(57)【要約】  本発明は、哺乳動物細胞において機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である核酸分子に関する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含む発現ベクターと宿主細胞にも関する。そのような発現ベクターは、組換えタンパク質（例えば、抗体およびレンチウイルスのポリペプチド）を生産するために使用されてもよい。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第１のポリヌクレオチド、または当該第１のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第２のポリヌクレオチド、または当該第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；
を含む核酸分子であって、（ａ）と（ｂ）が、５’−３’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、核酸分子。
【請求項２】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列のうちの１つに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子が、
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；
を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が、
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第３のポリヌクレオチド、または当該第３のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；
をさらに含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、この順番で５’−３’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、
先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記第３のポリヌクレオチドが、配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるヌクレオチド配列のうちの１つに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチド；
を含み、
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、この順番で５’−３’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、
先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が、誘導性エレメント、好ましくは抑制可能であるエレメントまたは活性化可能であるエレメント、をさらに含む、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項９】
哺乳動物細胞が、マウス、ラット、ハムスター、サルまたはヒトの細胞である、先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターが、アデノウイルスベクター、ｐＳＶまたはｐＣＭＶのプラスミドベクター、ワクシニアまたはレトロウイルスのベクター、バキュロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、である、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記核酸分子が、異種ポリヌクレオチドに機能可能に連結されている、請求項１０または請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、哺乳動物宿主細胞。
【請求項１４】
そのゲノムが、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、哺乳動物。
【請求項１５】
必要に応じて
（ｉ）ヘルパープラスミド；
（ｉｉ）ウイルスゲノムプラスミド；
（ｉｉｉ）緩衝液；
（ｉｖ）制限酵素；
（ｖ）トランスフェクション培地；および
（ｖｉ）哺乳動物細胞
からなる群より選択される１つ以上の追加の構成要素と共に、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクターおよび／または請求項１３に記載の宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞において機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である核酸分子に関する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含む発現ベクターと宿主細胞にも関する。そのような発現ベクターは、組換えタンパク質（例えば、抗体およびレンチウイルスのポリペプチド）を生産するために使用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の転写が起こるためには、ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子プロモーターに結合し、転写を開始しなければならない。一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩは、リボソームＲＮＡをコードする遺伝子を転写し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、メッセンジャーＲＮＡ、いくつかの低分子核内ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡをコードする遺伝子を転写するが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、トランスファーＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡをコードする遺伝子を転写する。
【０００３】
転写は、いつ転写が起こるか、およびどのくらいのＲＮＡが生成されるか、を制御するために調節される。ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写は、少なくとも５つのメカニズムによって調節され得る：
（ｉ）特異性因子は、所与のプロモーターまたはプロモーターのセットに対するＲＮＡポリメラーゼの特異性を変化させ、それらに結合する可能性を高くするか低くする（例えば、原核生物の転写において使用されるシグマ因子）。
（ｉｉ）リプレッサーは、オペレーター（プロモーター領域に近接するかプロモーター領域と重なっているＤＮＡ鎖上のコード配列）に結合し、鎖に沿ったＲＮＡポリメラーゼの進行を妨げ、従って、遺伝子の発現を妨げる。
（ｉｉｉ）転写因子は、タンパク質コード配列の開始点にＲＮＡポリメラーゼを配置し、次いで、ｍＲＮＡを転写するためにポリメラーゼを解放する。
（ｉｖ）アクチベーターは、ＲＮＡポリメラーゼと特定のプロモーターとの間の相互作用を増強し、遺伝子の発現を促進する。エンハンサーは、ＤＮＡを輪にして特定のプロモーターを開始複合体に導くためにアクチベーターによって結合されるＤＮＡヘリックス上の部位である。
（ｖ）サイレンサーは、特定の転写因子が結合すると、遺伝子の発現をサイレンスすることができるＤＮＡ配列の領域である。
【０００４】
典型的な哺乳動物のプロモーターは、基本転写装置が結合する５０〜１００塩基対のコア領域と、１種以上の転写アクチベータータンパク質（トランスアクチベーター）が結合し得るエンハンサー領域と、からなる。エンハンサーに結合することができるトランスアクチベーターの数とタイプは、どの特異的結合部位が存在するかに依存する。開始速度は、プロモーターのエンハンサーに実際に結合しているトランスアクチベーターの数とタイプによって決まる。エンハンサーに加えて、異なる転写因子が結合すると遺伝子発現を低下させるサイレンサーが存在する。
【０００５】
