(57)【要約】  タウｍＲＮＡおよびタンパク質発現を減少させるための組成物および方法が本明細書で提供される。これらの組成物および方法は、タウに関連する疾患および障害を治療するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２〜１７で示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記核酸塩基配列のいずれかにおけるＣがシトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが２’−修飾を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
表２〜８で示される配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含み、前記核酸塩基配列のいずれかにおけるＣがシトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが２’−修飾を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
表２〜８で示される配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
表２〜８で示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
表２〜８で示される核酸塩基配列のいずれかを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
表２〜８で示される核酸塩基配列のいずれかからなる、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結がホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結のどちらかである、請求項２から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの３’末端にリン酸架橋を通して付着したリンカーを含み、以下の構造：
【化１】
2019500428.tif 000037
のいずれかを有する、請求項２から７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ＲＮＡｓｅＨとは独立に、タウｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を減少させる、請求項２から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
表９〜１５および１７で示される配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含み、前記核酸塩基配列のいずれかにおけるＣがシトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが２’−修飾を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
表９〜１５および１７で示される配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかを含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかからなる、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結である、請求項１０から１４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
少なくとも５個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含む、請求項１０から１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
少なくとも７個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含む、請求項１０から１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
１０個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含む、請求項１０から１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ＲＮＡｓｅＨを活性化することによりタウｍＲＮＡまたはタンパク質発現を減少させる、請求項１０から１８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記核酸塩基配列のいずれかにおける各Ｃが５−メチルシトシンである、請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号４８７〜５０６のいずれか１つの少なくとも１２個の連続した核酸塩基と相補的である核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが２’−修飾を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号４８７〜５０６のいずれか１つの少なくとも１２個の連続した核酸塩基と１００％相補的である核酸塩基配列を含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
１つまたは複数の５−メチルシトシンを含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドが２’−修飾を有する、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
少なくとも５個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
少なくとも７個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
１０個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含む、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
１２から３０個の核酸塩基を含む、請求項１から２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
１２から２５個の核酸塩基を含む、請求項１から２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
１５から２０個の核酸塩基を含む、請求項１から２７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記２’−修飾が、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される、請求項１から３０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記２’−修飾が２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）である、請求項１から３０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
インビトロで、タウｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルを少なくとも３０％減少させることができる、請求項１から３２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
インビボで、タウｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルを少なくとも３０％減少させることができる、請求項１から３２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３６】
請求項１から３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの治療有効量を対象に投与することを含む、前記対象におけるタウ発現レベルを減少させる方法。
【請求項３７】
前記対象が、タウに関連する疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記タウに関連する疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症候群−認知症複合病（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、パンチドランカー、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化症、ダウン症候群、ドラベ症候群、癲癇、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体（ＦＴＤＰ−１７）と連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節膠腫、神経節細胞腫、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、封入体筋炎、鉛脳症、リティコ・ボディグ病、髄膜腫血管腫症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰ−Ｃ）、神経原線維変化を伴う非グアマニアン運動神経病、ピック病（ＰｉＤ）、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、神経原線維変化優位型認知症（Tangle-predominant dementia）、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、または結節性硬化症から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドが、前記対象に、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、経口、静脈内、または皮下経路を通して投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
第２の作用物質を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象がヒトである、請求項３６から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
それを必要とする対象におけるタウに関連する疾患を治療するための、請求項１から３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４３】
それを必要とする対象におけるタウに関連する疾患の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１から３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４４】
前記オリゴヌクレオチドが表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかを含み、第１から第５のヌクレオチドが２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含み、第６から第１５のヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオシドを各々含み、第１６から第２０のヌクレオチドが２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
配列番号２０８、２８４、２８５、３１３、３２９、３３５、３６６、３８４、３８６、４０５、４７３、および４７４のいずれか１つから選択される核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
第１から第５のヌクレオチドが２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含み、第６から第１５のヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオシドを各々含み、第１６から第２０のヌクレオチドが２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含む、請求項４５に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月２１日出願の米国特許仮出願第６２／２７０１６５号明細書の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、タウｍＲＮＡおよびタンパク質発現を減少させるための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、タウに関連する疾患を治療するのに有用である。
【０００３】
背景
タウは、微小管を安定化して軸索の輸送を容易にする、微小管に関連するタンパク質である。タウタンパク質は、チューブリンと相互作用して、微小管を安定化し、チューブリンアセンブリが微小管になることを促進する。微小管ネットワークは、細胞骨格の形成ならびに細胞の構造および形態の維持、ならびに小胞、細胞小器官および高分子の細胞内輸送のためのプラットホームの提供を含む多くの重要な細胞過程に関与する。微小管に対するタウの結合は、微小管を安定化するので、タウは、これらの細胞過程のうちで最も重要なメディエーターである。
【０００４】
少なくとも６種のタウアイソフォームがヒトの脳中に存在し、３５２〜４４１アミノ酸残基長の範囲にある。タウアイソフォームは、１７番染色体に位置する単一の遺伝子ＭＡＰＴ（微小管に関連するタンパク質タウ）に由来する。ＭＡＰＴ転写物は、複雑な、調節された代替的スプライシングを受けて、複数のｍＲＮＡ種を生ずる。ＭＡＰＴのエクソン２および３は、それぞれ２９−または５８アミノ酸の配列をコードして、したがってエクソン２および／または３の代替的スプライシングは、０Ｎ、１Ｎ、または２Ｎタウと、それぞれ称される、Ｎ末端で２９アミノ酸の酸性ドメインのゼロ、１、または２個のコピーの包含を生ずる。ＭＡＰＴのエクソン１０は、微小管結合ドメインをコードしており、したがって、エクソン１０の包含は、追加の微小管結合ドメインの存在を導く。タウには他の場所に３個の微小管結合ドメインがあるので、エクソン１０を含むタウアイソフォームは、微小管結合ドメインの４回の繰り返しを有するタウタンパク質を意味する「４Ｒタウ」と称される。エクソン１０を含まないタウアイソフォームは「３Ｒタウ」と称され、それは、微小管結合ドメインの３回の繰り返しを有するタウタンパク質を意味する。４Ｒタウアイソフォームは、３Ｒタウアイソフォームよりも強く微小管に結合すると思われ、その理由は、４Ｒタウアイソフォームが１個多くの微小管結合ドメインを有するからである。４Ｒタウに対する３Ｒタウの比は、発生時に調節されて、胎児組織はもっぱら３Ｒタウを発現して、成人ヒト組織は、およそ等しいレベルの３Ｒタウおよび４Ｒタウを発現する。
【０００５】
タウはリンタンパク質であり、最も長いタウアイソフォームでは、約８５箇所のリン酸化可能な部位（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）を有する（Pedersen and Sigurdsson, Trends in Molecular Medicine 2015, 21 (6): 394）。リン酸化は、正常タウタンパク質ではこれらの部位の約半分で報告されている。タウは、細胞サイクル中に絶えずリン酸化されて脱リン酸化される。タウは、その脱リン酸化された形態でのみ微小管と会合できるので、したがって、タウのリン酸化は、ニューロン内で直接微小管会合−解離のスイッチとして作用する。病理学的条件下で、タウタンパク質は、過度にリン酸化されて、チューブリン結合の喪失および微小管の不安定化を生じ、続いて病原性の神経原線維変化におけるタウの凝集および堆積が生ずる。タウのプロテアーゼ切断フラグメント（Ａｓｐ１３、Ｇｌｕ３９１、およびＡｓｐ４２１）も神経原線維変化において同定されている。
【０００６】
発明の概要
ヒト微小管に関連するタンパク質タウ（ＭＡＰＴ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、およびこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、タウｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を減少させる方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される組成物および方法は、タウに関連する疾患の治療に有用である。
【０００７】
一態様において、表２〜１７で示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、核酸塩基配列のいずれかにおけるＣが、シトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが２’−修飾を有する、オリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。２’−修飾は、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、２’−修飾は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）である。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列のいずれかにおける各Ｃは、５−メチルシトシンである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から３０核酸塩基の長さである。例えば、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から２５核酸塩基の長さである。例えば、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５から２０核酸塩基の長さである。例えば、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の核酸塩基を含むことができる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、立体的遮断剤である。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タウｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を、ＲＮＡｓｅＨとは独立に減少させる。立体的遮断剤のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８で示される配列のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む立体的遮断剤であり、ここで、核酸塩基配列のいずれかにおけるＣは、シトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは２’−修飾を有する。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８で示される配列のいずれかと、少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８で示される配列のいずれかと、少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８で示される核酸塩基配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８で示される核酸塩基配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列のいずれかにおける各Ｃは、５−メチルシトシンである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドサブユニットにおいて２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端にリン酸架橋を通して付着したリンカーを含み、該オリゴヌクレオチドは、以下の構造のいずれかを有する：
【００１２】
【化１】
2019500428.tif 000002
