(57)【要約】【課題】本発明は、熱安定性に優れた高温活性及び耐熱性を有する新たなポリリン酸依存性グルコキナーゼ、これを含む組成物及びこれを用いたグルコース６−リン酸の製造方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼ。
【請求項２】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼは、配列番号１のＤＮＡ配列から発現されたことを特徴とする、請求項１に記載のポリリン酸依存性グルコキナーゼ。
【請求項３】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼは配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリリン酸依存性グルコキナーゼ。
【請求項４】
アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼ、グルコース及びポリリン酸を含む、グルコース６−リン酸を製造するための組成物。
【請求項５】
前記組成物の全容積を基準に、前記グルコース１重量％〜３重量％、前記ポリリン酸塩１〜１０重量％、前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼ１０〜５０Ｕ／ｍｌを含むことでグルコース６−リン酸への転換収率が７０％以上であることを特徴とする、請求項４に記載のグルコース６−リン酸を製造するための組成物。
【請求項６】
前記組成物の全容積基準に、前記グルコース５重量％〜２０重量％、前記ポリリン酸塩５〜１２重量％、前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼ１０〜５０Ｕ／ｍｌを含むことでグルコース６−リン酸への転換収率が５０％以上であることを特徴とする、請求項４に記載のグルコース６−リン酸を製造するための組成物。
【請求項７】
前記組成物はマグネシウムイオンをさらに含むことを特徴とする、請求項５又は６に記載のグルコース６−リン酸を製造するための組成物。
【請求項８】
前記マグネシウムイオンの濃度は０．２ｍＭ〜２０ｍＭであることを特徴とする、請求項７に記載のグルコース６−リン酸を製造するための組成物。
【請求項９】
前記グルコース６−リン酸は４５℃〜９０℃の温度および／またはｐＨ４〜ｐＨ１０の条件で製造されたことを特徴とする、請求項４に記載のグルコース６−リン酸を製造するための組成物。
【請求項１０】
アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼ、グルコース及びポリリン酸を含む組成物からグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１１】
前記グルコースは澱粉またはセルロースを液化または糖化させたものであることを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１２】
前記ポリリン酸塩はヘキサメタリン酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１３】
前記グルコース６−リン酸の製造は４５℃〜９０℃の温度および／またはｐＨ４〜ｐＨ１０の条件で行われることを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１４】
前記組成物がマグネシウムイオンをさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１５】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼの含量は１０Ｕ／ｍｌ〜５０Ｕ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１６】
前記グルコースは前記組成物の 重量 を基準に０．１重量％〜４０重量％であることを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１７】
前記ポリリン酸塩は前記組成物の 重量 を基準に０．５重量％〜２５重量％であることを特徴とする、請求項１０に記載のグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１８】
アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼ、糖化酵素、澱粉およびポリリン酸塩を含む組成物からグルコース６−リン酸を製造する方法。
【請求項１９】
前記糖化酵素は、α-アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα-グルコシダーゼのいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載のグルコース６−リン酸の製造方法。
【請求項２０】
請求項３に記載のポリリン酸依存性グルコキナーゼをコードする遺伝子を備える組換え発現ベクター。
【請求項２１】
配列番号１の遺伝子を備える組換え発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋ、ＫＣＣＭ１１８１４Ｐ）。
【請求項２２】
アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼ、グルコースまたは澱粉、ポリリン酸塩、および追加酵素と反応して、
グルコース１−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、フルクトース６−リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、フルクトース１，６−二リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ミオイノシトール３−リン酸（Ｄ−ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ミオイノシトール（Ｄ−ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、グルクロン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、グルコサミン６−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、グルコサミン（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ−アセチルマンノサミン６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｏｓａｍｉｎｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ−アセチルニューラミン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、マンノース６−リン酸（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）、タガトース６−リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、タガトース