(57)【要約】  本発明は、卵母細胞中のミトコンドリアマイクロインジェクションの方法に関する。本方法は、卵母細胞中のマイクロインジェクションのための哺乳動物ミトコンドリアを単離してそのミトコンドリア活性を増加させることを含む。マイクロインジェクトされるミトコンドリアは、哺乳動物血小板から単離し、マイクロインジェクション前に好ましい培地中でインキュベートすることができる。本発明の方法から得られるミトコンドリアがマイクロインジェクトされる卵母細胞は、本明細書に開示の方法を体外受精手順と同時に使用する場合、より高い率の受精および胚盤胞形成を有することが示される。本発明は、一般に、卵母細胞中のミトコンドリア活性の欠損を治療する方法、哺乳動物血小板からミトコンドリアを単離する方法、および／または卵母細胞中のマイクロインジェクションのためのミトコンドリアを調製する方法に関する。
2019500395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵母細胞中のミトコンドリア活性の欠損を治療する方法であって、
哺乳動物から卵母細胞を抽出するステップ；
前記哺乳動物の血小板から複数のミトコンドリアを単離するステップ；
前記複数のミトコンドリアを、前記哺乳動物の前記卵母細胞中にマイクロインジェクトするステップ；および
マイクロインジェクトされた前記卵母細胞の体外受精を実施するステップ
を含み、前記受精卵母細胞は、改善された胚盤胞形成の率を示す方法。
【請求項２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ミトコンドリアを培地中でインキュベートしてそれらのＡＴＰ産生および／または全体的なミトコンドリア機能もしくは生合成を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
体外受精手順と同時に実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物血小板からミトコンドリアを単離する方法であって、
哺乳動物から血液試料を抽出するステップ；
前記血液試料に抗凝固剤を添加するステップ；
前記血液試料を遠心分離して血小板ペレットを得るステップ；
血小板不活性を維持する緩衝液中で前記血小板ペレットを懸濁させるステップ；
前記血小板を遠心分離して前記緩衝液からそれらを分離するステップ；
前記分離された血小板を第１のミトコンドリア単離試薬中で懸濁させて混合物を形成し、前記混合物をボルテックスに供するステップ；
第２のミトコンドリア単離試薬を添加し、前記混合物をボルテックスに供するステップ；および
第３のミトコンドリア単離試薬を添加し、前記混合物を遠心分離して精製ミトコンドリアのペレットを得るステップ
を含む方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗凝固剤が、クエン酸デキストロースである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記血小板不活性を維持する緩衝液が、プロスタグランジンＥ−１を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のミトコンドリア試薬が、ミトコンドリア単離試薬Ａであり、前記第２のミトコンドリア試薬が、ミトコンドリア単離試薬Ｂであり、前記第３のミトコンドリア試薬が、ミトコンドリア単離試薬Ｃである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
体外受精手順と同時に実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
卵母細胞中のマイクロインジェクションのためのミトコンドリアを調製する方法であって、
哺乳動物血小板から複数のミトコンドリアを単離するステップ；
前記複数のミトコンドリアを、０．２マイクロモル〜２０マイクロモルの濃度におけるＬ−カルニチンを含む培地中で２０〜６０分間インキュベートするステップ
を含み、
インキュベートされた前記ミトコンドリアは、増加したＡＴＰ産生および／または全体的なミトコンドリア機能もしくは生合成を示す方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物血小板を、ヒトから得る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｌ−カルニチンが、２０マイクロモル濃度を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記インキュベーションの持続時間が、６０分間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
体外受精手順と同時に実施する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロインジェクトされる哺乳動物卵母細胞中のミトコンドリア活性を増加させるための哺乳動物卵母細胞中へのミトコンドリアマイクロインジェクションの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアゲノムは、点突然変異および再配列、特に欠失の蓄積を介して加齢に伴って劣化することが公知である。核ＤＮＡと比較したミトコンドリアＤＮＡ（「ｍｔＤＮＡ」）の急速な劣化は、ミトコンドリア中のヒストンの不存在に関連し得ることが仮定されている（Ｋｉｔａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｖａｒｉｅｓ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏ，４９（４）：７３０−６，１９９３）。いずれにしても、ｍｔＤＮＡの突然変異率は、核ＤＮＡのものの１５〜２０倍であると推定される（Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｖｉｎｅ  ＡＴＰ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  β  Ｓｕｂｕｎｉｔ：Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｕｓｔａｉｎ  Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ  Ｔｉｍｅｓ  Ｍｏｒｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１２：８１−９０，１９８７）。ヒト卵母細胞における説得的証拠は、突然変異ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の蓄積（Ｓｕｇａｎｕｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ，Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  ３９：１６−２１，１９９３；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｒｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｏｃｙｔｅｓ，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５７：２３９−２４７，１９９５；Ｋｅｅｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ａｇｉｎｇ  ｉｎ  Ｗｏｍｅｎ，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，６４（３）：５７７−５８３，１９９５；Ｗｉｌｄｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １６：９０９−９１７，２００１）と関連する相当の加齢に伴う不全を示唆している（Ｆａｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｇｇ  Ｄｏｎｏｒ’ｓ  Ａｇｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒ  Ｐｒｉｏｒ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｏｎ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  Ｏｕｔｃｏｍｅ，Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６８：３７０−３７２，１９９７；Ｊａｎｓｅｎ，Ｏｌｄｅｒ  Ｏｖａｒｉｅｓ：Ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｅｄ  Ｊ  Ａｕｓｔ  １６２：６２３−６２４，１９９５）。
