(57)【要約】  本発明は、個体から単離された生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）を判定するためのインビトロ方法に関する。さらに、本発明の方法は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の抗生物質耐性の判定も可能にする。本発明のさらなる態様は、前記方法を実施するためのキットに関する。【選択図】図１
2019506169.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から単離された生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリを判定するための、および／または少なくとも１つの抗生物質に対する前記ヘリコバクター・ピロリの耐性を判定するためのインビトロ方法であって、
Ｉ．個体から単離された生物学的試料を得るステップ、
ＩＩ．前記試料からＤＮＡを精製（単離）するステップ、および
ＩＩＩ．前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含むヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの部分を増幅させるステップであって、前記増幅は、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのペア（プライマーのペア）および少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用するリアルタイムＰＣＲによって実施され、前記プライマーのペアは、前記突然変異を跨ぐＤＮＡ領域中でハイブリダイズし、それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、５’および３’末端において２つの異なるマーカーで標識されており、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記遺伝子の野生型アレルの少なくとも１つの遺伝子部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質耐性を担う前記遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つの遺伝子部分に相補的かつ特異的である、ステップ、
ＩＶ．好ましくは、ＰＣＲサイクル閾値において、前記オリゴヌクレオチドプローブが標識されている前記マーカーのレベルを計測することにより、増幅された野生型および／または突然変異ＤＮＡを定量するステップであって、前記野生型アレルの前記少なくとも１つの遺伝子部分に相補的かつ特異的な前記プローブが標識されている前記マーカーのみの存在は、正常ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性でない前記Ｈｐの存在とを定義し、前記遺伝子の前記突然変異アレルの前記少なくとも１つの遺伝子部分に相補的かつ特異的な前記プローブが標識されている前記マーカーのみの存在は、突然変異ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Ｈｐの存在とを定義し、および両方のマーカーの存在は、前記遺伝子の野生型アレルおよび突然変異アレルを有するヘテロ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Ｈｐの存在とを定義するステップを含む方法。
【請求項２】
前記生物学的試料は、糞便試料である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗生物質は、クラリスロマイシン、レボフロキサシン、アモキシシリン、メトロニダゾール、チニダゾール、テトラサイクリン、リファブチンおよびそれらの組合せを含む群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、前記５’末端において高強度蛍光マーカー（レポーター）で標識されており、かつ前記３’末端において非蛍光または低強度マーカー（クエンチャー）で標識されている請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーは、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＳＹＢＥＲ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴおよびＲＯＸから選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヘリコバクター・ピロリの前記遺伝子は、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ｇｙｒＡおよびｐｂｐ−１から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記突然変異は、点突然変異または一塩基多型（ＳＮＰ）である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異は、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子についてＡ２１４３Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４２Ｇ、前記ｇｙｒＡ遺伝子についてＣ２６１Ａ、Ｃ２６１Ｇ、Ｇ２７１Ａ、Ｇ２７１ＴおよびＡ２７２Ｇ、ならびに前記ｐｂｐ−１遺伝子についてＣ４１３ＡおよびＣ４１３Ｇから選択され、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の前記突然変異は、前記Ｈｐのクラリスロマイシン耐性を担い、前記ｇｙｒＡ遺伝子の前記突然変異は、前記Ｈｐのレボフロキサシン耐性を担い、および前記ｐｂｐ−１遺伝子の前記突然変異は、前記Ｈｐのアモキシシリン耐性を担う請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の少なくとも１つの遺伝子の前記少なくとも１つの部分は、配列番号１〜４またはそれらの組合せの中から選択され、配列番号１および２は、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を指し、配列番号３は、前記ｇｙｒＡ遺伝子を指し、および配列番号４は、前記ｐｂｐ−１遺伝子を指す請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのプライマーのペアは、配列番号５〜１４を含む群から選択され、そのうちの配列番号５および６は、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の前記少なくとも１つの部分を増幅させるためのものであり、配列番号９および１０は、前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の前記少なくとも１つの部分を増幅させるためのものであり、かつ配列番号１３および１４は、前記ｐｂｐ−１遺伝子、好ましくは配列番号４の前記少なくとも１つの部分を増幅させるためのものである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、マイナーグルーブバインダー化学物質で修飾されている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１３〜２３を含む群から選択され、
