(57)【要約】ｉ）腫瘍標的化部分と；（ｉｉ）免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される）；（ｉｉｉ）サイトカイン分子および／または（ｉｖ）間質調節部分の１つ、２つまたは全てとを含む多重特異性分子が開示される。それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法および上記の分子を用いて癌を治療する方法がさらに開示される。
2019512272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重特異性または多機能性分子ポリペプチドであって、
（ｉ）癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば第１の腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｉ）サイトカイン分子；および
（ｉｖ）間質調節部分
の２つまたは全てと
を含む多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２】
（ｉ）、（ｉｉ）ならびに（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の一方または両方を含む、請求項１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３】
（ｉ）、（ｉｉｉ）ならびに（ｉｉ）および（ｉｖ）の一方または両方を含む、請求項１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４】
（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）を含む、請求項１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む、請求項１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６】
多重特異性または多機能性分子ポリペプチドであって、
（ｉ）１つまたは複数の癌抗原に結合する少なくとも２つの腫瘍標的化部分、例えば第１および第２の腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；および
（ｉｉｉ）間質調節部分
の一方または両方と
を含む多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７】
間質調節部分と、腫瘍抗原または間質抗原に結合する腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子または受容体分子）とを含む多機能性（例えば、二機能性）分子ポリペプチド。
【請求項８】
第２の腫瘍標的化部分をさらに含み、前記第２の腫瘍標的化部分は、前記第１の腫瘍標的化部分、例えば（ｉ）の前記腫瘍標的化部分と同じかまたは異なる癌抗原に結合する、請求項１〜５または７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９】
前記第２の腫瘍標的化部分は、前記第１の腫瘍標的化部分と同じ癌抗原における異なるエピトープに結合する、請求項６または８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０】
前記第２の腫瘍標的化部分および前記第１の腫瘍標的化部分は、異なる癌抗原に結合する、請求項６または８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１】
前記異なる癌抗原は、同じ細胞または腫瘍組織に存在する、請求項１０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２】
前記異なる癌抗原は、異なる細胞または腫瘍組織に存在する、請求項１０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３】
前記第１の腫瘍標的化部分および前記第２の腫瘍標的化部分の前記癌抗原に対する親和性、例えば複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の親和性と等しいかまたはそれを超える、請求項１１または１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４】
前記第１の腫瘍標的化部分および前記第２の腫瘍標的化部分の前記癌抗原に対する前記親和性、例えば前記複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは前記多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の前記親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い、請求項１３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５】
腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する前記第１の腫瘍標的化部分および前記第２の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、前記腫瘍標的化部分または前記第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性と等しいかまたはそれを超える、請求項１１または１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６】
前記腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する前記第１の腫瘍標的化部分および前記第２の腫瘍標的化部分の前記親和性、例えば前記複合親和性は、前記腫瘍標的化部分または前記第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い、請求項１５に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７】
少なくとも２つの非隣接ポリペプチド鎖を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１８】
Ａ、Ｂ−［二量体化モジュール］−Ｃ、−Ｄ
（式中、
（１）前記二量体化モジュールは、免疫グロブリン定常ドメイン、例えば重鎖定常ドメイン（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体重鎖定常領域、例えばＦｃ領域）または免疫グロブリン可変領域（例えば、Ｆａｂ領域）の定常ドメインを含み；および
（２）Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、独立して、存在しないか；（ｉ）腫瘍標的化部分、例えば第１および／もしくは第２の腫瘍標的化部分；（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；（ｉｉｉ）サイトカイン分子または（ｉｖ）間質調節部分である）
を含む多重特異性または多機能性分子ポリペプチドであって、
（ｉ）癌抗原に結合する前記腫瘍標的化部分、例えば第１の腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｉ）サイトカイン分子；および
（ｉｖ）間質調節部分
の１つ、２つまたは全てと
を含み、ただし、
（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し、
１つの（ｉ）および１つの（ｉｉ）が存在する場合、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）または両方は、存在し、または
１つの（ｉ）および１つの（ｉｉｉ）が存在する場合、（ｉｉ）もしくは（ｉｖ）または両方は、存在する、多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１９】
（ｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、第１の免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、第２の免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み、かつＣおよびＤは、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャを含み）；
（ｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、第１のサイトカイン分子を含み、かつＤは、第２のサイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み、かつＣおよびＤは、同じかまたは異なるサイトカイン分子を含み）；
（ｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、第１の間質調節部分を含み、かつＤは、第２の間質調節部分を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み、かつＣおよびＤは、同じかまたは異なる間質調節部分を含み）；
（ｉｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、サイトカイン分子を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、間質調節部分を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、間質調節部分を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、サイトカイン分子を含み、かつＤは、間質調節部分を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｉｘ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、間質調節部分を含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｘ）Ａは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢ、ＣおよびＤの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉ）Ｂは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＣおよびＤの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉｉ）Ｃは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢおよびＤの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉｉｉ）Ｄは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢおよびＣの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ免疫細胞エンゲージャおよび非存在であり；
（ｘｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および免疫細胞エンゲージャであり；
（ｘｖｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれサイトカイン分子および非存在であり；
（ｘｖｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在およびサイトカイン分子であり；
（ｘｖｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ間質調節部分および非存在であり；
（ｘｉｘ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および間質調節部分であり；
（ｘｘ）Ａは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｘｉ）Ｂは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｘｉｉ）Ｃは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢまたはＤの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｘｉｉｉ）Ｄは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢまたはＣの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｉｖ）ＡまたはＢは、腫瘍標的化部分を含み、かつＣは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖ）ＡまたはＢは、腫瘍標的化部分を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＣは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖｉ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つの免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、腫瘍標的化部分を含み、かつＣは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖｉｉ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つの免疫細胞エンゲージャを含み、かつＣは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖｉｉｉ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つのサイトカインを含み、かつＤは、腫瘍標的化部分を含み、かつＣは、免疫細胞エンゲージャを含み；または
（ｘｉｘ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つのサイトカインを含み、かつＣは、腫瘍標的化部分を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含む、請求項１８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２０】
（ｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、免疫細胞エンゲージャ（例えば、樹枝状細胞エンゲージャ）を含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、サイトカイン分子を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ免疫細胞エンゲージャおよび非存在であり；
（ｉｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および免疫細胞エンゲージャ、例えばＴ細胞エンゲージャであり；
（ｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれサイトカイン分子および非存在であり；
（ｖｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在およびサイトカイン分子であり；
（ｖｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ間質調節部分および非存在であり；
（ｖｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および間質調節部分であり；または
（ｉｘ）Ａは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分を含む、請求項１８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２１】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分は、同じ癌抗原における異なるエピトープに結合する、請求項１９または２０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２２】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分は、異なる癌抗原に結合する、請求項１９または２０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２３】
前記異なる癌抗原は、同じ細胞または腫瘍組織に存在する、請求項２２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２４】
前記異なる癌抗原は、異なる細胞または腫瘍組織に存在する、請求項２２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２５】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分の前記癌抗原に対する親和性、例えば複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の親和性と等しいかまたはそれを超える、請求項２１または２２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２６】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分の前記癌抗原に対する前記親和性、例えば前記複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは前記多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の前記親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い、請求項２５に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２７】
腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する前記第１および第２の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、前記腫瘍標的化部分または前記第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性と等しいかまたはそれを超える、請求項２１または２２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２８】
前記腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する前記第１および第２の腫瘍標的化部分の前記親和性、例えば前記複合親和性は、前記腫瘍標的化部分または前記第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い、請求項２７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項２９】
前記免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えばエフェクター細胞に結合するが、それを活性化しない、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３０】
前記免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えばエフェクター細胞に結合し、かつそれを活性化する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３１】
前記腫瘍標的化部分は、前記癌抗原に結合する抗体分子、受容体分子（例えば、受容体、受容体断片もしくはその機能的変異体）またはリガンド分子（例えば、リガンド、リガンド断片もしくはその機能的変異体）、あるいはその組合せを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３２】
前記腫瘍標的化部分は、血液癌、固形腫瘍、転移性癌、軟部組織腫瘍、転移性病変またはその組合せに存在する癌抗原に結合する、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３３】
前記癌抗原は、腫瘍抗原もしくは間質抗原または血液抗原である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３４】
前記腫瘍抗原または間質抗原は、線維性または線維形成性固形腫瘍に存在する、請求項３３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３５】
前記腫瘍抗原または間質抗原は、腫瘍、例えば限定された腫瘍灌流、圧縮された血管または線維性腫瘍間質の１つまたは複数を有することを特徴とする種類の腫瘍に存在する、請求項３３または３４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３６】
前記腫瘍、例えば固形腫瘍は、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌または肝臓癌の１つまたは複数から選択される、請求項３２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３７】
前記血液癌は、Ｂ細胞またはＴ細胞悪性腫瘍、例えばホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫または急性リンパ球性白血病の１つまたは複数から選択される、請求項３２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３８】
前記癌抗原、例えば固形腫瘍抗原は、ＰＤＬ１、メソテリン、ＣＤ４７、ガングリオシド２（ＧＤ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｒｏｎキナーゼ、ｃ−Ｍｅｔ、未熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化塩素イオンチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−Β受容体、ＡＦＰ、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、ＣＤ４７、αアクチニン−４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ＮＡ８８−１、ＮＰＭ、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＲＣＣ、ＲＵＩ１、ＲＵＩ２、ＳＡＧＥ、ＴＲＧ、ＴＲＰ１、ＴＳＴＡ、葉酸受容体α、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１）、炭水化物（Ｌｅ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２またはＲＡＮＫＬから選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項３９】
前記癌抗原は、ＰＤＬ１、メソテリン、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼまたはｃ−Ｍｅｔから選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４０】
前記癌抗原は、線維芽細胞活性化プロテアーゼ（ＦＡＰ）、ＴＧＦ−β、ヒアルロン酸、コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ、テネイシンＣまたはテネイシンＷから選択される間質抗原である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４１】
前記癌抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ９９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、ＳＬＡＭＦ７またはＮＹ−ＥＳＯ１から選択される血液抗原である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４２】
前記腫瘍標的化部分は、メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＣＤ４７またはＣＤ１２３から選択される癌抗原に対する抗体分子から選択される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４３】
前記腫瘍標的化部分は、メソテリンに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４４】
前記腫瘍標的化部分は、ＰＤＬ１に結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４５】
メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＣＤ１２３またはＣＤ４７から選択される２つまたは３つの癌抗原に対する２つまたは３つの抗体分子を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４６】
前記腫瘍標的化部分は、ＰＤＬ１に結合し、かつＰＤ１とのＰＤＬ１の相互作用を阻害する、請求項４２、４４または４５のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４７】
前記腫瘍標的化部分は、ＰＤＬ１に結合し、かつＰＤ１とのＰＤＬ１の相互作用を阻害しない、請求項４２、４４または４５のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４８】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗メソテリン抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項４９】
前記第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗メソテリン抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５０】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＦＡＰ抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５１】
前記第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＦＡＰ抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５２】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＨＥＲ３抗体分子および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体分子であり；または
前記第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＨＥＲ３抗体分子および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体分子である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５３】
前記第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＣＤ１２３抗体分子および抗ＣＤ４７抗体分子であり；または
前記第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＣＤ１２３抗体分子および抗ＣＤ４７抗体分子である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５４】
前記免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャまたはその組合せから選択される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５５】
前記免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞への結合およびＮＫ細胞の活性化を媒介するＮＫ細胞エンゲージャを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５６】
前記免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞への結合を媒介するが、ＮＫ細胞の活性化を媒介しないＮＫ細胞エンゲージャを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５７】
前記ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂまたは両方）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４としても知られている）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０に結合する（例えば、それを活性化する）抗体分子、例えば抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５８】
前記ＮＫ細胞エンゲージャは、抗体分子、例えば抗原結合ドメインである、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項５９】
前記ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０またはＮＫｐ４６に結合する抗体分子、例えば抗原結合ドメインである、請求項５８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６０】
前記ＮＫ細胞エンゲージャは、リガンドであり、任意選択的に、前記リガンドは、免疫グロブリン定常領域、例えばＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６１】
ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６の前記リガンドは、ウイルスＨＡである、請求項６０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６２】
ＤＡＰ１０の前記リガンドは、ＮＫＧ２Ｄの補助受容体である、請求項６０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６３】
ＣＤ１６の前記リガンドは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンド、例えば抗体Ｆｃ領域をさらに含むＣＤ１６ａ／ｂリガンドである、請求項６０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６４】
前記免疫細胞エンゲージャは、Ｂ細胞、マクロファージおよび／もしくは樹枝状細胞の１つもしくは複数への結合もしくはその活性化または両方を媒介する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６５】
前記免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）；Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；４１ＢＢ；ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つまたは複数から選択されるＢ細胞、マクロファージおよび／または樹枝状細胞エンゲージャを含む、請求項６４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６６】
前記Ｂ細胞エンゲージャは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンドまたはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子である、請求項６４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６７】
前記マクロファージ細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４０Ｌ；ＯＸ４０Ｌ；ＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項６４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６８】
前記樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項６４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項６９】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）またはその組合せを含み、例えば、前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、前記多重特異性または多機能性分子ポリペプチドに共有結合される、請求項６７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７０】
前記サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはインターフェロンγ、またはその断片もしくは変異体、あるいは上記のサイトカインのいずれかの組合せから選択される、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７１】
前記サイトカイン分子は、モノマーまたは二量体である、請求項７０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７２】
前記サイトカイン分子は、受容体二量体化ドメイン、例えばＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインをさらに含む、請求項７０または７１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７３】
前記サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、共有結合されず、例えば非共有結合的に結合される、請求項７０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７４】
前記間質調節部分は、間質または細胞外基質（ＥＣＭ）成分のレベルもしくは産生の減少；腫瘍線維化の減少；間質腫瘍輸送の増加；腫瘍灌流の改善；腫瘍微小血管系の拡張；腫瘍における間質液圧（ＩＦＰ）の低下または腫瘍もしくは腫瘍血管系への薬剤、例えば癌治療薬もしくは細胞療法薬の浸透もしくは拡散の減少もしくは促進の１つまたは複数を引き起こす、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７５】
減少される前記間質またはＥＣＭ成分は、グリコサミノグリカンもしくは細胞外タンパク質またはその組合せから選択される、請求項７４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７６】
前記グリコサミノグリカンは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはＨＡとしても知られている）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、エンタクチン、テネイシン、アグリカンおよびケラチン硫酸から選択される、請求項７５に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７７】
前記細胞外タンパク質は、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン、フィブロネクチンまたはビトロネクチンから選択される、請求項７５に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７８】
前記間質調節部分は、腫瘍間質または細胞外基質（ＥＣＭ）を分解する酵素分子を含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項７９】
前記酵素分子は、ヒアルロニダーゼ分子、コラゲナーゼ分子、コンドロイチナーゼ分子、マトリックスメタロプロテイナーゼ分子（例えば、マクロファージメタロエラスターゼ）または上記のいずれかの変異体（例えば、断片）から選択される、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８０】
前記間質調節部分は、ヒアルロン酸のレベルまたは産生を減少させる、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８１】
前記間質調節部分は、ヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン合成を阻害する薬剤またはヒアルロン酸に対する抗体分子を含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８２】
前記ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼ分子またはその変異体（例えば、その断片）である、請求項８１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８３】
前記ヒアルロナン分解酵素は、中性または酸性ｐＨ、例えば約４〜５のｐＨで活性である、請求項８１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８４】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、哺乳動物ヒアルロニダーゼ分子、例えば組み換えヒトヒアルロニダーゼ分子またはその変異体（例えば、その切断型）である、請求項８２または８３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８５】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２もしくはＰＨ−２０／ＳＰＡＭ１またはその変異体（例えば、その切断型）から選択される、請求項８４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８６】
前記切断型は、Ｃ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着部位または前記ＧＰＩ付着部位の一部を欠いている、請求項８４または８５に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８７】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、グリコシル化され、例えば少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む、請求項８２〜８６のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８８】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１のアミノ酸配列またはその断片、あるいはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６１の前記アミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０もしくは１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む、請求項８２〜８７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項８９】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、
（ｉ）配列番号６１の３６−４６４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６１に記載されるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０の３６−４８１、３６−４８２または３６−４８３のアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号６１に記載されるアミノ酸の配列のポリペプチドまたは切断型に対する少なくとも９５％〜１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号６１に記載される前記アミノ酸配列に対する３０、２０、１０、５個またはそれよりも少ないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列
を含む、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９０】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１の前記アミノ酸配列に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一のアミノ酸配列を含む、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９１】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９２】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、ＰＨ２０、例えばｒＨｕＰＨ２０である、請求項８２〜８８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９３】
前記ヒアルロニダーゼ分子は、ＨＹＡＬ１であり、かつ配列番号６２のアミノ酸配列またはその断片、あるいはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６２の前記アミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０もしくは１５個以下の改変（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む、請求項８２〜８７のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９４】
前記ヒアルロナン分解酵素、例えば前記ヒアルロニダーゼ分子は、ポリマーをさらに含み、例えば、ポリマー、例えばＰＥＧにコンジュゲートされる、請求項８２〜９３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９５】
前記ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化ＰＨ２０酵素（ＰＥＧＰＨ２０）である、請求項９４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９６】
前記ヒアルロナン分解酵素、例えば前記ヒアルロニダーゼ分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖定常領域、より特定的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）をさらに含む、請求項８２〜９３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９７】
前記免疫グロブリン定常領域（例えば、前記Ｆｃ領域）は、前記ヒアルロナン分解酵素、例えば前記ヒアルロニダーゼ分子に結合され、例えば共有結合される、請求項９６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９８】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるように改変され、例えば変異される、請求項９６または９７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項９９】
前記ヒアルロナン分解酵素、例えば前記ヒアルロニダーゼ分子は、二量体を形成する、請求項８２〜９３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１００】
前記間質調節部分は、ヒアルロナン、例えばＨＡシンターゼの合成の阻害剤を含む、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０１】
前記阻害剤は、ＨＡシンターゼに対するセンスもしくはアンチセンス核酸分子を含むか、または小分子薬剤である、請求項１００に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０２】
前記阻害剤は、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）もしくはその誘導体（例えば、６，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンもしくは５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン）またはレフルノミドもしくはその誘導体である、請求項１０１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０３】
前記間質調節部分は、コラゲナーゼ分子、例えば哺乳動物コラゲナーゼ分子またはその変異体（例えば、断片）を含む、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０４】
前記コラゲナーゼ分子は、例えば、（配列番号６３のアミノ酸配列またはその断片、あるいはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６３の前記アミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０もしくは１５個以下の改変（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むコラゲナーゼ分子ＩＶである、請求項１０３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０５】
２つの結合特異性または機能を含み、例えば、例として、
ｉ）前記腫瘍標的化部分および前記免疫細胞エンゲージャであって、ただし、前記多重特異性分子が前記腫瘍標的化部分および前記免疫細胞エンゲージャのみを含む場合、前記免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞抗原に対する抗体分子でない、前記腫瘍標的化部分および前記免疫細胞エンゲージャ；または
ｉｉ）前記腫瘍標的化部分および前記間質調節部分
を含む二重特異性または二機能性分子である、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０６】
３つまたは４つの結合特異性または機能を含み、例えば、三重特異性または四重特異性分子である、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０７】
（ｉ）少なくとも２つの腫瘍標的化部分、前記免疫細胞エンゲージャおよび前記サイトカイン分子；
（ｉｉ）前記腫瘍標的化部分、前記免疫細胞エンゲージャおよび前記間質調節部分；または
（ｉｉｉ）メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）もしくはインスリン成長因子１Ｒ（ＩＧＦ１Ｒ）、ＣＤ４７またはＣＤ１２３から選択される２つの癌抗原であって、ただし、ＦＡＰおよびＩＧＦ１Ｒでない２つの癌抗原に結合する少なくとも２つの腫瘍標的化部分およびサイトカイン分子
を含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０８】
（ｉ）１つの腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）２つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）と；
（ｉｉｉ）１つのサイトカイン分子、または
（ｉｖ）１つの間質調節部分
の一方または両方と
を含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１０９】
（ｉ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）と；
（ｉｉ）１つの免疫細胞エンゲージャと；
（ｉｉｉ）１つのサイトカイン分子、または
（ｉｖ）１つの間質調節部分
の一方または両方と
を含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１０】
（ｉ）１つの腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）１つの免疫細胞エンゲージャと；
（ｉｉｉ）２つのサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）の一方または両方と
を含む、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１１】
前記２つの腫瘍標的化部分の１つは、ＰＤＬ１に結合し；前記２つの腫瘍標的化部分の１つは、メソテリンに結合し；前記免疫細胞エンゲージャは、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ３０に結合し；かつ前記サイトカイン分子は、ＩＬ２である、請求項１０９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１２】
前記腫瘍標的化部分もしくは前記免疫細胞エンゲージャまたは両方は、（ｉ）抗体分子、例えば少なくとも１つの免疫グロブリンドメインおよび／あるいは（ｉｉ）受容体もしくはリガンドまたはその断片を含む、請求項１〜１１１のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１３】
前記腫瘍標的化抗体分子は、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数で前記固形腫瘍抗原および／または前記間質抗原に結合する、請求項１１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１４】
前記免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数で前記ＮＫ細胞抗原、前記Ｂ細胞抗原、前記樹枝状細胞抗原および／または前記マクロファージ細胞抗原に結合する、請求項１１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１５】
前記腫瘍標的化抗体分子は、前記腫瘍抗原または前記間質抗原上の立体構造または線形エピトープに結合する、請求項１１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１６】
前記免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、前記ＮＫ細胞抗原、前記Ｂ細胞抗原、前記樹枝状細胞抗原および／または前記マクロファージ細胞抗原上の立体構造または線形エピトープに結合する、請求項１１４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１７】
前記腫瘍標的化抗体分子は、単一特異性抗体分子、二重特異性抗体分子または三重特異性抗体分子である、請求項１１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１８】
前記腫瘍標的化抗体分子は、一価抗体分子、二価抗体分子または三価抗体分子である、請求項１１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１１９】
前記免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、単一特異性、二重特異性抗体分子または三重特異性抗体である、請求項１１６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２０】
前記免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、一価、二価または三価抗体である、請求項１１６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２１】
前記腫瘍標的化抗体分子および／または免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体もしくは二重特異性抗体またはその断片、その単一ドメイン変異体、あるいはラクダ科抗体）である、請求項１１２〜１２０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２２】
前記腫瘍標的化抗体分子および免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、独立して、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体もしくは二重特異性抗体またはその断片、その単一ドメイン変異体、あるいはラクダ科抗体）である、請求項１１２〜１２０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２３】
前記腫瘍標的化抗体分子および／または免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１２２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２４】
前記腫瘍標的化抗体分子および／または免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、κもしくはλの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１２２または１２３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２５】
前記腫瘍標的化部分もしくは前記免疫細胞エンゲージャまたは両方は、前記腫瘍抗原および／もしくは前記間質抗原、または前記ＮＫ細胞抗原、前記Ｂ細胞抗原、前記樹枝状細胞抗原および／もしくは前記マクロファージ細胞抗原に結合する受容体もしくは受容体断片またはリガンドもしくはリガンド断片を含む、請求項１１２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２６】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の前記重鎖定常領域、より特定的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の前記重鎖定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）をさらに含む、請求項１〜１２５のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２７】
前記免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、前記腫瘍標的化部分、前記免疫細胞エンゲージャまたは前記サイトカイン分子の１つまたは複数に結合され、例えば共有結合される、請求項１２６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２８】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるように改変され、例えば変異される、請求項１２６または１２７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１２９】
前記腫瘍標的化部分または免疫細胞エンゲージャは、κもしくはλの前記軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１〜１２８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３０】
第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分を含み、前記第１の腫瘍標的化部分は、κ軽鎖定常領域またはその断片を含み、かつ前記第２の腫瘍標的化部分は、λ軽鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１２９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３１】
第１の腫瘍部分および第２の腫瘍標的化部分を含み、前記第１の腫瘍標的化部分および前記第２の腫瘍標的化部分は、共通の軽鎖可変領域を含む、請求項１〜１２８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３２】
前記免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、腫瘍標的化部分、前記免疫細胞エンゲージャ、前記サイトカイン分子または前記間質調節部分の１つまたは複数に結合され、例えば共有結合される、請求項１〜１２８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３３】
第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）のインターフェースは、例えば、非改変インターフェースと比べて二量体化を増加または減少させるように改変され、例えば変異される、請求項１〜１３２のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３４】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）の二量体化は、例えば、非改変インターフェースと比べてヘテロ多量体：ホモ多量体のより高い比率が生じるように、第１および第２のＦｃ領域のＦｃインターフェースに、対になった空洞−突起（「ノブ・イン・ホール」）、静電相互作用または鎖交換の１つまたは複数を提供することによって促進される、請求項１３３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３５】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、例えば、ヒトＩｇＧ１の前記Ｆｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７または４０９の１つまたは複数から選択される位置にアミノ酸置換を含む、請求項１３３または１３４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３６】
前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖ（例えば、空洞もしくはホールに対応する）またはＴ３６６Ｗ（例えば、突起もしくはノブに対応する）あるいはその組合せから選択されるアミノ酸置換を含む、請求項１３３〜１３５のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３７】
リンカー、例えば前記標的化部分および前記サイトカイン分子もしくは前記間質調節部分、前記標的化部分および前記免疫細胞エンゲージャ、前記サイトカイン分子もしくは前記間質調節部分および前記免疫細胞エンゲージャ、前記サイトカイン分子もしくは前記間質調節部分および前記免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、前記Ｆｃ領域）、前記標的化部分および前記免疫グロブリン鎖定常領域、または前記免疫細胞エンゲージャおよび前記免疫グロブリン鎖定常領域の１つまたは複数間のリンカーをさらに含む、請求項１〜１３６のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３８】
前記リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、ペプチドリンカー、フレキシブルリンカー、剛性リンカー、らせん状リンカーまたは非らせん状リンカーから選択される、請求項１３７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１３９】
前記リンカーは、ペプチドリンカーである、請求項１３８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４０】
前記ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む、請求項１３９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４１】
第１および第２の非隣接ポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）前記第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、サイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャに連結される、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、例えば抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖを含み；および
（ｉｉ）前記第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原（例えば、前記第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する前記第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば前記Ｆａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む、請求項１〜１４０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４２】
第１および第２の非隣接ポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）前記第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、前記第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）前記第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、前記第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）前記第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、前記癌抗原に結合する前記第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば前記Ｆａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む、請求項１〜１４０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４３】
第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含む三重特異性分子であり、
（ｉ）前記第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、前記第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）前記第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、前記第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）前記第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、前記癌抗原に結合する前記第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば前記Ｆａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含み、
前記第１または第２のポリペプチドのいずれかは、前記第１または第２の免疫グロブリン定常ドメインのＣ末端に任意選択的に共有結合されるサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャをさらに含む、請求項１〜１４０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４４】
第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含む四重特異性分子であり、
（ｉ）前記第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、前記第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）前記第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、前記第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）前記第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、前記癌抗原に結合する前記第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば前記Ｆａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含み、
前記第１および第２のポリペプチドは、前記第１または第２の免疫グロブリン定常ドメインのＣ末端に任意選択的に共有結合されるサイトカイン分子および／または免疫細胞エンゲージャをさらに含む、請求項１〜１４０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４５】
ａ）第１のポリペプチドであって、
前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子と；
腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャ；間質調節部分およびサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチドと
を含む第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子と；
腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチドと
を含む第２のポリペプチドと
を含み、腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャ；間質調節部分およびサイトカイン分子を含む、請求項１〜１４０のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４６】
腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよび２つのサイトカイン分子または２つの間質調節部分；
腫瘍標的化部分；２つの免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子または間質調節部分；または
２つの腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子または間質調節部分
を含む、請求項１４５に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４７】
２つの腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子を含み、前記２つの腫瘍標的化部分の１つは、ＰＤＬ１に結合する抗体分子であり；前記２つの腫瘍標的化部分の１つは、メソテリンに結合し；前記免疫細胞エンゲージャは、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ３０に結合し；かつ前記サイトカインは、ＩＬ２である、請求項１４６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４８】
ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと；
ｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびにサイトカイン分子または間質調節部分を含むこと；または
ｉｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと；および
ｉｖ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと；
ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびにサイトカイン分子または間質調節部分を含むこと；または
ｉｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；前記第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと
を含む、請求項１４６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１４９】
（ｉ）前記腫瘍標的化部分は、
（ｉａ）ＰＤＬ１、メソテリン、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼもしくはｃ−Ｍｅｔから選択される固形腫瘍抗原に対する抗体分子；および／または
（ｉｂ）ＦＡＰ、ヒアルロン酸、コラーゲンＩＶ、テネイシンＣもしくはテネイシンＷから選択される間質抗原に対する抗体分子；あるいは
前記固形腫瘍抗原に対する前記抗体分子と、前記間質抗原に対する前記抗体分子との組合せと；
（ｉｉ）
（ｉｉａ）ＣＤ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０Ｌ；Ｂ７−Ｈ６またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される前記免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｂ）ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７もしくはＩＬ−２１、その断片もしくは変異体または上記のサイトカイン分子のいずれかの組合せから選択される前記サイトカイン分子；
（ｉｉｃ）ヒアルロニダーゼまたはゼラチナーゼから選択される前記間質調節部分
の１つ、２つまたは全てと
を含む、請求項１〜１４８のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５０】
メソテリン、例えばヒトメソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０ＬポリペプチドおよびＩＬ−１５またはＩＬ−２分子を含む、請求項１４９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５１】
前記抗体分子は、軽鎖および重鎖を有する、メソテリンに対するＦａｂを含む、請求項１５０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５２】
メソテリンに対する前記Ｆａｂの前記重鎖は、前記ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子、例えばヒトＩＬ−１５分子をさらに含み、任意選択的に、前記Ｆａｂおよび前記ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子は、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して結合される、請求項１５１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５３】
以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、メソテリンに対する前記Ｆａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）からＩＬ−１５またはＩＬ−２を有し、任意選択的に、前記Ｆａｂおよび前記ＩＬ−１５またはＩＬ−２間のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む、請求項１５２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５４】
メソテリンに対する前記Ｆａｂの前記軽鎖は、ＣＤ４０Ｌをさらに含み、任意選択的に、前記Ｆａｂおよび前記ＣＤ４０Ｌは、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して結合される、請求項１５０〜１５３のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５５】
以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ４０Ｌに融合されたメソテリンに対する前記Ｆａｂの軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬ１）を有し、任意選択的に、前記Ｆａｂおよび前記ＣＤ４０Ｌ間のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む、請求項１５４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５６】
ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに対する抗体分子およびＩＬ−１５またはＩＬ−２分子を含む、請求項１４９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５７】
前記抗体分子は、軽鎖および重鎖を有する、ＦＡＰに対するＦａｂを含む、請求項１５６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５８】
ＦＡＰに対する前記Ｆａｂの前記重鎖は、前記第１のＦｃ領域の前記Ｆｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）のメンバーを有する第１のＦｃ領域をさらに含む、請求項１５７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１５９】
以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、第１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）に融合されたＦＡＰの前記Ｆａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）を有する、請求項１５８に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６０】
前記ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子、例えばヒトＩＬ−１５またはＩＬ−２分子は、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して連結される、前記第２のＦｃ領域の前記Ｆｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第２のメンバーを有する第２のＦｃ領域をさらに含む、請求項１５６〜１５９のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６１】
以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子−第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）を有し、例えば、前記ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子および前記第２のＦｃ領域は、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して連結される、請求項１６０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６２】
免疫細胞エンゲージャをさらに含む、請求項１５６〜１６１のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６３】
前記免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンドを含む、請求項１６２に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６４】
前記免疫細胞エンハンサーは、前記対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の前記第２のメンバーおよび前記ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子、例えばヒトＩＬ−１５またはＩＬ−２分子を有する前記第２のＦｃ領域に結合され、例えば共有結合され、任意選択的に、前記ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２分子と前記第２のＦｃ領域との間および／または前記第２のＦｃ領域と前記免疫細胞エンハンサーとの間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む、請求項１６２または１６３に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６５】
以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子−第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）−免疫細胞エンハンサーを有し、任意選択的に、前記ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２分子と前記第２のＦｃ領域との間および／または前記第２のＦｃ領域と前記免疫細胞エンハンサーとの間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む、請求項１６４に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６６】
第２の免疫細胞エンハンサーをさらに含む、請求項１５６〜１６５のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６７】
前記第２の免疫細胞エンハンサーは、Ｂ７Ｈ６分子を含む、請求項１６６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６８】
前記第２の免疫細胞エンハンサーは、前記第１のＦｃ領域の前記Ｆｃインターフェース中の前記対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の前記第１のメンバーおよび前記Ｆａｂの前記重鎖を有する前記第１のＦｃ領域に結合され、例えば共有結合され、任意選択的に、前記Ｂ７Ｈ６分子および前記第１のＦｃ領域間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む、請求項１６６または１６７に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１６９】
固形腫瘍抗原または間質抗原に対する標的化抗体分子および少なくとも２つの免疫細胞エンハンサーを含む、請求項１４９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７０】
前記抗体分子は、メソテリンまたはＦＡＰに結合する、請求項１６９に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７１】
前記免疫細胞エンハンサーは、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト）またはＳＴＩＮＧアゴニストおよびＯＸ４０に対する抗体分子である、請求項１６９または１７０に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７２】
前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に、２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）またはその組合せを含み、任意選択的に、前記ＳＴＩＮＧアゴニストは、前記標的化抗体または前記免疫細胞エンハンサーに結合される（例えば、直接コンジュゲートされる）、請求項１７１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７３】
前記ＴＬＲアゴニストは、非メチル化ＣｐＧ配列を含む、請求項１７１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７４】
メソテリンまたはＦＡＰに対する第１の結合特異性およびＯＸ４０に対する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体を含む、請求項９２〜９６のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１７５】
請求項１〜１７４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１７６】
（ｉ）請求項１〜１７４のいずれか一項に記載の腫瘍標的化部分；
（ｉｉ）請求項１〜１７４のいずれか一項に記載の免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｉ）請求項１〜１７４のいずれか一項に記載のサイトカイン分子；および
（ｉｖ）任意選択的に、請求項１３７〜１７４のいずれか一項に記載のリンカー
の１つまたは複数をコードする単離核酸分子。
【請求項１７７】
本明細書に記載される前記多重特異性もしくは多機能性分子のいずれかをコードする前記ヌクレオチド配列またはそれと実質的に相同である（例えば、それと少なくとも９５％〜９９．９％同一である）ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１７８】
請求項１７５〜１７７のいずれか一項に記載の核酸分子の１つまたは複数を含むベクター、例えば発現ベクター。
【請求項１７９】
請求項１７５〜１７８のいずれか一項に記載の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８０】
請求項１〜１７４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドを作製、例えば産生する方法であって、好適な条件、例えば遺伝子発現および／またはホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化に好適な条件下において、請求項１７９に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項１８１】
請求項１〜１７４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドと、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤とを含む医薬組成物。
【請求項１８２】
癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜１７４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドを投与することを含み、前記多重特異性抗体は、前記癌を治療するのに有効な量で投与される、方法。
【請求項１８３】
前記癌は、固形腫瘍癌または転移性病変である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記固形腫瘍癌は、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌または肝臓癌の１つまたは複数である、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記癌は、血液癌である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８６】
第２の治療処置を投与することをさらに含む、請求項１８２〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記第２の治療処置は、治療剤（例えば、化学療法剤、生物剤、ホルモン療法）、放射線または手術を含む、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記治療剤は、化学療法剤または生物剤から選択される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記第１の腫瘍標的化部分は、ＣＤ１２３に結合し、前記第２の腫瘍標的化部分は、ＣＤ４７に結合し、かつ前記Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３アゴニストであるかまたはそれを含む、請求項６に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１９０】
前記免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞への結合およびＴ細胞の活性化を媒介するＴ細胞エンゲージャを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１９１】
前記免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞への結合を媒介するが、Ｔ細胞の活性化を媒介しないＴ細胞エンゲージャを含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【請求項１９２】
前記Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２またはＣＤ２２６に結合する、請求項１９０または１９１に記載の多重特異性または多機能性分子ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１０，９２９号明細書、および２０１６年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／３１０，８９９号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
腫瘍標的化部分と、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子または間質調節因子（ｓｔｒｏｍａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の１つ、２つまたは全てとを含む多重特異性分子およびそれを使用する方法が開示される。間質調節部分（ｓｔｒｏｍａｌ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）および腫瘍標的化部分を含む多機能性分子も本明細書に開示され、それを使用する方法が開示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本開示は、特に（ｉ）腫瘍標的化部分と；（ｉｉ）免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される）；（ｉｉｉ）サイトカイン分子；および／または（ｉｖ）間質調節部分の１つ、２つまたは全てとを含む新規な多重特異性または多機能性分子に関する。ある実施形態において、多重特異性分子は、（ｉ）間質調節部分および（ｉｉ）腫瘍抗原または間質抗原に結合する腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子または受容体分子）を含む。「多重特異性」または「多機能性」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
【０００４】
理論に制約されることを望むものではないが、本明細書に開示される多重特異性または多機能性分子は、癌細胞において、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞またはマクロファージから選択される免疫エフェクター細胞）を標的化（例えば、局在化、架橋および／または活性化）し、および／または腫瘍間質を変化させ、例えば、癌部位の近くの腫瘍微小環境を変化させることが予想される。本明細書に記載される多重特異性分子を用いて免疫細胞の近接および／または活性を増大させることは、癌細胞に対する免疫応答を促進し、それにより、より有効な癌治療を提供することが予想される。理論に制約されるものではないが、癌細胞に対する標的化され、局在化された免疫応答は、本明細書に記載される多重特異性分子の全身毒性の作用を低減するものと考えられる。したがって、特に上記の部分を含む多重特異性分子（例えば、多重特異性または多機能性抗体分子）、それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法、および上記の分子を用いて癌を治療する方法が本明細書において提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、一態様において、本開示は、
（ｉ）癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば第１の腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｉ）サイトカイン分子；および
（ｉｖ）間質調節部分
の１つ、２つまたは全てと
を含む多重特異性または多重特異性分子（例えば、ポリペプチドまたはそれをコードする核酸）を特徴とする。
【０００６】
上記の分子のある実施形態において、
（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）が存在し、
１つの（ｉ）および１つの（ｉｉ）が存在する場合、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）または両方が存在し、または
１つの（ｉ）および１つの（ｉｉｉ）が存在する場合、（ｉｉ）もしくは（ｉｖ）または両方が存在する。
【０００７】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、（ｉ）、（ｉｉ）ならびに（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の一方または両方を含む。
【０００８】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、（ｉ）、（ｉｉｉ）ならびに（ｉｉ）および（ｉｖ）の一方または両方を含む。
【０００９】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。他の実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｖ）を含む。
【００１０】
さらに別の実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む。
【００１１】
別の態様において、
（ｉ）１つまたは複数の癌抗原に結合する少なくとも２つの腫瘍標的化部分、例えば第１および第２の腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｉ）間質調節部分；および
（ｉｖ）例えば、少なくとも２つの非隣接ポリペプチドを含むサイトカイン分子（例えば、多連鎖サイトカイン）
の１つ、２つまたは全てと
を含む多重特異性または多機能性分子ポリペプチドが本明細書において提供される。ある実施形態において、サイトカイン分子は、２つの鎖、例えばαおよびβ鎖（例えば、ＩＬ−１２）を含む。
【００１２】
ある実施形態において、少なくとも２つの腫瘍標的化部分、例えば第１および第２の腫瘍標的化部分は、同じかまたは異なる癌抗原に結合する。
【００１３】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、本明細書に記載される１つまたは２つの免疫細胞エンゲージャを含む。一実施形態において、１つまたは２つの免疫細胞エンゲージャは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１またはＡ２ａＲの１つまたは２つから選択されるチェックポイント分子に結合し、および／またはそれを阻害する抗体分子を含む。一実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、１つの免疫細胞エンゲージャ、例えばチェックポイントバインダーに対する２つの腫瘍標的化部分を含む。一実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、２つの免疫細胞エンゲージャ、例えば２つのチェックポイントバインダー（例えば、同じかまたは異なるチェックポイントバインダー）に対する２つの腫瘍標的化部分を含む。
【００１４】
ある実施形態において、第１の腫瘍標的化部分は、ＣＤ１２３に結合し、第２の腫瘍標的化部分は、ＣＤ４７に結合し、かつＴ細胞エンゲージャは、ＣＤ３アゴニストであるかまたはそれを含む。
【００１５】
さらに別の態様において、多機能性（例えば、二機能性）分子は、間質調節部分と、腫瘍抗原または間質抗原に結合する腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子または受容体分子）とを含む。
【００１６】
上記の多重特異性または多機能性分子のいずれかの実施形態において、分子は、第２の腫瘍標的化部分をさらに含み得る。実施形態において、第２の腫瘍標的化部分は、第１の腫瘍標的化部分、例えば（ｉ）の腫瘍標的化部分と同じかまたは異なる癌抗原に結合する。第２の腫瘍標的化部分は、第１の腫瘍標的化部分と同じ癌抗原における異なるエピトープに結合する。他の実施形態において、第２の腫瘍標的化部分および第１の腫瘍標的化部分は、異なる癌抗原に結合する。異なる癌抗原は、同じ細もしくは腫瘍組織に存在し得るか、または異なる細胞もしくは腫瘍組織に存在し得る。
【００１７】
理論に制約されることを望むものではないが、本明細書に記載される多重特異性分子などの免疫療法薬の全身毒性は、免疫応答を引き起こす前に免疫療法薬を主に腫瘍および／または間質に指向させることにより、管理、例えば減少され得るものと考えられる。この効果は、１つまたは複数の腫瘍標的化部分の親和性が免疫細胞エンゲージャおよび／またはサイトカインの親和性より高いようにバランスを取ることによって達成され得る。ある実施形態において、１つまたは複数の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、対応する免疫エフェクター細胞に対する多重特異性分子（例えば、免疫細胞エンゲージャおよび／またはサイトカイン）の親和性、例えば複合親和性と比較して腫瘍および／または間質細胞に対して少なくとも１０倍高い。複合親和性は、当該技術分野において公知の技術を用いて測定され得る。例えば、Ｍｅｓｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ．５；１３２：１４１−１４７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｂａ．２０１６．０９．０２８．Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｓｅｐ  ２６に記載されるように、単一の設備で二価二重特異性分子の結合活性の評価を可能にする、例えばＳＰＲに基づくアッセイを用いる。
【００１８】
したがって、多重特異性または多機能性分子のある実施形態において、第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分の癌抗原に対する親和性、例えば複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の親和性と等しいかまたはそれを超える。例えば、第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分の癌抗原に対する親和性、例えば複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い。
【００１９】
多重特異性または多機能性分子のさらに他の実施形態において、腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、腫瘍標的化部分または第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性と等しいかまたはそれを超える。例えば、腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、腫瘍標的化部分または第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い。
【００２０】
別の態様において、
Ａ、Ｂ−［二量体化モジュール］−Ｃ、−Ｄ
（式中、
（１）二量体化モジュールは、免疫グロブリン定常ドメイン、例えば重鎖定常ドメイン（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体重鎖定常領域、例えばＦｃ領域）、または免疫グロブリン可変領域の定常ドメイン（例えば、Ｆａｂ領域）を含み；および
（２）Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、独立して、存在しないか；（ｉ）腫瘍標的化部分、例えば第１および／もしくは第２の腫瘍標的化部分；（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；（ｉｉｉ）サイトカイン分子または（ｉｖ）間質調節部分である）
を含む多重特異性または多機能性分子ポリペプチドが本明細書において提供される。
【００２１】
ある実施形態において、前記多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、
（ｉ）癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば第１の腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｉ）サイトカイン分子；および
（ｉｖ）間質調節部分
の１つ、２つまたは全てとを含む。ある実施形態において、
（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し、
１つの（ｉ）および１つの（ｉｉ）が存在する場合、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）または両方は、存在し、または
