(57)【要約】間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物を含む組成物が開示される。細胞構築物を作製する方法、毛髪回復の方法、およびキットも開示される。本発明は、間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物のような細胞構築物を作製するためのパラレルバイオプリンティングシステムおよび方法も開示される。2019535705.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物を含む複数のチャンネルを含むハイドロゲルを含む組成物。
【請求項２】
ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルが、少なくとも1種の追加の細胞型をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルの中の少なくとも1種の追加の細胞型が、皮膚線維芽細胞、内皮細胞、前脂肪細胞、免疫細胞、メラノサイト、または幹細胞である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルが、少なくとも1種の毛包成熟因子を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも1種の毛包成熟因子が、線維芽細胞増殖因子（FGF）、Wntアゴニスト、またはそれらの組み合わせである、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
FGFが、FGF5、FGF7、FGF9、FG10、またはそれらの組み合わせである、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
Wntアゴニストが、CHIR99021、LiCl、SB-216763、またはCAS 853220-52-7である、請求項5記載の組成物。
【請求項８】
細胞構築物がメラノサイトをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
細胞構築物が実質的に直線状である、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
細胞構築物が曲線状である、請求項1〜8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
細胞構築物の表面が不規則である、請求項1〜10のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
間葉系細胞が細胞構築物の一方の末端に区分されており、上皮細胞が細胞構築物の他方の末端に区分されている、請求項1〜11のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
細胞構築物が長さ50〜10,000μmおよび直径50〜2000μmである、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４】
細胞構築物が長さ4〜10mmおよび直径50〜750μmである、請求項1〜12のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１５】
間葉系細胞と上皮細胞との比が10:1〜1:10である、請求項1〜14のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１６】
間葉系細胞と上皮細胞との比が1:2〜1:1である、請求項1〜14のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
間葉系細胞が真皮乳頭細胞である、請求項1〜16のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１８】
細胞構築物が嚢胞をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１９】
嚢胞が真皮乳頭細胞を含む、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
上皮細胞が皮膚上皮細胞である、請求項1〜19のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
皮膚上皮細胞がケラチノサイトである、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
間葉系細胞および上皮細胞がヒト細胞である、請求項1〜21のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２３】
ハイドロゲルが、コラーゲン、ヒアルロン酸もしくはその塩、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
ハイドロゲルがアルギン酸を含む、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
ハイドロゲルが架橋されている、請求項1〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
請求項1〜25のいずれか一項記載の組成物とキットの使用説明書とを含むキット。
【請求項２７】
細胞構築物を植え込むための器具をさらに含む、請求項26記載のキット。
【請求項２８】
間葉系細胞および上皮細胞のハイドロゲル内への沈着を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の組成物を作製する方法。
【請求項２９】
ハイドロゲル内への針の挿入ならびに針の先端からの間葉系細胞および上皮細胞の押し出しと同時の針の引き抜きによって、間葉系細胞および上皮細胞の混合物をハイドロゲル内に沈着させる、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ハイドロゲル内への1本または複数本の針の挿入ならびに針の先端からの間葉系細胞および上皮細胞の押し出しと同時の針の引き抜きによって、間葉系細胞および上皮細胞をハイドロゲル内に沈着させる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
間葉系細胞が針の先端に区分される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
間葉系細胞を針の先端から沈着させ、次いで上皮細胞を針から沈着させて、チャンネルの下端に間葉系細胞を有しチャンネルの上端に上皮細胞を有する区分された細胞構築物を提供する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
細胞の沈着の前に、最初に上皮細胞が針に充填され、次いで間葉系細胞が針の先端に充填される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
針が、少なくとも2種の異なる細胞型のための少なくとも2種の異なるインプットの共通軸の周囲に同心流を提供する2種以上の別々の材料経路を有する同軸デバイスであり、同軸針のコアから間葉系細胞が押し出され、マントル層から上皮細胞が押し出される、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
針のコアから間葉系細胞を沈着させ、次いで同軸針のマントル層から上皮細胞を沈着させて、チャンネルの下端に間葉系細胞を有しチャンネルの上端に上皮細胞を有する区分された細胞構築物を提供する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
間葉系細胞および上皮細胞を、押し出し化合物をさらに含む1種または複数種の組成物の一部として沈着させる、請求項28〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
押し出し化合物が、アルギン酸、ハイドロゲル、コラーゲン、Novogel（登録商標）、Matrigel（登録商標）、細胞外マトリックス成分、または水溶性架橋性生分解性ポリマーを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
細胞構築物を成熟させる工程をさらに含む、請求項28〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
細胞構築物を1〜42日間成熟させる、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
細胞構築物を7〜21日間成熟させる、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
細胞構築物をハイドロゲルから取り出す工程をさらに含む、請求項28〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも1本の針と、
針と流体連通した1または複数のリザーバーであって、間葉系細胞、上皮細胞、またはそれらの混合物を含む、1または複数のリザーバーと、
少なくとも1本の針の内容物を押し出すための手段と、
ハイドロゲルの表面に対して針を位置付ける作動手段と
を含む自動デバイスによって、沈着が制御される、請求項28〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
自動デバイスが複数の構築物をハイドロゲルに沈着させる、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
自動デバイスが、少なくとも1本の針の内容物を押し出すための手段と通信接続されたコンピュータプロセッサを含む、請求項42または43記載の方法。
【請求項４５】
間葉系細胞および上皮細胞がヒト細胞である、請求項28〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
上皮細胞をスフェロイドとして沈着させない、請求項28〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
針がベベルを有する、請求項28〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
針が10〜45度のベベルを有する、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
針が約30度のベベルを有する、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
針の内径が150〜1000μmである、請求項28〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
針の外径が約250μm〜約1250μmである、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
ハイドロゲルが架橋されている、請求項28〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
間葉系細胞および上皮細胞を含む円柱形の細胞構築物。
【請求項５４】
メラノサイトをさらに含む、請求項53記載の細胞構築物。
【請求項５５】
実質的に直線状である、請求項53または54記載の細胞構築物。
【請求項５６】
曲線状である、請求項54または54記載の細胞構築物。
【請求項５７】
細胞構築物の表面が不規則である、請求項53〜54のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項５８】
間葉系細胞が細胞構築物の一方の末端に区分されており、上皮細胞が細胞構築物の他方の末端に区分されている、請求項53〜57のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項５９】
長さ50〜10,000μmおよび直径50〜2000μmである、請求項53〜58のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６０】
長さ4〜10mmおよび直径50〜750μmである、請求項53〜59のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６１】
間葉系細胞と上皮細胞との比が10:1〜1:10である、請求項53〜60のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６２】
間葉系細胞と上皮細胞との比が1:2〜1:1である、請求項53〜61のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６３】
間葉系細胞が真皮乳頭細胞である、請求項53〜62のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６４】
嚢胞をさらに含む、請求項53〜63のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６５】
嚢胞が真皮乳頭細胞を含む、請求項64記載の細胞構築物。
【請求項６６】
上皮細胞が皮膚上皮細胞である、請求項53〜65のいずれか一項記載の細胞構築物。
【請求項６７】
皮膚上皮細胞がケラチノサイトである、請求項66記載の細胞構築物。
【請求項６８】
間葉系細胞および上皮細胞がヒト細胞である、請求項53〜67のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
請求項53〜68のいずれか一項記載の細胞構築物の少なくとも1つを、個体の皮膚内に植え込む工程を含む、個体における毛髪回復の方法。
【請求項７０】
皮膚が頭皮である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
植え込みが手動である、請求項69または70記載の方法。
【請求項７２】
植え込みが自動である、請求項69または70記載の方法。
【請求項７３】
間葉系細胞および上皮細胞を含む組成物を個体の皮膚内に植え込む工程を含む、個体における毛髪回復の方法。
【請求項７４】
組成物が、皮膚内への針の挿入によって植え込まれる、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
針が、少なくとも2種の異なる細胞型のための少なくとも2種の異なるインプットの共通軸の周囲に同心流を提供する2種以上の別々の材料経路を有する同軸デバイスであり、同軸針のコアから間葉系細胞が押し出され、マントル層から上皮細胞が押し出される、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
皮膚が頭皮である、請求項73〜75のいずれか一項記載の方法。
【請求項７７】
植え込みが手動である、請求項73〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
植え込みが自動である、請求項73〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
複数のヒト細胞を含む第1のバイオインクおよび第1のアウトレットを含む、第1のディスペンサ；
複数のヒト細胞を含む第2のバイオインクおよび第2のアウトレットを含む、第2のディスペンサ；
第1のモジュール、第2のモジュール、および共通のアウトレットを含む、共通のディスペンスモジュール
を含み、
第1のモジュールが第1のディスペンサと流体連通しており、第1のモジュールが第1のインレット、第1のボディ、および第1のディスペンスチップを含み；
第2のモジュールが第2のディスペンサと流体連通しており、第2のモジュールが第2のインレット、第2のボディ、および第2のディスペンスチップを含み；かつ
共通のアウトレットが第1のディスペンスチップおよび第2のディスペンスチップを含み、第1のディスペンスチップが第2のディスペンスチップと実質的に平行しており、第1のディスペンスチップが第1のバイオインクの少なくとも一部分を沈着させるためのものであり、第2のディスペンスチップが第2のバイオインクの少なくとも一部分を沈着させるためのものである、
バイオプリンターシステムと共に使用するための分配システム。
【請求項８０】
第1のモジュールおよび第2のモジュールが対称的な配置を形成する、請求項79記載のシステム。
【請求項８１】
受容面をさらに含む、請求項79〜80のいずれか一項記載のシステム。
【請求項８２】
受容面が半固体材料を含む、請求項81記載のシステム。
【請求項８３】
半固体材料が、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するハイドロゲルを含む、請求項82記載のシステム。
【請求項８４】
半固体材料が細胞構築物である、請求項82記載のシステム。
【請求項８５】
第2のバイオインクが、第1のバイオインクと異なるヒト細胞の組成を有する、請求項79〜84のいずれか一項記載のシステム。
【請求項８６】
第1のバイオインクが、第2のバイオインクに存在しない少なくとも1種の細胞型を含む、請求項85記載のシステム。
【請求項８７】
第1のバイオインクが間葉系細胞を含む、請求項86記載のシステム。
【請求項８８】
間葉系細胞が真皮乳頭細胞である、請求項87記載のシステム。
【請求項８９】
第2のバイオインクが上皮細胞を含む、請求項79〜88のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９０】
上皮細胞が皮膚上皮細胞である、請求項89記載のシステム。
【請求項９１】
皮膚上皮細胞がケラチノサイトである、請求項90記載のシステム。
【請求項９２】
第1のバイオインクがゲルをさらに含む、請求項79〜91のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９３】
ゲルがハイドロゲルである、請求項92記載のシステム。
【請求項９４】
第1のモジュールおよび第2のモジュールが、それぞれ第1のバイオインクおよび第2のバイオインクを吸引することができる、請求項79〜93のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９５】
