(57)【要約】本発明は、概して、シーケンシングライブラリー調製方法に関する。特定の実施形態では、２種またはそれよりも多くの鋳型核酸をＰＥＧ誘導体などの連結用分子によってともに接合する。核酸断片の同一のコピーまたは二重鎖断片の両方の鎖をともに連結することができる。連結核酸を増幅し、連結アンプリコンを創出する。連結プライマーを用いたエマルジョンＰＣＲによりシーケンシングクラスターをシードするための連結鋳型核酸を創出し、そして、エラーは、連結断片の１つのみにそれらが存在することによって容易に同定され得る。
2019514357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖核酸の標的化捕捉のための方法であって、
それぞれが捕捉領域およびプライマー部位を含む２つの５’連結標的核酸を提供するステップと、
前記２つの５’連結標的核酸を、前記捕捉領域に相補的な標的領域および複数のプライマーを含む分子に、前記標的領域と前記捕捉領域の結合は可能にするが前記プライマーと前記プライマー部位の結合は阻害する条件下で曝露させるステップであって、前記標的領域で、前記２つの５’連結標的核酸のうちの少なくとも一方を前記分子に結合させるステップと、
前記条件を、前記プライマー部位と前記プライマーの結合が可能になるように変更するステップであって、前記分子のプライマーを前記２つの５’連結標的核酸の両方の前記プライマー部位と結合させるステップと、
鎖置換型ポリメラーゼを使用して前記プライマーを伸長させるステップであって、前記５’連結標的核酸のそれぞれの分子結合コピーを生じさせるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記プライマー部位がユニバーサルプライマー部位であり、前記プライマーがユニバーサルプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記５’連結標的核酸のそれぞれの前記分子結合コピーがシードされたクラスターをさらに創出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クラスターをシーケンシングするステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的化ＤＮＡシーケンシングのためにゲノムの関心領域を捕捉するための方法であって、
ユニバーサルプローブ部位を複数の二重鎖核酸断片上にライゲートするステップであって、前記複数の二重鎖核酸断片はゲノムの関心領域を少なくとも１つ含む、ステップと、
ユニバーサルプローブ部位を含む一本鎖核酸断片を創出するために、前記複数のライゲートした二重鎖核酸断片を変性させるステップと、
前記一本鎖核酸断片を、前記ゲノムの関心領域の少なくとも一部分と相補的な標的化プローブを含む複数の連結捕捉用プローブに曝露させるステップであって、前記標的化プローブは、ユニバーサルプローブおよびユニバーサルプライミング部位と連結しており、前記曝露が、前記ユニバーサルプローブと前記ユニバーサルプローブ部位の結合を可能にするために前記標的化プローブと前記標的核酸配列の結合が必要である条件下でなされ、前記標的化プローブの伸長はブロックされている、ステップと、
前記ゲノムの関心領域のコピーを生じるために、鎖置換型ポリメラーゼを使用して前記ユニバーサルプローブを伸長させるステップと、
前記ゲノムの関心領域をシーケンシングするステップと
を含む方法。
【請求項６】
前記変性ステップ、曝露ステップ、伸長ステップ、および増幅ステップが、エマルジョンドロップレット中でなされる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ライゲートするステップが、前記複数の二重鎖核酸断片上に固有のバーコードをライゲートするステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記固有のバーコードが、センス特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
連結用分子を使用して前記標的化プローブと前記ユニバーサルプローブを接合するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的化プローブおよび前記ユニバーサルプローブがビオチン化されており、前記連結用分子がストレプトアビジン由来分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記シーケンシングするステップの前に、前記ゲノムの関心領域を増幅するために、前記曝露するステップおよび伸長させるステップを繰り返してステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記シーケンシングするステップの前に、非連結ユニバーサルプローブを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップをさらに含む、請求項５または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲ増幅および前記ユニバーサルプライミング部位と相補的なユニバーサルプライマーを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップをさらに含む、請求項５または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅ステップが前記ゲノムの関心領域の連結コピーを生じるように、前記ユニバーサルプライマーが連結される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅ステップが前記ゲノムの関心領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖の連結コピーを生じるように、前記連結ユニバーサルプライマーがセンス特異的である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１６年３月２８日に出願された米国仮出願番号第６２／３１３，９７４号、２０１６年７月７日に出願された米国仮出願番号第６２／３５９，４６８号、２０１６年１０月１８日に出願された米国仮出願番号第６２／４０９，６３３号に基づく優先権および利益を主張しており、これら仮出願の各々の内容は参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、核酸の捕捉、増幅およびシーケンシングに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ハイスループットゲノムシーケンシングプラットフォームは、大量のデータを手頃な価格で生じるが、それらは十分に正確ではない。最良のシーケンシング技法であってもエラー率が約１パーセントである。これは単一のヒトゲノムの配列における何十万ものエラーに変換される。不正確な塩基呼び出し（ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）により、配列の誤アラインメントおよび突然変異の誤同定が導かれる。塩基呼び出しおよびアラインメントアルゴリズムが利用可能であるが、増幅およびシーケンシングのエラーによって品質が負の影響を受ける。
【０００４】
増幅およびシーケンシング技法は進歩してきたが、塩基呼び出しおよびアラインメントは依然としてエラーだらけである。例えば、現在の主要なシーケンシングプラットフォームでは、ＤＮＡ断片をチャネル壁などの固体支持体に付着させる。断片が固体支持体に付着したら、断片を増幅し、増幅産物をシーディング断片に近接する固体支持体に付着させる。このプロセスを、シーディング断片と同一であるべきである増幅産物のクラスターが形成されるまで繰り返す。しかし、クラスターにはただ１つの断片をシードする。エラーがシーディング断片に存在するまたはクラスターの増幅においてエラーが生じた場合、エラーはクラスターの全部または一部で繰り返される。このエラーにより、塩基の誤同定が導かれ、シーケンシングアラインメントが複雑になる。
【０００５】
これらの型のエラーを捉えるために、標準のバーコードシーケンシング方法では、数十〜数百コピーの同じ鋳型、または十〜数百のクラスターを使用して比較用の試料プールを創出する。コピーまたはクラスターの数を大幅に増加させることにより、エラーを決定することができる。しかし、この戦略は費用がかかるものであり、また、シーケンシングのバンド幅を消耗する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明は、同じ出発鋳型に由来する２つまたはそれよりも多くの断片を連結することによって塩基呼び出しの正確度を増大させるための方法を提供する。断片は、二重鎖ＤＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖であってよい。例えば二重鎖分子の両方の鎖を含めた多数の鋳型を連結して単一の読み取りにすることにより、情報密度が増大し、エラー率が低下する。二重鎖の実施形態では、二重鎖データから、真のバリアントと増幅またはシーケンシングにおいて導入されるエラーとの即時の区別が可能になる（例えば、ポリメラーゼにより一方のセンスにおいてなされ得るエラーは両方の鎖で繰り返される可能性は低いが、真のバリアントは両方の鎖で繰り返される可能性がある）。センス特異的バーコードを使用して、クラスター内のセンスおよびアンチセンス鋳型コピー両方の存在を確認することができる。専用のセンスおよびアンチセンスシーケンシング読み取りを使用して、導入されたエラーと真のバリアントとを区別することができる。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本発明は、二重鎖ＤＮＡ分子に対する連結標的捕捉方法を提供する。溶液に基づく標的捕捉方法ならびにドロップレットに基づく標的捕捉方法が提供される。溶液に基づく方法およびドロップレットに基づく方法では、ユニバーサルプローブおよび標的特異的プローブを含む連結標的捕捉用プローブを使用し、反応は、ユニバーサルプローブの結合を可能にするために標的特異的プローブが結合することが必要になる条件下でなされる。多数の結合および伸長ステップが伴うので、従来の単一結合標的捕捉と比べて特異性が改善される。次いで、結合したユニバーサルプローブを、鎖置換型ポリメラーゼを使用して伸長させて標的鎖のコピーを生じさせ、次いでそれを、ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲを使用して増幅することができる。本発明の方法では、ＰＣＲ−捕捉−ＰＣＲワークフローを単一のＰＣＲおよび捕捉ステップで置き換える。より高い特異性および二重鎖情報が必要な場合は、連結捕捉用プローブをＤＮＡのセンスの一方または両方で使用することができる。以下に考察する通り、多数のリンカー型が可能である。本発明の溶液に基づく標的捕捉方法と同様に、使用者が、ドロップレット中での多重化ＰＣＲに制限されるのではなく、ドロップレット中での標的捕捉を実現することを可能にする、ドロップレットに基づく方法を提供する。捕捉方法を本明細書に記載の連結プライマーと組み合わせて、連結二重鎖分子をドロップレットから創出することができる。ある特定の実施形態では、標的捕捉用プローブならびにユニバーサルプライマーを含むナノ粒子を使用して、５’連結分子のプールから標的化された領域を捕捉し、標的化された分子のみを、クラスターをシーケンシングするための二重鎖シードに変換することができる。
【０００８】
本発明の方法は、試料調製およびシーケンシングに適用される。試料調製方法では、本発明により、同一の断片または核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を表す断片を一緒に接合することが可能になる。連結用分子により断片を接合し、複合体を創出する。複合体は、同一の断片または二重鎖断片に加えて、アダプター、プライマー、および結合性分子を含んでよい。さらに、一部の実施形態では、複合体は、一緒に連結した複数の同一断片を含んでよい。出生前試料などの、標的ＤＮＡ含有量が低い試料では、複数の断片を一緒に連結することにより、シーケンシングおよび増幅エラーの即時同定で正確度を増大させて断片を増幅し、シーケンシングすることができる。
【０００９】
連結断片は、連結増幅プライマーを用いて核酸断片を増幅することによって創出することができる。ある特定の実施形態では、ユニバーサルプライミング部位を標的断片上にライゲートして鋳型分子を創出することができる。方法は、ドロップレットおよび非ドロップレットワークフローを含んでよく、両方の鎖を表す連結分子がおよそ少なくとも５０％の率で生じる。ドロップレット増幅方法では、鋳型分子を多重増幅プライマーおよび連結ユニバーサルプライマーと一緒にドロップレットに添加することができる。プライマーは、多重化遺伝子特異的フォワードおよびリバース増幅プライマーであってよい。次いで、ドロップレットをエマルジョンＰＣＲ増幅またはデジタルＰＣＲ増幅に供すことができる。増幅産物は、用途に依存して元の核酸断片または元の核酸断片のセンス鎖およびアンチセンス鎖の連結コピーであるはずである。２つまたはそれよりも多くのプライマーまたは核酸断片をポリエチレングリコール誘導体、オリゴ糖、脂質、炭化水素、ポリマーまたはタンパク質によって連結することができる。ある特定の実施形態では、４つまたはそれよりも多くのビオチン化プライマーまたは核酸断片を、ストレプトアビジン分子または官能性をもたせたナノ粒子を用いて連結することができる。本発明の連結プライマーはまた、全てのクラスター読み取りが同じ連結鋳型分子を起源とすることを確実にするために固有のクラスター識別子配列を含んでよい。
【００１０】
本発明の方法では、増幅技法に組み入れられたとき塩基呼び出しが改善される。従来の増幅方法では、アンプリコンは単一の鋳型から創出される。断片にエラーが存在する場合、増幅産物を通じてエラーが伝播する。単一の鋳型を使用する代わりに、複数の同一の鋳型または二重鎖ＤＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む鋳型を使用して増幅産物を創出する。鋳型鎖の１つにエラーが生じた場合、複数の鋳型の使用では、単一の鋳型とは対照的に、シーケンシングステップにおいてそのようなエラーを同定することが可能になる。二重鎖ＤＮＡ断片の両方の鎖を鋳型として使用する場合、エラーを、両方の鎖において見いだされるはずである真のバリアントと区別することができる。
【００１１】
本発明のある特定の技法では、複数の鋳型をシードすることにより、エラーを、塩基が同じではない位置における単一の読み取りにおいてシーケンシングの質が低下することを通じて真のバリアントと区別することができる（真のバリアントは全ての読み取り上に存在することになり、それにより、強力なシグナルがもたらされる）。複数の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖でクラスターをシードすることにより、第１のセンス読み取りの結果を第２のアンチセンス読み取りの結果と比較して両方の鋳型鎖におけるバリアントの存在を確認することによって真のバリアントおよびエラーを同定することができる。
【００１２】
本発明の方法は、単一の出発分子から、連結核酸断片を創出することを含む。単一の核酸断片から連結クラスターシーディング複合体を調製することにより（例えば、本明細書に記載のエマルジョンＰＣＲ方法を使用して）、２つの異なる核酸断片に由来するハイブリッド複合体が創出されるリスクが排除される。
【００１３】
追加的な方法は、高密度シーケンシングの実行におけるクラスター間のクロストークを減少させることに関する。方法は、２種またはそれよりも多くの異なるアダプターを異なるプライマー配列にライゲートして、異なるアダプタープライマー配列に対応する異なるシーケンシングプライマーの使用によってクラスターの区別を可能にすることを含んでよい。
【００１４】
本発明の方法は、ドロップレットにより形成された連結二重鎖分子についての二重鎖同定戦略を含む。記載の通り、本発明のドロップレットに基づく方法は、連結二重鎖断片の形成（ＤＮＡ二重鎖の各側からの表示を含有する連結分子）を少なくとも５０％の率でもたらすことができ、したがって、非二重鎖産物からのデータを省き二重鎖産物の利点を増大させる正確度を得るために、これらの産物の同定が重要になる。二重鎖同定方法としては、例えば、アニーリング温度が異なる２セットのプライマーを使用した二段階ＰＣＲ手法を挙げることができ、この手法では、最初の何回かのサイクルを低温で遺伝子特異的バーコーディングプライマーを用いて実施して二重鎖の各センスを増幅および同定しながら、その後のサイクルにユニバーサル尾部を添加する。二重鎖の各センスが複数のバーコードで標識されることを防ぐために、バーコーディングサイクルの数を限定する。次いで、その後のサイクルを高温で、これらの条件下ではバーコーディングプライマーは結合することができないのでユニバーサルプライマーによって、実施することができる。次いで、二重鎖産物を、シーケンシング解析の間にそれらのセンス特異的バーコードが存在することによって同定し、非二重鎖クラスターと区別することができる。したがって、二重鎖クラスターのシードによってもたらされるより高い忠実度が評価され得る。
【００１５】
非ドロップレット実施形態では、単一の増幅サイクルを使用して、元の断片の両方のセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する連結二重鎖分子を創出することができる。次いで、連結二重鎖分子をシーケンシング用のフローセル中に直接ローディングし、それにより、増幅により誘導される配列または長さの偏り（例えば、全ゲノムシーケンシングにおいて）を回避し、かつ、増幅により導入されるエラーおよびローディング効率の悪さによる核酸の喪失を回避することができる。例えば、シーケンサーのローディング効率を、（アウトプット読み取りの数）／（読み取りを形成することが可能なインプット分子の数）と定義することができる場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑについてのローディング効率は＜０．１％であり、他のＩｌｌｕｍｉｎａ計器についても同様である。これは、６００ｕＬより多くの試料がシーケンサーにローディングされる一方で、約７ｕＬしか結合のためにフローセルの内部に保持されず、その結果、出発材料が大きく喪失するので、流体の喪失に大きく起因する。本明細書に記載の非ドロップレット、直接ローディング方法では、これらの非効率性が改善される。
【００１６】
直接ローディングの実施形態に加えてフローセルローディングの収率および標的捕捉収率が重要である他の適用に関しては、喪失を最小限にするために、フローセルローディングと標的化シーケンシングを組み合わせることが有益であり得る。そのような組合せでは、さらに、余分のステップが排除されることによってワークフローが単純化される。フローセル上の標的を捕捉するための方法が存在するが、それらには少なくとも２つの欠点がある。第１に、それらは、フローセル上に捕捉された領域をシーケンシングすることができない。無細胞ＤＮＡなどの短い断片に関してはこれがシグナルの大きな喪失の原因になり得る。第２に、それらは、本発明に記載されている連結二重鎖分子をシーケンシングのために捕捉することができない。したがって、本発明の方法は、二重鎖分子のフローセルに基づく標的捕捉を含む。本発明の方法によると、フローセルは、標的領域を有するオリゴの一方のセンスを含有し、一方、他方のセンスはヘアピン状になっており、すぐには結合に利用可能でない。連結分子の一方のセンスをフローセル上に捕捉した後、他方のフローセルオリゴを活性化して、連結断片の他方のセンスを捕捉する（例えば、ウラシル消化、酵素消化、または光を使用する）。次いで、鋳型を伸長させることができ、クラスター生成を通常通り続けることができる。
【００１７】
本発明の方法により、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）などの固体支持体上での増幅が改善される。Ｉｌｌｕｍｉｎａ技法では、ブリッジ増幅を使用してアンプリコンのクラスターを形成する。断片中にエラーが存在する場合、クラスター内でエラーが繰り返される。しかし、本発明を用いると、連結断片を固体支持体に接触させる。同一のものまたは二重鎖ＤＮＡ分子の各鎖を表すものであり得る断片がクラスターにシードされ、その結果、断片のそれぞれに由来する全アンプリコンの画分がもたらされる。この技法は、エラーをシーケンシングステップにおいて容易に決定することを可能にするものであり、また、真のバリアントを呼び出すことおよびそれらをシーケンシングまたは増幅（例えば、ＰＣＲ）エラーと区別することに役立ち得る。
【００１８】
本発明の方法により、多重化増幅プロセスが改善される。本発明の一部の実施形態では、連結断片をその後の増幅のためにドロップレット中で形成すること、またはドロップレット中に導入することができる。断片の一部にエラーが存在する場合、エラーは、未加工のシーケンシングデータを用いて決定可能である。一部の実施形態では、連結断片をマイクロスフェアに結合させ、次いで、増幅を伴い、断片は、アンプリコンでマイクロスフェアをシードすることができる。本発明では、同じ断片の複数のコピーを使用して複数のアンプリコンを形成するという利点を提供することにより、種々の適用における塩基呼び出しを改善する。
【００１９】
