(57)【要約】  本発明は、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療のための方法における使用のための、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）および生弱毒化ＰＲＲＳウイルスの非複製性免疫原の組合せと薬学的に許容される担体とを含むワクチンであって、ここで、該ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関して単回投与で投与される、ワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療のための方法における使用のための、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）および生弱毒化ＰＲＲＳウイルスの非複製性免疫原の組合せと薬学的に許容される担体とを含むワクチンであって、該ワクチンがＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関して単回投与で投与されることを特徴とするワクチン。
【請求項２】
エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原が、それぞれ、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の不活化病原体であることを特徴とする、請求項１記載の使用のためのワクチン。
【請求項３】
レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）病原体が血清群ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ）の細菌を含み、そして所望により、血清群タラスソビ（Ｔａｒａｓｓｏｖｉ）、オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、グリッポチフォサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、イクテロヘモラジエ（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）およびカニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）の少なくとも１つの細菌を含み、ここで、血清群オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）の細菌が、特に、血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の細菌であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項４】
ワクチンが非経口投与されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項５】
ワクチンが筋肉内投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の使用のためのワクチン。
【請求項６】
エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）および生弱毒化ＰＲＲＳウイルスの非複製性免疫原の組合せと薬学的に許容される担体とを含むワクチンを投与することを含む、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療のための方法であって、該ワクチンがＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関して単回投与として投与されることを特徴とする方法。
【請求項７】
エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原ならびに薬学的に許容される担体を含む第１ワクチンと、凍結乾燥生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第２ワクチンと、第２ワクチンを第１ワクチンと混合してエリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）および生弱毒化ＰＲＲＳウイルスの非複製性免疫原の組合せと薬学的に許容される担体とを含むワクチンを生成させることが可能であるという指示書、との組合せであって、ここで、該ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関して単回投与で投与される、組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的にはブタの健康の分野に関する。ブタは多数の病原性微生物に感染しやすい。感染の防除は、一般に、安定した飼料管理、抗ウイルス薬および抗生物質のような薬剤での治療、またはワクチンを使用する予防的治療により行われる。特に、本発明は、ＰＲＲＳ（ブタ生殖器呼吸器症候群）ウイルス、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義）に対するワクチン、および、そのようなワクチンを使用してそのような感染に対して動物を防御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＲＲＳウイルスは１９８７年に北米および中欧で初めて報告された。ＰＲＲＳウイルスは小さなエンベロープＲＮＡウイルスである。それは、約１５キロベースのサイズを有する一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含有する。該ゲノムは９個のオープンリーディングフレームを含有する。該ウイルスはニドウイルス目アルテリウイルス科アルテリウイルス属のメンバーである。ＰＲＲＳＶの２つの原型株は、北米株ＶＲ−２３３２および欧州株レリスタッドウイルス（ＬＶ）である。該欧州および北米ＰＲＲＳＶ株は、類似した臨床症状を引き起こす。２０００年代初めに、北米遺伝子型の高病原性株が中国で出現した。この株ＨＰ−ＰＲＲＳＶは他の全ての株より強毒性であり、世界中のアジア諸国で大きな損失を引き起こしている。臨床徴候には、雌ブタにおける生殖障害、例えば流産および死産またはミイラ変性胎児の出産、ならびに耳および外陰部のチアノーゼが含まれる。新生ブタにおいて該疾患は呼吸困難を引き起こし、グレッセー病のような呼吸器感染症に対する感受性を高める。ＰＲＲＳウイルスに関しては、不活化ウイルスワクチンが記載されており商業的に入手可能であるが、生弱毒化形態の欧州型（Ｉ型）または北米型（ＩＩ型）のいずれかを含む修飾生ウイルス（ＭＬＶ）がその防除のための主要な免疫学的手段である。幾つかのワクチンが当技術分野で商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）は、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスＩ型を含むワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる感染症（ウイルス血症）を軽減するために登録されている。