(57)【要約】  抗原特異性Ｔ細胞活性化をｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイするための方法であって、（ａ）候補抗原ポリペプチドが密に会合した、貪食可能な粒子を与え、会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；（ｂ）可変抗原提示細胞を与える工程と；（ｃ）抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になる条件で、洗浄された粒子と、抗原提示細胞とを接触させる工程と；（ｄ）可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；（ｅ）抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、Ｔ細胞サンプルと、粒子と接触した抗原提示細胞とを接触させる工程と；（ｆ）Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程とを含む、方法。
2019500604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法であって、
ａ．候補抗原ポリペプチドが密に会合した、貪食可能な粒子を与え、会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｂ．可変抗原提示細胞を与える工程と；
ｃ．前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件で、前記洗浄された粒子と、前記抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ．可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；
ｅ．抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記粒子と接触した前記抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｆ．前記Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法が、（ａ’）貪食可能な粒子に候補ポリペプチドを密に会合させる工程、および／または（ａ”）粒子に会合した候補抗原に対して変性洗浄を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法であって、
ａ．貪食可能な粒子を与える工程と；
ｂ．前記粒子に候補抗原ポリペプチドを密に会合させる工程と；
ｃ．前記会合したポリペプチドを含む前記粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｄ．可変抗原提示細胞を与える工程と；
ｅ．前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件で、前記洗浄された粒子と、前記抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｆ．可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；
ｇ．抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記粒子と接触した前記抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｈ．前記Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞活性化度を、関連するリファレンスと比較する工程をさらに含み、リファレンスと比較して、前記サンプルにおけるＴ細胞活性化度が高いことが、前記候補抗原が、前記サンプルにおける抗原特異性Ｔ細胞活性化を引き起こすという結果の指標である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することが、前記サンプル中の活性化されたＴ細胞の割合を決定することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
いくつかの候補抗原を同じＴ細胞サンプルに対してアッセイする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１０の候補抗原を同じＴ細胞サンプルに対してアッセイする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記粒子は、最大寸法が５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、さらにより好ましくは０．５〜２μｍの区間、または最も好ましくは約１μｍである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記粒子は、実質的に球状である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変性洗浄が、前記会合したポリペプチドを含む粒子を高いｐＨ、例えば、少なくともｐＨ１３、より好ましくは少なくともｐＨ１４、最も好ましくは少なくともｐＨ１４．３にすることを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記変性洗浄が、前記会合したポリペプチドを含む粒子を低いｐＨにすることを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記変性洗浄が、前記会合したポリペプチドを含む粒子を高温、例えば、少なくとも９０℃、より好ましくは少なくとも９２℃、最も好ましくは少なくとも９５℃にすることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記変性洗浄が、前記会合したポリペプチドを含む粒子を、十分な濃度、例えば、少なくとも５Ｍ、６Ｍ、７Ｍまたは８Ｍで、変性剤、例えば、尿素または塩酸グアニジンにさらすことを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記変性洗浄によって、抗原中のエンドトキシンの量が、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、エンドトキシンの最終的な濃度が１００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満になるような量になる、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記粒子が、常磁性特性を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記候補抗原ポリペプチドが、前記粒子に共有結合している、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記候補抗原ポリペプチドが、金属キレートを介し、前記粒子に結合している、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原提示細胞と前記Ｔ細胞サンプルが、同じ個体に由来する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞と前記Ｔ細胞サンプルが、同じ血液サンプルに由来する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記抗原提示細胞と前記Ｔ細胞サンプルが、同じ個体由来のＰＢＭＣサンプルに由来する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＢＭＣサンプルが、新鮮であるか、または凍結されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞サンプルが、腫瘍、好ましくは、腫瘍中のリンパ管に由来する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞サンプルが、腹水に由来する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞サンプルが、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記洗浄された粒子、前記抗原提示細胞および前記Ｔ細胞サンプルを同時に接触させる、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、またはこれらの組合せの分泌によって反応する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、多発性硬化症を診断するためのものであるか、または多発性硬化症の経過を追跡するためのものであり、Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することを含み、Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することは、ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２の分泌によって反応する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することが、ＥＬＩＳｐｏｔまたはＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を用いて行われる、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記候補抗原ポリペプチドが、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも７５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記候補抗原ポリペプチドが、タンパク質エピトープシグネチャタグ（ＰｒＥＳＴ）の形態である、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞サンプルがヒト由来であり、前記候補抗原ポリペプチド配列がヒト由来である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記候補抗原ポリペプチドが、疾患に関わりがあることが知られている抗原、または疾患に関わりがあることが疑われる抗原に由来する、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記候補抗原ポリペプチドが、以下のポリペプチド：
