(57)【要約】  肝損傷を治療及び／または解消させることにおけるプラスミノゲンの用途であって、異なるタイプの肝損傷の治療に新しい治療ステラテジーを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための方法。
【請求項２】
前記肝組織損傷及びその関連疾患は放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肝組織損傷及びその関連疾患は中毒性肝損傷及びその関連疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病性肝損傷及びその関連疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記糖尿病性の肝損傷及びその関連疾患は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記肝組織損傷及びその関連疾患は、肝組織損傷によってもたらされる肝機能異常、肝酵素学的異常、肝臓周辺の不快感及び接触痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものであることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ（ｄｅｌｔａ）−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と組み合わせて投与できることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
有効用量のプラスミノゲンを含有する容器、及び被験者の肝組織損傷及びその関連疾患の予防及び／または治療における製品の投与を指導するプロトコルを含むことを特徴とする、被験者の肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための製品。
【請求項１２】
さらに一種類または複数種類の他の薬物を含有する容器を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の製品。
【請求項１３】
前記プロトコルはさらに前記プラスミノゲンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できることを説明していることを特徴とする、請求項１２に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は各種原因に起因する肝組織損傷の治療及び／または予防における、プラスミノゲンまたはプラスミンの用途に関するものであり、さらには肝組織損傷及びその関連疾患の治療に対して全く新しい治療ステラテジーを提供する。
【背景技術】
【０００２】
肝損傷または肝組織損傷は各種原因によってもたらされる肝臓実質病変であり、肝臓組織炎症、肝細胞の変性、壊死、肝組織の繊維化などの一連の病理的変化の総称である。よく見られる原因は炎症、肝臓うっ血、ウイルス感染、中毒、薬物、放射などである。一部の疾患は肝細胞の損傷を伴い、例えば糖尿病、肝炎、高血圧、アテローム性動脈硬化などである。
薬物は肝組織損傷を引き起こす一つのよく見られる原因である。肝組織損傷を引き起こす常用の薬物は以下を含む：抗結核薬：リファンピシン、イソニコチン酸ヒドラジット、エタンブトール等；抗腫瘍薬：シクロフォスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、カルボプラチン、シスプラチン等；高脂血症治療系：スタチン系（アトルバスタチン、ロバスタチン）、フェノフィブラート、クロフィブラート、ニコチン酸など；ステロイドホルモン：雌性ホルモン系薬物、経口避妊薬、雄性アナボリックステロイド等；心血管薬：アミオダロン、ワルファリン、カルシウムイオン拮抗剤等；抗リウマチ薬：インドメタシン、フェンブフェン、アスピリン、インドメタシン等；抗生剤：クロロマイセチン、ロキシスロマイシン、ケトコナゾール、ペニシリン系、スルフォンアミド系等；抗アレルギー薬：プロメタジン（塩酸プロメタジン）、クロルフェニラミン（マレイン酸クロルフェニラミン）、ロラタジン（クラリチン）等；抗潰瘍薬：シメチジン、ラニチジン、ファモチジン等；抗真菌薬、例えばリバビリン等である。
アルコールは肝臓に対する巨大な脅威であり、長期間または断続的に大量に飲酒することは肝組織損傷をもたらし、飲酒量が大きい、持続的に飲用する時間が長い場合ほど、結果がひどいものとなる。アルコールは直接肝細胞に害を与え、その構造及び機能に影響を与える。
【０００３】
アルコール性の肝損傷は慢性中毒性の肝損傷であり、長期にわたり大量に飲酒することによってもたらされる肝臓疾患である。初期は通常、脂肪肝として現れ、さらに進行すればアルコール性肝炎、肝繊維化及び肝硬変にまで進行する。主な臨床症状は悪心、嘔吐、黄疸であり、肝腫大及び圧迫痛を伴うことがある。アルコールの摂取がひどい時は肝細胞の広範囲の壊死を誘発することがあり、場合はよっては肝不全につながる。アルコール性の肝臓疾患は中国でよくみられる肝臓疾患の一つであり、国民の健康を脅かすものである（非特許文献１）。
エタノールによる中毒性の肝損傷以外に、他の「肝臓への親和性が高い毒物」、例えば環境中の化学的な有毒物質及び一部の薬物も肝臓の損傷をもたらすことがある。人体の重要な解毒器官として、肝臓は、肝動脈及び肝静脈という二重の血液供給を有する。化学物質は胃腸管門静脈または体循環から肝臓に入って変換が行われ、そのため肝臓は化学物中の毒性物質によるダメージを受けやすい。大自然及び人類の生産過程においていずれも肝臓への有毒性を有する物質が存在し、「肝臓への親和性が高い毒物」と称し、これらの毒物は集団中で感受性が高く、潜伏期が短く、病変の過程は化学物質の量と直接相関し、肝臓の異なる程度の肝細胞壊死、脂肪変性、肝硬変を引き起こす。病理的な表現は以下を含む：（１）脂肪変性。四塩化炭素、黄リン等はリポタンパクの合成及び運搬を干渉するものであり、脂肪肝となってしまう。（２）脂質の過酸化反応、これは中毒性の肝損傷の特殊な表現形式であり、例えば四塩化炭素は体内で代謝して酸化能力の非常に強い中間生成物を生成し、これにより生物膜上の脂質過酸化をもたらし、膜のリン脂質を破壊し、細胞の構造と機能を改変させる。（３）胆汁鬱滞反応、主に肝細胞膜と微絨毛がダメージを受け、胆汁酸の排泄障害をもたらすことに関連する（非特許文献２）。
【０００４】
放射も肝組織損傷をもたらすことがある。一般的に、放射源は天然または人工エネルギー源によって生じる高エネルギー電磁波または高エネルギー粒子である。高線量の放射線の瞬間照射または低線量の長時間照射のいずれもが組織損傷をもたらす可能性があり、放射のエネルギーは細胞の染色体、酵素を破壊し、細胞の正常な機能を乱してしまう。
糖尿病性の肝組織損傷は糖尿病によって引き起こされる肝臓組織学及び機能に変化が生じる病変である。糖尿病によって引き起こされる肝損傷は以下を含む：肝酵素学的異常であって、肝細胞内の二酸化炭素の蓄積、酸中毒、酸素供給の減少、酸素消耗の増加を引き起こし、肝臓アミノ基移転酵素の活性を向上させ、ビリルビンの代謝を乱し、ひどいものは肝細胞の壊死をもたらす；脂肪肝、脂肪肝をもたらすすべての病因において、糖尿病は第３位を占め、そのうち、２１％〜７８％の糖尿病患者は脂肪肝を伴う；肝炎、肝硬変及び肝臓がん、そのうち糖尿病患者におけるウイルス性肝炎の疾患率は健常者の２〜４倍であり、原発性の肝臓がんの発生率は健常者の４倍である。糖尿病性の肝臓疾患は百万単位の患者のクオリティ・オブ・ライフを害するだけでなく、同時に巨大なコスト負担となり、医療保険システムに対しても大変看護の負担を要するものである。
肝臓のウイルス感染も肝損傷をもたらすよくある原因であり、例えばＢ型ウイルス性肝炎、Ｃ型ウイルス性肝炎、Ｅ型ウイルス性肝炎等である。
肝臓内のうっ血も肝組織損傷をもたらす。血液の肝臓内における鬱滞は以下の幾つかの要因によって引き起こされる：肝中心静脈閉塞症、バッド・キアリ症候群、慢性右心不全及び狭窄性心膜炎である。
如何なる上行大静脈の血液が心臓に戻ることを阻害する疾患も肝臓うっ血をもたらす可能性があり、例えばリウマチ性の心臓弁膜症、慢性狭窄性心膜炎、高血圧性心臓病、虚血性心臓病、肺心症、先天性の心臓疾患等である。
うっ血性の肝損傷は最初に肝小葉の中央域に影響を与え、肝小葉の中央静脈がうっ血、拡張し、肝類洞壁拡張の程度は肝類洞壁から小葉中央静脈の遠近に応じて異なり、小葉中央の肝細胞が圧迫を受け、変形及び萎縮し、細胞液内は顆粒状の変化を呈し、核凝縮、核分裂、細胞壊死が起こり、ブラウン色の色素沈着を伴い、ブラウン色の色素は小葉の中央に位置し、胆の鬱滞により、近接する中央静脈の肝臓の実質変性壊死が最もひどく、うっ血がひどくなることに従い、壊死組織は肝門域に延伸し、重度うっ血患者は肝門域にのみ比較的正常な肝臓組織を有し、時間が長くなることにつれ、中央静脈周囲の網状繊維は陥没する可能性があり、網状繊維組織及び細い繊維束は中央静脈から他の中央静脈に延伸  する。
【０００５】
肝組織損傷の治療において、現在は主に病因のコントロール及び治療、及びフォロー治療を行うことである。長期的に、科学者はずっと損傷した肝組織に対して直接的で、優れた修復効果を有する薬物を探してきた。本発明もこれに対してさらに研究を進めている。実験により、人体の体内に天然に存在するタンパク質、プラスミノゲンは、中毒、放射、化学療法薬物及び糖尿病によってもたらされる肝組織損傷に対して優れた修復作用を有することを見出した。プラスミノゲンは肝組織損傷及びその関連疾患を治療する新しいストラテジーとなることが望まれる。
プラスミノゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）はプラスミンの非活性前駆体であって、単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである（非特許文献３，４参照）。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的なソースである（引用文献５、６参照）。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンはアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡ  またはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす（非特許文献７）。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの同源トリクル環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントは血管阻害剤と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成されることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｘｉａｏ−Ｌａｎ  Ｌｕ，Ｊｉｎ−Ｙａｎ  Ｌｕｏ，Ｍｉｎｇ  Ｔａｏ，Ｙａｎ  Ｇｅｎ，Ｐｉｎｇ  ＺＨＡＯ，Ｈｏｎｇ−Ｌｉ  Ｚｈａｏ，Ｘｉａｏ−Ｄｏｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｎｅｉ  Ｄｏｎｇ，Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００４，１０（１６）
