(57)【要約】本発明は、根または塊茎ジュースを処理するための方法を提供し、本方法は、a)根または塊茎の脂質を28g/kg乾燥重量未満のレベルまで除去するための、根または塊茎ジュースの前処理工程；b)根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−16℃の温度まで冷却して氷の結晶を形成させる工程；およびc)氷の結晶を根または塊茎ジュースから分離して、濃縮された根または塊茎ジュースを、第1の根または塊茎ジュース産物として得る工程を含んでなる。さらに、本発明は、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュース産物を得る方法、ならびに根または塊茎の遊離アミノ酸を含む産物、およびそれらの使用を提供する。独立プロダクト-バイ-プロセス請求項は、可溶性タンパク質中のカルボニル含量または乾物ベースでの遊離アミノ酸の量に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 根または塊茎の脂質を28g/kg乾燥重量未満のレベルまで除去するための、根または塊茎ジュースの前処理工程；
b) 根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−16℃の温度まで冷却して氷の結晶を形成させる工程；および
c) 氷の結晶を根または塊茎ジュースから分離して、第1の根または塊茎ジュース産物として、濃縮された根または塊茎ジュースを得る工程
を含んでなる、根または塊茎ジュースを処理するための方法。
【請求項２】
前処理が軟凝集(flocculation)、沈降、浮選、遠心分離または精密ろ過を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
氷の結晶が根または塊茎ジュースからろ過、水力学的洗浄、ピストン洗浄または遠心分離によって分離される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
濃縮された根または塊茎ジュースが、乾物に基づいて、少なくとも30重量％のタンパク質を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
続いて、濃縮された根または塊茎ジュースを透析ろ過して、乾物に基づいて、少なくとも50重量％、好ましくは少なくとも60重量％のタンパク質を含む、濃縮された根または塊茎ジュースを得る、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
濃縮された根または塊茎ジュースを凝固、吸着、ろ過、クロマトグラフィー、泡沫抽出、または低温に供して、
根または塊茎タンパク質分離物の少なくとも1つの画分と、
第2の根または塊茎ジュース産物として、タンパク質を枯渇させた、遊離アミノ酸を含む根または塊茎ジュースと
を得る、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
根または塊茎タンパク質分離物が本質的に未変性の根または塊茎タンパク質分離物である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースを酵素処理に供して、遊離アミノ酸アスパラギンをアスパラギン酸に変換し、かつ/または遊離アミノ酸グルタミンをグルタミン酸に、および/もしくは任意でγ-アミノ酪酸に変換する、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースを乾燥させて、遊離アミノ酸を含む根または塊茎アミノ酸粉末を得る工程を含み、該粉末が味成分および/または味覚増強剤である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
根または塊茎アミノ酸粉末がうま味またはこく味を与える、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
根または塊茎ジュースを＋5℃〜−10℃の温度まで冷却してアスパラギン結晶を形成させ、続いてアスパラギン結晶を分離する工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
トリグリコアルカロイドの含量を800mg/kg乾物未満、好ましくは320mg/kg乾物未満に低下させる工程をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
カルボニル含量が4.7mmol/kg可溶性タンパク質未満である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項１４】
少なくとも25重量％の乾物含量を有し、
乾物のうちのパーセントとして少なくとも16重量％の遊離アミノ酸を含み、
その遊離アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸およびγ-アミノ酪酸を合わせて、遊離アミノ酸の重量％として少なくとも20重量％、好ましくは少なくとも25重量％、ならびに、アスパラギンおよびアスパラギン酸を合わせて、少なくとも25重量％、好ましくは少なくとも30重量％含み、
脱塩水中の4.5重量％溶液の420、520および620nmでの吸光度の合計として測定された、濃縮された根または塊茎ジュースのトータルカラーが、0.7未満、好ましくは0.5未満であり、かつ
カルボニル含量が4.7mmol/kg可溶性タンパク質未満である、
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項１５】
0.1重量％濃度の前記濃縮された根または塊茎ジュースあるいは根または塊茎粉末とOPA試薬との反応およびその後の340nmでの分析によって測定された遊離アミン含量が、1400〜2400mmol/kg乾物である、請求項13または14に記載の根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項１６】
SO4833-1/2013に従う生菌数試験法で測定された微生物数が、104CFU/グラム未満、好ましくは103CFU/グラム未満である、請求項13〜15のいずれか一項に記載の根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項１７】
フェノール酸の含量が500mg/kg乾燥重量未満である、請求項13〜16のいずれか一項に記載の根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項１８】
トリグリコアルカロイドの濃度が800mg/kg乾燥重量未満、好ましくは320mg/kg未満である、請求項13〜17のいずれか一項に記載の根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項１９】
少なくとも18重量％のアスパラギンおよび/または少なくとも40重量％のアスパラギン酸および/または少なくとも5重量％のγアミノ酪酸を含む、請求項13〜18のいずれか一項に記載の根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項２０】
乾物含量が90重量％を超える、請求項13〜19のいずれか一項に記載の根または塊茎アミノ酸粉末。
【請求項２１】
食品用途における味成分および/または味覚増強剤としての、請求項13〜20のいずれか一項に記載の根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末の使用。
【請求項２２】
味をよくする野菜エキスとしての、請求項21に記載の使用。
【請求項２３】
調味製品としての、自然調味料としての、または食品成分としての、請求項21に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、根または塊茎のジュース、特にジャガイモジュースを処理する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
根または塊茎ジュースは、根または塊茎から得られる水性の液体であり、これは、例えば、ジャガイモ塊茎からのデンプン分離後の副産物として、または例えばフライドポテトを作る際に消費ジャガイモをカットして加工することから生じる側流から得ることができる。根または塊茎ジュースには、様々な機能性ペプチドならびに他の成分が豊富に存在する。また、それは、根または塊茎、とりわけジャガイモが処理される規模のために、大量に入手可能である。これにより、根または塊茎ジュースは様々な成分の潜在的に興味を起こさせる供給源になる。
【０００３】
しかしながら、根または塊茎ジュースの欠点は、それが本質的に不安定であることである。生の根または塊茎ジュースは、天然の酵素を大量に含み、その多くは興味深い特性を有する。ところが、これらの酵素のいくつかはタンパク質分解性であり、その結果、これらは根または塊茎ジュース中の他のタンパク質およびペプチドを分解する。そのため、生の根または塊茎ジュースは、1時間以内にその本来の性質を失ってしまう。これらの酵素の、例えば熱または酸処理による、不活性化は選択肢ではない。なぜならば、それが酵素を変性させ、かつ興味深い機能性成分および未変性状態に関連する望ましい性質を破壊するからである。
【０００４】
さらに、根または塊茎ジュースは容易に酸化する傾向がある。生の根または塊茎ジュースは、多くのフェノール酸、多価不飽和脂肪酸、ならびにリポ酸およびスルホアミノ酸を含有し、これらは、空気中の酸素および/または酵素の影響下で、いろいろな毒性種および/または着色種へと劣化する。酸化はまた、フェノール化合物のキノンへの変換をもたらし、キノンはすぐにまとまって暗色のポリマー残留物になる。酸化プロセス反応の間に、タンパク質は部分的に架橋することがあり、これはタンパク質の溶解性および未変性状態を劇的に減少させる。
【０００５】
また、根または塊茎ジュースの味は、そのようなプロセスによって悪影響を受ける。
【０００６】
これらの劣化・分解プロセスにより、高価な精製技術でも適用されない限り、食品グレードの諸成分の分離のために、軽度に劣化した根または塊茎ジュースでさえ使用することができない。
【０００７】
さらに、根または塊茎ジュースは、メイラード(Maillard)生成物の形成を起こしやすい。メイラード生成物は、遊離アミンおよび還元糖から、物質の暗色化と揮発性フレーバーの発生をもたらす一連の複雑な連結反応において高い温度で形成される。ある種の食品ではこの反応は非常に望ましいが、制御されないメイラード反応は、「焦げた」匂いがする不快な暗色の生成物をもたらす。乾燥プロセスは、特に、メイラード生成物を生じる傾向がある。
【０００８】
上述の加水分解反応および酸化反応は、根または塊茎ジュース中の内因性酵素、特にパタチン、ポリフェノールオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼの存在によって悪化する。さらに、タンパク質分解は、タンパク質を苦みのあるペプチドへと分解する。また、根または塊茎ジュースは、感染した塊茎に由来する望ましくない微生物を高レベルで含むことがある。これらの生物は時間と機会が与えられれば、ジュースを腐らせるであろう。5'-ヌクレオチドのような望ましい化合物は、脱リン酸化されてヌクレオシドになる。
【０００９】
不安定な化合物を含む水性分散液または溶液から水を除去するための公知の技術は、凍結濃縮である。結晶性物質、特に硝酸カリウムまたはリン酸カリウムを分離するためのジャガイモ濃厚ジュースの凍結濃縮がWO 01/28958(特許文献1)に記載されているが、そこに記載された手順は、ジャガイモタンパク質の変性につながるため、新鮮なジャガイモジュースを使用する場合に許容できる結果をもたらさず、本発明との関連においては望ましくない(ジャガイモ濃厚ジュースは熱凝固ジャガイモジュースであり、そこから凝固(変性)したタンパク質が除去されており、続いて濃縮される)。
【００１０】
さらに、根または塊茎ジュースは、一般に、氷の形成および成長を妨害する様々な化合物を含んでいる。このような化合物の存在はまた、フィルターが容易に目詰まりするので、ろ過を妨げる傾向がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 01/28958
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、根または塊茎ジュースを処理するための方法であって、以下の工程：
a) 根または塊茎の脂質を28g/kg乾燥重量未満のレベルまで除去するための、根または塊茎ジュースの前処理工程；
b) 根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−16℃の温度まで冷却して氷の結晶を形成させる工程；および
c) 氷の結晶を根または塊茎ジュースから分離して、第1の根または塊茎ジュース産物として、濃縮された根または塊茎ジュースを得る工程
を含んでなる方法を提供する。さらに、本発明は、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュース産物を得る方法、ならびに根または塊茎の遊離アミノ酸を含む産物、およびそれらの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】可溶性固形物の含量に対するジャガイモジュースの凝固点の依存性。
【図２】ベルトフィルターの出口の写真。前処理されていないジャガイモジュースを凍結濃縮処理すると、ろ過布の目詰まりが生じる。
【図３】ベルトフィルターの出口の写真。脂質除去の前処理の後で凍結濃縮から得られた、ろ過および洗浄した氷ケーク。
【図４】Amano SD-C100S (Amano社, 日本)によるglnからgluへの変換。
【図５】PreventAse (DSM社)によるglnからgluへの変換。
【図６】gluからGABAへの変換。
【図７】HC PIおよびTPIの乳化能力(EC)と比較した、凍結濃縮した物質のEC。全体として、凍結濃縮した物質は、エマルションを全く安定化できなかったHC PIよりも高いECを有し、また、TPIよりも高いECを有していた。
【図８】pH3で総タンパク質分離物と比較した、凍結濃縮ジャガイモおよびタンパク質濃縮物の乳化能力(EC)。
【図９】タンパク質濃度7重量％においてpH7.0およびpH3でTPI 1と比較した、凍結濃縮TPC、TPoC、dTPCのゲル強度。
【図１０】タンパク質サンプルTP1およびTP2と比較した、凍結濃縮タンパク質サンプルの溶解性。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
本発明は、根または塊茎ジュースを処理するための方法であって、以下の工程：
a) 根または塊茎の脂質を28g/kg乾燥重量未満のレベルまで除去するための、根または塊茎ジュースの前処理工程；
b) 根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−16℃の温度まで冷却して氷の結晶を形成させる工程；および
c) 氷の結晶を根または塊茎ジュースから分離して、第1の根または塊茎ジュース産物として、濃縮された根または塊茎ジュースを得る工程
を含んでなる方法を提供する。
【００１５】
根または塊茎ジュースは、本発明との関連において、根または塊茎からのジュースであり、以下では「ジュース」とも呼ぶことがある。根および塊茎には、以下の種が含まれる：ジャガイモ(ソラヌム・ツベロスム(Solanum tuberosum)またはアイリッシュポテト、世界中の温帯地域で栽培される季節性作物)；サツマイモ(イポメア・バタタス(Ipomoea batatas)、主にヒトの食物に使用される、熱帯および亜熱帯地域で栽培される季節性作物)；キャッサバ(マニオク、マンジョカまたはユカとも呼ばれるManihot esculenta、異名M. utilissimaを含み、ユカ・ダルセ(yuca dulce)とも呼ばれるM. palmata、異名M. dulcisも含む。これらは熱帯および亜熱帯地域で栽培される半永続型作物である)；ヤムイモ(Dioscorea属の種、デンプン質の主要食料として熱帯地方で広く栽培される)；ヤウティア(主にカリブ海地域で栽培される数種の植物を含むグループ、食用塊茎をもつものと食用茎をもつものがある。マランガ、ニューココヤム、オクモ(ocumo)とも呼ばれるXanthosoma属の種を含み、タンニア(tannia)(アメリカサトイモ(X. sagittifolium))も含む)；タロイモ(コロカシア・エスクレンタ(Colocasia esculenta)、食用デンプン質の球茎または地下茎のために栽培されるサトイモ科のグループ、食用に熱帯地方全体で栽培される。ダシーン(dasheen)、エドエ(eddoe)、タロまたはオールドココヤムとも呼ばれる)；アラカチャ(アラカコア・キサントリザ(Arracacoa xanthorrhiza))；クズウコン(マランタ・アルンディナセア(Maranta arundinacea))；チュファ(ショクヨウガヤツリ(Cyperus esculentus))；サゴヤシ(Metroxylon属の種)；オカおよびウルーコ(オキザリス・ツベロサ(Oxalis tuberosa)およびウルクス・ツベロサス(Ullucus tuberosus))；ヤムビーンおよびヒカマ(パキリズス・エロスス(Pachyrxhizus erosus)およびP.アングラツス(P. angulatus))；マシュア(トロパエオルム・ツベロスム(Tropaeolum tuberosum))；エルサレム・アーティチョーク(キクイモ、ヘリアンサス・ツベロサス(Helianthus tuberosus))。