本発明の方法は、複数のシーケンシングプラットフォームに組み入れることができる。例えば、従来の合成によるシーケンシングでは、各塩基を逐次的に決定することができる。エラーは、バイオインフォマティクス技法を使用してデータを解析するまで決定されない。しかし、本発明では、シーケンシング方法体系の間に核酸の複数の断片を連結することが可能になる。複数の断片を同時に解析することにより、塩基間の一致により正確度が示され、その一方、塩基間の不一致はシグナルエラーになる。本発明を用いると、バイオインフォマティクスを適用することなく、未加工のシーケンシングデータからエラーを決定できる。この技法では、より少数のコピーまたはクラスターが使用され、シーケンシングスループットが増加し、また、費用が減少する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｅは、連結断片を形成するプロセスを示す図である。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｅは、連結断片を形成するプロセスを示す図である。
【００２１】
【図２】図２は、固体支持体に付着した連結鋳型を示す図である。
【００２２】
【図３】図３は、連結断片の例を示す図である。
【００２３】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｃは、連結断片の伸長および増幅を示す図である。
【図４−２】図４Ａ〜４Ｃは、連結断片の伸長および増幅を示す図である。
【図４−３】図４Ａ〜４Ｃは、連結断片の伸長および増幅を示す図である。
【００２４】
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、連結断片におけるエラー決定を示す図である。
【００２５】
【図６】図６は、アダプターおよびプライマーを示す図である。
【００２６】
【図７】図７は、エマルジョンＰＣＲによる連結核酸断片の創出のプロセスを示す図である。
【００２７】
【図８】図８は、エマルジョンＰＣＲにおける４連結断片の創出およびシーケンシングクラスターをシードするための４連結断片のフローセルハイブリダイゼーションを示す図である。
【００２８】
【図９−１】図９は、本発明のある特定の実施形態によるライゲーションアダプターを示す図である。
【図９−２】図９は、本発明のある特定の実施形態によるライゲーションアダプターを示す図である。
【００２９】
【図１０】図１０は、本発明のある特定の実施形態によるデジタルＰＣＲプライマーを示す図である。
【００３０】
【図１１】図１１は、エマルジョンＰＣＲによるビーズ上での連結核酸断片の創出のプロセスを示す図である。
【００３１】
【図１２】図１２は、本発明の実施形態による連結核酸ビーズのＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングを示す図である。
【００３２】
【図１３】図１３は、異なるアダプターおよびシーケンシングプライマー部位を用いた連結核酸断片の創出のプロセスを示す図である。
【００３３】
【図１４】図１４は、クロストークを低減するために異なるシーケンシングプライマー部位を有するクラスターのシーケンシングのプロセスを示す図である。
【００３４】
【図１５】図１５は、シーケンシングクラスターにわたるクロストークを例示する図である。
【００３５】
【図１６】図１６は、連結二重鎖核酸を創出するための本発明のドロップレットに基づく方法を例示する図である。
【００３６】
【図１７】図１７は、例証的な連結プライマーおよびフォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーおよび本発明の１つの方法に従ったそれらの使用を示す図である。
【００３７】
【図１８】図１８は、例証的な連結プライマーおよびフォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーおよび本発明の１つの方法に従ったそれらの使用を示す図である。
【００３８】
【図１９】図１９は、本発明の遺伝子特異的プライマーを示す図である。
【００３９】
【図２０】図２０は、図１７に示されている生成物方法を用いた本発明のシーケンシング方法を示す図である。
【００４０】
【図２１】図２１は、図１８に示されている生成物方法を用いた本発明のシーケンシング方法を示す図である。
【００４１】
【図２２−１】図２２Ａおよび２２Ｂは、１つの連結アダプターを使用した非ドロップレット連結二重鎖形成法を示す図である。
【図２２−２】図２２Ａおよび２２Ｂは、１つの連結アダプターを使用した非ドロップレット連結二重鎖形成法を示す図である。
【００４２】
【図２３−１】図２３Ａおよび２３Ｂは、２つの連結アダプターを使用した非ドロップレット連結二重鎖形成法を示す図である。
【図２３−２】図２３Ａおよび２３Ｂは、２つの連結アダプターを使用した非ドロップレット連結二重鎖形成法を示す図である。
【００４３】
【図２４−１】図２４Ａおよび２４Ｂは、連結二重鎖分子を使用した直接ローディングシーケンシング方法のステップを例示する図である。
【図２４−２】図２４Ａおよび２４Ｂは、連結二重鎖分子を使用した直接ローディングシーケンシング方法のステップを例示する図である。
【００４４】
【図２５】図２５は、フローセル結合方法の例証的なステップを示す図である。
【００４５】
【図２６】図２６は、例証的なオフラインフローセル調製プロトコールを示す図である。
【００４６】
【図２７】図２７は、二重鎖分子に対するフローセルに基づく標的捕捉方法を例示する図である。
【００４７】
【図２８−１】図２８Ａ〜２８Ｅは、例証的な、二重鎖分子についてのフローセルに基づく標的捕捉およびシーケンシング方法のステップを示す図である。
【図２８−２】図２８Ａ〜２８Ｅは、例証的な、二重鎖分子についてのフローセルに基づく標的捕捉およびシーケンシング方法のステップを示す図である。
【図２８−３】図２８Ａ〜２８Ｅは、例証的な、二重鎖分子についてのフローセルに基づく標的捕捉およびシーケンシング方法のステップを示す図である。
【図２８−４】図２８Ａ〜２８Ｅは、例証的な、二重鎖分子についてのフローセルに基づく標的捕捉およびシーケンシング方法のステップを示す図である。
【図２８−５】図２８Ａ〜２８Ｅは、例証的な、二重鎖分子についてのフローセルに基づく標的捕捉およびシーケンシング方法のステップを示す図である。
【００４８】
【図２９−１】図２９Ａ〜２９Ｄは、ある特定の実施形態による二重鎖同定方法を例示する図である。
【図２９−２】図２９Ａ〜２９Ｄは、ある特定の実施形態による二重鎖同定方法を例示する図である。
【図２９−３】図２９Ａ〜２９Ｄは、ある特定の実施形態による二重鎖同定方法を例示する図である。
【図２９−４】図２９Ａ〜２９Ｄは、ある特定の実施形態による二重鎖同定方法を例示する図である。
【００４９】
【図３０】図３０は、ＫＲＡＳアンプリコンとアラインメントされた、単独でシードされたクラスターを使用したシーケンシングのエラー率を示すグラフである。
【００５０】
【図３１】図３１は、図３０に示されている結果を生じさせるのに使用した、シーケンシング方法のために単独でシードされたクラスター、および、図４３に示されている結果を生じさせるのに使用した、シーケンシング方法のために二重にシードされたクラスターを示す図である。
【００５１】
【図３２】図３２は、単一のシーケンシング読み取りおよびシグナルの質に基づく本発明の塩基呼び出し方法を例示する図である。
【００５２】
【図３３】図３３は、センスおよびアンチセンスシーケンシング読み取りの比較に基づく塩基呼び出し方法を示す図である。
【００５３】
【図３４】図３４は、二重鎖核酸の連結標的捕捉の例証的な方法を例示する図である。
【００５４】
【図３５】図３５は、連結された標的捕捉核酸の増幅方法を例示する図である。
【００５５】
【図３６】図３６は、ドロップレットに基づく標的捕捉および連結二重鎖核酸生成の方法を示す図である。
【００５６】
【図３７−１】図３７ＡおよびＢは、本発明のドロップレットに基づく標的捕捉方法のステップを示す図である。
【図３７−２】図３７ＡおよびＢは、本発明のドロップレットに基づく標的捕捉方法のステップを示す図である。
【００５７】
【図３８】図３８は、ユニバーサルプライマーおよび捕捉されるべき連結分子の捕捉領域に相補的な標的領域を含む鎖を有するナノ粒子を示す。
【００５８】
【図３９】図３９は、捕捉領域と標的領域の結合を例示する図である。
【００５９】
【図４０】図４０は、ユニバーサルプライマーと連結分子上のユニバーサルプライマー部位の結合を示す図である。
【００６０】
【図４１】図４１は、元の連結分子の両方の鎖を含む標的分子のナノ粒子連結コピーを生成するための、鎖置換型ポリメラーゼによるユニバーサルプライマー伸長を示す図である。
【００６１】
【図４２】図４２は、本出願の他の箇所に記載されているフローセルシーケンサーにクラスターをシードするために使用することができる二重にシードされたナノ粒子を示す図である。
【００６２】
【図４３】図４３は、ＫＲＡＳアンプリコンとアラインメントされた二重にシードされたクラスターを使用したシーケンシングのエラー率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
詳細な説明
本発明は、一般には、２つの核酸断片を接合することによって核酸を増幅しシーケンシングするための方法に関する。これらの断片は、単一の断片の２つの同一のコピーであってもよく、二重鎖核酸の両方の鎖であってもよい。２つの断片を使用することにより、エラー率が低下し、アラインメントの効率が上昇し、また、シーケンシングの費用が低減する。
【００６４】
核酸は、一般に、試料または対象から得られる。本発明の方法に従って標識および／または検出するための標的分子としては、これだけに限定されないが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、発現したＲＮＡおよび／または染色体（単数または複数）などの遺伝子材料およびプロテオミクス材料が挙げられる。本発明の方法は、全細胞由来のＤＮＡまたは１つもしくは複数の細胞から得られた遺伝子材料もしくはプロテオミクス材料の部分に適用可能である。本発明の方法により、ウイルスなどの非細胞供給源からＤＮＡまたはＲＮＡを得ることが可能になる。対象に関しては、試料は、任意の臨床的に許容される様式で得ることができ、核酸鋳型は当技術分野で公知の方法によって試料から抽出される。一般に、核酸は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｎｉａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２８０〜２８１頁、１９８２年）に記載されているものなどの様々な技法によって生体試料から抽出することができる。
【００６５】
核酸鋳型は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸鋳型は、合成されたものであってもよく、天然に存在する供給源に由来するものであってもよい。核酸は、生物学的なものであるか、環境的なものであるか、身体的なものであるかまたは合成されたものであるかにかかわらず、任意の供給源または試料から得ることができる。一実施形態では、核酸鋳型は、タンパク質、脂質および非鋳型核酸などの種々の他の構成成分を含有する試料から単離される。核酸鋳型は、任意の細胞性材料から得ることもでき、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞性生物体から得ることもできる。本発明において使用するための試料は、ウイルス、ウイルス粒子または調製物を含む。核酸はまた、細菌または真菌などの微生物から、環境試料などの試料から得ることもできる。
【００６６】
本発明では、標的材料は、試料中に含有されるＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびその他を含めた任意の核酸である。核酸分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。核酸分子は、合成されたものであってもよく、天然に存在する供給源に由来するものであってもよい。一実施形態では、核酸分子は、タンパク質、脂質および非鋳型核酸などの種々の他の構成成分を含有する生体試料から単離される。核酸鋳型分子は、任意の細胞性材料から得ることもでき、動物、植物、細菌、真菌、または任意の他の細胞性生物体から得ることもできる。ある特定の実施形態では、核酸分子を単一細胞から得る。本発明において使用するための生体試料は、ウイルス粒子または調製物を含む。核酸分子は、生物体から直接得ることもでき、生物体から、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便および組織から得た生体試料から得ることもできる。任意の組織または体液検体は、本発明における使用のための核酸の供給源として使用することができる。核酸分子は、初代細胞の培養物または細胞株などの培養細胞から単離することもできる。鋳型核酸を得る細胞または組織にウイルスまたは他の細胞内病原体を感染させることができる。さらに、核酸は、ウイルス試料、または環境試料などの非細胞または非組織試料から得ることができる。
【００６７】
試料は、生物検体、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡであってもよい。ある特定の実施形態では、核酸分子は、タンパク質、酵素、基質、抗体、結合剤、ビーズ、小分子、ペプチド、または任意の他の分子などの他の標的分子に結合しており、標的分子の数量化および／または検出の代理として機能する。一般に、核酸は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）に記載されているものなどの様々な技法によって生体試料から抽出することができる。核酸分子は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖領域（例えば、ステム構造およびループ構造）を有する二本鎖であってよい。抗体またはアプタマーなどの高親和性結合性部分に結合することができるタンパク質またはタンパク質の一部（アミノ酸ポリマー）は、例えば、ドロップレットにおけるオリゴヌクレオチド標識の標的分子である。
【００６８】
核酸鋳型は、生物体から直接、または生物体から得た生体試料から、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、痰、便および組織から得ることができる。特定の実施形態では、核酸を新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）から得る。特定の実施形態では、核酸をホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から得る。任意の組織または体液検体を本発明における使用のための核酸の供給源として使用することができる。核酸鋳型はまた、初代細胞培養物などの培養細胞または細胞株から単離することもできる。鋳型核酸を得る細胞または組織をウイルスまたは他の細胞内病原体に感染させることができる。試料は、生物検体、ｃＤＮＡライブラリー、ウイルスＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡから抽出された全ＲＮＡであってもよい。
【００６９】
生体試料を界面活性剤または界面活性物質の存在下でホモジナイズまたは分画することができる。緩衝液中の界面活性剤の濃度は約０．０５％〜約１０．０％であってよい。界面活性剤の濃度は、最大で界面活性剤が溶液中で可溶性のままになる量であってよい。好ましい実施形態では、界面活性剤の濃度は、０．１％〜約２％である。界面活性剤、特に非変性の穏やかなものは、試料が可溶化されるように作用する。界面活性剤は、イオン性であっても非イオン性であってもよい。非イオン性界面活性剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘシリーズ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２−ＣＨ２）ｘＯＨ、ｘ＝９〜１０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、ｘ＝７〜８）などのトリトン、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレン（９）ドデシルエーテル、ジギトニン、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ６３０オクチルフェニルポリエチレングリコール、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ベータＯＧ）、ｎ−ドデシル−ベータ、Ｔｗｅｅｎ  ２０ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート、Ｔｗｅｅｎ  ８０ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ポリドカノール、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）、ＮＰ−４０ノニルフェニルポリエチレングリコール、Ｃ１２Ｅ８（オクタエチレングリコールｎ−ドデシルモノエーテル）、ヘキサエチレングリコールモノ−ｎ−テトラデシルエーテル（Ｃ１４ＥＯ６）、オクチル−ベータ−チオグルコピラノシド（オクチルチオグルコシド、ＯＴＧ）、Ｅｍｕｌｇｅｎ、およびポリオキシエチレン１０ラウリルエーテル（Ｃ１２Ｅ１０）が挙げられる。イオン性界面活性剤（陰イオン性または陽イオン性）の例としては、デオキシコール酸、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ−ラウロイルザルコシン、および臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）が挙げられる。Ｃｈａｐｓ、双性イオン性３−１４、および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネートなどの双性イオン性試薬も本発明の精製スキームにおいて使用することができる。尿素を別の界面活性剤または界面活性物質を伴ってまたは伴わずに添加することができることも企図されている。
【００７０】
溶解またはホモジナイゼーション溶液は、還元剤などの他の薬剤をさらに含有してよい。そのような還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ベータ−メルカプトエタノール、ＤＴＥ、ＧＳＨ、システイン、システアミン、トリカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、または亜硫酸の塩が挙げられる。
【００７１】
核酸が得られたら、当技術分野で公知の任意の方法によって変性させて一本鎖核酸鋳型を生成し、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドにより鋳型上の標的領域が挟まれるように、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの対を一本鎖核酸鋳型とハイブリダイズさせる。
【００７２】
一部の実施形態では、核酸を断片化または分解してより小さな核酸断片にすることができる。ゲノム核酸を含めた核酸は、機械的断片化、化学的断片化、および酵素的断片化などの種々の方法のいずれかを使用して断片化することができる。核酸の断片化の方法は、当技術分野で公知であり、それらとしては、これだけに限定されないが、ＤＮａｓｅ消化、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、機械的せん断などが挙げられる（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、１９８９年、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ−−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔｓ  ＩおよびＩＩ）」、１９９３年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃ．  Ｐ．  Ｏｒｄａｈｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９７６年、３巻：２９８５〜２９９９頁；Ｐ．  Ｊ．  Ｏｅｆｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９６年、２４巻：３８７９〜３８８９頁；Ｙ．  Ｒ．  Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９８年、８巻：８４８〜８５５頁）。米国特許公開第２００５／０１１２５９０号は、当技術分野で公知の種々の断片化方法の概要を提供する。
【００７３】
ゲノム核酸は、均一な断片に断片化することもでき、ランダムに断片化することもできる。ある特定の態様では、核酸を断片化して、約５キロベースまたは１００キロベースの断片長を有する断片を形成させる。好ましい実施形態では、ゲノム核酸断片は、１キロベースから２０キロベースまでにわたってよい。好ましい断片はサイズが変動し得、平均断片長が約１０キロベースである。しかし、捕捉される核酸標的の型に応じて所望の断片長および断片長の範囲を調整することができる。特定の断片化の方法を選択して、所望の断片長を実現する。いくつかの非限定的な例を下に提示する。
【００７４】
