(57)【要約】本開示は、癌関連バイオマーカーの変更された糖鎖付加パターンに基づく、癌、特に乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、及び前立腺癌の非浸潤性診断に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における前立腺癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、マクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）へ結合するＰＳＡのグリコフォームのレベルについて、ＭＧＬへのＰＳＡの結合を決定することによってアッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＰＳＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、及び
前記比較に基づいて前記被験体における前立腺癌の疾患状態を決定すること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記被験体から得られたサンプルをＰＳＡタンパク質抗原についてアッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）及びＭＧＬからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンへ結合するＣＥＡグリコフォームのレベルについて、前記レクチンへのＣＥＡの結合を決定することによってアッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＥＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、並びに
前記比較に基づいて前記被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
ＭＢＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＢＬ及びＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬ、又はＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬへのＣＥＡの結合が、アッセイされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体から得られたサンプルをＣＥＡタンパク質抗原についてアッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
被験体における膵臓癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するＣＡ１９−９のグリコフォームのレベルについて、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＣＡ１９−９の結合を決定することによってアッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＡ１９−９のグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、及び
前記比較に基づいて前記被験体における前立腺癌の疾患状態を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記被験体から得られたサンプルをＣＡ１９−９タンパク質抗原についてアッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被験体における乳癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬ及び小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）からなる群から選択される１つ又は複数のレクチンへ結合するＣＡ１５−３グリコフォームのレベルについて、アッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＡ１５−３のグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、及び
前記比較に基づいて前記被験体における乳癌の疾患状態を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記サンプルから得られたサンプルを、ＤＳＬ及びＧａｌ４からなる群から選択されるレクチンを結合する１つ又は複数のさらなるＣＡ１５−３グリコフォームについて、アッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のさらなるレクチン結合ＣＥＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体から得られたサンプルを、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５及びＣＥＡからなる群から選択される１つ又は複数の従来のバイオマーカーについて、アッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル中の前記グリコフォーム又は前記バイオマーカーのレベルが、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較して、増加することが、前記被験体が前記癌を有すること又は有するリスクがあることを示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングするための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記モニタリングが、前記癌の開始のモニタリングのため、前記癌を有するかもしくは発症するリスクの任意の変化のモニタリングのため、治療への応答のモニタリングのため、前記癌の再燃のモニタリングのため、又は前記癌の再発のモニタリングのためである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バイオマーカーの前記１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームのレベルについてアッセイすることが、
サンプル中に含有されるバイオマーカーを捕捉するために、前記バイオマーカーについて特異的な抗体へ前記サンプルをさらすこと、
前記捕捉されたバイオマーカーを１つ又は複数のレクチンへさらすこと、及び
検出可能シグナルの補助により、前記１つ又は複数のレクチンへの前記捕捉されたバイオマーカーの結合のレベルを測定すること、
を含む結合アッセイによって実行される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマーカーの前記１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームのレベルについてアッセイすることが、
サンプル中に含有される前記バイオマーカーの１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームを捕捉するために、１つ又は複数のレクチンへ前記サンプルをさらすこと、
前記捕捉されたバイオマーカーを該バイオマーカーに特異的な抗体へさらすこと、及び
検出可能シグナルの補助により、該バイオマーカーについて特異的な抗体への前記捕捉されたバイオマーカーの結合のレベルを測定すること、
を含む結合アッセイによって実行される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記レクチン又は前記抗体のいずれかがナノ粒子上で固定化される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、腹膜腔液体及び組織サンプルからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＳＡ結合剤及びＭＧＬを含み、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記ＭＧＬのいずれかが検出可能標識を含む、請求項１、２又は１１〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項１９】
ＰＳＡ結合剤をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＣＥＡ結合剤並びにＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンを含み、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記レクチンのいずれかが検出可能標識を含む、請求項３〜５又は１１〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２１】
ＭＢＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＢＬ及びＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬ、又はＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
ＣＥＡ結合剤をさらに含む、請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＣＡ１９−９結合剤及びＤＣ−ＳＩＧＮを含み、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記ＤＣ−ＳＩＧＮのいずれかが検出可能標識を含む、請求項６、７又は１１〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２４】
ＣＡ−１９−９結合剤をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
ＣＡ１５−３結合剤並びにＭＧＬ及びＷＧＡからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンを含み、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記１つ又は複数のレクチンのいずれかが検出可能標識を含む、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２６】
ＣＡ−１５−３結合剤をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、Ｅ−セレクチン、ＤＳＬ、及びＧａｌ４からなる群から選択される１つ又は複数のレクチンをさらに含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記レクチンがナノ粒子上で固定化される、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記ナノ粒子のすべての次元が、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１８〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、タンパク質ナノ粒子、ミネラルナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶、金属ナノ粒子、プラスチックナノ粒子、ポリスチレンナノ粒子、ポリ（エチレングリコール）ナノ粒子、ポリエチレンナノ粒子、ポリ（アクリル酸）ナノ粒子、ポリ（メチルメタクリレート）ナノ粒子、ポリサッカライドナノ粒子、コロイド金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、炭素ナノ粒子、多孔質シリカナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法又はキット。
【請求項３１】
前記ナノ粒子がランタニドキレート（ユウロピウム（ＩＩＩ）等）によりドープされる、請求項２９又は３０に記載の方法又はキット。
【請求項３２】
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬへ結合するＰＳＡのグリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における前立腺癌の疾患状態を決定するためのＭＧＬの使用。
【請求項３３】
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬを結合するＣＥＡグリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定するためのＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬの使用。
【請求項３４】
前記被験体から得られたサンプルを、ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するＣＡ１９−９グリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における膵臓癌の疾患状態を決定するためのＤＣ−ＳＩＧＮの使用。
【請求項３５】
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬ、ＷＧＡ、ＤＳＬ、及び／又はＧａｌ４へ結合するＣＡ１５−３グリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における乳癌の疾患状態を決定するための、単独又は組み合わせのいずれかでのＭＧＬ又はＷＧＡの、任意にＤＳＬ及び／又はＧａｌ４と組み合わせた使用。
【請求項３６】
前記レクチンがナノ粒子上で固定化されるか、又は検出可能標識により標識される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
被験体における前記癌をスクリーニング、診断、予後予測及び／又はモニタリングするための、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌関連バイオマーカー、特にＣＡ１５−３、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９及びＰＳＡの変更された糖鎖付加パターンに基づく、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌等の癌の非浸潤性診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示のいくつかの具体的な実施形態は、乳癌（ＢｒＣａ）（世界中の女性における癌死亡の２番目の主要原因である）に関する。罹患率は３０歳未満の女性の中では非常に低いが、４５歳以降に増加する。ヒト上皮細胞の表層側上に所在するムチン１（ＭＵＣ１、ＣＡ１５−３としても公知）は、５つの可能な糖鎖付加部位が存在する高度に保存された２０アミノ酸の反復単位（タンデム反復）からなる細胞外部分を備えた５００〜１０００ｋＤａの範囲の分子量の大きな膜貫通糖タンパク質である。ＣＡ１５−３抗原は腫瘍細胞から分泌され、乳癌患者の臨床経過のモニタリングのための十分に確立された血清学マーカーであるが、それは不良な感度を有し、すべての乳癌患者のうちの１７％のみで陽性である（Ｆｌｅｉｓｈｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＣＡ１５−３アッセイは、低い感度に起因してステージＩ及びＩＩの疾患において、診断試験として好適ではないが、進行した乳癌において、抗原レベルの変化は、早期再発、残存病変の存在、及び不良な予後の寛解維持について有用な非浸潤性指標を提供する。したがって、特に一次病巣の早期検出のため、そしてさらに癌についての悪性度、進行度、及び治療有効性のより早期且つより正確なモニタリングのための、改善されたＢｒＣａバイオマーカーの緊急の必要性がある。
【０００３】
消化管癌（結腸直腸癌及び膵臓癌が挙げられる）及び前立腺癌等の癌のための改善されたバイオマーカーについての必要性もある。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、本発明は、被験体における前立腺癌の疾患状態を決定する方法を提供する。方法は、ｉ）前記被験体から得られたサンプルを、マクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）へ結合するＰＳＡのグリコフォームのレベルについて、ＭＧＬへのＰＳＡの結合を決定することによってアッセイするステップと；ｉｉ）前記サンプル中の前記レクチン結合ＰＳＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較するステップと；ｉｉｉ）前記比較に基づいて前記被験体における前立腺癌の疾患状態を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、方法は、前記サンプルを従来のＰＳＡタンパク質抗原についてもアッセイすることをさらに含み得る。
【０００５】
別の態様において、本発明は、被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定する方法を提供する。方法は、ｉ）前記被験体から得られたサンプルを、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）及びＭＧＬからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンへ結合するＣＥＡグリコフォームのレベルについて、前記レクチンへのＣＥＡの結合を決定することによってアッセイするステップと；ｉｉ）前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＥＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較するステップと；ｉｉｉ）前記比較に基づいて前記被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、方法は、前記サンプルを、ＭＢＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮ；ＭＢＬ及びＭＧＬ；ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬ；又はＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬへのＣＥＡの結合について、アッセイすることをさらに含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、方法は、前記サンプルを従来のＣＥＡタンパク質抗原についてもアッセイすることを含み得る。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、被験体における膵臓癌の疾患状態を決定する方法を提供する。方法は、ｉ）前記被験体から得られたサンプルを、ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するＣＡ１９−９のグリコフォームのレベルについて、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＣＡ１９−９の結合を決定することによってアッセイするステップと；ｉｉ）前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＡ１９−９のグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較するステップと；ｉｉｉ）前記比較に基づいて前記被験体における前立腺癌の疾患状態を決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、方法は、前記サンプルを従来のＣＡ１９−９タンパク質抗原についてもアッセイすることをさらに含み得る。
【０００７】
一態様において、本開示は、被験体における乳癌の疾患状態を決定する方法を提供する。方法は、ｉ）前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬ及びＷＧＡからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンへ結合するＣＡ１５−３グリコフォームのレベルについて、アッセイするステップと；ｉｉ）前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＡ１５−３のグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較するステップと；ｉｉｉ）前記比較に基づいて前記被験体における乳癌の疾患状態を決定するステップと、を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、乳癌の疾患状態を決定する方法は、前記サンプルから得られたサンプルを、バイオマーカーのうちの１つもしくは複数のさらなるレクチン結合グリコフォーム（そこで、前記バイオマーカーはＣＡ１５−３であり、前記レクチンはＤＳＬ及びＧａｌ４からなる群から選択される）について、並びに／又は、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５及びＣＥＡからなる群から選択される１つもしくは複数の従来のバイオマーカーについて、並びに／又は、バイオマーカーのうちの１つもしくは複数のさらなるレクチン結合グリコフォーム（そこで、前記バイオマーカーはＣＡ１２５及びＣＥＡから選択され、前記レクチンは、ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、及びＥ−セレクチンからなる群から選択される）について、アッセイすることをさらに含み得る。
【０００９】
アッセイされたサンプル中の上で説明されたグリコフォーム又はバイオマーカーのうちの任意の１つのレベルが、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較して、増加することは、前記被験体が癌を有すること又は有するリスクがあることを示し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態において、被験体における癌の疾患状態を決定する上記の方法は、前記癌をスクリーニング、診断、予測、又はモニタリングするために実行され得る。いくつかの実施形態において、前記モニタリングは、前記癌の開始のモニタリングのため、前記癌を有するかもしくは発症するリスクの任意の変化のモニタリングのため、治療への応答のモニタリングのため、前記癌の再燃のモニタリングのため、又は前記癌の再発のモニタリングのためである。
【００１１】
さらなる態様において、本開示は、上で説明された方法又はそれらの実施形態のうちの任意の１つにおける使用のためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットはＰＳＡ結合剤及びＭＧＬを含み、そこで、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記ＭＧＬのいずれかは検出可能標識を含む。他のいくつかの実施形態において、キットは、ＣＥＡ結合剤並びにＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンを含み、そこで、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記レクチンのいずれかは検出可能標識を含む。いくつかのなおさらなる実施形態において、キットはＣＡ１９−９結合剤及びＤＣ−ＳＩＧＮを含み、そこで、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記ＤＣ−ＳＩＧＮのいずれかは検出可能標識を含む。いくつかのなおさらなる実施形態において、キットは、ＣＡ１５−３結合剤並びにＭＧＬ及びＷＧＡからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンを含み、そこで、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記１つ又は複数のレクチンのいずれかは検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、問題になっているレクチンは検出可能ナノ粒子上で固定化され得るか、又はそれは検出可能標識により標識され得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、キットは、任意にナノ粒子上で固定化されて提供される、ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、Ｅ−セレクチン、ＤＳＬ及びＧａｌ４からなる群から選択される１つ又は複数のレクチン、並びに／又は、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５及びＣＥＡからなる群から選択されるバイオマーカーへ結合する少なくとも１つの試薬をさらに含み得る。
【００１３】
