(57)【要約】  広範囲のｐＨにわたって生存率の向上を示す、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６を含有する安定なプロバイオティクス組成物、および種々の環境条件下でのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の生菌数を計数するフローサイトメトリー法の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６を含有するプロバイオティクス組成物であって、他のプロバイオティクス菌株と比較して広範囲のｐＨにわたって生存率および安定性の向上を示すプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
ｐＨが２．０、７．０および９．０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
プロバイオティクスが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の芽胞、栄養細胞、および生存細胞数および死細胞数を検出するフローサイトメトリー法であって、
ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の乾燥芽胞をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁させて懸濁液を得る工程と、
ｂ）工程ａ）の懸濁液を７５℃の水浴中で３０分間インキュベートし、４５℃に冷却して懸濁液を得る工程と、
ｃ）グルコース酵母エキス寒天上で工程ａ）およびｂ）の懸濁液の生菌数を計数する工程と、
ｄ）工程ａ）およびｂ）の懸濁液の生菌数を、以下の工程：
ｉ）工程ａ）およびｂ）の芽胞懸濁液（１０7／ｍｌ）を、３７℃で６０分間５０μＭのｃＦＤＡで、最後の１０分間で１０μＭのＰＩで別々に二重染色する工程と、
ｉｉ）工程ａ）およびｂ）の芽胞懸濁液（１０7／ｍｌ）を、それぞれＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）（希釈率１：１０００）およびポリスチレン微小球の較正懸濁液（希釈率１：１００）で、別々のチューブ中で３７℃で１０分間染色する工程と、
ｉｉｉ）ＦＳＣ−４３０ユニット、ＳＳＣ−４２５ユニット、ＦＩＴＣ−２８０ユニットおよびＰＥ−２６９ユニットに設定された電圧パラメータを用いて、フローサイトメトリー検出を実施する工程と、
ｉｖ）サイトグラム中の細菌シグナル対微小球シグナルの比から、試料中の細菌密度を決定する工程と、
ｖ）ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）染色により検出される芽胞の総数を式
ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）+領域における事象数
芽胞の総数＝-------------------------------------------×106×希釈倍率(DF）
ビーズにおける事象数
によって計算する工程と、
ｖｉ）生芽胞の数を式
ｃＦＤＡ+領域における事象数
芽胞の数＝---------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
または
芽胞総数−ＰＩ+領域における事象数
芽胞の数＝---------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
によって計算する工程と
を含むフローサイトメトリー分析を使用して計数する工程と
を含むフローサイトメトリー法。
【請求項５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の生存率を、プロバイオティクス錠剤、カプセル剤、乳製品、飲料、菓子、薬用化粧品クリーム中で試験するが、これらに限定されない、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
これは、２０１６年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６２４２６２６５号から優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、一般に、広範囲のｐＨにわたって生存率の向上を示す、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６を含有する安定なプロバイオティクス組成物に関する。より具体的には、本発明は、種々の環境条件下でのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の生菌数を計数する方法としてのフローサイトメトリーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、その薬効と治療上の利点から、現在栄養補助食品として関心を集めている。それは過去１０年間で指数関数的な成長を示しており、現在は種々の製剤で、そしてプロバイオティクスの豊富な食品や飲料として利用可能である。生存能力はプロバイオティクスの機能にとって重要な側面と考えられる。貯蔵安定性があり、生きているプロバイオティクスは、常に市場で入手可能な他のものよりも商業的優位性を有する。また、プロバイオティクスの生菌数の正確な計数はその治療活性にとって重要である。プロバイオティクスは、生きているが培養不可能な状態で存在することが知られており、その場合、標準的なプレートカウント法の計数は、芽胞数を正確に計数することができないであろう。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応およびマイクロプレート蛍光色素アッセイを含む、いくつかの代替方法を使用して生細菌数を決定することができる。（Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria, Catherine Davis, Journal of Microbiological Methods, Volume 103, August 2014, Pages 9-17）