第1のディスペンサおよび第2のディスペンサが、それぞれ第1のバイオインクおよび第2のバイオインクを吸引することができる、請求項79〜94のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９６】
第1のディスペンサが第2のディスペンサと実質的に平行している、請求項79〜95のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９７】
第1のディスペンサが第1のモジュールに取り付けられており、第2のディスペンサが第2のモジュールに取り付けられている、請求項79〜96のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９８】
第1のディスペンサが第1のモジュールから分離可能な単位であり、第2のディスペンサが第2のモジュールから分離可能な単位である、請求項79〜97のいずれか一項記載のシステム。
【請求項９９】
第1のディスペンサおよび第2のディスペンサが押し出しによるディスペンサである、請求項79〜98のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１００】
第1のディスペンサおよび第2のディスペンサが空気圧駆動式ディスペンサである、請求項79〜99のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１０１】
共通のアウトレットを半固体材料の中へ第1の所定の距離だけ降下させる工程であって、共通のアウトレットが第1のディスペンスチップおよび第2のディスペンスチップを含み、共通のアウトレットが半固体材料の中へ降下する際、共通のアウトレットが、半固体材料の中へ降下した共通のアウトレットの領域と等しい半固体材料の領域に取って代わる、工程；
第1のディスペンスチップを使用して、所定の量の第1のバイオインクを半固体材料内に沈着させる工程であって、第1のバイオインクが複数のヒト細胞を含み、共通のアウトレットが第1の所定の距離だけ上昇する間に沈着が起こる、工程；ならびに
第2のディスペンスチップを使用して、所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる工程であって、第2のバイオインクが複数のヒト細胞を含み、共通のアウトレットが第2の所定の距離だけ上昇する間に沈着が起こる、工程
を含み、分配された所定の量の第1のバイオインクおよび分配された所定の量の第2のバイオインクが半固体材料内で細胞構築物を形成する、
細胞構築物を作製する方法。
【請求項１０２】
所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる前に、所定の量の第1のバイオインクを第1のディスペンスチップを使用して吸引する工程をさらに含む、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させた後に、所定の量の第2のバイオインクを第2のディスペンスチップを使用して吸引する工程をさらに含む、請求項101〜102のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる前に、所定の時間、共通のアウトレットのいかなる作動も一時停止する工程をさらに含む、請求項101〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させた後に、所定の時間、共通のアウトレットのいかなる作動も一時停止する工程をさらに含む、請求項101〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
所定の量の第1のバイオインクの分配の前に、共通のアウトレットを半固体材料内で所定の長さだけ上昇させる工程をさらに含む、請求項101〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
所定の量の第2のバイオインクの分配の前に、共通のアウトレットを所定の長さだけ水平方向に移動させる工程をさらに含む、請求項101〜106のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
所定の量の第2のバイオインクの分配の後に、共通のアウトレットを所定の長さだけ水平方向に移動させる工程；および
共通のアウトレットを半固体材料の外へ垂直方向に移動させる工程
をさらに含む、請求項101〜107のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０９】
請求項101の工程を繰り返す工程；および
所定の量の第1のバイオインクの2回目の分配の前に、第2のバイオインクを第2のディスペンスチップから吸引して第2のモジュールへ戻す工程
をさらに含む、請求項101〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
半固体材料がハイドロゲルである、請求項101〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
半固体材料がアルギン酸である、請求項101〜109のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
半固体材料が細胞構築物である、請求項101〜109のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１３】
第1のバイオインクが、第2のバイオインクと異なるヒト細胞の組成を有する、請求項101〜112のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
第1のバイオインクが、第2のバイオインクに存在しない少なくとも1種の細胞型を含む、請求項113記載の方法。
【請求項１１５】
第1のバイオインクが間葉系細胞を含む、請求項101〜114のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１６】
間葉系細胞が真皮乳頭細胞である、請求項115記載の方法。
【請求項１１７】
第2のバイオインクが上皮細胞を含む、請求項101〜116のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１８】
上皮細胞が皮膚上皮細胞である、請求項117記載の方法。
【請求項１１９】
皮膚上皮細胞がケラチノサイトである、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
第1のディスペンスチップが第2のディスペンスチップと実質的に平行している、請求項101〜119のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２１】
第1のディスペンサおよび第2のディスペンサが押し出しによるディスペンサである、請求項101〜120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２２】
第1のディスペンサおよび第2のディスペンサが空気圧駆動式ディスペンサである、請求項101〜120のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２３】
第1のバイオインクの所定の量がおよそ0.5〜1.0マイクロリットル（μL）である、請求項101〜122のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２４】
第2のバイオインクの所定の量がおよそ2.0〜3.0マイクロリットル（μL）である、請求項101〜123のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２５】
分配された第1のバイオインクがおよそ0.5〜1.0ミリメートルの長さを有する実質的な直線を形成する、請求項101〜124のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２６】
分配された第2のバイオインクがおよそ2.5〜3.0ミリメートルの長さを有する実質的な直線を形成する、請求項101〜125のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２７】
一時停止の所定の時間がおよそ5〜15秒である、請求項104〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２８】
第1の上昇工程において、所定の上昇の距離がおよそ1.0〜2.0ミリメートル（mm）である、請求項101〜127のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２９】
吸引される第1のバイオインクの所定の量がおよそ1.0〜1.5マイクロリットル（μL）である、請求項102記載の方法。
【請求項１３０】
吸引される第2のバイオインクの所定の量がおよそ2.0〜3.5マイクロリットル（μL）である、請求項103記載の方法。
【請求項１３１】
吸引される第2のバイオインクの所定の量がおよそ1.0〜1.5マイクロリットル（μL）である、請求項109記載の方法。
【請求項１３２】
請求項101の全工程がおよそ75〜120秒で実施される、請求項101記載の方法。
【請求項１３３】
水平方向の所定の長さがおよそ0.1〜0.5ミリメートル（mm）である、請求項107記載の方法。
【請求項１３４】
第1の上昇工程において、第1の所定の距離が半固体材料の最大の深さとおよそ等しい、請求項101記載の方法。
【請求項１３５】
共通のアウトレットによる沈着の際に1種または複数種のバイオインクを沈着させることによって、共通のアウトレットが上昇する間に勾配を作出する工程をさらに含む、請求項101〜134のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３６】
勾配が1種または複数種のバイオインクの中の1種または複数種の細胞型の異なる細胞濃度に基づく、請求項135記載の方法。
【請求項１３７】
勾配が1種または複数種のバイオインクの中の異なる細胞型に基づく、請求項135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３８】
勾配が、1種または複数種のバイオインクの中の異なる細胞型に基づき、かつ1種または複数種のバイオインクの中の1種または複数種の細胞型の異なる細胞濃度に基づく、請求項135のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３９】
共通のアウトレットがおよそ0.4〜2.0ミリメートル（mm）の直径を含む、請求項79〜100のいずれか一項記載のシステム。
【請求項１４０】
共通のアウトレットがおよそ1.0ミリメートルの直径を含む、請求項139記載のシステム。
【請求項１４１】
細胞構築物がヒト組織構築物である、請求項84記載のシステム。
【請求項１４２】
細胞構築物がヒト組織構築物である、請求項79記載の方法。
【請求項１４３】
細胞構築物がヒト組織構築物である、請求項90記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、毛髪移植のための組成物および方法の領域にある。具体的には、本発明は、間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物を含む組成物を提供する。本発明は、細胞構築物を作製する方法、毛髪回復の方法、およびキットも提供する。本発明は、パラレルバイオプリンティングシステム、ならびに間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物のような細胞構築物を、パラレルバイオプリンティングシステムを使用して作製する方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
現代の毛髪移植は1950年代に始まり、当時は、4mmのパンチを使用して毛包が採取されていた。移植片の生存を増強し、移植された毛髪をより天然に見せるため、パンチサイズは徐々に縮小された。次いで、1990年代初期には、マイクログラフト（マルチブレードナイフで採取された多数の小さい移植片の使用）が毛髪移植の標準になった。次いで、収率を最大化し、ドナー毛嚢に対する傷害を最小化するため、パンチ採取は廃止され、ドナーストリップ切除が選択されるようになった。シングルストリップ採取の重大な欠点は、結果として生じるドナー瘢痕であった。そのような瘢痕は、ベリーショートの髪型を選んだ患者、または拡大した瘢痕を伴って治癒した患者において、美容上の問題となった。シングルストリップ採取は、一次閉鎖が困難な硬く張っている頭皮を有する患者においても問題があった。Rassman et al.,Dermatol.Surg.25:720-727(2002)（非特許文献1）を参照すること。
【０００３】
毛包のシングルストリップ採取の欠点を克服する試みにおいて、Rassman et al.(2002)（非特許文献1）は、極めて小さいパンチ切開を通して個々の毛包単位（FU）をドナーから直接取り出す毛包単位抽出（FUE）を開発した。FUEには、以下のものを含む、多数の重大な欠点が存在する。（1）ドナーエリアの傷害（FUの切除は、従来のストリップ採取と比較して、切開の全長の著しい増加を伴った）、（2）美容的要因（抽出に適したFUを相当数見出すため、広範囲のドナー区域をFUEに備えて短く刈らなければならず、それが「重大な術後の美容的問題」を与えた）、（3）毛包の傷害（従来の採取で予想されるより多くのFUが傷害を受けた）、（4）毛包の方向の歪み（小さいドナー部位は、治癒する時に、隣接したFUの毛髪の方向または角度を歪ませる瘢痕を作出した）、（5）感染リスクの増加（毛包方向の歪みを回避するため、1日または数日の間隔で追加のFUE手技を行った場合、ドナーエリアに細菌性病原体が存在する可能性がほぼ確実に高まった）、および（6）手術時間の増加（FUEは従来の採取よりはるかに多くの時間を消費した）。Unger,W.,"Commentary,"Dermatol.Surg.25:727-728(2002)（非特許文献2）を参照すること。
【０００４】
FUEの代替法は、ヒト毛包のデノボエンジニアリングである。過去20〜30年にわたる研究は、毛髪形成に関与する決定的な細胞が、真皮乳頭細胞を含む間葉系集団およびその上層の上皮ケラチノサイトであることを突き止めた。その後の研究は、毛鞘および毛幹を形成するようケラチノサイトを誘導するためには、真皮乳頭細胞が厳密に必要とされることを確立した。初期の再構築実験は、齧歯類細胞を用いて行われたが、比較可能なヒト細胞が試験された時、毛髪成長の成功には直接至らなかった。これは、毛髪形成における種特異的な違いを強調する。ヒト真皮乳頭細胞の3Dスフェロイドへの凝集が、細胞内の完全な真皮乳頭遺伝子発現サインを部分的に回復し、それによって、関連する毛髪誘導特性が回復されることが見出された。スフェロイド培養の使用は必要であると見なされたが、7種の細胞株のうちの2種は、レシピエント皮膚において新毛を促進することができず、成長した毛包は小さく、しばしば、皮膚表面外にまで伸びる毛髪線維を生じることができなかった。Higgins et al,PNAS 770:19679-88(2013)（非特許文献3）。
【０００５】
従って、以前の欠点を克服する、毛包のデノボ生成の新たな方法が、当技術分野において必要とされている。本発明は、これらの欠点を克服し、移植および毛髪喪失の処置のためのFUのほぼ無限の供給を提供する。本発明は、パラレルバイオプリンティングシステムおよび細胞構築物を作製するためにパラレルバイオプリンティングシステムを使用する対応する方法をさらに提供する。プリントされた後に本質的に固定されるサーモプラスチックのような従来の三次元印刷材料とは異なり、バイオインクは、流体力学的性質を有し、従って、バイオプリンティング後に流動する傾向を有する。バイオインクの動的性質に対処するためのアプローチは、半固体材料のような支持材料にバイオプリントすることである。支持材料は、バイオプリントされたバイオインクの流動を制限することができる。その結果として、通常はバイオプリンティング後にその形状を保持するための完全性を欠く、薄い垂直な構造が、可能になり得る。しかしながら、このアプローチは、連続的または平行な構成で隣接したラインセグメントのように、2種の別々のバイオインクのような2種の材料を、区別してバイオプリントしなければならない時に、技術的に問題となる。例えば、第2のディスペンサおよび/または分配された第2のバイオインクの動きは、第1のディスペンサによって分配された第1のバイオインクを、直接妨害するか、または支持材料の妨害を介して間接的に妨害する可能性がある。従って、この技術的問題の解決策は、実質的に平行している2個のディスペンスチップと共に、共通のアウトレットを有する、パラレル分配システムを有するバイオプリンタを開発することである。
【０００６】
平面にバイオプリントする時ですら、支持材料なしでは、隣接した2種の別々のバイオインクによって形状を作製する能力は、それぞれのバイオインクの流動挙動によって損なわれ得る。第1の分配されたバイオインクが、第2の分配されたバイオインクの目標区域に流入した場合、実現されるバイオプリント構造は実質的に逸脱する可能性がある。本発明のパラレルバイオプリンティングシステムおよび対応する方法は、実質的に平行な2個の別々のディスペンスチップからの2種の別々のバイオインクの沈着を可能にするため、それによって、この技術的問題は解決される。これは、バイオインクの流動学的特性に関連した前記の複雑化を解決することによって、複数の別々のバイオインクの区別された沈着および/またはパターン形成を容易にする。具体的には、本発明は、第1のバイオインクの沈着後の流動が所望のパターンを損なう前に、かつ/または2種以上の異なるバイオインクを沈着させることができる1個の個々のディスペンサに、支持材料内の動きを制限することによって、複数の別々のバイオインクの沈着が所望のパターンを達成することを可能にする。
【０００７】
