(57)【要約】  本発明は、心血管疾患のリスクを決定する新規の方法であって、サンプルからＭＭＰ−８およびＣＲＰを検出する段階、および検出されたＭＭＰ−８およびＣＲＰの量をＭＭＰ−８およびＣＲＰの各々のあらかじめ定められた値と比較する段階を含み、上記ＭＭＰ−８およびＣＲＰの上昇されたレベルの検出は、心血管イベントまたは疾患の存在、あるいはリスクを示す方法に関する。本発明はまた、心血管イベントを誘発するリスクを予測するか、血管イベントまたは心血管疾患に対する治療の効果をモニタリングするか、あるいは無症状心血管疾患の存在を検出するためにＭＭＰ−８およびＣＲＰを検出する用途に関する。また、本発明は、ＣＶＤ疾患の存在またはＣＶＤイベントのリスクに対するリスク予測モデルを構築する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患のリスクを決定する方法であって、サンプル中のマトリックスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を検出する工程、および検出されたＭＭＰ−８およびＣＲＰの量をＭＭＰ−８およびＣＲＰの各々のあらかじめ定められた値と比較する工程を含み、ＭＭＰ−８およびＣＲＰのレベルの上昇の検出が心血管疾患の存在を示すか、または心血管疾患イベントもしくは心血管疾患のリスクを示す方法。
【請求項２】
前記ＭＭＰ−８の量がＭＭＰ−８に対するあらかじめ定められた値を超過し、かつ前記ＣＲＰの量がＣＲＰに対するあらかじめ定められた値を超過する場合に、ＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出されたレベルが上昇する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＭＰ−８およびＣＲＰのレベルの上昇の検出が、検出後１年以内に心血管イベントを発症するリスクを予測する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
活性化されたＭＭＰ−８が検出される請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記心血管イベントまたは心血管疾患が、心血管疾患（ＣＶＤ）、狭心症および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）などの冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、高血圧性心臓疾患、リウマチ性心臓疾患、心筋症、心房細動、先天性心疾患、心内膜炎、大動脈瘤ならびに末梢動脈疾患からなるリストより選択され、好ましくは、前記心血管疾患がＣＶＤイベント、またはＡＭＩなどのＣＡＤである請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
心血管イベントまたは心血管疾患に対する治療の効果をモニタリングするために使用される請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
最初またはその後の心血管イベントのリスクを評価するために使用される請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
無症状心血管疾患を検出するために使用される請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが血清、血漿または全血である請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが血清である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＭＭＰ−８の検出が免疫アッセイで行われる請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＲＰの検出が免疫アッセイで行われる請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫アッセイが、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＭＡ、ラテラルフローおよびマイクロ流体に基づくポイント−オブ−ケア（ＰｏＣ）アッセイ、比濁法、ネフェロメトリー、粒子強化比濁法、粒子強化ネフェロメトリーおよびラテックス凝集法からなる群より選択される１つ以上である請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中のＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出に基づき、ＣＶＤ疾患の存在またはＣＶＤイベントのリスクに対するリスク予測モデルを構築する方法。
【請求項１５】
検出後１年以内に心血管イベントを発症するリスクを予測するための、最初またはその後の心血管イベントのリスクを評価するための、心血管疾患の進行または心血管イベントが生じるリスクに対する治療または投薬の有効性をモニタリングするための、または明らかな臨床的症状より前の無症状心血管疾患の存在を検出するためのＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管疾患の予測を改善し、予後を推定する方法を記述する。本発明の方法は、心血管疾患イベントのリスクのある対象と健常対象とを区別するために特に適しているバイオマーカーの同定およびその後の組み合わせに基づく。本明細書において同定されたバイオマーカーはまた、無症状心血管疾患の検出において、また心血管疾患に対する治療または投薬の効果をモニタリングするためにも使用することができる。本発明は、心血管疾患イベントの予後を予測し、推定するための、また心血管疾患イベントに対する治療および投薬の効果をモニタリングするためのマトリックスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）の使用を含む。さらに、ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度測定は、無症状心血管疾患を検出するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患（ＣＶＤｓ）は、心臓または血管に関わる疾患の分類の一つである。世界的に、死亡の主な原因としては心血管疾患が挙げられる。心血管疾患は、狭心症および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）などの冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、高血圧性心臓病、リウマチ性心臓病、心筋症、心房細動、先天性心臓病、心内膜炎、大動脈瘤ならびに末梢動脈疾患のような疾患を含む。
