(57)【要約】  本発明は、患者がエステルプロドラッグの処置に感受性であるかを評価するための診断および治療方法に関する。本発明の方法は、化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置成功の評価のための予測値としての、腫瘍サンプルのカルボキシルエステラーゼ２(ＣＥＳ２)発現の分析を含む。あるいは、本発明は処置感受性を評価するための別の予測値としての、プロドラッグおよび活性治療剤の尿比の分析を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する患者を診断および／または階層化するインビトロ法であって、
ａ．患者の腫瘍サンプルを提供する手順、
ｂ．腫瘍サンプルにおけるカルボキシルエステラーゼ２(ＣＥＳ２)発現を決定する手順
を含み、
腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現の欠如が、患者がエステルプロドラッグを用いた処置から利益を受けないリスクを示し、そして、腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現が、患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置から利益を得ることを示す、
方法。
【請求項２】
癌患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者であるかを評価するインビトロ法であって、
ａ．患者の腫瘍サンプルを提供する手順、
ｂ．腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現レベルを決定する手順
を含み、
腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現が、患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者であることを示す、
方法。
【請求項３】
癌が胆管癌(ＢＴＣ)である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍隣接組織が健常組織である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
エステルプロドラッグがＣＡＰ７．１またはその誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた患者の処置をモニタリングするインビトロ法であって、
処置中の患者から得られた尿サンプルにおけるエステルプロドラッグと化学療法剤の比(プロドラッグ：化学療法剤＝尿比  ＵＲ)を決定することを含み、
対照または基準値と比較して減少したＵＲが、処置に対する応答を示し、エステルプロドラッグを用いた処置を継続すべきであることを示す、
方法。
【請求項７】
エステルプロドラッグがＣＡＰ７．１またはその誘導体であり、化学療法剤がエトポシドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
患者由来の腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現を決定する手順をさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
処置が患者へのエステルプロドラッグの投与を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
患者の癌処置において使用するためのエステルプロドラッグであって、該処置が
ａ．請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法により、癌患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者であるか否かを評価すること、および
ｂ．(ｉ)患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者ではないことについて減少したリスクを有するならば、化学療法剤のエステルプロドラッグを用いて癌患者を処置すること
(ｉｉ)患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者ではないことについて増大したリスクを有するならば、化学療法剤のエステルプロドラッグと異なる処置を含む処置レジメンを用いて癌患者を処置すること
を含む、エステルプロドラッグ。
【請求項１１】
化学療法剤のエステルプロドラッグがエトポシドのエステルプロドラッグ、好ましくはＣＡＰ７．１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌が胆管癌(ＢＴＣ)である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者の癌処置において使用するためのエステルプロドラッグであって、該処置が、
ａ．治療有効量の化学療法剤のエステルプロドラッグを患者に投与すること、
ｂ．患者から尿サンプルを取得すること、
ｃ．尿サンプルにおける化学療法剤のエステルプロドラッグと化学療法剤の尿比を決定すること
を含む、エステルプロドラッグ。
【請求項１４】
化学療法剤のエステルプロドラッグがエトポシドのエステルプロドラッグであり、好ましくはプロドラッグがＣＡＰ７．１であり、化学療法剤がエトポシドである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのエステルプロドラッグ。
【請求項１５】
癌が胆管癌(ＢＴＣ)であるか、または特に胃腸管における他のＣＥＳ２陽性癌である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのエステルプロドラッグ。
【請求項１６】
癌が結腸直腸癌である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのエステルプロドラッグ。
【請求項１７】
対象における固形腫瘍疾患を処置する方法であって、
ａ．患者の腫瘍組織のサンプルおよび／または患者における腫瘍に(直接)隣接する健常組織のサンプルを提供する手順、
ｂ．患者の前記腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織細胞または腫瘍組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定する手順、および／または
ｃ．患者における腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定する手順；および
ｄ．患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、治療有効量の化学療法剤のエステルプロドラッグを患者に投与する；または
患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、治療有効量のエステルプロドラッグではない化学療法剤を患者に投与する手順を含む、方法。
【請求項１８】
固形腫瘍疾患が結腸直腸癌(ＣＲＣ)である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
化学療法剤のエステルプロドラッグがＣＡＰ７．１もしくはその誘導体またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者の組織サンプルの提供が腫瘍組織および／または隣接する健常組織を伴う切除を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍に隣接する組織サンプルが腫瘍組織を囲む(接触する)少なくとも１つの非腫瘍細胞を含む、好ましくは固有層の細胞を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
免疫組織化学、好ましくはＣＥＳ２特異的抗体、例えば＃ａｂ６４８６７(ウサギポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、イギリス)を用いることによりＣＥＳ２発現を決定する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＥＳ発現が腫瘍組織および／または隣接する健常組織に浸潤する白血球において決定される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
固形腫瘍疾患を有する患者のための処置を決定する方法であって、
ａ．患者の腫瘍組織サンプルおよび／または患者における腫瘍に(直接)隣接する健常組織サンプルを提供する手順、
ｂ．患者の前記腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織細胞または腫瘍組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定する手順、および／または
ｃ．患者における腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定する手順；および
ｄ．患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、治療有効量の化学療法剤のエステルプロドラッグを患者に対する処置として決定する手順；または