−配列番号１３および／または１４は、前記プライマーのペア配列番号５および６と使用され、および配列番号１３は、抗生物質耐性を担う前記突然変異を有さない前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号１４は、Ａ２１４３Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４２Ｇから選択されるクラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有する前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−配列番号１５、１６および１７は、前記プライマーのペア配列番号７および８と使用され、および配列番号１５は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号１６および／または１７は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｎ８７Ｌｙｓ突然変異を有する前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−配列番号１８、１９および２０は、前記プライマーのペア配列番号９および１０と使用され、および配列番号１８は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、配列番号１９は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｐ９１Ｇｌｙ突然変異を有する前記ｇｙｒＡ遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ／または配列番号２０は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｐ９１Ｔｙ突然変異を有する前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−配列番号２１、２２および２３は、前記プライマーのペア配列番号１１および１２と使用され、および配列番号２１は、アモキシシリン耐性を担う前記突然変異を有さない前記ｐｂｐ−１遺伝子、好ましくは配列番号４の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号２２および／または２３は、アモキシシリン耐性を担うＳｅｒ４１３Ａｒｇ突然変異を有する前記ｐｂｐ−１遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
個体から単離された生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリを判定するための、ならびに／またはＡ２１４３Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４２Ｇを含む群において選択される２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされるクラリスロマイシンに対する、かつ／もしくはＣ２６１Ａ、Ｃ２６１Ｇ、Ｇ２７１Ａ、Ｇ２７１ＴおよびＡ２７２Ｇを含む群において選択されるｇｙｒＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされるレボフロキサシンに対する、かつ／もしくはＣ４１３ＡおよびＣ４１３Ｇを含む群において選択されるｐｂｐ−１遺伝子の突然変異によって引き起こされるアモキシシリンに対する前記ヘリコバクター・ピロリの耐性を判定するためのキットであって、
−リアルタイムＰＣＲにより、前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含む少なくとも１つのヘリコバクター・ピロリ遺伝子の少なくとも１つの部分を増幅させるための少なくとも１つのプライマーのペアであって、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について配列番号５および６から、前記ｇｙｒＡ遺伝子について配列番号９および１０から、かつ前記ｐｂｐ−１遺伝子について配列番号１３および１４から選択される、少なくとも１つのプライマーのペア、および
−２つの異なるマーカーで標識された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブであって、そのうちの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含むヘリコバクター・ピロリの少なくとも１つの遺伝子の野生型アレルの少なくとも１つの部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する前記耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含むヘリコバクター・ピロリの少なくとも１つの遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つの部分に相補的かつ特異的であり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１３〜２３を含む群において選択される、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、
−配列番号１３および／または１４は、前記プライマーのペア配列番号５および６と使用され、および配列番号１３は、クラリスロマイシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号１４は、Ａ２１４３Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４２Ｇを含む群において選択されるクラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有する前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−配列番号１５、１６および１７は、前記プライマーのペア配列番号７および８と使用され、および配列番号１５は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号１６および／または１７は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｎ８７Ｌｙｓ突然変異を有する前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−配列番号１８、１９および２０は、前記プライマーのペア配列番号９および１０と使用され、および配列番号１８は、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異を有さない前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、配列番号１９は、Ａｓｐ９１Ｇｌｙ突然変異を有する前記ｇｙｒＡ遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ／または配列番号２０は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｐ９１Ｔｙ突然変異を有する前記ｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−配列番号２１、２２および２３は、前記プライマーのペア配列番号１１および１２と使用され、および配列番号２１は、アモキシシリン耐性を担う前記突然変異を有さない前記ｐｂｐ−１遺伝子、好ましくは配列番号４の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号２２および／または２３は、アモキシシリン耐性を担うＳｅｒ４１３Ａｒｇ突然変異を有する前記ｐｂｐ−１遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的であるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体から単離された生物学的試料中のヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）を判定するためのインビトロ方法に関する。さらに、本発明の方法は、ヘリコバクター・ピロリの抗生物質耐性の判定も可能にする。