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ（登録商標）ＭＬＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）は、ＰＲＲＳウイルスにより引き起こされる疾患の軽減を助けるワクチンである。Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＲＲＳ（Ｚｏｅｔｉｓ，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡから入手可能）もＭＬＶワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスにより引き起こされる呼吸器および生殖器形態の両方の疾患に対する防御のために登録されている。他のＰＲＲＳワクチンは、例えば、ＷＯ２００６／０７４９８６、ＵＳ８７２８４８７およびＷＯ２０１４／０４８９５５に記載されている。
【０００３】
ブタにおけるエリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）（Ｅｒｙ）により引き起こされる感染症は丹毒として公知であり、成長期および成体のブタを冒す最も古く認識されている疾患の１つである。集約的養豚地域のブタの５０％までがＥｒｙにより群生されているとみなされている。該細菌は一般に扁桃組織に存在する。これらの典型的な健常キャリアはそれらの糞便または口腔鼻分泌物内に該細菌を排出することが可能であり、他のブタにとっての重要な感染源である。疾病発生は急性または慢性である可能性があり、臨床的に不顕性の感染も生じる。急性発生は、突然の予期せぬ死亡、発熱性発作、関節痛、および、全身性チアノーゼからしばしば示されているダイヤモンド様皮膚（菱形蕁麻疹）病変まで様々にわたる皮膚病変により特徴づけられる。慢性丹毒は急性発生に続発する傾向にあり、関節肥大および跛行により特徴づけられる。慢性丹毒の第２の形態は増殖性弁膜心内膜炎である。弁膜病変を有するブタは、臨床的徴候をほとんど示さない可能性がある；しかし、労作時に、呼吸困難、嗜眠およびチアノーゼの徴候を示すことがあり、感染症により急死しうる。急性罹患妊娠ブタは、おそらく発熱が原因で流産しうる。ワクチン接種は、疾患発生を抑制するのに非常に有効である。注射可能なバクテリンおよび他の非複製性免疫原は公知であり、長期間の免疫を付与する。エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の非複製性免疫原を含む商業的に入手可能なワクチンとしては、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＥＲＹ＋Ｐａｒｖｏ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、ＦａｒｒｏｗＳｕｒｅ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｚｏｅｔｉｓ）、ＥｒｙＳｅｎｇ（登録商標）Ｐａｒｖｏ（Ｈｉｐｒａ）およびＰＡＲＶＯＲＵＶＡＸ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）である。ワクチン接種の最適な時期は、飼養場によって異なる。感受性ブタは、離乳前、離乳時または離乳の数週間後にワクチン接種されうる。繁殖用集団に加えるために選択される雄ブタおよび雌ブタは、好ましくは、３〜５週間後に追加ワクチン接種されるべきである。ついで、種畜は年２回ワクチン接種されるべきである。一般に、ブタに感染する主要エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）株の間には良好な交差防御が存在する。
【０００４】
ブタパルボウイルスは世界中のブタに遍在する。ほとんど全ての雌ブタは２回目の妊娠の前には自然感染しており、免疫は生涯存続する。したがって、それは初産のブタに典型的な疾患である。免疫学的にナイーブなまたは高い受動抗体価を有する若い雌ブタは、該ウイルスにより引き起こされる生殖障害の最高のリスクを有する。妊娠３０日目より前の感染は、初期胚喪失を引き起こす。妊娠３０日〜７０日の間の胎児感染は、胎児の死亡およびミイラ化を引き起こしうる。全ての胎児が同時に感染するわけではなく、妊娠の異なる段階での死亡が一般的である。幾つかの胎児は生存し、そして、幾つかは生きたまま産まれるが持続感染状態となる。妊娠７０日の後で感染したほとんどの胎児は免疫応答を引き起こし、ウイルスを除去し、出生時には健康である。初産雌ブタから産まれた死産ブタおよび健常ブタを伴う、ミイラ化胎児を含む種々のサイズの死亡胎児との同腹子は、ブタパルボウイルスの特徴である。診断は、蛍光抗体検査、ミイラ化胎児からの肺を使用するウイルス単離、または死産ブタにおける初乳前抗体の実証による。雄ブタは、精液を含む種々の経路で急性感染後数週間にわたってウイルスを排出し、該ウイルスを群れの中に持ち込みうる。非複製性免疫原を含む有効なワクチンが広く利用可能であり、例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＥＲＹ＋Ｐａｒｖｏ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、ＦａｒｒｏｗＳｕｒｅ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｚｏｅｔｉｓ）およびＰＡＲＶＯＲＵＶＡＸ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）である。
【０００５】
レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）（広義のもの、すなわち、全ての病原性レプトスピラ菌）、特に血清群ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ）は、ブタにおける生殖不全（不妊、流産、死産、および衰弱子ブタの出産）の主要原因である。急性レプトスピラ症は成体ブタにおいて生じるが、ほとんどの場合無症状である。血清群ポモナおよびオーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）に感染したブタは、慢性腎キャリアとなりうる。流産は感染の１〜４週間後に生じ、胎児は自己溶解する。ミイラ化、浸軟、死産および衰弱ブタも見られる。診断は胎児組織または胃内容物におけるレプトスピラの実証に基づく。しかし、著しく自己溶解した胎児は、不十分な蛍光抗体および免疫組織化学の結果をもたらしうる。ＰＣＲ検査はより良好な感度および特異性を有する。（多価）バクテリンまたは他の非複製性免疫原での典型的な６〜１２ヶ月ごとのワクチン接種は、レプトスピラ症の軽減または更には予防をも促進する。現場での結果は、レプトスピラ感染が抗生物質では確実には排除され得ないことを示している。有効なワクチンが商業的に入手可能であり、例えば、ＦａｒｒｏｗＳｕｒｅ（登録商標）ＧｏｌｄおよびＬｅｐｔｏ−Ｅｒｙｖａｃ（登録商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、ならびにＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｅｒｙ＋Ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）である。