【０００３】
いくつかの独特な病態生理学的機序は、ＣＶＤ発病、進行および経過において、重要な役割を果たす。これらには、炎症、感染、プロトロンビン活性、トロンビン活性、ずり応力および内皮反応性があげられるが、それらに限定されるものではない。ＣＶＤの主な原因の中には、粥状動脈硬化症（atherosclerosis）があり、これは、影響を受けた血管壁内の脂質の蓄積および炎症を特徴とする疾患である。粥状動脈硬化プロセスおよび病理学的進行の過程において、脂肪病変または脂肪線条の蓄積および形成によって影響を受けた動脈壁が厚くなってプラーク（粥腫）が構築される。細胞外脂肪滴およびＩ型コラーゲンが豊富なＥＣＭを有する平滑筋および泡沫細胞コアは、時間が経過するにつれて（線維質）キャップを形成し、特に連続的で持続的な増強された炎症によって影響を受けたときに破裂する傾向がある（Herman et al.2001）。このような過程は、結果的には、有害な心血管イベントまたは転帰の原因となる閉塞および血栓を誘発する。
【０００４】
Ｉ型コラーゲンは、主なタンパク質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分であり、粥状動脈硬化病変における線維質キャップの耐力分子である。コラーゲン分解性マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）中でＭＭＰ−８は、触媒作用でＩ型コラーゲンの分解を開始するのに最も効率的で有能である（Sorsa et al.2006）。
【０００５】
病理学的に上昇されたＭＭＰ−８のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現、生成ならびに血清／血漿レベルが不安定狭心症において見出された。さらに、血清／血漿ＭＭＰ−８と過程との間の連関性、のみならず有害なＣＶＤ転帰の長期的な進行が見出された。上昇された血清ＭＭＰ−８レベルは、ＣＶＤ疾病率増加と関連があり、これを反映することが立証された。細胞培養研究において、ＭＭＰ−８は、保護性線維キャップを薄くし、したがって保護性線維キャップが脆弱になり破裂する、という能力を通して粥状動脈硬化プラーク不安定化に関与している（Herman et al.2001）。ヒト粥状動脈硬化プラークサンプルにおいて、ＭＭＰ−８タンパク質およびｍＲＮＡは、マクロファージと共存する（Molloy et al.2004）。さらに、腹部大動脈瘤は、正常大動脈組職よりも有意に高いＭＭＰ−８濃度を含有する（Wilson et al.2005）。増加されたプラークＭＭＰ−８の活性は、プラークが進行している無症状患者で観察された（Turu et al.2005）。また、破裂されやすいプラークは、より安定した形態を有する病変と比較したとき、免疫反応性ＭＭＰ−８をより多く発現する（Herman et al.2001）。
【０００６】
しかしながら、これまでは、ほんのわずかの研究が、血清ＭＭＰ−８濃度とＣＶＤとの連関性に関してのみなされてきた。少数の参加者を対象とした２件の対照群研究の結果は、心不全および脳虚血を有する患者の血清ＭＭＰ−８濃度が減少するという事実を示唆する（Wilson et al.2005;Lorenzl et al.2003）。最も最近の２つの大規模な研究において血漿ＭＭＰ−８濃度は、ＣＡＤの存在および重症度（Kato et al.2005）ならびに頚動脈プラーク進行（Turu et al.2005）と関連付けられた。Ｔｕｏｍａｉｎｅｎなどの研究（２００７年および２０１４年）は、血清ＭＭＰ−８濃度が一般的または無症状粥状動脈硬化症で上昇され、致命的な結果に関わっているということを示す。血漿ＭＭＰ−８は、代謝症候群の重要な予測因子であることが最近明らかになっており、このような関係は、前炎症性サイトカインｈｓ−ＣＲＰおよびＴＮＦ−αを調節した以降にも継続された（Hoseini et al.2015）。
【０００７】
上昇された全身性ＭＭＰ−８はまた、他の疾患においても重要な役割を果たす。ＥＣＭ処理、および炎症性反応および免疫反応の改変においてのみならず、薬物標的であることにおけるＭＭＰ−８の主な役割は、十分に立証されている。
【０００８】
ＣＲＰは、心血管疾患のリスクがある患者において増加されたレベルで存在することが明らかになった一般的な炎症性マーカーである。最近の研究によると、ＣＲＰの上昇された基底レベルを有する患者は、糖尿病、高血圧およびＣＶＤの増加されたリスクがあると提案されている。ＣＲＰは、粥状動脈硬化症および冠状動脈心臓疾患（ＣＨＤ）の両方のマーカーであると考えられる。
【０００９】
このような医学的および生物学的背景を基にし、有害なＣＶＤ転帰に発展するか、または進行するリスクの高い人々の早期または初期発病および／またはステージ／段階／過程を同定して（ＰｏＣ）−診断する能力は、医療分野および医療産業のみならず、世界的には、健康管理システムにも必須的であり、極めて重要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、血液サンプルからマトリックスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を検出する段階、および検出されたＭＭＰ−８およびＣＲＰの量をＭＭＰ−８およびＣＲＰの各々のあらかじめ定められた値と比較する段階を含み、上昇されたレベルのＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出が、心血管疾患の存在を示すか、または心血管イベント、あるいは心血管疾患のリスクを示す、心血管疾患のリスクを決定する新規な方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、明らかな臨床的症状より前の無症状ＣＶＤ疾患の存在またはＣＶＤイベントのリスクに対するリスク予測モデルを構築するための方法であり、該方法は、サンプルにおけるＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出に基づく。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、好ましくは試験から１年以内に心血管イベントを発症するリスクを予測するための；最初またはその後の心血管イベントのリスクを評価するための；心血管イベントまたは心血管疾患に対する治療の効果をモニタリングするための；または明らかな臨床的症状より前の無症状心血管疾患の存在を検出するためのＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出の使用であった。
【００１３】
