(57)【要約】  本発明は、第１の成分が遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)(成分Ａと呼ぶ)であり、成分Ａが被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも１つのファミリーの内因性表面発現を欠き、第２の成分が被分析物TCR鎖をコードするORFの送達用遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)である多成分システムに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の成分が、遺伝子操作されたTCR-提示細胞(eTPC)(成分Ａと呼ぶ)であり、成分Ａが被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも１つのファミリーの内因性表面発現を欠き、第２の成分が被分析物TCR鎖をコードするORFの送達のための遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)である、多成分システム。
【請求項２】
aAPXのファミリーが下記：
ａ．HLAクラスI
ｂ．HLAクラスII
ｃ．非HLA抗原提示複合体
のいずれかであり得る、請求項１に記載の多成分システム。
【請求項３】
成分Ａが
ａ．TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、
ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム受容部位である更なる成分(Ｂと呼ぶ)を含有する、
請求項１に記載の多成分システム。
【請求項４】
成分Ｃが成分Ｂとマッチし、成分Ｃが
ａ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
ｂ．被分析物TCR鎖対をコードする２つのORF
を送達するように設計されており、
ａ及び/又はｂは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分Ａ上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項５】
eTPC(成分Ａと呼ぶ)と、１又は２以上の被分析物TCR鎖をコードするORFの送達のための遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)とを含んでなり、
成分Ａが
ａ．TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、
ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム受容部位である更なる成分(Ｂと呼ぶ)を含有し、
成分Ｃが成分Ｂにマッチする遺伝子ドナーベクターを含み、成分Ｃが
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
ｄ．被分析物TCR鎖対をコードする２つのORF
を送達するように設計されており、
ａ及び/又はｂは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分Ａ上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項６】
成分Ａが、１つの被分析物TCR α、β、δ又はγ鎖をコードする単一ORFの組込みのためのゲノム受容部位である更なる成分(Ｄと呼ぶ)を含んでなる、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項７】
更なる成分(Ｅと呼ぶ)がＤにマッチする遺伝子ベクターであり、成分Ｅが、相補性の対をなす被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードするORFが成分Ｂに組み込まれているとき、成分Ａ上にTCRspとして発現されるように、１つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORFを送達するよう設計されており、成分Ｅが組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、請求項６に記載の多成分システム。
【請求項８】
成分Ａが以下
ａ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーター並びに少なくとも１つのレポーターを含有する単一成分合成構築物
ｂ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーター並びに少なくとも１つのレポーターを有して設計されている多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである成分(Ｆと呼ぶ)を更に含有し、ａ及び/又はｂの活性化が合成経路、天然型経路又はそれらの組合せから選択される少なくとも１つのシグナル変換経路に依存性である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項９】
ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤを含み、ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤが
ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物
ｂ．部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物
から選択される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１０】
ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤを含み、ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤがリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物である、請求項９に記載の多成分システム。
【請求項１１】
aAMが下記
ａ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ｂ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
ｃ．成分Ａプロテオームの変更に由来するペプチド
ｄ．成分Ａプロテオームの変更に由来するポリペプチド
ｅ．成分Ａメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１２】
成分ＡがCD4及び/又はCD8を発現する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１３】
成分Ａが追加のTCRコレセプターを発現する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１４】
成分ＡがCD28及び/又はCD45を発現する、請求項１３に記載の多成分システム。
【請求項１５】
成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが、以下の遺伝子エレメント：
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同性アーム
ｃ．真核生物プロモーター
ｄ．真核生物条件付き調節エレメント
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．選択マーカー
ｇ．スプライスアクセプター部位
ｈ．スプライスドナー部位
ｉ．非タンパク質コーディング遺伝子
ｊ．インスレーター
ｋ．可動遺伝子エレメント
ｌ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｍ．内部リボソーム進入部位(IRES)
ｎ．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
ｏ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１６】
成分Ｃ及び/又はＥを含み、成分Ｃ及び/又はＥが以下の遺伝子エレメント：
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同性アーム
ｃ．真核生物プロモーター
ｄ．真核生物条件付き調節エレメント
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．選択マーカー
ｇ．組込みの選択マーカー
ｈ．スプライスアクセプター部位
ｉ．スプライスドナー部位
ｊ．非タンパク質コーディング遺伝子
ｋ．インスレーター
ｌ．可動遺伝子エレメント
ｍ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｎ．内部リボソーム進入部位(IRES)
ｏ．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
ｐ．抗生物質耐性カセット
ｑ．細菌性複製起点
ｒ．酵母複製起点
ｓ．クローニング部位
ｔ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１７】
成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが、単一ORFのRMCE組込みのためであり、下記：
ａ．真核生物プロモーター
ｂ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｃ．コザックコンセンサス配列
ｄ．選択マーカー
ｅ．真核生物ターミネーター
を含んでなる、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１８】
成分Ｃ及び/又はＥが存在し、単一ORFのRMCE組込みのためであり、以下の遺伝子エレメント：
ａ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．コザックコンセンサス配列
ｃ．抗生物質耐性カセット
ｄ．細菌性複製起点
ｅ．１又は２以上のTCR鎖をコードする単一ORF及び/又は組込みの選択マーカーの導入のためのクローニング部位
を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１９】
成分Ｃ及び/又はＥを含み、成分Ｃ及び/又はＥは、成分Ｃ'及び/又はＥ'が得られるよう、少なくとも１つの被分析物TCR鎖をコードする少なくとも１つのORFと組み合わされている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項２０】
組合せは、成分Ｃ'及び/又はＥ'のライブラリーが得られるよう複数回行われる、請求項１９に記載の多成分システム。
【請求項２１】
被分析物TCR鎖をコードする配列が、
ａ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
ｂ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
ｃ．合成TCR鎖ORF配列
に由来する、請求項１９又は２０に記載の多成分システム。
【請求項２２】
１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'は、成分Ｃ'及び/又はＥ'にコードされる２つの相補性被分析物TCR鎖を成分Ｂ及び/又はＤ中に組み込んで細胞(eTPC-tと呼ぶ)が得られるように、成分Ａと組み合わされており、ここで、成分Ｂ及び/又はＤは、成分Ａの表面にTCRspを発現するような成分Ｂ'及び/又はＤ'となる、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項２３】
１つの成分Ｃ'又はＥ'は、成分Ｃ'又はＥ'にコードされる１つの被分析物TCR鎖を成分Ｂ又はＤに組み込んで細胞(eTPC-xと呼ぶ)が得られるように、成分Ａと組み合わされており、ここで、成分Ｂ又はＤは、eTPC-xが単一TCR鎖を発現するような成分Ｂ'又はＤ'となる、
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項２４】
１つの成分Ｃ'又はＥ'は、成分Ｃ'又はＥ'にコードされる１つの被分析物TCR鎖であって、eTPC-xに発現されるTCR鎖に相補性である被分析物TCR鎖をeTPC-xの成分Ｂ又はＤに組み込んでeTPC-tが得られるように、eTPC-xと組み合わされており、ここで、成分Ｂ又はＤは、TCRspをeTPC-tの表面に発現するような成分Ｂ'又はＤ'となる、請求項２３に記載の多成分システム。
【請求項２５】
ａ．成分Ａを少なくとも１つの成分Ｃ'及び/又はＥ'と組み合わせること、ここで、１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'は一対又は二対以上の相補性被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、及び下記
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．TCRsp及び/又は１又は２以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
ｄ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、請求項２２に規定するeTPC-tを製造するための方法。
【請求項２６】
ｂ、ｃ及びｄを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が工程ａで単一TCR鎖の相補対をコードする、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
方法が複数回行われ、各回の工程ａは別異のeTPC-tが得られるように別異の単一TCR鎖の相補対を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーが得られる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が、各eTPC-tが請求項２７の工程ａで用いるプールに由来する単一TCRspを発現するeTPC-tの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、請求項２７の工程ａにおいて２又は３以上の別異のTCR鎖の相補対を混合プールをコードする、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
ａ．成分Ａを、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'と組み合わせること、ここで、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上のＥ'は被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、並びに、
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、請求項２３に規定されるeTPC-xを製造する方法。
【請求項３１】
ｂ及びｃを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１つの成分Ｃ'又は１つの成分Ｅ'が工程ａにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
方法が複数回行われ、各回の工程ａは別異のeTPC-xが得られるように別異の被分析物TCR鎖を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-xのライブラリーが得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が、各eTPC-xが工程ａで用いるプールに由来する単一被分析物TCR鎖を発現するeTPC-xの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、工程ａにおける２又は３以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３５】
ａ．eTPC-xと１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'とを組み合わせること、ここで、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上のＥ'は、eTPC-xに組み込まれた被分析物TCR鎖に対して相補的である被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、並びに
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．TCRsp及び/又は１又は２以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
ｄ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる請求項２４に規定するeTPC-tを製造する方法。
【請求項３６】
ｂ、ｃ及びｄを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１つの成分Ｃ'又は１つの成分Ｅ'が工程ａにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
方法が複数回行われ、各回の工程ａは、TCRspを発現する別異のeTPC-tが得られるように、別異の被分析物TCR鎖を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーが得られる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が、各eTPC-tが工程ａで用いるプールに由来する単一TCRspを発現するeTPC-tの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、工程ａにおける２又は３以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードする、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項４０】
被分析物抗原が、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原が、少なくとも、可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化された反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)が積載されているaAPXであり、aAPX:aAMはCMとしてaAMが積載されているaAPXである、以下の特徴決定：
ａ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する特異性、及び/又は
ｂ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する親和性、及び/又は
ｃ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対するシグナル応答
に用いるための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の多成分システムから得られるeTPC-t。
【請求項４１】
少なくとも１つの被分析物eTPC-tを製造するための多成分システムの使用。
【請求項４２】
診断デバイスにおける少なくとも１つの被分析物eTPC-tの使用。
【請求項４３】
１又は２以上の被分析物eTPC-tを含んでなる診断デバイス。
【請求項４４】
１又は２以上の被分析物抗原を更に含んでなる請求項４３に記載の診断デバイス。
【請求項４５】
コントロール反応剤としての１又は２以上のeTPCの使用。
【請求項４６】
アッセイにおける請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
アッセイがフローサイトメトリーアッセイである請求項４６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、少なくとも、遺伝子操作されたＴ細胞レセプター(TCR)提示細胞(eTPC)、遺伝子操作されたゲノム受容部位及びマッチする遺伝子ドナーベクターである３つの成分で構成される多成分システムの構築、組立て及び使用に関する。本発明は、TCR対タンパク質の同定及び特徴決定のための、全長TCR対を被分析物抗原に提示する安定な派生細胞(eTPC-t)の迅速で高スループットな作製に用いられる。具体的には、eTPCは、CD3複合体の全ての成分を構成的に発現するが、TCRα、β、γ及びδ鎖の内因性発現を欠く。eTPCはまた、分析ワークフローにおけるeTPCによる抗原自己提示の可能性のあるバックグランドを排除するために、主要抗原提示複合体の発現を欠く。加えて、eTPCは、少なくとも１つの遺伝子操作されたゲノム受容部位を含有する。この部位は、TCR対をコードし、マッチした遺伝子ドナーベクターにより送達される遺伝物質の迅速で安定な組込みに用いられる。eTPCはまた、TCR刺激の検出のための任意成分 TCR刺激応答エレメントを含んでいてもよい。多成分システムは、臨床免疫診断における分析システムとして用いてもよい。更に、本発明は、診断、医学、美容及び研究開発のためにＴ細胞抗原及び同族TCRを同定し、特徴付けるための多成分システムの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の序論
Ｔリンパ球(Ｔ細胞)による免疫監視機構は、全ての有顎脊椎動物の適応免疫における中心的な機能である。Ｔ細胞による免疫監視機構は、Ｔ細胞サブタイプにわたる豊富な機能的多様性を介して達成され、該Ｔ細胞サブタイプは、病原体感染及び腫瘍性細胞の排除に貢献し、侵入病原体、共生微生物、食物の分子成分のような共生非自己因子に対する適応免疫応答を組織化し、更には自己の免疫寛容を維持する。様々な外来及び自己因子に応答するために、Ｔ細胞は、これらの外来及び自己因子の分子構成成分を特異的に検出できなければならない。よって、Ｔ細胞は、個体が遭遇する自己及び非自己分子の大多数を、病原性生物及び病的な自己に対する有効な応答を開始するために十分な特異性を持って、健常な自己に対するそのような応答の開始を回避しながら検出できなければならない。この任務の非常に複雑な性質は、外来及び自己の分子の両方の実際的に無限の多様性を考慮した場合に明らかになり、病原性生物は、Ｔ細胞による検出を逃れるための進化圧力の下にある。
【０００３】
Ｔ細胞レセプター(TCR)
Ｔ細胞は、主として、Ｔ細胞レセプター(TCR)の発現により規定される。TCRは、Ｔ細胞適応免疫の標的と相互作用しそれを感知する役割を担うＴ細胞の成分である。一般的に言えば、TCRは、細胞表面で提示されるヘテロ二量体タンパク質複合体で構成される。２つのTCR鎖の各々は、共に免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインに属し、逆並行βシートを形成する可変(Ｖ)領域及び定常(Ｃ)領域である２つの細胞外ドメインで構成される。これらは、短い細胞質尾部に隣接するＩ型膜貫通ドメインにより細胞膜に係留されている。多様な分子構成成分に適応してそれを検出するＴ細胞の素質は、Ｔ細胞発生中に生じるTCR鎖におけるバリエーションから生じる。このバリエーションは、Ｂ細胞における抗体発生に類似の様式で体細胞組換えにより生じる。
【０００４】
TCR鎖多様性
Ｔ細胞プールは、幾つかの機能及び表現型が不均質な下位集団からなる。しかし、Ｔ細胞は、その表面で発現される体性再編成TCRアイソフォームに従ってαβ又はγδに大きく分類できる。２つのTCR鎖対アイソフォーム、すなわちTCRα(TRA)とTCRβ(TRB)との対、及びTCRガンマ(TRG)とTCRデルタ(TRD)との対が存在する。TRA:TRB対を発現するＴ細胞はαβＴ細胞と呼ばれ、TRG:TRD対を発現するＴ細胞は、しばしばγδＴ細胞と呼ばれる。
αβ及びγδ形のTCRは、共に多様なリガンド、すなわち「抗原」の認識を担い、各Ｔ細胞は、Ｔ細胞成熟中にαβ又はγδレセプター鎖を新たに生じる。これらの新たなTCR鎖対は、体細胞V(D)J組換えと呼ばれるプロセスにおいてレセプター配列多様性を生じることにより認識の多様性を達成し、体細胞V(D)J組換えの後に各Ｔ細胞は、別個に再編成された単一TCRのコピーを発現する。TRA及びTRG遺伝子座では、幾つかの分離した可変(Ｖ)及び機能的(Ｊ)遺伝子セグメントが組換えのために利用可能であり、定常(Ｃ)遺伝子セグメントに並置されるので、VJ組換えと呼ばれる。TRB及びTRD遺伝子座での組換えは、更に、多様性(Ｄ)遺伝子セグメントを含むので、VDJ組換えと呼ばれる。
組換えられた各TCRは、αβＴ細胞の場合にα及びβ鎖、又はγδＴ細胞の場合にγ及びδ鎖により形成されるリガンド結合部位の構造により決定される、ユニークなリガンド特異性の能力を有する。TCRの構造多様性は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、各鎖の３つの短いヘアピンループに主に限定される。３つのCDRは、レセプター鎖対の各鎖からもたらされ、これらの６つのCDRループはまとめて、TCR細胞外ドメインの膜から遠い末端に存在して、抗原結合部位を形成する。
各TCR鎖における配列多様性は、２つの形態で達成される。第一に、組換えのための遺伝子セグメントの無作為選択は、基本的な配列多様性をもたらす。例えば、TRB組換えは、47のユニークＶ、２のユニークＤ及び13のユニークＪ生殖系列遺伝子セグメントの間で起こる。一般的に、Ｖ遺伝子セグメントは、CDR1及びCDR2ループの両方に貢献し、よって生殖系列にコードされている。配列多様性を生じるための第２の形態は、組み換えられるＶ、(Ｄ)及びＪ遺伝子セグメントの間の接合部にて鋳型ヌクレオチドの無作為欠失及び非鋳型ヌクレオチドの付加により生じる超可変CDR3ループ内で起こる。
【０００５】
TCR:CD3複合体
成熟αβ及びγδTCR鎖対は、ε、γ、δ及びζと呼ばれる幾つかのアクセサリーCD3サブユニットと一緒に複合体として細胞表面にて提示される。これらのサブユニットは、αβ又はγδTCRと一緒に３つの二量体(εγ、εδ、ζζ)として会合する。このTCR:CD3複合体は、αβ又はγδTCRと同族抗原との結合の際に細胞シグナル伝達応答を開始するためのユニットを形成する。TCR:CD3複合体として結合したCD3アクセサリーは、免疫レセプター活性化チロシンモチーフ(ITAM)と呼ばれるシグナル伝達モチーフに貢献する。
CD3ε、CD3γ及びCD3δは各々、単一のITAMに貢献するが、CD3ζホモ二量体は３つのITAMを含む。TCRと共に組み立てられる３つのCD3二量体(εγ、εδ、ζζ)は、よって、10のITAMに貢献する。同族抗原とのTCRライゲーションの際に、直列型チロシン残基のリン酸化は、重要な70kDaのζ鎖関連タンパク質(ζ-chain-associated protein of 70 kDa；ZAP-70)のようなSrcホモロジー２(Scr homology 2；SH2)ドメインを含むタンパク質のための対形成したドッキング部位を創出する。このようなタンパク質の動員は、Ｔ細胞活性化及び分化を最終的に担うTCR:CD3シグナル伝達複合体の形成を開始する。
【０００６】
αβＴ細胞
αβＴ細胞は、一般的に、ヒトにおいて、対応するγδＴ細胞よりも豊富に存在する。αβＴ細胞の多くは、細胞表面でHLA複合体により提示されるペプチド抗原と相互作用する。ペプチド-HLA(pHLA)認識Ｔ細胞は、最初に記述され、最もよく特徴決定されている。αβＴ細胞のより稀な形も記述されている。粘膜関連インバリアントＴ(MAIT)細胞は、比較的限定されたα及びβ鎖多様性を有するとみられ、タンパク質断片よりもむしろ細菌代謝産物を認識する。インバリアントナチュラルキラーＴ細胞(invariant natural killer T-cell；iNK Ｔ細胞)及び生殖系列によりコードされるミコリル反応性Ｔ細胞(germline-encoded mycolyl-reactive T-cell；GEM Ｔ細胞)は、非HLA分子により交差提示される糖脂質の認識に限定される。iNK Ｔ細胞は、大部分が、CD1dにより提示される糖脂質と相互作用すると考えられるが、GEM Ｔ細胞細胞は、CD1bにより提示される糖脂質と相互作用する。更に別の形のＴ細胞は、CD1a及びCD1cに関連付けられた糖脂質と相互作用すると考えられるが、このような細胞は、まだ詳細に特徴決定されていない。
【０００７】
通常型αβＴ細胞
ほとんどのαβＴ細胞の重要な特徴は、HLA分子に関連したペプチド抗原の認識である。これらは、しばしば、「通常型」αβＴ細胞と呼ばれる。個体内で自己HLA分子は、自己及び外来タンパク質からのペプチドをＴ細胞に提示し、悪性病変及び外来病原体に対する適応免疫、共生生物、食物及び自己に向けての適応寛容のための必須の基礎を提供する。HLAタンパク質をコードするHLA遺伝子座は、ヒトゲノムのうちで最も遺伝子密度が高く、多型性の領域であり、ヒトにおいて12,000を超えるアレレが記載されている。HLA遺伝子座における多型の程度が高いことにより、個体間のペプチド抗原提示の多様性が確実になり、このことは、集団レベルでの免疫のために重要である。
【０００８】
HLAクラスＩ及びII
２つの形の古典的HLA複合体、すなわちHLAクラスＩ(HLAI)及びHLAクラスII(HLAII)が存在する。３つの古典的HLAI遺伝子、すなわちHLA-A、HLA-B及びHLA-Cが存在する。これらの遺伝子は、インバリアントβ2ミクログロブリン(β2Ｍ)鎖と会合する膜貫通型α鎖をコードする。HLAIα鎖は、免疫グロブリンフォールド型の３つのドメイン、すなわちα1、α2及びα3で構成される。α3ドメインは、膜の近くにあり、大部分がインバリアントであるが、α1及びα2ドメインは一緒になって、多型の膜から遠くにある抗原結合窩を形成する。６つの古典的HLAII遺伝子、すなわちHLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA及びHLA-DRB1が存在する。これらの遺伝子は、α鎖及びβ鎖を含む、対形成したDP、DQ及びDRヘテロ二量体HLA複合体をコードする。各鎖は、免疫グロブリンフォールド型の２つの主要な構造ドメインを有し、ここで、α2及びβ2ドメインは、HLAIα3ドメインのものに類似の、膜に近い大部分がインバリアントのモジュールを含む。HLAIIα2及びβ2ドメインは一緒になって、膜から遠くにある抗原結合窩を形成し、多型性が高い領域である。
HLAI及びHLAIIの抗原結合窩は、８つの逆平行βシートのプラットフォーム上に２つの逆平行αヘリックスを含む。この窩において、ペプチド抗原が結合し、伸ばされた立体構造で提示される。HLAI及びHLAIIにおけるペプチド接触残基は、ほとんどの配列多型の場所であり、これは、異なるHLAアレレにより提示される多様なペプチドレパートリーの分子的基礎を構成する。ペプチドは、抗原結合窩と広範囲で接触し、その結果、各HLAアレレは、提示されたペプチドに対する別個の配列制約及び優先性を課す。所定のペプチドは、よって、限定された数のHLAとだけ結合し、相互的に、各アレレは、所定のタンパク質からのペプチドコレクションの特定の画分だけを受け入れる。各個体に存在するHLAI及びHLAIIアレレのセットは、HLAハプロタイプと呼ばれる。HLAI及びHLAII遺伝子の多型並びに遺伝性のアレレの相互優性発現は、ヒト集団全体にわたるHLAハプロタイプの非常に大きい多様性を駆動し、これは、αβTCRの莫大な配列多様性と組み合わせた場合に、これらのHLA-抗原-TCR相互作用の分析の標準化のために大きな障害となる。
【０００９】
HLAI及びHLAIIのαβTCR結合
αβTCRは、HLA及びペプチド抗原(変化した自己)の両方の残基により形成される混合pHLA結合界面の一部としてペプチドを認識する。HLAI複合体は、ほぼ全ての有核細胞の表面に提示され、内因性タンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。Ｔ細胞は、よって、相互作用細胞のpHLAI複合体をサンプリングすることにより、HLAI提示細胞の内因性細胞性プロテオームを調べることができる。HLAIの結合は、相互作用Ｔ細胞によるTCR共レセプターCD8の発現を必要とするので、HLAIサンプリングは、CD8+αβＴ細胞に制限される。これとは対照的に、HLAII複合体の表面発現は、プロフェッショナルAPCに主に制限され、提示細胞にとって外因性のタンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。相互作用Ｔ細胞は、よって、提示細胞が存在する細胞外微小環境のプロテオームを調べることができる。HLAIIの結合は、相互作用Ｔ細胞によるTCR共レセプターCD4の発現を必要とするので、HLAIIサンプリングは、CD4+αβＴ細胞に制限される。
【００１０】
αβTCRの胸腺選択
上記のαβTCRの役割は、pHLA複合体の検出であり、TCR提示Ｔ細胞は、確立された免疫におけるそのＴ細胞の役割と密接な関係がある応答を高めることができる。個体において生じたαβTCRレパートリーは、特定のハプロタイプと関連して、多様性が実際に起こる前に遭遇する可能性が高い全ての外来抗原の巨大で予測できない多様性の理由であるはずである。この結果は、自己pHLAとの強い相互作用を回避するように特異的に教授されただけで特定されていないpHLA複合体を認識する能力を有して非常に多様で多数のαβTCRがある程度無作為化された様式で生じる背景に対して達成される。これは、胸腺選択と呼ばれるプロセスにおいてＴ細胞成熟中に注意深く調整される。
胸腺におけるＴ細胞成熟の第１の工程中に、十分な親和性をもって自己pHLA複合体と相互作用できないαβTCRを有するＴ細胞は、生存シグナルを奪われ、排除される。ポジティブ選択と呼ばれるこの工程により、正しいHLAに関連付けられて提示される外来又は変化したペプチドを少なくとも認識できる可能性があるTCRレパートリーを生存Ｔ細胞が確実に有することになる。その後、自己pHLAと強く相互作用し、よって自己免疫を駆動する能力を有するαβTCRは、ネガティブ選択のプロセスにより能動的に除去される。ポジティブ及びネガティブ選択のこの組合せは、末梢にある自己pHLAに対する低い親和性を有するαβTCRを有するＴ細胞だけをもたらす。これは、自己に制限されるが自己反応性ではないαβＴ細胞レパートリーを確立する。HLAハプロタイプに対するＴ細胞発生のこの高度に個別化された性質は、αβTCR-抗原-HLA相互作用の標準化された分析における困難を強調する。更に、これは、移植片拒絶及び移植片対宿主病の両方の基礎、並びに一個体において同定されるαβTCRが第２の個体において完全に異なる影響を有し得るという一般的な原理の基礎を形成し、このことは、実際の臨床において現れるTCRベース及びＴ細胞ベースの治療及び診断方策について明確な意味を有する。
【００１１】
非通常型αβＴ細胞
αβＴ細胞の非HLA拘束又は「非通常型」の形は、非常に異なる分子抗原標的を有する。これらの非通常型αβＴ細胞は、古典的HLA複合体を結合させないが、CD1ファミリー又はMR1のような保存されたHLA様タンパク質を結合させる。CD1ファミリーは、抗原交差提示に関与する４つの形(CD1a、ｂ、ｃ及びｄ)を含む。これらの細胞表面複合体は、HLAIによく似たα鎖を有し、これがβ2Ｍとヘテロ二量体を形成する。α鎖の膜から遠い表面で提示される小さい疎水性ポケットは、病原体由来の脂質ベースの抗原のための結合部位を形成する。自然様NK Ｔ細胞(innate like NK T-cell；iNK Ｔ細胞)は、脂質/CD1ファミリー認識の最もよく理解された例であり、GEM Ｔ細胞は、別の顕著な例を表す。「Ｉ型」iNK Ｔ細胞は、CD1dに関連付けられた脂質α-GalCerと強く相互作用することが知られている。これらのiNK Ｔ細胞は、固定されたTCRα鎖(Vα10/Jα18)及び限定された数のβ鎖(制限されたvβ使用を有する)を有する非常に限定されたTCR多様性を示し、これらは、Toll様及びNod様レセプターのような自然の病原体関連分子パターン(PAMPS)認識レセプターになぞらえられている。これとは対照的に、「II型」NK Ｔ細胞は、より多様なTCRレパートリーを示し、より多様な形態のCD1d-脂質複合体結合を有するとみられる。GEM Ｔ細胞は、CD1bにより提示されるマイコバクテリア由来糖脂質を認識するが、CD1a、ｂ及びｃによる抗原提示並びにそれらのＴ細胞認識の分子的な詳細は、理解され始めたばかりである。
MAIT細胞は、インバリアントTCRα鎖(TRAJ33、TRAJ20又はTRAJ12とライゲーションされたTRAV1-2)を主に発現し、該鎖は、一連のTCRβ鎖と対形成できる。ペプチド又は脂質の代わりに、MAIT TCRは、HLAI様分子であるMR1により提示される病原体由来葉酸及びリボフラビンベースの代謝産物と結合できる。MAIT TCRについて観察されるTCRにおける限定されているが著しい多様性は、保存されたMR1に関連付けられた多様であるが相関する代謝産物の認識を可能にするとみられる。
非古典的HLA拘束αβＴ細胞TCRがどのようにして成熟中に胸腺において選択されるのか、よく理解されていない。しかし、上で概説したネガティブ及びポジティブ選択の基本的なプロセスが当てはまるようであり、胸腺内で特殊化した適所においてこのことが生じることを示唆するいくらかの証拠がある。
【００１２】
γδＴ細胞
αβTCR発生及びpHLA結合の詳細な機械論的理解とは対照的に、抗原標的及びそれらのγδＴ細胞対応物の関係性については比較的ほとんど知られていない。このことは、循環Ｔ細胞区画中のそれらの量が比較的低いことが理由の一つである。しかし、γδＴ細胞は、厳密にHLA拘束されないと広く考えられており、抗体と同様に、より自由に表面抗原を認識するとみられる。加えて、より最近では、γδＴ細胞は、外来抗原との免疫系の主な相互作用部位である上皮組織の常在型Ｔ細胞区画を支配できることが認識されるようになってきている。更に、γδＴ細胞腫瘍免疫監視及び調節不全になった自己のその他の形の監視機構についての様々な機序が文献において明らかにされ始めている。自然様及び適応γδＴ細胞の両方の特異的抗原標的は、まだほとんど定義されていないが、PAMPの組織分布及び迅速な認識は、外来抗原に対する応答の初期及び適応免疫系がまだ成熟中の生命の初期の両方におけるγδＴ細胞の基本的な役割を示唆する。
γδＴ細胞の多様な機能は、異なるVγVδ遺伝子セグメント使用に基づくとみられ、γδＴ細胞が主にインバリアントTCRと一緒に、感染中の非常に初期にPAMPの自然様認識を媒介する２つの主なカテゴリーにおいて広く理解できる。PAMP以外に、これらのタイプのγδＴ細胞は、更に、細胞ストレス、感染及びおそらく腫瘍発生の非常に初期のサインを与え得るリン酸抗原を含む自己分子を認識すると考えられている。PAMP及びこのようないわゆる損傷関連分子パターン(danger associated molecular pattern；DAMPS)並びに多数の組織拘束自然様γδＴ細胞の認識は、これらの細胞が、予め活性化、ホーミング及びクローン増殖を必要とせず抗原負荷に対して迅速に応答するのに適していることを強く示唆する。
【００１３】
γδＴ細胞の第２の形は、実際はより適応性があり、非常に多様性のγδTCRレパートリー及び末梢を循環してリンパ系組織に直接アクセスする能力を有すると考えられている。このような抗原特異的γδＴ細胞は、CMVのような一般的なヒト病原体について記載されており、メモリー応答を形成するとみられる。しかし、γδＴ細胞は、活性化の後に比較的限定されたクローン性増殖のみを示し、末梢循環又は組織におけるTCR多様性及びγδＴ細胞の特異的応答の程度についてはほとんど利用可能なデータはない。更に、γδTCRはpHLA複合体と相互作用せず、よって、この状況においてペプチド抗原と結合しないと一般的に考えらえているが、γδＴ細胞の幾つかの抗原標的だけが特徴決定されており、根底にある分子フレームワークはわずかに理解されているだけである。
【００１４】
末梢γδＴ細胞の頻度が低いこと及びヒトにおける組織常在性Ｔ細胞を研究することが困難であることのために、この重要で多様なタイプのＴ細胞がどのようにして適応免疫応答に参加するのかについての我々の知識が制限されてきた。この台頭してきた研究領域は、稀なγδＴ細胞を捕捉して特徴決定し、それらのTCR対を単離し、それらの同族抗原を同定する、より信頼できる技術を必要とする。
【００１５】
抗原及び抗原提示細胞
Ｔ細胞及びTCRとの関係において、抗原は、TCRと結合でき、Ｔ細胞内のシグナル伝達をもたらす任意の分子と定義できる。最もよく特徴決定されているＴ細胞抗原は、HLAI及びHLAII複合体において提示され、通常型αβＴ細胞と結合するペプチドである。しかし、近年、非通常型αβＴ細胞及びγδＴ細胞が抗原として広範囲の生体分子、例えば脂質、リポペプチド、糖ペプチド、糖脂質並びに一連の代謝産物及び異化産物を結合できることが明らかになってきた。更に、γδＴ細胞が、抗体様の様式で完全にフォールドされたタンパク質と直接結合できることが明らかになってきた。よって、Ｔ細胞抗原がHLAにより提示されるペプチドに主に拘束されるという視点は、過去20年間で、ほぼ全ての生体分子を含むように拡大されている。この概念を念頭に置いて、何を抗原提示細胞(APC)と考えることができるかを定義することが適切である。
抗原及び抗原提示細胞
【００１６】
前出のセクションで定義したように、HLAI及びHLAIIは、細胞型全体にわたって共通点のない発現プロファイルを有する。ほぼ全ての有核細胞が細胞表面でHLAI複合体を提示し、よって、Ｔ細胞サンプリングのためにペプチド抗原を提示する能力があることが広く受け入れられている。これとは対照的に、HLAIIは制限された発現プロファイルを有し、少なくとも定常状態条件において、樹状細胞(DC)、マクロファージ及びＢ細胞を含む抗原提示の専門的な役割を有する細胞の表面でだけ発現される。これらの専門細胞型は、しばしばプロフェッショナルAPCと呼ばれる。この文書の目的のために、用語「APC」は、αβ又はγδＴ細胞によるサンプリングのために抗原を提示できる任意の有核細胞を表すために用いる。このような抗原は、特異的抗原提示複合体、例えばHLA及びHLA様分子において「カーゴ」として提示されるものに限定されないが、αβ又はγδTCR保有細胞と結合できる任意の細胞表面提示部分を含むことができる。
【００１７】
TCRの治療への使用
