(57)【要約】本開示の実施形態は、細胞培養培地であって、（ａ）実質的に単細胞の懸濁液へと解離した、ヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）であって、ヒト上皮腫瘍細胞を含む、ＣＴＯＳと、（ｂ）フィーダー細胞と、（ｃ）少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（Ｒｈｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む定義された細胞培養培地と、場合により（ｄ）補充血清アルブミン（ＳＡ）と、を含み、細胞培養培地が、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内に上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０％の増殖を提供する、細胞培養培地を含む。【選択図】図１０
2019535280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地であって、
（ａ）実質的に単細胞の懸濁液へと解離した、ヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）であって、ヒト上皮腫瘍細胞を含む、ＣＴＯＳと、
（ｂ）フィーダー細胞と、
（ｃ）少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（Ｒｈｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む定義された細胞培養培地であって、場合により、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤およびＲ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない、定義された細胞培養培地と、場合により、
（ｄ）補充血清アルブミン（ＳＡ）と、を含み、
前記細胞培養培地が、前記解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内に前記上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０％の増殖を提供する、細胞培養培地。
【請求項２】
前記ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳが、ヒト癌患者から取り出され、場合により外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される腫瘍含有試料から培養される、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項３】
前記ヒト患者が、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している、請求項１または２に記載の細胞培養培地。
【請求項４】
前記上皮腫瘍細胞が、前記解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内に前記ヒト患者から取り出された前記腫瘍含有試料のクローン多様性を実質的に保持している、請求項２または３に記載の細胞培養培地。
【請求項５】
前記ヒト上皮腫瘍細胞が、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項６】
前記解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１日以内に前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％増殖を提供する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項７】
前記解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約７日以内に前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約２０〜３０％の増殖を提供する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項８】
前記解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約７日以内に前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約６０％の増殖を提供する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項９】
前記解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内に、前記ヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に約または少なくとも約５：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、２００：１、５００：１、または１０００：１の比を提供し、前記ヒト上皮腫瘍細胞が、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／またはＣＤ１３３の細胞表面発現を場合により特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
前記定義された培地が、血清、場合によりウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
前記血清の濃度が、約１〜５％の範囲であり、または約１％、２％、３％、４％、もしくは５％である、請求項１０に記載の細胞培養培地。
【請求項１２】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
Ｙ２７６３２の濃度が、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である、請求項１２に記載の細胞培養培地。
【請求項１４】
前記補充ＳＡが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項１５】
前記補充ＳＡの濃度が、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、あるいは約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１〜１４に記載の細胞培養培地。
【請求項１６】
前記フィーダー細胞が、非増殖性線維芽細胞、場合によりヒト線維芽細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞培養培地を含む、低い細胞結合表面を有する組織培養プレート。
【請求項１８】
インビトロ細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞を培養または増殖させる方法であって、
（Ａ）前記ヒト上皮腫瘍細胞を含むヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を実質的に単細胞の懸濁液中へと解離させることと、
（Ｂ）少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む定義された細胞培養培地中で、前記解離したＣＴＯＳとフィーダー細胞とを共培養することであって、場合により、前記定義された細胞培養培地が、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤およびＲ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでおらず、場合により前記細胞培養培地が補充血清アルブミン（ＳＡ）を含む、共培養することと、を含み、
前記方法が、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４日以内に前記細胞培養培地中で前記上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０％の増殖を提供する、方法。
【請求項１９】
前記実質的に解離したＣＴＯＳが、低細胞結合表面を有する組織培養プレート中で共培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳが、ヒト癌患者から取り出され、場合により外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される腫瘍試料から培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト患者が、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記上皮腫瘍細胞が、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４日以内に前記ヒト患者から取り出された前記腫瘍試料の前記クローン多様性を実質的に保持している、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒト上皮腫瘍細胞が、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖を提供する、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約７日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約２０〜３０％の増殖を提供する、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約７日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約６０％の増殖を提供する、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４日以内に、前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に少なくとも約５：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、２００：１、５００：１、または１０００：１の比を提供し、前記ヒト上皮腫瘍細胞が、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／またはＣＤ１３３の細胞表面発現を場合により特徴とする、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記定義された細胞培養培地が、血清、場合によりウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記血清の濃度が、約１〜５％の範囲であり、または約１％、２％、３％、４％、もしくは５％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｙ２７６３２の濃度が、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記補充ＳＡが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項３３】
前記補充ＳＡの濃度が、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、あるいは約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である、請求項１８〜３２のいずれか１項に記載の細胞培養培地。
【請求項３４】
前記フィーダー細胞が、非増殖性線維芽細胞、場合によりヒト線維芽細胞である、請求項１８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
場合により、
ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料を組織消化培地中で細片化およびインキュベートすることと、
ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む定義された無血清かつフィーダー非含有のＣＴＯＳ成長培地中で、前記ＣＴＯＳを形成するのに十分な時間、前記腫瘍含有試料を培養することと、を含み、前記ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳが、前記腫瘍含有試料から培養される、請求項１８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組織消化培地が、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの１つ以上から選択されたプロテアーゼを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ニコチンアミドの濃度が、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００ｍＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００ｍＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００ｍＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０ｍＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０ｍＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０ｍＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０ｍＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０ｍＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５ｍＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１ｍＭの範囲である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｗｎｔ３Ａの濃度が、約０．１〜１０，０００または１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜４００、１〜４００、１０〜４００、２０〜４００、３０〜４００、５０〜４００、４０〜４００、６０〜４００、７０〜４００、８０〜４００、９０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜３００、１〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３０〜３００、４０〜３００、５０〜３００、６０〜３００、７０〜３００、８０〜３００、９０〜３００、１００〜３００、２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜２００、１〜２００、１０〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１５０、１〜１５０、１０〜１５０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、６０〜１５０、７０〜１５０、８０〜１５０、９０〜１５０、１００〜１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１２０、１〜１２０、１０〜１２０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、１００〜１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１００、１〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００ｎｇ／ｍｌに及ぶ、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＢＭＰ阻害剤がノギンであり、前記ノギンの濃度が、場合により約０．