【０００３】
ヒト卵母細胞は、年齢にかかわらず、その妊娠潜在性が大きく変動する。卵母−精子合流の５回のうち約１回のみが、発育し得る妊娠をもたらす（Ｅｄｍｏｎｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅａｒｌｙ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｗｏｍｅｎ，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ３８：４４７−４５３，１９８２）。これは、少なくとも部分的には、年齢にかかわらずヒト卵母細胞中で見出される異数性染色体の高い割合に起因すると考えられる（Ｒｏｎｇ−Ｈｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ  Ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｒｅｓｔｅｄ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ８１：９１２−９１８，２００４）が、この異数性の原因は不明である。加齢に伴う異数性が産生される機序（メカニズム）は、酸化ストレスの上昇、ＡＴＰ産生の減少、および活性酸素種の増加に依存的であることが示唆されており（Ｓｃｈｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｎｏｎ−Ｄｉｓｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｏｃｙｔｅｓ：Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ？  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  １５（Ｓ２）：１６０−１７２，２００４；Ｂａｒｔｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｈｙ  Ｄｏ  Ｏｌｄｅｒ  Ｗｏｍｅｎ  Ｈａｖｅ  Ｐｏｏｒ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅｓ？  Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｊ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ  ２１：７９−８３，２００４）、それらの全てはミトコンドリア欠損の結果である。
【０００４】
体外受精（ＩＶＦ）受療は、（１）受精なし、（２）移植に好適な発達段階前の停止、または（３）着床および移植後の妊娠の樹立の不成功により表現することができる卵母細胞不全を示す。形態学的研究は、不適切なミトコンドリアが未授精卵またはヒト発達停止と関連することを示唆している（Ｈｅｎｇ−Ｋｉｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ  Ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｒｅｓｔｅｄ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０４２：１７７−１８５，２００５）。１９９０年代後半において、推定正常卵母細胞から欠陥卵母細胞への異種細胞質移植によりこのような停止を補正することが試みられた。この手順からのいくつかの成功例が報告された（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｒｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｆａｎｔ  ａｆｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ａｎｕｃｌｅａｔｅ  Ｄｏｎｏｒ  Ｏｏｃｙｔｅ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｉｎｔｏ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  Ｅｇｇｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ３５０：１８６−１８７，１９９７；Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｍａｔｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｏｃｙｔｅｓ，Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ４：２６９−２８０，１９９８；Ｓｃｏｔｔ，Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｏｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  １６ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｎ  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９８）。
【０００５】
５パーセント未満の卵細胞容積のインジェクトにもかかわらず、この卵細胞質移植手順を使用して１９９０年代後半に出生した３０人の新生児の２人から血球を採取した場合、ミトコンドリアの約３分の１がドナー卵に由来することが見出された。２００２年５月９日、ＦＤＡ  諮問委員会は、卵細胞質移植手順を考察するためのパブリックミーティングを催した。ＦＤＡは、生殖系列を変更する潜在性、ミトコンドリアヘテロプラスミーと関連する医学的リスク、ある研究において報告される胎児におけるターナー症候群の高い発生率（１３例の妊娠報告の２例）、およびデータの不足を引用してこの「デファクト生殖系列遺伝子移植」技術に関する懸念を表明した。ＦＤＡは、異種ｍｔＤＮＡの混合を懸念し、この手順を禁止した（Ｓａｎｔｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｒｅｆｌｅｃｔｓ  Ｏｏｃｙｔｅ  Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｕｔｃｏｍｅ，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  ８５：５８２−５９１，２００６）。
【０００６】
