(57)【要約】  本発明は、細胞培養において産生されるタンパク質中のトリスリフィドレベルを減少させるための、細胞培養添加剤としてのスルホシステインおよびその誘導体の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質中のトリスルフィド結合の形成を減少させる方法であって、前記タンパク質を発現する細胞を培養することを含み、それによって、有意な量のシステインまたはシスチンを含有しないが、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含む細胞培養物中に１回以上、フィード培地が細胞培養物に添加され、それによって、前記タンパク質中のトリスリフィド連結形成は、フィード培地中のシステインおよび／またはシスチンが、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩によって置換されていなかった細胞培養培地中で培養された細胞によって発現されるタンパク質に対して減少する、前記方法。
【請求項２】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩が、Ｓ−スルホシステインナトリウム塩であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩が、細胞培養物中のそれらの濃度が０．４〜５０ｍＭになる量で、フィード培地中に添加されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、少なくとも１以上の糖類成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子、および１以上の核酸成分を含む細胞培養培地中で培養されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィードのｐＨが、６．８〜７．５であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
フィード培地が、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩、ビタミン、微量元素、およびアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質中の軽鎖および重鎖の間のトリスルフィド連結形成が減少することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質中の重鎖中のシステイン２５９およびシステイン３１９の間の連結におけるトリスルフィド形成が減少することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
−バイオリアクターに細胞および液体細胞培養培地を充填すること、
−バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること、
−バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、または前記インキュベーション時間内に１回または数回、細胞培養培地、この場合においてフィード培地をバイオリアクターに添加すること、
これによって、フィード培地はＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含み、システインおよび／またはシスチンの有意な量を含まない、
によって方法が行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
フィード培地が、１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度でＳ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたって、システインおよび／またはシスチンを含有するフィード培地が添加されないことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養において産生されるＩｇＧのようなタンパク質中のトリスリフィドレベルを減少させるための細胞培養添加剤としてのスルホシステインおよびその誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、およびとりわけ、モノクロナール抗体（ｍＡｂ）は、広範囲の疾病の処置に使用される治療用化合物の重要な種類になっている。
抗体を含む治療用タンパク質などのかかる生体分子の効率的および経済的な大規模生産は、バイオテクノロジーおよび医薬品産業のためのますます重要な検討事項である。
典型的には、タンパク質は、例えば、関心対象のタンパク質を産生するように組換え操作された哺乳動物細胞系または細菌細胞系のいずれかを使用した細胞培養法を用いて産生される。
【０００３】
しかしながら、組換え産生されたタンパク質は、著しい異種性を示す。かかる異種性は、酸化、脱アミド化および糖化、と同様に、タンパク質分解性成熟、タンパク質フォールディング、グリコシル化、リン酸化、およびジスルフィド結合形成などの翻訳後修飾などの化学的に誘導された修飾から生じ得る。分子の異種性は、特に、治療用タンパク質のヒトにおける使用を意図し、食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制当局によって承認されなければならない場合には望ましくない。
【０００４】
とりわけ関心を得た１つの分子異種性は、トリスリフィド結合の形成である。
抗体（または免疫グロブリン）は、２つの軽鎖ポリペプチド（ＬＣ）および２つの重鎖ポリペプチド（ＨＣ）の４つのポリペプチド鎖から構成される。４つの鎖は、典型的には、重鎖および軽鎖中に存在するシステイン残基の間で形成するジスルフィド結合によって「Ｙ」配置で結合される。
【０００５】
これらのジスルフィド連結は、天然のＨＣ２ＬＣ２テトラマーの全体の構造を支配する。典型的には、抗体は、Ｈ鎖を連結する２つのヒンジ領域ジスルフィドおよび各重Ｈ鎖およびＬ鎖の間の１つのジスルフィド結合を包含する４つの鎖間ジスルフィド結合を含有する。さらに、１２個の鎖内ジスルフィド連結は、分子中に存在するそれぞれの残りのシステイン残基を伴うことができる。不完全なジスルフィド結合形成、または酸化またはベータ脱離後のジスルフィドスクランブリングによる結合破壊はすべて、抗体異種性の潜在的な起源である。さらに、さらなるタイプの修飾、すなわちトリスルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−）結合形成が最近報告された。トリスルフィド結合形成に関するさらなる情報は、Pristatsky et al., Anal. Chem. 81: 6148 (2009)に見出され得る。