１〜１０，０００または１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜４００、１〜４００、１０〜４００、２０〜４００、３０〜４００、５０〜４００、４０〜４００、６０〜４００、７０〜４００、８０〜４００、９０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜３００、１〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３０〜３００、４０〜３００、５０〜３００、６０〜３００、７０〜３００、８０〜３００、９０〜３００、１００〜３００、２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜２００、１〜２００、１０〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１５０、１〜１５０、１０〜１５０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、６０〜１５０、７０〜１５０、８０〜１５０、９０〜１５０、１００〜１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１２０、１〜１２０、１０〜１２０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、１００〜１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１００、１〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストがＲ−スポンジン−１であり、前記Ｒ−スポンジン−１の濃度が場合により、約０．１〜１０，０００もしくは１〜１０００もしくは１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０，０００、１〜１０，０００、１０〜１０，０００、２０〜１０，０００、３０〜１０，０００、４０〜１０，０００、５０〜１０，０００、６０〜１０，０００、７０〜１０，０００、８０〜１０，０００、９０〜１０，０００、１００〜１０，０００、２００〜１０，０００、３００〜１０，０００、４００〜１０，０００、５００〜１０，０００、１０００〜１０，０００、５０００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５０００、１〜５０００、１０〜５０００、２０〜５０００、３０〜１０，０００、４０〜５０００、５０〜５０００、６０〜５０００、７０〜５０００、８０〜５０００、９０〜５０００、１００〜５０００、２００〜５０００、３００〜５０００、４００〜５０００、５００〜５０００、１０００〜５０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜８００、１〜８００、１０〜８００、２０〜８００、３０〜８００、４０〜８００、５０〜８００、６０〜８００、７０〜８００、８０〜８００、９０〜８００、１００〜８００、２００〜８００、３００〜８００、４００〜８００、５００〜８００、６００〜８００、７００〜８００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜７００、１〜７００、１０〜７００、２０〜７００、３０〜７００、４０〜７００、５０〜７００、６０〜７００、７０〜７００、８０〜７００、９０〜７００、１００〜７００、２００〜７００、３００〜７００、４００〜７００、５００〜７００、６００〜７００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜６００、１〜６００、１０〜６００、２０〜６００、３０〜６００、４０〜６００、５０〜６００、６０〜６００、７０〜６００、８０〜６００、９０〜６００、１００〜６００、２００〜６００、３００〜６００、４００〜６００、５００〜６００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２であり、Ｙ２７６３２の濃度が場合により、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
治療薬に対するヒト患者の応答性を検査する方法であって、
前記治療薬を請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養培地へ、または請求項１７〜４１のいずれか１項に記載の方法によって調製された細胞培養培地へ投与することと、
上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
上皮腫瘍細胞増殖における低下および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導が、前記治療薬への前記ヒト患者の応答性を示し、上皮腫瘍細胞増殖における低下および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、前記治療薬への前記ヒト患者の耐性を示す、方法。
【請求項４３】
前記解離したＣＴＯＳを共培養するのと同じ日に前記治療薬を投与することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記解離したＣＴＯＳの共培養の少なくとも１日後に前記治療薬を投与することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記解離したＣＴＯＳの共培養の約１、２、３、４、５、６、もしくは７日後にまたは約１、２、３、４、５、６、もしくは７日以内に前記治療薬を投与することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療薬の投与の約１４日以内に上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療薬を投与する約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記治療薬を投与する約７、６、または５日以内に上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
上皮腫瘍細胞増殖を測定するステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞増殖マーカーが、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、請求項４２〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
−定義された無血清かつフィーダー非含有の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）成長培地、
−組織消化培地、
−低細胞結合表面を有する組織培養プレート、
−補充血清アルブミン（ＳＡ）を場合により含む、定義された細胞培養培地であって、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤およびＲ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない、定義された細胞培養培地、
−凍結フィーダー細胞、
−Ｒｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、場合により、
−細胞増殖マーカーおよび／または細胞アポトーシスマーカー、のいずれかの組み合わせを含む、試料調製キット。
【請求項５４】
前記ＣＴＯＳ成長培地が、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む、請求項５３に記載の試料調製キット。
【請求項５５】
前記組織消化培地が、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの１つ以上から選択されるプロテアーゼを含む、請求項５３または５４に記載の試料調製キット。
【請求項５６】
前記定義された培養培地が、血清、場合によりウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を約１〜５％の範囲の、または約１％、２％、３％、４％、または５％である濃度で含む、請求項５３または５４に記載の試料調製キット。
【請求項５７】
前記凍結フィーダー細胞が、非増殖性線維芽細胞、場合によりヒト線維芽細胞である、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の試料調製キット。
【請求項５８】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の試料調製キット。
【請求項５９】
前記細胞増殖マーカーが、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の試料調製キット。
【請求項６０】
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の試料調製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらの各々が全体として参照により本明細書に組み入れられる２０１７年５月３１日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０８６５５６および２０１６年１１月２１日出願のＰＣＴ／ＣＮ２０１６／１０６６１９に対する優先権を特許請求する。
【０００２】
本開示の実施形態は、癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）からの患者由来の初代上皮腫瘍細胞の細胞増殖および条件的初期化のための細胞培養および関連方法に関する。１つ以上の治療薬に対する上皮腫瘍細胞の応答性を査定する方法も含まれている。
【背景技術】
【０００３】
診断および治療を改善する安定した尽力にもかかわらず、癌は、世界中で主たる死因のままである。癌の多様性または異質性は、新たな療法の開発に対する妨げを呈し、もっともらしい反応者を識別することを困難にもさせている。その上、多くの癌療法は、追加的な点突然変異、および治療用試薬の標的を迂回する代替的な経路を含む、先天性耐性および後天性耐性によって困難なものとなる。
【０００４】
将来的な成功する療法は、化学療法薬および標的治療薬の有効性を正確に査定するために容易に操作され得る患者由来の原発性腫瘍細胞の迅速かつ非選択的な発生の開発とともに、腫瘍進行および転移過程に潜む事象の包括的な解析によることになるであろう。
【０００５】
一例として、照射されたフィーダー細胞およびＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を用いた癌細胞の初代培養は、異種性上皮腫瘍細胞の成長を促進し、個々の患者についての薬物感受性を調査するために説明されてきた（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１８０：５９９−６０７，２０１２を参照されたい）。しかしながら、これらの共培養条件は、患者腫瘍から単離された単細胞がまれにしか播種されないとき、間質細胞の過剰成長によって厄介となる。
【０００６】
この間質細胞混入を解決する１つのアプローチは、ＦＡＣＳを使用して、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）陽性細胞部分集団を精製することである。しかし、細胞表面マーカー発現に基づいた精製は、元の患者腫瘍から得られた腫瘍細胞のクローン選択の危険性を高め、したがって、元の患者腫瘍のクローン多様性を公正に表すことにしばしば失敗する。
【０００７】
したがって、間質細胞の成長を低減させるだけでなく、元の腫瘍の試料のクローン多様性も維持する、フィーダー細胞およびＲｏｃｋ阻害剤システムにおける初代上皮腫瘍細胞を細胞増殖させるための改良された培養条件を開発する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１８０：５９９−６０７，２０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示の実施形態は、細胞培養培地であって、
（ａ）実質的に単細胞の懸濁液へと解離した、ヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）であって、ヒト上皮腫瘍細胞を含む、ＣＴＯＳと、
（ｂ）フィーダー細胞と、
（ｃ）少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（Ｒｈｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む定義された細胞培養培地と、場合により
（ｄ）補充血清アルブミン（ＳＡ）と、を含み、
細胞培養培地が、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内に上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０％の増殖を提供する、細胞培養培地を含む。
【００１０】
いくつかの場合において、定義された細胞培養培地は、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、およびＲ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない。
【００１１】
ある特定の実施形態において、ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳは、例えば、外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される、ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料から培養される。ある特定の実施形態において、ヒト患者は、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している。
【００１２】
ある特定の実施形態において、上皮腫瘍細胞は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内にヒト患者から取り出された腫瘍含有試料のクローン多様性を実質的に保持している。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ヒト上皮腫瘍細胞は、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１日以内にヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖を提供する。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約７日以内にヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約２０〜３０％の増殖を提供する。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約７日以内にヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約６０％の増殖を提供する。
【００１５】
ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内にヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に約または少なくとも約５：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、２００：１、５００：１、または１０００：１の比を提供し、この中で、ヒト上皮腫瘍細胞は、例えば、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／またはＣＤ１３３の細胞表面発現を特徴とする。
【００１６】
いくつかの実施形態において、定義された培地は、血清、例えばウシ血清アルブミン（ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態において、血清の濃度は、約１〜５％の範囲であり、または約１％、２％、３％、４％、もしくは５％である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、Ｙ２７６３２の濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、補充ＳＡは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される。ある特定の実施形態では、補充ＳＡの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、あるいは約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、非増殖性線維芽細胞、例えば、ヒト線維芽細胞である。
【００２０】
本明細書に説明する細胞培養培地を含む、低細胞結合表面を有する組織培養プレートも含まれる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、インビトロ細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞を培養または増殖させる方法であって、
（Ａ）ヒト上皮腫瘍細胞を含むヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を実質的に単細胞の懸濁液中へと解離させることと、