【０００６】
発明の目的
ブタの健康管理のための、簡便、安全、そして効果的な手段が絶えず必要とされている。特に、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療に使用されうる、簡便、安全、そして効果的なワクチンが必要とされている。特にこれらの病原体による感染は、雌ブタの繁殖能力を低下させうる。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概略
本発明の目的を達成するために、種々の病原性微生物による感染に対してブタを防御するための新規ワクチンを案出し、該ワクチンは、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）および生弱毒化ＰＲＲＳウイルスの非複製性免疫原の組合せと薬学的に許容される担体とを含み、ここで、該ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関して単回投与（１回量）で投与される。該ワクチンは、雌ブタにおいてその繁殖能力を改善するために非常に好適に使用される。
【０００８】
本発明においては、該ワクチンはＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関して単回投与で投与される。ＰＲＲＳウイルス感染に対する混合ワクチン（組合せワクチン）で、該ワクチンの単回投与後でもブタが成功裏にワクチン接種されうることが有利に見出された。これは、防御のレベルを回復させるために初回ワクチン接種の例えば６〜１２ヶ月後にフォローアップワクチン接種を行うことを排除するものではない。このフォローアップワクチン接種は、追加ワクチン接種後にのみ防御が得られると考えられる初回−追加ワクチン接種方式における追加ワクチン接種とは異なる。初回−追加ワクチン接種方式においては、それらの２回のワクチン接種は典型的には２〜４週間隔である。
【０００９】
エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルス感染を治療するためのワクチンは公知であり商業的に入手可能であるが、安全かつ簡便な方法で良好な防御をもたらすための新規な方法が絶えず必要とされている。これらの病原体の全てに対する混合ワクチンは米国で商業的に入手可能である（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ−ＰＬＥ）。しかし、これは、適切な防御に到達するため、それらの抗原の全てに対してツーショットワクチン（ａ  ｔｗｏ  ｓｈｏｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）である（ワクチン接種は３〜４週間以内に繰返される必要がある）。これとは別に、当技術分野において記載されているツーショット投与レジメンでさえも、動物がＰＲＲＳウイルスに陽性である場合、例えば、それらの免疫系が該ウイルスで既に（予め）感作されていることが明らかである場合に成功するに過ぎない。したがって、公知の投与方式は、実際には３回（ａ  ｔｈｒｅｅ  ｓｈｏｔ）免疫化方式である。実際に、ＰＲＲＳウイルスは、それに対する適切な防御に到達するのが容易ではない免疫回避ウイルスである。驚くべきことに、本出願人は、ＰＲＲＳウイルス陰性動物においてさえも、弱毒化生ＰＲＲＳウイルスをＥｒｙ、ｐａｒｏおよびＬｅｐｔｏ抗原と組合せて使用した場合、１回（ｏｎｅ  ｓｈｏｔ）ワクチン接種で十分であることを見出した。これは理解されてはいないが、正の抗原干渉の結果でありうる。更に、想定または示唆される抗原の組合せが、任意の新規投与レジメンにおいて、安全かつ有効な混合（組合せ）ワクチンをもたらしうるかどうかは、主にそれらの抗原の予測不可能な干渉効果ゆえに常に不確実である。実際、任意の個々の投与レジメンにおいて、任意の想定される混合ワクチンの安全性および有効性に関しては、あるレベルの不確実性が常に存在する。
【００１０】
欧州医薬品評価庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＥＭＥＡ）の獣医薬品委員会（Ｔｈｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）はその刊行物「混合獣医薬品の要件に関するガイダンス（Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（ＥＭＥＡ，２０００，ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７−ＦＩＮＡＬ）において、「混合ワクチンの開発は容易ではない。各組合せは、品質、安全性および有効性に関して、個々に開発され、研究されるべきである。」（２／６頁）と記載している。該委員会は更に、良好な混合ワクチンの探索は、典型的には、例えば保存剤、賦形剤および安定剤、不活性化剤ならびにアジュバントを含む、混合ワクチンにおける個々の成分の間の適合性を含むことを示している。第３頁の最上部の段落において、「混合ワクチンにおいては、２以上の成分の存在がしばしば相互作用を引き起こして、特定の成分が単独で投与された場合と比較して低減または増強した、個々の成分に対する応答をもたらしうる。そのような相互作用は本質的に免疫学的であることが多いが、免疫系への直接的影響がより小さい他の因子によっても引き起こされうる。」と記載されている。
【００１１】
米国保健社会福祉省食品医薬品局生物製剤評価研究センター（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、「予防可能な疾患に対する混合ワクチンの評価に関する業界向けガイダンス：製造、試験および臨床研究（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）」を１９９７年４月に公開し、該ガイダンスには、「複数の１価ワクチンを組合せることは、所望のものより低い安全性および有効性を有する新たな組合せをもたらしうることを経験は示している。時には、不活化ワクチンの成分は、有効成分の１以上に対して不利に作用しうる。」と記載されており（第３頁「成分の適合性（Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」）、このことは、特に、不活化ワクチンが生ワクチンの有効性に悪影響を及ぼしうることを示しており、例えば、百日咳生ワクチンと不活化ポリオウイルスワクチンとの組合せが、低下した百日咳効力を有するワクチンとなったという例が起こった。ワクチンにおける任意の追加的成分は、個々のワクチンと比較して最終製品の安全性および効力を複雑にしうることが示されている。