【０００６】
Rashmi Kshirsagar et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 109, No. 10, October, 2012, page 2523-2532には、システイン含有量とトリスリフィド結合の形成の間の関係が見られるので、細胞培養培地におけるシステイン含有量を補正し、特に減少させることを示唆している。
【０００７】
ＷＯ２０１１／０４１７２１は、溶液中のタンパク質を固体支持体と接触させて会合させ、次いで還元剤を含む溶液に前記タンパク質を暴露することによって、タンパク質中のトリスルフィド結合をジスルフィド結合に変換する方法を開示する。
【０００８】
ＷＯ２０１２１５８５５１は、有効量のシステイン分解阻害剤、例えば、グルタチオン、ピルビン酸塩などの存在下、前記タンパク質を発現する培養細胞を含む、大量生産中にタンパク質中のトリスルフィド結合の形成を減少させる方法を開示する。
タンパク質中のトリスルフィドレベルを減少させるその他の複雑でなく、および／またはより効率的な方法を見出すことが好ましい。
【発明の概要】
【０００９】
細胞培養培地中のシステインがＳ−スルホシステインおよび／またはその塩に置換された場合、前記細胞培養培地中で産生されるタンパク質中のトリスルフィド結合の量は、システインを含む同じ細胞培養培地と比較して減少することが見出されている。
【００１０】
したがって、本発明は、タンパク質中のトリスルフィド結合の形成を減少させる方法であって、前記タンパク質を発現する細胞を培養することを含み、これにより、有意な量のシステインまたはシスチンを含まないが、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含む、細胞培養物中に１回以上、フィード培地が細胞培養物に添加され、それによって、前記タンパク質中のトリスリフィド連結の形成が、フィード培地中のシステインおよび／またはシスチンが部分的または好ましくは完全にＳ−スルホシステインおよび／またはその塩によって置換されていない細胞培養培地中で培養された細胞と比較して減少する、前記方法に関する。
【００１１】
好ましい態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、Ｓ−スルホシステインナトリウム塩である。
好ましい態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィードのｐＨは、６．８〜７．５である。
【００１２】
別の好ましい態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステインの塩は、細胞培養におけるそれらの濃度が０．４〜５０ｍＭになるような量で添加される。
【００１３】
一態様において、細胞は、少なくとも１以上の糖成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分を含む細胞培養培地において培養される。
【００１４】
一態様において、前記タンパク質中の軽鎖と重鎖との間のトリスルフィド結合形成は、フィード培地中のシステインおよび／またはシスチンがＳ−スルホシステインおよび／またはその塩によって置換されていない細胞培養培地中で培養された細胞に対して減少される。
【００１５】
一態様において、本発明の方法は、
−バイオリアクターに細胞および液体細胞培養培地を充填し、
−バイオリアクター中で細胞をインキュベートし、
−バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたり連続的に、またはこのインキュベーション時間内に１回または数回、細胞培養培地、この場合においてフィード培地をバイオリアクターに加えること、
これによって、フィード培地は、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含み、有意な量のシステインおよび／またはシスチンを含まない、により行われる。当然、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含まない他のフィード培地を添加することも可能である。好ましくは、システインおよび／またはシスチンを含有するフィード培地は添加されない。
【００１６】
好ましくはフィード培地は、Ｓ−スルホシステインおよび／またはＳ−スルホシステイン塩を１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度、好ましくは５〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で含む。
好ましくは、バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの前時間にわたって、システインおよび／またはシスチンを含有するフィード培地は添加されない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＩｇＧ中のトリスルフィドレベルを監視するために使用される方策を示す。
【００１８】
【図２】図２〜５は、ＦＢプロセスの１３日目および１８日目における結びつけられたＬｙｓ−Ｃ／トリプシン消化物におけるトリスルフィド連結ペプチドの相対的定量を示す。さらなる詳細は、例において見出し得る。
【図３】図２〜５は、ＦＢプロセスの１３日目および１８日目における結びつけられたＬｙｓ−Ｃ／トリプシン消化物におけるトリスルフィド連結ペプチドの相対的定量を示す。さらなる詳細は、例において見出し得る。
【図４】図２〜５は、ＦＢプロセスの１３日目および１８日目における結びつけられたＬｙｓ−Ｃ／トリプシン消化物におけるトリスルフィド連結ペプチドの相対的定量を示す。さらなる詳細は、例において見出し得る。
【図５】図２〜５は、ＦＢプロセスの１３日目および１８日目における結びつけられたＬｙｓ−Ｃ／トリプシン消化物におけるトリスルフィド連結ペプチドの相対的定量を示す。さらなる詳細は、例において見出し得る。
【００１９】
【図６】図６は、ジスルフィド架橋を有するＬＣ−ＨＣ連結とトリスルフィド架橋を有するＬＣ−ＨＣ連結との間の関係を示す、抽出されたイオンクロマトグラムの重ね合わせを示す。さらなる詳細は、例において見出し得る。
【００２０】
