(57)【要約】【解決手段】治療薬の腸内送達のためのｐＨ感受性ナノ粒子を含有する製剤が提供される。ナノ粒子は、胃内での分解に対して治療薬を保護し、それを小腸または結腸で放出させることを可能にするｐＨ感受性ポリマーを含む。ナノ粒子製剤は、経口投与したときに感受性の生物治療薬を分解から保護するのに特に有効であり、注射によるそのような薬剤の投与を回避することを可能にする。製剤を製造する方法、ならびに製剤を用いて疾患を処置する方法も提供される。
2019534897.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子サイズが５０ｎｍ以下を有する複数のナノ粒子を含み、前記ナノ粒子がｐＨ感受性ポリマーおよび約１００００ダルトン以下の分子量を有する治療薬を含む、治療薬の経口製剤。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、本質的に前記ｐＨ感受性ポリマーおよび前記治療薬からなる、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、界面活性剤、脂質、粘膜付着性ポリマーならびにそれらの組合せからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記製剤が約５．０より高いｐＨにおいて水性媒体をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記ナノ粒子を水性媒体中に約２．０未満のｐＨにて配置した２時間後に、前記治療薬の５％未満が前記ナノ粒子から放出される、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記ナノ粒子が約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの平均粒子サイズを有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記治療薬がペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記治療薬がインシュリンである、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記ｐＨ感受性ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネート、またはメチルメタクリレート／メタクリレート共重合体である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
平均粒子サイズが１００ｎｍ以下を有する複数のナノ粒子を含み、前記ナノ粒子がｐＨ感受性ポリマーおよび１００００ダルトンを超える分子量を有する治療薬を含む、治療薬の経口製剤。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、本質的に前記ｐＨ感受性ポリマーおよび前記治療薬からなる、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、界面活性剤、脂質、粘膜付着性ポリマーならびにそれらの組合せからなる群から選択される成分をさらに含む、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１３】
前記製剤が約５．０より大きいｐＨにおいて水性媒体をさらに含む、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
前記ナノ粒子を水性媒体中に約２．０未満のｐＨにて配置した２時間後に、前記治療薬の５％未満が前記ナノ粒子から放出される、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１５】
前記治療薬が、タンパク質、核酸、抗体、ウイルス様粒子、ベクター、ワクチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１６】
前記治療薬が、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２、抗ＲＳＶ、抗インターロイキン、および抗ＴＮＦからなる群から選択されるか、またはセツキシマブ、トラスツズマブ、パリビズマブ、トシリズマブ、およびアダリムマブからなる群から選択される抗体である、請求項１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記ｐＨ感受性ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネート、またはメチルメタクリレート／メタクリレート共重合体である、請求項１１に記載の製剤。
【請求項１８】
治療薬の経口投与製剤を調製する方法であって、
（ａ）治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを含む水性媒体を調製し、その溶液は約５．５より大きいｐＨを有し、それによって前記ポリマーは治療薬と会合したナノ粒子を形成する工程と、
（ｂ）任意に前記溶液のｐＨを約４．０未満に下げる工程、
とを含む前記方法。
【請求項１９】
工程（ａ）が、５．５未満のｐＨで治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを含む水溶液を提供し、次いで界面活性剤、脂質、および緩衝剤を含有する溶液を添加することによってｐＨを５．５より大に上昇させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨ５〜８において緩衝液および１種以上の安定化賦形剤、または界面活性剤として０〜１０ｍＭのタウロコール酸ナトリウム、脂質としての０〜１．５ｍＭのホスファチジルコリン、緩衝液としての０〜１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および０〜５０ｍＭの
リン酸ナトリウムを含有する溶液を添加することによって前記ｐＨを５．５より大になるように上昇させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｐＨを工程（ｂ）においてＨＣｌの添加によって低下させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
（ｃ）工程（ｂ）、または工程（ｂ）が行われない場合は工程（ａ）からもたらされる前記製剤を凍結乾燥すること、
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療薬が約１００００ダルトン以下の分子量を有し、かつ得られる製剤が約５０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含むか、または前記治療薬が、約１００００ダルトンより大きい分子量を有し、かつ得られる製剤が約１００ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｐＨ感受性ポリマーがヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネート、またはメチルメタクリレート／メタクリレート共重合体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療薬がタンパク質、核酸、抗体、ワクチン、ベクターおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法によって調製された治療薬の経口製剤。
【請求項２７】
疾患の処置を補助する方法であって、請求項１に記載の製剤をそれを必要とする対象に経口投与することを含み、前記製剤は前記疾患の処置を補助する治療薬を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記治療薬がインシュリンであり、前記疾患が、糖尿病、インシュリン欠乏に関連するメタボリック症候群、および乳児、小児、または青年期の糖尿病性ケトアシドーシスからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療薬が抗腫瘍抗体であり、前記疾患ががんである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療薬が抗炎症性抗体であり、前記疾患が抗炎症性疾患である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療薬の腸内送達のためのｐＨ感受性ナノ粒子を含有する製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質およびペプチドは、糖尿病、心臓病、およびがんなどの疾患を処置するために長年にわたって使用されてきており、ワクチンに使用されている。ほとんどの場合、これらの薬剤の経口送達は胃の中の酸性条件のために失敗して来た。さらに、インビトロ実験は、消化管内に天然に存在する酵素の存在下で多くのタンパク質およびペプチドが急速に不活性化または破壊されることを示していた。最後に、治療用タンパク質またはペプチドは、過剰の水素イオンまたはヒドロキシルイオンの存在下で化学的にまたは物理的に不安定になり得る。したがって、治療用タンパク質またはペプチドは一般に非経口的に患者に送達される。
【０００３】
糖尿病は慢性的な高血糖値を特徴としている。２０１４年現在、世界中で推定３億８，７００万人が糖尿病に罹患しており、特に低開発途上国および発展途上国でその数が多くなっている。２０３５年までに５億９，２００万人の糖尿病患者がいると推定されている。したがって、糖尿病は重大な世界的問題である。
ペプチドホルモンであるインシュリンは、糖尿病のいくつかの形態を処置するために使用されている。それは一般にその短い半減期および胃腸管における分解のために液体注射形態で送達される。インシュリンは注射可能な形態で頻繁に投与されなければならないので、患者、特に子供はそれが不便であると感じる。したがって、経口剤形などのより便利な非注射可能形態のインシュリンの開発に対する大きな需要がある。
【０００４】
ペプチド、タンパク質、および他の生物配合物の経口送達は望ましい一方で、適切な製剤は設計が困難である。ｐＨ感受性ポリマーの使用を含む、治療用タンパク質を胃酸による分解から保護するためのさまざまなコーティングが提案されて来た。ヒト胃腸管のｐＨは、胃（ｐＨ２〜３）から小腸（ｐＨ６．５〜７．０）、大腸（７．０〜７．８）まで次第に増加する。胃の中では、ｐＨ感受性ポリマーは理想的には胃液の分解作用に抵抗し、そして薬物分子はこうして保護される。胃を空にした後、薬物は腸に移動し、ｐＨ感受性ポリマーは可溶性になる。こうして、薬物は、薬物の溶解とポリマーマトリックスの孔を通る拡散との組み合わせによって腸内で制御された方法で放出され得る。
【０００５】
タンパク質またはペプチド治療薬の経口送達のためにｐＨ感受性粒子を調製するためのさまざまな方法が使用されてきた。その方法には、凍結乾燥、噴霧乾燥、多重エマルジョン−溶媒蒸発、ナノ沈殿、およびコアセルベーションが含まれる（Current Drug Therapy, 7:219-234, 2012）。しかしながら、これらの方法の各々はその欠点を有する。
【０００６】
溶媒蒸発は、薬物および担体を溶媒に溶解し、次いで溶媒を蒸発させることによって固溶体または分散液を調製するための一般的な方法である。得られた固体塊を粉砕しそして篩分けする。しかしながら、この方法ではスケールアップしそして物理的および化学的安定性を達成することは困難である。
親油性薬物の溶解を増加させる手段として薬物とポリマーの共沈が使用されてきた。ナノ沈殿物は、水混和性溶媒中の薬物とポリマーの溶液を安定剤を含有する水溶液に移すことによって調製される。急速な溶媒拡散によって、共沈物が瞬時に形成される。
【０００７】
乳化蒸発法においては、水と混和しない溶媒（例えば、ジクロロメタンまたはクロロホルム）中に薬物およびポリマーを含有する溶液を乳化剤を含有する水溶液に乳化する。その後の油／水エマルジョンからの溶媒の蒸発は、微粒子および／またはナノ粒子の形成をもたらす。乳化拡散法は乳化蒸発法と同様であるが、部分的に水溶性の溶媒（例えば、ベンジルアルコール）を使用する。油／水エマルジョンから溶媒を拡散させて粒子を形成するためには大量の水が必要である。
【０００８】
塩析プロセスにおいて、ポリマーと薬物の有機溶液は、電解質（例えば、ＭｇＣｌ２）と安定剤（例えば、ポリビニルアルコール）を含有する水相に乳化される。続いて十分量の水をエマルジョンに添加して有機溶媒の水への拡散を誘導し、ポリマーの沈殿および微粒子および／またはナノ粒子の形成をもたらす。多量の乳化剤および電解質を除去するためには複雑な精製段階が必要である。
【０００９】
ＰＣＴ出願ＷＯ ２０１０／１１３１７７は、インシュリンおよびメタクリル酸／メタクリル酸メチルコポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ  Ｌ  １００）を含有する経口インシュリンｐＨ感受性送達剤を開示している。薬剤は、流動パラフィンを使用する二重乳化技術によって調製され、これは不安定である。
米国公開特許出願第２０１０／０２１５４９号は、インシュリンと、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）などのｐＨ感受性ポリマーとを含有するコア−シェル粒子を記載している。粒子からのインシュリンの放出は、酸性媒体中では遅いが中性媒体中では速い。粒子は流動床噴霧技術により調製され、約２ｍｍの直径を有する粒子をもたらす。
【００１０】
Ｊｅｌｖｅｈｇａｒｉら（ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ、第１１巻、第３号、２０１０年９月、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  １００−５５および異なる分子量を有するキトサンを用いたｐＨ感受性インシュリンナノ粒子の開発）は、メタクリル酸／メタクリル酸メチルコポリマー（EUDRAGIT L 100）および分子量の異なるキトサンを使用したインシュリン含有ナノ粒子の形成を記載する。簡単に説明すると、０．４ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬインシュリンを０．２％キトサンと混合し、次いで２４ｍＬの０．２％（重量／体積）Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ  １００−５５エタノール溶液に注入した。注入中、混合物を５００ＲＰＭで撹拌して薬物およびポリマーを沈殿させ、得られた乳白色の分散液を２０μｍ孔フィルターを通して濾過した。インシュリン負荷効率は１８〜３０％であった。粒子の大きさは、約１３５ｎｍから約２００ｎｍの範囲であった。
【００１１】
粒子サイズは、経口送達用のポリマーベースの製剤の吸収、分布、およびインビボ性能を決定するための重要な因子である。一般に、ナノ粒子は、微粒子よりも高い細胞内取り込み効率を有する。Ｂａｋｈｒｕら（生分解性ナノ粒子によるタンパク質の経口送達、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０１３年； ６５：８１１）およびＰａｎｙａｍ、Ｊ．およびＬａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．（細胞および組織への薬物および酵素送達のための生分解性ナノ粒子、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２００３年；５５：３２９）は、１００ｎｍの粒子サイズを有するポリ（ラクチド−コグリコリド）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子の細胞内取り込みが、Ｃａｃｏ−２細胞中で１μｍ微粒子より２．５倍高く、１０μｍ微粒子より６倍高いことを報告した。同様の現象がラットで観察されており、ＰＬＧＡナノ粒子の細胞内取り込みは、１μｍおよび１０μｍの微粒子よりもそれぞれ１５倍および２５０倍高かった。＜１００ｎｍの粒子サイズを有するナノ粒子は、パイエル板(Peyer's patch)に効率的に取り込まれ、次いで体循環に吸収される（Ｗｏｉｔｉｓｋｉ ＣＢ．ら、消化管取り込みおよび転座を介したインシュリンナノ粒子の改善された経口送達に対する戦略  ＢｉｏＤｒｕｇ  ２００８年；２２：２２３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