【００１２】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全の基礎（Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｂａｓｉｃｓ）」と称されるｅラーニングコースを公開しており、これは、モジュール（ＭＯＤＵＬＥ）２において、混合ワクチンに関して検討している。このモジュールは、初めに、「認可混合ワクチンは、製品が安全で有効であり、許容可能な品質を有することを保証するために、各国当局による承認を得る前に広範な試験を受ける。」と記載している。更に、「したがって、全ての組合せに関して、製造業者は、各抗原成分の効力、免疫を誘導するように組合された場合のワクチン成分の有効性、毒性への可能な復帰のリスク、および他のワクチン成分との反応を評価しなければならない。」とも記載されている。
【００１３】
全体として、特定の抗原のいずれの組合せも単純ではなく、安全性および有効性を決定するための実験を要する。
【００１４】
また、本発明は、ワクチン自体とは別に、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療のための方法における使用のための混合ワクチン（組合せワクチン）、そのようなワクチンの製造方法（構成方法）、ならびに、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療のための方法であって、該動物に該ワクチンを、特にＰＲＲＳウイルスに関する１回量を、非経口的に特に筋肉内に投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原ならびに薬学的に許容される担体を含む第１ワクチンと、凍結乾燥生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第２ワクチンと、本発明のワクチンを生成させるために第２ワクチンを第１ワクチンと混合することが可能であるという指示書との組合せに関する。実際には、第１ワクチンおよび第２ワクチンは別々の独立したワクチンとして販売されうるが、それらは、１つの多重混合ワクチンを生成させるために２つのワクチンを混合することが可能であるという指示をラベル、パッケージリーフレットまたはその他に有し、ここで、ワクチンはＰＲＲＳウイルスによる感染に対する治療に関する１回量（単回投与）で投与される。
【００１６】
定義
ワクチンは、対象動物において病原性微生物（「病原体」）に対する防御免疫を誘導しうる、すなわち、後記の病原体による感染に対する予防的治療を成功裏にもたらしうる、対象動物に安全に投与される医薬組成物である。ワクチンは、アジュバント、すなわち、ワクチンにより誘導される免疫応答を増強しうる物質または組成物、と共に使用されうる。
【００１７】
病原体の非複製性免疫原は、（野生型または弱毒化形態のいずれかの）全体としての生複製性病原体以外の病原体に対応する任意の物質または化合物であり、この場合、この免疫応答の結果として、対応毒性病原体またはその毒性因子の１以上が宿主免疫系により認識され、最終的に少なくとも部分的に中和されるように、対応病原体に対して免疫応答を惹起する。非複製性免疫原の典型例は、不活化（死滅）全病原体、ならびにこれらの病原体のサブユニット、例えばカプシドタンパク質および表面発現タンパク質、例えば組換え発現タンパク質である。非複製性免疫原（例えば、死滅全病原体、細胞ライセート、サブユニットなど）は、主に体液性（すなわち、抗体の誘導）の免疫応答を惹起する。
【００１８】
病原体による感染に対する予防的治療は、その病原体による感染またはその感染から生じる障害、病原体での治療後チャレンジから生じるもの、の予防または改善を助けること、特に、そのようなチャレンジの後の宿主におけるその負荷を減少させること、そして所望により、病原体による治療後感染から生じる１以上の臨床症状の予防または改善を助けることである。
【００１９】
生弱毒化病原体は、低減した毒性を有する病原体の生存可能で複製可能な形態である。弱毒化の方法は、感染性病原体を採取し、典型的には細胞系による病原体の多重継代または病原体の遺伝的修飾により、それが無害または弱毒性になるようにそれを改変する。
【００２０】
予防的治療に使用されるワクチンの単回投与は、防御免疫を得るためには、ワクチン接種がワクチンの第２投与で増強される必要がないことを意味する。ツーショットレジメンにおいては、初回（プライム）ワクチン接種は、典型的には初回投与から６週間以内、一般には初回投与から３週間以内または更には２週間以内に増強（ブースト）され、そして、第２（ブースト）投与の後で初めて、防御免疫、すなわち、前記の予防的治療の成功が達成されうる。
【００２１】
薬学的に許容される担体は生体適合性媒体であり、すなわち、それは、投与後に対象動物において有意な有害反応を引き起こさず、ワクチン投与後に宿主動物の免疫系に抗原を提示しうる媒体である。そのような担体は、油のような１以上の疎水性液体とエマルジョンをおそらくは形成し、水および／または任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体でありうる。しかし、担体はまた、凍結乾燥ワクチン（糖および／またはタンパク質に基づくもの）を得るために一般的に使用されるような固体でありうる。
【００２２】
発明の実施形態
１つの実施形態においては、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原は、それぞれ、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の不活化病原体である。例えば、該病原体を単に死滅させることにより、（全ての）免疫原を非複製形態で利用可能にするための簡便な方法が提供される。不活化病原体を利用可能にすることにより任意のサブユニットワクチンも本ワクチンにおける使用に好適でありうるが、関連免疫原はそれ自体で存在し、そして天然に存在する生きた病原体においてそれが存在する様態（それに類似した様態）で存在する。
【００２３】
もう１つの実施形態においては、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）病原体は、最も重要なブタレプトスピラ病原体である血清群ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ）の細菌を含む。場合により、血清群タラスソビ（Ｔａｒａｓｓｏｖｉ）、オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、グリッポチフォサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、イクテロヘモラジエ（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）およびカニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）の少なくとも１つの細菌も存在し、ここで、血清群オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）の細菌は、特に、血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の細菌である。