（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ）、アルロース６−リン酸（Ｄ−ａｌｌｕｌｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アルロース（Ｄ−ａｌｌｕｌｏｓｅ）、グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ジヒドロキシアセトンリン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のいずれか一つ以上を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなポリリン酸依存性グルコキナーゼ、前記グルコキナーゼを含む組成物、及びこれを用いたグルコース６−リン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体代謝において重要なリン酸化化合物であるグルコース６−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、解糖系（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ）、ペントースリン酸経路（ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ）及びヘキソサミン生合成経路（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ）などによって非常に様々な代謝産物に転換することができるため産業的に重要な化合物である。グルコース６−リン酸から一連の連鎖酵素反応を利用して、特定の高付加価値化合物を製造しようとする生物工程では、グルコース６−リン酸の経済的製造方法が非常に重要である。
【０００３】
今までグルコース６−リン酸を酵素的に製造するためには、原料のグルコースにアデノシン二リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＡＤＰ）またはアデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＡＴＰ）のリン酸基（ＡＤＰを利用する場合にはβ−リン酸基、ＡＴＰを利用する場合にはγ−リン酸基）を転移するＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ、ＥＣ  ２．７．１．１４７）またはＡＴＰ依存性グルコキナーゼ（ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ，ＥＣ  ２．７．１．２）を利用することと、原料のグルコースにリン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のポリマーであるポリリン酸［ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｐｏｌｙ（Ｐｉ）ｎ］のリン酸基を転移するポリリン酸依存性グルコキナーゼ［Ｐｏｌｙ（Ｐｉ）ｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ、ＥＣ  ２．７．１．６３］を利用する方法が報告されている。
【０００４】
製造工程の経済性と安定性の面で、ＡＤＰまたはＡＴＰ依存性グルコキナーゼを用いてグルコース６−リン酸を生産する方法はリン酸基供与体として高価のＡＤＰまたはＡＴＰを必要とする短所がある。この解決手段として脱リン酸化で生成されたＡＭＰまたはＡＤＰにＰｏｌｙ（Ｐｉ）ｎのリン酸基を転移するポリリン酸−ＡＭＰ／ＡＤＰリン酸転移酵素（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＡＭＰ／ＡＤＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を併用使用してＡＤＰまたはＡＴＰを再生する方法が報告されているが、アデニンヌクレオチド（ａｄｅｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ）が物理化学的（熱、ｐＨなど）に安定性が高くないなどの問題点があって実用化には限界がある。
［反応式１］
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【０００５】
一方、ポリリン酸依存性グルコキナーゼを利用してグルコース６−リン酸を生産する方法は、リン酸基供与体として比較的低価で安定なＰｏｌｙ（Ｐｉ）ｎを使用してグルコース６−リン酸を直接生産することができる。したがってＡＤＰまたはＡＴＰ−依存性グルコキナーゼを利用してグルコース６−リン酸を生産する方法よりも製造工程において経済的かつ実用化の面で優秀な製造方法であると言える。
［反応式２］
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ポリリン酸依存性グルコキナーゼ、前記酵素を含む組成物、およびこれを用いたグルコース６−リン酸の生産方法に関する。特定化合物の酵素的製造工程の効率化の面で酵素の安定性は非常に重要な特性である。しかし、今まで本発明に係るポリリン酸依存性グルコキナーゼはいくつかの微生物種で限定的に報告され、分離された酵素のほとんどは中温性微生物由来の酵素であって熱安定性などが低いと報告されている（表１）。これを解決するために本発明は、好熱性微生物から安定性に優れた高温性及び耐熱性の新たなポリリン酸依存性グルコキナーゼ、前記酵素を含む組成物、およびこれを用いたグルコース６−リン酸の生産方法を提供する。
【表１】
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【０００７】
生体代謝において解糖系（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ｐａｔｈｗａｙ）とペントースリン酸経路（ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ）のリン酸化化合物であるグルコース６−リン酸（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は様々な代謝産物に変換することができるため産業的に非常に有用なリン酸化化合物である。グルコース６−リン酸から一連の連鎖酵素反応を利用して高付加価値産物を生産しようとする工程は、グルコース６−リン酸の経済的製造工程の方法が必要である。
【０００８】
一般的に、生体代謝でグルコースをグルコース６−リン酸に酵素的に転換するためにはリン酸基供与体としてＡＴＰまたはＡＤＰを使用し、前記反応経路で使用するＡＴＰまたはＡＤＰが高価格であるためグルコース６−リン酸の酵素的製造工程の商業的開発には限界がある。また、微生物発酵で生産されたグルコース６−リン酸は細胞膜の透過ができないため生産方法として適当ではない。
【０００９】
リン酸基供与体としてリン酸の重合体であるＰｏｌｙ（Ｐｉ）ｎ（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は自然界に多く存在し、化学的製法でも経済的に安価で生産することができるため商業的に高価値の化合物である。したがって、酵素とこれらのＰｏｌｙ（Ｐｉ）ｎを利用して、グルコースからグルコース６−リン酸を効率的に製造する方法を開発することは商業的に非常に重要である。