もう一つの重要な技術的課題は、バイオインクの流体力学である。流体抵抗性は、流路長と共に増加する。バイオインクの生体材料構成成分の価値のため、理想的には、デッドボリュームが最小化されるべきである。デッドボリュームは、流体チャンネルの直径を最小化することによって最小化され得る。流体抵抗性は、流体チャンネルの直径が減少するにつれ増加する。バイオインクは、しばしば、非ニュートン性であり、即ち、粘度が一定でなく、適用された力によって極めて変動する。この可変性の粘度は、バイオプリンティング過程の複雑さを増加させ、バイオインクの調節された分配を技術的課題にする。従って、バイオインクの非ニュートン特性とカップリングした、本質的に高い流体抵抗性は、複雑化を与える。具体的には、材料のディスペンサからの流出が始まる時間および/または止まる時間は、それぞれ、ディスペンサに力が適用される時間および/または除去される時間と同一でない。これは、複数の別々のバイオインクの高分解能の区別されたパターン形成を容易にするという目的をディスペンサが達成することを直接阻害する。例えば、第2のバイオインクが第2のディスペンスチップから流出し始める時に、第1のバイオインクが第1のディスペンスチップからまだ流出中であれば、実現される構造は所望の構造から逸脱するであろう。
【０００８】
本明細書中に記載されたパラレルバイオプリンティングシステムおよび方法の目的は、バイオインクの流動学的特性に関連した前記の技術的課題を解決することによって、複数の別々のバイオインクの区別された沈着および/またはパターン形成を容易にすることである。具体的には、本発明は、材料の沈着後の流動が所望のパターンを損なう前に、2種以上の異なるバイオインクを沈着させることができる1個の個々のディスペンサに、支持材料内の動きを制限することによって、所望の構造および/またはパターンを達成するための複数の別々のバイオインクの同時沈着を可能にする。前記のバイオインクの流体力学に関する技術的課題を解決するため、開示されたパラレルバイオプリンティングシステムは、バイオインクのような生体材料の流動を止めるための、吸引工程のような反対の力の適用を可能にする。さらに、開示されたパラレルバイオプリンティングシステムは、パラレルバイオプリンティングシステムの一時的な調節の復帰を可能にし、第1の分配されたバイオインクによって負の影響を受けることなく、その後のバイオインクを沈着させることを可能にする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Rassman et al.,Dermatol.Surg.25:720-727(2002)
【非特許文献２】Unger,W.,"Commentary,"Dermatol.Surg.25:727-728(2002)
【非特許文献３】Higgins et al,PNAS 770:19679-88(2013)
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物を含む複数のチャンネルを含むハイドロゲルを含む組成物を提供する。一つの態様において、ハイドロゲルは、コラーゲン、変性コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸もしくはその塩、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、またはそれらの組み合わせである。ある種の態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルは、少なくとも1種の追加の細胞型をさらに含む。他の態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルの中の少なくとも1種の追加の細胞型は、皮膚線維芽細胞、内皮細胞、前脂肪細胞、免疫細胞、メラノサイト、または幹細胞である。他の態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルは、少なくとも1種の毛包成熟因子を含む。他の態様において、少なくとも1種の毛包成熟因子は、線維芽細胞増殖因子（FGF）、Wntアゴニスト、骨形成タンパク質（BMP）、またはそれらの組み合わせである。他の態様において、FGFは、FGF7、FGF9、FG10、またはそれらの組み合わせである。他の態様において、Wntアゴニストは、CHIR99021、LiCl、SB-216763、またはCAS 853220-52-7である。他の態様において、BMPは、BMP2、BMP4、またはBMP6である。他の態様において、細胞構築物は、メラノサイトをさらに含む。他の態様において、細胞構築物は、実質的に直線状である。他の態様において、細胞構築物は、曲線状である。他の態様において、細胞構築物の表面は、不規則である。他の態様において、間葉系細胞は、細胞構築物の一方の末端に区分されており、上皮細胞は、細胞構築物の他方の末端に区分されている。他の態様において、細胞構築物は、長さ50〜10,000μmおよび直径50〜2000μmである。他の態様において、細胞構築物は、長さ4〜10mmおよび直径50〜750μmである。他の態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、10:1〜1:10である。他の態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、1:2〜1:1である。他の態様において、間葉系細胞は、真皮乳頭細胞である。他の態様において、細胞構築物は、嚢胞をさらに含む。他の態様において、嚢胞は、真皮乳頭細胞を含む。他の態様において、上皮細胞は、皮膚上皮細胞である。他の態様において、皮膚上皮細胞は、ケラチノサイトである。他の態様において、間葉系細胞および上皮細胞は、ヒト細胞である。
【００１１】
ハイドロゲルの体積は、細胞構築物の数に依って、300μl〜50mlまたはそれ以上の範囲であり得る。
【００１２】
本発明は、本発明の組成物とキットの使用説明書とを含むキットをさらに提供する。一つの態様において、キットは、細胞構築物を植え込むための器具をさらに含む。
【００１３】
本発明は、間葉系細胞および上皮細胞のハイドロゲル内への沈着を含む、本発明の組成物を作製する方法をさらに提供する。一つの態様において、間葉系細胞および上皮細胞の混合物を、ハイドロゲル内への針の挿入、ならびにディスペンスチップのような針の先端からの間葉系細胞および上皮細胞の押し出しと同時の針の引き抜きによって、ハイドロゲル内に沈着させる。針の先端および「ディスペンスチップ」は、本開示において交換可能に使用される。他の態様において、間葉系細胞および上皮細胞を、ハイドロゲル内への1本または複数本の針の挿入、ならびに針の先端からの間葉系細胞および上皮細胞の押し出しと同時の針の引き抜きによって、ハイドロゲル内に沈着させる。他の態様において、間葉系細胞は、針の先端に区分される。他の態様において、間葉系細胞を針の先端から沈着させ、次いで上皮細胞を針から沈着させて、チャンネルの下端に間葉系細胞を有しチャンネルの上端に上皮細胞を有する区分された細胞構築物を提供する。他の態様において、細胞の沈着の前に、最初に上皮細胞が針に充填され、次いで間葉系細胞が針の先端に充填される。他の態様において、針は、少なくとも2種の異なる細胞型のための少なくとも2種の異なるインプットの同心流を提供する、コアおよび少なくとも1個のマントル層を有する多軸デバイスであり、コアから間葉系細胞が押し出され、マントル層から上皮細胞が押し出される。他の態様において、針のコアから間葉系細胞を沈着させ、次いで針のマントル層から上皮細胞を沈着させて、チャンネルの下端に間葉系細胞を有しチャンネルの上端に上皮細胞を有する区分された細胞構築物を提供する。他の態様において、間葉系細胞および上皮細胞を、押し出し化合物をさらに含む1種または複数種の組成物の一部として沈着させる。他の態様において、押し出し化合物は、アルギン酸、ハイドロゲル、コラーゲン、Novogel（登録商標）、Matrigel（登録商標）、細胞外マトリックス成分、または水溶性架橋性生分解性ポリマーである。他の態様において、方法は、細胞構築物を成熟させる工程をさらに含む。一つの態様において、細胞構築物を、1〜42日間成熟させる。他の態様において、細胞構築物を、7〜21日間成熟させる。他の態様において、方法は、細胞構築物をハイドロゲルから取り出す工程をさらに含む。他の態様において、沈着は、少なくとも1本の針と、針と流体連通した1または複数のリザーバーであって、間葉系細胞、上皮細胞、またはそれらの混合物を含む1または複数のリザーバーと、少なくとも1本の針の内容物を押し出すための手段と、ハイドロゲルの表面に対して針を位置付ける作動手段とを含む自動デバイスによって制御される。他の態様において、自動デバイスは、複数の構築物をハイドロゲルに沈着させる。他の態様において、自動デバイスは、少なくとも1本の針の内容物を押し出すための手段と通信接続されたコンピュータプロセッサを含む。他の態様において、間葉系細胞および上皮細胞は、ヒト細胞である。他の態様において、上皮細胞を、スフェロイドとして沈着させない。
【００１４】
本発明は、間葉系細胞および上皮細胞を含む円柱形の細胞構築物をさらに提供する。一つの態様において、細胞構築物は、メラノサイトをさらに含む。他の態様において、細胞構築物は、実質的に直線状である。他の態様において、細胞構築物は、曲線状である。他の態様において、細胞構築物の表面は、不規則である。他の態様において、間葉系細胞は、細胞構築物の一方の末端に区分されており、上皮細胞は、細胞構築物の他方の末端に区分されている。他の態様において、細胞構築物は、長さ50〜10,000μmおよび直径50〜2000μmである。他の態様において、細胞構築物は、長さ4〜10mmおよび直径50〜750μmである。他の態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、10:1〜1:10である。他の態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、1:2〜1:1である。他の態様において、間葉系細胞は、真皮乳頭細胞である。他の態様において、細胞構築物は、嚢胞をさらに含む。他の態様において、嚢胞は、真皮乳頭細胞を含む。他の態様において、上皮細胞は、皮膚上皮細胞である。他の態様において、皮膚上皮細胞は、ケラチノサイトである。他の態様において、間葉系細胞および上皮細胞は、ヒト細胞である。
【００１５】
本発明は、本明細書中に記載された細胞構築物の少なくとも1つを、個体の皮膚内に植え込む工程を含む、個体における毛髪回復の方法をさらに提供する。一つの態様において、皮膚は、頭皮である。他の態様において、植え込みは、手動である。他の態様において、植え込みは、自動である。
【００１６】
本発明は、間葉系細胞および上皮細胞を含む組成物を個体の皮膚内に植え込む工程を含む、個体における毛髪回復の方法をさらに提供する。一つの態様において、組成物は、皮膚内への針の挿入によって植え込まれる。もう一つの態様において、針は、少なくとも2種の異なる細胞型のための少なくとも2種の異なるインプットの共通軸の周囲に同心流を提供する2種以上の別々の材料経路を有する同軸デバイスであり、同軸針のコアから間葉系細胞が押し出され、マントル層から上皮細胞が押し出される。他の態様において、皮膚は、頭皮である。他の態様において、植え込みは、手動である。他の態様において、植え込みは、自動である。
【００１７】
複数のヒト細胞を含む第1のバイオインクおよび第1のアウトレットを含む、第1のディスペンサ；複数のヒト細胞を含む第2のバイオインクおよび第2のアウトレットを含む、第2のディスペンサ；第1のモジュール、第2のモジュール、および共通のアウトレットを含む、共通のディスペンスモジュールを含む、パラレルバイオプリンティングシステムであって、第1のモジュールが第1のディスペンサと流体連通しており、第1のモジュールが第1のインレット、第1のボディ、および第1のディスペンスチップを含み；第2のモジュールが第2のディスペンサと流体連通しており、第2のモジュールが第2のインレット、第2のボディ、および第2のディスペンスチップを含み；共通のアウトレットが第1のディスペンスチップおよび第2のディスペンスチップを含み、第1のディスペンスチップが第2のディスペンスチップと実質的に平行しており、第1のディスペンスチップが第1のバイオインクの少なくとも一部分を沈着させるためのものであり、第2のディスペンスチップが第2のバイオインクの少なくとも一部分を沈着させるためのものである、パラレルバイオプリンティングシステムも開示される。
【００１８】
共通のアウトレットを半固体材料の中へ第1の所定の距離だけ降下させる工程であって、共通のアウトレットが第1のディスペンスチップおよび第2のディスペンスチップを含み、第1のディスペンスチップが第2のディスペンスチップと実質的に平行しており、共通のアウトレットが半固体材料の中へ降下する際、共通のアウトレットが、半固体材料の中へ降下した共通のアウトレットの領域と等しい半固体材料の領域に取って代わる、工程；第1のディスペンスチップを使用して、所定の量の第1のバイオインクを半固体材料内に沈着させる工程であって、第1のバイオインクが複数のヒト細胞を含み、共通のアウトレットが第1の所定の距離だけ上昇する間に沈着が起こる、工程；ならびに第2のディスペンスチップを使用して、所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる工程であって、第2のバイオインクが複数のヒト細胞を含み、共通のアウトレットが第2の所定の距離だけ上昇する間に沈着が起こる、工程：を含む、細胞構築物を作製する方法であって、分配された所定の量の第1のバイオインクおよび分配された所定の量の第2のバイオインクが半固体材料内で細胞構築物を形成する方法が、さらに開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1A〜1Bは、毛包オルガノイドの特徴決定を示す。図1Aは、24時間後の層構造を示す毛包オルガノイドの顕微鏡写真を示す。図1Bは、ヒト真皮乳頭（HHDP）細胞の2D培養物における遺伝子の発現を、毛包オルガノイドにおいて発現された遺伝子の発現と比較する2種の棒グラフである。毛包オルガノイドは、2D HHDP培養に関連した遺伝子の抑制、およびネイティブの毛包において見出される遺伝子発現の誘導を示した。
【図２】図2A〜2Fは、Higgins et al.,PNAS 110:19679-88(2013)によって報告された、5日間培養されたHHDP細胞（図2E）および6週間培養されたHHDP細胞（図2F）と比較した、14日目の嚢胞を示す培養細胞の顕微鏡写真（図2A〜2D）を示す。オルガノイドは、80:20 HHDP:HEKから作製された。
【図３Ａ】図3Aは、バイオプリントされた全層皮膚へのHHDP細胞の植え込みからの結果を示す。
【図３Ｂ】図3B〜3Eは、バイオプリントされた真皮乳頭の、周囲の皮膚支持体との凝集物（図3B）、ケラチノサイトオーバーレイを含むもの（図3C）、および7日間の培養後（図3D）を示す。図3Eは、バイオプリントされた皮膚へプリントされた真皮乳頭の顕微鏡写真である。
【図３Ｃ】図3B〜3Eは、バイオプリントされた真皮乳頭の、周囲の皮膚支持体との凝集物（図3B）、ケラチノサイトオーバーレイを含むもの（図3C）、および7日間の培養後（図3D）を示す。図3Eは、バイオプリントされた皮膚へプリントされた真皮乳頭の顕微鏡写真である。
【図３Ｄ】図3B〜3Eは、バイオプリントされた真皮乳頭の、周囲の皮膚支持体との凝集物（図3B）、ケラチノサイトオーバーレイを含むもの（図3C）、および7日間の培養後（図3D）を示す。図3Eは、バイオプリントされた皮膚へプリントされた真皮乳頭の顕微鏡写真である。
【図３Ｅ】図3B〜3Eは、バイオプリントされた真皮乳頭の、周囲の皮膚支持体との凝集物（図3B）、ケラチノサイトオーバーレイを含むもの（図3C）、および7日間の培養後（図3D）を示す。図3Eは、バイオプリントされた皮膚へプリントされた真皮乳頭の顕微鏡写真である。
【図３Ｆ】図3F〜3Hは、プリントされたオルガノイドの染色を示す。オルガノイドの劇的なインビボ様リモデリングは存在せず、共通の失敗モードは、1週間以内のオルガノイドの凝集であった。
【図３Ｇ】図3F〜3Hは、プリントされたオルガノイドの染色を示す。オルガノイドの劇的なインビボ様リモデリングは存在せず、共通の失敗モードは、1週間以内のオルガノイドの凝集であった。
【図３Ｈ】図3F〜3Hは、プリントされたオルガノイドの染色を示す。オルガノイドの劇的なインビボ様リモデリングは存在せず、共通の失敗モードは、1週間以内のオルガノイドの凝集であった。
【図４】間葉系細胞および上皮細胞を含む組織構築物を作製する方法を示す模式図である。支持ゲル（401）は、不活性の非細胞接着性ハイドロゲル（例えば、Novagel（登録商標）、アルギン酸、またはヒアルロン酸）である。細胞は、100％上皮細胞および間葉系細胞（70:30比）を含み、チャンネル（403）を与えるため、複数本の針（402）（例えば、500μm、ベベル30°、30mm）によってゲル内へ挿入される。単位は、7〜21日間またはそれ以上培養される。
【図５】図5A〜5Bは、外径260μm（図5A）または515μm（図5B）のサイズの針によってハイドロゲル内へ沈着させた（混合細胞から作製された）4mm長の細胞構築物の写真を示す。これらの結果は、ハイドロゲル内に細胞のチャンネルを得るためには、針のサイズが重要であることを示す。500μmの針が最適であった。
【図６】図6A〜6Cは、様々な型のハイドロゲル組成物（図6A、ラット尾部コラーゲン（6mg/ml）； 図6B、ゼラチン（8％）； 図6C、ラミニン/フィブロネクチン（15μg/ml±12.5））の、チャンネル内の細胞構築物の成熟および癒合に対する効果を示す写真である。これらの結果は、ハイドロゲルの選択が細胞構築物の成熟および癒合性に対して明白な効果を及ぼしたこと、ならびに細胞外マトリックス（ECM）の添加が沈着を有意に改善しなかったことを示している。
【図７】図7A〜7Fは、ラット尾部コラーゲン内へ沈着させた時（図7A、7日培養；図7B、21日培養）、8％ゼラチン内へ沈着させた時（図7C、7日培養；図7D、21日培養）、およびラミニン/フィブロネクチン内へ沈着させた時（図7E、7日培養；図7F、21日培養）の、混合された真皮乳頭細胞およびケラチノサイトから作製された組織構築物を示す。これらの構築物は、ネイティブ毛包において見られる組織化を欠いていた。これらの結果は、ECMを含有している細胞構築物の組織化の欠如も証明する。