ａ．自己免疫疾患に罹患した組織または細胞の中で高度に発現することが知られているポリペプチド；
ｂ．新生物疾患に関わりがあることが知られているポリペプチド；
ｃ．自己免疫疾患に関わりがあることが知られているポリペプチド；
ｄ．感染症に関わりがあることが知られているポリペプチド；または
ｅ．アレルギーまたは同様の過敏症に関わりがあることが知られているポリペプチド
に由来する、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
試験被験体において自己反応性を診断するための請求項１〜３３のいずれかに記載の方法であって、
ａ．候補ペプチド自己抗原が密に会合した、貪食可能な粒子を与え、前記会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｂ．前記試験被験体から、生存能力のあるＴ細胞と生存能力のある抗原提示細胞とを含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを与える工程と；
ｃ．抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になり、抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、前記ＰＢＭＣサンプルと、前記粒子とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ．前記接触したＰＢＭＣ細胞において、活性化したＴ細胞の割合を定量する工程と；
ｅ．定量された前記割合と、健康な被験体に由来する相当する定量された割合とを比較する工程であって、それによって、試験被験体において活性化したＴ細胞の割合が大きいことは、前記試験被験体において前記候補自己抗原に対する自己反応性の指標となる工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異性Ｔ細胞活性化の決定を含む、診断方法および分析方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
適応免疫系は、免疫系の一部を構成し、より一般的な様式で応答する自然免疫系とは対照的に、生物が遭遇する様々な病原体または細胞に損傷を与える攻撃に特異的に適応し、応答することが可能である。適応系は、体液性免疫（すなわち、Ｂ細胞によって分泌される抗体）と、Ｔ細胞媒介性免疫の両方を含む。適応免疫系の特異性は、Ｂ細胞およびＴ細胞で発現するＢ細胞受容体およびＴ細胞受容体にある。遺伝子断片を混合する複雑な系によって、身体は、ほぼ無限の多様なＢ細胞およびＴ細胞を生成し、それぞれの細胞が、特定のタンパク質またはペプチドに特異的な受容体を発現する。
【０００３】
Ｔ細胞は、適応免疫系の主要な部分を形成するリンパ球であり、Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。これを特徴付けるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、細胞表面で発現し、それぞれの受容体が、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子との関係において提示される抗原由来ペプチドを認識する。数種類のＴ細胞が存在し、それぞれ、細胞免疫反応において固有の機能を有する。
【０００４】
簡潔に言うと、異なる機能を有する２種類の主なＴ細胞が存在する。ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞表面のＭＨＣクラスＩ受容体（ヒトでは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩと呼ばれる）上に提示されるペプチドに結合する。全ての有核細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現する。提示されたペプチドが、外来のもの（ウイルス感染の兆候であることが最も多い）であると考えられる場合、細胞傷害性Ｔ細胞は、グランザイムＢまたはパーフォリンのいずれかのタンパク質によって細胞を死滅させる。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、表面マーカーＣＤ４を発現し、死滅させるのではなく、細胞間の炎症誘発シグナル、時には阻害シグナルの両方を増強するサイトカインの分泌によって免疫反応を指揮する。Ｔヘルパー細胞の別の重要な機能は、Ｂ細胞のクラススイッチ、例えば、ＩｇＭを分泌するＢ細胞からＩｇＧを分泌する細胞へのクラススイッチを誘発することであり、抗原に対する体液性免疫反応が高まるだろう。
【０００５】
Ｔヘルパー細胞は、そのＴＣＲによって、いわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）または内皮細胞の表面で特異的に発現する受容体であるＭＨＣ−ＩＩ（ヒトでは、ＨＬＡクラスＩＩと呼ばれる）表面に提示された対応するペプチドに結合する。Ｔ細胞活性化は、Ｔｈ−ＡＰＣ相互作用が起こる微小環境と、ＡＰＣ表面で発現するいわゆる共刺激分子の種類に依存する。Ｔヘルパー細胞は、異なるＴｈサブセット（例えば、炎症誘発性のＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７細胞）または制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と呼ばれる阻害Ｔヘルパー細胞型に分化することができる。制御されない免疫系は有害であり、組織の損傷および自己免疫を引き起こす場合があるため、後者のサブセットは、免疫反応を制御するために非常に重要である。
【０００６】
ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ、フローサイトメトリーを用いたサイトカインの細胞内染色、ＦＡＳＣＩＡ、増殖アッセイ（例えば、チミジン取り込み、ＣＦＳＥまたはＢｒｄＵ染色）、ＭＨＣ−ＩまたはＩＩのテトラマーを用いた特異的なＴＣＲ検出および分泌したサイトカインのＥＬＩＳＡ分析またはＬｕｍｉｎｅｘ分析を含め、抗原特異性Ｔ細胞活性化を決定するのに適したいくつかの方法が存在する。
【０００７】
ＥＬＩＳｐｏｔ技術を用い、刺激に反応した細胞による特異的なサイトカインの放出を直接検出する。細胞を膜に播種し、サイトカインを分泌する細胞の数を測定する。どのサイトカインを測定するかに応じて、マクロファージまたはＴ細胞活性化などの様々な変数を測定することができる。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔは、ＥＬＩＳｐｏｔ技術に基づいて構築され、数種類の異なる分泌したサイトカインの同時読み取りを可能にする。これにより、細胞活性化のより正確で微妙な差の概算が可能になる。これらの両方法は、Ｔ細胞活性化を迅速かつ容易に測定する方法を与える。
【０００８】
近年、組換え発現された大量のタンパク質、すなわちクローニング技術および細菌または哺乳動物の発現系を用いて作製されたタンパク質が、Ｈｕｍａｎ  Ａｔｌａｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔのような大規模な研究によって生産されている。本発明者らは、特異的にＴ細胞を活性化する抗原について、このようなポリペプチドの集合をスクリーニングすることができることが、重要な科学的かつ実際的な関心事であることを認識するようになった。例えば、自己免疫疾患、新生物疾患、アレルギーまたはポリペプチドライブラリーに対する感染症を罹患した患者に由来するＴ細胞サンプルをスクリーニングし、どのエピトープが患者のＴ細胞と反応するかを決定することが目的となり得るだろう。現行の方法は、一般的に、どのエピトープが、患者の免疫系が（すなわち体液性反応）に対して抗体を生成するのかを決定することに集中しており、適応免疫系の主要な部分であるＴ細胞媒介性免疫に対する関連情報は提供されない。したがって、患者または患者群においてＴ細胞活性化を引き起こす抗原を大スケールで決定することができれば、疾患のために新規バイオマーカーの新しいプールを利用し、より良い診断を可能にし、患者の疾患進行のモニタリングを補助し、治療標的を同定するなどに役立つ。
【０００９】
現実的な理由から、今日存在する大きなポリペプチドの集合は、通常、Ｅ．ｃｏｌｉが発現したタンパク質で構成されており、したがって、宿主細胞の外側の膜に由来するかなりの量のエンドトキシンを含む。環境汚染に起因して、真核宿主で調製されたポリペプチドの集合、または非生物ペプチド合成によって調製されたポリペプチドの集合でさえ、実際にはかなりのレベルのエンドトキシンを含む。エンドトキシンは、タンパク質と結合する傾向があり、一旦ポリペプチドサンプルに混入してしまうと、除去するのは困難なことが多いため、大きな集合を調製する際に、エンドトキシンを検出限界未満のレベルまで除外するプロセスを確立することは現実的ではない。
【００１０】
残念ながら、Ｔ細胞活性化を決定するアッセイに共通する問題は、Ｔ細胞に接触する低レベルのエンドトキシンでさえ、通常は非常に低レベルである抗原特異性活性化を覆い隠す活性化を引き起こすことである。試験されるＴ細胞の集合のほんの一部のみが、抗原特異性の様式で所与の抗原と反応し（抗原に最近遭遇した被験体由来の血液の１／１００００の程度で）、一方、細胞の大部分がエンドトキシンに応答し、高レベルのバックグラウンドを生じる。遍在するエンドトキシンの混入を考慮すると、現行のポリペプチドの集合を用い、上に概説したスクリーニングを行うことは実現不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、当該技術分野で、候補抗原調製においてエンドトキシンの混入に耐えることができ、大きなポリペプチドの集合をスクリーニングすることができる、抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法が依然として必要である。本発明の目的は、抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための改良された方法および手段を提供することである。
【００１２】
定義
エンドトキシン、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の外側の細胞壁に見出される共有結合した脂質と多糖サブユニットを含む。