これにもかかわらず、２００１年、および２００４年においても、中国のＴｚｅｎｇらは、標準的なＡＲＴ手順により繰り返し妊娠し得なかった女性における良好な妊娠および生児出生をもたらす自己卵丘顆粒膜細胞から卵母細胞中へのミトコンドリアの移植を報告した。同様に、Ｋｏｎｇらは、ヒト卵母細胞中への顆粒膜細胞ミトコンドリアの移植を報告した。２００７年の刊行物において、Ｙｉらは、若齢および高齢マウスからの受精卵中への肝ミトコンドリアの注射が胚発達を改善することを報告した。
【０００７】
しかしながら、これらの研究は全て様々な欠点がある。報告は、ほとんど実験的な詳細を有さず、それにより評価も裏付けも不可能でないにしても困難になり、または最初の報告から数年が経過しているにもかかわらず、それらは論文審査のある学術誌に公開されておらず、またはそれらは他の技術よりもいかなる良好な結果も示していない。さらに、老齢顆粒膜または肝細胞は低減した機能および質を有し、実際、増殖するように刺激される休止状態の老齢顆粒膜細胞は、卵母細胞よりも高レベルの突然変異ｍｔＤＮＡを有すると予測することができる。これにもかかわらず、実験研究は継続している。例えば、要約表題「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｏｏｃｔｙｅｓ  ｍａｙ  ｂｅ  Ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｂｙ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」のポスターが、２０１２年４月にサンディエゴで開催されたＡＳＢＭＢの学会において提示された。
【０００８】
ある参照文献、米国特許第８，９９９，７１４号明細書は、全てが母性遺伝子関連細胞に由来する外因性ミトコンドリア、外因性ミトコンドリアＤＮＡ、細胞核のＤＮＡ、または外因性細胞核であり得る少なくとも１つの外因性細胞構成成分を、真核細胞に提供することによる真核細胞の改変を記載している。「母性遺伝子関連」は、真核細胞の対象資源の母親、生物学的なシブリング、姉妹の子、または母親の姉妹の子を意味する。ミトコンドリア補充による補給または補完は、（例えば、加齢または疾患に起因して）呼吸能が減弱している細胞のための治療法の基礎を提供する。母性遺伝子関連細胞は、血球、筋細胞、神経細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、幹細胞、多能性細胞などであり得る。机上の実施例は、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象中への幹細胞の自己移植前のドナーミトコンドリアの最小侵襲資源として血小板の使用を示唆している。しかしながら、ミトコンドリア資源としての母性遺伝子関連細胞の使用は、卵母細胞がそのミトコンドリアＤＮＡのヘテロプラスミーを示すリスクを上昇させる。
【０００９】
しかしながら、この分野における従来の研究の全ては、哺乳動物卵母細胞中でミトコンドリア活性を回復させる効率的な方法を提供することができず、その結果、ミトコンドリアヘテロプラスミーなどの合併症を回避しながら、それらは受精することができず、良好な胚盤胞形成を受けることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本明細書に開示される例示的実施形態の目的は、当分野における欠点を緩和し、ミトコンドリアヘテロプラシー（ｈｅｔｅｒｏｐｌａｓｙ）を予防する一方、マイクロインジェクトされる卵母細胞が良好な受精および胚盤胞形成を受けることを可能とする卵母細胞中へのミトコンドリアマイクロインジェクションの方法を提供することである。
【００１１】
本明細書に開示される例示的実施形態の別の目的は、卵母細胞中へのマイクロインジェクションのために哺乳動物血小板からミトコンドリアを効率的に抽出する方法を提供することである。
【００１２】
本明細書に開示される例示的実施形態のさらに別の目的は、ミトコンドリア機能および／または生合成を増加させる培地中でのインキュベーションを介してマイクロインジェクションのために抽出ミトコンドリアを調製する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のより完全な理解およびそれに付随する利点の多くは容易に得られる。それというのも、添付の図面と結び付けて考慮する場合、以下の詳細な説明を参照してそれらがより良好に理解されるためである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】対照および疑似マイクロインジェクションと比較した１０ピコリットルの精製ミトコンドリアのマイクロインジェクション後のＡＴＰレベルを示す。
【図２】使用された蛍光顕微鏡観察およびそれぞれの処理（対照、疑似、マイクロインジェクト）後の個々の卵母細胞の評価されたＡＴＰレベルを、顕微鏡観察の画像およびその代表的なグラフを含めて示す。
【図３】異なる濃度のＬ−カルニチンが補給されたインキュベーション緩衝液中での２０または６０分間の精製ミトコンドリアのインキュベーションの効果を示す。
【図４】自己ミトコンドリアマイクロインジェクションを用いてまたは用いずに体外受精（ＩＶＦ）により受精させた高齢ハムスター卵母細胞および後続の胚盤胞段階への発達の比較を示す。
【図５Ａ】ミトコンドリア内膜感受性色素ＪＣ−１（２μＭ）により染色させた血小板を示す（６３０倍の倍率）。
【図５Ｂ】図５Ａに見られるものと同一の血小板試料の一部の３１５０倍の倍率を示す。
【図５Ｃ】化合物ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン）による、図５Ａおよび５Ｂにおいて使用される同一の血小板調製物の一部の処理を示す。
【図６Ａ】血小板の活性を実証するためにＦｌｕｏ−４（３ｕＭ）により処理された、開示の精製法からの血小板を示す。
【図６Ｂ】Ｆｌｕｏ−４により染色されたが、２ｍＭの塩化カルシウム（追加のカルシウムイオンを提供するため）および十分なカルシウムイオンの存在下でイオノフォアＡ２３１８７（血小板活性化を刺激する化合物）により処理された開示の精製法からの血小板を示す。
【図７Ａ】血小板調製手順から調製された血小板タンパク質抽出物中のＣＤ４２ｂについてのウェスタンブロットを示す。
【図７Ｂ】血小板調製手順からのＣＤ４２ｂ（血小板特異的タンパク質）についてのウェスタンブロットおよびタンパク質グルコホリンＣＤ４５（白血球特異的タンパク質）についての別のウェスタンブロットを示す。
【図８】開示の精製法からの精製ミトコンドリア中のミトコンドリアＤＮＡの存在を実証するためのＰＣＲ増幅を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本実施例において説明される本発明の好ましい実施形態の説明において、明確性のため、規定の専門用語を用いる。しかしながら、本発明はそのように選択される規定の用語に限定されるものではなく、それぞれの用語は類似の目的を達成するために類似の様式で機能する全ての技術的等価物を含むことを理解すべきである。本発明のいくつかの好ましい実施形態が説明目的のために記載され、本明細書において具体的に概略されていない他の形態で本発明を具体化することができることが理解される。
【００１６】
本発明は、体外受精患者自身の血小板からのミトコンドリアが、その患者のエネルギー欠損卵母細胞の受精能を改善するために必要とされる「余分の」エネルギーを提供し得るという認識と、血小板が効率的に「若齢」ミトコンドリアを提供するという認識との組合せ、高齢患者または老齢実験動物からの血小板がその同一患者からの筋生検物が高レベルの突然変異ｍｔＤＮＡを有する場合であっても、それらのミトコンドリア中で欠陥ｍｔＤＮＡをたとえ有するにしてもほとんど有さないという観察により支持される結論に基づく。
【００１７】