【非特許文献２】Ｔｉｍ  ＣＭＡ  Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，Ｂａｒｔ  Ｊ  Ｖｅｒｗｅｒ，Ｃａｒｉｎ  ＭＪ  ｖａｎ  Ｎｉｅｕｗｋｅｒｋ，Ｃｈｒｉｓ  ＪＪ  Ｍｕｌｄｅｒ，Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１１，１４（１６）
【非特許文献３】Ｗｉｍａｎ，Ｂ．ａｎｄ  Ｗａｌｌｅｎ，Ｐ．（１９７５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０，４８９−４９４．
【非特許文献４】Ｓａｋｓｅｌａ，Ｏ．ａｎｄ  Ｒｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．（１９８８）．Ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４，９３−１２６
【非特許文献５】Ｒａｕｍ，Ｄ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｄ．，Ａｌｐｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｌｅｖｅｙ，Ｒ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｔａｒｚｌ，Ｔ．Ｅ．（１９８０）．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８，１０３６−１０３７
【非特許文献６】Ｗａｌｌｅｎ  Ｐ（１９８０）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ．Ｉｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，Ｋｌｉｎｅ  ＤＬ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ  ＫＫＮ，ｅｄｓ．（Ｆｌｏｒｉｄａ：ＣＲＣ．
【非特許文献７】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｚａｊｄｅｌ，Ｍ．，Ｃｌａｅｙｓ，Ｈ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｓ．（１９７５）．Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ７２，２５７７−２５８１．
【非特許文献８】Ｍａｒｄｅｒ  Ｖ  Ｊ，Ｎｏｖｏｋｈａｔｎｙ  Ｖ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ，ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２０１０，８（３）：４３３−４４４．
【非特許文献９】Ｈｕｎｔ  Ｊ  Ａ，Ｐｅｔｔｅｗａｙ  Ｊｒ  Ｓ  Ｒ，Ｓｃｕｄｅｒｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕ−ｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎ［Ｊ］．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，２００８，１００（３）：４１３−４１９．
【非特許文献１０】Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ，Ｃｌａｅｙｓ  Ｈ，Ｚａｊｄｅｌ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｙｓｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｎｅ“ｍｉｎｉ”−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（ＭＷ，３８，０００）ｂｙ  ｅｌａｓｔａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，１９７８，３：１９１−２０９．
【非特許文献１１】Ｎａｇａｉ  Ｎ，Ｄｅｍａｒｓｉｎ  Ｅ，Ｖａｎ  Ｈｏｅｆ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００３，１（２）：３０７−３１３．
【非特許文献１２】Ｊａｅ  Ｋｙｕ  Ｒｙｕ，Ｍａｒｋ  Ａ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｓａｒａ  Ｇ．Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，２０１５，６：８１６４．
【非特許文献１３】Ｄｉｍｉｔｒｉｏｓ  Ｄａｖａｌｏｓ，Ｋａｔｅｒｉｎａ  Ａｋａｓｓｏｇｌｏｕ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１２．  ３４（１）：４３−６２．
【非特許文献１４】Ｖａｌｖｉ  Ｄ，Ｍａｎｎｉｎｏ  ＤＭ，Ｍｕｌｌｅｒｏｖａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｈｒｏｎ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔ  Ｐｕｌｍｏｎ  Ｄｉｓ  ２０１２；７：１７３−８２．
【非特許文献１５】Ｋａｒｍｅｎ  Ａ，Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ  Ｆ，Ｌａｄｕｅ  ＪＳ（Ｊａｎ１９５５）．Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．３４（１）：１２６−３１．
【非特許文献１６】Ｗａｎｇ  ＣＳ，Ｃｈａｎｇ  ＴＴ，Ｙａｏ  ＷＪ，Ｗａｎｇ  ＳＴ，Ｃｈｏｕ  Ｐ（Ａｐｒ  ２０１２）．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ａｌａｎｉｎｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｒａｎｇｅ  ｏｎ  ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｏｓａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ＝Ｔａｉｗａｎ  Ｙｉ  Ｚｈｉ．１１１（４）：２０１−８．
【非特許文献１７】Ｈｕａ  Ｌｉｕ，Ｚｈｅ  Ｗａｎｇ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ  Ｎｏｗｉｃｋｉ．Ｃａｓｐａｓｅ−１２  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃａｒｂｏｎ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２０１４  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２８；２０（４８）：１８１８９−１８１９８．
【非特許文献１８】Ｋａｍｙａｒ  Ｚａｈｅｄｉ，Ｓｈａｒｏｎ  Ｌ．Ｂａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ／ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ−Ｎ１−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ＣＣｌ４−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０３：Ｇ５４６−Ｇ５６０，２０１２．
【発明の概要】
【０００７】
一方において、本発明はプラスミノゲンまたはプラスミンの、被験者の肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための薬物、製品、薬物キットにおける用途に係る。本発明はさらに製薬方法に係り、プラスミノゲンと薬学上許容し得る担体を共に、肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／治療するための薬物、製品、薬物キットに製造することを含む。
【０００８】
一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は放射または化学物質によってもたらされる肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患は、がん治療に用いられる放射線化学療法及び薬物である。一つの実施形態において、前記放射は想定外の事故または仕事環境などの他の事件に起因する放射である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は中毒性の肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記中毒性の肝損傷はアルコールを含む「肝臓への親和性が高い毒物」によってもたらされる中毒性の肝損傷である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病によって引き起こされるものであり、糖尿病の合併症の一つである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患はウイルス感染による肝炎によってもたらされるものであり、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスによってもたらされる肝炎である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は薬物性の肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は肝臓内における血液の鬱滞（肝臓うっ血）に起因するものである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病性の肝損傷及びその関連疾患であり、中毒性の肝損傷及びその関連疾患、薬物性肝損傷またはその関連疾患、放射性の肝損傷及びその関連疾患、ウイルス感染性肝損傷及びその関連疾患、うっ血性肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は肝組織損傷によってもたらされる肝機能異常、肝臓の酵素学異常、肝臓周辺の不快感と圧迫痛、肝腫大、脾腫大、肝臓脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんである。
【０００９】