コアプロモーターは、様々な異なるエレメントから構成され、これらには、標準的なものと非標準的なものという２つのカテゴリーが存在する。標準的なコアプロモーターエレメントには、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター（Ｉｎｒ）、ＴＦＩＩＢ認識エレメント（ＢＲＥ）、下流プロモーターエレメント（ＤＰＥ）および下流コアエレメント（ＤＣＥ）が包含される。これらのエレメントは、全てではないが多くのタンパク質コード遺伝子のコアプロモーターの中に見出され得る。ＴＡＴＡボックス（配列ＴＡＴＡＡ）は通常、転写開始点（ＴＳＳ）の２０〜３０ｂｐ上流に見出され、ＴＦＩＩＤ基本転写因子の結合部位として働く。Ｉｎｒエレメント（コンセンサス配列ＹＹＡＮＴ／ＡＹＹ）が存在する場合、これは、コンセンサスの最初のＡが転写物の最初の塩基となるようにＴＳＳを包含する。ＢＲＥエレメントは、ＴＡＴＡボックスの上流（ＢＲＥｕ  コンセンサス  Ｇ／Ｃ  Ｇ／Ｃ  Ｇ／Ａ  ＣＧＣＣ）または下流（ＢＲＥｄ  コンセンサス  Ｇ／Ａ  Ｔ  Ｔ／Ａ  Ｔ／Ｇ  Ｔ／Ｇ  Ｔ／Ｇ  Ｔ／Ｇ）の両方に見出され得る。技術的には標準的なコアプロモーターエレメントではないが、ＣＣＡＡＴボックス（ＴＳＳの５０〜１００ｂｐ上流に位置する）は、このカテゴリーに包含されることが多い。ＣＣＡＡＴボックスはまた、基本転写因子（ＴＦ）の結合にも寄与する。
【０００６】
非標準的なコアプロモーターエレメントには、ＣｐＧアイランド、ＡＴＧデザート（ATG desert）および転写開始プラットフォーム（ＴＩＰ）が包含される。ＣｐＧアイランドは、一般的に、比較的高い割合のＣｐＧジヌクレオチドを含むＤＮＡのストレッチ５００〜２０００ｂｐに及ぶ。ＣｐＧジヌクレオチドは通常、Ｃ残基上でメチル化されて転写を減少させるが、ＣｐＧアイランド内では、それらはメチル化されないままであり、転写を促進する。ＡＴＧデザートは、周囲の領域よりもＡＴＧトリヌクレオチドの頻度が低いＤＮＡの領域である。それらは、ＴＳＳの上流と下流の約１０００ｂｐに及び、一般的に、ＴＡＴＡボックスを含まないプロモーターを伴う。
【０００７】
強力なプロモーターは、高い頻度で転写を開始するプロモーターであり、非常に有用なツールとなり得る。例えば生化学では、強力なプロモーターを、転写プロセスを研究するために、または組換えタンパク質の生産を駆動するために、用いることができる。強力なプロモーターはまた、遺伝学においても有用である。例えば、強力なプロモーターを、遺伝子のノックダウンのためのｓｈＲＮＡの発現を駆動するために、またはタンパク質の機能を推定するためのｃＤＮＡの過剰発現のために、用いることができる。
【０００８】
特に強力なプロモーターはまた、医学的用途を有する可能性もある。例えば、組換えウイルスワクチンにおいて、より高い抗原の発現は、より良好な免疫応答をもたらす。
【発明の概要】
【０００９】
哺乳動物系において使用される最も強力なプロモーターは、一般的に、恒常的に発現される細胞遺伝子に由来するか、あるいはウイルス遺伝子に由来する。しかし、付随する遺伝子の発現レベルに関して最も強力であるプロモーターは、最も細胞型に依存するプロモーターである（すなわち、それらが機能するであろう細胞のタイプが限られている）ことが多い。
【００１０】
従って、本発明の目的は、高いレベルで、および／または様々な哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である核酸分子を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供することである。そのような発現ベクターは、組換えポリペプチド（例えば、抗体およびレンチウイルスのポリペプチド）を高いレベルで生産するために使用されてもよい。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第１のポリヌクレオチド、または当該第１のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第２のポリヌクレオチド、または当該第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；
を含む核酸分子であって、（ａ）と（ｂ）が、この順番で５’−３’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、核酸分子を提供する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターであって、核酸分子が異種ポリヌクレオチドに機能可能に連結されている、発現ベクターを提供する。
【００１５】
本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞も提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の発現ベクターを含むキットも提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一部の実施形態において、核酸分子は、単離された核酸分子である。本発明の核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能であり、すなわち、プロモーターとして働いている。一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、恒常的プロモーターとして働く。
【００１８】
本発明の核酸分子は、（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドを含む。配列番号１〜３の配列は、添付の「配列」のセクションに提示されている。第１のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列のうちの１つに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。最も好ましくは、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を有する。
【００１９】
本発明の核酸分子は、代替的に、第１のポリヌクレオチドの機能的フラグメントを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「当該第１のポリヌクレオチドの機能的フラグメント」なる用語は、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの発現の促進において、完全な第１のポリヌクレオチドの活性の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％）を保持する、第１のポリヌクレオチドの一部を指す。核酸配列のプロモーター活性を測定および比較するための方法は、以下で説明されるように、当技術分野において周知である。
【００２０】
好ましくは、第１のポリヌクレオチドの機能的フラグメントは、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。
【００２１】
本発明の核酸分子はまた、（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第２のポリヌクレオチド、または当該第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメント、を含む。配列番号４の配列は、添付の「配列」のセクションに提示されている。好ましくは、第２のポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列に対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。最も好ましくは、第２のポリヌクレオチドは、配列番号４のポリヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
本発明の核酸分子は、代替的に、第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメントを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「当該第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメント」なる用語は、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの発現の促進において、完全な第２のポリヌクレオチドの活性の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％）を保持する、第２のポリヌクレオチドの一部を指す。核酸配列のプロモーター活性を測定および比較するための方法は、以下で説明されるように、当技術分野において周知である。好ましくは、第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメントは、配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。