（Ｂ）少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む定義された細胞培養培地中で、解離したＣＴＯＳとフィーダー細胞とを共培養することとを含み、
ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４日以内に細胞培養培地中で上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０％の増殖を提供する、方法を含む。
【００２２】
いくつかの場合において、定義された細胞培養培地は、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤およびＲ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、補充血清アルブミン（ＳＡ）を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、実質的に解離したＣＴＯＳは、低細胞結合表面を有する組織培養プレート中で共培養される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳは、例えば、外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される、ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料から培養される。いくつかの実施形態において、ヒト患者は、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している。いくつかの実施形態において、上皮腫瘍細胞は、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４日以内にヒト患者から取り出された腫瘍試料のクローン多様性を実質的に保持している。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ヒト上皮腫瘍細胞は、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、方法または細胞培養培地は、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖を提供する。いくつかの実施形態において、方法または細胞培養培地は、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約７日以内に細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約２０〜３０％の増殖を提供する。いくつかの実施形態において、方法または細胞培養培地は、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約７日以内に細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約６０％の増殖を提供する。
【００２７】
特定の実施形態において、方法または細胞培養培地は、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４日以内に細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に少なくとも約５：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、２００：１、５００：１、または１０００：１の比を提供し、ヒト上皮腫瘍細胞は、例えば、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／またはＣＤ１３３の細胞表面発現を特徴とする。
【００２８】
いくつかの実施形態において、定義された細胞培養培地は、血清、場合により、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む。いくつかの実施形態において、血清の濃度は、約１〜５％の範囲であるかまたは、もしくは約１％、２％、３％、４％、または５％である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤、例えばＹ２７６３２の濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、補充ＳＡは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される。ある特定の実施形態において、補充ＳＡの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、あるいは約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、非増殖性線維芽細胞、例えば、ヒト線維芽細胞である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳは、ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料から培養され、例えば、
腫瘍含有試料を組織消化培地中で細片化およびインキュベートすることと、
ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む定義された無血清かつフィーダー非含有のＣＴＯＳ成長培地中で、ＣＴＯＳを形成するのに十分な時間、腫瘍含有試料を培養することと、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、組織消化培地は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの１つ以上から選択されるプロテアーゼを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ニコチンアミドの濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００ｍＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００ｍＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００ｍＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０ｍＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０ｍＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０ｍＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０ｍＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０ｍＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５ｍＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１ｍＭの範囲である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ３Ａの濃度は、約０．１〜１０，０００もしくは１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜４００、１〜４００、１０〜４００、２０〜４００、３０〜４００、５０〜４００、４０〜４００、６０〜４００、７０〜４００、８０〜４００、９０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜３００、１〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３０〜３００、４０〜３００、５０〜３００、６０〜３００、７０〜３００、８０〜３００、９０〜３００、１００〜３００、２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜２００、１〜２００、１０〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１５０、１〜１５０、１０〜１５０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、６０〜１５０、７０〜１５０、８０〜１５０、９０〜１５０、１００〜１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１２０、１〜１２０、１０〜１２０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、１００〜１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１００、１〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤はノギンであり、いくつかの実施形態において、ＢＭＰ阻害剤の濃度は、約０．１〜１０，０００または１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜４００、１〜４００、１０〜４００、２０〜４００、３０〜４００、５０〜４００、４０〜４００、６０〜４００、７０〜４００、８０〜４００、９０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜３００、１〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３０〜３００、４０〜３００、５０〜３００、６０〜３００、７０〜３００、８０〜３００、９０〜３００、１００〜３００、２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜２００、１〜２００、１０〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１５０、１〜１５０、１０〜１５０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、６０〜１５０、７０〜１５０、８０〜１５０、９０〜１５０、１００〜１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１２０、１〜１２０、１０〜１２０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、１００〜１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１００、１〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストは、Ｒ−スポンジン−１であり、いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストの濃度は、約０．１〜１０，０００または１〜１０００もしくは１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０，０００、１〜１０，０００、１０〜１０，０００、２０〜１０，０００、３０〜１０，０００、４０〜１０，０００、５０〜１０，０００、６０〜１０，０００、７０〜１０，０００、８０〜１０，０００、９０〜１０，０００、１００〜１０，０００、２００〜１０，０００、３００〜１０，０００、４００〜１０，０００、５００〜１０，０００、１０００〜１０，０００、５０００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５０００、１〜５０００、１０〜５０００、２０〜５０００、３０〜１０，０００、４０〜５０００、５０〜５０００、６０〜５０００、７０〜５０００、８０〜５０００、９０〜５０００、１００〜５０００、２００〜５０００、３００〜５０００、４００〜５０００、５００〜５０００、１０００〜５０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜８００、１〜８００、１０〜８００、２０〜８００、３０〜８００、４０〜８００、５０〜８００、６０〜８００、７０〜８００、８０〜８００、９０〜８００、１００〜８００、２００〜８００、３００〜８００、４００〜８００、５００〜８００、６００〜８００、７００〜８００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜７００、１〜７００、１０〜７００、２０〜７００、３０〜７００、４０〜７００、５０〜７００、６０〜７００、７０〜７００、８０〜７００、９０〜７００、１００〜７００、２００〜７００、３００〜７００、４００〜７００、５００〜７００、６００〜７００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜６００、１〜６００、１０〜６００、２０〜６００、３０〜６００、４０〜６００、５０〜６００、６０〜６００、７０〜６００、８０〜６００、９０〜６００、１００〜６００、２００〜６００、３００〜６００、４００〜６００、５００〜６００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２であり、いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１または０．５〜１μＭの範囲である。
【００３９】
治療薬に対するヒト患者の応答性を検査する方法であって、
治療薬を本明細書に説明する細胞培養培地もしくは共培養へ、または本明細書に説明する方法によって調製された細胞培養培地もしくは共培養へ投与することと、
上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
上皮腫瘍細胞増殖における低下および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導が、治療薬へのヒト患者の応答性を示し、上皮腫瘍細胞増殖における低下および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、治療薬へのヒト患者の耐性を示す、方法も含まれる。
【００４０】
ある特定の方法は、解離したＣＴＯＳを共培養するのと同じ日に治療薬を投与することを含む。ある特定の方法は、解離したＣＴＯＳの共培養の少なくとも１日後に治療薬を投与することを含む。ある特定の方法は、解離したＣＴＯＳの共培養の約１、２、３、４、５、６、もしくは７日後にまたは約１、２、３、４、５、６、もしくは７日以内に治療薬を投与することを含む。いくつかの方法は、治療薬を投与する約１４日以内に上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む。特定の方法は、治療薬を投与する約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む。ある特定の方法は、治療薬を投与する約７、６、または５日以内に上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、上皮腫瘍細胞増殖を測定するステップは、細胞増殖マーカーを測定することを含む。いくつかの実施形態において、細胞増殖マーカーは、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップは、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む。いくつかの実施形態において、細胞アポトーシスマーカーは、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される。
【００４３】
−定義された無血清かつフィーダー非含有の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）成長培地、
−組織消化培地、
−低細胞結合表面を有する組織培養プレート、
−定義された細胞培養培地、
−凍結フィーダー細胞、
−Ｒｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ならびに場合により、
−細胞増殖マーカーおよび／または細胞アポトーシスマーカー、
のいずれかの組み合わせを含む、試料調製キットも含まれる。
【００４４】
いくつかのキットにおいて、ＣＴＯＳ成長培地は、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む。
【００４５】
いくつかのキットにおいて、組織消化培地は、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの１つ以上から選択されるプロテアーゼを含む。
【００４６】
いくつかのキットにおいて、定義された培養培地は、血清、例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を約１〜５％の範囲の、または約１％、２％、３％、４％、または５％である濃度で含む。いくつかのキットにおいて、凍結フィーダー細胞は、非増殖性線維芽細胞、例えば、ヒト線維芽細胞である。
