(57)【要約】新生細胞の細胞あたりのプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）発現量を検出する方法を提供する。この方法の態様は、標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が新生物試料中に存在するか否かを検出することを備える。加えて、発明の方法を実施する際に有用性を見出すキットをも提供する。
2019535001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の閾値を上回るプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を発現する新生細胞が新生物試料中に存在するか否かを検出する方法であって、
前記新生物試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバーと接触させ、標識細胞懸濁液を生成すること、
前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が前記新生物試料中に存在するか否かを検出すること
を備える、方法。
【請求項２】
前記サイトメトリーによってアッセイすることは、細胞周期をアッセイすることをさらに有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サイトメトリーによってアッセイすることは、異数性をアッセイすることをさらに有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
検出された細胞は、増殖性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させることは、前記新生物試料を免疫細胞に特異的な少なくとも１個の標識結着メンバーと接触させることをさらに有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検出された細胞は、循環腫瘍細胞、造血器癌細胞、または固形腫瘍の細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記所定の閾値は、１個の細胞あたり１００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
被検体中の新生物が抗プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）免疫療法応答性であるか否かを識別する方法であって、
前記新生物から調製される細胞懸濁液試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバーと接触させ、標識細胞懸濁液を生成すること、
前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、所定の閾値を超えるＰＤ−Ｌ１レベルを各発現する細胞集団が存在するか否かを検出し、前記新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であるか否かを識別すること
を備える、方法。
【請求項９】
前記細胞集団は、異数体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異数体の細胞は、前記被検体中の循環腫瘍細胞の存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、増殖性免疫細胞が存在するか否かを検出することをさらに備える、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
被検体を新生物について処置する方法であって、
抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性新生物を含む被検体に投与することを備え、
前記新生物は請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法に従って抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別される、
方法。
【請求項１３】
ＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバー、及び
固定試薬を含む細胞懸濁液固定液
を備える、キット。
【請求項１４】
前記細胞懸濁液固定液は、透過処理試薬を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
細胞破砕装置をさらに備える、請求項１３または１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
がんは、両性に等しく影響を与える、世界中で推定年間１２７０万件の症例を有する、依然として世界的に主な死因の１つである。この数は、２０３０年までに２１００万件に増加すると予想されている。
【０００２】
免疫系は、腫瘍発生に密接に関わり、転移への病勢進行中に特に決定的な役割を果たす。免疫とがん細胞との間の複雑なクロストークが腫瘍増殖をも増すため、がんについて免疫系の影響は、厳密には抑制的ではない。がん進行における免疫系の関与は、現在一般的にがんの特徴とみなされる。したがって、免疫系ががんにどのように応答するかは、最終的な結果を決定する。
【０００３】
被検体の免疫系ががんへの有意な初期応答を開始する事例でも、がんは、免疫抑制の引き金となる免疫チェックポイントタンパク質の発現量を有するさまざまな機構を通じて、免疫応答の破壊的要素を依然として回避する可能性がある。さらに免疫攻撃の回避をもたらす機構は、免疫エフェクター（すなわち、「免疫編集」）、及び腫瘍内の免疫抑制環境の漸進的形成に対して抵抗性である腫瘍バリアントの選択を有する。
【０００４】
免疫療法は、効率的にがんを標的とするように、及び／または免疫回避を防止するように、被検体の免疫系に合理的に再指示しようとする。
【発明の概要】
【０００５】
新生細胞の細胞あたりのプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）発現量を検出する方法を提供する。この方法の態様は、標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が新生物試料中に存在するか否かを検出する。加えて、本発明の方法を実施する際に有用性を見出すキットをも提供する。
【０００６】
本発明は、添付の図面と併せて読まれるときに、以下の発明を実施するための形態から最も良く理解される。一般的な慣例に従い、図面のさまざまな特徴が一定の縮尺ではないことを強調する。それとは対照的に、さまざまな特徴の寸法は、明確さのために任意に拡大される、または縮小される。図面に含まれるのは、以下の図である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本明細書に記載されるようなＰＤ−Ｌ１標識及びフローサイトメトリー解析を使用するＰＤ−Ｌ１の陽性対照細胞及び陰性対照細胞の明らかなサイトメトリー分離を示す。
【図２】陰性対照試料に添加されるＰＤ−Ｌ１陽性細胞のさまざまな割合によって調製される混合試料中でＰＤ−Ｌ１陽性細胞の検出の直線性を示す。
【図３】本明細書に記載されるように実施形態に使用されるような細胞あたりのＰＤ−Ｌ１定量化についてＰＤ−Ｌ１蛍光のＭＥＳＦビーズに基づく標準化を示す。
【図４】腫瘍及び免疫細胞サブセットの定量的ＰＤ−Ｌ１発現量解析、ならびに患者由来試料中のＰＤ−Ｌ１発現細胞の特異的な検出の妥当性確認を示す。
【図５】表２を示す。
【図６】本明細書に記載される実施形態に従ってアッセイされる肺腫瘍組織免疫細胞浸潤物の増殖を示す。
【図７】本明細書に記載される実施形態に従ってアッセイされるような腫瘍組織中の、マクロファージの減少、及び非Ｔ細胞の増加を示す。
【図８】本明細書に記載される実施形態に従ってアッセイされるような腫瘍組織中に存在するリンパ球の、二倍性と比較して、異数性における増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
新生細胞の細胞あたりのプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の発現量を検出する方法を提供する。この方法の態様は、標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が新生物試料中に存在するか否かを検出することを備える。加えて、本発明の方法を実施する際に有用性を見出すキットをも提供する。
【０００９】
本発明の方法及びキットを説明する前に、本発明が説明される特定の方法またはキットに限定されず、そのようなものとして当然のことながら、変えることができることを理解するべきである。また、本明細書に使用される専門用語が特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定であることを意図されないことを理解するべきである。
【００１０】
値の範囲を提供する場合、文脈が別段に明確に指示しない限り、その範囲の上限値と下限値との間の下限値から１０分の１までの各介在値をも具体的に開示することを理解する。いずれかの記載値、または記載範囲中の介在値と、いずれかの他の記載値、またはその記載範囲中の介在値との間のより小さな各範囲は、本発明内に包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は、この範囲に独立して含まれてもよく、または除外されてもよく、また、記載範囲中のいずれかの具体的に除外された限界値を条件として、いずれか一方の上限値及び下限値をより小さな範囲に含む範囲、いかなる上限値及び下限値もより小さな範囲に含まない範囲、または上限値及び下限値の両方をより小さな範囲に含む範囲は、本発明内に包含される。また、記載範囲が一方または両方の限界値を含む場合、これらの含まれた限界値のいずれか一方、または両方を除外する範囲を本発明に含む。
【００１１】
別段に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料のいずれかの類似物またはこれらの均等物が本発明の実施または試験に使用されることが可能であるが、ここで、ある程度の可能性がある、好ましい方法及び材料を記載する。本明細書に言及される、すべての刊行物は、参照により本明細書に援用され、方法及び／または材料と関連する、これらの刊行物を引用する、これらの方法及び／または材料を開示して、記載する。矛盾があるという程度まで、本開示が援用された刊行物のいかなる開示にも優先することを理解する。
【００１２】
当業者に明らかであるように、本開示を読めば、本明細書に記述され、図示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分けられる、またはこれらの特徴と組み合わされることができる、別個の構成要素及び特徴を含む。いずれかの列挙された方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能であるいずれかの他の順序で実施されることが可能である。
【００１３】
本明細書に、また添付の特許請求の範囲に使用されるように、別段に文脈が明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、たとえば、「細胞」への言及は、複数のこれらのような細胞を含み、「標識結着メンバー」への言及は、１個以上の標識結着メンバー及びそれらの均等物、たとえば、当業者に知られている抗体などへの言及を含む。
【００１４】
本明細書に考察されるこれらの刊行物は、本開示の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、先行発明によってこのような刊行物に本発明が先行する権利がないという承認として解釈されない。さらに、与えられる公開日は、実際の公開日と異なる可能性があり、独立して確認される必要がある可能性がある。
【００１５】
方法
上記に要約されるように、本発明の実施形態は、所定の閾値を上回るプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を発現する細胞を検出する方法を対象とする。本発明の方法において、ＰＤ−Ｌ１発現を検出することができる細胞は、さまざまな例において、新生細胞及び免疫細胞を含む。その結果、いくつかの例において、本発明の方法において検出される、細胞、たとえば、新生細胞などは、所定の閾値を超えるＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞あたりの発現レベルを有する。
【００１６】
本明細書に使用されるような、「ＰＤ−Ｌ１の細胞あたりの発現レベル」、または「ＰＤ−Ｌ１の細胞あたりの発現量」によって、細胞の表面上に存在するＰＤ−Ｌ１分子の量を意味する。本開示の方法は、細胞試料をサイトメトリーによってアッセイして、ＰＤ−Ｌ１の細胞あたりの発現量を定量化した後に、所定の閾値を超えるＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞あたりの発現レベルを有する試料中の１個以上の細胞を検出することを備える。より詳細に以下に記載される、細胞試料をサイトメトリーによってアッセイするさまざまな手段を本発明の方法に用いることができる。
【００１７】
ＰＤ−Ｌ１発現細胞
上記に要約されるように、本開示は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を検出する方法を提供する。ＰＤ−Ｌ１発現は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現レベル、またはＰＤ−Ｌ１符号化転写物（すなわち、ｍＲＮＡ）発現レベルに基づき、細胞あたりの基準で定量化されることができる。いくつかの例において、本発明の方法は、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１タンパク質発現量のみを定量化し、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１転写物発現量を定量化しない。いくつかの例において、ＰＤ−Ｌ１タンパク質レベル及びＰＤ−Ｌ１転写レベルの両方を定量化する組み合わされた方法を用いることができる。
【００１８】
さらに詳細に以下に記載されるように、本発明の方法の実施形態は、細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を検出することを備えることができる。本明細書に使用されるように、用語「サイトメトリーによってアッセイする」は、細胞ごとの基準で細胞パラメータの測定を説明し、そこでこのような測定は、ある一定の細胞パラメータまたはパラメータセットを有する個々の細胞の検出、またはこれを共有する細胞集団の計数を可能にする。本発明の方法において、細胞学的にアッセイされる１つのこのようなパラメータは、ＰＤ−Ｌ１の細胞あたりの発現量である。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４としても知られている）は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞上に発現する細胞表面受容体であるＰＤＣＤ１遺伝子によって符号化されるタンパク質を結着する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を妨げることによって免疫チェックポイントとして機能し、自己免疫を低下させ、自己寛容を促進する。ＰＤ−Ｌ１は、複数の異なるがん細胞型上に発現することがわかった。がん細胞上のＰＤ−Ｌ１の存在は、がん細胞免疫回避に寄与する、Ｔ細胞活性化を阻害する。複数のがん治療は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を阻害することによってがん細胞免疫回避を防止することを対象とする。
【００２０】
本開示は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞を検出することを備える。所定の閾値を上回る細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する新生細胞は、宿主免疫系を効果的に回避する可能性がより高いことができる。所定の閾値を上回る細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する新生細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を撹乱することに向けた治療によって影響を受ける可能性がより高いことができる。いくつかの例において、新生細胞の表面上のＰＤ−Ｌ１発現量を効果的に定量化し、閾値レベルを上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞を検出することによって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を標的にする治療の有効性を予測することができる。
【００２１】
本開示は、被検体中の新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であるか否かを識別する方法を備える。本明細書に使用されるように、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性は、たとえば、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１へ拮抗薬を使用することによってなどを備える、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を標的にする処置への新生物の応答性を一般的に指す。このようなものとして、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する細胞は、いくつかの例において、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性細胞と称されることができる。１個以上の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性細胞を含む新生物は、いくつかの例において、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性新生物と称されることができる。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法への細胞または新生物の応答性を予測する、または決定することができる。たとえば、いくつかの例において、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の存在を検出する方法は、細胞が由来する新生物が抗ＰＤ−Ｌ／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であることを予測することができる。いくつかの例において、たとえば、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の存在は、細胞が由来する新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であることを陽性に識別する。本発明の方法は、さらに詳細に以下に記載される、さまざまな異なる新生物に由来する所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する細胞を検出する際に有用性を見出す。
【００２２】
本開示の方法において検出される細胞は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する。このようなものとして、本開示の方法は、ＰＤ−Ｌ１の細胞あたりの発現レベルをサイトメトリーによって定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１タンパク質及び／またはＰＤ−Ｌ１転写物を発現する細胞を識別することを備える。本開示において有用なＰＤ−Ｌ１発現量についての所定の閾値は、たとえば、アッセイされる細胞型（たとえば、細胞が由来する新生物のタイプ）、他の測定された細胞パラメータ（たとえば、細胞周期パラメータ、異数性パラメータなど）、及びＰＤ−Ｌ１タンパク質または転写物を検出するか否かなどを含む、さまざまな要因により変わる。さらに詳細に以下に記載されるように、サイトメトリーによって、ＰＤ−Ｌ１発現量を決定し、そこで細胞の表面上でＰＤ−Ｌ１タンパク質を結着する標識特異的結着メンバーと細胞を接触させることを備えるが、これに限定されない、さまざまなプロトコルによって、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現量を決定することができる。いくつかの例において、サイトメトリーによってＰＤ−Ｌ１発現量を決定し、そこの細胞内でＰＤ−Ｌ１転写物を結着する標識特異的結着メンバーと細胞を接触させることを備えるが、これに限定されない、さまざまなプロトコルによって、ＰＤ−Ｌ１転写物発現量を決定することができる。
【００２３】
いくつかの例において、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を定量化することは、標準試料へのＰＤ−Ｌ１特異的結着パートナー標識細胞のＰＤ−Ｌ１蛍光を較正することを備えることができる。状況により、標準試料は、アッセイされた細胞によって、並行して、連続して、または同時にサイトメトリーによってアッセイされることができる。たとえば、いくつかの例において、標準試料は、サイトメトリーによってアッセイされ、定量化のためにアッセイを較正することができ、その後、標識細胞懸濁液試料は、較正されたサイトメトリーのアッセイを使用してアッセイされることができる。いくつかの例において、標準試料を標識細胞懸濁液試料に加える（すなわち、添加する）ことができ、標識細胞の細胞あたりの発現量を定量化するために標準試料に基づく較正を細胞のサイトメトリー解析中に実施することができる。いくつかの例において、標識細胞試料の各実行の間に、または各実行中に、標準試料に関する較正を実施することができる。いくつかの例において、標準試料に関する較正を実行の各バッチの間に、または各バッチ中に実施することができる。
【００２４】
たとえば、標準化された微粒子（すなわち、ビーズ）、標準化された対照細胞、標準化された蛍光粒子、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載されたアッセイに、細胞あたりのマーカー発現量への標識細胞蛍光を較正する、いずれかの簡便な標準試料を用いることができる。いくつかの例において、たとえば、可溶性蛍光色素分子等量（ＭＥＳＦ）ビーズ、または平均等量蛍光色素（ＭＥＦＬ）ビーズなどの、スペクトルが等しい微粒子標準試料を使用することができる。定量的なサイトメトリーに有用な微粒子標準試料は、微粒子あたりに結着されるフルオロフォアの既知の量によって標識される微粒子、またはフルオロフォア標識分子を結着するために既知の原子価によって標識される微粒子を一般的に含むいずれかの微粒子に変わる。定量的なサイトメトリーのための微粒子標準試料は、標的細胞の細胞膜への蛍光色素接着をシミュレーションし、定量化のために、たとえば、フローサイトメトリーアッセイ、または細胞サイトメトリーアッセイなどを含む、サイトメトリーアッセイの較正を可能にする。
【００２５】
たとえば、いくつかの例において、定量的サイトメトリーのための微粒子標準試料は、異なるフルオロフォア量によって標識される微粒子の、たとえば、２集団、３集団、４集団、５集団、６集団などを含む、２つ以上の集団を含む。選択されるフルオロフォアは、一般的に、記載された方法の標識特異的結着メンバーのうちの１個以上に使用されるフルオロフォアと同一である、これに等しい、またはこれと同等である。微粒子標準試料中の有用なフルオロフォアは、たとえば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、ＦＩＴＣ、ＰＥ、Ｃｙ５、ＡＰＣなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、異なるフルオロフォアを含む２個以上の微粒子標準試料は、混合されることができ、たとえば、そこで２個以上の異なる標識特異的結着メンバーの定量化は、本発明の方法に使用される。いくつかの例において、異なるフルオロフォアを含む微粒子標準試料を混合せず、異なる量の単一のフルオロフォア結着型を有する異なる微粒子集団を用いることができる。
【００２６】