プレートカウント法は、特に混合培養におけるプロバイオティクス株の細胞密度の正確で再現性のある推定をサポートしない（Suitability of MRS-bile agar for the selective enumeration of mixed probiotic bacteria in presence of mesophilic lactic acid cultures and yoghurt bacteria、S. Sohrabvandi, A.-M. Mortazavian, M.-R. Dolatkhnejad, A.B. Monfared, Iranian Journal of Biotechnology., 10 (2012), pp. 16-21）。それは、培養条件下で複製する生きている生物のサブセットだけを推定する。
したがって、プロバイオティクス製剤の実際の細菌数を決定するための新規な方法を開発することが必要である。本発明は、安定なプロバイオティクス組成物およびその検出方法を開示することによって上記の問題を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の主な目的は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６を含有する安定なプロバイオティクス組成物であって、他の市販のプロバイオティクスと比較して、広範囲のｐＨにわたって生存率および安定性の向上を示すプロバイオティクス組成物を開示することである。
本発明のさらに別の目的は、生芽胞および栄養細胞を検出して計数するための簡単で正確な商業的に実行可能なフローサイトメトリー法を開示することである。
本発明は前述の目的を達成し、さらに関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
広範囲のｐＨにわたって生存率の向上を示す、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６を含有する安定なプロバイオティクス組成物、および種々の環境条件下でのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の生菌数を計数するためのフローサイトメトリー法の使用を開示する。
本発明の他の特徴および利点は、例えば本発明の原理を説明する添付の画像と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１ａ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６芽胞のフローサイトメトリー分析を示す。  １０ｍｇの乾燥芽胞を１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、７５℃で３０分間活性化した後、例１に記載のように蛍光染色した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。  １ａ：ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）染色のためのゲーティング法−マイクロビーズおよび染色芽胞は、非染色対照に対して別々にゲーティングする。
【図１ｂ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６芽胞のフローサイトメトリー分析を示す。  １０ｍｇの乾燥芽胞を１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、７５℃で３０分間活性化した後、例１に記載のように蛍光染色した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。  １ｂ：カルボキシフルオレセインジアセテート（ｃＦＤＡ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色のためのゲーティング法。ドットプロットは、ｃＦＤＡとＰＩの両方についての二重染色を表す。象限４（Ｑ４）は生細胞を表し、Ｑ１は死細胞、Ｑ２は損傷細胞を表す。二重陽性細胞は、生芽胞を計数するのに考慮しなかった。
【図１ｃ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６芽胞のフローサイトメトリー分析を示す。  １０ｍｇの乾燥芽胞を１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、７５℃で３０分間活性化した後、例１に記載のように蛍光染色した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。  １ｃ：生芽胞および死芽胞のＦＣＭ分析のための代表的なドットプロット
【図２ａ】フローサイトメトリーの検証を示す。  ２ａ：芽胞懸濁液を希釈し、各希釈物を前述のようにＦＣＭにより分析した。定量分析を表２に示す。
【図２ｂ】フローサイトメトリーの検証を示す。  ２ｂ：芽胞のＦＣＭ分析
【図２ｃ】フローサイトメトリーの検証を示す。  ２ｃ：栄養細胞
【図２ｄ】フローサイトメトリーの検証を示す。  ２ｄ：芽胞と栄養細胞との混合物
【図２ｅ】フローサイトメトリーの検証を示す。  ２ｅ：死細胞