いくつかのさらなる態様において、本発明は、被験体における癌の疾患状態を決定するための異なるレクチンの使用を提供する。より具体的には、前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬへ結合するＰＳＡのグリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における前立腺癌の疾患状態を決定するためのＭＧＬの使用；前記被験体から得られたサンプルを、ＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬを結合するＣＥＡグリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定するためのＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬの使用；前記被験体から得られたサンプルを、ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するＣＡ１９−９グリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における膵臓癌の疾患状態を決定するためのＤＣ−ＳＩＧＮの使用；並びに、前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬ、ＷＧＡ、ＤＳＬ、及び／又はＧａｌ４へ結合するＣＡ１５−３グリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における乳癌の疾患状態を決定するための、単独又は組み合わせのいずれかでのＭＧＬ又はＷＧＡの、任意にＤＳＬ及び／又はＧａｌ４と組み合わせた使用が、本明細書において提供される。これらの実施形態のうちの任意のものにおいて、問題になっているレクチンは、ナノ粒子上で固定化され得るか、又は検出可能標識により標識され得る。
【００１４】
本発明の他の目的、態様、実施形態、詳細及び利点は、以下の図、発明の概要、実施例及び従属請求項から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
以下において、本発明は、添付の図面を参照して好ましい実施形態を用いて、より詳しく記載されるだろう。
【００１６】
【図１】異なるアッセイフォーマットの図解の表示である。図１Ａは従来のＣＡ１５−３の免疫アッセイを図示し、そこでは、捕捉モノクローナル抗体及びトレーサーモノクローナル抗体は、ＣＡ１５−３のタンパク質コア及びシアル化された炭水化物エピトープをそれぞれ検出する。図１Ｂは組み合わせ免疫レクチンアッセイを図示し、そこでは、ＣＡ１５−３は特異的なモノクローナル抗体により捕捉され、Ｅｕ＋３−ナノ粒子上にコーティングされたレクチン（それはＣＡ１５−３のグリカン部分へ結合する）によりトレースされる。
【図２】Ａ）ビオチン化Ｍａ５５２モノクローナル抗体又はＢ）ビオチン化Ｍａ６９５モノクローナル抗体上で捕捉されたＣＡ１５−３へのレクチン−ナノ粒子（レクチン化（ｌｅｃｔｉｎｇ）−ＮＰ）の結合を示す。Ｘ軸は使用される異なるレクチン−ＮＰを示す一方で、Ｙ軸はシグナル対バックグラウンド比を示す。ＭＧＬレクチン及びＷＧＡレクチンのみが、ＢｒＣａ関連ＣＡ１５−３との有意な結合を示す。
【図３】ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイにおける回収率を実証する。単純なマトリックス（ＴＳＡ−ＢＳＡ）又は複雑なマトリックス（すなわち血清）のいずれか中に少量添加したＢｒＣａ関連ＣＡ１５−３による、並列のＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイの特異的なシグナルを比較した。優れた回収が、少量添加したバッファー及び少量添加したプールされた健康な男性の血清の両方で、優れた推定分析感度（１Ｕ／ｍｌ）で観察された（＞９５％）。
【図４】プールされ少量添加した健康な男性の血清におけるＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイについての用量応答曲線を示す。５〜２５０／ｍｌのＢｒＣａ細胞株からのＣＡ１５−３が、ビオチン化Ｍａ５５２モノクローナル抗体上で捕捉された。ＷＧＡ−ＮＰをトレーサーとして使用した。推定検出限界は、１Ｕ／ｍｌのＢｒＣａ関連ＣＡ１５−３であった。
【図５】捕捉モノクローナル抗体の交差反応性を実証する。抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体（ｂｉｏＭａ６９５（Ａ）又はｂｉｏＭａ５５２（Ｂ）のいずれか）が捕捉物として使用される場合に、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイは、ＯｖＣａ−ＣＡ１２５との交差反応性を示さない。抗ＣＡ１２５  ｂｉｏＯｖ１９７モノクローナル抗体が捕捉剤として使用された場合に、ＣＡ１２５ＭＧＬアッセイは、ＯｖＣａ関連ＣＡ１２５と比較して、ＢｒＣａ関連ＣＡ１５−３との１０倍低い結合を示す（Ｃ）。
【図６】乳癌（ＢＣ）患者と健康な対照（ＨＣ）との間の従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ（Ａ）及びＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ（Ｂ及びＣ）のボックスプロット分析を示す。４５名の異なるＢＣ患者からのすべての縦断的なＢＣサンプル（ｎ＝１９９）を、３１名のＨＣからのサンプルと比較した。捕捉剤として、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ１はＭａ５５２（Ｂ）に基づくが、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ２はＭａ６９６モノクローナル抗体（Ｃ）に基づく。ＢＣ群及びＨＣ群において測定された中央値濃度の間で何倍の差があるのかが、図内で与えられる。線は何倍の差があるかを表さない。
【図７】乳癌（ＢＣ）患者と健康な対照（ＨＣ）との間の従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ（Ａ）及びＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ（Ｂ及びＣ）のボックスプロットを示す。４５名の異なるＢＣ患者からの合計１９９の縦断的なサンプルの中の第１のサンプル（ｎ＝４５）を、３１名のＨＣと比較した。捕捉剤として、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ１はＭａ５５２（Ｂ）に基づくが、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ２はＭａ６９６モノクローナル抗体に基づく。ＢＣ群及びＨＣ群において測定された中央値濃度の間で何倍の差があるのかを示す。
【図８】健康な対照（ＨＣ、ｎ＝１８）及び乳癌患者（ＢＣ、ｎ＝４１）から得られた第１のサンプルの間のＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイのボックスプロットを示す。ＨＣとＢＣとの間の中央値において３．７倍の差がある。
【図９】ＢｒＣａ患者（ｎ＝４５）及び健康な対照（ｎ＝３１）の第１のサンプルを使用して生成された、すべての３つのＣＡ１５−３アッセイ（従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ「ＣＡ１５３ＩＡ１ｓｔ４５」、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ１「ＣＡ１５３ＭＧＬ１１ｓｔ４５」、及びＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ２「ＣＡ１５３ＭＧＬ２１ｓｔ４５」）についてのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ１が最も高く（０，８９７）、次にＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ２（０，８４８）、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイが最も低い（０，８０５）。
【図１０】ＢｒＣａ症例（ｎ＝４１）及び健康な女性の対照（ｎ＝１８）の血漿サンプルを使用して生成された、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ「ＣＡ１５３ＩＡ１ｓｔ４１」及びＣＡ１５−３ＷＧＡ「ＣＡ１５３ＷＧＡ１ｓｔ４１」アッセイについてのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ（０．８３３）よりも、ＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイ（０．８８０）がより高い。
【図１１】ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイとＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイとの間の相関性を実証する。ＢｒＣａ患者からのすべての４１の血漿サンプルにおいて、アッセイ間の低い相関性が観察され、こられのアッセイが捕捉されたＣＡ１５−３の異なるエピトープを認識することが指摘された。
【図１２】従来のＣＡ１５−３  ＩＡとＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイとの間の相関性を実証する。（Ａ）すべての（ｎ＝１９９）縦断的な乳癌患者サンプルに加えて（Ｂ）第１のサンプル（ｎ＝４５）において、アッセイ間の低い相関性が観察され、これらのアッセイが捕捉されたＣＡ１５−３の異なるエピトープを認識することが指摘された。
【図１３】従来のＣＡ１５−３  ＩＡとＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイとの間の相関性を実証する。ＢｒＣａ患者からの４１の血漿サンプルにおいて、アッセイ間の低い相関性が観察され、これらのアッセイが捕捉されたＣＡ１５−３の異なるエピトープを認識することが指摘された。
【図１４】転移性乳癌症例（ｎ＝５４）及び健康な女性の対照（ｎ＝２３）の血漿サンプルを使用した、実施例４の３つのアッセイ（すなわち従来のＣＡ１５−３アッセイ（ＡＵＣ＝０．８３３）、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ（ＡＵＣ＝０．８６５）、及びＣＡ１５−５ＷＧＡアッセイ（０．９３９））のＲＯＣ曲線及びＡＵＣを示す。
【図１５】実施例４の３つのアッセイ（すなわち従来のＣＡ１５−３アッセイ（ＡＵＣ＝０．８２６）、ＣＡ１５−３ＷＧＡＥｕ−キレート標識アッセイ（ＡＵＣ＝０．８９０）、及びＥｕナノ粒子ＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイ（０．９２６））のＲＯＣ曲線及びＡＵＣを示す。
【図１６】ＣＲＣ患者（サンプリング時に無治療及び治療下の両方）及び血漿ＣＥＡ＜５ｎｇ／ｍｌを有する健康な対照からの、従来のＣＥＡ免疫アッセイ（図１６Ａ）並びにＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎ糖鎖バリアントアッセイ（図１６Ｂ）及びＣＥＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイ（図１６Ｃ）の比較を示す。
【図１７】大腸炎及びＣＲＣの患者における従来のアッセイ及びレクチンＣＥＡアッセイにより測定されたＣＥＡレベルを示す（図１７Ａ）。図１７Ｂ中で、ＣＲＣ患者は２つのカテゴリー（フォローアップの終了時で生存していた患者及びフォローアップの間に死亡した患者）へと分類される。マン・ホイットニーのＵ検定でｐ＜０．０１：＊＊、ｐ＜０．０５：＊、及びｐ＞０．０５：・であった。短い水平なバーは中央値を示す。長い水平線は商業的なＣＥＡ免疫アッセイについての５ｎｇ／ｍｌのカットオフ、及び点線は異なる糖鎖バリアントＣＥＡアッセイについて予想されるカットオフレベルを示す。
【図１８】従来のＣＥＡ免疫アッセイへの比較における、ＭＧＬレクチンアッセイ、ＭＢＬレクチンアッセイ及びＤＣ−ｓｉｇｎレクチンアッセイの血漿ＣＥＡについてＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣを、結腸直腸癌の患者（ｎ＝２３）及び大腸炎の患者（ｎ＝１４）のＥＤＴＡ血漿ＣＥＡについて遂行した。破線は従来のＣＥＡ免疫アッセイ、及び実線はレクチンＣＥＡアッセイを示す。
【図１９】図１９Ａは、商業的なＣＡ１９−９免疫アッセイにより測定された血漿ＣＡ１９−９濃度（Ｕ／ｍＬ）を示す。３つの膵臓癌サンプルのみがカットオフの３７Ｕ／ｍＬを超えるＣＡ１９−９濃度を有していた。中央値のＣＡ１９−９濃度において、膵臓癌の患者（ｎ＝１０）と良性の対照（ｎ＝２７）との間で統計的有意差は観察されなかった。短い水平なバーは中央値ＣＡ１９−９値を示す。図１９Ｂは、ＣＡ１９−９レクチンナノ粒子アッセイにより測定された血漿糖鎖バリアントＣＡ１９−９（すなわちＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）の濃度（Ｕ／ｍＬ）を示す。血漿糖鎖バリアントＣＡ１９−９濃度は、膵臓癌及び良性の胃腸疾患のいくつかにおいて上昇する。１０名の膵臓癌患者のうちの８名は、カットオフの１０Ｕ／ｍＬを超える血漿糖鎖バリアントＣＡ１９−９濃度を有していた。膵臓癌患者（ｎ＝１０）と健康な対照に加えて良性の対照（ｎ＝２７）との間で中央値糖鎖バリアントＣＡ１９−９濃度における統計的有意差があった。短い水平なバーは中央値のＣＡ１９−９値を示す。
【図２０】ＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイによる異なるＰＳＡ形態からの用量応答曲線（三重検体からの測定された平均蛍光シグナル）を示す。ＬＮＣａＰ  ＰＳＡの較正曲線（◇）及び健康なドナーからの精漿ＰＳＡ（□）。
【図２１】組織学的に良性の前立腺組織及び癌性の前立腺組織からの溶解物中のＰＳＡ糖鎖バリアントを測定する、ＭＧＬ結合ナノ粒子からの蛍光シグナルを示す。良性の組織に比較して、癌組織中でＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントの統計的に有意な増加があった。
【図２２】前立腺癌患者（ｎ＝７４）、ＢＰＨ患者（ｎ＝６９）及び健康な若い男性（ｎ＝１１）からの尿ＰＳＡからのＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイの全ＰＳＡ補正蛍光シグナルを示す。ｔＰＳＡ補正蛍光シグナルを、サンプル中のｔＰＳＡ濃度によって割ったＥｕナノ粒子から測定された蛍光として計算した。健康な若い男性（ｎ＝１１）と、陰性ＰＣＡ生検の男性又はグリーソンスコア６の前立腺癌の男性（ｎ＝６９）と、グリーソンスコア７〜９の前立腺癌患者（ｎ＝７４）と、グリーソンスコア９の前立腺癌患者（ｎ＝１１）との間で、尿ＰＳＡからのＭＧＬ結合ナノ粒子のｔＰＳＡ補正蛍光シグナルを比較した。１０／２５／５０／７５／９０番目のパーセンタイル値を図中でマークする。
【図２３】ＰＳＡＷＧＡ（図２３Ａ）、ＰＳＡＧＡｌ４（図２３Ｂ）及びＰＳＡデクチン２（図２３Ｃ）の糖鎖バリアントアッセイにおける、３つの重複検体からの平均蛍光シグナルとしての蛍光シグナルを示す。若い男性（ｎ＝６）と、陰性ＰＣａ生検の男性又はグリーソンスコア６のＰＣａの男性（ｎ＝１４）と、臨床的に有意なＰＣａの男性（ｎ＝１７）との間で、尿ＰＳＡからのＷＧＡ結合ナノ粒子の蛍光シグナルを比較した（図２３Ａ）。若い男性（ｎ＝９）と、陰性ＰＣａ生検の男性又はグリーソンスコア６のＰＣａの男性（ｎ＝１９）と、臨床的に有意なＰＣａの男性（ｎ＝２６）との間で、尿ＰＳＡからのＧＡｌ４結合ナノ粒子の蛍光シグナルを比較した（図２３Ｂ）。若い男性（ｎ＝９）と、陰性ＰＣａ生検の男性又はグリーソンスコア６のＰＣａの男性（ｎ＝９）と、臨床的に有意なＰＣａの男性（ｎ＝２６）との間で、尿ＰＳＡからのＧＡｌ４結合ナノ粒子の蛍光シグナルを比較した（図２３Ｃ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、既知の癌バイオマーカーのグリコフォームを、同じバイオマーカーの他の種を上回る改善された感度により同定することを目指す研究に、少なくとも部分的に基づく。この目的に従って、本開示は、特に前記癌をスクリーニング、診断、予測、又はモニタリングするための、癌を患うこと又は患うリスクがあることが疑われる被験体における癌状態を決定する手段及び方法を提供する。具体的な実施形態によれば、前記癌は、乳癌、消化管癌（結腸直腸癌又は膵臓癌等）又は前立腺癌である。
【００１８】
本明細書において使用される時、「又は」という用語は、「及び」及び「又は」両方の意味を有する（すなわち「及び／又は」）。さらに、単数名詞の意味は複数名詞の意味を包含し、したがって単数の用語は特別の定めのない限りその複数形の意味も保有し得る。換言すれば、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という用語は１つ又は複数を意味し得る。
【００１９】
本明細書において使用される時、「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、及びいくつかの実施形態において、乳癌に関連するような実施形態において、最も好ましくは女性であるが、他のいくつかの実施形態において、前立腺癌に関連するような実施形態において、最も好ましくは男性を指す。問題になっている実施形態に依存して、前記被験体は、診断の有無にかかわらず癌を患い得るか、癌を患うことが疑われるか、癌のリスクがあるか、又は癌について既に治療され得る。本明細書において、「ヒト被験体」、「患者」及び「個体」という用語は交換可能である。
【００２０】
本明細書において使用される時、「サンプル」という用語は、組織サンプル（乳房組織から採取された生検サンプル等）及び体液（被験体から採取された腹水、尿、血液、血漿、血清及び腹膜腔液等）のサンプルを指す。いくつかの実施形態において、前記組織サンプルは、ホルマリン固定組織サンプル又はラフィン包埋組織サンプルであり得る。一般的に、被験体から分析される予定のサンプルを得ることは、被験体の癌の疾患状態を決定する本方法の一部ではない。血液、血清又は血漿のサンプルは、本方法及びそのすべての実施形態において使用される、最も好ましいサンプルタイプである。
【００２１】
「サンプル」という用語は、それらの入手後に任意の適切な手法（遠心分離、濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー、試薬による処理、洗浄、又はサンプルのある特定の構成要素（細胞集団等）についてのエンリッチが挙げられるがこれらに限定されない）において、操作又は処理されたサンプルも包含する。
【００２２】
本明細書において使用される時、「バイオマーカー」及び「マーカー」という用語は交換可能であり、外見上健康な被験体から採取された匹敵するサンプルと比較して、癌を患う被験体から採取されたサンプル中で差異的に存在する分子を指す。したがって、バイオマーカーは癌バイオマーカーと称され得る。好ましい癌バイオマーカーとしては、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９及びＰＳＡ、並びに特にそのある特定のレクチン結合グリコフォームが挙げられる。本明細書において使用される時、「ＣＡ１５−３」、「ＣＡ１２５」、「ＣＥＡ」、「ＣＡ１９−９」、及び「ＰＳＡ」という用語は、それぞれ従来のＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、及びＰＳＡのタンパク質抗原を指し、それらは従来の免疫アッセイによって検出可能である。本明細書において使用される時、ＣＡ１５−３レクチン、ＣＡ１２５レクチン、ＣＥＡレクチン、ＣＡ１９−９レクチン、及びＰＳＡレクチンという用語は、これらのバイオマーカーのレクチン結合グリコフォームを指す。一例として、「ＣＡ１５−３ＷＧＡ」という用語は、ＷＧＡへ結合するＣＡ１５−３のグリコフォームを指す。
【００２３】
２つ以上のバイオマーカーのレベルの査定を考慮する実施形態において、癌の疾患状態が決定される予定の被験体から得られた同じか又は異なるサンプルは、各々の査定のために使用され得る。前記異なるサンプルは同じタイプ又は異なるタイプであり得る。
【００２４】
本明細書において使用される時、「レベル」という用語は、特別の指示のない限り「量」及び「濃度」と交換可能である。
【００２５】
バイオマーカーの検出されたレベルが、前記バイオマーカーと関連する疾患の存在、又は存在のリスクを表すかどうかを決定するために、関連する対照におけるそのレベルを決定しなければならない。一旦対照レベルが分かったならば、決定したマーカーレベルはそれと比較することができ、差異の有意性は標準的な統計的手法を使用して査定することができる。いくつかの実施形態において、決定したバイオマーカーレベルと対照レベルとの間の統計的有意差は、問題になっている疾患を表す。いくつかのさらなる実施形態において、対照と比較される前に、バイオマーカーレベルは標準的な方法を使用して正規化される。
【００２６】
分析される予定のサンプル中のバイオマーカーのアッセイレベルを、関連する対照のそのレベル又は既定の閾値と比較することは、いくつかの実施形態において、計算デバイスのプロセッサによって遂行され得る。
【００２７】
計算デバイスのプロセッサが前記比較のために使用されるかどうかにかかわらず、バイオマーカーのアッセイレベルのレベルは、サンプル中のバイオマーカーのレベルが、例えば既定の閾値レベル又は対照サンプル中のバイオマーカーのレベルの少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍又は３０倍であるならば、少なくともいくつかの実施形態において「増加した」又は「より高い」として決定される。いくつかの実施形態において、分析される予定のサンプル中のバイオマーカーのレベルと既定の閾値レベル又は対照サンプル中のバイオマーカーのレベルとの間の差は、適切な診断結果、予後結果、予測結果を提供するために統計的に有意でなければならない。
【００２８】
癌の疾患状態が決定される予定の被験体、又は癌についてスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングされる予定の被験体から得られたサンプル中のバイオマーカーの濃度は、関連する対照サンプルのその濃度又は既定の閾値と比較して、その検出された濃度がより低いか、本質的に同じであるか、又は本質的に変更されなかったならば、「増加しなかった」又は「正常である」と判断される。
【００２９】
本明細書において使用される時、「対照」という用語は、外見上健康な個体、もしくは外見上健康な個体のプールから得られた対照サンプルを指し得るか、又は既定の閾値（すなわちカットオフ値、それは問題になっている疾患の存在又は非存在を表す）を指し得る。適切な閾値の決定のための統計的方法は、当業者に容易に明らかである。閾値は、必要であるならば、同じ年齢の被験体、人口層特色、及び／又は疾患状態などのサンプルから決定され得る。閾値は、問題になっている疾患に罹患しない単一の個体を起源とし得るか、又は２名以上のかかる個体からプールされた値であり得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、「対照サンプル」という用語は、癌の疾患状態が決定される予定の同じ被験体から得られるが、疾患状態決定のタイムポイントとは異なるタイムポイントで得られたサンプルを指す。かかる異なるタイムポイントの非限定例としては、疾患の診断前の１つ又は複数のタイムポイント、疾患の診断後の１つ又は複数のタイムポイント、疾患の治療前の１つ又は複数のタイムポイント、疾患の治療の間の１つ又は複数のタイムポイント、及び疾患の治療後の１つ又は複数のタイムポイントが挙げられる。典型的には、乳癌の疾患状態決定の目的が前記疾患をモニタリングすること、特に疾患の開始もしくは疾患のリスク発生、治療への応答、疾患の再燃又は疾患の再発をモニタリングすることである場合に、同じ被験体から得られたかかる対照サンプルが使用される。
【００３１】
本明細書において使用される時、「外見上健康な」という用語は、癌の徴候を示さずしたがって癌に罹患していないと思われるか、又は癌を発症しないと予測される、個体、又は個体のプールを指す。
【００３２】
本明細書において使用される時、「疾患を表す」という用語は、バイオマーカーへ適用された場合に、最小９５％で信頼レベルを設定するルーチンの統計的手法を使用して、前記疾患、又は前記疾患のステージの診断に役立ち、前記疾患の有る被験体、又は前記疾患のステージにおいて検出されたレベルが、前記疾患の無い被験体、又は前記疾患の別のステージよりも、有意により頻繁に見出されるような、レベルを指す。好ましくは、疾患を表すレベルは、疾患を有する被験体のうちの少なくとも８０％で見出され、疾患を有していない被験体のうちの１０％未満で見出される。より好ましくは、疾患を表すレベルは、疾患を有する被験体のうちの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はそれを超えて見出され、疾患を有していない被験体のうちの１０％未満、８％未満、５％未満、２．５％、又は１％未満で見出される。
【００３３】
ルーチンの診断で使用される既存のＣＡ１５−３免疫アッセイは、ＣＡ１５−３の異なるエピトープを認識する２つの異なるモノクローナル抗体による血清又は血漿中のＣＡ１５−３抗原レベルの決定に基づく。いくつかの非限定実施形態において、抗体のうちの１つはタンパク質エピトープについて特異的であり得、その一方で他の抗体は炭水化物エピトープ（シアル化された炭水化物エピトープ等）について特異的であり得る。かかる従来の免疫アッセイ（「ＣＡ１５−３抗原濃度についてサンプルをアッセイする」こととして本明細書において参照される）は、いくつかの異なる販売業者から市販で入手可能である。したがって、「ＣＡ１５−３」という用語は、従来の免疫アッセイによって認識可能なＣＡ１５−３種を指す。いくつかの実施形態において、カットオフレベル（２０Ｕ／ｍｌ、２２Ｕ／ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ又は３５Ｕ／ｍｌ等）が用いられ得る。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態に結びつく実験において、２８の異なる植物のパネル又は試験されたヒトレクチンの中で、２つのレクチン（すなわちマクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）及び小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ））が、乳癌細胞株に由来するＣＡ１５−３に対して著しく高い反応性を示した。チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＬ）及びガレクチン−４（Ｇａｌ４）も、癌性ＣＡ１５−３に対してある程度の反応性を示した。