【００２３】
配列番号４は、転写開始点（ＴＳＳ）を含む。その＋１の部位（すなわち、転写される一番目の塩基）は、配列ＴＣＡＧＡＴＣ中の一番目のＴである。これは、配列番号４の３’末端に出現する。ＴＳＳの下流のあらゆるものがＲＮＡに転写されることになる。
【００２４】
従って、第２のポリヌクレオチドまたはその機能的フラグメントは配列ＴＣＡＧＡＴＣを含むことが好ましい。
【００２５】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）と（ｂ）は、５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００２６】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）と（ｂ）は、この順番で隣接して５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００２７】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）と（ｂ）は、この順番で隣接して５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００２８】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）と（ｂ）は、この順番で隣接して５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００２９】
本発明はまた、
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第１のポリヌクレオチド、または当該第１のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第２のポリヌクレオチド、または当該第２のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；および
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるヌクレオチド配列に対する少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する第３のポリヌクレオチド、または当該第３のポリヌクレオチドの機能的フラグメント；
を含む核酸分子であって、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、この順番で５’−３’に連結されており、前記核酸分子が、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である、核酸分子も提供する。
【００３０】
配列番号５〜７の配列は、添付の「配列」のセクションに提示されている。
【００３１】
第３のポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるヌクレオチド配列のうちの１つに対する少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。最も好ましくは、第３のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
本発明の核酸分子は、代替的に、第３のポリヌクレオチドの機能的フラグメントを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「当該第３のポリヌクレオチドの機能的フラグメント」なる用語は、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの発現の促進において、完全な第３のポリヌクレオチドの活性の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％）を保持する、第３のポリヌクレオチドの一部を指す。核酸配列のプロモーター活性を測定および比較するための方法は、以下で説明されるように、当技術分野において周知である。
【００３３】
好ましくは、第３のポリヌクレオチドの機能的フラグメントは、配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるポリヌクレオチド配列の長さの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。
【００３４】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号１、配列番号２または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、この順番で５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００３５】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、この順番で隣接して５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００３６】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、この順番で隣接して５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００３７】
一部の好ましい実施形態では、核酸分子は、
（ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する第１のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有する第３のポリヌクレオチド；
を含み、ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、この順番で隣接して５’−３’に連結されており、前記核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「異種ポリヌクレオチド」なる用語は、所望のｍＲＮＡまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。異種ポリヌクレオチドの例としては、ポリペプチド（例えば、ウイルスまたは哺乳動物のポリペプチド）をコードするものが挙げられる。
【００３９】
一部の好ましい実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、分泌経路に入るタンパク質（例えば、膜結合タンパク質、分泌抗体または他の分泌タンパク質）をコードする。そのような異種ポリヌクレオチドを発現する細胞は、細胞を溶解することなく培養培地から生産物を回収できる、バイオリアクターまたは懸濁培養用容器における組換え分泌タンパク質の連続生産に特に適しているであろう。
【００４０】
他の好ましい異種ポリヌクレオチドは、細胞全体という形で使用できるか、あるいは細胞溶解によって回収できる、細胞に付随したままであるタンパク質（膜タンパク質または細胞質タンパク質など）をコードするものである。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、抗体をコードする。本発明の一部の他の好ましい実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、ウイルスのポリペプチドをコードする。好ましくは、ウイルスのポリペプチドは、表面糖タンパク質（例えば、ＶＳＶ  Ｇ）である。ＶＳＶ  Ｇポリペプチドは、水疱性口内炎ウイルスに由来する１回膜貫通糖タンパク質である。それは、幅広い感染指向性を媒介する。他の実施形態では、ウイルスのポリペプチドは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、ＲｅｖまたはＴａｔである。「Ｇａｇ−Ｐｏｌ」なる用語は、タンパク質分解により切断されて、機能を有する逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼならびにウイルス構築に構造上重要である少なくとも２つのタンパク質を生じさせる、レトロウイルスのタンパク質を指す。好ましくは、Ｇａｇ−Ｐｏｌの配列は、レンチウイルスに由来し、最も好ましくはＨＩＶに由来する。Ｒｅｖタンパク質は、細胞質内へのウイルスゲノムの輸送を助ける。好ましくは、Ｒｅｖポリペプチドの配列は、レンチウイルスに由来し、最も好ましくはＨＩＶに由来する。Ｔａｔタンパク質は、ウイルス転写の効率を高める。好ましくは、Ｔａｔポリペプチドの配列は、レンチウイルスに由来し、最も好ましくはＨＩＶに由来する。