【図３ａ−１】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図３ａ−２】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図３ｂ−１】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図３ｂ−２】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図３ｃ−１】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図３ｃ−２】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図３ｄ】ＦＣＭによって測定した場合の（生きているがあるが培養不可能な細菌）ＶＢＮＣ数および蘇生数を示す。  芽胞懸濁液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートし、続いて洗浄し、栄養ブロス（ＮＢ）に懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、前述のようにＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。データは、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図４ａ】市販の調製物における芽胞の生存率を示す。  錠剤、カプセル剤およびオレンジジュース中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ芽胞の生存率：総数および生芽胞数をＦＣＭによって測定した。データは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図４ｂ】市販の調製物における芽胞の生存率を示す。  錠剤、カプセル剤およびオレンジジュース中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ芽胞の生存率：総数および生芽胞数をＦＣＭによって測定した。データは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図４ｃ】市販の調製物における芽胞の生存率を示す。  錠剤、カプセル剤およびオレンジジュース中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ芽胞の生存率：総数および生芽胞数をＦＣＭによって測定した。データは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。
【図５−１】フローサイトメトリーによるプロバイオティクスの安定性の比較を示す。  細菌数を前述のようにフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって評価した。全てのプロバイオティクス製剤を、それらの有効期限前に使用した。プロバイオティクスＥは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の市販製剤である。ＣＦＤＡ陽性細胞を生細胞とした。データは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。  Ａ−  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  Ｂ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ  Ｃ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｄ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｅ−  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ  ５８５６
【図５−２】フローサイトメトリーによるプロバイオティクスの安定性の比較を示す。  細菌数を前述のようにフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって評価した。全てのプロバイオティクス製剤を、それらの有効期限前に使用した。プロバイオティクスＥは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の市販製剤である。ＣＦＤＡ陽性細胞を生細胞とした。データは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。  Ａ−  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  Ｂ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ  Ｃ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｄ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｅ−  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ  ５８５６