ゲノム核酸の化学的断片化は、いくつかの異なる方法を使用して実現することができる。例えば、塩基加水分解および酸加水分解を含めた加水分解反応が核酸を断片化するための一般的な技法である。加水分解は、所望の加水分解の程度に応じて、温度を上昇させることによって容易になる。断片化は、下記の通り温度およびｐＨを変更することによって実現することができる。せん断に関してｐＨに基づく加水分解の利点は、一本鎖産物をもたらすことができることである。さらに、温度をある特定の緩衝系（例えばＴｒｉｓ）と共に使用して、加水分解を実現するためにｐＨを中性から上下に一時的にシフトさせ、次いで、長期保管のためなどで、中性に戻すことができる。異なる量のせん断（したがって、様々な長さの分布）をもたらすために、ｐＨおよび温度の両方を調節することができる。
【００７５】
核酸の加水分解による断片化の他の方法としては、アルカリ加水分解、ホルマリン固定、金属錯体（例えば、ポルフィリン）による加水分解、および／またはヒドロキシルラジカルによる加水分解が挙げられる。ＲＮＡはアルカリ性条件下でせん断されるが（例えば、Ｎｏｒｄｈｏｆｆら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．、２１巻（１５号）：３３４７〜５７頁（２００３年）を参照されたい）、ＤＮＡは、強酸の存在下でせん断することができる。
【００７６】
ゲノム核酸断片を生成するための例証的な酸／塩基加水分解プロトコールは、Ｓａｒｇｅｎｔら（１９８８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２巻：４３２頁に記載されている。簡単に述べると、精製ＤＮＡ１ｇを０．１ＮのＮａＯＨ５０ｍＬ中に溶解させる。濃縮ＨＣｌ１．５ｍＬを添加し、溶液を直ちに混合する。ＤＮＡはすぐに沈殿し、大きな凝集体の形成を防ぐために、数秒よりも長く撹拌すべきでない。試料を室温で２０分インキュベートしてＤＮＡを部分的に脱プリン化する。その後、１０ＮのＮａＯＨ（ＯＨ−−０．１Ｎまで濃縮）２ｍＬを添加し、試料をＤＮＡが完全に再溶解するまで撹拌する。次いで、ＤＮＡを加水分解させるために試料を６５℃で３０分インキュベートする。得られる断片は一般には約２５０〜１０００ヌクレオチドにわたるが、加水分解の条件に応じてより長くまたはより短く変動し得る。
【００７７】
一実施形態では、ゲノム核酸を精製した後、それを、７．５から８．０の間のｐＨのＴｒｉｓベースの緩衝液、例えばＱｉａｇｅｎのＤＮＡ水和溶液などに再懸濁させる。次いで、再懸濁させたゲノム核酸を６５℃まで加熱し、終夜インキュベートする。加熱により緩衝液のｐＨが低〜中間の６の範囲にシフトし、それにより、酸加水分解が導かれる。経時的に、酸加水分解により、ゲノム核酸の一本鎖産物および／または二本鎖産物への断片化が引き起こされる。
【００７８】
化学的切断は特異的なものであってもよい。例えば、選択された核酸分子、特に、ホスホロチオエート修飾された核酸分子をアルキル化によって切断することができる（例えば、Ｋ．  Ａ．  Ｂｒｏｗｎｅ、「Ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２４巻（２７号）：７９５０〜７９６２頁（２００２年）を参照されたい）。ホスホロチオエート修飾でのアルキル化により、核酸分子がその修飾部位で切断されやすくなる。Ｉ．  Ｇ．  ＧｕｔおよびＳ．  Ｂｅｃｋ、「Ａ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻（８号）：１３６７〜１３７３頁（１９９５年）を参照されたい。
【００７９】
本発明の方法はまた、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｒ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．、７４巻：５６０〜５６４頁に開示されている技法を使用して核酸を化学的にせん断することも企図している。そのプロトコールでは、例えば、グアニンにおける、アデニンにおける、シトシンおよびチミンにおける、ならびにシトシンのみにおける優先的切断など、核酸が特定の塩基において断片化されるように設計された化学物質に曝露させることによって、ゲノム核酸を化学的に切断することができる。
【００８０】
核酸の断片への機械的せん断は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して行うことができる。例えば、核酸の断片化は、水力せん断（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒｉｎｇ）、針を通した粉砕、および超音波処理によって実現することができる。例えば、Ｑｕａｉｌら、（２０１０年１１月）、ＤＮＡ：  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｂｒｅａｋａｇｅ．  Ｉｎ：  ｅＬＳ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ．  ｄｏｉ：  １０．１００２／９７８０４７００１５９０２．ａ０００５  ３３３．ｐｕｂ２を参照されたい。
【００８１】
核酸は、噴霧によってせん断することもできる。（Ｒｏｅ、ＢＡ、Ｃｒａｂｔｒｅｅ．  ＪＳおよびＫｈａｎ、ＡＳ、１９９６年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ、２００６年を参照されたい。噴霧は、核酸溶液を噴霧器の小さな穴に強制的に通すことによって創出されたミストから、断片化されたＤＮＡを収集することを伴う。噴霧によって得られる断片のサイズは、ＤＮＡ溶液が穴を通過するスピード、噴霧器を通じて噴出されるガスの圧力の変更、溶液の粘度、および温度によって主に決定される。得られるＤＮＡ断片は、狭いサイズ範囲（７００〜１３３０ｂｐ）に分布する。核酸のせん断は、得られた核酸を狭い毛細管またはオリフィスに通すことによって実現することができる（Ｏｅｆｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９６年；Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１９９５年）。この技法は、核酸試料をシリンジポンプによって強制的に小さな穴に通した結果として起こる点でのポイントシンク流体力学に基づく。
【００８２】
水力せん断（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．、ＵＳＡ）では、溶液中のＤＮＡを、急激に収縮するチューブに通す。収縮に近づくにつれ、流体が加速されて収縮したより小さな面積を通る体積流量が維持される。この加速中、抗力によりＤＮＡがぷっつり切れるまで伸ばされる。ＤＮＡは小片がせん断力による化学結合の破壊には小さすぎるものになるまで断片化される。流体の流速および収縮のサイズにより最終的なＤＮＡ断片のサイズが決定される。
【００８３】
超音波処理も、核酸を短時間の超音波処理、すなわち超音波エネルギーに供することによって核酸を断片化するために使用される。超音波処理（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって核酸をせん断して断片にする方法は、米国特許公開第２００９／０２３３８１４号に記載されている。本方法では、得られた精製核酸は、粒子が配置された懸濁液中に入れられる。次いで、試料および粒子の懸濁液を超音波処理して核酸断片にする。
【００８４】
ＤＮＡを断片化するために使用することができる音波に基づく系は、米国特許第６，７１９，４４９号、および同第６，９４８，８４３号に記載されており、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｉｎｃ．により製造された。米国特許第６，２３５，５０１号には、閉じた容器中、液体媒体の存在下で、急速に振動する相反的な機械的エネルギーを適用することによって高分子量のＤＮＡ断片を生成する、機械的に焦点を合わせる超音波処理（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）方法が記載されており、これを、ＤＮＡを機械的に断片化するために使用することができる。
【００８５】
核酸をせん断して断片にする別の方法では、例えば、ＤｉａｇｏｎｎｏｄｅのＢｉｏＲｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，Ｉｎｃ．により市販されている電気せん断デバイス）を用いたせん断など、超音波エネルギーを使用して液体における気体性キャビテーションを生じさせる。キャビテーションは、液体中の圧力の変化に起因してする、溶解した気体または蒸気の小さな泡の形成である。これらの泡は、共鳴振動し、活発な渦巻きまたはマイクロストリーミングを生じさせることができる。結果生じる機械的ストレスにより、核酸の断片へのせん断が導かれ得る。
【００８６】
酵素的断片化は、酵素的切断としても公知であり、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リボザイム、およびＤＮＡザイムなどの酵素を使用して核酸を切断して断片にするものである。そのような酵素は、広範に知られており、商業的に入手可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１年）およびＲｏｂｅｒｔｓ  ＲＪ（１９８０年１月）、「Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、８巻（１号）：ｒ６３〜ｒ８０を参照されたい。様々な酵素的断片化技法が当技術分野で周知であり、そのような技法がシーケンシングのために核酸を断片化するために頻繁に使用される。例えば、Ａｌａｚａｒｄら、２００２年；Ｂｅｎｔｚｌｅｙら、１９９８年；Ｂｅｎｔｚｌｅｙら、１９９６年；Ｆａｕｌｓｔｉｃｈら、１９９７年；Ｇｌｏｖｅｒら、１９９５年；Ｋｉｒｐｅｋａｒら、１９９４年；Ｏｗｅｎｓら、１９９８年；Ｐｉｅｌｅｓら、１９９３年；Ｓｃｈｕｅｔｔｅら、１９９５年；Ｓｍｉｒｎｏｖら、１９９６年；Ｗｕ  ＆  Ａｂｏｌｅｎｅｅｎ、２００１年；Ｗｕら、１９９８年ａ。
【００８７】
核酸を断片化するために使用される最も一般的な酵素は、エンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子のいずれに特異的なものであってもよい。核酸分子の切断を核酸分子内でランダムに行うこともでき、核酸分子の特定の配列において切断することもできる。核酸分子の特異的断片化は、１種または複数種の酵素を逐次的な反応でまたは同時に使用して実現することができる。
【００８８】
制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸内の特異的な配列を認識し、一般に、核酸を断片化するために、両方の鎖を認識部位内またはその付近のいずれかで切断する。天然に存在する制限エンドヌクレアーゼは、それらの組成および酵素補因子の必要性、それらの標的配列の性質、および、それらのＤＮＡ切断部位の標的配列に対する位置に基づいて４つの群（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、およびＩＶ型）にカテゴリー化される。Ｂｉｃｋｌｅ  ＴＡ、Ｋｒｕｇｅｒ  ＤＨ（１９９３年６月）、「Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、５７巻（２号）：４３４〜５０頁；Ｂｏｙｅｒ  ＨＷ（１９７１年）。「ＤＮＡ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ」、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２５巻：１５３〜７６頁；Ｙｕａｎ  Ｒ（１９８１年）。「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ」、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５０巻：２８５〜３１９頁。全ての型の酵素が特定の短いＤＮＡ配列を認識し、ＤＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断を行って、末端５’リン酸を有する特定の断片をもたらす。これらの酵素は、それらの認識配列、サブユニットの組成、切断位置、および補因子の必要性が異なる。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＪ（２００３年）、「Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ：  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻（３号）：２２５〜４３頁。
【００８９】
制限エンドヌクレアーゼにより二本鎖核酸における特異的シーケンシングを認識し、一般に両方の鎖を切断する場合、ニッキングエンドヌクレアーゼにより、核酸の鎖の一方のみを切断して断片にすることが可能である。核酸を断片化するために使用されるニッキング酵素は、天然に存在するものであっても制限酵素から遺伝子操作されたものであってもよい。Ｃｈａｎら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、（２０１１年）、３９巻（１号）：１〜１８頁を参照されたい。
【００９０】
一部の実施形態では、ＤＮＡを生物体または生物学的培地において生物学的プロセスでせん断する。そのようなＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡは血流中を自由に循環する。例えば、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）は、母体の血流中を自由に循環する胎児ＤＮＡである。無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、血流中を自由に循環する腫瘍ＤＮＡである。一部の実施形態では、断片化されたまたはせん断されたＤＮＡを使用するが、ＤＮＡは、断片化された形態で得られる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、核酸断片を接合して複合体にする。例えば、同一の断片に関しては図３を、および二重鎖核酸の２つの鎖に関しては図１６を参照されたい。任意の連結用分子を使用して分子を接合することができる。本発明において使用されるリンカーは、合成することもでき、種々の会社、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．、およびＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リンカーは、２種のプライマーまたは２つの核酸断片を接合するための任意の分子であってよい。連結用分子により複数の断片を接合することもできる。任意の数の断片を複合体に組み入れることができる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、連結用分子はストレプトアビジン分子であってよく、連結される断片はビオチン化核酸を含んでよい。増幅によって連結核酸断片を創出するために連結プライマーを使用する実施形態では、プライマーをビオチン化し、ストレプトアビジン分子上に接合することができる。例えば、４つの断片を四量体ストレプトアビジン上に接合することができる。例えばコンカテマーを形成することにより、４つよりも多くの分子を接合することができる。本発明のある特定の方法では、２つまたはそれよりも多くの核酸断片をクリック化学反応によって連結することができる。参照により本明細書に組み込まれるＫｏｌｂら、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｅｗ  Ｇｏｏｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．、２００１年６月１日；４０巻（１１号）：２００４〜２０２１頁を参照されたい。
【００９３】
例としておよびいくつかの公知のナノ粒子のうちの連結用分子は、単一の連結分子内の何百ものまたは何千もの断片を含めた多数の断片を連結することができる。連結ナノ粒子の１つの例は、チオールでキャップされた合成ＤＮＡ配列で表面が修飾されたコロイド金を含む多価ＤＮＡ金ナノ粒子であり得る。参照により本明細書に組み込まれるＭｉｒｋｉｎら、１９９６年、Ａ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｎａｔｕｒｅ、３８２巻：６０７〜６０９頁を参照されたい。表面ＤＮＡ配列は、所望の鋳型分子配列に相補的であってもよく、ユニバーサルプライマーを含んでもよい。
【００９４】
連結用分子は、核酸断片の分離にも役立ち得る。好ましい実施形態では、断片を、それらの間での結合が防止されるように方向付ける。空間的な分離および断片の方向の制御を生じさせるリンカーを用いると、崩壊または断片間の結合を回避および防止することができる。
【００９５】
一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または修飾ＰＥＧであってよい。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４、またはＰＥＧ−１１などの修飾ＰＥＧを使用して２つのアダプターまたは核酸を接合することができる。別の実施例では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で修飾ＰＥＧを使用して２つのアダプターを接合する。Ｓｃｈｌｉｎｇｍａｎら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、８３巻（２０１１年）、９１〜９５頁を参照されたい。任意のオリゴヌクレオチドまたは他の分子を使用してアダプターまたは核酸を接合することができる。
【００９６】
一部の実施形態では、アプタマーを使用して２つのアダプターまたは核酸を結合する。アプタマーは、プライマーまたは核酸などの種々の分子標的に結合するように設計することができる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）によって設計または選択することができる。アプタマーは、標的分子に特異的に結合する核酸巨大分子である。全ての核酸と同様に、特定の核酸リガンド、すなわち、アプタマーも、一般には１５〜４０ヌクレオチド長のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｔ、ＣおよびＧ）の直鎖配列によって記載することができる。一部の好ましい実施形態では、アプタマーは、反転塩基または修飾塩基を含んでよい。一部の実施形態では、アプタマーまたは修飾アプタマーは、少なくとも１つの反転塩基または修飾塩基を含む。
【００９７】
リンカーは、反転塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｂａｓｅｓ）で構成されてもよく、少なくとも１つの反転塩基を含んでもよいことが理解されるべきである。反転塩基または修飾塩基は、任意の商業的実体から取得することができる。反転塩基または修飾塩基は、開発されており、市販されている。反転塩基または修飾塩基は、他の分子に組み入れることができる。例えば、２−アミノプリンをオリゴヌクレオチドに置換することができる。２−アミノプリンは、ＤＮＡの構造および動力学をモニタリングするためのプローブとして有用な蛍光塩基である。２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）は、塩基をｄＴと対合させると３つの水素結合を形成することができ、また、短いオリゴのＴｍを上昇させることができる修飾塩基である。５−ブロモ−デオキシウリジンは、オリゴヌクレオチドに組み入れて、ＵＶ光への曝露でＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と架橋結合させることができる光反応性ハロゲン化塩基である。反転塩基または修飾塩基の他の例としては、デオキシウリジン（ｄＵ）、反転ｄＴ、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、５−メチルデオキシシチジン、または２’−デオキシイノシン（ｄＩ）が挙げられる。任意の反転塩基または修飾塩基を鋳型核酸の連結に使用することができることが理解されるべきである。
【００９８】
好ましい実施形態では、リンカーは、２種のプライマーまたは２つの核酸断片を接合するための分子を含む。リンカーは、単一分子であってもよく、複数の分子であってもよい。リンカーは、数個の反転塩基または修飾塩基を含んでもよく、または全体が反転塩基または修飾塩基であってもよい。リンカーは、ワトソン・クリック塩基と反転塩基または修飾塩基の両方を含んでよい。
【００９９】
任意のスペーサー分子または連結用分子を本発明において使用することができることが理解されるべきである。一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサー分子は、脂質もしくはオリゴ糖、またはオリゴ糖および脂質であってよい。米国特許第５，１２２，４５０号を参照されたい。本実施例では、分子は、脂質分子であることが好ましく、少なくとも２つの疎水性ポリアルキレン鎖を有するグリセリドまたはホスファチドであることがより好ましい。
【０１００】