【００１６】
好ましくは、根または塊茎はジャガイモ、サツマイモ、キャッサバまたはヤムイモであり、より好ましくは、根または塊茎はジャガイモ(Solanum tuberosum)である。
【００１７】
根または塊茎ジュースは、本発明との関連において、根または塊茎から得られる水性の液体であり、例えば、加圧、粉砕およびろ過、パルス電界処理によって、チップおよびフライのような根または塊茎の加工品を生産するためのウォータージェットからの流出液として、または当技術分野で知られている他の手段によって得られる。沈降性の不溶性固形物は根または塊茎ジュース中に本質的に存在しないが、得られるジュースは通常、浮遊固形物を含むか、または経時劣化によって固形物を自然に形成する可溶性の前駆物質を含み、これらの物質は、重力によって沈降しないかまたはほとんど沈降せず、ジュースの濁りの原因となる。総浮遊固形物(TSS)は、根または塊茎ジュース中に分散した形態で存在する全ての固形物を示す。この固形物は、十分に小さく、底に沈むことによって溶液から相分離することはないが、分子的に溶解もされない。要するに、TSSは、根または塊茎ジュース中に溶解しないで分散している固形物の全量である。
【００１８】
本発明との関連における根または塊茎ジュースは、生の根または塊茎ジュース、すなわち、ジュース中の諸成分がそれらの天然状態で存在する根また塊茎ジュースである。これは、タンパク質が未変性の状態にあるかどうかを分析することによって判定することができ、(再)溶解性試験または動的熱量測定スキャンによって試験され得る(Walstra, P. (2003). Proteins. In Physical Chemistry of Foods (pp. 221-267). New York: Marcel Dekker社)。さらに、本発明との関連における根または塊茎ジュースは、本質的に色を持たないことが好ましい。これは、根または塊茎ジュースのトータルカラーを分析することによって示される。
【００１９】
トータルカラーは、固形分4.5重量％の溶液における420、520および620nmでの吸光度の合計として測定される。様々な固形分を有するジュースでは、その溶液を、例えば、4.5重量％に希釈して、トータルカラーを直接測定することができる；または、例えば、ジュースの固形分が4.5重量％未満である場合には、固形分に関して調整することによってトータルカラーを数学的に得ることができる。
【００２０】
本発明との関連におけるジュースは、得られたままで使用することができる。しかし、本発明との関連における根または塊茎ジュースは、ジュース成分の生の天然状態に影響を与えないか、ほとんど影響を与えない特定の処理を受けていてもよい。
【００２１】
したがって、根または塊茎ジュースは、任意で、本方法に先立って希釈または濃縮され得る。希釈は、希釈する根または塊茎ジュースよりも少ないタンパク質および/または塩を含むタンパク質非変性溶媒(好ましくは水)を添加することによって、達成することができる。最も好ましくは、タンパク質非変性溶媒はpH4〜8であり得る普通の水である。このpHにするために適した酸および/または塩は、他の箇所に記載されている。
【００２２】
根または塊茎ジュースの濃縮は、従来の方法によって達成することができる。適切な方法には、蒸発、膜濃縮(「逆浸透」とも呼ばれる)、ならびに膜蒸留(MD)およびパーベーパレーション(PER)などの代替的な膜ベースの分離が含まれる。
【００２３】
蒸発は、一般に、気液相分離を使用し、比較的安価である。当業者は、蒸発を用いてジュースの濃縮を生じさせる方法を十分に認識している。
【００２４】
蒸発を用いて、約100重量％までの、任意の乾物(dry matter)含量を達成することが可能であり、例えば50重量％までの、高い乾物含量を有する溶液も蒸発により得ることができる。しかしながら、蒸発はタンパク質を変性させるリスクがあり、通常は比較的時間がかかる。タンパク質の未変性構造を保持するために、蒸発は、例えばほぼ室温の、比較的低い温度で行う必要があるが、その場合にも、蒸発が生じる遅い速度は、より低品質の産物をもたらす。
【００２５】
したがって、蒸発は、好ましくは、熱凝固のような、タンパク質の変性および分離をもたらす技術と併用されるが、未変性タンパク質の分離に用いられる技術と併用することもできる(下記参照)。
【００２６】
逆浸透(RO)は半透膜の分子篩機構に基づき、半透膜は、固形物および溶解化合物、ならびに濃縮ジュースを保持する(保持液)が、水は通過させる(透過液)。逆浸透を使用すると、原料ジュースの浸透圧のため、約25重量％という乾物含量の上限が存在する。
【００２７】
逆浸透は2種類の方法で行うことができ、連続モードでは、濃度を段階的に増加させる複数の膜分離ユニットが必要とされる。バッチモードでは、所望の濃度に達するまで、保持液がROユニットに戻されて再循環される。当業者は、ある特定のジュースが所望の一定濃度に達するように逆浸透ユニットをどのように構成したらいいかを十分に認識している。
【００２８】
また、ジュースの分子成分を生の状態に(すなわち、天然の機能性を保持したまま)残しておく他の処理を受けた根または塊茎ジュースの、本発明での使用が意図される。そのような処理の例は、デンプンの除去、pHの調節、塩の添加または除去、消泡、根または塊茎繊維の除去、ろ過、あるいは拡張床クロマトグラフィーである。
【００２９】
根または塊茎ジュースのpHの調整は、当技術分野で公知の任意の手段によって達成することができ、例えば、HCl、H2SO4、H3PO4などの強酸の添加により、酢酸、クエン酸、ギ酸、乳酸、グルコン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、コハク酸、アジピン酸、酒石酸、重亜硫酸ナトリウム(気体SO2またはNaHSO3により形成される)などの弱酸の添加により、NaOH、KOHなどの強塩基の添加により、またはアンモニア、ソーダ、カリ、もしくは上記の酸の適切な共役塩基などの弱塩基の添加により行われる。さらに、例えば緩衝化された根または塊茎ジュースを得るために、これらの酸および塩基の組み合わせを添加してもよい。
【００３０】
本発明との関連において、HClが好ましい強酸であり、アジピン酸が好ましい弱酸であり(それがグルタミン酸からGABAへの変換を停止させるという理由のため)、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムが好ましい強塩基である。
【００３１】
別の処理は、根または塊茎ジュースへの塩の添加、該ジュースからの塩の除去である。塩は、生の根または塊茎ジュースを安定化させるため、化学的および酵素的反応を制御するため、導電率を調整するため、または様々なイオン種の溶解性を調整するために、添加され得る。適切な塩には、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオンと、塩化物、リン酸、亜硫酸および酢酸などのアニオンからの塩が含まれる。好ましくは、添加される塩は、塩化ナトリウムまたはカリウム、リン酸カルシウム、亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、および酢酸ナトリウムである。
【００３２】
塩はまた、透析ろ過、電気透析または容量性脱イオンなどの方法によって除去することもできる。また、他の化合物、例えばタンパク質分解酵素に対する阻害剤化合物を添加してもよい。そのような化合物は当技術分野で周知である。
【００３３】
別の処理は、例えば、デンプン粒を工業的に得るために一般的であるような、デンプンの除去である。デンプンの除去方法は周知である。本発明との関連における根または塊茎ジュースは、好ましくは、デンプン分離からの根または塊茎ジュース副産物である。すなわち、本発明との関連における根または塊茎ジュースは、好ましくは多くても1.0重量％のデンプン、より好ましくは0.5重量％、最も好ましくは0.01重量％のデンプンを含む。最も好ましくは、本発明との関連において、根または塊茎ジュースは、デンプンの除去と、ろ過、逆浸透、軟凝集(flocculation)、沈降、定在波超音波分離または遠心分離のうち1つまたは複数の処理を受けている。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法は、プロセスラインあたり少なくとも0.01m3/h、好ましくは少なくとも0.1m3/h、より好ましくは少なくとも1m3/h、さらにより好ましくは少なくとも10m3/hの根または塊茎ジュース量などの、工業規模で根または塊茎ジュースを処理することに関する。
【００３５】
許容される経済的な方法で生の根または塊茎ジュースを凍結濃縮できるようにするためには、凍結濃縮に先立って根または塊茎ジュースから根または塊茎脂質を除去することが不可欠であると判明した。根または塊茎の脂質は、乾燥重量1kgあたり28g未満、好ましくは25g未満、より好ましくは23g未満、より好ましくは21g未満、より好ましくは19g未満、最も好ましくは乾燥重量1kgあたり16g未満のレベルにまで除去すべきである。好ましくは、除去される根または塊茎の脂質は不飽和脂質である。根または塊茎ジュース中の根または塊茎脂質の量は、Matyashと共同研究者らの方法によって測定することができる(Matyash V., Liebisch G., Kurzchalia T.V., Shevchenko A., & Schwudke D. (2008), J Lipid Res. 49(5):1137-46 “Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics”)。
【００３６】
根または塊茎の脂質を除去するための前処理は、該ジュースの「生の」特性、すなわち根または塊茎ジュース中のタンパク質の天然状態、に影響を与えないか、ほとんど影響を与えないことが必須である。当業者は、タンパク質の天然状態に影響を与えずに根または塊茎の脂質除去を達成するための様々な方法を認識している。こうした方法には、例えば、軟凝集、沈降、浮選、遠心分離または精密ろ過が含まれる。
【００３７】
軟凝集は、Fe電極を用いた電気的軟凝集によって、または天然もしくは合成ポリイオン化合物、好ましくは天然および/または合成のポリアニオン化合物とポリカチオン化合物の組み合わせの添加によって、達成することができる。より好ましくは、軟凝集は、出願PCT/NL2015/050605に記載されるように、根または塊茎ジュースを凝固剤および軟凝集剤と接触させてフロック(floc)物質を形成させることによって達成され、上記のPCT出願においては、
a) 凝固剤がカチオン性凝固剤を含み、軟凝集剤が4〜6mPa・sの比粘度および45〜75％の電荷密度を有するアニオン性ポリアクリルアミドを含む；または
b) 凝固剤が式SiO32-の高分子シリケートを含み、軟凝集剤が3〜5mPa・sの比粘度および多くても30％の電荷密度を有するカチオン性ポリアクリルアミドを含む；または
c) 凝固剤がカチオン性凝固剤を含み、軟凝集剤がカラギーナンを含み；
続いて、清澄化された根または塊茎ジュースおよびフロック物質を得るために、フロック物質が該ジュースから分離される。
【００３８】
軟凝集の好ましい方法は、Kemira社のSuperfloc A150などのポリアクリルアミドを、ポリタンニン(例えば、Servyeco社のBio20)およびk-カラギーナン(例えば、FMC biopolymer社のGelcarin GP812)と組み合わせて、使用することである。
【００３９】
軟凝集の別の好ましい方法は、Walocel CRT 60.000 PA 07 (Dow Chemicals社)などのカルボキシメチルセルロースを、BioSO3 (Servyeco社)などのポリタンニンおよびGelcarin GP812などのk-カラギーナンと組み合わせて使用する。
【００４０】
軟凝集は、22℃以下、より好ましくは18℃以下、例えば15〜18℃の温度で実施することが好ましい。22℃以下の温度では、根または塊茎ジュースの脂質分解速度が実質的に低下し、これは、分離された産物がより少ない脂質酸化生成物を含むことを確実にする。
【００４１】
18℃を超える温度では、根または塊茎ジュースに由来するフロックの一部が「浮遊」する傾向を示し、分離を妨げる。18℃以下の温度では、この傾向が見られない。
【００４２】
脂質の存在は、一般的に、どのような実施可能な程度にも凍結濃縮が起こらないようにするので、28g/kg乾燥重量未満の量まで脂質を除去することが不可欠である。しかし、本発明との関連における脂質の除去は不完全であってよい。それでも、高品質の産物のためには、少なくとも不飽和脂質を可能な限り除去することが好ましい。不飽和脂質は一般に飽和脂質よりも高い劣化速度を有するため、不飽和脂質の除去は、飽和脂質の除去よりも分離産物の純度に大きな影響を及ぼす。しかしながら、一般的に、脂質を28g/kg乾燥重量未満の量まで除去することは、高品質の産物の分離を可能にするのに十分である。
【００４３】
沈降は、重力および遠心力、ならびに静的超音波を用いた沈降促進によって達成することができる。
【００４４】
浮選は、マイクロバブルの添加によって、あるいは根または塊茎ジュースの熟成(ageing)によって達成することができる。マイクロバブルを加えることによって浮選を達成することが好ましい。
【００４５】
遠心分離は、例えば、ディスクスタック遠心分離機またはボウル遠心分離機によって達成することができる。遠心分離をディスクスタック遠心分離機で達成することが好ましい。
【００４６】
ろ過は、例えば、マイクロ、ウルトラまたはナノろ過によって、あるいは予めコーティングされた回転式真空フィルターによって達成することができる。予めコーティングされた回転式真空フィルターでろ過を達成することが好ましい。
【００４７】
根または塊茎の脂質除去を達成する方法の中では、軟凝集、沈降または遠心分離が好ましく、軟凝集および沈降が最も好ましい。
【００４８】
本発明の方法は、根または塊茎ジュースを冷却して氷の結晶を形成させる前に、総浮遊固形物(TSS)を除去する処理も含むことが好ましい。TSSの量は、4.5重量％の乾物含量を有するジュースの吸光度を620nmで測定することによって決定され得る。
【００４９】
TSSは好ましくは、620nmでの吸光度として表して3.2未満のレベル、好ましくは2.7未満、より好ましくは2.4未満、さらに好ましくは2.1未満、さらに好ましくは1.7未満、さらに好ましくは0.6未満、最も好ましくは0.2未満のレベルにまで除去すべきである。
【００５０】
TSSは、大容量の工業用ディスクスタック分離機、高速遠心分離または精密ろ過によってこれらのレベルにまで除去することができる。
【００５１】
好ましくは、TSSは高速遠心分離または精密ろ過によって除去され得る。
【００５２】
根または塊茎の脂質とTSSの両方を除去する前処理が非常に好ましい。そのような方法には、例えば、軟凝集、沈降、浮選、遠心分離または精密ろ過が含まれる。これに関連して特に好ましい1つの前処理は、軟凝集である。
【００５３】
上記の1つまたは複数の前処理によって根または塊茎ジュースから根または塊茎の脂質と任意でTSSを除去した後、根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−14℃の温度まで冷却して氷の結晶を形成させる。好ましくは、根または塊茎ジュースを−1.5℃〜−12℃の温度、より好ましくは−4℃〜−9℃の温度、さらにより好ましくは−6℃〜−9℃の温度まで冷却する。
【００５４】
根または塊茎ジュースの凝固点は、可溶性固形物の濃度および種類に依存する。可溶性固形物の様々な濃度における根または塊茎ジュースの凝固点値を、ジャガイモジュースにより例示される図1に示す。凍結濃縮を用いて達成され得る最大乾物含量(これは可溶性固形物の量である)は、タンパク質含量が比較的低いジュースの場合、60重量％である。本発明の場合の出発ジュースのような、比較的高いタンパク質含量を有するジュースでは、少なくとも30重量％、好ましくは少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％の乾物含量に達しうる。
【００５５】
任意の態様では、根または塊茎ジュースは、結晶性成分を氷結晶とのその共晶点で共結晶化するために、共晶点まで冷却される。共晶点は、塩-水混合物の相図(phase diagram)における特徴的な点である。共晶点では、氷と塩(または他の結晶化可能な物質)と特定(一定)濃度の溶液との間に平衡が存在する。この特定濃度は共晶濃度と呼ばれ、この平衡が見いだされる温度は共晶温度である。結晶性化合物の共晶点は、根または塊茎ジュース中の結晶化性固形物の濃度に依存する。
【００５６】
特定の結晶性化合物の共晶点は、氷と他の成分の両方の同時結晶化を観測することによって決定され得る。直接観測ができない場合には、さらなる冷却のためにシステムに投入されるエネルギーの量にかかわらず、システムの最終温度に変化がない時に共晶点が検出され得る。
【００５７】
氷結晶と共結晶化することができる1つの化合物はアスパラギンである。これに関して、根または塊茎ジュースは、15〜30g/Lのアスパラギンの濃度で、＋5℃〜−10℃、好ましくは−2℃〜−8℃、より好ましくは−3℃〜−7℃の温度まで冷却する必要がある。最も好ましくは、約30g/Lのアスパラギンを含有する根または塊茎ジュースの共晶点は、約−4℃である。