【００１３】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞は、サイトカイン分泌を介して免疫応答を調整する細胞である。これらの細胞は、他の免疫細胞を抑制するか、または増強することができ、例えば、Ｂ細胞の抗体クラススイッチ、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖を刺激するか、または食細胞を増強することができる。これらは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩを介する抗原提示によって達成され、これらは、特定の抗原内の約１５アミノ酸の伸長（いわゆるＴ細胞エピトープ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。
【００１４】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍細胞、感染細胞またはそれ以外の損傷した細胞を死滅させる細胞である。ＣＤ４＋  Ｔ細胞とは異なり、これらの細胞は、活性化のためにＡＰＣを必要としない。これらのＴ細胞受容体は、全ての有核細胞表面で発現するタンパク質であるＭＨＣクラスＩによって提示される抗原由来ペプチド（約９〜１１アミノ酸長）を認識する。
【００１５】
抗原特異性Ｔ細胞活性化は、共刺激と組み合わせて、ＴＣＲと、ＭＨＣ（ＨＬＡ）分子表面に提示される所定のペプチドとの相互作用を必要とするプロセスである。
【００１６】
タンパク質エピトープシグネチャタグ（ＰｒＥＳＴ）：組換え産生されたペプチド。宿主（例えばヒト）由来のタンパク質のフラグメントであり、このペプチドから誘導されるタンパク質の固有のペプチド配列を表している（Ｌｉｎｄｓｋｏｇ  Ｍ、Ｒｏｃｋｂｅｒｇ  Ｊ、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ、Ｓｔｅｒｋｙ  Ｆ．、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００５；３８（５）：７２３−７を参照）。
【００１７】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、典型的には、細胞外の生物またはタンパク質（すなわち、抗原）を貪食するか、または内在化し、処理後に、ＭＨＣクラスＩＩ表面の抗原由来ペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞またはマクロファージ、細胞である。血液中では、単球が最も豊富に含まれる抗原提示細胞である。
【００１８】
貪食可能な粒子は、免疫系の細胞、特に単球によって貪食され得る粒子であると定義される。
【００１９】
末梢血単核細胞ＰＢＭＣは、全血の密度勾配遠心分離によって調製されたヒト血液の画分である。ＰＢＭＣ画分は、主にリンパ球（７０〜９０％）と単球（１０〜３０％）からなっており、赤血球、顆粒球および血漿は除去されている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、以下の項目に関する。以下の項目に開示される特定事項は、その特定事項が特許請求の範囲に開示されているのと同じ様式で開示されているとみなすべきである。
【００２１】
１．抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法であって、
ａ．候補抗原ポリペプチドが密に会合した、貪食可能な粒子を与え、会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｂ．可変抗原提示細胞を与える工程と；
ｃ．抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になる条件で、洗浄された粒子と、抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
【００２２】
ｄ．可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；
ｅ．抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、Ｔ細胞サンプルと、粒子と接触した抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｆ．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程と
を含む、方法。
【００２３】
２．方法が、（ａ’）貪食可能な粒子に候補ポリペプチドを密に会合させる工程、および／または（ａ”）粒子に会合した候補抗原に対して変性洗浄を行う工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
【００２４】
３．抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法であって、
ａ．貪食可能な粒子を与える工程と；
ｂ．粒子に候補抗原ポリペプチドを密に会合させる工程と；
ｃ．会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｄ．可変抗原提示細胞を与える工程と；
ｅ．抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になる条件で、洗浄された粒子と、抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｆ．可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；
ｇ．抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、Ｔ細胞サンプルと、粒子と接触した抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｈ．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程と
を含む、方法。
【００２５】
４．Ｔ細胞活性化度を、関連するリファレンスと比較する工程をさらに含み、リファレンスと比較して、サンプルにおけるＴ細胞活性化度が高いことが、その候補抗原が、そのサンプルにおける抗原特異性Ｔ細胞活性化を引き起こすという結果の指標である、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２６】
５．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することが、サンプル中の活性化されたＴ細胞の割合を決定することを含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
【００２７】
６．いくつかの候補抗原を同じＴ細胞サンプルに対してアッセイする、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
【００２８】
７．少なくとも１０の候補抗原を同じＴ細胞サンプルに対してアッセイする、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２９】
８．粒子は、最大寸法が５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、さらにより好ましくは０．５〜２μｍの区間、または最も好ましくは約１μｍである、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
【００３０】
９．粒子は、実質的に球状である、項目８に記載の方法。
【００３１】
１０．変性洗浄が、会合したポリペプチドを含む粒子を高いｐＨ、例えば、少なくともｐＨ１３、より好ましくは少なくともｐＨ１４、最も好ましくは少なくともｐＨ１４．３にすることを含む、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
【００３２】
１１．変性洗浄が、会合したポリペプチドを含む粒子を低いｐＨにすることを含む、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
【００３３】
１２．変性洗浄が、会合したポリペプチドを含む粒子を高温、例えば、少なくとも９０℃、より好ましくは少なくとも９２℃、最も好ましくは少なくとも９５℃にすることを含む、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
【００３４】
１３．変性洗浄が、会合したポリペプチドを含む粒子を、十分な濃度、例えば、少なくとも５Ｍ、６Ｍ、７Ｍまたは８Ｍで、変性剤、例えば、尿素または塩酸グアニジンにさらすことを含む、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
【００３５】
１４．変性洗浄によって、抗原中のエンドトキシンの量が、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、エンドトキシンの最終的な濃度が１００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満になるような量になる、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００３６】
１５．粒子が、常磁性特性を有する、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
【００３７】
１６．候補抗原ポリペプチドが、粒子に共有結合している、項目１〜１５のいずれかに記載の方法。
【００３８】
１７．候補抗原ポリペプチドが、金属キレートを介し、粒子に結合している、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
【００３９】
１８．抗原提示細胞とＴ細胞サンプルが、同じ個体に由来する、項目１〜１７のいずれかに記載の方法。
【００４０】
１９．抗原提示細胞とＴ細胞サンプルが、同じ血液サンプルに由来する、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
【００４１】
２０．抗原提示細胞とＴ細胞サンプルが、同じ個体由来のＰＢＭＣサンプルに由来する、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
【００４２】
２１．ＰＢＭＣサンプルが、新鮮であるか、または凍結されている、項目２０に記載の方法。
【００４３】
２２．Ｔ細胞サンプルが、腫瘍、好ましくは、腫瘍中のリンパ管に由来する、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
【００４４】