【００４７】
ある特定のキットは、例えば、ＣＴＯＳ成長培地および／または定義された細胞培養培地へと添加されることになっている補充ＳＡを含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地および／または定義された細胞培養培地は、補充ＳＡを含む。いくつかの実施形態において、補充ＳＡは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される。ある特定の実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地および／または定義された細胞培養培地中の補充ＳＡの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、あるいは約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００４８】
いくつかのキットにおいて、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される。いくつかのキットにおいて、細胞増殖マーカーは、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される。いくつかのキットにおいて、細胞アポトーシスマーカーは、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を形成するために定義された成長培地中の懸濁液中で培養された腫瘍細胞を示す。
【図１Ｂ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を形成するために定義された成長培地中の懸濁液中で培養された腫瘍細胞を示す。
【図１Ｃ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を形成するために定義された成長培地中の懸濁液中で培養された腫瘍細胞を示す。
【図１Ｄ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を形成するために定義された成長培地中の懸濁液中で培養された腫瘍細胞を示す。
【図２Ａ】正常結腸直腸組織外科的試料から単離された単細胞を示す。
【図２Ｂ】正常結腸直腸組織外科的試料から単離された単細胞を示す。
【図３Ａ】正常結腸直腸組織外科的試料から単離され、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）の共培養系中に播種された細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図３Ｂ】正常結腸直腸組織外科的試料から単離され、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）の共培養系中に播種された細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図４Ａ】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に解離しおよび播種された６名の異なる患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ））に由来する単一の腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図４Ｂ】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に解離しおよび播種された６名の異なる患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ））に由来する単一の腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図４Ｃ】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に解離しおよび播種された６名の異なる患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ））に由来する単一の腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図４Ｄ】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に解離しおよび播種された６名の異なる患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ））に由来する単一の腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図４Ｅ】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に解離しおよび播種された６名の異なる患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ））に由来する単一の腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図４Ｆ】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に解離しおよび播種された６名の異なる患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ））に由来する単一の腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。
【図５Ａ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に播種された非細胞増殖性単細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。
【図５Ｂ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に播種された非細胞増殖性単細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。
【図５Ｃ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に播種された非細胞増殖性単細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。
【図５Ｄ】患者の結腸直腸腫瘍外科的試料から単離され、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）選択的共培養系中に播種された非細胞増殖性単細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕの組込みによって測定した。
【図６】初代上皮腫瘍細胞を使用して、薬物および薬物の組み合わせに対する応答性を検査した細胞増殖後共培養系を示す。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。最上部から最下部までの行は次のとおりである：フルオロウラシル（５−ＦＵ）、オキサリプラチン、オキサリプラチン＋５−ＦＵ（１０μＭ）、ＳＮ−３８、ＳＮ−３８＋５−ＦＵ（１０μＭ）、ＳＮ−３８＋５−ＦＵ（１０μＭ）＋オキサリプラチン（２．５μＭ）左から右への列は、検査した一次薬物の低下する濃度を示す。
【図７Ａ】曲線下面積における腫瘍成長抑制（７Ａ）、および定量的薬物感受性スコア（７Ｂ）を含む、ある特定の化学療法およびその組み合わせに対する、８名の個々の患者に由来する上皮腫瘍細胞の応答特性を示す。
【図７Ｂ】曲線下面積における腫瘍成長抑制（７Ａ）、および定量的薬物感受性スコア（７Ｂ）を含む、ある特定の化学療法およびその組み合わせに対する、８名の個々の患者に由来する上皮腫瘍細胞の応答特性を示す。
【図８−１】２名の異なる患者に由来する正常結腸直腸組織外科的試料から単離され、（図８Ａ〜図８Ｂ）完全培地、（図８Ｃ〜図８Ｄ）Ｗｎｔ−３Ａ−ノギン非含有の完全培地、（図８Ｅ〜図８Ｆ）Ｒ−スポンジンおよびノギン非含有の完全培地、ならびに（図８Ｇ〜図８Ｈ）Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、およびノギン非含有の完全培地を用いる、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）共培養系中で成長した細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕ組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。正常結腸直腸上皮細胞は、図８Ｅ〜図８Ｆの選択培地中でも図８Ｇ〜図８Ｈの選択培地中でも成長しない。
【図８−２】２名の異なる患者に由来する正常結腸直腸組織外科的試料から単離され、（図８Ａ〜図８Ｂ）完全培地、（図８Ｃ〜図８Ｄ）Ｗｎｔ−３Ａ−ノギン非含有の完全培地、（図８Ｅ〜図８Ｆ）Ｒ−スポンジンおよびノギン非含有の完全培地、ならびに（図８Ｇ〜図８Ｈ）Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、およびノギン非含有の完全培地を用いる、フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）共培養系中で成長した細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕ組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。正常結腸直腸上皮細胞は、図８Ｅ〜図８Ｆの選択培地中でも図８Ｇ〜図８Ｈの選択培地中でも成長しない。
【図９−１】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）共培養系の（図９Ａ〜図９Ｂ）完全培地、（図９Ｃ〜図９Ｄ）Ｗｎｔ−３Ａ−ノギン非含有の完全培地、（図９Ｅ〜図９Ｆ）Ｒ−スポンジンおよびノギン非含有の完全培地、ならびに（図９Ｇ〜図９Ｈ）Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、およびノギン非含有の完全培地中で解離しおよび播種された、患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）から単離された腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕ組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。正常細胞とは対照的に、腫瘍結腸直腸上皮細胞は、図９Ｅ〜図９Ｆの選択培地および図９Ｇ〜図９Ｈの選択培地の中で成長した。
【図９−２】フィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）共培養系の（図９Ａ〜図９Ｂ）完全培地、（図９Ｃ〜図９Ｄ）Ｗｎｔ−３Ａ−ノギン非含有の完全培地、（図９Ｅ〜図９Ｆ）Ｒ−スポンジンおよびノギン非含有の完全培地、ならびに（図９Ｇ〜図９Ｈ）Ｗｎｔ−３Ａ、Ｒ−スポンジン、およびノギン非含有の完全培地中で解離しおよび播種された、患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）から単離された腫瘍細胞を示す。細胞増殖は、Ｅｄｕ組込みによって測定した。青色の染色はＤＡＰＩであり、黄色の染色はＥｐＣａｍであり、赤色の染色はＥｄｕである。正常細胞とは対照的に、腫瘍結腸直腸上皮細胞は、図９Ｅ〜図９Ｆの選択培地および図９Ｇ〜図９Ｈの選択培地の中で成長した。
【図１０】補充ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はヒト上皮腫瘍細胞の成長を支持することを示す。ＤＦ１２：ＤＭＥＭ／Ｆ１２系培養培地。ＤＦ１２＋ＢＳＡ：ＢＳＡを補充したＤＭＥＭ／１２系培養培地。細胞増殖は、ＥｄＵ組込みによって測定した。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本開示の実施形態は、癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）の条件的初期化によって患者由来の上皮腫瘍細胞を細胞増殖するための方法および組成物の発見に関する。本明細書に説明する方法および組成物は、フィーダー細胞共培養における間質細胞の過成長を低減させるだけでなく、元の腫瘍試料のクローン多様性も維持する。これらの方法および組成物は、患者に直接由来する初代腫瘍細胞の時宜的な精製および増殖を可能にし、例えば、１つ以上の治療薬に対する患者の腫瘍細胞の起こり得る応答性を査定するために使用することができる。このようなものは、例えば、初回培養時から１週間または２週間を待たない比較的短い時間枠で、患者に対する最適な処置選択肢を同定する利点を提供する。
【００５１】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明する技術用語および科学用語と同様のまたは等価のいかなる方法および材料も、本発明の実施または検査において使用することができるが、ある特定の好ましい方法および材料が本明細書で説明される。特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される公表物および参考文献はすべて、各個々の公表物または参考文献が参照により組み入れられるよう具体的かつここに示されたかのように、当該公表物および参考文献の全体が参照により組み入れられる。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００５２】
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、当該冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは１つ超を（すなわち、少なくとも１つを）指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は、１つの要素または１つ超の要素を意味する。
【００５３】
「約」が意味するのは、参照となる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さまたは長さに対して２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％程度変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さまたは長さである。
【００５４】
本明細書のいたるところで、文脈が別段に必要としない限り、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「を含んでいる」という用語は、陳述されているステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意するが、いかなる他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外も含意しないことは理解されるであろう。「からなっている」が意味するのは、「ならなっている」という句に続くものが何であれ、これを含むことであり、これに限定される。したがって、「からなっている」という句は、列挙された要素が必要とされまたは必須であることを示し、いかなる他の要素も存在しないことがあることを示す。「から本質的になっている」が意味するのは、この句の後に列挙され、列挙された要素について本開示において指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定される、いかなる要素も含むことである。したがって、「から本質的になる」という句は、列挙された要素が必要とされまたは必須であるが、他の要素が選択肢として存在し、他の要素が列挙された要素の活性または作用に実質的に影響するかどうかによって存在していても存在していなくてもよいことを示す。
【００５５】
「単離される」が意味するのは、その本来の状態において通常付随する構成要素が実質的にまたは本質的にない材料である。
【００５６】
「を調節している」という用語は、典型的には対照と比較して統計的に有意なまたは生理学的に有意な量で「上昇する」または「亢進する」、および「低下する」または「低減する」ことを含む。「上昇した」または「亢進した」量は典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成なしもしくは対照組成の試料、または検査対象によって生じる量の約もしくは少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００倍、または約もしくは少なくとも約５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％である（これらの間の整数および範囲をすべて含む）上昇を含むことができる。「低下した」または「低減した」量は典型的には、「統計的に有意な」量であり、組成なしもしくは対照組成の試料、または検査対象によって生じる量の約もしくは少なくとも約１．２、１．４、１．６、１．８、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００倍、または約もしくは少なくとも約５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％である（これらの間の整数および範囲をすべて含む）低下を含むことができる。