微粒子標準試料を蛍光標識に直接コンジュゲートすることができる、またはいくつかの例において、蛍光による標識抗体を微粒子標準試料へ結着することができる。いくつかの例において、微粒子標準試料は、非蛍光性であるが、「標識可能」であることができる。標識可能な微粒子標準試料は、既知の抗体結着能力を一般的に有し、この能力は、本明細書に記載される方法において、たとえば、特異的結着メンバーとして使用される同一の抗体などを含む、既知の量の使用者の抗体を含む微粒子の染色を可能にする。標識可能な微粒子標準試料は、いくつかの例において、方法に用いられる特定の標識特異的結着メンバーのフルオロフォア対タンパク質（ＦＴＰ）の比の決定及び／またはさらなる較正を可能にする、事前に標識された微粒子標準試料と併せて用いられることができる。本明細書に記載された方法に有用性を見出すことができる定量的サイトメトリーについての、たとえば、蛍光によって標識された微粒子標準試料、及び標識可能な微粒子標準試料などを含むさまざまな異なる微粒子標準試料は、たとえば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及び同様のものから市販されているものを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、これらのようなものによって標識される標識特異的結着メンバー及び／または細胞の蛍光を微粒子標準試料に対して較正し（たとえば、異なるフルオロフォア量によって標識される２つ以上の微粒子集団の蛍光をアッセイすることによって）、標準曲線を確立することができる。標準曲線の確立後または確立中に、標識細胞懸濁液試料をアッセイすることができ、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を決定することができる。定量化された細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現レベルを所定の閾値と比較することができ、この所定の閾値は、たとえば、細胞あたりに発現するＰＤ−Ｌ１タンパク質の分子数に基づき確立される閾値、バックグラウンド蛍光に基づき確立される閾値、ＰＤ−Ｌ１のバックグラウンド発現量（たとえば、細胞あたりの発現量などを含む）に基づき確立される閾値、及び同様のものを含む。
【００２８】
いくつかの例において、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量についての所定の閾値を細胞あたりのＰＤ−Ｌ１タンパク質の分子数として表すことができ、この分子数は、たとえば、１個の細胞あたり１０個の分子の閾値、１個の細胞あたり２０個の分子の閾値、１個の細胞あたり３０個の分子の閾値、１個の細胞あたり４０個の分子の閾値、１個の細胞あたり５０個の分子の閾値、１個の細胞あたり６０個の分子の閾値、１個の細胞あたり７０個の分子の閾値、１個の細胞あたり８０個の分子の閾値、１個の細胞あたり９０個の分子の閾値、１個の細胞あたり１００個の分子の閾値、１個の細胞あたり２００個の分子の閾値、１個の細胞あたり３００個の分子の閾値、１個の細胞あたり４００個の分子の閾値、１個の細胞あたり５００個の分子の閾値、１個の細胞あたり６００個の分子の閾値、１個の細胞あたり７００個の分子の閾値、１個の細胞あたり８００個の分子の閾値、１個の細胞あたり９００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１０００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１１００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１２００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１３００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１４００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１５００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１６００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１７００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１８００個の分子の閾値、１個の細胞あたり１９００個の分子の閾値、１個の細胞あたり２０００個の分子の閾値などを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
その結果、いくつかの例において、細胞が上記に列挙された所定の閾値のうちの１つ以上を上回る細胞の表面上に発現するＰＤ−Ｌ１タンパク質分子の細胞あたりの数を含むと識別される場合に、細胞は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現すると検出される。
【００３０】
いくつかの例において、本明細書に記載されるこれらの方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する単一細胞を検出する。いくつかの例において、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する検出された単一細胞の存在は、有意とみなされる。いくつかの例において、本明細書に記載されるこれらの方法は、有意とみなされる検出された細胞についての所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する細胞の閾値（すなわち、有意とみなされる所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する細胞集団について最小サイズ）を含むことができる。状況により、閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する検出された細胞集団のサイズは、変わり、１個の細胞から１００万個の細胞に及ぶことができ、たとえば、１個の細胞、１個以上の細胞、１０個以上の細胞、１００個以上の細胞、１，０００個以上の細胞、１０，０００個以上の細胞、１００，０００個以上の細胞などを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
いくつかの例において、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する、検出された細胞集団のサイズは、相対的な用語で表されることができる。たとえば、この集団のサイズは、試料中のすべての細胞の割合、解析されるすべての細胞の割合、試料内のすべての特定の細胞型の割合、解析されたすべての特定の細胞型の割合などとして表されることができる。いくつかの例において、検出された集団のサイズは、細胞懸濁液試料中の、たとえば、０．１％以上、１％以上、１０％以上などを含むが、これらに限定されない、０．０１％以上の新生細胞を超えることができる。
【００３２】
いくつかの例において、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性を発現するＰＤ−Ｌ１、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性である可能性があるＰＤ−Ｌ１、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と検出されるＰＤ−Ｌ１として、細胞、たとえば、新生細胞などを分類するために、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現すると検出される細胞集団のサイズは、所定の閾値を超えなければならない。上述されるように、検出された集団のサイズについての閾値、たとえば、発現するＰＤ−Ｌ１とみなされる新生物などについての閾値は、複数の要因に基づき変わり、いくつかの例において、１個の細胞であることができる。いくつかの例において、この集団の、検出された集団のサイズについての閾値、たとえば、発現するＰＤ−Ｌ１とみなされる新生物などについての閾値は、たとえば、試料中の０．０１％以上の新生細胞、試料中の０．１％以上の新生細胞、試料中の１％以上の新生細胞、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、２個以上の細胞を含む１個より多い細胞を超えなければならない。
【００３３】
サイトメトリーアッセイ
上記に要約されるように、本開示の方法は、サイトメトリーによってアッセイする標識細胞懸濁液を含む。標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイするさまざまな方法は、たとえば、フローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによってアッセイすること、たとえば、細胞サイトメーターを使用することなどによって、標識細胞懸濁液を細胞サイトメトリーによってアッセイすること、及び同様のことを備えるが、これらに限定されない、本明細書に記載された方法における有用性を見出すことができる。標識細胞懸濁液試料を、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量についてアッセイすることができる。いくつかの事例において、サイトメトリーによってアッセイされる、追加の細胞パラメータは、本開示の新生細胞を検出する際に有用性を見出すこともできる。その結果、さまざまな細胞パラメータを測定するために、標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイするさまざまな方法を用いることができる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞試料をサイトメトリーによってアッセイすることは、フローサイトメトリーを使用して実施されることができる。フローサイトメトリーは、流体培地中の、異なる粒子（たとえば、細胞）型、すなわち、標識（波長、強度）、サイズなどの点で互いに異なる粒子間で識別し、区別するためにマルチパラメータデータを使用する方法論である。試料をフローサイトメトリーによって解析する際に、最初に試料のアリコットをフローサイトメーターの流路中に導入する。この流路中で、試料内の細胞が実質的に１回に１個、１箇所以上の感知領域を通過するときに、そこで各細胞は、別々に、かつ個々に光源（またはいくつかの例において、２箇所以上の別個の光源）へ単波長で曝露され、要望通りに、たとえば、光散乱パラメータなどの細胞パラメータ、及び／またはたとえば、蛍光放射などのマーカーパラメータの測定は、各細胞について別々に記録される。要望通りに、各細胞について記録されたデータをリアルタイムに解析する、または後の解析のために、コンピュータなどのデータストレージ及び解析手段に格納する。
【００３５】
フローサイトメトリーに基づく方法において、懸濁液中で、細胞は、１回に実質的に１個、流路中の１箇所以上の感知領域を通過し、各領域中で、各細胞は、エネルギー源によって照射される。このエネルギー源は、照明器を含むことができ、この照明器は、適切なフィルタを含む、レーザ（たとえば、Ｈｅ／Ｎｅまたはアルゴン）または水銀アークランプまたはＬＥＤによって提供されるような、単波長の光を放射する。たとえば、４８８ｎｍでの光は、単一の感知領域を含むフローサイトメーターに放射の波長として使用されることができる。２つの異なる波長で光を放射するフローサイトメーターについて、放射光の追加の波長を用いることができ、対象となる特異的な波長は、４０５ｎｍ、５３５ｎｍ、５６１ｎｍ、６３５ｎｍ、６４２ｎｍ、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。ポリペプチドへエネルギー源によって結着される標識特異的結着メンバーの励起後に、励起された標識は、蛍光を放射し、各細胞上のポリペプチドの定量レベルは、細胞が１箇所以上の感知領域を通過する場合に、１つ以上の蛍光検出器によって検出されることができる。
【００３６】
フローサイトメトリーにおいて、蛍光マーカーによって標識される細胞から放射される蛍光を検出することに加えて、細胞が感知領域を通過し、エネルギー源によって照射される場合に、検出器、たとえば、光電子増倍管（または「ＰＭＴ」）、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などの集光器をも使用して、各細胞を通過する光（一般的に、前方光散乱と称される）、感知領域を通り細胞の流動方向へ直交方向に反射される光（一般的に、直交または側方光散乱と称される）を記録する。取得される各データタイプ、たとえば、前方光散乱（またはＦＳＣ）、直交光散乱（ＳＳＣ）、及び蛍光放射（ＦＬ１、ＦＬ２など）は、各細胞（または各「事象」）について別々のパラメータを含む。
【００３７】
フローサイトメーターは、１つ以上の電気検出器をさらに含むことができる。ある一定の実施形態において、電気検出器は、粒子／細胞の流路中の開口部を横切って伝播される電場を通過する、粒子または細胞により引き起こされる撹乱を検出するために用いられることができる。電気検出器を含むこれらのようなフローサイトメーターは、細胞を向ける流路または開口部を横切って電場を伝播する、対応する電気エネルギー放射源を含む。いずれかの簡便な電場及び／または適切な検出器（複数可）による場の組み合わせは、この場を通過する粒子（または細胞）の検出及び／または測定のために使用されることができ、この場は、たとえば、直流電場、交流電場、高周波場、及び同様のものなどを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
フローサイトメーターは、コンピュータなどの、データ取得手段、データ解析手段及びデータ記録手段をさらに含み、そこで複数のデータチャネルは、細胞が感知領域を通過する場合に、各細胞について各検出器からのデータを記録する。この解析システムの目的は、各細胞が１セットのデジタル化されたパラメータ値としてそれ自体を提示するために細胞を分類し、計数することであり、また試料についてのデータを全体として蓄積することである。
【００３９】
対象となる特定の細胞分集団は、この集団全体について収集されるデータに基づき「ゲート開閉」によって解析されることができる。適切なゲートを選択するために、たとえば、この機器の配置を調整することなどによって、たとえば、励起パラメータ、収集パラメータ、補償パラメータなどを含む、データをプロットし、適切な分集団分離を取得する。いくつかの例において、この手順は、前方光散乱（ＦＳＣ）対側方（すなわち、直交）光散乱（ＳＳＣ）を二次元ドットプロット上にプロットすることによって行われる。つぎにフローサイトメーターのオペレーターは、所望の細胞分集団（すなわち、ゲート内のこれらの細胞）を選択し、ゲート内にない細胞を除外する。要望される場合に、オペレーターは、コンピュータ画面上のカーソルを使用して所望の分集団周囲に線を描画することによってゲートを選択することができる。つぎに、蛍光などの、これらの細胞についての他のパラメータをプロットすることによって、ゲート内のこれらの細胞のみをさらに解析する。
【００４０】
たとえば、上記に記載されるような、蛍光データを取得することが可能であるいずれかのフローサイトメーターを用いることができる。有用なフローサイトメーターは、たとえば、流動細胞、マイクロ流体チップなどを含む、１回に実質的に１個、細胞が感知領域を流通するさまざまな異なる手段を利用するものを含む。対象となるフローサイトメーターシステムの非限定的な例は、たとえば、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ），Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ），Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ），Ｃｙｔｏｎｏｍｅ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ），Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ），ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ），Ｓｏｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ），Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ），Ｕｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ），Ｃｙｔｅｋ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ），Ｐｒｏｐｅｌ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ），Ｏｒｆｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｋｅｔｃｈｕｍ，ＩＤ），ｈａｎｄｙｅｍ  ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ），Ｓｙｓｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ），Ｐａｒｔｅｃ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．（Ｔｓｕｃｈｉｕｒａ，Ｊａｐａｎ），Ｂａｙ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ），Ｆｕｒｕｋａｗａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ），Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ），Ａｐｏｇｅｅ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ．（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、商業サプライヤーから利用可能なフローサイトメーターシステムである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、細胞サイトメーターを使用して、細胞試料をサイトメトリーによってアッセイすることを実施することができる。本明細書に使用されるように、用語「細胞サイトメーター」（「撮像サイトメーター」または「自動撮像サイトメーター」とも称される）は、自動または半自動細胞撮像装置を一般的に指し、この撮像装置は、撮像容器上に、または撮像容器中に沈殿した細胞を撮像し、試料のすべての、またはほとんどの細胞についてのデータを収集することができる。細胞サイトメトリーにおいて、さまざまな異なる方法に従って、撮像を実施することができる。いくつかの例において、細胞サイトメーターは、撮像容器上に、または撮像容器中に存在する細胞の広視野画像を低い拡大倍率（たとえば、５×、１０×など）で収集し、特定のパラメータ（たとえば、サイズ、形状、色、蛍光など）について細胞の位置を識別する、及び／または細胞をスクリーニングすることができる。細胞の位置を識別した後に、細胞サイトメーターは、より高い拡大倍率（たとえば、２０×、４０×、６０×、１００×など）で、たとえば、標的方式などで、識別された細胞のすべて、または一部の画像を収集することをし始めることができる。
【００４２】
他の例において、細胞サイトメーターは、撮像容器を走査することによって、撮像容器上に、または撮像容器中に存在する細胞を撮像することができる。走査を低いまたは高い拡大倍率で実施することができる。いくつかの例において、高い拡大倍率で走査を実施し、すべての、またはほとんどの細胞の画像を捕捉する。いくつかの例において、低い拡大倍率で走査を実施し、撮像容器上で、または撮像容器中で細胞の位置を識別する。細胞の位置を識別した後に、細胞サイトメーターは、たとえば、標的方式などで、識別された細胞のすべての、若しくは一部のより高い拡大倍率画像を収集し始めることができる、または高い拡大倍率で配置された細胞を再走査することができる。
【００４３】
細胞サイトメーターシステムに使用される撮像容器を変える。いくつかの例において、たとえば、スライドグラスなどの、一般的に使用される検査用撮像装置は、細胞サイトメーターシステムにおける撮像容器として機能することができる。いくつかの例において、細胞サイトメーターの撮像容器を特定の細胞サイトメーターに関する使用のために特異的に設計することができる。有用な撮像容器は、たとえば、スライド（たとえば、スライドグラス）、シャーレ（たとえば、グラスボトム撮像ディッシュ）、プレート（たとえば、マルチウェル撮像プレート）などを含むが、これらに限定されない。撮像容器は、この容器の少なくとも一部中に、たとえば、光学的明瞭度などの顕微鏡に修正可能な光学特性を一般的に有する。撮像容器は、個々の区画を含んでも良いし、含まなくても良い。たとえば、撮像容器として利用されるスライドグラスは、個々の区画を一般的に含まず、スライド上に沈殿する細胞は、スライド表面の周囲に広がることができる。代替に、撮像容器として利用されるマルチウェル撮像プレートは、個々の区画（すなわち、ウェル）を有し、これらの区画中に１個以上の細胞は、沈殿することができる。
【００４４】
細胞サイトメーターは、撮像コンポーネント、たとえば、自動顕微鏡などを含む。細胞サイトメーターの撮像コンポーネントは、撮像される対象物（たとえば、細胞）からの透過光、反射光、または放射光を収集するために、さまざまな拡大倍率（たとえば、５×、１０×、２０×、４０×、６０×、１００×など）の１つ以上の目標を有することができる。目標によって収集される光は、画像キャプチャ装置に向けられる前に、１つ以上のダイクロイックミラー、フィルタまたはレンズを通して一般的に処理される。
【００４５】
適切な画像キャプチャ装置は、デジタル画像を捕捉することができる１台以上のデジタルカメラ（カラーカメラ及びモノクロカメラを含む）と、取り付けられた画像処理回路へ、または画像処理回路へ後の転送のために取り付けられたストレージデバイスへ、デジタル画像を格納する、及び／または画像を転送する手段とを含むことができる。適切なデジタルカラーカメラは、変更され、いずれかのデジタルカメラ（たとえば、１つ以上のＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサを備える）を一般的に含む。適切なデジタルカメラは、たとえば、特注デジタルカメラ、民生用デジタルカラーカメラ（たとえば、顕微鏡用途に変えられた民生用デジタルカラーカメラ）及びこれらのデジタル顕微鏡カラーカメラを含むが、これらに限定されず、これらのカメラは、たとえば、Ｄｉｎｏ−Ｅｙｅ、Ｄｉｎｏ−Ｌｉｔｅ、Ｊｅｎｏｐｔｉｋ  ＰｒｏｇＲｅｓ、ＫｏＰａ、Ｌｅｉｃａ、Ｍｏｔｉｃ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｏｍａｎｏ、ＯｐｔｉｘＣａｍ、ＰｉｘｅｌＬＩＮＫ，Ｚｅｉｓｓなどを含むが、これらに限定されず、さまざまな製造業者から市販されている。
【００４６】
細胞サイトメーターは、コンピュータのような、データ取得手段、データ解析手段及びデータ記録手段をさらに含み、そこで１つ以上のデータチャネルは、撮像容器の各細胞またはほとんどの細胞について１つ以上の画像キャプチャ装置からのデータを記録する。解析システムの目的は、細胞を分類し、計数して、各細胞が１セットのデジタル化されたパラメータ値としてそれ自体を提示すること、全体として試料についてのデータを蓄積することである。いくつかの事例において、細胞サイトメーターは、各細胞の画像を記録し、ユーザインタフェースへ接続されることができ、そこでこれらのような画像は、デバイスのユーザによって見直されることができる。
【００４７】
特定のポリペプチドを発現する細胞を検出する方法に基づく細胞サイトメーターは、蛍光標識された特異的結着メンバーを含む試料の細胞を接触させること、及び細胞サイトメーターを使用して撮像することによって蛍光標識された細胞を検出することを備えることができる。さらに詳細に本明細書の他の箇所に記載されるように、各標識細胞の蛍光は、サイトメトリーによって定量化され、特定のポリペプチドの細胞あたりの発現量を識別すること、たとえば、細胞が所定の閾値を上回るポリペプチドを発現するか否かを検出することができる。
【００４８】