経口送達用のｐＨ感受性粒子の工業生産のためにも費用対効果が高くかつ容易に拡大可能である改良された方法が必要とされている。水不溶性または有毒な有機溶媒を含まない、または有機溶媒の使用を完全に回避するｐＨ感受性粒子を調製する方法もまた必要とされている。さらに、高い負荷効率および良好な生物学的利用能を有するタンパク質、ペプチド、および他の治療薬の経口送達のためのｐＨ感受性粒子が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、治療薬の腸内送達のためのナノ粒子を含有する組成物、およびナノ粒子の製造方法を提供する。
本発明の一態様は、治療薬の経口製剤に使用するための組成物である。組成物は、５０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含み、それによって高い生物学的利用能を提供する。組成物は、ｐＨ感受性ポリマーおよび約１００００ダルトン以下の分子量を有する治療薬を含む。好ましい実施態様において、治療薬は約１０００から約１００００ダルトンの間の分子量を有する。特定の実施態様において、治療薬は、ナノ粒子と会合しているか、ナノ粒子に付着しているか、またはナノ粒子内に埋め込まれている。特定の実施態様において、ナノ粒子は本質的にｐＨ感受性ポリマーおよび治療薬からなる。いくつかの実施態様において、組成物は、界面活性剤、脂質、粘膜付着性ポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成分をさらに含む。特定の実施態様において、組成物は約５．０を超えるｐＨで解離する。特定の好ましい実施態様において、約２．０未満のｐＨの水溶液中で２時間で５％未満の治療薬がナノ粒子から放出される。
【００１４】
いくつかの実施態様において、上記のナノ粒子は、約１０ｎｍから約３０ｎｍの平均粒子サイズを有する。いくつかの実施態様において、治療薬はペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬、またはそれらの組み合わせである。特定の好ましい態様において、治療薬はインシュリンである。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、カルボキシル基を含有するアニオン性ポリマーを含むか、またはそれから構成される。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、メチルメタクリル酸とメタクリル酸とのアニオン性コポリマー、例えば、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：２である。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートなどのヒドロキシプロピルメチルセルロースのアニオン性ポリマーである。
【００１５】
本発明の別の態様は、１００ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含む治療薬の経口製剤用の組成物である。組成物は、ｐＨ感受性ポリマーと、約１００００ダルトンを超える分子量を有する治療薬とを含む。好ましい実施態様において、治療薬は、約１００００ダルトン超から約４０００００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様において、組成物は本質的にｐＨ感受性ポリマーおよび治療薬からなる。いくつかの実施態様において、組成物は、界面活性剤、脂質、粘膜付着性ポリマー、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成分をさらに含む。好ましい実施態様において、組成物は約５．０を超えるｐＨで解離する。特定の好ましい実施態様において、約２．０未満のｐＨの水溶液中で２時間で５％未満の治療薬がナノ粒子から放出される。いくつかの実施態様において、治療薬は、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、ベクター、ウイルス様粒子、ワクチン、またはそれらの組み合わせである。特定の好ましい実施態様において、治療薬は抗体である。
【００１６】
いくつかの実施態様において、抗体は、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２、抗ＲＳＶ、抗インターロイキン、および抗ＴＮＦからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、抗体は、セツキシマブ、トラスツズマブ、パリビズマブ、トシリズマブ、およびアダリムマブからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、メチルメタクリル酸とメタクリル酸とのアニオン性コポリマー、例えば、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：２である。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートなどのヒドロキシプロピルメチルセルロースのアニオン性ポリマーである。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、治療薬の経口投与用製剤を調製する方法である。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを含み、約５．５を超えるｐＨを有し、ナノ粒子を含有する水溶液を提供する工程；および（ｂ）溶液のｐＨを約４．０未満に低下させることにより、治療薬とポリマーとが共沈し、ポリマーが治療薬を捕捉し、当該ポリマーは、約５．０より高いｐＨで解離し、治療薬を放出することができる。特定の実施態様において、工程（ａ）は、５．０未満のｐＨで治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを含む水溶液を提供し、次いでｐＨ５．５〜８の緩衝液、またはタウロコール酸塩または他の胆汁酸などの界面活性剤、脂質、緩衝剤、および任意に治療薬の活性を維持するための１つ以上の安定剤を含有する溶液を添加することによってｐＨを５．５以上に上昇させることを含む。いくつかの実施態様において、ｐＨは、界面活性剤として約３ｍＭのタウロコール酸ナトリウム、脂質として約０．７５ｍＭのホスファチジルコリン、約１０６ｍＭの塩化ナトリウム、およびＮａＯＨでｐＨ６．５に調整された約２８ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する溶液の添加によって５．５を超えるまで上昇する。いくつかの実施態様において、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリスなどの緩衝剤を使用するか、または水酸化ナトリウムなどの塩基を使用して、ｐＨを５．０超に上げる。いくつかの実施態様において、工程（ｂ）でｐＨをＨＣｌの添加によって下げる。特定の実施態様において、当該方法は、工程（ｂ）から得られる製剤を凍結乾燥することをさらに含む。
【００１８】
上記の方法のいくつかの実施態様において、治療薬は約１００００ダルトン未満の分子量を有し、得られる製剤は約５０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含む。いくつかの実施態様において、治療薬は約１００００ダルトンを超える分子量を有し、得られる製剤は約１００ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含む。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、メチルメタクリル酸とメタクリル酸とのアニオン性コポリマー、例えば、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：２である。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートなどのヒドロキシプロピルメチルセルロースのアニオン性ポリマーである。いくつかの実施態様において、治療薬はペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬、またはそれらの組み合わせである。好ましい実施態様において、治療薬の経口製剤は上記の方法によって調製される。
【００１９】
本発明の別の態様は、疾患を処置する方法、または疾患の処置を補助する方法である。この方法は、それを必要とする対象に上記の組成物のいずれかを経口投与することを含む。組成物は、疾患の処置を補助する治療薬を含む。いくつかの実施態様において、治療薬はインシュリンであり、疾患は糖尿病、インシュリン欠乏に関連するメタボリック症候群、または乳児、小児もしくは青年期の糖尿病性ケトアシドーシスである。他の実施態様において、治療薬は抗腫瘍抗体であり、そして疾患はがんである。特定の実施態様において、治療薬は抗炎症性抗体であり、そして疾患は炎症性疾患である。
【００２０】
本発明は、以下の実施態様のリストに要約され得る。
１．平均粒子サイズが５０ｎｍ以下の複数のナノ粒子を含み、ｐＨ感受性ポリマーと約１００００ダルトン以下の分子量を有する治療薬とを含むナノ粒子を含む、治療薬の経口製剤。
【００２１】
２．ナノ粒子が本質的に前記ｐＨ感受性ポリマーおよび前記治療薬からなる、実施態様１に記載の製剤。
【００２２】
３．ナノ粒子がさらに、界面活性剤、脂質、軟膜付着性ポリマー、およびそれらの組合せからなる群から選択される成分を含む、実施態様１に記載の製剤。
【００２３】
４．ナノ粒子が約５．０より高いｐＨにて解離し、治療薬を放出する、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００２４】
５．５％未満の治療薬が約２．０未満のｐＨで水溶液中において２時間後にナノ粒子から放出される、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００２５】
６．ナノ粒子が約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの平均粒子サイズを有する、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００２６】
７．治療薬がペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬、またはそれらの組合せである、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００２７】
８．治療薬がインシュリンである、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００２８】
９．ｐＨ感受性ポリマーが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートまたはメチルメタクリレート／メタクリレートコポリマーである、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００２９】
１０．ナノ粒子が、約４５ｎｍ以下、または約４０ｎｍ以下、または約３５ｎｍ以下、または約３０ｎｍ以下、または約２５ｎｍ以下、または約５ｎｍから約５０ｎｍ、または約５ｎｍから約２０ｎｍ、または約５ｎｍから約３０ｎｍ、または約５ｎｍから約４０ｎｍ、または約１０ｎｍから約４０、または約２０ｎｍから約４０ｎｍ、または約２０ｎｍから約５０ｎｍの平均粒子サイズを有する、先行する実施形態のいずれかに記載の製剤。
【００３０】
１１．ｐＨ感受性ポリマーが、ｐＨ約５．０からｐＨ約８．０、または約４．５から約８．５、または約５．５から約８．０、または約６．０から約８．５、または約６．５から約８．５の約３７℃で水に実質的に可溶性である、先行する実施態様のいずれかに記載の製剤。
【００３１】
１２．ｐＨ感受性ポリマーが、約１．５から約３．５、または約１．０から約４．０、または約２．０から約４．０、または約１．０から約６．０、または約１．０から約６．５、または約１．０から約７．０、または約１．０から約７．５のｐＨにて約３７℃で水に実質的に不溶性である、先行する実施形態のいずれかに記載の製剤。
【００３２】
１３．１００ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含み、ナノ粒子がｐＨ感受性ポリマーと１００００ダルトンを超える分子量を有する治療薬とを含む、治療薬の経口製剤。
【００３３】
１４．ナノ粒子が本質的に前記ｐＨ感受性ポリマーおよび前記治療薬からなる、実施態様１３に記載の製剤。
【００３４】
１５．ナノ粒子が、界面活性剤、脂質、粘膜付着性ポリマー、およびそれらの組合わせからなる群から選択される成分をさらに含む、実施形態１３または実施形態１４に記載の製剤。
【００３５】
１６．ナノ粒子が約５．０より高いｐＨで解離または溶解して治療薬を放出する、実施形態１３〜１５のいずれかに記載の製剤。
【００３６】
１７．５％未満の治療薬が約２．０より低いｐＨで水溶液中で２時間後にナノ粒子から放出される、実施態様１３〜１６のいずれかに記載の製剤。
【００３７】
１８．治療薬が、タンパク質、核酸、抗体、ベクター、ウイルス様粒子、ワクチン、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、実施形態１３〜１７のいずれかに記載の製剤。
【００３８】
１９．治療薬が、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２、抗ＲＳＶ、抗インターロイキン、および抗ＴＮＦからなる群から選択されるか、またはセツキシマブ、トラスツズマブ、パリビズマブ、トシリズマブ、およびアダリムマブからなる群から選択される抗体である、実施形態１８に記載の製剤。
【００３９】
２０．ｐＨ感受性ポリマーが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートまたはメチルメタクリレート／メタクリレートコポリマーである、実施態様１３〜１９のいずれかに記載の製剤。
【００４０】
２１．ナノ粒子が約９０ｎｍ以下、または約８０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する、実施態様１３〜２０のいずれかに記載の製剤。
【００４１】
２２．ｐＨ感受性ポリマーが約３７℃でｐＨ約５．０から約８．０、または約４．５から約８．５、または約５．５から約８．０、または約６．０から約８．５、または約６．５から約８．５で実質的に水に可溶である、実施形態１３〜２１のいずれかに記載の製剤。
【００４２】
２３．ｐＨ感受性ポリマーが、ｐＨ約１．５から約３．５、または約１．０から約４．０、または約２．０から約４．０、または約１．０から約６．０、または約１．０から約６．５、または約１．０から約７．０、または約１．０から約７．５で、約３７℃にて水に実質的に不溶性である、実施形態１３〜２２のいずれかに記載の製剤。
【００４３】
２４．治療薬の経口投与製剤を調製する方法であって、