【００５８】
この方法により得られるアスパラギン産物は、一般に、少なくとも90重量％、好ましくは少なくとも95重量％、より好ましくは少なくとも98重量％の乾物含量を有する粉末である。該乾物は少なくとも53重量％、好ましくは少なくとも86重量％の遊離アミノ酸類を含む。該アミノ酸は、遊離アミノ酸の重量％として、少なくとも90重量％、好ましくは少なくとも95重量％のアスパラギンを含む。
【００５９】
氷および任意で他の結晶を得るために根または塊茎ジュースを冷却することは、当技術分野で公知の任意の手段により達成され得る。好ましくは、冷却は、懸濁結晶化、層(フィルム)結晶化またはブロック結晶化によって達成される。
【００６０】
一態様では、冷却は懸濁結晶化によって達成され、これは氷核形成(核形成)の初期段階と、これに続く溶液中の氷核の成長に関わる第2段階とを含む。これは、スクレープドサーフェス(scraped surface)熱交換器において適切に行うことができる。スクレープド熱交換器では、その壁が冷却され、その結果、氷の結晶が冷却された壁にくっつく傾向がある。スクレーパを連続的に動かすことで、そうした結晶を取り除き、氷が熱交換器につくのを防止している。
【００６１】
別の態様では、冷却は層結晶化によって達成される。これは、冷たい表面を通してジュースを流すことによる該表面上でのジュース中に存在する水の結晶化により達成することができ、その結果、氷の層が形成されて、ジュースが濃縮される。
【００６２】
ブロック結晶化は、溶液が完全に凍結して、生産物の中心の温度が凝固点を大きく下回る場合に起こる。その後、凍結溶液全体を解凍し、重力解凍アシスト(gravitational thawing assisted)を用いて、または分離効率を高める他の技術によって、濃縮画分を氷画分から分離する。
【００６３】
冷却の好ましい方法は、懸濁結晶化および層結晶化であり、最も好ましくは懸濁結晶化であるが、それは、懸濁結晶化が氷結晶の速い成長速度を可能にし、かつ良好な熱伝導率、それゆえに、より高いエネルギー効率に関連するからである。
【００６４】
根または塊茎ジュースの冷却は、好ましくは、可能な限り高い冷却速度を用いて、例えば、少なくとも4℃/分、好ましくは少なくとも8℃/分、より好ましくは少なくとも12℃/分、さらに好ましくは少なくとも15℃/分を用いて達成される。指示された温度への冷却は、2〜10分以内に達成することがさらに好ましい。冷却は、好ましくは、時間とともにほぼ線形に達成されるが、異なる時間に様々な速度を用いて冷却することを排除するものではない。
【００６５】
任意で、根または塊茎ジュースを上記の温度まで冷却した後、形成された氷の結晶を成長させるために、根または塊茎ジュースをしばらくの間この温度に保持する。この間、ジュースは決して静止したままではなく、例えば、混合することによってそれを達成することができる。好ましくは、根または塊茎ジュースは、指示された温度に1分〜24時間保持され得る。好ましくは、根または塊茎ジュースを指示された温度に30分〜12時間、より好ましくは1〜6時間保持する。
【００６６】
さらに、冷却の間、ジュースを混合することが好ましく、例えば、200〜2000rpm、好ましくは400〜1500rpm、より好ましくは700〜1100rpmで撹拌することが好ましい。発泡を最小限に抑えるために、1100rpm未満、好ましくは1000rpm未満の撹拌速度が好適である。
【００６７】
本発明の方法のこの第2の工程は、氷結晶の形成をもたらす。氷結晶は、好ましくは実質的に純粋な水、例えば、少なくとも70重量％、好ましくは少なくとも80重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、最も好ましくは少なくとも97重量％の水である。氷結晶は、好ましくは1mm〜10ミクロン、より好ましくは1mm〜500ミクロン、最も好ましくは900〜200ミクロンのサイズを有する。ミクロンは、全体を通して、マイクロメートルに等しい。これに関連して、氷結晶のサイズは、例えば、顕微鏡インラインレーザープローブ測定または目視検査などによって、氷結晶の最長直線径を測定することによって決定することができる。
【００６８】
氷結晶の形成後、根または塊茎ジュースから氷結晶を分離して、第1の根または塊茎ジュース産物として、濃縮された根または塊茎ジュースを得る。根または塊茎ジュースから氷結晶を分離するための適切な方法は、当技術分野で周知であり、例えば、ろ過、水力学的洗浄カラム、および遠心分離を含む。
【００６９】
ろ過は、好ましくは、10〜500ミクロン、好ましくは20〜200ミクロン、より好ましくは40〜100ミクロンのフィルターを用いて達成される。ろ過は、連続法またはバッチ法で行うことができるが、好ましくは連続法である。
【００７０】
さらに好ましい態様では、ろ過は、当技術分野で周知のように、減圧によりアシストされる。
【００７１】
あるいは、氷結晶の分離は水力学的洗浄によっても達成され得る。これは水力学的洗浄カラムの使用により行うことができる。
【００７２】
水力学的洗浄では、洗浄カラムの底にあるフィルターを通して濃縮物を絞り出す。このようにして、氷結晶の充填層を形成する。次に、該充填層を上方に押し上げる。洗浄カラムの頂部で、氷を削り取って溶かし、溶けた水の一部を用いて充填層を洗浄する。水力学的洗浄の変法では、ピストンを使用して氷/水混合物を底部フィルターに通して押し付ける。その場合には、この技術はピストン洗浄と呼ばれることがある。
【００７３】
さらにまた、氷結晶の分離は遠心分離によっても達成され得る。これはピーリング遠心分離機を用いて行うことができる。
【００７４】
前記流体を遠心ろ過-清澄化システムにポンプで送り、そこで高g力(重力の最大7500倍)を受けて、ジュースは重質相(母液)と軽質相(氷)に分離される。発生した高い遠心力のおかげで、液相が氷から分離し、遠心分離機の壁にあるフィルターを通過する。圧縮された氷ケークをピーラーで取り除き、そのピーラーが掻き取った氷を氷排出接続部に運ぶ。あらゆる残留固形物を分離して、手動浄化ユニットから手作業で取り出すか、または自浄式ユニットにより自動的に排出する。
【００７５】
根または塊茎ジュースの冷却が、結晶性化合物、例えばアスパラギン、の共結晶化を伴う場合、この化合物は、氷結晶とともに根または塊茎ジュースから分離される。それは、氷を溶かし、続いて、例えば結晶化または乾燥などの公知の方法によって、結晶性化合物を分離することにより単離され得る。
【００７６】
根または塊茎ジュースから氷結晶を分離した後、濃縮された根または塊茎ジュースが得られる。濃縮された根または塊茎ジュースは、少なくとも30重量％のタンパク質を含み、好ましくは少なくとも35重量％、より好ましくは少なくとも40重量％、例えば、30〜50重量％、好ましくは30〜60重量％、より好ましくは30〜70重量％のタンパク質を含む。濃縮された根または塊茎ジュース中のタンパク質含量は、ジュース中の乾物量に基づいて重量％として表される。乾物量に基づくタンパク質含量は、Sprint(商標)ラピッドタンパク質分析計で測定することができる。濃縮された根または塊茎ジュース中のタンパク質は、本質的に未変性のタンパク質である。
【００７７】
凍結濃縮によって得られたタンパク質が、既知のタンパク質産物よりも分解が少なく、結果として高品質であることは、本発明の明白な利点である。凍結濃縮によって得られたタンパク質は、吸収クロマトグラフィーまたは精密ろ過などの別の方法で得られた場合よりも、酸化および加水分解される程度が低い。これは、例えば、カルボニル含量から知ることができる。タンパク質の分解はカルボニル基をもたらし、そのためカルボニル基の量(「カルボニル含量」)はタンパク質の分解状態を反映する。カルボニル基が少ないほど、タンパク質の分解は少ない。本明細書に記載される凍結濃縮を用いると、タンパク質が他の方法で分離される場合よりも、カルボニル含量が低く、それゆえに分解の程度が少ない根または塊茎分離物を得ることが可能である。
【００７８】
また、アニシジン値を用いてタンパク質の品質を反映させることもできる。アニシジン値は脂質酸化生成物の量を反映しており、そのため、より高いアニシジン値はより低い品質の産物を示す。本明細書に記載される凍結濃縮を用いると、より高い品質の根または塊茎分離物を得ることが可能である。
【００７９】
したがって、本発明は、同様に、高品質かつ高純度であって、分解されていないタンパク質を含む根または塊茎分離物にも関する。この根または塊茎分離物は、4.7mmol/kg可溶性タンパク質未満、好ましくは4mmol/kg可溶性タンパク質未満のカルボニル含量によって特徴づけることができる。そのような根または塊茎分離物は、好ましくは未変性である。さらに好ましくは、根または塊茎分離物は、トータルカラーが0.7未満、好ましくは0.5未満である。
【００８０】
濃縮された根または塊茎ジュースは、任意でさらに濃縮して、より高いタンパク質含量を有する濃縮された根または塊茎ジュースを得ることができる。これは、例えば、透析ろ過または水性2相分配法によって達成され得る。これは、乾物量に基づいて、少なくとも50重量％のタンパク質、好ましくは少なくとも60重量％のタンパク質、より好ましくは少なくとも65重量％のタンパク質、さらには少なくとも70重量％のタンパク質、例えば、50〜90重量％、好ましくは60〜85重量％、より好ましくは65〜85重量％のタンパク質を含む、濃縮された根または塊茎ジュースをもたらすことができる。
【００８１】
透析ろ過は、水または塩溶液に対して、2〜15kDaメンブレン、好ましくは3〜8kDaメンブレン、最も好ましくは4〜6kDaメンブレンを通して達成され得る。透析ろ過中の濃縮ジュースの温度は、30℃を超えてはならず、好ましくは25℃を超えず、より好ましくは18℃を超えない。
【００８２】
水性2相分配法は、主に一方の相への関心対象のタンパク質の分配に基づき、汚染物質は他方の相に実質的に全て存在する。例えば、Yuzugullu Y. & Duman Y.A. (2015) Prep Biochem Biotechnol.;45(7):696-711., “Aqueous two-phase (PEG4000/Na2SO4) extraction and characterization of an acid invertase from potato tuber (Solanum tuberosum)”に記載されている。
【００８３】
本方法の利点は、凍結濃縮プロセスが根または塊茎ジュースの生物学的劣化をほとんど何ももたらさないことである。したがって、本方法から得られた根または塊茎ジュースおよび粉末の微生物数は低いままであり、また、処理中に実質的な着色が見られない。
【００８４】
また、処理後の根または塊茎ジュースおよび粉末のTGAレベルは低く、根または塊茎ジュースおよび粉末は処理中にメイラード生成物を実質的に全く生じさせない。
【００８５】
さらに、根または塊茎ジュースを濃縮する他の方法と比較して、装置への付着物と腐食が最小限に抑えられる。
【００８６】
また、本方法で処理された根または塊茎ジュース、およびそのようなジュースから得られる産物は、本質的に色をもたない。これは、化学的および微生物学的劣化のために、明らかな黄褐色〜暗褐色を常に有する先行技術の産物とは異なる。
【００８７】
さらに、フェノール酸の含量は一般に低い。
【００８８】
本方法によって得られた根または塊茎ジュース産物および根または塊茎粉末は、アレルゲンフリーであり、一般に遺伝子組み換え生物に由来しないことがさらに有利である。
【００８９】
本方法を使用して得られる濃縮した根または塊茎ジュースは、様々な産物を得るためにさらに処理することができる。そのような産物の1つは、根または塊茎タンパク質分離物であり得る。根または塊茎タンパク質分離物の分離はまた同時に、第2の根または塊茎ジュース産物として、タンパク質を枯渇させた、遊離アミノ酸を含む根または塊茎ジュースをもたらす。
【００９０】
一態様において、根または塊茎タンパク質分離物は変性された分離物である。変性された根または塊茎タンパク質分離物は、適切には、濃縮した根または塊茎ジュースの凝固、好ましくは熱凝固または化学凝固によって得ることができる。
【００９１】
熱凝固は、濃縮した根または塊茎ジュースを、存在する根または塊茎タンパク質の最高変性温度より上に加熱することによって、達成され得る。好ましくは、変性された根または塊茎タンパク質分離物を得るための熱凝固は、濃縮した根または塊茎ジュースを少なくとも80℃、好ましくは少なくとも90℃の温度に、少なくとも15分間、好ましくは少なくとも30分間、より好ましくは少なくとも60分間加熱することによって達成される。これは、根または塊茎タンパク質の変性とその後の凝固をもたらし、続いてタンパク質を、濃縮した根または塊茎ジュースから分離することができる。
【００９２】
あるいは、変性された根または塊茎タンパク質を化学凝固によって得ることができる。化学凝固は、根または塊茎タンパク質を結果として変性させる化学物質の添加によって達成され得る。適切な化学物質には、酸、硫酸アンモニウム、カルボキシメチルセルロース、エタノール、塩化マンガンおよび塩化第二鉄が含まれる。適切な酸には、当技術分野で知られるような、例えば塩酸、硫酸、酢酸またはクエン酸が含まれる。好ましくは、化学凝固は酸凝固である。続いて、変性および凝固した根または塊茎タンパク質を含む根または塊茎ジュースは、例えば変性した根または塊茎タンパク質分離物の分離などの、さらなる処理に使用され得る。
【００９３】
凝固後に、濃縮した根または塊茎ジュースから変性した根または塊茎タンパク質を分離することは、例えばろ過または遠心分離などの、任意の適切な方法によって達成することができる。
【００９４】
変性した根または塊茎タンパク質のろ過は、好ましくは20〜250ミクロン、より好ましくは30〜200ミクロン、さらにより好ましくは40〜100ミクロンのフィルターを用いて達成される。ろ過は、連続法またはバッチ法で行うことができるが、好ましくは連続法である。
【００９５】
あるいは、変性した根または塊茎タンパク質の分離は、遠心分離によって達成される。
【００９６】
変性した根または塊茎タンパク質分離物は、任意でさらなる処理または洗浄後に、例えば、牛飼料として、根または塊茎タンパク質加水分解物の供給源として、あるいはタンパク質系接着剤の供給源として使用することができる。
【００９７】
別の態様において、根または塊茎タンパク質分離物は、未変性の根または塊茎タンパク質分離物である。これに関連して、未変性とは、本質的に全てのタンパク質がその天然の酵素活性を保持していることを意味し、その結果、根または塊茎タンパク質分離物は本質的に未変性である。
【００９８】
未変性の根または塊茎タンパク質分離物は、濃縮した根または塊茎ジュースから様々な方法で得ることができる。適切な方法には、例えば、ろ過、吸着、クロマトグラフィー、泡沫抽出または低温分離が含まれる。
【００９９】
濃縮した根または塊茎ジュースから未変性の根または塊茎タンパク質分離物を得るためのろ過は、好ましくは限外ろ過である。ろ過は、濃縮した根または塊茎ジュースを、未変性タンパク質を保持するフィルターユニットに供することによって達成することができる。
【０１００】
ろ過を実施する好ましい方法は、限外ろ過(UF)を用いることである。限外ろ過は、5kDa〜500kDaの分子量範囲の溶質を分離することができ、そのため浮遊固形物、コロイド、細菌およびウイルスの分離に使用され得る。これには、アスパラギナーゼおよびグルタミナーゼなどの残留酵素を除去するためのろ過が含まれる。
【０１０１】
UFメンブレンは、直径1〜20nmの範囲の細孔を有する。好ましいUFメンブレンは、異方性UFメンブレンである。限外ろ過メンブレンが巨大分子を保持する能力は、従来、その分子量カットオフ(MWCO)の観点から特定されている。10kDaのMWCO値は、そのメンブレンが10kDaの分子量を有する分子の90％を供給溶液から保持し得ることを意味する。本発明との関連において、好ましいMWCOは、5〜500kDaメンブレン、好ましくは5〜100kDa、より好ましくは5〜30kDa、より好ましくは5〜10kDaである。
【０１０２】
濃縮した根または塊茎ジュースから未変性の根または塊茎タンパク質分離物を得るための吸着は、充填床クロマトグラフィー、拡張床クロマトグラフィー、移動床クロマトグラフィーまたはメンブレンクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって達成され得る。好ましくは、未変性の根または塊茎タンパク質の吸着は、拡張床、流動床または充填床吸着を含む。これは、未変性の根または塊茎タンパク質分離物の溶液をもたらす。
【０１０３】
濃縮した根または塊茎ジュースから未変性の根または塊茎タンパク質分離物を得るための泡沫抽出は、Weijenberg, D. C., Mulder, J. J., & Drinkenburg, A. A. H. (1978). Ind. Eng. Chem. Process Des. Dev, 17(2), 209-213 “The Recovery of Protein from Potato Juice Waste Water by Foam Separation”に記載される方法により達成され得る。
【０１０４】
濃縮した根または塊茎ジュースから未変性の根または塊茎タンパク質分離物を得るための低温分離は、低温での前処理および低温での濃縮により達成され得る。
