容体結合モエティおよび遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含む例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。図6Bは、ガイド核酸(例えば、sgRNA)と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質を含むアクチュエータモエティを含む例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。
【図７】切断モエティを含むキメラ受容体ポリペプチドおよびGMPを含むキメラアダプターポリペプチドを含む例示的なシステムを示す。
【図８】図8A〜Dは、リン酸化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す; 図8E〜Hは、コンフォメーション変化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図９】キメラ受容体ポリペプチド、GMPを含むキメラアダプターポリペプチド、および切断モエティを含む第2アダプターポリペプチドを含む例示的なシステムを示す。
【図１０】図10A〜Dは、少なくとも2つのアダプターポリペプチドおよびリン酸化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す; 図10E〜Hは、少なくとも2つのアダプターポリペプチドおよびコンフォメーション変化を受ける受容体を含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図１１】少なくとも1つの標的指向配列を含む例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。
【図１２】図12A〜Cは、例示的な細胞内受容体を含むシステムを模式的に示す。
【図１３】図13A〜Dは、切断認識部位がインテイン配列を含むシステムを模式的に示す; 図13E〜Hは、切断認識部位がインテイン配列を含むシステムの代替的配置を示す。
【図１４】図14A〜Dは、切断認識部位がジスルフィド結合を含むシステムを模式的に示す; 図14E〜Hは、切断認識部位がジスルフィド結合を含むシステムの代替的配置を示す。
【図１５】CRISPR-Casシステムのサブタイプのためのゲノム遺伝子座の構造を提供する、Makarova, K.S. et al, 「An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems」, Nat Rev Microbiol (2015) 13:722-736の図2から適応された実例を示す。
【図１６】図16A〜Dは、少なくとも2つのアダプターポリペプチドを含むシステムにおけるGMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に示す。
【図１７】ゲノム編集および遺伝子調節のような遺伝子調整のための本発明の工学的に操作されたキメラ抗原受容体の模式図を示す。
【図１８】本開示の工学的に操作されたキメラ抗原受容体の膜貫通ドメインと遺伝子調整ドメインとの間に位置するリンカーのバリアントを示す。
【図１９】図19A〜19Fは、遺伝子調整ドメインおよびいくつかの場合には、その関連したアダプタープロテアーゼを有する工学的に操作されたキメラ抗原受容体を示す。図19Aは、細胞表面抗原に結合するそのような組換え受容体を示す。図19Bは、可溶性抗原に結合することができる遺伝子調整のための組換え受容体を描く。図19Cは、細胞外マトリックス(ECM)シグナルに結合することができる遺伝子調整性の、工学的に操作された受容体を示す。図19Dは、二量体化受容体を示す。受容体の一方は、細胞外ドメイン(ECD)、膜貫通ドメイン(TM)、細胞内ドメイン(ICD)、ペプチド切断配列、および遺伝子調整エフェクタードメインを含む。二量体の他方の受容体は、ECD、TM、ICD、およびプロテアーゼを含む。図19Eは、遺伝子発現を調整しまたは遺伝子を編集しうる二量体化受容体の別の例を示す。二量体化受容体の一方は、ECD、TM、ICD、ペプチド切断配列、および遺伝子調整エフェクタードメインを含むことができる。二量体の他方の受容体は、プロテアーゼではなく、ECD、TMおよびICDを含むことができる。この二量体化受容体を切断するプロテアーゼは、活性化された二量体化受容体に会合するアダプタータンパク質に融合することができる。図19Fは、遺伝子調整ドメインに融合した工学的に操作されたキメラ抗原受容体を含むオリゴマー化受容体の例を示す。
【図２０】図20Aおよび20Bは、異なるキメラ抗原受容体を提供し、sgRNAによって標的遺伝子にガイドされるdCas9-アクチベータドメインの結合を示す。図20Aは、組換えキメラ抗原受容体ポリペプチドおよびいくつかの場合には、Notchおよびプレセニリン-プロテアーゼ、GPCRおよびβ2-アレスチン-プロテアーゼ、インテグリンおよびパキシリン-プロテアーゼ、カドヘリンおよびβ-カテニン-プロテアーゼ、デスレセプターおよびFADD-プロテアーゼのようなその関連したアダプタープロテアーゼポリペプチド、ならびにキメラ抗原受容体を示す。
【図２１Ａ】dCas9-アクチベータにカップリングしたキメラ抗原GPCRの使用を示す。
【図２１Ｂ】プロテアーゼモエティがGPCRにカップリングされ、かつdCas9-アクチベータドメインが活性化GPCRに動員されたアダプタータンパク質にカップリングされる代替的な構成を示す。
【図２２−１】図22Aおよび22Bは、インテグリン-dCas9遺伝子調整ポリペプチドおよびフィブロネクチンのようなインテグリンリガンドに対するそれらの応答を示す。図22Aは、キメラ抗原インテグリン-dCas9アクチベータの模式図を描く。図22Bは、フィブロネクチンに応答するインテグリン-dCas9複合体を示す。レポーター遺伝子に特異的なsgRNAに結合すると、組換え複合体はレポーター(H2B-GFP)の転写を活性化した。
【図２２−２】図22Cは、浮遊細胞と比較した接着細胞におけるインテグリン-dCas9複合体の活性を示す。図22Dおよび22Eは、インテグリンのβサブユニットに対するパキシリン-TEVの結合特異性をαサブユニットと比べて示す。
【図２３−１】図23Aおよび23Bは、キメラGPCR遺伝子調整ドメインポリペプチドの例示的な態様を提供する。図23Aは、GPCRに基づくキメラ抗原受容体-dCas9アクチベータによる標的遺伝子調節のスキームを示す。
【図２３−２】図23Aおよび23Bは、キメラGPCR遺伝子調整ドメインポリペプチドの例示的な態様を提供する。図23Bは、CXCR4-dCas9ポリペプチドがCXCL12に対して応答性であり、発光レポーターを活性化したことを示す。
【図２３−３】図23Cおよび23Dは、LPAR1、CXCR4およびhM3Dを含むキメラGPCR受容体を示し、リガンド、β-アレスチン-プロテアーゼおよびsgRNAの存在下での蛍光レポーター(GFP)の対応する活性化を示す。
【図２３−４】図23Eおよび23Fは、キメラ受容体からの放出後のsgRNAによって標的とされたdCas9-VPRおよびレポーター遺伝子のプロモーターに直接結合するTetR-VPRから生じるレポーター遺伝子の転写調節のレベルを比較する。
【図２４】図24A〜24Gは、本発明のモジュールキメラ人工Notch受容体の例示的な態様を示す。図24Aは、そのリガンドデルタ(Delta)に結合した野生型Notchを示す。受容体がDeltaに結合することにより活性化された後、ICDはプロテアーゼにより切断され、核に移動して標的遺伝子を調節する。図24Bは、Notch ICDがdCas9融合タンパク質で置換されているキメラ人工Notch受容体を示す。dCas9融合タンパク質は、アクチベータドメイン、例えば、VP64ドメインまたはリプレッサドメイン、例えば、KRABドメインのようなエフェクタードメインを含むことができる。図24Cは、Notch ECDがCD47結合scFvで置換されたdCas9融合タンパク質を含む別のキメラ人工Notch受容体を示す。図24Dは、免疫細胞のような細胞の表面上に発現された例示的なモジュールキメラ人工Notch受容体およびアダプター-プロテアーゼ融合タンパク質(プレシニリン-TEVプロテアーゼ)を示す。モジュールキメラ人工Notch受容体は、dCas9融合ポリペプチド、リンカーおよびエフェクタードメインを含むことができる。Delta-Notch結合に際して、プレシニリンはキメラ人工Notch受容体と会合することができる。次にTEVプロテアーゼは、キメラ人工Notch受容体のペプチド切断ドメインを切断することができる。Notch-dCas9-アクチベータを発現する細胞における蛍光レポーターの活性化は、HEK293細胞については図24Eに、Jurkat細胞については図24Fに、およびTHP-1マクロファージでは図24Gに示されている。
【図２５】図25A〜25Cは、本明細書において記述されるキメラ抗原Notch受容体を用いたNotch受容体の内因性応答を再形成するための理論モデルを示す。図25Aは、シグナル伝達細胞上に発現したDeltaに結合する際の内因性Notchを発現する受容細胞の内因性食細胞応答の抑制を示す。図25Bは、工学的に操作されたcaN受容体が、外的Deltaシグナルに対する内因性食細胞応答を再配線するために作製されうることを示す。図25Cは、細胞の内因性食細胞応答の抑制をDelta結合時の活性化にシフトさせるために工学的に操作されたcaN受容体を産生できることを示す。
【図２６−１】図26A〜26Dは、Notch-dCas9アクチベータがDelta結合に際して、細胞アポトーシスまたは細胞周期を制御するものなどの標的遺伝子を活性化できることを示す。Notch-dCas9ポリペプチドを発現する細胞は、Deltaの存在下での場合に標的遺伝子を活性化した(図26Bおよび26D)。Notchキメラ抗原受容体は、Deltaの非存在下で標的遺伝子の転写を活性化しなかった(図26Aおよび26C)。
【図２６−２】図26-1の説明を参照のこと。
【図２７】図27Aおよび27Bは、Notch-dCas9アクチベータがsgUAS (SEQ ID NO:1; gtactccgacctctagtgt)によりUASプロモーターにガイドされ、レポーター遺伝子(H2B-シトリン)の転写を活性化することを示す。図27Aは、プロセスの模式図を提供する。図27Bは、Notch-dCas9アクチベータがDeltaに応答することを示す。
【図２８】図28Aおよび28Bは、CXCR4-dCas9-VPRポリペプチドがCXCL12リガンドに応答し、レポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の転写を活性化することを示す。図28A: sgRNA (sgTET; SEQ ID NO:2; gtacgttctctatcactgata)と複合体形成したCXCR4-dCas9-VPRポリペプチドのリガンド結合の模式図を提供する。図28Aは、工学的に操作されたキメラ抗原受容体に関連しうるβ2-アレスチン-プロテアーゼ融合タンパク質も示す。この図はまた、(1) 遊離dCas9-VPRの核への移動、(2) sgTET-dCas9-VPR複合体のルシフェラーゼ遺伝子の転写を調節するTetOプロモーターへの結合、および(3) レポーターの転写を示す。図28Bは、ルシフェラーゼ遺伝子の転写が、CXCR4-dCas9-VPRポリペプチドへのCXCL2結合によって調節されることを示す。
【図２９】図29Aおよび29Bは、インテグリン-dCas9-VPRポリペプチドが細胞外マトリックスリガンドに応答し、レポーター遺伝子(H2B-シトリン)の転写を活性化することを示す。図29Aは、インテグリン-dCas9-VPRポリペプチドへのリガンド結合の際のレポーターの転写活性化の模式図を示す。図29Bは、ECMからのシグナルに応答してインテグリンに基づく工学的に操作されたキメラ抗原受容体-dCas9複合体がレポーター発現を誘導したことを示す。
【図３０】図30Aおよび30Bは、「Split ANDゲート」または「Cascade ANDゲート」論理に基づいた本明細書において記述されるキメラ抗原受容体-エフェクターポリペプチドの例示的な態様を示す。図30Aは、工学的に操作された受容体を分離するために繋がれたスプリットdCas9エフェクターの模式図を示す。図30Bは、リガンドに結合すると、TetO駆動キメラ受容体-dCas9ポリペプチドの発現を誘導するキメラ受容体-tTaポリペプチドの模式図を提供する。
【図３１Ａ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。Cas9誘導体の発現を促進するために置換または工学的に操作されうる、Notch細胞内ドメインの切断および核移行を伴うNotch1受容体の活性化を示す。Cas9に対するエフェクタードメインの融合およびユーザ定義の単一ガイドRNA (sgRNA)配列は、標的指向性の遺伝子調節を可能にする。
【図３１Ｂ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。細胞局在およびDelta依存性レポーター活性化について最初に試験されたmCherryタグ付キメラ受容体コンストラクトの模式的デザインを示す。Notch1細胞外ドメイン(hNECD)および膜貫通ドメインの直後に、ヒトコドン最適化ヌクレアーゼデッドCas9 (dCas9)および三要素(tripartite)アクチベータドメイン(VP64、p65およびRta; VPR)が融合される。コンストラクトNC5は、既知のER搬出シグナルから導出された成熟シグナルを含む。
【図３１Ｃ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。表面固定化されたDelta有りまたは無しで培養された場合のキメラ受容体の遺伝子活性化効率を確認するために用いられる、上流活性化配列(Upstream Activating Sequence: UAS)またはヒストン2B (H2B)-シトリンレポーター遺伝子を駆動するCSL結合(示されていない)プロモーターおよび安定に組み込まれたプロモーターを標的とするsgRNA (例えば、それぞれsgUASまたはsasgCSL)を組み込まれたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株の模式図を示す。固定化されたDeltaリガンドによるNC5受容体の活性化は、dCas9-VPRの切断および核移行をもたらす。配列特異的sgRNA (例えば、sgUASまたはsasgCSL)と複合体形成したdCas9-VPRは、プロモーターへの複合体の結合およびH2B-シトリン遺伝子の活性化を可能にする。
【図３１Ｄ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。固定化されたDeltaに4日間曝露した場合にH2B発現を生じるNC5キメラでトランスフェクトされたCHO細胞の実例の顕微鏡画像を示す。スケールバー, 20 μm。
【図３１Ｅ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。NC5 (化膿連鎖球菌(S. pyogenes) dCas9およびsgUAS)について安定に選択されたCHO UAS-H2Bクローンでのまたは野生型ヒトNotch1もしくはNC5 (黄色ブドウ球菌(S. aureus) dCas9およびsasgCSL)を有するCHO CSL-H2Bクローンでの、ならびに露出表面またはDeltaが固定化された表面上で4日間培養での相対的H2Bレベル(正規化された発現)を示す(n = 3)。平均 ± SEM。
【図３１Ｆ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。NC5 (化膿連鎖球菌dCas9およびsgUAS)について安定に選択されたCHO UAS-H2Bクローンでのまたは野生型ヒトNotch1もしくはNC5 (黄色ブドウ球菌dCas9およびsasgCSL)を有するCHO 12xCSL-H2Bクローンでの、ならびに露出表面またはDeltaが固定化された表面上で4日間培養でのH2B-シトリンを活性化する細胞の割合を示す(n = 3)。平均 ± SEM, ＊＊(-Delta)対照と比較して、p < 0.01。
【図３１Ｇ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。dCas9-VPRの切断および核移行をもたらす固定化されたDeltaリガンドによるNC5受容体の活性化を示す。
【図３１Ｈ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。dCas9-VPR、NC5 + Delta + DAPT、NC5 + Delta、NC5 - Deltaの存在下での、およびコンストラクトなしでのtet-誘導性EGFP遺伝子および標的指向sgRNA (sgTET)を安定に発現するHEK293Tレポーター細胞からのEGFPレポーター強度ヒストグラムを示す。
【図３１Ｉ】細胞外シグナルに応答してCas9を動員するための受容体に基づく戦略の態様を示す。NC5受容体をトランスフェクトし、3日間さまざまな濃度の固定化されたDelta上で培養したHEK293Tレポーター細胞のEGFP活性化の等高線図(同数の細胞が等高線の各対の間に入る)を示す。
【図３２Ａ】本明細書において記述される態様による合成Cas9受容体システムの模式図を示す。標的内因性遺伝子の調整は、Deltaのような、細胞外シグナルに応答する。システムのデザインに依存して、種々の下流細胞挙動が天然の細胞外インプットから誘発されうる。
【図３２Ｂ】左は、hNECD-dCas9-VPR (コンストラクトNC5)を介するCDKN1B活性化がG0/G1期にDelta依存性細胞周期停止を誘導することを示す。右は、一態様による高CDKN1BおよびG0/G1停止の細胞(2n DNAを有する)をもたらすNC5からのdCas9-VPRのDelta依存性切断の略図を示す。
【図３２Ｃ】異なる培養条件下での高CDKN1BおよびG0/G1停止の細胞の実例のフローサイトメトリープロットおよび定量% (陰影領域)を示す: sgRNAのみ、sgRNA + Delta、sgRNA + NC5、またはsgRNA + NC5 + Deltaを有するHEK293細胞。NC5をsgCDKN1B-組み込み細胞に一過的にトランスフェクトし、これを次いで、Delta被覆表面または露出表面上で4日間培養した。n = 3, 平均 ± SEM。G0/G1停止細胞は、プロットの左上の陰影付きの角部に対応し、棒グラフ中の各ペアの上バーに対応する。G2停止細胞は、プロットの右上の陰影付きの角部に対応し、棒グラフ中の各ペアの下バーに対応する。
【図３３】左パネルは、コンストラクトNC1 (赤色)およびsgUAS (青色)でトランスフェクトしたCHO細胞の実例の共焦点蛍光顕微鏡写真を示す。H2B (緑色、核)の早期活性化が観察される。右パネルは、Notch-Cas9キメラのDelta依存性切断における核局在化シグナルと膜成熟シグナルの強度間のバランスの略図を示す。
【図３４】コンストラクトNC1〜NC4 (上、図31B参照)でトランスフェクトし、Deltaの非存在下でのH2B発現(下)を有するCHO細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。スケールバー, 20 μm。
【図３５−１】図35Aは、アミノ酸残基番号647〜670に見出された化膿連鎖球菌(S. py.) Cas9における天然NLS配列を示す。図は、この「内因性」NLS (iNLS)が、表面接近可能なヘリックス・リンカー・へリックス構造(PDB ID: 4UN3)を形成しうることを示している。図35Bは、dCas9-VPR(上)または変異iNLS dCas9-VPR (中央)でトランスフェクトされた、pTET-EGFPレポーターおよび標的指向sgRNA (sgTET)を安定に組み込まれたHEK293細胞の実例の結果を示す。コンストラクトの存在下または非存在下(下)におけるEGFP活性化およびEGFP活性化(非トランスフェクション細胞に対して正規化)の定量化の代表的ヒストグラムを示す。
【図３５−２】図35Cは、iNLSモチーフが破壊された場合のHEK293T細胞における損なわれた核局在化およびEGFPレポーター活性化を顕微鏡使用により示す。図35Cおよび35Dは、iNLS-変異dCas9-VPRのN末に合成NLSを付加すると、EGFP活性化が部分的に回復することを、顕微鏡使用により視覚的におよび定量的に示す。
【図３６Ａ】Delta依存性遺伝子編集を示す。NC5バリアント: 野生型化膿連鎖球菌ヌクレアーゼ活性Cas9に融合されたhNECD (hNECD-Cas9)でのDelta依存性DNA切断を模式的に示す。
【図３６Ｂ】Delta依存性遺伝子編集を示す。安定に組み込まれたEGFPおよび標的指向sgRNA (sgEGFP)を有するCHO細胞におけるhNECD-Cas9による遺伝子編集/切断の有効性を示す。
【図３６Ｃ】Delta依存性遺伝子編集を示す。HEK293T細胞中で安定に発現され、CXCR4の5'非翻訳領域(UTR)およびイントロン1を標的とするようにデザインされた2つのsgRNA (「sgCXCR4」の左右の短いバー)の実例図を示す。スケールバー, 1000 bp。
【図３６Ｄ】Delta依存性遺伝子編集を示す。上パネルは、SDS-PAGEゲル中でT7E1によって切断された産物の量によって検出される、HEK293T細胞におけるCXCR4遺伝子のDelta誘導hNECD-Cas9媒介性修飾の程度をアッセイするためのT7E1エンドヌクレアーゼの実例の結果を示す。下パネルは、CXCR4 indel変異の頻度の実例の結果を示す。
【図３６Ｅ】Delta依存性遺伝子編集を示す。HEK293T細胞におけるCXCR4タンパク質発現のフローサイトメトリーに基づく免疫蛍光染色の定量化のための実例の結果を示す。
【図３７Ａ】ヒト、アフリカツメガエル(Xenopus)、ゼブラフィッシュ(Zebrafish)、およびショウジョウバエ(Drosophila)相同体のEGF-11およびEGF-12リピートのアライメントを示す。同一の残基は灰色の四角で示される。星印(＊)は保存されたシステインおよびCa2+結合コンセンサス残基に印を付けている。
【図３７Ｂ】(レポーターアッセイによって評価したときの)さまざまなEGF欠失バリアントの可変活性化レベルを示す。
【図３８】遺伝子特異的sgRNA (1遺伝子あたり2つ)によって標的とされるCXCR4およびCD95遺伝子の同時活性化を示す。4日間培養物における示された条件下でのCXCR4およびCD95の相対活性化レベルを示す(a.u., 任意単位)。データは平均蛍光強度 ± SEMとして表示される(n = 3の独立した実験)。陰性対照dCas9-VPR + sgNT (非標的指向)においてそれぞれ、CXCR4およびCD95レベルと比較して、#、## p < 0.01、0.001、＊、＊＊ p < 0.01、0.001。
【図３９Ａ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。細胞周期のDelta依存性停止を誘発するための最小NC5受容体バリアントの使用を模式的に示す。
【図３９Ｂ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。CDKN1B過剰発現に起因するG0/G1期での細胞停止を描く。
【図３９Ｃ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。dCas9-VPRおよびsgCDKN1Bを有する細胞において、CDKN1B上方制御がG0/G1富化と同時であったこと、ならびにdCas9-VPRおよび非標的指向gsRNAを有する細胞において、CDKN1Bの最小限の増加が観察されたことを示す。
【図３９Ｄ】図39Cの説明を参照のこと。
【図３９Ｅ】Deltaシグナルの細胞周期相特異的停止への変換を示す。DAPTを有する細胞におけるDelta誘導性CDKN1B上方制御およびG0/G1停止の無効化を示す。
【図３９Ｆ】図39Eの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
本明細書において開示するいくつかの方法の実施では、別段の表示がある場合を除き、当技術分野の技能の範囲内にある、従来の免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えDNAの技法を使用する。例えばSambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition（2012）、Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubel, et al. eds.）シリーズ、Methods In Enzymology（Academic Press, Inc.）シリーズ、PCR 2: A Practical Approach（M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.（1995））、Harlow and Lane, eds.（1988）Antibodies, A Laboratory Manual、およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition（R.I. Freshney, ed.（2010））を参照されたい。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば「キメラ膜貫通受容体」（a chimeric transmembrane receptor）という用語は、複数のキメラ膜貫通受容体を包含する。
【００５９】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に関して、許容誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定または決定される方法、すなわち測定システムの制約に一部依存するであろう。例えば「約」は、当技術分野における慣例によれば、1（または1超の）標準偏差内であることを意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の20％まで、10％まで、5％まで、または1％までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的なシステムまたは過程に関して、この用語は、ある値の1オーダー以内、好ましくは1/5〜5倍以内、より好ましくは1/2〜2倍以内を意味することができる。本願および特許請求の範囲において特定の値が記載される場合は、別段の言明がある場合を除き、その特定の値の許容誤差範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「細胞」とは、一般に、生物学的細胞を指すことができる。細胞は、生きている生物の基本的な構造、機能および/または生物学的単位であることができる。細胞は、1つまたは複数の細胞を有する任意の生物に由来することができる。いくつかの非限定的な例として、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物からの細胞（例えば作物、果実、野菜、穀物、ダイズ、コーン（corn）、トウモロコシ（maize）、コムギ、種子、トマト、コメ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、まぐさ、ジャガイモ、ワタ、麻、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類（liverworts）、蘚類（mosses）からの細胞）、藻類細胞（例えばボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）、ヤツマタモク（Sargassum patens C. Agardh）など）、海藻（例えばケルプ）、真菌細胞（例えば酵母細胞、キノコからの細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えばミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）からの細胞、脊椎動物（例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）からの細胞、哺乳動物（例えばブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）からの細胞などが挙げられる。場合によっては、細胞は天然の生物に由来しない（例えば細胞は、合成的に作製された、時に人工細胞と呼ばれる、細胞であることができる）。
【００６１】
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、一般に、塩基-糖-リン酸の組合せを指す。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドは合成ヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチドは、核酸配列（例えばデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA））の単量体単位であることができる。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸である、アデノシン三リン酸（ATP）、ウリジン三リン酸（UTP）、シトシン三リン酸（CTP）、グアノシン三リン酸（GTP）およびdATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTPなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、またはそれらの誘導体を包含しうる。そのような誘導体としては、例えば［αS］dATP、7-デアザ-dGTPおよび7-デアザ-dATP、ならびに当該誘導体を含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書において使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ddNTP）およびそれらの誘導体を指しうる。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の具体例としては、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、およびddTTPを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。ヌクレオチドは無標識であってもよく、周知の技法によって検出可能に標識されていてもよい。標識化は、量子ドットで実行することもできる。検出可能なラベルとしては、例えば放射性同位体、蛍光ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベルおよび酵素ラベルを挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光ラベルとしては、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン（FAM）、2'7'-ジメトキシ-4'5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、ローダミン、6-カルボキシローダミン（R6G）、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、4-(4'ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（DABCYL）、Cascade Blue、Oregon Green、Texas Red、シアニンおよび5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）が挙げられ得るが、それらに限定されるわけではない。蛍光標識ヌクレオチドの具体例としては、Perkin Elmer（カリフォルニア州フォスターシティ）から入手できる[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP、および[dROX]ddTTP; Amersham（イリノイ州アーリントンハイツ）から入手できるFluoroLinkデオキシヌクレオチド、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP、およびFluoroLink Cy5-dUTP; Boehringer Mannheim（インディアナ州インディアナポリス）から入手できるフルオレセイン-15-dATP、フルオレセイン-12-dUTP、テトラメチル-ローダミン-6-dUTP、IR770-9-dATP、フルオレセイン-12-ddUTP、フルオレセイン-12-UTP、およびフルオレセイン-15-2'-dATP;ならびにMolecular Probes（オレゴン州ユージーン）から入手できる染色体標識ヌクレオチド（Chromosome Labeled Nucleotide）、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、Cascade Blue-7-UTP、Cascade Blue-7-dUTP、フルオレセイン-12-UTP、フルオレセイン-12-dUTP、Oregon Green 488-5-dUTP、Rhodamine Green-5-UTP、Rhodamine Green-5-dUTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、Texas Red-5-UTP、Texas Red-5-dUTP、およびTexas Red-12-dUTPを挙げることができる。ヌクレオチドは化学修飾によって標識またはマークすることもできる。化学修飾された単独ヌクレオチドは、ビオチン-dNTPであることができる。ビオチン化dNTPのいくつかの非限定的例としては、ビオチン-dATP（例えばbio-N6-ddATP、ビオチン-14-dATP）、ビオチン-dCTP（例えばビオチン-11-dCTP、ビオチン-14-dCTP）、およびビオチン-dUTP（例えばビオチン-11-dUTP、ビオチン-16-dUTP、ビオチン-20-dUTP）を挙げることができる。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さのポリマー型のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか）またはその類似体（一本鎖型、二本鎖型、または複数本鎖型のいずれか）を指すために、可換的に使用される。ポリヌクレオチドは細胞にとって外因性または内在性であることができる。ポリヌクレオチドは無細胞環境に存在することができる。ポリヌクレオチドは遺伝子またはそのフラグメントであることができる。ポリヌクレオチドはDNAであることができる。ポリヌクレオチドはRNAであることができる。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の類似体（例えば改変された主鎖、糖、または核酸塩基）を含むことができる。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、その修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に加えることができる。類似体のいくつかの非限定的な例として、5-ブロモウラシル、ペプチド核酸、キセノ核酸、モルホリノ類（morpholinos）、ロックト核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、7-デアザ-GTP、発蛍光団（例えば糖に連結されたローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基類似体、CpGアイランド、メチル-7-グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン（pseudourdine）、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子または遺伝子フラグメントのコーディング領域またはノンコーディング領域、連鎖解析から規定される1つまたは複数の座位、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、短鎖干渉RNA（siRNA）、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、無細胞DNA（cfDNA）および無細胞RNA（cfRNA）を含む無細胞ポリヌクレオチド、核酸プローブ、ならびにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。
【００６３】
本明細書において用いられる「標的ポリヌクレオチド」および「標的核酸」という用語は、本開示のアクチュエータモエティによって標的とされる核酸またはポリヌクレオチドをいう。標的核酸はDNAであることができる。標的核酸はRNAであることができる。標的核酸は、染色体配列または染色体外配列(例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、クロロプラスト配列など)をいうことができる。標的核酸は、一ヌクレオチド置換によって核酸サンプル中の他のいずれの配列にも関連しない可能性がある核酸配列であることができる。標的核酸は、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のヌクレオチド置換によって核酸サンプル中の他のいずれの配列にも関連しない可能性がある核酸配列であることができる。いくつかの態様において、置換は、標的核酸の5'末端の5、10、15、20、25、30、または35ヌクレオチド以内に起こらないことがある。いくつかの態様において、置換は、標的核酸の3'末端の5、10、15、20、25、30、35ヌクレオチド以内に起こらないことがある。一般に「標的配列」という用語は、標的核酸の一本鎖上の核酸配列をいう。標的配列は、遺伝子の一部分、調節配列、ゲノムDNA、cfDNAおよび/またはcfRNAを含む無細胞核酸、cDNA、融合遺伝子、およびmRNA、miRNA、rRNAを含むRNAなどであることができる。
【００６４】
本明細書において用いられる「遺伝子」という用語は、RNA転写産物のコード化に関与する核酸(例えば、ゲノムDNAおよびcDNAのようなDNA)およびその対応するヌクレオチド配列をいう。ゲノムDNAに関して本明細書において用いられる用語は、介在する非コード領域ならびに調節領域を含み、5'および3'末端を含むことができる。いくつかの使用において、この用語は、5'および3'非翻訳領域(5'-UTRおよび3'-UTR)、エキソンおよびイントロンを含む、転写された配列を包含する。いくつかの遺伝子において、転写された領域は、ポリペプチドをコードする「読み取り枠」を含むであろう。この用語のいくつかの使用において、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするのに必要なコード配列(例えば「読み取り枠」または「コード領域」)のみを含む。いくつかの場合、遺伝子はポリペプチド、例えばリボソームRNA遺伝子(rRNA)およびトランスファーRNA (tRNA)遺伝子をコードしない。いくつかの場合、「遺伝子」という用語は、転写された配列だけでなく、加えて上流および下流の調節領域、エンハンサーおよびプロモーターを含む非転写領域も含む。遺伝子は、生物のゲノム中のその天然の位置にある「内因性遺伝子」または天然遺伝子をいうことができる。遺伝子は「外因性遺伝子」または非天然遺伝子をいうことができる。非天然遺伝子は、宿主生物において通常見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子をいうことができる。非天然遺伝子はまた、生物のゲノム中のその天然の位置にない遺伝子をいうこともできる。非天然遺伝子はまた、変異、挿入および/または欠失を含む天然に存在する核酸またはポリペプチド配列(例えば、非天然配列)をいうこともできる。
【００６５】
「トランスフェクション」または「トランスフェクトされた」という用語は、非ウイルス性またはウイルス性の方法による細胞への核酸の導入をいう。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列でありうる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88を参照されたい。
【００６６】
「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがDNA鋳型から(例えばmRNAもしくは他のRNA転写産物へ)転写される1つもしくは複数のプロセスおよび/または転写されたmRNAが続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へ翻訳されるプロセスをいう。転写産物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」ということができる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含むことができる。発現に関して「上方制御される」とは一般に、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAのようなRNA)および/またはポリペプチド配列の野生型状態におけるその発現レベルと比べた発現レベルの増加をいうが、「下方制御される」とは一般に、ポリヌクレオチド(例えば、mRNAのようなRNA)および/またはポリペプチド配列の野生型状態におけるその発現と比べた発現レベルの減少をいう。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、細胞内で一時的または安定的に起こりうる。「一過性発現」の間、トランスフェクトされた遺伝子は、細胞分裂中に娘細胞に移されない。その発現はトランスフェクトされた細胞に限定されているので、遺伝子の発現は経時的に失われる。対照的に、トランスフェクトされた遺伝子の安定した発現は、遺伝子がトランスフェクトされた細胞に選択優位性を与える別の遺伝子と同時トランスフェクトされた場合に起こりうる。そのような選択優位性は、細胞に提示されるある種の毒素に対する耐性でありうる。
【００６７】
「発現カセット」、「発現コンストラクト」または「発現ベクター」という用語は、コード配列および鋳型配列のようなヌクレオチド配列、ならびにコード配列の発現に必要な配列を含む核酸をいう。発現カセットは、ウイルス性または非ウイルス性であることができる。例えば、発現カセットは、宿主細胞中に導入されると、RNAまたはポリペプチドの転写および/または翻訳をそれぞれもたらす核酸コンストラクトを含む。翻訳されないまたは翻訳できないアンチセンスコンストラクトまたはセンスコンストラクトは、この定義によって明白に含まれる。当業者は、挿入されたポリヌクレオチド配列が同一である必要はないが、それが由来する遺伝子の配列と実質的に類似しているに過ぎないことを認識するであろう。
【００６８】
本明細書において用いられる「プラスミド」は一般に、非ウイルス発現ベクター、例えば、遺伝子の発現に必要な遺伝子および/または調節エレメントをコードする核酸分子をいう。本明細書において用いられる「ウイルスベクター」は一般に、別の核酸を細胞に輸送することができるウイルス由来の核酸をいう。ウイルスベクターは、ベクターが適切な環境に存在する場合にベクターによって運ばれる1つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質を発現させることができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００６９】
本明細書において用いられる「プロモーター」という用語は、細胞内のコード配列の転写を駆動することができるポリヌクレオチド配列をいう。したがって、本開示のポリヌクレオチドコンストラクトにおいて用いられるプロモーターは、遺伝子の転写のタイミングおよび/または速度を調節するまたは調整することに関与するシス作用性転写制御エレメントおよび調節配列を含む。例えば、プロモーターは、転写調節に関与した、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組み込み配列、5'および3'非翻訳領域、またはイントロン配列を含むシス作用性転写制御エレメントであることができる。これらのシス作用性配列は、典型的には、遺伝子転写を実行する(オン/オフする、調節する、調整するなど)ためにタンパク質または他の生体分子と相互作用する。「構成的プロモーター」は、ほぼ全ての組織型において転写を開始することができるものであり、「組織特異的プロモーター」は、1つまたは2〜3つの特定の組織型においてのみ転写を開始する。「誘導性プロモーター」は、特定の環境条件、発生条件、または薬物もしくは化学的条件の下でのみ転写を開始するものである。
【００７０】
本明細書において使用される「相補体」（complement、complements）、「相補的」および「相補性」という用語は、一般に、所与の配列に完全に相補的であり、ハイブリダイズすることができる配列を指す。場合により、所与の配列とハイブリダイズする配列は、その塩基の配列が所与の領域においてその結合パートナーの塩基に、例えばA-T、A-U、G-C、およびG-U塩基対が形成されるように相補的に結合する能力を有するのであれば、当該所与の分子の「相補体」または「逆相補体」と呼ばれる。一般に、第2配列にハイブリダイズすることができる第1配列は、ハイブリダイゼーション反応中に、第2配列または第2配列セットへのハイブリダイゼーションが、非標的配列とのハイブリダイゼーションよりも、好ましくなる（例えば、所与の条件セット下で、例えば当技術分野においてよく使用されるストリンジェントな条件下で、熱力学的により安定になる）ように、第2配列に特異的または選択的にハイブリダイズすることができる。通例、ハイブリダイズ可能な配列同士は、各々の長さの全部または一部分にわたって、ある度合の配列相補性、例えば25％〜100％の相補性、例えば少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、および100％の配列相補性を共有する。例えば相補性パーセントを評価するなどの目的で、配列同一性を、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって、例えば限定するわけではないが、Needleman-Wunschアルゴリズム（例えばwww.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.htmlにおいて、任意でデフォルト設定で、利用することができるEMBOSS Needleアライナーを参照されたい）、BLASTアルゴリズム（例えばblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて、任意でデフォルト設定で、利用することができるBLASTアラインメントツールを参照されたい）、またはSmith-Watermanアルゴリズム（例えばwww.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.htmlにおいて、任意でデフォルト設定で、利用することができるEMBOSS Waterアライナーを参照されたい）によって、測定することができる。最適アラインメントは、選ばれたアルゴリズムの任意の適切なパラメータを使って、例えばデフォルトパラメータを使って、評価することができる。
【００７１】
相補性は、完全な相補性であるか、実質的/十分な相補性であることができる。2つの核酸間の完全な相補性は、デュプレックス（duplex）中の各塩基がワトソン-クリックペアリングによって相補的塩基に結合しているデュプレックスを、それら2つの核酸が形成できることを意味しうる。実質的なまたは十分な相補性は、一方の鎖中の配列が、反対鎖中の配列に完全にはおよび/または完璧には相補的でないが、一組のハイブリダイゼーション条件（例えば塩濃度および温度）下で、それら2つの鎖上の塩基間には十分な結合が生じて、安定なハイブリッド複合体を形成することを意味しうる。そのような条件は、配列と標準的な数学的計算とを使ってハイブリダイズした鎖のTmを予測することによって、または常法を使ってTmを実験的に決定することによって、予測することができる。
【００７２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では、ペプチド結合によって接合された少なくとも2アミノ酸残基のポリマーを指すために、可換的に使用される。この用語は、特別な長さのポリマーを意味せず、そのペプチドが組換え技法を使って生産されるか、化学的合成または酵素的合成を使って生産されるか、天然物であるかどうかを、含意もしくは区別することも意図されていない。この用語は、天然のアミノ酸ポリマーにも、少なくとも1つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーにも適用される。場合により、ポリマーは非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖、ならびに二次構造および/または三次構造（例えばドメイン）を持つまたは持たないタンパク質を包含する。この用語は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、酸化、および他の任意の操作、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書において使用される「アミノ酸」（amino acidおよびamino acids）という用語は、一般に、天然アミノ酸および非天然アミノ酸、例えば限定するわけではないが、修飾アミノ酸およびアミノ酸類似体を指す。修飾アミノ酸には、アミノ酸上に天然には存在しない基または化学モエティを含むように化学的に修飾された天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含めることができる。アミノ酸類似体は、アミノ酸誘導体を指すことができる。「アミノ酸」という用語はD-アミノ酸とL-アミノ酸をどちらも包含する。
【００７３】
「誘導体」、「バリアント」および「フラグメント」という用語は、ポリペプチドに関して本明細書において使用される場合、例えばアミノ酸配列、構造（例えば二次構造および/または三次構造）、活性（例えば酵素活性）および/または機能のいずれかが野生型ポリペプチドと関連するポリペプチドを指す。ポリペプチドの誘導体、バリアントおよびフラグメントは、野生型ポリペプチドと比較して、1つまたは複数のアミノ酸変異（例えば突然変異、挿入、および欠失）、トラスケーション、修飾、またはそれらの組合せを含むことができる。
【００７４】
本明細書において使用される「同一性パーセント（％）」という用語は、最大の同一性パーセントが達成されるように配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に（すなわち最適アラインメントのために候補配列およびリファレンス配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較という目的には非相同配列を無視することができる）、リファレンス配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージを指す。同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野における技量の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばBLAST、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公に利用できるコンピュータソフトウェアを使って達成することができる。2つの配列の同一性パーセントは、BLASTを使って試験配列を比較配列とアラインメントし、アラインメントされた試験配列中のアミノ酸またはヌクレオチドのうち、比較配列中の同じ位置にあるアミノ酸またはヌクレオチドと同一であるものの数を決定し、同一アミノ酸またはヌクレオチドの数を比較配列中のアミノ酸またはヌクレオチドの数で割ることによって、計算することができる。
【００７５】
本明細書において使用される「遺伝子調整ポリペプチド」または「GMP」という用語は、発現または活性を調節する能力および/または核酸配列を編集する能力を有するアクチュエータモエティを、少なくとも含むポリペプチドを指す。GMPは、遺伝子発現の調整には関与しない追加ペプチド配列、例えば切断認識部位、リンカー配列、標的指向配列などを含むことができる。
【００７６】
本明細書において使用される「アクチュエータモエティ」、「アクチュエータドメイン」、および「遺伝子調整ドメイン」という用語は、外因性であるか内在性であるかを問わず遺伝子の発現または活性を調節することおよび/または核酸配列を編集することができるモエティを指す。アクチュエータモエティは、遺伝子の発現を転写レベルおよび/または翻訳レベルで調節することができる。アクチュエータモエティは、例えば染色体DNAまたはcDNAなどのDNAからのmRNAの生産を調節することによって、遺伝子発現を転写レベルで調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、特異的DNA配列に結合することでDNAからmRNAへの転写の速度を制御する、少なくとも1つの転写因子を動員する。アクチュエータモエティは、それ自身がDNAに結合して、例えばRNAポリメラーゼなどのタンパク質および他の関連タンパク質がDNAテンプレート上で集合することを防ぐ物理的妨害によって、転写を調節することができる。アクチュエータモエティは、例えばmRNAテンプレートからのタンパク質の生産を調節することにより、翻訳レベルで遺伝子の発現を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、mRNA転写産物の安定性に影響を及ぼすことによって、遺伝子発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、核酸配列（例えばゲノムの一領域）を編集することによって遺伝子の発現を調節する。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、mRNAテンプレートを編集することによって、遺伝子の発現を調節する。核酸配列の編集は、場合によっては、根底にある、遺伝子発現のためのテンプレートを変化させることができる。
【００７７】
本明細書にいうCasタンパク質は、あるタイプのタンパク質またはポリペプチドであることができる。Casタンパク質はヌクレアーゼを指しうる。Casタンパク質はエンドリボヌクレアーゼを指しうる。Casタンパク質は、当該Casタンパク質の任意の修飾（例えば短縮型、突然変異型、延長型）ポリペプチド配列またはホモログを指しうる。Casタンパク質はコドン最適化することができる。Casタンパク質はCasタンパク質のコドン最適化ホモログであることができる。Casタンパク質は、酵素的に不活性、部分的に活性、構成的に活性、完全に活性、誘導性に活性、および/またはより活性（例えば当該タンパク質またはポリペプチドの野生型ホモログより活性）であることができる。Casタンパク質はCas9であることができる。Casタンパク質はCpf1であることができる。Casタンパク質はC2c2であることができる。Casタンパク質（例えばバリアント、突然変異型、酵素不活性型および/または条件付き酵素不活性型の部位指向性（site-directed）ポリペプチド）は、標的核酸に結合することができる。Casタンパク質（例えばバリアント、突然変異型、酵素不活性型および/または条件付き酵素不活性型のエンドリボヌクレアーゼ）は、標的RNAまたは標的DNAに結合することができる。
【００７８】
本明細書において使用される「crRNA」という用語は、一般に、野生型の例示的crRNA（例えば化膿連鎖球菌由来のcrRNA）に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つ核酸を指すことができる。crRNAは、一般に、野生型の例示的crRNA（例えば化膿連鎖球菌由来のcrRNA）に対して、多くて約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つ核酸を指すことができる。crRNAは、欠失、挿入、または置換などのヌクレオチド変化を含みうる修飾型のcrRNA、バリアント、突然変異体、またはキメラを指すことができる。crRNAは、野生型の例示的crRNA（例えば化膿連鎖球菌由来のcrRNA）配列に対し、少なくとも6連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも約60％の同一性を有する核酸であることができる。例えば、crRNA配列は、野生型の例示的crRNA配列（例えば化膿連鎖球菌由来のcrRNA）に対し、少なくとも6連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも約60％同一、少なくとも約65％同一、少なくとも約70％同一、少なくとも約75％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約85％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、または100％同一であることができる。
【００７９】
本明細書において使用される「tracrRNA」という用語は、一般に、野生型の例示的tracrRNA配列（例えば化膿連鎖球菌由来のtracrRNA）に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つ核酸を指すことができる。tracrRNAは、野生型の例示的tracrRNA配列（例えば化膿連鎖球菌由来のtracrRNA）に対して、多くて約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つ核酸を指すことができる。tracrRNAは、欠失、挿入、または置換などのヌクレオチド変化を含みうる修飾型のtracrRNA、バリアント、突然変異体、またはキメラを指すことができる。tracrRNAは、野生型の例示的tracrRNA（例えば化膿連鎖球菌由来のtracrRNA）配列に対し、少なくとも6連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも約60％同一であることができる核酸を指すことができる。例えば、tracrRNA配列は、野生型の例示的tracrRNA（例えば化膿連鎖球菌由来のtracrRNA）配列に対し、少なくとも6連続ヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも約60％同一、少なくとも約65％同一、少なくとも約70％同一、少なくとも約75％同一、少なくとも約80％同一、少なくとも約85％同一、少なくとも約90％同一、少なくとも約95％同一、少なくとも約98％同一、少なくとも約99％同一、または100％同一であることができる。
【００８０】
本明細書において使用される場合、ガイド核酸は、別の核酸にハイブリダイズすることができる核酸を指すことができる。ガイド核酸はRNAであることができる。ガイド核酸はDNAであることができる。ガイド核酸は、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムすることができる。標的となる核酸、すなわち標的核酸は、ヌクレオチドを含むことができる。ガイド核酸はヌクレオチドを含むことができる。標的核酸の一部分は、ガイド核酸の一部分に相補的であることができる。二本鎖標的ポリヌクレオチドのうち、ガイド核酸に相補的であってガイド核酸とハイブリダイズする方の鎖を、相補鎖と呼ぶことができる。二本鎖標的ポリヌクレオチドのうち、相補鎖に相補的であり、それゆえにガイド核酸には相補的でありえない方の鎖を、非相補鎖と呼ぶことができる。ガイド核酸は1つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、「シングルガイド核酸（single guide nucleic acid）」と呼ぶことができる。ガイド核酸は2つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、「ダブルガイド核酸（double guide nucleic acid）」と呼ぶことができる。別段の明示がなければ、「ガイド核酸」という用語は包括的であって、シングルガイド核酸とダブルガイド核酸の両方を指しうる。
【００８１】
ガイド核酸は、「核酸を標的とするセグメント」または「核酸を標的とする配列」と呼びうるセグメントを含むことができる。核酸を標的とする核酸は、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」または「Casタンパク質結合セグメント」と呼ぶことができるセグメントを含みうる。
【００８２】
ペプチドに関して、本明細書において使用される「切断認識部位」という用語は、ペプチドの部位であって、ペプチド結合またはジスルフィド結合などの化学結合が切断されうる部位を指す。切断はさまざまな方法によって達成することができる。ペプチド結合の切断は、例えばプロテアーゼなどの酵素によって、またはタンパク質スプライシング（例えばインテイン）によって、促進されうる。ジスルフィド結合の切断は、例えばオキシドレダクターゼなどの酵素によって促進されうる。
【００８３】
本明細書において使用される「標的指向配列」という用語は、細胞内の場所への、例えば形質膜もしくは所与の細胞小器官の膜、核、サイトゾル、ミトコンドリア、小胞体（ER）、ゴルジ、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソームまたは他の細胞小器官への、タンパク質の局在化（または保留）を媒介する標的指向ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を指す。例えば標的指向配列は、タンパク質（例えば受容体ポリペプチドまたはアダプターポリペプチド）を、核局在化シグナル（NLS）を利用して核に、または核外移行シグナル（NES）を利用して細胞核外、例えば細胞質に、またはミトコンドリアを標的とするシグナルを利用してミトコンドリアに、またはER保留シグナルを利用して小胞体（ER）に、またはペルオキシソームを標的とするシグナルを利用してペルオキシソームに、または膜局在化シグナルを利用して形質膜に、またはそれらを組合せて、向かわせることができる。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「融合物」とは、1つまたは複数の非ネイティブ配列（例えばモエティ）を含むタンパク質および/または核酸を指すことができる。融合物は、1つまたは複数の同じ非ネイティブ配列を含むことができる。融合物は1つまたは複数の異なる非ネイティブ配列を含むことができる。融合物はキメラであることができる。融合物は核酸アフィニティータグを含むことができる。融合物はバーコードを含むことができる。融合物はペプチドアフィニティータグを含むことができる。融合物は、部位指向性ポリペプチドの細胞内局在をもたらしうる（核を標的とするための核局在化シグナル（NLS）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、クロロプラストを標的とするためのクロロプラスト局在化シグナル、小胞体（ER）保留シグナルなど）。融合物は、追跡または精製に使用することができる非ネイティブ配列（例えばアフィニティータグ）を提供することができる。融合物は、ビオチンなどの小分子またはAlexa fluor色素、シアニン3色素、シアニン5色素などの色素であることができる。
【００８５】
