(57)【要約】本発明は、血液サンプルにおける血管内フィブリンの分解の結果もたらされた、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法に関し、この方法はサンプルに含有されるＤダイマーのルーチンアッセイと、そのサンプルにおけるフィブリン形成の動的測定とを含む。この方法は、患者における肺塞栓症もしくは深部静脈血栓症を除外するため、および／または患者における血栓症もしくは凝固活性化もしくは血栓形成傾向を診断するために使用されてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの血液サンプル中の静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法であって、前記方法は、一方では前記サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）を得るための前記サンプル中のＤダイマーの前記アッセイを含み、他方ではこの同じサンプル中のフィブリン形成の動的測定を含み、前記動的測定は以下のステップ、
ａ）前記サンプル中の凝固の活性化をトリガすることなく開始するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、前記インキュベートされたサンプル中でトロンビンの生成およびフィブリン血餅の形成をトリガするステップと、
ｃ）前記フィブリン血餅を形成するｂ）で得られた前記サンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップと、
ｄ）ｃ）で分析された前記フィブリン血餅の形成プロファイルを確立し、前記プロファイルから、プロファイル曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された前記サンプルの特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））とを抽出するステップと、
ｅ）血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）を算出するステップであって、
ｅ１）凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／ＨＣ）を得るために、ｄ）で定められたＦＦＴを用いて前記凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベルの関数として前記サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）を調整するステップ、および
ｅ２）Ｒを得るために、ｄ）で定められたＶｐ（ＴＡ）を用いて炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてｅ１）で得られた調整ＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／ＨＣを調整するステップ
によって算出するステップと、
ｆ）ｅ）で得られた前記フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲを、閾値に対して、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの前記閾値に対して比較するステップと、
ｇ）ｅ）で得られた前記フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲと、前記サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）とを用いて、凝固活性化状態において存在する線溶亢進によって生成されたフィブリノゲン分解産物のレベル（ＦｇＤＰ（ＨＦ））を定めるステップと、
ｈ）ｇ）で得られた前記ＦｇＤＰ（ＨＦ）レベルを閾値に対して比較し、ｄ）で得られた前記フィブリン形成時間（ＦＦＴ）を閾値に対して比較するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｅ）において、初期フィブリノゲン量（ＦＥＵ）で表されるレベルＲを算出するステップは、
ｅ１）次の等式を用いて、凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／ＨＣ）を算出するステップであって、
【数１】
2019507345.tif 000040
ここで対照時間とは、ステップａ）〜ｄ）に従って測定された、血栓症の疑いのない健康な患者からのサンプルの平均フィブリン血餅形成時間である、ステップ、および
ｅ２）次の等式を用いてレベルＲを算出するステップであって、
【数２】
2019507345.tif 000041
ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））は、次の等式を有する標準曲線における特性の値Ｖｐ（ＴＡ）に対して演繹されるフィブリノゲン濃度であり、
ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂ、
ここで
ｙは前記フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された特性の値であり、
ｘは前記フィブリノゲン濃度であり、
ａおよびｂは、前記フィブリンプラトーのレベルと前記フィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式の定数であり、
前記標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、前記血液サンプルの前記フィブリノゲン濃度が定められており、かつその特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））がステップａ）〜ｄ）によって定められている、ステップ
によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｆ）において、ｅ）で得られたレベルＲが前記閾値未満、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値未満であることは、前記患者における血栓症を除外することを可能にし、ｅ）で得られたレベルＲが前記閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いことは、前記患者における血栓症の可能性を示すことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｇ）は、
ｇ１）既知のレベルのＦｇＤＰおよび既知のレベルのＤダイマーを有する血液サンプルを用いて確立された標準曲線において、前記サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）に対応するＦｇＤＰのレベルを定めるステップと、
ｇ２）ｇ１）で用いられた前記標準曲線において、ステップｅ）で得られた調整されたＤダイマーのレベル（Ｒ）に対応するＦｇＤＰのレベルを定めるステップと、
ｇ３）ｇ１）で得られたＦｇＤＰのレベルからｇ２）で得られたＦｇＤＰのレベルを引くことによって、線溶亢進によって生成されたＦｇＤＰのレベル（ＦｇＤＰ（ＨＦ））を定めるステップとで構成されるステップを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｈ）は、
ｈ１）ＦｇＤＰ（ＨＦ）と閾値、特に１μｇ／ｍｌの閾値とを比較するステップであって、ＦｇＤＰ（ＨＦ）が前記閾値未満または陰性であることは、前記患者における血栓症を除外することを可能にし、ＦｇＤＰ（ＨＦ）が前記閾値よりも高いことは、前記患者における血栓症の可能性を示す、ステップ、
ｈ２）ＦＦＴと閾値、特に［ｅ１）の対照時間−１標準偏差］に等しい閾値、たとえば１３５秒の対照時間に対する１２０秒の閾値とを比較するステップであって、ＦＦＴが前記閾値未満であることは、患者が血栓症を有さないが急性凝固活性化状態を有することを示し、ＦＦＴが前記閾値よりも高いことは、前記患者における血栓症を示す、ステップ
で構成されるステップを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
−  ステップｈ２）において血栓症が診断されたとき、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は、ステップｅ）で得られたＤダイマーのレベルＲであり、
−  ステップｈ１）およびｈ２）において血栓症が除外されたが、ステップｅ）で得られたレベルＲは閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いとき、前記方法は、次の等式を用いて静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）を算出するステップからなるステップも含み、
【数３】
2019507345.tif 000042
ここでＤｄｉＳは、前記サンプル中のＤダイマーのレベルであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者からの血液サンプル中の静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法であって、前記方法は、一方では前記サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）を得るための前記サンプル中のＤダイマーの前記アッセイを含み、他方ではこの同じサンプルのフィブリン形成の動的測定を含み、前記動的測定は以下のステップ、
ａ）前記サンプル中の凝固の活性化をトリガすることなく開始するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、前記インキュベートされたサンプル中でトロンビンの生成およびフィブリン血餅の形成をトリガするステップと、
ｃ）前記フィブリン血餅を形成するｂ）で得られた前記サンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップと、
ｄ）ｃ）で分析された前記フィブリン血餅の形成プロファイルを確立し、このプロファイルから、前記プロファイルの曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された前記サンプルの特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））とを抽出するステップと、
ｅ’）血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）を算出するステップであって、
ｅ’１）炎症に対して調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／Ｉ）を得るために、ｄ）で定められたＶｐ（ＴＡ）を用いて炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数として前記サンプルのＤダイマーのレベルＤｄｉＳを調整するステップ、および
ｅ’２）低いＤダイマーレベルに対してｅ’１）で得られた炎症に対して調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／Ｉ）を補正するステップ
によって算出するステップ、ならびに
炎症の関数として前記患者からの前記サンプルを分類するステップと、
ｆ’）ｅ）で得られた前記フィブリンの前記分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲを、閾値に対して、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値に対して比較するステップと、
ｇ’）前記サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）およびｅ’）で得られたレベルＲを用いるか、またはｅ’１）で得られた炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／Ｉおよびｅ’）で得られたレベルＲを用いて、線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｄｄｉ（ＨＦ））を定めるステップと、
ｈ’）ｇ’）で得られたレベルＤｄｉ（ＨＦ）を閾値に対して比較し、ＴＡ／ＦＦＴ比率を閾値に対して比較するステップであって、ここでＴＡはｄ）で得られた前記フィブリン重合プラトーに達する時間であり、ＦＦＴはｄ）で得られた前記フィブリン形成時間である、ステップと
を含む、方法。
【請求項８】
ステップｅ’）において、初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表されるレベルＲは、
ｅ’１）次の等式によって、炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／Ｉ）を算出するステップであって、
【数４】
2019507345.tif 000043
ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））は、次の等式を有する標準曲線における特性の値Ｖｐ（ＴＡ）に対して演繹されるフィブリノゲン濃度であり、
ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂ、
ここで
ｙは前記フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された特性の値であり、
ｘは前記フィブリノゲン濃度であり、
ａおよびｂは、前記フィブリンプラトーのレベルと前記フィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式の定数であり、
前記標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、前記血液サンプルの前記フィブリノゲン濃度が定められており、かつその特性の値Ｖｐ（ＴＡ）がステップａ）〜ｄ）によって定められている、ステップ、
ｅ’２）ｅ’１）で得られたレベルＤｄｉＳ／Ｉを次の等式によって補正するステップであって、
Ｒ＝ＤｄｉＳ／Ｉ＋［０．５−ＦＤｄｉ−Ｓ］
ここでＦＤｄｉ−Ｓは低いＤダイマーレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対する補正因子であり、ＦＤｄｉ−Ｓの値は次の等式を有する前記標準曲線における前記サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）に対する前記補正因子の値に対応し、
ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ
ここでｙは前記補正因子Ｆであり、
ｘはＤダイマーのレベルであり、
ａ、ｂおよびｃは、前記補正因子とＤダイマーのレベルとを結び付ける多項式の定数であり、
前記標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、前記血液サンプルのＤダイマーのレベルが定められており、かつそれに対する前記補正因子が経験的に定められているため、レベルＤｄｉＳ／Ｉが０．５μｇ／ｍｌ  ＦＥＵ（フィブリノゲン換算量）の前記閾値に関連付けられる、ステップ
によって得られることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップｅ’）において、炎症の関数として前記患者からの前記サンプルを分類するステップは、
−  比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））を算出するステップであって、ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））はｅ１’）で定められた前記フィブリノゲン濃度である、ステップ、および
−  もし比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））＞０．２０であれば、前記患者からの前記サンプルを炎症を有さない患者のグループＩに分類するステップ、または
−  もし比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））≦０．２０であれば、前記患者からの前記サンプルを炎症を有する患者のグループＩＩに分類するステップ
を含むことを特徴とする、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｆ’）において、ｅ’）で得られたレベルＲが前記閾値未満、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値未満であることは、前記患者における血栓症を除外することを可能にし、ｅ’）で得られたレベルＲが前記閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いことは、前記患者における血栓症の可能性を示すことを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｇ’）において、線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＨＦ）は、
ｇ’１）次の等式
【数５】
2019507345.tif 000044
を用いて、ステップｅ’）で定められたレベルＲと前記サンプルのＤダイマーのレベルＤｄｉＳとの比率として算出され、
ｇ’２）次の等式
【数６】
2019507345.tif 000045
を用いて、ステップｅ’）で定められたレベルＲとｅ’１）で得られたレベルＤｄｉＳ／Ｉとの比率として算出されることを特徴とする、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｈ’）において、
ｇ’１）で得られたレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔは、次のステップによって閾値と比較され、
ｈ’１）前記サンプルのレベルＤｄｉＳに対して、次の等式を有する標準曲線において比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄの値を定めるステップであって、
ｙ＝ａｘ−ｂ
ここでｘはＤダイマーのレベルであり、
ｙは血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルと、Ｄダイマーのレベルとの比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）であり、
ａおよびｂは、比率Ｒ／ＤｄｉＳとＤダイマーのレベルとを結び付ける等式の定数であり、
前記標準曲線は、
−  前記患者からの前記サンプルがグループＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用い、
−  前記患者からの前記サンプルがグループＩＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用いて確立されたものである、ステップ、ならびに
ｈ’’１）ｇ’１）で得られた線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔの値と、ｈ’１）で得られた比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄの値とを比較するステップであって、ここで
（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄ未満であることは、前記患者における血栓症を除外することを可能にし、（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄ以上であることは、前記患者における血栓症の可能性を示す、ステップであり、
ｇ’２）で得られたレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔは、次のステップによって閾値と比較され、
ｈ’２）前記サンプルのレベルＤｄｉＳに対して、次の等式を有する標準曲線において比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄの値を定めるステップであって、
ｙ＝ａｘ−ｂ
ここでｘはＤダイマーのレベルであり、
ｙは血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルと、炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルとの比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）であり、
ａおよびｂは、比率Ｒ／ＤｄｉＳ／ＩとＤダイマーのレベルとを結び付ける等式の定数であり、
前記標準曲線は、
−  前記患者からの前記サンプルがグループＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、ステップａ）〜ｅ’１）によって得られたそのレベルＤｄｉＳ／Ｉ、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用い、
−  前記患者からの前記サンプルがグループＩＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、ステップａ）〜ｅ’１）によって得られたそのレベルＤｄｉＳ／Ｉ、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用いて確立されたものである、ステップ、ならびに
ｈ’’２）ｇ’２）で得られた線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔの値と、ｈ’２）で得られた比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄの値とを比較するステップであって、ここで
（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄ未満であることは、前記患者における血栓症を除外することを可能にし、（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄ以上であることは、前記患者における血栓症の可能性を示す、ステップ
であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｈ’）において、比率ＴＡ／ＦＦＴを閾値に対して比較するステップは、
ｈ’３）比率ＴＡ／ＦＦＴを算出するステップであって、ここでＴＡはステップｄ）で定められた前記フィブリン重合プラトーに達する時間であり、ＦＦＴはステップｄ）で定められたフィブリン血餅形成時間である、ステップと、
ｈ’’３）前記患者からの前記サンプルがグループＩに分類されたとき：
比率ＴＡ／ＦＦＴを第１の閾値、特に第１の閾値１．７５に対して比較するステップであって、ここで
比率ＴＡ／ＦＦＴが前記第１の閾値より高いことは、グループＩに分類された前記患者における血栓症を除外し、かつ血栓形成傾向または凝固活性化状態を診断することを可能にし、
比率ＴＡ／ＦＦＴが前記閾値以下であることは、グループＩに分類された前記患者における血栓症を示す、ステップ、
前記患者からの前記サンプルがグループＩＩに分類されたとき：
比率ＴＡ／ＦＦＴを第１の閾値、特に第１の閾値１．６５に対して比較するステップであって、ここで
比率ＴＡ／ＦＦＴが前記第１の閾値より高いことは、グループＩＩに分類された前記患者における血栓症を除外し、かつ血栓形成傾向または凝固活性化状態を診断することを可能にし、
比率ＴＡ／ＦＦＴが前記閾値以下であることは、グループＩＩに分類された前記患者における血栓症を示す、ステップと
を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
−  ステップｈ’’３）において血栓症が診断されたとき、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は、ステップｅ’）で得られたＤダイマーのレベルＲであり、
−  ステップｈ’’１）、ｈ’’２）およびｈ’’３）において血栓症が除外されたが、ステップｅ’）で得られたレベルＲは前記閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いとき、前記方法は、次の等式を用いて静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）を算出するステップで構成されるステップも含み、
【数７】
2019507345.tif 000046