一つの実施形態において、前記フィブリンプラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記フィブリンプラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然フィブリンプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記糖尿病性の肝損傷の関連疾患または中毒性肝損傷の関連疾患は以下を含む：肝臓の酵素学異常、肝臓周辺の不快感と接触痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんである。一つの実施形態において、前記糖尿病性の肝損傷及びその関連疾患は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と共に投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：肝臓保護薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗凝固薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。
【００１０】
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記糖尿病によって引き起こされる肝損傷は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的である。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【００１１】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて使用できる。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投与は、肝臓域において、プラスミノゲンを含有するガイドチューブを用いることによって行われる。
一方で、本発明は被験者の肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療する方法に係り、被験者に有効量のプラスミノゲンまたはプラスミンを投与することを含む。本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミンを被験者の肝組織損傷及びその関連疾患の予防及び／または治療に用いることに係る。
【００１２】
一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患はがん治療に用いられる化学放射療法及び薬物である。一つの実施形態において、前記放射は想定外の事件によってもたらされる放射である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は中毒性肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記中毒性肝損傷はアルコールを含む「肝臓への親和性が高い毒物」によってもたらされる中毒性の肝損傷である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病によってもたらされるものであり、糖尿病の合併症の一つである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患はウイルスが肝臓に感染することによってもたらされる肝炎によるものであり、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスに起因する肝炎である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は薬物性の肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は肝臓内の血液鬱滞（肝臓うっ血）によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病性肝損傷及びその関連疾患であり、中毒性の肝損傷及びその関連疾患、薬物性肝損傷またはその関連疾患、放射性の肝損傷及びその関連疾患、ウイルス感染性肝損傷及びその関連疾患、うっ血性肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は肝組織損傷によってもたらされる肝機能異常、肝酵素学異常、肝臓周辺の不快感と接触痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんである。
【００１３】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記糖尿病性の肝損傷の関連疾患または中毒性肝損傷の関連疾患は以下を含む：肝酵素学異常、肝臓周辺の不快感と接触痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんである。一つの実施形態において、前記糖尿病性の肝損傷及びその関連疾患は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と共に投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：肝臓保護薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗凝固薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。
【００１４】
一つの実施形態において、前記糖尿病によって引き起こされる肝損傷は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的である。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて使用される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投与は、肝臓域において、プラスミノゲンを含有するガイドチューブを用いることによって行われる。
【００１５】
一方で、本発明は被験者の肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するためのプラスミノゲンまたはプラスミンに係り、前記プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する薬物組成物、または前記プラスミノゲンまたはプラスミンを含有する製品または薬物キットを含む。
一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患はがん治療に用いられる化学放射療法及び薬物である。一つの実施形態において、前記放射は想定外の事件によってもたらされる放射である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は中毒性肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記中毒性肝損傷はアルコールを含む「肝臓への親和性が高い毒物」によってもたらされる中毒性の肝損傷である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病によってもたらされるものであり、糖尿病の合併症の一つである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患はウイルスが肝臓に感染することによってもたらされる肝炎によるものであり、例えばＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスによってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は薬物性肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は肝臓内の血液鬱滞（肝臓うっ血）によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は糖尿病性の肝損傷及びその関連疾患、中毒性の肝損傷及びその関連疾患、薬物性肝損傷またはその関連疾患、放射性の肝損傷及びその関連疾患、ウイルス感染性肝損傷及びその関連疾患、うっ血性肝損傷及びその関連疾患である。一つの実施形態において、前記肝組織損傷及びその関連疾患は肝組織損傷によってもたらされる肝機能異常、肝酵素学異常、肝臓周辺の不快感と接触痛（圧痛）、肝腫大、脾腫大、肝臓脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんを含む。
【００１６】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記糖尿病性の肝損傷の関連疾患または中毒性肝損傷の関連疾患は以下を含む：肝酵素学異常、肝臓周辺の不快感と接触痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び肝臓がんである。一つの実施形態において、前記糖尿病性の肝損傷及びその関連疾患は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは一種類または複数種類の他の薬物と組み合わせて投与できる。一つの実施形態において、前記他の薬物とは以下を含む：肝臓保護薬、抗糖尿病薬、抗血栓薬、抗凝固薬、高脂血症治療薬、抗心脳血管疾患薬、抗感染薬。
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物で、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記糖尿病によって引き起こされる肝損傷は糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によってもたらされるものである。
一つの実施形態において、前記被験者のプラスミンまたはプラスミノゲンが低下している。具体的に、前記低下は先天的、継発的及び／または局所的なものである。
【００１７】
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列２、６、８、１０または１２は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を追加、削除及び／または置換したもので、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然としてプラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはＧｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換バリアントである：Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列２が示すプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。最も好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて使用できる。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
