(57)【要約】  本発明は、成分としてポリエチレングリコールをベースとする合成ヒドロゲルに個々の腎細胞を包埋し、尿細管構造が形成されるまで細胞を培養することによって、腎尿細管を形成する方法に関する。培養は、得られる尿細管構造のサイズ、構造、および形態、ならびに機能が成人ヒト腎尿細管に相当する、または少なくとも近くなるまで続けることができる。【図１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
成分としてポリエチレングリコールをベースとする合成ヒドロゲルに個々の腎細胞を包埋し、尿細管構造が形成されるまで細胞を培養することによって、腎尿細管を形成する方法。
【請求項２】
前記腎細胞が、腎尿細管細胞株に由来する、または初代腎尿細管細胞である、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もしくは間葉系幹細胞から誘導された細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腎細胞が、ヒト腎尿細管細胞株に由来する、または初代ヒト腎尿細管細胞である、またはヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もしくはヒト間葉系幹細胞から誘導された細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腎細胞が、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞、または集合管細胞であることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記腎尿細管細胞株が、正常な成人ヒト腎組織から誘導された不死化近位尿細管上皮細胞株であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記尿細管構造のサイズ、構造、および形態、ならびに機能が成人ヒト腎尿細管に相当する、または少なくとも近くなるまで、前記培養が続けられることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒト腎臓マーカーの発現、既知の腎毒性化合物に対する応答性、ならびにその結果生じる腎損傷およびアポトーシスマーカーの発現によって、ならびに、前記尿細管がアニオン帯電性有機分子を前記尿細管の内腔に輸送することができることによって、前記腎尿細管の機能を表すことができることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記尿細管細胞と、ヒドロゲル中で前記尿細管細胞と共局在する間葉系幹細胞および／または腎細胞および／または内皮細胞との共培養が行われることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記尿細管細胞と、ヒドロゲル中で前記尿細管細胞と共局在するヒト間葉系幹細胞および／またはヒト腎細胞および／またはヒト内皮細胞との共培養が行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地が０％（ｖ／ｖ）血清を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が血清を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法によって３次元ヒドロゲルマトリックス中で得られるヒト腎尿細管であって、サイズ、構造、および形態、ならびに機能が成人ヒト腎尿細管に相当する、または少なくとも近い、ヒト腎尿細管。
【請求項１３】
ヒト腎尿細管または哺乳類腎尿細管の形成の３次元モニタリングへの、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１４】
前記合成ヒドロゲル中にグリコサミノグリカンおよび／またはペプチドを組み込むことによる腎尿細管の形成に対する、ヒドロゲル剛性の影響および／または酵素により切断可能なペプチド架橋でのヒドロゲルの分解の影響の特徴付け、および／またはグリコサミノグリカンおよび／またはペプチドの存在の影響の特徴付けへの、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
化合物を前記培養培地に添加すること、または前記成分を前記ヒドロゲル中に包埋することによる、腎尿細管の形成に対する可溶性分子または作用物質の影響の特徴付けへの、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