【００４１】
第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチド（存在する場合）および異種ポリヌクレオチド（存在する場合）は、この順番で５’−３’方向に連結される。
【００４２】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間に、第２のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドとの間に、第２のポリヌクレオチドと異種ポリヌクレオチドとの間に、および第３のポリヌクレオチドと異種ポリヌクレオチドとの間に、１つ以上のリンカーヌクレオチドが存在してもよい（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のリンカーヌクレオチド）。存在する場合、そのようなリンカーポリヌクレオチドは、（例えば、ルシフェラーゼアッセイにおいて測定されるような）プロモーターフラグメントの効力に対する重大な有害作用を有するべきではない。好ましくは、リンカーヌクレオチドは存在せず、すなわち、好ましくは、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチド（存在する場合）および異種ポリヌクレオチド（存在する場合）は、この順番で隣接して５’−３’方向に連結される。
【００４３】
核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。
【００４４】
異種ポリヌクレオチドは、本発明の第１、第２および第３（存在する場合）のポリヌクレオチドに対して下流（すなわち、３’）の位置に機能可能に配置されるであろう。
【００４５】
本発明の状況下では、「転写を促進する」なる用語は、異種ポリヌクレオチドが本発明の第１、第２および第３（存在する場合）のポリヌクレオチドの下流に機能可能に結合または挿入されると異種ポリヌクレオチドの発現産物が得られるということを意味することが意図される。
【００４６】
本発明の一部の実施形態において、核酸分子は、誘導可能な様式で哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能であり、すなわち、核酸分子は誘導性プロモーターである。従って、核酸分子は、抑制可能であるか活性化可能であるエレメントを含んでもよい。例えば、本明細書で開示されるプロモーターのバージョンは、転写を抑制あるいは活性化できるタンパク質の結合部位を含むように改変されて誘導可能な形態を生じさせる可能性がある。これの一例では、本明細書で開示されるプロモーター（好ましくはｐ５６５またはｐ５６５ｉ）が、テトラサイクリンリプレッサータンパク質の結合部位を２〜７個含むように改変される可能性がある（最も好ましくは２〜３個の部位）。前記結合部位を挿入することによって、テトラサイクリンリプレッサータンパク質は、プロモーターに結合することが可能になり、そうすることで、プロモーター上での基本転写因子装置の構築を妨げ、それにより、転写と翻訳の両方を妨げる。これは、タンパク質の発現を抑止するであろう。ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンの存在下では、テトラサイクリンリプレッサータンパク質は、もはやＤＮＡに結合することができず、従って、このリプレッサーは、もはやプロモーターに結合できず、転写と翻訳は、妨害されずに進むことができる。そのため、作製されたプロモーターの転写活性は、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンのいずれかの存在によって誘導されると言え、従って、誘導性プロモーターと分類されるであろう。
【００４７】
「発現産物」なる用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）異種ポリヌクレオチドの転写産物であるＲＮＡ（例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）および（ｉｉ）異種ポリヌクレオチドの翻訳産物であるポリペプチドのいずれかまたは両方を意味することが意図される。
【００４８】
異種ポリヌクレオチドは、本発明の核酸分子の３’末端から５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、３０ｂｐまたは１０ｂｐ以内の領域に異種ポリヌクレオチドの５’末端が位置するように本発明の核酸分子の下流に機能可能に挿入されてもよい。
【００４９】
本発明の核酸分子によって促進された転写のレベルは、任意の適切な方法によってアッセイされてよい。例えば、そのようなアッセイのために、異種ポリヌクレオチドは、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子）または発現レポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ遺伝子等）であってもよい。好ましくは、プロモーター活性の確認は、ＦＬｕｃ遺伝子を用いて達成されてよい。
【００５０】
本発明の核酸分子の転写活性は、本発明の核酸分子の下流にレポーター遺伝子（ＦＬｕｃ遺伝子など）を機能可能に挿入することによって測定されてもよい。その後、ホタルルシフェラーゼタンパク質の発現レベルを用いて、得られる転写のレベルを示すことができる。これを達成するために、必要とされるＤＮＡ（Ｆｌｕｃ遺伝子の上流に本発明の核酸を含む）をプラスミドに導入してよく、次いで、このプラスミドを、好適なレシピエント細胞（例えば、２９３Ａ細胞）にトランスフェクトし、ホタルルシフェラーゼタンパク質を発現させる。２４時間後、細胞を溶解してよく、その細胞溶解物中のルシフェラーゼを、ルミノメーターを用いてそのルシフェリン基質の存在下でのその光の出力を測定することによってモニタリングしてよい。
【００５１】
核酸分子は、哺乳動物細胞において、機能可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を促進することが可能である。好ましい哺乳動物細胞には、マウス、ラット、ハムスター、サルおよびヒトの細胞が包含される。そのような細胞の例としては、ＨＥＫ細胞とその派生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ）、ＰｅｒＣ６細胞、９１１細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞およびＶＥＲＯ細胞；ＨｅｐＧ２、Ａ５４９およびＭＣＦ７などの癌細胞；ヒトまたは動物の生検から単離された初代細胞；ならびに幹細胞（胚性幹細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの多能性細胞、ならびに造血幹細胞、間葉系幹細胞等などの複能性幹細胞が包含される）が挙げられる。
【００５２】
好ましいヒト細胞には、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ａ細胞；ならびにヒト幹細胞（胚性幹細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの多能性細胞、ならびに造血幹細胞、間葉系幹細胞等などの複能性幹細胞が包含される）が包含される。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。好ましくは、発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。哺乳動物用発現ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、ｐＳＶとｐＣＭＶのシリーズのプラスミドベクター、ワクシニアベクターとレトロウイルスベクター、ならびにバキュロウイルスが挙げられる。一部の実施形態において、発現ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００５４】
発現ベクターは、以下のうちの１つ以上をさらに含んでもよい：複製開始点、選択マーカーおよびマルチクローニングサイト。
【００５５】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含む発現ベクターであって、核酸分子が異種ポリヌクレオチドに機能可能に連結されている、発現ベクターを提供する。