任意の細胞が加齢するにつれ、それは、その機能に有害な変化を受ける。酸化損傷および損傷タンパク質蓄積は、エネルギー産生ミトコンドリアの劣化とともに生じ得る。女性およびその卵母細胞が加齢するにつれ、正確な細胞機能についての潜在性は減少し、適切な受精、胚成熟、および着床の機会の可能性が低くなる。ｍｔＤＮＡの複製は、多くの種、例として、哺乳動物において卵母細胞成長全体にわたり生じるが、卵母細胞が加齢するにつれ、ミトコンドリアは、ＡＴＰを生成する細胞小器官の能力を低減させ得るｍｔＤＮＡ点突然変異および欠失を蓄積する一方、活性酸素種（ＲＯＳ）のその産生も増加させる。
【００１８】
減数分裂において一時停止する卵母細胞は活性細胞よりも少ない資源を要求するため、ミトコンドリアはそれほど多くの複製を必要とするわけではなく、活性酸素種の損傷のより多くの機会を与え、したがってｍｔＤＮＡ損傷の潜在性を増加させる。ミトコンドリアの複製は細胞の複製に非依存的であり、細胞の代謝要求に応じてどんな時にも生じ得る。ｍｔＤＮＡは複製し、ミトコンドリアは２つに分裂する。変更ｍｔＤＮＡ、例えば、欠失ｍｔＤＮＡが卵子の年齢とともに増加する場合、ＡＴＰ含有率の相対的減少が見られるはずである。それというのも、欠失ｍｔＤＮＡは正常ｍｔＤＮＡに対して機能的に優勢であり得るためである。このＡＴＰの減少は、エネルギーの欠落に起因して生化学的活性を実行する細胞の能力を大幅に制限する。
【００１９】
さらに、これらの減弱したミトコンドリアは、ミトコンドリア機能をさらに制限する老齢卵母細胞中の活性酸素種のレベルの増加に寄与する。ミトコンドリア機能の低減の全体的効果は、老齢卵母細胞の妊娠潜在性（受精能）の減少である。結果は、良好な受精の率を低減させるだけでなく、例えば、染色体異数性の増加に寄与する異常な受精の率も増加させる。
【００２０】
ＡＴＰ産生の量のいかなる降下も、潜在的に、ミトコンドリアの特異的機能、例えば、膜輸送、栄養素合成、および機械的作用に対して極端な効果を有する。具体的には、ＡＴＰの欠落は、完全に発達または着床する卵母細胞の不能性を担い得る。ＲＯＳのレベル増加は細胞およびそのミトコンドリアに対する有害作用を引き起こし得、したがって細胞機能にも影響する。細胞がその防御機序により不活性化し得るレベルを超過するＲＯＳの量は、細胞膜破壊、ＤＮＡ突然変異、およびフリーラジカルのいっそうさらなる蓄積も引き起こし得る。これらのフリーラジカルから過酸化脂質が形成される場合、それらは細胞膜の統合性を変更し得る。ミトコンドリア内膜が破壊される場合、酸化的リン酸化およびしたがってＡＴＰ合成が完全な細胞（卵母細胞）機能に必要な速度において生じ得なくなり得る。研究は、細胞膜の過酸化脂質がミトコンドリア損傷をさらに増加させるＣａ＋＋浸透性の増加を引き起こすことも示している。最後に、活性酸素種はｍｔＤＮＡのすぐ近くで産生され、ｍｔＤＮＡ欠失および老齢卵母細胞中で見出される他の形態の酸化ミトコンドリアＤＮＡを担うと仮定されている。
【００２１】
次いで、点突然変異または欠失の形態のこれらの突然変異は細胞から細胞に継続されることが許容される。ミトコンドリアは、細胞自体の分裂なしで細胞のエネルギー要求に従って必要により分裂する。老齢卵母細胞は減数分裂において一時停止して最大４０年間休止するため、それは上昇レベルのｍｔＤＮＡ欠失を有する。それというのも、それは多くのストレスに対処し、その寿命においてさらに多くのミトコンドリア複製を受けているためである。精子とは異なり、ヒト卵母細胞はその女性保有者と同一の暦年齢である。卵母細胞は最大５０年間、第１減数分裂において一時停止したままであり、したがってｍｔＤＮＡ突然変異（欠失、点突然変異、再配列など）の蓄積に起因してミトコンドリア機能不全の増加を示し得、次いでそれがＡＴＰの産生およびフリーラジカルの蓄積をもたらす。
【００２２】
本発明は、上記のとおり、血球の急速なターンオーバーが「若齢」ミトコンドリア、すなわち、異常をほとんど有さず、または有さないミトコンドリアを有するそのような血球を効率的に維持するという認識に基づく。したがって、血小板は「若齢」ミトコンドリアの資源であり得、ＡＴＰを作製する能力の増加をもたらし、したがってインジェクトされる卵母細胞のエネルギー容量を改善し、その卵の妊娠潜在性を改善する。さらに、欠陥または老化卵母細胞を有するその同一の患者の血小板からミトコンドリアを得ることは、ミトコンドリアおよび卵母細胞が同種起源であることを意味する。
【００２３】
以下、実施例１に説明されるとおり、ｍｔＤＮＡ欠失が加齢ハムスター卵母細胞中のＡＴＰ含有率の減少およびＲＯＳレベルの増加をもたらすことを示すことができる。
【実施例】
【００２４】
実施例１
それぞれのハムスター群からの２０μｌの卵母細胞細胞溶解物容量に対して定量ＰＣＲを実施して老齢ハムスター卵母細胞中でｍｔＤＮＡ欠失が存在するか否かを確認する。Ｔａｎｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）により設計されたプライマーを使用して野生型および欠失ｍｔＤＮＡの両方を増幅させる。プライマーの２つのペア（ＰＬ４８／ＰＬ４７およびＰＬ５１／ＰＬ５２）（同文献）を使用して若齢のものよりも高齢の生殖的に老齢なハムスター卵母細胞中の欠失ｍｔＤＮＡのより大きい検出を実証する。野生型および欠失ｍｔＤＮＡを定量するため、２つの標準曲線を構築する。ＰＣＲによる正常ｍｔＤＮＡ試料に由来するものを、全ｍｔＤＮＡの分析に使用する。欠失ｍｔＤＮＡのためにＤＮＡテンプレートを使用する。欠失および野生型ｍｔＤＮＡのレベルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）により定量される放射能により測定する。発光（放射能に比例）のレベルを既知量の標準ＤＮＡに対してプロットして回帰直線（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｎｅ）を作成し、それからそれぞれの試料中の特異的ＰＣＲ産物の含有率を計算する。欠失ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとの比を計算する。欠失ｍｔＤＮＡと野生型ｍｔＤＮＡとの比を、それぞれの試料からのＡＴＰおよびＲＯＳ含有率と比較する。
【００２５】
ＡＴＰ分析に必要とされる５０μｌを取り出した直後、残りの細胞溶解物をその冷凍保存チューブ中で再冷凍する。次いで、その残りの細胞溶解物の５０μｌを解凍し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０５Ｃ；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，ＮＨ，ＵＳＡ）を使用してＨ２Ｏ２の計測に利用する。Ｓｉｇｍａ製のルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）をプローブとして使用する。この容量をガラスチューブ中に装入し、ルミノメーター中で５分間平衡化させる。バックグラウンド化学発光をモニタリングする。次いで、ルミノールを添加し、化学発光を１５分間モニタリングする。結果を、ルミノール添加前およびルミノール添加５、１０、１５分後の総合の１分当たりのカウント数（ＣＰＭ）間の差（デルタ値）として表現する。
【００２６】
以下、実施例２に説明されるとおり、ミトコンドリアは、若齢（２ヵ月齢）ハムスター卵および高齢（１４〜１８ヵ月齢）ハムスター卵中に良好にインジェクトすることができ、（１）蛍光標識および透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）により測定されるとおりインジェクション後に存在すること、ならびに（２）ＡＴＰを正常レベルにおいて産生するように機能することを示すことができる。
【００２７】
実施例２