化合物を前記培地に添加すること、または前記化合物を前記ヒドロゲル中に包埋することによる、腎尿細管に対する前記化合物の毒性の分析への、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、または９６ウェルプレートでの前記方法の実施中における尿細管形成または腎毒性の検査への、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎尿細管を形成する方法に関し、したがって、開発プロセスを研究し、薬物毒性試験を行うことができる腎尿細管（腎細管）用のエクスビボモデルの確立に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネフロンは、腎臓の機能的な下位単位であり、腎小体と腎尿細管からなる。腎尿細管、特に近位尿細管は、代謝産物（毒素）の排泄および尿からの栄養素の再吸収に重要な役割を果たしている。したがって、近位尿細管は、腎臓を介して排泄される代謝産物および薬物に非常に敏感に応答する。
【０００３】
現在使用されている腎毒性アッセイは、２次元のインビトロ培養または動物モデルに基づいている。しかし、細胞−細胞の接触および細胞−マトリックスの接触がないため、細胞の２Ｄ培養は非常に人工的であり、したがって生理学的に重要な環境からかけ離れている。このため、腎毒性検査は、大抵は動物モデルで行われる。しかし、これらの研究は、例えば刊行物Archibald K, Coleman R, Foster C. Open letter to UK Prime Minister David Cameron and Health Secretary Andrew Lansley on safety of medicines. Lancet. 2011;377:1915から知られているように、約５０％の事例において、薬物に対するヒトの応答と比較して正反対の傾向を示す。
【０００４】
このため、Davies J. Engineered renal tissue as a potential platform for pharmacokinetic and nephrotoxicity testing. Drug Discovery Today (2014)に記載されているように、広く使用されている腎毒性アッセイの代替として、腎臓特異的なオルガノイドアッセイが開発された。ここで、３Ｄオルガノイドモデルによって、不死化細胞株（２Ｄ培養）の従来の使用に比べてインビボで腎毒性効果をより良好に理解可能であることを示すことができた(Astashkina A.I. et al. Comparing predictive drug nephrotoxicity biomarkers in kidney 3-D primary organoid culture and immortalized cell lines. Biomaterials (2012) 33 4712-21)。
【０００５】
さらに、とりわけ刊行物Astashkina A.I. et al. A 3-D organoid kidney culture model engineered for high-throughput nephrotoxicity assays. Biomaterials (2012)から、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を使用する、少なくとも一部は合成物質をベースとする腎尿細管モデル、ならびにコラーゲンおよびMatrigel（商標）からなる混合物を充填された絹タンパク質からなる多孔性ヒドロゲルをベースとする尿細管モデルも知られている。多孔性ヒドロゲルベースのモデルは、健康なまたは疾患特異的に変えた胎生マウス腎上皮細胞を利用した。ＨＡ−ＰＥＧＤＡをベースとするモデルは、高スループット適合アッセイで有望な結果を示した。全体として、３Ｄ研究は、腎臓に関する３Ｄ細胞培養モデルの重要性についての根拠を与えた。
【０００６】
さらに、とりわけDesRochers, T.M., Suter, L., Roth, A., Kaplan, D. Bioengineered 3D Human Kidney Tissue, a Platform for the Determination of Nephrotoxicity. Plos One 8, (2013)に記載されているように、コラーゲン、Matrigel（商標）、またはそれら両方のバイオポリマー調製物からの組合せをベースとする腎臓３Ｄ尿細管モデルが開発された。
【０００７】
従来技術の欠点は、従来の細胞培養における人工的な２Ｄ環境に関する上記の制限、または、あまり有意でないことがある、もしくは大きな生物学的相違により正反対の応答さえ示す動物モデルに加えて、上記のオルガノイドモデルでは以下のようなものがある。
【０００８】
