(57)【要約】  本発明は、GLP-1受容体作動薬とグルカゴン受容体作動薬とを含む組成物、及びその用途を提供する。特に、本発明は、有効薬物量のGLP-1受容体作動薬とグルカゴン受容体作動薬とを含む薬物組成物において、上記GLP-1受容体作動薬と上記グルカゴン受容体作動薬は、それぞれ独立に親水性ポリマーと複合体を形成するか、又は上記GLP-1受容体作動薬及び上記グルカゴン受容体作動薬がともに親水性ポリマーと複合体を形成する薬物組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効薬物量のGLP-1受容体作動薬とグルカゴン受容体作動薬とを含む薬物組成物において、前記GLP-1受容体作動薬及び前記グルカゴン受容体作動薬はそれぞれ独立に親水性重合体と複合体を形成するか、または前記GLP-1受容体作動薬及び前記グルカゴン受容体作動薬はともに親水性重合体と複合体を形成する、薬物組成物。
【請求項２】
さらに、薬学的に許容される担体を含む、請求項1に記載の薬物組成物。
【請求項３】
非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療、抗肥満、血糖降下、及び/又は脂質降下に用いられる、請求項1又は2記載の薬物組成物。
【請求項４】
前記GLP-1受容体作動薬と前記グルカゴン受容体作動薬は1個の前記親水性重合体を介して共有結合で結合されて複合体を形成する、請求項1〜3のいずれか1項記載の薬物組成物。
【請求項５】
前記親水性重合体の分子量は2kDa〜60kDa、5kDa〜50kDa、好ましくは10kDa〜40kDa、より好ましくは20kDa〜40kDa、特に好ましくは15kDa〜30kDa、特により好ましくは21kDa〜29kDaである、請求項1〜4のいずれか1項記載の薬物組成物。
【請求項６】
前記GLP-1受容体作動薬は、Exendin-4、Exendin-3、及びGLP-1から選択される、請求項1〜5のいずれか1項記載の薬物組成物。
【請求項７】
前記GLP-1受容体作動薬は、PB-105である、請求項6に記載の薬物組成物。
【請求項８】
前記Exendin-4、Exendin-3、及びGLP-1の配列は、野生型配列よりも、1つまたは複数の部位においてさらに修飾されている、請求項6に記載の薬物組成物。
【請求項９】
前記修飾は、リシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、又はアスパラギンの側鎖にカップリングに用いられる官能基を導入するものである、請求項8に記載の薬物組成物。
【請求項１０】
前記官能基は、メルカプト基、アジド基、マレイミド基、アミノ基、アルキニル基、ビニルスルホン基、ハロゲン、及びアルデヒド基から選択される、請求項9に記載の薬物組成物。
【請求項１１】
前記修飾は、システインの付加又は置換である、請求項8に記載の薬物組成物。
【請求項１２】
前記グルカゴン受容体作動薬は、グルカゴンである、請求項1に記載の薬物組成物。
【請求項１３】
前記グルカゴンは、PB-702、PB-703、PB-740、又はPB-741である、請求項12に記載の薬物組成物。
【請求項１４】
前記グルカゴンの配列は、野生型グルカゴンの配列よりも、1つまたは複数の部位においてさらに修飾されている、請求項12に記載の薬物組成物。
【請求項１５】
前記修飾は、リシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、又はアスパラギンの側鎖にカップリングに用いられる官能基を導入するものである、請求項14に記載の薬物組成物。
【請求項１６】
前記官能基は、メルカプト基、アジド基、マレイミド基、アミノ基、アルキニル基、ビニルスルホン基、ハロゲン、及びアルデヒド基から選択される、請求項15に記載の薬物組成物。
【請求項１７】
前記修飾は、システインの付加又は置換である、請求項14に記載の薬物組成物。
【請求項１８】
前記修飾は、配列番号2の12番目のリシンの側鎖にシステインが付加すること、配列番号2の12番目のリシンの側鎖にメルカプト酢酸が付加すること、配列番号2の12番目のリシンの側鎖にメルカプトプロピオン酸が付加すること、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にシステインが付加すること、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にメルカプトエチルが付加すること、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にメルカプトプロピル付加すること、及び、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にメルカプトプロピオン酸が付加することから選択される、請求項15に記載の薬物組成物。
【請求項１９】
前記システインの付加又は置換は、配列番号2の24番目のグルタミンをシステインに置換すること、配列番号2の12番目のリシンをシステインに置換すること、及び配列番号2の29番目の後にシステインが付加することから選択される、請求項17に記載の薬物組成物。
【請求項２０】
前記親水性重合体は、多糖、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、マレイン酸アクリル酸共重合体、ポリエステル、ポリアセタール、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリイミノカーボネート、ポリアミド、ビニルエーテル無水マレイン酸共重合体、スチレン無水マレイン酸共重合体、及びこれらの重合体からなる共重合体から選択される、請求項1〜19のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項２１】
前記親水性重合体は、ポリアルキレングリコールから選択される、請求項1〜20のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項２２】
前記親水性重合体は、ポリエチレングリコール（PEG）である、請求項1〜21のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項２３】
前記薬物組成物は、対象の食欲抑制、血清総コレステロール含有量の低下、及び/又は肝臓内トリグリセリド含有量の低下、及び/又は血糖降下に用いられる、請求項1〜22のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項２４】
前記GLP-1受容体作動薬と前記グルカゴン受容体作動薬のモル比は、1：0.01〜1：100、より好ましくは1：0.03〜1：50、最も好ましくは1：0.1〜1：30、特に好ましくは1：0.5〜1：20、特により好ましくは1：1〜1：10である、請求項1〜23のいずれか１項に記載の薬物組成物。
【請求項２５】
PB-721とPB-119の組み合わせ、PB-722とPB-119の組み合わせ、及びPB-708とPB-120の組み合わせから選択されるもの、又は、PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、及びPB-720から選択されるものを含む、薬物組成物。
【請求項２６】
GLP-1受容体作動薬とグルカゴン受容体作動薬を含む複合体において、前記GLP-1受容体作動薬と前記グルカゴン受容体作動薬が親水性重合体を介して複合体を形成する、複合体。
【請求項２７】
一般式X1-Z1-Y-Z2-X2で表される複合体。
（式中、X1はGLP-1受容体作動薬を示し、X2はグルカゴン受容体作動薬を示し、Yは親水性重合体を示し、Z1は第1のリンカーを示し、Z2は第2のリンカーを示す。）
【請求項２８】
前記第1のリンカーと前記第2のリンカーは、それぞれ独立に、活性化された反応性基を含み、前記反応性基は、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、ジスルフィド結合、メルカプト基、アルデヒド基、カルボニル基、O-置換ヒドロキシルアミノ基、活性エステル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、又は他の高い化学的反応性を持つ基であり、より好ましくは、前記反応性基がマレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、及びジスルフィド結合から選択される、請求項27に記載の複合体。
【請求項２９】
前記親水性重合体は、活性化されたものであり、前記GLP-1受容体作動薬及び前記グルカゴン受容体作動薬と複合され、好ましくは前記重合体が修飾された、反応性基を持つ重合体であることにより、前記重合体は前記反応性基の活性化により前記GLP-1受容体作動薬及び前記グルカゴン受容体作動薬と複合され、より好ましくは前記反応性基がマレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、ジスルフィド結合、メルカプト基、アルデヒド基、カルボニル基、O-置換ヒドロキシルアミノ、活性エステル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、及び他の高い化学的反応性を持つ基から選択される、請求項27に記載の複合体。
【請求項３０】
PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、及びPB-720から選択される、請求項27に記載の複合体。
【請求項３１】
請求項1〜25のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項26〜30のいずれか１項に記載の複合体、及び含まれてもよい取扱説明書を含む、キット。
【請求項３２】
請求項1〜25のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項26〜30のいずれか１項に記載の複合体の、非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療、抗肥満、及び/又は脂質降下、血糖降下に用いられる薬物の調製における用途。
【請求項３３】
請求項1〜25のいずれか１項に記載の組成物、又は請求項26〜30のいずれか１項に記載の複合体の、対象の食欲抑制、血清総コレステロール含有量の低下、及び/又は肝臓内トリグリセリド含有量の低下に用いられる薬物の調製における用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2015年12月29日に中国特許庁へ提出された、発明の名称「GLP-1受容体作動薬とグルカゴン受容体作動薬とを含む組成物、及びその用途」である中国特許出願201511017796.2に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は薬物分野に属する。特に、本発明はGLP-1受容体作動薬及びグルカゴン受容体作動薬を含む組成物及びその抗肥満及び/又は脂質降下のための用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年の経済発展に伴う食生活・生活習慣の変化により、肥満者の割合は年々増加している。世界保健機関（WHO）の最新統計によると、世界の肥満人口と過体重人口は、1980年の8.57億人から2013年の21億人に急増し、世界の人口の約3分の1を占めた。2014年に18歳以上の成人のうち、19億人以上が過体重であり、中でも、6億人が肥満であった。2014年に18歳以上の成人の39％が過体重で、13％が肥満であった。かつては高所得国の問題と見なされていた過体重・肥満は、現在、低中所得国で増加傾向にある。過体重・肥満は、血圧を上昇させ、血中コレステロール値を増加させ、糖尿病、心血管疾患、および癌を含む若干の慢性疾患の主要な危険因子である。