たとえば、上述されるような、蛍光データを取得することができるいずれかの細胞サイトメーターを用いることができる。有用な細胞サイトメーターは、自動化された細胞サイトメトリー撮像のさまざまな異なる手段を利用して、試料のすべての、またはほとんどの細胞を解析するサイトメーターを含む。対象となる細胞サイトメーターシステムの非限定的な例は、商業サプライヤーから利用可能である細胞サイトメーターシステムであり、これらの商業サプライヤーは、たとえば、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｔｈｏｒｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本開示の方法は、特定のポリペプチドの細胞あたりの発現レベルをサイトメトリーによって定量化し、所定の閾値を上回るポリペプチドを発現する細胞を識別することを備える。本開示の方法は、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量をサイトメトリーによって定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する１個以上の細胞を識別することを備えることができる。しかしながら、またＰＤ−Ｌ１に加えて他のマーカーのレベルは、たとえば、細胞周期関連の発現生成物（たとえば、細胞周期関連ＲＮＡ、細胞周期関連ポリペプチドなど）、免疫関連の発現生成物（たとえば、免疫関連ＲＮＡ、免疫関連ポリペプチドなど）、ＤＮＡ量などを含む、本明細書に記載された方法において評価されることができる。たとえば、所定の閾値を上回る、若しくは下回るバイオマーカーのレベルを有する、またはこれらのような他のマーカーを含まない、細胞の検出は、本明細書に記載された方法に有用な、さらなる細胞パラメータを識別するように機能することができる。
【００５０】
所定の閾値は、上述されるような、特定のポリペプチドのそれらの発現に基づき細胞を識別する際に、またはたとえば、細胞周期マーカー、異数性マーカー、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、他の細胞パラメータに、有用性を見出すことができる。
【００５１】
本開示に有用なポリペプチド発現について所定の閾値は、検出されるポリペプチド、及び特定の状況により変わる。いくつかの例において、細胞あたりのポリペプチド発現量についての所定の閾値は、細胞あたりのポリペプチドの分子数として表されることができ、たとえば、１個の細胞あたり１０分子の閾値、１個の細胞あたり２０分子の閾値、１個の細胞あたり３０分子の閾値、１個の細胞あたり４０分子の閾値、１個の細胞あたり５０分子の閾値、１個の細胞あたり６０分子の閾値、１個の細胞あたり７０分子の閾値、１個の細胞あたり８０分子の閾値、１個の細胞あたり９０分子の閾値、１個の細胞あたり１００分子の閾値、１個の細胞あたり２００分子の閾値、１個の細胞あたり３００分子の閾値、１個の細胞あたり４００分子の閾値、１個の細胞あたり５００分子の閾値、１個の細胞あたり６００分子の閾値、１個の細胞あたり７００分子の閾値、１個の細胞あたり８００分子の閾値、１個の細胞あたり９００分子の閾値、１個の細胞あたり１０００分子の閾値、１個の細胞あたり１１００分子の閾値、１個の細胞あたり１２００分子の閾値、１個の細胞あたり１３００分子の閾値、１個の細胞あたり１４００分子の閾値、１個の細胞あたり１５００分子の閾値、１個の細胞あたり１６００分子の閾値、１個の細胞あたり１７００分子の閾値、１個の細胞あたり１８００分子の閾値、１個の細胞あたり１９００分子の閾値、１個の細胞あたり２０００分子の閾値などを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
他の例において、所定の閾値は、マーカーの相対レベルであることができる。マーカーの相対レベルは、たとえば、本発明のマーカーのそれらのレベル中で異なることが知られている２つの別々の細胞集団中でマーカーの発現レベルの比較を行うことによって決定されることなどを備える、さまざまな手段によって決定されることができる。たとえば、高レベルのマーカーＸを含むことが知られている第一細胞集団を、たとえば、サイトメーター上などで、測定し、低レベルのマーカーＸを含むことが知られている第二細胞集団と比較し、この比較を使用して閾値レベルを決定し、この閾値レベルを使用して、低レベルまたは高レベルのいずれか一方のマーカーＸを有するような細胞をカテゴリー化することができる。
【００５３】
マーカーの相対レベルは、細胞集団、たとえば、未知のレベルのマーカーＸの細胞集団、または異なるレベルのマーカーＸを有する細胞分集団を含むのではないかと疑われる細胞集団などの内のマーカーレベルの比較を行うことによって決定されることができる。たとえば、マーカーＸのレベルは、たとえば、ヒストグラムなどの上に測定をプロットすることができるように、少なくとも十分な数の細胞のサイトメーター上で測定され、２つ以上の細胞分集団間の分離は、マーカーＸの個々の細胞レベルに基づき明らかにされる。その結果、つぎにサイトメーターのオペレーターは、分集団間の閾値レベルを決定することができ、この閾値レベルを使用して、特定の分集団、たとえば、低レベルのマーカーＸを有する分集団、または高レベルのマーカーＸを有する分集団などに属するような細胞をカテゴリー化することができる。
【００５４】
いくつかの例において、閾値は、サイトメーターの検出の限界値に基づくことができる。たとえば、細胞集団の細胞は、これらの細胞が特定のマーカーのいずれかの検出可能なレベルを有する場合に、特定のマーカーを有する（すなわち、特定のマーカーについて陽性である）と識別されることができる。同様に、細胞集団の細胞は、これらの細胞が特定のマーカーの検出可能なレベルを有さない場合に、特定のマーカーを有さない（すなわち、特定のマーカーについて陰性である）と識別されることができる。その結果、サイトメーターの検出レベルを使用して、要望通り、マーカーの閾値を決定することができる。
【００５５】
いくつかの例において、閾値は、たとえば、以前に実施された対照実験、または以前に取得された参照発現レベルなどから、以前に決定されたマーカーレベルに基づくことができる。たとえば、以前に解析された試料において決定されたマーカーレベルを使用して、マーカー閾値レベルを決定することができる。いくつかの例において、正常なマーカー範囲を表すマーカーの閾値を決定することができるように、健常な被検体から得られた細胞の期待されるマーカーレベルを使用して、正常なマーカーレベルを決定することができる。これらのような例において、正常なマーカー範囲外、すなわち、正常なマーカー範囲を上回る、または下回るマーカー発現は、特定のマーカーの閾値を上回るか、下回るかのいずれか一方であるとみなされる。いくつかの例において、これらのような以前に決定されたマーカーレベル、または以前に決定された閾値レベルの使用により、対照または参照細胞試料が存在しない、細胞の解析、及び細胞分集団の識別が可能になる。
【００５６】
上述されるように、本開示の方法は、細胞周期パラメータをアッセイすることを備えることができる。有用な細胞周期パラメータは、たとえば、増殖、細胞周期の期（Ｇ1 、Ｇ2 、Ｍ、Ｇ2 −Ｍ、Ｓ、Ｇ0 、Ｇ1 後、及び同様のもの）などを含むが、これらに限定されない。細胞周期パラメータは、たとえば、細胞が増殖性であるか否かを識別すること、細胞の細胞周期の期を識別することなどを備える、細胞あたりの基準にアッセイされることができる。細胞の細胞周期パラメータを決定するいずれかの簡便な手段を本発明の方法に用いることができる。いくつかの例において、方法は、特定の細胞型を定量化することができるだけではなく、定量化された細胞型がたとえば、定量化された細胞型内の増殖性細胞の数または割合などを有する、増殖性であるか否かを判定することもできる。いくつかの例において、方法は、免疫細胞型を定量化することができるだけではなく、定量化された免疫細胞型がたとえば、定量化された免疫細胞型内の増殖性免疫細胞の数または割合などを有する、増殖性であるか否かを判定することもできる。いくつかの例において、方法は、増殖性腫瘍浸潤性リンパ球が存在するか否かを判定すること、及び／またはそれらの量を決定することができる。いくつかの例において、方法は、増殖性ＣＤ４＋細胞が存在するか否かを判定すること、及び／またはそれらの量を決定することができる。いくつかの例において、方法は、増殖性ＣＤ８＋細胞が存在するか否かを判定すること、及び／またはそれらの量を決定することができる。いくつかの例において、方法は、ＣＤ４／ＣＤ８細胞の割合を決定すること、増殖性ＣＤ４及び／またはＣＤ８細胞が増殖性であるか否かを判定すること、及び／またはそれらの量を決定することができる。
【００５７】
いくつかの例において、細胞の細胞周期をアッセイすることは、細胞のＤＮＡ量（すなわち、細胞あたりのＤＮＡ量）を決定することを備えることができる。さまざまな方法は、細胞あたりのＤＮＡ量を決定することによって細胞の細胞周期をアッセイするために用いられることができる。いくつかの例において、ＤＮＡ標識試薬（たとえば、自家蛍光を有する核酸色素または染料）を用いて、細胞のＤＮＡを標識することができ、この標識の強度を測定することに基づきＤＮＡ量を定量化することができる。方法に用いられるサイトメトリー方法により、ＤＮＡ量を使用して、さまざまな方式において細胞周期を評価することができる。１つの実施形態において、たとえば、用いられるサイトメトリーの種類（たとえば、フローサイトメトリー、細胞サイトメトリーなど）にかかわらず、ＤＮＡ標識試薬によって標識される細胞の蛍光強度をサイトメーター上で解析し、ヒストグラム上にプロットすることができる。各細胞の細胞周期の期の識別を可能にする、ヒストグラムからのＤＮＡ量の相対量を各細胞について決定することができる。いくつかの例において、このようなヒストグラムは、サイトメトリーＤＮＡプロファイルとも称される、サイトメトリー細胞周期プロファイルを表すことができる。
【００５８】
いくつかの例において、細胞の細胞周期をアッセイすることは、発現した細胞周期マーカー（細胞周期バイオマーカーとも称される）をアッセイすることを備えることができる。本明細書に使用されるような、発現した細胞周期マーカーは、細胞周期の１つ以上の特定の期中に、特異的に発現する、または存在しない、これらの細胞マーカー（たとえば、細胞表面マーカー及び細胞内マーカー）を指す。その結果、発現した細胞周期マーカーに特異的な標識結着メンバーは、細胞の細胞周期機構の構成要素を結着する、これらの特異的な結着メンバーへ含まれる。細胞周期バイオマーカーは、いくつかの例において、細胞の細胞周期の期を決定する際に、または細胞が増殖性であるか否かを判定する際に、有用であることができる。本明細書に記載される方法に有用な細胞周期バイオマーカーは、検出される、特定のアッセイ及び／または特定の細胞型及び／または細胞集団により変わる。いくつかの例において、本明細書に記載される方法に有用性を見出すことができる細胞周期バイオマーカーは、たとえば、Ｋｉ６７、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、リン酸化ヒストンＨ３、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
発現した細胞周期マーカーをさまざまな方式で検出することができる。たとえば、発現した細胞周期バイオマーカーをタンパク質レベルで、たとえば、細胞周期バイオマーカータンパク質に特異的な標識特異的結着メンバーの使用などを通じて、検出することができる。いくつかの例において、発現した細胞周期バイオマーカーをＲＮＡレベルで、たとえば、細胞周期バイオマーカーＲＮＡに特異的な標識特異的結着メンバーの使用などを通じて、検出することができる。
【００６０】
上述されるように、本開示の方法は、異数性をアッセイすることを備えることができる。異数性サイトメトリーによって測定するいずれかの簡便な方法を本発明の方法に用いることができる。いくつかの例において、細胞の測定されたＤＮＡ量に基づき、異数体として細胞を識別することができ、異数体細胞は、細胞のゲノムのすべての、または一部の重複を表す、異常に高レベルのＤＮＡ量を一般的に有する。異数性を検出するために、細胞周期評価に関してＤＮＡ量を評価する上述される方法に類似した方法を用いることができる。いくつかの例において、正常な細胞についての閾値のＤＮＡ量の値以上の相対ＤＮＡ量は、細胞が異数体であることを示すことができ、この閾値は、正常な細胞のＤＮＡ量の（≧）１．０５倍以上であることができ、たとえば、正常な細胞のＤＮＡ量の、≧１．０６倍、≧１．０７倍、≧１．０８倍、≧１．０９倍、≧１．１０倍、≧１．１１倍、≧１．１２倍、及び≧１．１３倍を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
いくつかの例において、染色体特異的プローブまたは遺伝子特異的プローブを用いて、異数性を評価することができる。たとえば、遺伝子特異的プローブまたは染色体特異的プローブを使用する蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、細胞の全体的な倍数性を決定することができる、または特定の遺伝子若しくは染色体の重複を検出することができる。たとえば、二倍体生物中で、特異的な遺伝子、または特異的な染色体についての２本より多いプローブの存在は、対象細胞が異数体であることを示すことができる。
【００６２】
倍数性評価（たとえば、細胞が異数体、二倍体などであるか否かを含む、細胞倍数性を評価すること）は、本発明の方法において、さまざまな目的のために用いられることができる。たとえば、いくつかの例において、倍数性評価を用いて、集団のうちの細胞が異数体または二倍体であるか否かを判定すること、たとえば、新生細胞が異数体または倍数体であるか否か、免疫細胞が異数体または二倍体であるか否か、または同様のものであるか否かを判定することなどができる。いくつかの例において、倍数性評価は、たとえば、検出された細胞の倍数性状態と被検体中に存在することができる他の細胞型との間の関係などによって、試料及び／または被検体の他の特性を通知することができる。たとえば、いくつかの例において、ある一定の異数体細胞の識別は、検出された異数体細胞型以外の被検体中の新生細胞型の存在を示す、及び／または予測することができ、たとえば、被検体の腫瘍組織中の異数体免疫細胞の存在は、被検体中の循環腫瘍細胞の存在を示すことができる。いくつかの例において、肺腫瘍組織中の異数体免疫細胞の存在は、被検体中の循環腫瘍細胞の存在を示すことができる。
【００６３】
細胞パラメータの評価を本発明の方法に使用し、記述されたパラメータを測定することによって検出される１つ以上の特性を有する細胞を検出することができる。たとえば、いくつかの例において、検出された細胞は、たとえば、細胞の１つ以上の評価された異数性パラメータなどに基づき、異数体細胞であると判定されることができる。いくつかの例において、検出された細胞は、たとえば、細胞の１つ以上の評価された細胞周期パラメータなどに基づき、増殖性細胞であると判定されることができる。細胞は、記述されたパラメータを測定することによって検出される特性の組み合わせを有すると検出されることができる。たとえば、細胞は、増殖性及び異数体の両方であると判定されることができる。加えて、特定の細胞を検出する際に特性が存在しないことをも使用し、この特定の細胞は、たとえば、この細胞が増殖性ではないこと、この細胞が異数体ではないことなどを検出することができる。いくつかの例において、検出された細胞は、一方の特性を有するが他方の特性を欠くこと、たとえば、この細胞は、増殖性であるが異数体ではないこと、細胞は、異数体であるが増殖性ではないことなどがあり得る。本明細書に記載されたパラメータのいずれかの組み合わせは、本開示の方法に有用性を見出すことができる。
【００６４】
いくつかの例において、本開示の方法は、対象細胞が免疫細胞であるか否かを判定することをさらに備えることができる。たとえば、１個以上の免疫細胞マーカーの有無を検出することを通して、たとえば、免疫細胞マーカーに特異的な標識特異的結着メンバーと細胞を接触させることを通して、対象細胞が免疫細胞であるか否かを判定するさまざまな方法を用いることができる。
【００６５】
たとえば、いくつかの例において、非免疫新生細胞は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現すること、また細胞懸濁液に加えられる免疫細胞特異的結着メンバーによって標識しないことに基づき検出されることができる。その結果、いくつかの例において、方法は、たとえば、細胞懸濁液を免疫細胞についての１個以上の標識特異的結着メンバーと接触させることなどによって、識別された細胞が免疫細胞ではないと判定することをさらに備えることができる。
【００６６】
その結果、いくつかの例において、細胞及び／または細胞集団は、特定の免疫細胞マーカーについて陰性であると、または細胞が実際には、免疫細胞、若しくは特定の免疫細胞型ではないことを示す所定の閾値を下回る免疫細胞マーカーの発現レベルを有すると識別されることができる。たとえば、ＰＤ−Ｌ１発現細胞を免疫細胞ではないと識別するなどのために、有用な免疫細胞マーカーは、たとえば、ＣＤ１１４、ＣＤ１１７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ８、ＣＤ９１、Ｆｏｘｐ３、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。その結果、いくつかの例において、検出された新生細胞のさらなる特徴は、１個以上の免疫細胞マーカーの所定の閾値を下回る発現を欠くこと、またはこれを下回る発現を有すること、たとえば、上記に列挙されたこれらなどを含む、免疫細胞マーカーへ抗体を使用して検出されることであることができる。
【００６７】
いくつかの例において、細胞は、たとえば、本明細書に記載されたマーカーのいずれかの組み合わせを含むが、これに限定されない、免疫細胞マーカーの組み合わせの発現について本明細書に記載された方法でアッセイされることができる。たとえば、いくつかの例において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、ＣＤ８及びＣＤ４５の発現についてアッセイされることができ、検出された細胞がＣＤ８及びＣＤ４５について陰性であるときに、または免疫細胞ではない細胞を示す所定の閾値を下回るＣＤ８及びＣＤ４５を発現するときに、免疫細胞ではないと識別されることができる。
【００６８】
いくつかの例において、細胞は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現すること、及び細胞懸濁液に加えられる免疫細胞特異的結着メンバーによって標識することに基づき検出されることができる。その結果、いくつかの例において、方法は、たとえば、細胞懸濁液を免疫細胞についての１個以上の標識特異的結着メンバーと接触させることなどによって、識別された細胞が免疫細胞であると判定することをさらに備えることができる。
【００６９】
その結果、いくつかの例において、細胞及び／または細胞集団は、特定の免疫細胞マーカーについて陽性であると、または細胞が実際には、免疫細胞若しくは特定の免疫細胞型であることを示す所定の閾値を上回る免疫細胞マーカーの発現レベルを有すると識別されることができる。たとえば、ＰＤ−Ｌ１発現細胞を免疫細胞と識別するなどのために、有用な免疫細胞マーカーは、たとえば、ＣＤ１１４、ＣＤ１１７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ８、ＣＤ９１、Ｆｏｘｐ３、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。その結果、いくつかの例において、検出された細胞のさらなる特徴は、１個以上の免疫細胞マーカーの発現を有すること、または１個以上の免疫細胞マーカーの所定の閾値を上回る発現を有すること、たとえば、上記に列挙されるこれらなどを含む、たとえば、免疫細胞マーカーへ抗体を使用して検出されることなどであることができる。
【００７０】
いくつかの例において、細胞は、たとえば、本明細書に記載されたマーカーのいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されない、免疫細胞マーカーの組み合わせの発現について本明細書に記載された方法にアッセイされることができる。たとえば、いくつかの例において、ＰＤ−Ｌ１発現細胞は、ＣＤ８及びＣＤ４５の発現についてアッセイされることができ、検出された細胞がＣＤ８及びＣＤ４５に陽性であるときに、または免疫細胞である細胞を示す１つ以上の所定の閾値を上回るＣＤ８及びＣＤ４５を発現するときに、免疫細胞であると識別されることができる。
【００７１】
いくつかの例において、本明細書に記載された方法は、たとえば、検出されたＰＤ−Ｌ１発現細胞が循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）であるか否かを判定するなどのために、ＣＴＣについて１個以上のマーカーをアッセイすることをさらに備えることができる。本明細書に使用されるように、用語「ＣＴＣ」は、これらの新生細胞を一般的に指し、これらの新生細胞は、腫瘍（たとえば、腫瘍の縁部）から脱落し、血流またはリンパ系によって一掃されるため、ＣＴＣを体の中で循環させる。ＣＴＣマーカーは、たとえば、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、サイトケラチン８、サイトケラチン１８及びサイトケラチン１９を含むが、これらに限定されない、血流中のＣＴＣを識別する際に使用される、これらのマーカーなどを含む。いくつかの例において、ＣＴＣの特徴は、たとえば、本明細書に記載されるこれらの免疫細胞マーカーのうちの１個以上などを含むが、これらに限定されない、１個以上の免疫細胞マーカーについて陰性であることであることができる。たとえば、いくつかの例において、検出されたＣＴＣは、ＣＤ４５について陰性である。
【００７２】
いくつかの例において、ＣＴＣは、１個以上のがん抗原、及び／または１個以上のがん関連抗原の発現に基づきさらに識別される、及び／または特徴づけられることができる。がん抗原の非限定的な例は、たとえば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量−メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＧＤ２、及び同様のものなどを含むが、これらに限定されない。またがん関連抗原は、たとえば、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、αフェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲＳ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメインＢ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒ  α、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、及びビメンチンを含むが、これらに限定されない。
【００７３】
いくつかの例において、本開示の方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を検出し、たとえば、上述されるＣＴＣマーカーのうちの１個以上の検出などに基づき、細胞をさらに分析し、細胞がＣＴＣであるか否かを判定することを備える。いくつかの例において、本明細書に記載される方法に従って、ＣＴＣまたはＣＴＣ集団を試料（たとえば、被検体の血液試料）から収集し、ＣＴＣまたはＣＴＣ集団をアッセイし、ＣＴＣまたはＣＴＣ集団が所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現するか否かを判定する。
【００７４】
本開示の方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の検出を含む。いくつかの例において、本発明の方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する複数の細胞の検出を含むことができる。たとえば、いくつかの例において、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞集団のサイズを決定することができる。所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞集団のサイズの定量化をサイトメトリーによって測定することができる。たとえば、いくつかの例において、フローサイトメーターを使用して、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞数を計数することができる。いくつかの例において、細胞サイトメーターを使用して、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞数を計数することができる。細胞数を計数することによって、ＰＤ−Ｌ１発現集団のサイズを決定することができる。
【００７５】
試料