【０１０５】
未変性のまたは変性した根または塊茎タンパク質分離物を分離した後、根または塊茎タンパク質分離物は好ましくは乾燥される。乾燥に先立って、根または塊茎タンパク質分離物を濃縮することができ、これは、根または塊茎タンパク質分離物が未変性のタンパク質分離物の溶液として得られる場合に好ましい。濃縮は、好ましくは、例えば上記のような凍結濃縮によって達成することができ、根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−16℃の温度まで冷却して、氷結晶を形成させる工程；および該氷結晶を根または塊茎ジュースから分離して、濃縮された根または塊茎タンパク質分離物を得る工程によって達成される。
【０１０６】
濃縮は、別法として、第1の根または塊茎ジュース産物である濃縮した根または塊茎ジュースのさらなる濃縮について記載したような、限外ろ過、透析ろ過によって達成することもできる。
【０１０７】
根または塊茎タンパク質分離物の乾燥は、水分含量が多くても10重量％、好ましくは少なくとも8重量％、より好ましくは少なくとも5重量％である(未変性のまたは変性した)根または塊茎タンパク質粉末をもたらす。根または塊茎タンパク質粉末の乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、減圧乾燥、薄膜乾燥などの任意の方法、好ましくは薄膜乾燥、より好ましくは減圧下での撹拌式薄膜乾燥によって達成することができる。
【０１０８】
凍結乾燥は、液体物質を凍結させ、例えばZirbus Technology社のSublimatorのような従来の凍結乾燥装置を用いて、減圧下で氷を昇華させることによって達成され得る。
【０１０９】
本質的に未変性の根または塊茎タンパク質分離物は、様々な興味深い特性を有する。未変性の根または塊茎タンパク質は、暫定的に3つのクラスに分けることができる：(i)パタチンファミリー、相同性の高い酸性43kDa糖タンパク質(根または塊茎タンパク質の40〜50重量％)、(ii)塩基性5〜25kDaプロテアーゼ阻害剤(根または塊茎タンパク質の30〜40重量％)、および(iii)他のタンパク質、主として高分子量のタンパク質(根または塊茎タンパク質の10〜20重量％)(Pots A.M., Gruppen H., Diepenbeek R. van, Leem J.J. van der, Boekel M.A.J.S. van, Wijngaard G., & Voragen A.G.J. (1999), J. Sci. Food. Agric., 79, 1557 1564 “The effect of storage of whole potatoes of three cultivars on the patatin and protease inhibitor content; a study using capillary electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry”)。
【０１１０】
パタチンは、リピドアシルヒドロラーゼおよびトランスフェラーゼ活性を有する糖タンパク質のファミリーであり、根または塊茎中の総可溶性タンパク質の最大40重量％を占める。
【０１１１】
プロテアーゼ阻害剤は、それらの分子量に基づいて異なるグループに分けることができる。プロテアーゼ阻害剤の異なるグループは、プロテアーゼ阻害剤I (分子量約39kDa)、カルボキシペプチダーゼ阻害剤(分子量約4100Da)、プロテアーゼ阻害剤IIaおよびIIb (分子量約20.7kDa)、およびプロテアーゼ阻害剤A5 (分子量約26kDa)として同定される。総根または塊茎タンパク質におけるプロテアーゼ阻害剤のこれらの異なるグループの比は、根または塊茎の品種に依存する。根または塊茎由来のプロテアーゼ阻害剤は、潜在的に重要な広範な用途を有する。プロテアーゼ阻害剤は、例えば、糖尿病の治療、哺乳動物における満腹感の誘発、皮膚癌のリスクの低減、細菌増殖の抑制、ならびに皮膚掻痒および腸の炎症の予防または治療に有用であることが示されている。
【０１１２】
未変性の根または塊茎タンパク質分離物は、総体的な根または塊茎タンパク質分離物(すなわち、根または塊茎由来の実質的に全てのタンパク質をそれらの未変性の形態で含む)であってもよいし、また、それは例えばパタチン分離物またはプロテアーゼ阻害剤分離物であってもよい。必要に応じて、未変性の根または塊茎タンパク質分離物をさらに分画して、上記のような別個のタンパク質画分を得ることができる。好ましくは、未変性の根または塊茎タンパク質分離物は、根または塊茎タンパク質の乾燥粉末であり、これは上記の乾燥方法によって得ることができる。
【０１１３】
濃縮した根または塊茎ジュースから得られる別の産物は、遊離アミノ酸を含む。遊離アミノ酸は、タンパク質に組み込まれていないアミノ酸であり、したがって、溶液中に遊離している、分子的に溶解した種として、濃縮した根または塊茎ジュース中に存在する。
【０１１４】
遊離アミノ酸としては、天然に存在するα-アミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、およびバリンが挙げられる。さらに、本発明との関連において、γ-アミノ酸であるγ-アミノ酪酸(GABA)はアミノ酸と見なされる。
【０１１５】
濃縮した根または塊茎ジュースは、一般に、好ましい遊離アミノ酸の組成を有する。根または塊茎由来の遊離アミノ酸は、濃縮した根または塊茎ジュースの形態、あるいは根または塊茎アミノ酸粉末の形態で適切に使用され得る。根または塊茎タンパク質分離物(未変性または変性)の分離は、遊離アミノ酸の付随的な除去につながらないので、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースもまた、同様に好ましい遊離アミノ酸組成を有する。そのような好ましいアミノ酸組成のため、濃縮した根または塊茎ジュース、さらにはタンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースは、根または塊茎アミノ酸物質を濃縮溶液または粉末の形態で得るための魅力的な原料物質になる。
【０１１６】
濃縮した根または塊茎ジュースを上記の方法のいずれかに供して、根または塊茎タンパク質分離物を得ることはまた、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースである第2の根または塊茎ジュース産物をもたらす。タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースは遊離アミノ酸を含む。タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースは、乾物量に基づいて、多くても1重量％のタンパク質、好ましくは多くても0.5重量％、より好ましくは多くても0.25重量％、さらにより好ましくは多くても0.1重量％のタンパク質を含む。残留タンパク質は、上記のとおり、4.7mmol/kg可溶性タンパク質未満、好ましくは4mmol/kg可溶性タンパク質未満のカルボニル含量を有する。
【０１１７】
タンパク質枯渇ジュースを乾燥させて、遊離アミノ酸を含む根または塊茎粉末を得ることができる。この粉末は、根または塊茎アミノ酸粉末(AAP)とも呼ばれる。好ましくは、根または塊茎アミノ酸粉末は、少なくとも90重量％、好ましくは少なくとも95重量％、より好ましくは少なくとも98重量％の乾物含量を有する。乾物含量は、該粉末を102℃のストーブ内で最大6時間乾燥させ、その後サンプルをデシケーター内で冷却することによって測定することができる。あるいは、乾物含量は凍結乾燥によっても測定され得る。サンプルを乾燥前と乾燥後に秤量して、乾物含量を計算することができる。この根または塊茎アミノ酸粉末は、食品にうま味またはこく味を与える味成分および/または味覚増強剤として使用することができる。好ましくは、味成分および/または味覚増強剤はうま味を付与する。別の好ましい態様では、味成分および/または味覚増強剤はこく味を付与する。好ましい態様では、根または塊茎アミノ酸粉末は、味をよくする野菜エキスとして、または調味製品として、自然調味料として、もしくは食品成分として使用される。
【０１１８】
根または塊茎アミノ酸粉末を得るための乾燥に先立って、タンパク質枯渇ジュースを、例えば上記のように凍結乾燥することによって、濃縮することが好ましいことがある。例えば、根または塊茎ジュースを−0.3℃〜−16℃の温度まで冷却して氷結晶を形成させ、氷結晶を、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースから分離すると、濃縮されたタンパク質枯渇ジュースが得られる。あるいは、上記の根または塊茎ジュースを濃縮するための上記方法のいずれかを使用して、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースを濃縮することもできる。さらにまた、適切に適用して、タンパク質枯渇ジュースを濃縮することもできる。
【０１１９】
好ましくは、濃縮されたタンパク質枯渇ジュースは、少なくとも30重量％の乾物含量、好ましくは少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％、さらにより好ましくは少なくとも60重量％、さらにより好ましくは少なくとも70重量％の乾物含量を有する。
【０１２０】
一般に、タンパク質枯渇ジュースの濃縮および乾燥は、(タンパク質を含む)根または塊茎ジュースの濃縮および乾燥、あるいは根または塊茎タンパク質分離物の溶液および粉末の濃縮および乾燥に関して記載した上記方法のいずれかによって達成され得る。
【０１２１】
場合により、本発明の方法は、トリグリコアルカロイド(「TGA」)の含量を800mg/kg乾物未満、好ましくは400mg/kg乾物未満、より好ましくは320mg/kg乾物未満、より好ましくは200mg/kg乾物未満、さらにより好ましくは100mg/kg乾物未満に低下させる工程を含む。この工程は、本方法の前または後であってよく、また、中間工程であってもよい。TGAの量は、Altと共同研究者らの方法によって測定することができる(Alt V., Steinhof R., Lotz M., Ulber R., Kasper C., & Scheper T. (2005) Eng. Life Sci. 2005, 5, No. 6 “Optimization of Glycoalkaloid Analysis for Use in Industrial Potato Fruit Juice Downstreaming”)。
【０１２２】
TGAの量を低下させるための適切な方法は、当技術分野で公知であり、例えば、吸収、抽出、および熱的、酵素的または微生物による分解を含む。
【０１２３】
TGAの吸収は、好ましくは、WO2008/056977またはWO2008/069651に記載の方法によって達成され得る。簡単に説明すると、これらの方法は、根または塊茎ジュースからのグリコアルカロイドを活性炭または粘土に吸収させ、続いて根または塊茎ジュースをろ過して粘土または活性炭を除去して、TGAが除去された根または塊茎ジュースを取得することを含む。
【０１２４】
TGAはまた、変性した根または塊茎タンパク質分離物を分離するための上記と同様の手順で、加熱することによっても除去され得る。
【０１２５】
こうして、本発明は、同様に、本方法により得られる根または塊茎ジュース産物、あるいは根または塊茎アミノ酸粉末に関係し、これらは、少なくとも25重量％の乾物含量を有し、乾物のうちのパーセントとして少なくとも16重量％の遊離アミノ酸を含み、その遊離アミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸およびγ-アミノ酪酸を合わせて、遊離アミノ酸の重量％として少なくとも20重量％、好ましくは少なくとも25重量％、ならびに、アスパラギンおよびアスパラギン酸を合わせて、少なくとも25重量％、好ましくは少なくとも30重量％含み、ここで、脱塩水中の4.5重量％溶液の420、520および620nmでの吸光度の合計として測定された、濃縮した根または塊茎ジュースのトータルカラーは、0.7未満、好ましくは0.6未満、より好ましくは0.5未満である。根または塊茎ジュース産物は、上記のような濃縮した根または塊茎ジュース、あるいはタンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースであり得る。
【０１２６】
好ましくは、本方法により得られる根または塊茎ジュース産物、あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、少なくとも30重量％、好ましくは少なくとも40重量％、より好ましくは少なくとも50重量％の乾物含量を有する。より好適な態様では、根または塊茎ジュース産物を上で定義した濃縮および/または乾燥工程に付して、好ましくは、少なくとも90重量％、好ましくは少なくとも95重量％、より好ましくは少なくとも98重量％の乾物含量を有する、根または塊茎アミノ酸粉末を得る。
【０１２７】
根または塊茎ジュース産物、あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、乾物のうちのパーセントとして、少なくとも16重量％の遊離アミノ酸を含む。好ましくは、乾物は少なくとも19重量％、より好ましくは少なくとも21重量％、より好ましくは少なくとも23重量％、さらにより好ましくは少なくとも25重量％のアミノ酸を含む。
【０１２８】
根または塊茎ジュース産物、あるいは根または塊茎アミノ酸粉末の乾物中のアミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸、およびγ-アミノ酪酸を合わせて、少なくとも20重量％、好ましくは少なくとも25重量％、より好ましくは少なくとも30重量％、ならびに、アスパラギンとアスパラギン酸を合わせて、少なくとも25重量％、好ましくは少なくとも30重量％、より好ましくは少なくとも34重量％で含む。一般に、根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末中の特定のアミノ酸の量は、遊離アミノ酸(GABAを含む)の重量％として表される。
【０１２９】
好ましくは、グルタミン、グルタミン酸、およびγ-アミノ酪酸の合計は、少なくとも10重量％のグルタミン酸、好ましくは少なくとも20重量％のグルタミン酸、より好ましくは少なくとも30重量％のグルタミン酸を含む。また、アスパラギンとアスパラギン酸の合計は、好ましくは、アスパラギン酸を少なくとも15重量％、より好ましくは少なくとも20重量％含む。
【０１３０】
より好適な態様では、本発明の方法は、タンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースに酵素処理を施す工程を含む。好ましい酵素処理には、遊離アミノ酸アスパラギンのアスパラギン酸への変換、ならびに/または遊離アミノ酸グルタミンのグルタミン酸へのおよび/もしくは任意でγ-アミノ酪酸への変換、あるいはRNAを5'-GMPおよび/または5'-AMPに変換する酵素処理が含まれる。そのような方法は外因性または内因性酵素を含み得る。
【０１３１】
根または塊茎ジュースの酵素処理は、それぞれの特定の酵素に適したpHおよび温度条件下で所望の酵素の作用に根または塊茎ジュースをさらすことによって達成され得る。こうした条件はある程度重複している。
【０１３２】
遊離アミノ酸のアスパラギンをアスパラギン酸に変換するのに適した酵素には、例えば、PreventAse (DSM社)、Acrylaway (Novozymes社)、Crisantaspase、Colaspase、ElsparおよびErwinaseが含まれ、PreventAseが好ましい。
【０１３３】
酵素処理はpH4.5〜7、好ましくは5.0〜6.7、より好ましくは5.5〜6.5のpHで行うことが好ましい。さらに好ましくは20〜70℃、より好ましくは34〜45℃の温度である。
【０１３４】
酵素の用量は非常に酵素依存性であるが、好ましくは、酵素用量は4000ppm未満、好ましくは1000ppm未満、より好ましくは500ppm未満である。
【０１３５】
遊離アミノ酸のグルタミンをグルタミン酸に変換するのに適した酵素には、例えば、pH5.0〜7.0、好ましくは6.2〜6.8、より好ましくは約6.5でのグルタミナーゼSD-100CS (Amano Enzymes社, 日本)が含まれる。さらに好ましくは、その温度は40〜70℃、好ましくは50〜70℃、より好ましくは55〜65℃である。
【０１３６】
さらに好ましい態様では、酵素用量は1000mg/L未満、好ましくは500mg/L未満、より好ましくは250mg/L未満である。あるいは、上記の条件下でのPreventAse (DSM)もまた、アスパラギンのアスパラギン酸への変換を行うために使用することができる。
【０１３７】
好ましくは、グルタミンの酵素的変換はグルタミン酸を生じる。任意に、このようにして生産されたグルタミン酸は、γ-アミノ酪酸に変換され得る。これは、例えばグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いる、酵素的変換によって達成することができる。より好ましい態様では、グルタミン酸デカルボキシラーゼは、グルタミン酸のGABAへの変換を行うために、根または塊茎ジュース中に内生的に存在する。