生活習慣への介入（適度な運動と健康的な食事）は、しばしば肥満の発症を完全に制御できない。この場合は、薬物介入は適切かつ必要と考えられる。オルリスタットは世界で唯一のOTC抗肥満薬であり、世界中で4,000万人以上が服用し、体重減少に成功し、現在、ベストセラーの抗肥満薬である。オルリスタットは、強力で特異的な長時間作用型胃腸リパーゼ阻害薬であり、食事から摂取した脂肪の吸収を直接に遮断することにより、摂取されたカロリー及び脂肪が消費エネルギーより低くなると、体脂肪は自然に減少して、体重減少が達成される。但し、オルリスタットは、様々な欠点があり、例えば、一部の人たちに対する体重減少効果は顕著でなく、また、毎日、食事中や食後に服用する必要があり、ペイシェント・コンプライアンスが悪い。しかも、それは安全性についても危険がある。アメリカ食品医薬品局（FDA）は2010年5月にオルリスタット（orlistat）による重篤な肝障害のリスクの可能性があると警告している。従って、他のメカニズムの新しい抗肥満薬を開発する必要がある。
グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）は、食後に腸のL細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンであり、すい臓β細胞を刺激してインスリンを分泌させることで、食後血糖値の変動を安定させる。GLP-1の外因性投与は、2型糖尿病の患者の血糖値を正常化する。GLP-1による血糖値を低下させる作用はグルコース濃度依存性があるので、血糖値を調節するとともに、低血糖のリスクを大幅に低減させる。GLP-1に基づく薬物としては、例えば、Byetta、Victoza、Albiglutide、及びDulaglutideが挙げられ、近年では、これらは市場に出回っており、糖尿病薬の中で徐々に重要な位置を占めてきている。
臨床的応用において、GLP-1類薬物は血糖値を下げながら体重を減らす効果があることが発見され、このメカニズムは、GLP-1が胃腸管に作用して胃内容物の排出および腸運動を遅延させること、並びに、GLP-1が中枢神経系に作用して食欲を抑制し、満腹感を増することにより、食事摂取を減少させる目的を達成することである可能性がある。ノボノルディスクファーマ株式会社製のVictozaは、さらに2014年に肥満症治療薬としての適応症の追加が承認された。但し、半減期が短いために、Victozaで治療された患者は1日1回注射する必要があり、長期適用患者の苦痛を増す。
【０００４】
グルカゴンは、29個のアミノ酸からなるペプチドであり、プレプログルカゴンの53〜81番目のアミノ酸に相当する、配列His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr（配列番号2）を持つ。オキシントモジュリン（Oxyntomodulin、単にOXMと呼ばれる）は、37個のアミノ酸からなるペプチドであり、オクタペプチドカルボキシ末端伸長（プレプログルカゴンの82〜89番目アミノ酸）を伴うグルカゴンの完全29アミノ酸配列を含む。メルク（Merck）株式会社とZealand社はいずれも抗肥満・血糖降下に用いられるためにオキシントモジュリンの誘導体を開発している。メルク株式会社によって開発された抗肥満用デュアル作動薬ポリペプチド項目はすでに第Ｉ相臨床試験段階に入り、Zealand社のzp2929は、まだ前臨床試験段階にある。
オキシントモジュリンの抗肥満における応用には魅力的な見通しが立っているが、未だ欠点がある。例えば、ヒト血漿中のオキシントモジュリンの半減期は非常に短く（8〜12分）、デュアル受容体作動薬としては、その活性が悪く、両方の受容体を活性化する能力は、いずれもプロペプチドよりも遥かに低いので、人体への投与量はmg/kgのレベルにする必要がある。しかも、オキシントモジュリンは、両方の受容体に対する作動活性は、その割合が固定されており、調節できなく、かかる割合が必ずしも抗肥満効果を発揮するのに最適な割合ではない。従って、これらの問題に対して薬物設計を最適化する方法は、多くの医薬品R＆D従事者にとって最も重要な問題となる。
Exendin-4は、アメリカドクトカゲの唾液から単離された、39個のアミノ酸を含むポリペプチド配列であり、GLP-1と53％の同一性を有する。研究により、Exendin-4は同様にGLP-1受容体に結合することができ、GLP-1と薬理学的に類似の活性化作用を示すことが示された。
非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）とは、アルコールその他の原因が明確な肝障害以外による肝細胞中の過剰な脂肪蓄積を主な特徴とする臨床病理学的症候群であり、インスリン抵抗性及び疾患感受性遺伝子と密接に関連している後天性代謝ストレス性肝障害をいう。中でも、単純な脂肪肝（SFL）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）及びその関連する肝硬変を含む。肥満及びその関連するメタボリックシンドロームのグローバル化が進んでいるとともに、非アルコール性脂肪性肝疾患は、欧米などの先進国、中国の豊かな地域で慢性肝疾患の重要な原因となっている。普通の成人のNAFLDの罹患率は10％〜30％であり、そのうち10％〜20％がNASHであり、後者の肝硬変の発生率は10年以内に25％と高い。非アルコール性脂肪性肝疾患は、代償性肝硬変、肝細胞癌、および肝臓移植後再発に直接つながることに加えて、他の慢性肝疾患の進行にも影響し、2型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症の発症に関与する。メタボリックシンドロームに関連する悪性腫瘍、動脈硬化性の心臓血管および脳血管疾患、および肝硬変は、非アルコール性脂肪性肝疾患の患者の生活の質および平均余命に影響する重要な因子である。このため、非アルコール性脂肪性肝疾患は現代医学の新たな挑戦であり、近い将来、非アルコール性脂肪性肝疾患によってヒトの健康に対する危害が増え続ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、研究において、親水性ポリマー修飾のGLP-1受容体作動薬と親水性ポリマー修飾のグルカゴン受容体作動薬を同時に使用することにより、両方が結合されているか、独立して存在しているかにかかわらず、いずれも単一のGLP-1受容体作動薬よりもはるかに優れた結果（例えば、抗肥満）を示し、また、より高い活性を達成するとともに、in vivoでの半減期を大幅に延長し、投与頻度を減少させる。特に、本発明の技術案では、体重を低下させることに加えて、肥満動物の脂肪代謝異常の症状を改善し、長期投与後の動物のin vivoでの血清・肝臓トリグリセリド、及び血清総コレステロールの含有量を顕著に低下させることができることが予期せずに見出された。非アルコール性脂肪肝の治療のための新しい可能性を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一側面では、本発明は、有効薬物量のGLP-1受容体作動薬及びグルカゴン受容体作動薬を含む薬物組成物において、上記GLP-1受容体作動薬及び上記グルカゴン受容体作動薬は、それぞれ独立に親水性ポリマーと複合体（conjugates）を形成するか、又は上記GLP-1受容体作動薬及び上記グルカゴン受容体作動薬はともに親水性ポリマーと複合体を形成する薬物組成物を提供する。本発明の薬物組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含むことができる。
幾つかの実施形態において、本発明の薬物組成物は、非アルコール性脂肪性肝疾患、抗肥満、及び/又は脂質降下の予防又は治療に用いられる。他の実施形態において、本発明の薬物組成物は、対象の食欲抑制、血清総コレステロール含有量の低下、及び/又は肝臓内トリグリセリド含有量の低減の低下に用いられることができる。
幾つかの実施形態において、本発明の薬物組成物は、上記GLP-1受容体作動薬と上記グルカゴン受容体作動薬とが1個の親水性ポリマーを介して共有結合で結合されて複合体を形成する。
【０００７】
幾つかの実施形態において、本発明における薬物組成物は、上記親水性ポリマーの分子量が2kDa〜60kDa、5kDa〜50kDa、好ましくは10kDa〜40kDa、より好ましくは20kDa〜40kDa、特に好ましくは15kDa〜30kDa、特により好ましくは21kDa〜29kDaである。特に、上記ポリマー（例えば、PEG）の分子量は約2kDa〜約50kDa、好ましくは約3kDa〜約40kDa、より好ましくは約4kDa〜約35kDa、さらに好ましくは約5kDa〜約30kDa、例えば、約5kDa、約10kDa、約15kDa、約20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、約25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、約30kDa、約35kDa、約40kDa、約45kDa、及び上記各分子量値の間の任意の値である。
幾つかの実施形態において、上記GLP-1受容体作動薬は、Exendin-4、Exendin-3、及びGLP-1から選択される。特に、上記GLP-1受容体作動薬は、PB-105（例えば、配列番号1に示される配列を持つ）から選択される。
幾つかの実施形態において、上記グルカゴン受容体作動薬は、グルカゴンである。特に、上記グルカゴンは、PB-702（例えば、配列番号3に示される配列を持ち、且つ12番目のリシンの側鎖のアミノ基にアミド結合によってシステイン残基が連結されている）、PB-703（例えば、配列番号4に示される配列を持ち、即ち、24番目のグルタミンはシステインに置換されている）、PB-740（例えば、配列番号5に示される配列を持ち、即ち、29番目のアミノ酸の後に1個のシステイン残基が付加している）、又はPB-741（例えば、配列番号6に示される配列を持ち、且つ24番目のグルタミンの側鎖「-CO-NH2」は「-CO-NH-CH2CH2-SH」に修飾されている）である。
【０００８】
幾つかの実施形態において、上記グルカゴンの配列は、野生型グルカゴン配列よりも、1つまたは複数の部位においてさらに修飾されている。特に、上記修飾は、リシン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、又はアスパラギンの側鎖にカップリングに用いられる官能基（例えば、メルカプト基、アジド基、マレイミド基、アミノ基、アルキニル基、ビニルスルホン基、ハロゲン、又はアルデヒド基）を導入し、例えば、配列番号2の12番目のリシンの側鎖にシステインが付加し、配列番号2の12番目のリシンの側鎖にメルカプト酢酸が付加し、配列番号2の12番目のリシンの側鎖にメルカプトプロピオン酸が付加し、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にメルカプトエチルが付加し、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にメルカプトプロピルが付加し、並びに、配列番号2の24番目のグルタミンの側鎖にメルカプトプロピオン酸が付加している。それ以外、又はそれに代えて、上記修飾は、システイン付加若しくは置換であり、例えば、配列番号2の24番目のグルタミンがシステインに置換され、配列番号2の12番目のリシンがシステインに置換され、及び/又は配列番号2の29番目のアミノ酸の後にシステインが付加している。
幾つかの実施形態において、上記親水性ポリマーは、多糖、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、マレイン酸アクリル酸共重合体、ポリエステル、ポリアセタール、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリイミノカーボネート、ポリアミド、ビニルエーテル無水マレイン酸共重合体、スチレン無水マレイン酸共重合体、及びこれらの重合体からなる共重合体である重合体から選択される。特に、上記親水性ポリマーは、ポリアルキレングリコールから選択され、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）である。