初代Ｔ細胞の養子移入は、免疫不全患者にウイルス免疫を与えるために、ウイルス抗原に向かう、エクスビボで増殖させたＴ細胞をまず用いて、1990年代初期に臨床背景において初めて試験された。特定のがん抗原に対してエクスビボで増殖させた初代Ｔ細胞を用いる同様のアプローチが、そのすぐ後に悪性腫瘍の処置において試験された。現在でも課題であり続けるこれらの初期のアプローチにおけるある限界は、治療製品において組成を精細に最適化する必要性と対立する、Ｔ細胞の性質及び多様性についての理解の欠如である。現在、エクスビボで増殖させた初代Ｔ細胞の使用は、ウイルス抗原に対する特異性を有する初代Ｔ細胞を用いる一握りのイニシアティブ以外は、製薬業界においてほぼあきらめられている。
【００１８】
近年、遺伝物質を初代ヒト細胞に安定して導入する能力により、実験的遺伝子改変Ｔ細胞治療剤の種類が増えてきている。このような治療用細胞製品は、Ｔ細胞応答の力を利用し、Ｔ細胞特異性を疾患関連抗原標的、例えば悪性細胞によってのみ発現される抗原に向けなおすことを目的とする。これらは、実際のTCR鎖対ではなく、キメラ抗原レセプター(CAR)をレシピエントＴ細胞に移入することに主に頼っている。CARは、CD3-TCR機能を模倣する合成キメラレセプターを生成するための、シグナルレセプターエレメント、例えばCD3複合体のζ鎖にグラフトされた標的化部分(多くの場合、悪性細胞の表面発現タンパク質を標的にする一本鎖抗体エレメント)である。これらのいわゆるCAR Ｔ細胞(CAR-T)製品は、現在までに臨床試験においてまちまちの成功度を示しており、その可能性にもかかわらず、固有のユニークな分子標的を有する腫瘍、例えばＢ細胞悪性病変を超えて解釈することは容易ではない。代わりに、全長TCR鎖対ORFをＴ細胞に移入することについての興味が増えてきている。このようなTCRが操作されたＴ細胞治療剤は、困難な製造プロセスや、CAR-T製品と同様に、確認された抗原標的及び標的化構築物の欠如により現在制限されている。現在までに、悪性細胞上のHLAIにより提示されるペプチド抗原の認識のためのαβTCRの使用に焦点が当てられており、このアプローチの基本的な困難は、悪性細胞に特異的な抗原が必要であるということである。
【００１９】
TCR-pHLA相互作用が比較的低親和性のものであるので、天然型TCRは、TCRが操作されたＴ細胞療法のために最適ではないようであると考えられている。幾つかのアプローチが、一本鎖抗体親和性成熟と同じ方法で、インビトロで親和性成熟TCRのために考案されている。これらのTCR親和性成熟アプローチも、一般的に、一方の鎖のＶ領域を別の鎖のＶ領域に融合させて単一ポリペプチド構築物を作製する一本鎖フォーマットを用いる。このような単一ポリペプチドを、次いで、抗体操作ワークフローから適応させたファージ又は酵母ディスプレイシステムにおいて用いることができ、標的結合に基づく何回かの選択を経ることができる。このような一本鎖TCRアプローチにおいて、機能的TCR鎖対を得る点において２つの固有の限界が存在する。第一に、選択が標的との結合親和性に基づくことである。しかし、TCR親和性がTCRシグナル伝達出力の強さ又は能力と常に相関するわけではないことが十分に文書化されている。第二に、親和性に基づく一本鎖構築物の選択が、それらが全長レセプターとして一旦再構成されると、等価な親和性であると常に解釈されない。
【００２０】
治療との関係において、親和性成熟化TCR対において更なる重要な限界が存在する。つまり、それらの配列が変更されたことを考慮すると、定義による得られた構築物はもはや胸腺選択に供されず、ここで、自己抗原と強く反応するTCRは、レパートリーから削除される。よって、これらの改変TCRは、自己反応性である固有の危険性を有し、この危険性を、現在の方法を用いてインビトロで除くことは非常に難しい。同じ理由により、治療用途のための選択されたか又は操作されたTCRはいずれも、個別化される必要がある。もしTCRが人工的に操作されるか又は天然型TCRが個体にわたって用いられるならば、破滅的な可能性がある自己免疫を回避するために、特定の各個体のHLAハプロタイプ及び提示されるペプチドレパートリーに基づいて交差反応性を除かなければならない。このことは、胸腺選択が、その所定の個体にのみ特異的な全ての利用可能なHLA分子の背景において行われるという事実のためである。このような交差反応性の可能性は不明である。しかし、我々のTCRレパートリーが、同じ種の他の個体のpHLA複合体を外来であると認識する能力は、適応免疫の基本的な特性であり、移植片拒絶及び移植片対宿主病を支持する。がん特異的黒色腫関連抗原(MAGE)に対する成熟TCR鎖対を用いる最近の臨床試験は、胸腺選択を迂回することの潜在的な問題に光を当てた。成熟TCRを有する自家Ｔ細胞を２名のがん患者に注入して戻したとき、これらの患者は、致命的な心臓疾患を迅速に発症した。その後の研究により、MAGE特異的成熟化TCRは、心臓タンパク質であるタイチンからのHLAIにより提示されるペプチドと交差反応性であったことがわかった。このことは、交差反応性は、TCRの治療への使用において別個の可能性であることを強く示唆する。
【００２１】
TCRを治療目的のために利用するための別の達成手段は、抗体治療用物質とほぼ同じ方法でそれらを親和性反応剤として用いることにある。一本鎖TCR分子は、コンジュゲート薬物物質を特定のHLA-抗原発現細胞集団に送達するために試験されている。このようなアプローチは、一般的に、CAR-T又はTCRが操作されたＴ細胞療法より安全であると考えられている。なぜなら、薬物物質の投与を単純に撤回することができるからである。しかし、交差反応性の可能性及び予測困難なオフターゲット効果により、この背景における可能性のある限界がまだ存在する。
【００２２】
臨床診断におけるTCRレパートリー検出
関連する観点において、臨床診断目的のために特定のTCR配列の量の検出を用いることに対する興味が増加している。特にディープシーケンシング法の台頭につれて、ある個体内の全体の、そして特定の関係におけるマッチするαβ対についての完全なTCR多様性を把握することが可能である。このことは、患者における疾患関連抗原に対する免疫応答の確立のための代理の読み出しとして、増殖したＴ細胞クローンの量を単に検出することにより特定の状態及び疾患状態を診断するための手段になる可能性がある。しかし、このような包括的なアプローチは、確立された臨床タイムポイントを有する非常に強い免疫応答に現在のところ限定されており、配列決定により同定された任意の特定のTCRの特異的抗原標的を同定することの根底にある困難に苦しんでいる。
【００２３】
Ｔ細胞抗原の治療及び診断のための使用
適応免疫応答を活用する基本的な強さは、TCR-抗原相互作用の精巧な特異性が、各病原体、がん細胞又は自己免疫疾患に特異的に関連する抗原についての詳細な知識を必要とするという中心的な技術的困難と言い換えられる。更に、各抗原は、特異的抗原提示複合体又はそのアレレにより提示され得るので、抗原の発見は、関連する各HLA遺伝子及びアレレについて行わなければならない。強い適応免疫応答と関連し、保存されたエピトープ応答階層を一般的に示すHIV、インフルエンザ及びCMVのような幾つかの感染性疾患について、最も重要なエピトープが、幾つかの一般的なHLAと関連付けられてマッピングされている。同様に、がん、アレルギー及び自己免疫の分野において、関連Ｔ細胞抗原をマッピングする系統的な試みが増えてきている。しかし、これらは、困難な手順であり、異なる臨床状況と関連するＴ細胞抗原を系統的に表す努力は、効率的で確固とした迅速で適応性のあるプロトコールが存在しないことにより妨げられている。
特に、がん細胞は、困難で重要な態様である。なぜなら、悪性細胞の表面で提示されるペプチドのほとんどは自己抗原であるか又は自己抗原に非常に類似しているからである。よって、胸腺選択は、これらのペプチドを強く認識しうるTCRを削除するであろう。それと同時に、腫瘍は免疫認識を逃れるように発展する。このことは、確立された腫瘍に対する有力な免疫応答が比較的稀であり、標的を予測又は発見することが難しいことを意味する。しかし、これらの応答は存在し、そして重要なことには、通常、よりよい結果と関連している。このような応答の標的、腫瘍関連抗原(TAA)は、ほとんどの場合、自己からの区別可能な特徴を有し、がん発展中に過剰発現されるか、発展のこの段階では細胞型に存在しないか、又は遺伝子変異若しくは翻訳後改変、例えばリン酸化により特異的に変更されたタンパク質に由来する。
【００２４】
利用可能な場合、このようなエピトープの知識により、基礎的な発見、診断目的のため及び例えばワクチン効力の試験として関連するＴ細胞応答を調べることが可能になる。重要なことに、これらは、アレルギー及び自己免疫におけるＴ細胞寛容化のための高度に特異的な標的と、重大なことに、特異的免疫療法のため及び悪性細胞に対抗する価値のある標的に向かう点とを提供する。悪性病変は、細胞免疫療法の有望性として特に価値のある標的であり、Ｔ細胞操作における進展は、がんのタイプについての特異的マーカーがたまたま利用可能である幾つかの場合を超える確認された標的TAAの欠如により遅くなる。
細胞療法の可能性及び確認された標的の欠如に鑑みて、見込のあるTCR抗原の同定は、いまだに、特に癌を処置するための努力におけるTCRに基づく免疫療法の最も急を要する障害の一つである。
【００２５】
TCR及びＴ細胞抗原分析の技術的観点
全体として、TCRに基づく療法の発展はまだその初期段階であり、限定された成功しかしていない。とてつもない可能性があるが、診断的アプローチは、患者の疾患状態又は療法に対する応答を評価することを目的とする比較臨床研究においてほとんど実施されていない。天然型TCR鎖対の安定した捕捉と、高スループットにて細胞同士のコミュニケーションの機能的関係におけるTCR-抗原相互作用の系統的な分析とについて十分に発展していない技術は、TCRに基づく療法及び診断の発展のための主な障害である。
【００２６】
ディープシーケンシングアプローチにより、健常及び疾患におけるＴ細胞レセプター多様性についての理解が改善されている。しかし、これらのアプローチは、主にTCRβ鎖のCDR3領域にわたる短い区間に一般的に焦点を当てている。ほとんどの研究は、TCRα鎖の寄与を無視しており、対合したαβ鎖及び興味の対象と決定されたTCRの抗原特異性を分析しようとしたものはほとんどない。単細胞封入及び遺伝子バーコーディングを用いる最近のワークフローにより、天然型TCRαβまたγδ鎖対の対形成及び全長配列の分析が可能になっているが、このようなワークフローは、まだ実験段階である。
【００２７】
単離TCR鎖対は、生物物理学的又は機能的形態のいずれかで抗原特異性の点で分析できる。生物物理学的分析は、TCR及び分析物抗原の両方を可溶形で組換え生成することを必要とする。HLA拘束TCRの場合、このことは、よって、全ての個別のTCR及び同族pHLA複合体の生成を必要とするであろう。このことは、技術的に非常に困難であり、遅くてスループットが低い。更に、このような分析は、相互作用親和性のみを与え、これは予測可能な様式での機能的特徴との関連が低い。
最近まで、細胞との関係での単離TCR配列の詳細な機能解析は、初代Ｔ細胞又は不死Ｔ細胞株への分析物TCR鎖対のトランスフェクションと、細胞活性化の伝統的なフローサイトメトリ分析による細胞応答の検出又は抗原負荷の際のトランスフェクションされた細胞から分泌される因子の検出という面倒なプロトコールにより制限されてきた。Guoらによる最近の発表において、単細胞からの対形成したTCR鎖の迅速なクローニング、発現及び機能的特徴決定が報告された(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054)。この研究では、分析物ヒトαβTCR対を、αβTCR発現が欠如したレポーター細胞株で発現させているが、これは、TCR刺激の際に活性化されるNur77プロモーターと連結した緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター系を含んでいた。この系は、レポーター細胞株ゲノムへの標準化されたTCR組込みの欠如のために、まだ非効率であり、APCエレメントによる細胞に結合した抗原負荷のための系統的な方法を提供しない。
【００２８】
既知のＴ細胞抗原に対するTCRの同定についてのワークフローと同様に、健常及び疾患における新規なＴ細胞抗原のデノボ発見は、まだ非常に困難である。ほとんどのアプローチは、いまだに実際は生物物理学的であり、免疫化プロトコールにおいて試験しようとする候補抗原を、又は上記のように同族TCRの同定により生成することを狙いとする。Ｔ細胞抗原発見の分野における標準化はほとんど又は全く存在せず、この分野は、ほとんど学術研究に限定されている。
【００２９】
治療及び診断のための使用の両方においてTCR及びそれらの同族に対する興味の蓄積、並びに著しい数の天然型TCRαβ及びγδ鎖対を捕捉する手段の出現につれて、TCR-抗原相互作用の系統的解析のための信頼できる高スループットで標準化された技術がまだ欠如している。重要なことに、TCR及び抗原が共に生細胞により提示される細胞間コミュニケーションの天然の状況におけるTCR鎖対の機能解析のための標準化されたシステムが欠如している。更に、細胞間コミュニケーションの関連する状況におけるTCR候補の選択及び/又はTCR鎖対の親和性成熟を達成できるシステムが欠如している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
記載したように、天然型の細胞状況で発現されるTCR対を有する細胞の高スループット作製のための標準化された技術を現在欠いている。全長TCR対を単一コピーとしてTCR提示細胞のゲノム中に挿入し得、その結果、前記TCRが分析及び選択のために天然型CD3細胞表面複合体で提示されるシステムを有することは非常に望ましい。CD3複合体により提示されるTCR対は、親和性分析が、単鎖TCR及び他の非天然型TCRディスプレイ技術の場合ではない、実際の天然型TCR組成を反映するものであることを確実にする。更に、生存細胞におけるCD3複合体でのTCR対の提示は、TCR対の機能的分析に絶対的に必要なことである。機能的分析(TCRシグナル伝達出力の分析を意味する)は、TCR選択及び遺伝子操作ワークフロー(シグナル出力が、一般に、細胞治療薬に関する使用に最も重要なパラメーターである)において決定的に重要であり、他のディスプレイプラットフォームで決定されるように、同族抗原/HLAとのTCRの親和性と十分に相関付けられていない。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は上記の必要性に取り組むものである。詳細には、本発明は、TCR及びＴ細胞抗原の発見及び特徴決定に用いられる、遺伝子操作された多成分細胞システムの構築及び使用に関する。多成分システムは、少なくとも、遺伝子操作されたＴ細胞レセプター(TCR)提示細胞(eTPC)、遺伝子操作されたゲノム受容部位及びマッチする遺伝子ドナーベクターである３つの成分で構成される。本発明は、全長TCR対を被分析物抗原に提示する安定な派生細胞(eTPC-t)の迅速で高スループットな作製に用いられる。加えて、eTPCは、少なくとも１つの遺伝子操作されたゲノム受容部位を含有する。この部位は、TCR対をコードし、マッチした遺伝子ドナーベクターにより送達される遺伝物質の迅速で安定な組込みに用いられる。eTPCはまた、TCR刺激のインビトロ検出のための任意成分 TCR刺激応答エレメントを含んでいてもよい。多成分システムは、臨床免疫診断における分析システムの鍵となるTCR中心エレメントを編成するために用いてもよい。更に、本発明は、前記同定され特徴付けられたTCR対配列の、免疫療法剤及び免疫診断剤の製造のための使用に関する。
【００３２】
本発明により、系統化された様式での種々の被分析物eTPC形態の組立てのための高度に標準化されたシステムが可能となる。この標準化及びシステム化は、マッチしたドナーベクター/ゲノム受容部位サブシステムを用いる、TCR鎖ORFの高度に規定され制御可能なゲノム組込みにより達成される。この制御可能で予測可能なシステムは、細胞表面で被分析物TCRを発現する分析eTPC集団を生成するプロセスに顕著な効率性をもたらし、無誘導のゲノム組込み及び/又はウイルスアプローチを用いるランダムな組み込みに依拠していた以前のシステムと比較して、このプロセスのサイクル時間及びコストを低減させる。更に、システムのデザインは、部分的には、組み込まれたTCR ORFの制御可能なコピー数、通常は各鎖の単一コピーを確実にすることであり、これにより、組み込まれた表面発現TCRの発現レベルの厳格な管理が可能となる。このことは、TCR対集団の相対的親和性又はシグナル伝達出力の分析について重要な側面である。更に、
ベクタープールからTCR ORFを単一コピーで組み込む能力により、いわゆる「ショットガン組込み」(ドナーベクターが組み込まれた各細胞は、多様なTCR ORF集団をコードする可能性があるベクターのライブラリーから単一ORFのみを受容し得る)が可能となる。このことにより、ドナーベクターにコードされるTCR ORFライブラリーを、細胞表面に単一の所望の被分析物TCR対を発現するTPCライブラリー(本質的には、バクテリオファージ又は酵母ディスプレイシステムに似た細胞ベースアレイシステムである)へ変換することが可能になる。このアレイシステムは、単一被分析物TCR対がシークエンシングベースの同定のために回収することができる単一細胞において発現されることを確実にすることにより、特異的抗原に対するTCR配列の同定を容易にすることができ、及び/又はTCR配列のライブラリー内に含まれる抗原特異性を同定することができる。
【００３３】
eTPCの１つの更なる鍵となる観点は、抗原提示複合体の発現の欠失である。一般に、eTPCは、少なくともHLAクラスＩ発現を欠くように遺伝子操作されなければならない。このことは重要な特徴である。なぜならば、そのことにより、eTPC-tが発現するTCRに対するeTPC-tによる抗原の自己提示の可能性が排除されるからである。このことは、外因性遊離抗原の添加を利用するワークフローでの抗原特異的応答の検出における偽陽性率を低下させる。更に、このことにより、eTPC-tが被分析物抗原を自己提示する可能性を排除しつつ、特定のHLAを提示する被分析物APC細胞をeTPC-t及び混合培養系に直接添加される外因性抗原と予め混合し得る混合培養分析的ワークフローが可能となる。このことから、eTPC-t産物の柔軟性及び効率性が大いに改善される。
【００３４】
本発明は、その成分が１又は２以上の被分析物eTPC-tの製造に用いられる、遺伝子操作された多成分システムの提供に関する。これら被分析物eTPC-tは、その後、１又は２以上の出力を得るために、１又は２以上の被分析物抗原(まとめて、eTPC:抗原システム、eTPC:A)と組み合わされる。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により及び/又は可溶性又は不動化被分析物抗原として提供され、及び/又、非細胞ベースの粒子(NCBP)に提示される。
【００３５】
最小形態の多成分システムは、第１の成分eTPC(成分Ａと呼ぶ)及び第２の成分 遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)を含んでなる(図１)。
eTPCは、本システムの他の全ての成分が関係する、多成分システムの基本成分である。したがって、eTPCは、天然型であるか又は操作された或る特徴を含み、この特徴により、eTPCは、被分析物eTPC-t集団を作製するための使用に適切とされる。
【００３６】
eTPC、成分Ａは、
ｉ．TCRα、β、δ及びγ鎖の内因性発現を欠き、
ii．細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
iii．更なる成分(成分Ｂと呼ぶ)である、少なくとも１つの被分析物TCRα、β、δ又はγ鎖をコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム受容部位を含み、
ここで、ｉ)は、前記発現を欠く天然に存在する細胞集団の選択により取得されてもよいし、該発現を欠くように遺伝子操作されてもよく、ii)は、前記発現を含む天然に存在する細胞集団の選択により取得されてもよいし、該発現を含むように遺伝子操作されていてもよく、iii)は、遺伝子工学の手段によりゲノムに導入されていてもよい。このような細胞が得られる種々の手段を詳述する方法を図31〜37に示す。
【００３７】
天然に存在する細胞集団からのTCRα、β、δ及びγ鎖を欠くeTPC細胞候補の選択は、当該分野で周知の方法により達成できる。TCRα、β、δ及びγ鎖に特異的な親和性反応剤を用いる標的細胞の染色、並びにTCRα、β、δ及びγ鎖を欠く細胞の選択はこれを直接達成し得る。
TCRα、β、δ及びγ鎖発現を欠くようにeTPCを遺伝子操作することは、標的付けられていない又は標的付けられた手段により達成され得る。細胞の標的付けられていない変異誘発は、細胞に化学的、放射線又はその他の変異原を提供し、次いで、標的TCRα、β、δ及びγ鎖の発現を欠く細胞を選択することにより達成できる。ゲノム遺伝子座の標的付けられた変異は、
ｉ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii．CRISPR/Cas9媒介ターゲティング、
iii．合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む(が、これらに限定されない)異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座でDNA修復エラー変異誘発を誘導し、その後、変異細胞を、TCRα、β、δ及びγ鎖の発現を欠く細胞の選択により取得する。
【００３８】
CD3並びに成分Ｂ及び/又はＤの組込みのオプションは、当業者に周知であるが、相同性指向組換え(HDR)及び/又はランダム組込み法を含んでよく、ここで、HDRは、HDRが生じるゲノム遺伝子座の標的付けられた変異により促進され得、
ｉ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii．CRISPR/Cas9媒介ターゲティング、
iii．合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む(が、これらに限定されない)異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座でHDRによる部位特異的DNA修復を誘導する。この事象の後、一部の細胞は、組み込まれたHDRベクターを有し、以下：
iv．非破壊的表現型発現解析
v．破壊的表現型発現解析
vi．遺伝子解析
の任意の組合せにより選択及び/又は決定できる
ここで、iv及びviは、奏功するゲノム組込み事象の選択及び決定のための好ましい方法である。
或いは、ウイルスベクターを用いて、部位特異的又は非特異的様式で必要な成分を送達することができる。
【００３９】
eTPC成分Ａは、分析ワークフローにおいて被分析物抗原と共に用いるように設計されていことを考えると、好ましい態様では、eTPCは、このような分析に干渉するであろう因子を提示するeTPCを最小限にする特徴を含む。
eTPC成分Ａは、必要に応じて、被分析物 抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物 抗原性分子(aAM)の少なくとも１つのファミリーの内因性表面発現を欠き、表面発現の欠如は、標的被分析物抗原のマッチさせた分析(matched analysis)における干渉を最小化するように選択される。
aAPXのファミリーは、以下のいずれであってもよい：
ｉ．HLAクラスＩ
ii．HLAクラスII
iii．非HLA抗原提示複合体。
【００４０】
aAMは：
ｉ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ii．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
iii．成分Ａプロテオームの変更に由来するペプチド
iv．成分Ａプロテオームの変更に由来するポリペプチド
ｖ．成分Ａメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される。
成分Ａ eTPCは、必要に応じて、Ｔ細胞コレセプターを更に含んでよく、この特徴により、被分析物eTPCと被分析物APCとの強固な又は変化する形態のコミュニケーションが可能となり、整調可能なコミュニケーションは、特異的被分析物TCRsp及び/又は被分析物抗原の同定又は特徴決定に適切である。
【００４１】
本発明に関して、eTPC成分Ａは、必要に応じて、CD4及び/又はCD8を発現してよく、ここで、CD4又はCD8の発現は、それぞれHLAII型及びHLAI型のaAPXへの結合にeTPCを制限する。
eTPC 成分Ａは、必要に応じて、CD28及び/又はCD45を発現してよく、ここで、CD28及びCD45は、シグナル伝達に対するポジティブフィードフォワード効果によりシグナル感受性に寄与する一方、シグナル伝達に対するネガティブフィードバック効果によりシグナル特異性にも寄与し得る。なぜならば、これらは、発現された被分析物TCRspによりシグナル伝達に関係するからである。
成分Ａ eTPCは、必要に応じて、細胞表面接着分子成分の導入又は内因性細胞表面接着分子の除去を更に含んで、それぞれ、被分析物APCとのeTPCの結合及び免疫シナプスの形成を促進し、又はAPCが関与する分析ワークフロー内での堅固な結合及び有害な細胞クラスタリングの形成を回避してもよい。
成分Ａに追加のORFとして導入され得るか又は成分Ａから遺伝子除去され得る接着分子は、インテグリンファミリーの接着タンパク質から選択できる。
【００４２】
最小多成分システムの第２の成分は、少なくとも１つの被分析物TCR鎖をコードする少なくとも１つのORFの組込みに用いられる遺伝子ドナーベクター(成分Ｃ)である(図１)。
成分Ｃは、eTPC(成分Ａ)のゲノム内に含まれる成分Ｂのゲノム受容部位とカップリングされている遺伝子ドナーベクターである。成分Ｃは、遺伝子ドナーベクターにコードされる、１又は２以上の被分析物TCR鎖をコードするORFのゲノム受容部位(成分Ｂ)への組み込みのために設計されている。ここで、この組込みは、標的eTPCによる被分析物TCR鎖の発現をもたらす。
対をなす遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は組込みカップルとも記載される。
【００４３】
eTPCは、eTPC:Aシステムを用いる分析ワークフロー内で、同族抗原による刺激に応答するように設計されている。よって、発現されたTCRspの刺激からのシグナル伝達応答についての標準化されたレポーター読み出しがあることが望ましい。
eTPC成分Ａは：
ｉ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーターと少なくとも１つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
ii．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーターと少なくとも１つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメント 成分Ｆと呼ぶ成分を更に含み、ここで、ｉ及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも１つのシグナル伝達経路に依存する。
【００４４】
eTPCは、提示されたTCRspと被分析物抗原との結合をアッセイするために設計されている。結合の読み出しは、TCRsp結合に応答する合成レポーターエレメントの誘導により達成し得る。したがって、eTPCは、
iii．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーターと少なくとも１つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
iv．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーターと少なくとも１つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメント 成分Ｆと呼ぶ成分を更に含んでいてもよく、ここで、i及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも１つのシグナル変換経路に依存する。
天然型プロモーターと対立するものとしての合成プロモーターを有する合成TCR刺激応答エレメント(成分Ｆ)は、天然のTCR刺激応答を模擬する可能性が少なく、よって、天然のＴ細胞刺激とは距離がある近似を表す。しかし、合成プロモーターは、被分析物抗原に生産的に結合するTCRspを提示するeTPC-tの堅固な同定のためのレポーター応答の整調及び調節の関して非常な柔軟性を提供する。
【００４５】
単一成分合成構築物は、シグナルレポーター応答の増幅又は変調の余地が限られているが、実施及び結果の予測がより簡単である。多成分構築物は、構築物複合体応答ネットワークに実質的に無制限の余地があるという利点を有するが、このことは、実施及び予想がより困難であるという代償を伴う。ネットワークはまた、二次応答レポーターのフィードバックループ、抑制及び活性化を開始する場合をもたらす。
合成プロモーターは、当初の天然のTCRシグナル伝達経路の下流に存在させ得るか又は該経路と置き換えることができる人工的合成シグナル伝達成分に連結することができる。この場合、CD3複合体は、人工的合成シグナル伝達経路及び応答ネットワークと部分的又は全体的にカップリングされることができる。このような人工的経路は、応答の微調整又は増強に関して、モジュール式で順応性が高いという利点を提供する。
【００４６】
好適な実施形態は、合成プロモーター及び少なくとも部分的な合成シグナル伝達経路を有する多成分合成構築物を移用する。これは、制限された静止状態シグナル応答であるが、被分析物抗原とTCRspとのライゲーションが生じたときに、カップリングされた高いレポーターシグナルを有することを確実にする最も堅固な手段を提供する。
TCRsp刺激と成分Ｆとをカップリングさせる正確な様式にかかわらず、所望の終端結果は検出可能なレポーターである。好適な実施形態において、蛍光検出(すなわち、FACS)及び/又は物理的選択方法(例えば、磁気活性化細胞選別(MACS))に従うレポーターが望ましい。或いは、レポーターは、分光光度、蛍光又は発光アッセイ(好ましくは非破壊的性質のもの)による検出のための、分泌されるものであるか又は細胞内分子であり得る。ここで、当該集団は、その後、レポーター分子の存否に基いて選択することができる。加えて、応答は、単一レポータータイプに制限されず、１又は２以上の異なるレポーターの組合せであり得る。
【００４７】
１つの状況において、合成プロモーター及び部分的合成シグナル伝達経路を有する多成分合成構築物(駆動因子-アクチベーター/リプレッサー＋増幅因子-レポーター)は、以下：
駆動因子-アクチベーター/リプレッサー：
ａ)合成プロモーター
ｂ)コザック配列
ｃ)転写因子
ｄ)第１のターミネーター
増幅因子-レポーター
ｅ)第２の合成プロモーター
ｆ)コザック配列
ｇ)レポーター
ｈ)第２のターミネーター
を含んでなり、ここで、
ａ)は、被分析物抗原へのTCRspのライゲーションにより生じる当初の天然のシグナル伝達経路とカップリングされて設計されている合成プロモーター(駆動因子)を表す。最小駆動因子は、１又は２以上の転写因子結合部位及びコアプロモーターを含んでなり、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、開始エレメント(Inr)及び転写開始部位を含んでなり；ｂ)は、転写因子の効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し；ｃ)は、第２の合成プロモーターのDNA配列に結合することができる合成又は天然の転写因子(アクチベーター又はリプレッサー)をコードするORFを表し；ｄ)は、転写因子のmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の１又は２以上の非翻訳３'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい；ｅ)は、ｃ)転写因子及びコアプロモーターの結合のための１又は２以上の認識部位をコードする第２の合成プロモーター(増幅因子)を表し、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、Inr及び転写開始部位を含んでなる；ｆ)は、レポーターの効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し；ｇ)は、レポータータンパク質をコードするORFを表し；ｈ)は、レポーターのmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の１又は２以上の非翻訳３'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい。
【００４８】
増幅因子-レポーターパラダイムとカップリングされた駆動因子-アクチベーター/リプレッサーは追加の駆動因子-アクチベーター/リプレッサー及び増幅因子-レポーター対及び/又は追加の増幅因子-レポーター単位を含むように拡張することが可能であることを認識することは重要である。更に、アクチベーターは、ネガティブ選択方法及び/又はネガティブ-フィードバックループのために、増幅因子-レポーター単位及び/又は駆動因子-アクチベーター/リプレッサー単位を停止させるためのリプレッサーと置換可能である。
【００４９】
第２の状況において、合成プロモーター(駆動因子-レポーター)を有する単一成分合成構築物は、以下：
ａ)合成プロモーター
ｂ)コザック配列
ｃ)レポーター
ｄ)ターミネーター
を含んでなり、ここで
ａ)は、被分析物抗原へのTCRspのライゲーションにより生じる当初の天然のシグナル伝達経路とカップリングされて設計されている合成プロモーター(駆動因子)を表す。最小駆動因子は、１又は２以上の転写因子結合部位及びコアプロモーターを含んでなり、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、Inr及び転写開始部位を含んでなり；ｂ)は、レポーターの効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し；ｃ)は、レポータータンパク質をコードするORFを表し；ｄ)は、レポーターのmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の１又は２以上の非翻訳３'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい。
【００５０】
拡大形態の多成分システムにおいて、成分Ａ eTPCは、第２のゲノムドナーベクター(成分Ｅと呼ぶ；これもまたシステムに追加される)とカップリングされている第２のゲノム受容部位(成分Ｄと呼ぶ)を更に含有してもよい(図２)。このような細胞が得られる種々の手段を詳述する方法を図37〜38に示す。
多成分システム 成分Ａは、１又は２以上の追加の組込みカップルを更に含んでなってもよい。
eTPC及び１つ又は２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、分析又は調製ワークフロー内で使用するeTPC-tの製造に用いる。
eTPC-tは、２つの相補性TCR鎖を組み込んでTCRspを形成することにより製造されてもよいし、又は代替的に、各相補性鎖を逐次提供することにより二工程で製造してもよい(図３)。
遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は、多成分システムの組込みカップルサブシステムとして働く。遺伝子ドナーベクターは、先ず、標的ORFと組み合わされなければならず、ここで、基本ドナーベクターが当該標的ORFをコードするようになる。次いで、組立てられて準備が整ったドナーベクターは、標的ORFをゲノム受容部位と交換するために標的eTPCに導入され、よって、標的ORFが、標的細胞のカップリングされた受容部位に組み込まれる(図４)。
【００５１】
遺伝子ドナーベクター成分Ｃ及び/又はＥを含んでなる多成分システムは、成分Ｃ'及び/又はＥ'が得られるように、少なくとも１つの被分析物TCR鎖をコードする少なくとも１つのORFと組み合わされる。ここで、組合せは、遺伝子ドナーベクターの正しいコーディングフレームへの正しい配向での、遺伝物質のライゲーションとして定義される。
遺伝子ドナーベクターＣ及び/又はＥへの１又は２以上のORFの組合せは、独特なORFのライブラリーを用いて、
ｉ．複数のORFをコードするＣ'及び/又はＥ'ベクターの別個のライブラリーを得るための単一の別個の反応
ii．複数のORFをコードするＣ'及び/又はＥ'ベクターのプールされたライブラリーを得るための単一反応
として複数回行なってもよい。ここで、別個のライブラリーは、独特なTCR鎖をコードする独特なORFを有するeTPC-tの別個のライブラリーが得られるように、成分Ａと複数回組み合わされてもよく、プールされたライブラリーは、各eTPC-tは元のベクタープールからのランダム化された１又は２以上の被分析物TCR鎖をコードするORFが組み込まれており、結果として、各eTPC-tが単一ランダムの独特なTCRspを発現する１又は２以上のプールされたeTPC-tのライブラリーが得られるように、成分Ａと１回又は２回以上組み合わされてもよい。
ゲノム受容部位への予測可能なコピー数の１又は２以上のORFの効率的組込みは、被分析物eTPC集団が迅速に調製及び特徴決定され得る標準化eTPCの動作のために非常に有利である。よって、ゲノム受容部位及びカップリングされたドナーベクターはeTPCの機能に重要である。更に、eTPCを、成分Ｂ及びＤが互いに隔離されてドナーベクター成分Ｃが成分Ｂで組み込まれず、その逆も同様であるようにすることが非常に望ましい。加えて、成分Ｂ及び/又は成分Ｄが、規定された単一の相補性TCR鎖対の導入が迅速で反復可能であり、単一対のみの正しい組込み及び送達の可能性が高いeTPC-tの作製方法に適することも望ましい。
【００５２】
ゲノム受容部位は：
ｉ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ii．部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
iii．部位特異的相同組換え用の天然型ゲノム部位
から選択され得、ここで、ｉ)がRCME用に好適な形態のゲノム受容部位である。RMCE法は、各成分Ｂ及びＤが隔離された特異性を有するように、個別のリコンビナーゼ酵素に特異的である選択された異種特異的部位を採用してよい。
ゲノム受容部位である成分Ｂ及び/又は成分Ｄは、以下の遺伝子エレメント：
ｉ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ii．相同性アーム
iii．真核生物プロモーター
iv．真核生物条件付き調節エレメント
v．真核生物ターミネーター
vi．選択マーカー
vii．スプライスアクセプター部位
viii．スプライスドナー部位
ix．非タンパク質コーディング遺伝子
x．インスレーター
xi．可動遺伝子エレメント
xii．メガヌクレアーゼ認識部位
xiii．内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる。
【００５３】
好ましいゲノム受容部位は、以前に記載したエレメントのリストからの以下の選択されたエレメントを用いる２つの異なる配置で構成される。
第１の配置は、RMCE組込みにより、１又は２以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFを受け入れるためのものであり、ここで、該配置は
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ] [Ｆ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
Ｂ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｃ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｄ)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカーであり、
Ｅ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｆ)は、エレメントｖ)真核生物ターミネーターである。
【００５４】
第２の配置は、RMCE組込みにより、１又は２以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする２つのORFを受け入れるためのものであり、ここで、該配置は：
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ] [Ｆ] [Ｇ] [Ｈ] [Ｉ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
Ｂ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｃ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｄ)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー１であり、
Ｅ)は、エレメントｖ)真核生物二方向転写ターミネーターであり、
Ｆ)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー２であり、
Ｇ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｈ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｉ)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
更に、この第２の配置において、エレメントＦ、Ｇ及びＩは、アンチセンス方向にコードされる。
【００５５】
成分Ｃ及び/又はＥは、以下の遺伝子エレメント：
ｉ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ii．相同性アーム
iii．真核生物プロモーター
iv．真核生物条件付き調節エレメント
v．真核生物ターミネーター
vi．選択マーカー
vii．スプライスアクセプター部位
viii．スプライスドナー部位
ix．非タンパク質コーディング遺伝子
x．インスレーター
xi．可動遺伝子エレメント
xii．メガヌクレアーゼ認識部位
xiii．内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv．コザックコンセンサス配列
xvi．組込みの選択マーカー