ドナー雌ハムスターから取り出された０．５〜１．０ｍｌの血液試料中のミトコンドリアを、ｉｓｏｌｙｍｐｈを介して遠心分離により単離し、ミトコンドリア特異的色素であるＭｉｔｏＦｌｕｏｒ  Ｒｅｄにより標識することによりタグ付けする。この長波長蛍光発光色素のＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ５９４は、Ｈｅ−Ｎｅレーザの５９４スペクトル線による最適な励起のために設計されている。ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ５９４色素を使用して生存細胞を染色し、それは酸化的リン酸化に積極的に関与するミトコンドリアの尺度である適切な膜電位を有する細胞小器官内で濃縮される。ＭｉｔｏＦｌｕｏｒによりタグ付けされた精製ミトコンドリアを、ドナー雌ハムスターから取り出された卵母細胞中にマイクロインジェクトする。対照卵母細胞には、等容量のミトコンドリアインキュベーション培地をインジェクトする。次いで、処理卵母細胞中のタグ付けされたミトコンドリアを共焦点顕微鏡観察およびＴＥＭ観察する。ミトコンドリア密度を対照および処理卵母細胞中で測定して有意な活性ミトコンドリア分裂の存在または不存在を評価する。次いで、ＴＥＭに使用されない処理および対照卵母細胞を回収し、ＡＴＰおよびＲＯＳレベルを測定する。
【００２８】
以下、実施例３に説明されるとおり、ミトコンドリアがインジェクトされた卵母細胞は、老齢ハムスターの子宮内で良好に受精および着床させることもでき、それらの着床後の胚からのミトコンドリアを有する正常ハムスター仔およびＡＴＰを正常レベルにおいて産生するように機能し、ドナー／レシピエント母親に由来するｍｔＤＮＡのみを有する同種の胎児への発達をもたらす。
【００２９】
実施例３
ミトコンドリアがインジェクトされた卵母細胞をドナー精子と受精させ、受精卵を体外で胚盤胞段階まで培養する。得られる胚盤胞を元の卵母細胞を取り出した雌ハムスターの子宮に移植して戻し、オリジナルの卵母細胞は片側だけで取り出され、残留卵巣が発育可能な妊娠の維持において適切に機能することを可能とする。Ｓｗａｎｓｏｎにより開発され、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載のマウス胚移植の方法をハムスターに使用し、注射用ペントバルビタールＮａに代えてイソフルランガスの麻酔の使用に修正する。胎児の発達過程をモニタリングし、送達直後に血液試料を雄仔から抜き取る。この血液試料からｍｔＤＮＡを回収し、ＰＣＲ増幅および制限酵素消化により分析して母親のｍｔＤＮＡとの１００％の相同性を実証する。出産４週間後、卵母細胞ミトコンドリア分析のために雌仔を過排卵させてＦ１子孫における正常機能および形態を決定する。卵母細胞ならびに小さい（０．２５ｍｌ）血液試料をＡＴＰおよびＲＯＳレベルについて、ならびにｍｔＤＮＡ含有率および構造について、特にＲＴ−ＰＣＲにより全長および欠失ｍｔＤＮＡ分子の相対量を評価して分析する。
【００３０】
血小板からのミトコンドリアの単離は、公知の手順である。例えば、Ｆｕｋａｍｉ，１９７３；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，Ｂｌｏｏｄ：４２（６），１９７３参照。公知の方法のいずれかを用いてミトコンドリアを得ることができる。同様に、卵母細胞中へのミトコンドリアのマイクロインジェクションは公知の手順であり、公知の方法のいずれかを用いることができる。例えば、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ−Ｓｔａｒｖｅｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｆｆｅｃｔｓ  Ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｏｏｃｙｔｅｓ，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ．２０１０  Ｍａｒ；１０（２）：１３７−４２参照。
【００３１】
「高齢」血小板は、若齢哺乳動物、例として、ハムスターおよびヒトからの血小板からのミトコンドリアに類似する機能的（高いＡＴＰレベル）および形態的（インタクトな細胞小器官構造）特性を有する「若齢」ミトコンドリアの資源であり得る。高齢ハムスター血小板からの「若齢」ミトコンドリアがマイクロインジェクトされたハムスター卵母細胞を用いる研究は改善されたエネルギー保存（高いＡＴＰレベル）および低減したＲＯＳを示したが、従来の研究は、規定の物質による細胞または単離ミトコンドリアの処理を介してミトコンドリア機能を改善することができることを示唆している。ミトコンドリアは、種々の機序を介してＡＴＰの産生および／またはそのようなミトコンドリアの全体的な生合成もしくは機能を最終的に支援する薬剤を含有する培地中でそれらのミトコンドリアをインキュベートした後に卵母細胞中に導入することができる。１つのそのような薬剤は、コエンザイムＣｏＱ１０である。他の薬剤としては、限定されるものではないが、Ｌ−カルニチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、１７ベータ−エスタジオール（Ｅ２）、およびデシルユビキノン（ＤＵＱ）が挙げられる。上記薬剤のそれぞれは、種々の尺度、例として、酸素消費（ＣｏＱ１０）（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ｑ１０  ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｅｆｏｒｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏ．Ｓｕｒｇ．（２００５）１２９，２５−３２）、ミトコンドリア生合成のマスター調節因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ｇコアクチベーター１ａの発現（ＰＧＣｌａ）、（Ｌ−カルニチン）（Ｌ−Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４６４，５６８−５７３）、ＲＯＳの低減（ビタミンＣ）（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ，ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：ａｌｌ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ｂｕｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ，Ｖａｌｄｅｃａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｒｅｄｏｘ  Ｒｅｐｏｒｔ  １５，２０７−２１６）、ＲＯＳ誘導タンパク質酸化の尺度であるミトコンドリアタンパク質カルボニル化（ビタミンＥ）（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−Ｌｉｐｏｉｃ  Ａｃｉｄ，ＣｏＱ１０，ａｎｄ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ  Ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｍｉｃｅ，Ａｂａｄｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６０７２２）、呼吸鎖複合体Ｉ活性および呼吸商（ＲＱ）（ＰＱＱ）（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏ���ｉｎｅ  Ｑｕｉｎｏｎｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３６，３９０−３９６）、ＡＴＰレベルおよび呼吸調節（Ｅ２）（１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７，９２−１０２）、ならびに呼吸鎖複合体Ｉ／ＩＩＩおよびＩＩ／ＩＩＩ活性（ＤＵＱ）（Ｄｅｃｙｌｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ．ｂｙ  Ｔｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，８６３９−８６４５）により評価されるとおり、未処理細胞または単離ミトコンドリアと比較して２７〜７４％だけミトコンドリア機能を改善することが報告されている。