本発明のさらなる態様は、前記方法を実行するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）は、ヘリコバクター属に属する微好気性、好酸性の有鞭毛グラム陰性細菌である。
現在、Ｈｐは、世界人口の約半数の胃にコロニー形成する細菌であり、消化性潰瘍およびＭＡＬＴリンパ腫における病因論的因子、胃腺癌についてのリスク因子ならびに他の胃内および胃外型病変と関連する因子とみなされている。
Ｈｐ感染は、ある者が属する人種ではなく、低い社会経済状態に相関することが周知である。実際、Ｈｐ感染は、発展途上国において極めて蔓延している。この細菌の伝染様式は依然として不明であるが、しかし、経口または糞便−経口経路が最も可能性が高いと考えられている。
【０００３】
Ｈｐ感染を診断する方法は、１）侵襲的方法、特に胃粘膜の生検採取を伴う内視鏡検査および後続の分析、ならびに２）非侵襲的方法、例えば呼気試験、糞便中の抗原についての試験または血液中の抗体についての試験として分類可能である。
最も一般的な非侵襲的方法の１つは、尿素呼気試験（ＵＢＴ）である。この方法は、放射性炭素同位体で標識された尿素を含有する飲料を患者に飲用させることを必要とする。Ｈｐの存在下において、ウレアーゼによって触媒される尿素は分裂し、呼気中のアンモニウムおよび顕著な二酸化炭素の形成および放出をもたらす。個体の呼気分析が顕著なＣＯ２の存在を明らかにする場合、この試験は陽性であり、したがって個体はＨｐによって感染されているとみなされる。
血清学的試験は、Ｈｐを標的化するＩｇＧ抗体を探索することを必要とする。しかし、これらの試験は、活動性感染を事前のＨｐ感染から区別することを可能にしない。したがって、これらは、治療法の有効性のモニタリングについて理想的とみなされず、まして根絶を確認するための事後試験ともみなされない。
さらなる最小侵襲的方法は、糞便中の抗原（ＨｐＳＡ）についての試験に基づく。この場合、免疫酵素的試験が個体の糞便試料に対して実施される。
この方法は、呼気試験の妥当な代替試験であるが、特に治療法の効果を評価することが望まれる場合、低い感度および特異度を特徴とする。
Ｈｐ感染を根絶するための治療法に関して最も一般的なものとしては、抗生物質に伴うプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）の投与が挙げられる。
特に、ファーストライン療法（ラインＩ）は、実際に、ＰＰＩおよびクラリスロマイシンの１４日間の投与、次いでＰＰＩ、クラリスロマイシンおよびアモキシシリンまたはレボフロキサシンおよびメトロニダゾールの７〜１０日間の投与を提供する三重療法を含む。あるいは、連続療法が利用可能であり、それは、１グラム×２回のアモキシシリンおよびＰＰＩの５日間の投与、次いで次の５日間の５００ｍｇのクラリスロマイシン×２回、ＰＰＩおよび５００ｍｇ×２回のチニダゾールを提供する。
残念ながら、抗生物質に対する耐性がこの治療アプローチの成功の欠落にとって最も重要な因子である。特に、呼吸器疾病ならびに婦人科および寄生虫感染症の治療のためのクラリスロマイシンの広範な使用は、この抗生物質に対する一次抵抗を増加させている。
クラリスロマイシンは、多くのマクロライドと同様に、細菌リボソームの５０Ｓサブユニットに結合することにより、その抗菌作用を展開する。この結合は、（酵素トランスロカーゼを遮断することにより）リボソームのＡ部位からＰ部位へのペプチドのトランスロケーションを妨害し、（酵素トランスフェラーゼを遮断することにより）ペプチド鎖の延長の阻害を引き起こす。
レボフロキサシンおよびアモキシシリンに対する耐性もかなり蔓延している。
Ｈｐの根絶のためのレボフロキサシンの使用が一般的慣行であり、それは、クラリスロマイシンベース治療の不成功後の「セカンドライン療法」レジメにおけるその役割のためである。フルオロキノロンは、ＤＮＡのらせん構造の維持に不可欠な酵素であるＤＮＡギラーゼ（トポイソメラーゼＩＩ）のＡサブユニットに結合することにより、用量依存的細菌効果を付与する。感受性株において、レボフロキサシンは、ＤＮＡ合成を遮断し、高用量においてＲＮＡ合成も遮断する。
【０００４】
アモキシシリンは、アンピシリンと類似の活性を有するアミノペニシリンであり、胃液酸度に対する良好な安定性ならびにペニシリンおよびアンピシリンよりも大きい経口バイオアベイラビリティを特徴とする。ペニシリンと同様に、アモキシシリンは、細菌細胞壁に作用し、壁自体の剛性を確保するために必要な架橋の形成（ペプチド転移のプロセス）を妨害する。これは、ペプチド転移のプロセスを担う酵素であるトランスペプチダーゼと安定で不活性な複合体を形成する。アモキシシリンは、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方を含む作用スペクトルを有し、基本的に３つの耐性機序が存在する：
１）ベータラクタム環を開環させることによって抗生物質を不活性化させるベータラクタマーゼ酵素の産生、
２）分子に対する細菌の浸透性の低減、および
３）アモキシシリンに結合するタンパク質、またはペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）の改変。
アモキシシリンは、Ｈｐを根絶するために使用すべき最初の抗生物質であり、その低い耐性率にも起因して依然として今日でも一般的な治療スキームで使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記に照らして、ヘリコバクター・ピロリを判定し得る技術、すなわち個体におけるこの細菌による感染の診断を可能にし、非侵襲的、経済的、迅速かつ診断精度の高い技術を有することが極めて必要とされ続けている。特に、試料中のヘリコバクター・ピロリの存在を判定することができ、細菌の抗生物質耐性を同時に評価し得る方法を有することが強く必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人らは、個体から単離された生物学的試料に対してインビトロで実施され、分子分析、好ましくは突然変異の場合にヘリコバクター・ピロリによる感染を撲滅するための治療法において一般に使用される抗生物質、好ましくはクラリスロマイシン、レボフロキサシンおよびアモキシシリンに対する耐性を担うヘリコバクター・ピロリ遺伝子の突然変異部位を含む領域のゲノタイピングを提供する方法による、上記の必要性についての解決手段を見出した。