１つの（ｉ）および１つの（ｉｉｉ）が存在する場合、（ｉｉ）もしくは（ｉｖ）または両方は、存在する。
【００２２】
例示的な多重特異性または多機能性分子は、以下を含む：
（ｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、第１の免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、第２の免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み、かつＣおよびＤは、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャを含み）；
（ｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、第１のサイトカイン分子を含み、かつＤは、第２のサイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み、かつＣおよびＤは、同じかまたは異なるサイトカイン分子を含み）；
（ｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、第１の間質調節部分を含み、かつＤは、第２の間質調節部分を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み、かつＣおよびＤは、同じかまたは異なる間質調節部分を含み）；
（ｉｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、サイトカイン分子を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、間質調節部分を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、間質調節部分を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｖｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、サイトカイン分子を含み、かつＤは、間質調節部分を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｉｘ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、間質調節部分を含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｘ）Ａは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢ、ＣおよびＤの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉ）Ｂは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＣおよびＤの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉｉ）Ｃは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢおよびＤの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉｉｉ）Ｄは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢおよびＣの少なくとも１つ、２つまたは３つは、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子、間質調節部分を含むかまたは存在せず、ただし、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が存在しない場合、（ｉ）および（ｉｖ）は、存在し；
（ｘｉｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ免疫細胞エンゲージャおよび非存在であり；
（ｘｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および免疫細胞エンゲージャであり；
（ｘｖｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれサイトカイン分子および非存在であり；
（ｘｖｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在およびサイトカイン分子であり；
（ｘｖｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ間質調節部分および非存在であり；
（ｘｉｘ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および間質調節部分であり；
（ｘｘ）Ａは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｘｉ）Ｂは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｘｉｉ）Ｃは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢまたはＤの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｘｉｉｉ）Ｄは、腫瘍標的化部分を含み、かつＡ、ＢまたはＣの１つは、間質調節部分を含み；
（ｘｉｖ）ＡまたはＢは、腫瘍標的化部分を含み、かつＣは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖ）ＡまたはＢは、腫瘍標的化部分を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み、かつＣは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖｉ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つの免疫細胞エンゲージャを含み、かつＤは、腫瘍標的化部分を含み、かつＣは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖｉｉ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つの免疫細胞エンゲージャを含み、かつＣは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢは、サイトカイン分子を含み；
（ｘｖｉｉｉ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つのサイトカインを含み、かつＤは、腫瘍標的化部分を含み、かつＣは、免疫細胞エンゲージャを含み；または
（ｘｉｘ）Ａおよび／またはＢは、１つまたは２つのサイトカインを含み、かつＣは、腫瘍標的化部分を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含む。
【００２３】
例示的な分子の選択は、以下を含む：
（ｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、免疫細胞エンゲージャ（例えば、樹枝状細胞エンゲージャ）を含み、かつＤは、サイトカイン分子を含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、Ｃは、サイトカイン分子を含み、かつＤは、免疫細胞エンゲージャを含み（例えば、ＡおよびＢは、同じかまたは異なる標的化部分を含み）；
（ｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ免疫細胞エンゲージャおよび非存在であり；
（ｉｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および免疫細胞エンゲージャ、例えばＴ細胞エンゲージャであり；
（ｖ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれサイトカイン分子および非存在であり；
（ｖｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在およびサイトカイン分子であり；
（ｖｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ間質調節部分および非存在であり；
（ｖｉｉｉ）Ａは、第１の腫瘍標的化部分を含み、Ｂは、第２の腫瘍標的化部分を含み、ＣおよびＤは、それぞれ非存在および間質調節部分であり；または
（ｉｘ）Ａは、腫瘍標的化部分を含み、かつＢ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分を含む。
【００２４】
上記の分子のいずれかのある実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分は、同じ癌抗原における異なるエピトープまたは異なる癌抗原に結合する。
【００２５】
他の実施形態において、異なる癌抗原は、同じ細胞または腫瘍組織または異なる細胞または腫瘍組織に存在する。
【００２６】
上記の分子のいずれかの他の実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分の癌抗原に対する親和性、例えば複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の親和性と等しいかまたはそれを超える。例えば、第１および第２の腫瘍標的化部分の癌抗原に対する親和性、例えば複合親和性は、その対応する結合メンバーに対する（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）（単独でまたは多重特異性分子の一部としてのいずれかで）の親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い。
【００２７】
上記の分子のいずれかのさらに他の実施形態において、腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する第１および第２の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、腫瘍標的化部分または第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性と等しいかまたはそれを超える。例えば、腫瘍、例えば癌細胞または間質細胞に対する第１および第２の腫瘍標的化部分の親和性、例えば複合親和性は、腫瘍標的化部分または第２の腫瘍標的化部分の１つのみを有する同様の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドの親和性より少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５または１００倍高い。
【００２８】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌抗原に結合するが、それを活性化または調節しない。他の実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌抗原に結合し、かつそれを活性化または調節する。
【００２９】
他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えばエフェクター細胞に結合するが、それを活性化しない。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えばエフェクター細胞に結合し、かつそれを活性化する。
【００３０】
他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えばエフェクター細胞に結合するが、それを活性化しない。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えばエフェクター細胞に結合し、かつそれを活性化する。
【００３１】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞に結合し、かつそれを活性化するＴ細胞エンゲージャを含む。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞に結合し、かつそれを活性化しないＴ細胞エンゲージャを含む。
【００３２】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、樹枝状細胞に結合し、かつそれを活性化する樹枝状細胞エンゲージャを含む。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、樹枝状細胞に結合し、かつそれを活性化しない樹枝状細胞エンゲージャを含む。
【００３３】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、マクロファージ細胞に結合し、かつそれを活性化するマクロファージ細胞エンゲージャを含む。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、マクロファージ細胞に結合し、かつそれを活性化しないマクロファージ細胞エンゲージャを含む。
【００３４】
さらに他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャおよび／または腫瘍標的化部分は、チェックポイント阻害剤（例えば、チェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば免疫細胞）に結合するが、それを阻害しない。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャおよび／または腫瘍標的化部分は、チェックポイント阻害剤（例えば、チェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば免疫細胞）に結合し、かつそれを阻害する。例示的なチェックポイント分子としては、限定はされないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１およびＡ２ａＲが挙げられる。一実施形態において、免疫細胞エンゲージャおよび／または腫瘍標的化部分は、ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用に結合するが、それを阻害しない。別の実施形態において、免疫細胞エンゲージャおよび／または腫瘍標的化部分は、ＰＤ１−ＰＤＬ１相互作用に結合し、かつそれを阻害する。
【００３５】
本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、例えば、多重特異性分子との関連外で（または個々の成分、例えば個々の免疫細胞エンゲージャを有する多重特異性分子に関連して）成分が個別に示されるとき、開示される多重特異性分子は、免疫細胞を活性化しないが、２つ以上の成分、例えば２つ以上の免疫細胞エンゲージャを含む多重特異性分子に関連して示されるとき、多重特異性分子は、免疫細胞を活性化する。２つの異なる受容体が多重特異性分子の異なる部分によって結合されるとき、またはエフェクター細胞の同じ受容体における２つの異なるエピトープが多重特異性分子によって結合されるとき（例えば、免疫細胞における対応する受容体の活性化または阻害）、例えば、多重特異性分子は、免疫細胞に結合するときに活性化され得る。活性レベルは、例えば、多重特異性分子中の個別に示される成分を、多重特異性分子中で組み合わせて示される２つ以上の成分と例えば比較することにより、本明細書に記載されるアッセイのいずれかによって評価され得る。理論に制約されることを望むものではないが、多重特異性分子の２つ以上の異なる部分の結合は、物理的状態、例えば、立体構造、凝集の変化を引き起こすものと考えられ、これは、癌細胞に対する免疫応答の、調節され、標的化された活性化をもたらし、このような調節された活性化は、本明細書に記載される多重特異性分子の全身毒性の作用を低減するものと考えられる。
【００３６】
他の実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌抗原に結合する抗体分子、受容体分子（例えば、受容体、受容体断片もしくはその機能的変異体）またはリガンド分子（例えば、リガンド、リガンド断片もしくはその機能的変異体）、あるいはその組合せを含む。例えば、腫瘍標的化部分は、血液癌、固形腫瘍、転移性癌、軟部組織腫瘍、転移性病変またはその組合せに存在する癌抗原に結合し得る。他の実施形態において、癌抗原は、腫瘍抗原もしくは間質抗原または血液抗原である。腫瘍抗原または間質抗原は、線維性または線維形成性固形腫瘍に存在し得る。例えば、腫瘍抗原または間質抗原は、腫瘍、例えば限定された腫瘍灌流、圧縮された血管または線維性腫瘍間質の１つまたは複数を有することを特徴とする種類の腫瘍に存在する。
【００３７】
標的化され得る例示的な癌としては、限定はされないが、腫瘍、例えば固形腫瘍、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌または肝臓癌が挙げられる。癌はまた、限定はされないが、Ｂ細胞またはＴ細胞悪性腫瘍、例えばホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫および急性リンパ球性白血病を含む血液癌であり得る。
【００３８】
ある実施形態において、癌抗原、例えば固形腫瘍抗原は、ＰＤＬ１、ＣＤ４７、メソテリン、ガングリオシド２（ＧＤ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｒｏｎキナーゼ、ｃ−Ｍｅｔ、未熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化塩素イオンチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−β受容体、ＡＦＰ、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、ＣＤ４７、αアクチニン−４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ＮＡ８８−１、ＮＰＭ、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＲＣＣ、ＲＵＩ１、ＲＵＩ２、ＳＡＧＥ、ＴＲＧ、ＴＲＰ１、ＴＳＴＡ、葉酸受容体α、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１）、炭水化物（Ｌｅ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２またはＲＡＮＫＬから選択される。他の実施形態において、癌抗原は、線維芽細胞活性化プロテアーゼ（ＦＡＰ）、ＴＧＦ−β、ヒアルロン酸、コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ、テネイシンＣまたはテネイシンＷから選択され得る間質抗原である。癌抗原が血液抗原である実施形態において、癌抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ９９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、ＳＬＡＭＦ７またはＮＹ−ＥＳＯ１から選択され得る。
【００３９】
本明細書に開示される多重特異性または多機能性分子のいずれかのある実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＣＤ４７またはＣＤ１２３から選択される癌抗原に対する抗体分子から選択される。例えば、腫瘍標的化部分は、メソテリンまたはＰＤＬ１に結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含み得る。ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＰＤＬ１に結合し、かつＰＤ１とのＰＤＬ１の相互作用を阻害する。他の実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＰＤＬ１に結合し、かつＰＤ１とのＰＤ  Ｌ１の相互作用を阻害しない。
【００４０】
実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＡＰ、ＣＤ１２３またはＣＤ４７から選択される２つまたは３つの癌抗原に対する２つまたは３つの抗体分子を含み得る。例えば、第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗メソテリン抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子であり；または第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗メソテリン抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である。他の組合せとしては、限定はされないが、第１および第２の腫瘍標的化部分が、それぞれ抗ＦＡＰ抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子であり；または第２および第１の腫瘍標的化部分が、それぞれ抗ＦＡＰ抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子であることが挙げられる。他の実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＨＥＲ３抗体分子および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体分子であり；または第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＨＥＲ３抗体分子および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体分子である。他の実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＣＤ１２３抗体分子および抗ＣＤ４７抗体分子であり；または第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＣＤ１２３抗体分子および抗ＣＤ４７抗体分子である。
【００４１】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャまたはその組合せから選択される免疫細胞エンゲージャを含み得る。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞への結合およびＮＫ細胞の活性化を媒介するＮＫ細胞エンゲージャを含む。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞への結合を媒介するが、ＮＫ細胞の活性化を媒介しないＮＫ細胞エンゲージャを含む。例示的なＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂまたは両方）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４としても知られている）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＣＤ１６０に結合する（例えば、それを活性化する、抗体分子、例えば抗原結合ドメインまたはリガンドから選択され得る。ある実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０またはＮＫｐ４６に結合する抗体分子、例えば抗原結合ドメインである。
【００４２】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞への結合およびＴ細胞の活性化を媒介するＴ細胞エンゲージャを含む。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞への結合を媒介するが、Ｔ細胞の活性化を媒介しないＴ細胞エンゲージャを含む。
【００４３】
多重特異性または多機能性分子の他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、リガンドであり、任意選択的に、リガンドは、免疫グロブリン定常領域、例えばＦｃ領域をさらに含む。例えば、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６のリガンドは、ウイルスＨＡであり；ＤＡＰ１０のリガンドは、ＮＫＧ２Ｄの補助受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり；ＣＤ１６のリガンドは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンド、例えば抗体Ｆｃ領域をさらに含むＣＤ１６ａ／ｂリガンドである。
【００４４】
他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージおよび／もしくは樹枝状細胞またはそれらの両方、それらの１つもしくは複数への結合またはそれらの活性化を媒介する。
【００４５】
多重特異性または多機能性分子の他の実施形態において、Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２またはＣＤ２２６のアゴニストである。他の実施形態において、Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２またはＣＤ２２６に結合するが、それを活性化しない。
【００４６】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）；Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；４１ＢＢ；ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つまたは複数から選択されるＢ細胞、マクロファージおよび／または樹枝状細胞エンゲージャを含む。
【００４７】
ある実施形態において、Ｂ細胞エンゲージャは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンドまたはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子である。
【００４８】
他の実施形態において、マクロファージ細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４０Ｌ；ＯＸ４０Ｌ；ＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストである。
【００４９】
さらに他の実施形態において、樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストである。例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に、２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）またはその組合せを含み得る。ＳＴＩＮＧアゴニストは、例えば、当該技術分野において公知の技術により、多重特異性または多機能性分子に共有結合され得る。
【００５０】
他の実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、またはインターフェロンγ、またはその断片もしくは変異体、あるいは上記のサイトカインのいずれかの組合せから選択される。サイトカインは、モノマーまたは二量体であり得る。例えば、サイトカイン分子は、受容体二量体化ドメイン、例えばＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインをさらに含み得る。他の実施形態において、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、共有結合されず、例えば非共有結合的に結合される。
【００５１】
他の実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、間質または細胞外基質（ＥＣＭ）成分のレベルもしくは産生の減少；腫瘍線維化の減少；間質腫瘍輸送の増加；腫瘍灌流の改善；腫瘍微小血管系の拡張；腫瘍における間質液圧（ＩＦＰ）の低下または腫瘍もしくは腫瘍血管系への薬剤、例えば癌治療薬もしくは細胞療法薬の浸透もしくは拡散の減少もしくは促進の１つまたは複数を引き起こす間質調節部分を含み得る。例えば、減少される間質またはＥＣＭ成分は、グリコサミノグリカンもしくは細胞外タンパク質またはその組合せから選択される。グリコサミノグリカンは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはＨＡとしても知られている）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、エンタクチン、テネイシン、アグリカンまたはケラチン硫酸から選択され得る。例示的な細胞外タンパク質としては、限定はされないが、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン、フィブロネクチンまたはビトロネクチンが挙げられる。
【００５２】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、腫瘍間質または細胞外基質（ＥＣＭ）を分解する酵素分子を含む間質調節部分を含む。酵素分子は、ヒアルロニダーゼ分子、コラゲナーゼ分子、コンドロイチナーゼ分子、マトリックスメタロプロテイナーゼ分子（例えば、マクロファージメタロエラスターゼ）または上記のいずれかの変異体（例えば、断片）から選択され得る。
【００５３】
ある実施形態において、間質調節部分は、ヒアルロン酸のレベルまたは産生を減少させる。例えば、間質調節部分は、ヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン合成を阻害する薬剤またはヒアルロン酸に対する抗体分子を含む。
【００５４】
さらに他の実施形態において、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼ分子またはその変異体（例えば、その断片）である。ヒアルロナン分解酵素は、中性または酸性ｐＨ、例えば約４〜５のｐＨで活性であり得る。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、哺乳動物ヒアルロニダーゼ分子、例えば組み換えヒトヒアルロニダーゼ分子またはその変異体（例えば、その切断型）である。例えば、ヒアルロニダーゼ分子は、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２もしくはＰＨ−２０／ＳＰＡＭ１またはその変異体（例えば、その切断型）から選択され得る。さらに他の実施形態において、切断型は、Ｃ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着部位またはＧＰＩ付着部位の一部を欠いている。
【００５５】
さらに他の実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、グリコシル化され、例えば少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む。
【００５６】
一実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１のアミノ酸配列またはその断片、あるいはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０もしくは１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、
（ｉ）配列番号６１の３６−４６４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６１に記載されるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０の３６−４８１、３６−４８２または３６−４８３のアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号６１に記載されるアミノ酸の配列のポリペプチドまたは切断型に対する少なくとも９５％〜１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号６１に記載されるアミノ酸配列に対する３０、２０、１０、５個またはそれよりも少ないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列
を含む。
【００５８】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一のアミノ酸配列を含み；または配列番号６１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００５９】
他の実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、ＰＨ２０、例えばｒＨｕＰＨ２０である。
【００６０】
一実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、ＨＹＡＬ１であり、かつアミノ酸配列：配列番号６２またはその断片、あるいはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０もしくは１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【００６１】
ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子は、ポリマーをさらに含み、例えば、ポリマー、例えばＰＥＧにコンジュゲートされる。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化ＰＨ２０酵素（ＰＥＧＰＨ２０）であり得る。
【００６２】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチド、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖定常領域、より特定的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）をさらに含む。
【００６３】
ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子に結合され、例えば共有結合される。ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるように改変され、例えば変異される。ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子は、二量体を形成する。
【００６４】
ある実施形態において、間質調節部分は、ヒアルロナン、例えばＨＡシンターゼの合成の阻害剤を含む。ある実施形態において、阻害剤は、ＨＡシンターゼに対するセンスもしくはアンチセンス核酸分子を含むか、または小分子薬剤である。ある実施形態において、阻害剤は、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）もしくはその誘導体（例えば、６，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンもしくは５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン）またはレフルノミドもしくはその誘導体である。ある実施形態において、間質調節部分は、コラゲナーゼ分子、例えば哺乳動物コラゲナーゼ分子またはその変異体（例えば、断片）を含む。ある実施形態において、コラゲナーゼ分子は、例えば、配列番号６３のアミノ酸配列またはその断片、あるいはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むコラゲナーゼ分子ＩＶである。
【００６５】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、２つの結合特異性または機能を含み、例えば、例として、ｉ）腫瘍標的化部分および免疫細胞エンゲージャであって、ただし、多重特異性分子が腫瘍標的化部分および免疫細胞エンゲージャのみを含む場合、免疫細胞エンゲージャは、ＮＫ細胞抗原に対する抗体分子でない、腫瘍標的化部分および免疫細胞エンゲージャ；またはｉｉ）腫瘍標的化部分および間質調節部分を含む二重特異性または二機能性分子である。
【００６６】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、３つまたは４つの結合特異性または機能を含み、例えば、三重特異性または四重特異性分子である。ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、（ｉ）少なくとも２つの腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子；（ｉｉ）腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャおよび間質調節部分；または（ｉｉｉ）メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）もしくはインスリン成長因子１Ｒ（ＩＧＦ１Ｒ）、ＣＤ４７またはＣＤ１２３から選択される２つの癌抗原であって、ただし、ＦＡＰおよびＩＧＦ１Ｒでない２つの癌抗原に結合する少なくとも２つの腫瘍標的化部分およびサイトカイン分子を含む。
【００６７】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、（ｉ）１つの腫瘍標的化部分と；（ｉｉ）２つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）と；（ｉｉｉ）１つのサイトカイン分子、または（ｉｖ）１つの間質調節部分の一方または両方とを含む。ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、（ｉ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）と；（ｉｉ）１つの免疫細胞エンゲージャと；（ｉｉｉ）１つのサイトカイン分子、または（ｉｖ）１つの間質調節部分の一方または両方とを含む。ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、（ｉ）１つの腫瘍標的化部分と；（ｉｉ）１つの免疫細胞エンゲージャと；（ｉｉｉ）２つのサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）の一方または両方とを含む。
【００６８】
ある実施形態において、２つの腫瘍標的化部分の１つが、ＰＤＬ１に結合し；２つの腫瘍標的化部分の１つは、メソテリンに結合し；免疫細胞エンゲージャは、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ３０に結合し；かつサイトカイン分子は、ＩＬ２である。
【００６９】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分もしくは免疫細胞エンゲージャまたは両方は、（ｉ）抗体分子、例えば少なくとも１つの免疫グロブリンドメインおよび／あるいは（ｉｉ）受容体もしくはリガンドまたはその断片を含む。
【００７０】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子は、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数で固形腫瘍抗原および／または間質抗原に結合する。
【００７１】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数でＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹枝状細胞抗原および／またはマクロファージ細胞抗原に結合する。
【００７２】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子は、腫瘍抗原または間質抗原上の立体構造または線形エピトープに結合する。
【００７３】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹枝状細胞抗原および／またはマクロファージ細胞抗原上の立体構造または線形エピトープに結合する。
【００７４】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子は、単一特異性抗体分子、二重特異性抗体分子または三重特異性抗体分子である。
【００７５】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子は、一価抗体分子、二価抗体分子または三価抗体分子である。
【００７６】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、単一特異性、二重特異性抗体分子または三重特異性抗体である。
【００７７】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、一価、二価または三価抗体である。
【００７８】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子および／または免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体もしくは二重特異性抗体またはその断片、その単一ドメイン変異体、あるいはラクダ科抗体）である。
【００７９】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子および免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、独立して、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体もしくは二重特異性抗体またはその断片、その単一ドメイン変異体、あるいはラクダ科抗体）である。
【００８０】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子および／または免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域またはその断片を含む。
【００８１】
ある実施形態において、腫瘍標的化抗体分子および／または免疫細胞エンゲージャ抗体分子は、κもしくはλの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域またはその断片を含む。
【００８２】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分もしくは免疫細胞エンゲージャまたは両方は、腫瘍抗原および／もしくは間質抗原、またはＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹枝状細胞抗原および／もしくはマクロファージ細胞抗原に結合する受容体もしくは受容体断片またはリガンドもしくはリガンド断片を含む。
【００８３】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の重鎖定常領域、より特定的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）をさらに含む。ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子の１つまたは複数に結合され、例えば共有結合される。ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるように改変され、例えば変異される。
【００８４】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、少なくとも２つの非隣接ポリペプチド鎖を含む。
【００８５】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分または免疫細胞エンゲージャは、κもしくはλの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域またはその断片を含む。
【００８６】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分を含み、第１の腫瘍標的化部分は、κ軽鎖定常領域またはその断片を含み、かつ第２の腫瘍標的化部分は、λ軽鎖定常領域またはその断片を含む。
【００８７】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１の腫瘍部分および第２の腫瘍標的化部分を含み、第１の腫瘍標的化部分および第２の腫瘍標的化部分は、共通の軽鎖可変領域を含む。
【００８８】
ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子または間質調節部分の１つまたは複数に結合され、例えば共有結合される。
【００８９】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、例えば、非改変インターフェースと比べて二量体化を増加または減少させるように改変され、例えば変異される第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）のインターフェースを含む。
【００９０】
ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）の二量体化は、例えば、非改変インターフェースと比べてヘテロ多量体：ホモ多量体のより高い比率が生じるように、第１および第２のＦｃ領域のＦｃインターフェースに、対になった空洞−突起（「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」）、静電相互作用または鎖交換の１つまたは複数を提供することによって促進される。
【００９１】
ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７または４０９の１つまたは複数から選択される位置にアミノ酸置換を含む。
【００９２】
ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖ（例えば、空洞もしくはホールに対応する）またはＴ３６６Ｗ（例えば、突起もしくはノブに対応する）あるいはその組合せから選択されるアミノ酸置換を含む。
【００９３】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、リンカー、例えば標的化部分およびサイトカイン分子もしくは間質調節部分、標的化部分および免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子もしくは間質調節部分および免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子もしくは間質調節部分および免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）、標的化部分および免疫グロブリン鎖定常領域、または免疫細胞エンゲージャおよび免疫グロブリン鎖定常領域の１つまたは複数間のリンカーをさらに含む。
【００９４】
ある実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、ペプチドリンカー、フレキシブルリンカー、剛性リンカー、らせん状リンカーまたは非らせん状リンカーから選択される。ある実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む。
【００９５】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１および第２の非隣接ポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、サイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャに連結される、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、例えば抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖを含み；および
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。
【００９６】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１および第２の非隣接ポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、癌抗原に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。
【００９７】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含む三重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、癌抗原に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含み、
第１または第２のポリペプチドのいずれかは、第１または第２の免疫グロブリン定常ドメインのＣ末端に任意選択的に共有結合されるサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャをさらに含む。
【００９８】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含む四重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチド間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子、間質調節部分または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、癌抗原に結合する第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含み、
第１および第２のポリペプチドは、第１または第２の免疫グロブリン定常ドメインのＣ末端に任意選択的に共有結合されるサイトカイン分子および／または免疫細胞エンゲージャをさらに含む。
【００９９】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、ａ）第１のポリペプチドであって、第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子と；腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャ；間質調節部分およびサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチドとを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第２のポリペプチドであって、第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子と；腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチドとを含む第２のポリペプチドとを含み、多重特異性または多機能性分子ポリペプチドは、腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャ；間質調節部分およびサイトカイン分子を含む。
【０１００】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよび２つのサイトカイン分子または２つの間質調節部分；
腫瘍標的化部分；２つの免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子または間質調節部分；または
２つの腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子または間質調節部分
を含む。
【０１０１】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、２つの腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子を含み、２つの腫瘍標的化部分の１つは、ＰＤＬ１に結合する抗体分子であり；２つの腫瘍標的化部分の１つは、メソテリンに結合し；免疫細胞エンゲージャは、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ３０に結合し；かつサイトカインは、ＩＬ２である。
【０１０２】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、
ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと；
ｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびにサイトカイン分子または間質調節部分を含むこと；または
ｉｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと；
ｉｖ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと；
ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびにサイトカイン分子または間質調節部分を含むこと；または
ｉｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子ならびに免疫細胞エンゲージャを含むこと
を含む。
【０１０３】
ある実施形態において、（ｉ）腫瘍標的化部分は、
（ｉａ）ＰＤＬ１、メソテリン、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼもしくはｃ−Ｍｅｔから選択される固形腫瘍抗原に対する抗体分子；および／または
（ｉｂ）ＦＡＰ、ヒアルロン酸、コラーゲンＩＶ、テネイシンＣもしくはテネイシンＷから選択される間質抗原に対する抗体分子；あるいは
固形腫瘍抗原に対する抗体分子と、間質抗原に対する抗体分子との組合せと；
（ｉｉ）
（ｉｉａ）ＣＤ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０Ｌ；Ｂ７−Ｈ６またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉｂ）ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８もしくはＩＬ−２１、その断片もしくは変異体または上記のサイトカイン分子のいずれかの組合せから選択されるサイトカイン分子；
（ｉｉｃ）ヒアルロニダーゼまたはゼラチナーゼから選択される間質調節部分
の１つ、２つまたは全てと
を含む。
【０１０４】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、メソテリン、例えばヒトメソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０ＬポリペプチドおよびＩＬ−１５またはＩＬ−２分子を含む。
【０１０５】
ある実施形態において、抗体分子は、軽鎖および重鎖を有する、メソテリンに対するＦａｂを含む。
【０１０６】
ある実施形態において、メソテリンに対するＦａｂの重鎖は、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子、例えばヒトＩＬ−１５分子をさらに含み、任意選択的に、ＦａｂおよびＩＬ−１５またはＩＬ−２分子は、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して結合される。
【０１０７】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、メソテリンに対するＦａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）からＩＬ−１５またはＩＬ−２を有し、任意選択的に、ＦａｂおよびＩＬ−１５またはＩＬ−２間のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。
【０１０８】
ある実施形態において、メソテリンに対するＦａｂの軽鎖は、ＣＤ４０Ｌをさらに含み、任意選択的に、ＦａｂおよびＣＤ４０Ｌは、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して結合される。
【０１０９】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ４０Ｌに融合されたメソテリンに対するＦａｂの軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬ１）を有し、任意選択的に、ＦａｂおよびＣＤ４０Ｌ間のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。
【０１１０】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性分子は、ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに対する抗体分子およびＩＬ−１５またはＩＬ−２分子を含む。ある実施形態において、抗体分子は、軽鎖および重鎖を有する、ＦＡＰに対するＦａｂを含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対するＦａｂの重鎖は、第１のＦｃ領域のＦｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）のメンバーを有する第１のＦｃ領域をさらに含む。
【０１１１】
ある実施形態において、多機能性または多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、第１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）に融合されたＦＡＰのＦａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）を有する。
【０１１２】
ある実施形態において、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子、例えばヒトＩＬ−１５またはＩＬ−２分子は、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して連結される、第２のＦｃ領域のＦｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第２のメンバーを有する第２のＦｃ領域をさらに含む。
【０１１３】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子−第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）を有し、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子および第２のＦｃ領域は、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して連結される。
【０１１４】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、免疫細胞エンゲージャをさらに含む。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンドを含む。ある実施形態において、免疫細胞エンハンサーは、対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第２のメンバーおよびＩＬ−１５またはＩＬ−２分子、例えばヒトＩＬ−１５またはＩＬ−２分子を有する第２のＦｃ領域に結合され、例えば共有結合され、任意選択的に、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２分子と第２のＦｃ領域との間および／または第２のＦｃ領域と免疫細胞エンハンサーとの間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む。
【０１１５】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＩＬ−１５またはＩＬ−２分子−第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）−免疫細胞エンハンサーを有し、任意選択的に、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−２分子と第２のＦｃ領域との間および／または第２のＦｃ領域と免疫細胞エンハンサーとの間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む。
【０１１６】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、第２の免疫細胞エンハンサーをさらに含む。ある実施形態において、第２の免疫細胞エンハンサーは、Ｂ７Ｈ６分子を含む。ある実施形態において、第２の免疫細胞エンハンサーは、第１のＦｃ領域のＦｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第１のメンバーおよびＦａｂの重鎖を有する第１のＦｃ領域に結合され、例えば共有結合され、任意選択的に、Ｂ７Ｈ６分子および第１のＦｃ領域間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む。
【０１１７】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、固形腫瘍抗原または間質抗原に対する標的化抗体分子および少なくとも２つの免疫細胞エンハンサーを含む。ある実施形態において、抗体分子は、メソテリンまたはＦＡＰに結合する。ある実施形態において、免疫細胞エンハンサーは、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト）またはＳＴＩＮＧアゴニストおよびＯＸ４０に対する抗体分子である。ある実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に、２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）またはその組合せを含み、任意選択的に、ＳＴＩＮＧアゴニストは、標的化抗体または免疫細胞エンハンサーに結合される（例えば、直接コンジュゲートされる）。ある実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、非メチル化ＣｐＧ配列を含む。
【０１１８】
ある実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、メソテリンまたはＦＡＰに対する第１の結合特異性およびＯＸ４０に対する第２の結合特異性を有する二重特異性抗体を含む。
【０１１９】
上記の多重特異性分子のいずれかのある実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１ＲまたはＦＡＰから選択される癌抗原に対する抗体分子から選択される。ある実施形態において、多重特異性分子は、メソテリン、ＰＤＬ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１ＲまたはＦＡＰから選択される２つまたは３つの癌抗原に対する２つまたは３つの抗体分子を含む。ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＰＤ  Ｌ１に結合し、かつＰＤ  Ｌ１と、そのリガンド、例えばＰＤ１との相互作用を阻害する。他の実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＰＤ  Ｌ１に結合し、かつＰＤ  Ｌ１と、そのリガンド、例えばＰＤ１との相互作用を阻害しない。
【０１２０】
ある実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗メソテリン抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である。ある実施形態において、第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗メソテリン抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である。
【０１２１】
ある実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＦＡＰ抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である。ある実施形態において、第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＦＡＰ抗体分子および抗ＰＤＬ１抗体分子である。
【０１２２】
ある実施形態において、第１および第２の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＨＥＲ３抗体分子および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体分子である。ある実施形態において、第２および第１の腫瘍標的化部分は、それぞれ抗ＨＥＲ３抗体分子および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体分子である。
【０１２３】
上記の多重特異性分子のいずれかのある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０に対する抗体分子、ＮＫｐ４６、ＣＤ４０Ｌまたは４１ＢＢＬに対する抗体分子から選択される。
【０１２４】
上記の多重特異性分子のいずれかのある実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２分子（例えば、ＩＬ−２もしくはその機能的変異体）、ＩＬ−１５分子（例えば、ＩＬ−１５もしくはその機能的変異体）またはＩＬ−２１分子（例えば、ＩＬ−２１もしくはその機能的変異体）である。
【０１２５】
上記の多重特異性分子のいずれかのある実施形態において、間質調節分子は、ヒアルロニダーゼ（例えば、ヒアルロニダーゼ１）もしくはその機能的変異体またはゼラチナーゼもしくはその機能的変異体から選択される。
【０１２６】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１２７】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）および抗ＮＫｐ３０  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ３０  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１２８】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）および抗ＮＫｐ３０  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ３０  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１２９】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）および抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）を含む。
【０１３０】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３１】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１３２】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３３】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３４】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３５】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）および抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）を含む。
【０１３６】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３７】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３８】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１３９】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１４０】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１４１】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）およびゼラチナーゼ（またはその機能的変異体）を含む。
【０１４２】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびゼラチナーゼ（またはその機能的変異体）を含む。
【０１４３】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分、ＩＬ−２１またはその機能的変異体、４１ＢＢ−ＬおよびＣＤ４０Ｌを含む。
【０１４４】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分およびＣＤ４０Ｌを含む。
【０１４５】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分およびＩＬ−１５を含む。
【０１４６】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１４７】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）および抗ＮＫｐ３０  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ３０  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１４８】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）および抗ＮＫｐ３０  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ３０  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１４９】
一実施形態において、多重特異性分子は、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１５０】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）および抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）を含む。
【０１５１】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１５２】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１５３】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗メソテリン腫瘍標的化部分（例えば、抗メソテリンＦａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１５４】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１５５】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１５６】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）および抗ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＣＤ３  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０１５７】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１５８】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）、抗ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＣＤ３  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−２（またはその機能的変異体）を含む。
【０１５９】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）および抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）を含む。
【０１６０】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）およびＩＬ−７（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６１】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）、抗ＣＤ３  Ｔ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＣＤ３  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−７（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６２】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＨＥＲ３腫瘍標的化部分（例えば、抗ＨＥＲ３  Ｆａｂ）、抗ＩＧＦ１Ｒ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）およびＩＬ−７（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６３】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６４】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６５】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６６】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６７】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ部分（例えば、抗ＮＫｐ４６  ＦａｂまたはｓｃＦｖ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびヒアルロニダーゼ１（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６８】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）およびゼラチナーゼ（またはその機能的変異体）を含む。
【０１６９】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗ＦＡＰ腫瘍標的化部分（例えば、抗ＦＡＰ  Ｆａｂ）、抗ＰＤＬ１腫瘍標的化部分（例えば、抗ＰＤＬ１  Ｆａｂ）、ＩＬ−２（またはその機能的変異体）およびゼラチナーゼ（またはその機能的変異体）を含む。
【０１７０】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される任意の多重特異性または多機能性分子ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。
【０１７１】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される多重特異性もしくは多機能性分子のいずれかをコードするヌクレオチド配列またはそれと実質的に相同である（例えば、それと少なくとも９５％〜９９．９％同一である）ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。
【０１７２】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される任意の核酸分子の１つまたは複数を含むベクター、例えば発現ベクターを提供する。
【０１７３】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１７４】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される多重特異性または多機能性分子ポリペプチドを作製、例えば生成する方法であって、好適な条件、例えば遺伝子発現および／またはホモ二量体化もしくはヘテロ二量体化に好適な条件下において、本明細書に記載される宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。
【０１７５】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される多重特異性または多機能性分子ポリペプチドと、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０１７６】
別の態様において、本開示は、癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される多重特異性または多機能性分子ポリペプチドを投与することを含み、多重特異性抗体は、癌を治療するのに有効な量で投与される、方法を提供する。
【０１７７】
ある実施形態において、癌は、固形腫瘍癌または転移性病変である。ある実施形態において、固形腫瘍癌は、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌または肝臓癌の１つまたは複数である。ある実施形態において、癌は、血液癌である。
【０１７８】
ある実施形態において、本方法は、第２の治療処置を投与することをさらに含む。ある実施形態において、第２の治療処置は、治療剤（例えば、化学療法剤、生物剤、ホルモン療法）、放射線または手術を含む。ある実施形態において、治療剤は、化学療法剤または生物剤から選択される。
【０１７９】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは均等な方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、好適な方法および材料が後述される。全ての刊行物、特許出願、特許および本明細書において言及される参考文献は、全体が参照により援用される。抵触する場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。さらに、材料、方法および実施例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることは意図されていない。
【０１８０】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１Ａ−１Ｃ】単一のポリペプチド鎖、例えばｓｃＦｖベースフォーマットを含む多重特異性分子の概略図を示す。二重特異性および三重特異性分子は、ｓｃＦｖコアを含み得る。パートナーＡは、任意選択的にリンカーによって連結されるＶＨのＮ末端またはＶＬのＣ末端（それぞれ図１Ａまたは図１Ｂ）に連結され得、パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２に対応する。パートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１および結合部分２は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；結合部分２に対応するパートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるサイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。三重特異性フォーマットの実施形態において、パートナーＡおよびＢは、それぞれ結合部分２および３として、例えばリンカーを介してｓｃＦｖに結合される（図１Ｃ）。パートナーＡおよびパートナーＢは、独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１、結合部分２および結合部分３は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；パートナーＡおよびＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるサイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。パートナーＡは、例えば、本明細書に記載される間質調節部分であり得る。ある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化部分であり、結合部分２は、間質調節部分である。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；結合部分２に対応するパートナーＡは、例えば、本明細書に記載される間質調節部分である。三重特異性フォーマットの実施形態において、パートナーＡおよびＢは、それぞれ結合部分２および３として例えばリンカーを介してｓｃＦｖに結合される（図１Ｃ）。三重特異性分子は、融合パートナーＢ、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャであり得る結合部分３を追加する。融合パートナーＡおよびＢは、それぞれＦａｂの重鎖および軽鎖上またはｓｃＦｖの軽鎖および重鎖上にあり得る。ある実施形態において、パートナーＡは、例えば、本明細書に記載される間質調節部分である。ある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化部分であり、結合部分２は、間質調節部分である。
【図２Ａ−２Ｃ】単一のポリペプチド鎖、例えばｓｃＦｖベースフォーマットを含む多重特異性分子の概略図を示す。二重特異性および三重特異性分子は、ｓｃＦｖコアを含み得る。パートナーＡは、任意選択的にリンカーによって連結されるＶＨのＣ末端またはＶＬのＮ末端（それぞれ図２Ａまたは図２Ｂ）に連結され得、パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２に対応する。パートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；結合部分２に対応するパートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるサイトカイン、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、結合部分１および結合部分２は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。三重特異性フォーマットの実施形態において、パートナーＡおよびＢは、それぞれ結合部分２および３として例えばリンカーを介してｓｃＦｖに結合される（図１Ｃ）。パートナーＡおよびパートナーＢは、独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１、結合部分２および結合部分３は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；パートナーＡおよびＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるサイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。パートナーＡは、任意選択的にリンカーによって連結されるＶＨのＣ末端またはＶＬのＮ末端（それぞれ図２Ａまたは図２Ｂ）に連結され得、パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２に対応する。ある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化部分であり、結合部分２は、間質調節部分である。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；結合部分２に対応するパートナーＡは、例えば、本明細書に記載される間質調節部分である。三重特異性フォーマットの実施形態において、パートナーＡおよびＢは、それぞれ結合部分２および３として例えばリンカーを介してｓｃＦｖに結合される（図２Ｃ）。三重特異性分子は、融合パートナーＢ、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャであり得る結合部分３を追加する。融合パートナーＡおよびＢは、それぞれＦａｂの重鎖および軽鎖上またはｓｃＦｖの軽鎖および重鎖上にあり得る。ある実施形態において、パートナーＡは、例えば、本明細書に記載される間質調節部分である。ある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化部分であり、結合部分２は、間質調節部分である。
【図３Ａ−３Ｃ】第１および第２のポリペプチド鎖、例えばＣ末端融合を有するＦａｂベースフォーマットを含む多重特異性分子の概略図を示す。二重特異性および三重特異性分子は、Ｆａｂコアを含み得る。ＦａｂのＶＨおよびＶＬは、分子の結合部分１として機能し得る。パートナーＡは、任意選択的にリンカーによって連結されるＣＬまたはＣＨ１のいずれかのＣ末端（それぞれ図３Ａまたは図３Ｂ）に連結され得、パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２に対応する。パートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１および結合部分２は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するＦａｂであり；結合部分２に対応するパートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるサイトカイン、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。三重特異性フォーマットの実施形態において、パートナーＡおよびＢは、それぞれ結合部分２および３として例えばリンカーを介してＦａｂのＣ末端に連結される（図３Ｃ）。パートナーＡおよびパートナーＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１、結合部分２および結合部分３は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するｓｃＦｖであり；パートナーＡおよびＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるサイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。ＦａｂのＶＨおよびＶＬは、分子の結合部分１として機能する。リンカーによって連結されるＣＬまたはＣＨ１のいずれかのＣ末端（それぞれ図３Ａおよび図３Ｂ）に融合され得る融合パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２である。二重特異性フォーマットのある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化Ｆａｂおよび融合パートナーＡであり、結合部分２は、間質調節分子である。三重特異性フォーマットは、それぞれ結合部分２および３としてＦａｂのＣ末端に融合パートナーＡおよびＢを有し得る（図３Ｃ）。三重特異性分子は、融合パートナーＢ、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャであり得る結合部分３を追加する。融合パートナーＡおよびＢは、それぞれＦａｂの重鎖および軽鎖上またはＦａｂの軽鎖および重鎖上にあり得る。
【図４Ａ−４Ｃ】第１および第２のポリペプチド鎖、例えばＮ末端融合を有するＦａｂベースフォーマットを含む多重特異性分子の概略図を示す。示される二重特異性および三重特異性分子は、Ｆａｂコアを含む。ＦａｂのＶＨおよびＶＬは、分子の結合部分１として機能し得る。パートナーＡは、任意選択的にリンカーによって連結されるＶＬまたはＶＨのいずれかのＮ末端（それぞれ図４Ａまたは図４Ｂ）に連結され得、パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２に対応する。パートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１および結合部分２は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するＦａｂであり；結合部分２に対応するパートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるサイトカイン、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。三重特異性フォーマットの実施形態において、パートナーＡおよびＢは、それぞれ結合部分２および３として例えばリンカーを介してＦａｂのＮ末端に連結される（図４Ｃ）。パートナーＡおよびパートナーＢは、独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、結合部分１、結合部分２および結合部分３は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分、例えば癌抗原に結合するＦａｂであり；結合部分２および結合部分３に対応するパートナーＡおよびパートナーＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるサイトカイン、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。二重特異性および三重特異性分子は、Ｆａｂコアを含み得る。ＦａｂのＶＨおよびＶＬは、分子の結合部分１として機能し得る。リンカーによって連結されるＣＬまたはＣＨ１のいずれかのＮ末端（それぞれ図４Ａおよび図４Ｂ）に融合され得る融合パートナーＡは、二重特異性フォーマット中の結合部分２である。二重特異性フォーマットの実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化Ｆａｂおよび融合パートナーＡであり、結合部分２は、間質調節分子である。実施形態において、三重特異性フォーマットは、それぞれ結合部分２および３としてＦａｂのＣ末端上に融合パートナーＡおよびＢを有する（図４Ｃ）。三重特異性分子は、融合パートナーＢ、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャであり得る結合部分３を追加する。融合パートナーＡおよびＢは、それぞれＦａｂの重鎖および軽鎖上またはＦａｂの軽鎖および重鎖上にあり得る。
【図５Ａ−５Ｃ】第１および第２のポリペプチド鎖、例えばＦｃベースフォーマットを含む多重特異性分子の概略図を示す。示される実施形態において、多重特異性分子は、ヘテロ二量体Ｆｃコア（ノブ・イン・ホール（ＫｉＨ））を含む。二重特異性分子は、それぞれ結合部分１および２として示されるパートナーＡおよびＢを有し得る（図５Ａ）。パートナーＡおよびパートナーＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。パートナーＡおよびパートナーＢは、第１または第２のメンバーのいずれかまたはヘテロ二量体Ｆｃコアのメンバーのそれぞれに連結され得る。一実施形態において、パートナーＡは、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＮ末端に連結され、パートナーＢは、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＮ末端に連結される。あるいは、パートナーＡは、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＣ末端に連結され、パートナーＢは、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＣ末端に連結される。あるいは、パートナーＡは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第１のメンバーのＮ末端に連結され得、パートナーＢは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第２のメンバーのＣ末端に連結され得る。他の実施形態において、パートナーＢは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第１のメンバーのＮ末端に連結され得、パートナーＡは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第２のメンバーのＣ末端に連結され得る。ある実施形態において、結合部分１および結合部分２は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ．ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化部分であり、結合部分２は、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。例示的な三重特異性および四重特異性分子は、それぞれ図５Ｂおよび５Ｃに示される。それぞれ単一または複数の結合部分３および４であり得る１つまたは２つのさらなるパートナーＣおよびＤが上記の分子に加えられ得る。パートナーＡ、パートナーＢ、パートナーＣおよびパートナーＤは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、パートナーＣおよびパートナーＤは、Ｆｃコアの第１および第２のメンバーのいずれかのＣ末端に加えられ得、それによりそれぞれ結合特異性３および４を形成する。ある実施形態において、パートナーＡ〜Ｄ（それぞれ結合特異性１〜４に対応する）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載される腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。一実施形態において、パートナーＡである。実施形態において、パートナーＡは、腫瘍標的化部分であり、パートナーＢ、パートナーＣおよびＤは、それぞれ独立して、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。二重特異性分子は、それぞれ結合部分１および２として示されるパートナーＡおよびＢを有し得る（図５Ａ）。パートナーＡおよびパートナーＢは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載される間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。パートナーＡおよびパートナーＢは、第１または第２のメンバーのいずれかまたはヘテロ二量体Ｆｃコアのメンバーのそれぞれに連結され得る。一実施形態において、パートナーＡは、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＮ末端に連結され、パートナーＢは、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＮ末端に連結される。あるいは、パートナーＡは、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＣ末端に連結され、パートナーＢは、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域のＣ末端に連結される。あるいは、パートナーＡは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第１のメンバーのＮ末端に連結され得、パートナーＢは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第２のメンバーのＣ末端に連結され得る。他の実施形態において、パートナーＢは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第１のメンバーのＮ末端に連結され得、パートナーＡは、ヘテロ二量体Ｆｃコアの第２のメンバーのＣ末端に連結され得る。ある実施形態において、結合部分１は、腫瘍標的化部分であり、結合部分２は、間質調節部分である。他の実施形態において、結合部分２は、腫瘍標的化部分であり、結合部分１は、間質調節部分である。例示的な三重特異性および四重特異性分子は、それぞれ図５Ｂおよび５Ｃに示される。それぞれ単一または複数の結合部分３および４であり得る１つまたは２つのさらなるパートナーＣおよびＤが上記の分子に加えられ得る。パートナーＡ、パートナーＢ、パートナーＣおよびパートナーＤは、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、パートナーＣおよびパートナーＤは、Ｆｃコアの第１および第２のメンバーのいずれかのＣ末端に加えられ得、それによりそれぞれ結合特異性３および４を形成する。ある実施形態において、パートナーＡ〜Ｄ（それぞれ結合特異性１〜４に対応する）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載される腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャまたは間質調節部分から選択される。ある実施形態において、パートナーＡ、Ｂ、ＣまたはＤの１つは、間質調節部分であり、パートナーＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤの１つは、腫瘍標的化部分であり、２つの残りのパートナーは、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【図６】結合部位＃２に融合された結合部位＃１に対応するＦａｂを含む二重特異性分子の例示的な概略図を示す。実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、サイトカイン分子、またはリガンド分子または免疫細胞エンゲージャであり、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択される。実施形態において、二重特異性分子は、２つの非隣接ポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して、結合部位＃２に融合された、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有する。