上記に要約されるように、本開示の方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が新生物試料中に存在するか否かを検出することを備える。本明細書に記載された方法は、さまざまな新生物試料に適用可能であり、そこで新生物試料は、いずれかの新生物（すなわち、異常に増殖する）組織または細胞集団または細胞の試料を含むことができる。異常な組織増殖は、たとえば、対象組織の増殖を適切で正常な、または健常な組織の増殖と比較することなどによるまざまな手段によって、決定されることができる。新生物は、良性新生物、原位置新生物、悪性新生物、及び不確定または未知の挙動の新生物を含む。悪性新生物は、がんを含み、その結果、本発明の方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現するがん細胞ががん試料中に存在するか否かを検出することを備えることができる。
【００７６】
本明細書に記載されるこれらの方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞がさまざまな異なる新生物試料中に存在するか否かを検出する際に有用性を見出し、これらの異なる新生物試料は、たとえば、さまざまながんから得られる試料などを含み、これらのさまざまながんは、たとえば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌（たとえば、カポジ肉腫、リンパ腫など）、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌（肝外の）、膀胱癌、骨癌（たとえば、ユーイング肉腫、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫など）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（たとえば、星細胞腫、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫など）、乳癌（たとえば、女性乳癌、男性乳癌、小児期乳癌など）、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（たとえば、小児期、胃腸など）、原発不明癌、心臓（ｃａｒｄｉａｃ）（心臓（ｈｅａｒｔ））腫瘍、中枢神経系（たとえば、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、リンパ腫など）、子宮頚癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、管（たとえば、胆管、肝外など）、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（たとえば、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫など）、骨の線維性組織球腫（たとえば、悪性、骨肉腫など）、胆のう癌、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞性腫瘍（たとえば、頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣など）、妊娠性絨毛性疾患、グリオーマ、ヘアリー細胞白血病、頭頚部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球症（たとえば、ランゲルハンス細胞など）、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島腫瘍（たとえば、膵神経内分泌腫瘍など）、カポジ肉腫、腎癌（たとえば、腎細胞、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍など）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病（たとえば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病など）、口唇及び口腔癌、肝癌（原発性）、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌（たとえば、非小細胞、小細胞など）、リンパ腫（たとえば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）など）、マクログロブリン血症（たとえば、ワルデンストレームなど）、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、メラノーマ、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在性原発を含む転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子を含む正中線管癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病（たとえば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）など）、骨髄性白血病（たとえば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）など）、骨髄増殖性疾患（たとえば、慢性など）、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔（Ｏｒａｌ）癌、口腔（Ｏｒａｌ  Ｃａｖｉｔｙ）癌（たとえば、口唇など）、中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌（たとえば、上皮、胚細胞腫瘍、低悪性度腫瘍など）、膵癌、膵神経内分泌腫瘍（膵島腫瘍）、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎）癌、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（たとえば、ユーイング、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織、子宮など）、セザリー症候群、皮膚癌（たとえば、小児期、メラノーマ、メルケル細胞癌、非メラノーマ性など）、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、有棘細胞癌、扁平上皮頸部癌（たとえば、原発不明、転移性などを含む）、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、尿管及び腎盂腎癌、尿道癌、子宮癌（たとえば、子宮内膜など）、子宮肉腫、腟癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに同様のものを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書に記載される方法に有用な試料は、原発性腫瘍から、たとえば、生検または外科的切除などから、得られる試料、または非腫瘍組織から得られる試料であることができる。非腫瘍組織は、がん調査を含むが、これに限定されない、さまざまな理由について評価されることができる。たとえば、いくつかの例において、非腫瘍組織をアッセイし、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生物の細胞を検出することにより、新生物の存在を識別することができる。固体及び流体の両方の非腫瘍試料を評価することができる。評価されることができる有用な固形組織は、たとえば、既存のがんに隣接する組織（たとえば、皮膚組織、肺組織、乳房組織など）、リンパ節組織などを含むが、これらに限定されない。評価されることができる有用な流体試料は、血液試料、リンパ液試料などを含むが、これらに限定されない、本質的にいずれかの体液試料を含む。
【００７８】
同様に評価されることができるがん及び腫瘍組織は、固体試料及び液体試料を含む。たとえば、造血器癌の事例において、血液試料または骨髄試料を評価することができる。いくつかの例において、本明細書に記載された方法に従って評価される試料は、固形腫瘍試料である。たとえば、上記に列挙されたこれらのがんのいずれかを含む、さまざまな異なるがんから固形腫瘍試料を取得することができる。いくつかの例において、固形腫瘍試料は、上皮組織の癌、または上皮癌であることができる。
【００７９】
上皮癌は、細胞腫を含む。細胞腫の非限定的な例は、腺房細胞癌（ａｃｉｎａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺房細胞癌（ａｃｉｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺房細胞癌（ａｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄ  ｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺扁平上皮癌、付属器癌、副腎皮質癌、肺胞癌、エナメル上皮癌、アポクリン癌、基底細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、気管支原性肺癌、胆管細胞癌、絨毛癌、明細胞癌、膠様癌、篩状癌、非浸潤性乳管癌、胎児性癌、鎧状癌、類内膜癌、類表皮癌、混合腫瘍由来癌、多形性腺腫由来癌、甲状腺濾胞癌、肝細胞癌、上皮内癌、乳管癌、ハースル細胞癌、炎症性乳癌、大細胞癌、浸潤性小葉癌、小葉癌、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、髄様癌、髄膜癌腫症、メルケル細胞癌、粘液性癌、粘表皮癌、上咽頭癌、非小細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、燕麦細胞癌、乳頭癌、腎細胞癌、スキルス癌、脂腺癌、単純癌、印環細胞癌、小細胞癌、小細胞肺癌、紡錘細胞癌、有棘細胞癌、終末乳管癌、移行上皮癌、管状癌、疣状癌、及び同様のものを含む。
【００８０】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞がたとえば、上皮肺癌腫瘍、上皮乳癌腫瘍などを含む、上皮性腫瘍試料中に存在するか否かを検出する際に有用性を見出す。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が非細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍中に存在するか否かを検出する際に有用性を見出す。いくつかの例において、上皮性腫瘍は、有棘細胞癌、腺癌または腺扁平上皮癌であり、検出された細胞（複数可）は、有棘細胞癌の細胞、腺癌の細胞、または腺扁平上皮癌の細胞を含む。
【００８１】
いくつかの例において、本明細書に記載された方法は、ＰＤ−Ｌ１陽性と以前に識別されている新生物試料上で実施されることができる。いくつかの例において、本明細書に記載された方法は、ＰＤ−Ｌ１を発現すると一般的にみなされる、または期待される新生物試料上で実施されることができる。ＰＤ−Ｌ１を発現するということが以前に示されている腫瘍は、たとえば、腎細胞癌（ＲＣＣ）、メラノーマ、卵巣癌、ＮＳＣＬＣなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、新生物試料は、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によってＰＤ−Ｌ１陽性と以前に識別されている可能性がある。治療へのコンパニオン診断としてＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣは、患者が治療に応答性であるかを決定する際に問題になっている。ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣに関する問題は、再評価者の主観、プロセッシングのばらつき、半定量的カットオフにおける差、腫瘍細胞の染色におけるばらつき、免疫細胞の染色、間質細胞の染色などを有する。いくつかの例において、本明細書に記載される方法を利用して、以前のＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣアッセイの結果を妥当性確認することができる。いくつかの例において、本開示の方法がＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣと関連する問題を被らない場合に、本明細書に記載される方法をＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣアッセイの代替に使用することができる。
【００８２】
固形組織診及び生検吸引液を得るためのこれらの生検方法を含むが、これらに限定されない、いずれかの簡便な試料採取方法を使用して、新生細胞を含む新生物試料を取得することができる。いくつかの例において、外科手技を含むがこれに限定されない、試料を取得すること以外の目的のために実施される、別々の医療手技の部分として取得されることができる新生細胞を含む試料を得ることができる。他の例において、たとえば、別々の医療手技の部分としてではなく、新生細胞を含む試料を独立して取得することができる。試料採取方法は、変わり、たとえば、採取を追加の医療手技の部分として実施するか否か、得られる試料の特定のタイプ、試料を得るための主な目的、及び／または試料を処理する及び／または解析する方法に依存する。
【００８３】
本開示の方法に使用される試料は、いずれかの簡便な手段によって採取されることができる。いくつかの例において、新生物試料を生検から調製する。がんの種類、及び／または実施される生検の種類により、試料を固形組織診または液体細胞診から調製することができる。
【００８４】
いくつかの例において、外科生検からの試料を調製することができる。外科生検用のいずれかの簡便で適切な技術を試料採取のために利用して、たとえば、切除生検、切開生検、ワイヤローカリゼーション生検、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載される方法に従って試料を評価することができる。いくつかの例において、たとえば、腫瘍切除、乳房切除、リンパ節手術、腋窩リンパ節切開、センチネルリンパ節手術、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、試料を取得すること以外の主な目的を有する外科手技の一部として、外科生検を得ることができる。
【００８５】
いくつかの例において、試料を針生検によって得ることができる。針生検用のいずれかの簡便で適切な技術を試料採取のために利用し、たとえば、穿刺吸引（ＦＮＡ）、コアニードル生検、定位コア生検、吸引式生検、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載される方法に従って、試料を解析することができる。
【００８６】
ＦＮＡ生検は、触診可能な病変、及び触診不可能な病変の両方に実施されることができ、１８から２５ゲージなどに及ぶ、小ゲージニードルの導入を腫瘤または疑われる領域中に、また細胞材料の抽出に伴う。ＦＮＡがコイメージングを用いて実施される、またはこれを用いずに実施されるか否かは、変更することができ、この病変が触診可能であるか否かを含むさまざまな要因に依存する。ＦＮＡがコイメージングを用いて実施される例において、この技術は、画像誘導ＦＮＡと称されることができ、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、蛍光透視法、マンモグラフィ、ＭＲＩ及び同様のものなどの放射線撮像技術を含み得るが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように試料を採取する際に有用な、ＦＮＡ技術、及びその変形形態は、変わり、特定の技術の選択は、たとえば、被検体の特性、特定の検出された病変の特性、解析手順などを有するが、これらに限定されない、さまざまな要因に依存する。これらのようなＦＮＡ技術の変形形態は、たとえば、オープンエンドニードル（すなわち、「フレンチ技術」）、陰圧技術、撮像誘導ＦＮＡ、及び同様のものなどを含むが、これらに限定されない。このようなものとして、特定のＦＮＡ技術は、陰圧吸引を含んでも良いし、含まなくても良い。たとえば、フレンチ技術において、病変内のＦＮＡの短い、急速なストロークは、細胞の移動を引き起こし、陰圧吸引を必要とせずに毛管作用を介してニードル内への効果的な採取を可能にする。いくつかの例において、たとえば、過剰な流体の（たとえば、嚢胞性病変の）ときに、プランジャーを取り外したシリンジを、ＦＮＡによって試料を採取する際に用いることができる。いくつかの例において、陰圧を利用して、試料をシリンジ中へ引き込むことができる。いくつかの例において、シリンジホルダーまたは吸引ガンまたは吸引ハンドルを使用することができる。
【００８７】
コアニードル生検を触診可能な病変、及び触診不可能な病変の両方に実施することができ、腫瘤または疑わしい領域中へ中空コアニードルの導入、及び細胞材料の抽出を伴う。コイメージングを用いて、またはこれを用いずにコアニードル生検を実施するか否かは、変更することができ、病変が触診可能であるか否かを有するさまざまな要因に依存する。コイメージングを用いてコアニードル生検を実施する例において、この技術は、画像誘導コアニードル生検または定位コアニードル生検と称されることができ、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、蛍光透視法、マンモグラフィ、ＭＲＩ及び同様のものなどの放射線撮像技術を含み得るが、これらに限定されない。これらのようなコアニードル生検技術の変形形態は、たとえば、吸引式コア生検、撮像誘導コア生検、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。このようなものとして、特定のコアニードル生検技術は、コア生検ニードルの挿入前に皮膚中に切開を含んでもよいし、含まなくてもよい。たとえば、吸引式コア生検中に、小さな切り口を入れ、中空プローブをこの切り口に挿通し、病変部位に誘導した後に、真空圧によって組織のシリンダーをプローブ中に引き入れる。一般に、コアニードル生検は、記述されたＦＮＡ技術より多い組織を得る。
【００８８】
いくつかの例において、用語「ニードル生検」は、いずれかの生検を一般的に指すことができ、この生検は、麻酔を必要とせずに実施されることが可能であり、または局所麻酔のみを必要とする可能性があり、外科手技とみなされない。いくつかの例において、これらのような生検は、「ニードル」以外のデバイスを利用することができ、このようなものとして、限定されないが、これらのデバイスは、パンチ生検、たとえば、皮膚パンチ生検などを得るために利用されることができる。これらのようなデバイスは、たとえば、皮膚パンチ生検の採取に使用されるこれらのデバイスを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
特定の被検体、及び／または被検体の特定の病変の特異的なものを用いて、これらの特異的なものに依存する特定の生検方法に従って、１回の生検、または複数回の生検を実施することができる。たとえば、いくつかの例において、単一の生検、たとえば、単一ＦＮＡ生検または単一コアニードル生検などは、特定の被検体、または特定の被検体の病変を十分にサンプリングするように実施されることができる。他の例において、複数回の生検、たとえば、複数回のＦＮＡ生検、または複数回のコアニードル生検などは、被検体または被検体の病変から単一の試料、または複数の試料の採取のために実施されることができる。複数回の生検を採取する例において、生検の実際の回数は、特定の被検体、及び／または被検体の特定の１箇所の病変、または複数箇所の病変により変わり、このようなものとして、たとえば、２回の生検、３回の生検、４回の生検、５回の生検、６回の生検、７回の生検、８回の生検、９回の生検、１０回の生検などを含むが、これらに限定されない、２回から１０回以上の生検に及ぶことができる。複数回の生検は、コタイムリー方式で採取されることができる、または所定の期間にわたり、たとえば、調査プロトコルの部分などとして、採取されることができる。
【００９０】
本明細書に記載される方法に従って採取された新生物試料は、固体試料、半固体試料、または液体試料であることができる。たとえば、いくつかの例において、利用される採取技術、たとえば、細胞の解離または吸引を引き起こす技術などの性質によって、採取された試料は、採取に基づき液体試料であることができる。他の例において、利用される採取技術、たとえば、外科的採取またはコア試料採取などの性質によって、採取された試料は、採取に基づき固体試料または半固体試料であることができる。採取された試料が固体試料または半固体試料である実施形態において、試料の細胞を解離し、採取後に液体試料を形成することができる。固体組織試料及び半固体組織試料を解離する方法は、機械的解離、化学的解離、酵素的解離、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
いくつかの例において、固形腫瘍試料は、機械的細胞破砕を受けることができる。機械的細胞破砕のいずれかの簡便な方法は、市販の細胞破砕装置を使用して実施される細胞破砕を有するが、これに限定されない、下流側ステップについて固形組織試料を調製することに有用性を見出すことができ、これらの細胞破砕装置は、たとえば、ｍｉｃｒｏＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）、ｍｉｃｒｏＤｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）、及び同様のものなどを含む、ｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐ（ＩｎｃｅｌｌＤｘ，Ｉｎｃ）キット、Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）を提供するものなどのような、ＩｎｃｅｌｌＤｘ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から利用可能であるものなどを含む。機械的細胞破砕は、たとえば、緩衝液などを含む、いずれかの適切な溶液中で実施されることができる。いくつかの例において、機械的細胞破砕は、化学的または酵素的細胞破砕と組み合わされることができる。いくつかの例において、細胞破砕中に固定試薬を加える。いくつかの例において、細胞破砕直後を含む、細胞破砕後に固定試薬を加える。さらに詳細に以下に記載される、細胞破砕後に加えられることができる固定試薬は、たとえば、ｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐ（ＩｎｃｅｌｌＤｘ，Ｉｎｃ）を含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、固定液は、固定／透過処理試薬の併用であることができる。
【００９２】
いくつかの例において、標識細胞懸濁液試料を調製する際に使用される固定液は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞をＰＤ−Ｌ１非発現細胞からサイトメトリーによって分離する能力を提供し、この能力は、たとえば、所定の閾値を上回る細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する細胞を、所定の閾値を下回る細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現レベルを有する細胞から効果的にサイトメトリーによって分離する能力を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
たとえば、解離または細胞破砕などの、試料の採取または調製に基づき、得られた液体の細胞懸濁液の細胞を、要望通りに固定する、及び／または透過処理することができる。このようなものとして、これらの方法の態様は、試料を適切な固定試薬と接触させることによって懸濁液の細胞を固定することを備えることができる。対象となる固定試薬は、所望の時点に細胞を固定する固定試薬である。いずれかの簡便な固定試薬を用いることができ、適切な固定試薬は、穏やかな架橋剤を含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、穏やかな架橋剤は、ホルムアルデヒドに基づく固定液であることができ、この固定液は、たとえば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド／アセトン、ＩｎｃｅｌｌＦＰ（ＩｎｃｅｌｌＤｘ，Ｉｎｃ）などを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、アルコールに基づく固定液を用いることができ、この固定液は、たとえば、メタノール／アセトン、エタノールなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、約１％〜２％の最終濃度でホルムアルデヒドに基づく固定液を使用することができる。