xvii．抗生物質耐性カセット
xviii．細菌性複製起点
xix．酵母複製起点
xx．クローニング部位
の少なくとも１つで構成される。
【００５６】
好適な遺伝子ドナーベクター(成分Ｃ及び/又は成分Ｅ)は、以前に記載したエレメントのリストからの以下の選択されたエレメントを用いる２つの異なる、可能性のある配置で構成される。
第１の配置は、RMCE組込みによる、１又は２以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFの送達のためのものであり、ここで、該配置は
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｂ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｃ)は、エレメントxx)１又は２以上のTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードする単一ORFのクローニング部位であり、
Ｄ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｅ)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌性複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを一緒に連結するために用いてよい。
【００５７】
第２の配置は、RMCE組込みによる、１又は２以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする２つのORFの送達のためのものであり、ここで、該配置は：
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ] [Ｆ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｂ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｃ)は、１又は２以上のTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードし、真核生物のターミネーターを有する２又は３以上のORFの導入のためのクローニング部位であり、
Ｄ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列(アンチセンス方向)であり、
Ｅ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｆ)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを各ORF内で一緒に連結するために用いてよい。
【００５８】
被分析物eTPC-t集団の作製
上記多成分システムは、eTPC:Aシステムの分析又は調製ワークフロー内で被分析物抗原に対して被分析物TCRspを提示するように働く別異の形態の被分析物eTPC集団又はそのライブラリーを作製する複数の方法で使用してもよい。
作製されるeTPC-t集団は、特定の供給源から被分析物TCR鎖(これに対して候補抗原を分析する)を導く必要がある。
被分析物TCR鎖をコードする配列の供給源は、
ｉ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
ii．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
iii．合成TCR鎖ORF配列
から誘導することができ、ここで、i)は、胸腺選択に起因して、一般に、自己のaAPX及び/又はaAPX積荷に対して交差反応性である可能性が高くない天然型TCRspの発見に好適であり；ii)は、候補TCR親和性反応剤を同定するために使用されてもよく；iii)は、TCR親和性反応剤の親和性成熟において用いられてもよい。
【００５９】
単一組込みカップルを含んでなる多成分システムは、TCR鎖の相補対のORFと組み合わされた成分Ｃ'を提供することにより、eTPC-tを成分Ａから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR対は部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対はTCRspとして細胞表面に提示される(図５)。
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、TCR鎖の相補対のORFと組み合わされた成分Ｃ'を提供することにより、eTPC-tを成分Ａから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR対は部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対は細胞表面にTCRspとして提示される。第２の組込みカップルＤ/Ｅは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図６)。
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、各々が相補性TCR鎖対の１つの鎖をコードする１つのORFと組み合わされた成分Ｃ'及びＥ'を提供することにより、eTPC-tを成分Ａから一工程で作製するために用いられてもよい。両被分析物TCRは部位Ｂ又はＤに組み込まれ、成分Ｂ'及びＤ'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対は細胞表面にTCRspとして提示される(図７)。
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、単一被分析物TCR鎖のORFと組み合わされた成分Ｃ'を提供することにより、eTPC-xを成分Ａから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR鎖は部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR鎖を発現するが相補性鎖を欠いており、よって表面TCRを発現しない。第２の組込みカップルＤ/Ｅは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図８)。
【００６０】
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、単一被分析物TCR鎖のORFと組み合わされた成分Ｃ'を先ず提供することにより、eTPC-tを成分Ａから二工程で作製するために使用されてもよい。この被分析物TCR鎖は部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR鎖を発現するが相補性鎖を欠いており、よって表面TCRを発現しない(eTPC-x中間体)。第２の組込みカップルＤ/Ｅは非改変のままである。第２の工程において、ベクターが、事前に組み込まれたTCR鎖に相補性である第２の単一被分析物TCR鎖のORFと組み合わされたＥ'が提供される。この第２の相補性被分析物TCR鎖は部位Ｄに組み込まれ、成分Ｄ'が作製される。得られる細胞株は提供された相補性被分析物TCR鎖対を発現し、これは細胞表面でTCRspとして提示される(図９)。
被分析物eTPC-x及び/又はeTPC-t集団をeTPCから作製する上記の例において、多成分システムは、既知の被分析物TCR鎖を規定された様式で提供して、規定されたTCRspを発現する被分析物eTPCの別個の集団を作製するために用いられる。この方法は、分析又は調製ワークフローに提供するeTCP-x及び/又はeTCP-tのライブラリーを構築するために複数回繰り返されてもよい。代替アプローチは、遺伝子ドナーベクターと組み合わされる被分析物TCR鎖のプールされたライブラリーを採用し、これらをショットガン様式で組み込んで、被分析物eTPC-tのプールされたライブラリー(各eTPC-tは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする)を取得することである。同じショットガン原理をeTPC-xのプールの作製に適用することができる。これは、候補TCRspの大きなライブラリーを被分析物抗原に対して分析するときに特に有用である。
【００６１】
１つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、被分析物TCR対のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わされた成分Ｃ'を提供することにより、eTPC-tプールを成分Ａから一工程で作製するために用いてもよい。この対は各細胞内で部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製され、ここで、各eTPC-tは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする。得られる細胞プールは集団として複数の被分析物TCRspを発現する細胞集団を含む(図10)。
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、被分析物TCR対のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わせた成分Ｃ'を提供することにより、eTPC-tプールを成分Ａから一工程で作製するために用いてもよい。この対は各細胞内で部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製され、ここで、各eTPC-tは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする。得られる細胞プールは集団として複数の被分析物TCRspを発現する細胞集団を含む。第２の組込みカップルＤ/Ｅは非改変のままである(図11)。
【００６２】
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わせた成分Ｃ'を提供し(結果として、各eTPCは、成分Ｃ'にコードされる単一ランダム化されたTCR鎖ORFが部位Ｂに組み込まれ、成分Ｂ'が作製される)、同時に、成分Ｃ'に提供される第１のライブラリーに相補性である単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わせた成分Ｅ'を提供する(結果として、各eTPC-tは、成分Ｅ'にコードされる単一ランダム化された相補性TCR鎖ORFが部位Ｄに組み込まれ、成分Ｄ'が作製される)ことにより、eTPC-tプールを成分Ａから一工程で作製するために用いてもよい。eTPC-tプール中の得られる各細胞は、ランダム化された相補性TCR鎖ORFの単一対を有し、その結果、プール中の各細胞はランダム化されたTCRspを発現する。このプールされたライブラリーは、成分Ｃ'及びＥ'に提供されたセットからの可能性のある全ての相補性TCR鎖組合せを含む(図12)。
２つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、eTPC-tプールを事前に得られたe-TPC-xから一工程で作製するために用いてもよい。ここで、部位ＢはＢ'に変換され、単一被分析物TCR鎖を含む。eTPC-tは、既に組み込まれた鎖に相補性である単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わされた成分Ｅ'を提供することにより作製される。各eTPC-tは、提供されたＥ'ライブラリーの単一ランダム化されたTCR鎖ORFが部位Ｄに組み込まれ、成分Ｄ'が作製されている。eTPC-tプール中の得られる各細胞は、eTPC-xから出発し、各単一相補性被分析物TCR鎖を選択することにより提供される被分析物TCR鎖を有し、その結果、プール中の各細胞はORFのランダム対をTCRspとして発現する。このアプローチは、相補性TCR鎖対中の固定された鎖に対する種々の単一鎖の効果を分析するときに用いられる(図13)。
【００６３】
eTPC-xは、２つの組込みカップルを含んでなるeTPC-tから、組込みのマーカーをコードするか又はORFをコードしない更なる組込みベクター 成分Ｙ又はＺのいずれか１つを提供することにより作製されてもよい。成分Ｙ又はＺとeTPC-tとの組合せは、単一TCR鎖を発現するeTPC-xが得られるように当該部位の一方を交換する(図14)。
eTPC-tのeTPC-xへの変換に好適な遺伝子組込みベクター 成分Ｙ及び成分Ｚは、上記成分Ｃ及びＥと同じ組込みベクター要件を含むが、TCR鎖ORFをコードせず、好ましくは組込みのマーカーをコードする。
eTPC-x又はそのライブラリーは、標的アッセイにおいてTCRsp誘導体を迅速にスクリーニングするために、eTPC-x中のＢ'又はＤ'に組み込まれたTCR鎖ORFと相補性であるTCR鎖ORFの一過性トランスフェクションに用いることができる。
【００６４】
被分析物eTPC-tと被分析物抗原との接触
本発明は、遺伝子操作された多成分システムの提供に関する。成分Ａ及び１又は２以上の成分Ｃ'及び/又は１又は２以上の成分Ｅ'を用いて１又は２以上の被分析物eTPC-tを作製する。分析デバイスの編成のための被分析物eTPC-t集団を、まとめて、eTPC:抗原(eTPC:A)システム(図24)と呼ぶ。多成分システム内で、１若しくは２以上の成分Ｃ'及び/又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が成分Ａと組み合わされて、種々の形態の被分析物eTPC-tが作製される。次いで、これら被分析物eTPC-tが、分析eTPC:Aシステム内で１又は２以上の１又は２以上の被分析物抗原と組み合わされて、１又は２以上の出力が得られる。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により及び/又は可溶性若しくは不動化親和性反応剤として提供され、及び/又は非細胞ベースの粒子(NCBP)に提示される。
【００６５】
被分析物抗原は、TCRがeTPC:Aシステムにおいて推定上結合できる任意の物質であり：
ｉ．aAPX(被分析物抗原提示複合体)及び/又は
ii．aAM(被分析物抗原性分子)及び/又は
iii．aAPX:aAM(被分析物抗原性分子を提示する被分析物抗原提示複合体)及び/又は
iv．CM(非被分析物 積荷分子)及び/又は
ｖ．aAPX:CM(積荷分子を提示する被分析物抗原提示複合体)
で表されてもよく、ここで、aAPXは、aAMを提示できる複合体であり、aAMは、TCRにより直接認識されるか又はaAPXに積載された場合にTCRにより認識される任意の分子であり、aAPX:aAMは、aAMを積載したaAPXであり、CMは、aAPXに積載され得るが、被分析物でなく、よって被分析物抗原提示細胞(APC)又はアッセイシステム自体に由来し得る積荷分子であり、aAPX:CMは、CMが積載されたaAPXである。
【００６６】
これら形態の被分析物抗原は、eTPC:Aシステム内で、」eTPCに異なる態様で提示されてもよく、
ｉ．被分析物抗原提示細胞(APC)及び/又は
ii．可溶性又は不動化親和性反応剤及び/又は
iii．非細胞ベースの粒子(NCBP)
として表されてもよく、ここで、
被分析物抗原提示細胞(APC)は、eTPC-tに抗原を提示することができる任意のAPCと考えられ、親和性反応剤は、eTPC:AシステムにおいてeTPC-tの細胞表面でTCRspの結合及び/又は刺激を探索するための被分析物として作製される任意の反応剤と考えられる。この反応剤は、被分析物抗原性分子(aAM)、被分析物抗原提示複合体(aAPX)、又はaAMが積載されたaAPX(aAPX:aAM)であることが多い。aAPX:aAMの代表例は、TCRを染色するために用いられるpHLA-マルチマー反応剤(例えば、「テトラマー」)である。この点に関して、親和性反応剤は抗体又は類似物でもあり得る。非細胞ベースの粒子(NCBP)は、粒子が、eTPC:Aシステム内でeTPC-t表面でのTCRsp結合について評価されるべき被分析物抗原又はその他物質である限りにおいて、親和性反応剤に類似する様式で作用する。しかし、NCBPは、提示された被分析物抗原又は他の結合体の識別体として直接又は間接に作用する、遺伝子又は他の情報を更に運搬することが可能なより大きな物質として考えることもできる。NCBPの代表例は、ファージディスプレイ場面でのバクテリオファージであり、ここで、ファージは抗体フラグメント-抗原結合(FAB)をディスプレイし得る。陽性標識されたeTPC-tは、ファージと共に回収され、配列決定されて、eTPC-t表面のTCRspに特異的なFABが同定されてもよい。
【００６７】
分析eTPC:Aシステムは、１又は２以上のeTPC-t集団を用いる１又は２以上の被分析物抗原の選択で構成される(図24)。被分析物eTPC-t集団は、上記のとおり、多成分システムを用いて作製される(図１〜14)。eTPC:Aシステムは、被分析物抗原と被分析物eTPC-t集団との物理的接触を可能にする形式で提供され、この接触により１又は２以上の被分析物抗原と１又は２以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体形成が可能となる。ここで、被分析物抗原は、以下：
ｉ．aAPX(被分析物抗原提示複合体)及び/又は
ii．aAM(被分析物抗原性分子)及び/又は
iii．aAPX:aAM(被分析物抗原性分子を提示する被分析物抗原提示複合体)及び/又は
iv．CM(非被分析物積荷分子)及び/又は
ｖ．aAPX:CM(積荷分子を提示する被分析物抗原提示複合体)
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、として提供され、被分析物APCにより提示され、又は、可溶性及び/又は不動化親和性反応剤又はNCBPにより提示され、その結果、複合体形成は当該複合体の安定化を導き得、また、複合体形成は、eTPC-tの観察可能な標識、及び/又はあれば、被分析物eTPC内での成分Ｆによるシグナル伝達の誘導、及び/又は観察される可能性がある被分析物APC中の観察可能なシグナルを導く。
【００６８】
本発明に関して、eTPC:Aシステムは：
ｉ．単一被分析物eTPC-tの入力、又は
ii．プールされた被分析物eTPC-tのライブラリーの入力
で構成され、以下：
iii．単一被分析物APCの入力、又は
iv．単一被分析物親和性反応剤の入力、又は
ｖ．単一被分析物NCBPの入力、又は
vi．プールされた被分析物APCのライブラリーの入力、又は
vii．被分析物親和性反応剤のプールされたライブラリの入力、又は
viii．被分析物NCBPのプールされたライブラリの入力
の１つと組み合わされる。
【００６９】
緩衝液系における接触
被分析物APCと被分析物eTPC-tとの接触は、許容される細胞培養系又は緩衝液系で行われ、ここで、当該系は、被分析物eAPC及び被分析物TC細胞の両方、被分析物親和性反応剤又は被分析物NCBPの機能を許容する培地を含む。
可溶性被分析物親和性反応剤、不動化親和性反応剤及び/又は被分析物NCBPと被分析物eTPC-tとの接触は、許容される緩衝化系で行われ、ここで、当該系は、被分析物抗原及び被分析物eTPC-t細胞の両方の機能を許容する緩衝化培地を含む。
【００７０】
親和性反応剤又はNCBPでのeTPC-tの標識
二部構成デバイスから得られる被分析物eTPC-tは、eTPC-tにより提示されるTCRspの特徴決定に用いてもよい。この特徴決定は、被分析物eTPC-tが不動化若しくは可溶性親和性反応剤又は非細胞ベースの粒子(NCBP)と接触してeTPC-tが標識されるような様式で行ってもよい(図15)。
e標識は、フローサイトメトリー、顕微鏡観察、分光分析若しくはルミノメトリーのような方法による標識の直接観察により、又は不動化親和性反応剤若しくはNCBPでの捕捉により検出されることが考えられる。類似する様式において、親和性反応剤又はNCBPは、含まれるならば、レポーターエレメント(成分Ｆ)を刺激してもよい。成分Ｆの刺激により、同定のためのeTPC-t及び/又は親和性反応剤又はNCBPの選択が可能となる(図16)。
【００７１】
シグナル応答の定義
二部構成デバイスから得られる被分析物被分析物eTPC-tは、被分析物抗原に対する、被分析物TCRspを発現する被分析物eTPC-tのシグナル応答の特徴決定に用いられ、ここで、このシグナル応答は、二値(binary)又は徐々に変化するもののいずれであってもよく、eeTPC-tに固有なもの(図15、16及び17)及び/又は含まれるならばAPCに固有なもの(図18)として測定され得る。このシグナルは、フローサイトメトリー、顕微鏡観察、分光分析若しくはルミノメトリー又は当業者に公知のその他の方法のような方法により検出されてもよい。
【００７２】
シグナル応答を有するAPCとの接触
被分析物APCはまた、eTPC:Aシステム内でeTPC-tと接触させてもよい。一般に、応答は、eTPC-t内で報告されるシグナルにより測定される(図17)が、APC内で報告されるシグナルにより測定されてもよい(図18)。
【００７３】
一般的方法−eTPC-tの選択
eTPC:A組合せシステムから、入力の被分析物eTPC-t又は被分析物eTPC-tのライブラリーからの１又は２以上の被分析物eTPC-tを選択して、１又は２以上の被分析物eTPC-tを得る方法であって、発現したTCRspが１又は２以上の被分析物抗原と結合する方法は：
ｉ．１又は２以上の被分析物eTPC-tを１又は２以上の被分析物抗原と組み合わせて、被分析物TCRspと被分析物抗原との接触をもたらすことと、以下の少なくとも１つ：
ii．形成される場合、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
iii．標識された被分析物抗原からのシグナルを測定すること、及び/又は
iv．もしあるならば、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eTPC-tによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
ｖ．もしあるならば、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定することと、
vi．工程ii、iii、iv及び/又はｖに基づく１又は２以上の被分析物eTPC-tの選択であって、選択が、ポジティブ及び/又はネガティブ測定により行われることと
を含み、ここで、ｉ、iv及びvi又はｉ、ｖ及びviは、好ましい構成を含む。
【００７４】
一般的方法−被分析物抗原の選択
入力の被分析物抗原又は被分析物抗原のライブラリーから１又は２以上の被分析物抗原を選択して１又は２以上の被分析物抗原を得る方法であって、発現した被分析物抗原が、被分析物eTPC-tにより提示される１又は２以上の被分析物TCRspと結合する方法は：
ｉ．１又は２以上の被分析物抗原を１又は２以上の被分析物eTPC-tとを組み合わせて、被分析物抗原により提示される被分析物抗原と１又は２以上の被分析物eTPC-tの被分析物TCRspとの接触をもたらすことと、
ii．形成する場合、１又は２以上の被分析物抗原と１又は２以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定することと、及び/又は
iii．標識された被分析物抗原からのシグナルを測定することと、及び/又は
iv．誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される１又は２以上の被分析物eTPC-tにおけるシグナル応答を測定することと、及び/又は
ｖ．誘導される場合、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定することと、
vi．工程ii、iii、iv及び/又はｖからの１又は２以上の被分析物抗原の選択であって、選択が、ポジティブ及び/又はネガティブ測定により行われることと
を含み、ここで、ｉ、iv及びvi又はｉ、ｖ及びviは、好ましい構成を含む。
【００７５】
一般的方法−シグナル伝達による選択
eTPC:A組合せシステムから、被分析物eTPC-t及び/又は被分析物APC及び/又は親和性反応剤及び/又はNCBPを、レポートされるシグナル応答に基いて選択する方法は：
ｉ．天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
ii．eTPC-tが成分Ｆを含有する場合及び/又はAPCが等価な合成レポーターエレメントを含む場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
も含んでよい。
APC及び/又はeTPC-tに固有である誘導された天然型又は合成のシグナル応答は、以下：
ｉ．分泌された生体分子
ii．分泌された化学物質
iii．細胞内生体分子
iv．細胞内化学物質
ｖ．表面発現された生体分子
vi．被分析物eTPC-tの被分析物APCに対する細胞毒性作用
vii．シグナル応答が被分析物APCにおいて誘導され、ａ〜ｅのいずれかの増減を検出することにより決定されるような被分析物eTPC-tの被分析物APCに対するパラクリン作用
viii．被分析物eTPC-tの増殖
ix．被分析物eTPC-tと被分析物APCとの間の免疫シナプス
の１又は２以上の増減を検出することにより測定され、ここで、前記検出されるシグナル応答は、eTPC:A組合せシステム及び/又は並行して組み立てられた組合せシステムの組立ての前の、被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tに固有の非誘導シグナル応答状態と比較され、ここで、被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tは、用いるeTPC:A組合せシステム内でシグナル応答を誘導しないことが知られている対照の被分析物抗原及び/又は被分析物TCR種及び/又は可溶性被分析物抗原を提示し得る。
【００７６】
標識及び/又はシグナル応答による選択の方法
eTPC:A組合せシステムから、被分析物eTPC-t及び/又は被分析物親和性反応剤及び/又は被分析物NCBPを、前記親和性反応剤又はNCBPによるeTPC-tの測定可能な標識に基いて選択する方法は：
ｉ．親和性反応剤又はNCBPによるeTPC-tの標識を決定する
ことを含み、
ii．天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
iii．eTPC-tが成分Ｆを含有する場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
も含んでよく、
ここで、eTPC-tの標識を検出することによりeTPC-t及び/又は親和性反応剤及び/又はNCBPを選択することは、親和性反応剤及び/又はNCBPに検出可能な標識を含ませることによる、親和性反応剤及び/又はNCBPによるeTPC-tの表面標識の検出を含んでよい。この検出可能な標識は、蛍光、発光、分光、化学、放射化学又は親和性部分であってよい。よって、eTPC-tのこの選択は、FACS、MACS又は等価な高スループットスクリーニング及び選択方法に基づいて行ってよい。
【００７７】
まとめ
eTPC:A組合せシステム内で、１若しくは２以上の被分析物eTPC-t又は１若しくは２以上の被分析物APCにおけるシグナル応答の測定、又は被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により媒介され得るeTPC-tの標識は、一次システム出力の選択に重要であり(図24 工程v)、ここで、一次システム出力は、単一細胞若しくは細胞プール、及び/又は単一親和性反応剤若しくは親和性反応剤プール、及び/又は単一NCBP若しくはNCBPプールである。ここで、細胞又は反応剤の選択は、接触させた被分析物APC又は被分析物eTPC-t細胞のいずれか及び/又は両方において報告されるシグナル応答の存否に基いて、或いは親和性反応剤又はNCBPでのeTPC-tの測定可能な標識により行ってもよい。
【００７８】
eTPC:Aシステムからの一次システム出力の取得
本発明は、被分析物eTPC-tが得られる二部構成デバイスの提供に関する。次いで、これら被分析物eTPC-tを、上記のように、eTPC:Aシステムにより１又は２以上の被分析物抗原と組み合わせて、１又は２以上の出力を得る。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により及び/又は可溶性又は不動化反応剤として提供されるか、及び/又は非細胞ベースの粒子(NCBP)に提示される。システムは、１又は２以上のeTPC-t集団を用いる１又は２以上の被分析物抗原の選択で構成される(図24)。eTPC:Aシステムは、被分析物抗原と被分析物eTPC-t集団との物理的接触を可能にする形式で提供され、この接触により１又は２以上の被分析物抗原と１又は２以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体形成が可能となる。ここで、被分析物抗原は、以下：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM及び/又は
iv．CM及び/又は
v．aAPX:CM
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、として提供され、被分析物APCにより提示され、又は、可溶性及び/又は不動化親和性反応剤又はNCBPにより提示され、その結果、複合体形成は当該複合体の安定化を導き得、また、複合体形成は、eTPC-tの標識、及び/又はあれば、被分析物eTPC内でのシグナル伝達の誘導、及び/又は報告されるか若しくは観察される可能性がある被分析物APCを導く。
【００７９】
誘導されたシグナル応答の報告及び/又はeTPC-tの標識の態様は上述の通りであり、eTPC:Aシステムに構築される二部構成デバイスの一次出力の取得時に測定される必要があるのは、これらの報告される応答及び/又は標識である。
eTPC:Aシステムからの一次出力は、選択された細胞集団及び/又は選択された親和性反応剤若しくは選択されたNCBPであり、ここで、選択は：
ｉ．親和性反応剤若しくはNCBPによるeTPC-tの測定可能な標識、及び/又は
ii．eTPC-tにおいて検出されるシグナル応答、及び/又は
iii．eTPC-tにおける検出されるシグナル応答の欠如、及び/又は
iv．被分析物APCにおいて検出されるシグナル応答、及び/又は
ｖ．被分析物APCにおいて検出されるシグナル応答の欠如
に基づいて行われ、ここで、一次出力は、単一細胞若しくは細胞プール及び/又は１又は２以上のeTPC-t結合親和性反応剤若しくはNCBP(eTPC-tに結合した親和性反応剤若しくはNCBP)として表すことができる。
【００８０】
eTPC:A組合せシステムから、被分析物親和性反応剤、NCBP若しくは被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tを、接触細胞における応答に基づいて選択してもよい。つまり、被分析物APCは、接触している被分析物eTPC-tにおける、報告される応答又はその欠如に基づいて選択してもよい。逆に、被分析物eTPC-tは、接触している被分析物抗原における、報告される応答又はその欠如に基づいて選択してもよいし、或いは被分析物抗原が被分析物親和性反応剤又はNCBPである場合は、被分析物親和性反応剤又はNCBPはeTPC-t応答から選択できる。
【００８１】
システムからの一次APC出力は、選択された細胞であり、ここで、選択は、被分析物APC又はeTPC-tのいずれかにおける報告されるシグナル応答の存否に基づいて行われ、これら細胞は、１若しくは２以上のAPC及び/又はeTPC-tを含んでよく、ここで、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図24 工程v)。
システムからの一次eTPC-t出力は、選択された細胞であり、ここで、選択は報告されるシグナル応答の存否に基づいて行われ、これら細胞はeTPC-tを含んでよく、ここで、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図24 工程v)。
システムからの一次被分析物親和性反応剤又はNCBP出力は、親和性反応剤又はNCBPが結合したか又はしていない選択された細胞である。ここで、選択は、標識又は被分析物eTPC-tにより報告されるシグナル応答の存否に基づいて行われ、選択された親和性反応剤又はNCBPは、同じアイデンティティの親和性反応剤プール又は異なるアイデンティティの親和性反応剤又はNCBPプールを含んでよい(図24 工程v)。
【００８２】
eTPC:A組合せシステム内の被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tにおいて報告されるシグナルは、被分析物細胞集団又は被分析物親和性反応剤又はNCBPを選択して一次出力を提供するために用いてもよい。
APC及び/又はeTPC-t型の一次出力は、eTPC:A組合せシステムが二元培養性質のものである場合(例えば図15〜18)、二元システムから、所望の被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-t集団を二部構成システムから選択することにより達成され得る。
eTPC-tの一次出力は、eTPC:A組合せシステムが、１又は２以上の被分析物eTPC-tと被分析物抗原との二元組成のものである場合(例えば、図19〜21)、eTPC:Aシステム内で、被分析物親和性反応剤若しくはNCBPで標識されるか又は被分析物親和性反応剤若しくはNCBP若しくは被分析物APCにより活性化される所望の被分析物eTPC-t集団を選択することにより達成され得る。
被分析物親和性反応剤又はNCBPの一次出力は、eTPC:A組合せシステムが１又は２以上の被分析物eTPC-tと被分析物親和性反応剤又はNCBPとの二元組成のものである場合(例えば、図21)、被分析物 親和性反応剤若しくはNCBPで標識されているか及び/又は被分析物 親和性反応剤若しくはNCBPにより誘導されたシグナルを有する所望の被分析物eTPC-t集団を、eTPC:Aシステムから選択することにより達成され得る。
APCの一次出力は、eTPC:A組合せシステムが、固定された被分析物eTPC-t及びプールされたライブラリー被分析物APCの性質のものである場合(例えば図22)、被分析物APCを、被分析物APC内での応答の検出又は応答の欠如に基いて選択することにより達成され得る。
【００８３】
一次出力を得ることができる幾つかの異なる態様があり、ここで、各態様は選別工程を伴う。選別は、蛍光活性化細胞選別(FACS)及び/又は磁性活性化細胞選別(MACS)及び/又は異なる親和性活性化細胞選別法により達成してよい。
一次出力たるAPC及び/又はeTPC-t細胞及び/又はeTPC結合親和性反応剤若しくはNCBPは、単一細胞選別により単一細胞を得てもよく、及び/又は細胞プール選別により細胞プールを得てもよい。
一次出力たるAPC及び/又はeTPC-t細胞は、単一細胞選別により単一細胞を得てもよく、必要に応じてその後、単一細胞を増殖させて、選択されたAPC又はeTPC-t細胞のモノクローナルプールを得てもよい。
一次出力たるAPC及び/又はeTPC-t細胞は、細胞プール選別により細胞プールを得てもよく、必要に応じてその後、細胞プールを増殖させて、選択されたAPC及び/又はeTPC-t細胞のプールを得てもよい。
【００８４】
eTPC:Aシステムからの終端システム出力の取得
測定されるシグナル応答又は安定な複合体形成に基づいて選択された被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tである一次出力を取得する上記の方法に続いて、eTPC:Aシステムからの終端出力を、選択されたAPC及び/又はeTPC一次出力の更なる加工処理により得てもよい。
本発明に関して、多成分システムからの終端出力は、被分析物APC又は被分析物eTPC-t又は被分析物親和性反応剤又はNCBPにより提示され、eTPC:A組合せシステムからの選択により多成分システムからの一次出力として得られる
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM及び/又は
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM及び/又は
vi．TCRsp
のアイデンティティである。
【００８５】
eTPC:Aシステム内で、被分析物APC及び被分析物eTPC-tにより提示される被分析物分子が遺伝子にコードされている場合が頻繁にある。例えばNCBPがバクテリオファージによりディスプレイされる場合、被分析物NCBPが遺伝子にコードされるアイデンティティを有する場合もそうである。よって、被分析物APC又は被分析物eTPC-tにより提示される被分析物分子を同定するために、作製された被分析物APC、eTPC-t及び被分析物NCBPの遺伝子配列決定を行ってよい。
APCは、選別された及び/又は増殖させたAPC細胞のゲノム又はトランスクリプトームについて遺伝子配列を得て：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM及び/又は
のアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムの終端出力を表す。
本発明に関して、遺伝子成分を有する被分析物NCBPは、選別された及び/又は拡大された被分析物NCBPのゲノム又はトランスクリプトームについて遺伝子配列を得て、被分析物NCBPのアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、得られるアイデンティティはeTPC:Aシステムの終端出力を表す。
【００８６】
eTPC-tは、選別及び/又は増殖されたeTPC-t細胞の成分Ｂ'及び/又は成分Ｄ'について遺伝子配列を得て、TCRspのアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、TCRspの得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムの終端出力を表す。
eTPCは、選別及び/又は増殖されたeTPC-t細胞のゲノム又はトランスクリプトームについて遺伝子配列を得て、TCRspのアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、TCRspの得られるアイデンティティはeTPC:Aシステムの終端出力を表す。
【００８７】
遺伝子配列決定は、様々な態様で、様々な遺伝物質源から、特定の加工処理あり又はなしで達成できる。
本発明に関して、配列決定工程の前に
ｉ．ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
ii．成分Ｂ'及び/又はＤ'のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
iii．成分Ｂ'及び/又はＤ'のDNA及び/又はRNA転写産物をPCR及び/又はRT-PCRによりにより増幅すること
を行ってよい。
配列決定工程は、多成分システムの一次出力として得られるAPC又はeTPC-t又は被分析物NCBP又はそれらのプールに対して破壊的であってよい。
【００８８】
配列決定工程が一次出力eTPC-tに対して破壊的であるeTPC:Aシステムから一次出力を得ることが望ましい場合、二部構成デバイスの終端出力として得られる配列情報を用いて、被分析物eTPC-tと等価な出力eTPC-tを作製してよい。
遺伝子によりコードされる被分析物分子の上記場面において、eTPC:Aシステムの終端出力は、成分Ｂ'及び/又はＤ'並びに/又は細胞ゲノム及び/若しくはトランスクリプトームから配列情報を得ることにより得てよい。しかし、幾つかの実施形態では、抗原情報は、遺伝子によりコードされない。翻訳後修飾される抗原、非遺伝子的手段によりeTPC:A組合せシステムに提供される抗原、被分析物APCプロテオソーム又は代謝物の誘導又は改変された状態から現れる抗原、eTPC:Aシステムに固有のCMは、遺伝子配列決定手段により合理的に同定されない場合がある。
【００８９】
非遺伝子手段によりeTPC:Aシステムに提供され得るaAMの重要な場合において、提供されたaAMをaAPX:aAM複合体としてAPCが提示し得る２つの異なる態様が存在する。第１の場面において、aAMは、aAPXと直接結合し得、細胞表面でaAPX:aAM複合体を形成し得る形態で提供される。このようなaAMの一例は、HLA複合体についてのペプチド抗原である。第２の場面において、aAMは、被分析物APCにより取り込まれ、aAPXにおいて積荷として積載され、細胞表面でaAPX:aAM複合体を形成するようにプロセスされる形態で提供される。
aAM積荷又はCM積荷を選択し同定する方法であって、積荷が、多成分システムの一次出力として選択されて得られるAPCのaAPXに積載される代謝物及び/又はペプチドである方法は、
ｉ．aAPX:aAM又はaAPX:CM又は積荷aM又は積荷CMを単離することと、
ii．積載された積荷を同定することと
を含み、ここで、同定される積載された積荷(CM又はaAM)は、二部構成デバイスの終端出力である。
【００９０】
一般に、選択されたAPCから積荷分子を同定できる２つの態様が存在する。第一に、aAPX:aAM又はaAPX:CMからの積荷の強制放出により、その後の同定に利用可能なaAM又はCMの単離がもたらされる。この例は、HLA複合体からペプチドaAMを遊離させるAPCの酸洗浄である。第二に、(例えば複合体の遊離及び免疫親和性単離法による)aAPX:aAM又はaAPX:CMの捕捉により、aAPX:aAM又はaAPX:CM複合体の単離がもたらされ、aAM又はCMを同定することができる。
単離aAM及び/若しくはCMを直接に又は単離aAPX:aAM若しくはaAPX:CM複合体から同定する方法は：
ｉ．質量分析
ii．ペプチド配列決定分析
を含むことができ、ここで、含まれるaAM及び/又はCMのアイデンティティは、二部構成デバイスの終端出力である。
【００９１】
二部構成デバイスをeTPC:Aシステムとして用いる、被分析物抗原に関するTCRspの親和性の決定
一次出力を得る上記の方法であって、一次出力が、測定されるシグナル応答に基づいて選択される被分析物eTPC-t細胞である方法の後に、eTPC-t一次出力を親和性分析に供して、同族被分析物抗原に対するTCRspの親和性を決定してよく、ここで、被分析物抗原は、以下：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM及び/又は
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、可溶性親和性反応剤として提供されるか又は被分析物APC若しくは被分析物NCBPにより提示され、被分析物TCRspの親和性は以下の方法：
ｉ．選択された被分析物eTPC-tを、所定範囲の濃度の被分析物抗原で標識すること、