【００１０】
しかし、従来報告されたＰｏｌｙ（Ｐｉ）ｎを用いたグルコース６−リン酸の生産酵素のほとんどは反応温度および熱安定性が低いため工程の適用には限界がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、好熱性微生物由来の高温活性及び耐熱性に優れた新たなポリリン酸依存性グルコキナーゼ及びこれを用いたグルコース６−リン酸の生産方法を提供する。
【００１２】
以下、本発明の様々な態様について詳細に説明する。
【００１３】
具体的に本発明の一態様は、アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の高温活性及び耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼを提供する。
【００１４】
具体的に、前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼは配列番号２のアミノ酸配列に記載のものであり、前記配列と７０％以上、具体的に８０％以上、さらに具体的に９０％以上、より一層具体的に９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列であり、実質的に前記酵素と同一または相当するポリリン酸依存性グルコキナーゼを構成するタンパク質であれば制限なく含まれる。また、前記相同性を示す配列として実質的にポリリン酸依存性のグルコースリン酸化機能を表すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、置換、または挿入されたタンパク質変異体であっても本発明の範囲内に含まれるのは自明である。
【００１５】
本発明における用語、「相同性」は、共通進化起源の共有に関係なく特定のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の同一性や相当性の程度を意味し百分率で表示できる。本明細書では、特定のポリペプチド配列、またはポリヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」で表示される。例えば、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）と類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ  ２．０を利用するか、厳格に定義された条件下で用いたハイブリダイゼーション実験によって配列を比較することで確認することができ、定義された適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知の方法で決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９．ｉｎｆｒａを参照）。ある具体例で、二つのアミノ酸配列がアミノ酸配列の所定の長さにおいてポリペプチドのマッチが少なくとも２１％（具体的には、少なくとも約５０％、特に約７５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％）であるとき、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。
【００１６】
さらに、本発明の他の態様は、アナエロリネア（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ）属由来の耐熱性のポリリン酸依存性グルコキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的に本発明は、配列番号１の塩基配列に記載されてポリリン酸依存性グルコキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明における用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが共有結合によって長く鎖状に連なったヌクレオチドのポリマーであり、一般的に所定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。
【００１７】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、前記配列番号２のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を備える。前記ポリヌクレオチドはコドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、または前記酵素を発現する生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えない範囲内でコーディング領域において様々な変更が可能である。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１のポリヌクレオチド配列を備える。また、前記配列と７０％以上、具体的に８０％以上、さらに具体的に９０％以上、より一層具体的に９５％以上、最も具体的には９８％以上の相同性を示すヌクレオチド配列であり、実質的にポリリン酸依存性グルコースリン酸化の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを備える。また、一部の配列が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列を有する変異体も本発明の範囲に含まれるのは自明である。
【００１８】
グルコース６−リン酸を製造するための組成物は、当該組成物の全容積を基準に、グルコース１重量％〜３重量％、ポリリン酸塩（Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）１〜１０重量％、ポリリン酸依存性グルコキナーゼ１０〜５０Ｕ／ｍｌ、および任意に１〜２０ｍＭのマグネシウムイオン（例えば、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２）の条件下で転換収率が７０％以上、具体的に８０％以上、より具体的に９０％以上である。
【００１９】
具体的にグルコース２重量％、ポリリン酸塩１．５重量％、ポリリン酸依存性グルコキナーゼ１０〜５０Ｕ／ｍｌ、及び任意に１０ｍＭのＭｇＳＯ４の条件で転換収率が６０％以上であり、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％以上である。
【００２０】
グルコース６−リン酸を製造するための組成物は、当該組成物の全容積を基準にグルコース５重量％〜２０重量％、ポリリン酸塩５〜１２重量％、ポリリン酸依存性グルコキナーゼ１０〜５０Ｕ／ｍｌ、及び任意に１〜２０ｍＭのマグネシウムイオン（例えば、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２）を含むことで、グルコース６−リン酸への転換収率が５０％以上、具体的に６０％以上、より具体的に７０％以上になる。
【００２１】
具体的に、組成物の全容積を基準に、前記グルコース１５重量％、ポリリン酸塩１０重量％、ポリリン酸依存性グルコキナーゼ１０〜５０Ｕ／ｍｌ、及び任意に１０ｍＭのＭｇＳＯ４の条件で転換収率が５０％以上であり、より具体的に６０％以上、より具体的に６５％以上である。