【００９４】
いくつかの例において、細胞を透過処理試薬と接触させることによって、試料中の細胞を透過処理する。対象となる透過処理試薬は、たとえば、以下にさらに詳細に記載されるような、標識バイオマーカープローブが細胞内環境へのアクセスを可能にする試薬である。いずれかの簡便な透過処理試薬を用いることができ、そこで適切な試薬は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＮＰ−４０、サポニンなどのような穏やかな界面活性剤と、メタノールと、同様のものとを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
本開示の方法に使用される試薬をサイトメトリーによってアッセイする。その結果、いくつかの例において、新生物試料を処理し、サイトメトリーアッセイに適している細胞懸濁液を生成することができる。サイトメトリーアッセイに適している試料を生成するために処理することは、たとえば、細胞破砕、解離、固定、透過処理などを含む、上述される、いずれかの個々のステップ、またはこれらのステップの組み合わせを含むことができる。要求される処理量は、固形組織試料がその液体試料をさらに処理することを一般的に要求する試料の供給源を含む、さまざまな要因に依存する。たとえば、液体試料、たとえば、造血器試料などの処理は、細胞破砕または解離を必要としないことができるため、要望通りに固定及び／または透過処理のみを必要とする可能性がある。
【００９６】
細胞懸濁液試料の細胞を１個以上の標識特異的結着メンバーによって一般的に標識する。たとえば、本開示の方法は、細胞懸濁液試料を、ＰＤ−Ｌ１に特異的な標識特異的結着メンバーと接触させることを一般的に備える。他の特異的結着メンバー、及び他の標識試薬は、たとえば、マーカー（たとえば、免疫細胞マーカー）、細胞の核などを含むが、これらに限定されない、本明細書に記載されるような細胞または細胞集団のさまざまな態様を標識する本発明の方法において有用性を見出すことができる。これらのような試薬は、さらに詳細に以下に記載される。
【００９７】
たとえば、細胞懸濁液の細胞を特異的結着メンバーと接触させることなどの、接触させることは、いずれかの簡便で適切な手段によって実施されることができる。いくつかの例において、特異的結着メンバーのアリコットを細胞懸濁液へ加えることによって、細胞懸濁液の細胞を特異的結着メンバーと接触させることができる。接触した細胞懸濁液を要望通りにインキュベートする、及び／または後に固定することができる。
【００９８】
試薬
上記に要約されるように、本発明の方法は、所定の閾値を上回る細胞あたりのＰＤ−Ｌ１レベルを発現する細胞の検出を備えるため、これらの方法を実施する際に有用なさまざまな試薬を含む。たとえば、本発明の方法は、サイトメトリーアッセイが実施されることを可能にするために、細胞を標識特異的結着メンバーの試薬と接触させることによって、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を検出することを一般的に備える。
【００９９】
細胞あたりの特定のポリペプチドレベルを効果的にサイトメトリーによって定量化するために、標識特異的結着メンバーから測定された蛍光量と、特異的結着メンバーによって結着されたポリペプチド数との間の直接相関は、望ましい可能性がある。いくつかの例において、標識特異的結着メンバーによって放射される蛍光量は、標識特異的結着メンバーによって結着されたポリペプチド数に線形相関する。一般的に、排他的ではないが、標識特異的結着メンバーは、標的ポリペプチドの１分子を結着する。このようなものとして、いくつかの例において、細胞の表面上でポリペプチドに結着される複数の標識特異的結着メンバーから検出される蛍光量と、細胞が発現するポリペプチド数との間に１対１の相関があることができる。その結果、細胞あたりのポリペプチド発現量をサイトメトリーによって定量化する例において、各特異的結着メンバーが同一の蛍光量を本質的に放射するように、使用される標識特異的結着メンバーは、同一の接着された標識量をすべて均一に有することができる。たとえば、標識特異的結着メンバーは、単一の接着された標識、または単一の蛍光部分を有することができる。代替に、標識特異的結着メンバーは、複数の接着された標識（たとえば、２個の接着された標識、３個の接着された標識、４個の接着された標識など）、または複数の蛍光部分（たとえば、２箇所の部分、３箇所の部分、４箇所の部分など）を含むことができ、ただし複数のこれらは、標識特異的結着メンバーの各分子について同一である。
【０１００】
対象となる特異的結着剤は、抗体結着剤、タンパク質、ペプチド、ハプテン、核酸などを含む。本明細書に使用されるような用語「抗体結着剤」は、対象となる分析物に結着するために十分である、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体または断片を含む。抗体断片は、たとえば、単量体Ｆａｂ断片、単量体Ｆａｂ’断片、または二量体Ｆ（ａｂ）’2 断片であることが可能である。また、用語「抗体結着剤」の範囲内には、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、またはヒト化抗体若しくはキメラ抗体などの抗体工学によって産生される分子があり、これらのヒト化抗体またはキメラ抗体は、キメラ抗体を産生するために重鎖及び軽鎖の定常領域の置換によって、またはヒト化抗体を産生するためにこれらの定常領域と可変領域のフレームワーク部分との両方の置換によって、モノクローナル抗体から産生される。対象となる核酸結着剤は、細胞中でバイオマーカー核酸に特異的に結着する、または特異的にハイブリダイズする核酸である。これらの核酸の長さは、オリゴヌクレオチドが特異的結着剤として機能するために十分である限り、変更されることができ、いくつかの例において、たとえば、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、及び２５ｎｔを含むが、これらに限定されない、１４〜５０ｎｔなどの、たとえば、１５〜２５ｎｔなどの、１３〜１００ｎｔに及ぶ。これらの核酸結着剤を作製するオリゴヌクレオチドは、要望通りに、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、またはそれらの合成類縁体であることができる。
【０１０１】
上述されるように、本明細書に記載される特異的結着メンバーは、一般的に検出可能に標識される（すなわち、接着された検出可能な標識を含む、検出可能な標識によって結着されるなど）。したがって、対象となるバイオマーカーに特異的に結着する、または特異的にハイブリダイズする特異的結着領域に加えて、特異的結着剤は、検出可能な標識をさらに含むことができる、または検出可能な標識によって結着される、若しくはこれに接着されることができる。検出可能な標識として対象となるものには、蛍光色素がある。蛍光色素（フルオロフォア）は、撮像用途（たとえば、蛍光顕微鏡）及びサイトメトリー用途における使用に適している多くの色素のいずれかから選択されることが可能である。多数の色素は、さまざまな供給源、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及びＥｘｃｉｔｏｎ（Ｄａｙｔｏｎ，ＯＨ）などから市販されている。対象となるフルオロフォアの例は、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸と、アクリジン及び誘導体（たとえば、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アクリジンレッド及びアクリジンイソチオシアネートなどの）と、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）と、４−アミノ−Ｎ−［（３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホン酸（ルシファーイエローＶＳ）と、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミドと、アントラニルアミドと、ブリリアントイエローと、クマリン及び誘導体（たとえば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＳ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクルアリン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（クマリン１５１）などの）と、シアニン及び誘導体（たとえば、シアノシン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７などの）と、４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と、５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）と、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリンと、ジエチルアミノクマリンと、ジエチレントリアミンペンタアセテートと、４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と、４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸と、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）と、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）と、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）と、エオシン及び誘導体（たとえば、エオシン及びエオシンイソチオシアネートなどの）と、エリスロシン及び誘導体（たとえば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネートなどの）と、エチジウムと、フルオレセイン及び誘導体（たとえば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシ���ルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン及びＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）などの）と、フルオレスカミンと、ＩＲ１４４と、ＩＲ１４４６と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、造礁サンゴ由来蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）と、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）と、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅローダミン、ルシファーイエローと、マラカイトグリーンイソチオシアネートと、４−メチルウンベリフェロンと、オルトクレゾールフタレインと、ニトロチロシンと、パラローズアニリンと、ナイルレッドと、オレゴングリーンと、フェノールレッドと、Ｂ−フィコエリトリンと、ｏ−フタルジアルデヒドと、ピレン及び誘導体（たとえば、ピレン、ピレン酪酸及びスクシンイミジル１−ピレン酪酸などの）と、リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）と、ローダミン及び誘導体（たとえば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、４，７−ジクロロローダミンリサミン、ローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、及びテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの）と、リボフラビンと、ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体と、キサンテンと、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。当業者に知られている他のフルオロフォアまたはそれらの組み合わせ、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）及びＥｘｃｉｔｏｎ（Ｄａｙｔｏｎ，ＯＨ）から利用可能なこれらなどをも使用することができる。
【０１０２】
本開示の方法は、細胞懸濁液の細胞を標識して、サイトメトリーによってアッセイされることができる標識細胞懸濁液を生成するために、ＰＤ−Ｌ１の特異的な標識結着メンバー（すなわち、標識ＰＤ−Ｌ１特異的結着メンバー）の使用を一般的に備える。上述されるように、状況により、ＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバーは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を特異的に結着することができる、またはＰＤ−Ｌ１転写物を特異的に結着することができる。
【０１０３】
いくつかの例において、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的な標識結着メンバーは、細胞表面上に発現するＰＤ−Ｌ１タンパク質を特異的に結着することができる。ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質は、残基１から約残基１８までのシグナルペプチドドメイン、約残基１９から約残基２３８までの細胞外トポロジカルドメイン、約残基２３９から約残基２５９までの膜貫通ドメイン、及び約残基２６０から２９０までの細胞質トポロジカルドメインを有する、２９０個のアミノ酸ポリペプチドである。ヒトＰＤ−Ｌ１の主なアイソフォーム（プログラム細胞死１リガンド１アイソフォームａ前駆体ＮＰ＿０５４８６２．１）は、以下のアミノ酸配列、ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号：１）を含む。
【０１０４】
またヒトＰＤ−Ｌ１は、微量な代替のスプライスされたアイソフォーム（プログラム細胞死１リガンド１アイソフォームｂ前駆体ＮＰ＿００１２５４６３５．１）を含み、このアイソフォームは、以下のアミノ酸配列、ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号：２）を含む。
【０１０５】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的な、有用な特異的結着メンバーは、抗体を含むが、これらに限定されず、これらの抗体は、これらの抗体の配列が提供される、上記のヒトＰＤ−Ｌ１アイソフォームのうちの一方または両方を結着する抗体を含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、フルオロフォアに直接コンジュゲートされる抗ＰＤ−Ｌ１（すなわち、抗ＣＤ２７４）抗体は、記述された方法に有用性を見出すことができる。有用な市販されている直接コンジュゲートされた抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、たとえば、以下の表１に列挙されるものを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
【表１−１】
2019535001.tif 000003
【０１０７】
【表１−２】
2019535001.tif 000004
【０１０８】
【表１−３】
2019535001.tif 000005
【０１０９】
いくつかの例において、非コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に記載された方法において有用性を見出すことができ、たとえば、上記に列挙される表１中のこれらの商業サプライヤーなどを含む、たとえば、商業サプライヤーから利用可能であるこれらの非コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、非コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、たとえば、非コンジュゲート抗体をフルオロフォアにコンジュゲートすることを有するが、これに限定されない使用の前にコンジュゲートされることができる。
【０１１０】
抗ＰＤ−Ｌ１タンパク質の特異的結着メンバーは、抗体に限定されず、またいくつかの例において、たとえば、抗ＰＤ−Ｌ１アプタマー、抗ＰＤ−Ｌ１ハプテンなどを含むこともできる。加えて、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的な合成特異的結着メンバーは、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１結着部分に由来することもできる。たとえば、いくつかの例において、ＰＤ−Ｌ１の特異的結着メンバーは、たとえば、ＲＣＳＢタンパク質構造データバンク（ＰＤＢ）構造４ＺＱＫに示され、Ｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２３：２３４１−２３４８などに記述されるような、たとえば、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の結着相互作用などに基づき、ＰＤ−１由来ＰＤ−Ｌ１結着ドメインを含むように合理的に設計されることができ、この本開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１１】
いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、ＰＤ−Ｌ１転写物に特異的な標識結着メンバーを使用することができる。ＰＤ−Ｌ１転写物に特異的な標識結着メンバーは、細胞中に発現するＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡを特異的に結着することができる。ＰＤ−Ｌ１転写物に特異的な有用な特異的結着メンバーは、ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ配列のすべて、または一部に相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、有用なオリゴヌクレオチドプローブは、ヒトＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ転写物に相補的な配列を含むことができ、この配列は、たとえば、
ホモサピエンスＣＤ２７４分子（ＣＤ２７４）、転写バリアント１、ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１４１４３．３）：
ＧＧＣＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＡＴＡＴＧＴＧＧＴＡＧＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＡＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＴＡＡＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＡＧＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＣＣＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＧＧＴＴＣＡＴＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＡＡＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＴＡＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＣＡＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴＡＧＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＣＴＡＡＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＣＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＣＴＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＴＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＡＴＣＴＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＡＴＡＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＴＡＡＴＣＴＡＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＣＡＣＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＴＡＡＧＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＧＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＴＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡ（配列番号：３）、または、
ホモサピエンスＣＤ２７４分子（ＣＤ２７４）、転写バリアント２、ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１２６７７０６．１）：
ＧＧＣＧＣＡＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＴＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＴＡＧＧＧＧＴＴＣＡＴＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＡＡＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＴＴＧＡＴＡＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣＴＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＴＧＡＧＧＧＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴＧＡＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＧＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＣＡＡＡＣＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＣＣＧＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴＡＧＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＣＣＣＡＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＡＣＣＴＡＡＴＣＴＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣＡＣＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＧＴＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧＴＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＡＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＣＣＣＴＴＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＴＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＡＴＣＴＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＡＴＡＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧＧＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＧＴＡＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＡＧＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡＴＡＡＴＣＴＡＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＣＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＴＡＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＧＡＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＣＡＣＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＣＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＴＡＡＧＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＧＴＣＣＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＣＡＴＴＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＣＣＴＴＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＧＴＴＡＴＣＴＧＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＡＴＡＧＴＣＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＴＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＴＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡ（配列番号：４）
を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
有用なオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡに基づくことができ、たとえば、ＤＮＡ原位置ハイブリダイゼーションプローブ、ＲＮＡ原位置ハイブリダイゼーションプローブ（たとえば、リボプローブ）、及びたとえば、１つ以上の合成ヌクレオシド塩基（たとえば、ロックド核酸（ＬＮＡ）及び同様のもののような）などを含む１つ以上の合成成分を含むアンチセンスプローブなどを含む、原位置ハイブリダイゼーションに使用されるこれらのプローブを含み得るが、これらに限定されない。これらのようなプローブは、長さを変えることができ、この長さは、いくつかの例において、１４〜５０ｎｔのような、たとえば、１５〜２５ｎｔなどの１３〜１００ｎｔに及ぶことができる。オリゴヌクレオチドプローブは、たとえば、本明細書に記載されるこれらのフルオロフォアなどを含む、フルオロフォアによって直接コンジュゲートされることができる。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドプローブは、部分によってコンジュゲートされることができ、この部分は、オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすると、標識の結着を可能にする。たとえば、オリゴヌクレオチドを１つ以上のビオチン分子にコンジュゲートすることができ、たとえば、蛍光によって標識されるストレプトアビジンを導入することなどによって、ハイブリダイゼーション後に、オリゴヌクレオチドを標識することが可能になる。
【０１１３】
本明細書に記載された方法に有用な試薬は、免疫細胞に特異的な標識特異的結着メンバーを含むこともできる。これらのような特異的結着メンバーは、本開示の細胞集団内で免疫細胞の識別、及び／または上述されるような免疫細胞ではないような細胞の識別を可能にすることができる。
【０１１４】
免疫細胞についてのいずれかの簡便な標識特異的結着メンバーは、たとえば、個々の免疫細胞マーカーに特異的な抗体などを含むが、これらに限定されない本明細書に記載された方法に有用性を見出すことができ、これらの個々の免疫細胞マーカーに特異的な抗体は、たとえば、抗ＣＤ１１４抗体、抗ＣＤ１１７抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１４郊外、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６郊外、抗ＣＤ１８２抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９１抗体、抗Ｆｏｘｐ３抗体、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。その結果、いくつかの例において、検出された新生細胞のさらなる特徴は、たとえば、上記に列挙されるようなものなどを含む、免疫細胞マーカーに抗体を使用して検出されるなどのような、１つ以上の免疫細胞マーカーの所定の閾値の発現量を欠くこと、または所定の閾値を下回る発現量を有することである。
【０１１５】
上述したように、たとえば、ＤＮＡ量の検出などについて、本明細書に記載された方法は、１つ以上のＤＮＡ標識試薬を使用するＤＮＡの検出を備えることができる。さまざまなＤＮＡ標識試薬は、本明細書に記載された方法に有用性を見出すことができ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（２’−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−１Ｈ，１’Ｈ−２，５’−ビベンゾイミダゾールトリハイドロクロライド）、及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（４−［６−（４−メチル−１−ピペラジニル）−１’，３’−ジヒドロ−１Ｈ，２’Ｈ−２，５’−ビベンゾイミダゾール−２’−イリデン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−オントリハイドロクロライド）、及びＨｏｅｃｈｓｔシリーズの他のものと、ＳＹＴＯ４０、ＳＹＴＯ１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、２１、２２、２３、２４、２５（グリーン）と、ＳＹＴＯ１７、５９（レッド）、ＤＡＰＩ、ＤＲＡＱ５（商標）（二本鎖ＤＮＡについて高いアフィニティーを有するアントラキノン色素）、ＹＯＹＯ−１、ヨウ化プロピジウム、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−３及びＴＯＴＯ−３、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸ、メチルグリーン、アクリジンホモダイマー、７−アミノアクチノマイシンＤ、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクトリジン（ｍｅｔｈｏｘｙａｃｔｒｉｄｉｎｅ）とを含むが、これらに限定されない。
【０１１６】
上述されたマーカーは、細胞内マーカーを含む。本明細書に使用されるような、用語「細胞内マーカー」は、細胞膜の外面を越える細胞内にある細胞の構成要素を指す。これらのような構成要素は、細胞膜の内面、細胞質、核、ミトコンドリア、小胞体などを含むが、これらに限定されない、細胞のいずれかの内側構成要素であることができる、またはこの内側構成要素内にあることができる。このようなものとして、細胞内マーカーの標識化または検出は、細胞膜の少なくとも外面を越える細胞内マーカーの特異的標識または特異的結着剤の輸送を必要とする。いくつかの例において、細胞内マーカーについての標識または特異的結着剤は、膜透過性であるため、細胞内マーカーの標識について膜透過性の調節を必要としない可能性がある。いくつかの例において、細胞内マーカーについての標識または特異的結着剤は、膜不透過性であるため、たとえば、本明細書に記載されるような１つ以上の透過処理試薬による細胞の調製及び／または処置などを含む、細胞内マーカーの標識について膜透過性の調節を必要とする可能性がある。
【０１１７】
上述されたマーカーは、細胞表面マーカーを含む。本明細書に使用されるような、用語「細胞表面マーカー」は、細胞の細胞膜の外面上に、部分的に、または完全に、少なくとも曝露される細胞の構成要素を指すため、細胞透過性を調節することなく、たとえば、本明細書に記載されるような１つ以上の透過処理試薬の使用などをせずに、アクセスされることができる。いくつかの例において、細胞表面マーカーは、細胞膜の外面上に曝露される一部を含むだけではなく、細胞内部分及び／または膜貫通部分をも含む細胞の構成要素を含む。
【０１１８】
本明細書に記載されるように、また当業者に容易に明らかであるように、本明細書に記載される薬剤及び標識のいずれかの組み合わせは、この組み合わせが適切であり、これらの構成要素が物理的に、または光学的に干渉しない場合に限り、記載される方法に用いられることができる。たとえば、２つ以上の所望の構成要素の組み合わせを可能にするために、特定の標識の変更または置換を用いることが可能であること、及び／または、これらを用いるべきであることは、当業者の技術の範囲内にある。非限定的な例として、バイオマーカーの特定の蛍光標識が特定の発光波長の所望のＤＮＡ標識剤と光学的に干渉する（たとえば、重複する発光スペクトルを有する）場合に、バイオマーカーの蛍光標識は、所望のＤＮＡ標識剤と重複する発光スペクトルを全く、またはほとんど含まない、異なる蛍光標識と置換されることができる。
【０１１９】
処置方法
上記に要約されるように、本開示は、新生物について被検体を処置する方法を備える。用語「被検体」、「個体」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる、いずれかの哺乳類被検体、特にヒトを指す。
【０１２０】
本発明の方法の態様は、被検体中の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性新生物を識別すること、また抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を被検体に投与することによって被検体を処置することを一般的に備える。被検体中の新生物を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別することは、本明細書に記述される方法のいずれかに従って実施されることができ、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生物の細胞をサイトメトリーによって検出することを一般的に備える。
【０１２１】
本明細書に記載された方法に従って処置される被検体は、ＰＤ−Ｌ１を発現する疑いがある新生物を含有する被検体を含む。いくつかの例において、本明細書に記載された方法に従って処置される被検体は、免疫回避の疑いがある新生物を含む、または免疫回避の徴候を示す、被検体であることができる。さまざまな指標は、たとえば、腫瘍増殖または進行、免疫抑制、免疫療法への無応答性、及び同様のものを含むが、これらに限定されない、新生物によって免疫回避を示唆することができる。腫瘍微小環境中に存在するさまざまな要因及び事象は、免疫回避または腫瘍進行を直接的に示すことができ、間接的に、たとえば、適切な同時刺激がない活性化Ｔ細胞の存在、Ｔ細胞抑制分子（たとえば、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｅなど）の腫瘍細胞発現、腫瘍抗原減少、ＭＨＣ分子のダウンレギュレーション、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（たとえば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇｓ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ＦｏｘＰ３＋など）、ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞の存在、免疫抑制因子及び腫瘍由来サイトカイン（たとえば、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ型ＩＦＮ、ガングリオシド、受容体結着癌関連表面抗原（ＲＣＡＳ１）など）、免疫抑制骨髄系細胞集団の存在（未熟骨髄系細胞集団、たとえば、ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２としても知られている）またはアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、調節樹状細胞（ＤＣ）、代替活性化Ｍ１及びＭ２マクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＭＤＳＣなど）、ＴＣＲζ鎖のダウンレギュレーション、免疫抑制酵素（たとえば、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、アルギナーゼ、核内因子カッパーＢ抑制キナーゼ（ＩＫＫ）２など）、及び同様のものを含むが、これらに限定されない免疫回避を示す。いくつかの例において、特定の腫瘍特性は、免疫回避を示すこともでき、この免疫回避は、たとえば、細胞傷害性経路に対する腫瘍抵抗性（たとえば、ＦＡＳ変異を有する腫瘍中にみられるような）、ＴＲＡＩＬ受容体の細胞死受容体５（ＤＲ５）を符号化する遺伝子中の変異、抗アポトーシス分子の過剰発現（たとえば、ＦＬＩＰ、ＢＣＬ−ＸＬなど）、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
いくつかの例において、被検体中の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性細胞を検出する本明細書に記載された方法は、免疫関連疾患を有する被検体、または免疫関連疾患にかかる増加したリスクにある被検体への抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法の投与を制限するように機能することができる。免疫細胞上に自然に発現することによって、ＰＤ−Ｌ１標的療法は、被検体の免疫細胞に悪影響を与えることが可能である。いくつかの例において、本開示の方法は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法前に、たとえば、被検体が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法によって悪影響を受ける可能性が最も高いこと、またはたとえば、免疫関連疾患を有するこれらの被検体などを含む、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法による有害事象を有することを備える、これらの被検体をスクリーニングするために使用されることができる。
【０１２３】
免疫関連疾患の非限定的な例は、自己免疫異常、たとえば、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索＆ニューロンニューロパチー、Ｂａｌｏ病、Ｂｅｈｃｅｔ病、水疱性類天疱瘡、心筋症、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ病、セリアック病、Ｃｈａｇａｓ病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、Ｃｒｏｈｎ病、Ｃｏｇａｎ症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、Ｄｅｖｉｃ病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、Ｄｒｅｓｓｌｅｒ症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、Ｅｖａｎｓ症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）(以前にＷｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症と称される)、Ｇｒａｖｅｓ病、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、橋本脳症、橋本病、溶血性貧血、Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（1型糖尿病）、若年性筋炎、川崎病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性の、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、Ｍｏｏｒｅｎ潰瘍、Ｍｕｃｈａ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（Ｄｅｖｉｃの)、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性連鎖球菌関連性精神神経障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、Ｐａｒｒｙ  Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒ症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、Ｒａｙｎａｕｄ現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、Ｒｅｉｔｅｒ症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ様関節炎、サルコイドーシス、Ｓｃｈｍｉｄｔ症候群、強膜炎、強皮症、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、Ｓｕｓａｃ症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、Ｔｏｌｏｓａ−Ｈｕｎｔ症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、小水疱性皮膚症、白斑、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症（多発血管炎性肉芽腫症と称されるようになった（ＧＰＡ））、及び同様のものなどの、たとえば、自己免疫異常を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
いくつかの例において、また免疫関連疾患は、たとえば、感染または他の免疫刺激状態と戦う被検体中に存在するような、活性化された免疫系を含むことができる。
【０１２５】
いくつかの例において、新生物を含む被検体を検査し、被検体の新生物の１個以上の細胞が所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現するか否かを判定することができ、その後、１個以上の細胞が検出される場合に、被検体を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法によって処置することができる。いずれかの新生物をアッセイし、被検体の新生物が免疫回避の指標を以前に示したか否かを含む、被検体の新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性である可能性を評価することができる。
【０１２６】
いくつかの例において、新生物と診断される被検体を評価し、新生物についていずれかの他の処置を受ける前に、本明細書に記載されるような、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法への応答性の可能性を決定する。いくつかの例において、新生物と診断される被検体を評価し、本明細書に記載されるような、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法への応答性の可能性を決定し、そして新生物について一連の治療を受ける。いくつかの例において、新生物について一連の治療を受けた後に、新生物と診断される被検体を評価し、本明細書に記載されるような、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法へ応答性の可能性を決定する。
【０１２７】
被検体を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について評価する前に、その間に、またはその後に被検体へ投与されることができる新生物治療は、たとえば、新生物の種類、被検体の病歴、一般的な健康状態、及び／またはいずれかの併存症、及び同様のものなどを含む、複数の要因によって変わる。有用な新生物治療は、たとえば、放射線療法、化学療法、免疫療法、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
いくつかの例において、たとえば、免疫療法を含むが、これに限定されない一連の治療を開始する前に、被検体を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について評価することができる。たとえば、いくつかの例において、医療従事者は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を投与する前に、被検体をアッセイし、被検体のがんの抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性を決定することができ、たとえば、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する１個以上の細胞の検出などを通して、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性である可能性が高いと被検体の新生物を識別する場合にのみ、医療従事者は、この治療を投与することができる。
【０１２９】
被検体を評価し、被検体の新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であるか否かを判定することができる、一連の処置を開始する前の期間は、変更されることができ、１日以下から１ヶ月以上までに及び、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月などを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの例において、被検体の新生物の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性についての評価を実施するのと同じ日に、一連の処置を開始することができる。
【０１３０】
いくつかの例において、一連の処置をすでに投与した後に、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について、被検体を評価することができる。たとえば、いくつかの例において、たとえば、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を含むが、これに限定されない、一連の失敗した免疫療法後に、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について、被検体の新生物を評価することができる。いくつかの例において、この評価が新生物を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別する場合、つぎに抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を２回試みることができる。いくつかの例において、評価が新生物を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性ではないと識別する場合、つぎに医療従事者は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を２回試みないことができる。いくつかの例において、新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性ではないことを示す評価は、別の一連の治療（たとえば、非ＰＤ−Ｌ１免疫療法、化学療法、放射線療法など）を正当化することを示すことができる。