【図７】任意選択的にリンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１のメンバー、例えば第１のＦｃ分子に連結される結合部位＃１；および任意選択的にリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバーに連結される結合部位＃２に対応するＦａｂを含む二重特異性分子の例示的な概略図を示す。実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍標的化部分であり、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャ、例えばリガンド分子または免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択される。実施形態において、二重特異性分子は、３つの非隣接ポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的に、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起またはノブを含む第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有し；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的にホールまたは空洞を含む第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）に連結される結合部位＃２（例えば、サイトカイン分子、リガンド分子または例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を有する。実施形態において、Ｆｃ分子の第１および第２のメンバーは、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【図８Ａ】結合部位＃２および結合部位＃３に融合された結合部位＃１に対応するＦａｂを含む三重特異性分子の例示的な概略図を示す。実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍標的化部分であり、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２および＃３は、独立して、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ、例えばリガンド分子または免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択される。実施形態において、三重特異性分子は、図８Ａ中の２つの非隣接ポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して結合部位＃３（例えば、サイトカイン分子、リガンドまたはｓｃＦｖから選択される）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ（例えば、Ｎ−から−ＣにｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬ）に融合された、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有する。図８Ｂは、別の立体配置を示し、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介してサイトカイン分子に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：リガンドまたはｓｃＦｖ（例えば、リガンドまたは例えば免疫細胞に結合するｓｃＦｖ）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有する。図８Ｃは、別の立体配置を示し、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：リガンドまたは例えば第１の免疫細胞に結合するｓｃＦｖに任意選択的にリンカーを介して連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：リガンドまたは例えば第２の免疫細胞に結合するｓｃＦｖに任意選択的にリンカーを介して連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有する。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図９Ａ】結合部位＃１、結合部位＃２、結合部位＃３に対応するＦａｂを含む三重特異性分子の例示的な概略図を示し、これらのそれぞれは、例えばリンカーを介して免疫グロブリン結合ドメインの第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子に連結される。実施形態において、三重特異性分子は、図９Ａ〜９Ｂに示される３つの非隣接ポリペプチドを含む。図９Ａに示される実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第１のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し、この第１のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第１のＦｃ分子のＣ末端に連結される結合部位＃３を任意選択的にさらに含むことができ；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃの配向で、例えばリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第２のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される結合部位＃２を含み；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを含む。図９Ｂに示される実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第１のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃの配向で、例えばリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第２のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される結合部位＃２を含み、この第２のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第２のＦｃ分子のＣ末端）に連結される結合部位＃３を任意選択的にさらに含むことができ；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを含む。上記の実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２および＃３は、独立して、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ、例えばリガンド分子または免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択される。実施形態において、Ｆｃ分子の第１および第２のメンバーは、三重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【図９Ｂ】同上。
【図１０Ａ】結合部位＃１、結合部位＃２、結合部位＃３および結合部位＃４に対応するＦａｂを含む四重特異性分子の例示的な概略図を示し、これらのそれぞれは、例えば、リンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子に連結される。実施形態において、四重特異性分子は、図１０Ａ〜１０Ｃに示される３つの非隣接ポリペプチドを含む。図１０Ａに示される実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第１のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し、この第１のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第１のＦｃ分子のＣ末端）に連結される結合部位＃３を任意選択的にさらに含むことができ；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃの配向で、例えばリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第２のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される結合部位＃２を含み、この第２のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第２のＦｃ分子のＣ末端）に連結される結合部位＃４を任意選択的にさらに含むことができ；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを含む。図１０Ａに示される実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２、＃３および４は、独立して、サイトカイン分子、リガンド分子または例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択される。図１０Ａに示される実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２、＃３および４は、独立して、サイトカイン分子、リガンド分子または例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択される。図１０Ｂに示される実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−ＶＬの配向で、例えばリンカーを介して第２のＦｃメンバーのＮ末端に連結されるＮＫ細胞エンゲージャ、例えばｓｃＦｖを示し；結合部位＃３は、例えば、リンカーを介して第１のＦｃメンバーのＣ末端に連結されるサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ、例えばｓｃＦｖを示し；結合部位＃４は、例えば、リンカーを介して第２のＦｃメンバーのＣ末端に連結されるリガンド分子または例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖを示す。図１０Ｃに示される実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−ＶＬの配向で、例えばリンカーを介して第２のＦｃメンバーのＮ末端に連結されるＮＫ細胞エンゲージャ、例えばｓｃＦｖを示し；結合部位＃３は、例えば、リンカーを介して第１のＦｃメンバーのＣ末端に連結されるリガンド分子または免疫細胞エンゲージャ、例えばｓｃＦｖを示し；結合部位＃４は、例えば、リンカーを介して第２のＦｃメンバーのＣ末端に連結されるリガンド分子または例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖを示す。上記の四重特異性分子のいずれかの実施形態において、Ｆｃ分子の第１および第２のメンバーは、四重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１１Ａ−１１Ｃ】例示的な三重特異性分子を示す。図１１Ａは、メソテリン腫瘍抗原に向けられたＦａｂ分子を含む三重特異性分子の概略図を示し、第１のポリペプチドは、リンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに連結されるＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み、Ｆａｂの第２のポリペプチドは、リンカーを介してＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）に連結される軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む。図１１Ｂは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（破線の下線で示される）を介してヒトＩＬ−１５サイトカイン（標準フォントで示される）に連結されるＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１（ＶＨおよびＣＨ１についてそれぞれ下線および太字で示される）を提供する。図１１Ｃは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（破線の下線で示される）を介してヒトＣＤ４０Ｌ（標準フォントで示される）に連結されるＦａｂのκ軽鎖ＶＬ−ＣＬ（ＶＬおよびＣＬについてそれぞれ下線および太字で示される）を提供する。
【図１２Ａ−１２Ｄ】間質標的に対するＦａｂおよびサイトカイン分子を含む例示的な二重特異性分子を示し、これらのそれぞれは、例えば、リンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子に連結される。図１２Ａは、間質抗原に指向されたＦａｂ分子を含む二重特異性分子の概略図を示し、第１のポリペプチドは、空洞を有する第１のＦｃ分子に連結される間質抗原に対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み；第２のポリペプチドは、突起を有する第２のＦｃ分子に連結されるＩＬ−１５サイトカインを含み；第３のポリペプチドは、間質抗原に対するＦａｂの軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む。図１２Ｂは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてヒトＩＬ−１５サイトカイン（下線で示される）を提供し、突起を有する第２のＦｃ分子（標準フォントで示される）に連結される任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（破線の下線で示される）をさらに含む。図１２Ｃは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて空洞を有する第１のＦｃ分子（標準フォントで示される）に連結される、間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１（ＶＨおよびＣＨ１についてそれぞれ下線および太字で示される）を提供する。図１２Ｄは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂのκ軽鎖ＶＬ−ＣＬ（ＶＬおよびＣＬについてそれぞれ下線および太字で示される）を提供する。
【図１３Ａ−１３Ｄ】間質標的に対するＦａｂ、２つの免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子を含む例示的な四重特異性分子を示し、これらのそれぞれは、例えば、リンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子に連結される。図１３Ａは、間質抗原に指向されたＦａｂ分子を含む四重特異性分子の概略図を示し、第１のポリペプチドは、空洞を有する第１のＦｃ分子に連結される間質抗原に対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み、第１の免疫細胞エンゲージャ、例えばＢ７Ｈ６をさらに含み；第２のポリペプチドは、任意選択的にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、突起を有する第２のＦｃ分子に連結されるＩＬ−１５サイトカインを含み、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して第２の免疫細胞エンゲージャ、例えばＣＤ４０Ｌをさらに含み；第３のポリペプチドは、間質抗原に対するＦａｂの軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む。図１３Ｂは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてヒトＩＬ−１５サイトカイン（下線で示される）を提供し、突起を有する第２のＦｃ分子（太字で示される）に連結される任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（破線の下線で示される）をさらに含み、これは、ヒトＣＤ４０Ｌアミノ酸配列（標準フォントで示される）に連結される、例えば任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（破線の下線で示される）をさらに含む。図１３Ｃは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて空洞を有する第１のＦｃ分子（標準フォントで示される）に連結される、間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１（ＶＨおよびＣＨ１についてそれぞれ下線および太字で示される）を提供し、これは、ヒトＢ７Ｈ６アミノ酸配列（下線で示される）に連結される、例えば任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（破線の下線で示される）をさらに含む。図１３Ｄは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂのκ軽鎖ＶＬ−ＣＬ（ＶＬおよびＣＬについてそれぞれ下線および標準フォントで示される）を提供する。
【図１４Ａ】メソテリンに対するＦａｂ（分子Ａ）、２つの免疫細胞エンゲージャ、４１ＢＢ−リガンド（分子Ｃ）およびＣＤ４０リガンド（分子Ｄ）ならびにサイトカイン分子（分子Ｂ）を含む例示的な四重特異性分子を示し、これらのそれぞれは、例えば、リンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子（ノブ・イン・ホール、ＫｉＨ、Ｆｃ第１のメンバーおよびＦｃホール第２のメンバー）に連結される。図１４Ａ〜１４Ｂは、メソテリン抗原に指向されたＦａｂ分子を含む四重特異性分子の概略図を示し、第１のポリペプチドは、ＣＨ３領域中の突起（ノブ）を有する第１のＦｃ分子に連結されるメソテリン抗原に対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み、第１の免疫細胞エンゲージャ、例えば４１ＢＢ−リガンドをさらに含み；第２のポリペプチドは、任意選択的にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、空洞（ホール）を有する第２のＦｃ分子に連結されるＩＬ−２１サイトカインを含み、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して第２の免疫細胞エンゲージャ、例えばＣＤ４０Ｌをさらに含み；第３のポリペプチドは、メソテリン抗原（分子Ａ）に対するＦａｂの軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む。以下のアミノ酸配列が示される：  （ｉ）メソテリン結合Ｆａｂ（ａ＿ｈＭｅｓｏ＿ＳＳ１＿Ｆａｂ）の重鎖および軽鎖のそれぞれに対応する分子Ａ；  （ｉｉ）ヒトＩＬ−２１に対応する分子Ｂ；  （ｉｉｉ）分子Ｂおよび第２のＦｃ領域間のリンカー（分子Ｂ−ＫｉＨ＿Ｆｃリンカー）；  （ｉｖ）第１のＦｃ領域および分子Ｃ間のリンカー（ＫｉＨ＿Ｆｃ−分子Ｃリンカー）；  （ｖ）ヒト４１ＢＢリガンドに対応する分子Ｃ；  （ｖｉ）第２のＦｃ領域および分子Ｄ間のリンカー（ＫｉＨ＿Ｆｃ−分子Ｄリンカー）；  （ｖｉｉ）ヒトＣＤ４０Ｌに対応する分子Ｃ；  （ｖｉｉｉ）ＮからＣの配向で、メソテリンＦａｂのＶＨ、位置３５４にＣの代わりにＳおよび位置３６６にＴの代わりにＷの置換を含むＣＨ２−ＣＨ３アミノ酸配列、続いてＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーおよびヒト４１ＢＢリガンドを含む第１のメンバーＦｃ領域（Ｆｃノブ）；および  （ｉｘ）ＮからＣの配向で、ヒトＩＬ−２１、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、位置３４９にＹの代わりにＣ、位置３６６にＴの代わりにＳ、位置３６８にＬの代わりにＡ、位置４０７にＹの代わりにＶの置換を含むＣＨ２−ＣＨ３アミノ酸配列、続いてＧｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびヒトＣＤ４０Ｌを含む第２のメンバーＦｃ領域（Ｆｃホール）。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ−１５Ｄ】例示的な二重特異性抗体分子の概略図である。図１５Ａは、「ノブ・イン・ホール」ヘテロ二量体化を用いた二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｂは、共通の軽鎖を用いた二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｃは、ＩｇＧ−Ｆａｂ二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｄは、ＩｇＧ−ｄｓｓｃＦｖ２二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｅは、ＤＶＤ二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｆは、ダイアボディの概略図である。図１５Ｇは、ＤＡＲＴ二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｈは、ＴａｎｄＡｂ二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｉは、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２二重特異性抗体の概略図である。図１５Ｊは、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の概略図である。図１５Ａ〜１５Ｊに示される分子の構成単位のそれぞれをコードする対応するｍＲＮＡは、以下に示される抗体分子である。
【図１５Ｅ−１５Ｈ】同上。
【図１５Ｉ−１５Ｊ】同上。
【図１６】結合部位＃２に融合された結合部位＃１に対応するＦａｂを含む二重特異性分子の例示的な概略図を示す。実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、間質調節部分である。実施形態において、二重特異性分子は、２つの非隣接ポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して、結合部位＃２に融合された、例えば癌抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有する。
【図１７】任意選択的にリンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１のメンバー、例えば第１のＦｃ分子に連結される結合部位＃１；および任意選択的にリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバーに連結される結合部位＃２に対応するＦａｂを含む二重特異性分子の例示的な概略図を示す。実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍標的化部分であり、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、間質調節部分である。実施形態において、二重特異性分子は、３つの非隣接ポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的に、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起またはノブを含む第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有し；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的にホールまたは空洞を含む第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）に連結される結合部位＃２（間質調節部分）を有する。実施形態において、Ｆｃ分子の第１および第２のメンバーは、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【図１８】結合部位＃２および結合部位＃３に融合された結合部位＃１に対応するＦａｂを含む三重特異性分子の例示的な概略図を示す。実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍標的化部分であり、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ、例えばリガンド分子または免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択され；結合部位３は、間質調節部分である。実施形態において、三重特異性分子は、図１８中の２つの非隣接ポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して結合部位＃３（間質調節部分）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ（例えば、Ｎ−から−ＣにｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬ）に融合された、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを有する。
【図１９Ａ】結合部位＃１、結合部位＃２、結合部位＃３に対応するＦａｂを含む三重特異性分子の例示的な概略図を示し、これらのそれぞれは、例えば、リンカーを介して免疫グロブリン結合ドメインの第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子に連結される。実施形態において、三重特異性分子は、図１９Ａ〜１９Ｂに示される３つの非隣接ポリペプチドを含む。図１９Ａに示される実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第１のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し、この第１のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第１のＦｃ分子のＣ末端に連結される結合部位＃３を任意選択的にさらに含むことができ；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃの配向で、例えばリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第２のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される結合部位＃２を含み；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを含む。図１９Ｂに示される実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第１のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃの配向で、例えばリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第２のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される結合部位＃２を含み、この第２のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第２のＦｃ分子のＣ末端）に連結される結合部位＃３を任意選択的にさらに含むことができ；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを含む。上記の実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ、例えばリガンド分子または免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択され；結合部位＃３は、間質調節部分である。実施形態において、Ｆｃ分子の第１および第２のメンバーは、三重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【図１９Ｂ】同上。
【図２０】結合部位＃１、結合部位＃２、結合部位＃３および結合部位＃４に対応するＦａｂを含む四重特異性分子の例示的な概略図を示し、これらのそれぞれは、例えば、リンカーを介して免疫グロブリン定常領域の第１および第２のメンバー、例えば第１および第２のＦｃ分子に連結される。実施形態において、四重特異性分子は、３つの非隣接ポリペプチドを含む。実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：例えば、リンカーを介してＦｃ分子の第１のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第１のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＨ−ＣＨ１を有し、この第１のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第１のＦｃ分子のＣ末端）に連結される結合部位＃３を任意選択的にさらに含むことができ；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃの配向で、例えばリンカーを介してＦｃ分子の第２のメンバー（例えば、任意選択的に突起または空洞を含む第２のＦｃ分子のＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結される結合部位＃２を含み、この第２のメンバーは、任意選択的にリンカーを介して第２のＦｃ分子のＣ末端）に連結される結合部位＃４を任意選択的にさらに含むことができ；第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに：例えば、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂのＶＬ−ＣＬを含む。図１０に示される実施形態において、結合部位＃１は、腫瘍または間質抗原に結合し；結合部位＃２および＃４は、独立して、サイトカイン分子、リガンド分子または例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖから選択され；結合部位＃３は、間質調節部分である。
【図２１】多重特異性分子１のゲルである。
【図２２】多重特異性分子２のゲルである。
【図２３】多重特異性分子３のゲルである。
【図２４】多重特異性分子４のゲルである。
【図２５】多重特異性分子５のゲルである。
【図２６】多重特異性分子６のゲルである。
【図２７】多重特異性分子７のゲルである。
【図２８】多重特異性分子８のゲルである。
【図２９】多重特異性分子９のゲルである。
【図３０】多重特異性分子１０のゲルである。
【図３１】多重特異性分子１１のゲルである。
【図３２】多重特異性分子１２のゲルである。
【図３３】多重特異性分子１３のゲルである。
【図３４】多重特異性分子１４のゲルである。
【図３５】多重特異性分子１５のゲルである。
【図３６】多重特異性分子１６のゲルである。
【図３７】多重特異性分子１７のゲルである。
【図３８】多重特異性分子１８のゲルである。
【図３９】多重特異性分子１９のゲルである。
【図４０】多重特異性分子２０のゲルである。
【図４１】多重特異性分子２１のゲルである。
【図４２】多重特異性分子２２のゲルである。
【図４３】多重特異性分子１のサイズ排除クロマトグラムである。
【図４４】多重特異性分子５のサイズ排除クロマトグラムである。
【図４５】多重特異性分子１１のサイズ排除クロマトグラムである。
【図４６】多重特異性分子１２のサイズ排除クロマトグラムである。
【図４７】多重特異性分子１３のサイズ排除クロマトグラムである。
【図４８】ヒトメソテリン（配列番号１８１から生成される）に結合する、多重特異性分子１（丸、実線）、多重特異性分子２（菱形、破線）および多重特異性分子３（四角形、点線）のＥＬＩＳＡである。
【図４９】ヒトメソテリン（配列番号１８１から生成される）に結合する、多重特異性分子５（丸、実線）、多重特異性分子６（菱形、短鎖線）、多重特異性分子７（四角形、点線）および多重特異性分子８（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図５０】ヒトメソテリン（配列番号１８１から生成される）に結合する、多重特異性分子９（丸、実線）、多重特異性分子１１（菱形、短鎖線）、多重特異性分子１０（四角形、点線）および多重特異性分子１２（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図５１】ヒトＰＤ１Ｌ１（配列番号１７８から生成される）に結合する、多重特異性分子５（丸、実線）、多重特異性分子６（菱形、長鎖線）、多重特異性分子７（四角形、点線）および多重特異性分子９（三角形、短鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図５２】ヒトＰＤ１Ｌ１（配列番号１７８から生成される）に結合する、多重特異性分子１１（丸、実線）、多重特異性分子８（菱形、長鎖線）、多重特異性分子１０（四角形、点線）および多重特異性分子１２（三角形、短鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図５３】ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）に結合する、多重特異性分子１（丸、実線）、多重特異性分子２（菱形、破線）および多重特異性分子４（四角形、点線）のＥＬＩＳＡである。
【図５４】ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）に結合する、多重特異性分子６（丸、実線）、多重特異性分子８（菱形、長鎖線）、多重特異性分子１０（四角形、点線）および多重特異性分子１２（三角形、短鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図５５】ヒトＮＫｐ３０（配列番号１８０から生成される）を用いた多重特異性分子２（丸、実線）および多重特異性分子３（菱形、破線）のＥＬＩＳＡである。
【図５６】ヒトＮＫｐ４６（配列番号１７９から生成される）を用いた多重特異性分子７（丸、実線）、多重特異性分子９（菱形、破線）および多重特異性分子１１（四角形、点線）のＥＬＩＳＡである。
【図５７】ヒトＮＫｐ４６（配列番号１７９から生成される）を用いた多重特異性分子８（丸、実線）、多重特異性分子１０（菱形、破線）および多重特異性分子１１（四角形、点線）のＥＬＩＳＡである。
【図５８】多重特異性分子１（丸、実線）、多重特異性分子２（菱形、点線）、多重特異性分子３（四角形、破線）および多重特異性分子４（三角形、破線および点線）についての細胞殺滅曲線である。
【図５９】多重特異性分子１（黒一色）、多重特異性分子２（斜線）、多重特異性分子３（白色）および多重特異性分子４（点付き）についてのＩＦＮγのサイトカイン放出である。
【図６０】多重特異性分子５（丸）、多重特異性分子６（菱形、短鎖線）、多重特異性分子７（四角形、点線）および多重特異性分子８（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図６１】多重特異性分子５（丸）、多重特異性分子６（菱形、短鎖線）、多重特異性分子９（四角形、点線）および多重特異性分子１０（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図６２】多重特異性分子５（丸）、多重特異性分子６（菱形、短鎖線）、多重特異性分子１１（四角形、点線）および多重特異性分子１２（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図６３】（配列番号１８１からの）ヒトメソテリンへの多重特異性分子２２の結合である。
【図６４】（配列番号１７８からの）ヒトＰＤ１Ｌ１への多重特異性分子２２の結合である。
【図６５】ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）に結合する、多重特異性分子１３（丸、実線）、多重特異性分子１６（菱形、短鎖線）、多重特異性分子１７（四角形、点線）および多重特異性分子２２（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図６６】ヒトＮＫｐ４６（配列番号１７９から生成される）に結合する、多重特異性分子１４（丸、実線）、多重特異性分子２１（菱形、短鎖線）および多重特異性分子２２（四角形、点線）のＥＬＩＳＡである。
【図６７】多重特異性分子１８（丸、実線）、多重特異性分子１３（菱形、短鎖線）、多重特異性分子１４（四角形、点線）および多重特異性分子１６（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図６８】多重特異性分子１８（黒一色）、多重特異性分子１３（点付き）、多重特異性分子１４（白色）および多重特異性分子１６（斜線）についてのＩＦＮγのサイトカイン放出である。
【図６９】多重特異性分子１８（丸、実線）、多重特異性分子１３（菱形、短鎖線）、多重特異性分子１５（四角形、点線）および多重特異性分子１７（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図７０】多重特異性分子１８（黒一色）、多重特異性分子１３（点付き）、多重特異性分子１５（白色）および多重特異性分子１７（斜線）についてのＩＦＮγのサイトカイン放出である。
【図７１】多重特異性分子１８（丸、実線）、多重特異性分子１５（四角形、点線）および多重特異性分子２０（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図７２】多重特異性分子１８（黒一色）、多重特異性分子１５（白色）および多重特異性分子２０（斜線）についてのＩＦＮγのサイトカイン放出である。
【図７３】多重特異性分子１８（丸、実線）、多重特異性分子１４（四角形、点線）および多重特異性分子２１（三角形、長鎖線）についての細胞殺滅曲線である。
【図７４】多重特異性分子１８（黒一色）、多重特異性分子１４（白色）および多重特異性分子２１（斜線）についてのＩＦＮγのサイトカイン放出である。
【図７５】多重特異性分子２３（丸、実線）および多重特異性分子２２（菱形、破線）についての細胞殺滅曲線である。
【図７６】多重特異性分子２３（黒一色）および多重特異性分子２２（斜線）についてのＩＦＮγのサイトカイン放出である。
【図７７】多重特異性分子２４のゲルである。
【図７８】多重特異性分子２５のゲルである。
【図７９】多重特異性分子２６のゲルである。
【図８０】多重特異性分子２７のゲルである。
【図８１】多重特異性分子２８のゲルである。
【図８２】多重特異性分子２９のゲルである。
【図８３】多重特異性分子３０のゲルである。
【図８４】多重特異性分子３１のゲルである。
【図８５】多重特異性分子３２のゲルである。
【図８６】多重特異性分子２４のサイズ排除クロマトグラムである。
【図８７】多重特異性分子２５のサイズ排除クロマトグラムである。
【図８８】多重特異性分子２６のサイズ排除クロマトグラムである。
【図８９】多重特異性分子２８のサイズ排除クロマトグラムである。
【図９０】多重特異性分子２９のサイズ排除クロマトグラムである。
【図９１】多重特異性分子３０のサイズ排除クロマトグラムである。
【図９２】多重特異性分子３１のサイズ排除クロマトグラムである。
【図９３】配列番号１７８からのヒトＰＤＬ１を用いた多重特異性分子２７（丸、実線）、多重特異性分子２８（菱形、短鎖線）、多重特異性分子２９（四角形、点線）および多重特異性分子３２（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図９４】配列番号２２５からのヒトＦＡＰを用いた多重特異性分子２４（丸、実線）、多重特異性分子２５（菱形、短鎖線）、多重特異性分子２６（四角形、点線）および多重特異性分子２７（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図９５】配列番号２２５からのヒトＦＡＰを用いた多重特異性分子２８（丸、実線）、多重特異性分子３０（菱形、短鎖線）、多重特異性分子３１（四角形、点線）および多重特異性分子３２（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図９６】配列番号１７９から生成されるヒトＮＫｐ４６への多重特異性分子２９の結合である。
【図９７】配列番号１８２からのヒトＩＬ２Ｒαを用いた多重特異性分子２５（丸、実線）、多重特異性分子２８（菱形、短鎖線）、多重特異性分子２９（四角形、点線）および多重特異性分子３２（三角形、長鎖線）のＥＬＩＳＡである。
【図９８】多重特異性分子２４（丸）、多重特異性分子２５（菱形）および多重特異性分子２６（四角形）のヒアルロニダーゼ活性についての比濁酵素アッセイであり、ヒアルロン酸の分解は、吸光度の低下をもたらす。
【図９９】多重特異性分子２７（丸）、多重特異性分子２８（菱形）および多重特異性分子２９（四角形）のヒアルロニダーゼ活性についての比濁酵素アッセイであり、ヒアルロン酸の分解は、吸光度の低下をもたらす。
【図１００】ヒアルロニダーゼ活性についてのゲルベースのアッセイであり、白色のバンドは、分解されたヒアルロン酸を表す。レーン１は、ラダーであり、レーン２は、多重特異性分子２４であり、レーン３は、多重特異性分子２５であり、レーン４は、多重特異性分子２６であり、レーン５は、多重特異性分子２７であり、レーン６は、多重特異性分子２８であり、レーン７は、多重特異性分子２９である。
【図１０１】多重特異性分子３０（丸）、多重特異性分子３１（菱形）および多重特異性分子３２（四角形）のＩＶ型コラゲナーゼ活性であり、ゼラチナーゼの分解は、蛍光の増加をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【０１８２】
複数の（例えば、２つ以上の）結合特異性（または機能性）を含む多重特異性分子（本明細書において「多機能性分子」とも呼ばれる）が本明細書に開示され、第１の結合特異性は、癌細胞に選択的に局在し、例えば、それは、腫瘍標的化部分を含み；第２（または第３、または第４）の結合特異性は、免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される）；および／またはサイトカイン分子の一方または両方を含む。一実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性（または二機能性）分子、三重特異性（または三機能性）分子または四重特異性（または四機能性）分子である。理論に制約されるものではないが、本明細書に開示される多重特異性分子は、癌細胞の存在下で、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞またはマクロファージから選択される免疫エフェクター細胞）を局在化（例えば、架橋）および／または活性化することが予想される。本明細書に記載される多重特異性分子を用いて、癌細胞の存在下で、免疫細胞の近接および／または活性を増大させることは、標的癌細胞に対する免疫応答を促進し、それにより、より有効な癌治療を提供することが予想される。したがって、特に上記の部分を含む多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体分子）、それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法、および上記の分子を用いて癌を治療する方法が本明細書において提供される。
【０１８３】
（ｉ）間質調節部分および（ｉｉ）腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子、または受容体分子）を含む新規な多機能性、例えば多重特異性分子が開示される。理論に制約されるものではないが、本明細書に開示される多機能性分子は、特に癌部位を標的化し（例えば、それに局在し）、腫瘍間質を変化させ、例えば癌部位の近くの腫瘍微小環境を変化させるものと考えられる。多機能性分子は、免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される）；および／またはサイトカイン分子の一方または両方をさらに含み得る。したがって、特に上記の部分を含む多機能性、例えば多重特異性分子、それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法、および上記の分子を用いて癌を治療する方法が本明細書において提供される。
【０１８４】
（ｉ）間質調節部分および（ｉｉ）腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子、または受容体分子）を含む新規な多機能性、例えば多重特異性分子も本明細書に開示される。理論に制約されるものではないが、本明細書に開示される多機能性分子は、特に癌部位を標的化し（例えば、それに局在し）、腫瘍間質を変化させ、例えば癌部位の近くの腫瘍微小環境を変化させるものと考えられる。多機能性分子は、免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される）；および／またはサイトカイン分子の一方または両方をさらに含み得る。したがって、特に上記の部分を含む多機能性、例えば多重特異性分子、それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法、および上記の分子を用いて癌を治療する方法が本明細書において提供される。
【０１８５】
定義
ある実施形態において、多重特異性分子は、腫瘍標的化部分を含む。本明細書において使用される際の「腫瘍標的化部分」は、癌細胞中の標的を認識し、またはそれと関連する、例えばそれに結合する結合剤を指す。腫瘍標的化部分は、癌抗原（例えば、腫瘍および／または間質抗原）に結合する抗体分子、受容体分子（例えば、完全長受容体、受容体断片、またはその融合（例えば、受容体−Ｆｃ融合））、またはリガンド分子（例えば、完全長リガンド、リガンド断片、またはその融合（例えば、リガンド−Ｆｃ融合））であり得る。実施形態において、腫瘍標的化部分は、標的腫瘍に特異的に結合し、例えば標的腫瘍に選択的に結合する。例えば、腫瘍標的化部分が抗体分子である場合、それは、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数で癌抗原（例えば、腫瘍抗原および／または間質抗原）に結合する。
【０１８６】
ある実施形態において、多重特異性分子は、免疫細胞エンゲージャを含む。「免疫細胞エンゲージャ」は、免疫細胞、例えば免疫応答に関与する細胞に結合し、および／またはそれを活性化する１つまたは複数の結合特異性を指す。実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞および／またはマクロファージ細胞から選択される。免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞抗原（例えば、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹枝状細胞抗原および／またはマクロファージ細胞抗原）に結合する抗体分子、受容体分子（例えば、完全長受容体、受容体断片、またはその融合（例えば、受容体−Ｆｃ融合））、またはリガンド分子（例えば、完全長リガンド、リガンド断片、またはその融合（例えば、リガンド−Ｆｃ融合））であり得る。実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、標的免疫細胞に特異的に結合し、例えば標的免疫細胞に選択的に結合する。例えば、免疫細胞エンゲージャが抗体分子である場合、それは、約１０ｎＭ未満、より典型的には１０〜１００ｐＭの解離定数で免疫細胞抗原（例えば、ＮＫ細胞抗原、Ｂ細胞抗原、樹枝状細胞抗原、および／またはマクロファージ細胞抗原）に結合する。
【０１８７】
ある実施形態において、多重特異性分子は、サイトカイン分子を含む。本明細書において使用される際、「サイトカイン分子」は、サイトカインの完全長、断片もしくは変異体を指し；サイトカインは、受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体二量体化ドメイン；または天然サイトカインの少なくとも１つの活性を引き出すサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）をさらに含む。ある実施形態において、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）もしくはインターフェロンγ、またはその断片もしくは変異体、あるいは上記のサイトカインのいずれかの組合せから選択される。サイトカイン分子は、モノマーまたは二量体であり得る。実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含み得る。他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択される、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）である。
【０１８８】
本明細書において使用される際、例えば、抗体分子、サイトカイン分子、受容体分子中で使用される際の「分子」という用語は、非修飾（例えば、天然）分子の少なくとも１つの機能および／または活性が残っている限り、完全長の天然分子、ならびに変異体、例えば機能的変異体（例えば、切断、断片、変異形態（例えば、実質的に類似の配列）またはその誘導体化形態）を含む。
【０１８９】
ある実施形態において、多機能性分子は、間質調節部分を含む。本明細書において使用される際の「間質調節部分」は、間質の成分を変化させる、例えば分解することが可能な物質、例えばタンパク質（例えば、酵素）を指す。実施形態において、間質の成分は、例えば、ＥＣＭ成分、例えばグリコサミノグリカン、例えばヒアルロナン（ヒアルロン酸またはＨＡとしても知られている）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、エンタクチン、テネイシン、アグリカンおよびケラチン硫酸；または細胞外タンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンから選択される。
【０１９０】
「機能的変異体」という用語は、天然配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、天然配列の１つまたは複数の活性を有することが可能なポリペプチドを指す。
【０１９１】
いくつかの用語が以下に定義される。本明細書において使用される際、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上、例えば少なくとも１つの冠詞の目的語を指す。本明細書における「含む」という用語とともに使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。
【０１９２】
本明細書において使用される際、「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を所与として測定される量の許容される誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所与の範囲の値の２０パーセント（％）以内、典型的に１０％以内、より典型的に５％以内である。
【０１９３】
本明細書において使用される際の「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。抗体分子は、抗体（例えば、完全長抗体）および抗体断片を包含する。一実施形態において、抗体分子は、完全長抗体の抗原結合または機能性断片、または完全長免疫グロブリン鎖を含む。例えば、完全長抗体は、天然であるか、または通常の免疫グロブリン遺伝子断片組み換えプロセス）によって形成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）である。実施形態において、抗体分子は、抗体断片など、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な抗原結合部分を指す。抗体断片、例えば機能性断片は、抗体の一部、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。機能性抗体断片は、完全な（例えば、完全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」または「機能性断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された組み換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）からなる「Ｆｖ」断片などの可変領域からなる単離断片も含む。ある実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ断片または単一のアミノ酸残基などの抗原結合活性を有さない抗体の部分を含まない。例示的な抗体分子としては、完全長抗体および抗体断片、例えばｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖｓ）が挙げられる。
【０１９４】
本明細書において使用される際、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得るアミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然可変ドメインのアミノ酸配列の全てまたは一部を含み得る。例えば、配列は、１つ、２つまたはそれを超えるＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでいてもまたは含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成と適合する他の改変を含み得る。
【０１９５】
実施形態において、抗体分子は、単一特異性であり、例えば、それは、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。ある実施形態において、抗体分子は、多重特異性であり、例えば、それは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態において、抗体分子は、二重特異性抗体分子である。本明細書において使用される際の「二重特異性抗体分子」は、２つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれを超える）エピトープおよび／または抗原に対する特異性を有する抗体分子を指す。
【０１９６】
本明細書において使用される際の「抗原」（Ａｇ）は、例えば、特定の免疫細胞の活性化および／または抗体産生に関与する免疫応答を引き起こし得る分子を指す。ほぼ全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原であり得る。抗原はまた、ゲノム組み換え体またはＤＮＡに由来し得る。例えば、免疫応答を引き起こすことが可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが「抗原」をコードする。実施形態において、抗原は、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はなく、抗原は、１つの遺伝子によってコードされる必要も全くない。実施形態において、抗原は、合成され得るか、または生体サンプル、例えば組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、または他の生物学的要素を含む体液に由来し得る。本明細書において使用される際、「腫瘍抗原」または同義的に「癌抗原」は、免疫応答を引き起こし得る、癌、例えば癌細胞または腫瘍微小環境に存在するかまたはそれと結合される任意の分子を含む。本明細書において使用される際、「免疫細胞抗原」は、免疫応答を引き起こし得る免疫細胞に存在するか、またはそれと結合される任意の分子を含む。
【０１９７】
抗体分子の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する抗体分子、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の部分を指す。実施形態において、抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。高度可変領域と呼ばれる、重鎖および軽鎖の可変領域内の３つの極めて異なる区域が、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存される隣接区域間に配置される。ＦＲは、免疫グロブリン中の高度可変領域間におよびそれに隣接して天然に見られるアミノ酸配列である。実施形態において、抗体分子中、軽鎖の３つの高度可変領域および重鎖の３つの高度可変領域は、結合された抗原の３次元空間に相補的な抗原結合表面を形成するように３次元空間中で互いに対して配置される。重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの高度可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７に定義され、記載されている。各可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端にアミノ酸の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
【０１９８】
本明細書において使用される際の「癌」は、あらゆるタイプの発癌過程および／または癌性増殖を包含し得る。実施形態において、癌は、原発腫瘍ならびに転移性組織または悪性形質転換した細胞、組織、または器官を含む。実施形態において、癌は、あらゆる病理組織および段階、例えば癌の侵襲性／重症度の段階を包含する。実施形態において、癌は、再発性および／または耐性癌を含む。「癌」および「腫瘍」という用語は、同義的に使用され得る。例えば、両方の用語は、固形および液性腫瘍を包含する。本明細書において使用される際、「癌」または「腫瘍」という用語は、前癌性、ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
【０１９９】
本明細書において使用される際、「免疫細胞」は、例えば、感染因子および異物から保護するために免疫系中で機能する様々な細胞のいずれかを指す。実施形態において、この用語は、白血球、例えば好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球を含む。生来の白血球は、食細胞（例えば、マクロファージ、好中球、および樹枝状細胞）、肥満細胞、好酸球、好塩基球、およびナチュラルキラー細胞を含む。生来の白血球は、接触によってより大きい病原体を攻撃することにより、または微生物を取り込み、次にそれを殺滅することにより、病原体を同定および除去し、適応免疫応答の活性化におけるメディエータである。適応免疫系の細胞は、リンパ球と呼ばれる特殊なタイプの白血球である。Ｂ細胞およびＴ細胞は、リンパ球の重要なタイプであり、骨髄中の造血幹細胞に由来する。Ｂ細胞が、体液性免疫応答に関与する一方、Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫応答に関与する。「免疫細胞」という用語は、免疫エフェクター細胞を含む。
【０２００】
「免疫エフェクター細胞」は、その用語が本明細書において使用される際、例えば免疫エフェクター応答の促進において免疫応答に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、限定はされないが、Ｔ細胞、例えばα／βＴ細胞およびγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ  Ｔ）細胞および肥満細胞が挙げられる。
【０２０１】
「エフェクター機能」または「エフェクター応答」という用語は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【０２０２】
本発明の組成物および方法は、所定の配列またはそれと実質的に同一もしくは類似の配列、例えば所定の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列を有するポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列に関して、「実質的に同一」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有し得るように、ｉ）第２のアミノ酸配列中のアライメントされたアミノ酸残基と同一である十分または最小数のアミノ酸残基、またはｉｉ）第２のアミノ酸配列中のアライメントされたアミノ酸残基の保存的置換を含有する第１のアミノ酸を指すために本明細書において使用される。例えば、参照配列、例えば本明細書において提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％．９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列である。
【０２０３】
ヌクレオチド配列に関して、「実質的に同一」という用語は、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造ポリペプチドドメインまたは共通の機能ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列中のアライメントされたヌクレオチドと同一である十分または最小数のヌクレオチドを含有する第１の核酸配列を指すために本明細書において使用される。例えば、参照配列、例えば本明細書において提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【０２０４】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は、本明細書において同義的に使用される）の計算は、以下のように行われる。
【０２０５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的のためにアライメントされる（例えば、ギャップが、最適なアライメントのために第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、非相同配列は、比較目的のために無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的のためにアライメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、その位置において同一である（本明細書において使用される際、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」に相当する）。
【０２０６】
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【０２０７】
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて行われ得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み付けおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を用いて決定される。パラメータの特に好ましい組（および特に規定されない限り使用されるべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを用いたＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【０２０８】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７）のアルゴリズムを用いて決定され得る。
【０２０９】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために、公共のデータベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施されて、本発明の核酸（例えば、配列番号１）分子と相同のヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施されて、本発明のタンパク分子と相同のアミノ酸配列が得られる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように用いられ得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【０２１０】
本発明の分子が、それらの機能に実質的な影響を与えないさらなる保存的または非必須アミノ酸置換を有し得ることが理解される。
【０２１１】
「アミノ酸」という用語は、アミノ官能基および酸官能基の両方を含み、天然アミノ酸のポリマーに含まれることが可能な全ての分子（天然または合成にかかわらず）を包含することが意図される。例示的なアミノ酸は、天然アミノ酸；その類似体、誘導体および同族体；変異側鎖を有するアミノ酸類似体；および上記のいずれかのいずれかの全ての立体異性体を含む。本明細書において使用される際、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−またはＬ−光学異性体の両方およびペプチド模倣体を含む。
【０２１２】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【０２１３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」（一本鎖の場合）という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において同義的に使用される。ポリマーは、直鎖状または分枝鎖状であってもよく、それは、修飾アミノ酸を含んでもよく、それは、非アミノ酸によって介在されてもよい。この用語は、修飾されている、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作をされているアミノ酸ポリマーも包含する。ポリペプチドは、天然源から単離され得、真核生物または原核生物宿主から組み換え技術によって産生され得、または合成手順の産物であり得る。
【０２１４】
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、同義的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよく、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって介在され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに修飾され得る。核酸は、天然に存在しないかまたは非天然配置で別のポリヌクレオチドと連結された組み換えポリヌクレオチド、またはゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、もしくは合成起源のポリヌクレオチドであり得る。
【０２１５】
本明細書において使用される際の「単離された」という用語は、その元のまたは天然の環境（例えば、それが天然である場合、自然な環境）から取り出された物質を指す。例えば、生きている動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、自然系における共存物質のいくつかまたは全てからのヒトの介入によって分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、このようなベクターまたは組成物は、それが天然に見られる環境の一部ではない点でなお単離されている。
【０２１６】
本発明の様々な態様が、以下にさらに詳述される。さらなる定義が本明細書全体を通して示される。
【０２１７】
抗体分子
一実施形態において、抗体分子は、癌抗原、例えば腫瘍抗原または間質抗原に結合する。ある実施形態において、癌抗原は、例えば、哺乳動物、例えばヒト癌抗原である。他の実施形態において、抗体分子は、免疫細胞抗原、例えば哺乳動物、例えばヒト免疫細胞抗原に結合する。例えば、抗体分子は、エピトープ、例えば癌抗原または免疫細胞抗原上の線形または立体構造エピトープに特異的に結合する。
【０２１８】
一実施形態において、抗体分子は、単一特異性抗体分子であり、単一のエピトープに結合する。例えば、それぞれが同じエピトープに結合する複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を有する単一特異性抗体分子である。
【０２１９】
一実施形態において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、それは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複する。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複しない。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、第３、第４または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子または四重特異性抗体分子である。
【０２２０】
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、同じ抗原、例えば同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複する。一実施形態において、第１および第２のエピトープは重複しない。一実施形態において、第１および第２のエピトープは、異なる抗原、例えば異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列ならびに第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体および第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片、および第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体またはその断片を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖもしくはＦａｂまたはその断片、および第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖもしくはＦａｂまたはその断片を含む。
【０２２１】
一実施形態において、抗体分子は、ダイアボディ、および一本鎖分子、ならびに抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略記される）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン）配列（本明細書においてＶＬと略記される）を含み得る。一実施形態において、抗体分子は、重鎖および軽鎖（本明細書において半抗体と呼ばれる）を含むかまたはそれからなる。別の例において、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによりＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一の可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）、およびキメラ（例えば、ヒト化）抗体などの２つの抗原結合部位を形成し、これは、全抗体の修飾によって産生されてもよく、または組み換えＤＮＡ技術を用いてデノボ合成されたものである。これらの機能的抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、限定はされないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの抗体、および抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）に由来し得る。抗体分子の調製物は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体分子はまた、ヒト、ヒト化、ＣＤＲ移植、またはインビトロで産生された抗体であり得る。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有し得る。抗体は、例えば、κまたはλから選択される軽鎖も有し得る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書における「抗体」という用語と同義的に使用される。
【０２２２】
抗体分子の抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ科またはラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体が挙げられる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、断片は、完全な抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【０２２３】
抗体分子は、完全な分子ならびにその機能性断片を含む。抗体分子の定常領域は、抗体の特性を調節するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるために）、改変、例えば変異され得る。
【０２２４】
抗体分子はまた、単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含み得る。例としては、限定はされないが、重鎖抗体、軽鎖を生来含まない抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作抗体および抗体に由来するもの以外の単一ドメイン足場が挙げられる。単一ドメイン抗体は、最先端のまたは任意の将来の単一ドメイン抗体のいずれかであり得る。単一ドメイン抗体は、限定はされないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含む任意の種に由来し得る。本発明の別の態様によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を含まない重鎖抗体として知られている天然の単一ドメイン抗体である。このような単一ドメイン抗体は、例えば、国際公開第９４０４６７８号パンフレットに開示されている。明確にするために、軽鎖を生来含まない重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書においてＶＨＨまたはナノボディとして知られている。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ中で育てられた抗体に由来し得る。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）以外の他の種が、軽鎖を生来含まない重鎖抗体を産生することができ；このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０２２５】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲまたはＦＷ）と呼ばれる、より保存される領域が分散した、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超変異性の領域に細分され得る。
【０２２６】
フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は、いくつかの方法によって厳密に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウエアによって使用されるＡｂＭ定義を参照されたい。一般に、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。
【０２２７】
本明細書において使用される際の「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）および各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。
【０２２８】
所与のＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって記載されるものを含むいくつかの公知のスキームのいずれかを用いて決定され得る。本明細書において使用される際、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキームに従って定義されるＣＤＲは、「高度可変ループ」と呼ばれることもある。
【０２２９】
例えば、Ｋａｂａｔにより、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ；軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）中のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａにより、ＶＨ中のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ；ＶＬ中のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。
【０２３０】
各ＶＨおよびＶＬは、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。
【０２３１】
抗体分子は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。
【０２３２】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術により、またはハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、組み換え方法）により作製され得る。
【０２３３】
抗体は、組み換えにより産生され、例えばファージディスプレイによってまたはコンビナトリアル法によって産生され得る。
【０２３４】
抗体を産生するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｋａｎｇらの国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；Ｄｏｗｅｒらの国際公開第９１／１７２７１号パンフレット；Ｗｉｎｔｅｒらの国際公開第９２／２０７９１号パンフレット；Ｍａｒｋｌａｎｄらの国際公開第９２／１５６７９号パンフレット；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇらの国際公開第９３／０１２８８号パンフレット；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第９２／０１０４７号パンフレット；Ｇａｒｒａｒｄらの国際公開第９２／０９６９０号パンフレット；Ｌａｄｎｅｒらの国際公開第９０／０２８０９号パンフレット；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２（これらの全ての内容が参照により本明細書に援用される）に記載されているように）。
【０２３５】
一実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されたマウス中で作製された抗体）、または非ヒト抗体、例えばげっ歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は、げっ歯類（マウスまたはラット抗体）である。げっ歯類抗体を産生する方法は、当該技術分野において公知である。
【０２３６】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系より、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。対象とする抗原で免疫化したこれらのトランスジェニックマウスに由来する脾細胞が、ヒトタンパク質からのエピトープに対する特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを産生するのに使用される（例えば、Ｗｏｏｄらの国際出願国際公開第９１／００９０６号パンフレット、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらのＰＣＴ公開国際公開第９１／１０７４１号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際出願国際公開第９２／０３９１８号パンフレット；Ｋａｙらの国際公開第９２／０３９１７号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６を参照）。
【０２３７】
抗体分子は、可変領域またはその一部、例えばＣＤＲが非ヒト生物、例えばラットまたはマウス中で産生されたものであり得る。キメラ、ＣＤＲ移植、およびヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物、例えばラットまたはマウス中で産生され、次にヒトにおける抗原性を減少させるように、例えば可変フレームワークまたは定常領域中で修飾された抗体分子は、本発明の範囲内である。
【０２３８】
「効果的ヒト」タンパク質は、中和抗体応答、例えばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を実質的に誘発しないタンパク質である。ＨＡＭＡは、多くの状況において、例えば、抗体分子が、例えば慢性または再発性の病態の治療において繰り返し投与される場合に問題となり得る。ＨＡＭＡ応答は、血清からの抗体クリアランスの増加のため（例えば、Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３２：１８０−１９０（１９９０）を参照）およびさらにアレルギー反応の可能性のため（例えば、ＬｏＢｕｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５：５１１７−５１２３（１９８６）を参照）、繰り返しの抗体投与を無効にする可能性があり得る。
【０２３９】
キメラ抗体は、当該技術分野において公知の組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公開ＰＣＴ／米国特許第８６／０２２６９号明細書；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９を参照）。
【０２４０】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ドナーＣＤＲで置き換えられた、少なくとも１つまたは２つであるが、一般に３つ全ての（重およびまたは軽免疫グロブリン鎖の）レシピエントＣＤＲを有する。抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられてもよく、またはＣＤＲのいくつかのみが非ヒトＣＤＲで置き換えられ得る。抗原への結合に必要な数のＣＤＲを置き換えるのみでよい。好ましくは、ドナーは、げっ歯類抗体、例えばラットまたはマウス抗体であり、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。典型的に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態において、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば、げっ歯類）である。アクセプターフレームワークは、天然（例えば、ヒト）フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、またはそれと約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％以上同一の配列である。
【０２４１】
本明細書において使用される際、「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリーにおいて最も高い頻度で存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７を参照）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置は、ファミリーにおけるその位置に最も高い頻度で存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が等しい頻度で存在する場合、いずれもコンセンサス配列に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を指す。
【０２４２】
抗体分子は、当該技術分野において公知の方法によってヒト化され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、およびＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書および米国特許第５，６９３，７６２号明細書（これらの全ての内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２４３】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体分子は、ＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換によって産生され得、免疫グロブリン鎖の１つ、２つまたは全てのＣＤＲが置換され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号明細書（これらの全ての内容が参照により本明細書に明示的に援用される）を参照されたい。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するのに使用され得るＣＤＲ移植方法を記載しており（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願ＧＢ  ２１８８６３８Ａ号明細書；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号明細書）、その内容が参照により明示的に援用される。
【０２４４】
特異的アミノ酸が置換、欠失または付加されているヒト化抗体分子も本発明の範囲内である。ドナーからアミノ酸を選択する基準は、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、例えば米国特許第５，５８５，０８９号明細書の第１２〜１６欄、例えば米国特許第５，５８５，０８９号明細書の第１２〜１６欄に記載され、これらの内容が参照により本明細書に援用される。抗体をヒト化するための他の技術は、１９９２年１２月２３日に公開されたＰａｄｌａｎらの欧州特許出願公開第５１９５９６  Ａ１号明細書に記載されている。
【０２４５】
抗体分子は、一本鎖抗体であり得る。一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）は、操作されていてもよい（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８８０：２６３−８０；およびＲｅｉｔｅｒ，Ｙ．（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２：２４５−５２を参照）。一本鎖抗体は、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を産生するように二量体化または多量体化され得る。
【０２４６】
さらに他の実施形態において、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥの重鎖定常領域から選択され；特に例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態において、抗体分子は、例えば、κまたはλの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体の特性を調節するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるために）、改変、例えば変異され得る。一実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有し；補体を固定することができる。他の実施形態において、抗体は、エフェクター細胞を動員せず；または補体を固定しない。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する減少した能力を有するかまたはそのような能力を有さない。例えば、それは、Ｆｃ受容体への結合を支持しないアイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の変異体であり、例えば、それは、突然変異したまたは欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。
【０２４７】
抗体定常領域を改変するための方法は、当該技術分野において公知である。改変された機能、例えば細胞上のＦｃＲ、または補体のＣ１成分などのエフェクターリガンドに対する改変された親和性を有する抗体は、抗体の定常部分中の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置換することによって生成され得る（例えば、欧州特許出願公開第３８８，１５１  Ａ１号明細書、米国特許第５，６２４，８２１および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（これらの全ての内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。マウス、または他の種に適用される場合、免疫グロブリンがこれらの機能を減少させるかまたはなくす類似のタイプの改変が記載され得る。
【０２４８】
抗体分子は、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化または連結され得る。本明細書において使用される際、「誘導体化」抗体分子は、修飾されているものである。誘導体化の方法としては、限定はされないが、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、毒素、酵素またはビオチンなどの親和性リガンドの付加が挙げられる。したがって、本発明の抗体分子は、免疫接着分子を含む、本明細書に記載される抗体の、誘導体化および他の形態で修飾された形態を含むことが意図される。例えば、抗体分子は、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能薬剤、細胞毒性剤、医薬品、および／または抗体または抗体部分と別の分子との結合を媒介し得るタンパク質またはペプチド（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）などの１つまたは複数の他の分子実体に（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合的結合またはその他によって）機能的に連結され得る。
【０２４９】
誘導体化抗体分子の１つのタイプは、（例えば、二重特異性抗体を産生するために同じタイプまたは異なるタイプの）２つ以上の抗体を架橋することによって産生される。好適な架橋剤は、適切なスペーサによって隔てられた２つの明確に反応性の基を有するヘテロ二機能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二機能性（例えば、スベリン酸ジサクシンイミジル）であるものを含む。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）から入手可能である。
【０２５０】
多重特異性抗体分子
本明細書に定義される多重特異性および多機能性分子の例示的な構造が全体を通して記載されている。例示的な構造は、Ｗｅｉｄｌｅ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１−１８（２０１３）；およびＳｐｉｅｓｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７：９５−１０６（これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される）にさらに記載されている。
【０２５１】
実施形態において、多重特異性抗体分子は、２つ以上の抗原結合部位を含むことができ、異なる部位は、異なる抗原に対して特異的である。実施形態において、多重特異性抗体分子は、同じ抗原上の１つを超える（例えば、２つ以上の）エピトープに結合し得る。実施形態において、多重特異性抗体分子は、標的細胞（例えば、癌細胞）に対して特異的な抗原結合部位、および免疫エフェクター細胞に対して特異的な異なる抗原結合部位を含む。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体分子は、５つの異なる構造グループ：（ｉ）二重特異性免疫グロブリンＧ（ＢｓＩｇＧ）；（ｉｉ）さらなる抗原結合部分が付加されたＩｇＧ；（ｉｉｉ）二重特異性抗体断片；（ｉｖ）二重特異性融合タンパク質；および（ｖ）二重特異性抗体コンジュゲートに分類され得る。
【０２５２】
ＢｓＩｇＧは、各抗原に対して一価のフォーマットである。例示的なＢｓＩｇＧフォーマットとしては、限定はされないが、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ、ノブ・イン・ホール共通ＬＣ、ノブ・イン・ホールアセンブリ、荷電対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤボディ、トリオマブ、ＬＵＺ−Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ−ボディ、直交性Ｆａｂが挙げられる。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。例示的なＢｓＩｇＧとしては、抗ＣＤ３アームおよび抗ＥｐＣＡＭアームを含有するカツマキソマブ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ，Ｎｅｏｐｈａｒｍ）；およびＣＤ３およびＨＥＲ２を標的にするエルツマキソマブ（Ｎｅｏｖｉｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられる。ある実施形態において、ＢｓＩｇＧは、ヘテロ二量体化のために操作される重鎖を含む。例えば、重鎖は、「ノブ・イントゥ・ホール」手法、ＳＥＥＤプラットフォーム、共通の重鎖（例えば、κλ−ボディ中）、およびヘテロ二量体Ｆｃ領域の使用を用いてヘテロ二量体化のために操作され得る。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＢｓＩｇＧ中のホモ二量体の重鎖対合を避けるのに使用されている手法としては、ノブ・イン・ホール、デュオボディ、アジメトリック、荷電対、ＨＡ−ＴＦ、ＳＥＥＤボディ、および示差タンパク質Ａ親和性が挙げられる。同文献を参照されたい。ＢｓＩｇＧは、異なる宿主細胞中の成分抗体の別個の発現およびその後の精製／ＢｓＩｇＧへの組み立てによって生成され得る。ＢｓＩｇＧはまた、単一の宿主細胞中の成分抗体の発現によって産生され得る。ＢｓＩｇＧは、親和性クロマトグラフィーを用いて、例えばタンパク質Ａおよび逐次ｐＨ溶出を用いて精製され得る。
【０２５３】
さらなる抗原結合部分が付加されたＩｇＧは、二重特異性抗体分子の別のフォーマットである。例えば、単一特異性ＩｇＧは、例えば、重鎖または軽鎖のいずれかのＮ−またはＣ末端において、さらなる抗原結合単位を単一特異性ＩｇＧ上に付加することにより、二重特異性を有するように操作され得る。例示的なさらなる抗原結合単位としては、単一ドメイン抗体（例えば、可変重鎖または可変軽鎖）、操作タンパク質足場、および対になった抗体可変ドメイン（例えば、一本鎖可変断片または可変断片）が挙げられる。同文献を参照されたい。付加されたＩｇＧフォーマットの例としては、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ−Ｉｇ）、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＫＩＨ  ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、ザイボディ、およびＤＶＩ−ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）が挙げられる。Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５−１０６を参照されたい。ＩｇＧ−ｓｃＦｖの例は、ＩＧＦ−１ＲおよびＨＥＲ３に結合するＭＭ−１４１（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。ＤＶＤ−Ｉｇの例としては、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βに結合するＡＢＴ−９８１（ＡｂｂＶｉｅ）；およびＴＮＦおよびＩＬ−１７Ａに結合するＡＢＴ−１２２（ＡｂｂＶｉｅ）が挙げられる。
【０２５４】
二重特異性抗体断片（ＢｓＡｂ）は、抗体定常ドメインのいくつかまたは全てを欠く二重特異性抗体分子のフォーマットである。例えば、いくつかのＢｓＡｂは、Ｆｃ領域を欠いている。実施形態において、二重特異性抗体断片は、単一の宿主細胞中のＢｓＡｂの効率的な発現を可能にするペプチドリンカーによって連結される重鎖および軽鎖領域を含む。例示的な二重特異性抗体断片としては、限定はされないが、ナノボディ、ナノボディ−ＨＡＳ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３  ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、および細胞内抗体が挙げられる。同文献を参照されたい。例えば、ＢｉＴＥフォーマットは、タンデムｓｃＦｖｓを含み、成分ｓｃＦｖは、Ｔ細胞上のＣＤ３および癌細胞上の表面抗原に結合する。
【０２５５】
二重特異性融合タンパク質は、例えば、さらなる特異性および／または機能性を付加するために、他のタンパク質に連結される抗体断片を含む。二重特異性融合タンパク質の例は、ＨＬＡ提示ペプチドを認識する親和性成熟Ｔ細胞受容体に連結される抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むｉｍｍＴＡＣである。実施形態において、ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）方法を用いて、より高い原子価を有する二重特異性抗体分子を生成することができる。また、アルブミン結合タンパク質またはヒト血清アルブミンへの融合は、抗体断片の血清半減期を延長することができる。同文献を参照されたい。
【０２５６】
実施形態において、化学的コンジュゲーション、例えば、抗体および／または抗体断片の化学的コンジュゲーションを用いてＢｓＡｂ分子を生成することができる。同文献を参照されたい。例示的な二重特異性抗体コンジュゲートとしては、低分子量薬剤が各Ｆａｂアームまたは抗体またはその断片中の単一の反応性リジンに部位特異的にコンジュゲートされる、ＣｏｖＸ−ボディフォーマットが挙げられる。実施形態において、コンジュゲーションにより、低分子量薬剤の血清半減期が向上される。例示的なＣｏｖＸ−ボディは、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２のいずれかを阻害する２つの短鎖ペプチドにコンジュゲートされた抗体を含むＣＶＸ−２４１（ＮＣＴ０１００４８２２）である。同文献を参照されたい。
【０２５７】
抗体分子は、例えば、宿主系における少なくとも１つまたは複数の成分の組み換え発現によって生成され得る。例示的な宿主系としては、真核細胞（例えば、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、または昆虫細胞、例えばＳＦ９またはＳ２細胞）および原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が挙げられる。二重特異性抗体分子は、異なる宿主細胞中の成分の別個の発現およびその後の精製／組み立てによって生成され得る。あるいは、抗体分子は、単一の宿主細胞中の成分の発現によって生成され得る。二重特異性抗体分子の精製は、例えば、タンパク質Ａおよび逐次ｐＨ溶出を用いた親和性クロマトグラフィーなどの様々な方法によって行われ得る。他の実施形態において、親和性タグは、精製、例えばヒスチジン含有タグ、ｍｙｃタグ、またはストレプトアビジンタグに使用され得る。
【０２５８】
ＣＤＲ移植足場
