(57)【要約】  本発明は、同数のヒトＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含むナノスフェア、ならびにそれらの製造方法およびナノスフェアの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
同数の
（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および
（ｉｉ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくは、これらからなるナノスフェア。
【請求項２】
前記同数は３〜６０である、請求項１に記載のナノスフェア。
【請求項３】
前記ヒトＳＥＣ１４様タンパク質が、
（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、
（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、
（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、
（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および
（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）、から選択される、請求項１または２に記載のナノスフェア。
【請求項４】
前記ＳＥＣ１４様タンパク質がα−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノスフェア。
【請求項５】
前記同数は２４である、請求項５に記載のナノスフェア。
【請求項６】
前記α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の前記同族リガンドがトコフェロールであり、好ましくは前記トコフェロールがα−トコフェロールであり、さらに好ましくは前記α−トコフェロールがＲ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールである、請求項４または５に記載のナノスフェア。
【請求項７】
前記ＳＥＣ１４様タンパク質が細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノスフェア。
【請求項８】
前記ＣＲＡＬＢＰの前記同族リガンドがシス−レチノールまたはシスレチナールであり、好ましくは前記シス−レチノールまたはシスレチナールが９−シス−レチナール、１１−シス−レチナール、９，１３−ジシス−レチナール、９−シス−レチノール、１１−シス−レチノールおよび９，１３−ジシス−レチノールから選択される、請求項７に記載のナノスフェア。
【請求項９】
前記ＳＥＣ１４様タンパク質がアミノ酸配列を含み、前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記アミノ酸配列が、
（ａ）配列番号３の５６位に対応する位置でＬおよびＩから選択されるアミノ酸残基、
（ｂ）配列番号３の６１位に対応する位置のアミノ酸残基Ｆ、
（ｃ）配列番号３の６３位に対応する位置でＬ、Ｖ、Ｑ、ＨおよびＹから選択されるアミノ酸残基、
（ｄ）配列番号３の６７位に対応する位置でＷ、Ｙ、ＦおよびＬから選択されるアミノ酸残基、
（ｅ）配列番号３の７０位に対応する位置のアミノ酸残基Ｌ、または
（ｆ）配列番号３の位置７４に対応する位置でＹ、Ｖ、ＦおよびＨから選択されるアミノ酸残基、を含み、
前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記アミノ酸配列は、（ａ）〜（ｆ）の前記アミノ酸残基のうちのいずれか１つを少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ含み、
前記ナノスフェアに含まれる前記同数のＳＥＣ１４様タンパク質の第１番目の前記アミノ酸配列の（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれか１つの、好ましくは少なくとも４つのアミノ酸残基が、前記ナノスフェアに含まれる前記同数のＳＥＣ１４様タンパク質の第２番目および第３番目の前記アミノ酸配列の（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれか１つの、少なくとも４つのアミノ酸残基に結合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノスフェア。
【請求項１０】
同数の
（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および
（ｉｉ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらなるナノスフェアの製造方法であって、
（ａ）水溶液Ｉ中に前記ＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、前記溶液Ｉ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、前記溶液Ｉは塩を含み、前記塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、
（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドを提供するステップであって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、
（ｃ）前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記濃度と前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの前記濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、
（ｄ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質および前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドがナノスフェアに集合できるようになるステップと、
（ｅ）前記溶液ＩＩＩから前記ナノスフェアを分離するステップと、
（ｆ）任意により前記ナノスフェアを精製するステップと、を含む、方法。
【請求項１１】
同数の
（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および
（ｉｉ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらなるナノスフェアの製造方法であって、
（ａ）水溶液Ｉ中に前記ＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、前記溶液Ｉ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、
（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドを提供するステップであって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、
（ｃ）前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記濃度と前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの前記濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、
（ｄ）前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去するステップであって、前記界面活性剤を前記溶液ＩＩＩから除去することにより、前記ＳＥＣ１４様タンパク質および前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドがナノスフェアに集合できるようになるステップと、
（ｅ）前記溶液ＩＩＩから前記ナノスフェアを分離するステップと、
（ｆ）任意により前記ナノスフェアを精製するステップと、を含む、方法。
【請求項１２】
同数の
（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および
（ｉｉ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらなるナノスフェアの製造方法であって、
（ａ）水溶液Ｉ中に前記ＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、前記溶液Ｉ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、前記溶液Ｉは塩を含み、前記塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、
（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドを提供するステップであって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、
（ｃ）前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記濃度と前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの前記濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、前記溶液ＩＩＩ中の前記水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、
（ｄ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質および前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドが、前記ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよび前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようにするステップと、
（ｅ）前記溶液ＩＩＩから前記単量体複合体を分離するステップと、
（ｆ）任意により前記単量体複合体を精製するステップと、
（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、前記溶液ＩＶが前記単量体複合体を含み、前記溶液ＩＶ中の前記単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、前記溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、前記溶液ＩＶが塩を含み、前記塩の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、
（ｈ）前記単量体複合体が前記ナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む、方法。
【請求項１３】
同数の
（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および
（ｉｉ）前記ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらなるナノスフェアの製造方法であって、
（ａ）水溶液Ｉ中に前記ＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、前記溶液Ｉ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、前記溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、
（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドを提供するステップであって、前記溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、前記溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、
（ｃ）前記溶液Ｉと前記溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、前記溶液ＩＩＩ中の前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記濃度と前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドの前記濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、
（ｄ）前記溶液ＩＩＩから前記界面活性剤を除去するステップであって、前記界面活性剤を前記溶液ＩＩＩから除去することにより、前記ＳＥＣ１４様タンパク質および前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドが前記ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよび前記ＳＥＣ１４様タンパク質の前記同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようになるステップと、
（ｅ）前記溶液ＩＩＩから前記単量体複合体を分離するステップと、
（ｆ）任意により前記単量体複合体を精製するステップと、
（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、前記溶液ＩＶが前記単量体複合体を含み、前記溶液ＩＶ中の前記単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、前記溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、前記溶液ＩＶは塩を含み、前記塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、
（ｈ）前記単量体複合体が前記ナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む、方法。
【請求項１４】
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノスフェアと、
（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは前記炎症性疾患は関節炎である）の治療または予防方法、好ましくは治療方法において使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のナノスフェアまたは請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同数のヒトＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含むナノスフェア、ならびにそれらの製造方法およびナノスフェアの使用に関する。
関連技術
【０００２】
ＳＥＣ１４遺伝子産物ＳＥＣ１４ｐは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において最初に同定され、ゴルジ装置から原形質膜へのホスファチジルイノシトールの輸送タンパク質として働く。ＳＥＣ１４タンパク質中のドメインのＸ線構造は、脂質結合のための疎水性ポケットを有する特徴的なα−β−αサンドイッチを明らかにする。Ｓｅｃ１４ｐは、脂質シグナル伝達事象を小胞の出芽に関与するタンパク質と統合することにより、トランスゴルジネットワークからの分泌小胞の生合成に必須である。ＳＥＣ１４ｐ（ＳＦＨ２、ＳＦＨ３、ＳＦＨ４、およびＳＦＨ５）の酵母相同体は、ＰｔｄＩｎｓキナーゼおよびホスホリパーゼＤ活性を調節し、ホスホイノシチドの産生を促進することによって補完的な機能を果たす（ＬＬｉ，Ｘ．ら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０００  １１：１９８９−２００５およびその中に引用されている参考文献）。
【０００３】
高等真核生物では、酵母ＳＥＣ１４ｐの機能的ホモログは、関連する機能を有するＳＥＣ１４様タンパク質ファミリーを構成する（Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｔ．Ｋ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４  １３６：３０８０−３０９４）。ＩｎｔｅｒＰｒｏ統合データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）によるタンパク質配列分析および分類は、ＳＥＣ１４様タンパク質ファミリーのメンバーすべてが、ＣＲＡＬＢＰおよび三重機能ＴＲＩＯタンパク質の一次構造に由来し、特徴的なＣＲＡＬ−ＴＲＩＯ（ＩＰＲ００１２５１）ドメインを共通して有すると予測している。ＣＲＡＬ−ＴＲＩＯドメインは、小さい親油性分子を隔離するための構造的足場を表す（Ｐａｎａｇａｂｋｏ  Ｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３  ４２：６４６７−６４７４およびその中に引用されている参考文献）。ドメインは、ＳＥＣ１４様タンパク質のすべてを構成してもよく、またはその一部のみを構成してもよい。ＳＥＣ１４ｐ、ＣＲＡＬＢＰまたはα−ＴＴＰなどのＣＲＡＬ−ＴＲＩＯのみのタンパク質は、それぞれホスファチジルイノシトール、１１−シス−レチナールおよびα−トコフェロール（α−ｔｏｌ）の膜間輸送のための細胞質因子として同定されている（Ｐａｎａｇａｂｋｏ  Ｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３  ４２：６４６７−６４７４およびその中に引用されている参考文献）。
【０００４】
α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）は、親水性媒体を通して親油性ビタミンＥ分子の輸送を促進し、生物によって同化される、細胞質ゾル３２ｋＤａタンパク質である。これは、脂質調節に関与することが公知であるＳＥＣ１４様タンパク質ファミリーに属する（Ｐａｎａｇａｂｋｏ  Ｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３  ４２：６４６７−６４７４；Ｌ．Ａｒａｖｉｎｄら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９９  ９：１９５−１９７およびその中に引用されている参考文献）。フォールドは、結合空洞の床、可変数のαヘリックス、および親油性同族リガンドが結合ポケットにアクセスできるカルボキシ末端領域の可動ヘリックスゲートを構成する５つの平行β鎖からなる（Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ａ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００４  １０３１：４４−５９；Ｍｅｉｅｒ  Ｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３  ３３１：７２５−７３４）。α−ＴＴＰは、ラットおよびヒトの両方で単離されており、肝臓で主に発現されるが、胎盤および脳にも存在する（Ｋａｅｍｐｆ−Ｒｏｔｚｏｌｌら、Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２００３  ２４，４３９−４４４およびその中に引用されている参考文献）。α−ＴＴＰは、肝細胞におけるビタミンＥの調節において重要な役割を果たし、その不十分な発現または変異が、ＡＶＥＤ遺伝病の発生に直接関連することから、生物の健康に不可欠である（Ｏｕａｈｃｈｉ  Ｋ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５  ９：１４１−１４５）。
【０００５】