【００２２】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼは４５℃〜９０℃で活性を示し、より具体的に５５℃〜８０℃、最も具体的に６５℃〜７０℃で活性を示す。
【００２３】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼはｐＨ４〜ｐＨ１０で活性を示し、最も具体的にはｐＨ４〜ｐＨ５で活性を示す。
【００２４】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼは、マグネシウムイオンの存在下で活性が増加する。
【００２５】
前記マグネシウムの濃度は、具体的に０．５ｍＭ〜２０ｍＭであり、より具体的に０．２ｍＭ〜１０ｍＭ、最も具体的には１ｍＭである。
【００２６】
本発明のさらに他の一態様は、本願に開示されたポリリン酸依存性グルコキナーゼ、グルコース及びポリリン酸塩を含む組成物に関する。
【００２７】
前記組成物はさらにマグネシウムイオンを含むことができる。前記組成物はグルコース６−リン酸の製造に使用される。当該態様において、各成分との含量などの詳細な説明は、前記態様あるいは下記の態様で説明した内容と同様であるので、これに対する詳細な記載は省略する。
【００２８】
本発明の更に他の一態様は、本願に開示されたポリリン酸依存性グルコキナーゼ、グルコース及びポリリン酸塩を含む組成物からグルコース６−リン酸を製造する方法を提供する。
【００２９】
前記製造反応条件は、４５℃〜９０℃の温度、ｐＨ４〜ｐＨ１０である。
【００３０】
前記グルコースは澱粉またはセルロースを液化または糖化させたものであり得る。
【００３１】
前記ポリリン酸塩はリン酸基の供与体であり、例えば、ヘキサメタリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、トリポリリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ヘキサメタリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などがあるが、これらに限定されなく市販の物も使用できる。
【００３２】
前記グルコース６−リン酸の製造温度は４５℃〜９０℃であり、より具体的には５５℃〜８０℃、最も具体的には６５℃〜７０℃である。
【００３３】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼの分子量は１０ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、具体的に２０ｋＤａ〜５０ｋＤａである。
【００３４】
前記グルコース６−リン酸の製造には、マグネシウムイオン、例えば、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４をさらに含むことができる。具体的にＭｇＳＯ４をさらに含む。
【００３５】
前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼの含有量は１０Ｕ／ｍｌの〜５０Ｕ／ｍｌである。
【００３６】
前記グルコースは全体組成物の容積を基準に、０．１重量％〜４０重量％であり、より具体的には１重量％〜２０重量％、最も具体的には１重量％〜１０重量％である。
【００３７】
前記ポリリン酸塩は、全組成物の容積を基準に０．５重量％〜２５重量％であり、より具体的には１重量％〜２０重量％、最も具体的には１重量％〜１０重量％である。
【００３８】
本発明のさらに他の一態様は、本願に記述されたポリリン酸依存性グルコキナーゼ、糖化酵素、澱粉およびポリリン酸塩を含む組成物からグルコース６−リン酸を製造する方法を提供する。
【００３９】
前記製造反応条件は、４５℃〜９０℃の温度、ｐＨ４〜ｐＨ１０である。
【００４０】
前記糖化酵素は、α-アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα-グルコシダーゼの１つ以上である。
【００４１】
本発明のさらに他の一様態は、前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼを生産する微生物、具体的にエスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）の微生物を提供する。
【００４２】
本発明における用語「ポリリン酸依存性グルコキナーゼを生産する微生物」とは、本酵素を生物内で生産できる原核または真核の微生物菌株であって、具体的には遺伝的操作又は自然突然変異により本酵素を培地または微生物の体内で蓄積することができる微生物を意味する。
【００４３】
具体的に前記微生物は、配列番号２のポリペプチドを発現する微生物であれば特にその種類は限定されず、原核細胞または真核細胞の両方が可能であるが、具体的に原核細胞である。例としてエスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌株が含まれ、具体的にはエスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物であり、例えばエスケリキア・コリー（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明における用語「発現」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作動可能に備える組み換えベクターで形質転換されるか、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に挿入されて達成できるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体に挿入されて位置するか染色体以外に位置するかに関係なく、その両方を含む。また、前記ポリヌクレオチドは標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは宿主細胞内に導入されて発現さえでれば、いかなる形で導入されても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自発的発現に必要なすべての要素を備えた遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞への導入が可能であるが、これに限定されない。前記発現カセットは通常、前記ポリヌクレオチドで作動可能に連結したプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終了シグナルを備える。前記発現カセットは自己複製が可能な発現ベクターであり得る。また、前記ポリヌクレオチドはその自体形態のままで宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結される。
【００４６】
また、前記「作動可能に連結」という用語は、本発明における目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始および媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結したことを意味する。