幾つかの実施形態において、上記GLP-1受容体作動薬と上記グルカゴン受容体作動薬のモル比は、1：0.001〜1：1000、好ましくは1：0.01〜1：100、より好ましくは1：0.03〜1：50、最も好ましくは1：0.1〜1：30、特に好ましくは1：0.5〜1：20、特により好ましくは1：1〜1：10であり、例えば、1：0.1、1：0.2、1：0.3、1：0.4、1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8、1：0.9、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、及び上記の各比の間の任意値である。
【０００９】
他の側面において、本発明は、PEG化されたGLP-1受容体作動薬及びPEG化されたグルカゴン受容体作動薬を含む薬物組成物を提供する。特に、上記PEG化されたGLP-1受容体作動薬は、PB-119、PB-120、及びPB-107から選択され、上記PEG化されたグルカゴン受容体作動薬はPB-707、PB-708、PB-709、PB-713、PB-721、及びPB-722から選択される。
更に他の側面において、本発明は、GLP-1受容体作動薬及びグルカゴン受容体作動薬を含む複合体において、上記GLP-1受容体作動薬と上記グルカゴン受容体作動薬とが親水性ポリマーを介して複合体を形成する。
本発明の複合体は、GLP-1受容体作動薬及び/又はグルカゴン受容体作動薬は、親水性ポリマーと直接に、若しくはリンカーを介して複合され、好ましくは、システインのメルカプト基、又は他のアミノ酸のメルカプト基を介して複合される。
【００１０】
更に他の側面において、本発明は、一般式：X1-Z1-Y-Z2-X2（ここで、X1は、GLP-1受容体作動薬を示し、X2は、グルカゴン受容体作動薬を示し、Yは、親水性ポリマーを示し、Z1は、第1のリンカーを示し、Z2は、第2のリンカーを示す。）で表される複合体を提供する。特に、本発明は、式Exendin-4-Z1-PEG-Z2-グルカゴンで表される複合体、例えば、式PB105-PEG-PB703で表される複合体（例えば、PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、PB-720）を提供する。
本発明において、上記リンカー、上記第1のリンカー及び/又は上記第2のリンカーは、それぞれ独立に反応性基（例えば、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、ジスルフィド結合、メルカプト基、アルデヒド基、カルボニル基、O-置換ヒドロキシルアミノ基、活性エステル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、又は他の高い化学的反応性を持つ基）の活性化された基を含む。より好ましくは、上記反応性基は、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、及びジスルフィド結合から選択される。
本発明において、上記リンカー、上記第1のリンカー及び/又は上記第2のリンカーは、それぞれ独立に活性化された反応性基（例えば、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、ジスルフィド結合、メルカプト基、アルデヒド基、カルボニル基、O-置換ヒドロキシルアミノ基、活性エステル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、又は他の高い化学的反応性を持つ基）を含む。より好ましくは、上記反応性基は、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、及びジスルフィド結合から選択される。
【００１１】
幾つかの実施形態において、上記親水性ポリマーが活性化されたものであることにより、上記GLP-1受容体作動薬及び上記グルカゴン受容体作動薬と複合され、好ましくは、上記重合体は修飾された、反応性基を持つ重合体であり、これにより、上記重合体は上記反応性基の活性化により上記GLP-1受容体作動薬及び上記グルカゴン受容体作動薬と複合され、より好ましくは、上記反応性基は、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、ジスルフィド結合、メルカプト基、アルデヒド基、カルボニル基、O-置換ヒドロキシルアミノ、活性エステル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、及び他の高い化学的反応性を持つ基から選択される。
他の側面において、本発明は、PB-721とPB-119の組み合わせ、PB-722とPB-119の組み合わせ、及びPB-708とPB-120の組み合わせから選択されるもの、又は、PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、及びPB-720から選択されるもの、を含む薬物組成物を提供する。具体的には、PB-119、PB-120、PB-707、PB-708、PB-709、PB-713、PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、PB-720、PB-721、PB-722の構造は表1に示される。
更に他の側面において、本発明は、本発明にかかる薬物組成物又は複合体、及び含まれてもよい取扱説明書を含むキットを提供する。
【００１２】
更に他の側面において、本発明は、本発明にかかる組成物又は本発明にかかる複合体の非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療、抗肥満、及び/又は脂質降下のための薬物の調製における応用を提供する。
更に他の側面において、本発明は、本発明にかかる組成物又は本発明にかかる複合体の対象の食欲抑制、血清総コレステロール含有量の低下、及び/又は肝臓内トリグリセリド含有量の低下のための薬物の調製における応用を提供する。
更に他の側面において、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療、抗肥満、及び/又は脂質降下のために用いられる上記のような組成物又は複合体を提供する。
【００１３】
更に他の側面において、本発明は、対象の食欲抑制、血清総コレステロール含有量の低下、及び/又は肝臓内トリグリセリド含有量の低下に用いられる上記のような組成物又は複合体を提供する。
更に他の側面において、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患の予防又は治療、抗肥満、及び/又は脂質降下に用いられる方法において、このような必要がある対象に本発明にかかる組成物又は複合体を投与することを含む方法を提供する。
更に他の態様では、本発明は、対象の食欲抑制、血清総コレステロール含有量の低下、及び/又は肝臓内トリグリセリド含有量の低下に用いられる方法において、本発明にかかる組成物又は複合体を投与することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明者は、さらに、本発明にかかる組成物と複合体は所望の効果を維持するために必要な投薬頻度を大幅に低減させることも予期せずに見出した。いくつかの実施形態において、本発明にかかる複合体は、上記対象に、少なくとも30日ごとに、少なくとも25日ごとに、少なくとも20日ごとに、少なくとも15日ごとに、少なくとも10日ごとに、少なくとも9日ごとに、少なくとも8日ごとに、少なくとも7日ごとに、少なくとも6日ごとに、少なくとも5日ごとに、少なくとも4日ごとに、少なくとも3日ごとに、少なくとも2日ごとに、少なくとも1日ごとに1回投与される。いくつかの実施形態において、本発明にかかる複合体は、上記対象に、多くとも30日ごとに、多くとも25日ごとに、多くとも20日ごとに、多くとも15日ごとに、多くとも10日ごとに、多くとも9日ごとに、多くとも8日ごとに、多くとも7日ごとに、多くとも6日ごとに、多くとも5日ごとに、多くとも4日ごとに、多くとも3日ごとに、多くとも2日ごとに、多くとも1日ごとに1回投与される。
本発明にかかる組成物と複合体は投薬頻度を大幅に低減させ、対象の服薬コンプライアンスを向上させている。
本発明にかかる組成物と複合体は、体重増加を防止する、または体重減少を促進するために用いられる。「防止」とは、治療していない場合と比較して、体重増加を抑制または減少させることであり、必ずしも体重増加の完全な停止を意味しない。本発明にかかる組成物と複合体は、食事摂取量の減少、及び/又はエネルギー消費の増加を引き起こすことができるために、体重に対する予測可能な作用をもたらす。本発明にかかる組成物と複合体は、体重に対する作用に依存せずに、グルコース耐性・循環コレステロールレベルに有益な作用（例えば、循環LDLレベルを低下させ、HDL/LDL比を上昇させることができる）を有することができる。従って、本発明の化合物は、過剰体重に起因するか、若しくは過剰体重によって特徴付けられるいかなる病症を直接的又は間接的に治療するために用いられ、例えば、肥満症、病的肥満症、肥満関連炎症、肥満関連胆嚢疾患、肥満誘発睡眠時無呼吸症群の治療及び/又は予防ために用いられる。本発明にかかる組成物及び複合体は、代謝症候群、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、2型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化脂質異常症（atherogenic dyslipidimia）、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、冠動脈疾患、又は脳卒中を治療するためにも用いられる。本発明にかかる組成物及び複合体のこれらの疾病における作用は、それらの体重に対する作用に起因するか、若しくはそれに関連するか、若しくはそれらの体重に対する作用に依存しない可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】PB-716の精製プロファイルを示す。
【図２】PB-717の精製プロファイルを示す。
【図３】PB-718の精製プロファイルを示す。
【図４】PB-719の精製プロファイルを示す。
【図５】PB-720の精製プロファイルを示す。
【図６】PB-716シリーズ化合物の単回投与のDIOマウスの体重に対する影響を示す。
【図７】PB-716シリーズ化合物の連続投与のDIOマウスの累積食事摂取に対する影響を示す。
【図８】14日連続投与後のモデル対照群に対する投与各群の累積食事摂取量の減少率を示す。
【図９】PB-716シリーズ化合物の連続投与のDIOマウスの体重に対する影響を示す。
【図１０】PB-716シリーズ化合物の連続投与後のDIOマウスの体重減少率を示す。
【図１１】PB-716シリーズ化合物の長期投与のDIOマウスのランダム血糖に対する影響を示す。
【図１２】化合物PB-718、PB-119、及び配合剤（PB-708+PB-120）の連続投与のDIOマウスの体重に対する影響を示す。
【図１３】PB-718、PB-119、及び配合剤（PB-708+PB-120）の連続投与後のDIOマウスの体重減少率を示す。
【図１４】化合物PB-718、PB-119、及び配合剤（PB-708+PB-120）の長期投与のDIOマウスの累積食事摂取に対する影響を示す。
【図１５】14日連続投与後のモデル対照群に対する累積食事摂取量の減少率を示す。
【図１６】PB-718、PB-119、及び配合剤（PB-708+PB-120）の連続投与後のDIOマウスのランダム血糖に対する影響を示す。