「トリスルフィド結合」は、追加の硫黄原子をジスルフィド結合に挿入することによって生成され、それにより３つの連続する硫黄原子の共有結合が生じる。トリスルフィドは翻訳後修飾である。トリスルフィド結合は、タンパク質中のシステイン残基間に形成され得、分子内（すなわち、同じタンパク質中の２つのシステイン間）または分子間（すなわち、別々のタンパク質中の２つのシステイン間）に形成することができる。トリスルフィドは、例えば、主に軽重鎖結合において鎖間連結で検出された。
【００２１】
トリスルフィド結合の存在は、例えば、ペプチド・マッピングを使用して検出されることができ、余分な硫黄原子（３２Ｄａ）に起因する損なわれていないタンパク質の質量の増加に基づいて検出され得る。したがって、トリスルフィド結合は、質量分析、または高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣ−ＭＳシステムを利用するペプチドマッピング）によって検出することができる。図１は、そのような分析がどのように実施され得るかの一般的なスキームを示す。さらなる詳細は、例において見出し得る。
【００２２】
「タンパク質」は、アミノ酸残基の１以上の鎖からなる巨大分子である。オリゴペプチドおよび好ましくはポリペプチドは、タンパク質の定義内に包含される。タンパク質は、接触メタボリック反応、ＤＮＡ複製、刺激への応答、およびある位置から別の位置への分子の輸送を包含する、生体内での広範な機能の配列を実施する。タンパク質は、互いに主にアミノ酸配列が異なる。ほとんどのタンパク質は、独自の３次元構造に折り畳まれている。タンパク質は、例えば、天然に存在するタンパク質、または好ましくは組換え産生されたタンパク質である。タンパク質の例は、酵素または好ましくは抗体である。前述のタンパク質の断片、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらの任意の組み合わせもまた、本発明によるタンパク質として含まれる。
【００２３】
「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を言う。典型的には、抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な４つのポリペプチド鎖構造を有し、前記鎖は例えば鎖間ジスルフィド結合によって安定化されている。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、モノマーまたはポリマー形態、例えば、ペンタマー形態で存在するＩｇＭ抗体および／またはモノマー、ダイマーまたはマルチマー形態で存在するＩｇＡ抗体で存在し得る。抗体はまた、リガンド特異的結合ドメインを保持するか、または含むように修飾されている限り、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを包含し得る。
【００２４】
「フラグメント」という用語は、損傷のないまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を言う。フラグメントは、損傷のないまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理によって得ることができる。フラグメントは組換え手段によっても得ることができる。組換えにより産生される場合、フラグメントは、単独で、または融合タンパク質と呼ばれるより大きなタンパク質の一部として発現され得る。例示的なフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントを包含する。例示的な融合タンパク質としては、Ｆｃ融合タンパク質を包含する。本発明によれば、融合タンパク質はまた、用語「抗体」に網羅される。
【００２５】
（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニルプロパン酸とも呼ばれるＳ−スルホシステインは、例えば、硫酸とシステインの縮合によって得られる産物である。適切な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、リチウム塩類、ナトリウム塩類、カリウム塩類、カルシウム塩類またはマグネシウム塩類またはそれらの混合物である。ナトリウム塩類、カリウム塩類、カルシウム塩およびマグネシウム塩が好ましく、ナトリウム塩類、特にナトリウム塩が最も好ましい。
【００２６】
Ｓ−スルホシステインおよびその塩は、以下の式Ｉ：
【化１】
2019514918.tif 000002
によって示され得、Ｒは
【化２】
2019514918.tif 000003
であり、ＸはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、好ましくは、Ｈ、Ｎａ、Ｋである。用語プロパン酸は、用語プロピオン酸の代わりに使用され得る。
【００２７】
（Ｓ）−２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロパン酸、Ｓ−スルホ−システインまたはシステイン−Ｓ−硫酸とも呼ばれる２−アミノ−３−スルホスルファニル−プロピオン酸およびその塩の合成は、例えばI.H.Segel および M.J.Johnson, Analytical Biochemistry 5 (1963), 330-337 およびJ.S. Church, D.J. Evans, Spectrochimica Acta Part A 69 (2008) 256-262に開示されている。Ｓ−スルホ−システインは、米国Sigma-Aldrichから市販されている。そのナトリウム塩は、さらにスイスBachemから市販されている。
【００２８】
細胞培養は、細胞が培養される任意の仕組み（setup）である。細胞培養は、例えば、医薬品のような標的分子、特に抗体のような組換えタンパク質を産生するために使用される。
【００２９】
細胞培養培地は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持する成分の任意の混合物である。それは、複雑な培地または化学的に規定された培地であってもよい。細胞培養培地は、細胞のインビトロでの増殖を維持および／または支持するのに必要なすべての成分またはいくつかの成分のみを含むことができ、さらなる成分が別々に添加される。細胞培養培地の例は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するために必要なすべての成分ならびに培地サプリメントまたはフィードを含む完全培地である。基本培地とも呼ばれる完全培地は、典型的には６．８〜７．８のｐＨを有する。フィード培地は好ましくはｐＨが８．５未満である。本発明に従って使用される細胞培養培地は、好ましくは化学的に規定された細胞培養培地である。