１９８７年には、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）を、９−シス−レチナール（Ｋｄ＝５３ｎＭ）、１１−シス−レチナール（Ｋｄ＝２０ｎＭ）および１１−シス−レチノール（Ｋｄ＝６０ｎＭ）に対するナノモル親和性を有する高親和性バインダーとして同定した（Ｓａａｒｉ  ＪＣ，ａｎｄ  Ｂｒｅｄｂｅｒｇ  ＤＬ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８７  ２６２：７６１８−２２）。同じ研究は、ＣＲＡＬＢＰが１３−シスまたはオールトランス−レチナールのいずれにも結合しないことを示した。ＣＲＡＬＢＰの付加的な機能は、その同族シス−同族リガンドを早期異性化から保護する能力によって付与される。ＣＲＡＬＢＰは、視覚サイクルのレチナールフラックス、オールトランス−レチナールから１１−シス−レチナールへの眼の生化学的再生経路も増加させる。この経路において、ＣＲＡＬＢは、ＲＰＥ６５のイソメラーゼ活性を刺激し（Ｐ．Ｄ．Ｋｉｓｅｒら、２０１５  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：４０９−４１５）、１１−シス−レチノールのＲＤＨ５デヒドロゲナーゼへの結合を促進する（Ｇａｍｂｌｅ  ＭＶ１ら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９９９  ４０：２２７９−９２）。最後に、未知の機序による細胞外の細胞質を介したＲＤＨ５からの１１−シス−レチナールの転位をシャペロンで行う。ヒトＣＲＡＬＢＰの遺伝子突然変異の特徴は、このタンパク質がロッドおよびコーンにおける効果的な暗順応に必須であることを示し得る（Ｍ．Ｓ．Ｂｕｒｓｔｅｄｔら、２００３  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４３：２５５９−２５７１）。
【０００６】
ＳＥＣ１４様Ｃｌａｖｅｓｉｎ１および２は、両方とも、ニューロンにおいて排他的に発現する。これらのタンパク質は、細胞質ゾルであるが、エンドソーム膜において豊富なホスファチジルイノシトール３，５−ビスホスフェートと相互作用することによって、ＣＲＡＬ−ＴＲＩＯドメインを介してエンドソーム／リソソームコンパートメントにも結合する（Ｋａｔｏｈ  Ｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９  ２８４：２７６４６−５４）。Ｃｌａｖｅｓｉｎは、クラスリン被覆小胞上に豊富にあり、クラスリン重鎖およびアダプタータンパク質−１、クラスリン被覆小胞の主要な被覆成分と複合体を形成する。干渉ＲＮＡのレンチウイルス送達を用いたニューロン中のｃｌａｖｅｓｉｎのアイソフォーム特異的ノックダウンは、後期エンドソーム／リソソーム形態の独特のニューロン特異的調節を示す（Ｋａｔｏｈ  Ｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９  ２８４：２７６４６−５４）。
【０００７】
α−ＴＴＰおよびＣＲＡＬＢＰなどのＳＥＣ１４様タンパク質は、低いナノモル親和性を有する特定の天然同族リガンドに結合する。このような同族リガンドは、血漿から隔離され、不溶性脂質の自由拡散を損なう熱力学的障壁を克服するように選択される（Ｃｏｈｎ，Ｗ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  １９９９  ６９：１５６−１５７）。眼におけるＣＲＡＬＢＰ媒介性細胞内１１−シス−レチナール輸送は、持続的視力にとって不可欠である（Ｍ．Ｓ．Ｂｕｒｓｔｅｄｔら、２００３  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４３：２５５９−２５７１）。α−ＴＴＰは、最高の抗酸化効力を有するビタミンＥ異性体であるα−トコフェロールを選択的に保持することにより、成人男性のビタミンＥ恒常性にとって必須である（Ｋｏｎｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ａｒａｉ，Ｈ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ２０１５  １６：１９−３４）。
【０００８】
数多くの遺伝性疾患は、ＳＥＣ１４様タンパク質に関連している。ＴＴＰＡのヒトα−ＴＴＰ遺伝子産物の欠損が、常染色体劣性のビタミンＥ単独欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）の表現型を引き起こすことが報告されている（Ｏｕａｈｃｈｉ  Ｋ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５  ９：１４１−１４５）。この疾患は、検出不能であるか、または顕著に低下したビタミンＥの血漿レベル、脊髄小脳変性症、運動失調、反射消失、および固有受容感覚の喪失を特徴とする。関連する神経学的表現型を伴う運動失調の別の形態は、ＡＴＣＡＹのＳＥＣ１４様Ｃａｙｔａｘｉｎ遺伝子産物における突然変異によって引き起こされる（Ｂｏｍａｒ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００３  ３５：２６４−２６９）。ＲＬＢＰ１遺伝子のＣＲＡＬＢＰ遺伝子産物の欠損は、重度の網膜病変を引き起こす（Ｍａｗ  Ｍ．Ａ．ら、１９９７  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１９８−２００）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＳＥＣ１４様タンパク質ファミリーおよびその同族リガンドのこれまでに知られていないナノ球状凝集体の驚くべき発見、その製造方法およびその使用に関する。
【００１０】
従って、第１の態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアを提供する。好ましくは、同数は３〜６０であり、さらに好ましくは、同数は９〜６０である。本発明の非常に好ましい実施形態において、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、本発明のナノスフェアの製造方法および本発明のナノスフェアの使用を提供する。
【００１２】
したがって、さらなる態様では、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、（ｄ）ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドがナノスフェアに集合できるようにするステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩからナノスフェアを分離するステップと、（ｆ）任意によりナノスフェアを精製するステップと、を含む、方法を提供する。
【００１３】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、（ｄ）溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去するステップであって、界面活性剤を溶液ＩＩＩから除去することにより、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドがナノスフェアに集合できるようになるステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩからナノスフェアを分離するステップと、（ｆ）任意によりナノスフェアを精製するステップと、を含む方法を提供する。
【００１４】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、（ｄ）ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドが、ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようにするステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩから単量体複合体を分離するステップと、（ｆ）任意により単量体複合体を精製するステップと、（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、溶液ＩＶが単量体複合体を含み、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液ＩＶは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｈ）単量体複合体がナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む方法を提供する。
【００１５】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、（ｄ）溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去するステップであって、界面活性剤を溶液ＩＩＩから除去することにより、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドが、ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようになるステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩから単量体複合体を分離するステップと、（ｆ）任意により単量体複合体を精製するステップと、（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、溶液ＩＶが単量体複合体を含み、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液ＩＶは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｈ）単量体複合体がナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む方法を提供する。
【００１６】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、（ａ）本発明のナノスフェアと、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは炎症性疾患は関節炎である）の治療または予防方法、好ましくは治療方法において使用する、本発明のナノスフェアまたは医薬組成物を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様および好ましい実施形態は、この説明が進むにつれて明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Ａ）単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌおよびα−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアからなる同族リガンド複合体の混合物の分取用ＳＥＣトレースを示す図である。ピークＳは、０．７６Ｍｄａの質量に相関する保持容量を中心とした、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアを表し、ピークＭは、３２ｋＤａの質量に相関する単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌを表す。ピークＶは、カラムの空隙容積を中心として、高度に凝集したタンパク質を含む。
【図１Ｂ】Ｂ）アポ−α−ＴＴＰ（黒色トレース）、ならびに単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌおよびα−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアからなる同族リガンド複合体の混合物を表すホロ−α−ＴＴＰ（灰色トレース）の分析用ＳＥＣトレースを示す図である。アポ−α−ＴＴＰ（黒いトレース）は、６４ｋＤａの質量と相関する保持容量を中心とした二量体アポ−α−ＴＴＰ、および３２ｋＤａの質量と相関する保持容量を中心とした単量体のアポ−α−ＴＴＰの存在を示す。ホロ−α−ＴＴＰ（灰色のトレース）は、０．７６Ｍｄａの質量と相関する保持容量を中心としたα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェア、および３２ｋＤａの質量と相関する単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌの存在を示す。軽微なピークＤは、６４ｋＤａの質量に相関する保持容量を中心とした、同族リガンドを含まない二量体アポ−α−ＴＴＰからなることが最も目に見える可能性が高い。
【図２】球状物体の物理的存在を明らかにした分取用ＳＥＣによるピークＳのピーク画分の陰性染色透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。
【図３】組換えα−ＴＴＰの存在が抗６ｘＨｉｓおよび抗α−ＴＴＰ抗体によって確認された分取用ＳＥＣのピーク画分のウェスタンブロットである。
【図４】分取用ＳＥＣのピーク画分Ｍ、ＤおよびＳの天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。ピークＳは、約０．８０ＭＤａの質量を有するオリゴマーα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアを含み、ピークＤは、主に約６４ｋＤａの質量を有するホモ二量体アポ−α−ＴＴＰを含み、ピークＭは、ほとんどが単量体なα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌを含む。
【図５】単量体アポ−α−ＴＴＰ（１）、単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌ（２）およびオリゴマーα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェア（３）について、２２２ｎｍでＣＤ分光法によってモニターされた熱変性トレースを示す図である。
【図６】オリゴマーα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの二十四量体集合体の原子モデルを示す図である。左側には、３つの対称軸に沿った原子モデルの図が描かれている。挿入図は、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの酸化形態における２回対称軸に沿った菱面体チャネルにわたる２つの隣接するＣ８０間のシスチン結合形成を示す。右側には、ノード上に置かれた単量体のリボン画を有するねじれてキャンテレーションされた（ｃａｎｔｅｌｌａｔｅｄ）立方体（ＴＣＣ）の幾何学的表現が示されている。
【図７Ａ】Ａ）３回軸上のタンパク質−タンパク質相互作用の概略図（Ａ）、およびα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの安定性に寄与するタンパク質−タンパク質相互作用の概要表（Ｂ）である。ＦｏｌｄＸ（Ｇｕｅｒｏｉｓ  Ｒ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＪＥ，Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｌ（２００２），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ３２０：３６９−３８７）コンピュータアルゴリズムを使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を評価した。このために、後のエネルギー計算および構造比較のための参照構造を生成するために、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアが最小化された（２９８Ｋ、ｐＨ７、０．０５Ｍのイオン強度）。
【図７Ｂ】Ａ）３回軸上のタンパク質−タンパク質相互作用の概略図（Ａ）、およびα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの安定性に寄与するタンパク質−タンパク質相互作用の概要表（Ｂ）である。ＦｏｌｄＸ（Ｇｕｅｒｏｉｓ  Ｒ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＪＥ，Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｌ（２００２），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ３２０：３６９−３８７）コンピュータアルゴリズムを使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を評価した。このために、後のエネルギー計算および構造比較のための参照構造を生成するために、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアが最小化された（２９８Ｋ、ｐＨ７、０．０５Ｍのイオン強度）。
【図８Ａ】Ａ）主に疎水性な残基が、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの三量体形態をもたらす特徴的な配列パターンでクラスタ化されている。非常に類似したパターンの疎水性残基がＣＲＡＬＢＰの一次配列（配列番号８および配列番号９）に存在する。
【図８Ｂ】Ｂ）ＭＵＬＴＡＬＩＮウェブサービス（Ｃｏｒｐｅｔ，Ｆ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８  １６：１０８８１−１０８９０）を用いた、他のＳＥＣ１４様タンパク質におけるα−ＴＴＰのＮ末端セグメント（ａａ４７〜９０）および関連セグメントの一次配列アラインメントを示す図である。保存されたまたは半保存された残基は明るい灰色で示されている。特徴的な配列パターン（配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２  配列番号１３および配列番号１４）の主に疎水性な残基は、黒い三角形によってマークされる。
【図８Ｃ】Ｃ）α−ＴＴＰ（ａａ４７〜９０）およびＣＲＡＬＢＰ（ａａ９１〜１２３）の二次ヘリックス−ループ−ヘリックス構造のＰＳＩＰＲＥＤに基づく比較が、高い構造類似性（配列番号１５および配列番号１６）を示す図である。
【図９】明るい灰色で強調表示されている特徴的な配列パターンの残基を有する、好ましいＳＥＣ１４様タンパク質の一次配列が描写されている図である。
【図１０】分析用ＳＥＣからのＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールナノスフェアのピーク画分の陰性染色透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像であり、９〜４８ｎｍのサイズ範囲の球状物体の物理的存在を明らかにした。
【図１１Ａ】単量体ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールおよびＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールナノスフェアとからなる同族リガンド複合体の混合物の分析用ＳＥＣトレースを示す図である。Ａ）保持容量１７．５ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１５ｍｌでのピークは、平均質量４２０ｋＤａに相関する。Ｂ）コール酸ナトリウムの存在下で予め添加したリガンドとの混合物：保持容量１７．８ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１３．５ｍｌでのピークは、平均質量１７００ｋＤａに相関する。Ｃ）エタノールの存在下で予め添加したリガンドとの混合物：保持容量１７．８ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１５ｍｌでのピークは、平均質量５４０ｋＤａに相関する。実線トレースは２８０ｎｍで監視されたタンパク質の濃度を表し、破線トレースは４０５ｎｍで監視された結合９−シス−レチナールの濃度を表す。数字の付いた矢印は、ホモオリゴマー複合体の多重度を示す。