【００５６】
本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む哺乳動物宿主細胞も提供する。発現ベクターは、任意の適切な方法によって宿主細胞にトランスフェクトされてよい。好ましくは、宿主細胞は、上述されたものなどの哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。そのような宿主細胞は、単離された細胞であってもよい。
【００５７】
本発明はさらに、そのゲノムが本発明の核酸分子または本発明の発現ベクターを含む哺乳動物を提供する。好ましくは、本発明の核酸分子または本発明の発現ベクターは、本発明の前記核酸分子に機能可能に連結されているか本発明の前記発現ベクターに機能可能に挿入されている異種ポリヌクレオチドが哺乳動物の１つ以上の細胞において発現されるように哺乳動物のゲノム中に挿入される。好ましくは、哺乳動物は、マウスまたはラットである。一部の実施形態において、哺乳動物は、ヒトではない哺乳動物である。
【００５８】
本発明はまた、必要に応じて
（ｉ）ヘルパープラスミド（例えば、本発明のプロモーターの調節制御下にあるレンチウイルスのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むもの）；
（ｉｉ）ウイルスゲノムプラスミド（例えば、必要とされる導入遺伝子の単純な挿入に適合していてもよいパッケージングシグナルを有するもの）；
（ｉｉｉ）緩衝液；
（ｉｖ）制限酵素；
（ｖ）トランスフェクション培地；および
（ｖｉ）哺乳動物細胞
からなる群より選択される１つ以上の追加の構成要素と共に、本発明の発現ベクターおよび／または宿主細胞を含むキットも提供する。
【００５９】
百分率でのアミノ酸配列同一性およびヌクレオチド配列同一性は、ＢＬＡＳＴのアライメント法を用いて取得されてもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），  「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータが使用される。
【００６０】
タンパク質データベースにおいて類似配列を見出すために、標準的なタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を用いてもよい。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは、類似した局所領域を見出すように設計されている。配列の類似性が配列全体に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐはまた、全体的なアライメントも報告し、これは、タンパク質の同定を目的とする場合には好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータが使用される。場合によっては、「ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ」がオフにされてもよい。
【００６１】
また、ＢＬＡＳＴＸプログラム、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３によりＢＬＡＳＴタンパク質検索が実施されてもよい。比較を目的としてギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９で説明されているように（ＢＬＡＳＴ２．０の）Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用できる。あるいは、（ＢＬＡＳＴ２．０の）ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施できる（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する際、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータが使用されてもよい。
【００６２】
ヌクレオチド配列の比較に関しては、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ−ｍｅｇａｂｌａｓｔおよびｂｌａｓｔｎを用いて、この目標を達成してもよい。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータが使用される。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間の長いアライメントを効率的に見出すように特別に設計されている。本発明の核酸と類似しているが同一ではないヌクレオチド配列を見出すためにＤｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いてもよい。
【００６３】
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似配列を見出す。このプログラムは、最初にクエリワードとの正確な一致（ワードヒット）を特定する。次いで、ＢＬＡＳＴプログラムは、これらのワードヒットを複数のステップで拡張して最終ギャップアライメントを生成する。一部の実施形態において、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２を用いて実施できる。
【００６４】
ＢＬＡＳＴ検索の感度を左右する重要なパラメータの１つは、ワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも高感度である最も重要な理由は、それが、より短いデフォルトのワードサイズ（１１）を使用するということである。このために、ｂｌａｓｔｎは、他の生物に由来する関連ヌクレオチド配列とのアライメントの発見においてＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ワードサイズは、ｂｌａｓｔｎにおいて調整可能であり、デフォルト値から最小の７に減らして検索の感度を上げることができる。
【００６５】
新しく導入されたｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔのページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｎｅｗｓｌｔｒ／ＦａｌｌＷｉｎｔｅｒ０２／ｂｌａｓｔｌａｂ．ｈｔｍｌ）を用いて、より高感度の検索を達成できる。このページは、Ｍａら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００２  Ｍａｒ；  １８（３）：４４０−５）によって報告されたものと類似するアルゴリズムを使用する。アライメントの拡張のためのシードとして正確なワードの一致を必要とするのではなく、ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔは、テンプレートのより長いウィンドウ内の非連続ワード（non-contiguous word）を使用する。コーディングモードでは、コドンの一番目と二番目の位置における一致を見出すことに集中する一方で三番目の位置における不一致を無視することによって、三番目の塩基のゆらぎが考慮される。同じワードサイズを使用したｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ＭＥＧＡＢＬＡＳＴでの検索は、同じワードサイズを使用した標準的なｂｌａｓｔｎよりも高感度かつ効率的である。ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔに固有のパラメータは、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１または１２；ｔｅｍｐｌａｔｅ：１６、１８、または２１；ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｔｙｐｅ：ｃｏｄｉｎｇ（０）、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ（１）、またはｂｏｔｈ（２）である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ｐＳＦ−ＳｎａｐＦａｓｔ  ＦＬｕｃレポーターベクターのバックグラウンドマップ。
【図２】組換えプロモーターフラグメントを様々な標準的プロモーターと比較したチャート。エラーバーは標準誤差を示す。実験は３連で実施した。