（ａ）治療薬と、ｐＨ感受性ポリマーを含むナノ粒子とを含む水性媒体を提供することで、前記媒体は、約５．０以上のｐＨを有し、
（ｂ）媒体のｐＨを約４．０未満に低下させ、それによってポリマーが治療薬と緊密に会合するようになる、
工程を含む前記方法。
【００４４】
２５．工程（ａ）が、５．０未満のｐＨで治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを含む水溶液を提供し、次いで界面活性剤、脂質および緩衝液を含有する溶液を添加することによってｐＨを５．０以上に上昇させることを含む、実施形態２４に記載の方法。
【００４５】
２６．ｐＨが５〜８の緩衝液および１以上の安定化賦形剤を含有する溶液、または界面活性剤として０〜約１０ｍＭのタウロコール酸ナトリウム、脂質として０〜約１．５ｍＭのホスファチジルコリン、０〜約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、および緩衝剤として０〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する溶液の添加によってｐＨが５．０を超えるまで上昇させる、実施形態２５に記載の方法。
【００４６】
２７．ＨＣｌの添加によって工程（ｂ）においてｐＨが低下される、実施態様２４〜２７のいずれかに記載の製剤。
【００４７】
２８．さらに、（ｃ）工程（ｂ）からもたらされる製剤を凍結乾燥させることを含む、実施態様２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【００４８】
２９．治療薬が約１００００ダルトン以下の分子量を有し、得られる製剤が約５０ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含み、治療薬は、約１００００ダルトンを超える分子量を有し、得られた製剤は、約１００ｎｍ以下の平均粒径子サイズ有する複数のナノ粒子を含む、実施形態２４〜２８のいずれかに記載の方法。
【００４９】
３０．ｐＨ感受性ポリマーが、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートまたはメチルメタクリレート／メタクリレートコポリマーである、実施態様２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【００５０】
３１．治療薬が、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、ベクター、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施形態２４〜３０のいずれかに記載の方法。
【００５１】
３２．実施態様２４〜３１のいずれかに記載の方法を含む方法によって調製された治療薬の経口製剤。
【００５２】
３３．疾患の処置を補助する方法であって、実施態様１〜２３のいずれかに記載の製剤をそれを必要とする対象に経口投与することを含み、該製剤は前記疾患の処置を補助する治療薬を含む方法。
【００５３】
３４．治療薬がインシュリンであり、疾患が糖尿病、インシュリン欠乏症に関連するメタボリック症候群、および乳児、子供または青年期の糖尿病性ケトアシドーシスからなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法。
【００５４】
３５．治療薬が抗腫瘍抗体で、疾患ががんである実施態様３３に記載の方法。
【００５５】
３６．治療薬が抗炎症性抗体で、疾患が炎症性疾患である実施態様３３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明によるナノ粒子経口送達製剤を製造するための無溶媒方法のフローチャートである。
【図２】図２は、本発明によるナノ粒子経口送達製剤を製造するための改変された無溶媒方法のフローチャートである。
【図３】図３は、本発明によるナノ粒子経口送達製剤を製造するための溶媒ベースの方法のフローチャートである。
【図４】図４は、無溶媒法によって製造されたインシュリン製剤からのインシュリン放出の時間経過を示す。放出媒体は、模擬胃液（ＳＧＦ）または模擬腸液（ＳＩＦ）であった。インシュリン濃度は、媒体のＨＰＬＣ分取によって得られたインシュリンピークについて曲線下面積（ＡＵＣ）の単位で表される。
【図５】図５は、絶食状態の模擬胃液（ＦａＳＳＧＦ）および絶食状態の模擬腸液（ＦａＳＳＩＦ）におけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の時間経過を示す。放出されたインシュリンの量は、インシュリン特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡを用いたＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の時間経過を示す図である。
【図７】図７は、ＨＰＬＣを用いたＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の時間経過を示す。
【図８】図８は、動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）を用いた粒子サイズ測定を示す。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡを用いた、ＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の時間経過を示す図である。
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡを用いたＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の時間経過を示す図である。
【図１１】図１１は、ＨＰＬＣを用いた、ＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の経時変化を示す。
【図１２】図１２は、ＥＬＩＳＡを用いた、ＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の経時変化を示す。
【図１３】図１３は、ＨＰＬＣを用いた、ＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の経時変化を示す。
【図１４】図１４は、ＤＬＳを用いた粒子サイズ測定を示す。
【図１５】図１５は、ＥＬＩＳＡを用いた、ＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の経時変化を示す。
【図１６】図１６は、ＨＰＬＣを用いたＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおけるインシュリン製剤からのインシュリン放出の経時変化を示す。
【図１７】図１７は凍結乾燥圧力プロファイルを示す。
【図１８】図１８は凍結乾燥温度プロファイルを示す。
【図１９】図１９は、インシュリン製剤の投与および対照に対するヒト対象の食後血糖の変化を示す。
【図２０】図２０は、種々のインシュリン製剤の投与後の３匹のイヌの平均標準化血糖を示す。
【図２１】図２１は、サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣを用いたｐＨ２．１およびｐＨ６．５における抗ＥＧＦＲ抗体の放出プロファイルを示す。
【図２２】図２２は、ＥＬＩＳＡを用いたＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦにおける抗Ｈｅｒ２抗体の放出プロファイルを示す。
【図２３】図２３は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いたｐＨ２．１およびｐＨ６．５における抗ＲＳＶ抗体の放出プロファイルを示す。
【図２４】図２４は、ＥＬＩＳＡを用いたｐＨ２．１およびｐＨ６．５における抗ＲＳＶ抗体の放出プロファイルを示す。
【図２５】図２５は、ＥＬＩＳＡを用いたｐＨ２．１およびｐＨ６．５における抗ＴＮＦ抗体の放出プロファイルを示す。
【図２６】図２６は、ＥＬＩＳＡを用いたｐＨ２．１およびｐＨ６．５における抗ＩＬ６抗体の放出プロファイルを示す。
【図２７】図２７は、Ａ ２８０を用いて分光光度的に測定されたＦＡＳＳＩＦおよびＦＡＳＳＩＦにおけるアスコルビン酸の放出プロファイルを示す。
【図２８】図２８は、ＤＬＳを用いたアスコルビン酸含有ナノ粒子の粒子サイズの測定を示す。
【図２９】図２９は、溶媒ベースの方法によってカプセル化されたアルブミンの放出プロファイルを示す。
【図３０】図３０は、溶媒ベースの方法によってカプセル化されたインシュリンからのインシュリン放出の経時変化を示す。
【図３１】図３１は、溶媒ベースの方法によってカプセル化されたインシュリンおよび２％アルギン酸を含有するナノ粒子製剤からのインシュリン放出の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明を任意の特定の機構または分子構造に限定することを意図することなく、本発明のナノ粒子は、ナノ粒子のポリマー鎖と治療薬の分子との間に安定な会合を与えると考えられ、治療薬は低いｐＨでポリマー鎖と緊密に結合し、それによって治療薬を低ｐＨでの分解から保護する。本発明で使用されるｐＨ感受性ポリマーは、典型的には、低ｐＨでは中性（プロトン化）であるが中性ｐＨでは負に帯電（脱プロトン化）し、粒子サイズがｐＨ依存的な変化を導くような置換基を含み、粒子は中性ｐＨではナノスケールであるが、低ｐＨではマイクロスケールサイズである。ナノ粒子を生成するために超音波処理または加熱などの外部エネルギーは必要ない。低ｐＨで（例えば、胃内環境において）のより大きな粒径は、治療薬の保護を強化し得るが、中性ｐＨでのより小さな粒径は、治療薬の吸収を促進する。いくつかの実施態様において、ナノ粒子は完全に解離し得、そしてそれらの分子成分は中性ｐＨで完全に可溶化する。他の実施態様において、ナノ粒子は中性ｐＨでは解離しないが、細胞吸収または傍細胞輸送による良好な生物学的利用能を可能にするほど小さいサイズのものである。
【００５８】
本発明のナノ粒子組成物の重要な特性はそれらの非常に小さいサイズであり、これは以前の粒子組成物で得られたものよりも高い生物学的利用能をもたらす。中性ｐＨにおけるナノ粒子のサイズは、治療薬の分子サイズによってある程度決定される。一般に、治療薬の分子サイズが大きいほど、中性ｐＨで存在するナノ粒子のサイズは大きくなるだろう。原則として、ポリマーのｐＨ依存性と共に治療薬の分子サイズの連続体を反映して、ナノ粒子サイズの連続体を本発明の方法で製造することができるが、便宜上、ナノ粒子組成物は、治療薬の分子量に応じて、本明細書では「低分子量」または「高分子量」のいずれかであると区別される。
【００５９】
本発明の低分子量実施態様において、ナノ粒子配合物は、５０ｎｍ以下、または約４５ｎｍ以下、または約４０ｎｍ以下、または約３５ｎｍ以下、または約３０ｎｍ以下、または約２５ｎｍ以下の平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含む。本明細書で使用されるように、「粒子サイズ」は、粒子の流体力学的直径を指す。平均流体力学的直径は、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて決定することができる。好ましくは、低分子量の実施態様のナノ粒子は、約５０ｎｍ未満、または約１０ｎｍから約３０ｎｍ、または約１５ｎｍから約２５ｎｍの平均粒子サイズを有する。他の実施態様において、ナノ粒子は、約５ｎｍから約５０ｎｍ、または約５ｎｍから約２０ｎｍ、または約５ｎｍから約３０ｎｍ、または約５ｎｍから約４０ｎｍ、または約１０ｎｍから約４０ｎｍ、または約２０ｎｍから約４０ｎｍ、または約２０ｎｍから約５０ｎｍの平均粒子サイズを有する。ナノ粒子は、ｐＨ感受性ポリマーおよび約１００００ダルトン以下、または約９０００ダルトン以下、８０００ダルトン以下、７０００ダルトン以下、６０００ダルトン以下、５０００ダルトン以下、４０００ダルトン以下、３０００ダルトン以下、２０００ダルトン以下、または１５００ダルトン以下の平均分子量を有する治療薬を含む。いくつかの実施態様において、治療薬は、約１０００から約１００００ダルトン、または約１０００ダルトンから約５０００ダルトン、または約１０００ダルトンから約３０００ダルトン、または約１０００ダルトンから約４０００ダルトン、約５００ダルトンから約５０００ダルトン、または約３０００ダルトンから約５０００ダルトン、または約５０００ダルトンから約１００００ダルトンの分子量を有する。さらに他の実施態様において、低分子量形態のナノ粒子組成物は、約１０００ダルトンから約１５０００ダルトン、または約５０００ダルトンから約１５０００ダルトン、または約３０００ダルトンから約８０００ダルトンの分子量を有する１つ以上の治療薬を含有する。
【００６０】
本発明の高分子量実施態様において、ナノ粒子配合物は、約１００ｎｍ以下、または約９０ｎｍ以下、または約８０ｎｍ以下、または約１１０ｎｍ以下、または約１２０ｎｍ以下、または約１３０ｎｍ以下、または約１４０ｎｍ以下、または約１５０ｎｍ以下、または約３０ｎｍから約９０ｎｍ、または約３０ｎｍから約１００ｎｍ、または約４０ｎｍから約１００ｎｍ、または約５０ｎｍから約１００ｎｍ、または約６０ｎｍから約９０ｎｍの平均粒子サイズを有する複数のナノ粒子を含む。ナノ粒子は、ｐＨ感受性ポリマーおよび約１００００ダルトン以上、例えば１５０００ダルトン以上、２００００ダルトン以上、２５０００ダルトン以上、３００００ダルトン以上、４００００ダルトン以上、または５００００ダルトン以上の分子量を有する治療薬を含む。いくつかの実施態様において、治療薬は、約５００００ダルトン以上、例えば、６００００ダルトン以上、７００００ダルトン以上、８００００ダルトン以上、または９００００ダルトン以上の分子量を有する。他の実施態様において、治療薬は、約１１０００ダルトンから約２００００ダルトンまで、または約３００００ダルトンまで、約４００００ダルトンまで、約５００００ダルトンまで、約７００００ダルトンまで、約１０００００ダルトンまで、約１５００００ダルトンまで、約２０００００ダルトンまで、約３０００００ダルトンまで、または約５０００００ダルトンまでの分子量を有する治療薬を含む。
【００６１】
本発明のナノ粒子のｐＨ依存性溶解度は、ナノ粒子と共に含有され、ナノ粒子のマトリクスを形成する１つ以上のポリマーまたはコポリマーのｐＨ依存性溶解度によって決定される。医薬組成物に使用するのに適しているさまざまなｐＨ依存性ポリマーが知られている。そのようなポリマーは、無毒性、非アレルギー性、純粋な形で入手可能でありそして生理学的にも薬理学的にも不活性であるべきである。好ましくはそれらはまた非代謝性である。特定の好ましい実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、ポリマー骨格の長さに沿って周期的に分布している複数のカルボキシル基を所有するアニオン性ポリマーである。いくつかの実施態様において、ポリマーの水溶性、およびポリマーによって形成されるナノ粒子または微粒子のサイズのｐＨ依存性は、ポリマー鎖上のカルボキシル基または他の置換基の量または分布を調整することによって微調整することができる。特定の実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、メタクリル酸とアクリル酸エステルまたはメタクリル酸エステルとのコポリマーである。特定の実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、メタクリル酸−メタクリル酸メチルコポリマー、またはメタクリル酸−アクリル酸エチルコポリマーである。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：１、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）１：２、または両方の組み合わせであり、ポリ（メタクリル酸−コ−メチルメタクリレート）のエステル基に対するカルボキシル基の比（カルボキシル／エステル比）を操作してポリマーのｐＨ感受性を制御することができる。