【図１１Ｂ】単量体ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールおよびＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールナノスフェアとからなる同族リガンド複合体の混合物の分析用ＳＥＣトレースを示す図である。Ａ）保持容量１７．５ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１５ｍｌでのピークは、平均質量４２０ｋＤａに相関する。Ｂ）コール酸ナトリウムの存在下で予め添加したリガンドとの混合物：保持容量１７．８ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１３．５ｍｌでのピークは、平均質量１７００ｋＤａに相関する。Ｃ）エタノールの存在下で予め添加したリガンドとの混合物：保持容量１７．８ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１５ｍｌでのピークは、平均質量５４０ｋＤａに相関する。実線トレースは２８０ｎｍで監視されたタンパク質の濃度を表し、破線トレースは４０５ｎｍで監視された結合９−シス−レチナールの濃度を表す。数字の付いた矢印は、ホモオリゴマー複合体の多重度を示す。
【図１１Ｃ】単量体ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールおよびＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールナノスフェアとからなる同族リガンド複合体の混合物の分析用ＳＥＣトレースを示す図である。Ａ）保持容量１７．５ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１５ｍｌでのピークは、平均質量４２０ｋＤａに相関する。Ｂ）コール酸ナトリウムの存在下で予め添加したリガンドとの混合物：保持容量１７．８ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１３．５ｍｌでのピークは、平均質量１７００ｋＤａに相関する。Ｃ）エタノールの存在下で予め添加したリガンドとの混合物：保持容量１７．８ｍｌでのピークは、平均質量３６ｋＤａに相関し、１５ｍｌでのピークは、平均質量５４０ｋＤａに相関する。実線トレースは２８０ｎｍで監視されたタンパク質の濃度を表し、破線トレースは４０５ｎｍで監視された結合９−シス−レチナールの濃度を表す。数字の付いた矢印は、ホモオリゴマー複合体の多重度を示す。
【図１２Ａ】単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌのトランスサイトーシスおよびα−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアのトランスサイトーシスの（Ａ）ヒト臍（ｕｍｂｅｌｉｃａｌ）静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単層におけるトランスサイトーシス（斜線領域）の速度および傍細胞フラックス（暗領域）の速度の同時判定、（Ｂ）異種ヒト上皮性結腸直腸腺癌細胞（ＣａＣｏ−２）単層におけるトランスサイトーシスおよび傍細胞フラックスの対応する速度を示す図である。
【図１２Ｂ】単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌのトランスサイトーシスおよびα−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアのトランスサイトーシスの（Ａ）ヒト臍（ｕｍｂｅｌｉｃａｌ）静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単層におけるトランスサイトーシス（斜線領域）の速度および傍細胞フラックス（暗領域）の速度の同時判定、（Ｂ）異種ヒト上皮性結腸直腸腺癌細胞（ＣａＣｏ−２）単層におけるトランスサイトーシスおよび傍細胞フラックスの対応する速度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２１】
ナノスフェア：本明細書で使用する用語「ナノスフェア」は、複数のＳＥＣ１４様タンパク質および同数のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドによって形成された、典型的に、かつ好ましくは多面体構造の組成物を指す。典型的に、かつ好ましくは、数は、少なくとも３で最大６０である。さらに好ましくは、数は、少なくとも９で最大で６０である。さらにより好ましくは、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの同数は３の倍数であり、さらに好ましくは、同数は３、９、１２、２４、３６、４８および６０であり、さらにより好ましくは９、１２、２４、３６、４８および６０である。さらにより好ましくは、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの同数は３の倍数であり、数は、少なくとも３で最大６０であり、さらに好ましくは、同数は３、９、１２、２４、３６、４８および６０であり、さらにより好ましくは９、１２、２４、３６、４８および６０である。典型的に、かつ好ましくは、多面体構造体は、好ましくは本実施例３Ｅに記載されている様式で動的光散乱によって測定され、５ｎｍ〜６０ｎｍのサイズ、好ましくは７ｎｍ〜５５ｎｍのサイズ、さらに好ましくは９ｎｍ〜４８ｎｍのサイズである。従って、本明細書で使用されるように、典型的に、かつ好ましくは、用語「ナノスフェア」は、好ましくは動的光散乱によって測定されるように、およびさらに好ましくは本実施例３Ｅに記載されているように、５ｎｍ〜６０ｎｍのサイズ、好ましくは７ｎｍ〜５５ｎｍのサイズ、さらに好ましくは９ｎｍ〜４８ｎｍのサイズの多面体構造体を指し、多面体構造体は、少なくとも３、さらに好ましくは、多面体構造は、少なくとも９、さらに好ましくは少なくとも１２、またはさらにより好ましくは少なくとも２４、３６、４８または６０コピーのＳＥＣ１４様タンパク質および同数のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドによって形成される。典型的に、かつ好ましくは、一定数の同数のＳＥＣ１４様タンパク質は、好ましくは動的光散乱によって測定されるとおり、さらに好ましくは本実施例３Ｅに記載されるように、５ｎｍ〜６０ｎｍのサイズ、好ましくは７ｎｍ〜５５ｎｍのサイズ、さらに好ましくは９ｎｍ〜４８ｎｍのサイズの多面体構造を有する中空タンパク質コートを形成し、多面体構造においては、同数のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドが凝集される。したがって、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドのナノスフェアにおける化学量論比は１：１である。典型的に、かつ好ましくは、ナノスフェアは、１つのタイプのＳＥＣ１４様タンパク質および同数のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドから構成される。典型的に、かつ好ましくは、多面体構造を有する中空コートを形成する同数のＳＥＣ１４様タンパク質構築ブロックは、本明細書において「プロトマー」とも呼ばれる。
【００２２】
ＳＥＣ１４様タンパク質：用語「ＳＥＣ１４様タンパク質」または「ＳＥＣ１４様タンパク質ファミリー」は、本明細書において同義で使用されるように、タンパク質構造ドメインを指す（Ｓｈａ  Ｂ１ら、Ｎａｔｕｒｅ．１９９８  ３９１：５０６−１０）、典型的に、かつ好ましくは小さな親油性分子に結合するＣＲＡＬ−ＴＲＩＯ（Ｐａｎａｇａｂｋｏ  Ｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３  ４２：６４６７−６４７４）と命名される。ＣＲＡＬ−ＴＲＩＯ脂質結合ドメインは、α／βドメインであり、大きな疎水性ポケットを形成する。そのポケット床は、平行なベータシートを構成する鎖２、３、４および５を有する６つのβ鎖から構成され、鎖１および６は逆平行である。空洞の側面はα−ヘリックスによって形成される。ＣＲＡＬ−ＴＲＩＯドメインは、タンパク質の全てまたはその一部のみを構成することができる（Ｓｈａ  Ｂ１ら、Ｎａｔｕｒｅ．１９９８  ３９１：５０６−１０；Ｐａｎａｇａｂｋｏ  Ｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００３  ４２：６４６７−６４７４）。典型的に、かつ好ましくは、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含まない形態は、本明細書では、ＳＥＣ１４様タンパク質の「アポ」形態とも呼ばれる。
【００２３】
ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンド：本明細書で使用される場合、用語「ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンド」は、少なくとも、典型的に、かつ好ましくは、１〜１００ｎＭのナノモル親和性を有し、さらに典型的に、かつ好ましくは６〜６０ｎＭの親和性を有する、ＣＲＡＬ−ＴＲＩＯ脂質結合ポケットに結合する分子、典型的に、かつ好ましくは脂質を指し、この分子は典型的に、かつ好ましくはＳＥＣ１４様タンパク質と機能的に会合している。機能的に会合している：本明細書で使用される場合、用語「機能的に会合している」は、少なくとも、典型的には、かつ好ましくは１〜１００ｎＭのナノモルの親和性を有し、さらに典型的には、かつ好ましくは６〜６０ｎＭの親和性を有する、本明細書で同族リガンドと呼ばれる生理的同族リガンドの結合に決定的に依存するＳＥＣ１４様タンパク質の生理学的機能を指す。一例として、Ｒ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールは、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の同族リガンドを表し、Ｒ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールは、最も強力な脂溶性抗酸化物質のうちの１つを表す。
【００２４】
結合：本明細書で使用される場合、用語「結合」は、２つの分子が一緒に結合されるすべての可能な方法、好ましくは化学的相互作用を指す。化学的相互作用には、共有結合および非共有結合による相互作用が含まれる。非共有結合相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であるが、共有結合相互作用は共有結合に基づく。好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質の各々は、少なくとも１つの共有結合または少なくとも１つの非共有結合相互作用によってＳＥＣ１４様タンパク質の少なくとも１つの同族リガンドのうちの１つに結合する。さらに好ましくは、ＳＥＣ１４様タンパク質の各々は、少なくとも１つの非共有結合相互作用によってＳＥＣ１４様タンパク質の少なくとも１つの同族リガンドのうちの１つに結合する。
【００２５】
配列同一性：２つの所与のアミノ酸配列の配列同一性は、両方の配列のアライメントに基づいて決定される。当業者は、配列同一性を決定するためのアルゴリズムを利用することができる。好ましくは、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）または「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）など、公的に利用可能なコンピュータホモロジープログラムを用いて、これにより、好ましくは、ＮＣＢＩホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムによって、そこで提供されるデフォルト設定を用いて、決定される。典型的で、かつ好ましい標準設定は以下の通りである：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリの範囲での最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１；拡張１；構成調整：条件付き構成スコアマトリクス調整。
【００２６】
残基に対応する位置：別のアミノ酸配列の所与の残基に対応するアミノ酸配列の位置は、配列アラインメントによって、典型的に、かつ好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて、最も好ましくは標準設定を用いて同定することができる。典型的で、かつ好ましい標準設定は以下の通りである：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリの範囲での最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１；拡張１；構成調整：条件付き構成スコアマトリクス調整。「残基に対応する位置」の非常に好ましい決定が、本発明の好ましい実施形態に対応するＳＥＣ１４様タンパク質α−ＴＴＰおよびＣＲＡＬＢＰによって、図８Ａおよび図８Ｂに概説されている。
【００２７】
有効量：本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するために必要な、または十分な量を指す。好ましくは、用語「有効量」は、（ｉ）特定の疾患、医学的状態、もしくは障害を治療もしくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患、医学的状態、もしくは障害のうちの１つ以上の症状を軽減する、改善する、もしくは排除する、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、医学的状態、もしくは障害の１つ以上の症状の発症を予防または遅延させる本発明のナノスフェアの量を指す。本発明のナノスフェアまたは医薬組成物の有効量は、こうした選択された結果を達成する量であり、このような量は、当業者によって日常的に決定され得る。有効量は、投与される特定の組成物および対象のサイズに依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の特定の組成物の有効量を経験上、決定することができる。
【００２８】
本発明は、ＳＥＣ１４様タンパク質ファミリーおよびその同族リガンドのこれまでに知られていないナノ球状凝集体の驚くべき発見、その製造方法およびその使用に関する。
【００２９】
従って、第１の態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアを提供する。好ましくは、同数は３〜６０である。さらに好ましくは、同数は９〜６０である。
【００３０】
本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数である。本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、同数は３〜６０である。したがって、本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、同数は、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、または６０である。
【００３１】
本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３、９、１２、２４、３６、４８または６０である。本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、同数は９、１２，２４，３６，４８または６０である。本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、同数は２４または４８である。
【００３２】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態において、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００３３】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質は、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）であり、好ましくは、同数は２４である。好ましくは、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の同族リガンドがトコフェロールであり、好ましくはトコフェロールがα−トコフェロールであり、さらに好ましくはα−トコフェロールがＲ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールである。
【００３４】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態において、ＳＥＣ１４様タンパク質は、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）であり、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の同族リガンドはα−トコフェロールであり、同数は３〜６０であり、好ましくは、α−トコフェロールは、Ｒ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールである。
【００３５】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態において、ＳＥＣ１４様タンパク質は、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）であり、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の同族リガンドはα−トコフェロールであり、同数は９〜６０であり、好ましくは、α−トコフェロールは、Ｒ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールである。
【００３６】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質は、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）であり、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の同族リガンドはＲ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールであり、同数は３〜６０であり、好ましくは、同数は３、９、１２、２４、３６、４８または６０である。本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、同数は２４または４８である。
【００３７】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質は、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）であり、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）の同族リガンドは、Ｒ，Ｒ，Ｒ−α−トコフェロールであり、同数は９〜６０であり、好ましくは、同数は９、１２、２４、３６、４８または６０である。本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、同数は２４または４８である。
【００３８】
もう１つの非常に好ましい実施形態では、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアを提供し、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００３９】