【００３５】
簡潔さのために、「ＣＡ１５−３レクチン」は、ＣＡ１５−３の任意の１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームを指す一般的な用語として使用され、例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４（それらはそれぞれＣＡ１５−３のＭＧＬ結合種、ＷＧＡ結合種、ＤＳＬ結合種、及びＧａｌ４結合種を指す）が挙げられる。
【００３６】
乳癌由来の単離されたＣＡ１５−３により得られた結果の臨床上の適用可能性は、転移性乳癌の患者から得られたサンプルの小さなコホートにおいて検証された。ＣＡ１５−３ＭＧＬ又はＣＡ１５−３ＷＧＡについてサンプルをアッセイすることによって、乳癌の被験体は、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイの使用によるよりも高い感度で、健康な対照から識別され得る。さらに、健康な対照と乳癌患者との間で中央値が何倍の差があるのかは、既存のＣＡ１５−３免疫アッセイで２倍だけであり、その一方でＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイで＞２００倍であった。異なるコホートにおいて、健康な対照と乳癌患者との間で中央値が何倍の差があるのかは、既存のＣＡ１５−３免疫アッセイで２．８倍だけであり、その一方でＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイで＞４００倍であった。いくつかの実施形態において、ＣＡ１５−３ＷＧＡは、使用されるのに好ましいレクチンである。
【００３７】
異なるバイオマーカーの性能を比較する１つ手法は、ＲＯＣ曲線を描き、それらのＡＵＣ値、偽陽性率、偽陰性率、及び成功率を比較することである。実験部分において実証されるように、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイの偽陰性率は従来のアッセイよりも低かった。さらに、より高いＡＵＣ値が、従来のＣＡ１５−３アッセイよりもＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ及びＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイの両方において得られた。
【００３８】
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を利用して、当業者に周知であるように、マーカーの感度と特異度との間のトレードオフを実証することができる。感度はマーカーが疾患を検出する能力の尺度であり、特異度はマーカーが疾患の非存在を検出する能力の尺度である。ＲＯＣ曲線の水平方向のＸ軸は１−特異度を示し、それは偽陽性の率に伴って増加する。ＲＯＣ曲線の垂直方向のＹ軸は感度を示し、それは真陽性の率に伴って増加する。したがって、選択された特定のカットオフについて、特異度及び感度の値が決定され得る。換言すれば、ＲＯＣ曲線上のデータポイントは、様々な決定境界での真陽性及び偽陽性の分類の比率を示す。至適の結果は、真陽性比率が１．０に接近し、偽陽性の比率が０．０に接近するように得られる。しかしながら、カットオフを特異度を増加させるように変化させるにつれて、感度は通常低減し、その逆も成立する。
【００３９】
本明細書において使用される時、「偽陽性」という用語は、罹患していない被験体を罹患した被験体として不正確に分類する試験結果を指す。同様に、「偽陰性」は、罹患した被験体を罹患していない被験体として不正確に分類する試験結果を指す。
【００４０】
本明細書において使用される時、「真陽性」は、疾患を有する被験体を罹患した被験体として正確に分類する試験結果を指す。同様に、「真陰性」は、罹患していない被験体を罹患していないとして正確に分類する試験結果を指す。
【００４１】
上記のものに従って、「成功率」という用語は、陽性の結果の罹患した個体のパーセンテージで表現した比率を指す、一方で、「偽陽性率」という用語は、陽性の結果の罹患していない個体のパーセンテージで発現した比率を指す。
【００４２】
ＲＯＣ曲線下の面積（しばしばＡＵＣと称される）は、疾患被験体の正確な同定におけるマーカーの有用性の尺度である。したがって、ＡＵＣを使用して試験の有効性を決定することができる。１の面積は理想の試験を示し、０．５の面積は価値がない試験を示す。診断試験又は予測試験の正確性の分類のための従来の大まかな指針は以下の通りである。０．９〜１のＡＵＣ値は優れた診断力又は予後予測力の有る試験を示し、０．８０〜０．９０のＡＵＣ値は良好な診断力又は予後予測力の有る試験を示し、０．７０〜０．８０のＡＵＣ値は適正な診断力又は予後予測力の有る試験を示し、０．６０〜０．７０のＡＵＣ値は不十分な診断力又は予後予測力の有る試験を示し、０．５０〜０．６０のＡＵＣ値は不合格の診断力又は予後予測力の有る試験を示す。
【００４３】
ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイは、互いに又は従来の免疫アッセイと良好に相関しなかった。したがっていくつかの実施形態において、これらのアッセイを組み合わせて使用してそれらの性能を相補することは有利であろうことが意図される。
【００４４】
上記のものに従って、本発明は、前記被験体から得られたサンプルを、ＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡについてアッセイすることによって、被験体における乳癌状態を決定する方法を提供する。前記サンプル中の前記ＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡのレベルが、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較して、増加することは、前記被験体が乳癌を有すること又は有するリスクがあることを示す。その一方で、前記サンプル中の前記ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡの両方のレベルが、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較して、増加しないか又は正常であることは、前記被験体が乳癌に関して外見上健康であること、又は乳癌を有するかもしく発症するリスクがないことを示す。ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ及びＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイの結果が行われた臨床分析において良好に相関しなかったので、ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡの両方についてのアッセイを実行することによって、方法の感度が改善され得ることが意図される。
【００４５】
上記の方法のいくつかの実施形態において、乳癌の疾患状態が決定される予定の被験体から得られたサンプルは、疾患状態の決定の性能を改善するために、ＣＡ１５−３ＤＳＬ及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４のうちの１つ又は両方についてさらにアッセイされ得る。したがって、前記サンプルは、ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＤＳＬ；ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４；ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＡ１５−３ＤＳＬ；ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４；ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４；ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４；又はＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４のいずれかについてアッセイされ得る。
【００４６】
本明細書において開示される任意の態様及び実施形態において、ＣＡ１５−３レクチンについての既定の閾値は、約２Ｕ／ｍｌ〜約３Ｕ／ｍｌ（例えば約２．５Ｕ／ｍｌ）であり得る。しかしながら、所望の感度及び特異性に依存して、ＣＡ１５−３レクチンについての他の既定の閾値が使用され得る。他のかかる閾値の非限定例としては、約２Ｕ／ｍｌ〜約７Ｕ／ｍｌ、約２Ｕ／ｍｌ〜約６Ｕ／ｍｌ、約２Ｕ／ｍｌ〜約５Ｕ／ｍｌ、及び約２Ｕ／ｍｌ〜約４Ｕ／ｍｌの範囲内に収まる任意の値が挙げられる。スクリーニングの目的、及びアッセイの臨床感度を最大化する必要がある他の使用のために、約０．５〜２Ｕ／ｍｌ（例えば約１Ｕ／ｍｌ又は１．５Ｕ／ｍｌ）のような低い閾値も使用され得る。その一方で、診断、又はアッセイの臨床特異性を最大化する必要がある他の実施形態において、約５〜２０Ｕ／ｍｌ（例えば約１０Ｕ／ｍｌ又は１５Ｕ／ｍｌ）のような高い閾値も使用され得る。しかしながら、これらの範囲も検出技法の詳細に依存して変動し得る。
【００４７】
ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ又はＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイと従来のＣＡ１５−３免疫アッセイとの間の相関性が低いので、方法中にさらなるバイオマーカーとしてＣＡ１５−３を包含することによっても、方法の感度が改善され得ることが意図される。したがって、いくつかの実施形態において、被験体の乳癌の疾患状態を決定する方法は、前記サンプルから得られたサンプルを、上で説明された１つ又は複数のＣＡ１５−３レクチン種についてアッセイすること、及び前記被験体から得られた同じサンプル又は異なるサンプルをＣＡ１５−３濃度について従来通りにアッセイすることを含み得る。かかる方法において、ＣＡ１５−３レクチン種のうちの少なくとも１つのレベルが増加すること、又はＣＡ１５−３のレベルが増加することは、前記被験体が乳癌を有すること又は有するリスクがあることを示すだろう。その一方で、ＣＡ１５−３のレベルが増加しないか又は正常であることと組み合わせて、すべてのアッセイされたＣＡ１５−３レクチン種のレベルが増加しないか又は正常であることは、前記被験体が乳癌を有していないこと又は有するリスクないこと（すなわち外見上健康であること）を示すだろう。所望の性能（例えば感度及び特異性に関して）に依存して、方法は、
ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１５−３；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１５−３；又は
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１５−３
のいずれかについて、同じサンプル又は異なるサンプルをアッセイすることを含み得る。
【００４８】
ムチン１６又はＭＵＣ１６としても公知であるヒト癌抗原１２５（ＣＡ１２５）は複雑な膜貫通糖タンパク質であり、上皮性卵巣癌について最も広く使用されるバイオマーカーである。しかしながら、その発現は、他の癌（乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌及び肝臓癌が挙げられる）においても上昇し得る。したがって、ＣＡ１２５の１つ又は複数のレクチン結合グリコフォーム（本明細書においてＣＡ１２５レクチンと集合的に称される）は、本方法のいくつかの実施形態において、被験体の乳癌の疾患状態の決定のためのさらなるマーカーとして使用され得る。被験体の乳癌の疾患状態（感度又は特異性等）の決定における方法の所望の性能に依存して、前記被験体から得られたサンプルは、
ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１２５レクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１２５レクチン；又は
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＡ１２５レクチン
のいずれかについてアッセイされ得る。
【００４９】
好ましくは、ＣＡ１２５レクチンはＣＡ１２５ＭＧＬであるが、それはＣＡ１２５のレクチン結合種のうちの任意の１つ又は複数でもあり得る。換言すれば、ＣＡ１２５レクチンという一般的な用語における前記「レクチン」は、任意の１つ又は複数のＣＡ１２５結合レクチンを指し、そこで、前記レクチンは、ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、及びＥ−セレクチンからなる群から選択される。ＣＡ１５−３レクチン及びＣＡ１２５レクチンの、上で開示される組み合わせのうちの任意の１つについてアッセイすることは、従来のＣＡ１５−３及び／又はＣＡ１２５についてアッセイすることをさらに含み得る。いくつかの非限定実施形態において、３５Ｕ／ｍｌのカットオフ値はＣＡ１２５について用いられ得る。
【００５０】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、特に大腸の癌（結腸直腸癌）について広く使用される糖タンパク質バイオマーカーである。しかしながら、その発現は、他の多くの癌（乳癌、胃腸管の癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、及び前立腺癌が挙げられる）においても上昇する。したがって、ＣＥＡの１つ又は複数のレクチン結合グリコフォーム（本明細書においてＣＥＡレクチンと集合的に称される）は、本方法のいくつかの実施形態において、被験体の乳癌の疾患状態の決定のためのさらなるマーカーとして使用され得る。被験体の乳癌の疾患状態（感度又は特異性等）の決定における方法の所望の性能に依存して、前記被験体から得られたサンプルは、
ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＥＡレクチン；又は
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、及びＣＥＡレクチン
のいずれかについてアッセイされ得る。
【００５１】
好ましくは、ＣＥＡレクチンは、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及び／又はＣＥＡＭＧＬであるが、それはＣＥＡのレクチン結合種のうちの他の１つ又は複数であり得る。換言すれば、ＣＥＡレクチンという一般的な用語における前記「レクチン」は、任意の１つ又は複数のＣＥＡ結合レクチンを指し、そこで、前記レクチンは、ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、及びＥ−セレクチンからなる群から選択される。ＣＡ１５−３レクチン及びＣＥＡレクチンの、上で開示される組み合わせのうちの任意の１つについてアッセイすることは、従来のＣＡ１５−３及び／又はＣＥＡについてアッセイすることをさらに含み得る。いくつかの非限定実施形態において、約２．５μｇ／ｌ〜約１０μｇ／ｌ（２．７μｇ／ｌ又は５μｇ／ｌ等）の範囲の任意のカットオフ値は、ＣＥＡについて用いられ得る。
【００５２】
さらに、いくつかの実施形態において、被験体の乳癌の疾患状態を決定する本方法は、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１２５レクチン及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；
ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン；又は
ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチン
のいずれかについて、前記被験体から得られたサンプルをアッセイすることを含み得る。
【００５３】
好ましくは、ＣＡ１２５レクチンはＣＡ１２５ＭＧＬであり、ＣＥＡレクチンはＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬであるが、ＣＡ１２５レクチン及びＣＥＡレクチンという一般的な用語中の前記「レクチン」は、互いに独立して、任意の１つ又は複数のＣＡ１２５結合レクチン又はＣＥＡ結合レクチンを指し、そこで、前記レクチンはそれぞれ、ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、及びＥ−セレクチンからなる群から選択される。ＣＡ１５−３レクチン、ＣＡ１２５レクチン、及びＣＥＡレクチンの、上で開示される組み合わせのうちの任意の１つについてアッセイすることは、従来のＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、及び／又はＣＥＡについてアッセイすることをさらに含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、被験体の乳癌の疾患状態を決定する本方法は、
ＣＥＡＭＢＬ
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、
ＣＥＡＭＧＬ、
ＣＥＡＭＢＬ及びＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、
ＣＥＡＭＢＬ及びＣＥＡＭＧＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＥＡＭＧＬ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及びＣＥＡＭＧＬ、
ＣＥＡＭＢＬ及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＭＢＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ；
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＭＧＬ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４；
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＭＧＬ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４；
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＤＳＬ、
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４、又は
ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、及びＣＡ１５−３ＧＡＬ４
について、前記被験体から得られたサンプルをアッセイすることを含み得る。
【００５５】
上で説明されたバイオマーカーの組み合わせのうちの任意の１つについてサンプルをアッセイすることは、１つ又は複数のＣＡ１２５レクチン種（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）、１つ又は複数のＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）種、従来のＣＥＡ、従来のＣＡ１５−３、従来のＣＡ１２５、及び従来のＣＡ１９−９からなる群から選択される、１つ又は複数の乳癌に関連するバイオマーカーについてもアッセイすることをさらに含み得る。
【００５６】
より一般的には、被験体の乳癌の疾患状態を決定する本方法は、いくつかの実施形態において、前記被験体から得られたサンプルを、ＣＥＡレクチン（例えばＣＥＡＭＢＬＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬ）、ＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）、及びＣＡ１５−３レクチン（例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡ、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ及び／又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４と組み合わせて）からなる群から選択されるバイオマーカーのうちの任意の１つ又は複数のレクチン結合種についてアッセイすること、並びに任意にサンプルを、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５及びＣＡ１５−３からなる群から選択される１つ又は複数の従来の乳癌関連バイオマーカーについてもアッセイすることを含み得る。
【００５７】
上で説明された実施形態のうちの任意のものにおいて、被験体における乳癌の疾患状態を決定する方法は、乳癌がデノボであろうと、再発性の出現であろうと、疑いであろうとも、乳癌をスクリーニング、診断、予後予測、及び／又はモニタリングする方法としてより具体的に定められ得る。
【００５８】
上記のものに従って、本方法は、いくつかの実施形態において、乳癌を診断すること、すなわち被験体が乳癌を有するかどうか、又は有するかもしくは発症するリスクがあるかどうかを決定することを対象とする。これは、乳癌の存在又はリスクが最終的に決定されないが、そのさらなる診断検査が保証される事例を包含することも意図される。かかる実施形態において、方法それ自体は、被験体における乳癌の存在もしくは非存在又はリスクの決定要因ではないが、さらなる診断検査が必要であるか又は有益だろうということが指摘され得る。したがって、本方法は、被験体における乳癌の存在もしくは非存在又はリスクの最終決定のために１つ又は複数の他の診断方法と組み合わせられ得る。他のかかる診断方法は当業者に周知である。
【００５９】
非侵襲性であり、尿サンプル及び血清サンプルの分析に好適であるので、本方法及びその様々な実施形態は、乳癌を有する被検体又は有するかもしくは発症するリスクがある被験体を同定するために、集団検診プロトコールの中へ容易に組み込まれ得る。これは、乳癌の早期診断だけでなく、中年期以降に乳癌を発症する同定されたリスクの増加の有る被験体における乳癌の開始についての積極的監視も可能にするだろう。さらに、乳癌の早期検出は、治癒のチャンスが最も高い時の疾患の早期治療を可能にするだろう。
【００６０】
本方法及びその様々な実施形態は、診断目的だけでなく、乳癌の予後もしくは転帰の予測、又は乳癌の開始、乳癌の任意のリスクの発生、被験体の乳癌からの回復もしくは生存、疾患の任意の可能性の有る再燃もしくは再発、又は治療への応答のモニタリングのためにも使用され得る。いくつかの実施形態において、方法は、上で説明された１つ又は複数のＣＡ１５−３レクチン種のレベルを、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５レクチン、ＣＡ１２５、ＣＥＡレクチン及びＣＥＡからなる群から選択される１つ又は複数のさらなるバイオマーカーのレベルを上で記載したように同時に比較すること有り又は無しで、異なるタイムポイントで同じ被験体から得られた１つ又は複数の他のサンプル中のそれぞれのレベルと比較することによって前記被験体における乳癌をモニタリングすることを含む。モニタリングにおいて用いられ得るサンプルは、乳癌の診断後、並びに／又は乳癌を軽減もしくは治癒させる治療法的介入（例えば外科手術、放射線療法、化学療法、他の好適な治療処置、又はその任意の組み合わせによる）の前、その間、及びその後の異なるタイムポイントで収集されたサンプルが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記モニタリングは、異なるタイムポイントでアッセイするステップを少なくとも２回反復することによって実行され、そこで、前記タイムポイントは、上で説明されたタイムポイントから互いに独立して選択される。いくつかの実施形態において、モニタリングは乳癌の治療の間もしくはその後に実行され、及び／又は、バイオマーカーのうちの少なくとも１つのレベルが、同じ被験体から得られた１つ又は複数の早期サンプルよりも高いか、又は関連する対照よりも高いかもしくは既定の閾値を超えるならば、方法は、乳癌の再燃もしくは再発を有するとして、又は乳癌の再燃もしくは再発のリスクがあるとして、前記被験体を決定することを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本方法は、乳癌の早期診断、並びに乳癌の再燃、再発及び進行の早期検出のために特に好適である。したがって、ＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡは、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５レクチン、ＣＡ１２５、ＣＥＡレクチン及びＣＥＡからなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーと上で記載したように組み合わせて、乳癌の再燃、再発及び／又は進行に加えて、乳癌についての早期腫瘍マーカーとして役立ち得る。したがって、本方法及び本明細書において開示される任意のバイオマーカーの組み合わせは、診断、予後予測及びモニタリングの目的だけでなく、乳癌について無症候の女性又は乳癌を発症するリスクのスクリーニングのためにも使用され得る。