【図３】経時的アッセイにおいて、最も高性能の３種の組換えプロモーター（ｐ５６５、ｐ５６７およびｐ５７６）を様々な標準的高発現プロモーターと比較したグラフ。
【図４】組換えプロモーターｐ５６５によって駆動されたタンパク質発現レベル。
【図５】それぞれプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１およびＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖを用いた、ＣＭＶプロモーターおよびＯｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「ハイブリッド」ｐｒｏｍ−５６５プロモーターからのＨＥＫ２９３細胞におけるタンパク質過剰発現（ｐｃＤＮＡ３．１は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能なタンパク質発現ベクターである。このプラスミドベクターは、前初期ＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーター、一本鎖ＤＮＡを作り出すためのＦ１オリジンと並んだウシ成長因子（ＢｇＨ）ポリアデニル化シグナル、ならびにネオマイシン−カナマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ）の発現を駆動するＳＶ４０プロモーター、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いて目的の外因性タンパク質を発現させる場合、前記タンパク質のコード配列は、ＣＭＶプロモーターとＴ７プロモーターの下流（３’）に、しかしＢｇＨポリアデニル化シグナルの上流（５’）に、５’から３’の向きで挿入される必要がある。このプラスミドはまた、細菌細胞における選択のためのアンピシリン耐性遺伝子も含む。ＳｎａｐＦａｓｔ  ＰｒｏＶ１は、その後ろにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続く本明細書でｐ５６５ｉと呼称されるプロモーターを含む、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌｔｄによって設計されたタンパク質発現ベクターである。ＳｎａｐＦａｓｔ  ＰｒｏＶ１ベクターを用いて目的の外因性タンパク質を発現させる場合、前記タンパク質のコード配列は、ｐ５６５ｉプロモーターの下流（３’）に、しかしＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの上流（５’）に、５’から３’の向きで挿入される必要がある。このプラスミドはまた、細菌細胞における選択のためのカナマイシン耐性遺伝子も含む。）。様々なＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１またはＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖのいずれかでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓ（商標）自動ウェスタンブロットシステムを使用して、培養上清または細胞溶解物のタンパク質レベルをトランスフェクションから７２時間後にウェスタンブロットによって決定した。マウス抗ＦＬＡＧ一次抗体および二次ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰでＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を検出した。
【図６】それぞれプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１およびＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖを用いた、ＣＭＶプロモーターおよびＯｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「ハイブリッド」ｐｒｏｍ−５６５プロモーターからのＨＥＫ２９３細胞におけるタンパク質過剰発現。様々なＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１またはＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖのいずれかでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓ（商標）自動ウェスタンブロットシステムを使用して、培養上清または細胞溶解物のタンパク質レベルをトランスフェクションから７２時間後にウェスタンブロットによって決定した。マウス抗ＦＬＡＧ一次抗体および二次ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰでＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を検出した。
【図７】それぞれプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１およびＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖを用いた、ＣＭＶプロモーターおよびＯｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「ハイブリッド」ｐｒｏｍ−５６５プロモーターからのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるタンパク質過剰発現。様々なＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１またはＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖのいずれかでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓ（商標）自動ウェスタンブロットシステムを使用して、培養上清または細胞溶解物のタンパク質レベルをトランスフェクションから７２時間後にウェスタンブロットによって決定した。マウス抗ＦＬＡＧ一次抗体および二次ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰでＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を検出した。
【図８】それぞれプラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１およびＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖを用いた、ＣＭＶプロモーターおよびＯｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「ハイブリッド」ｐｒｏｍ−５６５プロモーターからのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるタンパク質過剰発現。様々なＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を発現するｐｃＤＮＡ３．１またはＳｎａｐＦａｓｔ  Ｐｒｏ１ｖのいずれかでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓ（商標）自動ウェスタンブロットシステムを使用して、培養上清または細胞溶解物のタンパク質レベルをトランスフェクションから７２時間後にウェスタンブロットによって決定した。マウス抗ＦＬＡＧ一次抗体および二次ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰでＦＬＡＧタグ付き融合タンパク質を検出した。
【図９】ＨＣＴ１１６細胞において本発明のプロモーターによって駆動されたＧＦＰの発現レベル。
【図１０】Ａ５４９細胞において本発明のプロモーターによって駆動されたＧＦＰの発現レベル。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの実施例では、特に明記しない限り、部および百分率は、重量によるものであり、度はセ氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、説明を目的として提示されているに過ぎないということが理解されるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途および条件に適合させるために本発明の様々な変更および改変を行うことができる。従って、本明細書で示され、説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、上記の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変も、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【００６８】