【００１８】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは例えば、体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、椎管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投与は、肝臓域において、プラスミノゲンを含有するガイドチューブを用いることによって行われる。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは容器中に分別包装されている。好ましくは、該製品または薬物キットはさらに他の薬物を含み、該薬物キットのその他の容器中に分別包装されている。該薬物キットはさらにプロコトルを含み、前記プラスミノゲンは肝臓組織損傷及びその関連疾患の治療に用いることができると説明するものであり、肝臓組織損傷及びその関連疾患は具体的には、例えば該糖尿病によって引き起こされる糖尿病による肝臓損傷及びその関連疾患、中毒性の肝損傷及びその関連疾患、薬物性の肝損傷またはその関連疾患、放射によってもたらされる肝損傷及びその関連疾患、ウイルス感染によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患、うっ血によってもたらされる肝損傷及びその関連疾患であり、且つさらには、前記プラスミノゲンまたはプラスミンは他の薬物または療法を投与する前、投与と同時、及び／または後に投与できる。
【００１９】
本発明は本発明の実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせ後の技術構成は本出願で明確に開示され、前記技術構成が単独且つ明確に開示されているのと一緒である。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示され、それぞれのサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているのと一緒である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「糖尿病性肝損傷」は糖尿病によって引き起こされる肝臓組織学及び機能変化が起こる病変である。それは主に糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、微小血管の病変によるものである。糖尿病が引き起こす肝損傷は以下を含む：肝酵素学的異常、それは肝細胞内の二酸化炭素蓄積、酸中毒、酸素供給の減少、酸素消耗の増加をもたらし、肝臓のアミノ基移転酵素の活性を向上させ、ビリルビンの代謝の乱れを引き起こし、ひどい者は肝細胞の壊死を引き起こすことがある；脂肪肝、脂肪肝のすべての病因において、糖尿病は第３位を占め、そのうち２１％〜７８％の糖尿病患者は脂肪肝を患っている；肝炎、肝硬変及び肝臓がん、糖尿病患者におけるウイルス性肝炎の疾患率はおおよそ健常者の２〜４倍であり、原発性の肝臓がんの発生率はおおよそ健常者の４倍である。
「化学性肝損傷」または「中毒性肝損傷」は化学性の肝臓毒性物質によってもたらされる肝損傷である。これらの化学物質はアルコール、環境中の化学有毒物質及び一部の薬物を含む。大自然及び人類の工業生産過程において、いずれも肝臓に毒性のある物質が存在し、「肝臓への親和性が高い毒物（肝臓親和性毒物）」と呼ばれている。これらの毒物は人間の集合において感受性が高く、潜伏期間が短く、病変の過程と化学物質の量が直接相関し、肝臓の異なる程度の肝細胞壊死、脂肪変性、肝硬変をもたらすことができる。
【００２１】
「肝臓への親和性が高い毒物」は肝臓に対して毒性のある物質の総称である。アルコールは生活において最もよく見られる「肝臓への親和性が高い毒物」である。アルコール以外にも、環境中の化学有毒物質及び一部の薬物も肝損傷をもたらすことがある。人体の重要な解毒器官として、肝臓は肝動脈及び肝静脈の二重の血液供給を有する。化学物質は胃腸道門静脈または体内循環から肝臓に入り変換が行われ、そのため肝臓は化学物質中の毒性物質によってダメージを受やすい。大自然及び人類の生産過程においていずれも肝臓に有毒性を有する物質が存在し、「肝臓への親和性が高い毒物」と呼ばれる。これらは肝臓に入ると、肝臓の異なる程度の肝細胞壊死、脂肪変性、肝硬変をもたらす。病理的な表れは以下を含む：（１）脂肪変性。四塩化炭素、黄リン等はリポタンパクの合成及び運搬を干渉し、脂肪肝となる。（２）脂質の過酸化反応、これは中毒性の肝損傷の特殊な表現形式であり、例えば四塩化炭素は体内で代謝されて酸化能力の非常に強い中間生成物を生成し、これにより生物膜上の脂質の過酸化をもたらし、膜のリン脂質を破壊し、細胞の構造と機能を改変させる。（３）胆汁欝滞反応、主に肝細胞膜と微絨毛がダメージを受け、胆汁酸の排泄障害をもたらすことに関連する。
【００２２】
「薬物性肝損傷」とは薬物の使用過程における、薬物自身または／及び代謝生成物または特殊体質によって生じる薬物に対する超感受性または耐受性の低下がもたらす肝損傷を薬物性肝損傷といい、薬物性の肝疾患とも称され、臨床においては各種急性慢性肝疾患として現れ、軽いものは投与を停止した後に自然に回復でき、ひどい者は生命を脅かされる可能性があり、積極的に治療、救命しなければならない。「薬物性肝損傷」は従来の肝疾患既往歴を有しない健常者または元々重大な疾患がある患者において発生する；薬物の用量が過量の場合に発生する場合あれば、正常な用量で発生する場合もある。
「放射性肝損傷」は高エネルギー電気解離放射、α、β粒子、γ放射線、χ放射線及び中子線によってもたらされる放射性のダメージである。高線量の放射線の瞬間照射または低線量の長時間照射はいずれも組織損傷を引き起こすことがあり、放射のエネルギーは細胞の染色体、酵素を破壊し、細胞の正常な機能を乱れさせる。
「ウイルス感染性肝損傷」はウイルス感染によってもたらされる肝損傷の総称である。前記ウイルス感染でよく見られるのはＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスがもたらす感染である。
「うっ血性肝損傷」は血液の肝臓内における鬱滞によってもたらされる肝組織損傷の病変である。いかなる上行大静脈の血液が心臓に戻ることを阻害する疾患も肝臓うっ血をもたらす可能性があり、例えばリウマチ性の心臓弁膜症、慢性狭窄性心膜炎、高血圧性心臓病、虚血性心臓病、肺心症、先天性の心臓疾患等である。
【００２３】
「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００２４】
Ｇｌｕ−プラスミノゲンは天然のフルサイズのプラスミノゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）、該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Δ−プラスミノゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず（非特許文献８，９）、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり（非特許文献９）、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７に示す通りである。ミニプラスミノゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており（非特許文献１０）、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基が開始アミノ酸である）と文献が報告し（非特許文献１１参照）、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００２５】
本発明の  「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノゲン」と「フィブリンプラスミノゲン」、「繊維タンパクプラスミノゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノゲン及びプラスミンをカバーするものである。
循環プロセスにおいて、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解し、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのＰａｐドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションに維持する重要な決定クラスターであり、ＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００２６】
「プラスミノゲン活性フラグメント」とはプラスミノゲンのタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノゲンの技術構成は、プラスミノゲン活性フラグメントでプラスミノゲンの替わりとする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントはプラスミノゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノゲンは該プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノゲン活性を有するタンパク質を含む。
現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノゲン活性化剤阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、その後に分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行うことができる。
【００２７】
「オルソロジー（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）」とは異なる種どうしのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノゲン活性を有するプラスミノゲン直系同源物または直系同系物である。
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換変異体」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００２８】
「分離された」プラスミノゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノゲンを含む。
【００２９】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【００３０】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、アミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂのアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂのあるアミノ酸配列と同一性を有する所定のアミノ酸配列Ａの占める％）は以下のように計算される：  
分数Ｘ／Ｙ×１００
【００３１】
そのうちＸは配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾病が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況である；  （ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害する；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させる。