【００６２】
いくつかの態様において、本開示は、乳癌以外の被験体の疾患状態を決定するためのバイオマーカーとしての、ＣＡ１５−３レクチン（好ましくはＣＡ１５−３ＭＧＬ）の使用も提供する。本発明者は、上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）の被験体もしくは子宮内膜症の被験体のいずれかとして、又は外見上健康であるとして、被験体を正確に同定するために、ＣＡ１５−３ＭＧＬバイオマーカーが使用され得るという実験的な証拠を有する。したがって、本開示は、被験体のＥＯＣの疾患状態を決定するための、又はＥＯＣを診断、予後予測、もしくはモニタリングするためのバイオマーカーとしての、ＣＡ１５−３レクチン（好ましくはＣＡ１５−３ＭＧＬ）の使用を提供する。被験体におけるＥＯＣの疾患状態を決定する方法に加えて、被験体におけるＥＯＣを診断、予後予測、又はモニタリングする方法も提供され、そこで、方法は、前記被験体から得られたサンプルをＣＡ１５−３レクチンについて（好ましくはＣＡ１５−３ＭＧＬについて）アッセイすることを含む。前記ＣＡ１５−３レクチン（好ましくは前記ＣＡ１５−３ＭＧＬ）のレベルの増加は、前記被験体がＥＯＣを有するか、又は有するリスクがあることを示す。任意に、前記ＣＡ１５−３レクチン（好ましくは前記ＣＡ１５−３ＭＧＬ）は、１つもしくは複数の従来の乳癌関連バイオマーカー（ＣＡ１２５、ＣＥＡ及びＣＡ１５−３が挙げられるがこれらに限定されない）、及び／又は１つもしくは複数のそのレクチン結合種（ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＢＬが挙げられるがこれらに限定されない）との任意の組み合わせで、使用され得る。したがって、被験体におけるＥＯＣの疾患状態を決定するか、又は被験体におけるＥＯＣをスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングする方法は、前記被験体から得られたサンプルを、上で説明されたさらなるバイオマーカーのうちの１つ又は複数についてアッセイすることをさらに含み得る。乳癌に関して本明細書において開示される実施形態の任意の詳細は、本明細書において繰り返されなくても、ＥＯＣに関する実施形態に適用される。
【００６３】
いくつかのさらなる実施形態において、乳癌に関して開示される任意のバイオマーカーの組み合わせは、被験体のＥＯＣの疾患状態を決定するために、又は被験体におけるＥＯＣをスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために使用され得る。
【００６４】
他のいくつかの態様において、本開示は、より詳細に以下に例示されるように、消化管癌（結腸直腸癌等）及び膵臓癌と関連するバイオマーカーの様々なレクチン結合種の複数の使用を提供する。さらに、被験体における消化管癌の状態を決定する方法に加えて、被験体における消化管癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングする方法が提供される。乳癌に関して本明細書において開示される実施形態の任意の詳細は、本明細書において繰り返されなくても、消化管癌に関する実施形態に適用される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本開示は、被験体の結腸直腸癌の疾患状態を決定するための、又は前記被験体における結腸直腸癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくモニタリングするためのバイオマーカーとしての、ＣＡ１５−３レクチン（例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡ、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ及び／又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４と組み合わせて）の使用も提供する。被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定する方法に加えて、被験体における結腸直腸癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングする方法も提供され、そこで、方法は、前記被験体から得られたサンプルを前記ＣＡ１５−３レクチンについてアッセイすることを含む。前記ＣＡ１５−３レクチン種のレベルが増加すること、又はＣＡ１５−３のレベルが増加することは、前記被験体が結腸直腸癌を有すること又は有するリスクがあることを示すだろう。任意に、前記ＣＡ１５−３レクチンは、１つ又は複数の従来の結腸直腸癌関連バイオマーカー（ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５及びＣＡ１５−３が挙げられるがこれらに限定されない）、並びに／又は１つ又は複数のそのレクチン結合種（ＣＥＡレクチン（例えばＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬ）、ＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）、及びＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）が挙げられるがこれらに限定されない）との任意の組み合わせで使用され得る。したがって、被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定するか、又は被験体における結腸直腸癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングする方法は、前記被験体から得られたサンプルを、上で説明されたさらなるバイオマーカーのうちの１つ又は複数についてアッセイすることをさらに含み得る。
【００６６】
本発明者による実験的な証拠によれば、ＭＧＬ、樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、及びマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）は、複数の結腸直腸癌由来ＣＥＡ調製物と高い反応性を示す。したがって、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬは、上で説明された結腸直腸癌診断の様々な態様における使用のための特に強力なバイオマーカーであり、単独で、又は１つもしくは複数の従来の結腸直腸癌関連バイオマーカー（ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、及びＣＡ１５−３が挙げられるがこれらに限定されない）、並びに／又は、ＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）、及びＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）、ＣＡ１５−３レクチン（例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡ、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ及び／又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４と組み合わせて）、及びさらなるＣＥＡレクチン種が挙げられるがこれらに限定されないものからなる群から選択される、１つもしくは複数のそのレクチン結合種との任意の組み合わせのいずれかで使用され得る。
【００６７】
実施例５において実証されるように、異なる糖鎖バリアントＣＥＡアッセイ（すなわちＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎ、ＣＥＡＭＧＬ又はＣＥＡＭＢＬについてのアッセイ）は、ＣＥＡ腫瘍マーカーの結腸直腸癌特異性を改善することができる。正常な範囲中の血漿ＣＥＡレベルを有するＣＲＣ患者及び健康な対照は、レクチン糖鎖バリアントＣＥＡアッセイにより差異的に検出され、ＣＲＣにおいてＣＥＡグリコフォームの量は増加した。偽陰性の数は、ＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎ、ＣＥＡＭＧＬ又はＣＥＡＭＢＬアッセイを使用して有意に減少した。したがって、結腸直腸癌に関連する本方法及び使用のいくつかの好ましい実施形態は、結腸直腸癌の疾患状態が決定される予定の被験体から得られたサンプルを、ｉ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＭＢＬ；ｉｉ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ；ｉｉｉ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＭＧＬ；ｉｖ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＭＢＬ及びＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ；ｖ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＭＢＬ及びＣＥＡＭＧＬ；ｖｉ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＥＡＭＧＬ；又はｖｉ）ＣＥＡ有り又は無しでＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＥＡＭＧＬについてアッセイすることに基づく、及び／又はそれらについてアッセイすることを含む。他の癌（特に乳癌）に関して本明細書において開示される任意の実施形態及びその詳細は、本明細書において繰り返されなくても、結腸直腸癌に関する実施形態に適用される。
【００６８】
糖鎖抗原（ＣＡ１９−９）は特に膵臓癌について広く使用されるバイオマーカーである。しかしながら、その発現は、他の多くの消化管癌（結腸直腸癌及び肝臓癌が挙げられる）においても上昇する。したがって、ＣＡ１９−９の１つ又は複数のレクチン結合グリコフォーム（集合的に本明細書においてＣＡ１９−９レクチンと称される）は、本方法のいくつかの実施形態において、被験体の消化管癌（結腸直腸癌及び膵臓癌等）の疾患状態の決定のためのさらなるマーカーとして使用され得る。好ましいＣＡ１９−９種はＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮである。いくつかの非限定実施形態において、カットオフ値（約２６Ｕ／ｍｌ又は約３７Ｕ／ｍｌ等）はＣＡ１９−９について用いられ得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本開示は、被験体の膵臓癌の疾患状態を決定するための、又は前記被験体における膵臓癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくモニタリングするためのバイオマーカーとしての、ＣＡ１５−３レクチン（例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡ、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ及び／又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４と組み合わせて）の使用も提供する。被験体における膵臓癌の疾患状態を決定する方法に加えて、被験体における膵臓癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングする方法も提供され、そこで、方法は、前記被験体から得られたサンプルをＣＡ１５−３レクチンについてアッセイすることを含む。前記ＣＡ１５−３レクチン種のレベルが増加すること、又はＣＡ１５−３のレベルが増加することは、前記被験体が膵臓癌を有すること又は有するリスクがあることを示すだろう。任意に、前記ＣＡ１５−３レクチンは、１つ又は複数の従来の膵臓癌関連バイオマーカー（ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５及びＣＡ１５−３が挙げられるがこれらに限定されない）、並びに／又は１つ又は複数のそのレクチン結合種（ＣＥＡレクチン（例えばＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＢＬ）、ＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）、及びＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）が挙げられるがこれらに限定されない）との任意の組み合わせで使用され得る。したがって、被験体における膵臓癌の疾患状態を決定するか、又は被験体における膵臓癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングする方法は、前記被験体から得られたサンプルを、上で説明されたさらなるバイオマーカーのうちの１つ又は複数についてアッセイすることをさらに含み得る。
【００７０】
実施例６において実証されるように、ＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮは、従来のＣＡ１９−９免疫アッセイに比較して、健康な対照及び良性の対照（すなわち肝臓又は胆管の良性疾患を有する患者）からの膵臓癌患者の弁別を改善した。さらに、ＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮアッセイは偽陰性の数を減少させ、感度は有意に改善された。したがって、膵臓癌に関連する本方法及び使用のいくつかの好ましい実施形態は、膵臓癌の疾患状態が決定される予定の被験体から得られたサンプルを、従来のＣＡ１９−９抗原についてアッセイすること有り又は無しで、ＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮについてアッセイすることに基づく、及び／又はそれらについてアッセイすることを含む。他の癌（特に乳癌）に関して本明細書において開示される任意の実施形態及びその詳細は、本明細書において繰り返されなくても、膵臓癌に関する実施形態に適用される。
【００７１】
あるいは、ＣＥＡレクチン（例えばＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬ）、ＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）及びＣＡ１５−３レクチン（例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡ、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ及び／又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４と組み合わせて）からなる群から選択される、レクチン結合バイオマーカー種の任意の適切な組み合わせは、任意に従来のＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５及びＣＡ１５−３の任意の所望の組み合わせと共に、消化管癌（結腸直腸癌及び膵臓癌が挙げられる）に関して上で説明された実施形態のうちの任意のものにおいて用いられ得る。非限定なより具体的な代替物において、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及び／又はＣＥＡＭＧＬは、１つ又は複数の従来の消化管癌関連バイオマーカー（ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、及びＣＡ１５−３が挙げられるがこれらに限定されない）、並びに／又は、ＣＡ１９−９レクチン（例えばＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ）、及びＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）、ＣＡ１５−３レクチン（例えばＣＡ１５−３ＭＧＬ及び／又はＣＡ１５−３ＷＧＡ、任意にＣＡ１５−３ＤＳＬ及び／又はＣＡ１５−３ＧＡＬ４と組み合わせて）、及びさらなるＣＥＡレクチン種からなる群から選択される、１つ又は複数のそのレクチン結合種との任意の組み合わせで使用される。いくつかのさらなる実施形態において、乳癌に関して開示される任意のバイオマーカーの組み合わせは、被験体の消化管癌の状態を決定するために、又は被験体における消化管癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために使用され、そこで、前記消化管癌としては結腸直腸癌及び膵臓癌が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
さらに、一態様において、本開示は、被験体の前立腺癌の疾患状態を決定するための又は前記被験体における前立腺癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするためのバイオマーカーとしての使用のために、単独又は任意のその組み合わせのいずれかで、前立腺特異的抗原の１つ又は複数のレクチン結合種（すなわちＰＳＡレクチン、好ましくはＰＳＡＭＧＬ、１つもしくは複数のＣＥＡレクチン種（ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬ等）、及び／又は１つもしくは複数のＣＡ１９−９レクチン種（ＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮ等））の使用を提供する。任意に、上で説明されたレクチン結合バイオマーカーのうちの任意の１つ又は複数は、従来のＰＳＡ、ＣＥＡ、及び／又はＣＡ１９−９のバイオマーカーとの任意の組み合わせで使用され得る。いくつかの具体的な実施形態において、アッセイされるレクチン結合バイオマーカー種としては、
ＰＳＡＭＧＬ；
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ；
ＣＥＡＭＢＬ；
ＣＡ１９−９レクチン；
ＰＳＡＭＧＬ及びＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ；
ＰＳＡＭＧＬ及びＣＥＡＭＢＬ；
ＰＳＡＭＧＬ及びＣＡ１９−９レクチン；
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＥＡＭＢＬ；
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＡ１９−９レクチン；
ＣＥＡＭＢＬ及びＣＡ１９−９レクチン；
ＰＳＡＭＧＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及びＣＥＡＭＢＬ；
ＰＳＡＭＧＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、及びＣＡ１９−９レクチン；
ＰＳＡＭＧＬ、ＣＥＡＭＢＬ、及びＣＡ１９−９レクチン；
ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、及びＣＡ１９−９レクチン；又は
ＰＳＡＭＧＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、及びＣＡ１９−９レクチン
が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
サンプルを上で説明された特異的バイオマーカーの組み合わせのうちの任意の１つについてアッセイすることは、ＰＳＡ、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９から選択される、１つ又は複数の従来のバイオマーカーについてもアッセイすることをさらに含み得る。
【００７４】
実施例７において実証されるように、ＰＳＡＭＧＬは、癌性ＰＳＡ抗原と非癌性ＰＳＡ抗原との間で弁別することができる。したがって、前立腺癌に関連する本方法及び使用のいくつかの好ましい実施形態は、前立腺癌の疾患状態が決定される予定の被験体から得られたサンプルを、従来のＰＳＡ抗原についてアッセイすること有り又は無しで、ＰＳＡＭＧＬ  についてアッセイすることに基づく、及び／又はそれらについてアッセイすることを含む。他の癌（特に乳癌）に関して本明細書において開示される任意の実施形態及びその詳細は、本明細書において繰り返されなくても、前立腺癌に関する実施形態に適用される。
【００７５】
いくつかのさらなる実施形態において、ＰＳＡＷＧＡ、ＰＳＡＧａｌ４、及び／又はＰＳＡデクチン２は、被験体における前立腺癌の疾患状態を決定することについて使用され得る。したがって、前立腺癌に関連する本方法及び使用のいくつかの好ましい実施形態は、前立腺癌の疾患状態が決定される予定の被験体から得られたサンプルを、ＰＳＡＷＧＡ、ＰＳＡＧａｌ４、もしくはＰＳＡデンチン（Ｄｅｎｔｉｎ）２；ＰＳＡＭＧＬ及びＰＳＡＷＧＡ；ＰＳＡＭＧＬ及びＰＳＡＧａｌ４；ＰＳＡＭＧＬ及びＰＳＡデンチン２；ＰＳＡＷＧＡ及びＰＳＡＧａｌ４；ＰＳＡＷＧＡ及びＰＳＡデンチン２；ＰＳＡＧａｌ４及びＰＳＡデンチン２；ＰＳＡＭＧＬ、ＰＳＡＷＧＡ、及びＰＳＡＧａｌ４；ＰＳＡＭＧＬ、ＰＳＡＷＧＡ、及びＰＳＡデンチン２；ＰＳＡＷＧＡ、ＰＳＡＧａｌ４、及びＰＳＡデンチン２；ＰＳＡＭＧＬ、ＰＳＡＧａｌ４、及びＰＳＡデンチン２；又はＰＳＡＭＧＬ、ＰＳＡＷＧＡ、ＰＳＡＧａｌ４、及びＰＳＡデンチン２についてアッセイすることに基づく、及び／又はそれらについてアッセイすることを含む。これらの実施形態のうちの任意のものは従来のＰＳＡの抗原についてもアッセイすることを含み得る。
【００７６】
簡潔さのために、本明細書において開示される従来の癌関連バイオマーカー（すなわちＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、又はＰＳＡ）は、「ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ」という一般的な用語によって集合的に参照される一方で、そのレクチン結合グリコフォームは「ＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチン」という一般的な用語によって参照される。問題になっている実施形態に依存して、この用語は、当業者によって容易に理解されるように、この用語によって包含される１つ又は複数のバイオマーカー又はグリコフォームをそれぞれ指す。好ましいＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチン種としては、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ、ＣＡ１５−３ＤＳＬ、ＣＡ１５−３ＧＡＬ４、ＣＡ１２５ＭＧＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＥＡＭＢＬ、及びＰＳＡＭＧＬが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
サンプルを本明細書において開示される任意のＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチンについてアッセイすることは、当技術分野において利用可能な任意の手段、方法又は技法によって実行され得る。好ましいが非限定な例は、問題になっているレクチンに結合するＧｌｙｃｏＰｒｏｔのレベルを決定することである。これは例えばサンドイッチアッセイによって遂行され、そこで、ＧｌｙｃｏＰｒｏｔに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体又はその断片（例えばＦａｂ断片）は捕捉剤として使用され、問題になっているレクチンはトレーサーとして使用される。トレーサーとしての使用のために、前記レクチンは検出可能に直接的又は間接的に標識され得る。
【００７８】
本明細書において使用される時、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン構造を指す。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、又は多くの良好に特徴づけられた抗原結合断片もしくはその一本鎖バリアントのうちの任意のものとして存在することができ、そのすべては、「抗体」という用語によって本明細書中に包含される。前記抗原結合断片の非限定例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦｖ断片が挙げられる。前記断片及びバリアントは、組み換えＤＮＡ技法によって、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的分離もしくは化学的分離によって、当技術分野において周知のように産生され得る。「抗体」という用語としては、イソタイプクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ並びにそのサブタイプのポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び組み換え抗体も挙げられるがこれらに限定されない。
【００７９】