【００５７】
ある特定の実施形態において、細胞培養における上皮腫瘍細胞の「純度」は、具体的に定義されることがある。例えば、ある特定の培地または培養は、他の患者細胞型、例えば、間質細胞のような非癌性細胞に対して、約または少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％純粋であるこれらの間の整数および範囲をすべて含む）上皮腫瘍細胞を含むことがある。
【００５８】
「統計的に有意な」が意味するのは、結果が、偶然生じたようではなかったことである。統計的有意性は、当該技術分野で公知の何らかの方法によって決定することができる。通常使用される有意性の尺度はｐ値を含み、ｐ値とは、帰無仮説が真である場合に、観察された事象が生じるかどうかの頻度または確率である。得られたｐ値が有意性レベルよりも小さな場合、帰無仮説は棄却される。単純な場合において、有意性レベルは、０．０５以下のｐ値で定義される。
【００５９】
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ総じてまたは完全に、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより多量の何らかの所与の量を意味する。
【００６０】
先に記載のように、ある特定の実施形態は、実質的に単細胞の懸濁液中へと解離した癌組織を起源とするスフェロイドの条件的初期化のための共培養および方法に関する。「癌組織を起源とするスフェロイド」（または「ＣＴＯＳ」）という用語は、細胞間接触が、非常に精製された腫瘍生細胞間で保持される初代上皮腫瘍細胞のスフェロイドクラスターに関する（例えば、Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０８：６２３５−６２４０，２０１１、Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．８：１３１−９，２０１３を参照されたい）。ＣＴＯＳを調製するための例示的な方法は、当該技術分野で公知であり（上述）、本明細書に説明されている。上皮細胞の条件的初期化についての細胞培養条件は、例えば、ＷＯ２０１２／０６５０６７およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１８０：５９９−６０７，２０１２）に説明されている。
【００６１】
ある特定の実施形態はしたがって、（ａ）実質的に単細胞の懸濁液中へと解離されたヒトエクスビボ由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）であって、ヒト上皮腫瘍細胞を含む、ＣＴＯＳと、（ｂ）フィーダー細胞と、（ｃ）解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４日以内に上皮腫瘍細胞の少なくとも１０％の増殖を提供する、少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む、定義された細胞培養培地と、を含む細胞培養培地に関する。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤およびＲ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、補充血清アルブミン（ＳＡ）を含む。「補充」という用語は、何らかの所与の動物血清中に存在するＳＡとは異なる、当該ＳＡとは異種性である、または当該ＳＡに加えて存在する、ＳＡを指し、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）である。
【００６２】
（Ａ）ヒト上皮腫瘍細胞を含むヒトエクスビボ由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）を実質的に単細胞の懸濁液中へと解離することと、（Ｂ）少なくとも１つのＲｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む定義された細胞培養培地中で、解離したＣＴＯＳをフィーダー細胞と共培養することと、を含む、インビトロ細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞を培養または増殖させる方法も含まれる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、共培養または成長培地は、さらなる因子または補充物、例えば、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、ノギンのような骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、Ｒ−スポンジン−１のようなＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、および上述のいずれかの組み合わせのような外来性因子または補充物を含んでいないかまたは実質的に含んでいない。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＣＴＯＳは、ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料から培養される。腫瘍含有試料の非限定例としては、当該技術分野で公知のもののうちとりわけ、外科的試料、生検、胸水、腹水が挙げられる。特定の実施形態において、ヒト患者は、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患しており、ヒト上皮腫瘍細胞は、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される。
【００６５】
ある特定の実施形態において、上皮腫瘍細胞は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１日以内に（これらの間の組み合わせ、整数、および範囲をすべて含む）ヒト患者から取り出された腫瘍含有試料のクローン多様性（例えば、約または少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）を実質的に保持している。腫瘍細胞の集団のクローン多様性は、当該技術分野で公知の技術により測定することができる（例えば、Ｓｈｉｂａｔａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３８：４０２−４０３，２００６、Ｍａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．３８：４６８−４７３，２００６、およびＭｅｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ．３：１３８８−１３９７，２０１０を参照されたい）。
【００６６】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地および方法は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後またはステップ（Ａ）および（Ｂ）の後約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１日以内に（これらの間の組み合わせ、整数および範囲をすべて含む）上皮腫瘍細胞の約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の増殖を提供する。
【００６７】
例えば、特定の細胞培養培地および方法は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後の、またはステップ（Ａ）および（Ｂ）の後の約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６，もしくは５日以内に、または約５〜１４、６〜１４、７〜１４、８〜１４、９〜１４、１０〜１４、１１〜１４、１２〜１４、もしくは１３〜１４日以内に、または約５〜１３、６〜１３、７〜１３、８〜１３、９〜１３、１０〜１３、１１〜１３、もしくは１２〜１３日以内に、または約５〜１２、６〜１２、７〜１２、８〜１２、９〜１２、１０〜１２、もしくは１１〜１２日以内に、または約５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、もしくは１０〜１１日以内に、または約５〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０、もしくは９〜１０日以内に、または約５〜９、６〜９、７〜９、もしくは８〜９日以内に、または約５〜８、６〜８、もしくは７〜８日以内に、または約５〜７もしくは６〜７日以内に、または約５〜６日以内に、上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５，もしくは１０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、１５〜６５、１５〜７０、１５〜７５、１５〜８０、１５〜８５、１５〜９０、１５〜９５，もしくは１５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２０〜６５、２０〜７０、２０〜７５、２０〜８０、２０〜８５、２０〜９０、２０〜９５，もしくは２０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、２５〜４５、２５〜５０、２５〜５５、２５〜６０、２５〜６５、２５〜７０、２５〜７５、２５〜８０、２５〜８５、２５〜９０、２５〜９５、もしくは２５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５、もしくは３０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、３５〜５５、３５〜６０、３５〜６５、３５〜７０、３５〜７５、３５〜８０、３５〜８５、３５〜９０、３５〜９５，もしくは３５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約４０〜４５、４０〜５０、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５、もしくは４０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約４５〜５０、４５〜５５、４５〜６０、４５〜６５、４５〜７０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５，もしくは４５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、もしくは５０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約５５〜６０、５５〜６５、５５〜７０、５５〜７５、５５〜８０、５５〜８５、５５〜９０、５５〜９５、もしくは５５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６０〜９５、もしくは６０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約６５〜７０、６５〜７５、６５〜８０、６５〜８５、６５〜９０、６５〜９５、もしくは６５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７０〜９５、もしくは７０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約７５〜８０、７５〜８５、７５〜９０、７５〜９５，もしくは７５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約８０〜８５、８０〜９０、８０〜９５、もしくは８０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約８５〜９０、８５〜９５、もしくは８５〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約９０〜９５，もしくは９０〜１００％の増殖、または上皮腫瘍細胞の約もしくは少なくとも約９５〜１００％の増殖を提供し、これらの組み合わせをすべて含む。具体的な実施形態は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後の、またはステップ（Ａ）および（Ｂ）の後の約７日以内に、上皮腫瘍細胞の少なくとも約２０〜３０％の増殖、または約７日以内に上皮腫瘍細胞の少なくとも約６０％の増殖を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地および方法は、解離したＣＴＯＳと（ｂ）および（ｃ）との共培養後の、またはステップ（Ａ）および（Ｂ）の後の約４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１日以内に（これらの間の組み合わせ、整数および範囲をすべて含む）、ヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に約または少なくとも約５：１、１０：１、２０：１、５０：１、１００：１、２００：１、５００：１、１０００：１の比を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト上皮腫瘍細胞は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）および／またはＣＤ１３３の細胞形態学的性質および／または細胞表面発現を特徴とする。いくつかの実施形態において、間質細胞は、ビメンチンおよび／またはアルファ平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の細胞形態学的性質および／または細胞表面発現を特徴とする。
【００６９】
いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、「定義された培地」を含む。ある特定の実施形態において、「定義された培地」とは、化学的構成要素がすべて既知であるヒトまたは動物の細胞のインビトロまたはエクスビボ細胞培養に適切な成長培地である。いくつかの実施形態において、定義された培地は、血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む。いくつかの実施形態において、血清の濃度は、約１〜５％の範囲であるか、または約１％、２％、３％、４％，もしくは５％である。いくつかの実施形態において、定義された培地は、「無血清」または「実質的に無血清」であり、すなわち、培地は、添加される血清、例えば、ＦＢＳまたはウシ胎児血清ＦＣＳを欠失しているかまたは実質的に欠失している。
【００７０】
いくつかの実施形態において、定義された培地は、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ、またはこれらの組み合わせのような基礎培地を含み、例えば、追加的な構成要素、例えば成長因子、酸化防止剤、および／またはエネルギー源を補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２である。したがって、特定の実施形態において、定義された培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍの栄養素混合物（Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、またはＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭを含む。いくつかの実施形態において、培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を、例えば、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１．３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０の比で含む。
【００７１】