実施形態において、抗体分子は、ＣＤＲ移植足場ドメインである。実施形態において、足場ドメインは、フィブロネクチンドメイン、例えばフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づいている。フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインの全体的な折り畳みは、最小機能抗体断片、抗体重鎖の可変ドメインのものと密接に関連している。Ｆｎ３の末端に３つのループがあり；ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの位置は、抗体のＶＨドメインのＣＤＲ１、２および３の位置にほぼ相当する。Ｆｎ３は、ジスルフィド結合を有さず；したがって、Ｆｎ３は、抗体およびそれらの断片と異なり、還元条件下で安定している（例えば、国際公開第９８／５６９１５号パンフレット；国際公開第０１／６４９４２号パンフレット；国際公開第００／３４７８４号パンフレットを参照）。Ｆｎ３ドメインは、例えば、本明細書に記載される抗原／マーカー／細胞に結合するドメインを選択するように、（例えば、本明細書に記載されるＣＤＲまたは高度可変ループを用いて）修飾または変異され得る。
【０２５９】
実施形態において、足場ドメイン、例えば折り畳みドメインは、抗体、例えばモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインから３つのβ鎖を削除することによって作成される「ミニボディ」足場に基づいている（例えば、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．７：９；およびＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５３０３−５３０９を参照）。「ミニボディ」は、２つの高度可変ループを提示するように使用され得る。実施形態において、足場ドメインは、Ｖ様ドメイン（例えば、Ｃｏｉａらの国際公開第９９／４５１１０号パンフレットを参照）または２つのジスルフィド結合によってつなぎ合わされた７４残基の６鎖βシートサンドイッチであるテンダミスタチンに由来するドメイン（例えば、ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｅｓｓ，１９９５，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０を参照）である。例えば、テンダミスタチンのループは、例えば、本明細書に記載されるマーカー／抗原／細胞に結合するドメインを選択するように（例えば、ＣＤＲまたは高度可変ループを用いて）修飾または変異され得る。別の例示的な足場ドメインは、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインに由来するβ−サンドイッチ構造である（例えば、国際公開第００／６００７０号パンフレットを参照）。
【０２６０】
他の例示的な足場ドメインとしては、限定はされないが、Ｔ細胞受容体；ＭＨＣタンパク質；細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型リピート、ＥＧＦリピート）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、エコチン、ＢＰＴＩなど）；ＴＰＲリピート；三葉構造；亜鉛フィンガードメイン；ＤＮＡ結合タンパク質；特に、モノマーＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えばプロテアーゼ（特に不活性化プロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ；シャペロン、例えばチオレドキシン、および熱ショックタンパク質；および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＨ２およびＳＨ３ドメインなど）が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００４０００９５３０号明細書および米国特許第７，５０１，１２１号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０２６１】
実施形態において、足場ドメインは、例えば、以下の基準の１つまたは複数によって評価および選択される：（１）アミノ酸配列、（２）いくつかの相同ドメインの配列、（３）３次元構造、および／または（４）一連のｐＨ、温度、塩分、有機溶媒、酸化剤濃度にわたる安定性データ。実施形態において、足場ドメインは、小さい安定したタンパク質ドメイン、例えば１００、７０、５０、４０または３０未満のアミノ酸のタンパク質である。ドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含んでもよく、または金属、例えば亜鉛をキレートし得る。
【０２６２】
抗体に基づく融合
抗体のＮまたはＣ末端に結合されるさらなる結合実体を含有する様々なフォーマットが生成され得る。一本鎖またはジスルフィド安定化ＦｖまたはＦａｂとのこれらの融合は、各抗原に対する二価結合特異性を有する四価分子の生成をもたらす。ｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂと、ＩｇＧとの組合せは、３つ以上の異なる抗原を認識し得る分子の生成を可能にする。
【０２６３】
抗体−Ｆａｂ融合
抗体−Ｆａｂ融合は、第１の標的に対する従来の抗体、および抗体重鎖のＣ末端に融合された第２の標的に対するＦａｂを含む二重特異性抗体である。一般的に、この抗体およびＦａｂは、共通の軽鎖を有するであろう。抗体融合は、（１）標的融合のＤＮＡ配列を操作し、（２）融合タンパク質を発現するように、標的ＤＮＡを好適な宿主細胞へとトランスフェクトすることによって生成され得る。抗体−ｓｃＦｖ融合は、Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１５９によって記載されているように、ＣＨ３ドメインのＣ末端とｓｃＦｖのＮ末端との間の（Ｇｌｙ）−Ｓｅｒリンカーによって連結され得るようである。
【０２６４】
抗体−ｓｃＦｖ融合
抗体−ｓｃＦｖ融合は、従来の抗体、および抗体重鎖のＣ末端に融合された独自の特異性のｓｃＦｖを含む二重特異性抗体である。ｓｃＦｖは、直接またはリンカーペプチドを介して、ｓｃＦｖの重鎖を介してＣ末端に融合され得る。抗体融合は、（１）標的融合のＤＮＡ配列を操作し、（２）融合タンパク質を発現するように、標的ＤＮＡを好適な宿主細胞へとトランスフェクトすることによって生成され得る。抗体−ｓｃＦｖ融合は、Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１５９によって記載されているように、ＣＨ３ドメインのＣ末端とｓｃＦｖのＮ末端との間の（Ｇｌｙ）−Ｓｅｒリンカーによって連結され得るようである。
【０２６５】
可変ドメイン免疫グロブリンＤＶＤ
関連するフォーマットは、短鎖リンカー配列によってＶドメインのＮ末端に配置される、第２の特異性のＶＨおよびＶＬドメインから構成される二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ）である。
【０２６６】
他の例示的な多重特異性抗体フォーマットとしては、例えば、以下のもの、米国特許出願公開第２０１６０１１４０５７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０２４３７７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４００５１８３３号明細書、米国特許出願公開第２０１３００２２６０１号明細書、米国特許出願公開第２０１５００１７１８７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２０１７４６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１５０１３３６３８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０２６６５６８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０１４５３４０Ａ１号明細書、国際公開第２０１５１２７１５８Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０２０３５９１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３２２２２１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３０３３９６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２９３６１３号明細書、米国特許出願公開第２０１３００１７２００Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０１０２１３５Ａ１号明細書、国際公開第２０１５１９７５９８Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１５１９７５８２Ａ１号パンフレット、米国特許第９３５９４３７号明細書、米国特許出願公開第２０１５００１８５２９号明細書、国際公開第２０１６１１５２７４Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１６０８７４１６Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２００８００６９８２０Ａ１号明細書、米国特許第９１４５５８８Ｂ号明細書、米国特許第７９１９２５７号明細書、および米国特許出願公開第２０１５０２３２５６０Ａ１号明細書に記載されるものが挙げられる。完全抗体−Ｆａｂ／ｓｃＦａｂフォーマットを用いる例示的な多重特異性分子としては、以下のもの、米国特許第９３８２３２３Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１４００７２５８１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３０８２８５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１６５６３８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０２６７６８６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３７７２６９Ａ１号明細書、米国特許第７７４１４４６Ｂ２号明細書、および国際公開第１９９５００９９１７Ａ１号パンフレットに記載されるものが挙げられる。ドメイン交換フォーマットを用いる例示的な多重特異性分子としては、以下のもの、米国特許出願公開第２０１５０３１５２９６Ａ１号明細書、国際公開第２０１６０８７６５０Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１６００７５７８５Ａ１号明細書、国際公開第２０１６０１６２９９Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１６０１３０３４７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１５０１６６６７０号明細書、米国特許第８７０３１３２Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１００３１６６４５号明細書、米国特許第８２２７５７７Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１３００７８２４９号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０２６７】
Ｆｃ含有実体（ミニ抗体）
ミニ抗体としても知られているＦｃ含有実体は、ｓｃＦｖを、定常重鎖領域ドメイン３（ＣＨ３−ｓｃＦｖ）のＣ末端に、および／または異なる特異性を有する抗体のヒンジ領域（ｓｃＦｖ−ヒンジ−Ｆｃ）に融合することによって生成され得る。ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端に融合されたジスルフィド安定化可変ドメイン（ペプチドリンカーを用いない）を有する三価実体も作製され得る。
【０２６８】
Ｆｃ含有多重特異性分子
ある実施形態において、本明細書に開示される多重特異性分子は、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）を含む。例示的なＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域；より特定的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択され得る。
【０２６９】
ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるように改変され、例えば変異される。
【０２７０】
他の実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１および第２のＦｃ領域）のインターフェースが、例えば、非改変インターフェース、例えば天然インターフェースと比べて二量体化を増加または減少させるように改変され、例えば変異される。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）の二量体化が、例えば、非改変インターフェースと比べてヘテロ多量体対ホモ多量体のより高い比率が生じるように、第１および第２のＦｃ領域のＦｃインターフェースに対になった突起−空洞（「ノブ・イン・ホール」）、静電相互作用または鎖交換の１つまたは複数を提供することによって促進され得る。
【０２７１】
ある実施形態において、多重特異性分子は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９の１つまたは複数から選択される位置に対になったアミノ酸置換を含む。例えば、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば、空洞またはホールに対応する）、およびＴ３６６Ｗ（例えば、突起またはノブに対応する）から選択される対になったアミノ酸置換を含み得る。
【０２７２】
他の実施形態において、多機能性分子は、半減期延長剤、例えばヒト血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンに対する抗体分子を含む。
【０２７３】
ヘテロ二量体化抗体分子および作製方法
不適切な重鎖対合の問題に対処するように、多重特異性抗体を産生する様々な方法が開示されている。例示的な方法が後述される。例示的な多重特異性抗体フォーマットおよび前記多重特異性抗体を作製する方法はまた、例えば、Ｓｐｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７（２０１５）９５−１０６；およびＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ｍＡｂｓ  ４：６，６５３−６６３；２０１２年１１月／１２月（これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【０２７４】
ヘテロ二量体化二重特異性抗体は、天然ＩｇＧ構造に基づいており、２つの結合アームは、異なる抗原を認識する。所定の一価（および同時）抗原結合を可能にするＩｇＧ由来のフォーマットは、軽鎖の誤対合（例えば、共通の軽鎖）を最小限に抑える技術と組み合わされた、強制的な重鎖ヘテロ二量体化によって生成される。強制的な重鎖ヘテロ二量体化は、例えば、ノブ・イン・ホールまたは鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）を用いて得ることができる。
【０２７５】
ノブ・イン・ホール
米国特許第５，７３１，１１６号明細書、米国特許第７，４７６，７２４号明細書およびＲｉｄｇｗａｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７−６２１に記載されるノブ・イン・ホールは、概して、（１）ヘテロ二量体化を促進するように一方または両方の抗体のＣＨ３ドメインを変異させ；（２）ヘテロ二量体化を促進する条件下で変異された抗体を組み合わせることを含む。「ノブ」または「突起」は、典型的に、親抗体中の小さいアミノ酸をより大きいアミノ酸（例えば、Ｔ３６６ＹまたはＴ３６６Ｗ）で置換することによって作成され；「ホール」または「空洞」は、親抗体中のより大きい残基をより小さいアミノ酸（例えば、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ）で置換することによって作成される。
【０２７６】
Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体について、Ｆｃ部分の適切なヘテロ二量体化を促進するために、重鎖の定常領域への特異的変異の導入が用いられ得る。いくつかのこのような技術がＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｍＡｂｓ（２０１２）４：６，１−１１）に概説され、この内容は、全体が参照により本明細書に援用される。これらの技術は、抗体重鎖の１つのＣＨ３ドメインの１つへの嵩高の残基の導入を含む「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）手法を含む。この嵩高の残基は、重鎖の適切な対合を促進するように、対になった重鎖の他のＣＨ３ドメインにおける相補的な「ホール」に適合する（例えば、米国特許第７６４２２２８号明細書を参照）。
【０２７７】
例示的なＫｉＨ変異としては、「ノブ」重鎖におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、および「ホール」重鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖが挙げられる。他の例示的なＫｉＨ変異がさらなる任意選択の安定化Ｆｃシステイン変異とともに表１に示される。
【０２７８】
【表１】
2019512272.tif 000003
【０２７９】
他のＦｃ変異が、他の鎖のＣＨ３ドメイン中の３つの正に荷電した残基と対合する１つの鎖のＣＨ３ドメイン中の３つの負に荷電した残基を同定したＩｇａｗａおよびＴｓｕｎｏｄａによって提供される。これらの特異的な荷電残基対は、Ｅ３５６−Ｋ４３９、Ｅ３５７−Ｋ３７０、Ｄ３９９−Ｋ４０９であり、逆も同様である。鎖Ａ中の以下の３つの変異：Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７ＫおよびＤ３９９Ｋ、ならびび鎖Ｂ中のＫ３７０Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４３９Ｅの少なくとも２つを単独でまたは新たに同定されたジスルフィド架橋と組み合わせて導入することにより、それらは、ホモ二量体化を抑制するのと同時に、非常に効率的なヘテロ二量体化に有利に機能することができた（Ｍａｒｔｅｎｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ  ａｎｔｉｃ−Ｍｅｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：６１４４−５２；ＰＭＩＤ：１７０６２６９１）。Ｘｅｎｃｏｒは、鎖ＡにおけるＳ３６４Ｈ、Ｆ４０５Ａ（ＨＡ）と、鎖Ｂ（ＴＦ）におけるＹ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆとの組合せを定義しながら、最大ヘテロ二量体化について後にスクリーニングされる構造計算および配列情報に基づいて４１の変異体対を定義した（Ｍｏｏｒｅ  ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＭＡｂｓ  ２０１１；３：５４６−５７；ＰＭＩＤ：２２１２３０５５）。
【０２８０】
多重特異性抗体のヘテロ二量体化を促進するための他の例示的なＦｃ変異としては、以下の参考文献（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）、国際公開第２０１６０７１３７７Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４００７９６８９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０１９４３８９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２５７７６３号明細書、国際公開第２０１６０７１３７６Ａ２号パンフレット、国際公開第２０１５１０７０２６Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１５１０７０２５Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１５１０７０１５Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０３５３６３６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１９９２９４Ａ１号明細書、米国特許第７７５０１２８Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２２９９１５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１５０３４４５７０Ａ１号明細書、米国特許第８００３７７４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１５０３３７０４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１５０１７５７０７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２４２０７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１９５８４９Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１４９８７６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０２００３３１Ａ１号明細書、米国特許第９３０９３１１Ｂ２号明細書、米国特許第８５８６７１３号明細書、米国特許出願公開第２０１４００３７６２１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１７８６０５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３６３４２６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１４００５１８３５Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２０１１００５４１５１Ａ１号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０２８１】
安定化システイン変異はまた、ＫｉＨおよび他のＦｃヘテロ二量体化促進変異体と組み合わせて使用されている。例えば、米国特許第７１８３０７６号明細書を参照されたい。他の例示的なシステイン修飾としては、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３４８８３９Ａ１号明細書、米国特許第７８５５２７５Ｂ２号明細書、および米国特許第９０００１３０Ｂ２号明細書に開示されるものが挙げられる。
【０２８２】
鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）
鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）Ｃ（Ｈ）３ヘテロ二量体を考案することにより、二重特異性および非対称融合タンパク質を支持するヘテロ二量体Ｆｃプラットフォームが公知である。ヒトＩｇＧおよびＩｇＡ  Ｃ（Ｈ）３ドメインのこれらの誘導体は、ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ  Ｃ（Ｈ）３配列の交互のセグメントから構成される相補的ヒトＳＥＥＤ  Ｃ（Ｈ）３ヘテロ二量体を生成する。ＳＥＥＤ  Ｃ（Ｈ）３ドメインの得られる対は、哺乳類細胞内で発現されるとき、ヘテロ二量体を形成するように優先的に結合する。ＳＥＥＤボディ（Ｓｂ）融合タンパク質は、１つまたは複数の融合パートナーと遺伝的に連鎖し得る［ＩｇＧ１ヒンジ］−Ｃ（Ｈ）２−［ＳＥＥＤ  Ｃ（Ｈ）３］からなる（例えば、Ｄａｖｉｓ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ：ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ＣＨ３  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ａｎ  Ｆｃ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０１０；２３：１９５−２０２；ＰＭＩＤ：２０２９９５４２および米国特許第８８７１９１２号明細書（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２８３】
デュオボディ
適切な重鎖対合を有する二重特異性抗体を産生するための「デュオボディ」技術が公知である。デュオボディ技術は、産生後（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）交換反応において安定した二重特異性ヒトＩｇＧ１抗体を産生するための３つの基本的工程を含む。第１の工程において、第３の定常（ＣＨ３）ドメイン中に単一の適合した変異をそれぞれ含む２つのＩｇＧ１が標準的な哺乳動物組み換え細胞株を用いて別々に産生される。その後、これらのＩｇＧ１抗体は、回収および精製のための標準的なプロセスに従って精製される。産生および精製（産生後）後、２つの抗体は、調整された実験室条件下で再結合されて、非常に高い収率（典型的に＞９５％）で二重特異性抗体産物をもたらす（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１３；１１０（１３）：５１４５−５１５０およびＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２０１４；９（１０）：２４５０−６３（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２８４】
静電相互作用
ホモ二量体の形成が静電的に不利であるように、荷電アミノ酸によるＣＨ３アミノ酸交換を用いて多重特異性抗体を作製する方法が開示されている。欧州特許第１８７０４５９号明細書および国際公開第２００９０８９００４号パンフレットには、宿主細胞内の異なる抗体ドメインの共発現時にヘテロ二量体の形成に有利に機能する他の手法が記載されている。これらの方法において、両方のＣＨ３ドメインにおけるＣＨ３−ＣＨ３境界部である、重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）を構成する１つまたは複数の残基が荷電アミノ酸で置き換えられて、ホモ二量体の形成が静電的に不利であり、ヘテロ二量体化が静電的に有利であるようにする。静電相互作用を用いて多重特異性分子を作製するさらなる方法が、米国特許出願公開第２０１０００１５１３３号明細書、米国特許第８５９２５６２Ｂ２号明細書、米国特許第９２０００６０Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１４０１５４２５４Ａ１号明細書、および米国特許第９３５８２８６Ａ１号明細書を含む参考文献（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０２８５】
共通の軽鎖
軽鎖の誤対合は、二重特異性ＩｇＧの均質な調製物を生成することを避ける必要がある。これを行うための１つの方法は、共通の軽鎖の原理の使用、すなわち１つの軽鎖を共有するが、別の特異性を依然として有する２つの結合剤を組み合わせることによる。モノマーの混合物からの所望の二重特異性抗体の形成を促進する例示的な方法は、二重特異性抗体の異種可変重鎖領域のそれぞれと相互作用する共通の可変軽鎖を提供することによる。例えば、米国特許第７１８３０７６Ｂ２号明細書、米国特許出願公開第２０１１０１７７０７３Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第２８４７２３１Ａ１号明細書、国際公開第２０１６０７９０８１Ａ１号パンフレット、および欧州特許出願公開第３０５５３２９Ａ１号明細書（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）に開示されるような、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体を産生する組成物および方法である。
【０２８６】
ＣｒｏｓｓＭａｂ
軽鎖の誤対合を減少させるための別の選択肢は、二重特異性抗体の半分のＦａｂ中のＣＨ１およびＣＬドメインを交換することにより、非特異的なＬ鎖の誤対合を避けるＣｒｏｓｓＭａｂ技術である。このようなクロスオーバー変異体は、結合特異性および親和性を保持するが、Ｌ鎖の誤対合が防がれるほど２つのアームを異ならせる。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術（上記のＫｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．に概説されるように）は、適切な対合の形成を促進するように、重鎖と軽鎖との間のドメイン交換を含む。簡潔には、２つの異なる軽鎖−重鎖対を用いることによって２つの抗原に結合し得る二重特異性ＩｇＧ様ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を構築するために、２工程の修飾プロセスが適用される。まず、二量体化の境界部が、ヘテロ二量体化手法、例えばノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）技術を用いて各重鎖のＣ末端へと操作されて、１つの抗体（例えば、抗体Ａ）および第２の抗体（例えば、抗体Ｂ）からの２つの異なる重鎖のヘテロ二量体のみが確実に効率的に形成される。次に、１つの抗体の定常重鎖１（ＣＨ１）および定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが交換されて（抗体Ａ）、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを不変に保つ。ＣＨ１およびＣＬドメインの交換は、修飾抗体（抗体Ａ）軽鎖が修飾抗体（抗体Ａ）重鎖とのみ効率的に二量体化し得る一方、非修飾抗体（抗体Ｂ）軽鎖が非修飾抗体（抗体Ｂ）重鎖とのみ効率的に二量体化し得ることを確実にし；したがって、所望の二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂのみが効率的に形成されるであろう（例えば、Ｃａｉｎ，Ｃ．ＳｃｉＢＸ  ４（２８）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｃｉｂｘ．２０１１．７８３（この内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０２８７】
共通の重鎖
モノマーの混合物からの所望の二重特異性抗体の形成を促進する例示的な方法は、二重特異性抗体の異種可変軽鎖領域のそれぞれと相互作用する共通の可変重鎖を提供することによる。共通の重鎖を有する二重特異性抗体を産生する組成物および方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１２０１８４７１６号明細書、米国特許出願公開第２０１３０３１７２００号明細書、および米国特許出願公開第２０１６０２６４６８５Ａ１号明細書（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）に開示されている。
【０２８８】
アミノ酸修飾
適切な軽鎖の対合を有する多重特異性抗体を産生する代替的な組成物および方法は、様々なアミノ酸修飾を含む。例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓは、ＣＨ１および／またはＣＬドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸修飾、ＶＨおよび／またはＶＬドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸修飾、またはその組合せを有するヘテロ二量体を記載しており、これらのドメインは、軽鎖と重鎖との間の境界部の一部であり、各重鎖と所望の軽鎖との間に優先的な対合を形成して、ヘテロ二量体対の２つの重鎖および２つの軽鎖が細胞内で共発現されるとき、第１のヘテロ二量体の重鎖が他のものより軽鎖の１つと優先的に対合するようになっている（例えば、国際公開第２０１５１８１８０５号パンフレットを参照）。他の例示的な方法は、国際公開第２０１６０２６９４３号パンフレット（Ａｒｇｅｎ−Ｘ）、米国特許出願公開第２０１５０２１１００１号明細書、米国特許出願公開第２０１４００７２５８１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１６００３９９４７Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２０１５０３６８３５２号明細書に記載されている。
【０２８９】
λ／κフォーマット
λ軽鎖ポリペプチドおよびκ軽鎖ポリペプチドを含む多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体分子）は、ヘテロ二量体化を可能にするのに使用され得る。λ軽鎖ポリペプチドおよびκ軽鎖ポリペプチドを含む二重特異性抗体分子を生成するための方法が、２０１６年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／３９９，３１９号明細書に開示され、これは、全体が参照により本明細書に援用される。
【０２９０】
実施形態において、多重特異性分子は、多重特異性抗体分子、例えば２つの結合特異性を含む抗体分子、例えば二重特異性抗体分子を含む。多重特異性抗体分子は、
第１のエピトープに対して特異的なλ軽鎖ポリペプチド１（ＬＬＣＰ１）；
第１のエピトープに対して特異的な重鎖ポリペプチド１（ＨＣＰ１）；
第２のエピトープに対して特異的なκ軽鎖ポリペプチド２（ＫＬＣＰ２）；および
第２のエピトープに対して特異的な重鎖ポリペプチド２（ＨＣＰ２）
を含む。
【０２９１】
「λ軽鎖ポリペプチド１（ＬＬＣＰ１）」は、その用語が本明細書において使用される際、同種の重鎖可変領域と組み合わされると、そのエピトープおよびＨＣＰ１との複合体に対する特異的結合を媒介し得るように、十分な軽鎖（ＬＣ）配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態において、それは、ＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態において、ＬＬＣＰ１は、そのエピトープおよびＨＣＰ１との複合体の特異的結合を媒介するために、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびＣＨ１、またはそれからの十分な配列を含む。ＬＬＣＰ１は、そのＨＣＰ１と一緒に、第１のエピトープに対する特異性を提供する（一方、ＫＬＣＰ２は、そのＨＣＰ２と一緒に、第２のエピトープに対する特異性を提供する）。本明細書の他の箇所に記載されるように、ＬＬＣＰ１は、ＨＣＰ２よりＨＣＰ１に対する高い親和性を有する。
【０２９２】
「κ軽鎖ポリペプチド２（ＫＬＣＰ２）」は、その用語が本明細書において使用される際、同種の重鎖可変領域と組み合わされると、そのエピトープおよびＨＣＰ２との複合体に対する特異的結合を媒介し得るように、十分な軽鎖（ＬＣ）配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態において、それは、ＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態において、ＫＬＣＰ２は、そのエピトープおよびＨＣＰ２との複合体に対する特異的結合を媒介するために、ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、ＬＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、およびＣＨ１、またはそれからの十分な配列を含む。ＫＬＣＰ２は、そのＨＣＰ２と一緒に、第２のエピトープに対する特異性を提供する（一方、ＬＬＣＰ１は、そのＨＣＰ１と一緒に、第１のエピトープに対する特異性を提供する）。
【０２９３】
「重鎖ポリペプチド１（ＨＣＰ１）」は、その用語が本明細書において使用される際、同種のＬＬＣＰ１と組み合わされると、そのエピトープおよびＨＣＰ１との複合体に対する特異的結合を媒介し得るように、十分な重鎖（ＨＣ）配列、例えば、ＨＣ可変領域配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態において、それは、ＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態において、それは、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域の全てまたは断片を含む。一実施形態において、ＨＣＰ１は、（ｉ）そのエピトープおよびＬＬＣＰ１との複合体の特異的結合を媒介するために、（ｉｉ）本明細書に記載されるように、ＫＬＣＰ２ではなくＬＬＣＰ１と優先的に複合するために；および（ｉｉｉ）本明細書に記載されるように、ＨＣＰ１の別の分子ではなくＨＣＰ２と優先的に複合するために、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、またはそれからの十分な配列を含む。ＨＣＰ１は、そのＬＬＣＰ１と一緒に、第１のエピトープに対する特異性を提供する（一方、ＫＬＣＰ２は、そのＨＣＰ２と一緒に、第２のエピトープに対する特異性を提供する）。
【０２９４】
「重鎖ポリペプチド２（ＨＣＰ２）」は、その用語が本明細書において使用される際、同種のＬＬＣＰ１と組み合わされると、そのエピトープおよびＨＣＰ１との複合体に対する特異的結合を媒介し得るように、十分な重鎖（ＨＣ）配列、例えば、ＨＣ可変領域配列を含むポリペプチドを指す。一実施形態において、それは、ＣＨ１領域の全てまたは断片を含む。一実施形態において、それは、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域の全てまたは断片を含む。一実施形態において、ＨＣＰ１は、（ｉ）そのエピトープおよびＫＬＣＰ２との複合体の特異的結合を媒介するために、（ｉｉ）本明細書に記載されるように、ＬＬＣＰ１ではなくＫＬＣＰ２と優先的に複合するために；および（ｉｉｉ）本明細書に記載されるように、ＨＣＰ２の別の分子ではなくＨＣＰ１に複合するために、ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、またはそれからの十分な配列を含む。ＨＣＰ２は、そのＫＬＣＰ２と一緒に、第２のエピトープに対する特異性を提供する（一方、ＬＬＣＰ１は、そのそのＨＣＰ１と一緒に、第１のエピトープに対する特異性を提供する）。
【０２９５】
本明細書に開示される多重特異性抗体分子のある実施形態において、
ＬＬＣＰ１は、ＨＣＰ２よりＨＣＰ１に対してより高い親和性を有し；および／または
ＫＬＣＰ２は、ＨＣＰ１よりＨＣＰ２に対してより高い親和性を有する。
【０２９６】
実施形態において、ＨＣＰ１に対するＬＬＣＰ１の親和性は、予め選択された条件下、例えば水性緩衝液中、例えばｐＨ７において、生理食塩水中、例えばｐＨ７において、または生理学的条件下において、多重特異性抗体分子分子の少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５、または９９．９％が、ＨＣＰ１と複合体化または結合されたＬＬＣＰ１を有するように、ＨＣＰ２に対するその親和性より十分に高い。
【０２９７】
本明細書に開示される多重特異性抗体分子のある実施形態において、
ＨＣＰ１は、ＨＣＰ１の第２の分子よりＨＣＰ２に対してより高い親和性を有し；および／または
ＨＣＰ２は、ＨＣＰ２の第２の分子よりＨＣＰ１に対してより高い親和性を有する。
【０２９８】
実施形態において、ＨＣＰ２に対するＨＣＰ１の親和性は、予め選択された条件下、例えば水性緩衝液中、例えばｐＨ７において、生理食塩水中、例えばｐＨ７において、または生理学的条件下において、多重特異性抗体分子分子の少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５または９９．９％が、ＨＣＰ２と複合体化または結合されたＨＣＰ１を有するように、ＨＣＰ１の第２の分子に対するその親和性より十分に高い。
【０２９９】
別の態様において、多重特異性抗体分子を作製または生成するための方法が本明細書に開示される。本方法は、（ｉ）〜（ｉｖ）が関連する条件下において、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、または両方）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む重鎖ポリペプチド）を提供すること；
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、または両方）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む重鎖ポリペプチド）を提供すること；
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１のＶＨ）と優先的に結合するλ鎖ポリペプチド（例えば、λ軽鎖可変領域（ＶＬλ）、λ軽定常鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｃｈａｉｎ）（ＶＬλ）、または両方）を提供すること；および
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２のＶＨ）と優先的に結合するκ鎖ポリペプチド（例えば、λ軽鎖可変領域（ＶＬκ）、λ軽定常鎖（ＶＬκ）、または両方）を提供すること
を含む。
【０３００】
実施形態において、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を促進するＦｃインターフェースを形成する。
【０３０１】
実施形態において、（ｉ）〜（ｉｖ）（例えば、（ｉ）〜（ｉｖ）をコードする核酸）は、単一細胞、例えば単一の哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞に導入される。実施形態において、（ｉ）〜（ｉｖ）は、細胞内で発現される。
【０３０２】
実施形態において、（ｉ）〜（ｉｖ）（例えば、（ｉ）〜（ｉｖ）をコードする核酸）は、異なる細胞、例えば異なる哺乳類細胞、例えば２つ以上のＣＨＯ細胞に導入される。実施形態において、（ｉ）〜（ｉｖ）は、細胞内で発現される。
【０３０３】
一実施形態において、本方法は、例えば、λ−および／または−κ−特異的な精製、例えば親和性クロマトグラフィーを用いて細胞発現抗体分子を精製することをさらに含む。
【０３０４】
実施形態において、本方法は、細胞発現多重特異性抗体分子を評価することをさらに含む。例えば、精製された細胞発現多重特異性抗体分子は、質量分析法を含む、当該技術分野において公知の技術によって分析され得る。一実施形態において、精製された細胞発現抗体分子は、切断され、例えばパパインで消化されて、Ｆａｂ部分を生じ、質量分析法を用いて評価される。
【０３０５】
実施形態において、本方法は、適切に対になったκ／λ多重特異性、例えば二重特異性抗体分子を高い収率、例えば少なくとも７５％、８０、９０、９５、９８、９９、９９．５または９９．９％で生成する。
【０３０６】
他の実施形態において、
（ｉ）第１の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ１）（例えば、第１の重鎖可変領域（第１のＶＨ）、第１のＣＨ１、第１の重鎖定常領域（例えば、第１のＣＨ２、第１のＣＨ３、または両方）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む重鎖ポリペプチド）（例えば、ＨＣＰ１は、第１のエピトープに結合する）；
（ｉｉ）第２の重鎖ポリペプチド（ＨＣＰ２）（例えば、第２の重鎖可変領域（第２のＶＨ）、第２のＣＨ１、第２の重鎖定常領域（例えば、第２のＣＨ２、第２のＣＨ３、または両方）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む重鎖ポリペプチド）（例えば、ＨＣＰ２は、第２のエピトープに結合する）；
（ｉｉｉ）第１の重鎖ポリペプチド（例えば、第１のＶＨ）と優先的に結合するλ軽鎖ポリペプチド（ＬＬＣＰ１）（例えば、λ軽鎖可変領域（ＶＬｌ）、λ軽定常鎖（ＶＬｌ）、または両方）（例えば、ＬＬＣＰ１は、第１のエピトープに結合する）；および
（ｉｖ）第２の重鎖ポリペプチド（例えば、第２のＶＨ）と優先的に結合するκ軽鎖ポリペプチド（ＫＬＣＰ２）（例えば、λ軽鎖可変領域（ＶＬｋ）、λ軽定常鎖（ＶＬｋ）、または両方）（例えば、ＫＬＣＰ２は、第２のエピトープに結合する）
を含む多重特異性、例えば二重特異性抗体分子である。
【０３０７】
実施形態において、第１および第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロ二量体化を促進するＦｃインターフェースを形成する。実施形態において、多重特異性抗体分子は、Ｆｃ定常、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ノブ修飾を有する）に連結される第１の重鎖可変領域にヘテロ二量体化されたハイブリッドＶＬｌ−ＣＬｌを含む第１の結合特異性、およびＦｃ定常、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（ホール修飾を有する）に連結される第２の重鎖可変領域にヘテロ二量体化されたハイブリッドＶＬｋ−ＣＬｋを含む第２の結合特異性を有する。
【０３０８】
例示的な多重特異性の立体配置：
ある実施形態において、多重特異性分子は、第１および第２の非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャに連結される、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）、例えば抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖを含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、ｓｃＦｖに連結されるＦａｂ分子を含む。実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性分子である。
【０３０９】
他の実施形態において、多重特異性分子は、第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチドの間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチドの間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ分子に連結される、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ分子、サイトカインまたは免疫細胞エンゲージャ（例えば、ｓｃＦｖ）に連結されるＦａｂ分子を含む。実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性分子である。
【０３１０】
他の実施形態において、多重特異性分子は、第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチドの間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば癌抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチドの間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ分子に連結される、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ分子、サイトカインまたは免疫細胞エンゲージャ（例えば、ｓｃＦｖ）に連結されるＦａｂ分子を含み、第１または第２のポリペプチドのいずれかは、第１または第２の免疫グロブリン定常ドメインのＣ末端に任意選択的に共有結合される、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャをさらに含む。実施形態において、多重特異性分子は、三重特異性分子である。
【０３１１】
他の実施形態において、多重特異性分子は、第１、第２および第３の非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチドの間の結合を促進する第１のドメイン（例えば、第１の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第１のＦｃ分子）に連結される、例えば腫瘍または間質抗原に結合する腫瘍標的化部分、例えば抗体分子（例えば、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１）を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２のポリペプチドの間の結合を促進する第２のドメイン（例えば、第２の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、本明細書に記載される第２のＦｃ分子）に連結されるサイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャ（例えば、抗体分子、例えば免疫細胞抗原に結合するｓｃＦｖ）を含み；および
（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、例えば、ＮからＣの配向で、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ分子に連結される、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ分子、サイトカインまたは免疫細胞エンゲージャ（例えば、ｓｃＦｖ）に連結されるＦａｂ分子を含み、第１および第２のポリペプチドのいずれかは、任意選択的に第１または第２の免疫グロブリン定常ドメインのＣ末端に共有結合されるサイトカイン分子、免疫細胞エンゲージャまたは両方をさらに含む。実施形態において、多重特異性分子は、四重特異性分子である。
【０３１２】
他の実施形態において、多重特異性分子は、第１および第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、例えばＮからＣ方向に：
腫瘍標的化部分；
（任意選択的に）第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および
免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子を含む第１のポリペプチドを含み；第２のポリペプチドは、例えば、ＮからＣ方向に：
腫瘍標的化部分、またはそのサブユニット；
（任意選択的に）第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および
免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子を含む第２のポリペプチドを含み、第１および第２のポリペプチドは異なる。
【０３１３】
実施形態において、第１のポリペプチドの腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化分子（例えば、Ｆａｂ）の軽鎖可変ドメインを含み；第２のポリペプチドの腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化分子（例えば、Ｆａｂ）の重鎖可変ドメインを含む。
【０３１４】
他の実施形態において、第１のポリペプチドの第１の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化分子（例えば、Ｆａｂ）の重鎖可変ドメインを含み；第２のポリペプチドの第２の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化分子（例えば、Ｆａｂ）の軽鎖可変ドメインを含む。
【０３１５】
他の実施形態において、第１のポリペプチドの第１の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化分子（例えば、Ｆａｂ）の軽鎖可変ドメインを含み；第２のポリペプチドの第２の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化分子（例えば、Ｆａｂ）の重鎖可変ドメインを含む。
【０３１６】
他の実施形態において、第１のポリペプチドの腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化ｓｃＦｖを含み；第２のポリペプチドの腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化ｓｃＦｖを含む。
【０３１７】
他の実施形態において、多重特異性分子は、
ａ）以下を含む第１のポリペプチド：
第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第１のドメイン、例えば第１のＦｃ分子；および
腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチド；ならびに
ｂ）以下を含む第２のポリペプチド：
第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第２のドメイン、例えば第２のＦｃ分子；および
腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチド
を含み、多重特異性分子は、腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子を含む。実施形態において、多重特異性分子は、以下のもの：
（ｉ）腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよび２つのサイトカイン分子；
（ｉｉ）腫瘍標的化部分；２つの免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子；または
（ｉｉｉ）２つの腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャおよびサイトカイン分子
の１つを含む。
【０３１８】
他の実施形態において、多重特異性分子は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、
ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第１のドメイン、例えば第１のＦｃ分子および免疫細胞エンゲージャを含み；
ｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第１のドメイン、例えば第１のＦｃ分子およびサイトカイン分子を含み；または
ｉｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第１のドメイン、例えば第１のＦｃ分子および免疫細胞エンゲージャを含み；
ｉｖ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第２のドメイン、例えば第２のＦｃ分子および免疫細胞エンゲージャを含み；
ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第２のドメイン、例えば第２のＦｃ分子およびサイトカイン分子を含み；または
ｉｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第２のドメイン、例えば第２のＦｃ分子および免疫細胞エンゲージャを含む。
【０３１９】
本出願のさらなる特徴および実施形態は、以下の１つまたは複数を含む。
【０３２０】
別の態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端の配向で、下式を含む多重特異性（例えば、二重または三重特異性）分子を特徴とする：
Ｒ１−（任意選択的にＬ１）−Ｒ２−（任意選択的にＬ２）−Ｒ３；
Ｒ１−（任意選択的にＬ１）−Ｒ３−（任意選択的にＬ２）−Ｒ２；
Ｒ２−（任意選択的にＬ１）−Ｒ１−（任意選択的にＬ２）−Ｒ３；
Ｒ２−（任意選択的にＬ１）−Ｒ３−（任意選択的にＬ２）−Ｒ１；
Ｒ３−（任意選択的にＬ１）−Ｒ１−（任意選択的にＬ２）−Ｒ２；または
Ｒ３−（任意選択的にＬ１）−Ｒ２−（任意選択的にＬ２）−Ｒ１；
（ｉ）Ｒ１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分であり、Ｒ２およびＲ３が存在する場合のみ、Ｒ１は０であり得、またはＲ１は、１つ、２つまたはそれを超える腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる腫瘍標的化部分）を含み；
（ｉｉ）Ｒ２は、本明細書に記載される免疫細胞エンゲージャであり、Ｒ１およびＲ３が存在する場合のみ、Ｒ２は０であり得、またはＲ２は、１つ、２つまたはそれを超える免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）を含み；
（ｉｉｉ）Ｒ３は、本明細書に記載されるサイトカイン分子であり、Ｒ１およびＲ２が存在する場合のみ、Ｒ３は０であり得、またはＲ３は、１つ、２つまたはそれを超えるサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）を含み；
（ｉｖ）任意選択的に、Ｌ１および／またはＬ２は、本明細書に記載されるリンカーのいずれかである。
【０３２１】
ある実施形態において、Ｒ１および／またはＲ２は、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体、または二重特異性抗体もしくはその断片、その単一ドメイン変異体、またはラクダ科抗体）である。
【０３２２】
他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、共通の軽鎖二重特異性ＩｇＧ；二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＩｇＧ−ｄｓｓｃ−Ｆｖ２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン）、ＩｇＧ−ｄｓＦｖ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、全抗体−Ｆａｂ、全抗体−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化分子）、またはＴａｎｄＡｂから選択される。
【０３２３】
他の実施形態において、多重特異性分子は、Ｒ４をさらに含み、Ｒ４は、第２の腫瘍標的化部分；第２の免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャ）または第２のサイトカイン分子である。
【０３２４】
他の実施形態において、多重特異性分子は、Ｌ３をさらに含むことができ、Ｌ３は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカー）である。
【０３２５】
ある実施形態において、Ｒ４は、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な重鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含む抗体）、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体、または二重特異性抗体もしくはその断片、その単一ドメイン変異体、またはラクダ科抗体）である。
【０３２６】
他の実施形態において、Ｒ１およびＲ４は、共通の軽鎖二重特異性ＩｇＧ；二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＩｇＧ−ｄｓｓｃ−Ｆｖ２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン）、ＩｇＧ−ｄｓＦｖ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、全抗体−Ｆａｂ、全抗体−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化分子）、またはＴａｎｄＡｂである。
【０３２７】
他の実施形態において、Ｒ２およびＲ４は、共通の軽鎖二重特異性ＩｇＧ；二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＩｇＧ−ｄｓｓｃ−Ｆｖ２、ＤＶＤ（二重可変ドメイン）、ＩｇＧ−ｄｓＦｖ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、全抗体−Ｆａｂ、全抗体−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化分子）、またはＴａｎｄＡｂである。
【０３２８】
別の態様において、本発明は、Ｒ１およびＲ２を含む多重特異性分子を特徴とし、
（ｉ）Ｒ１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分であり、例えば、Ｒ１は、１つ、２つまたはそれを超える腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる腫瘍標的化部分）を含み；
（ｉｉ）Ｒ２は、本明細書に記載されるサイトカイン分子であり、例えば、Ｒ２は、１つ、２つまたはそれを超えるサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）を含み；および
（ｉｉｉ）任意選択的に、Ｌ１および／またはＬ２は、本明細書に記載されるリンカーである。
【０３２９】
ある実施形態において、Ｒ１は、抗ＦＡＰ  Ｆａｂであり、Ｒ２は、ＩＬ−１５ポリペプチドである。ある実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、例えば第１および第２のＦｃを含むノブ・イン・ホールＦｃ二量体を介して二量体化される（例えば、図ＸＡに示されるように）。ある実施形態において、第１のＦｃは、Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３６８ＡまたはＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、第２のＦｃは、Ｔ３６６Ｗから選択されるアミノ酸置換を含む。
【０３３０】
別の態様において、本発明は、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３を含む多重特異性分子を特徴とし、
（ｉ）Ｒ１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分であり、例えば、Ｒ１は、１つ、２つまたはそれを超える腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる腫瘍標的化部分）を含み；
（ｉｉ）Ｒ２は、本明細書に記載される免疫細胞エンゲージャであり、例えば、Ｒ２は、１つ、２つまたはそれを超える免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）を含み；
（ｉｉｉ）Ｒ３は、本明細書に記載されるサイトカイン分子であり、例えば、Ｒ３は、１つ、２つまたはそれを超えるサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）を含み；
（ｉｖ）任意選択的に、Ｌ１および／またはＬ２は、本明細書に記載されるリンカーである。
【０３３１】
ある実施形態において、Ｒ１は、抗メソテリンＦａｂであり、Ｒ２は、ＩＬ−１５ポリペプチドであり、Ｒ３は、ＣＤ４０Ｌポリペプチドである。ある実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、例えば第１および第２のＦｃを含むノブ・イン・ホールＦｃを介して二量体化される。ある実施形態において、第１のＦｃは、例えば、Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３６８ＡまたはＹ４０７Ｖから選択される、位置３６６、３６８および／または４０７におけるアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、第２のＦｃは、位置３６６におけるアミノ酸置換、例えばＴ３６６Ｗを含む。
【０３３２】
別の態様において、本発明は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４を含む多重特異性分子を特徴とし、
（ｉ）Ｒ１は、本明細書に記載される腫瘍標的化部分であり；
（ｉｉ）Ｒ２およびＲ４は、それぞれ本明細書に記載される第１および第２の免疫細胞エンゲージャであり；
（ｉｉｉ）Ｒ３は、本明細書に記載されるサイトカイン分子であり；および
（ｉｖ）任意選択的に、Ｌ１および／またはＬ２は、本明細書に記載されるリンカーである。
【０３３３】
ある実施形態において、Ｒ１は、抗ＦＡＰ  Ｆａｂであり、Ｒ３は、ＩＬ−１５ポリペプチドであり、Ｒ２は、ＣＤ４０Ｌポリペプチドであり、Ｒ４は、Ｂ７Ｈ６ポリペプチドである。ある実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、Ｆｃ二量体を介して二量体化される。ある実施形態において、Ｆｃは、Ｔ３６６Ｓ；Ｌ３６８ＡまたはＹ４０７Ｖから選択されるアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、Ｆｃは、Ｔ３６６Ｗから選択されるアミノ酸置換を含む。
【０３３４】
腫瘍標的化部分
本開示は、分子を腫瘍細胞に指向する１つまたは複数の腫瘍特異的標的化部分を含む、例えばそれを含むように操作される特に多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）分子を提供する。
【０３３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される多重特異性分子は、腫瘍標的化部分を含む。腫瘍標的化部分は、抗体分子（例えば、本明細書に記載される抗原結合ドメイン）、受容体もしくは受容体断片、またはリガンドもしくはリガンド断片、またはその組合せから選択され得る。ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、腫瘍細胞（例えば、腫瘍細胞の表面に存在する分子、例えば抗原）と関連する、例えばそれに結合する。いくつかの実施形態において、腫瘍標的化部分は、本明細書に開示される多重特異性分子を標的化し、例えばそれを癌（例えば、癌または腫瘍細胞）に指向する。ある実施形態において、癌は、血液癌、固形癌、転移性癌、またはその組合せから選択される。
【０３３６】
ある実施形態において、多重特異性分子、例えば腫瘍標的化部分は、固形腫瘍抗原または間質抗原に結合する。固形腫瘍抗原または間質抗原は、固形腫瘍、またはその転移性病変に存在し得る。ある実施形態において、固形腫瘍は、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）、乳癌、大腸癌、肺癌（例えば、小細胞または非小細胞肺癌）、皮膚癌、卵巣癌、または肝臓癌の１つまたは複数から選択される。一実施形態において、固形腫瘍は、線維性または線維形成性固形腫瘍である。例えば、固形腫瘍抗原または間質抗原は、腫瘍、例えば限定された腫瘍灌流、圧縮された血管、または線維性腫瘍間質の１つまたは複数を有することが特徴である種類の腫瘍に存在し得る。
【０３３７】
いくつかの実施形態において、固形腫瘍抗原は、ＰＤＬ１、ＣＤ４７、メソテリン、ガングリオシド２（ＧＤ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｒｏｎキナーゼ、ｃ−Ｍｅｔ、未熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化塩素イオンチャネル２、サイクリン−Ｂ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ−β受容体、ＡＦＰ、ＥＴＡ、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、β−カテニン、ＣＤＫ４、ＣＤＣ２７、ＣＤ４７、αアクチニン−４、ＴＲＰ１／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐ１００、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ１、ガングリオシド、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ２０、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ＮＡ８８−１、ＮＰＭ、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＲＣＣ、ＲＵＩ１、ＲＵＩ２、ＳＡＧＥ、ＴＲＧ、ＴＲＰ１、ＴＳＴＡ、葉酸受容体α、Ｌ１−ＣＡＭ、ＣＡＩＸ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｇｐＡ３３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１）、炭水化物（Ｌｅ）、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、またはＲＡＮＫＬの１つまたは複数から選択される。
【０３３８】
ある実施形態において、固形腫瘍抗原は、ＰＤＬ１、メソテリン、ＣＤ４７、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＰＳＣＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼ、またはｃ−Ｍｅｔから選択される。
【０３３９】
一実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリンに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化１】
2019512272.tif 000004
の重鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０３４０】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）；ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）；およびＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）から選択される１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０３４１】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）を含み；ＣＤＲ２は、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）を含み；およびＣＤＲ３は、ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０３４２】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）からなり；ＣＤＲ２は、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）からなり；ＣＤＲ３は、ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０３４３】
実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化２】
2019512272.tif 000005
の重鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３４４】
実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化３】
2019512272.tif 000006
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えばアミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０３４５】
あるいは、または本明細書に開示されるメソテリンに対する重鎖と組み合わせて、メソテリンに対する抗体分子は、
【化４】
2019512272.tif 000007
の軽鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号７のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０３４６】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）；ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）；およびＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０３４７】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）を含み；ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）を含み；ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０３４８】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）からなり；ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）からなり；ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０３４９】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化５】
2019512272.tif 000008
の軽鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５０】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化６】
2019512272.tif 000009
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ１）をさらに含む。実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えばアミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０３５１】
他の実施形態において、多重特異性分子、例えば腫瘍標的化部分は、間質抗原に結合する。実施形態において、間質抗原は、線維芽細胞活性化プロテアーゼ（ＦＡＰ）、ＴＧＦ−β、ヒアルロン酸、コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ、テネイシンＣ、またはテネイシンＷの１つまたは複数から選択される。
【０３５２】
一実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｃに下線で示される重鎖可変ドメイン配列（配列番号１３）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１３のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｃに下線で示される重鎖可変ドメイン配列（配列番号１３）またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５３】
実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化７】
2019512272.tif 000010
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えばアミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣＥＶ（配列番号１５）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０３５４】
あるいは、または本明細書に開示されるＦＡＰに対する重鎖と組み合わせて、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｄに下線で示される軽鎖可変ドメイン配列（配列番号１６）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１６のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｄに下線で示される軽鎖可変ドメイン配列（配列番号１６）またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５５】
実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化８】
2019512272.tif 000011
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ１）をさらに含む。ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えばアミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０３５６】
他の実施形態において、多重特異性分子、例えば腫瘍標的化部分は、血液癌、例えば白血病またはリンパ腫の表面に存在する分子、例えば抗原に結合する。ある実施形態において、血液癌は、Ｂ細胞またはＴ細胞悪性腫瘍である。ある実施形態において、血液癌は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、多発性骨髄腫、または急性リンパ球性白血病の１つまたは複数から選択される。実施形態において、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）以外である。実施形態において、血液抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、またはＣＤ２０から選択される。実施形態において、血液抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１９以外である。実施形態において、血液抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ９９、ＣＤ３０、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ２２、ＳＬＡＭＦ７、またはＮＹ−ＥＳＯ１から選択される。
【０３５７】
サイトカイン分子
サイトカインは、一般に、例えば、シグナル伝達経路を介して細胞活性に影響を与えるポリペプチドである。したがって、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、有用であり、細胞内の応答を調節するように細胞膜の外部から信号を伝達する受容体媒介シグナル伝達と関連し得る。サイトカインは、免疫応答のメディエータであるタンパク性シグナル伝達化合物である。それらは、増殖、分化および細胞生存／アポトーシスを含む多くの異なる細胞機能を制御し；サイトカインはまた、ウイルス感染および自己免疫疾患を含むいくつかの病態生理学的過程に関与する。サイトカインは、自然（単球、マクロファージ、樹枝状細胞）および適応（Ｔ−およびＢ細胞）免疫系の両方の様々な細胞によって様々な刺激下で合成される。サイトカインは、２つのグループ：炎症性および抗炎症性に分類され得る。ＩＦＮγ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインは、主に、自然免疫細胞およびＴｈ１細胞に由来する。ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−５を含む抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ２免疫細胞から合成される。
【０３５８】
本開示は、１つまたは複数のサイトカイン分子、例えば免疫調節（例えば、炎症性）サイトカインおよびその変異体、例えばその機能的変異体を含む、例えばそれを含むように操作される特に多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、ある実施形態において、サイトカイン分子は、インターロイキンまたはその変異体、例えばその機能的変異体である。ある実施形態において、インターロイキンは、炎症性インターロイキンである。ある実施形態において、インターロイキンは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、またはインターフェロンγから選択される。ある実施形態において、サイトカイン分子は、炎症性サイトカインである。
【０３５９】
いくつかの実施形態において、サイトカインは、一本鎖サイトカインである。いくつかの実施形態において、サイトカインは、多連鎖サイトカインである（例えば、サイトカインは、２つ以上の（例えば、２つの）ポリペプチド鎖を含む。例示的な多連鎖サイトカインは、ＩＬ−１２である。
【０３６０】
有用なサイトカインの例としては、限定はされないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦβが挙げられる。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＧＦ−βからなる群から選択されるサイトカインである。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γからなる群から選択されるサイトカインである。いくつかの実施形態において、サイトカインは、Ｎ−および／またはＯ−グリコシル化部位を除去するように変異される。グリコシル化の除去により、組み換え産生で得られる産物の均質性が増加される。
【０３６１】
一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＩＬ−２である。特定の実施形態において、ＩＬ−２サイトカインは、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、およびＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。別の特定の実施形態において、ＩＬ−２サイトカインは、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する減少した結合親和性を有する変異ＩＬ−２サイトカインである。β−およびγ−サブユニット（それぞれＣＤ１２２およびＣＤ１３２としても知られている）と一緒に、α−サブユニット（ＣＤ２５としても知られている）は、ヘテロ三量体高親和性ＩＬ−２受容体を形成する一方、β−およびγ−サブユニットのみからなる二量体受容体は、中間親和性ＩＬ−２受容体と呼ばれる。全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１２／０５１９９１号明細書に記載されるように、ＩＬ−２受容体のα−サブユニットに対する減少した結合を有する変異ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、制御性Ｔ細胞内のＩＬ−２シグナル伝達を誘導する減少した能力を有し、Ｔ細胞内のより少ない活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を誘導し、インビボでの減少した毒性プロフィールを有する。減少した毒性を有するこのようなサイトカインの使用は、Ｆｃドメインの存在により長い血清半減期を有する、本発明に係る多重特異性または多機能性ポリペプチドにおいて特に有利である。一実施形態において、本発明に係る多重特異性または多機能性ポリペプチドの変異ＩＬ−２サイトカインは、非変異ＩＬ−２サイトカインと比較して、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）のα−サブユニットに対する変異ＩＬ−２サイトカインの親和性を減少させるかまたはなくすが、中間親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２受容体のβおよびγサブユニットからなる）に対する変異ＩＬ−２サイトカインの親和性を保つ少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。特定の実施形態において、変異ＩＬ−２サイトカインは、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５、および７２に対応する位置から選択される１つ、２つまたは３つの位置に１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態において、変異ＩＬ−２サイトカインは、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５および７２に対応する位置に３つのアミノ酸置換を含む。さらに一層具体的な実施形態において、変異ＩＬ−２サイトカインは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ−２である。一実施形態において、変異ＩＬ−２サイトカインは、ＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を除去する、ヒトＩＬ−２の位置３に対応する位置にアミノ酸変異をさらに含む。特に、前記さらなるアミノ酸変異は、トレオニン残基をアラニン残基で置換するアミノ酸置換���ある。本発明に有用な特定の変異ＩＬ−２サイトカインは、ヒトＩＬ−２の残基３、４２、４５および７２に対応する位置に４つのアミノ酸置換を含む。特異的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇである。ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１２／０５１９９１号明細書および添付の実施例に示されるように、前記四重変異ＩＬ−２ポリペプチド（ＩＬ−２ｑｍ）は、ＣＤ２５への検出可能な結合を示さず、Ｔ細胞内でアポトーシスを誘導する減少した能力、Ｔｒｅｇ細胞内のＩＬ−２シグナル伝達を誘導する減少した能力、およびインビボでの減少した毒性プロフィールを示す。しかしながら、それは、エフェクター細胞内のＩＬ−２シグナル伝達を活性化し、エフェクター細胞の増殖を誘導し、ＮＫ細胞によって二次サイトカインとしてＩＦＮ−γを生成する能力を保持する。
【０３６２】
上記の実施形態のいずれかに係るＩＬ−２または変異ＩＬ−２サイトカインは、増加した発現または安定性などのさらなる利点を提供するさらなる変異を含み得る。例えば、位置１２５におけるシステインは、ジスルフィド架橋ＩＬ−２二量体の形成を避けるために、アラニンなどの中性アミノ酸で置換され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に係る多重特異性または多機能性ポリペプチドのＩＬ−２または変異ＩＬ−２サイトカインは、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置にさらなるアミノ酸変異を含む。一実施形態において、前記さらなるアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。
【０３６３】
特定の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのＩＬ−２サイトカインは、配列番号２２７
【化９】
2019512272.tif 000012
のポリペプチド配列を含む。別の特定の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのＩＬ−２サイトカインは、配列番号２２８
【化１０】
2019512272.tif 000013
のポリペプチド配列を含む。
【０３６４】
別の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＩＬ−１２である。特定の実施形態において、前記ＩＬ−１２サイトカインは、一本鎖ＩＬ−１２サイトカインである。さらに一層具体的な実施形態において、一本鎖ＩＬ−１２サイトカインは、配列番号２２９
【化１１】
2019512272.tif 000014
のポリペプチド配列を含む。一実施形態において、ＩＬ−１２サイトカインは、ＮＫ細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、Ｔ細胞における増殖、およびＴ細胞における分化からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。
【０３６５】
別の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＩＬ−１０である。特定の実施形態において、前記ＩＬ−１０サイトカインは、一本鎖ＩＬ−１０サイトカインである。さらに一層具体的な実施形態において、一本鎖ＩＬ−１０サイトカインは、配列番号２３０
【化１２】
2019512272.tif 000015
のポリペプチド配列を含む。別の特定の実施形態において、ＩＬ−１０サイトカインは、モノマーＩＬ−１０サイトカインである。より具体的な実施形態において、モノマーＩＬ−１０サイトカインは、配列番号２３１
【化１３】
2019512272.tif 000016
のポリペプチド配列を含む。一実施形態において、ＩＬ−１０サイトカインは、サイトカイン分泌の阻害、抗原提示細胞による抗原提示の阻害、酸素ラジカル放出の減少、およびＴ細胞増殖の阻害からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。サイトカインがＩＬ−１０である、本発明に係る多重特異性または多機能性ポリペプチドは、例えば炎症性疾患の治療における、炎症の抑制に特に有用である。
【０３６６】
別の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカインは、ＩＬ−１５である。特定の実施形態において、前記ＩＬ−１５サイトカインは、ＩＬ−１５受容体のα−サブユニットに対する減少した結合親和性を有する変異ＩＬ−１５サイトカインである。理論に制約されることを望むものではないが、ＩＬ−１５受容体のα−サブユニットに対する減少した結合を有する変異ＩＬ−１５ポリペプチドは、全身にわたって線維芽細胞に結合する減少した能力を有し、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドと比較して、向上した薬物動態および毒性プロフィールをもたらす。記載される変異ＩＬ−２および変異ＩＬ−１５エフェクター部分などの減少した毒性を有するサイトカインの使用は、Ｆｃドメインの存在により長い血清半減期を有する、本発明に係る多重特異性または多機能性ポリペプチドにおいて特に有利である。一実施形態において、本発明に係る多重特異性または多機能性ポリペプチドの変異ＩＬ−１５サイトカインは、非変異ＩＬ−１５サイトカインと比較して、ＩＬ−１５受容体のα−サブユニットに対する変異ＩＬ−１５サイトカインの親和性を減少させるかまたはなくすが、中間親和性ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体（ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体のβ−およびγ−サブユニットからなる）に対する変異ＩＬ−１５サイトカインの親和性を保つ少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一実施形態において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。特定の実施形態において、変異ＩＬ−１５サイトカインは、ヒトＩＬ−１５の残基５３に対応する位置にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態において、変異ＩＬ−１５サイトカインは、アミノ酸置換Ｅ５３Ａを含むヒトＩＬ−１５である。一実施形態において、変異ＩＬ−１５サイトカインは、ＩＬ−１５のＮ−グリコシル化部位を除去する、ヒトＩＬ−１５の位置７９に対応する位置にアミノ酸変異をさらに含む。特に、前記さらなるアミノ酸変異は、アスパラギン残基をアラニン残基で置換するアミノ酸置換である。さらに一層具体的な実施形態において、ＩＬ−１５サイトカインは、配列番号２３２
【化１４】
2019512272.tif 000017
のポリペプチド配列を含む。一実施形態において、ＩＬ−１５サイトカインは、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、およびＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。
【０３６７】
多重特異性または多機能性ポリペプチドにおけるエフェクター部分として有用な変異サイトカイン分子は、当該技術分野において周知の遺伝的または化学的方法を用いて、欠失、置換、挿入または修飾によって調製され得る。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含み得る。適切なヌクレオチド変化は、例えばシークエンシングによって確認され得る。置換または挿入は、天然ならびに非天然アミノ酸残基を含み得る。アミノ酸修飾は、グリコシル化部位または炭水化物結合の付加または除去などの化学修飾の周知の方法を含む。
【０３６８】
一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦである。特定の実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦサイトカインは、顆粒球、単球または樹枝状細胞における増殖および／または分化を引き起こし得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＩＦＮ−αである。特定の実施形態において、ＩＦＮ−αサイトカインは、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害、および主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）の発現の上方制御からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。別の特定の実施形態において、ＩＦＮ−αサイトカインは、腫瘍細胞における増殖を阻害し得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＩＦＮγである。特定の実施形態において、ＩＦＮ−γサイトカインは、増加したマクロファージ活性、ＭＨＣ分子の増加した発現、および増加したＮＫ細胞活性からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＩＬ−７である。特定の実施形態において、ＩＬ−７サイトカインは、Ｔおよび／またはＢリンパ球の増殖を引き起こし得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＩＬ−８である。特定の実施形態において、ＩＬ−８サイトカインは、好中球における走化性を引き起こし得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＭＩＰ−１αである。特定の実施形態において、ＭＩＰ−１αサイトカインは、単球およびＴリンパ球細胞における走化性を引き起こし得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＭＩＰ−１βである。特定の実施形態において、ＭＩＰ−１βサイトカインは、単球およびＴリンパ球細胞における走化性を引き起こし得る。一実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドのサイトカイン、特に一本鎖サイトカインは、ＴＧＦ−βである。特定の実施形態において、ＴＧＦ−βサイトカインは、単球における走化性、マクロファージにおける走化性、活性化マクロファージにおけるＩＬ−１発現の上方制御、および活性化Ｂ細胞におけるＩｇＡ発現の上方制御からなる群から選択される細胞応答の１つまたは複数を引き起こし得る。
【０３６９】
一実施形態において、本発明の多重特異性または多機能性ポリペプチドは、対照サイトカインの解離定数（ＫＤ）より少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０倍大きい解離定数（ＫＤ）でサイトカイン受容体に結合する。別の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、２つ以上のエフェクター部分を含む対応する多重特異性または多機能性ポリペプチドのＫＤより少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きいＫＤでサイトカイン受容体に結合する。別の実施形態において、多重特異性または多機能性ポリペプチドは、２つ以上のサイトカインを含む対応する多重特異性または多機能性ポリペプチドの解離定数ＫＤより約１０倍大きい解離定数ＫＤでサイトカイン受容体に結合する。
【０３７０】
ある実施形態において、本明細書に開示される多重特異性分子は、サイトカイン分子を含む。実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカインの完全長、断片もしくは変異体；サイトカイン受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体二量体化ドメインまたはサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）を含む。
【０３７１】
ある実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−２１もしくはインターフェロンγ、またはその断片もしくは変異体、あるいは上記のサイトカインのいずれかの組合せから選択される。サイトカイン分子は、モノマーまたは二量体であり得る。実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含み得る。
【０３７２】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えばＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択される、サイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）である。
【０３７３】
一実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５、例えばヒトＩＬ−１５である（例えば、アミノ酸配列：
【化１５】
2019512272.tif 000018
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３７４】
ある実施形態において、サイトカイン分子は、受容体二量体化ドメイン、例えばＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインを含む。一実施形態において、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインは、アミノ酸配列：
【化１６】
2019512272.tif 000019
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、多重特異性分子のサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、例えば、リンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、例えばアミノ酸配列ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号１９）を含むリンカーを介して共有結合される。他の実施形態において、多重特異性分子のサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、共有結合されず、例えば非共有結合的に結合される。