リンカーは、任意の数のアダプター、プライマー、および断片のコピーで構成されてよい。リンカーは、２つの同一のアームを含んでよく、各アームが結合性分子、増幅プライマー、シーケンシングプライマー、アダプター、および断片で構成される。リンカーは、任意の数のアーム、例えば、３つまたは４つのアームを連結することができる。本発明の一部の態様では、核酸鋳型がスペーサー分子によって連結されることが理解されるべきである。本発明におけるリンカーは、２つの断片またはプライマーを接合するための任意の分子または方法であってよい。一部の実施形態では、ポリエチレングリコールまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ４もしくはＰＥＧ−１１などの修飾ＰＥＧを使用する。一部の実施形態では、リンカーは、脂質または炭化水素である。一部の実施形態では、タンパク質によりアダプターまたは核酸を接合することができる。一部の実施形態では、オリゴ糖によりプライマーまたは核酸を連結する。一部の実施形態では、アプタマーによりプライマーまたは核酸を連結する。断片を連結する場合、コピーは、それらの間での結合が防止されるように同相になるように方向付けられる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、リンカーは、抗体であってよい。抗体は、単量体、二量体または五量体であってよい。２種のプライマーまたは核酸を接合するための任意の抗体を使用することができることが理解されるべきである。例えば、ヌクレオシドを、タンパク質とカップリングすることによって免疫原性にすることができることは当技術分野で公知である。Ｖｏｉｄ、ＢＳ（１９７９年）、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、７巻、１９３〜２０４頁を参照されたい。さらに、抗体を、修飾核酸に結合するように調製することができる。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ、１２巻、３号を参照されたい。
【０１０２】
リンカーは、増幅の間、複合体に付着したままであってよい。一部の実施形態では、リンカーを増幅前に除去する。一部の実施形態では、リンカーを結合性分子に付着させ、次いで、結合性分子を増幅プライマーに付着させる。リンカーを除去すると、結合性分子または結合性プライマーが露出する。露出した結合性分子が固体支持体にも付着し、アーチが形成される。リンカーは、溶媒での洗浄、熱の適用、ｐＨの変更、界面活性剤または界面活性物質での洗浄などを含めた、当技術分野における任意の公知の方法によって除去することができる。
【０１０３】
本発明の方法は、リンカー分子を用いて連結する核酸を提供する。遺伝子材料が少ない試料では、同一の断片または二重鎖核酸の両方の鎖を含む断片が同時にまたは逐次的に増幅されることを確実にするために、核酸を連結することができる。出生前試料などの試料は、遺伝子含有量が低く、本発明による連結断片を増幅することにより、検出可能な含有量が増加する。この方法では、シグナルノイズ比が低下し、標的配列の検出が改善される。
【０１０４】
本発明の方法では、断片などの標的核酸を検出可能なレベルまで増幅するために、増幅を利用する。任意の公知の増幅技法を本発明において使用することができることが理解されるべきである。さらに、増幅プロセスによって創出される増幅したセグメントは、それ自体がその後の増幅のための効率的な鋳型になり得る。
【０１０５】
増幅とは、核酸配列の追加的なコピーの生成を指し、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応または当技術分野で周知の他の技術を使用して実施される（例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．［１９９５年］）。増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１年）ＰＮＡＳ、８８巻：１８９〜１９３頁；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１巻：５〜１６頁）、リガーゼ検出反応（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１年）ＰＮＡＳ、８８巻：１８９〜１９３頁）、転写に基づく増幅系、核酸配列に基づく増幅、ローリングサークル増幅、および超分枝ローリングサークル増幅などの、核酸分子を増幅する当技術分野で公知の任意の増幅反応であってよい。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＰＣＲに基づくものではないＤＮＡ増幅技法である多重置換増幅（ＭＤＡ）により、微量のＤＮＡ試料をゲノム解析のために迅速に増幅する。反応はランダムな六量体プライマーを鋳型とアニーリングすることによって開始される。ＤＮＡ合成を忠実度の高い酵素によって一定の温度で行う。しかし、任意の増幅方法を本発明と共に使用することができることが理解されるべきである。
【０１０７】
本発明のある特定の実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、ゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を、クローニングまたは精製を伴わずに上昇させるための、Ｋ．  Ｂ．  Ｍｕｌｌｉｓによる方法（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、これによって参照により組み込まれる）を指す。標的配列を増幅するためのプロセスは、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物に過剰なオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で的確な熱サイクルを連続させる。プライマーはそれらの二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。
本発明の一部の態様では、ＰＣＲプライマーをリンカー分子により接合し、ＰＣＲプロセスを通じて、同一の断片のコピーまたは二重鎖断片の両方の鎖とプライマーを連結する。他の実施形態では、アダプターをプライマーまたは断片のコピーに付加する。得られる複合体は、一般に、連結用分子によって直接または間接的に接合した、２つの同一の断片のコピーまたは二重鎖核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。連結断片または鎖の一方または両方がエラーを含み得ることが理解されるべきである。しかし、それぞれが正確に同じ塩基においてマッチするエラーを有する確率は低い。塩基における２つの断片間の不一致は、真のバリアントとは対照的に、エラーを示す。次いで、塩基を、単に未加工のシーケンシングデータから不明のものと同定することができる。
【０１０８】
プライマーは、これだけに限定されないが、適切な配列のクローニングおよび当技術分野で周知の方法を使用した直接化学合成を含めた種々の方法によって調製することができる（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８巻：９０頁（１９７９年）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８巻：１０９頁（１９７９年））。プライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの商業的な供給源から入手することもできる。プライマーは、同一の融解温度を有するものであってよい。プライマーの長さを５’末端または３’末端において伸長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。また、各プライマー対のアニーリング位置を、プライマー対の配列および長さにより所望の融解温度がもたらされるように設計することができる。２５塩基対よりも小さなプライマーの融解温度を決定するための最も単純な方程式は、Ｗａｌｌａｃｅ則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。これだけに限定されないが、Ａｒｒａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ、およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇからのＤＮＡｓｉｓを含めたコンピュータプログラムをプライマーの設計に使用することもできる。各プライマーのＴＭ（融解またはアニーリング温度）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐから入手可能なＯｌｉｇｏ  Ｄｅｓｉｇｎなどのソフトウェアプログラムを使用して算出される。
【０１０９】
一部の実施形態では、増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次いで、プライマーを標的分子内のそれらの相補配列とアニーリングさせる。アニーリング後、新しい相補鎖の対を形成するために、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させる。所望の標的配列の増幅したセグメントを高濃度で得るために、変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長のステップを何度も繰り返すことができる（すなわち、変性、アニーリングおよび伸長が１サイクルを構成し、多数のサイクルを行うことができる）。所望の標的配列の増幅したセグメントの長さは、プライマーの互いとの相対的な位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。
【０１１０】
一部の実施形態では、本発明の複合体を創出するために、プライマーを連結用分子またはスペーサー分子によって連結して、２つの連結断片のコピーを創出する。他の実施形態では、２つの断片を少なくとも１つのＰＣＲステップの後に連結する。ＰＣＲは、断片を連結用分子によって接合する前、またはその後に断片に適用することができることが理解されるべきである。一部の実施形態では、断片を接合する場合、接合した断片に対してＰＣＲを実行することができる。一部の実施形態では、連結コピーに増幅を行う。増幅ステップは、連結プライマーを含む。結果は、ＰＣＲのサイクル後、断片のコピーを含む連結複合体が生成するというものである。
【０１１１】
ＰＣＲを用いると、ゲノムＤＮＡ内の特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法体系（例えば、染色、標識したプローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み入れ、その後のアビジン−酵素コンジュゲートによる検出；３２Ｐ標識した、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどのデオキシヌクレオチド三リン酸の増幅したセグメントへの組み入れ）によって検出することができるレベルまで増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列を適切なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセスによって創出される増幅したセグメント自体が、その後のＰＣＲ増幅のための効率的な鋳型である。増幅された標的配列を使用して、組換えベクターに挿入するためのＤＮＡ（例えば、遺伝子）のセグメントを得ることができる。
【０１１２】
他の増幅方法および戦略も本発明において利用することができる。例えば、別の手法は、ＰＣＲとリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を組み合わせることである。ＰＣＲではＬＣＲよりも速く増幅がなされ、開始に必要な標的ＤＮＡのコピーがより少ないので、ＰＣＲを第１のステップとして使用し、その後にＬＣＲを行うことができる。次いで、増幅産物をＬＣＲまたはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）において、突然変異が存在するかどうかを示すものであるアレル特異的に使用することができる。別の手法は、ＬＣＲまたはＬＤＲを増幅およびアレル特異的識別の両方に使用することである。後者の反応は、線形増幅がもたらされるという点で有利である。したがって、増幅産物の量は、元の検体における標的ＤＮＡの量を反映するものであり、したがって、定量化を可能にするものである。
【０１１３】
ＬＣＲでは、標的配列の全長と相補的な近接するオリゴヌクレオチドの対を利用する（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１年）ＰＮＡＳ、８８巻：１８９〜１９３頁；Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．（１９９１年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１巻：５〜１６頁）。標的配列がこれらの配列の接合部においてプライマーと完全に相補的である場合、ＤＮＡリガーゼが近接する３’および５’末端ヌクレオチドに連結し、それにより複合配列が形成される。熱サイクルで熱安定性ＤＮＡリガーゼを使用すると、複合配列が逐次的に増幅される。オリゴヌクレオチドの接合部における一塩基ミスマッチにより、ライゲーションおよび増幅が妨げられる。したがって、プロセスは、アレル特異的である。突然変異体に特異的な３’ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの別のセットを別の反応において使用して、突然変異アレルを同定する。一連の標準の条件を使用して、任意の既知の部位における全ての可能性のある突然変異を検出することができる。ＬＣＲでは、一般には、ゲノムＤＮＡの両方の鎖を４種のプライマーとのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの標的として利用し、産物を、熱サイクルを繰り返すことによって指数関数的に増加させる。
【０１１４】
増幅またはシーケンシングアダプターまたはバーコード、またはこれらの組合せを、断片化された核酸に付着させることができる。そのような分子は、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）からなど、商業的に得ることができる。ある特定の実施形態では、そのような配列を鋳型核酸分子にリガーゼなどの酵素を用いて付着させる。適切なリガーゼとしては、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から市販されているＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼが挙げられる。ライゲーションは、平滑末端によるものであってもよく、相補的な突出末端の使用を介するものであってもよい。
ある特定の実施形態では、断片化後、平滑末端を形成するために、断片の末端を修復し、余分を切り取る（例えばエキソヌクレアーゼを使用して）、または埋める（例えば、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを使用して）。一部の実施形態では、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能なものなどの市販のキットを使用して末端修復を実施して、平滑末端５’リン酸化核酸末端を生じさせる。平滑末端が生じたら、末端をポリメラーゼおよびｄＡＴＰで処理して、断片の３’末端および５’末端への付加と独立した鋳型を形成させ、したがって、単一のＡ突出部を生成する。この単一のＡが、Ｔ−Ａクローニングと称される方法における断片と５’末端由来の単一のＴ突出部とのライゲーションのガイドになり得る。あるいは、制限酵素によって残される突出部の可能性のある組合せは制限酵素消化後に分かるので、末端をそのまま、すなわち、不揃いの末端のままにすることもできる。ある特定の実施形態では、相補的な突出末端を有する二本鎖オリゴヌクレオチドを使用する。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のバーコードを、それぞれの、任意の、または全ての断片に付着させる。バーコード配列は、一般に、配列をシーケンシング反応において有用なものにするある特定の特徴を含む。バーコード配列は、各配列が核酸の特定の部分と相関し、それにより、配列読み取りが、それらが由来する部分とまた相関することが可能になるように設計される。バーコード配列のセットを設計する方法は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２３５，４７５号に示されている。ある特定の実施形態では、バーコード配列を鋳型核酸分子に、例えば酵素を用いて付着させる。酵素は、上記のリガーゼまたはポリメラーゼであってよい。バーコード配列の核酸鋳型への付着は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００８／００８１３３０号および米国特許公開第２０１１／０３０１０４２号に示されている。バーコード配列のセットを設計するための方法およびバーコード配列を付着させるための他の方法は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５３７，８９７号；同第６，１３８，０７７号；同第６，３５２，８２８号；同第５，６３６，４００号；同第６，１７２，２１４号；および同第５，８６３，７２２号に示されている。任意の処理ステップ（例えば、入手、単離、断片化、増幅、またはバーコーディング）の後に、核酸をシーケンシングすることができる。
【０１１６】
例証的なバーコード配列のセットを設計するための方法およびバーコード配列を付着させるための他の方法は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１３８，０７７号；同第６，３５２，８２８号；同第５，６３６，４００号；同第６，１７２，２１４号；同第６２３５，４７５号；同第７，３９３，６６５号；同第７，５４４，４７３号；同第５，８４６，７１９号；同第５，６９５，９３４号；同第５，６０４，０９７号；同第６，１５０，５１６号；同第ＲＥ３９，７９３号；同第７，５３７，８９７号；同第６１７２，２１８号；および同第５，８６３，７２２号に示されている。
【０１１７】
バーコード配列は、一般に、配列をシーケンシング反応において有用なものにするある特定の特徴を有する。例えば、バーコード配列は、最小のホモポリマー領域を有するまたはホモポリマー領域を有さない、すなわち、バーコード配列内で、例えばＡＡまたはＣＣＣなど、一列に同じ塩基を２つまたはそれよりも多くを有さないように設計することができる。バーコード配列はまた、シーケンシングされる標的領域と重複しない、または標的と同一の配列を含有しないように設計することもできる。
【０１１８】
第１のバーコード配列および第２のバーコード配列を、配列の各対が特定の試料と相関し、それにより、試料を区別し、検証することが可能になるように設計する。バーコード配列のセットを設計する方法は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＢｒｅｎｎｅｒら（米国特許第６，２３５，４７５号）に示されている。ある特定の実施形態では、バーコード配列は、約２ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドまで、好ましくは約４ヌクレオチドから約２０ヌクレオチドまでにわたる。バーコード配列は、鋳型核酸と一緒にシーケンシングされる、または別個の読み取りでシーケンシングすることもできるので、オリゴヌクレオチド長は、付着した鋳型核酸からの最長の読み取りを可能にするための最小の長さであるべきである。一般に、バーコード配列は、鋳型核酸分子から少なくとも１塩基の間隔を空ける。
【０１１９】
本発明の方法は、バーコード配列を鋳型核酸に付着させることを伴う。鋳型核酸は、種々の機械的方法、化学的方法および／または酵素的方法を使用して、所望の長さ、例えば、一般に、１００塩基から５００塩基までまたはそれより長くまで断片化またはせん断することができる。ＤＮＡは、超音波処理によってランダムにせん断すること、ＤＮａｓｅまたは１種もしくは複数種の制限酵素、トランスポザーゼ、またはニッキング酵素に曝露させることができる。ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ、熱とそれに加えてマグネシウムに簡単に曝露させることによって、またはせん断によって断片化することができる。ＲＮＡは、断片化の前またはその後にｃＤＮＡに変換することができる。
【０１２０】
バーコード配列を、当技術分野で公知の方法を使用して鋳型に組み込む。バーコード配列を、例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ、Ｔｏｐｏクローニング（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのトポイソメラーゼ酵素を使用したトポイソメラーゼベクタークローニングシステム）、または化学的ライゲーションもしくはコンジュゲーションを使用して鋳型に組み込む。リガーゼは、オリゴヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）と鋳型核酸分子をライゲートすることができる任意の酵素であってよい。適切なリガーゼとしては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４  ＲＮＡリガーゼが挙げられる（そのようなリガーゼはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから商業的に入手可能である）。リガーゼを使用する方法は当技術分野で周知である。ポリメラーゼは、鋳型核酸分子の３’末端および５’末端にヌクレオチドを付加することができる任意の酵素であってよい。バーコード配列は、ＰＣＲ反応によってＰＣＲプライマーの一部として組み入れることができる。分子バーコードの組み入れまたはバーコードが組み入れられる場合にはその位置にかかわらず、シーケンシングアダプターは、核酸産物に二方向性に付着させることができ、したがって、同じシーケンシングの実行において、標的配列の５’末端および３’末端のどちらに由来するシーケンシング読み取りも存在することになる。一部の場合では、読み取りの方向を示すために標的配列の５’末端または３’末端におけるバーコードの位置を使用することが有利である。シーケンシングアダプターを、ＰＣＲまたはライゲーションなどの技法を使用してどのように付着させるかは当業者には周知である。