融合物は、機能的効果を持つ任意のタンパク質を指すことができる。例えば融合タンパク質は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、リモデリング活性、プロテアーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、シンターゼ活性、シンテターゼ活性、または脱ミリストイル化活性を含むことができる。エフェクタータンパク質はゲノム座位を修飾することができる。融合タンパク質はCasタンパク質中の融合物であることができる。融合タンパク質はCasタンパク質中の非ネイティブ配列であることができる。
【００８６】
本明細書において使用される場合、「非ネイティブ」とは、ネイティブ核酸またはネイティブタンパク質中に見いだされない核酸またはポリペプチド配列を指す。非ネイティブは、アフィニティータグを指すことができる。非ネイティブは融合物を指すことができる。非ネイティブは、突然変異、挿入および/または欠失を含む天然の核酸またはポリペプチド配列を指すこともできる。非ネイティブ配列は、非ネイティブ配列が融合される核酸および/またはポリペプチド配列も呈しうる活性（例えば酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を呈しかつ/またはコードすることができる。非ネイティブ核酸またはポリペプチド配列を、遺伝子工学により、天然の核酸またはポリペプチド配列（もしくはそのバリアント）に連結することで、キメラ核酸および/またはポリペプチドをコードするキメラ核酸および/またはポリペプチドを生成させることができる。
【００８７】
本明細書において用いられる場合、「処置する」または「処置」は、以下のいずれか1つをいう: 疾患、例えばがんの1つもしくは複数の症状を改善すること; 発生する前にそのような症状の顕在化を防ぐこと; (再発エピソード中のより長い期間に、症状の悪化の減速もしくは予防などから明らかでありうるように)疾患の進行を減速することもしくは完全に予防すること; 寛解期間の開始を増強すること; 疾患の進行性慢性段階(1次および2次の両方の段階)で引き起こされる不可逆的損傷を減速すること; 前記進行段階の開始を遅らせること、またはそれらの任意の組み合わせ。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」およびそれらの派生語は、薬剤または組成物の所望の生物学的作用部位への送達を可能にするために用いられうる方法をいう。これらの方法は、非経口投与(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、髄腔内、鼻腔内、硝子体内、注入および局所注射)、経粘膜注射、経口投与、坐薬としての投与、ならびに局所投与を含むが、これらに限定されることはない。投与は、非経口を含めて、任意の経路によるものである。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内を含む。他の送達様式は、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、移植などを含むが、これらに限定されることはない。当業者は、疾患に関連する1つまたは複数の症状を予防または緩和するために本開示の組成物の治療的有効量を投与するためのさらなる方法を知っているであろう。
【００８９】
細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステム、方法、および組成物が本明細書において開示される。1つの局面において、本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節するためのシステムを提供する。例示的なシステムは、(a) 抗原に結合する際に修飾されるキメラ受容体ポリペプチドであって、受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、キメラ受容体ポリペプチド; (b) 受容体修飾に応答して受容体に結合するキメラアダプターポリペプチド; (c) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティであって、切断認識部位の切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体形成する、アクチュエータモエティを含む、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)、および (d) 切断認識部位に近接している場合に切断認識部位を切断する切断モエティを含む。本システムのキメラ受容体ポリペプチド、キメラアダプターポリペプチド、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)、および切断モエティは、種々の構成で配置することができる。例示となる非限定的な構成が本明細書において記述される。いくつかの態様において、GMPはキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ切断モエティはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。いくつかの態様において、GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ切断モエティはキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成する。いくつかの態様において、切断モエティは、受容体修飾に応答してキメラ受容体ポリペプチドに結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつGMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。
【００９０】
例示的な構成では、GMPはキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ切断モエティはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。例示的な構成のキメラ受容体ポリペプチドは、(a) 抗原相互作用ドメイン、および (b) 切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含むことができる。図1は例示的なキメラ受容体ポリペプチドを示す。受容体は、抗原相互作用ドメイン101および遺伝子調整ポリペプチド(GMP) 102を含む。GMP 102は、切断認識部位102bに連結されたアクチュエータモエティ102aを含むことができる。
【００９１】
いくつかの態様において、(i) キメラ受容体ポリペプチドは抗原結合に応答して修飾され、(ii) 切断認識部位はキメラ受容体ポリペプチドの修飾に応答して切断モエティにより切断され、(iii) アクチュエータモエティは切断認識部位でキメラ受容体ポリペプチドから切断された後に、標的ポリヌクレオチドと複合体形成し; かつ (iv) キメラ受容体ポリペプチドは、SEQ ID NO: 39を含まない。
2019500887.tif 000003
【００９２】
本システムのキメラ受容体ポリペプチドは、内因性受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。キメラ受容体ポリペプチドは、例えば抗原相互作用ドメイン(本明細書において「細胞外センサードメイン」ともいわれる)を介して、少なくとも1つの抗原(例えば、少なくとも1つのリガンド)に特異的に結合することができる。キメラ受容体ポリペプチドは、リガンド結合に応答して、コンフォメーション変化および/または化学修飾のような修飾を受けることができる。そのような修飾は、シグナル伝達事象およびさまざまな細胞プロセスに関与するシグナル伝達タンパク質を含むが、これらに限定されない、受容体結合パートナー(例えば、タンパク質のようなパートナー)に動員することができる。例えば、シグナル伝達タンパク質は、翻訳調節; 転写調節; ならびにメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、SUMO化、リボシル化およびシトルリン化の調節を含む後成的修飾による遺伝子発現の、プログラムされた変化のような細胞応答の調節(例えば、活性化および/または脱活性化)に関与することができる。キメラ受容体ポリペプチドのコンフォメーション変化は、それまで曝露されていない受容体の1つまたは複数の領域を曝露することができ、曝露された領域はシグナル伝達タンパク質を動員および/または結合することができる。受容体上の化学的修飾、例えばリン酸化および/または脱リン酸化(例えば、チロシン、セリン、トレオニン、および/または任意の他の適当なアミノ酸残基の位置での)はまた、細胞内プロセスの調節に関与するシグナル伝達タンパク質を動員することができる。シグナル伝達タンパク質は受容体に直接的にまたは受容体に間接的に、例えばより大きな複合体の一部として、結合することができる。
【００９３】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、膜貫通受容体である。例示的な膜貫通受容体を図2に示す。膜貫通受容体は、細胞膜に埋め込まれ、少なくとも細胞外領域201、形質膜のような膜202にまたがる領域、および細胞内領域203を有することができる。抗原相互作用ドメインは細胞外領域の一部分を形成することができ、GMPは細胞内領域の一部分を形成することができる。膜受容体は、周囲環境(例えば、細胞外および/または細胞内環境)からの、小分子、イオンまたはタンパク質のような、少なくとも1つのシグナルを検出することができ、さらなるタンパク質およびシグナル伝達分子を伴う少なくとも1つのシグナル伝達カスケードを介して細胞応答を開始することができる。いくつかの受容体は細胞のある領域から別の領域へ、例えば形質膜または細胞質から核へ、およびその逆へ移動することができる。そのような移動は、受容体へのリガンド結合を条件とすることができる。膜受容体の例としては、Notch受容体; Gタンパク質共役受容体(GPCR); インテグリン受容体;カドヘリン受容体; 酵素活性を保有する受容体および固有の酵素活性を保有するのではなく、非共有結合した酵素(例えば、キナーゼ)を刺激することによって作用する受容体を含む触媒性受容体; 腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーのメンバーのようなデスレセプター; ならびに免疫受容体が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００９４】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、Notch受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。Notch受容体は、細胞間の接触シグナル伝達を媒介し、細胞間コミュニケーション、例えば2つの接触している細胞(受信細胞と送信細胞)間のコミュニケーションの発達および他の局面において中心的な役割を果たす膜貫通タンパク質である。受信細胞において発現されるNotch受容体は、送信細胞上に発現される、そのリガンド(デルタ(delta)ファミリーのタンパク質)を認識する。これらの接触細胞上でのnotchおよびdeltaの会合は、膜から細胞質への受容体の細胞内部分の放出を最終的に引き起こすnotch受容体の2段階タンパク質分解をもたらす。
【００９５】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、Notch受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、Notch、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、Notch、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。Notch、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、Notch、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【００９６】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、Notch1、Notch2、Notch3、およびNotch4またはその任意の相同体から選択されるNotch、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【００９７】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。GPCRは一般に、7つの膜貫通αヘリックスにより特徴付けられ、7つの膜貫通ヘリックスがリガンド結合ドメインとして働く形質膜内の空洞を形成した、たる形に似た三次構造に配置されうる。リガンドは、GPCRの他の場所、例えば細胞外ループおよび/またはN末の尾部に結合することもできる。リガンド結合は会合Gタンパク質を活性化することができ、これが次いで、さまざまなシグナル伝達経路において機能する。このシグナル伝達を脱活性化するために、GPCRはまず、リン酸化によって化学的に修飾されることができる。リン酸化により次いで、さらなるシグナル伝達のために共アダプタータンパク質(例えば、アレスチンタンパク質)を動員することができる。
【００９８】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、GPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、GPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、GPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。GPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、GPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【００９９】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、クラスAオーファン; クラスBオーファン; クラスCオーファン; 味覚受容体、1型; 味覚受容体、2型; 5-ヒドロキシトリプタミン受容体; アセチルコリン受容体(ムスカリン性); アデノシン受容体; Adhesion型; アドレナリン受容体 アンジオテンシン受容体; アペリン受容体; 胆汁酸受容体; ボンベシン受容体; ブラジキニン受容体; カルシトニン受容体; カルシウム感知受容体; カンナビノイド受容体; ケメリン受容体; ケモカイン受容体; コレシストキニン受容体; クラスFrizzled GPCR (例えば、Wnt受容体); 補体ペプチド受容体(complement peptide receptor); 副腎皮質刺激ホルモン放出因子受容体; ドーパミン受容体; エンドセリン受容体; Gタンパク質共役型エストロゲン受容体; ホルミルペプチド受容体; 遊離脂肪酸受容体; GABAB受容体; ガラニン受容体; グレリン受容体; グルカゴン受容体ファミリー; 糖タンパク質ホルモン受容体; 性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体(gonadotrophin-releasing hormone receptor); GPR18、GPR55およびGPR119; ヒスタミン受容体; ヒドロキシカルボン酸受容体; キスペプチン受容体; ロイコトリエン受容体; リゾホスファチジン酸(LPA)受容体; リゾリン脂質(S1P)受容体; メラニン凝集ホルモン受容体; メラノコルチン受容体; メラトニン受容体; 代謝型グルタミン酸受容体; モチリン受容体; ニューロメジンU受容体; 神経ペプチドFF/神経ペプチドAF受容体; 神経ペプチドS受容体; 神経ペプチドW/神経ペプチドB受容体; 神経ペプチドY受容体; ニューロテンシン受容体; オピオイド受容体; オレキシン受容体; オキソグルタル酸受容体; P2Y受容体; 副甲状腺ホルモン受容体; 血小板活性化因子受容体; プロキネチシン受容体; プロラクチン放出ペプチド受容体; プロスタノイド受容体; プロテイナーゼ活性化受容体; QRFP受容体; リラキシンファミリーペプチド受容体; ソマトスタチン受容体; コハク酸受容体; タキキニン受容体; 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体; 微量アミン受容体; ウロテンシン受容体; バソプレシンおよびオキシトシン受容体; VIPならびにPACAP受容体から選択されるGPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１００】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1A(HTR1A)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1B(HTR1B)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1D (HTR1D)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1E (HTR1E)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1F (HTR1F)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2A(HTR2A)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2B(HTR2B)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2C(HTR2C)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体4(HTR4)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体5A(HTR5A)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体5B(HTR5BP)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体6(HTR6)、5-ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体7、アデニル酸シクラーゼ結合体(HTR7)、コリン作動性受容体、ムスカリン1(CHRM1)、コリン作動性受容体、ムスカリン2(CHRM2)、コリン作動性受容体、ムスカリン3(CHRM3)、コリン作動性受容体、ムスカリン4(CHRM4)、コリン作動性受容体、ムスカリン5(CHRM5)、アデノシンA1受容体(ADORA1)、アデノシンA2a受容体(ADORA2A)、アデノシンA2b受容体(ADORA2B)、アデノシンA3受容体(ADORA3)、接着Gタンパク質共役受容体A1 (ADGRA1)、接着Gタンパク質共役受容体A2(ADGRA2)、接着Gタンパク質共役型受容体A3(ADGRA3)、接着Gタンパク質共役型受容体B1(ADGRB1)、接着Gタンパク質共役型受容体B2(ADGRB2)、接着Gタンパク質共役型受容体B3(ADGRB3)、カドヘリンEGF LAG 7回貫通G型受容体 1 (CELSR1)、カドヘリンEGF LAG 7回貫通G型受容体2 (CELSR2)、カドヘリンEGF LAG 7回貫通G型受容体3 (CELSR3)、接着Gタンパク質共役受容体D1(ADGRD1)、接着Gタンパク質共役型受容体D2(ADGRD2)、接着Gタンパク質共役型受容体E1(ADGRE1)、接着Gタンパク質共役型受容体E2(ADGRE2)、接着Gタンパク質共役型受容体E3(ADGRE3)、接着Gタンパク質共役型受容体E4(ADGRE4P)、接着Gタンパク質共役型受容体E5(ADGRE5)、接着Gタンパク質共役型受容体F1(ADGRF1)、接着Gタンパク質共役型受容体F2(ADGRF2)、接着Gタンパク質共役型受容体F3(ADGRF3)、 接着Gタンパク質共役型受容体F4(ADGRF4)、接着Gタンパク質共役型受容体F5(ADGRF5)、接着Gタンパク質共役型受容体G1(ADGRG1)、接着Gタンパク質共役型受容体G2(ADGRG2)、接着Gタンパク質共役型受容体G3(ADGRG3)、接着Gタンパク質共役型受容体G4(ADGRG4)、接着Gタンパク質共役型受容体G5(ADGRG5)、接着Gタンパク質共役型受容体G6(ADGRG6)、接着Gタンパク質共役型受容体G7(ADGRG7)、接着Gタンパク質共役型受容体L1(ADGRL1)、接着Gタンパク質共役型受容体L2(ADGRL2)、接着Gタンパク質共役型受容体L3(ADGRL3)、接着Gタンパク質共役型受容体L4(ADGRL4)、接着Gタンパク質共役型受容体V1(ADGRV1)、アドレナリン受容体α1A(ADRA1A)、アドレナリン受容体α1B(ADRA1B)、アドレナリン受容体α1D(ADRA1D)、アドレナリン受容体α2A(ADRA2A)、アドレナリン受容体α2B(ADRA2B)、アドレナリン受容体α2C(ADRA2C)、アドレナリン受容体β1(ADRB1)、アドレナリン受容体β2(ADRB2)、アドレナリン受容体β3(ADRB3)、アンジオテンシンII受容体1型(AGTR1)、アンギオテンシンII受容体2型(AGTR2)、アペリン受容体(APLNR)、Gタンパク質共役胆汁酸受容体1(GPBAR1)、ニューロメジンB受容体(NMBR)、ガストリン放出ペプチド受容体(GRPR)、ボンベシン様受容体3(BRS3)、ブラジキニン受容体B1(BDKRB1)、ブラジキニン受容体B2(BDKRB2)、カルシトニン受容体(CALCR)、カルシトニン受容体様受容体(CALCRL)、カルシウム感知受容体(CASR)、Gタンパク質共役型受容体、クラスC(GPRC6A)、カンナビノイド受容体1(脳)(CNR1)、カンナビノイド受容体2(CNR2)、ケメリンケモカイン様受容体1(CMKLR1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体1(CCR1)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体2(CCR2)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体3(CCR3)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体4(CCR4)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5(遺伝子/偽遺伝子)(CCR5)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体6(CCR6)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体7(CCR7)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体8(CCR8)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体9(CCR9)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体10(CCR10)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体1(CXCR1)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体2(CXCR2)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体3(CXCR3)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4(CXCR4)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体5(CXCR5)、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体6(CXCR6)、ケモカイン(C-X3-Cモチーフ)受容体1(CX3CR1)、ケモカイン(Cモチーフ)受容体1(XCR1)、非定型ケモカイン受容体1(ダフィー血液型)(ACKR1)、非定型ケモカイン受容体2(ACKR2)、非定型ケモカイン受容体3(ACKR3)、非定型ケモカイン受容体4(ACKR4)、ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体様2(CCRL2)、コレシストキニンA受容体(CCKAR)、コレシストキニンB受容体(CCKBR)、Gタンパク質共役受容体1(GPR1)、ボンベシン様受容体3(BRS3)、Gタンパク質共役受容体3(GPR3)、Gタンパク質共役型受容体4(GPR4)、Gタンパク質共役型受容体6(GPR6)、Gタンパク質共役型受容体12(GPR12)、Gタンパク質共役型受容体15(GPR15)、Gタンパク質共役型受容体17(GPR17)、Gタンパク質共役型受容体18(GPR18)、Gタンパク質共役型受容体19(GPR19)、Gタンパク質共役型受容体20(GPR20)、Gタンパク質共役型受容体21(GPR21)、Gタンパク質共役型受容体22(GPR22)、Gタンパク質共役型受容体25(GPR25)、Gタンパク質共役型受容体26(GPR26)、Gタンパク質共役型受容体27(GPR27)、Gタンパク質共役型受容体31(GPR31)、Gタンパク質共役型受容体32(GPR32)、Gタンパク質共役型受容体33(遺伝子/偽遺伝子)(GPR33)、Gタンパク質共役型受容体34(GPR34)、Gタンパク質共役型受容体35(GPR35)、Gタンパク質共役型受容体37(エンドセリン受容体型B様)(GPR37)、Gタンパク質共役型受容体37様1(GPR37L1)、Gタンパク質共役型受容体39(GPR39)、Gタンパク質共役型受容体42(遺伝子/偽遺伝子)(GPR42)、Gタンパク質共役型受容体45(GPR45)、Gタンパク質共役型受容体50(GPR50)、Gタンパク質共役型受容体52(GPR52)、Gタンパク質共役型受容体55(GPR55)、Gタンパク質共役型受容体61(GPR61)、Gタンパク質共役型受容体62(GPR62)、Gタンパク質共役型受容体63(GPR63)、Gタンパク質共役型受容体65(GPR65)、Gタンパク質共役型受容体68(GPR68)、Gタンパク質共役型受容体75(GPR75)、Gタンパク質共役型受容体78(GPR78)、Gタンパク質共役型受容体79(GPR79)、Gタンパク質共役型受容体82(GPR82)、Gタンパク質共役型受容体83(GPR83)、Gタンパク質共役型受容体84(GPR84)、Gタンパク質共役型受容体85(GPR85)、Gタンパク質共役型受容体87(GPR87)、Gタンパク質共役型受容体88(GPR88)、Gタンパク質共役型受容体101(GPR101)、Gタンパク質共役型受容体119(GPR119)、Gタンパク質共役型受容体132(GPR132)、Gタンパク質共役型受容体135(GPR135)、Gタンパク質共役型受容体139(GPR139)、Gタンパク質共役型受容体141(GPR141)、Gタンパク質共役型受容体142(GPR142)、Gタンパク質共役型受容体146(GPR146)、Gタンパク質共役型受容体148(GPR148)、Gタンパク質共役型受容体149(GPR149)、Gタンパク質共役型受容体150(GPR150)、Gタンパク質共役型受容体151(GPR151)、Gタンパク質共役型受容体152(GPR152)、Gタンパク質共役型受容体153(GPR153)、Gタンパク質共役型受容体160(GPR160)、Gタンパク質共役型受容体161(GPR161)、Gタンパク質共役型受容体162(GPR162)、Gタンパク質共役型受容体171(GPR171)、Gタンパク質共役型受容体173(GPR173)、Gタンパク質共役型受容体174(GPR174)、Gタンパク質共役型受容体176(GPR176)、Gタンパク質共役型受容体182(GPR182)、Gタンパク質共役型受容体183(GPR183)、Gタンパク質共役型受容体4(LGR4)を含むロイシンリッチリピート、Gタンパク質共役型受容体5(LGR5)を含むロイシンリッチリピート、Gタンパク質共役型受容体6(LGR6)を含むロイシンリッチリピート、MAS1がん原遺伝子(MAS1)、MAS1がん原遺伝子様(MAS1L)、MAS関連GPRファミリーD(MRGPRD)、MAS関連GPRファミリーメンバーE(MRGPRE)、MAS関連GPRファミリーメンバーF(MRGPRF)、MAS関連GPRファミリーメンバーG(MRGPRG)、MAS関連GPRファミリーメンバーX1(MRGPRX1)、MAS関連GPRファミリーメンバーX2(MRGPRX2)、MAS関連GPRファミリーメンバーX3(MRGPRX3)、MAS関連GPRファミリーメンバーX4(MRGPRX4)、オプシン3(OPN3)、オプシン4(OPN4)、オプシン5(OPN5)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY8)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY10)、微量アミン関連受容体2(TAAR2)、微量アミン関連受容体3(遺伝子/偽遺伝子)(TAAR3)、微量アミン関連受容体4(TAAR4P)、微量アミン関連受容体5(TAAR5)、微量アミン関連受容体6(TAAR6)、微量アミン関連受容体8(TAAR8)、微量アミン関連受容体9(遺伝子/偽遺伝子)(TAAR9)、Gタンパク質共役型受容体156(GPR156)、Gタンパク質共役型受容体158(GPR158)、Gタンパク質共役型受容体179(GPR179)、Gタンパク質共役型受容体、Cクラス(GPRC5A)、Gタンパク質共役型受容体、クラスC(GPRC5B)、Gタンパク質共役型受容体、クラスC(GPRC5C)、Gタンパク質共役型受容体、クラスC(GPRC5D)、frizzledクラス受容体(frizzled class receptor )1(FZD1)、frizzledクラス受容体2(FZD2)、frizzledクラス受容体3(FZD3)、frizzledクラス受容体4(FZD4)、frizzledクラス受容体5(FZD5)、frizzledクラス受容体6(FZD6)、frizzledクラス受容体7(FZD7)、frizzledクラス受容体8(FZD8)、frizzledクラス受容体9(FZD9)、frizzledクラス受容体10(FZD10)、スムーズンド、frizzledクラス受容体(SMO)、補体成分3a受容体1(C3AR1)、補体成分5a受容体1(C5AR1)、補体成分5a受容体2(C5AR2)、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体1(CRHR1)、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体2(CRHR2)、ドーパミン受容体D1(DRD1)、ドーパミン受容体D2(DRD2)、ドーパミン受容体D3(DRD3)、ドーパミン受容体D4(DRD4)、ドーパミン受容体D5(DRD5)、エンドセリン受容体タイプA(EDNRA)、エンドセリン受容体タイプB(EDNRB)、ホルミルペプチド受容体1(FPR1)、ホルミルペプチド受容体2(FPR2)、ホルミルペプチド受容体3(FPR3)、遊離脂肪酸受容体1(FFAR1)、遊離脂肪酸受容体2(FFAR2)、遊離脂肪酸受容体3(FFAR3)、遊離脂肪酸受容体4(FFAR4)、Gタンパク質共役型受容体42(遺伝子/偽遺伝子)(GPR42)、γ-アミノ酪酸(GABA)B受容体、1(GABBR1)、γ-アミノ酪酸(GABA)B受容体、2(GABBR2)、ガラニン受容体1(GALR1)、ガラニン受容体2(GALR2)、ガラニン受容体3(GALR3)、成長ホルモン分泌促進受容体(GHSR)、成長ホルモン放出ホルモン受容体(GHRHR)、胃抑制ポリペプチド受容体(GIPR)、グルカゴン様ペプチド1受容体(GLP1R)、グルカゴン様ペプチド2受容体(GLP2R)、グルカゴン受容体(GCGR)、セクレチン受容体(SCTR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、黄体形成ホルモン/絨毛性ゴナドトロピン受容体(LHCGR)、甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体(GNRHR)、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体2(偽遺伝子)(GNRHR2)、Gタンパク質共役型受容体18(GPR18)、Gタンパク質共役型受容体55(GPR55)、Gタンパク質共役型受容体119(GPR119)、Gタンパク質共役型エストロゲン受容体1(GPER1)、ヒスタミン受容体H1(HRH1)、ヒスタミン受容体H2(HRH2)、ヒスタミン受容体H3(HRH3)、ヒスタミン受容体H4(HRH4)、ヒドロキシカルボン酸受容体1(HCAR1)、ヒドロキシカルボン酸受容体2(HCAR2)、ヒドロキシカルボン酸受容体3(HCAR3)、KISS1受容体(KISS1R)、ロイコトリエンB4受容体(LTB4R)、ロイコトリエンB4受容体2(LTB4R2)、システイニルロイコトリエン受容体1(CYSLTR1)、システイニルロイコトリエン受容体2(CYSLTR2)、オキソエイコサノイド(OXE)受容体1(OXER1)、ホルミルペプチド受容体2(FPR2)、リゾホスファチジン酸受容体1(LPAR1)、リゾホスファチジン酸受容体2(LPAR2)、リゾホスファチジン酸受容体3(LPAR3)、リゾホスファチジン酸受容体4(LPAR4)、リゾホスファチジン酸受容体5(LPAR5)、リゾホスファチジン酸受容体6(LPAR6)、スフィンゴシン-1-リン酸受容体1(S1PR1)、スフィンゴシン-1-リン酸受容体2(S1PR2)、スフィンゴシン-1-リン酸受容体3(S1PR3)、スフィンゴシン-1-リン酸受容体4(S1PR4)、
スフィンゴシン-1-リン酸受容体5(S1PR5)、メラニン凝集ホルモン受容体1(MCHR1)、メラニン凝集ホルモン受容体2(MCHR2)、メラノコルチン1受容体(αメラノサイト刺激ホルモン受容体)(MC1R)、メラノコルチン2受容体(副腎皮質刺激ホルモン)(MC2R)、メラノコルチン3受容体(MC3R)、メラノコルチン4受容体(MC4R)、メラノコルチン5受容体(MC5R)、メラトニン受容体1A(MTNR1A)、メラトニン受容体1B(MTNR1B)、グルタミン酸受容体、代謝調節型1(GRM1)、グルタミン酸受容体、代謝調節型2(GRM2)、グルタミン酸受容体、代謝調節型3(GRM3)、グルタミン酸受容体、代謝調節型4(GRM4)、グルタミン酸受容体、代謝調節型5(GRM5)、グルタミン酸受容体、代謝調節型6(GRM6)、グルタミン酸受容体、代謝調節型7(GRM7)、グルタミン酸受容体、代謝調節型8(GRM8)、モチリン受容体(MLNR)、ニューロメジンU受容体1(NMUR1)、ニューロメジンU受容体2(NMUR2)、ニューロペプチドFF受容体1(NPFFR1)、ニューロペプチドFF受容体2(NPFFR2)、ニューロペプチドS受容体1(NPSR1)、ニューロペプチドB/W受容体1(NPBWR1)、ニューロペプチドB/W受容体2(NPBWR2)、ニューロペプチドY受容体Y1(NPY1R)、ニューロペプチドY受容体Y2(NPY2R)、ニューロペプチドY受容体Y4(NPY4R)、ニューロペプチドY受容体Y5(NPY5R)、ニューロペプチドY受容体Y6(偽遺伝子) (NPY6R)、ニューロテンシン受容体1(高親和性)(NTSR1)、ニューロテンシン受容体2(NTSR2)、オピオイド受容体、δ1(OPRD1)、オピオイド受容体、κ1(OPRK1)、オピオイド受容体、mu 1(OPRM1)、オピエート受容体様1(OPRL1)、ヒポクレチン(オレキシン)受容体1(HCRTR1)、ヒポクレチン(オレキシン)受容体2(HCRTR2)、Gタンパク質共役型受容体107(GPR107)、Gタンパク質共役型受容体137(GPR137)、嗅覚受容体ファミリー51サブファミリーEメンバー1(OR51E1)、膜貫通タンパク質、脂肪細胞関連1(TPRA1)、Gタンパク質共役型受容体143(GPR143)、Gタンパク質共役型受容体157(GPR157)、オキソグルタル酸(α-ケトグルタル酸)受容体1(OXGR1)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY1)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY2)、ピリミジン作動性受容体P2Y(P2RY4)、ピリミジン作動性受容体P2Y(P2RY6)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY11)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY12)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY13)、プリン作動性受容体P2Y(P2RY14)、副甲状腺ホルモン1受容体(PTH1R)、副甲状腺ホルモン2受容体(PTH2R)、血小板活性化因子受容体(PTAFR)、プロキネチシン受容体1(PROKR1)、プロキネチネシン受容体2(PROKR2)、プロラクチン放出ホルモン受容体(PRLHR)、プロスタグランジンD2受容体(DP)(PTGDR)、プロスタグランジンD2受容体2(PTGDR2)、プロスタグランジンE受容体1(PTGER1)、プロスタグランジンE受容体2(PTGER2)、プロスタグランジンE受容体3(PTGER3)、プロスタグランジンE受容体4(PTGER4)、プロスタグランジンF受容体(PTGFR)、プロスタグランジンI2(プロスタサイクリン)受容体(IP)(PTGIR)、トロンボキサンA2受容体(TBXA2R)、凝固因子IIトロンビン受容体(F2R)、F2R様トリプシン受容体1(F2RL1)、凝固因子IIトロンビン受容体様2(F2RL2)、F2R様トロンビン/トリプシン受容体3(F2RL3)、ピログルタミル化RFアミドペプチド受容体(QRFPR)、リラキシン/インスリン様ファミリーペプチド受容体1(RXFP1)、リラキシン/インスリン様ファミリーペプチド受容体2(RXFP2)、リラキシン/インスリン様ファミリーペプチド受容体3(RXFP3)、リラキシン/インスリン様ファミリーペプチド受容体4(RXFP4)、ソマトスタチン受容体1(SSTR1)、ソマトスタチン受容体2(SSTR2)、ソマトスタチン受容体3(SSTR3)、ソマトスタチン受容体4(SSTR4)、ソマトスタチン受容体5(SSTR5)、コハク酸受容体1(SUCNR1)、タキキニン受容体1(TACR1)、タキキニン受容体2(TACR2)、タキキニン受容体3(TACR3)、味覚1受容体メンバー1(TAS1R1)、味覚1受容体メンバー2(TAS1R2)、味覚1受容体メンバー3(TAS1R3)、味覚2受容体メンバー1(TAS2R1)、味覚2受容体メンバー3(TAS2R3)、味覚2受容体メンバー4(TAS2R4)、味覚2受容体メンバー5(TAS2R5)、味覚2受容体メンバー7(TAS2R7)、味覚2受容体メンバー8(TAS2R8)、味覚2受容体メンバー9(TAS2R9)、味覚2受容体メンバー10(TAS2R10)、味覚2受容体メンバー13(TAS2R13)、味覚2受容体メンバー14(TAS2R14)、味覚2受容体メンバー16(TAS2R16)、味覚2受容体メンバー19(TAS2R19)、味覚2受容体メンバー20(TAS2R20)、味覚2受容体メンバー30(TAS2R30)、味覚2受容体メンバー31(TAS2R31)、味覚2受容体メンバー38(TAS2R38)、味覚2受容体メンバー39(TAS2R39)、味覚2受容体メンバー40(TAS2R40)、味覚2受容体メンバー41(TAS2R41)、味覚2受容体メンバー42(TAS2R42)、味覚2受容体メンバー43(TAS2R43)、味覚2受容体メンバー45(TAS2R45)、味覚2受容体メンバー46(TAS2R46)、味覚2受容体メンバー50(TAS2R50)、味覚2受容体メンバー60(TAS2R60)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体(TRHR)、微量アミン関連受容体1(TAAR1)、ウロテンシン2受容体(UTS2R)、アルギニンバソプレシン受容体1A(AVPR1A)、アルギニンバソプレシン受容体1B(AVPR1B)、アルギニンバソプレシン受容体2(AVPR2)、オキシトシン受容体(OXTR)、アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド1(脳下垂体)受容体I型(ADCYAP1R1)、血管作動性腸管ペプチド受容体1(VIPR1)、血管作動性腸管ペプチド受容体2(VIPR2)、その任意の誘導体、その任意のバリアント、およびその任意のフラグメントからなる群より選択されるGPCRを含む。
【０１０１】
GPCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、任意の適当なGPCRリガンド、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む抗原に結合することができる。GPCRによって結合されることができるリガンドの非限定的な例としては、(-)-アドレナリン、(-)-ノルアドレナリン、(リゾ)リン脂質メディエータ、[des-Arg10]カリジン、[des-Arg9]ブラジキニン、[des-Gln14]グレリン、[Hyp3]ブラジキニン、[Leu]エンケファリン、[Met]エンケファリン、12-ヒドロキシヘプタデカトリエン酸、12R-HETE、12S-HETE、12S-HPETE、15S-HETE、17β-エストラジオール、20-ヒドロキシ-LTB4、2-アラキドノイルグリセロール、2-オレオイル-LPA、3-ヒドロキシオクタン酸、5-ヒドロキシトリプタミン、5-オキソ-15-HETE、5-オキソ-ETE、5-オキソ-ETrE、5-オキソ-ODE、5S-HETE、5S-HPETE、7α,25-ジヒドロキシコレステロール、アセチルコリン、ACTH、アデノシン二リン酸、アデノシン、アドレノメデュリン2/インテルメジン、アドレノメデュリン、アミリン、アナンダミド、アンギオテンシンII、アンギオテンシンIII、アネキシンI、アペリン受容体早期内因性リガンド(apelin receptor early endogenous ligand)、アペリン-13、アペリン-17、アペリン-36、アスピリン誘発リポキシンA4、アスピリン誘発レゾルビンD1、ATP、βデフェンシン4A、ビッグダイノルフィン、ウシ副腎髄質ペプチド8-22、ブラジキニン、C3a、C5a、Ca2+、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、カルシトニン、カテプシンG、CCK-33、CCK-4、CCK-8、CCL1、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、ケメリン、ケノデオキシコール酸、コール酸、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、CST-17、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12α、CXCL12β、CXCL13、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、システイニルロイコトリエン(CysLT)、ウラシルヌクレオチド、デオキシコール酸、ジヒドロスフィンゴシン-1-リン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ドーパミン、ダイノルフィンA、ダイノルフィンA-(1-13)、ダイノルフィンA-(1-8)、ダイノルフィンB、エンドモルフィン-1、エンドセリン-1、エンドセリン-2、エンドセリン-3、F2L、遊離脂肪酸、FSH、GABA、ガラニン、ガラニン様ペプチド、胃抑制ポリペプチド、ガストリン-17、ガストリン放出ペプチド、グレリン、GHRH、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1-(7-36)アミド、グルカゴン様ペプチド1-(7-37)、グルカゴン様ペプチド2、グルカゴン様ペプチド2-(3-33)、GnRH I、GnRH II、GRP-(18-27)、hCG、ヒスタミン、ヒューマニン、INSL3、INSL5、カリジン、キスペプチン-10、キスペプチン-13、キスペプチン-14、キスペプチン-54、キヌレン酸、ラージニューロメジンN、ラージニューロテンシン、L-グルタミン酸、LH、リトコール酸、L-乳酸、長鎖カルボン酸、LPA、LTB4、LTC4、LTD4、LTE4、LXA4、Lys-[Hyp3]-ブラジキニン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、中鎖脂肪酸、メラニン凝集ホルモン、メラトニン、メチルカルバミルPAF、Mg2+、モチリン、N-アラキドノイルグリシン、ニューロキニンA、ニューロキニンB、ニューロメジンB、ニューロメジンN、ニューロメジンS-33、ニューロメジンU-25、ニューロノスタチン、ニューロペプチドAF、ニューロペプチドB-23、ニューロペプチドB-29、ニューロペプチドFF、ニューロペプチドS、ニューロペプチドSF、ニューロペプチドW-23、ニューロペプチドW-30、ニューロペプチドY、ニューロペプチドY-(3-36)、ニューロテンシン、ノシセプチン/オルファニンFQ、N-オレオイルエタノールアミド、オベスタチン、オクトパミン、オレキシン-A、オレキシン-B、オキシステロール、オキシトシン、PACAP-27、PACAP-38、PAF、膵臓ポリペプチド、ペプチドYY、PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2、PGJ2、PHM、ホスファチジルセリン、PHV、プロキネチシン-1、プロキネチシン-2、プロキネチシン-2β、プロサポシン、PrRP-20、PrRP-31、PTH、PTHrP、PTHrP-(1-36)、QRFP43、リラキシン、リラキシン-1、リラキシン-3、レゾルビンD1、レゾルビンE1、RFRP-1、RFRP-3、R-スポンジン、セクレチン、セリンプロテアーゼ、スフィンゴシン1-リン酸、スフィンゴシルホスホリルコリン、SRIF-14、SRIF-28、サブスタンスP、コハク酸、トロンビン、トロンボキサンA2、TIP39、T-キニン、TRH、TSH、チラミン、UDP-グルコース、ウリジン二リン酸、ウロコルチン1、ウロコルチン2、ウロコルチン3、ウロテンシンII関連ペプチド、ウロテンシンII、バソプレシン、VIP、Wnt、Wnt-1、Wnt-10a、Wnt-10b、Wnt-11、Wnt-16、Wnt-2、Wnt-2b、Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a、Wnt-8b、Wnt-9a、Wnt-9b、XCL1、XCL2、Zn2+、α-CGRP、α-ケトグルタル酸、α-MSH、α-ネオエンドルフィン、β-アラニン、β-CGRP、β-D-ヒドロキシ酪酸、β-エンドルフィン、β-MSH、β-ネオエンドルフィン、β-フェニルエチルアミン、およびγ-MSHが挙げられる。
【０１０２】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、インテグリン受容体、インテグリン受容体サブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。インテグリン受容体は、細胞-細胞および細胞-細胞外マトリックス(ECM)相互作用のための架橋として機能できる膜貫通受容体である。インテグリン受容体は一般に、非共有結合的に会合するαサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体として形成される。少なくとも18個のαサブユニットおよび少なくとも8個のβサブユニットが存在する。各サブユニットは一般に、細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)、膜にまたがる領域、および細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、インテグリンサブユニット(例えば、αサブユニットもしくはβサブユニット)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、インテグリンサブユニット(例えば、αサブユニットもしくはβサブユニット)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも膜にまたがる領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、インテグリンサブユニット(例えば、αサブユニットもしくはβサブユニット)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。インテグリンサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、インテグリンサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１０３】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αV、αL、αM、αX、αD、αE、およびαIIbからなる群より選択されるインテグリン受容体αサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、およびβ8からなる群より選択されるインテグリン受容体βサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。αサブユニット、βサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、ヘテロ二量体化(例えば、αサブユニットがβサブユニットと二量体化)して、インテグリン受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを形成することができる。インテグリン受容体の非限定的な例としては、α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α10β1、αVβ1、αLβ1、αMβ1、αXβ1、αDβ1、αIIbβ1、αEβ1、α1β2、α2β2、α3β2、α4β2、α5β2、α6β2、α7β2、α8β2、α9β2、α10β2、αVβ2、αLβ2、αMβ2、αXβ2、αDβ2、αIIbβ2、αEβ2、α1β3、α2β3、α3β3、α4β3、α5β3、α6β3、α7β3、α8β3、α9β3、α10β3、αVβ3、αLβ3、αMβ3、αXβ3、αDβ3、αIIbβ3、αEβ3、α1β4、α2β4、α3β4、α4β4、α5β4、α6β4、α7β4、α8β4、α9β4、α10β4、αVβ4、αLβ4、αMβ4、αXβ4、αDβ4、αIIbβ4、αEβ4、α1β5、α2β5、α3β5、α4β5、α5β5、α6β5、α7β5、α8β5、α9β5、α10β5、αVβ5、αLβ5、αMβ5、αXβ5、αDβ5、αIIbβ5、αEβ5、α1β6、α2β6、α3β6、α4β6、α5β6、α6β6、α7β6、α8β6、α9β6、α10β6、αVβ6、αLβ6、αMβ6、αXβ6、αDβ6、αIIbβ6、αEβ6、α1β7、α2β7、α3β7、α4β7、α5β7、α6β7、α7β7、α8β7、α9β7、α10β7、αVβ7、αLβ7、αMβ7、αXβ7、αDβ7、αIIbβ7、αEβ7、α1β8、α2β8、α3β8、α4β8、α5β8、α6β8、α7β8、α8β8、α9β8、α10β8、αVβ8、αLβ8、αMβ8、αXβ8、αDβ8、αIIbβ8、およびαEβ8受容体が挙げられる。インテグリンサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、内因性インテグリンサブユニット(例えば、野生型インテグリンサブユニット)と二量体化することができる。
【０１０４】
インテグリンサブユニット、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、任意の適当なインテグリンリガンド、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む抗原に結合することができる。インテグリン受容体によって結合されることができるリガンドの非限定的な例としては、アデノウイルスペントンベースタンパク質、β-グルカン、骨シアロタンパク質(BSP)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、コラーゲン(CN、例えばCNI-IV)、サイトタクチン/テネイシン-C、デコルシン、変性コラーゲン、ディスインテグリン、E-カドヘリン、エコーウイルス1受容体、エピリグリン、第X因子、FcεRII(CD23)、フィブリン(Fb)、フィブリノゲン(Fg)、フィブロネクチン(Fn)、ヘパリン、HIV Tatタンパク質、iC3b、細胞接着分子(例えば、ICAM-1,2,3,4,5)、インバシン、L1細胞接着分子(L1-CAM)、ラミニン、リポ多糖類(LPS)、MAdCAM-1、マトリックスメタロプロテアーゼ-2(MMPe)、好中球阻害因子(NIF)、オステオポンチン(OPまたはOPN)、プラスミノゲン、プロトロンビン、精子フェルチリン(sperm fertilin)、トロンボスポンジン(TSP)、血管細胞接着分子1(VCAM-1)、ビトロネクチン(VNまたはVTN)、およびヴォン・ヴィレブランド因子(vWF)が挙げられる。
【０１０５】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、カドヘリン分子、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。リガンドおよび受容体の両方として機能できるカドヘリン分子は、細胞接着の媒介に関与するある種のタンパク質をいう。カドヘリン分子は一般に、5つのタンデム反復細胞外ドメイン、単一膜貫通セグメントおよび細胞質領域からなる。例えば、E-カドヘリンまたはCDH1は、細胞外ドメインにおける5つのリピート、1つの膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなる。E-カドヘリンが細胞内ドメインの領域でリン酸化されると、β-カテニンおよびp120-カテニンのようなアダプタータンパク質が受容体に結合することができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞外領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも膜にまたがる領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１０６】
キメラ受容体ポリペプチドは、古典的カドヘリン、デスモソームカドヘリン、プロトカドヘリンおよび非従来型カドヘリン(unconventional cadherin)から選択されるカドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、CDH1(E-カドヘリン、上皮)、CDH2(N-カドヘリン、神経)、CDH12(カドヘリン12、2型、N-カドヘリン2)、およびCDH3 (P-カドヘリン、胎盤)から選択される古典的カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、デスモグレイン(DSG1、DSG2、DSG3、DSG4)およびデスモコリン(DSC1、DSC2、DSC3)から選択されるデスモソーマカドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、PCDH1、PCDH10、PCDH11X、PCDH11Y、PCDH12、PCDH15、PCDH17、PCDH18、PCDH19、PCDH20、PCDH7、PCDH8、PCDH9、PCDHA1、PCDHA10、PCDHA11、PCDHA12、PCDHA13、PCDHA2、PCDHA3、PCDHA4、PCDHA5、PCDHA6、PCDHA7、PCDHA8、PCDHA9、PCDHAC1、PCDHAC2、PCDHB1、PCDHB10、PCDHB11、PCDHB12、PCDHB13、PCDHB14、PCDHB15、PCDHB16、PCDHB17、PCDHB18、PCDHB2、PCDHB3、PCDHB4、PCDHB5、PCDHB6、PCDHB7、PCDHB8、PCDHB9、PCDHGA1、PCDHGA10、PCDHGA11、PCDHGA12、PCDHGA2、PCDHGA3、PCDHGA4、PCDHGA5、PCDHGA6、PCDHGA7、PCDHGA8、PCDHGA9、PCDHGB1、PCDHGB2、PCDHGB3、PCDHGB4、PCDHGB5、PCDHGB6、PCDHGB7、PCDHGC3、PCDHGC4、PCDHGC5、FAT、FAT2、およびFAT)から選択されるプロトカドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、CDH4(R-カドヘリン、網膜)、CDH5(VE-カドヘリン、血管内皮)、CDH6(K-カドヘリン、腎臓)、CDH7(カドヘリン7、2型)、CDH8(カドヘリン8、2型)、CDH9(カドヘリン9、2型、T1-カドヘリン)、CDH10(カドヘリン10、2型、T2-カドヘリン)、CDH11(OB-カドヘリン、骨芽細胞)、CDH13(T-カドヘリン、H-カドヘリン、心臓)、CDH15(M-カドヘリン、筋管)、CDH16(KSP-カドヘリン)、CDH17(LIカドヘリン、肝臓-腸)、CDH18(カドヘリン18、2型)、CDH19(カドヘリン19、2型)、CDH20(カドヘリン20、2型)、CDH23(カドヘリン23、感覚神経上皮)、CDH24、CDH26、CDH28、CELSR1、CELSR2、CELSR3、CLSTN1、CLSTN2、CLSTN3、DCHS1、DCHS2、LOC389118、PCLKC、RESDA1、およびRETから選択される非従来型カドヘリンを含む。
【０１０７】
カドヘリン、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、任意の適当なカドヘリンリガンド、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む抗原に結合することができる。カドヘリンリガンドは、例えば、別のカドヘリン受容体(例えば、細胞のカドヘリン受容体)を含むことができる。
【０１０８】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、触媒性受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。触媒性受容体の例としては、受容体チロシンキナーゼ(RTK)および受容体トレオニン/セリンキナーゼ(RTSK)が挙げられるが、これらに限定されることはない。RTKおよびRTSKのような触媒性受容体は、ある種の酵素活性を保有する。例えば、RTKは基質タンパク質をチロシン残基上でリン酸化することができ、これが次に、アダプタータンパク質の結合部位として作用することができる。RTKは一般に、N末細胞外リガンド結合ドメイン、単一膜貫通αへリックス、およびタンパク質チロシンキナーゼ活性を有する細胞質ゾルC末ドメインを含む。いくつかのRTKは単一ポリペプチドからなるが、いくつかは2対のポリペプチド鎖、例えばインスリン受容体およびいくつかの関連受容体からなる二量体である。これらの受容体の細胞外ドメインへのリガンドの結合は、細胞質キナーゼドメインを活性化し、リガンド結合によって開始されるシグナルを伝える受容体自体および細胞内標的タンパク質の両方のリン酸化をもたらしうる。いくつかのRTKにおいて、リガンド結合は受容体二量体化を誘導する。いくつかのリガンド(例えば、PDGFおよびNGFのような成長因子)はそれ自体、2つの同一のポリペプチド鎖からなる二量体である。これらの成長因子は、2つの異なる受容体分子に同時に結合することによって二量体化を直接誘導することができる。他の成長因子(例えば、EGFのような)は単量体であるが、しかし受容体を架橋できる2つの異なる受容体結合部位を有する。リガンド誘導性の二量体化は、二量体化ポリペプチド鎖が相互に交差リン酸化する受容体の自己リン酸化をもたらすことができる。いくつかの受容体は多量体化することができる。
【０１０９】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、RTK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような触媒性受容体の少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、RTK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような触媒性受容体の少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、RTK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような触媒性受容体の少なくとも細胞内領域(例えば細胞質ドメイン)を含む。RTK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、RTK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１１０】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、クラスI RTK(例えば、EGFRを含む上皮成長因子(EGF)受容体ファミリー; ErbB-2、ErbB-3、およびErbB-4を含むErbBファミリー)、クラスII RTK(例えば、INSR、IGF-1R、およびIRRを含むインスリン受容体ファミリー)、クラスIII RTK(例えば、PDGFR-α、PDGFR-β、CSF-1R、KIT/SCFR、およびFLK2/FLT3を含む血小板由来成長因子(PDGF)受容体ファミリー)、クラスIV RTK(例えば、FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、およびFGFR-4を含む線維芽細胞増殖因子(FGF)受容体ファミリー)、クラスV RTK(例えば、VEGFR1、VEGFR2、およびVEGFR3を含む血管内皮増殖因子(VEGF)受容体ファミリー)、クラスVI RTK(例えば、肝細胞増殖因子受容体(HGFR/MET)およびRONを含む肝細胞増殖因子(HGF)受容体ファミリー)、クラスVII RTK(例えば、TRKA、TRKBおよびTRKCを含むトロポミオシン受容体キナーゼ(Trk)受容体ファミリー)、クラスVIII RTK(例えば、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、およびEPHB6を含むエフリン(Eph)受容体ファミリー)、クラスIX RTK(例えば、AXL、MER、およびTRYO3のようなAXL受容体ファミリー)、クラスX RTK(例えば、LTKおよびALKのようなLTK受容体ファミリー)、クラスXI RTK(例えば、TIEおよびTEKのようなTIE受容体ファミリー)、クラスXII RTK(例えば、ROR受容体ファミリーROR1およびROR2)、クラスXIII RTK(例えば、DDR1およびDDR2のようなジスコイジンドメイン受容体(DDR)ファミリー)、クラスXIV RTK(例えば、RETのようなRET受容体ファミリー)、クラスXV RTK(例えば、PTK7を含むKLG受容体ファミリー)、クラスXVI RTK(例えば、Rykを含むRYK受容体ファミリー)、クラスXVII RTK(例えば、MuSKのようなMuSK受容体ファミリー)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１１１】