【図１７】長期投与のDIOマウスのランダム体重に対する影響を示す。
【図１８】長期投与後のDIOマウスのランダム体重減少率を示す。
【図１９】長期投与のDIOマウスの食事摂取に対する影響を示す。
【図２０】長期投与後のDIOマウスの累積食事摂取量の減少率を示す。
【図２１】長期投与のDIOマウスの血清トリグリセリドレベルに対する影響を示す。
【図２２】長期投与のDIOマウスの肝臓トリグリセリド含有量に対する影響を示す。
【図２３】長期投与のDIOマウスの血清総コレステロール含有量に対する影響を示す。
【図２４】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの体重に対する影響を示す。
【図２５】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの累積食事摂取に対する影響を示す。
【図２６】本発明にかかる組成物の長期投与後の肥満カニクイザルの平均摂食量変化率―投与回数の柱状グラフを示す。
【図２７】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの血清トリグリセリドに対する影響を示す。
【図２８】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの血清グルコースに対する影響を示す。
【図２９】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの血清アラニンアミノ基転移酵素に対する影響を示す。
【図３０】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの腹囲に対する影響を示す。
【図３１】本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザルの脂肪分布に対する影響を示す。
【図３２】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与のDIOマウスの累積食事摂取に対する影響を示す。
【図３３】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のモデル対照群に対する累積食事摂取量の減少率を示す。
【図３４】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与のDIOマウスの体重に対する影響を示す。
【図３５】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のDIOマウスの体重減少率を示す。
【図３６】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のDIOマウスの空腹時血糖減少率を示す。
【図３７】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のDIOマウスの経口ブドウ糖負荷に対する影響を示す。
【図３８】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のマウスの血中グルコース濃度を示す。
【図３９】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のマウス血清インスリンのレベルを示す。
【図４０】配合剤（PB-119+PB-722）の21日連続投与後のマウスのNASH点数評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（定義）
本明細書に用いられる「リンカー」、「第1のリンカー」、「第2のリンカー」などの用語とは、本発明において重合体と生物活性分子とを結合する基、断片、化学結合、又はいずれかの繋がる役割を果たす実体（entity）をいう。本発明において、上記リンカーは、活性化基（例えば、マレイミド基、ハロゲン、ビニルスルホン基、ジスルフィド結合、メルカプト基、アルデヒド基、カルボニル基、O-置換ヒドロキシルアミノ、活性エステル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、又は他の高い化学的反応性を持つ基）を含んでもよく、例えば、MAL、ppMALなどが挙げられる。
本明細書にかかる「ポリエチレングリコール」は、当業者によって一般的に理解されている意味を有し、特に断らない限り、ポリエチレングリコール（構造の異なる、直鎖状、分枝鎖状、星状などの分岐構造を含む）それ自体、およびそれらの末端修飾された誘導体を含む。例えば、上記PEGは、メトキシポリエチレングリコール（mPEG）である。本明細書において、特に断らない限り、上記ポリエチレングリコール（PEG）は、末端基がヒドロキシル基であるタイプを含み、さらに末端が他の基であるタイプも含む。上記他の基はアルコキシ基、シクロアルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アルケニル基、アリールオキシ基、又はアラルキルオキシ基を含むが、これらに限定されない。これらのPEG分子タイプは、いずれも従来技術で公知であり、且つポリペプチド修飾に一般的に使用されるものである。PEG側鎖は、直鎖状、分枝鎖状、分岐状、または複数のアームからなるものであってもよく、異なるポリエチレングリコールは異なる高分子鎖の長さおよび重合構造を有することができる。
本明細書にかかる「複合体」とは、生物活性を持つ分子（例えば、GLP-1受容体作動薬、及びグルカゴン受容体作動薬）がポリエチレングリコール分子と直接的に、若しくはリンカーを介して共有結合で結合された生成物をいう。
【００１７】
なお、重合体、例えばポリエチレングリコールについては、その分子量を複数種の方法により測定することができる。重合体は、一定の分布範囲内の異なる重合度の分子からなり、一般に平均分子量で重合体の分子量を表す。具体的には、数平均分子量であってもよく、重量平均分子量であってもよい。重合体は重合度が大きく異なる場合には、数平均分子量と重量平均分子量にいくらかの偏差が存在することがあるが、分布範囲の狭い重合体ついては、両方が等しくなる傾向がある。本明細書にかかる重合体、例えば、ポリエチレングリコールは、その分子量に関しては、重量平均分子量であってもよく、数平均分子量であってもよく、好ましくは数平均分子量である。
本明細書に記載の「GLP-1受容体作動薬」とは、GLP-1受容体に対する作動作用を持つ物質をいい、例えば、野生型GLP-1及びその変異体（例えば、GLP-1-（7-37）、及びGLP-1-（7-36）アミド）、野生型exendin-4及びその変異体、野生型exendin-3及びその変異体である。幾つかの実施形態において、本発明にかかるGLP-1受容体作動薬と親水性重合体とで形成された複合体は長時間作用する。他の実施形態において、本発明にかかるGLP-1受容体作動薬及びグルカゴン受容体作動薬と親水性重合体とで形成された複合体は長時間作用する。
本明細書に記載された「グルカゴン受容体作動薬」とは、グルカゴン受容体に対する作動作用を持つ物質をいい、例えば、野生型グルカゴン及びその変異体である。例えば、上記グルカゴンは、PB-702（例えば、配列番号3に表される配列を有し、且つ12番目のリシン側鎖のアミノ基にアミド結合によってシステイン残基が連結されている）、PB-703（例えば、配列番号4に表される配列を有し、即ち、24番目のグルタミンがシステインに置換されている）、PB-740（例えば、配列番号5に表される配列を有し、即ち、29番目のアミノ酸の後に1個のシステイン残基が付加している）、又はPB-741（例えば、配列番号6に表される配列を有し、且つ24番目のグルタミンの側鎖「-CO-NH2」は「-CO-NH-CH2CH2-SH」に修飾されている）。幾つかの実施形態において、本発明にかかるグルカゴン受容体作動薬と親水性重合体とで形成された複合体は長時間作用する。
【００１８】
本明細書に記載の「Exendin-4」とは、毒トカゲの唾液の分泌物に発見されたポリペプチド（J.Biol.Chem,265,20259-20262,1990；J.Biol.Chem,267,7402-7405,1992）、及び基本的にGLP-1受容体に対する作動作用を保持しているその変異体をいう。野生型Exendin-4はGLP-1（7-36）と高い同一性（53％）があり、その配列は、His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、配列番号7）である。
本明細書に記載の「グルカゴン」とは、プレプログルカゴンの53〜81番目のアミノ酸に相当するポリペプチド（配列番号2に表される配列を有し、即ち、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thrである）、及び基本的にグルカゴン受容体に対する作動作用を保持しているその変異体をいう。
本明細書に用いられる「長時間作用」の用語とは、受容体作動薬に用いられる場合には、その投与頻度として、多くとも1日1回であり、好ましくは、数日、例えば、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、15日、20日、25日、30日、40日、50日、又はそれ以上である。
【００１９】
例えば、「含む」、「含有」及び「持つ」といった用語は、限定することを意図するものではない。なお、特に断らない限り、数詞で修飾されていない場合に複数形を含み、「又は」、「若しくは」とは、「及び/又は」を意味する。本明細書中で別途に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語・科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書に記載の「変異体」と「機能性変異体」とは互換可能に使用でき、修飾若しくは改変された生物学分子をいい、好ましくはかかる変異体がその生物学的活性を維持していることを意味する。例えば、ポリペプチドの「変異体」とは、1または数個の置換、欠如、挿入、融合、切断、又はそれらの任意組み合わせによりアミノ酸配列が異なるポリペプチドをいう。変異体ポリペプチドは、完全機能性であるか、又は1種以上の活性が欠乏していてもよい。完全機能性変異体は、例えば、保守的改変のみ、又は鍵残基ではない改変や鍵領域ではない改変を含んでもよい。機能性変異体は、類似しているアミノ酸の置換を含んでもよく、それは、機能が改変しない、又は著しく改変しないことをもたらす。
別途に定義されない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。該分野にかかる定義及び用語については、当業者は具体的にCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel）を参考にすることができる。アミノ酸残基の略号は、該分野に用いられる、20種の一般的に使用されるL-アミノ酸の1つを指す標準的な3文字および/または1文字記号である。
【００２０】
本明細書に用いられる「薬物組成物」の用語とは、ある特定の目的を達成するために一緒に組み合わされた、少なくとも1種の薬物と、含まれてもよい薬学的に許容される担体または賦形剤との組み合わせを意味する。ある実施形態において、上記薬物組成物には、本発明の目的を達成するために一緒に働くことができる限り、時間および/または空間において別々の組み合わせを含む。例えば、上記薬物組成物に含まれる成分（例えば、本発明にかかる複合体）は全体として対象に投与され、若しくは別々に分けられて対象に投与されることができる。上記薬物組成物に含まれる成分が別々に分けられて対象に投与される場合には、上記成分は、同時又は順に対象に投与されることができる。好ましくは、上記薬学的に許容される担体が水、緩衝溶液、PBS（リン酸塩緩衝液）のような等張塩溶液、グルコース、マンニトール、D-グルコース、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、0.3％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリプロピレングリコール、トリグリセリドなどのポリアルキレングリコールである。用いられた薬学的に許容される担体のタイプは、特に、本発明にかかる組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内、又は静脈内投与用に製剤化されているか否かに依存する。本発明にかかる組成物は、添加剤として、湿潤剤、乳化剤、又は緩衝剤を含んでもよい。