【００１３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーであり、それは、５’および３’末端における２つのウィングセグメント（それぞれ、５’ウィングおよび３’ウィングとも言われる）の間に位置する連続した２’−デオキシリボヌクレオチドの中央ギャップセグメントを有する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨを活性化することによりタウｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を減少させる。該ギャップマーのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル連結であることができる。いくつかの実施形態において、ギャップマーは、少なくとも５個（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチを含み、５’および３’ウィングセグメントは、１つまたは複数の２’−修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも７個（例えば、７、８、９、１０、１１、１２個）の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、１０個の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含む。２’−修飾は、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、ギャップマーは、５’ウィングおよび３’ウィングに２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオチドを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、タウを標的とするギャップマーは、２０ヌクレオシドの長さである５−１０−５ギャップマーであり、そこで、中央ギャップセグメントは１０個の連続した２’−デオキシヌクレオシドを含み、５’ウィングおよび３’ウィングと隣接し、各ウィングは各々２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を有する５個のヌクレオシドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７で示される配列のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むギャップマーであり、ここで、核酸塩基配列のいずれかにおけるＣは、シトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが２’−修飾を有する。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７で示される配列のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７で示される核酸塩基配列のいずれかからなる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかを含む５−１０−５ギャップマーであり、ここで、第１から第５のヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含み、第６から第１５のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオシドを各々含み、第１６から第２０のヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基配列のいずれかにおける各Ｃは、５−メチルシトシンである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２０８、２８４、２８５、３１３、３２９、３３５、３６６、３８４、３８６、４０５、４７３、および４７４のいずれか１つから選択される核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２８４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２８４を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２８５または２０８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２８５または２０８を含む。
【００１７】
別の態様において、１、２、または３箇所のミスマッチを有する、配列番号４８７〜５０６のいずれか１つの少なくとも１２個の連続した核酸塩基と相補的である核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが、２’−修飾を有するオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、配列番号４８７〜５０６のいずれか１つの少なくとも１２個の連続した核酸塩基と１００％相補的である核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは２’−修飾を有する。該２’−修飾は、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、該２’−修飾は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）である。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも５個（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも７個（例えば、７、８、９、１０、１１、１２個）の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドは、１０個の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで、タウｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、少なくとも３０％減少させることができる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで、タウｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを少なくとも３０％減少させることができる。
【００２０】
別の態様において、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれか、および薬学的に許容される担体を含む組成物が、本明細書で提供される。
【００２１】
さらなる態様において、例えば、タウに関連する疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい対象におけるタウ発現レベルを、該対象に、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかの治療有効量を投与することにより減少させる方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、そのような方法は、第２の作用物質を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象に、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、経口、静脈内、または皮下経路を通して投与することができる。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【００２２】
それを必要とする対象、例えば、タウに関連する疾患に罹患しているか、または罹患しやすい対象におけるタウに関連する疾患を治療するのに使用するための、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の、それを必要とする対象におけるタウに関連する疾患を治療するための使用も含まれる。本開示は、それを必要とする対象におけるタウに関連する疾患の治療に使用するための医薬の製造における本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も含む。
【００２３】
タウに関連する疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症候群−認知症複合病（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、パンチドランカー、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化症、ダウン症候群、ドラベ症候群、癲癇、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体（ＦＴＤＰ−１７）と連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節膠腫、神経節細胞腫、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、封入体筋炎、鉛脳症、リティコ・ボディグ病、髄膜腫血管腫症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、Ｃ型ニーマンピック病（ＮＰ−Ｃ）、神経原線維変化を伴う非グアマニアン運動神経病、ピック病（ＰｉＤ）、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、神経原線維変化優位型認知症（Tangle-predominant dementia）、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、または結節性硬化症から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの物理的特徴付けを示す。図１Ａは、配列番号２８４を含み、式Ｃ２３０Ｈ３２１Ｎ７２Ｏ１２０Ｐ１９Ｓ１９および７２１２．３Ｄａの予想される分子量を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の構造を示す。図１Ｂは、配列番号２８４を含み、７２１４．３の測定されたピーク質量を有するＡＳＯの液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）のデータを示す。図１Ｃは、配列番号２８４を含むＡＳＯについてのＬＣ−ＭＳのデコンヴォリューションピークの報告を示す。図１Ｄは、配列番号２８５を含み、７２３２．５の測定されたピーク質量を有するＡＳＯのＬＣ−ＭＳデータを示す。図１Ｅは、配列番号２８５を含むＡＳＯについてのＬＣ−ＭＳのデコンヴォリューションピークの報告を示す。
【図１−２】（前記の通り。）
【図１−３】（前記の通り。）
【図２】図２Ａ〜２Ｅは、アンチセンスオリゴヌクレオチド処置前および後の、代表的なｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウス系統におけるヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを示す。図２Ａは、６種全てのヒトタウ転写物が、ｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウス（トランスジェニック系統５１０、月齢２ヵ月の雌マウス）の前脳で見出されたことを示す代表的ＲＴ−ＰＣＲ結果である。エクソン２、３および１０が、交互にスプライシングされて、６種のタウアイソフォーム：２−３−１０−；２＋３−１０−；２＋３＋１０−；２−３−１０＋；２＋３−１０＋；２＋３＋１０＋を生ずる。４Ｒは、エクソン１０を有するタウアイソフォームを表し、３Ｒは、エクソン１０を有しないタウアイソフォームを表し；０Ｎは、エクソン２もエクソン３も有しないタウアイソフォームを表し；１Ｎは、エクソン２またはエクソン３のどちらかを有するタウアイソフォームを表し；２Ｎは、エクソン２およびエクソン３の両方を有するタウアイソフォームを表す。図２Ｂは、４８〜６７ｋＤの分子量を有し、アミノ酸範囲が３５２〜４４１の６種のタウタンパク質アイソフォームを示す代表的ウェスタンブロットである。それらは、（１）２９アミノ酸のＮ末端部分のゼロ、１または２個の挿入物の包含（０Ｎ、１Ｎ、または２Ｎ）、または（２）３または４個の微小管結合ドメインの包含（３Ｒまたは４Ｒ）において異なる。図２Ｃは、ｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスの脳中における、ヒトタウに特異的な抗体で染色したヒトタウの正常軸索の分布を示す代表的免疫組織化学画像である。図２Ｄは、配列番号２８５を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによる単回処置後４週間目のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスの皮質におけるタウｍＲＮＡのノックダウンを示す棒グラフである。図２Ｅは、配列番号２８５を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによる単回処置後４週間目のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスの海馬におけるタウタンパク質ノックダウンを示す代表的ウェスタンブロットである。
【図３】図３は、ｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスにおける配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチドの広い脳分布を示す一連のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション画像である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチドの１、１０、５０、２００、または４００μｇの単回ＩＣＶ注射後４週間または１２週間目のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウス中におけるヒトタウｍＲＮＡ（図４Ａ）およびタンパク質（図４Ｂ）発現の用量依存性の阻害を示すドットプロットである。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチドの２００μｇを単回ＩＣＶ注射後した後のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウス中におけるヒトタウｍＲＮＡ（図５Ａ）およびタンパク質（図５Ｂ）の発現レベルの時間経過を示すドットプロットである。
【００２５】
詳細な記載
微小管に関連するタンパク質タウ（ＭＡＰＴ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物、およびこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してタウ発現を減少させる方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される組成物および方法は、タウに関連する疾患の治療に有用である。
【００２６】
定義
本明細書および請求項で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に他のように指示されていない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「ａ  ｃｅｌｌ」は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００２７】
全ての数的表示、例えば、範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、（＋）または（−）０．１刻みで変化した近似である。常に明示的に述べられるとは限らないが、全ての数的表示の前に「約」という用語が先行すると理解されるべきである。常に明示的に述べられるとは限らないが、本明細書に記載される試薬は、単なる例であり、そのような試薬の等価物は、当技術分野において知られているということも理解されるべきである。
【００２８】
用語「２’−修飾」は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドのフラノース環の２’−位におけるＨまたはＯＨの別の基による置換を指す。
【００２９】
本明細書において使用する「２’−Ｏ−メトキシエチル」、「２’−ＭＯＥ」、または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＯＣＨ３」は、フラノース環の２’位におけるＯ−メトキシエチル修飾を指す。２’−Ｏ−メトキシエチルで修飾された糖は、修飾された糖である。「２’−ＭＯＥヌクレオシド／ヌクレオチド」または「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド／ヌクレオチド」は、２’−ＭＯＥで修飾された糖部分を含むヌクレオシド／ヌクレオチドを指す。
【００３０】
「５−メチルシトシン」は、５’位に付着したメチル基で修飾されたシトシンを指す。
【００３１】
本明細書において使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、例えば、標的ゲノム配列、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ分子の対応するセグメントに相補的である核酸塩基配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から３０核酸塩基の長さである。
【００３２】
用語「相補性」または「相補的な」は、対応する核酸塩基間の水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合）により媒介される、第１の核酸鎖の核酸塩基と第２の核酸鎖の核酸塩基の間の塩基対形成能力を指す。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と相補的であり、グアノシン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と相補的であり、グアノシン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と相補的である。ある実施形態では、相補的な核酸塩基は、その標的核酸の核酸塩基と塩基対を形成することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基を意味する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのある位置における核酸塩基が、標的核酸のある位置における核酸塩基と水素結合することができれば、その場合には、該オリゴヌクレオチドと該標的核酸の間の水素結合の位置が、その核酸塩基対で相補的であるということになる。ある修飾を含む核酸塩基は、カウンターパートの核酸塩基と対を形成する能力を保つことができ、したがって、やはり核酸塩基相補的であり得る。
【００３３】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量を指す。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患の発症または疾患症状を予防するために必要な量である予防有効量と同じであるかまたは異なることができる。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬で投与することができる。治療用の化合物の「治療有効量」（すなわち、効果的な投薬量）は、治療用の化合物の選択に依存する。本発明の組成物は、１日当たり１回または複数回から、１日おきに１回を含む１週間当たり１回または複数回投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的健康および／または年齢および存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない、ある因子が、対象を効果的に治療するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響し得ることを認識するであろう。その上、本明細書に記載された治療用の化合物の治療有効量を用いる対象の治療は、単回処置または一連の処置を含むことができる。
【００３４】
本明細書において使用する用語「ギャップマー」は、連続した２’−デオキシリボヌクレオチドからなる中央ギャップセグメントを含むキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを指し、それは、ＲＮＡｓｅＨを活性化することができ、５’および３’末端で、各々ヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性を与える１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む２つのウィングセグメントと隣接している。
【００３５】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸鎖の塩基対形成および二重鎖構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、完全に相補的な核酸鎖の間またはミスマッチした重要でない領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖の間で起こり得る。特定の機構に制約されないが、対形成の最も一般的な機構は、水素結合を含み、それは、核酸鎖の相補的核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの水素結合であってもよい。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通して対となる相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、変化するストリンジェントな状況下で起こり得る。本明細書において使用するハイブリダイゼーションとは、少なくとも比較的低いストリンジェント条件下における相補的核酸鎖の塩基対形成および二重鎖構造の形成を指し、例えば、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中の３７℃におけるハイブリダイゼーションと、それに続く４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ含有溶液中の洗浄は、３７℃で使用することができ、最終的に１×ＳＳＣ中４５℃で洗浄される。
【００３６】
用語「阻害する」または「阻害」は、標的核酸またはタンパク質の発現または活性の低下または遮断を指し、標的の発現または活性の完全排除は必ずしも示さない。
【００３７】
用語「ヌクレオシド間連結」は、ヌクレオシド間の化学結合を指す。
【００３８】
用語「ノックダウン」または「発現のノックダウン」は、試薬、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの処置後における遺伝子の低下したｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を指す。発現のノックダウンは、転写、ｍＲＮＡスプライシング、または翻訳中に起こり得る。
【００３９】
用語「ミスマッチ」は、第１の核酸鎖の核酸塩基が、第２の核酸鎖の対応する核酸塩基と相補的でない場合を指す。
【００４０】
用語「核酸塩基配列」は、任意の糖、連結基、および／または核酸塩基の修飾とは独立の連続した核酸塩基の順序を指す。