他のいくつかの実施形態において、サンドイッチアッセイは反転させた手法を使用して遂行され得る。かかる事例において、問題になっているレクチンは捕捉剤として、ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ特異的抗体（好ましくはモノクローナル抗体）は直接的又は間接的に検出可能に標識されたトレーサーとして使用される。尿は血液よりも妨害する糖鎖付加分子を少なく含有するので、反転させたサンドイッチアッセイは、血液サンプルよりも尿サンプルでより良好に作動し得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、サンドイッチアッセイは、捕捉剤について特異的でない任意のＧｌｙｃｏＰｒｏｔ種を除去するために、捕捉ステップ後に１つ又は複数の洗浄ステップを含み得る。適切な洗浄溶液及び条件（例えば時間及び温度）は、当業者に公知である。
【００８１】
本発明の様々な実施形態に記載のサンドイッチアッセイは、固体表面（マイクロタイタープレート）上で、又はラテラルフローフォーマットにおいて遂行され得る。例えばストレプトアビジン−ビオチン複合体を経由して固体表面へ捕捉剤を結合する又はラテラルフローアッセイに捕捉剤を取り込むための手段及び方法は、当技術分野において公知であり、当業者に容易に明らかである。
【００８２】
本固相サンドイッチアッセイで使用される好適な基質としては、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、硼ケイ酸塩、金属酸化物（アルミナ及び酸化ニッケル等）、金、様々なクレイ、ニトロセルロース、又はナイロンが挙げられるがこれらに限定されない。上記のように、いくつかの実施形態において、基質を適切な化合物によりコーティングして、捕捉剤（すなわち抗ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗体又はレクチンのいずれか）の基質への結合を促進することができる。いくつかのさらなる実施形態において、１つ又は複数の対照抗体又は対照レクチンも基質へ付着され得る。
【００８３】
任意の１つ又は複数の（好ましくはモノクローナル）抗ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗体は、捕捉剤又はトレーサーのいずれかとして、上記のサンドイッチアッセイにおいて使用され得る。好適な商業的な抗ＣＡ１５−３抗体の非限定例としてはＭａ５５２及びＭａ６９５が挙げられる一方で、好適な商業的な抗ＣＡ１２５抗体の非限定例としてはＯｖ１８５、Ｏｖ１９７及びＯｖＫ９５（少なくともＦｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（スウェーデン）から利用可能）が挙げられる。さらなるＧｌｙｃｏＰｒｏｔ特異的モノクローナル抗体は当技術分野において利用可能であるか、又は当技術分野において周知の方法に従って産生され得る。トレーサーとしての使用のために、抗ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗体は、当技術分野において公知の任意の適切な標識（蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識が挙げられるがこれらに限定されない）により標識され得る。いくつかの実施形態において、前記抗ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗体は、例えば検出可能ナノ粒子への固定化を介して間接的に検出可能に標識され得る。
【００８４】
レクチンは複数の供給源から市販で入手可能である。いくつかのレクチン（ＭＧＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮ等）は、ヒトＩｇＧ１−ＦｃへのＣ末端の融合有り又は無しで利用可能である。両方の形態は本方法において用いられ得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合形態が好ましい。
【００８５】
トレーサーとしての使用のために、レクチンは、様々な手法によって、当技術分野において周知のように検出可能に標識され得る。いくつかの実施形態において、サンプルをＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチンのレベルについてアッセイすることのために用いられる１つ又は複数のレクチンは、標準的な技法を使用して、任意の利用可能な検出可能標識により直接標識され得る。例えば、ＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチンは、ランタニドキレート（ユウロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）又はネオジニウム（ｎｅｏｄｙｎｉｕｍ）（ＩＩＩ）のキレート等）により直接標識され得るか、又は比色定量検出を介する検出が可能にされ得る（例えばＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチンをホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）とコンジュゲートすることによって）。他のいくつかの実施形態において、用いられる１つ又は複数のレクチンは、例えば検出可能ナノ粒子上での前記１つ又は複数のレクチンの固定化によって、検出可能に間接的に標識され得る。かかるナノ粒子固定化レクチンは短縮のためにレクチン−ＮＰｓと呼ばれる。
【００８６】
本明細書において使用される時、「ナノ粒子」（ＮＰ）という用語は、約１０００ｎｍ未満（例えば約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下）の１つ又は複数の次元（例えば直径）を有する合成又は天然の粒子を指す。本明細書において使用される時、「約」という用語は、所定値の±１０％の値の範囲を指す。例えば、「約１００ｎｍ」という語句は、１００ｎｍ±１０％又は９０ｎｍ〜１１０ｎｍを包含する。ナノ粒子は一般的に球形を有し得るが、非球形（楕円体の形状等）も使用され得る。いくつかの実施形態において、前記ナノ粒子のすべての次元は、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である。
【００８７】
多様な異なる材料が本ナノ粒子において利用され得る。好適なポリマーの非限定例としては、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリサッカライド、及びコポリマー、又はその組み合わせが挙げられる。他の好適なナノ粒子材料としては、コロイド金、銀、量子ドット、炭素、多孔質シリコン、及びリポソームが挙げられるがこれらに限定されない。さらなる好適なナノ粒子材料としては、タンパク質ナノ粒子、ミネラルナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶、金属ナノ粒子、及びプラスチックナノ粒子が挙げられる。
【００８８】
本発明又は開示の様々な実施形態における使用のために好適なナノ粒子は、任意の公知の手段によって、直接的又は間接的に定性的又は定量的に検出可能であり得る。例えば、ナノ粒子は、例えばアップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＰ）、共鳴粒子、量子ドット及び金粒子の場合でのように、先天的特性に起因して検出可能であり得る。他のいくつかの実施形態において、ナノ粒子は、例えば蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識によって検出可能にされ得る。いくつかのさらなる実施形態において、ランタニド（すなわち、ユウロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）及びネオジニウム（ｎｅｏｄｙｎｉｕｍ）（ＩＩＩ）等の、可視波長又は近赤外波長又は赤外線波長の発光放射及び長い蛍光減衰を備えた発光ランタニドイオン）による標識又はドーピングは、本ナノ粒子を検出可能にするための好ましい手段である。
【００８９】
レクチンは、当技術分野において公知の任意の好適な方法（実施例１において開示されるものが挙げられるがこれらに限定されない）によって、ナノ粒子上で固定化され得る。２つ以上の異なるレクチンを包含するそれらの実施形態において、前記異なるレクチンは、任意の所望の比で、同じナノ粒子又は異なるナノ粒子のいずれか上で固定化され得る。
【００９０】
いくつかの非限定実施形態において、最も好ましいナノ粒子は、直径が約９７ｎｍ又は約１０７ｎｍのいずれかであるポリスチレンナノ粒子である。さらなる好ましいナノ粒子としては、ユウロピウムキレートをドープしたナノ粒子が挙げられる。かかるナノ粒子の利点としては、ｉ）１粒子あたり多数のキレートによって提供されるシグナルの増幅、ｉｉ）粒子上の固定化されたレクチンの高密度によって可能にされる、それらの標的糖鎖構造エピトープへのレクチンの機能的親和性（結合活性）の強化、及びｉｉｉ）多価ナノ粒子の生成によって可能にされるような使用されるレクチンの糖鎖構造特異性が挙げられる。しかしながら、ナノ粒子は、本発明又は開示及びそれらの様々な実施形態の実行のための適切な結合活性効果及びシグナル増幅を提供する、単なる１つの好ましい手法である。
【００９１】
さらに、２つ以上の異なるレクチンを包含するそれらの実施形態において、サンプルは、同じアッセイ（すなわち同時に）において、又は異なるアッセイ（すなわち並列して）において同時もしくは順次のいずれかで、異なるＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチン種についてアッセイされ得る。任意のかかるアッセイにおいて、前記異なるレクチンは、異なる標識の同じものにより直接的又は間接的のいずれかで検出可能に標識され得る。いくつかの実施形態において、例えば単一アッセイにおける異なるレクチン種を運ぶ、異なって標識されたナノ粒子の使用によるマルチプレックス化は、本明細書において開示される方法又はその実施形態のうちの任意のものを実行するための好ましいフォーマットであり得る。
【００９２】
いくつかの具体的な実施形態において、検出可能標識（ユウロピウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、及びジスプロシウム（ＩＩＩ）から選択されるランタニドキレート等）により標識された、同じナノ粒子又は異なるナノ粒子上で固定化された１つ又は複数のレクチンは、トレーサーとして使用される。いくつかのより具体的な実施形態において、ユウロピウムキレートは検出可能標識として使用される。非限定的な好ましい実施形態において、レクチン−ＮＰはトレーサーとして使用され、約３００００のＥｕキレートによりドープされる。他のいくつかの具体的な実施形態において、問題になっているレクチンは、アップコンバージョンリン（ＵＣＰ）粒子（それはラテラルフローフォーマットにおけるトレーサーとしての使用のために特に好適である）上に付着される。
【００９３】
任意の利用可能なセンサー技術の使用によって、検出可能シグナルを生成することも可能である。例えば、固体表面は、結合反応を標識部分の使用の有り又は無しで検出可能シグナルに変換することが可能な認識要素（トランスデューサー）を取り込むことができる。異なるタイプのトランスデューサーを用いることができ、電気化学的検出又は光学的検出に基づくものが挙げられる。当業者に明らかなように、検出は均一又は不均一な検出技法にも基づき得る。
【００９４】
固体表面（マイクロタイターウェル、アレイ、又はセンサー等）の上へコーティングする代わりに、ナノ粒子の表面上のレクチンをコーティングすることは、特にレクチンが特異的抗体と組み合わせて使用される非競合的アッセイフォーマットにおいて、アッセイ性能に関して有意な利益をもたらす。かかる抗体が固相へ結合される場合に、レクチンの親和性に比較して抗体の典型的には有意により高い親和性は、第１のステップとして、高い効率及び安定性により固相の上へ標的バイオマーカー分子を捕捉することにすべて利用され得る。抗体の高親和性を考慮すると、標的化エピトープの１コピーのみを備えた小さな標的分子も、高い安定性により捕捉され得る。一旦標的分子が捕捉されたならば、レクチンナノ粒子の結合活性効果（すなわち複数の接するレクチンが接する捕捉された標的分子へ結合することができ、それによって、単数のレクチン分子に比較して結合力を有意に増加させる効果）も、すべて利用され得る。
【００９５】
典型的にはナノ粒子が測定可能なシグナルの有意な強化を可能にするという事実とさらに合わせて、レクチン−ＮＰ／固相−抗体アプローチは、両方の結合パートナーの高い特異性、単一の抗体の高い結合力、複数の接する糖鎖構造（結合活性効果）上の複数の接するレクチンの高い結合力、及び各々の結合されたナノ粒子について検出可能シグナルの高いレベルを至適に組み合わせることで、分析的属性及び臨床的属性の両方に関して高感度及び高特異性の両方の至適の組み合わせをもたらす。
【００９６】
さらに、典型的にはレクチンは、標的糖鎖構造（グリコフォーム）に対する高い特異性を有するが、かかる形態は標的化されたもの以外の分子中でも存在し得る。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、洗浄ステップを標的分子抗体捕捉相及びレクチン−ＮＰ結合相の間に用いて、いくつかの事例において、標的化分子と同じ糖鎖構造を含み、したがって、種間の交差反応性に基づく非特異的検出のリスクをもたらし得る、非標的化未結合分子をすべて洗い流す。一旦、特異的標的分子が抗体の使用によって捕捉され、レクチン結合ステップ前に他の分子が洗浄されたならば、レクチンによる望まれない標的の非特異的結合のリスクは、取り除かれるようになる。かかる洗浄ステップは、レクチン−ＮＰの周囲の遠位部位への結合についての標的分子の競合（これは多くの事例において低い親和性により生じるが）も防止することが好ましい。しかしながら、交差反応性及び遠位の結合の両方のリスクは、高分子量を持った多くの分子（ＣＡ１５−３等、そこで、接するレクチンが同じ標的分子中の接する糖鎖構造へ結合し得る）の事例でのように、標的分子が複数の反応性の糖鎖構造を有する場合に、増加する。かかる事例において、レクチン−ＮＰ結合反応前の洗浄ステップによる非競合的レクチン−ＮＰ／固相−抗体アプローチの使用は、レクチンが固相へ結合されるプラットフォーム、又はレクチン−ＮＰｓが中間の洗浄ステップ無しで用いられるプラットフォームに比較して、有意により感受性があり且つ標的特異的なアッセイをもたらす。同様に、結合活性効果のほとんど完全な欠如に起因して、レクチン（抗体の代わりに）が固相へ結合されるアッセイプラットフォームは、小さな標的分子（１分子あたり１つの糖鎖構造部分のみを有するＰＳＡ等）では性能は不良である。
【００９７】
本開示は、本方法及びその様々な実施形態で使用されるキットも提供する。その最も広範囲の形態において、キットは、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、Ｃ１９−９及びＰＳＡからなる群から選択される、癌関連糖タンパク質バイオマーカーの１つ又は複数のレクチン結合種のアッセイのための試薬を含む。換言すれば、キットは、ＣＡ１５−３レクチン、ＣＡ１２５レクチン、ＣＥＡレクチン、ＣＡ１９−９レクチン及びＰＳＡレクチンからなる群から選択される、任意の所望のＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチン種又はその組み合わせについてサンプルをアッセイするための試薬を含む。アッセイされる各々のＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチンについて、少なくとも１つ試薬は、問題になっているＧｌｙｃｏＰｒｏｔについて特異的なＧｌｙｃｏＰｒｏｔ結合剤（モノクローナル抗ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗体等）であり、試薬のうちの少なくとも１つは、問題になっているレクチン（好ましくはナノ粒子上に固定化された）である。前記ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ結合剤又は前記レクチンのいずれかは検出可能に標識される。レクチンは、それが固定化された検出可能ナノ粒子を介して間接的に標識され得る。アッセイされるＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチン種及びしたがってキット中に含まれる試薬は、キットを使用する意図される目的に（特にスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングする癌に）依存し、好ましい組み合わせは上記の本開示から明らかである。
【００９８】
任意に、キットは、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ及びＰＳＡからなる群から好ましくは選択される１つ又は複数の従来のＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗原のアッセイについて試薬も含み得る。前記従来のＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗原のアッセイのための典型的な試薬の非限定例としては、アッセイされる各々の従来のＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗原についての２つのＧｌｙｃｏＰｒｏｔ結合剤（２つのモノクローナル抗ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗体等、それらは前記ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ中の異なるエピトープへ結合する）が挙げられる。各々の特異的なＧｌｙｃｏＰｒｏｔについて、結合剤のうちの１つは、それぞれのＧｌｙｃｏＰｒｏｔレクチンのアッセイのために提供された、ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ結合剤と同じであり得る。それにもかかわらず、ＧｌｙｃｏＰｒｏｔ結合剤のうちの１つは固体表面上に固定化され得るか、又はラテラルフローフォーマットにおける捕捉剤としての使用のために提供され得るが、他のＧｌｙｃｏＰｒｏｔ結合剤は検出可能標識を含み得る。アッセイされる従来のＧｌｙｃｏＰｒｏｔ抗原及びしたがってキット中に含まれる試薬は、キットを使用する意図される目的に（特にスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングする癌に）依存し、好ましい組み合わせは上記の本開示から明らかである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、キットは、被験体の乳癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における乳癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供される。かかる事例において、キットは、ＣＡ１５−３結合剤（モノクローナル抗ＣＡ１５−３抗体等）並びにＭＧＬ及び／又はＷＧＡ（任意に同じナノ粒子又は異なるナノ粒子の上へ固定化される）を含む。いくつかのさらなる実施形態において、ＤＳＬ及び／又はＧａｌ４（任意に同じナノ粒子又は異なるナノ粒子の上へ固定化される）も提供され得る。前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記レクチンのいずれかは、検出可能標識を含むか、又は固体表面（マイクロタイタープレート等）上に固定化される。いくつかのさらなる実施形態において、プレートのストレプトアビジンコーティング及び抗体のビオチン化は、前記付着のために使用される。同じことを達成する代替手法は、当業者が容易に利用可能である。
【０１００】
いくつかのさらなる実施形態において、被験体の乳癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における乳癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供されるキットは、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５レクチン（例えばＣＡ１２５ＭＧＬ）、ＣＡ１２５、ＣＥＡレクチン（例えばＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬ）及びＣＥＡからなる群から選択される追加のバイオマーカーのアッセイのための試薬も含み得る。これらのアッセイのために好適な試薬は上述したものから明らかである。
【０１０１】
したがって、いくつかの実施形態において、特に乳癌を考慮すると、キットは、ＣＡ１５−３タンパク質濃度のアッセイのための１つ又は複数の試薬をさらに含み得る。ＣＡ１５−３タンパク質濃度のアッセイのための典型的な試薬の非限定例としては、ＣＡ１５−３中の異なるタンパク質エピトープへ結合する２つのＣＡ１５−３結合剤（２つのモノクローナル抗ＣＡ１５−３抗体等）が挙げられる。ＣＡ１５−３結合剤のうちの１つは、ＣＡ１５−３ＭＧＬ又はＣＡ１５−３ＷＧＡのアッセイのために提供された、ＣＡ１５−３結合剤と同じであり得る。２つのＣＡ１５−３結合剤のうちの１つは固体表面上に固定化され得るか、又はラテラルフローフォーマットにおける捕捉剤としての使用のために提供され得るが、他のＣＡ１５−３結合剤は検出可能標識を含み得る。あるいは又は加えて、対応する試薬は、ＣＡ１２５及び／又はＣＥＡについてサンプルをアッセイするためにキット中に含まれ得る。
【０１０２】
任意に、キットは、ＭＧＬ及び／又はＷＧＡへのＣＡ１５−３結合の測定された値に比較するために対照も含み得る。いくつかの実施形態において、対照は測定された値に比較するための閾値である。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、キットは、被験体の結腸直腸癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における結腸直腸癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供される。かかる事例において、キットは、ＣＥＡ結合剤（モノクローナル抗ＣＥＡ抗体等）並びにＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬからなる群から選択される少なくとも１つのレクチン（任意にナノ粒子の上へ固定化される）を含む。２つ以上のレクチンが使用される予定ならば、それらは、同じナノ粒子又は異なるナノ粒子の上へ固定化され得る。いくつかの実施形態において、使用されるレクチンは、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ又はＣＥＡＭＧＬであり得る一方で、他の実施形態において、レクチンＣＥＡＭＢＬ及びＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ；ＣＥＡＭＢＬ及びＣＥＡＭＧＬ；ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＥＡＭＧＬ；又はＣＥＡ；又はＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＥＡＭＧＬは組み合わせて使用される。前記ＣＥＡ結合剤又は前記レクチンのいずれかは、検出可能標識を含むか、又は固体表面（マイクロタイタープレート等）上に固定化されている。
【０１０４】
いくつかのさらなる実施形態において、プレートのストレプトアビジンコーティング及び抗体のビオチン化は、前記付着のために使用される。同じことを達成する代替手法は、当業者が容易に利用可能である。いくつかのさらなる実施形態において、被験体の結腸直腸癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における結腸直腸癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供されるキットは、追加のバイオマーカー（ＣＥＡ等）のアッセイのための試薬も含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、キットは、ＣＥＡタンパク質濃度のアッセイのための１つ又は複数の試薬をさらに含み得る。この目的のために好適な試薬は当技術分野において容易に利用可能であり、モノクローナル抗ＣＥＡ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、２つのモノクローナル抗ＣＥＡ抗体（それらはＣＥＡ中の異なるタンパク質エピトープへ結合する）が用いられ得る。ＣＥＡ結合剤のうちの１つは、ＣＥＡＭＢＬ、ＣＥＡＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＣＥＡＭＧＬをアッセイするために提供された、ＣＥＡ結合剤と同じであり得る。２つのＣＥＡ結合剤のうちの１つは固体表面上に固定化され得るか、又はラテラルフローフォーマットにおける捕捉剤としての使用のために提供され得るが、他のＣＥＡ結合剤は検出可能標識を含み得る。
【０１０５】
任意に、キットは、ＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬへのＣＥＡ結合の測定された値に比較するために対照も含み得る。いくつかの実施形態において、対照は測定された値に比較するための閾値である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、キットは、被験体の膵臓癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における膵臓癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供される。かかる事例において、キットは、ＣＡ１９−９結合剤（モノクローナル抗ＣＡ１９−９抗体等）及び少なくとも１つのレクチン（好ましくはＤＣ−ＳＩＧＮ、任意にナノ粒子の上へ固定化される）を含む。前記ＣＡ１９−９結合剤又は前記レクチンのいずれかは、検出可能標識を含むか、又は固体表面（マイクロタイタープレート等）上に固定化される。いくつかのさらなる実施形態において、プレートのストレプトアビジンコーティング及び抗体のビオチン化は、前記付着のために使用される。同じことを達成する代替手法は、当業者が容易に利用可能である。