本発明の一様態によれば、上昇されたＭＭＰ−８およびＣＲＰレベル検出に基づき、対象は、さらなる検査が受けられるか、さらなる医学的相談を受けることができる。
【００１４】
本発明のさらなる様態によれば、本発明は、最初の心血管イベントまたはその後の心血管イベントが現れる前に患者が心臓病検査を受けられるように、案内するのに役立つであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】高い血清ＣＲＰおよび高いＭＭＰ−８濃度の組み合わせを有する対象（実線）およびその組み合わせを有さない対象（点線）において、１年間追跡観察したときに発生したＣＶＤイベントがない場合の累積生存率。分析は、年齢および性別によって調整されたカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）推定値を使用して実施した。
【図１Ｂ】高い血清ＣＲＰおよび高いＭＭＰ−８濃度の組み合わせを有する対象（実線）およびその組み合わせを有さない対象（点線）において、１年間追跡観察したときに発生したＡＭＩがない場合の累積生存率。分析は、年齢および性別によって調整されたカプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）推定値を使用して実施した。
【図２】ＡＭＩ患者から得られ、時間分解免疫蛍光アッセイ（ＩＦＭＡ）および固相酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定したＭＭＰ−８濃度に対する相関関係データ。このような結果は、散布図に表示される。
【図３Ａ】ＡＭＩまたは狭心症患者および対照対象からの平均ＭＭＰ−８濃度は、ＩＦＭＡで測定された。患者と対照との間のＭＭＰ−８濃度の差は、２つの分析の両方で極めて有意（ｐ＜０．００１）であったが、患者と対照との間の差は、ＥＬＩＳＡよりＩＦＭＡでより大きい。結果は、箱ひげ図として表示される。中心線は、平均を表し、エラーバーは、９５％ＣＩを表す。
【図３Ｂ】ＡＭＩまたは狭心症患者および対照対象からの平均ＭＭＰ−８濃度は、ＥＬＩＳＡで測定された。患者と対照との間のＭＭＰ−８濃度の差は、２つの分析の両方で極めて有意（ｐ＜０．００１）であったが、患者と対照との間の差は、ＥＬＩＳＡよりＩＦＭＡでより大きい。結果は、箱ひげ図として表示される。中心線は、平均を表し、エラーバーは、９５％ＣＩを表す。
【図４Ａ】ＩＦＭＡで測定された狭心症患者またはＡＭＩ患者および対照対象由来のＭＰＰ−８濃度の、ＣＲＰ濃度との相関関係データ。（Ａ）ＩＦＭＡで収得したＭＭＰ−８濃度は、相関係数ｒ０．３１１で統計的に有意（ｐ＝０．００８）に相関した。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＡ（Ｂ）で測定された狭心症患者またはＡＭＩ患者および対照対象由来のＭＰＰ−８濃度の、ＣＲＰ濃度との相関関係データ。ＥＬＩＳＡで収得したＭＭＰ−８濃度は、相関係数ｒ０．３０１で統計的に有意（ｐ＝０．０１１）に相関した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、人体において異なる免疫系統を示す２つの一般に知られている炎症性マーカー、すなわちＭＭＰ−８およびＣＲＰの組み合わせが、心血管疾患のリスクを予測し、心血管疾患の予後を推定し、心血管疾患および心血管イベントのリスクに対する持続的な治療、ならびに投薬の有効性をモニタリングするために使用され得るということを見出した。さらに、ＭＭＰ−８およびＣＲＰは、狭心症、息切れ、疲労感、動悸および軽い眩暈などの明らかな臨床的症状より前の無症状心血管疾患を検出するために使用することができる。
【００１７】
このように、対象の全血、血漿または血清におけるＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度の検出は、たとえば、１）心血管疾患イベントのリスクを決定し；２）明らかな臨床的症状より前の無症状心血管疾患または障害の存在を決定し；３）心血管疾患または障害の予後を推定し；そして４）心血管疾患の進行または心血管イベントが有するリスクに対する治療、あるいは投薬の効果をモニタリングするのに有用である。
【００１８】
ＣＲＰおよびＭＭＰ−８の両方を決定することの組み合わせが有用であると考えられる。ＣＶＤにおいて、粥状動脈硬化破裂過程、内皮機能障害およびインスリン受容体機能障害の発達は、病理学的に過度なＣＲＰ、前炎症性サイトカイン、反応性酸素種およびタンパク質分解の独立的な作用または協同的な作用を含む。これらのメカニズムは、「沈黙の殺人者」とも呼ばれる連続的で持続的な全身性低級炎症を誘発する。低級全身性炎症の一部であるタンパク質分解過程は、ＭＭＰ−８の作用を含み、また最も効果的なＩ型コーラゼナーゼはまた、サイトカイン、ケモカイン、トランフォーミング増殖因子−１、セルピン、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、インスリン受容体、免疫および細胞信号伝達因子などの非マトリックス性生体活性基質を分解することによって、様々な疾患において病的な経路／方向に対する全身性免疫および代謝反応を変形させることができる。
【００１９】
好中球、単核球／マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞および形質細胞をはじめとする様々な細胞によって、ＭＭＰ−８が発現および生産され得るが、これらに限定されるものではない。これら細胞中の多くの数が粥状動脈硬化またはＣＶＤ病変に存在するか、またはこれらに構成される。これら細胞は、ＣＲＰおよび前炎症性メディエータに影響を及ぼして発現し、また病理学的に上昇された全身性ＭＭＰ−８を生成し、これは、全身性低級炎症の必須要素と見なされるのみならず、しばしば検出される。
【００２０】
本発明による心血管疾患は、狭心症および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）などの冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、高血圧性心臓疾患、リウマチ性心臓疾患、心筋症、心房細動、先天性心疾患、心内膜炎、大動脈瘤および末梢動脈疾患のような疾患を含む。本発明の好ましい実施形態において、このような疾患は、ＣＶＤまたは疾患イベント、たとえば、ＡＭＩのようなＣＡＤイベントである。
【００２１】
本発明の一実施形態は、心血管疾患に関わるリスクを決定する方法であって、サンプルからＭＭＰ−８およびＣＲＰを検出する段階、およびＭＭＰ−８、ならびにＣＲＰの量をＭＭＰ−８およびＣＲＰの各々のあらかじめ定められた値と比較する段階を含み、上記ＭＭＰ−８およびＣＲＰの上昇されたレベルの検出は、対象において心血管疾患の存在を示すか、または心血管イベント、あるいは心血管疾患のリスクを示す方法に関する。上昇されたＭＭＰ−８およびＣＲＰレベルの検出に基づき、対象は、さらなる医学的相談またはさらなる検査を受けるように指示することができる。