ここでＤｄｉＳは、前記サンプル中のＤダイマーのレベルであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記血液サンプルは１μｌから３００μｌ、好ましくは５０μｌから２００μｌの体積を有することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記血液サンプルは無希釈であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルのＤダイマーの前記アッセイは、免疫比濁法または免疫酵素法に従って行われることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップａ）は、前記患者からの前記血液サンプルと組織因子と任意にはリン脂質とを混合するステップ、好ましくは前記患者からの前記血液サンプルと組織因子とリン脂質とを混合するステップによって行われることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップａ）の前記組織因子は、０．５〜５ｐＭ、好ましくは２ｐＭの濃度で存在することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップａ）の前記混合物はカルシウムイオンを含むことを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）は、ステップａ）で得られた前記混合物を３０℃から４０℃の温度にて２０秒から４００秒、好ましくは６０秒から３００秒の時間インキュベートするステップを含むことを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップｂ）において、トロンビン生成およびフィブリン血餅形成をトリガするステップは、インキュベートされた前記サンプルにカルシウムイオンを加えるステップによって行われることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
患者からの前記血液サンプルは血漿サンプルであることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記血漿サンプルは乏血小板血漿サンプルであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップｃ）において、ｂ）で得られた前記サンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップは、３５０〜８００ｎｍの波長、好ましくは５４０ｎｍの波長における光学濃度の時間変動（ＤＯＤ）を測定するステップによって行われることを特徴とする、請求項２３および２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップｃ）の光学濃度の測定は、前記Ｄダイマーをアッセイするために用いられるのと同じ波長である５４０ｎｍにて行われることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者からの前記血液サンプルは全血サンプルであることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記全血サンプルはクエン酸全血サンプルであることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｂ）で得られた前記サンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップは、トロンボエラストグラフィ、レオメトリ、または画像分析によって行われることを特徴とする、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくともステップｃ）およびｄ）は、自動診断デバイスまたは遠隔生物学アナライザ、好ましくは凝固アナライザにおいて行われることを特徴とする、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
患者における静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を診断するためのインビトロの方法であって、
−  請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法を用いて、前記患者からの血液サンプルにおけるＶＴＥに対して特異的なＤダイマーのアッセイを行うステップと、
−  前記患者に関する診断を提供するステップと
で構成されるステップを含む、診断のインビトロの方法。
【請求項３２】
前記患者に関する前記診断とは（ｉ）血栓症の除外、（ｉｉ）急性凝固活性化状態、または（ｉｉｉ）血栓症であることを特徴とする、請求項３１に記載の診断のインビトロの方法。
【請求項３３】
前記患者が高齢の個体であるか、がんである患者であるか、感染症である患者であるか、または血栓形成傾向である患者であるとき、ＶＴＥに対して特異的なＤダイマーを前記アッセイするステップは、請求項７〜１４および１５〜３０のいずれか一項に記載の方法を用いて行われることを特徴とする、請求項３１に記載の診断のインビトロの方法。
【請求項３４】
前記患者に関する前記診断とは（ｉ）血栓症の除外、（ｉｉ）急性凝固活性化状態、（ｉｉｉ）血栓形成傾向、または（ｉｖ）血栓症であることを特徴とする、請求項３２に記載の診断のインビトロの方法。
【請求項３５】
前記患者に関する前記診断とは、重篤でない血栓症または肺梗塞の場合の血栓症であることを特徴とする、請求項３４に記載の診断のインビトロの方法。
【請求項３６】
静脈血栓塞栓症に対して特異的な高いＤダイマーのレベルＤｄｉＶＴＥは、肺塞栓症または深部静脈血栓症の程度を表すものであることを特徴とする、請求項６、１４および１５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
親出願
本国際出願は、本明細書においてその内容を全体として引用により援用する、２０１６年２月１８日出願の仏国特許出願第１６  ５１３４８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、血液サンプル中の静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法に関し、この方法は、一方ではサンプルのＤダイマーのルーチンアッセイを含み、他方ではこのサンプルのフィブリン形成の動的測定を含む。この方法は特に、血液サンプルにおける肺塞栓症および深部静脈血栓症のインビトロ診断に対して意図されるものである。
【背景技術】
【０００３】
本発明の状況
静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ：Ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ）は、主要な公衆衛生の問題である。それは、深部静脈血栓症（ＤＶＴ：ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）およびその即時型の生命の危険性のある肺塞栓症（ＰＥ：ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｍｂｏｌｉｓｍ）の概念をグループ化したものである。ＶＴＥの病原論の基本原理はウィルヒョウ（Ｖｉｒｃｈｏｗ）によって説明されており、ウィルヒョウは３つの血栓症促進因子の組み合わせにおいて血栓症の起源を定義しており、それらの血栓症促進因子とは静脈うっ血と；内皮の機能異常または障害と；凝固因子の活性化、過粘稠、抗トロンビン欠損、血栓形成傾向、ネフローゼ症候群、深刻な身体的外傷または熱傷の後の変化、播種性がん、妊娠後期、民族性、年齢、喫煙、または肥満症による凝固性亢進とである（非特許文献１）。
【０００４】
肺塞栓症（ＰＥ）はすべての救急医に恐れられている疾患である。なぜなら肺塞栓症（ＰＥ）はしばしば非常に異なる症状によって顕在化するか、または完全に無症状であるために診断が難しく、おそらくは診断が最も困難な疾患の１つだからである。肺塞栓症は一般的な状態であるため、突然起こる任意の呼吸異常はこの診断を示唆するはずである。それは急性の恐ろしい胸部痛を引き起こす。心電図、心筋酵素（トランスアミナーゼ、トロポニンなど）のアッセイ、および肺シンチグラフィによって、それを心筋梗塞と区別する必要がある。それを、抗凝固剤の使用が禁忌となる急性心膜炎および大動脈解離と区別する必要がある。
【０００５】
いくつかのタイプのＰＥが存在する。
−  急性肺性心を伴う肺塞栓症は致命的になり得るものであり、特に外科手技後の寝たきりの患者に起こる。それは最初の数時間で悪化するおそれがあり、外科手技または塞栓除去術または血栓溶解処置を必要とする。致死的転帰はなおも非常に一般的である。
−  突然死または虚脱による数分以内の死をもたらす、激烈な肺塞栓症。
−  あまり明白ではない肺塞栓症は非常に一般的であり、その症状はしばしば判断を誤らせる。その診断はしばしば数日後に届く。
−  心不全および呼吸不全である患者における肺塞栓症は一般的であり、その重篤性から予防的な抗凝固剤処置を必要とする。
【０００６】
深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の臨床徴候は、しばしばあまり明白ではないか、存在すらしないか、または進行してＰＥにならないために重篤性がずっと低い表在性静脈血栓症の臨床徴候に類似するものである。次のものからＤＶＴを区別する必要がある。
−  深部血腫、なぜなら抗凝固剤処置が出血を促進することになるため、
−  脚の皮下の感染性疾患、
−  静脈炎後疾患、および
−  かなり類似した臨床像を与える膝窩嚢胞の破裂。
【０００７】
次の３つのタイプの合併症が存在する。ＰＥ、その症例の半分近くは完全に無症候性である；静脈系における血栓の伸長；および患者の３分の１近くにおける一般的な合併症である静脈炎後疾患。
【０００８】
スコアによって、呼吸困難または胸部痛の存在下でのＰＥの臨床的確率の評価が可能になる。患者の処置を最適化するため、特に治療のアプローチを定めるための診断デシジョンツリーにおいて、スコアが用いられる。現在の診断アルゴリズムは、以下を含むアプローチに基づくものである。
−  臨床的確率を評価する第１のステップ：ＤＶＴのウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）スコア（非特許文献２）、ＰＥのウェルズスコアまたはジュネーブ（Ｇｅｎｅｖｅ）スコアおよびそれらの簡略化バージョン（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、いくつかの危険因子、症状および臨床徴候をグループ化したもの、
−  その後大部分の場合には、非常に感受性が高いがあまり特異的な検査ではないＤダイマーのアッセイが続き、それが陽性であるときには  ヨウ素化造影製品の注射を伴うスパイラル胸部血管走査、またはＰＥにおける肺シンチグラフィ、またはＤＶＴにおけるドップラーの実施が課される。低い臨床的確率と、０．５μｇ／ｍｌの閾値未満のＤダイマーレベルとの組み合わせによって、優れた陰性の予測値によってＰＥまたはＤＶＴの存在を除外することが可能になる。
【０００９】
除外テストとしてＤダイマーアッセイを用いることの結果として、血栓を可視化し、かつＰＥの場合には発症した肺動脈の数およびタイプから重篤度を診断するために、高価なイメージングテストに頼ることが必要となる。加えて、こうした検査は救急科における患者の滞在を延長し、照射の要因であり、少なからぬコストの原因となる。血管走査は、ヨウ素化造影製品に対するアレルギー反応、腎不全、および肺水腫の原因となることがある。
【００１０】
図１に示されるとおり、Ｄダイマー抗原は、トロンビンと、凝固因子ＦＸＩＩＩａと、プラスミンとの連続的作用によって形成されるフィブリンの分解の一意のマーカーである。具体的には、トロンビンがフィブリノゲンを切断してフィブリンモノマーにし、このフィブリンモノマーが重合して、ＦＸＩＩＩａおよびプラスミン形成に対する基質の役割をする。次いで、トロンビンがフィブリンに連結したままでフィブリンポリマーに結合したＦＸＩＩＩを活性化することによってＦＸＩＩＩａを生成し、このＦＸＩＩＩａが重合フィブリンのＤドメイン間の共有結合の形成を触媒する。最後に、プラスミンが重合フィブリンを分解することによって、Ｄダイマー−フラグメントＥ複合体を含有する最終生成物を含むさまざまな分子量のフィブリン分解産物（ＦＤＰ：ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を放出し、かつＤダイマー抗原を露出し、このＤダイマー抗原はプラスミンによって放出されるまでは検出不可能なままである。Ｄダイマー抗原は、フィブリン血餅に取り込まれる前のフィブリンに由来するＦＤＰにも、プラスミンによる血餅の分解後に放出される高分子量複合体にも存在し得る（非特許文献６）。
【００１１】
Ｄダイマーは、フィブリン血餅形成および線維素溶解のマーカーである。線維素溶解は、血餅の安定性およびそれが血餅形成後に始まるときには血栓の危険性に重要な役割を果たす。もしそれが同時に開始されれば、トロンビン−フィブリン結合とプラスミン−フィブリン結合との間、したがってフィブリンの形成と溶解との間に競合が存在する。
【００１２】
Ｄダイマーは可溶性フィブリンポリマーの分解から生じ、これは血管内凝固活性化のマーカーである（非特許文献７）。図２に示されるとおり、凝固亢進状態および急性炎症性状態において、Ｄダイマーは炎症部位に局所的に存在する酵素による血管外フィブリン分解からも生じる。この概念は、がんまたは急性炎症性状態である患者においてしばしばＤダイマーのレベルが高いことによって支持される（非特許文献８）。
【００１３】
線維素溶解が広がって全身性になるとき（「線溶亢進」）、大過剰に生成したプラスミンによるフィブリノゲン分解が可能になる。図２に示されるとおり、それはＤダイマーを含むフィブリン分解産物と、フィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ：ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）との両方の循環に現れる。よって、がんおよび顕著な凝固活性化状態においては、高いＤダイマーレベルと高いＦｇＤＰレベルとの組み合わせが生じる。
【００１４】
現在用いられているＤダイマーアッセイは同一ではない。なぜなら、Ｄダイマー抗原は異なるサイズのＦＤＰに存在しており、モノクローナル抗体は異なるエピトープを認識するからである（非特許文献９）。最も一般的に用いられる方法は自動免疫比濁法であり、これは抗Ｄダイマー抗原モノクローナル抗体でコートされたラテックス微粒子の懸濁物の濁度の変化に基づくものである。サンプル中にＤダイマーが存在することで、ラテックス微粒子が凝集し、媒体の濁度の増加を示す結果として、５４０ｎｍにおける測光による吸光度の増加がもたらされる。これらの血漿アッセイは、全血における凝集テストよりも良好な感度を有する（非特許文献１０）ためにＶＴＥの除外を可能にするが、非常に特異的ということはなく、ＶＴＥの診断に用いることはできない。
【００１５】
しかし、どの先行技術の方法も、血管内フィブリン溶解の結果もたらされるＤダイマーを定めるために、サンプルのフィブリン形成の動的測定と、凝固亢進、炎症および線溶亢進によって生成されるＤダイマーおよびフィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ）とを結び付けていない。よって、どの現行法も血液サンプル中の静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーを測定できない。
【００１６】
よって、Ｄダイマーの通常のアッセイと同様に感受性が高いが、それよりも特異性の高いインビトロ診断法を提供することは、ＰＥまたはＤＶＴを有する疑いがある患者における、たとえばヨウ素化造影製品の注射を伴うスパイラル胸部血管走査または肺シンチグラフィなどのイメージング検査の必要性を低減できる。こうした方法は、コストを制限し、患者、特に血栓症の危険性の高い高齢の個体およびがんである患者のより早急な処置を確実にし、かつ行われるべき処置に関する迅速な判断ができることを可能にするだろう。
【００１７】
したがって、患者からのサンプルにおける静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーを定めるために利用可能な方法を有することが必要とされており、前記方法は図２に示されるとおり、凝固亢進、炎症および線溶亢進によって生成された前記患者のＤダイマーを、血管内フィブリン溶解によってもたらされた血栓症に対して特異的なＤダイマーと区別できる。加えてこうした方法は、研究室において緊急時に行うか、または患者のベッドサイドで行い得るようにするために自動化される必要がある。さらに、この方法は信頼性が高く、再現性があり、かつ簡単である必要があり、処置に関する判断を助ける必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｌｏｐｅｚ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，２００９，１２３（Ｓｕｐｐｌ．４）：Ｓ３０−３４
【非特許文献２】Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００７，５（Ｓｕｐｐｌ．１）：４１−５０
【非特許文献３】Ｃｅｒｉａｎｉ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２０１０，８（５）：９５７−９７０
【非特許文献４】Ｋｌｏｋ，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２００８，１６８（１９）：２１３１−２１３６
【非特許文献５】Ｌｅ  Ｇａｌ，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２００６，１４４（３）：１６５−１７１
【非特許文献６】Ａｄａｍ，Ｂｌｏｏｄ，２００９，１１３（１３）：２８７８−２８８７
【非特許文献７】Ｍｉｒｓｈａｈｉ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１４，９（３）：ｅ９２３７９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９２３７９
【非特許文献８】Ｄｉｒｉｘ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００２，８６（３）：３８９−３９５
【非特許文献９】Ｄｅｍｐｆｌｅ，ＦＡＣＴ  ｓｔｕｄｙ  ｇｒｏｕｐ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２００１，８５（４）：６７１−６７８
【非特許文献１０】ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９９９，８２（６）：１５８８−１５９２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、凝固活性化、炎症および過剰な線維素溶解に由来するＤダイマーを、血管内フィブリン分解に由来する血栓症に対して特異的なＤダイマーと区別し、かつそれらを定量的に測定できる方法を開発した。加えてこの方法は、それらのＤダイマーを自動の実験用デバイス、遠隔生物学デバイス、またはポータブルデバイスにおいて緊急の状況で定めることを可能にする。開発された方法は信頼性が高く、簡単であり、実施が迅速であり、かつ再現性がある。さらに、本発明者らはこの方法を洗練することにより、この方法の改変バージョンにおいて、この方法は年齢にかかわらずすべての患者に適用でき、かつ偽陰性の数を低減して、根底にある血栓形成傾向の事象、亜区域性または重篤でない肺塞栓症の事象、心筋梗塞の事象、がんの事象、感染症の事象、および妊娠の事象における静脈血栓症、ならびに根底に炎症の感受性を有する高齢の対象に対する静脈血栓症を検出することを可能にする。最後に、一般的なアッセイ方法とは反対に、本発明による方法は年齢の関数としての任意の調整を必要としない。
【００２０】
本発明による方法は、３つの知見に基づくものである。凝固活性化状態とは反対に、血栓症においては凝固亢進および線溶亢進が存在しないか、または低減している。他方で、主に重要なのは炎症性態である。
【００２１】
より具体的には、第１の側面において、本発明は、患者からの血液サンプル中の静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法の第１のバージョンに関し、前記方法は、一方ではサンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ：Ｄ−ｄｉｍｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ）を得るためのサンプル中のＤダイマーのアッセイを含み、他方ではこの同じサンプル中のフィブリン形成の動的測定を含み、前記動的測定は以下のステップを含む。
ａ）サンプル中の凝固の活性化をトリガすることなく開始するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、インキュベートされたサンプル中でトロンビンの生成およびフィブリン血餅の形成をトリガするステップと、
ｃ）フィブリン血餅を形成するｂ）で得られたサンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップと、
ｄ）ｃ）で分析されたフィブリン血餅の形成プロファイルを確立し、このプロファイルから、プロファイル曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ：ｆｉｂｒｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定されたサンプルの特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））とを抽出するステップと、
ｅ）血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）を算出するステップであって、
ｅ１）凝固亢進（ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／ＨＣ）を得るために、ｄ）で定められたＦＦＴを用いて凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）を調整するステップ、および
ｅ２）Ｒを得るために、ｄ）で定められたＶｐ（ＴＡ）を用いて炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてｅ１）で得られた調整ＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／ＨＣを調整するステップによって算出するステップと、
ｆ）ｅ）で得られたフィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲを、閾値に対して、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値に対して比較するステップと、
ｇ）ｅ）で得られたフィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲと、サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）とを用いて、凝固活性化状態において存在する線溶亢進（ｈｙｐｅｒｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）（ＦｇＤＰ（ＨＦ））によって生成されたフィブリノゲン分解産物のレベルを定めるステップと、
ｈ）ｇ）で得られたＦｇＤＰ（ＨＦ）レベルを閾値に対して比較し、ｄ）で得られたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）を閾値に対して比較するステップとである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第１のバージョンは、ステップｅ）において、初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ：ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｕｎｉｔｓ）で表されるレベルＲを算出するステップが、次のステップによって行われることを特徴とする。
ｅ１）次の等式を用いて、凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／ＨＣ）を算出するステップであって、
【００２３】
【数１】
2019507345.tif 000002
【００２４】
ここで対照時間（Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｉｍｅ）とは、ステップａ）〜ｄ）に従って測定された、血栓症の疑いのない健康な患者からのサンプルの平均フィブリン血餅形成時間である、ステップ、および
ｅ２）次の等式を用いてレベルＲを算出するステップであって、
【００２５】
【数２】
2019507345.tif 000003
【００２６】
ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））は、次の等式を有する標準曲線における特性の値Ｖｐ（ＴＡ）に対して演繹されるフィブリノゲン濃度であり、
ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂ、
ここで
ｙはフィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された特性の値であり、
ｘはフィブリノゲン濃度であり、
ａおよびｂは、フィブリンプラトーのレベルとフィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式の定数であり、
標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、この血液サンプルのフィブリノゲン濃度が定められており、かつその特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））がステップａ）〜ｄ）によって定められている、ステップ。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第１のバージョンは、ステップｆ）において、ｅ）で得られたレベルＲが閾値未満、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値未満であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にし、レベルＲが閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いことは、その患者における血栓症の可能性を示すことを特徴とする。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第１のバージョンは、ステップｇ）が次のステップで構成されるステップを含むことを特徴とする。
ｇ１）既知のレベルのＦｇＤＰおよび既知のレベルのＤダイマーを有する血液サンプルを用いて確立された標準曲線において、サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）に対応するＦｇＤＰのレベルを定めるステップ、
ｇ２）ｇ１）で用いられた標準曲線において、ステップｅ）で得られた調整されたＤダイマーのレベル（Ｒ）に対応するＦｇＤＰのレベルを定めるステップ、および
ｇ３）ｇ１）で得られたＦｇＤＰのレベルからｇ２）で得られたＦｇＤＰのレベルを引くことによって、線溶亢進によって生成されたＦｇＤＰのレベル（ＦｇＤＰ（ＨＦ））を定めるステップ。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第１のバージョンは、ステップｈ）が次のステップで構成されるステップを含むことを特徴とする。
ｈ１）ＦｇＤＰ（ＨＦ）と閾値、特に１μｇ／ｍｌの閾値とを比較するステップであって、ＦｇＤＰ（ＨＦ）が閾値未満または陰性であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にし、ＦｇＤＰ（ＨＦ）が閾値よりも高いことは、その患者における血栓症の可能性を示す、ステップ、
ｈ２）ＦＦＴと閾値、特に［ｅ１）の対照時間−１標準偏差］に等しい閾値、たとえば１３５秒の対照時間に対する１２０秒の閾値とを比較するステップであって、ＦＦＴが閾値未満であることは、患者が血栓症を有さないが急性凝固活性化状態を有することを示し、ＦＦＴが閾値よりも高いことは、その患者における血栓症を示す、ステップ。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第１のバージョンは、次のことを特徴とする。
−  ステップｈ２）において血栓症が診断されたとき、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は、ステップｅ）で得られたＤダイマーのレベルＲであり、
−  ステップｈ１）およびｈ２）において血栓症が除外されたが、ステップｅ）で得られたレベルＲは閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いとき、この方法は、次の等式を用いて静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）を算出するステップで構成されるステップも含み、
【００３１】
【数３】
2019507345.tif 000004
【００３２】
ここでＤｄｉＳは、サンプル中のＤダイマーのレベルである。
【００３３】
ＤｄｉＶＴＥレベルは肺塞栓症または深部静脈血栓症の程度を表すものであり、したがって疾患の重篤度を表す。
【００３４】
加えて本発明は、患者からの血液サンプル中の静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法の第２のバージョンに関し、前記方法は、一方ではサンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）を得るためのサンプル中のＤダイマーのアッセイを含み、他方ではこの同じサンプルのフィブリン形成の動的測定を含み、前記動的測定は以下のステップを含む。
ａ）サンプル中の凝固の活性化をトリガすることなく開始するステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、インキュベートされたサンプル中でトロンビンの生成およびフィブリン血餅の形成をトリガするステップと、
ｃ）フィブリン血餅を形成するｂ）で得られたサンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップと、
ｄ）ｃ）で分析されたフィブリン血餅の形成プロファイルを確立し、このプロファイルから、プロファイル曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定されたサンプルの特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））とを抽出するステップと、
ｅ’）血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）を算出するステップであって、
ｅ’１）炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）に対して調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／Ｉ）を得るために、ｄ）で定められたＶｐ（ＴＡ）を用いて炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベルＤｄｉＳを調整するステップ、および
ｅ’２）低いＤダイマーレベルに対してｅ’１）で得られた炎症に対して調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／Ｉ）を補正するステップによって算出するステップ、ならびに
炎症の関数として患者からのサンプルを分類するステップと、
ｆ’）ｅ）で得られたフィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲを、閾値に対して、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値に対して比較するステップと、
ｇ’）サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）およびｅ’）で得られたレベルＲを用いるか、またはｅ’１）で得られた炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／Ｉおよびｅ’）で得られたレベルＲを用いて、線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｄｄｉ（ＨＦ））を定めるステップと、
ｈ’）ｇ’）で得られたレベルＤｄｉ（ＨＦ）を閾値に対して比較し、ＴＡ／ＦＦＴ比率を閾値に対して比較するステップであって、ここでＴＡはｄ）で得られたフィブリン重合プラトーに達する時間であり、ＦＦＴはｄ）で得られたフィブリン形成時間である、ステップとである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、ステップｅ’）において、初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表されるレベルＲが、次のステップによって得られることを特徴とする。
ｅ’１）次の等式によって、炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／Ｉ）を算出するステップであって、
【００３６】
【数４】
2019507345.tif 000005
【００３７】
ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））は、次の等式を有する標準曲線における特性の値Ｖｐ（ＴＡ）に対して演繹されるフィブリノゲン濃度であり、
ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂ、
ここで
ｙはフィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された特性の値であり、
ｘはフィブリノゲン濃度であり、
ａおよびｂは、フィブリンプラトーのレベルとフィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式の定数であり、
標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、この血液サンプルのフィブリノゲン濃度が定められており、かつその特性の値Ｖｐ（ＴＡ）がステップａ）〜ｄ）によって定められている、ステップ、
ｅ’２）ｅ’１）で得られたレベルＤｄｉＳ／Ｉを次の等式によって補正するステップであって、
Ｒ＝ＤｄｉＳ／Ｉ＋［０．５−ＦＤｄｉ−Ｓ］
ここでＦＤｄｉ−Ｓは低いＤダイマーレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対する補正因子であり、この値は次の等式を有する標準曲線におけるサンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）に対する補正因子の値に対応し、
ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ
ここでｙは補正因子Ｆであり、
ｘはＤダイマーのレベルであり、
ａ、ｂおよびｃは、補正因子とＤダイマーのレベルとを結び付ける多項式の定数であり、
標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、この血液サンプルのＤダイマーのレベルが定められており、かつそれに対する補正因子が経験的に定められているため、レベルＤｄｉＳ／Ｉが０．５μｇ／ｍｌ  ＦＥＵ（フィブリノゲン換算量）の閾値に関連付けられる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、ステップｅ’）において、炎症の関数として患者からのサンプルを分類するステップが次のステップを含むことを特徴とする。
−  比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））を算出するステップであって、ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））はｅ１’）で定められたフィブリノゲン濃度である、ステップ、および
−  もし比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））＞０．２０であれば、その患者からのサンプルを炎症を有さない患者のグループＩに分類するステップ、または
−  もし比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））≦０．２０であれば、その患者からのサンプルを炎症を有する患者のグループＩＩに分類するステップである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、ステップｆ’）において、ｅ’）で得られたレベルＲが閾値未満、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値未満であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にすることを特徴とする。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、ステップｇ’）において、線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＨＦ）が、次のとおりに算出されることを特徴とする。
ｇ’１）次の等式を用いて、ステップｅ’）で定められたレベルＲとサンプルのＤダイマーのレベルＤｄｉＳとの比率として算出される。
【００４１】
【数５】
2019507345.tif 000006
【００４２】
ｇ’２）次の等式を用いて、ステップｅ’）で定められたレベルＲとｅ’１）で得られたレベルＤｄｉＳ／Ｉとの比率として算出される。
【００４３】
【数６】
2019507345.tif 000007
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、次のことを特徴とする。ステップｈ’）において、
−  ｇ’１）で得られたレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔは、次のステップによって閾値と比較され、
ｈ’１）サンプルのレベルＤｄｉＳに対して、次の等式を有する標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）曲線において比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄの値を定めるステップであって、
ｙ＝ａｘ−ｂ
ここでｘはＤダイマーのレベルであり、
ｙは血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルと、Ｄダイマーのレベルとの比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）であり、
ａおよびｂは、比率Ｒ／ＤｄｉＳとＤダイマーのレベルとを結び付ける等式の定数であり、
標準曲線は、以下を用いて確立されたものであり、
−  患者からのサンプルがグループＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲ、ならびに
−  患者からのサンプルがグループＩＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲである、ステップ、ならびに
ｈ’’１）ｇ’１）で得られた線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔの値と、ｈ’１）で得られた比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄの値とを比較するステップであって、ここで
（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄ未満であることは、その患者（ｐａｔｉｅｎｔ）における血栓症を除外することを可能にし、（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄ以上であることは、その患者における血栓症の可能性を示す、ステップであり、
−  ｇ’２）で得られたレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔは、次のステップによって閾値と比較され、
ｈ’２）サンプルのレベルＤｄｉＳに対して、次の等式を有する標準曲線において比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄの値を定めるステップであって、
ｙ＝ａｘ−ｂ
ここでｘはＤダイマーのレベルであり、
ｙは血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルと、炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルとの比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）であり、
ａおよびｂは、比率Ｒ／ＤｄｉＳ／ＩとＤダイマーのレベルとを結び付ける等式の定数であり、
標準曲線は、次のとおりに確立されたものであり、
−  患者からのサンプルがグループＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、ステップａ）〜ｅ’１）によって得られたそのレベルＤｄｉＳ／Ｉ、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用い、
−  患者からのサンプルがグループＩＩに分類されたとき：ステップｅ’）によってグループＩＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、ステップａ）〜ｅ’１）によって得られたそのレベルＤｄｉＳ／Ｉ、およびステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用いる、ステップ、ならびに
ｈ’’２）ｇ’２）で得られた線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔの値と、ｈ’２）で得られた比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄの値とを比較するステップであって、ここで
（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄ未満であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にし、（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄ以上であることは、その患者における血栓症の可能性を示す、ステップである。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、ステップｈ’）において、比率ＴＡ／ＦＦＴを閾値に対して比較するステップが次のステップを含むことを特徴とする。
ｈ’３）比率ＴＡ／ＦＦＴを算出するステップであって、ここでＴＡはステップｄ）で定められたフィブリン重合プラトーに達する時間であり、ＦＦＴはステップｄ）で定められたフィブリン血餅形成時間である、ステップと、
ｈ’’３）患者からのサンプルがグループＩに分類されたとき：比率ＴＡ／ＦＦＴを第１の閾値、特に１３５秒の対照時間に対する第１の閾値１．７５に対して比較するステップであって、ここで
比率ＴＡ／ＦＦＴが第１の閾値より高いことは、グループＩに分類された患者における血栓症を除外し、かつ血栓形成傾向または凝固活性化状態を診断することを可能にし、
比率ＴＡ／ＦＦＴが第１の閾値以下であることは、グループＩに分類された患者における血栓症を示す、ステップ、
患者からのサンプルがグループＩＩに分類されたとき：比率ＴＡ／ＦＦＴを第２の閾値、特に１３５秒の対照時間に対する第２の閾値１．６５に対して比較するステップであって、ここで
比率ＴＡ／ＦＦＴが第２の閾値より高いことは、グループＩＩに分類された患者における血栓症を除外し、かつ血栓形成傾向または凝固活性化状態を診断することを可能にし、
比率ＴＡ／ＦＦＴが第２の閾値以下であることは、グループＩＩに分類された患者における血栓症を示す、ステップとであり、
ここで対照時間とは、ステップａ）〜ｄ）に従って測定された、血栓症の疑いを呈しない健康な対象からのサンプルのフィブリン血餅形成に対する平均時間である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第２のバージョンは、次のことを特徴とする。
−  ステップｈ’’３）において血栓症が診断されたとき、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は、ステップｅ’）で得られたＤダイマーのレベルＲであり、
−  ステップｈ’’１）、ｈ’’２）およびｈ’’３）において血栓症が除外されたが、ステップｅ’）で得られたレベルＲは閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高いとき、この方法は、次の等式を用いて静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）を算出するステップで構成されるステップも含み、
【００４７】
【数７】
2019507345.tif 000008
【００４８】
ここでＤｄｉＳは、サンプル中のＤダイマーのレベルである。
【００４９】
レベルＤｄｉＶＴＥは肺塞栓症または深部静脈血栓症の程度を表すものであり、したがって疾患の重篤度を表す。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明による方法の第１または第２のバージョンは、血液サンプルが１μｌから３００μｌ、好ましくは５０μｌから２００μｌの体積を有することを特徴とする。好ましくは、血液サンプルは無希釈である。
【００５１】
サンプルのＤダイマーのアッセイは、免疫比濁法または免疫酵素法に従って行われ得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法のステップａ）は、患者からの血液サンプルと組織因子と任意にはリン脂質とを混合するステップ、好ましくは患者からの血液サンプルと組織因子とリン脂質とを混合するステップによって行われる。ステップａ）の組織因子は、０．５〜５ｐＭ、好ましくは２ｐＭの濃度で存在し得る。ステップａ）の混合物は、トロンビン生成およびフィブリン形成をトリガするためのカルシウムイオンを含み得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法のステップｂ）は、ステップａ）で得られた混合物を３０℃から４０℃の温度にて２０秒から４００秒、好ましくは６０秒から３００秒の時間インキュベートするステップを含むことを特徴とする。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ステップｂ）において、トロンビン生成およびフィブリン血餅形成をトリガするステップは、インキュベートされたサンプルにカルシウムイオンを加えるステップによって行われる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法において用いられる血液サンプルは、血漿サンプルである。血漿サンプルは、乏血小板血漿サンプルであり得る。これらの実施形態においては、ステップｃ）において、ｂ）で得られたサンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップは、３５０〜８００ｎｍの波長、好ましくは５４０ｎｍの波長における光学濃度の時間変動（ＤＯＤ）を測定するステップによって行われる。好ましくは、ステップｃ）の光学濃度の測定は、Ｄダイマーをアッセイするために用いられるのと同じ波長である５４０ｎｍにて行われる。
【００５６】
他の実施形態において、本発明によるアッセイ方法において用いられる血液サンプルは、全血サンプルである。全血サンプルは、クエン酸全血サンプルであり得る。これらの実施形態においては、ステップｃ）において、ｂ）で得られたサンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップは、トロンボエラストグラフィ、レオメトリ、または画像分析によって行われる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法は、少なくともステップｃ）およびｄ）が自動診断デバイスまたは遠隔生物学アナライザ、好ましくは凝固アナライザにおいて行われることを特徴とする。
【００５８】
第２の側面において、本発明は患者における静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を診断するためのインビトロの方法に関し、この方法は次のステップで構成されるステップを含む。
−  本明細書に記載されるＶＴＥに対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法を用いて、患者からの血液サンプルにおけるＶＴＥに対して特異的なＤダイマーのアッセイを行うステップと、
−  その患者に関する診断を提供するステップとである。
【００５９】
本発明によるインビトロ診断方法の１つにおいて、その患者に関する診断とは（ｉ）血栓症の除外、（ｉｉ）急性凝固活性化状態、または（ｉｉｉ）血栓症である。
【００６０】
患者が高齢の個体であるか、がんである患者であるか、感染症である患者であるか、または血栓形成傾向である患者であるような実施形態において、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするステップは、本発明のアッセイ方法の第２のバージョンを用いて行われる。この場合、その患者に関する診断とは（ｉ）血栓症の除外、（ｉｉ）急性凝固活性化状態、（ｉｉｉ）血栓形成傾向、または（ｉｖ）血栓症である。