【００２４】
また、前記のとおり、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）およびＰＲＲＳウイルスによる感染に対するブタの予防的治療のための方法における使用のためのワクチンのもう１つの実施形態においては、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原は、不活化（例えば、死滅）病原体である。特に、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）病原体は血清群ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ）の細菌を含み、所望により、血清群タラスソビ（Ｔａｒａｓｓｏｖｉ）、オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、グリッポチフォサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、イクテロヘモラジエ（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）およびカニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）の少なくとも１つの細菌を含み、ここで、血清群オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）の細菌は、特に、血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の細菌である。
【００２５】
更にもう１つの実施形態においては、ワクチンは非経口投与され、すなわち、口および消化管以外の体のどこかに投与される。ワクチンは、例えば、筋肉内に投与されうる。
【００２６】
前記のとおり、本発明はまた、混合ワクチンを構成する方法に関し、該方法は、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む第１組成物を、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の免疫原を含む第２組成物と、薬学的に許容される担体中で混合することを含む。もう１つの実施形態においては、第１組成物は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳから公知なように、安定剤中に凍結乾燥ＰＲＲＳウイルスを含む。該混合は、好ましくは、ワクチンを動物に投与する多くとも２４時間前、あるいは、投与の多くとも１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または１／２時間前に行う。
【００２７】
次に、以下の実施例を用いて、本発明を更に詳細に説明する。
【００２８】
実施例
実験１：Ｅｒｙ、ｐａｒｖｏ、ｌｅｐｔｏの非生免疫原の組合せ
最初の実験においては、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルス、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原の組合せの安全性および有効性を評価した。非生抗原のそのような組合せにとって、特に安全性は重要な観点である。これは、内毒素ショックのリスクと共に、そのような（非生）ワクチンにおいて典型的に使用される比較的大量の抗原であるからであり、特に免疫原がグラム陰性菌（その細菌の細胞壁は内毒素性リポ多糖を含む）の不活化病原体を含む場合である。
【００２９】
履歴的に管理された野外研究として研究を設計した。レプトスピラ感染に関連した流産率の増加の履歴を有する飼養場でそれを行った。血清群ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ）に対する高い抗体価が幾つかの動物において見出され、これは最近のレプトスピラ血清群ポモナ感染を示している。該飼養場はＰＲＲＳウイルス感染に対して陰性であった。
【００３０】
研究の開始時に、水性ｄｌ−α−トコフェロールアセタートベースアジュバント中にエリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）（ホルマリン不活化細菌、株Ｍ２）、ブタパルボウイルス（ＢＰＬ不活化ウイルス、株０１４）およびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）［血清群ポモナ、タラスソビ（Ｔａｒａｓｓｏｖｉ）、オーストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）（血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、グリッポチフォサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、イクテロヘモラジエ（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）およびカニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）のＢＰＬ不活化細菌］の非複製性免疫原を含有するワクチンを、飼養場における全ての繁殖用雌ブタおよび交換用（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）雌ブタの頚部筋肉に、４週間隔で２回ワクチン接種した。このワクチン組成物は「Ｅｒｙ／ｐａｒｖｏ／ｌｅｐｔｏ」と称される。その後の泌乳の２週目に、Ｅｒｙ／ｐａｒｖｏ／ｌｅｐｔｏを該動物に再びワクチン接種した。同じスケジュールで、新しい交換用雌ブタにワクチン接種した。
【００３１】
該研究におけるブタの繁殖能力をモニターした。分娩結果および関連する繁殖データを収集して、ワクチン接種が流産の発生率に何らかの影響を及ぼしたかどうかを判定した。研究期間中に得られた結果を過去のデータと比較した。パルボウイルスおよびＥｒｙも生殖に有意な悪影響を及ぼすため（ｐａｒｖｏは胎児を殺す可能性があり、Ｅｒｙは流産を引き起こす可能性がある）、この点での大幅な改善は、該ワクチンがこれらの病原体に対しても有効であるという良好な指標である。
【００３２】
研究中に有害事象は報告されず、このことは、ワクチンが安全であったことを示している。有効性に関しては、季節の影響を考慮して、研究期間と研究前期間との間で流産率を比較した。ワクチン接種後、ワクチン接種前の１２．６％からワクチン接種開始後の０．５％への減少という、流産に関する迅速な改善が示された。これは９６％の流産率の減少である。飼養場における流産の総数は、５５から６に減少した。飼養場における流産の数が少ない傾向は、ワクチン接種計画の開始後および次の季節において安定していた。流産の頻度は低いままであった（すなわち、０．６％）。ワクチンの安全性および有効性は、２０１５年１１月にＰｏｒｃｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ２０１５  １：１６／ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ４０８１３−０１５−００１１−０）に報告された別の研究において確認された。この研究はウイルス血症、腎感染および尿中排出に焦点を合わせている。