ii．工程ａの染色された被分析物eTPC-tについてFACS分析を行うこと、
iii．所定の濃度範囲の被分析物抗原について被分析物被分析物eTPC-tの蛍光標識の強度を決定すること、
iv．TCRspの被分析物抗原に対する親和性を算出すること
により決定される。
【００９２】
被分析物TCRspの親和性はまた、以前に記載された方法(ただし、標識された参照物も含んでいてよい)によって決定してもよく、親和性は参照物の蛍光強度に対する被分析物抗原の蛍光強度の比を用いて算出され、ここで、標識された参照物は：
ｉ．被分析物TCR鎖の一方又は両方に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t、
ii．１又は２以上のCD3タンパク質に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
iii．標識された参照物たる単一TCR鎖又は標識された参照物たるTCR鎖対を提示する細胞又は粒子
から選択される。
【００９３】
アッセイ標準物質としてのeTPC-tの使用
本発明は、その成分が１又は２以上の被分析物eTPC-tの製造に用いられる遺伝子操作された多成分システムの提供、製造されたeTPC-tのeTPC:A分析システムにおける使用(ここで、該システムは、被分析物eTPC-tにより提示されるTCRspの被分析物抗原特異性を決定するため、及び所望であれば、被分析物抗原に対する親和性を有するか又は有しないeTPC-tの選択に用いられる)に関する。
本システムは、TCR保有細胞の存在を検出するアッセイのコントロール及び較正に用いるため(実施例９参照)、又は選択された特異性TCR対の検出を目的とする親和性反応剤及び/若しくはNCBPの開発及び/若しくは製造におけるコントロールのためのTCR提示標準物質の迅速な作製に理想的に適切である。
過去20年間、HLAマルチマー反応剤は、Ｔ細胞研究の重要な一部であり、上記の例を通じて用いられているように、特定のTCRを提示するＴ細胞(及び他の細胞型)を標識するために用いられてきた。HLA分子のビオチン化及びストレプトアビジンでの多量体化に基づく四量体化反応剤として元々得られたこれら反応剤は、今や、多量体化の程度が異なる種々の形態を採る。多量体化は、一般に、HLAマルチマー反応剤の信頼できる機能の鍵であると考えられる。なぜならば、TCR-抗原-HLA相互作用は比較的弱く、よって、HLA-抗原分子のマルチマー状態は同族TCRとの相互作用を安定化するからである。代表的なアッセイは、HLAマルチマー反応剤と準備された末梢血標本との接触、及び標本内の標識されたＴ細胞のフローサイトメトリーを用いる検出を必要とする。
【００９４】
これら反応剤の比較的複雑な性質を考慮すれば、抗体反応剤の堅牢な製造及び使用とは異なり、臨床診断への使用はほとんど考えられてこなかった。ルーチンの臨床診断への組込みに対する重要な課題は、複雑な生物学的標本中で低頻度のＴ細胞被分析物という状況において、比較的複雑で不安定な反応剤を用いて偽陽性及び偽陰性のシグナル検出を抑える手段である。偽陽性は、HLA-マルチマー反応剤が分解した場合(これはＴ細胞への非特異的結合が高くなるという結果を生じ得る)に観察されることが多い。反応剤の分解はまた、特異的TCR結合を抑制して偽陰性の読み出しを導く。関連する課題は、所与の抗原特異的Ｔ細胞集団が患者標本中の細胞の極僅な部分である可能性があるという問題であり、よって、HLAマルチマーの標識は、フローサイトメトリーアッセイからの検出の場合、実際的限界に近いことが多い。したがって、所与の標本中でＴ細胞標識が観察されないことが真正陰性を表しているのか又は偽陰性の結果であるのかが不明であることが多い。更に、この両義性は、反応剤自体の比較的不安定な性質及び正しい標本調製に対する感受性により増幅される。
【００９５】
HLAマルチマー反応剤アッセイの信頼できない性質を克服するため、堅固で高度に規定されたアッセイ標準が必要である。組換えTCを、フローサイトメトリーに適合性のマイクロビーズで官能化し得る種々の形式で作製することが可能である。しかし、このような製造は信頼できず、或る特定の対を相当な量で作製することが現実的でないことが多い。組換えタンパク質TCR標準反応剤よりむしろ、eTPC-tは、任意のヒトTCRを発現可能であり、単純な哺乳動物細胞培養系で迅速に大量生産可能である組換え細胞標準反応剤である。更に、eTPC-t中のTCRは、天然型CD3複合体の状況で細胞表面で提示され、よって、被分析物 初代Ｔ細胞集団(又は他の細胞集団)内と同じTCRコンホメーションを確実に反映する。eTPC-tの信頼できるアッセイ標準物質についての使用における１つの鍵となる観点は、eTPC-t反応剤の安定性及び現実の配布である。なぜならば、生存細胞培養物は、臨床診断用途に、ルーチンの研究用途にさえ実用的でない。
よって、上記のeTPC:Aシステムは、規定された特異性及び所望の抗原を有する親和性反応剤、NCBP又は他の検出反応剤による染色強度のTCRspを有する１又は２以上のeTPC-tを選択し特徴付けるために用いてもよい。
【００９６】
選択されたeTPC-t、又は独立して選択されたTCR対を有する作製されたeTPC-tは、特異的TCR対の存在を検出するように設計されたアッセイにおいて、抗原を有する親和性反応剤、NCBP又は他の検出反応剤のコントロールの標準反応剤として使用してもよい。このようなアッセイは、
ａ)臨床標本における選択されたTCR特異性のＴ細胞の存在を決定する細胞数測定アッセイ；
ｂ)治療用細胞製剤であるTCR発現初代Ｔ細胞の製造において、特異的TCRを有する細胞の存在を決定する細胞数測定アッセイ；
ｃ)治療用細胞製剤である遺伝子操作されたTCR発現Ｔ細胞の製造において、特異的TCRを有する細胞の存在を決定する細胞数測定アッセイ；
ｄ)特定のTCR対を検出するように設計された所与の親和性反応剤、NCBP又は他の反応剤の特異性及び/又は検出量を決定するアッセイ；
を含んでなってもよく、ここで、このアッセイは、標識又は非標識の反応剤を用いるフローサイトメトリーアッセイ又は静的結合であってもよい。
【００９７】
このようなアッセイに用いるeTPC-tは、
ａ)生存細胞
ｂ)凍結保存細胞
ｃ)化学的に固定された細胞
ｄ)放射線照射細胞
として作製されてもよく、ここで、ａ)及びｂ)は組み合わされてもよく、ｂ)及びｃ)は組み合わされてもよく、ｂ)及びｄ)は組み合わされてもよい。
図面の説明
本発明を以下の非限定的図面において説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１−単一組込みカップル多成分システムの成分の説明  ４成分を含んでなる多成分細胞システム(MCS)の一例。第１の成分Ａは、当該細胞の全ての要求される遺伝子操作された特徴を有するeTPC株自体である。eTPC Ａは、相補性被分析物TCR鎖対ORFの組込みのためのゲノム組込み部位である第２の成分Ｂを含有する。eTPC Ａに含まれる第３の成分は、TCRライゲーションに際して誘導される合成レポーター構築物Ｆである。１つの追加の独立成分Ｃは部位ＢへのORFの部位特異的組込み用遺伝子ドナーベクターを表し、ここで矢印はカップリングされた特異性を示す。
【図２】図２−二重組込みカップル多成分システムの成分の説明  ６成分を含んでなる多成分細胞システム(MCS)の一例。第１の成分Ａは、当該細胞の全ての要求される遺伝子操作された特徴を有するeTPC株自体である。eTPC Ａは３つの更なる成分を含有し、そのうちの２つは、被分析物TCR鎖対の組込みのためのゲノム組込み部位であるＢ及びＤである。eTPC Ａに含まれる第３の成分は、TCRライゲーションに際して誘導される合成レポーター構築物Ｆである。２つの追加の独立成分Ｃ及びＥは、それぞれ部位Ｂ及びＤへのORFの部位特異的組込み用遺伝子ドナーベクターを表し、ここで矢印はカップリングされた特異性を示す。対をなす組込み部位/ドナーベクターカップルの各々は、異なる手段により、単一ORF又はORF対を組み込んで被分析物TCR鎖対発現を導入するような形式とされ得る。
【図３】図３−異なる被分析物TCRspを提示するeTPCの編成  被分析物eTPC集団を製造する多成分細胞システム(MCS)の動作は、eTPCから始まり、ドナーベクターを利用して被分析物TCRsp又は単一被分析物TCR鎖を発現する細胞を創出する。TCRspを提示するeTPCはeTPC-tと呼ばれ、２つの相補TCR鎖をコードするORFのeTPCへの導入により創出され得る(工程ｉ)。単一被分析物TCR鎖のみを発現するeTPCはeTPC-xと呼ばれ、単一TCR鎖をコードするORFのeTPCへの導入により創出され得る(工程ii)。或いは、第２の相補TCR鎖をコードするORFが既存のeTPC-xに導入されているeTPC-tがeTPC-xから創出されてもよい(工程iii)。幾つかの例において、eTPC-xはeTPC-tから単一被分析物TCR鎖を除去することにより創出されてもよい(工程iv)。
【図４】図４−遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位組込みカップルの動作  遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は組込みカップルを形成し、ここで、遺伝子ドナーベクター内でコードされる１又は２以上のORFはカップリングされたゲノム受容部位に特異的に組み込まれ得る。組込みカップルの動作における工程１は１又は２以上の標的ORFをドナーベクターに導入することである。当初のドナーベクターはＸと呼ばれ、標的ORFの導入により、プライムされたドナーベクターＸ'に改変される。工程２は、プライムされたドナーベクターＸ'とゲノム受容部位を有する細胞Ｙとの組合せを伴う。プライムされたドナーベクターによりコードされたORFの受容部位への導入は、組み込まれた部位を有する細胞Ｙ'の創出を生じる。
【図５】図５−一工程及び１つのベクター形式を用いるeTPCシステムの編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位を含有する。遺伝子ドナーベクターＣはＤとカップリングされている。ドナーベクターＣはTCR鎖対をコードする。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC ＡはドナーベクターＣと組み合わされる。得られる細胞は、部位Ｃ'を創出し、TCR鎖対の２つのORFを送達するため、インサートＣがＢゲノム受容部位に交換されている。この細胞は、TCRspを表面に提示することができ、よってeTPC-tと呼ばれる。
【図６】図６−１つのベクター及び未使用の受容部位を用いる一工程でのeTPC-tの編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位Ｂ及びＤを含有する。遺伝子ドナーベクターＣ'はＤとカップリングされている。ドナーベクターＣ'はTCR鎖対をコードする。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC ＡはドナーベクターＣ'と組み合わされる。得られる細胞は、部位Ｂ'を創出し、TCR鎖対の２つのORFを送達するために、インサートＣ'がＢゲノム受容部位に交換されている。ゲノム受容部位Ｄは未使用のままである。この細胞はTCRspを表面に提示することができ、よってeTPC-tと呼ばれる。
【図７】図７−２つのベクター及び２つの組込みカップルを用いる一工程でのeTPC-tの編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位Ｂ及びＤを含有する。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。別異の遺伝子ドナーベクターＣ'及びＥ'は独立して、それぞれＢ及びＤとカップリングされている。ドナーベクターＣ'は単一TCR鎖をコードし、ドナーベクターＥ'は第２の相互関係性TCR鎖をコードする。eTPC ＡはドナーベクターＣ'及びＥ'と組み合わされる。得られる細胞は、部位Ｂ'を創出し、第１のTCR鎖のORFを送達するために、インサートＣがＢゲノム受容部位に交換されている。加えて、得られる細胞株は、部位Ｄ'を創出し、第２のTCR鎖のORFを送達するために、インサートＥ'がＤゲノム受容部位に交換されている。この細胞はTCRspを表面に提示することができ、よってeTPC-tと呼ばれる。
【図８】図８−１つのベクター及び未使用の受容部位を用いる一工程でのeTPC-xの編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位Ｂ及びＤを含有する。遺伝子ドナーベクターＣ'はＤとカップリングされている。ドナーベクターＣ'は単一TCR鎖をコードする。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC ＡはドナーベクターＣ'と組み合わされる。得られる細胞は、部位Ｂ'を創出し、単一TCR鎖ORFを送達するために、インサートＣ'がＢゲノム受容部位に交換されている。ゲノム受容部位Ｄは未使用のままである。この細胞は単一TCR鎖のみを発現し、よってeTPC-xと呼ばれる。
【図９】図９−２つのベクターを用いる二工程でのeTPC-tの編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位Ｂ及びＤを含有する。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。別異の遺伝子ドナーベクターＣ'及びＥ'は独立して、それぞれＢ及びＤとカップリングされている。ドナーベクターＣ'は単一TCR鎖をコードし、ドナーベクターＥ'は第２の相互関係性TCR鎖をコードする。工程１において、eTPC ＡはドナーベクターＣ'と組み合わされる。得られる細胞は、部位Ｂ'を創出し、第１のTCR鎖のORFを送達するために、インサートＣ'がＢゲノム受容部位に交換されている。この細胞は単一TCR鎖のみを発現し、よってeTPC-xと呼ばれる。ゲノム受容部位Ｄは未使用のままである。工程２において、eTPC-xはドナーベクターＥ'と組み合わされる。得られる細胞は、部位Ｄ'を創出し、第２の相補性TCR鎖のORFを送達するため、インサートＥ'がＤゲノム受容部位に交換されている。この細胞はTCRspを表面に提示することができ、よってeTPC-tと呼ばれる。
【図１０】図10−eTPCからの、単一複製ベクター中の対をなす被分析物TCR鎖を用いる、選択されたTCR鎖対ライブラリーからの異なるTCR鎖対を発現するeTPC-tプールのショットガン編成  eTPC Ａはゲノム受容部位Ｂを含有する。遺伝子ドナーベクターＣ'はＢとカップリングされている。ドナーベクターC' i、C' ii及びC' iiiは、別異のTCR鎖対をコードし、別個のTCR鎖対の混合ベクターライブラリーを構成する。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC ＡはドナーベクターC' i、C' ii及びC' iiiと同時に組み合わされる。得られる細胞プールは、複数の独立する例において、部位B' i、B' ii及びB' iiiを創出し、当初のベクターライブラリーに含有される各別個のTCR鎖対の２つのORFを送達するために、インサートＣがＢゲノム受容部位に交換されている。このeTPC-t細胞プールは、各々が別異のTCR鎖対を発現する３つの別異の細胞クローン(TCRsp i、ii及びiii)の混合集団を含んでなり、eTPC-tのプールされたライブラリーを形成する。
【図１１】図11−eTPCからの、単一複製ベクター中の対をなす被分析物TCR鎖を用いる、選択されたTCR鎖対ライブラリーからの別個のTCR鎖対を発現し、未使用の受容部位を有するeTPC-tプールのショットガン編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位Ｂ及びＤを含有する。遺伝子ドナーベクターＣ'はＢとカップリングされている。ドナーベクターC' i、C' ii及びC' iiiは別異のTCR鎖対をコードし、別個のTCR鎖対の混合ベクターライブラリーを構成する。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC ＡはドナーベクターC' i、C' ii及びC' iiiと同時に組み合わされる。得られる細胞プールは、複数の独立する例では、部位B' i、B' ii及びB' iiiを創出し、当初のベクターライブラリーに含有される各別個のTCR鎖対の２つのORFを送達するために、インサートＣがＢゲノム受容部位に交換されている。このeTPC-t細胞プールは、各々が別異のTCR鎖対を発現する３つの別異の細胞クローン(TCRsp i、ii及びiiiと呼ぶ)の混合集団を含んでなり、eTPC-tのプールされたライブラリーを形成する。ゲノム受容部位Ｄは未使用のままである。
【図１２】図12−eTPCからの、２つのベクターを用いる、選択された単一TCR鎖ライブラリーからの対をなすTCR鎖対のランダムな組合せを発現するeTPC-tプールのショットガン編成  eTPC Ａは別異のゲノム受容部位Ｂ及びＤを含有する。別異の遺伝子ドナーベクターＣ'及びＥ'は独立して、それぞれＢ及びＤとカップリングされている。ドナーベクターC' i及びC' iiは各々が単一TCR鎖をコードし、ドナーベクターE' i及びE' iiは各々が相互関係性単一TCR鎖をコードする。eTPC ＡはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC ＡはドナーベクターC' i、C' ii、E' i及びE' iiと同時に組み合わされる。得られる細胞プールは、複数の独立する例で、各々がTCR鎖の単一ORFを送達するための部位B' i及びB' iiを創出するために、インサートC' i又はC' iiがＢゲノム受容部位に交換されている。得られる細胞プールは更に、複数の独立する例で、各々が、部位C' i及びC' iiのものと相互関係性であるTCR鎖の単一ORFを送達するための部位E' i及びE' iiを創出するために、インサートE i又はE iiがＤゲノム受容部位に交換されている。得られるeTPC-t細胞プールは、各々が、当初のベクターライブラリーに含有される相互関係性TCR鎖の各々の１つで構成される別個のランダム化されたTCRspを表面で発現する４つの別異の細胞コホートの混合集団を含んでなる。
【図１３】図13−対をなさない被分析物TCR鎖を有するeTPC-xからの、選択された単一TCR鎖ライブラリーからの対をなすTCR鎖対のランダムな組合せを発現するeTPC-tプールのショットガン編成  eTPC-xは、単一TCR鎖を発現する交換されたゲノム受容部位Ｂ'及び別異のゲノム受容部位Ｄを含有する。別異の遺伝子ドナーベクターE' i及びE' iiはそれぞれＤとカップリングされている。ドナーベクターE' i及びE' iiは各々が単一TCR鎖をコードする。eTPC-xはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。eTPC-xはドナーベクターE' i及びE' iiと同時に組み合わされる。得られる細胞プールは、複数の独立する例で、各々がTCR鎖の単一ORFを送達する部位E i及びE' iiを創出するために、インサートE' i又はE' iiがＤゲノム受容部位に交換されている。得られるeTPC-t細胞プールは、当初のベクターライブラリーに含有される各TCR鎖の１つと対をなすＢ'から発現されるTCR鎖で構成される別個のTCRspを表面で発現する２つの別異の細胞コホートの混合集団を含んでなる。
【図１４】図14−eTPC-tのeTPC-xへの復帰  上パネルに示す細胞はTCRspを表面に提示することができ、よってeTPC-tと呼ばれる。このeTPC-tは、TCR ORFが占めていることでＢ'及びＤ'形態にあるゲノム受容部位Ｂ及びＤを有する。遺伝子ドナーベクターは、ゲノム受容部位マーカーを有し、部位Ｂ'又はＤ'とカップリングされている(Ｙ及びＺと呼ぶ)。Ｙ又はＺのeTPC-tへの付加は、Ｂ'又はＤ'のいずれかによりコードされるTCR鎖にゲノム受容部位マーカーを交換する。得られる細胞は単一TCR鎖のみを発現し、よってeTPC-xと呼ばれる。
【図１５】図15−可能性のある被分析物親和性反応剤-又はNCBP-結合eTPC-tの出力状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作  被分析物eTPC-tは、表面の相互関係性TCRspをコードする１つのORFが各々組み込まれた部位Ｂ'及びＤ'を含有する。被分析物eTPC-t及び被分析物親和性反応剤又はNCBPが接触すると、異なるeTPC-t標識状態が達成され得る；本実施例においては、１つのネガティブ及び３つのポジティブである。ネガティブ状態は、入力eTPC-tの静止状態であり、被分析物親和性反応剤又はNCBPの検出可能な結合がなく、被分析物親和性反応剤又はNCBPがeTPC-tにより提示されるTCRspと安定な複合体を形成できないことを示す。３つのポジティブ状態は、細胞に付されるより濃い影で示されるように、被分析物親和性反応剤又はNCBPの結合程度の仮想範囲を示す。これは、被分析物親和性反応剤又はNCBP被分析物の、eTPC-t集団により発現されるTCRspに対する結合の等級付けを示す。
【図１６】図16−被分析物親和性反応剤又はNCBPに対する可能性のあるシグナルにより報告されるeTPC-tの出力状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作  被分析物eTPC-tは、表面の相互関係性TCRspをコードする１つのORFが各々組み込まれた部位Ｂ'及びＤ'を含有する。eTPC-tはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。被分析物eTPC-t及び被分析物親和性反応剤又はNCBPが接触すると、異なるeTPC-t応答状態が達成され得、本実施例では、１つのネガティブ及び３つのポジティブである。ネガティブ状態は、eTPC-tの静止状態であり、Ｆエレメントでのシグナル強度がなく、被分析物親和性反応剤又はNCBPが複合体を形成してeTPC-tにより提示されるTCRspを刺激することができないことを示す。３つのポジティブ状態は、Ｆからの漸増シグナル強度を示す。状態F'+、F'++及びF'+++はそれぞれ低、中及び高シグナル強度を表す。細胞に付されるより濃い影で示されるように、ヘキサゴンと呼ばれるＦの遺伝子産物は蓄積して各細胞状態のシグナル強度を報告する。これは、eTPC-t集団により発現される被分析物TCRspの被分析物親和性反応剤又はNCBPに対する応答(Ｆエレメントへのシグナル変換を生じる)の等級付けを示す。
【図１７】図17−被分析物APCに対する可能性のあるシグナルにより報告されるeTPC-tの出力状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作  被分析物eTPC-tは、表面の相互関係性TCRspをコードする１つのORFが各々組み込まれた部位Ｂ'及びＤ'を含有する。eTPC-tはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。被分析物eTPC-t及び被分析物APC集団が接触すると、異なるeTPC-t応答状態が達成され得、本実施例では、１つのネガティブ及び３つのポジティブである。ネガティブ状態はeTPC-tの静止状態であり、Ｆエレメントでのシグナル強度がなく、被分析物APCにより提示されるaAPX:aAM/CM又はaAMがeTPC-tにより提示されるTCRspを刺激できないことを示す。３つのポジティブ状態はＦからの漸増シグナル強度を示す。状態F'+、F'++及びF'+++はそれぞれ低、中及び高シグナル強度を表す。細胞に付されるより濃い影で示されるように、ヘキサゴンと呼ばれるＦの遺伝子産物は蓄積して各細胞状態のシグナル強度を報告する。これは、eTPC-t集団により発現される被分析物TCRspの、被分析物APCにより提示される被分析物aAPX:aAM/CM又はaAMに対する応答の等級付けを示す。
【図１８】図18−可能性のある被分析物APCの出力状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作  被分析物eTPC-tは、表面の相互関係性TCRspをコードする１つのORFが各々組み込まれた部位Ｂ'及びＤ'を含有する。eTPC-tはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。被分析物eTPC-tと被分析物APC集団とが接触すると、異なるAPC応答状態が達成される。本実施例では、１つのネガティブ状態及び３つのポジティブ状態である。ネガティブ状態は被分析物APCの静止状態であり、TCRsp鎖対は被分析物APCにより提示されるaAPX:aAM/CM又はaAM複合体を刺激することができないことを表す。３つのポジティブ状態は、接触されたaAPX:aAM/CM又はaAMからの漸増シグナル強度を示す。各細胞状態の報告されるシグナル強度は、*、**、***で表され、細胞の濃淡の色づけによっても示す。これは、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRsp鎖対に対する、被分析物aAPX:aAM/CM又はaAMの応答が段階的であることを示す。
【図１９】図19−eTPC-tプールからの被分析物親和性反応剤又はNCBPとのTCRsp鎖対の結合を同定するeTPC:A組合せの動作  eTPC-tプールは、部位B' i、ii又はiii及びD' i、ii又はiiiを有する細胞を含有する。ここで、各eTPC-tは相補性TCR鎖対をコードするORF対が組み込まれており、よって、該集団中の各細胞コホートは、別個のTCRspを表面で発現する。被分析物親和性反応剤又はNCBPを被分析物eTPC-tプールと接触させる。本実施例では、B' i/D' iから発現するTCR鎖対(TCRsp i)のみが、被分析物親和性反応剤又はNCBPに特異的であり、TCRsp iを有するeTPC-tの細胞コホート(etTPC-t*)のみが、被分析物抗原又はNCBPと検出可能に結合することができる(*)。被分析物親和性反応剤又はNCBPに結合したeTPC-t*は、プールから、親和性反応剤-又はNCBP-標識に基いて選択され得る。その後、選択され単離されたeTPC-t*の被分析物TCRspをコードするORFは、Ｂ'及びＤ'のDNAを直接的に又はＢ'及びＤ'の発現された転写物の逆転写トランスクリプターゼPCRにより間接的に配列決定することにより同定することができる。
【図２０】図20−被分析物親和性反応剤又はNCBPでの刺激によるシグナル-レポート応答の誘導を介する、eTPC-tのプールからTCRsp鎖対を同定するeTPC:A組合せシステムの動作  eTPC-tプールは、部位B' i、ii又はiii及びD' i、ii又はiiiを有する細胞を含有する。ここで、各eTPC-tは、TCR鎖の相補対をコードするORF対が組み込まれており、よって、該集団中の各細胞コホートは別個のTCRspを表面で発現する。eTPC-tはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。被分析物抗原又はNCBPを被分析物eTPC-tプールと接触させる。本実施例では、B' i/D' iから発現したTCR鎖対(TCRsp i)のみが被分析物親和性反応剤又はNCBPに特異的であり、TCRsp iを有するeTPC-tの細胞コホート(eTPC-t*)のみが、エレメントＦを介するシグナルレポート応答を誘導することができる(*)。被分析物親和性反応剤又はNCBPに結合したeTPC-t*は、eTPC-tのプールから、親和性反応剤-又はNCBP-標識に基いて選択され得る。その後、選択され単離されたeTPC-t*の被分析物TCRspをコードするORFは、Ｂ'及びＤ'のDNAを直接的に又はＢ'及びＤ'の発現された転写物の逆転写トランスクリプターゼPCRにより間接的に配列決定することにより同定することができる。
【図２１】図21−被分析物APCでの刺激によるシグナル-レポート応答の誘導を介する、eTPC-tのプールからTCRsp鎖対を同定するeTPC:A組合せシステムの動作  eTPC-tプールは、部位B' i、ii又はiii及びD' i、ii又はiiiを有する細胞を含有する。ここで、各eTPC-tは、相互関係性TCR鎖対をコードするORF対が組み込まれており、よって、該集団中の各細胞コホートは別個のTCRspを表面で発現する。eTPC-tはTCRシグナル応答エレメントＦを更に含有する。被分析物APCは表面でaAPX:aAM/CM又はaAMを発現する。本実施例では、B' i/D' iから発現したTCR鎖対(TCRsp i)のみが被分析物APCにより提示されるaAPX:aAM/CM又はaAMに特異的であり、eTPC-tプール及び被分析物APC集団が接触すると、TCRsp iを有するeTPC-tの細胞コホート(eTPC-t*)のみが、状態Ｆ'を介するTCRsp結合を報告する。被分析物APCにより刺激されるeTPC-t*は、プールから、シグナルレポート応答に基いて選択され得る。その後、選択され単離されたeTPC-t*の被分析物TCRspをコードするORFは、Ｂ'及びＤ'のDNAを直接的に又はＢ'及びＤ'の発現された転写物の逆転写トランスクリプターゼPCRにより間接的に配列決定することにより同定することができる。
【図２２】図22−APC中心シグナルレポート応答の誘導を介する、被分析物APCにより提示される被分析物抗原を同定するeTPC:A組合せシステムの動作  被分析物APCプールは、種々のaAPX:aAM/CM又はaAMを表面に発現する細胞を含有する。被分析物eTPC-tは、TCRspの表面での発現を駆動する、交換されたゲノム受容部位Ｂ'及びＤ'を含有する。本実施例では、複合体aAPX:aAM/CM又はaAM iのみが被分析物eTPC-tにより提示されるTCRspに特異的である。被分析物APCプール及び被分析物eTPC-t集団が接触すると、aAPX:aAM/CM iを発現する細胞コホートのみが応答する(*)。この応答は、eTPC-t結合に固有のシグナル応答(例えば、表面表現型、転写物の豊富さ又は細胞死の変化)であり得る。応答する被分析物APCは、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspと接触したaAPX:aAM/CM又はaAMを決定するために選択され得る。
【図２３】図23−eTPC-tによる親和性反応物又はNCBP反応剤の捕捉を介する親和性反応剤又はNCBPのプールから親和性反応剤又はNCBPを同定するeTPC:A組合せシステムの動作  被分析物eTPC-tは、表面にてTCRspの発現を駆動する交換されたゲノム受容部位Ｂ'及びＤ'を含む。親和性反応物又はNCBPプールを被分析物eTPC-tと接触させる。これは、被分析物eTPC-tにより提示されるTCRspに特異的な被分析物親和性反応物又はNCBPの結合を許容する。この図において、TCRspは、親和性反応物又はNCBP iとのみ特異的に結合し、よって、被分析物eTPC-tは、親和性反応剤又はNCBP iでのみ標識される。よって、親和性反応剤又はNCBPは、eTPC-tとの結合を介してプールから選択され得、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspに特異的なこれらの親和性反応剤又はNCBPを同定し得る。
【図２４】図24−eTPC:A組合せシステムの組立てのためのeTPC-tを作製する多成分システムの動作。遺伝子操作された多成分細胞システム(MCS)が製造された被分析物 遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)をeTPC:A組合せシステムにおいて種々の被分析物抗原と接触させることを含む全体システム。一次出力が導かれるのはeTPC:A組合せシステムからであり、これら一次出力から終端出力が導かれる。全体システムの動作は、２つの相：製造相及び分析相を含む。  第１相の１つの態様点において、被分析物抗原が作製される。この被分析物抗原は、種々の形態の抗原性部分；被分析物抗原提示複合体(aAPX)；被分析物抗原性分子(aAM)；aAM積荷を積載したaAPX(aAPX:aAM)；積荷分子(CM)；CMを積載したaAPX(aAPX:CM)に抗原を発現し、ここで、被分析物抗原は、被分析物eTPC-tに対する親和性又はシグナル誘導について試験されるものを表し(工程ｉ)、被分析物抗原は、少なくとも１つの以下の形態：可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により提示されるかまたは細胞(APC)の表面に提示される不動化された反応剤を採り得る。第１相の別の態様において、多成分システムを用いて、細胞表面に被分析物TCR鎖対(TCRsp)を発現する細胞を作製する(工程ii)。細胞表面にTCRspを発現するeTPCは、eTPC-tと呼ばれ、ここで、eTPC-tは、TCRspを被分析物抗原に提示して、被分析物抗原に対する親和性又はシグナル誘導を試験する。eTPC-tと被分析物抗原との接触は、eTPC:A組合せシステムの組立てに起因する(工程iii)。  全体システムの第２相は、eTPC:A組合せシステムの組立てをもたらす第１相(工程iii)で作製したeTPC-tと被分析物抗原との接触である(工程iii)。接触させた被分析物抗原は、被分析物部分を被分析物eTPC-tに提示し、eTPC-tと結合して、提示されたTCRspと安定な複合体を形成する可能性がある。eTPC:A組合せシステム内で、被分析物抗原又は被分析物eTPC-tの出力は、反応する種又は安定に複合体化した種が同定され得るように、シグナル状態又は安定な複合体(直接同定され得る；*及び陰影で示す)を変化させ得る(工程iv)。eTPC:Aシステム内で変更されたシグナル状態に基づいて、特異的被分析物抗原は、eTPC-tにおいて応答を誘導するか若しくはTCRspと安定な複合体を形成する能力又は(該当する場合)被分析物抗原において応答を誘導するeTPC-tの能力に基づいて選択され得る。同様に、被分析物eTPC-tは、接触された被分析物抗原において応答を誘導する能力若しくはeTPC-tにおいてシグナル応答を誘導する被分析物の能力又はTCRspと安定な複合体を形成する被分析物抗原の能力に基づいて選択され得る。この応答性又は安定な複合体に基づく選択は、eTPC:A組合せシステムの一次出力を生じる(工程ｖ)。被分析物細胞及び/又は被分析物抗原を工程ｖから得ることにより、提示される被分析物aAPX、aAM、aAPX:aAM、CM、aAPX:CM及び/又はTCRspは、システム動作の終端出力として同定され得る(工程vi)。
【図２５】図25−HEK239細胞株における、HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子座の標的化変異誘発を有する細胞の選択ａ)HEK293コントロール細胞(破線ヒストグラム)と比較した、Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミドとHLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子座を標的するgRNAとでのトランスフェクションの48時間後の２つの独立細胞集団におけるGFP蛍光シグナル(灰色ヒストグラム)。GFPサブセットゲート内のGFPシグナルを有する細胞をポリクローナル集団として選別した。ｂ)PE-Cy5抗HLA-ABC接合抗体で標識されたときに２つの選別されたポリクローナル集団で観察された細胞表面HLA-ABCシグナル(灰色ヒストグラム)。低いPE-Cy5抗HLA-ABCシグナルを示しソートゲート内で提示された単一細胞を選別して、モノクローンを確立した。非標識HEK293細胞(点線ヒストグラム)及びPE-Cy5抗HLA-ABC標識HEK293細胞(漆黒線ヒストグラム)をコントロールとして供した。
【図２６】図26−HLA-ABCnullモノクローンの表現型分析：モノクローン集団をPE-Cy5抗HLA-ABC接合抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した(灰色ヒストグラム)。非標識HEK293細胞(破線ヒストグラム)及びPE-Cy5抗HLA-ABC標識HEK293細胞(漆黒線ヒストグラム)をコントロールとして供した。３つ全てのモノクローン株が、非標識コントロールに一致する蛍光シグナルを示したことにより、各株がHLA-ABC表面発現を欠いていることが証明された。
【図２７】図27−標的付けられたHLAにおけるゲノム欠失を証明する表面HLA-ABC発現を欠くモノクローンの選択の遺伝子特徴決定。PCRアプリコンを、特定のHLAアレレのgRNAゲノム標的部位に及ぶプライマーを用いて作製し、そのサイズを電気泳動により決定した。予想されたサイズは、野生型HLA-Aアプリコンが1067bpであり、HLA-Bアプリコンが717bpであり、HLA-Cアプリコンが1221bpである。
【図２８】図28−合成成分Ｄを伴うか又は伴わない合成成分Ｂの標的付けられたゲノム組込みを有する細胞の選択  ａ)Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミドとAAVS1遺伝子座を標的するgRNAとAAVS1左右相同性アームが隣接する成分Ｂ遺伝子エレメントとでのトランスフェクションの48時間後のGFP蛍光シグナル(灰色ヒストグラム)。HEK293細胞をGFPネガティブコントロールとして供した(点線ヒストグラム)。GFP+ゲート内でGFPシグナルを有する細胞をポリクローナル集団として選別した。ｂ)Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミドとAAVS1遺伝子座を標的するgRNAと共にAAVS1左右相同性アームが隣接する成分Ｂ及びＤとでのトランスフェクションの48時間GFP蛍光シグナル(灰色ヒストグラム)。HEK293細胞をGFPネガティブコントロールとして供した(点線ヒストグラム)。GFP+ゲート内でGFPシグナルを有する細胞をポリクローナル集団として選別した。ｃ)BFPシグナルを維持するがRFPシグナルは検出されないものがD1選別ポリクローナル集団内に観察された。Q3象限内の高いBFPシグナルを示す単一細胞を選別し、合成成分Ｂを含有するeTPCモノクローンを樹立した。ｄ)BFP及びRFPシグナルを維持するものがD2選別ポリクローナル集団内に観察された。Q2象限内の高いBFP及びRFPシグナルを示す単一細胞を選別し、合成成分Ｂ及び合成成分Ｄを含有するeTPCモノクローンを樹立した。
【図２９】図29−eTPCモノクローンの表現型分析：ａ及びｂ)維持されたBFP発現を表示するモノクローン集団は、合成成分Ｂの組込みを示唆する。ｃ)維持されたBFP及びRFP発現を表示するモノクローン集団は、合成成分Ｂ及び合成成分Ｄの両方の組込みを示唆する。
【図３０】図30−AAVS1遺伝子座における成分Ｂ又は成分Ｂ及びＤの組込み用のモノクローンの選択の遺伝子特徴決定  ａ)PCRアプリコンを、成分Ｂ及び/又はＤでプライムするプライマーを用いて作製し、サイズを電気泳動により決定した。ポジティブアプリコンの予想サイズは、成分Ｂ及び/又はＤの安定な組込みを示す380bpである。ｂ)PCRアプリコンを、相同性アームによりコードされる領域に対して遠位であるAAVS1ゲノム配列並びに成分Ｂ及び/又はＤによりコードされるSV40 pAターミネーターでプライムするプライマーを用いて作製し、サイズを電気泳動により決定した。ポジティブアプリコンの予想サイズは、AAVS1部位に生じた成分Ｂ及び/又はＤの組込みを示す660bpである。
【図３１】図31は、標的基本細胞の同定及びeTPC又はそのバリアントを取得する本発明の方法を図説する。  標的基本細胞からeTPC及び/又はeTPC+Fを遺伝子操作して取得する方法は、・工程ａは標的基本細胞の選択である。・工程ｂは、細胞表面に相補性TCR鎖対をCD3と複合体化したタンパク質(TCRsp)として発現することにコンピテントな(適格な)標的基本細胞として規定されるTCRspコンピテント基本細胞を同定し選択することである。・工程ｃは、天然に又は遺伝子操作により遺伝子コードされたCD3を含有するが、細胞がTCR鎖の相補対をコードする核酸と共に提供されたときという条件で、CD3を表面で発現するTCRspコンピテント基本細胞として規定される確証基本細胞を同定し選択することである。・工程ｄは、ゲノムに組み込まれた成分Ｂ及び/又は成分Ｄを含有するように遺伝子操作されているが正確なコピー数及び位置は決定されていない確証基本細胞として規定される推定eTPCを遺伝子操作し、選択することである。・工程ｅは、各成分Ｂ及び/又はＤを単一コピーでのみ有することが確証されている推定eTPCとして規定されるeTPCを確証し、選択することである。必要に応じて、成分Ｂ及び/又は成分Ｄは、成分Ｃ'及び/又はＥ'内にコードされる少なくとも１つのORFを組み込む能力について試験される。・工程ｆは、ゲノムに組み込まれた成分Ｆを含有するように遺伝子操作されているが、成分Ｆを介してシグナル応答を誘発可能であることを確証するために試験されていないeTPCとして定義される推定eTPC+Fを遺伝子操作し、選択することである。・工程ｇは、試験されて、TCR鎖の相補対の同族抗原での刺激により成分Ｆを介してシグナル応答を誘発する能力が確証されている推定eTPC+Fとして定義されるeTPC+Fを確証し、選択することである。必要に応じて、成分Ｆのゲノム位置及びコピー数を決定する。  標的基本細胞から、事前にeTPCを作製する必要なく、直接eTPC+Fを作製することが可能である。この場合、該方法は、工程ａ〜ｃを含み、更に下記工程を含む・工程ｈは、ゲノムに組み込まれた成分Ｆを含有するように遺伝子操作されているが、成分Ｆを介してシグナル応答を誘発可能であることを確証するために試験されていない確証基本細胞として定義される推定の基本細胞＋Ｆを遺伝子操作し、選択することである。・工程ｉは、試験されて、TCR鎖の相補対の同族抗原での刺激により成分Ｆを介してシグナル応答を誘発する能力が確証されている推定の基本細胞＋Ｆとして定義されるＡ基本細胞＋Ｆを確証し、選択することである。必要に応じて、成分Ｆのゲノム位置及びコピー数を決定する。・工程ｊは、ゲノムに組み込まれた成分Ｂ及び/又は成分Ｄを含有するように遺伝子操作されているが、正確なコピー数及び位置は決定されていない基本細胞＋Ｆとして定義される推定eTPC+Fを遺伝子操作し、選択することである。・工程ｇは、各成分Ｂ及び/又はＤを単一コピーでのみ有することが確証されている推定eTPC+Fとして定義されるeTPC+Fを確証し、選択することである。必要に応じて、成分Ｂ及び/又は成分Ｄは、成分Ｃ'及び/又はＥ'内にコードされる少なくとも１つのORFを組み込む能力について試験される。