【００６１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態のより詳細な説明が、以下に与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】凝固活性化の図である。ＦｐＡ−ＦｐＢ＝フィブリノペプチドＡおよびＢ；ＴＡＴ＝トロンビン−抗トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ）複合体；ならびにＦ１＋２＝プロトロンビンフラグメント。
【図２】凝固亢進、炎症、および凝固活性化状態における線溶亢進、および静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）によるＤダイマー形成の動態を示す図である。
【図３】血漿または全血サンプルにおける、本発明に従うＶＴＥに対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法の原理を示す図であって、サンプルのＤダイマーの通常のアッセイと、このサンプルのフィブリン形成の動的測定とを含む図である。
【図４】この方法の第１のバージョンによる、患者からの前記サンプルにおける凝固亢進、炎症、および線溶亢進によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーに基づく、生物学的サンプルにおけるＶＴＥに対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法の解説を示す図である。
【図５】フィブリン血餅形成プロファイル（ステップｄ）を示す図である。（Ａ）本発明の方法による、時間の関数としての光学濃度（ＯＤ）の測定による、フィブリノゲンが３．５ｇ／ｌである正常な患者（ＰＮ：ｎｏｒｍａｌ  ｐａｔｉｅｎｔ）からの血漿と、フィブリノゲンが３．０ｇ／ｌである凝固亢進状態を有する患者（Ｐ  Ｈｙｐｅｒ）からの血漿のサンプルとの場合；および（Ｂ）本発明の方法の変形による、時間の関数としてのプラトーに達する時間における振幅のトロンボエラストメトリ測定による、フィブリノゲンレベルが２．０ｇ／ｌである正常な患者（ＰＮ）からの全血サンプルと、フィブリノゲンレベルが５．０ｇ／ｌである高フィブリノゲン血症の（ｈｙｐｅｒｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｅｍｉｃ）患者（Ｐ  Ｈｙｐｅｒｆｉｂ）からの全血サンプルとの場合。
【図６】炎症の関数として、血栓症の疑いのある患者からの５１の血漿サンプルに対する本発明による方法によるフィブリン重合プラトーに達する時間における光学濃度の変動（ＤＯＤ）を示す図であって、（Ａ）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベル；および（Ｂ）フィブリノゲン（Ｆｉｂ）のレベルによって表された図である。
【図７】本発明による方法によるフィブリン形成時間の関数としてのプラトーに達する時間を示す図であって、（Ａ）既知のがんを有するか、もしくは有さない患者、または血栓症の疑いのある患者からの２１９サンプルに対するもの；および（Ｂ）血栓症の疑いのあるがんである患者からの３４サンプルに対するものである。
【図８】サンプルのＤダイマーの関数として凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベルを示す図であって（ステップｅ））、（Ａ）血栓症の疑いのある患者からの８７サンプルに対するもの；および（Ｂ）活動性のがんを有する患者からの２８サンプルに対するものである。
【図９】参照方法（クラウス（Ｃｌａｕｓｓ））によって定められたフィブリノゲンのレベルの関数として、本発明の方法に従って測定したフィブリン重合プラトーに達する時間における光学濃度の変動（ＤＯＤ）を示す図であって、（Ａ）血栓症の疑いのある、がんを有するか、または有さない患者からの２１９サンプル；および（Ｂ）血栓症の疑いのある、活動性のがんである患者からの２３サンプルにおける図である。（Ｃ）クラウスの方法によって血漿において定められたフィブリノゲンのレベルの関数としての、血栓症の疑いのある患者からの７つの全血サンプルにおける本発明による方法の変形に従って測定されたフィブリン重合プラトーに達する時間における振幅。
【図１０】静脈血栓症を有する患者および有さない患者１４人からのサンプルにおける、ＳＴＡ  Ｌｉａｔｅｓｔ（登録商標）ＦＤＰラテックス法（スターゴ）によって測定されたフィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ）のレベルと、以下のレベルとの相関を示す図である。（Ａ）通常のＤダイマー（スターゴの方法）；（Ｂ）血漿に対して行われた本発明の方法に従う、凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマー（スターゴの方法）；ならびに（Ｃ）全血サンプルに対して行われた本発明の方法の変形に従う、凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマー（スターゴの方法）。
【図１１】静脈血栓症を有する患者および有さない患者１４人からのサンプルにおける、ＳＴＡ  Ｌｉａｔｅｓｔ（登録商標）ＦＤＰラテックス法（スターゴ）によって測定されたフィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ）のレベルと、以下のレベルとの相関を示す図である。（Ａ）Ｄダイマー（インスツルメンテイション・ラボラトリー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ＩＬの方法）；ならびに（Ｂ）血漿サンプルに対して行われた本発明の方法に従う、凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマー（ＩＬの方法）。
【図１２】本発明の方法および比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］によるＤダイマー（スターゴの方法）の調整の比較を示す図であって、（Ａ）イメージングにおける静脈血栓症を有さない２１５人の患者からの血漿におけるもの；ならびに（Ｂ）イメージングにおけるＰＥおよび／またはＤＶＴを有する２１人の患者からの血漿におけるものである。（Ｉ：炎症、Ｆ：線溶亢進、Ｄｄｉ：Ｄダイマー、Ｆｉｂ：フィブリノゲン）。
【図１３】本発明の方法および比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］によるＤダイマー（ＩＬの方法）の調整の比較を示す図であって、（Ａ）イメージングにおける静脈血栓症を有さない１９９人の患者からの血漿におけるもの；ならびに（Ｂ）イメージングにおけるＰＥおよび／またはＤＶＴを有する１５人の患者からの血漿におけるものである。（Ｉ：炎症、Ｆ：線溶亢進、Ｄｄｉ：Ｄダイマー、Ｆｉｂ：フィブリノゲン）。
【図１４】低いＤダイマーのレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対する補正因子ＦＤｄｉ−Ｓと、（Ａ）血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲとの相関を示す図であって、（Ｂ）血漿サンプルに対して行われる本発明の方法に従う、炎症の関数としての調整（ＤｄｉＳ／Ｉ）、およびサンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）の関数としての等式Ｒ＝ＤｄｉＳ／Ｉ＋［０．５−ＦＤｄｉ−Ｓ］による低いＤダイマーのレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対する補正の後に得られるものである。
【図１５】ｉ）Ｄダイマーのアッセイ、ｉｉ）年齢に関して調整されたＤダイマーのアッセイ、ｉｉｉ）本発明の方法による、年齢の関数としての血栓症の除外のパーセンテージの比較を示す図であって、（Ａ）静脈血栓症の疑いのある７９６人の患者に対する図；および（Ｂ）静脈血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、がんである５８人の患者に対する図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
上述のとおり、本発明は、患者からの生物学的サンプルにおける血栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルを定めるための方法と、静脈血栓塞栓症（肺塞栓症または深部静脈血栓症）の診断または凝固活性化状態の識別におけるこの方法の適用とに関する。
【００６４】
Ｉ−  静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法
本発明によるアッセイ方法は、２つの主要なステップを含む。一方はＤダイマーのアッセイであり、他方はフィブリン形成の動的測定である。これらの主要ステップは、患者からの血液サンプルに対して行われる。
【００６５】
Ａ．患者からの血液サンプル
本明細書において用いられる「患者」という用語は、ヒトを示す。「患者」という用語は特定の年齢を示さないため、小児、青年、および高齢の個体を含む成人を包含する。一般的に、患者とは肺塞栓症または深部静脈血栓症を有することが疑われる対象、たとえば病院の救急科で呼吸困難および／または胸部痛の処置を受ける患者などである。さらに、こうした患者は既知の医学的状態を有さないことがある。代替的に、こうした患者は、血栓症に対する素因を有することが知られている患者（たとえば、がんである患者、妊娠中の女性または出産直後の女性、術後の段階の患者、旅行中または特に長期旅行などの旅行直後の対象など）；凝固亢進状態を呈する患者（たとえば、血栓形成傾向である患者、腎不全である患者、外傷、転倒、もしくは骨折を経験した患者、または高齢の対象など）；凝固活性化状態を呈する患者（たとえば、感染症もしくは敗血症である患者、肺疾患、気管支炎、もしくは呼吸不全である患者、炎症性疾患である患者、胃炎である患者、心筋症である患者、または脳卒中の病歴のある患者など）であることがある。本発明の状況において、「正常な患者」または「健康な患者」という用語は、その患者に血栓症の疑いがないときに用いられる。
【００６６】
本発明による方法は、患者からの単純な血液の生物学的サンプルを使用する。血液サンプルは、血液サンプルを回収する目的のために患者の静脈から採られる。好ましくは、この血液の生物学的サンプルは無希釈でこの方法に用いられる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明による方法は、全血（すなわち、すべての成分を有する血液）のサンプルに対して行われる。全血はクエン酸化されてもよい。この場合、採られた全血はクエン酸チューブに回収される。
【００６８】
他の実施形態において、本発明による方法は、血液サンプルから得られた血漿サンプルに対して行われる。ヒト血液から血漿を得るための方法は、当該技術分野において公知である。好ましくは、生物学的サンプルは乏血小板血漿（ＰＰＰ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）サンプルである。この場合、この生物学的サンプルは特に、患者の血液サンプルを含むクエン酸チューブを１８〜２２℃の温度のサーモスタット遠心機内で２０００〜２５００ｇの速度にて１５分間遠心分離することによって得ることができる。
【００６９】
乏血小板血漿サンプルを保存する必要があるときは、次のステップで構成される以下のプロトコルを用いることが可能である。
−  血漿を迅速にデカントして、白血球細胞および血小板の細胞層より上の約０．５ｃｍの血漿を残すステップ、
−  溶血チューブまたはプラスチックチューブに血漿を回収するステップ、
−  このチューブを１８〜２２℃の温度のサーモスタット遠心機内で２０００〜２５００ｇの速度にて１５分間遠心分離するステップ、
−  （細胞デブリを含む）チューブの底部を取らないように０．５〜１ｍｌのフラクションにアリコートするステップ、次いで
−  −７０℃から−９０℃、好ましくは−８０℃の温度にて急速冷凍するステップ。
【００７０】
本発明によるアッセイは、任意の適切な体積の血液サンプルに対して行われ得る。一般的に本発明においては、小体積の血液サンプルが用いられる。たとえば、血液の生物学的サンプルは、１μｌから３００μｌの体積、好ましくは５０μｌから２００μｌ、好ましくは試薬（以下を参照）の添加後の最終体積３００μｌに対して約２００μｌの体積、好ましくは試薬の添加後の最終体積１５０μｌに対して約１００μｌの体積を有する。こうした体積は実際にルーチン機器における分析のために十分であるが、遠隔生物学デバイスにおいては、サンプル体積対最終体積の比（すなわち約２：３の比）が忠実にされるのであれば、その体積が低減されてもよい。ポータブルデバイスの場合に、試薬が凍結乾燥されていて患者のベッドサイドで使用時にサンプルによって再構成される場合には、同じ最終反応濃度が得られるのであれば、その体積が５μｌから２０μｌ、好ましくは１０μｌの体積までさらに低減されてもよい。
【００７１】
Ｂ．サンプルのＤダイマーのアッセイ
本発明による方法において、第１の主要ステップ（血液サンプル中のＤダイマーのアッセイ）は、任意の適切な方法によって行われ得る。いくつかの実施形態においては、サンプルのＤダイマーの通常のアッセイが行われるだろう。「サンプルのＤダイマーの通常のアッセイ」という表現は、たとえばラテックス法などの免疫比濁法、またはたとえばＥＬＩＳＡ（「酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）」）法もしくはＥＬＦＡ（「酵素結合蛍光アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙ）」）法などの免疫酵素法に従って行われるアッセイを意味することが意図される。免疫比濁法は、Ｄダイマーを含む溶液の濁度の変化に基づくものである。典型的に、免疫比濁法は（ｉ）患者からの血液サンプルと、抗Ｄダイマー抗原モノクローナル抗体でコートされたラテックス微粒子の懸濁物とを混合するステップ（「ラテックス法」）、次いで（ｉｉ）特に所与の波長、典型的には５４０ｎｍにて、混合物の濁度をモニタするステップを含む。免疫酵素法は、抗Ｄダイマー抗原モノクローナル抗体によって本発明のＤダイマーを捕捉するステップと、次いで標識二次抗体によってそれらを明らかにするステップとを含む。
【００７２】
Ｃ．フィブリン形成の動的測定
本発明による方法は、３つの知見に基づくものである。凝固活性化状態とは反対に、血栓症においては凝固亢進および線溶亢進が存在しないか、または低減している。他方で、主に重要なのは炎症性状態である。
【００７３】
上に示されるとおり、本発明者らは、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法の２つのバージョンを開発した。本発明の方法の第１のバージョンによるフィブリン形成の動的測定は、いくつかのステップ、すなわちステップａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、およびｇ）と、診断ステップであるステップｈ）とを含む。本発明による方法の第２のバージョンによるフィブリン形成の動的測定は、第１のバージョンと同じステップａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）と、第１のバージョンのステップとは異なるステップｅ’）、ｆ’）、およびｇ’）と、診断ステップであるステップｈ’）とを含む。これらのステップを、以下に詳細に説明する。
【００７４】
方法のステップ
ステップａ）
本発明によるアッセイ方法のステップａ）は、血液サンプル中の凝固の活性化をトリガすることなく開始するステップで構成される。凝固活性化の開始は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法によって行うことができ、その方法は、ハーゲマン因子または凝固因子ＸＩＩの活性化（病変血管から剥がれたコラーゲンと前記因子とが接触するときに起こること）からなる内因性の経路を介するものであってもよいし、組織病変の際に組織因子によって開始されて血液凝固をもたらす外因性の経路を介するものであってもよい。たとえば、外因性の経路を介すると、ステップａ）は血液の生物学的サンプルと、組織因子と、任意にはリン脂質とを混合するステップを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、ステップａ）は、凝固の内因性の経路の活性化をトリガすることなく開始するために、血液サンプルと、組織因子と、任意にはリン脂質とを混合するステップを含む。この場合、血液の生物学的サンプルは、組織因子（ＴＦ：ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ）、好ましくはヒト組織因子と、好ましくは半精製または精製されたリン脂質（ＰＬ：ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）との溶液に混合される。特に遠隔生物学デバイスまたはポータブルデバイスの場合に、組織因子とリン脂質とは、好ましくは血液の生物学的サンプルによって再構成されるように凍結乾燥される。
【００７５】
ステップａ）の混合物は、混合物中に２〜５μＭの最終濃度のリン脂質、好ましくは約４μＭの濃度を含み得る。好ましくは組織因子は、血液の生物学的サンプルとの混合物におけるその最終濃度が０．５〜２０ｐＭ、好ましくは１〜５ｐＭ、たとえば２ｐＭなどになるような量で用いられる。
【００７６】
加えて、ステップａ）の混合物はカルシウムイオンを含んでもよい。カルシウムイオンは１５〜２０ｍＭ、好ましくは１７ｍＭの最終濃度にて存在してもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明による方法のステップａ）は、次のステップを含む。
ａ１）リン脂質および任意にはカルシウムイオンの溶液に組織因子を導入するステップ、次いで
ａ２）ａ１）で得られた溶液と、血液の生物学的サンプルとを混合するステップ。
【００７８】
他の実施形態において、本発明による方法のステップａ）は、次のステップを含む。
ａ１）組織因子の溶液にリン脂質を導入し、任意にはカルシウムイオンを加えるステップ、次いで
ａ２）血液の生物学的サンプルによって再構成されるように、ａ１）で得られた溶液を凍結乾燥するステップ。
【００７９】
ステップａ）の最後に、重合プラトーまでのフィブリン形成プロファイルを定めるための、少なくとも組織因子と血漿の生物学的サンプルとの混合物、または少なくとも組織因子と全血の生物学的サンプルとの混合物が得られる。
【００８０】
ステップｂ）
ステップｂ）は、ステップａ）で得られた混合物をインキュベートし、次いでインキュベートされたサンプル中でトロンビン生成およびフィブリン血餅形成をトリガするステップで構成される。トロンビン生成およびフィブリン血餅形成をトリガするステップは、当該技術分野において公知の任意の方法によって行われ得る。このトリガするステップは、内因性または内因性の経路の凝固因子の複雑なカスケードを伴い、その結果としてフィブリノゲンから重合フィブリンへの転換がもたらされることによって、フィブリン血餅が生じる。いくつかの特定の実施形態において、このトリガするステップは、得られた混合物にカルシウムイオンを加えるステップによって行われる。
【００８１】
よってステップｂ）は、ステップａ）で得られた混合物をインキュベートするステップを含む。インキュベーションは、任意の適切な時間および温度条件下で行われ得る。このインキュベーションは、典型的には２０秒から４００秒、好ましくは６０秒から３００秒、好ましくは３００秒の時間、ルーチン機器において３０℃から４０℃の温度、好ましくは約３７℃の温度にて行われてもよい。特に遠隔生物学機器の使用、好ましくはポータブルデバイスの使用による体積の低減に伴って、このインキュベーション時間は６０秒未満、好ましくは３０秒未満まで短くされ得る。
【００８２】
次いで、インキュベートされた混合物にカルシウムイオンが加えられる。これらのカルシウムイオンはＣａＣｌ２溶液の形で、約０．１Ｍの濃度で加えられ得る。組織因子の存在下で、カルシウムの添加を通じてトロンビン生成およびフィブリン血餅形成がトリガされる。
【００８３】
ステップｃ）
ステップｃ）は、フィブリン血餅を形成するサンプルの少なくとも１つの特性の時間変動を測定するステップで構成される。この特性は、フィブリン血餅形成をモニタすることを可能にする任意の光学的または物理的特性であってもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、特に使用される生物学的サンプルが血漿サンプルである場合に、測定される特性は好ましくは光学的特性、特に少なくとも１つの波長における光学濃度（ＯＤ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（吸光度とも呼ばれる）である。波長は３５０ｎｍから８００ｎｍであってもよい。好ましくは、光学濃度測定は、Ｄダイマーの通常のアッセイに用いられる波長である５４０ｎｍの波長にて行われる。
【００８５】
よってたとえばステップｃ）の間、フィブリン血餅形成はたとえば２秒以下ごとに、３５０ｎｍから８００ｎｍの少なくとも１つの波長、好ましくは５４０ｎｍにて、１〜１０分、好ましくは１０分の期間光学濃度を測定することによって、動的にモニタされる。したがってこの期間の間に、特にたとえば１０〜２０秒であってもよいベース時間（または初期時間ｔｉ）における光学濃度と比較した光学濃度の変動（ＤＯＤ）によって、フィブリン血餅形成が分析される。よって、分析波長λおよび測定時間ｔにおいて、ＤＯＤ（λ）ｔは、時間ｔに波長λにて測定された光学濃度値（ＯＤ（λ）ｔ）から、時間ｔｉに波長λにて測定された光学濃度値（ＯＤ（λ）ｔｉ）を引いたものに相当し、これは次のとおりに算出される。
ＤＯＤ（λ）ｔ＝ＯＤ（λ）ｔ−ＯＤ（λ）ｔｉ
【００８６】
代替的には、本発明による方法のステップｃ）において動的に測定される、フィブリン血餅を形成するサンプルの特性は物理的特性であり、それは濁度、弾性、粘度、粘弾性、剛性率などであってもよい。
【００８７】
よって他の実施形態において、特に使用される生物学的サンプルが全血サンプルである場合に、ステップｃ）において動的にモニタされるフィブリン血餅の物理的特性は、好ましくはトロンボエラストグラフィ、レオメトリ、または画像分析によって測定される。一般的にフィブリン血餅形成は、フィブリン重合プラトーに達する時間における振幅に達するまでの、たとえば１０分以下、好ましくは５分未満などの期間にわたる、血餅の物理的特性の時間変動によってモニタされる。
【００８８】
ステップｄ）
本発明による方法のステップｄ）は、最初にステップｃ）において分析されたフィブリン血餅の形成プロファイルを確立するステップで構成される。
【００８９】
「フィブリン血餅の形成プロファイル」という表現は、フィブリン重合プラトーまでのフィブリン形成中の時間の関数としての血餅の少なくとも１つの光学的または物理的特性の変化を意味することが意図される。
【００９０】
フィブリン形成の動的測定に続いて、トロンビン生成およびフィブリン血餅形成が開始された血液サンプルの少なくとも１つの特性を時間の関数として定めることによって、次の３つのデータが提供される。
−  フィブリン血餅形成時間（ＦＦＴ）、
−  フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）、および
−  時間ＴＡにおいて測定された特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））。
【００９１】
したがってステップｄ）は、確立されたフィブリン血餅形成プロファイルから、曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された光学的または物理的特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））とを抽出するステップで構成される。代替的に、光学的または物理的特性の値は重合プラトーの９０％より多くに達する時間、好ましくは重合プラトーの９５％より多くに達する時間、たとえば９６％、または９７％、または９８％、または９９％などに達する時間に測定され得ることを当業者は理解するだろう。
【００９２】
測定される特性が光学濃度である場合、すなわち特に血漿サンプルの場合には、曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定されたサンプルのＤＯＤ（ＴＡ）とが、フィブリン血餅形成プロファイル（プラトーを有するＳ形状曲線に似たシグモイドプロファイル）から抽出される。
【００９３】
トロンボエラストグラフィによって物理的特性が測定される場合、すなわち特に全血サンプルの場合には、曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン血餅形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）における振幅（Ａ（ＴＡ））とが、フィブリン血餅形成プロファイル（音叉の形状を有するプロファイル）から抽出される。