【００３２】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与され、疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現するプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００３３】
（本発明のプラスミノゲンの製造）
プラスミノゲンは自然界から分離及び精製され、さらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖の機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【００３４】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産できる。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然で関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。
【００３５】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、外部由来に期待のＤＮＡ配列によって形質転換されるそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）はクローンするターゲット抗体をコードするポリヌクレオチドの原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母はエタノール脱水素酵素、イソ細胞色素Ｃ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターによって起動される。
【００３６】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノゲンの発現に用いることができる（例えばターゲット抗−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、ＲＮＡの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
一旦合成（化学または組み換え方式）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノゲンを精製することができる。該プラスミノゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、ターゲット抗体以外の大分子などである。
【００３７】
（薬物配合剤）
必要とする純度のプラスミノゲンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルエタノール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンチルエタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンである；親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドンである；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【００３８】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、抗高血圧薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
本発明のプラスミノゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に包まれることができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）。
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌ろ過膜でろ過することで容易に実現できる。
【００３９】
本発明のプラスミノゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過基質を含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールエタノール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγメチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に１００日間以上分子を放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現する。
【００４０】
（投与及び用量）
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るｐＨ及び等張状態に調整する。
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、エタノール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【００４１】
医療関係者は各種臨床的要素により用量の案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量の日程表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において糖尿病肝臓疾患及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
【００４２】
（治療効力及び治療安全性）
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。そのうち前記治療効力を判断する方法は以下を含むが、これらに限られない：１）被験者の肝臓機能に対する検査で、例えば患者体内の酵素学レベル、例えば血清アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、アルブミン、グロブリン、コリンエステラーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ペプチド転移酵素などの水準が正常値の範囲内にあるかに対して検査を行い、本発明中のプラスミノゲンを用いて被験者に対して治療を行った後、前記肝機能の数値が正常値に戻るかまたは改善されることを望まれ、例えば、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）：０〜４０μ／Ｌ、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）：０〜４０μ／Ｌ、グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）：４０単位未満、総ビリルビン：３．４〜２０．５μｍｏｌ／Ｌである；２）被験者のプロトロンビン時間（ＰＴ）及び活動度（ＰＴＡ）に対して検査を行う：ＰＴは肝臓凝血因子の合成機能を反映する重要な指標であり、ＰＴＡはＰＴ測定値の常用される表示方法であり、肝臓疾患の進行及び予後の判断に比較的大きな価値を有し、そのうちＰＴＡ進行性が４０％以下に低下することを肝不全の重要な診断基準の一つとし、＜２０％の者は肝臓機能が不良であることを示し、本発明中のプラスミノゲン及びそのバリアントを用いて被験者に対して治療を行った後、患者体内のＰＴＡの低下予期が明らかに改善されている；３）映像学検査：腹部の肝胆脾エコー、ＣＴまたは核磁気共鳴を含み、肝損傷の回復の程度を知るためである；４）腫瘍マーカーの検査、例えばアルファ・フェトプロテインＡＦＰ、ＣＡ１９９、ＡＦＵなどである；５）肝臓組織生検を行い、繊維化及びその他の損傷の回復の程度を判断する。また、本発明はさらにプラスミノゲン及びそのバリアントを用いて被験者に対して治療を行う過程中及び治療後において、前記該治療案の安全性に対する判断は、被験者の血清半減期、治療半減期、半数中毒量（ＴＤ５０）、半数致死量（ＬＤ５０）に対して統計を行い、または治療過程中においてまたは治療後に発生する各種望ましくない有害事象例えばアレルギー反応に対して観察を行うことを含むが、これらに限られない。
【００４３】
（製品または薬物キット）
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患の治療に用いられる本発明のプラスミノゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病によって引き起こされる肝損傷及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを投与した後の体重の変化を示したものである。
【図２】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを１５日間連続的に投与した後の肝臓のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の観察結果を示したものである。
【図３】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを１５日間連続的に投与した後の肝臓フィブリン免疫染色の顕微鏡による観察結果を示したものである。
【図４】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間連続的に投与した後の体重変化を示したものである。
【図５】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間連続的に投与した後の肝臓のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の観察結果を示したものである。
【図６】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間連続的に投与した後の肝臓フィブリン免疫染色の顕微鏡による観察結果を示したものである。
【図７】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間連続的に投与した後の肝臓Ｆ４／８０免疫染色の観察結果を示したものである。
【図８】２４〜２５週齢の糖尿病マウスに対してプラスミノゲンを３１日間連続的に投与した後の血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の測定結果を示したものである。
【図９】プラスミノゲンを投与した０、２、７日目の、四塩化炭素による急性肝損傷マウスの肝臓ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の観察結果を示したものである。
【図１０】ｐｌｇ−／−四塩化炭素による急性肝損傷のマウスに対してプラスミノゲンを投与した１８、２４、４８時間後の肝臓ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の観察結果を示したものである。