【０３７５】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、例えばヒトＩＬ−２である（例えば、アミノ酸配列：
【化１７】
2019512272.tif 000020
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０３７６】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１８、例えばヒトＩＬ−１８である（例えば、アミノ酸配列：
【化１８】
2019512272.tif 000021
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０３７７】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２１、例えばヒトＩＬ−２１である（例えば、アミノ酸配列：
【化１９】
2019512272.tif 000022
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０３７８】
さらに他の実施形態において、サイトカイン分子は、インターフェロンγ、例えばヒトインターフェロンγである（例えば、アミノ酸配列：
【化２０】
2019512272.tif 000023
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０３７９】
免疫細胞エンゲージャ
本明細書に開示される多重特異性分子の免疫細胞エンゲージャは、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞への結合、および／またはその活性化を媒介し得る。ある実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞、またはマクロファージ細胞エンゲージャ、またはその組合せから選択される。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャ、またはその組合せの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される。免疫細胞エンゲージャは、免疫系のアゴニストであり得る。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、抗体分子、リガンド分子（例えば、免疫グロブリン定常領域、例えばＦｃ領域をさらに含むリガンド）、小分子、ヌクレオチド分子であり得る。
【０３８０】
ナチュラルキラー細胞エンゲージャ
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、抗体に依存しない方法で腫瘍およびウイルス感染細胞を認識し、破壊する。ＮＫ細胞の制御は、ＮＫ細胞表面上の受容体を活性化および阻害することによって媒介される。受容体を活性化する１つのファミリーは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６を含む天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）である。ＮＣＲは、癌細胞上のヘパラン硫酸の認識によって腫瘍標的化を開始させる。ＮＫＧ２Ｄは、細胞傷害性活性をもたらす活性化キラー（ＮＫ）細胞における刺激および共刺激自然免疫応答の両方を提供する受容体である。ＤＮＡＭ１は、細胞間接着、リンパ球シグナル伝達、細胞毒性、ならびに細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞によって媒介されるリンホカイン分泌に関与する受容体である。ＤＡＰ１０（ＨＣＳＴとしても知られている）は、ＫＬＲＫ１と結合して、リンパ細胞および骨髄細胞内で活性化受容体ＫＬＲＫ１−ＨＣＳＴを形成する膜貫通アダプタータンパク質であり；この受容体は、ＭＨＣクラスＩ鎖関連ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ、およびＵ（任意選択的にＬ１）６−結合タンパク質（ＵＬＢＰ）などの細胞表面リガンドを発現する標的細胞に対する細胞毒性を引き起こす際に大きい役割を果たし；ＫＬＲＫ１−ＨＣＳＴ受容体は、腫瘍に対する免疫学的監視において役割を果たし、腫瘍細胞の細胞溶解に必要とされ；実際に、ＫＬＲＫ１リガンドを発現しない黒色腫細胞は、ＮＫ細胞によって媒介される免疫学的監視から逃れる。ＣＤ１６は、複合体化または凝集ＩｇＧおよびさらにモノマーＩｇＧに結合し、それにより抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および食作用などの他の抗体依存性応答を媒介する、ＩｇＧのＦｃ領域の受容体である。
【０３８１】
ある実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）であり、ＨＡは、インフルエンザウイルスの表面に見られる糖タンパク質である。それは、上気道または赤血球中の細胞などの細胞に、膜上のシアル酸でウイルスを結合させるのに関与する。ＨＡは、少なくとも１８の異なる抗原を有する。これらのサブタイプは、Ｈ１〜Ｈ１８と名付けられる。ＮＣＲは、ウイルスタンパク質を認識し得る。ＮＫｐ４６は、センダイウイルスおよびニューカッスル病ウイルスを含む、インフルエンザのＨＡおよびパラミクソウイルスのＨＡ−ＮＡと相互作用することができることが示されている。ＮＫｐ４６に加えて、ＮＫｐ４４も様々なインフルエンザサブタイプのＨＡと機能的に相互作用し得る。
【０３８２】
本開示は、ＮＫ細胞への結合および／またはその活性化を媒介する１つまたは複数のＮＫ細胞エンゲージャを含むように操作される特に多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、ある実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、または両方）、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ２７、ＰＳＧＬ１、ＣＤ９６、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＮＫｐ８０、ＣＤ２４４（ＳＬＡＭＦ４または２Ｂ４としても知られている）、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、またはＣＤ１６０に結合する（例えば、それを活性化する）抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される。
【０３８３】
一実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、Ｂ７−６であるＮＫｐ３０のリガンドであり、例えば、
【化２１】
2019512272.tif 000024
のアミノ酸配列、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３８４】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ウイルスＨＡである、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６のリガンドである。ウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）は、ウイルスの表面にある糖タンパク質である。ＨＡタンパク質は、細胞膜とのウイルス膜の融合に寄与するシアル酸糖部分を介して、細胞の膜にウイルスを結合させる（例えば、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｓｅｐ；３１（９）：２６８０−９“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｂｙ  ＮＫｐ４４  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｙ  ＮＫｐ３０”；およびＮａｔｕｒｅ．２００１  Ｆｅｂ  ２２；４０９（６８２３）：１０５５−６０“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｏｎ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＮＫｐ４６  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ”（これらのそれぞれの内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０３８５】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはＵＬＢＰ１から選択されるＮＫＧ２Ｄのリガンドであり、例えば、
（ｉ）ＭＩＣＡは、アミノ酸配列：
【化２２】
2019512272.tif 000025
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）ＭＩＣＢは、アミノ酸配列：
【化２３】
2019512272.tif 000026
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉｉ）ＵＬＢＰ１は、アミノ酸配列：
【化２４】
2019512272.tif 000027
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３８６】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＥＣＴＩＮ２またはＮＥＣＬ５から選択されるＤＮＡＭ１のリガンドであり、例えば、
（ｉ）ＮＥＣＴＩＮ２は、アミノ酸配列：
【化２５】
2019512272.tif 000028
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉ）ＮＥＣＬ５は、アミノ酸配列：
【化２６】
2019512272.tif 000029
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３８７】
さらに他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫＧ２Ｄのアダプターである、ＤＡＰ１０のリガンドである（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ｍａｙ  ２４；１０２（２１）：７６４１−７６４６；およびＢｌｏｏｄ，１５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１  Ｖｏｌｕｍｅ  １１８，Ｎｕｍｂｅｒ  １１（これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０３８８】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンドである、ＣＤ１６のリガンドであり、例えば、ＣＤ１６ａ／ｂリガンドは、抗体Ｆｃ領域をさらに含む（例えば、どのように抗体がＦｃを用いて、ＣＤ１６を介してＮＫ細胞を誘発するかを記載しているＦｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：７６（この全内容が本明細書に援用される）を参照）。
【０３８９】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＥＣＬ２である、ＣＲＴＡＭのリガンドであり、例えば、ＮＥＣＬ２は、アミノ酸配列：
【化２７】
2019512272.tif 000030
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９０】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ７０である、ＣＤ２７のリガンドであり、例えば、ＣＤ７０は、アミノ酸配列：
【化２８】
2019512272.tif 000031
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９１】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）である、ＰＳＧＬ１のリガンドであり、例えば、Ｌ−セレクチンは、アミノ酸配列：
【化２９】
2019512272.tif 000032
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９２】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＥＣＬ５である、ＣＤ９６のリガンドであり、例えば、ＮＥＣＬ５は、アミノ酸配列：
【化３０】
2019512272.tif 000033
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９３】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ７２である、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）のリガンドであり、例えば、ＣＤ７２は、アミノ酸配列：
【化３１】
2019512272.tif 000034
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９４】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＬＥＣ２Ｂ（ＡＩＣＬ）である、ＮＫｐ８０のリガンドであり、例えば、ＣＬＥＣ２Ｂ（ＡＩＣＬ）は、アミノ酸配列：
【化３２】
2019512272.tif 000035
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９５】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ４８である、ＣＤ２４４のリガンドであり、例えば、ＣＤ４８は、アミノ酸配列：
【化３３】
2019512272.tif 000036
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０３９６】
Ｔ細胞エンゲージャ
本開示は、Ｔ細胞への結合および／またはその活性化を媒介する１つまたは複数のＴ細胞エンゲージャを含むように操作される特に多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。したがって、ある実施形態において、Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６の１つまたは複数に結合する（例えば、ある実施形態において、それを活性化する）抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される。他の実施形態において、Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲζ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＴＩＭ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、またはＣＤ２２６の１つまたは複数に結合し、それを活性化しない抗原結合ドメインまたはリガンドから選択される。ある実施形態において、Ｔ細胞エンゲージャは、ＣＤ３に結合する。
【０３９７】
Ｂ細胞、マクロファージおよび樹枝状細胞エンゲージャ
概して、Ｂリンパ球としても知られているＢ細胞は、リンパ球サブタイプの白血球のタイプである。それらは、抗体を分泌することにより、適応免疫系の体液性免疫成分中で機能する。さらに、Ｂ細胞は、抗原（それらは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）としても分類される）を提示し、サイトカインを分泌する。マクロファージは、食作用により、細胞残屑、異物、微生物、癌細胞を取り込み、消化する白血球のタイプである。食作用に加えて、それらは、非特異的防御（自然免疫）において重要な役割を果たし、また、リンパ球などの他の免疫細胞を動員することによって特異的防御機構（適応免疫）を開始させるのに役立つ。例えば、それらは、Ｔ細胞に対する抗原提示因子（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｒ）として重要である。炎症の増加および免疫系の刺激に加えて、マクロファージは、重要な抗炎症の役割も果たし、サイトカインの放出によって免疫反応を減少させ得る。樹枝状細胞（ＤＣ）は、抗原物質をプロセシングし、免疫系のＴ細胞に対する細胞表面にそれを提示する際に機能する抗原提示細胞である。
【０３９８】
本開示は、Ｂ細胞、マクロファージ、および／または樹枝状細胞への結合および／またはその活性化を媒介する、１つまたは複数のＢ細胞、マクロファージ、および／または樹枝状細胞エンゲージャを含む、例えば含むように操作される特に多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性）タンパク質を提供する。
【０３９９】
したがって、ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）；Ｔｏｌｌ様受容体のアゴニスト（例えば、本明細書に記載されるような例えばＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；４１ＢＢ；ＣＤ２；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つまたは複数から選択されるＢ細胞、マクロファージおよび／または樹枝状細胞エンゲージャを含む。
【０４００】
ある実施形態において、Ｂ細胞エンゲージャは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンドまたはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子である。
【０４０１】
ある実施形態において、マクロファージエンゲージャは、ＣＤ２アゴニストである。ある実施形態において、マクロファージエンゲージャは、ＣＤ４０Ｌに結合する抗原結合ドメイン、またはＣＤ４０に結合する抗原結合ドメインまたはリガンド、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、本明細書に記載されるような）、例えばＴＬＲ９またはＴＬＲ４（例えば、ｃａＴＬＲ４（構成的活性型ＴＬＲ４）、ＣＤ４７、またはＳＴＩＮＧアゴニストである。ある実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）または環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）である。ある実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ビオチン化されている。
【０４０２】
ある実施形態において、樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニストである。ある実施形態において、樹枝状細胞エンゲージャは、リガンド、受容体アゴニスト、またはＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢの１つまたは複数に結合する抗体分子、ＴＬＲアゴニスト（例えば、本明細書に記載されるような）（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ４（例えば、ｃａＴＬＲ４（構成的活性型ＴＬＲ４））、ＣＤ４７、またはおよびＳＴＩＮＧアゴニストである。ある実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）または環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）である。ある実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ビオチン化されている。
【０４０３】
他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｂ細胞、マクロファージ、および／または樹枝状細胞の１つまたは複数への結合、またはその活性化を媒介する。例示的なＢ細胞、マクロファージ、および／または樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）；Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；４１ＢＢアゴニスト；ＣＤ２；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つまたは複数から選択され得る。
【０４０４】
ある実施形態において、Ｂ細胞エンゲージャは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンドまたはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子の１つまたは複数から選択される。
【０４０５】
他の実施形態において、マクロファージ細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４０Ｌ；ＯＸ４０Ｌ；ＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））；ＣＤ４７アゴニスト；またはＳＴＩＮＧアゴニストの１つまたは複数から選択される。
【０４０６】
他の実施形態において、樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストの１つまたは複数から選択される。
【０４０７】
一実施形態において、ＯＸ４０Ｌは、アミノ酸配列：
【化３４】
2019512272.tif 000037
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０４０８】
別の実施形態において、ＣＤ４０Ｌは、アミノ酸配列：
【化３５】
2019512272.tif 000038
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０４０９】
さらに他の実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に、２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）、またはその組合せを含む。
【０４１０】
一実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、例えば、アミノ酸配列：
【化３６】
2019512272.tif 000039
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む、４１ＢＢリガンドを含む。
【０４１１】
Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質のホモログである進化的に保存された受容体であり、微生物病原体によってのみ発現される、病原体関連微生物パターン（ＰＡＭＰ）として知られている高度に保存された構造モチーフ、または壊死または死細胞から放出される内因性分子である危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を認識する。ＰＡＭＰは、リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）およびリポペプチド、ならびにフラジェリン、細菌ＤＮＡおよびウイルス二本鎖ＲＮＡなどの様々な細菌細胞壁成分を含む。ＤＡＭＰは、熱ショックタンパク質などの細胞内タンパク質ならびに細胞外基質からのタンパク質断片を含む。対応するＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによるＴＬＲの刺激は、シグナル伝達カスケードを開始させて、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢおよびインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）などの転写因子の活性化をもたらす。ＴＬＲによるシグナル伝達は、適応免疫応答を指向する、インターフェロン（ＩＦＮ）、炎症性サイトカインおよびエフェクターサイトカインの産生を含む様々な細胞応答をもたらす。ＴＬＲは、いくつかの炎症性および免疫障害に関与し、癌において役割を果たす（Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  Ｓ．＆Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．，２００９．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：５７−６３）。
【０４１２】
ＴＬＲは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含有する細胞外ドメイン、およびＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれる保存領域を含有する細胞質尾部によって特徴付けられるＩ型膜貫通タンパクである。１０人のヒトおよび１２匹のマウスのＴＬＲが、特徴付けられており、ヒトではＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０、およびマウスではＴＬＲ１〜ＴＬＲ９、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２およびＴＬＲ１３であり、ＴＬＲ１０のホモログは、偽遺伝子である。ＴＬＲ２は、細菌リポタンパク質、リポマンナンおよびリポタイコ酸を含む、グラム陽性菌からの様々なＰＡＭＰの認識のために極めて重要である。ＴＬＲ３は、ウイルスに由来する二本鎖ＲＮＡに関与する。ＴＬＲ４は、主に、リポ多糖によって活性化される。ＴＬＲ５は、細菌フラジェリンを検出し、ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡに対する応答に必要とされる。最後に、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、小型の合成抗ウイルス分子を認識し、一本鎖ＲＮＡは、それらの天然リガンドであることが報告されている。ＴＬＲ１１は、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）由来のプロフィリン様タンパク質を認識することが報告されている。ＴＬＲの特異性のレパートリーは、互いにヘテロ二量体化するＴＬＲの能力によって拡大されるようである。例えば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６の二量体が、ジアシル化リポタンパク質に対する応答に必要とされる一方、ＴＬＲ２およびＴＬＲ１は、相互作用して、トリアシル化リポタンパク質を認識する。ＴＬＲの特異性はまた、ＬＰＳに応答してＴＬＲ４との複合体を形成するＭＤ−２およびＣＤ１４などの様々なアダプターおよびアクセサリー分子によって影響される。
【０４１３】
ＴＬＲシグナル伝達は、少なくとも２つの異なる経路：炎症性サイトカインの産生をもたらすＭｙＤ８８依存性経路、およびＩＦＮ−βの刺激および樹枝状細胞の成熟に関連するＭｙＤ８８非依存性経路からなる。ＭｙＤ８８依存性経路は、ＴＬＲ３を除いて、全てのＴＬＲに共通である（Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＩＬ−１−ａｎｄ  ＩＬ−１８−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．９（１）：１４３−５０）。ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰによる活性化により、ＴＬＲは、ヘテロ二量体化またはホモ二量体化して、細胞質ＴＩＲドメインを介したアダプタータンパク質の動員を誘導する。個々のＴＬＲは、異なるアダプター分子の使用によって異なるシグナル伝達応答を誘導する。ＴＬＲ４およびＴＬＲ２シグナル伝達は、ＭｙＤ８８依存性経路に関与するアダプターＴＩＲＡＰ／Ｍａｌを必要とする。ＴＬＲ３は、アダプターＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ−１を介して、ＭｙＤ８８に依存しない方法で、二本鎖ＲＮＡに応答してＩＦＮ−βの産生を引き起こす。ＴＲＡＭ／ＴＩＣＡＭ−２は、機能がＴＬＲ４経路に限られるＭｙＤ８８非依存性経路に関与する別のアダプター分子である。
【０４１４】
ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９は、ウイルス核酸を認識し、Ｉ型ＩＦＮを誘導する。Ｉ型ＩＦＮの誘導をもたらすシグナル伝達機構は、活性化されるＴＬＲに応じて異なる。それらは、インターフェロン調節因子、ＩＲＦ、抗ウイルス防御、細胞増殖および免疫調節において重要な役割を果たすことが知られている転写因子のファミリーを含む。３つのＩＲＦ（ＩＲＦ３、ＩＲＦ５およびＩＲＦ７）は、ウイルス媒介性ＴＬＲシグナル伝達の直接のトランスデューサとして機能する。ＴＬＲ３およびＴＬＲ４は、ＩＲＦ３およびＩＲＦ７を活性化する一方、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８は、ＩＲＦ５およびＩＲＦ７を活性化する（Ｄｏｙｌｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．ＩＲＦ３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ＴＬＲ３／ＴＬＲ４−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１７（３）：２５１−６３）。さらに、ＴＬＲ９リガンドＣｐＧ−Ａによって刺激されるＩ型ＩＦＮ産生は、ＰＩ（３）ＫおよびｍＴＯＲによって媒介されることが示されている（Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ  Ｍ．＆Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ．２００８．ＲＡＰｐｉｎｇ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｉｎ  ｐＤＣｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍＴＯＲ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０９７−１０９９）。
【０４１５】
ＴＬＲ−９
ＴＬＲ９は、ＤＮＡ分子中の非メチル化ＣｐＧ配列を認識する。ＣｐＧ部位は、細菌ゲノムまたはウイルスＤＮＡと比較して脊椎動物ゲノムにおいて比較的稀である（約１％）。ＴＬＲ９は、Ｂリンパ球、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および形質細胞様樹状細胞などの免疫系の多くの細胞によって発現される。ＴＬＲ９は、エンドソーム区画内で、細胞内で発現され、ＣｐＧモチーフに富むＤＮＡに結合することにより、免疫系にウイルスおよび細菌感染を警告するように機能する。ＴＬＲ９シグナルは、細胞の活性化をもたらして、炎症反応を開始させて、Ｉ型インターフェロンおよびＩＬ−１２などのサイトカインの産生をもたらす。
【０４１６】
ＴＬＲアゴニスト
ＴＬＲアゴニストは、１つまたは複数のＴＬＲ、例えばヒトＴＬＲ−１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の１つまたは複数を作動させ得る。ある実施形態において、本明細書に記載される補助剤は、ＴＬＲアゴニストである。ある実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ヒトＴＬＲ−９を特異的に作動させる。ある実施形態において、ＴＬＲ−９アゴニストは、ＣｐＧ部分である。本明細書において使用される際、ＣｐＧ部分は、配列：５’−Ｃ−ホスフェート−Ｇ−３’、すなわち１つのみのホスフェートによって隔てられたシトシンおよびグアニンを有する線状ジヌクレオチドである。
【０４１７】
ある実施形態において、ＣｐＧ部分は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれを超えるＣｐＧジヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ＣｐＧ部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＣｐＧジヌクレオチドからなる。ある実施形態において、ＣｐＧ部分は、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、５〜１０、５〜２０、５〜３０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、または１０〜５０のＣｐＧジヌクレオチドを有する。
【０４１８】
ある実施形態において、ＴＬＲ−９アゴニストは、合成ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）である。ＣｐＧ  ＯＤＮは、特定の配列コンテキスト（ＣｐＧモチーフ）において非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する短い合成一本鎖ＤＮＡ分子である。ＣｐＧ  ＯＤＮは、ゲノム細菌ＤＮＡに見られる天然ホスホジエステル（ＰＯ）骨格ではなく、部分的にまたは完全にホスホロチオエート化された（ＰＳ）骨格を有する。ＣｐＧ  ＯＤＮの３つの主なクラス：クラスＡ、ＢおよびＣがあり、これらは、その免疫刺激活性が異なる。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮは、ＰＯ中心ＣｐＧ含有回文モチーフ（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｍｏｔｉｆ）およびＰＳ−修飾３’ポリ−Ｇストリングによって特徴付けられる。それらは、ｐＤＣからの高いＩＦＮ−α産生を誘導するが、ＴＬＲ９依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達および炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−６）産生の弱い刺激因子である。ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドを有する完全ＰＳ骨格を含む。それらは、Ｂ細胞およびＴＬＲ９依存性ＮＦ−κＢシグナル伝達を強く活性化するが、ＩＦＮ−α分泌を弱く刺激する。ＣｐＧ−Ｃ  ＯＤＮは、クラスＡおよびＢの両方の特徴を兼ね備えている。それらは、完全なＰＳ骨格およびＣｐＧ含有回文モチーフを含む。Ｃ−クラスＣｐＧ  ＯＤＮは、ｐＤＣからの強いＩＦＮ−α産生ならびにＢ細胞刺激を誘導する。
【０４１９】
間質調節部分
固形腫瘍は、正常組織の構造に類似した異なる構造を有し、異なるが互いに依存する２つの区画：腫瘍細胞が生じ、それらが分散される、実質（腫瘍細胞）および間質を含む。全ての腫瘍は、間質を有し、栄養補給および老廃物の除去のために間質を必要とする。細胞懸濁液として成長する腫瘍（例えば、白血病、腹水腫瘍）の場合、血漿が間質として機能する（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｔｒｏｍａ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｋｕｆｅ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｈｏｌｌａｎｄ−Ｆｒｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ：ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ；２００３）。間質は、細胞外基質（ＥＣＭ）および細胞外分子とともに、線維芽細胞／筋線維芽細胞、グリア、上皮、脂肪、血管、平滑筋、および免疫細胞を含む様々な細胞型を含む（Ｌｉ  Ｈａｎｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｔｒｏｍａ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０１：８０５−８１５（２００７））。
【０４２０】
本明細書に記載される間質調節部分は、間質の成分、例えばＥＣＭ成分、例えばグリコサミノグリカン、例えばヒアルロナン（ヒアルロン酸またはＨＡとしても知られている）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、エンタクチン、テネイシン、アグリカンおよびケラチン硫酸；または細胞外タンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、およびビトロネクチンを分解することが可能な部分（例えば、タンパク質、例えば酵素）を含む。
【０４２１】
間質調節酵素
ある実施形態において、間質調節部分は、酵素である。例えば、間質調節部分は、限定はされないが、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、コンドロイチナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、マクロファージメタロエラスターゼ）を含み得る。
【０４２２】
ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼは、動物界全体に見られる中性および酸活性酵素の群である。ヒアルロニダーゼは、基質特異性、および作用機序に関して様々である。ヒアルロニダーゼの３つの一般的クラスがある：（１）主な最終産物として四糖類および六糖類を伴うエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼである哺乳動物型ヒアルロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３５）。それらは、加水分解およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸を分解することができ；（２）細菌ヒアルロニダーゼ（ＥＣ  ４．２．９９．１）は、ヒアルロナンおよび様々な程度にコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。それらは、主に二糖類最終産物を生じるβ脱離反応によって作用するエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであり；（３）ヒル類、他の寄生生物、および甲殻類からのヒアルロニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３６）は、β１−３結合の加水分解によって四糖類および六糖類最終産物を生成するエンド−β−グルクロニダーゼである。
【０４２３】
哺乳動物ヒアルロニダーゼは、２つのグループ：（１）中性活性および（２）酸活性酵素にさらに分類され得る。ヒトゲノム中の６つのヒアルロニダーゼ様遺伝子、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３  ＨＹＡＬ４  ＨＹＡＬＰ１およびＰＨ２０／ＳＰＡＭ１がある。ＨＹＡＬＰ１は、偽遺伝子であり、ＨＹＡＬ３は、任意の公知の基質に対する酵素活性を有することは示されていない。ＨＹＡＬ４は、コンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対する活性を欠いている。ＨＹＡＬ１は、典型的な酸活性酵素であり、ＰＨ２０は、典型的な中性活性酵素である。ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２などの酸活性ヒアルロニダーゼは、中性ｐＨで触媒活性を欠いている。例えば、ＨＹＡＬ１は、ｐＨ４．５超で、インビトロで触媒活性を有さない（Ｆｒｏｓｔ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，“Ａ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｎｏｔ  Ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２５１，ｐｐ．２６３−２６９（１９９７）。ＨＹＡＬ２は、インビトロで非常に低い比活性を有する酸活性酵素である。
【０４２４】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、哺乳動物ヒアルロニダーゼである。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、組み換えヒトヒアルロニダーゼである。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、中性活性ヒアルロニダーゼである。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、中性活性可溶性ヒアルロニダーゼである。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、組み換えＰＨ２０中性活性酵素である。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、組み換えＰＨ２０中性活性可溶性酵素である。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、グリコシル化されている。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、少なくとも１つのＮ−結合グリカンを有する。組み換えヒアルロニダーゼは、当業者に公知の従来の方法を用いて産生され得る（例えば、米国特許第７７６７４２９号明細書（この全内容が参照により本明細書に援用される））。
【０４２５】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、ｒＨｕＰＨ２０である（Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）とも呼ばれる；Ｈａｌｏｚｙｍｅによって現在製造されている；２００５年にＦＤＡによって承認されている（例えば、Ｓｃｏｄｅｌｌｅｒ  Ｐ（２０１４）Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｅｗ  Ｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏ−Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃａｒｃｉｎｏｇ  Ｍｕｔａｇｅ  ５：１７８；米国特許第７７６７４２９号明細書；米国特許第８２０２５１７号明細書；米国特許第７４３１３８０号明細書；米国特許第８４５０４７０号明細書；米国特許第８７７２２４６号明細書；米国特許第８５８０２５２号明細書（これらの全内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。ｒＨｕＰＨ２０は、ヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０の可溶性断片をコードするＤＮＡプラスミドを含有する遺伝子操作されたＣＨＯ細胞によって産生される。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、グリコシル化されている。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼは、少なくとも１つのＮ−結合グリカンを有する。組み換えヒアルロニダーゼは、当業者に公知の従来の方法を用いて産生され得る（例えば、米国特許第７７６７４２９号明細書（この全内容が参照により本明細書に援用される））。ある実施形態において、ｒＨｕＰＨ２０は、
【化３７】
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のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一の配列を有する。
【０４２６】
本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナンを分解する薬剤であり得、またはヒアルロナンの合成を阻害する薬剤であり得る。例えば、抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン分解酵素であり得る。別の例において、抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン合成を阻害する薬剤である。例えば、抗ヒアルロナン剤は、ＨＡシンターゼに対するセンスまたはアンチセンス核酸分子などのヒアルロナン合成を阻害する薬剤であるか、または小分子薬剤である。例えば、抗ヒアルロナン剤は、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）もしくはその誘導体、またはレフルノミドもしくはその誘導体である。このような誘導体としては、例えば、６，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンまたは５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンである、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）の誘導体が挙げられる。
【０４２７】
本明細書において提供される方法のさらなる例において、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼである。ある例において、ヒアルロナン分解酵素は、Ｃ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着部位またはＧＰＩ付着部位の一部を欠いている、ＰＨ２０ヒアルロニダーゼまたはその切断型である。具体例において、ヒアルロニダーゼは、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ラット、マウスまたはモルモットＰＨ２０から選択されるＰＨ２０である。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、中性活性であり、かつおよびＮ−グリコシル化されたヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼであり、（ａ）完全長ＰＨ２０であるかまたはＰＨ２０のＣ末端切断型であるヒアルロニダーゼポリペプチド（ここで、切断型は、少なくとも、配列番号３９のアミノ酸残基３６−４６４、例えば３６−４８１、３６−４８２、３６−４８３を含み、完全長ＰＨ２０は、配列番号３９に記載されるアミノ酸の配列を有する）；または（ｂ）配列番号３９に記載されるアミノ酸の配列のポリペプチドまたは切断型と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むヒアルロニダーゼポリペプチド；または（ｃ）アミノ酸置換を含む（ａ）または（ｂ）のヒアルロニダーゼポリペプチドであって、それにより、配列番号３９に記載されるポリペプチドまたはその対応する切断型との少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するヒアルロニダーゼポリペプチドの中から選択される。例示的な例において、ヒアルロナン分解酵素は、組成が示されたｒＨｕＰＨ２０を含むＰＨ２０である。
【０４２８】
他の例において、抗ヒアルロナン剤は、ポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されるヒアルロナン分解酵素である。ポリマーは、ＰＥＧおよび抗ヒアルロナン剤ＰＥＧ化ヒアルロナン分解酵素であり得る。したがって、本明細書において提供される方法のある例において、ヒアルロナン分解酵素は、ポリマーへのコンジュゲーションによって修飾される。例えば、ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧにコンジュゲートされ、したがって、ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化される。例示的な例において、ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化ＰＨ２０酵素（ＰＥＧＰＨ２０）である。本明細書において提供される方法において、コルチコステロイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンの中から選択されるグルココルチコイドであり得る。
【０４２９】
コンドロイチナーゼ
コンドロイチナーゼは、エンドグリコシダーゼ反応を介して、グリコサミノグリカン、特にコンドロイチンおよびコンドロイチン硫酸を分解する、動物界全体に見られる酵素である。ある実施形態において、コンドロイチナーゼは、哺乳動物コンドロイチナーゼである。ある実施形態において、コンドロイチナーゼは、組み換えヒトコンドロイチナーゼである。ある実施形態において、コンドロイチナーゼは、ＨＹＡＬ４である。他の例示的なコンドロイチナーゼとしては、コンドロイチナーゼＡＢＣ（プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）に由来する；特開平６−１５３９４７号公報、Ｔ．Ｙａｍａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，１５２３（１９６８）、Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，１５４３（１９６８））、コンドロイチナーゼＡＣ（フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）に由来する；Ｔ．Ｙａｍａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，１５２３（１９６８））、コンドロイチナーゼＡＣ  ＩＩ（アルスロバクター・アウレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）に由来する；Ｋ．Ｈｉｙａｍａ，ａｎｄ  Ｓ．Ｏｋａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，１８２４（１９７５）、Ｋ．Ｈｉｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｏｋａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），８０，１２０１（１９７６））、ヒアルロニダーゼＡＣＩＩＩ（フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）Ｈｐ１０２に由来する；Ｈｉｒｏｆｕｍｉ  Ｍｉｙａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，６１，１０２３（１９８９））、コンドロイチナーゼＢ（フラボバクテリウム・ヘパリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）に由来する；Ｙ．Ｍ．Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５６，９７３（１９７４）、Ｙ．Ｍ．Ｍｉｃｈｅｌａｃｃｉ  ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１５１，１２１（１９７５）、Ｋｅｎｉｃｈｉ  Ｍａｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，５７，１１８９（１９８５））、コンドロイチナーゼＣ（フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）Ｈｐ１０２に由来する；Ｈｉｒｏｆｕｍｉ  Ｍｉｙａｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｉｋａｇａｋｕ，６１，１０２３（１９３９））などが挙げられる。
【０４３０】
マトリックスメタロプロテアーゼ
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外基質（ＥＣＭ）分解に関与する主なプロテアーゼである亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。ＭＭＰは、広範囲の細胞外分子および多くの生物活性分子を分解することが可能である。２４のＭＭＰ遺伝子が、ヒトにおいて同定されており、これは、ドメイン構成および基質選択に基づいて６つのグループに分けることができる：コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１、−８および−１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３、−１０および−１１）、マトリリシン（ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−２６）、膜タイプ（ＭＴ）−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４、−１５、−１６、−１７、−２４および−２５）およびその他（ＭＭＰ−１２、−１９、−２０、−２１、−２３、−２７および−２８）。ある実施形態において、間質調節部分は、ヒト組み換えＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、１０、−１１、−１２、−１３、−１４、１５、−１５、−１７、−１８、−１９、２０、−２１、−２２、−２３、または−２４）である。
【０４３１】
コラゲナーゼ
３つの哺乳動物コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１、−８、および−１３）は、コラーゲン細胞外基質を切断することが可能である、主な分泌されるエンドペプチダーゼである。線維性コラーゲンに加えて、コラゲナーゼは、成長因子を含むいくつかの他のマトリックスおよび非マトリックスタンパク質を切断し得る。コラゲナーゼは、不活性プロフォーム（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）として合成され、活性化されると、それらの活性は、メタロプロテイナーゼの特異的組織阻害剤、ＴＩＭＰにより、ならびに非特異的プロティナーゼ阻害剤により阻害される（Ａｌａ−ａｈｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．２００５  Ｍａｒ−Ａｐｒ；８７（３−４）：２７３−８６）。ある実施形態において、間質調節部分は、コラゲナーゼである。ある実施形態において、コラゲナーゼは、ヒト組み換えコラゲナーゼである。ある実施形態において、コラゲナーゼは、ＭＭＰ−１である。ある実施形態において、コラゲナーゼは、ＭＭＰ−８である。ある実施形態において、コラゲナーゼは、ＭＭＰ−１３である。
【０４３２】
マクロファージメタロエラスターゼ
ＭＭＰ−１２としても知られているマクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＥ）は、ＭＭＰのストロメリシンサブグループのメンバーであり、可溶性および不溶性エラスチンならびにＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパラン、およびコンドロイチン硫酸を含む、広範囲のマトリックスおよび非マトリックス基質の加水分解を触媒する（Ｅｒｊａ  Ｋｅｒｋｅｌａｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２０００）１１４，１１１３−１１１９；ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１５２３−１７４７．２０００．００９９３）。ある実施形態において、間質調節部分は、ＭＭＥである。ある実施形態において、ＭＭＥは、ヒト組み換えＭＭＥである。ある実施形態において、ＭＭＥは、ＭＭＰ−１２である。
【０４３３】
例示的な多重特異性分子
本開示は、（ｉ）腫瘍標的化部分；および（ｉｉ）免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される）；および／または（ｉｉｉ）サイトカイン分子の一方または両方を含む、特に新規な多重特異性分子に関する。理論に制約されるものではないが、本明細書に開示される多重特異性分子は、癌細胞において、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞またはマクロファージから選択される免疫エフェクター細胞）を標的化（例えば、局在化、架橋および／または活性化）することが予想される。本明細書に記載される多重特異性分子を用いて、免疫細胞の近接および／または活性を増大させることは、癌細胞に対する免疫応答を促進し、それにより、より有効な癌治療を提供することが予想される。したがって、特に上記の部分を含む多重特異性分子（例えば、多重特異性抗体分子）、それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法、および上記の分子を用いて癌を治療する方法が本明細書において提供される。
【０４３４】
したがって、一態様において、本開示は、
（ｉ）例えば、癌抗原（例えば、固形腫瘍抗原、間質抗原、または血液抗原）に結合する腫瘍標的化部分と；
（ｉｉ）例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャもしくはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つもしくは全てから選択される免疫細胞エンゲージャ；または
（ｉｉｉ）サイトカイン分子
の１つまたは２つと
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０４３５】
一実施形態において、多重特異性分子は、２つの結合特異性または機能を含み、例えば、それは、例えば、
ｉ）腫瘍標的化部分およびサイトカイン分子；または
ｉｉ）腫瘍標的化部分および免疫細胞エンゲージャ
を含む二重特異性または二機能性分子である。
【０４３６】
他の実施形態において、多重特異性分子は、３つまたは４つの結合特異性または機能を含み、例えば、それは、三重特異性または四重特異性分子である。例示的な三重特異性および四重特異性分子は、
（ｉ）１つの腫瘍標的化部分、１つの免疫細胞エンゲージャ、および１つのサイトカイン分子；
（ｉｉ）１つの腫瘍標的化部分および２つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）；
（ｉｉｉ）１つの腫瘍標的化部分および２つのサイトカイン（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン）；
（ｉｖ）１つの腫瘍標的化部分、２つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）、および１つのサイトカイン分子；
（ｖ）１つの腫瘍標的化部分、１つの免疫細胞エンゲージャ、および２つのサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）；
（ｖｉ）１つの腫瘍標的化部分および３つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）；
（ｖｉｉ）１つの腫瘍標的化部分および３つのサイトカイン分子（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）；
（ｖｉｉｉ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）および１つの免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｘ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）および１つのサイトカイン分子；および
（ｉｘ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）、１つの免疫細胞エンゲージャ、および１つのサイトカイン分子
を含む。
【０４３７】
ある実施形態において、多重特異性分子は、一本鎖抗体分子、例えば単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ラクダ科、またはサメ抗体、および第２の部分を含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＨからＶＬを含み（例えば、図１Ａおよび１Ｂに示されるように）；ｓｃＦｖは、第１の結合特異性を形成し得る（図１Ａ〜１Ｂに結合部分「１」として示される）。ある実施形態において、第２の部分（図１Ａ〜１ＢにパートナーＡとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の前に（例えば、図１Ａに示されるように）、またはＮ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の後に配置され（例えば、図１Ｂに示されるように）；第２の部分は、第２の結合特異性を形成し得る（図１Ａ〜１Ｂに結合部分「２」として示される）。他の実施形態において、多重特異性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＬからＶＨを含み（例えば、図２Ａおよび２Ｂに示されるように）；ｓｃＦｖは、第１の結合特異性を形成し得る（図２Ａ〜２Ｂに結合部分「１」として示される）。ある実施形態において、第２の部分（図２Ａ〜２ＢにパートナーＡとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の前に（例えば、図２Ａに示されるように）、またはＮ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の後に配置され（例えば、図２Ｂに示されるように）；第２の部分は、第２の結合特異性を形成し得る（図２Ａ〜２Ｂに結合部分「２」として示される）。実施形態において、ｓｃＦｖは、腫瘍標的化部分であり得（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質、または血液抗原に結合する）、または免疫細胞エンゲージャであり得る（例えば、免疫細胞抗原に結合する）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、図１Ａ〜１Ｂまたは２Ａ〜２ＢにパートナーＡとして示される）は、腫瘍標的化部分（例えば、ｓｃＦｖが腫瘍標的化部分でない実施形態において）、免疫細胞エンゲージャ（例えば、ｓｃＦｖが免疫細胞エンゲージャでない実施形態において）、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）である。実施形態において、パートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するｓｃＦｖであり、第２の部分は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）である。
【０４３８】
他の実施形態において、多重特異性分子は、一本鎖ポリペプチド、例えば隣接単一ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなる三重特異性または三機能性である。例えば、多重特異性分子は、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば本明細書に記載されるような固形腫瘍、間質、または血液抗原に対する第１の結合特異性）、本明細書に記載されるサイトカイン分子、および免疫細胞エンゲージャ（例えば、本明細書に記載される免疫細胞抗原に対する第２の結合特異性）、または上記のいずれかの少なくとも２つの任意の組合せを含み得る。
【０４３９】
ある実施形態において、多重特異性分子は、一本鎖抗体分子、例えば単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ラクダ科、またはサメ抗体、および第２の部分を含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分および／または第３の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＨからＶＬを含み（例えば、図１Ｃに示されるように）；ｓｃＦｖは、第１の結合特異性を形成し得る（図１Ｃに結合部分「１」として示される）。ある実施形態において、第２または第３の部分（図１ＣにパートナーＡおよびＢとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の前に配置され（例えば、図１Ｃに示されるように）、第３の部分（パートナーＢ）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の後に配置され（例えば、図１Ｃに示されるように）；第２および第３の部分は、第２および第３の結合特異性を形成し得る（図１Ｃにそれぞれ結合部分「２」および結合部分「３」として示される）。他の実施形態において、多重特異性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分および／または第３の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＬからＶＨを含む（例えば、図２Ｃに示されるように）。ある実施形態において、第２の部分（図２ＣにパートナーＡとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の前に配置され（例えば、図２Ｃに示されるように）、第３の部分（パートナーＢ）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の後に配置され（例えば、図２Ｃに示されるように）；第２および第３の部分は、第２および第３の結合特異性を形成し得る（図２Ｃにそれぞれ結合部分「２」および結合部分「３」として示される）。実施形態において、上記の多重特異性分子のいずれかのｓｃＦｖは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分および第３の部分（例えば、図１Ｃまたは２ＣにパートナーＡおよびパートナーＢとして示される）は、独立して、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から選択される。実施形態において、パートナーＡおよび／またはパートナーＢは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するｓｃＦｖであり、第２の部分および第３の部分は、独立して、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第２および第３の部分は、独立して、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。
【０４４０】
ある実施形態において、多重特異性分子は、ＣＤ１６（Ｆｃ□ＲＩＩＩ）に結合するＮＫ細胞エンゲージャ（すなわちｓｃＦｖ）の一本鎖ポリペプチド、および腫瘍標的化部分、すなわちＣＤ３３を標的化するｓｃＦｖからなっていない。他の実施形態において、多重特異性分子は、ＣＤ１６に結合するｓｃＦｖの一本鎖ポリペプチド、ＩＬ−１５サイトカイン、およびＣＤ３３を標的化するｓｃＦｖからなっていない。
【０４４１】
実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｂまたは図４Ａ〜４Ｂに示される立体配置を有する。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、第１の結合特異性、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび図４Ａ〜４Ｂに結合部分「１」として示される）を形成する。実施形態において、第２の部分（パートナーＡとして示される）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかに連結される。実施形態において、第２の部分は、第２の結合特異性（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび図４Ａ〜４Ｂに結合部分「２」として示される）を形成する。
【０４４２】
図３Ａ〜３Ｂに示される一実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のポリペプチドのＣＬ領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のポリペプチドのＣＨ１領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ｂに示されるように）。
【０４４３】
図４Ａ〜４Ｂに示される別の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のポリペプチドのＶＬ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のポリペプチドのＶＨ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ｂに示されるように）。
【０４４４】
実施形態において、第１および第２のポリペプチド（例えば、ＶＨおよびＶＬ領域）は、結合部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４Ｂ中の結合部分１）を形成することができ；例えば、第１および第２のポリペプチドは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４ＢにパートナーＡとして示される）は、第２の結合部分を形成し、例えば、それは、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から選択される。実施形態において、第２の部分、例えばパートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、多重特異性分子は、Ｆａｂ分子を含み、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、または受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子から選択される。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するＦａｂであり、第２の部分は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、または受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子である。
【０４４５】
実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｂまたは図４Ａ〜４Ｂに示される立体配置を有する。実施形態において、第２の部分（パートナーＡとして示される）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれか（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれか）に連結される。
【０４４６】
図３Ａ〜３Ｂに示される二重特異性または二機能性分子の一実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣＬ領域（例えば、ＣＬ領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣＨ１領域（例えば、ＣＨ１領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ｂに示されるように）。
【０４４７】
図４Ａ〜４Ｂに示される二重特異性または二機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＶＬ領域（例えば、ＶＬ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＶＨ領域（例えば、ＶＨ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ｂに示されるように）。
【０４４８】
二重特異性または二機能性分子の実施形態において、第１および第２のポリペプチド（例えば、ＶＨおよびＶＬ領域）は、結合部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４Ｂ中の結合部分１）を形成することができ；例えば、第１および第２のポリペプチドは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４ＢにパートナーＡとして示される）は、第２の結合部分を形成し、例えば、それは、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から選択される。実施形態において、第２の部分、例えばパートナーＡは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、多重特異性分子は、Ｆａｂ分子を含み、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、サイトカイン分子）から選択される。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するＦａｂであり、第２の部分は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子である。
【０４４９】
他の実施形態において、多重特異性分子は、三重特異性または三機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、図３Ｃおよび４Ｃに示される立体配置を有する。実施形態において、第２の部分および第３の部分（それぞれパートナーＡおよびＢとして示される）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのそれぞれのＣ末端、Ｎ末端、または両方に連結される。一実施形態において、第２の部分および第３の部分は、第２および第１のポリペプチド（または第１および第２のポリペプチド）のそれぞれのＣ末端に連結される。別の実施形態において、第２の部分および第３の部分は、第２および第１のポリペプチド（または第１および第２のポリペプチド）のそれぞれのＮ末端に連結される。一実施形態において、第２の部分および第３の部分は、第２および第１のポリペプチド（または第１および第２のポリペプチド）のそれぞれのＮ−およびＣ末端に連結される。図３Ｃおよび４Ｃに例示されるものを含む任意の立体配置が本開示によって意図される。
【０４５０】
図３Ｃ〜４Ｃに示される三重特異性または三機能性分子の一実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のポリペプチドのＣＬ領域のＣ末端）に連結され（例えば、図３Ｃに示されるように）、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のポリペプチドのＣＨ１領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ｃに示されるように）。
【０４５１】
図３Ｃ〜４Ｃに示される三重特異性または三機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のポリペプチドのＶＬ領域のＮ末端）に連結され（例えば、図４Ｃに示されるように）、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のポリペプチドのＶＨ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ｃに示されるように）。
【０４５２】
三重特異性または三機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のポリペプチドのＶＬ領域のＮ末端）に連結され、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のポリペプチドのＣＨ１領域のＣ末端）に連結される。
【０４５３】
三重特異性または三機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のポリペプチドのＣＬ領域のＮ末端）に連結され、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のポリペプチドのＶＨ領域のＮ末端）に連結される。
【０４５４】
三重特異性または三機能性分子の実施形態において、第１および第２のポリペプチド（例えば、ＶＨおよびＶＬ領域）は、第１の結合特異性（例えば、図３Ｃおよび４Ｃ中の結合部分「１」）を形成することができ；例えば、第１および第２のポリペプチドは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分および第３の部分（例えば、図３Ｃおよび４ＣにパートナーＡおよびＢとして示される）は、第２および第３の結合特異性を形成し、例えば、それは、独立して、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から選択される。実施形態において、第２および第３の結合特異性、例えば、パートナーＡおよびＢは、独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、多重特異性分子は、Ｆａｂ分子を含み、第２の部分および第３の部分は、独立して、第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。ある実施形態において、第１の結合特異性、第２の結合特異性および第３の結合特異性は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するＦａｂであり、第２および第３の部分は、独立して、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するＦａｂであり；第２の部分は、サイトカイン分子であり；第３の部分は、免疫細胞エンゲージャである。
【０４５５】
一実施形態において、多重特異性分子は、少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは少なくとも４つの非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）を含み；および
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）を含む。
【０４５６】
実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。ある実施形態において、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９の１つまたは複数から選択される位置に対になったアミノ酸置換を含む。例えば、第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１のＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば、空洞またはホールに対応する）から選択されるアミノ酸置換を含むことができ、第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第２のＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｗ（例えば、突起またはノブに対応する）を含む。ある実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、ヘテロ二量体の第１および第２のＦｃ領域の第１および第２のメンバーである。
【０４５７】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、二重特異性分子を形成する。ある実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の結合特異性（例えば、図５Ａ中のパートナーＡまたは結合特異性１）を含み、第２のポリペプチドは、第２の結合特異性（例えば、図５Ａ中のパートナーＢまたは結合特異性２）を含む。実施形態において、第１および第２の結合特異性（それぞれパートナーＡおよびパートナーＢ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。実施形態において、第１および第２の結合特異性は、第１または第２のポリペプチドのいずれかまたはポリペプチドのそれぞれ（例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ分子の一方または両方のメンバー）に連結される。一実施形態において、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。あるいは、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。あるいは、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。他の実施形態において、第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。一実施形態において、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、例えば、図５Ａに示されるように）空洞またはホールを含む。
【０４５８】
ある実施形態において、二重特異性分子の第１および第２の結合特異性（結合部分１および結合部分２）は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、Ｔ細胞エンゲージャ、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、第１の結合特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合特異性は、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４５９】
図５Ａに示されるある実施形態において、二重特異性分子は、パートナーＡおよびＢを有することができ、これらは、それぞれ第１および第２の結合特異性（結合部分１および２）として示される（図５Ａ）。第１および第２の結合特異性は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、第１の結合特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合特異性は、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４６０】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、三重特異性または四重特異性分子を形成する（例えば、それぞれ図５Ｂ〜５Ｃに示されるように）。
【０４６１】
三重特異性分子のある実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の結合特異性（例えば、図５Ｂ中のパートナーＡまたは結合部分１）を含み、第２のポリペプチドは、第２の結合特異性（例えば、図５Ｂ中のパートナーＢまたは結合特異性２）を含み、第１または第２のポリペプチドのいずれかは、第３の結合特異性（例えば、図５Ｂ中のパートナーＣまたは結合部分３）をさらに含む。実施形態において、第１および第２の結合特異性は、第１または第２のポリペプチドのいずれかまたはポリペプチドのそれぞれ（例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ分子の一方または両方のメンバー）に連結される。一実施形態において、第１および第２の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１および第２のポリペプチドのそれぞれのＮ末端に連結され、第３の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１または第２のポリペプチドのいずれかのＣ末端に連結される。一実施形態において、第３の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、図５Ｂに示される第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結される。一実施形態において、第３の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結される。一実施形態において、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、例えば、図５Ｂに示されるように）ホールまたは空洞を含む。
【０４６２】
実施形態において、第１、第２および第３の結合特異性（それぞれパートナーＡ、パートナーＢ、およびパートナーＣ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。一実施形態において、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第３の結合特異性（例えば、パートナーＣ）は、第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。他の実施形態において、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第３の結合特異性（例えば、パートナーＣ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。第１、第２および第３の結合特異性は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、第１、第２および第３の結合特異性（それぞれ結合部分１〜３に対応するパートナーＡ〜Ｃ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。実施形態において、第１の結合特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２および第３の結合特異性は、それぞれ独立して、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４６３】
四重特異性分子のある実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の結合特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＡまたは結合部分１）および第３の結合特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＣまたは結合部分３）を含み、第２のポリペプチドは、第２の結合特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＢまたは結合特異性２）および第４の結合特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＤまたは結合部分４）を含む。一実施形態において、第１および第２の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１および第２のポリペプチドのそれぞれのＮ末端に連結され、第３および第４の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１および第２のポリペプチドのそれぞれのＣ末端に連結される。第１または第２のポリペプチドのＮ−またはＣ末端への結合特異性のいずれの置き換えも本開示によって包含される。一実施形態において、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、図５Ｃに示される第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結され；第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、図５Ｃに示される第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結され；第３の結合特異性（例えば、パートナーＣ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、図５Ｃに示される第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結され；第４の結合特異性（例えば、パートナーＤ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結される。一実施形態において、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、例えば、図５Ｃに示されるように）空洞またはホールを含む。実施形態において、第１、第２、第３および第４の結合特異性（それぞれパートナーＡ、パートナーＢ、パートナーＣおよびパートナーＤ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。第１、第２、第３および第４の結合特異性は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、第１、第２、第３および第４の結合特異性（それぞれ結合部分１〜４に対応するパートナーＡ〜Ｄ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。実施形態において、第１の結合特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２、第３および第４の結合特異性は、それぞれ独立して、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４６４】
一実施形態において、多重特異性分子は、２つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む二重特異性分子である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１および第２の結合部位をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１および第２の結合特異性（それぞれ結合部位１〜２）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して、第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば腫瘍または間質抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば癌抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ癌抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有する（例えば、この立体配置の例が図６に示される）。一実施形態において、任意選択的にリンカーを介して、第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含む二重特異性分子である。ある実施形態において、第１の結合特異性（例えば、図６中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；第２の結合特異性（例えば、図６中の結合部位＃２）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、受容体リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４６５】
別の実施形態において、多重特異性分子は、２つまたは少なくとも３つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の結合特異性、例えば第１の抗体分子を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）を含み；および
（任意選択的に）（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含む。
【０４６６】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１および第２の結合特異性（例えば、部位）をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１および第２の結合特異性（それぞれ結合部位１〜２）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４６７】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ａ）任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）；
（ｂ）任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択される第２の結合特異性（例えば、第２の結合部位）
を有し；および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ癌抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有する（例えば、この立体配置の例が図７に示される）。
【０４６８】
一実施形態において、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）、および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に対応するＦａｂを含む二重特異性分子である。ある実施形態において、第１の結合特異性（例えば、図７中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；第２の結合特異性（例えば、図７中の結合部位＃２）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４６９】
実施形態において、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０４７０】
実施形態において、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０４７１】
一実施形態において、多重特異性分子は、２つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む三重特異性分子である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１、第２および第３の結合特異性をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１、第２および第３の結合特異性（それぞれ結合部位１〜３）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４７２】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ｉ）任意選択的にリンカーを介して、第２の結合特異性（例えば、結合部位＃３、例えば、サイトカイン、リガンドまたは第２の抗体分子、例えばｓｃＦｖ）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば腫瘍または間質抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）を有し；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して、第３の結合特異性（例えば、結合部位＃２、例えば、サイトカイン、リガンドまたは第２の抗体分子、例えばｓｃＦｖ）に連結される、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有する（例えば、この立体配置の例が図８Ａ〜８Ｃに示される）。
【０４７３】
一実施形態において、任意選択的にリンカーを介して、第２および第３の結合特異性（例えば、結合部位＃２および＃３）に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含む二重特異性分子である。ある実施形態において、第１の結合特異性（例えば、図８Ａ〜８Ｃ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２および第３の結合特異性（例えば、図８Ａ〜８Ｃ中の結合部位＃２および＃３）は、独立して、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される。一実施形態において、第１の結合特異性（例えば、図８Ａ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２の結合特異性（例えば、図８Ａ中の結合部位＃３）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択され；第３の結合特異性（例えば、図８Ａ中の結合部位＃２）は、免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）である。他の実施形態において、第１の結合特異性（例えば、図８Ｂ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２の結合特異性（例えば、図８Ｂ中の結合部位＃３）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択され；第３の結合特異性（例えば、図８Ｂ中の結合部位＃２）は、リガンドまたは免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）である。他の実施形態において、第１の結合特異性（例えば、図８Ｃ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２の結合特異性（例えば、図８Ｃ中の結合部位＃３）は、例えば、受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャであり；第３の結合特異性（例えば、図８Ｃ中の結合部位＃２）は、リガンドまたは免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４７４】
別の実施形態において、多重特異性分子は、２つのまたは少なくとも３つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む三重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の結合特異性、例えば第１の抗体分子を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される第２の結合特異性を含み；および
（任意選択的に）（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含み、
第１または第２のポリペプチドのいずれかは、第３の結合特異性をさらに含む。
【０４７５】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１、第２、および第３の結合特異性（例えば、部位）をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１、第２および第３の結合特異性（それぞれ結合部位１〜３）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４７６】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ａ）任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば腫瘍または間質抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）；
（ｂ）任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択される第２の結合特異性（例えば、第２の結合部位）
を有し；および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有し、