【００６２】
特定の実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、好ましくはメチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、例えば、約１：１のモル比のメチルメタクリレート対メタクリル酸を有するメチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマーである。特定の実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、約６０，０００から約２００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸コハク酸セルロース（ＣＡＳＥ）、酢酸トリメリット酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（またはヒプロメロースフタレート）（ＨＰＭＣＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネート（またはヒプロメロースアセテートサクシネート）（ＨＰＭＣＡＳ）、シェラックガム、またはポリ酢酸ビニルフタレート（ＰＶＡＰ）などのセルロース誘導体である。特定の実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、好ましくは、例えば、約１０，０００ダルトン〜約５００，０００ダルトンの分子量を有する、ヒドロキシプロピルメチルセルロース・アセテート・サクシネートである。上述のポリマーの全ては、所望のｐＨ感受性を達成し、薬物放出または粒子サイズを制御し、そして経口投与時の薬物の生物学的利用能を改善するために、個々にまたは組み合わせて使用され得る。
【００６３】
本発明で使用するためのｐＨ依存性ポリマーは、酸性ｐＨでは不溶性であり、中性および／またはアルカリ性ｐＨでは可溶性である。いくつかの実施態様において、ｐＨ感受性ポリマーは、約３７℃で、約５．０〜約８．０、または約４．５〜約８．５、または約５．５〜約８．０、または約６．０〜約８．５、または約６．５〜約８．５のｐＨにおいて水に実質的に可溶性である。ｐＨ感受性ポリマーはまた、約１．５〜約３．５、または約１．０〜約４．０、または約２．０〜約４．０、または約１．０〜約６．０、または約１．０〜約６．５、または約１．０〜約７．０、または約１．０〜約７．５のｐＨにおいて約３７℃で水に実質的に不溶性である。
【００６４】
ｐＨ感受性ポリマーの溶解度の１つの有用な尺度は、ｐＨまたは他の条件の関数としての治療薬の放出である。本明細書中で使用される場合、治療薬の「放出」とは、会合治療薬を含有する微粒子から会合治療薬を含有する小型ナノ粒子を放出すること、または微粒子もしくはナノ粒子から治療薬の個々の分子を放出することをいう。放出は、数秒または数分以内のように非常に迅速であるか、または遅くなり得て、実質的な量の治療薬が放出されるのに数時間またはそれ以上かかる。重要なパラメータは、治療薬を酸性ｐＨにおいて保持する微粒子および／またはナノ粒子の能力である。
【００６５】
特定の実施態様において、粒子を０．０１ＮのＨＣｌの溶液に２３℃で約６時間曝露すると、粒子から約３３質量％未満の治療薬が放出される。他の実施態様において、ｐＨ約６．８、約２３℃で約１時間、粒子をリン酸緩衝食塩水の溶液に曝露すると、４０質量％を超える治療薬が粒子から放出される。好ましくは、微粒子／ナノ粒子は、これらの両方の性質（すなわち、低ｐＨでの非常に遅い放出および高ｐＨでの急速で完全な放出）を有する。高ｐＨでは、治療薬は高い度合いに（例えば３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上）、生理学的または薬理学的に適切な時間枠内（例えば、１０分、３０分、６０分、９０分、または１２０分以内）に放出されるべきである。低ｐＨでは、治療薬は胃を通過するのに必要な時間中に実質的に放出されるべきではない。特定の実施態様において、約２．０未満のｐＨで２時間で５％未満の治療薬が粒子から放出される。
【００６６】
特定の実施態様において、治療薬とｐＨ感受性ポリマーとの質量比は、約１０：１から約１：１２、例えば、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１１、または約１：１２である。いくつかの実施態様において、該質量比は約５：１から約１：５、または約３：１から約１：３、または約２：１から約１：２、または約１：１である。
【００６７】
いくつかの実施態様において、ナノ粒子は本質的にｐＨ感受性ポリマーおよび治療薬からなる。いくつかの実施態様において、ナノ粒子および／またはナノ粒子組成物および／または医薬組成物は本質的に溶媒を含まない。他の実施態様において、ナノ粒子は、緩衝剤、界面活性剤、脂質、粘膜付着性ポリマー、安定化賦形剤、およびそれらの組み合わせなどの１つ以上の成分をさらに含むことができる。これらの追加の成分は、ナノ粒子の調製中またはナノ粒子からの薬剤の放出後に治療薬の溶解性を維持するのに有用であり得るか、またはナノ粒子の凝集を防止するか、水溶液または水中でのナノ粒子の懸濁性を促進するのに有用であり得、そしてまた治療薬の生物学的利用能を改善することができる。それらはまた、ナノ粒子の保存性または有用な半減期を改善し得、そしてナノ粒子の構造および／または凍結乾燥後の治療薬の生物学的利用能を維持するのを助けることができる。粘膜付着性ポリマーは、腸粘膜の表面へのナノ粒子の付着を改善し、腸上皮細胞への、そして最終的には血液への吸収を改善に導くことができる。
【００６８】
界面活性剤としては、オレイン酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸塩（またはエステル）またはデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸塩（またはエステル）、またはタウロコール酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、およびステアリルフマル酸ナトリウムを含むアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンエーテル、ポリソルベート８０、およびアルキルグリコシドを含む非イオン性界面活性剤、第四級アンモニウム化合物を含むカチオン性界面活性剤を含み得る。
【００６９】
脂質としては、例えば、リン脂質（中性、カチオン性、またはアニオン性）、脂肪酸（例えば、オレイン酸、カプリル酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸ナトリウム、リノール酸ナトリウム、またはカプリル酸ナトリウム）、脂肪アルコール、および／またはステロールを含む。脂質には、スフィンゴミエリンを含むがこれに限定されないスフィンゴ脂質、ガングリオシド、グロボサイドおよびセレブロシドを含むスフィンゴ糖脂質、ステアリル、オレイルおよびリノレイルアミンを含むがこれらに限定されない界面活性剤アミンが含まれる。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、「リン脂質」は、そのヒドロキシル基の一方がリン酸でエステル化され、そして他の２つのヒドロキシル基が等しいか互いに異なり、飽和または不飽和であり得る長鎖脂肪酸でエステル化された、グリセロールの両親媒性誘導体であると理解される。中性リン脂質は、一般に、他のリン酸ヒドロキシルが極性基（通常はヒドロキシルまたはアミノ）で置換されたアルコールによってエステル化されており、かつその正味電荷がゼロであるものである。電荷を有するリン脂質は、一般に、他のリン酸ヒドロキシルが極性基で置換されたアルコールによってエステル化され、その正味電荷が正または負であるものである。
【００７１】
リン脂質の例には、ホスファチジン酸（‘ＰＡ’）、ホスファチジルコリン（‘ＰＣ’）、ホスファチジルグリセロール（‘ＰＧ’）、ホスファチジルエタノールアミン（‘ＰＥ’）、ホスファチジルイノシトール（‘ＰＩ’）、ホスファチジルセリン（‘ＰＳ’）、スフィンゴミエリン（脳のスフィンゴミエリンを含む）、レシチン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ジアラキドイルホスファチジルコリン（‘ＤＡＰＣ’）、ジデカノイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（‘ＤＤＰＣ'）、ジエライドイルホスファチジルコリン（‘ＤＥＰＣ’）、ジラウロイルホスファチジルコリン（‘ＤＬＰＣ’）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（‘ＤＭＰＣ’）、ジオレオイルホスファチジルコリン（‘ＤＯＰＣ’）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（‘ＤＰＰＣ’）、ジステアロイルホスファチジルコリン（‘ＤＳＰＣ’）１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（‘ＰＯＰＣ’）、ジアラキドイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＡＰＧ’）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルグリセロール（‘ＤＤＰＧ‘）、ジエライドイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＥＰＧ’）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＬＰＧ’）、ジリノレオイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＭＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＯＰＧ’）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＰＰＧ’）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（‘ＤＳＰＧ’）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルグリセロール（‘ＰＯＰＧ’）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＡＰＦ’）、ジデカノイル−Ｌ−αホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＤＰＥ’）、ジエライドイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＥＰＥ’）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＬＰＥ’）、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＭＰＥ’）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＯＰＥ’）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＰＰＥ’）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（‘ＤＳＰＥ’）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（‘ＰＯＰＥ’）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＡＰＩ’）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（‘ＤＤＰＩ’）、ジエライドイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＥＰＩ’）、ジラウロイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＬＰＩ’）、ジリノレイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＭＰＩ’）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＯＰＩ’）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＰＰＩ’）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（‘ＤＳＰＩ’）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルイノシトール（‘ＰＯＰＩ’）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（��ＤＡＰＳ’）、ジデカノイル−Ｌ−α−ホスファチジルセリン（‘ＤＤＰＳ’）、ジエライドイルホスファチジルセリン（‘ＤＥＰＳ’）、ジラウロイルホスファチジルセリン（‘ＤＬＰＳ’）、ジリノレオイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン（‘ＤＭＰＳ’）、ジオレオイルホスファチジルセリン（‘ＤＯＰＳ’）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（‘ＤＰＰＳ’）、
ジステアロイルホスファチジルセリン（‘ＤＳＰＳ’）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルセリン（‘ＰＯＰＳ’）、ジアラキドイルスフィンゴミエリン、ジデカノイルスフィンゴミエリン、ジエライドイルスフィンゴミエリン、ジラウロイルスフィンゴミエリン、ジリノレオイルスフィンゴミエリン、ジミリストイルスフィンゴミエリン、スフィンゴミエリン、ジオレオイルスフィンゴミリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ならびに１−パルミトイル−２−オレオイル−スフィンゴミエリンを含む。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「脂肪酸」は、その構造が、１個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖に結合したカルボキシル基である化合物を意味する。炭化水素鎖は飽和または不飽和であり得る（すなわち、アルキル、アルケニルまたはアルキニル炭化水素鎖）。また、炭化水素鎖は直鎖状でも分枝状でもよい。さらに、いくつかの態様において、炭化水素鎖中の水素は置換されていてもよい。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「脂肪アルコール」は、その構造が、１個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖に結合したアルコール基である化合物を意味する。炭化水素鎖は飽和でも不飽和でもよい（すなわち、アルキル、アルケニルまたはアルキニル炭化水素鎖）。炭化水素鎖は直鎖状でも分枝状でもよい。さらに、いくつかの実施態様において、炭化水素鎖中の水素は置換されていてもよい。
【００７４】