【００４７】
本発明における用語「ベクター」は、宿主細胞に塩基のクローニングおよび／または転移する任意の媒体をいう。ベクターは他のＤＮＡ断片が結合し結合された断片の複製ができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であり得る。「複製単位」とは生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自己調節によって複製が可能である任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。「ベクター」は試験管内、生体外または生体内で宿主細胞に塩基を導入するためのウイルスおよび非ウイルス媒介物を含み、また、小環状ＤＮＡを含む。例えば、前記ベクターはバクテリアＤＮＡの配列を持たないプラスミドである。ＣｐＧ領域で豊富なバクテリアＤＮＡ配列の除去は、転移遺伝子発現サイレンシングを減少させ、プラスミドＤＮＡベクターによる発現を持続させるために行われる（例えば、Ｅｈｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３．  ＨｕｍＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：２１５−２５；Ｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  ＭｏＩ  Ｔｈｅｒ  ５：７３１−７３８；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：８５６−８６４）。また、前記ベクターはトランスポゾン（Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２００３．  ３７：３−２９）、または人工染色体を含む。具体的に、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ１９２０、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２およびｐＭＷ１１８ベクターやこれらのプロモーターなどを変異させた変異ベクターなどを使用することができるが、これらに限定されない。
【００４８】
特に本発明のベクターは、適切な宿主内で目的タンパク質が発現さえできれば適切な発現調節配列と作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を備えるＤＮＡ製造物であり得る。前記発現調節配列は、転写を開始させるプロモーター、この転写を調節する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列と、転写および翻訳の終結を調節する配列を備える。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製されて機能し、ゲノムに統合されることもできる。
【００４９】
本発明で使用するベクターは宿主細胞内で複製さえできれば特に限定されず、当業界で知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例として、天然又は組換えプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージがある。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥ１５、λＥ１５１５、Ｍ１３または／およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどの使用が可能であるが、これらに限定されない。プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などの使用が可能であるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明は、前記ポリリン酸依存性グルコキナーゼをコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００５１】
本発明は、配列番号１の遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換されたことを特徴とする、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋ）（受託機関：韓国微生物保存センター、受託日：２０１６．０２．１６．、受託番号：ＫＣＣＭ１１８１４Ｐ）を提供する。
【００５２】
本発明は、ポリリン酸及びグルコースまたは澱粉から本発明の酵素と追加機能を有する酵素（α−ａｍｙｌａｓｅ、ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ、α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ａｌｄｏｌａｓｅ、ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｋｉｎａｓｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅなど）を用いたｏｎｅ−ｐｏｔ酵素反応（ｏｎｅ−ｐｏｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ）を利用し、下記の様々な化合物を経済的に製造する方法を提供する。
【００５３】
産業的に有用である様々な化合物は、グルコース１−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、フルクトース６−リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、フルクトース１，６−二リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ  １，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ミオイノシトール３−リン酸（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ミオイノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、グルクロン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、グルコサミン６−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、グルコサミン（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ−アセチルグルコサミン６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ−アセチルマンノサミン６−リン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｏｓａｍｉｎｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｍａｎｏｓａｍｉｎｅ）、Ｎ−アセチルニューラミン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、マンノース６−リン酸（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、マンノース（Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ）、タガトース６−リン酸（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、タガトース（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ）、アルロース６−リン酸（Ｄ−ａｌｌｕｌｏｓｅ  ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アルロース（Ｄ−ａｌｌｕｌｏｓｅ）、グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ジヒドロキシアセトンリン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などがあり、これらに限定されなくグルコース６−リン酸を用いた様々な化合物を含むことができる。
【発明の効果】
【００５４】
本発明の酵素は、高温で酵素反応ができるため、高温の反応工程で基質［グルコース、Ｐｏｌｙ（Ｐｉ）ｎ］の溶解度を増加させて高濃度で基質の使用が可能であり、物質拡散速度の増加、反応速度の増加、反応時間の短縮などにより単位生産性が向上する。また、高温の酵素反応工程で外部微生物などによる工程汚染を最小限に抑えることができる。また、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅｔｙ）微生物で本発明の酵素を大量に組換え発現した後に耐熱性の特性を利用し死菌化した菌体で利用する場合、高温で熱処理する方法で効果的に組換え微生物を死菌化できるだけでなく、組換え酵素を分離して利用する場合にも遺伝子組換え微生物由来のタンパク質を選択的に変性させて除去することができ、酵素の精製工程の効率化が可能な利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の製造方法をフローチャート（ｆｌｏｗ−ｃｈａｒｔ）で示した。
【００５６】
【図２】グルコースとＡＴＰが反応した反応式である。
【００５７】
【図３】グルコースとポリリン酸が反応した反応式である。
【００５８】
【図４】細胞破砕上澄み液（ＣＦＥ）、タンパク質のサイズ測定マーカー（Ｍ）と精製された組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼ（ＰＥ）のタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析結果である。
【００５９】
【図５】組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼのｐＨによる活性を示したグラフである。
【００６０】
【図６】組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの温度による活性を示したグラフである。
【００６１】
【図７】組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの金属イオンの種類による活性を示したグラフである。
【００６２】
【図８】組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの熱処理温度による活性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
現在、比較的低価の炭素源であって大量生産が可能な澱粉またはセルロース由来のグルコースは、化学、医薬、化粧品、食品産業において有用で様々な化合物を生産するために、化学的または生物学的転換工程の基礎原料で使用される。
【００６４】
しかし、特に生物工程中の酵素的転換工程で基礎原料のリン酸化グルコースは現在高価であるためその活用は非常に制限的である。
【００６５】
産業的側面で、グルコース代謝の非常に重要な代謝産物であるグルコース６−リン酸は自然界（生物体）に存在する様々な代謝酵素を利用する時に非常に有用な反応を誘導する基礎原料として用いられる。
【００６６】
したがって、本発明は、産業的に様々な有用化合物を生産できる原料であるグルコース６−リン酸をグルコース及びポリリン酸塩から経済的に生産する酵素と酵素的製造方法を提供しようとする。
【００６７】
また本発明は、グルコース６−リン酸及び製造方法を活用し、医薬、化粧品、食品産業で酵素的に製造可能な高付加価値機能性化合物を提供しようとする。
【実施例１】
【００６８】
ポリリン酸依存性グルコキナーゼの遺伝子を含む組換え発現ベクターおよび形質転換微生物の製造
【００６９】
本発明の高温活性及び耐熱性の特性を有する新たなポリリン酸依存性グルコキナーゼを提供するために、好熱性微生物であるアナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼの遺伝子を分離し、組換え発現ベクターおよび形質転換微生物を製造した。
【００７０】
具体的に、Ｇｅｎｂａｎｋに登録された遺伝子配列を対象に、本発明の酵素に関連する遺伝子配列を選抜し、これらの中から好熱性微生物由来の遺伝子配列だけを選定した。遺伝子塩基配列［配列番号１］とアミノ酸配列［配列番号２］で登録されたアナエロリネア・サーモフィラの遺伝子の塩基配列をもとに、順方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ、配列番号３）と逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、配列番号４）を考案した。合成したプライマーを用いてアナエロリネア・サーモフィラの染色体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）から該当遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、増幅されたポリリン酸依存性グルコキナーゼ遺伝子は制限酵素のＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて大腸菌発現用プラスミドベクターのｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入してＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋと命名された組換え発現ベクターを作製した。ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋは通常の形質転換方法［参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．］で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋと命名された形質転換微生物を製造した。
【実施例２】
【００７１】
組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの製造
【００７２】