【図５−３】フローサイトメトリーによるプロバイオティクスの安定性の比較を示す。  細菌数を前述のようにフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって評価した。全てのプロバイオティクス製剤を、それらの有効期限前に使用した。プロバイオティクスＥは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の市販製剤である。ＣＦＤＡ陽性細胞を生細胞とした。データは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。  Ａ−  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ  Ｂ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ  Ｃ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｄ−  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｅ−  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ  ５８５６
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（図１ａ、１ｂ、１ｃ、図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、図４ａ、４ｂ、４ｃおよび図５）
最も好ましい実施態様では、本発明は、他のプロバイオティクス菌株と比較して広範囲のｐＨにわたって生存率および安定性の向上を示す、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６を含有するプロバイオティクス組成物に関する。
【０００７】
関連実施形態では、ｐＨは２．０、７．０および９．０である。別の関連実施形態では、プロバイオティクスは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の芽胞、栄養細胞、および生存細胞数および死細胞数を検出するフローサイトメトリー法を開示し、前記方法は：
ａ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の乾燥芽胞をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に懸濁させて懸濁液を得る工程と、
ｂ）工程ａ）の懸濁液を７５℃の水浴中で３０分間インキュベートし、４５℃に冷却して懸濁液を得る工程と、
ｃ）グルコース酵母エキス寒天上で工程ａ）およびｂ）の懸濁液の生菌数を計数する工程と、
ｄ）工程ａ）およびｂ）の懸濁液の生菌数を、以下の工程：
ｉ）工程ａ）およびｂ）の芽胞懸濁液（１０7／ｍｌ）を３７℃で６０分間５０μＭのｃＦＤＡで、最後の１０分間は１０μＭのＰＩで別々に二重染色する工程と、
ｉｉ）工程ａ）およびｂ）の芽胞懸濁液（１０7／ｍｌ）を、別々のチューブ中でそれぞれＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）（希釈率１：１０００）およびポリスチレン微小球の較正懸濁液（希釈率１：１００）で、３７℃で１０分間染色する工程と、
ｉｉｉ）ＦＳＣ−４３０ユニット、ＳＳＣ−４２５ユニット、ＦＩＴＣ−２８０ユニットおよびＰＥ−２６９ユニットに設定された電圧パラメータを用いて、フローサイトメトリー検出を実施する工程と、
ｉｖ）サイトグラム中の細菌シグナル対微小球シグナルの比から、試料中の細菌密度を決定する工程と、
ｖ）ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）染色により検出される芽胞の総数を式
ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）+領域における事象数
芽胞の総数＝------------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
によって計算する工程と、
ｖｉ）生芽胞の数を式
ｃＦＤＡ+領域における事象数
芽胞の数＝---------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
または
芽胞総数−ＰＩ+領域における事象数
芽胞の数＝---------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
によって計算する工程と
を含むフローサイトメトリー分析を使用して計数する工程と
を含む。
【０００９】
関連実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の生存率を試験する方法は、プロバイオティクス錠剤、カプセル剤、乳製品、飲料、菓子、薬用化粧品クリーム、粘膜調製物、および食品物質中で実施するが、これらに限定されない。
本明細書の下記に含まれる特定の例は、本発明の最も好ましい実施形態を例示する。
【実施例】
【００１０】
（例１）
方法
試験材料：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６試料は、Ｓａｍｉ  Ｌａｂｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  （Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、Ｉｎｄｉａ）によって、社内仕様の優れた医薬品の製造と品質管理に関する基準に従って製造した。純粋なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６芽胞を噴霧乾燥し、食品グレードのマルトデキストリン（Ｓａｎｗａ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．  Ｋａｓｈｉｈａｒａ、Ｎａｒａ、Ｊａｐａｎ）で標準化して、粉末形態の最終製品１ｇ当たり１５×１０9ＣＦＵの所望の濃度を達成した。錠剤およびカプセル剤は、Ｓａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｙｓｏｎ、ＵＴ、ＵＳＡによって製造された。他のプロバイオティクスの市販製剤は市場から購入し、それらの使用期限内に使用した。