【００３０】
典型的には、本発明による細胞培養培地は、バイオリアクターにおける細胞の増殖を維持および／または支持するため、および前記細胞のＩｇＧ産生を支持するために使用される。
【００３１】
いくつかの細胞培養培地は、滅菌水性液体として提供される。液体細胞培養培地の欠点は、短かい貯蔵寿命、輸送および貯蔵が困難であることである。結果として、多くの細胞培養培地は、現在、微細粉砕された乾燥粉末混合物として提供されている。それらは、水および／または水溶液および溶解状態で溶解する目的で製造され、前記細胞からの生物薬剤の増殖および／または産生のための実質的な栄養源を細胞に、しばしば他の補助剤と共に供給するために、設計される。
【００３２】
大部分のバイオ医薬品生産プラットフォームは流加回分細胞培養プロトコールに基づいている。その目的は、典型的には、増加する市場の需要に応え、製造コストを低減するために、高力価細胞培養プロセスを開発することである。高性能な組換え細胞系の使用に加えて、細胞培養培地およびプロセスパラメータの改善は、最大の生産能力を実現するために必要とされる。
【００３３】
流加回分プロセスでは、基本培地が初期増殖と産生を支援し、フィード培地は栄養素の枯渇を防ぎ、産生段階を維持する。培地は、異なる産生段階の間に異なる代謝要求に対応するように選択される。供給方策および制御パラメータを包含するプロセスパラメータ設定は、細胞増殖およびタンパク質産生に適した化学的および物理的環境を規定する。
【００３４】
フィードまたはフィード培地は、細胞培地中の初期増殖と産生を支える基礎培地ではなく、栄養素の枯渇を防ぎ、産生段階を持続させるために、後の段階で添加される培地である細胞培養培地である。フィード培地は、基礎培養培地と比較して、より高い濃度のいくつかの成分を有することができる。例えば、アミノ酸または炭水化物を包含する栄養素などのいくつかの成分は、約５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍、または約１０００倍の基礎培地における濃度でフィード培地中に存在し得る。
【００３５】
本発明によれば、有意な量のシステインおよび／またはシスチンを含有しないがＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を置換物として含有するフィード培地は、システインおよび／またはシスチンを５％（ｗ／ｗ）未満の量で、好ましくは１％（ｗ／ｗ）未満の量のＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含有し、最も好ましくは、システインおよび／またはシスチンを含まず、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩、ならびにシステインおよび／またはシスチン以外の潜在的な他のフィード成分のみを含む任意の培地である。
【００３６】
哺乳動物細胞培養培地は、哺乳動物細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持する成分の混合物である。哺乳動物細胞の例は、ヒトまたは動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｉ  ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ−１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞またはヒト細胞である。
【００３７】
化学的に規定された細胞培養培地は、化学的に規定されない物質を含まない細胞培養培地である。これは、培地中に使用される全ての化学物質の化学組成は、既知であることを意味する。化学的に規定された培地は、酵母、動物または植物の組織を含まず、フィーダー細胞、血清、抽出物、加水分解物または消化物または他の化学的に不十分に規定される成分を含まない。化学的に規定されていないか、またはあまり規定されていない化学成分は、化学組成および構造が知られておらず、変化する組成で存在するか、またはアルブミンまたはカゼインのようなタンパク質の化学組成および構造の評価と同等の、莫大な実験努力でのみ規定し得るものである。
【００３８】
粉末細胞培養培地または乾燥粉末培地は、典型的には粉砕プロセスまたは凍結乾燥プロセスから生じる細胞培養培地である。それは、粉末細胞培養培地が顆粒状の粒状培地であり、液体培地ではないことを意味する。用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と互換的に使用され得る。しかしながら、本明細書で使用される「乾燥粉末」は、単に、造粒された材料の外観を言い、特に指示がない限り、材料が錯化または凝集した溶媒を完全に含まないことを意味するものではない。粉末細胞培養培地は、造粒化細胞培養培地であってもよく、例えば、ローラー圧縮によって造粒される。
【００３９】
粉末細胞培養培地は、好ましくは、全ての成分を混合し、粉砕することによって産生される。成分の混合は、粉砕によって乾燥粉末細胞培養培地を産生する当業者に既知である。好ましくは、混合物のすべての部分がほぼ同じ組成を有するように、全ての成分を完全に混合する。組成物の均一性が高いほど、均質な細胞増殖に関してもたらされる培地の品質がより良好である。
【００４０】
粉砕は、粉末細胞培養培地を産生するのに適した任意のタイプのミルで行うことができる。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルである。ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルが好ましく、ピンミルが非常に好ましい。
当業者は、そのようなミルを如何に稼働するかを知っている。
【００４１】
粉砕した粉末培地の使用のために、溶媒、好ましくは水（最もとりわけ蒸留および／または脱イオン水または精製水または注射用水）または水性緩衝剤を培地に添加し、培地が完全に溶媒に溶解されるまで成分は混合される。
【００４２】
溶媒はまた、生理食塩水、適切なｐＨ範囲（典型的にはｐＨ１．０〜ｐＨ１０．０の範囲）を提供する可溶性の酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、防腐剤、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含み得る。
【００４３】