【００９４】
レオメトリまたは画像分析によって物理的特性が測定される場合、すなわち特に全血サンプルの場合には、曲線の接線の変曲点において測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）における振幅（Ａ（ＴＡ））とが、フィブリン血餅形成プロファイル（プラトーを有するＳ形状曲線に似たシグモイドプロファイル）から抽出される。
【００９５】
このことは、以下に特に示されている。
−  図５ａにおいて、正常（健康）な患者からの血漿および凝固亢進を有する患者からの血漿によって示され、
−  図５ｂにおいて、正常な患者からの全血および高フィブリノゲン血症を有する患者からの全血によって示される。
【００９６】
曲線の接線の変曲点において定められるフィブリン形成時間（ＦＦＴ）と、フィブリンプラトーの開始に達する時間（ＴＡ）とは、光学濃度測定を用いる方法に対する凝固亢進性血漿、またはトロンボエラストグラフィ、レオメトリ、もしくは画像分析によって物理的特性が測定される方法に対する高フィブリノゲンレベルを有する全血のいずれによっても、凝固亢進に対して比例的に短くなる。
【００９７】
プラトーに達する時間におけるＤＯＤ（ＴＡ）、またはプラトーに達する時間における振幅（Ａ（ＴＡ））のいずれかによって表されるフィブリン重合プラトーのレベルは炎症によって増加し、これは図５のフィブリノゲンのレベルによって表されるか、または２つのタンパク質（ＣＲＰおよびフィブリノゲン）のアッセイが行われた患者からのサンプルにおける図６（Ａ）のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ：Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のレベルおよび図６（Ｂ）のフィブリノゲンのレベルによって表される。
【００９８】
プラトーに達する時間におけるＯＤの値は、正常な患者からの血漿（３．５ｇ／ｌ）よりも凝固亢進を有する患者からの血漿の方が低く、これは含有されるフィブリノゲンが少ないためである（３．０ｇ／ｌ）。
【００９９】
プラトーに達する時間における振幅Ａは、正常レベルのフィブリノゲン（２．５ｇ／ｌ）を有する正常な血液よりも、高レベルのフィブリノゲン（５ｇ／ｌ）を有する全血の方が高い。
【０１００】
静脈血栓症を有するか否かにかかわらず活動性のがんを有さない患者に対する図７（Ａ）、および活動性のがんを有する患者に対する図７（Ｂ）に示されるとおり、血栓症の疑いのあるすべての患者について、フィブリン重合プラトーに達する時間はフィブリン形成時間に比例する。抗凝固剤処置の不在下では、患者に関係なくこのプラトーに達する時間は８分を超えない。
【０１０１】
この方法の第１のバージョン  −  ステップｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ）
本発明による第１の方法は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）に対して特異的なＤダイマーのレベル、すなわち血管内フィブリン分解に特異的に由来するＤダイマーのレベルを定めることを可能にし、これはサンプルのＤダイマーのレベルを次のものの関数として調整することによるものである。
−  トロンビンおよびフィブリン生成の開始後の、凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベル、
−  炎症によって生成されたＤダイマーのレベル、ならびに
−  線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル。
【０１０２】
特に実施例１に記載されるとおり、こうした方法は、問題となる患者の静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルを非常に短時間（すなわち１０分未満）で定めることを可能にする。具体的には、肺塞栓症を有する患者および有さない患者、深部静脈血栓症を有する患者および有さない患者、ならびに凝固活性化状態を有する患者および有さない患者のさまざまな血漿を、トロンビン生成の開始後のフィブリン血餅形成プロファイルにおいて１０分未満で識別する。
【０１０３】
ステップｅ）
本発明者らが最初に開発したこの方法の第１のバージョンにおいて、ステップｅ）は、サンプルのＤダイマーのレベルを凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベルの関数として、および炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数として調整することによって、血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルを算出するステップで構成される。より具体的には、血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）は、次のステップによって算出される。
ｅ１）凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベルを得るために、ｄ）で定められたＦＦＴを用いて凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）を調整するステップ、および
ｅ２）Ｒを得るために、ｄ）で定められたＶｐ（ＴＡ）を用いて炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数として、ｅ１）で算出された凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベルを調整するステップ。
【０１０４】
具体的には、実施例１に示されるとおり、血栓症を有さない患者からのサンプルに比べて、肺塞栓症（ＰＥ）および／または深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を有する患者からのすべてのサンプルにおいて、フィブリン形成時間（ＦＦＴ）の系統的な延長が存在することを本発明者らは観察した。凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてＤダイマーを調整するために、実施例２の線形実施例を利用する。
【０１０５】
凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／ＨＣ）は、サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）から次の式によって定められる。
【０１０６】
【数８】
2019507345.tif 000009
【０１０７】
ここで対照時間とは、本発明による方法のステップａ）〜ｄ）によって測定された、血栓症の疑いを有さない正常で健康な対象からのサンプルのフィブリン血餅形成の平均時間である。
【０１０８】
これは特に実施例３に示されている。よってステップｅ）は、凝固亢進の結果もたらされるＤダイマーを考慮するようにしてｄ）で測定されたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）からＤダイマーを算出するステップを含む。
【０１０９】
血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）は、凝固亢進の関数として調整されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ／ＨＣ）を、次の式によって炎症の関数として調整することによって算出される。
【０１１０】
【数９】
2019507345.tif 000010
【０１１１】
ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））は、次の等式を有する標準曲線における特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））に対して演繹されるフィブリノゲン濃度であり、
ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂ、
ここで
ｙはフィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された特性の値であり、
ｘはフィブリノゲン濃度であり、
ａおよびｂは、フィブリンプラトーのレベル（値または振幅）とフィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式の定数であり、
標準曲線は血液サンプルを用いて確立されたものであり、この血液サンプルのフィブリノゲン濃度が定められており、かつその特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））が本発明による方法のステップａ）〜ｄ）によって定められている。
【０１１２】
よって、血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）は、初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表される。
【０１１３】
上記に示されたとおり、光学濃度の測定に基づく方法の場合、たとえば血漿サンプルの場合などにはＶｐ（ＴＡ）はＤＯＤ（ＴＡ）、すなわちフィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された光学濃度であり、トロンボエラストグラフィ、レオメトリ、または画像分析によって物理的特性が測定されることに基づく方法の場合、たとえば全血サンプルの場合などにはＶｐ（ＴＡ）はＡ（ＴＡ）、すなわちフィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された振幅である。
【０１１４】
炎症のレベル（すなわちフィブリノゲン濃度）の判定を可能にする標準曲線の例は、それぞれＤＯＤの測定に基づく方法の場合が図９（Ａ）〜（Ｂ）および実施例４に提供され、トロンボエラストグラフィによる物理的特性の測定に基づく方法の場合が図９（Ｃ）および実施例４に提供されている。
【０１１５】
よって、得られたＤダイマーのレベルは、初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表される。
【０１１６】
ステップｆ）
本発明による方法の第１のバージョンのステップｆ）は、患者からのサンプルにおける静脈血栓症、特に肺塞栓症（ＰＥ）または深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の確率を定めるために、ｅ）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルを閾値と比較するステップで構成される。好ましくは、閾値は０．５０μｇ／ｍｌである。具体的には、好ましくは、プラスミンによって生成されるＤダイマーの量は使用される８Ｄ２および２．１．１６抗体によるＦＥＵ（フィブリノゲン換算量）の約５０％であるため、測定の陽性閾値は０．５０μｇ／ｍｌである。好ましくは、この閾値はＤダイマーの通常のアッセイの閾値と同じである。
【０１１７】
ｅ）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲが閾値（好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値）未満であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にする。ｅ）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲが閾値（好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値）より高いことは、その患者における血栓症の可能性を示す。
【０１１８】
特に、表４に示されるとおり、比率Ｒによって定められてＦＥＵ（フィブリノゲン換算量）で表されるｅ）で得られたＤダイマーのレベルを有する患者のうち、血栓症を有さない患者の９０％より多くが陰性レベル（すなわち０．５μｇ／ｍｌの閾値未満）を有し、かつ血栓症を有さない患者すべてが０．５０μｇ／ｍｌから１０．５μｇ／ｍｌの範囲の陽性レベル（すなわち０．５μｇ／ｍｌの閾値より高い）を有する。血栓症を有さない患者であって、０．５０μｇ／ｍｌから２．７μｇ／ｍｌのレベルを有する偽陽性であることが見出された患者（＜１０％）のうち、３分の１はレベル＜０．６０μｇ／ｍｌを有し、３分の１はがんを有し、３分の１は凝固活性化状態（骨折、血栓性微小血管症、妊娠、または術後）を有する。つまり、偽陽性レベルのＤダイマーを有する患者の８０％は、凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数としてＤダイマーを調整することによって陰性にされる。
【０１１９】
一般的に、ステップｆ）で行われる比較によってその患者における血栓症を除外することが可能になるとき、この方法はステップｆ）で止められ得る。もし反対が当てはまれば、この方法は続けられる。
【０１２０】
ステップｇ）
本発明による方法の第１のバージョンは次いで、凝固活性化状態において存在する線溶亢進によって生成されたフィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ）のレベルを定めるステップｇ）を含む。よってステップｇ）は、次のステップで構成される。
ｇ１）サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）からＦｇＤＰのレベルを定めるステップ、
ｇ２）ステップｅ）で得られた調整されたＤダイマーのレベル（Ｒ）からＦｇＤＰのレベルを定めるステップ、および
ｇ３）ｇ１）で得られたＦｇＤＰのレベルからｇ２）で得られたＦｇＤＰのレベルを引くことによって、線溶亢進によって生成されたＦｇＤＰのレベル（ＦｇＤＰＨＦ）を算出するステップ。
【０１２１】
具体的には、がんの場合および顕著な凝固活性化状態においては高レベルのＤダイマーが生成され、大量に存在するプラスミンの作用下で形成される高レベルのフィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ）と組み合わされる。
【０１２２】
特に、図１０に示されるとおり、通常のアッセイによって定められたサンプルのＤダイマーのレベルと、血漿サンプルに対して行われた本発明の方法に従って凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベル（上記ステップｅ））とは、これらのサンプルにおいてラテックス法によって測定された、線溶亢進の結果もたらされるＦｇＤＰのレベルと完璧に相関する。図１１に示されるとおり、これはどのＤダイマー試薬を用いてもそうである。全血サンプルに対して行われた本発明の方法に従って凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルについても、同じことが当てはまる。よってＦｇＤＰのレベルは、得られたＤダイマーのレベルから線形回帰によって算出できる。
【０１２３】
顕著な凝固活性化状態において、本発明者らは以下のことを観察した。
−  かなりの線溶亢進があり、大量のＦｇＤＰが生じる。
−  フィブリノゲンから生成されたＦｇＤＰは、血栓症を有さない患者に由来するサンプルよりも、肺塞栓症（ＰＥ）および／または深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を有する患者に由来するサンプルの方が系統的に低い。よって、通常のＤダイマーの関数として生成されたＦｇＤＰと、ｅ）で得られた調整Ｄダイマーの関数として生成されたＦｇＤＰとの陽性の差によって、実施例６においては１μｇ／ｍｌである閾値において、血栓症を有する患者と血栓症を有さない患者とを区別することが可能になる。図１１に示されるとおり、これはどのＤダイマー試薬を用いてもそうである。
−  実施例１に記載されるとおり、対照時間−１標準偏差の閾値において、凝固活性化状態においてはフィブリン形成時間（ＦＦＴ）が短くなる。実施例６に記載されるとおり、このことを利用して、顕著な線溶亢進の存在下での血栓症を除外し、急性凝固活性化状態に注意を向ける。
【０１２４】
実施例５、６、および７に示されるとおり、このことによって、患者からの前記サンプルにおける肺塞栓症または深部静脈血栓症の確率を直接的かつ迅速に定め、かつ／または凝固活性化に注意を向けることが可能になる。より優先的には、実施例８に示されるとおり、このことによって、高レベルのＤダイマーの存在下でＰＥおよびＤＶＴの確率を増すか、または肺塞栓症もしくは静脈血栓症の程度に注意を向けることが可能になる。
【０１２５】
よって、サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）の関数として生成されたＦｇＤＰと、ｅ）で得られた調整Ｄダイマーのレベル（Ｒ）の関数として生成されたＦｇＤＰとの陽性の差によって、予め定められた閾値において、血栓症の可能性を有する患者と血栓症を有さない患者とを区別することが可能になる。以下に提供される実施例の場合、本発明者らは１μｇ／ｍｌの閾値を予め定めている。
【０１２６】
より具体的には、ステップｇ）は次のステップで構成される。
ｇ１）既知のレベルのＦｇＤＰおよび既知のレベルのＤダイマーを有する血液サンプルを用いて確立された標準曲線において、サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）に対応するＦｇＤＰのレベルを定めるステップ、
ｇ２）この同じ標準曲線において、ステップｅ）で得られた調整されたＤダイマーのレベル（Ｒ）に対応するＦｇＤＰのレベルを定めるステップ、および
ｇ３）ｇ１）で得られたＦｇＤＰのレベルからｇ２）で得られたＦｇＤＰのレベルを引くことによって、線溶亢進によって生成されたＦｇＤＰのレベル（ＦｇＤＰ（ＨＦ））を算出するステップ。
【０１２７】
ステップｈ）
最後に、本発明による方法の第１のバージョンのステップｈ）は、ｇ）で得られた線溶亢進によって生成されたＦｇＤＰのレベル（ＦｇＤＰ（ＨＦ））を閾値に対して比較するステップと、ｄ）で得られたフィブリン形成時間（ＦＦＴ）を閾値に対して比較するステップとを含む。
【０１２８】
より具体的には、ステップｈ）は次のステップで構成される第１のステップを含む。
ｈ１）ＦｇＤＰ（ＨＦ）と閾値（たとえば１μｇ／ｍｌの閾値など）とを比較するステップであって、ＦｇＤＰ（ＨＦ）が閾値未満または陰性であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にし、ＦｇＤＰ（ＨＦ）が閾値よりも高いことは、その患者における血栓症の可能性を示す。
【０１２９】
閾値とは、多数のサンプルを用いて確立された予め定められた閾値であることを当業者は認識するだろう。調査したサンプルに基づいて、本発明者らは予め定められた閾値１μｇ／ｍｌを用いた。
【０１３０】
次いでステップｈ）は、次のステップで構成される第２のステップを含む。
ｈ２）ＦＦＴと閾値、特に［対照時間−１標準偏差］に等しい閾値、たとえば１３５秒の対照時間に対する１２０秒の閾値とを比較するステップであって、ＦＦＴが閾値未満であることは、患者が血栓症を有さないが急性凝固活性化状態を有することを示し、ＦＦＴが閾値よりも高いことは、その患者における血栓症を示し、対照時間はステップｅ１）で定められる。
【０１３１】
ここでも、閾値とは多数のサンプルを用いて確立された予め定められた閾値であることを当業者は認識するだろう。調査したサンプルに基づいて、本発明者らは１３５秒の対照時間に対する１２０秒の予め定められた閾値を用いた。
【０１３２】
よって、特に図１２に示されるとおり、偽陽性レベルのＤダイマーを有する患者の９２％、すなわち血栓症を有さない患者の９７％は、ステップｈ）に従うＤダイマーの調整によって陰性にされ、図１３に示されるとおり、これはＤダイマーをアッセイするためのどの試薬でもそうである。
【０１３３】
好ましくは、この方法の最後に得られる静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルが高いことは、肺塞栓症（ＰＥ）または深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の程度を表す。よって、本発明による方法によって患者における血栓症が診断される場合に、ステップｅ）で得られるＤダイマーのレベルＲを臨床的に用いられる尺度、すなわち０．５μｇ／ｍｌの閾値に関連付けたものは、肺塞栓症または静脈血栓症の程度、したがって疾患の重篤度に比例する。実際に、重篤度の診断は通常はイメージングにおいて、発症した肺動脈の数およびタイプによって定められる。
【０１３４】
より具体的には、本発明による方法のステップｈ２）において患者における血栓症が診断される場合、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は、ステップｅ）で得られるＤダイマーのレベルＲである。
【０１３５】
本発明による方法のステップｈ１）およびｈ２）において患者における血栓症が除外されるが、ステップｅ）で得られたレベルＲは閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高い場合、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は次の式によって算出され、
【０１３６】
【数１０】
2019507345.tif 000011
【０１３７】
ここでＲはステップｅ）で得られたＤダイマーのレベルであり、ＤｄｉＳはサンプルのＤダイマーのレベルである。この算出は、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルを、臨床的に用いられる閾値より下のレベルに関連付けることを可能にする。
【０１３８】
こうしてこの方法の最後に提供される静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルは、次いで肺塞栓症または深部静脈血栓症の程度を表す。
【０１３９】
「ＰＥの程度またはＤＶＴの場所を表すレベル」という表現は、静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルが、ＰＥの程度（すなわちその重篤度）またはＤＶＴの場所と直接相関することを意味することが意図される。表７に示されるとおり、「高レベル」という用語は、約１μｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌまたはそれ以上のレベルを意味することが意図される。
【０１４０】
この方法の第２のバージョン  −  ステップｅ’）、ｆ’）、ｇ’）およびｈ’）
静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）に対して特異的なＤダイマーのレベルを定めることを可能にする本発明による方法の第２のバージョンは、第１の方法のステップと同一のステップａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）と、第１のバージョンのステップとは異なるステップｅ’）、ｆ’）、ｇ’）およびｈ’）とを含む。
【０１４１】
ステップｅ’）
ステップｅ）の第２の変形は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の症例の大部分（７５％）におけるＤダイマーのレベルが４μｇ／ｍｌ未満であることに注目した本発明者らによって開発された。凝固活性化状態とは反対に、血栓症においては凝固亢進および線溶亢進が存在しないか、または低減している。他方で、主に重要なのは炎症性状態である。具体的には、ＶＴＥの８０％に対して、半分は炎症を有さない患者の第１のグループであり（フィブリノゲン濃度：３．０〜４．５ｇ／ｌ）、半分は亜正常炎症を有する患者の第２のグループである（フィブリノゲン濃度：４．５〜６．０ｇ／ｌ）。さらに、フィブリン血餅重合プラトーに達する時間（ＴＡ）は血栓症の方が早く、ＶＴＥを凝固活性化状態または血栓形成傾向と区別することを可能にする。
【０１４２】
結果として、本発明による方法の第２のバージョンのステップｅ’）は、次のステップで構成される。
−  血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルを算出するステップであって、
ｅ’１）炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベルを調整するステップ、および
ｅ’２）この調整レベルを低Ｄｄｉレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対して補正するステップによって算出するステップ、ならびに
−  炎症の関数として患者からの血液サンプルを分類するステップ。
【０１４３】