RTK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、任意の適当なRTKリガンド、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む抗原に結合することができる。RTKリガンドの非限定的な例としては、成長因子、サイトカイン、およびホルモンが挙げられる。成長因子には、例えば、上皮成長因子ファミリーのメンバー(例えば、上皮成長因子またはEGF、ヘパリン結合EGF様成長因子またはHB-EGF、形質転換成長因子-αまたはTGF-α、アンフィレグリンまたはAR、エピレグリンまたはEPR、エピジェン、ベータセルリンまたはBTC、ニューレグリン-1またはNRG1、ニューレグリン-2またはNRG2、ニューレグリン-3またはNRG3、およびニューレグリン-4またはNRG4)、線維芽細胞成長因子ファミリー(例えば、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15/19、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21、およびFGF23)、血管内皮成長因子ファミリー(例えば、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、およびPIGF)、ならびに血小板由来成長因子ファミリー(例えば、PDGFA、PDGFB、PDGFC、およびPDGFD)が含まれる。ホルモンには、例えば、インスリン/IGF/リラキシンファミリーのメンバー(例えば、インスリン、インスリン様成長因子、リラキシン1、リラキシン2、リラキシン3を含むリラキシンファミリーペプチド、ライディッヒ細胞特異的インスリン様ペプチド(遺伝子INSL3)、初期胎盤インスリン様ペプチド(ELIP)(遺伝子INSL4)、インスリン様ペプチド5(遺伝子INSL5)、およびインスリン様ペプチド6)が含まれる。
【０１１２】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような触媒性受容体の少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような触媒性受容体の少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような触媒性受容体の少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１１３】
RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、セリンおよび/またはトレオニン残基で基質をリン酸化することができ、コンセンサス配列に基づいて特定の残基を選択しうる。キメラ受容体ポリペプチドは、I型RTSK、II型RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。いくつかの態様において、I型受容体セリン/トレオニンキナーゼを含むキメラ受容体ポリペプチドは、II型受容体と複合体形成しない限り不活性である。いくつかの態様において、II型受容体セリン/トレオニンを含むキメラ受容体ポリペプチドは、I型受容体と複合体形成する場合にI型受容体をリン酸化し活性化しうる構成的に活性なキナーゼドメインを含む。II型受容体セリン/トレオニンキナーゼは、I型パートナーのキナーゼドメインをリン酸化し、タンパク質パートナーの置換を引き起こしうる。タンパク質パートナーの置換は、他のタンパク質、例えばSMADファミリーのある種のメンバーの結合およびリン酸化を可能としうる。キメラ受容体ポリペプチドは、ALK1 (ACVRL1)、ALK2 (ACVR1A)、ALK3 (BMPR1A)、ALK4 (ACVR1B)、ALK5 (TGFβR1)、ALK6 (BMPR1B)、およびALK7 (ACVR1C)からなる群より選択されるI型受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。キメラ受容体ポリペプチドは、TGFβR2、BMPR2、ACVR2A、ACVR2B、およびAMHR2 (AMHR)からなる群より選択されるII型受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、TGF-β受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１１４】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、固有の酵素活性を保有するのではなく、Srcキナーゼ(例えば、c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Lck、Hck、Blk、LynおよびFrk)もしくはJAKキナーゼ(例えば、JAK1、JAK2、JAK3、およびTYK2)のような、非共有結合細胞内キナーゼを刺激する受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。これらには、サイトカインおよびポリペプチドホルモンに対する受容体のようなサイトカイン受容体スーパーファミリーが含まれる。サイトカイン受容体は一般に、N末細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通αへリックス、およびC末細胞質ドメインを含む。サイトカイン受容体の細胞質ドメインは一般に、既知の触媒活性を欠いている。代わりに、サイトカイン受容体は、受容体へのリガンド結合の結果として活性化されうる非受容体キナーゼ(例えば、チロシンキナーゼまたはトレオニン/セリンキナーゼ)と関連して機能することができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞内キナーゼ(例えば、サイトカイン受容体)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントと非共有結合する触媒性受容体の少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞内キナーゼ(例えば、サイトカイン受容体)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントと非共有結合する触媒性受容体の少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞内キナーゼ(例えば、サイトカイン受容体)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントと非共有結合する触媒性受容体の少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。細胞内キナーゼ、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントと非共有結合する触媒性受容体を含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、細胞内キナーゼ、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントと非共有結合する触媒性受容体を含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１１５】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、サイトカイン受容体、例えばI型サイトカイン受容体もしくはII型サイトカイン受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、インターロイキン受容体(例えば、IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-9R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-21R、IL-23R、IL-27R、およびIL-31R)、コロニー刺激因子受容体(例えば、エリスロポエチン受容体、CSF-1R、CSF-2R、GM-CSFR、およびG-CSFR)、ホルモン受容体/神経ペプチド受容体(例えば、成長ホルモン受容体、プロラクチン受容体、およびレプチン受容体)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、II型サイトカイン受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、インターフェロン受容体(例えば、IFNAR1、IFNAR2、およびIFNGR)、インターロイキン受容体(例えば、IL-10R、IL-20R、IL-22R、およびIL-28R)、組織因子受容体(血小板組織因子とも呼ばれる)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１１６】
サイトカイン受容体を含むキメラ受容体ポリペプチドは、任意の適当なサイトカイン受容体リガンド、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む抗原に結合することができる。サイトカイン受容体リガンドの非限定的な例としては、インターロイキン(例えば、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28、およびIL-31)、インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、コロニー刺激因子(例えば、エリスロポエチン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子またはGM-CSF、および顆粒球コロニー刺激因子またはG-CSF)、ならびにホルモン(例えば、プロラクチンおよびレプチン)が挙げられる。
【０１１７】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、デスレセプター、デスドメインを含む受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。デスレセプターは、アポトーシスおよび炎症の調節に関与することが多い。デスレセプターは、TNFR1、Fas受容体、DR4(TRAIL受容体1またはTRAILR1としても知られる)およびDR5(TRAIL受容体2またはTRAILR2としても知られる)のようなTNF受容体ファミリーのメンバーを含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、デスレセプター、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、デスレセプター、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、デスレセプター、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質)ドメインを含む。デスレセプター、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、リガンド結合に応答して受容体オリゴマー化を受けることができ、これが今度は、特殊化されたアダプタータンパク質の動員およびカスパーゼカスケードのような、シグナル伝達カスケードの活性化をもたらすことができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、デスレセプター、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含み、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１１８】
デスレセプターを含むキメラ受容体ポリペプチドは、任意の適当なデスレセプターリガンド、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む抗原に結合することができる。デスレセプターによって結合されるリガンドの非限定的な例としては、TNFα、Fasリガンド、およびTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(TRAIL)が挙げられる。
【０１１９】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、免疫受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。免疫受容体は、免疫グロブリンと構造的特徴、例えば、免疫グロブリンドメインまたは折畳みとして知られるドメインを共有する免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)のメンバーを含む。IgSFメンバーには、細胞表面抗原受容体、免疫系の共受容体および共刺激分子、ならびにリンパ球への抗原提示に関与する分子が含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、免疫受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞外領域(例えば、リガンド結合ドメイン)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、免疫受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも膜にまたがる領域を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、免疫受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの少なくとも細胞内領域(例えば、細胞質ドメイン)を含む。免疫受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、結合パートナーを動員することができる。いくつかの態様において、免疫受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体へのリガンド結合は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせをもたらし、これが結合パートナーを受容体に動員する。
【０１２０】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような細胞表面抗原受容体を含む。T細胞受容体は一般に、TCR-α鎖およびTCR-β鎖またはTCR-δ鎖およびTCR-γ鎖のいずれかの2つの鎖を含む。TCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドは、主要組織適合複合体(MHC)タンパク質に結合することができる。B細胞受容体は一般に、膜結合免疫グロブリンおよびシグナル伝達モエティを含む。BCR、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体は、同種のBCR抗原に結合することができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、ある種の免疫受容体の細胞質ドメインに見出される少なくとも免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ(ITAM)を含む。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、ある種の免疫受容体の細胞質ドメインに見出される少なくとも免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ(ITIM)を含む。ITAMおよび/またはITIMドメインを含むキメラ受容体ポリペプチドは、抗原相互作用ドメインへのリガンド結合後にリン酸化されることができる。リン酸化された領域は、免疫細胞シグナル伝達に関与する他のタンパク質のドッキング部位として働くことができる。
【０１２１】
キメラ受容体ポリペプチドの抗原相互作用ドメインは、膜結合抗原、例えば細胞の細胞外表面(例えば、標的細胞)に結合した抗原に結合することができる。いくつかの態様において、抗原相互作用ドメインは、非膜結合抗原、例えば細胞(例えば、標的細胞)によって分泌される細胞外抗原または細胞の細胞質に位置する抗原に結合する。抗原(例えば、膜結合および非膜結合)は、ウイルス感染、細菌感染および/もしくは寄生虫感染のような疾患; 炎症性疾患および/もしくは自己免疫疾患; またはがんおよび/もしくは腫瘍のような新生物と関連することができる。例えば、がん抗原は、免疫応答、特にT細胞媒介免疫応答を誘発できる腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。キメラ受容体ポリペプチドの抗原結合部分の選択は、標的とされるがん抗原の特定のタイプに依存しうる。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する1つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として働くことができるいくつかのタンパク質を発現することができる。抗原相互作用ドメインは、細胞表面シグナル、細胞外マトリックス(ECM)、傍分泌シグナル、接触分泌シグナル、内分泌シグナル、自己分泌シグナル、細胞内の遺伝子プログラムを誘発もしくは制御できるシグナル、またはそれらの任意の組み合わせに結合することができる。いくつかの態様において、組換えキメラ受容体ポリペプチドに結合する細胞シグナル間の相互作用は、細胞-細胞相互作用、細胞-可溶性化学物質相互作用、および細胞-マトリックスまたは微小環境相互作用を伴う。
【０１２２】
キメラ受容体ポリペプチドの遺伝子調整ポリペプチド（GMP）は、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含むことができる。アクチュエータモエティは、ヌクレアーゼ（例えばDNAヌクレアーゼおよび/またはRNAヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼ欠損型であるか野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ活性が低減している修飾ヌクレアーゼ（例えばDNAヌクレアーゼおよび/またはRNAヌクレアーゼ）、その誘導体、そのバリアント、またはそのフラグメントを含むことができる。アクチュエータモエティは、遺伝子の発現または活性を調節することおよび/または核酸（例えば遺伝子および/または遺伝子産物）の配列を編集することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、DNAヌクレアーゼ、例えば標的DNA配列のゲノム編集を誘導するための工学的に操作された（例えばプログラム可能なまたは標的指向可能な）DNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、RNAヌクレアーゼ、例えば標的RNA配列の編集を誘導するための工学的に操作された（例えばプログラム可能なまたは標的指向可能な）RNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは低減したまたはごくわずかなヌクレアーゼ活性を有する。低減したまたはごくわずかなヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑圧もしくは強化するのに有効な追加因子の動員によって、遺伝子の発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または転写抑制を誘導することができる、DNAヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼヌルDNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または転写抑制を誘導することができる、RNAヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼヌルRNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、核酸ガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、DNAガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、RNAガイドアクチュエータモエティである。アクチュエータモエティは、外因性であるか内在性であるかを問わず遺伝子の発現または活性を調節することおよび/または核酸配列を編集することができる。
【０１２３】
アクチュエータモエティには任意の適切なヌクレアーゼを使用することができる。適切なヌクレアーゼとして、CRISPR関連（Cas）タンパク質またはCasヌクレアーゼ、例えばI型CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、II型CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、III型CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、IV型CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、V型CRISPR関連（Cas）ポリペプチド、およびVI型CRISPR関連（Cas）ポリペプチド;ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）;転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）;メガヌクレアーゼ; RNA結合タンパク質（RBP）; CRISPR関連RNA結合タンパク質;リコンビナーゼ;フリッパーゼ;トランスポザーゼ;アルゴノート（Ago）タンパク質(例えば、原核生物アルゴノート(pAgo)、古細菌アルゴノート(aAgo)、および真核生物アルゴノート(eAgo));それらの任意の誘導体;それらの任意のバリアント;およびそれらの任意のフラグメントが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１２４】
遺伝子の調節は、任意の関心対象の遺伝子の調節であることができる。本明細書に記載する遺伝子の遺伝子ホモログも包含されると考えられる。例えば遺伝子は本明細書に記載する遺伝子に対して一定の同一性および/または相同性を呈することができる。それゆえに、（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の相同性を呈する遺伝子、または約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、もしくは約100％の相同性を呈する遺伝子は、修飾することができると考えられる。また、（核酸レベルまたはタンパク質レベルで）50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を呈する遺伝子、または約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、もしくは約100％の同一性を呈する遺伝子も、修飾することができると考えられる。
【０１２５】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、非天然CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）/Cas（CRISPR-associated: CRISPR関連）システムにおいて機能するCRISPR関連（Cas）タンパク質またはCasヌクレアーゼを含む。細菌において、このシステムは、外来DNAに対する適応免疫を与えることができる（Barrangou, R., et al,「CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes」Science（2007）315: 1709-1712、Makarova, K.S., et al,「Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems」Nat Rev Microbiol（2011）9:467- 477、Garneau, J. E., et al,「The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA」Nature（2010）468:67-71、Sapranauskas, R., et al,「The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli」Nucleic Acids Res（2011 ）39: 9275-9282）。
【０１２６】
多様な哺乳動物、動物、植物、および酵母を含む広範囲にわたる種々の生物において、ゲノム工学ツールとして、CRISPR/Casシステム（例えば修飾型および/または無修飾型）を利用することができる。CRISPR/Casシステムは、遺伝子の発現および/または活性の標的調節または核酸編集のための、Casタンパク質と複合体形成したガイドRNA（gRNA）などのガイド核酸を含むことができる。RNAにガイドされたCasタンパク質（例えばCas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ）は、配列依存的に、標的ポリヌクレオチド（例えばDNA）に、特異的に結合することができる。Casタンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、それは、DNAを切断することができ（Gasiunas, G., et al,「Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria」Proc Natl Acad Sci USA（2012）109:E2579-E2 86、Jinek, M., et al「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」Science（2012）337:816-821、Sternberg, S. H., et al「DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9」Nature（2014）507:62、Deltcheva, E., et al「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III」 Nature（2011）471 :602-607）、さまざまな生物およびモデル系においてプログラム可能なゲノム編集に幅広く使用されてきた（Cong, L., et al「Multiplex genome engineering using CRISPR Cas systems」 Science（2013）339:819-823、Jiang, W., et al「RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems」Nat.Biotechnol.（2013）31:233-239、Sander, J. D. & Joung, J. K「CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes」Nature Biotechnol.（2014）32:347-355）。
【０１２７】
場合により、Casタンパク質は、ヌクレアーゼ欠損タンパク質を与えるか、野生型Casタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を持つタンパク質を与えるように、突然変異および/または修飾に付される。ヌクレアーゼ欠損タンパク質は、DNAに結合する能力を保つことはできるが、核酸切断活性を欠くか、低減した核酸切断活性を有しうる。Casヌクレアーゼ（例えば野生型ヌクレアーゼ活性を保っているもの、低減したヌクレアーゼ活性を有するもの、および/またはヌクレアーゼ活性を欠くもの）を含むアクチュエータモエティは、CRISPR/Casシステムにおいて、標的遺伝子または標的タンパク質のレベルおよび/または活性を調節する（例えば減少させ、増加させ、または排除する）ように機能することができる。Casタンパク質は標的ポリヌクレオチドに結合し、物理的妨害によって転写を妨げるか、非機能的遺伝子産物を与えるように核酸配列を編集することができる。
【０１２８】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAなどのガイド核酸と複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、シングルガイドRNA（sgRNA）などのシングルガイド核酸と複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質との複合体を形成することができるガイドRNA（例えばsgRNA）などのガイド核酸と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質（RBP）を含む。図3Aは、アクチュエータモエティが、ガイド核酸（例えばsgRNA）と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質300aを含む、キメラ受容体ポリペプチドを含むシステムを模式的に図解している。例えば、RNA結合タンパク質（RBP）からのガイド核酸の解離によってまたは切断認識部位300cの切断によってRBPから放出される際に、ガイド核酸は、遺伝子の発現および/もしくは活性を調節するようにまたは核酸配列を編集するように作動可能であるCasタンパク質との複合体300bを形成することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または転写抑制を誘導することができる、DNAヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼヌルDNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または転写抑制を誘導することができる、RNAヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼヌルRNA結合タンパク質を含む。例えばアクチュエータモエティは切断活性を欠くCasタンパク質を含むことができる。
【０１２９】
任意の適切なCRISPR/Casシステムを使用することができる。CRISPR/Casシステムはさまざまな命名システムを使って言及することができる。例示的な命名システムはMakarova, K.S. et al「An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems」Nat Rev Microbiol（2015）13:722-736およびShmakov, S. et al「Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems」Mol Cell（2015）60:1-13に掲載されている。CRISPR/Casシステムは、I型、II型、III型、IV型、V型、VI型システム、または他の任意の適切なCRISPR/Casシステムであることができる。ここで使用されるCRISPR/Casシステムは、クラス1、クラス2、または他の任意の適切に分類されたCRISPR/Casシステムであることができる。クラス1またはクラス2の決定は、エフェクターモジュールをコードする遺伝子に基づくことができる。クラス1システムは一般にマルチサブユニットcrRNA-エフェクター複合体を有し、一方クラス2システムは一般に単一のタンパク質、例えばCas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、またはcrRNA-エフェクター複合体を有する。クラス1 CRISPR/Casシステムは、調節を達成するために、複数のCasタンパク質の複合体を使用しうる。クラス1 CRISPR/Casシステムは、例えばI型（例えばI、IA、IB、IC、ID、IE、IF、IU型）、III型（例えばIII、IIIA、IIIB、IIIC、IIID型）、およびIV型（例えばIV、IVA、IVB型）のCRISPR/Casタイプを含むことができる。クラス2 CRISPR/Casシステムは調節を達成するために単一の大きなCasタンパク質を使用することができる。クラス2CRISPR/Casシステムは例えばII型（例えばII、IIA、IIB型）およびV型のCRISPR/Casタイプを含むことができる。CRISPRシステムは互いに相補的であることができ、かつ/またはCRISPR座位を標的とするのを容易にするために機能ユニットをトランスに提供することができる。図15は、Makarova, K.S. et al,「An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems」Nat Rev Microbiol（2015）13:722-736の図2から採った図であり、これは、CRISPR-Casシステムのサブタイプについて、ゲノム座位のアーキテクチャを示している。
【０１３０】
Casタンパク質を含むアクチュエータモエティは、クラス1またはクラス2のCasタンパク質であることができる。Casタンパク質は、I型、II型、III型、IV型、V型Casタンパク質、またはVI型Casタンパク質であることができる。Casタンパク質は1つまたは複数のドメインを含むことができる。ドメインの非限定的な例として、ガイド核酸認識および/または結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えばDNaseドメインまたはRNaseドメイン、RuvC、HNH）、DNA結合ドメイン、RNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質-タンパク質相互作用ドメイン、および二量体化ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識および/または結合ドメインはガイド核酸と相互作用することができる。ヌクレアーゼドメインは核酸切断のための触媒活性を含むことができる。ヌクレアーゼドメインは核酸切断を防ぐために触媒活性を欠くことができる。Casタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドに融合されたキメラCasタンパク質であることができる。Casタンパク質は、例えば異なるCasタンパク質からのドメインを含む、さまざまなCasタンパク質のキメラであることができる。
【０１３１】
Casタンパク質の非限定的な例として、c2c1、C2c2、c2c3、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e（CasD）、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9（Csn1またはCsx12）、Cas10、Cas10d、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Cpf1、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1（CasA）、Cse2（CasB）、Cse3（CasE）、Cse4（CasC）、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、およびCu1966、ならびにそれらのホモログまたは修飾型が挙げられる。
【０１３２】
Casタンパク質は任意の適切な生物に由来しうる。非限定的な例として、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトミセス・プリスチナエ・スピラリス（Streptomyces pristinae spiralis）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲンス（Streptomyces viridochromo genes）、ストレプトミセス・ビリドクロモゲンス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（AlicyclobacHlus acidocaldarius）、バチルス・シュードミコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニチレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エクシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア目の細菌（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属の種（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属種（Cyanothece sp.）、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、緑膿菌、シネココッカス属の種（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェクス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルジセルロシルプトル・ベクシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンジダツス・デサルホルディス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラナエロビウス・サーモフィラス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシジチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシジチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属の種（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィラス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワトソニイ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクター・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属の種（Nostoc sp.）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ属の種（Arthrospira sp.）、リングビア属の種（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オシキラトリア属の種（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）、レプトトリキア・シャヒイ（Leptotrichia shahii）、およびフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）が挙げられる���いくつかの局面において、生物は化膿連鎖球菌である。いくつかの局面において、生物は黄色ブドウ球菌である。いくつかの局面において、生物はストレプトコッカス・サーモフィラス（S. thermophilus）である。
【０１３３】
Casタンパク質はさまざまな細菌種、例えば限定するわけではないが、ベイロネラ・アティピカル（Veillonella atypical）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Fusobacterium nucleatum）、フィリファクター・アロシス（Filifactor alocis）、ソロバクテリウム・モオレイ（Solobacterium moorei）、コプロコッカス・カツス（Coprococcus catus）、トレポネーマ・デンティコーラ（Treponema denticola）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Peptoniphilus duerdenii）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium mitsuokai）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）、スタフィロコッカス・シュードインテルメジウス（Staphylococcus pseudintermedius）、アシドアミノコッカス・インテスチン（Acidaminococcus intestine）、オルセネラ・ウリ（Olsenella uli）、オエノコッカス・キタハラエ（Oenococcus kitaharae）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、マイコプラズマ・モービレ（Mycoplasma mobile）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・オビニューモニエ（Mycoplasma ovipneumoniae）、マイコプラズマ・カニス（Mycoplasma canis）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）、ユウバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ユウバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis subsp. Torquens）、イリオバクター・ポリトロパス（Ilyobacter polytropus）、ルミノコッカス・アルバス（Ruminococcus albus）、アッカーマンシア・ムチニフィラ（Akkermansia muciniphila）、アシドサーマス・セルロリチカス（Acidothermus cellulolyticus）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・デンチウム（Bifidobacterium dentium）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）、エルシミクロビウム・ミヌツム（Elusimicrobium minutum）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Nitratifractor salsuginis）、スフェロケタ・クロブス（Sphaerochaeta globus）、フィブロバクター・スクシノゲネス亜種スクシノアゲネス（Fibrobacter succinogenes subsp. Succinogenes）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、カプノシトファーガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、プレボテラ・ミカンス（Prevotella micans）、プレボテラ・ルミニコラ（Prevotella ruminicola）、フラボバクテリウム・コルムナレ（Flavobacterium columnare）、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、カンジダトス・プニセイスピリナム・マリナム（Candidatus Puniceispirillum marinum）、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）、ラルストニア・シジギイ（Ralstonia syzygii）、ジノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）、アゾスピリラム（Azospirillum）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）、ブラジリゾビウム（Bradyrhizobium）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ（Campylobacter jejuni subsp. Jejuni）、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、アシドボラクス・エブレウス（Acidovorax ebreus）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、 パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ロゼブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ（Pasteurella multocida subsp. Multocida）、ステレラ・ワズワルテンシス（Sutterella wadsworthensis）、プロテオバクテリウム（proteobacterium）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、パラステレラ・エクスクレメンチホミニス（Parasutterella excrementihominis）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、およびフランシセラ・ノビシダに由来しうる。
【０１３４】
本明細書において使用されるCasタンパク質は、野生型または修飾型のCasタンパク質であることができる。Casタンパク質は、野生型または修飾Casタンパク質の活性バリアント、不活性バリアント、またはフラグメントであることができる。Casタンパク質は、野生型のCasタンパク質と比較して欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどといったアミノ酸変化を含むことができる。Casタンパク質は、野生型の例示的Casタンパク質に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性または配列類似性を持つポリペプチドであることができる。Casタンパク質は、野生型の例示的Casタンパク質に対して多くて約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つポリペプチドであることができる。バリアントまたはフラグメントは、野生型もしくは修飾Casタンパク質またはその一部分に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性または配列類似性を含むことができる。バリアントまたはフラグメントは、核酸切断活性を欠いた状態で、ガイド核酸との複合体として核酸座位を標的とすることができる。
【０１３５】
Casタンパク質は、1つまたは複数のヌクレアーゼドメイン、例えばDNaseドメインを含むことができる。例えばCas9タンパク質は、RuvC様ヌクレアーゼドメインおよび/またはHNH様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。RuvCドメインおよびHNHドメインはそれぞれ二本鎖DNAの異なる鎖を切断して、DNAに二本鎖切断を生じさせることができる。Casタンパク質はヌクレアーゼドメインを1つだけ含む場合もある（例えばCpf1はRuvCドメインを含むが、HNHドメインを欠く）。
【０１３６】
Casタンパク質は、野生型Casタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えばRuvCドメイン、HNHドメイン）に対して少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１３７】
遺伝子発現の調節を最適化するためにCasタンパク質を修飾することができる。核酸結合アフィニティー、核酸結合特異性、および/または酵素活性を増加または減少させるために、Casタンパク質を修飾することができる。Casタンパク質の他の活性または性質、例えば安定性を変化させるために、Casタンパク質を修飾することもできる。例えば、Casタンパク質の1つまたは複数のヌクレアーゼドメインを修飾し、欠失させ、または不活化することができ、あるいはCasタンパク質をトランケートすることで、タンパク質の機能にとって必須でないドメインを除去するか、遺伝子発現を調節するためにCasタンパク質の活性を最適化（例えば強化または低減）することができる。
【０１３８】
Casタンパク質は融合タンパク質であることができる。例えばCasタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインに融合することができる。Casタンパク質は、増加した安定性または減少した安定性を与える異種ポリペプチドに融合することもできる。融合されるドメインまたは異種ポリペプチドは、Casタンパク質のN末、C末、または内部に位置しうる。
【０１３９】
Casタンパク質は任意の形態で提供することができる。例えばCasタンパク質は、Casタンパク質のみまたはガイド核酸と複合体形成したCasタンパク質などといったタンパク質の形態で、提供することができる。Casタンパク質は、Casタンパク質をコードする核酸の形態で、例えばRNA（例えばメッセンジャーRNA（mRNA））またはDNAの形態で、提供することができる。Casタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率のよい翻訳のために、コドン最適化することができる。
【０１４０】
Casタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれうる。Casタンパク質をコードする核酸は、細胞中で活性なプロモーターに機能的に連結することができる。Casタンパク質をコードする核酸は発現コンストラクト中のプロモーターに機能的に連結することができる。発現コンストラクトとしては、関心対象の遺伝子または他の核酸配列（例えばCas遺伝子）を発現させる能力を有しかつそのような関心対象の核酸配列を標的細胞に移入することができる、任意の核酸コンストラクトを挙げることができる。
【０１４１】
いくつかの態様では、Casタンパク質がデッド（dead）Casタンパク質である。デッドCasタンパク質は、核酸切断活性を欠くタンパク質であることができる。
【０１４２】
Casタンパク質は、野生型Casタンパク質の修飾型を含むことができる。野生型Casタンパク質の修飾型は、Casタンパク質の核酸切断活性を低減するアミノ酸変化（例えば欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば修飾型のCasタンパク質は、野生型Casタンパク質（例えば化膿連鎖球菌からのCas9）の90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有しうる。修飾型のCasタンパク質は実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。Casタンパク質が実質的な核酸切断活性を有しない修飾型である場合は、それを、酵素的に不活性および/または「デッド」（「d」と略記する）ということができる。デッドCasタンパク質（例えばdCas、dCas9）は、標的ポリヌクレオチドに結合することはできるが、標的ポリヌクレオチドを切断することはできない。いくつかの局面において、デッドCasタンパク質はデッドCas9タンパク質である。
【０１４３】
dCas9ポリペプチドは、標的DNAの転写を活性化または抑制するために、シングルガイドRNA（sgRNA）と会合することができる。sgRNAは、工学的に操作されたキメラ受容体ポリペプチドを発現する細胞に導入することができる。場合により、そのような細胞は、同じ核酸を標的とする1つまたは複数の異なるsgRNAを含有する。別の例では、sgRNAが細胞中の異なる核酸を標的とする。ガイドRNAが標的とする核酸は、免疫細胞などの細胞中で発現する核酸であればなんでもよい。標的となる核酸は、免疫細胞の調節に関与する遺伝子であってもよい。いくつかの態様において、核酸はがんと関連する。がんと関連する核酸は、細胞周期遺伝子、細胞応答遺伝子、アポトーシス遺伝子、または貪食遺伝子であることができる。組換えガイドRNAは、CRISPRタンパク質、ヌクレアーゼヌルCRISPRタンパク質、そのバリアント、またはその誘導体によって認識されうる。
【０１４４】
酵素的に不活性とは、ポリヌクレオチド中の核酸配列に配列特異的に結合することはできるが、標的ポリヌクレオチドを切断することはできないポリペプチドを指すことができる。酵素的に不活性な部位指向性ポリペプチドは、酵素的に不活性なドメイン（例えばヌクレアーゼドメイン）を含むことができる。酵素的に不活性とは活性がないことを指しうる。酵素的に不活性とは活性が実質的にないことを指しする。酵素的に不活性とは活性が本質的にないことを指しうる。酵素的に不活性とは、野生型の例示的活性（例えば核酸切断活性、野生型Cas9活性）と比較して、1％未満、2％未満、3％未満、4％未満、5％未満、6％未満、7％未満、8％未満、9％未満、または10％未満の活性を指しうる。
【０１４５】
Casタンパク質の1つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えばRuvC、HNH）は、それらがもはや機能的でなくなるか、低減したヌクレアーゼ活性を含むように、欠失または突然変異させることができる。例えば、少なくとも2つのヌクレアーゼドメインを含むCasタンパク質（例えばCas9）において、ヌクレアーゼドメインの一方を欠失または突然変異させた場合、その結果生じるCasタンパク質は、ニッカーゼと呼ばれ、二本鎖DNA内のCRISPR RNA（crRNA）認識配列に一本鎖切断を生じさせることはできるが、二本鎖切断を生じさせることはできない。そのようなニッカーゼは、相補鎖または非相補鎖を切断することはできるが、両方を切断することはできない。Casタンパク質のヌクレアーゼドメインのすべて（例えばCas9タンパク質中のRuvCヌクレアーゼドメインとHNHヌクレアーゼドメインの両方; Cpf1タンパク質中のRuvCヌクレアーゼドメイン）を欠失または突然変異させた場合、その結果生じるCasタンパク質は、二本鎖DNAの両方の鎖を切断する能力が低減しているか、またはそのような能力を有することができない。Cas9タンパク質をニッカーゼに変換することができる突然変異の一例は、化膿連鎖球菌からのCas9のRuvCドメイン中のD10A（Cas9の10番目におけるアスパラギン酸からアラニンへの）突然変異である。化膿連鎖球菌からのCas9のHNHドメインにおけるH939A（アミノ酸位置839においてヒスチジンからアラニンへ）またはH840A（アミノ酸位置840においてヒスチジンからアラニンへ）は、このCas9をニッカーゼに変換することができる。Cas9タンパク質をデッドCas9に変換することができる突然変異の一例は、化膿連鎖球菌からのCas9のRuvCドメイン中のD10A（Cas9の10番目におけるアスパラギン酸からアラニンへの）突然変異およびHNHドメイン中のH939A（アミノ酸位置839においてヒスチジンからアラニンへ）またはH840A（アミノ酸位置840においてヒスチジンからアラニンへ）である。
【０１４６】
デッドCasタンパク質は、野生型のタンパク質と比較して1つまたは複数の突然変異を含むことができる。突然変異は、野生型Casタンパク質の複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数における核酸切断活性の90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性をもたらすことができる。突然変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数であって、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保っているが、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は低減しているものをもたらすことができる。突然変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数であって、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保っているが、標的核酸の相補鎖を切断する能力は低減しているものをもたらすことができる。突然変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの1つまたは複数であって、標的核酸の相補鎖および非相補鎖を切断する能力を欠くものをもたらすことができる。ヌクレアーゼドメイン中の突然変異させるべき残基は、ヌクレアーゼの1つまたは複数の触媒残基に対応しうる。例えば、複数の核酸切断ドメイン（例えばヌクレアーゼドメイン）のうちの1つまたは複数を失活させるために、Asp10、His840、Asn854およびAsn856などといった、野生型の例示的化膿連鎖球菌Cas9ポリペプチド中の残基を、突然変異させることができる。Casタンパク質のヌクレアーゼドメイン中の突然変異させるべき残基は、例えば配列アラインメントおよび/または構造アラインメントによって決定した場合に、野生型化膿連鎖球菌Cas9ポリペプチドの残基Asp10、His840、Asn854およびAsn856に対応しうる。
【０１４７】
非限定的な例として、残基D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、および/またはA987（または任意のCasタンパク質の対応する突然変異）を突然変異させることができる。例えばD10A、G12A、G17A、E762A、H840A、N854A、N863A、H982A、H983A、A984A、および/またはD986Aなど。アラニン置換以外の突然変異も適切でありうる。
【０１４８】
D10A突然変異をH840A、N854A、またはN856A突然変異のうちの1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠くCas9タンパク質（例えばデッドCas9タンパク質）を生産することができる。H840A突然変異を、D10A、N854A、またはN856A突然変異のうちの1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生産することができる。N854A突然変異を、H840A、D10A、またはN856A突然変異のうちの1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生産することができる。N856A突然変異を、H840A、N854A、またはD10A突然変異のうちの1つまたは複数と組み合わせて、DNA切断活性を実質的に欠く部位指向性ポリペプチドを生産することができる。
【０１４９】
いくつかの態様において、Casタンパク質はクラス2のCasタンパク質である。いくつかの態様において、Casタンパク質はII型Casタンパク質である。いくつかの態様において、Casタンパク質はCas9タンパク質であるか、Cas9タンパク質の修飾型であるか、またはCas9タンパク質に由来する。例えば切断活性を欠くCas9タンパク質。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は化膿連鎖球菌からのCas9タンパク質（例えばSwissProtアクセッション番号Q99ZW2）である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は黄色ブドウ球菌からのCas9（例えばSwissProtアクセッション番号J7RUA5）である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、化膿連鎖球菌または黄色ブドウ球菌からのCas9タンパク質の修飾型である。いくつかの態様において、Cas9タンパク質は、化膿連鎖球菌または黄色ブドウ球菌からのCas9タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠く化膿連鎖球菌または黄色ブドウ球菌Cas9タンパク質。
【０１５０】
Cas9とは、一般に、野生型の例示的Cas9ポリペプチド（例えば化膿連鎖球菌からのCas9）に対して、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つポリペプチドを指しうる。Cas9とは、野生型の例示的Cas9ポリペプチド（例えば化膿連鎖球菌からのもの）に対して、多くて約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％の配列同一性および/または配列類似性を持つポリペプチドを指しうる。Cas9とは、欠失、挿入、置換、バリアント、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含むことができる野生型または修飾型のCas9タンパク質を指しうる。
【０１５１】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」、すなわち「ZFN」を含む。ZFNとは、切断ドメイン、例えばFokIの切断ドメインと、DNAおよびRNAなどのポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも1つのジンクフィンガーモチーフ（例えば少なくとも2、3、4、または5個のジンクフィンガーモチーフ）との融合物を指す。2つの個別のZFNが一定の配向および間隔でポリヌクレオチド中の一定の位置でヘテロ二量体化すると、そのポリヌクレオチドの切断が起こりうる。例えばDNAに結合するZFNはDNA中の二本鎖切断を誘導することができる。2つの切断ドメインを二量体化し、それらにDNAを切断させるために、2つの個別のZFNは、それぞれのC末で、一定距離を置いて、DNAの反対鎖に結合することができる。場合により、ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間のリンカー配列は、各結合部位の5'エッジが、約5〜7塩基対で分離されていることを必要としうる。場合により、切断ドメインは、各ジンクフィンガードメインのC末に融合される。例示的なZFNとして、Urnov et al., Nature Reviews Genetics, 2010, 11:636-646、Gaj et al., Nat Methods, 2012, 9（8）:805-7、米国特許第6,534,261号、同第6,607,882号、同第6,746,838号、同第6,794,136号、同第6,824,978号、同第6,866,997号、同第6,933,113号、同第6,979,539号、同第7,013,219号、同第7,030,215号、同第7,220,719号、同第7,241,573号、同第7,241,574号、同第7,585,849号、同第7,595,376号、同第6,903,185号、同第6,479,626号、ならびに米国出願公開第2003/0232410号および同第2009/0203140号に記載されているものが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１５２】