【０１３８】
別の好ましい方法は、RNAを5'-GMPおよび/または5'-AMPに変換するための酵素処理を含む。適切な酵素には、例えば、65〜75℃、好ましくは70℃の温度およびpH4〜7、好ましくはpH4.5〜6.0、好ましくは約pH5.0でのRP-1 (Amano Enzymes社, 日本)が含まれる。
【０１３９】
別の好ましい態様では、根または塊茎ジュース由来の内因性ヌクレアーゼ酵素が、RNAの5'-GMPおよび/または5'-AMPへの変換をもたらす。これは好ましくは、pH6〜9、好ましくはpH7〜8、より好ましくは約pH7.5で起こる。さらに好ましくは、その温度は60〜75℃、好ましくは約70℃である。
【０１４０】
より好ましい態様では、RNAの5'-GMPおよび/または5'-AMPへの変換を行う処理は、5'-AMPを5'-IMPに変換するDeamizyme 50.000 (Amano Enzymes社)と組み合わされる。
【０１４１】
上記の酵素的変換後に溶液中に残存する酵素はどれも、当技術分野で公知でありかつ上に記載したように、例えば限外ろ過によって、除去され得る。したがって、本発明はさらに、残留酵素を除去するための限外ろ過工程をさらに含む、上記の方法に関する。
【０１４２】
このような変換は、例えば、グルタミンに対するグルタミン酸のレベル、およびアスパラギンに対するアスパラギン酸のレベルを増加させたり、あるいは5'-GMPおよび/または5'-AMPおよび/または5'-IMPの含量を増加させたりすることができる。好ましくは、こうした処理により、グルタミン、グルタミン酸、およびγ-アミノ酪酸の合計が、少なくとも90重量％のグルタミン酸、好ましくは少なくとも95重量％のグルタミン酸を含み、かつアスパラギンとアスパラギン酸の合計が、少なくとも90重量％のアスパラギン酸、好ましくは少なくとも95重量％のアスパラギン酸を含む、根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末がもたらされる。この態様は、根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末が味成分および/または味覚増強剤として使用される場合に特に好適である。
【０１４３】
さらに好ましくは、5'-GMPおよび/または5'-AMPおよび/または5'-IMPの含量は、少なくとも400mg/kg乾物、好ましくは少なくとも600mg/kg乾物、より好ましくは少なくとも900mg/kg乾物、最も好ましくは少なくとも1000mg/kg乾物である。この態様は、根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末がうま味成分および/またはうま味増強剤として使用される場合に特に好適である。
【０１４４】
これに関連して、別の好ましい産物は、遊離アミノ酸の重量％として表して、少なくとも18重量％のアスパラギンおよび/または少なくとも40重量％のアスパラギン酸および/または少なくとも5重量％のGABAを含む。
【０１４５】
さらに、本方法によって得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、好ましくは、OPA分析で測定して、少なくとも1000mmol/kg乾物の遊離アミン含量、好ましくは少なくとも1400mmol/kg乾物、より好ましくは少なくとも1500mmol/kg乾物、さらにより好ましくは少なくとも1800mmol/kg乾物、さらにより好ましくは少なくとも2400mmol/kg乾物の遊離アミン含量を有する。
【０１４６】
遊離アミン含量は、0.1重量％濃度の濃縮した根または塊茎ジュースあるいは根または塊茎粉末とオルト-フタルアルデヒド(「OPA」)試薬との反応、およびその後の340nmでの分析によって測定することができる。
【０１４７】
また、本方法によって得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、好ましくは、ISO 4833-1/2013に従う生菌数試験法で測定して、104CFU/グラム未満、好ましくは103CFU/グラム未満の微生物数を有する。
【０１４８】
さらに、本方法によって得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、好ましくは、500mg/kg DM未満、好ましくは400mg/kg DM未満、より好ましくは300mg/kg DM未満のフェノール酸含量を有する。
【０１４９】
また、本方法によって得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、好ましくは、800mg/kg乾物未満のグリコアルカロイドの濃度、好ましくは400mg/kg乾物未満、より好ましくは320mg/kg乾物未満、より好ましくは200mg/kg乾物未満、さらにより好ましくは100mg/kg乾物未満のグリコアルカロイド濃度を有する。
【０１５０】
また、本方法によって得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、好ましくは、メイラード生成物の含量が低い。メイラード生成物は、公知の分離プロトコルの間に様々な内在性化合物から自然に形成される生成物である。したがって、それらの形成は可能な限り抑制されるべきである。メイラード生成物の量は、ヒドロキシメチルフルフラールの量によって推定され得る。好ましくは、ヒドロキシメチルフルフラールの量は、5mg/kg乾燥重量未満、好ましくは2.5mg/kg乾燥重量未満、より好ましくは1mg/kg乾燥重量未満であるべきである。さらに、メイラード生成物のもう1つの指標であるフロシンは、好ましくは300mg/kg乾物未満、より好ましくは100mg/kg乾物未満、さらにより好ましくは5mg/kg乾物未満、最も好ましくは4mg/kg乾物未満である。
【０１５１】
メイラード生成物は、還元糖がタンパク質、ペプチド、アミノ酸、またはアミンなどのアミノ化合物と同時に存在するときにいつでも形成される生成物である。メイラード生成物の測定には、メイラード反応のための経路が1つだけではないので、多くの異なる生成物が含まれる。メイラード反応は、オルト-フタルアルデヒドアッセイを用いて遊離第1級アミノ基の量を測定することによって追跡することができる。あるいは、フロシンの形態の生成物の進行を測定することができ、また、ヒドロキシメチルフルフラールを、HPLCおよび光度UV検出器を用いてJeuringおよびKupersのプロトコルに従って測定することができる(Jeuring J. & Kuppers F., (1980) J. Ass. Off. Anal. Chem. 63, 1215 (“High Performance Liquid Chromatography of Furfural and Hydroxymethylfurfural in Spirits and Honey”)。
【０１５２】
また、本方法によって得られる根または塊茎ジュース産物あるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、好ましくは、5'-ヌクレオチドの5'-GMPと5'-AMPと5'-IMPの含量が少なくとも400mg/kg乾物、好ましくは少なくとも600mg/kg乾物、より好ましくは少なくとも900mg/kg乾物、最も好ましくは少なくとも1000mg/kg乾物である。
【０１５３】
他の箇所で定義されるような色を本質的にもたない産物およびジュースを得るために、アニオン交換または活性炭処理などのさらなる処理を必要としないことが、本方法のさらなる利点である。しかし、TGA除去などの他の目的を達成するために、または有機酸を除去するために、これらの処理を適用してもよい。
【０１５４】
本発明の根または塊茎アミノ酸粉末あるいはタンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースは、有利には、例えば添加物の形で、味成分および/または味覚増強剤として使用することができる。これらの組成物は食品に強いうま味またはこく味を付与する。したがって、本発明は、同様に、食品用途における味成分および/または味覚増強剤としての根または塊茎遊離アミノ酸の使用に関係する。
【０１５５】
うま味は一般的においしい味と見なされている。それは、酸味、甘味、苦味、塩味の4つの基本的な味の次にくる5番目の味である。うま味は主にグルタミン酸に起因するが、5'-リボヌクレオチド、アスパラギン酸、およびカリウムによって促進され得る。グルタミン酸によるうま味は、GABAによっても増強され、代償的な割合のGABAで置き換えることができる。これは、グルタミン酸の実質的減少および低グルタミン酸(MSG)うま味製品につながる。
【０１５６】
こく味は、それ自体の味はないものの、味の増強として作用すると考えられている。それは、味の広がり、豊かさ、持続性を引き出すだけでなく、最初の味にパンチを与えると言われている。正確なメカニズムはまだ十分には分かっていない。
【０１５７】
好ましくは、前記組成物は強いうま味を与える。別の好ましい組成物は強いこく味を与える。
【０１５８】
したがって、本発明のタンパク質を枯渇させた根または塊茎ジュースあるいは根または塊茎アミノ酸粉末は、だし汁、ブイヨン、麺類、ドレッシング、シーズニング、ソース、調理済みの食料もしくは食材キット、またはそれらの一部、フォン(fond)、ソース、薬味類、スパイスもしくはハーブ組成物、マリネなどの、風味豊かな食品用途に適用するのに非常に適している。
【０１５９】
食品への添加は、任意の所望の濃度、例えば0.1〜2.0重量％、にすることができる。
【０１６０】
さらに、アミノ酸分離物は食品サプリメントとして使用することができる。
【０１６１】
明瞭さおよび簡潔な説明のために、本発明の特徴は、同じまたは別個の実施態様の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載された特徴の全部または一部の組み合わせを有する実施態様を含み得ることが理解されよう。
【０１６２】
ここで、本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【０１６３】
トータルカラーの測定
全てのサンプルを5.0 Bx (4.5重量％乾物に相当)に希釈し、エッペンドルフ遠心分離機で14,000rpm、10分間遠心分離して不溶性物質を除去した。ブリックス値が5未満の物質はそのまま遠心分離した。各サンプルの上清1mLのアリコート2つをキュベットに入れ、BioRad SmartSpec Plus分光光度計に置いた。吸光度を脱塩水(demiwater)ブランクに対して420、520および620にて2つ組で読み取って合計した。吸光度が1より大きい場合は、吸光度を読み取ることができるまでサンプルを脱塩水で正確に希釈した。
【０１６４】
乾物含量の測定
予め計量したアルミニウム蒸発プレート上のサンプルの2gアリコートを、標準誤差1mg未満の分析天びんで正確に秤量した。サンプルを50mbar未満の圧力で50℃にて作動している減圧乾燥チャンバに導入し、一晩乾燥させた。プレートを乾燥チャンバから取り出し、周囲温度まで冷却して、再度秤量した。次いで、質量差から乾物含量を算出した。
【０１６５】
遊離アミンレベルの測定
アミン基とオルト-フタルアルデヒド(OPA, CAS 643-79-8)との間の特異的反応をモニタリングすることにより、遊離NH2基についてサンプルを分析した。
【０１６６】
96％エタノール100μL中にOPA (SigmaAldrich社, 00681) 5mgを溶解することによって、OPAのストック溶液を調製した。2-メルカプトエタノール(Merck社, 8.05740.0250) 5μLを添加した。全ての物質をエタノールに溶解させた後、pH10.5の100mM炭酸緩衝液10mLを添加した。直射日光を避けてこの試薬を貯蔵し、1時間以内に使用した。サンプルを0.1重量％のおよその濃度に正確に希釈した。希釈サンプル20μLをOPAストック溶液180μLに添加し、暗所で正確に1分30秒間インキュベートし、その際にThermoScientific Multiskan GOプレートリーダーを用いて340nmでの吸光度を読み取った。
【０１６７】
アミン含量は、0〜5mM濃度のグルタミン酸標準溶液から作成した検量線に対して測定した。
【０１６８】
アミノ酸含量の測定
サンプルは、当技術分野で知られているように、ポストカラムニンヒドリン誘導体化および光度検出を含む古典的なイオン交換液体クロマトグラフィーを用いたHPLC-UV/FLUおよび/またはBiochromアミノ酸分析装置を用いて、アミノ酸分析に供した。
【０１６９】
グリコアルカロイドレベルの測定
根または塊茎サンプル中のトリグリコアルカロイド(TGA)のレベルは、本質的にAltと共同研究者らの方法に従って測定した(Alt V., Steinhof R., Lotz M., Ulber R., Kasper C., & Scheper T. (2005) Eng. Life Sci. 2005, 5, No. 6 “Optimization of Glycoalkaloid Analysis for Use in Industrial Potato Fruit Juice Downstreaming”)。
【０１７０】
簡単に説明すると、サンプルを、20mMのヘプタンスルホン酸ナトリウム塩(VWR 152783K)を含有する5％酢酸溶液中に少なくとも2時間溶解または希釈した。9000g、周囲温度での遠心分離(Heraeus Multifuge 1 SR, ローター75002006)により不溶性物質を除去し、上清を0.45μm GHPメンブレン(PALL PN 4556T)付きのGHP Acrodisc 13mmシリンジフィルターで直接1.5mL HPLCバイアル(VWR 548-0004)中にろ過し、アルミニウムci 11mmのゴム/ブチル/TEFキャップ(VWR 548-0010)を取り付けた。サンプルを、RobotlonオンラインSPEシステム(Separations)を介してSPEカラム(Oasis HLB prospect-2/Symbiosisカートリッジ2.0×10mm粒子サイズ30μm)上に自動的に導入した。グリコアルカロイドをHypersil ODS C18 (250mm×4.6mm 5μm)カラムに溶出し、50％アセトニトリル/リン酸緩衝液pH7.6を用いて分離した。Smartline UV検出器2520 (Knauer社)を用いて検体を検出し、精製グリコアルカロイド(α-ソラニン，Carl Roth 4192,1およびα-チャコニン Carl Roth 2826,1)から作成した検量線で定量した。
【０１７１】
全フェノール酸含量の測定
根または塊茎には、326nmでの高い比分子吸光度により特徴づけられるフェノール酸の2つの主要な種、すなわちクロロゲン酸とカフェ酸が含まれており、そのうち前者が圧倒的に豊富である。全フェノール酸含量は、精製クロロゲン酸(0〜5μg/mL、Caymans Chemical社 70930)から構築した検量線を参照して、根または塊茎ジュースサンプルの326nmでの吸光度を測定することによって決定した。次いで、線形回帰によりフェノール酸レベル(「CGA」)を算出した。
【０１７２】
総浮遊固形物の測定
根または塊茎ジュースを4.5重量％の乾物含量に希釈し、620nmでの吸光度を、UV/Vis分光光度計(BioRad SmartSpec Plus)を用いて1cm経路長のキュベットで脱塩水に対して測定した。1より高い吸光度を有するサンプルについては、吸光度が1未満になるまで、脱塩水で正確な希釈物を調製した。次いで、報告された値をこの希釈について補正した。より低い乾物含量を有するサンプルの場合は、低い乾物含量で測定を行い、4.5重量％の乾物含量に数学的に変換した。
【０１７３】
脂質含量の測定
サンプル中の脂質含量は、Matyashと共同研究者らの方法によって測定した(Matyash V., Liebisch G., Kurzchalia T.V., Shevchenko A., & Schwudke D., (2008) J Lipid Res.;49(5):1137-46 “Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics”)。
【０１７４】
トータルカラーの測定
トータルカラーは、4.5重量％固形物の溶液における420、520および620nmでの吸光度の合計として測定される。濁りが色に寄与しないように、測定前にサンプルをエッペンドルフチューブに入れて最大rpmで遠心分離した。異なる固形分を有するジュースの場合、その溶液を、例えば4.5重量％に希釈して、トータルカラーを直接測定することができる。また、例えばジュースの固形分が4.5重量％より低い場合には、固形分に関して調整することによってトータルカラーを数学的に得ることができる。トータルカラーは「色」と略記され得る。
【０１７５】
実施例1：FCジャガイモジュースの生産
凍結結晶化によるジャガイモジュース濃縮物の生産
ジャガイモジュースは、工業用デンプンジャガイモから調製した。その材料を低温で軟凝集させることによって前処理するか、またはそのまま使用した。未処理のジャガイモジュースは、乾物1kgあたり42±7gの脂質を含んでいた。
【０１７６】