オルガノイドモデルは、動物由来の細胞、および胚性または誘導多能性幹細胞を使用し、これらは、種の違いにより、倫理上の理由から、および奇形腫の発生のリスクにより、使用が制限されている。さらに、使用されるバイオポリマーベースのマトリックス系は、大きなバッチ依存性のばらつきを有し、したがって低い再現性でしか適用可能でない。さらに、機械的特性および生体分子特性の所定の変化はなく、したがって、尿細管形成に対するこれらのパラメータの研究は可能でない。
【０００９】
さらに、生物学的な欠点は、尿細管様構造の寸法、形状、および形態が、対象のヒト腎尿細管とは明らかに異なることである。
【００１０】
さらに、ＨＡ−ＰＥＧＤＡヒドロゲルは、特にマウス腎臓から得られた近位尿細管の断片を使用し、したがって、ヒトにおける状況を述べる、またはヒト尿細管形成の過程を研究するのには適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、構造および機能がヒト近位腎尿細管のモデルに非常に近く、尿細管の形成および／または薬物に対する応答を研究することができる、規定され、かつ特性を変更可能なヒト尿細管３次元モデル系を作製することにある。
【００１２】
このモデル系は、ロバストであり、長期安定性を有し、より長期間、すなわち少なくとも４〜６週間にわたって再現性のある試験を可能にする。さらに、例えば代謝活性および毒性ならびに腎疾患マーカーに関する有意なアッセイ、ならびに、例えば形態学、免疫化学、フローサイトメトリ、ＰＣＲ、ウェスタンブロットのための拡張された単一細胞分析を用いることによっても、尿細管形成および薬物効果などに対する様々な細胞指令信号の影響、例えば機械的特性、再構成可能性、可溶性シグナル伝達分子の提示、天然細胞環境、いわゆる細胞外マトリックスの影響を特徴付け可能である。ここで、作用物質および薬物の投与に対する応答は、確立されているインビボ試験のものと概して同等であり、したがって、コストがかかり倫理的な問題もある動物実験を制限する助けとなる。
【００１３】
さらに、アレイ技法が、ブロードバンドテスト（スクリーニング）の拡大を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、請求項１の特徴を備える方法によって達成される。さらなる発展形態は、従属請求項に示されている。
【００１５】
本発明による腎尿細管を形成する方法では、成分としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとする合成ヒドロゲル中に個々の腎細胞を包埋し、尿細管構造が形成されるまで細胞の培養を行う。
【００１６】
特に有利な実施形態によれば、ＰＥＧヒドロゲル系は、酵素により切断可能なペプチド、好ましくはマトリックスメタロプロテアーゼにより切断可能なペプチド（ＭＭＰペプチド）によって架橋され、したがって、ヒドロゲル系は切断可能であり、局所的に再構成可能である。
【００１７】
ここで、ポリエチレングリコール分子は、共役ペプチドによってＰＥＧ−ペプチド／ＰＥＧ系に架橋され、したがってＰＥＧ−ペプチド／ＰＥＧヒドロゲルを形成することができる。ここで、ＰＥＧ−ＭＭＰ／ＰＥＧヒドロゲルが好ましい。好ましくは、ポリエチレングリコールとして多価ポリエチレングリコールが使用される。ここで、４アームポリエチレングリコール（スターＰＥＧ）が好ましい。
【００１８】
本発明のさらに好ましい変形形態によれば、ペプチド分子によってＰＥＧ分子をグリコサミノグリカン、例えばヘパリンの分子と互いに架橋して、ヒドロゲルを形成することができる。好ましくは、この変形形態では、ＰＥＧ−ＭＭＰ／ヘパリンヒドロゲル系が使用され、スターＰＥＧ−ＭＭＰ／ヘパリンヒドロゲル系が特に有利であることが判明している。一変形形態では、ヒドロゲルのヒドロゲルマトリックスは、チオール末端スターＰＥＧ−ペプチド共役体と、マレイミド、好ましくは４〜６個のマレイミド基によって官能化されたヘパリンとの共有結合架橋によって形成される。ヒドロゲルマトリックスの架橋は、マイケル付加によって行われる。
【００１９】
好ましくは、培養に使用される腎細胞は、腎尿細管細胞株に由来する、または初代腎尿細管細胞である、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もしくは間葉系幹細胞から誘導された細胞である。
【００２０】
ここで、腎細胞が、ヒト腎尿細管細胞株に由来する、またはヒト初代腎尿細管細胞である、またはヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）もしくはヒト間葉系幹細胞から誘導された細胞であるとき、特に有利である。
【００２１】
腎尿細管細胞は、例えば、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞、または集合管細胞でよい。好ましくは、初代腎尿細管細胞は、ヒト初代近位腎尿細管細胞である。
【００２２】
有利には、腎尿細管細胞株は、正常な成人ヒト腎組織から誘導された不死化近位尿細管上皮細胞株である。
【００２３】