本発明の薬物組成物は、いずれかの適当な投与経路（例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内投与が可能である。）で投与することができる。
本明細書に用いられる「有効薬物量」、「有効量」とは、投与された対象に対する有益な効果を示すのに十分な投与量を意味する。投与される実際量、投与速度、及び時間経過は、治療される患者自身の状態、及び重症度に依存する。治療の処方（例えば、投与量に対する決定など）は、最終的に一般開業医および他の医師の責任であり、それに依存して決定を下し、治療される疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および医者に知られている他の因子が一般に考慮される。
【００２１】
本明細書に用いられる「対象」の用語とは、ヒトのような哺乳動物をいうが、例えば、野生動物（例えば、アオサギ、コウノトリ、鶴など）、家畜（例えば、アヒル、ガチョウなど）、又は実験動物（例えば、オランウータン、猿、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、マーモット、ジリスなど）のような他の動物でもよい。
本発明の広義の範囲に示された数値範囲およびパラメータは近似値を含むが、具体的な実施例に示される数値は可能な限り正確に記録される。しかしながら、数値は本質的に、それぞれの測定において存在する標準偏差による一定の誤差を含まなければならない。また、本明細書に開示されるすべての範囲は、その中に含まれるいずれか、及びすべてのサブレンジを含むものと理解されるべきである。例えば、記載された「1〜10」という範囲は、最小値1と最大値10の間（端点を含む）のいずれか、及び全てのサブレンジを含むものと理解されるべきであり、言い換えれば、最小値である1以上の数値から始まる全てのサブレンジ（例えば、1〜6.1）、及び最大値である10以下の数値で終わるサブレンジ（例えば、5.5〜10）と理解されるべきである。また、「本明細書に組み込まれる」と言及されるいかなる参考文献は、その全体として組み込まれると理解されるべきである。
【００２２】
なお、本明細書で使用された単数形は、明らかに1個の対象に限定されない限り、その対応する対象の複数形を含むことに留意すべきである。「または」という用語は、文脈上他に明白に指示されない限り、「および/または」という用語と互換的に使用することができる。
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態および態様を証明し、さらに説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００２３】
【表１】
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【実施例】
【００２４】
（実施例1：PB-119（PB-105とmPEG-ppMAL-23KDの複合体）の調製）
10mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と65mgのmPEG23KD-ppMAL（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-105とPEGのモル比は1：1.2である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）で過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl 、pH4.0）によってカラム体積の10倍量で、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００２５】
（実施例2：PB-120（PB-105とmPEG-ppMAL-25KDの複合体）の調製）
10mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と72mgのmPEG25KD-ppMAL（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-105とPEGのモル比は1：1.2である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によって過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の10倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００２６】
（実施例3：PB-107（PB-105とmPEG-ppMAL-30KDの複合体）の調製）
10mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と86mgのmPEG30KD-ppMAL（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-105とPEGのモル比は1：1.2である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH4.0）で過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0  ）によってカラム体積の10倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００２７】
（実施例4：PB-707（PB-703とmPEG-ppMAL-23KDの複合体）の調製）
10mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と100mgのmPEG-ppMAL-23KD（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-703とPEGのモル比は1：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によって過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の15倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００２８】
（実施例5：PB-708（PB-703とmPEG-ppMAL-25KDの複合体）の調製）
10mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と110mgのmPEG-ppMAL-25KD（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-703とPEGのモル比は1：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mMのHAc-NaAc、pH 4.0）によって過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM   HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の15倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００２９】
（実施例6：PB-709（PB-703とmPEG-ppMAL-30KDの複合体）の調製）
10mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と130mgのmPEG-ppMAL-30KD（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-703とPEGのモル比は1：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）で過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM   HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の15倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを続きの薬力学試験に供した。
【００３０】
（実施例7：PB-713（PB-703とmPEG-ppMAL-40KDの複合体）の調製）
10mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）と175mgのmPEG-ppMAL-40KD（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-703とPEGのモル比は1：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）で過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の15倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００３１】
（実施例8：PB-721（PB-740とmPEG-ppMAL-23KDの複合体）の調製）
10mgのPB-740（チャイニーズ ペプチド カンパニーから購入）と96mgのmPEG-ppMAL-23KD（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PB-740とPEGのモル比は1：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によって過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の15倍量で溶出し、30％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００３２】
（実施例9：PB-722（PB-741とmPEG-ppMAL-23KDの複合体）の調製）
10mgのPB-741（チャイニーズ ペプチド カンパニーから購入）と97mgのmPEG-ppMAL-23KD（派格生物医薬公司製）を100mLガラス瓶に秤量し（PB-741とPEGのモル比は1：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）5mlで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化した10mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によって過剰なPEGを溶出し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の15倍量で溶出し、300％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。
【００３３】
（実施例10：PB-716（PB-703とPB-105とPEG-（ppMAL）2-40KDの複合体）の調製）
20mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、21mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、及び158.6mgのPEG-（ppMAL）2-40KD（派格生物医薬公司製）を50mLガラス瓶に秤量し（PEG：PB-105：PB-703の仕込みモル比は1：1.2：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）10mLで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（HAc-NaAc、20mM 、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化された20mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の30倍量で溶出し、40％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの目的物の画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。PB-716の精製プロファイルを図1に示す。
【００３４】
（実施例11：PB-717（PB-703とPB-105とPEG-（ppMAL）2-30KDの複合体）の調製）
20mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、21mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、及び119mgのPEG-（ppMAL）2-30KD（派格生物医薬公司製）を100mLガラス瓶に秤量し（PEG：PB-105：PB-703の仕込みモル比は1：1.2：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）10mLで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化された20mL Macrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（HAc-NaAc、20mM、 pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化させ、その後、溶出液B（20mM   HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の30倍量で溶出し、40％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの目的物の画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。PB-717の精製プロファイルを図2に示す。
【００３５】
（実施例12：PB-718（PB-703とPB-105とPEG-（ppMAL）2-25KDの複合体）の調製）
20mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、21mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、及び99mgのPEG-（ppMAL）2-25KD（派格生物医薬公司製）を100mLガラス瓶に秤量し（PEG：PB-105：PB-703の仕込みモル比は1：1.2：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）10mLで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化させた20mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の30倍量で溶出し、40％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの目的物の画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。PB-718の精製プロファイルを図3に示す。
【００３６】
（実施例13：PB-719（PB-703とPB-105とPEG-（ppMAL）2-20KDの複合体）の調製）
20mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、21mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、及び79.3mgのPEG-（ppMAL）2-20KD（派格生物医薬公司製）を100mLガラス瓶に秤量し（PEG：PB-105：PB-703の仕込みモル比は1：1.2：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）10mLで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化させた20mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化し、その後、溶出液B（20mM   HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の30倍量で溶出し、40％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの目的物の画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。PB-719の精製プロファイルを図4に示す。
【００３７】
（実施例14：PB-720（PB-703とPB-105とPEG-（ppMAL）2-10KDの複合体）の調製）
20mgのPB-105（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、21mgのPB-703（成都凱捷生物医薬技術発展有限公司から購入）、及び39.7mgのPEG-（ppMAL）2-10KD（派格生物医薬公司製）を100mLガラス瓶に秤量し（PEG：PB-105：PB-703の仕込みモル比は1：1.2：1.5である）、PBS緩衝液（0.2M、pH6.5）10mLで溶解し、室温（25℃）で撹拌しながら1時間反応させ、塩酸でpH4.0に調整して反応を終了し、4℃で放置して精製し、用意した。
上記反応液を超純水で5倍希釈した後、酢酸でpH4.0に調節し、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化させた20mLのMacrocap  SPの陽イオン交換クロマトグラフィ用カラムにサンプルをロードした後、緩衝液A（20mM  HAc-NaAc、pH 4.0）によってカラム体積の3〜4倍量で平衡化し、その後、溶出液B（20mM  HAc-NaAc+1M  NaCl、pH4.0）によってカラム体積の30倍量で溶出し、40％までグラジエント溶出し、同体積で溶出ピークを収集し、HPLCにより収集した各画分を分析し、純度95％超えの目的物の画分を混合した後、定量し、サンプルを以後の薬力学試験に供した。PB-720の精製プロファイルを図5に示す。
【００３８】
（実施例15：ペグ化グルカゴンのin vitro EC50）
グルカゴン受容体を安定に発現するHEK293細胞（輝源生物技術（上海）有限公司）を10％FBS（Hyclone）を添加したDMEM（Hyclone）培地で培養し、37℃で放置し、10％CO2のインキュベーターで培養した。細胞をパンクレアチン（Hyclone）により消化し、5×104細胞/100ulの密度で96-ウェルプレートに播種し、16〜24時間培養し、元の培地を捨て、無血清DMEM培地に交換し、4時間培養し続けた。野生型グルカゴン、グルカゴン変異体、及びペグ化グルカゴン（終濃度はそれぞれ100nmol/L、30nmol/L、10nmol/L、3nmol/L、1nmol/L、0.3nmol/L、0.1nmol/L、0.01nmol/Lである）を加えて細胞とともに20minインキュベートし、インキュベーション用培地を捨て、細胞溶解液（cAMP ELISAキットに付け、R&D Systems）を加え、-80℃の冷蔵庫に置いて2回凍結融解して細胞を溶解させ、低温で上清液を遠心回収した。cAMP ELISAキット（R&D Systems）の説明書に基づいて取り扱い、標準曲線を描くことによりサンプルのウェル上清におけるcAMP濃度を測定した。Graphpad Prismソフトウェアを使用してグルカゴン及びその変異体の用量反応曲線を描き、各サンプルの曲線におけるEC50を計算した。
野生型グルカゴン、グルカゴン変異体、及びペグ化グルカゴンは、いずれも細胞レベルで用量依存的にHEK293/グルカゴンR細胞内cAMP含有量を増加させたことが示された。細胞を刺激して放出させたcAMPのEC50値を表2に示す。
【００３９】
【表２】
2019500399.tif 000003
【００４０】
（実施例16：本発明にかかる複合体の長期投与のDIOマウスの抗肥満に対する薬力学試験）
雄性C57BL/6マウス（常州キャヴェンス実験動物有限公司）は、高脂肪飼料（江蘇メディサイエンス生物医薬有限公司、MD12032、45％kcal）で9週間飼育され、同齢の通常飼料（蘇州双獅実験動物飼料技術有限公司、151113）で飼育されたマウスと比較して、体重が20％以上上回っており、肥満（DIO、Diet-induced Obesity）と判定されたモデルの構築に成功した。DIOマウス35匹、体重、ランダム血糖に基づいて群分けをし、7群に分けた。1群あたり5匹とした。それぞれPB-716群（383μg/kg）、PB-717群（383μg/kg）、PB-718 群（383μg/kg）、PB-719群（383μg/kg）、PB-720群（383μg/kg）、Victoza群（200μg/kg）、及びモデル対照群（生理食塩水）（投与量はいずれもペプチド含有量であり）であった。1回目投与後、各群を96時間観察し、その後、2回目投与し、その後の試験では、Victoza群は、1日1回投与し、他の各群は、3日に1回投与した。連続投与試験は合計で14日間行い、試験期間において毎日、マウス体重と食事摂取量を測定し、試験開始前及び終了後でそれぞれランダム血糖を1回測定した。
1回目投与後、各群動物とモデル対照群とを比較すると、体重はいずれも顕著に減少た。これらの結果を図6に示した。投与後48〜96時間で、Victoza群は体重が徐々に戻り、96時間までに該群マウスの体重は対照群の体重と比べて顕著な差がなかった。PB-720群マウスは投与後48〜96時間で体重が基本的に一定に維持され、わずかに戻った。PB-716、PB-717、PB-718、及びPB-719群マウスは、投与後48時間で体重が依然として減少傾向を維持し、投与後72〜96時間で体重はわずかに戻った。対照群と比較して、PB-716、PB-717、PB-718、及びPB-719群は、単回投与の体重に対する低減作用が投与後96時間までに維持でき、PEG化後に、化合物の動物体内の作用時間を大きく延長させることが示された。
連続投与のDIOマウス食事摂取に対する影響を図7に示す。単回投与後96時間観察してから、連続投与試験を開始した。ここで、Victoza群は毎日1回投与し、他の各群は3日に1回投与した。連続投与開始後の14日以内においては、モデル対照群の累積食事摂取量は直線的に上昇する傾向があり、他の各群は対照群よりも食事摂取量がいずれも異なる程度に低減した。14日間連続投与試験終了の時点まで、PB-716群とVictoza群の累積食事摂取量は最も大きく低減され、それぞれ58.67％、50.82％になった。PB-720、PB-719、PB-718、及びPB-717もそれぞれ31.83％、34.88％、48.79％、及び39.63％低減した。図8は14日連続投与後の投与各群の累積食事摂取量のモデル対照群に対する減少率を示す。
【００４１】