本発明のもう１つの非常に好ましい実施形態において、ＳＥＣ１４様タンパク質は、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）である。好ましくは、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドはシス−レチノールまたはシスレチナールであり、さらに好ましくはシス−レチノールまたはシスレチナールは、９−シス−レチナール、１１−シス−レチナール、９，１３−ジシス−レチナール、９−シス−レチノール、１１−シス−レチノールおよび９，１３−ジシス−レチノールから選択される。本発明の非常に好ましい実施形態では、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドは、９−シス−レチナールである。本発明のさらに非常に好ましい実施形態では、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドは１１−シス−レチナールである。本発明の別の好ましい実施形態では、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドは９−シス−レチノールである。本発明のもう１つの別の好ましい実施形態では、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドは１１−シス−レチノールである。本発明のもう１つの別の実施形態では、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドは、９，１３−ジシス−レチナールである。本発明のもう１つの別の実施形態では、ＣＲＡＬＢＰの同族リガンドは、９，１３−ジシス−レチノールである。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、ＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）配列番号３（α−ＴＴＰヒト）、（ｂ）配列番号４（ＣＲＡＬＢＰヒト）、（ｃ）配列番号５（ＣＬＶＳ１ヒト）、（ｄ）配列番号６（ＣＬＶＳ２ヒト）、および（ｅ）配列番号７（ＴＴＰＡＬヒト）から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質は、アミノ酸配列ストレッチを含み、アミノ酸配列ストレッチは、（ａ）配列番号３のアミノ酸５６〜７４、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１００〜１１８、（ｃ）配列番号５のアミノ酸８０〜９８、（ｄ）配列番号６のアミノ酸５８〜７６、および（ｅ）配列番号７のアミノ酸８５〜１０３から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列は、（ａ）配列番号３の５６位に対応するＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列の位置でＬおよびＩから選択されるアミノ酸残基、（ｂ）配列番号３の６１位に対応するＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列の位置のアミノ酸残基Ｆ、（ｃ）配列番号３の６３位に対応するＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列の位置でＬ、Ｖ、Ｑ、ＨおよびＹから選択されるアミノ酸残基、（ｄ）配列番号３の６７位に対応するＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列の位置でＷ、Ｙ、ＦおよびＬから選択されるアミノ酸残基、（ｅ）配列番号３の７０位に対応するＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列の位置のアミノ酸残基Ｌ、または（ｆ）配列番号３の７４位に対応するＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列の位置でＹ、Ｖ、ＦおよびＨから選択されるアミノ酸残基、を含み、ＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｆ）のアミノ酸残基のうちのいずれか１つを少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ含み、ナノスフェアに含まれる同数のＳＥＣ１４様タンパク質の第１番目のアミノ酸配列の（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの１つの、好ましくは少なくとも４つのアミノ酸残基が、ナノスフェアに含まれる同数のＳＥＣ１４様タンパク質の第２番目および第３番目のアミノ酸配列の（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれか１つの、少なくとも４つのアミノ酸残基に結合される。
【００４３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質は、アミノ酸配列を含み、ＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列は、（ａ）配列番号３の５６位に対応する位置でＬおよびＩから選択されるアミノ酸残基、（ｂ）配列番号３の６１位に対応する位置のアミノ酸残基Ｆ、（ｃ）配列番号３の６３位に対応する位置でＬ、Ｖ、Ｑ、ＨおよびＹから選択されるアミノ酸残基、（ｄ）配列番号３の６７位に対応する位置でＷ、Ｙ、ＦおよびＬから選択されるアミノ酸残基、（ｅ）配列番号３の７０位に対応する位置のアミノ酸残基Ｌ、または（ｆ）配列番号３の位置７４に対応する位置でＹ、Ｖ、ＦおよびＨから選択されるアミノ酸残基、を含み、ＳＥＣ１４様タンパク質のアミノ酸配列は、（ａ）〜（ｆ）のアミノ酸残基のうちのいずれか１つを少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ含み、ナノスフェアに含まれる同数のＳＥＣ１４様タンパク質の第１番目のアミノ酸配列の（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの１つの、好ましくは少なくとも４つのアミノ酸残基が、ナノスフェアに含まれる同数のＳＥＣ１４様タンパク質の第２番目および第３番目のアミノ酸配列の（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれか１つの、少なくとも４つのアミノ酸残基に結合される。
【００４４】
この理論に拘束されるものではないが、前述のアミノ配列残基およびパターンは、ＳＥＣ１４様タンパク質の三量体凝集体の形成に有利であり、これは本発明のナノスフェアの形成に有利であると考えられる。さらに、この理論に拘束されるものではないが、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを隔離するプロセスは、そのＳＥＣ１４様タンパク質の可動ゲートと呼ばれるそのＣ末端領域のヘリックスエレメントの閉鎖運動を含む、ＳＥＣ１４様タンパク質におけるコンフォメーションの再配列を伴うと考えられている。したがって、この理論に拘束されるものではないが、三量体凝集体および特に本発明のナノスフェアの形成は、上述のアミノ配列残基および他の方法では溶媒に接近できないパターンを保持するヘリックスターンヘリックスセグメントのアンマスキングに影響するＳＥＣ１４様タンパク質のＮ末端領域内におけるコンフォメーションの再構成に依存すると考えられている。典型的には、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの装填手順により、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィーなどの好適なクロマトグラフィー方法によって精製することができる単量体およびナノスフェアタンパク質−リガンド複合体の混合物が生じる。
【００４５】
さらに、本発明者らは、本発明のナノスフェア、特にＳＥＣ１４様タンパク質α−ＴＴＰの本発明のナノスフェアが、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞を介して効率的にトランスサイトーシスが行われる（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｅ）ことを示した。このプロセスは、標準的な上皮細胞系を介する同じナノスフェアのトランスサイトーシスが欠如していることが実証されることによって非常に特異的であることが示された。結果として、本発明のナノスフェアは、血流に注入されたときに血液脳関門を克服するのに非常に好適であると予想される。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの各々は、少なくとも１つの非共有結合的相互作用によってＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つに結合し、好ましくは、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの各々は、少なくとも１つの非共有結合的相互作用によってＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つのみに結合する。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は３〜６０である、ナノスフェアの製造方法を提供し、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、（ｄ）ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドがナノスフェアに集合できるようにするステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩからナノスフェアを分離するステップと、（ｆ）任意によりナノスフェアを精製するステップと、を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。特に、本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は９〜６０である、ナノスフェアの製造方法を提供し、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、（ｄ）ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドがナノスフェアに集合できるようにするステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩからナノスフェアを分離するステップと、（ｆ）任意によりナノスフェアを精製するステップと、を含む方法を提供する。
【００５０】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。特に、本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００５１】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．２５ｍＭ〜０．７５ｍＭである。
【００５２】
さらに好ましい実施形態では、溶液ＩのｐＨは７〜８である。好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭである。さらに好ましくは、塩の濃度は３０ｍＭ〜３５０ｍＭであり、さらに好ましくは塩の濃度は１００ｍＭ〜２５０ｍＭである。
【００５３】
さらに好ましい実施形態において、塩は、一価、二価、三価または四価の無機または有機塩から選択され、さらに好ましくは、塩は二価、三価または四価の無機または有機塩から選択され、さらにより好ましくは、塩は、ＨＰＯ４２−、ＳＯ４２−、酒石酸塩、マロン酸塩、Ｄ−ミオ−イノシトール１，４，５−三リン酸およびＤ−ミオ−イノシトール１，３，４，５−テトラキス（リン酸）カリウム塩から選択される二価、三価または四価の陰イオンを含む。
【００５４】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は３０μＭ〜３００ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は２００μＭ〜２００ｍＭである。
【００５５】
溶液ＩＩの溶媒は水溶性溶媒である。典型的に、かつ好ましくは、水溶性溶媒が製造者によって供給されたときに、水溶性溶媒に典型的に含まれる少量の水以外に、任意の水の追加量は含まずに、溶液ＩＩのために使用される水溶性溶媒が少量、すなわち１０％（容量／容量）以下の水を含み得ることは、本発明の範囲内である。さらに好ましくは、水溶性溶媒は、８％（容量／容量）超、好ましくは７％（容量／容量）超、さらに好ましくは５％（容量／容量）超の水を含まない。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、水溶性溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、メチルペンタンジオールおよびグリセロールから選択され、さらに好ましくは、水溶性溶媒は、エタノール、イソプロパノール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は、３：１〜１：３（モル／モル）であり、好ましくは、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は２：１〜１：２（モル／モル）である。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態では、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容積は、１〜５％（容量／容量）であり、好ましくは、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容積は、２〜４％（容量／容量）である。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドをナノスフェアに集合させることができることは、溶液ＩＩＩを４〜３７℃の温度に、好ましくは室温で１時間から２４時間、好ましくは１２から２４時間の期間、維持することによって行われる。
【００６０】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ナノスフェアを溶液ＩＩＩから分離することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態では、ナノスフェアを精製することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００６２】
さらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は３〜６０である、本明細書に記載の本発明のナノスフェアの製造方法を提供し、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、（ｄ）溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去するステップであって、界面活性剤を溶液ＩＩＩから除去することにより、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドがナノスフェアに集合できるようになるステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩからナノスフェアを分離するステップと、（ｆ）任意によりナノスフェアを精製するステップと、を含む方法を提供する。本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。特に、本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は９〜６０である、本明細書に記載の本発明のナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、（ｄ）溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去するステップであって、界面活性剤を溶液ＩＩＩから除去することにより、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドがナノスフェアに集合できるようになるステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩからナノスフェアを分離するステップと、（ｆ）任意によりナノスフェアを精製するステップと、を含む方法を提供する。本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。特に、本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００６４】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。
【００６５】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．２５ｍＭ〜０．７５ｍＭである。さらに好ましい実施形態では、溶液ＩのｐＨは７〜８である。
【００６６】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は３０μＭ〜３００ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は２００μＭ〜２００ｍＭである。
【００６７】
本発明の方法では、溶液ＩＩは界面活性剤を含む。界面活性剤は、溶液ＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを可溶化するのに役立つ。本発明の好ましい実施形態では、界面活性剤は、非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤から選択される。好ましくは、非イオン系界面活性剤は、オクチルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−グルコシド、デシルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−マルトシド、デシルβ−Ｄ−マルトシド、ウンデシルβ−Ｄ−マルトシド、ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ポリエチレングリコール２００から選択される。好ましくは、陰イオン系界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシグリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムから選択される。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、非イオン系界面活性剤は、オクチルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−グルコシド、デシルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−マルトシド、デシルβ−Ｄ−マルトシド、ウンデシルβ−Ｄ−マルトシド、ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ポリエチレングリコール２００から選択される。
【００６９】
さらなる非常に好ましい実施形態では、陰イオン系界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシグリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムから選択される。非常に好ましい実施形態では、界面活性剤は陰イオン系界面活性剤であり、陰イオン系界面活性剤はコール酸ナトリウムである。
【００７０】
溶液ＩＩ中で使用される界面活性剤の濃度は、当業者によって決定され得、溶液ＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを可溶化するために当業者の知識に基づいており、濃度は使用される界面活性剤の性質に依存する。典型的に、かつ好ましくは溶液ＩＩ中の界面活性剤の濃度は、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、典型的に、かつ好ましくは非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤の臨界ミセル濃度より高い。典型的に、かつ好ましくは、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、典型的に、かつ好ましくは非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤の臨界ミセル濃度は、０．５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は１０ｍＭ以上である。
【００７１】