【００３３】
したがって、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原の組合せを含むワクチンは安全であり、これらの病原体の全てに対して有効であると結論づけられうる。ｅｒｙ／ｐａｒｖｏ／ｌｅｐｔｏの不活化病原体と比較して比較的少量の抗原しか（本質的に）含有しない生ＰＲＲＳウイルスをこのワクチンに添加した場合、ｅｒｙ／ｐａｒｖｏ／ｌｅｐｔｏ免疫原の有効性に悪影響があるとは予想されない。しかし、安全性は損なわれる可能性があり、生ＰＲＲＳウイルスに対する不活化免疫原の効果は未知であり、評価される必要がある。これは別の実験で行った。その結果は後記に示されている。
【００３４】
実験２：生ＰＲＲＳワクチンに対するＥＰＬ混合ワクチンの効果
本研究の目的は、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原の組合せを含むワクチンにおける生弱毒化ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）１型ワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ）再構成体の、６週齢ＳＰＦ子ブタにおけるワクチンの可能性を評価することであった。
【００３５】
該研究は、２つの群に均等に配置された４０頭のＰＲＲＳＶ抗体陰性子ブタを使用して行った。群１および２に、用量当たり４．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０に希釈された２ｍｌのＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳを筋肉内（ＩＭ）に１回ワクチン接種した（この用量は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳに関する４．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０の最小用量を若干上回る用量に相当する）。群１は、前記実験１に示されている実験用Ｅｒｙ／Ｐａｒｖｏ／Ｌｅｐｔｏ混合ワクチン中で希釈されたＰＲＲＳワクチンの投与を受けた。該ワクチンを２５℃の温度で混合し、少なくとも１時間放置した後、動物に実際に投与した。群２は、ディルバック・フォルテ（Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ）中で希釈された生弱毒化ウイルスの投与を受け、よって、実際には、通常のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳの、その最小用量を若干上回る用量の投与を受けた。実際、この群は陽性対照として用いられた。
【００３６】
以下のパラメーターを測定した：局所反応および全身反応、ＰＲＲＳＶウイルス血症およびＰＲＲＳＶ血清学。このようにして、該ワクチン株が宿主動物において正常に複製されうるかどうかが確認可能であり、それは、有効な免疫応答の誘導のための必要条件である。ワクチン接種日から実験終了［ワクチン接種の２８日後（２８ｄｐｖ）（ｄｐｖ：ワクチン接種後日数）］まで、全ての子ブタを臨床徴候に関して毎日観察した。ワクチン接種直前ならびにワクチン接種の２週間後および４週間後に血液サンプルを採取した。ワクチン接種後の種々の時点で得られた血清サンプルを使用して、ＰＲＲＳＶ特異的ウイルス血症および血清学的応答を決定した。
【００３７】
獣医学的検査は、全ての子ブタがワクチン接種日に健康であることを示した。ワクチン接種に関連づけられうる有害事象は見られなかった。ワクチン接種後第１４日の採血後の夕方に、群２における１頭の子ブタが死亡したことが判明した。剖検を行い、死因はおそらく採血による頚部血腫であった。
【００３８】
ＰＲＲＳウイルス血清学の結果を表１に示す。ＰＲＲＳウイルス血症の結果を表２に示す。
【表１】
2019535786.tif 000002
【表２】
2019535786.tif 000003
【００３９】
混合ワクチンのＰＰＲＳウイルスに関する血清学の結果およびウイルス血症の結果は、最小防御用量およびより高い用量の両方において、陽性対照［単独のワクチン接種としてのＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ］の場合と同等であるようであった。したがって、これらのデータは、ＰＲＲＳウイルスが、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原の組合せを含むワクチン中でのインキュベーションに耐えて生存しうることを示している。これらのデータに基づいて、弱毒化生ＰＲＲＳウイルスおよびエリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の非複製性免疫原を含む（二成分）混合ワクチンも安全かつ有効であると理解される。このワクチンに、ブタパルボウイルスの非複製性免疫原を加えて、ブタパルボウイルスによる感染に対する防御を得ることも可能である。そのような三成分ワクチンも、現在の結果に基づいて安全かつ有効であると理解される。これは全て、特にこれらの動物の繁殖能力を向上させることを目的とした、ブタに対する以下のワクチン接種計画を提供するのを助けることを可能にする多数の異なるワクチンを提供する：エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ブタパルボウイルスおよびレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）の非複製性免疫原を含む混合ワクチンでの最初の妊娠（典型的には２０〜３０週齢）の前の動物の基本ワクチン接種、例えば、初回（プライム）−追加（ブースト）ワクチン接種、ここで、初回−追加方式が用いられる場合、本発明に従って、初回または追加ワクチンは生弱毒化ＰＲＲＳウイルスと組合される（いずれの場合も、該ワクチンのＰＲＲＳ成分は単回投与ワクチンとして使用される）。初回−追加ワクチン接種は、例えば、２０週齢および２４週齢に行われうるであろう。ついで、この基本ワクチン接種は、本発明の混合ワクチンの単回投与により、または、状況に応じて抗原の１以上が存在しない（例えば、飼養場がいずれのレプトスピラ細菌によっても感染していないと予想される場合にはレプトスピラ抗原が存在しない）場合は混合ワクチンにより、ｅｒｙ／ｐａｒｖｏ／ｌｅｐｔｏ／ｐｒｒｓ感染に対して毎年繰返されうる。ＰＲＲＳに関しては、飼養場におけるＰＲＲＳ感染圧に応じて、必要だと判断される場合には６ヵ月ごと（または更には３ヵ月ごと）にワクチン接種が繰返されうる。より短い間隔でのそのような再ワクチン接種は、生弱毒化ＰＲＲＳウイルスと共にエリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）の非複製性免疫原を含む混合ワクチンを使用して行われうる。レプトスピラおよびパルボウイルスに関しては、レプトスピラおよびパルボウイルスワクチンがブタにおいては約１年の免疫持続期間を有しうるので、そのような短期間の再ワクチン接種は典型的には必要だとはみなされない。