【図８】図8A〜8Dは、100％皮膚細胞の細胞混合物が、所望の毛包単位幾何学へバイオプリントされ、次いで、14日間（図8A）および21日間（図8B〜8D）培養された、ペーストのみのプリントの顕微鏡写真である。図8Dにおいては、ラット尾部コラーゲンが、支持ハイドロゲルではなく細胞ペーストに添加された。これらの組織構築物は、毛包に特徴的な嚢胞形成を発達させた。
【図９】図9A〜9Fは、14日間（図9A〜9C）および21日間（図9D〜9F）培養された時のBrdU+染色による嚢胞の顕微鏡写真を示す。BrdU+染色は、嚢胞内の真皮乳頭細胞の存在を示している。
【図１０】図10A〜10Fは、嚢胞における遺伝子発現が、2日、5日、および21日で迅速に変化することを示す棒グラフ（図10A〜10C）および顕微鏡写真（図10D〜10F）であり、誘導がスフェロイドと比較してより頑強であることを示唆する。
【図１１】図11A〜11Cは、アルギン酸ゲルに沈着させた細胞ペーストの写真である。アルギン酸ゲルの使用は、他のハイドロゲルと比較して、極めて滑らかな沈着をもたらした。いくつかのチャンネルは細胞のキャップを有していたが、それは、他のハイドロゲルよりはるかに低頻度であった。
【図１２】図12A〜12Bは、7日後のアルギン酸に沈着させた組織構築物の顕微鏡写真である。嚢胞が、アルギン酸ゲル内に迅速に効率的に形成された。
【図１３】図13A〜13Bは、嚢胞の分割が経時的により組織化されたことを示す、1日目（図13A）および7日目（図13B）の組織構築物の顕微鏡写真である。
【図１４】図14A〜14Dは、組織構築物内の嚢胞様構造の形成を示す、沈着後14日目の組織構築物の顕微鏡写真である。
【図１５】図15A〜15Dは、沈着後14日目にBrdU（赤）およびCK6（緑）によって染色された組織構築物の顕微鏡写真である。染色パターンは、細胞が、存続しており、組織構築物内に均一に分布していることを示している。
【図１６】15日目に、組織構築物が毛包関連遺伝子のアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。
【図１７】チャンネルの下部に真皮乳頭細胞を有し上部にケラチノサイトを有する区分された構築物を示す。
【図１８】下部に真皮乳頭細胞を有し上部にケラチノサイトを有する、アルギン酸に沈着させたチャンネルの写真である。均質な細胞混合物の良好な垂直性およびクラスタリングが得られた。
【図１９】図19A〜19Bは、2種の異なる細胞型のための2種の異なるインプットの同心流を提供する同軸針を示し、ここで、例えば、間葉系細胞がコアから押し出され、上皮細胞がマントル層から押し出される。図19Bは、30°のベベルを示す針の末端の拡大された一部分を示す。
【図２０】図20A〜20Eは、同軸針送達技術を示す。図20Aは、ハイドロゲルの上に位置付けられた、間葉系細胞（真皮乳頭細胞）がコアに、上皮細胞（ケラチノサイト）がマントル層に充填された同軸針を示す。図20Bは、針のハイドロゲル内への注入を示す。図20Cは、間葉系細胞のハイドロゲル内への注入を示す。図20Dは、針を引き抜きながらの上皮細胞の注入を示す。図20Eは、チャンネルの下部に区分された間葉系細胞およびチャンネルの上部に区分された上皮細胞を含むチャンネルを含有しているハイドロゲルの上方に引き抜かれた針を示す。
【図２１】図21A〜21Dは、チャンネルの下部に区分された間葉系細胞およびチャンネルの上部に区分された上皮細胞を含むチャンネルを与えるため、最初に間葉系細胞が針に充填され、針が上皮細胞を含有している容器の上に置かれ（図21A）、針が上皮細胞へ挿入され、上皮細胞が針へ吸引され（図21B）、次いで、針がハイドロゲルへ挿入され（図21C）、次いで、間葉系細胞および上皮細胞の注入と同時に、針がハイドロゲルから引き抜かれる（図21D）、区分されたチャンネルを提供する代替的な方法を示す。
【図２２】図22（左パネル）は、4個のポンプを含有しているバイオプリンタを使用した沈着プログラム（右パネル）による2種の異なるビーズ溶液の同軸沈着の結果を示す顕微鏡写真を示す。
【図２３】図23A〜23Bは、同軸沈着の結果を示す顕微鏡写真を示す。
【図２４Ａ】図24A〜24Cは、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティングシステムの例示的な態様を示し、図24Aおよび図24Cは側面図を示し、図24Bは底面図を示している。
【図２４Ｂ】図24A〜24Cは、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティングシステムの例示的な態様を示し、図24Aおよび図24Cは側面図を示し、図24Bは底面図を示している。
【図２４Ｃ】図24A〜24Cは、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティングシステムの例示的な態様を示し、図24Aおよび図24Cは側面図を示し、図24Bは底面図を示している。
【図２５Ａ】図25A〜25Bは、図24A〜Cに記載されたパラレルバイオプリンティングシステムの例示的な態様を使用した、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティング法の例示的な態様を示す。
【図２５Ｂ】図25A〜25Bは、図24A〜Cに記載されたパラレルバイオプリンティングシステムの例示的な態様を使用した、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティング法の例示的な態様を示す。
【図２６Ａ】図26A〜26Cは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに異なる一時停止時間および吸引工程を含む方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２６Ｂ】図26A〜26Cは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに異なる一時停止時間および吸引工程を含む方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２６Ｃ】図26A〜26Cは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに異なる一時停止時間および吸引工程を含む方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２７Ａ】図27A〜27Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに吸引工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２７Ｂ】図27A〜27Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに吸引工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２７Ｃ】図27A〜27Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに吸引工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２７Ｄ】図27A〜27Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに吸引工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２８Ａ】図28A〜28Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに上昇工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２８Ｂ】図28A〜28Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに上昇工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２８Ｃ】図28A〜28Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに上昇工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２８Ｄ】図28A〜28Dは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに上昇工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【図２９】図29A〜29Bは、パラレルバイオプリンティングシステムならびに移動工程を含む方法および含まない方法を使用して作製された細胞構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語は、全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「（a）」、「（an）」、および「（the）」には、前後関係が明白に他のことを指示しない限り、複数の指示が含まれる。本明細書中の「または」との言及には、他に明記されない限り、「および/または」が包含されるものとする。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、「組織」とは、細胞の凝集物を意味する。いくつかの態様において、組織内の細胞は、癒合または融合している。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、「バイオプリンティング（bioprinting）」、「バイオプリンティング（bio-printing）」、「バイオプリントされた（bioprinted）」、または「バイオプリントされた（bio-printed）」とは、自動または半自動のコンピュータ支援三次元プロトタイピングデバイス（例えば、バイオプリンタ）と適合性の方法論を介した、細胞（例えば、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁物、細胞濃縮物、多細胞凝集物、多細胞体等）の三次元の正確な沈着の利用を意味する。適当なバイオプリンタには、Organovo,Inc.（San Diego,CA）からのNovogen Bioprinter（登録商標）、ならびに米国特許第9,149,952号および米国公開出願第2015/0093932号、第2015/0004273号、および第2015/0037445号に記載されたものが含まれる。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、間葉系細胞とは、真皮乳頭細胞へ分化することができる多能性間質細胞、および真皮乳頭細胞自体である。間葉系細胞は、細胞外マトリックスに存在する。間葉系細胞および真皮乳頭細胞は、PromoCell GmbHおよびScienCell Research Laboratoriesから市販されている。間葉系細胞は、Sigma-Aldrich Co.,LLCから入手可能であるような市販の成長培地において培養され得る。
【００２４】
本明細書中で使用されるように、上皮細胞は、上皮に由来する細胞である。上皮細胞の一例は、皮膚の最も外側の層の約90％を形成するケラチノサイトである。上皮細胞およびケラチノサイトは、PromoCell GmbHおよびLonzaから市販されている。上皮細胞は、Sigma-Aldrich Co.,LLCから入手可能であるような市販の成長培地において培養され得る。
【００２５】
本明細書中で使用されるように、メラノサイトとは、表皮の下層および毛包に見出され得るメラニン生成細胞である。メラノサイトは、種々の位置の子供の包皮または成人の皮膚の表皮から単離され得る。一つの態様において、毛髪回復のレシピエントの天然色とマッチするよう、特定の強度/色のメラニンを生成するメラノサイトが選択される。一つの態様において、メラノサイトは、淡色を有する。もう一つの態様において、メラノサイトは、濃色を有する。メラノサイトは、PromoCell GmbH、American Type Culture Collection ATCC、およびGenlantisから市販されている。メラノサイトは、ATCC、PromoCell GmbH、Lonza、Genlantis、およびProvitroから入手可能であるような市販の成長培地において培養され得る。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、「個体」とは、ヒト、霊長類、類人猿、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマ、およびその他を含むが、これらに限定されるわけではない任意の哺乳類種の生物である。対象は、生存しているかまたは死亡している任意の哺乳類種であり得る。
【００２７】
本明細書中で使用されるように、「毛包成熟因子」とは、毛髪を成長させることができる嚢胞が作製されるよう間葉系細胞および表皮細胞の成熟を促進する因子である。毛包成熟因子の例には、線維芽細胞増殖因子（FGF）およびWntアゴニスト、BMP、BMP阻害剤、TNFアゴニストが含まれる。具体的なFGFには、FGF5、FGF7、FGF9、およびFGF10が含まれる。具体的なBMPには、BMP2、BMP4、およびBMP6が含まれる。Wntアゴニストとは、古典的Wntシグナリング経路においてGSK3（例えば、GSK3β）を阻害する分子である。Wntアゴニストの非限定的な例には、CHIR99021、LiCl、SB-216763、およびCAS 853220-52-7が含まれる。他のWntアゴニストは、Santa Cruz BiotechnologyおよびR&D Systemsのような供給元から市販されている。
【００２８】
本明細書中で使用されるように、「約」または「およそ」とは、記述された値の±10％を意味する。例えば、約10には、9〜11が含まれる。あるいは、およそ10には、9〜11が含まれる。
【００２９】
一つの態様において、細胞構築物は、区分されている。「区分された」とは、構築物が、区別された濃度の間葉系細胞および上皮細胞を含む一つまたは複数の領域を含有していることを意味する。一つの態様において、区分された構築物は、間葉系細胞のみを含有している一つの領域、および上皮細胞のみを含むもう一つの領域を含む。この態様において、他の細胞型が任意でそれらの領域に存在してもよいことが理解される。もう一つの態様において、区分された構築物は、細胞の大多数が間葉系細胞である一つの領域および細胞の大多数が上皮細胞であるもう一つの領域を含む。再び、この態様において、他の細胞型が任意でそれらの領域に存在してもよいことが理解される。
【００３０】
ハイドロゲルには、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するものが含まれる。他の態様において、適当なハイドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる態様において、適当なハイドロゲルには、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびそのコポリマー、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせに由来するものが含まれる。様々な具体的な態様において、閉じ込め材料は、ハイドロゲル、NovoGel（商標）、アガロース、アルギン酸、ゼラチン、Matrigel（登録商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドハイドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリレート（PEG-DA）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン、絹、またはそれらの組み合わせより選択される。いくつかの態様において、ハイドロゲルは、架橋されている。架橋されたハイドロゲルは、チャンネルを破壊することなく、ディスペンスチップのような針を同一のチャンネルに繰り返し挿入することを可能にする強剛性を提供する。架橋性ハイドロゲル形成材料には、アルギン酸およびその塩のような多糖、ペプチド、ポリホスファゼン、ならびにイオン的に架橋されるポリアクリレート、ならびに温度またはpHによってそれぞれ架橋されるポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーのようなブロックポリマーが含まれる。いくつかの態様において、ハイドロゲルは、生分解性である。
【００３１】
もう一つの態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルは、増殖因子またはホルモンをさらに含む。一つの態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルは、α-MSH、β-MSH、またはγ-MSHのようなメラノサイト刺激ホルモン（MSH）を含む。
【００３２】
ハイドロゲル組成物