２３．Ｔ細胞サンプルが、腹水に由来する、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
【００４５】
２４．Ｔ細胞サンプルが、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目１〜２３のいずれかに記載の方法。
【００４６】
２５．洗浄された粒子、抗原提示細胞およびＴ細胞サンプルを同時に接触させる、項目１〜２４のいずれかに記載の方法。
【００４７】
２６．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、またはこれらの組合せの分泌によって反応する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含む、項目１〜２５のいずれかに記載の方法。
【００４８】
２７．方法が、多発性硬化症を診断するためのものであるか、または多発性硬化症の経過を追跡するためのものであり、Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することを含み、Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することは、ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２の分泌によって反応する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含む、項目１〜２６のいずれかに記載の方法。
【００４９】
２８．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することが、ＥＬＩＳｐｏｔまたはＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を用いて行われる、項目１〜２７のいずれかに記載の方法。
【００５０】
２９．候補抗原ポリペプチドが、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも７５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む、項目１〜２８のいずれかに記載の方法。
【００５１】
３０．候補抗原ポリペプチドが、タンパク質エピトープシグネチャタグ（ＰｒＥＳＴ）の形態である、項目１〜２９のいずれかに記載の方法。
【００５２】
３１．Ｔ細胞サンプルがヒト由来であり、候補抗原ポリペプチド配列がヒト由来である、項目１〜３０のいずれかに記載の方法。
【００５３】
３２．候補抗原ポリペプチドが、疾患に関わりがあることが知られている抗原、または疾患に関わりがあることが疑われる抗原に由来する、項目１〜３１のいずれかに記載の方法。
【００５４】
３３．候補抗原ポリペプチドが、以下のポリペプチド：
ａ．自己免疫疾患に罹患した組織または細胞の中で高度に発現することが知られているポリペプチド；
ｂ．新生物疾患に関わりがあることが知られているポリペプチド；
ｃ．自己免疫疾患に関わりがあることが知られているポリペプチド；
ｄ．感染症に関わりがあることが知られているポリペプチド；または
ｅ．アレルギーまたは同様の過敏症に関わりがあることが知られているポリペプチド
に由来する、項目１〜３２のいずれかに記載の方法。
【００５５】
３４．試験被験体において自己反応性を診断するための項目１〜３３のいずれかに記載の方法であって、
ａ．候補ペプチド自己抗原が密に会合した、貪食可能な粒子を与え、会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｂ．試験被験体から、生存能力のあるＴ細胞と生存能力のある抗原提示細胞とを含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを与える工程と；
ｃ．抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になり、抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、ＰＢＭＣサンプルと、粒子とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ．接触したＰＢＭＣ細胞において、活性化したＴ細胞の割合を定量する工程と；
ｅ．定量された割合と、健康な被験体に由来する相当する定量された割合とを比較する工程であって、それによって、試験被験体において活性化したＴ細胞の割合が大きいことは、この試験被験体において候補自己抗原に対する自己反応性の指標となる工程と
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】エンドトキシン除去のための様々な洗浄の比較。様々な変性洗浄の有効性を未洗浄ビーズと比較して、様々な洗浄を行ったタンパク質に接続したビーズに応答した単球活性を評価した。活性化が低い方が望ましい。一元配置ＡＮＯＶＡを用いてＰ値を決定した。ひげ線は、ＳＤを意味する。
【図２】細胞増殖アッセイを用いたＴ細胞活性化の測定。オボアルブミン感作マウス由来の脾細胞を用いたチミジン取り込みアッセイ。オボアルブミンが接続したビーズ、ウシ血清アルブミンが接続したビーズ、培地の比較。スチューデントのＴ検定でＰ値が決定され、ｐ＜０．０５が見出されたときに示された。ひげ線はＳＤを示す。
【図３】ＭＳの疑わしい自己抗原を用いて刺激したときの、多発性硬化症（ＭＳ）患者および健康なコントロールにおけるＴ細胞活性化を比較するＩＦＮγ／ＩＬ−２２／ＩＬ−１７  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイ。Ｐ値は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定を用いて決定され、見出されたときに記載されている。ひげ線は、平均のＣＩ９５％を示す。
【図４】１２５種類のタンパク質のライブラリーに対する、多発性硬化症患者における自己抗原スクリーニング。ＭＳ患者由来のＰＢＭＣから、健康なコントロール由来のＰＢＭＣまでのＴ細胞活性化の比較。パネルＡ、ＩＬ２２−ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによる活性化の決定。パネルＢ、ＩＬ１７−ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによる活性化の決定。パネルＣ、ＩＦＮγ−ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによる活性化の決定。患者のＴ細胞は、ライブラリー中の特定のタンパク質とさらに有意に反応する。白四角および黒丸は、それぞれ患者およびコントロールのＰＢＭＣの平均活性化を示し、ひげ線は、平均のＣＩ９５％を示す。Ｐ値は、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定した。アスタリスクは、Ｐ値を示す。
【図５】ビーズの大きさがＴ細胞活性化に及ぼす影響。オボアルブミン感作マウス由来の脾細胞を用いた増殖アッセイ（チミジン取り込みによる）。直径５．６μｍ、１μｍおよび０．２μｍの異なる大きさのビーズに接続したオボアルブミンの比較。スチューデントのＴ検定を用いてＰ値が決定され、ｐ＜０．０５が見出されたときに記載された。ひげ線はＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、以下により詳細に開示する抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法および手段を提供する。抗原特異性Ｔ細胞活性化に対するアッセイにおいて、エンドトキシンが混入したポリペプチドを用いることに関連する問題を解決することによって、本方法および本手段によって、バイオマーカーの発見、診断、患者における疾患進行のモニタリング、治療標的の同定などのための新しいポリペプチドの集合および既存のポリペプチドの集合の大規模スクリーニングを可能にし、容易にする。
【００５８】
抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法
第１の態様において、本発明は、抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．候補抗原ポリペプチドが密に会合した、貪食可能な粒子を与え、会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、本方法の後のいずれかの工程（ｂ〜ｆ）を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｂ．可変抗原提示細胞（ＡＰＣ）を与える工程と；
ｃ．抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になる条件で、洗浄された粒子と、粒子と接触した抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ．可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；
ｅ．抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、Ｔ細胞サンプルと、抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｆ．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程と
を含む、方法を提供する。
この方法は、（ａ’）貪食可能な粒子に候補ポリペプチドを密に会合させる工程、および／または（ａ”）粒子に会合した候補抗原に対して変性洗浄を行う工程をさらに含んでいてもよい。したがって、第１の態様の方法は、
ａ．貪食可能な粒子を与える工程と；
ｂ．粒子に候補抗原ポリペプチドを密に会合させる工程と；
ｃ．会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、本方法の後の任意の工程（ｄ〜ｈ）を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｄ．可変抗原提示細胞を与える工程と；
ｅ．抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になる条件で、洗浄された粒子と、抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｆ．可変Ｔ細胞を含む、アッセイされるＴ細胞サンプルを与える工程と；