【００３２】
ミトコンドリア機能の向上は、多数の手法、例として、限定されるものではないが、ミトコンドリアＮＡＤＨおよびＦＡＤ蛍光（Ｄｕｍｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｅｒｍ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ［Ｃａ２＋］ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｃａ２＋ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｇｇ  ｈａｖｅ  ａｎ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＡＴＰ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｄｕｍｏｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００４  １３１：３０５７−３０６７）；ＡＴＰレベルまたはＡＴＰ／ＡＤＰ比；呼吸鎖複合体活性；ＲＯＳレベル；酸素利用；ならびにＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の変化で証明することができる。したがって、これらのレベル、比、または値のいずれかを改善する任意の薬剤を使用してミトコンドリアの活性を強化することができる。卵母細胞中へのマイクロインジェクション前にミトコンドリアをプレインキュベートするために使用される培地の配合は、選択されるミトコンドリア向上物質の組成および濃度の定型的な変更により最適化することができる。ミトコンドリア向上物質は、好ましくは、上記の方法の少なくとも１つにより計測されるそのような物質の不存在下で、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、いっそうより好ましくは、少なくとも３０％、最も好ましくは、少なくとも５０％だけのＡＴＰの産生および／またはミトコンドリアの全体的な生合成もしくは機能の増加を有するように選択される。
【００３３】
マイクロインジェクトされたミトコンドリアが高齢ハムスター卵母細胞のＡＴＰレベルに対する効果を有したか否かを試験するため、実施例４に説明されるとおり、実際のおよび疑似インジェクション後にＡＴＰレベルを計測した。
【００３４】
実施例４：高齢ハムスター卵母細胞中への精製ミトコンドリアのマイクロインジェクションにより刺激されるＡＴＰの増加
【００３５】
実験：高齢（１０〜１２ヵ月）ハムスターから回収された卵母細胞を処理せず（対照）、それに１０ピコリットルの緩衝液（疑似）をマイクロインジェクトし、またはそれに１０ピコリットルの緩衝液中の精製血小板ミトコンドリアをマイクロインジェクトした。続いて、個々の卵母細胞を溶解させ、ＡＴＰレベルを化学発光アッセイにより測定した。
【００３６】
結果：実験の結果を図１に示す。疑似インジェクションにより刺激されたＡＴＰレベルの増加が存在するが、１０ピコリットルの精製ミトコンドリアのマイクロインジェクション後のＡＴＰレベルのさらなる統計的に有意な増加が存在する。未処理対照に対する疑似インジェクトの増加は６％である一方、ミトコンドリアのマイクロインジェクションは、ＡＴＰレベルを未処理対照に対して３８．６％、および疑似インジェクトに対して３１％だけ増加させた。したがって、疑似処理と比較して高齢ハムスター卵母細胞中への精製ミトコンドリアのマイクロインジェクションにより刺激されたＡＴＰ増加の５．２倍多い増加が存在する（ｐ＜０．０５）。
【００３７】
ＡＴＰレベル増加がミトコンドリア増加に起因したか、単にＡＴＰ活性の増加に起因したかを試験するため、実施例５に説明されるとおり、高齢ハムスター卵母細胞中への実際のおよび疑似インジェクション後に蛍光顕微鏡観察を実施してミトコンドリア蛍光を計測した。
【００３８】
実施例５：老齢ハムスター卵母細胞中への精製ミトコンドリアのマイクロインジェクション後のミトコンドリアの増加
【００３９】
実験：老齢（１０〜１２ヵ月）ハムスターから回収された卵母細胞を処理せず（対照）、それに１０ピコリットルの緩衝液（疑似）をマイクロインジェクトし、またはそれに１０ピコリットルの緩衝液中の精製血小板ミトコンドリアをマイクロインジェクトした。続いて、膜電位に関係なくミトコンドリアを染色する（したがって、全ミトコンドリアを染色する）ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＧｒｅｅｎＦＭにより個々の卵母細胞を処理した。それぞれの処理（対照、疑似、マイクロインジェクト）後に蛍光顕微鏡観察を使用して個々の卵母細胞の染色を評価した。代表的な写真を図２のグラフ上方に示す。
【００４０】
結果：疑似インジェクションにより刺激された蛍光の増加が存在するが、１０ピコリットルの精製ミトコンドリアのマイクロインジェクション後の蛍光のさらなる統計的に有意な増加が存在する。未処理対照に対する疑似インジェクトの増加は（３３％）である一方、ミトコンドリアのマイクロインジェクションは蛍光を未処理対照に対して１３３％、および疑似インジェクトに対して７５％だけ増加させた。したがって、疑似マイクロインジェクション処理と比較して高齢ハムスター卵母細胞中への精製ミトコンドリアのマイクロインジェクションにより刺激されたミトコンドリア蛍光の２．３倍大きい増加が存在する（ｐ＜０．０５）。
【００４１】
単離ミトコンドリア中のＡＴＰレベルに対する補給物の効果を試験するため、実施例６に説明されるとおり、Ｌ−カルニチンを異なる濃度で使用した。
【００４２】
実施例６：単離ミトコンドリア中のＡＴＰレベルに対する補給物の効果を試験するための実験：Ｌ−カルニチン
【００４３】
実験：単離ヒト血小板ミトコンドリアのアリコートを、異なる濃度のＬ−カルニチン（ＡＴＰを産生するためのミトコンドリアによる使用のための脂肪分子の取り込みおよび代謝を刺激することが公知の化合物）の存在下で異なる時間量、インキュベートした。このグラフのＸ軸に沿って、数字１、２、３、および４は、ミトコンドリアインキュベーション緩衝液中の０、０．２マイクロモル濃度、２．０マイクロモル濃度、および２０マイクロモル濃度のＬ−カルニチンを指す。
【００４４】
結果：実験の結果を図３に示す。斜線付き円柱のミトコンドリアアリコート（系列１）をＬ−カルニチンの存在下で２０分間インキュベートした一方、斜線なし円柱のミトコンドリアアリコート（系列２）をＬ−カルニチンの存在下で６０分間インキュベートした。これらのインキュベーション時間後、試料を加工して超高感度化学発光アッセイによりＡＴＰを計測した。
【００４５】
実験は、２０または６０分間のいずれかのミトコンドリアインキュベーション培地へのＬ−カルニチンの添加が、適切な濃度のＬ−カルニチンを使用する場合、ミトコンドリア中のＡＴＰレベルを有意に増加させ得ることを示す。この実験において、ＡＴＰレベルの最大増加は、Ｌ−カルニチンが２．０マイクロモル濃度において存在する場合に見られた。２０分間のインキュベーション（系列１）の場合、Ｌ−カルニチンはＡＴＰレベルの４７％の増加を産生した。６０分間のインキュベーション（系列２）の場合、この増加は８０％であった。したがって、卵母細胞中へのミトコンドリアマイクロインジェクションの調製に利用可能な約３時間の時間域が存在する典型的なＩＶＦ手順において、Ｌ−カルニチンとのインキュベーションはミトコンドリア中のＡＴＰレベルを有意に増加させる一方、インキュベーション期間をＩＶＦ時間域内にフィットさせることを可能とする。
【００４６】