【図１１】ｐｌｇ−／−四塩化炭素による急性肝損傷のマウスに対してプラスミノゲンを投与した１８、２４、４８時間後の肝臓フィブリン免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１２】５．０Ｇｙ  Ｘ線照射によるマウスに対してプラスミノゲンを投与１０日後の肝臓Ｆ４／８０免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１３】１０ｍｇ／Ｋｇシスプラチン化学療法による損傷モデルマウスにプラスミノゲンを投与した７日後の肝臓フィブリンの免疫染色の観察結果を示したものである。
【図１４】ｐｌｇ−／−四塩化炭素による急性肝損傷マウスに対してプラスミノゲンを投与した１８、２４、４８時間後及び７日後の肝臓ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の観察結果を示したものである。
【００４５】
＜実施例＞
【実施例１】
【００４６】
実施例１は神経損傷が発生している糖尿病後期マウスの体重に対するプラスミノゲンの影響に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録し、連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与ループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを投与する第０、４、７、１１、１６日目にそれぞれ体重を測定する。その結果は、プラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループは０、４、７、１１、１６日目に体重（図１）に明らかな差異がなく、プラスミノゲンは動物体重に対して影響が大きくないことが示されている。
【実施例２】
【００４７】
実施例２は糖尿病による肝損傷の末期肝臓組織損傷に対するプラスミノゲンの保護作用に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録し、連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した後、肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入する。
ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の結果が示すように、溶媒ＰＢＳ投与対照グループにおいて、肝細胞は重度の脂肪変性を示し、脂質が沈着し、細胞核は辺縁部に押され、細胞に軽度な水様変性が起こり、肝索に乱れが生じる；プラスミノゲン投与グループは溶媒投与対照グループに比べ、肝細胞の脂肪変が減軽され、軽度脂肪変となり、中程度の水様変性を主とする。プラスミノゲンは糖尿病による肝損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例３】
【００４８】
実施例３はプラスミノゲンが糖尿病マウスの肝臓組織フィブリンレベルを減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に１５日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。１６日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定する。固定した後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流し、それからＴＢＳで１回洗う。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる（非特許文献１２〜１４）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とすることができる。
研究により、プラスミノゲン投与グループ（図３Ｂ）と溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図３Ａ）を比較した場合、プラスミノゲン投与グループのマウスの肝臓組織フィブリンのレベルが低下し、プラスミノゲンはフィブリンレベルの沈着を阻害する機能を有し、損傷がある程度修復されていることを示している。
【実施例４】
【００４９】
実施例４は糖尿病マウスの体重に対するプラスミノゲンの影響に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを２０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各１０匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してからグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与ループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを投与する第０、４、７、１１、１６、２１、２６、３１日目にそれぞれ体重を測定する。
その結果は、プラスミノゲン投与グループ及び溶媒ＰＢＳ投与対照グループは０、４、７、１１、１６、２１、２６、３１日目に体重に明らかな差異がなく（図４）、これは、プラスミノゲンは動物体重に対して大きな影響がないことが示されている。
【実施例５】
【００５０】
実施例５は糖尿病による肝損傷末期の肝臓組織損傷に対するプラスミノゲンの保護作用に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り、１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定した後、肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入する。
ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の結果が示すように、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図５Ａ）において、肝細胞は重度の脂肪変性を示し、脂質が沈着し、大きな脂肪空胞となり、細胞核は辺縁部に押され、肝索に乱れが生じる；肝類洞壁が狭窄し、且つ肝索にて数量の異なる炎性病巣（↑）が見られる。プラスミノゲン投与グループ（図５Ｂ）は肝臓に軽度の脂肪変性が生じ、損傷は軽度の水様変性が主であり、細胞液が溶解して主に門脈域と中央静脈中央域に分布し、門脈域及び中央静脈周囲は影響が比較的軽く、同時に肝索域に軽度な炎症性細胞浸潤が見られる、これはプラスミノゲンを投与した後の肝臓は損傷が明らかに修復されていることを示している。
【実施例６】
【００５１】
実施例６はプラスミノゲンが糖尿病マウスの肝臓組織フィブリンレベルを減少させることを示したものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。３２日目にマウスを殺処分して肝臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定した後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍで、切片を脱パラフィンさせて再水和した後にさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の正常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、顕微鏡下で２００倍にて切片を観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、有機体の損傷に対する刺激応答反応として、フィブリノーゲンは加水分解してフィブリンとなる（非特許文献１２〜１４）。そのためフィブリノーゲンレベルを損傷の程度の一つの指標とする。
研究により、プラスミノゲン投与グループ（図６Ｂ）と溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図６Ａ）を比較した場合、プラスミノゲン投与グループのマウスの肝臓組織フィブリンのレベルが低下し、プラスミノゲンはフィブリンレベルの沈着を阻害する機能を有し、プラスミノゲンは糖尿病マウスの生体損傷に顕著な修復機能を有することを示している。
【実施例７】
【００５２】
実施例７はプラスミノゲンの糖尿病マウスの肝臓組織の炎症の減軽に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹選び、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各５匹である。実験開始当日を０日目として体重測定及びグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスに対して２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日にて尾静脈からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを３１日間投与した後にマウスを殺処分して肝臓組織を取り１０％中性ホルマリン固定液中において２４時間固定する。固定した後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させて及びキシレンで透明にした後にパラフィンで包埋させる。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから再水和してさらに１回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗う。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流し、透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で４００倍にて観察する。
Ｆ４／８０はマクロファージマーカーであって、炎症反応の程度及び段階を示すことができる。その結果は以下を示している。プラスミノゲン投与グループ（図７Ｂ）と溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図７Ａ）を比較した場合、プラスミノゲン投与グループのＦ４／８０陽性レベルは明らかに低下し、これはプラスミノゲンを投与した後の肝臓組織の炎症の程度が減軽されていることを示している。図７ＣはＦ４／８０免疫グループ化陽性発現数の定量分析結果であり、プラスミノゲン投与グループのＦ４／８０の発現量が明らかに減少され、且つ統計学的差異を有し、これはプラスミノゲンを注射することで糖尿病マウスの肝臓の炎症の修復を顕著に促進できることを示している。
【実施例８】
【００５３】
実施例８はプラスミノゲンの糖尿病マウスの肝損傷の修復促進に関するものである。