いくつかの態様において、ZFNを含むアクチュエータモエティは、DNAなどの標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を生じさせることができる。DNA中の二本鎖切断は、遺伝子修飾の導入（例えば核酸編集）を可能にするDNA切断修復をもたらしうる。DNA切断修復は、非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え修復（homology-directed repair）（HDR）によって起こりうる。HDRでは、標的DNAの部位に隣接するホモロジーアームを含有するドナーDNA修復テンプレートを、用意することができる。いくつかの態様において、ZFNは、部位特異的一本鎖DNA切断、すなわちニックを誘発し、よってHDRをもたらすジンクフィンガーニッカーゼである。ジンクフィンガーニッカーゼの説明は、例えばRamirez et al., Nucl Acids Res, 2012, 40（12）:5560-8、Kim et al., Genome Res, 2012, 22（7）:1327-33に見いだされる。いくつかの態様において、ZFNは、ポリヌクレオチド（例えばDNAおよび/またはRNA）に結合するが、ポリヌクレオチドを切断することはできない。
【０１５３】
いくつかの態様において、ZFNを含むアクチュエータモエティの切断ドメインは、野生型切断ドメインの修飾型を含む。修飾型の切断ドメインは、切断ドメインの核酸切断活性を低減するアミノ酸変化（例えば欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば修飾型の切断ドメインは、野生型切断ドメインの核酸切断活性の90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有することができる。修飾型の切断ドメインは、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。いくつかの態様において、切断ドメインは酵素的に不活性である。
【０１５４】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、「TALEN」、すなわち「TAL-エフェクターヌクレアーゼ」を含む。TALENとは、一般にDNA結合性タンデムリピートの中央ドメインと切断ドメインとを含有する工学的に操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって生産することができる。場合により、DNA結合性タンデムリピートは、長さにして33〜35アミノ酸を含み、少なくとも1つの特異的DNA塩基対を認識することができる2つの超可変アミノ酸残基を12番目と13番目に含有する。転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、野生型もしくは突然変異型FokIエンドヌクレアーゼまたはFokIの触媒ドメインなどのヌクレアーゼに融合することができる。FokIをTALENに使用するために、例えば切断特異性または切断活性を改良する数個の突然変異が、FokIに加えられている。そのようなTALENは所望する任意のDNA配列に結合するように工学的に操作することができる。TALENは、標的DNA配列中に二本鎖切断を作り出し、次にそれがNHEJまたはHDRを起こすことによって遺伝子修飾（例えば核酸配列編集）を生じさせるために、使用することができる。場合によっては、HDRを促進するために一本鎖ドナーDNA修復テンプレートが用意される。TALENとそれらを使った遺伝子編集に関する詳細な説明は、例えば米国特許第8,440,431号、同第8,440,432号、同第8,450,471号、同第8,586,363号、および同第8,697,853号、Scharenberg et al., Curr Gene Ther, 2013, 13（4）:291-303、Gaj et al., Nat Methods, 2012, 9（8）:805-7、Beurdeley et al., Nat Commun, 2013, 4:1762、ならびに Joung and Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2013, 14（1）:49-55に見いだされる。
【０１５５】
いくつかの態様において、TALENは、ヌクレアーゼ活性が低減するように工学的に操作される。いくつかの態様において、TALENのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの修飾型を含む。修飾型のヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低減するアミノ酸変化（例えば欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば修飾型のヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有することができる。修飾型のヌクレアーゼドメインは、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは酵素的に不活性である。
【０１５６】
いくつかの態様において、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、転写を調整することができてヌクレアーゼを含まないドメインに融合される。いくつかの態様において、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、転写活性化因子として機能するように設計される。いくつかの態様において、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、転写抑制因子として機能するように設計される。例えば、転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質のDNA結合ドメインを、1つまたは複数の転写活性化ドメインに、または1つもしくは複数の転写抑制ドメインに、融合（または連結）することができる。転写活性化ドメインの非限定的な例として、単純ヘルペスVP16活性化ドメインおよびVP16活性化ドメインの四量体リピート、例えばVP64活性化ドメインが挙げられる。転写抑制ドメインの非限定的な例として、Kruppel関連ボックスドメインが挙げられる。
【０１５７】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティはメガヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼは一般に、高度に特異的であることができるレアカッター（rare-cutting）エンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、少なくとも12塩基対長、例えば12〜40塩基対、12〜50塩基対、または12〜60塩基対長の範囲のDNA標的部位を認識することができる。メガヌクレアーゼは、モジュール型DNA結合性ヌクレアーゼ、例えば少なくとも1つのエンドヌクレアーゼ触媒ドメインと核酸標的配列を指定する少なくとも1つのDNA結合ドメインまたはタンパク質とを含む任意の融合タンパク質であることができる。DNA結合ドメインは、一本鎖または二本鎖DNAを認識する少なくとも1つのモチーフを含有することができる。メガヌクレアーゼは単量体型または二量体型であることができる。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは天然のもの（自然界に見いだされるもの）または野生型であり、他の例では、メガヌクレアーゼが非天然物、人工物、工学的に操作されたもの、合成物、合理的に設計されたもの、または人造物である。いくつかの態様では、本開示のメガヌクレアーゼとして、I-CreIメガヌクレアーゼ、I-CeuIメガヌクレアーゼ、I-MsoIメガヌクレアーゼ、I-SceIメガヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの誘導体、およびそれらのフラグメントが挙げられる。有用なメガヌクレアーゼと遺伝子編集におけるそれらの応用について詳細な説明は、例えばSilva et al., Curr Gene Ther, 2011, 11（1）:11-27、Zaslavoskiy et al., BMC Bioinfomatics, 2014, 15:191、Takeuchi et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111（11）:4061-4066、ならびに米国特許第7,842,489号、同第7,897,372号、同第8,021,867号、同第8,163,514号、同第8,133,697号、同第8,021,867号、同第8,119,361号、同第8,119,381号、同第8,124,36号、および同第8,129,134号に見いだされる。
【０１５８】
いくつかの態様において、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの修飾型を含む。修飾型のヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低減するアミノ酸変化（例えば欠失、挿入、または置換）を含むことができる。例えば修飾型のヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、5％未満、または1％未満の核酸切断活性を有することができる。修飾型のヌクレアーゼドメインは、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインは酵素的に不活性である。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼはDNAに結合することはできるが、DNAを切断することはできない。
【０１５９】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、1つまたは複数の転写抑制因子ドメイン、活性化因子ドメイン、エピジェネティックドメイン、リコンビナーゼドメイン、トランスポザーゼドメイン、フリッパーゼドメイン、ニッカーゼドメイン、またはそれらの任意の組合せに融合される。活性化ドメインは、酵素のカルボキシル末端に位置する1つまたは複数のタンデム活性化ドメインを含むことができる。他の場合に、アクチュエータモエティは、タンパク質のカルボキシル末端に位置する1つまたは複数のタンデム抑制因子ドメインを含む。非限定的な例示的活性化ドメインとしては、GAL4、単純ヘルペス活性化ドメインVP16、VP64（単純ヘルペス活性化ドメインVP16の四量体）、NF-κB p65サブユニット、エプスタイン・バー・ウイルスRトランス活性化因子（Rta）が挙げられ、それらは、Chavez et al., Nat Methods, 2015, 12（4）:326-328および米国特許出願公開第20140068797号に記載されている。非限定的な例示的抑制ドメインとしては、Kox1のKRAB（Kruppel関連ボックス）ドメイン、Mad mSIN3相互作用ドメイン（SID）、ERF抑制因子ドメイン（ERD）が挙げられ、それらは、Chavez et al., Nat Methods, 2015, 12（4）:326-328および米国特許出願公開第20140068797号に記載されている。アクチュエータモエティは、増加した安定性または減少した安定性を与える異種ポリペプチドに融合することもできる。融合されるドメインまたは異種ポリペプチドは、アクチュエータモエティのN末、C末、または内部に位置しうる。
【０１６０】
アクチュエータモエティは、容易な追跡または精製のための異種ポリペプチド、例えば蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグを含むことができる。蛍光タンパク質の例として、緑色蛍光タンパク質（例えばGFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1）、黄色蛍光タンパク質（例えばYFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1）、青色蛍光タンパク質（例えばeBFP、eBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire）、シアン蛍光タンパク質（例えばeCFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan）、赤色蛍光タンパク質（mKate、mKate2、mPlum、DsRedモノマー、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry、Jred）、オレンジ色蛍光タンパク質（mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato）、および他の任意の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例として、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（TRX）、ポリ(NANP)、タンデムアフィニティー精製（TAP）タグ、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、ヘマグルチニン（HA）、nus、Softag1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、SI、T7、V5、VSV-G、ヒスチジン（His）、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（BCCP）、およびカルモジュリンが挙げられる。
【０１６１】
キメラ受容体ポリペプチドのいくつかのコンフィギュレーションでは、GMPの切断認識部位が抗原相互作用ドメインとアクチュエータモエティに挟まれている。アクチュエータモエティは切断モエティによる認識部位の切断によってGMPから放出されうる。切断モエティは、例えば切断認識部位に近接したときに、切断認識部位を認識しかつ/または切断することができる。切断モエティはポリペプチド配列を含むことができる。切断モエティはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成することができる。切断モエティは、キメラアダプターポリペプチドのN末、C末または内部部分を形成することができる。いくつかの態様において、切断モエティはキメラアダプターポリペプチドと複合体形成する。切断モエティは、キメラアダプターポリペプチドのN末、C末または内部部分と複合体形成することができる。図3Bは、本システムのさまざまな構成要素の例示的配置を示している。GMPの切断認識部位302bは、抗原相互作用ドメイン301とアクチュエータモエティ302aに挟まれており、切断モエティ304はキメラアダプターポリペプチド303の一部分を形成している。
【０１６２】
図4A〜Dは、GMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に図解している。図4Aは、膜貫通キメラ受容体ポリペプチドへの抗原の結合を示す。膜貫通キメラ受容体ポリペプチドは、抗原相互作用ドメイン401を有する細胞外領域とGMPを含む細胞内領域とを含む。GMPは切断認識部位402bに連結されたアクチュエータモエティ402aを含む。抗原結合に応答して、受容体は、受容体の細胞内領域におけるリン酸化403によって修飾される（図4B）。受容体修飾（例えばリン酸化）に続いて、図4Cに示すように、受容体結合モエティを含むアダプタータンパク質が受容体に動員される。受容体は切断モエティ404を含み、その切断モエティはアダプターとの複合体を形成するか、例えばペプチド結合および/またはペプチドリンカーによって、受容体結合モエティに連結されうる。切断認識部位に近接すると、切断モエティは認識部位を切断して、図4Dに示すように、アクチュエータモエティをGMPから放出させることができる。放出されると、アクチュエータモエティは核に進入して、標的遺伝子の発現および/または活性を調節するか、核酸配列を編集することができる。図4E〜Hは、受容体修飾がコンフォメーション変化を含む、類似のシステムを示す。いくつかの態様において、アダプタータンパク質は（例えば膜結合型タンパク質として）膜に係留される。
【０１６３】
いくつかの態様において、切断モエティは、切断認識部位に近接した場合にのみ、認識部位を切断する。切断認識部位は、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列を含みうる。切断モエティは、ポリペプチド配列を認識するプロテアーゼ活性を含むことができる。プロテアーゼ活性を含む切断モエティは、プロテアーゼ、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントであることができる。プロテアーゼとは、ポリペプチドがより小さなポリペプチドまたはアミノ酸へと切断されるタンパク質分解を行う、任意の酵素を指す。切断モエティとしての使用には、さまざまなプロテアーゼが適している。いくつかのプロテアーゼは選択性が低い（highly promiscuous）ので、幅広いタンパク質基質が加水分解されうる。いくつかのプロテアーゼは特異性が高く、一定の配列を持つ基質、例えば切断認識配列またはペプチド切断ドメインを持つ基質だけを切断することができる。いくつかの態様において、切断認識部位は、複数の切断認識配列を含み、各切断認識配列は、プロテアーゼ活性を含む同じ切断モエティまたは異なる切断モエティ（例えばプロテアーゼ）によって認識されうる。切断モエティとして使用することができる配列特異的プロテアーゼとしては、スーパーファミリーCAプロテアーゼ、例えば、パパイン（パパイア（Carica papaya））、ブロメライン（パイナップル（Ananas comosus））、カテプシンK（苔類）およびカルパイン（ホモ・サピエンス（Homo sapiens））を含む、ファミリーC1、C2、C6、C10、C12、C16、C19、C28、C31、C32、C33、C39、C47、C51、C54、C58、C64、C65、C66、C67、C70、C71、C76、C78、C83、C85、C86、C87、C93、C96、C98、およびC101; スーパーファミリーCDプロテアーゼ、例えばファミリーC11、C13、C14、C25、C50、C80、およびC84:例えばカスパーゼ-1（ドブネズミ（Rattus norvegicus））およびセパラーゼ（サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））;スーパーファミリーCEプロテアーゼ、例えば、アデナイン（ヒトアデノウイルス2型）を含むファミリーC5、C48、C55、C57、C63、およびC79;スーパーファミリーCFプロテアーゼ、例えば、ピログルタミルペプチダーゼI（バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens））を含むファミリーC15;スーパーファミリーCLプロテアーゼ、例えば、ソルターゼA（黄色ブドウ球菌）を含むファミリーC60およびC82;スーパーファミリーCMプロテアーゼ、例えば、C型肝炎ウイルスペプチダーゼ2（C型肝炎ウイルス）を含むファミリーC18;スーパーファミリーCNプロテアーゼ、例えば、シンドビスウイルス型nsP2ペプチダーゼ（シンドビスウイルス）を含むファミリーC9;スーパーファミリーCOプロテアーゼ、例えば、ジペプチジルペプチダーゼVI（リシニバチルス・スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus））を含むファミリーC40;スーパーファミリーCPプロテアーゼ、例えば、DeSI-1ペプチダーゼ（ハツカネズミ（Mus musculus））を含むファミリーC97;スーパーファミリーPAプロテアーゼ、例えば、TEVプロテアーゼ（タバコエッチウイルス）を含む、ファミリーC3、C4、C24、C30、C37、C62、C74、およびC99;スーパーファミリーPBプロテアーゼ、例えば、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ前駆体（ホモ・サピエンス）を含むファミリーC44、C45、C59、C69、C89、およびC95;スーパーファミリーPCプロテアーゼ、γ-グルタミルヒドロラーゼ（ドブネズミ）を含む、ファミリーC26およびC56;スーパーファミリーPDプロテアーゼ、例えば、ヘッジホッグタンパク質（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））を含むファミリーC46;スーパーファミリーPEプロテアーゼ、例えば、DmpAアミノペプチダーゼ（オクロバクテリウム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi））を含むファミリーP1;他のプロテアーゼ、例えばファミリーC7、C8、C21、C23、C27、C36、C42、C53およびC75が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるプロテアーゼとして、セリンプロテアーゼ、例えばスーパーファミリーSB、例えばファミリーS8およびS53のもの、例えばサブチリシン（バチルス・リケニフォルミス）;スーパーファミリーSC、例えばファミリーS9、S10、S15、S28、S33、およびS37のもの、例えばプロリルオリゴペプチダーゼ（イノシシ（Sus scrofa））;スーパーファミリーSE、例えばファミリーS11、S12、およびS13のもの、例えばD-Ala-D-AlaペプチダーゼC（大腸菌）;スーパーファミリーSF、例えばファミリーS24およびS26のもの、例えばシグナルペプチダーゼI（大腸菌）;スーパーファミリーSJ、例えばファミリーS16、S50、およびS69のもの、例えばlon-Aペプチダーゼ（大腸菌）;スーパーファミリーSK、例えばファミリーS14、S41、およびS49のもの、例えばClpプロテアーゼ（大腸菌）;スーパーファミリーSO、例えばファミリーS74のもの、例えばファージK1FエンドシアリダーゼCIMCD自己切断タンパク質（腸内細菌ファージK1F）;スーパーファミリーSP、例えばファミリーS59のもの、例えばヌクレオポリン145（ホモ・サピエンス）;スーパーファミリーSR、例えばファミリーS60のもの、例えばラクトフェリン（ホモ・サピエンス）;スーパーファミリーSS、ファミリーS66のもの、例えばムレインテトラペプチダーゼLD-カルボキシペプチダーゼ（緑膿菌）;スーパーファミリーST、例えばファミリーS54のもの、例えばロンボイド-1（キイロショウジョウバエ）;スーパーファミリーPA、例えばファミリーS1、S3、S6、S7、S29、S30、S31、S32、S39、S46、S55、S64、S65、およびS75のもの、例えばキモトリプシンA（ウシ（Bos taurus））;スーパーファミリーPB、例えばファミリーS45およびS63のもの、例えばペニシリンGアシラーゼ前駆体（大腸菌）;スーパーファミリーPC、例えばファミリーS51のもの、例えばジペプチダーゼE（大腸菌）;スーパーファミリーPE、例えばファミリーP1のもの、例えばDmpAアミノペプチダーゼ（オクロバクテリウム・アンスロピ）;割り当てられていないもの、例えばファミリーS48、S62、S68、S71、S72、S79、およびS81;スレオニンプロテアーゼ、例えばスーパーファミリーPBクラン、例えばファミリーT1、T2、T3、およびT6のもの、例えば古細菌プロテアソーム（archaean proteasome）βコンポーネント（テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum））;およびスーパーファミリーPEクラン、例えばファミリーT5のもの、例えばオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（サッカロミセス・セレビシエ）;アスパラギン酸プロテアーゼ、例えばBACE1、BACE2;カテプシンD;カテプシンE;キモシン;ナプシン-A;ネペンテシン;ペプシン;プラスメプシン;プレセニリン;レニン;ならびにHIV-1プロテアーゼ、およびメタロプロテイナーゼ、例えばエキソペプチダーゼ、メタロエキソペプチダーゼ;エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼが挙げられる。切断認識配列（例えばポリペプチド配列）は本明細書に開示するプロテアーゼのどれで認識されてもよい。
【０１６４】
いくつかの態様において、切断認識部位は、アクロモペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパイン、カルパインI、カルパインII、カルボキシペプチダーゼA、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼG、カルボキシペプチダーゼP、カルボキシペプチダーゼW、カルボキシペプチダーゼY、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、カスパーゼ11、カスパーゼ12、カスパーゼ13、カテプシンB、カテプシンC、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンG、カテプシンH、カテプシンL、キモパパイン、キマーゼ、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体C1r、補体C1s、補体因子D、補体因子I、ククミシン、ジペプチジルペプチダーゼIV、エラスターゼ（白血球）、エラスターゼ（膵）、エンドプロテイナーゼArg-C、エンドプロテイナーゼAsp-N、エンドプロテイナーゼGlu-C、エンドプロテイナーゼLys-C、エンテロキナーゼ、第Xa因子、フィシン、フューリン、グランザイムA、グランザイムB、HIVプロテアーゼ、IGase、組織カリクレイン、ロイシンアミノペプチダーゼ（全般）、ロイシンアミノペプチダーゼ（サイトゾル）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ミクロソーム）、マトリックスメタロプロテアーゼ、メチオニンアミノペプチダーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロリダーゼ、プロナーゼE、前立腺特異抗原、ストレプトミセス・グリセウス由来の好アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス由来のプロテアーゼ、アスペルギルス・サイトイ由来のプロテアーゼ、ショウユコウジカビ由来のプロテアーゼ、プロテアーゼ（B.リケニフォルミス）（アルカリ性またはアルカラーゼ）、バチルス・ポリミキサ由来のプロテアーゼ、バチルス属の種由来のプロテアーゼ、クモノスカビ属の種由来のプロテアーゼ、プロテアーゼS、プロテアソーム、コウジカビ由来のプロテイナーゼ、プロテイナーゼ3、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、プロテインC、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ、レンニン、レンニン、ストレプトキナーゼ、サブチリシン、サーモライシン、トロンビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、トリプターゼおよびウロキナーゼからなる群より選択されるプロテアーゼによって認識される切断認識配列（例えばポリペプチド配列またはペプチド切断ドメイン）を含む。
【０１６５】
表1に、本開示のシステムにおいて使用することができる例示的プロテアーゼおよび関連認識配列を列挙する。
【０１６６】
（表１）例示的プロテアーゼおよび関連認識配列
2019500887.tif 000004
2019500887.tif 000005
【０１６７】
切断モエティとして使用するために選択されるプロテアーゼは、所望の特徴、例えばペプチド結合選択性、一定のpHにおける活性、分子質量などに基づいて選択することができる。例示的プロテアーゼの性質を表2に掲載する。
【０１６８】
（表２）例示的プロテアーゼおよびプロテアーゼの特徴
2019500887.tif 000006
2019500887.tif 000007
【０１６９】
いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応することでアクチュエータモエティを放出するインテイン配列の第1部分を含む。キメラ受容体ポリペプチドからのアクチュエータモエティの放出を容易にするために、異種スプリットインテインシステムを使用することができる。アクチュエータモエティはインテイン配列の第1部分に共有結合で連結することができる。アクチュエータモエティは、そのN末またはC末を介して、インテイン配列の第1部分に連結することができる。インテイン配列の第2部分は、キメラアダプターポリペプチドの一部であることができる。インテイン配列の第2部分は切断モエティとしての役割を果たすことができる。インテイン配列の第1部分または第2部分はN末インテイン、C末インテイン、またはアクチュエータモエティの放出を容易にすることができるインテインの他の任意の適切な部分であることができる。インテイン配列は任意の適切な供給源に由来しうる。第1部分および第2部分は、同じ供給源または異なる供給源（例えば生物、タンパク質）に由来しうる。
【０１７０】
図13Aに示す具体例では、キメラ受容体ポリペプチドが、N末インテインを含むインテイン配列の第1部分1302にペプチド結合を介して（例えばそのN末またはC末で）共有結合されたアクチュエータモエティ1301を含む。アクチュエータモエティ-N末インテイン融合物は、図13Bに示すようにC末インテインを含むインテイン配列の第2部分1303、例えばアダプターポリペプチドに連結されたインテイン配列の第2部分と接触させることができる。インテイン配列の第1部分と第2部分とのこの接触は、図13Cに示すように（例えばアクチュエータモエティとN末インテインとの間にある部位における）部位特異的切断をもたらすことができ、それによって図13Dに示すようにアクチュエータモエティが放出される。図13E〜Hに示す代替的コンフィギュレーションでは、アクチュエータモエティが、受容体ポリペプチドではなくアダプターポリペプチドに連結され、かつ/またはアダプターポリペプチドと複合体形成している。別の具体例では、C末インテインを含むインテインの第1部分に、ペプチド結合を介して、アクチュエータモエティを（例えばそのN末またはC末において）共有結合で連結することができる。アクチュエータモエティ-C末インテイン融合物は、N末インテインを含むインテイン配列の第2部分と接触させることができる。インテインの第1部分と第2部分とのこの接触は、（例えばアクチュエータモエティとC末インテインとの間にある適切な部位における）部位特異的切断をもたらすことができ、それによってアクチュエータモエティが放出される。
【０１７１】
いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合はアクチュエータモエティをキメラ受容体ポリペプチドに連結することができる。ジスルフィド結合は、アクチュエータモエティと受容体の1つまたは複数のシステインの間に形成させることができる。システインはアクチュエータモエティまたは受容体中に工学的に作製することができる。システインは、ネイティブ配列または野生型配列の一部であることができる。システインは、アクチュエータモエティまたは受容体に付加されたリンカーペプチド中に存在することができる。ジスルフィド結合の切断は、例えばジスルフィド結合の酸化還元条件を変化させることなどによって、容易にすることができる。酸化還元条件の改変は、ジスルフィド結合のチオールへの還元とアクチュエータモエティの放出につながりうる。ジスルフィド結合の切断は、ジスルフィド結合の還元を触媒することができる酸化還元作用物質を含む切断モエティによって容易にすることができる。酸化還元作用物質は、酵素、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントであることができる。酵素はオキシドレダクターゼであることができる。オキシドレダクターゼの例として、タンパク質ジスルフィドレダクターゼ、チオレドキシン、グルタレドキシン、チオールジスルフィドオキシドレダクターゼ（例えばDsbA、BdbA-D、MdbA、およびSdbA）、およびグルタチオンジスルフィドレダクターゼが挙げられる。酸化還元作用物質は、原核生物および真核生物を含む任意の適切な供給源に由来しうる。酵素の最適な活性のために補因子（例えばニコチンアミド補因子、フラビン、ならびにそれらの誘導体および類似体）を供給することができる。
【０１７２】
図14Aに示される具体例において、キメラ受容体ポリペプチドは、ジスルフィド結合によって連結されたアクチュエータモエティ1401を含む。ジスルフィド結合は、図14Bに示されるように、酸化還元酵素、例えばアダプターポリペプチドと複合体形成および/または連結された酸化還元酵素のような酵素を含む切断モエティ1402によって切断されることができる。ジスルフィド結合の切断は、図14Cに示されるように、アクチュエータモエティを放出することができる。放出されると、アクチュエータモエティは、細胞核に移動することができ、そこで、図14Dに示されるように標的ポリヌクレオチドの発現(例えば、遺伝子発現)および/もしくは活性を調節するようにまたは核酸配列を編集するように作動可能である。図14E〜Hは、アクチュエータモエティがアダプターポリペプチドと複合体形成および/または連結され、切断モエティ(例えば、酸化還元酵素)が受容体に連結される代替の構成を例示する。
【０１７３】
いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、細胞の特異的領域へ受容体を輸送させる少なくとも1つの標的指向配列を含む。標的指向配列は、標的指向配列が連結されているポリペプチドを、細胞の特異的領域へ輸送させるために使用することができる。例えば、標的指向配列は、受容体を、核局在化シグナル（NLS）を利用して細胞核に、または核外移行シグナル（NES）を利用して核外（例えば細胞質）に、またはミトコンドリア、小胞体（ER）、ゴルジ、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソーム、形質膜、もしくは細胞のさまざまな細胞小器官の膜に、向かわせることができる。いくつかの態様において、標的指向配列は核外移行シグナル（NES）を含み、ポリペプチドを核外に、例えば細胞の細胞質に向かわせる。標的指向配列は、さまざまな核外移行シグナルを利用してポリペプチドを細胞質に向かわせることができる。核外移行シグナルは一般に、タンパク質を、核輸送を使った核膜孔複合体による細胞核から細胞質への搬出の標的にする、疎水性残基（例えば少なくとも約2、3、4、または5個の疎水性残基）の短いアミノ酸配列である。NES基質のすべてが構成的に核から搬出されうるわけではない。いくつかの態様において、標的指向配列は核局在化シグナル（NLS、例えばSV40 NLS）を含み、ポリペプチドを細胞核へと向かわせる。標的指向配列は、さまざまな核局在化シグナル（NLS）を利用して、ポリペプチドを細胞核へと向かわせることができる。NLSは、一要素（monopartite）配列または二要素（bipartite）配列であることができる。
【０１７４】
NLSの非限定的な例として、アミノ酸配列
2019500887.tif 000008
を有するSV40ウイルスラージT抗原のNLS;ヌクレオプラスミンからのNLS（例えば
2019500887.tif 000009
を持つヌクレオプラスミン二パーツNLS）;アミノ酸配列
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を有するc-myc NLS;配列
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を有するhRNPA1 M9 NLS;インポーチン-アルファからのIBBドメインの配列
2019500887.tif 000012
;筋腫Tタンパク質の配列
2019500887.tif 000013
;ヒトp53の配列
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;マウスc-abl IVの配列
2019500887.tif 000015
;インフルエンザウイルスNS1の配列
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;肝炎ウイルスデルタ抗原の配列
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;マウスMx1タンパク質の配列
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;ヒトポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの配列
2019500887.tif 000019
;およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列
2019500887.tif 000020
に由来するNLS配列が挙げられる。
【０１７５】
いくつかの態様において、標的指向配列は膜を標的とするペプチドを含み、ポリペプチドを形質膜または細胞小器官の膜に向かわせる。膜を標的とする配列は、細胞表面膜または他の細胞膜へのキメラ膜貫通受容体ポリペプチドの輸送をもたらしうる。細胞膜と会合している分子は膜会合を容易にする一定の領域を含有し、そのような領域を膜を標的とする配列に組み入れることができる。例えばいくつかのタンパク質はN末またはC末にアシル化された配列を含有し、これらのアシルモエティは膜会合を容易にする。そのような配列はアシルトランスフェラーゼによって認識されることが可能であり、特定の配列モチーフに従うことが多い。一定のアシル化モチーフは単一のアシルモエティによる修飾を受けることができ（多くの場合、アニオン性脂質ヘッドグループとの会合を改善するために、いくつかの正荷電残基が続いている（例えばヒトc-Src））、他のアシル化モチーフは複数のアシルモエティによる修飾を受けることができる。例えばタンパク質チロシンキナーゼSrcのN末配列は単一のミリストイルモエティを含むことができる。Srcファミリーメンバーのサブセット（例えばYes、Fyn、Lck）およびGタンパク質アルファサブユニットなどといった一定のプロテインキナーゼのN末領域には、二重アシル化領域がある。そのような二重アシル化領域は、多くの場合、そのようなタンパク質の最初の18アミノ酸内に位置して、配列モチーフMet-Gly-Cys-Xaa-Cys（SEQ ID NO:56）に合致し、ここでは、Metが切断され、GlyがNアシル化され、Cys残基がSアシル化される。Glyはミリストイル化されることが多く、Cysはパルミトイル化されうる。Gタンパク質ガンマサブユニットおよび他のタンパク質のC末に由来する、C15またはC10イソプレニルモエティで修飾されうる配列モチーフCys-Ala-Ala-Xaa（いわゆる「CAAXボックス」）に合致するアシル化領域も利用することができる。これらのアシル化モチーフおよび他のアシル化モチーフには、Gauthier-Campbell et al., Molecular Biology of the Cell 15: 2205-2217（2004）、Glabati et al., Biochem. J. 303: 697-700（1994）およびZlakine et al., J. Cell Science 110: 673-679（1997）において議論されているものが含まれ、膜局在化を誘導するために標的指向配列中に組み入れることができる。
【０１７６】
一定の態様では、アシル化モチーフを含有するタンパク質からのネイティブ配列が、標的指向配列に組み入れられる。例えばいくつかの態様では、Lck、FynもしくはYesまたはGタンパク質アルファサブユニットのN末部分、例えばそのようなタンパク質からの最初の25個またはそれ以下（例えば突然変異を持っていてもよいネイティブ配列の約5〜約20アミノ酸、約10〜約19アミノ酸、または約15〜約19アミノ酸）のN末アミノ酸をキメラポリペプチドのN末内に組み入れることができる。一定の態様では、CAAXボックスモチーフ配列を含有するGタンパク質ガンマサブユニットからの約25アミノ酸以下（例えば突然変異を持っていてもよいネイティブ配列の約5〜約20アミノ酸、約10〜約18アミノ酸、または約15〜約18アミノ酸）のC末配列を、キメラポリペプチドのC末に連結することができる。
【０１７７】
任意の、膜を標的とする配列を使用することができる。いくつかの態様では、そのような配列として、受容体からのミリストイル化標的指向配列、パルミトイル化標的指向配列、プレニル化配列（すなわちファルネシル化、ゲラニル-ゲラニル化、CAAXボックス）、タンパク質-タンパク質相互作用モチーフまたは膜貫通配列（シグナルペプチドを利用するもの）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。例として、例えばten Klooster, J.P. et al, Biology of the Cell（2007）99, 1-12、Vincent, S., et al., Nature Biotechnology 21:936-40, 1098（2003)において議論されているものが挙げられる。
【０１７８】
さまざまな膜におけるタンパク質保留を増加させることができるさらなるタンパク質ドメインが存在する。例えば約120アミノ酸のプレクストリンホモロジー（PH）ドメインが、典型的には細胞内シグナル伝達に関与する200を超えるヒトタンパク質に見いだされる。PHドメインは、膜内でさまざまなホスファチジルイノシトール（PI）脂質（例えばPI(3,4,5)-P3、PI(3,4)-P2、PI(4,5)-P2）に結合することができるので、タンパク質を異なる膜または細胞コンパートメントに動員する際に、鍵となる役割を果たすことができる。多くの場合、PI脂質のリン酸化状態は、例えばPI-3キナーゼまたはPTENなどによって調節されるので、膜とPHドメインとの相互作用は、アシル脂質によるものほどは安定ではありえない。
【０１７９】
いくつかの態様において、ポリペプチドを細胞膜に向かわせる標的指向配列は、膜アンカーシグナル配列を利用することができる。さまざまな膜アンカー配列を利用することができる。例えばさまざまな膜結合型タンパク質の膜アンカーシグナル配列を使用することができる。配列として、1）IL-2受容体ベータ鎖およびインスリン受容体ベータ鎖などのクラスI内在性膜タンパク質; 2）中性エンドペプチダーゼなどのクラスII内在性膜タンパク質; 3）ヒトシトクロム P450 NF25などのIII型タンパク質;および4）ヒトP糖タンパク質などのIV型タンパク質からの配列を挙げることができる。
【０１８０】
いくつかの態様では、キメラ受容体ポリペプチドが、タンパク質フォールディングを支援できるポリペプチドフォールディングドメインに連結される。いくつかの態様では、アクチュエータモエティが細胞透過性ドメインに連結される。例えば細胞透過性ドメインは、HIV-1 TATタンパク質、ヒトB型肝炎ウイルスからのTLM細胞透過性モチーフ、MPG、Pep-1、VP22、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来しうる。細胞透過性ドメインは、アクチュエータモエティのN末、C末、またはアクチュエータモエティ内のどこにでも位置しうる。
【０１８１】
標的指向配列は、例えば受容体のN末、C末、または内部領域など、キメラ受容体ポリペプチドの任意の適当な領域に連結することができる。いくつかの態様では、少なくとも2つの標的指向配列が受容体に連結される。図5に示す例示的キメラ受容体ポリペプチドでは、第1の標的指向配列501aを受容体の細胞外領域に連結することができ、第2の標的指向配列501bを受容体の細胞内領域に、例えばGMPに、連結することができる。受容体が複数の標的指向配列（例えば細胞の異なる場所に向けられた標的指向配列）に連結された場合、受容体の最終的局在は、標的指向配列の相対的強さによって決定されうる。例えば、NESを含む標的指向配列とNLSを含む標的指向配列の両方を有する受容体は、そのNESがNLSより強ければ、細胞質に局在することができる。あるいは、NLSがNESより強ければ、受容体は、たとえ核局在化シグナルと核外移行シグナルの両方が受容体上に存在しても、核に局在することができる。標的指向配列は、細胞局在の度合を微調整するために、例えばNLSおよびNESのそれぞれの複数コピーを含むことができる。
【０１８２】
場合により、標的指向配列はアクチュエータモエティに連結される。切断認識部位の切断によるGMP（および受容体）からのアクチュエータモエティの放出に続いて、標的指向配列は、受容体とは異なる細胞の場所にアクチュエータモエティを向かわせることができる。例えばキメラ膜貫通受容体は受容体を形質膜に向かわせる第1の標的指向配列を含むことができ、アクチュエータモエティは別途、細胞核へ局在化させる第2の標的指向配列を含むことができる。まず、アクチュエータモエティ（受容体の一部分を形成しているもの）は、第1の標的指向配列ゆえに、形質膜に局在化されうる。切断認識部位の切断によるGMPからのアクチュエータモエティの放出に続いて、アクチュエータモエティは、第2の標的指向配列による標的指向によって、細胞核に局在化することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、切断認識配列の切断後に、細胞核に移動する。
【０１８３】
抗原に結合して受容体が修飾を受けた場合、キメラ受容体ポリペプチドへのキメラアダプターポリペプチドの結合は、切断モエティを切断認識部位に近接させることができる。認識部位の切断はアクチュエータモエティをGMPから放出させることができる。放出に続いて、アクチュエータモエティは、例えば細胞質内または細胞核内で、標的ポリヌクレオチドと複合体形成するように作動可能である。アクチュエータモエティと標的ポリヌクレオチドとの複合体形成は、少なくとも1つの遺伝子の発現および/または活性を調節するか、核酸配列を編集することができる。
【０１８４】
別の例示的な構成では、GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ切断モエティはキメラ受容体ポリペプチドの一部分を形成する。例示的な構成のキメラアダプターポリペプチドは、(a) 抗原に結合する際に修飾を受けた受容体に結合する受容体結合モエティ; および(b) 受容体結合モエティに連結された遺伝子調整ポリペプチド(GMP)であり、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、GMPを含むことができ; ここで: (i) 切断認識部位が、受容体結合に応答して切断モエティにより切断可能であり; かつ(ii) アクチュエータモエティが、切断認識部位の切断に応答して標的ポリヌクレオチドと複合体形成するように作動可能である。図6Aは、例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。キメラアダプターポリペプチドは、GMP 602に連結された受容体結合モエティ601を含むことができる。GMPは、切断認識部位602bに連結されたアクチュエータモエティ602aを含むことができる。
【０１８５】
キメラアダプターポリペプチドの受容体結合モエティは、受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントに結合できる任意の結合パートナー(例えば、タンパク質)であることができる。いくつかの態様において、アダプターは、膜に結合している受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの結合パートナーを含む。いくつかの態様において、アダプターは、膜に結合していない(例えば、細胞内または細胞質の)受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの結合パートナーを含む。アダプターポリヌクレオチドは、シグナル伝達タンパク質または受容体に動員された他のタンパク質の受容体結合ドメインを含みうる。キメラアダプターポリペプチドは、受容体修飾、例えば、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせに応答してキメラ受容体ポリペプチドに動員されることができる。受容体は、リガンド結合に応答して受容体修飾を受けうる。受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメント、および結合パートナー(例えば、タンパク質)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントは、受容体へのアダプターポリペプチドの望ましい動員レベルを最適化するように選択することができる。
【０１８６】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、Notch受容体がリガンドに結合している場合にNotch受容体に動員される、分子(例えば、タンパク質)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。キメラアダプターポリペプチドは、プレセニリン-1(PSEN1)、ニカストリン、前咽頭欠損1(APH-1)、およびプレセニリンエンハンサ2(PEN-2)からなる群より選択される、タンパク質、その任意の誘導体、バリアントまたはフラグメントを含むことができる。
【０１８７】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、GPCRがリガンド(例えば、コンフォメーション修飾および/または生化学修飾を受けたリガンド結合GPCR)に結合している場合にGPCRに動員される、分子(例えば、タンパク質)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。キメラアダプターポリペプチドは、以下からなる群から選択されるタンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる: AKAP79 (AKAP5)およびAKAP250 (AKAP12, グラビン)、アレスチン(例えば、β-アレスチン)、ATBP50、カルモジュリン、DRIP78 (DNAJC14)、Homer、GASP1、GEC1 (GABARAPL1)、INAD、JAK2、LARG (ARHGEF12)、MAGI2、MAGI3、M10 MHC、MPP3、MRAPおよびMRAP2、MUPP1 (MPDZ)、ニューロコンドリン、NHERF1 (EBP50, SLC9A3R1)、NHERF2 (SLC9A3R2)、NINAA、ODR4、p85、PDZ-RhoGEF (ARHGEF11)、ペリプラキン、PICK 1、PSD95、RACK1 (GNB2L1)、RAMP1、RAMP2、RAMP3、RanBP2、REEPs、RTPs、RTP4、Shank、SNX1、シントロフィン、スピノフィリン、TCTEXT1 (DYNLT1)、ならびにUSP4。
【０１８８】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、受容体がリガンドに結合している場合にインテグリン受容体に動員される、分子(例えば、タンパク質)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。インテグリン受容体に動員されるアダプタータンパク質の例としては、構造的アダプタータンパク質、スキャフォールドアダプタータンパク質、および触媒活性を有するアダプタータンパク質が挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、タリン、キンドリン、フィラミンおよびテンシンから選択される、タンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、パキシリンおよびキンドリンから選択される、タンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、接着斑キナーゼ(FAK)、Src、およびタンパク質ホスファターゼ2A (PP2A)から選択される、タンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、RAB21、PTPN2、AUP1、BIN1、COL8A1、およびITGB1から選択される、タンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１８９】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、カドヘリン受容体に動員される、分子(例えば、タンパク質)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。分子は、受容体修飾(例えば、化学的修飾、例えば、リン酸化および/またはコンフォメーション変化)の結果として受容体に動員されうる。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、α-カテニン、β-カテニン、γ-カテニン、カテニンデルタ-1 (p120-カテニン)、AJAP1、CTNND1、DLGAP5、TBC1D2、LIMA1、CAV1、TRPV4、CTNNB1複合体、PIP5K1C、RAB8B、RAPGEF2、DDR1、PSEN1、CDH1、CDC27、CTNNA1、およびEGFRから選択される、タンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１９０】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、RTSK、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドに動員される分子(例えば、タンパク質)を含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD6、およびSMAD7、およびSMAD9 (SMAD8といわれることもある)を含むSMADファミリーメンバーから選択される、タンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメント; 受容体活性化のためのSMADアンカー(SARA); SMURFタンパク質(例えば、SMURF1、SMURF2); ならびにその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、サイトカイン受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ受容体ポリペプチドに動員される分子(例えば、タンパク質)を含む。いくつかの態様において、アダプターポリペプチドは、gp130、CD131、CD132、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１９１】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、リン酸化されたRTKもしくはRTSK、または非共有結合した細胞内キナーゼによってリン酸化された受容体に動員される分子を含む。活性化された受容体(例えば、キメラ受容体ポリペプチド)内の特定のアミノ酸残基(例えば、チロシン残基)のリン酸化は、Srcホモロジー2 (SH2)ドメイン含有タンパク質およびホスホチロシン結合(PTB)ドメイン含有タンパク質のような分子の結合部位を作製することができる。いくつかの態様において、アダプターポリペプチドは、ABL1、ABL2、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、EAT-2、FER、FES、FGR、FRK、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、ITK、JAK2、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1、ZAP70、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような、SH2ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの態様おいて、アダプターポリペプチドは、APBA1、APBA2、APBA3、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、TENC1、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、FRS2、FRS3、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、TLN1、TLN2、X11a、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントのような、PTBドメインを含むタンパク質を含む。
【０１９２】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、TNF受容体に動員されるタンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。そのようなタンパク質は、TNR受容体関連因子またはTRAFSと呼ばれることもあり、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、およびTRAF7を含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、受容体相互作用セリン/トレオニン-タンパク質キナーゼ1 (RIP1もしくはRIPK1)および受容体相互作用セリン/トレオニン-タンパク質キナーゼ3 (RIP3もしくはRIPK3)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、TRAF2に結合する腫瘍壊死因子受容体1型関連デス(DEATH)ドメイン(TRADD)およびデッドドメインを有するFas関連タンパク質(FADD)のような、TNFRに動員されるアダプタータンパク質、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１９３】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、リン酸化された、ITAM、例えばTCRのような免疫受容体を含むキメラポリペプチド受容体のITAMに動員される分子(例えば、タンパク質)、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。活性化された受容体内の特定のチロシン残基のリン酸化は、Srcホモロジー2 (SH2)ドメイン含有タンパク質およびホスホチロシン結合(PTB)ドメイン含有タンパク質のような分子の結合部位を作製することができる。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、ABL1、ABL2、BCAR3、BLK、BLNK、BMX、BTK、CHN2、CISH、CRK、CRKL、CSK、DAPP1、EAT-2、FER、FES、FGR、FRK、FYN、GADS、GRAP、GRAP2、GRB10、GRB14、GRB2、GRB7、HCK、HSH2D、INPP5D、INPPL1、ITK、JAK2、LCK、LCP2、LYN、MATK、NCK1、NCK2、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PLCG1、PLCG2、PTK6、PTPN11、PTPN6、RASA1、SAP、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D1A、SH2D1B、SH2D2A、SH2D3A、SH2D3C、SH2D4A、SH2D4B、SH2D5、SH2D6、SH3BP2、SHB、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、SHD、SHE、SHP1、SHP2、SLA、SLA2、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SRC、SRMS、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUPT6H、SYK、TEC、TENC1、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、TXK、VAV1、VAV2、VAV3、YES1、ZAP70、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、APBA1、APBA2、APBA3、EPS8、EPS8L1、EPS8L2、EPS8L3、TENC1、TNS、TNS1、TNS3、TNS4、DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6、DOK7、FRS2、FRS3、IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、SHC1、SHC2、SHC3、SHC4、TLN1、TLN2、X11a、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。
【０１９４】
いくつかの構成において、本システムのキメラアダプターポリペプチドは、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)を含むことができる。本明細書の他の箇所に記述されるように、GMPは、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含むことができる。アクチュエータモエティは、ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ欠損したもしくはヌクレアーゼ活性の低減した改変ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、本明細書の他の箇所に記述されているようにそのバリアント、その誘導体、またはそのフラグメントを含むことができる。アクチュエータモエティは、遺伝子の発現もしくは活性を調節し、および/または核酸(例えば、遺伝子および/もしくは遺伝子産物)の配列を編集することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列のゲノム編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) DNAヌクレアーゼのようなDNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) RNAヌクレアーゼのようなRNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、遺伝子の発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるDNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損DNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるRNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損RNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは核酸ガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、DNAガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティはRNAガイドアクチュエータモエティである。アクチュエータモエティは、外因性であろうと内因性であろうと、遺伝子の発現もしくは活性を調節し、および/または核酸配列を編集することができる。例えば、アクチュエータモエティは、切断活性を欠くCasタンパク質を含むことができる。