ジャガイモジュースの軟凝集は、低温バージョンの軟凝集手順で行った。簡単に説明すると、900Lのジャガイモジュースを15℃に冷却し、11mg/Lのポリアクリルアミド(Superfloc A150, Kemira社)、650mg/Lのポリタンニン(Bio20, Servyeco社)および50mg/Lのk-カラギーナン(Gelcarin GP812, FMC biopolymer社)を導入することによって軟凝集を行った。この処理は、ジャガイモジュース中の脂質含量を25g/kg乾物未満に減少させた。この低温手順は、フロックの初期沈降速度を8cm/hから50cm/hに変化させた。5kDa PES限外ろ過メンブレン(Koch社)にジュースを通過させることによって、タンパク質をジュースから除去した。
【０１７７】
清澄化したジャガイモジュースおよび未処理の対照ジュースを別々に凍結濃縮ユニット(EFC separations BVおよびThorIce社)で凍結濃縮に付した。液体を1℃に予冷し、−0.3℃〜−16℃の温度で作動している結晶化チャンバに導入して氷スラリーを形成させた。
【０１７８】
ジェネレータによって生成されたスラリー氷は、Thor-Iceジェネレータ(Thor-Ice社, アイスランド)の内部をこすり落とすことによって生じた多くの小さな結晶からできた低温「スラッシュ(slush)」である。氷の結晶はフレーク氷の大きな塊に比べて小さい。小さなスラリー氷粒子は、他のどのタイプの氷よりも大きな熱伝達をもたらす。氷粒子中の球状結晶は良好な流動特性を示し、従来のポンプと配管パイプを通しての容易な循環を可能にする。小さなサイズの結晶は隙間に流れ込み、より大きな表面接触をもたらし、したがって、氷冷却の他の伝統的な形態(フレーク、ブロックまたはシェルなど)よりもはるかに速い冷却速度を提供する。
【０１７９】
この製氷機のユニークな特徴は、それがモジュール技術で開発されたという事実である(Thor-Ice社)。このプロセスのスケールアップはスケールアウト(scaling out)によって行われる。プロセスの流れへの冷却能力と熱伝達を調整する/バランスをとる適応型凍結装置のおかげで、10％から90％を超える範囲の様々な密度レベルで、スラリー氷を生成することができる。氷の詰まりは、スクレーパによって発生したトルクがある値を超えたときに、温かい冷媒を熱交換面に送る制御システムによって防止される。
【０１８０】
所与の瞬間での正確なジュース凍結温度は、溶解している固形物のレベルに依存した。システムに与えられるエネルギーの量は、ジュースの濃度にかかわらず、氷の生成を一定に保つ製氷機によって自動的に調節される。氷の結晶を、80ミクロンのフィルター布を備えた減圧式ベルトフィルター上で連続的に回収し、予冷したジュース(1℃)で洗浄し、これを結晶化チャンバに再導入した。上記の洗浄を用いて氷の純度を高め、同時にその液体を、反応器に供給するために使用する。氷は1時間に最大220kg(100〜220kg/h)の割合で回収された。
【０１８１】
この段階で、未処理のジャガイモジュースは劣化のためほぼすぐにろ過できなくなったが、清澄化したタンパク質除去ジュースは顕著な目詰まりなしに40重量％乾物にまで濃縮された。
【０１８２】
別の実験では、デンプン抽出プロセスから得られたジャガイモジュースを、上記のような軟凝集を用いた脂質除去の前処理に供して、生のジュースと比較した。したがって、脂質を含まずタンパク質を含むジュースを、脂質とタンパク質を含むジュースと比較した。脂質除去は、脂質を含まないジュースの620nmでの吸光度が0.3であり、脂質を含むジュースの620nmでの吸光度が6.5であることから分かるように、TSSの付随的除去をもたらした。
【０１８３】
この場合、さらに、脂質除去は効果的な凍結濃縮をもたらした一方、脂質含有ジュースは、フィルターがすぐに目詰まりしたため、凍結濃縮にかけることができなかった。
【０１８４】
脂質除去を達成するために、様々な異なる前処理(精密ろ過、遠心分離、軟凝集、ディスクスタック分離；表1参照)を行った。低速遠心分離を使用した場合を除いて、全ての場合に、結果は結晶化温度およびろ過性の点で上記と同等であった。精密ろ過、高速遠心分離および軟凝集を使用すると、ジャガイモジュースの凍結濃縮が可能であった。低速遠心分離を使用すると、ろ過性が、凍結濃縮を実施できないようなものであった。
【０１８５】
精密ろ過：微生物と浮遊粒子を分離するために、ジャガイモジュースを特別な孔サイズのメンブレン(0.1〜10μm)に通す。未処理のジュースを、約1〜3m/sの比較的高速度で、シートまたは管形態の半透膜に平行または接線方向の低〜中程度の圧力(約100〜400kPa)で通過させる。液体がメンブレンフィルターを通過することを可能にするために、処理装置には一般にポンプが取り付けられる。
-  高速遠心分離：20mLのジャガイモジュースを10,500gで10分間遠心分離した；
-  低速遠心分離：工業用ジャガイモジュース処理においてジャガイモジュースが一般的に受けるg力および滞留時間をシミュレートするために、ジャガイモジュースを2900gで1分間遠心分離した。
【０１８６】
分離機：ディスクスタック分離機は、高遠心力を使用して、1つの連続したプロセスで固形物を分離する。密度のより高い固形物がこのような力を受けると、回転ボウル壁に向かって外側へ押しやられる一方で、密度のより低い液相は同心の内層を形成する。特別なプレート(「ディスクスタック」)の挿入は、追加の表面沈降領域をもたらし、分離プロセスのスピードアップに寄与する。
ディスクスタック分離機は、4つの主要部を特徴とする。
1. 入口ゾーン：入口ゾーンは、ジュースを回転ボウルの速度にまで加速する。良好な入口設計はまた、発泡を防止し、産物における剪断力を減少させ、温度上昇を最小にし、かつボウル内で起こっている分離プロセスの乱れを回避する。
2. ディスクスタック領域：浮遊した(およびより重い)粒子は、ディスク間のスペースに運ばれ、同時に固形物排出部に集められる。
3. 液体排出部：脂肪を含まないジャガイモジュースは、分離されると、装置の頂部から分離機の外に運び出される。
4. 固形物排出部：取り除かれた固形物は、該マシンの底部で、この排出部から連続的に排出される。
【０１８７】
（表１）前処理と、対応する乾物含量(％)、総浮遊固形分(OD 620nm)および脂質含量(％)、ならびに凍結濃縮の実施可能性
2019506876.tif 000002
【０１８８】
実施例2：浮遊固形物の許容レベル
未処理のジャガイモジュースの効率的な凍結濃縮は、ジュース中の浮遊固形物が小さな氷結晶の除去を目的としたフィルターを詰まらせる、という事実によって妨げられる。少ないレベルの浮遊固形物は許容され得るが、レベルが高くなるにつれ、問題が大きくなる。濁度として表される浮遊固形物の許容レベルを、0.2バールの圧力差で40ミクロンのフィルター布に通したジャガイモジュースにおいて調べた。
【０１８９】
実施例1に記載した軟凝集ジャガイモジュースを、ジャガイモ「低温画分」(すなわち、軟凝集前に入手可能な、ある量のジャガイモジュース)と混合して、制御された量の浮遊固形物を含む混合物を形成した。これらの混合物を、VCP-80ポンプ(VWR社)により維持された0.2バールの圧力差で、直径55mmのブフナー漏斗を覆った40ミクロンのフィルター布(Sefar 07-40/25)に通した。フィルターが目詰まりするまでフィルター布に通した液体の量を、最大1リットルまで記録した。
【０１９０】
（表２）目詰まりするまで40ミクロンのフィルター布に通したジャガイモジュースの量に及ぼす濁度の影響
2019506876.tif 000003
【０１９１】
結果が示すように、TSSのレベルが増加すると、フィルターが目詰まりを起こす原因となる。当業者には理解されるように、フィルター多孔性の増加、ろ過助剤の添加、またはフィルターを連続的に洗浄する任意のタイプの操作によって、目詰まりを低減することができる。それでもなお、浮遊固形物のレベル上昇は、全ての場合に凍結濃縮プロセスの簡便性に悪影響を及ぼす。
【０１９２】
実施例3：脂質の許容レベル
ジャガイモジュース中の脂質の存在は、凍結濃縮の適用を不可能にする。ジャガイモの脂質は氷結晶の形成を妨害する傾向がある。多くても28g/kg乾物、好ましくはより少ない脂質として定義される、脂質フリーの状態では、凍結濃縮は、溶解したジャガイモ成分を含む水溶液の中に分散した氷結晶の「スラッシュ」をもたらす。水が氷の結晶にだんだんと凍結するにつれて、その液体はさらにいっそう濃縮される。
【０１９３】
対照的に、高レベルの脂質性物質が存在する場合、適切な氷スラッシュ/水系は形成されず、代わりに、もともとジュース中に存在する全ての成分を取り込んだ「アイスクリーム」様のテクスチャが形成される。
【０１９４】
この現象は、脂質の存在が「アイスクリーム」をもたらす一方で、脂質の不在が「シャーベット」タイプのアイスを生じさせるアイス製造の現象と類似しているようである。
【０１９５】
ジャガイモジュース中の脂質量の増加の影響は、規定の脂質含量を有するジャガイモジュース混合物で凍結濃縮を行うことによって判断された。これらの混合物は、実施例1に従って軟凝集により清澄化されたジャガイモジュースを、脂質が豊富なジャガイモ「低温画分」(すなわち、軟凝集前に入手可能な、ある量のジャガイモジュース)と混合することによって調製した。次いで、これらの混合物の30mLアリコートを、−20℃のエタノールで連続的に冷却したステンレス鋼ボウルに入れた。機械式トップミキサーを200rpmで作動させて撹拌を行った。得られた物質を目視検査により評価した。
【０１９６】
実施例4：脂質除去とその後の凍結濃縮によって得られた産物と既知の処理によって得られた産物との比較
実施例1の物質(この実施例では「サンプル1」と称し、「FC」と表示する)を、以下に記載するような、文献からの方法に基づいて製造された異なる調製物と比較した。
【０１９７】
サンプル2、「そのまま」のジャガイモジュース(PJ)：工業用デンプンジャガイモ塊茎(Solanum tuberosum ‘Seresta')を、おろし金を備えたキッチントップジューサー(Braun社)ですりおろした。デンプンと繊維を実質的に含まないジュースを「そのまま」使用した。
【０１９８】
サンプル3「GB」、Edens et al 1997 “Novel Food Composition” WO 97/42834に従うジャガイモタンパク質溶液：1500mLのジャガイモ実(fruit)ジュースに4.5gのCaCl2*2H2O (SigmaAldrich C3881)および2.7gのNa2HPO4*2H2O (Merck 1.06580)を添加して、5分間撹拌した。5M NaOH溶液を用いてpHを7.5に調整した。このジャガイモジュースを、6バケットのウィンドシールド(6-bucket windshielded)ローターを用いたMistrall 6000遠心分離機で4500rpm、1分間遠心分離することによって、粒子状物質を除いた。上清を回収し、10kDaポリエーテルスルホンMWCOメンブレン(Millipore社，PGLC 15005)を装填した限外ろ過ユニットを3バールで作動させて濃縮した。限外ろ過の後、濃縮物を200mg/LのNaHSO3 (Merck社, 1.06657)を含有する脱塩水で希釈し、1％w/vのタンパク質濃度に希釈したサンプルで透析ろ過に供した。得られたタンパク質溶液を凍結乾燥し、使用するまで周囲温度で保存した。
【０１９９】
サンプル4「PM」は、オランダのGasselternijveenにあるジャガイモデンプン工場から得られたProtamylasse (Avebe社)であった。Protamylasseは、ジャガイモジュースからタンパク質を凝固させた後に残るジュースの濃縮物である。
【０２００】
サンプル5「UL」および6「UL+AC」は、Batenburg et al 2015 “Potato derived flavor enhancing composition and method for the manufacture thereof”, WO2015000606に記載される方法に従って、活性炭処理あり(「UL+AC」)およびなし(「UL」)で、調製された。
【０２０１】
2kgの工業用デンプンジャガイモ(Gasselternijveenにあるジャガイモデンプン工場、Avebe社)を、おろし金を備えたキッチントップジューサーですりおろした。このジュースをNo.2焼結ガラスろ過器(Robu H11, ボロシリケイト)および再度S&S 595ブフナーろ過器(Schleicher & Shuell社, 311.611)でろ過した。この溶液をホットプレート上で8分間沸騰させ、沈殿物をろ過することによってタンパク質を除去した。ろ液を氷水で冷却して、そのまま保存する(サンプル5)か、または10g/LのNorit CA Plus活性炭で4℃にて一晩処理した(サンプル6)。活性炭の大半をS&S 595ブフナーろ過器でのろ過によって除去する一方で、微粒子を0.45ミクロンのフィルター(Pall社, PN AP-4438T)で除去した。
【０２０２】
サンプル7「フロックからの液体画分」は、特許出願EP 14183425.9の方法に従ってジャガイモジュースの軟凝集によって調製した。等容積の水で固形物を抽出して、該サンプルを得た。
【０２０３】
（表４）得られた産物と種々の公知の方法で得られた産物との比較
2019506876.tif 000004
a) 意味のあるレベルの遊離アミノ酸を含有しない、タンパク質に富むサンプル
b) アミノ酸レベルは、サンプル乾物1kgあたりのアミノ酸のグラム数として表される
c) CGA＝クロロゲン酸、ジャガイモに含まれる主なフェノール酸
d) HMF＝ヒドロキシメチルフルフラール、メイラード生成物の重要な指標
e) nd＝検出されない
【０２０４】
トータルカラーは、ジュースの諸成分のさらなる分解により比較的高いが、産物を凍結濃縮によって得た場合には、はるかに低い。
【０２０５】
熱処理されたジャガイモジュースは、グルタミンのレベルが低下し、ピログルタミン酸のレベルが増加する。さらに、熱に曝すと、初期のメイラード生成物であるフロシンが増加する。広範な熱処理により、検出可能なレベルのヒドロキシメチルフルフラール(HMF)が生じる。
【０２０６】
実施例5：エネルギー要件
ジャガイモジュース溶液の濃縮は、基本的に、液相を犠牲にしての固相の富化である。この分離は、主に機械的分離または相変化によって、多くの方法で達成することができる。相変化濃縮は、所与の溶液(水混合物)の温度を上昇または低下させることによって行われる。周囲条件で開始して、水を蒸発または凍結させることができる；しかし、これらの相変化に関連するエネルギー損失(一次エネルギーとみなされる)は、それぞれ、1barで2260kJ/kgおよび334kJ/kgである。
【０２０７】
それゆえに、加熱処理の主な欠点は、高いエネルギー消費、ならびに官能特性(色の変化、異臭の形成)および栄養特性の熱による劣化である。
【０２０８】
熱による濃縮
現在、タンパク質除去および55％の乾物含量までのジャガイモジュースの濃縮(protamylasseの生産)は、熱処理によって行われている。
【０２０９】
完全なタンパク質凝固および濃縮のために、高圧蒸気を用いてジャガイモジュースの温度を45℃から105℃に上昇させる。
【０２１０】
理論的計算は次の式を用いて行われている：
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[式1]
式中：
-  m＝質量流量(kg/h)；
-  Tp＝相転移温度(K)；
-  TdおよびTf＝それぞれ入口温度および出口温度(K)；
-  Cpfeed＝Tp未満の第1相の比熱容量(kJ/kg K)；
-  Cpconc＝Tpを超える第2相の比熱容量；
-  Cpvapor＝Tpを超える第2相の比熱容量；
-  ΔHp＝相交換の潜熱(蒸発の場合2260kJ/kg)。
【０２１１】
式1から得られた値は、出力の単位であるkJ/hで表される。この値に3600秒(1時間)を掛けると、エネルギー(kJ/sまたはkW)が得られる。
【０２１２】
凍結濃縮
同様に相変化プロセスであるので、式1はここでも当てはまる。清澄化したジャガイモジュースを15℃から−15℃にした(ΔT)。氷の熱容量(cpice)を適用した；圧力1バール、0℃で起こる水の相変化のΔHpは、334kJ/kgに等しい。凍結濃縮ユニットから出ていく濃縮されたジャガイモジュースは、55％乾物の最終濃度を有すると推定される。
【０２１３】
凍結濃縮のためのエネルギー消費の理論的計算は、水の蒸発および融解の2つのエンタルピー間の比率と、溶液が冷却されるときの温度差(ΔT)がより低いという事実のために、熱処理に対して88％のエネルギー減少値を示した。
【０２１４】
この設備の実際のエネルギー使用から導かれた特定のエネルギー消費量は、工業用蒸発設備と比較して凍結濃縮が64％のエネルギー節約を実現できることを示した。
【０２１５】
凍結濃縮技術では、主要なエネルギー消費を伴う構成要素は晶析装置(製氷機)である。その効率は、温度差だけでなく、滞留時間にも依存し、滞留時間は、このプロセスをエネルギー的に実現可能に保つために、せいぜい数秒でなければならない。このことが予冷システムを強く推奨する理由である。プロセス統合のための可能な解決策として、生成された氷は、それ以上の精製手順を必要としないため(氷の純度≧98％)、費用のかからない冷却媒体として使用することができる。
【０２１６】
実施例6：グルタミンとアスパラギンのグルタミン酸とアスパラギン酸への変換
アミノ酸アスパラギンおよびグルタミンは一般に風味のないものと見なされているが、うま味を付与するそれらの対応物であるアスパラギン酸およびグルタミン酸に商業的酵素製剤によって変換することが可能である。