本明細書で使用されるように、そして他に特定されない限り、用語「脂肪酸塩」は、脂肪酸と無機／有機塩基との間の反応から形成される化合物を意味する。さらに、この用語は、脂肪族アルコールと無機／有機酸との間の反応から形成される化合物を包含する。そのような酸の例には、硫酸およびリン酸が含まれる。脂肪酸塩の炭化水素鎖は飽和でも不飽和でもよい（すなわち、アルキル、アルケニルまたはアルキニル炭化水素鎖）。また、炭化水素鎖は直鎖状でも分枝状でもよい。さらに、いくつかの実施態様において、炭化水素鎖中の水素は置換されていてもよい。
【００７５】
好ましくは脂質対ｐＨ感受性ポリマーの質量比は約１：１０から約８：１、例えば約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、または約８：１である。
【００７６】
粘膜付着性ポリマーは、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸、およびポリキサマーを含み得る。好ましくは、粘膜付着性ポリマーは、約１０，０００ダルトン〜約１５０，０００ダルトン、または約１０，０００ダルトン〜約３００，０００ダルトン、または約１０，０００ダルトン〜約６００，０００ダルトンの分子量を有する。
【００７７】
いくつかの実施態様において、低分子量治療薬は、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子薬（すなわち、１５００ダルトン以下の分子量を有する任意の種類の医薬品）、またはそれらの組み合わせである。ペプチドは、抗腫瘍ペプチド（例えば、ロイプロリド）、代謝性疾患を処置するペプチド（例えば、インシュリングラルギン、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト）、ペプチドホルモン（例えば、ＥＰＯ）、抗感染薬（例えば、テラバンシン、プロテアーゼ阻害剤）、鎮痛剤／麻酔ペプチド（例えばエンケファリン）、および抗炎症ペプチドを含む。タンパク質は、抗腫瘍タンパク質（例えば、抗ＶＥＧＦ剤、インターフェロン、サイトカイン）、代謝性疾患を処置するタンパク質（例えば、インシュリン、グルカゴン）、タンパク質ホルモン（例えば、カルシトニン、ゴナドトロピン放出ホルモン）、抗感染性タンパク質（例えば、（インターフェロン）、抗炎症性タンパク質（抗ＴＮＦアルファ剤）、モノクローナル抗体、ワクチン、酵素、および酵素阻害剤を含み得る。核酸には、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにアデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを含む、遺伝子編集および遺伝子治療のための核酸が含まれ得る。好ましい低分子量治療薬はインシュリンである。
【００７８】
本明細書で使用される「インシュリン（またはインスリン）」という用語は、任意の天然に存在するまたは組換えのインシュリンを指す。したがって、本発明で使用されるインシュリンは、例えばインシュリン類似体および誘導体を含む。ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ヒツジなどの任意の適切な種由来のインシュリンを使用することができる。好ましい実施態様において、インシュリンは組換えヒトインシュリンである。天然インシュリンまたは合成インシュリンは、単量体、重合体、および／または原線維様インシュリンを含み得、インシュリン分子はｐＨに応じて異なる形態を取り得ることが理解される。
【００７９】
高分子量の実施態様において、治療薬は、例えば、タンパク質、核酸、抗体、ウイルス様粒子、ワクチン、またはそれらの組み合わせであり得る。タンパク質（本明細書で定義されるように、高分子量であれ低分子量であれ）には、抗腫瘍タンパク質（例えば抗ＶＥＧＦ剤、インターフェロン、サイトカイン）、代謝疾患を処置するタンパク質（例えばインシュリン、グルカゴン）、タンパク質ホルモン（例えばカルシトニン、ゴナドトロピン放出ホルモン）、抗感染性タンパク質（例えば、インターフェロン）、抗炎症性タンパク質（抗ＴＮＦアルファ剤）、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ワクチン、酵素、および酵素阻害剤を含み得る。核酸（本明細書で定義されるように高分子量であれ低分子量であれ）には、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子編集および遺伝子治療が含まれる。
【００８０】
抗体は、本発明における使用のための好ましい高分子量治療剤である。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、キメラ、または組換えであり得、そしてまたそのような抗体の抗原結合フラグメントであり得る。モノクローナル抗体は、天然または組換え免疫グロブリン分子であり得る。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの任意の種類の免疫グロブリンであり得る。本発明で使用するための抗体は、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、ナノボディ、ｓｃＦｖなどの単一ドメイン抗体、および抗体融合タンパク質などの抗体類似体および誘導体を含む。好ましい抗体は、それぞれセツキシマブ、トラスツズマブ、パリビズマブ、トシリズマブ、およびアダリムマブを含む、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＲＳＶ、インターロイキン、およびＴＮＦに結合する抗体を含む。
【００８１】
ある好ましい実施態様において、本発明の組成物は、水性媒体中に懸濁した状態で、または凍結乾燥材料としてのいずれかで、本発明の複数の任意のナノ粒子または微粒子を、１つ以上の担体、充填剤、結合剤、緩衝剤、流動促進剤、溶液、溶媒、界面活性剤、電解質、塩、潤滑剤、崩壊剤、膨潤剤、酸化防止剤、またはナノ粒子状または微粒子状形態ではない追加の治療剤などの１以上の賦形剤と一緒に含有する医薬組成物である。医薬組成物はまた、異なる治療薬を有する２つ以上の異なる種類の本発明のナノ粒子、または異なる放出プロファイルを有する異なるナノ粒子中の同じ治療薬を含み得る。医薬組成物はまた、治療薬を担持しない「空の」ｐＨ依存性ナノ粒子を含有し得る。医薬組成物は、好ましくは、カプセル剤、錠剤、または液体中の経口懸濁液剤の形態などの経口送達用に処方される。医薬組成物の特定の実施態様は、小児用に処方されている。一実施態様において、製剤は飲料であるか、またはオレンジジュースなどの果物または野菜ジュースなどの飲料として、あるいはミルクまたはヨーグルトなどの乳製品中の再構成に適している。
【００８２】
充填剤としては、ラクトース、サッカロース、グルコース、デンプン、微結晶セルロース、極細セルロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸水素カルシウム、ケイ酸アルミニウム、非晶質シリカ、塩化ナトリウム、デンプン、および二塩基性リン酸カルシウム無水物を含む。特定の実施態様において、充填剤は水を吸収し得るが、水溶性ではない。他の特定の実施態様において、充填剤は球状化助剤である。球状化助剤は、クロスポビドン、カラギーナン、キトサン、ペクチン酸、グリセリド、β−シクロデキストリン、セルロース誘導体、微結晶セルロース、粉末セルロース、ポリプラスドン、クロスポビドン、およびポリエチレンオキシドのうちの１つ以上を含み得る。一実施態様において、充填剤は微結晶セルロースを含む。
【００８３】
結合剤としては、セルロースエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、プロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース、例えばヒプロメロース２９１０、ＭＥＴＨＯＣＥＬ  Ｅ）、カルボキシメチルセルロース、デンプン、アルファ化デンプン、アカシア、トラガカントゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、微結晶セルロース、および低置換度ヒドロキシプロピルセルロースを含む。特定の実施態様において、結合剤は湿式結合剤から選択される。一実施態様において、結合剤はセルロースエーテル、例えばヒプロメロースから選択される。
【００８４】
崩壊剤には、デンプン、ナトリウム架橋カルボキシメチルセルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシプロピルデンプンが含まれる。
流動促進剤としては、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、煙霧状二酸化ケイ素、炭酸マグネシウム、ラウリル硫酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸、パルミチン酸、セタノール、ステアロール、およびタルクが含まれる。
潤滑剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、およびシリコーン処理タルクが含まれる。
【００８５】
医薬組成物はまた、水性媒体、例えば任意の水系媒体、例えば水、食塩水、糖溶液、輸液、または緩衝液を含み得る。水性媒体は、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの１種以上の水溶性有機溶媒を含み得るが、特定の実施態様において、医薬組成物は無溶媒である。水性媒体は無菌であるのが好ましくそして活性剤の担体として使用するのに適しており、そして有機溶媒がどうしても存在するのならば低濃度の水溶性有機溶媒を有するのが好ましい。水性媒体の例としては、注射用水、食塩水、リンゲル液、Ｄ５Ｗ、または他の水混和性物質の溶液、例えばデキストロースおよび他の電解質を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
医薬組成物は、無機酸および塩基、ならびに有機酸および塩基を含む、薬学的に許容し得る無毒の酸または塩基から調製される塩などの薬学的に許容し得る塩を含有し得る。本明細書で提供される組成物に適した薬学的に許容し得る塩基付加塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛から作られる金属塩、またはリジン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインから作られる有機塩が含まれる。適切な無毒の酸としては、酢酸、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、フロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、硫酸、酒石酸、およびｐ−トルエンスルホン酸などの無機、有機酸が含まれる。非毒性酸には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、およびメタンスルホン酸が含まれる。したがって、特定の塩の例には、塩酸塩およびメシル酸塩が含まれる。
【００８７】
本発明は、治療薬の経口製剤を製造するためのいくつかの方法を提供する。１つの方法は、治療薬とｐＨ感受性ポリマーとを会合させて該治療薬およびポリマーを含有するナノ粒子を形成することを含む無溶媒法である。可溶性治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを含有する水溶液が提供される。溶液は最初に約５．０〜５．５のｐＨを有し、その後溶液のｐＨは約４．０未満に下げられ、それによって治療薬とポリマーとが会合する。そのようにして形成されたポリマー−治療薬複合体は酸性ｐＨで安定なままである。複合体が哺乳動物対象に経口投与される場合、治療薬は胃環境中で実質的に分解されず、そしてより高いｐＨの腸環境中で生物学的に利用可能な形態で放出される。
【００８８】
この方法の一実施態様において、治療薬およびポリマーを最初に酸性水溶液（すなわち、約５．５未満のｐＨ）に添加し、次に界面活性剤、脂質、および酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリスなどの緩衝剤、または水酸化ナトリウムなどの塩基を含有する溶液を添加することによってｐＨを約５．５より大に上昇させる。ポリマーは酸性ｐＨで不溶性であり、治療薬と会合した微粒子またはナノ粒子（ｐＨに応じて）を形成する。微粒子は、５．５を超えるｐＨで水溶液中で小さなナノ粒子になり、いくつかの実施態様において、ナノ粒子は解離し、可溶性治療薬を分子形態またはポリマーの粒子と会合していない形態で放出する。一実施態様において、ｐＨは、約３ｍＭのタウロコール酸ナトリウム、約０．７５ｍＭのホスファチジルコリン、約１０６ｍＭの塩化ナトリウム、およびＮａＯＨで約ｐＨ６．５に調整された約２８ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する溶液を添加することによって５．５を超えるまで上昇させる。
【００８９】
いくつかの実施態様において、ＨＣｌの添加によってｐＨを約４．０未満に下げる。この方法は、緊密に会合された治療薬を有する非常に小さいナノ粒子の生成および経口投与時の高い生物学的利用能を可能にする。実施態様において、治療薬はインシュリンであり、形成されたナノ粒子は５０ｎｍ未満、好ましくは３０ｎｍ未満、例えば平均サイズ約１８ｎｍなどの小さいサイズを有し、ナノ粒子の形成はインシュリンと約１００％の会合を達成する。場合により、配合物は次に凍結乾燥され、貯蔵され、そして後に経口投与のために水性媒体中で再構成されてもよい。凍結乾燥ナノ粒子は、経口投与用の懸濁液剤、カプセル剤、または錠剤剤形として処方することができる。凍結乾燥ナノ粒子は、凍結乾燥前と比較して同じまたは類似のサイズのナノ粒子として再構成時に放出される。このようにして形成されたナノ粒子は解離せず、治療薬がインシュリンのような酸性ｐＨで非常に可溶性であるものであっても、治療薬は酸性ｐＨで放出されないであろう。
【００９０】
本明細書で「改変無溶媒」法と呼ばれる別の実施態様において、治療薬およびポリマーを、治療薬を処方するのに適した第１の水性媒体に加え、およびアセテート、サクシネート、クエン酸エステル、ヒスチジン、ホスフェート、トリスなどの緩衝剤、または水酸化ナトリウムなどの塩基を含有する、約６．５のｐＨを有する第２の水性媒体を、第１の水性媒体に添加してｐＨを５．０より大に上昇させ、そして第３の水性媒体を形成する。次いで、第３の水性媒体を凍結乾燥する。ナノ粒子は、凍結乾燥プロセスの前に形成され、そして凍結乾燥材料の再構成後になお存在する。このようにして形成されたナノ粒子は溶解または解離せず、該治療薬が酸性ｐＨで非常に可溶性であっても、胃内環境の酸性ｐＨでは治療薬が粒子から放出されないであろう。凍結乾燥ナノ粒子は、経口投与用の懸濁液剤、カプセル剤、または錠剤剤形として処方することができる。
【００９１】
上記の無溶媒方法の好ましい実施態様において、水性媒体中の治療薬の濃度は、約０．０５％から約１．０％重量／体積、より好ましくは約０．１％から約０．３％重量／体積である。上記の無溶媒方法の好ましい実施態様において、水性媒体中のポリマーの濃度は、約０．５％から約１０％重量／体積、より好ましくは約１．０％から約３．０％重量／体積である。
【００９２】
本発明の別の態様は、経口投与可能な治療薬の製剤を調製するための溶媒ベースの方法である。この方法は、有機溶媒などの水混和性非水性溶媒に溶解したｐＨ感受性ポリマーを含む約２〜１０体積の水性媒体に、治療薬を含む１体積の水性媒体を加えることを含み、それによって薬剤およびｐＨ感受性ポリマーが、治療薬を含有するナノ粒子または微粒子を形成する。次に懸濁液を遠心分離し、沈殿したナノ粒子または微粒子が貯蔵または他の水性媒体への再懸濁のために回収される。
【００９３】