【００２２】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、心血管疾患を検出し、一次心血管イベントまたは後続心血管イベントのリスクを推定し、明らかな臨床的症状より前の無症状心血管疾患を検出するか、または心血管疾患の進行、あるいは心血管イベントが有するリスクに対する治療または投薬の効果をモニタリングする方法であって、サンプルからＭＭＰ−８およびＣＲＰを検出する段階、および検出されたＭＭＰ−８およびＣＲＰの量をＭＭＰ−８およびＣＲＰの各々のあらかじめ定められた値と比較する段階を含み、上記上昇されたレベルのＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出は、心血管疾患の存在を示すか、または心血管イベント、あるいは心血管疾患のリスクを示す方法に関する。本発明によれば、ＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出されたレベルは、ＭＭＰ−８の量がＭＭＰ−８に対するあらかじめ定められた値以上であり、ＣＲＰの量がＣＲＰに対するあらかじめ定められた値以上である場合に上昇される。
【００２３】
本発明によれば、心血管疾患に関わるリスクを決定する方法において、心血管イベントまたは心血管疾患は、心血管疾患（ＣＶＤ）、狭心症および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）などの冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒症、高血圧性心臓疾患、リウマチ性心臓疾患、心筋症、心房細動、先天性心臓病、心内膜炎、大動脈瘤および末梢動脈疾患からなるリストより選択されることがあり、好ましくは、このような心血管イベントまたは心血管疾患は、ＣＶＤイベントまたはＡＭＩなどのＣＡＤである。
【００２４】
リスク予測モデルは、特定疾患および結果（予後モデル）を有するか（診断モデル）、または開発する確率を推定するために使用され得る。臨床実験において、これらのモデルは、患者に通知して治療管理を案内するのに使用される。ヘンドリクセン（Hendriksen）（2013）などによると、予測モデルが日常的な実験で使用される前に３段階が推奨される。開発段階において、通常的に多変量論理（診断）または生存（予後）回帰分析を利用したモデル開発に重点を置いている。開発されたモデルの性能は、判別、検定および（再）分類で表現される。検証段階において、開発されたモデルは、同一の性能測定を利用する新たな患者セットでテストされる。最後に、適用段階において、実際に患者管理を案内する予測モデルの能力が評価される。本明細書に記述の方法で検出されたＭＭＰ−８およびＣＲＰ値は、ＣＶＤイベントのリスクに対する予測モデルを構成するために使用され得る。
【００２５】
心血管疾患に対する治療には、生活様式の変化、投薬、血管再生、心臓リハビリなどの侵襲性手術、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。
【００２６】
心血管疾患治療剤は、血液を薄くして血液が凝固されることを防止する抗血小板、コレステロールを低下させるアトルバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチンおよびプラバスタチンなどのスタチン、アテノロール、ビソプロロール、メトプロロールおよびネビボロールを含むベータ−遮断剤、硝酸薬、ラミプリルおよびリシノプリルなどのＡＣＥ（アンギオテンシン−転換酵素）抑制剤、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗剤およびカルシウム通路遮断剤、小便を通して過剰の水分と塩分を体外に排出させることによって作用する利尿剤、のみならず、血漿または血清で増加されたＣＲＰとＭＭＰ−８およびＭＭＰ−８レベルを減少させるドキシサイクリン投薬を含む（Payne etal.2011,Kormi et al.2014,Alfakry et al.2016）。本発明の方法はまた、心血管疾患に対するこれらまたは他の治療法の有効性をモニタリングし、治療途中、一次心血管イベントまたはそれ以降も心血管イベントを予測するために使用され得る。上記結果に基づき、患者が治療および投薬手順によって低いＭＭＰ−８およびＣＲＰ値を有し、またＭＭＰ−８およびＣＲＰ値の組み合わせが治療および投薬手順によって低い場合、患者の疾患は、統制下にあり、患者に対するリスクは、低くなる。
【００２７】
ＭＭＰ−８および／またはＣＲＰ濃度、量またはレベルを検出するか、または測定するために使用されるサンプルは、通常、全血、血漿または血清である。ある例において、本発明の方法は、サンプルからマーカーの存在、量またはレベルを検出するか、または決定する前に個体からサンプルを収得する段階をさらに含む。好ましくは、サンプルは、血清または血漿である。
【００２８】
サンプル中のＭＭＰ−８濃度は、当業界に知られている任意の方法を使用して測定することができる。分析は、定性的、半定量的または定量的免疫分析であり得る。本発明による適切な検出方法の非限定的な例としては、ウエスタンブロッティング法、ＩＦＭＡ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＥＭＡ、ラテラルフローアッセイ、ディップスティック分析法、マイクロ流体ポイント−オブ−ケア（ＰｏＣ）アッセイ、表面プラズモン共鳴分析、電気化学的分析または任意の他の知られているリガンド結合または直接検出分析システムを含む。直接検出分析システムまたは技術は、分析のためのリガンド結合に基づかない任意の方法、すなわち、高圧液体クロマトグラフィー［ＨＰＬＣ］またはＳＤＳ−ＰＡＧＥなどのゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などのサイズ排除クロマトグラフィー［ＳＥＣ］；または核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、ＵＶ／ＶＩＳ−分光法、電気噴霧−イオン化（ＥＳＩ）などの分子分光法のような技術を意味する。
【００２９】