【００４０】
結論としては、新規混合ワクチンの安全性および有効性は十分だと言うことができる。追加的な血清学的データ（特にブタパルボウイルスおよびレプトスピラ細菌に関するもの）および／またはチャレンジデータ（特にＰＲＲＳウイルスおよびエリジペロスリックス・ルジオパシエに関するもの）を用いて、対応病原体のそれぞれに関する該新規混合ワクチンの有効性を確認することが可能である。
【００４１】
実験３：ＥＰＬ／ＰＲＲＳ混合ワクチンの血清学的結果
この実験の目的は、Ｅｒｙ＋Ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｅｒｙ＋Ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ）とＰＲＲＳ生ワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ）との提携混合使用の場合の血清学的反応を、それらの単独のワクチンと比較して確認することであった。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳは通常は１回投与され、一方、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｅｒｙ＋Ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ（ＥＰＬ）の基本ワクチン接種は４週間隔の２回のワクチン接種からなる。したがって、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳは、ＥＰＬ初回ワクチン接種中またはＥＰＬ追加ワクチン接種中に同時投与されうる。この研究においては、両方の混合選択肢を試験した。
【００４２】
この研究のために、６４頭の２０週齢のブタ（全てのワクチン成分に関して血清陰性）を使用し、それぞれ１６頭の動物の４群に割り当てた。群１は、２０週齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＥＰＬ＋Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳを、そして２４週齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＥＰＬをワクチン接種した。群２は、２０週齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＥＰＬを、そして２４週齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＥＰＬ＋Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳをワクチン接種した。群３は、２０週齢および２４週齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＥＰＬをワクチン接種した。群４は、２０週齢でＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳをワクチン接種した。ワクチン接種後２０週間の間に血液を定期的に採取し、血清をそれぞれの血清学的試験で試験した。
【００４３】
試験開始時に動物が血清陰性であり、かつ、各対照群における少なくとも１０頭がワクチン接種から除外された成分に関して血清陰性のままである、すなわち、群４がＥｒｙ、ｐａｒｖｏおよびレプトスピラに関して陰性であり、そして、群３がＰＲＲＳに関して陰性であるならば、試験が妥当であったと言える。これらの基準は満たされた。抗原ごとの全体的な結果は後記に記載されている。
【００４４】
ＰＲＲＳ血清学（ＰＲＲＳ  Ｘ３試験、ＩＤＥＸＸを使用）
研究開始時には、ほとんどの動物が血清陰性であった。提携混合使用ワクチン接種（群１および２）の後の応答は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ単独（群４）と少なくとも同程度に良好であり、一方、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ単独の群３は低レベルのままであった。したがって、２０週齢または２４週齢での提携混合使用は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳのＰＲＲＳ成分に悪影響を及ぼさなかったと結論づけられうる。
【００４５】
Ｅｒｙ血清学（ＣＩＶＴＥＳＴ  ｓｕｉｓ  ＳＥ／ＭＲ、Ｈｉｐｒａを使用）
研究開始時には、ほとんどの動物が血清陰性であった。提携混合使用ワクチン接種（群１および２）の後の応答はＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ単独（群３）と少なくとも同程度に良好であり、一方、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ単独の群４は低レベルのままであった。したがって、２０週齢または２４週齢での提携混合使用は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋ＬｅｐｔｏのＥｒｙ成分に悪影響を及ぼさなかったと結論づけられうる。
【００４６】
パルボ（Ｐａｒｖｏ）血清学（自家製ＨＩテストおよびＩＮｇｅｚｉｍ  ＰＰＶテスト，Ｉｎｇｅｎａｓａを使用）
ＨＩ試験は、感染後のパルボ（Ｐａｒｖｏ）抗体を検出するためにしばしば使用されるが、ワクチン接種後、多数の不応答体が見いだされるので、ワクチン接種後の血清学的研究にはそれほど適していない。したがって、この抗原は、ＨＩ試験、並びに、より高感度の商業的に入手可能なＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【００４７】
研究開始時には、どちらの試験においてもほとんどの動物が血清陰性であった。提携混合使用ワクチン接種（群１および２）の後の応答は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ単独（群３）と少なくとも同程度に良好であり、一方、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ単独の群４は低レベルのままであった。したがって、２０週齢または２４週齢での提携混合使用は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏのパルボ（Ｐａｒｖｏ）成分に悪影響を及ぼさなかったと結論づけられうる。
【００４８】
レプト（Ｌｅｐｔｏ）血清学（自家製血清群特異的ＥＬＩＳＡを使用）
感染後のレプトスピラ抗体を検出するためには、一般に、ＭＡＴ（ミクロ凝集反応）試験が用いられる。しかし、この試験は、ＩｇＭ抗体を主に測定し、それは、短寿命であり主に初回ワクチン接種後に誘導され、一方、主にＩｇＧ抗体は追加ワクチン接種後に誘導される。加えて、幾つかの血清型はＭＡＴ試験においてはほとんど応答せず、このことによっても、この試験は血清学的研究にはそれほど適していない。ＩｇＧは防御に関与しておりそしてＭＡＴ試験はそれほど適していないため、血清型特異的抗体ＥＬＩＳＡを社内で開発し、検証した。この研究においては、これらの血清型特異的阻害ＥＬＩＳＡを用いて、血清型特異的ＩｇＧ応答を測定した。