【００１１】
フローサイトメトリー用試料調製
ＦＣＭ分析および生菌数推定のために、１０ｍｇの芽胞（（１５×１０9／ｇ）を１ｍｌの無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に懸濁させ、７５℃の水浴中で３０分間インキュベートし、その後直ちに４５℃未満に冷却した。この懸濁液をＦＣＭ分析用とするか、またはさらに滅菌ＰＢＳで連続希釈し、生菌数を前述のようにグルコース酵母エキス寒天（ＨｉＭｅｄｉａ、Ｍｕｍｂａｉ、Ｉｎｄｉａ）上にプレーティングして計数した。１セットの芽胞を、７５℃で３０分間の活性化工程なしでＦＣＭによって分析した。各実験は３回繰り返した。芽胞生菌数の平均値をｌｏｇ10ＣＦＵで表した。
蛍光染色
使用した蛍光染色剤は、ｃＦＤＡ、ＰＩ、およびＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）およびポリスチレン微小球の校正懸濁液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）であった。ｃＦＤＡおよびＰＩによる二重染色は、芽胞懸濁液（１０7／ｍｌ）を３７℃で６０分間５０μＭのｃＦＤＡで、最後の１０分間は１０μＭのＰＩでインキュベートすることによって行った。ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）を１０００倍に、マイクロビーズを１００倍希釈して、１×濃度のＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）および１×１０6ビーズ／ｍｌを得た。芽胞を別々のチューブ中で、３７℃で１０分間染色した。
【００１２】
フローサイトメトリー
Ｃａｎｔｏ  ＩＩサイトメーターを用いてＦＣＭ取得を行い、Ｄｉｖａ  ソフトウェア６．２．１（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてデータ分析を行った。製造元の指示に従って、サイトメトリーセットアップおよびトラッキング（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｓｅｔ  ｕｐ  ａｎｄ  ｔｒａｃｋｉｎｇ）（ＣＳＴ）ビーズ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメーター設定を標準化した。フローサイトメトリーに使用する全ての緩衝液は、０．２μｍフィルターに通して濾過し、バックグラウンドの細菌ノイズを防いだ。濾過した緩衝液を陰性対照として実施し、閾値を２０００に設定した。光電子増倍管（ＰＭＴ）の前方および側方散乱電圧を、滅菌緩衝液および細菌を含有する緩衝液を流すことによって調整した。染色試料および非染色試料に基づいて蛍光電圧を調整した。二重染色の間のＦＩＴＣ（ｃＦＤＡ）とＰＥ（ＰＩ）の重なりを最小にするために、補正制御を各セットの実験で行った。最終的なＰＭＴ電圧パラメータを、ＦＳＣ−４３０ユニット、ＳＳＣ−４２５ユニット、ＦＩＴＣ−２８０ユニットおよびＰＥ−２６９ユニットに設定した。無染色芽胞を用いて自動蛍光ゲーティングを行った。ポリスチレン微粒子の較正懸濁液は、前方散乱対蛍光のプロットでＳＹＴＯ  ＢＣ（登録商標）と区別することができる。サイトグラム中の細菌シグナル対微小球シグナルの比から、試料中の細菌密度を決定することができる。
【００１３】
計算
ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）染色により検出される芽胞の総数を
ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）+領域における事象数
芽胞の総数’＝-------------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
によって計算した。
生存可能な芽胞の数を
ＣＦＤＡ+領域における事象数
芽胞の数’＝---------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
または
芽胞総数−ＰＩ+領域における事象数
芽胞の数’＝---------------------------------------×106×希釈倍率(DF)
ビーズにおける事象数
によって計算した。
【００１４】
フローサイトメトリーの検証
１５×１０7芽胞／ｍｌの芽胞ストックを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６（１５×１０9／ｇの強度）から調製した。芽胞懸濁液をＰＢＳで連続希釈し、ＦＣＭにより各希釈液から個々に計数し、プレートカウントと比較した。芽胞と栄養細胞との間の違いを見出すために、芽胞を栄養ブロス（ＨｉＭｅｄｉａ、Ｉｎｄｉａ）中で一晩増殖させ、細胞を個々にまたは新しい芽胞と混合した後に分析した。あるいは、栄養細胞をイソプロピルアルコールにさらし、次いで芽胞と混合して生細胞および死細胞の計数におけるＦＣＭの感度を示した。
ＶＢＮＣおよび蘇生
発芽にとって好ましい環境下でのＶＢＮＣ芽胞の割合およびそれらの蘇生を試験するために、芽胞懸濁液（１．５×１０7／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２）中で２４時間インキュベートした。芽胞を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、栄養ブロスに懸濁させ、３７℃で６０分間インキュベートした。生芽胞は、ＦＣＭとプレートカウントの両方によって計数した。
【００１５】