ｇ．抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、Ｔ細胞サンプルと、粒子と接触した抗原提示細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｈ．Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定する工程と
を含んでいてもよい。
【００５９】
洗浄された粒子、抗原提示細胞およびＴ細胞サンプルを、同じ容器内で同時に接触させてもよい。抗原特異性の細胞活性化が可能になる条件のために、Ｔ細胞サンプルと、粒子と接触させた抗原提示細胞とを接触させる工程における条件は、抗原特異性ではないＴ細胞活性化からのバックグラウンドが、このアッセイを妨害しないほど十分に低いような条件でなければならない。
【００６０】
候補抗原ポリペプチド
候補抗原ポリペプチドは、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも７５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む。候補抗原ポリペプチドは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｔａｇ（ＰｒＥＳＴ）の形態であってもよい。ＰｒＥＳＴからなる大きなタンパク質ライブラリー、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ａｔｌａｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔの中で作製されたライブラリーが既に存在する（Ｕｈｌｅｎ  Ｍ、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ  Ｌ、Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ  ＢＭ、Ｌｉｎｄｓｋｏｇ  Ｃ、Ｏｋｓｖｏｌｄ  Ｐ、Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ  Ａら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｔｉｓｓｕｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４７（６２２０）：１２６０４１９）。ＰｒＥＳＴは、対応する全長タンパク質に固有のアミノ酸配列を含み、ほとんどのヒトタンパク質に対する抗体を作成するための大規模Ｈｕｍａｎ  Ａｔｌａｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔで使用されてきた。同じヒトタンパク質のためにいくつかのＰｒＥＳＴを使用すると、関連するＴ細胞エピトープを発見する機会が増える。ＡＰＣによる抗原の分解は均一なプロセスではないため、ＡＰＣによって提示されるフラグメントより大きな抗原ポリペプチドは、各抗原の多種多様なエピトープが提示されることも確実にする。言い換えると、特定の大きさを有するポリペプチド抗原の使用は、ＡＰＣの貪食経路を利用することによって可能になり、細胞処理を行わずに直接的にＭＣＨ受容体に結合することができる短いペプチド中の抗原を提示することと比較すると、より少ない抗原ポリペプチドを使用し、優れた抗原の検出が可能になる。
【００６１】
候補抗原ポリペプチドは、疾患に関わりがあることが知られている抗原、または疾患に関わりがあることが疑われる抗原に由来していてもよい。例えば、候補抗原ポリペプチドは、以下のポリペプチドに由来する。
ａ．自己免疫疾患に罹患した組織または細胞の中で高度に発現することが知られているポリペプチド。例は、プロインスリン、ミエリン関連タンパク質である。
ｂ．新生物疾患に関わりがあることが知られているポリペプチド。例は、エストロゲン受容体、上皮成長因子受容体、サイクリン依存性キナーゼ１である。
ｃ．自己免疫疾患に関わりがあることが知られているポリペプチド。例：ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、トランスアルドラーゼ。
ｄ．感染症に関わりがあることが知られているポリペプチド。例：ウイルスキャプシド抗原、細菌エンテロトキシン。
ｅ．アレルギーまたは同様の過敏症に関わりがあることが知られているポリペプチド。例：Ｃａｎ  ｆ  １、Ｅｑｕ  ｃ  １、Ｆｅｌ  ｄ  １。
ｆ．既知の腫瘍抗原；例えば、ｐ５３、ＥＲＢＢ２（Ｅｒｂ−Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート  ３−キナーゼ）における共通の変異によって作られるネオアンチゲン。
ｇ．既知の改変タンパク質、例えば、シトルリン化されたバリアントまたはリン酸化タンパク質。
【００６２】
Ｔ細胞サンプルと候補抗原ポリペプチドは、同じ種または異なる種に由来する。例えば、自己免疫または新生物疾患を研究するために、Ｔ細胞サンプルと候補抗原ポリペプチドは、好ましくは、同じ種に由来する。感染症を研究するために、Ｔ細胞サンプルは宿主に由来し、候補抗原ポリペプチドは、目的の病原体に由来する。アレルギーまたは類似の過敏症を研究するために、Ｔ細胞サンプルは、目的の被験体に由来し、候補抗原ポリペプチドは、この被験体においてアレルギーまたは他の過敏症反応を誘発することが知られているか、または誘発することが疑われる異なる種に由来する。
【００６３】
Ｔ細胞サンプルは、ヒト由来であってもよく、候補抗原ポリペプチド配列は、ヒト由来であってもよい。
【００６４】
粒子の特性
粒子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ、以下に論じる）によって貪食可能である。ＡＰＣは、多くの異なる材料および形状の粒子を貪食することができる。これとは対照的に、粒子の大きさは、貪食作用のために限定される。大きさが小さすぎると、抗原提示細胞は、粒子を貪食するように誘発されないだろう。大きさが大きすぎると、抗原提示細胞に適合しないため、粒子を貪食することができないだろう。
【００６５】
粒子は、最大寸法が５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、さらにより好ましくは０．５〜２μｍの間隔、または最も好ましくは約１μｍであってもよい。粒子は、実質的に球状であってもよく、この場合、寸法とは、直径を指す。
【００６６】
細菌の大きさと似た大きさであれば、ＡＰＣによる完全な貪食作用が容易になる。これにより、抗原がＡＰＣによって分解され、その後、ＭＨＣＩＩを介してＴ細胞に確実に提示される。最適な大きさは、特定のＡＰＣの種類に依存し、通常の実験によって決定することができる（実施例５、図５を参照）。
【００６７】
粒子は、常磁性特性を有していてもよく、粒子を回収することができ、および／または磁石によって所定の位置に保持することができることによって、以下に記載する変性洗浄が容易になる。しかし、他の手段によって、例えば、粒子をカラムに保持することによって、または粒子を重力または遠心分離処理によって沈降させることによって、洗浄を行うことも可能である。
【００６８】
抗原ポリペプチドと粒子との会合
抗原ポリペプチドは、粒子が抗原から解離することなく、以下に記載する変性洗浄を行うことができる様式で、粒子に会合する。
【００６９】
ポリペプチドを粒子に会合させる１つの可能な方法を実施例１に示す。しかし、会合の正確な様式は、本発明の方法にとって重大ではない。好ましくは、候補抗原ポリペプチドは、粒子に共有結合している。または、候補抗原ポリペプチドは、金属キレートを介して粒子に接続していてもよい。
【００７０】
例えば、イミノジ酢酸などの金属キレート配位子と結合した粒子は、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋またはＦｅ３＋などの金属イオンと結合することができる。これらの金属キレートは、その後、例えば、ヒスチジンまたはシステインを含むタンパク質およびペプチドに、大きな強度で結合することができる。したがって、金属キレートを含む粒子は、結合したペプチド／タンパク質中のＬＰＳおよび他の汚染成分の量を減らすためのストリンジェントな洗浄が可能な様式で、ペプチド／タンパク質に非共有結合的に吸着することができる。
【００７１】
変性洗浄
変性洗浄は、候補抗原ポリペプチド中のエンドトキシンのレベルを、抗原特異性Ｔ細胞活性化度を決定する後の工程を妨害しないレベルまで下げるために行われる。
【００７２】
エンドトキシンは、ポリペプチドと密に会合するため、その二次構造および三次構造を少なくとも一時的に破壊する定義による変性洗浄を行うことは、非常に有利であり、多くの場合に、エンドトキシンをポリペプチドから解離することが不可欠である。本用途において、非常に少量のエンドトキシンでさえ、妨害となる。
【００７３】
抗原提示細胞は、取り込まれた後に、抗原ポリペプチドを小さなフラグメントに分解し、したがって、一時的な変性および不可逆的な変性（３Ｄ構造の破壊）の両方に耐えることができる。本発明によって開示される粒子との会合によって、そうしなければ不溶性になるか、または凝集し得る変性タンパク質の取り扱いが可能になる。
【００７４】
実施例２および図１に示すように、変性洗浄の特定の様式は、本発明の文脈において重要ではない。例えば、変性洗浄は、会合しているポリペプチドを高ｐＨ、低ｐＨ、高温にするか、変性剤にさらすか、またはこれらの組合せを行うことを含んでいてもよい。好ましくは、変性洗浄は、会合しているポリペプチドを高ｐＨにすること、または強い変性剤、例えば、８Ｍ尿素または６Ｍグアニジン−ＨＣｌにさらすことを含む。最も好ましくは、変性洗浄は、会合しているポリペプチドを少なくとも１３．０、より好ましくは少なくとも１４．０、最も好ましくは少なくとも１４．３の高ｐＨに付すことを含む。変性は、会合しているポリペプチドに対し、１〜５Ｍ、好ましくは１〜３Ｍ、より好ましくは１．５〜２．５Ｍ、最も好ましくは２Ｍの強アルカリ、例えばＮａＯＨまたはＫＯＨ、好ましくはＮａＯＨを用いた洗浄を行うことを含んでいてもよい。
【００７５】
変性洗浄の特に有利な点は、粒子と、会合しているポリペプチドとを用いた調製物が滅菌されるように条件を選択可能であることである。調製物が生きた微生物で汚染されている場合、細胞培養におけるその後の工程は、損なわれる可能性がある。特に、高ｐＨ洗浄（例えば、ｐＨ＞１４）では、簡便に同時にかつ迅速に調製物を滅菌し、エンドトキシンを除去するのに有効な変性洗浄を達成することができる。
【００７６】
好都合なことに、変性洗浄は、エンドトキシンを洗い流すことに加えて、エンドトキシンを分解するか、または不活性化するような洗浄である。高ｐＨ洗浄（例えば、ｐＨ＞１４）は、エンドトキシンに対して不活性化する作用を有する。