連続投与のDIOマウス体重に対する影響を図9及び図10に示す。試験終了後、モデル対照群の体重は投与前よりも10.24％増加しているが、投与各群の体重はいずれも異なる程度に減少した。中でも、PB-716群は最も顕著に減少し、体重が投与前よりも38.03％減少し、モデル対照群より差が統計的に有意である（p＜0.001）。他の各群の体重減少の詳細は、Victoza群で投与前よりも体重が15.83％減少し（p<0.05）、PB-720群で10.21％減少し（p<0.05）、PB-719群で24.73％減少し（p＜0.001）、PB-718群で30.25％減少し（p＜0.001）、PB-717群で28.11％減少している（p＜0.001）。PB-716シリーズ化合物の長期投与はDIOマウス体重に対して顕著な抑制作用があることが示された。
連続投与のDIOマウスのランダム血糖に対する影響を図11に示す。9週間の高脂肪食飼育後、C57BL/6マウスのランダム血糖はある程度向上し、通常飼料飼育群のランダム血糖値の平均値は8.7mmol/Lであるが、高脂肪食飼育群マウスのランダム血糖値の平均値は33.3％上昇し、11.6mmol/Lになった。各群動物への投与後、ランダム血糖値はいずれも顕著に低減し、PB-716群は最も大きく低減し、平均して51.06％低減し（p<0.05）、PB-720、PB-719、PB-718も、それぞれ29.31％、33.40％、及び38.89％低減し、モデル対照群よりも差がいずれも統計的に有意である（p＜0.05）。PB-716シリーズ化合物の長期投与はDIOマウスに対して血糖降下作用があることが示された。
結果として、PB-716シリーズExendin-4・グルカゴンデュアル作動薬複合体はPEG分子と結合していることにより、化合物の動物体内の作用時間を大きく延長させる。PB-716シリーズ化合物の長期投与はDIOマウスの食事摂取に対して顕著な抑制作用があり、顕著にDIOマウスの体重を減少させ、中でも、PB-716の抗肥満效果は最もよいことが示された。
【００４２】
（実施例17：PB-708とPB-120の組み合わせの長期投与のDIOマウスの抗肥満に対する薬力学試験）
雄性C57BL/6マウス（常州キャヴェンス実験動物有限公司）は、高脂肪飼料（江蘇メディサイエンス生物医薬有限公司、MD12032、45％kcal）で12週間飼育され、同齢の通常飼料（蘇州双獅実験動物飼料技術有限公司、151113）で飼育されたマウスと比較して体重が20％以上上回っており、肥満（DIO、Diet-induced Obesity）と判定されたモデルの構築に成功した。DIOマウス35匹は、体重、血糖に基づいて無作為に7群に分け、1群あたり5匹とした。それぞれVictoza群（200μg/kg）、PB-718高用量群（383μg/kg）、PB-718低用量群（153.2μg/kg）、PB-119群（210μg/kg）、PEG-OXM（天然型GLP-1受容体・グルカゴン受容体デュアル作動薬Oxyntomodulinと23KD PEGの複合体）群（222.5μg/kg）、配合剤投与群（172.9μg/kg PB-708+210μg/kg PB-120）、及びモデル対照群（生理食塩水）（投与量はいずれもペプチド含有量であり）である。Victoza群は1日1回投与し、他の各群は2日に1回投与した。連続投与試験は合計で14日間行い、試験期間で、毎日、マウス体重と食事摂取量を測定し、試験開始前及び終了後でそれぞれランダム血糖値を1回測定した。
長期投与のDIOマウス体重に対する影響を図12及び図13に示す。試験終了後、モデル対照群の体重は投与前よりも6.30％増加している一方で、投与各群の体重はいずれも異なる程度に減少した。中でも、Victoza群は投与前よりも体重が15.92％減少し（p<0.05）、PB-119群は13.33％減少し（p＜0.05）、Victoza群の抗肥満效果と類似している。PEG-OXM群が1.34％だけ減少している（p>0.05）ことは、天然型デュアル作動薬OxyntomodulinのグルカゴンとGLP-1受容体に対する作動活性はいずれも弱いためであるかもしれない。配合剤投与群は、体重が投与前よりも24.72％減少し、モデル対照群と比較して差が統計的に有意である（p＜0.001）。PB-718のDIOマウスにおける抗肥満效果は用量相関性を示し、PB-718の低用量群は体重が18.78％減少している（p＜0.001）が、PB-718の高用量群は体重が27.38％減少している（p＜0.001）。実験結果により、グルカゴン・GLP-1受容体に対するデュアル作動薬PB-718、及びグルカゴン受容体作動薬+GLP-1受容体作動薬の配合剤の長期投与はDIOマウスの体重に対して顕著な抑制作用があり、その抗肥満效果はGLP-1受容体作動薬PB-119の単独投与よりも顕著に優れていた。
【００４３】
長期投与のDIOマウスの食事摂取に対する影響を図14及び図15に示す。試験期間で、モデル対照群の累積食事摂取量は直線的に上昇する傾向があり、他の各群は対照群よりも食事摂取量がいすれも異なる程度に減少した。14日間連続投与試験終了の時点で、配合剤群及びPB-718の高用量群は累積食事摂取量が最も大きく低減し、それぞれ43.69％、45.34％になった。PB-718低用量群、PB-119群もそれぞれ34.37％、39.95％低減した。
長期投与のDIOマウスのランダム血糖に対する影響を図16に示す。12週間の高脂肪食飼育後、C57BL/6マウスのランダム血糖はある程度向上し、通常飼料飼育群のランダム血糖値の平均値は8.7mmol/Lである一方で、高脂肪食飼育群マウスのランダム血糖値の平均値は17.3％上昇し、10.2mmol/Lになった。各群動物への投与後、ランダム血糖値はいずれも顕著に低減し、PB-718高用量群、配合剤群、PB-119、及びPB-718低用量群の血糖値はそれぞれ31.61％、31.61％、27.27％、28.30％低減し、モデル対照群と比較して差がいすれも統計的に有意である（p＜0.05）。化合物PB-718の長期投与はDIOマウスに対して一定の血糖降下作用があることが示された。
【００４４】
（実施例18：PB-119とPB-721又はPB-722との組み合わせのDIOマウスの抗肥満に対する薬力学試験）
雄性C57BL/6マウス（常州キャヴェンス実験動物有限公司）は、高脂肪飼料（江蘇メディサイエンス生物医薬有限公司、MD12032、45％kcal）で16週間飼育され、同齢の通常飼料（蘇州双獅実験動物飼料技術有限公司、151113）で飼育されたマウスと比較して体重が20％以上上回っており、肥満（DIO、Diet-induced Obesity）と判定されたモデルの構築に成功した。DIOマウス80匹は、体重、血糖値に基づいて無作為に10群に分け、1群あたり8匹とした。それぞれモデル対照群、PB-119（10nmol/kg）群、PB-721（60nmol/kg）群、PB-722（60nmol/kg）群、PB-722（10nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-722（30nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-722（60nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-722（100nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-722（150nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-721（60nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、及びモデル対照群（生理食塩水）である。各群では、いずれも皮下投与し、2日に1回とした。試験は合計で21日間行い、11回投与した。試験期間中、毎日、動物の体重と食事摂取量を測定し、1日目及び21日目に動物の血糖値を測定し、21日目に動物の血清トリグリセリド、血清総コレステロール、及び肝臓トリグリセリドなどの指標を測定した。
長期投与のDIOマウスの体重に対する影響を図17及び図18に示す。試験期間中、モデル対照群動物の体重は安定している傾向にあり、投与各群の体重はいずれも異なる程度に減少した。投与終了後、モデル対照群動物は体重が投与前よりも0.85％増加し、10nmol/kgのPB-119単独投与群はマウスの体重が14.37％減少し、60nmol/LのPB-721及び60nmol/LのPB-722単独投与後のマウス体重は、それぞれ21.65％、21.95％減少した。同等の用量の配合剤投与群（10nmol/kg  PB-119+60nmol/kg  PB-721）及び（10nmol/kg  PB-119+60nmol/kg  PB-722）ではマウスの体重が、それぞれ47.18％、40.02％減少し、その体重減少率は配合された2つの成分の単独投与による減少率を合せたものを超えた。配合された2つの成分の同時使用はDIOマウスの体重の減少に対して相乗効果があることが示された。
さらに、本発明者は、GLP-1受容体作動薬（即ち、PB-119）とグルカゴン受容体作動薬（即ち、PB-722）のモル比がある一定の範囲にある場合には、抗肥満效果は予想外に良いことを予期せずに見出した。PB-722（60nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-722（100nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群、PB-722（150nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）群のデータを参考にできる。
【００４５】
長期投与のDIOマウスの食事摂取量に対する影響を図19及び図20に示す。PB-119、PB-721、及びPB-722の単独投与はDIOマウスの食欲に対して一定の抑制作用があるが、PB-119とPB-721の併用、又はPB-119とPB-722の併用はDIOマウスの食欲に対して強い抑制作用を生じ、その抑制效果は両方のいずれかの単独投与による抑制效果を合せたものよりも顕著であった。モデル対照群のマウスに対して、10nmol/kg PB-119、60nmol/kg PB-721、及び60nmol/kg PB-722単独投与群は累積食事摂取が、それぞれ25.14％、2.36％、9.11％低減した。10nmol/kgのPB-119と60nmol/kgのPB-721の配合剤投与群は累積食事摂取が61.44％低減している一方で、10nmol/kgのPB-119と60nmol/kgのPB-722の配合剤投与群は累積食事摂取が50.56％低減した。
血清トリグリセリド、血清総コレステロール、及び肝臓トリグリセリドの結果を図21、図22、及び図23に示す。モデル対照群のDIOマウスの総コレステロールと肝臓トリグリセリドのレベルはいずれも顕著に正常対照群より高く、明らかな脂質代謝異常の状態を示した。10nmol/kgのPB-119、60nmol/kgのPB-721、及び60nmol/kgのPB-722の単独長期投与は、DIOマウスの血清トリグリセリドのレベルに対して著しい改善をもたらした。同等の用量のPB-119とPB-721、又はPB-119とPB-722の配合剤投与群はマウスの血清トリグリセリドのレベルはモデル対照群よりも顕著に低減し（p<0.05）、それらの減少率は、それぞれ32.58％、22.83％となった。
DIOマウスの肝臓トリグリセリド含有量は明らかに正常対照マウスより高い（p<0.01）。10nmol/kgのPB-119単独投与群のマウスの肝臓トリグリセリド含有量は、モデル対照群と比較して、12.67％低減し（p>0.05）、60nmol/kgのPB-721、60nmol/kgのPB-722の単独投与群及びそれらの配合剤投与群のマウスの肝臓トリグリセリド含有量は、モデル対照よりも明らかに低減し（p<0.01）、正常対照マウスの肝臓トリグリセリドのレベルに近づき、減少率はそれぞれ73.29％、76.84％、64.47％、及び74.48％となった。