好ましくは、培養は、尿細管構造のサイズ、構造、および形態、ならびに機能が成人ヒト腎尿細管に相当する、または少なくとも近くなるまで続けられる。
【００２４】
腎尿細管の機能は、例えば、ヒト腎臓マーカー、好ましくは極性化マーカーの発現、既知の腎毒性化合物、例えばシスプラチンに対する応答性、ならびにその結果生じる腎損傷マーカー（例えば腎損傷マーカーＫＩＭ１）およびアポトーシスマーカー（例えば切断可能なカスパーゼ−３）の発現、ならびに、尿細管がアニオン帯電性有機分子を尿細管の内腔に輸送することができることによって表すことができる。
【００２５】
本発明の一形態に対応して、尿細管細胞と、ヒドロゲル中で尿細管細胞と共局在する間葉系幹細胞、腎細胞、または内皮細胞との共培養が行われる。
【００２６】
尿細管細胞と、ヒドロゲル中で尿細管細胞と共局在するヒト間葉系幹細胞および／またはヒト腎細胞および／またはヒト内皮細胞との共培養が特に好ましい。
【００２７】
この方法は、血清があるか、血清がない、すなわち０％（ｖ／ｖ）血清であるかにかかわらず行うことができる。
【００２８】
この方法によって、サイズ、構造、および形態、ならびに機能が成人のヒト尿細管に相当する、または少なくとも近いヒト腎尿細管を３次元ヒドロゲルマトリックスで得られる。
【００２９】
この方法は、ヒト尿細管、またはマウスやラットなど哺乳類尿細管の形成の３次元モニタリングへの使用に適している。
【００３０】
ここで、合成ヒドロゲル中にグリコサミノグリカンおよび／またはペプチドを組み込むことによる腎尿細管の形成に対する、ヒドロゲル剛性の影響および／または酵素により切断可能なペプチド架橋（好ましくはＭＭＰ）でのヒドロゲルの分解の影響の特徴付け、および／またはグリコサミノグリカン（例えばヘパリン）および／またはペプチド（好ましくは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質から誘導されるシグナルペプチド）の存在の影響の特徴付けへの使用が特に有利である。
【００３１】
ここで、化合物を培地に添加すること、または成分をヒドロゲル中に包埋することによる、腎尿細管の形成に対する可溶性分子または作用物質、例えばシグナル伝達分子、特に成長因子の影響の特徴付けを行う方法を使用することができる。
【００３２】
化合物を培地に添加すること、または化合物をヒドロゲル中に包埋することによる、腎尿細管に対する化合物の毒性の分析を行う方法の適用が特に好ましい。
【００３３】
有利には、尿細管形成または腎毒性の検査は、２４ウェル、４８ウェル、または９６ウェルプレートの方法を行うことによって行うことができる。
【００３４】
本発明の形態のさらなる詳細、特徴、および利点は、添付の図面を参照して例示的実施形態の以下の説明から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】エクスビボ腎尿細管アッセイの実験構成を示す図である。
【図２Ａ】培養４週間後の、金属スパチュラ上の初代近位細胞を含むヒドロゲルを示す図である。
【図２Ｂ】様々なヒドロゲル系におけるＨＫ−２細胞の培養における４週間後の腎臓構造の顕微鏡写真を示す図である。
【図３Ａ】細胞培養４週間後のＨＫ−２細胞の極性化を示す顕微鏡写真を示す図である。
【図３Ｂ】細胞培養４週間後の初代ヒト近位尿細管細胞での極性化マーカーの免疫蛍光を示す顕微鏡写真を示す図である。
【図４】アニオン性有機蛍光染料を伴うインキュベーション前と後のヒドロゲル中の腎尿細管の顕微鏡写真、ならびに位相差および蛍光画像を示す図である。
【図５】ＨＫ−２細胞を使用した場合の、シスプラチンを伴う４８時間のインキュベーション後の代謝活性および細胞傷害性を示すグラフである。
【図６】ＨＫ−２細胞を使用した場合の、シスプラチンを伴うまたは伴わないインキュベーション後の腎損傷に関するバイオマーカーＫＩＭ−１の発現を示す顕微鏡写真を示す図である。
【図７】１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いたＨＫ−２細胞の使用時と、１０％パネキシンＮＴＡ血清代替品（ＮＴＡ）を用いたＨＫ−２細胞の使用時とを比較した、尿細管形成の定量化のグラフを示す図である。
【図８】細胞培養３週目にPresto Blueアッセイを用いて測定した、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いたＨＫ−２細胞の培養と１０％パネキシンＮＴＡ血清代替品（ＮＴＡ）を用いた培養との代謝活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