いくつかの実施形態において、先に記載したように、細胞培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、ＲＯＣＫ−１および／またはＲＯＣＫ−２阻害剤を含むか、または利用する。ＲＯＣＫ阻害剤の非限定例としては、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６が挙げられる。特定の実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）の濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、先に記載したように、細胞培養培地は、ＢＳＡおよび／もしくはＨＡＳのような補充ＳＡを含むか、または方法は、ＢＳＡおよび／もしくはＨＡＳのような補充ＳＡを利用する。ある特定の実施形態において、補充ＳＡの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００７３】
特定の実施形態において、細胞培養培地はフィーダー細胞を含むか、または方法はフィーダー細胞を利用する。本明細書で使用する場合、「解離したＣＴＯＳと共培養すること」は、フィーダー細胞がＣＴＯＳと同じ培地および同じ容器または培養プレートを共有することを意味する。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、非増殖性フィーダー細胞である。例えば、いくつかの場合において、フィーダー細胞は増殖を抑制するが代謝活性は維持するよう処理される。具体的な場合において、フィーダー細胞は、ガンマ照射で照射され、および／または細胞分裂を停止させるが細胞の代謝活性は維持するマイトマイシンＣを用いて処理される。いくつかの実施形態において、フィーダー細胞は、増殖を抑制するために処理されていない。例えば、いくつかの場合において、フィーダー細胞は、ＣＴＯＳとの物理的接触を防止する多孔性フィルタ上に配置され、フィーダー細胞の増殖を抑制するためにフィーダー細胞を処理する必要なく、ＣＴＯＳとともに培養される。
【００７４】
フィーダー細胞は、いずれかの哺乳類から得ることができ、フィーダー細胞の動物源は、培養されているＣＴＯＳと同じ動物源である必要はない。例えば、フィーダー細胞の例示的な源としては、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトのフィーダー細胞が挙げられるが、これらに限定されない。フィーダー細胞の具体的な型は、脾細胞、マクロファージ、胸腺細胞、および線維芽細胞を含む。いくつかの実施形態において、脾細胞、マクロファージ、胸腺細胞、および／または線維芽細胞は、非増殖性である。１つの具体的な例としては、確立されたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞株に由来するマウス線維芽細胞のサブクローンであるＪ２細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｊ２細胞はガンマ照射される。特定の実施形態において、Ｊ２細胞は、マイトマイシンＣを用いて処理される。具体的な実施形態において、フィーダー細胞は、非増殖性線維芽細胞、例えば、ヒト線維芽細胞である。
【００７５】
ある特定の実施形態において、細胞培養培地または方法は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素を除外するかまたはそうでなければ含んでいない。ＥＣＭの詳細な例としては、コラーゲン、マトリゲル、ラミニン、およびフィブロネクチンが挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、実質的に単細胞の懸濁液中へと解離されるヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳ、およびフィーダー細胞は、低細胞結合プレート、または低細胞結合表面を有する組織培養プレートの中で培養される。非限定例としては、低細胞結合表面を有する、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェルのプレート、ならびに９６ウェル、３８４ウェル、および１５３６ウェルのプレートのようなマイクロタイタープレートが挙げられる。低細胞結合プレートは市販されている（例えば、Ｎｕｎｃ（商標）Ｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰｌａｔｅｓまたはＭｉｃｒｏｐｌａｔｅｓを参照されたい）。低細胞結合プレートの使用は、例えば、幹細胞の細胞接着および望ましくない分化を低減させ、上皮腫瘍細胞に対して正常上皮細胞および間質細胞を優先的に枯渇させる。したがって、ある特定の実施形態は、本明細書に説明する細胞培養培地または共培養を含む、低細胞結合表面を有する組織培養プレートに関する。ある特定の方法は、例えば、１つのまたは複数の共培養ステップのための低細胞結合表面を有する組織培養プレートを採用する。
【００７７】
ある特定の実施形態において、先に記載したように、ヒトエクスビボ由来ＣＴＯＳは、ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料から培養され、このことは、組織消化培地中で細片化およびインキュベートすることと、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、ＷＮＴ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む定義された無血清（または実質的に無血清）かつフィーダー非含有のＣＴＯＳ成長培地中で、ＣＴＯＳを形成するのに十分な時間、腫瘍含有試料を培養することとを含む。具体的な実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地は、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、ノギン、Ｒ−スポンジン−１、およびＹ２７６３２を補充したＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（定義された無血清かつフィーダー非含有の培地（ＳＦＭ））である。具体的な実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地は、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、およびＹ２７６３２を補充し、かつノギン、Ｒ−スポンジン−１を含んでいないかまたは実質的に含んでいないＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（定義された無血清かつフィーダー非含有の培地（ＳＦＭ））である。具体的な実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地は、ニコチンアミドおよびＹ２７６３２を補充し、かつノギン、Ｒ−スポンジン−１、およびＷｎｔ３Ａを含んでいないかまたは実質的に含んでいないＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（定義された無血清かつフィーダー非含有の培地（ＳＦＭ））である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、組織消化または組織解離培地は、１つ以上のプロテアーゼを含む。プロテアーゼの例としては、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。市販の組織消化または解離培地の非限定例としては、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＴＬ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＴＭ、およびＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＤＨなどが挙げられる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地中のニコチンアミドの濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００ｍＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００ｍＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００ｍＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０ｍＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０ｍＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０ｍＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０ｍＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０ｍＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５ｍＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１ｍＭの範囲である。
【００８０】
ある特定の実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地中のＷｎｔ３Ａの濃度は、約０．１〜１０，０００もしくは１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜４００、１〜４００、１０〜４００、２０〜４００、３０〜４００、５０〜４００、４０〜４００、６０〜４００、７０〜４００、８０〜４００、９０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜３００、１〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３０〜３００、４０〜３００、５０〜３００、６０〜３００、７０〜３００、８０〜３００、９０〜３００、１００〜３００、２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜２００、１〜２００、１０〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１５０、１〜１５０、１０〜１５０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、６０〜１５０、７０〜１５０、８０〜１５０、９０〜１５０、１００〜１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１２０、１〜１２０、１０〜１２０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、１００〜１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１００、１〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地中のＢＭＰ阻害剤はノギンである。特定の実施形態において、ＢＭＰ阻害剤、例えば、ノギンの濃度は、約０．１〜１０，０００もしくは１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜４００、１〜４００、１０〜４００、２０〜４００、３０〜４００、５０〜４００、４０〜４００、６０〜４００、７０〜４００、８０〜４００、９０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜３００、１〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３０〜３００、４０〜３００、５０〜３００、６０〜３００、７０〜３００、８０〜３００、９０〜３００、１００〜３００、２００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜２００、１〜２００、１０〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１５０、１〜１５０、１０〜１５０、２０〜１５０、３０〜１５０、４０〜１５０、５０〜１５０、６０〜１５０、７０〜１５０、８０〜１５０、９０〜１５０、１００〜１５０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１２０、１〜１２０、１０〜１２０、２０〜１２０、３０〜１２０、４０〜１２０、５０〜１２０、６０〜１２０、７０〜１２０、８０〜１２０、９０〜１２０、１００〜１２０ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１００、１〜１００、１０〜１００、２０〜１００、３０〜１００、４０〜１００、５０〜１００、６０〜１００、７０〜１００、８０〜１００、９０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００８２】
特定の実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地中のＷｎｔ／β〜カテニンシグナル伝達アゴニストは、Ｒ〜スポンジン〜１である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ／β〜カテニンシグナル伝達アゴニスト、例えば、Ｒ〜スポンジン〜１の濃度は、約０．１〜１０，０００もしくは１〜１０００もしくは１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０，０００、１〜１０，０００、１０〜１０，０００、２０〜１０，０００、３０〜１０，０００、４０〜１０，０００、５０〜１０，０００、６０〜１０，０００、７０〜１０，０００、８０〜１０，０００、９０〜１０，０００、１００〜１０，０００、２００〜１０，０００、３００〜１０，０００、４００〜１０，０００、５００〜１０，０００、１０００〜１０，０００、５０００〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５０００、１〜５０００、１０〜５０００、２０〜５０００、３０〜１０，０００、４０〜５０００、５０〜５０００、６０〜５０００、７０〜５０００、８０〜５０００、９０〜５０００、１００〜５０００、２００〜５０００、３００〜５０００、４００〜５０００、５００〜５０００、１０００〜５０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜１０００、１〜１０００、１０〜１０００、２０〜１０００、３０〜１０００、４０〜１０００、５０〜１０００、６０〜１０００、７０〜１０００、８０〜１０００、９０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、８００〜１０００、９００〜１０００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜８００、１〜８００、１０〜８００、２０〜８００、３０〜８００、４０〜８００、５０〜８００、６０〜８００、７０〜８００、８０〜８００、９０〜８００、１００〜８００、２００〜８００、３００〜８００、４００〜８００、５００〜８００、６００〜８００、７００〜８００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜７００、１〜７００、１０〜７００、２０〜７００、３０〜７００、４０〜７００、５０〜７００、６０〜７００、７０〜７００、８０〜７００、９０〜７００、１００〜７００、２００〜７００、３００〜７００、４００〜７００、５００〜７００、６００〜７００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜６００、１〜６００、１０〜６００、２０〜６００、３０〜６００、４０〜６００、５０〜６００、６０〜６００、７０〜６００、８０〜６００、９０〜６００、１００〜６００、２００〜６００、３００〜６００、４００〜６００、５００〜６００ｎｇ／ｍｌ、または約０．１〜５００、１〜５００、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲である．
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地中のＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２の濃度は、約０．１〜１０００、０．５〜１０００、１〜１０００、５〜１０００、１０〜１０００、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００μＭ、または約０．１〜５００、０．５〜５００、１〜５００、５〜５００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００μＭ、または約０．１〜１００、０．５〜１００、１〜１００、５〜１００、１０〜１００、５０〜１００μＭ、または約０．１〜５０、０．５〜５０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０μＭ、または約０．１〜４０、０．５〜４０、１〜４０、５〜４０、１０〜４０μＭ、または約０．１〜３０、０．５〜３０、１〜３０、５〜３０、１０〜３０μＭ、または約０．１〜２０、０．５〜２０、１〜２０、５〜２０、１０〜２０μＭ、または約０．１〜１０、０．５〜１０、１〜１０、５〜１０μＭ、または約０．１〜５、０．５〜５、１〜５μＭ、または約０．１〜１もしくは０．５〜１μＭの範囲である．