【０２１７】
2つのそのような酵素製剤を取得した：DSM社からのPreventAseおよびAmano社からのSD-C100S。
【０２１８】
グルタミンを変換するための酵素の最適条件を人工ジャガイモジュースにおいて決定した。次いで、各酵素を適切な条件下で、タンパク質を枯渇させた濃縮ジャガイモジュースに適用し、その後、そのジュースをアミノ酸含量について分析した。
【０２１９】
人工PJは、クエン酸(Merck 1.00244)を6.3g/Lで、KCl (Prolabo 26759.291)を7.4g/Lで溶解し、pHを1M〜5M KOHで3、4、5、6および7の値に調整することにより調製した。グルタミン(Applichem A3734)をそれぞれ1.9g/Lまたは3.2g/Lの濃度で溶解した；これらの濃度はジャガイモジュース中の典型的なレベルに対応する。これらのサンプルに、酵素を0.1％(SD-C100S)または0.4％(Preventase)のレベルで添加した。これに続いて、24、31、42、48または60℃で30分間インキュベートした。0.10倍量の1M NaOHを添加して反応を停止させた。これらのサンプルの50μLアリコートを最終容量2.5mLに希釈し、ベルテロー(Berthelot)アッセイに導入した。この方法は、GlnまたはAsnをGluまたはAspに変換する際に放出されるアンモニアを検出するものである。100μLの希釈サンプルをマイクロタイタープレートに添加した。各ウェルに次のものを添加した：エタノール中の10％フェノールを20μL；5g/Lのニトロプルシドナトリウムを20μL；次亜塩素酸ナトリウム溶液1部と、20％クエン酸三ナトリウムおよび1％NaOHを含有する溶液4部から調製された酸化性溶液50μL。この反応を周囲条件下で進行させた後、形成されたカラー複合体を、640nmでの吸光度を測定することによって定量した。0〜100マイクロモル濃度の炭酸アンモニウムから検量線を作成した。
【０２２０】
両方の酵素の最適なpHおよび温度条件は等高線グラフで表示される。Amano物質には、pHと温度の両方で明確な最適条件が存在する。対照的に、DSM酵素は、温度には軽度にしか影響を受けないが、pHには強く反応する。
【０２２１】
タンパク質を除去した濃縮ジャガイモジュースにおいて、両方の酵素がアスパラギン酸およびグルタミン酸を産生する能力について試験した。
【０２２２】
150mLのジュースを4mg/LのPreventAse (DSM社)により周囲温度(約24℃)、pH6.0で処理した。アリコートを採取して酵素を導入し、1、2、24および48時間インキュベートした。1リットルのジュースを1mg/mLのAmano SD-C100SによりpH6.5、60℃で処理した。アリコートを採取して酵素を導入し、1、3および24時間インキュベートした。これらのサンプルを上記の方法に従って遊離アミノ酸について分析した。
【０２２３】
SD-C100Sはグルタミン酸のみを産生し、一方Preventaseはアスパラギン酸(速やかに)とグルタミン酸(よりゆっくり)の両方を産生する。
【０２２４】
（表５）PreventAse (pH6.0および周囲温度で4g/L)によるアスパラギンのアスパラギン酸への、およびグルタミンのグルタミン酸への変換。アミノ酸はg/kg乾物として表される。
2019506876.tif 000006
【０２２５】
（表６）Amano SD-C100S (pH6.5および60℃で1mg/L)によるグルタミン酸の形成
2019506876.tif 000007
【０２２６】
実施例7：RNAの5'-ヌクレオチドへの変換
ヌクレオチドの中で、5'プリンヌクレオチドである5'-AMP、5'-GMPおよび5'-IMPのみがうま味を与える。これらのヌクレオチドは、適切な酵素による核酸の酵素的分解によって産生される。好ましくない条件下では、内因性酵素は、核酸をうま味のない3'-ヌクレオチドに分解しうる。4種類の異なるタンパク質除去ジャガイモジュース濃縮物を調製して、Amano RP-1G (RNase, Amano社, 日本)にさらした。
【０２２７】
濃縮物は、実施例1に記載したように調製した軟凝集ジャガイモジュースから出発して、以下のように調製した：
濃縮物A： 5kDaメンブレンを用いた限外ろ過により、ジャガイモジュースからタンパク質を除去した。透過物を回収し、逆浸透により濃縮し、蒸発によりさらに濃縮した。
濃縮物B： 5kDaメンブレンを用いた限外ろ過により、ジャガイモジュースからタンパク質を除去した。透過物を回収して、蒸発により濃縮した。
濃縮物C： 混合モードのイオン交換樹脂にタンパク質を結合させることにより、ジャガイモジュースからタンパク質を除去した。タンパク質枯渇ジュースを回収し、逆浸透により濃縮し、蒸発によりさらに濃縮した。
濃縮物D： 混合モードのイオン交換樹脂にタンパク質を結合させることにより、ジャガイモジュースからタンパク質を除去した。タンパク質枯渇ジュースを回収し、逆浸透により濃縮し、凍結結晶化によりさらに濃縮した。
【０２２８】
全てのジュースの50mLアリコートをpH5.0に調整し、内因性酵素活性を不活性化するために95℃で10分間インキュベートした。それぞれの25mLを非インキュベート対照としてとっておき、残りの25mLを0.1g/LのAmano RP-1Gにより70℃で1時間処理した。これらのサンプルを凍結して、外部分析のために発送した。5'ヌクレオチドのレベルは、260および280nmでの二重波長検出を用いたShimadzu WAX-1カラムでのHPLCによって測定した。最も優勢な5'-ヌクレオチドは5'-IMPであり、表7に報告される。総5'プリンヌクレオチドの合計も同様に報告される。
【０２２９】
（表７）Amano RP-1Gで処理する前後の5'ヌクレオチド
2019506876.tif 000008
【０２３０】
メンブレン技術によって調製された濃縮物は、比較的低レベルの5'ヌクレオチドを示した。明らかに、これらのヌクレオチドの起源であるRNAは、限外ろ過メンブレンを通り抜けることができない。FC法は、最高量の5'ヌクレオチドをもたらし、また、ヌクレアーゼにさらした時にこれらのヌクレオチドの最大増加を示す。これにより、低温処理はRNAを重合形態で保持することが実証される。
【０２３１】
実施例8：温度および時間の関数としてのジャガイモジュース中の脂質の加水分解および酸化による劣化
脂質の分解の程度を、異なる温度で45分間にわたって測定した。簡単に説明すると、予冷したジャガイモ(4℃)をすりおろし、そのジュースを3℃の温度、22℃の周囲温度または37℃の処理温度でインキュベートした。工業規模での処理中のジャガイモジュースのすりおろし、取り扱いおよびポンプ輸送は廃熱(waste heat)をもたらすので、30〜40℃のジャガイモジュース温度は日常的に達成される。
【０２３２】
15、30および45分間のインキュベーション後、進行中の酵素反応を停止させかつ脂質抽出を容易にするために、ジャガイモジュースの5mLアリコートをクロロホルム(Merck 1.02445) 5mLとメタノール(Prolabo 20847.347) 10.5mLの混合物中に直接ピペットで入れた。この抽出はBligh & Dyerの方法に従って行った。最終抽出物を予め計量した試験管内で減圧下に蒸発乾固させ、このようにして回収された脂質性物質の量をSatorius分析天びん(1712型)で秤量することにより測定した。その後、回収された脂質性物質を、さらなる分析のためにヘキサン(Alfa Aesar 33321) 5mL中に再溶解した。
【０２３３】
リン脂質のレベルは、Rouserの方法(Rouser, G., Fleischer, S. & Yamamoto, A. (1970) Lipids 5, 494-496)に従って測定し、一方糖脂質のレベルはオルシノール法を用いて測定した。簡単に説明すると、脂質抽出物の100μLアリコートをガラス試験管内で蒸発乾固させた。200mgのオルシノール(SigmaAldrich 447420)を100mLの70％v：v硫酸(Merck 1.00731)に溶解した。この溶液2mLを各ガラス試験管に添加し、800℃で20分間インキュベートした。周囲温度まで冷却した後、Multiskan Go (Thermo Scientific社)で505nmでの吸光度を読み取り、グルコース(Merck 8337.0250)から作成した検量線と比較して糖脂質レベルを決定した。
【０２３４】
多価不飽和脂肪酸の一次酸化生成物であるヒドロペルオキシドは、Shanta and Deckerの方法によって推定した(Shanta, N.C and Decker, E.A, 1994, J. AOCS Int, 77, p421-4 “Rapid, sensitive, iron-based spectrophotometric method for determination of peroxide value of food lipids”)。簡単に説明すると、0.4M HCl中の0.132M BaCl2 (Prolabo 21716.266)を、同量の0.144M硫酸第2鉄7水和物(SigmaAldrich F7002)と混合することにより、チオシアン酸鉄(III)試薬の溶液を調製した。この溶液を同量の3.94Mチオシアン酸アンモニウム(Prolabo 21344.237)と混合した。ヘキサンに溶解した脂質性物質100μLを1.4mLのメタノール/n-ブタノール(Prolabo 20808.325)(1：1 v：v)に混合し、続いて15μLのチオシアン酸鉄(III)試薬を添加し、十分に混合した。20分後、510nmでの吸光度を読み取り、クメンヒドロペルオキシド(SigmaAldrich 247502)から作成された吸光度単位として表される検量線のそれと比較した。
【０２３５】
二次酸化生成物は、American Oil Chemists Society (AOCS, 2004, Official method Cd. 18-90: Official methods and recommended practices of the American Oil Chemists Society)の方法に従って、パラ-アニシジン値(pAV)を測定することによって推定した。この方法は、脂肪アルデヒド、特に不飽和の脂肪アルデヒドを検出するものである。より低いpAV値は、より少ない脂肪酸の分解・劣化を示すことが一般的に認められている。
【０２３６】
簡単に説明すると、ヘキサンに溶解した脂質抽出物1.7mLに20mMパラ-アニシジン(SigmaAldrich A88255)0.3mLを添加した。10分後に、ヘキサンブランクに対して、350nmでの吸光度を読み取った。これらの分析の結果を表8に報告する。
【０２３７】
（表８）ジャガイモジュース中の脂質の加水分解および酸化による劣化
2019506876.tif 000009
【０２３８】
表8に見られるように、劣化していない糖脂質およびリン脂質が、時間の経過とともに、特に高い温度で、劣化する。一次酸化生成物は、より高い温度ではやや高いレベルで存在するものの、それらのレベルは、全ての場合に、定量レベルよりも低い。対照的に、pAV値によって示される二次酸化生成物は、より高い温度で経時的に急速に増加する。
【０２３９】
実施例9：タンパク質枯渇ジャガイモ濃縮物/抽出物およびアスパラギン酸を富化したタンパク質枯渇ジャガイモ濃縮物/抽出物の味認識
タンパク質枯渇ジャガイモ抽出物によって、塩味、甘味、酸味、苦味の4つの基本的な味を強化または増強することができる。また、5番目の味であるうま味も、該ジャガイモ抽出物により強化され得る。さらに、機械味覚(mechano-taste)、痛み味覚(pain-taste)および温度味覚(thermo-taste)の感覚を高めることができる。ジャガイモ抽出物の正確な効果は、ジャガイモ抽出物が存在するマトリックス、およびマトリックス自体にどのような味が存在するかに依存する。水ベースと脂肪ベースとの区別、ならびに香味(savory)系と甘味系との区別がなされた。テイスティングは、5人または10人のパネルでブラインド(片側)にて行った。
【０２４０】
ジャガイモ抽出物を、ジャガイモ抽出物を有しない基準物と比較した表9から分かるように、多くの異なる感覚の組み合わせが存在する。感覚の大部分は、スパイス、チリ・ペッパー、セロリの存在など、基準物の初期組成に関連し、スパイシーさの増強が認識された。塩が存在するときはいつでも、特に他のスパイスやハーブがなければ、増強された塩味が認識された。このような味認識とは別に、クリーミーな食感、持続する味覚、ある特定の味、例えばチーズ、柑橘類、肉の味なども、ジャガイモ抽出物の存在下で増強された。アルコール飲料の場合には、より強いアルコール感覚を認識することができた。
【０２４１】
ジャガイモ抽出物をアスパラギン酸の富化されたジャガイモ抽出物と比較した表10から分かるように、味覚にはいくつかの傾向がある。ジャガイモ抽出物＋Aspは、ジャガイモ抽出物単独よりも甘味を増強し、これはうま味に寄与するアスパラギン酸に関連している可能性があり、うま味は甘味と塩味を強化する。うま味は、5'ヌクレオチドの存在下でさらに増強され得る。また、アスパラギン酸を含むジャガイモ抽出物は、ジャガイモ抽出物単独よりも特定の風味を高める。クリーミーな食感は、ジャガイモ抽出物で観察されたが、アスパラギン酸を含むジャガイモ抽出物ではより少ない。スパイシーさは、そのままのジャガイモ抽出物で、より強かった。
【０２４２】
（表９）甘味系または香味系における、水ベースまたは脂肪ベースであるいくつかの適用についての、ジャガイモ抽出物(x)に関する味覚(n＝5)
2019506876.tif 000010
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【０２４３】
（表１０）ジャガイモ抽出物(x)をアスパラギン酸の富化されたジャガイモ抽出物(o)と比較した味覚(n＝10)。いずれかの抽出物の記号が多いほど強い効果を示す。
2019506876.tif 000014
【０２４４】
実施例10：低温処理したジャガイモタンパク質の機能性
処理
新鮮なジャガイモジュース(PJ)を熱交換器で18℃に冷却し、軟凝集とその後の沈降による前処理に付した。残存するジュースを清澄化ジャガイモジュース(CPJ)と呼び、上記のように分離機で仕上げた。CPJは、620nmでの吸光度＜0.3および12g/kg乾物の脂質含量を有していた。
【０２４５】
CPJを実施例1に記載の方法による凍結濃縮技術によって約30重量％乾物(DM)にまで濃縮することにより、凍結濃縮した総ジャガイモ濃縮物(FC TPoC)を調製した。
【０２４６】
5kDaメンブレンカットオフを有するらせん状に巻いたKochメンブレンを備えた限外ろ過(UF)システムでCPJを濃縮することにより、凍結濃縮した総タンパク質濃縮物(FC TPC)を調製した。UFの保持液を、実施例1に記載した凍結濃縮技術(EFC separations)により約30重量％DMにまで濃縮した。
【０２４７】
5kDaメンブレンカットオフを有するらせん状に巻いたKochメンブレンを備えたUFシステムで脱塩水に対してCPJを透析ろ過することによって、凍結濃縮および透析ろ過した総タンパク質濃縮物(FC dTPC)を調製した。
【０２４８】
次いで、FC TPoC、FC TPCおよびFC dTPCを凍結乾燥(Sublimator 2x3x3， Zirbus Technology BV，プロセスパラメータ：低圧(0.05mbarの深真空)、低温凍結(−55℃))により乾燥させた。
【０２４９】
低温処理を用いないで、特許WO 2008069650 A1に記載のクロマトグラフィーを用いて調製された、TPI 1およびTPI 2と呼ばれる2種の総タンパク質分離物(TPI)、ならびに熱凝固総タンパク質分離物(オランダのAvebe社から入手可能なHC PI)を比較のために含めた。TPIを噴霧乾燥によって乾燥させ、HC PIをフラッシュ乾燥(flash-drying)によって乾燥させた。
【０２５０】
組成
得られたFC濃縮物は全てのジャガイモタンパク質を含有するが、プロセスに応じて総タンパク質含量が異なり、総タンパク質含量の差が、それらを総ジャガイモ濃縮物(TPoC)または総タンパク質濃縮物(TPCもしくはdTPC)にする。乾燥した濃縮物の組成、ならびにTPIおよびHC PIの組成は、表11に見出すことができる。
【０２５１】
機能性
いくつかのタンパク質機能性、例えば溶解性、乳化能力、およびゲル強度を試験した。
【０２５２】
溶解性
溶解性を測定するにあたって、50mLの5重量％タンパク質分散液を調製した(A)。次に、10mLを新しいチューブ(B)に移す。チューブ(B)を800gで10分間遠心分離し(Heraeus Mulitfuge 1S-R, Thermo Electron社)、上清を新しいチューブ(C)にデカントする。チューブC中の上清の乾物含量およびチューブA中のタンパク質分散液の乾物含量を、15分間、150℃に設定したハロゲン水分計(HR83, Mettler Toledo社)で測定した。その後、溶解性を、A中のDM％で割ったC中のDM％×100％として表す。
【０２５３】
乳化能力