本明細書に記載される各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
実施例１：組換えプロモーターフラグメント
表１で特定されている配列からなる組換えプロモーターフラグメントを作製した。
【００７０】
【表１】
2019506882.tif 000003
【００７１】
上記のプロモーターフラグメントにおいて、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチド（存在する場合）は、隣接して連結された。
【００７２】
実施例２：プロモーターを含む発現ベクターの構築
ホタルルシフェラーゼアッセイで使用したレポーターベクターは、以下のように構築した。
【００７３】
ベクターの調製
図１に示されるＳｎａｐＦａｓｔ（ＳＦ）ベクターを使用した。ＳｎａｐＦａｓｔベクターのバックボーンは、ｐＵＣの細菌の複製開始点、アンピシリン耐性遺伝子およびマルチクローニングサイトからなる。ホタルルシフェラーゼをコードする配列を、ＮｃｏＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位の間でマルチクローニングサイトにクローニングした（図１を参照のこと）。ルシフェラーゼをコードする配列は、Ｋｏｚａｋリボソーム結合部位を包含する。
【００７４】
レポータープラスミドをＢｇｌＩＩで線状化した後、脱リン酸化して、ベクター骨格の再連結を防いだ。切断されたベクターを、ゲル抽出およびその後のカラムを利用した精製によって、切断されていないベクターから単離した。次いで、組換えプロモーターフラグメント（実施例１のもの）を、ＢｇｌＩＩで切断したベクターに連結した。
【００７５】
ベクターを標準的なＥ．ｃｏｌｉのクローニング用株に形質転換し、ＬＢカナマイシン選択プレート上にプレーティングして、１コロニーあたり１つの組換えプロモーターを得た。ミニスケールでのプラスミド調製のためにコロニーを採取した。これらのプロモーターのクローンを、ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションおよびその後のルシフェラーゼ発現アッセイに使用した。
【００７６】
実施例３：プロモーター活性のアッセイ
材料および方法
各組換えプロモーターに由来するコロニーからプラスミドＤＮＡを精製した。組換えプロモーターを含むレポーターベクターを、いくつかの９６ウェルプレートにおいてＨＥＫ２９３細胞に個々にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を用いて各ウェルをルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【００７７】
簡単に説明すると、各アッセイを次のように実施した。培養培地を各ウェルから除去した。１００μｌのレポーター溶解バッファを各ウェルの細胞に添加した。マイクロタイタープレート（複数可）を−２０℃で３０分間インキュベートして細胞を溶解させた後、プレートを室温で３０分間インキュベートすることにより解凍した。ピペッティングによって細胞溶解物を均質化した。各溶解物のサンプル２５μｌをルミノメーター用チューブに移した。ルシフェラーゼアッセイ試薬は、それにルシフェラーゼアッセイバッファを添加することによって再構成した。サンプルをＬｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７ルミノメーター（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で分析した。ルミノメーターは、２５μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を注入した後、２秒間にわたって発光された光を記録するように設定した。ルミノメーターのアウトプットは、相対的光ユニットで与えられた。
【００７８】
組換えプロモーターを、標準的な高発現プロモーターのセレクションと比較した。
【００７９】
結果
結果を図２に示す。組換えプロモーターフラグメントｐ５６７およびｐ５７６は、このアッセイにおいてＣＭＶ（現在の至適基準）よりも良好に機能した。
【００８０】
実施例４：経時的実験
経時的実験のために、３つの組換えプロモーター（ｐ５６５、ｐ５６７およびｐ５７６）を選択した。結果を図３に示す。
【００８１】
これらの結果は、組換えプロモーターが、トランスフェクションの２４時間後から７２時間後までの間にわたって、一貫して高いルシフェラーゼ発現を生じさせたということを示す。
【００８２】
実施例５：組換えプロモーターからの発現レベル
本発明の組換えプロモーターｐ５６５によって駆動されるタンパク質発現レベルを、対照として示されるＣＭＶプロモーターでの発現と共に図４に示す。商業的に有用である４つの異なる抗原（タンパク質「Ｗ」、「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」）の発現について、ｐ５６５プロモーターを標準的なＣＭＶプロモーターと比較した。各抗原について、コード配列を、図１に示すものと同等のベクターにおいてＣＭＶプロモーターまたはｐ５６５プロモーターのいずれかの下流にクローニングした。
【００８３】
１日目に、３００μｌという体積の血清不含培養培地で１ウェルあたり３０，０００細胞という密度にてＨＥＫ２９３Ａｄ細胞を４８ウェルマイクロタイタープレートに播種した。２日目に、発現ベクターの各々について、各ウェルの細胞を０．７５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。ＤＮＡ１μｇあたり３μｇという比率で分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて細胞をトランスフェクトした。ＤＮＡを細胞に添加する前に、ＤＮＡをＰＥＩと共に室温で２０分間インキュベートしてＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を形成させた。トランスフェクションが行われてから３日後に、各ウェルの上清を回収し、発現された抗原の量についてウェスタンブロットにより分析した。
【００８４】
実施例６：ＨＥＫ２９３細胞における発現レベル
分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）でＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＰ５６５ｉから様々なヒト遺伝子（表２を参照のこと）を過剰発現させた。
【００８５】
【表２】
2019506882.tif 000004
【００８６】
１ウェルあたり２５，０００細胞という密度にて４８ウェルプレートのフォーマット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でＨＥＫ２９３細胞を播種して、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションの前に２４時間、組織培養した。ＦＬＡＧをタグ付けされたヒト遺伝子をＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＰ５６５ｉから発現する各プラスミドＤＮＡ（７５０ｎｇ）を、１：３という比率で分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤＡ）と混合し、このＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を、ＨＥＫ２９３細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに一過的にトランスフェクトした。一過性トランスフェクションからの各ＦＬＡＧタグ付きヒトタンパク質の発現を、マウス抗ＦＬＡＧ一次抗体および二次ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いてトランスフェクションから７２時間後に自動ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）により分析した。結果を図５および図６に示す。