患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、治療有効量のエステルプロドラッグではない化学療法剤を患者に対する処置として決定する手順
を含む、方法。
【請求項２５】
固形腫瘍疾患が結腸直腸癌(ＣＲＣ)である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
化学療法剤のエステルプロドラッグがＣＡＰ７．１またはその誘導体、またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者の組織サンプルの提供が腫瘍組織および／または隣接する健常組織を伴う切除を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍に隣接する組織サンプルが腫瘍組織を直接囲む(接触する)少なくとも１つの非腫瘍細胞を含む、好ましくは固有層の細胞を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
免疫組織化学により、好ましくは＃ａｂ６４８６７ウサギポリクローナル抗体(Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、イギリス)のようなＣＥＳ２特異的抗体を使用することによりＣＥＳ２発現を決定する、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍組織および／または隣接する健常組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２発現を決定する、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
白血球が形質細胞である、請求項１７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は患者がエステルプロドラッグの処置に感受性であるか否を評価するための診断および治療方法に関する。本発明の方法は、化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置成功の評価についての予測値としての、腫瘍サンプルにおけるカルボキシルエステラーゼ２(ＣＥＳ２)発現の分析を含む。あるいは、本発明は処置感受性を評価するための別の予測値としてのプロドラッグと活性治療剤の尿比の分析を含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
説明
多くの癌処置について、処置成功は個々の患者で異なる。これらのばらつきは特定の化学療法剤に対する癌疾患の先天的または後天的耐性によることがある。多剤耐性腫瘍細胞は長期治療後に化学療法剤に対して耐性となる。耐性は内因性または後天的耐性であり得て、癌処置の失敗となる主な寄与因子として知られている。臨床薬物耐性はしばしば、様々な構造的に多様な薬剤に対するデノボ耐性として、または以前の化学療法において使用されたことがない化学療法剤に対して獲得された交差耐性として特徴付けられる多剤耐性(ＭＤＲ)表現型として存在する。
【０００３】
薬剤耐性の根底にある細胞学的根拠は十分には理解されていないが、その獲得に寄与するいくつかの因子が特定されている。これらは薬剤排出機序、増大された薬剤不活性化(例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびアルキル化剤耐性)、薬剤標的変異(トポイソメラーゼ変異)、変更されたＤＮＡ修復およびアポトーシス耐性(ｐ５３変異、ｂｃｌ−２過剰発現など)を含む。
【０００４】
多くの薬剤はシトクロームＰ４５０(ＣＹＰ)アイソザイムにより代謝される。いくつかの薬剤は、それらの標的部位に到達するかまたは中央循環において特定の量に達する前に、消化器(Ｇｌ)管、肝臓および／または中央循環においてエステラーゼ酵素により急速に分解されて治療効果をもたらす。薬物の吸収薬物動態を評価するために、２つの薬物動態パラメーター、すなわち、血漿濃度−時間曲線下面積(ＡＵＣ)およびピーク血漿濃度(Ｃｍａｘ)が一般に使用される。しかしながら、中央循環における吸収動態の改善の程度および薬物の利用可能性(すなわち、バイオアベイラビリティ)は主に薬物のＡＵＣを用いることにより評価される。治療的に活性ではあるが吸収が乏しいいくつかの薬物の吸収動態および経口バイオアベイラビリティは、Ｇｌ管からより容易に吸収されるそれらのエステルプロドラッグの合成により改善され得る。エステルプロドラッグはエステル部分を有するプロドラッグである。吸収されると、エステルプロドラッグはエステラーゼの作用のもと、加水分解されて活性薬物を生成する。プロドラッグは癌処置において、活性化合物のバイオアベイラビリティを強化するために使用される。しかしながら、全ての患者が同一の変換効率で投与されたプロドラッグをその活性形態に変換するとは限らない。
【０００５】
胆管癌(ＢＴＣ)は、全ての消化器癌の３％および全ての原発性肝臓癌の１５％を占める新生物である。過去２０年間で、ＢＴＣの発生率は、主に肝内形態の増加により上昇している(Khan, S. A. et al., "Cholangiocarcinoma", Lancet, 366:1303-14 (2005); Patel, T. et al., "Cholangiocarcinoma", Nat Clin Pract Gastroentel Hepatol, 3:33-42 (2006))。タイ北部は最も高い発生率を有する(Shaib, Y. et al., "The epidemiology of holangiocarcinoma", Semin Liver Dis, 24:115-125 (2004))。治癒の唯一の可能性は完全な外科的切除である。完全な切除のために、初期診断が重要であるが、困難である。マージンフリー切除を行っても、５年生存率はわずか２０％〜４０％である(Jarmagin, W. R., et al., "Surgical management of cholangiocarcinoma", Semin Liver Dis, 24:18 (2004); Gores, G. J., "Cholangocarcinoma: current concepts and insight", Hepatology, 37:961-969 (2003))。切除不能な疾患は通常、６か月〜１年生存期間を示す(Jarmagin, W. R., et al., "Surgical management of cholangiocarcinoma", Semin Liver Dis, 24:18 (2004))。ＢＴＣ患者のほぼ３分の１が、切除には遅すぎる。したがって、ＢＴＣの初期での診断方法を確立する必要がある。
【０００６】
現在、ＢＴＣの診断は、臨床症状を有する患者におけるコンピュータ断層撮影法または超音波検査または内視鏡的逆行性胆管造影(ＥＲＣ)としての胆道の画像に頼る。ＥＲＣによるブラシ細胞診は組織診断を可能とするが、ＢＴＣの線維形成性のため、感受性が乏しい(Gores, G. J., "Cholangocarcinoma: current concepts and insight", Hepatology, 37:961-969 (2003); Abu-Hamda, E. M., et al., "Endoscopic management of cholagiocarcinoma", Semin Liver Dis, 4:165-175 (2004))。結果的に、臨床医はしばしば、悪性腫瘍の診断の他の手掛かりを明らかにし、腫瘍マーカーはより多くの情報を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、プロドラッグの使用を含む治療の処置成功を予測するための方法が当分野において必要である。本発明はまた、胆管癌患者について処置成功を評価するためのより良好な診断を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＣＡＰ７．１の分子標的は、エトポシドと同様、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩＩである。ＣＡＰ７．１のより好ましい治療効果および副作用プロファイルについて想定される理由は、プロドラッグ変換に有益である開列酵素、カルボキシルエステラーゼ２(ＣＥＳ２) (Ｕｔｋｕら、未発表)が、胆管腫瘍のような特定の組織において主に発現することである。プロドラッグＣＡＰ７．１は、肝臓を通過する間におよび腸肝再循環後に結腸において、ＣＥＳ２により、その親部分に優先的に変換される。ＢＴＣを含む様々な胃腸腫瘍の免疫組織学染色が、どのようにして腫瘍および非腫瘍腸組織内のＣＥＳ２の空間的発現がＣＡＰ７．１の治療効果に影響を及ぼすかという問題に取り組むために実施された。
【０００９】
消化器腫瘍におけるＣＥＳ２の発現の分析により、プロドラッグ変換の重要なチェックポイントとして肝臓組織および末梢血単核細胞を明らかとした。胆管癌は肝臓内(肝臓内ＢＴＣ)または肝臓の閉鎖された領域(肝臓外ＢＴＣ)に由来すため、肝臓におけるＣＥＳ２発現は、腫瘍環境の近接での薬物蓄積に寄与しうるためＢＴＣにおけるＣＡＰ７．１の使用に有益である。
【００１０】