溶媒ベースの方法の好ましい実施態様において、水溶液中の治療薬の濃度は約０．０５％から約１．０％重量／体積、より好ましくは約０．１％から約０．３％重量／体積である。好ましい実施態様において、水溶液中のポリマーの濃度は、約０．５％から約１０％重量／体積、より好ましくは約１．０％から約３．０％重量／体積である。
【００９４】
溶媒ベースの方法において、水混和性溶媒は、１〜６個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖、または環状アルコールなどの任意の極性有機溶媒であり得るか、または少なくとも１つのケトン、ジケトン、不飽和ケトンまたはシクロケトンを含み得る。好ましい態様において、溶媒はエタノールである。
【００９５】
本発明の別の態様は、疾患または病状を処置する方法、あるいは疾患または病状の処置を補助する方法である。この方法は、本発明によるナノ粒子配合物を含む医薬組成物などの組成物をそれを必要とする対象に経口投与することを含む。配合物は、前記疾患の処置を補助する治療薬を含む。好ましくは、治療薬は、単独で経口投与した場合、または従来の経口医薬製剤を使用した場合に分解されるかまたは吸収され難いであろうものである。対象はヒトなどの哺乳動物であり得る。
【００９６】
いくつかの実施態様において、治療薬はインシュリンであり、本発明のインシュリン含有組成物は、乳児、小児または青年における糖尿病、インシュリン欠乏に関連するメタボリック症候群、または糖尿病性ケトアシドーシスを処置するために経口投与される。糖尿病は１型または２型であり得、そして対象はインシュリン投与を必要とする任意の哺乳動物またはヒトであり得る。本発明の組成物の経口投与は、対象の従来のインシュリン治療（例えば、非経口投与されるインシュリン）の全部または一部を置き換えることができる。
【００９７】
他の実施態様において、治療薬は抗腫瘍抗体（すなわち、任意の機序によって腫瘍細胞の死をもたらす抗体）であり、それは対象のがんを処置するために対象に投与される。抗腫瘍抗体としては、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗Ｈｅｒ２（例えば、トラスツズマブ）、抗ＲＳＶ（例えば、パリビズマブ）、抗インターロイキン（例えば、トシリズマブ）が含まれるが、これらに限定されない。がんは、乳癌、結腸直腸癌、または頭頸部癌などの、１つまたは複数の抗体による処置に感受性のある任意のがんであり得る。
【００９８】
さらに他の実施態様において、治療薬は抗炎症性抗体であり、そして疾患は炎症性疾患である。抗炎症性抗体としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する抗体およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患としては、クローン病、慢性関節リウマチ、多関節性若年性特発性関節炎、および全身性若年性特発性関節炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
この方法によって形成されたナノ粒子または微粒子は、丸剤、錠剤、カプセル剤、飲料剤、液体懸濁剤または凍結乾燥粉末を含む任意の剤形で使用することができる。この組成物は、経口、吸入、口腔内、舌下、鼻腔内、坐薬または非経口を含む任意の投与経路で使用することができる。好ましくは、配合物は経腸投与用であり、さらにより好ましくは経口投与用である。
「製剤(配合物)」および「組成物」という用語は本明細書では互換的に使用される。
【実施例】
【０１００】
実施例１  材料と方法
絶食状態模擬胃液（ＦａＳＳＧＦ）：ヒトＦａＳＳＧＦは、Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ（英国ロンドン）から入手した。それは０．０８ｍＭのタウロコール酸ナトリウム、０．０２ｍＭのレシチン、３４．２ｍＭの塩化ナトリウム、および２５．１ｍＭの塩酸を含んでいた。溶液のｐＨは１．６であった。
絶食状態模擬腸液（ＦａＳＳＩＦ）：ヒトＦａＳＳＩＦは、Ｂｉｏｒｅｌｅｖａｎｔ（英国ロンドン）から入手した。それは、３ｍＭタウロコール酸ナトリウム、０．７５ｍＭレシチン、１０５．９ｍＭ塩化ナトリウム、２８．４ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム、および８．７ｍＭ水酸化ナトリウムを含有していた。溶液のｐＨは６．５であった。
【０１０１】
無溶媒法：治療薬を溶解し、ｐＨ感受性ポリマーを治療薬が可溶である酸性水性媒体中に懸濁した。次いで、３ｍＭのタウロコール酸ナトリウム、０．７５ｍＭのホスファチジルコリン、１０６ｍＭの塩化ナトリウム、および２８ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する溶液を添加することによってｐＨを５．５以上に上昇させるか、または酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、トリスなどの緩衝液を用いてｐＨを５．０より大に上昇させるか、またはｐＨをＮａＯＨで６．５に調整した。ｐＨ６．５では、ポリマーのナノ粒子が存在した。その後、ｐＨをＨＣｌで４．０未満に下げて、治療薬を粒子と緊密に会合させた。場合により、この懸濁液を次いで凍結乾燥した。
【０１０２】
改変された無溶媒法：高分子量治療薬およびｐＨ感受性ポリマーを水性媒体中で混合し、続いてこれにｐＨ６．５の溶液を添加し、会合した治療薬と共にナノ粒子を形成し、次いで懸濁液を凍結乾燥した。凍結乾燥したサンプルを次いで適切な水溶液または緩衝液で再構成した。
【０１０３】
溶媒ベース法：ｐＨ感受性ポリマーを１００％エタノールに可溶化して、溶液中で約１％から約５％の最終濃度を達成した。次いで、水溶液中の１容量の治療薬を、ポリマーを含有する２〜１０容量の有機溶液に添加した。次いで溶液を遠心分離し、沈殿したナノ粒子を回収した。
改変された溶媒ベース法：ｐＨ感受性ポリマーを１００％エタノールに可溶化して、溶液中で約１％から約５％の最終濃度を達成した。薬剤が可溶性である酸性ｐＨ（ｐＨ約４．０以下）の水溶液中の１容量の治療薬を採取し、ｐＨを約５．０以上に上昇させて、治療薬を沈殿させた。次いで、そのように調製した治療薬を、ポリマーを含有する２〜１０容量の有機溶液に添加したところ、ポリマーは沈殿した治療薬と会合した。次いで溶液を遠心分離し、ポリマーおよび治療薬を含有するナノ粒子を回収した。
【０１０４】
インシュリン酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：インシュリンの検出および定量化は、ヒトイソインシュリンインスタントＥＬＩＳＡキット（Affymetrix /eBioscience Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して実施した。分析前にサンプルを１００，０００倍に希釈し、キットのプロトコルによって推奨されるように段階的にさらに希釈した。
【０１０５】
インシュリン高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：インシュリンの検出および定量化は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８カラムを使用してＨＰＬＣにより行った。使用した溶媒はアセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸であり、溶出したインシュリンピークは２８０ｎｍの吸光度としてモニターした。溶出プロファイルは以下の表１に示す通りであった。
【表１】
2019534897.tif 000003
【０１０６】
凍結乾燥：凍結乾燥のために、アリコートの溶液を−５０℃で２時間凍結し、そして次に１℃の傾斜速度で、７５ミリトール(mTorr)の圧力で２０℃に加熱した。凍結乾燥は、試料と接触しているピラニ真空計が７５ミリトール以下に達するまで行った。
【０１０７】
インシュリンナノ粒子配合物：表２は、治療薬としてインシュリンおよびｐＨ感受性ポリマーとしてEUDRAGIT L 100を含有するようにされた種々のナノ粒子配合物の組成物を示す。配合物は、さらに以下の実施例において説明される。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
実施例２：凍結乾燥後のインシュリンナノ粒子の溶解度
インシュリン配合物１の組成を表２に記載する。配合物を凍結乾燥し、次いで凍結乾燥粉末（１ｍｇのインシュリンを含有する）１０ｍｇをｐＨ６．５の緩衝液１ｍＬで再構成し、ナノ粒子を形成した。次いで、１００μＬの１Ｎ ＨＣｌを溶液に添加し、それによってポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００）およびインシュリンを含有する粒子を沈殿させた。遠心分離後の上清のＨＰＬＣ分析は、インシュリンがＨＣｌに非常に溶けやすいとしてもインシュリンを全く示さず、インシュリンが粒子と緊密に会合したことを実証した。それにもかかわらず、遠心分離後の沈殿物をｐＨ７．２のＰＢＳに可溶化すると、以前に沈殿したポリマーが懸濁し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に基づいてＰＢＳ中の可溶化または懸濁形態のインシュリン（１ｍｇ）を完全に回収することができた。
【０１１０】
実施例３：インシュリンナノ粒子のサイズ分布および溶解度
配合物２の２つの５ｍｌ試料をｐＨ２．５に調整したところ、それが微粒子の沈殿を引き起こした。次にサンプルを３０００ｒｐｍで遠心分離して粒子を沈降させた。上清をＨＰＬＣで分析したところ、インシュリンは示されず、沈殿した粒子とインシュリンの緊密な会合が示された。各試料のペレットに、５ｍＬのＦａＳＳＩＦまたはＦａＳＳＧＦのいずれかを添加して粒子をｐＨ６．５（ＦａＳＳＩＦ）または２．０未満のｐＨ（ＦａＳＳＧＦ）で再懸濁した。インシュリン放出プロファイルをモニターし、そしてデータを図４に示す。データは、インシュリンがＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）で放出されたがＦａＳＳＧＦ（酸性ｐＨ）ではほとんど放出されなかったことを示す。再懸濁粒子のサイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Malvern Instruments、Malvern、英国）および製造業者によって提供されたソフトウェアを使用して分析した。再懸濁粒子は２０．７６ｎｍのＺ平均直径を有していた。
【０１１１】
実施例４：酸性および中性ｐＨでのインシュリンナノ粒子のＨＰＬＣ分析
配合物３は、ポリマーとしてＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｓ−１００を用いて無溶媒法に従って調製した。溶液のｐＨが３．５に低下したとき、粒子は可溶性ではなかった。粒子をｐＨ７．２のＰＢＳに移したとき、沈殿した粒子は完全に懸濁または可溶性になり、ＰＢＳ中のインシュリンを完全に回収した。
【０１１２】
実施例５：オレンジジュースの凍結乾燥配合物の再構成
配合物４は、無溶媒法に従って調製した。ｐＨが３．５に低下したとき、たとえインシュリンが酸性ｐＨに非常に可溶性であっても、粒子は可溶性ではなかった。粒子を遠心分離によって沈殿させ、次いで沈殿物をｐＨ７．２のＰＢＳに可溶化し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に基づいてインシュリン含有量を完全に回収した。沈殿物はまた、通常の市販のオレンジジュース中に再構成され、そしてオレンジジュースの分析は、液体中に遊離インシュリンが存在しないことを示した。しかしながら、ｐＨを６．０に調整した場合、インシュリン含有粒子は上清中に残った。この結果は、オレンジジュースまたは他のフルーツジュースまたは酸性飲料に再構成された配合物が、糖尿病患者用の小児用配合物として使用できることを示唆している。
【０１１３】
実施例６：粘膜付着性ポリマーを含有するインシュリンナノ粒子配合物
配合物５を無溶媒法に従って調製した。次に配合物を３ｍＬフリントガラスバイアル中の１．２ｍＬアリコートに分け、そして凍結乾燥した。ＨＰＬＣ分析は、インシュリンで捕捉されたポリマーがｐＨ５．９で可溶性であるため、再構成された凍結乾燥粉末がインスリンを完全に放出することを示した。
【０１１４】
粘膜付着性ポリマーポロキサマーを含有する配合物６を、改変無溶媒法に従って調製した。ｐＨを３．５に調整した。次に製剤を３ｍＬフリントガラスバイアル中の１．２ｍＬアリコートに分け、そして凍結乾燥した。ＨＰＬＣ分析は、インシュリンと共に捕捉されたポリマーがｐＨ３．５では可溶性ではないので、再構成された凍結乾燥粉末はインスリンを放出しないことを示した。
【０１１５】
粘膜付着性ポリマーポロキサマーを含有する配合物７を、無溶媒方法に従って調製した。次に配合物を３ｍＬフリントガラスバイアル中の１．２ｍＬアリコートに分け、そして凍結乾燥した。ＨＰＬＣ分析は、インシュリンで捕捉されたポリマーがｐＨ５．９で可溶性であるため、再構成された凍結乾燥粉末がインシュリンを完全に放出することを示した。
【０１１６】
粘膜付着性ポリマーアルギン酸塩、ヒプロメロース、およびポロキサマーを含有する配合物８を、改変無溶媒ナノ粒子形成方法に従って調製した。次に配合物を３ｍＬフリントガラスバイアル中の１．２ｍＬアリコートに分け、そして凍結乾燥した。最終ｐＨは５．９であった。ＨＰＬＣ分析は、インシュリンで捕捉されたポリマーがｐＨ５．９で可溶性であるため、再構成された凍結乾燥粉末がインシュリンを完全に放出することを示した。
【０１１７】
実施例７：脂肪酸透過性促進剤を含有するナノ粒子のサイズ
透過性促進剤としてカプリル酸を含有する配合物９は、インスリンおよびＥＵＤＲＡＧＩＴを酸性水溶液に添加し、続いてＮａＯＨ、次いでｐＨ６．５の緩衝液を添加することによって調製した。この溶液に、透過性促進剤のカプリル酸を添加し、配合物のｐＨを５．６に調整した。配合物の平均粒子サイズは２３ｎｍであった。配合物の１ｍＬアリコートを２０ｍＬバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。ＨＰＬＣ分析は、インシュリンと共に捕捉されたポリマーがｐＨ５．６で可溶性であるので、再構成された凍結乾燥粉末がインシュリンを完全に放出することを示した。
透過性促進剤としてオレイン酸を含有する配合物１０は、インスリンおよびオイドラギット(Eudragit)を酸性水溶液に添加し、続いてＮａＯＨ、次いでｐＨ６．５の緩衝液を添加することによって調製した。この溶液に、透過性促進剤のオレイン酸を添加し、そして配合物のｐＨは５．６に達した。配合物の粒子サイズは１８．６ｎｍであった。配合物の１ｍＬアリコートを２０ｍＬバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。ＨＰＬＣ分析は、インシュリンで捕捉されたポリマーがｐＨ５．９で可溶性であるため、再構成された凍結乾燥粉末がインスリンを完全に放出することを示した。
【０１１８】
実施例８：ＦａＳＳＩＦまたはＦａＳＳＧＦで再構成された凍結乾燥ナノ粒子配合物からのインシュリン放出
配合物１１は、ＤＬＳによって測定されたときに１８．２８ｎｍの平均粒子サイズを有していた。１ｍｌの試料を２つの２０ｍｌバイアルに分配しそして凍結乾燥した。１つのバイアルをＦａＳＳＧＦで再構成し、そしてｐＨを２．０未満に調整した。第二のバイアルをｐＨ ６．５にてＦａＳＳＩＦで再構成した。インスリン放出プロファイルは、インスリン特異的ＥＬＩＳＡを用いて２４時間モニターした。各時点で、サンプルを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡによってそのインスリン含有量についてアッセイした。図５に示す放出プロファイルは、インスリンがｐＨ６．５でのみ上清中に放出され、２．０未満の酸性ｐＨでは放出されないことを示した。