さらに好ましい実施形態において、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度と、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は、３：１〜１：３（モル／モル）であり、好ましくは、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度と、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は２：１〜１：２（モル／モル）である。
【００７２】
さらに好ましい実施形態において、溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去することは、透析によって実施され、好ましくは透析により溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去することは、膜にわたって行われ、好ましくは、膜は１〜２５ｋＤ、好ましくは５〜２０ｋＤ、さらにより好ましくは１０〜１５ｋＤの分画分子量を含む。好ましくは、透析は第１の緩衝液を用いて行い、第１の緩衝液は、アルカリ金属のハロゲン化物を含み、好ましくはアルカリ金属のハロゲン化物は、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムであり、さらに好ましくはアルカリ金属のハロゲン化物は、塩化ナトリウムであり、好ましくはアルカリ金属のハロゲン化物の濃度、好ましくは、第１の緩衝液中の塩化ナトリウムの濃度は、１〜１０００ｍＭであり、好ましくは１０〜５００ｍＭであり、より好ましくは５０〜２５０ｍＭであり、最も好ましくは１００〜２００ｍＭである。
【００７３】
透析は、４℃〜３７℃の温度で行うことが好ましく、透析は、４〜２４時間かけて行うことが好ましい。
【００７４】
さらに好ましい実施形態では、ナノスフェアを溶液ＩＩＩから分離することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００７５】
さらに好ましい実施形態では、ナノスフェアを精製することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００７６】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含む、好ましくはこれらからなるナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度が１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｂ）溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩの溶媒が水溶性溶媒であるステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であり、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容量が０．５〜８％（容量／容量）であるステップと、（ｄ）ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドが、ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようにするステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩから単量体複合体を分離するステップと、（ｆ）任意により単量体複合体を精製するステップと、（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、溶液ＩＶが単量体複合体を含み、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液ＩＶは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｈ）単量体複合体がナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む方法を提供する。
【００７７】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。
【００７８】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．２５ｍＭ〜０．７５ｍＭである。
【００７９】
さらに好ましい実施形態では、溶液ＩのｐＨは７〜８である。好ましくは、溶液Ｉは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭである。さらに好ましくは、塩の濃度は３０ｍＭ〜３５０ｍＭであり、さらに好ましくは塩の濃度は１００ｍＭ〜２５０ｍＭである。
【００８０】
さらに好ましい実施形態において、塩は、一価、二価、三価または四価の無機または有機塩から選択され、さらに好ましくは、塩は二価、三価または四価の無機または有機塩から選択され、さらにより好ましくは、塩は、ＨＰＯ４２−、ＳＯ４２−、酒石酸塩、マロン酸塩、Ｄ−ミオ−イノシトール１，４，５−三リン酸およびＤ−ミオ−イノシトール１，３，４，５−テトラキス（リン酸）カリウム塩から選択される二価、三価または四価の陰イオンを含む。
【００８１】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は３０μＭ〜３００ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は２００μＭ〜２００ｍＭである。
【００８２】
溶液ＩＩの溶媒は水溶性溶媒である。典型的に、かつ好ましくは、水溶性溶媒が製造者によって供給されたときに、水溶性溶媒に典型的に含まれる少量の水以外に、任意の水の追加量は含まずに、溶液ＩＩのために使用される水溶性溶媒が少量、すなわち１０％（容量／容量）以下の水を含み得ることは、本発明の範囲内である。さらに好ましくは、水溶性溶媒は、８％（容量／容量）超、好ましくは７％（容量／容量）超、さらに好ましくは５％（容量／容量）超の水を含まない。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態において、水溶性溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、メチルペンタンジオールおよびグリセロールから選択され、さらに好ましくは、水溶性溶媒は、エタノール、イソプロパノール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は、３：１〜１：３（モル／モル）であり、好ましくは、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は２：１〜１：２（モル／モル）である。
【００８５】
本発明の別の好ましい実施形態では、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容積は、１〜５％（容量／容量）であり、好ましくは、溶液ＩＩＩ中の水溶性溶媒の容積は、２〜４％（容量／容量）である。
【００８６】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドで単量体複合体を形成できることは、溶液ＩＩＩを４〜３７℃の温度に、好ましくは室温で１時間から２４時間、好ましくは１２から２４時間の期間、維持することによって行われる。
【００８７】
本発明の別の好ましい実施形態では、単量体複合体を溶液ＩＩＩから分離することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００８８】
本発明の別の好ましい実施形態では、単量体複合体を精製することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００８９】
本発明の別の好ましい実施形態では、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度は１２ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、溶液ＩＶのｐＨは７〜８であり、さらに好ましくは溶液ＩＶのｐＨは７．２〜７．８である。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、溶液ＩＶは、塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、好ましくは、塩は、一価、二価、三価または四価の無機または有機塩から選択される。さらに好ましくは、塩は、二価、三価または四価の無機または有機塩から選択され、さらにより好ましくは、塩は、ＨＰＯ４２−、ＳＯ４２−、酒石酸塩、マロン酸塩、Ｄ−ミオ−イノシトール１，４，５−三リン酸およびＤ−ミオ−イノシトール１，３，４，５−テトラキス（リン酸）カリウム塩から選択される二価、三価または四価の陰イオンを含む。
【００９１】
別の好ましい実施形態では、溶液ＩＶは、ＰＥＧを含み、ＰＥＧの濃度は１容量／容量％〜３０容量／容量％であり、好ましくは、ＰＥＧは、ＰＥＧ２００、４００、８００、２０００、３３５０  ４０００、８０００、１２０００、１６０００などの２００〜３０，０００、より好ましくは２００〜２００００の重量平均分子量を有する。
【００９２】
溶液ＩＶに含まれる場合、塩およびＰＥＧは、本発明の溶液ＩＶに有益であり、かつ好ましい、両親媒性沈殿剤を表す。両親媒性沈殿剤および本発明のうちの好ましい１つなどの両親媒性沈殿剤の混合物は、当業者に公知である。他の両親媒性沈殿剤および両親媒性沈殿剤の混合物も本発明に包含される。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、単量体複合体をナノスフェアの結晶を形成させ得ることは、４℃〜３７℃の一定温度で行われ、好ましくは、一定温度は１０℃〜２０℃であり、さらに好ましくは、温度は１６℃〜１９℃である。
【００９４】
さらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は３〜６０である、本明細書に記載の本発明のナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、（ｄ）溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去するステップであって、界面活性剤を溶液ＩＩＩから除去することにより、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドが、ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようになるステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩから単量体複合体を分離するステップと、（ｆ）任意により単量体複合体を精製するステップと、（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、溶液ＩＶが単量体複合体を含み、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液ＩＶは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｈ）単量体複合体がナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む方法を提供する。本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。特に、本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は９〜６０である、本明細書に記載の本発明のナノスフェアの製造方法であって、（ａ）水溶液Ｉ中にＳＥＣ１４様タンパク質を提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度が１μＭ〜５ｍＭであり、溶液ＩのｐＨが６〜９であるステップと、（ｂ）水溶液ＩＩ中にＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを提供するステップであって、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度が５μＭ〜５００ｍＭであり、溶液ＩＩが界面活性剤を含むステップと、（ｃ）溶液Ｉと溶液ＩＩとを混合することによって溶液ＩＩＩを生成するステップであって、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度とＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比が４：１〜１：４（モル／モル）であるステップと、（ｄ）溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去するステップであって、界面活性剤を溶液ＩＩＩから除去することにより、ＳＥＣ１４様タンパク質およびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドが、ＳＥＣ１４様タンパク質のうちの１つおよびＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドのうちの１つからなる単量体複合体を形成できるようになるステップと、（ｅ）溶液ＩＩＩから単量体複合体を分離するステップと、（ｆ）任意により単量体複合体を精製するステップと、（ｇ）水溶液ＩＶを生成するステップであって、溶液ＩＶが単量体複合体を含み、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであり、溶液ＩＶのｐＨが６〜９であり、好ましくは、溶液ＩＶは塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであるステップと、（ｈ）単量体複合体がナノスフェアの結晶を形成できるようになるステップと、含む方法を提供する。本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。特に、本発明の非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【００９６】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態は、本発明のナノスフェアの好ましいおよび非常に好ましい実施形態を含む。
【００９７】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．１ｍＭ〜１ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度は０．２５ｍＭ〜０．７５ｍＭである。さらに好ましい実施形態では、溶液ＩのｐＨは７〜８である。
【００９８】
さらに好ましい実施形態では、溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は３０μＭ〜３００ｍＭであり、さらに好ましくは溶液Ｉ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度は２００μＭ〜２００ｍＭである。
【００９９】
本発明の方法では、溶液ＩＩは界面活性剤を含む。界面活性剤は、溶液ＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを可溶化するのに役立つ。本発明の好ましい実施形態では、界面活性剤は、非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤から選択される。好ましくは、非イオン系界面活性剤は、オクチルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−グルコシド、デシルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−マルトシド、デシルβ−Ｄ−マルトシド、ウンデシルβ−Ｄ−マルトシド、ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ポリエチレングリコール２００から選択される。好ましくは、陰イオン系界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシグリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムから選択される。
【０１００】
さらに好ましい実施形態では、非イオン系界面活性剤は、オクチルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−グルコシド、デシルβ−Ｄ−グルコシド、ノニルβ−Ｄ−マルトシド、デシルβ−Ｄ−マルトシド、ウンデシルβ−Ｄ−マルトシド、ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ポリエチレングリコール２００から選択される。
【０１０１】
さらなる非常に好ましい実施形態では、陰イオン系界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシグリココール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムから選択される。非常に好ましい実施形態では、界面活性剤は陰イオン系界面活性剤であり、陰イオン系界面活性剤はコール酸ナトリウムである。
【０１０２】
溶液ＩＩ中で使用される界面活性剤の濃度は、当業者によって決定され得、溶液ＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを可溶化するために当業者の知識に基づいており、濃度は使用される界面活性剤の性質に依存する。典型的に、かつ好ましくは溶液ＩＩ中の界面活性剤の濃度は、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、典型的に、かつ好ましくは非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤の臨界ミセル濃度より高い。典型的に、かつ好ましくは、界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）、典型的に、かつ好ましくは非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤の臨界ミセル濃度は、０．５ｍＭ以上であり、さらに好ましくは非イオン系界面活性剤または陰イオン系界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は１０ｍＭ以上である。
【０１０３】
さらに好ましい実施形態において、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度と、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は、３：１〜１：３（モル／モル）であり、好ましくは、溶液ＩＩＩ中のＳＥＣ１４様タンパク質の濃度と、ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドの濃度との比は２：１〜１：２（モル／モル）である。
【０１０４】
さらに好ましい実施形態において、溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去することは、透析によって実施され、好ましくは透析により溶液ＩＩＩから界面活性剤を除去することは、膜にわたって行われ、好ましくは、膜は１〜２５ｋＤ、好ましくは５〜２０ｋＤ、さらにより好ましくは１０〜１５ｋＤの分画分子量を含む。好ましくは、透析は第１の緩衝液を用いて行い、第１の緩衝液は、アルカリ金属のハロゲン化物を含み、好ましくはアルカリ金属のハロゲン化物は、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムであり、さらに好ましくはアルカリ金属のハロゲン化物は、塩化ナトリウムであり、好ましくはアルカリ金属のハロゲン化物の濃度、好ましくは、第１の緩衝液中の塩化ナトリウムの濃度は、１〜１０００ｍＭであり、好ましくは１０〜５００ｍＭであり、より好ましくは５０〜２５０ｍＭであり、最も好ましくは１００〜２００ｍＭである。
【０１０５】
透析は、４℃〜３７℃の温度で行うことが好ましく、透析は、４〜２４時間かけて行うことが好ましい。
【０１０６】