しかしながら、腫瘍内のＣＥＳ２発現は不均一であり、いくつかの場合には、腫瘍に隣接する組織における発現よりも低い。腫瘍細胞それ自体に加えて、免疫細胞はいくつかの腫瘍のすぐ近辺に浸潤し、高レベルのＣＥＳ２を発現することが示された。したがって、ある患者において、腫瘍に隣接する非腫瘍組織はＣＥＳ２の関連する供給源であり得る。生検において全ての患者が腫瘍内浸潤を示したわけではなかった。肝臓内のＣＥＳ介在性初回通過効果は、エステラーゼ活性依存性生物活性薬物の全身利用可能性に大幅に寄与し得るが、主な腫瘍特異的効果はその腫瘍内放出により介在されるときもまた、増大され得る。これは、腫瘍組織における腫瘍浸潤リンパ球もしくは肝臓におけるＣＥＳ２の発現と独立しておよび／またはそれに加えて、それぞれの薬物の蓄積をもたらす。
【００１１】
臨床的にいえば、ＣＥＳ２＋ＢＴＣ症例は、１)局所薬物レベルの増大、２)ＣＥＳ＋リンパ球および３)胆管腫瘍周辺のＣＥＳ２＋肝臓組織というＣＡＰ７．１での治療から数倍の利益を得るはずである。
【００１２】
したがって、
ａ．患者の腫瘍サンプルの提供、
ｂ．腫瘍サンプルにおけるカルボキシルエステラーゼ２(ＣＥＳ２)発現の決定
の手順を含む、癌を有する患者を診断および／または階層化する方法により、上記の問題は初めて解決され、
ここで、腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現の欠如は患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置により利益を得ないとのリスクを示し、そして
腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現は、患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置により利益を得ることを示す。
【００１３】
別の態様において、本発明は
ａ．患者の腫瘍サンプルの提供、
ｂ．腫瘍サンプルにおけるカルボキシルエステラーゼ２(ＣＥＳ２)発現の決定
の手順を含む、患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者であるかを評価する方法を含み、
ここで、腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現は、患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者であることを示す。
【００１４】
本明細書で使用される用語「癌」とは、制御されていないまたは調節不全の細胞増殖、減少した細胞分化、周辺組織に浸潤する不適切な能力および／または異所性部位で新たな増殖を確立する能力により特徴付けられる細胞障害をいう。用語「癌」は、限定されないが、固形腫瘍および血液腫瘍を含む。用語「癌」は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液および血管の疾患を包含する。用語「癌」はさらに、原発性および転移性癌を包含する。
【００１５】
固形腫瘍の非限定的な例は、膵臓癌；膀胱癌；結腸直腸癌；胆管癌、転移性乳癌を含む乳癌；アンドロゲン依存性およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含む前立腺癌；例えば、転移性腎細胞癌を含む腎臓癌；肝臓癌；例えば、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、気管支肺胞癌(ＢＡＣ)および肺腺癌を含む肺癌；例えば、進行性上皮または原発性腹膜癌を含む卵巣癌；子宮頸癌；胃癌；食道癌；頭頸癌；例えば、頭頸部の扁平上皮癌を含む胸腺癌；例えば、悪性黒色腫を含む皮膚癌；転移性神経内分泌腫瘍を含む神経内分泌癌；例えば、神経膠腫、未分化乏突起神経膠腫、成人多形性グリア芽細胞腫、および成人未分化星状細胞腫を含む脳腫瘍；神経芽腫、骨癌；軟組織肉腫；および甲状腺癌を含む。
【００１６】
血液系腫瘍の非限定的な例は、移行期ＣＭＬおよび慢性期ＣＭＬ(ＣＭＬ−ＢＰ)を含む急性骨髄白血病(ＡＭＬ)；慢性骨髄白血病(ＣＭＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；ホジキン病(ＨＤ)；濾胞性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；Ｂ細胞リンパ腫；Ｔ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫(ＭＭ)；ワルデンストレームマクログロブリン血症；不応性貧血(ＲＡ)、環状鉄芽球を伴う不応性貧血(ＲＡＲＳ)、芽球増加を伴う不応性貧血(ＲＡＥＢ)および形質転換(ＲＡＥＢ−Ｔ)におけるＲＡＥＢを含む骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)；ならびに骨髄増殖性症候群を含む。
【００１７】
しかしながら、本発明の好ましい実施態様はＣＥＳ２陽性である胃腸癌に関する。最も好ましいのは胆管癌(ＢＴＣ)である。
【００１８】
本発明の状況において、腫瘍サンプルは、好ましくは腫瘍細胞のサンプルである。しかしながら、本発明の状況において、用語「腫瘍サンプル」はさらに、組織に隣接する腫瘍のサンプルもまた、含むべきである。その理由は、本発明が、一部患者の腫瘍隣接組織がＣＥＳ２発現レベルの上昇を示すことを示すためである。サンプルの性質は癌のタイプによって変化し、血液もしくは血清サンプルから組織サンプルの範囲に至ることがある。好ましいものは生検により得られた組織サンプル、特に胆管癌に関する実施態様である。
【００１９】
腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現レベルは、好ましくは免疫学的に、好ましくは抗体染色により決定される。しかしながら、本発明はまた、限定されないが質量スペクトル法またはＰＣＲに基づく技術のようなＣＥＳ２発現の検出のための方法を使用し得る。ＣＥＳ２の発現レベルは、腫瘍がＣＥＳ２を発現するかしないか、または腫瘍が減少または増大したＣＥＳ２発現を有するかを評価するために、対照または基準と比較され得る。例えば、対照または基準値はＣＥＳ２陰性基準腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２発現の所定値である。
【００２０】
本明細書で使用される「プロドラッグ」は、対象の体内で代謝変換され、したがって活性部分を遊離する薬物分子の化学誘導体(薬学的に活性な成分)を意味する。用語「エステルプロドラッグ」は、したがって、対象の体内で加水分解のような変換をうけて活性薬物を遊離する薬学的に活性な成分の不活性なエステル形態(すなわち−ＣＯ−ＯＲ；ここでＲは有機置換基である)として理解される。エステルプロドラッグは、好ましくはＣＥＳ２によって変換される。
【００２１】
プロドラッグは、好ましい実施態様において、エトポシドプロドラッグ、例えば式Ｉ： 
【化１】
2019507878.tif 000002
〔式中、
ＸはＯ、ＮＨおよびＳから成る群から選択され、
ｎは０、１または２であり、
Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｈ、メチルおよびエチルからなる群から選択されるか、または一体となってＣＲ３Ｒ４を形成し、
ここで、Ｒ３およびＲ４はＨ、メチルおよびエチルである〕
を有する化合物、またはそれらのプロドラッグ、誘導体溶媒和物もしくは塩である。
【００２２】
好ましくは、本発明のプロドラッグは
【化２】
2019507878.tif 000003
から選択される。好ましくは、本発明の化合物はＣＡＰ７．１である。
【００２３】
ある好ましい態様において、本発明はまた、本明細書に開示される方法における使用のための上記プロドラッグを提供する。
【００２４】
本発明の別の態様はさらに、処置において癌患者から得られた尿サンプル中の化学療法剤のエステルプロドラッグと化学療法剤の比(プロドラッグ：活性化合物＝尿比  ＵＲを決定する方法を含む、癌患者における化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置をモニタリングする方法に関し、ここで、対照または基準値と比較して減少したＵＲは、処置に対する応答およびエステルプロドラッグを用いた処置を継続するべきであることを示す。
【００２５】
この状況における基準または対照値とは、化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に応答しない患者におけるＵＲをいう。
【００２６】
ある別の態様において、本発明はさらに、処置において癌患者から得られた尿サンプル中の化学療法剤のエステルプロドラッグと化学療法剤の比(プロドラッグ：活性化合物＝尿比  ＵＲ)を決定する方法を含む、癌患者における化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置をモニタリングする方法に関し、ここで、対照または基準値と比較して増大したＵＲは、患者が処置に対する非応答者であることおよびエステルプロドラッグを用いた処置を中断すべきであることを示す。
【００２７】
この態様において、この状況における基準または対照値は化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に応答する患者におけるＵＲを参照する。
【００２８】
ＵＲを決定するために、処置はエステルプロドラッグの患者への投与の手順を含む。
【００２９】