間葉系細胞および上皮細胞を含む細胞構築物を含む複数のチャンネルを含むハイドロゲルを含む組成物が提供される。いくつかの態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルは、皮膚線維芽細胞、内皮細胞、前脂肪細胞、免疫細胞、メラノサイト、または幹細胞のような少なくとも1種の追加の細胞型をさらに含む。有用な幹細胞の例には、Lgr5、CD34、LRC、Lgr6、Lrig1/MTS24、Blimp1、およびK15*のような異なる遺伝子/タンパク質発現またはプロモーター活性によって同定された幹細胞を含む、天然に毛包に含まれるものが含まれる。Jaks et al.,Exp.Cell Res.316:1422-1428(2010)を参照すること。一つの態様において、ハイドロゲル、細胞構築物、および/またはチャンネルは、少なくとも1種の毛包成熟因子を含む。少なくとも1種の毛包成熟因子には、線維芽細胞増殖因子（FGF）、Wntアゴニスト、BMP、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。FGFには、FGF7、FGF9、FG10、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。Wntアゴニストには、CHIR99021、LiCl、SB-216763、およびCAS 853220-52-7が含まれるが、これらに限定されるわけではない。BMPには、BMP2、BMP4、およびBMP6が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
一つの態様において、細胞構築物は、メラノサイトをさらに含む。
【００３４】
細胞構築物は、細長く、実質的に直線状であってもよいしまたは曲線状であってもよい。一つの態様において、細胞構築物の表面は、不規則である。
【００３５】
一つの態様において、間葉系細胞は、細胞構築物の一方の末端に区分され、上皮細胞は細胞構築物のもう一方の末端に区分される。もう一つの態様において、細胞構築物は、長さ50〜10,000μm、直径50〜2000μmである。もう一つの態様において、細胞構築物は、長さ4〜10mm、直径50〜750μmである。
【００３６】
一つの態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、10:1〜1:10である。もう一つの態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、1:2〜1:1である。
【００３７】
一つの態様において、間葉系細胞は、真皮乳頭細胞である。
【００３８】
一つの態様において、細胞構築物は、毛髪を生じる嚢胞を含む。もう一つの態様において、嚢胞は、真皮乳頭細胞を含む。
【００３９】
一つの態様において、上皮細胞は、皮膚上皮細胞である。もう一つの態様において、皮膚上皮細胞は、ケラチノサイトである。
【００４０】
一つの態様において、間葉系細胞および上皮細胞は、ヒト細胞である。
【００４１】
一つの態様において、ハイドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロン酸もしくはその塩、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、またはそれらの組み合わせを含む。もう一つの態様において、ハイドロゲルは、アルギン酸を含む。もう一つの態様において、ハイドロゲルは、架橋されている。アルギン酸ハイドロゲルの使用は、他のハイドロゲルと比較して極めて滑らかな沈着を与えることが発見された。アルギン酸内のいくつかのチャンネルは細胞のキャップを有していたが、キャップは他のハイドロゲルよりはるかに低頻度であった。
【００４２】
キット
細胞構築物を含むハイドロゲル組成物と、キットの維持および使用のための説明書とを含むキットも、提供される。例えば、説明書は、ハイドロゲル組成物を、例えば、4〜40℃に冷蔵しておくことを使用者に説明していてよい。もう一つの態様において、説明書は、細胞構築物をハイドロゲル組成物から取り出し、個体の皮膚下に植え込むことを使用者に説明していてよい。一つの態様において、皮膚は、個体の頭皮である。
【００４３】
一つの態様において、キットは、細胞構築物を取り出し植え込むための器具をさらに含んでいてよい。毛包の植え込みのために有用な任意の器具が提供され得る。一つの態様において、器具はピンセットである。もう一つの態様において、器具は、ハイドロゲルへ挿入され、細胞構築物の上でスライドする管である。管は、ガラス、ステンレス鋼、およびプラスチックを含む生体適合性の強剛な物質で作製されていてよい。細胞構築物の管への挿入を容易にするため、軽微な真空が管に適用され得る。次いで、管は、引き抜かれ、レシピエント区域に再配置され、皮膚下に挿入される。一つの態様において、ハイドロゲルへの挿入を容易にするため、管は末端にベベルを有する。もう一つの態様において、ベベルは、10〜45度である。もう一つの態様において、ベベルは、約30度である。もう一つの態様において、管のベベルを有する末端は、構築物を含有している管の皮膚への挿入を可能にするため、鋭い。もう一つの態様において、細胞構築物の射出は、管への正の圧力の適用によって容易にされる。もう一つの態様において、細胞構築物は、植え込みの前に濯がれる。
【００４４】
一つの態様において、キットは、細胞構築物をハイドロゲルから取り出し、個体の皮膚へ植え込むロボットデバイスを含んでいてよい。ロボットデバイスには、コンピュータスクリプトに従って、管を位置付け、細胞構築物をハイドロゲルから取り出し、細胞構築物を皮膚へ挿入するコンピュータ支援デバイスが含まれ得る。さらなる態様において、コンピュータスクリプトは、例えば、一つまたは複数のコンピュータプログラム、コンピュータアプリケーション、またはコンピュータモジュールである。キットは、細胞構築物の取り出しおよび送達のための1本または複数本の管を含んでいてよい。
【００４５】
もう一つの態様において、キットは、植え込みの前に細胞構築物と組み合わせられ得る脂肪由来間質細胞および/または幹細胞をさらに含んでいてよい。脂肪由来間質細胞および幹細胞を単離し植え込む方法は、米国公開出願第2007/0258956号に記載されている。キットは、単一の組成物または別々の組成物として、細胞構築物と共に、脂肪由来細胞および/または幹細胞を植え込むための説明書も含んでいてよい。
【００４６】
もう一つの態様において、キットは、少なくとも1種の毛包成熟因子をさらに含んでいてよい。少なくとも1種の毛包成熟因子には、線維芽細胞増殖因子（FGF）、Wntアゴニスト、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。FGFには、FGF7、FGF9、FG10、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。Wntアゴニストには、CHIR99021、LiCl、SB-216763、およびCAS 853220-52-7が含まれるが、これらに限定されるわけではない。キットは、単一の組成物または別々の組成物として、細胞構築物と共に、少なくとも1種の毛包成熟因子を植え込むための説明書も含んでいてよい。
【００４７】
ハイドロゲル組成物を作製する方法
間葉系細胞および上皮細胞のハイドロゲルへの沈着を含む、組成物を作製する方法も提供される。一つの態様において、間葉系細胞および上皮細胞の混合物を、ハイドロゲル内への1本または複数本の針の挿入、ならびにディスペンスチップのような針の先端からの間葉系細胞および上皮細胞の押し出しと同時の針の引き抜きによって、ハイドロゲル内へ沈着させる。複数本の針が利用される時、針は連続的に挿入され、例えば、間葉系細胞を含有している第1の針がハイドロゲル内へ挿入され、間葉系細胞を沈着させ、次いで、第2の針が、第1の針によって作製されたチャンネル内へ挿入され、上皮細胞を沈着させる。一つの態様において、細胞を、1種または複数種の押し出し化合物を含む組成物の一部として沈着させる。もう一つの態様において、細胞を、押し出し化合物なしで沈着させる。もう一つの態様において、間葉系細胞および上皮細胞を、ハイドロゲル内への針の挿入、ならびにディスペンスチップのような針の先端からの間葉系細胞および上皮細胞の押し出しと同時の針の引き抜きによって、ハイドロゲル内へ沈着させる。一つの態様において、間葉系細胞は、ディスペンスチップのような針の先端に区分される。もう一つの態様において、チャンネルの下端に間葉系細胞を有しチャンネルの上端に上皮細胞を有する区分された細胞構築物を提供するため、間葉系細胞をディスペンスチップのような針の先端から沈着させ、次いで、上皮細胞を針から沈着させる。もう一つの態様において、細胞の沈着の前に、最初に上皮細胞が針に充填され、次いでディスペンスチップのような針の先端に間葉系細胞が充填される。
【００４８】
一つの態様において、針は、少なくとも2種の異なる細胞型のための少なくとも2種の異なるインプットの共通軸の周囲に同心流を提供する2種以上の別々の材料経路を有する共軸デバイスであり、ここで、同軸針のコアから間葉系細胞は押し出され、マントル層から上皮細胞は押し出される。
【００４９】
図19A〜19Bは、2種の異なる細胞インプットによって供給される同軸針（5）を示す。一つの態様において、針のコアから間葉系細胞を沈着させ、次いで針のマントル層から上皮細胞を沈着させて、チャンネルの下端に間葉系細胞を有しチャンネルの上端に上皮細胞を有する区分された細胞構築物を提供する。
【００５０】
一つの態様において、間葉系細胞および上皮細胞を、押し出し化合物をさらに含む1種または複数種の組成物の一部として沈着させる。もう一つの態様において、押し出し化合物には、アルギン酸、ハイドロゲル、コラーゲン、Novogel（登録商標）、Matrigel（登録商標）、細胞外マトリックス成分、または水溶性架橋性生分解性ポリマーが含まれる。
【００５１】
一つの態様において、細胞構築物を、ハイドロゲルに沈着させた後に成熟させる。もう一つの態様において、細胞構築物を、1〜42日間成熟させる。もう一つの態様において、細胞構築物を、7〜21日間成熟させる。
【００５２】
一つの態様において、方法は、細胞構築物をハイドロゲルから取り出す工程をさらに含む。細胞構築物は、手動で取り出されてもよいしまたは自動デバイスの使用によって取り出されてもよい。もう一つの態様において、自動デバイスは、少なくとも1本の針と、針と流体連通した1または複数のリザーバーであって、間葉系細胞、上皮細胞、またはそれらの混合物を含む1または複数のリザーバーと、少なくとも1本の針の内容物を押し出すための手段と、ハイドロゲルの表面に対して針を位置付ける作動手段とを含む。針の内容物を押し出すための手段には、圧力の適用、圧縮ガスの適用、ピストンの使用、油圧システム、またはそれらの組み合わせが含まれる。もう一つの態様において、自動デバイスは、少なくとも1本の針の内容物を押し出すための手段と通信接続されたコンピュータプロセッサを含む。この態様において、コンピュータプロセッサは、ハイドロゲルへの細胞沈着のタイミングおよび量を調節する。
【００５３】
一つの態様において、針は、ベベルを有する。もう一つの態様において、針は、10〜45度のベベルを有する。もう一つの態様において、針は、約30度のベベルを有する。もう一つの態様において、針の外径は、約250μm〜約1250μmである。もう一つの態様において、針の外径は、350〜1000μmである。もう一つの態様において、針の外径は、約500μmである。もう一つの態様において、針の内径は、約150〜約1000μmである。
【００５４】
針の外径が約250μm〜約1250μmである、請求項50記載の方法。
【００５５】
一つの態様において、自動デバイスは、複数の構築物をハイドロゲルに沈着させる。もう一つの態様において、自動デバイスは、1,000〜10,000個の細胞構築物をハイドロゲルに沈着させる。
【００５６】
間葉系細胞および上皮細胞は、任意の哺乳類に由来してよい。一つの態様において、間葉系および上皮細胞は、ヒト細胞である。
【００５７】
一つの態様において、上皮細胞を、スフェロイドとして沈着させない。
【００５８】
細胞構築物
間葉系細胞および上皮細胞を含む円柱形の細胞構築物が提供される。一つの態様において、細胞構築物は、追加の細胞を含む。一つの態様において、細胞構築物は、メラノサイトをさらに含む。
【００５９】
一つの態様において、細胞構築物は、実質的に直線状である、即ち、その長さに沿って約20％を超えて厚さが逸脱しない。もう一つの態様において、細胞構築物は、曲線状である。もう一つの態様において、細胞構築物の表面は、不規則であり、例えば、凸凹、隆起、くぼみ、および/または裂け目を含む。
【００６０】
一つの態様において、間葉系細胞は、細胞構築物の一方の末端に区分され、上皮細胞は、細胞構築物のもう一方の末端に区分される。
【００６１】
一つの態様において、細胞構築物は、長さ50〜10,000μm、直径50〜2000μmである。もう一つの態様において、細胞構築物は、長さ4〜10mm、直径50〜750μmである。もう一つの態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、10:1〜1:10である。もう一つの態様において、間葉系細胞と上皮細胞との比は、1:2〜1:1である。
【００６２】
一つの態様において、間葉系細胞は、真皮乳頭細胞である。
【００６３】
一つの態様において、細胞構築物は、嚢胞をさらに含む。もう一つの態様において、嚢胞は、毛髪を成長させることができる。もう一つの態様において、嚢胞は、真皮乳頭細胞を含む。
【００６４】
一つの態様において、上皮細胞は、皮膚上皮細胞である。もう一つの態様において、皮膚上皮細胞は、ケラチノサイトである。
【００６５】
毛髪回復の方法
本明細書中に記載される少なくとも1個の細胞構築物を個体の皮膚に植え込む工程を含む、個体における毛髪回復の方法が提供される。一つの態様において、皮膚は頭皮である。
【００６６】
一つの態様において、植え込みは手動である。この態様において、細胞構築物は、例えば、ピンセットで、ハイドロゲルから引き抜かれ、任意で、ハイドロゲルを除去するために濯がれ、皮膚に作製された孔へ挿入される。孔は、メスまたはパンチで作製され得る。
【００６７】
もう一つの態様において、植え込みは自動である。この態様において、細胞構築物は、細胞構築物をハイドロゲルから取り出し、個体の皮膚に植え込むロボットデバイスによって、ハイドロゲルから引き抜かれる。ロボットデバイスは、コンピュータスクリプトに従って、管を位置付け、管への挿入によって細胞構築物をハイドロゲルから取り出し、細胞構築物を皮膚へ挿入するコンピュータ支援デバイスを含んでいてよい。さらなる態様において、コンピュータスクリプトは、例えば、一つまたは複数のコンピュータプログラム、コンピュータアプリケーション、またはコンピュータモジュールである。ロボットデバイスは、例えば、頭皮の天然の毛髪線を回復させるため、所望のパターンで細胞構築物を皮膚に送達するため、コンピュータスクリプトに従って、メスまたはパンチで皮膚に孔を作出してもよい。
【００６８】
細胞構築物をバイオプリントするためのパラレルバイオプリンティングシステム
第1のバイオインクおよび第1のアウトレットを含む第1のディスペンサであって、第1のバイオインクが複数のヒト細胞を含む、ディスペンサ；第2のバイオインクおよび第2のアウトレットを含む第2のディスペンサであって、第2のバイオインクが複数のヒト細胞を含む、ディスペンサ；第1のモジュール、第2のモジュール、および共通のアウトレットを含む共通のディスペンスモジュール：を含むパラレルバイオプリンティングシステムであって、第1のモジュールが第1のディスペンサと流体連通しており、第1のモジュールが第1のインレット、第1のボディ、および第1のディスペンスチップを含み；第2のモジュールが第2のディスペンサと流体連通しており、第2のモジュールが第2のインレット、第2のボディ、および第2のディスペンスチップを含み；共通のアウトレットが第1のディスペンスチップおよび第2のディスペンスチップを含み、第1のディスペンスチップが第2のディスペンスチップと実質的に平行しており、第1のディスペンスチップが第1のバイオインクの少なくとも一部分を沈着させるためのものであり、第2のディスペンスチップが第2のバイオインクの少なくとも一部分を沈着させるためのものであるパラレルバイオプリンティングシステムも開示される。
【００６９】
分配システムのいくつかの態様において、第1のモジュールおよび第2のモジュールは、対称的な配置を形成する。いくつかの態様において、分配システムは、受容面をさらに含む。いくつかの態様において、受容面は、半固体材料を含む。いくつかの態様において、半固体材料は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するハイドロゲルを含む。いくつかの態様において、半固体材料には、ヒト組織構築物を含むが、これに限定されるわけではない細胞構築物が含まれる。いくつかの態様において、第2のバイオインクは、第1のバイオインクと異なるヒト細胞の組成を有する。いくつかの態様において、第1のバイオインクは、第2のバイオインクに存在しない少なくとも1種の細胞型を含む。
【００７０】
いくつかの態様において、第1のバイオインクは、間葉系細胞を含む。いくつかの態様において、間葉系細胞は、真皮乳頭細胞である。いくつかの態様において、第2のバイオインクは、上皮細胞を含む。いくつかの態様において、上皮細胞は、皮膚上皮細胞である。いくつかの態様において、皮膚上皮細胞は、ケラチノサイトである。いくつかの態様において、第2のバイオインクは、ケラチノサイトおよび平滑筋細胞をさらに含む。異なる細胞型に加えて、第1および第2のバイオインクは、異なる濃度の同一の細胞型または異なる細胞型を含んでいてもよい。
【００７１】
いくつかの態様において、第1のバイオインクは、ゲルをさらに含む。いくつかの態様において、ゲルは、ハイドロゲルである。
【００７２】
いくつかの態様において、第1のモジュールおよび第2のモジュールは、それぞれ第1のバイオインクおよび第2のバイオインクを吸引することができる。いくつかの態様において、第1のディスペンサおよび第2のディスペンサは、第1のバイオインクおよび第2のバイオインクをそれぞれ吸引することができる。
【００７３】
いくつかの態様において、第1のディスペンサは、第2のディスペンサと実質的に平行している。
【００７４】
いくつかの態様において、第1のディスペンサは、第1のモジュールに取り付けられており、第2のディスペンサは、第2のモジュールに取り付けられている。いくつかの態様において、第1のディスペンサは、第1のモジュールから分離可能な単位であり、第2のディスペンサは、第2のモジュールから分離可能な単位である。
【００７５】
いくつかの態様において、第1のディスペンサおよび第2のディスペンサは、自動シリンジディスペンサまたは空気圧駆動式ディスペンサを含むが、これらに限定されるわけではない、押し出しによるディスペンサである。
【００７６】