【図３２】図32−TCRspコンピテント基本細胞を同定し選択する方法  eTPCの遺伝子操作における第１のプロセスとしての、CD3と複合体化したTCR鎖対(TCRsp)を細胞表面に発現することにコンピテントである標的基本細胞(TCRspコンピテント基本細胞と呼ぶ)を同定し選択する方法・工程ａは、標的基本細胞を選択することである。・工程ｂは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での染色である。・工程ｃは、細胞がTCRsp及びCD3の表面発現を欠くかどうかを同定することである。・工程ｄは、細胞を、相補性TCR鎖対(pTCR)及びCD3タンパク質の発現をコードする核酸でトランスフェクトすることである。・工程ｅは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｆは、TCRsp及びCD3の表面発現を有する細胞を同定し、細胞がTCRsp発現にコンピテントであることを確証することである。・工程ｇは、工程ｆで同定した細胞をTCRspコンピテント基本細胞として選択することである。
【図３３】図33−確証基本細胞をTCRspコンピテント基本細胞から同定し選択する第１の方法  TCRspコンピテント基本細胞を同定し、確証基本細胞として選択することができる第１の方法、ここで、確証基本細胞は、TCRspを発現することができ、CD3の発現を遺伝子コードする細胞である。  本方法は以下を含む・工程ｇは、TCRspコンピテント基本細胞を選択することである(図31)。・工程ｈは、相補性TCR鎖対(pTCR)の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクションである。・工程ｉは、CD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｊは、CD3の表面発現を有する細胞を同定し、細胞が、TCPspをコードする核酸と共に提供されたとき、CD3を発現可能であることを確証することである。・工程ｋは、工程ｊに規定される同定細胞を確証基本細胞として選択することである。
【図３４】図34−確証基本細胞をTCRspコンピテント基本細胞から同定し、遺伝子操作して選択する第２の方法  TCRspコンピテント基本細胞を、同定し、遺伝子操作して、確証基本細胞として選択することができる第２の方法、ここで、確証基本細胞は、TCRspを発現することができ、CD3の発現を遺伝子コードする細胞である。  本方法は以下を含む・工程ｇは、TCRspコンピテント基本細胞を選択することである(図31)。・工程ｈは、相補性TCR鎖対(pTCR)の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクション、及び独立に行われる、CD3の発現をコードする核酸でのトランスフェクションである。・工程ｉは、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｊは、独立の両トランスフェクションにおいて、TCRsp及び/又はCD3発現を欠く細胞を同定することである。・工程ｋは、CD3の発現をコードする核酸を細胞のゲノムに組み込むことである。・工程ｌは、相補性TCR鎖対(pTCR)の発現をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすることである。・工程ｍは、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｎは、TCRsp及びCD3を細胞表面に発現する細胞を選択することである。・工程ｏは、工程ｎの遺伝子操作された細胞を確証基本細胞として選択することである。
【図３５】図35−確証基本細胞をTCRspコンピテント基本細胞から同定し、遺伝子操作して選択する第３の方法  TCRspコンピテント基本細胞を同定し、遺伝子操作し、確証基本細胞として選択することができる第３の方法、ここで、確証基本細胞は、TCRspを発現することができ、CD3の発現を遺伝子コードする細胞である。  本方法は以下を含む・工程ｇは、TCRspコンピテント基本細胞を選択することである(図31)。・工程ｈは、CD3の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクションである。・工程ｉは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｊは、TCRsp及びCD3の表面発現を有する細胞を同定することである。・工程ｋは、CD3の発現をコードする核酸を細胞のゲノムに組み込むことである。・工程ｌは、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｍは、TCRsp及び/又はCD3を細胞表面に発現する細胞を選択することである。・工程ｎは、TCRゲノム遺伝子座の標的付けられた変異である。・工程ｏは、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｐは、TCRsp及び/又はCD3の細胞表面での発現を欠く細胞を選択することである。・工程ｑは、TCR鎖相補対の単一鎖(TCRc1)の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクションである。・工程ｒは、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｓは、細胞表面でのTCRsp及び/又はCD3の発現を欠く細胞を選択することである。・工程ｔは、TCR鎖相補対の単一鎖(TCRc2)(工程ｑのTCRc1の同族対である)の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクションである。・工程ｕは、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｖは、細胞表面でのTCRsp及び/又はCD3の発現を欠く細胞を選択することである。・工程ｗは、工程ｖの遺伝子操作細胞を確証基本細胞として選択することである。
【図３６】図36−確証基本細胞を標的基本細胞から同定し、遺伝子操作し、選択する方法  標的基本細胞を同定し、遺伝子操作し、確証基本細胞として選択することができる方法、ここで、確証基本細胞は、TCRspを発現することができ、CD3の発現を遺伝子コードする細胞である。確証基本細胞の選択は、eTPCの遺伝子操作における第２のプロセスである。  本方法は以下を含む・工程ａは、標的基本細胞を選択することである。・工程ｂは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での染色である。・工程ｃは、TCRsp及びCD3の表面発現を同定することである。・工程ｄは、工程ｃで決定されたように、TCRspコンピテント基本細胞を選択することである。・工程ｅは、TCRゲノム遺伝子座の標的付けられた変異である。・工程ｆは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｇは、細胞表面でのTCRsp及びCD3の発現を欠く細胞を選択することである。・工程ｈは、TCR鎖相補対の単一鎖(TCRc1)の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクションである。・工程ｉは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｊは、細胞表面でのTCRsp及びCD3の発現を欠く細胞を選択することである。・工程ｋは、TCR鎖相補対の単一鎖(TCRc2)(工程ｑのTCRc1の同族対である)の発現をコードする核酸での細胞のトランスフェクションである。・工程ｌは、TCRsp及びCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｍは、細胞表面でのTCRsp及びCD3の発現を欠く細胞を選択することである。・工程ｎは、工程ｖの遺伝子操作細胞を確証基本細胞として選択することである。
【図３７】図37−確証基本細胞から、eTPC又はeTPC+Fを遺伝子操作し選択する方法  eTPCを遺伝子操作し選択する方法、ここで、確証基本細胞は、ゲノムに組み込まれた成分Ｂ及び/又は成分Ｄを含有するように遺伝子操作され、推定eTPCを得て、その後、推定eTPCは、各成分Ｂ及び/又はＤを単一コピーでのみ有することが確証される。必要に応じて、成分Ｂ及び/又は成分Ｄを試験して、成分Ｃ'及び/又はＥ'内にコードされる少なくとも１つのORFを組み込む能力を確認する。  本方法は以下を含む・工程ａは、図32〜36に示す方法のいずれかを用いて、確証基本細胞を選択することである。・工程ｂは、成分Ｂ及び/又は成分Ｂを細胞のゲノムに組み込むことである。・工程ｃは、成分Ｂ及び/又は成分Ｄ選択マーカーの発現について選択することにより、成分Ｂ及び/又はＣが組み込まれた細胞を選択することである。・工程ｄは、工程ｃに従って推定eTPCを取得することである。・工程ｅは、成分Ｂ及び/又はＤのゲノムでの位置、及び各成分が単一コピーでのみゲノム内に存在することを確証することである。・工程ｆは、必要に応じて、細胞を、組込み因子と組み合わせた成分Ｃ'及び/又はＥ'でトランスフェクトすることである。・工程ｇは、必要に応じて、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｈは、必要に応じて、TCRsp及び/又はCD3の表面発現を有する細胞を同定することである。・工程ｉは、必要に応じて、成分Ｂ及び/又はＤ選択マーカーの喪失を同定することである。・工程ｊは、必要に応じて、成分Ｃ'及び/又は成分Ｅ'組込みの選択マーカーの獲得を同定することである。・工程ｋは、推定eTPCをeTPCとして確証することである。ここで、確証は、工程ｅ、及び/又は工程ｆ、ｉ、ｊ及び/又はｇのいずれか及びｈにより決定される。  工程ｄから工程ｋへの破線矢印は、推定eTPCが工程ｅに規定される最小限の確証によってeTPCであると確証されることを示す。工程ｅからｆへの破線矢印はこのプロセスが任意選択であることを示し、工程ｈ、ｉ及びｊを囲む点線箱はｈ、ｉ又はｊの少なくとも１つが行われなければならないことを示す。点線箱から工程ｋへの破線は、工程ｈ、ｉ及び/又はｊにおいて決定されるような、eTPCの更なる確証及び特徴決定を示す。  この方法はまた、eTPC+Fを取得するために、工程ａ、工程ｄ及び工程ｋを以下のように置換してもよい。・工程ａは、図38に規定する置換した方法を用いて、Ａ基本細胞＋Ｆを選択することである。・工程ｄは、工程ｃに従って推定eTPC+Fを取得することである。・工程ｋは、推定eTPC+FをeTPC+Fとして確証することである。ここで、確証は、工程ｅ、及び/又は工程ｆ、ｉ、ｊ及び/又はｇのいずれか及びｈにより決定される。
【図３８】図38−確証基本細胞から、eTPC+F又はeTPCを遺伝子操作し選択する方法  eTPC+Fを遺伝子操作し選択する方法ここで、eTPCは、ゲノムに組み込まれた成分Ｆを含有するように遺伝子操作され、推定eTPC+Fを得て、その後、推定eTPC+Fは、細胞及び成分ＦがTCR鎖相補対の同族抗原での刺激により成分Ｆを介してシグナル応答を誘発可能であることを確証するために試験される。必要に応じて、成分Ｆのゲノム位置及びコピー数を決定する。  本方法は以下を含む・工程ａは、図37に規定される方法を用いて、eTPCを選択することである。・工程ｂは、成分Ｆを細胞のゲノムに組み込むことである。・工程ｃは、成分Ｆ組込みの選択マーカーの発現について選択することにより、成分Ｆが組み込まれた細胞を選択することである。・工程ｄは、工程ｃに従って推定eTPC+Fを取得することである。・工程ｅは、必要に応じて、ゲノム内での成分Ｆの位置及び細胞のゲノムに存在するコピー数を確証することである。・工程ｆは、組込み因子と組み合わされた成分Ｃ'及び/又はＥ'で細胞をトランスフェクトすることである。・工程ｇは、必要に応じて、TCRsp及び/又はCD3特異的親和性反応剤での細胞の染色である。・工程ｈは、必要に応じて、TCRsp及び/又はCD3の表面発現を有する細胞を選択することである。・工程ｉは、成分Ｂ及び/又はＤ選択マーカーの喪失を選択することである。・工程ｊは、成分Ｃ'及び/又は成分Ｅ'組込みの選択マーカーの獲得を選択することである。・工程ｋは、少なくとも１つの工程ｈ、ｉ及び/又はｊにより選択されるような選択細胞のTCRspを、TCRspに対する同族抗原で刺激することである。・工程ｌは、工程ｋの刺激により誘導されるシグナル応答を検出することである。ここで、応答は成分Ｆにより報告される。・工程ｍは、推定eTPC+FをeTPC+Fとして確証することである。ここで、確証は工程ｌ及び必要に応じて工程ｅにより決定される。  工程ｍへの破線矢印は、工程ｌに規定される最小の確証により推定eTPC+FがeTPC+Fであると確証されることを示す。工程ｈ、ｉ及びｊを囲む点線箱は、工程ｋのための細胞を選択するために、ｈ、ｉ又はｊの少なくとも１つが行われなければならないことを示す。  この方法はまた、工程ａ、ｄ、ｆ及びｍを以下のように置換してもよい。・工程ａは、図32〜36に示すいずれかの方法のいずれかを用いて、確証基本細胞を選択することである。・工程ｄは、工程ｃに従ってＡ推定基本細胞＋Ｆを取得することである。・工程ｆは、TCR鎖の相補対の発現をコードする核酸を一過性にトランスフェクトすることである。・工程ｍは、推定の基本細胞＋Ｆを基本細胞＋Ｆとして確証することである。ここで、確証は工程ｌ及び必要に応じて工程ｅにより決定される。
【図３９】図39−標的基本細胞のFACS分析、ここで、細胞は抗TCR-α-β及び抗CD3で染色されている。  プロットは、標的基本細胞がCD3及びTCRspの表面発現を欠くことを明確に証明する。染色細胞(黒線、灰色塗潰し)と非染色細胞(破線、塗潰しなし)との間に蛍光強度の有意差はない。
【図４０】図40−標的基本細胞のFACS分析  細胞を、CD3及びpTCRの一過性発現をコードするプラスミドでトランスフェクトし、その後、抗TCR-α-β及び抗CD3並びに、可溶性抗原としてのdexA2-NLV-PEで染色した(aAPX:aM)。２つの異なるpTCRを用いた。第１のpTCR(Ａ)はdexA2-NLV-PEに結合できないことが知られている一方、第２のpTCR(Ｂ)はdexA2-NLV-PEに同族抗原として結合することが知られている。コントロールとして、標的基本細胞を、発現をコードしないプラスミド(空ベクターコントロールと呼ぶ)でトランスフェクトした(Ｃ)。全てのプロットで抗CD3蛍光強度をｙ軸とし、左パネルでは、ｘ軸を抗TCR-α-β蛍光強度とし、右パネルではｘ軸をdexA2-NLV-PE蛍光強度とする。各プロット内(右上隅)の値は、CD3+TCRsp+又はCD3+dexA2-NLV-PE+に関してポジティブな細胞の率である。  プロットは、標的基本細胞が、CD3及びTCRspの発現をコードする核酸と共に提供されるとき、CD3及びTCRspを発現可能であることを明確に証明する。加えて、dexA2-NLV-PEに結合することが知られているpTCR(Ｂ)によりコードされるTCRspは、該可溶性抗原への明確な結合を示す。このことは、TCRspが生物学的機能を保持することを示している。対照的に、dexA2-NLV-PEに結合できないことが知られているTCRsp(Ｂ)は結合を示さなかった。
【図４１】図41−TCRspコンピテント基本細胞のCD3及びTCRsp表面発現喪失の同定  TCR-α(Ａ)、TCR-β(Ｂ)又は空ベクターコントロール(Ｃ)のいずれかの発現をコードするプラスミドでトランスフェクトされたTCRspコンピテント基本細胞のCD3及びTCRsp表面発現喪失の同定。TCRα又はTCRβプラスミドでトランスフェクトされた細胞の蛍光強度に、空ベクターコントロールとの比較による有意差は観察されなかった。このことは、相補性TCR鎖の内因性発現の喪失を示す。加えて、CD3の表面発現も示されなかった。このことは更に、細胞が内因性CD3もいずれのTCR鎖も発現しなかったことを確証する。
【図４２】図42−CD3を組み込むための、TCRspコンピテント基本細胞の一過性トランスフェクション  CD3をゲノムに組み込むための、TCRspコンピテント基本細胞の一過性トランスフェクション。TCRspコンピテント基本細胞は、HLA-A遺伝子座に標的付けられた部位特異的相同組換えプラスミドにおいてCD3をコードする第３のプラスミドに加え、２つの組込み因子Cas9-2A-GFP及びガイドRNAの発現をコードする２つのプラスミドでトランスフェクトされた。比較として、コントロールのトランスフェクションを、発現をコードしない空ベクターを用いて行った。GFP発現を示す細胞(その後、組込み細胞集団に含まれる)を細胞選別により選択した。
【図４３】図43−第１の選択のための、選別された細胞の一過性トランスフェクション  図42からの選別された細胞の一過性トランスフェクション。選別された細胞は、３つのプラスミドでトランスフェクトした(Ｂ)。第１のプラスミドはGFPの発現をコードし、トランスフェクションコントロールとして用いた。第２及び第３のプラスミドは各々TCR-α(V3.C.3)鎖又はTCR-β鎖のいずれかをコードしていた。コントロールのトランスフェクションは、細胞を、TCRspをコードするプラスミド(Ａ)と共に提供せずに行った。細胞を抗CD3で染色し、CD3表面発現を示す細胞を選択して、選別した。
【図４４】図44−第２の選択のための、選別された細胞の一過性トランスフェクション  図43からの選別された細胞の一過性トランスフェクション。選別された細胞は、３つのプラスミドでトランスフェクトした(Ｂ)。第１のプラスミドはGFPの発現をコードし、トランスフェクションコントロールとして用いた。第２及び第３のプラスミドは各々TCR-α(V3.C.3)鎖又はTCR-β鎖のいずれかをコードしていた。コントロールのトランスフェクションは、細胞を、TCRspをコードするプラスミド(Ａ)と共に提供せずに行った。細胞を抗CD3で染色し、CD3表面発現を示す細胞を選択して、選別した。
【図４５】図45−第３の選択のための、選別された細胞の一過性トランスフェクション  図44からの選別された細胞の一過性トランスフェクション。選別された細胞は、３つのプラスミドでトランスフェクトした(Ｂ)。第１のプラスミドはGFPの発現をコードし、トランスフェクションコントロールとして用いた。第２及び第３のプラスミドは各々TCR-α(V3.C.3)鎖又はTCR-β鎖のいずれかをコードしていた。コントロールのトランスフェクションは、細胞を、TCRspをコードするプラスミド(Ａ)と共に提供せずに行った。細胞を抗CD3で染色し、高いCD3表面発現を示す96細胞を選択して、モノクローニングのために選別し(CD3モノクローン選択ボックス)、残るCD3+細胞を、低温保存用プールとして選別した。
【図４６】図46−eTPC特徴決定  CD3及びTCRsp表面発現を示す図45からのモノクローンの同定及び選択。細胞は、相補性TCRspをコードする２つのプラスミド及びGFP発現をコードする第３のプラスミドで一過性にトランスフェクトされた(Ａ)。コントロールのトランスフェクションは、GFPプラスミドのみを用いて細胞をトランスフェクトして行った(Ｂ)。２つのトランスフェクションのFAC分析(GFP+細胞についてゲーティング)は、モノクローンが、TCRspの発現をコードする遺伝物の提供という条件付きで、CD3発現を示すことを明確に示した。その後、モノクローンを確証基本細胞として選択した。
【図４７】図47−成分Ｄ及び/又はＢを含有するモノクローンの遺伝子特徴決定  ２つの表は、実施例２及び３で作製した、成分Ｂ又は成分Ｂ及びＤをそれぞれ含有する細胞の遺伝子特徴決定のまとめを示す。
【図４８】図48：親eTPCからのeTPC-t作製の証明  モデルのTCRα/β対(JG9-TCR)(これは、HLA-A*02:01に提示されるHCMV抗原に関して既知の特異性を有する)を、eTPC親株への組込み用に選択した。JG9-TCR-α ORFを成分Ｅ'状況に、JG9-TCR-βを成分Ｃ'状況にクローニングした。２つのゲノム組込み部位Ｂ及びＤ(レポーターBFP及びRFPをそれぞれコードする)を有するeTPC株ACL-488への成分Ｃ'及びＥ'プラスミド及びflpリコンビナーゼをコードする構築物のトランスフェクションによるRMCEによってeTPC-tを作製した。トランスフェクションの10日後、成分Ｂ及びＤ選択マーカーがコードするBFP及びRFPシグナルが低下した個々の細胞を単一細胞として選別した。得られるモノクローナルeTPC-t ACL-851を、親eTPCと並行して分析した。一例を示す。  ａ)及びｂ)親eTPC細胞株ACL-488及び一例のモノクローナルを、フローサイトメトリーによりBFP及びRFPシグナルについて分析した。このプロットは、生存単一細胞をBFP対RFPとして表示し、eTPC細胞株が成分Ｂ及びＤに存在する選択マーカーについてポジティブであり(ａ)、得られるモノクローンが、Ｂ/ＣとＤ/Ｅとの間の組込みカップル事象に関して予測されるように、これらマーカーを喪失していることを示している(ｂ)。比率値は、ａ)においては二重ポジティブ細胞の、ｂ)においては二重ネガティブ細胞の割合を表す。  ｃ)〜ｆ)eTPC ACL-488及びモノクローンeTPC-t ACL-851を、CD3及びTCRα/β(TCRab)に対する抗体並びにJG9-TCRに特異的なHLAマルチマー反応剤(Dex HLA-A*02:01-NLVP)で染色し、フローサイトメトリーで分析し、生存単一細胞についてゲーティングした。親eTPC株は、細胞表面でCD3についてもTCRについてもポジティブ染色を示さず(ｃ)、HLAマルチマー反応剤での染色についてもネガティブであった(ｄ)。対照的に、得られるモノクローンは、細胞表面でCD3及びTCRの両方についてポジティブ染色を示し(ｅ)、発現されたJG9-TCRに特異的なマルチマー反応剤でポジティブ染色を示した。比率値は、ｃ)及びｅ)においてはCD3/TCRab二重ポジティブ細胞の、ｄ)及びｆ)においてはCD3/HLA-マルチマー二重ポジティブ細胞の割合を表す。  ｇ)ゲノムDNAを、モノクローナルeTPC-t ACL-851から調製し、成分Ｄ'によりコードされるJG9-TCR-α鎖又は成分Ｂ'によりコードされるJG9-TCR-β鎖に特異的なプライマーを用いるPCRに供した。PCR産物をアガロースゲルにより分離し、予想されるバンドサイズとして観察した。ｈ)ゲノムDNAを、モノクローナルeTPC-t ACL-851から調製し、成分Ｄ'によりコードされるJG9-TCR-α鎖又は成分Ｂ'によりコードされるJG9-TCR-β鎖に特異的なプライマー及びプローブを用いるデジタルドロップPCRに供した。TCRα定常(TRAC)のイントロンについての参照アプリコンプライマー/プローブ対を含ませた。表は、TCRα及びTCRβに対する参照の比を示す。0.33付近の比は、TCRα及びβ鎖の各々の単一コピーがeTPC-t株ACL-851に存在すること、すなわち、eTPC-t株ACL-851が三倍体株であることを示す。
【図４９】図49−eTPC-tからのeTPC-x復帰の証明  TCRα及びβ鎖をそれぞれ部位Ｄ'及びＢ'にて発現する親eTPC-t細胞株ACL-851を、GFPをコードするドナーベクター(成分Ｚ)で成分Ｄ'を交換することによりeTPC-x株に復帰させた。成分Ｚは、GFP ORFを挟むリコンビナーゼ異種特異的F14/F15部位を含み、よって、成分Ｄ'に適合していた。eTPC-t株ACL-851を、flpリコンビナーゼをコードする構築物と共に成分Ｚでトランスフェクトした。トランスフェクションの７日後に、GFPシグナルについてポジティブの個々の細胞を選別し、モノクローンとして増殖させた。得られるモノクローナルeTPC-x株を、親eTPC-tと並行してフローサイトメトリにより分析した。一例を示す。ａ)及びｂ)親eTPC-t ACL-851に由来するモノクローンeTPC-x ACL-987を、GFP発現について親株と共にフローサイトメトリにより分析した。プロットは、ゲーティングした生存単一細胞のSSC対GFPパラメータを表示する。親の細胞株は、GFP発現がない(ａ)が、モノクローンACL-987は、予想されたようにGFPを獲得し(ｂ)、このことは、TCRα ORFがGFP ORFに交換されたことを示す。Ｃ)及びＤ)親eTPC-t ACL-851と共に、親ACL-851に由来するモノクローンeTPC-x ACL-987を、CD3及びTCRabに対する抗体で染色し、フローサイトメトリにより分析した。プロットは、生存単一細胞に対してゲーティングしたCD3対TCRabパラメータを表示する。親細胞は、CD3及びTCRabの両方についてポジティブ染色を示した(ｃ)が、派生したモノクローンは、両方についてネガティブ染色を示し(ｄ)、このことは、派生したeTPC-x株におけるTCRα ORFの喪失を確証するものである。
【図５０】図50−eTPC-tのプールを作製するための、eTPC-xへのショットガン組込みの証明  eTPC-tプールを、成分Ｂ'で単一TCRβ鎖を発現する親eTPC-x株から作製した。eTPC-x株は、利用可能な部位ＤにてレポーターとしてGFPを発現した。親の鎖を含む64のバリアントTCRα鎖のプールを構築した。親のTCR鎖対は、HLA-A*02:01において提示されるHCMV抗原について既知の特異性を有するJG9-TCRを表す。成分Ｅのプールを親eTPC-x ACL-987に、flpリコンビナーゼをコードする構築物と共にトランスフェクトした。ポリクローナル株は、トランスフェクションの10日後に、GFPポジティブ細胞についての選別により選択した。得られるACL-988ポリクローナルeTPC-tは、その後、GFPについてネガティブ染色及びHLAマルチマー反応剤(DEX HLA-A*02:01-NLVP)についてポジティブ又はネガティブ染色に基づいて選別した。回収した単一細胞を配列決定して、コードされるTCR-α鎖を同定し、親のTCR鎖対に特異的なHLAマルチマー反応剤での染色に関して、天然型TCR-β鎖と対を形成するTCR-α鎖バリアントの各々について並行して行った分析と比較した。ａ)及びｂ)親eTPC-x ACL-987株及び得られるポリクローンeTPC-t ACL-988株を、GFP発現についてフローサイトメトリにより分析した。プロットは、生存単一細胞のSSC対GFPパラメータを表示する。親細胞株は、GFPについてポジティブシグナルを示し、このことは、インタクトな成分Ｄを示す(ａ)。派生したポリクローナル株は、GFPについて半ポジティブ及び半ネガティブを示し(ｂ)、このことは、ポリクローナル集団中の細胞の半分が、ＤにてGFP ORFがTCRα ORFに交換されて成分Ｄ'を形成した可能性があることを示す。  ｃ)及びｄ)親eTPC-x ACL-987株及び得られるポリクローンeTPC-t ACL-988株を、CD3抗体及び親JG9-TCRに特異的なHLAマルチマー(DEX HLA-A*02:01-NLVP)で染色し、フローサイトメトリにより分析した。プロットは、生存単一細胞のCD3対HLAマルチマーパラメータを表示する。親細胞株は、CD3及びHLAマルチマー両方の染色についてネガティブである(ｃ)。Ｄ)の左パネルは、ゲーティングしたGFPネガティブ事象を表示し、右パネルはGFPポジティブ事象を表示する。成分ＤがＤ'に変換されたGFPネガティブ事象のみが、CD3ポジティブ染色を示し、その部分集合が、HLAマルチマーについてポジティブ染色を示す。HLAマルチマーネガティブ及びポジティブゲートでゲーティングして単一細胞を選別し、成分Ｄ'に組み込まれたORFを配列決定して、TCRα ORFのアイデンティティーを決定した。  ｅ)64全てのJG9-TCR-αバリアントを、各々が独立して親のeTPC-x(ACL-987)にトランスフェクトされ得るように発現構築物にクローニングした。HLA-A*02:01-NLVPテトラマー反応剤に対する相対染色単位(relative staining unit：RSU)を各々について決定した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対する、CD3ポジティブ集団についてのHLA-A*02:01-NLVPテトラマーシグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、HLAマルチマー反応剤に対する各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標である。図ｅ)にプロットした各点は、64の各バリアントについて観察されたRSUを表す。白抜き丸は、GFPネガティブ/HLAマルチマーポジティブゲートから回収した配列決定細胞に相関する。白抜き三角は、GFPネガティブ/HLAマルチマーネガティブゲートから回収した配列決定細胞に相関する。
【図５１】図51−成分Ｆの機能的証明  成分Ｆを有するeTPC-t細胞株(ACL-1277)であって、成分Ｂ'及びＤ'でのTCR鎖が、HLA-A*02:01において提示されるHMCV抗原性ペプチドNLVPMVATVに特異的なTCR対をコードする細胞株。成分ＦレポーターはRFPであった。このeTPC-tを、HLA特徴が異なる様々なAPC株と、モデルペプチド抗原の存在下及び不在下で24時間接触させ、接触させた培養物をフローサイトメトリにより分析した。フローサイトメトリヒストグラムプロットは、APCにより提示されなかった特定の表面マーカーについての抗体染色により同定された生存単一Ｔ細胞のRFPシグナルに対する事象カウントを示す。ａ)及びｂ)HLA-A*02:01のみを発現するAPC細胞(ACL-209)を、NLVPMVATV(ａ)又はVYALPLKML(ｂ)ペプチドでパルスし、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。ｃ)及びｄ)HLA-A*24:02のみを発現するAPC細胞(ACL-963)を、NLVPMVATV(ｃ)又はVYALPLKML(ｄ)ペプチドでパルスし、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。ｅ)HLA-A*02:01のみを発現するAPC細胞(ACL-209)を、ペプチドパルスなしで放置し、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。ｆ)細胞表面でHLAを発現しないAPC細胞(ACL-128)を、NLVPMVATVでパルスし、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。RFPシグナルは、NLVPMVATV(発現TCRの既知の標的を表す)でパルスしたHLA-A*02:01発現細胞の存在下でのみeTPC-t ACL-1277において顕著に増加した。ヒストグラムのゲート及び値は、RFPポジティブ及びRFPネガティブゲートにおける事象の割合を反映する。このことは、eTPC-tにより発現されるTCRspと同族HLA/抗原との結合(aAPX:aAM)に対する成分Ｆの特異的応答を示す。
【図５２】図52−TCR標準としてのeTPCの使用  HLA-A*02:01において提示されるCMVに由来するNLVPMVATVペプチドに特異的なTCRを発現するeTPC-t細胞株(ACL-852)を、TCR発現を欠くeTPC(ACL-442)と比較した。細胞を採集し、固定しないままとしたか又はPFAで固定した。ａ)eTPC-t及びeTPC細胞を、eTPC-t(ACL-852)により提示されるTCRに特異的なHLAマルチマー反応剤で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ゲーティングした単一細胞をヒストグラムプロットとして表示する。ACL-442を上パネルに表示し、ACL-852を下パネルに表示した。ACL-852細胞のみがHLAマルチマー反応剤での染色を示した。非固定細胞(左パネル)は固定細胞(右パネル)と等価の染色を示した。ｂ)eTPC-t細胞を、CD58に対する抗体で染色した後、単離PBMCに添加した。次いで、eTPC-tを含まないPBMCプール及びeTPC-tでスパイクされたPBMCプールを、eTPC-t(ACL-852)により提示される特異的なTCRに特異的なHLAマルチマー反応剤(CMV-HLA-A*02:01-NLVPM-pp65)で染色した。左パネルはPBMC単独を表示し、右パネルはPBMC及び単一細胞としてゲートされたeTPC-tを表示する(CD58対HLAマルチマーパラメーター)。特異的標識を有するPBMC(CD8 Ｔ細胞)は、両標本においてマルチマー-ポジティブ細胞として観察することができる一方、eTPC-tは、CD58/HLAマルチマー二重ポジティブ細胞として容易に見出すことができる(右パネル)。
【実施例】
【００９９】
材料及び方法
ARH-77細胞のエレクトロポレーション
反応あたり、４×106細胞を、500μl RPMI 1640中、Gene Pulser XCELLTM(Bio-Rad)を使用するGlutamax-I(Life Technologies)を以下の設定で用いてエレクトロポレートした：方形波285V、パルス長12.5ms、１秒間隔で２パルス。
Cas9プラスミドV1.A.8に用いたDNA濃度は、組込み部位を標的するgRNAについて10μg/ml及び7.5μg/mlであった(HLA内因性遺伝子座における組込みについてはV2.I.10及びV2.J.1、標的AAVS1部位についてはV2.J.6)(表１)。
組込みベクターを濃度7.5μg/ulでエレクトロポレートした。
HLA遺伝子座におけるHDR組込みのためには、HLAクラスI V1.C.6及びV1.C.9プラスミドを用いた。AAVS1遺伝子座におけるHDR組込みのためには、HLAクラスI V1.F.8及びV1.F.10並びにHLAクラスII V1.I.5及びV1.I.7を用いた。
pp65 ORFのバリアントを事前に作製したHLAモノアレレ株に組み込んだ。GFPマーカーに連結した形態のpp65を含有するプラスミドV1.G.9及びV1.H.1をこの目的に用いた。
１つのRMCE部位を有するARH-77 HLA-ヌル株を作製するため、マーカーに隣接する異種特異的リコンビナーゼ部位を有するプラスミドを用いた。RFPについてはV4.B.2、BFPについてはV4.B.3を用いた。同プラスミドを同時エレクトロポレートして、２つのRMCE部位を含む安定な株を作製した。
RMCEを用いてモノアレレHLA株もまた作製し、ここでは、ベクターV4.D.2を、１つのRMCE部位を含有する細胞にエレクトロポレートした。
エレクトロポレーション後、細胞を、Glutamax-I＋10％ FBSを含む培養培地RPMI 1640中で２日間インキュベートした(37℃，５％ CO2)後、分析した。
【０１００】
HEK293細胞のトランスフェクション
トランスフェクションの１日前、細胞を1.2〜1.4×106細胞/60mmディッシュの密度で90％ DMEM＋２mML-グルタミン＋10％ HI-FBS(Life Technologies)中に播種した。
翌日、65％コンフルーエントの細胞を、総量５μgのDNA及びjetPEI(登録商標)(Polyplusトランスフェクション試薬、Life Technologies)(N/P比６)でトランスフェクトした。培地を交換した後、トランスフェクションを行った。
HLAクラスＩ遺伝子の欠失のために、細胞を、0.42μgのCas9_GFPをコードするDNAベクター(V1.A.8)、HLA-A、B及びCを標的するgRNA(それぞれ、V2.A.1、V2.A.7及びV2.B.3)及び空ベクター(V1.C.2)でトランスフェクトした。
AAVS1遺伝子座におけるRMCE部位の組込みのために、細胞を0.5μgのV1.A.8；0.625μgのgRNA V2.J.6及び0.75μgの(RMCE部位によって挟まれる２つのマーカーをコードする)プラスミド(RFPについてはV4.B.2、BFPについてはV4.B.3)でトランスフェクトし、空ベクターV1.C.2を用いて５μgのDNAを満たした。
DNA及びjetPEI(登録商標)のストック溶液を、それぞれ滅菌１Ｍ NaCl及び150mM NaClに希釈した。各溶液の最終容量を総混合容量の50％とした。次いで、PEI溶液を希釈したDNAに加え、混合物を室温にて15分間インキュベートした。最後に、DNA/PEI混合物を60mmディッシュに、細胞フィルムを破壊しないように注意深く加えた。細胞を(37℃，５％ CO2，95％相対湿度で)48時間インキュベートした後、GFP発現分析を行った。
【０１０１】
対をなす組込みカップル間のRMCE
RMCE組込みのために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)0.6μg、２μgの成分Ｃ/Ｙ、２μgの成分Ｅ/Ｚ、DNA送達を追跡するためのマーカーをコードするDNA0.4μgでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、GFP又はRFPポジティブのいずれかのDNA送達マーカーについてポジティブな細胞を、FACSにより選別した。トランスフェクションの４〜10日後に、成分Ｄ及びＢ選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質シグナルの減少を示す個々の細胞を、FACSにより選別した。ACL-987の作製については例外で、GFPポジティブを示す個々の細胞をFACSにより選別した。
【０１０２】
【表１】
2019535313.tif 000003
【０１０３】
相対染色単位(RSU)を特徴決定するTCR鎖対の一過性発現
一過性発現のために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)、JG9-TCR-αバリアント(VP.7751.RC1.A1〜VP.7751.RC1.H8)、JG9-TCR-βWT鎖(V3.C.5)及びDNAベクタービヒクル(V1.C.2)でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、全ての細胞をHLA-A*02:01-NLVPテトラマー及び抗CD3抗体で染色した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対する、CD3ポジティブ集団についてのHLA-A*02:01-NLVPテトラマーシグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標であった。
【０１０４】
蛍光活性化細胞選別(FACS)
Cas9-P2A-GFP(V1.A.8)又はGFP選択マーカーをコードするプラスミド(V1.A.4)をエレクトロポレートし又はトランスフェクトした細胞を、FACSJAzzTM細胞ソーター(BD Biosciences)を用いて、一過性GFP発現について選別した。
HEK 293細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS １×(Life Technologies)中に再懸濁した後、20％ HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM １×培地中で細胞選別を行った。
ARH-77細胞を洗浄し、適切な容量のDPBS中に再懸濁した後、Glutamax-I並びに20％ HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含むRPMI 1640中で選別を行った。
【０１０５】
遺伝子特徴決定のためのゲノムDNA抽出
DNAは、QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いて５×106細胞から抽出した。DNAは、1×TE(10mM Tris pH8.0及び0.1mM EDTA)中に貯蔵した。
【０１０６】
正しいゲノム位置への組込みの確証
所望の表現型特徴を有するモノクローンをスクリーニングし、分子レベルで評価し、これを、製造業者が推奨する成分及び容量を用いる20μlの反応剤中、Q5(登録商標) Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NBE)を用いるPCRにより行った。
HLA I ORFがHLA遺伝子座に組み込まれたかどうかを決定するため、プライマー9.C.4及び9.D.6を用いた；正しい右相同性アーム組換えは１kbアプリコンにより示された(表２)。
AAVS1遺伝子座におけるHLA組込みについて、４セットのプライマーを用いた：正しい左相同性アーム組換え(1.1kb)を評価する9.C.3及び9.C.8、右相同性アーム組換え(660bp)を評価する9.C.4及び9.D.1、内部構築物のCMVプロモーター(810bp)を増幅する1.C.5及び9.C.5、並びに内部構築物のSV40pAターミネーターについてのアプリコンを取得する1.C.2及び9.C.10(380bp)。HEK293及びARH-77 HLA-ヌル株におけるRMCE部位組込みの評価を、プライマーセット２及び４を用いて行った。
HEK293細胞におけるHLAクラスＩ欠失を確証するため、特異的HLAプライマーを以下のとおり用いた：HLA-Aを標的する4.A.3及び4.A.4、HLA-Bについての4.A.7及び4.B.1、並びにHLA-Cについての4.B.5及び8.A.1。最初に、PCR Master Mixを、全成分(Q5(登録商標)反応緩衝液、dNTP、Hot-Start Q5(登録商標) DNAポリメラーゼ、プライマーFwd及びRev、100ngのDNAテンプレート並びにH20)を用いて調製した。PCR反応は、C1000 TouchTM Thermal Cycler(Bio-Rad)を用いて行った。PCR産物は、１×TAE緩衝液中、１％アガロースゲルで、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて泳動させ、10,000希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)を用いて分析した。
【０１０７】
【表２】
2019535313.tif 000004
【０１０８】
興味対象の成分の安定発現を有するポリクローナ及びモノクローナル細胞の選別
組み込まれたタンパク質又はマーカーを構成的に発現する細胞の集団を取得するために、細胞を、第１のGFP+選択の７〜15日後に選別した。
表面タンパク質を発現すると予測される細胞については、抗体染色を行なった後、選別を行った。HLAクラスＩ遺伝子については、PE-CyTM5マウス抗ヒトHLA-ABC抗体(BD Biosciences)を用いた。HLA-DR及びHLA-DPの染色は、Alexa Fluor(登録商標) 647マウス抗ヒトHLA-DR、DP、DQ(BD Biosciences)を用いて行った。
HEK 293由来細胞株の場合、細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS １×(Life Technologies)中で洗浄した後、20％ HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM １×培地中で細胞選別を行った。
ARH-77由来細胞株を適切な容量のDPBS中で洗浄した後、Glutamax-I並びに20％ HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含むRPMI 1640中で選別を行った。
HLAノックアウト又は組込みのために、細胞の選択を、それぞれHLA発現の喪失又は獲得に基いて行った。RMCE部位が組み込まれた細胞を、BFP及びRFPマーカーの発現に基いて選別し、pp65変異体が組み込まれたHLAモノクローンをGFP発現について選別した(表３)。