【０１９５】
任意の適当なヌクレアーゼをアクチュエータモエティにおいて用いることができる。適当なヌクレアーゼには、I型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、II型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、III型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、IV型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、V型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、およびVI型CRISPR関連(Cas)ポリペプチドを含むCRISPR関連(Cas)タンパク質またはCasヌクレアーゼ; 亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN); 転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN); メガヌクレアーゼ; RNA結合タンパク質(RBP); CRISPR関連RNA結合タンパク質;リコンビナーゼ; フリッパーゼ; トランスポゼース; アルゴノート(Argonaute; Ago)タンパク質(例えば、原核生物アルゴノート(pAgo)、古細菌アルゴノート(aAgo)、および真核生物アルゴノート(eAgo)); その任意の誘導体; その任意のバリアント; ならびにその任意のフラグメントが含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成することができる、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)を含む。
【０１９６】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成することができる、ガイドRNAのような、ガイド核酸と任意で複合体形成されるRNA結合タンパク質(RBP)を含む。図6Bは、アクチュエータモエティが、ガイド核酸と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質600aを含む、例示的なキメラアダプターポリペプチドを示す。例えばRBPからのガイド核酸の解離または切断認識部位の切断により、RNA結合タンパク質(RBP)から放出されると、ガイド核酸はCasタンパク質600bと複合体を形成することができ、Casタンパク質600bは、標的ポリヌクレオチドの発現(例えば、遺伝子発現)および/もしくは活性を調節するようにまたは核酸配列を編集するように作動可能である。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるDNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損DNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるRNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損RNA結合タンパク質を含む。例えば、アクチュエータモエティは、切断活性を欠くCasタンパク質を含むことができる。
【０１９７】
いくつかの態様において、切断認識部位は、受容体結合モエティとアクチュエータモエティとに挟まれている。アクチュエータモエティは、切断モエティによる認識部位の切断によって、GMPからおよびキメラアダプターポリペプチドから放出されることができる。切断モエティは、例えば、切断認識部位に近接している場合に、切断認識部位を認識および/または切断することができる。切断モエティは、ポリペプチド配列を含むことができる。切断モエティは、いくつかの構成において、キメラ受容体ポリペプチドの一部分を形成する。切断モエティは、キメラ受容体ポリペプチドのN末、C末または内部部分を形成することができる。いくつかの態様において、切断モエティは、キメラ受容体ポリペプチドと複合体形成する。切断モエティは、キメラ受容体ポリペプチドのN末、C末、または内部部分と複合体形成することができる。図7に示される例示的な構成において、切断認識部位702bは受容体結合モエティ701とアクチュエータモエティ702aとに挟まれ、切断モエティ706はキメラ受容体ポリペプチド705の一部分を形成する。
【０１９８】
図8A〜Dは、GMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に図解している。図8Aは、膜貫通キメラ受容体ポリペプチドへの抗原の結合を示す。膜貫通キメラ受容体ポリペプチドは、抗原相互作用ドメイン805を有する細胞外領域と、切断モエティ806を含む細胞内領域とを含む。切断モエティは、受容体と複合体形成するか、例えばペプチド結合および/またはペプチドリンカーによって、受容体に連結されうる。GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。受容体結合モエティ801に連結されたGMPは、切断認識部位802bに連結されたアクチュエータモエティ802aを含む。抗原結合に応答して、受容体は、受容体の細胞内領域におけるリン酸化803によって修飾される（図8B）。受容体修飾（例えばリン酸化）に続いて、図8Cに示すように、キメラアダプターポリペプチドが受容体に動員される。受容体は切断モエティ806を含む。切断認識部位に近接すると、切断モエティは認識部位を切断して、図8Dに示すように、アクチュエータモエティをGMPから放出させることができる。放出されると、アクチュエータモエティは核に進入して、標的遺伝子の発現および/または活性を調節するか、核酸配列を編集することができる。図8E〜Hは、受容体修飾がコンフォメーション変化を含む、類似のシステムを示す。いくつかの態様において、キメラアダプタータンパク質は膜に（例えば膜結合型タンパク質として）係留される。
【０１９９】
別のコンフィギュレーションでは、切断モエティが、受容体ポリペプチドが修飾を受けたときにキメラ受容体ポリペプチドに結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成する。例示的コンフィギュレーションを、図9に示す。切断認識部位902bが受容体結合モエティ901とアクチュエータモエティ902aに挟まれ、切断モエティ906が第2アダプターポリペプチド907の一部分を形成する。
【０２００】
図10A〜Dは、GMPからのアクチュエータモエティの放出を模式的に図解している。図10Aは、膜貫通キメラ受容体ポリペプチドへの抗原の結合を示す。膜貫通キメラ受容体ポリペプチドは、抗原相互作用ドメインを有する細胞外領域と細胞内領域とを含む。切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含むGMPは、キメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。切断認識部位1002bは受容体結合モエティ1001とアクチュエータモエティ1002aとに挟まれている。抗原結合に応答して、受容体は、細胞内領域におけるリン酸化1003によって修飾される（図10B）。受容体修飾（例えばリン酸化）に続いて、図10Bに示すように、キメラアダプターポリペプチドが受容体に動員される。切断モエティ1006を含む第2アダプターポリペプチド1007も、修飾された受容体に動員される（図10C）。切断モエティは、第2アダプターポリペプチドと複合体形成するか、例えばペプチド結合および/またはペプチドリンカーによって、アダプターに連結されうる。切断認識部位に近接すると、切断モエティは認識部位を切断して、図10Dに示すように、アクチュエータモエティをGMPから放出させることができる。放出されると、アクチュエータモエティは核に進入して、標的遺伝子の発現および/または活性を調節するか、核酸配列を編集することができる。図10E〜Hは、受容体修飾がコンフォメーション変化を含む、類似のシステムを示している。いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは膜に（例えば膜結合型タンパク質として）係留される。いくつかの態様において、第2アダプターポリペプチドは膜に（例えば膜結合型タンパク質として）係留される。
【０２０１】
図16A〜Dは、第1膜係留アダプターと第2細胞質アダプターとを含むシステムにおけるアクチュエータモエティの放出を模式的に図解している。図16Aは、膜係留ドメイン1601a（例えばCAAX）、プロテアーゼ認識部位1601b（例えばTEV）、およびアクチュエータモエティ1601cを含む第1膜係留アダプターと、キメラ膜貫通受容体1602との会合を示す。キメラ膜貫通受容体はスキャフォールドとして機能することができ、少なくとも2つのアダプター結合部位（例えばEGFRまたは受容体チロシンキナーゼ（RTK））を含む。一方のアダプター結合部位は図16Bに示すように膜係留アダプターと会合することができる。膜係留アダプターの会合は、場合によっては、受容体への抗原結合に依存する。いくつかのシステムにおいて、膜係留アダプターは受容体に近接して位置し、会合は受容体への抗原結合に依存しないだろう。図16Bおよび図16Cに示すように、抗原と受容体との相互作用は、細胞質受容体結合モエティ1603aとプロテアーゼ1603bとを含む第2アダプタータンパク質を、受容体の他方のアダプター結合部位に、条件付きで動員する。プロテアーゼを含む第2アダプタータンパク質は、膜貫通受容体に動員されると、膜係留分子のプロテアーゼ認識部位1601bを切断し、それによって、図16Dに示すようにアクチュエータモエティ1601cを放出することができる。
【０２０２】
いくつかの態様において、切断モエティは、切断認識部位に近接した場合にのみ、認識部位において切断する。いくつかの態様において、切断認識部位は、プロテアーゼの認識配列であるポリペプチド配列（例えばペプチド切断ドメイン）を含む。切断モエティは、前記ポリペプチド配列を認識するプロテアーゼ活性を含むことができる。プロテアーゼ活性を含む切断モエティは、限定するわけではないが、本明細書の他の項で説明するプロテアーゼ、またはそれらの任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むプロテアーゼであることができる。いくつかの態様において、切断認識部位は、複数の切断認識配列を含み、各切断認識配列は、プロテアーゼ活性を含む同じ切断モエティまたは異なる切断モエティ（例えばプロテアーゼ）によって認識されうる。
【０２０３】
いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応することでアクチュエータモエティを放出するインテイン配列の第1部分を含む。キメラアダプターポリペプチドからのアクチュエータモエティの放出を容易にするために、異種スプリットインテインシステムを使用することができる。アクチュエータモエティはインテイン配列の第1部分に共有結合で連結することができる。アクチュエータモエティは、そのN末またはC末を介して、インテイン配列の第1部分に連結することができる。切断モエティはインテイン配列の第2部分を含むことができる。インテイン配列の第1部分または第2部分はN末インテイン、C末インテイン、またはアクチュエータモエティの放出を容易にすることができるインテインの他の任意の適切な部分であることができる。インテイン配列は任意の適切な供給源に由来しうる。第1部分および第2部分は、同じ供給源または異なる供給源（例えば生物、タンパク質）に由来しうる。ある具体例では、N末インテインを含むインテイン配列の第1部分に、ペプチド結合を介して、アクチュエータモエティを（例えばそのN末またはC末において）共有結合で連結することができる。アクチュエータモエティ-N末インテイン融合物は、C末インテインを含むインテイン配列の第2部分と接触させることができる。インテイン配列の第1部分と第2部分とのこの接触は、（例えばアクチュエータモエティとN末インテインとの間にある部位における）部位特異的切断をもたらすことができ、それによってアクチュエータモエティが放出される。別の具体例では、C末インテインを含むインテインの第1部分に、ペプチド結合を介して、アクチュエータモエティを（例えばそのN末またはC末において）共有結合で連結することができる。アクチュエータモエティ-C末インテイン融合物は、N末インテインを含むインテイン配列の第2部分と接触させることができる。インテインの第1部分と第2部分とのこの接触は、（例えばアクチュエータモエティとC末インテインとの間にある適切な部位における）部位特異的切断をもたらすことができ、それによってアクチュエータモエティが放出される。
【０２０４】
いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合はアクチュエータモエティをキメラアダプターポリペプチド中の受容体結合モエティに連結することができる。ジスルフィド結合は、アクチュエータモエティと受容体結合モエティの1つまたは複数のシステインの間に形成させることができる。システインはアクチュエータモエティまたは受容体結合モエティ中に工学的に作製することができる。システインは、アクチュエータモエティまたは受容体結合モエティのネイティブ配列または野生型配列の一部であることができる。システインは、アクチュエータモエティまたは受容体結合モエティに付加されたリンカーペプチド中に存在することができる。ジスルフィド結合の切断は、例えばジスルフィド結合の酸化還元条件を変化させることなどによって、容易にすることができる。酸化還元条件の改変は、ジスルフィド結合のチオールへの還元とアクチュエータモエティの放出につながりうる。ジスルフィド結合の切断は、ジスルフィド結合の還元をもたらすことができる酸化還元作用物質を含む切断モエティによって容易にすることができる。酸化還元作用物質は、酵素、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントであることができる。酵素はオキシドレダクターゼであることができる。オキシドレダクターゼの例として、タンパク質ジスルフィドレダクターゼ、チオレドキシン、グルタレドキシン、チオールジスルフィドオキシドレダクターゼ（例えばDsbA、BdbA-D、MdbA、SdbA）、およびグルタチオンジスルフィドレダクターゼが挙げられる。酸化還元作用物質は、原核生物および真核生物を含む任意の適切な供給源に由来しうる。酵素の最適な活性のために補因子（例えばニコチンアミド補因子、フラビン、ならびにそれらの誘導体および類似体）を供給することができる。
【０２０５】
いくつかの態様において、キメラアダプターポリペプチドは、細胞の特異的領域へアダプターを輸送させる少なくとも1つの標的指向配列を含む。例えば、標的指向配列は、アダプターを、核局在化シグナル（NLS）を利用して細胞核に、または核外移行シグナル（NES）を利用して細胞核外に（例えば細胞質）に、またはミトコンドリア、小胞体（ER）、ゴルジ、クロロプラスト、アポプラスト、ペルオキシソーム、形質膜、もしくは細胞のさまざまな細胞小器官の膜に、向かわせることができる。いくつかの態様において、標的指向配列は核外移行シグナル（NES）を含み、キメラアダプターポリペプチドを細胞核外に向かわせる。いくつかの態様において、標的指向配列は核局在化シグナル（NLS）を含み、アダプターを細胞核へと向かわせる。標的指向配列は、さまざまな核局在化シグナル（NLS）を利用して、アダプターを細胞核へと向かわせることができる。いくつかの態様において、標的指向配列は膜を標的とする配列を含み、アダプターを形質膜または細胞小器官の膜に向かわせる。標的指向配列は、前述の膜アンカーシグナル配列を利用して、ポリペプチドを膜に向かわせることができる。さまざまな膜アンカー配列を利用することができる。
【０２０６】
標的指向配列は、例えばポリペプチドのN末もしくはC末、またはアダプターの内部領域など、キメラアダプターポリペプチドの任意の適当な領域に連結することができる。いくつかの態様では、少なくとも2つの標的指向配列がアダプターに連結される。例えば図11に示すように、第1の標的指向配列1101aをアダプターの受容体結合モエティに連結し、第2の標的指向配列1101bをアダプターのGMPに、例えばアクチュエータモエティに、連結することができる。アダプターが複数の標的指向配列（例えば細胞の異なる場所に向けられた標的指向配列）に連結された場合、アダプターの最終的局在は、標的指向配列の相対的強さによって決定されうる。例えば、NESを含む標的指向配列とNLSを含む標的指向配列の両方を有するアダプターは、そのNESがNLSより強ければ、サイトゾルに局在することができる。あるいは、NLSがNESより強ければ、アダプターは、たとえ核局在化シグナルと核外移行シグナルの両方がアダプター上に存在しても、核に局在することができる。標的指向配列は、細胞局在の度合を微調整するために、例えばNLSおよびNESのそれぞれの複数コピーを含むことができる。
【０２０７】
場合により、標的指向配列はアクチュエータモエティに連結される。切断認識部位の切断によるGMP（およびアダプター）からのアクチュエータモエティの放出に続いて、標的指向配列は、アダプターとは異なる細胞の場所にアクチュエータモエティを向かわせることができる。例えばキメラアダプターポリペプチドはアダプターを細胞質に向かわせる第1の標的指向配列を含むことができ、アクチュエータモエティは別途、細胞核へ局在化させる第2の標的指向配列を含むことができる。まず、アクチュエータモエティ（アダプターの一部分を形成しているもの）は、第1の標的指向配列ゆえに、細胞質に局在化することができる。切断認識部位の切断によるGMPからのアクチュエータモエティの放出に続いて、アクチュエータモエティは、第2の標的指向配列による標的指向によって、細胞核に局在化されることができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、切断認識配列の切断後に、細胞核に移動する。
【０２０８】
いくつかの態様において、標的指向配列は膜を標的とするペプチドを含み、ポリペプチドを形質膜または細胞小器官の膜に向かわせる。膜を標的とする配列は、細胞表面膜または他の細胞膜へのキメラ膜貫通受容体ポリペプチドの輸送をもたらしうる。本明細書において前述した任意の適切な膜標的配列を使用しうる。
【０２０９】
いくつかの態様では、キメラアダプターポリペプチドが、タンパク質フォールディングを支援できるポリペプチドフォールディングドメインに連結される。いくつかの態様では、アクチュエータモエティを細胞透過性ドメインに連結することができる。例えば細胞透過性ドメインは、HIV-1 TATタンパク質、ヒトB型肝炎ウイルスからのTLM細胞透過性モチーフ、MPG、Pep-1、VP22、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来しうる。細胞透過性ドメインは、アクチュエータモエティのN末、C末、またはアクチュエータモエティ内のどこにでも位置しうる。
【０２１０】
本システムのアクチュエータモエティは、キメラアダプターポリペプチドまたはキメラ受容体ポリペプチドからの放出時に、標的ポリヌクレオチドに結合して、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効な転写アクチベータを含む。アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効な転写リプレッサを含むことができる。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外来遺伝子を保有するプラスミドを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNA、例えばmRNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。アクチュエータモエティは、GMPからの切断時にアクチュエータが核に移動することを可能にする核局在化シグナルの1つまたは複数のコピーを含むことができる。
【０２１１】
いくつかの局面において、キメラ受容体ポリペプチドは、キメラ細胞内受容体である。例示的なキメラ細胞内受容体は、(a) 抗原に特異的に結合する抗原相互作用ドメイン、および (b) 抗原相互作用ドメインに連結されたアクチュエータモエティを含む。いくつかの態様において、(i) キメラ細胞内受容体が抗原結合に応答して修飾され、(ii) キメラ細胞内受容体ポリペプチドが修飾に応答して細胞の核に移動し、および(iii) アクチュエータモエティが核内の標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する。
【０２１２】
いくつかの態様において、キメラ細胞内受容体は核内受容体である。例えば、キメラ細胞内受容体ポリペプチドは、甲状腺ホルモン受容体α(TRα)、甲状腺ホルモン受容体β(TRβ)、レチノイン酸受容体-α(RAR-α)、レチノイン酸受容体-β(RAR-β)、レチノイン酸受容体-γ(RAR-γ)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-α(PPARα)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-β/δ(PPAR-β/δ)、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-γ(PPARγ)、Rev-ErbAα、Rev-ErbAβ、RAR関連オーファン受容体α(RORα)、RAR関連オーファン受容体β(RORβ)、RAR関連オーファン受容体γ(RORγ)、肝臓X受容体-α、肝臓X受容体-β、ファルネソイドX受容体、ファルネソイドX受容体-β、ビタミンD受容体、プレグナンX受容体、構造性核内受容体(constitutive adrostane receptor)、肝細胞核因子-4-α(HNF4α)、肝細胞核因子-4-γ(HNF4γ)、レチノイドX受容体-α(RXRα)、レチノイドX受容体-β(RXRβ)、レチノイドX受容体-γ(RXRγ)、精巣受容体2(TR2)、精巣受容体4(TR4)、ショウジョウバエ(Drosophila tailless)遺伝子(TLX)の相同体、光受容体細胞特異的核内受容体(PNR)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター-転写因子I(COUP-TFI)、ニワトリオボアルブミン上流プロモーター-転写因子II(COUP-TFII)、V-erbA関連(EAR-2)、エストロゲン受容体-α(ERα)、エストロゲン受容体-β(ERβ)、エストロゲン関連受容体-α(ERRα)、エストロゲン関連受容体β(ERRβ)、エストロゲン関連受容体γ(ERRγ)、グルココルチコイド受容体(GR)、ミネラロコルチコイド受容体(MR)、プロゲステロン受容体(PR)、アンドロゲン受容体(AR)、神経成長因子IB(NGFIB)、核内受容体関連1(NURR1)、ニューロン由来オーファン受容体1(NOR1)、ステロイド生成因子1(SF1)、肝臓受容体相同体1(LRH-1)、および生殖細胞核因子(GCNF)から選択される核内受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。
【０２１３】
核内受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むキメラ細胞内受容体は、核内受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントの任意の適当なリガンドを含む抗原に結合することができる。核内受容体のリガンドの非限定的な例としては、甲状腺ホルモン、ビタミンAおよび関連化合物、脂肪酸、プロスタグランジン、ヘム、コレステロール、ATRA、オキシステロール、ビタミンD、生体異物、アンドロスタン、レチノイド、エストロゲン、コルチゾール、アルドステロン、プロゲステロン、テストステロン、ならびにホスファチジルイノシトールが挙げられる。いくつかの態様において、抗原はホルモンである。
【０２１４】
図12A〜Cは、核内受容体を含む例示的な細胞内受容体を含むシステムを模式的に示す。システムは、アクチュエータモエティ1201を含む受容体1200を含む。核内受容体に結合するリガンドがない場合、受容体は、図12Aに示されるような結合タンパク質1202との相互作用によって、細胞のある区画、例えば細胞質に隔離することができる。図12Bに示されるようにリガンド1203が細胞内受容体に結合すると、受容体は結合タンパク質1202から解離して核に移動することができる。受容体と複合体形成および/または連結したアクチュエータモエティ1201は、受容体を用いて核に入り、これはここで、標的ポリヌクレオチドの発現(例えば、遺伝子発現)および/もしくは活性を調節するようにまたは核酸配列を編集するように作動可能である。
【０２１５】
アクチュエータモエティは、ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ欠損したもしくはヌクレアーゼ活性の低減した改変ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、本明細書の他の箇所に記述されているようにそのバリアント、その誘導体、またはそのフラグメントを含むことができる。アクチュエータモエティは、遺伝子の発現もしくは活性を調節し、および/または核酸(例えば、遺伝子および/もしくは遺伝子産物)の配列を編集することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列のゲノム編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) DNAヌクレアーゼのようなDNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) RNAヌクレアーゼのようなRNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、遺伝子の発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるDNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損DNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるRNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損RNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは核酸ガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、DNAガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティはRNAガイドアクチュエータモエティである。アクチュエータモエティは、外因性であろうと内因性であろうと、遺伝子の発現もしくは活性を調節し、および/または核酸配列を編集することができる。
【０２１６】
任意の適当なヌクレアーゼをアクチュエータモエティにおいて用いることができる。適当なヌクレアーゼには、I型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、II型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、III型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、IV型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、V型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、およびVI型CRISPR関連(Cas)ポリペプチドを含むCRISPR関連(Cas)タンパク質またはCasヌクレアーゼ; 亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN); 転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN); メガヌクレアーゼ; RNA結合タンパク質(RBP); CRISPR関連RNA結合タンパク質;リコンビナーゼ; フリッパーゼ; トランスポゼース; アルゴノートタンパク質(例えば、原核生物アルゴノート(pAgo)、古細菌アルゴノート(aAgo)、および真核生物アルゴノート(eAgo)); その任意の誘導体; その任意のバリアント; ならびにその任意のフラグメントが含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体を形成するCasタンパク質を含む。
【０２１７】
細胞内受容体のアクチュエータモエティは、細胞核への移動(例えば、細胞内受容体による)の際に、標的ポリヌクレオチドに結合して、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様にいて、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効な転写アクチベータを含む。アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効な転写リプレッサを含むことができる。
【０２１８】
いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外来遺伝子を保有するプラスミドを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNA、例えばmRNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。
【０２１９】
いくつかの場合において、標的指向配列は、細胞内受容体に連結される。例えば、標的指向配列は受容体を、核局在化シグナル(NLS)を利用して細胞核に、核外移行シグナル(NES)を利用して細胞核の外側に(例えば、細胞質に)、ミトコンドリア、小胞体(ER)、ゴルジ体、クロロプラスト、アポプラスト、またはペルオキシソームに向けることができる。いくつかの態様において、標的指向配列は、核外移行シグナル(NES)を含み、受容体を細胞核の外側に向ける。いくつかの態様において、標的指向配列は核局在化シグナル(NLS)を含み、受容体を細胞核に向ける。標的指向配列は、さまざまな核局在化シグナル(NLS)を利用して受容体を細胞核に向けることができる。いくつかの態様において、キメラ細胞内受容体は、タンパク質折畳みを補助できるポリペプチド折畳みドメインに連結される。
【０２２０】
本システムは、種々の細胞に導入することができる。細胞はインビトロであることができる。細胞はインビボであることができる。細胞はエクスビボであることができる。細胞は単離された細胞であることができる。細胞は、生物の内部の細胞であることができる。細胞は生物であることができる。細胞は、細胞培養物中の細胞であることができる。細胞は、細胞の集合の1つであることができる。細胞は、哺乳類細胞であることができ、または哺乳類細胞に由来することができる。細胞は、げっ歯類細胞であることができ、またはげっ歯類細胞に由来することができる。細胞は、ヒト細胞であることができ、またはヒト細胞に由来することができる。細胞は、原核細胞であることができ、または原核細胞に由来することができる。細胞は、細菌細胞であることができ、または細菌細胞に由来することができる。細胞は、古細菌細胞であることができ、または古細菌細胞に由来することができる。細胞は、真核細胞であることができ、または真核細胞に由来することができる。細胞は多能性幹細胞であることができる。細胞は、植物細胞であることができ、または植物細胞に由来することができる。細胞は、動物細胞であることができ、または動物細胞に由来することができる。細胞は、無脊椎動物細胞であることができ、または無脊椎動物細胞に由来することができる。細胞は、脊椎動物細胞であることができ、または脊椎動物細胞に由来することができる。細胞は、微生物細胞であることができ、または微生物細胞に由来することができる。細胞は、真菌細胞であることができ、または真菌細胞に由来することができる。細胞は、特定の臓器または組織由来であることができる。
【０２２１】
細胞は、幹細胞または前駆細胞であることができる。細胞は、幹細胞(例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞、iPS細胞)および前駆細胞(例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など)を含むことができる。細胞は、げっ歯類幹細胞、げっ歯類前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞などを含む哺乳類幹細胞および前駆細胞を含むことができる。クローン細胞は、細胞の子孫を含むことができる。細胞は、標的核酸を含むことができる。細胞は生きている生物に存在することができる。細胞は、遺伝子改変細胞であることができる。細胞は宿主細胞であることができる。
【０２２２】
細胞は全能性幹細胞であることができるが、しかしながら、本開示のいくつかの態様において、「細胞」という用語が用いられうるが、全能性幹細胞をいわないこともある。細胞は植物細胞であることができるが、本開示のいくつかの態様において、「細胞」という用語が用いられうるが、植物細胞をいわないこともある。細胞は多能性細胞であることができる。例えば、細胞は、造血細胞系統内の他の細胞に分化できる多能性造血細胞であることができるが、任意の他の非造血細胞に分化することができないこともある。細胞は生物全体に発達することができうる。細胞は、生物全体に発達することができることもありできないこともある。細胞は生物全体でありうる。
【０２２３】
細胞は初代細胞であることができる。例えば、初代細胞の培養は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、15回またはそれ以上継代することができる。細胞は単細胞生物であることができる。細胞は培養で増殖させることができる。
【０２２４】
細胞は病変細胞であることができる。病変細胞は、変化した代謝的特徴、遺伝子発現特徴、および/または形態学的特徴を有することができる。病変細胞は、がん細胞、糖尿病細胞、およびアポトーシス細胞であることができる。病変細胞は、罹患対象由来の細胞であることができる。例示的な疾患は、血液障害、がん、代謝障害、眼障害、臓器障害、筋骨格障害、心臓疾患などを含むことができる。
【０２２５】
細胞が初代細胞である場合、それらはいずれかの方法によって個体から採取されうる。例えば、白血球はアフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離などによって採取されうる。皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などのような組織からの細胞は、生検によって採取することができる。採取した細胞の分散または懸濁のために適切な溶液が用いられうる。そのような溶液は一般に、低濃度の許容される緩衝液と併せて、ウシ胎児血清または他の天然に存在する因子を好都合に補充した、平衡塩類溶液(例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ハンクス平衡塩類溶液など)であることができる。緩衝液は、HEPES、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを含むことができる。細胞は、直ちに用いられうるか、またはそれらは(例えば、凍結によって)貯蔵されうる。凍結細胞を融解することができ、再使用することができる。細胞は、DMSO、血清、培地緩衝液(例えば、10% DMSO、50%血清、40%緩衝化培地)および/または凍結温度で細胞を保存するために用いられる他のそのような一般的な溶液中で凍結することができる。
【０２２６】
本システムを利用できる細胞の非限定的な例としては、B細胞、T細胞(細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、調節性T細胞、Tヘルパー細胞)、ナチュラルキラー細胞、サイトカイン誘導キラー(CIK)細胞(例えばUS20080241194を参照のこと)のようなリンパ系細胞; 顆粒球(好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球、好中球顆粒球/過分化好中球)、単球/マクロファージ、赤血球(網状赤血球)、肥満細胞、血小板/巨核球、樹状細胞のような骨髄細胞; 甲状腺(甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞)、副甲状腺(上皮小体主細胞、好酸性細胞)、副腎(クロム親和性細胞)、松果体(松果体細胞)細胞を含む内分泌系からの細胞; グリア細胞(アストロサイト、ミクログリア)、巨細胞性神経分泌細胞、星細胞、ベッチェル細胞、および下垂体(ゴナドトロープ、コルチコトロフ、サイロトロープ、ソマトトロープ、ラクトトロープ)を含む神経系の細胞; 肺細胞(I型肺細胞、II型肺細胞)、クララ細胞、杯細胞、塵埃細胞を含む呼吸器系の細胞; 心筋細胞、周皮細胞を含む呼吸器系の細胞; 胃(胃主細胞、壁細胞)、杯細胞、パネート細胞、G細胞、D細胞、ECL細胞、I細胞、K細胞、S細胞を含む消化器系の細胞;クロム親和性細胞、APUD細胞、肝臓(肝細胞、クッパー細胞)、軟骨/骨/筋肉を含む腸内分泌細胞; 骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、歯(セメント芽細胞、エナメル芽細胞)を含む骨細胞; 軟骨芽細胞、軟骨細胞を含む軟骨細胞; トリコサイト、ケラチノサイト、メラノサイト(母斑細胞)を含む皮膚細胞; 筋細胞を含む筋肉細胞; 有足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞/糸球体外メサンギウム細胞、近位尿細管刷子縁細胞、緻密斑細胞を含む泌尿器系細胞; 精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵巣を含む生殖系細胞; 脂肪細胞、線維芽細胞、腱細胞、表皮角化細胞(分化表皮細胞)、表皮基底細胞(幹細胞)、指の爪および足指の爪のケラチノサイト、爪床基底細胞(幹細胞)、髄質毛幹細胞、皮質毛幹細胞、クチクラ毛幹細胞、クチクラ毛根鞘細胞、ハクスリー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛幹細胞(幹細胞)、湿潤層状障壁上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の層状扁平上皮の被蓋上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道および膣の上皮の基底細胞(幹細胞)、尿の上皮細胞(膀胱および尿管の粘膜)、外分泌腺上皮細胞、唾液腺粘液細胞(多糖を豊富に分泌)、唾液腺漿液細胞(糖タンパク質酵素を豊富に分泌)、舌のフォン・エブネル腺細胞(味蕾の洗浄)、乳腺細胞(乳汁分泌)、涙腺細胞(涙液分泌)、耳の耳道腺細胞(耳垢分泌)、エクリン汗腺暗細胞(糖タンパク質分泌)、エクリン汗腺明細胞(小分子分泌)を含む他の細胞、アポクリン汗腺細胞(臭気分泌、性ホルモン感受性)、瞼のMoll腺細胞(特殊汗腺)、皮脂腺細胞(脂質豊富な皮脂分泌)、鼻のボーマン腺細胞(嗅上皮を洗浄)、十二指腸のブルンナー腺細胞(酵素およびアルカリ性粘液)、精細胞(精液のためのフルクトースを含む精液成分を分泌する)、前立腺細胞(精液成分を分泌する)、尿道球腺細胞(粘液分泌)、バルトリン腺細胞(膣液分泌)、リトレ腺細胞 (粘液分泌)、子宮内膜細胞(炭水化物分泌)、呼吸および消化管の孤立した杯細胞(粘液分泌)、胃内層粘液細胞(粘液分泌)、胃腺酵素原細胞(ペプシノゲン分泌)、胃腺酸分泌細胞(塩酸分泌)、膵腺房細胞(重炭酸塩および消化酵素分泌)���小腸のパネート細胞(リゾチーム分泌)、肺のII型肺細胞(界面活性剤分泌)、肺のクララ細胞、ホルモン分泌細胞、下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、脳下垂体中葉細胞、巨細胞性神経分泌細胞、腸管および気道細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎腺細胞、クロム親和細胞、精巣のライデック細胞、卵胞の莢膜細胞、破裂した卵胞の黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、卵胞膜黄体細胞、傍糸球体細胞(レニン分泌)、腎臓の緻密斑細胞、代謝および貯蔵細胞、関門機能細胞(肺、腸、外分泌腺および尿生殖器)、腎臓、I型肺細胞(肺の気腔の粘膜(lining air space of lung))、膵管細胞(腺房中心細胞)、無筋導管細胞(汗腺、唾液腺、乳腺などの)、導管細胞(精嚢、前立腺などの)、閉ざされた体内腔を裏打ちする上皮細胞(Epithelial cells lining closed internal body cavities)、推進機能を有する繊毛細胞、細胞外マトリックス分泌細胞、収縮性細胞; 骨格筋細胞、幹細胞、心筋細胞、血液および免疫系細胞、エリスロサイト(赤血球)、巨核球(血小板前駆体)、単球、結合組織マクロファージ(各種タイプ)、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞(骨内)、樹枝状細胞(リンパ系組織内)、小膠細胞(中枢神経内)、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、肥満細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、血液および免疫系(さまざまなタイプ)の委任前駆細胞および幹細胞(Stem cells and committed progenitors for the blood and immune system (various types))、多能性幹細胞、全能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、感覚変換器細胞、自律神経ニューロン細胞、感覚器官および末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、水晶体細胞、色素細胞、メラニン細胞、網膜色素上皮細胞、生殖細胞、卵原細胞/卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞(精母細胞の幹細胞)、精子、ナース細胞、卵巣卵胞細胞、セルトリ細胞(精巣内)、胸腺上皮細胞、間質細胞、ならびに間質腎臓細胞が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２２７】
標的ポリヌクレオチドの発現(例えば、遺伝子発現)を調節するために、細胞に導入された本システムを用いることができる。1つの局面において、本開示は、細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(a) キメラ受容体ポリペプチドを抗原に曝露する段階であって、ここで (i) キメラ受容体ポリペプチドが抗原への曝露により修飾され、かつ (ii) 受容体修飾がコンフォメーション変化または化学修飾を含む、段階; (b) 修飾に応答してキメラアダプターポリペプチドを受容体に結合させて、遺伝子調整ポリペプチド(GMP)と切断モエティとの間で複合体を形成させる段階であって、ここでGMPは切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含む、段階; および (c) 切断認識部位を切断モエティによって切断する段階であって、ここで切断認識部位の切断の際にアクチュエータモエティが活性化されて標的ポリヌクレオチドと複合体を形成する、段階を含む。いくつかの態様において、GMPはキメラ受容体ポリペプチドの細胞内領域の一部分を形成し、かつ切断モエティはキメラアダプターポリペプチドの一部を形成する。いくつかの態様において、GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、かつ切断モエティはキメラ受容体ポリペプチドの細胞内部分の一部分を形成する。いくつかの態様において、切断モエティは、受容体修飾に応答して受容体に結合する第2アダプターポリペプチドと複合体形成し、かつGMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成する。
【０２２８】
キメラ受容体ポリペプチドは、本明細書において記述される任意のキメラ受容体ポリペプチドであることができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは、膜貫通受容体である。例えば、キメラ膜貫通受容体ポリペプチドは、Wnt受容体(例えば、Frizzledファミリー受容体)のようなGタンパク質共役受容体(GPCR); インテグリン受容体; カドヘリン受容体; 酵素活性を保有する受容体および固有の酵素活性を保有するのではなく、非共有結合した酵素(例えば、キナーゼ)を刺激することによって作用する受容体を含む触媒性受容体; 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーのようなデスレセプター; T細胞受容体のような免疫受容体; またはその任意の誘導体、バリアント、もしくはフラグメントを含む。いくつかの態様において、受容体はSEQ ID NO: 39を含まない。
【０２２９】
細胞において発現されたキメラ受容体ポリペプチドを抗原に曝露することは、インビトロおよび/またはインビボで行うことができる。細胞において発現されたキメラ受容体ポリペプチドを抗原に曝露することは、受容体を、膜結合抗原または非膜結合抗原であることができる抗原と接触させることを含むことができる。抗原は、場合によっては、細胞の膜に結合している。抗原は、場合によっては、細胞の膜に結合していない。細胞を抗原に曝露することは、抗原の存在下において本システムを発現する細胞を培養することによりインビトロで行うことができる。例えば、本システムを発現する細胞は、付着細胞としてまたは浮遊状態で培養することができ、抗原を細胞培地に添加することができる。場合によっては、抗原は標的細胞により発現され、曝露することは、本システムを発現する細胞と抗原を発現する標的細胞とを共培養することを含むことができる。細胞は、例えばサプリメント、成長因子、イオンなどを有する、さまざまな適当なタイプの細胞培地の中で共培養することができる。本システムを発現する細胞を、標的細胞(例えば、抗原を発現する標的細胞)に曝露することは、場合によっては、細胞を対象、例えばヒト対象に投与し、細胞を循環系によって標的細胞に局在させることによりインビボで達成することができる。
【０２３０】
曝露することは、任意の適当な長さの時間、例えば少なくとも1分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも30分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも 4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも20時間、少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも 3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも1ヶ月間またはそれ以上の間、行うことができる。
【０２３１】
キメラ受容体ポリペプチドは、本明細書において記述される任意の適当な抗原に結合することができる。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは膜貫通受容体である。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは細胞内受容体である。いくつかの態様において、キメラ受容体ポリペプチドは核内受容体である。キメラ受容体ポリペプチドの抗原相互作用ドメインは、膜結合抗原、例えば細胞の細胞外表面(例えば、標的細胞)に結合した抗原に結合することができる。いくつかの態様において、抗原相互作用ドメインは、非膜結合抗原、例えば細胞(例えば、標的細胞)によって分泌される細胞外抗原または細胞(例えば、標的細胞)の細胞質に位置する抗原に結合する。抗原(例えば、膜結合および非膜結合)は、ウイルス感染、細菌感染および/もしくは寄生虫感染のような疾患; 炎症性疾患および/もしくは自己免疫疾患; またはがんおよび/もしくは腫瘍のような新生物と関連することができる。
【０２３２】
抗原への曝露により、キメラ受容体は受容体修飾を受けることができる。受容体修飾は、コンフォメーション変化、化学修飾、またはその組み合わせを含むことができる。化学的修飾は、例えば、受容体の少なくとも1つのアミノ酸残基のリン酸化または脱リン酸化を含むことができる。リン酸化および/または脱リン酸化は、例えば、チロシン、セリン、トレオニン、またはキメラ受容体ポリペプチドの任意の他の適当なアミノ酸残基の位置で行われることができる。受容体修飾に応答したキメラ受容体ポリペプチドへのキメラアダプターポリペプチドの結合は、GMPと切断モエティとの間で複合体を形成することができる。GMPと切断モエティとの間の複合体の形成は、切断モエティによる切断認識部位の切断をもたらすことができる。いくつかの態様において、切断認識部位は、プロテアーゼ活性を含む切断モエティによって認識されるポリペプチド配列(例えば、ペプチド切断ドメイン)を含む。切断モエティは、ポリペプチド配列を認識するプロテアーゼ活性を含むことができる。プロテアーゼ活性を含む切断モエティは、限定するものではないが、本明細書の他の箇所に記述された任意のプロテアーゼ、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むプロテアーゼであることができる。いくつかの態様において、切断認識部位は、複数の切断認識配列を含み、各切断認識配列は、プロテアーゼ活性を含む同じまたは異なる切断モエティ(例えば、プロテアーゼ)によって認識されることができる。いくつかの態様において、受容体修飾は複数の修飾部位での修飾を含み、各修飾は、キメラアダプターポリペプチドに結合するのに有効である。いくつかの態様において、(i) GMPはキメラアダプターポリペプチドの一部分を形成し、(ii) キメラアダプターポリペプチドは切断認識部位の切断後にキメラ受容体ポリペプチドから放出され、かつ(iii) GMPを含むさらなるキメラアダプターポリペプチドは、修飾された受容体に結合する。
【０２３３】
いくつかの態様において、切断認識部位は、インテイン配列の第2部分と反応してアクチュエータモエティを放出する、インテイン配列の第1部分を含む。本明細書の他の箇所に記述されている、異種スプリットインテインシステムを用いて、アクチュエータモエティの放出を容易にすることができる。アクチュエータモエティは、インテイン配列の第1部分に共有結合することができる。アクチュエータモエティは、そのN末またはC末を介してインテイン配列の第1部分に連結することができる。切断モエティは、インテイン配列の第2部分を含むことができる。インテイン配列の第1部分または第2部分は、N末インテイン、C末インテイン、またはアクチュエータモエティの放出を促進できるインテインの任意の他の適当な部分であることができる。インテイン配列は、任意の適当な供給源由来であることができる。第1部分および第2部分は、同じまたは異なる供給源(例えば、生物、タンパク質)由来であることができる。具体例において、アクチュエータモエティはペプチド結合を介して、N末インテインを含むインテイン配列の第1部分に(例えば、そのN末またはC末で)共有結合することができる。アクチュエータモエティ-N末インテイン融合物を、C末インテインを含むインテイン配列の第2部分と接触させることができる。インテイン配列の第1部分と第2部分とのこの接触は、(例えば、アクチュエータモエティとN末インテインとの間の部位での)部位特異的切断をもたらすことができ、それによってアクチュエータモエティが放出される。別の具体例において、アクチュエータモエティはペプチド結合を介して、C末インテインを含むインテインの第1部分に(例えば、そのN末またはC末で)共有結合することができる。アクチュエータモエティ-C末インテイン融合物を、N末インテインを含むインテイン配列の第2部分と接触させることができる。インテインの第1部分と第2部分とのこの接触は、(例えば、アクチュエータモエティとC末インテインとの間の適当な部位での)部位特異的切断をもたらすことができ、それによってアクチュエータモエティが放出される。
【０２３４】
いくつかの態様において、切断認識部位はジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、切断モエティは酸化還元酵素活性を含む。ジスルフィド結合は、アクチュエータモエティをキメラアダプターポリペプチドまたはキメラ受容体ポリペプチドの一部分に連結することができる。ジスルフィド結合は、アクチュエータモエティの1つまたは複数のシステインによって形成することができる。システインをアクチュエータモエティに工学的に操作することができる。システインは、アクチュエータモエティの天然または野生型配列の部分であることができる。システインは、アクチュエータモエティに付加されたリンカーペプチド中に存在することができる。ジスルフィド結合の切断は、例えば、ジスルフィド結合の酸化還元条件を変えることによって促進することができる。酸化還元条件の変更は、ジスルフィド結合のチオールへの還元およびアクチュエータモエティの放出をもたらすことができる。ジスルフィド結合の切断は、ジスルフィド結合の還元をもたらすことができる酸化還元剤を含む切断モエティによって促進することができる。酸化還元剤は、酵素、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントであることができる。酵素は酸化還元酵素であることができる。酸化還元酵素の例としては、タンパク質-ジスルフィド還元酵素、チオレドキシン、グルタレドキシン、チオールジスルフィド酸化還元酵素(例えば、DsbA、BdbA-D、MdbA、SdbA)およびグルタチオンジスルフィド還元酵素が挙げられる。酸化還元剤は、原核生物および真核生物を含む任意の適当な供給源由来であることができる。酵素の最適活性のために補因子(例えば、ニコチンアミド補因子、フラビン、ならびにそれらの誘導体および類似体)を供給することができる。
【０２３５】
本明細書の他の箇所に記述されるように、GMPは、切断認識部位に連結されたアクチュエータモエティを含むことができる。アクチュエータモエティは、ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ欠損したもしくはヌクレアーゼ活性の低減した改変ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、本明細書の他の箇所に記述されているようにそのバリアント、その誘導体、またはそのフラグメントを含むことができる。アクチュエータモエティは、遺伝子の発現および/もしくは活性を調節し、または核酸(例えば、遺伝子および/もしくは遺伝子産物)の配列を編集することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列のゲノム編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) DNAヌクレアーゼのようなDNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) RNAヌクレアーゼのようなRNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるDNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損DNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるRNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損RNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは核酸ガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、DNAガイドアクチュエータモエティである。いくつかの態様において、アクチュエータモエティはRNAガイドアクチュエータモエティである。アクチュエータモエティは、外因性であろうと内因性であろうと、遺伝子の発現もしくは活性を調節し、および/または核酸配列を編集することができる。切断認識部位の切断の際にアクチュエータモエティは活性化されて、標的ポリヌクレオチドと複合体形成する。
【０２３６】
任意の適当なヌクレアーゼをアクチュエータモエティにおいて用いることができる。適当なヌクレアーゼには、I型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、II型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、III型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、IV型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、V型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、およびVI型CRISPR関連(Cas)ポリペプチドを含むCRISPR関連(Cas)タンパク質またはCasヌクレアーゼ; 亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN); 転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN); メガヌクレアーゼ; RNA結合タンパク質(RBP); CRISPR関連RNA結合タンパク質;リコンビナーゼ; フリッパーゼ; トランスポゼース; アルゴノートタンパク質(例えば、原核生物アルゴノート(pAgo)、古細菌アルゴノート(aAgo)、および真核生物アルゴノート(eAgo)); その任意の誘導体; その任意のバリアント; ならびにその任意のフラグメントが含まれるが、これらに限定されることはない。
【０２３７】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成することができる、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、切断活性を欠くCasタンパク質を含む。
【０２３８】
本システムのアクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドに結合して、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、標的ポリヌクレオチドの発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有効な転写アクチベータを含む。アクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるのに有効な転写リプレッサを含むことができる。
【０２３９】
いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外来遺伝子を保有するプラスミドを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNA、例えばmRNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。アクチュエータモエティは、GMPからの切断時にアクチュエータが核に移動することを可能にする核局在化シグナルの1つまたは複数のコピーを含むことができる。
【０２４０】
本明細書における局面のさまざまな態様の標的ポリヌクレオチドは、DNAまたはRNA (例えば、mRNA)であることができる。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であることができる。標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAであることができる。標的ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであることができる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドによるものであることができる。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物(例えば、タンパク質)をコードする配列または非コード配列(例えば、調節ポリヌクレオチド)であることができる。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外来遺伝子を保有するプラスミドを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNA、例えばmRNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物を含む。
【０２４１】
標的ポリヌクレオチドは、いくつかの疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドならびにシグナル伝達生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドを含んでもよい。標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路と関連する配列、例えばシグナル伝達生化学経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、罹患組織に由来する細胞において、非疾患対照の組織または細胞と比較して異常なレベルでまたは異常な形態で転写産物または翻訳産物を与えている、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。いくつかの態様において、これは、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子である。いくつかの態様において、これは、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子である。改変された発現は、疾患の発生および/または進行と相関しうる。疾患関連遺伝子は、病因に直接的に係わる、または病因に係わる遺伝子と連鎖不均衡にある、突然変異または遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写産物または翻訳産物は公知であっても未知であってもよく、正常レベルであっても異常レベルであってもよい。
【０２４２】
疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例は、ワールドワイドウェブで利用可能なジョンズ・ホプキンズ大学McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine（メリーランド州ボルチモア）およびアメリカ国立医学図書館国立生物工学情報センター（メリーランド州ベセスダ）から入手することができる。一定の疾患および障害と関連する例示的遺伝子を表3および表4に掲載する。シグナル伝達生化学経路関連遺伝子およびポリヌクレオチドの例を表5に列挙する。
【０２４３】
これらの遺伝子および経路における突然変異は、機能に影響を及ぼす不適正なタンパク質または不適正な量のタンパク質の生産をもたしうる。
【０２４４】
（表３）
2019500887.tif 000021
2019500887.tif 000022
【０２４５】
（表４）
2019500887.tif 000023
2019500887.tif 000024
2019500887.tif 000025
【０２４６】
（表５）
2019500887.tif 000026
2019500887.tif 000027
2019500887.tif 000028
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2019500887.tif 000035
【０２４７】
標的ポリヌクレオチド配列は、20ヌクレオチド長の標的核酸またはプロトスペーサー配列（すなわちガイド核酸のスペーサー領域によって認識される配列）を含むことができる。プロトスペーサーは20ヌクレオチド長未満であることができる。プロトスペーサーは、少なくとも5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30ヌクレオチド長またはそれ以上であることができる。プロトスペーサー配列は、多くて5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30ヌクレオチド長またはそれ以上であることができる。プロトスペーサー配列は、PAMの第1ヌクレオチドのすぐ5'側の16、17、18、19、20、21、22、または23塩基であることができる。プロトスペーサー配列は、PAM配列の最後のヌクレオチドのすぐ3'側の16、17、18、19、20、21、22、または23塩基であることができる。プロトスペーサー配列はPAM配列の第1ヌクレオチドのすぐ5'側の20塩基であることができる。プロトスペーサー配列はPAMの最後のヌクレオチドのすぐ3'側の20塩基であることができる。標的核酸配列はPAMの5'側または3'側であることができる。
【０２４８】
プロトスペーサー配列は、ガイド核酸の、核酸を標的とするセグメントが結合することのできる標的ポリヌクレオチド中に存在する核酸配列を含むことができる。例えばプロトスペーサー配列は、ガイド核酸がそれに対する相補性を有するように設計される配列を含むことができる。プロトスペーサー配列は、細胞の核もしくは細胞質内またはミトコンドリアもしくはクロロプラストなどの細胞小器官内に位置することができる任意のポリヌクレオチドを含むことができる。プロトスペーサー配列はCasタンパク質の切断部位を含むことができる。プロトスペーサー配列はCasタンパク質の切断部位に隣接することができる。
【０２４９】
Casタンパク質は、ガイド核酸の、核酸を標的とする配列が結合することのできる配列の内側または外側の部位で標的ポリヌクレオチドに結合することができる。結合部位は、Casタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生じさせることのできる核酸位置を含むことができる。
【０２５０】
Casタンパク質による標的核酸の部位特異的結合は、ガイド核酸と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決まる位置で起こりうる。Casタンパク質による標的核酸の部位特異的結合は、標的核酸中のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短いモチーフによって決定される位置で起こりうる。PAMは、プロトスペーサーに、例えばプロトスペーサー配列の3'端に、隣接しうる。例えばCas9の結合部位は、PAM配列の約1〜約25、または約2〜約5、または約19〜約23塩基対（例えば3塩基対）上流または下流であることができる。Cas（例えばCas9）の結合部位はPAM配列の3塩基対上流であることができる。Cas（例えばCpf1）の結合部位は、（＋）鎖上の19塩基および（-）鎖上の23塩基であることができる。
【０２５１】
異なる生物は異なるPAM配列を含みうる。異なるCasタンパク質は異なるPAM配列を認識することができる。例えば化膿連鎖球菌の場合、PAMは配列5'-XRR-3'を含むことができ、ここで、RはAまたはGのどちらかであることができ、Xは任意のヌクレオチドであって、Xはスペーサー配列が標的とする標的核酸配列のすぐ3'側にある。化膿連鎖球菌Cas9（SpyCas9）のPAM配列は5'-XGG-3'であることができ、ここで、Xは任意のDNAヌクレオチドであって、標的DNAの非相補鎖のプロトスペーサー配列のすぐ3'側にある。Cpf1のPAMは5'-TTX-3'であることができ、ここで、Xは任意のDNAヌクレオチドであって、CRISPR認識配列のすぐ5'側にある。
【０２５２】
ガイド核酸の標的配列は、PAM配列に隣接する標的配列内の配列を突き止めるバイオインフォマティクスアプローチで同定することができる。ガイド核酸にとって最適な標的配列は、例えば最も高いオン-ターゲット活性および最も低いオフ-ターゲット活性を持つ配列を同定するためにいくつかのガイド核酸配列を試験する実験的アプローチによって同定することができる。標的配列の位置は望ましい実験アウトカムによって決定することができる。例えば標的プロトスペーサーは、標的遺伝子を活性化しまたは抑制するために、プロモーター中に配置することができる。標的プロトスペーサーは、5'の構成的に発現するエクソンまたは公知ドメインをコードする配列などのコーディング配列内に存在することができる。標的プロトスペーサーは、オフ-ターゲット効果を軽減するために、ゲノム内のユニークな配列であることができる。潜在的標的プロトスペーサーを決定してランク付けするためのアルゴリズムは、公的に利用できるものが当技術分野では数多く公知であり、それらを使用することができる。
【０２５３】
いくつかの局面において、本明細書に開示するシステムは、遺伝子疾患または医学的状態に関連する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節することができる。米国国立衛生研究所のウェブサイトにトピックサブセクションGenetic Disordersという小見出しでさらにくわしく説明されている広範囲にわたる遺伝子疾患（ウェブサイトhealth.nih.gov/topic/GeneticDisorders）。
【０２５４】
明らかなように、本発明のシステムを用いて関心対象の任意のポリヌクレオチド配列を標的とすることができると考えられる。本発明のシステムを用いて有効に処置されうる状態または疾患のいくつかの例が表3〜5に含まれており、それらの状態に現在関連する遺伝子の例もそこに提供されている。しかしながら、例示された遺伝子は網羅的ではない。
【０２５５】
標的核酸は、1つまたは複数のガイド核酸と少なくとも部分的に相補的な1つまたは複数の配列を含むことができる。標的核酸は、いくつかある核酸実体の中でも特に、遺伝子の一部もしくは全部、遺伝子の5'末端、遺伝子の3'末端、調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー)、偽遺伝子、非コードDNA、マイクロサテライト、イントロン、エキソン、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、センスDNA、アンチセンスDNA、核様体DNA、クロロプラストDNA、またはRNAであることができる。標的核酸は、プラスミドDNAの一部または全部であることができる。プラスミドDNAまたはその一部分は、負の超らせんであることができる。標的核酸は、インビトロまたはインビボであることができる。
【０２５６】
標的核酸は、低GC含量領域内の配列を含むことができる。標的核酸は、負の超らせんであることができる。非限定的な例として、標的核酸は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60もしくは65%またはそれ以上のGC含量を含むことができる。標的核酸は、多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60もしくは65%またはそれ以上のGC含量を含むことができる。
【０２５７】
特定のGC含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする標的核酸の長さであることができる。GC含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする領域の長さよりも長くても短くてもよい。GC含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする領域の長さより少なくとも30、40、50、60、70、80、90もしくは100またはそれ以上のヌクレオチド、長くても短くてもよい。GC含量を含む領域は、ガイド核酸とハイブリダイズする領域の長さより多くとも30、40、50、60、70、80、90もしくは100またはそれ以上のヌクレオチド、長くても短くてもよい。
【０２５８】
1つの局面において、本開示は、核を含む細胞内での標的ポリヌクレオチドの発現を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(a) キメラ細胞内受容体を抗原に曝露する段階であって、ここで (i) 受容体が抗原相互作用ドメインおよびアクチュエータモエティを含み、かつ (ii) 抗原への曝露の際に受容体が修飾される、段階; (b) 修飾された受容体を核に移動させる段階; (c) アクチュエータモエティと標的ポリヌクレオチドとの間で複合体を形成する段階を含む。本明細書の他の箇所に記述されるように、キメラ細胞内受容体は、核内受容体、またはその任意の誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含むことができる。いくつかの態様において、キメラ細胞内受容体はホルモンに結合する。
【０２５９】
抗原に曝露されると、キメラ細胞内受容体は受容体修飾を受けることができる。受容体修飾に続いて、キメラ細胞内受容体は細胞ヌクレアーゼに移動することができる。核において、アクチュエータモエティは標的ポリヌクレオチドとの複合体を形成することができる。
【０２６０】
前述のように、アクチュエータモエティは、ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、野生型ヌクレアーゼと比較してヌクレアーゼ欠損したもしくはヌクレアーゼ活性の低減した改変ヌクレアーゼ(例えば、DNAヌクレアーゼおよび/もしくはRNAヌクレアーゼ)、本明細書の他の箇所に記述されているようにそのバリアント、その誘導体、またはそのフラグメントを含むことができる。アクチュエータモエティは、遺伝子の発現および/もしくは活性を調節し、または核酸(例えば、遺伝子および/もしくは遺伝子産物)の配列を編集することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列のゲノム編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) DNAヌクレアーゼのようなDNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の編集を誘導するために工学的に操作された(例えば、プログラム可能または標的指向可能な) RNAヌクレアーゼのようなRNAヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有する。低減されたまたは最小限のヌクレアーゼ活性を有するアクチュエータモエティは、標的ポリヌクレオチドの物理的妨害によって、または標的ポリヌクレオチドの発現を抑制もしくは増強するのに有効なさらなる因子の動員によって、発現および/または活性を調節することができる。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的DNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるDNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損DNA結合タンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、標的RNA配列の転写活性化または抑制を誘導できるRNAヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼ欠損RNA結合タンパク質を含む。アクチュエータモエティは、外因性であろうと内因性であろうと、遺伝子の発現もしくは活性を調節し、および/または核酸配列を編集することができる。
【０２６１】
任意の適当なヌクレアーゼをアクチュエータモエティにおいて用いることができる。適当なヌクレアーゼには、I型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、II型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、III型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、IV型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、V型CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、およびVI型CRISPR関連(Cas)ポリペプチドを含むCRISPR関連(Cas)タンパク質またはCasヌクレアーゼ; 亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN); 転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN); メガヌクレアーゼ; RNA結合タンパク質(RBP); CRISPR関連RNA結合タンパク質;リコンビナーゼ; フリッパーゼ; トランスポゼース; アルゴノートタンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはゲノムDNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、プラスミドの領域、例えば外来遺伝子を保有するプラスミドを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドはRNA、例えばmRNAを含む。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子または遺伝子産物; その任意の誘導体; その任意のバリアント; およびその任意のフラグメントを含む。
【０２６２】
いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体を形成するCasタンパク質を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、Casタンパク質と複合体を形成することができる、ガイドRNAのような、ガイド核酸と複合体形成していてもよいRNA結合タンパク質(RBP)を含む。いくつかの態様において、アクチュエータモエティは、切断活性を欠くCasタンパク質を含む。
【０２６３】
いくつかの局面において、本開示は、宿主細胞における標的核酸の転写を選択的に調整する方法を提供する。本方法は、(a) 宿主細胞に、(i) Casタンパク質が酵素的に不活性である(例えば、デッドCas、dCas9)かまたは低減された(例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼ)活性を示す、キメラCasタンパク質(例えば、受容体もしくはアダプタータンパク質に融合されたCasタンパク質)、またはキメラCasタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、アクチュエータモエティ; および (ii) ガイド核酸、またはガイド核酸をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入する段階を伴うことができる。ガイド核酸は、(i) 標的核酸(例えば、ゲノムDNA、mRNA)中の標的配列と相補的なヌクレオチド配列を含む第1セグメント(例えば、スペーサー領域、核酸を標的とする領域); および (ii) Casタンパク質と相互作用する第2セグメント(例えば、タンパク質結合セグメントまたはCasタンパク質結合セグメント)を含むことができる。Casタンパク質は、(i) ガイド核酸と相互作用するガイド核酸結合部分; および (ii) ヌクレアーゼ活性を示さないか、または低減されたヌクレアーゼ活性を示す部分を含むことができる。ガイド核酸およびデッドCasタンパク質は、宿主細胞において複合体を形成することができる。複合体は、宿主細胞中の標的DNAの転写を選択的に調整することができる。標的ポリヌクレオチドは、本明細書において記述される任意の標的ポリヌクレオチド、例えば本明細書の他の箇所に記述される遺伝子に関連する任意の標的ポリヌクレオチドであることができる。
【０２６４】
本発明の諸局面のさまざまな態様では、宿主細胞における標的核酸の転写を選択的に調整（低減または増加）するために、本システムを使用することができる。標的核酸の転写の選択的調整は、標的核酸の転写を低減または増加させることはできるが、非標的核酸またはオフ-ターゲット核酸の転写を実質的に調整することはできず、例えば非標的核酸の転写は、ガイド核酸/酵素的に不活性なまたは酵素活性が低減した（enzymatically reduced）Casタンパク質複合体などのアクチュエータモエティが存在しない場合の非標的核酸の転写のレベルと比較して、1％未満、5％未満、10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、または50％未満しか調整されないだろう。例えば、標的核酸の転写の選択的調整（例えば低減または増加）は、標的核酸の転写を、ガイド核酸/酵素的に不活性なまたは酵素活性が低減したCasタンパク質複合体などのアクチュエータモエティが存在しない場合の標的核酸の転写のレベルと比較して、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減または増加させることができる。
【０２６５】
いくつかの態様において、本開示は、標的核酸の転写を増加させるための方法を提供する。標的核酸の転写は、ガイド核酸/酵素的に不活性なまたは酵素活性が低減したCasタンパク質複合体などのアクチュエータモエティが存在しない場合の標的DNAの転写のレベルと比較して、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約1.6倍、少なくとも約1.7倍、少なくとも約1.8倍、少なくとも約1.9倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約3.5倍、少なくとも約4倍、少なくとも約4.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約12倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍、少なくとも約70倍、または少なくとも約100倍増加することができる。標的核酸の転写の選択的増加は標的核酸の転写を増加させるが、非標的DNAの転写は実質的に増加させることができず、例えば非標的核酸の転写は、ガイド核酸/酵素的に不活性なまたは酵素活性が低減したCasタンパク質複合体などのアクチュエータモエティが存在しない場合の非標的DNAの転写のレベルと比較して、全く増加しないわけではないとしても、その増加は、約5倍未満、約4倍未満、約3倍未満、約2倍未満、約1.8倍未満、約1.6倍未満、約1.4倍未満、約1.2倍未満、または約1.1倍未満である。
【０２６６】
いくつかの態様において、本開示は、標的核酸の転写を減少させるための方法を提供する。標的核酸の転写は、ガイド核酸/酵素的に不活性なまたは酵素活性が低減したCasタンパク質複合体などのアクチュエータモエティが存在しない場合の標的DNAの転写のレベルと比較して、少なくとも約1.1分の1、少なくとも約1.2分の1、少なくとも約1.3分の1、少なくとも約1.4分の1、少なくとも約1.5分の1、少なくとも約1.6分の1、少なくとも約1.7分の1、少なくとも約1.8分の1、少なくとも約1.9分の1、少なくとも約2分の1、少なくとも約2.5分の1、少なくとも約3分の1、少なくとも約3.5分の1、少なくとも約4分の1、少なくとも約4.5分の1、少なくとも約5分の1、少なくとも約6分の1、少なくとも約7分の1、少なくとも約8分の1、少なくとも約9分の1、少なくとも約10分の1、少なくとも約12分の1、少なくとも約15分の1、少なくとも約20分の1、少なくとも約50分の1、少なくとも約70分の1、または少なくとも約100分の1に減少することができる。標的核酸の転写の選択的減少は標的核酸の転写を減少させるが、非標的DNAの転写を実質的に減少させることはできず、例えば非標的核酸の転写は、ガイド核酸/酵素的に不活性なまたは酵素活性が低減したCasタンパク質複合体などのアクチュエータモエティが存在しない場合の非標的DNAの転写のレベルと比較して、全く減少しないわけではないとしても、それが、約5分の1以下、約4分の1以下、約3分の1以下、約2分の1以下、約1.8分の1以下、約1.6分の1以下、約1.4分の1以下、約1.2分の1以下、または約1.1分の1以下まで減少することはない。
【０２６７】
転写調整は、酵素的に不活性なCasタンパク質などのアクチュエータモエティを異種配列に融合することによって達成することができる。異種配列は、適切な融合パートナー、例えば標的核酸に直接作用するか、標的核酸と会合したポリペプチド（例えばヒストンまたは他のDNA結合タンパク質）に作用することによって、転写を間接的に増加させ、減少させ、または他の形で調整する活性を与えるポリペプチドであることができる。適切な融合パートナーの非限定的な例として、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を与えるポリペプチドが挙げられる。
【０２６８】
適切な融合パートナーとして、標的核酸の転写を直接増加させるポリペプチドを挙げることができる。例えば転写活性化因子もしくはそのフラグメント、転写活性化因子を動員するタンパク質もしくはそのフラグメント、または小分子/薬物応答性転写調節因子。適切な融合パートナーとして、標的核酸の転写を直接減少させるポリペプチドを挙げることができる。例えば転写抑制因子もしくはそのフラグメント、転写抑制因子を動員するタンパク質もしくはそのフラグメント、または小分子/薬物応答性転写調節因子。
【０２６９】
異種配列または融合パートナーは、アクチュエータモエティ、例えばデッドCasタンパク質の、C末、N末、または内部（すなわちN末またはC末以外の部分）に融合することができる。融合パートナーの非限定的な例として、転写活性化因子、転写抑制因子、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（KMT）、ヒストンリジンデメチラーゼ（Histone Lysine Demethylate）、ヒストンリジンアセチルトランスフェラーゼ（KAT）、ヒストンリジンデアセチラーゼ、DNAメチラーゼ（アデノシン修飾またはシトシン修飾）、CTCF、末梢動員エレメント（periphery recruitment element）（例えばラミンA、ラミンB）、およびタンパク質ドッキングエレメント（例えばFKBP/FRB）が挙げられる。
【０２７０】
転写活性化因子の非限定的な例として、GAL4、VP16、VP64、およびp65サブドメイン（NFカッパB）が挙げられる。
【０２７１】
転写抑制因子の非限定的な例として、Kruippel関連ボックス（Kruippel associated box）（KRABまたはSKD）、Mad mSIN3相互作用ドメイン（SID）、およびERF抑制因子ドメイン（ERD）が挙げられる。
【０２７２】
ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（KMT）の非限定的な例として、KMT1ファミリーのメンバー（例えばSUV39H1、SUV39H2、G9A、ESET/SETDB1、Clr4、Su(var)3-9）、KMT2ファミリーメンバー（例えばhSET1A、hSET1B、MLL1〜5、ASH1、およびホモログ（Trx、Trr、Ash1））、KMT3ファミリー（SYMD2、NSD1）、KMT4（DOT1Lおよびホモログ）、KMT5ファミリー（Pr-SET7/8、SUV4-20H1、およびホモログ）、KMT6（EZH2）、およびKMT8（例えばRIZ1）が挙げられる。
【０２７３】
ヒストンリジンデメチラーゼ（Histone Lysine Demethylate）（KDM）の非限定的な例としては、KDM1ファミリーのメンバー（LSD1/BHC110、Splsd1/Swm1/Saf110、Su(var)3-3）、KDM3ファミリー（JHDM2a/b）、KDM4ファミリー（JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、およびホモログ（Rph1））、KDM5ファミリー（JARID1A/RBP2、JARID1B/PLU-1、JARIDIC/SMCX、JARID1D/SMCY、およびホモログ（Lid、Jhn2、Jmj2））、およびKDM6ファミリー（例えばUTX、JMJD3）が挙げられる。
【０２７４】
KATの非限定的な例として、KAT2ファミリーのメンバー（hGCN5、PCAF、およびホモログ（dGCN5/PCAF、Gcn5）、KAT3ファミリー（CBP、p300、およびホモログ（dCBP/NEJ））、KAT4、KAT5、KAT6、KAT7、KAT8、およびKAT13が挙げられる。
【０２７５】
いくつかの態様において、デッドCasタンパク質またはデッドCas融合タンパク質を含むアクチュエータモエティは、標的核酸中の特定の場所（すなわち配列）に、ガイド核酸によって標的指向され、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合するのを阻止する（例えばこれにより、転写活性化因子機能を選択的に阻害することができる）および/または局所的クロマチン状態を修飾する（例えば標的核酸を修飾することまたは標的核酸と会合するポリペプチドを修飾することができる融合配列を使用する場合）などの座位特異的調節を発揮する。場合によっては、変化は一過性（例えば転写抑制または転写活性化）である。場合によっては、変化は遺伝性（例えば、標的DNAに、または標的DNAと会合するタンパク質、例えばヌクレオソームのヒストンに、エピジェネティック修飾が加えられる場合）である。
【０２７６】
いくつかの態様において、ガイド核酸は、標的核酸の転写を調整する目的で標的核酸に異種ポリペプチドを動員するためのタンパク質結合セグメントを含むことができる。適切な異種ポリペプチドの非限定的な例として、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を与えるポリペプチドが挙げられる。ガイド核酸は、転写活性化因子、転写抑制因子、またはそれらのフラグメントを動員するためのタンパク質結合セグメントを含むことができる。
【０２７７】
いくつかの態様において、遺伝子発現調整は、標的核酸の調節エレメント、例えば転写応答エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー）、上流活性化配列（UAS）、および/またはDNAの発現を制御することができると思われる機能未知もしくは機能公知の配列を標的とするように設計されたガイド核酸を使用することによって達成される。
【０２７８】
本願の諸局面のさまざまな態様において、本開示は、CRISPR/Casシステムで使用するためのガイド核酸を提供する。ガイド核酸（例えばガイドRNA）はCasタンパク質に結合して、そのCasタンパク質を標的ポリヌクレオチド内の特異的な場所に標的指向させることができる。ガイド核酸は、核酸を標的とするセグメントおよびCasタンパク質結合セグメントを含むことができる。
【０２７９】
ガイド核酸とは、別の核酸、例えば細胞のゲノム中の標的ポリヌクレオチドに、ハイブリダイズすることができる核酸を指しうる。ガイド核酸はRNA、例えばガイドRNAであることができる。ガイド核酸はDNAであることができる。ガイド核酸はDNAおよびRNAを含むことができる。ガイド核酸は一本鎖であることができる。ガイド核酸は二本鎖であることができる。ガイド核酸はヌクレオチド類似体を含むことができる。ガイド核酸は修飾ヌクレオチドを含むことができる。ガイド核酸は、核酸の配列に部位特異的に結合するようにプログラムまたは設計することができる。
【０２８０】
ガイド核酸は、新しい特徴または強化された特徴を核酸に与えるために、1つまたは複数の修飾を含むことができる。ガイド核酸は核酸アフィニティータグを含むことができる。ガイド核酸は合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、および/または修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０２８１】
ガイド核酸は、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー配列に相補的な、核酸を標的とする領域（例えばスペーサー領域）を、例えば5'端もしくは3'端またはその近傍に含むことができる。ガイド核酸のスペーサーは、プロトスペーサーと、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対合）によって配列特異的に相互作用することができる。プロトスペーサー配列は、標的ポリヌクレオチド中のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の5'側または3'側に位置しうる。スペーサー領域のヌクレオチド配列はさまざまであることができ、ガイド核酸が相互作用することのできる標的核酸内の場所を決定する。ガイド核酸のスペーサー領域は、標的核酸内の任意の所望する配列にハイブリダイズするように設計または修飾することができる。
【０２８２】
ガイド核酸は2つの別個の核酸分子を含むことができ、これをダブルガイド核酸と呼ぶことができる。ガイド核酸は単一の核酸分子を含むことができ、これをシングルガイド核酸（例えばsgRNA）と呼ぶことができる。いくつかの態様において、ガイド核酸は融合されたCRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化型crRNA（tracrRNA）とを含むシングルガイド核酸である。いくつかの態様において、ガイド核酸はcrRNAを含むシングルガイド核酸である。いくつかの態様において、ガイド核酸はcrRNAを含むがtracrRNAを欠くシングルガイド核酸である。いくつかの態様において、ガイド核酸は、融合されていないcrRNAとtracrRNAとを含むダブルガイド核酸である。例示的ダブルガイド核酸は、crRNA様分子とtracrRNA様分子とを含むことができる。例示的なシングルガイド核酸はcrRNA様分子を含むことができる。例示的シングルガイド核酸は融合されたcrRNA様分子とtracrRNA様分子とを含むことができる。
【０２８３】
crRNAは、ガイド核酸の、核酸を標的とするセグメント（例えばスペーサー領域）と、ガイド核酸のCasタンパク質結合セグメントの二本鎖デュプレックス（double-stranded duplex）の半分を形成することができるヌクレオチドのストレッチとを含むことができる。
【０２８４】
tracrRNAは、gRNAのCasタンパク質結合セグメントの二本鎖デュプレックスの他方の半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含むことができる。crRNAのヌクレオチドのストレッチは、tracrRNAのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それとハイブリダイズして、ガイド核酸のCasタンパク質結合ドメインの二本鎖デュプレックスを形成することができる。
【０２８５】
crRNAとtracrRNAはハイブリダイズしてガイド核酸を形成することができる。crRNAは、標的核酸認識配列（例えばプロトスペーサー）にハイブリダイズする、一本鎖核酸を標的とするセグメント（例えばスペーサー領域）を提供することもできる。スペーサー領域を含むcrRNAの配列、またはtracrRNA分子の配列は、そのガイド核酸を使用しようとする種に特異的であるように設計することができる。
【０２８６】
いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は、18〜72ヌクレオチド長であることができる。ガイド核酸の、核酸を標的とする領域（例えばスペーサー領域）は、約12ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さを有することができる。例えばガイド核酸の、核酸を標的とする領域（例えばスペーサー領域）は、約12ヌクレオチド（nt）〜約80nt、約12nt〜約50nt、約12nt〜約40nt、約12nt〜約30nt、約12nt〜約25nt、約12nt〜約20nt、約12nt〜約19nt、約12nt〜約18nt、約12nt〜約17nt、約12nt〜約16nt、または約12nt〜約15ntの長さを有することができる。あるいは、DNAを標的とするセグメントは、約18nt〜約20nt、約18nt〜約25nt、約18nt〜約30nt、約18nt〜約35nt、約18nt〜約40nt、約18nt〜約45nt、約18nt〜約50nt、約18nt〜約60nt、約18nt〜約70nt、約18nt〜約80nt、約18nt〜約90nt、約18nt〜約100nt、約20nt〜約25nt、約20nt〜約30nt、約20nt〜約35nt、約20nt〜約40nt、約20nt〜約45nt、約20nt〜約50nt、約20nt〜約60nt、約20nt〜約70nt、約20nt〜約80nt、約20nt〜約90nt、または約20nt〜約100ntの長さを有することができる。核酸を標的とする領域の長さは、少なくとも5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30ヌクレオチドまたはそれ以上であることができる。核酸を標的とする領域（例えばスペーサー配列）の長さは、多くて5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30ヌクレオチドまたはそれ以上であることができる。
【０２８７】
いくつかの態様において、ガイド核酸（例えばスペーサー）の、核酸を標的とする領域は20ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は19ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は18ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は17ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は16ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は21ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、ガイド核酸の、核酸を標的とする領域は22ヌクレオチド長である。
【０２８８】
標的核酸のヌクレオチド配列（標的配列）に相補的なガイド核酸のヌクレオチド配列は、例えば少なくとも約12nt、少なくとも約15nt、少なくとも約18nt、少なくとも約19nt、少なくとも約20nt、少なくとも約25nt、少なくとも約30nt、少なくとも約35nt、または少なくとも約40ntの長さを有することができる。標的核酸のヌクレオチド配列（標的配列）に相補的なガイド核酸のヌクレオチド配列は、約12ヌクレオチド（nt）〜約80nt、約12nt〜約50nt、約12nt〜約45nt、約12nt〜約40nt、約12nt〜約35nt、約12nt〜約30nt、約12nt〜約25nt、約12nt〜約20nt、約12nt〜約19nt、約19nt〜約20nt、約19nt〜約25nt、約19nt〜約30nt、約19nt〜約35nt、約19nt〜約40nt、約19nt〜約45nt、約19nt〜約50nt、約19nt〜約60nt、約20nt〜約25nt、約20nt〜約30nt、約20nt〜約35nt、約20nt〜約40nt、約20nt〜約45nt、約20nt〜約50nt、または約20nt〜約60ntの長さを有することができる。
【０２８９】
プロトスペーサー配列は、関心対象の領域内のPAMを同定し、PAMの上流または下流にある望ましいサイズの領域をプロトスペーサーとして選択することによって、同定することができる。対応するスペーサー配列はプロトスペーサー領域の相補配列を決定することによって設計することができる。
【０２９０】
スペーサー配列はコンピュータプログラム（例えば機械可読コード）を使って同定することができる。コンピュータプログラムは、予測融解温度、二次構造形成、および予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％GC、ゲノムにおける出現の頻度、メチル化状態、SNPの存在などの変数を使用することができる。
【０２９１】
核酸を標的とする配列（例えばスペーサー配列）と標的核酸（例えばプロトスペーサー）との間の相補性パーセントは、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％であることができる。核酸を標的とする配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約20個の連続ヌクレオチドにわたって、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％であることができる。
【０２９２】
ガイド核酸のCasタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な2つのヌクレオチドストレッチ（例えばcrRNAおよびtracrRNA）を含むことができる。互いに相補的な2つのヌクレオチドストレッチ（例えばcrRNAおよびtracrRNA）は、介在ヌクレオチド（例えばシングルガイド核酸の場合はリンカー）によって共有結合で連結することができる。互いに相補的な2つのヌクレオチドストレッチ（例えばcrRNAおよびtracrRNA）はハイブリダイズすることで、Casタンパク質結合セグメントの二本鎖RNAデュプレックスまたはヘアピンを形成し、よってステム-ループ構造をもたらすことができる。crRNAとtracrRNAは、crRNAの3'端とtracrRNAの5'端とで、共有結合によって連結することができる。あるいは、tracrRNAとcrRNAを、tracrRNAの5'端とcrRNAの3'端とで、共有結合によって連結することもできる。
【０２９３】
ガイド核酸のCasタンパク質結合セグメントは、約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド、例えば約10ヌクレオチド（nt）〜約20nt、約20nt〜約30nt、約30nt〜約40nt、約40nt〜約50nt、約50nt〜約60nt、約60nt〜約70nt、約70nt〜約80nt、約80nt〜約90nt、または約90nt〜約100ntの長さを有することができる。例えばガイド核酸のCasタンパク質結合セグメントは、約15ヌクレオチド（nt）〜約80nt、約15nt〜約50nt、約15nt〜約40nt、約15nt〜約30ntまたは約15nt〜約25ntの長さを有することができる。
【０２９４】
ガイド核酸のCasタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスは、約6塩基対（bp）〜約50bpの長さを有することができる。例えばタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスは、約6bp〜約40bp、約6bp〜約30bp、約6bp〜約25bp、約6bp〜約20bp、約6bp〜約15bp、約8bp〜約40bp、約8bp〜約30bp、約8bp〜約25bp、約8bp〜約20bpまたは約8bp〜約15bpの長さを有することができる。例えばCasタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスは、約8bp〜約10bp、約10bp〜約15bp、約15bp〜約18bp、約18bp〜約20bp、約20bp〜約25bp、約25bp〜約30bp、約30bp〜約35bp、約35bp〜約40bp、または約40bp〜約50bpの長さを有することができる。いくつかの態様において、Casタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスは36塩基対の長さを有することができる。ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスを形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも約60％であることができる。例えば、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスを形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％であることができる。場合により、タンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスを形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、100％である。
【０２９５】
リンカー（例えばシングルガイド核酸中のcrRNAとtracrRNAとを連結するもの）は、約3ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さを有することができる。例えばリンカーは、約3ヌクレオチド（nt）〜約90nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約80nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約70nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約60nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約50nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約40nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約30nt、約3ヌクレオチド（nt）〜約20nt、または約3ヌクレオチド（nt）〜約10ntの長さを有することができる。例えばリンカーは、約3nt〜約5nt、約5nt〜約10nt、約10nt〜約15nt、約15nt〜約20nt、約20nt〜約25nt、約25nt〜約30nt、約30nt〜約35nt、約35nt〜約40nt、約40nt〜約50nt、約50nt〜約60nt、約60nt〜約70nt、約70nt〜約80nt、約80nt〜約90nt、または約90nt〜約100ntの長さを有することができる。いくつかの態様において、DNAを標的とするRNAのリンカーは4ntである。
【０２９６】
ガイド核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾されたまたは調節された安定性、細胞内標的指向、蛍光ラベルによる追跡、タンパク質またはタンパク質複合体のための結合部位など）を与える修飾または配列を含むことができる。そのような修飾の例として、例えば、5'キャップ（例えば7-メチルグアニル酸キャップ（m7G））、3'ポリアデニル化テール（すなわち3'ポリ(A)テール）、リボスイッチ配列（例えばタンパク質および/またはタンパク質複合体による調節された安定性および/または調節されたアクセシビリティを可能にするもの）、安定性制御配列、dsRNAデュプレックス（すなわちヘアピン）を形成する配列、細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）にRNAを標的指向させる修飾または配列、追跡を可能にする修飾または配列（例えば蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にするモエティへのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、DNAメチルトランスフェラーゼ、DNAデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびそれらの組合せを含む、DNAに作用するタンパク質）の結合部位を与える修飾または配列が挙げられる。
【０２９７】
ガイド核酸は、核酸に新しい特徴または強化された特徴（例えば改良された安定性）を与えるために、1つまたは複数の修飾（例えば塩基修飾、主鎖修飾）を含むことができる。ガイド核酸は核酸アフィニティータグを含むことができる。ヌクレオシドは塩基-糖の組合せであることができる。ヌクレオシドの塩基部分は複素環式塩基であることができる。そのような複素環式塩基のうち最も一般的な2種類の塩基がプリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸をさらに含むヌクレオシドであることができる。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の2'、3'、または5'ヒドロキシルモエティに連結されうる。ガイド核酸を形成させる際に、リン酸基は、隣接ヌクレオシドを互いに共有結合で連結して、線状ポリマー化合物を形成させることができる。次に、この線状ポリマー化合物のそれぞれの端をさらに接合して、環状の化合物を形成させることができる。ただし、一般的には、線状化合物が適切である。加えて、線状化合物は内部ヌクレオチド塩基相補性を有してもよく、したがって完全にまたは部分的に二本鎖の化合物が生成するように、折りたたまれうる。ガイド核酸内で、リン酸基は、一般に、ガイド核酸のヌクレオシド間主鎖を形成するということができる。ガイド核酸の連結部または主鎖は、3'→5'ホスホジエステル連結部であることができる。
【０２９８】
ガイド核酸は、修飾主鎖および/または修飾ヌクレオシド間連結部を含むことができる。修飾主鎖としては、主鎖中にリン原子を保っているもの、および主鎖中にリン原子を有しないものを挙げることができる。
【０２９９】
リン原子をそこに含有する適切な修飾ガイド核酸主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルその他のアルキルホスホネート、例えば3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、および通常の3'-5'連結部を有するボラノホスフェート、2'-5'連結類似体、および1つまたは複数のヌクレオチド間連結部が3'→3'、5'→5'または2'→2'連結部であって極性が反転しているものを挙げることができる。反転した極性を有する適切なガイド核酸は、最も3'端のヌクレオチド間連結部にある単一の3'→3'連結部（すなわち単一の反転ヌクレオシド残基であって、核酸塩基が欠けているか、その代わりにヒドロキシル基を有するもの）を含むことができる。さまざまな塩（例えば塩化カリウムまたは塩化ナトリウム）、混合塩、および遊離酸型も含めることができる。
【０３００】
ガイド核酸は、1つまたは複数のホスホロチオエートおよび/またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結部、特に-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-（すなわちメチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖）、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-O-N(CH3)-CH2-CH2-を含むことができる（ネイティブホスホジエステルヌクレオチド間連結部は-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-と表される）。
【０３０１】
ガイド核酸はモルホリノ主鎖構造を含むことができる。例えば核酸はリボース環の代わりに6員モルホリノ環を含むことができる。これらの態様のいくつかでは、ホスホジエステル連結部の代わりにホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結部が使用される。
【０３０２】
ガイド核酸は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結部、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結部、または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間連結部によって形成されるポリヌクレオチド主鎖を含むことができる。これらには、モルホリノ連結部（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの;シロキサン主鎖;スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖;ホルムアセチル（formacetyl）およびチオホルムアセチル（thioformacetyl）主鎖;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;リボアセチル（riboacetyl）主鎖;アルケン含有主鎖;スルファメート主鎖;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖;スルホネートおよびスルホンアミド主鎖;アミド主鎖;その他、混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有するものを含めることができる。
【０３０３】
ガイド核酸は核酸ミメティックを含むことができる。「ミメティック」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環とヌクレオチド間連結部の両方が、非フラノース基で置き換えられているポリヌクレオチドを包含するものとすることができ、フラノース環のみの置き換えは、糖代用物と呼ぶこともできる。複素環式塩基モエティまたは修飾複素環式塩基モエティは、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持しておくことができる。そのような核酸の一つとしてペプチド核酸（PNA）を挙げることができる。PNAでは、ポリヌクレオチドの糖主鎖を、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置き換えることができる。ヌクレオチドは保たれ、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。PNA化合物中の主鎖は、PNAにアミド含有主鎖を与える2つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位を含むことができる。複素環式塩基モエティは、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に、直接的または間接的に結合されうる。
【０３０４】
ガイド核酸は、モルホリノ環に取り付けられた複素環式塩基を有する、連結されたモルホリノ単位（すなわちモルホリノ核酸）を含むことができる。連結基は、モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を連結することができる。非イオン性のモルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞のタンパク質との望ましくない相互作用が少なくなりうる。モルホリノベースのポリヌクレオチドはガイド核酸の非イオン性ミメティックでありうる。モルホリノクラスに含まれるさまざまな化合物を異なる連結基を使って接合することができる。ポリヌクレオチドミメティックのさらなるクラスを、シクロヘキセニル核酸（CeNA）と呼ぶことができる。核酸分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置き換えることができる。ホスホラミダイトケミストリーを用いるオリゴマー化合物合成のために、CeNA DMT保護ホスホラミダイトモノマーを調製して、使用することができる。核酸鎖へのCeNAモノマーの組み入れは、DNA/RNAハイブリッドの安定性を増加させることができる。CeNAオリゴアデニル酸は、ネイティブ複合体と類似する安定性で、核酸相補体と複合体形成することができる。さらなる修飾として、2'-ヒドロキシル基が糖環の4'炭素原子に連結されることによって2'-C,4'-C-オキシメチレン連結部を形成し、よって二環式糖モエティを形成している、ロックト核酸（LNA）を挙げることができる。連結部は、2'酸素原子と4'炭素原子を架橋するメチレン（-CH2-）基であることができ、ここで、nは1または2である。LNAおよびLNA類似体は、相補的核酸との非常に高いデュプレックス熱安定性（Tm＝＋3〜＋10℃）、3'-エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解性を呈することができる。
【０３０５】
ガイド核酸は1つまたは複数の置換糖モエティを含むことができる。適切なポリヌクレオチドは、OH; F; O-、S-、もしくはN-アルキル; O-、S-、もしくはN-アルケニル; O-、S-もしくはN-アルキニル; またはO-アルキル-O-アルキルから選択される糖置換基を含むことができる（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または無置換C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルである）。特に適切なのは、O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON((CH2)nCH3)2である（ここで、nおよびmは1〜約10である）。糖置換基は、C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、ガイド核酸の薬物動態特性を改良するための基、またはガイド核酸の薬力学的性質を改良するための基、および同様の性質を有する他の置換基から選択することができる。適切な修飾として、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOE、すなわちアルコキシアルコキシ基としても公知である）を挙げることができる。さらなる適切な修飾として、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、2'-DMAOEとしても公知である）および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2'-DMAEOEとしても公知である）、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2を挙げることができる。
【０３０６】
他の適切な糖置換基として、メトキシ（-O-CH3）、アミノプロポキシ（--OCH2CH2CH2NH2）、アリル（-CH2-CH＝CH2）、-O-アリル（--O--CH2-CH＝CH2）およびフルオロ（F）を挙げることができる。2'-糖置換はアラビノ位（上向き）でもリボ位（下向き）でもよい。適切な2'-アラビノ修飾は2'-Fである。同様の修飾をオリゴマー化合物の他の位置にも、特に3'末ヌクレオシド上または2'-5'連結ヌクレオチド中の糖の3'位、および5'末ヌクレオチドの5'位にも加えうる。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチルモエティなどの糖ミメティックも有しうる。
【０３０７】
ガイド核酸は、核酸塩基（単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書にいう「無修飾」または「天然」核酸塩基として、プリン塩基（例えばアデニン（A）およびグアニン（G））、およびピリミジン塩基（例えばチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U））を挙げることができる。修飾核酸塩基としては、他の合成および天然核酸塩基、例えば5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニル（-C＝C-CH3）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、2-F-アデニン、2-アミノ-アデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンを挙げることができる。修飾核酸塩基として、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾオキサジン-2(3H)-オン）、フェノチアジンシチジン（1H-ピリミド(5,4-b)(1,4)ベンゾチアジン-2(3H)-オン）、G-クランプ（G-clamp）、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド(5,4-(b)(1,4)ベンゾオキサジン-2(3H)-オン）、カルバゾールシチジン（2H-ピリミド(4,5-b)インドール-2-オン）、ピリドインドールシチジン（H-ピリド(3',2':4,5)ピロロ(2,3-d)ピリミジン-2-オン）を挙げることができる。
【０３０８】
複素環式塩基モエティとして、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば7-デアザ-アデニン、7-デアザグアノシン、2-アミノピリジンおよび2-ピリドンで置き換えられているものを挙げることができる。核酸塩基は、ポリヌクレオチド化合物の結合アフィニティーを増加させるのに役立ちうる。これらは、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリン、例えば2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含みうる。5-メチルシトシン置換は、核酸デュプレックスの安定性を0.6〜1.2℃増加させることができ、（例えば2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせると）適切な塩基置換になりうる。
【０３０９】
ガイド核酸の修飾は、ガイド核酸の活性、細胞分布または細胞取り込みを強化することができる1つまたは複数のモエティまたはコンジュゲートをガイド核酸に化学的に連結する工程を含むことができる。これらのモエティまたはコンジュゲートとして、1級または2級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合で結合されるコンジュゲート基を挙げることができる。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を強化する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を強化することができる基を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。コンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。薬力学的性質を強化する基としては、取り込みを改良し、分解に対する耐性を強化し、かつ/または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強くする基が挙げられる。薬物動態特性を強化することができる基としては、核酸の取り込み、分布、代謝または排泄を改良する基が挙げられる。コンジュゲートモエティとしては、コレステロールモエティ、コール酸、チオエーテル（例えばヘキシル-S-トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチルモエティ、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロールモエティなどの脂質モエティを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
【０３１０】
修飾は、「タンパク質形質導入ドメイン」（Protein Transduction Domain）、すなわちPTD（つまり細胞透過性ペプチド（CPP））を含みうる。PTDは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、または小胞膜を横切ることを容易にする、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機化合物を指すことができる。PTDは、小さな極性分子から大きな高分子および/またはナノ粒子まで多岐にわたりうる別の分子に取り付けることができ、その分子が膜を横切るのを、例えば細胞外間隙から細胞内スペースに、またはサイトゾルから細胞小器官内に移動するのを、容易にすることができる。PTDはポリペプチドのアミノ末端に共有結合で連結することができる。PTDはポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合で連結することができる。PTDは核酸に共有結合で連結することができる。例示的なPTDとしては、最小ペプチドタンパク質導入ドメイン（minimal peptide protein transduction domain）;細胞への進入を支持するのに十分ないくつかのアルギニン（例えば3、4、5、6、7、8、9、10、または10〜50個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列、VP22ドメイン、ショウジョウバエ（Drosophila）アンテナペディアタンパク質導入ドメイン、トランケート型ヒトカルシトニンペプチド、ポリリジン、およびトランスポータン、3アルギニン残基〜50アルギニン残基のアルギニンホモポリマーを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。PTDは活性化可能な（activatable）CPP（ACPP）であることができる。ACPPとしては、正味の電荷をほとんどゼロまで低減することができそれによって細胞への接着と取り込みを阻害する対応ポリアニオン（例えばGlu9、すなわち「E9」）に切断可能なリンカーを介して接続された、ポリカチオン性CPP（例えばArg9、すなわち「R9」）を挙げることができる。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその固有の接着性が局所的に露わになり、よってACPPは膜を横切るように「活性化」される。
【０３１１】