【０１２１】
図６は、可能性のあるアダプターおよびプライマーの立体配置の例を示す。６０２に示されている通り、Ｐ７プライマーがＲｅａｄ２プライマー部位に付着しており、Ｒｅａｄ２プライマー部位は相補領域に付着している。６０３では、連結ＰＣＲプライミング領域が固有の分子識別子に付着している。６０４に示されている通り、Ｐ５プライマーがインデックス読み取りプライマー部位、およびシーディング制御部位に付着している。
【０１２２】
一部の実施形態では、断片の多数のコピーを接合する。２つ、３つ、４つなどいずれにせよ任意の数の断片を接合することができることが理解されるべきである。接合したコピーは、単位と称することができる。次いで、いくつかの単位を連結用分子を用いて接合することができる。任意の数の単位を連結用分子によって接合することができることが理解されるべきである。これにより、複合体内の情報密度が増大する。複合体を固体支持体に付着させたら、複合体を増幅する。増幅産物を固体支持体に付着させることができる。断片の複数のコピーを接合して複合体にし、次いで複合体を増幅することにより、固体支持体上の情報密度が増大する。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、核酸を２つまたはそれよりも多くの接合したプライマーによって増幅することができる。任意の公知の増幅方法を連結プライマーと併せて使用することができる。ある特定の実施形態では、デジタルＰＣＲまたはエマルジョンＰＣＲを使用して、シーケンシングクラスターにシードするためまたは他のシーケンシング方法において使用するための２つまたはそれよりも多くの連結核酸断片を創出することができる。好ましい実施形態では、アダプターをシーケンシングされる目的の核酸断片とライゲートすることによって鋳型核酸を創出することができる。アダプターは、任意選択で、ユニバーサルプライミング部位、１つまたは複数のシーケンシングプライマー部位、および所与のクラスター内の全てのシーケンシング読み取りが同じ出発鋳型を起源とすることを確実にするための固有のクラスター識別子を含んでよい。図９は、本発明のある特定の実施形態に従って設計された例証的なライゲーションアダプターを示す。例えば、アダプターは、ｙ１：ＣＣＴＡＣＴＣＧＣＴＡＣ（配列番号１）、ｙ２：ＡＴＧＣＧＡＧＣＣＴＣＴ（配列番号２）、ｙ３：ＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡ（配列番号３）、およびｙ４：ＴＧＣＡＧＧＡＴＧＧＴＧ（配列番号４）などの様々なステム領域と共に使用することができる。アダプター配列は、シーケンシングフローセル上の隣接するクラスターを区別するために、一連のランダムな塩基（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多く）を含んでよい固有のクラスター識別子（ＵＣＩ）を含んでよい。アダプター配列は、Ｔ突出部を除去し、ライゲーション効率を低下させる可能性がある３’エキソヌクレアーゼ消化を低減するために、ホスホロチオエート連結したＴを含んでよい。３’リン酸ブロッカーは任意選択であり、本発明のデジタルＰＣＲ方法に必須なものではない。
【０１２４】
シーケンシングされる核酸断片にアダプターをライゲートしたら、エマルジョンまたはドロップレットを創出することができる。ドロップレットは、不混和性担体流体で囲まれた水性ドロップレットであってよい。そのようなドロップレットを形成させ、ドロップレットを用いたＰＣＲ増幅を行う方法は、例えば、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第２００８／００１４５８９号、同第２００８／０００３１４２号、および同第２０１０／０１３７１６３号）、Ｓｔｏｎｅら（米国特許第７，７０８，９４９号および米国特許出願第２０１０／０１７２８０３号）、ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第７，０４１，４８１号、ＲＥ４１，７８０として再発行）に示されている。
【０１２５】
好ましい実施形態では、最終的なクラスターにただ１つの鋳型分子がシードされることを確実にするため、および異なる核酸断片を含有するハイブリッド連結核酸複合体の形成を防止するために、単一の鋳型核酸分子をドロップレットに添加する。遺伝子特異的であってよい種々のマルチプレックスプライマーも、連結プライマーと一緒にドロップレットに添加することができる。連結プライマーは、本明細書に記載の方法のいずれかに従って連結された２つまたはそれよりも多くのプライマーであってよい。連結プライマーは、例えば、ライゲートされたアダプターにおけるユニバーサルプライミング部位に対応するユニバーサルプライミング部位ならびにシーケンシングプライマー部位（例えば、１つよりも多くの分子がクラスターにシードされている時に同定するための異なるインデックスプライミング部位）を含んでよい。ある特定の実施形態では、連結プライマーは、シーケンシングされる特定の関心領域を標的とする遺伝子特異的プライマーを含んでよく、したがって、最初のライゲートするステップを回避することができ、また、連結プライマーデジタルＰＣＲ増幅のために非修飾核酸断片を直接ドロップレットに添加することができる。図１０は、ある特定の本発明の方法によるプライマーおよびライゲートされた鋳型核酸断片を例示し、ここで、ライゲートされた鋳型は連結ユニバーサルプライマーのプライミング部位に対応するプライミング部位を含み、また、標的核酸の連結コピーを創出するために遺伝子特異的マルチプレックスプライマーを使用する。
【０１２６】
図７は、本発明の例証的な連結プライマーエマルジョンＰＣＲ方法を例示する。関心領域７２４を有する無細胞ＤＮＡなどの試料核酸断片７０１をアダプター７２５とライゲーション７０３して、鋳型分子７３０を形成させる。次いで、ドロップレット７２６中で、単一の鋳型分子７３０、連結プライマー７２２、およびマルチプレックス遺伝子特異的プライマー７２３を含むエマルジョンを創出７０５する。次いで、公知のエマルジョンＰＣＲ方法を使用して鋳型をドロップレット中で増幅して、シーケンシングプライマー部位、核酸の関心領域７２４および本明細書に記載の他の任意選択の配列のいずれかを含む鋳型分子７３０の連結コピーを創出する。次いで、エマルジョンを任意の公知の方法に従って破壊７０７して、鋳型分子の連結コピーを放出させる。ＰＣＲ増幅により連結鋳型分子にＰＣＲエラー７２１が導入される可能性があるが、二重コピークラスターシーディングを伴う開示されている方法の性質は、そのようなエラーを同定し、クラスターにシードする連結コピーの両方に存在することになる真のバリアント７２０と区別することができるものであることに留意するべきである。次いで、連結鋳型分子７３０を、クラスターシーディングをシーケンシングするために、任意選択で、スクリーニング、精製、または酵素的選択７０９することができる。次いで、連結鋳型７３０をフローセルとハイブリダイズさせるか、またはそうでなければ他で記載されている通りシーケンシング７１１する。
【０１２７】
前に記載した通り、連結鋳型分子は、２つまたはそれよりも多くの核酸断片のコピーを含んでよい。図８は、４つの断片コピーを含む連結鋳型分子または複合体を形成するために使用するドロップレット７２６を例示する。ドロップレット７２６は、２つの交互プライマーの２つのコピーを有する４つの連結プライマーの複合体７２２を含む。そのような連結プライマーの複合体は、例えば、上記のストレプトアビジン／ビオチン四量体を使用して形成させることができる。ドロップレット７２６は、遺伝子特異的マルチプレックスプライマー７２３、および、好ましくは、シーケンシングされる核酸断片鋳型分子７３０の単一コピーをさらに含んでよい。そうでなければ、ドロップレットを図７に関して記載されているのと同じ様式でＰＣＲ増幅に供することができ、シーケンシングのためにクラスターにシードし、また、希な場合正真正銘のバリアント７２０とＰＣＲエラー７２１または他の偽陽性の同定および区別を補助する、４つの鋳型分子の連結コピーが生成するという代替的な結果が伴う。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、高密度シーケンシングの実行において近くのクラスター間のクロストークを減少させることに関する。図１５は、シーケンシング読み取り中に隣接するクラスターからのマッチする塩基により単一のクラスター内の真の混合塩基が遮蔽される可能性があるクロストークによって提示される問題を例示する。このクロストークを減少させるために、異なるシーケンシングプライマー部位を有する第２のアダプターをライゲーション中に添加することができ、対応するシーケンシングプライマーを使用して、クラスター内での塩基の一致と隣接するクラスター間での塩基の一致の区別を補助する。これらの方法は任意の標準のシーケンシング技法において使用することができるが、図１３および１４は、連結プライマーエマルジョンＰＣＲおよび連結断片クラスターシーディングに適用される方法を例示する。図１３は、それぞれ関心領域７２４および７３６を有する無細胞ＤＮＡなどの複数の試料核酸断片７０１および７３５を示し、これらを２つの異なるアダプター７２５および７３４とライゲーション７０３して、異なる関心領域７２４および７３６を特徴付けされるバリアント７２０と一緒に含む第１の鋳型分子７３０および第２の鋳型分子７３３を形成させる。次いで、２つのエマルジョンを創出７０５し、これらのエマルジョンはそれぞれ、鋳型分子７３０または７３３のうちの一方、各アダプターに対応する連結プライマー７２２、およびマルチプレックス遺伝子特異的プライマー７２３をドロップレット７２６中に含む。次いで、公知のエマルジョンＰＣＲ方法を使用して鋳型をドロップレット中で増幅して、２つの異なるアダプター７２５および７３４によって導入された異なるシーケンシングプライマー部位を含む鋳型分子７３０および７３３の連結コピーを創出する。次いで、エマルジョンを任意の公知の方法に従って破壊７０７して、鋳型分子７３０および７３３の連結コピーを放出させる。ＰＣＲ増幅により連結鋳型分子にＰＣＲエラー７２１が導入される可能性があるが、二重コピークラスターシーディングを伴う開示されている方法の性質は、そのようなエラーをそのように同定し、クラスターにシードする連結コピーの両方に存在することになるバリアント７２０と区別することができるというものであることに留意するべきである。次いで、連結鋳型分子７３０および７３３を、クラスターシーディングをシーケンシングするために、任意選択で、スクリーニング、精製、または酵素的選択７０９することができる。次いで、連結鋳型７３０をフローセルとハイブリダイズさせるまたはそうでなければ他で記載されている通りシーケンシング７１１する。
【０１２９】
図１４に示されている通り、クラスターに２つの鋳型アダプター７２５または７３４のうちの一方をシードする。シーケンシング方法の例証的なステップは、次いで、クラスターの全ての一方のセンスにわたって共通するシーケンシングプライミング部位を使用して短い読み取りを行うこと；クラスターの全ての他方のセンスにわたって共通するインデックス読み取りを行って、複数の鋳型による可能性のあるクラスターシーディングを同定すること；第２のアダプター７３４のシーケンシングプライミング部位に対応するプライマーを用いて標的クラスターに対する読み取りを行うこと；および、次いで、第１のアダプター７２５のシーケンシングプライミング部位に対応するプライマーを用いて隣接するクラスターに対する長いインデックス読み取りを行うことを含む。隣接するクラスターが第１のアダプター７２５のシーケンシングプライミング部位を含有する確率は５０％であり、上記の技法を使用することにより、隣接するクラスターの読み取りを同定し、単一のクラスター内の混合塩基を遮蔽するクロストークのリスクを減少させることができる。本発明の方法によってもたらされるクロストークの減少で、バリアント７２０の同定およびＰＣＲエラー７２１との区別をより確実に実現することができる。
【０１３０】
図１Ａに示されている通り、リンカー１０３は、濃度駆動Ｔｍを有する２つの短いプライマー１０５を含む。リンカー１０３またはプライマー１０５は、ユニバーサルアダプターにも付着させることができる（示されていない）。上記のエマルジョンＰＣＲ技法の代替として、連結プライマー増幅を、複数のリニアＰＣＲステップを使用して実現することができる。リニアＰＣＲの間、ゲノム鋳型の２つのコピー１０７を調製する。図１Ｂに示されている通り、複合体１０９は、リンカー１０３、プライマー１０５および核酸鋳型の同一のコピー１０７を含む。図１Ｃに示されている通り、異なるリンカー１１６およびアダプター１１８を使用した第２のリニアＰＣＲステップを使用して、核酸鋳型１０７に対して逆のセンス１１４を創出する。複合体１０９および１１９にユニバーサルＰＣＲなどの増幅の追加的なステップを行って、両方のセンス（センスおよびアンチセンス）の複数のアンプリコンを創出する。図１Ｄおよび１Ｅを参照されたい。
【０１３１】
複合体の例が図３に示されている。図３に示されている通り、複合体３０１は、２種のプライマー３０３に付着したリンカー３０１を含有する。複合体はまた、配列読み取りプライマー３０５および標的核酸３０９に連結するためのアダプター３０７も含む。複合体はまた、相補的なアダプター３１１およびプライマー３１３も含む。好ましい実施形態では、プライマー３１３はＰ７プライマーであり、プライマー３０３はＰ５プライマーである。アダプター、プライマー、および標的核酸の任意の組合せ、方向または立体配置を組織化することができることが理解されるべきである。複合体はバーコードを含んでよいことも理解されるべきである。図３は例であり、実施形態を限定するものではない。
【０１３２】
本発明の複合体は、マイクロビーズ、ビーズ、チャネル壁、マイクロチップなどの種々の固体支持体に付着させることができる。
【０１３３】
接合した断片のシーケンシングは、当技術分野で公知の任意の方法によるものであってよい。本発明は、Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓからのゲノムシーケンサー（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻：３７６〜３８０頁；米国特許第６，２７４，３２０号；同第６，２５８，５６８号；同第６，２１０，８９１号）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からのＳＯＬｉＤシステム、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）からのＨＥＬＩＳＣＯＰＥシステム（例えば、米国特許公開第２００７／００７０３４９号を参照されたい）、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）からのＩｏｎシーケンサーを含めた種々のシーケンシングプラットフォームに適用される。
【０１３４】
好ましい実施形態では、シーケンシングは、各塩基を逐次的に決定することができる方法による。ＤＮＡシーケンシング技法としては、標識したターミネーターまたはプライマーおよび平板または毛細管におけるゲル分離を使用する古典的なジデオキシシーケンシング反応（Ｓａｎｇｅｒ法）、可逆的に終結させた標識したヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、４５４シーケンシング、標識したオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーとのアレル特異的ハイブリダイゼーション、標識したクローンのライブラリーとのアレル特異的ハイブリダイゼーションを使用し、その後、ライゲーション、重合ステップ中の標識したヌクレオチドの組み入れのリアルタイムモニタリングを行う、合成によるシーケンシング、ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、およびＳＯＬｉＤシーケンシングが挙げられる。分離した分子のシーケンシングがつい最近、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する逐次的なまたは単一の伸長反応によって、ならびにプローブのライブラリーとの単一のまたは逐次的な示差的ハイブリダイゼーションによって実証された。
【０１３５】
リンカーをアダプター、プライマー、または結合性分子に付着させることもできることが理解されるべきである。リンカーは、これらの種に、任意の方向または配置で付着させることができる。連結用分子をアダプターまたはプライマーに直接付着させ、核酸断片に間接的に連結することができる。本発明の一部の態様では、連結用分子を増幅の前、またはその後に除去することができる。一部の実施形態では、連結用分子を複合体に残存させる。一部の実施形態では、連結用分子をシーケンシングの前に除去し、他の実施形態では、連結用分子をシーケンシングの間、複合体に残存させる。
【０１３６】
提供される発明の方法において使用することができるシーケンシング技法としては、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）（Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ．  Ｄ．ら（２００８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２０巻：１０６〜１０９頁）が挙げられる。ｔＳＭＳ技法では、ＤＮＡ試料を切断しておよそ１００〜２００ヌクレオチドの鎖にし、ポリＡ配列を各ＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。蛍光標識したアデノシンヌクレオチドを付加することによって各鎖を標識する。次いで、ＤＮＡ鎖を、数百万のオリゴ−Ｔ捕捉部位が表面に固定化されたフローセルとハイブリダイズさせる。鋳型の密度は、１ｃｍ２当たり約１億個の鋳型であってよい。次いで、フローセルを計器、例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅシーケンサーにローディングし、フローセルの表面にレーザーを照明し、それにより、各鋳型の位置を明らかにする。ＣＣＤカメラにより、フローセル表面上の鋳型の位置をマッピングすることができる。次いで、鋳型蛍光標識を切断し、洗い流す。ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識したヌクレオチドを導入することによってシーケンシング反応を開始させる。オリゴ−Ｔ核酸がプライマーとしての機能を果たす。ポリメラーゼにより標識したヌクレオチドがプライマーに鋳型指向的に組み入れられる。ポリメラーゼおよび組み入れられなかったヌクレオチドを除去する。蛍光標識したヌクレオチドの組み入れを指向させた鋳型をフローセル表面のイメージングによって検出する。イメージング後、切断ステップにより蛍光標識を除去し、他の蛍光標識したヌクレオチドを用いて、所望の読み取り長が実現されるまでプロセスを繰り返す。各ヌクレオチド付加ステップで配列情報を収集する。本発明を用いると、連結断片を縦列で同定することができる。ｔＳＭＳについてのさらなる記載は、例えば、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許第７，１６９，５６０号）、Ｌａｐｉｄｕｓら（米国特許出願第２００９／０１９１５６５号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許第６，８１８，３９５号）、Ｈａｒｒｉｓ（米国特許第７，２８２，３３７号）、Ｑｕａｋｅら（米国特許出願第２００２／０１６４６２９号）、およびＢｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、１００巻：３９６０〜３９６４頁（２００３年）に示されており、これらの参考文献のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