本発明の一様態によれば、ＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出は、免疫分析法で実行され得る。より好ましくは、１つ以上の免疫分析法が、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＭＡ、比濁法、混濁法、粒子強化比濁法、粒子強化混濁法、ラテックス凝集、側面流れ分析法および微細流体ＰｏＣ分析法からなる群より選択され得る。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態は、心血管イベントを予測するか、心血管疾患の予後を推定し、心血管疾患の進行および心血管イベントが有するリスクに対する治療または投薬の有効性をモニタリングし、明らかな臨床的症状以前に無症状心血管疾患を検出する方法であって、上記ＣＲＰは、たとえば、約２．５ｍｇ／ｌのカット−オフ値を適用するラテックス免疫分析法ＣＲＰ１６によってテストされ、ＭＭＰ−８は、約５５ｎｇ／ｍｌのカット−オフ値を適用する時間−分割免疫蛍光分析法によってテストされる方法である。
【００３１】
他に明示されない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される用語は、診断分野で一般に使用される意味を有する。特に、下記用語は、以下に指示された意味を有する。
【００３２】
用語「無症状疾患の検出」または「無症状障害の検出」は、明らかな臨床的症状、すなわち疾患または障害の診断以前に無症状疾患の存在を確認するか、または測定することを意味するものと理解されるべきである。用語「無症状疾患」は、臨床的検出表面下にとどまっている疾病を意味するものと理解されるべきである。無症状疾患は、認知可能な臨床的所見を有しない。これは、認知可能な兆候および症状を有する臨床的疾患とは異なる。ＣＶＤ、糖尿病、甲状腺機能低下症およびリウマチ性関節炎を含む多くの疾患は、臨床的疾患として浮上される前には、頻繁に無症状である。
【００３３】
用語「陽性」および「陰性」は、被験物質、すなわちＭＭＰ−８またはＣＲＰのサンプル中の濃度が、それぞれあらかじめ定められた値（基準線、閾値または参照濃度）より超過（高いまたは陽性）および未満（低いまたは陰性）であることを指す。
【００３４】
サンプルにおいて分析物に対する「あらかじめ定められた値」は、正常個体においてサンプル中の分析物の基準濃度または閾値濃度を指し；上記サンプル中の分析物の値が上記あらかじめ定められた値を超過する場合、テスト結果は、陽性である。サンプル中の分析物に対するあらかじめ定められた値は、分析フォーマットおよび分析に使用された特定試薬（たとえば、使用された特定抗体）に応じて変わり得るが、当業者は、知られている量の分析物を含む対照群サンプルに対する正常個体におけるサンプル中の分析物の濃度を推定することによって決定し、設定することができる。
【００３５】
「連続変数」とは、最小値と最大値の間の任意の値を取り得る変数を指す。
【００３６】
「活性ＭＭＰ−８」とは、その先駆体形態または前駆体形態とは異なる活性タンパク質分解酵素の異なる形態を指す。
【００３７】
「ＭＭＰ−８活性化」とは、ＭＭＰ−８の予備形成体を活性／活性化された、すなわち触媒的に有能なＭＭＰ−８で形質転換および／または転換させる生物学的または生化学的過程を指す。本発明の好ましい一実施形態によれば、活性化されたＭＭＰ−８が検出される。
【００３８】
本発明者らは、活性ＭＭＰ−８の高分子量種の代わりに、より小さいＭＭＰ−８の断片を検出することによって、活性ＭＭＰ−８の検出を向上させ得るということを以前に見出した（ＷＯ２０１５／１２８５４９）。
【００３９】
本発明の実施形態はまた、コンピュータシステムがＭＭＰ−８およびＣＲＰの決定に基づき、個々人が心血管疾患またはイベントを進化させることに関わるリスクを有しているかの可否を決定する方法を実行させるシステムおよびコンピュータ読取可能媒体を提供する。
【００４０】
特に本発明は、さらに生物学的サンプルを分析するためのシステムに関し、上記システムは、
ａ）生物学的サンプルを受信し、
ＭＭＰ−８およびＣＲＰを決定するように構成された決定モジュール；および／または
ｂ）ＭＭＰ−８およびＣＲＰ値を含むテスト結果情報；
ｃ）上記決定モジュールからの情報を貯蔵するように構成された貯蔵装置；
ｄ）上記貯蔵装置上に貯蔵されたテスト結果情報を基準データと比較し、比較結果を提供するように適用された比較モジュールであって、上記比較結果が基準サンプル／下記対象または患者群から誘導される、所定レベルから誘導される、比較モジュール；
現在正常レベルのＭＭＰ−８を有していることで知られていることによって、生物学的サンプルおよび参照サンプルに対する類似した結果が現在疾患または疾患イベントを有していないか、疾患にかかる傾向のない対象を示すか、または疾患、あるいは疾患イベントが発生するか、疾患が進行するリスクを有していないか、または有する傾向のない対象を示すことで知られている対象、または患者群；および／または
疾患を有しているか、または疾患にかかりやすいことで知られていることによって、生物学的サンプルおよび参照サンプルに対する類似した結果が疾患または疾患のイベントを有しているか、疾患または疾患のイベントにかかりやすい対象を示すか、または疾患、あるいは疾患のイベントが発生するか、疾患が進行するリスクを有しているか、有しやすい対象を示すことで知られている対象、または患者群；および
ｅ）ユーザに対する比較結果に部分的に基づくコンテンツをディスプレイするためのディスプレイモジュールであって、上記コンテンツが現在疾患を有しているか、心血管疾患にかかりやすい対象または疾患、あるいは疾患イベントが発生するか、疾患が進行する増加されたリスクを有しているか、または有しやすい対象を示す信号である、ディスプレイモジュールを含む。
【００４１】
実施例
下記実施例は、単に本発明の様々な実施形態を例示するための目的で提供されており、決して本発明を限定するものではない。当業者は、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明が、本発明の目的を実行し、上記で言及された結果および利点を得るのに適合されていることが容易に認知できるであろう。
【００４２】
母集団に基づくサンプル
ＦＩＮＲＩＳＫ９７は、フィンランドの５つの地理的領域で実施された２５歳〜７４歳の調査参加者８４４６人の母集団に基づくサンプルを含んでいた（Borodulin et al.2015）。本アンケート調査には、自体管理アンケートおよび体重、身長、および血圧測定値のみならず、血液採取に対する臨床検査が含まれていた。本研究は、国立保健院（National Public Health Institute）の倫理委員会の承認が得られ、ヘルシンキ宣言にしたがって実施された。
【００４３】
実験室分析