いくつかの実施態様において、患者のサンプルにおける低いＵＲ(１０未満、より好ましくは５未満、より好ましくは４未満、３未満、２未満、１未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１未満、好ましくは０．０９未満、０．０８未満、０．０７未満、０．０６未満、最も好ましくは０．０５未満)は、処置に対する応答およびエステルプロドラッグを用いた処置を継続するべきであることを示す。
【００３０】
いくつかの実施態様において、患者のサンプルにおける０．５未満のＵＲは、処置に対する応答およびエステルプロドラッグを用いた処置を継続するべきであることを示す。
【００３１】
いくつかの実施態様において、患者のサンプルにおける０．１未満、好ましくは０．０５未満のＵＲは、処置に対する応答およびエステルプロドラッグを用いた処置を継続するべきであることを示す。
【００３２】
本明細書に記載の発明の方法は、好ましい実施態様において、インビボ法またはエキソビボ法である。
【００３３】
本発明により患者から得られた尿サンプルは、好ましくは特定の期間で回収された尿サンプルである。例えば、いくつかの実施態様において期間は少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間である。
【００３４】
ＵＲの決定に加えて、本発明はまた、ＵＲの決定および患者由来の腫瘍サンプルにおけるＣＥＳ２の発現を決定する手順の両方を含む方法を提供する。ＣＥＳ２発現およびＵＲの組合せの予測値は両マーカーについての単独予測値より極めて高い。
【００３５】
本発明の別の態様はさらに、
ａ．本願発明の何れかの方法により、癌患者が化学療法剤のエステルプロドラッグに対する応答者であるかどうかを評価すること、および
ｂ．(ｉ)患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者ではないことについて減少したリスクを有するならば、癌患者を化学療法剤のエステルプロドラッグを用いて処置すること、または
(ｉｉ)患者が化学療法剤のエステルプロドラッグを用いた処置に対する応答者ではないことについて増大したリスクを有するならば、癌患者を化学療法剤のエステルプロドラッグと異なる処置を含む処置レジメンを用いて処置すること
を含む、患者の癌を処置する方法に関する。
【００３６】
化学療法剤のエステルプロドラッグは、好ましくはエトポシドのエステルプロドラッグ、好ましくはＣＡＰ７．１である。癌は上記定義のとおりであるか、または好ましくは胆管癌(ＢＴＣ)である。
【００３７】
さらなる態様は、
ａ．治療有効量の化学療法剤のエステルプロドラッグを患者に投与すること、
ｂ．患者由来の尿サンプルを取得すること、
ｃ．尿サンプル中の化学療法剤のエステルプロドラッグと化学療法剤の尿比を決定すること
を含む、患者の癌を処置する方法に関する。
【００３８】
対照または基準値と比較して減少した尿比は、患者の癌が化学療法剤のエステルプロドラッグに感受性であることを示す。好ましくは、対照または基準値と比較して減少した尿比は、化学療法剤のエステルプロドラッグの投与または副作用を避けるための薬量の調整を含む処置を継続することを示し、またはここで対照または基準値と比較して増大した尿比は、化学療法剤のエステルプロドラッグの投与を含む処置を中断することを示す。
【００３９】
本明細書に記載の発明の状況において、用語「患者」は、動物またはヒトをいうものとする。好ましくは、動物患者は哺乳動物、より好ましくは、ウシ亜科動物、ウマ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどのような家畜、またはイヌ、ネコ、トリ、齧歯類などのようなペット動物である。最も好ましくは、患者はヒト患者である。
【００４０】
多様な検査結果、放射線結果または臨床結果のいずれかが達成されるならば、疾患または障害を有する患者への化合物、製品および／または医薬組成物の患者への投与は成功であると考えられる。例えば、疾患または障害に関連する１以上の症状が軽減され、減少し、阻害されるまたは次の段階に、すなわち、悪い段階に進行しないとき、投与は成功であると考えられる。障害が、寛解が見られるかまたは次の段階に、すなわち、悪い段階に進行しないとき、投与は成功であると考えられる。好ましくは、本明細書に記載の発明の状況において、癌細胞亜集団の増殖の量、数または速度が減少するかまたは減弱するとき、処置の成功が達成される。このような結果は、処置された患者に処置後の癌再発またはさらなる転移の形成を避けるためのより良い機会を与える。
【００４１】
本明細書に記載の発明にかかる癌はまた、結腸直腸癌であり得る。
【００４２】
さらに、本発明の別の態様において、
ａ．患者の腫瘍組織のサンプルおよび／または患者における腫瘍に(直接)隣接する健常組織のサンプルを提供すること
ｂ．患者の前記腫瘍組織の前記サンプルの、腫瘍組織細胞または腫瘍組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定すること、および／または
ｃ．患者における腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの、健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定すること
；および
ｄ．患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、治療有効量の化学療法剤のエステルプロドラッグを患者に投与すること；または
患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、治療有効量のエステルプロドラッグではない化学療法剤を患者に投与すること
を含む、固形腫瘍疾患を処置する方法が提供される。
【００４３】
また、
ａ．患者の腫瘍組織のサンプルおよび／または患者における腫瘍に(直接的に)隣接する健常組織のサンプルを提供する手順
ｂ．患者の前記腫瘍組織の前記サンプルの、腫瘍組織細胞または腫瘍組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定する手順、および／または
ｃ．患者における腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの、健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球におけるＣＥＳ２の発現レベルを決定する手順
；および
ｄ．患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現するか、または有意に多く発現するならば、治療有効量の化学療法剤のエステルプロドラッグが患者に対する処置として決定される；または
患者の腫瘍組織の前記サンプルの腫瘍組織または腫瘍組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、および／または患者の腫瘍に隣接する健常組織の前記サンプルの健常組織細胞および／または健常組織浸潤白血球において、対照と比較してＣＥＳ２が発現しないか、または有意に低く発現するならば、治療有効量のエステルプロドラッグではない化学療法剤が患者に対する処置として決定される手順
を含む、固形腫瘍を有する患者に対する処置を決定するための方法も提供される。
【００４４】
固形腫瘍疾患は、好ましくは結腸直腸癌(ＣＲＣ)である。
【００４５】
本明細書に記載のように、好ましい実施態様において、化学療法剤のエステルプロドラッグはＣＡＰ７．１またはその誘導体もしくは塩もしくは溶媒和物である。
【００４６】
いくつかの実施態様において患者の組織サンプルを提供することは、腫瘍組織および／または隣接する健常組織を伴う切除を含む。
【００４７】
本明細書に記載の発明の状況において、腫瘍に隣接する組織のサンプルは、好ましくは固有層の細胞を含む、好ましくは少なくとも１つの腫瘍組織を直接囲んでいる(接触している)非腫瘍細胞を含む。
【００４８】
いくつかの実施態様において、ＣＥＳ２の発現は免疫組織化学的に、好ましくは♯ａｂ６４８６７ウサギポリクローナル抗体(Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、イギリス)のようなＣＥＳ２特異的抗体により決定される。ＣＥＳ２発現の等級付けは、この節で説明することができる。ＣＥＳ２発現の等級付けは、好ましい実施態様において、本発明の実施例に記載のように実施される。
【００４９】
上の２つの本発明の方法の他の好ましい実施態様において、ＣＥＳ発現は、本明細書に記載の独創的な処置または治療決定を行うために、腫瘍組織および／または隣接する健常組織に浸潤する白血球において決定される。
【００５０】
用語「白血球」とは、好中球、好酸球、好塩基球、単球を含む顆粒球およびＢ細胞およびＴ細胞を含むリンパ球および特に断らない限り、血小板をいう。いくつかの好ましい実施態様において、本発明の状況における用語「白血球」は、形質細胞に関する。
【００５１】
本発明は、添付の図面および配列表を参照して以下の実施例においてこれよりさらに説明されるが、それに限定されるものではない。本発明の目的のために、本明細書で引用される全ての文献は、それらの全体における参照により、本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＣＥＳ２組織染色：Ａ：ＣＡＰ７応答患者；Ｂ：ＣＡＰ７非応答患者。