２５−２８周齢ｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、ランダムに２つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与グループ３匹、プラスミノゲン投与グループ６匹である。実験開始当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、実験２日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与して且つ１日目と記録し、連続的に３１日間投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスを２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日に応じて尾静脉からプラスミノゲンを注射し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループに対して同じ体積のＰＢＳを投与する。プラスミノゲンを３１日間投与した後に眼球を摘出して全血を採取し、血清が析出してから４℃、３５００ｒ／ｍｉｎにて１０分間遠心させ、上澄み液を取って測定を行う。本実験はグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素測定薬物キット（南京建成生物工程研究所、品番Ｃ００９−２）であり、ライトマン‐フランケル法（Ｒｅｉｔｍａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ）を用いて血清中のグルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ）の含有量を測定する。
グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素は肝臓の健康状態を示す重要な指標であり（非特許文献１５、１６参照）、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素の正常参考値の範囲は９〜５０Ｕ／Ｌである。測定結果は以下を示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループの血清中のＡＬＴの含有量は明らかに正常な生理的指標より高く、プラスミノゲン投与グループは既に体内の正常水準に戻り、さらにプラスミノゲン投与グループは溶媒ＰＢＳ投与対照グループより顕著に低く、且つ統計学的差異を有する（図８）。糖尿病末期のモデルマウスにおいて、プラスミノゲンを注射することはより効果的に肝損傷を修復できることを示している。
【実施例９】
【００５４】
実施例９はプラスミノゲンの急性肝臓中毒の肝臓に対する保護作用に関するものである。
７−８週齢のｐｌｇ＋／＋マウスを１８匹取り、オスメスは限られず、ランダムで二つのグループに分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ９匹である。二つのグループのマウスを０．５ｍＬ／ｋｇ体重に応じて経腹部注射により四塩化炭素を投与し、連続的に二日間投与し、急性肝損傷モデルを構築する（非特許文献１７、１８）。四塩化炭素は使用する前にトウモロコシ油で希釈し、前者と後者の体積比は１：７である。モデル構築当日を０日目とし、１日目からプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスを毎日１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループは同じ体積のＰＢＳを投与し、連続的に７日間投与する。０、２、７日目にそれぞれ二つのグループのマウスを３匹ずつ取って殺処分し、解剖して肝臓の状況を観察して記録し、それから肝臓組織を１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定させる。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下において２００倍下にて観察を行う。
ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）の結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図９Ａ−Ｃ）及びプラスミノゲン投与グループ（図９Ｄ−Ｆ）のマウスの肝臓は０日目に主に中央静脈周囲に砕片状の壊死があり、壊死域において細胞核が破裂し、細胞液が淡く染色され、その他の壊死していない域にも中度の水様変性が見られ、細胞が膨れている；２日目に中央静脈が拡張し、肝細胞の構造が乱れ、少量の炎症性細胞浸潤が生じ、二つのグループに明確な差異が見られない。しかし７日目において、溶媒ＰＢＳ投与対照グループは依然少量の肝細胞変性が見られ、細胞に軽度な膨れが生じ、肝索が乱れ、肝類洞壁が狭窄し、且つ門脈域周囲に軽度な炎症性細胞浸潤が生じているが、プラスミノゲン投与グループの肝臓は基本的に正常な細胞液の紅染色に戻り、肝索が規則的で、肝類洞壁が明晰である。これによりプラスミノゲンは肝損傷の修復を促進できることが示されている。
【実施例１０】
【００５５】
実施例１０はプラスミノゲンの急性肝臓中毒の肝臓に対する保護作用に関するものである。
７−１１週齢のｐｌｇ―／―オスマウスを１８匹取り、ランダムに二つのグループに分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ９匹である。二つのグループのマウスを０．５ｍＬ／ｋｇ体重に応じて経腹部注射により四塩化炭素を投与し、一回のみ処理を行い、急性肝損傷モデルを構築する（非特許文献１７、１８参照）。四塩化炭素は使用する前にトウモロコシ油で希釈し、前者と後者の体積比は１：７である。モデル構築が完了した後に３０分以内にプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスを毎日１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループは同じ体積のＰＢＳを投与し、連続的に２日間投与する。投薬後１８、２４、４８時間後にそれぞれ二つのグループのマウスを３匹ずつ取って殺処分し、解剖して肝臓の状況を観察して記録し、それから肝臓組織を１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定させる。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下において２００倍下にて観察を行う。
結果は以下のように示している。溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１０Ａ−Ｃ）は１８ｈ、２４ｈ、４８ｈにいずれも異なる程度の壊死が見られ、１８ｈ、２４ｈは片状壊死を主とし、４８ｈにはブリッジ部の壊死が発生し、細胞核が破裂し、細胞液が浅く染色され、且つ損傷が悪化し続け、主に中央静脈周囲に分布し、壊死域には中度の炎症性細胞浸潤が見られる（↓）。門脈域の周囲は壊死が比較的軽く、軽度の水様変性が主であり、軽度の炎症性細胞浸潤を伴い、軽度の胆管増殖が生じている。プラスミノゲン投与グループ（図１０Ｄ−Ｆ）は１８ｈ、２４ｈ、４８ｈにおいて対照グループに比較して、いずれも明らかな壊死が見られなく、損傷は軽度な水様変性を主にし、門脈域周囲に分布し、中央静脈周囲の肝細胞は影響されていなく、２４ｈ時は１８ｈ時より好転し、水様変性が減軽され、中央静脈周囲の肝細胞は軽度な脂肪変性が生じ、細胞液が浅く染色され、軽度の炎症性細胞浸潤を伴う。これによりプラスミノゲンはｐｌｇ−／−急性肝損傷モデルのネズミ肝臓損傷の修復を促進できることが示されている。
【実施例１１】
【００５６】
実施例１１はプラスミノゲンの急性肝損傷モデルマウスの肝臓組織のフィブリン沈着を減軽することに関するものである。
７〜１１週齢のｐｌｇ−／−オスマウスを１８匹取り、ランダムに二つのグループに分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ９匹ずつである。二つのグループのマウスを０．５ｍＬ／ｋｇ体重に応じて経腹腔で四塩化炭素を注射し、一回のみ処理し、急性肝損傷モデルを構築する（非特許文献１７、１８）。四塩化炭素は使用する前にトウモロコシ油で希釈し、前者と後者の体積比は１：７である。モデル構築が完了した後に３０分以内にプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスを毎日１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループは同じ体積のＰＢＳを投与し、連続的に２日間投与する。投薬後１８、２４、４８時間後にそれぞれ二つのグループのマウスを３匹ずつ取って殺処分し、解剖して肝臓の状況を観察して記録し、それから肝臓組織を１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定させる。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してから一回水洗いする。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、２回水洗いし、毎回５分間である。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。ウサギ抗マウスフィブリン（フィブリノーゲン）抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗う。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解される  （非特許文献１２〜１４参照）。そのためフィブリノーゲンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。
結果は以下を示している。１８、２４、４８時間の三つのタイミングのプラスミノゲン投与グループ（図１１Ｄ−Ｆ）のフィブリンの陽性着色は明らかに溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１１Ａ−Ｃ）より浅い。さらに時間が長くなるにつれてフィブリンの着色も次第に浅くなる傾向を有する。これはプラスミノゲンを注射することでフィブリンの沈着を減少させ、肝損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例１２】
【００５７】
実施例１２はプラスミノゲンの５．０ＧｙＸ線照射によるマウスの肝臓組織の炎症の修復に関するものである。
本実験は６〜８週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つのグループに分け、溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループに分け、各グループ５匹ずつである。グループ分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器６ＭＶ  Ｘ線を用いて５．０Ｇｙにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は２．０Ｇｙ／ｍｉｎであり、吸収線量は５．０Ｇｙである（２．５分間照射）。モデルを構築してから、３時間以内にプラスミノゲンを投与する。実験が開始した当日を０日目として体重測定してグループ分けを行い、１日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は１０日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後１１日間観察し、全実験期間は２１日である。プラスミノゲン投与グループに対して１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じて尾静脈から注射することで投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループには同じ体積のＰＢＳを投与する。２１日目にマウスを殺処分して解剖して肝臓を取り、それから肝臓を１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定させる。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してから一回水洗いする。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで３０分間修復し、室温にて２０分間冷却してからやさしく洗い流す。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＦ４／８０抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗う。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察する。