DIOマウスの血清総コレステロール含有量は明らかに正常対照マウス（P<0.001）より高い。10nmol/kgのPB-119、60nmol/kgのPB-721、及び60nmol/kgのPB-722の単独長期投与群のDIOマウスの血清総コレステロール含有量は低減し（p<0.05）、減少率はそれぞれ39.35％、60.86％、及び60.56％となった。同等の用量のPB-119とPB-721、又はPB-119とPB-722の配合剤投与群のマウスの血清総コレステロール含有量はモデル対照群よりも著しく低減し（p<0.001）、それらの減少率は90.85％、91.88％になった。
【００４６】
（実施例19：食餌誘発性肥満カニクイザルでの抗肥満の薬力学試験）
14匹の食餌誘発性の肥満カニクイザル（海南金港生物技術股▲フン▼有限公司から購入され、蘇州薬明康▲徳▼で食餌によって誘発された肥満モデル、ボディマス指数BMI>35）は、体重に基づいて無作為に4群に分けられ、空白対照群として、1匹/性別であり、投与群として、2匹/性別である。即ち、空白対照群（0.9％生理食塩水）、低用量群（本発明にかかる組成物）、中用量群（本発明にかかる組成物）、高用量群（本発明にかかる組成物）である。各群動物ではいずれも4日ごとに1回皮下投与し、8回の連続投与を行った。実験期間中、毎日、動物を1日2回に飼育ケージの傍らで観察し、実験動物の一般的な状態、行為、活動量、排泄、呼吸、及び他の異常な症状を観察し、毎日、食事摂取量を測定し、体重を4日ごとに1回測定し、試験における1日目（投与前）と32日目（投与後）で採血して血液生化学的指標を測定した。
試験中、体重減少と食事摂取量の低減の以外は、あらゆる実験動物はいずれも該化合物に対する耐性がよく、他の異常な表現がない。
本発明にかかる組成物の長期投与の肥満カニクイザル体重に対する影響を図24に示す。試験期間において、空白対照群の動物の体重は安定している傾向にあり、投与各群の体重はいずれも異なる程度に減少した。投与終了後、空白対照群の動物の体重は投与前よりも0.065％増加し、低用量群、中用量群、高用量群の体重はそれぞれ15.0％、12.4％、11.5％減少した。
【００４７】
長期投与の食餌誘発性肥満カニクイザルの食事摂取量に対する影響を図25及び図26に示す。4日ごとに1回投与し、8回連続投与後、投与各群の食事摂取量はいずれも著しく低減した。空白対照群は、投与前よりも、食事摂取量が2.33％だけ低減した。低・中・高用量群は、投与前よりも、食事摂取量がそれぞれ75.6％、62.5％、53.7％低減した。
以上の結果により、本発明にかかる組成物は対象の体重を非常に顕著に減少させるとともに、極めて顕著に対象の食欲を抑制させることができることが示された。
実験動物の血液生化学検査の結果を表3（3A及び3B）に示す。トリグリセリド、グルコース、及びアラニンアミノ基転移酵素の平均値を図27、28、及び29に示す。食餌誘発性肥満カニクイザルは、それぞれ本発明にかかる組成物を皮下注射し、4日ごとに1回、8週間連続した。投与後に比べて投与前に、血清トリグリセリド、血清グルコース、血清アラニンアミノ基転移酵素は低減していた。空白対照群は、投与後に比べて投与前に、トリグリセリドがほとんど変化しておらず、グルコースがわずかに増加し、アラニンアミノ基転移酵素がわずかに増加した。高・中・低投与群の血液生化学検査では異常がない。
【００４８】
【表３Ａ】
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【００４９】
【表３Ｂ】
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【００５０】
長期投与の食餌誘発性肥満カニクイザルの腹囲及び脂肪分布に対する影響を図30及び図31に示す。4日ごとに1回投与し、8回連続した後、投与各群の腹囲と脂肪分布はいずれも明らかに低減した。空白対照群は、投与前後のカニクイザルの腹囲と脂肪分布はいずれもあまり変化しない。
【００５１】
（実施例20：PB-119・PB-722の配合剤の食餌誘発性肥満マウスの抗肥満・血糖降下に対する薬力学試験）
雄性C57BL/6マウス（由来同上）は、高脂肪飼料（45％kcal）で22週間飼育され、同齢の通常飼料で飼育されたマウスと比較して、平均体重と血糖は20％以上上回っており、肥満・高血糖モデルと判定された構築に成功した。DIOマウス36匹では、体重と空腹時血糖に基づいて無作為に群分けをし、6群に分けられ、1群にあたり6匹とした。中でも、群1はモデル対照群であり、群2は10nmol/kg（42.03μg/kg、ペプチドで、以下同様）のPB-119であり、群3は60nmol/kg（212.58μg/kg）のPB-722であり、群4と群5はそれぞれ10nmol/kg（42.03μg/kg）のPB-119を20nmol/kg（70.86μg/kg）及び60nmol/kg（212.58μg/kg）のPB-722と組み合わせた配合剤群であり、群6は25nmol/kg（75.02μg/kg）リラグルチドの注射液である。群6に1日2回投与した以外は、他の各群は、2日に1回投与した。連続投与し、試験は合計で21日間行い、試験期間において、投与当日にマウス体重と食事摂取量を測定し、最終投与終了後の2日目にランダム血糖と空腹時血糖を測定した。
結果より、配合剤（PB-119+PB-722）の連続投与はDIOマウスの食事摂取量及び体重に対して顕著な抑制作用を有することが示された。
連続投与開始後の21日間で、モデル対照群は、累積食事摂取量が直線的に上昇する傾向がある。配合剤各群は、対照群よりも食事摂取量がいずれも異なる程度に低減した。その結果を図32及び図33に示す。21日間連続投与試験が終了した時点で、累積食事摂取量が最も多く低減しているのは群5（PB-722（60nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg））であり、61.1％であった。累積食事摂取量が最も少なく低減しているのはPB-119群であり、14.4％であった。
【００５２】
モデル対照群は、投与前よりも体重が2.3％増加している一方で、投与各群は、体重がいずれも異なる程度に減少した。その結果を図34及び図35に示す。配合剤群PB-722（60nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）は最も著しく減少し、投与前よりも、体重が46.1％減少し、モデル対照群よりも差が統計的に有意である（p＜0.01）。PB-119群は体重が最も少なく減少し、投与前よりも16.6％減少した。
配合剤の連続投与はマウスの空腹時血糖を著しく低減させ、対照群において空腹時血中グルコース濃度が上昇した以外は、他の各処理群は異なる程度に低減した。その結果を図36に示す。中でも、配合剤群PB-722（60nmol/kg）+PB-119（10nmol/kg）は最も著しく低減し、投与前よりも血糖は39.6％低下した。1日2回投与のリラグルチド群では、空腹時血中グルコース濃度は37.0％低下した。PB-119群では、血糖値は最も少なく低下し、投与前よりも17.9％低下した。
配合剤の連続投与はマウスの経口ブドウ糖負荷も著しく改善した。21間日投与終了後、経口ブドウ糖負荷試験を行った。マウスに2.5g/kgのグルコース溶液を胃内投与し、グルコース投与前の0min、グルコース投与後の15min、30min、60min、120minにランダム血糖値を測定した。結果より、配合剤の高・低用量群での血漿中グルコース濃度-時間曲線下面積は明らかに対照群より小さく、また明らかにリラグルチド群より良い。本発明にかかる配合剤はマウスの経口ブドウ糖負荷を効果的に改善したことが示された。その結果を図37に示す。
【００５３】
（実施例21：PB-119・PB-722の配合剤の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）のマウスモデルに対する薬力学試験）
30匹のC57/BL6Jマウス（上海霊暢生物技術有限公司から購入）は本実験に用いられ、そのうちの24匹は、生後1週間はストレプトゾトシン（STZ）を腹腔内注射し、高脂肪飼料（リサーチダイエット社から購入）で5週間飼育され、非アルコール性脂肪肝炎（NASH）モデルの構築に成功し、他の6匹は正常マウス対照とし、通常飼料で飼育された。第6週から投与し、24匹のNASHモデルのマウスを体重に基づいて無作為に4群に分け、1群あたり6匹とした。それぞれ空白対照群（0.9％生理食塩水）、陽性対照群（10mg/kgのテルミサルタン）、低用量群（10nmol/kg  PB-119+30nmol/kg  PB-722）、高用量群（10nmol/kg  PB-119+60nmol/kg  PB-722）である。陽性対照群は1日1回経口投与し、他の各群は、いずれも2日ごとに1回皮下投与し、21日間連続投与した。投与期間中、毎日に体重をはかり、食事摂取量を2日ごとに1回測定した。最終投与日に投与終了後、一晩絶食させ、動物を秤量した後で安楽死させ、それぞれ血清と肝臓組織を採取し、肝重量を量った。血清グルコースとインスリンのレベルを検査した。肝臓組織はホルムアルデヒド溶液で固定され、HE染色、オイルレッド染色、及びシリウスレッド染色で染色して組織切片を作製し、その切片を点数で評価し、NASH指標を判定した。
長期投与のマウスの血中グルコース濃度・インスリンのレベルに対する影響を図38、39に示す。モデル対照群は、血中グルコース濃度が正常対照群より著しく増加した。陽性対照であるテルミサルタンは動物血糖に対する影響がない。配合剤の低用量群（10nmol/kg  PB-119+30nmol/kg  PB-722）と高用量群（10nmol/kg  PB-119+60nmol/kg  PB-722）は長期投与後、血中グルコース濃度が顕著に低下し、血糖降下作用が比較的顕著であることが示された。長期投与後の各群のインスリンのレベルはいずれも明らかな変化がないこと、並びに血中グルコース濃度の変化により、配合剤の長期投与が動物のインスリン感受性を改善したことが示された。
21日間連続投与後のマウスの肝臓切片のNASH点数評価（NAS Score）を図40に示す。モデル対照群のNASH点数評価は明らかに正常対照群より高く、モデル構築に成功したことが示された。PB-119+PB-722の配合剤の長期投与は用量依存的に動物のNASH点数評価を改善し、配合剤投与はマウスのNASHを著しく改善していることが示された。配合剤の高・低用量群のNASH点数評価は、いずれも陽性対照薬であるテルミサルタンより低い。
【００５４】
上記の説明は好ましい実施形態だけであり、単なる例示として、本発明を実施するために必要な特徴の組み合わせを限定するものではない。提供されているタイトルは、本発明の様々な実施形態を限定することを意味するものではない。例えば、「含む」、「持つ」、及び「含有」という用語は、限定することを意図するものではない。なお、特に断らない限り、数詞で修飾されていない場合に複数形を含み、「又は」、「若しくは」とは、「及び/又は」を意味する。本明細書中で他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術・科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本出願で言及された全ての刊行物・特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明で述べた方法および組成物の様々な修飾及び変更が当業者にとって明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態で述べたが、特許請求の範囲に記載された発明は、そのような特定の実施形態に不適切に限定されるべきではないことが理解される。実際に、関連分野の当業者にとっては自明である、本発明に記載される態様を実施するための様々な変更は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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