【図２】ＣＡＰ７．１で処置された対象群の尿比：１＝ＵＲ＜０.０４１６およびＣＥＳ＋の疾患対象および部分応答を有する患者；２＝ＵＲ＞０.０４１６およびＣＥＳ＋であるまたは決定していない、ＳＤを有する患者３＝ＵＲ＞０.０４１６およびＣＥＳ−／＋であるまたは決定していない、ＰＤを有する患者。
【図３】ＣＥＳ発現の採点。(Ａ)正常組織の切片または(Ｂ)段階的ＣＲＣ由来のＴＭＡスポットを、免疫組織化学により、ＣＥＳ２に対して染色した(褐色)；ヘマトキシリンで染色した核(青)。(Ａ)腺窩を有する上皮性細胞における強い発現を伴う正常結腸における特徴的なＣＥＳ−２分布。(Ｂ)０点：全ての腫瘍細胞がＣＥＳ−２を発現していない；５点：腫瘍細胞の約２０％において強いＣＥＳ−２発現；６点：腫瘍細胞の最大９０％において中程度のＣＥＳ−２発現；７点：腫瘍細胞の最大９０％において強いＣＥＳ−２発現；８点：腫瘍細胞の９０％以上において中程度のＣＥＳ−２発現。代表図；元の倍率ｘ１００。バーは１００μｍを表す。
【図４】ＣＲＣにおけるＣＥＳ−２発現。種々のグレードのＣＲＣを有する患者に由来する腫瘍および正常結腸組織を、免疫組織化学により、ＣＥＳ−２について染色した。腫瘍および上皮性細胞のＣＥＳ−２発現を採点した。(Ａ)腫瘍グレードＧ２(ｎ＝１０)およびＧ３(ｎ＝４)の切除されたＣＲＣ組織に由来するＣＥＳ−２発現の点数。平均＋／−ＳＤを伴う散布図。(Ｂ)腫瘍グレードＧ１(ｎ＝４)、Ｇ２(ｎ＝４７)およびＧ３(ｎ＝３５)に由来するＣＲＣ組織のＴＭＡスポットからのＣＥＳ−２発現の点数。平均＋／−ＳＤを伴う散布図。
【図５】ＣＲＣにおける腫瘍組織内および周辺のＣＥＳ２＋細胞の細胞型および局在化。ＣＥＳ−２発現については免疫組織化学、または種々の細胞型についてはタンパク質を、グレード２のＣＲＣを有する患者から切除されたＣＲＣ腫瘍組織のサンプルを用いて実施した。ヘマトキシリンを用いて核を染色した。(Ａ)正常組織領域または(Ｂ、Ｃ)腫瘍領域をＣＥＳ−２に対して染色し、矢印は多数のＣＥＳ−２＋細胞を示す。腫瘍組織を(Ｄ)ＣＤ１１ｂ＋免疫細胞(赤)、(Ｅ)ＭＰＯ＋好中球(赤)、(Ｆ)ＣＤ２０＋Ｂ細胞(赤)およびＣＤ３＋Ｔ細胞(褐色)、(Ｇ)ＣＤ１６３＋マクロファージ(赤)およびＣＥＳ−２＋細胞(青)または(Ｈ)ＣＤ１３８＋形質細胞(赤)およびＣＤ６８＋マクロファージ(褐色)に対して染色した。グレード２〜３のＣＲＣを有する患者(ｎ＝１０)についての代表図；元の倍率ｘ１００。バーは１００μｍを表す。
【図６】ＣＲＣ由来の腸組織におけるＣＥＳ−２＋形質細胞。(Ａ、Ｂ)ＣＲＣ患者由来の正常結腸組織または(Ｃ、Ｅ)ＣＲＣ腫瘍組織を免疫蛍光により(Ａ、Ｃ)ＣＥＳ−２(赤)およびＣＤ１３８(緑)に対してまたは免疫組織化学により(Ｂ、Ｄ、Ｅ)ＣＥＳ−２(褐色)およびＭＵＭ−１(赤)に対して染色した。ＤＡＰＩ(Ａ、Ｃ)またはヘマトキシリン(Ｂ、Ｄ、Ｅ)を用いて核を染色し、青色になった。グレード２〜３のＣＲＣを有する患者(ｎ＝１０)についての代表図；元の倍率ｘ４００。バーは２０μｍを表す。
【００５３】
応答者＝患者が治療的利益を示し、少なくとも２周期のＣＡＰ７．１を与えられる。
【実施例】
【００５４】
プロドラッグＣＡＰ７．１は活性なエトポシドへの変換を必要とするため、局所的および全身的なＣＥＳ２発現がＣＡＰ７．１の有効性および安全性についての決定因子であり得る。
【００５５】
ＣＥＳ２タンパク質発現のＩＨＣ評価は、ＣＡＰ７．１の応答および耐性の予測をもたらす可能性があり、市販後調査における患者階層化に利用されることがある。ＣＡＰ７．１：エトポシドの尿比(ＵＲ)の評価は、薬物レベルを最適化するための薬物の治療モニタリングを潜在的に支持し得る、ＢＴＣを有する患者におけるＣＡＰ７．１の代謝についての情報を提供し得る。
【００５６】
ＣＡＰ７．１のエトポシドへの変換における主な決定要因は、ヒトカルボキシルエステラーゼ、特にＣＥＳ２である。したがって、腫瘍部位におけるＣＥＳ２によるＣＡＰ７．１のエトポシドへの変換は、特に腫瘍において強く発現するＣＥＳ２を有する患者に利益を提供し得る。さらに、全身変換率もまた重要であり得る。
【００５７】
したがって、全身発現を評価するための腫瘍および末梢単核細胞(ＰＢＭＣ)における発現を評価するために、腫瘍生検におけるＣＥＳ２発現を測定することが提案される。さらに、ＣＡＰ７．１およびエトポシドの尿比はＣＡＰ７．１のエトポシドへの全身変換に対する指標を提供する。
【００５８】
実施例１：ＣＥＳ２腫瘍発現はＣＡＰ７．１治療成功と相関する
新たな治験プロトコルにおいて、仮説を試験するために腫瘍組織サンプルのＣＥＳ２の染色を導入した。したがって、ＣＡＰ７．１で処置された７名の患者およびＢＳＣ対照としての１名の患者に由来するデータがＢＴＣ腫瘍におけるＣＥＳ２＋発現について利用可能である(表１)。
【表１】
2019507878.tif 000004
【００５９】
腫瘍サンプルのＣＥＳ２染色を図１に示す。図１Ａは、ＣＡＰ７．１処置に応答する患者において高いＣＥＳ２発現が観察されるが、非応答応答患者において低いＣＥＳ２発現が観察されることを示す(図１Ｂ)。
【００６０】
実施例２：第Ｉ相および第II相試験におけるＣＡＰ７．１およびエトポシドの尿薬物分析
２４時間尿採取物におけるＣＡＰ７．１のエトポシドへの変換およびＣＡＰ７．１：エトポシドの尿比(ＵＲ)に関する第Ｉ相および第II相データの評価を行った。ＵＲおよびＣＥＳ２発現に関して、ＣＡＰ７．１に対するＳＤ(安定な疾患)およびＰＲ(部分応答)応答を含む疾患制御された患者およびＣＡＰ７．１に対する非応答者(進行性疾患を有する患者(ＰＤ))についての尿回収データを評価した。結果を図２に示す：ＵＲは高いＣＥＳ２発現を有するＣＡＰ７．１に応答する対象が２つの群に分類され、一方は低いＵＲを有し、もう一方は高いＵＲを有する。
【００６１】
低いＵＲを有する群は、０．００７１６(０．０１２１)の中央値(範囲)を有した。この群の７５％四分位数は０．０４１６であった。したがって、ＵＲが０．０４１６未満の高いＣＥＳ２発現を有するあらゆる応答者は低ＵＲ対象に分類し、ＣＥＳ２発現は高いがＵＲがＵＲ０．０１４６以上の応答者は高ＵＲ対象として分類した。
【表２】
2019507878.tif 000005
【００６２】
表２から理解できるように、低い尿比を有する対象はＣＡＰ７．１応答者である可能性が極めて高い。
【００６３】
実施例３：腫瘍細胞におけるＣＥＳ−２発現は結腸直腸癌における腫瘍グレードと相関しない。
近年の免疫組織化学的分析は、ＣＲＣにおいて広範なＣＥＳ−２発現を示す[５、６]。基本レベルのＣＥＳ発現についてより多くの情報を得るために、免疫組織化学を用いて手術の切除領域に由来する非炎症性結腸組織を分析した。上皮性細胞におけるＣＥＳ−２発現は、表面上皮において最も高い発現を伴う正常ヒト結腸において腺窩とともに増大したが、発現は腺窩の基部で完全に減少したことが明らかになった(図３Ｂ)。これはＣＥＳ−２発現が上皮性細胞分化中に増大したことを示す。
【００６４】
グレードＧ２およびＧ３のＣＲＣ腫瘍サンプル由来の少数の患者サンプル(ｎ＝１４)を用いた初期の試験は、ＣＥＳ−２発現スコアおよび腫瘍グレードの間に顕著な相関を示さなかった(マン・ホイットニー検定；図４Ａ)。８６患者を表すマイクロアレイ由来の８６サンプル(盲腸：ｎ＝８、結腸：ｎ＝５６、直腸：ｎ＝２２)スクリーニングは、腫瘍グレードに対する顕著な相関を有さない０〜８のＣＥＳ−２発現スコアであった(クラスカル−ウォリス検定；図４Ｂ)。このように、腫瘍細胞内のＣＥＳ−２の発現レベルは腫瘍の状態と関連しなかった。
【００６５】
ＴＭＡサンプルは腫瘍内の１つの位置にのみ由来するため、スコア０のサンプルが対応する切除された腫瘍組織のより広い領域におけるＣＥＳ−２発現パターンの代表例であることを確認することが重要であった。ＴＭＡおよび切除された腫瘍組織のより広い領域に由来する同一のＣＥＳ−２発現スコアが明らかになったのはＣＲＣ症例のわずか半分である(示さず)。いくつかの腫瘍はＣＥＳ−２タンパク質を全く有さないため、可能性のある代償メカニズムとしてＣＥＳ−１の発現について試験した。試験されたＴＭＡ(ｎ＝８６)由来の全ての腫瘍および切除された腫瘍組織のより広い領域にスポット(ｎ＝１４)はＣＥＳ−１について陰性であった。さらに、試験された盲腸、結腸および直腸のＮＥＣは、ＣＥＳ−１およびＣＥＳ−２の両方について陰性であった(示さず)。
【００６６】
ＣＲＣにおいて、ＣＥＳ−２発現もまた、単一の腫瘍内で不均一であった。したがって、腫瘍の外科的切除の間に回収された正常結腸組織および全グレードのＣＲＣ腫瘍との間のＣＥＳ−２発現を比較するために、患者適合サンプル(ｎ＝４１)に焦点を当てた。上皮性細胞スコア５〜８の範囲の中程度から強いＣＥＳ−２発現を示す。ＣＲＣにおける上皮性細胞由来の腫瘍細胞と比較して、ＣＥＳ−２の全体の発現は正常上皮性細胞において顕著に高かった(ウィルコクソンの符号順位検定でｐ＝０．０３２３)。
【００６７】
実施例４：腫瘍発現ＣＥＳ−２の直近における免疫細胞。
ＣＲＣ手術から離れた非癌領域から採取した固有層のサンプルの試験は、中程度の白血球浸潤、および多数の白血球がＣＥＳ−２を強く発現したことを示した(図５Ａ)。いくつかの腫瘍において、癌障害の直近を囲む組織は散剤的なＣＥＳ−２＋細胞(図５Ｂ)を示すのみであったが、他の腫瘍において組織は重度に浸潤された(図５Ｃ)。腫瘍周辺の組織におけるＣＥＳ−２＋細胞の数は腫瘍細胞におけるＣＥＳ−２発現レベルと独立した。腫瘍に直接浸潤する白血球は常にＣＥＳ−２について陰性であるが、腫瘍の近くに位置する白血球におけるＣＥＳ−２発現は、一貫して高い(図５Ｂ、Ｃ)。ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞(図５Ｄ)、ＭＰＯ＋好中球(図５Ｅ)、ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ２０＋Ｂ細胞(図５Ｆ)、ＣＤ１６３＋マクロファージ(図５Ｇ)ならびにＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ１３８＋形質細胞(図５Ｈ)に注目した腫瘍周辺組織の免疫組織化学的分析は、様々な型の白血球の存在を明らかにした。