第１または第２のポリペプチドのいずれかは、任意選択的にリンカーを介して、第１または第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１または第２のＦｃ領域）に連結される第３の結合特異性をさらに含む。一実施形態において、第３の結合特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される。別の実施形態において、第３の結合特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される。これらの立体配置の例が図９Ａ〜９Ｂに示される。
【０４７７】
一実施形態において、三重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）；および任意選択的にリンカーを介して、第３の結合特異性（例えば、結合部位＃３）をさらに含む第２のＦｃ領域に連結される第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に対応するＦａｂを含む（例えば、図９Ａに示されるように）。他の実施形態において、三重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第３の結合特異性（例えば、結合部位＃３）をさらに含む第１のＦｃ領域に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）；および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に対応するＦａｂを含む（例えば、図９Ｂに示されるように）。
【０４７８】
ある実施形態において、（ａ）第１の結合特異性（例えば、図９Ａ〜９Ｂ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；（ｂ）第２の結合特異性（例えば、図９Ａ〜９Ｂ中の結合部位＃２）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択され；（ｃ）第３の結合特異性（例えば、図９Ａ〜９Ｂ中の結合部位＃３）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４７９】
実施形態において、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０４８０】
実施形態において、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０４８１】
別の実施形態において、多重特異性分子は、２つまたは少なくとも３つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む四重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の結合特異性、例えば第１の抗体分子を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される第２の結合特異性を含み；および
（任意選択的に）（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含み、
第１または第２のポリペプチドは、第３および第４の結合特異性をさらに含む。
【０４８２】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１、第２、第３および第４の結合特異性（例えば、部位）をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１、第２、第３および第４の結合特異性（それぞれ結合部位１〜４）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０４８３】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ａ）任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば腫瘍または間質抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）；
（ｂ）任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択される第２の結合特異性（例えば、第２の結合部位）
を有し；および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有し、
第１および第２のポリペプチドは、それぞれ任意選択的にリンカーを介して、第１および第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１および第２のＦｃ領域）にそれぞれ連結される第３および第４の結合特異性をさらに含む。一実施形態において、第３の結合特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結され；第４の結合特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される。これらの立体配置の例が図１０Ａ〜１０Ｃに示される。
【０４８４】
一実施形態において、四重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第４の結合特異性（例えば、結合部位＃４）をさらに含む第１のＦｃ領域に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）；および任意選択的にリンカーを介して、第３の結合特異性（例えば、結合部位＃３）をさらに含む第２のＦｃ領域に連結される第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に対応するＦａｂを含む（例えば、図１０Ａに示されるように）。他の実施形態において、四重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第３の結合特異性（例えば、結合部位＃３）をさらに含む第１のＦｃ領域に連結される第１の結合特異性（結合部位＃１）；および任意選択的にリンカーを介して、第４の結合特異性（例えば、結合部位＃４）をさらに含む第２のＦｃ領域に連結される第２の結合特異性（例えば、結合部位＃２）に対応するＦａｂを含む。
【０４８５】
ある実施形態において、（ａ）第１の結合特異性（例えば、図１０Ａ〜１０Ｃ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２、第３および第４の結合特異性（例えば、図１０Ａ中の結合部位＃２〜４）は、それぞれ独立して、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４８６】
一実施形態において、（ａ）第１の結合特異性（例えば、図１０Ｂ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；（ｂ）第２の結合特異性（例えば、図１０Ｂ中の結合部位＃２）は、受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ）であり；（ｃ）第３の結合特異性（例えば、図１０Ｂ中の結合部位＃３）は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャであり；（ｄ）第４の結合特異性（例えば、図１０Ｂ中の結合部位＃４）は、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、マクロファージまたは樹枝状細胞エンゲージャ）である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４８７】
一実施形態において、（ａ）第１の結合特異性（例えば、図１０Ｃ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；（ｂ）第２の結合特異性（例えば、図１０Ｃ中の結合部位＃２）は、受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ）であり；（ｃ）第３の結合特異性（例えば、図１０Ｃ中の結合部位＃３）は、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、マクロファージまたは樹枝状細胞エンゲージャ）であり；（ｄ）第４の結合特異性（例えば、図１０Ｃ中の結合部位＃４）は、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、マクロファージまたは樹枝状細胞エンゲージャ）である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０４８８】
実施形態において、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０４８９】
実施形態において、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０４９０】
腫瘍標的化部分
一実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリンに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化３８】
2019512272.tif 000041
の重鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０４９１】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）；ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）；およびＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）から選択される１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０４９２】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）を含み；ＣＤＲ２は、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）を含み；ＣＤＲ３は、ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０４９３】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）からなり；ＣＤＲ２は、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）からなり；ＣＤＲ３は、ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０４９４】
実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化３９】
2019512272.tif 000042
の重鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化４０】
2019512272.tif 000043
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０４９５】
あるいは、または本明細書に開示されるメソテリンに対する重鎖と組み合わせて、メソテリンに対する抗体分子は、
【化４１】
2019512272.tif 000044
の軽鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号７のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０４９６】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）；ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）；およびＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０４９７】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）を含み；ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）を含み；ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０４９８】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）からなり；ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）からなり；ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０４９９】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化４２】
2019512272.tif 000045
の軽鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５００】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化４３】
2019512272.tif 000046
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ１）をさらに含む。実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０５０１】
他の実施形態において、多重特異性分子、例えば腫瘍標的化部分は、間質抗原に結合する。実施形態において、間質抗原は、線維芽細胞活性化プロテアーゼ（ＦＡＰ）、ＴＧＦ−β、ヒアルロン酸、コラーゲン、例えばコラーゲンＩＶ、テネイシンＣ、またはテネイシンＷの１つまたは複数から選択される。
【０５０２】
一実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｃに下線で示される重鎖可変ドメイン配列（配列番号１３）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１３のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｃに下線で示される重鎖可変ドメイン配列（配列番号１３）またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５０３】
実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化４４】
2019512272.tif 000047
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣＥＶ（配列番号１５）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０５０４】
あるいは、または本明細書に開示されるＦＡＰに対する重鎖と組み合わせて、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｄに下線で示される軽鎖可変ドメイン配列（配列番号１６）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１６のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、図１２Ｄに下線で示される軽鎖可変ドメイン配列（配列番号１６）またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５０５】
実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化４５】
2019512272.tif 000048
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ１）をさらに含む。ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０５０６】
免疫細胞エンゲージャ
一実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、Ｂ７−６であるＮＫｐ３０のリガンドであり、例えば、
【化４６】
2019512272.tif 000049
のアミノ酸配列、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５０７】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはＵＬＢＰ１から選択されるＮＫＧ２Ｄのリガンドであり、例えば、
（ｉ）ＭＩＣＡは、アミノ酸配列：
【化４７】
2019512272.tif 000050
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）ＭＩＣＢは、アミノ酸配列：
【化４８】
2019512272.tif 000051
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉｉ）ＵＬＢＰ１は、アミノ酸配列：
【化４９】
2019512272.tif 000052
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５０８】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＥＣＴＩＮ２またはＮＥＣＬ５から選択されるＤＮＡＭ１のリガンドであり、例えば、
（ｉ）ＮＥＣＴＩＮ２は、アミノ酸配列：
【化５０】
2019512272.tif 000053
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉ）ＮＥＣＬ５は、アミノ酸配列：
【化５１】
2019512272.tif 000054
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５０９】
さらに他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＫＧ２Ｄのアダプターである、ＤＡＰ１０のリガンドである（例えば、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ｍａｙ  ２４；１０２（２１）：７６４１−７６４６；およびＢｌｏｏｄ，１５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１  Ｖｏｌｕｍｅ  １１８，Ｎｕｍｂｅｒ  １１（これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に援用される）を参照）。
【０５１０】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンドである、ＣＤ１６のリガンドであり、例えば、ＣＤ１６ａ／ｂリガンドは、抗体Ｆｃ領域をさらに含む（例えば、どのように抗体がＦｃを用いて、ＣＤ１６を介してＮＫ細胞を誘発するかを記載しているＦｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：７６（この全内容が本明細書に援用される）を参照）。
【０５１１】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＥＣＬ２である、ＣＲＴＡＭのリガンドであり、例えば、ＮＥＣＬ２は、アミノ酸配列：
【化５２】
2019512272.tif 000055
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１２】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ７０である、ＣＤ２７のリガンドであり、例えば、ＣＤ７０は、アミノ酸配列：
【化５３】
2019512272.tif 000056
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１３】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）である、ＰＳＧＬ１のリガンドであり、例えば、Ｌ−セレクチンは、アミノ酸配列：
【化５４】
2019512272.tif 000057
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１４】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＮＥＣＬ５である、ＣＤ９６のリガンドであり、例えば、ＮＥＣＬ５は、アミノ酸配列：
【化５５】
2019512272.tif 000058
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１５】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ７２である、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）のリガンドであり、例えば、ＣＤ７２は、アミノ酸配列：
【化５６】
2019512272.tif 000059
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１６】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＬＥＣ２Ｂ（ＡＩＣＬ）である、ＮＫｐ８０のリガンドであり、例えば、ＣＬＥＣ２Ｂ（ＡＩＣＬ）は、アミノ酸配列：
【化５７】
2019512272.tif 000060
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１７】
他の実施形態において、ＮＫ細胞エンゲージャは、ＣＤ４８である、ＣＤ２４４のリガンドであり、例えば、ＣＤ４８は、アミノ酸配列：
【化５８】
2019512272.tif 000061
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５１８】
他の実施形態において、樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストまたはその断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４））、ＣＤ４７アゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストの１つまたは複数から選択される。
【０５１９】
一実施形態において、ＯＸ４０Ｌは、アミノ酸配列：
【化５９】
2019512272.tif 000062
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５２０】
別の実施形態において、ＣＤ４０Ｌは、アミノ酸配列：
【化６０】
2019512272.tif 000063
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５２１】
さらに他の実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に、２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）、またはその組合せを含む。
【０５２２】
一実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、例えば、アミノ酸配列：
【化６１】
2019512272.tif 000064
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む４１ＢＢリガンドを含む。
【０５２３】
サイトカイン分子
ある実施形態において、本明細書に開示される多重特異性分子は、サイトカイン分子を含む。実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカインの完全長、断片もしくは変異体；サイトカイン受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体二量体化ドメイン；またはサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）を含む。ある実施形態において、サイトカインは、一本鎖である。ある実施形態において、サイトカインは、２つまたは２つ以上のポリペプチド鎖を含む。例示的な多連鎖サイトカイン分子は、ＩＬ１２である。
【０５２４】
ある実施形態において、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）もしくはインターフェロンγ、またはその断片もしくは変異体、あるいは上記のサイトカインのいずれかの組合せから選択される。サイトカイン分子は、モノマーまたは二量体であり得る。実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体二量体化ドメインをさらに含み得る。
【０５２５】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えばＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒから選択されるサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）である。
【０５２６】
一実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５、例えばヒトＩＬ−１５である（例えば、アミノ酸配列：
【化６２】
2019512272.tif 000065
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５２７】
ある実施形態において、サイトカイン分子は、受容体二量体化ドメイン、例えばＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインを含む。一実施形態において、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインは、アミノ酸配列：
【化６３】
2019512272.tif 000066
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、多重特異性分子のサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、例えば、リンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、例えばアミノ酸配列ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号１９）を含むリンカーを介して、共有結合される。他の実施形態において、多重特異性分子のサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、共有結合されず、例えば非共有結合的に結合される。
【０５２８】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、例えばヒトＩＬ−２である（例えば、アミノ酸配列：
【化６４】
2019512272.tif 000067
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０５２９】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１８、例えばヒトＩＬ−１８である（例えば、アミノ酸配列：
【化６５】
2019512272.tif 000068
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０５３０】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２１、例えばヒトＩＬ−２１である（例えば、アミノ酸配列：
【化６６】
2019512272.tif 000069
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０５３１】
さらに他の実施形態において、サイトカイン分子は、インターフェロンγ、例えば、ヒトインターフェロンγである（例えば、アミノ酸配列：
【化６７】
2019512272.tif 000070
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０５３２】
リンカー
本明細書に開示される多重特異性分子は、リンカー、例えば標的化部分およびサイトカイン分子、標的化部分および免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子および免疫細胞エンゲージャ、サイトカイン分子および免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）、標的化部分および免疫グロブリン鎖定常領域、または免疫細胞エンゲージャおよび免疫グロブリン鎖定常領域の１つまたは複数の間のリンカーをさらに含み得る。実施形態において、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、ペプチドリンカー、フレキシブルリンカー、剛性リンカー、らせん状リンカーもしくは非らせん状リンカーまたはその組合せから選択されるリンカーである。
【０５３３】
一実施形態において、多重特異性分子は、１つ、２つ、３つまたは４つのリンカー、例えばペプチドリンカーを含み得る。一実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む。例示的なペプチドリンカーは、本明細書に開示される図に示され（例えば、図１１Ｂ〜１１Ｃ、１２Ｂ、１３Ｂ〜Ｃ、１４Ａ〜Ｂ）、例えばＧＧＧＧＳ（配列番号４２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）；またはＤＶＰＳＧＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）から選択されるペプチドリンカーである。
【０５３４】
例示的な多重特異性の立体配置：
ある実施形態において、本明細書に開示される多重特異性分子のいずれかは、
（Ｉ）以下を含む腫瘍標的化部分：
（ａ）メソテリン、ＧＤ２、ＰＭＳＡ、ＣＥＡ、Ｒｏｎキナーゼ、またはｃ−Ｍｅｔから選択される固形腫瘍抗原に対する抗体分子；および／または
（ｂ）ＦＡＰ、ヒアルロン酸、コラーゲンＩＶ、テネイシンＣ、またはテネイシンＷから選択される、間質抗原に対する抗体分子；または
（ｃ）固形腫瘍抗原に対する抗体分子と、間質抗原に対する抗体分子との組合せ；および
（ＩＩ）以下の一方または両方：
（ａ）ＣＤ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０Ｌ；Ｂ７Ｈ６、４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）もしくはＳＴＩＮＧアゴニストまたはその組合せの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される免疫細胞エンゲージャ；または
（ｂ）ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−７もしくはＩＬ−２１、その断片もしくは変異体、またはサイトカイン受容体に対する抗体分子（例えば、ＩＬ−１５Ｒａ、またはＩＬ−２１Ｒに対する抗体（例えば、作動性抗体））、あるいは上記のいずれかの組合せから選択されるサイトカイン分子
を含み得る。
【０５３５】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリン、ＰＳＣＡまたはＦＡＰに結合する抗体分子である。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＮＫｐ３０またはＣＤ１６に結合する抗体分子である。他の実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、Ｂ７Ｈ６または４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）から選択される。他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１、またはサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばＩＬ−１５ＲａまたはＩＬ−２１Ｒに対する抗体分子（例えば、作動性抗体）から選択される。
【０５３６】
ある実施形態において、二重特異性分子は、（ｉ）メソテリンに対する抗体分子およびＮＫｐ３０に対する抗体分子；（ｉｉ）メソテリンに対する抗体分子およびＣＤ１６に対する抗体分子；（ｉｉｉ）ＰＳＣＡに対する抗体分子およびＮＫｐ３０に対する抗体分子；（ｉｖ）ＰＳＣＡに対する抗体分子およびＣＤ１６に対する抗体分子；（ｖ）ＦＡＰに対する抗体分子およびＮＫｐ３０に対する抗体分子；（ｖｉ）ＦＡＰに対する抗体分子およびＣＤ１６に対する抗体分子；（ｖｉｉ）ＦＡＰに対する抗体分子およびＩＬ−１５分子；（ｖｉｉｉ）ＦＡＰに対する抗体分子およびＩＬ−１５Ｒａに対する抗体分子（例えば、作動性抗体）；（ｉｘ）ＦＡＰに対する抗体分子およびＩＬ−２１に対する抗体分子（例えば、作動性抗体）；または（ｘ）ＦＡＰに対する抗体分子およびＩＬ−２１Ｒに対する抗体分子（例えば、作動性抗体）から選択される。
【０５３７】
他の実施形態において、三重特異性分子は、メソテリンに対する抗体分子、ＰＳＣＡに対する抗体分子もしくはＦＡＰに対する抗体分子；免疫細胞エンゲージャ、例えばＮＫｐ３０に対する抗体分子もしくはＣＤ１６に対する抗体分子から選択されるＮＫ細胞エンゲージャ；またはＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬもしくはＣＤ４０に対する抗体分子もしくはＯＸ４０に対する抗体分子から選択されるマクロファージ細胞エンゲージャ；およびＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５Ｒａに対する抗体またはＩＬ−２１Ｒに対する抗体から選択されるサイトカイン分子から選択される腫瘍標的化部分を含む。例示的な組合せとしては、限定はされないが、（ｉ）メソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０Ｌポリペプチド；およびＩＬ−１５分子；（ｉｉ）メソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０Ｌポリペプチド；およびＩＬ−１５分子；（ｉｉｉ）メソテリンに対する抗体分子；ＮＫｐ３０に結合する抗体分子；およびＩＬ−１５分子；（ｉｖ）メソテリンに対する抗体分子；ＣＤ１６に結合する抗体分子；およびＩＬ−１５分子；（ｖ）ＰＳＣＡに対する抗体分子；ＮＫｐ３０に結合する抗体分子；およびＩＬ−１５分子；（ｖｉ）ＰＳＣＡに対する抗体分子；ＣＤ１６に結合する抗体分子；およびＩＬ−１５分子；（ｖｉｉ）ＰＳＣＡに対する抗体分子；ＣＤ１６に結合する抗体分子；およびＩＬ−２１分子；または（ｖｉｉｉ）メソテリンに対する抗体分子；ＣＤ１６に結合する抗体分子；およびＩＬ−２１分子が挙げられる。
【０５３８】
他の実施形態において、四重特異性分子は、（ｉ）メソテリン、例えばヒトメソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０Ｌポリペプチド；ＩＬ−１５分子；およびＢ７Ｈ６；（ｉｉ）ＦＡＰに対する抗体分子、例えばヒトメソテリン；ＣＤ４０Ｌポリペプチド；ＩＬ−１５分子；およびＢ７Ｈ６；または（ｉｉｉ）メソテリン、例えばヒトメソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０Ｌポリペプチド；ＩＬ−２１分子；および４１ＢＢＬを含む。
【０５３９】
ある実施形態において、多重特異性分子は、メソテリン、例えばヒトメソテリンに対する抗体分子；ＣＤ４０Ｌポリペプチド；およびＩＬ−１５分子を含む。一実施形態において、抗体分子は、軽鎖および重鎖を有する、メソテリンに対するＦａｂを含む。実施形態において、メソテリンに対するＦａｂの重鎖は、ＩＬ−１５分子、例えばヒトＩＬ−１５分子をさらに含み、任意選択的に、ＦａｂおよびＩＬ−１５分子は、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して結合される。ある実施形態において、多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、メソテリンに対するＦａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）からＩＬ−１５を有し、任意選択的に、ＦａｂとＩＬ−１５との間にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。ある実施形態において、多重特異性分子は、アミノ酸配列：
【化６８】
2019512272.tif 000071
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５４０】
実施形態において、メソテリンに対するＦａｂの軽鎖は、ＣＤ４０Ｌをさらに含み、任意選択的に、ＦａｂおよびＣＤ４０Ｌは、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して結合される。一実施形態において、多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ４０Ｌに融合されたメソテリンに対するＦａｂの軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬ１）を有し、任意選択的に、ＦａｂおよびＣＤ４０Ｌの間のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。実施形態において、多重特異性分子は、アミノ酸配列：
【化６９】
2019512272.tif 000072
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５４１】
他の実施形態において、多重特異性分子は、ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに対する抗体分子、およびＩＬ−１５分子を含む。ある実施形態において、抗体分子は、軽鎖および重鎖を有する、ＦＡＰに対するＦａｂを含む。ＦＡＰに対するＦａｂの重鎖は、第１のＦｃ領域のＦｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）のメンバーを有する第１のＦｃ領域をさらに含み得る。例えば、多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、第１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）に融合されたＦＡＰのＦａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）を有することができ、例えば、アミノ酸配列：
【化７０】
2019512272.tif 000073
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５４２】
実施形態において、ＦＡＰに対するＦａｂの軽鎖は、アミノ酸配列：
【化７１】
2019512272.tif 000074
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５４３】
実施形態において、ＩＬ−１５分子、例えばヒトＩＬ−１５分子は、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して連結される、第２のＦｃ領域のＦｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第２のメンバーを有する第２のＦｃ領域をさらに含む。一実施形態において、多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＩＬ−１５分子−第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）を有し、例えば、ＩＬ−１５分子および第２のＦｃ領域は、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを介して連結され、例えば、アミノ酸配列：
【化７２】
2019512272.tif 000075
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号５０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５４４】
他の実施形態において、ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに対する抗体分子、およびＩＬ−１５分子を含む多重特異性分子は、例えば、本明細書に記載されるような免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＣＤ４０リガンド）をさらに含む。ある実施形態において、免疫細胞エンハンサーは、対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第２のメンバーを有する第２のＦｃ領域、およびＩＬ−１５分子、例えばヒトＩＬ−１５分子に結合され、例えば共有結合され、任意選択的に、ＩＬ−１５分子と第２のＦｃ領域との間および／または第２のＦｃ領域と免疫細胞エンハンサーとの間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む。実施形態において、多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、ＩＬ−１５分子−第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）−免疫細胞エンハンサーを有し、任意選択的に、ＩＬ−１５分子と第２のＦｃ領域との間および／または第２のＦｃ領域と免疫細胞エンハンサーとの間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含み、例えば、それは、アミノ酸配列：
【化７３】
2019512272.tif 000076
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号５１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５４５】
他の実施形態において、ＦＡＰ、例えばヒトＦＡＰに対する抗体分子、ＩＬ−１５分子、およびＣＤ４０リガンドを含み、第２の免疫細胞エンハンサー、例えばＢ７Ｈ６分子をさらに含む多重特異性分子である。ある実施形態において、第２の免疫細胞エンハンサーは、第１のＦｃ領域のＦｃインターフェース中の対になった空洞−突起（ノブ・イン・ホール）の第１のメンバーおよびＦａｂの重鎖を有する第１のＦｃ領域に結合され、例えば共有結合され、任意選択的に、Ｂ７Ｈ６分子および第１のＦｃ領域間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含む。実施形態において、多重特異性分子は、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、Ｂ７Ｈ６分子に融合された第１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）に融合されたＦＡＰに対するＦａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）を有し、任意選択的に、第１のＦｃ領域とＢ７Ｈ６分子との間に、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むリンカーを含み、例えば、アミノ酸配列：
【化７４】
2019512272.tif 000077
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号５２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０５４６】
別の態様において、本発明は、
以下を含む第１のアミノ酸配列：
【化７５】
2019512272.tif 000078
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、ＩＬ−１５ポリペプチド、リンカー、および免疫グロブリンＦｃを含む）；
以下を含む第２のアミノ酸配列：
【化７６】
2019512272.tif 000079
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、Ｆａｂの抗ＦＡＰ重鎖および免疫グロブリンＦｃを含む）；および
以下を含む第３のアミノ酸配列：
【化７７】
2019512272.tif 000080
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列）（ここで、アミノ酸配列は、抗ＦＡＰ  Ｆａｂのヒトκ軽鎖を含む）
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０５４７】
ある実施形態において、第１のアミノ酸配列は、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。ある実施形態において、第２のアミノ酸配列は、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣＥＶ（配列番号１５）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。ある実施形態において、第３のアミノ酸配列は、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。
【０５４８】
別の態様において、本発明は、
以下を含む第１のアミノ酸配列：
【化７８】
2019512272.tif 000081
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチド、ＩＬ−１５、リンカー、および免疫グロブリンＦｃを含む）；
以下を含む第２のアミノ酸配列：
【化７９】
2019512272.tif 000082
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチド、Ｆａｂの抗ＦＡＰ重鎖および免疫グロブリンＦｃを含む）；および
以下を含む第３のアミノ酸配列：
【化８０】
2019512272.tif 000083
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチドおよび抗ＦＡＰ  Ｆａｂのヒトκ軽鎖を含む）
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０５４９】
別の態様において、本発明は、
以下を含む第１のアミノ酸配列：
【化８１】
2019512272.tif 000084
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、Ｆａｂの抗メソテリン重鎖、リンカー、およびＩＬ−１５を含む）；および
以下を含む第２のアミノ酸配列：
【化８２】
2019512272.tif 000085
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、抗メソテリンＦａｂのヒトκ軽鎖、リンカー、およびＣＤ４０Ｌを含む）
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０５５０】
ある実施形態において、第１のアミノ酸配列は、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。ある実施形態において、第２のアミノ酸配列は、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。
【０５５１】
別の態様において、本発明は、
以下を含む第１のアミノ酸配列：
【化８３】
2019512272.tif 000086
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチド、Ｆａｂの抗メソテリン重鎖、リンカー、およびＩＬ−１５を含む）；および
以下を含む第２のアミノ酸配列：
【化８４】
2019512272.tif 000087
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチド、抗メソテリンＦａｂのヒトκ軽鎖、リンカー、およびＣＤ４０Ｌを含む）
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０５５２】
別の態様において、本発明は、
以下を含む第１のアミノ酸配列：
【化８５】
2019512272.tif 000088
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、ＩＬ−１５、リンカー、および免疫グロブリンＦｃ、リンカー、およびＣＤ４０Ｌを含む）；
以下を含む第２のアミノ酸配列：
【化８６】
2019512272.tif 000089
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、Ｆａｂの抗Ｂ７Ｈ６重鎖および免疫グロブリンＦｃ、リンカー、およびＢ７Ｈ６を含む）；および
以下を含む第３のアミノ酸配列：
【化８７】
2019512272.tif 000090
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、抗ＦＡＰ  Ｆａｂのヒトκ軽鎖を含む）
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０５５３】
ある実施形態において、第１のアミノ酸配列は、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。ある実施形態において、第２のアミノ酸配列は、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣＥＶ（配列番号１５）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。ある実施形態において、第３のアミノ酸配列は、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列をさらに含む。
【０５５４】
別の態様において、本発明は、
以下を含む第１のアミノ酸配列：
【化８８】
2019512272.tif 000091
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチド、ＩＬ−１５、リンカー、および免疫グロブリンＦｃ、リンカー、およびＣＤ４０Ｌを含む）；
以下を含む（またはそれと実質的に相同の）第２のアミノ酸配列：
【化８９】
2019512272.tif 000092
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチド、Ｆａｂの抗ＦＡＰ重鎖および免疫グロブリンＦｃ、リンカー、およびＢ７Ｈ６を含む）；および
以下を含む第３のアミノ酸配列：
【化９０】
2019512272.tif 000093
またはそれと実質的に相同のアミノ酸配列（ここで、アミノ酸配列は、リーダーペプチドおよび抗ＦＡＰ  Ｆａｂのヒトκ軽鎖を含む）
を含む多重特異性分子を特徴とする。
【０５５５】
例示的な三重特異性分子は、メソテリン腫瘍抗原に指向されたＦａｂ分子を含み、第１のポリペプチドは、リンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに連結されるＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み、Ｆａｂの第２のポリペプチドは、リンカーを介してＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）に連結される軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む（図１１Ａ〜Ｃ）。図１１Ｂは、Ｎ−からＣ−の配向で、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（斜体で示される）を介してヒトＩＬ−１５サイトカイン（標準フォントで示される）に連結される任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１（ＶＨおよびＣＨ１についてそれぞれ下線および太字で示される）を示す。図１１Ｃは、Ｎ−からＣ−の配向で、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（斜体で示される）を介してヒトＣＤ４０Ｌ（オレンジ色で示される）に連結される任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてＦａｂのκ軽鎖ＶＬ−ＣＬ（ＶＬおよびＣＬについてそれぞれ下線および太字で示される）を示す。
【０５５６】
例示的な二重特異性分子は、間質抗原に指向されたＦａｂ分子を含み、第１のポリペプチドは、空洞を有する第１のＦｃ分子に連結される間質抗原に対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み；第２のポリペプチドは、突起を有する第２のＦｃ分子に連結されるＩＬ−１５サイトカインを含み；第３のポリペプチドは、間質抗原に対するＦａｂの軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む（図１２Ａ）。図１２Ｂは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてヒトＩＬ−１５サイトカイン（標準フォントで示される）を示し、これは、突起を有する第２のＦｃ分子（斜体で示される）に連結される任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（斜体で示される）をさらに含む。図１２Ｃは、Ｎ−からＣ−の配向で、空洞を有する第１のＦｃ分子（標準フォントで示される）に連結される任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１（ＶＨおよびＣＨ１についてそれぞれ下線および太字で示される）を示す。図１２Ｄは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂのκ軽鎖ＶＬ−ＣＬ（ＶＬおよびＣＬについてそれぞれ下線および太字で示される）を示す。
【０５５７】
例示的な四重特異性分子は、メソテリン抗原に指向されたＦａｂ分子を含み、第１のポリペプチドは、ＣＨ３領域中の突起（ノブ）を有する第１のＦｃ分子に連結されるメソテリン抗原に対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み、第１の免疫細胞エンゲージャ、例えば４１ＢＢ−リガンドをさらに含み；第２のポリペプチドは、任意選択的にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、空洞（ホール）を有する第２のＦｃ分子に連結されるＩＬ−２１サイトカインを含み、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、第２の免疫細胞エンゲージャ、例えばＣＤ４０Ｌをさらに含み；第３のポリペプチドは、メソテリン抗原（分子Ａ）に対するＦａｂの軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む（図１４Ａ〜１４Ｂ）。以下のアミノ酸配列が含まれる：（ｉ）メソテリンＦａｂ（ｈＭｅｓｏ＿ＳＳ１＿Ｆａｂ）の重鎖および軽鎖のそれぞれに対応する分子Ａ；（ｉｉ）ヒトＩＬ−２１に対応する分子Ｂ；（ｉｉｉ）分子Ｂおよび第２のＦｃ領域間のリンカー（分子ＢからＫｉＨ＿Ｆｃリンカー）；（ｉｖ）第１のＦｃ領域および分子Ｃの間のリンカー（ＫｉＨ＿Ｆｃから分子Ｃリンカー）；（ｖ）ヒト４１ＢＢリガンドに対応する分子Ｃ；（ｖｉ）第２のＦｃ領域および分子Ｄの間のリンカー（ＫｉＨ＿Ｆｃから分子Ｄリンカー）；（ｖｉｉ）ヒトＣＤ４０Ｌに対応する分子Ｃ；（ｖｉｉｉ）ＮからＣの配向で、メソテリンＦａｂのＶＨ、位置３６６にＷの代わりにＴの置換を含むＣＨ２−ＣＨ３アミノ酸配列、続いてＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーおよびヒト４１ＢＢリガンドを含む第１のメンバーＦｃ領域（Ｆｃノブ）；および（ｉｘ）ＮからＣの配向で、ヒトＩＬ−２１、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、位置３６６にＳの代わりにＴ、位置３６８にＡの代わりにＬ、位置４０７にＶの代わりにＹの置換を含むＣＨ２−ＣＨ３アミノ酸配列、続いてＧｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびヒトＣＤ４０Ｌを含む第２のメンバーＦｃ領域（Ｆｃホール）。
【０５５８】
例示的な四重特異性分子は、間質抗原に指向されたＦａｂ分子を含み、第１のポリペプチドは、空洞を有する第１のＦｃ分子に連結される間質抗原に対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１を含み、第１の免疫細胞エンゲージャ、Ｂ７Ｈ６をさらに含み；第２のポリペプチドは、任意選択的にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、突起を有する第２のＦｃ分子に連結されるＩＬ−１５サイトカインを含み、例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、第２の免疫細胞エンゲージャ、ＣＤ４０Ｌをさらに含み；第３のポリペプチドは、間質抗原に対するＦａｂの軽鎖ＶＬ−ＣＬを含む（図１３Ａ）。図１３Ｂは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いてヒトＩＬ−１５サイトカイン（標準フォントで示される）を示し、これは、突起を有する第２のＦｃ分子（標準フォントで示される）に連結される任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（斜体で示される）をさらに含み、これは、ヒトＣＤ４０Ｌアミノ酸配列（斜体で示される）に連結される、例えば任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（斜体で示される）をさらに含む。図１３Ｃは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて空洞を有する第１のＦｃ分子（標準フォントで示される）に連結される、間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂの重鎖ＶＨ−ＣＨ１（ＶＨおよびＣＨ１についてそれぞれ下線および太字で示される）を示し、これは、ヒトＢ７Ｈ６アミノ酸配列（青色で示される）に連結される、例えば任意選択のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（斜体で示される）をさらに含む。図１３Ｄは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択のシグナルペプチドのアミノ酸配列（斜体で示される）、続いて間質抗原ＦＡＰに対するＦａｂのκ軽鎖ＶＬ−ＣＬ（ＶＬおよびＣＬについてそれぞれ下線および太字で示される）を示す。
【０５５９】
間質調節部分を含む例示的な多重特異性分子
本開示は、特に（ｉ）間質調節部分および（ｉｉ）腫瘍抗原または間質抗原に結合する腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子、または受容体分子）を含む、新規な多機能性、例えば多重特異性分子に関する。理論に制約されるものではないが、本明細書に開示される多機能性分子は、特に癌部位を標的化（例えば、それに局在化）し、腫瘍間質を変化させ、例えば癌部位の近くの腫瘍微小環境を変化させるものと考えられる。多機能性分子は、免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される）；および／またはサイトカイン分子の一方または両方をさらに含み得る。したがって、特に上記の部分を含む多機能性、例えば多重特異性分子、それをコードする核酸、上記の分子を生成する方法、および上記の分子を用いて癌を治療する方法が本明細書において提供される。
【０５６０】
したがって、一態様において、本開示は、間質調節部分および例えば癌抗原（例えば、固形腫瘍抗原、間質抗原、または血液抗原）に結合する腫瘍標的化部分（例えば、抗体分子、リガンド分子、または受容体分子）を含む多機能性（例えば、二機能性）分子を特徴とする。
【０５６１】
ある実施形態において、多機能性分子は、以下の１つまたは２つ：
（ｉ）例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャの１つ、２つ、３つまたは全てから選択される免疫細胞エンゲージャ；または
（ｉｉ）サイトカイン分子
をさらに含む。
【０５６２】
他の実施形態において、多機能性分子は、３つまたは４つの結合特異性または機能を含み、例えば、それは、三重特異性または四重特異性分子である。例示的な三重特異性および四重特異性分子は、
（ｉ）１つの腫瘍標的化部分、１つの間質調節部分および１つの免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｉ）１つの腫瘍標的化部分、１つの間質調節部分および１つのサイトカイン分子；
（ｉｉｉ）１つの腫瘍標的化部分、１つの間質調節部分および２つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、同じかまたは異なる免疫細胞エンゲージャ）；
（ｉｖ）１つの腫瘍標的化部分、１つの間質調節部分および２つのサイトカイン（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン）；
（ｖ）１つの腫瘍標的化部分、１つの間質調節部分、１つの免疫細胞エンゲージャ、および１つのサイトカイン分子；
（ｖｉ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）および１つの間質調節部分；
（ｖｉｉ）１つの腫瘍標的化部分および２つの間質調節部分（例えば、同じかまたは異なる間質調節部分）；
（ｖｉｉｉ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）、１つの間質調節部分および１つの免疫細胞エンゲージャ；
（ｉｘ）２つの腫瘍標的化部分（例えば、同じかまたは異なる標的化部分）、１つの間質調節部分および１つのサイトカイン分子；
（ｘ）１つの腫瘍標的化部分、２つの間質調節部分（例えば、同じかまたは異なる間質調節部分）および１つの免疫細胞エンゲージャ；および
（ｘｉ）１つの腫瘍標的化部分、２つの間質調節部分（例えば、同じかまたは異なる間質調節部分）および１つのサイトカイン分子
を含む。
【０５６３】
間質調節部分
ある実施形態において、間質調節部分は、間質または細胞外基質（ＥＣＭ）成分のレベルもしくは産生の減少；腫瘍線維化の減少；間質腫瘍輸送の増加；腫瘍灌流の改善；腫瘍微小血管系の拡張；腫瘍における間質液圧（ＩＦＰ）の低下または腫瘍もしくは腫瘍血管系への薬剤、例えば癌治療薬もしくは細胞療法薬の浸透もしくは拡散の減少または促進の１つまたは複数を引き起こす。
【０５６４】
ある実施形態において、減少される間質またはＥＣＭ成分は、グリコサミノグリカンまたは細胞外タンパク質、またはその組合せから選択される。ある実施形態において、グリコサミノグリカンは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはＨＡとしても知られている）、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、エンタクチン、テネイシン、アグリカンおよびケラチン硫酸から選択される。ある実施形態において、細胞外タンパク質は、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、またはビトロネクチンから選択される。ある実施形態において、間質調節部分は、腫瘍間質または細胞外基質（ＥＣＭ）を分解する酵素分子を含む。ある実施形態において、酵素分子は、ヒアルロニダーゼ分子、コラゲナーゼ分子、コンドロイチナーゼ分子、マトリックスメタロプロテイナーゼ分子（例えば、マクロファージメタロエラスターゼ）、または上記のいずれかの変異体（例えば、断片）から選択される。「酵素分子」という用語は、完全長、酵素の断片もしくは変異体、例えば、天然酵素の少なくとも１つの機能的特性を保持する酵素変異体を含む。
【０５６５】
ある実施形態において、間質調節部分は、ヒアルロン酸のレベルまたは産生を減少させる。他の実施形態において、間質調節部分は、ヒアルロナン分解酵素、ヒアルロナン合成を阻害する薬剤、またはヒアルロン酸に対する抗体分子を含む。
【０５６６】
ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼ分子、例えば完全長またはその変異体（例えば、その断片）である。ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素は、中性または酸性ｐＨ、例えば約４〜５のｐＨで活性である。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、哺乳動物ヒアルロニダーゼ分子、例えば組み換えヒトヒアルロニダーゼ分子、例えば完全長またはその変異体（例えば、その断片、例えば、切断型）である。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、またはＰＨ−２０／ＳＰＡＭ１、またはその変異体（例えば、その切断型）から選択される。ある実施形態において、切断型は、Ｃ末端グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着部位またはＧＰＩ付着部位の一部を欠いている。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、グリコシル化され、例えば少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含む。
【０５６７】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、アミノ酸配列：
【化９１】
2019512272.tif 000094
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５６８】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、
（ｉ）配列番号６１の３６−４６４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６１に記載されるアミノ酸の配列を有するＰＨ２０の３６−４８１、３６−４８２、または３６−４８３のアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号６１に記載されるアミノ酸の配列のポリペプチドまたは切断型に対する少なくとも９５％〜１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号６１に記載されるアミノ酸配列に対する３０、２０、１０、５またはそれよりも少ないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、配列番号６１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０５６９】
ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、ＰＨ２０、例えばｒＨｕＰＨ２０である。ある実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子は、ＨＹＡＬ１であり、アミノ酸配列：
【化９２】
2019512272.tif 000095
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５７０】
ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子は、ポリマーをさらに含み、例えば、ポリマー、例えばＰＥＧにコンジュゲートされる。ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素は、ＰＥＧ化ＰＨ２０酵素（ＰＥＧＰＨ２０）である。ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の重鎖定常領域、より特定的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）をさらに含む。ある実施形態において、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子に結合され、例えば共有結合される。ある実施形態において、免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能の１つまたは複数を増加または減少させるように改変され、例えば変異される。ある実施形態において、ヒアルロナン分解酵素、例えばヒアルロニダーゼ分子は、二量体を形成する。
【０５７１】
ある実施形態において、間質調節部分は、ヒアルロナン、例えばＨＡシンターゼの合成の阻害剤を含む。ある実施形態において、阻害剤は、ＨＡシンターゼに対するセンスもしくはアンチセンス核酸分子を含むか、または小分子薬剤である。ある実施形態において、阻害剤は、４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）もしくはその誘導体（例えば、６，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリンまたは５，７−ジヒドロキシ−４−メチルクマリン）またはレフルノミドもしくはその誘導体である。
【０５７２】
ある実施形態において、間質調節部分は、ヒアルロン酸に対する抗体分子を含む。
【０５７３】
ある実施形態において、間質調節部分は、コラゲナーゼ分子、例えば哺乳動物コラゲナーゼ分子またはその変異体（例えば、断片）を含む。ある実施形態において、コラゲナーゼ分子は、例えば、
【化９３】
2019512272.tif 000096
のアミノ酸配列、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むコラゲナーゼ分子ＩＶである。
【０５７４】
腫瘍標的化部分
ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリンに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化９４】
2019512272.tif 000097
の重鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号１のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５７５】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）；ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）；およびＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５７６】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）を含み；ＣＤＲ２は、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）を含み；ＣＤＲ３は、ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５７７】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ（配列番号２）からなり；ＣＤＲ２は、ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号３）からなり；ＣＤＲ３は、ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号４）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５７８】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化９５】
2019512272.tif 000098
の重鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５７９】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化９６】
2019512272.tif 000099
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。
【０５８０】
ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）を含むシグナルペプチドをさらに含む。
【０５８１】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化９７】
2019512272.tif 000100
の軽鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号７のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５８２】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）；ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）；およびＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５８３】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）を含み；ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）を含み；ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５８４】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号８）からなり；ＣＤＲ２は、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号９）からなり；ＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＬＴ（配列番号１０）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５８５】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、
【化９８】
2019512272.tif 000101
の軽鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５８６】
ある実施形態において、メソテリンに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化９９】
2019512272.tif 000102
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ１）をさらに含む。
【０５８７】
ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号６４）を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）を含む。
【０５８８】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、ＦＡＰに結合する抗体分子（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む。
【０５８９】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、
【化１００】
2019512272.tif 000103
の重鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号６５のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５９０】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、ＳＲＹＴＦＴＥＹＴＩＨ（配列番号６６）；ＧＩＮＰＮＮＧＩＰＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６７）；およびＲＲＩＡＹＧＹＤＥＧＨＡＭＤＹ（配列番号６８）から選択される１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５９１】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＲＹＴＦＴＥＹＴＩＨ（配列番号６６）を含み；ＣＤＲ２は、ＧＩＮＰＮＮＧＩＰＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６７）を含み；ＣＤＲ３は、ＲＲＩＡＹＧＹＤＥＧＨＡＭＤＹ（配列番号６８）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５９２】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＳＲＹＴＦＴＥＹＴＩＨ（配列番号６６）からなり；ＣＤＲ２は、ＧＩＮＰＮＮＧＩＰＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６７）からなり；ＣＤＲ３は、ＲＲＩＡＹＧＹＤＥＧＨＡＭＤＹ（配列番号６８）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５９３】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、
【化１０１】
2019512272.tif 000104
の重鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０５９４】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化１０２】
2019512272.tif 000105
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ１）をさらに含む。
【０５９５】
ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１６）を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）を含む。ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、
【化１０３】
2019512272.tif 000106
の軽鎖可変ドメイン配列からの１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば配列番号６９のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５９６】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号７０）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号７１）；およびＱＱＹＦＳＹＰＬＴ（配列番号７２）から選択される１つ、２つ、３つのＣＤＲ、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲを含む。
【０５９７】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号７０）を含み；ＣＤＲ２は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号７１）を含み；ＣＤＲ３は、ＱＱＹＦＳＹＰＬＴ（配列番号７２）を含む）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５９８】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、３つのＣＤＲ（ここで、ＣＤＲ１は、ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＲＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号７０）からなり；ＣＤＲ２は、ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号７１）からなり；ＣＤＲ３は、ＱＱＹＦＳＹＰＬＴ（配列番号７２）からなる）、または密接に関連したＣＤＲ、例えば少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、２つ、３つまたは４つ以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するＣＤＲからなる。
【０５９９】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、
【化１０４】
2019512272.tif 000107
（配列番号６９の軽鎖可変ドメイン配列またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６００】
ある実施形態において、ＦＡＰに対する抗体分子は、Ｆａｂであり、アミノ酸配列：
【化１０５】
2019512272.tif 000108
またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ１）をさらに含む。
【０６０１】
ある実施形態において、抗体分子は、シグナルペプチド、例えば、アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１２）を含むシグナルペプチドをさらに含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１６）を含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列：ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号６）を含む。
【０６０２】
免疫細胞エンゲージャ
ある実施形態において、ＮＫｐ３０のリガンドは、Ｂ７−６であり、例えば、
【化１０６】
2019512272.tif 000109
のアミノ酸配列、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６０３】
ある実施形態において、ＮＫｐ４４またはＮＫｐ４６のリガンドは、ウイルスＨＡである。
【０６０４】
ある実施形態において、ＤＡＰ１０のリガンドは、ＮＫＧ２Ｄの補助受容体である。
【０６０５】
ある実施形態において、ＣＤ１６のリガンドは、ＣＤ１６ａ／ｂリガンド、例えば抗体Ｆｃ領域をさらに含むＣＤ１６ａ／ｂリガンドである。
【０６０６】
ある実施形態において、ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはＵＬＢＰ１から選択され、例えば、（ｉ）ＭＩＣＡは、アミノ酸配列：
【化１０７】
2019512272.tif 000110
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）ＭＩＣＢは、アミノ酸配列：
【化１０８】
2019512272.tif 000111
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉｉ）ＵＬＢＰ１は、アミノ酸配列：
【化１０９】
2019512272.tif 000112
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６０７】
ある実施形態において、ＤＮＡＭ１のリガンドは、ＮＥＣＴＩＮ２またはＮＥＣＬ５から選択され、例えば、
（ｉ）ＮＥＣＴＩＮ２は、アミノ酸配列：
【化１１０】
2019512272.tif 000113
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み；または
（ｉｉ）ＮＥＣＬ５は、アミノ酸配列：
【化１１１】
2019512272.tif 000114
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６０８】
ある実施形態において、ＣＲＴＡＭのリガンドは、ＮＥＣＬ２であり、例えば、ＮＥＣＬ２は、アミノ酸配列：
【化１１２】
2019512272.tif 000115
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６０９】
ある実施形態において、ＣＤ２７のリガンドは、ＣＤ７０であり、例えば、ＣＤ７０は、アミノ酸配列：
【化１１３】
2019512272.tif 000116
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１０】
ある実施形態において、ＰＳＧＬ１のリガンドは、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）であり、例えば、Ｌ−セレクチンは、アミノ酸配列：
【化１１４】
2019512272.tif 000117
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１１】
ある実施形態において、ＣＤ９６のリガンドは、ＮＥＣＬ５であり、例えば、ＮＥＣＬ５は、アミノ酸配列：
【化１１５】
2019512272.tif 000118
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１２】
ある実施形態において、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）のリガンドは、ＣＤ７２であり、例えば、ＣＤ７２は、アミノ酸配列：
【化１１６】
2019512272.tif 000119
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１３】
ある実施形態において、ＮＫｐ８０のリガンドは、ＣＬＥＣ２Ｂ（ＡＩＣＬ）であり、例えば、ＣＬＥＣ２Ｂ（ＡＩＣＬ）は、アミノ酸配列：
【化１１７】
2019512272.tif 000120
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１４】
ある実施形態において、ＣＤ２４４のリガンドは、ＣＤ４８であり、例えば、ＣＤ４８は、アミノ酸配列：
【化１１８】
2019512272.tif 000121
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３５のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１５】
ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、Ｂ細胞、マクロファージ、および／または樹枝状細胞の１つまたは複数への結合、またはその活性化を媒介する。ある実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）もしくはＣＤ７０リガンド；ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；ＯＸ４０に対する抗体分子；ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）；Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；４１ＢＢアゴニスト；ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４７アゴニスト；またはＳＴＩＮＧアゴニストあるいはその組合せの１つまたは複数から選択されるＢ細胞、マクロファージ、および／または樹枝状細胞エンゲージャを含む。ある実施形態において、Ｂ細胞エンゲージャは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０ＬもしくはＣＤ７０リガンドまたはＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子である。ある実施形態において、マクロファージ細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト；ＣＤ４０Ｌ；ＯＸ４０Ｌ；ＯＸ４０、ＣＤ４０もしくはＣＤ７０に結合する抗体分子；Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストもしくはその断片（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９）；ＣＤ４７またはＳＴＩＮＧアゴニストである。ある実施形態において、樹枝状細胞エンゲージャは、ＣＤ２アゴニスト、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０Ｌ、４１ＢＢアゴニスト、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（例えば、ＴＬＲ４、例えば構成的活性型ＴＬＲ４（ｃａＴＬＲ４）もしくはＴＬＲ９アゴニスト）；ＣＤ４７アゴニストまたはＳＴＩＮＧアゴニストである。
【０６１６】
ある実施形態において、ＯＸ４０Ｌは、アミノ酸配列：
【化１１９】
2019512272.tif 000122
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３６のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１７】
ある実施形態において、ＣＤ４０Ｌは、アミノ酸配列：
【化１２０】
2019512272.tif 000123
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６１８】
ある実施形態において、ＳＴＩＮＧアゴニストは、任意選択的に、２’，５’または３’，５’リン酸塩結合とともに環状ジヌクレオチド、例えば環状ジ−ＧＭＰ（ｃｄＧＭＰ）、環状ジ−ＡＭＰ（ｃｄＡＭＰ）、またはその組合せを含む。
【０６１９】
一実施形態において、免疫細胞エンゲージャは、例えば、アミノ酸配列：
【化１２１】
2019512272.tif 000124
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号３８のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む、４１ＢＢリガンドを含む。
【０６２０】
サイトカイン分子
一実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５、例えばヒトＩＬ−１５である（例えば、アミノ酸配列：
【化１２２】
2019512272.tif 000125
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号１７のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６２１】
ある実施形態において、サイトカイン分子は、受容体二量体化ドメイン、例えばＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインを含む。一実施形態において、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメインは、アミノ酸配列：
【化１２３】
2019512272.tif 000126
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号７３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、多重特異性分子のサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、例えば、リンカー（例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、例えばアミノ酸配列ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号１９）を含むリンカーを介して、共有結合される。他の実施形態において、多重特異性分子のサイトカイン分子（例えば、ＩＬ−１５）および受容体二量体化ドメイン（例えば、ＩＬ１５Ｒα二量体化ドメイン）は、共有結合されず、例えば非共有結合的に結合される。
【０６２２】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、例えばヒトＩＬ−２である（例えば、アミノ酸配列：
【化１２４】
2019512272.tif 000127
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０６２３】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−１８、例えばヒトＩＬ−１８である（例えば、アミノ酸配列：
【化１２５】
2019512272.tif 000128
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号７４のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０６２４】
他の実施形態において、サイトカイン分子は、ＩＬ−２１、例えばヒトＩＬ−２１である（例えば、アミノ酸配列：
【化１２６】
2019512272.tif 000129
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０６２５】
さらに他の実施形態において、サイトカイン分子は、インターフェロンγ、例えば、ヒトインターフェロンγである（例えば、アミノ酸配列：
【化１２７】
2019512272.tif 000130
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号２３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む）。
【０６２６】
リンカー
ある実施形態において、多機能性分子は、リンカー、例えば腫瘍標的化部分および間質調節部分、サイトカイン分子および免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、Ｆｃ領域）、標的化部分および免疫グロブリン鎖定常領域、または免疫細胞エンゲージャおよび免疫グロブリン鎖定常領域間のリンカーをさらに含む。
【０６２７】
ある実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、ペプチドリンカー、フレキシブルリンカー、剛性リンカー、らせん状リンカー、または非らせん状リンカーから選択される。ある実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含む。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号４２）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４４）；およびＤＶＰＳＧＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）から選択される。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、リンカーのＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡファミリーである（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（２００１）１４（８）：５２９−５３２に記載されるように）。これらは、２〜５の範囲のｎを有する剛性のらせん状リンカーである。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ（配列番号７５）；ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ（配列番号７６）；ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ（配列番号７７）；およびＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ（配列番号７８）から選択される。
【０６２８】
多機能性分子の立体配置
ある実施形態において、多機能性分子は、一本鎖抗体分子、例えば単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ラクダ科、またはサメ抗体、および第２の部分を含む。ある実施形態において、多機能性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＨからＶＬを含み（例えば、図１Ａおよび１Ｂに示されるように）；ｓｃＦｖは、第１の結合特異性を形成し得る（図１Ａ〜１Ｂに結合部分「１」として示される）。ある実施形態において、第２の部分（図１Ａ〜１ＢにパートナーＡとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の前に（例えば、図１Ａに示されるように）、またはＮ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の後に配置され（例えば、図１Ｂに示されるように）；第２の部分は、第２の結合特異性を形成し得る（図１Ａ〜１Ｂに結合部分「２」として示される）。他の実施形態において、多機能性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＬからＶＨを含み（例えば、図２Ａおよび２Ｂに示されるように）；ｓｃＦｖは、第１の結合特異性を形成し得る（図２Ａ〜２Ｂに結合部分「１」として示される）。ある実施形態において、第２の部分（図２Ａ〜２ＢにパートナーＡとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の前に（例えば、図２Ａに示されるように）、またはＮ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の後に配置され（例えば、図２Ｂに示されるように）、第２の部分は、第２の結合特異性を形成し得る（図２Ａ〜２Ｂに結合部分「２」として示される）。実施形態において、ｓｃＦｖは、腫瘍標的化部分であり得（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質、または血液抗原に結合する）、または免疫細胞エンゲージャであり得る（例えば、免疫細胞抗原に結合する）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、図１Ａ〜１Ｂまたは２Ａ〜２ＢにパートナーＡとして示される）は、例えば、本明細書に記載されるような間質調節である。
【０６２９】
他の実施形態において、多機能性分子は、一本鎖ポリペプチド、例えば、隣接単一ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなる三重特異性または三機能性である。例えば、多機能性分子は、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば本明細書に記載されるような固形腫瘍、間質、または血液抗原に対する第１の結合特異性）、例えば本明細書に記載されるような間質調節、および本明細書に記載されるサイトカイン分子、および免疫細胞エンゲージャ（例えば、本明細書に記載される免疫細胞抗原に対する第２の結合特異性）の１つまたは上記のいずれかの任意の組合せを含み得る。
【０６３０】