【００４１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、各々修飾されているかまたは修飾されていない、連結したデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）および／またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーを指す。特に限定しない限り、該用語は、天然核酸と同様に結合する性質を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸、およびホスホジエステル連結以外の代替的ヌクレオシド間連結を有する核酸を包含する。
【００４２】
用語「ホスホロチオエート連結」は、ホスホジエステル結合が、非架橋の酸素原子の１個を硫黄原子で置き換えることにより修飾されたヌクレオシド間連結を指す。
【００４３】
用語「センス鎖」は、二本鎖構造からなるＤＮＡ分子のコード鎖、プラスの鎖、または非テンプレート鎖を指す。コード鎖は、ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）がＲＮＡ中ではウラシル（Ｕ）により置き換えられていることを除いて、ｍＲＮＡ配列と同じ配列を有する。「アンチセンス鎖」は、ＤＮＡ分子の非コード鎖またはｍＲＮＡの合成のためのテンプレートとしてはたらくテンプレート鎖を指す。それ故、アンチセンス鎖の配列は、センス鎖およびｍＲＮＡ（ＲＮＡ中ではＴの位置にＵ）の配列と相補的である。
【００４４】
本明細書において使用する用語「立体的遮断剤」は、標的核酸（例えば、標的ゲノム配列、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ分子）とハイブリダイズして、ＲＮＡｓｅＨを活性化することなく、標的核酸の転写、スプライシング、および／または翻訳に干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。
【００４５】
本明細書において使用する「標的とする」または「標的とされる」は、標的核酸、例えば、標的ゲノム配列、プレｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはそれらのフラグメントまたはバリアントと特異的にハイブリダイズすることができ、標的核酸の転写、スプライシング、および／または翻訳をモジュレートすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および選択を指す。
【００４６】
本明細書において使用する「タウ」（「微小管に関連するタンパク質タウとしても知られている」、ＭＡＰＴ、ＭＳＴＤ；ＰＰＮＤ；ＤＤＰＡＣ；ＭＡＰＴＬ；ＭＴＢＴ１；ＭＴＢＴ２；ＦＴＤＰ−１７；ＰＰＰ１Ｒ１０３）は、遺伝子ＭＡＰＴによりコードされた、微小管に関連するタンパク質を指す。ヒトのＭＡＰＴ遺伝子は、染色体の位置１７ｑ２１．１にマッピングされており、ヒトＭＡＰＴ遺伝子のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＧ＿００７３９８．１（配列番号３０４）に見出すことができる。ＭＡＰＴイントロンおよびエクソン配列および分岐点は、転写物：ＭＡＰＴ−２０３ＥＮＳＴ０００００３４４２９０を使用してＥｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースウェブサイトに基づいて決定することができる。ヒトでは、複雑な交互スプライシングに基づいて、８種のタウアイソフォームが存在する。用語「タウ」は、タウの全てのアイソフォームを総称的に指して使用される。最も長いヒトタウアイソフォームのタンパク質およびｍＲＮＡ配列は：
ホモサピエンスの微小管に関連するタンパク質タウ（ＭＡＰＴ）、転写物のバリアント６、ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１１２３０６６．３）
【００４７】
【化２−１】
2019500428.tif 000003
【００４８】
【化２−２】
2019500428.tif 000004
【００４９】
【化２−３】
2019500428.tif 000005
ホモサピエンス微小管に関連するタンパク質タウアイソフォーム６（ＮＰ＿００１１１６５３８．２）
【００５０】
【化３】
2019500428.tif 000006
である。
他のヒトタウアイソフォームのｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて以下の受託番号で見出すことができる：
タウアイソフォーム１：ＮＭ＿０１６８３５．４（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿０５８５１９．３（タンパク質）；
タウアイソフォーム２：ＮＭ＿００５９１０．５（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿００５９０１．２（タンパク質）；
タウアイソフォーム３：ＮＭ＿０１６８３４．４（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿０５８５１８．１（タンパク質）；
タウアイソフォーム４：ＮＭ＿０１６８４１．４（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿０５８５２５．１（タンパク質）；
タウアイソフォーム５：ＮＭ＿００１１２３０６７．３（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿００１１１６５３９．１（タンパク質）；
タウアイソフォーム７：ＮＭ＿００１２０３２５１．１（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿００１１９０１８０．１（タンパク質）；
タウアイソフォーム８：ＮＭ＿００１２０３２５２．１（ｍＲＮＡ）→ＮＰ＿００１１９０１８１．１（タンパク質）。
本明細書で使用する、ヒトタウタンパク質は、タウアイソフォームのいずれかと、その全長にわたって、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質も包含する。マウス、サル、および他の動物のタウタンパク質の配列は当技術分野において知られている。
【００５１】
用語「タウに関連する疾患」は、異常なタウタンパク質の発現、分泌、リン酸化、切断、および／または凝集と関連する疾患を含むが、これらに限定されない。タウに関連する疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症候群−認知症複合病（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、パンチドランカー、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化症、ダウン症候群、ドラベ症候群、癲癇、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体（ＦＴＤＰ−１７）と連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節膠腫、神経節細胞腫、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、封入体筋炎、鉛脳症、リティコ・ボディグ病、髄膜腫血管腫症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰ−Ｃ）、神経原線維変化を伴う非グアマニアン運動神経病、ピック病（ＰｉＤ）、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、神経原線維変化優位型認知症（Tangle-predominant dementia）、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、および結節性硬化症を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
用語「相同性」または「同一性」は、２個のポリマー分子間、例えば、２個の核酸分子間、例えば、２個のＤＮＡ分子もしくは２個のＲＮＡ分子間、または２個のポリペプチド分子間のサブユニットの配列同一性を指す。２個の分子の両方におけるサブユニット位置が、同じモノマーのサブユニットにより占められている場合；例えば、２個のＤＮＡ分子の各々における位置が、アデニンにより占められていれば、その場合、それらは、その位置において相同であるか、または同一である。２個の配列間の相同性は、一致する、すなわち相同性の位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、ポリマー中１０個のサブユニットの長さのうちの５つの位置）が相同であれば、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうち９）が一致する、すなわち相同であれば、２つの配列は９０％相同である。「配列同一性」のパーセンテージは、２つの最適に整列された配列を、比較ウィンドウにわたって比較することにより決定することができ、その場合、比較ウィンドウにおけるアミノ酸配列のフラグメントは、２つの配列の最適な整列について参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（例えば、ギャップまたは重なり）を含んでもよい。該パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列で現れる位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の合計数により除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。出された結果は問題にしている配列に関する対象配列の同一性のパーセントである。
【００５３】
用語「単離された」は、天然の状態から変更されたかまたは取り出されたことを指す。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状態で共存する材料から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、または自然のままでない環境、例えばホスト細胞などの中で存在することができる。
【００５４】
用語「治療する」または「治療」は、治療処置および予防的または防止手段の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害を予防するかまたは減速させることである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能のいずれにせよ、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、病態の緩和または一時的軽減、および寛解（不完全かまたは完全のいずれにせよ）を含むが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して長期化された生存も意味することができる。
【００５５】
用語「対象」は、本発明の方法による治療が提供される動物、ヒトまたは非ヒトを指す。獣医学的および非獣医学的適用が企図される。該用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、齧歯類、例えばマウスおよびラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含むが、これらに限定されない。典型的な対象は、ヒト、家畜、および家庭の愛玩動物、例えば、ネコおよびイヌなどを含む。
【００５６】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様なまたは等価の方法および材料が、本発明を実施するために使用され得るが、適当な方法および材料が下に記載される。本明細書で言及された全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配するものとする。それに加えて、材料、方法、および例は、例示のためだけであり、限定を意図するものではない。
【００５７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下の記載で記述される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載および図面、および請求項から明らかであろう。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＲＮＡの低下、翻訳の抑止、ｍｉＲＮＡの阻害、スプライシングモジュレーション、およびポリアデニル化箇所の選択を含む、ますます多くの用途で利用される強力かつ多機能の作用物質である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの十分な数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合を形成できる場合に標的核酸に結合して、標的核酸の転写および／または翻訳をモジュレートする。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、標的核酸、例えば、標的ゲノム配列、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ分子の核酸塩基配列と相補的である。ハイブリダイゼーションは、水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合）が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的核酸塩基と標的核酸との間で形成される場合に起こる。アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の非相補的核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、依然として標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができる限り、許容され得る。
【００５９】
ＡＳＯは、ＲＮａｓｅＨ依存またはＲＮａｓｅＨ独立のいずれかの様式により標的タンパク質の発現を減少させるように設計され得る（Watts JK, et al., J Pathol. 2012 January; 226(2): 365-379を参照されたい）。ＤＮＡの連続したストレッチを含むＡＳＯが標的ＲＮＡとハイブリダイズした場合、ＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖はＲＮａｓｅＨを動員し、それが二重鎖の標的ＲＮＡを切断し、それに続く細胞ヌクレアーゼによるＲＮＡフラグメントの分解を促進する。ＡＳＯは、プレｍＲＮＡのプロセシングおよび／またはｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を立体的に遮断することにより、ＲＮＡｓｅＨとは独立に、標的の発現を減少させることもできる。
【００６０】
微小管に関連するタンパク質タウ（ＭＡＰＴ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、または５箇所のミスマッチを有する、ＭＡＰＴゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのセグメントと相補的な核酸塩基配列を有する。完全な塩基対形成が起これば（例えば、ＡとＴの間およびＣとＧの間の対形成）、オリゴヌクレオチドと対応する標的核酸との間でミスマッチは数えられることになる。ミスマッチは、２つの配列が最高に整列されたときに、第１の核酸の核酸塩基が第２の核酸の対応する核酸塩基と対形成することができない場合に起こる。例えば、第１の配列中の位置が核酸塩基Ａを有し、第２の配列の対応する位置がＡと対を形成できない核酸塩基（例えば、ＣまたはＧ）を有するならば、それはミスマッチを構成する。一方の配列中の位置が核酸塩基を有し、他方の配列の対応する位置が核酸塩基を有しない場合にも、ミスマッチは数えられる。ヌクレオチドまたはヌクレオシド間連結の糖部分に対する修飾は、ミスマッチとはされない。したがって、一方の配列がＧを含み、第２の配列の対応する核酸塩基が修飾されたＣ（例えば、５−メチルシトシン）を含む場合には、数えられるミスマッチはないであろう。
【００６１】
核酸のストレッチに関係して、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのセグメントと、セグメントの全長にわたって、少なくとも、７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％，９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸との相補性のパーセントは、当技術分野において知られた日常的方法、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ）またはＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656）を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴゲノムＤＮＡ、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのセグメントと１００％相補的な（すなわち、完全に相補的な）核酸塩基配列を有する。本明細書において使用する、「完全に相補的な」または「１００％相補的な」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と精密な塩基対を形成することができることを指す。例えば、２０個の核酸塩基アンチセンス化合物は、アンチセンス化合物と完全に相補的である標的核酸の対応する２０個の核酸塩基部分がある限り、４００核酸塩基の長さの標的配列と完全に相補的である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１、２、または３箇所のミスマッチを有する、表１で示されるいずれかの配列の少なくとも１２個の連続した核酸塩基（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続した核酸塩基）と相補的である核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１で示されるいずれかの配列のうち少なくとも１２個の連続した核酸塩基（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続した核酸塩基）と１００％相補的である核酸塩基配列を含む。
【００６３】
本明細書で提供されるアンチセンス化合物は、特定のヌクレオチド配列、配列番号、またはそれらの一部と定義されたパーセント同一性を有することもある。本明細書において使用する、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それが同じ核酸塩基対形成能力を有するならば、本明細書で開示された配列と同一である。例えば、ウラシルおよびチミジンは両方ともアデニンと対を形成するので、開示されたＤＮＡ配列におけるチミジンの位置にウラシルを含有するＲＮＡは、上記ＤＮＡ配列と同一と考えられるであろう。本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して非同一の塩基を有する本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドならびにオリゴヌクレオチドの短縮および延長した形式も企図される。非同一の塩基は、互いに隣接していることもあり、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド全体に分散されていることもある。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列同一性のパーセントは、それが比較されている配列に対して同一の塩基対形成を有する塩基の数に従って計算することができる。配列同一性のパーセントは、当技術分野において知られた日常的方法、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ）またはＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656）を使用して；またはギャッププログラム（Ｕｎｉｘのためのウィスコンシン配列分析パッケージ、バージョン８  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、  Ｍａｄｉｓｏｎ  ウィスコンシン州）により、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Adv. Appl. Math. , 1981, 2, 482-489）を使用する初期設定を使用して、決定することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、表２〜１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、核酸塩基配列のいずれかのＣが、シトシンまたは５−メチルシトシンのどちらかであり、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドが２’−修飾を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、表２〜１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかと、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかからなる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から３０核酸塩基の長さである。例えば、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２から２５核酸塩基の長さである。例えば、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５から２０核酸塩基の長さである。例えば、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の核酸塩基を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１７個の核酸塩基を含む。活性を除くことなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さを増大または減少することおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチド中にミスマッチ塩基（例えば、１、２、３、４、または５箇所のミスマッチ）を導入することは可能である。