【０１１９】
粘膜付着性ポリマーＨＰＭＣを含有する配合物１２は、ＤＬＳにより測定したところ２３．１１ｎｍの平均粒子サイズを有していた。１ｍｌアリコートを２つの２０ｍｌバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。１つのバイアルをＦａＳＳＧＦで再構成し、そしてｐＨを２．０未満に調整した。第二のバイアルをｐＨ ６．５にてＦａＳＳＩＦで再構成した。インスリン放出プロファイルを２４時間モニターした。各時点で、試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡの両方を用いてそのインスリン含有量についてアッセイした。図６および７は、２つの異なる方法によって測定された放出プロファイルを示す。ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡの両方は、インスリンがｐＨ６．５でのみ上清に放出され、粘膜付着性ポリマーのナノ粒子中に包含されることで、２．０未満の酸性ｐＨでは放出されないことを示した。
【０１２０】
粘膜付着性ポリマーアルギン酸塩を含有する配合物１３は、ＤＬＳによって測定したところ１８．７９ｎｍの平均粒子サイズを有していた（図８）。１ｍｌアリコートを２つの２０ｍｌバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。１つのバイアルをＦａＳＳＧＦで再構成し、そしてｐＨを２．０未満に調整した。第二のバイアルをｐＨ ６．５にてＦａＳＳＩＦで再構成した。インスリン放出プロファイルをＥＬＩＳＡにより２４時間モニターした。各時点で、試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をそのインスリン含有量についてアッセイした。放出プロファイルを図９に示す。インスリンはｐＨ６．５でのみ上清に放出され、ナノ粒子にアルギン酸塩を含めることで、２．０未満の酸性ｐＨでは放出されなかった。
【０１２１】
粘膜付着性ポリマーキトサンを含有する配合物１４は、ＤＬＳにより測定したところ１５７７ｎｍの平均粒子サイズを有していた。大きな粒径は、ｐＨ６．５でのキトサンの不溶性によるものであり得る。１ｍｌアリコートを２つの２０ｍｌバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。１つのバイアルをＦａＳＳＧＦで再構成し、そしてｐＨを２．０未満に調整した。第二のバイアルをｐＨ６．５のＦａＳＳＩＦで再構成した。インスリン放出プロファイルを２４時間モニターした。各時点で、試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡおよびＨＰＬＣの両方によってそのインスリン含有量についてアッセイした。図１０および１１は両方の方法の放出プロファイルを示す。インスリンはｐＨ６．５でのみ上清中に放出され、ナノ粒子中にキトサンを含めることで、２．０未満の酸性ｐＨでは放出されなかった。
【０１２２】
透過性促進剤としてカプリル酸を含有する配合物１５は、ＤＬＳにより測定したところ２３．６７ｎｍの平均粒子サイズを有していた。１ｍｌアリコートを２つの２０ｍｌバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。１つのバイアルをＦａＳＳＧＦで再構成し、そしてｐＨを２．０未満に調整した。第二のバイアルをｐＨ６．５のＦａＳＳＩＦで再構成した。インスリン放出プロファイルを２４時間モニターした。各時点で、試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡおよびＨＰＬＣによってそのインスリン含有量についてアッセイした。放出プロファイルを図１２および図１３に示す。インスリンはｐＨ６．５でのみ上清中に放出され、カプリル酸がナノ粒子中に包含されていることで、２．０未満の酸性ｐＨでは放出されなかった。
【０１２３】
透過性促進剤としてオレイン酸を含有する配合物１６は、ＤＬＳによって測定したところ１８．５５ｎｍの平均粒子サイズを有していた（図１４）。１ｍｌアリコートを２つの２０ｍｌバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。１つのバイアルをＦａＳＳＧＦで再構成し、そしてｐＨを２．０未満に調整した。第二のバイアルをｐＨ６．５のＦａＳＳＩＦで再構成した。インスリン放出プロファイルを２４時間モニターした。各時点で、試料を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡおよびＨＰＬＣによってそのインスリン含有量についてアッセイした。図１５および１６は放出プロファイルを示す。インスリンはｐＨ６．５でのみ上清に放出され、オレイン酸のナノ粒子に含まれていたことで、２．０未満の酸性ｐＨでは放出されなかった。
【０１２４】
実施例９：経口インシュリン製剤を用いた糖尿病の処置
溶媒ベースの方法によって調製された配合物の有効性は、２型糖尿病を有し、夜間に１００ｍｇのメトホルミンおよび４２単位のインスリンの一日量を服用しているヒト対象において試験された。この投薬プロトコルは陽性対照と見なされた。陰性対照のために、投薬は一日悉く止められた。
ナノ粒子配合物は以下のように調製した。２１２ｍｇのインスリンを１５０ｍＬのビーカーに量り取り、続いて５ｍＬの０．０１Ｎ ＨＣｌを加えてインスリンを溶解させた。次に、エタノール中１．０７２ｇのＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００を加え、続いて１０５ｍＬのｐＨ６．５緩衝液を加えた。混合物のｐＨは５．７１であった。 次にそれを５Ｎ ＮａＯＨを用いて５．９５（配合物１６を得る）またはＨＣｌを用いてｐＨ３．３（配合物１７を得る）のいずれかに調整した。各配合物１６ｍＬを５０ｍＬバイアル６本に分注し、ゴム栓で部分的に栓をして凍結乾燥した。凍結乾燥の完了は、試料と接触しているピラニ真空計によって測定された圧力が棚設定圧力に達したときであると考えられた（図１７および１８）。次に配合物を注射用水１５ｍＬで再構成して、最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。２ｍｇ／ｍＬのインスリンを含有する１５ｍＬのこの配合物を、一晩に１配合物ずつ、対象によって経口摂取させた。すべての薬は食事の直後に服用させた。食事の２時間後に、OneTouch Ultra（登録商標）テストストリップ（LifeScan, Inc.）を備えたOneTouch Ultra（登録商標）グルコース計を使用して血糖値を測定した。最初の読みは、時間０であった。データは、血糖がメトホルミンおよびインスリンの投与後に着実に減少したが（陽性対照）、血糖値は投薬の非存在下で２００ｍｇ／ｄｌより高いことを示した（陰性対照）。実験データは、配合物１７（ｐＨ５．９）または配合物１８（ｐＨ３．５）のいずれかの経口投与が食後血糖を減少させることができることを示した。約２時間目から血糖値は正常血糖値（約１００ ｍｇ／ｄｌ）まで着実に低下した（図１９）。
【０１２５】
実施例１０：経口インシュリン製剤での血糖の制御
単回経口投与量のＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００−インスリン（製剤１６）に対するイヌにおける血糖反応と、市販のＨＵＭＵＬＩＮ Ｒインスリン（Lilly、米国）の単回皮下注射の血糖反応とを比較するために実験を行った。
３匹の非ナイーブ雌ビーグル犬に、２日目に経口胃管栄養法によりＵＳＰ注射用無菌水中２ｍｇ／ｋｇ用量の配合物１６を投与し、４日目に皮下注射により０．５Ｕ／ｋｇ用量のＨＵＭＵＬＩＮ Ｒインスリンを投与した。血糖値を、給餌直前、食物除去直後、食物除去後１、２、３、４、および６時間に測定した。２日目および４日目に、摂食直前、食物除去直後であるが投薬前、ならびに投薬の１、２、３、４、６および２４時間後（給餌前）に血糖値を測定した。５日目の試験データ収集の完了後に動物をストックに戻した。試験デザインを表３に示す。犬に死亡率および試験品関連の臨床観察または有害作用は認められなかった。結果を図２０に示す。
【０１２６】
経口インスリン製剤の経口投与後の３匹のイヌの血糖は、給餌後６時間で対照グルコースレベルの８０〜９８％の範囲であった。対照的に、ＨＵＭＵＬＩＮの皮下投与は、対照グルコースレベルの８０〜１３４％をもたらし、したがって、ＨＵＭＵＬＩＮの皮下投与と比較して、ナノ粒子インスリン製剤の経口投与後の低血糖の長期維持を示唆する。配合物１６の経口投与は、投与後２時間以内に３匹の犬のうち２匹について正常化血糖値をもたらした。ＨＵＭＵＬＩＮの投与は、投与後１時間以内に血糖値の低下をもたらしたが、１日目（非投与）の値と比較した場合、投与後３〜６時間の血糖値の上昇（対照値の１２０％〜１７４％）をもたらした。これらの観察は、ナノ粒子−インスリン配合物の経口投与が分泌後の体内の内因性インスリンの効果をよりよく模倣し、より良いグルコース恒常性を提供することを示唆している。全体として、血糖値は、ＨＵＭＵＬＩＮの皮下投与後よりも配合物１６の経口投与後の方が低く、より安定していた（変動が少なかった）。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
実施例１１：無溶媒法による抗−ＥＧＦＲ抗体経口製剤の調製
ＥＲＢＩＴＵＸ（セツキシマブ）は、頭頸部癌および結腸直腸癌の処置に適応される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）拮抗薬である。推奨される初期用量は、１２０分の静脈内注入として投与される４００ｍｇ／ｍ２である（最大注入速度１０ ｍｇ／分）。セツキシマブは、８．４８ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、１．８８ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、０．４１ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、および米国薬局方注射用水を含有する５ｍｇ／ｍＬの溶液として商品化されている。この剤形中の４００μＬのセツキシマブを１０ｍＬバイアル中の２０ｍｇのＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に添加し、続いて２ｍＬのｐＨ６．５緩衝液を添加した（表４）。
【０１２９】
この溶液を１．２ｍＬのサンプルに等分し、それを１０ｍＬバイアルに入れて凍結乾燥した。１つのサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＧＦで再構成し、２つ目のサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＩＦで再構成した。１２０μＬのサンプルを０、１、２、４、８および２４時間で採取し、１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。サイズ排除クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ分析のために、各サンプルの上清４０μＬを注入した。Ｔｏｓｏｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを使用してＳＥＣ−ＨＰＬＣを実施した。放出プロファイルは、セツキシマブがＦａＳＳＧＦ（酸性ｐＨ）中の上清中に放出されなかったが、ＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）中の上清中に放出されたことを示した（図２１）。２４時間のＦａＳＳＧＦサンプルの遠心分離後、ペレットを１ｍＬのＰＢＳでｐＨ７．４にて再構成したところ、抗体が上清中に放出された。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
実施例１２：無溶媒法による抗Ｈｅｒ２抗体経口製剤の調製
ハーセプチン（トラスツズマブ）は、乳がんの補助処置として適応される。トラスツズマブは、静脈内投与用の無菌の白色〜淡黄色の防腐剤を含まない凍結乾燥粉末である。トラスツズマブの各市販の多用途バイアルは、４４０ｍｇのトラスツズマブ、４００ｍｇのα、α−トレハロース二水和物、９．９ｍｇのＬ−ヒスチジンＨＣｌ、６．４ｍｇのＬ−ヒスチジン、および１．８ｍｇのポリソルベート２０、米国薬局方を凍結乾燥形態で含有していた。注射用水２０ｍＬで再構成すると、ｐＨ約６．０の２１ｍｇ／ｍＬトラスツズマブを含有する溶液が得られた。この試験のために、２００μＬの市販のトラスツズマブを１０ｍＬバイアル中の７０ｍｇのＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に加えた。この溶液に、７．５ｍＬのｐＨ６．５緩衝液を添加した。次に、１．４５ｍＬアリコートの溶液を１０ｍＬバイアルに入れて凍結乾燥した。１つのサンプルはｐＨ２．１の１ｍＬのＦａＳＳＧＦで再構成し、２つ目のサンプルはｐＨ６．５のＦａＳＳＩＦで再構成した。１２０μＬのサンプルを０、１、２、４、８、および２４時間で採取し、１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。回収したトラスツズマブの活性を機能的ＥＬＩＳＡアッセイで評価した。この目的のために、ＦａＳＳＧＦ（ｐＨ１．５〜２）またはＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）で再構成した後、トラスツズマブ配合物緩衝液の緩衝能力のために最終ｐＨをそれぞれｐＨ１．５および６．５に調整した。次にサンプルをＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で２０，０００倍に希釈した。トラスツズマブの検出および定量化は、その後、ヒトＩｇＧ全Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！（登録商標）キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実施した。２４時間後でさえも酸性ｐＨで上清中へのトラスツズマブの放出は観察されなかった。しかしながら、ｐＨ６．５では、ほとんどの抗体が１時間以内に上清に放出された（図２２）。
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
実施例１３．無溶媒法による抗ＲＳＶ抗体経口製剤の調製