市販調製物中の芽胞数
カプセル剤の全内容物を５０ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、一方、錠剤を秤量して完全に粉砕し、５０ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。試料を、前述のようにＦＣＭならびにプレートカウントによって分析した。
オレンジジュース中の芽胞数
過剰分を有する所定数の芽胞を、市場から購入した市販のオレンジジュース中に混ぜた。ジュースを４℃で２４時間貯蔵し、芽胞の数をＦＣＭおよびプレートカウント法の両方によって決定した。
市販のプロバイオティクス
４つのプロバイオティクスを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６と比較した。それらは、地元のスーパーマーケットから購入したか、または製造業者もしくは販売代理店から入手した。全てラベルに従って保存し、全て使用期限前に試験に使用した。錠剤およびカプセル剤は、前述のように活性化工程なしでフローサイトメトリー用に処理した。
統計分析：
Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。結果は平均値±標準偏差として表した。有意差の分析にはマンホイットニー検定を使用し、＜０．０５のＰ値を統計的に有意と見なした。
【００１６】
（例２）
結果
フローサイトメトリーによるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓの芽胞の計数
フローサイトメトリーに従って、芽胞を、ドットプロットの４つの象限に分配した。象限１（Ｑ１）は、ＰＩ染色死細胞を表し、Ｑ２は、ＰＩおよびＣＦＤＡの両方によって染色された、損傷細胞として分類された芽胞を有した。生芽胞は、Ｑ３では、ＣＦＤＡ陽性細胞として見ることができたが、Ｑ４では、非染色芽胞はわずかしか見られなかった。芽胞数の計数のための生芽胞として、ＣＦＤＡ+ＰＩ-（Ｑ３）細胞を検討した。ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）染色によって決定された芽胞の総数は、１５．７２±０．９２×１０9／ｇであることが見出された。（ＣＦＤＡ＋）細胞によって計算された生芽胞は１４．０７±０．６２×１０9／ｇであることが見出され、総数からＰＩ陽性（死）細胞を差し引くことによって計算される生芽胞は１３．９７±０．４２×１０9／ｇであり（図１ａ、１ｂおよび１ｃ）、非常に類似していた。活性化工程をＦＣＭ分析前に省略した場合、総数および生菌数はわずかに多かった（１６．６±０．２３）（図１ａ、１ｂ、１ｃおよび表１）。
【００１７】
表１：生芽胞の計算を示す表
【表１】
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【００１８】
フローサイトメトリーの検証
ＦＣＭによる芽胞計数方法を検証するために、芽胞ストックを希釈し、各希釈においてＦＣＭにより総数および生芽胞を計数した。（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄおよび２ｅ）にて示すように、ＦＣＭは１ｍｌ当たり１０7〜１０5のストックからの芽胞を計数するのに高感度であった。芽胞の１０倍希釈はＦＣＭカウントに反映され、計数に使用される希釈に関係なく、芽胞１グラム当たり同等の総数および生菌数をもたらした。１ｍｌあたり１０4未満の芽胞の希釈は、ＦＣＭ分析のために１００００の事象を収集することが実施可能ではなかったので、採用されなかった。ＦＣＭによる新たに調製された芽胞の懸濁液の生芽胞数（１４．０２±０．７８×１０9／ｇ）はプレートカウント（１３．２４±２．９×１０9／ｇ）に非常に類似し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の計数方法をさらに検証した。芽胞と栄養細胞との差を見出すために、芽胞を発芽させ、栄養ブロス中で一晩増殖させ、細胞をＦＣＭにより分析した。栄養細胞は、ＳＹＴＯ  ＢＣ（商標）染色プロットにおいて、芽胞と比較して異なる集団として見られた。ＣＦＤＡによる生染色およびＰＩによる死染色は、芽胞を栄養細胞と区別することができなかった。アッセイの感度を確立するために、ＦＣＭ分析のために等比率で、芽胞と混合した死滅栄養細胞を使用した（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄおよび２ｅ）。芽胞と死滅細胞との混合は、ＰＩによって染色される死細胞の増加を示し（５４．９％）、一方、生芽胞は４４．３％であった。これらの結果により、所与の集団中の芽胞、栄養細胞ならびに生存細胞および死細胞の数を特定するための正確な技術としてＦＣＭの頑健性が確立される（図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅおよび表２）。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
ＶＢＮＣおよび蘇生
ＶＢＮＣは、好ましくない環境条件によって誘発される状態である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６において、酸性ｐＨを使用して、ＶＢＮＣを誘発させた。酸性緩衝液中でのインキュベーション前の芽胞の生菌数は、ＦＣＭにより１３．１２±０．７６×１０7／ｍｌ、プレーティングにより１２．５±０．８４×１０7／ｍｌであった。ｐＨ２．０の酢酸緩衝液中で室温で２４時間インキュベートした後、プレーティングにより推定された芽胞数は７．２５±１．０６×１０5／ｍｌに減少したが、ＦＣＭにより８．７±０．１９×１０7／ｍｌであった。興味深いことに、二重陽性象限内の芽胞数は、ストレスの多い状態に２４時間さらした後でより多く、細胞損傷を示唆していた。栄養ブロス中で６０分間インキュベートすると、プレートカウントで１１．５±２．１×１０7／ｍｌへ増加、ＦＣＭにより１１．１３±０．３１×１０7／ｍｌへの増加が見られ、芽胞の生存率が回復した（図３ａ、３ｂ、３ｃおよび３ｄ）。