【００６６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学的修飾
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合により連結されて一緒になっている繰り返しヌクレオチド単位からなる。各ヌクレオチドは、糖部分と連結された核酸塩基、および糖部分に共有結合で連結された１つまたは複数のリン酸基を含むヌクレオシドで構成される。ホスホジエステル結合は、プリン（グアニンおよび／またはアデニン）および／またはピリミジン塩基（ＤＮＡについてはチミンおよびシトシン；ならびにＲＮＡについてはウラシルおよびシトシン）にグリコシドの結合を通して連結された糖残基（ＲＮＡのためのリボースまたはＤＮＡのためのデオキシリボースのいずれか、総称でフラノース）で作られている。
【００６７】
本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドのサブユニットおよび／またはヌクレオシド間連結を含有することができる。オリゴヌクレオチドに対する化学的修飾は、ヌクレオシド間連結、糖部分、核酸塩基、および／または骨格における変化を包含する。修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性、有効性を改善すること、および／または免疫原性を低下させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、修飾されていないオリゴヌクレオチドと比較した場合、ヌクレアーゼに対する増大した耐性、核酸標的に対する増強された結合親和性、増強された細胞による取り込み、および／または増大した阻害活性を有するように修飾することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、自然に生ずるホスホジエステルとヌクレオシド間連結を含む。ホスホジエステル連結は、他のリン含有連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネートなど、もしくはホスホルアミデート連結、または非リン含有連結に修飾され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートによるヌクレオシド間連結である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾された糖部分を含む。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、フラノース環における２’修飾、二環式核酸（ＢＮＡ）を形成する非ジェミナル環原子の架橋、糖環の酸素原子の他の原子による置き換え、またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、２’−修飾されたフラノース環を有する。典型的２’−修飾は、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、糖部分に２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、所与の位置におけるヌクレオチドの同じヌクレオチドの修飾された形式による置換を含むことができる。例えば、ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）は、対応するヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、ベータ−Ｄ−ガラクロシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン、クエノシン、２−チオシトシン、または２，６−ジアミノプリンにより置き換えられ得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの免疫原性を低下させる化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。例えば、５−メチルシトシンまたは２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を含有するオリゴヌクレオチドは、マウスにおいて減少した免疫刺激を示すことが示されている（Henry S. et al., J Pharmacol Exp Ther. 2000 Feb; 292(2):468-79）。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、シトシンの代わりに５−メチルシトシンを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−メチルシトシンおよび２’ＭＯＥ修飾を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’末端に以下の構造を有するＣ６リンカーを含み：
【００７３】
【化４】
2019500428.tif 000007
該リンカーは、オリゴヌクレオチドの３’末端にリン酸架橋を通して付着し、ここで、Ｒ＝ＰＯ２−Ｏ−オリゴヌクレオチド（ホスホジエステルヌクレオシド間連結のため）またはＲ＝ＰＯＳ−Ｏ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートヌクレオシド間連結のため）である。そのような３’Ｃ６リンカーは、３’−エキソヌクレアーゼの攻撃を遮断することができ、それ故、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性および効果の持続期間を増強する（ｓｉＲＮＡに適用される同様な戦略について、２００５／０２１７４９号パンフレットを参照されたい）。いくつかの場合に、３’Ｃ６リンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および／または精製を容易にすることもできる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の以下の構造を有することができる。
【００７４】
【化５】
2019500428.tif 000008
【００７５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、代替的骨格、例えば、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖環の２個の炭素原子をつなぐ架橋を含む二環式ヌクレオシド（ＢＮＡ）を含むことができる。例えば、そのようなＢＮＡは、糖部分の４’−炭素と２’−炭素をつなぐ４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む「束縛されたエチル」（または「ｃＥｔ」）を含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖単位の４’位と２’位の間で２個の炭素原子をつなぐ架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。そのようなＬＮＡは、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ、オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡ、または米国特許第７，０５３，２０７号明細書；第６，２６８，４９０号明細書；第６，７７０，７４８号明細書；第６，７９４，４９９号明細書；第７，０３４，１３３号明細書；第６，５２５，１９１号明細書；第７，６９６，３４５号明細書；第７，５６９，５７５号明細書；第７，３１４，９２３号明細書；第７，２１７，８０５号明細書；第７，０８４，１２５号明細書；または第６，６７０，４６１号明細書；国際公開第９８／３９３５２号パンフレットまたは国際公開第９９／１４２２６号パンフレットに記載された任意の他のＬＮＡを含むことができる。他の適当なＬＮＡは、Braasch et al., Chern. Biol. 8: l-7, 2001; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs 2: 558-561, 2001; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 21: 6365-6372, 2003; Koshkin et al., Tetrahedron, 54: 3607-3630, 1998; Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 11: 2211-2226, 2003; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther. 3: 239-243, 2001; Singh et al., Chem. Commun. 4: 455-456, 1998; Singh et al., J. Org. Chem., 63: 10035-10039, 1998;またはWahlestedt et al., PNAS 97: 5633-5638, 2000に記載されたＬＮＡを含む。
【００７６】
立体的遮断剤
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合して、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するタンパク質、転写因子、スプライシング因子、リボソーム、および／または翻訳機構の標的核酸への接近を立体的に遮断することができ、したがってＲＮＡｓｅＨを活性化せずに、標的発現を減少させる。例えば、そのような立体的遮断剤は、標的の開始コドンの周囲の配列にハイブリダイズして、イントロンの分岐点配列を遮断して、スプライス部位を標的とし、イントロンおよび／またはエクソンの配列を挟み、またはエクソンスプライシングエンハンサーなどの調節配列を標的とすることにより、標的タンパク質の発現を低下させることができる。立体的遮断剤は、前もって決定されているかまたは予測されたイントロン−エクソンの境界および遺伝子構造に基づいて設計することができ、異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドのパネルを、同じ箇所を遮断するために発生させることができる。ＢＬＡＳＴ分析は、各ＡＳＯについて、オフターゲットハイブリダイゼーションを最小化するために実施することができる。
【００７７】
立体的遮断剤は、異常なｍＲＮＡを認識して分解する内因性の細胞サーベイランス経路を活用することにより、ｍＲＮＡ低下を達成することができる。１つのそのような経路は、ナンセンス−媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）であり、それは、遺伝子発現をモジュレートして、可能性として毒性のタンパク質がｍＲＮＡから生成することを防止する。プレｍＲＮＡプロセシングにおける欠陥は、早期の停止コドン（ＰＴＣ）が導入された場合に、タンパク質の機能喪失をもたらして、オープンリーディングフレームを破壊する。そのようなＰＴＣ−含有ｍＲＮＡは、翻訳リボソームと必須ＮＭＤ因子ＵＰＦ１を含むエクソン接合複合体の構成要素との間の情報交換を含み、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの活性によりＲＮＡを分解するＮＭＤのための基質であることができる。ＡＳＯは、標的ｍＲＮＡをＮＭＤ経路に向かわせることにより、標的ｍＲＮＡの低下を起こさせるように、合理的に設計することができる。これは、立体的遮断剤の配列を、特定のコードエクソン、イントロン−エクソン接合、または適当なプレｍＲＮＡプロセシングに必要な他の配列と相補的であるように設計して、エクソンスキッピング、フレームシフティングを導入し、および／またはＰＴＣを導入することにより達成することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、立体的遮断剤、例えば、表２〜８のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかを含む立体的遮断剤である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表２〜８のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかからなる立体的遮断剤からなる。下の実施例で詳述されるように、立体的遮断剤は、標的タウを構成するエクソン（例えば、エクソン１、４、５、７、９、１１、１２、１３）、ＭＡＰＴの開始コドンを挟む配列、スプライスアクセプターおよびドナー、スプライシングの分岐点、ポリピリミジントラック関連配列、またはスプライシングのエンハンサーまたは阻害剤の配列を標的とするように設計された。開始コドンおよびエクソン１を標的とすることは、翻訳の開始を遮断する可能性がある。スプライシングに干渉して、および／またはエクソンスキッピングを誘発するＡＳＯは、フレームシフティングおよび／または下流の早期の停止コドンの導入をもたらして、ＭＡＰＴｍＲＮＡおよび／またはタウタンパク質の低下を導くことになる。
【００７９】
化学的修飾は、立体的遮断剤中に組み込まれて、それらの安定性、有効性、および／または細胞の取り込みを改善することができる。立体的遮断剤は、各ヌクレオチド位置でまたはいくつかの選択された位置で化学的修飾を有することができる。例えば、糖環の２’−修飾（２’−Ｏ−メトキシエチル、ＭＯＥなど）の組み込み、ロックド核酸（ＬＮＡ）の包含および／または骨格修飾（ホスホロチオエートなど）は、ヌクレアーゼ分解を減少させ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させることができる。糖および／または骨格の修飾の他に、立体的遮断剤がＤＮＡまたはＲＮＡと非常に異なるオリゴマーから作製され得る。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチド模倣体であり、その核酸塩基がアミド結合により連結されている。アミド骨格は無荷電なので、結合は、高い率の会合および高い親和性により特徴付けられる（Bentin T, Biochemistry. 1996; 35:8863-8869; Smulevitch SV, Nat Biotech. 1996; 14:1700-1704を参照されたい）。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯまたは「モルホリノ類」と一般的に呼ばれている）は、別の無荷電のＤＮＡ類似体である。ＰＭＯは、ＰＮＡ結合を特徴付ける高い親和性で相補的な標的と結合することはないが、細胞内部の効果的な作用物質であることが証明されている（Summerton J, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997; 7:187-195; Corey DR, Genome Biol. 2001; 2:REVIEWS1015を参照されたい）。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−修飾されたヌクレオチドを含む立体的遮断剤である。２’−修飾は、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチドサブユニットで２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾を有する立体的遮断剤である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間のホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結を有する立体的遮断剤である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨの結合を妨げる骨格修飾を含有する立体的遮断剤である。そのような立体的遮断剤は、修飾されたヌクレオシド間連結、例えば、メチルホスホネート連結、メチルホスホノチオエート連結、ホスホロモルホリデート連結、ホスホロピペラジデート連結またはホスホラミダイト連結を含むことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド間の１つ置きの連結が、２’低級アルキル部分（例えば、Ｃ１〜Ｃ４、直鎖状または分岐、飽和または不飽和アルキル、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロピルなど）またはそれらの組合せを有する修飾されたリン酸エステルを含有することもある。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１４９，７９７号明細書に記載された１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む立体的遮断剤である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とする立体的遮断剤は、３’末端に以下の構造を有するＣ６リンカーを含み：
【００８４】
【化６】
2019500428.tif 000009
上記構造は、リン酸架橋を通してオリゴヌクレオチドの３’末端に付着しており、式中、Ｒ＝ＰＯ２−Ｏ−オリゴヌクレオチド（ホスホジエステルヌクレオシド間連結について）またはＲ＝ＰＯＳ−Ｏ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートヌクレオシド間連結について）である。したがって、ＭＡＰＴを標的とする、ホスホジエステルのヌクレオシド間連結を有する立体的遮断剤は、以下の構造を有することができ：
【００８５】
【化７】
2019500428.tif 000010
ＭＡＰＴを標的とする、ホスホロチオエートのヌクレオシド間連結を有する立体的遮断剤は、以下の構造を有することができる。
【００８６】
【化８】
2019500428.tif 000011
【００８７】
ギャップマー
ＤＮＡの連続したストレッチを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞のエンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＨを、標的ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖に動員し、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖中の標的ＲＮＡを切断することができる。ギャップマーは、キメラアンチセンス化合物である。キメラアンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性、増大した細胞の取り込み、標的核酸に対する増大した結合親和性、および／または増大した阻害活性を与えるように修飾された少なくとも１つの領域、および第１領域のヌクレオチドと化学的に異なるヌクレオチドを有する第２の領域を含有する。
【００８８】
ギャップマーは、５’および３’末端で修飾されたヌクレオチドからなる２個のウィングセグメント間に位置する連続した２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチからなる中央ギャップセグメントを有する。ギャップセグメントは、エンドヌクレアーゼＲＮＡｓｅＨ切断のための基質として役割を果たすが、一方、修飾されたヌクレオチドを有するウィングセグメントは、他のヌクレアーゼ分解に対する増大した耐性を与える。ウィング−ギャップ−ウィングセグメントは、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載することもでき、「Ｘ」は、５’ウィングの長さを表し、「Ｙ」は、ギャップの長さを表し、「Ｚ」は３’ウィングの長さを表す。「Ｘ」および「Ｚ」は、一様な、変異した、または交互の糖部分を含むこともできる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ギャップマーの中央ギャップセグメントは、少なくとも５個（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個）の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドからなり、５’および３’ウィングセグメントは、１つまたは複数の２’−修飾されたヌクレオチドを含む。４個までの連続した２’−デオキシリボヌクレオチドのストレッチを含むキメラオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨを活性化しないことが報告されている。米国特許第９，１５７，０８１号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも７個（例えば、７、８、９、１０、１１、１２個）の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含むギャップマーである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０個の連続した２’−デオキシリボヌクレオチドを含むギャップマーである。２’−修飾は、２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするギャップマーは、２０ヌクレオシドの長さである５−１０−５ギャップマーであり、ここで、中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、２’−修飾を各々有する５個のヌクレオシドを各々含む５’および３’ウィングセグメントと隣接している。他の適当なギャップマーは、５−９−５ギャップマー、５−８−５ギャップマー、４−８−６ギャップマー、６−８−４ギャップマー、または５−７−６ギャップマーを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーであり、例えば、表９〜１５および１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかと少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）の配列同一性を有する核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかを含むギャップマーである。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかからなるギャップマーである。下の実施例で詳述するように、ギャップマーは、開始コドンの周囲の配列、エクソン１、またはＭＡＰＴ転写物の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的とするように設計された。いくつかの実施形態において、ギャップマーは、３’ＵＴＲを標的とするように設計された。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表９〜１５および１７のいずれかで示される核酸塩基配列のいずれかを含む５−１０−５ギャップマーであり、ここで、第１から第５のヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含み、第６から第１５のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオシドを各々含み、第１６から第２０ヌクレオチドは、２’−Ｏ−ＭＯＥで修飾されたヌクレオシドを各々含む。