興味対象の遺伝子を発現する細胞のモノクローナル選別を、200μlの増殖培地を含む96ウェルプレート中で行った。サンプルあたり１〜２のプレートを選別した。直後に、残りの細胞のポリクローナル選別を、FACSチューブ中、細胞ソーターInfluxTM(BD Biosciences)において二方式選別設定を用いて行った。
【０１０９】
モノクローナル集団の表現型スクリーニング
増殖させたモノクローン集団の20,000細胞を、分析のためにマイクロタイタープレートに移し、細胞を250μlのDPBS １×(Life Technologies)に再懸濁し、LRSFortessaTM(BD Biosciences)で分析した。
BFP及びRFP発現を、それぞれBV421用PMTs及びPE-Texas Red fluorophoreを用いて検出した。
【０１１０】
【表３】
2019535313.tif 000005
【０１１１】
表面発現を有するタンパク質については、細胞を先ず、PE-CyTM5マウス抗ヒトHLA-ABC抗体(BD Biosciences)又はAlexa Fluor(登録商標) 647マウス抗ヒトHLA-DR、DP、DQ(BD Biosciences)を用いて染色した。染色溶液は、100μlの染色緩衝液(DPBS＋2％ FBS)に希釈した推奨される抗体容量を用いて調製した。細胞を１時間４℃にてインキュベートし、次いで、500μlの染色緩衝液で２回洗浄した後、分析を行った。
選択モノクローンは通常の増殖培地で維持した。HEK239細胞はDMEM＋２mML-グルタミン＋10％ HI-FBS(Life Technologies)中で増殖させ、ARH-7細胞は、Glutamax-I＋10％ HI-FBSを含むRPMI 1640中で増殖させた。
細胞のコンフルーエンスを、10〜12×106に達するまで毎日モニターした。DNAを５×106細胞から、QIAamp DNA Minikit(Qiagen)を用いて抽出した。残りの細胞を更に増殖させ、密度３×106細胞/mlで、70％増殖培地＋20％ HI-FBS＋10％ DMSO中に凍結保存した。
【０１１２】
eTPC-t細胞の選別
単一細胞選別又はポリクローン選別を、BDInflux装置を用いる標準的な細胞選別法により達成した。簡潔には、ACL細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS １×(Life Technologies)中に再懸濁した後、20％ HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM １×培地中で細胞選別を行った。
細胞を、HLA-マルチマー反応剤で氷上にて10分間染色した後、CD3及び/又はTCRab抗体で染色した。BDInflux装置による特異的細胞蛍光特性の検出を表３に示す。
モノクローナル作製のための単一細胞の選別のため、興味対象の表現型を表示する細胞を、200μlの増殖培地を含有する96ウェルプレートに配置した。サンプルあたり１〜２のプレートを選別した。ポリクローナル細胞選別を、培地を含有するFACSチューブ中、細胞ソーターInfluxTM(BD Biosciences)において二方式選別設定を用いて行った。
分子特徴決定のために、JG9-TCR-αバリアントの単一細胞を選別し、５μlのヌクレアーゼフリーの水を予め充填したPCRプレートに配置した。その後の加工処理まで、標本を急速凍結した(snap-frozen)。
【０１１３】
遺伝子特徴決定のためのゲノムDNA抽出
DNAは、QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いて５×106細胞から抽出した。DNAは、1×TE(10mM Tris pH8.0及び0.1mM EDTA)中に貯蔵した。
【０１１４】
成分Ｂ又はＤへのTRA-ORF及びTRB-ORFのRMCE組込みを評価するためのPCR反応
TRA-ORFの組込みを評価するために用いるプライマーを、TRA-Cセグメント(フォワードプライマー1.F.7)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネーター(リバースプライマー15.H.2)にアニールさせた。予測サイズ566bp。
TRB-ORFの組込みを評価するために用いるプライマーを、TRB-Cセグメント(フォワードプライマー1.F.9)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネーター(リバースプライマー15.H.2)にアニールさせた。予測サイズ610bp。PCR産物は、１×TAE緩衝液中、１％アガロースゲルで、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて泳動させ、10,000希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)を用いて分析した。
【０１１５】
【表４】
2019535313.tif 000006
【０１１６】
【表５】
2019535313.tif 000007
【０１１７】
DNA送達後にゲノム中のTRA-ORF及びTRB-ORFのコピー数を評価するためのddPCR反応
選択したACL-851モノクローンのDNAを、興味対象のTCR_ORF Ｃセグメントを標的する特異的プライマー及びプローブを用いることにより分析した。
TCR-α ORFコピー数を評価するために用いるプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.7、リバースプライマー1.F.8及びプローブ1.G.1)をTRACセグメントにアニールさせた。
TCR-β ORFコピー数を評価するために用いるプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.9、リバースプライマー1.F.10及びプローブ1.G.2)をTRBCセグメントにアニールさせた。
全ての場合で、参照遺伝子(TRAC)を同時にスクリーニングして、プライマー10.A.9及び10.A.10並びにHEXと接合した蛍光プローブ10.B.6を用いて染色体のコピー数を決定した。組込みコピー数から、参照遺伝子(TRAC)について、HEK293細胞は参照遺伝子(TRAC)について三倍体であると考えられた。
デジタルドロップPCRの前に、DNAをMfeI(NEB)で消化し、直列組込みを分離した。反応セットアップ及びサイクル条件は、QX200TM Droplet Reader及びDroplet Generator及びC1000 TouchTM deep-well Thermal cycler(Bio-Rad)を用いるddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad)のプロトコルに従った。QuantaSoftTMソフトウェアを用いてデータを取得し、FAMの検出にはCh1を用い、HEXについてはCh2を用いた。
【０１１８】
【表６】
2019535313.tif 000008
【０１１９】
【表７】
2019535313.tif 000009
【０１２０】
【表８】
2019535313.tif 000010
【０１２１】
単一Ｔ細胞からのTCRα及びβ鎖の配列決定
FACS選別した個々のeTPC-t細胞を、TCR-α及びTCR-βの各々についてＶ領域特異的プライマーコレクションを伴う二工程増幅プロセス、続いて、配列分析のためのTCR-α及びTCR-βアプリコンを生じるペア型ネステッドPCR反応に供した。この手順は、以前に記載されている(Hanら、Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684-692)。以下の材料を、記載する手順で用いた：
【０１２２】
【表９】
2019535313.tif 000011
【０１２３】
成分Ｆの機能的証明
eTPC-t及びAPC細胞を、RPMI+10％熱不活化胎仔ウシ血清(完全培地)中で、0.2×106〜1.5×106細胞/mlの間、37℃、90％相対湿度及び５％CO2にて慣例的に培養した。ペプチドNLVPMVATV及びVYALPLKMLは、Genescriptにより合成され、凍結乾燥された状態で受領した。ペプチドの一次ストックを10％DMSOに懸濁し、−80℃にて貯蔵した。作業ストックは、50μＭにて完全培地(50×濃縮)に用時調製した。HLA-A*02:01(ACL-209)又はHLA-A*24:02(ACL-963)又はHLA-ヌル(ACL-128)を提示する以下のAPCを用いた。eTPC-t細胞株(ACL-1277、成分Ａ)は、２つの独特なゲノム受容部位(成分Ｂ、Ｄ)を有し、HLAヌルとなるように遺伝子操作されており、天然型CD3発現を利用し、二成分 合成応答エレメント(成分Ｆ)を有した。加えて、ACL-1277は、成分Ｂ、ＤがＢ'/Ｄ'に変換されおり、pHLA：HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCRspをコードするTCRα/β ORFが組み込まれている(実施例８を参照)。
【０１２４】
抗原パルス手順
APC細胞の活発に増殖している培養物(0.5〜1.0×106細胞/ml)を懸濁し、サンプルを採取し、計数して細胞濃度を決定した。その後、１百万細胞を採集し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS、Gibco)で１回洗浄した後、細胞濃度１〜２×106細胞/mlにて１μＭのペプチドと又はペプチドなしで完全培地に懸濁した。細胞を２時間、標準培養条件で、24ウェル培養プレートにてインキュベートした。２時間後、細胞を採集し、遠心分離(400rcf、３分間)によりペレット化した後、DPBSで３×10mlで洗浄した。細胞を、その後、完全培地中に0.2×106細胞/mlにて懸濁した。
【０１２５】
eTPC-t採集
eTPC-t細胞の活発に増殖している培養物(0.5〜1.0×106細胞/ml)を懸濁し、サンプルを採取し、計数して細胞濃度を決定した。細胞を採集し、PBSで１回洗浄し、次いで、完全培地中に0.6×106細胞/mlの濃度にて懸濁した。
【０１２６】
eTPC:AシステムにおけるeTPC-tとAPCとの接触
96ウェル丸底プレートの各ウェルに、50μlの完全培地、50μlのAPC、続いて50μlのeTPC-tを加えた。これは、１：３の比の約10,000のAPC及び30,000のeTPC-tであり、約0.27×106細胞/mlの全細胞濃度であった。次いで、細胞混合物を標準培養条件にて約24時間インキュベートした。
【０１２７】
染色及び分析
24時間のインキュベーション後、細胞を採集し、0.75mlのＶ底Micronicチューブに移植し、500μlのDPBSで１回洗浄し、その後、以下のように死細胞マーカー(DCM-APC-H7)で染色した。各ウェルに、25μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、15〜20分間インキュベートした。染色溶液は、100μl染色溶液あたり0.5μlのDCM-APC-H7で構成されていた。インキュベーション後、細胞を、500μlのDPBS＋２％FCS(洗浄緩衝液)で２回洗浄した。次いで、細胞をeTPC-tに独特な表面マーカーについて染色した。各ウェルに、30μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、30〜45分間インキュベートした。染色溶液は、100μl染色溶液あたり2.5μlの抗myc-AF647で構成された(クローン9E10、Santa Cruz Biotech)。インキュベーション後、細胞を、500μlの洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで、200μlの洗浄緩衝液に懸濁し、次いで、FACSによりLSR-Fortessa(BD Biosciences)で分析した。
【０１２８】
標準物質としてのeTPCの使用
細胞調製
CMVウイルスに由来するNLVPペプチドに特異的なTCRを有するeTPC細胞株を採集し、50mlチューブにプールした。細胞を400gにて５分間ペレット化し、PBSで１回洗浄した。eTPCを３mlのPBSに再懸濁し、計数した。４百万細胞を固定のために各15mlチューブに分配した。
【０１２９】
固定
固定溶液を使用前に新たに、細胞固定液(10％パラホルムアルデヒド(PFA))及びリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含む)を最終濃度２％ PFAに希釈することにより調製した。１mlの固定溶液を細胞ペレットに加え、数回のピペッティングにより細胞を混合した。未処理コントロールについては、固定溶液に代えて１mlのPBSを加えた。細胞を、室温にて５分間インキュベートした後、３mlのPBSを添加して洗浄し、400gにて５分間ペレット化した。次いで、細胞を500μlのPBSに再懸濁した後、染色のためmicronicチューブに移した。
【０１３０】
染色
細胞を先ずマルチマーで10分間室温にて染色した後、抗CD3抗体を加え、サンプルを更に４℃にて30分間インキュベートした。LSRFortessaで細胞を取得した。
【０１３１】
スパイクインアッセイ
CMVウイルスに由来するNLVPペプチドに特異的なTCRを有するeTPC細胞株を採集し、50mlチューブにプールした。細胞をPBSで１回洗浄し、400gにて５分間ペレット化させて沈降させた。次いで、細胞を５mlのPBSに再懸濁した後、フローサイトメーターで単一細胞として、300μlの染色緩衝液を含む５ml FACSチューブ中に選別した。
選別は細胞の散乱にのみ基いた。ゲーティング：SSC対FSC→散乱プロットからの生存細胞のゲーティング；生存細胞をFSC-W対FSCでプロットした
→選別する単一細胞のゲーティング。細胞を400gにて５分間ペレット化し、計数し、Alexa 647-CD58で30分間４℃にて染色し、洗浄した後、スパイクインアッセイで使用した。
CMVペプチド(NLVP)に関してポジティブな、健常血液ドナー由来の凍結PBMC(勾配分離を用いて事前に50mlチューブに単離)を解凍し、計数した後、スパイクイン実験に用いた。
スパイクインアッセイのために、micronicチューブにおいて、２×106のPBMCをeTPCなしで又は50 000のeTPCと共に混合した。細胞を先ずマルチマーで10分間室温にて染色した後、抗CD3及び抗CD8抗体を加え、サンプルを４℃にて更に30分間インキュベートした。LSRFortessaで細胞を取得した。
【０１３２】
実施例
実施例１：標的化変異誘発によるAPX遺伝子ファミリーの欠失
本実施例では、遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)の形質を作製するために、抗原提示複合体(APX)のファミリーをコードする遺伝子の標的化変異誘発をどのように達成したかを記載する。前記形質はAPXファミリーの少なくとも１つのメンバーの表面発現の欠失である。
本実施例では、標的付けられたAPXは、HEK293細胞株における主要HLAクラスＩファミリーの３つのメンバーHLA-A、HLA-B及びHLA-Cを含んでなっていた。HEK293細胞は、HLA-ABCの内因性表面発現を示すヒト胚性腎臓細胞に由来するものであった。細胞遺伝学的分析は、この細胞株が三倍体に近い核型を有し、したがってHEK293細胞が各HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の３つのアレレをコードしていることを証明した。
HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の標的化変異誘発は遺伝子操作されたCRISPR/Cas9システムを用いて行われ、該システムでは、Cas9ヌクレアーゼ活性は、合成ガイドRNA(gRNA)によりHLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子座に標的付けられた。４〜５の独特なgRNAが、各HLA遺伝子遺伝子座について、保存されたヌクレオチド配列を標的するように設計され、標的付けられた部位は遺伝子コーディング配列の開始点に向けられた。なぜならば、このことがヌルアレレを生じさせる可能性がより高いからであった。標的付けられた遺伝子座で変異を誘導するgRNAの効率が決定され、最も効率的なgRNAが、HLA-A、HLA-B及びHLA-Cヌル(HLA-ABCnull)HEK293細胞株を生じさせるために選択された。
【０１３３】
HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子座を標的する最適なgRNAをコードするプラスミドを、Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミドと共に、「方法」に記載するように、HEK293細胞にトランスフェクトした。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの２日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図25a)。遺伝子編集事象が生じるに十分な時間、有害変異の場合には、残る内因性HLAIタンパク質の発現を喪失させるに十分な時間を可能とするために、GFP選別された細胞を５日間以上更に増殖させた。この増殖期間後、細胞を、汎-HLA-ABC抗体で染色し、表面でのHLA-ABC発現が低減した細胞を同定した(図25b)。汎-HLA-ABC抗体染色の欠如は、各HLA-A、HLA-B及びHLA-Cアレレが変異したことを示唆した。個々のHLA-ABCネガティブ細胞を選別し、増殖させてモノクローン集団とした。
【０１３４】
HLA-ABCnullモノクローンは、HLA-ABCの表面発現の欠如により確証された。モノクローンのサブセットがHLA-ABCの表面発現を欠くことを証明した。その３つの例のモノクローンACL-414、ACL-415及びACL-416を図26に示す。HLAI表面発現を欠くモノクローンの更なる遺伝子特徴決定を、細胞株がHLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の全てのアレレにおいて基礎をなす遺伝子変異を有することを決定することにより行った(図27)。アプリコンサイズ変化の検出のためにgRNAゲノム標的部位に亘るプライマー及び/又は配列決定のためのテンプレートとして用いるプライマーを使用するPCRにより、遺伝子特徴決定を行った。図27は、基本細胞株(例えば、ACL-414)のアプリコンサイズと比較して短いPCRアプリコンにより検出されるHLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子のアレレに遺伝子欠失を含むHLA-ABCnullモノクローンの選択を示す。
結論として、遺伝子改変されたHEK293細胞株(ACL-414、ACL-415及びACL-416を含む)は、HLA-ABCの表面発現を欠くことが証明され、したがって遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)の形質を有していた。
【０１３５】
実施例２：成分Ｂを含むHLA-ABCnullの作製
本実施例では、成分ＢをHLA-ABCnullモノクローン株ACL-414に安定に組み込んでeTPCの第２の形質を生じさせる方法を記載する。前記第２の形質は、少なくとも１つのORFの組込みのための少なくとも１つのゲノム受容部位を含み、ここで、ゲノム受容部位はリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物であった。
本実施例では、ゲノム組込み部位(成分Ｂ)は選択された遺伝子エレメントで構成される。２つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3(これらは、選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟み込む)。FRT部位の５'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の３'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。異種特異的リコンビナーゼ部位の外側に非コーディングシス調節エレメントが位置することの利点は、それらがマッチした遺伝子ドナーベクター(成分Ｃ)に必要でないことである。したがって、遺伝子ドナーベクターの細胞送達後、コードされるORFの一過性発現は観察されない。このことから、奏功するRMCEの選択が、遺伝子ドナーベクターからのORFの細胞発現がおそらく成分Ｂへの正しい組込み後にのみ生じるような、より信頼できるものとなった。なぜならば、適切なシス調節エレメントが含まれているからである(実施例６を参照)。
【０１３６】
ゲノムセーフハーバー遺伝子座(AAVS1)への成分Ｂの安定なゲノム組込みを促進するため、成分ＢのDNAエレメントがAAVS1左右相同性アームに挟まれたプラスミドを構築した。各アームは、AAVS1ゲノム遺伝子座に相同な＞500bpの配列で構成されていた。
成分Ｂの安定な組込みは、ゲノムセーフハーバー遺伝子座AAVS1での相同性指向組換え(HDR)のプロセスにより達成された。ACL-414細胞株を、AAVS1遺伝子座を標的する最適なgRNAをコードするプラスミド、Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミド及びAAVS1左右相同性アームが隣接する成分Ｂ遺伝子エレメントをコードするプラスミドでトランスフェクトした。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの２日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図28a)。GFP選別された細胞を７日間以上更に増殖させて、HDRが生じ、選択マーカーBFPの一過性発現を喪失するに十分な時間を許容させた。この増殖期間の後、細胞をFACS装置で分析し、個々のBFPポジティブ細胞を選別し、増殖させてモノクローン集団とした(図28c)。
【０１３７】
個々のモノクローン株を、維持されたBFP発現に基いて、所望のAAVS1ゲノム位置への成分Ｂの単一組込みのために選択した。細胞株ACL-469及びACL-470は、BFP発現が維持されたモノクローンであった(図29a及びb)。遺伝子特徴決定を、モノクローンACL-469及びACL-470から抽出したDNAについて行い、それらのゲノムに成分Ｂが組み込まれていること及び成分ＢがAAVS1部位に組み込まれていることを証明した(図30)。ゲノム組込みの確証は、成分Ｂに特異的なプライマーを用いた予想サイズのPCRアプリコンの検出により決定した(図30a)。成分ＢがAAVS1部位に組み込まれていることの確証は、相同性アームによりコードされる領域に対して遠位であるAAVS1ゲノム配列に対して設計されたプライマー及び成分ＢがコードするSV40 pAターミネーターに独特なプライマーを用いた予想サイズのPCRアプリコンの検出により決定した(図30b)。成分Ｂのコピー数はデジタルドロップPCRにより決定し、ここでは、成分Ｂ及び参照遺伝子DNA分子の数を測定し比を算出した(表１)。モノクローンACL-469及びACL-470は、１対３の比で成分Ｂ分子及び参照遺伝子分子を含んでいた。基本のHEK293細胞株は三倍体に近い核型を有することを考慮すると、このことは、ACL-469及びACL-470細胞株への成分Ｂの単一組込みを証明している。
結論として、遺伝子改変されたACL-469及びACL-470細胞株はHLA-ABCnullであり、単一コピーの、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位を含んでおり、したがってeTPCにおいて更に改変することができる２つの形質を含む細胞株の作製が証明された。
【０１３８】
実施例３：成分Ｂ及び成分Ｄを含有するHLA-ABCnull細胞の作製
本実施例では、成分Ｂ及び成分ＤをHLA-ABCnullモノクローン株ACL-414に安定に組み込んでeTPCの第２の形質を生じさせる方法を記載する。前記第２の形質は、少なくとも１つのORFの組込みのための２つのゲノム受容部位を含み、ここで、ゲノム受容部位はリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物であった。
本実施例は、第２のゲノム受容部位(成分Ｄ)を追加したことを除き、実施例２に記載されたものと同じ方法及び成分を使用する。成分Ｄ遺伝子エレメントは、成分Ｂとは異なる２つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15で構成された。これら部位は、選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟むものであった。F14部位の５'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の３'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。実施例２のように、成分Ｄ遺伝子エレメントは、各々がAAVS1ゲノム遺伝子座に相同な＞500bpの配列で構成されるAAVS1左右相同性アームに挟まれていた。
成分Ｂ及び成分Ｄを、成分Ｄエレメントをコードするプラスミドのトランスフェクションミックスへの追加を除き、実施例２に記載したようにAAVS1に組み込んだ。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの２日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図28b)。GFP選別された細胞を７日間以上更に増殖させ、その後、細胞をFACS装置で分析し、個々のBFP及びRFPポジティブ細胞を選別し、増殖させて、モノクローン集団とした(図28d)。
【０１３９】
個々のモノクローン株を、維持されたBFP及びRFP発現に基き、異なるAAVS1アレレへの成分Ｂの単一組込み及び成分Ｄの単一組込みのために選択した。細胞株ACL-472はBFP及びRFP発現が維持された代表的なモノクローンであった(図29c)。実施例２に記載のように、遺伝子特徴決定を、モノクローンACL-472から抽出したDNAについて行い、それらのゲノムに成分Ｂ及び成分Ｄが組み込まれていること及び両成分がAAVS1部位に組み込まれていることを証明した(図30)。両成分Ｂ及びＤのコピー数はデジタルドロップPCRにより決定し、ここでは、成分Ｂ、Ｄ及び参照遺伝子DNA分子の数を測定し比を算出した。モノクローンACL-472は、２対３の比で成分Ｂ及びＤ分子と参照遺伝子分子とを含んでいた(表２)。基本のHEK293細胞株は三倍体に近い核型を有することを考慮すると、このことは、ACL-472細胞株への成分Ｂの単一組込み及び成分Ｄの単一組込みを証明している。
結論として、遺伝子改変されたACL-472細胞株はHLA-ABCnullであり、単一コピーの、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位 成分Ｂ及び成分Ｄを含んでおり、したがってeTPCにおいて更に改変することができる複数の形質を含む細胞株の作製が証明された。
【０１４０】
実施例４：TCR及びCD3を欠くaAPX-細胞へのCD3の組込み
本実施例では、図32及び図34のワークフローの例を示す。ここでは、第１の標的基本細胞は適切なTCRspコンピテント基本細胞として同定され、続いて、TCRspコンピテント基本細胞は、ゲノムに、CD3の４つ全てのタンパク質CD3γ、δ、ε及びζをコードする単一ORFとしてCD3の発現をコードする遺伝物質が組み込まれることにより遺伝子操作される。４つのコードされるタンパク質は、自己切断ウイルスP2Aペプチドを介して連結され、その結果、転写物の翻訳の間に、各P2Aペプチドの作用により、４つの個々のタンパク質の分離及び放出が引き起こされる。翻訳及び分離が生じると、CD3タンパク質は、その後、遊離して、会合し、CD3複合体に組み立てられる。しかし、組立て及び細胞表面への輸送は、翻訳された相補性TCR鎖対の存在下でのみ生じる。
BD LSRFortessa装置と高スループットサンプラーとを用いてFAC分析を行った。BD Influx細胞ソーター又はBD FACSJazzソーターを用いてFAC選別を行った。PEI法による化学的トランスフェクションを用いてACL-5及び派生細胞のトランスフェクションを行った(NP比６、PEI反応あたりの最終DNA濃度200ng/μl及び3.33μgのトータルDNA/１百万細胞)。当業者に公知の標準手順を用いて細胞を染色した。CD3及びTCR-α-βに対する親和性を有する蛍光標識抗体はBDから購入した。抗CD3はFITC又はPE-CF5486と接合され、抗TCR-α-βはBV786又はAPCと接合されていた。aAPX:aAM可溶性反応剤はImmudexから購入した。特に、デクストラマーHLA-A*0201は、NLVPMVATVが積荷として積載されており、PEフルオロフォアに接合されており、A2-NLV-PEと呼ばれた。用いたプラスミドは、当業者に公知の標準方法を用いて取得した。
【０１４１】
TCRspコンピテント基本細胞の同定及び選択
HEK293由来細胞ACL-5を標的基本細胞として選択し(図32、工程ａ)、抗TCR-α-β及び抗CD3で染色し、続いてFACS分析して、TCRsp及びCD3の表面発現の欠失を同定した(図32、工程ｂ)。比較として、コントロール細胞を染色して分析した。図39に示すように、表面発現は検出されなかった(図32、工程ｃ)。加えて、CD3発現の欠失はまた、標的基本細胞がTCR-γ-δ発現を欠くことを示し、TCR鎖相補対の発現の不在下ではCD3が表面に発現することができないことを示した。
その後、標的基本細胞を３つの一過性発現プラスミドで化学的にトランスフェクトした。第１のプラスミドは４つ全てのCD3タンパク質を、P2Aウイルスペプチドにより連結された単一ORFとしてコードしていた(V3.C.6)。第２及び第３のプラスミドはTCR鎖の相補対(pTCR)をコードし、ここで、各プラスミドはTCRα鎖又はTCRβ鎖のいずれかの一過性発現をコードしていた(図32、工程ｄ)。２つの異なるTCRα-β対をトランスフェクトした。１つの対は、NLVPMVATVペプチドが積載されたHLA-A*02:01に特異的なTCRspをコードし(V3.C.3、V3.C.5、A2-NLVpos)、他方の対は、特異的でないTCRspをコードしていた(V3.C.2、V3.C.4、A2-NLVneg)。
２日間の増殖後、トランスフェクト細胞を、抗TCR-α-β及び抗CD3で染色し(図32、工程ｅ)、加えて、A2-NLVpos TCRab対の同族抗原である可溶性aAPX:aM(dexA2-NLV-PE)を用いて細胞を染色した。染色細胞をその後FACSにより分析し、該細胞がCD3及びTCRspの表面発現についてコンピテントであることが示された(図40)。加えて、A2-NLVposをトランスフェクトした細胞はdexA2-NLV-PEへの結合を示した一方、A2-NLVnegをトランスフェクトした細胞はdexA2-NLV-PEへの結合を示さなかった(図40)。このことは、細胞がTCRspの発現に関してコンピテントであることを示した(図32、工程ｆ)。その後、標的基本細胞を適切なTCRspコンピテント基本細胞として選択した。
次いで、TCRspコンピテント基本細胞をHLAクラスＩファミリーのaAPXの標的化変異に供して、細胞を、HLAクラスＩファミリーのaAPXの発現を欠くものとした。実施例１に示した手順を用いて変異細胞を得た。加えて、TCRspコンピテント基本細胞は、天然に、HLAクラスIIファミリーのaAPXの発現を欠いており、よって、得られたTCRspコンピテント基本細胞は、２つのファミリーのaAPXの発現を欠くものであった。
【０１４２】
確証基本細胞の同定、遺伝子操作及び選択
TCRspコンピテント基本細胞(２つのaAPXファミリーの発現を欠く)を、２つの一過性発現プラスミドで化学的にトランスフェクトした。第１のプラスミドは以前に記載したとおりのCD3をコードし(V3.C.6)、他方はTCRα(V3.C.2、V3.C.3)又はTCRβ(V3.C.4、V3.C.5)のいずれかをコードしていた。これは、図34、工程ｈの改変バージョンである。２日間の増殖後、トランスフェクト細胞を、抗TCR-α-β及び抗CD3で染色し(図34、工程ｉ)、その後FACSにより分析し(図41)、該細胞がTCRsp及びCD3の表面発現を欠くことが同定され(図34、工程ｉ)、CD3もTCRα又はTCRβも内因性に発現されないことが確証された。
CD3をTCRspコンピテント基本細胞に組み込んだ(図34、工程ｋ)。組込みを達成するため、細胞を３つのプラスミドで一過性にトランスフェクトした。第１のプラスミドは第１の組込み因子Cas9-2A-GFPの発現をコードし(V1.A.8)、第２のプラスミドは第２の組込み因子(HLA-A遺伝子座に標的付けられたガイドRNA)の発現をコードしていた(V2.A.2)。第３のプラスミドは、HLA-A遺伝子座に標的付けられた部位特異的相同組換え用であり、ヒトEF1a-長プロモーター及びSV40pAターミネーターによるCD3の発現タンパク質を、P2Aウイルスペプチドにより連結された単一ORFとしてコードしていた(V4.I.7)。
トランスフェクションの２日後、細胞を採集し、GFP発現に基いて選別し、CD3をコードする配列がHLA-A遺伝子座に組み込まれたCas9発現細胞の割合を高めた(図42)。
選別された細胞を３日間増殖させた後、細胞を３つのプラスミドでコトランスフェクトした。第１のプラスミドGFPの発現をコードし、トランスフェクションコントロールとして用いた。第２及び第３のプラスミドは各々、pTCR(A2-NLVpos)のTCR-α(V3.C.3)鎖又はTCR-β鎖(V3.C.5)のいずれかをコードしていた(図34、工程ｌ)。トランスフェクト細胞を２日間増殖させ、その後、抗CD3で染色した(図34、工程ｍ)。次いで、細胞をCD3の表面発現について選択し(図34、工程ｎ)、ここで、選択は、FAC選別によりポリクローナル集団として行った(図43)。
【０１４３】
選別された細胞を11日間増殖させた後、上記のとおり、別の回のトランスフェクションに供し(図34、工程ｌ)、染色し(図34、工程ｍ)、選択した(図34、工程ｍ)(図44)。選別された細胞を増殖させ、その後、３回目のトランスフェクション及び染色を行った。次いで、染色細胞をTCRsp発現について選択し、96の単一細胞を、モノクローン化するために単一細胞選別により選択した(図45)。残りの染色細胞を、ポリクローナル選別により選択し、−80℃で凍結保存した。
低温保存、PCR、ddPCR及びFACS分析によるゲノム及び表現型分析に利用可能な数になるまで単一細胞クローンを増殖させた。96の単一細胞選択物のうち、20が分析まで生存し、20クローンのうちの８つが正しいゲノム組込みに関してポジティブであり、デジタルドロップ分析によってもポジティブであった。この８つのポジティブモノクローンを、pTCR(A2-NLVneg)のTCR-α(V3.C.2)鎖又はTCR-β鎖(V3.C.4)のいずれかをコードする２つのプラスミド及びGFP発現をトランスフェクションコントロールとしてコードする第３のプラスミド(V1.A.4)でトランスフェクトした。次いで、細胞を抗CD3及び抗TCR-α-βで染色し、TCRsp及びCD3の表面発現について分析した(図34、工程ｎ)。８つのうち２株が表面発現についてポジティブであった。１つの株は高率の発現を示し(図46)、その後、この株を確証基本細胞として選択した。
【０１４４】
実施例５：一工程でのeTPC-t作製の証明
本実施例は、標準化様式でのeTPC-tの作製を記載する。ここで、親のeTPCは、別異の合成ゲノム受容部位 成分Ｂ及びＤを含有する。遺伝子ドナーベクター成分Ｃ'及びＥ'は、HLA-A2アレレにおいて提示されるとき、ヒトサイトメガロウイルスポリペプチド65(HCMV pp65)に由来する抗原性ペプチドNLVPMVATV(NLVP)と結合することが知られている単一鎖のTCR対(JG9-TCR)を含むものであった。成分Ｃ'及びＥ'はRMCE用に設計され、親の成分Ｃ及びＥに由来する。
本実施例は、TCRヌル、HLAヌル、CD4ヌル及びCD8ヌルであり、更に成分Ｂ及びＤを含有する親eTPC細胞株ACL-488を使用する。成分Ｂは、コザック配列及び選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟む２つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3を含む。FRT部位の５'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の３'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。成分Ｄは、成分Ｂとは異なる２つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含む。これら部位は、コザック配列及び選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟む。F14部位の５'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の３'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。
本実施例は、各々が２つの異種特異的リコンビナーゼ部位FRT/F3(Ｃ')及びF14/F15(Ｅ')を含み、よってそれぞれ成分Ｂ及びＤにマッチしている遺伝子ドナーベクター(成分Ｃ'及び成分Ｅ')を使用する。成分Ｃ'は、FRT/F3部位間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-β鎖をコードするTCR ORFを更に含む。成分Ｅ'は、F14/F15部位間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-α鎖をコードするTCR ORFを更に含む。
【０１４５】
eTPC-tを、ACL-488(eTPC)のエレクトロポレーションによるRMCEによって作製した。エレクトロポレーションの４〜10日後、成分Ｄ及びＢ選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質シグナルBFP及びRFPが低下した個々の細胞をFACSにより選別した。個々のモノクローンを増殖させた後、表現型について評価した。得られるモノクローンACL-851はBFP及びRFPネガティブであった(図48 a及びb)。ACL-851はまたTCR及びCD3表面発現を示した一方、親の細胞株は示さなかった(図48 ｃ及びｅ)。更に、導入されたJG9-TCRは、HLA-A*02:01-NLVPテトラマーでの特異的染色を示し、このことは、該JG9-TCRが、eTPC-tの表面で機能的なTCRspであることを示唆している(図48 ｄ〜ｆ)。ACL-851は、ゲノムに組み込まれた成分Ｂ'及び成分Ｄ'によりコードされるTCRspを含有することがPCRにより確証された(図48 ｇ及びｈ)。
まとめると、eTPCは、RMCEベースの組込み法を用いて成分Ｃ'及びＥ'に送達されるTCR ORFを組み込む(その結果、成分Ｂ及びＤが成分Ｂ'及びＤ'に変換される)ことにより、eTPC-tに変換された。このeTPC-tは細胞表面に機能的TCRspを発現した。更に、本実施例は、eTPC-t及び被分析物抗原の二元組成物が組み合わされて、eTPC-tが可溶性被分析物抗原(HLAマルチマー：HLA-A*02:01-NLVPMVATV)との複合体形成に基いて選択されるという単純なeTPC:Aシステムの動作を証明している。
【０１４６】
実施例６：eTPC-xへのeTPC-tの変換の証明
本実施例はeTPC-tのeTPC-xへの変換を記載する。ここで、eTPC-xはTCR鎖ORFをコードする成分Ｂ'を有し、成分Ｄは相補性TCR鎖ORFの組込みに利用可能である。eTPC-xの成分ＤへのeTPC-tの成分Ｄ'の変換は、成分Ｄ'にマッチしている遺伝子ドナーベクター(成分Ｚ)の使用により達成される。
本実施例では、実施例５で作製した親eTPC-t細胞株ACL-851を用いた。成分Ｚは、成分Ｄ'にマッチしている２つの異種特異的リコンビナーゼ部位F14/F15、コザック配列、開始コドン及び組込みの選択マーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするORFで構成されるプラスミドベクターである。eTPC-tを成分Ｚ及びRMCEリコンビナーゼ酵素をコードするベクターとエレクトロポレーションにより組み合わせた。その後、細胞を、CD3提示の喪失及びGFP組込みの選択マーカーの獲得について選択した。モノクローンACL-987をFACSにより表現型に関して特徴付けた。ACL-987はGFPを獲得し、CD3及びTCRabを喪失したことが観察され(図49ｂ、ｄ)、このことは、JG9-TCR-αのGFP ORFでの交換及び成分Ｄ'の成分Ｄへの変換が奏功し、よって、eTPC-xが作製されたことを示している。対照的に、親eTPC-tであるACL-851は、GFP発現を欠き、CD3及びTCRab表面発現を有する(図49ａ〜ｃ)。
まとめると、本実施例は、成分Ｄ'のJG9-TCR-α TCR ORFを除去し、GFP組込みの選択マーカーと交換することによって代替の相補性TCR鎖ORFの更なる組込みカップリング事象のための成分Ｄを作製することによるeTPC-tのeTPC-xへの変換を証明する。この変換は、ゲノム組込みのためのRMCE法を用いて行われた。
【０１４７】
実施例７：eTPC-xへのショットガン組込みによるeTPC-tプールの作製の証明
本実施例は、64の単一JG9-TCR-αバリアントをコードするベクター(成分Ｅ)のプールを、単一工程として、親のeTPC-x細胞株(実施例４に記載する)に組み込んで、プールされたeTPC-tライブラリー(各細胞に元のベクタープールからのα鎖をコードする単一ランダムTCR ORFが組み込まれている結果、各eTPC-tがTCR ORFの単一ランダム対をTCRspとして発現する)を作製する方法を記載する。個々のeTPC-tが一緒に組み合わさって、プールされたeTPC-tのライブラリーを構成し、ここで、細胞プールは、おそらく、64のTCR-αと元の定まったTCRβ鎖との可能な対の全ての組合せを表わしている(図12概略図参照)。このような方法を、本明細書において、「ショットガン」組込みと呼ぶ。64のJG9-TCRαバリアントは、Ｖ及びＪフラグメントの接合部にあるCDR3配列を改変することにより作製した。
本実施例では、JG9-TCR-β(成分Ｂ')及びCD3複合体を表面発現しない親eTPC-x細胞株ACL-987(実施例６参照)を用いた。成分Ｄは、実施例６に記載するように、選択マーカーGFPをコードする。本実施例では64のJG9-TCR-αバリアントフラグメントを成分Ｅドナーベクターにクローニングして、F14/F15部位に挟まれ成分Ｄにマッチする成分Ｅ'を作製した。その後、64のベクターを単一ベクタープールに組み合わせた。