図１に示される方法は、架橋された４アームのポリエチレングリコール（スターＰＥＧ）と、複数のマレイミド基で官能化されたヘパリンとから形成されたヒドロゲルの使用に基づく。そのようなヒドロゲルの形成は、例えば、Tsurkan M.V. et al. Defined Polymer-Peptide Conjugates to Form Cell-Instructive starPEG-Heparin Matrices In Situ. Advanced Materials (2013)に既に記載されている。ヒドロゲルマトリックスの細胞制御による局所分解および再構成を可能にするために、スターＰＥＧを修飾し、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により切断可能なペプチドを含むようにした。ヘパリン−マレイミドとスターＰＥＧは、どちらもリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解される。これら２つの溶液を混合することによって、ヘパリン−マレイミドとチオール末端ＰＥＧ−ペプチド共役体またはチオール末端ＰＥＧとのマイケル付加により、１分未満でヒドロゲルが生じる。ヒト近位尿細管上皮細胞を、ピペットを用いたヘパリン−マレイミド溶液への最初の混入、およびそれに続くヘパリン−マレイミド−細胞混合物とスターＰＥＧ溶液との混合によって、ヒドロゲルに包埋した。
【００３７】
細胞株ＨＫ−２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１９０）のヒト近位腎尿細管上皮細胞を、Biochrom社の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補ってGibco社のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。ＨＫ−２細胞をヒドロゲル中にヒドロゲル当たり５００００細胞で包埋し、４週間培養した。３日ごとに培地を交換した。約３週間後に尿細管の形成が生じた。
【００３８】
図１は、ヘパリン−ペプチド共役体およびＰＥＧ−ペプチド共役体をヒト腎上皮細胞（ＨＫ−２）と混合して、バイオハイブリッドヒドロゲルを形成する様子を概略的に示す。細胞の培養は、尿細管構造が形成されるまで行う。培養４週間後、腎尿細管が既に形成されていた。培養期間全体にわたって、毒性および尿細管形成の検査は、尿細管の発達のどの段階でも行うことができる。
【００３９】
図２Ａは、培養４週間後の、金属スパチュラ上の初代近位尿細管細胞を含むヒドロゲルを示す。安定したディスクを形成するヒドロゲルは、容易に取扱い可能である。
【００４０】
ヒドロゲルは、適切な硫酸化パターンを有するヘパリン、または別のグリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸から作製することもできる。図２Ｂは、ＨＫ−２細胞を含む３つの異なるヒドロゲル系、すなわち分解性ＰＥＧ−ＭＭＰ／ＰＥＧヒドロゲル、非分解性（非切断性）ＰＥＧ／ヘパリンヒドロゲル、および分解性ＰＥＧ−ＭＭＰ／ヘパリンヒドロゲルの顕微鏡写真を示す。ここで、培養の結果を比較した。腎尿細管の形成に関する最良の結果は、分解性ＰＥＧ−ＭＭＰ／ヘパリンヒドロゲルにおいて達成することができた。
【００４１】
これらのヒドロゲルの機械的特性は、２つの材料成分の混合比、すなわちＰＥＧ−ＭＭＰとヘパリンのモル比、すなわち架橋度を調整することによって容易に適合させることができる。これは、モジュール式に調整可能な系を生成し、尿細管形成における系の機械的特性（剛性）を試験することができる。ここで、剛性の変化は、貯蔵弾性率によって表すと、２００Ｐａから６ｋＰａまで可能である。貯蔵弾性率は、好ましくは振動レオメトリによって決定することができる。さらに、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のペプチドをＰＥＧまたはヘパリンに結合させて、尿細管形成に対するそれらの作用を調べることができる。ヘパリンの負電荷を用いて、例えば成長因子またはサイトカインなどの可溶性因子を静電結合することができる。次いで、これらの因子を時間と共に解放して、インビボ環境のダイナミクスをシミュレートすることができる。このようにして、複数の因子について、腎尿細管形成に対するそれらの作用を同時に調べることができた。
【００４２】
ヒト近位尿細管細胞株およびヒト初代近位尿細管細胞の研究を行った。分解性ＰＥＧ−ＭＭＰ／ヘパリンヒドロゲル中の細胞は、インビボヒト近位尿細管の特性に近い解剖学的、生理学的、および機能的特性を有する管状構造を形成した。従来知られているインビトロ法のいずれにおいても、インビトロでは、インビボヒト近位尿細管の直径に近い直径を有するヒト近位尿細管を生成することができなかった。この構造はまた、インビボ近位腎尿細管でも見られた従来の極性化マーカーおよび細胞外マトリックス成分を有する。
【００４３】
上記の従来技術に勝る本発明の利点は以下の点である。
・ヒト細胞系
・尿細管構造が、解剖学的サイズ範囲内にある