ミトコンドリアがマイクロインジェクトされた高齢ハムスター卵母細胞が受精後に増加した胚盤胞形成を示すか否かを試験するため、実施例７に説明されるとおり、対照および模擬受精卵母細胞をマイクロインジェクトされた卵母細胞に対して比較した。
【００４７】
実施例７：自己ミトコンドリアマイクロインジェクションを用いてまたは用いずに体外受精（ＩＶＦ）により受精させた高齢ハムスター卵母細胞および後続の胚盤胞段階への発達の比較
【００４８】
実験：高齢（ｎ＝４８）ハムスター卵母細胞を正常条件下で回収し、次いでＩＶＦを行い、ＨＥＣＭ−９中で最大９６時間培養した。模擬高齢（ｎ＝２５）卵母細胞には培地のみをインジェクトし、次いでＩＶＦを行い、ＨＥＣＭ−９中で最大９６時間培養した。高齢（ｎ＝１２）卵母細胞にはさらに、単離自己ミトコンドリアをインジェクトし、次いでＩＶＦを行い、ＨＥＣＭ−９中で最大９６時間培養した。
【００４９】
結果：実験の結果を図４に示す。ＩＶＦ処理により、４８個の高齢ハムスター卵母細胞のうち１９個が胚盤胞段階（２００〜３００個の細胞）に進行する受精胚になった。これは、ＩＶＦを受けた高齢卵母細胞の４０％を表す。培地の模擬インジェクションは、受精し、胚盤胞に発達する高齢ハムスター卵母細胞の８％の増加（２５個のＩＶＦ処理ハムスター卵母細胞の１２個または４８％）をもたらした。しかしながら、この変化は、統計的に有意でなかった。それというのも、ｐ値が０．１２３であったためである（０．０５以下のｐ値が統計的に有意とみなされる）。最終的に、ハムスター血小板からの自己ミトコンドリアがインジェクトされた高齢ハムスター卵母細胞の８もしくは１２個または６７％が受精し、胚盤胞に発達した。これは、未処理対照卵母細胞と比較して胚盤胞に発達する良好に受精した高齢ハムスター卵母細胞の６７．５％の増加を表す。これは統計的に有意な変化であり、ｐ値は０．０３７５であった。
【００５０】
上記ハムスター試験から回収されたデータを使用して、実施例８に説明されるとおり、精製血小板およびそのような血小板からの精製ミトコンドリアを調製する新規方法を開発した。この方法は、特にヒト受精手順に関してＩＶＦ手順において使用が要求される約３時間の時間域内で実施することができる一方、抽出されるミトコンドリアの量および質も最大化する追加の利益を有する。
【００５１】
実施例８：ヒト血液からの精製血小板および血小板ミトコンドリアの調製
【００５２】
本発明は、血小板単離手順、緩衝液濃度、および緩衝液ｐＨの最適化および調整を企図する。本発明は、種々の遠心分離ステップのそれぞれの時間および速度の調整および最適化を企図する。血小板凝集および損失をもたらし得る血小板活性化を最小化するように設計される試薬を緩衝液組成物中に含めることができる。単離手順は、望ましくは、２時間の下、血液試料取得から精製血小板の回収の時間までストリームライン化する。したがって、記載の方法は、精製血小板およびミトコンドリアを最適化し、後にマイクロインジェクトされるミトコンドリアの質を最大化する。さらに、本方法は、ＩＶＦ手順において使用が要求される約３時間の時間域以内に実施することができる。
【００５３】
約６〜７ｍｌの末梢静脈血を熟練の瀉血医により、抗凝固剤としての１．５ｍｌのＡＣＤ（ＡＣＤは、クエン酸デキストロースである）を含有するガラスｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に抜き取る。追加の１ｍｌのＡＣＤを血液に添加してから、一連の遠心分離ステップにより血小板単離手順を開始する。
【００５４】
以下の遠心分離ステップの全ては、テーブルトップ遠心分離機中で室温においてブレーキ「オフ」設定で実施する。
【００５５】
ＡＣＤを添加し、反転により穏やかに混合した後、全血試料を５００ｘｇにおいて１５分間遠心分離して多血小板血漿（ＰＲＰ）分画を赤血球および白血球から分離する。ＰＲＰ層を広口径プラスチックトランスファーピペットにより慎重に取り出し、無菌プラスチックコニカルチューブ（処理される全血の容量に応じて１５ｍｌまたは５０ｍｌチューブのいずれか）に移す。粗製ＰＲＰを含有するこのコニカルチューブを１００ｘｇにおいて１５分間遠心分離していかなる赤血球／白血球汚染物もピペッティングにより除去する。純粋なＰＲＰ上清を新たなコニカルチューブに慎重に移し、８００ｘｇにおいて１５分間遠心分離して精製血小板ペレットを得る。
【００５６】
上記遠心分離からの上清を慎重に除去し、残りの血小板ペレットを１．０ｍｌの改変タイロード緩衝液中で（穏やかに上下にピペッティングすることにより）再懸濁させる。改変タイロード緩衝液の成分は、１４５ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣ１、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＮａ／ＨＥＰＥＳ、６ｍＭのグルコース、および１ｍＭのＥＧＴＡである。緩衝液のｐＨは７．４である。次いで、プロスタグランジンＥ−１（ＰＧＥ−１）を緩衝液に添加することができる。それというのも、ＰＧＥ−１は血小板の不活性化状態での維持に役立つことが公知であるためである。次いで、１．０ｍｌの懸濁血小板をより小さい容量にアリコート化し、実施すべき実験に応じて直ちに使用し、または−８０℃において冷凍保存する。−８０℃におけるアリコートの保存のため、アリコートを１０００ｘｇにおいて１０分間遠心分離する。上清を慎重に除去し、血小板ペレットを−８０℃において冷凍する。
【００５７】
ヒト血小板調製物の純度を、図５Ａから５Ｃに示されるとおり、染色および共焦点顕微鏡観察により評価する。図５Ａにおいて、血小板をミトコンドリア内膜感受性色素ＪＣ−１（２μＭ）（６３０倍の倍率）により染色する。点状の赤色蛍光（赤色蛍光の全てではないが、一部を図５Ａの引き出し線により示す）は、ＪＣ−１色素が強力なミトコンドリア内膜電位（Ψｍ）を有する血小板内でインタクトなミトコンドリアに結合していることを示す。図５Ｂは、図５Ａに見られる同一の血小板試料の一部の３１５０倍の倍率である。図５Ｂは、血小板内でのミトコンドリアの点状赤色染色を示す。図５Ｂの赤色染色の全てではないが、一部を図５Ｂの引き出し線により示す。赤色染色されたミトコンドリアは、ＡＴＰ産生を支持し得るΨｍを有するミトコンドリアを反映する。図５Ｃは、化合物ＦＣＣＰ（カルボニルシアニド−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン）による、上記実験（図５Ａおよび５Ｂ）において使用された同一の血小板調製物の一部の処理を示す。ＦＣＣＰは、ミトコンドリア内膜電位Ψｍを破壊する化学物質である脱共役剤である。Ψｍの破壊は、機能的ミトコンドリアを示す赤色蛍光の排除をもたらす。図５Ｃにおいて赤色染色は存在しない。残りの緑色染色は、血小板内のミトコンドリアの特異的染色の結果であるが、それらのミトコンドリアは、ミトコンドリアの主要機能であるミトコンドリアのＡＴＰ産生を可能とし得るΨｍをもはや有さない。ＦＣＣＰによるこれらの血小板の処理時の赤色の損失は、赤色染色がＡＴＰ合成し得る機能的ミトコンドリアを反映したことを示す。
【００５８】
図６Ａおよび６Ｂは、精製ヒト血小板の機能性のさらなる証拠を提供する。図６Ａは、Ｆｌｕｏ−４（３ｕＭ）により処理された血小板を示す。暗緑色蛍光は、機能的であるが、不活性化した血小板を示す。血小板を活性化させるため、それらは凝集し始めて血液凝固プロセスを開始し得るため、カルシウムイオンが血小板細胞質内で顕著な濃度であるはずである。細胞内の細胞質カルシウムが血小板中で豊富でない場合、血小板は不活性のままであり、それは良好な結果である。それというのも、血小板が精製され、プライミングされるが、それらが活性化されず、それにより調製の間、凝集しなかったことを示すためである。
【００５９】