ガイド核酸は任意の形態で提供することができる。例えばガイド核酸はRNAの形態で、2分子（例えば個別のcrRNAおよびtracrRNA）として、または1分子（例えばsgRNA）として、提供することができる。ガイド核酸はCasタンパク質との複合体の形態で提供することができる。ガイド核酸はRNAをコードするDNAの形態でも提供することができる。ガイド核酸をコードするDNAは、シングルガイド核酸（例えばsgRNA）または個別のRNA分子（例えば個別のcrRNAおよびtracrRNA）をコードすることができる。後者の場合、ガイド核酸をコードするDNAは、crRNAとtracrRNAをそれぞれコードする個別のDNA分子として提供することができる。
【０３１２】
ガイド核酸をコードするDNAは、細胞のゲノムに安定に組み込まれることができ、任意で、当該細胞において活性なプロモーターに機能的に連結することができる。ガイド核酸をコードするDNAは、発現コンストラクト中のプロモーターに機能的に連結することができる。
【０３１３】
ガイド核酸は任意の適切な方法によって調製することができる。例えばガイド核酸は、例えばT7 RNAポリメラーゼを使ったインビトロ転写によって、調製することができる。ガイド核酸は、化学合成によって調製される合成的に生産された分子であることもできる。
【０３１４】
ガイド核酸は安定性を増加させるための配列を含むことができる。例えば、ガイド核酸は転写ターミネーターセグメント（すなわち転写終結配列）を含むことができる。転写ターミネーターセグメントは、全部で、約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド、例えば約10ヌクレオチド（nt）〜約20nt、約20nt〜約30nt、約30nt〜約40nt、約40nt〜約50nt、約50nt〜約60nt、約60nt〜約70nt、約70nt〜約80nt、約80nt〜約90nt、または約90nt〜約100ntの長さを有することができる。例えば転写ターミネーターセグメントは、約15ヌクレオチド（nt）〜約80nt、約15nt〜約50nt、約15nt〜約40nt、約15nt〜約30ntまたは約15nt〜約25ntの長さを有することができる。転写終結配列は真核細胞中または原核細胞中で機能的であることができる。
【０３１５】
本願の諸局面のさまざまな態様では、複数のアクチュエータモエティが同じ細胞中で同時に使用される。いくつかの態様では、Casタンパク質を含むアクチュエータモエティを、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、ZFNを含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、TALENを含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、メガヌクレアーゼを含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、RNA結合タンパク質（RBP）を含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、CRISPR関連RNA結合タンパク質を含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、リコンビナーゼを含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、フリッパーゼを含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リ���ンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、トランスポザーゼを含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、またはアルゴノートタンパク質を含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。いくつかの態様では、アルゴノートタンパク質を含むアクチュエータモエティを、Casタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、メガヌクレアーゼ、RNA結合タンパク質（RBP）、CRISPR関連RNA結合タンパク質、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、またはトランスポザーゼを含む第2アクチュエータモエティと同時に使用することができる。
【０３１６】
本明細書における局面の様々な態様では、同じ標的DNA上または異なる標的DNA上の異なる場所における転写を同時に調整するために、複数のCRISPR/Cas複合体が同じ細胞中で同時に使用される。複数のCRISPR/Cas複合体は、単一供給源または単一タイプのCasタンパク質を、複数のガイド核酸と共に使用することで、異なる核酸を標的とすることができる。あるいは、複数のCRISPR/Cas複合体は、いくつもの核酸を標的とするために、オルソロガスCasタンパク質（例えば化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、S.サーモフィラス、L.イノキュア、および髄膜炎菌（N. meningitides）などの異なる生物からのデッドCas9タンパク質）を使用することができる。
【０３１７】
いくつかの態様では、同じ標的DNA上または異なる標的DNA上の異なる場所における転写を同時に調整するために、複数のガイド核酸を同じ細胞中で同時に使用することができる。いくつかの態様では、2つ以上のガイド核酸が、同じ遺伝子または転写物または座位を標的とする。いくつかの態様では、2つ以上のガイド核酸が、異なる無関係な座位を標的とする。いくつかの態様では、2つ以上のガイド核酸が、異なる座位ではあるが関連する座位を標的とする。
【０３１８】
2つ以上のガイド核酸は同じ発現ベクター上に同時に存在することができる。2つ以上のガイド核酸は同じ転写制御を受けることができる。いくつかの態様では、2つ以上（例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、10個以上、15個以上、20個以上、25個以上、30個以上、35個以上、40個以上、45個以上、または50個以上）のガイド核酸を、標的細胞中で同時に（同じベクターまたは異なるベクターから）発現させる。発現したガイド核酸は、デッドCasタンパク質（例えば化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、S.サーモフィラス、L.イノキュア、および髄膜炎菌（N. meningitides）などの異なる細菌からのdCas9タンパク質）によって、別々に認識されうる。
【０３１９】
複数のガイド核酸を発現させるために、エンドヌクレアーゼが媒介する人工的ガイド核酸プロセシングシステムを利用することができる（例えばガイドRNAをプロセシングするためにCsy4エンドリボヌクレアーゼを使用することができる）。例えば複数のガイドRNAを、（例えばU6プロモーターから発現される）前駆体転写産物上の、Csy4特異的RNA配列で分離されたタンデムアレイへと、コンカテマー化することができる。共発現させたCsy4タンパク質は、複数のガイドRNAへと前駆体転写産物を切断することができる。すべてのガイドRNAが1つの前駆体転写産物からプロセシングされるので、類似するdCas9結合が得られるように、それらの濃度を標準化することができる。
【０３２０】
本開示の方法および組成物と共に使用することができるプロモーターとして、例えば真核細胞、哺乳類細胞、非ヒト哺乳類細胞またはヒト細胞において活性なプロモーターが挙げられる。プロモーターは誘導性プロモーターまたは構成的に活性なプロモーターであることができる。上記に代えて、または上記に加えて、プロモーターは組織特異的または細胞特異的であることができる。
【０３２１】
適切な真核プロモーター（すなわち真核細胞中で機能するプロモーター）の非限定的な例として、サイトメガロウイルス（CMV）前初期、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスからの長末端反復（LTR）、ヒト伸長因子-1プロモーター（EF1）、ニワトリベータ-アクチンプロモーター（beta-active promoter）に融合されたサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサーを含むハイブリッドコンストラクト（CAG）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（MSCV）、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1座位プロモーター（PGK）およびマウスメタロチオネイン-Iからの真核プロモーターを挙げることができる。プロモーターは真菌プロモーターであることができる。プロモーターは植物プロモーターであることができる。植物プロモーターのデータベースを見いだすことができる（例えばPlantProm）。発現ベクターは翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含有しうる。発現ベクターは発現を増幅するための適当な配列も含みうる。
【０３２２】
本開示の組成物および分子(例えば、ポリペプチドおよび/またはポリペプチドをコードする核酸)を宿主細胞へ導入するために任意の適当な送達方法を用いることができる。組成物(例えば、アクチュエータモエティ、例えばCasタンパク質、融合物、またはキメラ; キメラ受容体; アダプター; ガイド核酸)は、同時にまたは時間的に離して送達することができる。遺伝子改変の方法の選択は、形質転換される細胞のタイプおよび/または形質転換が行われる状況(例えば、インビトロ、エクスビボまたはインビボ)に依存することができる。
【０３２３】
送達の方法は、本開示の組成物(例えば、Casタンパク質、Casキメラ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸のようなアクチュエータモエティ)をコードするヌクレオチド配列を含む1つもしくは複数の核酸を、標的ポリヌクレオチドに接触させる段階または細胞(もしくは細胞の集団)に導入する段階を伴うことができる。本開示の組成物をコードするヌクレオチド配列を含む適当な核酸は、発現ベクターを含むことができ、ここで本開示の1つまたは複数の組成物(例えば、Casタンパク質、Casキメラ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸のようなアクチュエータモエティ)をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、組換え発現ベクターである。
【０３２４】
送達方法または形質転換の非限定的な例としては、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、細胞透過性ペプチドの使用、およびナノ粒子媒介核酸送達が挙げられる。
【０３２５】
いくつかの局面において、本開示は、本明細書において記述される1つもしくは複数のポリヌクレオチド、または1つもしくは複数のオリゴヌクレオチド、または本明細書において記述されるベクター、またはその1つもしくは複数の転写産物、および/またはそれから転写された1つもしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達する段階を含む方法を提供する。いくつかの局面において、本開示は、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むまたはそのような細胞から産生される生物(動物、植物、または真菌のような)をさらに提供する。いくつかの態様において、Casタンパク質および/またはキメラ受容体および/またはアダプターはガイド配列と、組み合わされて、および任意で複合体形成されて、細胞に送達される。
【０３２６】
本明細書において開示されるポリペプチドのいずれか(例えば、受容体ポリペプチド、アダプターポリペプチド、Casタンパク質のようなアクチュエータモエティなど)をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化することができる。コドン最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図された宿主生物または細胞のコドン選好を模倣するために外来由来の(例えば、組換え) DNAの変異を伴うことができる。したがって、コドンは変更することができるが、コードされたタンパク質は変化しないままである。例えば、意図する標的細胞がヒト細胞である場合、適当なCasタンパク質を産生するためにヒトコドン最適化ポリヌクレオチドを用いることができよう。別の非限定的な例として、意図する宿主細胞がマウス細胞である場合、Casタンパク質をコードするマウスコドン最適化ポリヌクレオチドは、適当なCasタンパク質であることができよう。アクチュエータモエティ(例えば、Casタンパク質)のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、関心対象の多くの宿主細胞に対してコドン最適化することができる。宿主細胞は、任意の生物由来の細胞(例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー(Botryococcus braunii)、クラミドモナス・レインハルドティ(Chlamydomonas reinhardtii)、ナンノクロロプシス・ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)、クロレラ・ピレノイドサ(Chlorella pyrenoidosa)、ヤツマタモク(Sargassum patens C. Agardh)など、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、動物細胞、無脊椎動物(例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など)由来の細胞、脊椎動物(例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類)由来の細胞、哺乳類(例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど)由来の細胞などであることができる。場合によっては、コドン最適化が必要とされない場合もある。場合によっては、コドン最適化が好ましい場合がある。
【０３２７】
哺乳類細胞または哺乳類の標的組織に核酸を導入するには、従来のウイルスベースおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用することができる。そのような方法は、本開示の組成物をコードする核酸を、培養中の細胞または宿主細胞中の細胞に投与するために、使用することができる。非ウイルスベクター送達システムとしては、DNAプラスミド、RNA（例えば本明細書に記載するベクターの転写産物）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合体形成した核酸を挙げることができる。ウイルスベクター送達システムとしては、細胞への送達後に、エピソームゲノムを有するか、組み込まれたゲノムを有することができる、DNAウイルスおよびRNAウイルスを挙げることができる。
【０３２８】
核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック法、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、人工ビリオン、および作用物質によって強化された（agent-enhanced）DNAの取り込みを挙げることができる。ポリヌクレオチドの高効率受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質を使用することができる。送達は細胞（例えばインビトロまたはエクスビボ投与）または標的組織（例えばインビボ投与）への送達であることができる。免疫脂質（immunolipid）複合体などの標的リポソームを含む脂質:核酸複合体の調製を使用することができる。
【０３２９】
体内の特異的細胞を標的とし、ウイルスペイロードを細胞の核へと輸送するには、RNAウイルスまたはDNAウイルスに基づくシステムを使用することができる。ウイルスベクターを直接投与するか（インビボ）、インビトロで細胞を処理するためにウイルスベクターを使用することができ、修飾された細胞を任意で投与することができる（エクスビボ）。ウイルスに基づくシステムとしては、遺伝子移入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を使って行うことができ、これは挿入されたトランスジーンの長期発現をもたらしうる。多種多様な細胞タイプおよび標的組織において高い形質導入効率を観察することができる。
【０３３０】
レトロウイルスの細胞向性は、外来エンベロープタンパク質を組み入れて、標的細胞の潜在的標的集団を拡張することによって変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染して、高いウイルス価を生産することができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存しうる。レトロウイルスベクターは、最大6〜10kbの外来配列をパッケージングすることができるシス作用性長末端反復を含むことができる。最小シス作用性LTRは、ベクターの複製およびパッケージングにとって十分であることができ、標的細胞中に治療遺伝子を組み込んで永続的なトランスジーン発現を与えるために、使用することができる。レトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せに基づくものを挙げることができる。
【０３３１】
アデノウイルスに基づくシステムを使用することができる。アデノウイルスに基づくシステムはトランスジーンの一過性発現をもたらしうる。アデノウイルスに基づくベクターは細胞中で高い形質導入効率を有することができ、細胞分裂を必要としない。アデノウイルスに基づくベクターでは、高い力価および高い発現レベルを得ることができる。例えば核酸およびペプチドのインビトロ生産において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子治療法のために、アデノ随伴ウイルス（「AAV」）ベクターを使って、細胞を標的核酸で形質導入することができる。
【０３３２】
宿主細胞を感染させる能力を有するウイルス粒子を形成させるために、パッケージング細胞を使用することができる。そのような細胞として、293細胞（例えばアデノウイルスパッケージング用）およびPsi2細胞またはPA317細胞（例えばレトロウイルスパッケージング用）を挙げることができる。ウイルスベクターは、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を生産することによって生成させることができる。ベクターはパッケージングとその後の宿主への組込みに必要な最小ウイルス配列を含有することができる。ベクターは、発現させようとするポリヌクレオチドのための発現カセットで置き換えられる他のウイルス配列を含有することができる。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給することができる。例えばAAVベクターは、パッケージングと宿主ゲノムへの組込みに必要な、AAVゲノムからのITR配列を含むことができる。ウイルスDNAは、ITR配列を欠きつつも、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするヘルパープラスミドを含有することができる細胞株中で、パッケージングされうる。細胞株をヘルパーとしてのアデノウイルスで感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進することができる。アデノウイルスの混入は、熱処理（アデノウイルスはAAVよりも熱処理に対する感受性が高い）によって低減することができる。例えば参照により本明細書に組み入れられるUS20030087817に記載されているように、核酸を細胞に送達するためのさらなる方法を使用することができる。
【０３３３】
宿主細胞には、本明細書に記載する1つまたは複数のベクターを、一過性または非一過性にトランスフェクトすることができる。細胞には、それが対象中に天然に存在する状態で、トランスフェクションを行うことができる。細胞は、対象から採取したもの、または対象に由来するものであって、それにトランスフェクションを行うことができる。細胞は、対象から採取された細胞に由来するもの、例えば細胞株であることができる。いくつかの態様において、本明細書に記載する1つまたは複数のベクターをトランスフェクトされた細胞は、1つまたは複数のベクターに由来する配列を含む新しい細胞株を樹立するために使用される。いくつかの態様において、本開示の組成物を一過性に（例えば1つまたは複数のベクターの一過性トランスフェクションによって、またはRNAのトランスフェクションによって）トランスフェクトされ、CRISPR複合体などのアクチュエータモエティの活性によって修飾された細胞は、その修飾を含有するが他の外因性配列はすべて欠いている細胞を含む、新しい細胞株を樹立するために使用される。
【０３３４】
本開示の方法では宿主細胞と適合する任意の適切なベクターを使用することができる。真核宿主細胞用のベクターの非限定的な例として、pXT1、pSG5（Stratagene（商標））、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLSV40（Pharmacia（商標））が挙げられる。
【０３３５】
いくつかの態様において、ガイド核酸および/またはCasタンパク質もしくはCasキメラをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント（例えばプロモーターなどの転写制御エレメント）に機能的に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、または原核細胞（細菌細胞または古細菌細胞）のいずれかにおいて、機能的であることができる。いくつかの態様において、ガイド核酸および/またはCasタンパク質もしくはCasキメラをコードするヌクレオチド配列は、原核細胞および/または真核細胞におけるガイド核酸および/またはCasタンパク質もしくはCasキメラをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに、機能的に連結される。
【０３３６】
使用する宿主/ベクターシステムに依存して、発現ベクターには、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなど、いくつかある適切な転写および翻訳制御エレメントを、どれでも使用することができる（例えばU6プロモーター、H1プロモーターなど;上記参照）（例えばBitter et al.（1987）Methods in Enzymology, 153:516-544参照）。
【０３３７】
いくつかの態様において、本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、RNAとして提供することができる。そのような場合、本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、直接的化学合成によって生産するか、DNAからインビトロで転写することができる。本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、RNAポリメラーゼ酵素（例えばT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼなど）を使って、インビトロで合成することができる。ひとたび合成されたら、RNAは標的DNAと直接接触するか、核酸を細胞中に導入するための任意の適切な技法（例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクションなど）を使って、細胞中に導入することができる。
【０３３８】
ガイド核酸（DNAまたはRNAのどちらかとして導入されるもの）および/またはCasタンパク質もしくはCasキメラ（DNAまたはRNAとして導入されるもの）をコードするヌクレオチドは、適切なトランスフェクション技法を使って細胞に与えることができる。例えばAngel and Yanik（2010）PLoS ONE 5（7）: e11756、ならびにQiagen製の市販TransMessenger（登録商標）試薬、Stemgent製のStemfect（商標）RNAトランスフェクションキット、およびMirus Bio LLC製のTransIT（登録商標）-mRNAトランスフェクションキットを参照されたい。また、Beumer et al.（2008）「Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases」PNAS 105（50）:19821-19826も参照されたい。本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）をコードする核酸は、DNAベクターまたはオリゴヌクレオチドに載せて提供することができる。核酸を標的細胞中にトランスフェクトするのに有用な多くのベクター、例えばプラスミド、コスミド、ミニサークル、ファージ、ウイルスなどを利用することができる。核酸を含むベクターはエピソームとして、例えばプラスミド、ミニサークルDNA、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルスとして、維持されるか、相同組換えまたはランダム組込みによって、標的細胞ゲノムに組みこまれうる（例えばMMLV、HIV-1、およびALVなどのレトロウイルス由来ベクター）。
【０３３９】
Casタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、および/またはアダプターは、ポリペプチドとして細胞に与えることができる。そのようなタンパク質は、任意で、産物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合されていてもよい。このドメインは、明確なプロテアーゼ切断部位、例えばTEVプロテアーゼによって切断されるTEV配列を介して、ポリペプチドに連結することができる。リンカーは、1つまたは複数の可動性配列、例えば1〜10個のグリシン残基も含みうる。いくつかの態様において、融合タンパク質の切断は、産物の溶解度を維持する緩衝液中、例えば0.5〜2M尿素の存在下、溶解度を増加させるポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチドの存在下などで行われる。興味深いドメインとしては、エンドソーム溶解（endosomolytic）ドメイン、例えばインフルエンザHAドメイン、および生産に役立つ他のポリペプチド、例えばIF2ドメイン、GSTドメイン、GRPEドメインなどが挙げられる。ポリペプチドは安定性が改良されるように製剤化することができる。例えばペプチドをPEG化することができ、この場合、ポリエチレンオキシ基は血流中で強化された寿命をもたらす。
【０３４０】
本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、細胞による取り込みを促進するために、ポリペプチド浸透性ドメインに融合することができる。本開示の非組込みポリペプチドには、ペプチド、ペプチドミメティック、および非ペプチド担体を含むいくつかの浸透性ドメインを使用することができる。例えば浸透性ペプチドは、アミノ酸配列
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を含む、ペネトラチンと呼ばれるキイロショウジョウバエ転写因子アンテナペディア（Antennapaedia）の第3アルファヘリックスに由来しうる。別の例として、浸透性ペプチドは、例えば天然tatタンパク質のアミノ酸49〜57を含みうるHIV-1 tat塩基性領域アミノ酸配列を含むことができる。他の浸透性ドメインとして、ポリ-アルギニンモチーフ、例えばHIV-1 revタンパク質のアミノ酸34〜56の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンなどが挙げられる。（例えば、トランスロケーションペプチドおよびペプトイドの教示に関して本明細書に特に組み入れられる、Futaki et al.（2003）Curr Protein Pept Sci. 2003 April; 4（2）: 87-9および446;ならびにWender et al.（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97（24）:13003-8;米国特許出願公開第20030220334号、同第20030083256号、同第20030032593号、および同第20030022831号を参照されたい）。ノナアルギニン（R9）配列を使用することができる。（Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002）。融合を行う部位は、ポリペプチドの生物学的活性、分泌または結合特徴が最適化されるように選択することができる。
【０３４１】
本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、インビトロで、または真核細胞によって、もしくは原核細胞によって生産し、アンフォールディング、例えば熱変性、DTT還元などによってさらに処理し、さらに再フォールディングすることができる。
【０３４２】
本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、インビトロ合成によって調製することができる。例えばApplied Biosystems, Inc.、Beckmanなどによる自動シンセサイザーなど、さまざまな市販の合成装置を使用することができる。シンセサイザーを使用することにより、天然アミノ酸の代わりに非天然アミノ酸を使用することができる。調製の具体的な手順および方法は、利便性、経済性、要求される純度などによって決まりうる。
【０３４３】
本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、従来の組換え合成法に従って単離、精製することもできる。溶解物を発現宿主から調製し、溶解物をHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技法を使って精製することができる。組成物は、産物の調製方法およびその精製方法に関係する夾雑物に対して、例えば少なくとも20重量％の所望の産物、少なくとも約75重量％、少なくとも約95重量％、また治療用である場合は、例えば少なくとも約99.5重量％の産物を含むことができる。パーセンテージは総タンパク質量に基づくことができる。
【０３４４】
本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）は、核酸として導入されるかポリペプチドとして導入されるかを問わず、約30分〜約24時間、例えば1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、12時間、16時間、18時間、20時間、または約30分から約24時間までの他の任意の期間にわたって、細胞に与えることができ、それをほぼ毎日〜約4日ごと、例えば1.5日ごと、2日ごと、3日ごとの頻度、またはほぼ毎日から約4日ごとまでの他の任意の頻度で、繰り返すことができる。組成物は対象細胞に1回または複数回、例えば1回、2回、3回、または4回以上与えることができ、各接触イベントに続いて、細胞をある期間にわたって、例えば16〜24時間にわたって、作用物質と共にインキュベートしておき、その後、培地を新鮮培地で置き換えて、細胞をさらに培養することができる。
【０３４５】
2つ以上の異なる標的指向複合体（例えば、同じまたは異なる標的DNA内の異なる配列に相補的な2つの異なるガイド核酸）を細胞に与える場合、それらの複合体は同時に（例えば2つのポリペプチドおよび/または核酸として）与えるか、または同時に送達することができる。あるいは、例えばある標的指向複合体をまず与え、次に第2の複合体を与える、またはその逆など、それらを連続的に与えてもよい。
【０３４６】
有効量の本開示の組成物（例えばCasタンパク質またはCasキメラなどのアクチュエータモエティ、キメラ受容体、アダプター、ガイド核酸など）を、標的DNAまたは標的細胞に与えることができる。有効量とは、陰性対照、例えば空ベクターまたは無関係なポリペプチドと接触させた細胞と比較して、2つの相同配列間に観察される標的調節の量に、例えば少なくとも約2倍の変化（増加または減少）を誘導する量でありうる。有効量または有効用量は、標的遺伝子調節に、例えば約2倍の変化、約3倍の変化、約4倍の変化、約7倍、約8倍の増加、約10倍、約50倍、約100倍、約200倍、約500倍、約700倍、約1000倍、約5000倍、または約10000倍の変化を誘導することができる。標的遺伝子調節の量は、任意の適切な方法によって測定することができる。
【０３４７】
細胞と組成物との接触は、細胞の生存を増進する任意の培地中および任意の培養条件下で行うことができる。例えば、都合のよい任意の適当な栄養培地、例えばウシ胎児血清または熱非働化ヤギ血清（約5〜10％）、L-グルタミン、チオール、特に2-メルカプトエタノール、ならびに抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したイスコフ改変ダルベッコDMEMまたはRPMI1640に、細胞を懸濁することができる。培養物は、細胞が反応する成長因子を含有しうる。成長因子とは、本明細書における定義では、膜貫通受容体への特異的効果によって、培養細胞または無傷の組織中の細胞の生存、成長および/または分化を増進する能力を有する分子である。成長因子としてはポリペプチド因子および非ポリペプチド因子を挙げることができる。
【０３４８】
数多くの態様において、選ばれた送達システムは、特異的組織または特異的細胞タイプを標的とする。場合により、送達システムの組織標的指向または細胞標的指向は、送達システムを組織特異的マーカーまたは細胞特異的マーカーに結合させることによって達成される。ウイルス送達システムおよび非ウイルス送達システムは、関心対象の標的組織または標的細胞タイプに合わせてカスタマイズすることができる。
【０３４９】
本明細書に記載する分子を含有する薬学的組成物は、予防的処置および/または治療的処置のために投与することができる。治療的応用では、ある疾患または状態を患っている対象に、その疾患または状態の症状を治療するか、少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、またはその状態を治療し、治癒させ、改善し、もしくは寛解させるのに十分な量で、組成物を投与することができる。この用途にとって有効な量は、疾患の重症度および経過、治療歴、対象の健康状態、体重、および薬物に対する応答、ならびに治療医の判断に基づいて変動しうる。
【０３５０】
複数の治療剤は、任意の順序で、または同時に、投与することができる。同時である場合、複数の治療剤は、単一の統合された形態で与えるか、複数の形態で、例えば複数の個別の丸剤として投与することができる。分子は、単一のパッケージに、または複数のパッケージに、一緒にまたは別々に充填することができる。治療剤の1つまたは全部を複数回に分けて与えることができる。同時でない場合、複数回にわたる投与の間のタイミングは、さまざまであってよく、約1ヶ月に及びうる。
【０３５１】
本明細書に記載する分子は、ある疾患または状態の発生前、発生中、または発生後に投与することができ、ある化合物を含有する組成物を投与するタイミングは、さまざまであることができる。例えば薬学的組成物は予防薬として使用することができ、状態または疾患に冒されがちな対象に、その疾患または状態の発生を防止するために、継続して投与することができる。分子および薬学的組成物は、発症中に、または発症後可能な限りすぐに、対象に投与することができる。分子の投与は、発症後最初の48時間以内、発症後最初の24時間以内、発症後最初の6時間以内、発症後3時間以内に、開始することができる。初回の投与は、本明細書に記載する任意の製剤を使って、実用的な任意の経路、例えば本明細書に記載する任意の経路によることができる。分子は、疾患または状態の開始が検出されるか疑われた後、可能な限りすぐに、その疾患の処置に必要な期間にわたって、例えば約1ヶ月〜約3ヶ月にわたって、投与することができる。処置の長さは対象ごとに異なりうる。
【０３５２】
分子は生物学的コンパートメントにパッケージングすることができる。分子を含む生物学的コンパートメントは対象に投与することができる。生物学的コンパートメントとしては、ウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス）、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、微粒子、ナノカプセル、小胞、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルを挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
【０３５３】
例えば生物学的コンパートメントはリポソームを含むことができる。リポソームは、それぞれが反対向きの両親媒性脂質分子を含有する2つの単層を含むことができる1つまたは複数の脂質二重層を含む自己集合構造であることができる。両親媒性脂質は、1つまたは2つまたはそれ以上の非極性（疎水性）アシル鎖またはアルキル鎖に共有結合で連結された極性（親水性）ヘッドグループを含むことができる。疎水性アシル鎖と周囲の水性媒質との間のエネルギー的に不利な接触は、両親媒性脂質分子が、極性ヘッドグループを二重層の表面に向かって配向させ、アシル鎖を二重層の内部に向かって配向させることで、アシル鎖を水性環境との接触から効果的に遮蔽するように自身を配置させる誘因となる。
【０３５４】
リポソームに使用される好ましい両親媒性化合物の例としては、ホスホグリセリドおよびスフィンゴリピドを挙げることができ、それらの代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよび卵スフィンゴミエリン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０３５５】
生物学的コンパートメントはナノ粒子を含むことができる。ナノ粒子は、約40ナノメートル〜約1.5マイクロメートル、約50ナノメートル〜約1.2マイクロメートル、約60ナノメートル〜約1マイクロメートル、約70ナノメートル〜約800ナノメートル、約80ナノメートル〜約600ナノメートル、約90ナノメートル〜約400ナノメートル、約100ナノメートル〜約200ナノメートルの直径を含みうる。
【０３５６】
場合によっては、ナノ粒子のサイズが増加するに連れて放出速度は遅くなるか引き延ばされ、ナノ粒子のサイズが減少するに連れて、放出速度は増加しうる。
【０３５７】
ナノ粒子中のアルブミンの量は、約5％〜約85％アルブミン（v/v）、約10％〜約80％、約15％〜約80％、約20％〜約70％アルブミン（v/v）、約25％〜約60％、約30％〜約50％、または約35％〜約40％の範囲に及びうる。薬学的組成物は、最大で30、40、50、60、70もしくは80％またはそれ以上のナノ粒子を含むことができる。場合によっては本開示の核酸分子をナノ粒子の表面に結合させることができる。
【０３５８】
生物学的コンパートメントはウイルスを含むことができる。ウイルスは、本開示の薬学的組成物のための送達システムになりうる。例示的なウイルスとして、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスIまたはII、パルボウイルス、細網内皮症ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）を挙げることができる。本開示の薬学的組成物は、ウイルスを使って細胞に送達することができる。ウイルスは、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に感染し、形質導入することができる。エクスビボ送達およびインビトロ送達では、治療を必要とする対象に形質導入細胞を投与することができる。
【０３５９】
薬学的組成物はウイルス送達システムにパッケージングすることができる。例えば組成物は、HSV-1ヘルパーウイルスフリーパッケージングシステムによってビリオンにパッケージングすることができる。
【０３６０】
ウイルス送達システム（例えば本開示の薬学的組成物を含むウイルス）は、脳室内に直接注射、定位注射によって、ミニポンプ注入システムによって、対流、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内、および/または皮下注射によって、その必要がある対象の細胞、組織、または器官に投与することができる。場合によっては、細胞を、インビトロまたはエクスビボで、ウイルス送達システムを使って形質導入することができる。形質導入細胞は疾患を有する対象に投与することができる。例えば、薬学的組成物を含むウイルス送達システムで幹細胞に形質導入し、疾患を処置するために、その幹細胞を患者に移植することができる。場合により、対象に与えられる形質導入細胞の用量は、単回投与で、約1×105細胞/kg、約5×105細胞/kg、約1×106細胞/kg、約2×106細胞/kg、約3×106細胞/kg、約4×106細胞/kg、約5×106細胞/kg、約6×106細胞/kg、約7×106細胞/kg、約8×106細胞/kg、約9×106細胞/kg、約1×107細胞/kg、約5×107細胞/kg、約1×108細胞/kg、またはそれ以上であることができる。
【０３６１】
細胞への生物学的コンパートメントの導入は、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（PEI）媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、およびナノ粒子媒介核酸送達などによって行うことができる。
【０３６２】
本明細書に記載する分子（例えばポリペプチドおよび/または核酸）は、組成物中に、約1mg〜約2000mg;約5mg〜約1000mg、約10mg〜約25mg〜500mg、約50mg〜約250mg、約100mg〜約200mg、約1mg〜約50mg、約50mg〜約100mg、約100mg〜約150mg、約150mg〜約200mg、約200mg〜約250mg、約250mg〜約300mg、約300mg〜約350mg、約350mg〜約400mg、約400mg〜約450mg、約450mg〜約500mg、約500mg〜約550mg、約550mg〜約600mg、約600mg〜約650mg、約650mg〜約700mg、約700mg〜約750mg、約750mg〜約800mg、約800mg〜約850mg、約850mg〜約900mg、約900mg〜約950mg、または約950mg〜約1000mgの範囲で存在することができる。
【０３６３】
本明細書に記載する分子（例えばポリペプチドおよび/または核酸）は、組成物中に、約1mg、約2mg、約3mg、約4mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約125mg、約150mg、約175mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg、約1000mg、約1050mg、約1100mg、約1150mg、約1200mg、約1250mg、約1300mg、約1350mg、約1400mg、約1450mg、約1500mg、約1550mg、約1600mg、約1650mg、約1700mg、約1750mg、約1800mg、約1850mg、約1900mg、約1950mg、または約2000mgの量で存在することができる。
【０３６４】
本明細書に記載する分子（例えばポリペプチドおよび/または核酸）は、組成物中に、少なくとも0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、10単位またはそれ以上の活性/mg分子を与える量で存在することができる。活性は遺伝子発現の調節であることができる。いくつかの態様において、対象に送達される分子の活性の総単位数は、少なくとも25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、もしくは250,000単位またはそれ以上である。いくつかの態様において、対象に送達される分子の活性の総単位数は、多くて25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、もしくは250,000単位またはそれ以上である。
【０３６５】
いくつかの態様では、体重50kgあたりに標準化して、少なくとも約10,000単位の活性が対象に送達される。いくつかの態様では、体重50kgあたりに標準化して、少なくとも約10,000、15,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000、200,000、210,000、220,000、230,000、もしくは250,000単位またはそれ以上の活性の分子が、対象に送達される。いくつかの態様では、治療有効用量が、少なくとも5×105、1×106、2×106、3×106、4、106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、1.1×107、1.2×107、1.5×107、1.6×107、1.7×107、1.8×107、1.9×107、2×107、2.1×107、または3×107単位またはそれ以上の活性の分子を含む。いくつかの態様では、治療有効用量が、多くて5×105、1×106、2×106、3×106、4、106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、1.1×107、1.2×107、1.5×107、1.6×107、1.7×107、1.8×107、1.9×107、2×107、2.1×107、または3×107単位またはそれ以上の活性の分子を含む。
【０３６６】
いくつかの態様において、治療有効用量は、少なくとも約10,000、15,000、20,000、22,000、24,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、200,000、または500,000単位/kg体重である。いくつかの態様において、治療有効用量は、多くて約10,000、15,000、20,000、22,000、24,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、200,000、または500,000単位/kg体重である。
【０３６７】
いくつかの態様において、対象に送達される分子の活性は、少なくとも10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、30,000、32,000、34,000、35,000、36,000、37,000、40,000、45,000、もしくは50,000U/mg分子またはそれ以上である。いくつかの態様において、対象に送達される分子の活性は、多くて10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、30,000、32,000、34,000、35,000、36,000、37,000、40,000、45,000、もしくは50,000U/mg分子またはそれ以上である。
【０３６８】
本願の諸局面のさまざまな態様において、薬物動態データおよび薬力学データを得ることができる。そのようなデータを得るためにさまざまな実験技法を利用することができる。特定の組成物を記述する適当な薬物動態および薬力学プロファイル構成要素は、ヒト対象における薬物代謝の変動ゆえに変動しうる。薬物動態プロファイルおよび薬力学プロファイルは、一群の対象の平均パラメータの決定に基づきうる。対象の群は、代表的平均を決定するのに適した任意の妥当な数の対象、例えば5対象、10対象、15対象、20対象、25対象、30対象、35対象またはそれ以上の対象を含む。平均は、測定される各パラメータについて全対象測定値の平均を計算することによって決定することができる。本明細書に記載するように、所望の血中プロファイルまたは有効な血中プロファイルなどといった所望の薬物動態プロファイルまたは薬力学プロファイルが達成されるように、用量を調整することができる。
【０３６９】
薬物動態パラメータは、分子を記述するのに適した任意のパラメータであることができる。例えばCmaxは、例えば約25ng/mL以上、約50ng/mL以上、約75ng/mL以上、約100ng/mL以上、約200ng/mL以上、約300ng/mL以上、約400ng/mL以上、約500ng/mL以上、約600ng/mL以上、約700ng/mL以上、約800ng/mL以上、約900ng/mL以上、約1000ng/mL以上、約1250ng/mL以上、約1500ng/mL以上、約1750ng/mL以上、約2000ng/mL以上であるか、本明細書に記載する分子の薬物動態プロファイルを記述するのに適した他の任意のCmaxであることができる。
【０３７０】
本明細書に記載するTmaxは、例えば約0.5時間以下、約1時間以下、約1.5時間以下、約2時間以下、約2.5時間以下、約3時間以下、約3.5時間以下、約4時間以下、約4.5時間以下、約5時間以下であるか、本明細書に記載する分子の薬物動態プロファイルを記述するのに適した他の任意のTmaxであることができる。
【０３７１】
本明細書に記載する分子のAUC（0-inf）は、例えば約50ng・時間/mL以上、約100ng/時間/mL以上、約150ng/時間/mL以上、約200ng・時間/mL以上、約250ng/時間/mL以上、約300ng/時間/mL以上、約350ng/時間/mL以上、約400ng/時間/mL以上、約450ng/時間/mL以上、約500ng/時間/mL以上、約600ng/時間/mL以上、約700ng/時間/mL以上、約800ng/時間/mL以上、約900ng/時間/mL以上、約1000ng・時間/mL以上、約1250ng/時間/mL以上、約1500ng/時間/mL以上、約1750ng/時間/mL以上、約2000ng/時間/mL以上、約2500ng/時間/mL以上、約3000ng/時間/mL以上、約3500ng/時間/mL以上、約4000ng/時間/mL以上、約5000ng/時間/mL以上、約6000ng/時間/mL以上、約7000ng/時間/mL以上、約8000ng/時間/mL以上、約9000ng/時間/mL以上、約10,000ng/時間/mL以上であるか、本明細書に記載する分子の薬物動態プロファイルを記述するのに適した他の任意のAUC（0-inf）であることができる。
【０３７２】
投与の約1時間後の、本明細書に記載する分子の血漿中濃度は、例えば約25ng/mL以上、約50ng/mL以上、約75ng/mL以上、約100ng/mL以上、約150ng/mL以上、約200ng/mL以上、約300ng/mL以上、約400ng/mL以上、約500ng/mL以上、約600ng/mL以上、約700ng/mL以上、約800ng/mL以上、約900ng/mL以上、約1000ng/mL以上、約1200ng/mL以上であるか、本明細書に記載する分子の他の任意の血漿中濃度であることができる。
【０３７３】
薬力学パラメータは、本開示の薬学的組成物を記述するのに適した任意のパラメータであることができる。例えば薬力学プロファイルは、例えば約2時間、約4時間、約8時間、約12時間、または約24時間後に、炎症に関連する因子の減少を呈することができる。
【０３７４】
本願の諸局面のさまざまな態様では、本開示の方法が対象において行われる。対象はヒトであることができる。対象は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ）であることができる。対象は脊椎動物または無脊椎動物であることができる。対象は実験動物であることができる。対象は患者であることができる。対象は疾患を患っていてもよい。対象は疾患の症状を呈してもよい。対象は疾患の症状を呈さないが、それでも疾患を有しうる。対象は介護者の医療を受けていてもよい（例えば対象は入院して、医師の処置を受けている）。対象は植物または作物であることができる。
【実施例】
【０３７５】
以下の実施例は、本開示のさまざまな態様を説明する目的で与えられており、本開示を限定することを全く意味していない。本実施例は、本明細書において記述される方法とともに、目下、好ましい態様を代表するものであり、例示するものであって、本開示の範囲に対する限定と意図されるものではない。
【０３７６】
実施例1: ゲノム編集または転写調節を介して遺伝子発現を調整できるエフェクタータンパク質につながれた工学的に操作された組換えキメラ受容体
遺伝子調整ドメインを含む工学的に操作されたキメラ抗原受容体を図17に提供する。工学的に操作された人工組換え受容体は、細胞外ドメイン(ECD)、膜貫通ドメイン(TM)、およびICD (細胞内ドメイン)を線形の順序で含む。ECDは特異的リガンド結合活性を有する。TMは細胞膜にまたがり、ICDはゲノム操作機能を保有する。TMおよびICDはペプチドリンカー配列により連結され、ペプチド配列はプロテアーゼにより認識されることができる。受容体は細胞上に発現され、そのリガンドに結合することができる1701。リガンド結合に際して、プロテアーゼにつながれた(融合された)アダプタータンパク質は、タンパク質-タンパク質相互作用、クラスタ形成またはスキャフォールド媒介相互作用を介して受容体に動員される。アダプター−プロテアーゼが工学的に操作されたキメラ抗原受容体と結び付いた後に、プロテアーゼは受容体から遺伝子調整ドメインを放出する1705。次いで、遺伝子調整ドメインは、核に自由に移動して、標的遺伝子を調節または編集する1709。ICDは転写因子を含むことができ、遺伝子発現またはエピジェネティクス(Nu, 核)を調整することができる。
【０３７７】
受容体は、リンカーを介して遺伝子調整ドメインに融合することができる(図18)。リンカーは、工学的に操作された受容体の膜貫通ドメインと遺伝子調整ドメイン(細胞内アクチュエータドメイン)との間に位置することができる。リンカーは、1つもしくは複数の小胞体搬出シグナル、1つもしくは複数のペプチドリンカー配列、1つもしくは複数のペプチド折畳みドメイン、1つもしくは複数のプロテアーゼ切断ドメイン、1つもしくは複数の細胞局在化ドメイン、例えば、核局在化シグナルもしくはミトコンドリア局在化シグナル、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。場合によっては、リンカーの構成要素は任意の順序で配置することができる。
【０３７８】
工学的に操作されたキメラ抗原受容体は、細胞表面抗原に結合するようにデザインすることができる(図19A)。場合によっては、工学的に操作されたキメラ抗原受容体およびアダプター−プロテアーゼは、受容細胞の細胞表面上に位置し、リガンドはシグナル伝達細胞の表面上にある。受容体は、細胞の局所環境に位置する可溶性抗原に結合するように工学的に操作することができる(図19B)。あるいは、工学的に操作されたキメラ抗原受容体は、細胞外マトリックス(ECM)のリガンドまたはシグナル伝達分子に結合することができる(図19C)。他の態様において、工学的に操作されたキメラ抗原受容体は、細胞質プロテアーゼに連結された相互作用受容体と二量体化することができる(図19D)。他の例では、相互作用受容体はプロテアーゼにつながれず、リガンド結合受容体はアダプター−プロテアーゼポリペプチドを動員しうる(図19E)。さらに他の態様において、キメラ受容体は、同じ細胞上にある他の受容体(天然受容体、内因性受容体、または合成受容体)と複合体を形成する(図19F)。
【０３７９】
工学的に操作されたキメラ抗原受容体−遺伝子調整ドメインポリペプチドは、Notch、GPCR、インテグリン、カドヘリン、デスレセプター、およびキメラ抗原受容体のような受容体に基づくことができる(図20A)。これらのポリペプチドは、プレシニリン-プロテアーゼ、β2アレスチン-プロテアーゼ、パキシリン-プロテアーゼ、βカテニン-プロテアーゼまたはFADD-プロテアーゼのようなアダプター−プロテアーゼ融合タンパク質とともに発現させることができる。遺伝子調整ドメインがCas9またはdCas9のようなCRISPRタンパク質を含む場合、ドメインはガイドRNA (gRNA、例えばsgRNA)に結合することができる。プロテアーゼは、核に移動し、sgRNAと相補的なDNA配列に結合しうる遺伝子調整ドメイン-sgRNAを放出することができる(図20B)。DNA配列は、標的遺伝子の調整領域またはプロモーターに存在することができる。
【０３８０】
実施例2: GPCRS、インテグリンおよびNotchに基づく工学的に操作された組換えキメラ受容体
本実施例は、工学的に操作された組換えキメラ受容体システムの3つのクラスについて記述する。これらの受容体にはGタンパク質共役受容体(GPCR)、インテグリン、およびNotchが含まれ、これらはがん微小環境に関連するさまざまなタイプのリガンドおよびシグナルを自然に検出する。例えば、7回膜貫通ドメイン受容体、7TM受容体、ヘプタヘリックス受容体、セルペンチン受容体、およびGタンパク質結合受容体(GPLR)として知られるGPCRは、細胞外の分子を感知し、シグナル伝達経路および、最終的には、細胞内部の細胞応答を活性化する受容体の大きなタンパク質ファミリーを構成する。
【０３８１】
A1. dCas9を含む組換えキメラGPCR
Gタンパク質共役受容体は真核生物においてのみ見出される。これらの受容体に結合し活性化するリガンドは非常に多様であり、光感受性化合物、臭気、フェロモン、ホルモン、および神経伝達物質を含む。GPCRリガンドは、小分子からペプチドまで大型タンパク質までサイズが異なる。注目すべきことに、Gタンパク質共役受容体は多くの疾患に関与しており、現代の全医薬品のおよそ40%の標的でもある。Gタンパク質共役受容体を伴う天然の主要なシグナル伝達経路は、cAMPシグナル経路、またはホスファチジルイノシトールシグナル経路のいずれかを伴う、複雑なものでありうる。
【０３８２】
リガンドがGPCRに結合すると、それはGPCRのコンフォメーション変化を引き起こすことができ、これによって、それがグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)として作用することが可能になる。次いで、GPCRは、その結合したGDPをGTPと交換することによって、関連するGタンパク質を活性化することができる。Gタンパク質のαサブユニットは、結合したGTPとともに、βサブユニットおよびγサブユニットから解離して、αサブユニットタイプ(Gαs、Gαi/o、Gαq/11 、Gα12/13)に直接依存する細胞内シグナル伝達タンパク質または標的機能タンパク質にさらに影響を与えることができる。
【０３８３】
重要なことに、GPCRは、多種多様の生理学的過程に関与している。その生理学的役割のいくつかの例としては、視覚、味覚(味)、嗅覚、行動および気分調節、自律神経系伝達、および恒常性調整が挙げられる。多くのGPCRの中で、3つのクラスが免疫細胞媒介性がん治療に特に関連している。第1のクラスのGPCRは、免疫系の活性および炎症を調節することができる。例えば、ケモカインGPCR受容体は、免疫系の細胞間の細胞間コミュニケーションを媒介するリガンドに結合する。ヒスタミンGPCR受容体は、炎症性メディエータに結合し、炎症応答における標的細胞タイプに関与する。Toll様GPCR受容体(TLR)は、免疫調整に関与し、T細胞の免疫応答の抑制に直接関与しており、これは、がん細胞上のPDL-1がT細胞上のPD-1受容体との相互作用を介してT細胞を抑制しうるという最近の発見と密接に関連している。第2のクラスのGPCRは、細胞密度の感知を調整することができる。不十分な接触阻害は、侵襲性がん細胞の特徴である。がん細胞は、高密度のがんが増殖し、続いて免疫細胞の機能をブロックできるように、細胞密度のそれ自体による感知を工学的に操作できるという証拠がある。工学的に操作されたT細胞を用いて密度感知挙動を解読できることは、がん細胞の処置計画となろう。第3のクラスのGPCRは、いくつかのタイプの腫瘍の増殖および転移に関与する。
【０３８４】
がん微小環境のT細胞認識を増強できる合成GPCRを作製するために、C-X-Cケモカイン受容体タイプ4 (CXCR4)およびリゾホスファチジン酸受容体(LPAR)の2種類のGPCRを最初に試験した。CXCR4は、リンパ球に対して強力な走化性活性を有する分子である、間質由来因子-1 (SDF1、CXCL12とも呼ばれる)に特異的なα-ケモカイン受容体である。CXCR4発現は、多くの健常な組織では低いかまたは存在しないが、乳がん、卵巣がん、黒色腫、および前立腺がんを含む多くのタイプのがんでは高度に発現される。がん細胞におけるこの受容体の高発現は、CXCL12発現がCXCR4陽性細胞と正の相関を有するがん細胞におけるCXCL12の高濃度に関連している。LPARは、脂質シグナル伝達分子リゾホスファチジン酸(LPA)に結合する。細胞増殖を刺激するLPAの能力のため、異常なLPAシグナル伝達は、多くの方法でがんに関連している。例えば、オートタキシンまたはLPA受容体の調節不全は、発がんおよび転移に寄与しうる過剰増殖をもたらすことができる。
【０３８５】
本開示の合成GPCRは、GPCRのGタンパク質ドメインをdCas9アクチベータドメインで置換することにより作製することができる(図21A)。例えば、dCas9-VPR (VP64、p65AD、およびRtaを含む三要素アクチベータ融合物)は、TEV切断可能配列を介してGPCRに融合することができる2111。dCas9-VPRは、TEV切断後のdCas9-VPRの核局在化を増強するために、核局在化シグナル(NLS)の2つのコピーに融合することもできる。TEVプロテアーゼは、リガンド結合の際に条件付きでGPCRに動員されるタンパク質であるβ-アレスチンに融合することができる2121。図21に描かれる本開示の態様は、工学的に操作されたGPCR-dCas9アクチベータがT細胞上で発現され2111、卵巣がん2101のようながんを処置するために用いられうることを示す。LPA (GPCRリガンド)の細胞外濃度の増加は、工学的に操作されたLPAR1-dCas9 2131を活性化することができ、これが次いで、TEVプロテアーゼに融合したβ-アレスチン2121を動員する。プロテアーゼは、TEV特異的ペプチドを切断することによってdCas9を核に放出することができる。dCas9はまた、ガイドRNA、例えばプログラム可能なsgRNAと複合体を形成することもできる。核において、dCas9-sgRNAはIL-2のような遺伝子を活性化することができ2141、これが細胞死滅化を増強することができる2151。
【０３８６】
図23Aおよび23Bは、宿主細胞、例えばHEK293細胞におけるキメラCXCR4-dCas9-VPR-mCherry 2301の活性を試験する3つの独立した実験からの結果を示す。リガンド結合2311の後、β2-アレスチン-プロテアーゼを活性化受容体に動員し、プロテアーゼはdCas9-VPR-mCherryを受容体2321から放出した。β2-アレスチン-プロテアーゼの発現コンストラクトは、2351として示されている。レポーターコンストラクトは2341に示されている。各実験において、dCas9-VPRは、ルシフェラーゼ発現を特異的に活性化する単一のガイドRNA (sgRNA)と対合しており、ルシフェラーゼ発現が発光を生成する。この実験では、sgRNA-BFPを用いた2331。いくつかの実験において、scFv-mCherry-VPR 2305および/またはdCas9-10xGCN4 2307を対照として用いた。
【０３８７】