【０１０７】
いくつかのさらなる実施形態において、被験体の膵臓癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における膵臓癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供されるキットは、追加のバイオマーカー（ＣＡ１９−９等）のアッセイのための試薬も含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、キットは、ＣＡ１９−９タンパク質濃度のアッセイのための１つ又は複数の試薬をさらに含み得る。この目的のために好適な試薬は当技術分野において容易に利用可能であり、モノクローナル抗ＣＡ１９−９抗体が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、２つのモノクローナル抗ＣＡ１９−９抗体（それらはＣＡ１９−９中の異なるタンパク質エピトープへ結合する）が用いられ得る。かかる事例において、ＣＡ１９−９結合剤のうちの１つは、ＣＡ１９−９ＤＣ−ＳＩＧＮのアッセイのために提供された、ＣＡ１９−９結合剤と同じであり得る。２つのＣＡ１９−９結合剤のうちの１つは固体表面上に固定化され得るか、又はラテラルフローフォーマットにおける捕捉剤としての使用のために提供され得るが、他のＣＡ１９−９結合剤は検出可能標識を含み得る。
【０１０８】
任意に、キットは、ＤＣ−ＳＩＧＮへのＣＡ１９−９結合の測定された値に比較するために対照も含み得る。いくつかの実施形態において、対照は測定された値に比較するための閾値である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、キットは、被験体の前立腺癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における前立腺癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供される。かかる事例において、キットは、ＰＳＡ結合剤（モノクローナル抗ＰＳＡ抗体又はその抗原結合断片等）及び少なくとも１つのレクチン（好ましくはＭＧＬ、任意にナノ粒子の上へ固定化される）を含む。前記ＰＳＡ結合剤又は前記レクチンのいずれかは、検出可能標識を含むか、又は固体表面（マイクロタイタープレート等）上に固定化される。いくつかのさらなる実施形態において、プレートのストレプトアビジンコーティング及び抗体のビオチン化は、前記付着のために使用される。同じことを達成する代替手法は、当業者が容易に利用可能である。
【０１１０】
いくつかのさらなる実施形態において、被験体の前立腺癌の疾患状態を決定するために、又は前記被験体における前立腺癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするために提供されるキットは、追加のバイオマーカー（ＰＳＡ等）のアッセイのための試薬も含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、キットは、ＰＳＡタンパク質濃度のアッセイのための１つ又は複数の試薬をさらに含み得る。この目的のために好適な試薬は当技術分野において容易に利用可能であり、モノクローナル抗ＰＳＡ抗体及びその抗原結合断片が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、２つのモノクローナル抗ＰＳＡ抗体（それらはＰＳＡ中の異なるタンパク質エピトープへ結合する）が用いられ得る。かかる事例において、ＰＳＡ結合剤のうちの１つは、ＰＳＡＭＧＬのアッセイのために提供された、ＰＳＡ結合剤と同じであり得る。２つのＰＳＡ結合剤のうちの１つは固体表面上に固定化され得るか、又はラテラルフローフォーマットにおける捕捉剤としての使用のために提供され得るが、他のＰＳＡ結合剤は検出可能標識を含み得る。
【０１１１】
任意に、キットは、ＭＧＬへのＰＳＡ結合の測定された値に比較するために対照も含み得る。いくつかの実施形態において、対照は測定された値に比較するための閾値である。
【０１１２】
いくつかのさらなる実施形態において、キットは、本開示の任意の方法の遂行のためのコンピューター実行可能な命令を含むコンピューター可読メディアも含み得る。
【０１１３】
サンプルを上で説明されたバイオマーカーの組み合わせについてアッセイするための試薬に加えて、キットは、前記サンプルを、他のバイオマーカーについて（特に、問題になっている癌以外の任意の疾患（他の癌等）と関連する１つ又は複数のバイオマーカーについて）アッセイするための試薬も含み得る。したがって、キットは、その濃度がアッセイされる１つ又は複数の他のバイオマーカーの特異性及び感度に依存して、癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングするだけでなく、例えば他の癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングするためにも使用され得る。
【０１１４】
当業者によって容易に理解されるように、本方法の様々な詳細及び実施形態はさらに本キットへ適用される。したがって、好適なナノ粒子の特性及び特色は、例えばキットに関して本明細書において繰り返されない。
【０１１５】
ＭＧＬ及び／もしくはＷＧＡの使用（任意にＤＳＬ及び／又はＧａｌ４による任意の組み合わせで）、又は任意の組成物（同じものを含むナノ粒子組成物等）の使用が、被験体における乳癌の状態を決定するために、又は被験体における乳癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするためにも提供される。本方法及びその実施形態に関して開示された任意の詳細及び各論は、詳細及び各論が本明細書において繰り返されなくても、これらのバイオマーカーの様々な使用へ適用される。
【０１１６】
ＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／もしくはＭＧＬの使用、又は任意の組成物（同じものを含むナノ粒子組成物等）の使用が、被験体における結腸直腸癌の状態を決定するために、又は被験体における結腸直腸癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするためにも提供される。本方法及びその実施形態に関して開示された任意の詳細及び各論は、詳細及び各論が本明細書において繰り返されなくても、これらのバイオマーカーの様々な使用へ適用される。
【０１１７】
ＤＣ−ＳＩＧＮの使用、又は任意の組成物（同じものを含むナノ粒子組成物等）の使用が、被験体における膵臓癌の状態を決定するために、又は被験体における膵臓癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするためにも提供される。本方法及びその実施形態に関して開示された任意の詳細及び各論は、詳細及び各論が本明細書において繰り返されなくても、これらのバイオマーカーの様々な使用へ適用される。
【０１１８】
ＭＧＬの使用、又は任意の組成物（同じものを含むナノ粒子組成物等）の使用が、被験体における前立腺癌の状態を決定するために、又は被験体における前立腺癌をスクリーニング、診断、予後予測、もしくはモニタリングするためにも提供される。本方法及びその実施形態に関して開示された任意の詳細及び各論は、詳細及び各論が本明細書において繰り返されなくても、これらのバイオマーカーの様々な使用へ適用される。
【０１１９】
様々な他のレクチン結合バイオマーカー種及び任意のその組み合わせの使用も提供される。かかる使用の任意の詳細及び特徴は上記の本開示から明らかである。
【０１２０】
技術が進歩するにつれて、様々な手法で発明概念を実装することができることは当業者に明らかであろう。本発明及びその実施形態は、下で記載される実施例に限定されないが、請求項の範囲内で変動し得る。
【実施例】
【０１２１】
乳癌
実施例１：材料及び方法
ＣＡ１５−３の起源及び臨床的なサンプル
原発性乳癌（ＢｒＣａ）細胞株からの癌性ＣＡ１５−３をＦｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（スウェーデン）から得た。
【０１２２】
すべての臨床的なサンプルは、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ  ｏｆ  Ｐｉｒｋａｎｍａａの倫理指針に従う適切な許可及びインフォームドコンセントによりＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔａｍｐｅｒｅ（フィンランド）によって提供された。臨床的なサンプルは、４５名の異なるＢｒＣａ患者及び対照として外見上健康な女性からの血清／血漿サンプル（ＨＣ、ｎ＝３１）からの縦断的な血漿サンプルのコホート（ｎ＝１９９）を含んでいた。
【０１２３】
抗ＣＡ１５−３抗体
２つの異なるモノクローナル抗ＣＡ１５−３抗体（すなわちＭａ５５２及びＭａ６９５、それらは、それぞれＭＵＣ−１（ＣＡ１５−３）抗原のタンパク質コア及びシアル化された炭水化物エピトープを検出する）を、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（スウェーデン）から得た。
【０１２４】
固相捕捉剤としての使用のために、当技術分野において公知の標準的な手順を使用して、ビオチンイソチオシアネートの４０倍モル過剰により室温（ＲＴ）で４時間抗体をビオチン化した。ビオチン化抗体を、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ及び０．５ｇ／ＬのＮａＮ３を含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）の使用によって、ＮＡＰ−５及びＮＡＰ−１０ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｃｈｅｎｅｃｔａｄｙ、ＮＹ、米国））により精製した。標識された抗体を１ｇ／ＬのＢＳＡ（Ｂｉｏｒｅｂａ（Ｎｙｏｎ、スイス））により安定化し、＋４℃で貯蔵した。
【０１２５】
レクチン
１５の植物レクチンのパネルをＶＥＣＴＯＲ  ｌａｂから購入し、１３のヒトレクチンのパネルをＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍから購入した。
【表１】
2019522223.tif 000002
【０１２６】
レクチンを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得られた、ユウロピウムキレートをドープした単分散のカルボキシル修飾されたＦｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ（商標）ポリスチレンナノ粒子（直径９７ｎｍ）の上へ固定化した。用いられたナノ粒子は１粒子あたり３０，０００のキレートイオンに等価な長寿命の蛍光を産生する。
【０１２７】
いくつかのマイナーな修飾の有る、以前に記載された手順を使用して、レクチンの第１級アミノ基を、ナノ粒子の活性化カルボキシル基へ共有結合でカップルした（Ｓｏｕｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，２２５４−２２６０）。ナノ粒子（１ｅ１０１２粒子）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中で懸濁し、それらの表面を、０．７５ｍｍｏｌ／ＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国））及び１０ｍｍｏｌ／ＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により活性化した。共役反応におけるレクチンの濃度は０．６２５ｍｇ／ｍｌであり、反応は１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含んでいた。活性化された粒子をレクチンと混合した。共役反応物を激しく振盪しながら＋２３℃で２時間インキュベーションした。最終洗浄及び残りの活性基のブロッキングを、トリスベースのバッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス、０．５ｇ／ＬのＮａＮ３（ｐＨ８．５））中で遂行し、ナノ粒子−レクチンコンジュゲートを、２ｇ／ＬのＢＳＡを補足した同じバッファー中で４℃で貯蔵した。使用の第１の事例の前に、粒子を完全に混合し、超音波処理し、軽く遠心分離（３５０ｇ、５分）して非コロイド状凝集物を単分散懸濁物から分離した。
【０１２８】
従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ
製造者の指示に従ってＣａｎＡｇ  ＣＡ１５−３  ＥＩＡキット（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、血清中のＣＡ１５−３濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。簡潔には、ビオチン化捕捉モノクローナル抗体（ｂｉｏＭａ６９５）及びＨＲＰコンジュゲートトレーサーモノクローナル抗体（Ｍａ５５２）を、１：４１希釈のキャリブレーター及び臨床的な血清／血漿サンプルと一緒にストレプトアビジン（ＳＡｖ）コーティングマイクロタイターウェルの中へ添加した。２時間のインキュベーション後にウェルを６回洗浄し、基質のＴＭＢを添加し、光学的密度を停止溶液の添加後に４５０ｎｍで測定した。この従来のＣＡ１５−３免疫アッセイの基本的な原理を図１Ａ中で図示する。
【０１２９】
抗ＣＡ１５−３抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイ
これらの実験中で使用される、Ｒｅｄアッセイバッファー、洗浄バッファー、及びストレプトアビジンコーティング低蛍光マイクロタイタープレートを、Ｋａｉｖｏｇｅｎ  Ｏｙ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）から購入した。
【０１３０】
ビオチン化固相抗体（１００ｎｇ）（すなわちｂｉｏＭａ６９５又はｂｉｏＭａ５５２）を、４０μＬのアッセイバッファー中でストレプトアビジンコーティングマイクロタイターウェルの上へ固定化した。ＲＴでの１時間のインキュベーション及び９００ｒｐｍでの振盪後に、ウェルを洗浄溶液により２回洗浄し、アッセイにすぐ使用した。
【０１３１】
次に、５０μｌの希釈したサンプル（１：４０、アッセイバッファー中で）を各々のウェルへ添加し、振盪しながらＲＴで１時間インキュベーションした。それによってウェル上に捕捉されたＣＡ１５−３抗原を、ＣＡ１５−３のレクチン結合グリカンエピトープを検出するためにＥｕ３＋標識レクチン−ナノ粒子を使用して、時間分解蛍光（ＴＲＦ）によって分析した。これは、以下のように実行した。様々なレクチンによりコーティングされた１ｅ７のＥｕ３＋−ＮＰｓを含有する２５μｌのアッセイバッファーを、ＣＬＲ（ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＧＬ、ＭＢＬ、ＭＭＲ）についての追加の６ｍＭのＣａＣｌ２と共に、各々のウェルへ添加し、振盪しながらＲＴで２時間インキュベーションした。インキュベーション後に、ウェルを洗浄バッファーにより６回洗浄した。ユウロピウムについての時間分解蛍光を、Ｖｉｃｔｏｒ３Ｖ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンターを使用して、乾燥ウェルから測定した（ｌｅｘ：３４０ｎｍ；ｌｅｍ：６１５ｎｍ）。
【０１３２】
実施例２：抗ＣＡ１５−３抗体−レクチンナノ粒子サンドイッチアッセイ
これらの実験において、ＴＳＡ−ＢＳＡ（７．５％のＢＳＡを含むトリスアジ化ナトリウム）中に少量添加された、ＢｒＣａ細胞株から精製した５、１０又は１００Ｕ／ｍｌのＣＡ１５−３（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用した。ＢｒＣａ関連ＣＡ１５−３を、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイターウェル上のビオチン化Ｍａ５５２又はＭａ６９５の抗ＣＡ１５−３抗体のいずれかにより最初に捕捉した。ＥｕをドープしたＮＰｓ上でコーティングした植物又はヒトのレクチンのパネルを、図１Ｂ中に概略的に図示され、実施例１中でより詳細に記載されるように、ＢｒＣａ−ＣＡ１５−３認識レクチンのスクリーニングのためのトレーサーとして使用した。
【０１３３】
ヒトレクチンＭＧＬ及び植物レクチンＷＧＡは、試験されたレクチンの中でもＢｒＣａＣＡ１５−３抗原と優れた反応性を示した。シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は、両方のレクチンＮＰｓで５Ｕ／ｍｌの率で２を超えていた（図２）。ＤＳＬ及びＧａｌ−４もＢｒＣａＣＡ１５−３への結合を示したが、Ｓ／Ｂ比はＷＧＡ及びＭＧＬによるものよりも低かった。対応する結果は、Ｍａ５５２又はＭａ６９５が捕捉抗体として使用されたかどうかに関係なく得られた。
【０１３４】
ＢｒＣａ−ＣＡ１５−３抗原への有意に高い結合レベルへ起因して、ＭＧＬ−ＮＰｓ及びＷＧＡ−ＮＰｓを、ＣＡ１５−３レクチンアッセイの開発及び至適化のために選択した。
【０１３５】
次に、複雑なマトリックス（すなわちヒト血清）中のＢｒＣａ由来ＣＡ１５−３の回収を決定した。この目的のために、５〜１００Ｕ／ｍｌのＣＡ１５−３を、健康な男性のプールされた血清又は単純なＴＳＡ−ＢＳＡバッファーのいずれか中に並列して少量添加した。ＣＡ１５−３を、ストレプトアビジンマイクロタイタープレート上のビオチン化Ｍａ５５２又はＭａ６９５モノクローナル抗体により最初に捕捉し、洗浄後に、ＭＧＬ−ＮＰｓにより最終的にトレースして回収率を調査した。１Ｕ／ｍｌの推定された分析感度で優れた回収（９５〜１１０％）が達成された（図３）。結果から、固有の血清成分がアッセイを妨害しないことが指摘される。
【０１３６】
同等に優れた回収及び分析感度がＷＧＡ−ＮＰｓにより観察された（図４）。これらの実験において、５〜２５０Ｕ／ｍｌのＢｒＣａ由来ＣＡ１５−３を健康な男性からプールされた血清中に少量添加し、ビオチン化Ｍａ５５２を捕捉抗体として使用し、ＷＧＡ  ＮＰｓをトレーサーとして使用した。
【０１３７】
結果の正確性を確認するために、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ及びＣＡ１２５ＭＧＬアッセイにおいて使用される抗体の交差反応性を試験した（図５）。卵巣癌由来ＣＡ１２５との交差反応性は、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ（そこで、抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体が捕捉剤として使用された）において見出されなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。その一方で、ＢｒＣａ−ＣＡ１５−３抗原とのある程度の交差反応性は、ＣＡ１２５ＭＧＬアッセイ（そこで、抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体が捕捉抗体として使用された）において観察された。ＣＡ１２５とＣＡ１５−３の測定された濃度の間で１０倍の差異が検出された（図５Ｃ）。
【０１３８】
実施例３：臨床サンプルの分析
乳癌細胞株に基づいてＣＡ１５−３抗原により得られた結果を臨床情況へと変換できるかどうかを試験するために、臨床サンプルの小さなコホートを、本レクチン−ＮＰアッセイ及び従来のＣＡ１５−３免疫アッセイにより並行して分析した。
【０１３９】
ボックスプロット分析
それらのＣＡ１５−３タンパク質含有量（従来の）及びＣＡ１５−３ＭＧＬグリコフォーム含有量に関しての、臨床乳癌サンプル（４５名の異なる乳癌患者からのｎ＝１９９）及び健康な対照（ｎ＝３１）のボックスプロット分析を、図６Ａ〜６Ｃ中で示す。結果によれば、従来のＣＡ１５−３  ＩＡは、健康な女性においてもＣＡ１５−３を検出した。従来のＣＡ１５−３  ＩＡにより健康な対照と乳癌患者との間で中央値の２倍の差が検出された一方で、本ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイによりこれらの臨床群の間で＞２００倍の差が検出された（図６）。対応する結果は、Ｍａ５５２又はＭａ６９５が捕捉抗体として使用されたかどうかに関係なく得られた。特にしかしながら、Ｍａ５５２が捕捉抗体として使用された場合に、健康な対照のうちの７７％（２４／３１）は本ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイにより検出不可能であった（すなわち０Ｕ／ｍｌ）。
【０１４０】
各々の乳癌患者（ｎ＝４５）及びすべての対照サンプル（ｎ＝３１）について第１の血清サンプルのみを使用して、別の一連のボックスプロット分析を遂行した。これらの分析において、従来のＣＡ１５−３  ＩＡにより健康な対照と乳癌患者との間で中央値の２．８倍の差が検出された一方で、Ｍａ５５２又はＭａ６９５が捕捉抗体として使用されたのには関わらず、本ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイによりこれらの臨床群の間で＞４００倍の差が検出された（図７）。
【０１４１】
ＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイにもボックスプロット分析を行った。実践的な理由のために、４１名の乳癌患者のみ及び１８名の対照のみのサンプルからの第１の血清サンプルを、分析において使用した。結果から、ＣＡ１５−３ＷＧＡを使用して、乳癌患者と健康な対照を成功裡に識別できることが明らかに指摘される（図８）。
【０１４２】
ＲＯＣ曲線及びＡＵＣ分析
乳癌と健康な対照とを弁別するためのＲＯＣ曲線分析を、ＣＡ１５−３、ＣＡ１５−３ＭＧＬ、及びＣＡ１５−３ＷＧＡに関して遂行した。ＲＯＣ曲線を図９及び１０中で示す一方で、得られたＡＵＣ値を以下に要約する。
【表２】
2019522223.tif 000003
【表３】
2019522223.tif 000004
【０１４３】
結果によれば、ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイの両方は、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイよりも乳癌患者と健康な対照との間でより良好に弁別することができた。
【０１４４】
成功率の査定
マーカーのＣＡ１５−３及びＣＡ１５−３ＭＧＬについての成功率を、乳癌症例（ｎ＝４５、各々の患者からの第１の連続的なサンプル）に関して決定した。以下のカットオフ値（ＣＡ１５−３について２５ＩＵ／ｍｌ及びＣＡ１５−３ＭＧＬについて２ＩＵ／ｍｌ）を使用して、血清サンプルを、各々のマーカーについて陰性又は陽性であるとして各々分類した。
【表４】
2019522223.tif 000005
【０１４５】
これらの結果から、用いられた臨床コホートにおいて、乳癌患者を罹患した個体として正確に同定するためのＣＡ１５−３ＭＧＬの成功率は、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ（６０％）のものと比較して、優れている（７１．５％）ことが指摘される。アッセイの組み合わせ使用は、成功率を７７％へ改善した。
【０１４６】
異なるアッセイ間の相関性
図２中で示されるように、Ｅｕ（ＩＩＩ）ナノ粒子上に固定化された場合のＭＧＬ及びＷＧＡの両方（それぞれＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイ及びＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイ）は、ＢｒＣａ関連ＣＡ１５−３を認識することができた。しかしながら、アッセイが臨床サンプルに適用された場合に、結果は良好に相関しなかった（図１１）。この結果から、ＣＡ１５−３の糖鎖付加パターンが異なる乳癌患者の間で変動し、ＣＡ１５−３ＭＧＬ及びＣＡ１５−３ＷＧＡの両方についてアッセイすることは、偽陰性率の減少によって感度を促進し得ることが指摘される。
【０１４７】
さらに、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイと従来のＣＡ１５−３免疫アッセイ（ＩＡ）との間の相関性は、図１２中で実証されるように、ＢｒＣａ患者（ｎ＝１９９）からの臨床サンプルにおいて非常に乏しい（Ｒ２＝０．２６）と思われた。この場合もやはり、この結果から、アッセイの各々はＣＡ１５−３を異なって検出するが、互いを相補するために使用され得ることが指摘される。
【０１４８】
さらに、ＣＡ１５−３ＷＧＡアッセイは、従来のＣＡ１５−３免疫アッセイと低相関であった（図１３）。しかしながら、相関性は、ＣＡ１５−３ＭＧＬアッセイと従来のＣＡ１５−３免疫アッセイとの間の相関性よりも良好であった。
【０１４９】
実施例４。臨床サンプルのさらなる分析
転移性乳癌患者及び健康な対照のコホートを、検出可能ナノ粒子の上へレクチンを固定化することによって、又は直接的なＥｕキレート標識によって、ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＡ１５−３ＭＧＬについて分析した。
【０１５０】
ＣＡ１５−３ＷＧＡ及びＣＡ１５−３ＭＧＬのＥｕナノ粒子アッセイ