よってステップｅ）と比べると、ステップｅ’）においては、フィブリン形成時間（ＦＦＴ）を用いて凝固亢進によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベルを調整することが削除されている。このことは、ＦＦＴが短く（ＦＦＴ＜［平均対照時間−１標準偏差］、たとえば１３５秒の対照に対してＦＦＴ≦１２０秒など）罹患率が１０００当り２．５である血栓形成傾向が根底にある場合の血栓症を検出することを可能にする。
【０１４４】
低Ｄｄｉレベルに対する調整レベルの補正によって、以下の事象における血栓症を検出することが可能になる。
（ｉ）Ｄダイマーが一般的に低く（≦１．５μｇ／ｍｌ）、かつ罹患率がＰＥの２０％の領域にある、亜区域性または重篤でない肺塞栓症の事象、および
（ｉｉ）  炎症が顕著であり（≧５ｇ／ｌ）、かつ罹患率がＰＥの１５％の領域にある、肺梗塞（肺塞栓症合併症）の事象。
【０１４５】
最後に、炎症の関数として患者からのサンプルを分類することによって、がん（患者の２０％）、感染症（患者の１０％）、および根底に炎症の感受性を有する高齢の個体の場合の血栓症を定めることが可能になる。
【０１４６】
より具体的には、ステップｅ’）において、血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲは、次のステップによって定められる。
ｅ’１）ステップｄ）で定められた重合プラトーに達する時間に測定された特性の値Ｖｐ（ＴＡ）を用いて、サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）から炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルであるＤｄｉＳ／Ｉを算出するステップ、および
ｅ’２）血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベル（Ｒ）を定めるために、Ｄダイマーのレベル＜４μｇ／ｍｌに対してｅ’１）で得られたレベルＤｄｉＳ／Ｉを補正するステップ。
【０１４７】
ステップｅ’１）。よってステップｅ’１）は、次の等式によって、ステップｄ）で定められた重合プラトーに達する時間に測定された特性の値Ｖｐ（ＴＡ）を用いて、サンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）から炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／Ｉを算出するステップで構成される。
【０１４８】
【数１１】
2019507345.tif 000012
【０１４９】
ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））は、等式ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂを有する標準曲線における特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））に対して演繹されるフィブリノゲン濃度であり、ここで
ｙはフィブリン重合プラトーに達する時間（ＴＡ）に測定された特性の値であり、
ｘはフィブリノゲン濃度であり、
ａおよびｂは、フィブリンプラトーのレベル（値または振幅）とフィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式に対する定数であり、
標準曲線は血液サンプルを用いて確立されたものであり、この血液サンプルのフィブリノゲン濃度が定められており、かつその特性の値（Ｖｐ（ＴＡ））が本発明による方法のステップａ）〜ｄ）によって定められている。
【０１５０】
よって、炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／Ｉは、初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表される。
【０１５１】
ステップｅ’２）。ステップｅ’２）は、低いＤダイマーのレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対してｅ’１）で得られたレベルＤｄｉＳ／Ｉを補正することによって、血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベル（Ｒ）を算出するステップで構成される。この低いＤダイマーのレベルをフィブリノゲンの関数として補正することは、比率ＤｄｉＳ／Ｉを０．５μｇ／ｍｌ  ＦＥＵ（フィブリノゲン換算量）の閾値に近付けるという目的を有する。
【０１５２】
レベルＲは、次の等式を用いて算出される。
Ｒ＝ＤｄｉＳ／Ｉ＋［０．５−ＦＤｄｉ−Ｓ］
ここでＦＤｄｉ−Ｓは低いＤダイマーのレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対する補正因子であり、この値は次の等式を有する標準曲線におけるサンプルのＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）に対する補正因子の値Ｆに対応し、
ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃ
ここでｙは補正因子Ｆであり、
ｘはＤダイマーのレベルであり、
ａ、ｂおよびｃは、補正因子とＤダイマーのレベルとを結び付ける多項式に対する定数であり、
標準曲線は血液サンプルに対して確立されたものであり、この血液サンプルのＤダイマーのレベルが定められており、かつそれに対する補正因子が経験的に定められているため、比率ＤｄｉＳ／Ｉが０．５μｇ／ｍｌ  ＦＥＵ（フィブリノゲン換算量）の閾値に関連付けられる。
【０１５３】
本発明者らによって確立された標準曲線は、図１４（Ｂ）に提供されている。
【０１５４】
サンプルの分類。ステップｅ’）は、炎症の関数としてサンプルを分類するステップで構成されるステップも含む。より具体的には、このステップは、比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））を算出するステップであって、ここで［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））はｅ’１）で演繹されたフィブリノゲン濃度である、ステップと、患者からのサンプルを以下のとおりに分類するステップとで構成される。
−  もし比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））＞０．２０（すなわち［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））＜５ｇ／ｌ）であれば、グループＩ（炎症を有さない患者）、または
−  もし比率１／［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））≦０．２０（すなわち［Ｆｉｂ］（Ｖｐ（ＴＡ））≧５ｇ／ｌ）であれば、グループＩＩ（炎症を有する患者）。
【０１５５】
ステップｆ’）
本発明による方法の第２のバージョンのステップｆ’）は、ｅ’）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲを閾値に対して比較するステップで構成される。
【０１５６】
ｅ’）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲが閾値未満（好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値未満）であることは、その患者における血栓症を除外することを可能にする。ｅ’）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルＲが閾値より高い（好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値より高い）ことは、その患者における血栓症の可能性を示す。
【０１５７】
ステップｇ’）
ステップｇ’）は、線溶亢進において、大過剰に生成されたプラスミンによってフィブリノゲンが分解されるという事実に基づいている。図２に示されるとおり、Ｄダイマーを含むフィブリン分解産物（ＦＤＰ）と、フィブリノゲン分解産物（ＦｇＤＰ）とが循環に現れる。よって、がんおよび顕著な凝固活性化状態においては、高いＤダイマーのレベルと高いＦｇＤＰのレベルとの組み合わせが生じる。よって、線溶亢進によって生成されたＦｇＤＰのレベル、または線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベルを意味する区別なしに測定することが可能である。
【０１５８】
したがって本発明による方法は、サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）と、ｅ’）で得られたフィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｒ）とを用いるか、またはｅ’１）で得られた炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／Ｉと、ｅ’）で得られたレベルＲとを用いて、凝固活性化状態において存在する線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベルを算出するステップｇ’）を含む。
【０１５９】
より具体的には、ステップｇ’）は次のステップで構成される。
ｇ’１）線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベルＤｄｉＨＦまたは（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔを、ステップｅ’）で定められた調整および補正されたＤダイマーのレベル（Ｒ）と、サンプル中のＤダイマーのレベル（ＤｄｉＳ）との比率として、次の等式を用いて算出するステップ、
【０１６０】
【数１２】
2019507345.tif 000013
【０１６１】
ｇ’２）線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベルＤｄｉＨＦまたは（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔを、ステップｅ’）で定められた調整および補正されたＤダイマーのレベル（Ｒ）と、ｅ’１）で得られた炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルＤｄｉＳ／Ｉとの比率として、次の等式を用いて算出するステップ。
【０１６２】
【数１３】
2019507345.tif 000014
【０１６３】
ステップｈ’）
最後に、本発明による方法の第２のバージョンのステップｈ’）は、ｇ’）で得られた線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（ＤｄｉＨＦ）を閾値に対して比較するステップと、比率ＴＡ／ＦＦＴを閾値に対して比較するステップとを含む。ステップｈ）で用いられるＦＦＴをステップｈ’）で用いられる比率ＴＡ／ＦＦＴに置き換えることによって、凝固活性化状態および血栓形成傾向と、フィブリン血餅重合プラトーに達する時間がより急速である血栓症とを区別することが可能になる。
【０１６４】
より具体的には、ステップｈ’）は最初に次のステップで構成されるステップを含む。
ｈ’１）サンプルのレベルＤｄｉＳに対して、次の等式を有する標準曲線において比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄの値を定めるステップであって、
ｙ＝ａｘ−ｂ
ここでｘはＤダイマーのレベルであり、
ｙは血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルと、Ｄダイマーのレベルとの比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）であり、
ａおよびｂは、比率Ｒ／ＤｄｉＳとＤダイマーのレベルとを結び付ける等式に対する定数であり、
標準曲線は、次のとおりに確立されたものであり、
−  患者からのサンプルがグループＩに分類されたとき：本発明の方法のステップｅ’）によってグループＩに分類された血液サンプル、既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、および本発明による方法のステップａ）〜ｅ’２）によって定められたそのレベルＲを用い、
−  患者からのサンプルがグループＩＩに分類されたとき：本発明の方法のステップｅ’）によってグループＩＩに分類された血液サンプル、既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、および本発明による方法のステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用いる、ステップ、
ｈ’’１）ｇ’１）で得られる線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔの値と、ｈ’１）で得られる比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄの値とを比較するステップであって、ここで（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄよりも低いことは、その患者における血栓症を除外することを可能にし、（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ）ｓｔａｎｄａｒｄ以上であることは、その患者における血栓症の可能性を示す、ステップ、
【０１６５】
ｈ’２）サンプルのレベルＤｄｉＳに対して、次の等式を有する標準曲線において比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄの値を定めるステップであって、
ｙ＝ａｘ−ｂ
ここでｘはＤダイマーのレベルであり、
ｙは血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルと、炎症の関数として調整されたＤダイマーのレベルとの比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）であり、
ａおよびｂは、比率Ｒ／ＤｄｉＳ／ＩとＤダイマーのレベルとを結び付ける等式に対する定数であり、
標準曲線は、次のとおりに確立されたものであり、
−  患者からのサンプルがグループＩに分類されたとき：本発明の方法のステップｅ’）によってグループＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、本発明による方法のステップａ）〜ｅ’１）によって得られたそのレベルＤｄｉＳ／Ｉ、および本発明による方法のステップａ）〜ｅ’２）によって得られたレベルＲを用い、
−  患者からのサンプルがグループＩＩに分類されたとき：本発明の方法のステップｅ’）によってグループＩＩに分類された血液サンプル、および既知であるか、または定められたそのＤダイマーのレベル、本発明による方法のステップａ）〜ｅ’１）によって得られたそのレベルＤｄｉＳ／Ｉ、および本発明による方法のステップａ）〜ｅ’２）によって得られたそのレベルＲを用いる、ステップ、
ｈ’’２）ｇ’２）で得られる線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベル（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔの値と、ｈ’２）で得られる比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄの値とを比較するステップであって、ここで（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄよりも低いことは、その患者における血栓症を除外することを可能にし、（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｐａｔｉｅｎｔが比率（Ｒ／ＤｄｉＳ／Ｉ）ｓｔａｎｄａｒｄ以上であることは、その患者における血栓症の可能性を示す、ステップ。
【０１６６】
ステップｈ’）はさらに、次のステップで構成されるステップを含む。
ｈ’３）比率ＴＡ／ＦＦＴを算出するステップであって、ここでＴＡはステップｄ）で定められたフィブリン重合プラトーに達する時間であり、ＦＦＴはステップｄ）で定められたフィブリン血餅形成時間である、ステップと、
ｈ’’３）患者からのサンプルがグループＩに分類されたとき：比率ＴＡ／ＦＦＴを第１の閾値、特に１３５秒の対照時間に対する第１の閾値１．７５に対して比較するステップであって、ここで
比率ＴＡ／ＦＦＴが第１の閾値より高いことは、グループＩに分類された患者における血栓症を除外し、かつ血栓形成傾向または凝固活性化状態を診断することを可能にし、
比率ＴＡ／ＦＦＴが第１の閾値以下であることは、グループＩに分類された患者における血栓症を示す、ステップ、
患者からのサンプルがグループＩＩに分類されたとき：比率ＴＡ／ＦＦＴを第２の閾値、特に１３５秒の対照時間に対する第２の閾値１．６５に対して比較するステップであって、ここで
比率ＴＡ／ＦＦＴが第２の閾値より高いことは、グループＩＩに分類された患者における血栓症を除外し、かつ血栓形成傾向または凝固活性化状態を診断することを可能にし、
比率ＴＡ／ＦＦＴが第２の閾値以下であることは、グループＩＩに分類された患者における血栓症を示す、ステップであり、
ここで対照時間とは、ステップａ）〜ｄ）に従って測定された、血栓症の疑いのない健康な対象からのサンプルの平均フィブリン血餅形成時間である。
【０１６７】
テストされたサンプルに基づいて、本発明者らは、ステップｅ’）でグループＩに分類されたサンプルに対する第１の閾値１．７５と、ステップｅ’）でグループＩＩに分類されたサンプルに対する第２の閾値１．５５とを定めた。これらの閾値は予め定められたものであり、テストされるサンプルの総数または使用される試薬のバッチの関数として変動し得ることを当業者は理解するだろう。
【０１６８】
フィブリン血餅形成時間（ＦＦＴ）を考慮することによって、血栓症（それに対するＴＡ／ＦＦＴは閾値以下である）と、凝固活性化状態および血栓形成傾向を有する血栓症（それに対するＴＡ／ＦＦＴは閾値より高い）とを区別することが可能である。実際に、血栓形成傾向におけるＦＦＴは常に短い（≦［対照時間−１標準偏差］、たとえば１３５秒の対照時間に対して＜１２０秒）のに対し、凝固活性化状態におけるＦＦＴは対照時間に等しい。
【０１６９】
好ましくは、この方法の最後に得られる静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルが高いことは、肺塞栓症（ＰＥ）または深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の程度を表す。よって、本発明による方法によって患者における血栓症が診断される場合に、ステップｅ’）で得られるＤダイマーのレベルＲを臨床的に用いられる尺度、すなわち０．５μｇ／ｍｌの閾値に対して関連付けたものは、ＰＥまたはＤＶＴの程度、したがって疾患の重篤度に比例する。実際に、重篤度の診断は通常はイメージングにおいて、発症した肺動脈の数およびタイプによって定められる。
【０１７０】
より具体的には、本発明による方法のステップｈ’’３）において患者における血栓症が診断される場合、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）は、ステップｅ’）で得られるＤダイマーのレベルＲである。
【０１７１】
ステップｈ’’１）、ｈ’’２）およびｈ’’３）において血栓症が除外されるが、ステップｅ’）で得られたレベルＲは閾値より高く、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値よりも高い場合、この方法は、次の等式を用いて静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベル（ＤｄｉＶＴＥ）を算出するステップで構成されるステップも含み、
【０１７２】
【数１４】
2019507345.tif 000015
【０１７３】
ここでＤｄｉＳは、サンプル中のＤダイマーのレベルである。この算出は、静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルを、閾値より下のレベルに関連付けることを可能にする。
【０１７４】
こうしてこの方法の最後に提供される静脈血栓症に対して特異的なＤダイマーのレベルは、次いで肺塞栓症または深部静脈血栓症の程度を表す。
【０１７５】
Ｃ．自動化
ステップｃ）の光学濃度の測定は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法によって行われ得る。たとえば、ステップｃ）のＯＤ測定は任意の好適な既存の機器、特に濁度計または分光光度計を用いて行われ得る。特にいくつかの実施形態においては、本発明による方法の少なくともステップｃ）およびｄ）が、ルーチン自動診断デバイス、好ましくは凝固アナライザにおいて行われる。優先的には、本発明による方法のすべてのステップが、こうした自動デバイスにおいて行われる。より優先的には、この測定はルーチン自動デバイスにおいてＤダイマーの通常のアッセイと同時に行われる。たとえば、実施例９および１０に記載されるとおり、本発明による方法はスターゴ（Ｓｔａｇｏ）グループのＳＴＡ−Ｒ（登録商標）ＭａｘまたはＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動デバイスにおいて行われる。
【０１７６】
こうした自動デバイスは、同時にサンプルをロードし、混合動作およびインキュベーションを行い、ある波長における光学濃度を測定して、緊急の状況における単一のサンプル、または同時に複数のサンプルによって得られる血餅形成プロファイルを定めることを可能にする。全体のプロセスが１０分未満で行われる。このことは、このプロセスを高速で信頼性が高く、かつ患者において再現性のある方法にする。
【０１７７】
本発明による方法は、遠隔生物学デバイスまたは患者のベッドサイドのポータブルデバイスにおいても使用され得る。いくつかの好ましい実施形態において、使用される遠隔生物学デバイスまたはポータブルデバイスは、物理的方法、好ましくは光学的方法、たとえばトロンボエラストグラフィもしくはレオメトリ法、または画像分析法などに基づくものである。優先的には、緊急の状況において単一のサンプルによって得られるフィブリン血餅形成プロファイルを定めるために、本発明による方法のこの変形のすべてのステップが、こうしたデバイスにおいて行われる。Ｄダイマーの通常のアッセイに対するものと同じ血液のチューブを用いて、全体のプロセスが５分未満で行われる。
【０１７８】
ＩＩ  −  インビトロの診断の方法
本発明に従う静脈血栓塞栓症に対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法は、患者からの（たとえば血漿または全血などの）血液サンプルを用いて、これらの患者の年齢にかかわらず、かつこれらの患者の根底にある病理学的または生理的条件にかかわらず、これらの患者における静脈血栓塞栓症を診断することを可能にする。本発明者らによって得られた結果に示されるとおり、本発明による方法は、血栓塞栓症である患者の１００％を偽陰性なしに診断することを可能にし、かつＤダイマーをアッセイするための通常の方法よりも多くの患者を除外することを可能にする。
【０１７９】
よって本発明は、患者における静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）のインビトロ診断のための方法に関し、この方法は次のステップで構成されるステップを含む。
−  サンプル中のＶＴＥに対して特異的なＤダイマーのレベルを得るために、本明細書に記載される方法の第１または第２のバージョンに従って、患者からの血液サンプル中のＶＴＥに対して特異的なＤダイマーの定量的アッセイを行うステップと、
−  その患者に関する診断を提供するステップとである。
【０１８０】
一般的に、テストされる患者が高齢の個体であるか、がんである患者であるか、感染症である患者であるか、または血栓形成傾向である患者である場合に、好ましくは本発明に従うＶＴＥに対して特異的なＤダイマーをアッセイするための方法の第２のバージョンが選択されることになる。それ以外の場合には、本発明による方法の第１のバージョンが用いられてもよい。
【０１８１】
この方法の第１のバージョンが用いられるとき、その患者に関する診断とは（ｉ）血栓症の除外、（ｉｉ）急性凝固活性化状態、または（ｉｉｉ）血栓症であってもよい。この方法の第２のバージョンが用いられるとき、その患者に関する診断とは（ｉ）血栓症の除外、（ｉｉ）急性凝固活性化状態、（ｉｉｉ）血栓形成傾向を有する患者における血栓症、または（ｉｖ）低レベルの重篤度を有する血栓症もしくは肺梗塞の事象における血栓症を含む血栓症であってもよい。
【０１８２】
別様に定義されない限り、記載において用いられるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の通常の専門家によって一般的に理解される用語と同じ意味を有する。同様に、本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、すべての特許および他のすべての参考文献は、引用によって援用される。