ｐＨ、ウシ胎児血清、糖などの調整のための緩衝物質のような物質を細胞培養培地と溶媒との混合物にさらに加えることも可能である。次いで、得られた液体細胞培養培地を、増殖または維持される細胞と接触させる。
【００４４】
本発明の方法で処置される細胞は、正常細胞、不死化細胞、罹患細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞であってもよく、そのいずれも確立されたまたは形質転換された細胞系であるか、または天然源から得られる。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、より好ましくはＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨＥＫまたはＣＨＯ細胞であり、最も好ましくはＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−（ＤＧ４４およびＤｕｘｂ１１）、ＣＨＯ−ＭおよびＣＨＯＫ１細胞である。
【００４５】
細胞培養培地、特に完全培地は、典型的には少なくとも１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝剤成分、１以上の補因子、および１以上の核酸成分を含む。
【００４６】
培地は、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック酸および／または化学的に調製された非イオン性界面活性剤のような界面活性成分をも含み得る。好適な非イオン性界面活性剤の一例は、ポロキサマーとも呼ばれる第一級ヒドロキシル基で停止する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤であり、ドイツのBASFから商品名プルロニック（pluronic）（登録商標）の下に入手可能である。
【００４７】
糖類成分は、グルコース、ガラクトース、リボースまたはフルクトース（単糖類の例）またはスクロース、ラクトースまたはマルトース（二糖類の例）などのすべての単糖類または二糖類である。
【００４８】
本発明によるアミノ酸の例は、チロシン、タンパク質原性アミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリン、ならびにＤ−アミノ酸のような非タンパク質原性アミノ酸である。
【００４９】
チロシンは、Ｌ−またはＤ−チロシン、好ましくはＬ−チロシンである。
システインは、Ｌ−またはＤ−システイン、好ましくはＬ−システインである。
【００５０】
ビタミン類の例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナル、さまざまなレチノイド、および４つのカロチノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）、ビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体も包含される。
【００５１】
塩の例は、重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオンまたはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を含む成分である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、リン酸ナトリウム一塩基性無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、リン酸ナトリウム二塩基性無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
【００５２】
緩衝剤の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
【００５３】
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよび誘導体、グルタチオン、ヘムヌクレオチドリン酸および誘導体である。
【００５４】
本発明による核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミンまたはウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、およびアデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドである。
【００５５】
フィード培地は、完全培地と比較して異なる組成を有し得る。それらは、典型的には、アミノ酸、微量元素およびビタミンを含む。それらはまた、糖成分を含んでもよいが、製造上の理由から、糖成分が別個のフィード中に添加されることがある。
【００５６】
本発明の方法に従って使用される適切なフィード培地は、Ｓ−スルホシステインに加えて、例えば以下の化合物の１つ以上を含むが、システインまたはシスチンは含まない：
【００５７】
Ｌ−アスパラギン一水和物
Ｌ−イソロイシン
Ｌ−フェニルアラニン
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム一水和物 
Ｌ−ロイシン
Ｌ−スレオニン
Ｌ−リシン一塩酸塩
Ｌ−プロリン
Ｌ−セリン
Ｌ−アルギニン一塩酸塩
【００５８】
Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物 
Ｌ−メチオニン
Ｌ−バリン
Ｌ−アスパラギン酸モノナトリウム一水和物
Ｌ−トリプトファン
コリンコロリド
ミオイノシトール 
ニコチンアミド
Ｄ（＋）パントテン酸カルシウム 
ピリドキシン塩酸塩 
【００５９】
塩化チアミン塩酸塩
ビタミンＢ１２(シアノバラミン)微粒子化物
ビオチン
葉酸
リボフラビン
硫酸マグネシウム無水物
硫酸銅（ＩＩ）五水和物
硫酸亜鉛七水和物
１，４−ジアミノブタン二塩酸塩
ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物
【００６０】
硫酸カドミウム水和物
塩化マンガン酸（ＩＩ）四水和物
塩化ニッケル（ＩＩ）六水和物 
メタケイ酸ナトリウム
メタバナジウム酸ナトリウム
塩化スズ（ＩＩ）二水和物
亜セレン酸ナトリウム（約４５％ＳＥ）
リン酸二水素ナトリウム一水和物 
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（約１８％ＦＥ）
【００６１】
本発明の要旨は、システインおよび／またはシスチンをＳ−スルホシステインおよび／またはその塩によって置き換えることによって、細胞培養物中で産生されるタンパク質、または好ましくはＩｇＧに見出されるトリスルフィド結合の量を減少させることである。