【００９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされるＭＡＰＴゲノム配列
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＡＰＴゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＧ＿００７３９８．１；配列番号３０４）の特定の領域または対応するタウｍＲＮＡまたは転写物（配列番号３０６）の領域を標的とするように設計されている。ＭＡＰＴのイントロンおよびエクソン配列および分岐点は、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースのウェブサイトに基づいて転写物：ＭＡＰＴ−２０３  ＥＮＳＴ０００００３４４２９０を使用して決定した。ヒトＭＡＰＴ遺伝子のエクソン、イントロン、およびイントロン／エクソン接合のスクリーニングにより、ＭＡＰＴ遺伝子または転写物中のいくつかの領域を、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とすることは、他の領域を標的とするよりもタウ発現を低下させるために一層効果的であることが明らかになった。例えば、表１には、ＭＡＰＴ遺伝子または転写物中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的とされ得るいくつかの好ましい領域の配列をリストに挙げる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１、２、または３箇所のミスマッチを有する、配列番号４８７〜５０６のいずれか１つの少なくとも１２個の連続した核酸塩基（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続した核酸塩基）と相補的である核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４８７〜５０６のいずれか１つの少なくとも１２個の連続した核酸塩基（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の連続した核酸塩基）と１００％相補的である核酸塩基配列を含む。
【００９５】
【表１】
2019500428.tif 000012
【００９６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート
アンチセンスオリゴヌクレオチドと別の部分とのコンジュゲーションは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞の取り込み、および／または組織分布を改善することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種または複数の診断用化合物、レポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ−耐性を付与する部分、親油性分子、コレステロール、脂質、レクチン、リンカー、ステロイド、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、テルペン、トリテルペン、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、ビタミン、ビオチン、炭水化物、デキストラン、染料、プルラン、キチン、キトサン、合成炭水化物、オリゴラクテート１５量体、天然ポリマー、低または中分子量ポリマー、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、ペプチド模倣体、トランスフェリン、クマリン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、および／またはローダミンと共有結合で連結することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リンカー分子に付着している。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脂質またはコレステロールと連結されている。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性リポソーム（ＮＬ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と連結されている。ＬＮＰは、自己集合するカチオン性脂質に基づくシステムであり、それは、例えば、中性脂質（リポソーム基部）；カチオン性脂質（オリゴヌクレオチド装荷のため）；コレステロール（リポソームを安定化するため）；およびＰＥＧ−脂質（製剤の安定化、電荷遮蔽および血流における拡張された循環のため）を含むことができる。中性リポソーム（ＮＬ）は、非カチオン性脂質に基づく粒子である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脂肪酸、例えば、オメガ−３脂肪酸またはオメガ−６脂肪酸と連結されている。適当なオメガ−３脂肪酸は、例えば、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ヘキサデカトリエン酸（ＨＴＡ）、ヘンエイコサペンタエン酸（ＨＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、テトラコサペンタエン酸、およびテトラコサヘキサエン酸を含む。
【００９９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド活性の試験
アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、インビトロまたはインビボで試験することができる。インビトロで試験するためには、ＡＳＯを、培養細胞中にトランスフェクションまたは電気穿孔により導入することができる。処置期間の後で、ＡＳＯで処置された細胞におけるＭＡＰＴ（タウ）の発現レベルを決定して、未処置対照細胞におけるＭＡＰＴ（タウ）の発現レベルと比較することができる。
【０１００】
ＭＡＰＴ発現レベルは、任意の適当な方法により、例えば、ＭＡＰＴ  ｍＲＮＡのレベルの定量により、ＭＡＰＴ  ｍＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡ産生量を測定することにより、またはタウタンパク質の量を決定することにより決定することができる。これらの方法は、試料基準により試料について実施するかまたは高処理能力分析のために修飾することができる。
【０１０１】
ＭＡＰＴ  ｍＲＮＡのレベルは、ＭＡＰＴ転写物のセグメントに特異的にハイブリダイズするプローブにより、例えば、ノーザンブロット分析により検出および定量することができる。ＭＡＰＴ  ｍＲＮＡのレベルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＭＡＰＴ転写物を認識する一対のプライマーを使用して検出および定量することもできる。ＰＣＲのための一般的手順は、MacPherson et al., PCR: A Practical Approach, (IRL Press at Oxford University Press (1991))で教示されている。しかしながら、各適用反応のために使用されるＰＣＲ条件は経験的に決定される。多くのパラメーター、例えば、アニーリング温度および時間、増量時間、Ｍｇ２＋および／またはＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレート、および／またはデオキシリボヌクレオチドの相対濃度が、反応の成功に影響する。増幅後、生じたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動に続いて臭化エチジウム染色および紫外照明を用いて可視化することにより検出することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴ  ｍＲＮＡのレベルは、任意の市販のリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、増幅ステップ中に検出可能な染料またはレポーターを同時に組み込むことにより、標的核酸の増幅をモニターする定量的リアルタイムＰＣＲにより検出および定量することができる。
【０１０３】
あるいは、標識は、元の核酸試料（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その他）に直接付けるか、または増幅が完了した後で増幅生成物に付けてもよい。標識を核酸に付ける手段は、当業者に周知であり、例えば、核酸のキナーゼ操作およびそれに続く、試料核酸を標識（例えば、蛍光団）に接合する核酸リンカーの取り付け（ライゲーション）によるニックトランスレーションまたは末端標識（例えば、標識されたＲＮＡを用いて）を含む。
【０１０４】
本発明で使用するために適当な検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物を含む。本発明で有用な標識は、標識されたストレプトアビジンコンジュゲートを用いる染色のためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光性染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光性タンパク質等）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびその他ＥＬＩＳＡで一般的に使用されるもの）、および比色標識、例えばコロイド状金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズを含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号明細書；第３，８５０，７５２号明細書；第３，９３９，３５０号明細書；第３，９９６，３４５号明細書；第４，２７７，４３７号明細書；第４，２７５，１４９号明細書；および第４，３６６，２４１号明細書を含む。
【０１０５】
標識の検出は当業者には周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光性マーカーは、発光を検出する光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供して該基質に対する酵素の作用による反応生成物の産生を検出することにより検出され、および比色標識は、着色した標識を単に視覚により検出する。核酸を標識して標識されてハイブリダイズした核酸を検出する方法の詳細な総説については、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい。
【０１０６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性は、タウタンパク質レベルを、当技術分野において知られた方法を使用して測定することにより評価することもできる。例えば、タウタンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、免疫測定、免疫沈降、免疫蛍光アッセイ、免疫細胞化学、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、放射免疫測定、免疫放射線測定法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法、共焦点顕微鏡、酵素アッセイ、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により定量され得る。
【０１０７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボにおける活性は、動物モデルで試験することもできる。試験は、正常動物または実験疾患動物モデルで実施することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される希釈剤で製剤化することができ、適当な投与経路を通して送達される。治療期間の後、組織試料、例えば、脳組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脊髄を収集してタウ発現レベルを、上で記載された方法のいずれかを使用して測定することができる。組織学的分析を、脳の構造および／または神経原線維変化の存在を評価するために実施することができる。治療された動物の表現型の変化、例えば、改善された認知または運動性もモニターして評価することができる。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドの合成および特徴付け
一本鎖のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において知られた任意の核酸重合方法、例えば、ホスホラミダイト法（S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage and R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223）を用いる固相合成、Ｈ−ホスホネート、ホスホルトリエステル化学、または酵素的合成を使用して合成することができる。自動化された市販の合成機、例えば、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ、テキサス州）、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）の合成機を使用することができる。いくつかの実施形態において、一本鎖のオリゴヌクレオチドは、例えば、Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA.のCurrent Protocolsに記載されている標準的固相ホスホラミダイト化学を使用して生成される。ホスホロチオエート連結は、フェニルアセチルジスルフィドまたはＤＤＴＴ（（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオン）などの硫化試薬を使用して導入することができる。同様な技法および市販の修飾されたアミダイトおよび制御細孔ガラス（ＣＰＧ）生成物（controlled-pore glass (CPG) products）、例えば、ビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラレンなどで修飾されたアミダイトおよび／またはＣＰＧを、修飾されたオリゴヌクレオチド、または蛍光標識された、ビオチン、またはその他とのコンジュゲートオリゴヌクレオチドを合成するために使用することは周知である。
【０１０９】
出発原料および各合成ステップからの生成物の品質の制御は、最終生成物中の不純物のレベルを最小化するために極めて重要である。しかしながら、カップリング当たりの合成ステップの数およびカップリングの数を考慮すれば、不純物の存在は不可避である。精製方法が、最終のオリゴヌクレオチド生成物から望ましくない不純物を排除するために使用され得る。一本鎖のオリゴヌクレオチドのために一般的に使用される精製技法は、逆相イオン対高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＩＰ−ＨＰＬＣ）、毛細管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）、アニオン交換ＨＰＬＣ（ＡＸ−ＨＰＬＣ）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む。
【０１１０】
精製後、オリゴヌクレオチドは、質量分析法により分析することができ、２６０ｎｍの波長で分光学的に定量される。
【０１１１】
治療における使用および治療方法
対象、例えば、ヒトにおけるタウ発現レベルを、対象に本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかの治療有効量を投与することにより、減少させる方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、静脈内、経口、または皮下経路を通して対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、そのような方法は、タウに関連する疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい対象を同定および選択することをさらに含む。
【０１１２】
本明細書で提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの医薬組成物は、対象におけるタウに関連する疾患を治療または予防するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの医薬組成物を、患者におけるタウに関連する疾患の治療または予防に使用するために提供する。さらなる実施形態において、本発明は、患者におけるタウに関連する疾患の治療または予防に使用するための医薬の製造における、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【０１１３】
タウに関連する疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン症候群−認知症複合病（ＡＬＳ−ＰＤＣ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、パンチドランカー、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化症、ダウン症候群、ドラベ症候群、癲癇、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体（ＦＴＤＰ−１７）と連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節膠腫、神経節細胞腫、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、ハンチントン病、封入体筋炎、鉛脳症、リティコ・ボディグ病、髄膜腫血管腫症、多系統萎縮症、筋緊張性ジストロフィー、ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰ−Ｃ）、神経原線維変化を伴う非グアマニアン運動神経病、ピック病（ＰｉＤ）、脳炎後パーキンソン症候群、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症（tangle only dementia）、神経原線維変化優位型認知症（Tangle-predominant dementia）、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、および結節性硬化症を含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
組合せ療法
上で記載された種々のオリゴヌクレオチドは、他の治療パートナーとの組合せで使用することができる。したがって、本明細書に記載されたタウに関連する疾患を治療する方法は、第２の作用物質を、治療を必要とする対象に投与することをさらに含むことができる。例えば、微小管が関連するタンパク質タウ（ＭＡＰＴ）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タウタンパク質に特異的に結合する抗体および／またはアミロイドベータ（Ａβ）を標的とする作用物質、例えば、Ａβまたはベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）阻害剤に結合する抗体との組合せで使用することができる。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、タウタンパク質に特異的に結合する抗体との組合せで使用される。いくつかの実施形態において、ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＡＣＥ阻害剤との組合せで使用される。
【０１１５】