さらに好ましい実施形態では、単量体複合体を溶液ＩＩＩから分離することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【０１０７】
さらに好ましい実施形態では、単量体複合体を精製することは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。
【０１０８】
本発明の別の好ましい実施形態では、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは、溶液ＩＶ中の単量体複合体の濃度は１２ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、溶液ＩＶのｐＨは７〜８であり、さらに好ましくは溶液ＩＶのｐＨは７．２〜７．８である。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、溶液ＩＶは、塩を含み、塩の濃度は１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、好ましくは、塩は、一価、二価、三価または四価の無機または有機塩から選択される。さらに好ましくは、塩は、二価、三価または四価の無機または有機塩から選択され、さらにより好ましくは、塩は、ＨＰＯ４２−、ＳＯ４２−、酒石酸塩、マロン酸塩、Ｄ−ミオ−イノシトール１，４，５−三リン酸およびＤ−ミオ−イノシトール１，３，４，５−テトラキス（リン酸）カリウム塩から選択される二価、三価または四価の陰イオンを含む。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、溶液ＩＶは、ＰＥＧを含み、ＰＥＧの濃度は１容量／容量％〜３０容量／容量％であり、好ましくは、ＰＥＧは、ＰＥＧ２００、４００、８００、２０００、３３５０  ４０００、８０００、１２０００、１６０００などの２００〜３０，０００、より好ましくは２００〜２００００の重量平均分子量を有する。
【０１１１】
溶液ＩＶに含まれる場合、塩およびＰＥＧは、本発明の溶液ＩＶに有益であり、かつ好ましい、両親媒性沈殿剤を表す。両親媒性沈殿剤および本発明のうちの好ましい１つなどの両親媒性沈殿剤の混合物は、当業者に公知である。他の両親媒性沈殿剤および両親媒性沈殿剤の混合物も本発明に包含される。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、単量体複合体をナノスフェアの結晶を形成させ得ることは、４℃〜３７℃の一定温度で行われ、好ましくは、一定温度は１０℃〜２０℃であり、さらに好ましくは、温度は１６℃〜１９℃である。
【０１１３】
典型的に、かつ好ましくは、ＳＥＣ１４様タンパク質は、宿主においてＳＥＣ１４様タンパク質の異種発現によって得られ、好ましくは、宿主は大腸菌であり、任意により異種発現ＳＥＣ１４様タンパク質は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー、さらに好ましくはＮｉ−ＮＴＡ樹脂上のアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
【０１１４】
もう１つのさらなる態様において、本発明は、（ａ）本発明のナノスフェアと、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するための本発明によるナノスフェアまたは医薬組成物を提供する。
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは炎症性疾患は関節炎である）の治療または予防方法、好ましくは治療方法において使用する、本発明のナノスフェアまたは医薬組成物を提供する。好ましくは、治療または予防の方法は、ヒトに対するものである。さらに好ましいのは、高齢者における予防である。
【０１１７】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明によるナノスフェアまたは医薬組成物は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは炎症性疾患は関節炎である）の治療または予防方法、好ましくは治療方法において使用するためのものである。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、ヒトにおけるビタミンＥのレベルを増加させることによって軽減される疾患を治療または予防する方法において使用するための本発明によるナノスフェアまたは医薬組成物を提供し、好ましくは、疾患は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症  創傷治癒障害または炎症性疾患（さらに好ましくは炎症性疾患は関節炎である）であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）から選択される。
【０１１９】
本発明による創傷治癒の治療および／または予防は、好ましくは、手術後のケロイド形成の減少を増やすのに有益であると考えられる。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、ヒトにおけるビタミンＡのレベルを増加させることによって軽減される疾患を治療または予防する方法において使用するための本発明によるナノスフェアまたは医薬組成物を提供し、好ましくは、疾患は、眼疾患またはヒト不妊症であり、ヒトＳＥＣ−１４様タンパク質は、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）である。
【０１２１】
本発明によるヒト妊孕性の治療および／または予防、それ故に、特に、カップルの不妊症の治療および／または予防は、女性の子宮機能または精子数もしくは精子の運動性のいずれかの障害の軽減および／または排除に有益であると考えられている。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは炎症性疾患は関節炎である）の治療または予防、好ましくは治療のための薬剤の製造において、本発明によるナノスフェアの使用または医薬組成物の使用を提供する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは炎症性疾患は関節炎である）の治療または予防、好ましくは治療のための、本発明によるナノスフェアの使用または医薬組成物の使用を提供する。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、ビタミンＥ欠乏を伴う運動失調症（ＡＶＥＤ）、筋ジストロフィー、低脂血症、低リポタンパク血症、異常脂質血症、ヒト不妊症、創傷治癒障害または炎症性疾患（好ましくは炎症性疾患は関節炎である）の治療および／または予防方法、好ましくは治療方法を提供し、ヒトにおいて、この方法は、有効量の本発明のナノスフェアまたは医薬組成物をヒトに投与することを含む。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、ヒトにおけるビタミンＡのレベルを増加させることによって軽減される疾患を治療または予防する方法において使用するための本発明によるナノスフェアまたは医薬組成物を提供し、好ましくは、疾患は、眼疾患であり、ヒトＳＥＣ−１４様タンパク質は、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）である。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の方法のいずれか１つにより得ることができるナノスフェアを提供し、ナノスフェアは、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は３〜６０である。本発明のさらなる非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明の方法のいずれか１つにより得ることができるナノスフェアを提供し、ナノスフェアは、同数の（ｉ）ヒトＳＥＣ１４様タンパク質、および（ｉｉ）ＳＥＣ１４様タンパク質の同族リガンドを含み、好ましくはこれらからなり、好ましくは、同数は９〜６０である。本発明のさらなる非常に好ましい実施形態では、同数は３の倍数であり、好ましくは、数は３〜６０であり、ヒトＳＥＣ１４様タンパク質は、（ａ）α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）、（ｂ）細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、（ｃ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ１（ＣＬＶＳ１）、（ｄ）Ｃｌａｖｅｓｉｎ２（ＣＬＶＳ２）、および（ｅ）α−トコフェロール輸送タンパク質様（ＴＴＰＡＬ）から選択される。
実施例
実施例１
単量体α−ＴＴＰの発現および精製
【０１２８】
ヒトｃＤＮＡライブラリー由来のＰＣＲ産物を、プライマー５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＣ−ＧＡＴＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１）および５’−ＣＣＧＴＣＡＴＴＧＡＡＴＧＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴＧＣ−３’（配列番号２）を用いて、ｐＥＴ−２８ａベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ．ＵＳＡ）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより、Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグ付きα−ＴＴＰ発現構築物を作製した。タンパク質の発現は、Ｔ７プロモーターの制御下で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株で行った。形質転換した細菌を３７℃で光学密度（ＯＤ６００）０．８まで増殖させ、３３０ｍＭイソプロピル−チオガラクトピラノシドにより、３０℃で一晩誘導させた。細菌は、７’３００ｇおよび４℃で３０分間遠心することによって収穫した。１リットルの培地から得られた細菌ペレットを、２５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．５（容量／容量）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）に再懸濁した。収穫した細胞を、Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌで２回破壊した。溶解物を３９’０００ｇ、４℃で４０分間遠心した。清澄化された上清を１２ｍｌのＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）の入ったカラムに通過させた。２８０ｎｍでのＵＶ吸収がベースラインのレベルを回復するまで、洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）でカラムをすすぐことにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）でタンパク質を溶出した。溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）中、４℃で一晩、トロンビン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて（Ｈｉｓ）６タグを切断した。アポ−α−ＴＴＰの凝集を防ぐために、タンパク質溶出液をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，ＤＥ）遠心濃縮器（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）を用いて、≦２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
実施例２
単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌおよびα−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアからなる同族リガンド複合体の混合物の調製
【０１２９】
α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌ同族リガンド複合体の形成は、新たに調製したアポ−α−ＴＴＰを界面活性剤可溶化α−トコフェロールの存在下で透析することによって達成された。要するに、１ｍｇのα−Ｔｏｌの液滴に４０．９ｍｇの固体のコール酸ナトリウムを重層し、続いて１ｍｌの溶出緩衝液（２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁させた。全ての材料が溶解して透明溶液になるまで、懸濁液を超音波浴で処理した。アポ−α−ＴＴＰ（≦２．５ｍｇ／ｍｌで１１ｍｌ）には、トコフェロール−コール酸ナトリウム溶液を９：１（容量／容量）比で補足し、１２〜１４ｋＤａのＭＷＣＯ範囲を有するＣｅｌｌｕＳｅｐ  Ｔ３透析管状膜（Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＴＸ，ＵＳＡ）に移した。透析は３リットルの緩衝液（２０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対して４℃で６時間ずつ２段階にて行った。透析液（１２ｍｌ）を最終濃度０．０１％（容量／容量）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加したＭｉｌｌｅｘ  ＧＰ０．２２μｍフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）で濾過し、２ｍｌまで減少させ、分取用サイズ排除クロマトグラフィーで分離した。単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌ同族リガンド複合体のサイズに対応する画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ；Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，ＤＥ）を用いて２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶化に直接使用した。α−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアのサイズに対応する画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮器（ＭＷＣＯ３０ｋＤａ）を用いて１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により再精製した。
実施例３
α−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの特徴
Ａ．サイズ排除クロマトグラフィー
【０１３０】
α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの分取および分析用ＳＥＣを、それぞれ、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｓｏｓｅ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅおよびＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で実施した（両方ともＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に付属）。分析は、ＳＥＣ緩衝液（１０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中、６℃で０．５ｍｌ／分（分析）から１．５ｍｌ／分（分取）の範囲の流速で実施した。ＳＥＣカラムは、市販のタンパク質較正キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて較正した（図１）。
Ｂ．陰性染色透過電子顕微鏡法
【０１３１】
３００μｇ／ｍｌの濃度でのα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアのサンプルを、事前に空気中で低圧でグロー放電により親水性にしておいたｐａｒｌｏｄｉｏｎ炭素被覆銅グリッドに１分間吸着させた。吸着後、グリッドを３滴の二回蒸留水で洗浄し、２滴の０．７５％蟻酸ウラニルで染色した。Ｍｏｒａｄａ  ＣＣＤカメラ（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を装備した、８０ｋＶで動作するＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２透過電子顕微鏡で電子顕微鏡写真を記録した。画像解析は、ＩｍａｇｅＪ画像処理プログラムＶ１．４９ｏ（ＮＩＨ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて行った（図２）。
Ｃ．ウェスタンブロッティング
【０１３２】
端的にいえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを１２％ＰＡＧＥゲル上で行った。ニトロセルロース膜でブロッティングする前に、転写緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３）中でゲルを２０分間インキュベートした。ブロッティングは、半乾式ブロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて１３０ｍＡで５０分間行った。分析のために、α−ＴＴＰ（α−ＴＴＰ抗体［Ｃ２Ｃ３］Ｃ−ターム、ＧｅｎｅＴｅｘ  Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する市販の一次抗体を使用した。ＬＩ−ＣＯＲのＩＲＤｙｅ二次抗体をＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷまたはＩＲＤｙｅ  ６８０ＲＤのいずれかによる視覚化に用い、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線システム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＥ，ＵＳＡ）でスキャンを行った（図３）。
Ｄ．ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動
【０１３３】
ネイティブＰＡＧＥは、プレキャストＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４〜１６％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。各タンパク質サンプル（２０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ）を等容量のネイティブＰＡＧＥローディングバッファ（６２ｍＭトリス、２５％グリセロール、１％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）と混合した。ゲルをランニングバッファ（５０ｍＭトリシン、５０ｍＭ  ＢｉｓＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中、３０分間４℃で、１６０Ｖ、次に、１８０Ｖで、ブロモフェノールブルーマーカがゲルの末端に達するまで作動させた。タンパク質の視覚化は、ＳＹＰＲＯルビータンパク質ゲル染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色することによって達成された（図４）。
Ｅ．動的光散乱
【０１３４】