【０１３１】
被検体を評価し、被検体の新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であるか否かを判定することができる、一連の処置が終了した後の期間は、変更されることができ、１日以下から１ヶ月以上までに及び、たとえば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月などを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの例において、被検体の新生物の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性についての評価を、一連の治療が終了するのと同じ日に実施する。いくつかの例において、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性についての評価を、被検体の長期経過観察評価中に実施することができる。この時点で長期間の経過観察を実施する一連の処置後の期間の長さは、変更され、３ヶ月以下から１０年以上までに及び、たとえば、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年などを含み得るが、これらに限定されない。
【０１３２】
いくつかの例において、被検体が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性新生物を含むか否かの評価を、一連の治療中に実施し、この新生物について被検体を治療することができる。たとえば、新生物について被検体を治療する一連の治療を開始することができ、一連の治療中に、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性の１つ以上の評価を実施し、たとえば、治療を監視することなどができる。いくつかの例において、被検体は、たとえば、一連の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を含むが、これに限定されない、一連の免疫療法を受けることができ、被検体の新生物の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性の１つ以上の評価は、免疫療法中に実施されることができる。これらのような評価は、たとえば、免疫療法を続けるか否かの評価などを含むが、これに限定されない、さまざまな理由で実施され、一連の免疫療法を変更する（たとえば、投与されている免疫療法の薬物を変更する、投与されている免疫療法の薬物の投与量を変更する、投与の頻度を変更するなど）か否かを評価することができる。たとえば、被検体の新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であることを一連の治療中の評価が示す場合に、つぎに被検体は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法に切り替えられることができる、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法の被検体の投与量は、増加することができる、または被検体に抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を投与する頻度は、増加することができる。対して、被検体の新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性ではないことを一連の治療中の評価が示す場合に、つぎに、被検体は、非抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法に切り替えられることができる、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法の被検体の投与量は、減少する、若しくは終了することができる、または被検体に抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を投与する頻度は、低下する、若しくは終結することができる。
【０１３３】
一連の処置中に行われる評価は、本明細書においてモニタリングとも称されることができ、このモニタリングは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性を監視することを備える。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を受ける被検体を監視することに加えて、また本発明の方法は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法処置ではない一連の処置中に抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について被検体の新生物を監視することを備える。たとえば、いくつかの例において、放射線療法を受ける被検体を、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について監視することができ、被検体の新生物を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別する場合に、放射線療法と併せて、または放射線療法の代替に、つぎに、一連の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を開始することができる。いくつかの例において、化学療法を受ける被検体を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について監視することができ、被検体の新生物を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別する場合に、つぎに、化学療法と併せて、または化学療法の代替に、一連の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を開始することができる。いくつかの例において、非抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法（すなわち、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１以外の標的を含む免疫療法）を受ける被検体を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性について監視することができ、被検体の新生物を抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別する場合に、つぎに一連の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を、非抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法と併せて、またはこの代替に、開始することができる。
【０１３４】
抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性である、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であると予測される、新生物を含む被検体を治療する方法は、被検体に抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を投与することを一般的に備える。いずれかの抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法は、本発明の方法に有用性を見出すことができ、これらの本発明の方法は、たとえば、１つ以上の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１治療拮抗薬の有効量を被検体に投与することを備えるこれらの治療を含むが、これらに限定されず、そこでこれらのような拮抗薬は、たとえば、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）（アテゾリズマブ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、ＣＡ−１７０、ＢＭＳ−２０２、ＢＭＳ−８、ＢＭＳ−３７、ＢＭＳ−２４２、及び同様のものを含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））は、ヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であり、がんを治療するために使用される。ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））は、以前にＭＫ−３４７５、ランブロリズマブなどとして知られており、ＰＤ−１受容体を標的とするがん免疫療法に使用されるヒト化抗体である。アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標））は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質に対するＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒト化、設計されたモノクローナル抗体である。デュルバルマブ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）は、ＰＤ−Ｌ１を標的とする治療用モノクローナル抗体である。アベルマブ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ＆Ｐｆｉｚｅｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても知られている）は、アイソタイプＩｇＧ１の完全ヒトモノクローナルＰＤ−Ｌ１抗体である。ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、ＭＤＸ−１１０５としても知られている）は、ＰＤ−Ｌ１に結着するように、またそれがＰＤ−１に結着することを妨げるように示される遮断抗体である（Ｕ．Ｓ．ＮＩＨ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｎｏ．ＮＣＴ００７２９６６４参照）。ＣＡ−１７０（Ｃｕｒｉｓ，Ｉｎｃ．）は、小分子ＰＤ−Ｌ１拮抗薬である。ＢＭＳ−２０２、ＢＭＳ−８、ＢＭＳ−３７、ＢＭＳ−２４２は、ＰＤ−１を結着する小分子ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１複合体拮抗薬である（たとえば、Ｋａｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ７（２１）参照、この本開示はその全体を参照により本明細書に援用される）。
【０１３６】
抗ＰＤ−Ｌ１拮抗薬は、本明細書に記載される方法に有用な、たとえば、抗体などを含み、たとえば、米国特許第７，７２２，８６８号、第７，７９４，７１０号、第７，８９２，５４０号、第７，９４３，７４３号、第８，１６８，１７９号、第８，２１７，１４９号、第８，３５４，５０９号、第８，３８３，７９６号、第８，４６０，９２７号、第８，５５２，１５４号、第８，７４１，２９５号、第８，７４７，８３３号、第８，７７９，１０８号、第８，９５２，１３６号、第８，９８１，０６３号、第９，０４５，５４５号、第９，１０２，７２５号、第９，１０９，０３４号、第９，１７５，０８２号、第９，２１２，２２４号、第９，２７３，１３５号及び第９，４０２，８８８号に記述されるこれらなどを含むが、これらに限定されず、これらの本開示は、それらの全体を参照により本明細書に援用される。
【０１３７】
抗ＰＤ−１拮抗薬は、本明細書に記載される方法に有用な、たとえば、抗体などを含み、たとえば、第６，８０８，７１０号、第７，０２９，６７４号、第７，１０１，５５０号、第７，４８８，８０２号、第７，５２１，０５１号、第８，００８，４４９号、第８，０８８，９０５号、第８，１６８，７５７号、第８，４６０，８８６号、第８，７０９，４１６号、第８，９５１，５１８号、第８，９５２，１３６号、第８，９９３，７３１号、第９，０６７，９９８号、第９，０８４，７７６号、第９，１０２，７２５号、第９，１０２，７２７号、第９，１０２，７２８号、第９，１０９，０３４号、第９，１８１，３４２号、第９，２０５，１４８号、第９，２１７，０３４号、第９，２２０，７７６号、第９，３０８，２５３号、第９，３５８，２８９号、第９，３８７，２４７号及び第９，４０２，８９９号に記述されるこれらなどを含むが、これらに限定されず、これらの本開示は、それらの全体を参照により本明細書に援用される。
【０１３８】
本発明の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１拮抗薬のうちの１個以上を含む組成物を、とりわけ、治療中の指示、及び処方する医師の判断により、１日１回、１日数回、または１日複数回でも投与することができる。
【０１３９】
治療中の状態、及び投与中の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１医薬品の組成により、投与方法を選択することができる。本発明の薬剤（複数可）の投与は、全身投与を用いることもできるが、所定の器官または腫瘍へ、皮下注入、静脈内注入、腹腔内注入、筋肉内注入、そして場合により直接注入を含むが、これらに限定されない、さまざまな方式で行われることができる。医薬組成物の投与は、単一経路を介する、またはいくつかの経路によって同時であることができる。
【０１４０】
「有効量」とは、治療効果を有するために十分な量を意味する。新生物を治療する有効量は、たとえば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％を含むが、これらに限定されない、一般的に少なくとも約１％までの新生物の徴候及び／またはサイズを調節する。これらのようなものは、たとえば、影響を受ける細胞数に統計的に有意で定量可能な変化をもたらす。これは、原発腫瘍のサイズにおける減少、遠隔臓器中の微小転移数における減少、再発転移性疾患における減少などであることができる。
【０１４１】
キット
また、提供されるものは、上述された方法のうちの１つ以上を実施するためのキットである。本発明のキットは、大きく異なることができる。本発明のキットに含まれる試薬及び装置は、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞を検出する方法に関して、上記に言及されるものを含む。
【０１４２】
これらは、たとえば、ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体などを含む、たとえば、ＰＤ−Ｌ１についての特異的結着メンバーなどを含む。本発明のキットは、たとえば、細胞固定液、細胞透過処理試薬、細胞標識試薬、緩衝剤、希釈液などを含むが、これらに限定されない、１個以上の試料調製試薬をさらに含むことができる。上記の成分は、別々の容器に存在することができる、または１つ以上の成分は、単一の容器、たとえば、ガラスまたはプラスチックのバイアル中で混合することができる。いくつかの例において、本開示のキットは、試料調製装置、たとえば、ホモジナイザーなどをさらに含むことができる。
【０１４３】
キットは、試料取得装置、たとえば、血液採取装置または生検採取装置などをさらに含むことができる。生検採取装置の非限定的な例は、たとえば、針生検装置、コア生検装置、パンチ生検装置、外科的生検装置、吸引式生検装置などを含むが、これらに限定されない。いくつかの例において、キットは、たとえば、酵素、酵素阻害剤、界面活性剤、細胞解離培地または緩衝液、ボルテックス装置、章動装置、揺動装置などを含むが、これらに限定されない、細胞解離についての１つ以上の試薬及び／または装置をさらに含むことができる。本発明のキットは、たとえば、対照細胞試料（たとえば、陽性対照細胞試料、陰性対照細胞試料など）、較正試薬（たとえば、蛍光ビーズ、標識前細胞など）を含むが、これらに限定されない、対照試薬及び試料をさらに含むことができる。
【０１４４】
上記の成分に加えて、本発明のキットは、本発明の方法を実施するための指示をさらに含むことができる。これらの指示は、さまざまな形態の中で、本発明のキットに存在することができ、これらのうちの１つ以上は、キット内に存在することができる。これらの指示が存在することができる１つの形態は、適切な媒体または基材、たとえば、情報を印刷する１枚または複数枚の紙などの上に、キットの梱包中に、添付文書などの中に、印刷された情報としての形態である。さらに別の手段は、情報を記録している、コンピュータ可読媒体、たとえば、ディスケット、ＣＤなどである。存在することができるさらに別の手段は、ウェブサイトアドレスであり、このウェブサイトアドレスは、インターネットを介して使用され、離れた場所で情報にアクセスすることができる。いずれかの簡便な手段は、キットに存在することができる。
【０１４５】
添付の請求項にかかわらず、本開示は、以下の付記によっても定義される。
１．所定の閾値を上回るプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を発現する新生細胞が新生物試料中に存在するか否かを検出する方法であって、
前記新生物試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバーと接触させ、標識細胞懸濁液を生成すること、
前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量を定量化し、所定の閾値を上回るＰＤ−Ｌ１を発現する新生細胞が前記新生物試料中に存在するか否かを検出すること
を備える、方法。
２．前記サイトメトリーによってアッセイすることは、細胞周期をアッセイすることをさらに有する、付記１に記載の方法。
３．細胞周期をアッセイすることは、細胞あたりのＤＮＡ量を定量化することを有する、付記２に記載の方法。
４．細胞周期をアッセイすることは、発現した細胞周期マーカーを検出することを有する、付記２または３に記載の方法。
５．前記細胞懸濁液の試料をＤＮＡ標識試薬と接触させることをさらに備える、付記１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【０１４６】
６．前記新生物試料を、発現した細胞周期マーカーに特異的な標識結着メンバーと接触させることをさらに備える、付記１〜５のいずれか一つに記載の方法。
７．前記サイトメトリーによってアッセイすることは、異数性をアッセイすることをさらに有する、付記１〜６のいずれか一つに記載の方法。
８．検出された細胞は、増殖性である、付記１〜７のいずれか一つに記載の方法。
９．検出された細胞は、異数体である、付記１〜８のいずれか一つに記載の方法。
１０．前記標識は、前記新生物試料を免疫細胞に特異的な少なくとも１個の標識結着メンバーと接触させることをさらに有する、付記１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【０１４７】
１１．免疫細胞に特異的な前記少なくとも１個の標識結着メンバーは、リンパ球マーカーＣＤ４５に特異的な標識結着メンバーを含む、付記１０に記載の方法。
１２．免疫細胞に特異的な前記少なくとも１個の標識結着メンバーは、リンパ球マーカーＣＤ８に特異的な標識結着メンバーを含む、付記１０または１１に記載の方法。
１３免疫細胞の少なくとも１個のマーカーに陰性である細胞を検出することを備える、付記１０〜１２のいずれか一つに記載の方法。
１４．前記新生物試料は、体液試料である、付記１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
１５．前記体液試料は、血液試料である、付記１４に記載の方法。
【０１４８】
１６．検出された細胞は、循環腫瘍細胞である、付記１４または１５に記載の方法。
１７．検出された細胞は、造血器癌細胞である、付記１４〜１６のいずれか一つに記載の方法。
１８．前記新生物試料は、固形腫瘍試料である、付記１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
１９．前記固形腫瘍は、上皮性腫瘍である、付記１８に記載の方法。
２０．前記固形腫瘍は、肺癌腫瘍である、付記１８または１９に記載の方法。
【０１４９】
２１．前記肺癌腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍である、付記２０に記載の方法。
２２．前記固形腫瘍は、乳癌腫瘍である、付記１８または１９に記載の方法。
２３．検出された細胞は、扁平上皮癌細胞を含む、付記１８〜２２のいずれか一つに記載の方法。
２４．検出された細胞は、腺癌細胞を含む、付記１８〜２２のいずれか一つに記載の方法。
２５．検出された細胞は、腺扁平上皮癌細胞を含む、付記１８〜２２のいずれか一つに記載の方法。
【０１５０】
２６．前記新生物試料は、生検から調製される、付記１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
２７．前記生検は、固形組織診である、付記２６に記載の方法。
２８．前記新生物試料を前記固形組織診から調製する、付記２７に記載の方法。
２９．前記新生物試料を前記固形組織診から調製することは、前記固形組織診の組織をホモジナイズすることを有する、付記２８に記載の方法。
３０．前記生検は、液体生検である、付記２６に記載の方法。
【０１５１】
３１．前記新生物試料を前記液体生検から調製することをさらに備える、付記３０に記載の方法。
３２．前記生検は、穿刺吸引（ＦＮＡ）生検である、付記２６に記載の方法。
３３．前記新生物試料を前記ＦＮＡ生検から調製することをさらに備える、付記３２に記載の方法。
３４．前記標識細胞懸濁液試料の前記細胞は、固定される、付記１〜３３のいずれか一つに記載の方法。
３５．前記新生物試料の前記細胞を固定することをさらに備える、付記１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
【０１５２】
３６．前記新生物試料の前記細胞を固定することは、前記接触前に実施される、付記３５に記載の方法。
３７．前記新生物試料の前記細胞を固定することは、前記接触中に実施される、付記３５に記載の方法。
３８．前記新生物試料の前記細胞を固定することは、前記接触後に実施される、付記３５に記載の方法。
３９．前記細胞を固定することは、前記新生物試料の前記細胞を穏和な架橋剤と接触させることを有する、付記３５〜３８のいずれか一つに記載の方法。
４０．前記穏和な架橋剤は、ホルムアルデヒドに基づく固定液を含む、付記３９に記載の方法。
【０１５３】
４１．前記所定の閾値は、１個の細胞あたり１００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、付記１〜４０のいずれか一つに記載の方法。
４２．前記所定の閾値は、１個の細胞あたり５００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、付記４１に記載の方法。
４３．前記所定の閾値は、１０００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、付記４２に記載の方法。
４４．被検体中の新生物が抗プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）免疫療法応答性であるか否かかを識別する方法であって、
前記新生物から調製される細胞懸濁液試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバーと接触させ、標識細胞懸濁液を生成すること、
前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、所定の閾値を超えるＰＤ−Ｌ１レベルを各発現する細胞集団が存在するか否かを検出し、前記新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であるか否かを識別すること
を備える、方法。
４５．前記サイトメトリーによってアッセイすることは、細胞周期をアッセイすることをさらに有する、付記４４に記載の方法。
【０１５４】
４６．細胞周期をアッセイすることは、細胞あたりのＤＮＡ量を定量化することを有する、付記４５に記載の方法。
４７．細胞周期をアッセイすることは、発現した細胞周期マーカーを検出することを有する、付記４５または４６に記載の方法。