【００６２】
前記タンパク質、特に抗体中の軽鎖と重鎖との間のトリスルフィド連結形成は、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩によってフィード中のシステインおよび／またはシスチンを置換しない細胞培地と比べて、効率的に、典型的には７５％を上回って削減される。
【００６３】
驚くべきことに、別のトリスルフィド形成の減少が見出された。重鎖中のシステイン２５９とシステイン３１９との間の連結における前記タンパク質、特に抗体中のトリスルフィド形成が見出され、本発明の方法でも減少させることができた。
【００６４】
本発明によるシステインおよび／またはシスチンの代わりにＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィード培地で処理される細胞は、典型的には、生物製剤の製造目的のためにバイオリアクターで培養される細胞である。
【００６５】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、システインおよび／またはシスチンの添加に匹敵する細胞培養の任意の段階で細胞に添加することができる。細胞培養を開始するときに添加することができる。この場合、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、好ましくは、細胞培養を開始するために使用される基本培地の他の成分と混合され、粉砕される。次いで、粉末が溶解し、所望の均一な濃度の培地成分を有する液体細胞培養培地を生成するように、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むこの乾燥粉末混合物を、粉末および溶媒を混合することによって適切な溶媒に溶解する。
【００６６】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、細胞の培養中に１回以上添加することもできる。細胞培養は、典型的には１〜３週間行われる。この時間の間、フィード培地は連続的に、または１回以上添加される。Ｓ−スルフォシステインおよび／またはその塩は、他のフィード培地成分と一緒にフィード培地の培養物に添加することができるか、またはＳ−スルホシステインおよび／またはその塩のみを含む別のフィードに加えることができる。また、フィードは、典型的には液体であるので、フィードの全ての成分は、細胞培養物に添加する前に適切な溶媒に溶解される。
【００６７】
好ましい態様において、細胞培養は、システインおよび／またはシスチンを含むがＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含まない基本培地で開始され、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩がフィードとして添加される。好ましくは、細胞培養中に少なくとも４回、好ましくは４〜６回添加される。一態様において、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩は、２日ごと〜４日ごとに添加される。
【００６８】
Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィードのｐＨは、典型的には５〜７．５、好ましくは６．８〜７．５、最も好ましくは６．８〜７．１の間である。
【００６９】
典型的には、細胞培養は、
ａ）バイオリアクターに入れること、
ｂ）培養される細胞をバイオリアクター中の液体細胞培養培地と混合すること、
ｃ）ステップｂ）の混合物をある時間インキュベートし、それによって、Ｓ−スルホシステインを含むが、有意な量の好ましくは全くシスチンまたはシステインを含まないフィード培地をその時間中に少なくとも１回添加すること
によって行われる。
【００７０】
バイオリアクターは、細胞を培養することができる任意の容器、バッグ、器またはタンクである。細胞培養を行うことは、当業者に既知である。これは、典型的には、ｐＨ、浸透圧、温度、撹拌、通気（酸素／ＣＯ２）などの適切な条件下で細胞をバイオリアクター内でインキュベートすること、および細胞培養中にフィード培地を１回または数回任意に添加することによって行われる。好ましくは、細胞培養は流加回分細胞培養として行われる。
【００７１】
流加回分培養は、細胞の培養中に１つまたは複数の栄養素（基質）がバイオリアクターにフィード（供給）され、生成物が実行終了までバイオリアクターに残る細胞培養プロセスである。この方法の別の説明は、基本培地が最初の細胞培養を支持し、栄養枯渇を防ぐためにフィード培地が追加された培養物の説明である。流加回分培養の利点は、培養液中の供給基質の濃度を任意に所望のレベルに制御できることである。
【００７２】
一般に、流加回分培養は、１つの栄養素（または複数の栄養素）の濃度を制御することが、この場合Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩のような所望の代謝産物の均質性または収率に影響を及ぼす場合、従来の回分培養より優れている。
【００７３】
その結果として、好ましくは本発明は、
−細胞および液体細胞培養培地をバイオリアクターに充填すること、
−バイオリアクター中で細胞をインキュベートすること、
−バイオリアクター中での細胞のインキュベーションの全時間にわたって、連続的に、前記インキュベーション時間内に１回ないし数回、細胞培養培地、この場合フィード培地をバイオリアクターに加え、
それによって、フィード培地は、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むが、有意な量の、好ましくは全くシステインおよび／またはシスチンを含まず、好ましくは、６．８〜７．５のｐＨを有すること、
によって実施される。
【００７４】
トリスルフィド結合の量の減少は、細胞培養物が可能な限り少ないシステインおよび／またはシスチンを含む場合に特に有効であることが見出されている。結果として、細胞がＳ−スルホシステインおよび／またはその塩単独で増殖することができる場合、好ましくは、細胞培養物はいかなるシステインおよび／またはシスチンを含まない。いくつかの細胞では、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むがシステインおよび／またはシスチンを含まない培地において十分な性能および／または増殖を示さないので、基本培地はシステインおよび／またはシスチンを含む必要がある。この場合、好ましくは、基本培地はシステインおよび／またはシスチンを含み、培養中に添加されるフィード培地は追加のシステインおよび／またはシスチンを含まない。