実際、本出願人らは、予測外にも、下記の方法が、多くの偽陽性を生じさせるために低い特異度を特徴とする現在利用可能な非侵襲的方法と比較して極めて信頼性が高いことを見出した。
【０００７】
本発明の方法の特定の利点は、生物学的試料中のＨｐの存在、すなわちこの細菌による感染の判定の他、それが、同定されるＨｐの株が根絶療法において使用される抗生物質の１つに対する耐性を担う突然変異を担持するか否かの判定を同時に可能にすることである。したがって、本出願人らによって発明された方法を使用すると、単一の非侵襲的であり、迅速であり、感度および特異度が高い試験により、Ｈｐによる感染を判定し、細菌の抗生物質耐性、好ましくはクラリスロマイシン、レボフロキサシンまたはアモキシシリンに対するこの耐性を判定することが可能である。
【０００８】
したがって、本発明の方法は、治療的観点から非常に有利であることが示される。なぜなら、最も初期の段階から、細菌の根絶する目的に最も好適な治療に患者を誘導することができるためである。換言すると、患者は、最も初期の段階から、治療成功がより大きいアドホック治療を受ける。
本発明の方法はまた、医療サービスについての利点を有する。なぜなら、本発明は、種々の利用可能な薬理学的療法を用いる実際の根絶試行に基づく、細菌を根絶するために設計された現在利用可能な治療アプローチに伴う浪費の排除を見込むためである。
したがって、本発明の主題は、添付の独立請求項に規定されるとおり、ヘリコバクター・ピロリを判定／モニタリングするための、および／または特に治療目的のために一般に使用される抗生物質に対するヘリコバクター・ピロリの耐性を判定するための方法に関する。
さらに、本発明の主題は、添付の独立請求項に規定されるとおり、方法を実行するためのキットにさらに関する。
本発明の方法およびキットの好ましい態様は、添付の従属請求項に定義される。
本発明の追加の特徴および利点は、添付の図面も参照する以下の詳細な説明および例示的で非限定的な実施例からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の方法の増幅ステップの実行の図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、個体から単離された生物学的試料に対してインビトロで実施される、前記試料内のヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）の存在を判定もしくはさらにモニタリングするための、および／または少なくとも１つの抗生物質に対するＨｐの耐性を判定するための方法であって、
（ｉ）個体から単離された生物学的試料を得るステップ、
（ｉｉ）前記試料からＤＮＡを精製（単離）するステップ、および
（ｉｉｉ）突然変異の場合に前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも１つのヌクレオチド部位を含むＨｐ遺伝子の少なくとも１つの部分を増幅させるステップであって、前記増幅は、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのペア（プライマーのペア）および少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用するＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲによって実施され、プライマーのペアは、前記突然変異部位を跨ぐ核酸の領域中で対合し、前記オリゴヌクレオチドプローブは、２つの異なるマーカーで標識されており、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの正常部位を含むＨｐ遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的かつ特異的（すなわち、前記遺伝子の正常／非突然変異アレルに相補的）であり、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含むＨｐ遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的かつ特異的（すなわち、前記遺伝子の突然変異アレルに相補的）である、ステップ（図１を参照）、
（ｉｖ）２つのマーカーのレベルを計測することにより、増幅された正常および／または突然変異ＤＮＡを定量するステップであって、
−  増幅ＤＮＡの不存在は、試料中のＨｐの不存在を意味し、
−  前記遺伝子の野生型アレルに相補的かつ特異的なプローブが標識されているマーカーのみの存在は、正常ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性でない前記Ｈｐの存在とを定義し、
−  前記遺伝子の突然変異アレルに相補的かつ特異的なプローブが標識されているマーカーのみの存在は、突然変異ホモ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Ｈｐの存在とを定義し、
−  両方のマーカーの存在は、前記遺伝子の野生型アレルおよび突然変異アレルを有するヘテロ接合型ゲノタイプと、したがって前記抗生物質に耐性である前記Ｈｐの存在とを定義する、ステップを含む方法に関する。
【００１１】
図１は、ステップ（ｉｉｉ）を図式化し、実際には、フォワードおよびリバースプライマーのペアは、突然変異の場合に抗生物質耐性を担う部位（それぞれＤＮＡの鎖上）を跨ぐ。このペアは、抗生物質耐性の原因である突然変異部位を含有するＨｐ遺伝子領域の増幅を可能にする。プローブのペアは、一方が、正常（野生型）、すなわち非突然変異遺伝子の領域と特異的にハイブリダイズし、他方が、突然変異を含有する遺伝子の領域とハイブリダイズするように選択される。この２つは、２つの異なるマーカーで標識されており、その結果、一方のマーカーまたは両方の検出がＨｐゲノタイプの判定を可能にし得る。細菌が試料に不存在である場合、プライマーが対合するＤＮＡを見出さないため、増幅は生じないのは明らかである。ステップ（ｉｖ）に従って行う検出は、前記試料内に存在する任意のＨｐのゲノタイプを判定することを可能にし、前記ゲノタイプは、増幅遺伝子部分が突然変異を有さない場合、正常ホモ接合型であり、または増幅遺伝子部分が突然変異を有する場合、突然変異ホモ接合型であり、または増幅遺伝子部分の半分が非突然変異であり、半分が突然変異している場合、ヘテロ接合型である。
したがって、増幅産物の存在は、前記生物学的試料中のＨｐ、したがってＨｐによる感染の存在を規定する一方、上記ゲノタイピングは、細菌が少なくとも１つの抗生物質に耐性であるか否かを判定することを可能にする。
【００１２】
本発明が参照とする抗生物質は、Ｈｐ感染を治療上処置する目的のために個々にまたは組合せで一般に使用されるものである。好ましくは、抗生物質は、クラリスロマイシン、レボフロキサシン、アモキシシリン、メトロニダゾール、チニダゾール、テトラサイクリン、リファブチンおよびそれらの組合せを含む群において選択される。本発明の目的のため、好ましい抗生物質は、クラリスロマイシン、レボフロキサシン、アモキシシリンおよびそれらの組合せの中から選択され、最も好ましくはクラリスロマイシンである。
【００１３】
本発明に関して、抗生物質に対する耐性は、細菌、この場合にはＨｐが、根絶療法において使用される抗生物質または抗生物質のプールに対して耐性になる機序を意味する。参照される抗生物質は上記のものである。