【００８４】
いくつかの実施形態において、消化されたまたは解離した腫瘍含有試料は、ＣＴＯＳ成長培地中で、ＣＴＯＳを形成するために約もしくは約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、もしくは７２時間未満、または約もしくは約１、２、３、４、５、６、もしくは７日未満の間、培養されてから、本明細書に記載されているように、実質的に単細胞の懸濁液に解離され、フィーダー細胞およびＲＯＣＫ阻害剤と共培養される。
【００８５】
先に記載のように、本明細書に説明する細胞培養培地および方法はとりわけ、１つ以上の治療薬に対する患者腫瘍の起こり得る応答性を検査または査定して、比較的短い時間枠、例えば、１週間または２週間を待たずに、患者に対する最適な処置選択肢を同定する利点を提供するために使用することができる。したがって、ある特定の実施形態は、（ａ）本明細書に説明する細胞培養培地へ治療薬を投与することと、（ｂ）上皮腫瘍細胞増殖および／または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することとを含む、治療薬（例えば、薬物または候補薬）の応答性を検査する方法を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、上皮腫瘍細胞増殖における低下（例えば、統計的に有意な低下）は、治療薬に対するヒト患者（すなわち、ヒト患者における腫瘍）の応答性を示し、いくつかの実施形態において、上皮腫瘍細胞増殖における低下の欠如（例えば、統計的に有意な低下の欠如）は、治療薬に対するヒト患者（すなわち、ヒト患者における腫瘍）の耐性およびおそらくは非応答性を示す。いくつかの実施形態において、上皮腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導（例えば、統計的に有意な上昇）は、治療薬に対するヒト患者（すなわち、ヒト患者における腫瘍）の応答性を示す。特定の実施形態において、上皮腫瘍細胞増殖における上昇の欠如（例えば、統計的に有意な上昇の欠如）は、治療薬に対するヒト患者（すなわち、ヒト患者における腫瘍）の耐性およびおそらくは非応答性を示す。ある特定の実施形態において、上皮腫瘍細胞増殖における低下および腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導は、治療薬に対するヒト患者の応答性を示し、上皮腫瘍細胞増殖における低下の欠如は、治療薬に対するヒト患者の耐性またはおそらくは非応答性を示す。
【００８７】
いくつかの実施形態において、応答性を検査する方法は、細胞培養培地中でＣＴＯＳを解離させおよび共培養するのと同じ日に（例えば、同時にまたは実質的に同時に）治療薬を投与することを含む。ある特定の実施形態は、細胞培養培地中でＣＴＯＳを解離させおよび共培養する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、もしくは７２時間以内に、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、もしくは７２時間時に、治療薬を投与することを含む。細胞培養培地中でＣＴＯＳを解離および共培養した後約１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、もしくは２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、もしくは３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、もしくは４〜７、４〜６、４〜５、もしくは５〜７、５〜６、もしくは６〜７日間または約１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、もしくは２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、もしくは３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、もしくは４〜７、４〜６、４〜５、もしくは５〜７、５〜６、もしくは６〜７以内に治療薬を投与する方法を含む、細胞培養培地中でＣＴＯＳを解離および共培養した後約１、２、３、４、５、６、もしくは７日間または約１、２、３、４、５、６、もしくは７日以内に治療薬を投与する方法も含まれる。
【００８８】
ある特定の実施形態は、治療薬を投与する約１４日以内に、例えば、治療薬を投与する約１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５日以内に腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖および／または腫瘍細胞アポト〜シスを測定するステップを含む。具体的な実施形態は、治療薬を投与する約５〜１４、６〜１４、７〜１４、８〜１４、９〜１４、１０〜１４、１１〜１４、１２〜１４、もしくは１３〜１４日以内に、または約５〜１３、６〜１３、７〜１３、８〜１３、９〜１３、１０〜１３、１１〜１３、もしくは１２〜１３日以内に、または約５〜１２、６〜１２、７〜１２、８〜１２、９〜１２、１０〜１２、もしくは１１〜１２日以内に、または約５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、もしくは１０〜１１日以内に、または約５〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０、もしくは９〜１０日以内に、または約５〜９、６〜９、７〜９、もしくは８〜９日以内に、または約５〜８、６〜８、もしくは７〜８日以内に、または約５〜７もしくは６〜７日以内に、または約５〜６日以内に腫瘍細胞の集団における腫瘍細胞増殖および／または腫瘍細胞アポト〜シスを測定するステップを含む。
【００８９】
ある特定の実施形態において、検査するための治療薬または薬物は、小分子である。例示的な小分子としては、細胞毒性薬、化学治療薬、および抗血管新生薬、例えば、種々の癌の処置において有用とみなされたものが挙げられる。小分子の特定のクラスは、アルキル化薬、代謝拮抗物質、アントラシクリン、抗腫瘍抗生物質、白金、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、ツルニチソウ属（ｖｉｎｃａ）アルカロイド、およびタキサンを含む。
【００９０】
小分子の具体例としては、クロランブシル、シクロホスファミド、シレンギチド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メルファラン、プロカルバジン、チオテパ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、エンザスタウリン、ブスルファン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ゲフェチニブ、エルロチニブ、イダルビシン、テモゾロミド、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、テムシロリムス、エベロリムス、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ＣＴ５２９２３、およびパクリタキセル、ならびに上述のいずれかの医薬として許容され得る塩、酸、または誘導体が挙げられる。小分子の追加例としては、イマチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、スニチニブ、バタラニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＡＥＥ−７８８、ジコロアセタート（ｄｉｃｈｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、タモキシフェン、ファスジル、ＳＢ−６８１３２３、およびセマキサニブ（ＳＵ５４１６）が挙げられる（Ｃｈｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８：８２９−９０９，２００９を参照されたい）。
【００９１】
小分子のさらなる例としては、チオテパ、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））のようなアルキル化薬；ブスルファン、イムプロスルファン、およびピポスルファンのようなアルキルスルホナート薬；ベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスファオルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチルアメルアミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロス尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような副腎皮質拮抗物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎ���）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセタート；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標），Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロミチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）のようなレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに上述のいずれかの医薬として許容され得る塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００９２】
例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲンのような腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するよう作用する抗ホルモン薬；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンのような抗アンドロゲン、ならびに上述のいずれかの医薬として許容され得る塩、酸または誘導体も含まれる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、治療薬は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある特定の実施形態において、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは他のポリペプチドは、癌関連抗原、または癌抗原、例えば、検査される腫瘍細胞クラスターによって発現される癌抗原へ特異的に結合する。例示的な癌抗原としては、細胞表面受容体のような細胞表面タンパク質が挙げられる。癌関連抗原として、このような細胞表面タンパク質または受容体へ結合するリガンドも含まれる。具体的な実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、細胞内癌抗原へ特異的に結合する。いくつかの実施形態において、癌抗原と結合する癌は、乳癌、転移性脳癌、前立腺癌、消化管癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、頭頚部癌、胃癌、膀胱癌、膵癌、肝癌、腎癌、扁平上皮癌、中枢神経系癌もしくは脳癌、黒色腫、非黒色腫性癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、上皮性腫瘍、骨癌、または造血系癌のうちの１つ以上である。
【００９４】
特定の実施形態において、抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは他のポリペプチドは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮成長因子ＶＥＧＦ（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テナシン、ビメンチン、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸アンヒドラーゼ９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０全癌腫抗原（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来成長因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝ホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、ルイス−Ｙ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉性起源腫瘍上で発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、および／またはメソテリンのような、少なくとも１つの癌関連抗原または癌抗原へ特異的に結合する。
【００９５】
ある特定の実施形態において、抗体は、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アラシズマブ（ペゴル）、アマツキシマブ、アポリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ビタツズマブ（メルタンシン）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブ（メルタンシン）、カンツズマブ（ラブスタシン）、カプロマブ（ペンデチド）、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ（ボガトックス）、シクスツムマブ、クリバツズマブ（テトラキセタン）、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、エクロメキシマブ、エドレコロマブ、エロツズマブ、エナバツズマブ、エンシツキシマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、ＦＢＴＡ０５、フィギツムマブ、フランボツマブ、ガリキシマブ、ゲンツズマブ、ガニツマブ、ゲンツズマブ（オゾガマイシン）、ギレンツキシマブ、グレンバツムマブ（ベドチン）、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、インダツキシマブラブタンシン、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ（ＭＤＸ−１０１）、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ（メルタンシン）、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モキセツモマブ（パスドトクス）、ナコロマブ（タフェナトクス）、ナプツモマブ（エスタフェナトクス）、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、Ｎｅｕｒａｄｉａｂ（登録商標）（放射性ヨウ素含有または非含有）、ＮＲ−ＬＵ−１０、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ（モナトクス）、オレゴボマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、ペンツモマブ、ペルツズマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サマリズマブ、シブロツズマブ、シツキシマブ、タバルマブ、タプリツモマブ（パプトクス）、テナツモマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、トレメリムマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシツモマブ、ＴＲＢＳ０７、トラスツズマブ、ツコツズマブ（セルモロイキン）、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、およびザルツムマブのような抗体を含む、抗癌治療用抗体のような治療用抗体である。これらの抗体のフラグメント、変異体、および誘導体も含まれる．
【００９６】