用語「組合せ」は、１つの単位剤形で固定された組合せ、または本発明の化合物および組合せパートナー（例えば下で説明される別の薬、「治療剤」または「共作用物質」とも称される）が、独立に、同時にまたは組合せパートナーが協同的、例えば、相乗的効果を示すことを可能にする時間間隔内に別々に投与されてもよい組合せ投与のいずれかを指す。単一構成要素は、キット中に梱包されても、または別々に梱包されてもよい。構成要素（例えば、散剤または液剤）の一方または両方が投与の前に所望の用量に再構成または希釈されてもよい。本明細書で利用される用語「共投与」または「組合せ投与」等は、選択された組合せパートナーをそれを必要とする単独の対象（例えば患者）に投与することを包含することを意味し、該活性物質が同じ経路の投与によりまたは同時に投与される必要があるとは限らない治療計画を含むことが意図される。本明細書において使用する用語「薬学的組合せ」は、２種以上の治療剤の混合または組合せから生ずる製品を意味し、治療剤の固定された組合せおよび固定されない組合せの両方を含む。用語「固定された組合せ」は、治療剤、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドおよび組合せパートナーが、両方とも単一の実体または剤形で、患者に同時に投与されることを意味する。用語「固定されない組合せ」は、治療剤、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドおよび組合せパートナーが、両方とも患者に別々の実体として、同時に、並行して、または順次にのいずれかで特定の時間制限なく投与されることを意味し、そのような投与は、患者の身体中における上記２種の化合物の治療的に有効なレベルを提供する。後者は、カクテル療法、例えば３種以上の治療剤の投与にも適用される。
【０１１６】
本明細書において使用する用語「薬学的組合せ」は、１つの単位剤形に固定された組合せか、または２種以上の治療剤が、独立に、同時にまたは別々に時間間隔内に投与されることができ、特にこれらの時間間隔が、組合せパートナーが協同的、例えば、相乗的効果を示すことを可能にする固定されない組合せもしくは組合せ投与のためのキットオブパーツのいずれかを指す。
【０１１７】
用語「組合せ療法」は、本開示で記載された治療的状態または障害を治療するための２種以上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、実質的に同時の様式で、例えば、有効成分の比が固定された単一のカプセル剤で、これらの治療剤を共投与することを包含する。あるいは、そのような投与は、複数の、または各有効成分について別々の容器（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、および液剤）で共投与することを包含する。散剤および／または液剤は、投与の前に所望の用量に再構成または希釈することができる。それに加えて、そのような投与は、ほぼ同時または異なる時期のいずれかにおける逐次様式における各タイプの治療剤の使用も包含する。いずれの場合にも、治療計画は、本明細書に記載された状態または障害の治療における薬物の組合せの有益な効果を提供するであろう。
【０１１８】
試料の調製
組織試料は、当技術分野において知られた任意の方法を使用してアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療される対象から、例えば、生検または手術により得ることができる。例えば、脳脊髄液を含む試料は、注射器に取り付けられた細い注射針が、腰部で脊柱管中に挿入されて、真空が作られ、脳脊髄液が注射針を通して吸引されて注射器に収集され得る腰部穿刺により得ることができる。ＣＴ撮像、超音波、または内視鏡が、このタイプの手順を導くために使用され得る。
【０１１９】
試料は、瞬間凍結して、後で使用するために−８０℃で貯蔵することもできる。試料は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または酢酸／エタノールなどの固定剤で固定することもできる。ＲＮＡまたはタンパク質は、新鮮な、凍結したまたは固定された試料から分析のために抽出することもできる。
【０１２０】
医薬組成物、投薬量、および投与
組成物、例えば、本明細書で提供される１種または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物も本明細書で提供される。医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用する「薬学的に許容される担体」という言葉は、医薬投与と適合可能な生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路と適合可能であるように製剤化される。投与経路の例は、髄腔内、頭蓋内、鼻腔内、静脈内、経口、または皮下投与を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を越えることができる抗体とコンジュゲート化することができ（例えば、トランスフェリン受容体、インスリン、レプチン、またはインスリン様成長因子１と結合する抗体）、静脈内に送達され得る（Evers et al., Advanced Drug Delivery Reviews 87 (2015): 90-103）。
【０１２２】
適当な医薬組成物を製剤化する方法は、当技術分野において知られており、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21st ed., 2005;およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)のシリーズの書物を参照されたい。例えば、非経口的、皮内、髄腔内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：滅菌希釈剤、例えば、注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸など；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など；および等張性調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどを含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスまたはプラスチックでできた複数の用量のバイアル中に封入することができる。
【０１２３】
注射用に使用するために適当な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および注射用滅菌溶液または分散液の即時調製のための滅菌散剤を含むことができる。静脈内投与のために適当な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ニュージャージー州）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合に、組成物は、滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度に流体であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきで、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保持されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、および適当なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張化剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる作用物質、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含むことによりもたらされ得る。
【０１２４】
注射用滅菌溶液は、活性化合物を必要とされる量で適当な溶媒中に１種または上で列挙した成分の組合せで組み込み、必要な時には、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。
【０１２５】
一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上で列挙したものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、それらの方法は、有効成分に任意の追加の所望の成分を加えて、それらの前もって滅菌濾過した溶液から粉末を生ずる。
【０１２６】
経口組成物は、不活性希釈剤または可食性の担体を一般的に含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物は、うがい薬として使用するために、流体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤、および／または補助材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、任意の以下の成分、または同様な性質の化合物：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトースなど；崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなど；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅなど；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリンなど；または着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ着香料などを含有することができる。
【０１２７】
吸入による投与のために、化合物は、適当な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器またはディスペンサーまたはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形態で送達することができる。そのような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されたものを含む。本明細書に記載された治療用の化合物の全身投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与のために、バリアを透過するために適当な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー剤または坐剤の使用により遂行することができる。経皮投与のためには、活性化合物が、当技術分野で一般的に知られている軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化される。
【０１２８】
一実施形態において、治療用の化合物は、身体からの急速な排出に対して治療用の化合物を保護する担体を用いて、埋め込みおよびマイクロカプセル化された送達システムを含む、排出が制御放出製剤などに調製される。
【０１２９】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中に、投与のための使用説明書と一緒に含めることができる。
【０１３０】
非限定的な例において、少なくとも１種の医薬剤を含有する医薬組成物が、液剤（例えば、熱硬化性液剤）として、固体の構成要素（例えば、粉末または生分解性生体適合性ポリマー（例えば、カチオン性生分解性生体適合性ポリマー））として、またはゲルの構成要素（例えば、生分解性生体適合性ポリマー）として製剤化される。いくつかの実施形態において、少なくとも１種の医薬剤を含有する少なくとも組成物が、アルギン酸塩ゲル（例えば、アルギン酸ナトリウム）、セルロース系ゲル（例えば、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシエチルセルロース）、またはキトサン系ゲル（例えば、キトサングリセロホスフェート）の群から選択されるゲルとして製剤化される。本明細書に記載された任意の医薬組成物を製剤化するために使用され得る薬物溶出ポリマーの追加の例には、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコールと組み合わされたデキストラン、ポリアクリル酸と組み合わされたデキストラン、ポリガラクツロン酸、ガラクツロン多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、タマリンドガム、キサンタムガム、セルロースガム、グアーガム（カルボキシメチルグアー）、ペクチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、Ｎ−イソプロピルポリアクリルアミド、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、プルロン酸、ポリ乳酸、シクロデキストリン、シクロアミロース、レシリン、ポリブタジエン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル、ポリデプシペプチド、ポリヒドロキシブチレート、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリエチレングリコール、ポリオルガノホスホラゼン、ポリオルトエステル、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリアンヒドリド、ポリシラミン、ポリＮ−ビニルカプロラクタム、およびゲランが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的組織への送達は、カチオン性リポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子および微小球（Dass CR. J Pharm Pharmacal 2002; 54(1):3-27）を含むが、これらに限定されない担体媒介送達により増強され得る。
【０１３２】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患の発症または疾患症状を予防するために必要な量である予防有効量と同じであるかまたは異なることもできる。有効量は、１回または複数の投与、適用または投薬量で投与することができる。治療用の化合物の治療有効量（すなわち、効果的な投薬量）は、治療用の化合物の選択に依存する。組成物は、１日に１回または複数回から１週間に１回または１日おきに１回を含む複数回投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的健康および／または年齢、および存在する他の疾患を含むが、これらに限定されないある要因が、対象を効果的に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響し得ることを認識するであろう。その上、本明細書に記載された治療用の化合物の治療有効量を用いる対象の治療は、単回処置または一連の処置を含むことができる。
【０１３３】
治療用の化合物の投薬量、毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物における、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％の治療的に有効な用量）を決定するための標準的薬学的手順により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療の指標であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療の指標を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用されることもあるが、感染されていない細胞を損傷する可能性を最小化して、それにより、副作用を低下させるために、そのような化合物を罹患した組織の部位に向ける送達システムを設計するように注意が払われるべきである。
【０１３４】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを使用して、ヒトで使用するための投薬量の範囲を製剤化することができる。そのような化合物の投薬量は、毒性が殆どまたは全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイにより概算することができる。用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最高の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環する血漿中の濃度範囲を達成するように、動物モデルで製剤化することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与するために、滅菌水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、または脳脊髄液（ＣＳＦ）に溶解される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、髄腔内に、例えば、Ｌ３またはＬ４椎間板スペースにボーラス注射により、または髄腔内ポンプを使用して点滴により投与される。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、約０．００１〜１０００ｍｇ（例えば、約０．１〜８００ｍｇ、約１〜６００ｍｇ、約１０〜５００ｍｇ、約５０〜４５０ｍｇ、約８０〜３００ｍｇ、約１００〜２００ｍｇ）の本明細書に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、それを必要とする対象に投与される。
【０１３７】
キット
上で記載された１種または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび使用説明書を含むキットも提供される。使用説明書は、タウに関連する疾患の診断または治療のための指示を含むことができる。本明細書で提供されるキットは、任意の本明細書に記載された方法に従って使用することができる。当業者は、本明細書で提供されるキットについて他の適当な使用を知っており、キットをそのような用途に用いることができるであろう。本明細書で提供されるキットは、試料を分析のために、例えば実験室に返送するため使用することができる郵送用容器（例えば、郵便料金支払い済みの封筒または郵送パック）を含むこともできる。キットが、試料のための１つまたは複数の容器を含むことができるか、または試料が標準的な血液収集バイアル中にあることができる。キットは、１つまたは複数のインフォームドコンセント用紙、試験請求用紙、および本明細書に記載された方法でキットをどのように使用するかについての指示を含むことができる。そのようなキットを使用するための方法も本明細書に含まれる。１つまたは複数の用紙（例えば、試験請求用紙）および試料を保存する容器を、例えば、試料を提供した対象を同定するためのバーコードでコード化することができる。
【０１３８】
当業者は、本明細書に記載されたものと同様なまたは等価の多くの方法および材料を認識し、それらを本発明の実施で使用することができるであろう。実際、本発明は、本明細書に記載された方法および材料に決して限定されない。
【実施例】
【０１３９】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は請求項に記載された本発明の範囲を限定しない。
【０１４０】
[実施例１]
一般的材料および方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および精製
本発明に記載された、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホラミダイト化学を使用して、インビトロで使用するためのＭｅｒｍａｄｅ  １９２  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）およびインビボ目的のためのＭｅｒｍａｄｅ１２（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）で調製した。ホスホルアミダイトを、アセトニトリル中に０．１５Ｍ濃度（Ｍｅｒｍａｄｅ  １９２では０．０８Ｍ）で溶解して；カップリングを、５−エチルチオテトラゾールのアセトニトリル中の０．５Ｍ溶液（Ｍｅｒｍａｄｅ  １９２では０．２５Ｍ）によりホスホルアミダイトを活性化することにより行った。カップリング時間は通常３〜４分の間であった。硫化を、フェニルアセチルジスルフィドの０．２Ｍ溶液を５分使用することにより行った。酸化は、ピリジン中の０．０２Ｍヨウ素溶液（２０％）／水（９．５％）／テトラヒドロフラン（７０．５％）により２分間行った。キャッピングを、標準的キャッピング試薬を使用して行った。オリゴヌクレオチドの成長鎖を、次のカップリングのためにトルエン中３％ジクロロ酢酸によりデトリチル化した。配列の完了後、支持体に結合した化合物を切断して、液体水酸化アンモニウムにより６５℃で２時間脱保護した。得られた粗溶液を、直ちにＨＰＬＣ（Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）により精製した。精製された分画を質量分析法により分析して、２６０ｎＭにおけるそれらの吸光係数に従ってＵＶにより定量した。抜き取られた分画を脱塩して凍結乾燥した。
【０１４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ試験
ヒトの細胞株、例えばＨｕｈ７細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞など、およびＣＯＳ１ミドリザルの細胞株を含むが、これらに限定されない種々の細胞株で、アンチセンスオリゴヌクレオチドをインビトロで試験した。細胞は、市販の業者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）から得て、業者の使用説明に従って培養した。
【０１４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国のウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎに所在のＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．から得たヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ヒトニューロンでも試験した。ｈＥＳＣを、ニューロゲニン−２（Ｎｇｎ２）、ニューロンの系統に特異的な転写因子の強制発現により、機能的ニューロン細胞に変換した。ｒｔＴＡの構成性の発現およびｔｅｔＯプロモーターによって駆動される外因性タンパク質のテトラサイクリン誘導性の発現のために、レンチウイルス送達を使用することにより、Ｎｇｎ２構築物をｈＥＳＣに送達した。試料は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓにより確立されたｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（「ＮＡＳ指針）およびヒト対象の保護のためのｔｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（「ＤＨＨＳ」）の規制（連邦規則集第４５編パート１Ｑ）に準拠する。