Ｆ４／８０免疫組織染色  （Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の効果が示すように、５．０ＧｙＸ線で照射してモデル構築した後の溶媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１２Ａ）のマウスファージマーカーの発現量はプラスミノゲングループ（図１２Ｂ）より高く、これはプラスミノゲンを投与した後に、動物の肝臓組織の炎症が顕著に減軽されたことを示している。
【実施例１３】
【００５８】
実施例１３はプラスミノゲンのシスプラチン化学療法損傷モデルマウスの肝臓組織のフィブリン沈着を減少させることに関するものである。
８〜９週齢の健康なオスＣ５７マウスを１０匹取り、ランダムに二つのグループに分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ５匹ずつである。グループ分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、１０ｍｇ／Ｋｇ体重に応じて一回のみ経腹腔でシスプラチンを注射する。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与グループを毎日１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループは同じ体積のＰＢＳを投与する。実験開始当日を０日目として体重を測ってからグループ分けし、一日目から腹腔注射してシスプラチンモデル構築を行い、モデル構築後３時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、投与期間は７日間である。８日目にマウスを殺処分し、肝臓を取って１０％中性フルマリン固定液において２４〜４８時間固定を行う。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してから一回水洗いする。クエン酸で３０分間修復し、室温にて１０分間冷却してからやさしく洗い流す。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、ＰＡＰマーカーで組織を囲む。１０％の健常ヒツジ血清液  （Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間封止する；時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスフィブリン抗体（Ａｂｃａｍ）４℃で終夜インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＴＢＳで２回洗い、毎回５分間である。ＤＡＢ薬物キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で顕色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流す。透明になるよう段階的に脱水してから封止させ、切片を顕微鏡下で２００倍にて観察する。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解される  （非特許文献１２〜１４）。そのためフィブリノーゲンのレベルを損傷程度の一つの指標とすることができる。
結果は以下を示している。触媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１３Ａ）における肝臓組織中のフィブリンの陽性着色は明らかにプラスミノゲン投与グループ（図１３Ｂ）より深い。これはプラスミノゲンが損傷した肝臓組織中に沈着したフィブリンを顕著に減少させたことを示し、プラスミノゲンがシスプラチンによってもたらされる肝損傷の修復を促進できることを示している。
【実施例１４】
【００５９】
実施例１４はプラスミノゲンの急性肝臓中毒の肝臓に対する保護作用に関するものである。
７−１１週齢のｐｌｇ―／―オスマウスを６匹取り、ランダムに二つのグループに分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照グループ及びプラスミノゲン投与グループで、各グループ３匹である。二つのグループのマウスを０．５ｍＬ／ｋｇ体重に応じて経腹部注射により四塩化炭素を投与し、一回のみ処理を行い、急性肝損傷モデルを構築する（非特許文献１７、１８）。四塩化炭素は使用する前にトウモロコシ油で希釈し、前者と後者の体積比は１：７である。モデル構築が完了した後に３０分以内にプラスミノゲンまたはＰＢＳを投与する。プラスミノゲン投与グループのマウスを毎日１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照グループは同じ体積のＰＢＳを投与し、連続的に７日間投与する。８日目にマウスを殺処分し、解剖して肝臓の状況を観察して記録し、それから肝臓組織を１０％中性ホルマリン固定液中において２４〜４８時間固定させる。固定後の肝臓組織をエタノールで段階的に脱水させ及びキシレンで透明化処理した後にパラフィンで包埋処理を行う。組織切片の厚みは５μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに再水和してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ（ＨＥ染色）、１％塩酸エタノールで分化させ、アンモニア水で安定化させ、さらにエタノールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下において２００倍下にて観察を行う。
結果は以下のように示している。触媒ＰＢＳ投与対照グループ（図１４Ａ）に対して、肝臓中央静脈が拡張し、内皮細胞が壊死し、中央静脈の周囲肝細胞にいずれも大面積の巣状壊死が発生し、細胞核が破砕して深く染色され、その他の壊死していない区域には軽度の水様変性があり、細胞が膨れ、細胞液が透明で、壊死域の軽度な炎症性細胞浸潤を伴う；プラスミノゲン投与グループ（図１４Ｂ）において、肝臓に明らかな壊死が見られなく、損傷は軽度の水様変性がメインであり、少量の肝細胞は細胞液の酸嗜好が増強し、赤く染色される。プラスミノゲンの組織損傷は明らかに触媒ＰＢＳ対照グループより軽く、プラスミノゲンはｐｌｇ−／−急性肝損傷モデルのマウス肝損傷の修復を促進できることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月28日(2018.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のプラスミノゲンを含有する、肝組織損傷及びその関連疾患の予防剤または治療剤。
【請求項２】
前記肝組織損傷及びその関連疾患が、放射または化学物質によって引き起こされる肝損傷及び／またはその関連疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の予防剤または治療剤。
【請求項３】
前記肝組織損傷及び／またはその関連疾患が、中毒性肝損傷及び／またはその関連疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の予防剤または治療剤。
【請求項４】
前記肝組織損傷及び／またはその関連疾患が、糖尿病性肝損傷及び／またはその関連疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の予防剤または治療剤。
【請求項５】
前記糖尿病性の肝損傷及び／またはその関連疾患が、糖尿病によって引き起こされる大血管、小血管、及び／または微小血管の病変によってもたらされるものであることを特徴とする、請求項４に記載の予防剤または治療剤。
【請求項６】
前記肝組織損傷及び／またはその関連疾患が、肝組織損傷によってもたらされる肝機能異常、肝酵素学的異常、肝臓周辺の不快感及び接触痛、肝腫大、脾腫大、肝脾腫大、肝炎、脂肪肝、胆管炎、肝硬変、肝壊死及び／または肝臓がんであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項７】
前記プラスミノゲンが、配列番号２、６、８、１０または１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つプラスミノゲン活性を有するものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項８】
前記プラスミノゲンが、プラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つプラスミノゲン活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項９】
前記プラスミノゲンが、Ｇｌｕ−プラスミノゲン、Ｌｙｓ−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ（ｄｅｌｔａ）−プラスミノゲンまたはそれらの任意の組み合わせから選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１０】
前記プラスミノゲンが、一種類または複数種類の他の薬物と組み合わせて投与されるものであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の予防剤または治療剤。
【請求項１１】
有効用量のプラスミノゲンを含有する製剤、当該製剤を格納する容器、並びに、被験者の肝組織損傷及びその関連疾患を予防及び／または治療するための前記製剤の投与方法を示すプロトコルを含むことを特徴とする、被験者の肝組織損傷及び／またはその関連疾患を予防及び／または治療するためのキット。
【請求項１２】
さらに一種類または複数種類の他の薬物を含有することを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記プロトコルが、さらに前記プラスミノゲンは前記他の薬物を投与する前、投与と同時、及び／または投与後に投与できることを説明していることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【国際調査報告】
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