いくつかの態様において、共通のアウトレットは、およそ0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、および2.0mmの直径を含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.4mm〜2.0mmの直径を含む。
【００７７】
細胞構築物を作製するためのパラレルバイオプリンティング法
共通のアウトレットを半固体材料の中へ第1の所定の距離だけ降下させる工程であって、共通のアウトレットが第1のディスペンスチップおよび第2のディスペンスチップを含み、第1のディスペンスチップが第2のディスペンスチップと実質的に平行しており、共通のアウトレットが半固体材料の中へ降下する際、共通のアウトレットが、半固体材料の中へ降下した共通のアウトレットの区域と等しい半固体材料の区域に取って代わる、工程；第1のディスペンスチップを使用して、所定の量の第1のバイオインクを半固体材料内に沈着させる工程であって、第1のバイオインクが複数のヒト細胞を含み、共通のアウトレットが第1の所定の距離だけ上昇する間に沈着が起こる、工程；ならびに第2のディスペンスチップを使用して、所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる工程であって、第2のバイオインクが複数のヒト細胞を含み、共通のアウトレットが第2の所定の距離だけ上昇する間に沈着が起こる、工程：を含む、細胞構築物を作製する方法であって、分配された所定の量の第1のバイオインクおよび分配された所定の量の第2のバイオインクが半固体材料内で細胞構築物を形成する方法が、さらに開示される。いくつかの態様において、前述の方法は、およそ75〜120秒で実施される。いくつかの態様において、方法は、前述の方法を1回または複数回繰り返す工程をさらに含む。いくつかの態様において、細胞構築物は、ヒト組織構築物である。
【００７８】
いくつかの態様において、方法は、所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる前に、第1のディスペンスチップを使用して、所定の量の第1のバイオインクを吸引する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させた後に、第2のディスペンスチップを使用して、所定の量の第2のバイオインクを吸引する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、所定の量の第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させる前に、所定の時間、共通のアウトレットのいかなる作動も一時停止する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、所定の量を第2のバイオインクを半固体材料内に沈着させた後に、所定の時間、共通のアウトレットのいかなる作動も一時停止する工程をさらに含む。
【００７９】
いくつかの態様において、方法は、所定の量の第1のバイオインクの分配の前に、共通のアウトレットを半固体材料内で所定の長さだけ上昇させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、所定の量の第2のバイオインクの分配の前に、共通のアウトレットを所定の長さだけ水平方向に移動させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、所定の量の第2のバイオインクの分配の後に、共通のアウトレットを所定の長さだけ水平方向に移動させる工程；および共通のアウトレットを半固体材料の外へ垂直方向に移動させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前述の方法を1回または複数回繰り返す工程をさらに含み、それは、2回目の所定の量の第1のバイオインクの分配の前に、第2のディスペンスチップから第2のバイオインクを吸引し、第2のモジュールへ戻す工程をさらに含む。
【００８０】
いくつかの態様において、半固体材料は、ハイドロゲルである。いくつかの態様において、半固体材料は、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヒアルロナン、フィブリン、アルギン酸、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するハイドロゲルを含む。いくつかの態様において、半固体材料は、ヒト組織構築物を含むが、これに限定されるわけではない細胞構築物を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、第1のバイオインクは、第2のバイオインクと異なるヒト細胞の組成を有する。いくつかの態様において、第1のバイオインクは、第2のバイオインクに存在しない少なくとも1種の細胞型を含む。
【００８２】
いくつかの態様において、第1のバイオインクは、間葉系細胞を含む。いくつかの態様において、間葉系細胞は、真皮乳頭細胞である。いくつかの態様において、第2のバイオインクは、上皮細胞を含む。いくつかの態様において、上皮細胞は、皮膚上皮細胞である。いくつかの態様において、皮膚上皮細胞は、ケラチノサイトである。いくつかの態様において、第2のバイオインクは、ケラチノサイトおよび平滑筋細胞をさらに含む。異なる細胞型に加えて、第1および第2バイオインクは、異なる濃度の同一の細胞型または異なる細胞型を含んでいてもよい。
【００８３】
いくつかの態様において、第1のディスペンサおよび第2のディスペンサは、自動シリンジディスペンサまたは空気圧駆動式ディスペンサを含むが、これらに限定されるわけではない、押し出しによるディスペンサである。
【００８４】
異なる細胞構築物は異なる構造および体積を有するため、第1のバイオインクおよび第2のバイオインクの所定の量は、任意の所望の体積であり得る。いくつかの態様において、第1のバイオインクの所定の量は、およそ0.5マイクロリットル（μL）、0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL、および1.0μLを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.5〜1.0μLである。いくつかの態様において、第2のバイオインクの所定の量は、およそ2.0マイクロリットル（μL）、2.1μL、2.2μL、2.3μL、2.4μL、2.5μL、2.6μL、2.7μL、2.8μL、2.9μL、および3.0μLを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ2.0〜3.0μLである。
【００８５】
いくつかの態様において、分配された第1のバイオインクは、およそ0.5ミリメートル（mm）、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、および1.0mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.5〜1.0mmの長さ、ならびにおよそ0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、および1.0mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.5〜1.5mmの直径を有する実質的な直線を形成する。いくつかの態様において、分配された第2のバイオインクは、およそ2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3.0mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、および3.5mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ2.5〜3.5ミリメートルの長さ、ならびにおよそ0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、および1.5mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.5〜1.5mmの直径を有する実質的な直線を形成する。他の態様において、異なる細胞構築物は異なる構造および体積を有するため、第1のバイオインクおよび第2のバイオインクは、異なる長さおよび異なる構造（即ち、実質的に直線状でない）を有していてもよい。
【００８６】
いくつかの態様において、最初に形成された細胞構築物は、およそ3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4.0mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、および4.5mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ3.0〜4.5ミリメートルの長さ、およそ0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、および1.5mmmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.5〜1.5mmの直径を有する実質的な直線を有する。他の態様において、異なる細胞構築物は、異なる構造、長さ、および体積を有するため、形成された細胞構築物は、異なる長さおよび異なる構造（即ち、実質的に直線状でない）を有していてもよい。
【００８７】
いくつかの態様において、第1の上昇工程において、所定の上昇距離は、およそ1.0ミリメートル（mm）、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、および2.0mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ1.0〜2.0mmである。異なる細胞構築物は、異なる構造および体積を有するため、第1のバイオインクおよび第2のバイオインクの所定の量は、任意の所望の体積であり得る。いくつかの態様において、吸引される第1のバイオインクの所定の量は、およそ1.0マイクロリットル（μL）、1.1μL、1.2μL、1.3μL、1.4μL、および1.5μLを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ1.0〜1.5μLである。いくつかの態様において、吸引される第2のバイオインクの所定の量は、およそ2.0マイクロリットル（μL）、2.1μL、2.3μL、2.4μL、2.5μL、2.6μL、2.7μL、2.8μL、2.9μL、および3.0μLを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ2.0〜3.0μLである。
【００８８】
いくつかの態様において、この前述の方法を1回または複数回繰り返す時、共通のアウトレットが固体材料の中へ降下する前に吸引される第2のバイオインクの所定の量は、およそ1.0マイクロリットル（μL）、1.1μL、1.2μL、1.3μL、1.4μL、および1.5μLを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ1.0〜1.5μLである。いくつかの態様において、水平の所定の長さは、およそ0.1ミリメートル（mm）、0.2mm、0.3mm、0.4mm、および0.5mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ0.1〜0.5mmである。いくつかの態様において、第1の上昇工程において、第1の所定の長さは、およそ半固体材料の最大の深さと等しく、およそ1.0ミリメートル（mm）、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、および2.0mmを含むが、これらに限定されるわけではない、およそ1.0〜2.0mmであり得る。いくつかの態様において、一時停止の所定の時間は、およそ1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒、10秒、11秒、12秒、13秒、14秒、および15秒を含むが、これらに限定されるわけではない、およそ5〜15秒である。
【００８９】
勾配を含む細胞構築物をバイオプリントするためのパラレルバイオプリンティング法
いくつかの態様において、方法は、共通のアウトレットが上昇する間にディスペンスチップを含む共通のアウトレットが沈着させる際、1種または複数種のバイオインクを沈着させることによって、勾配を作出する工程をさらに含む。いくつかの態様において、勾配は、1種または複数種のバイオインクの中の1種または複数種の細胞型の異なる細胞濃度に基づく。例えば、勾配は、最低垂直点から最高垂直点への細胞濃度の増加、あるいは最低垂直点から最高垂直点への細胞濃度の減少のような、1種または複数種の細胞型の細胞濃度の垂直方向の増加または減少を含むであろう。前記のように、勾配は、ヒト組織構築物を含む細胞構築物を含む半固体材料のような支持材料において作出され得る。1種または複数種の細胞型の異なる細胞濃度は、異なる細胞濃度を有するバイオインクを調製することによって達成され得る。例えば、第1のバイオインクが、ある細胞濃度の1種または複数種の細胞型を含んでおり、第2のバイオインクが、異なる細胞濃度の1種または複数種の細胞型を含んでいてよい。例えば、第1のバイオインクが、ある細胞濃度の間葉系細胞を含んでおり、第2のバイオインクが、異なる細胞濃度の間葉系細胞を含んでいてよい。あるいは、第1のバイオインクが、ある細胞濃度の間葉系細胞および上皮細胞の組み合わせ混合物を含んでおり、第2のバイオインクが、異なる細胞濃度の間葉系細胞および上皮細胞の組み合わせ混合物を含んでいてよい。任意で、2種以上の細胞型が利用されてもよい。
【００９０】
いくつかの態様において、勾配は、1種または複数種のバイオインクの中の異なる細胞型に基づき、かつ1種または複数種のバイオインクの中の1種または複数種の細胞型の異なる細胞濃度に基づく。例えば、第1のバイオインクが、ある細胞濃度の間葉系細胞を含んでおり、第2のバイオインクが、もう一つの細胞濃度の上皮細胞を含んでいてよい。あるいは、第1のバイオインクが、ある細胞濃度の間葉系細胞および上皮細胞の組み合わせ混合物を含んでおり、第2のバイオインクが、異なる細胞濃度の間葉系細胞および上皮細胞の組み合わせ混合物を含んでいてよい。任意で、2種以上の細胞型が利用されてもよい。
【００９１】
いくつかの態様において、勾配は、1種または複数種のバイオインクの中の異なる細胞型に基づく。例えば、第1のバイオインクが間葉系細胞（即ち、真皮乳頭細胞）を含んでおり、第2のバイオインクが上皮細胞（即ち、皮膚上皮細胞、ケラチノサイト）を含んでいてよい。
【実施例】
【００９２】
実施例1
細胞の混合された凝集物の沈着
出発点は、真皮乳頭細胞およびケラチノサイトの混合された凝集物の沈着を含んでいた。凝集したスフェロイド構造（図1Aを参照すること）は、文献（Higgins(2013)）に記載されたものと比較可能であり、インビボ植え込み後の毛髪様構造に由来する。本発明者らの研究において、凝集物は、インビトロで有意なリモデリングを受けなかった。また、遺伝子発現パターンが、2D培養において失われた（図1B）。リモデリングの欠如（図2A〜2F）は、他の報告と一致しており、スフェロイド構造の再現可能なインビトロリモデリングの示唆は存在しない。より頑強な製作過程によって、凝集物は、適当なインビトロ環境が提供された場合に、増加した成熟能力を有することを、本発明者らは期待した。
【００９３】
凝集物の形態形成をさらに推進するため、本発明者らは、毛髪形成を促進する数種の方法を試みた。最初に、本発明者らは、バイオプリントされた皮膚組織（バイオプリントされた皮膚組織を作製する方法については、例えば、米国公開特許第2016/0122723号を参照すること）に凝集物を導入した。結果（図3A）は、一貫せず、インビボで観察される形態形成および嚢胞形成を欠いていた。第2に、本発明者らは、皮膚線維芽細胞および付加的な細胞外マトリックスの層に凝集物を沈着させた（図3B〜3D）。凝集物は、個々の毛髪形成構造として残存するのではなく、付加的な形態形成の兆候なしに、大きい構造へとさらに癒合したため、これは不成功であった（図3E〜3H）。最後に、凝集物を沈着させ、ケラチノサイトから構成された偽表皮で覆った。このアプローチも、細胞凝集物のリモデリングを誘導することができなかった。これらの実験から、インビトロでの毛包凝集物のリモデリングの誘導は、重大な技術的エンジニアリングの課題であり、これらの障壁を克服するためには、代替的なアプローチが必要とされると考えられた。
【００９４】
実施例2
ハイドロゲルチャンネルへの細胞の沈着
実施例1に記載された失敗から、本発明者らは、その後の移植手技を支援すると予想される、製作の自動化、凝集の排除、および極性の組み入れを含む新たな方法を開発した。毛包単位をバイオプリントする最初の方法が開発され、その結果は、細胞凝集物実験と比較して、有意に改善されていた。この方法は、適切な細胞型を含む別個の毛包チャンネルをハイドロゲル内にバイオプリンティングする工程を含んでいた。図4は、チャンネルを形成するための、細胞を含有している針のハイドロゲルへの挿入を示す。
【００９５】
細胞の調製の前に、ハイドロゲルベースを注入する。ハイドロゲル組成物を最適化し、凝集を促進する細胞接着性が低い生体適合性材料に焦点を当てた。アガロース、アルギン酸、およびヒアルロン酸（HA）を、リード候補として選択し、試験した。ハイドロゲルを作製し、架橋のために十分な時間、ウェルに沈着させた。試験される際、ハイドロゲルは無細胞であったが、皮膚線維芽細胞、内皮細胞、前脂肪細胞、または免疫細胞のような他の細胞型が組み入れられていてもよい。さらに、ゲル内の細胞チャンネルおよび小さい体積のゲルが移植されるよう、構築物を設計した。一つの態様において、ハイドロゲルは、臨床的使用と適合性であり、外科的操作を可能にするために十分に強力であり、皮膚科適用において有用である。
【００９６】