血液サンプリングの前に、参加者らは、４時間断食し、一日中予想より早い時間に重い食事を避けるように要請を受けた。平均断食時間は、５（ＩＱＲ  ２）時間であった。超高感度なＣＲＰの測定は、２００５年ヘルシンキに所在した国立保健福祉部疾病リスク管理局（the Disease Risk Unit in the National Institute for Health and Welfare）でＡｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｃ８０００分析器（アボットラボラトリーズ社製、アボット  パーク、ＩＬ、ＵＳＡ）上でラテックス免疫分析法を利用して凍結血清サンプル（−７０℃）から実施した。ＭＭＰ−８濃度を、製造会社の指針にしたがってＩＦＭＡ（メディックス  バイオケミカ社製、エスポー、フィンランド共和国）によって測定した。
【００４４】
ＩＦＭＡを利用したＭＭＰ−８分析
ＭＭＰ−８  ＩＦＭＡは、ヒトＭＭＰ−８を測定するための定量的酵素免疫分析法である。このようなサンドイッチ分析は、ヒトＭＭＰ−８に対する２つの単一クローン抗体を使用する。抗体１４９１−Ｅ６−Ｆ７および１４９２−Ｂ３−Ｃ１１（メディックス  バイオケミカ社製、エスポー、フィンランド共和国）を捕獲抗体および追跡抗体として各々使用した。マイクロウェルプレートを、ＭＭＰ−８に対する単一クローン抗体でコーティングした。ＭＭＰ−８の存在を検出するために使用される酵素接合体を形成するＨＲＰに他の抗体を接合した。分析を実行するために、８０μｌの分析バッファおよび２０μｌの標準物、対照群およびサンプルをプレートの適切なウェルに添加した。プレートを水平振盪器上で室温で１時間インキュベートした。標準中のＭＭＰ−８、対照群、およびサンプル中に存在する場合、マイクロウェルに結合した。結合されない物質を除去するため、ウェルを５回洗浄した。このような洗浄段階後に、１００μｌの酵素接合体をすべてのウェルに添加した。プレートを水平振盪器上で１時間、再びインキュベートした後、上記のように洗浄した。その後、１００μｌのＡＢＴＳ酵素基質をウェルに添加した。プレートを上記のように１５分間振盪させた。５０μｌの酸性停止溶液を添加して反応を終結させた。溶液を混合するため、プレートを穏やかに振盪させた。マイクロプレートリーダ（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、バンター（Vantaa）、フィンランド共和国）を使用して４１４ｎｍでウェル内の溶液吸光度を測定した。対照群およびサンプルの濃度を生成された標準曲線から収得した。
【００４５】
ＥＬＩＳＡ（アマシャム社製）を利用したＭＭＰ−８分析
ＥＬＩＳＡは、サンドイッチ原理を基盤に直ちに使用できる固相酵素結合免疫吸着測定法である。１００μｌのサンプル（１：４希釈液）および標準物をヒトＭＭＰ−８を認識する抗体でコーティングされたマイクロタイタ（microtiter）ウェル内で室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを４回洗浄した。捕獲されたヒトＭＭＰ−８に結合するであろう１００μｌのビオチン化追跡抗体を添加した。インキュベーション１時間後、ウェルを４回洗浄した。次いで、１００μｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体を添加し、ビオチン化トレーサ抗体に結合させる。インキュベーション１時間後、ウェルを再び洗浄した。１００μｌのＴＭＢ溶液を添加すると、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ接合体が基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と反応するであろう。３０分間、インキュベートした後、１００μｌのシュウ酸を添加し、培養を停止させた。分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、バンター、フィンランド共和国）を使用し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準物と同時に実行するサンプルのヒトＭＭＰ−８濃度は、標準曲線から測定することができる。
【００４６】
ｈｓＣＲＰ解析
ｈｓＣＲＰ分析は、文献（Salomaa et al.2010）に記述されているように、ラテックス免疫分析法ＣＲＰ１６（アボット社製、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｃ８０００）を使用して実行した。
【００４７】
統計
後続措置として国立病院死亡原因記録簿および国立病院退院記録簿の記録連携を通じて１年以内に次の項目を確認した：心血管疾患（ＣＶＤ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（発病率が低いため、５年間実行）、およびがん（非黒色腫皮膚がんを除く）。分析を、基準線で各々ＣＶＤ、ＩＢＤ、またはがんにかかっていない７４４８人、７８９３人、または８２７６人の対象に対して実行した。
【００４８】
偶発性疾患またはイベントの有無にかかわらず、対象の間で血清ＣＲＰおよびＭＭＰ−８濃度の差に対する統計的有意性をｔ−検定で分析した。分析前に、非対称分布を有する値は、対数変換によって正規化された。ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度を考慮した偶発性疾患に対する生存データは、年齢および性別によって調整されたコックス比例ハザードモデルを使用して分析された。リスクは、ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度の百分位点数で推定しており、５０番目の百分位点数をカット−オフ値として選択し、すなわち、基準範囲は、ＭＭＰ−８またはＣＲＰ値を有する人、あるいは５０番目の百分位点数未満の値を有する人であった。したがって、結果は、基準範囲と比較したとき、閾値をすべて超過するＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度を有する対象に対して計算された。統計分析は、ＳＰＳＳ  ２２．０（ＩＢＭ  Ｃｏｒｐ．２０１３，ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓバージョン２２．０，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ：ＩＢＭ社）を使用して実行された。
【００４９】
実施例１．対象においてＣＶＤおよびＡＭＩに関わる血清ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度