【実施例】
【０１８３】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を説明するものである。しかし、これらの実施例は単なる例示のみのために提供されるものであって、いかなるやり方でも本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【０１８４】
実験プロトコル
実施例において用いたプロトコルは、以下のとおりである。
プロトコルＡ
プロトコルＡは、ＳＴＡＲ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動凝固アナライザ（スターゴ）において行う方法である。
【０１８５】
ＳＴＡＲ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ自動デバイスの８つのキュベットに、機器によって以下を同時に加える（ステップａ））。
−  Ｄダイマーの通常のアッセイに対して意図されたクエン酸チューブを２５００ｇの速度にて１５分間遠心分離した後に得た、２００μｌの純粋な血漿サンプル、
−  ５０μｌの組織因子およびリン脂質の混合物［ＴＦ＋ＰＬ］、凍結乾燥して水で戻したもの；最終濃度２〜５ｐＭの組織因子（ＴＦ）および４μＭのリン脂質（ＰＬ）。
【０１８６】
自動デバイスはアームによって撹拌し、３７℃にて３００秒間のインキュベーションを行う。自動デバイスは次いで、５０μｌのＣａＣｌ２を加えて最終濃度１６．７ｍＭにし、このトリガ試薬をニードルによって撹拌する（ステップｂ））。自動デバイスは次いで、５４０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を時間の関数として１０分間測定し（ステップｃ））、フィブリン形成曲線をプロットする。
【０１８７】
図５ａ（ステップｄ））に記載したとおり、測定の「後処理」に対するアルゴリズムは、曲線の接線からフィブリン形成時間（ＦＦＴ）を算出し、かつプラトーの時間ＴＡにおけるＯＤおよび時間Ｔ０〜１０秒におけるＯＤから、プラトーに達する時間（ＴＡ）におけるＯＤの変動（ＤＯＤ）を算出することを可能にする。図８および実施例３に示すとおり、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルを、式［（Ｘ）ｘ（ＦＦＴ／対照時間）］によって算出し、ここでＸは測定したＤダイマーのレベルである。
【０１８８】
炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルを、比率［調整Ｄダイマー／炎症］によって算出する。図９および実施例４に示すとおり、炎症のレベルを等式ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂから定め、ここでｙはＤＯＤであり、ｘはフィブリノゲン濃度であり、ａおよびｂはフィブリンプラトーのレベルとフィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式に対する定数である。よって、Ｄダイマーをフィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表す（ステップｅ））。
【０１８９】
血餅重合に達する時間を比率ＴＡ／ＦＦＴによって算出し、ここでＴＡはステップｄ）で定めたフィブリン重合プラトーに達する時間であり、ＦＦＴはステップｄ）で定めたフィブリン血餅形成時間である。
【０１９０】
プロトコルＢ
プロトコルＢは、Ｒｏｔｅｍ（登録商標）デルタ自動凝固アナライザにおいて行う方法である。
【０１９１】
３７℃に予熱した、Ｄダイマーの通常のアッセイに対して意図されたクエン酸チューブから取った、３００μｌの無希釈全血（本発明による方法の変形のステップａ）およびｂ））を、４０μｌの組織因子およびリン脂質の混合物［ＴＦ＋ＰＬ］を含有する前もって予熱した機器のキュベットに加え、この混合物は凍結乾燥して水で戻したものであり；２〜５ｐＭの組織因子（ＴＦ）および４μＭのリン脂質（ＰＬ）の最終濃度にし、かつ１６．７ｍＭのＣａＣｌ２の最終濃度にする。トロンボエラストマー測定を開始し（本発明による方法の変形のステップｃ））、次いで血液と試薬との混合物３００μｌを機器によって分析し、この機器はフィブリン血餅の凝固活性化、形成、重合、および安定性を３０分間継続的に記録して、通常のパラメータ（ＣＴ、ＣＦＴ、角度α、Ａ５、Ａ１０、ＭＣＦ、ＭＣＦ−ｔ）を提供する。
【０１９２】
図５（Ｂ）に記載したとおり、接線からのフィブリン形成時間（ＦＦＴ）およびフィブリン形成曲線のプラトーに達する時間（ＴＡ）における振幅を、時間の関数としての振幅の時間変化から算出する（本発明による方法の変形のステップｄ））。実施例３に示すとおり、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルを、式［（Ｘ）ｘ（ＦＦＴ／対照時間）］によって算出し、ここでＸは測定したＤダイマーのレベルである。
【０１９３】
炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルを、比率［調整Ｄダイマー／炎症のレベル］によって算出する。図９および実施例４に示すとおり、プラトーに達する時間における振幅（ｍｍ）とフィブリノゲン濃度とを結び付ける線形方程式からこのレベルを定める。よって、Ｄダイマーを初期フィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表す（本発明による方法の変形のステップｅ））。
【０１９４】
プロトコルＣ
プロトコルＣは、ＳＴＡＲ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動凝固アナライザ（スターゴ）において行う方法である。
【０１９５】
ＳＴＡＲ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ自動デバイスのキュベットに、機器によって以下を同時に加える（ステップａ））。
−  ２００μｌの陰性対照または陽性対照血漿の各々のサンプル、凍結乾燥して水で再構成したもの、
−  ５０μｌの組織因子およびリン脂質の混合物［ＴＦ＋ＰＬ］、凍結乾燥して水で戻したもの；最終濃度２ｐＭの組織因子（ＴＦ）および４μＭのリン脂質（ＰＬ）。
【０１９６】
自動デバイスはアームによって撹拌し、３７℃にて３００秒間のインキュベーションを行い、次いで５０μｌのＣａＣｌ２を加えて最終濃度１６．７ｍＭにし、このトリガ試薬をニードルによって撹拌する（ステップｂ））。自動デバイスは次いで、５４０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を時間の関数として１０分間測定し（ステップｃ））、各対照血漿に対するフィブリン形成曲線をプロットする。
【０１９７】
図５Ａ（ステップｄ）））に記載したとおり、測定の「後処理」に対するアルゴリズムは、各対照血漿に対する曲線の接線からフィブリン形成時間（ＦＦＴ）を算出し、かつプラトーの時間ＴにおけるＯＤおよび時間Ｔ０〜１０秒におけるＯＤから、プラトーに達する時間（ＴＡ）におけるＯＤの変動（ＤＯＤ）を算出することを可能にする。
【０１９８】
図８および実施例３に示すとおり、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルを、式［（Ｘ）ｘ（ＦＦＴ／対照時間）］によって算出し、ここでＸは測定したＤダイマーのレベルである。
【０１９９】
炎症によって生成されたＤダイマーの関数として調整されたＤダイマーのレベルを、比率［調整Ｄダイマー／炎症のレベル］によって算出する。図９（Ａ）および（Ｂ）ならびに実施例４に示すとおり、このレベルを等式ｙ＝ａｌｎ（ｘ）−ｂから定め、ここでｙはＤＯＤであり、ｘはフィブリノゲン濃度であり、ａおよびｂは（ａ  ａｎｄ  ｂ  ｏｆ）フィブリンプラトーのレベルとフィブリノゲン濃度とを結び付ける対数方程式に対する定数である。よって、Ｄダイマーをフィブリノゲン換算量（ＦＥＵ）で表す（ステップｅ））。
【０２００】
実施例１：正常な患者および（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からのさまざまな血漿のフィブリン形成時間
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｄ）は、この方法の第１または第２のバージョンのものであることを意味する区別を有さない。
【０２０１】
図５および以下の表１に示すとおり、テストしたＰＥおよび／またはＤＶＴの疑いのある患者からのサンプルの中で、正常な患者（血栓症の疑いのない正常で健康な対象）、血栓症の除外を有する患者、およびイメージングにおいて静脈血栓症の陽性の診断を有する患者から、凝固活性化状態を有する患者のサンプルを、凝固亢進を表すフィブリン形成時間（ＦＦＴ）、プラトーに達する時間（ＴＡ）、および血餅重合に達する時間（比率ＴＡ／ＦＦＴ）に関して区別する。
【０２０２】
凝固亢進状態を示す患者に対するフィブリン形成時間（ＦＦＴ）は、より短い。しかし驚くべきことに、がん患者を含む血栓症の除外を有する患者とは反対に、ＰＥおよび／またはＤＶＴの診断を有する患者には凝固亢進状態が存在しない。本発明の方法の第１のバージョンにおいては、血栓症を有する患者と有さない患者とを識別するためにこのことを利用している。
【０２０３】
抗凝固剤処置を受けている患者を除き、含まれるすべての患者のプラトーに達する時間は８分間を超えず、抗凝固剤処置を受けている患者に対する結果の提供はフィブリン形成時間に限っている。
【０２０４】
血餅重合に達する時間は、正常な患者、または凝固活性化状態を有する患者、またはがん患者を含む血栓症の除外を有する患者よりも、ＰＥおよび／またはＤＶＴの診断を有する患者において短くなる（比率ＴＡ／ＦＦＴがより低い）。本発明の方法の第２のバージョンにおいては、血栓症を有する患者と有さない患者とを識別するためにこのことを利用している。
【０２０５】
表１．フィブリン形成時間（ＦＦＴ）、およびプラトーに達する時間（ＴＡ）、および血餅重合に達する時間（ＴＡ／ＦＦＴ）に関する、正常な患者および血栓症またはがんを有するか否かにかかわらず血栓症の疑いのある患者の血漿の中からの、凝固亢進状態を有する患者の血漿の識別。
【０２０６】
【表１】
2019507345.tif 000016
【０２０７】
実施例２：（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からのさまざまな血漿における凝固亢進によるＤダイマーの生成
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｅ）は、この方法の第１のバージョンのものである。
【０２０８】
図８（Ａ、Ｂ）に示すとおり、テストしたＰＥおよび／またはＤＶＴの疑いのある患者からのサンプルの中では、がんを有するかまたは有さない、イメージングにおいて血栓症の陽性の診断を有する患者または血栓症の除外を有する患者のいずれに対しても、フィブリン形成時間の関数として生じたＤダイマーはサンプルの初期Ｄダイマーとよく相関する。
【０２０９】
次の式によってサンプルのＤダイマーのレベルＸから調整ＤダイマーＹを算出することによって、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてサンプルのＤダイマーを調整するために、線形関数を利用する。
【０２１０】
【数１５】
2019507345.tif 000017
【０２１１】
このことによって、血栓症を有する患者におけるフィブリン形成時間ＦＦＴの伸長に対して比例的にＤダイマーを増幅し、かつ凝固亢進を有する患者におけるフィブリン形成時間ＦＦＴの短縮に対して比例的にＤダイマーを減算することが可能になる。
【０２１２】
この比率は、アッセイに用いるＤダイマー試薬のタイプおよびバッチの関数として変動し、かつフィブリン形成を測定するために用いる組織因子−リン脂質試薬のバッチの関数として変動する。次いで、試薬のバッチをこの式に従って有利に較正できる。
【０２１３】
実施例３：（血栓症を有しおよび有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からのさまざまな血漿に対する、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｅ）は、この方法の第１のバージョンのものである。
【０２１４】
特に実施例２および以下の表２に記載したとおり、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてＤダイマーを調整するために、本発明による方法の実施例２の線形相関ｙ＝ａｘ＋ｂを利用する。以下の表２に示すとおり、特に血栓症を有さない患者よりも血栓症を有する患者の方がＤダイマーのレベルが３．６倍高く、血栓症を有さないがん患者よりも血栓症を有するがん患者の方が２．３倍高いことに基づいて、血栓症を有する患者と有さない患者とを識別する。
【０２１５】
凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてＤダイマーを調整することによって、凝固活性化状態における凝固亢進によって生成されたＤダイマーを減算することが可能になる。
【０２１６】
表２．（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からの血漿における、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整
【０２１７】
【表２】
2019507345.tif 000018
【０２１８】
実施例４：本発明の方法による、正常な患者および（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からのさまざまな血漿のフィブリンプラトーのレベル
血漿サンプル
この実施例の第１の部分において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｄ）は、この方法の第１または第２のバージョンのものであることを意味する区別を有さない。
【０２１９】
図６および図９ならびに以下の表３に示すとおり、テストしたＰＥおよび／またはＤＶＴの疑いのある患者からのサンプルの中で、イメージングにおいて血栓症の陽性の診断を有するか、または血栓症の除外を有する患者からのサンプルと、凝固活性化状態を有する患者および正常な患者（血栓症の疑いのない正常で健康な対象）とを、炎症を表すフィブリン形成プラトーのレベルに関して区別する。本発明の方法によるＤＯＤプラトーのレベルは、血栓症の存在または除外とは独立に、図６（Ａ、Ｂ）においてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびフィブリノゲンによって表される炎症が大きいほど高くなる。
【０２２０】
図９（Ａ、Ｂ）に記載したとおり、最大血餅重合を表すフィブリン形成プラトーのレベルは、患者にかかわらずサンプルのフィブリノゲンのレベルと対数方程式ｙ＝ａｌｎｘ＋ｂに従ってよく相関し、ここでｙはプラトー開始時間における光学濃度の変動であり、ｌｎｘはフィブリノゲンのレベルを表すｘのネイピア対数である。変数ｘは、ｘのネイピア対数の指数関数によって、等式から算出する。以下の表３に示すとおり、フィブリノゲンのレベルとＤＯＤとを結び付ける因子は、患者にかかわらず一定である。
【０２２１】
以下の表３に示すとおり、がんを有する患者の場合を含む、血栓症を有する患者および有さない患者は、フィブリノゲンおよび／またはＤＯＤの量によって表される炎症に基づいて識別する。
【０２２２】
表３．フィブリン形成プラトーに達する時間におけるＤＯＤによって定めた（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からの血漿のフィブリンプラトーのレベル。
【０２２３】
【表３】
2019507345.tif 000019
【０２２４】
全血サンプル
この実施例の第２の部分において用いるプロトコルは、プロトコルＢである。この方法は、抗血小板阻害剤、この場合はサイトカラシンＤの存在下で行う。
【０２２５】
炎症のレベルは、図５（Ｂ）に示した全血における代替的方法に従うプラトーに達する時間における振幅と、図９（Ｃ）に示したクラウスにおけるフィブリノゲンのレベルとを結び付ける線形方程式から定める。本発明による方法の変形によってテストする患者に対して、プラトーに達する時間における振幅に基づく方法と、ＤＯＤの決定に基づく本発明の方法との両方によって識別を行う。
【０２２６】
実施例５：本発明の方法による、正常な患者および（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からのさまざまな血漿に対する、炎症によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｅ）およびｆ）は、この方法の第１または第２のバージョンのものであるという区別を有さない。
【０２２７】
本発明による方法の実施例４の対数関数を利用して、比率Ｒによって、炎症によって生成されたＤダイマーの関数としてＤダイマーを調整し、
【０２２８】
【数１６】
2019507345.tif 000020
【０２２９】
かつそれらをフィブリノゲン換算量ＦＥＵで表す。
【０２３０】
プラスミンが生成するＤダイマーの量は、使用するラテックス試薬の抗体８Ｄ２および２．１．１６によるＦＥＵ単位の約５０％であるため、測定の陽性閾値は０．５μｇ／ｍｌである。
【０２３１】
図１２（Ａ、Ｂ）および以下の表４に示すとおり、患者からのサンプルにおいて肺塞栓症（ＰＥ）または深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の確率を定めるために、閾値、好ましくは０．５μｇ／ｍｌの閾値に対して調整Ｄダイマーのレベルを定める。
【０２３２】
Ｄダイマーに関して除外された１２７人の患者はすべて、陰性の調整Ｄダイマーレベルを有する。偽陽性のＤダイマーを有する、血栓症を有さない８８人の患者のうち、８０％は陰性の調整Ｄダイマーレベルを有してイメージングを回避する。よって、血栓症を有さない患者の９０％より多くが、本発明の方法によってイメージングを回避する。
【０２３３】
以下の表４に示すとおり、血栓症を有する患者の１００％が、０．５２μｇ／ｍｌから１０．５μｇ／ｍｌの範囲の陽性の調整Ｄダイマーレベルを有する。
【０２３４】
０．５０μｇ／ｍｌから２．７３μｇ／ｍｌのレベルを有する調整Ｄダイマーの点から偽陽性であることを見出した、血栓症を有さない患者からのサンプルのうち、１／３はレベル＜０．６０μｇ／ｍｌを有し、１／３はがんを有し、１／３は凝固活性化状態を有する。
【０２３５】
表４．凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数および炎症に対して調整されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整による、（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からの血漿の識別
【０２３６】
【表４】
2019507345.tif 000021
【０２３７】
実施例６：血管内フィブリンによって生成されたＤダイマーと、線溶亢進に関する高い凝固活性化状態において生成されたＤダイマーとの区別
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｇ）は、この方法の第１のバージョンのものである。
【０２３８】
これらの活性化状態において存在するＤダイマーと、血栓症のＤダイマーとの区別を、線溶亢進に関して行う。急性活性化状態におけるプラスミンによるフィブリノゲン分解産物ＦｇＤＰの生成は、それらの除外を可能にする。スターゴ試薬に対しては図１０（Ａ、Ｂ）、ＩＬ試薬（ステップｇ））に対しては図１１（Ａ、Ｂ）の線形方程式から線溶亢進を算出する。
【０２３９】
線溶亢進の存在下で（ＦｇＤＰ＞７μｇ／ｍｌ）、血管内フィブリンによって生成されたＦｇＤＰは、血栓症を有さない患者からのサンプルよりも、血栓症を有する患者に由来するサンプルの方が系統的に低い。これはどのＤダイマー試薬を用いてもそうである。このことによって、以下の表５に示すとおり、１μｇ／ｍｌの閾値において陽性であるＤダイマー調整の前後のＦｇＤＰの差に基づいて、血栓症を有する患者と血栓症を有さない患者とを識別することが可能になる。反対に、血栓症を有さない患者において差が陰性または＜１．０であることは、急性凝固活性化状態に注意を向けることを可能にする。
【０２４０】
表５．ＳＴＡＲ（登録商標）（スターゴ）における光学的方法による、ＦｇＤＰの演繹による線溶亢進の関数としての（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からの血漿の識別
【０２４１】
【表５】
2019507345.tif 000022
【０２４２】
よって、凝固亢進（Ｈ）、炎症（Ｉ）、および線溶亢進（Ｆ）によって等しく生成されたＤダイマーの関数として調整された陰性のＤダイマーのレベルに基づいて、９５％の患者がイメージングを回避する。
【０２４３】
実施例７に示すとおり、偽陽性のうちの３つは閾値の限界にあり、４つはがんであり、３つは凝固活性化の原因を有して、フィブリン形成時間のかなりの短縮に基づいて偽陰性を生じることなくイメージングを回避できる。
【０２４４】
実施例７：本発明の方法によるＤダイマーの調整と比率［クラウスの方法によるＤｄｉ／フィブリノゲン］との比較
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｈ）は、この方法の第１のバージョンのものである。
【０２４５】
図１２および以下の表６によって示すとおり、本発明の方法の第１のバージョン（ステップｈ））に従う凝固亢進（Ｈ）、炎症（Ｉ）、および線溶亢進（Ｆ）によって生成されるＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整は、比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］よりも効果的である。以下の表６に示すとおり、因子５．３を掛けた調整Ｄダイマーのレベルが高いことに基づいて、血栓症を有する患者を血栓症を有さない患者から識別する。よって、図１２に示されるとおり、偽陽性レベルのＤダイマーを有する患者の９２％、すなわち血栓症を有さない患者の９７％は、ステップｈ）に従うＤダイマーの調整によって陰性にされる。７つの偽＋のうち、４つはがんであり、３つは閾値の限界である。
【０２４６】
表６．（血栓症を有するかまたは有さず、かつがんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からの血漿における、比率（ｒａｔｉｏｎ）［クラウスの方法によるＤダイマー／フィブリノゲン］による調整と比較した、本発明の光学的方法によるＤダイマーの調整（Ｈ：凝固亢進、Ｉ：炎症、Ｆ：線溶亢進、Ｄｄｉ：Ｄダイマー、Ｆｉｂ：フィブリノゲン）
【０２４７】
【表６】
2019507345.tif 000023
【０２４８】
比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］による偽陰性を本発明の方法によって検出することによって、血栓症を見逃さないことが可能になる。
【０２４９】
本発明の方法による偽陽性は比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］による偽陽性よりも少ないため、イメージングによって診断される患者の数を減らすことが可能になる。
【０２５０】
実施例８：ＰＥおよび／またはＤＶＴの確率に関する、本発明の方法に従って調整されたＤダイマーのレベルの影響
このステップにおいて用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｈ）は、この方法の第１のバージョンのものである。
【０２５１】
本発明の方法に従って調整されるＤダイマーの閾値は、有利には年齢の関数として調整したものではない。なぜならＤダイマーのレベルと、凝固活性化と、炎症とは、５０歳より後に年齢の関数として徐々に増加するからである。その結果として、比率を年齢の関数として調整していない。
【０２５２】
本発明の方法に従って調整したＤダイマーのレベルが高いほど、フィブリン形成時間を有する式およびＤＯＤによる比率の分母が大きくなり、ＰＥまたはＤＶＴの確率が高くなる。
【０２５３】
以下の表７に示すとおり、ＰＥの程度が高いほど、かつＤＶＴが遠位または表在性ではなくて近位であるほど、調整Ｄダイマーは高くなる。
【０２５４】
表７．凝固亢進（Ｈ）、炎症（Ｉ）、および線溶亢進（Ｆ）に対して調整されたＤダイマーのレベルの関数としてのＰＥおよびＤＶＴの確率、（ＦＦＴ：フィブリン形成時間、Ｔ：平均対照時間−１標準偏差＝１２０秒）、ＦｇＤＰ：フィブリノゲン分解産物、Ｄｄｉ：Ｄダイマー、Ａｃｔ：凝固活性化状態）。
【０２５５】
【表７】
2019507345.tif 000024
【０２５６】
実施例９：フィブリン形成測定の機器間の再現性
この実施例において用いるプロトコルは、この方法の第１または第２のバージョンのステップａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）に従って次のとおりに用いた、ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）におけるプロトコルＣである。