ある実施形態において、多機能性分子は、一本鎖抗体分子、例えば単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ラクダ科、またはサメ抗体、および第２の部分を含む。ある実施形態において、多機能性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分および／または第３の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＨからＶＬを含み（例えば、図１Ｃに示されるように）；ｓｃＦｖは、第１の結合特異性を形成し得る（図１Ｃに結合部分「１」として示される）。ある実施形態において、第２または第３の部分（図１ＣにパートナーＡおよびＢとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の前に配置され（例えば、図１Ｃに示されるように）、第３の部分（パートナーＢ）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の後に配置され（例えば、図１Ｃに示されるように）；第２および第３の部分は、第２および第３の結合特異性を形成し得る（図１Ｃにそれぞれ結合部分「２」および結合部分「３」として示される）。他の実施形態において、多機能性分子は、ＮからＣの配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の部分および／または第３の部分に連結されるｓｃＦｖのＶＬからＶＨを含む（例えば、図２Ｃに示されるように）。ある実施形態において、第２の部分（図２ＣにパートナーＡとして示される）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＬ領域の前に（例えば、図２Ｃに示されるように）、第３の部分（パートナーＢ）は、Ｎ−からＣ−の配向で、ｓｃＦｖのＶＨ領域の後に配置され（例えば、図２Ｃに示されるように）；第２および第３の部分は、第２および第３の結合特異性を形成し得る（図２Ｃにそれぞれ結合部分「２」および結合部分「３」として示される）。実施形態において、上記の多機能性分子のいずれかのｓｃＦｖは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分または第３の部分（例えば、図１Ｃまたは２ＣにパートナーＡおよびパートナーＢとして示される）は、例えば、本明細書に記載されるような間質調節を含み、残りの部分は、第２の腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から選択される。実施形態において、パートナーＡおよび／またはパートナーＢは、例えば、本明細書に記載されるような抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）、間質調節部分、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するｓｃＦｖであり、第２の部分は、例えば、本明細書に記載されるような間質調節であり、第３の部分は、独立して、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第２および第３の部分は、独立して、間質調節部分、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。
【０６３１】
実施形態において、多機能性分子は、二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｂまたは図４Ａ〜４Ｂに示される立体配置を有する。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、第１の結合特異性、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび図４Ａ〜４Ｂに結合部分「１」として示される）を形成する。実施形態において、第２の部分（パートナーＡとして示される）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかに連結される。実施形態において、第２の部分は、第２の結合特異性（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび図４Ａ〜４Ｂに結合部分「２」として示される）を形成する。
【０６３２】
図３Ａ〜３Ｂに示される一実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のポリペプチドのＣＬ領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のポリペプチドのＣＨ１領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ｂに示されるように）。
【０６３３】
図４Ａ〜４Ｂに示される別の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のポリペプチドのＶＬ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のポリペプチドのＶＨ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ｂに示されるように）。
【０６３４】
実施形態において、第１および第２のポリペプチド（例えば、ＶＨおよびＶＬ領域）は、結合部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４Ｂ中の結合部分１）を形成することができ；例えば、第１および第２のポリペプチドは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４ＢにパートナーＡとして示される）は、間質調節部分、例えば本明細書に記載される間質調節部分を含む。
【０６３５】
実施形態において、多重特異性分子は、二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、図３Ａ〜３Ｂまたは図４Ａ〜４Ｂに示される立体配置を有する。実施形態において、第２の部分（パートナーＡとして示される）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれか（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれか）に連結される。
【０６３６】
図３Ａ〜３Ｂに示される二重特異性または二機能性分子の一実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣＬ領域（例えば、ＣＬ領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣＨ１領域（例えば、ＣＨ１領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ｂに示されるように）。
【０６３７】
図４Ａ〜４Ｂに示される二重特異性または二機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＶＬ領域（例えば、ＶＬ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ａに示されるように）。他の実施形態において、第２の部分（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＶＨ領域（例えば、ＶＨ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ｂに示されるように）。
【０６３８】
二重特異性または二機能性分子の実施形態において、第１および第２のポリペプチド（例えば、ＶＨおよびＶＬ領域）は、結合部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４Ｂ中の結合部分１）を形成することができ；例えば、第１および第２のポリペプチドは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分（例えば、図３Ａ〜３Ｂおよび４Ａ〜４ＢにパートナーＡとして示される）は、例えば、本明細書に記載されるような間質調節部分を含む。
【０６３９】
一実施形態において、多重特異性分子は、Ｆａｂ分子を含み、第２の部分は、間質調節部分、または第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、サイトカイン分子）から選択される。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するＦａｂであり、第２の部分は、間質調節部分を含み、任意選択的に、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャをさらに含む。ある実施形態において、第２の部分は、第２の抗体分子（例えば、第２のｓｃＦｖまたはＦａｂ）、間質調節部分、受容体分子、受容体リガンド分子、またはサイトカイン分子である。
【０６４０】
他の実施形態において、多重特異性分子は、三重特異性または三機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、図３Ｃおよび４Ｃに示される立体配置を有する。実施形態において、第２の部分および第３の部分（それぞれパートナーＡおよびＢとして示される）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのそれぞれのＣ末端、Ｎ末端、または両方に連結される。一実施形態において、第２の部分および第３の部分は、第２および第１のポリペプチド（または第１および第２のポリペプチド）のそれぞれのＣ末端に連結される。別の実施形態において、第２の部分および第３の部分は、第２および第１のポリペプチド（または第１および第２のポリペプチド）のそれぞれのＮ末端に連結される。一実施形態において、第２の部分および第３の部分は、第２および第１のポリペプチド（または第１および第２のポリペプチド）のそれぞれのＮ−およびＣ末端に連結される。図３Ｃおよび４Ｃに例示されるものを含む任意の立体配置が本開示によって意図される。
【０６４１】
図３Ｃ〜４Ｃに示される三重特異性または三機能性分子の一実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のポリペプチドのＣＬ領域のＣ末端）に連結され（例えば、図３Ｃに示されるように）、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のポリペプチドのＣＨ１領域のＣ末端）に連結される（例えば、図３Ｃに示されるように）。
【０６４２】
図３Ｃ〜４Ｃに示される三重特異性または三機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のポリペプチドのＶＬ領域のＮ末端）に連結され（例えば、図４Ｃに示されるように）、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のポリペプチドのＶＨ領域のＮ末端）に連結される（例えば、図４Ｃに示されるように）。
【０６４３】
三重特異性または三機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のポリペプチドのＶＬ領域のＮ末端）に連結され、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のポリペプチドのＣＨ１領域のＣ末端）に連結される。
【０６４４】
三重特異性または三機能性分子の別の実施形態において、第２の部分（例えば、第２の結合特異性「２」に対応するパートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のポリペプチドのＣＬ領域のＮ末端）に連結され、第３の部分（例えば、第３の結合特異性「３」に対応するパートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のポリペプチドのＶＨ領域のＮ末端）に連結される。
【０６４５】
三重特異性または三機能性分子の実施形態において、第１および第２のポリペプチド（例えば、ＶＨおよびＶＬ領域）は、第１の結合特異性（例えば、図３Ｃおよび４Ｃ中の結合部分「１」）を形成することができ；例えば、第１および第２のポリペプチドは、腫瘍標的化部分（例えば、癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する）または免疫細胞エンゲージャ（例えば、免疫細胞抗原に結合する）であり得る。実施形態において、第２の部分または第３の部分（例えば、図３Ｃおよび４ＣにパートナーＡおよびＢとして示される）は、間質調節部分、例えば本明細書に記載される間質調節部分を含み、残りの部分は、腫瘍標的化部分、免疫細胞エンゲージャ、またはサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるような）から選択される。実施形態において、第２および第３の結合特異性、例えば、パートナーＡおよびＢは、独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。一実施形態において、多機能性分子は、Ｆａｂ分子を含み、第２の部分または第３の部分は、間質調節部分を含み、残りの部分は、第２の抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたは第２のＦａｂ）、受容体分子、またはリガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。ある実施形態において、第１の結合特異性、第２の結合特異性および第３の結合特異性は、それぞれ独立して、腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。一実施形態において、腫瘍標的化部分は、癌細胞抗原に対するＦａｂであり、第２または第３の部分は、間質調節部分であり、残りの部分は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャから選択される。
【０６４６】
一実施形態において、多機能性分子は、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの非隣接ポリペプチドを含み、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）を含み；および
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）を含む。
【０６４７】
実施形態において、多機能性分子は、二重特異性または二機能性分子であり、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は不連続であり、例えば、２つの別個のポリペプチド鎖である。ある実施形態において、第１および第２のポリペプチド（ｉ）および（ｉｉ）は、例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の３４７、３４９、３５０、３５１、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９７、３９８、３９９、４０５、４０７、または４０９の１つまたは複数から選択される位置に対になったアミノ酸置換を含む。例えば、第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１のＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、またはＹ４０７Ｖ（例えば、空洞またはホールに対応する）から選択されるアミノ酸置換を含むことができ、第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第２のＦｃ領域）は、Ｔ３６６Ｗ（例えば、突起またはノブに対応する）を含む。ある実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、ヘテロ二量体の第１および第２のＦｃ領域の第１および第２のメンバーである。
【０６４８】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、二機能性、例えば二重特異性分子を形成する。ある実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ａ中のパートナーＡまたは結合特異性１）を含み、第２のポリペプチドは、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ａ中のパートナーＢまたは結合特異性２）を含む。実施形態において、第１および第２の結合および／または機能的特異性（それぞれパートナーＡおよびパートナーＢ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。実施形態において、第１および第２の結合特異性は、第１または第２のポリペプチドのいずれかまたはポリペプチドのそれぞれ（例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ分子の一方または両方のメンバー）に連結される。一実施形態において、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。あるいは、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。あるいは、第１の結合特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第２の結合特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。他の実施形態において、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＢ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＡ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。一実施形態において、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、例えば、図５Ａに示されるように）空洞またはホールを含む。
【０６４９】
ある実施形態において、二機能性分子の第１および第２の結合および／または機能的特異性（結合部分１および結合部分２）は、それぞれ独立して、間質調節部分、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択され得る。ある実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分である。他の実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性は、免疫細胞エンゲージャであり、第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分であり、例えば、免疫細胞エンゲージャは、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０６５０】
図５Ａに示されるある実施形態において、二重特異性分子は、パートナーＡおよびＢを有することができ、これらは、それぞれ第１および第２の結合および／または機能的特異性（結合部分１および２）として示される（図５Ａ）。第１および第２の結合および／または機能的特異性は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分である。他の実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性は、免疫細胞エンゲージャであり、第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分であり、例えば、免疫細胞エンゲージャは、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０６５１】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、三機能性、例えば三重特異性、または四機能性、例えば四重特異性分子を形成する（例えば、それぞれ図５Ｂ〜５Ｃに示されるように）。
【０６５２】
三機能性、例えば三重特異性分子のある実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｂ中のパートナーＡまたは結合部分１）を含み、第２のポリペプチドは、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｂ中のパートナーＢまたは結合特異性２）を含み、第１または第２のポリペプチドのいずれかは、第３の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｂ中のパートナーＣまたは結合部分３）をさらに含む。実施形態において、第１および第２の結合および／または機能的特異性は、第１または第２のポリペプチドのいずれかまたはポリペプチドのそれぞれ（例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ分子の一方または両方のメンバー）に連結される。一実施形態において、第１および第２の結合および／または機能的特異性は、例えば、リンカーを介して第１および第２のポリペプチドのそれぞれのＮ末端に連結され、第３の結合および／または機能的特異性は、例えば、リンカーを介して第１または第２のポリペプチドのいずれかのＣ末端に連結される。一実施形態において、第３の結合および／または機能的特異性は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、図５Ｂに示される第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結される。一実施形態において、第３の結合および／または機能的特異性は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結される。一実施形態において、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、例えば、図５Ｂに示されるように）ホールまたは空洞を含む。
【０６５３】
実施形態において、第１、第２および第３の結合および／または機能的特異性（それぞれパートナーＡ、パートナーＢ、およびパートナーＣ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。一実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第２の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第３の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＣ）は、第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。他の実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＡ）は、第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第２の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＢ）は、第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、第１のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結され；第３の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＣ）は、第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２のＦｃ分子の−ＣＨ２−ＣＨ３−領域）に連結される。第１、第２および第３の結合および／または機能的特異性は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、第１、第２および第３の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部分１〜３に対応するパートナーＡ〜Ｃ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分であり、第３の結合および／または機能的特異性は、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０６５４】
四機能性、例えば四重特異性分子のある実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＡまたは結合部分１）および第３の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＣまたは結合部分３）を含み、第２のポリペプチドは、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｃ中のパートナーＢまたは結合特異性２）および第４の結合および／または機能的特異性（例えば、図５Ｃ中の）パートナーＤまたは結合部分４を含む。一実施形態において、第１および第２の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１および第２のポリペプチドのそれぞれのＮ末端に連結され、第３および第４の結合特異性は、例えば、リンカーを介して第１および第２のポリペプチドのそれぞれのＣ末端に連結される。第１または第２のポリペプチドのＮ−またはＣ末端への結合および／または機能的特異性のいずれの置き換えも本開示によって包含される。一実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＡ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＮ末端（例えば、図５Ｃに示される第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結され；第２の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＢ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＮ末端（例えば、図５Ｃに示される第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＮ末端）に連結され；第３の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＣ）は、例えば、リンカーを介して第１のポリペプチドのＣ末端（例えば、図５Ｃに示される第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結され；第４の結合および／または機能的特異性（例えば、パートナーＤ）は、例えば、リンカーを介して第２のポリペプチドのＣ末端（例えば、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域のＣ末端）に連結される。一実施形態において、第１の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、突起またはノブを含み、第２の−ＣＨ２−ＣＨ３領域は、例えば、図５Ｃに示されるように）空洞またはホールを含む。実施形態において、第１、第２、第３および第４の結合および／または機能的特異性（それぞれパートナーＡ、パートナーＢ、パートナーＣおよびパートナーＤ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から選択される。第１、第２、第３および第４の結合および／または機能的特異性は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）であり得る。ある実施形態において、第１、第２、第３および第４の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部分１〜４を対応するパートナーＡ〜Ｄ）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分であり、第３および第４の結合および／または機能的特異性は、それぞれ独立して、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０６５５】
一実施形態において、多機能性分子は、２つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む二重特異性分子である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１および第２の結合部位をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１および第２の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部位１〜２）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような間質調節部分、腫瘍標的化部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２、例えば、本明細書に記載されるような例えば間質調節部分）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば癌抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）を有し；第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば癌抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ癌抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有する（例えば、この立体配置の例が図１６に示される）。一実施形態において、任意選択的にリンカーを介して、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２、例えば、本明細書に記載されるような例えば間質調節部分）に連結される、第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含む二重特異性分子である。ある実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図１６中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図１６中の結合部位＃２）は、例えば、本明細書に記載される間質調節部分である。
【０６５６】
別の実施形態において、多機能性分子は、２つまたは少なくとも３つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む二機能性、例えば二重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の結合および／または機能的特異性、例えば第１の抗体分子を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）を含み；および
（任意選択的に）（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含む。
【０６５７】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１および第２の結合および／または機能的特異性（例えば、部位）をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１および第２の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部位１〜２）は、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分および間質調節部分である。
【０６５８】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ａ）任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）；
（ｂ）任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される間質調節部分である第２の結合および／または機能的特異性（例えば、第２の結合部位）
を有し；および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば癌抗原、例えば固形腫瘍、間質または血液抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ癌抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有する（例えば、この立体配置の例が図７に示される）。
【０６５９】
一実施形態において、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）、および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２、例えば、本明細書に記載されるような例えば間質調節部分）に対応するＦａｂを含む二機能性、例えば二重特異性分子である。
【０６６０】
ある実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図１７中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；および第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図１７中の結合部位＃２）は、例えば、本明細書に記載される間質調節部分である。
【０６６１】
実施形態において、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０６６２】
実施形態において、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０６６３】
一実施形態において、多機能性分子は、２つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む三機能性、例えば三重特異性分子である。実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１、第２および第３の結合および／または機能的特異性をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１、第２および第３の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部位１〜３）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。ある実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（結合部位１）は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合および／または機能的特異性（結合部位２）は、間質調節部分であり、第３の結合および／または機能的特異性（結合部位３）は、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０６６４】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ｉ）任意選択的にリンカーを介して、第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃３、例えば、サイトカイン、リガンドまたは第２の抗体分子、例えばｓｃＦｖ）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば癌抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）を有し；および
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：任意選択的にリンカーを介して、第３の結合および／または機能的特異性に連結される、第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬ（例えば、結合部位＃２、例えば、間質調節部分）を有する（例えば、この立体配置の例が図１８に示される。
【０６６５】
一実施形態において、二機能性、例えば二重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第２および第３の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２および＃３）に連結される第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含む。ある実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図１８中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図１８中の結合部位＃２）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択され；第３の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃３）は、間質調節部分である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０６６６】
別の実施形態において、多機能性分子は、２つまたは少なくとも３つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む三機能性、例えば三重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の結合特異性、例えば第１の抗体分子を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される第２の結合特異性を含み；および
（任意選択的に）（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含み、
第１または第２のポリペプチドのいずれかは、第３の結合および／または機能的特異性をさらに含む。
【０６６７】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１、第２、および第３の結合および／または機能的特異性（例えば、部位）をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１、第２および第３の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部位１〜３）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。一実施形態において、第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、第２の結合および／または機能的特異性（結合部位＃２）は、免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子であり、第３の結合および／または機能的特異性（結合部位＃３）は、例えば、図１９Ａまたは１９Ｂに示されるように、間質調節部分である。
【０６６８】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ａ）任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば腫瘍または間質抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）；
（ｂ）任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、第２の結合部位）
を有し；および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有し、
第１または第２のポリペプチドのいずれかは、任意選択的にリンカーを介して、第１または第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１または第２のＦｃ領域）に連結される第３の結合および／または機能的特異性をさらに含む。一実施形態において、第３の結合特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される。別の実施形態において、第３の結合特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される。これらの立体配置の例が図１９Ａ〜１９Ｂに示される。
【０６６９】
一実施形態において、三機能性、例えば三重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）；および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２）に対応するＦａｂを含み、第３の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃３）をさらに含む（例えば、図１９Ａに示されるように）。他の実施形態において、三機能性、例えば三重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含み、第３の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃３）；および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２）をさらに含む（例えば、図１９Ｂに示されるように）。
【０６７０】
ある実施形態において、（ａ）第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図１９Ａ〜１９Ｂ中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；（ｂ）第２の結合および／または機能的特異性（例えば、図１９Ａ〜１９Ｂ中の結合部位＃２）は、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択され；（ｃ）第３の結合および／または機能的特異性（例えば、図１９Ａ〜１９Ｂ中の結合部位＃３）は、間質調節部分である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０６７１】
実施形態において、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０６７２】
実施形態において、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０６７３】
別の実施形態において、多機能性分子は、２つまたは少なくとも３つの非隣接第１および第２のポリペプチドを含む四機能性、例えば四重特異性分子であり、
（ｉ）第１のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の結合および／または機能的特異性、例えば第１の抗体分子を含み；
（ｉｉ）第２のポリペプチドは、Ｎ−からＣ−の配向で、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される第２の結合および／または機能的特異性を含み；および
（任意選択的に）（ｉｉｉ）第３のポリペプチドは、第１の抗体分子または第２の抗体分子の一部を含み、
第１または第２のポリペプチドは、第３および第４の結合および／または機能的特異性をさらに含む。
【０６７４】
実施形態において、第１および第２のポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような間質調節部分、酵素分子、抗体分子（例えば、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）またはＦａｂ）、受容体分子、リガンド分子（例えば、受容体リガンドまたはサイトカイン分子）から独立して選択される第１、第２、第３および第４の結合および／または機能的特異性（例えば、部位）をそれぞれ含む。ある実施形態において、第１、第２、第３および第４の結合および／または機能的特異性（それぞれ結合部位１〜４）は、それぞれ独立して、例えば本明細書に記載されるような腫瘍標的化部分、間質調節部分、サイトカイン分子、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャから選択される。
【０６７５】
ある実施形態において、第１のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：
（ａ）任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される、第１の抗原ドメインの第１の部分、例えば腫瘍または間質抗原に結合する、例えばＦａｂ分子の第１のＶＨ−ＣＨ１（例えば、結合部位＃１）；
（ｂ）任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結される、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、第２の結合部位）
を有し；および
（ｃ）第３のポリペプチドは、Ｎ−から−Ｃに以下の立体配置：第１の抗原ドメインの第２の部分、例えば腫瘍または間質抗原（例えば、第１のＶＨ−ＣＨ１、例えば、結合部位＃１によって結合される同じ腫瘍または間質抗原）に結合する、例えばＦａｂの第１のＶＬ−ＣＬを有し、
第１および第２のポリペプチドは、それぞれ第３および第４の結合および／または機能的特異性をさらに含み、これらのそれぞれは、任意選択的にリンカーを介して、第１および第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１および第２のＦｃ領域）に連結される。一実施形態において、第３の結合および／または機能的特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第２のＦｃ領域）に連結され；第４の結合および／または機能的特異性は、任意選択的にリンカーを介して、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、ＣＨ３領域に連結されたＣＨ２）（例えば、第１のＦｃ領域）に連結される。これらの立体配置の例が図２０に示される。
【０６７６】
一実施形態において、四機能性、例えば四重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含み、第４の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃４）；および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２）をさらに含み、第３の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃３）をさらに含む（例えば、図２０に示されるように）。他の実施形態において、四機能性、例えば四重特異性分子は、任意選択的にリンカーを介して、第１のＦｃ領域に連結される第１の結合および／または機能的特異性（結合部位＃１）に対応するＦａｂを含み、第３の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃３）；および任意選択的にリンカーを介して、第２のＦｃ領域に連結される第２の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃２）をさらに含み、第４の結合および／または機能的特異性（例えば、結合部位＃４）をさらに含む。
【０６７７】
ある実施形態において、（ａ）第１の結合および／または機能的特異性（例えば、図２０中の結合部位＃１）は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；第２および第４の結合および／または機能的特異性（例えば、図２０中の結合部位＃２および４）は、それぞれ独立して、サイトカイン分子、または免疫細胞エンゲージャから選択され、例えば受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択され；第３の結合および／または機能的特異性（例えば、図２０中の結合部位＃３）は、間質調節部分である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０６７８】
別の実施形態において、（ａ）第１の結合および／または機能的特異性は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍、間質または血液抗原に結合し；（ｂ）第２の結合および／または機能的特異性は、受容体、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ）であり；（ｃ）第３の結合および／または機能的特異性は、サイトカイン分子または免疫細胞エンゲージャであり；（ｄ）第４の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０６７９】
一実施形態において、（ａ）第１の結合および／または機能的特異性は、腫瘍標的化部分であり、例えば癌抗原、例えば腫瘍または間質抗原に結合し；（ｂ）第２の結合および／または機能的特異性は、間質調節部分であり；（ｃ）第３の結合および／または機能的特異性は、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、マクロファージまたは樹枝状細胞エンゲージャ）であり；（ｄ）第４の結合および／または機能的特異性は、リガンド分子または免疫細胞抗原に結合する抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）から選択される免疫細胞エンゲージャ（例えば、マクロファージまたは樹枝状細胞エンゲージャ）である。抗体分子がｓｃＦＶである実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ立体配置で第１のポリペプチドのＣ末端に連結され得る。
【０６８０】
実施形態において、第１の免疫グロブリン定常領域（例えば、第１のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、例えば、本明細書に記載されるような突起またはノブを含む。
【０６８１】
実施形態において、第２の免疫グロブリン定常領域（例えば、第２のＣＨ２−ＣＨ３領域）は、空洞またはホールを含む。実施形態において、第１および第２の免疫グロブリン定常領域は、二重特異性分子のヘテロ二量体化を促進する。
【０６８２】
ある実施形態において、多機能性分子は、Ｎ末端からＣ末端の配向で、下式を含む：
Ｒ１−（任意選択的にＬ１）−Ｒ２；
Ｒ２−（任意選択的にＬ１）−Ｒ１；
（ｉ）Ｒ１は、１つ、２つまたはそれを超える間質調節部分、例えば本明細書に記載される同じかまたは異なる間質調節部分を含み；
（ｉｉ）Ｒ２は、１つ、２つまたはそれを超える腫瘍標的化部分、例えば本明細書に記載される同じかまたは異なる腫瘍標的化部分を含み；および
（ｉｉｉ）任意選択的に、Ｌ１は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカー）である。
【０６８３】
ある実施形態において、多機能性分子は、Ｒ３をさらに含み、Ｒ３は、１つ、２つまたはそれを超えるサイトカイン分子、例えば本明細書に記載されるサイトカイン分子を含む。
【０６８４】
ある実施形態において、多機能性分子は、Ｒ４をさらに含み、Ｒ４は、１つ、２つまたはそれを超える免疫細胞エンゲージャ（例えば、本明細書に記載されるＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャ）を含む。
【０６８５】
ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４を含む多機能性分子を記載している。
【０６８６】
ある実施形態において、多機能性分子は、Ｎ末端からＣ末端の配向で、下式を含む：
Ｒ１−（任意選択的にＬ１）−Ｒ２−（任意選択的にＬ２）−Ｒ３／Ｒ４；
Ｒ１−（任意選択的にＬ１）−Ｒ３／Ｒ４−（任意選択的にＬ２）−Ｒ２；
Ｒ２−（任意選択的にＬ１）−Ｒ１−（任意選択的にＬ２）−Ｒ３／Ｒ４；
Ｒ２−（任意選択的にＬ１）−Ｒ３／Ｒ４−（任意選択的にＬ２）−Ｒ１；
Ｒ３／Ｒ４−（任意選択的にＬ１）−Ｒ１−（任意選択的にＬ２）−Ｒ２；または
Ｒ３／Ｒ４−（任意選択的にＬ１）−Ｒ２−（任意選択的にＬ２）−Ｒ１；
（ｉ）Ｒ１は、１つ、２つまたはそれを超える間質調節部分（例えば、本明細書に記載される部分）（例えば、同じかまたは異なる間質調節部分）を含み；
（ｉｉ）Ｒ２は、１つ、２つまたはそれを超える腫瘍標的化部分（例えば、本明細書に記載される部分）（例えば、同じかまたは異なる腫瘍標的化部分）を含み；
（ｉｉｉ）Ｒ３は、１つ、２つまたはそれを超えるサイトカイン分子、例えばサイトカイン分子（例えば、本明細書に記載されるサイトカイン分子）（例えば、同じかまたは異なるサイトカイン分子）を含み；
（ｉｖ）Ｒ４は、１つ、２つまたはそれを超える免疫細胞エンゲージャ（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャ（例えば、本明細書に記載される免疫細胞エンゲージャ））を含み；
Ｒ３およびＲ４は、両方とも存在し；
Ｒ３は存在し、Ｒ４は存在せず；
Ｒ４は存在し、Ｒ３は存在せず；および
任意選択的に、Ｌ１および／またはＬ２は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカー）である。
【０６８７】
ある実施形態において、多機能性分子は、以下の立体配置：
（ｉ）任意選択的に、Ｆａｂと間質調節部分との間に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む、Ｎ末端からＣ末端に、腫瘍または間質抗原に結合するＦａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）に連結される間質調節部分；および／または
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、Ｆａｂの軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬ１）を有する。
【０６８８】
他の実施形態において、メソテリンに対するＦａｂ（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）は、ヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼ分子ＩＶに結合され、これは、例えば、Ｆａｂアミノ酸配列：
【化１２８】
2019512272.tif 000131
その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号７９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；および
例えば、以下を含むヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼ分子ＩＶの一方または両方：
（ｉ）以下のヒアルロニダーゼ分子アミノ酸配列
【化１２９】
2019512272.tif 000132
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉ）以下のコラゲナーゼ分子アミノ酸配列
配列番号６３、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み、任意選択的に、Ｆａｂと、ヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼ分子ＩＶとの間にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。
【０６８９】
ある実施形態において、第２のポリペプチドは、腫瘍または間質抗原に対するＦａｂの軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬ１）を含む。ある実施形態において、Ｆａｂの軽鎖は、メソテリンに結合し、例えば、アミノ酸配列：
【化１３０】
2019512272.tif 000133
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号８０のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６９０】
他の実施形態において、ヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼ分子ＩＶに結合されるＦＡＰに対するＦａｂ（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）は、例えば、Ｆａｂアミノ酸配列：
【化１３１】
2019512272.tif 000134
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号８１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；および
例えば、以下を含む、ヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼ分子ＩＶの一方または両方：
（ｉ）以下のヒアルロニダーゼ分子アミノ酸配列：
【化１３２】
2019512272.tif 000135
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または
（ｉｉ）以下のコラゲナーゼ分子アミノ酸配列
配列番号６３、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号６３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み、任意選択的に、Ｆａｂと、ヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼＩＶ分子との間にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを含む。ＶＨのアミノ酸配列には下線が引かれ、ＣＨ１のアミノ酸配列は、下線なしで示される。
【０６９１】
ある実施形態において、第２のポリペプチドは、ＦＡＰに対するＦａｂの軽鎖（例えば、ＶＬ−ＣＬ１）を含む。ある実施形態において、Ｆａｂの軽鎖は、ＦＡＰに結合し、例えば、アミノ酸配列：
【化１３３】
2019512272.tif 000136
、またはその断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号４９のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。ＶＬのアミノ酸配列には下線が引かれ、ＣＬ１のアミノ酸配列は、下線なしで示される。
【０６９２】
ある実施形態において、多機能性分子は、第１および第２のポリペプチドの結合を促進する第１および第２のドメイン、例えば第１および第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１および第２のＦｃ領域）をさらに含む。
【０６９３】
ある実施形態において、（ｉ）第１のポリペプチドは、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、Ｆａｂの重鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）から第１のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）を有し；（ｉｉ）第２のポリペプチドは、以下の立体配置：Ｎ末端からＣ末端に、Ｆａｂの軽鎖（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）から第２のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２からＣＨ３）を有する。
【０６９４】
ある実施形態において、第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１のＦｃ領域）は、アミノ酸配列：
【化１３４】
2019512272.tif 000137
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号８２のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６９５】
ある実施形態において、第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第２のＦｃ領域）は、アミノ酸配列：
【化１３５】
2019512272.tif 000138
、その断片またはそれと実質的に同一である（例えば、それと９５％〜９９．９％同一であるか、または配列番号８３のアミノ酸配列に対する少なくとも１つのアミノ酸改変であるが、５、１０または１５個以下の改変（例えば、置換、欠失または挿入、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。
【０６９６】
ある実施形態において、多機能性分子は、少なくとも１つのサイトカイン分子（例えば、Ｒ３）および／または少なくとも１つの免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｒ４）（例えば、ＮＫ細胞エンゲージャ、Ｔ細胞エンゲージャ、Ｂ細胞エンゲージャ、樹枝状細胞エンゲージャまたはマクロファージ細胞エンゲージャ）をさらに含む。ある実施形態において、間質調節部分（例えば、Ｒ１）、腫瘍標的化部分（例えば、Ｒ２）、およびサイトカイン分子（例えば、Ｒ３）および／または免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｒ４）の一方または両方が、同じポリペプチド中にあり、例えば、例えば、Ｎ−からＣ−方向に、間質調節部分は、第１のポリペプチドであり、腫瘍標的化部分は、第２のポリペプチドであり、サイトカイン分子および／または免疫細胞エンゲージャの一方または両方は、任意選択的にリンカーを介して連結される。
【０６９７】
ある実施形態において、間質調節部分（例えば、Ｒ１）、腫瘍標的化部分（例えば、Ｒ２）、およびサイトカイン分子（例えば、Ｒ３）および／または免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｒ４）の一方または両方は、同じポリペプチド中にあり、例えば、例えば、Ｎ−からＣ−方向に、腫瘍標的化部分は、第１のポリペプチドであり、間質調節部分は、第２のポリペプチドであり、サイトカイン分子および／または免疫細胞エンゲージャの一方または両方は、任意選択的にリンカーを介して連結される。ある実施形態において、間質調節部分、腫瘍標的化部分、およびサイトカイン分子（例えば、Ｒ３）および／または免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｒ４）の一方または両方は、異なるポリペプチド中にあり、例えば第１および第２のポリペプチドは、共有結合されない。
【０６９８】
ある実施形態において、１）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−方向に、第１の腫瘍標的化部分（例えば、Ｒ２）、間質調節部分（例えば、Ｒ１）、および任意選択的に、第１および第２のポリペプチド、例えば第１の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第１のＦｃ領域）の結合を促進する第１のドメインを含み；２）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−からＣ−方向に、第２の腫瘍標的化部分（例えば、Ｒ２）、および任意選択的に、第１および第２のポリペプチド、例えば第２の免疫グロブリン鎖定常領域（例えば、第２のＦｃ領域）の結合を促進する第２のドメインを含み；３）第１のおよび／または第２のポリペプチドのいずれかまたは両方は、例えば、Ｎ−からＣ−方向に、サイトカイン分子（例えば、Ｒ３）および／または免疫細胞エンゲージャ（例えば、Ｒ４）をさらに含む。
【０６９９】
ある実施形態において、第１の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化抗体分子（例えば、Ｆａｂ）の重鎖可変ドメインを含み；第２の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化抗体分子（例えば、Ｆａｂ）の軽鎖可変ドメインを含む。ある実施形態において、第１の腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化抗体の軽鎖可変ドメインを含み；第２のポリペプチドの腫瘍標的化部分は、腫瘍標的化抗体の重鎖可変ドメインを含む。
【０７００】
ある実施形態において、多機能性分子は、ａ）以下を含む第１のポリペプチド：第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および２つのポリペプチド（一方は腫瘍標的化部分を含み、他方は間質調節部分を含む）；ｂ）以下を含む第２のポリペプチド：第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および腫瘍標的化部分；免疫細胞エンゲージャ；およびサイトカイン分子から選択される２つのポリペプチドを含み、多機能性分子は、腫瘍標的化部分および間質調節部分；および免疫細胞エンゲージャまたはサイトカイン分子の一方または両方を含む。
【０７０１】
ある実施形態において、多機能性分子は、腫瘍標的化部分；間質調節部分；および免疫細胞エンゲージャ；腫瘍標的化部分；間質調節部分；およびサイトカイン分子；腫瘍標的化部分；間質調節部分；免疫細胞エンゲージャ；およびサイトカイン分子；腫瘍標的化部分；間質調節部分；および２つの免疫細胞エンゲージャ；腫瘍標的化部分；間質調節部分；および２つのサイトカイン分子；２つの腫瘍標的化部分；間質調節部分；および免疫細胞エンゲージャ；または腫瘍標的化部分；間質調節部分；および２つの免疫細胞エンゲージャを含む。
【０７０２】
ある実施形態において、多機能性分子は、以下を含み、ｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および間質調節部分を含み；ｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；およびサイトカイン分子および／または免疫細胞エンゲージャを含み；またはｉｉｉ）第１のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および免疫細胞エンゲージャを含み；ｉｖ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および間質調節部分を含み；ｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、腫瘍標的化部分；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；およびサイトカイン分子および／または免疫細胞エンゲージャを含み；またはｉｉｉ）第２のポリペプチドは、例えば、Ｎ−ＣまたはＣ−Ｎ方向に、サイトカイン；第１および第２のポリペプチドの結合を促進するドメイン、例えばＦｃ分子；および間質調節部分を含む。
【０７０３】
ある実施形態において、腫瘍標的化部分は、メソテリンまたはＦＡＰに対して特異的であり；間質調節部分は、ヒアルロニダーゼ分子またはコラゲナーゼＩＶ分子、またはその断片もしくは変異体を含み；サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子を含み；免疫細胞エンゲージャは、ＣＤ４０Ｌ分子を含み；免疫細胞エンゲージャは、Ｂ７Ｈ６分子を含む。
【０７０４】
例示的な多重特異性および多機能性分子および対応する核酸およびアミノ酸配列
【０７０５】
【表２】
2019512272.tif 000139
【０７０６】
【表３】
2019512272.tif 000140
【０７０７】
【表４】
2019512272.tif 000141
【０７０８】
【表５】
2019512272.tif 000142
【０７０９】
【表６】
2019512272.tif 000143
【０７１０】
【表７】
2019512272.tif 000144
【０７１１】
【表８】
2019512272.tif 000145
【０７１２】
【表９】
2019512272.tif 000146
【０７１３】
【表１０】
2019512272.tif 000147
【０７１４】
【表１１】
2019512272.tif 000148
【０７１５】
【表１２】
2019512272.tif 000149
【０７１６】
【表１３】
2019512272.tif 000150
【０７１７】
【表１４】
2019512272.tif 000151
【０７１８】
【表１５】
2019512272.tif 000152
【０７１９】
【表１６】
2019512272.tif 000153
【０７２０】
【表１７】
2019512272.tif 000154
【０７２１】
【表１８】
2019512272.tif 000155
【０７２２】
【表１９】
2019512272.tif 000156
【０７２３】
【表２０】
2019512272.tif 000157
【０７２４】
【表２１】
2019512272.tif 000158
【０７２５】
【表２２】
2019512272.tif 000159
【０７２６】
【表２３】
2019512272.tif 000160
【０７２７】
【表２４】
2019512272.tif 000161
【０７２８】
【表２５】
2019512272.tif 000162
【０７２９】
【表２６】
2019512272.tif 000163
【０７３０】
【表２７】
2019512272.tif 000164
【０７３１】
【表２８】
2019512272.tif 000165
【０７３２】
【表２９】
2019512272.tif 000166
【０７３３】
【表３０】
2019512272.tif 000167
【０７３４】
【表３１】
2019512272.tif 000168
【０７３５】
【表３２】
2019512272.tif 000169
【０７３６】
【表３３】
2019512272.tif 000170
【０７３７】
【表３４】
2019512272.tif 000171
【０７３８】
【表３５】
2019512272.tif 000172
【０７３９】
【表３６】
2019512272.tif 000173
【０７４０】
【表３７】
2019512272.tif 000174
【０７４１】
【表３８】
2019512272.tif 000175
【０７４２】
【表３９】
2019512272.tif 000176
【０７４３】
【表４０】
2019512272.tif 000177
【０７４４】
【表４１】
2019512272.tif 000178
【０７４５】
【表４２】
2019512272.tif 000179
【０７４６】
【表４３】
2019512272.tif 000180
【０７４７】
【表４４】
2019512272.tif 000181
【０７４８】
【表４５】
2019512272.tif 000182
【０７４９】
【表４６】
2019512272.tif 000183
【０７５０】
【表４７】
2019512272.tif 000184
【０７５１】
【表４８】
2019512272.tif 000185
【０７５２】
【表４９】
2019512272.tif 000186
【０７５３】
【表５０】
2019512272.tif 000187
【０７５４】
【表５１】
2019512272.tif 000188
【０７５５】
【表５２】
2019512272.tif 000189
【０７５６】
【表５３】
2019512272.tif 000190
【０７５７】
【表５４】
2019512272.tif 000191
【０７５８】
【表５５】
2019512272.tif 000192
【０７５９】
【表５６】
2019512272.tif 000193
【０７６０】
【表５７】
2019512272.tif 000194
【０７６１】
【表５８】
2019512272.tif 000195
【０７６２】
【表５９】
2019512272.tif 000196
【０７６３】
【表６０】
2019512272.tif 000197
【０７６４】
【表６１】
2019512272.tif 000198
【０７６５】
【表６２】
2019512272.tif 000199
【０７６６】
【表６３】
2019512272.tif 000200
【０７６７】
【表６４】
2019512272.tif 000201
【０７６８】
【表６５】
2019512272.tif 000202
【０７６９】
【表６６】
2019512272.tif 000203
【０７７０】
核酸
本発明はまた、本明細書に記載されるような抗体分子の重鎖および軽鎖可変領域およびＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。例えば、本発明は、本明細書に開示される抗体分子の１つまたは複数から選択される抗体分子の重鎖および軽鎖可変領域をそれぞれコードする第１および第２の核酸を特徴とする。核酸は、本明細書の表に記載されるヌクレオチド配列またはそれと実質的に同一の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の配列、または本明細書の表に示される配列と３、６、１５、３０、または４５ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含み得る。
【０７７１】
いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書の表に記載されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の、および／または１つまたは複数の置換、例えば、保存的置換を有する配列）を有する重鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、核酸は、本明細書の表に記載されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の、および／または１つまたは複数の置換、例えば、保存的置換を有する配列）を有する軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに別の実施形態において、核酸は、本明細書の表に記載されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に相同の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の、および／または１つまたは複数の置換、例えば、保存的置換を有する配列）を有する重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０７７２】
いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書の表に記載されるヌクレオチド配列、それと実質的に相同の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の、および／または本明細書に記載されるストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）を有する重鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態において、核酸は、本明細書の表に記載されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に相同の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の、および／または本明細書に記載されるストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）を有する軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含み得る。さらに別の実施形態において、核酸は、本明細書の表に記載されるヌクレオチド配列、またはそれと実質的に相同の配列（例えば、それと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％またはそれを超えて同一の、および／または本明細書に記載されるストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることが可能な配列）を有する重鎖および軽鎖可変領域からの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲまたは高度可変ループをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０７７３】
別の態様において、本出願は、本明細書に記載される核酸を含有する宿主細胞およびベクターを特徴とする。核酸は、以下により詳細に説明されるように、同じ宿主細胞または別個の宿主細胞中に存在する単一のベクターまたは別個のベクター中に存在し得る。
【０７７４】
ベクター
本明細書に記載される抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが本明細書においてさらに提供される。一実施形態において、ベクターは、本明細書に記載される抗体分子をコードするヌクレオチドを含む。一実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む。ベクターとしては、限定はされないが、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。
【０７７５】
多くのベクター系が用いられ得る。例えば、あるクラスのベクターは、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を用いる。別のクラスのベクターは、セムリキ森林ウイルス、東部馬脳炎ウイルスおよびフラビウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡ要素を用いる。
【０７７６】
さらに、ＤＮＡをその染色体に安定的に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーを導入することによって選択され得る。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性などを提供し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されるか、または共形質転換によって同じ細胞に導入され得る。さらなる要素も、ｍＲＮＡの最適な合成に必要とされ得る。これらの要素は、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得る。
【０７７７】
構築物を含有する発現ベクターまたはＤＮＡ配列が、発現のために調製されたら、発現ベクターは、適切な宿主細胞にトランスフェクトまたは導入され得る。例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクションまたは他の従来の方法などの様々な技術が、これを行うのに用いられ得る。プロトプラスト融合の場合、細胞は、倍地中で増殖され、適切な活性についてスクリーニングされる。
【０７７８】
得られたトランスフェクトされた細胞を培養するためのおよび生成された抗体分子を回収するための方法および条件は、当業者に公知であり、本明細書に基づいて、用いられる特定の発現ベクターおよび哺乳動物宿主細胞に応じて、変更または最適化され得る。
【０７７９】
細胞
別の態様において、本出願は、本明細書に記載される核酸を含有する宿主細胞およびベクターを特徴とする。核酸は、同じ宿主細胞または別個の宿主細胞中に存在する単一のベクターまたは別個のベクター中に存在し得る。宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。えば、哺乳動物細胞は、培養細胞または細胞株であり得る。例示的な哺乳類細胞としては、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞およびトランスジェニック動物に由来する細胞、例えば乳房上皮細胞が挙げられる。
【０７８０】
本発明は、本明細書に記載される抗体分子をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。
【０７８１】
一実施形態において、宿主細胞は、抗体分子をコードする核酸を含むように遺伝子操作される。
【０７８２】
一実施形態において、宿主細胞は、発現カセットを用いることによって遺伝子操作される。「発現カセット」という語句は、このような配列と適合する宿主における遺伝子の発現に影響を与えることが可能なヌクレオチド配列を指す。このようなカセットは、プロモーター、イントロンを伴うかまたは伴わないオープンリーディングフレーム、および終結シグナルを含み得る。例えば、誘導性プロモーターなど、発現を行うのに必要なまたは役立つさらなる因子も使用され得る。
【０７８３】
本発明は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞も提供する。
【０７８４】
細胞は、限定はされないが、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であり得る。好適な真核細胞としては、限定はされないが、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞およびＭＤＣＫＩＩ細胞が挙げられる。好適な昆虫細胞としては、限定はされないが、Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【０７８５】
使用および併用療法
本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される多重特異性分子を用いることにより、例えば、本明細書に記載される医薬組成物を用いることにより、対象における癌を治療することを含む。対象における癌の症状を軽減または改善するための方法、ならびに癌の増殖を抑制し、および／または１つまたは複数の癌細胞を殺滅するための方法も提供される。実施形態において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるまたは本明細書に記載される医薬組成物を投与された対象における、腫瘍のサイズを減少させ、および／または癌細胞の数を減少させる。
【０７８６】
実施形態において、癌は、血液癌である。実施形態において、血液癌は、白血病またはリンパ腫である。本明細書において使用される際、「血液癌」は、造血またはリンパ系組織の腫瘍、例えば血液、骨髄、またはリンパ節を冒す腫瘍を指す。例示的な血液悪性疾患としては、限定はされないが、白血病（例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞腫、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍が挙げられる。
【０７８７】
実施形態において、癌は、固形癌である。例示的な固形癌としては、限定はされないが、卵巣癌、直腸癌、胃癌、精巣癌、肛門部の癌、子宮癌、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、食道の癌、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、類表皮癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌、卵管の癌、子宮内膜の癌、膣の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、外陰部の癌、陰茎の癌、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌、脊髄軸腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記癌の転移性病変、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０７８８】
実施形態において、多重特異性分子（または医薬組成物）は、治療または予防される疾患に適切な方法で投与される。投与の量および頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定される。適切な投与量は、臨床試験によって決定され得る。例えば、「有効量」または「治療量」が示される場合、投与される医薬組成物（または多重特異性分子）の正確な量は、腫瘍のサイズの個人差、感染または転移の程度、対象の年齢、体重、および病態を考慮して、医師によって決定され得る。実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、１０４〜１０９個の細胞／ｋｇ体重、例えば、１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重の投与量（それらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得る。実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、これらの投与量で複数回投与され得る。実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、免疫療法において説明される注入技術を用いて投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８を参照）。
【０７８９】
実施形態において、多重特異性分子または医薬組成物は、非経口的に対象に投与される。実施形態において、細胞は、静脈内に、皮下に、腫瘍内に、リンパ節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、筋肉内に、皮内に、または腹腔内に、対象に投与される。実施形態において、細胞は、腫瘍またはリンパ節内に直接、投与され、例えば注入される。実施形態において、細胞は、注入（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８に記載されるように）または静脈内プッシュとして投与される。実施形態において、細胞は、注射可能なデポー製剤として投与される。実施形態において、対象は、哺乳動物である。実施形態において、対象は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、またはマウスである。実施形態において、対象は、ヒトである。実施形態において、対象は、例えば、１８歳未満、例えば、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳未満またはそれを下回る小児対象である。実施形態において、対象は、例えば、少なくとも１８歳、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、または８０〜９０歳の成人である。
【０７９０】
併用療法
本明細書に開示される多重特異性分子は、第２の治療剤または手順と組み合わせて使用され得る。
【０７９１】
実施形態において、多重特異性分子および第２の治療剤または手順は、対象が癌と診断された後、例えば、癌が対象から除去される前に投与／実施される。実施形態において、多重特異性分子および第２の治療剤または手順は、同時にまたは並行して投与／実施される。例えば、１つの治療の送達は、第２の送達が開始するときに依然として行われており、例えば、治療の投与の重複がある。他の実施形態において、多重特異性分子および第２の治療剤または手順は、連続して投与／実施される。例えば、１つの治療の送達は、他の治療の送達が開始する前に停止する。
【０７９２】
実施形態において、併用療法は、いずれかの薬剤単独での単剤療法より有効な治療をもたらし得る。実施形態において、第１および第２の治療の組合せは、単独の第１または第２の治療より有効である（例えば、症状および／または癌細胞のより大きい減少をもたらす）。実施形態において、併用療法は、単剤療法として投与されるときと同様の効果を得るのに通常必要とされる第１または第２の治療の用量と比較して、第１または第２の治療のより低い用量の使用を可能にする。実施形態において、併用療法は、部分的な相加効果、完全な相加効果を有するか、または相加効果を超える効果を有する。
【０７９３】
一実施形態において、多重特異性分子は、治療、例えば、癌治療（例えば、抗癌剤、免疫療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）、手術および／または放射線の１つまたは複数）と組み合わせて投与される。「化学療法薬」、「化学療法剤」および「抗癌剤」という用語は、本明細書において同義的に使用される。多重特異性分子および治療、例えば、癌治療の投与は、連続（重複を伴うかまたは伴わない）または同時であり得る。多重特異性分子の投与は、治療（例えば、癌治療）の過程において、連続的または断続的であり得る。本明細書に記載されるいくつかの治療を用いて、癌および非癌性疾患を治療することができる。例えば、ＰＤＴ有効性は、本明細書に記載される方法および組成物を用いて、癌性および非癌性の病態（例えば、結核）において強化され得る（例えば、Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６１：２５０−２８１に概説される）。
【０７９４】
抗癌治療
他の実施形態において、多重特異性分子は、低または小分子量化学療法剤と組み合わせて投与される。例示的な低または小分子量化学療法剤としては、限定はされないが、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標））、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（商標））、５−アザシチジン（アザシチジン、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、フルオロウラシル、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、メルカプトプリン、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、６−ＴＧ（６−チオグアニン、チオグアニン、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ（登録商標））、アブラキサン（タンパク結合パクリタキセル）、アクチノマイシン−Ｄ（ダクチノマイシン、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、オール−トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アメトプテリン（メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、ＭＴＸ、ＴＲＥＸＡＬＬ（商標）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標））、アミホスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アラビノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ、シタラビン、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、三酸化ヒ素（ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）、ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標））、ＢＣＮＵ（カルムスチン、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、カルシウムロイコボリン（シトロボラム因子、フォリン酸、ロイコボリン）、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１、イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチンウェハー（カルムスチンインプラントを有するプロリフェプロスパン（ｐｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ）２０、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウェハー）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＣＣＮＵ（ロムスチン、ＣｅｅＮＵ）、ＣＤＤＰ（シスプラチン、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標））、クロラムブシル（ロイケラン）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＩＣ、ＤＴＩＣ、イミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダウノマイシン（ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ルビドマイシン塩酸塩、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、デクスラゾキサン（ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ドセタキセ���（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））、エストラムスチン（ＥＭＣＹＴ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６、リン酸エトポシド、ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、フルオロウラシル（クリーム）（ＣＡＲＡＣ（商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ヒドロキシウレア（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）、ＤＲＯＸＩＡ（商標）、ＭＹＬＯＣＥＬ（商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（商標））、ＬＣＲ（ロイロクリスチン（ｌｅｕｒｏｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン、ＶＣＲ、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）、ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標））、Ｌ−ＰＡＭ（Ｌ−サルコリシン、メルファラン、フェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、メクロレタミン（メクロレタミン塩酸塩、ムスチン、ナイトロジェンマスタード、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、メスナ（ＭＥＳＮＥＸ（商標））、マイトマイシン（マイトマイシン−Ｃ、ＭＴＣ、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＯＮＸＡＬ（商標））、ペガスパルガーゼ（ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド（ＶＭ−２６、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、ＴＥＳＰＡ（チオホスファミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ）、チオテパ、ＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカレウコブラスチン、ＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビノレルビン（ビノレルビン酒石酸塩、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、およびボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標））が挙げられる。
【０７９５】
別の実施形態において、多重特異性分子は、生物製剤とともに投与される。癌の治療に有用な生物製剤は、当該技術分野において公知であり、本発明の結合分子は、例えば、このような公知の生物製剤とともに投与され得る。例えば、ＦＤＡは、乳癌の治療のための以下の生物製剤を承認している：ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）；ＨＥＲ２陽性乳癌において抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）；乳癌を治療するのに使用されるエストロゲン−受容体拮抗薬）；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；エストロゲンを作製するのに必要とされる酵素であるアロマターゼをブロックする非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；乳癌の治療に使用される不可逆的ステロイド性アロマターゼ不活性化剤）；ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．）；乳癌を治療するためにＦＤＡによって承認された非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；およびＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ；乳癌を治療するためにＦＤＡによって承認された非ステロイド性抗エストロゲン剤）。本発明の結合分子と組み合わされ得る他の生物製剤としては、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；血管新生を阻害するように設計された最初にＦＤＡに承認された治療）；およびＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）；Ｂ細胞リンパ腫の治療のために現在承認されている放射性標識モノクローナル抗体）が挙げられる。
【０７９６】
さらに、ＦＤＡは、大腸癌の治療のための以下の生物製剤を承認している：ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）；ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）、およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）は；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して指向されたモノクローナル抗体である）；ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（メシル酸イマチニブ；プロテインキナーゼ阻害剤）；およびＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（登録商標）（レバミゾール塩酸塩、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ（Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）；デュークスステージＣ結腸癌を有する患者における外科的切除後の５−フルオロウラシルと組み合わされた補助療法として１９９０年にＦＤＡによって承認された免疫調節剤）。
【０７９７】
肺癌の治療では、例示的な生物製剤としては、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）；ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的化するように設計された小分子）が挙げられる。
【０７９８】
多発性骨髄腫の治療では、例示的な生物製剤としては、ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）；プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。さらなる生物製剤としては、ＴＨＡＬＩＤＯＭＩＤ（登録商標）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｒｒｅｎ，Ｎ．Ｊ．）；骨髄腫細胞の増殖および生存を阻害する能力ならびに抗血管新生を含む、複数の作用を有するようである免疫調節剤）が挙げられる。