したがって、本発明の方法は、個体におけるＨｐ感染を判定／モニタリングすること、および同時に任意の判定／モニタリングされるＨｐ株の抗生物質耐性を判定することを可能にする。結果的に、本発明の方法は、Ｈｐ感染に伴う病変、とりわけ胃系を冒す病変、好ましくは胃炎、消化性潰瘍、胃癌、またはＭＡＬＴリンパ腫、消化不良、鉄欠乏性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、および胃十二指腸外の病変の判定も可能にする。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、本方法は、個体から単離された糞便試料に対して実施される。
糞便試料は、個体自身によって回収することができ、すなわち、本方法のステップ（ｉ）は、個体によって自主的に実施することができる。
一般に、糞便試料は、糞便の回収に好適な任意の装置を使用して回収される。好ましくは、装置は、糞便を回収し、可溶化手段を収容する可溶化チャンバ中でそれらを可溶化させるための部分を含む。可溶化手段は、好ましくは、ＰＢＳのような生理食塩溶液である。可溶化は、糞便試料の均一化を可能にし、好ましくは、例えばＶｏｒｔｅｘミキサ上で数秒間（約３０秒間）にわたり試料を激しく振盪させることによって実施／促進される。
糞便は、好ましくは、本発明の方法を実行するために適切な量の糞便の回収に好適なブラシを用いて回収される。特に、本発明の方法を実行するために回収すべき量（したがって、本方法の出発材料の量）は、１５０〜２５０ミリグラム（ｍｇ）の範囲であり、好ましくは、それは約２００ｍｇの糞便である。
本発明の方法を実行する目的のため、約１ｍｌの可溶化手段中で１５０〜２５０ｍｇ、好ましくは約２００ｍｇの糞便を可溶化させることが望ましい。
可溶化チャンバは、好ましくは、濾過エレメントによって回収チャンバから離隔されている。このように、可溶化された糞便は、例えば、重力によって回収チャンバ中のフィルタを通過し得る。フィルタの細孔よりも大きい寸法の可溶化糞便の部分は、回収チャンバ中へ通過しない。濾過された糞便は、回収チャンバから、好ましくは貫通可能な膜を介して、例えばシリンジを用いて回収され得る。
【００１５】
本発明の目的のため、濾過エレメントの細孔サイズは、好ましくは、１００〜２００ミクロン（μｍ）、より好ましくは１００〜１５０μｍ、一層より好ましくは１０５〜１２０μｍの範囲であり、一層より好ましくは、それは約１０６μｍである。したがって、通過する糞便の可溶化／濾過部分は、１００〜２００μｍ以下、好ましくは１００〜１５０μｍ以下、より好ましくは１０５〜１２０μｍ以下、より好ましくは約１０６μｍ以下の寸法を有する。
上記のとおり、個体から生物学的試料を得たら、または糞便を可溶化および／または濾過したら、生物学的試料または可溶化／濾過された糞便（以下、試料）を本方法のステップ（ｉｉ）に供する。
【００１６】
ＤＮＡは、規定の目的のために一般に全ての当業者に公知の方法を使用して試料から抽出される。本発明の目的のため、好ましい抽出方法は、好ましくは、処理すべき試料との１：１の比のフェノール−クロロホルム溶液の使用を含む。
特に、本発明の抽出方法は、Ｔｒｉｚｏｌを試料に添加するステップを含む。好ましくは、Ｔｒｉｚｏｌと試料との比は、１：１である。次いで、Ｔｒｉｚｏｌ：試料の混合物を好ましくは数秒間にわたり、例えばＶｏｒｔｅｘミキサ上で均等に混合する。
【００１７】
続いて、好ましくはクロロホルムをＴｒｉｚｏｌ：試料の混合物に添加する。Ｔｒｉｚｏｌ：試料の混合物の容量の１／１０に等しいクロロホルムの量を添加することが好ましい。
好ましくは、Ｔｒｉｚｏｌ：試料：クロロホルムの混合物を数秒間にわたり、例えばＶｏｒｔｅｘミキサ上で均等に混合する。
好ましくは、均等に混合した後、Ｔｒｉｚｏｌ：試料：クロロホルムの混合物を好ましくは遠心分離によって階層化する。１００００〜１４０００ｇ、好ましくは約１２０００ｇにおいて、好ましくは約１０分間の時間にわたり遠心分離することが望ましい。階層化は、好ましくは低温、より好ましくは約４℃において実施する。
【００１８】
Ｔｒｉｚｏｌ：試料：クロロホルムの混合物の階層化の終了時、通常、３相：水相、中間相およびフェノール相が得られる。
【００１９】
本発明の目的のため、水相を廃棄することが好ましい。
したがって、ＤＮＡを混合物の残りの部分から、すなわち有機相を表す中間相およびフェノール相から沈殿させる。
沈殿は、好ましくは、アルコール、例えばエタノール、より好ましくは１００％のエタノールを有機相に添加することによって達成される。
【００２０】
次いで、沈殿したＤＮＡを好ましくは例えば遠心分離によって沈降させる。好ましい遠心分離条件は、好ましくは低温、例えば約４℃において数分間にわたり約２０００ｇである。
ＤＮＡが沈殿したら（実際には、ＤＮＡはペレットを形成する）、表面相を除去することが好ましく、沈殿したＤＮＡを生理食塩溶液、例えばクエン酸ナトリウムにより、好ましくは少なくとも１回、より好ましくは２〜３回処理する（このステップは、ＤＮＡペレットの洗浄の１種である）。このステップは、好ましくは室温において、より好ましくは約３０分間にわたり実施する。
生理食塩溶液による全ての処理後、沈殿したＤＮＡの沈降のステップを、好ましくは例えば約２０００ｇにおける数分間の好ましくは低温（例えば、約４℃）での遠心分離によって行う。
【００２１】
続いて、沈殿したＤＮＡを好ましくはアルコール、例えばエタノール、好ましくは７５％のエタノールで処理する。前記処理は、好ましくは約２０〜３０分間にわたり、より好ましくは室温において実施する。
アルコールによる処理の終了時、沈殿したＤＮＡを、好ましくは例えば約２０００ｇにおける数分間の好ましくは低温（例えば、約４℃）での遠心分離によって沈降させる。
【００２２】
次いで、沈殿したＤＮＡを好ましくは乾燥させて、アルコールを完全に蒸発させる。
乾燥したＤＮＡを好ましくはアルカリ溶液中、より好ましくはＮａＯＨ（例えば、ＮａＯＨ  ８ｍＭ）中で再懸濁させる。
ステップ（Ｉ）の終了時、最終遠心分離ステップを最大速度（約１４０００ｇ）において１０分間程度、好ましくは室温において実施することが好ましい。上清（すなわち沈殿しなかった部分）を移し、緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡを好ましくはｐＨ７〜８においてそれに添加する。
【００２３】
後続のステップ（ｉｉｉ）にＤＮＡを使用する前、例えば全ての当業者に公知の技術（２６０／２８０ｎｍの分光光度計による読取り、アガロースゲル上でのＤＮＡ試料の可視化など）により、上記精製ＤＮＡを定量的および／または定性的に評価することが望ましい。
【００２４】
突然変異の場合に前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも１つのヌクレオチド部位を含むＨｐ遺伝子の少なくとも１つの部分を増幅させるステップは、ＰＣＲ、好ましくはリアルタイムＰＣＲ、より好ましくはＴａｑＭａｎ化学物質を用いるリアルタイムＰＣＲによって行われる。
リアルタイムＰＣＲ系において、増幅（増幅された）産物の蓄積のモニタリングは、オリゴヌクレオチドプローブの標識によって可能になる。
【００２５】
本方法のステップ（ｉｉｉ）において使用されるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも２つの異なるマーカー、好ましくは蛍光で標識されている。特に、レポーターとして定義される高強度蛍光マーカー、例えば修飾フルオレセイン、および第２のマーカー、好ましくはクエンチャーと称される低強度または非蛍光マーカー、例えば修飾ローダミンである。