ベースラインの転移性乳癌患者の血漿サンプル（ｎ＝５４）及び対照として健康な女性（ｎ＝２３）サンプルを使用して、ＮＰベースのバイオマーカーとしての両方のレクチンのアッセイ及び従来のＣＡ１５−３アッセイについて、ＲＯＣ曲線を生成した。両方のレクチンベースのバイオマーカーアッセイのＡＵＣ（曲線下面積）は、従来のアッセイ（ＡＵＣ＝０．８３３）を超えて優れており、ＣＡ１２５ＷＧＡ（０．９３９）で最も良好であるにように思われた（図１４）。したがって、この新しいＣＡ１５−３−レクチン（ＭＧＬ及びＷＧＡ）ナノ粒子概念は実質的に従来のＣＡ１５−３免疫アッセイに比較して、特異性に影響せずに、臨床的感度を増加させることができる。
【０１５１】
ＣＡ１５−３  ＷＧＡ−Ｅｕキレートベースのアッセイ
調査された多数のレクチンナノ粒子のうちで、組み換えヒトＭＧＬ  ＮＰｓ及び植物レクチンＷＧＡ  ＮＰｓのみが、ＢＣａ細胞株関連ＣＡ１５−３グリコフォームの検出について良好な能力を示した。ＷＧＡ  ＮＰｓアッセイの性能がＭＧＬ  ＮＰｓアッセイを超えて優れていたので、及びさらにＷＧＡが植物レクチンであり、組み換えＭＧＬよりもはるかに安価なので、ＷＧＡを可溶性のＥｕキレートにより直接標識した。直接標識したＷＧＡは、ＷＧＡナノ粒子と同じように良好に動作した（以下の表を参照）。
【０１５２】
レクチンが低い親和性を有することは周知である。したがって、Ｅｕ−ＮＰｓを使用して、結合活性効果を介してそれらの結合親和性を増加させた。しかしながら、少なくともＷＧＡは可溶性のＥｕキレート標識により非常に良好に動作する（親和性改善を必要とせずに）。任意の理論に限定されものではないが、これはＷＧＡそれ自体の良好な親和性に起因するためであり得、ＷＧＡ反応性のグリカンエピトープ（ＧｌｃＮＡｃ）が、大きな２００〜１０００ｋＤａの糖タンパク質であるＣＡ１５−３上の複数の位置で存在できるためでもある。したがって、ＷＧＡ−Ｅｕキレートの多くの分子が単一ＣＡ１５−３と結合することができ、ＷＧＡ−ＮＰｓのものに近い感度をもたらす。
【表５】
2019522223.tif 000006
【表６】
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【０１５３】
ＲＯＣ曲線を、ベースラインの転移性乳癌患者の血漿サンプル（ｎ＝５３）及び対照としての健康な女性のサンプル（ｎ＝２０）を使用して、ＣＡ１５−３ＷＧＡＮＰｓベースのバイオマーカーアッセイ、ＣＡ１５−３ＷＧＡ−Ｅｕキレートベースのバイオマーカーアッセイ、及び従来のＣＡ１５−３アッセイについて生成した。ナノ粒子又はＥｕキレートのいずれかで標識したＷＧＡをベースのバイオマーカーアッセイのＡＵＣ（曲線下面積）は、従来のアッセイ（ＡＵＣ＝０．８２６）を超えて優れていた。最も良好な性能がＥｕナノ粒子ベースのＣＡ１５−３ＷＧＡ（０．９２６）により得られた。しかしながら、ＥｕキレートベースのＣＡ１５−３ＷＧＡ（ＡＵＣ＝０．８９０）のＡＵＣは、ナノ粒子ベースのアッセイ（ＡＵＣ＝０．９２６）に接近していた（図１５）。
【０１５４】
結腸直腸癌
実施例５。結腸直腸癌についてのＣＥＡ糖鎖バリアントレクチンナノ粒子アッセイ
材料及び方法
臨床サンプル
大腸炎患者（ｎ＝１４）及び結腸直腸癌患者（ｎ＝３４）からのＥＤＴＡ血漿サンプルを、Ａｕｒｉａ  ｂｉｏｂａｎｋ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）から購入した。結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者のうちで、２３のＥＤＴＡサンプルを治療の前に採取し、それらを物質として分析し、開発したＣＥＡ糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイ及び商業的なＣＥＡ免疫アッセイ（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン））を使用して、大腸炎患者からのＥＤＴＡ血漿サンプルに比較した。ＣＥＡ＜５ｎｇ／ｍｌを有するＣＲＣ患者からのＥＤＴＡ血漿（ｎ＝２３）を、同じ範囲中のＣＥＡを有する健康なボランティア（ｎ＝１１）に比較した。
【０１５５】
材料
ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（免疫グロブリンＧ１断片、結晶化可能）と融合したヒトＤＣ−ｓｉｇｎ（樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン）及びヒトＭＢＬ（マンノース結合レクチン）を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓａｏｔａ、米国）から購入した。ヒトＭＧＬ（マクロファージガラクトース型レクチン）は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ、中国）からのものであった。抗ＣＥＡ  ｍＡｂ（モノクローナル抗体）１２−１４０−１及びＣＥＡの１つ調製物を、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン）から得た。抗ＣＥＡのｍＡｂ  Ｔ８４．６６及びＣＥＡ調製物は、Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｒａｄｉｕｍ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｏｓｌｏ、ノルウェー）のＫｊｅｌｌ  Ｎｕｓｔａｄからの好意による寄贈であった。別のＣＥＡ調製物をＨｙｔｅｓｔ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）から購入した。黄色のストレプトアビジンコーティング９６ウェルマイクロタイタープレートを、Ｋａｉｖｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で特に作製した。ＲＥＤアッセイバッファーをＫａｉｖｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．から購入した。ＤＥＬＦＩＡプレート振盪機、ＤＥＬＦＩＡプレート洗浄機、及びＶｉｃｔｏｒ（商標）フルオロメーターは、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）によって製造された。ブロメライン溶液ＩＤ−希釈物質１は、ＤｉａＭｅｄ（Ｃｒｅｓｓｉｅｒ  ＦＲ、スイス）からのものであった。ＮＡＰ−５バッファー交換カラム及びＮＡＰ−１０バッファー交換カラムを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）から購入した。
【０１５６】
方法
捕捉物の断片化
１２−１４０−１  Ｆａｂ２（断片、抗原結合）抗体断片を得るために、１２−１４０−１のｍＡｂ（１．１５ｍｇ）のバッファーを、ＮＡＰ−５カラムを使用して０．９％のＮａＣｌへ交換し、反応バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ）中のＩＤ−希釈物質１（１ｍｇのｍＡｂあたり５０μｌ）によりインキュベーションすることによって＋３７℃で２時間消化した。０．２ＭのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を０．０２ＭのＮＥＭの最終濃度で添加することによって、消化を停止した。プロテインＧ親和性精製を使用して、Ｆａｂ２抗体断片を精製した。
【０１５７】
ビオチン化
断片化ｍＡｂ及び全体の抗ＣＥＡ  ｍＡｂのバッファーを０．９％のＮａＣｌへ交換した。抗体を、４０倍のモル過剰のＢＩＴＣ（ビオチンイソチオシアネート）及び全反応体積の１／１０の５００ｍＭのＮａ２ＣＯ３バッファー（ｐＨ９．８）の添加によって、ビオチンとコンジュゲートした。反応物を、直射光から遠ざけてＲＴで４時間インキュベーションした。混合物を、ＴＳＡバッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮａＮ３）への２回のバッファー交換により精製し、１％のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）処理ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を、すべての混合物へ添加した。
【０１５８】
ビオチン化１２−１４０−１  Ｆａｂ２スポットの調製
ビオチン化１２−１４０−１  Ｆａｂ２（３０μｇ／ｍＬ）を、設定（７０％湿度、パルス５０μｓ、電圧９０Ｖ、遅延２５０μｓ、周波数１００Ｈｚ）の使用によって、Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ非接触マイクロ分注装置（ＧｅＳｉＭ（ドイツ））により、黄色のストレプトアビジンコーティング９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｋａｉｖｏｇｅｎ（フィンランド））の上へアレイ・イン・ウェルのフォーマットでプリントした。プリントバッファーは１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと共にリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を含有していた。
【０１５９】
レクチンナノ粒子アッセイ
レクチンを、実施例１において記載されるようにユウロピウムをドープしたナノ粒子上にコーティングした。すべてのアッセイを黄色のストレプトアビジンコーティング９６ウェルマイクロタイタープレート上で遂行した。１ウェルあたり２５μｌの全体積の三重検体を、すべてのアッセイインキュベーションにおいて使用し、ＲＴでゆっくりした振盪で遂行した。すべての３つのＣＥＡ調製物の等量を一緒に混合すること、並びにＴＳＡ−ＢＳＡバッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＮａＮ３、０．１％のＢＳＡ）中で２００、１００、５０、１５、５、２及び０ｎｇ／ｍｌの濃度へ混合物を希釈することによって、ＣＥＡスタンダードを調製した。ビオチン化ｍＡｂの１２−１４０−１及びＴ８４．６６を、ＲＥＤアッセイにおいて１ウェルあたり５０ｎｇ添加し、それぞれＭＢＬアッセイ及びＤＣ−ｓｉｇｎアッセイにおける捕捉物としての使用のために１時間インキュベーションすることによって固定化した。ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート中でのスポットとしてのビオチン化１２−１４０−１のＦａｂ２を、ヒトＭＧＬアッセイにおいて捕捉物として使用した。サンプル及びスタンダードを、ＭＢＬ及びＤＣ−ｓｉｇｎアッセイについては、バッファーＡ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１７５ｍＭのＣａＣｌ２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、３７．５Ｕ／ｍｌのヘパリン、１００μＭのＤＴＰＡ、０．０１％のツイーン４０、０．５ｍｇ／ｍｌのウシγ−グロブリン、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）、並びにヒトＭＧＬアッセイについては、バッファーＢ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、１７５ｍＭのＣａＣｌ２、３５０ｍＭのＮａＣｌ、５μｇ／ｍｌの未変性のマウスＩｇＧ、５μｇ／ｍｌのＨＢＲ−２、５μｇ／ｍｌのＭＡＫ−３３、１０５Ｕ／ｍｌのヘパリン、１００μＭのＤＴＰＡ、０．０１％のツイーン４０、０．５ｍｇ／ｍｌのウシγ−グロブリン、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）中で、５倍希釈した。２回ウェルを洗浄した後に、サンプル及びスタンダードを添加し、１時間インキュベーションした。ＭＢＬアッセイ及びＤＣ−ｓｉｇｎアッセイについて３ｍＭのＣａＣｌ２を添加し、ヒトＭＧＬアッセイについて１２ｍＭのＣａＣｌ２を添加した、ＲＥＤアッセイバッファー中で、レクチンナノ粒子を希釈した。添加したレクチンナノ粒子濃度は、それぞれＭＢＬアッセイ、ＤＣ−ｓｉｇｎアッセイ及びＭＧＬアッセイについて１ウェルあたり、２０×１０６、１５×１０６、及び３５×１０６粒子であった。ウェルを２回洗浄し、ナノ粒子溶液を添加した。プレートを２時間インキュベーションし、６回洗浄した。ユウロピウムの時間分解蛍光を、３４０ｎｍの励起波長を使用して６１５ｎｍの波長で測定した。測定サイクルは１０００μｓであり、４００μｓの遅延及び４００μｓの測定ウィンドウタイムであった。
【０１６０】
結果
ＣＥＡ＜５ｎｇ／ｍｌを有するＣＲＣ患者からのＥＤＴＡ血漿を、商業的なＣＥＡ免疫アッセイ並びにＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎ糖鎖バリアントアッセイ及びＣＥＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイを使用して、同じ範囲中のＣＥＡを有する健康なボランティアに比較した（図１６）。同等の血漿ＣＥＡレベルを有するＣＲＣ患者及び健康な対照は、レクチン糖鎖バリアントＣＥＡアッセイにより差異的に検出され、ＣＲＣにおいてＣＥＡグリコフォームの量は増加した。健康な対照のうちの７つはＣＥＡＭＧＬアッセイにより検出不可能であった。
【０１６１】
大腸炎又はＣＲＣの患者からの従来のＣＥＡ値をプロットした（図１７）。９５％信頼区間によるマン・ホイットニーのＵ検定は、統計的有意差の決定のために使用した試験であった。すべてのアッセイで図１７Ａにおける２つの群の間の差は有意であった。商業的なＣＥＡ免疫アッセイを使用する場合に、２３名のＣＲＣ患者のうちの１０名のみ（治療の前にサンプリングを行う）が、５ｎｇ／ｍｌの参照範囲を超える血漿ＣＥＡ値を有し、１３名のＣＲＣ患者は偽陰性であった。糖鎖バリアントＣＥＡアッセイは、偽陰性の数を、ＣＥＡＭＢＬアッセイ及びＣＥＡＭＧＬアッセイにより６に、並びにＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎアッセイにより８に減少させることができた。
【０１６２】
ＣＲＣ群を下位群（フォローアップ後に生存する患者（ｎ＝１３）及びフォローアップ後に死亡した患者（ｎ＝１０））へと分割した場合に（図１７Ｂ）、従来のＣＥＡアッセイ及びＭＧＬアッセイによる大腸炎群と「生存」群との間の差以外は、すべては有意なままであった。
【０１６３】
ＲＯＣ（受信者動作特性）をすべてのアッセイについて計算した（図１８）。ＡＵＣ（曲線下面積値）は従来のＣＥＡアッセイについては０．８２３であった。ＭＢＬアッセイ及び３つのレクチンアッセイの値を組み合わせる回帰モデルのＡＵＣは従来のアッセイのよりも高く、それぞれ０．８３７及び０．８４８であった。ＭＧＬアッセイ及びＤＣ−ｓｉｇｎアッセイのＡＵＣは従来のアッセイのよりも低く、それぞれ０．７５８及び０．８１７であった。
【０１６４】
試験された３２のレクチンの中で、ＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬは、ＥＤＴＡ血漿において癌性ＣＥＡ抗原について最も高い反応性及び低バックグラウンドを示した。
【０１６５】
商業的なＣＥＡ免疫アッセイに比較したレクチンＣＥＡアッセイによる改善
異なる糖鎖バリアントＣＥＡアッセイ（ＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎ、ＣＥＡＭＧＬ、又はＣＥＡＭＢＬ）は、ＣＥＡ腫瘍マーカーの結腸直腸癌特異性を改善することができる。正常な範囲中の血漿ＣＥＡレベルを有するＣＲＣ患者及び健康な対照は、レクチン糖鎖バリアントＣＥＡアッセイにより差異的に検出され、ＣＲＣにおいてＣＥＡグリコフォームの量は増加した。偽陰性の数は、ＣＥＡＤＣ−Ｓｉｇｎ、ＣＥＡＭＧＬ又はＣＥＡＭＢＬアッセイを使用して有意に減少した。
【０１６６】
膵臓癌
実施例６。ＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイ
材料及び方法
臨床サンプル及び対照サンプル
１６名の健康な若いボランティアからのＥＤＴＡ血漿を、適切な許可及びインフォームドコンセントによりＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕで収集した。胃腸疾患と診断され、ＣＡ１９−９レベルの上昇が頻繁に測定される患者からの１１の対照サンプルのＥＤＴＡ血漿サンプルを、Ａｕｒｉａ  Ｂｉｏｂａｎｋ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）から購入した。これらの対照のうちで、５名の患者が肝臓の線維化及び肝硬変を有し、２名の患者が慢性肝炎を有し、１名の患者がアルコール性肝臓疾患であると診断され、３名の患者が胆管の他の疾患を有すると診断された。ＣＡ１９−９値が＞５Ｕ／ｍＬ（４８５２Ｕ／ｍＬまでの範囲）であり任意の種類の癌の罹患のない１６名の対照からの追加のＥＤＴＡ血漿サンプルに加えて、膵臓癌患者からの１０のサンプルを、Ａｕｒｉａ  Ｂｉｏｂａｎｋから購入した。膵臓癌患者のうちで、８名は腺癌を有し、１名は神経内分泌腫瘍及び２名は転移性癌を有するとして分類された。胃腸疾患の１１名の患者及びＣＡ１９−９が＞５Ｕ／ｍＬである１６名の対照はすべて、良性の対照として判断された。
【０１６７】
材料
抗ＣＡ１９−９のｍＡｂ（モノクローナル抗体）ｃ２４１をＦｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン）から取得した。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（免疫グロブリンＧ１断片、結晶化可能）と融合したヒトＤＣ−ｓｉｇｎ（樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン）を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓａｏｔａ、米国）から購入した。黄色のストレプトアビジンコーティング９６ウェルマイクロタイタープレートを、Ｋａｉｖｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で特に作製した。ＲＥＤアッセイバッファーをＫａｉｖｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．から購入した。ＤＥＬＦＩＡプレート振盪機、ＤＥＬＦＩＡプレート洗浄機、及びＶｉｃｔｏｒ（商標）フルオロメーターは、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）によって製造された。
【０１６８】
Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．及びＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ．（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）からの同じ量のＣＡ１９−９抗原をプールし、キャリブレーターとして使用し、１、５、１０、２０、５０、１００Ｕ／ｍＬの希釈物を、５ｇ／ＬのＢＳＡを含有するトリス−食塩水−アジドバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＮａＮ３（ｐＨ７．７））中で作製し、三重検体として使用した。
【０１６９】
方法
開発されたＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイを、３ステップサンドイッチタイプのフォーマットで遂行し、そこで、抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体を捕捉物として及びレクチンコーティングナノ粒子をトレーサーとして使用した。すべての続いて行われるステップを室温で進め、遅い振盪によりインキュベーションを行った。
【０１７０】
捕捉抗体として使用されるビオチン化抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体ｃ２４１（７５ｎｇ／ウェル）を、１時間のインキュベーションで、２５μＬのＲＥＤアッセイバッファー中でストレプトアビジンコーティングウェルに固定化した。２回の洗浄後に、５μＬのサンプル又はキャリブレーターのいずれか及び５０ｍＭのＣａＣｌ２を添加した２０μＬのＲｅｄアッセイバッファーを、３つの複製で添加し、１時間インキュベーションした。ウェルを２回洗浄し、Ｅｕ（ＩＩＩ）−キレート染色ナノ粒子（１．０×１０７粒子／ウェル）へカップルしたＤＣ−ｓｉｇｎを、１２．５ｍＭのＣａＣｌ２を添加した３０μｌのＲＥＤアッセイバッファー中に添加した。ナノ粒子を２時間インキュベーションした後に、ウェルを６回を洗浄し、結合されたナノ粒子バイオコンジュゲートのＴＲＦをウェルの表面から直接測定した。
【０１７１】
商業的なＣＡ１９−９免疫アッセイキット（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｌｄｔ）を参照方法として使用して、開発されたＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイを比較した。
【０１７２】
結果
ＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイにより、中央値濃度は、膵臓癌患者について２０．８Ｕ／ｍＬ（四分位範囲：９．４５、３８Ｕ／ｍＬ）、良性の患者について５．９Ｕ／ｍＬ（四分位範囲：２．６、１６．８Ｕ／ｍＬ）、及び健康なボランティアについて４．９Ｕ／ｍＬ（四分位範囲：２．７、６．８Ｕ／ｍＬ）であった。ＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイは、従来のＣＡ１９−９免疫アッセイ（そこで、ボーダーラインの統計的有意差が膵臓癌患者と健康な対照との間でのみ観察された（ｐ＝０．０４１））に比較して、健康な対照（ｐ＝０．０００１）及び良性の対照（ｐ＝０．０２８）からの膵臓癌患者の弁別を改善した（図１）。従来のＣＡ１９−９免疫アッセイを使用した場合に、膵臓癌患者と良性の対照との間に統計的有意差はなかった（ｐ＝０．１０５）。
【０１７３】
さらに、１０名の膵臓癌患者のうちの３名のみが、従来のＣＡ１９−９免疫アッセイにおいて３７Ｕ／ｍＬの推奨カットオフを超えるＣＡ１９−９値を有し、試験した膵臓癌患者のうちの７０％（７／１０）が偽陰性として決定された結果となった。１０Ｕ／ｍＬのカットオフによりＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイを使用して、１０名の膵臓癌患者のうちの８名は陽性として正確に決定され、感度は有意に改善された。
【０１７４】
試験された２７のレクチンの中で、ＤＣ−ＳＩＧＮは癌性ＣＡ１９−９抗原について最も高い反応性のものであり、ＥＤＴＡ血漿又は血清のいずれかを使用した場合に良好な性能であることを示した。
【０１７５】
ＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイによる改善
ＣＡ１９−９糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイは、従来のＣＡ１９−９免疫アッセイに比較して、健康な対照及び良性の対照（肝臓又は胆管の良性の疾患を有する患者）からの膵臓癌患者の弁別を改善した。さらに、ＣＡ１９−９糖鎖バリアントアッセイは偽陰性の数を減少させ、感度は有意に改善された。
【０１７６】
前立腺癌
実施例７。ＰＳＡ糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイ
試薬及び装置類
健康なドナーからの精漿ＰＳＡを、適切な許可及びインフォームドコンセントによりＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｍａｌｍｏ、スウェーデン）から得た。前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）から精製したＰＳＡは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕからのものであった。ヒトＭＧＬ（マクロファージガラクトース型レクチン）は、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ、中国）からのものであった。コンジュゲートしていないＷＧＡ（小麦胚芽凝集素）はＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、イギリス）からのものであった。組み換えヒトＧａｌ４（ガレクチン４）及びデクチン２はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓａｏｔａ、米国）からのものであった。ストレプトアビジンによりコーティングしたマイクロタイターウェル、洗浄バッファー濃縮物、及びＲＥＤアッセイバッファーを、Ｋａｉｖｏｇｅｎ  Ｌｔｄ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）から購入した。ＤＥＬＦＩＡプレート振盪機、ＤＥＬＦＩＡプレート洗浄機、及びＶｉｃｔｏｒ（商標）フルオロメーターは、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）によって製造された。
【０１７７】
ＬＮＣａＰ  ＰＳＡをキャリブレーターとして使用し、希釈物（１〜２００μｇ／ＬのＬＮＣａＰ  ＰＳＡ）を、５ｇ／ＬのＢＳＡを含有するトリス−食塩水−アジドバッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＮａＮ３（ｐＨ７．７））中で作製し、三重検体として使用した。
【０１７８】
臨床サンプル及び対照サンプル