４８．前記細胞懸濁液試料をＤＮＡ標識試薬と接触させることをさらに備える、付記４４〜４７のいずれか一つに記載の方法。
４９．前記細胞懸濁液試料を発現した細胞周期マーカーに特異的な標識結着メンバーと接触させることをさらに備える、付記４４〜４８のいずれか一つに記載の方法。
５０．前記サイトメトリーによってアッセイすることは、異数性をアッセイすることをさらに有する、付記４４〜４９のいずれか一つに記載の方法。
【０１５５】
５１．前記細胞集団は、増殖性である、付記４４〜５０のいずれか一つに記載の方法。
５２．前記細胞集団は、異数体である、付記４４〜５１のいずれか一つに記載の方法。
５３．前記異数体細胞は、前記被検体中の循環腫瘍細胞の存在を示す、付記５２に記載の方法。
５４．前記標識は、前記細胞懸濁液試料を免疫細胞に特異的な少なくとも１個の標識結着メンバーと接触させることをさらに有する、付記４４〜５３のいずれか一つに記載の方法。
５５．免疫細胞に特異的な前記少なくとも１個の標識結着メンバーは、リンパ球マーカーＣＤ４５に特異的な標識結着メンバーを含む、付記５４に記載の方法。
【０１５６】
５６．免疫細胞に特異的な前記少なくとも１個の標識結着メンバーは、リンパ球マーカーＣＤ８に特異的な標識結着メンバーを含む、付記５４または５５に記載の方法。
５７．前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、増殖性免疫細胞が存在するか否かを検出することをさらに備える、付記５４〜５６のいずれか一つに記載の方法。
５８．増殖性免疫細胞量を定量化することをさらに備える、付記５７に記載の方法。
５９．前記細胞集団が免疫細胞マーカーに陰性であるか否かを識別することを備える、付記５４〜５８のいずれか一つに記載の方法。
６０．前記細胞集団は、循環腫瘍細胞を含む、付記４４〜５９のいずれか一つに記載の方法。
【０１５７】
６１．前記新生物は、造血器癌である、付記４４〜６０のいずれか一つに記載の方法。
６２．前記新生物は、固形腫瘍である、付記４４〜６０のいずれか一つに記載の方法。
６３．前記固形腫瘍は、上皮性腫瘍である、付記６２に記載の方法。
６４．前記固形腫瘍は、肺癌腫瘍である、付記６２または６１に記載の方法。
６５．前記肺癌腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍である、付記６４に記載の方法。
【０１５８】
６６．前記固形腫瘍は、乳癌腫瘍である、付記６２または６３に記載の方法。
６７．前記細胞集団は、扁平上皮癌細胞を含む、付記６３〜６６のいずれか一つに記載の方法。
６８．前記細胞集団は、腺癌細胞を含む、付記６３〜６６のいずれか一つに記載の方法。
６９．前記細胞集団は、腺扁平上皮癌細胞を含む、付記６３〜６６のいずれか一つに記載の方法。
７０．前記細胞懸濁液試料は、生検から調製される、付記４４〜６９のいずれか一つに記載の方法。
【０１５９】
７１．前記生検は、固形組織診である、付記７０に記載の方法。
７２．前記細胞懸濁液試料を前記固形組織診から調製することをさらに備える、付記７１に記載の方法。
７３．前記細胞懸濁液試料を前記固形組織診から調製することは、前記固形組織診の組織をホモジナイズすることを有する、付記７２に記載の方法。
７４．前記生検は、液体生検である、付記７０に記載の方法。
７５．前記細胞懸濁液試料を前記液体生検から調製することをさらに備える、付記７４に記載の方法。
【０１６０】
７６．前記生検は、穿刺吸引（ＦＮＡ）生検である、付記７０に記載の方法。
７７．前記細胞懸濁液試料を前記ＦＮＡ生検から調製することをさらに備える、付記７６に記載の方法。
７８．前記標識細胞懸濁液試料の前記細胞は、固定される、付記４４〜７７のいずれか一つに記載の方法。
７９．前記細胞懸濁液試料の前記細胞を固定することをさらに備える、付記４４〜７８のいずれか一つに記載の方法。
８０．前記細胞懸濁液の前記細胞を固定することは、前記接触前に実施される、付記７９に記載の方法。
【０１６１】
８１．前記細胞懸濁液の前記細胞を固定することは、前記接触中に実施される、付記７９に記載の方法。
８２．前記細胞懸濁液の前記細胞を固定することは、前記接触後に実施される、付記７９に記載の方法。
８３．前記細胞を固定することは、前記細胞懸濁液試料の前記細胞を穏和な架橋剤と接触させることを有する、付記７９〜８２のいずれか一つに記載の方法。
８４．前記穏和な架橋剤は、ホルムアルデヒドに基づく固定液を含む、付記８３に記載の方法。
８５．前記所定の閾値は、１個の細胞あたり１００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、付記４４〜８４のいずれか一つに記載の方法。
【０１６２】
８６．前記所定の閾値は、１個の細胞あたり５００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、付記８５に記載の方法。
８７．前記所定の閾値は、１０００個以上のＰＤ−Ｌ１分子である、付記８６に記載の方法。
８８．前記サイトメトリーによってアッセイすることは、前記細胞集団のサイズを定量化することをさらに有する、付記４４〜８７のいずれか一つに記載の方法。
８９．前記細胞集団の前記サイズが前記細胞懸濁液試料中の前記新生細胞の１％を超える場合に、前記新生物は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別される、付記８８に記載の方法。
９０．前記新生物は、免疫組織化学的検査によってＰＤ−Ｌ１陽性と以前に識別されている、付記４４〜８９のいずれか一つに記載の方法。
【０１６３】
９１．被検体を新生物について治療する方法であって、
抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法を、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性の新生物を含む被検体に投与することを備え、
前記新生物は付記４４〜９０のいずれか一つに記載の方法に従って、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別される、
方法。
９２．前記被検体は、化学療法によって以前に治療されている、付記９１に記載の方法。
９３．前記被検体は、放射線療法によって以前に治療されている、付記９１または９２に記載の方法。
９４．前記被検体は、免疫療法によって以前に治療されている、付記９１〜９３のいずれか一つに記載の方法。
９５．前記被検体は、免疫関連疾患を有するか、または免疫関連疾患を発症する増加したリスクにある、付記９１〜９４のいずれか一つに記載の方法。
【０１６４】
９６．前記抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）（ニボルマブ）、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）（アテゾリズマブ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、ＣＡ−１７０、ＢＭＳ−２０２、ＢＭＳ−８、ＢＭＳ−３７及びＢＭＳ−２４２からなる群から選択される１つ以上の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１療法の拮抗薬を前記被検体に投与することを備える、付記９１〜９５のいずれか一つに記載の方法。
９７．前記治療中に前記新生物の前記抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性を監視すること、及び、前記新生物が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性と識別されるときにのみ前記治療を継続することをさらに備える、付記９１〜９６のいずれか一つに記載の方法。
９８．前記監視することは、
前記新生物からの細胞懸濁液試料をＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバーと接触させ、標識細胞懸濁液を生成すること、
前記標識細胞懸濁液をサイトメトリーによってアッセイし、所定の閾値を超えるＰＤ−Ｌ１レベルを各発現する細胞集団が存在するか否かを検出し、前記腫瘍が抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫療法応答性であるか否かを識別すること
を有する、付記９７に記載の方法。
９９．ＰＤ−Ｌ１に特異的な標識結着メンバー、及び
固定試薬を含む細胞懸濁液固定液
を備える、キット。
１００．前記固定試薬は、穏和な架橋剤である、付記９９に記載のキット。
【０１６５】
１０１．前記穏和な架橋剤は、ホルムアルデヒドに基づく固定液を含む、付記１００に記載のキット。
１０２．透過処理試薬をさらに含む、付記９９〜１０１のいずれか一つに記載のキット。
１０３．前記細胞懸濁液固定液は、前記透過処理試薬を含む、付記１０２に記載のキット。
１０４．細胞破砕装置をさらに備える、付記９９〜１０３のいずれか一つに記載のキット。
１０５．ＤＮＡ標識試薬をさらに備える、付記９９〜１０４のいずれか一つに記載のキット。
【０１６６】
１０６．発現した細胞周期マーカーに特異的な標識結着メンバーをさらに備える、付記９９〜１０５のいずれか一つに記載のキット。
１０７．免疫細胞に特異的な少なくとも１個の標識結着メンバーをさらに備える、付記９９〜１０６のいずれか一つに記載のキット。
１０８．免疫細胞に特異的な前記少なくとも１個の標識結着メンバーは、リンパ球マーカーＣＤ４５に特異的な標識結着メンバーを含む、付記１０７に記載のキット。
１０９．免疫細胞に特異的な前記少なくとも１個の標識結着メンバーは、リンパ球マーカーＣＤ８に特異的な標識結着メンバーを含む、付記１０７または１０８に記載のキット。
１１０．生検採取装置をさらに備える、付記９９〜１０９のいずれか一つに記載のキット。
【実施例】
【０１６７】
以下の実施例は、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示され、発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図されず、また下記の実験が実施されるすべての実験である、若しくは下記の実験だけが実施される実験であることを表すことをも意図されない。使用された数（たとえば、量、温度など）に関する精度を確保する努力がなされてきたが、ある程度の実験上の誤差及び偏差は、考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は、質量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧、またはほぼ大気圧である。
【０１６８】
分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ１９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ１９９７）；及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）などの標準的な教科書に見出されることが可能であり、これらの本開示は、参照により本明細書に援用される。本開示に言及される遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、及びキットは、販売業者、たとえば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＣｌｏｎＴｅｃｈから利用可能である。
【０１６９】
実施例１
細胞懸濁液を、新たに採取された肺組織、またはＢｒｉｆｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ．１９８２  Ｍａｒ−Ａｐｒ；２６（２）：１９５−２００）に記載されるような非吸引穿刺細胞診（ＦＮＮＡＣ）方法（別名、「穿刺吸引細胞診（Ｃｙｔｏｐｕｎｃｔｕｒｅ）」方法）に従って穿刺吸引（ＦＮＡ）によって採取された試料から調製した。試料を健常な肺を含む被検体から、また非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む患者から採取した。
【０１７０】
新たに採取されたこれらの試料を、ＩｎｃｅｌｌＤｘ，Ｉｎｃ．ｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐ試料調製プロトコル（ＩｎｃｅｌｌＤｘ，Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して調整した。簡潔に、ｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐプロトコルは、単一細胞懸濁液を新たなヒト由来組織試料から調製するように設計される。ホモジナイザーは、組織を穏やかに撹乱し、ｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐ試薬は、個々の細胞を懸濁液中で固定し、透過処理する。ｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐプロトコルは、非酵素である。得られた組織が少ない試料を一体型キャップを備えた提供された２ｍＬの微量遠心機のチューブに配置した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（Ｄ−ＰＢＳ）（約８００μＬ）及びホモジナイザーをこのチューブに加えた。ホモジナイザーを電源に接続し、低速でブレードを回転させるように設定した（約１Ｖに調整された電圧）。穏和な組織撹乱は、生じ、細胞膜をせん断せずに無傷の細胞を除去した。組織撹乱が完了した後に、ホモジナイザーを処分した。生成された細胞懸濁液を遠心分離し（５分間約６００ｇで）、吸引によって、Ｄ−ＰＢＳの除去を容易にした。固定及び透過処理のために、遠心分離した細胞をｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐ試薬（約２ｍＬ）中で少なくとも１時間、環境温度で再懸濁した。
【０１７１】
調製された、ＦＮＮＡＣまたはｉｎｃｅｌｌＰｒｅｐのいずれかの細胞懸濁液を遠心分離して（６００ｇ、５分間）吸引し、ＰＢＳ／２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を加えた。このＰＢＳ／２％のＢＳＡ溶液を遠心分離及び吸引によって除去した。免疫細胞（ＣＤ３／ＣＤ８／ＣＤ４５）及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体（クローン２８−８またはＥ１Ｌ３Ｎ、コンジュゲートされた蛍光）の検出のための抗体を含む抗体パネルによって、これらの細胞懸濁液を３０分間環境温度で標識する。標識混合物を遠心分離及び吸引によって除去し、これらの細胞を、穏和なボルテックスによって１ｍＬのＰＢＳ／２％のＢＳＡ溶液により洗浄した。洗浄液の除去後、２００μＬのＤＡＰＩ標識液を作業濃度で加え、標識細胞懸濁液を暗所中に環境温度で３０分間、インキュベートした。
【０１７２】
４８８ｎｍ及び４０５ｎｍのレーザ構成を含む、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙｔｏＦＬＥＸプラットフォームをサイトメトリー解析に使用した。対照試料（ＳＵＰＭ２、ＰＤ−Ｌ１陽性対照細胞；ＰＣ３  ＰＤ−Ｌ１陰性対照細胞）をＰＤ−Ｌ１発現量について解析した。対照試料のサイトメトリー解析の結果を図１（左側パネル−陽性対照；右側パネル−陰性対照）に提供し、ＰＤ−Ｌ１発現細胞とＰＤ−Ｌ１非発現細胞との間に明確な分離を示した。
【０１７３】
ＰＤ−Ｌ１陽性細胞の割合のフローサイトメトリー定量化の直線性を評価した。簡潔に、既知の量の陽性対照細胞を添加された陰性細胞の試料を使用して、細胞混合実験を実施し、さまざまな抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用して、陽性細胞のフローサイトメトリー検出のために、これらの試料をアッセイした。図２に、直線性試験からのデータを提供し、さまざまな割合のＰＤ−Ｌ１陽性対照細胞（ｘ軸）を有する混合された細胞試料にわたり計算されたＰＤ−Ｌ１陽性の割合（ｙ軸）について強い直線性を示した。
【０１７４】
また細胞あたりのＰＤ−Ｌ１発現量のフローサイトメトリー定量化の直線性をアッセイした。計算された細胞あたりのＰＤ−Ｌ１受容体発現量は、既知の蛍光色素対タンパク質（ＦＴＰ）比を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンを使用する細胞染色法の平均蛍光強度に基づいた。対応する標準的な可用性蛍光色素分子等量（ＭＥＳＦ）ビーズを各試料に行い、定量化を促進した。蛍光色素の既知のコピーを含む、ＭＥＳＦビーズの使用は、既知の標準物質中の蛍光色素コピー数に対する、ビーズまたは細胞の合計蛍光色素に基づく定量的標準曲線の導出を可能にする。抗体（ＦＴＰ）に結着する既知の蛍光色素分子数、細胞／細胞型あたりの受容体コピーに基づき、すべての実施及び計算に関してＭＥＳＦビーズ標準を行うことによって、受容体コピー数を細胞あたりの基準に基づき決定した。ＭＥＳＦに基づき標準化された定量化の例を図３に提示する。
【０１７５】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７によって１：１のＦＴＰとして標識された２８−８抗ＰＤ−Ｌ１クローンを含む半自動化された、９６ウェルパネルを使用して、ＰＤ−Ｌ１フローサイトメトリー定量化アッセイを、患者由来のＮＳＣＬＣ試料を用いて妥当性確認した。アッセイは、バックグラウンド経由でＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の割合の定量化、及び細胞あたりの基準でＰＤ−Ｌ１受容体数を含んだ。このような定量化は、健常な（「正常な肺」）患者試料、及びＮＳＣＬＣ（「腫瘍」）患者試料から腫瘍細胞、及び免疫細胞サブセットの両方に実施された。図４に示されるように、ＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞の検出は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞をサイトメトリーによって検出する、この手法の使用を妥当性確認した、腫瘍試料に限定された。
【０１７６】
検査は、ＰＤ−Ｌ１発現量を二倍体細胞及び異数体細胞において同様に定量化することが可能であることを示した。この手法を使用して、たとえば、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞の割合、腫瘍細胞あたりに発現したＰＤ−Ｌ１受容体の平均数、ＰＤ−Ｌ１を発現する免疫細胞の割合、免疫細胞あたりに発現したＰＤ−Ｌ１受容体の平均数、ＰＤ−Ｌ１を発現する異数体腫瘍細胞集団の割合、ＰＤ−Ｌ１を発現する二倍体腫瘍細胞集団の割合、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の割合などを含む、さまざまな定量化測定を評価することができる。
【０１７７】
実施例２
さらに腫瘍及び免疫細胞について、臨床肺試料を調製し、フローサイトメトリーによって解析し、ＰＤ−Ｌ１及び細胞周期色素データを取得した。取得されたデータの例を図５に提供される表２に示す。また表２における比較のために提供されるものは、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によって評価されるような、ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍データの割合である。
【０１７８】
さらに、ベースラインとして使用された対照データに加えて、２２個の臨床肺試料から得られたデータを解析した。本明細書に記載された手法が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び細胞周期色素データを定量化する場合に、ＴＩＬの増殖状態を評価することが可能である。図６は、正常組織試料、腫瘍組織試料（２個の独立したアッセイからの）、及び対照細胞試料から決定されるようなＴＩＬ及びヘルパーＴ細胞のＧ１後の量を示す。このデータは、正常組織中に存在するＴＩＬと比較して、腫瘍組織中に存在するＴＩＬの増加した増殖を示す。加えて、対照ＰＢＭＣをＰＢＭＣのマーカーとして使用するときに、腫瘍組織は、ＣＤ８＋ＴＩＬ（３５．９％対２２．３％）の流入を有することがわかった。まとめると、このデータは、腫瘍組織空間内のＴＩＬにおける増加を実証し、これらのＴＩＬが正常組織と比較して増殖を増加させたことを実証する。
【０１７９】
また、非Ｔ細胞と比較してマクロファージの相対的な存在は、得られたデータの中で比較された。図７に示されるように、正常な肺組織試料と比較して、肺腫瘍組織試料（２個の独立したアッセイ）中で減少したマクロファージ数を観察した。したがって、本明細書に記載される解析方法は、正常組織と比較して、腫瘍組織が抗原提示細胞を失うことをも実証する。その結果、総じてこの例に提示されるデータは、記載された方法がマクロファージの減少、非Ｔ細胞の増加、ならびに腫瘍組織中のＣＤ８＋ＴＩＬ、及び両方のＣＤ３＋サブセットの増殖における増加を検出することが可能であることを示す。加えて、図８に示されるように、記載された方法は、肺組織試料（正常組織中の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）について正規化された）中で、二倍体ＣＴＬの量と比較して、ＣＴＬ間の異数性における増加を検出することも可能である。
【０１８０】
これらのデータは、腫瘍組織内に存在する免疫細胞の特性、たとえば、腫瘍組織内のある一定の免疫細胞集団のサイズ、これらの集団内の異数性の量、及び同様のものなどを含む、腫瘍組織試料の臨床的に有用な特性を検出して、定量化する、本明細書に記載された方法の能力をさらに実証する。アッセイが腫瘍組織中のこれらの細胞集団、及びその割合を定量化することが可能であるだけではなく、細胞周期色素解析の使用により、たとえば、免疫浸潤物の増殖などを含む、検出される細胞の機能状態を判定することがさらに可能になる。
【０１８１】
実施例３
上記に要約されるように、本明細書に記載される方法をさらに用いて、直接的に、または間接的に、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）について組織試料を解析することが可能である。例として、フローサイトメトリーによって、細胞周期色素及びＣＴＣ検出を使用して、肺組織試料を免疫細胞マーカー、ＰＤ−Ｌ１及び細胞周期パラメータについて解析した。表３は、以下のように、このような評価からのデータを提供する。
【０１８２】
【表２】
2019535001.tif 000006
【０１８３】
上記のデータにみられることが可能であるように、原発性肺腫瘍中の異数性の検出は、ＣＴＣの存在を示す。したがって、この例に提示される結果は、ＣＴＣが存在する可能性があるか否かを予測するために、腫瘍組織試料から本明細書に記載された方法に従って得られる、異数性データの使用をさらに裏付ける。
【０１８４】
前述したことは、本発明の原理を説明するに過ぎない。当業者が明示的に本明細書に記述されない、または示されないが、本発明の原理を具現化する、またその趣旨及び範囲内に含まれる、さまざまな配置を考案することができることを理解する。さらに、本明細書に列挙されるすべての例及び条件付き言語は、本発明の原理と、当該技術分野を推進することに発明者らが寄与する概念とを理解する際に読み手を援助することを主に意図され、これらのように具体的に列挙された例及び条件に限定せずに解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書中のすべての記載は、その構造上の、また機能上の均等物の両方を包含することを意図される。加えて、これらのような均等物が現在知られている均等物、及び将来に開発される均等物の両方、すなわち、構造に関係なく同一の機能を実行するように開発されるいずれかの要素を含むことを意図する。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載される例示的な実施形態に限定されることを意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【０１８５】
関連出願の相互参照
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従い、本出願は、２０１６年９月６日に出願された、米国仮特許出願第６２／３８４，０３７号の出願日に優先権を主張し、その本開示は、本明細書に参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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