【０７９９】
さらなる例示的な癌治療抗体としては、限定はされないが、３Ｆ８、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴール、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）、ＭＡＢＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、アルツモマブペンテテート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（ＨＹＢＲＩ−ＣＥＡＫＥＲ（登録商標））、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ（ＩＭＡ−６３８）、アポリズマブ、アルシツモマブ（ＣＥＡ−ＳＣＡＮ（登録商標））、バビツキシマブ、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（ＬＹＭＰＨＯＳＣＡＮ（登録商標））、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標）、ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ（登録商標））、ベシレソマブ（ＳＣＩＮＴＩＭＵＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド（ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（登録商標））、カツマキソマブ（ＲＥＭＯＶＡＢ（登録商標））、ＣＣ４９、セツキシマブ（Ｃ２２５、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、シタツズマブボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダセツズマブ、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標））、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エドレコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））、エロツズマブ、エピツモマブシツキセタン（ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（ＲＥＸＯＭＵＮ（登録商標））、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、フレソリムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グラムバツムマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、イブリツモマブ（イブリツモマブチウキセタン、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）（ＩＮＤＩＭＡＣＩＳ−１２５（登録商標））、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ（ＣＥＡ−ＣＩＤＥ（登録商標））、レクサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、ナコロマブタフェナトクス（ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナプツモマブエスタフェナトクス（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ  ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ネシツムマブ、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ（登録商標）、ＴＨＥＲＡＬＯＣ（登録商標））、ノフェツモマブメルペンタン（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ  ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）（ＶＥＲＬＵＭＡ（登録商標））、オファツムマブ（ＡＲＺＥＲＲＡ（登録商標））、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトクス（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（ＯＶＡＲＥＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペンツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（ＴＨＥＲＡＧＹＮ（登録商標））、パーツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標））、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラムシルマブ、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、リロツムマブ（ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（ＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブペンデチド（ｓａｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シルツキシマブ（ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、ソンツズマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（ＡＦＰ−ＣＩＤＥ（登録商標））、タプリツモマブパプトクス（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、ティガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（ＨＵＭＡＳＰＥＣＴ（登録商標））、ザノリムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＥＧＦＲ（登録商標））、およびザノリムマブ（ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４（登録商標））が挙げられる。
【０８００】
他の実施形態において、多重特異性分子は、ウイルス癌治療剤と組み合わせて投与される。例示的なウイルス癌治療剤としては、限定はされないが、ワクシニアウイルス（ｖｖＤＤ−ＣＤＳＲ）、癌胎児性抗原発現麻疹ウイルス、組み換えワクシニアウイルス（ＴＫ−欠失＋ＧＭ−ＣＳＦ）、セネカバレーウイルス−００１、ニューカッスル病ウイルス、コクサッキーウイルスＡ２１、ＧＬ−ＯＮＣ１、ＥＢＮＡ１  Ｃ末端／ＬＭＰ２キメラタンパク質発現組み換え修飾型ワクシニアアンカラワクチン、癌胎児性抗原発現麻疹ウイルス、Ｇ２０７腫瘍溶解性ウイルス、ｐ５３発現修飾型ワクシニアアンカラウイルスワクチン、ＯｎｃｏＶＥＸ  ＧＭ−ＣＳＦ修飾型１型単純ヘルペスウイルス、鶏痘ウイルスワクチンベクター、組み換えワクシニア前立腺特異的抗原ワクチン、ヒトパピローマウイルス１６／１８  Ｌ１ウイルス様粒子／ＡＳ０４ワクチン、ＭＶＡ−ＥＢＮＡ１／ＬＭＰ２  Ｉｎｊ．ワクチン、四価ＨＰＶワクチン、四価ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８型）組み換えワクチン（ＧＡＲＤＡＳＩＬ（登録商標））、組み換え鶏痘−ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭワクチン；組み換えワクシニア−ＣＥＡ（６Ｄ）−ＴＲＩＣＯＭワクチン、組み換え修飾型ワクシニアアンカラ−５Ｔ４ワクチン、組み換え鶏痘−ＴＲＩＣＯＭワクチン、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスＮＶ１０２０、ＨＰＶ  Ｌ１  ＶＬＰワクチンＶ５０４、ヒトパピローマウイルス二価（１６および１８型）ワクチン（ＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標））、単純ヘルペスウイルスＨＦ１０、Ａｄ５ＣＭＶ−ｐ５３遺伝子、組み換えワクシニアＤＦ３／ＭＵＣ１ワクチン、組み換えワクシニア−ＭＵＣ−１ワクチン、組み換えワクシニア−ＴＲＩＣＯＭワクチン、ＡＬＶＡＣ  ＭＡＲＴ−１ワクチン、複製欠損Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ベクター発現ヒトプレプロエンケファリン（ＮＰ２）、野生型レオウイルス、レオウイルス３型Ｄｅａｒｉｎｇ（ＲＥＯＬＹＳＩＮ（登録商標））、腫瘍溶解性ウイルスＨＳＶ１７１６、エプスタイン・バーウイルス標的抗原をコードする組み換え修飾型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベースのワクチン、組み換え鶏痘−前立腺特異的抗原ワクチン、組み換えワクシニア前立腺特異的抗原ワクチン、組み換えワクシニア−Ｂ７．１ワクチン、ｒＡｄ−ｐ５３遺伝子、Ａｄ５−デルタ２４ＲＧＤ、ＨＰＶワクチン５８０２９９、ＪＸ−５９４（チミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルス＋ＧＭ−ＣＳＦ）、ＨＰＶ−１６／１８  Ｌ１／ＡＳ０４、鶏痘ウイルスワクチンベクター、ワクシニア−チロシナーゼワクチン、ＭＥＤＩ−５１７  ＨＰＶ−１６／１８  ＶＬＰ  ＡＳ０４ワクチン、単純ヘルペスウイルスＴＫ９９ＵＮのチミジンキナーゼを含有するアデノウイルスベクター、ＨｓｐＥ７、ＦＰ２５３／フルダラビン、ＡＬＶＡＣ（２）黒色腫多重抗原治療用ワクチン、ＡＬＶＡＣ−ｈＢ７．１、カナリアポックス−ｈＩＬ−１２黒色腫ワクチン、Ａｄ−ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３、ｒＡｄ−ＩＦＮ  ＳＣＨ  ７２１０１５、ＴＩＬ−Ａｄ−ＩＮＦｇ、Ａｄ−ＩＳＦ３５、およびコクサッキーウイルスＡ２１（ＣＶＡ２１、ＣＡＶＡＴＡＫ（登録商標））が挙げられる。
【０８０１】
他の実施形態において、多重特異性分子は、ナノ医薬品と組み合わせて投与される。例示的な癌ナノ医薬品としては、限定はされないが、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（パクリタキセル結合アルブミンナノ粒子）、ＣＲＬＸ１０１（直鎖状のシクロデキストリンベースのポリマーにコンジュゲートされたＣＰＴ）、ＣＲＬＸ２８８（ドセタキセルを生分解性ポリマーポリ（乳酸−コ−グリコール酸）にコンジュゲートする）、シタラビンリポソーム（リポソームＡｒａ−Ｃ、ＤＥＰＯＣＹＴ（商標））、ダウノルビシンリポソーム（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、ドキソルビシンリポソーム（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、封入ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、およびＰＥＧ抗ＶＥＧＦアプタマー（ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標））が挙げられる。
【０８０２】
ある実施形態において、多重特異性分子は、パクリタキセルまたはパクリタキセル製剤、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）、タンパク結合パクリタキセル（例えば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））と組み合わせて投与される。例示的なパクリタキセル製剤としては、限定はされないが、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（Ａｂｒａｘｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって販売されるＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル（ＤＨＡ−パクリタキセル、Ｐｒｏｔａｒｇａによって販売されるＴａｘｏｐｒｅｘｉｎ）、ポリグルタミン酸塩結合パクリタキセル（ＰＧ−パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメクス（ｐｏｌｉｇｌｕｍｅｘ）、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃによって販売されるＣＴ−２１０３、ＸＹＯＴＡＸ）、腫瘍活性化プロドラッグ（ＴＡＰ）、ＡＮＧ１０５（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎによって販売される、パクリタキセルの３つの分子に結合されたＡｎｇｉｏｐｅｐ−２）、パクリタキセル−ＥＣ−１（ｅｒｂＢ２認識ペプチドＥＣ−１に結合されたパクリタキセル；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２００７）８７：２２５−２３０を参照）、およびグルコースコンジュゲートパクリタキセル（例えば、２’−パクリタキセルメチル２−グルコピラノシルスクシネート、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００７）１７：６１７−６２０を参照）が挙げられる。
【０８０３】
癌を治療するための例示的なＲＮＡｉおよびアンチセンスＲＮＡ剤としては、限定はされないが、ＣＡＬＡＡ−０１、ｓｉＧ１２Ｄ  ＬＯＤＥＲ（Ｌｏｃａｌ  Ｄｒｕｇ  ＥｌｕｔｅＲ）、およびＡＬＮ−ＶＳＰ０２が挙げられる。
【０８０４】
他の癌治療剤としては、限定はされないが、サイトカイン（例えば、アルデスロイキン（ＩＬ−２、インターロイキン−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標））、αインターフェロン（ＩＦＮ−α、インターフェロンα、ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（インターフェロンα−２ｂ）、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標）（インターフェロンα−２ａ））、エポエチンアルファ（ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標））、フィルグラスチム（Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球−コロニー刺激因子、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標））、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、サルグラモスチム、ＬＥＵＫＩＮＥ（商標））、ＩＬ−１１（インターロイキン−１１、オプレルベキン、ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標））、インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）（ＰＥＧインターフェロン、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（商標））、およびペグフィルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標）））、ホルモン治療剤（例えば、アミノグルテチミド（ＣＹＴＡＤＲＥＮ（登録商標））、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標））、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、フルオキシメステロン（ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標））、フルタミド（ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標））、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、ゴセレリン（ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、ロイプロリド（ＥＬＩＧＡＲＤ（商標）、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）、ＶＩＡＤＵＲ（商標））、メゲストロール（酢酸メゲストロール、ＭＥＧＡＣＥ（登録商標））、ニルタミド（ＡＮＡＮＤＲＯＮ（登録商標）、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標））、オクトレオチド（オクトレオチド酢酸塩、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ  ＬＡＲ（登録商標））、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ロミプロスチム（ＮＰＬＡＴＥ（登録商標））、タモキシフェン（ＮＯＶＡＬＤＥＸ（登録商標））、およびトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）））、ホスホリパーゼＡ２阻害剤（例えば、アナグレリド（ＡＧＲＹＬＩＮ（登録商標）））、生体応答調節剤（例えば、ＢＣＧ（ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）、ＴＩＣＥ（登録商標））、およびダルベポエチンアルファ（ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）））、標的治療剤（例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（商標））、デニロイキンジフチトクス（ＯＮＴＡＫ（登録商標））、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、メシル酸イマチニブ（ＳＴＩ−５７１、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、およびＳＵ１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）））、免疫調節抗血管新生剤（例えば、ＣＣ−５０１３（レナリドミド、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））、およびサリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）））、糖質コルチコステロイド（例えば、コルチゾ��（ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸エステルナトリウム、ＡＬＡ−ＣＯＲＴ（登録商標）、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ  ＡＣＥＴＡＴＥ（登録商標）、ヒドロコルチゾンリン酸エステルＬＡＮＡＣＯＲＴ（登録商標）、ＳＯＬＵ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標））、デカドロン（デキサメタゾン、酢酸デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、ＤＥＸＡＳＯＮＥ（登録商標）、ＤＩＯＤＥＸ（登録商標）、ＨＥＸＡＤＲＯＬ（登録商標）、ＭＡＸＩＤＥＸ（登録商標））、メチルプレドニゾロン（６−メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム、ＤＵＲＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＭＥＤＲＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）、Ｍ−ＰＲＥＤＮＩＳＯＬ（登録商標）、ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標））、プレドニゾロン（ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標）、ＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）、ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）、ＰＲＥＬＯＮＥ（登録商標））、およびプレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＤ  ＰＲＥＤ（登録商標）、ＭＥＴＩＣＯＲＴＥＮ（登録商標）、ＯＲＡＳＯＮＥ（登録商標）））、およびビスホスホネート（例えば、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、およびゾレドロン酸（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）））が挙げられる。
【０８０５】
ある実施形態において、多重特異性分子は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤）と組み合わせて使用される。例示的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、限定はされないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）経路阻害剤（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）経路阻害剤（例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦトラップ、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＶＥＧＦＲ−１阻害剤、ＶＥＧＦＲ−２阻害剤、ＶＥＧＦＲ−３阻害剤））、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）経路阻害剤（例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害剤（例えば、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤））、ＲＡＦ−１阻害剤、ＫＩＴ阻害剤およびＲＥＴ阻害剤が挙げられる。ある実施形態において、ＡＨＣＭ剤と組み合わせて使用される抗癌剤は、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６）、ボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ（商標）、ＡＺＤ２１７１）、ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）、ＢＭＳ−３５４８２５）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＣＧＰ５７１４８Ｂ、ＳＴＩ−５７１）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＴＹＶＥＲＢ（登録商標））、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、セマクサニブ（セマキシニブ、ＳＵ５４１６）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、トセラニブ（ＰＡＬＬＡＤＩＡ（登録商標））、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＺＤ６４７４）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７、ＰＴＫ／ＺＫ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、ニロチニブ（ＴＡＳＩＧＮＡ（登録商標））、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標））、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、ＥＮＭＤ−２０７６、ＰＣＩ−３２７６５、ＡＣ２２０、ドビチニブラクテート（ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ  ｌａｃｔａｔｅ）（ＴＫＩ２５８、ＣＨＩＲ−２５８）、ＢＩＢＷ  ２９９２（ＴＯＶＯＫ（商標））、ＳＧＸ５２３、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−２９９８０４、ＢＭＳ−７７７６０７、ＡＢＴ−８６９、ＭＰ４７０、ＢＩＢＦ  １１２０（ＶＡＲＧＡＴＥＦ（登録商標））、ＡＰ２４５３４、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＭＧＣＤ２６５、ＤＣＣ−２０３６、ＢＭＳ−６９０１５４、ＣＥＰ−１１９８１、チボザニブ（ｔｉｖｏｚａｎｉｂ）（ＡＶ−９５１）、ＯＳＩ−９３０、ＭＭ−１２１、ＸＬ−１８４、ＸＬ−６４７、ＸＬ２２８、ＡＥＥ７８８、ＡＧ−４９０、ＡＳＴ−６、ＢＭＳ−５９９６２６、ＣＵＤＣ−１０１、ＰＤ１５３０３５、ペリチニブ（ｐｅｌｉｔｉｎｉｂ）（ＥＫＢ−５６���）、バンデタニブ（ｚａｃｔｉｍａ）、ＷＺ３１４６、ＷＺ４００２、ＷＺ８０４０、ＡＢＴ−８６９（リニファニブ）、ＡＥＥ７８８、ＡＰ２４５３４（ポナチニブ）、ＡＶ−９５１（チボザニブ）、アキシチニブ、ＢＡＹ  ７３−４５０６（レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ））、ブリバニブアラニネート（ｂｒｉｖａｎｉｂ  ａｌａｎｉｎａｔｅ）（ＢＭＳ−５８２６６４）、ブリバニブ（ＢＭＳ−５４０２１５）、セジラニブ（ＡＺＤ２１７１）、ＣＨＩＲ−２５８（ドビチニブ）、ＣＰ  ６７３４５１、ＣＹＣ１１６、Ｅ７０８０、Ｋｉ８７５１、マシチニブ（ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）（ＡＢ１０１０）、ＭＧＣＤ−２６５、モテサニブジホスフェート（ｍｏｔｅｓａｎｉｂ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＡＭＧ−７０６）、ＭＰ−４７０、ＯＳＩ−９３０、パゾパニブ塩酸塩、ＰＤ１７３０７４、ソラフェニブトシル酸塩（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  Ｔｏｓｙｌａｔｅ）（Ｂａｙ  ４３−９００６）、ＳＵ  ５４０２、ＴＳＵ−６８（ＳＵ６６６８）、バタラニブ、ＸＬ８８０（ＧＳＫ１３６３０８９、ＥＸＥＬ−２８８０）からなる群から選択される。選択されるチロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはソラフェニブから選択される。一実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、スニチニブである。
【０８０６】
一実施形態において、多重特異性分子は、抗血管新生剤、または血管標的化剤または血管破壊剤の１つまたは複数と組み合わせて投与される。例示的な抗血管新生剤としては、特に、限定はされないが、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）；ＶＥＧＦ受容体阻害剤（例えば、イトラコナゾール）；内皮細胞の細胞増殖および／または遊走の阻害剤（例えば、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０）；血管新生刺激剤の阻害剤（例えば、スラミン）が挙げられる。血管標的化剤（ＶＴＡ）または血管破壊剤（ＶＤＡ）は、癌腫瘍の血管系（血管）を損傷して、中心壊死を引き起こすように設計される（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１０：４１５−４２７に概説される）。ＶＴＡは、小分子であり得る。例示的な小分子ＶＴＡとしては、限定はされないが、微小管不安定化薬剤（例えば、コンブレタスタチンＡ−４リン酸二ナトリウム（ＣＡ４Ｐ）、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２、Ｏｘｉ  ４５０３）；およびバジメザン（ｖａｄｉｍｅｚａｎ）（ＡＳＡ４０４）が挙げられる。
【０８０７】
免疫チェックポイント阻害剤
他の実施形態において、本明細書に記載される方法は、多重特異性分子と組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤の使用を含む。本方法は、インビボで治療プロトコルに使用され得る。
【０８０８】
実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子を阻害する。例示的なチェックポイント分子としては、限定はされないが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、およびＡ２ａＲが挙げられる。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １２．４（２０１２）：２５２−６４（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０８０９】
実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブなどの抗ＰＤ−１抗体である。ニボルマブ（ＭＤＸ−１１０６、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８とも呼ばれる）は、ＰＤ１を特異的に阻害する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、米国特許第８，００８，４４９号明細書および国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットを参照されたい。ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ−９００４７５またはＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。例えば、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６９（２）：１３４−４４、米国特許第８，３５４，５０９号明細書および国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットを参照されたい。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１またはＣｕｒｅ  Ｔｅｃｈとも呼ばれる）は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。例えば、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットを参照されたい。一実施形態において、ＰＤ−１の阻害剤は、それと実質的に同一または類似の配列、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはピディリズマブの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれを超えて同一の配列を有する抗体分子である。さらなる抗ＰＤ１抗体、例えば、ＡＭＰ  ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）は、例えば、米国特許第８，６０９，０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１００２８３３０号明細書、および／または米国特許出願公開第２０１２０１１４６４９号明細書に記載されている。
【０８１０】
ある実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、イムノアドヘシン、例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域）に融合されるＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）の細胞外／ＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。実施形態において、ＰＤ−１阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（例えば、国際公開第２０１１／０６６３４２号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレットに記載されるＢ７−ＤＣＩｇ）、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０８１１】
実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば、抗体分子である。ある実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、またはＭＤＸ−１１０５である。ある実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ａ０９−２４６−２とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）であり、これは、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。例示的なヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、国際公開第２０１３／０７９１７４号パンフレットに記載されている。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０抗体は、例えば、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載されている。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、例えば、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載されるＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９とも呼ばれる）である。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）であり、これは、ＰＤ−Ｌ１に対するヒトＦｃ−最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、米国特許第７，９４３，７４３号明細書および米国特許出願公開第２０１２００３９９０６号明細書を参照されたい。一実施形態において、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、それと実質的に同一または類似の配列、例えば、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、またはＭＤＸ−１１０５の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれを超えて同一の配列を有する抗体分子である。
【０８１２】
実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ２阻害剤、例えば、ＡＭＰ−２２４である（これは、ＰＤ１とＢ７−Ｈ１との間の相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合可溶性受容体である。例えば、国際公開第２０１０／０２７８２７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６６３４２号パンフレットを参照されたい。
【０８１３】
一実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ−３阻害剤、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体分子である。実施形態において、抗ＬＡＧ−３抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６（ＢＭＳ９８６０１６とも呼ばれる；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）である。ＢＭＳ−９８６０１６および他のヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号明細書、国際公開第２０１０／０１９５７０号パンフレット、および国際公開第２０１４／００８２１８号パンフレットに記載されている。
【０８１４】
実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、米国特許第８，５５２，１５６号明細書、国際公開第２０１１／１５５６０７号パンフレット、欧州特許第２５８１１１３号明細書および米国特許出願公開第２０１４／０４４７２８号明細書に記載されるＴＩＭ−３阻害剤、例えば抗ＴＩＭ３抗体分子である。
【０８１５】
実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４阻害剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体分子である。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ製のＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブとして知られていた、ＣＰ−６７５，２０６）；およびイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０とも呼ばれる、ＣＡＳ  Ｎｏ．４７７２０２−００−９）が挙げられる。他の例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、米国特許第５，８１１，０９７号明細書に記載されている。
【実施例】
【０８１６】
以下の実施例は、例示的であることが意図され、決して限定的であることは意図されていない。
【０８１７】
多重特異性分子およびその使用に向けられた実施例
一般的な方法：
１．プラスミドの構築
タンパク質配列をコードするＤＮＡをモンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）における発現について最適化し、合成し、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いて、ｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６９７）へとクローニングした。全ての構築物は、Ｉｇκリーダー配列（配列番号８４
【化１３６】
2019512272.tif 000204
、配列番号１６ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）を含んでいた。使用される核酸配列は、表１に示される。
【０８１８】
２．発現および精製
プラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４５２７）またはＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ２９１２７）のいずれかへと共トランスフェクトした。１：１のノブ対ホール重鎖比および３：２の軽鎖対重鎖比を用いて、多重特異性構築物のために１ｍｇの全ＤＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。ビオチン化が必要とされる場合、多重特異性構築物ＤＮＡに加えて、１リットル当たり２５０μｇの配列番号２２６のＢｉｒＡを加えた。Ｅｘｐｉ２９３細胞におけるトランスフェクションを、全ＤＮＡを用いて３：１の比率で直鎖状２５，０００Ｄａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ  ２３９６６）を用いて行った。ＤＮＡおよびＰＥＩをそれぞれ５０ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３１９８５０８８）培地に加え、滅菌ろ過した。ＤＮＡおよびＰＥＩを、１０分間組み合わせて、１．８〜２．８×１０６個の細胞／ｍＬの細胞密度および少なくとも９５％の生存率を有するＥｘｐｉ２９３細胞に加えた。ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションを、製造業者の指示に従って行った。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、トランスフェクション後５〜７日間にわたって８％のＣＯ２により、３７℃において、加湿したインキュベータ中で成長させ、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、５％のＣＯ２により、３２℃において１４日間にわたって成長させた。細胞を、４５００×ｇで遠心分離によってペレット化し、上清を０．２μｍの膜に通してろ過した。プロテインＡ樹脂（ＧＥ  １７−１２７９−０３）を、ろ過された上清に加え、室温で１〜３時間インキュベートした。樹脂を、３×１０カラム体積のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０−１４４）で洗浄されたカラムに充填した。結合タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．９を含むカラムから溶出した。必要に応じて、ＤＰＢＳの泳動用緩衝液を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにおいて、リガンド親和性および／またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、タンパク質をさらに精製した。
【０８１９】
３．ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、Ｐｉｅｒｃｅ  ９６ウェルストレプトアビジン被覆高容量プレート（１５５００）またはＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ９６ウェルマキシソーププレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４４−２４０４−２１）のいずれかを用いて行った。プレートを１×リン酸緩衝生理食塩水ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｉｅｒｃｅ  ２８３５２）で洗浄し、次に１０μｇ／ｍＬの捕捉タンパク質で被覆した。振とうしながら室温で２時間インキュベートした後、プレートを１×ＰＢＳＴで洗浄し、分子を、１μＭ〜１ｐＭの連続希釈を用いて行Ａ〜Ｇに加えた。プレートを３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬの、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされたａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０９−０３５−００８）またはストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ９９８）のいずれかを各ウェルに加えた。プレートを振とうしながら３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬの１−ｓｔｅｐ  ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２２）を各ウェルに加えた。プレートを５分間インキュベートし、１００μＬの１ＭのＨＣｌを用いて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーにおける４５０ｎｍでの吸光度を用いて、プレートを読み取った。
【０８２０】
４．細胞殺滅アッセイ
産生された構築物の活性を評価するために、ＢｘＰＣ３−ルシフェラーゼ細胞殺滅アッセイを行った。ルシフェラーゼ（Ｇｅｎｅｃｏｐｉａ  ＳＣＬ−Ｃ０１２−ＨＬＧ）を含有するＢｘＰＣ３細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ａ１１１３８０２）とともに、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  １１８７５１１９）および１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  １００８２１４７）中で成長させた。この細胞を用いて、１ウェル当たり１５，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種した。１日インキュベートした後、培地を除去し、０．５％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０１２２）を含む無血清培地ＲＰＭＩ１６４０と交換した。無血清培地中のＰＢＭＣ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ｌｏｔ  ＃  ＬＰ＿１２３）を、４５０，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートの行Ａ〜Ｇに加えた。化合物を、行Ａ〜Ｆ中の１μＭ〜１ｐＭの範囲の濃度において３連でカラムに加えた。プレートを測定前に６または２４時間インキュベートした。細胞殺滅測定へと進む前に１２０μＬを各ウェルから取り出し、９６ウェル低結合タンパク質プレートに加えた。これにより８０μＬがプレートに残り、８０μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６１０）を各ウェルに加えた。次に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーにおいてプレートを読み取った。
【０８２１】
５．サイトカイン放出アッセイ
サイトカイン放出アッセイのために、細胞殺滅プレートから取り出した上清を、ｑｕａｎｓｙｓ洗浄緩衝液で５倍に希釈した。ＱｕａｎｓｙｓヒトＩＦＮγ（Ｑｕａｎｓｙｓ  ４６４６４９ＨＵ）ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイキットについて、製造業者の指示に従った。プレートをＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋において撮像し、Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｑ−ｖｉｅｗソフトウェアを用いて分析した。
【０８２２】
実施例１
３つの異なるタンパク質鎖：配列番号１６８、配列番号１６９、および配列番号１９６を含む、メソテリンを標的化するＦａｂアームおよびＩＬ２エフェクターアームを含有する多重特異性分子１を、細胞に、配列番号１１６、配列番号１１８、および配列番号１１９を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２１に示される。図４３は、多重特異性分子１のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１１２ｐＭのＥＣ５０が得られた（図４８）。図５３は、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を評価し、１１１ｐＭのＥＣ５０が得られたことを示す。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、７９ｐＭであった（図５８）。図５９は、アッセイにおける多重特異性分子１についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８２３】
実施例２
配列番号１７４、配列番号１６９、配列番号１９６を含む、メソテリンを標的化するＦａｂアーム、ＩＬ２エフェクターアーム、および抗ＮＫｐ３０  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子２を、細胞に、配列番号１１７、配列番号１１８、および配列番号１１９を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２２に示される。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１．３８ｎＭのＥＣ５０が得られた（図４８）。図５３は、１５４ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を示す。配列番号１８０から生成されるヒトＮＫｐ３０との結合により、２３０ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５５）。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、４．７ｐＭであった（図５８）。図５９は、アッセイにおける多重特異性分子２についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８２４】
実施例３
配列番号１７４、配列番号１６９、および配列番号１９７を含む、メソテリン標的化アームおよび抗ＮＫｐ３０  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子３を、細胞に、配列番号１１７、配列番号１１８、および配列番号１２５を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子３を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２３に示される。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１５２ｐＭのＥＣ５０が得られた（図４８）。配列番号１８０から生成されるヒトＮＫｐ３０との結合により、９３．４ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５５）。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、５．９ｐＭであった（図５８）。図５９は、アッセイにおける多重特異性分子３についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８２５】
実施例４
配列番号１７６および配列番号１９６を含む、ＩＬ２エフェクターアームを含有する多重特異性分子４を、細胞に、配列番号１２４および配列番号１１９を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子４を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２４に示される。図５３は、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を評価し、１１０ｐＭのＥＣ５０が得られたことを示す。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、４１ｐＭであった（図５８）。図５９は、アッセイにおける多重特異性分子４についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８２６】
実施例５
配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アームおよびＰＤＬ１標的化アームを含有する多重特異性分子５を、細胞に、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子５を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２５に示される。図４４は、多重特異性分子５のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１６３ｎＭのＥＣ５０が得られた（図４９）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２５０ｐＭのＥＣ５０が得られた（図５１）。多重特異性分子５は、細胞殺滅アッセイにおいて有意な効果を有さなかった（図６０）。
【０８２７】
実施例６
配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７７、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、およびＩＬ２エフェクターアームを含有する多重特異性分子６を、細胞に、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２０、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子６を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２６に示される。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１３．１ｎＭのＥＣ５０が得られた（図４９）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、３６３ｐＭのＥＣ５０が得られた（図５１）。図５４は、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を評価し、１５６ｐＭのＥＣ５０が得られたことを示す。多重特異性分子６は、図６０に示される細胞殺滅アッセイにおいて、１５９ｐＭのＥＣ５０を示した。
【０８２８】
実施例７
配列番号１９３、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子７を、細胞に、配列番号１３６、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子７を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２７に示される。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２．３７ｎＭのＥＣ５０が得られた（図４９）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１５８ｐＭのＥＣ５０が得られた（図５１）。図５６は、４５０ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。多重特異性分子７は、１５ｐＭのＥＣ５０で、細胞殺滅アッセイにおいて細胞の増殖を示した（図６０）。
【０８２９】
実施例８
配列番号１９３、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、ＩＬ２エフェクターアーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子８を、細胞に、配列番号１３６、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子８を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２８に示される。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１．７７ｎＭのＥＣ５０が得られた（図４９）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２５５ｐＭのＥＣ５０が得られた（図５２）。図５４は、８４ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を示す。図５７は、６７０ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。多重特異性分子８は、４４ｐＭのＥＣ５０で、細胞殺滅アッセイにおいて細胞の増殖を示した（図６０）。
【０８３０】
実施例９
配列番号１９３、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子９を、細胞に、配列番号１３６、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子９を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図２９に示される。配列番号１８１のタンパク質１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２７５ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５０）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１２４ｐＭのＥＣ５０が得られた（図５１）。図５６は、６．２ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。多重特異性分子９は、８４ｐＭのＥＣ５０で、細胞殺滅アッセイにおいて細胞の増殖を示した（図）。
【０８３１】
実施例１０
配列番号１９３、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、ＩＬ２エフェクターアーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子１０を、細胞に、配列番号１３６、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１０を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３０に示される。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２６３ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５０）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１．９１ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５２）。図５４は、８８ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を示す。図５７は、１．８ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。多重特異性分子１０は、３５ｐＭのＥＣ５０で、細胞殺滅アッセイにおいて細胞の増殖を示した（図６１）。
【０８３２】
実施例１１
配列番号１９３、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子１１を、細胞に、配列番号１３６、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１１を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３１に示される。図４５は、多重特異性分子１１のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２０６ｐＭのＥＣ５０が得られた（図５２）。図５６は、８．７ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。多重特異性分子１１は、１１９ｐＭのＥＣ５０で、細胞殺滅アッセイにおいて細胞の増殖を示した（図６２）。
【０８３３】
実施例１２
配列番号１９３、配列番号１７３、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アーム、ＰＤＬ１標的化アーム、ＩＬ２エフェクターアーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子１２を、細胞に、配列番号１３６、配列番号１２３、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１２を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３２に示される。図２６は、多重特異性分子１２のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１８１のヒトメソテリンを用いて行われたＥＬＩＳＡにより、２１６ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５０）。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１．８２ｎＭのＥＣ５０が得られた（図５２）。図５４は、１０７ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１８２のヒトＩＬ２受容体αとの結合を示す。図５７は、１９．３ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。多重特異性分子１２は、１６ｐＭのＥＣ５０で、細胞殺滅アッセイにおいて細胞の増殖を示した（図６２）。
【０８３４】
実施例１３
配列番号１８７、配列番号１８５、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、およびＩＬ２エフェクターアームを含有する多重特異性分子１３を、細胞に、配列番号ＤＮＡ  ＢＨ０２２、配列番号１２８、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１３を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３３に示される。図４７は、多重特異性分子１３のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１８２からのヒトＩＬ２Ｒαを用いた多重特異性分子１３のＥＬＩＳＡにより、８５ｐＭのＥＣ５０が得られた（図６５）。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、１４ｐＭであった（図６７）。図６８は、アッセイにおける多重特異性分子１３についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８３５】
実施例１４
配列番号１８８、配列番号１８３、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子１４を、細胞に、配列番号１３１、配列番号１２６、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１４を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３４に示される。図６６は、２．３ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、１００ｐＭであった（図６７）。図６８は、アッセイにおける多重特異性分子１４についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８３６】
実施例１５
配列番号１８９、配列番号１８３、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、およびＣＤ３標的化アームを含有する多重特異性分子１５を、細胞に、配列番号１３２、配列番号１２６、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１５を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３５に示される。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、２７７ｐＭであった（図６９）。図７０は、アッセイにおける多重特異性分子１５についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８３７】
実施例１６
配列番号１８８、配列番号１８５、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ、およびＩＬ２エフェクターアームを含有する多重特異性分子１６を、細胞に、配列番号１３１、配列番号１２８、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１６を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３６に示される。配列番号１８２からのヒトＩＬ２Ｒαを用いた多重特異性分子１６のＥＬＩＳＡにより、１６７ｐＭのＥＣ５０が得られた（図６５）。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、３３０ｐＭであった（図６７）。図６８は、アッセイにおける多重特異性分子１６についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８３８】
実施例１７
配列番号１８９、配列番号１８５、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、ＣＤ３標的化アーム、およびＩＬ２エフェクターアームを含有する多重特異性分子１７を、細胞に、配列番号１３２、配列番号１２８、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１７を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３７に示される。配列番号１８２からのヒトＩＬ２Ｒαを用いた多重特異性分子１７のＥＬＩＳＡにより、１１６ｐＭのＥＣ５０が得られた（図６５）。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、１８ｐＭであった（図６９）。図７０は、アッセイにおける多重特異性分子１７についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８３９】
実施例１８
配列番号１８７、配列番号１８３、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アームおよびＩＧＦ１Ｒ標的化アームを含有する多重特異性分子１８を、細胞に、配列番号ＤＮＡ  ＢＨ０２２、配列番号１２６、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１８を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３８に示される。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、２８ｐＭであった（図６７）。図６８は、アッセイにおける多重特異性分子１８についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８４０】
実施例１９
配列番号１８７、配列番号１８６、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、およびＩＬ７エフェクターアームを含有する多重特異性分子１９を、細胞に、配列番号１３０、配列番号１２９、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子１９を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図３９に示される。
【０８４１】
実施例２０
配列番号１８９、配列番号１８６、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、ＣＤ３標的化アーム、およびＩＬ７エフェクターアームを含有する多重特異性分子２０を、細胞に、配列番号１３２、配列番号１２９、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２０を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図４０に示される。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、４４５ｐＭであった（図７１）。図７２は、アッセイにおける多重特異性分子２０についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８４２】
実施例２１
配列番号１９０、配列番号１６９、配列番号１８６、および配列番号１８４を含む、ＨＥＲ３標的化アーム、ＩＧＦ１Ｒ標的化アーム、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ、およびＩＬ７エフェクターアームを含有する多重特異性分子２１を、細胞に、配列番号１３３、配列番号１１８、配列番号１２８、および配列番号１２７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２１を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図４１に示される。図４６は、１．３ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、７７０ｐＭであった（図７３）。図７４は、アッセイにおける多重特異性分子２１についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８４３】
実施例２２
配列番号１９０、配列番号１６９、配列番号１９２、および配列番号１９１を含む、メソテリン標的化アーム、ＩＬ２エフェクターを有するＰＤＬ１標的化アーム、および抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャを含有する多重特異性分子２２を、細胞に、配列番号１３３、配列番号１１８、配列番号１３５、および配列番号１３４を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２２を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図４２に示される。配列番号１８１からのヒトメソテリンを用いた多重特異性分子２２のＥＬＩＳＡにより、３１０ｐＭのＥＣ５０が得られた（図６３）。図４４は、８ｐＭのＥＣ５０で、配列番号１７８からのヒトＰＤＬ１に結合する多重特異性分子２２についてのデータを示す。配列番号１８２からのヒトＩＬ２Ｒαを用いた多重特異性分子２２のＥＬＩＳＡにより、８．２ｎＭのＥＣ５０が得られた（図６５）。図４６は、２．４ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６との結合を示す。細胞殺滅アッセイにおけるＥＣ５０は、９９５ｐＭであった（図７５）。図７６は、アッセイにおける多重特異性分子２２についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８４４】
実施例２３
配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１９２、および配列番号１７１を含む、メソテリン標的化アームおよびＰＤＬ１標的化アームを含有する多重特異性分子２３を、細胞に、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１３５、および配列番号１２１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２３を精製し、図７５に示される細胞殺滅アッセイに使用して、２５０ｐＭのＥＣ５０を得た。図７６は、アッセイにおける多重特異性分子２３についてのＩＦＮγのサイトカイン放出データを示す。
【０８４５】
間質調節部分を含む多重特異性分子およびその使用に向けられた実施例
一般的な方法：
１．プラスミドの構築
タンパク質配列をコードするＤＮＡをモンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）における発現について最適化し、合成し、Ｇａｔｅｗａｙクローニングを用いて、ｐｃＤＮＡ３．４−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４６９７）へとクローニングした。全ての構築物は、Ｉｇκリーダー配列（配列番号８４
【化１３７】
2019512272.tif 000205
、配列番号６４ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）を含んでいた。使用される核酸配列は、表１０に示される。
【０８４６】
２．発現および精製
プラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１４５２７）またはＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ２９１２７）のいずれかへと共トランスフェクトした。１：１のノブ対ホール重鎖比および３：２の軽鎖対重鎖比を用いて、多重特異性構築物のために１ｍｇの全ＤＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。ビオチン化が必要とされる場合、多重特異性構築物ＤＮＡに加えて、１リットル当たり２５０μｇの配列番号１４４  ２２６のＢｉｒＡを加えた。Ｅｘｐｉ２９３細胞におけるトランスフェクションを、全ＤＮＡを用いて３：１の比率で直鎖状２５，０００Ｄａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ  ２３９６６）を用いて行った。ＤＮＡおよびＰＥＩをそれぞれ５０ｍＬのＯｐｔｉＭｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３１９８５０８８）培地に加え、滅菌ろ過した。ＤＮＡおよびＰＥＩを、１０分間組み合わせて、１．８〜２．８×１０６個の細胞／ｍＬの細胞密度および少なくとも９５％の生存率を有するＥｘｐｉ２９３細胞に加えた。ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションを、製造業者の指示に従って行った。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、トランスフェクション後５〜７日間にわたって８％のＣＯ２により、３７℃において、加湿したインキュベータ中で成長させ、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞を、５％のＣＯ２により、３２℃において１４日間にわたって成長させた。細胞を、４５００×ｇで遠心分離によってペレット化し、上清を０．２μｍの膜に通してろ過した。プロテインＡ樹脂（ＧＥ  １７−１２７９−０３）を、ろ過された上清に加え、室温で１〜３時間インキュベートした。樹脂を、３×１０カラム体積のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １４１９０−１４４）で洗浄されたカラムに充填した。結合タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．９を含むカラムから溶出した。必要に応じて、ＤＰＢＳの泳動用緩衝液を用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにおいて、リガンド親和性および／またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、タンパク質をさらに精製した。
【０８４７】
３．ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、Ｐｉｅｒｃｅ  ９６ウェルストレプトアビジン被覆高容量プレート（１５５００）またはＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ９６ウェルマキシソーププレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ４４−２４０４−２１）のいずれかを用いて行った。プレートを１×リン酸緩衝生理食塩水ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｉｅｒｃｅ  ２８３５２）で洗浄し、次に１０μｇ／ｍＬの捕捉タンパク質で被覆した。振とうしながら室温で２時間インキュベートした後、プレートを１×ＰＢＳＴで洗浄し、分子を、１μＭ〜１ｐＭの連続希釈を用いて行Ａ〜Ｇに加えた。プレートを３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬの、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされたａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０９−０３５−００８）またはストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＹ９９８）のいずれかを各ウェルに加えた。プレートを振とうしながら３０分間インキュベートし、洗浄し、１００μＬの１−ｓｔｅｐ  ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ３４０２２）を各ウェルに加えた。プレートを５分間インキュベートし、１００μＬの１ＭのＨＣｌを用いて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーにおける４５０ｎｍでの吸光度を用いて、プレートを読み取った。
【０８４８】
４．細胞殺滅アッセイ
産生された構築物の活性を評価するために、ＢｘＰＣ３−ルシフェラーゼ細胞殺滅アッセイを行った。ルシフェラーゼ（Ｇｅｎｅｃｏｐｉａ  ＳＣＬ−Ｃ０１２−ＨＬＧ）を含有するＢｘＰＣ３細胞を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ａ１１１３８０２）とともに、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  １１８７５１１９）および１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  １００８２１４７）中で成長させた。この細胞を用いて、１ウェル当たり１５，０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種した。１日インキュベートした後、培地を除去し、０．５％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０１２２）を含む無血清培地ＲＰＭＩ  １６４０と交換した。無血清培地中のＰＢＭＣ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ｌｏｔ  ＃  ＬＰ＿１２３）を、４５０，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートの行Ａ〜Ｇに加えた。化合物を行Ａ〜Ｆ中の１μＭ〜１０ｐＭの範囲の濃度において３連でカラムに加えた。プレートを測定前に６または２４時間インキュベートした。細胞殺滅測定へと進む前に１２０μＬを各ウェルから取り出し、９６ウェル低結合タンパク質プレートに加えた。これにより８０μＬがプレートに残り、８０μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅ２６１０）を各ウェルに加えた。次に、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーにおいてプレートを読み取った。
【０８４９】
５．サイトカイン放出アッセイ
サイトカイン放出アッセイのために、細胞殺滅プレートから取り出した上清を、ｑｕａｎｓｙｓ洗浄緩衝液で５倍に希釈した。ＱｕａｎｓｙｓヒトＩＦＮγ（Ｑｕａｎｓｙｓ  ４６４６４９ＨＵ）ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘアッセイキットについて、製造業者の指示に従った。プレートをＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋において撮像し、Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｑ−ｖｉｅｗソフトウェアを用いて分析した。
【０８５０】
６．比濁ヒアルロニダーゼ酵素アッセイ
ヒアルロニダーゼ活性を試験するために、酵素アッセイを、上述されるように行った（Ｄｏｒｆｍａｎ，Ａ．，Ｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．Ａ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９４８）。ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ  ５３７４７）のストック溶液を、３００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ５．３５中１ｍｇ／ｍＬで調製した。ヒアルロニダーゼ含有構築物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、７７ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ６００３）中１ｍｇ／ｍＬに希釈した。０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの酵素構築物を、１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸と組み合わせて、３７℃で４５分間インキュベートした。次に、酸性化したＢＳＡ溶液（２４ｍＭの酢酸ナトリウム、７９ｍＭの酢酸、０．１％のウシ血清アルブミン、ｐＨ３．７５）を、酵素および基質に加えた。室温で１０分間インキュベートした後、活性を５４０ｎｍでの吸光度で測定した。酵素がヒアルロン酸を分解するにつれて、ヒアルロニダーゼ活性は、吸光度の低下として見られる。
【０８５１】
７．ヒアルロニダーゼザイモグラム
ヒアルロニダーゼ活性をさらに実証するために、０．１ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ  ５３７４７）を含有する１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを作製した。構築物をゲル上で泳動させ、次にゲルを１時間にわたって３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  ９３４４３）中でインキュベートした。次に、ゲルを３７℃で１６時間にわたってアッセイ緩衝液（２０ｍＭのクエン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ３．５）中でインキュベートした。ゲルを、０．５％のアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ）（Ｓｉｇｍａ  Ｂ８４３８）を用いてヒアルロニダーゼ活性について染色し、アルシアンブルーは、ヒアルロン酸を青色に染色し、酵素がヒアルロン酸を分解した場合は透明の点を残す。
【０８５２】
８．ゼラチナーゼＡ酵素アッセイ
製造業者の指示に従って、ＥｎｚＣｈｅｋゼラチナーゼ／コラゲナーゼアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅ−１２０５５）を用いて、ＭＭＰ−２を含有する構築物の酵素活性を決定した。
【０８５３】
実施例２４
３つの異なるタンパク質鎖：配列番号２１４、配列番号２１５、および配列番号２１９を含む、ＦＡＰを標的化するＦａｂアームおよびヒアルロニダーゼアームを含有する多重特異性分子２４を、細胞に、配列番号２０２、配列番号２０３、および配列番号２０７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２３を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図７７に示される。多重特異性分子２３のサイズ排除クロマトグラムが図８６に示される。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、１４４ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９４）。図９８は、多重特異性分子２４がヒアルロニダーゼ活性を有することを実証する。ヒアルロニダーゼザイモグラム（図１００）中の青色背景における白色のバンドの存在は、多重特異性分子２４のヒアルロニダーゼ活性をさらに実証する。
【０８５４】
実施例２５
配列番号２１８、配列番号２１５、配列番号２１９を含む、ＦＡＰを標的化するＦａｂアーム、ＩＬ２エフェクターアーム、およびヒアルロニダーゼアームを含有する多重特異性分子２５を、細胞に、配列番号２０６、配列番号２０３、および配列番号２０７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２４を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図７８に示される。多重特異性分子２４のサイズ排除クロマトグラムが図８７に示される。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、１２８ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９４）。図７８１は、１０１ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）への多重特異性分子２５の結合を示す。図９８は、多重特異性分子２５がヒアルロニダーゼ活性を有することを実証する。ヒアルロニダーゼザイモグラム（図１００）中の青色背景における白色のバンドの存在は、多重特異性分子２５のヒアルロニダーゼ活性をさらに実証する。
【０８５５】
実施例２６
配列番号２１４、配列番号２１５、および配列番号２２４を含む、ＦＡＰ標的化アームおよびヒアルロニダーゼアームを含有する多重特異性分子２６を、細胞に、配列番号２０２、配列番号２０３、および配列番号２１２を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２５を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図７９に示される。多重特異性分子２５のサイズ排除クロマトグラムが図８８に示される。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、１８．５ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９４）。図９８は、多重特異性分子２６がヒアルロニダーゼ活性を有することを実証する。ヒアルロニダーゼザイモグラム（図１００）中の青色背景における白色のバンドの存在は、多重特異性分子２６のヒアルロニダーゼ活性をさらに実証する。
【０８５６】
実施例２７
配列番号２２０、配列番号１７１、配列番号２１９、および配列番号２１５を含む、ＰＤＬ１標的化アーム、ＦＡＰ標的化アーム、およびヒアルロニダーゼアームを含有する多重特異性分子２７を、細胞に、配列番号１２１、配列番号２０７、および配列番号２０８を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２６を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図８０に示される。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、５２ｐＭのＥＣ５０が得られた（図９３）。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、４４ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９４）。図９９は、多重特異性分子２７がヒアルロニダーゼ活性を有することを実証する。ヒアルロニダーゼザイモグラム（図１００）中の青色背景における白色のバンドの存在は、多重特異性分子２７のヒアルロニダーゼ活性をさらに実証する。
【０８５７】
実施例２８
配列番号２２１、配列番号１７１、配列番号２１９、および配列番号２１５を含む、ＰＤＬ１標的化アーム、ＦＡＰ標的化アーム、ＩＬ２エフェクターアーム、およびヒアルロニダーゼアームを含有する多重特異性分子２８を、細胞に、配列番号２０９、配列番号１２１、配列番号２０７、および配列番号２０８を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２７を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図８１に示される。多重特異性分子２７のサイズ排除クロマトグラムが図９０に示される。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、０．２０７ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９３）。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、６９ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９５）。図９７は、９７ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）への多重特異性分子２７の結合を示す。図９９は、多重特異性分子２８がヒアルロニダーゼ活性を有することを実証する。ヒアルロニダーゼザイモグラム（図１００）中の青色背景における白色のバンドの存在は、多重特異性分子２８のヒアルロニダーゼ活性をさらに実証する。
【０８５８】
実施例２９
配列番号２２１、配列番号１７１、配列番号２２２、および配列番号２２３を含む、ＰＤＬ１標的化アーム、抗ＮＫｐ４６  ＮＫ細胞エンゲージャ、ＩＬ２エフェクターアーム、およびヒアルロニダーゼアームを含有する多重特異性分子２９を、細胞に、配列番号２０９、配列番号１２１、配列番号２１０、および配列番号２１１を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２８を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図８２に示される。多重特異性分子２８のサイズ排除クロマトグラムが図９１に示される。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、８６６ｐＭのＥＣ５０が得られた（図９３）。配列番号１７９からのヒトＮＫｐ４６を用いたＥＬＩＳＡにより、１２６ｐＭのＥＣ５０が得られた（図９６）。図９７は、４８ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）への多重特異性分子６の結合を示す。図９９は、多重特異性分子２９がヒアルロニダーゼ活性を有することを実証する。ヒアルロニダーゼザイモグラム（図１００）中の青色背景における白色のバンドの存在は、多重特異性分子２９のヒアルロニダーゼ活性をさらに実証する。
【０８５９】
実施例３０
配列番号２１４、配列番号２１５、および配列番号２１６を含む、ＦＡＰ標的化アームおよびゼラチナーゼアームを含有する多重特異性分子３０を、細胞に、配列番号２０２、配列番号２０３、および配列番号２０７を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子２９を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図８３に示される。多重特異性分子３０のサイズ排除クロマトグラムが図９２に示される。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、３８５ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９５）。図１０１は、多重特異性分子３０がコラゲナーゼ活性を有することを実証する。
【０８６０】
実施例３１
配列番号２１４、配列番号２１５、および配列番号２１７を含む、ＦＡＰ標的化アームおよびゼラチナーゼアームを含有する多重特異性分子３１を、細胞に、配列番号２０２、配列番号２０３、および配列番号Ｄ２０５を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子３０を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図８４に示される。多重特異性分子３１のサイズ排除クロマトグラムが図９３に示される。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、４６６ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９５）。図１０１は、多重特異性分子３１がコラゲナーゼ活性を有することを実証する。
【０８６１】
実施例３２
配列番号２２１、配列番号１７１、配列番号２１６、および配列番号２１５を含む、ＰＤＬ１標的化アーム、ＦＡＰ標的化アーム、ＩＬ２エフェクターアーム、およびゼラチナーゼアームを含有する多重特異性分子３２を、細胞に、配列番号２０９、配列番号１２１、配列番号２０４、および配列番号２０３を共トランスフェクトすることによって発現させた。多重特異性分子３１を精製し、最終産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図８５に示される。配列番号１７８のヒトＰＤＬ１を用いて行われたＥＬＩＳＡにより、１５５ｐＭのＥＣ５０が得られた（図９３）。配列番号２２５から生成されるヒトＦＡＰを用いて、ＥＬＩＳＡを行ったところ、８５ｎＭのＥＣ５０が得られた（図９５）。図９７は、３６ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＩＬ２Ｒα（配列番号１８２から生成される）への多重特異性分子３２の結合を示す。図１０１は、多重特異性分子３２がコラゲナーゼ活性を有することを実証する。
【０８６２】
参照による援用
本明細書において言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により援用されるように具体的にかつ個別に示されているかのように、全体が参照により本明細書に援用される。
【０８６３】
均等物
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１Ａ−１Ｃ】
2019512272.tif 000206
【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
2019512272.tif 000209
【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
2019512272.tif 000212
【図８Ａ】
2019512272.tif 000213
【図８Ｂ】
2019512272.tif 000214
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2019512272.tif 000219
【図１０Ｃ】
2019512272.tif 000220
【図１１Ａ−１１Ｃ】
2019512272.tif 000221
【図１２Ａ−１２Ｄ】
2019512272.tif 000222
【図１３Ａ−１３Ｄ】
2019512272.tif 000223
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2019512272.tif 000225
【図１５Ａ−１５Ｄ】
2019512272.tif 000226
【図１５Ｅ−１５Ｈ】
2019512272.tif 000227
【図１５Ｉ−１５Ｊ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2019512272.tif 000243
【図３０】
2019512272.tif 000244
【図３１】
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【図３２】
2019512272.tif 000246
【図３３】
2019512272.tif 000247
【図３４】
2019512272.tif 000248
【図３５】
2019512272.tif 000249
【図３６】
2019512272.tif 000250
【図３７】
2019512272.tif 000251
【図３８】
2019512272.tif 000252
【図３９】
2019512272.tif 000253
【図４０】
2019512272.tif 000254
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
2019512272.tif 000262
【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
2019512272.tif 000270
【図５７】
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【図５８】
2019512272.tif 000272
【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
2019512272.tif 000286
【図７３】
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【図７４】
2019512272.tif 000288
【図７５】
2019512272.tif 000289
【図７６】
2019512272.tif 000290
【図７７】
2019512272.tif 000291
【図７８】
2019512272.tif 000292
【図７９】
2019512272.tif 000293
【図８０】
2019512272.tif 000294
【図８１】
2019512272.tif 000295
【図８２】
2019512272.tif 000296
【図８３】
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【図８４】
2019512272.tif 000298
【図８５】
2019512272.tif 000299
【図８６】
2019512272.tif 000300
【図８７】
2019512272.tif 000301
【図８８】
2019512272.tif 000302
【図８９】
2019512272.tif 000303
【図９０】
2019512272.tif 000304
【図９１】
2019512272.tif 000305
【図９２】
2019512272.tif 000306
【図９３】
2019512272.tif 000307
【図９４】
2019512272.tif 000308
【図９５】
2019512272.tif 000309
【図９６】
2019512272.tif 000310
【図９７】
2019512272.tif 000311
【図９８】
2019512272.tif 000312
【図９９】
2019512272.tif 000313
【図１００】
2019512272.tif 000314
【図１０１】
2019512272.tif 000315
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月26日(2018.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019512272000001.app
【国際調査報告】
2019512272.tif 000316
2019512272.tif 000317
2019512272.tif 000318
2019512272.tif 000319
2019512272.tif 000320
2019512272.tif 000321
2019512272.tif 000322
2019512272.tif 000323
2019512272.tif 000324
2019512272.tif 000325
2019512272.tif 000326