提供される発明の方法において使用することができるＤＮＡシーケンシング技法の別の例は、４５４シーケンシングである（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｍら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ、４３７巻、３７６〜３８０頁）。４５４シーケンシングは、二段階を伴う。第１のステップでは、ＤＮＡをせん断しておよそ３００〜８００塩基対の断片にし、断片を平滑末端化する。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターを断片の末端にライゲートする。アダプターは断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとして働く。断片を、ＤＮＡ捕捉用ビーズ、例えば、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズに、例えば、５’−ビオチンタグを含有するアダプターＢを使用して付着させることができる。本発明の方法を使用して、上記の通り接合させた断片をビーズ上に捕捉する。ビーズに付着した接合した断片を油−水エマルジョンのドロップレット中でＰＣＲ増幅する。結果は、各ビーズ上でクローン的に増幅されたＤＮＡ断片の複数のコピーである。第２のステップでは、ビーズをウェル（ピコリットルサイズ）中に捕捉する。各ＤＮＡ断片に対して並行してパイロシーケンシングを実施する。１つまたは複数のヌクレオチドの付加により光シグナルが生じ、それがシーケンシング計器のＣＣＤカメラによって記録される。シグナル強度は組み入れられたヌクレオチドの数に比例する。パイロシーケンシングでは、ヌクレオチド付加の際に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）を使用する。ＰＰｉはアデノシン５’−ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼはルシフェリンをオキシルシフェリンに変換するためにＡＴＰを使用し、この反応により光が生じ、それを検出し、分析する。
【０１３８】
提供される発明の方法において使用することができるＤＮＡシーケンシング技法の別の例は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングである（米国特許出願第２００９／００２６０８２号、同第２００９／０１２７５８９号、同第２０１０／００３５２５２号、同第２０１０／０１３７１４３号、同第２０１０／０１８８０７３号、同第２０１０／０１９７５０７号、同第２０１０／０２８２６１７号、同第２０１０／０３００５５９号、同第２０１０／０３００８９５号、同第２０１０／０３０１３９８号、および同第２０１０／０３０４９８２号）、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングでは、ＤＮＡをせん断しておよそ３００〜８００塩基対の断片にし、断片を平滑末端化する。次いで、オリゴヌクレオチドアダプターを断片の末端にライゲートする。アダプターは断片の増幅およびシーケンシングのためのプライマーとして働く。断片を表面に付着させることができ、断片が個別に分解可能になるような分解能で付着させる。本発明の方法を使用して、接合した断片を表面に付着させる。１つまたは複数のヌクレオチドの付加によりプロトン（Ｈ＋）が放出され、そのシグナルがシーケンシング計器において検出され、記録される。シグナル強度は組み入れられたヌクレオチドの数に比例する。
【０１３９】
図１１は、本発明のエマルジョンＰＣＲ方法を使用するＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングのためのビーズの調製を例示する。上記の連結鋳型の調製方法と同様に、関心領域７２４を有する無細胞ＤＮＡなどの試料核酸断片７０１を、一方の末端にリニアＰＣＲプライマー７２７を含み、他方の末端にユニバーサルＰＣＲプライマー７２８を含むアダプターとライゲーション７０３して、鋳型分子７３０を形成する。次いで、ドロップレット７２６中に、単一の鋳型分子７３０、マルチプレックス遺伝子特異的プライマー７２３、およびビーズ７２９上に接合した複数の連結プライマーを含むエマルジョンを創出７１３する。次いで、ドロップレット中で公知のＰＣＲ方法を使用して鋳型を増幅７１５して、鋳型分子７３０の多数のコピーを有するビーズを創出し、ビーズは、ＰＣＲにより導入されたエラー７２１を有する可能性がある。次いで、エマルジョンを破壊し、ビーズに連結した断片７３１をＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングのためにフローセルシーケンシングウェル７３２にローディング７１７する。ビーズの大部分はフローセルローディングの間に失われ、断片を含有するビーズ７３１のごく一部のみがフローセルウェル７３２に入る。
【０１４０】
図１２は、本発明の方法に従って単一の鋳型分子からシードされたビーズを使用したＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングのエラー同定の利点を例示し、単一のウェルからの読み取りにおける混合塩基によりＰＣＲエラーが示され、一方、他のウェルまたは参照ゲノムと異なり得るコンセンサス読み取りにより、試料核酸における真のバリアントが示される。
【０１４１】
本発明は、固相増幅によって生産された増幅された核酸をシーケンシングする方法も包含する。したがって、本発明は、固相増幅を使用して核酸鋳型のプールを増幅するステップ、および、核酸シーケンシング反応を行って、固相増幅反応において生成された少なくとも１つの増幅された核酸鎖の全部または一部の配列を決定するステップを含む、核酸シーケンシングの方法を提供する。シーケンシング反応の開始点は、シーケンシングプライマーを固相増幅反応の産物とアニーリングさせることによってもたらすことができる。これに関連して、鋳型ライブラリーの形成の間に付加されたアダプターの一方または両方は、シーケンシングプライマーと鋳型ライブラリーの全ゲノムまたは固相増幅によって引き出された増幅産物とのアニーリングを可能にするヌクレオチド配列を含んでよい。
【０１４２】
フォワードおよびリバース増幅プライマーの両方を固体表面上に共有結合により固定化する固相増幅反応の産物は、固定化されたポリヌクレオチド鎖と固定化された相補鎖の対のアニーリングによって形成される、いわゆる架橋構造であり、両方の鎖が５’末端で固体支持体に付着している。そのような架橋構造で構成されるアレイでは、ハイブリダイゼーションのための標準の条件下では、従来のシーケンシングプライマーと固定化された鎖の一方とのハイブリダイゼーションはこの鎖とその固定化された相補鎖のアニーリングと比較して有利でないので、典型的な核酸シーケンシング技法のために非効率的な鋳型が提供される。
【０１４３】
核酸シーケンシングのためにより適切な鋳型をもたらすためには、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を生じさせるために、架橋構造における固定化された鎖の一方の実質的に全てまたは少なくとも一部分を除去するまたは置き換えることが有利であり得る。したがって、一本鎖である鋳型の一部がシーケンシングプライマーとのハイブリダイゼーションのために利用可能になる。「架橋した」二本鎖核酸構造内の１つの固定化した鎖の全部または一部を除去するプロセスを本明細書では直線化と称することができ、これは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／０１１８１２８号においてさらに詳細に記載されている。
【０１４４】
架橋した鋳型構造は、一方または両方の鎖を制限エンドヌクレアーゼで切断することによってまたは一方の鎖をニッキングエンドヌクレアーゼで切断することによって直線化することができる。とりわけ、化学的切断（例えば、過ヨウ素酸を用いたジオール連結の切断）、エンドヌクレアーゼを用いた切断による脱塩基部位の切断（例えば、ＮＥＢから供給される「ＵＳＥＲ」、部品番号Ｍ５５０５５）、または熱もしくはアルカリへの曝露によるもの、そうでなければデオキシリボヌクレオチドで構成される増幅産物に組み入れられたリボヌクレオチドの切断、光化学的切断またはペプチドリンカーの切断を含めた他の切断方法を制限酵素またはニッキング酵素の代替として使用することができる。
【０１４５】
切断ステップ後、切断のために使用される方法にかかわらず、切断反応の産物を、固体支持体に付着していない切断された鎖（単数または複数）の一部分（単数または複数）を除去するために、変性条件に供することができる。適切な変性条件、例えば、水酸化ナトリウム溶液、ホルムアミド溶液または熱は、標準の分子生物学プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）を参照することで当業者には明らかになろう。変性により、部分的にまたは実質的に一本鎖のシーケンシング鋳型の生成がもたらされる。次いで、シーケンシングプライマーと鋳型の一本鎖部分のハイブリダイゼーションによってシーケンシング反応を開始させることができる。
【０１４６】
したがって、本発明は、核酸シーケンシング反応が、シーケンシングプライマーと直線化された増幅産物の一本鎖領域をハイブリダイズさせること、増幅されたシーケンシングされる鋳型鎖の領域と相補的なポリヌクレオチド鎖に１つまたは複数のヌクレオチドを逐次的に組み入れること、組み入れられたヌクレオチドの１つまたは複数に存在する塩基を同定すること、および、それにより鋳型鎖の領域の配列を決定することを含む方法を包含する。
【０１４７】
提供される発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングである。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングワークフローは、３つのステップに基づく：ライブラリーを事実上あらゆる核酸試料から調製し、増幅してクローンクラスターを生成し、大規模並列処理合成を使用してシーケンシングする。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングは、フォールドバックＰＣＲおよび固定されたプライマーを使用した固体表面上でのＤＮＡの増幅に基づく。ゲノムＤＮＡを断片化し、アダプターを断片の５’末端および３’末端に付加する。フローセルチャネルの表面に付着したＤＮＡ断片を伸長させ、ブリッジ増幅する。本発明の方法を使用して、接合した断片をフローセルチャネルに付着させ、伸長させ、ブリッジ増幅する。一部の実施形態では、リンカーをブリッジ増幅の前に除去する。一部の実施形態では、リンカーを増幅の間断片に付着したままにする。断片は二本鎖になり、その二本鎖分子を変性させる。固相増幅の複数のサイクル、その後の変性により、フローセルの各チャネルにおいて同じ鋳型の一本鎖ＤＮＡ分子のおよそ１，０００コピーのクラスターを数百万創出することができる。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびフルオロフォアで標識した可逆的終結ヌクレオチド４種を使用して逐次的なシーケンシングを実施する。ヌクレオチドの組み込み後、レーザーを使用してフルオロフォアを励起させ、画像を捕捉し、第１の塩基の同一性を記録する。組み入れられた塩基それぞれから３’ターミネーターおよびフルオロフォアを除去し、組み入れ、検出および同定ステップを繰り返す。この技術に従ったシーケンシングは、それぞれの全体が参照により組み込まれる、米国特許第７，９６０，１２０号；米国特許第７，８３５，８７１号；米国特許第７，２３２，６５６号；米国特許第７，５９８，０３５号；米国特許第６，９１１，３４５号；米国特許第６，８３３，２４６号；米国特許第６，８２８，１００号；米国特許第６，３０６，５９７号；米国特許第６，２１０，８９１号；米国特許公開第２０１１／０００９２７８号；米国特許公開第２００７／０１１４３６２号；米国特許公開第２００６／０２９２６１１号；および米国特許公開第２００６／００２４６８１号に記載されている。
【０１４８】
本発明の方法をＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｎｉａ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）に組み入れることができる。本発明を使用して、２つの同一の断片のコピーまたは二重鎖断片の両方の鎖を含む連結複合体のライブラリーを調製し、次いで、固体支持体に付着させる。複合体を増幅してクローンクラスターを生成し、次いで、大規模並列処理合成を使用してシーケンシングする。この方法では、各クラスターに１つの断片がシードされる。本発明を用いると、クラスターにシードするために２つの同一の断片または二重鎖断片の両方の鎖を使用する。シーケンシングの間、アンプリコン間で特定の塩基における一致がなければ、エラーが検出される。
【０１４９】
好ましい実施形態では、接合した断片をフローセルチャネル壁に付着させる。図２に示されている通り、複合体１０９および１１９をフローセルチャネル壁などの固体支持体２０２に付着させる。複合体１０９はセンスを含んでよく、複合体１１９はアンチセンスを含んでよい。各複合体をクラスターにシードする。図２に示されている通り、複合体１０９をクラスター１（２０５）にシードし、複合体１１９をクラスター２（２０７）にシードする。
【０１５０】
図４Ａは、複合体４０１の例を示す。複合体４０１は、リンカー４０６および核酸鋳型の同一のコピーを含む。しかし、核酸鋳型の１つのコピーは、エラー４１０を含む。複合体４０１を固体支持体４０２に結合性部位４０５を介して付着させる。一部の実施例では、結合性部位４０５は、フローセル表面に共有結合した相補的なオリゴヌクレオチド（複合体上のオリゴヌクレオチドと相補的）である。図４Ｂに示されている通り、複合体４０１を伸長させ、ブリッジ増幅してコピー４１８を創出する。このプロセスを繰り返し、図４Ｃに示されている通り、固体支持体４０２上にクラスター４５０を形成させる。このプロセスから、クラスターは、複合体の各半分に由来するオリゴヌクレオチドの混合物である。オリゴヌクレオチドの約半分がエラーを含有し、あとの半分はエラーを含有しない。
【０１５１】
図５Ａは、２つの複合体５０２および５０３を示し、複合体５０２はエラー５１０を含有する。次いで、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよびフルオロフォアで標識した可逆的終結ヌクレオチド４種を導入して逐次的なシーケンシングを行う。ヌクレオチドの組み込み後、レーザーを使用してフルオロフォアを励起させ、画像を捕捉し、第１の塩基の同一性を記録する。第１の塩基にはエラーが存在しないので、両方の塩基が同じ蛍光を発する。組み入れられた塩基それぞれから３’ターミネーターおよびフルオロフォアを除去し、組み入れ、検出および同定ステップを繰り返す。これらのステップを、エラーを含有する塩基に到達するまで繰り返す。この塩基では、塩基は同じ蛍光を発しない。塩基は違うように蛍光を発する。図５Ｂに示されている通り、混合蛍光は、塩基がマッチしないことを示すものになる。混合蛍光はエラーを示すものになり、塩基は不明またはＮとして報告される。図５Ｃを参照されたい。
【０１５２】
図１６は、核酸断片のセンス鎖およびアンチセンス鎖から連結二重鎖核酸を創出するための本発明のドロップレットに基づく方法を例示する。示されているように、両方の鎖上に表される稀なバリアントを有する二本鎖無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を得ることができる。次いで、二本鎖鋳型を、エマルジョンに、１つまたは複数の遺伝子特異的フォワードプライマー（例えば、エマルジョンは、１つよりも多くの遺伝子または遺伝子の一部に特異的な多重化フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含有してよい）、１つまたは複数の遺伝子特異的リバースプライマー、ユニバーサル連結プライマーと共に添加することができる。エマルジョンをエマルジョンＰＣＲに供して、連結二重鎖産物を創出することができる。次いで、エマルジョンを破壊し、非連結鋳型を消化する。次いで、残りの連結二重鎖産物をシーケンシングすることができる。二本鎖産物はドロップレットにフォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーと共に進入するので、二重鎖配列情報を得ることができる。エマルジョンＰＣＲの連結産物は、少なくとも約５０％の時間で両方の鋳型センスを含有し、これにより、平均エラー率が低下する。図１６に示されている通り、エマルジョンＰＣＲの間にＰＣＲエラーが二重鎖産物に導入されるが、ＰＣＲエラーは一方の鎖上にのみに存在し、真のバリアントは両方の鎖上に存在するので、この２つはシーケンシングの間に互いと容易に区別することができる。
【０１５３】
図１７および１８は、例証的なユニバーサル連結プライマーおよびフォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーならびに連結二重鎖産物を創出するためのＰＣＲ増幅におけるそれらの使用方法を示す。
【０１５４】
アンプリコン長は、感度を改善するために短く保持されることが好ましい。複数の実施例では、プライマー間の標的領域は約８６ｂｐである。追加的な遺伝子特異的プライマーは図１９に示されている。
【０１５５】
図２０および２１は、それぞれ図１７および１８からの産物を使用した本発明のシーケンシング方法を例示する。連結プライマーは、２つまたはそれよりも多くの部位を含有してよく、ＰＥＧ、ビオチン化ＤＮＡと結合したＴｒａｐｔａｖｉｄｉｎ、ＤＮＡをコーティングしたビーズ、ＤＮＡをコーティングしたナノ粒子、ゲルに基づくビーズ（例えば、アクリルアミド）に連結したＤＮＡで構成されてよい。ビーズは、ポリスチレン、ラテックス、磁気、シリカ、強磁性または類似した材料であってよい。付着は、従来の方法によるものであってよく、アミノ基とカルボキシル基の組合せによるものであることが好ましい。
【０１５６】
本発明の方法は、ドロップレットにより形成された連結二重鎖分子についての二重鎖同定戦略を含み得る。記載の通り、本発明のドロップレットに基づく方法は、連結二重鎖断片の形成（ＤＮＡ二重鎖の各側面からの表示を含有する連結分子）を少なくとも５０％の率でもたらすことができ、したがって、非二重鎖産物からのデータを省き二重鎖産物の利点を増大させる正確度を得るために、これらの産物の同定が重要になる。二重鎖同定方法としては、例えば、アニーリング温度が異なる２セットのプライマーを使用した二段階ＰＣＲ手法を挙げることができ、この手法では、最初の何回かのサイクルを低温で遺伝子特異的バーコーディングプライマーを用いて実施して二重鎖の各センスを増幅および同定しながら、その後のサイクルにユニバーサル尾部を添加する。二重鎖の各センスが複数のバーコードで標識されることを防ぐために、バーコーディングサイクルの数を限定する。次いで、その後のサイクルを高温で、これらの条件下ではバーコーディングプライマーは結合することができないのでユニバーサルプライマーによって、実施することができる。次いで、二重鎖産物を、シーケンシング解析の間にそれらのセンス特異的バーコードが存在することによって同定することができる。
【０１５７】
図２９Ａ〜Ｄは、本発明のある特定の実施形態による二重鎖同定方法を例示する。例示された実施例では、以下をドロップレットに添加することができる：連結プライマー；それぞれが高Ｔｍを有する（ＴｍはＬＮＡを使用して上昇させることができる）ユニバーサルフォワードプライマーおよびユニバーサルリバースプライマー；それぞれがユニバーサルフォワードプライマーよりも低いＴｍを有し、それよりも濃度が低い、バーコーディングされたフォワード遺伝子特異的プライマーおよびバーコーディングされたリバース遺伝子特異的プライマー；および二重鎖鋳型。次いで、エマルジョンＰＣＲを、バーコーディングされたプライマーが鋳型に結合するのを可能にする低アニーリング温度を有する第１のサイクル、その後、図２９Ｂに示されている産物を生成するための第２の低アニーリング温度サイクルで実行することができる。第３の低アニーリング温度サイクルにより、ユニバーサルプライマー結合の第１のサイクルが可能になる。このサイクルでは、バーコーディングされたプライマーをなお結合させて［Ａ＋Ｂ］より多くのＣおよびＤ産物を形成させ、また、ＣおよびＤ産物に結合させてより多くのＥおよびＦ産物を形成させることもできる。
【０１５８】
第３のサイクル後、図２９Ｃに示されている産物は、エマルジョン中に存在してよく、次いで、これを、第４の低アニーリング温度サイクルに供してユニバーサルプライマー結合の第２のサイクルを可能にすることができる。図２９Ｃに示されている通り、サイクル４の最後に完全なフォワードおよびリバースユニバーサル尾部を有する分子を得ることができる。その後のサイクルについてアニーリング温度を上昇させることができる。異なるバーコードを有するいくつかのＩ型産物およびＪ型産物が存在し得る（例えば、フォワード側またはリバース側のいずれかに完全なユニバーサル尾部を有する）。これらは、より高いアニーリング温度においてのみ直線的に増幅することができる。
【０１５９】