【００７７】
洗浄は、１回の洗浄であってもよく、または数回の繰り返しの洗浄、例えば２回、３回、４回または５回の洗浄を含んでいてもよい。
【００７８】
変性洗浄は、本明細書に開示する抗原特異性Ｔ細胞活性化をアッセイするための方法に適合する候補抗原ポリペプチド中のエンドトキシンレベルを生じなければならず、その結果、エンドトキシンは、抗原特異性Ｔ細胞活性化が十分に検出されるために、高すぎる妨害を引き起こさない。残留エンドトキシンのレベルは、簡便には、本明細書で実施例２に記載される通り、単球活性化アッセイ（ＩＬ−１β／ＩＬ−６  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）を用いて試験されてもよい。エンドトキシンの許容レベルは、状況、特に抗原の濃度に依存する。しかし、抗原中のエンドトキシンの量は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、エンドトキシンの最終的な濃度が１００ｐｇ／ｍｌ未満（すなわち、０〜１００ｐｇ／ｍｌ）、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、より好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満になるような量である。サンプル中のエンドトキシンを測定するための方法、例えばＬＡＬアッセイが知られている。
【００７９】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびＴ細胞サンプル
本発明の文脈において、ＡＰＣは、専門的な抗原提示細胞、例えば、単球／マクロファージまたは樹状細胞である。ＡＰＣは、初代細胞であってもよく、または不死化細胞であってもよい。
【００８０】
ＡＰＣは、Ｔ細胞サンプルのＴ細胞と適合していなければならず、その結果、Ｔ細胞が反応することができる抗原特異性の内容物（ＭＨＣ制限されている）において、Ｔ細胞に対して抗原を提示することができる。ＡＰＣおよびＴ細胞サンプルは、好ましくは、同じ種から得られ、ＭＨＣ受容体に関して受容体が適合している。しかし、異なる種に由来する遺伝子操作されたＡＰＣの使用も想定される。
【００８１】
抗原提示細胞とＴ細胞サンプルが同じ個体に由来する場合、ＡＰＣとＴ細胞との間のミスマッチの可能性は回避される。
【００８２】
抗原提示細胞とＴ細胞サンプルは、同じ血液サンプルに由来してもよく、実用的な観点から有利である。抗原提示細胞とＴ細胞サンプルは、同じ個体由来のＰＢＭＣサンプルに由来していてもよい。末梢血サンプルからＰＢＭＣを得ることは、通常のプロトコルであり、同時に、同じ個体からＡＰＣとＴ細胞の両方の便利な供給源を与える。
【００８３】
ＰＢＭＣサンプルは、新鮮なものを使用してもよく、または凍結させてもよい。凍結した細胞を使用することができる可能性は、物流の観点から大きな実用上の利点である。
【００８４】
Ｔ細胞サンプルは、腫瘍、好ましくは、腫瘍中のリンパ管に由来してもよい。
【００８５】
また、Ｔ細胞サンプルは、腹水に由来していてもよい。
【００８６】
Ｔ細胞サンプルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を両方とも含む全ＰＢＭＣ、精製されたＴ細胞の集合、または特定のＴ細胞の集合を欠いたＰＢＭＣを含んでいてもよい。
【００８７】
Ｔ細胞活性化度の決定
本方法は、Ｔ細胞活性化度を、関連するリファレンスと比較する工程をさらに含んでいてもよく、リファレンスと比較して、サンプルにおけるＴ細胞活性化度が高いことが、その候補抗原が、そのサンプルにおける抗原特異性Ｔ細胞活性化を引き起こすという結果の指標である。リファレンスは、「活性化」を定義するために重要であるため、活性化度は、好ましくは、リファレンスサンプルと比較して定義される。リファレンスサンプルは、例えば、患者サンプルを分析するときは正常な健康な個体に由来するサンプル、腫瘍または腫瘍を排出するリンパ節サンプルを分析するときは正常な組織由来のサンプル、治療後の効果をフォローアップするときには治療前のサンプルであってもよい。リファレンスサンプルを使用し、診断／予後判定のための閾値を設定し、抗原特異的な陽性（すなわち、活性化）または陰性（すなわち、下方制御）を決定する。
【００８８】
Ｔ細胞サンプル中のＴ細胞活性化度を決定することは、サンプル中の活性化したＴ細胞の割合、すなわち、サンプル中の全Ｔ細胞に対する活性化したＴ細胞の数を決定することを伴っていてもよい。リファレンスサンプル中の活性化した細胞の割合に対する、活性化した細胞の割合は、特異的な抗原に対するＴ細胞活性化の大きさの指標を与えるだろう。好ましくは、各分析において、個々のサンプルにおける自然発生的な活性化レベル（「バックグラウンド活性化レベル」）は、抗原を含まずにインキュベートされたサンプル（すなわち、ネガティブコントロール）で決定される。バックグラウンド活性化は、分析中に相殺されてもよい。言い換えると、活性化の割合は、活性化の割合からネガティブコントロールの値を引き算した正味の値で計算されてもよい。
【００８９】
実施例３に示すように、Ｔ細胞サンプル中のＴ細胞活性化度の決定は、ＥＬＩＳｐｏｔ／ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術または増殖アッセイ（すなわちチミジン取り込み）を用いて行われてもよい。しかし、その目的に適した他のアッセイおよび技術も公知であり、これを使用してもよい。Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することは、例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ／ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイによって、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）、インターロイキン２２（ＩＬ−２２）、またはこれらの組合せの分泌によって反応する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含んでいてもよい。特定の疾患または状態を分析するために、他の関連する検体（サイトカインの組合せ）を使用することができる。例えば、アレルギー患者を分析する場合、Ｔｈ１／Ｔｈ１７サイトカインではなくＴｈ２サイトカインを分析してもよい。Ｔ−ｒｅｇサイトカインは、癌、アレルギーおよびワクチン処置後に関心事となり得る。したがって、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術は、様々な条件下で様々な候補抗原ペプチドに対する関連する活性化プロファイルの分析を可能にする。これにより、例えば患者間の異質性、疾患の重篤度および進行に関する情報が加わる。
【００９０】
実施例３に見られるように、ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２分泌の決定は、ＭＳ患者を健康なコントロールと区別するために、ＩＦＮ−γよりも驚くほど良好である。したがって、Ｔ細胞サンプルにおけるＴ細胞活性化度を決定することは、好ましくは、ＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２の分泌によって反応する抗原提示細胞と接触したＴ細胞の割合を決定することを含み、この方法は、多発性硬化症を診断するためのものであるか、または多発性硬化症の経過をフォローアップするためのものである。言い換えると、ＭＳを有するか、またはＭＳを有することが疑われる被験体に由来するＴ細胞サンプルは、好ましくは、候補抗原に応答するＩＬ−１７および／またはＩＬ−２２分泌について分析される。
【００９１】
多重分析
実施例４に示すように、いくつかの候補抗原を同じＴ細胞サンプルに対してアッセイしてもよい。好ましくは、少なくとも１０の候補抗原を同じＴ細胞サンプルに対してアッセイする。本発明の方法を用いると、追加のサンプルが必ずしも実験室の作業を大幅に増加させるとは限らない。本発明の方法の強みは、多くの労力を要することなく多数の抗原をスクリーニングすることが容易なことである。このことの利点は、例えば、可能性がある自己抗原の大きなスクリーニングを行うことができ、真の自己抗原を発見する機会が増えることである。
【００９２】
自己反応性の診断
本方法の第１の態様は、試験被験体において自己反応性を診断するための方法であって、
ａ．候補ペプチド自己抗原が密に会合した、貪食可能な粒子を与え、会合したポリペプチドを含む粒子に対して変性洗浄を行い、エンドトキシンのレベルを、後の工程を妨害しないほど十分に低くする工程と；
ｂ．試験被験体から、可変Ｔ細胞と可変抗原提示細胞とを含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを与える工程と；
ｃ．抗原提示細胞によって粒子の貪食作用が可能になり、抗原提示細胞によって提示される抗原に反応して特異的なＴ細胞活性化が可能になる条件で、ＰＢＭＣサンプルと、粒子とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ．接触したＰＢＭＣ細胞において、活性化したＴ細胞の割合を定量する工程と；
ｅ．定量された割合と、健康な被験体に由来する相当する定量された割合とを比較することによって、試験被験体において活性化したＴ細胞の割合が大きいことは、この試験被験体において候補自己抗原に対する自己反応性の指標となる工程と
を含む、方法であってもよい。
【００９３】
実施例４に示すように、本発明は、多種多様な自己抗原を同時に、迅速にスクリーニングする強力なツールを提供し、これはＭＳに限定されない。スクリーニング可能なタンパク質の候補ライブラリーは、疾患および患者に応じて、容易に設計することができる。
【００９４】
抗原特異性Ｔ細胞が、疾患の特徴であり、抗原ライブラリーが、問題となっている疾患に適合する限り、自己免疫状態に加え、他の炎症性疾患に、この方法を使用することができる。
【００９５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と同じであると解釈すべきであるが、これに限定されない。全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示を、見出しおよび副見出しを有する章に配置しているのは、単に見やすさを改善するためのものであり、いかなる様式にも限定するものと解釈すべきではなく、その分割は、異なる見出しおよび副見出しでの特徴を互いに組み合わせることを除外せず、または限定しない。