【００７５】
当業者には、１種類または数種類のフィード培地を細胞培養物に添加することができることは明らかである。単一のフィード方策が使用される場合、唯一の種類のフィード培地が連続的に、または細胞培養中に１回または数回、細胞培養物に添加される。本発明の方法によれば、この単一のフィード培地は、有意な量のシステインおよび／またはシスチンを含有しないが、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を置換物として含有する。本発明の方法に従って、いくつかの異なるフィード培地を細胞培養物に添加する場合、好ましくは、これらのフィード培地のいずれもシステインおよび／またはシスチンを含有しない。
【００７６】
すべてのフィード培地がＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含有する必要はない。例えば、ビタミン、微量元素およびアミノ酸、ならびにＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィードと、他の時間に第２のフィードを添加することが好ましく、それによって第２のフィードは、例えば、好ましくはＳ−スルホシステインおよび／またはその塩を含まない炭水化物フィードである。いずれにしても、細胞培養中に少なくとも１回、有意な量の好ましくは全くシステインおよび／またはシスチンを含まないが、Ｓ−スルホシステインおよび／またはその塩を含むフィードが添加される。
【００７７】
本発明の方法では、トリスルフィドの量を効果的に減少させることができることが分かった。好ましくは、軽鎖と重鎖との間のトリスルフィド形成を減少させることができる。このトリスルフィドの形成は、フィード培地におけるシスチンおよび／またはシステインがＳ−スルホシステインおよび／またはその塩で置き換えられていない細胞培養プロセスと比較して、７５％を超え、好ましくは８５％を超え減少させることができる。
【００７８】
本発明の方法に従って処理され、トリスルフィド結合形成が低減されているタンパク質は、診断アッセイ、免疫アッセイおよび／または医薬組成物に使用することができる。
【００７９】
いくつかの態様において、タンパク質、例えば本発明の方法で処理された抗体は、未処理対照と比較して貯蔵安定性が増加している。別の態様において、タンパク質、例えば、本発明の方法で処理された抗体は、未処理対照と比較して、凝集傾向が低下している。さらに別の態様において、タンパク質、例えば本発明の方法を用いた抗体の処理は、未処理の対照と比較して酸化、例えば、メチオニンの酸化が減少する。
【００８０】
したがって、本発明はまた、タンパク質の組成物中のトリスルフィドのレベルを減少させることを含む、タンパク質、例えば抗体の組成物中のタンパク質酸化、例えばメチオニン酸化を減少させる方法を提供する。別の態様は、タンパク質の組成物中のトリスルフィドのレベルを減少させることを含む、タンパク質、例えば抗体の組成物中のタンパク質凝集を減少させる方法を提供する。別の態様は、前記タンパク質の組成物中のトリスルフィドのレベルを減少させることを含む、タンパク質、例えば抗体の組成物中のタンパク質安定性を増加させる方法を提供する。
【００８１】
別の態様は、上記プロセスステップを実施することによって抗体中のトリスルフィド結合をジスルフィド結合へ変換することによって、長期タンパク質および抗体貯蔵安定性を増加または高める方法を提供する。
【００８２】
本発明は、さらに、以下の図および例によって例示されるが、それに限定されない。
全ての出願、特許、および上および以下に引用した公表文献、同様に対応する特許出願２０１６年４月２８日出願のＥＰ１６１６７４６１．９は、参照して本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００８３】
例
以下の例は、本発明の実際的な適用を表す。
１．実施要綱
ａ．流加回分プロセス
ＩｇＧ１を発現する組換えＣＨＯ細胞を、１．５ｍＭのシステインを含有する完全に化学的に規定された基本培地（Cellvento（登録商標）ＣＨＯ  ２２０）中で増殖させた。３日、５日、７日、１０日、１４日に、システインまたはＳ−スルホシステインのいずれかを含有するフィードを添加した。
対照条件では、主フィードには、このアミノ酸の低い安定性のためにシステイン以外のビタミン、微量元素およびアミノ酸が包含していた。１５０ｍＭのシステインをｐＨ１１において別のフィードに溶解した。３日目、５日目、７日目、１０日目および１４日目に、それぞれ主フィードを３％、６％、６％、６％および６％（ｖ／ｖ）で添加したのに対して、システインを０．３％、０．６％、０．６％、０．６％および０．６％添加した。
【００８４】
ＳＳＣ条件のために、主フィードは同じビタミン、微量元素およびアミノ酸を包含し、さらに１５ｍＭのＳ−スルホシステイン二ナトリウム塩を補充した。主フィードは、それぞれ３、５、７、１０および１４日目に３％、６％、６％、６％および６％（ｖ／ｖ）添加され、対照状態と比較したときに同量のシステイン源をもたらした。グルコースを、両方の条件について毎日モニターし、４００ｇ／Ｌ溶液を使用して６ｇ／Ｌに調整した。
【００８５】
プロセスは、１．２Ｌバイオリアクター中、３７℃にて、ｐＨ７．０、５０％酸素溶解、１４０ｒｐｍ回転にて実施した。
試料は、バイオリアクターから１３日目および１８日目にトリスルフィド分析のために採取した。サンプリング後、細胞培養上澄みを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＩｇＧ濃度を自動濁度測定法（Cedex bioHT）を使用して定量し、さらなる処理のために凍結させた。
【００８６】
ｂ．細胞培養上澄みからのＩｇＧ精製
ＩｇＧは、タンパク質Ａ結合（Ｐｈｙｔｉｐｓ法）を使用して凍結試料から精製し、２００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭＮａＣｌおよび９６ｍＭトリスＨＣｌ中で溶離され、および再度定量した。
【００８７】
ｃ．ＩｇＧからのペプチド生成
最初に、試料中の遊離システインを、Ｎ−エチルマレイミド（０．１Ｍ酢酸Ｎａ緩衝液中の１０ｍＭ溶液、ｐＨ５．０）を暗所で３０分間添加することによってアルキル化した。