ハイドロゲルは、組織製作の新たな方法の基礎を形成する。バイオプリンタは、細胞のチャンネルを直接ハイドロゲルに沈着させる。ヒト真皮乳頭細胞、ヒトケラチノサイト、およびメラノサイトまたは特殊な鞘細胞のような可能性のあるアクセサリー細胞を含む細胞混合物が作製される。全ての細胞が、ヒトであり、形質転換されておらず、完全に分化している。細胞を様々な比で混合し、賦形剤なしにカスタムハミルトン注射器へ充填する。注射器をバイオプリンタに置き、次いで、予め設計されたスクリプトを使用して、ゲルにプリントする。スクリプトは、形成される原始毛包（proto-follicle）の数および構築物内のそれぞれの位置を命令する。針サイズの変動は、構築物の直径の調節を可能にする。次いで、プリンタが、配置された後、細胞懸濁物をハイドロゲルベースに注入し、細胞のチャンネルを形成する。
【００９７】
いくつかの課題を克服しなければならなかったため、この方法によるプリンティングは直ぐに実現可能ではなかった。第1に、個々の単位の継続的な維持を可能にするため、バイオプリンタ注入が安定的なチャンネルを作出するように、ハイドロゲル組成物/濃度を最適化した。第2に、針の先端が決定的であることが見出された。一貫した沈着を達成するためには、ベベルを有する針が必要とされることが見出された。本発明者らは、これを決定するため、いくつかの異なる形状およびサイズの針を試験した。失敗した試みは、不連続の沈着、チャンネルの上からの細胞の漏出、および意図された幾何学を崩壊させるゲル内の割れ目をもたらした。図5A〜5Bは、250μm（図5A）または500μm（図5B）のサイズの針によってハイドロゲル内に沈着させた混合細胞から作製された4mm長の細胞構築物の写真を示す。これらの結果は、針のサイズが、ハイドロゲル内に細胞のチャンネルを得るために重要であることを示している。図6A〜6Cは、様々な型のハイドロゲル組成物（図6A、ラット尾部コラーゲン（6mg/ml）；図6B、ゼラチン（8％）；図6C、ラミニン/フィブロネクチン（15μg/ml±12.5））の、チャンネル内の細胞構築物の成熟および癒合に対する効果を示す写真である。これらの結果は、細胞外マトリックス（ECM）の添加が沈着を有意に改善しなかったことを示している。
【００９８】
1〜3週間培養された最適化されたチャンネルプリントの特徴決定は、毛包様構造へのリモデリングを明らかにした（図8A〜8DF）。チャンネル内には、嚢胞構造が一般的に見出された。この所見は、インビトロで維持された凝集物とは対照的であって、インビボ注入後のリモデリングに類似している。再び、チャンネルプリントはインビボ条件に曝されなかった。バイオプリントされたチャンネルにおいて形成された嚢胞は、しばしば、真皮乳頭細胞を含有しており、このことは、リモデリングと、間葉系細胞型と上皮細胞型との相互シグナリングとの間の正の相関を示唆している。CK15、EpCam、およびCK6のようなマーカーによる上皮細胞の染色は、毛包形態形成と一致するケラチノサイトの分化をさらに支持した。
【００９９】
図8A〜8Dは、100％細胞混合物を、予め形成されたハイドロゲルにチャンネルとして自動的に沈着させ、次いで、14日間（図8A）および21日間（図8B〜8D）培養する、ペーストのみのプリントの顕微鏡写真である。これらの組織構築物は、毛包に特徴的な嚢胞形成を発達させた。少量のECMを、嚢胞成熟を駆動するため、細胞混合物に添加することができる（図8D）。
【０１００】
図9A〜9Fは、14日間（図9A〜9C）および21日間（図9D〜9F）培養した時のBrdU+染色による嚢胞の顕微鏡写真を示す。BrdU+染色は、嚢胞における真皮乳頭細胞の存在を示している。
【０１０１】
図10A〜10Fは、嚢胞における遺伝子発現が、2日、5日、および21日で迅速に変化することを示す棒グラフ（図10A〜10C）および顕微鏡写真（図10D〜10F）である。
【０１０２】
図11A〜11Cは、アルギン酸ゲルに沈着させた細胞ペーストの写真である。アルギン酸ゲルの使用は、他のハイドロゲルと比較して、極めて滑らかな沈着をもたらした。いくつかのチャンネルは、細胞のキャップを有していたが、それらは他のハイドロゲルよりはるかに低頻度であった。
【０１０３】
図12A〜12Bは、7日後のアルギン酸に沈着させた組織構築物の顕微鏡写真である。嚢胞が、アルギン酸ゲル内に迅速に効率的に形成された。
【０１０４】
図13A〜13Bは、嚢胞の分割が経時的により組織化されることを示す、1日目（図13A）および7日目（図13B）の組織構築物の顕微鏡写真である。
【０１０５】
図14A〜14Dは、組織構築物内の嚢胞様構造の形成を示す、沈着後14日目の組織構築物の顕微鏡写真である。
【０１０６】
図15A〜15Dは、沈着後14日目にBrdU（赤）およびCK6（緑）によって染色された組織構築物の顕微鏡写真である。染色パターンは、細胞が、存続しており、組織構築物内に均一に分布していることを示している。
【０１０７】
図16は、15日目に、組織構築物が毛包関連遺伝子のアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。
【０１０８】
1週間の培養後、バイオプリントされたチャンネルを、外科用ツールによってウェルから取り出し、成功裡に操作した。これは、この技術が、（1）原始毛包の形成、（2）適切な細胞型のパターン化された沈着、（3）外科的設置が可能な材料、を可能にすることを確証した。
【０１０９】
実施例3
区分された組織構築物を作製するための同軸針による細胞の沈着
一つの態様において、シングルニードルパンチを利用して、同軸針が、2種の異なる細胞集団をハイドロゲルに導入する。その過程は、以下の通りである：（1）同軸ノズルは、共通の排出口と共に2種の独立のフローストリームを有する。真皮乳頭細胞がコア流路を占有し、ケラチノサイトがマントル流路を占有するよう、2種の細胞型が充填される。（2）同軸針が、適切な深さまで垂直にハイドロゲルに入る。（3）真皮乳頭細胞のボーラスがコア流路を介して送達される。（4）同軸針をハイドロゲルから引き抜く際に、ケラチノサイトがマントルフローを利用して埋め戻される。この様式においては、1回の注入が、両方の細胞型を所望の区分に送達する。
【０１１０】
図17は、チャンネルの下部に真皮乳頭細胞を含み上部にケラチノサイトを含む区分された構築物を示す。
【０１１１】
図18は、下部に真皮乳頭細胞を含み上部にケラチノサイトを含む、アルギン酸に沈着させたチャンネルの写真である。均質な細胞混合物の良好な垂直性およびクラスタリングが得られた。
【０１１２】
図19A〜19Bは、2種の異なる細胞型のための2種の異なるインプットの同心流を提供する同軸針を示し、例えば、ここで、間葉系細胞はコアから押し出され、上皮細胞はマントル層から押し出される。図19Bは、30°のベベルを示す針の末端の拡大された一部分を示す。
【０１１３】
図20A〜20Eは、同軸針送達技術を示す。図20Aは、間葉系細胞がコアに充填され上皮細胞がマントル層に充填された同軸針を示し、ここで、針はハイドロゲルの上に位置付けられている。図20Bは、針のハイドロゲル内への注入を示す。図20Cは、間葉系細胞のハイドロゲル内への注入を示す。図20Dは、針を引き抜く際の上皮細胞の注入を示す。図20Eは、チャンネルの下部に間葉系細胞が区分されチャンネルの上部に上皮細胞が区分されたチャンネルを含有しているハイドロゲルの上方に引き抜かれた針を示す。
【０１１４】
図22（左パネル）は、4個のポンプを含有しているバイオプリンタを使用した、沈着プログラム（右パネル）に従った、2種の異なるビーズ溶液の同軸沈着の結果を示す。ポンプ4によって送達されたコア材料は、黄色に着色した10ミクロンビーズを含有していた。ポンプ2によって送達されたマントル材料は、青紫色に着色した10ミクロンビーズを含有していた。目盛りは（画像の縮尺に応じた）100ミクロンの間隔である。針の先端を、Aと記されたゲル位置まで挿入した。以下の移動の持続時間は、破線の下にある。針を700ミクロン上に移動させる。次いで、マントル材料を沈着させるため、ポンプピストン3を110ミクロン移動させながら、コア材料を同時に沈着させるため、ポンプ4も90ミクロン移動させる。引き抜きの持続時間は、破線の上にある。行程の最初の1000ミクロンの間に、コア材料およびマントル材料の両方を沈着させる。その後の3000ミクロンの間に、マントル材料のみを沈着させた。
【０１１５】
図23A〜23Bは、同軸沈着の結果を示す顕微鏡写真を示す。針のコアを、Novogel 2.0に懸濁した黄色のミクロン粒子を含有しているポンプヘッド4シリンジに接続した。針のマントルを、Novogel 2.0に懸濁した青紫色のミクロン粒子を含有しているポンプヘッド3シリンジに接続した。材料を、キュベット内に含有された（イメージングのために最適である）固体Novogel 2.0に沈着させた。顕微鏡写真は、外側の材料（2301）（Novogel 2.0に懸濁した青紫色のミクロン粒子）および内側の材料（Novogel 2.0に懸濁した黄色のミクロン粒子）を示した。
【０１１６】
実施例4
区分された組織構築物を作製するためのシングルコンパートメント針による細胞の沈着
もう一つの技術は、ケラチノサイトが充填された皮下注射器に接続された標準的なシングルコンパートメント針に頼る。次いで、針は、真皮乳頭細胞を含有しているバイアルに移され、小さいボーラスを吸引する。従って、シングルコンパートメント針内には、1回の針注入によって、ハイドロゲルにそのまま押し出されるであろう、所望の層状構造が存在する。
【０１１７】
図21A〜21Dは、チャンネルの下部に間葉系細胞が区分されチャンネルの上部に上皮細胞が区分されたチャンネルを与えるため、間葉系細胞が最初に針に充填され、その針が上皮細胞を含有している容器の上に置かれ（図21A）、針が上皮細胞に挿入され、上皮細胞が針に吸引され（図21B）、次いで、針がハイドロゲルに挿入され（図21C）、間葉系細胞および上皮細胞の注入と同時に針がハイドロゲルから引き抜かれる（図21D）、区分されたチャンネルを提供する方法を示す。
【０１１８】
図24A〜24Cは、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティングシステム2400の例示的な態様を示し、図24Aおよび図24Cが側面図を示し、図24Bが底面図を示している。図24Aに示されるように、パラレルバイオプリンティングシステム2400は、第1のディスペンサ2401、第2のディスペンサ2403、および共通のディスペンスモジュール2405を含む。第1のディスペンサ2401は、第1のバイオインク2402および第1のアウトレット（示されない）を含む。第2のディスペンサ2403は、第2のバイオインク2404および第2のアウトレット（示されない）を含む。第1のディスペンサ2401および第2のディスペンサ2403は、自動シリンジディスペンサまたは空気圧駆動式ディスペンサのような、押し出しによるディスペンサである。バイオプリンティングのために適当な他の型のディスペンサも、第1のディスペンサ2401および第2のディスペンサ2403のために可能である。示されないが、第1のアウトレットおよび第2のアウトレットは、ディスペンスチップのようなディスペンスアウトレットである。図24Aに示されるように、第1のディスペンサ2401の第1のアウトレットは、第1のモジュール2406の第1のインレット2409にカップリングされており、第2のディスペンサ2403の第2のアウトレットは、第2のモジュール2407の第2のインレット2405にカップリングされている。
【０１１９】
図24のこの例示的な態様において、第1のバイオインク2402は、第2のバイオインク2404と異なるヒト細胞の組成を有する。第1のバイオインク2402は、上皮細胞、具体的には、皮膚上皮細胞、より具体的には、ケラチノサイトを含む。第2のバイオインク2404は、間葉系細胞、具体的には、真皮乳頭細胞を含む。第1および第2のバイオインクの他の細胞型および/または他の細胞濃度の同一のもしくは異なる細胞型も可能である。簡潔のため、異なる型の第1および第2のバイオインクは、「細胞構築物をバイオプリントするためのパラレルバイオプリンティングシステム」セクションに記載される。
【０１２０】
図24Aに示されるように、第1のディスペンサ2401は、第1のモジュール2406に取り付けられており、第2のディスペンサ2403は、第2のモジュール2407に取り付けられている。しかしながら、第1のディスペンサ2401は、第1のモジュール2406から分離可能な単位であり、第2のディスペンサ2403は、第2のモジュール2407から分離可能な単位である。任意で、第1のディスペンサ2401は、第1のモジュール2406と調和していてよく、第2のディスペンサ2403は、第2のモジュール2407と調和していてよく、それによって、第1のディスペンサ2401の第1のアウトレット（示されない）、第2のディスペンサ2403の第2のアウトレット（示されない）、第1のインレット2409、および第2のインレット2405の必要性が省かれる。
【０１２１】
図24Aに示されるように、共通のディスペンスモジュール2405は、第1のモジュール2406、第2のモジュール2407、および共通のアウトレット2408を含む。第1のモジュール2406は、第1のインレット2409、第1のボディ2410、および第1のディスペンスチップ2411を含む。第1のモジュール2406は、第1のディスペンサ2401と流体連通している。第2のモジュール2407は、第2のインレット2412、第2のボディ2413、および第2のディスペンスチップ2414を含む。第2のモジュール2407は、第2のディスペンサ2403と流体連通している。図24Aに示されるように、第1のモジュール2406および第2のモジュール2407は、対称的な配置を形成する。
【０１２２】
図24Bに示されるように、共通のアウトレット2408は、第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンスチップ2414を含む。図24Cに示されるように、第1のディスペンスチップ2411は、第2のディスペンスチップ2414と実質的に平行している。図24Cに示されるように、第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンスチップ2414は、共通のアウトレット2408とも実質的に平行している。任意で、第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンスチップ2414は、共通のアウトレット2408と実質的に平行していなくてもよい。例えば、共通のアウトレット2408は、第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンスチップ2414から突出していてよく、例えば、第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンスチップ2414より低く突出していてもよいし、または第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンサ2414より高く突出していてもよい。共通のアウトレットは、およそ0.4mm〜2.0mmの直径を有していてよく、図24A〜24Cのこの例示的な態様において、共通のアウトレット2408は、直径およそ1.0mmであり、それは、図25A〜Bに記載される方法2500の例示的な態様によって作出される細胞構築物のおよその直径に相当する。
【０１２３】
任意で、パラレルバイオプリンティングシステム2400は、3個以上のディスペンサを有していてもよく、従って、このシステム2400の構成要素は、より高いスループットの需要を満たすかまたは細胞型もしくは細胞濃度の変動を満たすため、それ相応に規模を調整され得る。
【０１２４】
図25A〜25Bは、図24A〜Cに記載されたパラレルプリンティングシステム2400の例示的な態様を使用した、本明細書中に開示されたパラレルバイオプリンティング法2500A〜Bの例示的な態様を示す。図25Aの例示的な態様において、パラレルバイオプリンティング法2500Aは、工程2503〜2514を含み、任意で、工程2515を含む。工程2503において、パラレルバイオプリンティングシステム2400、具体的には、共通のアウトレット2408が、半固体材料2501の中へ所定の距離だけ降下する。この態様において、所定の距離は、半固体材料の最大の深さとおよそ等しい。図25A〜Bのこの例示的な態様において、半固体材料2501はアルギン酸を含む。
【０１２５】
工程2504において、共通のアウトレット2408が、およそ1.0〜2.0ミリメートル（mm）の所定の距離だけ上昇し、この態様において、共通のアウトレット2408は、およそ1.5mm上昇する。工程2505において、第1のディスペンスチップ2411が、所定の量の第1のバイオインク2402を半固体材料2501に沈着させ、ここで、沈着は、共通のアウトレット2408が上昇する間に起こる。分配される第1のバイオインク2402の所定の量は、およそ0.8μLであり、およそ0.8mmの長さおよびおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する。任意で、工程2505において、所定の量の第1のバイオインク2402は、0.8mmではなく、およそ1.0mmの長さを有する実質的な直線を有し、およそ0.8μLが1.0mmの長さにわたって均一に分布していてもよい。1.0mmではなく、およそ0.8mmの長さにわたっておよそ0.8μLを沈着させることの利点は、追加の0.2mmが、共通のアウトレット2408を引き抜くための付加的な空間となり、それによって、第1のバイオインクと第2のバイオインクとの間により広い間隙が作出され、それが、分配された第2のバイオインクへの第1のバイオインクのストリーキングのリスクを低下させ得ることである。
【０１２６】