【０１４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、培養細胞中に、培養で細胞が約６０〜８０％のコンフルエンシーに達した時に、トランスフェクションまたはヌクレオフェクションのいずれかにより導入した。トランスフェクションのために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＯｐｔｉＦｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈのカタログ番号１２５７９−０１７）と適当な細胞培養培地中で混合されて、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度および１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチド当たり２から１２μｇ／ｍＬの範囲のＯｐｔｉＦｅｃｔ（商標）濃度に達した。ヌクレオフェクションのためには、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中にＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩデバイス（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）を用いて導入した。ＡＳＯの有効性を試験するために、ヌクレオフェクションを９６ウェルのプレートで実施した。予備実験の後、高い生存能力および効率的なトランスフェクションに基づいてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液ＳＦを選択した。ヌクレオフェクションの当日に、６０〜８０％コンフルエントの培養物をトリプシン処理し、細胞を各ウェルにプレーティングした。ｈＥＳＣ由来ヒトニューロンを、１または１０μＭアンチセンスオリゴヌクレオチドを培地中に添加することにより処置して受動取り込みにより取り込ませた。
【０１４４】
細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチド処置後２４〜７２時間に採取して、直ぐにタウｍＲＮＡまたはタンパク質を単離して、当技術分野において知られたおよび本明細書に記載された方法を使用して測定した。一般的に、処置が複数の繰り返しで実施された場合、データは、繰り返された処置の平均として表した。使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株によって変化した。特定の細胞株について最適のアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定する方法は、当技術分野において周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＯｐｔｉＦｅｃｔを用いてトランスフェクトされた場合には１ｎＭから１，０００ｎＭの範囲の濃度で；およびヌクレオフェクションを使用してトランスフェクトされた場合には２５ｎＭから２０，０００ｎＭの範囲の濃度で使用した。
【０１４５】
ＭＡＰＴ（タウ）ｍＲＮＡのレベルの定量は、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をメーカーの使用説明書に従って使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって遂行した。リアルタイムＰＣＲに先行して、単離されたＲＮＡを逆転写反応にかけて、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生させて、それを次にリアルタイムＰＣＲ増幅のための基質として使用した。逆転写およびリアルタイムＰＣＲ反応を、同じ試料ウェル中で順次実施した。Ｆａｓｔｌａｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号２１６５１３）を、ウェル中の細胞を溶解するために使用して、培養細胞からＲＮＡを精製せずに、ｍＲＮＡを直接ｃＤＮＡに逆転写した。次にｃＤＮＡを、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してタウ発現を分析するために使用した。リアルタイムＰＣＲにより決定されたタウｍＲＮＡのレベルを、発現レベルが細胞で一定であるハウスキーピング遺伝子の発現レベル、例えば、ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒトＴＡＴＡ−ボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、またはヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）などを使用して標準化した。
【０１４６】
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ  カタログ番号２０４６４３）に記載されたプロトコルに従って、デュプレックスＲＴ−ＰＣＲ（duplex RT-PCR）反応を使用して、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲのために実施した。ヒトＭＡＰＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  ＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１：ＦＡＭ−ＭＧＢ）、ヒトＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  ＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１：ＶＩＣ−ＭＧＢ）、ヒトＴＢＰ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  カタログ番号４３２６３２２Ｅ）またはヒトＨＰＲＴ１（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  カタログ番号４３３３７６８Ｔ）に特異的なＴａｑｍａｎプローブを使用した。デュプレックスＲＴ−ＰＣＲのために推奨されるサイクリング条件に従って、試料をＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で実行した。全てのデータをｃＤＮＡ入力の量に対して制御して、タウｍＲＮＡのレベルを内因性の参照遺伝子のレベルに対して標準化した。タウおよび対照の遺伝子を、同様な高いＰＣＲ効率を有する同じ反応で増幅して、ΔΔＣＴ法による相対定量を可能にした。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞に対する残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表示した。
【０１４７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボにおける試験
ＭＡＰＴに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＳＯをマウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）中に頭蓋内空洞（ＩＣＶ）投与により送達することにより、インビボで試験した。マウスを５％イソフルランで麻酔して、その後、酸素／亜酸化窒素中のイソフルラン含有率を１．５〜２％に低下させて外科処置を通して維持した。直腸温度は、恒温加熱毛布および直腸プローブを用いて３６．９±１．０℃に維持した。麻酔されたマウスを定位装置において頭部の皮膚を剃毛して、ポビドン−ヨウ素溶液（Ｂｅｔａｄｉｎｅ）で消毒した。切開の前に、マウスにブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｌ／ｋｇ、皮下注射）を与えた。その後、切開して、注射のための脳座標を決定するために頭蓋を露出させた。１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射器およびマイクロポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）付きの２８Ｇ注射針を使用して、全ての動物について右側脳室中に、以下の座標：ＡＰ＝＋０．５ｍｍ；ＭＬ＝＋１．０ｍｍ；ＤＶ＝−２．５ｍｍに注射した（合計体積２μｌ）。流速は１μｌ／分であり、注射針を、点滴後引き抜く前に１分間その場に残した。皮膚を閉じて、マウスは単一のケージ中で回復させてからホームケージに戻した。追加の用量のブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｌ／ｋｇ、皮下注射）を、最初の４８時間の間、１日に２回投与した。
【０１４８】
動物は実験室／動物の技術員により毎日モニターされた。動物の一般的状態および創傷回復がモニターされて、体重が毎日測定された。終点で、動物をナトリウムペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ  Ｍｅｂｕｎａｔ、ＯｒｉｏｎＰｈａｒｍａ、フィンランド）で深く麻酔した。マウスを大槽穿刺してＣＳＦ（１匹のマウス当たり３〜５μＬ）を収集した。その後、マウスを心臓穿刺して、血液試料を収集した。約０．４〜０．５ｍＬの血液を５００μＬのプラスチックのラベンダーＫ２ＥＤＴＡ抗凝血剤チューブ中に収集し、２０００ｇで１０分間４℃で遠心分離して、血漿を等分した。その後マウスを断頭して脳を収集し、皮質、海馬、および小脳などの異なる脳領域に切り分けた。それに加えて、脊髄も収集した。
【０１４９】
[実施例２]
１８量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤によるＨｕｈ７細胞中におけるヒトタウ発現の阻害
アンチセンスオリゴヌクレオチドの立体的遮断剤は、全てのアイソフォーム中に存在する不変のエクソンであるヒトタウにおける構成性のエクソンのイントロン−エクソン接合を標的とするように設計された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの立体的遮断剤は、イントロンの分岐点配列にハイブリダイズし、スプライス部位を直接標的とし、イントロンおよびエクソンの配列、エクソンスプライシングエンハンサー部位を挟むことにより、エクソンスキッピングを誘発するように設計された。ＭＡＰＴを標的とする立体的遮断剤は、全てのヌクレオシドにおいて立体障害により作用して、ＲＮａｓｅＨまたはＲＩＳＣを活性化しない２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−Ｏ−ＭＯＥ）リボース糖修飾を有する、１８ヌクレオシドの長さとして、最初に設計された。該ヌクレオシド間連結は隅から隅までホスホジエステル連結である。無バイアスのスクリーニングを、ホスホジエステル骨格を有する上記１８量体の均一に修飾された２’−ＭＯＥのＡＳＯについて実施した。オフターゲットハイブリダイゼーションを避けるために、ＢＬＡＳＴ分析を、各モルホリノオリゴヌクレオチド配列について実施した。
【０１５０】
タウを標的とする１８量体の２’−Ｏ−ＭＯＥの立体的遮断剤を、インビトロで、ヒトタウｍＲＮＡの阻害におけるそれらの活性について試験した。Ｈｕｈ７細胞を１ウェル当たり１０，０００細胞の密度でプレーティングし、ＯｐｔｉＦｅｃｔ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号１２５７９−０１７）を使用して、２５ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。４８時間の処置期間の後、Ｆａｓｔｌａｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１６５１３）を使用して、培養細胞からｃＤＮＡを直接調製した。タウｍＲＮＡのレベルは、ヒトＭＡＰＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  ＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１：ＦＡＭ−ＭＧＢ）およびヒトＴＢＰ（ＴＡＴＡ−ｂｏｘ結合タンパク質）内因性対照（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号４３２６３２２Ｅ）に特異的なＴａｑｍａｎプローブを使用して、デュプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応で定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。全てのデータをｃＤＮＡ入力の量に合わせて制御し、タウｍＲＮＡのレベルを、内因性の参照遺伝子ＴＢＰのレベルに標準化した。タウおよびＴＢＰ対照遺伝子を、同様な高いＰＣＲ効率を有する同じ反応で増幅して、ΔΔＣＴ法による相対定量を可能にした。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞に対する残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表示した。表２は、Ｈｕｈ７細胞中のこれらの１８量体の２’−Ｏ−ＭＯＥの立体的遮断剤の活性を示す。
【０１５１】
【表２−１】
2019500428.tif 000013
【０１５２】
【表２−２】
2019500428.tif 000014
【０１５３】
【表２−３】
2019500428.tif 000015
【０１５４】
[実施例３]
１８量体の２’−Ｏ−ＭＯＥの立体的遮断剤によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中におけるヒトタウ発現の阻害
実施例２でタウ発現を顕著に減少させた立体的遮断剤を選択して、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙの細胞で試験した。培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、１，０００ｎＭの選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでヌクレオフェクトした。約２４時間の処置期間の後、Ｆａｓｔｌａｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１６５１３）を使用して培養細胞からｃＤＮＡを直接調製した。タウｍＲＮＡのレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲによりデュプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応を使用して測定し、ヒトＭＡＰＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１：ＦＡＭ−ＭＧＢ）およびヒトＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１：ＶＩＣ−ＭＧＢ）に特異的なＴａｑｍａｎプローブを使用した。全てのデータをｃＤＮＡ入力の量に合わせて制御し、タウｍＲＮＡのレベルを、内因性の参照遺伝子ＧＡＰＤＨのレベルに標準化した。タウおよびＧＡＰＤＨ対照遺伝子を、同様な高いＰＣＲ効率を有する同じ反応で増幅して、ΔΔＣＴ法による相対定量を可能にした。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞に対する残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表示した。表３は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中の選択された１８量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤の活性を示す。
【０１５５】
【表３】
2019500428.tif 000016
【０１５６】
タウｍＲＮＡの有意のインビトロ阻害を示した立体的遮断剤を、異なる用量で試験した。培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、０．１２５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、１，０００ｎＭ、２，０００ｎＭ、４，０００ｎＭおよび８，０００ｎＭの１種の選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでヌクレオフェクトした。約２４時間の処置期間の後、ｃＤＮＡを直接調製して、タウｍＲＮＡのレベルを、上で記載されたように定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、用量応答曲線を構築して、アンチセンスオリゴヌクレオチドのタウｍＲＮＡを低下させる異なる濃度の効果を調べることにより決定された。化合物の最大生物学的応答の半分を阻害するために要する濃度を決定することによりＩＣ５０の値を計算して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力の測定として使用することができる。表４は、選択された１８量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤のＩＣ５０値を示す。
【０１５７】
【表４】
2019500428.tif 000017
【０１５８】
[実施例４]
１２〜２５量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるヒトタウ発現の阻害
実施例２および３でタウ発現を有意に低下させた立体的遮断剤は、１２から２５ヌクレオシド長の異なる長さを有するように選択して作製した。これらの１２〜２５量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で試験した。培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２，０００ｎＭの選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでヌクレオフェクトした。約２４時間の処置期間の後、ｃＤＮＡを上で記載されたように直接調製して、タウｍＲＮＡのレベルを、上で記載されたようにして測定した。表５は、１２〜２５量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における活性を示す。
【０１５９】
【表５−１】
2019500428.tif 000018
【０１６０】
【表５−２】
2019500428.tif 000019
【０１６１】
ホスホジエステルヌクレオシド間連結を有する選択された１２〜２５量体２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤のＩＣ５０の値を、上で記載されたように決定して、表６に示した。
【０１６２】
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する多くの１２〜２５量体２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤を合成して、これらの立体的遮断剤のいくつかのＩＣ５０の値を表７に示した。
【０１６３】
【表６】
2019500428.tif 000020
【０１６４】
【表７】
2019500428.tif 000021
【０１６５】
[実施例５]
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における１７量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤によるヒトタウ発現の阻害
１７ヌクレオシドの長さの２’−ＭＯＥ立体的遮断剤を、ヒトタウ中における構成エクソンを標的とするように設計した。これらの１７量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤をＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で試験した。培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２，０００ｎＭの選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約２４時間の処置期間の後、ｃＤＮＡを直接調製して、タウｍＲＮＡのレベルを上で記載されたようにして測定した。表８は、１７量体の２’−Ｏ−ＭＯＥ立体的遮断剤のＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における活性を示す。
【０１６６】
【表８−１】
2019500428.tif 000022
【０１６７】
【表８−２】
2019500428.tif 000023
【０１６８】
[実施例６]
Ｈｕｈ７細胞における５−１０−５ギャップマーによるヒトタウ発現の阻害
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を、最短のタウアイソフォーム、転写物のバリアント４、ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１６８４１．４）に相補的であるように設計した。オフターゲットハイブリダイゼーションを避けるためにＢＬＡＳＴ分析を各オリゴヌクレオチド配列について実施した。新たに設計されて修飾されたキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオシドの長さである５−１０−５ギャップマーとして設計され、そこで中央ギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、各々２’−Ｏ−ＭＯＥリボース糖で修飾された５個のヌクレオシドを含む５’方向および３’方向のウィングセグメントと隣接している。各ギャップマー全体を通じてヌクレオシド間連結はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）連結である。