【０２５７】
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動デバイス（スターゴ）の８つのキュベットに、機器によって以下を同時に加える。
−  ２００μｌの対照血漿サンプル：正常（ＳＴＡ（登録商標）ＣＣＮ）；凝固亢進性（プロテインＳを枯渇させた血漿、ＳＴＡ  ＤＥＦ  ＰＳ）、および低線溶対照血漿（プラスミノゲンアクチベータインヒビター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ＰＡＩ−１、ＰＡＩ  ４Ｃを含有する血漿）、
−  ５０μｌの組織因子とリン脂質との混合物［ＴＦ  ２ｐＭ最終＋ＰＬ  ４μＭ最終］。
【０２５８】
撹拌および３７℃にて３００秒間のインキュベーションの後、自動デバイスは５０μｌのＣａＣｌ２を加えて最終濃度１６．７ｍＭにし、ニードルによって撹拌する。最後に、自動デバイスはフィブリン形成時間と、プラトーに達する時間（ＴＡ）における光学濃度の変動ＤＯＤとを、５４０ｎｍの波長にて時間の関数として１０分間測定する。
【０２５９】
３つのＳＴＡＲ（登録商標）機器において、この方法の機器間の再現性を次のとおりに定めた。３つの機器の各々において、連続する５日間にわたって２つの測定を１２シリーズ、つまり２４回の測定を行い、正常な対照血漿（ＣＣＮ）と、病理学的な対照血漿（ＤＰＳ：プロテインＳを枯渇させた対照血漿、凝固亢進性、ＰＡＩ：低線溶対照血漿）との各々２つのボトルを用い、すなわち各対照血漿に対して４８回の測定を行った。ロスナー（Ｒｏｓｎｅｒ）に従って、異常な値は除去した。
【０２６０】
フィブリン形成時間ＦＦＴに対して得た変動係数（ＣＶ：ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、すべて６％未満である。以下の表８に示すとおり、プラトーの時間におけるＯＤおよび最大ＯＤに対して得た変動係数は、どの対照血漿でもすべて３％未満である。ＳＴＡＲ（登録商標）間の変動は、どのパラメータおよび対照血漿でも２．５％未満である。
【０２６１】
表８．フィブリン形成の測定の機器間の再現性（ＣＣＮ：正常な対照血漿、ＤＰＳ：プロテインＳを枯渇させた対照血漿、凝固亢進性、ＰＡＩ：低線溶対照血漿）。
【０２６２】
【表８】
2019507345.tif 000025
【０２６３】
実施例１０：フィブリン形成測定の反復性
この実施例において用いるプロトコルは、この方法の第１または第２のバージョンのステップａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）に従って次のとおりに用いた、ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）におけるプロトコルＡである。
【０２６４】
ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動デバイス（スターゴ）の８つのキュベットに、機器によって以下を同時に加える。
−  ２００μｌの、正常な患者または静脈血栓症の疑いがある患者もしくはない患者からのクエン酸血漿のサンプル、
−  ５０μｌの組織因子とリン脂質との混合物［ＴＦ  ２ｐＭ最終＋ＰＬ  ４μＭ最終］。
【０２６５】
撹拌および３７℃にて３００秒間のインキュベーションの後、自動デバイスは５０μｌのＣａＣｌ２を最終濃度１６．７ｍＭにて加え、ニードルによって撹拌する。最後に、自動デバイスはフィブリン形成時間と、プラトーに達する時間（ＴＡ）における光学濃度の変動ＤＯＤとを、５４０ｎｍの波長にて時間の関数として１０分間測定する。
【０２６６】
この方法の各パラメータおよびサンプルの各々に対して、２つ組の測定の反復性を４つのＳＴＡＲ（登録商標）機器において定めた。正常な患者からの１５４の血漿をＳＴＡＲ（登録商標）機器の１つにおいて試薬の第１のバッチによってテストし、血栓症の疑いのある患者からの８３のサンプルのＤダイマー、フィブリン形成時間、プラトーにおけるＤＯＤ、およびフィブリノゲンを残りの３つのＳＴＡＲ（登録商標）機器において試薬の第２のバッチによってテストした。
【０２６７】
各々のパラメータに対して得た変動の平均および標準偏差を、以下の表９および表１０において報告している。
【０２６８】
表９および表１０に示すとおり、フィブリン形成測定に対して得た変動の平均は、１５４人の正常な患者に対して２％未満であり、８３人の静脈血栓症を有する患者および有さない患者に対して１％未満である。
【０２６９】
フィブリン形成のパラメータの測定は、クラウスの方法におけるフィブリノゲンの測定と同様に反復性がある。
【０２７０】
特異的Ｄダイマーの測定は、Ｄダイマーおよび比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］の測定と同様に反復性がある。変動の平均は２．３％未満である。
【０２７１】
２つ組において特異的Ｄダイマーによって陽性にされ、比率［Ｄｄｉ／Ｆｉｂ］によって陰性にされた５つのサンプルのうち、２つはイメージングで確認した肺塞栓症を有する患者からのものであり、２つは凝固過剰活性化を有し、１つは心疾患を有する患者からのものである。
すなわち、比率［Ｄｄｉ／Ｆｉｂ］によって偽陰性であることを見出した、ＰＥを有する２人の患者は本発明の方法によって診断できるが、ＰＥを有さない１人の患者は本発明の方法によってイメージングを必要とする。
【０２７２】
表９．正常な患者からのサンプルにおけるフィブリン形成測定の２つ組の反復性。
【０２７３】
【表９】
2019507345.tif 000026
【０２７４】
表１０．イメージングにおける血栓症を有する患者および有さない患者からのサンプルにおける、フィブリン形成、Ｄダイマーおよび本発明の方法に従って調整されたＤダイマー、ならびに比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］の測定の２つ組の反復性。
【０２７５】
【表１０】
2019507345.tif 000027
【０２７６】
実施例１１：Ｄダイマーをアッセイするための別の試薬による、本発明の方法に従うＤダイマーの調整
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｅ）からｈ）は、この方法の第１のバージョンのものである。
【０２７７】
Ｄダイマーをアッセイするためのインスツルメンテイション・ラボラトリー（ＩＬ）の方法によって、実施例２の式による凝固亢進（Ｈ）によって生成されたＤダイマーの関数、実施例４の対数関数および実施例５の比率Ｒによる炎症（Ｉ）の関数、ならびに実施例６の線形方程式による線溶亢進（Ｆ）の関数としてＤダイマーを調整する。
【０２７８】
凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてＤダイマーを調整することによって、凝固活性化状態における凝固亢進によって生成されたＤダイマーを減算することが可能になるが、表１１に示すとおり、血栓症を有する患者と有さない患者とを識別することはできない。
【０２７９】
表１１．血栓症の疑いのある患者からの血漿における、凝固亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーをアッセイするためのＩＬの方法によるＤダイマーの調整
【０２８０】
【表１１】
2019507345.tif 000028
【０２８１】
図１３および表１２に示すとおり、炎症によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整によって、血栓症を有する患者と有さない患者とを識別することが可能になる。よって、約９０％の患者が、陰性の調整Ｄダイマーレベルに対する２つのスターゴおよびＩＬ試薬の１つまたは他のものによるイメージングを回避できる。
【０２８２】
表１２．血栓症の疑いのある患者からの血漿における、凝固亢進および炎症によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーをアッセイするためのＩＬの方法によるＤダイマーの調整。
【０２８３】
【表１２】
2019507345.tif 000029
【０２８４】
図１３ならびに以下の表１３および表１４に示すとおり、凝固亢進（Ｈ）および炎症（Ｉ）に加えて、線溶亢進（Ｆ）によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーの調整によって、より多くの患者を識別することが可能になる。よって、９５％より多くの患者が、本発明の方法に従って調整した陰性のＤダイマーのレベルに基づいて、イメージングを回避できる。９つの偽＋のうち、３つは転移を伴うがんであり、３つは閾値の限界（≦０．６０）であり、３つは高齢の患者（＞８０歳）である。
【０２８５】
表１３．ＦｇＤＰの演繹による線溶亢進によって生成されたＤダイマーの関数としてのＤダイマーをアッセイするためのＩＬの方法による、本発明の方法による（血栓症を有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者からの血漿の識別。
【０２８６】
【表１３】
2019507345.tif 000030
【０２８７】
図１３および以下の表１４に示すとおり、本発明の方法によるこの調整は、比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］よりも効果的である。比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］による偽陰性を本発明の方法によって検出することによって、血栓症を見逃さないことが可能になる。本発明の方法による偽陽性は比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］による偽陽性よりも少ないため、イメージングを用いて診断される患者の数を減らすことが可能になる。
【０２８８】
表１４．血栓症を有するかまたは有さない患者からの血漿における、ＤダイマーをアッセイするためのＩＬ試薬による本発明の光学的方法と、比率［Ｄダイマー／フィブリノゲン］とによるＤダイマーの調整の比較（Ｈ：凝固亢進、Ｉ：炎症、Ｆ：線溶亢進、Ｄｄｉ：Ｄダイマー、Ｆｉｂ：フィブリノゲン）。
【０２８９】
【表１４】
2019507345.tif 000031
【０２９０】
実施例１２：年齢の関数としての（血栓症を有するかまたは有さず、がんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある患者に対する本発明による方法の診断性能レベル
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｅ）からｈ）は、この方法の第２のバージョンのものである。
【０２９１】
ステップｅ’）に従って、炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベルを調整し、この調整レベルを低いＤダイマーのレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対して補正することによって、血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲを算出した。炎症の関数として分類したサンプルの各々に対して、ステップｇ’）に従って、線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベルを算出した。次いで、患者における血栓症を除外もしくは診断するか、または患者における凝固活性化状態に注意を向けるために、比率ＴＡ／ＦＦＴを閾値に対して比較した。
【０２９２】
（血栓症を有するかまたは有さず、がんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのある合計２１８人の患者をテストした。テストしたこれら２１８人の患者のうち、４７％は５０歳を超えており、１７％は７５歳を超えており、１５％はがんを有した。１９９人の患者（９１．３％）において、イメージングテストまたは臨床的確率によるＤダイマーの陰性のアッセイに基づいて、ＰＥおよび／またはＤＶＴの診断を除外した。１９人の患者、すなわち８．７％において、陽性のイメージングテストに基づいてＰＥおよび／またはＤＶＴの診断を確認した。この２１８人の患者に対して、本発明の方法の第２のバージョンを用いて、血栓症または凝固活性化状態の除外および／または診断を行った。この方法の診断性能レベルを、Ｄダイマーの通常のアッセイおよび年齢調整Ｄダイマーの診断性能レベルと比較した。
【０２９３】
次いで、（血栓症を有するかまたは有さず、がんを有するかまたは有さない）血栓症の疑いのあるより多数の患者に対して、本発明の方法の診断性能レベルを定めた。テストした合計７９６人の患者において、４９％は５０歳を超えており、１９％は７５歳を超えており、７．３％はがんを有した。７３０人の患者（９１．７％）において、ＰＥおよび／またはＤＶＴの診断を除外した。６６人の患者、すなわち８．３％において、ＰＥおよび／またはＤＶＴの診断を確認した。
【０２９４】
高齢の患者においては、Ｄダイマーのレベル決定の臨床的有用性が限られる。これは、肺塞栓症を除外するためにＤダイマーの閾値を年齢によって調整する必要があるためである（Ｒｉｇｈｉｎｉら，ＪＡＭＡ，２０１４，３１１：１１１７−１１２４）。この調整した閾値は、５０歳以上の患者に対して年齢に１０を掛けたものに相当する。年齢に対して調整したＤダイマー閾値と、臨床的確率のプレテスト評価との組み合わせを、肺塞栓症が除外された可能性のある多数の患者と組み合わせる（Ｒｉｇｈｉｎｉら，ＪＡＭＡ，２０１４，３１１：１１１７−１１２４）。肺塞栓症（ＰＥ）および深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の臨床的確率のプレテスト評価のための方法は、当該技術分野において公知である（それぞれＫｏｌｏｋら，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２００８，１６８：２１−３１，およびＷｅｌｌｓら，ＮＥＪＭ，２００３，３４９：１２２７−１２３５を参照）。
【０２９５】
本発明の方法に従って調整されるＤダイマーの閾値は、有利には年齢の関数として調整したものではない。なぜならＤダイマーのレベルと、凝固活性化と、炎症とは、５０歳より後に年齢の関数として徐々に増加するからである。その結果として、比率を年齢の関数として調整していない。本発明の方法に従って調整したＤダイマーのレベルが高いほど、ＤＯＤによる比率の分母が大きくなり、ＰＥまたはＤＶＴの確率が高くなる。
【０２９６】
以下の表１５に示すとおり、血栓症の疑いのある２１８人の患者に対して、本発明の方法は、Ｄダイマーまたは年齢調整されたＤダイマーの通常のアッセイよりも多くの患者（約２０％多い）をさらに除外することを可能にする。よって、本発明の方法でテストした患者の７５％よりも多くが、補助的なイメージングテストを必要としない。
【０２９７】
表１５における性能レベルは、Ｄダイマーおよび年齢調整Ｄダイマーに対する通常の閾値０．５０μｇ／ｍｌと、本発明の方法によるこの実施例における閾値０．５１μｇ／ｍｌとにおいて与えている。偽陰性の診断がなければ、３つの方法の感受性は１００％である。他方で表１５に示すとおり、本発明の方法の特異性は、他の２つの方法よりもかなり高い。陽性の尤度比は他の２つの方法よりも高く、この結果が陽性であるときには、患者が血栓症を有する確率が他の方法よりも３倍高いことを確実にする。
【０２９８】
本発明による方法をより多数の患者に適用するときにも、類似の診断性能レベルを見出している。表１６に示すとおり、血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、この方法は７９％の患者を除外することを可能にし（他の方法よりも２０％より多い）、表１７および図１５（Ａ）に示すとおり、これは年齢に関係しない。加えて本発明による方法は、がんである患者（＜７５歳）をより多く除外することを可能にする（図１５（Ｂ）を参照）。最後に本発明による方法は、高齢の患者およびがんである患者だけでなく、がんである高齢の患者をより良好に除外することを可能にする（図１５（Ｂ）を参照）。より多数の患者に対する結果は、本発明による方法の特異性が参照方法と比べて高いことを示す（表１６を参照）。陽性の予測値は、参照方法の予測値よりも約２倍高い。
【０２９９】
表１５．血栓症の疑いのある２１８人の患者（１９人が血栓症を有し、１９９人が血栓症を有さない）に対する、本発明の方法の診断性能レベルと、Ｄダイマーおよび年齢調整Ｄダイマーのアッセイの診断性能レベルとの比較。
【０３００】
【表１５】
2019507345.tif 000032
【０３０１】
表１６．血栓症の疑いのある７９６人の患者（６６人が血栓症を有し、７３０人が血栓症を有さない）に対する、本発明の方法の診断性能レベルと、Ｄダイマーおよび年齢調整Ｄダイマーのアッセイの診断性能レベルとの比較。
【０３０２】
【表１６】
2019507345.tif 000033
【０３０３】
表１７．血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、Ｄダイマーのレベル（Ｄ−ｄｉ）が＜５．１μｇ／ｍｌである５０歳未満の３８６人の患者と５０歳より上の３７９人の患者とに対する、本発明の方法による血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベル（Ｄ−ｄｉ）。
【０３０４】
【表１７】
2019507345.tif 000034
【０３０５】
本発明の方法による血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルは、患者の年齢にかかわらず（平均年齢３８歳または７２歳）、血栓症の診断を有する患者のものと類似している。他方で、血栓症を有さない患者におけるＤダイマーは、予想どおり年齢の関数として高くなる。
【０３０６】
実施例１３：患者グループによる本発明による方法の診断性能レベル
この実施例において用いるプロトコルは、プロトコルＡである。この実施例において用いる方法のステップｅ）およびｈ）は、この方法の第２のバージョンのものである。
【０３０７】
ステップｅ’）に従って、炎症によって生成されたＤダイマーのレベルの関数としてサンプルのＤダイマーのレベルを調整し、この調整レベルを低いＤダイマーのレベル（＜４μｇ／ｍｌ）に対して補正することによって、血管内フィブリン分解の結果もたらされたＤダイマーのレベルＲを算出した。炎症の関数として分類したサンプルの各々に対して、ステップｇ’）に従って、線溶亢進によって生成されたＤダイマーのレベルを算出した。次いで、患者における血栓症を除外もしくは診断するか、または患者における凝固活性化状態に注意を向けるために、比率ＴＡ／ＦＦＴを閾値に対して比較した。
【０３０８】
本発明の方法の第２のバージョンを用いて、血栓症の疑いのある合計７９６人の患者に対して、本発明の方法の診断性能レベルを定めた。血栓症を有する８．３％の患者、がんを有する７．３％の患者、血栓症の素因を有する患者、凝固亢進状態を有する患者、および凝固活性化状態を有する患者に対する、本発明の方法によって得られた結果を以下の表１８〜２１に提供する。
【０３０９】
肺塞栓症（ＰＥ）および深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の診断
肺塞栓症（ＰＥ）を有する４６人の患者、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を有する１６人の患者、ＰＥおよびＤＶＴの両方を有する４人の患者、静脈血栓症の病歴（ＨＩＳＴ：ｈｉｓｔｏｒｙ）を有する１５人の患者に対して得た、本発明の方法の診断性能レベルを表１８に記載している。
【０３１０】
表１８．血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、血栓症の診断を有する６６人の患者に対して得た、本発明の方法の診断性能レベル。
【０３１１】
【表１８】
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【０３１２】
表１９に示すとおり、得た結果は、本発明による方法が、炎症のレベルが高い肺梗塞の事象および重篤でない分離した亜区域性肺塞栓症の事象を含む、静脈血栓塞栓症である患者の１００％近くを診断することを可能にすることを示す。なお表１８に示すとおり、定めた血管内フィブリン分解の結果もたらされるＤダイマーのレベルは、静脈血栓塞栓症（肺塞栓症または深部静脈血栓症）の病歴（ＨＩＳＴ）の場合に高くなる。
【０３１３】
表１９．血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、血栓症の診断を有する６６人の患者に対して得た、本発明の方法の診断性能レベル。
【０３１４】
【表１９】
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【０３１５】
血栓症素因状態
この研究でテストした血栓症の素因を示す１１３人の患者は、既知のがんである患者（５８人の患者、ＶＴＥに対して陰性と診断した４７人および陽性と診断した１１人を含む）、未知のがんである患者（２１人の患者、陰性と診断した１７人および陽性と診断した４人を含む）、妊娠中の女性（１４人の患者、すべて陰性と診断）、出産した女性（４人の患者、すべて陰性と診断）、術後の段階の患者（２人の患者、すべて陰性と診断）、および長期旅行をしたばかりの患者（１４人の患者、陽性と診断した１人を除いてすべて陰性と診断）であった。
【０３１６】
表２０．血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、血栓症の診断を有する１６人を含む、血栓症素因状態を有する１１３人の患者に対して得た、本発明の方法の診断性能レベル。
【０３１７】
【表２０】
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【０３１８】
血栓症素因状態を有する患者において得た結果は、本発明による方法が静脈血栓塞栓症である患者の１００％を診断することを可能にすることを明らかに示す。加えて表２０に示すとおり、本発明の方法は、がんでない患者の９３％より多くを除外することを可能にする。がんである患者において、Ｄダイマーを定めるための通常の方法による２２％と比べて、本発明の方法は患者の５０％の除外を可能にする。
【０３１９】
凝固亢進状態
この研究でテストした凝固亢進状態を有する４３６人の患者は、血栓形成傾向のある患者（４人の患者、陽性と診断した１人を除いてすべてＶＴＥ陰性と診断）、腎不全である患者（２６人の患者、陽性と診断した１人を除いてすべて陰性と診断）、外傷、転倒、または骨折をした患者（１３人の患者、すべて陰性と診断）、および５０歳以上の対象のグループ（３９３人の対象、陰性と診断した３５７人および陽性と診断した３６人を含む）であった。
【０３２０】
表２１．血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、血栓症の診断を有する３８人を含む、凝固亢進状態を有する４３６人の患者に対して得た、本発明の方法の診断性能レベル。
【０３２１】
【表２１】
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【０３２２】
凝固性亢進状態を有する患者において得た結果は、本発明による方法が静脈血栓塞栓症である患者の１００％を診断することを可能にすることを明らかに示す。加えて表２１に示すとおり、本発明の方法は、高齢の患者を含む患者の７５％より多くを除外することを可能にする。本発明の方法が除外しなかった高齢の患者のうち１／３はがんを有し、２／３は腎不全または凝固活性化である。
【０３２３】
凝固活性化状態
この研究でテストした凝固活性化状態を有する１４４人の患者は、感染症または敗血症である患者（５人の患者、すべてＶＴＥ陰性と診断）、肺疾患、気管支炎、または呼吸不全である患者（７１人の患者、陽性と診断した１人を除いてすべて陰性と診断）、炎症性疾患である患者（６人の患者、すべて陰性と診断）、胃炎である患者（７人の患者、すべて陰性と診断）、心筋症である患者（４５人の患者、陽性と診断した１人を除いてすべて陰性と診断）、および脳卒中の病歴のある患者（１０人の患者、すべて陰性と診断）であった。
【０３２４】
表２２．血栓症の疑いのある７９６人の患者のうち、血栓症の診断を有する２人を含む、凝固活性化状態を有する１４４人の患者に対して得た、本発明による方法の診断性能レベル。
【０３２５】
【表２２】
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【０３２６】
表２２に示すとおり、凝固活性化状態を有する１４４人の患者において得た結果は、本発明による方法が静脈血栓塞栓症である患者の１００％を診断し、加えて陰性の患者の８０％を除外する（平均年齢８０歳の心筋症を有する高齢の患者を除く）ことを可能にすることを明らかに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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