【００４９】
研究開始時には、全ての動物が血清陰性であった。提携混合使用ワクチン接種（群１および２）の後の応答は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏ単独（群３）と少なくとも同程度に良好であり、一方、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ単独の群４は低レベルのままであった。したがって、２０週齢または２４週齢での提携混合使用は、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋ｐａｒｖｏ＋ＬｅｐｔｏのＬｅｐｔｏ成分のいずれにも悪影響を及ぼさなかったと結論づけられうる。加えて、抗体価の経時的低下は類似プロファイルを示し、このことは、免疫の持続期間も影響を受けないことを示唆している。
【００５０】
結論としては、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳとＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｅｒｙ＋Ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏとの提携混合使用の後の抗体反応はいずれかのワクチン単独でのワクチン接種の後と少なくとも同程度に高く、したがって、ワクチン接種および免疫レベルは提携混合使用による悪影響を受けないと結論づけられうる。同様に、抗体力価の経時的低下は類似プロファイルを示し、このことは、全てのワクチン成分に関する免疫の持続期間も提携により悪影響を受けないことを示している。
【００５１】
実験４：Ｅｒｙ＋Ｐａｒｖｏ＋Ｌｅｐｔｏとの混合ワクチンにおける最小用量でのＰＲＲＳの有効性
この実験の目的は、ＥＰＬワクチンにおいて４．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／動物の最小用量で再構成された生弱毒化ＰＲＲＳＶ  ２型ワクチン（Ｐｒｉｍｅ  Ｐａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ）の有効性を評価することであった。
【００５２】
ＰＲＲＳＶに関して血清反応陰性の６６頭の５週齢の子ブタをこの研究に含めた。ＥＰＬ製剤（群１；再構成とワクチン接種との間に２５℃で１時間の待機時間）において又はディルバック・フォルテ（Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ）（群２）において再構成されたＰｒｉｍｅ  Ｐａｃ（登録商標）ＰＲＲＳの最小用量を、子ブタの頚部の右側の筋肉内にワクチン接種した。群３における子ブタには、同じＥＰＬ製剤の２ｍｌを頚部の右側の筋肉内にワクチン接種し、ＰＲＲＳチャレンジ対照として用いた。ワクチン接種後第４週に、毒性ＰＲＲＳＶ  ２型株，ネブラスカ（Ｎｅｂｒａｓｋａ）−１の５．０  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０の用量で、鼻腔内（ＩＮ）経路により鼻孔当たり１ｍｌで子ブタをチャレンジした。ワクチン接種の日、チャレンジの日、チャレンジの５、７、１０、１４および２８日後に、子ブタからの血液サンプルを採取した。チャレンジの１日前、チャレンジの直前、チャレンジの４時間後、およびその後チャレンジの１日後から１０日後まで毎日、直腸温度を測定した。チャレンジの前日、チャレンジの９日後および２５日後、体重を測定した。チャレンジ後第１０日に、群当たり１１頭のブタを安楽死させ、肺病変に関して観察した。チャレンジ後第２８日に、残りの子ブタを安楽死させた。
【００５３】
体温および体重
体温に関しては、ワクチン群のそれぞれにおいて、体温は対照群３の場合より低かった。混合使用群１とＰｒｉｍｅＰａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ単独群（群２）との間に差異がないことも判明した。体重に関しては、ワクチン接種動物は群３における非ワクチン接種動物より早く成長した。混合使用群１における動物は、Ｐｒｉｍｅ  Ｐａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ単独群（群２）における動物と同様の速度で成長することも判明した。
【００５４】
肺病変スコア
チャレンジ後第１０日に群当たり合計１１頭の動物のうちの半分の動物を安楽死させて、ＰＲＲＳ関連肺炎に関してそれらの肺を観察した。表３は、群当たりの視認可能な肺炎に罹患した肺の平均推定百分率を示す。この表から、一般に、ＰＲＲＳＶチャレンジ株は平均して肺病変をほとんど引き起こさなかったと結論づけられうる。それでも、ワクチン接種後第１０日に、ワクチン接種動物は、対照より少ない肺病変を示した。全体として、混合使用群とＰｒｉｍｅＰａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ単独群との間に大きな差異は見られなかった。
【表３】
2019535786.tif 000004
【００５５】
血清学的反応
ワクチン接種の日に、全ての動物はＰＲＲＳＶに関して血清陰性であり、このことは、ＰＲＲＳＶ陰性動物がこの研究に使用されたことを示している。ワクチン未接種対照群における動物は、チャレンジの日（すなわち、ワクチン接種の４週間後）まで血清陰性のままであった。一方、チャレンジの日に、ワクチン接種群に関しては抗体応答が測定され、このことは、混合使用群１およびＰｒｉｍｅ  Ｐａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ単独群（群２）の両方における動物がＰＲＲＳワクチン接種によって成功裏に感作されたことを示している。チャレンジ後のより遅い時点、すなわち、１０および２８ｄｐｃにおいて、抗体レベルの高さの上昇が観察されたが、これは、おそらく、チャレンジにより引き起こされたものである。
【００５６】
ＰＲＲＳウイルス血症
群当たりの平均ウイルス力価を表４に表す。この表は、ワクチン接種動物（群１および２）が、対照動物（群３）と比較して、平均して減少したそれらの血清中のウイルス量を有することを明らかに示している。ワクチン接種群のそれぞれの間でウイルス血症の高さにはほとんど差がない。
【表４】
2019535786.tif 000005
【００５７】
結論としては、最低用量（すなわち、ラベル表示による下限）においてさえも、ＥＰＬ製剤中で再構成された市販ワクチンＰｒｉｍｅ  Ｐａｃ（登録商標）ＰＲＲＳは動物を適切に血清転換し、病原性ＰＲＲＳＶに対する防御が得られることが確認された。
【国際調査報告】
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2019535786.tif 000007
2019535786.tif 000008