ＳＹＮＡＧＩＳ（パリビズマブ）は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質のＡ抗原部位中のエピトープに向けられた、組換えＤＮＡ技術によって産生されたヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧ１ｋ）である。各１００ｍｇ単回用量のパリビズマブ液体溶液は、ｐＨ約６．０で１ｍＬの容量中に、１００ｍｇのパリビズマブ、３．９ｍｇのヒスチジン、０．１ｍｇのグリシン、および０．５ｍｇの塩化物を含有する。剤形は筋肉内注射である。９８μＬのパリビズマブを１０ｍＬバイアル中の９８ｍｇのＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に加えた。この溶液に、９．８ｍＬのｐＨ６．５緩衝液を添加した。次いで、２つの１．１ｍＬ試料を１０ｍＬバイアルに入れ、そして凍結乾燥した。１つのサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＧＦ（ｐＨ２．１）で再構成し、２つ目のサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）で再構成した。１２０μＬのサンプルを０、１、２、４、８、および２４時間で採取し、１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。Ｔｏｓｏｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを使用して行われたＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析のために、各試料の上清４０μＬを注入した。２４時間後でさえも、トラスツズマブの放出は酸性ｐＨで観察されなかった。しかしながら、この抗体の完全な放出は、ｐＨ６．５のＦａＳＳＩＦにおいて観察された。２４時間のＦａＳＳＧＦサンプルの遠心分離後、ペレットをｐＨ７．４にて１ｍＬのＰＢＳで再構成した。パリビズマブは、酸性媒体中に２４時間保持した後でも、溶液が中性ｐＨに達したときにのみ放出された（図２３）。ＳＥＣデータに加えて、抗体活性を機能的ＥＬＩＳＡアッセイで評価した。この目的のために、ＦａＳＳＧＦまたはＦａＳＳＩＦで再構成した後、最終ｐＨをそれぞれｐＨ１．５および６．５に調整した。次にサンプルをＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で２０，０００倍に希釈した。次に、ヒトＩｇＧ全Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！（登録商標）キット（Affymetrix/eBioscience Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、パリビズマブの検出および定量化を行った。２４時間後でさえも、酸性ｐＨで上清中へのパリビズマブの放出は観察されなかった。しかしながら、ｐＨ６．５では、ほとんどの抗体が１時間以内に上清中に放出された（図２４）。
【０１３４】
【表６】
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【０１３５】
実施例１４：無溶媒法による抗ＴＮＦ抗体経口製剤の調製
ＨＵＭＩＲＡ（アダリムマブ）は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、およびプラーク乾癬の処置に適応される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遮断薬である。アダリムマブは皮下投与のためのアダリムマブの無菌の、保存料を含まない溶液として供給されている。薬物製品は、使い捨てのプレフィルドペンとして、または使い捨ての１ｍＬプレフィルドガラスシリンジとして供給される。ペンの中には、使い捨ての１ｍＬのプレフィルドガラスシリンジが入っている。アダリムマブの溶液は無色透明で、ｐＨは約５．２である。各注射器は０．８ｍＬ（４０ｍｇ）の医薬品を送達する。この剤形の各０．８ｍＬは、４０ｍｇのアダリムマブ、４．９３ｍｇの塩化ナトリウム、０．６９ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、１．２２ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、１．０４ｍｇのクエン酸一水和物、９．６ｍｇのマンニトール、０．８ｍｇのポリソルベート８０、ならびに注射用水・米国薬局方を含有する。ｐＨを調整するために必要に応じて水酸化ナトリウムを添加する。この剤形は筋肉内注射用である。配合物をそれぞれの配合物緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。２ｍＬのアダリムマブを１０ｍＬバイアル中の２０ｍｇのＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に添加した。この溶液の１．０ｍＬ試料を１０ｍＬバイアルに入れて凍結乾燥した。
【０１３６】
１つのサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＧＦ（ｐＨ２．１）で再構成し、第２のサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）で再構成した。１２０μＬのサンプルを０、１、２、４、８、および２４時間で採取し、１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。機能的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、上清をＴＮＦに対するその活性について分析した。この目的のために、各サンプルをＦａＳＳＧＦまたはＦａＳＳＩＦのいずれかで１０，０００倍希釈し、さらにキットのＡｄａｌｉｍｕｍａｂ（ＨＵＭＩＲＡ）ＥＬＩＳＡアッセイキット（Eagle Biosciences, Inc., 米国ニューハンプシャー州ナシュア）からの希釈サンプル緩衝液で６倍希釈した。２４時間後でさえ、酸性媒体中の上清中へのアダリムマブの放出はなかった。しかしながら、ｐＨ６．５では、ほとんどの抗体が１時間以内に上清中に放出された（図２５）。
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
実施例１５：無溶媒法による抗ＩＬ−６抗体経口製剤の調製
ＡＣＴＥＭＲＡ（トシリズマブ）は、関節リウマチ、多関節型若年性特発性関節炎、および全身性若年性特発性関節炎の処置に適応されるインターロイキン−６（ＩＬ−６）受容体拮抗薬である。これは、０．９ｍＬ中１６２ｍｇの抗体を提供する使い捨てプレフィルドガラスシリンジとして商品化されている。不活性成分は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物である。この剤形は皮下注射用である。この試験のために、製剤をそれぞれの製剤緩衝液で２ｍｇ／ｍＬに希釈した。１ｍＬのトシリズマブを１０ｍＬバイアル中の２０ｍｇのＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に加え、次いで１ｍＬのｐＨ６．５緩衝液を加えた。次いでｐＨを６．８に調整した。溶液の１．０ｍＬ試料を１０ｍＬバイアルに入れ、そして凍結乾燥した。
【０１３９】
１つのサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＧＦ（ｐＨ２．１）で再構成し、もう１つのサンプルは１ｍＬのＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）で再構成した。１２０μＬのサンプルを０、１、２、４、８、および２４時間で採取し、１．５ｍＬの遠心分離管に入れ、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。回収したトシリズマブの活性を機能的ＥＬＩＳＡアッセイで評価した。この目的のために、ＦａＳＳＧＦ（ｐＨ１．５〜２．０）またはＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）で再構成した後、最終ｐＨをそれぞれｐＨ１．５および６．５に調整した。次にサンプルをＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液で２０，０００倍に希釈した。次いで、トシリズマブの検出および定量化を、ヒトＩｇＧトータルＲｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ！（登録商標）キット（Affymetrix/eBioscience Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。２４時間後でさえも、酸性ｐＨで上清中へのトシリズマブの放出は観察されなかった。しかしながら、ｐＨ６．５では、ほとんどの抗体が１時間以内に上清中に放出された（図２６）。
【０１４０】
【表８】
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【０１４１】
実施例１６：無溶媒法によるアスコルビン酸経口製剤の調製
１０ｍＬのアスコルビン酸溶液を以下の組成で調製した：
７５ｇアスコルビン酸
１００ｍｇＥｕｄｒａｇｉｔ
１．７５ｇ大豆レシチン
２．７ｍＭタウロコール酸ナトリウム
０．７ｍＭ大豆レシチン
２８．３６ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム
１０５．８５ｍＭ塩化ナトリウム
１Ｎ−ＮａＯＨをｐＨ６．５にする量
【０１４２】
１００Ｋｄａのカットオフ透析膜を使用して１ｍｌの上記配合物を１００ｍｌのＦＡＳＳＩＦに対してｐＨで透析し、腸の状態で放出プロファイルを試験した。１ｍｌの第２のアリコートをｐＨ２．０に調整し、ｐＨ１．５にて１００ｍＬのＦＡＳＳＧＦに対して透析し、胃状態での放出プロファイルを試験した。試料のアリコートを異なる時点で採取し、アスコルビン酸含有量を、それぞれのＦＡＳＳＩＦまたはＦＡＳＳＧＦ溶液で１００倍希釈した後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使用して２６０ｎｍで測定した。ｐＨ６．５でＦＡＳＳＩＦに溶解したアスコルビン酸を標準として使用した。ブランクとしてＦＡＳＳＩＦまたはＦＡＳＳＧＦが使用された。
【０１４３】
データ（図２７参照）は、アスコルビン酸はｐＨ６．５でのみ放出され、強酸性ｐＨでは有意には放出されないことを示した。ＤＬＳによる最終配合物の平均粒子サイズは３４．９ｎｍであった（図２８）。結果は、配合物がビタミンＣの経口送達に有用であり、１７５ｍｇ／ｍＬの高負荷を提供することを示唆している。配合物は容易に凍結乾燥可能であり、そして懸濁液、錠剤、もしくはカプセルのための粉末として送達され得るか、または小児用配合物のための安定な水性懸濁液として送達され得る。
【０１４４】
実施例１７：溶媒ベース法によるウシ血清アルブミン含有ナノ粒子の調製
１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンをエタノール中の１０ｍＬの１％ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に希釈した。試料を−２０℃に３０分間保ち、次いで３２００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを一晩乾燥し、１ｍｇ／ｍＬのＦａＳＳＧＦ（ｐＨ１．５〜２．０）またはＦａＳＳＩＦ（ｐＨ６．５）のいずれか中で再構成した。図２９に示す放出プロファイルは、アルブミンが中性ｐＨ（ＦａＳＳＩＦ）では急速に上清中に放出され、酸性ｐＨ（ＦａＳＳＧＦ）ではゆっくりとのみ放出されたことを示している。
【０１４５】
実施例１８：溶媒ベース法によるインシュリンナノ粒子の調製
インスリンは酸性ｐＨでは可溶性であるが中性ｐＨでは可溶性ではないことが知られている。最初にインスリンを０．０１ＮのＨＣｌに溶解することによって１０ｍｇ ／ｍＬのインスリン溶液を調製した。０．１ｍＬのインスリン溶液を１ｍＬのエタノール中の２％ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００に添加した場合、目に見える沈殿は見られず、酸性ｐＨでインスリンが９０％の有機溶媒でも可溶性であることを示している。配合物を０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和すると、インスリンとＥＵＤＲＡＧＩＴが共沈した。沈殿物は、約１１１０ｎｍのＺ平均粒子サイズを有するナノ粒子を含んでいた。試料を−２０℃に３０分間保ち、次いで３２００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを真空遠心機を用いて２時間乾燥し、そしてＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦ中で放出プロファイルについて試験した。図３０に示すデータは、インスリンが好ましくは中性のｐＨで上清中に放出されたことを示している。
【０１４６】
実施例１９：インシュリン−アルギン酸含有ナノ粒子の溶媒ベース法による調製
水中の２％アルギン酸１００μＬをエタノール中の１％ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ １００ １ｍＬに加え、ボルテックスした。インスリンを０．０１ＮのＨＣｌに溶解することによって１０ｍｇ／ｍＬのインスリンを調製した。続いて、０．０１Ｎ ＨＣｌ中の１０ｍｇ／ｍＬインスリン０．１ｍＬをエタノール溶液に添加した。目に見える沈殿は起こらなかった。しかしながら、配合物を０．１ＮのＮａＯＨで中和すると、インスリンとＥＵＤＲＡＧＩＴが共沈した。試料を−２０℃に３０分間保ち、次いで３２００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを真空遠心機を用いて２時間乾燥し、ＦａＳＳＧＦおよびＦａＳＳＩＦ中のインスリン放出について試験した。データを図３１に示し、インスリンが中性ｐＨで上清中に優先的に放出されたことを示している。
【０１４７】
実施例２０：Ｅｕｄｒａｇｉｔナノ粒子とのインシュリンの会合
インシュリン含有ナノ粒子が以下のように、無溶媒法によって形成された。以下の組成を有する配合物が調製された。
１ｍＬの２０ｍｇ／ｍｌインシュリン備蓄品
１００ｍｇのＥｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ−１００
１００μＬの０．２Ｎ  ＮａＯＨをｐＨ６．５まで
２．７ｍＭのタウロコール酸ナトリウム
０．７ｍＭの大豆レシチン
２８．３６ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム
１０５．８５ｍＭの塩化ナトリウム
【０１４８】
配合物は、ＤＬＳ分析に基づいて１８ｎｍの粒子サイズを有していた。１ｍｌアリコートを２０ｍｌバイアルに分配し、そして凍結乾燥した。一方のバイアルをＦＡＳＳＧＦで再構成し、ｐＨをｐＨ１．６に調整した。得られた懸濁液は濁っていた。第二のバイアルをＦＡＳＳＩＦで再構成し、再構成した溶液のｐＨはｐＨ５．５であった。得られた懸濁液は白色の乳白色であった。第三のバイアルをＦＡＳＳＩＦで再構成し、ｐＨを６．５に調整した。得られた懸濁液は透き通った透明であった。サンプルを、５０，０００Ｄａのカットオフ分子量を有する透析チューブに移した。サンプルを２ｍＬのＦＡＳＳＧＦ ｐＨ１．６、ＦＡＳＳＩＦ ｐＨ５．５、またはｐＨ６．５のＦＡＳＳＩＦに対して透析し、透析チューブからのインスリン放出をＲＰ−ＨＰＬＣによって０、０．１５、０．３０、１．０、２．０、４．０、および２４時間でモニターした。ＨＰＬＣデータは、インシュリンが２４時間の間どのｐＨでもナノ粒子と緊密に会合したままであることを示していた。２４時間後、ＦＡＳＳＩＦ  ｐＨ６．５サンプルを透析バッグの内側から取り出し、ＲＰ−ＨＰＬＣ法によってインスリン含有量について試験した。データは、透析バッグ内のサンプルについて２ｍｇ／ｍＬのインスリンの完全回収が見られたことを示した。
【０１４９】
本明細書で使用されるとき、「から本質的になる」は、請求項の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。特に組成物の成分の説明または装置の要素の説明における「含む」という用語の本明細書における任意の記述は、「から本質的になる」または「からなる」と交換することができる。
本発明を特定の好ましい実施態様に関連して記載したが、当業者であれば、前述の明細書を読んだ後に、本明細書に記載の組成物および方法に対してさまざまな変更、均等物の置換、および他の修正を生じさせることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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