図２９Ｄに示されている通り、その後のＰＣＲサイクル（５＋）は、ユニバーサルプライマーの完全なユニバーサル尾部を有するアンプリコンへの結合のみが可能になる、上昇したアニーリング温度を有してよい。最後の数回のサイクルは、増幅された鎖がフォワードユニバーサル尾部の一部を介して連結することが可能になるように低アニーリング温度におけるものであってよい。あるいは、より長い連結プライマーを完全なフォワードユニバーサル尾部と共に使用することができ、それにより、より高いアニーリング温度で連結することが可能になるが、合成は難しく、また、連結の効率はより低くなり得る。上のセンスまたは下のセンスの連結はランダムに起こり、したがって、この連結プライマーを使用する連結分子の５０％はそれぞれのうちの１つを有するはずである（二重鎖情報）。ナノ粒子上に２つよりも多くの部位、例えば、１００部位を有する連結プライマーは、平均して、ほぼ１００％の時間で二重鎖情報を含有する。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、連結二重鎖分子は、エマルジョンＰＣＲを使用せずに創出することができる。非ドロップレット実施形態では、単一の増幅サイクルを使用して、元の断片の両方のセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する連結二重鎖分子を創出することができる。次いで、連結二重鎖分子をシーケンシング用のフローセル中に直接ローディングし、それにより、増幅により誘導される配列または長さの偏り（例えば、全ゲノムシーケンシングにおいて）を回避する、ならびに、増幅により導入されるエラーおよびローディング効率の悪さによる核酸の喪失を回避することができる。例えば、シーケンサーのローディング効率を（アウトプット読み取りの数）／（読み取りを形成することが可能なインプット分子の数）と定義することができる場合、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑについてのローディング効率は＜０．１％であり、他のＩｌｌｕｍｉｎａ計器についても同様である。これは、６００ｕＬより多くの試料がシーケンサーにローディングされる一方で、約７ｕＬしか結合のためにフローセルの内部に保持されず、その結果、出発材料が大きく喪失するので、流体喪失に大きく起因する。本明細書に記載の非ドロップレット、直接ローディング方法では、これらの非効率性が改善される。本発明の方法は、１サイクルのＰＣＲで二重鎖分子を創出する簡易化されたワークフローを含み得る。次いで、二重鎖分子を使用して単一のクラスターにシードし、正確度の高いシーケンシング読み取りをもたらすことができる。フローセルに直接ローディングし、次いでシーケンシングすることにより、ローディングによるＤＮＡの喪失が最小化される。
【０１６１】
本発明の直接ローディング、非ドロップレット方法には、例えば、組織生検、針吸引、または小さな体積の採血など、存在するＤＮＡの質量は小さいが高い正確度が望まれる場合の全ゲノムシーケンシングを含めた適用がある。追加的な適用としては、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料においてなど、ＤＮＡが分解されるまたは損傷を受ける場合が挙げられる。
【０１６２】
図２２Ａ、２２Ｂ、２３Ａ、および２３Ｂは、本発明のある特定の実施形態による非ドロップレット連結二重鎖形成方法を示す。１つ（図２２）または２つ（図２３）の連結アダプターを二本鎖ゲノム鋳型にライゲートし、次いで、鎖置換型ポリメラーゼを使用して伸長させて連結二重鎖分子を創出する。次いで、シーケンシングのために連結二重鎖をフローセルに直接ローディングする。図２３に例示されているものなどの２つの連結アダプターの適用では、連結断片を２つの方向に形成することができる（すなわち、リンカーを一方の末端に有する連結断片およびリンカーを逆の末端に有する連結断片）。図２２Ｂおよび２２Ｂに示されている通り、ライゲーションの結果、約５０％の所望の連結二重鎖産物が生じ、他の望ましくない産物はクラスターを形成しない。
【０１６３】
図２４Ａおよび２４Ｂは、連結二重鎖分子を使用した直接ローディングシーケンシング方法のステップを例示する。図２４Ａおよび２４Ｂの例証的な方法では、フローセルを、試薬を用いて初期化する。次いで、少量の連結ライブラリーを変性させ、全体積を初期化されたフローセルにローディングする。次いで、フローセルポートを密閉し、図２２および２３に例示されている方法で創出されるものなどの鋳型をフローセルに結合させる。フローセル上のＤＮＡを伸長させ、次いで、フローセルをフローセルシーケンシング計器にローディングする。例証的なフローセル結合は図２５に例示されており、フローセル捕捉、伸長、連結鋳型の洗浄、ブリッジ増幅、およびシーケンシングのステップを含む。連結二重鎖鋳型の他方のセンス鎖への結合は、図２５に例示されているものと類似したものである。
【０１６４】
図２６は、例証的なオフラインシーディングプロトコールをデフォルトのプロトコールと比較して例示する。ある特定の実施形態では、オフラインシーディングプロトコールのステップは、以下のステップをベンチにおいて室温で実施することを含んでよい：ＬＤＲを５回流すステップ、ＰＲ２を５回流すステップ、ＨＴ１を流すステップ、ＴＭＰをローディングするステップ、およびポートをＰＣＲテープで密閉するステップ。ここで、流すとは、フローセルを指定の試薬で満たし、約１０秒間待ち、次いで、フローセルを空にすることを意味する。ポートをＰＣＲテープで密閉した後、フローセルをビーズバス中、摂氏７５度で１０分インキュベートし、その後、摂氏４０度で１０分インキュベートする。フローセルを室温のベンチに戻し、密閉を解き、フローセルに摂氏４０度、ＰＲ２を５回流し、ＡＭＳ１を２回流し、摂氏４０度で２分のインキュベーションを３回伴ってＡＭＳ１を流し、ＡＭＳ１を満たし、シーケンシングのためにＭｉＳｅｑ計器（Ｉｌｌｕｍｎｉａ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）に移す。調製プロトコールにおける追加的なステップは、フローセルをそのプラスチック収納から出し、ポートを密閉するためのＰＣＲテープを予め切り取り、フローセルを、両側にＰＣＲテープまたはスコッチテープを用いてビーズバスにより擦り傷から保護することを含んでよい。
【０１６５】
直接ローディングの実施形態に加えてフローセルローディングの収率および標的捕捉収率が重要である他の適用に関しては、喪失を最小限にするために、フローセルローディングと標的化シーケンシングを組み合わせることが有益であり得る。そのような組合せでは、さらに、余分のステップが排除されることによってワークフローが単純化される。フローセル上の標的を捕捉するための方法が存在するが、それらには少なくとも２つの欠点がある。第１に、本方法では、フローセル上に捕捉された領域をシーケンシングすることができない。無細胞ＤＮＡなどの短い断片に関してはこれがシグナルの大きな喪失の原因になり得る。第２に、本方法では、本発明に記載されている連結二重鎖分子をシーケンシングのために捕捉することができない。したがって、本発明の方法は、二重鎖分子のフローセルに基づく標的捕捉を含む。本発明の方法によると、フローセルは、標的領域を有するオリゴヌクレオチド（オリゴ）の一方のセンスを含有し、一方、他方のセンスはヘアピン状になっており、すぐには結合に利用可能でない。図２７を参照されたい。連結分子の一方のセンスをフローセル上に捕捉した後、他方のフローセルオリゴを活性化して、連結断片の他方のセンスを捕捉する（例えば、ウラシル消化物、酵素消化、または光を使用する）。次いで、鋳型を伸長させることができ、クラスター生産を通常通り続けることができる。ある特定の実施形態では、１つのオリゴのセットは二重鎖核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖に相補的であってよく、別のセットは両方のセンス鎖およびアンチセンス鎖に付着したユニバーサルアダプターと相補的であってよく、ユニバーサルアダプターオリゴは最初の曝露ステップにおける結合を防止するためにヘアピン状であってよい。
【０１６６】
図２８Ａ〜Ｅは、二重鎖分子のフローセルに基づく標的捕捉のための例証的な方法のステップを例示する。図２８Ａは、例証的な標的捕捉ステップを示し、連結分子は、直接または従来の方法によってのいずれかでフローセルにローディングされる。図２８Ｂは、鋳型のフローセルへの結合の例証的なステップを示し、連結分子は、相補的な捕捉領域に結合し、フローセルオリゴの他方のセンスは放出されて連結断片の両方の遊離末端に結合する。図２８Ｃは、例証的な鎖置換ステップを示し、二重にシードされたクラスターを創出するために、鎖置換型ポリメラーゼを使用して両方の断片を伸長させる。次いで、図２８Ｄに示されている通り、連結鋳型を変性させ、フローセルから除去する。次いで、図２８Ｅに示されている通り、ブリッジ増幅を通常通りであるが、クラスターにシードする２つの分子を用いて、行うことができる。
【０１６７】
本発明の直接ローディング技法は、全ゲノムシーケンシング適用において、１つまたは２つの連結アダプターを用いたフローセル標的捕捉ステップを伴わずに使用することができる。標的化シーケンシング適用では、１つまたは２つの連結アダプターを用いたライゲーション後、収率について最適化された（例えば、オフターゲット棄却は不十分であるが収率が高い）チューブに基づく標的捕捉技法を使用することができる。次いで、上記の通り、図２８Ａ〜Ｅに記載されている標的捕捉ステップを伴ってまたは伴わずに連結二重鎖鋳型をフローセルに直接ローディングすることができる。ある特定の実施形態では、中間のチューブに基づく標的捕捉ステップを省くことができる。
【０１６８】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（検出器、Ｉｌｌｕｍｉｎａから市販されている）は、可逆的ターミネーター化学を使用して反復してシーケンシングされた数百万の固定化配列の並行した蛍光に基づく読み取りに基づく。一実施例では、最大８つのＤＮＡライブラリーを８レーンのフローセルにハイブリダイズさせる。レーンのそれぞれにおいて、一本鎖のライブラリー分子をフローセル表面に共有結合した相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。各ライブラリー分子のリバース鎖を合成し、次いで、今共有結合している分子をブリッジ増幅と称されるプロセスでさらに増幅する。これにより、それぞれが出発分子の１，０００よりも多くのコピーを含有するクラスターが生じる。次いで、一方の鎖を選択的に除去し、その後、遊離末端をブロックし、シーケンシングプライマーをクラスター分子のアダプター配列にアニーリングする。
【０１６９】
蛍光イメージングシステムは単一の鋳型分子からシグナルを検出するには感度が十分ではないが、検出器は、各クラスターからシグナルを検出するには感度がよい。本発明の本実施例では、多数のクラスターからのシグナルを解析する。各クラスターがある値、例えば、４種の塩基のうちの１つに近い値の蛍光を発することが予想される。クラスターが４種の塩基のうちの１つに近い値の蛍光を発しない場合には、その遺伝子座にエラーが存在することが決定される。
【０１７０】
シーケンシング後、各クラスターについて画像を解析し、強度を抽出する。Ｉｌｌｕｍｉｎａの塩基呼び出し器であるＢｕｓｔａｒｄでは、各サイクルおよびクラスターについて抽出される４つの強度値の２つの影響に対処しなければならない：第１に、フルオロフォアの発光スペクトルが同様であることおよび使用されるフィルターによる分離が限定されることに起因するＡとＣの強度の強力な相関ならびにＧとＴの強度の強力な相関；ならびに、第２に、それぞれフェージングおよびプレフェージングとして公知の、特定のサイクルについてのシグナルが前後のサイクルのシグナルに左右されること。フェージングおよびプレフェージングは、３’ターミネーターおよびフルオロフォアの不完全な除去、組み入れサイクルが不首尾のクラスター内の配列、ならびに有効な３’ターミネーターを有さないヌクレオチドの組み入れによって引き起こされる。フェージングおよびプレフェージングにより、特定のサイクルについて抽出される強度が、現在のサイクルのシグナルならびに前のサイクルおよび後ろのサイクルからのノイズからなるものになる。
【０１７１】
提供される発明の方法において使用することができるシーケンシング技術の別の例としては、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子、リアルタイム（ＳＭＲＴ）技術が挙げられる。ＳＭＲＴでは、４種のＤＮＡ塩基のそれぞれに４つの異なる蛍光色素のうちの１つを付着させる。これらの色素はリン酸基によって連結される。単一のＤＮＡポリメラーゼをゼロモード導波管（ＺＭＷ）の底部で鋳型一本鎖ＤＮＡの単一分子に固定化する。ＺＭＷは、ＺＭＷの外部に急速に拡散する（マイクロ秒で）蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対してＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの組み入れの観察を可能にする閉じ込め構造である。成長中の鎖へのヌクレオチドの組み入れには数ミリ秒かかる。この時間の間に、蛍光標識が励起され、蛍光シグナルが生じ、蛍光タグが切断される。色素の対応する蛍光の検出により、どの塩基が組み入れられたかが示される。プロセスを繰り返す。本発明の方法を使用すると、プロセスは、分析される断片を２つ用いて縦列で繰り返される。
【０１７２】
提供される発明の方法において使用することができるシーケンシング技法の別の例は、ナノポアシーケンシング（Ｓｏｎｉ  Ｇ  ＶおよびＭｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７年）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、５３巻：１９９６〜２００１頁）である。ナノポアは、直径１ナノメートルほどの小さな穴である。ナノポアを導電性流体に浸漬し、それにわたって電位を印加することにより、ナノポアを通じたイオンの伝導に起因してわずかな電流が生じる。流れる電流の量はナノポアのサイズに感受性である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するにつれ、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドによりナノポアが異なる程度にふさがれる。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときのナノポアを通過する電流の変化は、ＤＮＡ配列の読み取りを表す。本発明の方法を使用すると、２つの断片が同時にまたは逐次的に分析され、それにより、エラーの確率が低減する。
【０１７３】
本発明は、合成による単一分子のナノポアに基づくシーケンシング（Ｎａｎｏ−ＳＢＳ）などのナノポア技術と共に使用することができる。この戦略では、５’リン酸修飾されたヌクレオチドから放出される４つの異なるサイズのタグを検出することによって４種の塩基を区別することができる。ポリメラーゼ反応の間に各ヌクレオチドが成長中のＤＮＡ鎖に組み入れられるにつれ、そのタグが放出され、放出された順にナノポアに進入する。これにより、タグの別個の化学構造に起因する固有のイオン電流遮断サインが生じ、それにより、ＤＮＡ配列が電子的に一塩基分解能の単一分子レベルで決定される。本発明の方法を使用すると、２つの同一の断片または二重鎖断片の両方の鎖を同時にまたは逐次的に分析することができる。Ｋｕｍａｒら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、論文番号、６８４、ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ００６８４を参照されたい。
【０１７４】
配列読み取り解析またはアセンブリなどの上記の機能は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、ハード配線、またはこれらのいずれかの組合せを含む本発明のシステムを使用して実行することができる。
【０１７５】
本発明に従って使用することができるシーケンシング方法の１つは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０４０１８４９７、ＵＳ２００７／０１６６７０５Ａ１および米国特許第７，０５７，０２６号に記載されている通り、除去可能な３’ブロックを有する修飾ヌクレオチドの使用に依拠する。シーケンシングされる鋳型の領域に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に修飾ヌクレオチドが組み入れられたら、さらなる配列伸長を導くために利用可能な遊離の３’ＯＨ基がなくなり、したがって、ポリメラーゼはさらなるヌクレオチドを付加することができない。成長中の鎖に組み入れられた塩基の性質が決定されたら、３’ブロックを除去して次の連続的なヌクレオチドの付加を可能にする。これらの修飾ヌクレオチドを使用して引き出される産物の順序により、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列を推定することが可能である。そのような反応は、各組み入れステップの間に付加される塩基間の識別を容易にするために、修飾ヌクレオチドのそれぞれに、特定の塩基に対応することが公知の異なる標識を付着させれば、単一の実験で行うことができる。あるいは、修飾ヌクレオチドのそれぞれを別々に含有する別々の反応を行うことができる。
【０１７６】
図３２および３３は、本発明のシステムおよび方法を使用する代替物シーケンシング方法を例示する。図３２に示されている通り、クラスターに複数の鋳型コピーをシードし、増幅した後、エラーを、塩基が同じではない位置における単一の読み取りにおいてシーケンシングの質が低下することを通じて真のバリアントと区別することができる。クラスター内の全ての増幅された鎖は同時点、同方向での全ての読み取りであるので、シグナルの質の低下が、クラスター内の混合塩基呼び出しを決定するための唯一のやり方である。両方のセンス鎖およびアンチセンス鎖または異なるシーケンシングプライマー部位を有する鋳型をクラスターにシードする実施形態では、２つの異なるシーケンシング読み取り（例えば、各センスからの読み取りまたは２つの異なるシーケンシングプライマーを使用し読み取り）の結果を比較することによって真のバリアントとエラーを同定することができる。図３３は、２つの別々のシーケンシング読み取りを使用してセンスおよびアンチセンス読み取りからの塩基呼び出しを比較する本発明の方法を例示する。シーケンシングまたは他の導入されたエラーは、読み取りのうちの一方のみに見られるはずであるが、真のバリアントは、両方の読み取りにおいて観察されるはずである。
【０１７７】
連結標的捕捉方法は、標的化ＤＮＡシーケンシングのためのゲノムの関心領域の溶液に基づく捕捉を含んでよい。図３４および３５は、溶液に基づく標的捕捉の例証的な方法を例示する。ユニバーサルプローブおよび任意選択のバーコード（センス特異的なものであってよい）を抽出されたＤＮＡにライゲートする。次いで、ライゲートされたＤＮＡ産物を変性させ、ユニバーサルプライミング部位および標的特異的プローブと連結したユニバーサルプローブを含む連結標的捕捉用プローブと結合させる。標的捕捉を、ユニバーサルプローブが、標的化プローブの結合に起因して局所濃度が高くならなければ単独では結合することができない温度で実施する。次いで、鎖置換型ポリメラーゼ（例えば、ＢＳＴ、ｐｈｉ２９、またはＳＤ）を使用して標的に結合した連結プローブを伸長させる。図３４および３５の黒色のダイヤモンド形によって示される通り、標的化プローブは伸長からブロックされ、したがって、伸長は結合したユニバーサルプローブに沿ってのみ起こり、標的化プローブに連結したままの結合した標的核酸鎖がコピーされる。次いで、いくつかの連結ＰＣＲ伸長サイクルを使用して標的配列を増幅することができる。次いで、標的核酸の一方または両方の鎖を増幅するために、連結標的捕捉用プローブからのユニバーサルプライミング部位に対応するユニバーサルプライマーを使用してＰＣＲを実施することができる。このＰＣＲステップは、同じ反応で、清浄化ステップを必要とせずに実施することができる。次いで、増幅された標的配列を上記の通りシーケンシングすることができる。逆の方向に使用する場合には連結捕捉用プローブ間にギャップは必要ないが、ギャップがあってもよい。捕捉用プローブは、ユニバーサル５’リンカーを使用して、ユニバーサルリンカーを予め作製した捕捉用プローブと接合することによって生成することができる。捕捉用プローブをストレプトアビジン／ビオチンまたは上記の他の手段によって接合することができ、捕捉用プローブを鋳型として使用してユニバーサルリンカーを伸長させることができる。
【０１７８】
本発明の方法は、二重鎖分子を捕捉するための、任意選択で、ユニバーサル連結プライマーを使用する、ドロップレットに基づく標的捕捉を含む。図３６に示されているドロップレットに基づく方法は、図１６に例示されているものと同様であるが、上記および図３４〜３５に示されている連結標的捕捉用プローブを使用する。ユニバーサルプローブおよび任意選択のバーコード（センス特異的なものであってよい）を抽出されたＤＮＡ（例えば、無細胞ＤＮＡ）にライゲートする。エマルジョンを上記の通り二重鎖鋳型分子ならびにユニバーサルプライミング部位および標的特異的プローブと連結したユニバーサルプローブを含む標的捕捉用プローブを使用して創出する。上記の通り、標的捕捉を、ユニバーサルプローブが、標的化プローブの結合に起因して局所濃度が高くならなければ単独では結合することができない温度で実施し、また、捕捉用プローブは、それ自体の伸長はブロックされるが、ユニバーサルプライミング部位を含み、したがって、エマルジョンに含まれるユニバーサルプライマーおよび連結ユニバーサルプライマーを使用して標的核酸を増幅して、標的核酸の両方のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む連結二重鎖分子を生成することができる。標的捕捉を単独で実施するためにユニバーサルリンカーを省くことができる。次いで、エマルジョンを破壊し、非連結鋳型を酵素的に消化して連結二重鎖分子のみを残すことができ、次いで、クラスターにシードするまたはそうでなければ上記の通りシーケンシングすることができる。
【０１７９】