・尿細管構造が、インビボと同様に極性化される
・管状構造が機能的である（アニオン性有機分子を輸送する、腎毒性物質に応答する）
・長寿命−少なくとも５週間は培養することができる
・様々な細胞指令信号の影響を調べるために物質を調整できる
・細胞イメージングと染色のための光透過性物質
・患者の初代ヒト細胞を使用した個別化医療への応用可能性
・動物試験の必要性がない
・ヒドロゲルを分解し、定量分析（ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ＩＨＣ）または再移植のために細胞を使用することができる
・高スループットアッセイとして方法を使用することができる
・代謝活性も細胞毒性も容易に定量化することができる
【００４４】
この系の本質的な利点は、ＭＭＰペプチドで切断可能な合成スターＰＥＧ−ＭＭＰ／ヘパリンヒドロゲルにより、エクスビボで腎尿細管を作製する方法を可能にすることである。このバイオハイブリッドヒドロゲルは、組織工学の目的のために尿細管形成を直接制御することができる安定した調整可能な系を提供する。さらに、従来技術による上記の方法のいくつかとは対照的に、この方法は、ヒトの細胞を使用することができ、したがって、ヒトの腎尿細管形成のための直接的なモデルとして適している。このため、動物での腎毒性検査または２Ｄ細胞培養モデルに対する優れた代替となる。また、この方法によって、個別化された毒性試験のために患者の細胞を使用することもできる。
【００４５】
対照的に、従来技術で知られている上記の方法の多くでは、動物細胞もしくは幹細胞からの腎尿細管様構造、またはヒト細胞に由来する構造が産生されるが、これらは、ヒト近位腎尿細管よりも数桁小さく、特徴付けが不十分になることも多い。本発明による方法を用いると、尿細管形成を完全に特徴付けることができ、ここで、尿細管構造は、インビボ近位尿細管において見られる極性化標識および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を含む。本発明による方法は、生理学的サイズ範囲内の直径を有するヒト尿細管様構造を作製する初めての３Ｄ方法である。
【００４６】
この系のさらなる利点は、必要に応じて、コラゲナーゼを添加することによってヒドロゲルを分解することができることである。その後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはフローサイトメトリに関しては蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ：fluorescence-activated cell sorting）など、定量的方法によって尿細管細胞をさらに分析することができる。このようにして、尿細管細胞は、細胞移植のための患者用の細胞源としても使用することができる。
【００４７】
図３Ａは、細胞培養４週間後のＨＫ−２細胞の極性化を示す顕微鏡写真（１００μｍのスケールバー付き）を示す。図３Ｂは、細胞培養４週間後の初代ヒト近位尿細管細胞での極性化マーカーの免疫蛍光を示す顕微鏡写真（１００μｍのスケールバー付き）を示す。矢印は、細胞間の典型的な近接接続を示す。
【００４８】
図４は、アニオン性有機蛍光染料、すなわち蛍光性有機アニオン染料ジリチウム−４−アミノ−Ｎ−［３−（ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，６−ジスルホネート（ルシファーイエローと略記する）を伴うインキュベーション前（上）および後の、ヒドロゲル中の腎尿細管の顕微鏡写真（１００μｍのスケールバー付き）ならびに位相差および蛍光画像を示す。尿細管の機能は、とりわけ有機物質に関する輸送機能によって実証された。この目的のために、尿細管を、図１の例示（ヒドロゲル中でのＨＫ−２細胞の培養）に対応して、（ＭＭＰ感受性ペプチドリンカーを有する）ＰＥＧおよびヘパリンからなるヒドロゲル中で４週間培養し、インキュベーション前の図４の画像に示すように、光学顕微鏡法、すなわち位相差顕微鏡法および共焦点レーザ走査顕微鏡法により特徴付けた。光学顕微鏡法による特徴付け後、細胞培養培地を除去し、１００μＭの蛍光性有機アニオン染料ジリチウム−６−アミノ−２−（ヒドラジンカルボニル）−１，３−ジオキソベンゾ［ジ］イソキノリン−５，８−ジスルホネート（ルシファーイエローと呼ぶ）を含むフェノールレッド無しの培地に置き換えて、１時間インキュベートした。インキュベーション後、上記培地を、染料無しの培地に置き換え、尿細管を共焦点レーザ走査顕微鏡法によって再検査した。ここで、蛍光染料ルシファーイエローを尿細管の内腔で検出することができた。したがって、尿細管の有機アニオントランスポータは機能的に活性である。すなわち、図４に示すように、健康な腎尿細管の重要な機能性が示された。
【実施例】
【００４９】
実施例１