組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼを製造するためには、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ａｔ＿ｐｐｇｋをＬＢ液体培地５ｍｌが含まれた培養チューブに接種し、６００ｎｍにおける吸光度が２．０になるまで３７℃の振とう培養器で種菌培養した。本種菌培養された培養液をＬＢ液体培地が含まれた培養フラスコに接種して本培養した。６００ｎｍにおける吸光度が２．０になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加して組換え酵素の発現生産を誘導した。前記培養過程中の撹拌速度は２００ｒｐｍで培養温度は３７℃を維持した。培養液は８，０００×ｇと４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液で２回洗浄し、同じ緩衝液で懸濁後、超音波細胞破砕機を用いて細胞を破砕した。細胞破砕物は１３，０００×ｇと４℃で２０分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。組換え酵素は、前記上澄み液からＨｉｓ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製された組換え酵素液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液で透析した後、酵素の特性分析で使用した。
【００７３】
図４のＭはタンパク質のサイズ測定マーカー（ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒ）であり、ＣＦＥは細胞破砕上澄み液、ＰＥは精製された酵素である。精製された組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で約２８ｋＤａであることを確認した（図４）。
【実施例３】
【００７４】
組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの活性の分析
【００７５】
活性を分析するための反応組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液に懸濁された４％（ｗ／ｖ）グルコース、３％（ｗ／ｖ）のヘキサメタリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と１ｍＭのＭｇＣｌ２を用いた。前記反応組成物に０．１ｍｇ／ｍｌの精製酵素を添加して６０℃で１５分間反応後、ＨＰＬＣを用いて反応物を分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）カラムを使用し、８０℃で移動相として５ｍＭのＨ２ＳＯ４溶液を０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しながら行い、Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒでグルコース６−リン酸の検出と分析を実施した。
【００７６】
分析の結果、組換え精製酵素の反応物でグルコース６−リン酸の生成が確認された。
【実施例４】
【００７７】
ｐＨによる組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの活性の分析
【００７８】
本発明の酵素にいてｐＨの影響性を調べるための反応組成物は、様々なｐＨの５０ｍＭ緩衝溶液（ｐＨ４〜７、ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ；ｐＨ４〜７、ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ；ｐＨ７〜１０、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）に懸濁された４％（ｗ／ｖ）グルコース、３％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び１ｍＭのＭｇＣｌ２を使用した。前記各反応組成物に０．１ｍｇ／ｍｌの精製酵素を添加して６０℃で１５分間反応後、ＨＰＬＣを用いてグルコース６−リン酸を定量分析した。
【００７９】
その結果、図５に示すように、本発明のアナエロリネア・サーモフィラ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼは従来報告された酵素と異なり、ｐＨ４〜５近くの酸性で最大活性を示し、前記ｐＨに該当する緩衝溶液の中で酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）緩衝溶液で最も高い活性を示すことを確認した。また、ｐＨ調整４〜１０にわたる非常に広い範囲で最大活性の７０％以上の活性を示した（図５）。
【００８０】
このように本発明のポリリン酸依存性グルコキナーゼが有する好酸性及び高温活性の新たな特性は、澱粉デキストリン（ｄｅｘｔｒｉｎ）糖化酵素であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のグルコアミラーゼ［Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来の商用化した糖化酵素ＡＭＧ  ３００Ｌ（ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）、最適活性ｐＨ４．５、温度６０℃］などと一緒に使用する場合、澱粉デキストリンからグルコース６−リン酸を効率的に生産することができる。また、ｐＨ４〜１０にわたる広い範囲で最大活性の７０％以上の活性を有する本発明の酵素特性は産業的活用性が非常に高いと言える。
【実施例５】
【００８１】
温度による組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの活性の分析
【００８２】
温度による組換え酵素の活性を分析するための反応組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液に懸濁された４％（ｗ／ｖ）グルコース、３％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び１  ｍＭのＭｇＣｌ２を使用した。前記反応組成物に０．１ｍｇ／ｍｌの精製酵素を添加して４０〜８０℃で１５分間反応後、ＨＰＬＣを用いてグルコース６−リン酸を定量分析した。
【００８３】
その結果、図６に示すように、本発明の酵素は６５〜７０℃付近で最大活性を示した。また、６０〜８０℃にわたる広い温度範囲で最大活性に比べて９５％以上の活性を示した（図６）。
【００８４】
今までに報告されたポリリン酸依存性グルコキナーゼのうちサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）由来の酵素は高温活性と耐熱性酵素であると知られ、最適活性温度は５５℃であることを報告している［Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：１１０９−１１１７．参考］。
【００８５】