ある特定の実施形態は、２つ以上の治療薬の組み合わせに対する応答性を検査することを含む。したがって、ある特定の方法は、上述の例示的な治療薬のうちのいずれか２つ以上の組み合わせを含む、２つ以上の治療薬を培地懸濁液へ投与することを含む。
【００９７】
当該技術分野で公知のいかなる種々の方法も、腫瘍細胞増殖および／または腫瘍細胞アポトーシスを測定するために使用することができる。例えば、腫瘍細胞増殖を測定するある特定の方法は、１つ以上の細胞増殖マーカーを測定することを含む。例示的な細胞増殖マーカーは、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含む。したがって、ある特定の実施形態において、腫瘍細胞増殖を測定するステップは、例えば、これらの組み合わせを含む３Ｈ−チミジン、ＢｒｄＵ、Ｅｄｕ、Ｋｉ−６７、およびＰＣＮＡのうちの１つ以上から選択される細胞増殖マーカーを測定することを含む。
【００９８】
同様に、当該技術分野で公知のいずれかの種々の方法は、腫瘍細胞アポトーシスを測定するために使用することができる。「アポトーシス」は概して、特徴的な細胞変化（例えば、形態学的性質）および細胞死をもたらす生化学的事象を含む、多細胞生物において生じるプログラムされた細胞死の過程を指す。例示的な変化としては、小疱形成、細胞の縮化、核分断、染色質凝集、染色体ＤＮＡ断片化、および包括的なｍＲＮＡの崩壊が挙げられる。腫瘍細胞アポトーシスを測定するある特定の方法は、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む。例示的な細胞アポトーシスマーカーとしては、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイが挙げられる。したがって、ある特定の実施形態において、腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップは、例えば、これらの組み合わせを含むＦＬＩＣＡ、ＰＡＲＰ、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、およびＴＵＮＥＬアッセイのうちの１つ以上から選択される細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む。
【００９９】
ある特定の態様において、これらの応答性の検査または方法は、診断用実験室で実施され、次に、結果は、患者、または患者の健康管理および癌処置において役割を担っている医師もしくは他の医療提供者へ提供される。特定の実施形態はしたがって、腫瘍細胞クラスター応答性検査の結果を患者へ、または医師もしくは他の医療提供者へ提供するための方法を含む。これらの結果またはデータは、ハードコピーもしくは紙コピーの形態で、または計算機読取り可能媒体のような電子形態であることができる。
【０１００】
本明細書に説明する種々の構成要素のうちの１つ以上を含むキットも含まれる。例えば、このようなキットは、条件的初期化のための共培養を調製するために、および／またはヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料からＣＴＯＳを調製するために採用することができる。
【０１０１】
ある特定の実施形態はしたがって、
−定義された無血清かつフィーダー非含有の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）成長培地、
−組織消化または解離培地、
−低細胞結合表面を有する組織培養プレート、
−定義された細胞培養培地、
−凍結フィーダー細胞、
−Ｒｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ならびに
−細胞増殖マーカーおよび／または細胞アポトーシスマーカー、
のいずれかの組み合わせを含む、試料調製キットに関する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、キットは、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、および／もしくはＲＯＣＫ阻害剤を提供し、またはＣＴＯＳ成長培地は、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト、および／もしくはＲＯＣＫ阻害剤を含む。ある特定のキットは、例えば、ＣＴＯＳ成長培地および／または定義された細胞培養培地へ添加されることになっている補充ＳＡを含むかまたは提供する。いくつかの実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地および／または定義された細胞培養培地は、補充ＳＡを含む。いくつかの実施形態において、補充ＳＡは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される。ある特定の実施形態において、ＣＴＯＳ成長培地および／または定義された細胞培養培地中の補充ＳＡの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ未満、または約０��５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．５、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、１０．０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１．０、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２．０、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３．０、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８、１４．０、１４．２、１４．４、１４．６、１４．８、１５．０、１５．２、１５．４、１５．６、１５．８、１６．０、１６．２、１６．４、１６．６、１６．８、１７．０、１７．２、１７．４、１７．６、１７．８、１８．０、１８．２、１８．４、１８．６、１８．８、１９．０、１９．２、１９．４、１９．６、１９．８、もしくは２０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、定義された細胞培養培地は、血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を約１〜５％の範囲の濃度で、または約１％、２％、３％、４％、もしくは５％である濃度で含む。いくつかの実施形態において、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２、ＨＡ１１００ヒドロクロリド、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６のうちの１つ以上から選択される。ある特定の実施形態において、細胞増殖マーカーは、３Ｈ−チミジン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）、Ｋｉ−６７、および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）のうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態において、細胞アポトーシスマーカーは、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤（ＦＬＩＣＡ）、カスパーゼ活性化、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）開裂、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのうちの１つ以上から選択される。
【０１０４】
キットは、例えば、患者試料からのＣＴＯＳの調製方法、腫瘍上皮細胞の細胞増殖のための共培養ＣＴＯＳ、および／または１つ以上の治療薬に対する腫瘍上皮細胞の応答性に関して記載された説明書も含むことができる。
【０１０５】
本明細書に引用する公表物、特許出願、および発行された特許はすべて、各個々の公表物、特許出願、または発行された特許が参照により組み入れられるよう具体的かつ個々に示されたかのように、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０６】
上述の発明は、理解の明確さの目的のために説明および例として幾分詳細に説明してきたが、ある特定の変更および修正が本明細書または添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく行われることがあることは当業者に容易に明らかであろう。次の実施例は、説明として提供されるに過ぎず、制限として提供されるものではない。当業者は、本質的に同様の結果を生じるよう変更または修正され得る種々の決定的ではないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド（ＣＴＯＳ）の単離および単細胞培養物としての条件的初期化
大腸癌患者由来の正常および腫瘍外科的試料を、患者の同意書を受理した後にＢｅｉｊｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。
【０１０８】
簡潔には、ＣＴＯＳ培養物を調製するために、非腫瘍組織および壊死画分を腫瘍標本から注意深く取り出した。正常組織および腫瘍組織はいずれも、はさみを用いて直径１ｍｍ未満の小片へと切断した。細片化した腫瘍画分を、磁石撹拌棒を入れた滅菌済み１００ｍｌガラス製三角フラスコへと移した。０．２５Ｕ／ｍｌのＬｉｂｅｒａｓｅ  ＤＨ（定義された比のコラゲナーゼＩおよびＩＩ、非クロストリジアル中性プロテアーゼであるＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）含有）を含有する１０〜１５ｍｌの消化培地を、細片化した腫瘍組織へと添加して、酵素消化を開始した。酵素混合物を３７℃で１〜２時間、中等度に撹拌しながらインキュベートした。部分的な消化した腫瘍細胞クラスターを１００μｍ細胞保持器で濾過した。濾化物を４０μｍ細胞抑制剤で再度濾過した。４０μｍ細胞抑制剤上で保持した腫瘍細胞クラスターを収集し、ＨＢＳＳで２回洗浄した後、細胞成長因子および小分子阻害剤を補充した定義された成長培地中で再懸濁した。定義された成長培地中で腫瘍細胞クラスターを一晩回復させた。定義された完全成長培地は、ニコチンアミド、Ｗｎｔ３Ａ、ノギン（骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤）、Ｒ−スポンジン−１（Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達アゴニスト）、およびＹ２７６３２（Ｒｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ−１）阻害剤）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（定義された無血清かつフィーダー非含有培地（ＳＦＭ））とした。
【０１０９】
Ｒ−スポンジン−１およびノギンを補充していない、かついくつかの場合においてはＷｎｔ３Ａも補充していない上述の定義された完全成長培地を含む選択的成長培地も検査した（図８Ａ〜図８Ｈおよび図９Ａ〜図９Ｈを参照されたい）。正常上皮細胞は定義された完全成長培地中で成長した（図８Ａ〜図８Ｄ）が、選択的成長培地中では成長しなかった（図８Ｅ〜図８Ｈ）。対照的に、腫瘍上皮細胞は定義された完全成長培地（図９Ａ〜図９Ｄ）および選択的成長培地（図９Ｅ〜図９Ｈ）のいずれの中でも成長した。
【０１１０】
条件的初期化のために、収集したＣＴＯＳを、ウェルあたり約３０００個の細胞でフィーダー細胞／Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）共培養系を含有する低細胞結合プレート中で解離させおよび播種した（図４Ａ〜図４Ｆを参照されたい）。
【０１１１】
初回播種後、解離した腫瘍上皮細胞を、定義された選択的成長培地、すなわち、ニコチンアミドおよびＹ２７６３２（Ｒｈｏ結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ−１）阻害剤）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（定義された無血清かつフィーダー非含有培地（ＳＦＭ））の中での薬物検査に使用した。
【０１１２】
エクスビボ薬物検査のために、播種した腫瘍細胞を薬物または薬物の組み合わせへ７２時間曝露した。薬物をＤＭＳＯ中で調製し、培地中でのＤＭＳＯの終濃度は０．１％とした。薬物および薬物の組み合わせは、１０地点連続希釈において検査した（図６を参照されたい）。薬物を用いた曝露に続いて、上皮腫瘍細胞を５−ｅｔｈｙｎｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（Ｅｄｕ）で標識して、腫瘍細胞増殖速度を評価した。標識は、薬物曝露の存在下で２４時間続行した。対照群において、上皮腫瘍細胞は、培地交換とともに薬物曝露を受けなかったが、Ｅｄｕで同様に標識した。標識した腫瘍細胞を固定し、０．５％トリトンＸ−１００と３％ＢＳＡとを含有するブロッキング緩衝液中のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて、４℃で一晩染色した。腫瘍細胞をＥｐＣＡＭ抗体（１：４０００）とともに室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴですすいだ。その後、腫瘍細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７結合ヤギ抗マウス２次抗体とともに室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴですすいだ。
【０１１３】
固定された細胞を１×Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  Ｅｄｕ反応緩衝液と、ＣｕＳＯ４と、アジ化物結合Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素とを含有する反応混合物とともに暗所でインキュベートするＣｌｉｃｋ−ｉＴ反応によって、組み込まれたＥｄｕを検出した。染色した細胞をＰＢＳ時間で洗浄した後、画像の獲得および解析のために黒色壁のプレート中へと分配した。
【０１１４】
正常組織については、腫瘍クラスターは、上述の部分的酵素消化の下では観察されなかった。単細胞を収集し、１ウェルあたり３０００個の細胞でフィーダー細胞およびＲｏｃｋ阻害剤Ｙ２７６３２中に播種した。正常細胞を７２時間成長させた後、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（Ｅｄｕ）で標識して、腫瘍細胞増殖速度を評価した。正常細胞をＥｐＣＡＭ抗体で染色して、上皮細胞を同定した。
【０１１５】
画像獲得および解析のために、染色した腫瘍細胞を高コンテンツスクリーニング（ＨＣＳ）プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎ  ＸＴｉ  ＨＣＳリーダー）によって撮像した。１０倍対物レンズを用いて画像を収集した。２５の視野を各ウェルについて撮像し、３０００個超の細胞を解析のために捉えた。画像から、３つの蛍光シグナルをＨＣＳリーダーから得た。青色蛍光シグナルはヘキスト３３３４２で染色した核シグナルを記録し、緑色蛍光シグナルは新たに合成されたＤＮＡの中に組み込まれたＥｄｕを検出し、赤色蛍光シグナルはＥｐＣＡＭ陽性上皮細胞集団を検出した。Ｅｄｕ陽性部分母集団細胞の百分率を総上皮細胞計数の百分率として算出した。
【０１１６】
図７Ａ〜図７Ｂに示すように、薬物および薬物の組み合わせについてのＥｄｕを組みこまれた百分率の用量応答データを、８名の異なる患者について定量的薬物感受性スコアを用いて作成した（７Ｂ）。データは、最大効果レベル（Ａｍａｘ）、化合物の最大半値活性の濃度（ＥＣ５０）、占有面積移行を表すＨｉｌｌ係数、および活性面積（ＤＳＳ）に基づく多変量用量応答関連性を捉えるための定量的スコア化アプローチによって表して、選択的薬物応答パターンを同定することができる。
Ａｍａｘ（ＥｄＵ）＝ＭＩｃｍａｘ／ＭＩｃ
ＤＳＳ（曲線下面積）＝∫ＭＩ（ｘ）ｄｘ
Ａｍａｘ、ＥＣ５０、およびＤＳＳは、検査した薬物または薬物の組み合わせに対する患者の応答についての予測モデルを確立するために使用することができた。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｆ】
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【図５Ａ−５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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