ヒドロゲル作製のためのポリマー開始物質（前駆体）は、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-2610における記載に従って、分子量１５０００ｇ／ｍｏｌの、６つのマレイミド基で官能化されたヘパリン（ＨＥＰ−ＨＭ６）と、総分子量１５５００ｇ／ｍｏｌの、それぞれのアームにおいて酵素により切断可能なペプチド配列で官能化された４アームＰＥＧ（ＰＥＧ−ＭＭＰ）とからなる。ＰＥＧ−ヘパリンヒドロゲルは、以下の変更を加えて、Tsurkan et al., Advanced Materials 2013, vol. 25 (18) pp. 2606-261０に記載されているように作製した。５００００細胞（ＨＫ−２細胞＝ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１９０））を、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中に溶解した１２．５μｌ  ＨＥＰ−ＨＭ６（１２．５μｌに溶解した０．５６ｍｇのＨＥＰ−ＨＭ６）中に混合し、次いでＰＢＳ中に溶解した１２．５μｌ  ＰＥＧ−ＭＭＰ（１２．５μｌに溶解した０．５８ｍｇのＰＥＧ−ＭＭＰ）と混合して、ゲル形成を開始した。固形分は４．４％とし、ゲル成分のモル比は１：１とした。ヒドロゲル中に包埋した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Biochrom）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Gibco）中で４週間培養した。ゲル形成直後およびそれ以降は３日ごとに培地を交換した。驚くべきことに、第３週目から尿細管が形成され、これは光学顕微鏡法によって特徴付けられた。図２Ｂ（右）および図３Ａを参照されたい。得られたヒドロゲルは、ゲル形成後、５５０±２５０Ｐａの範囲内の貯蔵弾性率を有していた。貯蔵弾性率は、プレート直径２５ｍｍのプレート−プレート測定装置を有する回転式レオメータ（ARES LN2；TA Instruments（ドイツ、エシュボルン））を用いて、室温でＰＢＳ中に膨潤したヒドロゲルスライスの振動レオメトリを行うことにより、２５℃で、変形振幅２％を有するせん断周波数範囲１０−１〜１０２ｒａｄ・ｓ−１での周波数依存測定によって決定した。
【００５０】
実施例２
本発明は、腎毒性のためのアッセイとして使用することができる。これは、尿細管構造を腎毒性の化学療法剤シスプラチンを伴ってインキュベートすることによって示すことができた。腎尿細管細胞からのシスプラチン吸収は、細胞死を促し、炎症性サイトカインの産生を増加するシグナル伝達経路を活性化する。炎症性サイトカインは、損傷および細胞死にも関与する。培養４週間後、ＨＫ−２細胞を用いた実施例１と同様に、０〜１００μＭのシスプラチンを含有する無血清培地を用いて尿細管オルガノイドを４８時間インキュベートした。作用物質とのインキュベーション後、図５に示すように、用量依存的な代謝活性減少があった。それとは対照的に、やはり図５に示されるように、シスプラチン投与量が増加するにつれて尿細管の細胞傷害性は増加した。シスプラチンはまた、アポトーシス、すなわち細胞死の増加を引き起こし、これは、カスパーゼ−３の免疫細胞化学で観察することができた。また、図６に示すように、損傷した構造は、損傷を示す腎臓バイオマーカーＫＩＭ１を発現した。このバイオマーカーＫＩＭ１は、損傷した腎臓構造を特徴付けるためにインビボでも使用されるものである。
【００５１】
実施例３
実施例２による方法は、敗血症をモデリングするために、ドキソルビシンなど別の作用物質またはリポ多糖類などの毒素を用いて繰り返すこともできる。尿細管構造は、０〜１００μＭの含量での作用物質ドキソルビシンと共にインキュベートすることができる。代謝および細胞傷害性の測定に関して、図５と同様の結果を予想することができる。したがって、細胞死およびＫＩＭ−１発現も同様に分析することができた。
【００５２】
実施例４
このモデルは、成長因子が腎尿細管形成を促す様子を調べるために使用することもできる。この実施例では、血清中の成長因子の作用を調べた。成長因子を含まない血清代替物であるPAN-Biotech社のパネキシンＮＴＡを、対照血清（対照）、すなわち１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と同じ濃度で培地に添加した。培養期間中、尿細管形成を定量化し、培養３週間後に代謝活性を測定した。図７に示すように、血清中の成長因子の欠如は、尿細管形成を阻害する。図８に示すように、１０％ＦＢＳの添加によって細胞の代謝活性も同様に増加した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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