Ｌｙｓ−Ｃによる消化のために、５５μＬの消化緩衝液（８Ｍ尿素、０．１Ｍトリス、ｐＨ７）および１５μＬのＬｙｓ−Ｃ酵素（Promega,V1671）を加え、試料を３７℃で４時間インキュベートした。続いて、試料を４６８μｌの消化緩衝液の添加により１Ｍ尿素に希釈し、１２μＬトリプシンを添加することにより３７℃で一晩消化した。最終抗体濃度は５０ｍｇ／Ｌであった。ジスルフィドおよびトリスルフィド結合の分析のために、試料を１０％ギ酸（４．４μＬ）で処理して消化を止め、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【００８８】
ｄ．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法
得られたタンパク質混合物は、逆相ＨＰＬＣ（RSLC3000 nano LC, Thermo Scientific Dionex, Idstein, Germany）を使用して注入し、分離された。カートリッジ（PM100, C18, 5 μm, 0,3x5 mm, Thermo Scientific Dionex, Idstein, Germany）を有するナノＬＣカラム（Acquity UPLC M-Class HSS T3, 1.8 μm, 75 μm x 150 mm, Waters）は、試料の予備濃縮および分離のために使用された。ブランクランおよびカラム洗浄ランは、連続する試料ラン内で実施された。
【００８９】
変化する傾きを有する最適化された２６分直線勾配を５０℃で以下のように適用した（分／％Ｂ）：０／２、０．２５／２、８／１６、２０／２９、２６．２５／４５、２７．２５／９９、３０．２５／９９、３１．２５／２０、３２．２５／２０、３３．２５／９９、３４．２５／９９、３５．２５／２、３８／２。注入量は５〜７μＬ（約０．３５μｇ）であった。試料を１２０μＬ／分の流速でカートリッジに０．２５分間装填した。装填のために、９７．９５％の水、２％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡからなる溶出液を使用した。続いて、バルブを切り替え、試料を分析カラムに移し、０．６μＬ／分の流速を使用して分離した。ＨＰＬＣ溶出液をQExactive plus質量分析計（Thermo scientific, Bremen, Germany）に直接注入した。
【００９０】
質量分析計は、陽イオンモードで操作し、スプレイ電圧は１．９ｋＶ、キャピラリー温度は、２７５℃、およびＳ−レンズＲＦ電圧は、５５Ｖであった。ＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスキャンの場合、活性化タイプは衝突誘起解離（ＣＩＤ）であり、デフォルトの荷電状態は２であった。適用される４スキャンイベントＱＥｘａｃｔｉｖｅ法は、ｍ／ｚ２００−２０００および分解能（ＲＰ）７００００の後に、３つのサイクルのデータ依存性ＭＳ／ＭＳが、上位３つの最も強いイオンについてスキャンされる、完全ＭＳサーベイスキャンからなる。動的排除機能を有効にし、パラメータは以下のとおりであった：１０秒の動的排除、２ｍ／ｚの単離ウィンドウ、１７５００の分解能、ＡＧＣ目標３ｅ６、２５０ｍ秒の最大注入時間、２５の正規化衝突エネルギー、０．１％のアンダーフィル比、１．２ｅ４の強度閾値。
【００９１】
割り当てられていない荷電状態および荷電状態≧８は、ＭＳ／ＭＳトリガーのために拒否され、ポリシロキサンイオンを含有する拒否質量リストが可能にされた。動的排除は１０秒であった。複製ランは、荷電状態＋１排除の有無にかかわらず実施された。データ処理のために、分析された抗体の軽鎖および重鎖の配列をそれぞれ含有するインハウスタンパク質データベースに基づくＭａｓｃｏｔ ２．３誤差寛容性の検索（Matrix Science London, UK）を使用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、データベース検索の前にＭＳ２プロセッサを使用して荷電解絡（charge deconvolute）され、マスコットの設定は小さなペプチドの同定を可能にするようにされた：検索で試験され、報告書で証明された最短ペプチドは４アミノ酸に設定された。マスコット検索パラメータは、酵素がトリプシン、２つの欠損切断が許容され、トリプシン消化のための固定修飾カルバミドメチル化、ペプチド許容誤差：６ｐｐｍ、ＭＳ／ＭＳ許容誤差０．０５Ｄａ、ペプチド電荷＋２、＋３、＋４、誤差許容検索が活かされ、最小イオンスコア１５であった。
【００９２】
２．結果
図２〜５は、ＩｇＧの軽鎖と重鎖（ＬＣ−ＨＣ）との間、ならびにそれぞれ１３日目および１８日目のＨＣ（HC_cys259-Cys319）の２システイン残基との間のトリスルフィド形成の定量の結果を示す。
トリスルフィド連結ペプチドの相対百分率は、トリスルフィド連結ペプチドの面積を、トリスルフィド連結ペプチドとジスルフィド連結ペプチドの面積の合計で割ることによって計算された。
【００９３】
結果は、分離フィードのシステインを使用して作られた対照試料において、ＬＣ−ＨＣ連結ペプチドに対してトリスルフィドの最大量が見出されることが示される。トリスルフィドの量は、ＳＳＣフィードを使用して作られた試料において減少する。トリスルフィドの平均減少は、対照条件と比較した場合、ＳＳＣを使用したとき、１３日目で９３．３％、１８日目で９２．４％であった。重鎖中のシステイン２５９とシステイン３１９との間の結合におけるトリスルフィド形成が３桁低いことの証拠を見出した。相対量は非常に少ないが、データは非常に一貫しており、ＬＣ−ＨＣ連結の間のトリスルフィド形成について観察された傾向を確認する。トリスルフィドの量は、ＳＳＣフィードを使用して作られた試料において減少する。トリスルフィドの平均減少は、対照条件と比較した場合に、ＳＳＣを使用したとき、１３日目に４６．７％、１８日目に２５．９％である。
【００９４】
図６は、ジスルフィド架橋を有するＬＣ−ＨＣ連結とトリスルフィド架橋を有するＬＣ−ＨＣ連結との間の関係を示す、抽出されたイオンクロマトグラムの重ね合わせを示す。
【００９５】
図６は、別個のフィード中のシステインを使用した対照ＦＢ中のＬＣ−ＨＣ連結と比較した場合（薄い灰色）の、ジスルフィド連結ペプチドに関してＳＳＣを使用してＦＢ中のＬＣ−ＨＣ連結におけるトリスルフィド形成（濃い灰色）の相対的減少を示す。
【図１】
2019514918.tif 000004
【図２】
2019514918.tif 000005
【図３】
2019514918.tif 000006
【図４】
2019514918.tif 000007
【図５】
2019514918.tif 000008
【図６】
2019514918.tif 000009
【国際調査報告】
2019514918.tif 000010
2019514918.tif 000011
2019514918.tif 000012