分析用ＳＥＣ（１０ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）から得られたα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェア（濃度範囲０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ）の新鮮なプール画分を動的光散乱（ＤＬＳ）によって分析した。１ｃｍの経路長さのＵＶｅｔｔｅｓ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ＤＥ）を用いて、ＤｙｎａＰｒｏ分子サイズ測定装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で各サンプルのサイズ分布プロファイルの測定を行った。各データセットは、最低１００回の単一測定を含み、少なくとも５分間収集された。ＤＬＳ三重測定から、流体力学的半径１７．６±３．８ｎｍが得られた。
Ｆ．熱力学的分析
【０１３５】
Ｐｅｌｔｉｅｒ  ＰＦＤ−３５０Ｓ温度コントローラを備えたＪａｓｃｏ  Ｊ−１７５分光偏光計を用いて、アポ−α−ＴＴＰ、単量体α−ＴＴＰおよびα−ＴＴＰ−α−ＴｏｌナノスフェアのＣＤスペクトルおよび温度依存性タンパク質アンフォールディングを測定した。このために、１ｍｍの経路長の石英セル（１００μｌサンプル）を使用し、タンパク質濃度は０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲であった。応答は、５ｎｍの帯域幅で１秒に設定した。ＣＤスペクトルの結果に続いて、温度依存性タンパク質アンフォールディング実験のために波長を２２２ｎｍに調節した。温度は、２Ｋ／分の速度で、単量体α−ＴＴＰについては、２０℃から８０℃までで、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアについては２０℃から１００℃までで、０．５Ｋずつ上昇させた。転移温度（Ｔｍ）は、アンフォールディング曲線の１次導関数から計算した（図５）。
実施例４
α−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの結晶化および構造決定
【０１３６】
結晶は、１８℃で１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓナトリウム（ｐＨ７．５）中の１０〜１５％ＰＥＧ−４０００、１００〜１７５ｍＭ硫酸アンモニウムの範囲のリザーバ溶液を用いて、ハンギングまたはシッティングドロップ蒸気拡散のいずれかによって成長させた。新たに調製した単量体α−ＴＴＰ同族リガンド複合体を１２〜２２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で使用した。完全に還元された最高品質の結晶α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアは、３／１〜２／１（容量／容量）の範囲のタンパク質の液滴比でリザーバ上に２週間以内に観察された。結晶は、２０〜８０μｍの範囲のエッジ長さを有する立方体形状を有していた。完全に酸化されたα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの同形結晶は２ヶ月後に回収された。すべての結晶を、グリセロールを最終濃度２０％（容量／容量）まで２段階で添加した後、窒素中で急速凍結した。回折データは、Ｄｅｃｔｒｉｓ  Ｐｉｌａｔｕｓ  ２Ｍ  ＣＣＤ検出器（ＤＥＣＴＲＩＳ  Ｌｔｄ．，Ｂａｄｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、１００ＫでＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＳＬＳ）シンクロトロンビームラインＸ０６ＤＡ（ＰＳＩ  Ｖｉｌｌｉｇｅｎ）で収集した。すべてのデータは、ＸＤＳで指数付けされ、統合され、スケーリングされた（Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ．；Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．２０１０  ６６：１２５−１３２）。Ｐｈａｓｅｒ−ＭＲは、検索構造として単量体α−ＴＴＰ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＯＩＰ）の短縮型構造モデル（残基４７〜２７５）を用いて、初期相を計算するために使用した。還元されたα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアおよび酸化されたα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの原子モデルは、双方とも、ＣＯＯＴを用いた反復サイクルの手動モデル構築（Ｅｍｓｌｅｙ  Ｐ，Ｌｏｈｋａｍｐ  Ｂ，Ｓｃｏｔｔ  ＷＧ，Ｃｏｗｔａｎ  Ｋ．；Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．２０１０  ６６：４８６−５０１）およびＰｈｅｎｉｘプログラムスイートを用いた制限付き精密化（Ａｄａｍｓ  ＰＤら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．２０１０  ６６：２１３−２２１）により精密化された。両方の構造体の座標および構造因子は、ＩＤコード５ＤＩ６および５ＤＬＵでＲＣＳＢタンパク質データバンクに寄託されている。
実施例５
α−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの形成を導くタンパク質−タンパク質相互作用の特徴
【０１３７】
α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアは、単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌ同族リガンド複合体の単分散溶液から出発したときに、専ら結晶化した。ナノスフェアは、２４個のプロトマーで構成され、それぞれに結合した１つのα−Ｔｏｌがウイルスカプシドを連想させる回転楕円体のシェルに組み立てられている。両方のレドックス状態のα−ＴＴＰ−α−ＴｏｌナノスフェアのＸ線構造モデルは、可溶性調製物からのα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌ粒子の測定とサイズが一致する１６．８ｎｍの外径を有する。この構造は、直径８．１ｎｍの明らかに中空のキャビティによってさらに特徴付けられる。粒子のＸ線構造モデルのより詳細な検査により、各タンパク質モノマーの中心を頂点とし、それらをタンパク質−タンパク質接触界面を介して連結する、ねじれてキャンテレーションされた立方体（点対称群Ｏ、Ｓｃｈｏｅｎｆｌｉｅｓ表記法）のトポロジーが明らかになった。その点群によれば、ナノスフェアの対称操作は、３つのＣ４軸、４つのＣ３軸、および６つのＣ２軸（図６）の周りのみの本義回転である。
【０１３８】
それぞれのα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌモノマーは、最初の４つの隣接分子と接触している。それぞれのモノマーは、このような隣接分子のうちの２つを用いて、Ｃ３対称軸と交差する８つの三量体界面のうちの１つを形成し、第２の２つの隣接分子を用いて、Ｃ４軸のうちの１つと交差する６つの四量体界面のうちの１つを構築することを含む。四量体ユニットは、いずれにしても直接接していない第２の隣接ユニットによって完成する。１２個の菱形面が、ナノケージを完成させ、それぞれがＣ２対称軸のうちの１つを横切る。このような界面の２つの非対称エッジは、三量体および四量体集合体のエッジに対応する。各単量体は、これらの界面のうちの２つに関与する。α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの酸化形態は、本明細書では、菱面体チャネルを介して２つのα−ＴＴＰ−α−ＴｏｌユニットのＣ８０を架橋するジスルフィド架橋を１つ提示する。したがって、酸化されたα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアは、すべての三量体サブユニットに共有結合する全部で１２のＳＳ架橋を含む。酸化は、ヘリックスセグメントの局部的なほぐれを伴う（ａａ６５〜７９）。また、酸化は、隣接するＣ末端（ａａ２７５〜２７８）の規則的なα−ヘリックスモチーフへの構造化を誘導する。α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの還元形態と酸化形態との間には、他の重要な構造的差異は観察されない。
【０１３９】
高度に充填された三量体界面は、いくつかのタンパク質−タンパク質接触によって構成される。各ユニットは、ヘリックスセグメント４９〜５６、５７〜６４ループ、およびヘリックスセグメント６５〜７９の最初のターンならびに残基Ｒ１５１を介して、以下のものと相互作用する。パートナータンパク質は、ヘリックスセグメント６５〜７９内のアミノ酸６７〜７４およびＣ末端残基（ａａ２７５〜２７８）と相互作用する（図７）。
【０１４０】
三量体界面は、疎水性の充填によって特徴付けられ、塩橋によってさらに安定化される。これらの静電的相互作用は、主に界面の外部に局在し、１つのタンパク質上の残基Ｒ５７およびＲ１５１は、対向するユニットのＣ末端と相互作用する。残基Ｄ６４およびＫ７１は、界面のコアにより近く局在化して、１つの追加の塩橋（３．８７Åを構成する。まさしく中央で、３つのＷ６７残基は、ファンデルワールススタッキングによってＴ字型に互いに相互作用する。本発明者らの観察によれば、これは、全α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェア内に２つ以上のタンパク質を含む唯一の接触点である。
【０１４１】
Ｗ６７は、Ｌ６３、Ｆ６１およびＬ５６と一緒に、界面全体の結合自由エネルギーのおよそ３／４（７７％）を占める古典的な「ホットスポット」を構成する（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５  ２６７：３８３−３８６）。
実施例６
α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの三量体形態を導くタンパク質−タンパク質相互作用モチーフ内に保存された配列パターンの同定
【０１４２】
α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌモノマーのα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアプロトマーとの３次元重なりは、単量体α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌにおいて、Ｎ末端セグメント（ａａ１〜４７）のフォールディングにより、三量体界面が溶媒に曝されないことを立証した。ＳＥＣ１４様ファミリーの異なるメンバーの既知の構造の比較により、Ｎ末端セグメント１〜４７がＸ線散乱によって常に完全に検出されるとは限らないことを立証しており、このことは、タンパク質のこの部分があまり構造化されず、リフォールディングする傾向があることを示している（Ｓｈａ  Ｂ１，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＳＥ，Ｂａｎｋａｉｔｉｓ  ＶＡ，Ｌｕｏ  Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８  ３９１：５０６−１０；Ｍｅｉｅｒ  Ｒ，Ｔｏｍｉｚａｋｉ  Ｔ，Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｂｒｉｅｓｅ  Ｃ，Ｂａｕｍａｎｎ  Ｕ，Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ａ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３  ３３１：７２５−７３４；Ｈｅ  Ｘ，Ｌｏｂｓｉｇｅｒ  Ｊ，Ｓｔｏｃｋｅｒ  Ａ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００９  １０６：１８５４５−１８５５０；Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  Ｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５  １９０：２６１−２７０）。三量体集合体の形成は、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアの外側空間へのα−ＴＴＰのＮ末端尾部の移動による、三量体化モチーフのアンマスキングを必要とすると結論付けられた。従って、１〜４７セグメントは、恐らくコンフォメーションが定まっていないために、ナノスフェア上の構造において検出されなかった。
【０１４３】
ＰＳＩＰＲＥＤウェブサービスを使用することによる二次構造の分析は、α−ＴＴＰ（ａａ４７〜９０）およびＣＲＡＬＢＰ（ａａ９１〜１２３）の対応するヘリックスターンヘリックスモチーフが非常に類似していることを示した。モチーフ内では、主に疎水性な残基の特徴的な配列パターンが、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェア内の三量体形態を導くことが決定された（図８）。Ｍｕｌｔａｌｉｎ  ｗｅｂｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｏｒｐｅｔ，Ｆ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８  １６：１０８８１−１０８９０）による、関連するＳＥＣ１４様タンパク質の対応するセグメントとのα−ＴＴＰのＮ末端セグメント（ａａ４７〜９０）の一次配列アライメントにより、ヘリックスセグメント４９〜５６、５７〜６４ループ、およびヘリックスセグメントの第１のターン６５〜７９（図８）内で残基が多く保存されていることが明らかになった。
【０１４４】
ＭＵＬＴＡＬＩＮアライメントに使用されたヒト起源の配列は以下の通りであった：ｓｐ｜Ｐ４９６３８｜ＴＴＰＡ＿ヒトα−トコフェロール輸送タンパク質、ｓｐ｜Ｑ９ＢＴＸ７｜ＴＴＰＡＬ＿ヒトα−トコフェロール輸送タンパク質様、ｓｐ｜Ｑ８ＩＵＱ０｜ＣＬＶＳ１＿ヒトＣｌａｖｅｓｉｎ−１、ｓｐ｜Ｑ５ＳＹＣ１｜ＣＬＶＳ２＿ヒトＣｌａｖｅｓｉｎ−２およびｓｐ｜Ｐ１２２７１｜ＲＬＢＰ１＿ヒトレチンアルデヒド結合タンパク質１（図９）。
実施例７
単量体ＣＲＡＬＢＰの発現および精製
【０１４５】
ヒトＲＬＢＰ１  ｃＤＮＡは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｎｚｅｎｔｒｕｍ  ｆｕｒ  Ｇｅｎｏｍｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ＧｍｂＨ（ＪＲＡＵｐ９６９Ｄ１０２０Ｄ）から得た。Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグ付きＣＲＡＬＢＰ過剰発現ベクターは、ｐＥＴ−２８ａベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより構築した。Ｎ末端（Ｈｉｓ）６タグ付き構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。細胞を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地１２０ｍＬ中に、３７℃で撹拌しながら一晩培養した。一晩培養物を使用して、６ＬのＬＢ培地（３０μｇ／ｍＬカナマイシン）に播種した。培養物を２０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させ、次いで１ｍＭのイソプロピル−チオガラクトピラノシドで１６時間誘導した。細胞を５０００ｇで４５分間遠心することによって収穫し、２５０ｍＬの氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１重量／容量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で再懸濁した。細胞を２０分間の超音波処理により破壊し、溶解物を２０，０００ｇで３５分間遠心して残渣を除去した。（Ｈｉｓ）６タグ付きＣＲＡＬＢＰを、製造者の指示に従って、１０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ  ＳＵＰＥＲＦＬＯＷ（Ｑｉａｇｅｎ）でのアフィニティークロマトグラフィーにより、上清から精製した。簡潔に述べると、溶解物を予め溶解緩衝液中で平衡化したカラムに装填し、２００ｍＬの溶解緩衝液で洗浄し、３５ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭイミダゾール；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で溶出した。典型的な収量は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより判定した場合、純粋なＣＲＡＬＢＰ  ３５〜４０ｍｇであった。アポ−ＣＲＡＬＢＰの凝集を防ぐために、タンパク質溶出液をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，ＤＥ）遠心濃縮器（ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ）を用いて１０ｍｇ／ｍｌ以下まで濃縮した。
実施例８
単量体ＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールおよびＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールホモオリゴマーの同族リガンド複合体からなる混合物の調製
【０１４６】
１１−シス−レチナールを含むすべての手順は、明記されていない限り、４℃で暗赤色照明（４０Ｗルビー電球）下において行った。ＣＲＡＬＢＰを、コール酸ナトリウム（５５．７ｍＭ）の存在下で１６．７ｍＭの濃度でリガンドを添加し、混合物を４℃で１５分間インキュベートすることにより、１１−シス−レチナール（ＣＲＡＬＢＰよりも１．５倍モルが多い）に結合させた。あるいは、ＣＲＡＬＢＰを、エタノール中１６．７ｍＭの濃度でリガンドを添加し、混合物を４℃で１５分間、または４５分以内の間インキュベートすることにより、１１−シス−レチナール（ＣＲＡＬＢＰより１．５倍モルが多い）に結合させた。（Ｈｉｓ）６タグをトロンビンプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）２０ユニットを加え、その後、４℃で一晩インキュベートすることにより切断した。次いで、タンパク質溶液をＮｉ−ＮＴＡカラムに通して、未切断物質を除去した。素通り画分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。ＣＲＡＬＢＰの同族リガンド複合体をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離した。
実施例９
単量体ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールおよびＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールホモオリゴマーの同族リガンド複合体からなる混合物の調製
【０１４７】
９−シス−レチナールを含むすべての手順は、明記されていない限り、４℃で暗赤色照明（４０Ｗルビー電球）下において行った。ＣＲＡＬＢＰを、コール酸ナトリウム（５５．７ｍＭ）の存在下で１６．７ｍＭの濃度でリガンドを添加し、混合物を４℃で１５分間インキュベートすることにより、９−シス−レチナール（ＣＲＡＬＢＰよりも１．５倍モルが過剰である）に結合させた。あるいは、ＣＲＡＬＢＰを、エタノール中１６．７ｍＭの濃度でリガンドを添加し、混合物を４℃で１５分間インキュベートすることにより、９−シス−レチナール（ＣＲＡＬＢＰより１．５倍モルが多い）に結合させた。（Ｈｉｓ）６タグを４℃で一晩トロンビンプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）２０ユニットで切断し、タンパク質溶液をＮｉ−ＮＴＡカラムに通した。素通り画分をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。ＣＲＡＬＢＰの同族リガンド複合体の混合物をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分離した（図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ）。