【００２１】
市販調製物中の芽胞数
製造に関与するプロセスはプロバイオティクスの生存率に影響を与えることが知られているので、次にカプセル剤および錠剤製剤中の芽胞の生存率を計数した。生芽胞の数は、カプセル剤および錠剤の両方において２０億であることが観察され、これはカプセル剤のラベルと一致していた。ＦＣＭによる総数は、錠剤中で４．６±０．６３×１０9／ｇであったのに対し、３．５４±０．６８×１０9／カプセルであることが判明した。ＦＣＭにより計数された錠剤中の生芽胞は３．４±０．６２×１０9であり、一方カプセル剤中ではそれは２．２５±０．２６×１０9であった。生芽胞の数は、ＦＣＭ分析およびプレートカウントの両方により、市販製品中のラベルのとおり２０億以上であった（図４ａ、表３、４ｂおよび表４）。
【００２２】
【表３】
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【表４】
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【００２３】
オレンジジュース中における芽胞生存率
次に、オレンジジュース中におけるその生存率を試験し、これは市場においてプロバイオティクスの直接適用である。芽胞を市販のオレンジジュースに添加し、２４時間後に生存率を、ＦＣＭおよびプレートカウント法の両方によって評価した。図４ｃに示すように、ＦＣＭ法は、かなりの正確さで、オレンジジュースなどの市販の調製物からの芽胞の計数に適応可能であった（表５）。
【表５】
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【００２４】
プロバイオティクスの安定性の比較
安定性はプロバイオティクスにとって重要な基準である。したがって、市販のプロバイオティクス製剤の生菌数を、異なる条件で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６と比較した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６（プロバイオティクスＥ）は、室温で２４時間インキュベートした後でも、中性およびアルカリ性ｐＨで生存能力を示し、酸性条件下で１ｌｏｇ未満のＣＦＵの減少を示した。プロバイオティクスＡは中性およびアルカリ性ｐＨで安定していたが、酸性条件で２．５〜３ｌｏｇのＣＦＵの減少を観察した。プロバイオティクスＢのＣＦＵは、予想値より低い対数であった。２４時間までに、室温で２ｌｏｇのＣＦＵの減少を観察した。プロバイオティクスＣは中性ｐＨで安定であることが見出されたが、一方アルカリ性および酸性ｐＨでは、１および２ｌｏｇのＣＦＵの減少を観察した。酸性条件下では、プロバイオティクスＤは良好な安定性を示したが、ＲＴで２４時間インキュベートした後に２〜３ｌｏｇのＣＦＵの減少を観察した（図５）。市販のプロバイオティクスＣおよびＤは、室温では生存能力を急速に失うが、４℃で貯蔵した場合にはより良好な安定性を示した。比較において、市販の製剤からのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６（プロバイオティクスＥ）芽胞は、フローサイトメトリーによって観察されるように、酸性、中性およびアルカリ性条件下で、室温（２５℃±４℃）で良好な安定性を有することが見出された。
【００２５】
（例３）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の安定性
室温でのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６の安定性を、０時間〜２か月間試験した。生細胞はフローサイトメトリー分析を用いて決定した。結果を表６にまとめた。
【表６】
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【００２６】
結果は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ＭＴＣＣ５８５６が、２か月の期間にわたって室温（２５〜３０℃）で安定であることを示した。
本発明を好ましい実施形態を参照して説明してきたが、本発明がそれらに限定されないことを、当業者は明確に理解すべきである。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ａ−１】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ−１】
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【図３ａ−２】
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【図３ｂ−１】
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【図３ｂ−２】
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【図３ｃ−１】
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【図３ｃ−２】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【国際調査報告】
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