図25A〜25Bのこの例示的な態様において、第1のバイオインク2402は、第2のバイオインク2404と異なるヒト細胞の組成を有する。第1のバイオインク2402は、上皮細胞、具体的には、皮膚上皮細胞、より具体的には、ケラチノサイトを含む。第2のバイオインク2404は、間葉系細胞、具体的には、真皮乳頭細胞を含む。第1および第2のバイオインクの他の細胞型および/または他の細胞濃度の同一のもしくは異なる細胞型も可能である。簡潔のため、異なる型の第1および第2のバイオインクは、「細胞構築物をバイオプリントするためのパラレルバイオプリンティングシステム」セクションに記載される。工程2506において、共通のアウトレット2408が、およそ0.2mm上昇する。工程2507において、所定の量の第2のバイオインク2404を半固体材料2501に沈着させる前に、方法2500Aは、所定の時間、共通のアウトレット2408の作動を一時停止する。図25Aの例示的な態様において、工程2501における、この所定の時間は、およそ10秒である。工程2508において、所定の量の第2のバイオインク2404を半固体材料2501へ沈着させる前に、方法2500Aは、第1のディスペンスチップ2411を使用して、1.2μLの所定の量の第1のバイオインク2402を吸引する。
【０１２７】
工程2509において、所定の量の第2のバイオインク2404の分配の前に、共通のアウトレット2408が、所定の長さだけ水平方向に移動し、この例示的な態様において、水平の所定の長さは、およそ0.1mmである。任意で、工程2509において、移動は、所定の長さの水平方向の小刻みな動き、具体的には、およそ0.1mmの小刻みな動きであり得る。この工程2509において、共通のアウトレット2408は、以下の一連の水平方向の移動を実行する、+X 0.1mm、+Y 0.1mm、-X 0.1mm、および-Y 0.1mm。この工程2509の目的は、分配された第1のバイオインクが共通のアウトレット2408から分離されることを助長することであり、それは、次に、第2のバイオインクへの第1のバイオインクのストリーキングを低下させるであろう。
【０１２８】
工程2510において、第2のディスペンスチップ2414が、所定の量の第2のバイオインク2404を半固体材料2501に沈着させ、ここで、沈着は、共通のアウトレット2408が上昇する間に起こる。分配される所定の量の第1のバイオインク2404は、およそ2.4μLであり、およそ3.0mmの長さおよびおよそ1.0mmの直径の実質的な直線を有する。第2のバイオインク2404は、間葉系細胞、具体的には、真皮乳頭細胞を含む。
【０１２９】
工程2511において、所定の量の第2のバイオインク2404を半固体材料2501に沈着させた後、方法2500Aは、所定の時間、共通のアウトレットの作動を一時停止する。この例示的な態様の工程2511において、この所定の時間は、およそ10秒である。
【０１３０】
工程2512において、所定の量の第2のバイオインク2404を半固体材料2501に沈着させた後、方法2500Aは、第2のディスペンスチップを使用して、およそ1.2μLの所定の量の第2のバイオインクを吸引する。
【０１３１】
工程2513において、所定の量の第2のバイオインク2404の分配の後、共通のアウトレット2408が、およそ0.3mmの所定の長さだけ水平方向に移動し、その後、共通のアウトレット2408が、半固体材料2501の外へ垂直方向に移動する。
【０１３２】
工程2514において、共通のアウトレット2408が、半固体材料2501外へ同定装置（identifier）2502まで引き抜かれる。同定装置2502は、受容面または半固体材料2501の外部および表面上にある。同定装置2502は、空気媒体であり得る。
【０１３３】
パラレルバイオプリンティング法2500Aの工程2503〜2514は、およそ120秒以下で完了し得る。分配された所定の量の第1のバイオインク2402および分配された所定の量の第2のバイオインク2404は、半固体材料2501内で細胞構築物を形成する。従って、方法2500Aの例示的な態様において、形成された細胞構築物は、0.8μLの真皮乳頭細胞およびおよそ2.4μLのケラチノサイトから作製されたおよそ2.8μLを含み、およそ3.2mm（0.8mmの真皮乳頭細胞および2.4mmのケラチノサイト）の長さならびにおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する。
【０１３４】
任意で、使用者が方法2500aを繰り返すこと（即ち、2回以上）を望む場合には、工程2515において、方法2500aは、第2のディスペンスチップ2414を使用して、所定の量の第2のバイオインク2404を吸引し、具体的には、第2のバイオインク2404の所定の量は、およそ1.2μLである。工程2525の後に、パラレルバイオプリンティングシステム2400は、新しい所望の位置において2500Aの方法を繰り返すため、受容面上の異なるX、Y、Z位に移動するであろう。
【０１３５】
図25Bの例示的な態様において、パラレルバイオプリンティング法2500Bは、工程2503、2505、2510、および2514のみを含むパラレルバイオプリンティング法2500Aの簡易バージョンである。工程2503において、パラレルバイオプリンティングシステム2400、具体的には、共通のアウトレット2408が、半固体材料2501の中へ所定の距離だけ降下する。同定装置2502は、受容面または半固体材料2501の外部および表面上にある。この態様において、所定の距離は、半固体材料の最大の深さとおよそ等しい。図25A〜Bのこの例示的な態様において、半固体材料2501はアルギン酸を含む。
【０１３６】
方法2500Bの工程2505において、第1のディスペンスチップ2411が、所定の量の第1のバイオインク2402を半固体材料2501に沈着させ、ここで、沈着は、共通のアウトレット2408が上昇する間に起こる。分配される第1のバイオインク2402の所定の量は、およそ0.8μLであり、（方法2500Aにおける0.8mmではなく）およそ1.0mmの長さおよびおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する。工程2505において、およそ0.8μLの所定の量の第1のバイオインク2402が、1.0mmの長さにわたって均一に分布する。図25A〜25Bのこの例示的な態様において、第1のバイオインク2402は、第2のバイオインク2404と異なるヒト細胞の組成を有する。第1のバイオインク2402は、上皮細胞、具体的には、皮膚上皮細胞、より具体的には、ケラチノサイトを含む。第2のバイオインク2404は、間葉系細胞、具体的には、真皮乳頭細胞を含む。第1および第2のバイオインクの他の細胞型および/または他の細胞濃度の同一のもしくは異なる細胞型も可能である。簡潔のため、異なる型の第1および第2のバイオインクは、「細胞構築物をバイオプリントするためのパラレルバイオプリンティングシステム」セクションに記載される。
【０１３７】
方法2500Bの工程2510において、第2のディスペンスチップ2414が、所定の量の第2のバイオインク2404を半固体材料2501に沈着させ、ここで、沈着は、共通のアウトレット2408が上昇する間に起こる。分配される第1のバイオインク2404の所定の量は、およそ2.4μLであり、およそ3.0mmの長さおよびおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する。第2のバイオインク2404は、間葉系細胞、具体的には、真皮乳頭細胞を含む。
【０１３８】
方法2500Bの工程2514において、共通のアウトレット2408が、半固体材料2501外に同定装置2502まで引き抜かれる。同定装置2502は、受容面または半固体材料2501の外部および表面上にある。同定装置2502は空気培地であり得る。
【０１３９】
分配された第1のバイオインク2402の所定の量および分配された第2のバイオインク2404の所定の量は、半固体材料2501内で細胞構築物を形成する。従って、方法2500Aの例示的な態様において、形成された細胞構築物は、0.8μLの真皮乳頭細胞およびおよそ2.4μLのケラチノサイトから作製されたおよそ2.8μLを含み、およそ3.2mm（0.8mmの真皮乳頭細胞および2.4mmのケラチノサイト）の長さならびにおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する。
【０１４０】
図26A〜26Cは、パラレルバイオプリンティングシステム2400、ならびに異なる一時停止時間および吸引工程を含む方法2500Aの変動を使用して作製された細胞構築物を示す。具体的には、図26A〜26Cは、0.8μLの真皮乳頭細胞およびおよそ2.4μLのケラチノサイトから作製されたおよそ2.8μLを各々含み、およそ3.2mm（0.8mmの真皮乳頭細胞および2.4mmのケラチノサイト）の長さならびにおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する形成された細胞構築物を示す。図26Aは、方法2500Aの工程2507において、一時停止の所定の時間がおよそ120秒である場合に形成された細胞構築物を示す。対照的に、図26Bは、方法2500Aの工程2507において、一時停止の所定の時間がおよそ10秒である場合に形成された細胞構築物を示す。有意に、予想外に、図26Aは、図24Bより明らかに少ないストリーキングを有し、このことは、工程2507（または工程2511）における一時停止工程がストリーキング問題の有意な低下を補助し得ることを示唆している。
【０１４１】
ストリーキング問題は、第1のバイオインク2402または第2のバイオインク2404のようなバイオインクの遅延流が針中に存在する時、再発する問題点であることが見出された。第1のディスペンサ2401または第2のディスペンサ2403のようなディスペンサからのピストンが発動を中止した後、長時間、バイオインクはディスペンスチップから流出し続ける。標的細胞構築物をバイオプリントする時、遅延流によって、第1のバイオインク2402の一部が、第2のバイオインク2404と同時に分配されることになる。その結果、第2のバイオインク2404の目標領域への第1のバイオインク2402のストリーキングが起こる。さらに、複数の細胞構築物が連続的にプリントされる時、1個の細胞構築物からの第2のバイオインク2404の遅延流は、その後の細胞構築物の中の第1のバイオインク2402の目標領域へのストリーキングに至る。遅延流の解決策は、それぞれのバイオインクの各分配の後に、工程2507または2511のような一時停止工程を追加することである。この修飾によって、指定された領域へ流入するために十分な時間がバイオインクに与えられるため、ストリーキング挙動は大いに低下する。
【０１４２】
図26Cは、方法2500Aの工程2507において、一時停止の所定の時間がおよそ10秒であり、工程2508において、第1のディスペンスチップ2411が1.2μLの所定の量の第1のバイオインク2402を吸引する場合に形成された細胞構築物を示す。有意に、予想外に、図26Cは、図26A〜26Bより明らかに少ないストリーキングを有し、このことは、工程2508（または工程2512、工程2015）における吸引工程の追加が、ストリーキング問題の有意な低下を補助し得ることを示唆している。
【０１４３】
図27A〜27Dは、パラレルバイオプリンティングシステム2400、ならびに方法2500Aの吸引工程2508を含む変動および含まない変動を使用して作製された細胞構築物を示す。図27A〜27Dは、0.8μLの真皮乳頭細胞およびおよそ2.4μLのケラチノサイトから作製されたおよそ2.8μLを各々含み、およそ3.2mm（0.8mmの真皮乳頭細胞および2.4mmのケラチノサイト）の長さならびにおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する形成された細胞構築物を示す。図27A〜27Bは、任意の工程2515において、第1のディスペンスチップ2411が1.2μLの所定の量の第2のバイオインク2404を吸引する場合に形成された細胞構築物を示す。この吸引工程は、方法2500Aの2回目において第1のバイオインク2402が分配される時の、第2のバイオインク2404のストリーキングの低下を補助する。対照的に、図27C〜27Dは、任意での工程2515が省略される場合に形成された細胞構築物を示す。有意に、予想外に、図27A〜27Bは、第2のバイオインク2404の第1のバイオインク2402へのストリーキングを明らかに示さず、このことは、吸引工程がストリーキング問題の低下および望まれないバイオインクの流動の即時停止のための重要工程であることを示唆している。図26Cおよび27A〜27Dに示されるように、吸引は、望まれないバイオインクのストリーキングを低下させることができるもう一つの重要な特色である。吸引工程（即ち、工程2508、2512、2515）は、図24Cに示されるように、一時停止工程（即ち、一時停止工程2507、2511）の補足であってもよいし、または図27A〜27Dに示されるように、一時停止工程なしに吸引工程が含まれてもよい。一時停止工程は、2500Aまたは2500Bの方法を実行するために必要とされる時間を時には数分追加し、従って、スループットを低下させるため、吸引工程が一時停止工程なしに利用される場合、それは有利であり得る。対照的に、吸引は、2500Aまたは2500Bの方法を実行するために必要とされる時間を数秒しか追加しない。さらに、吸引は、望まれないバイオインクの流動を即時停止させ得ることが示されたため、吸引は、一時停止より有利である。
【０１４４】
図28A〜28Dは、パラレルバイオプリンティングシステム2400、ならびに方法2500Aの上昇工程2504を含む変動および含まない変動を使用して作製された細胞構築物を示す。図28A〜28Dは、0.8μLの真皮乳頭細胞およびおよそ2.4μLのケラチノサイトから作製された各々およそ2.8μLを含み、およそ3.2mm（0.8mmの真皮乳頭細胞および2.4mmのケラチノサイト）の長さならびにおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する形成された細胞構築物を示す。具体的には、図28A〜28Bの細胞構築物は、上昇工程2504を含んで作製される。対照的に、図28C〜28Dの細胞構築物は、上昇工程2504を含まずに作製される。この例において、方法2500Aの工程2504において、共通のアウトレット2408は、およそ1.5mmの所定の距離だけ上昇する。有意に、予想外に、図28A〜Bは、第1のバイオインク2402のバッジング（budging）形態学を示さないが、図28C〜Dは、第1のバイオインクの針軸からの放射状の外側バッジングを示す。この外側バッジングは、第1のバイオインクおよび第2のバイオインクによる細胞構築物の形成を補助するための支持材料として作用する周囲の半固体材料を破損させる可能性があるため、望ましくない。従って、工程2504は、第1のバイオインク2402の望ましくないバッジング形態学を有意に低下させかつ/または排除する。
【０１４５】
図29A〜29Bは、パラレルバイオプリンティングシステム2400、ならびに方法2500Aの移動工程2513を含む変動および含まない変動を使用して作製された細胞構築物を示す。図26A〜26Cは、0.8μLの真皮乳頭細胞およびおよそ2.4μLのケラチノサイトから作製されたおよそ2.8μLを各々含み、およそ3.2mm（0.8mmの真皮乳頭細胞および2.4mmのケラチノサイト）の長さならびにおよそ1.0mmの直径を有する実質的な直線を有する形成された細胞構築物を示す。図29Aは、移動工程2513を含んで作製された細胞構築物を示す。対照的に、図29Bは、移動工程2513を含まずに作製された細胞構築物を示す。工程2513において、共通のアウトレット2408は、およそ0.3mmの所定の長さだけ水平方向に移動し、その後、共通のアウトレット2408は、半固体材料2501の外へ垂直方向に移動する。
【０１４６】
有意に、予想外に、図29Aは、有意に短く、伸展の少ない構築物を有する細胞構築物を作製する。図29Bは、細胞構築物が、最初のバイオプリントされた長さの2倍を超えて伸展することを示し、このことは、望ましくない。この望まれない伸展の仮定された原因は、吸い上げであり得る。半固体材料がディスペンスチップ（即ち、第1のディスペンスチップ2411および第2のディスペンスチップ2414）の周囲に気密な密閉を形成すると仮定すると、ディスペンスチップの引き抜きは、より低圧の空洞を導入し、それが、下に存在する沈着させた細胞構築物を吸い上げる。従って、半固体材料からの最終的な上昇工程の前におよそ0.3mmだけ水平方向に移動させる追加の工程は、図29Bに示される伸展問題を排除した。以前には、半固体材料は、ディスペンスチップの周囲に気密な密閉を形成したが、図29Aに示されるように、水平の0.3mmの移動は、ディスペンスチップまで空気のチャンネルを開かせ、低圧の空洞が形成されるのを防止する。
【０１４７】
本発明の好ましい態様が本明細書中に示され記載されたが、そのような態様は例として提供されるに過ぎないことが、当業者には明白であろう。多数の変動、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に想到されるであろう。本明細書中に引用された特許、特許出願、および刊行物は、全て、参照によって完全に本明細書中に組み入れられる。
【図１】
2019535705.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2019535705.tif 000007
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
2019535705.tif 000038
【図２６Ａ】
2019535705.tif 000039
【図２６Ｂ】
2019535705.tif 000040
【図２６Ｃ】
2019535705.tif 000041
【図２７Ａ】
2019535705.tif 000042
【図２７Ｂ】
2019535705.tif 000043
【図２７Ｃ】
2019535705.tif 000044
【図２７Ｄ】
2019535705.tif 000045
【図２８Ａ】
2019535705.tif 000046
【図２８Ｂ】
2019535705.tif 000047
【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
2019535705.tif 000049
【図２９】
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【国際調査報告】
2019535705.tif 000051
2019535705.tif 000052