【００６８】
実施例５：腫瘍近辺における形質細胞は、ＣＲＣにおけるＣＥＳ−２の産生に寄与する。
血漿細胞区画に特異的に対処するために、組織は血漿および上皮細胞において発現するＣＥＳ−２およびＣＤ１３８[１５]およびそして大部分は形質細胞の核および細胞質で発現するＭＵＭ１[１６]についてそれぞれ共染色した。蛍光(図６Ａ、Ｃ)および明視野顕微鏡(図６Ｂ、Ｄ、Ｅ)により、ＣＲＣを有する患者由来の結腸組織(図４Ａ、Ｂ)およびＣＲＣ近辺における結腸組織(図６Ｃ、Ｄ)の固有層におけるＣＥＳ−２の産生として、形質細胞を確認した。全てのＣＥＳ−２＋細胞は形質細胞であったが、全ての形質細胞がＣＥＳ−２を発現したわけではなかった；ＣＥＳ−２を含まない形質細胞もまた、腫瘍周辺組織において存在した(図６Ｅ)。
【００６９】
これらの観察は腫瘍の直近の形質細胞が、イン・サイチュでＣＥＳの酵素活性の重要な供給源であることを示した。
【００７０】
材料および方法
ヒト組織および血液サンプル。以下の保管されたホルマリン固定パラフィン包埋(ＦＦＰＥ)サンプルを、Charite-Universitaetsmedizin, Zentrale Biomaterialbank (ZeBanC; http://biobank.charite.de/service/) (ベルリン、ドイツ)の組織バンクから得た：大腸の神経内分泌癌(ＮＥＣ) (盲腸、ｎ＝２；結腸、ｎ＝３；直腸、ｎ＝２)、クローン病(ＣＤ、ｎ＝４)または潰瘍性大腸炎(ＵＣ、ｎ＝５)を有する、組織マイクロアレイを含むＣＲＣを有する患者由来の腸組織；肝細胞(ＨＣＣ、ｎ＝５)または胆管細胞癌(ＣＣＣ、ｎ＝６)を有する患者由来の肝臓組織；ＣＲＣを有する患者由来の正常結腸組織。ヘマトキシリン／エオシン(Ｈ＆Ｅ)染色後に評価した正常な腸形態学を有する切除余白から採取した正常組織。健常なドナー由来の全体血液サンプルを白血球除去輸血からのろ過から得た。試験はCharite-Universitaetsmedizin Berlinにより承認された(登録番号ＥＡ１−１５７−１３)。
【表３】
2019507878.tif 000006
【００７１】
組織病理。ＣＥＳ−１に対する特異的抗体(クローンＥＰ１３７６Ｙ；Ｂｉｏｚｏｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、エヒング、ドイツ)またはＣＥＳ−２に対する特異的抗体(＃ａｂ６４８６７、ウサギポリクローナル抗体；Ａｂｃａｍ；ケンブリッジ、イギリス)とインキュベートする前に、保管した患者サンプルの薄切片(１〜２μｍ)をＨ＆Ｅ染色するかまたは熱誘発性回復した。これらをジアミノベンジジン(ＤＡＢ；Ｄａｋｏ)を色原体としてＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  ＨＲＰ  Ｓｙｓｔｅｍ(＃Ｋ４０１１；Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ)を用いて可視化した。核をヘマトキシリンで対比染色し、グリセロールゼラチンとスライドカバーに納める(いずれもＭｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ)。画像取得のために、ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ１顕微鏡(Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ、イェーナ、ドイツ)を使用した。全ての評価は盲検法で実施された。
【００７２】
組織サンプルにおけるＣＥＳ発現を評価するために、ＣＥＳ発現腫瘍細胞の発現レベルおよび割合を追加し、以下のように全体スコア２〜８を作り出した：発現レベル − １、低い発現；２、中程度の発現；３、強い発現。割合 − １、＜１０％；２、１０〜３０％；３、３１〜６０％；４、６１〜９０％；５、＞９０％(図３)。
【００７３】
ＣＥＳ−２＋白血球の検出のために、二重内因性酵素ブロック試薬(Ｄａｋｏ)を用いて内因性アルカリホスファターゼ(ＡＰ)をブロックする前に、切片を熱誘発性エピトープ検索手順に供した。洗浄後、切片を抗ＣＥＳ−２抗体とインキュベートし、その後ビオチニル化抗ウサギ−ヤギ抗体(Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツ)およびＡＰ−標識ストレプトアビジン(Ｄａｋｏ)とインキュベートした。ＶＥＣＴＯＲ  Ｂｌｕｅ基質キット(＃ＳＫ−５３００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、アメリカ合衆国)を用いてＡＰを可視化した。その後タンパク質を圧力釜により不活性化させ、切片をＣＤ３(クローンＭ−２０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、サンディエゴ、アメリカ合衆国)、ＣＤ１１ｂ(クローンＥＰ１３４５Ｙ；Ａｂｃａｍ)、ＣＤ２０(クローンＬ２６；Ｄａｋｏ)、ＣＤ６８  (クローンＰＧ  Ｍ１；Ｄａｋｏ)、ＣＤ１３８(クローンＭＩ１５；Ｄａｋｏ)、ＣＤ１６３(クローン１０Ｄ６；Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ヌスロッホ、ドイツ)またはＭＰＯ(＃Ａ０３８９、ウサギポリクローナル抗体；Ｄａｋｏ)に対して特異的な抗体とインキュベートし、その後ビオチニル化二次抗体(抗ヤギ、抗マウスまたは抗ウサギ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、アメリカ合衆国)およびＡＰ標識ストレプトアビジン(Ｄａｋｏ)とインキュベートした。色原体ＦａｓｔＲｅｄ(Ｄａｋｏ)を用いてＡＰを可視化した。核を上記のように対比染色し、スライドカバーに納め、ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ１顕微鏡を用いて画像を取得した。ＦａｓｔＲｅｄおよびＶＥＣＴＯＲ  Ｂｌｕｅは両方とも蛍光性であるため、共発現もまた、蛍光顕微鏡(放出ピーク：Ｒｅｄ／５６０ｎｍ、ＶＥＣＴＯＲ  Ｂｌｕｅ／６８０ｎｍ)を用いて検出した。ＣＥＳ−２発現形質細胞の免疫組織化学的検出のために、二重内因性酵素ブロック試薬(Ｄａｋｏ)を用いて内因性ＡＰをブロックする前に、切片を熱誘発性エピトープ検索手順に供した。その後抗ＭＵＭ１(クローンＭＵＭ１ｐ、Ｄａｋｏ)、ＬＳＡＢＴＭ＋、Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬＴＭ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ(＃Ｋ５００５、Ｄａｋｏ)とインキュベートした。発色後、タンパク質を圧力釜により不活性化させ、ペルオキシダーゼブロック溶液(Ｄａｋｏ)により内因性ペルオキシダーゼをブロックした。切片を抗ＣＥＳ−２、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  ＨＲＰ  ＳｙｓｔｅｍおよびＤＡＢとインキュベートした。核をヘマトキシリンで対比染色し、グリセロールゼラチンとスライドカバーに納める。さらに、ＣＥＳ−２およびＣＤ１３８の対比染色のために、免疫組織化学および蛍光を組み合わせた。二重内因性酵素ブロック試薬(Ｄａｋｏ)を用いて内因性ＡＰをブロックする前に、切片を熱誘発性エピトープ検索手順に供した。洗浄後、切片を抗ＣＥＳ−２抗体とインキュベートし、その後ビオチニル化抗ウサギ−ヤギ抗体(Ｄｉａｎｏｖａ)およびＡＰ−標識ストレプトアビジン(Ｄａｋｏ)とインキュベートした。ＬＳＡＢＴＭ＋、Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬＴＭ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＡＰを可視化した。その後タンパク質を圧力釜により不活性化させ、抗ＣＤ１３８(クローンＭＩ１５；Ｄａｋｏ)、ビオチニル化抗マウス二次抗体およびＡｌｅｘａ４８８−標識ストレプトアビジン(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)とインキュベートした。ＤＡＰＩ(Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、アメリカ合衆国)を用いて核を対比染色し、切片をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ(ＢＩＯＺＯＬ、エヒング、ドイツ)でカバーした。陰性対照は一次抗体を除いて上のように実施した。
【００７４】