【０１６９】
タウを標的とするギャップマーを、ヒトタウｍＲＮＡ発現の阻害についてインビトロで試験した。Ｈｕｈ７細胞を１ウェル当たり１０，０００細胞の密度でプレーティングし、ＯｐｔｉＦｅｃｔ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号１２５７９−０１７）を使用して２５ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。４８時間の処置期間の後、ｃＤＮＡを培養細胞から、Ｆａｓｔｌａｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１６５１３）を使用して直接調製した。タウｍＲＮＡのレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲによりデュプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応で、ヒトＭＡＰＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、ＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１：ＦＡＭ−ＭＧＢ）およびヒトＴＢＰ（ＴＡＴＡ−ｂｏｘ結合タンパク質）内因性対照（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、カタログ番号４３２６３２２Ｅ）に特異的なＴａｑｍａｎプローブを使用して測定した。全てのデータをｃＤＮＡ入力の量に合わせて制御し、タウｍＲＮＡのレベルを、内因性の参照遺伝子ＴＢＰのレベルに標準化した。タウおよびＴＢＰ対照遺伝子を、同様な高いＰＣＲ効率を有する同じ反応で増幅して、ΔΔＣＴ法による相対定量を可能にした。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞に対する残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表示した。表９は、Ｈｕｈ７細胞におけるギャップマーの活性を示す。
【０１７０】
【表９−１】
2019500428.tif 000024
【０１７１】
【表９−２】
2019500428.tif 000025
【０１７２】
[実施例７]
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中における５−１０−５ギャップマーによるヒトタウ発現の阻害
実施例６においてタウｍＲＮＡの発現を有意に減少させたギャップマーを選択して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で試験した。培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を２，０００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでヌクレオフェクトした。約２４時間の処置期間の後、培養細胞から、Ｆａｓｔｌａｎｅ  ｃｅｌｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２１６５１３）を使用して、ｃＤＮＡを直接調製した。タウｍＲＮＡのレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲによりデュプレックスＲＴ−ＰＣＲ反応を使用して測定し、ヒトＭＡＰＴ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  ＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１：ＦＡＭ−ＭＧＢ）およびヒトＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  ＡｓｓａｙＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１：ＶＩＣ−ＭＧＢ）に特異的なＴａｑｍａｎプローブを使用した。全てのデータをｃＤＮＡ入力の量に合わせて制御し、タウｍＲＮＡのレベルを、内因性の参照遺伝子ＧＡＰＤＨのレベルに標準化した。タウおよびＧＡＰＤＨ対照遺伝子を、同様な高いＰＣＲ効率を有する同じ反応で増幅して、ΔΔＣＴ法による相対定量を可能にした。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞に対する残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表示した。表１０は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における選択された５−１０−５ギャップマーの活性を示す。５−メチルシトシンを有する選択された５−１０−５ギャップマーのＩＣ５０の値は、上で記載されたようにＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で決定し、表１１に示した。
【０１７３】
【表１０】
2019500428.tif 000026
【０１７４】
【表１１】
2019500428.tif 000027
【０１７５】
[実施例８]
ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの特徴付け
ＭＡＰＴを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの高速液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）の装置を使用することにより特徴付けた。この方法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の予想される質量を確認して、試料の純度および存在する主な構成要素の同定についての情報を提供するために使用した。例えば、配列番号２８４を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図１Ａに示される構造およびＣ２３０Ｈ３２１Ｎ７２Ｏ１２０Ｐ１９Ｓ１９の式を有する。したがって、配列番号２８４を含むＡＳＯについて予想される分子量は約７２１２．３Ｄａである。図１Ｂは、配列番号２８４を含むＡＳＯについてＬＣ−ＭＳにより測定されたピーク質量は７２１４．３Ｄａであることを示す。図１Ｃは、配列番号２８４を含むＡＳＯについてＬＣ−ＭＳのデコンヴォリューションピークの報告を示す。
【０１７６】
配列番号２８５を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃ２３０Ｎ６９Ｏ１２４Ｐ１９Ｓ１９Ｈ３１８の式を有し、概算される分子量は７２３１．１１Ｄａである。図１Ｄは、配列番号２８５を含むＡＳＯについてＬＣ−ＭＳにより測定されたピーク質量が７２３２．５であることを示す。図１Ｅは、配列番号２８５を含むＡＳＯについてのＬＣ−ＭＳのデコンヴォリューションピークの報告を示す。
【０１７７】
[実施例９]
ＭＡＰＴを標的とするギャップマーのインビボにおける試験
ヒトタウ（ｈＴａｕ）トランスジェニックマウスの発生
ヒトタウ遺伝子ＭＡＰＴを含有するＢＡＣベクター（ｐＢＡＣｅ３．６）を、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのヒトゲノムのライブラリーから得た。ＭＡＰＴ遺伝子の全ての調節領域を含有すると予測される３種のベクターをスクリーニングした。ヒトゲノムＤＮＡを標準的ＰＣＲにかけて、ヒトタウ遺伝子の各エクソン、イントロンにまたがるプライマーおよび調節領域の存在について試験して、クローンの配列を決定するために使用した。ヒトＤＮＡとの比較により、１つのクローン（ＲＰ１１６６９Ｅ１４）がタウ遺伝子の全ての部分について完全であることが示された。このＢＡＣベクターをｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスを発生させるために使用した。精製ＤＮＡをＣ５７ＢＬ／６マウスの受精した胚に注射した。始祖の子マウスからの尾部ＤＮＡを制限酵素で消化して、エクソンに特異的なプローブとハイブリダイズさせ、同様に消化されたヒトＤＮＡを、導入遺伝子の完全性を試験するための対照として使用した。陽性の始祖の子マウスを増殖させた。数種のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニック系統が発生して、１系統がヒトＭＡＰＴｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を示した（図２Ａ〜２Ｃ）。この系統が、ヒト脳で見出される６種全てのヒト脳転写物およびタンパク質アイソフォームを発現した（図２Ａ〜２Ｃ）。ヘテロ接合体のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスは、１コピーの導入遺伝子を担持して、ＲＮＡおよびヒトタウ発現のレベルは内因性マウスタウ発現とほぼ同等であった。
【０１７８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトタウのインビボにおけるノックダウン
選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドをインビボで試験した。５群のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスに、１、１０、５０、２００、または４００μｇの選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを脳室内の（ＩＣＶ）ボーラス注射により投与するか、または対照マウスの群として未処置のままにした。全ての手順は、イソフルオラン麻酔下で、ＩＡＣＵＣの規制に従って実施した。ＩＣＶボーラス注射のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスの右側脳室中に注射した。１００μｇ／μｌのオリゴヌクレオチドを含有する２または４マイクロリットルのＰＢＳ溶液を注射した。オリゴヌクレオチド投与の直後、１時間、４時間、２４時間、２週間、４週間、１２週間または２４週間後に組織を収集した。海馬または皮質からＲＮＡを抽出して、ヒトタウｍＲＮＡの発現についてリアルタイムＰＣＲ分析により調べた。ヒトタウｍＲＮＡのレベルを上で記載されたように測定した。結果は、対照の未処置マウスと比較してＧＡＰＤＨレベルに標準化したヒトタウｍＲＮＡ発現の阻害率（パーセント）として計算した。タンパク質は、海馬または皮質から抽出して、ＥＬＩＳＡによりヒトタウタンパク質発現レベルについて調べ、合計タンパク質のレベルに合わせて標準化した。
【０１７９】
配列番号２８４または配列番号２８５を含む５−１０−５ギャップマーのインビボにおける活性を上で記載された方法を使用して試験した。表１２に示したように、両方のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの単回のＩＣＶ注射後２週間目で、皮質および海馬におけるヒトタウｍＲＮＡの発現を有意に阻害した。配列番号２８５を含むギャップマーについて、ヒトタウｍＲＮＡのノックダウンは、皮質および海馬の両方で約６５％であった。配列番号２８４を含むギャップマーについては、ヒトタウｍＲＮＡのノックダウンは、皮質および海馬の両方で、約４２％であった。ＡＳＯ処置の２週間後のタウタンパク質レベルについて、配列番号２８５を含むギャップマーは、皮質においてタウタンパク質発現の約５０％をノックダウンし；配列番号２８４を含むギャップマーは、皮質においてタウタンパク質発現の約３６％をノックダウンした。本発明者らは、海馬におけるＡＳＯ処置の２週間後にタウタンパク質レベルの有意の低下を観察しなかった。
【０１８０】
【表１２】
2019500428.tif 000028
【０１８１】
タウｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを、ギャップマーの単回のＩＣＶ注射後４週間目にも試験した。配列番号２８５を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳におけるヒトタウｍＲＮＡ（図２Ｄ）およびタンパク質（図２Ｅ）の発現を有意に阻害した。配列番号２８５を含むギャップマーについて、ヒトタウｍＲＮＡのノックダウンは、皮質および海馬の両方で約６０％であった（図２Ｄおよびデータ不掲載）。ウェスタンブロット分析は、配列番号２８５を含むギャップマーがヒトタウタンパク質レベルを、処置後４週間目に海馬で約５０％ノックダウンしたことを示した（図２Ｅ）。
【０１８２】
ｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスの脳におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳分布を検出するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験を、二重にジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されたロックド核酸（ＬＮＡ（商標）、Ｅｘｉｑｏｎ）プローブを使用して実施した。標的のアンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的である二重−ＤＩＧ  ＬＮＡプローブを終夜ハイブリダイズさせた。次に、プローブを、ヒツジ抗ＤＩＧアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１０９３２７４９１０）およびニトロブルーテトラゾリウムとアルカリホスファターゼの基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸とのコンジュゲート（ＢＣＩＰ）の比色反応を使用して検出した。代表的実験における配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳内分布を図３に示したが、それは、ＡＳＯの脳室からマウス脳実質への初期拡散を示し、分布シグナルは２４時間から２週間の間で変化しない。（図３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳中で４週間後でさえ安定である（データは示さず）。
【０１８３】
配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、ｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスにおけるヒトタウのｍＲＮＡ（図４Ａ）およびタンパク質（図４Ｂ）の発現の用量依存性阻害が観察された（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０１８４】
配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチド２００μｇの単回のＩＣＶ注射後のｈＴａｕ  ＢＡＣトランスジェニックマウスにおけるヒトタウｍＲＮＡ（図５Ａ）およびタンパク質（図５Ｂ）発現レベルの時間経過は、配列番号２８５のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、１２週間まで持続したタウｍＲＮＡおよびタンパク質発現の阻害を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。
【０１８５】
[実施例１０]
Ｈｕｈ７およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における、５−メチルシトシンを有する追加の５−１０−５ギャップマーによるヒトタウ発現の阻害
タウを標的とする５−メチルシトシンを有する追加のギャップマー配列を、上で記載されたＨｕｈ７およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるヒトタウｍＲＮＡ発現の阻害について、インビトロで試験した。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞と比較して、残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表す。表１３は、Ｈｕｈ７およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞における、５−１０−５ギャップマーの追加のスクリーニングされた配列の活性を示す。
【０１８６】
【表１３−１】
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【０１８７】
【表１３−２】
2019500428.tif 000030
【０１８８】
【表１３−３】
2019500428.tif 000031
【０１８９】
【表１３−４】
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【０１９０】
表１３中でタウｍＲＮＡ発現を有意に減少させたギャップマーを選択して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で試験した。選択された５−メチルシトシンを有する５−１０−５ギャップマーのＩＣ５０の値を上で記載されたようにＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で決定し、表１４に示した。
【０１９１】
【表１４】
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【０１９２】
[実施例１１]
５−メチルシトシンを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるサルおよびヒトのタウ発現の阻害
タウｍＲＮＡの発現を有意に減少させたいくつかのギャップマーを選択して、ＣＯＳ１ミドリザル細胞で試験した。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞と比較して残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表す。表１５は、ＣＯＳ１細胞における選択された５−１０−５ギャップマーの活性を示す。
【０１９３】
【表１５】
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【０１９４】
タウｍＲＮＡ発現を有意に減少させたいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択して、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ニューロンで試験した。結果は、ＰＢＳで処置された対照細胞と比較して残存タウｍＲＮＡのパーセントとして表す。表１６は、ヒトニューロンにおける選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を示す。
【０１９５】
【表１６】
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【０１９６】
[実施例１２]
ＭＡＰＴを標的とするギャップマーのインビボにおける試験
選択された５−１０−５ギャップマーのインビボにおける活性を、実施例９で記載された方法を使用して試験した。表１７に示したように、いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、皮質および海馬においてヒトタウｍＲＮＡおよびタンパク質発現を有意に阻害した。
【０１９７】
【表１７】
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【０１９８】
特に断りのない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本開示が属する分野に通じた専門家により通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０１９９】
特に指摘されない限り、特に詳細に記載されていない全ての方法、ステップ、技法および操作は、それ自体、当業者には明らかで知られている様式で実施することができ、実施されてきた。本明細書で言及した標準的便覧および一般的背景技術およびそこで例として引用されたさらなる参考文献に再び言及する。特に指摘されない限り、本明細書で引用された参考文献の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【０２００】
本発明の請求項は非限定的であり、下で提供される。
【０２０１】
特定の態様および請求項が、本明細書で詳細に開示されたが、これは例示の目的のためにのみ、例のために行われたもので、添付の請求項の範囲、または任意の対応する将来の適用の請求項の対象事物の範囲に関して、限定することは意図されない。特に、請求項により規定された本開示の精神および範囲から逸脱することなく、種々の置換、変更、および改変が本開示に対して為され得ることは、本発明者らにより企図されている。関心のある、またはライブラリータイプの核酸出発原料、クローンの選択は、本明細書に記載された態様の知識を有する当業者にとって日常的な事柄であると考えられる。他の態様、利点、および改変も以下の請求項の範囲内であると考えられる。当業者は、日常的実験より多くを使用せずに、本明細書に記載された本発明の特定の態様の多くの等価の事物を認識し、または確かめることができるであろう。そのような等価の事物は、以下の請求項によって包含されることが意図されている。後で出願される対応する出願における請求項の範囲の書き直しは、種々の国の特許法による制限に基づくこともあり、請求項の対象事物の放棄と解釈されるべきではない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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