したがって、本発明のアナエロリネア・サーモフィラ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼは６５〜７０℃の最適活性温度を示し、今まで報告されたポリリン酸依存性グルコキナーゼのうち高温活性が最も優秀な酵素であることを表す。
【実施例６】
【００８６】
金属イオンによる組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの活性の分析
【００８７】
今まで報告されたポリリン酸依存性グルコキナーゼは活性化のためにＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋及びＺｎ２＋などの金属イオンが必要であると知られている。本発明のポリリン酸依存性グルコキナーゼに対して金属イオンの種類による活性への影響を調べるため、１０ｍＭのＥＤＴＡを処理した後に透析された酵素試料を使用した。反応組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液に懸濁された２％（ｗ／ｖ）グルコース、１．５％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウムおよび１ｍＭの金属イオン（ＮｉＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ）を使用した。各反応組成物に金属イオンを除去した前記酵素試料０．１ｍｇ／ｍｌ添加して６０℃で１５分間反応後、ＨＰＬＣを用いてグルコース６−リン酸を定量分析した。金属イオンを処理しなかった酵素の活性に比べて各金属イオンを処理した場合の酵素活性を比較分析した。
【００８８】
その結果、アナエロリネア・サーモフィラ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼは図７に示すように、活性のためＭｇ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ及びＮｉなどの金属イオンに要求性を示した。金属イオンの中で、従来報告された酵素と同様にマグネシウムが最も効果的であり、特にＭｇＳＯ４を添加した場合に最大活性を示した（図７）。
【実施例７】
【００８９】
組換えポリリン酸依存性グルコキナーゼの温度安定性の分析
【００９０】
本発明のポリリン酸依存性グルコキナーゼの温度安定性を分析するために、組換え精製酵素（０．２ｍｇ／ｍｌ）を５５℃〜６５℃の温度範囲と様々な時間で熱処理した後、酵素の残存活性を比較分析した。
【００９１】
反応組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液に懸濁された４％（ｗ／ｖ）グルコース、３％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｘａｍｅｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及び１ｍＭのＭｇＣｌ２を使用した。残存活性を測定するために、前記反応組成物に温度別で熱処理した酵素試料を０．１ｍｇ／ｍｌ添加し６０℃で１５分間反応後、ＨＰＬＣでグルコース６−リン酸を定量分析した。
【００９２】
その結果、図８に示すように、温度５５℃では６時間にわたって酵素活性の減少がなく、６０℃の温度では４時間経過した後に酵素活性が約４９％減少した。また、６５℃の温度では０．５時間経過した後も約６２％の酵素活性が維持されることを確認した（図８）。
【００９３】
今まで報告されたポリリン酸依存性グルコキナーゼのうち、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）由来の酵素は耐熱性が最も優秀な酵素として知られており、５０℃で０．２５時間の熱処理後において５０％の活性が消失されることが報告された。耐熱性を高めるための形態である固定化酵素（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ−ｅｎｚｙｍｅ）は２時間後に５０％の活性が消失したことを報告した［Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９３：１１０９−１１１７．参考］。
【００９４】
したがって、本発明のアナエロリネア・サーモフィラ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼは、６０℃で４時間の熱処理後も約５１％の活性を維持することを示し、今まで報告された酵素の中で最も熱安定性が優秀であることを示す。
【実施例８】
【００９５】
基質濃度別における転換収率の分析
【００９６】
グルコース及びヘキサメタリン酸ナトリウム濃度別におけるグルコース６−リン酸の転換収率を分析した。反応組成物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液に懸濁された２〜１５％（ｗ／ｖ）グルコース、１．５〜１１．５％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのＭｇＳＯ４を使用した。各反応組成物に１０〜５０Ｕ／ｍｌの精製酵素を添加して５５℃で１２時間反応した後、ＨＰＬＣでグルコース６−リン酸を定量分析した。
【００９７】
その結果、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１．５％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用した場合に１２時間反応後で８１％の転換収率を示し、５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび３．５％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用した場合に１２時間反応後で７８％の転換収率を示し、１０％グルコースおよび７％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用した場合に１２時間反応後で７７％の転換収率を示し、１５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１０％（ｗ／ｖ）ヘキサメタリン酸ナトリウムを使用した場合に１２時間反応後で６５％の転換収率を示した。
【受託番号】
【００９８】
受託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１８１４Ｐ
受託日：２０１６０２１６
【図１】
2019506879.tif 000006
【図２】
2019506879.tif 000007
【図３】
2019506879.tif 000008
【図４】
2019506879.tif 000009
【図５】
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【図６】
2019506879.tif 000011
【図７】
2019506879.tif 000012
【図８】
2019506879.tif 000013
【配列表】
2019506879000001.app
【国際調査報告】
2019506879.tif 000014
2019506879.tif 000015
2019506879.tif 000016
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