【実施例】
【００９６】
[実施例１]
ビーズへのポリペプチド接続
遊離カルボン酸基を含むビーズに共有結合したポリペプチド。この実施例では、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した（直径が１μｍの球）。ビシンコニン酸、ＢＣＡ、タンパク質アッセイを用いて、首尾良い接続を確保するために、接続の前後でタンパク質濃度を測定した。数種類のポリペプチドを試験し、１ｍｇのビーズあたり平均で４８．７μｇ（平均：４８．７、ＳＤ：２０．５、Ｎ＝１０）が接続した。製造者の指示に従うと、ビーズ１ｍｇあたり５０μｇのポリペプチドを接続させることができ、この実施例で行われた接続の効率が高かったことを示している。
【００９７】
[実施例２]
変性洗浄によるエンドトキシンの除去
異なる種類の変性洗浄を用いたエンドトキシン除去を試験するために、４種類の様々な変性洗浄条件を使用した。（ａ）高ｐＨ（２Ｍ  ＮａＯＨ  ｐＨ１４．３）、（ｂ）加熱（９５℃）および変性剤（（ｃ）８Ｍ尿素、（ｄ）６Ｍ塩酸グアニジン）。単球の活性は、エンドトキシンによって強く増加し、したがって、単球の活性化を残留ＬＰＳをモニタリングするために使用することができるため、単球活性化アッセイ（ＩＬ−１β／ＩＬ−６  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）を用い、残留するエンドトキシンのレベルを試験した。
【００９８】
試験した全ての種類の変性洗浄は、未洗浄のビーズと比較して、単球活性化の量を有意に下げるように管理した（図１を参照）（全ての洗浄についてＰ＜０．０００１）。変性洗浄は、非常に効果的であり、洗浄されたビーズは、ネガティブコントロールに匹敵する程度まで細胞を刺激した。２ＭのＮａＯＨを用いて洗浄すると、最も少ない量のエンドトキシンが得られ、これに続き、８Ｍの尿素が近かった。
【００９９】
[実施例３]
Ｔ細胞活性化アッセイ
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ
１６人の多発性硬化症患者および９人の健康なコントロールに由来するサンプルを用い、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを行った。患者およびコントロールに由来するＰＢＭＣを、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレート中、疑わしい自己抗原と共にインキュベートした。図３に見られるように、ＭＳ患者の何人かは、有意に多い数の活性化された細胞を示した（パネルａ）。ＭＳ患者は、平均数が３７．４（９５％ＣＩで１３．０〜５２．９）のＩＬ−２２を分泌する活性化された細胞を有し、一方、健康なコントロールは、平均数が３．３（９５％ＣＩで０．９７〜５．６）の活性化された細胞を有していた。差のＰ値＝０．００６２。ＩＬ−１７を分泌する活性化された細胞について、０．２８（ＣＩ９５％が−１．４〜２．０）に対し、患者における数は１４．７（ＣＩ９５％で５．３〜２４．１）であり、差のＰ値は＜０．０００７である（パネルｂ）。しかし、ＩＦＮγを分泌する細胞について、その差は、統計的に有意ではなく、コントロールでは３３（ＣＩ９５％で７．１〜５９．０）であるのに対し、患者では平均数が８０．０（ＣＩ９５％で２２．３〜１３８）であり、Ｐ＝０．４９５である（パネルｃ）。有意性は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｕ検定を用いて計算した。
【０１００】
これらの結果は、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを用い、ビーズに接続した抗原を用いたＴ細胞の活性化を測定することができ、患者と健康なコントロールの比較を行うことができることを示す。驚くべきことに、Ｔ細胞活性化の古典的マーカーであるＩＦＮγは、患者とコントロールの比較において、最も弱い差を示した。しかし、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２は、両方とも患者とコントロールの比較において、強い有意な差を示し、このことは、ＭＳにおいて自己抗原を探すときに分析するために、これらがさらに適したサイトカインであり得ることを示している。
【０１０１】
増殖アッセイ
チミジン取り込みを用いた増殖アッセイ。オボアルブミン（ＯＶＡ）免疫化マウスに由来する脾細胞を、ＯＶＡまたはＢＳＡが接続したビーズと共にインキュベートし、抗原特異性増殖を測定した。ビーズと共にインキュベートした細胞の増殖は、刺激指数（ＳＩ）として表された。（図２に見られるように、ＯＶＡ−ビーズと共にインキュベートした細胞は、増殖が増加し、ＳＩは２．６９であった（９５％ＣＩで１．６〜３．７８、Ｐ＜０．００５））。ＢＳＡと共にインキュベートした細胞は、増殖が増加せず、ＳＩは０．９であった（９５％ＣＩで０．７〜１．１、Ｐ＝０．３７）。
【０１０２】
これらの結果は、ビーズに接続した抗原を用いた免疫細胞（この実施例では脾細胞）の活性化を、増殖アッセイによって測定可能であることを示す。また、ＯＶＡが接続したビーズは増殖を刺激したが、ＢＳＡが接続したビーズは増殖を全く誘発することができなかったため、観察された増殖は、抗原特異性であることも示している。この実験は、抗原特異性Ｔ細胞増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激のために、ビーズに接続した抗原を使用可能であることを示している。チミジン取り込みは、増殖を測定するための１つの方法にすぎず、したがって、増殖を測定するための他の方法、例えば、ＣＦＳＡ希釈およびＢｒｄＵ取り込みアッセイも適用可能である。
【０１０３】
[実施例４]
１２５種類のタンパク質のライブラリーに対するＭＳの自己抗原スクリーニング
多発性硬化症における自己抗原の同定：Ｔ細胞活性化のアッセイとして、ＩＦＮγ／ＩＬ−２２／ＩＬ−１７Ａ  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを用いる、ビーズに接続した多数のＰｒＥＳＴに対するＴ細胞活性化の測定。このようなスクリーニングは、ＭＳ患者由来のＰＢＭＣにおいて、健康なコントロールと比較して高いＴ細胞応答を刺激する抗原を検出することによって、可能性のある自己抗原を同定し、どの抗原をさらに分析するかを決定するのに役立つ。
【０１０４】
図４に見られるように、１６人の患者と９人の健康なコントロールのスクリーニングにおいて、二元配置ＡＮＯＶＡを用いて分析したとき、患者の活性化された細胞の平均数と、コントロールの活性化された細胞の平均数との統計的に有意な差を見ることができた。ＩＬ−２２を分泌する活性化されたＴ細胞の場合、抗原６番（Ｐ＜０．０００１）、抗原１８番（Ｐ＜０．０００１）、抗原２３番（Ｐ＜０．０００１）、抗原２９番（Ｐ＜０．０００１）および抗原３３番（Ｐ＜０．０５）の５種類の抗原について、差が見られた（パネルａ）。ＩＬ−１７を分泌する活性化されたＴ細胞の場合、抗原６番（Ｐ＜０．０５）、抗原１８番（Ｐ＜０．０００１）、抗原２３番（Ｐ＜０．０１）、抗原２９番（Ｐ＜０．０００１）および抗原３３番（Ｐ＜０．０５）の５種類の抗原について、患者とコントロールとで差が見られた（パネルｂ）。ＩＦＮγについては、抗原１８番（ｐ＜０．０００１）のみ差が見られた（パネルｃ）。
【０１０５】
これらの結果は、自己抗原スクリーニングとして、ＭＳにおいて可能な新しい自己抗原を同定するツールとして、本発明の方法を使用可能であることを示す。
【０１０６】
[実施例５]
貪食可能なビーズの適切なビーズの大きさの特定
チミジン取り込みを用いた増殖アッセイを使用し、抗原特異性Ｔ細胞活性化に対するビーズの大きさの影響を試験した。オボアルブミン（ＯＶＡ）免疫化マウスに由来する脾細胞を、異なる大きさのＯＶＡが接続したビーズを用いて刺激し、抗原特異性増殖を測定した。図５に見られるように、直径が０．２μｍのＯＶＡ−ビーズと共にインキュベートした細胞は、増殖が増加し、平均ＳＩは４．１であった（９５％ＣＩで２．４〜５．８、Ｐ＝０．００７）。直径が１μｍのＯＶＡ−ビーズと共にインキュベートした細胞は、増殖が増加し、平均ＳＩは８．４であった（９５％ＣＩで６．１〜１０．６、Ｐ＜０．００５）。直径が５．６μｍのＯＶＡ−ビーズと共にインキュベートした細胞は、増殖を増加させることができず、平均ＳＩは１．１であった（９５％ＣＩで０．４〜２．７、Ｐ＝０．８７６）。
【０１０７】
これらの結果は、異なる大きさのビーズに接続した抗原が、細胞増殖を刺激し得ることを示す。直径が約１μｍのビーズは、細胞刺激という観点で最も効果的なようであるが、大きさが０．２μｍより小さいビーズも機能する。直径が１μｍより大きいビーズも機能するが、直径が５．６μｍに近づくにつれて、ビーズは、細胞を全く刺激することができなくなることを予想することは合理的である。この大きさは、細菌の大きさに似ているので、１μｍが最適な大きさであることを推定することは合理的である。我々の免疫系は、この大きさの微生物／粒子を貪食し、反応するように進化してきた。正常な抗原提示細胞は、１０〜１５μｍの範囲の大きさを有する。
材料および方法
【０１０８】
[実施例１]
遊離カルボン酸基を含む常磁性ビーズへのタンパク質の共有結合。
この実施例では、直径が１μｍのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者のプロトコルに従ってカップリング手順を実施した（ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）およびＥＤＣ（エチルカルボジイミド）を用いた２工程の手順））。
【０１０９】
ＭＥＳバッファー（２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６）を用い、ビーズを２回洗浄した。次いで、ＭＥＳバッファー中５０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）および５０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドをビーズに加え、室温で３０分間インキュベートすることによって、カルボン酸基を活性化させた。磁石を用いてビーズを回収し、上清を除去し、ビーズをＭＥＳバッファーで２回洗浄した。タンパク質をＭＥＳバッファーで濃度が１ｍｇ／ｍｌ、合計１００ｕｇになるまで希釈し、これをビーズに加え、室温で１時間インキュベートした。磁石を用いてビーズを回収し、上清を除去し、タンパク質濃度測定のために保存した。未反応の活性化カルボン酸基を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用い、１５分間クエンチした。次いでビーズをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、−８０℃で保存した。