ヒト細胞株。ヒト細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda、アメリカ合衆国)またはGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ；ブラウンシュヴァイク、ドイツ)から得た。バーキットリンパ腫由来Ｒａｊｉ細胞(ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６)およびＴ細胞白血病由来Ｊｕｒｋａｔ細胞(ＤＳＭＺ  ＡＣＣ２８２)をリンパ芽について；汎発性組織球性リンパ腫Ｕ９３７細胞(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９３)および慢性骨髄性白血病由来Ｋ５６２細胞(ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３)を骨髄について；結腸直腸腺癌由来ＨＴ−２９細胞 (ＡＴＣＣ  ＨＴＢ３８)および胚腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３)上皮性細胞についてのモデルとして使用した。全ての細胞株１０％胎児ウシ血清(Ｌｉｎａｒｉｓ、ベッティンゲン、ドイツ)、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム(いずれもＢｉｏｃｈｒｏｍ、ベルリン、ドイツより)を添加したＲＰＭＩ１６４０(Ｇｉｂｃｏ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ダルムシュタット、ドイツ)から成る標準的な培養培地で維持した。週に２回継代するために、細胞をトリプシン(０．２５％)／エチレンジアミン四酢酸(１ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)で分離した。マイコプラズマ特異的ポリメラーゼ連鎖反応(ＶｅｎｏｒＧＥＭ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ)を用いて細胞を日常的に試験し、陽性細胞を廃棄した。先に記載したように標準的な培養物から分離した細胞(２ｘ１０８)をホルムアルデヒドで固定しパラフィンブロックに回収した[１４]。
【００７５】
末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)。製造者の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離(ρ＝１.０７８ｇ／ｍＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、フランクフルト、ドイツ)を用いてＰＢＭＣを調製した。免疫細胞化学のために、Ｓｈａｎｄｏｎサイトスピン遠心分離(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、アメリカ合衆国)を用いて、２ｘ１０５の新たに調製したＰＢＭＣを回転させて、スライドを調製した。
【００７６】
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)。特に断らない限り、試薬はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＲＮＡｐｕｒｅ(Ｐｅｑｌａｂ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、ドイツ)により調製されたＰＢＭＣおよび細胞株(５  １０ｘ１０６)に由来する総ＲＮＡ(１μｇ)は、ｃＤＮＡ逆転写キットを用いて逆転写した。ｍＲＮＡ発現は、以下の遺伝子発現アッセイ：ＣＥＳ１(＃Ｈｓ００２７５６０７＿ｍ１)、ＣＥＳ２(＃Ｈｓ０１０７７９４５＿ｍ１)およびグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ；＃Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１)およびＴａｑＭａｎ(登録商標)  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｉｎ  ａ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ(登録商標)デバイス(全てＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、アメリカ合衆国)を用いたＴａｑＭａｎ(登録商標)ＰＣＲにより評価した。定量化のために、各転写についての参照配列をｐＣＲ２.１  ＴＯＰＯ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フローニンゲン、オランダ)にクローニングし、１０２〜１０９のコピーまでを標準曲線に使用した。ＣＥＳ−１およびＣＥＳ−２の発現をＧＡＰＤＨに関して定量化した。
【００７７】
統計。統計試験のために、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６(Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、アメリカ合衆国)を使用した。Ｐ値≦０.０５が有意であると考えられる。
【００７８】
参考文献
［１］T. Satoh, M. Hosokawa, Structure, function and regulation of carboxylesterases, Chemi-co-biological interactions, 162 (2006) 195-211.
［２］S.C. Laizure, V. Herring, Z. Hu, K. Witbrodt, R.B. Parker, The role of human carboxyles-terases in drug metabolism: have we overlooked their importance?, Pharmacotherapy, 33 (2013) 210-222.
［３］T. Imai, M. Taketani, M. Shii, M. Hosokawa, K. Chiba, Substrate specificity of carboxy-lesterase isozymes and their contribution to hydrolase activity in human liver and small intestine, Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals, 34 (2006) 1734-1741.
［４］T. Tsuji, N. Kaneda, K. Kado, T. Yokokura, T. Yoshimoto, D. Tsuru, CPT-11 converting enzyme from rat serum: purification and some properties, Journal of pharmacobio-dynamics, 14 (1991) 341-349.
［５］G. Xu, W. Zhang, M.K. Ma, H.L. McLeod, Human carboxylesterase 2 is commonly ex-pressed in tumor tissue and is correlated with activation of irinotecan, Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 8 (2002) 2605-2611.
［６］C. Zhang, Y. Xu, Q. Zhong, X. Li, P. Gao, C. Feng, Q. Chu, Y. Chen, D. Liu, In vitro evaluation of the inhibitory potential of pharmaceutical excipients on human carboxylesterase 1A and 2, PloS one, 9 (2014) e93819.
［７］X. Tang, H. Wu, Z. Wu, G. Wang, Z. Wang, D. Zhu, Carboxylesterase 2 is downregulated in colorectal cancer following progression of the disease, Cancer investigation, 26 (2008) 178-181.
［８］M.A. Schiel, S.L. Green, W.I. Davis, P.C. Sanghani, W.F. Bosron, S.P. Sanghani, Expres-sion and characterization of a human carboxylesterase 2 splice variant, The Journal of phar-macology and experimental therapeutics, 323 (2007) 94-101.
［９］H. Nishimuta, J.B. Houston, A. Galetin, Hepatic, intestinal, renal, and plasma hydrolysis of prodrugs in human, cynomolgus monkey, dog, and rat: implications for in vitro-in vivo ex-trapolation of clearance of prodrugs, Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals, 42 (2014) 1522-1531.