基準線でＣＶＤを発症していない対象において、血清ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度の濃度レベル測定が実行されており、これらの濃度とＣＶＤまたはＡＭＩを発症する可能性との連関性は、上述されているように、１年の追跡調査で決定された。その結果、血清ＣＲＰおよびＭＭＰ−８濃度合計（各々の閾値／平均値より両方とも高い）が、ＡＭＩまたは任意のＣＶＤイベントを経験した人の方が、いずれも経験していない人と比較してより高かったことが示された。これらの群の間のこのような組み合わせの差は、有意であった（表１および表２）。表１に示すように、ＣＶＤを発症した対象の平均濃度合計は、１．９７であった反面、ＣＶＤを発症しなかった対象の平均濃度合計は、１．５５であった（ｐ＜０．００１）。ＭＭＰ−８の平均濃度は、単独では有意ではなかった反面、ＣＲＰ濃度は、ＣＶＤ（ｐ＜０．００１）対して単独で考慮したときにも有意であった。表２において、ＡＭＩを発症した対象の平均濃度合計は、２．０７であった反面、ＡＭＩを発症した対象の平均濃度合計は、１．５５であった（ｐ＝０．００１）ことが示されている。ＭＭＰ−８またはＣＲＰの平均濃度は、いずれもＡＭＩにおいて単独では有意ではなかった。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
【表２】
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【００５２】
表３は、低い（平均未満または負数）値と比較したときの高い（平均超過または正数）ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度値から計算された偶発性ＣＶＤイベントに対するハザード比（ＨＲ）を示し、ここで参照群（平均未満または負数）のＨＲを１に設定した。すべてのＭＭＰ−８、ＣＲＰまたはこれらの組み合わせが平均を超過する値を有する場合、ＨＲは、１より高いことで示された。ＨＲは、ＣＲＰおよびＭＭＰ−８（値）の組み合わせが単独値より高かった。高い（５０パーセンタイル超）ＣＲＰおよび高いＭＭＰ−８濃度の組み合わせは、これらバイオマーカー単独の高い濃度よりも高いＨＲを示す傾向があった。組み合わせの結果は、リスク予測において統計的有意性を示しており、ｐ値は、各々ＣＶＤの場合０．０１１、ＡＭＩの場合、０．０４３であった。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、ＣＶＤイベントまたはＡＭＩがない累積生存率は、ＭＭＰ−８またはＣＲＰ、あるいはＭＭＰ−８およびＣＲＰの両方が５０パーセンタイル未満である対象（０で表示）と比較したとき、ＣＲＰおよびＭＭＰ−８の両方が５０パーセンタイル超の対象（１．０で表示）の場合に示される。本図は、ＣＲＰとＭＭＰ−８の両方が５０パーセンタイル超である対象のリスクがより高いことを示す。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
実施例２．炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびがんに関わる血清ＭＭＰ−８およびＣＲＰ濃度
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、大腸および小腸の炎症性状態の部類である。クローン病および潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患の主な類型である。ＩＢＤは、罹患患者においてＣＲＰが担うことのできる様々な役割により、増加されたＣＲＰと有意に連関することが以前に示された（Henriksen et al.2008）。炎症性マーカーとして、ＣＲＰは、ＩＢＤの存在、重症度および治療法の側面でＩＢＤを予測、モニタリングおよび評価するのに役立つ。
【００５５】
たとえば、デンマーク研究者らは、高い血液レベルのＣＲＰを有する人々が低いＣＲＰレベルを有する人々と比較したとき、晩年にがんの発症のリスクが３０％以上高く、肺がんおよび場合によっては大腸がんのがんの発病のリスクと関係したことを示した（Cancer.Net,ASCO's Patient Web site）。研究者らはまた、がんにかかった人々の中でその診断前にＣＲＰレベルが高かった人々は、上昇されたレベルのＣＲＰを有さなかった人々よりも早く死亡する確率が８０％以上高いことを明らかにした。
【００５６】
したがって、従来の研究は、ＣＲＰとＩＢＤ、およびＣＲＰとがんとの間の連関性を提示している。本発明者らは、ＭＭＰ−８濃度および／またはＭＭＰ−８濃度とＣＲＰ濃度との合計が、このような疾患に関する指標または予測マーカーとして使用できるかの可否を研究したかった。本研究（表４）において、平均ＣＲＰまたはＭＭＰ−８濃度は、偶発性ＩＢＤを発症した対象と発症しなかった対象との間においては有意な差がなかったが、これらマーカーの合計は、有意であった。これら合計は、また偶発性がんを発症した対象において、そうでない対象よりも高く、この違いは、より高いＣＲＰレベルに起因する。がんの場合、単に平均ＣＲＰ濃度のみが有意であった。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
また、１年間の追跡調査でこれらバイオマーカーと偶発性がんとの関係を調査した。この場合、ＣＲＰおよびＭＭＰ−８濃度は、がんを発症しなかった対象に比べて偶発性がんを発症した対象において個別的におよび組み合わせで有意に高いことが示された（表５）。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
高いＭＭＰ−８濃度は、単独でも偶発性がん発症のリスクに有意に関連した。しかしながら、高い（５０パーセンタイル超）ＣＲＰおよび高い（５０パーセンタイル超）ＭＭＰ−８濃度を合わせると、ＭＭＰ−８単独で得られた予測に比べて偶発性ＩＢＤまたはがんの予測が向上されなかった（表６）。マーカーも、それらの合計もＩＢＤのリスクと関連がなかった。
【００６１】
【表６】
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【００６２】
実施例３．ＩＦＭＡまたはＥＬＩＳＡによって測定されたＭＭＰ−８濃度に対する相関関係データ
異なる抗体らの間の変化およびＭＭＰ−８、ならびにＭＭＰ−８の活性化された部分を検出するために使用される分野で知られている方法を知り、本発明者らは、収得された相関関係データがＭＭＰ−８濃度を測定するために使用される分析法に依存しているかの可否を研究したかった。ＭＭＰ−８濃度測定は、異なるＭＭＰ−８抗体を使用して上述したように、ＩＦＭＡおよびＥＬＩＳＡによって実行した。測定を、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）および対照群として入院した患者（３４３人の患者）を対象に実施した（Pussinen et al.2013）。対照群は、年齢±２年、性別、および地域が一致した。包含基準は下記の通りである：過去４週間以内に確定されたか、疑われるＣＨＤまたは脳卒中の履歴がまったくなく、手術または化学療法治療がまったくなかった。彼らは、狭心症、すなわち運動に関わり、休息で安静を取る任意の場所での胸痛の陽性履歴がなかった。彼らのうち誰も、糖尿病、高血圧、または異常脂質血症に対する投薬を受けていなかった。