図６Ｂは、Ｆｌｕｏ−４により染色されたが、２ｍＭの塩化カルシウム（追加のカルシウムイオンを提供するため）および十分なカルシウムイオンの存在下でイオノフォアＡ２３１８７（血小板活性化を刺激する化合物）により処理された図６Ａからの同一の血小板調製物を示す。Ａ２３１８７による血小板の活性化は、図６Ｂに見られるとおり、はるかにより強い緑色蛍光をもたらす。この結果は、血小板が機能的状態で単離されたことおよび適切な条件下でそれらを活性化させてそれらの機能の１つである血液凝固プロセスに関与させることができることを示す。
【００６０】
図７Ａおよび７Ｂに示されるとおり、ウェスタンブロッティングを使用して精製ヒト血小板のさらなる分析を実施した。ウェスタンブロッティングによる血小板特異的タンパク質ＣＤ４２ｂの検出および赤血球マーカータンパク質グリコホリンＡの不検出は、血小板単離手順がいかなる赤血球汚染物も不存在である純粋な血小板を生じさせることを示す。同様に、血小板特異的タンパク質ＣＤ４２ｂの検出および白血球マーカータンパク質ＣＤ４５の検出の不存在は、血小板単離手順がいかなる白血球汚染物も不存在である純粋な血小板を生じさせることを示す。同様に、血小板特異的タンパク質ＣＤ４２ｂの検出および白血球マーカータンパク質ＣＤ４５の検出の不存在は、血小板単離手順がいかなる白血球汚染物も不存在である純粋な血小板を生じさせることを示す。
【００６１】
図７Ａは、血小板調製手順から調製された血小板タンパク質抽出物のウェスタンブロットを示す。これらのタンパク質を含有する膜を２つの異なる抗体、タンパク質ＣＤ４２ｂ（血小板特異的タンパク質）を認識するもの、およびタンパク質グリコホリン（赤血球特異的タンパク質）を認識する別のものにより処理した。レーン１（赤色タンパク質）は、分子量標準のグループである。レーン２および３は、１１／２８／１６の血小板調製物からの２４マイクログラムのタンパク質のデュプリケートアリコートである。レーン４および５は、１１／３０／１６の血小板調製物からの２４マイクログラムのタンパク質のデュプリケートアリコートである。緑色タンパク質は、血小板特異的ＣＤ４２ｂタンパク質の存在を反映する。赤血球が血小板調製物を汚染していた場合、第２の抗体が検出され、赤色に発色し、サイズがより大きい赤血球特異的タンパク質グリコホリンがレーン２〜５の緑色バンドの上方に赤色バンドとして出現する。この結果は、血小板単離手順が、いかなる赤血球汚染物も不存在である純粋な血小板を生じさせることを示す。
【００６２】
図７Ｂは、血小板調製物から調製された血小板タンパク質抽出物のウェスタンブロットを示す。これらのタンパク質を含有する膜を２つの異なる抗体、タンパク質ＣＤ４２ｂ（血小板特異的タンパク質）を認識するもの、およびタンパク質グリコホリンＣＤ４５（白血球特異的タンパク質）を認識する別のものにより処理した。レーン１および２は、１１／２８／１６の血小板調製物からの２４マイクログラムのタンパク質のデュプリケートアリコートである。レーン３および４は、１１／３０／１６の血小板調製物からの２４マイクログラムのタンパク質のデュプリケートアリコートである。レーン５（赤色タンパク質）は、分子量標準のグループである。レーン１〜４の緑色タンパク質は、血小板特異的ＣＤ４２ｂタンパク質の存在を反映する。白血球が血小板調製物を汚染していた場合、第２の抗体が検出され、赤色に発色し、サイズがより小さい白血球特異的タンパク質ＣＤ４５がレーン１〜４の緑色バンドの下方に赤色バンドとして出現する。このより小さい赤色バンドの不存在は、血小板単離手順がいかなる白血球汚染物も不存在である純粋な血小板を生じさせることを示す。
【００６３】
このプロセスの次の段階において、精製ヒト血小板からミトコンドリアを単離するため、非イオン性洗浄剤溶解および分画遠心分離の組合せを使用する。この目的のため、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ製の市販のキットを使用することができるが、所望により他の試薬を使用して精製ミトコンドリアの収量および質をさらに改善することができる。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒプロトコルは以下のとおりである：使用直前、プロテアーゼ阻害剤（フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、およびペプスタチンのカクテル）をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ試薬Ａおよび試薬Ｃに添加する。
【００６４】
このプロセスは、以下のとおり開示されている：
１．選択アリコートを８５０ｘｇにおいて２分間遠心分離することにより、血小板をペレット化する。
２．上清を慎重に除去し、廃棄する。
３．８００μＬのミトコンドリア単離試薬Ａを添加する。中速において５秒間ボルテックスに供し、チューブを氷上で正確に２分間インキュベートする。
４．１０μＬのミトコンドリア単離試薬Ｂを添加する。最大速度において５秒間ボルテックスに供する。
５．チューブを氷上で５分間インキュベートし、その時間全て最大速度においてボルテックスに供する。
６．８００μＬのミトコンドリア単離試薬Ｃを添加する。チューブを数回反転させて混合する（ボルテックスには供さない）。
７．チューブを７００ｘｇにおいて４℃において１０分間遠心分離する。
８．上清を新たな微小遠心チューブに移し、１２，０００ｘｇにおいて４℃において１５分間遠心分離する。
９．リソソームおよびペルオキシソーム汚染物質の＞５０％の低減を有するミトコンドリアのより精製された分画を得るため、３０００ｘｇにおいて１５分間遠心分離する。
１０．上清（細胞質ゾル分画）を新たなチューブに移す。ペレットは単離ミトコンドリアを含有する。
１１．５００μＬのミトコンドリア単離試薬Ｃをペレットに添加し、１２，０００ｘｇにおいて５分間遠心分離する。上清を廃棄する。
１２．下流の加工前にミトコンドリアペレットを氷上で維持する。冷凍および解凍は、ミトコンドリア統合性を減弱させ得る。
【００６５】
次いで、図８に示されるとおり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用してヒトミトコンドリアの純度を評価する。図８において、単離ミトコンドリアのアリコートをＰＣＲ増幅により評価してミトコンドリアＤＮＡの存在を実証した。示されるとおり、図８は、レーン３に陽性対照を、レーン４に陰性対照を、およびレーン５に１００ｂｐラダーを含有する。レーン３の陽性試料は、ＰＣＲ反応により増幅されることが予測されるミトコンドリアＤＮＡの領域（ｍｔＤＮＡ含有ｐＦＣ−Ｔプラスミド）を含有し、予測される３００塩基対バンドを矢印により示す。ヒト血小板から開示の方法を使用して調製された２つの精製ミトコンドリア試料を、レーン１および２において評価する。両方の試料は、３００塩基対バンドの存在により示されるとおり、ミトコンドリアＤＮＡを含有する。これは、本発明者らが上記の手順によりヒト血液から単離された血小板からミトコンドリアの精製調製物を産生したさらなる証拠である。
【００６６】
２０１５年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２７１，７３３号明細書の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
上記説明および実施例は、本発明の原理の説明にすぎないとみなすべきである。本発明は、好ましい実施形態により限定されるものではなく、当業者に明らかな種々の手法で実行することができる。本発明の多数の用途は、容易に当業者に想起される。したがって、本発明を開示される具体的な実施例にも、または示され、記載される正確な構築および操作にも限定することは望まれない。むしろ、全ての好適な改変および均等物を用いることができ、それらは本発明の範囲内に収まる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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