【０１１０】
ビーズに接続したタンパク質の量を測定するために、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、接続前のタンパク質および接続後の上清中のタンパク質濃度を測定した。ＢＣＡアッセイは、製造業者のプロトコルに従って用いた。
【０１１１】
[実施例２]
変性洗浄によるエンドトキシンの除去。
ビーズを、Ｅ．ｃｏｌｉで産生された組換えタンパク質と接続させた。タンパク質が接続したビーズを、いくつかの異なる変性条件で洗浄し、エンドトキシンの除去を確実にした。残留するエンドトキシンは、単球反応性アッセイ（ＩＬ１Ｂ／ＩＬ６  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ−ａｓｓａｙ、ＭＡＢＴＥＣＨ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。
【０１１２】
エンドトキシン除去のために、ビーズを２Ｍ  ＮａＯＨ  ｐＨ１４．３、８Ｍ尿素または６Ｍグアニジン（グアニジン−ＨＣｌ）の３種類の異なる洗浄バッファー（全てＲＴで滅菌水）の１つで洗浄したか、またはＰＢＳ中、９５℃でインキュベートした。ビーズを緩衝液に懸濁させ、４分間振とうし、磁石で回収し、上清を除去した。これを３回繰り返した。熱処理したビーズをＰＢＳ  ｐＨ７．４に入れ、９５℃で５分間、加熱ブロックに入れ、磁石で回収し、上清を除去した。これを３回繰り返した。次いでビーズを滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、残りの洗浄緩衝液を除去した。
【０１１３】
エンドトキシンレベルを測定するために、単球反応性アッセイを使用した（ＩＬ−１β／ＩＬ−６ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイ、ＭＡＢＴＥＣＨ、スウェーデン）。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）の勾配遠心分離によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。細胞をｃＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地）に懸濁した。３，０００，０００個のビーズを、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレート中の各ウェルに、それぞれの種類のビーズおよび洗浄液についてウェル４個ずつに、添加した。未洗浄のビーズ、ＬＰＳおよび培地をコントロールとして使用した。ウェルあたり２００μｌのｃＲＰＭＩ細胞（各細胞濃度およびそれぞれの種類のビーズを２ウェル）中、１０，０００個および５，０００個細胞の濃度でＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートに細胞を添加した。プレートを３７℃および５％ＣＯ２の加湿環境下で１８時間インキュベートした。次いで、プレートを製造元のプロトコルに従って発色させ、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔリーダーで読み取った。
【０１１４】
[実施例３]
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ
ＭＳ中の患者対コントロールのＴ細胞活性化対懸濁した自己抗原を分析するためのＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを、ＩＦＮγ／ＩＬ１７／ＩＬ２２  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ（ＭＡＢＴＥＣＨ）を用いて行った。このプロトコルは、実際には実施例４に記載した通りであったが、１２５種類のタンパク質の全ライブラリーの代わりに１個の抗原に対する反応だけを分析した。
【０１１５】
増殖アッセイ
オボアルブミン感作マウス由来の脾細胞を用いたチミジン取り込みによる増殖アッセイ。刺激として、ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ）に接続したオボアルブミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）およびＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
【０１１６】
水酸化アルミニウムに吸着させた１００μｇのオボアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を毎月注射することによって、マウスに免疫を与えた。最初の注射から３ヶ月後、マウスを殺し、脾臓を採取した。脾細胞は、Ｔｈｕｎｂｅｒｇら、２００９、Ａｌｌｅｒｇｙ  ６４：９１９に記載される通り、標準的な手順によって調製した。
【０１１７】
細胞を、ｃＲＰＭＩ中、オボアルブミンが接続したビーズまたはＢＳＡが接続したビーズ（細胞あたり１０個のビーズ）と共に５日間インキュベートした。全ての細胞を、６％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で６日間インキュベートした。インキュベートの最後の１８時間に、１μＣｉ／ウェル［３Ｈ］のチミジンを細胞培養物に加えた。刺激を受けた３個組から得た、１分あたりの平均計測数（ｃｐｍ）を、刺激を受けていない細胞から得た平均ｃｐｍ値で割り算し、刺激指数（ＳＩ）として表した。ＳＩ値≧２．０は、一般に陽性とみなされる。
【０１１８】
[実施例４]
タンパク質に接続したビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を刺激として用い、Ｔ細胞活性化を測定するためのアッセイとして刺激ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ（ＩＦＮγ／ＩＬ１７／ＩＬ２２  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ、ＭＡＢＴＥＣＨ）を用いた、多発性硬化症の１２５種類のタンパク質のライブラリーに対する自己抗原スクリーニング。
【０１１９】
全１８人の多発性硬化症患者と、９人の健康なコントロールに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。１２５種類の異なるタンパク質は、Ｈｕｍａｎ  Ａｔｌａｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔからの多種多様なヒトに特異的なＰｒＥＳＴからなっていた。ＰｒＥＳＴを製造業者のプロトコルに従って、ビーズに接続させた（実施例１に記載した通り）。
【０１２０】
ＰＢＭＣを静脈血サンプル（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＥＤＴＡ管に採取した）から、標準的なプロトコルに従ったＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）によって単離した。細胞を凍結培地（４５％  ＦＣＳ、４５％  ＲＰＭＩ、１０％  ＤＭＳＯ）中で凍結させ、−１５０℃で保存した。
【０１２１】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔの９６ウェルフォーマットに合うように、１２５種類の異なるＰｒＥＳＴを４５種類の異なるプールに入れて保存し、その後、２Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、エンドトキシンを除去した（実施例２に記載した通り）。３，０００，０００個のビーズをＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートの各ウェルに添加し、それぞれ異なるプールを２個組で行った。抗ＣＤ３をポジティブコントロールとして使用し、培地のみ、裸のビーズを含む培地をネガティブコントロールとして使用した。
【０１２２】
ＰＢＭＣを３７℃の水中で解凍し、ｃＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％  ＦＣＳ、１％  Ｌ−ｇｌｕｔおよび１％  ペニシリン−ストレプトアビジン）で洗浄した。２００μｌのｃＲＰＭＩ中の２５０，０００個の細胞を各ウェルに添加し、次いでプレートを３７℃、５％ＣＯ２の加湿環境下で４４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを製造元（Ｍａｂｔｅｃｈ）のプロトコルに従って発色させ、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔリーダーで読み取った。
【０１２３】
[実施例５]
オボアルブミン感作マウス由来の脾細胞およびオボアルブミンに接続したビーズを用い、異なる大きさのビーズの有効性を評価した。表面にカルボン酸を含み、直径が５．６μｍ、１μｍ、０．２μｍの常磁性ビーズを、実施例１のプロトコルに従って、オボアルブミンまたはウシ血清アルブミンと接続した。
【０１２４】
抗原特異性Ｔ細胞活性化を刺激するためのビーズの有効性を試験するために、増殖アッセイ（３Ｈチミジン取り込み）を使用した。ビーズの濃度は、細胞濃度に対し、５．６μｍのビーズでは１：１、１μｍのビーズでは１０：１、０．２μｍのビーズでは５００：１であった。細胞と共にインキュベートしている間の全タンパク質濃度は、それぞれ５．６μｍ、１μｍ、０．２μｍの場合に１２５ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌであった。増殖アッセイを実施例３と同じ様式で行った。
【図１】
2019500604.tif 000003
【図２】
2019500604.tif 000004
【図３】
2019500604.tif 000005
【図４ａ】
2019500604.tif 000006
【図４ｂ】
2019500604.tif 000007
【図４ｃ】
2019500604.tif 000008
【図５】
2019500604.tif 000009
【国際調査報告】
2019500604.tif 000010
2019500604.tif 000011
2019500604.tif 000012
2019500604.tif 000013
2019500604.tif 000014