【００８７】
実施例７：ＣＨＯ細胞における発現レベル
分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、ＣＨＯ  Ｋ１細胞でＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＰ５６５ｉから様々なヒト遺伝子（表３を参照のこと）を過剰発現させた。
【００８８】
【表３】
2019506882.tif 000005
【００８９】
１ウェルあたり２０，０００細胞という密度にて４８ウェルプレートのフォーマット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でＣＨＯ  Ｋ１細胞を播種して、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションの前に２４時間、組織培養した。ＦＬＡＧをタグ付けされたヒト遺伝子をＣＭＶプロモーターまたはプロモーターＰ５６５ｉから発現する各プラスミドＤＮＡ（７５０ｎｇ）を、１：３という比率で分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤＡ）と混合し、このＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を、ＣＨＯ  Ｋ１細胞を播種した４８ウェルプレートの各ウェルに一過的にトランスフェクトした。一過性トランスフェクションからの各ＦＬＡＧタグ付きヒトタンパク質の発現を、マウス抗ＦＬＡＧ一次抗体および二次ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いてトランスフェクションから７２時間後に自動ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）により分析した。結果を図７および図８に示す。
【００９０】
実施例８：ＨＣＴ１１６細胞における発現レベル
分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、ＨＣＴ１１６細胞でＣＭＶプロモーター、Ｐ５６５ｉプロモーター、Ｐ５６５プロモーター、Ｐ５７６プロモーター、Ｐ５６７プロモーターから緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させた。
【００９１】
組織培養処理された４８ウェルプレートのフォーマット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で１ウェルあたり２５，０００細胞という密度にてＨＣＴ１１６細胞を播種し、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションの前に２４時間、培養した。高感度緑色蛍光タンパク質をＣＭＶプロモーター、Ｐ５６５ｉプロモーター、Ｐ５６５プロモーター、Ｐ５７６プロモーターまたはＰ５６７プロモーターから発現する各プラスミドＤＮＡ（７５０ｎｇ）を、１：３という比率で分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤＡ）と混合し、このＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を、ＨＣＴ１１６細胞に一過的にトランスフェクトした。ＨＣＴ１１６細胞のＭＦＩによって決定される高感度緑色タンパク質の発現を、トランスフェクションから４８時間後にフローサイトメトリーにより測定した。結果を図９に示す。
【００９２】
実施例９：Ａ５４９細胞における発現レベル
【００９３】
分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤａ）を用いた一過性トランスフェクションの方法によって、Ａ５４９細胞でＣＭＶプロモーター、Ｐ５６５ｉプロモーター、Ｐ５６５プロモーター、Ｐ５７６プロモーター、Ｐ５６７プロモーターから緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させた。
【００９４】
組織培養処理された４８ウェルプレートのフォーマット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で１ウェルあたり２５，０００細胞という密度にてＡ５４９細胞を播種し、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションの前に２４時間、培養した。高感度緑色蛍光タンパク質をＣＭＶプロモーター、Ｐ５６５ｉプロモーター、Ｐ５６５プロモーター、Ｐ５７６プロモーターまたはＰ５６７プロモーターから発現する各プラスミドＤＮＡ（７５０ｎｇ）を、１：３という比率で分枝状ＰＥＩ（２５ｋＤＡ）と混合し、このＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を、Ａ５４９細胞に一過的にトランスフェクトした。Ａ５４９細胞のＭＦＩによって決定される高感度緑色タンパク質の発現を、トランスフェクションから４８時間後にフローサイトメトリーにより測定した。結果を図１０に示す。
【００９５】
配列
配列番号３
ＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣ
配列番号２
ＣＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＴＡＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＡＣＧＴＣＡＴＴ
配列番号１
ＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＣＴＡＧＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＡＴＴＧＧＣＧＴＴＡＣＴＡＴＧＧＧＡＡＣＡＴＡＣＧＴＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣ
配列番号４
ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＣ
配列番号７
ＧＴＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧＧＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＡＣＧＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣＴＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡ
配列番号６
ＧＣＣＣＡＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＧＡＧＡＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＧＡＴＴＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＧＡＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＡＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡ
配列番号５
ＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧ
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
＜２２３＞合成プロモーターエレメント
【図１】
2019506882.tif 000006
【図２】
2019506882.tif 000007
【図３】
2019506882.tif 000008
【図４】
2019506882.tif 000009
【図５】
2019506882.tif 000010
【図６】
2019506882.tif 000011
【図７】
2019506882.tif 000012
【図８】
2019506882.tif 000013
【図９】
2019506882.tif 000014
【図１０】
2019506882.tif 000015
【配列表】
2019506882000001.app
【国際調査報告】
2019506882.tif 000016
2019506882.tif 000017
2019506882.tif 000018
2019506882.tif 000019
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