［１０］N. Silvestris, G. Simone, G. Partipilo, E. Scarpi, V. Lorusso, A.E. Brunetti, E. Maiello, A. Paradiso, A. Mangia, CES2, ABCG2, TS and Topo-I primary and synchronous metastasis expression and clinical outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with first-line FOLFIRI regimen, International journal of molecular sciences, 15 (2014) 15767-15777.
【００７９】
［１１］M. Taketani, M. Shii, K. Ohura, S. Ninomiya, T. Imai, Carboxylesterase in the liver and small intestine of experimental animals and human, Life sciences, 81 (2007) 924-932.
［１２］F.T.C. Bosman, F.; Hruban, R.H.; Theise, N.D., WHO classification of tumours of the digestive system., in: F.T.C. Bosman, F.; Hruban, R.H.; Theise, N.D. (Ed.) WHO classification of tumours of the digestive system, World health Organisation, Geneva, Switzerland, 2010.
［１３］L.H. Sobin, Gospodarowicz, M.K., Wittekind, C., TNM Classification of Malignant Tumours, Wiley-Blackwell, 2009, pp. 336.
［１４］C. Zanini, M. Forni, The cell block technique revisited for cells cultured in adherence and as "spheres", Histochemistry and cell biology, 140 (2013) 685-690.
［１５］F.P. O'Connell, J.L. Pinkus, G.S. Pinkus, CD138 (syndecan-1), a plasma cell marker immunohistochemical profile in hematopoietic and nonhematopoietic neoplasms, American journal of clinical pathology, 121 (2004) 254-263.
［１６］B. Falini, M. Fizzotti, A. Pucciarini, B. Bigerna, T. Marafioti, M. Gambacorta, R. Pacini, C. Alunni, L. Natali-Tanci, B. Ugolini, C. Sebastiani, G. Cattoretti, S. Pileri, R. Dalla-Favera, H. Stein, A monoclonal antibody (MUM1p) detects expression of the MUM1/IRF4 protein in a subset of germinal center B cells, plasma cells, and activated T cells, Blood, 95 (2000) 2084-2092.
［１７］S. Guichard, C. Terret, I. Hennebelle, I. Lochon, P. Chevreau, E. Fretigny, J. Selves, E. Chatelut, R. Bugat, P. Canal, CPT-11 converting carboxylesterase and topoisomerase activities in tumour and normal colon and liver tissues, British journal of cancer, 80 (1999) 364-370.
［１８］F.A. Farraye, R.D. Odze, J. Eaden, S.H. Itzkowitz, AGA technical review on the diagnosis and management of colorectal neoplasia in inflammatory bowel disease, Gastroenterology, 138 (2010) 746-774, 774 e741-744; quiz e712-743.
［１９］S. Chakrabarty, Regulation of human colon-carcinoma cell adhesion to extracellular matrix by transforming growth factor beta 1, International journal of cancer. Journal international du cancer, 50 (1992) 968-973.
［２０］S.R. Lepri, L.C. Zanelatto, P.B. da Silva, D. Sartori, L.R. Ribeiro, M.S. Mantovani, Effects of genistein and daidzein on cell proliferation kinetics in HT29 colon cancer cells: the expression of CTNNBIP1 (beta-catenin), APC (adenomatous polyposis coli) and BIRC5 (survivin), Human cell, 27 (2014) 78-84.
【００８０】
［２１］E. Cecchin, G. Corona, S. Masier, P. Biason, G. Cattarossi, S. Frustaci, A. Buonadonna, A. Colussi, G. Toffoli, Carboxylesterase isoform 2 mRNA expression in peripheral blood mon-onuclear cells is a predictive marker of the irinotecan to SN38 activation step in colorectal cancer patients, Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 11 (2005) 6901-6907.
［２２］W. Choi, D. Cogdell, Y. Feng, S.R. Hamilton, W. Zhang, Transcriptional activation of the carboxylesterase 2 gene by the p53 pathway, Cancer biology & therapy, 5 (2006) 1450-1456.
［２３］S. Braggio, A. Ferrara, M. Sartori, M. Bottacini, U. Zanelli, L. Zonzini, M. Petrone, Evaluation of the role of intestinal and liver metabolism in the conversion of two different ester prodrugs of sanfetrinem to the parent drug in vitro and in vivo using different rat tissues and a surgically prepared rat model, European journal of pharmaceutical sciences: official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 16 (2002) 45-51.
［２４］W. Zhang, G. Xu, H.L. McLeod, Comprehensive evaluation of carboxylesterase-2 ex-pression in normal human tissues using tissue array analysis, Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immuno-histochemistry, 10 (2002) 374-380.
［２５］J.S. Munger, G.P. Shi, E.A. Mark, D.T. Chin, C. Gerard, H.A. Chapman, A serine esterase released by human alveolar macrophages is closely related to liver microsomal carboxylesterases, The Journal of biological chemistry, 266 (1991) 18832-18838.
［２６］V. Costes, V. Magen, E. Legouffe, L. Durand, P. Baldet, J.F. Rossi, B. Klein, J. Brochier, The Mi15 monoclonal antibody (anti-syndecan-1) is a reliable marker for quantifying plasma cells in paraffin-embedded bone marrow biopsy specimens, Human pathology, 30 (1999) 1405-1411.
［２７］M. Bernfield, R. Kokenyesi, M. Kato, M.T. Hinkes, J. Spring, R.L. Gallo, E.J. Lose, Bi-ology of the syndecans: a family of transmembrane heparan sulfate proteoglycans, Annual review of cell biology, 8 (1992) 365-393.
［２８］A. Shimabukuro-Vornhagen, H.A. Schlosser, L. Gryschok, J. Malcher, K. Wennhold, M. Garcia-Marquez, T. Herbold, L.S. Neuhaus, H.J. Becker, A. Fiedler, P. Scherwitz, T. Koslowsky, R. Hake, D.L. Stippel, A.H. Holscher, S. Eidt, M. Hallek, S. Theurich, M.S. von Bergwelt-Baildon, Characterization of tumor-associated B-cell subsets in patients with colo-rectal cancer, Oncotarget, 5 (2014) 4651-4664.
［２９］R. Khanna, C.L. Morton, M.K. Danks, P.M. Potter, Proficient metabolism of irinotecan by a human intestinal carboxylesterase, Cancer research, 60 (2000) 4725-4728.
［３０］Y.T. Chen, L. Trzoss, D. Yang, B. Yan, Ontogenic expression of human carboxylesterase-2 and cytochrome P450 3A4 in liver and duodenum: postnatal surge and organ-dependent regulation, Toxicology, 330 (2015) 55-61.
［３１］M.L. Cupi, M. Sarra, I. Marafini, I. Monteleone, E. Franze, A. Ortenzi, A. Colantoni, G. Sica, P. Sileri, M.M. Rosado, R. Carsetti, T.T. MacDonald, F. Pallone, G. Monteleone, Plasma cells in the mucosa of patients with inflammatory bowel disease produce granzyme B and possess cytotoxic activities, Journal of immunology, 192 (2014) 6083-6091.
［３２］C.B. Westphalen, S. Asfaha, Y. Hayakawa, Y. Takemoto, D.J. Lukin, A.H. Nuber, A. Brandtner, W. Setlik, H. Remotti, A. Muley, X. Chen, R. May, C.W. Houchen, J.G. Fox, M.D. Gershon, M. Quante, T.C. Wang, Long-lived intestinal tuft cells serve as colon cancer-initiating cells, The Journal of clinical investigation, 124 (2014) 1283-1295.
【図１】
2019507878.tif 000007
【図２】
2019507878.tif 000008
【図３】
2019507878.tif 000009
【図４】
2019507878.tif 000010
【図５】
2019507878.tif 000011
【図６】
2019507878.tif 000012
【国際調査報告】
2019507878.tif 000013
2019507878.tif 000014