図３７ＡおよびＢは、本発明のドロップレットに基づく標的捕捉方法の追加的な詳細を提示する。図３７Ａのステップ０は、連結およびユニバーサルプライマーおよび標的捕捉用プローブと共にドロップレット中にローディングされるユニバーサルプローブおよびそれとライゲートした任意選択のバーコードを有する二重鎖鋳型分子を示す。鋳型ＤＮＡをドロップレット中で変性させ、次いで、標的捕捉用プローブを、変性させた鋳型鎖に、ユニバーサルプローブが標的化プローブも結合していなければ単独では結合しない温度で結合させる。次いで、ユニバーサルプライマーのみを捕捉された標的に結合させる。次いで、鎖置換型ポリメラーゼを用いた伸長が捕捉された標的に対してのみ起こる。図３７Ｂに移り、次いで、連結標的捕捉用プローブおよびプライマーが使い尽くされるまで伸長サイクルを実行する（例えば、４〜６回のサイクル）。次いで、得られた伸長産物をユニバーサル連結プライマーを使用して増幅して、鎖特異的バーコードを有する連結二重鎖分子を生成させる。溶液に基づく方法と同様に、逆の方向である場合には連結捕捉用プローブ間にギャップは必要ない。標的捕捉を単独で実施するためにユニバーサルリンカーを省く場合には連結捕捉用プローブを一方の方向または両方の方向に使用することができる。方法の種々の伸長および増幅ステップを行うために従来のポリメラーゼをドロップレット中で鎖置換型ポリメラーゼと混合することができる。
【０１８０】
本発明のある特定の方法は、連結分子の標的捕捉に関する。上記の方法を使用して創出されるものなどの分子の連結コピーを標的化し、捕捉し、シーケンシングのために連結分子に変換することができる。図３８〜４２は、連結分子のナノ粒子標的捕捉の例証的な方法を例示する。図３８は、ユニバーサルプライマーおよび捕捉される連結分子の捕捉領域に相補的な標的領域を含む鎖を有するナノ粒子を示す。図３９は、捕捉領域と標的領域の結合を例示する。このステップは、標的／捕捉領域は結合するがユニバーサルプライマーは結合しない温度で起こる。結合していない鋳型をこのステップで洗い流すことができる。次いで、反応の温度を低下させて、ユニバーサルプライマーの結合を可能にすることができる。図４０は、ユニバーサルプライマーと連結分子上のユニバーサルプライマー部位の結合を示す。図４１は、元の連結分子の両方の鎖を含む標的分子のナノ粒子連結コピーを生成するための、鎖置換型ポリメラーゼによるユニバーサルプライマー伸長を示す。図４２は、本出願の他の箇所に記載されているフローセルシーケンサーにクラスターをシードするために使用することができる二重にシードされたナノ粒子を示す。
【０１８１】
本発明の実施形態では、修飾ヌクレオチドを組み入れることができる。修飾ヌクレオチドは、検出のために標識（例えば、蛍光標識）することができる。したがって、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１０／０００９３５３号に記載されている通り、各ヌクレオチド型が異なる蛍光標識を有してよい。しかし、検出可能な標識は蛍光標識である必要はない。組み入れられたヌクレオチドの検出を可能にする任意の標識を使用することができる。蛍光標識したヌクレオチドを検出するための１つの方法は、標識したヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光の使用、または他の適切な照明の供給源の使用を含む。ヌクレオチド上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適切な検出手段によって検出することができる。クラスター化されたアレイの画像を記録するための適切な計器使用は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷ００７１２３７４４および米国特許公開第２０１０／０１１１７６８号に記載されている。
【実施例】
【０１８２】
（実施例１）
二重にシードされたクラスターを使用したＫＲＡＳアンプリコンのシーケンシングのエラーの減少
フローセルクラスターに単一の鋳型分子をシードした。単一の鋳型コピーは、図３１に示されている通り、連結鋳型分子を１つのみフローセルに結合させた連結鋳型のライブラリーに由来するものであった。次いで、ＫＲＡＳアンプリコンにアラインメントされた最初の３０００の単独でシードされたクラスターを、３５よりも大きいという質の閾値を適用することでシーケンシングのエラーについて分析した。図３０に示されている通り、単独でシードされたクラスターでは、約３０００の平均深度で０．１３％の平均エラーが生じた。単独でシードされたフローセルでは連結鋳型ライブラリーを使用したので、結果は、非連結鋳型分子を用いた標準の単一のシーディング方法を使用して生じるものよりも低いエラー率を表す可能性がある。
【０１８３】
次いで、フローセルクラスターに、連結鋳型分子を二重にシードし、ここで、連結分子の両方をクラスターにシードするためにフローセルに結合させた。次いで、ｃｈｒ１２アンプリコンにアラインメントされた最初の３０００の二重にシードされたクラスターを、同じく３５よりも大きい質の閾値、および０．８またはそれよりも大きい蛍光純度フィルターを適用してシーケンシングのエラーについて分析した。二重にシードされたクラスターでは、シーケンシングのエラーが７分の１に減少し、分析された塩基の喪失は単独でシードされたクラスターに対して３％未満であった。二重にシードされたクラスターについての平均エラー率は、図４３に示されている通り、約２９２０の平均深度で０．０２％であった。
参照による組み込み
【０１８４】
特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書の参照および引用が本開示全体を通してなされている。そのような文書は全て、あらゆる目的に関してそれらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
等価物
【０１８５】
本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく他の特定の形態に具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載の発明に対する限定ではなく、例示的なものであると理解されるべきである。
【０１８６】
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
二重鎖核酸の標的化捕捉のための方法であって、
それぞれが捕捉領域およびプライマー部位を含む２つの５’連結標的核酸を提供するステップと、
前記２つの５’連結標的核酸を、前記捕捉領域に相補的な標的領域および複数のプライマーを含む分子に、前記標的領域と前記捕捉領域の結合は可能にするが前記プライマーと前記プライミング部位の結合は阻害する条件下で曝露させ、その結果、前記標的領域で、前記２つの５’連結標的核酸のうちの少なくとも一方を前記分子に結合させるステップと、
前記条件を、前記プライミング部位と前記プライマーの結合が可能になるように変更し、その結果、前記分子のプライマーを前記２つの５’連結標的核酸の両方の前記プライミング部位と結合させるステップと、
鎖置換型ポリメラーゼを使用して前記プライマーを伸長させて、前記５’連結標的核酸のそれぞれの分子結合コピーを生じさせるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記プライマー部位がユニバーサルプライマー部位であり、前記プライマーがユニバーサルプライマーである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記５’連結標的核酸のそれぞれの前記分子結合コピーがシードされたクラスターをさらに創出する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記クラスターをシーケンシングするステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
標的化ＤＮＡシーケンシングのためにゲノムの関心領域を捕捉するための方法であって、
ユニバーサルプローブ部位を複数の二重鎖核酸断片上にライゲートするステップであり、前記複数の二重鎖核酸断片はゲノムの関心領域を少なくとも１つ含む、ステップと、
前記複数のライゲートした二重鎖核酸断片を変性させて、ユニバーサルプローブ部位を含む一本鎖核酸断片を創出するステップと、
前記一本鎖核酸断片を、前記ゲノムの関心領域の少なくとも一部分と相補的な標的化プローブを含む複数の連結捕捉用プローブに曝露させるステップであり、前記標的化プローブは、ユニバーサルプローブおよびユニバーサルプライミング部位と連結しており、前記曝露は、前記ユニバーサルプローブと前記ユニバーサルプローブ部位の結合を可能にするために前記標的化プローブと前記標的核酸配列の結合が必要である条件下でなされ、前記標的化プローブの伸長はブロックされている、ステップと、
鎖置換型ポリメラーゼを使用して前記ユニバーサルプローブを伸長させて、前記ゲノムの関心領域のコピーを生じさせるステップと、
ＰＣＲ増幅および前記ユニバーサルプライミング部位と相補的なユニバーサルプライマーを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップと、
前記ゲノムの関心領域をシーケンシングするステップと
を含む方法。
（項目６）
前記変性、曝露、伸長、および増幅ステップがエマルジョンドロップレット中でなされる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記増幅ステップにより前記ゲノムの関心領域の連結コピーが生じるように、前記ユニバーサルプライマーが連結である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記増幅ステップにより前記ゲノムの関心領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖の連結コピーが生じるように、前記連結ユニバーサルプライマーがセンス特異的である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ライゲートするステップが、前記複数の二重鎖核酸断片上に固有のバーコードをライゲートすることをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記固有のバーコードが、センス特異的である、項目９に記載の方法。
【図１−１】
2019514357.tif 000003
【図１−２】
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【図２】
2019514357.tif 000005
【図３】
2019514357.tif 000006
【図４−１】
2019514357.tif 000007
【図４−２】
2019514357.tif 000008
【図４−３】
2019514357.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019514357.tif 000013
【図９−１】
2019514357.tif 000014
【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2019514357.tif 000025
【図２０】
2019514357.tif 000026
【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月18日(2019.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムの関心領域を捕捉するための方法であって、
ユニバーサルアダプターを複数の核酸断片上にライゲートするステップであって、前記複数の核酸断片はゲノムの関心領域を少なくとも１つ含む、ステップと、
前記核酸断片を、前記ゲノムの関心領域の少なくとも一部分と相補的な標的化プローブを含む複数の連結捕捉用プローブに曝露させるステップであって、前記標的化プローブは、ユニバーサルプローブと連結しており、前記曝露が、前記ユニバーサルプローブと前記ユニバーサルプローブ部位の結合を可能にするために前記標的化プローブと前記標的核酸配列の結合が必要である条件下でなされる、ステップと、
前記ゲノムの関心領域のコピーを生じるために、前記ユニバーサルプローブを伸長させるステップと、
前記ゲノムの関心領域をシーケンシングするステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記曝露ステップ、伸長ステップ、および増幅ステップが、エマルジョンドロップレット中でなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ユニバーサルアダプターが、バーコード配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の核酸断片のうちの１つの核酸断片のセンス鎖およびアンチセンス鎖が前記核酸断片に由来したとして識別可能であるように、前記バーコード配列がセンス特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
連結用分子を使用して前記標的化プローブと前記ユニバーサルプローブを接合するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的化プローブおよび前記ユニバーサルプローブがビオチン化されており、前記連結用分子がストレプトアビジン由来分子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シーケンシングするステップの前に、前記ゲノムの関心領域を増幅するために、前記曝露するステップおよび伸長させるステップを繰り返すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記シーケンシングするステップの前に、非連結ユニバーサルプローブを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップをさらに含む、請求項１または７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＲ増幅および前記ユニバーサルプローブと相補的なユニバーサルプライマーを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップをさらに含む、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅ステップが前記ゲノムの関心領域の連結コピーを生じるように、前記ユニバーサルプライマーが連結される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅ステップが前記ゲノムの関心領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖の連結コピーを生じるように、前記連結ユニバーサルプライマーがセンス特異的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的化プローブの伸長はブロックされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的化プローブと前記ユニバーサルプライマーとはクリック化学反応によって連結されている、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記ユニバーサルアダプターは前記複数の核酸断片にわたって共通している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の核酸断片は２つまたはそれよりも多くの異なる標的化断片を含む、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の方法は、複数のシーケンシングプラットフォームに組み入れることができる。例えば、従来の合成によるシーケンシングでは、各塩基を逐次的に決定することができる。エラーは、バイオインフォマティクス技法を使用してデータを解析するまで決定されない。しかし、本発明では、シーケンシング方法体系の間に核酸の複数の断片を連結することが可能になる。複数の断片を同時に解析することにより、塩基間の一致により正確度が示され、その一方、塩基間の不一致はシグナルエラーになる。本発明を用いると、バイオインフォマティクスを適用することなく、未加工のシーケンシングデータからエラーを決定できる。この技法では、より少数のコピーまたはクラスターが使用され、シーケンシングスループットが増加し、また、費用が減少する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
二重鎖核酸の標的化捕捉のための方法であって、
それぞれが捕捉領域およびプライマー部位を含む２つの５’連結標的核酸を提供するステップと、
前記２つの５’連結標的核酸を、前記捕捉領域に相補的な標的領域および複数のプライマーを含む分子に、前記標的領域と前記捕捉領域の結合は可能にするが前記プライマーと前記プライマー部位の結合は阻害する条件下で曝露させるステップであって、前記標的領域で、前記２つの５’連結標的核酸のうちの少なくとも一方を前記分子に結合させるステップと、
前記条件を、前記プライマー部位と前記プライマーの結合が可能になるように変更するステップであって、前記分子のプライマーを前記２つの５’連結標的核酸の両方の前記プライマー部位と結合させるステップと、
鎖置換型ポリメラーゼを使用して前記プライマーを伸長させるステップであって、前記５’連結標的核酸のそれぞれの分子結合コピーを生じさせるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記プライマー部位がユニバーサルプライマー部位であり、前記プライマーがユニバーサルプライマーである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記５’連結標的核酸のそれぞれの前記分子結合コピーがシードされたクラスターをさらに創出する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記クラスターをシーケンシングするステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
標的化ＤＮＡシーケンシングのためにゲノムの関心領域を捕捉するための方法であって、
ユニバーサルプローブ部位を複数の二重鎖核酸断片上にライゲートするステップであって、前記複数の二重鎖核酸断片はゲノムの関心領域を少なくとも１つ含む、ステップと、
ユニバーサルプローブ部位を含む一本鎖核酸断片を創出するために、前記複数のライゲートした二重鎖核酸断片を変性させるステップと、
前記一本鎖核酸断片を、前記ゲノムの関心領域の少なくとも一部分と相補的な標的化プローブを含む複数の連結捕捉用プローブに曝露させるステップであって、前記標的化プローブは、ユニバーサルプローブおよびユニバーサルプライミング部位と連結しており、前記曝露が、前記ユニバーサルプローブと前記ユニバーサルプローブ部位の結合を可能にするために前記標的化プローブと前記標的核酸配列の結合が必要である条件下でなされ、前記標的化プローブの伸長はブロックされている、ステップと、
前記ゲノムの関心領域のコピーを生じるために、鎖置換型ポリメラーゼを使用して前記ユニバーサルプローブを伸長させるステップと、
前記ゲノムの関心領域をシーケンシングするステップと
を含む方法。
（項目６）
前記変性ステップ、曝露ステップ、伸長ステップ、および増幅ステップが、エマルジョンドロップレット中でなされる、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記ライゲートするステップが、前記複数の二重鎖核酸断片上に固有のバーコードをライゲートするステップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記固有のバーコードが、センス特異的である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
連結用分子を使用して前記標的化プローブと前記ユニバーサルプローブを接合するステップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１２）
前記標的化プローブおよび前記ユニバーサルプローブがビオチン化されており、前記連結用分子がストレプトアビジン由来分子を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記シーケンシングするステップの前に、前記ゲノムの関心領域を増幅するために、前記曝露するステップおよび伸長させるステップを繰り返してステップをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１４）
前記シーケンシングするステップの前に、非連結ユニバーサルプローブを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップをさらに含む、項目５または１３に記載の方法。
（項目１５）
ＰＣＲ増幅および前記ユニバーサルプライミング部位と相補的なユニバーサルプライマーを使用して前記ゲノムの関心領域を増幅するステップをさらに含む、項目５または１３に記載の方法。
（項目１６）
前記増幅ステップが前記ゲノムの関心領域の連結コピーを生じるように、前記ユニバーサルプライマーが連結される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記増幅ステップが前記ゲノムの関心領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖の連結コピーを生じるように、前記連結ユニバーサルプライマーがセンス特異的である、項目１５に記載の方法。
【国際調査報告】
2019514357.tif 000061
2019514357.tif 000062
2019514357.tif 000063