eTPC-tプールを、RMCEベースのゲノム組込みにより作製した。ここでは、eTPC-x(ACL-987)と64の成分Ｅ'とRMCEリコンビナーゼベクターとをエレクトロポレーションにより組み合わせた。ポリクローンを、GFP発現に基づいて選択した。得られるポリクローンACL-988は、GFPポジティブ細胞のみで構成される親株とは異なり、GFPポジティブ及びGFPネガティブの両方の細胞集団で構成された(図50 ａ及びｂ)。しかし、GFPネガティブ集団のみが、強いCD3発現を定常的に示し、このことは、成分Ｄの成分Ｄ'への変換が奏功したこと、したがってeTPC-xがeTPC-tプールに変換されたことを示す(図50 ｃ及びｄ)。更に、ACL-988 GFPネガティブ集団は、JG9-TCR特異的マルチマー反応剤(DEX HLA-A*02:01-NLVP)で染色したとき、２つの別異の強度を示した。このことは、この集団が、結合効率が異なるTCRバリアントを発現する細胞を含むことを示唆する。
【０１４８】
並行して、64全てのJG9-TCR-αバリアントを、親eTPC-x(ACL-987)に対して一過性トランスフェクションを可能とする発現構築物にクローニングした。バリアントJG9-TCRを発現する上記プールしたeTPC-tにおいて提示される各TCR対についてHLA-A*02:01-NLVPマルチマー反応剤 対 参照の相対染色単位(RSU)を決定した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対する、CD3ポジティブ集団についてのHLAマルチマーシグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標であった。各JG9-TCR-αバリアントでの親ACL-987株の独立のトランスフェクション後、細胞を、CD3に対する抗体及びHLA-マルチマー反応剤で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図51eにプロットした各点は、64のバリアントの各々について観察されたRSUを表す。
ACL-988プールの個々の細胞を、HLA-マルチマーポジティブ集団及びHLA-マルチマーネガティブ集団から、単一細胞選別した。各単一細胞について、バリアントJG9-TCR-α ORFをコードする成分Ｄ'を増幅して配列決定し、上記の一過性発現RSU単位の結果と比較した(図50e)。事実、HLA-マルチマーポジティブである個々のACL-988細胞は、個々に試験したバリアントにおいて高いRSU結果を優勢に示すJG9-TCR-αバリアントをコードしていた(図51e、白抜き円)。更に、pHLA-マルチマーネガティブである個々のACL-988細胞は、低いRSU結果を優勢に示すJG9-TCR-αバリアントをコードした(図51e、白抜き三角)。
結論として、本実施例は、eTPC-x及びプールされたベクター(成分Ｅ')ライブラリーの、複数の異なるTCRspeを含有するTPC-tのプールされたライブラリーへの変換のための多成分システムの使用を証明する。これは、ショットガン組込みを用いて単一工程で達成された。更に、本実施例は、eTPC-tプールが被分析物抗原(可溶性親和性反応剤として)と、eTPC:Aシステムに組み合わされることを証明した。被分析物抗原(HLA-マルチマー)との複合体形成に基いて単一細胞プールを選択し、その後、成分Ｄ'にコードされるTCR鎖ORFを抽出してDNA配列を取得し得ることが示された。
【０１４９】
実施例８：成分Ｆの機能的証明
本実施例では、２つの独特なゲノム受容部位(成分Ｂ、Ｄ)を有しHLAヌルであるように遺伝子操作され、天然型CD3発現を利用し、遺伝子操作されたゲノム二成分 合成応答エレメント(成分Ｆ)を有するeTPC細胞株(ACL-1277、成分Ａ)を記載する。
応答エレメントは、駆動因子-アクチベーター及び増幅因子-レポート成分で構成され、これらの両ユニットは、合成プロモーターを利用するものであった。駆動因子は、NFAT-AP1-NFkBのための３セットの直列の転写因子結合部位(３×NF-AP-NB)をコードする天然型TCRシグナル伝達経路に応答性の合成プロモーターである。転写活性化の際、駆動因子は、増幅因子プロモーター内に同族DNA認識配列が直列で６回存在する、ヘルペスVP16活性化ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン並びにＮ末端及びＣ末端の２つの核局在化シグナル(NV16G4N)の融合により導かれる合成の設計された転写因子であるアクチベータータンパク質の発現を誘導する。両駆動因子及び増幅因子プロモーターは、それぞれの転写因子結合部位の直ぐ３'側の、HCMV IE1プロモーターからのコアプロモータ配列(Ｂ認識エレメント(BRE)、TATAボックス、イニシエーター(INR)及び転写開始部位)を利用した。増幅因子は、転写活性化の際、レポーター赤色蛍光タンパク質(RFP)の発現を駆動する。
【０１５０】
本実施例では、実施例５に記載したように、eTPC細胞株をeTPC-t細胞株に変換した。ここで、成分Ｂ'及びＤ'のTCR鎖ORFは、HLA-ペプチド複合体(HLA)HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCR対をコードする。
次いで、eTPC-t細胞株を、HLA-A*02:01(ACL-209)若しくはHLA-A*24:02(ACL-963)を提示するか又はHLA-ヌル(ACL-128)であるAPCに対してチャレンジさせた。ここで、被分析物APCは、APCをペプチドNLVPMVATV若しくはVYALPLKMLでパルスするか又はしないことにより調製した。その後、eTPC-t及び被分析物APCを、10,000のAPCと24時間共培養した30,000のeTPC-tからなるeTPC:Aシステムに編成した。24時間後、当業者に公知の技法を用いて、細胞を採集し、洗浄し、集団を区別するためにeTPC-t及び被分析物APCに特異的なマーカーで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。eTPC-t(成分Ｆ)の強い活性化(RFP+発現＞80％)は、既知の同族抗原pHLA複合体を提示する被分析物APC、すなわち、A*02:01-NLVPMATVを有するAPCでチャレンジしたeTPC-tでのみ観察された(図51a)。対照的に、非特異的被分析物APC(図51b、c、d)又はHLA若しくはペプチドを欠くコントロール被分析物APCで構成されるeTPC:A編成においては、静止状態のRFP発現のみが観察された。
結論として、機能的成分Ｆを含むeTPC細胞株が遺伝子操作された後、eTPC-tを作製するために使用された。eTPC-tとその同族標的Ｔ細胞抗原を提示する被分析物APCとの相互作用に際して、応答はRFP発現の増加として測定可能であった。逆に、非同族Ｔ細胞抗原及びHLAを提示するか又はHLAを提示しない被分析物APCと接触させたときには、eTPC-tはバックグランドを超えるRFP発現の測定可能な増加を示さなかった。更に、本実施例は、被分析物APC及び被分析物eTPC-tが別の二元組成物に編成され、eTPC-t応答(TCRspと被分析物抗原との間の協調的複合体が生じる)が被分析物APC及びeTPC-tの両方を同定するために用いられるeTPC:Aシステムを証明する。
【０１５１】
実施例９：TCRを有するフローサイトメトリー標準物としてのeTPC-tの使用
本実施例では、インビトロFACSベースアッセイの標準物質としての使用のために、多成分システムを用いて作製され選択された後に、eTPC:Aシステムに編成されたeTPC-tの例を記載する。本実施例は、抗原性分子(AM)HCMV-pp65に由来するペプチドNLVPMVATVが積載されたHLA-A*02:01抗原提示複合体(APX)で構成される抗原(APX:AM)に特異的なTCRspを発現する、確証され選択されたeTPC-t(ACL-851、実施例５)の化学的固定及び低温保存を証明する。TCRspは、貯蔵から回復されたとき、pHLA-マルチマー(APX:AM)標識を維持した(図52a)。更に、これら細胞はヒト末梢血単核細胞(PBMC)調製物に対して「スパイクイン」であり得、同じ標本内で、フローサイトメトリーにより、HCMV-特異的初代Ｔ細胞と共に検出された(図52b)。eTPC-tをCD58抗体で予め染色した後、PBMCミックスにスパイクした後、テトラマー反応剤で染色した。CD58パラメーターを用いてeTPC-tとHLA-A*02:01に提示されるNLVPMVATVペプチドに特異的な初代Ｔ細胞とを区別した。このことは、特異的TCRsp鎖対を発現するeTPC-tは、抗原特異的Ｔ細胞を検出するフローサイトメトリーアッセイにおいて、TCR提示コントロール反応剤として使用できることを証明する。
【０１５２】
SEQUENCE LISTING
<110> Genovie AB
<120> An Engineered Multi-component System for Identification and Characterisation of T-cell receptors, T-cell antigens and their functional interaction
<130> ANO9
<160> 134
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1 <223> HCMV Antigen
<210> 2 <223> Analyte Antigenic Peptide
<210> 3 <223> Analyte Antigenic Peptide
<210> 4  <223> pcDNA3.1_GFP vector V1.A.4
<210> 5 <223> pcDNA3.1_RFP vector V1.A.6
<210> 6 <223> SpCas9-2A-GFP vector V1.A.8
<210> 7 <223> pMA-SV40pA vector V1.C.2
<210> 8 <223> HLA-A 02:01 6xHis + Exon2/3-HA-L+R vector V1.C.6
<210> 9 <223> HLA-B 35:01 6xHis + Exon2/3-HA-L+R vector V1.C.9
<210> 10 <223> AAVS1-L_B07_6xH vector V1.F.10
<210> 11 <223> AAVS1-S_A24_6xH vector V1.F.8
<210> 12 <223> AAVS1-l_GFP_HCMVpp65 vector V1.G.10
<210> 13 <223> AAVS1-l_GFP_HCMVpp65 ANET vector V1.G.9
<210> 14 <223> AAVS1-l_GFP_HCMVpp65 AIN vector V1.H.1
<210> 15 <223> AAVS1_DRA_Flag-DRB1_6xHis vector V1.I.5
<210> 16 <223> AAVS1_DPA1_Flag-DPB1_6xHis vector V1.I.7
<210> 17 <223> HLA-A-sg-sp-opti1 vector V2.A.1
<210> 18 <223> HLA-B-sg-sp-3 vector V2.A.7
<210> 19 <223> HLA-C-sg-sp-4 vector V2.B.3
<210> 20 <223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_1 vector V2.I.10
<210> 21 <223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2 vector V2.J.1
<210> 22 <223> AAVSI_sg-sp-opti_3 vector V2.J.6
<210> 23 <223> pMA-CS-JG9-TCRbeta vector V3.C.5
<210> 24  <223> AAVS_Efla-intron_F14_RFPnls_F15 vector V4.B.2
<210> 25 <223> AAVS_Efla-intron_FRT_BFPnls_F3 vector V4.B.3
<210> 26 <223> pMA_FRT_HLA-A*02:01-6xHis_F3 vector V4.D.2
<210> 27 <223> pMA-F14-GFP-F15 vector V4.H9
<210> 28 <223> CMVpro-Flp-sv40pA-V2 vector V4.I.8
<210> 29 <223> pMA-F14-TCR-JG9-alpha-F15 vector V7.A.3
<210> 30 <223> pMA-FRT-TCR-JG9-beta-F3 vector V7.A.4
<210> 31 <223> F14-TCRaF15 CDR3degen.64mix vector V8.F.8
<210> 32 <223> JG9-TRA CDR3 64 variants vectors backbone VP.7751.RC1-A1 to H8
<210> 33 <223> CDR3 sequence of a JG9-TRA 64 variant VP.7751.RC1_A1
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<210> 95 <223> CDR3 sequence of a JG9-TRA 64 variant VP.7751.RC1_H8
<210> 96 <223> pMA-sv40_OE_F1primer 1.C.2
<210> 97 <223> pMA-sv40_OE_R1 primer 1.C.3
<210> 98 <223> pMA-CMV_OE_R1 primer 1.C.5
<210> 99 <223> HLA-A-GT-Rg3 primer 4.A.3
<210> 100 <223> HLA-A-GT-Fg2 primer 4.A.4
<210> 101 <223> HLA-B-GT-Fg2 primer 4.A.7
<210> 102 <223> HLA-B-GT-Rg2 primer 4.B.1
<210> 103 <223> HLA-C-GT-Fg2 primer 4.B.5
<210> 104 <223> HLA-A-02_GT_Rg4 primer 4.I.9
<210> 105 <223> HLA-A-Exon3_HA-RE-BglII_F1 primer 6.I.9
<210> 106 <223> HLA-C-04-GT-Rg1 primer 8.A.1
<210> 107 <223> CMV-pA-HLA-Ex3_Probe_F1 primer 8.B.2
<210> 108 <223> CMV-pro_GT_R1 primer 9.C.3
<210> 109 <223> sv40pA_GT_F1 primer 9.C.4
<210> 110 <223> AAVS1_GT_F1 primer 9.C.5
<210> 111 <223> AAVS1_GT_F3 primer 9.C.7
<210> 112 <223> AAVS1_GT_F4 primer 9.C.8
<210> 113 <223> AAVS1_GT_R2 primer 9.C.10
<210> 114 <223> AAVS1_GT_R3 promer 9.D.1
<210> 115 <223> AAVS1_GT_R4 primer 9.D.2
<210> 116 <223> HLA-A-intron4_GT_R1 primer 9.D.6
<210> 117 <223> sv40pA-GT-F2 primer 9.D.7
<210> 118 <223> sv40pA-AAVS1-probe-FAM-F1 primer 9.J.2
<210> 119 <223> TRAC_TCRA-ex1_R1 primer 10.A.9
<210> 120 <223> TRAC_TCRA-promoter_F1 primer 10.A.10
<210> 121 <223> TRAC_probe (HEX) primer 10.B.6
<210> 122 <223> TRAC-GT-F1 primer 1.F.7
<210> 123 <223> sv40pA GT-R1 primer 15.H.2
<210> 124 <223> TRBC2-GT-F1 primer 1.F.9
<210> 125 <223> tGFP-Cterm-Out_SQ_F1 primer 3.J.5
<210> 126 <223> TRAC-GT-F1 ddPCR primer/probe
<210> 127 <223> TRAC-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.8
<210> 128 <223> TRAC-probe-FAM ddPCR primer/probe
<210> 129 <223> TRBC2-GT-F1 ddPCR primer/probe 1.F.9
<210> 130 <223> TRBC2-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.10
<210> 131 <223> TRBC2-probe-FAM ddPCR primer/probe 1.G.2
<210> 132 <223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.9
<210> 133 <223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.10
<210> 134 <223> TRAC-probe(HEX) ddPCR primer/probe 10.B.6
【０１５３】
略語リスト
aAPX          被分析物抗原提示複合体
aAM           被分析物抗原性分子
APC           抗原提示細胞
APX           抗原提示複合体
BFP           青色蛍光タンパク質
CAR-T         CAR Ｔ細胞
CM            積荷分子
CRISPR        クラスター化した規則配置性短パリンドローム配列反復
gRNA          Cas9ガイドRNA
【０１５４】
CAR           キメラ抗原レセプター
CDR           相補性決定領域
Ｃ領域        定常領域
CMV           サイトメガロウイルス
DAMPS         危険関連分子パターン
DC            樹状細胞
DNA           デオキシリボ核酸
Ｄ領域        多様性領域
eTPC          遺伝子操作されたTCR提示細胞
eTPC:A        被分析物eTPC-tが被分析物抗原と組み合わされているeTPC:抗原システム
【０１５５】
eTPC-t        全長TCR対を提示する遺伝子操作されたTCR提示細胞
FACS          蛍光活性化細胞選別
GEM Ｔ細胞    生殖系列によりコードされるミコリル反応性Ｔ細胞
GFP           緑色蛍光タンパク質
HLAI          HLAクラスＩ
HLAII         HLAクラスII
HDR           相同性指向組換え
HLA           ヒト白血球抗原
IgSF          イムノグロブリンスーパーファミリー
【０１５６】
IRES          内部リボソーム進入部位
iNK Ｔ細胞    インバリアントナチュラルキラーＴ細胞
Ｊ領域        連結領域
MACS          磁性活性化細胞選別
MAGE          メラノーマ関連抗原
MAIT          粘膜関連インバリアントＴ
NCBP          非細胞ベース粒子
ORF           オープンリーディングフレーム
PAMPS         病原体関連分子パターン
PCR           ポリメラーゼ連鎖反応
【０１５７】
RMCE          リコンビナーゼ媒介カセット交換
RFP           赤色蛍光タンパク質
DNA           リボ核酸
SH2           Src相同性２
Ｔ細胞        Ｔリンパ球
TCR           Ｔ細胞レセプター
TRA           TCRα
TRB           TCRβ
TRD           TCRδ
【０１５８】
TCRsp         CD3と複合体化したTCR表面タンパク質
TALEN         転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ
TRG           TRCγ
TAA           腫瘍関連抗原
Ｖ領域        可変領域
β2M          β2-ミクログロブリン
ZAP-70        70kDaのζ-鎖関連タンパク質
【０１５９】
定義
相補TCR鎖の対：翻訳されたタンパク質がTCR提示細胞の表面でTCRspを形成できる２つのTCR鎖。
親和性：２又は３以上の分子又はタンパク質の間の相互作用の動的又は平衡パラメータ
親和性反応剤：被分析物に関して特異的親和性を有するように設計された任意の反応剤。TCRspに関する親和性について使用されることがおおい。
アレレ：所与の遺伝子のバリアント形態。
AM：被分析物抗原性分子。一般に、ゲノムDNA及び/又は特定の導入遺伝子配列から細胞により発現されるタンパク質であるが、代謝産物でもあり得る。AMは、細胞で発現され、フラグメントが次いで積荷としてAPXにより又はそれ自体で細胞表面で提示され得る。積荷としてであってもなくても、AMは、次いで、Ｔ細胞レセプター保有細胞又は関連する親和性反応剤の標的になり得る。
アンプリコン：PCRを含む様々な方法を用いる人工的増幅の源及び/又は生成物であるDNA又はRNA片。
【０１６０】
被分析物：組合せシステムにおいて同定及び/又は測定及び/又は照会される興味対象の物質。
被分析物抗原：可溶性反応剤、不動化反応剤の形態で提供されるか、NCBPにより提示されるか、細胞表面に提示される以下AM、APX、APX:CM、APX:AMの少なくとも１つを含んでなる抗原
被分析物APC：被分析物抗原を提示する被分析物細胞
抗体：Ｂ細胞と呼ばれる免疫系の専門細胞により発現され、２つの鎖を含む親和性分子。Ｂ細胞は、一般には自己タンパク質に結合しないが、宿主を脅かす病原体又は毒素に結合して中和することができる、非常に多くの非常に多様なレパートリーの抗体を発現する。天然の又は人工的に遺伝子操作された抗体は親和性反応剤として用いられることがおおい。
抗原：TCRが結合し得、Ｔ細胞内で伝達されるシグナルをもたらる任意の分子(抗原提示複合体により提示されることが多い)
APC：抗原提示細胞。細胞表面にAM、APX、APXを保有する細胞。
APX：抗原提示複合体。有核細胞により、ゲノムDNA及び/又は特定の導入遺伝子配列をコードする遺伝子/ORFから細胞表面で発現及び提示されるタンパク質。APXは、ペプチド又はその他の代謝物分子である積荷を提示する。
Ｃ領域：定常領域。Ｔ細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの１つ。ｃ領域は、TCRの多様性を駆動するのではなく、免疫系における全般的機能を規定する別個のセグメントである。
【０１６１】
積荷積載装置：細胞に見出されるタンパク質又は他の提示される分子から、積荷分子を生成してAPXに積載する細胞性タンパク質セット。
CDR：相補性決定領域。標的結合機能のほとんどを行う、TCR及び抗体の、抗原に面する端部の短い配列。各抗体及びTCRは、６つのCDRを含み、これらは、一般に、多数の多様な標的分子の検出を可能にする、当該分子の最も可変な部分である。
CM：積荷子。抗原提示複合体、例えばHLA I又はHLA IIにより提示されるペプチド又は代謝物。CMは、ゲノムDNAから固有に細胞により発現されるか、培養培地に導入されるか又は特異的に導入された遺伝子配列から発現されることができる。
コピー数：細胞のゲノム内でコードされる規定された配列の存在総数。
細胞遺伝学的：染色体の構造及び機能に関する遺伝学、すなわち細胞の核型の決定。
細胞傷害性/細胞毒性：標的細胞を直接的で特異的に損傷する因子をＴ細胞が放出するプロセス。
Ｄ領域：多様性領域。Ｔ細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの１つ。各個が、これら領域の多くの異なるバリエーションを有し、そのことにより、各個体は非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装することが可能である。
DNA：デオキシリボ核酸。遺伝子及びタンパク質をコードする遺伝物質を形成する分子の化学名称。
内因性：細胞内に起源を発する物質。
【０１６２】
遺伝子操作された細胞：遺伝子改変によりゲノムが遺伝子操作されている、改変された細胞。
真核生物条件付き調節エレメント：規定された条件下で誘導又は抑制され得る、プロモーターの活性に影響し得るDNA配列
真核生物プロモーター：RNAポリメラーゼ結合部位及び応答エレメントをコードするDNA配列。プロモーター領域の配列は、RNAポリメラーゼ及び転写因子の結合を制御し、したがって、プロモーターは、興味対象の遺伝子がどこでいつ発現されるかを決定する大きな役割を演じる。
真核生物ターミネーター/シグナルターミネーター：RNAポリメラーゼIIと結合して転写終結プロセスの誘引するタンパク質因子により認識されるDNA配列。これは、ポリＡシグナルもコードする。
eTPC:抗原システム：eTPC:A。被分析物eTPC-tが被分析物抗原と組み合わされているシステム
FACS/フローサイトメトリー：蛍光活性化細胞選別。個々の細胞を特異的細胞表面及び細胞内マーカーの発現について分析できる分析技術。この技術の変法である細胞選別は、規定されたマーカーセットを有する細胞を、更なる分析のために回収することを可能にする。
APXのファミリー：抗原提示複合体を構成する機能的に関連するタンパク質をコードする幾つかの類似する遺伝子のセット。
蛍光(タンパク質)マーカー：特異的な消光及び発光の特徴を有し、顕微鏡観察、FACS及び関連技術により検出できる分子。
遺伝子ドナーベクター：遺伝物質をゲノム受容部位に送達するための遺伝子ベースのベクター。
【０１６３】
ゲノム受容部位：遺伝子ドナーベクター内にコードされるドナー遺伝物質の標的付けられた組込みのためのゲノム内の部位。
異種特異的リコンビナーゼ部位：２つのDNA分子のクロスオーバーを促進するための、リコンビナーゼ酵素により認識されるDNA配列。
HLA I：ヒト白血球抗原クラスＩ。ヒトにおいて全ての有核細胞で発現される遺伝子。発現したHLA Iは、細胞表面に輸送されて、そこで、内部タンパク質の短いフラグメント、ペプチドを積荷としてＴ細胞レセプターに提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質のフラグメントを提示する。HLA Iは、加えて、培養培地に加えられるか、導入遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から生成されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から生成されるペプチドを積荷として提示できる。HLAクラスＩ遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が、提示におけるバリエーションを導く同一遺伝子におけるバリエーションを有する可能性があることを意味する。HLAクラスIIと関連する。
HLA II：ヒト白血球抗原クラスII。ヒトにおいて適応免疫応答を調和し援助する特定細胞(例えば樹状細胞)で発現される遺伝子。HLAクラスＩと関連する。HLAクラスIIタンパク質は、細胞表面に輸送され、そこで、外部タンパク質の短いフラグメント、ペプチドを積荷としてＴ細胞レセプターに提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質のフラグメントを提示する。加えて、HLA IIは、培養培地に加えられるか、導入遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から生成されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から生成ペプチドを積荷として提示できる。HLAクラスII遺伝子は、多型であり、これは、異なる個体が、提示におけるバリエーションを導く同一遺伝子におけるバリエーションを有する可能性があることを意味する。
【０１６４】
相同アーム：相補相同アームとほぼ同一の配列同一性を有し、よって細胞プロセスである相同性指向修復による２つのDNA分子の交換を促進するDNA伸長部。
免疫監視：免疫系が感染、悪性病変又はその他の病原性である可能性のある変化を検出し、それにより活性化されるプロセス。
インスレーター：遺伝子が近傍の遺伝子の活性化又は抑制により影響されることを妨ぐDNA配列。インスレーターは、サイレント化された遺伝子から活発に転写される遺伝子へのヘテロクロマチンの広がりも妨ぐ。
組込み：細胞の染色体へのDNA配列の物理的ライゲーション。
組込みカップル：対をなす組込みベクター及びゲノム受容部位
内部リボソーム進入部位(IRES)：転写されると、キャップ非依存様式で翻訳の開始を可能にするRNAエレメントをコードするDNA配列。
Ｊ領域：連結領域。Ｔ細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの１つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
核型：細胞の染色体組成。
コザック配列：翻訳の効率的な開始に必要な短い配列
【０１６５】
主要HLAクラスＩ：遺伝子HLA-A、HLA-B及びHLA-Cで構成されるAPXのファミリー。
マッチした(する)：２つの成分が、相補成分間の相互作用を導き及び制限する遺伝子エレメントをコードするとき。
メガヌクレアーゼ認識部位：メガヌクレアーゼと一般に呼ばれるエンドデオキシリボヌクレアーゼにより認識されるDNA配列
代謝物：細胞の代謝経路により生成又は改変された分子
可動遺伝子エレメント：トランスポサーゼ酵素の活性を有するDNAの組込みを許容するDNA配列。
モノクローン細胞株：細胞複製の反復により単一始祖細胞から生成される規定された細胞群。
天然型：細胞に天然に生じる物質。
非コーディング遺伝子：機能的非コーディングRNA分子に転写されるタンパク質非コーディングDNA配列。
ORF：オープンリーディングフレーム。リボソームによるタンパク質(ポリペプチド)の合成のための翻訳フレームをコードする遺伝物質伸長部。
パラクリン：近傍細胞に直接作用する可溶性因子によるシグナル伝達。
【０１６６】
PCR：特定の標的DNA分子が指数関数的に増幅されるポリメラーゼ連鎖反応
ペプチド：６〜30アミノ酸長のアミノ酸の短い一続き。
表現型分析：細胞の観察可能な特徴の分析。
多型：同一遺伝子の異なるアレレの存在により、同一種の個体における異なる形態の存在。
ポリペプチド：三次元構造を形成する、一続きのペプチドからなるタンパク質。
プライマー：例えばPCRの間に、標的DNA配列の特異的認識を可能にする短いDNA配列。
一次出力：終端出力を誘導及び/又は決定することができるeETP-t細胞、被分析物APC細胞、NCBP又は他の被分析物抗原形態。
プロモーター：遺伝子発現の制御された開始のための調節DNAエレメント。
選択マーカー：人工的選択法に適切な形質を与えるDNA配列。
ショットガン組込み：ベクターのライブラリーが細胞集団に導入されるプロセスであって、このプロセスにより、任意の所与のベクターインサートの単一コピーのみが各単一細胞のゲノムに組み込まれ得る。組込みカップルを介する所与の細胞集団へのプールされたベクターの組込みを言うときに用いる。
【０１６７】
スプライスアクセプター部位：表面にTCRspを有する細胞又はTCRspベースの反応剤との相互作用のための、イントロンAM、APX CM又は親和性反応剤の３'末端のDNA配列。
スプライスドナー部位：イントロンの５'末端のDNA配列。
合成：人工的に生成又は細胞に導入された物質。
Ｔ細胞：Ｔリンパ球。その表面でＴ細胞レセプターを発現する白血球。自己と反応しないが、感染及び悪性疾患を認識し、同じ種のほとんどのメンバーからの移植片を拒絶する能力を有するように免疫系により選択される。
TCR：Ｔ細胞レセプター。Ｔリンパ球と呼ばれるリンパ球の亜集団により発現される親和性分子。ヒトでは、TCRは、ウイルス若しくは細菌感染又はガン性細胞からのフラグメントを含む、APX CM又はAPX AMにより提示される積荷を認識する。したがって、TCR認識は、適応免疫系の肝要な部分である。TCRは、細胞表面で対合した２つの鎖からなる。各細胞の表面で発現されるTCRは、様々な遺伝子(ｖ、ｄ、ｊ及びｃ領域)の大きなプールからランダムに組み立てられ、よって各個が、異なるTCRの非常に大きく多様なレパートリーを発現するＴ細胞のプールを有する。
TCRsp：CD3と複合体化して表面タンパク質として発現される相補性TCR鎖対、又は可溶性反応剤、不動化反応剤の形態のタンパク質若しくはNCBPにより提示されるタンパク質として発現される相補性TCR鎖対。
終端出力：AM、APX、APX:CM、APX:AM、親和性反応剤又はTCRspの形態の被分析物抗原及びTCR配列。
【０１６８】
TRA：TCRαをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの１つ。翻訳されたTCRα鎖タンパク質は、代表的には、翻訳されたTCRβ鎖タンパク質と対合して、α/βTCRspを形成する。
TRB：TCRβをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの１つ。翻訳されたTCRβ鎖タンパク質は、代表的には、TCRα鎖タンパク質と対合して、α/βTCRspを形成する。
TRD：TCRδをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの１つ。翻訳されたTCRδ鎖タンパク質は、代表的には、翻訳されたTCRγ鎖タンパク質と対合して、γ/δTCRspを形成する。
TRG：TCRγをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの１つ。翻訳されたTCRγ鎖タンパク質は、代表的には、転写されたTCRδ鎖タンパク質と対合して、γ/δTCRspを形成する。
Ｖ領域：可変領域。Ｔ細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの１つ。各個が、これら領域の多くの異なるバリエーションを有し、そのことにより、各個体は非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装することが可能である。
【０１６９】
項目
本発明を下記の項目において更に規定する：
1．第１の成分が遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)(成分Ａと呼ぶ)であり、第２の成分が被分析物TCR鎖をコードするORFの送達用遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)である多成分システム。
2．成分Ａが
ａ．TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、
ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム組込み部位である更なる成分(Ｂと呼ぶ)を含有する
項目１に記載の多成分システム。
3．成分Ｃが成分Ｂにマッチし、成分Ｃが
ａ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
ｂ．被分析物TCR鎖対をコードする２つのORF
を送達するために設計されており、ａ及び/又はｂは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分Ａ上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、項目１又は２に記載の多成分システム。
4．eTPC(成分Ａと呼ぶ)及び１又は２以上の被分析物TCR鎖をコードするORFの送達用遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)を含んでなり、成分Ａが
ａ．TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、
ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム組込み部位である更なる成分(Ｂと呼ぶ)を含有し、
成分Ｃが成分Ｂにマッチする遺伝子ドナーベクターを含んでなり、成分Ｃが
ａ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
ｂ．被分析物TCR鎖対をコードする２つのORF
を送達するように設計されており、ａ及び/又はｂは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分Ａ上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、項目１〜３のいずれか１項に記載の多成分システム。
5．成分Ａが１つの被分析物TCR α、β、δ又はγ鎖をコードする単一ORFの組込みのためのゲノム組込み部位である更なる成分(成分Ｄと呼ぶ)を含んでなる、項目１〜４のいずれか１項に記載の多成分システム。
【０１７０】
6．更なる成分(Ｅと呼ぶ)がＤにマッチする遺伝子ベクターであり、成分Ｅが１つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORFを送達するように設計されており、相補性の対をなす被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードするORFが成分Ｂに組み込まれているとき、成分Ａ上にTCRspとして発現され、成分Ｅが組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、項目５に記載の多成分システム。
7．成分Ａが
ａ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーターと少なくとも１つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
ｂ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーターと少なくとも１つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである成分(Ｆと呼ぶ)を更に含有し、ａ及び/又はｂの活性化が合成経路、天然型経路又はそれらの組合せから選択される少なくとも１つのシグナル変換経路に依存する、項目１〜６のいずれか１項に記載の多成分システム。
8．ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤを含み、ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤが
ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ｂ．部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
ｃ．部位特異的相同組換え用の天然型ゲノム部位
から選択される、項目１〜７のいずれか１項に記載の多成分システム。
9．成分Ａが被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも１つのファミリーの内因性表面発現を欠く、項目１〜８のいずれか１項に記載の多成分システム。
10．aAPXのファミリーが下記：
ａ．HLAクラスI
ｂ．HLAクラスII
ｃ．非HLA抗原提示複合体
のいずれかであってもよい、項目９に記載の多成分システム。
【０１７１】
11．aAMが
ａ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ｂ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
ｃ．成分Ａプロテオームの変更に由来するペプチド
ｄ．成分Ａプロテオームの変更に由来するポリペプチド
ｅ．成分Ａメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される、項目９又は10に記載の多成分システム。
12．成分ＡがCD4及び/又はCD8を発現する、項目１〜11のいずれか１項に記載の多成分システム。
13．成分Ａが追加のTCRコレセプターを発現する、項目１〜12のいずれか１項に記載の多成分システム。
14．成分ＡがCD28及び/又はCD45を発現する、項目13に記載の多成分システム。
15．成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが以下の遺伝子エレメント
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同性アーム
ｃ．真核生物プロモーター
ｄ．真核生物条件付き調節エレメント
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．選択マーカー
ｇ．スプライスアクセプター部位
ｈ．スプライスドナー部位
ｉ．非タンパク質コーディング遺伝子
ｊ．インスレーター
ｋ．可動遺伝子エレメント
ｌ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｍ．内部リボソーム進入部位(IRES)
ｎ．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
ｏ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる、項目１〜14のいずれか１項に記載の多成分システム。
【０１７２】
16．成分Ｃ及び/又はＥを含み、成分Ｃ及び/又はＥが以下の遺伝子エレメント
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同性アーム
ｃ．真核生物プロモーター
ｄ．真核生物条件付き調節エレメント
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．選択マーカー
ｇ．組込みの選択マーカー
ｈ．スプライスアクセプター部位
ｉ．スプライスドナー部位
ｊ．非タンパク質コーディング遺伝子
ｋ．インスレーター
ｌ．可動遺伝子エレメント
ｍ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｎ．内部リボソーム進入部位(IRES)