CXCR4-dCas9-VPR-mCherry 2361は、ドキシサイクリン(Dox)の添加およびコアクチベータの存在だけで組換え受容体の発現を誘発できるような、ドキシサイクリン誘導性プロモーター(TRE3G)から条件的に発現された。Doxなしでは、発光はない(図23B)。陽性対照として、「遊離」dCas9-VPR (これはCXCR4に融合していない)を添加し、予想通り、発光が生じた。Dox添加により、キメラCXCR4-dCas9が発現され、発光が検出された。図23Bは、発光がCXCR4リガンドCXCL12の濃度の増加に対して感受性であったことを示す。本明細書において記述されるキメラGPCR-dCas9タンパク質は、T細胞およびマクロファージのような免疫細胞において発現されることができる。また、走化性実験を実施して、CXCL12が、キメラGPCR-dCas9タンパク質を発現するT細胞に対する化学誘引物質として働きうるかどうかを判定することができる。
【０３８８】
CXCR4-dCas9-VPR-mCherryポリペプチドのアミノ酸配列の一例は、SEQ ID NO:3に提供されている。
【０３８９】
図23Cを参照して、sgRNA、β2-アレスチン-プロテアーゼ (「A」)およびLPAR1-dCas9-VPR (「B」)、CXCR4-dCas9-VPR (「C」)またはhM3D-dCas9-VPR (「D」)のいずれかを発現するHEK293T細胞において、リガンド(例えば、LPA、SDF1、またはCNO)の存在は、リガンドの非存在下と比較して、GFPレポータータンパク質のレベルの増加をもたらした(図23D)。それぞれのキメラ受容体へのリガンド結合は、受容体活性化およびアダプター−プロテアーゼ動員をもたらした。受容体に動員されたアダプター−プロテアーゼは、TEV切断部位で受容体からのdCas9-VPRの切断をもたらした。次いで、放出されたdCas9-VPRをsgRNAにより標的ポリヌクレオチドに対して標的指向させて、GFPレポーターの発現レベルを変化させた。
【０３９０】
A2. 切断モエティを含む組換えキメラGPCR受容体
代替的な構成において、本開示の合成GPCRは切断モエティを含み、アダプターポリペプチドはdCas9-エフェクタードメインを含む。例えば、図21Bに示されるように、dCas9-VPR (VP64、p65AD、およびRtaを含む三要素アクチベータ融合物) 2161は、TEV切断可能配列2181を介して、β2-アレスチンのような、アダプタータンパク質2171に融合することができる。β2-アレスチン-dCas9-VPRは、β2-アレスチン-dCas9-VPRの核外移行を増強するために、2コピーの核外移行シグナル(NES)を含むこともできる。TEVプロテアーゼ2191は、この構成において、GPCR 2100 (GPCR-プロテアーゼ)に融合することができる。β2-アレスチン-dCas9-VPRが活性化GPCR-プロテアーゼに動員されると、プロテアーゼはTEV-切断可能配列を切断し、β2-アレスチン-dCas9-VPRポリペプチドからdCas9-VPRを放出しうる。
【０３９１】
例えば、工学的に操作されたβ2-アレスチン-dCas9-VPRは、LPAR1 GPCRのような、合成GPCR-プロテアーゼで発現されることができる。LPA (GPCRリガンド)の細胞外濃度の増加は、工学的に操作されたLPAR1-プロテアーゼを活性化することができ、これによって次に、β2-アレスチン-dCas9-VPRが動員される。プロテアーゼは、TEV切断可能なペプチドを切断することによってdCas9を核に放出することができる。dCas9はまた、ガイドRNA、例えばプログラム可能なsgRNAと複合体を形成することもできる。核において、dCas9-sgRNAは、蛍光レポーター遺伝子のような、遺伝子を活性化することができる。
【０３９２】
別の例として、工学的に操作されたβ2-アレスチン-dCas9-VPRは、CXCR4 GPCRのような、合成GPCR-プロテアーゼで発現されることができる。SDF1 (GPCRリガンド)の細胞外濃度の増加は、工学的に操作されたCXCR4-プロテアーゼを活性化することができ、これによって次に、β2-アレスチン-dCas9-VPRが動員される。プロテアーゼは、TEV切断可能なペプチドを切断することによってdCas9を核に放出することができる。dCas9はまた、ガイドRNA、例えばプログラム可能なsgRNAと複合体を形成することもできる。核において、dCas9-sgRNAは、蛍光レポーター遺伝子のような、遺伝子を活性化することができる。
【０３９３】
別の例として、工学的に操作されたβ2-アレスチン-dCas9-VPRは、hM3D (hM3 GPCRのDREADDバージョン)のような、合成GPCR-プロテアーゼで発現させることができる。クロザピン-N-オキシド(CNO、GPCRリガンド)の細胞外濃度の増加は、工学的に操作されたhM3D-プロテアーゼを活性化することができ、これによって次に、β2-アレスチン-dCas9-VPRが動員される。プロテアーゼは、TEV切断可能なペプチドを切断することによってdCas9を核に放出することができる。dCas9はまた、ガイドRNA、例えばプログラム可能なsgRNAと複合体を形成することもできる。核において、dCas9-sgRNAは、蛍光レポーター遺伝子のような、遺伝子を活性化することができる。
【０３９４】
図23Eおよび23Fを参照して、リガンド(CNO)の存在下でのhM3D-プロテアーゼ(図23E、「A」) + β2-アレスチン-dCas9-VPR (図23E、「C」) + sgRNA (GFPレポーター遺伝子のTRE3Gプロモーターを標的とするsgTET)のGFPレポーターレベルは、hM3D-プロテアーゼ(図23E、「A」) + dCas9-VPR (図23E、「E」) + sgRNA (図23F、「D」と比較した「A+B+CNO」)のGFPレポーターレベルに匹敵する。陽性対照として、hM3D-プロテアーゼ(図23E、「A」) + β2-アレスチン-TetR-VPR (図23E、「B」) + sgRNA (リガンドCNOの存在下)のGFPレポーターレベルは、hM3D-プロテアーゼ(図23E、「A」) + TetR-VPR (図23E、「D」) + sgRNA (図23F、「E」と比較した「A+C+CNO」)のGFPレポーターレベルに匹敵する。(TetRはレポーター遺伝子のプロモーターに直接結合する)。hM3D-プロテアーゼへのリガンド(CNO)結合は、受容体活性化およびアダプター-dCas9-VPR動員をもたらした。活性化された受容体へのβ2-アレスチン-dCas9-VPRの動員は、TEV切断部位でアダプターからのdCas9-VPRの切断をもたらした。次いで、放出されたdCas9-VPRをsgRNAにより標的ポリヌクレオチドに標的指向させて、GFPレポーターの発現レベルを変化させた。
【０３９５】
B. dCas9-エフェクタードメインを含む組換えキメラインテグリン
dCas9-エフェクタードメイン、例えば、dCas9-アクチベータドメインに融合された工学的に操作されたインテグリンも本明細書において提供される(図22A)。異なる対のαサブユニットおよびβサブユニットを含むインテグリンは、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどのような多様なマトリックスシグナルを感知することができる。dCas9-VPR-mCherryは、TEV切断可能なペプチドリンカー配列を介して、任意のインテグリン、例えば、α5β1インテグリンのαサブユニットまたはβサブユニットのいずれかに融合された2201。TEVプロテアーゼは、リガンド結合によって対合インテグリンに条件的に動員されたタンパク質であるパキシリンに連結された2221。レポーター遺伝子に結合できるsgRNAを宿主細胞に導入した2231。さらに、転写レポーター遺伝子(H2B-GFP遺伝子)を導入して、sgRNAガイドdCas9-VPR制御活性化を視覚化した2241。受容体発現対照として、scFv、mCherryおよびVPRに連結されたインテグリンを用いた2211。実験において用いられた他の対照には、dCas9-10xGCN4対照が含まれる2251。図22Bに示されるように、リガンドなしの、βサブユニットに連結されたdCas9-アクチベータドメイン(図22D、「B」)は、最小のGFPシグナルをもたらした(GFPのゲノムコピーをレポーターシグナルとして用い核へのdCas9-VPRの「放出された」量を検出する)。フィブロネクチンの存在下において、高いGFP発現が検出され、キメラインテグリン-dCas9タンパク質がリガンド結合の際に転写を活性化することが示唆された。コラーゲンの存在下において、キメラインテグリン-dCas9タンパク質はレポーター遺伝子の転写を活性化しなかった。リガンド結合によるインテグリンの活性化に加えて、表面結合によるインテグリン活性化はまた、dCas-9VPRの放出およびGFP発現をもたらす。インテグリン-dCas9-VPR + パキシリン-プロテアーゼ + sgRNAシステムは、接着細胞において発現されると、浮遊培養物と比較して高いレベルの蛍光レポータータンパク質を生じる(図22C)。dCas9-VPRがαサブユニットに連結されている場合(図22D、「C」)、パキシリンはβ-インテグリン尾部に特異的に結合するので、インテグリンの活性化はβサブユニットに連結されたdCas9-VPR (図22E、「A+B」)と比較してGFPの最小発現をもたらす(図22E、「A+C」)。
【０３９６】
インテグリンβ1-dCas9-VPR-mCherryポリペプチドのアミノ酸配列の一例は、SEQ ID NO:4に提供されている。
【０３９７】
C. dCas9-エフェクタードメインを含む組換えキメラNotch
dCas9-アクチベータドメインを含むキメラNotch受容体も提供される(図24A〜24D)。1つの態様において、NotchはTEVペプチド切断配列リンカーなしでdCas9-アクチベータに直接融合された。第2の態様において、NotchはTEVペプチド切断配列を介してdCas9-アクチベータに直接融合された。TEVプロテアーゼはNotchアダプタータンパク質であるプレセニリン-1 (PS-1)に連結された。プレセニリン1は、γセクレターゼを含めて、細胞内のいくつかのタンパク質の、調節されたタンパク質分解事象を媒介する、プレセニリン複合体中の4つのコアタンパク質の1つである。各キメラ受容体の発現コンストラクトを作製し、HEK293細胞のような、宿主細胞に導入した。Notch-dCas9-VPR-mCherryポリペプチドのアミノ酸配列の一例は、SEQ ID NO:5に提供されている。
【０３９８】
実施例3: ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質に融合した工学的に操作されたキメラNotch受容体を用いた遺伝子調節の制御
本実施例は、細胞療法に対する新規のアプローチ、すなわち病的な微小環境を認識でき、正確な治療作用で応答できる改変された免疫細胞の作製について記述する。患者の免疫細胞は、特定の細胞および細胞の局所環境を感知し、それに応答しうる本来的に複雑なシステムを利用するので、これらの治療法のために有望な試薬である。
【０３９９】
遺伝子編集のためにヌクレアーゼCas9を用いることとは異なり、ヌクレアーゼ欠損Cas9 (dCas9)タンパク質は、ゲノム配列を遺伝的に改変することなしに、転写活性化または抑制のために用いることができる。低分子ガイドRNA (sgRNA)と対合するdCas9タンパク質は、相補的配列を含む遺伝子を認識かつ調節することができる。転写アクチベータまたはリプレッサにカップリングすることにより、このシステムは、遺伝子の正確な制御のための高度にプログラム可能なアプローチを供与することができる。dCas9は、細胞活動を調整するための強力なアプローチを供与するが、外部シグナルまたは環境シグナルのような、シグナルを感知する能力を欠いている。
【０４００】
細胞シグナル伝達経路は、その基礎となる同族シグナル伝達成分を置き換え、組換えることによって、非同族シグナルに応答するように再配線できる重要な分子であることが示されている。特に、Notch-Deltaシグナル伝達経路は、その単純な作用機序、迅速な動態、ならびに免疫細胞系列調節およびがん進行における重要な役割のために、合成による再配線のために特に魅力的である。NotchおよびDeltaは、後生動物において1回膜貫通タンパク質ファミリーである。それらの相互作用はNotch細胞内ドメイン(NICD)のタンパク質分解放出をもたらし、これが核へ移動し、標的遺伝子を活性化する。Notch経路の代替遺伝子を活性化するために合成転写因子(GAL4-AD)とNICDを置き換えることによって、または特定の受容体抗原に対する認識モチーフとNotch細胞外ドメイン(NECD)を置き換えることによってNotch分子を改変するためにタンパク質工学的アプローチが適用されている。
【０４０１】
A. CD47誘発CRISPR媒介性転写調節のためのモジュールキメラ人工Notch受容体の工学的操作
本実施例は、NotchおよびCRISPR/Casタンパク質を組み合わせて、標的細胞認識(Notchを介した)およびプログラム細胞応答(CRISPR/dCas9を介した)のためのカスタマイズ可能な直交シグナル伝達系を生成するキメラ受容体について記述する。接触媒介Notch-Deltaシグナル伝達およびRNAガイドCRISPRゲノム工学を利用する高度にプログラム可能ながん認識プラットフォームが本明細書において提供される。これらのキメラNotch受容体(図24A〜24C)は、NotchのNICDをCas9構成要素で置換することにより、任意の標的遺伝子を活性化するように用いることができる。Notch-Deltaの相互作用により、広範囲の複雑な細胞挙動を制御することができる。本明細書において記述されるキメラ抗原受容体は、局所細胞-細胞微小環境に応答してT細胞の転写および細胞活性を調整するために用いることができる。
【０４０２】
CD47誘発CRISPR媒介性転写調節のためのモジュールキメラ人工Notch受容体を産生することができる。野生型Notch受容体は、細胞外ドメイン(NECD)と細胞内ドメイン(NICD)の2つのモジュールを含む。キメラ人工Notch受容体(caN)を作製するために、NICDドメインを、転写アクチベータまたはリプレッサに融合されたdCas9 (また可視化のため、青色蛍光タンパク質BFPと融合された)と置き換えることができる。例えば、dCas9は、VP64またはVPRのアクチベータドメインと融合することができる。dCas9融合物は、Notch-Delta相互作用の際に核へ移動することができる(図24B)。キメラ人工Notch受容体をコードするコンストラクトを、細胞に形質転換することができる。NICDとしてのdCas9融合物の核移動を試験するために、GAL4 UAS-GFPレポーターコンストラクトを標的とするsgRNAを同時発現させることができる。Deltaを発現する別の細胞株との共培養により、dCas9-VP64-BFP蛍光および形質膜から核への移動によって、Notch-Deltaトランス活性化を経時的にモニターすることができる。
【０４０３】
NotchのNECDは、29〜36個のタンデム上皮成長因子(EGF)様リピートを含み、そのうちEGFリピート11〜12はDeltaとの産生的相互作用を促進する。非標準的な感知のため、NECDの選択領域は、同族の一本鎖可変フラグメント(scFv)で置き換えることができる。EGFリピートのさまざまな領域は、ヒトCD47 (hCD47)に対するscFvであるMABLで置き換えることができる。最小アクチベータGAL4esnをECDに連結して、受容体融合の転写活性を測定することができる。具体的には、hCD47を発現する細胞との共培養時にUAS-GFPレポーター発現を用いるMABL(ECD)-GAL4esnバリアントを用いることができる(図24C)。Notchキメラ抗原受容体は、受容体がDeltaまたはその所望のリガンドに結合した後にプレシニリン-TEVプロテアーゼを動員することができる。
【０４０４】
新規のCD47結合scFv-Notch受容体を作製するために、NICDおよびNECDモジュールを組み合わせることができる。予想される組み合わせ効果は、hCD47がCD47scFv-Notch-dCas9受容体を活性化し、sgRNAによりガイドされてレポーター発現を活性化できるdCas9-VP64の切断および核移動をもたらすというものである。バリアントは、dCas9バリアントおよび異なるsgRNAを用いることにより作製することができる。キメラ受容体は、CHO、HEK293、およびJurkatのような細胞株にトランスフェクトすることができる。
【０４０５】
図24A〜24Cに存在するNotch-dCas9-アクチベータを、活性および機能についてHEK293細胞（図24E)、T細胞（Jurkat細胞; 図24F)およびマクロファージ（THP-1; 図24G)において試験した。実験では、Notch-dCas9-アクチベータを各細胞株において発現させた。Delta-Notch相互作用の際に、蛍光レポーター発現がゲノムから活性化された。組換え細胞がDeltaに曝露された場合に細胞は高レベルのレポータータンパク質発現を示し、そうでない場合には低発現を示した。結果から、人工キメラ受容体が免疫細胞において完全に機能的であることが示される。細胞増殖の活性化でのこのような受容体の使用を試験するために、細胞アポトーシス遺伝子(カスパーゼ8 (CASP8))または細胞周期遺伝子(サイクリンD1 (CCND1)およびサイクリン依存性キナーゼ阻害因子1B (CDKN1B))に特異的な短いガイドRNAを、キメラ受容体とともに宿主細胞に導入した。結果は図26A〜26Dに提供されている。
【０４０６】
別の実験では、Notch-dCas9-アクチベータを、蛍光レポーター遺伝子のプロモーターに近い上流活性化配列(UAS)に結合できるガイドRNA (sgUAS; SEQ ID NO:1; gtactccgacctctagtgt)とともに細胞中で発現させた(図27A)。キメラ人工Notch受容体は、野生型NotchのECMおよびTMドメイン、ヌクレアーゼ-デッドCas9 (dCas)、ならびにVP64、p65およびRtaタンパク質(VPR)からなる三要素エフェクタードメインを含んでいた。Notchに結合するリガンドであるDeltaは、表面に固定化され、または別の細胞によって提示されることができる。Notch-Delta結合は、dCas9-VPRの切断および核への移動をもたらす。dCas9およびUAS調節因子エレメント(プロモーター)を標的とする単一ガイドRNA (sgUAS)は、蛍光シトリンタグ付きのヒストン-2B (H2B)の発現をもたらす。図27Bは、図27Aの細胞のフローサイトメトリーによる単一細胞蛍光を示す。Deltaを含まない表面上で培養された細胞と比較して、Delta被覆された表面上で培養された細胞において、H2B-シトリンの過剰発現が検出された。
【０４０７】
B. コンピュータシミュレーションおよびインビトロでのシグナル応答機能を形作るパラメータを含むキメラ抗原Notch受容体(caN)挙動の特徴付け
Notch-Delta活性化の単純さにより、シグナル応答の同調が可能とされる。数学的モデリングおよび実験は、NotchとDeltaの間の相互cis阻害が内因性Notchと合成Notchの両方が存在する場合の応答機能にどのように影響するかを調べることができる。これは、さまざまな強度のプロモーターを用いて同じ細胞内でcaN-dCas9-EGFPおよびDelta-mCherryの両方を発現させることによって行うことができる。
【０４０８】
どのようにcaNが細胞応答(例えば、貪食活性, P)を外部シグナル(例えば、DeltaまたはCD47)に再形成するかを研究するために、考慮すべき1つの状況には受容細胞における内因性Notch (図25A〜25CにおけるR)およびシグナル伝達細胞におけるDelta (図25A〜25CにおけるDT)が受容細胞のP応答の抑制をもたらすことが含まれる(図25A〜図25C)。普遍性を失うことなく、簡単にするために同様の速度定数を仮定することができる。このモデルは定常状態でのDTの増加とともにPが双曲線的に減少することを示すことができる。RによるPの内因性抑制より強い協同係数(ηR、抑制性ドメインを有するdCas9によって調整される重要なパラメータ)で内因性Notch(R)発現を抑制するcaN-dCas9受容体(N, 受容細胞中)の添加により、DTレベルの増加とともに出力を二相性応答に再配線することができる(図25B)。最後に、(Rとではなく) Nとの結合時にDTと競合するcis-Delta阻害(DC)のさらなる積み重ねは、DTに応答してP-応答が抑制から活性化にシフトする閾値を決定付ける別の重要なパラメータである(図25C)。
【０４０９】
コンピュータシミュレーションで同定された重要なパラメータは、インビトロ実験を用いて最適化することができる。特に、さまざまな受容体成分(図25A〜25CのDC、DT、RおよびN)の発現レベルは、既知の強さを有する構成的プロモーターコンストラクトを適用することによって調整することができる。さまざまなdCas9エフェクターを選択して、抑圧力を調整することができる。受容体-dCas9-エフェクターバリアントの活性化および抑制的強度は、特異的な内因性遺伝子を調節する既知の有効なsgRNAを用いて試験することができる。この方法はまた、最小限のオフターゲット効果でRの修飾を可能にする。
【０４１０】
C. 高CD47がん細胞に対する貪食応答を活性化するCD47結合caN-dCas9受容体でのマクロファージの工学的操作
本明細書において記述されるCD47結合キメラ抗原Notch受容体-dCas9融合タンパク質は、がんの進行および免疫回避のような、がんの分野において用いることができる。CD47結合caN-dCas9受容体が、がんにおける免疫回避を媒介または調節する有効性を試験するために、以前に記述されたCD47scFv-Notch-dCas9受容体をTHP-1由来マクロファージにおいて発現させることができる。ヒトCD47をCHO細胞において発現させることができる。SIRPα(内因性応答)、マクロファージ上のcaN-dCas9、および標的CHO細胞上のhCD47の表面発現のフローサイトメトリー分析を実施して、これらの細胞の理論モデルを反復様式で定式化および検証することができる。
【０４１１】
自然または天然のマクロファージ貪食応答がキメラ抗原Notch受容体で再形成されるかどうかを試験するために、SIRPαに対するsgRNA有りまたは無しで形質導入されたcaN-dCas9をコードするTHP-1マクロファージの貪食挙動の比較を行うことができる。適切な強度のsgSIRPAおよびdCas9リプレッサを反復モデルに情報を提供するようにデザインすることができる。工学的に操作されたマクロファージは、低、中、または高レベルのhCD47 (標的細胞DT)を発現する腺がんヒト上皮細胞株(A549)で攻撃することができる。CD47結合caN-dCas9融合タンパク質のデザインは、CD47低およびCD47高A549細胞が工学的に操作されたマクロファージによって貪食され、一方ではCD47低細胞が非sgSIRPA含有マクロファージによって貪食されるように最適化することができる。
【０４１２】
本実施例は、NotchおよびdCas9ドメインを含む合理的に工学的操作されたキメラ受容体のような、がん免疫療法のための新しい受容体を提供する。受容体は、がん特異的受容体レベルを感知することによって、免疫細胞のプログラム可能な転写制御を可能にする。
【０４１３】
実施例4: ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質に融合した工学的に操作されたキメラGPCR受容体を用いた遺伝子調節の制御
キメラ人工GPCR受容体は、AVPR2 (27アミノ酸残基)に由来するC末β2-アレスチン結合部位を有する完全長GPCR、プロテアーゼ切断部位、および三要素エフェクタードメイン(VPR)を有するヌクレアーゼ-デッドCas9 (dCas)を含むように産生された(図28A)。キメラβ2-アレスチン-プロテアーゼは、リガンド媒介性GPCR活性化時にプロテアーゼ切断部位を認識かつ切断する。dCas9-VPRは、tetOプロモーターを特異的に標的とする単一ガイドRNA (sgTet, SEQ ID NO:2; gtacgttctctatcactgata)とともに核へ移動し、レポータールシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現につながる。dCas9-VPR、CXCR4、またはキメラCXCR4-dCas9-VPRをコードする以下の発現コンストラクトの1つを、tetO駆動ルシフェラーゼ遺伝子およびβ2-アレスチン-プロテアーゼコンストラクトを安定に発現するHEK293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、さまざまな濃度にて18時間CXCL12 (CXCR4のリガンド)で処理した。ルシフェラーゼ発現の程度を測定するために、ルシフェラーゼによって切断された場合に、発光シグナルが放出され検出可能であるように、ルシフェリンが導入された(図28B)。
【０４１４】
実施例5: ヌクレアーゼ欠損Cas9タンパク質に融合した工学的に操作されたキメラインテグリン受容体を用いた遺伝子調節の制御
キメラ人工インテグリン受容体は、完全長β1-インテグリン、プロテアーゼ切断部位、および三要素エフェクタードメイン(VPR)を有するヌクレアーゼ-デッドCas9 (dCas)を含むように産生することができる(図29A)。αβ-インテグリン二量体に結合する細胞外マトリックスは、表面上に固定化され、または別の細胞により提示されることができる。インテグリン活性化は、β-インテグリンのC末へのキメラパキシリン-プロテアーゼの結合、プロテアーゼ切断部位の切断、およびdCas9-VPRの核への移動をもたらす。パキシリンは、β-インテグリンのHDRKモチーフを認識する。dCas9および上流活性化配列(UAS)プロモーターを標的とする単一ガイドRNA, sgUAS (SEQ ID NO:1; gtactccgacctctagtgt)は、レポーター遺伝子、例えば蛍光シトリンタグ付きのヒストン2Bをコードする遺伝子の発現を活性化することができる。UAS駆動H2B-シトリン遺伝子およびパキシリン-プロテアーゼコンストラクトの両方を安定に発現するHEK293細胞に、キメラβ1-インテグリン-dCas9-VPRおよびα-インテグリンをコードする発現コンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をECM被覆表面上で培養した。フローサイトメトリーデータは、ECMによって接触されなかった細胞と比較して、ECM表面によって接触された細胞がH2B-シトリンを過剰発現したことを示す(図29B)。
【０４１５】
実施例6: プログラム可能な機能に向けたロジック、カスケード、およびネットワークのための遺伝子調整ドメインに融合された複数の工学的に操作されたキメラ受容体
リガンド結合時の第1受容体が第2受容体の発現を活性化して「AND」ゲートを形成するように、2つの受容体を一緒に連結することによるものである。このようにして、両方のリガンドの存在のみが細胞応答を誘発することができる。「A AND NOT B」ゲートも可能である。例えば、がん細胞は第1の抗原を有するが、しかし第2の異なる抗原を欠くかどうかを判定するために、受容体Aをアクチベータに融合させることができ、受容体Bをリプレッサに融合させることができる。これによって、さらに特異的なシグナル操作に向けて複数のがん関連シグナルの統合が可能になる。このシステムはまた、活性化の際に細胞のエピジェネティック状態を変化させることができる「遺伝記憶」の構築を試験するために用いることができる。
【０４１６】
本明細書において記述されるANDゲートは、共刺激を支持する装置である。リンパ球の活性化のような天然プロセスは、有効な免疫応答の発達のために共刺激を必要とする。T細胞の共刺激は、T細胞の増殖、分化および生存にとって重要である。共刺激を伴わないT細胞の活性化は、T細胞アネルギー、T細胞欠損、または免疫寛容の発達をもたらしうる。例えば、T細胞は、完全に活性化されるようになる2つのシグナルに依存しうる: 第1シグナルは抗原特異的であり、これには抗原提示細胞(APC)の膜上のペプチド-MHC分子と相互作用するT細胞受容体(TCR)が含まれ、第2シグナルは抗原非特異的であり、これは、APCの膜上に発現される共刺激分子とT細胞との間の相互作用によって提供される。共刺激分子は、本明細書において記述される工学的に操作された組換えキメラ受容体と置き換えて、任意の共刺激シグナルをTCRに提供することができる。例えば、T細胞によって発現される1つの共刺激受容体はCD28であり、これはAPCの膜上でCD80 (B7.1)およびCD86 (B7.2)と相互作用する。T細胞によって発現される別の共刺激受容体は、ICOS-Lと相互作用するICOS (誘導性共刺激因子)である。CD28およびICOSは、TCRの同時刺激プロセスを支持するように工学的に操作することができる。
【０４１７】
「Split AND」ゲート(図30A)において、dCas9ポリペプチドは、その各リガンドを認識するために所望の受容体(例えば、NotchおよびGPCR)に個別につながれうる非機能的な構成要素またはドメインに分割することができる。両リガンドによるキメラ受容体の活性化は、切断およびdCas9機能の再構成とその後の遺伝子活性化を可能にすることができる。リガンドのいずれもキメラ受容体に結合しないか、またはリガンドの1つのみがキメラ受容体に結合するなら、この遺伝子調整の方法は活性化されない。
【０４１８】
「Cascade AND」ゲート(図30B)において、そのリガンド(例えばDelta)に結合した場合の第1キメラ受容体(例えばNotch)は、テトラサイクリントランスアクチベータtTaを介したTetO駆動の第2キメラ受容体-dCas9融合物の発現を誘導する。第2キメラ受容体(例えば、GPCR)は、そのリガンドを認識することができ、次にdCas9を切断することができ、sgRNA依存性の標的遺伝子発現(例えばH2B-シトリン)を誘導することができる。「Cascade AND」ゲートにおいて、第1リガンドおよび第2リガンドのその各受容体への結合は、シグナルカスケードが行われるために重要である。
【０４１９】
実施例7: 細胞外シグナルのゲノム調節への変換
本明細書において開示されるヒトNOTCH1-Cas9キメラ受容体は、細胞外Deltaリガンドと結合すると、哺乳類遺伝子発現を工学的に操作するために膜結合Cas9を放出するように開発されている。これらのキメラ受容体は、強い、Delta依存性のCas9媒介レポーター遺伝子の発現および内因性遺伝子機能の調整を示す。このキメラ受容体-Cas9技術は、細胞外キュー(cue)依存性ゲノム工学を開拓し、これはシグナル伝達経路を精査し、微小環境-感知細胞機能を可能とするのに有用であることができる。
【０４２０】
微生物のクラスタ化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連タンパク質9 (Cas9)は、標的指向様式で実質的に任意の遺伝子を編集、活性化または抑制するために利用されている。単一のガイドRNA (sgRNA)はCas9と相補的なDNA配列で結合し、これが次にそのRuvCおよびHNHドメインを通じて二本鎖切断を触媒する。これらのドメインの変異およびエフェクタードメインとの融合は、哺乳類細胞における標的指向性のゲノム調節を行うために、触媒作用的デッドCas9 (dCas9)を再利用することができる。
【０４２１】
CRISPR-Cas9を介したゲノム調節は、遺伝子型の変化が細胞の挙動に影響を与えうる「インサイド-アウト」プロセスである。逆に、細胞外微小環境はまた、「アウトサイド-イン」シグナル伝達プロセスを介して細胞の挙動に影響を与えることができる。したがって、両方の細胞プロセスを接続するために、これまでに未踏の戦略をとった(図31A)。Cas9の1回膜貫通Notch受容体への直接融合は、細胞外シグナルをCRISPRに基づくゲノム調節に経路指定する最初のクラスのツール(first-of-its-class tool)であるNotchキメラ受容体の基礎を形成する。Notch受容体は、場合によっては、その単純な機構のために魅力的な候補である。その同族リガンドDeltaのNotch細胞外ドメイン(NECD)への結合は、γ-セクレターゼ複合体がNotch細胞内ドメイン(NICD)を切断することを可能にし、Notch細胞内ドメイン(NICD)が次いで、核へ移動し、転写因子として機能する。種特異的Notch相同体およびそのドメインの分析は、Notchの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインの両方のモジュール性を以前に実証した。
【０４２２】
3コピーの核局在化シグナル(NLS)配列を有する三要素活性化ドメイン(VP64、p65およびRta)に融合した化膿連鎖球菌dCas9でヒトNOTCH1由来のNICDを置き換えることによって、融合コンストラクトNC1を作製した(図31B)。コンストラクトをmCherryで蛍光的にタグ付けして、その細胞下分布を判定した。次に、哺乳類細胞においてトランスフェクトされた場合、NC1融合コンストラクトがどのように細胞外Deltaリガンドに応答するかが判定された。Notch-Deltaシグナル伝達を精査するために以前に開発されたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)レポーター細胞株が使われた(Sprinzak, D. et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature 465, 86-90, doi:10.1038/nature08959 (2010))。CHO細胞株は、シトリン(YFP)タグ付きレポーター遺伝子、ヒストン2B (H2B)を制御する誘導性UAS (上流活性化配列)プロモーターを含んでいた。sgRNA (sgUAS)は、切断されたdCas9がUASプロモーターに結合することを可能にするレンチウイルス形質導入によって安定に発現された(表6参照)。キメラhNECD-dCas9-VPRコンストラクトをCHO細胞においてトランスフェクトし、これを次に、露出プレート表面または飽和量のDelta (親和性増強変異を有するDLL4 (Luca, V. C. et al. Structural biology. Structural basis for Notch1 engagement of Delta-like 4. Science 347, 847-853, doi:10.1126/science.1261093 (2015)))で被覆された表面上で4日間培養した。核に結合したH2B-シトリンの蛍光を画像化することにより、NC1が、表面吸着Deltaへの曝露によってH2B発現を誘導したかどうか判定された(図31C)。いくつかの細胞では、新生NC1分子が、おそらく一つには3つのNLSモチーフの存在により、小胞体(ER)においてスタックしたままであり、H2B発現を時期尚早に活性化することが観察された(図33)。
【０４２３】
本実施例において細胞外シグナル誘発dCas9媒介ゲノム調節を実施することには、受容体キメラの切断前の膜局在とdCas9の切断後の核移動とのバランスをとることが含まれた(図33)。その機能を最適化するために、NLSおよび既知の膜成熟シグナル(MMS)のコピー数をいくつかのhNECD-dCas9バリアントにおいて変化させた(図31B)。いずれのNLSも有しなかったNC2バリアントも、Deltaリガンドの非存在下においてH2B発現を誘導し、dCas9-VPR-mCherry (243 kDa; hNECDはサイズが188 kDaである)を含む細胞内ドメインの剪断サイズが、その時期尚早の切断を引き起こした可能性があることを示唆していた。そのため、22アミノ酸のNICD配列をコンストラクトNC3に戻し再導入した; このコンストラクトはNC1またはNC2よりも優れていなかった(図34)。タンパク質選別および再利用に関与する膜貫通タンパク質であるLMAN1由来のMMS配列
2019500887.tif 000037
も融合キメラのC末へ導入し、バリアントNC4およびNC5を得た。NC4は1つの合成NLSを有するが、NC5はそうではない。NC5のみがH2BのDelta依存性活性化を示し(図31D)、適切な膜成熟が合成NLSによって損なわれ、NC5におけるようなMMSが適切な成熟を促進することを示唆していた。最後に、NC5およびsgUASはレポーター細胞へ安定に組み込まれ、Deltaの非存在下では最小の基本的H2B発現に基づいて単一のクローンが単離された。Deltaに応答して3倍のH2B活性化(図31Eおよび31F)が観察されたので、NC5デザインを下流研究に用いた。
【０４２４】
コンストラクトNC2およびNC5における合成NLSの非存在下では、切断されたdCas9-VPR-mCherryは依然として、一つには化膿連鎖球菌(S. py.) Cas9の残基番号647〜670の予測される内因性NLS (iNLS)モチーフによるものと思われた核移動を示した。アミノ酸残基のこのiNLS配列
2019500887.tif 000038
は、化膿連鎖球菌Cas9の結晶構造においてヘリックス-リンカー-ヘリックスモチーフにマッピングされた。両ヘリックスの表面曝露は、インポーチン依存性核輸送のためのそれらのアクセス可能性を示唆していた(図35A)。dCas9-VPR-mCherryコンストラクトにおいてiNLSの6つのアルギニンまたはリジン残基をアラニン
2019500887.tif 000039
に変異させるとHEK293レポーター細胞においてEGFP活性化が(18倍から4倍にまで)損なわれた。わずかな割合(およそ16%)の細胞がEGFPを活性化し、この変異iNLSバリアントが機能的なままであったこと、および/または他の非標準的な潜在NLSが未同定のままであることが示唆された(図35B)。dCas9-VPR-mCherryコンストラクトにおいてアルギニンおよびリジン残基をアラニン
2019500887.tif 000040
に変異させることによってこのiNLSモチーフを破壊すると図35Cの代表的な共焦点顕微鏡画像において示されるように、ヒト胎児腎臓(HEK293T)細胞における核局在化およびEGFPレポーター活性化がひどく損なわれた。EGFPレポーターの代表的なヒストグラムが右側に示されている; 「ON」と考えられる細胞の割合は、トランスフェクトされていない「OFF」細胞を上回るレポーター強度を有していた。iNLS変異dCas9-VPRのN末に合成NLSを付加し戻すとEGFP活性化が部分的に回復し、dCas9のiNLSを変異させてもそのDNA結合機能は変化しないことが示唆された(図35D)。
【０４２５】
同様のレポーターアッセイ法(野生型NICDも結合することを可能にする12xCSLプロモーターによって駆動されるH2B-シトリン)において、別のCas9相同分子種を試験することによりキメラのモジュール性をさらに探った。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus) dCas9をNC5デザインにおいて導入した。得られたこの黄色ブドウ球菌NC5 dCas9バリアントはまた、黄色ブドウ球菌特異的sgRNA (sasgCSL)とともに、野生型ヒトNOTCH1と同様のDelta依存性活性化レベルを示した。
【０４２６】
固定化されたDeltaリガンドによるNC5受容体の活性化は、dCas9-VPRの切断および核移動をもたらす。配列特異的sgRNA (例えば、sgTET)と複合体形成したdCas9-VPRは、複合体の(例えば、TET)プロモーターへの結合およびEGFP遺伝子の活性化を可能にする(図31G)。図31Hは、tet誘導性EGFP遺伝子および標的指向sgRNA (sgTET)を安定に発現するHEK293Tレポーター細胞からのEGFPレポーター強度ヒストグラムを示す。dCas9-VPRまたはNC5受容体(γ-セクレターゼ阻害剤, DAPT有りまたは無し)でトランスフェクトした細胞を3日間、固定化(immbolized) Delta有りまたは無しで培養した。活性化細胞の割合(ON％)も示されている。細胞は、コンストラクトを有しない全ての細胞の基礎的強度を超えてONとみなされる。図31Iは、NC5受容体でトランスフェクトされ、3日間さまざまな濃度の固定化Delta上で培養されたHEK293Tレポーター細胞のEGFP活性化の等高線図(同数の細胞が等高線の各対の間に入る)を示す。Delta無しで培養された細胞および最高のDelta濃度で培養されたDAPT処理細胞は、EGFPを活性化しなかった。DAPT処理条件と比較した平均倍率変化が示されている。
【０４２７】
実質的に任意のゲノム標的へのsgRNA媒介性Cas9結合の識別力と天然の細胞外シグナルを経路指定する能力を組み合わせることで、指数関数的な量のシグナル伝達経路および機能が切り開かれる(図32A)。本明細書において開示されるNotchキメラ受容体は、新規のDelta依存性の細胞分裂周期停止を誘発するために用いられた。HEK293細胞は、細胞周期の内因性調節因子であるサイクリン依存性キナーゼ阻害因子1B (CDKN1B)を特異的に標的とするレンチウイルスパッケージングされたsgRNAで安定的に形質導入された。CDKN1Bの過剰発現は、G0/G1停止を誘導することが示されている(図32B)。NC5を、CDKN1B (sgCDKN1B)に対するsgRNAを安定に発現するHEK293細胞へトランスフェクトし、引き続いて細胞を露出表面またはDelta含有表面に導入した。Delta上で4日後、NC5を発現する細胞においてCDKN1Bの2倍超の上方制御(露出表面、トランスフェクトされていない対照と比較して)が観察された(図32C)。Delta曝露され、NC5をトランスフェクトされ、かつsgCDKN1B+の細胞の38%がG0/G1期に隔離されていると判定され、試験した他の全ての条件では細胞の2〜16%にすぎなかった。Delta無しで培養したsgCDKN1B+細胞におけるNC5の漏出は、おそらく一つには細胞-細胞接触時にCDKN1B発現を誘導しうるHEK293細胞における内因性DLL4に起因し(図32C、「NC5 + sgRNA」条件)、表面吸着親和性が増強されたDLL4と接触している細胞と類似しているが、わずかに小さい割合の表現型をもたらしたものと観測された。
【０４２８】
本実施例において例示されるNotchキメラ受容体アプローチは、細胞外シグナルに応答して遺伝子発現および細胞機能を調整することを可能にする。ゲノムターゲティングの特徴(例えば、異なるPAM認識モチーフ)を保有する本明細書におけるCas9相同分子種とのNICDのモジュール置換を、他の細胞外リガンドを認識する一本鎖可変フラグメントとのNECDの新しいモジュール置換に組み合わせることで、Notchキメラ受容体は天然のNotchリガンドを越えてさらに多数の細胞外シグナルと、およびさらに広いゲノム網羅(genomic coverage)と連動することができよう。Notchキメラ受容体は、単一または複数の下流の構成要素への経路指定による内因性シグナル伝達経路の研究および工学的操作のために、ならびに細胞外微小環境の感知を利用する細胞に基づく治療法のために広く有用であるものと想定される。
【０４２９】
方法
遺伝子コンストラクトの作製
標準的な分子クローニング技法を実施して、本実施例において記述される全てのコンストラクトを組み立てた(表6および8)。全てのNotchキメラ受容体を、CMVプロモーターおよびジェネティシン耐性マーカー下でpcDNA3ベクターにクローニングした。全てのsgRNAコンストラクトを、U6プロモーターを有するかつピューロマイシン耐性マーカーまたは蛍光マーカーのいずれかを有するpHRベクターにクローニングした。
【０４３０】
安定した細胞株の作製
図31A〜31Fにおいて用いられた全ての細胞株は、細胞株T-Rex-CHO-K1 (Invitrogen)に基づいていた。UAS-H2B-シトリンおよび12xCSL-H2B-シトリンの安定な細胞クローンが得られた。製造業者の指示にしたがいレンチウイルス形質導入(全てのsgRNAおよびSV40-EGFPの)またはTransIT-LT1試薬(Mirus Bio)を用いたプラスミドトランスフェクションから、さらなる細胞株を作製し、引き続いて適切な抗生物質選択および維持を行った。2週間のピューロマイシンおよびジェネティシン選択の後、UAS-H2B-シトリン系統中のNC5およびsgUASを発現する安定にトランスフェクトされたクローンをFACSによって単離した。全てのCHO細胞株を加湿インキュベーター中、5% CO2で37℃にて、10% Tet System Approved FBS (Clontech)、100 U/mLのペニシリンおよびストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン(Gibco)および10 μg/mLのブラストサイジン(VWR International)を補充したEarle’s Salts (Irvine Scientific)を有するAlpha MEM中で増殖させた。
【０４３１】
レンチウイルス産生および形質導入
レンチウイルスのパッケージングのためにHEK293T細胞(ATCC)を用いた。細胞を5% CO2で37℃にて、10% Tet System Approved FBS (Clontech)ならびに100 U/mLのペニシリンおよびストレプトマイシン(Gibco)を補充したGlutaMAX(商標)培地(Thermo Fisher)を含むDMEM高グルコース中で維持した。細胞を1日目に6ウェルプレート形式(Corning)において2.0〜3.0×105細胞/mLで播種した。2日目に、細胞はトランスフェクションの時点で50〜70%の集密度であった。各ウェルについて、pHRプラスミドベクター1.51 μg/mL、dR8.91 1.32 μgおよびpMD2.G (Addgene) 165 ngを、TransIT-LT1試薬7.5 μLを含むOpti-MEM還元血清培地(Gibco) 250 μL中で混合し、室温で15〜30分間インキュベートした。トランスフェクション複合体溶液を、HEK293T培養液に滴下して均等に分配した。3日目に培地を、下流の形質導入に適した新鮮な培地(例えば、CHO細胞株の場合にはAlpha MEM)と交換した。4日目に、レンチウイルスを無菌シリンジで上清から採取し、-80℃での保存または標的細胞培養物の即時形質導入のために0.45 μmのポリフッ化ビニリデンフィルタ(Millipore)を通してクライオバイアルにろ過した。
【０４３２】
ろ過されたレンチウイルス上清を適切な新鮮培地と1:1で混合して、形質導入のための標的細胞の培地に交換した。接着細胞培養物を50%の集密度で形質導入した。ポリブレン(Millipore)を5 μg/mLで加えた。sgRNAの組み込みのために、適切な抗生物質選択での形質導入から2日後に新鮮培地に交換した; 少なくとも90%の細胞が形質導入の2日後に安定に組み込まれたsgRNAを含むことがフローサイトメトリーを介して日常的に観察された。その後の細胞培養において抗生物質を維持した。抗生物質選択によって全ての非形質導入対照細胞を死滅させた後におよび1ラウンドの継代培養後に実験のため形質導入細胞株を用いた。細胞株は、マイコプラズマ汚染について試験されなかった。
【０４３３】
実験技法
Deltaの表面吸着: 本実施例において記述される実験は、1.5×104細胞/mLにて24ウェルプレートまたは48ウェルプレート(Corning)上にプレーティングした細胞で行われた。8-ヒスチジンタグを有するDLL4の親和性増強バリアント(E12)を用いて、2.15 μg/mLの飽和濃度でDeltaをプレート表面に吸着させ、細胞播種の前に37℃で2時間インキュベートした。CHO細胞での実験のために、5 μg/mLのハムスターフィブロネクチン(Innovative Research)もDeltaと一緒に吸着させた。
【０４３４】
フローサイトメトリー分析
細胞をトリプシン処理し、Scanford FACScan分析器(Becton Dickinson)および標準的なプロトコルを用いてレポーター蛍光またはタンパク質免疫蛍光について分析した。細胞内タンパク質の場合、細胞をトリプシン処理し、4％パラホルムアルデヒド溶液中で15分間固定し、PBS中2%の正常ロバ血清(Thermo Fisher)を含む0.3% Triton-X 100 (Sigma)の溶液中で適切な一次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。CDKN1Bに対する一次抗体(D69C12, Cell Signaling)を、製造業者の提案にしたがった濃度で用いた。次いで、細胞サンプルを、適切な種特異的Alexa 647ロバ二次抗体(Life Technologies)と1000分の1希釈で30分間インキュベートした。二次抗体のみ染色した細胞を陰性対照として用いた。
【０４３５】
（表６）プラスミドコンストラクト
2019500887.tif 000041
【０４３６】
（表７）安定した細胞株
2019500887.tif 000042
【０４３７】
（表８）選択配列
2019500887.tif 000043
【０４３８】
触媒的に活性なCas9の使用は、場合によっては、遺伝子編集による遺伝子調節のために用いることができる。図36Aは、NC5バリアント: 野生型化膿連鎖球菌ヌクレアーゼ活性Cas9 (hNECD-Cas9)に融合したhNECDを用いたDelta依存性DNA切断を示す。構成的に発現されたEGFP導入遺伝子は、sgRNAとしてsgEGFPを標的とした。図36Bは、安定に組み込まれたSV40駆動EGFPおよび標的指向sgRNA (例えば、sgEGFP)を有するCHO細胞におけるhNECD-Cas9の有効性を示す。EGFP陰性細胞のかなりの部分が、4日間の培養にわたってDeltaに曝露されたhNECD-Cas9-およびsgEGFP-陽性細胞において観察された。上部の、代表的な密度プロットは、培養4日後のさまざまな条件下での側方散乱(SSC) vs EGFPを示す。細胞は、sgEGFPを欠いているがhNECD-Cas9でトランスフェクトされたEGFP陽性CHO細胞の99%未満に設定された強度閾値を下回る場合、EGFP陰性であるとみなした。底部の、EGFP陰性細胞の定量分析が提供されている(n = 3)。平均 ± SEM。＊＊＊p < 0.001。
【０４３９】
図36Cは、HEK293T細胞中で安定に発現され、CXCR4の5'非翻訳領域(UTR)およびイントロン1を標的とするようにデザインされた2つのsgRNA (「sgCXCR4」の左右の短いバー)の実例の模式図を示す。スケールバー, 1000 bp。図36Dの上パネルは、SDS-PAGEゲル中でT7E1によって切断された生成物の量によって検出される、HEK293T細胞におけるCXCR4遺伝子のDelta誘導hNECD-Cas9媒介性修飾の程度をアッセイするためのT7E1エンドヌクレアーゼの使用の実例の結果を示す。下パネルは、切断された生成物と切断されていない生成物との比によって推定されるCXCR4 indel変異の頻度の実例の結果を示す(n = 3の独立した実験)。平均 ± SEM。＊全ての他の条件と比較して、p < 0.05。図36Eは、示された条件下で4日間培養されたHEK293T細胞におけるCXCR4タンパク質発現のフローサイトメトリーに基づく免疫蛍光染色の定量化のための実例の結果を示す(n = 3の独立した実験)。平均 ± SEM。＊全ての他の条件と比較して、p < 0.05。
【０４４０】
実施例8: 最小Notch (NC5)受容体バリアントの開発
場合によっては、インビボでの適用のために、最小のNC5受容体バリアントを開発することが望まれうる。1つの関心領域はNECDであり、これはおよそ1,700アミノ酸である(dCas9, およそ1,300アミノ酸と比較して)。NECDドメインは、複数の上皮成長因子(EGF)リピートからなり; 機能的分析によって上皮成長因子(EGF)リピート11および12が重要なDelta結合単位であることが正確に示された。EGF 11, 12リピートは系統発生の全体にわたって高度に保存されている。ヒト、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、およびショウジョウバエ相同体のEGF 11, 12リピートのアライメントは、高度に保存されたコンセンサス残基の存在を示す(図37A)。図37Bは、機能的に最小のNC5キメラ受容体バリアントを系統的に判定するように構築された一連の欠失バリアントおよび完全長NECDの模式図を提供する。対応する最小NC5受容体バリアント(ヒストグラム, 右)でトランスフェクトされ、Deltaとともに培養(特別の定めのない限り3日間)されたHEK293T細胞のEGFPレポーター強度ヒストグラムを提供する。全36個のEGFリピートの欠失は、Delta活性化の完全な喪失をもたらす(delta EGF, 欠損)。ショウジョウバエNotchにおいて、機能的最小バリアントは、EGF 11,12 (例えば、EGF(10-12], Rebay, I. et al. Cell 67, 687-699 (1991)にあるような区間表記)のみを保持することによって報告されている。しかしながら、ヒトNECDのEGF(10-12]バリアントは、野生型hNECDと比べて活性化の低下(13.5%, 図37B)を示した。これは、ヒトNotchの他のEGFリピートがNotch-Delta相互作用の安定性に寄与しうることを示唆していた。EGF11,12に隣接する1〜2個のEGFリピートの再導入は、EGF 11,12単独よりも悪くなり、活性化の完全な喪失をもたらした。対照的に、さらに3〜5個のEGFリピートを加えると、EGF(7-14]バリアントが最も高い活性化率(83.5%)を示し、活性化効率のより良好な回復が得られた。注目すべきことに、EGF(7-14]バリアントは、野生型NECDの長さのわずか3分の1である。
【０４４１】
実施例9: ゲノムのターゲティングおよび新規経路の構築
最小のNC5受容体バリアントでの2つの遺伝子の同時活性化は、HEK293T細胞における複数のsgRNA (1遺伝子につき2つ)−すなわちCXCR4を標的とし(sgCXCR4)かつCD95を標的とする(sgCD95)−によって、達成された。「遊離」dCas9-VPRおよびsgCXCR4またはsgCD95により、非標的指向sgRNA (例えば、sgNT)と比較して5.6倍または3.5倍の上方制御が観察された。CXCR4およびCD95の同時活性化は、それぞれsgNTに対して3.7倍および4.6倍の増加をもたらした(図38)。最小EGF(7-14] NC5受容体バリアントおよび両方のsgRNAを用い、dCas9-VPR+sgNTと比べて、Delta無しで、DAPTだけで、またはDeltaおよびDAPT有りで培養された細胞において、両遺伝子の有意な上方制御は観察されなかった。これらの細胞がDelta上で培養された場合、dCas9-VPR+sgNTを有する細胞と比較して、CXCR4 (2.2倍の上方制御)およびCD95 (1.7倍の上方制御)の同時活性化が観察された(図38)。
【０４４２】
最小のNC5受容体バリアントを用いて、細胞周期のDelta依存性停止を誘発した(図39A)。CDKN1B (サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1B)を、HEK293T細胞におけるsgRNA (sgCDKN1B)による標的とした。CDKN1Bの過剰発現は、G0/G1期での細胞停止を導く(図39B)。「遊離」dCas9-VPRおよびsgCDKN1Bを有する細胞では、CDKN1B上方制御がG0/G1富化と同時に起こった; dCas9-VPRおよび非標的指向gsRNA (sgNT, 図39Cおよび39D)では最小のCDKN1B増加が観察された。Delta誘導性CDKN1B上方制御および細胞におけるG0/G1停止は、DAPTによって抑止された(図39Eおよび39F)。
【０４４３】
本発明の好ましい態様が本明細書において示され記述されたが、そのような態様は単なる例示として提供されることが当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には数多くの変形、変更、および置換が行われよう。本明細書において記述される本発明の態様に対するさまざまな代替物が、本発明の実践において利用されうることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものと意図され、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されるものと意図される。
【０４４４】
非公式の配列表
SEQ ID NO:1
sgUAS
2019500887.tif 000044
SEQ ID NO:2
sgTET
2019500887.tif 000045
SEQ ID NO:3
CXCR4-dCas9-VPR-mCherry [CXCR4-V2尾部-TEV切断部位-dCas9-VPR-NLS-mCherry-HAタグ-リンカー]
2019500887.tif 000046
SEQ ID NO:4
CXCR4
2019500887.tif 000047
SEQ ID NO:5
V2尾部
2019500887.tif 000048
SEQ ID NO:6
TEV切断部位
2019500887.tif 000049
SEQ ID NO:7
dCas9
2019500887.tif 000050
SEQ ID NO:8
VPR (太字のNLS, 下線付きのリンカー)
2019500887.tif 000051
SEQ ID NO:9
NLS
2019500887.tif 000052
SEQ ID NO:9
mCherry
2019500887.tif 000053
SEQ ID NO:10
HAタグ
2019500887.tif 000054
SEQ ID NO:11
リンカー
2019500887.tif 000055
SEQ ID NO:12
ITGB1-dCas9-VPR-mCherry [インテグリンβ1-TEV切断部位-dCas9-VPR-NLS-mCherry-HAタグ-リンカー]
2019500887.tif 000056
SEQ ID NO:13
インテグリンβ1
2019500887.tif 000057
SEQ ID NO:14
TEV切断部位
2019500887.tif 000058
SEQ ID NO:15
dCas9
2019500887.tif 000059
SEQ ID NO:16
VPR (太字のNLS、下線付きのリンカー)
2019500887.tif 000060
SEQ ID NO:17
NLS
2019500887.tif 000061
SEQ ID NO:18
mCherry
2019500887.tif 000062
SEQ ID NO:19
HAタグ
2019500887.tif 000063
SEQ ID NO:20
リンカー
2019500887.tif 000064
SEQ ID NO:21
Notch-dCas9-VPR-mCherry [hNECD-TM-hNICD-dCas9-VPR-mCherry-HAタグ-リンカー]
2019500887.tif 000065
2019500887.tif 000066
SEQ ID NO:22
hNECD
2019500887.tif 000067
SEQ ID NO:23
TM
2019500887.tif 000068
SEQ ID NO:24
hNICD
2019500887.tif 000069
SEQ ID NO:25
dCas9
2019500887.tif 000070
SEQ ID NO:26
下線付きのリンカー配列を有するVPR
2019500887.tif 000071
SEQ ID NO:27
mCherry
2019500887.tif 000072
SEQ ID NO:28
HAタグ
2019500887.tif 000073
SEQ ID NO:29
HAタグとVPRとの間のリンカー
2019500887.tif 000074
【図１】
2019500887.tif 000076
【図２】
2019500887.tif 000077
【図３】
2019500887.tif 000078
【図４】
2019500887.tif 000079
【図５】
2019500887.tif 000080
【図６】
2019500887.tif 000081
【図７】
2019500887.tif 000082
【図８】
2019500887.tif 000083
【図９】
2019500887.tif 000084
【図１０】
2019500887.tif 000085
【図１１】
2019500887.tif 000086
【図１２】
2019500887.tif 000087
【図１３】
2019500887.tif 000088
【図１４】
2019500887.tif 000089
【図１５】
2019500887.tif 000090
【図１６】
2019500887.tif 000091
【図１７】
2019500887.tif 000092
【図１８】
2019500887.tif 000093
【図１９】
2019500887.tif 000094
【図２０】
2019500887.tif 000095
【図２１Ａ】
2019500887.tif 000096
【図２１Ｂ】
2019500887.tif 000097
【図２２−１】
2019500887.tif 000098
【図２２−２】
2019500887.tif 000099
【図２３−１】
2019500887.tif 000100
【図２３−２】
2019500887.tif 000101
【図２３−３】
2019500887.tif 000102
【図２３−４】
2019500887.tif 000103
【図２４】
2019500887.tif 000104
【図２５】
2019500887.tif 000105
【図２６−１】
2019500887.tif 000106
【図２６−２】
2019500887.tif 000107
【図２７】
2019500887.tif 000108
【図２８】
2019500887.tif 000109
【図２９】
2019500887.tif 000110
【図３０】
2019500887.tif 000111
【図３１Ａ】
2019500887.tif 000112
【図３１Ｂ】
2019500887.tif 000113
【図３１Ｃ】
2019500887.tif 000114
【図３１Ｄ】
2019500887.tif 000115
【図３１Ｅ】
2019500887.tif 000116
【図３１Ｆ】
2019500887.tif 000117
【図３１Ｇ】
2019500887.tif 000118
【図３１Ｈ】
2019500887.tif 000119
【図３１Ｉ】
2019500887.tif 000120
【図３２Ａ】
2019500887.tif 000121
【図３２Ｂ】
2019500887.tif 000122
【図３２Ｃ】
2019500887.tif 000123
【図３３】
2019500887.tif 000124
【図３４】
2019500887.tif 000125
【図３５−１】
2019500887.tif 000126
【図３５−２】
2019500887.tif 000127
【図３６Ａ】
2019500887.tif 000128
【図３６Ｂ】
2019500887.tif 000129
【図３６Ｃ】
2019500887.tif 000130
【図３６Ｄ】
2019500887.tif 000131
【図３６Ｅ】
2019500887.tif 000132
【図３７Ａ】
2019500887.tif 000133
【図３７Ｂ】
2019500887.tif 000134
【図３８】
2019500887.tif 000135
【図３９Ａ】
2019500887.tif 000136
【図３９Ｂ】
2019500887.tif 000137
【図３９Ｃ】
2019500887.tif 000138
【図３９Ｄ】
2019500887.tif 000139
【図３９Ｅ】
2019500887.tif 000140
【図３９Ｆ】
2019500887.tif 000141
【配列表】
2019500887000001.xml
【国際調査報告】
2019500887.tif 000173
2019500887.tif 000174
2019500887.tif 000175
2019500887.tif 000176