好ましくは、レポーターは、プローブの５’末端に結合しており、および／または好ましくは、クエンチャーは、プローブの３’末端に結合している。
【００２６】
クエンチャーの非蛍光により、リアルタイムＰＣＲ系は、レポーター蛍光色素のインプットをより高精度で計測し得る。レポーターおよびクエンチャーが互いに近接（接近）している場合、プローブ自体（クエンチャー）がレポーターの蛍光を吸収し、したがってそれを計測することができない。実際、これらの条件下での唯一の検出可能な蛍光は、クエンチャーの低蛍光である。
【００２７】
ＰＣＲ中、それぞれのプローブは、プライマーのペア（フォワードプライマーおよびリバースプライマー、図１を参照されたい）を跨ぐ領域中のその相補的配列との特異的アニーリング（対合）を遂行する。
ＤＮＡポリメラーゼは、標的ＤＮＡを複製するだけでなく、その５’−３’エンドヌクレアーゼ活性で、２つの蛍光マーカーを離隔し、したがってレポーターの発光を十分に検出可能にすることにより、それにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブも分解する。リアルタイムＰＣＲ中に複製した全てのＤＮＡペアについて、レポーター分子（蛍光マーカー）の解放が生じることを考慮すると、増幅プロセス中に蓄積する相対蛍光は、増幅されたＤＮＡの量に常に比例する。リアルタイムＰＣＲ反応の全持続期間にわたり、発光スペクトル収集プログラム、例えば配列検出システム（ＳＤＳ）を介して、プログラムによって計測されるレポーターの蛍光の変動を増幅カイネティクスのリアルタイム表示に変換することが可能である。
系の「バックグラウンドノイズ」のわずかな変動に起因するのではなく、特異的増幅イベントに起因してレポーターの蛍光閾値に達するＰＣＲサイクルは、反応の閾値サイクル（Ｃｔ）として定義される。本発明の方法において、標的ＤＮＡは、閾値サイクルにおいて、したがってＰＣＲ反応が指数関数増殖期である場合に定量される。
【００２８】
一方がＨｐ遺伝子の正常アレルについてのもの、および他方が突然変異アレルについてのもの（すなわちＨｐの抗生物質耐性を担う突然変異を担持するもの）である２つのオリゴヌクレオチドプローブは、２つの異なるレポーターで標識されており（発光する蛍光シグナルが異なる）、増幅されたアレルと、したがって細菌のゲノタイプとを追跡することが可能である。
したがって、増幅ステップは、細菌株のゲノタイピングを可能にし、すなわち、それは、不明試料のゲノタイプの判定を可能にする。本発明の増幅により、好ましくは単一ヌクレオチドの突然変異と関連する多型、すなわち点突然変異またはＳＮＰ（一塩基多型）を区別することが可能である。この場合、ＳＮＰは、突然変異の場合に抗生物質耐性を担うＨｐ遺伝子内に収まる。あるいは、本発明の増幅は、前記ヌクレオチドが、正常タンパク質中に存在するものと異なるアミノ酸になるトリプレットの翻訳を決定する単一ヌクレオチドの突然変異を区別することを可能にする。
好ましくは、本発明に関して、一塩基多型（ＳＮＰ）は、多型、すなわち単一ヌクレオチドに影響し、多型アレルが１％超の比率で集団中に存在するような遺伝子材料（ＤＮＡ）の（遺伝的）変異を意味する。この閾値未満では、通常、レアバリアントと言われる。
好ましくは、遺伝的変異は、ＤＮＡ中の塩基の置換、欠失または挿入によって引き起こされ得、コードおよび非コード領域を対象とし得る。多型遺伝子座は、集団の少なくとも２％がヘテロ接合型であるものである。これらの多型の結果は、タンパク質変異がそのタンパク質の機能も構造も変更しない場合、サイレントであり得る。あるいは、前記多型は、特に表現型の変化が観察される場合、例えばタンパク質が機能的に変更されている場合、非サイレント結果を有し得る。
【００２９】
ゲノタイピングステップは、突然変異の場合に抗生物質耐性を担う部位を含むＨｐ遺伝子の配列の少なくとも１つの部分を、前記部分の領域に相補的なオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのペア（プライマーのペア）で増幅させることによって実施される。実際には、抗生物質耐性を引き起こす少なくとも１つの突然変異部位は、プライマーのペア間に収まり、すなわち、プライマーのペアで増幅する領域は、抗生物質耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含有するＨｐ遺伝子の配列の部分を含む。
前記遺伝子は、好ましくは、２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ｇｙｒＡおよびＰＢＰ−１の中から選択される。
２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、突然変異の場合にクラリスロマイシンに対する耐性を担う。特に、この場合、本発明の方法を用いると、クラリスロマイシン耐性のほとんどを担う２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子中に収まる最も広範な突然変異の少なくとも１つを判定することが可能である。好ましくは、クラリスロマイシン耐性を担う前記突然変異は、Ａ２１４３Ｇ突然変異（すなわち２１４３位のアデニンがグアニンに改変されている）、Ａ２１４２Ｃ突然変異およびＡ２１４２Ｇ突然変異の中から選択される。
【００３０】
ｇｙｒＡ遺伝子は、突然変異の場合にレボフロキサシンに対する耐性を担う。特に、この場合、本発明の方法を用いると、その突然変異に起因して、リジンになる８７位におけるアミノ酸アスパラギンに影響する突然変異の少なくとも１つを判定することが可能である。具体的には、８７位において、２つの正常（野生型）バリアント、すなわちアミノ酸アスパラギンをコードするＡＡＣトリプレットまたはＡＡＴトリプレットが存在し得る。これらのトリプレットの３番目の塩基に影響し、それらをＡＡＡまたはＡＡＧに変形させる突然変異は、リジンによるアスパラギンの置換をもたらす。したがって、好ましくは、レボフロキサシン耐性を担う前記突然変異は、Ｃ２６１ＡおよびＣ２６１Ｇ突然変異から選択される。
【００３１】
さらに、本発明の方法を用いると、突然変異に起因して、グリシン、またはアスパラギン、またはアラニン、またはチロシンになる９１位におけるアスパラギン酸に影響する突然変異を判定することが可能である。
具体的には、９１位におけるトリプレット、すなわちＧＡＴ配列（アスパラギン酸をコードする）は、最初のヌクレオチド塩基の部位において、ＧＧＴトリプレット（グリシンをコードする）またはＴＡＴトリプレット（チロシンをコードする）で置換される。
したがって、本発明の方法を用いて判定されるレボフロキサシン耐性を担う突然変異は、好ましくは、Ｇ２７１Ａ、Ｇ２７１ＴおよびＡ２７２Ｇから選択される。
【００３２】
ＰＢＰ−１遺伝子は、突然変異の場合にアモキシシリンに対する耐性を担う。特に、この突然変異は、４１３位におけるアルギニンによるセリンのアミノ酸置換（Ｓｅｒ−４１３Ａｒｇ）を引き起こす。セリンをコードするＡＧＣトリプレットが３番目の塩基において突然変異され得、アルギニンをコードするトリプレットＡＧＡまたはＡＧＧになり得る。
好ましくは、本発明の方法を用いて判定されるアモキシシリン耐性を担う突然変異は、Ｃ４１３ＡおよびＣ４１３Ｇの中から選択される。
【００３３】
特に、Ｈｐ遺伝子配列の前記増幅部分は、配列番号１〜４の中から選択され、配列番号１および／または２は、２３Ｓ遺伝子を指し、配列番号３は、ｇｙｒＡ遺伝子を指し、および配列番号４は、ＰＢＰ−１遺伝子を指す。