ｏ．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
ｐ．抗生物質耐性カセット
ｑ．細菌性複製起点
ｒ．酵母複製起点
ｓ．クローニング部位
ｔ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる、項目１〜15のいずれか１項に記載の多成分システム。
17．成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが単一ORFのRMCE組込み用であり、下記：
ａ．真核生物プロモーター
ｂ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｃ．コザックコンセンサス配列
ｄ．選択マーカー
ｅ．真核生物ターミネーター
を含んでなる、項目１〜16のいずれか１項に記載の多成分システム。
18．成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが２又は３以上のORFのRMCE組込み用であり、以下の遺伝子エレメント：
ａ．真核生物プロモーター
ｂ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｃ．２又は３以上のコザックコンセンサス配列
ｄ．選択マーカー
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．第２の真核生物プロモーター
ｇ．第２の選択マーカー
ｈ．第２の真核生物ターミネーター
を含んでなる、項目１〜17のいずれか１項に記載の多成分システム。
19．成分Ｃ及び/又はＥが存在し、単一ORFのRMCE組込み用であり、以下の遺伝子エレメント：
ａ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．コザックコンセンサス配列
ｃ．抗生物質耐性カセット
ｄ．細菌性複製起点
ｅ．１又は２以上のTCR鎖をコードする単一ORF及び/又は組込みの選択マーカーの導入のためのクローニング部位
を含んでなる、項目１〜18のいずれか１項に記載の多成分システム。
20．成分Ｃ及び/又はＥが存在し、２又は３以上のORFのRMCE組込み用であり、以下：
ａ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．２又は３以上のコザックコンセンサス配列
ｃ．抗生物質耐性カセット
ｄ．細菌性複製起点
ｅ．１又は２以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする２又は３以上のORFを真核生物のターミネーターと共に導入するためのクローニング部位
を含んでなる、項目１〜19のいずれか１項に記載の多成分システム。
【０１７３】
21．成分Ｃ及び/又はＥを含み、成分Ｃ及び/又はＥは、成分Ｃ'及び/又はＥ'が得られるよう、少なくとも１つの被分析物TCR鎖をコードする少なくとも１つのORFと組み合わされている、項目１〜20のいずれか１項に記載の多成分システム。
22．組合せは、成分Ｃ'及び/又はＥ'のライブラリーが得られるよう複数回行われる、項目21に記載の多成分システム。
23．被分析物TCR鎖をコードする配列が
ａ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
ｂ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
ｃ．合成TCR鎖ORF配列
に由来する、項目21又は22に記載の多成分システム。
24．eTPC-tが成分Ａの表面にTCRspを発現するように、１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が、成分Ｃ'及び/又はＥ'にコードされる２つの相補性被分析物TCR鎖を成分Ｂ及び/又はＤに組み込んで細胞(eTPC-tと呼ぶ)を得るために、成分Ａと組み合わされており、ここで、成分Ｂ及び/又はＤは成分Ｂ'及び/又はＤ'となる、項目21〜23のいずれか１項に記載の多成分システム。
25．１つの成分Ｃ'又はＥ'が、成分Ｃ'又はＥ'にコードされる１つの被分析物TCR鎖を成分Ｂ又はＤに組み込んで細胞(eTPC-xと呼ぶ)を得るために、成分Ａと組み合わされており、ここで、成分Ｂ又はＤは、eTPC-xが表面に単一TCR鎖を発現するような成分Ｂ'又はＤ'となる、項目21〜23のいずれか１項に記載の多成分システム。
【０１７４】
26．１つの成分Ｃ'又はＥ'が、成分Ｃ'又はＥ'にコードされる１つの被分析物TCR鎖であって、eTPC-xに発現されるTCR鎖に相補性である被分析物TCR鎖をeTPC-xの成分Ｂ又はＤに組み込んでeTPC-tを得るために、eTPC-xと組み合わされており、ここで、成分Ｂ又はＤは、eTPC-tが表面にTCRspを発現するような成分Ｂ'又はＤ'となる、項目25に記載の多成分システム。
27．ａ．成分Ａを少なくとも１つの成分Ｃ'及び/又はＥ'と組み合わせること、ここで、１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'は一対又は二対以上の相補性被分析物TCR鎖をコードし、及び組込み因子と組み合わせること、並びに下記：
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．TCRsp及び/又は１又は２以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
ｄ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、項目24に規定するeTPC-tの製造方法。
28．ｂ及びｄを含む項目27に記載の方法。
29．１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が項目27の工程ａにおける単一TCR鎖の相補対をコードする、項目27又は28に記載の方法。
【０１７５】
30．離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーを得るために、複数回行われ、各回の項目27の工程ａが、独特なeTPC-tが得られるように、独特な単一TCR鎖の相補対を用いて行われる、項目29に記載の方法。
31．ライブラリーを得るために、１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が項目27の工程ａにおける２又は３以上の独特なTCR鎖の相補対の混合プールをコードし、ここで、ライブラリーはeTPC-tの混合集団を含んでなり、各eTPC-tは項目27の工程ａに用いるプールに由来する単一TCRspを発現する、項目27又は28に記載の方法。
32．ａ．成分Ａを１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'と組み合わせること、ここで、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上のＥ'は被分析物TCR鎖をコードし、及び組込み因子と組み合わせること、並びに下記：
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、項目25に規定するeTPC-xの製造方法。
33．ｂ及びｃを含む項目32に記載の方法。
34．１つの成分Ｃ'又は１つの成分Ｅ'が項目32の工程ａにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、項目32又は33に記載の方法。
35．離散的及び規定されたeTPC-xのライブラリーを得るために複数回行われ、各回の項目32の工程ａが、独特なeTPC-xが得られるように、独特な被分析物TCR鎖を用いて行われる、項目34に記載の方法。
【０１７６】
36．ライブラリーを得るために、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が項目32の工程ａにおける２又は３以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードし、ここで、ライブラリーはeTPC-xの混合集団を含んでなり、各eTPC-xは、項目32の工程ａに用いるプールに由来する単一被分析物TCR鎖を発現する、項目32又は33に記載の方法。
37．ａ．eTPC-xを１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'と組み合わせること、ここで、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上のＥ'は、eTPC-x中の組み込まれた被分析物TCR鎖に相補性である被分析物TCR鎖をコードし、及び組込み因子と組み合わせること、並びに下記：
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．TCRsp及び/又は１又は２以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
ｄ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、項目26に規定するeTPC-tの製造方法。
38．ｂ及びｄを含む項目37に記載の方法。
39．１つの成分Ｃ'又は１つの成分Ｅ'が項目37の工程ａにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、項目37又は38に記載の方法。
40．離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーを得るために複数回行われ、各回の項目37の工程ａが、TCRspを発現する独特なeTPC-tが得られるように、独特な被分析物TCR鎖を用いて行われる、項目39に記載の方法。
【０１７７】
41．ライブラリーを得るために、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が項目37の工程ａにおける２又は３以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードし、ここで、ライブラリーはeTPC-tの混合集団を含んでなり、各eTPC-tは、項目37の工程ａに用いるプールに由来する単一TCRspを発現する、項目37又は38に記載の方法。
42．下記の特徴決定：
ａ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する特異性、及び/又は
ｂ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する親和性、及び/又は
ｃ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対するシグナル応答
(ここで、被分析物抗原は、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原は、少なくとも下記：可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)に積載されるaAPXであり、aAPX:aAMはaAMにCMとして積載されるaAPXである)に用いるための、項目１〜26のいずれか１項に記載の多成分システムから得られるeTPC-t。
43．入力の被分析物eTPC-t又は被分析物eTPC-tのライブラリーから１又は２以上の被分析物eTPC-tを選択して、１又は２以上の被分析物抗原に結合する１又は２以上の被分析物eTPC-tを取得するための方法であって、
ａ．１又は２以上の被分析物eTPC-tを１又は２以上の被分析物抗原と組み合わせて、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspと被分析物抗原との間での接触を生じさせること、並びに下記：
ｂ．形成される場合、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
ｃ．誘導される場合、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eTPC-tによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
ｄ．誘導される場合、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定すること、及び
ｅ．工程ｂ及び/又は工程ｃに基いて１又は２以上のeTPC-tを選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
(ここで、被分析物抗原は、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原は、少なくとも下記：可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)に積載されるaAPXであり、aAPX:aAMはaAMにCMとして積載されるaAPXである)の少なくとも１つを含んでなる方法。
44．選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、項目43に記載の方法。
45．選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、項目44に記載の方法。
【０１７８】
46．選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、項目44に記載の方法。
47．選別された及び/又は拡大された細胞の成分Ｂ'及び/又は成分Ｄ'を配列決定する工程を更に含んでなる、項目44〜46のいずれか１項に記載の方法。
48．配列決定工程が
ａ．ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
ｂ．成分Ｂ'及び/又は成分Ｄ'のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
ｃ．成分Ｂ'及び/又は成分Ｄ'のDNA及び/又はRNA転写物をPCR及び/又はRT-PCRにより増幅すること
に後続する、項目47に記載の方法。
49．配列決定工程が細胞に対して破壊的であり、得られる配列決定情報が項目43工程ｅにおいて選択される被分析物eTPC-tを製造するために用いられる、項目47又は48に記載の方法。
50．選択された被分析物eTPC-tが親和性分析に付されて、TCRspの被分析物抗原に対する親和性が決定され、下記
ａ．選択された被分析物eTPC-tを、或る範囲の濃度の被分析物抗原で標識すること、
ｂ．工程ａの染色された被分析物eTPC-tについてFACS分析を行うこと、
ｃ．被分析物抗原の濃度範囲にわたって被分析物eTPC-t蛍光標識の強度を決定すること
ｄ．TCRspの被分析物抗原に対する親和性を算出すること、
を更に含んでなる、項目43、44、45、46、49のいずれか１項に記載の方法。
【０１７９】
51．工程ｂ〜ｃが標識された参照物を用いて行われ、工程ｄが被分析物抗原の蛍光強度 対 参照物の蛍光強度の比を用いて親和性を算出することである、項目50に記載の方法。
52．標識された参照物が
ａ．被分析物TCR鎖の一方又は両方に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
ｂ．１又は２以上のCD3タンパク質に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
ｃ．標識された参照物単一TCR鎖又は標識された参照物TCR鎖対を提示する細胞又は粒子
から選択される、項目51に記載の方法。
53．選択された被分析物eTPC-tがシグナル応答の特徴決定に付され、下記
ａ．天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
ｂ．eTPC-tが成分Ｆを含有する場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる項目43、44、45、46、49のいずれか１項に記載の方法。
54．誘導されたシグナル応答が、非誘導シグナル応答状態と比較した下記：
ａ．分泌された生体分子
ｂ．分泌された化学物質
ｃ．細胞内生体分子
ｄ．細胞内化学物質
ｅ．表面発現された生体分子
ｆ．eTPC-tのAPCに対する細胞毒性作用
ｇ．eTPC-tのAPCに対するパラクリン作用(シグナル応答がAPCにおいて誘導され、ａ〜ｅのいずれかの増減を検出することにより決定される)
ｈ．eTPC-tの増幅
ｉ．eTPC-tとAPCとの間での免疫学的シナプス形成
の１又は２以上の増減を検出することにより決定される、項目53に記載の方法。
55．入力の被分析物抗原又は被分析物抗原のライブラリーから１又は２以上の被分析物抗原を選択して、安定な複合体を形成し、及び/又は被分析物TCRspを発現する１又は２以上の被分析物eTPC-tの発現した被分析物抗原に対するシグナル応答を誘導する１又は２以上の被分析物抗原及び/又は被分析物抗原の配列を取得する方法であって、
ａ．１又は２以上の被分析物抗原を１又は２以上の被分析物eTPC-tと組み合わせて、被分析物抗原と１又は２以上の被分析物eTPC-tの被分析物TCRspとの間の接触を生じさせること、及び
ｂ．形成する場合、１又は２以上の被分析物抗原と１又は２以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
ｃ．誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される１又は２以上の被分析物eTPC-tにおけるシグナル応答を測定すること、及び/又は
ｄ．誘導される場合、１又は２以上の被分析物TCRspと１又は２以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定すること、及び
ｅ．工程ｂ、ｃ及び/又はｄから１又は２以上の被分析物抗原を選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
(ここで、被分析物抗原は、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原は、少なくとも下記：可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)に積載されるaAPXであり、aAPX:aAMはaAMにCMとして積載されるaAPXである)を含んでなる方法。
【０１８０】
56．選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、項目55に記載の方法。
57．選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、項目56に記載の方法。
58．選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、項目56に記載の方法。
59．選別された及び/又は拡大された細胞の被分析物抗原を配列決定する工程を更に含んでなる、項目55〜58のいずれか１項に記載の方法。
60．配列決定工程が下記
ａ．ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
ｂ．被分析物抗原のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
ｃ．被分析物抗原のDNA及び/又はRNA転写物をPCR及び/又はRT-PCRにより増幅すること、
に後続する、項目59に記載の方法。
【０１８１】
61．選択された被分析物抗原が被分析物eTPC-tのシグナル応答及び/又は被分析物APCのシグナル応答に基いて選択され、下記
ａ．天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
ｂ．被分析物eTPC-tが成分Ｆを含有する場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる項目55、56、57、58のいずれか１項に記載の方法。
62．誘導されたシグナル応答が非誘導シグナル応答状態と比較した下記：
ａ．分泌された生体分子
ｂ．分泌された化学物質
ｃ．細胞内生体分子
ｄ．細胞内化学物質
ｅ．表面発現された生体分子
ｆ．被分析物eTPC-tの被分析物APCに対する細胞毒性作用
ｇ．シグナル応答が被分析物APCにおいて誘導され、ａ〜ｅのいずれかの増減を検出することにより決定されるような、被分析物eTPC-tの被分析物APCに対するパラクリン作用
ｈ．被分析物eTPC-tの増幅
ｉ．被分析物eTPC-tと被分析物APCとの間での免疫学的シナプス
の１又は２以上の増減を検出することにより決定される、項目61に記載の方法。
63．積荷が、項目55〜62に規定する方法により選択され得られた被分析物APCのaAPXに積載された代謝物及び/又はペプチドであり、下記：
ａ．aAPX:aAM若しくはaAPX:CM又は積荷aM若しくは積荷CMを単離すること、及び
ｂ．積載された積荷を同定すること
を含んでなる、aAM積荷又はCM積荷を選択し同定する方法。
64．工程ｂが単離されたaAPX:aAM又はaAPX:CMを下記：
ａ．質量分析
ｂ．ペプチド配列決定分析
の１以上に付することを含んでなる、項目63に記載の方法。
65．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目43〜54に規定する方法により選択されたTCR鎖対配列又はTCR鎖対配列のライブラリー。
【０１８２】
66．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目55〜64に規定する方法により選択された抗原性分子及び/又は前記抗原性分子をコードするORF、又はそのライブラリー。
67．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目55〜62に規定する方法により選択された抗原性分子を積荷として積載した抗原提示複合体及び/又は前記複合体をコードするORF、又はそのライブラリー。
68．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目55〜62に規定する方法により選択されたAPC、又はAPCのライブラリー。
69．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目43〜54に規定する方法により選択されたeTPC-t、又はeTPC-tのライブラリー。
70．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目１〜-26のいずれかに記載のシステム。
71．下記：
ａ．診断
ｂ．医学
ｃ．美容
ｄ．研究開発
の少なくとも１つに用いるための、項目55〜62に規定する方法により選択された被分析物抗原を提示するNCBP又は被分析物抗原を提示するNCBPのライブラリー。
【図１】
2019535313.tif 000012
【図２】
2019535313.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019535313.tif 000020
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月31日(2019.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の成分が、遺伝子操作されたTCR-提示細胞(eTPC)(成分Ａと呼ぶ)であり、成分Ａが被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも１つのファミリーの内因性表面発現を欠き、TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、CD3タンパク質を発現し、各々が少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFの組込みのためのゲノム受容部位である２つの異なる更なる単一成分(Ｂ及びＤと呼ぶ)を含み、ゲノム受容部位Ｂ及びＤが各々、
ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物
ｂ．部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物
から選択され、
第２の成分が被分析物TCR鎖をコードするORFの送達のための遺伝子ドナーベクター(成分Ｃと呼ぶ)であり、成分Ｃは成分Ｂとマッチし、成分Ｃが
ｃ．少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
ｄ．被分析物TCR鎖対をコードする２つのORF
を送達するように設計されており、
ｃ及び/又はｄは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分Ａ上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、
多成分システム。
【請求項２】
aAPXのファミリーが下記：
ａ．HLAクラスI
ｂ．HLAクラスII
ｃ．非HLA抗原提示複合体
のいずれかであり得る、請求項１に記載の多成分システム。
【請求項３】
更なる成分(Ｅと呼ぶ)がＤにマッチする遺伝子ベクターであり、成分Ｅが、相補性の対をなす被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードするORFが成分Ｂに組み込まれているとき、成分Ａ上にTCRspとして発現されるように、１つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORFを送達するよう設計されており、成分Ｅが組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、請求項１又は２に記載の多成分システム。
【請求項４】
成分Ａが以下
ａ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーター並びに少なくとも１つのレポーターを含有する単一成分合成構築物
ｂ．少なくとも１つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも１つの合成プロモーター並びに少なくとも１つのレポーターを有して設計されている多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである成分(Ｆと呼ぶ)を更に含有し、ａ及び/又はｂの活性化が合成経路、天然型経路又はそれらの組合せから選択される少なくとも１つのシグナル変換経路に依存性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項５】
ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤを含み、ゲノム受容部位Ｂ及び/又はＤがリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物である、請求項１に記載の多成分システム。
【請求項６】
aAMが下記
ａ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ｂ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
ｃ．成分Ａプロテオームの変更に由来するペプチド
ｄ．成分Ａプロテオームの変更に由来するポリペプチド
ｅ．成分Ａメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項７】
成分ＡがCD4及び/又はCD8を発現する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項８】
成分Ａが追加のTCRコレセプターを発現する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項９】
成分ＡがCD28及び/又はCD45を発現する、請求項８に記載の多成分システム。
【請求項１０】
成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが、以下の遺伝子エレメント：
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同性アーム
ｃ．真核生物プロモーター
ｄ．真核生物条件付き調節エレメント
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．選択マーカー
ｇ．スプライスアクセプター部位
ｈ．スプライスドナー部位
ｉ．非タンパク質コーディング遺伝子
ｊ．インスレーター
ｋ．可動遺伝子エレメント
ｌ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｍ．内部リボソーム進入部位(IRES)
ｎ．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
ｏ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる、請求項２〜９のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１１】
成分Ｃ及び/又はＥを含み、成分Ｃ及び/又はＥが以下の遺伝子エレメント：
ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．相同性アーム
ｃ．真核生物プロモーター
ｄ．真核生物条件付き調節エレメント
ｅ．真核生物ターミネーター
ｆ．選択マーカー
ｇ．組込みの選択マーカー
ｈ．スプライスアクセプター部位
ｉ．スプライスドナー部位
ｊ．非タンパク質コーディング遺伝子
ｋ．インスレーター
ｌ．可動遺伝子エレメント
ｍ．メガヌクレアーゼ認識部位
ｎ．内部リボソーム進入部位(IRES)
ｏ．ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
ｐ．抗生物質耐性カセット
ｑ．細菌性複製起点
ｒ．酵母複製起点
ｓ．クローニング部位
ｔ．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１２】
成分Ｂ及び/又はＤを含み、成分Ｂ及び/又はＤが、単一ORFのRMCE組込みのためであり、下記：
ａ．真核生物プロモーター
ｂ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｃ．コザックコンセンサス配列
ｄ．選択マーカー
ｅ．真核生物ターミネーター
を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１３】
成分Ｃ及び/又はＥが存在し、単一ORFのRMCE組込みのためであり、以下の遺伝子エレメント：
ａ．一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
ｂ．コザックコンセンサス配列
ｃ．抗生物質耐性カセット
ｄ．細菌性複製起点
ｅ．１又は２以上のTCR鎖をコードする単一ORF及び/又は組込みの選択マーカーの導入のためのクローニング部位
を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１４】
成分Ｃ及び/又はＥを含み、成分Ｃ及び/又はＥは、成分Ｃ'及び/又はＥ'が得られるよう、少なくとも１つの被分析物TCR鎖をコードする少なくとも１つのORFと組み合わされている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１５】
組合せは、成分Ｃ'及び/又はＥ'のライブラリーが得られるよう複数回行われる、請求項１４に記載の多成分システム。
【請求項１６】
被分析物TCR鎖をコードする配列が、
ａ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
ｂ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
ｃ．合成TCR鎖ORF配列
に由来する、請求項１４又は１５に記載の多成分システム。
【請求項１７】
１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'は、成分Ｃ'及び/又はＥ'にコードされる２つの相補性被分析物TCR鎖を成分Ｂ及び/又はＤ中に組み込んで細胞(eTPC-tと呼ぶ)が得られるように、成分Ａと組み合わされており、ここで、成分Ｂ及び/又はＤは、成分Ａの表面にTCRspを発現するような成分Ｂ'及び/又はＤ'となる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１８】
１つの成分Ｃ'又はＥ'は、成分Ｃ'又はＥ'にコードされる１つの被分析物TCR鎖を成分Ｂ又はＤに組み込んで細胞(eTPC-xと呼ぶ)が得られるように、成分Ａと組み合わされており、ここで、成分Ｂ又はＤは、eTPC-xが単一TCR鎖を発現するような成分Ｂ'又はＤ'となる、
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項１９】
１つの成分Ｃ'又はＥ'は、成分Ｃ'又はＥ'にコードされる１つの被分析物TCR鎖であって、eTPC-xに発現されるTCR鎖に相補性である被分析物TCR鎖をeTPC-xの成分Ｂ又はＤに組み込んでeTPC-tが得られるように、eTPC-xと組み合わされており、ここで、成分Ｂ又はＤは、TCRspをeTPC-tの表面に発現するような成分Ｂ'又はＤ'となる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項２０】
ａ．成分Ａを少なくとも１つの成分Ｃ'及び/又はＥ'と組み合わせること、ここで、１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'は一対又は二対以上の相補性被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、及び下記
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．TCRsp及び/又は１又は２以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
ｄ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、請求項１７に規定するeTPC-tを製造するための方法。
【請求項２１】
ｂ、ｃ及びｄを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が工程ａで単一TCR鎖の相補対をコードする、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
方法が複数回行われ、各回の工程ａは別異のeTPC-tが得られるように別異の単一TCR鎖の相補対を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーが得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１又は２以上の成分Ｃ'及び/又はＥ'が、各eTPC-tが請求項２２の工程ａで用いるプールに由来する単一TCRspを発現するeTPC-tの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、請求項２３の工程ａにおいて２又は３以上の別異のTCR鎖の相補対を混合プールをコードする、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．成分Ａを、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'と組み合わせること、ここで、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上のＥ'は被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、並びに、
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる、請求項１８に規定されるeTPC-xを製造する方法。
【請求項２６】
ｂ及びｃを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つの成分Ｃ'又は１つの成分Ｅ'が工程ａにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
方法が複数回行われ、各回の工程ａは別異のeTPC-xが得られるように別異の被分析物TCR鎖を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-xのライブラリーが得られる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が、各eTPC-xが工程ａで用いるプールに由来する単一被分析物TCR鎖を発現するeTPC-xの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、工程ａにおける２又は３以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードする、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
ａ．eTPC-xと１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'とを組み合わせること、ここで、１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上のＥ'は、eTPC-xに組み込まれた被分析物TCR鎖に対して相補的である被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、並びに
ｂ．ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
ｃ．TCRsp及び/又は１又は２以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
ｄ．１又は２以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも１つを含んでなる請求項１８に規定するeTPC-tを製造する方法。
【請求項３１】
ｂ、ｃ及びｄを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１つの成分Ｃ'又は１つの成分Ｅ'が工程ａにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
方法が複数回行われ、各回の工程ａは、TCRspを発現する別異のeTPC-tが得られるように、別異の被分析物TCR鎖を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーが得られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
１若しくは２以上の成分Ｃ'又は１若しくは２以上の成分Ｅ'が、各eTPC-tが工程ａで用いるプールに由来する単一TCRspを発現するeTPC-tの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、工程ａにおける２又は３以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードする、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３５】
被分析物抗原が、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原が、少なくとも、可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化された反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)が積載されているaAPXであり、aAPX:aAMはCMとしてaAMが積載されているaAPXである、以下の特徴決定：
ａ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する特異性、及び/又は
ｂ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する親和性、及び/又は
ｃ．発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対するシグナル応答
に用いるための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の多成分システムから得られるeTPC-t。
【請求項３６】
少なくとも１つの被分析物eTPC-tを製造するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の多成分システム。
【請求項３７】
ａ．２つのゲノム受容部位(Ｂ及びＤと呼ぶ)を含み、その各々が少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFを含んでなってもよく
ｂ．CD3タンパク質を発現し
ｃ．Ｂ及びＤに含まれるもの以外のTCR鎖を発現せず
ここで、ゲノム受容部位Ｂ及びＤは各々
ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ｂ．部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
から選択される
ことを特徴とする被分析物eTPC。
【請求項３８】
ａ．２つのゲノム受容部位(Ｂ及びＤと呼ぶ)を含み、その各々が少なくとも１つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする２つのORFを含んでなってもよく
ｂ．CD3タンパク質を発現し
ｃ．Ｂ及びＤに含まれるもの以外のTCR鎖を発現せず
ここで、ゲノム受容部位Ｂ及びＤは各々
ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ｂ．部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
から選択される
ことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に規定される多成分システムから得ることができる被分析物eTPC。
【国際調査報告】
2019535313.tif 000064
2019535313.tif 000065
2019535313.tif 000066
2019535313.tif 000067
2019535313.tif 000068
2019535313.tif 000069