３６名のＰＣａ患者（１２名は組織学的に良性、及び２４名は癌性、グリーソン２〜４としてグレード付けられた）から、前立腺組織サンプルを、Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（フィンランド）で根治的前立腺切除術（ＲＰ）から外科手術直後に得た。サンプル組織を、さらなるプロセシングまで、プロテアーゼ阻害因子（ｃＯｍｐｌｅｔｅタブレット、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ））を添加した１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）バッファー中で−２０℃で保存した。Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｅｅｌ、ベルギー）からのトリトン−Ｘ−１００界面活性剤を使用して、サンプル体積の１／１０の１０×ＰＢＳ溶解バッファー（ｐＨ７．４、プロテアーゼ阻害因子を添加した、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のトリトン−Ｘ−１００）の添加によって、タンパク質プールを回収した。溶解を遅い振盪下で氷上で２時間行い、上清を−２０℃で保存した。各々のサンプルからの分析のために、１：１０希釈を５ｇ／ＬのＢＳＡを含有するトリス−食塩水−アジドバッファー中で行った。
【０１７９】
尿サンプルをＴｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。研究コホートは、前立腺癌（ＰＣａ）の臨床上の疑いの有る連続的な前向き登録された１４３名の男性を含み、ＩＭＰＲＯＤ試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０１８６４１３５）と登録された。ＥＤＴＡ血漿を、ＩＭＰＲＯＤ試験に登録された４５名の男性から得た。１１名の男性のボランティア（３５歳未満）からの尿サンプルをＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｋｕで収集した。
【０１８０】
方法
ビオチン化５Ａ１０  Ｆａｂスポットの調製
ビオチン化５Ａ１０  Ｆａｂ（１００μｇ／ｍＬ）を、設定（７０％湿度、パルス５０μｓ、電圧９０Ｖ、遅延２５０μｓ、周波数１００Ｈｚ）の使用によって、Ｎａｎｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ非接触マイクロ分注装置（ＧｅＳｉＭ（ドイツ））により、黄色のストレプトアビジンコーティング９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｋａｉｖｏｇｅｎ（フィンランド））の上へアレイ・イン・ウェルのフォーマットでプリントした。プリントバッファーは１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールと共にリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）を含有していた。
【０１８１】
組織溶解物についてのレクチンナノ粒子アッセイ
開発されたＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイを、３ステップサンドイッチタイプのフォーマットで遂行し、すべてのインキュベーションを室温で遅い振盪で遂行した。捕捉抗体として使用されるビオチン化遊離ＰＳＡ特異的組み換えＦａｂ断片（１５０ｎｇ／ウェル）を、１時間のインキュベーションで、１００μＬのＲＥＤアッセイバッファー中でストレプトアビジンコーティングウェルに固定化した。２回の洗浄後に、５０μＬの組織溶解物の希釈物又はキャリブレーターのいずれか及び５μｇ／ｍｌの未変性のマウスＩｇＧ、５μｇ／ｍｌのＨＢＲ−２、５μｇ／ｍｌのＭＡＫ−３３を添加した５０μＬのＲｅｄアッセイバッファーを、三重で添加し、１時間インキュベーションした。ウェルを２回洗浄し、Ｅｕ（ＩＩＩ）へカップルしたＭＧＬ−キレート染色ナノ粒子（２．０×１０７粒子／ウェル）を、３ｍＭのＣａＣｌ２を添加した１００μｌのＲＥＤアッセイバッファー中に添加した。ナノ粒子を２時間インキュベーションした後に、ウェルを６回を洗浄し、結合されたナノ粒子バイオコンジュゲートの時間分解蛍光（ＴＲＦ）をウェルの表面から直接測定した。
【０１８２】
ＬＮＣａＰ細胞によって分泌されたＰＳＡ及び健康なドナーからの精漿ＰＳＡを、開発されたＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントレクチン−ナノ粒子アッセイを使用して研究した。１〜１８０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲中の異なるＰＳＡ形態からの蛍光を図２０中で示す。サンプルインキュベーションにおいて２５μｌの異なるＰＳＡ濃度及び７５μｌのＲＥＤアッセイバッファーを使用した以外は、アッセイを組織溶解物についてのように行った。
【０１８３】
尿及びＥＤＴＡ血漿サンプルについてのレクチンナノ粒子アッセイ
ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートの上へスポットしたビオチン化５Ａ１０  Ｆａｂ（１００μｇ／ｍｌ）を、糖鎖バリアントｆＰＳＡＭＧＬアッセイにおいて捕捉物として使用した。ｆＰＳＡデクチン２ｆＰＳＡＷＧＡアッセイのためのビオチン化５Ａ１０  Ｆａｂ（８０ｎｇ／ウェル）、及び全ＰＳＡＧａｌ４アッセイのためのＨ１１７  ｍＡｂ（１２０ｎｇ／ウェル）を、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートの上へＲＥＤアッセイバッファー中で添加し、１時間インキュベーションした。
【０１８４】
２回の洗浄後に、２０μＬのサンプル又はキャリブレーターのいずれか及び５μｇ／ｍｌの未変性のマウスＩｇＧ、５μｇ／ｍｌのＨＢＲ−２、５μｇ／ｍｌのＭＡＫ−３３を添加した３０μＬのＲｅｄアッセイバッファーを、ｆＰＳＡＭＧＬアッセイに添加し；他のアッセイについては、１０μｌのサンプル又はキャリブレーター及び４０μｌのアッセイバッファーを使用した。サンプル及びキャリブレーターを三重で添加し、１時間インキュベーションした。レクチンナノ粒子を６ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＲＥＤアッセイバッファー中で希釈した。２回の洗浄後に、添加したレクチンナノ粒子濃度は、それぞれＭＢＬアッセイ、ｆＰＳＡＭＧＬ、ｆＰＳＡデクチン２、ｆＰＳＡＷＧＡ及び全ＰＳＡＧａｌ４アッセイについて１ウェルあたり、７×１０６、４×１０７、５×１０６、及び２×１０７粒子であった。プレートを６回洗浄し、２時間インキュベーションし、ＴＲＦを測定した。
【０１８５】
結果
健康なドナーからの精漿ＰＳＡ及び前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）に由来するＰＳＡは、開発されたＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイにより差異的に検出され、これは、このアッセイが癌性ＰＳＡのみを検出するからである（図２０）。
【０１８６】
１２の良性前立腺組織溶解物及び２４の癌性前立腺組織溶解物からのＰＳＡを、全体のウェルのフォーマットでナノ粒子ベースのレクチン免疫アッセイｆＰＳＡＭＧＬを使用して研究した。腫瘍組織は、ＰＣａ患者からの良性組織に比較して、ＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントにおいて統計的に有意な（ｐ＝０．００２）増加を示した（図２１）。すべての良性組織サンプルはＰＣａ患者からのものであったが、正常な前立腺組織顕微鏡像を有し、グリコシル化の変更が良性組織中のＰＳＡ上で既に生じ得る可能性がかなり高く、ｆＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイにより測定可能な蛍光シグナルをもたらす。
【０１８７】
前向き対照治験（ＩＭＰＲＯＤ、ＮＣＴ０１８６４１３５）におけるＰＣａの臨床上の疑いの有る１４３名の男性からの尿サンプルを、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートの上へスポットした捕捉５Ａ１０  Ｆａｂで、ｆＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイにより分析した。１４３名の男性のうちで、７４名は臨床的に有意なＰＣａ（グリーソンスコア≧７）と診断され、２０名の男性はグリーソンスコア６のグレードのＰＣａを有し、４９名は陰性の前立腺生検（生検陰性と称される）であった。加えて、１１名の若い健康な男性からの尿が含まれた。尿ＰＳＡからのＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイの、全ＰＳＡにより補正された蛍光シグナルを、図２２中で提示する。臨床的に有意なＰＣａの有る男性におけるＰＳＡ糖鎖バリアント濃度は、陰性のＰＣａ生検又はグリーソンスコア６のＰＣａを有する男性に比較して、尿の中央値において統計的に有意な（ｐ＝０．００６）増加があった。尿ＰＳＡ糖鎖バリアント含有量は、より侵襲性のグリーソンスコア９の前立腺癌においてさらに上昇するように思われた。尿ＰＳＡの濃度が試験されたすべての群について同じ範囲中であったにもかかわらず、若い男性からの尿ＰＳＡはｆＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイを使用して検出されなかった。臨床的に有意なＰＣａ、陰性の前立腺生検又はグリーソン６のＰＣａを有する患者、及び健康な若い男性についての尿ＰＳＡの濃度を、表７中に提示する。
【０１８８】
臨床的に有意な前立腺癌の弁別をさらに改善する能力を有する追加のＰＳＡ糖鎖バリアントアッセイを、図２３中に提示する。ＰＣａが確認されたか又は前立腺癌の疑いが有るが陰性の生検を有する男性からのＥＤＴＡ血漿を、健康な男性に比較した。ＰＳＡＷＧＡ、ＰＳＡＧａｌ４、及びＰＳＡデクチン２の糖鎖バリアントアッセイは、臨床的に有意なＰＣａの有る男性においてＰＳＡ糖鎖バリアント含有量の中央値の増加を示した。
【０１８９】
試験された３０のレクチンの中で、ＭＧＬは、癌性ＰＳＡ抗原と非癌性ＰＳＡ抗原との間で弁別する優れた能力を示した。
【表７】
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【０１９０】
ｆＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイによる改善
ｆＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイは、ＰＳＡの癌特異性を改善し、臨床的に有意なＰＣａの有る患者の弁別を支援でき、このアッセイはＰＣａ患者の前立腺癌組織及び尿中に存在するＰＳＡのグリコフォームを検出する。尿ＰＳＡは、高い濃度の場合でさえ、ｆＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイにより若い男性から検出不可能である。血液の代わりに尿サンプルを使用すると、サンプルは非侵襲性であるという利点を有し、サンプリングのための人材についての必要性がない。ＰＳＡ濃度範囲が、若い男性、ＰＣａ患者、及び陰性のＰＣａ生検の男性において同一であるので、従来の全ＰＳＡ免疫アッセイ又は遊離ＰＳＡの免疫アッセイは、区別することができない。
【０１９１】
ＰＳＡＭＧＬ糖鎖バリアントアッセイは組織溶解物及び尿サンプルのために好適であるので、他の腫瘍マーカーにより示されるように、血清サンプルに適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月12日(2019.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における前立腺癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、マクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）へ結合するＰＳＡのグリコフォームのレベルについてアッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＰＳＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、及び
前記比較に基づいて前記被験体における前立腺癌の疾患状態を決定すること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記被験体から得られたサンプルをＰＳＡタンパク質抗原についてアッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）及びＭＧＬからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンへ結合するＣＥＡグリコフォームのレベルについてアッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＥＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、並びに
前記比較に基づいて前記被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項４】
ＭＢＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＢＬ及びＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬ、又はＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬへのＣＥＡの結合が、アッセイされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体から得られたサンプルをＣＥＡタンパク質抗原についてアッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
被験体における膵臓癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するＣＡ１９−９のグリコフォームのレベルについてアッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＡ１９−９のグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、及び
前記比較に基づいて前記被験体における前立腺癌の疾患状態を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記被験体から得られたサンプルをＣＡ１９−９タンパク質抗原についてアッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被験体における乳癌の疾患状態を決定する方法であって、
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬ及び小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）からなる群から選択される１つ又は複数のレクチンへ結合するＣＡ１５−３グリコフォームのレベルについて、アッセイすること、
前記サンプル中の前記レクチン結合ＣＡ１５−３のグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、及び
前記比較に基づいて前記被験体における乳癌の疾患状態を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記サンプルから得られたサンプルを、ＤＳＬ及びＧａｌ４からなる群から選択されるレクチンを結合する１つ又は複数のさらなるＣＡ１５−３グリコフォームについて、アッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のさらなるレクチン結合ＣＥＡのグリコフォームの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体から得られたサンプルを、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５及びＣＥＡからなる群から選択される１つ又は複数の従来のバイオマーカーについて、アッセイすること、及び
前記サンプル中の前記１つ又は複数のバイオマーカーの検出されたレベルを、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較すること、
をさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル中の前記グリコフォーム又は前記バイオマーカーのレベルが、対照サンプルのそのレベル又は既定の閾値と比較して、増加することが、前記被験体が前記癌を有すること又は有するリスクがあることを示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌をスクリーニング、診断、予後予測、又はモニタリングするための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記モニタリングが、前記癌の開始のモニタリングのため、前記癌を有するかもしくは発症するリスクの任意の変化のモニタリングのため、治療への応答のモニタリングのため、前記癌の再燃のモニタリングのため、又は前記癌の再発のモニタリングのためである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バイオマーカーの前記１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームのレベルについてアッセイすることが、
サンプル中に含有されるバイオマーカーを捕捉するために、前記バイオマーカーについて特異的な抗体へ前記サンプルをさらすこと、
前記捕捉されたバイオマーカーを１つ又は複数のレクチンへさらすこと、及び
検出可能シグナルの補助により、前記１つ又は複数のレクチンへの前記捕捉されたバイオマーカーの結合のレベルを測定すること、
を含む結合アッセイによって実行される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バイオマーカーの前記１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームのレベルについてアッセイすることが、
サンプル中に含有される前記バイオマーカーの１つ又は複数のレクチン結合グリコフォームを捕捉するために、１つ又は複数のレクチンへ前記サンプルをさらすこと、
前記捕捉されたバイオマーカーを該バイオマーカーに特異的な抗体へさらすこと、及び
検出可能シグナルの補助により、該バイオマーカーについて特異的な抗体への前記捕捉されたバイオマーカーの結合のレベルを測定すること、
を含む結合アッセイによって実行される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記レクチン又は前記抗体のいずれかがナノ粒子上で固定化される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、腹膜腔液体及び組織サンプルからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＳＡ結合剤及びＭＧＬを含み、前記ＰＳＡ結合剤又は前記ＭＧＬのいずれかが検出可能標識を含む、請求項１、２又は１１〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項１９】
ＰＳＡ結合剤をさらに含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＣＥＡ結合剤並びにＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンを含み、前記ＣＥＡ結合剤又は前記レクチンのいずれかが検出可能標識を含む、請求項３〜５又は１１〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２１】
ＭＢＬ及びＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＢＬ及びＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬ、又はＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＭＧＬを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
ＣＥＡ結合剤をさらに含む、請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＣＡ１９−９結合剤及びＤＣ−ＳＩＧＮを含み、前記ＣＡ１９−９結合剤又は前記ＤＣ−ＳＩＧＮのいずれかが検出可能標識を含む、請求項６、７又は１１〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２４】
ＣＡ−１９−９結合剤をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
ＣＡ１５−３結合剤並びにＭＧＬ及びＷＧＡからなる群から選択される１つ又は複数のレクチンを含み、前記ＣＡ１５−３結合剤又は前記１つ又は複数のレクチンのいずれかが検出可能標識を含む、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
【請求項２６】
ＣＡ−１５−３結合剤をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
ＳＢＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＭＡＡ  ＩＩ、ＡＡＬ、ＵＥＡ、ＰＨＡ−Ｅ、ＲＣＡ、ＷＧＡ、ＷＦＡ、ＰＳＡ、ＶＶＬ、ＴＪＡ−ＩＩ、ＤＳＬ、ＨＰＡ、ＭＧＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＭＭＲ、ＭＢＬ、シグレック−２、シグレック−３、シグレック−５、シグレック−９、シグレック−１０、シグレック−１１、ガレクチン−３、ガレクチン−４、Ｅ−セレクチン、ＤＳＬ、及びＧａｌ４からなる群から選択される１つ又は複数のレクチンをさらに含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記レクチンがナノ粒子上で固定化される、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記ナノ粒子のすべての次元が、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、又は約５０ｎｍ以下である、請求項１６に記載の方法、又は請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、タンパク質ナノ粒子、ミネラルナノ粒子、ガラスナノ粒子、ナノ粒子結晶、金属ナノ粒子、プラスチックナノ粒子、ポリスチレンナノ粒子、ポリ（エチレングリコール）ナノ粒子、ポリエチレンナノ粒子、ポリ（アクリル酸）ナノ粒子、ポリ（メチルメタクリレート）ナノ粒子、ポリサッカライドナノ粒子、コロイド金ナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、炭素ナノ粒子、多孔質シリカナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法又はキット。
【請求項３１】
前記ナノ粒子がランタニドキレート（ユウロピウム（ＩＩＩ）等）によりドープされる、請求項２９又は３０に記載の方法又はキット。
【請求項３２】
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬへ結合するＰＳＡのグリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における前立腺癌の疾患状態を決定するためのＭＧＬの使用。
【請求項３３】
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬを結合するＣＥＡグリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における結腸直腸癌の疾患状態を決定するためのＭＢＬ、ＤＣ−ＳＩＧＮ及び／又はＭＧＬの使用。
【請求項３４】
前記被験体から得られたサンプルを、ＤＣ−ＳＩＧＮへ結合するＣＡ１９−９グリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における膵臓癌の疾患状態を決定するためのＤＣ−ＳＩＧＮの使用。
【請求項３５】
前記被験体から得られたサンプルを、ＭＧＬ、ＷＧＡ、ＤＳＬ、及び／又はＧａｌ４へ結合するＣＡ１５−３グリコフォームのレベルについてアッセイすることによって、被験体における乳癌の疾患状態を決定するための、単独又は組み合わせのいずれかでのＭＧＬ又はＷＧＡの、任意にＤＳＬ及び／又はＧａｌ４と組み合わせた使用。
【請求項３６】
前記レクチンがナノ粒子上で固定化されるか、又は検出可能標識により標識される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
被験体における前記癌をスクリーニング、診断、予後予測及び／又はモニタリングするための、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
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2019522223.tif 000039
2019522223.tif 000040
2019522223.tif 000041
2019522223.tif 000042
2019522223.tif 000043
2019522223.tif 000044
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