好ましくは、プライマーのペアは、配列番号５および配列番号６を含む。前記プライマーのペアは、配列番号１および／または２の配列、すなわちＨｐのクラリスロマイシン耐性を担う突然変異部位の少なくとも１つを含むＨｐの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列の部分の増幅を可能にする。
あるいは、プライマーのペアは、配列番号９および配列番号１０を含む。前記プライマーのペアは、配列番号３の配列、すなわちＨｐのレキソフロキサシン（ｌｅｘｏｆｌｏｘａｃｉｎ）耐性を担う突然変異部位の少なくとも１つを含むＨｐのｇｙｒＡ遺伝子の配列の部分の増幅を可能にする。
【００３４】
あるいは、プライマーのペアは、配列番号１３および配列番号１４を含む。前記プライマーのペアは、配列番号４の配列、すなわちＨｐのアモキシシリン耐性を担う突然変異部位の少なくとも１つを含むＨｐのＰＢＰ−１遺伝子の配列の部分の増幅を可能にする。
【００３５】
任意に、単一増幅反応において２つ以上のプライマーのペアを使用して２つ以上のＨｐの抗生物質耐性を同時に判定／モニタリングすること、特にＨｐ株のクラリスロマイシン耐性、および／またはレキソフロキサシン（ｌｅｘｏｆｌｏｘａｃｉｎ）耐性、および／またはアモキシシリン耐性を判定／モニタリングすることができる。
増幅は、プライマーのペアに加え、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用して実施される。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、一端、好ましくは５’末端において高強度マーカー（レポーター）で標識されており、かつ他端、好ましくは３’において非蛍光または低強度マーカー（クエンチャー）で標識されている。さらに、２つのオリゴヌクレオチドプローブのうちの一方は、前記遺伝子の正常アレルに相補的かつ特異的であり、および一方は、前記抗生物質耐性を担う突然変異アレルに相補的かつ特異的である（図１を参照されたい）。
【００３６】
オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、ＦＡＭ（赤色蛍光を有する）、ＶＩＣ（緑色蛍光を有する）、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＳＹＢＥＲ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴおよびＲＯＸの中から選択されるマーカーで標識されている。
【００３７】
上記に十分に説明されるとおり、これらの２つの蛍光マーカーが同一のオリゴヌクレオチドプローブ上に存在する場合、クエンチャーは、レポーターによって発光される蛍光を封鎖する（吸収する）一方、それらが離隔している場合、例えばＤＮＡポリメラーゼによる分解の結果として生じる場合、レポーターの蛍光は、クエンチャーによって吸収されず、したがって検出／計測することができる。
【００３８】
したがって、本発明に関して、クエンチャーは、レポーターの蛍光を消光し、したがってプローブがインタクトである場合、それ自体の蛍光のみが計測可能である低エネルギー蛍光マーカー（フルオロフォア、例えば修飾ローダミン）を意味する。好ましくは、プローブは、マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）化学物質を有するＴａｑＭａｎプローブである。マイナーグルーブバインダー化学物質を有するプローブは、プローブが少なくとも２つの異なる蛍光物質、例えばＶＩＣおよびＦＡＭで標識されている系を意味する。この化学物質は、プローブの融解温度（商標）を、それらの長さを増加させずに増加させることを可能にし、したがって短鎖プローブを設計することができる。
【００３９】
好ましくは、プローブは、配列番号１３〜２３の中から選択される。
特に、配列番号１３および／または配列番号１４は、プライマーのペア配列番号５および配列番号６と使用され、配列番号１３は、抗生物質耐性を担う突然変異を有さない２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号１４は、好ましくはＡ２１４３Ｇ突然変異、Ａ２１４２Ｃ突然変異およびＡ２１４２Ｇ突然変異の中から選択される抗生物質耐性を担う突然変異を担持する２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的である。または配列番号３は、正常アレルに特異的であり、かつ配列番号４は、クラリスロマイシン耐性を担う突然変異を担持するものに特異的である。
【００４０】
好ましくは、配列番号１５、１６、１７およびそれらの組合せの中から選択される少なくとも１つのプローブは、プライマーのペア配列番号７および８と使用される。特に、配列番号１５〜１７は、レボフロキサシン耐性を担う突然変異部位の少なくとも１つを含有する配列番号３の配列の部分に相補的かつ特異的である。配列番号１５は、ｇｙｒＡ遺伝子の正常アレルに特異的であり、かつ配列番号１６および１７は、Ａｓｎ８７Ｌｙｓ突然変異に特異的である。
【００４１】
好ましくは、配列番号１８、１９、２０およびそれらの組合せの中から選択される少なくとも１つのプローブは、プライマーのペア配列番号９および１０と使用される。特に、配列番号１８〜２０は、レボフロキサシン耐性を担う突然変異部位の少なくとも１つを含有する配列番号３の部分に相補的かつ特異的である。配列番号１８は、ｇｙｒＡ遺伝子の正常アレルに特異的であり、かつ配列番号１９および２０は、Ａｓｐ９１Ｇｌｙ突然変異およびＡｓｐ９１Ｔｙｒ突然変異にそれぞれ特異的である。
【００４２】
好ましくは、配列番号２１、２２、２３およびそれらの組合せの中から選択される少なくとも１つのプローブは、プライマーのペア配列番号１１および１２と使用される。特に、配列番号２１〜２３は、アモキシシリン耐性を担う突然変異部位の少なくとも１つを含有する配列番号４の配列の部分に相補的かつ特異的である。配列番号２１は、ＰＢＰ−１遺伝子の正常アレルに特異的であり、かつ配列番号２２および２３は、Ｓｅｒ４１３Ａｒｇ突然変異に特異的である。
【００４３】
本発明の方法において使用される配列を表Ｉに示す。特に、表は、配列の配列番号、本発明の方法において機能を考慮する配列の名称および配列自体を示す。
本発明の配列を添付の配列表に提供する。添付の配列表に含有される配列は、詳細な説明に組み込まれるものと理解すべきである。
本発明の主題は、表Ｉに列記され、添付の配列表に全体として記載される配列番号１〜２３と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を特徴とする配列も含むとみなすべきである。
【表１】
2019506169.tif 000003
2019506169.tif 000004
2019506169.tif 000005
2019506169.tif 000006
2019506169.tif 000007
2019506169.tif 000008
2019506169.tif 000009
2019506169.tif 000010
【００４４】
本発明の方法によれば、同一の増幅反応において少なくとも２つの異なる標識プローブが存在し、それぞれは、異なるフルオロフォアを有し、それぞれは、突然変異の場合に抗生物質耐性を引き起こすアレルの１つに相補的である。したがって、２つのフルオロフォアの１つの特異的波長における蛍光の増加は、その所与のアレルについてのホモ接合型の状態と同等である一方、両方の波長における蛍光の発光は、ヘテロ接合型の状態と同等である。
【００４５】