乳化能力を測定するにあたって、NaCl 0.5gを含む2重量％タンパク質分散液50mLを調製した。タンパク質分散液のpHをHClで4.5に調整した。約100gのヒマワリ油(Butella)を加え、Ultraturrax (IKA T18デジタル)を10,000rpmで30秒間用いてプレエマルションを調製した。プレエマルションを予め秤量したHobartボウル(N50)に移し、計量し、次いで最高速度(3)でかき混ぜた；その間、ヒマワリ油を25rpmでポンプ(Easy-load Masterflex, Cole Parmer Instrument社)を用いて該ボウルに絶えず供給した。エマルションが崩れたらすぐに、ポンプを停止し、エマルションの重量を測定した。乳化能力を、粉末1gあたりの油の量(g)として算出する。
【０２５４】
ゲル強度
ゲル強度は、タンパク質ゲルの最大の力(N)を測定することによって決定した。ゲルを調製するために、脱塩水中の8重量％タンパク質分散液を調製した。そのpHをHClまたはNaOHで3.0または7.0に調整し、初期タンパク質溶液の導電率がはるかに高い場合を除き、導電率を11mS/cmまたは14mS/cmに設定した。タンパク質分散液を水浴中95℃で45分間加熱し、その後該分散液を冷蔵庫で一晩冷却した。翌日、ゲル強度を、5kgロードセルおよび10mm円柱形プローブを取り付けたテクスチャーアナライザー(Stable Microsystems社)で測定した。圧縮時の力は、距離8mm、予備試験速度1.5mm/sで測定し、試験速度は1.5mm/sであった。
【０２５５】
（表１１）熱凝固タンパク質分離物(HC PI)および2つの総タンパク質分離物(TPI 1および2)と比較した、凍結濃縮(FC)した総ジャガイモ濃縮物(FC TPoC)、凍結濃縮した総タンパク質濃縮物(FC TPC)、ならびに凍結濃縮および透析ろ過した総タンパク質濃縮物(FC dTPC)の組成および物理化学的性質
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【０２５６】
凍結濃縮サンプルは、HC PIおよび両TPIよりもタンパク質含量が低かったが、全ての凍結濃縮サンプルがHC PIおよびTPIよりもはるかに高い溶解性を有していた。溶解性は、産物の機能性にとって非常に重要な特性である。凍結濃縮サンプルの導電率は、透析ろ過されたものを除いて、10重量％の粉末濃度でHC PIおよびTPIのそれよりもはるかに高かった。導電率はサンプル中に存在するミネラルの指標であり、したがって、処理中に緩衝液、塩または他の溶媒が添加されなかったので、FCサンプルがジャガイモにもともと存在する多くのミネラルをまだ含んでいることを示している。TPIは、溶出緩衝液を使用して、ジャガイモジュースの流れからタンパク質を吸収させるクロマトグラフ処理によって調製された。そのため、TPIの導電率は非常に低く、ジャガイモの天然のミネラルバランスが乱されている。ミネラルバランスは、ジャガイモタンパク質の最終的な機能性に大きな影響を与える。
【０２５７】
図6は、HC PIおよびTPIの乳化能力(EC)に対する凍結濃縮物質のECを示す。全体として、凍結濃縮物質は、エマルションを全く安定化できなかったHC PIよりも高いECを有し、また、TPIよりも高いECを有していた。
【０２５８】
図7は、pH3で総タンパク質分離物と比較した凍結濃縮ジャガイモおよびタンパク質濃縮物の乳化能力(EC)を示す。
【０２５９】
同様な乾物含量で、凍結濃縮dTPCのゲル強度は、pH7およびpH3でTPI 1のゲル強度よりもはるかに高かった(図8)。HC PIは、いかなる濃度およびpHにおいてもゲルを形成しなかった。
【０２６０】
ゲル中の同様なタンパク質重量で、凍結濃縮dTPC、TPoCおよびTPCのゲル強度は、pH7でTPI(およびHC PI、図示せず)のゲル強度よりも高かった。pH3では、FC TPoCのゲル強度はゼロで、TPI 1よりも低いが、FC TPCおよびFC dTPCのゲル強度はTPI 1(およびHC PI)のゲル強度よりも高い。これらの特性は、広範囲の食品にとって興味深いものである。
【０２６１】
実施例12
タンパク質サンプルを、実施例1に沿って様々な前処理により調製した。タンパク質サンプルには、前処理されないサンプル、ならびに精密ろ過、低速遠心分離、および軟凝集によって調製されたサンプルが含まれていた。タンパク質分解の量を反映するカルボニル含量は、本質的にLevineらの方法に従って測定した(Levine R.L., Garland D., Oliver C.N., Amici A., Climent I., Lenz A.G., Ahn B.W., Shaltiel S., & Stadtman E.R. (1990) Methods Enzymol.; 186:464-78. “Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins.”)。
【０２６２】
各サンプルについて、4〜8mgのタンパク質物質を含むアリコートを1.8mLの1-プロパノール(A19902, Alfa Aesar社)で希釈して、残留脂質を可溶化し、タンパク質を沈殿させた。サンプルを超音波浴で5分間超音波処理し、エッペンドルフ遠心分離機で14000rpmにて5分間スピンダウンした。沈殿物を1.8mLの1-プロパノールでさらに2回洗浄し、10mMの2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH, 04732, Sigma Aldrich社)を含有する2M HCl 500μLに溶解した。得られた物質を、10分ごとに十分に混合しながら、暗所で1時間インキュベートした。各チューブに20％トリクロロ酢酸(T9159, Sigma Aldrich社)500μLを加え、氷上で10分間インキュベートしてタンパク質を沈殿させた。タンパク質を遠心分離によって回収し、エタノール(ProLabo 83804.360)と酢酸エチル(109623, Sigma Aldrich社)の1：1混合物1mLで2回洗浄して未結合試薬を除去した。タンパク質ペレットを、10分ごとに十分に混合しながら、37℃の6Mグアニジン/HCl(0287, VWR社)中で1時間インキュベートすることによって溶解させた。得られた溶液を遠心分離によって未溶解物質から分離し、吸光度を6Mグアニジン/HCl溶液に対して370nmで読み取った。カルボニル含量は、22000L mol-1 cm-1のモル吸光係数を用いて吸光度から計算した。沈殿工程におけるタンパク質損失を説明するために、最終タンパク質濃度をSprint分析(Sprint高速タンパク質分析装置, CEM社)によりグアニジン溶液中で測定した。結果を表12に示す。
【０２６３】
（表１２）タンパク質分解に対する前処理のタイプの影響
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【０２６４】
これらの結果から、凍結濃縮で分離した場合に、軟凝集はタンパク質分解が最も少なく、それゆえに最高品質の産物につながることが明らかである。
【０２６５】
実施例13：未変性のジャガイモタンパク質産物の組成および機能性(比較)
数種の未変性ジャガイモタンパク質産物が先行技術において知られている。本方法が化学的に異なるタンパク質産物をもたらすかどうかを評価するために、未変性のジャガイモタンパク質産物を得るための既知の手順に従って得られた産物を、本方法を用いて得られた産物と比較した。
【０２６６】
比較産物1：
WO 97/42834に従って調製された未変性ジャガイモタンパク質
200gのCaCl2・2H2Oを、200mg/Lの亜硫酸水素ナトリウムを含有する新鮮な工業用デンプンジャガイモジュース(Avebe社, Gasselternijveen)200リットルに添加した。この混合物を5分間撹拌し、その後、360gのNa2HPO4・2H2Oを加えて、さらに5分間撹拌した。20％NaOH溶液を用いてpHを7.5に調整し、この混合物を100L/hで分離機に通して沈殿物を上清から分離した。沈殿物を捨て、上清をKoch 5kDaメンブレンを備えた限外ろ過ユニットで最終量15リットルに濃縮した。この濃縮物を、9gの亜硫酸水素ナトリウムを含有する脱塩水45リットルを用いて透析ろ過し、この場合も最終量を15リットルとした。4リットルを凍結保存した一方で、11リットルを175℃の入口温度および75℃の出口温度を用いて噴霧乾燥して、オフホワイトの粉末を得た。この物質の遊離アミノ酸含量は12.8g/kg DMであった。
【０２６７】
比較産物2：
US 2010/0087628に従う未変性ジャガイモタンパク質
手順を若干変更した：200mg/Lの亜硫酸塩を沈降タンクに添加することにより、低〜中性pHの未変性ジャガイモタンパク質を調製し、次いでUS 2010/0087628の手順で使用される高pH条件に調整した。US 2010/0087628には濃縮工程または乾燥工程が報告されていないので、この実施例で他のタンパク質に用いられたのと同じ濃縮および乾燥条件を使用した。このような工程は、溶出液中のタンパク質濃度が低すぎてタンパク質機能性実験ができないために、必要である。
【０２６８】
EBAクロマトグラフィーは、工業用ジャガイモジュースをpH4.8に調整し、リガンド修飾アガロース-タングステンカーバイドCS174 EBA樹脂(Upfront Chromatography社, デンマーク)を充填したカラムに7ベッドボリュームを上向流で導入することにより行った。ベッドを20mMクエン酸緩衝液pH4.8で洗浄し、pH11の水酸化ナトリウム溶液を用いて溶出することによりタンパク質を回収した。タンパク質溶出液を5kDa限外ろ過ユニットで限外ろ過することにより濃縮し、それがさらに処理されるまでそれを安定化するために噴霧乾燥した。この物質を10％濃度で脱塩水に再溶解し、US 2010/0087628のNaOH溶出液と一致させるためにpH11に調整した。この物質を再び上記のように噴霧乾燥させた。この物質の遊離アミノ酸含量は2.4g/kg DMであった。
【０２６９】
比較産物3：
EP 1 920 662に従うEBAクロマトグラフィーによる未変性ジャガイモタンパク質
2つの商用グレードの未変性ジャガイモタンパク質分離物をEP 1 920 662に従って調製した：S200およびS300。
【０２７０】
簡単に説明すると、EBAクロマトグラフィーは、工業用ジャガイモジュースをpH4.8に調整し、リガンド修飾アガロース-タングステンカーバイドCS174 EBA樹脂(Upfront Chromatography社, デンマーク)を充填したカラムに7ベッドボリュームを上向流で導入することにより行った。ベッドを20mMクエン酸緩衝液pH4.8で洗浄し、pH3のギ酸緩衝液(S200)およびpH6.0の炭酸緩衝液(S300)で溶出することによりタンパク質を回収した。タンパク質溶出液を5kDa限外ろ過ユニットで限外ろ過することにより濃縮し、175℃の入口温度および75℃の出口温度で噴霧乾燥した。S200の遊離アミノ酸含量は3.2g/kg DMであり、S300の遊離アミノ酸含量は0.6g/kg DMであった。
【０２７１】
結果
上記の全ての比較産物についてカルボニル含量およびアミン含量を測定した。結果を表13に示す。
【０２７２】
（表１３）比較産物1〜3のアミン含量およびカルボニル含量
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【０２７３】
実施例14
実施例10に記載したTPoCおよびTPCタンパク質産物の機能性を、実施例13で概説したように調製された既知のタンパク質産物の機能性と比較した。機能特性としての溶解性および乳化能力は、ジャガイモタンパク質が分離プロセス中に分解された程度の指標である。以下の標準化されたプロトコルを用いて全てのサンプルについて溶解性と乳化能力を測定した。
【０２７４】
溶解性
タンパク質産物を1.0％の粉末で脱塩水中に導入し、溶解挙動を視覚的に評価しながら溶解するまで撹拌した。完全に分散または溶解したとき、pHを6.0に調整した。得られた液体を800gで5分間遠心分離した。上清を100mM NaOH溶液で10倍に希釈し、280nmと310nmの間の吸光度の差を測定することによってタンパク質濃度を決定した。溶解性は、未処理対照に対する遠心分離サンプルにおけるシグナルの百分率として表した。
【０２７５】
乳化能力
60gの2％タンパク質溶液を、卓上スターラーでタンパク質粉末を溶解することによって調製した。pHを1M HClでpH6に調整した。そのタンパク質溶液を120gのヒマワリ油とUltaturraxで10000rpm、30秒間混合することにより、プレエマルションを調製した。150gのプレエマルションをHobartミキサーに移し、最高速度で混合しながら、油を25の一定速度でエマルションに徐々に添加した。エマルションがその粘性を失ったときに油の添加を停止した。乳化能力(EC)は、添加された油の総量を、移したプレエマルション中に存在するタンパク質の量で割ったものとして表される。
【０２７６】
結果
生産されたタンパク質サンプルは、溶解挙動、溶解性および乳化能力において明確な差異を示した。さらに、異なる生産方法は、匂いに明白な差異を有する産物をもたらした。
【０２７７】
（表１４）異なる処理経路により生産された未変性ジャガイモタンパク質の性質
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EBA：拡張床(Expanding Bed)クロマトグラフィー；UF：限外ろ過；FC：凍結濃縮。TPoC：総ジャガイモ濃縮物；TPC：総タンパク質濃縮物；乳化能：タンパク質1gあたりに結合する油のグラム数として表される乳化能力。
【０２７８】
実施例15
本発明により得られた産物に対して一連の酵素的変換および処理工程を行い、得られた物質を、基本的な味および「好み」の評価のために10人の試験パネルに提供した。
【０２７９】
サンプル調製
軟凝集および凍結濃縮したジャガイモタンパク質産物を実施例1に従って調製した。約2リットルのジャガイモジュース濃縮物をプールして、pH6.04で42.6 Bxの単一バッチを形成した。このバッチを十分に撹拌し、1.0g/LのSD-C100S (Amano社, UK)を用いたグルタミナーゼ処理のための2つのアリコートに分割した。1つのバッチを周囲温度(20〜25℃)に保ち、1つをグルタミナーゼと共に60℃でインキュベートした。サンプルを24時間後に回収し、周囲温度まで冷却した。
【０２８０】
次いで、これらのサンプルを2つのアリコートに分割し、そのうちの1つをインキュベートしない対照として取っておき、他方を周囲温度で24時間、1.0mLのアスパラギナーゼ(PreventAse L, DSM社, NL)と共にインキュベートした。全てのサンプルを4重量％の濃度で味見した。変換の程度は、「アミノ酸含量の測定」の箇所に記載したアミノ酸分析によってチェックした。変換は、アスパラギナーゼ処理について完全であり、グルタミナーゼ処理についてはほぼ完全(98％を超える)であった。
【０２８１】
味覚テスト
従業員ボランティアのパネル(n＝10)をつくって半訓練(semi-trained)味覚研究を行った。訓練は、メンバーを味に慣れさせ、かつ個々の味の味覚閾値を含めた個人のテイスティング能力の傾向を知るための、さまざまな濃度での基本的な味の事前テイスティングを含んだ。パネルメンバーは、味および味覚強度の採点法について指導と訓練を受けた。10名全てのパネリストがこの研究をやり終えた。
【０２８２】
体系的なプロトコルは、味覚アイテムの官能プロファイリングのためのEyeQuestion (EyeQuestionソフトウェア，バージョン3.15.1)において開発された。サンプルをブラインドテスト(個々のパネリストへの無作為サンプルを含む)として提供した。サンプルの順序は、パネル全体の平均最終結果において前のサンプルからの味の「持ち越し」を避けるために、各パネリストで異なっていた。
【０２８３】
全てのサンプルを等級付けするためのオンラインフォームを提供し、専用ソフトウェア(EyeQuestion)で自動化した。EyeQuestionにおいてVAS(視覚的アナログスケール)で味覚を評価した。VASでは味を0〜100の連続的尺度で評価し、0は味なしであり、100は最大の味である。サンプルを甘味、塩味、酸味、苦味、うま味の基本的な味覚特性で評価した。さらに、味の「好み」を−30〜＋30の尺度で評価し、マイナスのスコアは「嫌い」を示し、プラスのスコアは「好き」を示す。
【０２８４】
結果
（表１５）
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【０２８５】
酵素処理は、いくつかの方向でジャガイモアミノ酸濃縮物の味覚印象を変えた。苦味はあまり影響されなかったが、グルタミナーゼ処理は該物質のうま味を高めた。塩味も同様に増加したが、比較的程度は低かった。この増加はサンプル中に既に存在する塩の量と比較して控えめである。
【０２８６】
アスパラギン処理は、酸味の認識を高め、甘味の知覚を低下させ、また、うま味を増加させたが、グルタミン処理ほどではなかった。それにもかかわらず、アスパラギナーゼ処理は、グルタミナーゼ処理よりもはるかに強く該物質の「好み」を増加させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019506876.tif 000027
【図９】
2019506876.tif 000028
【図１０】
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【国際調査報告】
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