【００６３】
その結果が、以下表７および散布図（図２）の両方に示されている。平均ＭＭＰ−８濃度レベルをＩＦＭＡおよびＥＬＩＳＡで測定した場合、両方の分析において患者と対照群の間のＭＭＰ−８レベルの差は、極めて有意であった（ｐ＜０．００１）。狭心症またはＡＭＩ患者と対照群の間の差は、ＥＬＩＳＡよりＩＦＭＡでより大きかった（図３および表８）。
【００６４】
【表７】
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【００６５】
【表８】
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【００６６】
ＭＭＰ−８濃度は、狭心症またはＡＭＩ患者および対照群患者からＩＦＭＡ（図４ａ）およびＥＬＩＳＡ（図４ｂ）によって測定し、収得された濃度は、ＣＲＰ濃度と相関関係があった。（Ａ）ＩＦＭＡで測定したＭＭＰ−８濃度は、相関係数ｒ０．３１１（ｐ＝０．００８）と統計的に有意な相関関係があった反面、（Ｂ）ＥＬＩＳＡで測定したＭＭＰ−８濃度は、ＣＲＰ濃度に対して相関係数ｒ０．３０１（ｐ＝０．０１１）と統計的に有意な相関関係があるということを見せてくれた（図４）。したがって、相関関係は、テスト類型に独立的であることを示す。ＩＦＭＡまたはＥＬＩＳＡで測定した（標準偏差を有する）平均ＭＭＰ−８濃度が、以下の表９に提示されている。
【００６７】
【表９】
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【００６８】
参考文献
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2019535012.tif 000012
2019535012.tif 000013
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月30日(2019.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患のリスクを決定する方法であって、サンプル中のマトリックスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）およびＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）を検出する工程、および検出されたＭＭＰ−８およびＣＲＰの量をＭＭＰ−８およびＣＲＰの各々のあらかじめ定められた値と比較する工程を含み、ＭＭＰ−８およびＣＲＰのレベルの上昇の検出が心血管疾患の存在を示すか、または心血管疾患イベントもしくは心血管疾患のリスクを示す方法。
【請求項２】
前記ＭＭＰ−８の量がＭＭＰ−８に対するあらかじめ定められた値を超過し、かつ前記ＣＲＰの量がＣＲＰに対するあらかじめ定められた値を超過する場合に、ＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出されたレベルが上昇する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＭＰ−８およびＣＲＰのレベルの上昇の検出が、検出後１年以内に心血管イベントを発症するリスクを予測する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
活性化されたＭＭＰ−８が検出される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記心血管イベントまたは心血管疾患が、心血管疾患（ＣＶＤ）、狭心症および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）などの冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、高血圧性心臓疾患、リウマチ性心臓疾患、心筋症、心房細動、先天性心疾患、心内膜炎、大動脈瘤ならびに末梢動脈疾患からなるリストより選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
心血管イベントまたは心血管疾患に対する治療の効果をモニタリングするために使用される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
最初またはその後の心血管イベントのリスクを評価するために使用される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
無症状心血管疾患を検出するために使用される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サンプルが血清、血漿または全血である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが血清である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＭＭＰ−８の検出が免疫アッセイで行われる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＲＰの検出が免疫アッセイで行われる請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫アッセイが、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＭＡ、ラテラルフローおよびマイクロ流体に基づくポイント−オブ−ケア（ＰｏＣ）アッセイ、比濁法、ネフェロメトリー、粒子強化比濁法、粒子強化ネフェロメトリーおよびラテックス凝集法からなる群より選択される１つ以上である請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中のＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出に基づき、ＣＶＤ疾患の存在またはＣＶＤイベントのリスクに対するリスク予測モデルを構築する方法。
【請求項１５】
検出後１年以内に心血管イベントを発症するリスクを予測するための、最初またはその後の心血管イベントのリスクを評価するための、心血管疾患の進行または心血管イベントが生じるリスクに対する治療または投薬の有効性をモニタリングするための、または明らかな臨床的症状より前の無症状心血管疾患の存在を検出するためのＭＭＰ−８およびＣＲＰの検出の使用。
【国際調査報告】
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