実施例１０
ＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールホモオリゴマー複合体の特徴
Ａ．サイズ排除クロマトグラフィー
【０１４８】
ＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールホモオリゴマーの分取および分析用ＳＥＣを、それぞれ、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｓｏｓｅ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅおよびＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で実施した（両方ともＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に付属）。分析は、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中、６℃で０．５ｍｌ／分（分析）から１．５ｍｌ／分（分取）の範囲の流速で実施した。ＳＥＣカラムは両方とも、市販のタンパク質較正キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて較正した。単量体ＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールおよびホモオリゴマーＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールを表すピーク画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
Ｂ．陰性染色透過電子顕微鏡法
【０１４９】
０．３ｍｇ／ｍｌの濃度でのＣＲＡＬＢＰ−１１−シス−レチナールホモオリゴマーのサンプルを、事前に空気中で低圧でグロー放電により親水性にしておいたｐａｒｌｏｄｉｏｎ炭素被覆銅グリッドに１分間吸着させた。吸着後、グリッドを３滴の二回蒸留水で洗浄し、２滴の０．７５％蟻酸ウラニルで染色した。Ｍｏｒａｄａ  ＣＣＤカメラ（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を装備した、８０ｋＶで動作するＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２透過電子顕微鏡で電子顕微鏡写真を記録した。画像解析は、ＩｍａｇｅＪ画像処理プログラムＶ１．４９０（ＮＩＨ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて行った（図１０）。
実施例１１
ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールホモオリゴマー複合体の特徴
Ａ．サイズ排除クロマトグラフィー
【０１５０】
ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールホモオリゴマーの分取および分析用ＳＥＣを、それぞれ、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｓｏｓｅ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅおよびＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ＳＥＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で実施した（両方ともＡＥＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）に付属）。分析は、ＳＥＣ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中、６℃で０．５ｍｌ／分（分析）から１．５ｍｌ／分（分取）の範囲の流速で実施した。ＳＥＣカラムは両方とも、市販のタンパク質較正キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて較正した。単量体ＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールおよびホモオリゴマーＣＲＡＬＢＰ−９−シス−レチナールを表すピーク画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した（図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ）。
実施例１２
α−ＴＴＰ三量体を含むα−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアによるトランスサイトーシス
【０１５１】
分析用ゲル濾過からの単量体および二十四量体タンパク質に対応するα−ＴＴＰ画分を、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ（Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．（１９８４）．，Ｐｏｌａｋ，Ｊ．，Ｖａｒｎｄｅｌ，Ｉ．Ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．９８）によって以前に記述されたＰＩＥＲＣＥ法に従って、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。簡潔に述べると、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０）にタンパク質サンプルを移し、同じ緩衝液中で予め平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて標識した。ＦＩＴＣは、使用前に新たに無水ＤＭＳＯ（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。標識反応は、１ｍｌのタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）に５０μｌのＦＩＴＣ  ＤＭＳＯ溶液を添加することによって開始させた。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、予めＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて過剰のＦＩＴＣを除去することにより停止させた。標識されたタンパク質サンプルを、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で分析用ＳＥＣにより最終的に精製した。トランスフェリンを同じ方法で標識し、トランスサイトーシス実験における陽性対照として使用した。α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアによるトランスサイトーシスの促進を実証するために、本発明者らはヒト臍静脈由来の内皮初代細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。ＨＵＶＥＣは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃプロトコールに従って、トリプシン／ＥＤＴＡの補助により新鮮な臍帯から単離した。内皮起源の真正性は、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）およびＣＤ３１の陽性免疫蛍光共染色によって確認された。ＨＵＶＥＣは、ゼラチンを事前にコーティング（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）した、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、トランズウェルシステム（０．４μｍの孔径を有する浸透性ポリエステル膜；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）で培養した。培地を隔日に交換しながら、細胞は、培養７日以内に緊密な単層を形成させた。トランスサイトーシスを測定するために、２００μｇのＲＩＴＣ−デキストラン７０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）および２００μｇのＦＩＴＣ標識単量体α−ＴＴＰ、α−ＴＴＰ−α−Ｔｏｌナノスフェアのいずれか、またはトランスフェリン（陽性対照として）を含む媒体を頂端チャンバ（ａｐｉｃａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）にそれぞれ適用する。頂端チャンバにサンプルを添加した後の様々な時点（１５、３０、４５、６０、１２０、１８０および２４０分）で１００μｌの基底外側の培地をサンプリングすることにより、輸送を監視した。続いて、基底外側のアリコートを、Ｔｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００マイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，ＣＨ）を用いて、蛍光について４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長（ＦＩＴＣ）で分析した後、５４５ｎｍの励起波長および発光波長５９０ｎｍ（ＲＩＴＣ）で測定を行った。上皮細胞モデルとして表されるＣａＣｏ−２／ＴＣ７細胞株（ヒト結腸直腸腺癌細胞；Ｄｒ．Ｇ．Ｌｉｅｔｚ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫ）より厚意により提供）を、トランスサイトーシス実験における陰性対照として使用した。グルコース４．５ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン４ｍｍｏｌ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム１ｍｍｏｌ／ｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μμｇ／ｍｌ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および２０％（容量／容量）ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するダルベッコ変性イーグル培地中でＣａＣｏ−２細胞を維持した。ＣａＣｏ−２細胞は、バリアおよび輸送研究のためのインビボモデルとして広く使用されている（Ｐｉｅｇｈｏｌｄｔ  Ｓら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４  ７０：２５５−２６４；Ｋｏｐｓ  ＳＫ，Ｗｅｓｔ  ＡＢ，Ｌｅａｃｈ  Ｊ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＨ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １９９７  １２７：１７４４−１７５１；Ｌｅｖｙ  Ｅ，Ｍｅｈｒａｎ  Ｍ，Ｓｅｉｄｍａｎ  Ｅ．，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９５  ９：６２６−６３５）。ＣａＣｏ−２細胞は分化し、培養の１０日以内に上記と同じトランズウェルシステムで堅密な上皮単層を形成する。トランスサイトーシス実験は、ＨＵＶＥＣ実験に従って行った。フラックス速度は、Ｆｉｓｈｅｒらによって以前に記述されたとおり算出した（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｊら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００７  ２９３：Ｃ６４１−Ｃ６４９）。傍細胞フラックスの対照として、および密着結合の形成を保証するものとして、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）デキストラン（７０ｋＤａ）を密着結合対照として各実験において頂端チャンバに同時に添加した。ＲＩＴＣがそれぞれ５４５ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で検出されたことを除いて、ＲＩＴＣデキストランによる傍細胞輸送レベルをＦＩＴＣ−α−ＴＴＰと同じ様式で測定した。ＲＩＴＣおよびＦＩＴＣの異なる蛍光挙動により、目的のタンパク質およびデキストラン対照の同時分析が可能になった。デキストランは、内皮細胞によってかなりのレベルで内在化されないので、基底チャンバにおけるデキストランの蓄積はいずれも、傍細胞フラックスと相関する（図１２）。
実施例１３
ＣＲＡＬＢＰ三量体を含むＣＲＡＬＢＰ−シス−レチナールナノスフェアによるトランスサイトーシス
【０１５２】
分析ゲル濾過からの単量体およびホモオリゴマータンパク質に対応するＣＲＡＬＢＰ画分を、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒによって以前に記述されたＰＩＥＲＣＥ法に従ってフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識される（Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．（１９８４）．，Ｐｏｌａｋ，Ｊ．，Ｖａｒｎｄｅｌ，Ｉ．編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．９８）。簡潔に述べると、炭酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．０）にタンパク質サンプルを移し、同じ緩衝液中で予め平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて標識する。ＦＩＴＣは、使用前に新たに無水ＤＭＳＯ（１ｍｇ／ｍｌ）に溶解する。標識反応は、１ｍｌのタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）に５０μｌのＦＩＴＣ  ＤＭＳＯ溶液を添加することによって開始させる。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、予めＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて過剰のＦＩＴＣを除去することにより停止させる。標識タンパク質サンプルを、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）で分析用ＳＥＣにより最終的に精製する。トランスフェリンを同じ方法で標識し、トランスサイトーシス実験における陽性対照として使用する。ＣＲＡＬＢＰ−シス−レチナールナノスフェアによるトランスサイトーシスの促進を実証するために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃプロトコールに従って、トリプシン／ＥＤＴＡの補助により、新鮮な臍帯から単離されたヒト臍静脈由来の内皮初代細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用する。内皮起源の真正性は、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）およびＣＤ３１の陽性免疫蛍光共染色によって確認される。ＨＵＶＥＣは、ゼラチンを事前にコーティング（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）した、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、トランズウェルシステム（０．４μｍの孔径を有する浸透性ポリエステル膜；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）で培養する。培地を隔日に交換しながら、細胞は、培養７日以内に緊密な単層を形成させる。トランスサイトーシスを測定するために、２００μｇのＲＩＴＣ−デキストラン７０ｋＤａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）および２００μｇのＦＩＴＣ標識単量体ＣＲＡＬＢＰ、ＣＲＡＬＢＰ−シス−レチナールナノスフェアのいずれか、またはトランスフェリン（陽性対照として）を含む媒体を頂端チャンバにそれぞれ適用する。頂端チャンバにサンプルを添加した後の様々な時点（１５、３０、４５、６０、１２０、１８０および２４０分）で１００μｌの基底外側の培地をサンプリングすることにより、輸送を監視する。続いて、基底外側のアリコートを、Ｔｅｃａｎ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００マイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，ＣＨ）を用いて、蛍光について４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長（ＦＩＴＣ��で分析した後、５４５ｎｍの励起波長および発光波長５９０ｎｍ（ＲＩＴＣ）で測定を行う。上皮細胞モデルとして表されるＣａＣｏ−２／ＴＣ７細胞株（ヒト結腸直腸腺癌細胞；Ｄｒ．Ｇ．Ｌｉｅｔｚ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫ）より厚意により提供）を、トランスサイトーシス実験における陰性対照として使用する。グルコース４．５ｇ／ｌ、Ｌ−グルタミン４ｍｍｏｌ／ｌ、ピルビン酸ナトリウム１ｍｍｏｌ／ｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および２０％（容量／容量）ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するダルベッコ変性イーグル培地中でＣａＣｏ−２細胞を維持した。ＣａＣｏ−２細胞は、バリアおよび輸送研究のためのインビボモデルとして広く使用されている（Ｐｉｅｇｈｏｌｄｔ  Ｓら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１４  ７０：２５５−２６４；Ｋｏｐｓ  ＳＫ，Ｗｅｓｔ  ＡＢ，Ｌｅａｃｈ  Ｊ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＨ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １９９７  １２７：１７４４−１７５１；Ｌｅｖｙ  Ｅ，Ｍｅｈｒａｎ  Ｍ，Ｓｅｉｄｍａｎ  Ｅ．，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９５  ９：６２６−６３５）。ＣａＣｏ−２細胞は分化し、培養の１０日以内に上記と同じトランズウェルシステムで堅密な上皮単層を形成する。トランスサイトーシス実験は、ＨＵＶＥＣ実験に従って行う。フラックス速度は、Ｆｉｓｈｅｒらによって以前に記述されたとおり算出する（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｊら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００７  ２９３：Ｃ６４１−Ｃ６４９）。傍細胞フラックスの対照として、および密着結合の形成を保証するものとして、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）デキストラン（７０ｋＤａ）を密着結合対照として各実験において頂端チャンバに同時に添加する。ＲＩＴＣがそれぞれ５４５ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で検出されることを除いて、ＲＩＴＣデキストランによる傍細胞輸送レベルをＦＩＴＣ−α−ＴＴＰと同じ様式で測定する。ＲＩＴＣおよびＦＩＴＣの異なる蛍光挙動により、目的のタンパク質およびデキストラン対照の同時分析が可能になる。デキストランは、内皮細胞によってかなりのレベルで内在化されないことから、基底チャンバにおけるデキストランの蓄積はいずれも、傍細胞フラックスと相関する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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