本発明の主題は、本発明による方法を実行するためのキット、すなわち個体におけるＨｐ感染を判定／モニタリングし、同時にそのＨｐ株の抗生物質耐性を判定するためのキットにさらに関する。結果的に、キットは、Ｈｐ感染に伴う病変、とりわけ胃系を冒す病変、好ましくは胃炎、消化性潰瘍、胃癌、またはＭＡＬＴリンパ腫、消化不良、鉄欠乏性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、および胃十二指腸外の病変の判定も可能にする。
【００４６】
本発明の一実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのペア（プライマーのペア）および少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを含み、プライマーのペアは、抗生物質に対する耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含む少なくとも１つのＨｐ遺伝子のＤＮＡ領域中で対合し、特に前記少なくとも１つの突然変異部位を跨ぎ、前記オリゴヌクレオチドプローブは、２つの異なるマーカーで標識されており、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記遺伝子の正常アレルの遺伝子の領域の部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質耐性を担う前記遺伝子の突然変異アレルの遺伝子の領域の部分に相補的かつ特異的である。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、個体から単離された生物学的試料中のＨｐを判定するための、ならびに／またはＡ２１４３Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４２Ｇを含む群において選択される２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の突然変異によって誘発されるクラリスロマイシンに対する、かつ／もしくはＣ２６１Ａ、Ｃ２６１Ｇ、Ｇ２７１Ａ、Ｇ２７１Ｔ、Ａ２７２Ｇを含む群において選択されるｇｙｒＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされるレボフロキサシンに対する、かつ／もしくはＣ４１３ＡおよびＣ４１３Ｇを含む群において選択されるＰＢＰ−１遺伝子の突然変異によって誘発されるアモキシシリンに対する前記Ｈｐの耐性を判定するためのキットは、
−  リアルタイムＰＣＲにより、前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含む少なくとも１つのＨｐ遺伝子の少なくとも１つの部分を増幅させるための少なくとも１つのプライマーのペアであって、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について配列番号５および６の中から、ｇｙｒＡ遺伝子について配列番号９および１０の中から、かつｐｂｐ−１遺伝子について配列番号１３および１４の中から選択される、少なくとも１つのプライマーのペア、および
−  ２つの異なるマーカーで標識された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブであって、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含む少なくとも１つのＨｐ遺伝子の正常アレルの少なくとも１つの部分に相補的かつ特異的であり、および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブは、前記抗生物質に対する耐性を担う少なくとも１つの突然変異部位を含む少なくとも１つのＨｐ遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つの部分に相補的かつ特異的であり、前記オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１３〜２３を含む群において選択される、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブ
を含み、
−  配列番号１３および／または１４は、プライマーのペア配列番号５および６と使用され、および配列番号１３は、クラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有さない２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号１４は、Ａ２１４３Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４２Ｇを含む群において選択されるクラリスロマイシン耐性を担う突然変異を有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１および／または２の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−  配列番号１５、１６および１７は、プライマーのペア配列番号７および８と使用され、および配列番号１５は、レボフロキサシン耐性を担う突然変異を有さないｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、配列番号１６および／または１７は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｎ８７Ｌｙｓ突然変異を有するｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−  配列番号１８、１９および２０は、プライマーのペア配列番号９および１０と使用され、および配列番号１８は、レボフロキサシン耐性を担う突然変異を有さないｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、配列番号１９は、Ａｓｐ９１Ｇｌｙ突然変異を有するｇｙｒＡ遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ／または配列番号２０は、レボフロキサシン耐性を担うＡｓｐ９１Ｔｙ突然変異を有するｇｙｒＡ遺伝子、好ましくは配列番号３の少なくとも１つの部分に相補的であり、
−  配列番号２１、２２および２３は、プライマーのペア配列番号１１および１２と使用され、および配列番号２１は、アモキシシリン耐性を担う突然変異を有さないｐｂｐ−１遺伝子、好ましくは配列番号４の少なくとも１つの部分に相補的であり、かつ配列番号２２および／または２３は、アモキシシリン耐性を担うＳｅｒ４１３Ａｒｇ突然変異を有するｐｂｐ−１遺伝子の少なくとも１つの部分に相補的である。
【００４８】
任意にに、キットにおいて、少なくとも１つの酵素および少なくとも１つの緩衝液、例えば酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、陽性対照配列、陰性対照配列なども存在する。
＜実施例＞
【００４９】
細菌ＤＮＡの抽出
約２００ｍｇの糞便を２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で可溶化させた。
続いて、可溶化した糞便をＶｏｒｔｅｘミキサ上で約３０秒間振盪させることによって均一化した。
次いで、５００μｌのホモジネートを無菌シリンジで抜き取り、新たな１．５ｍｌの試験管中に移した。５００μｌのトリアゾル（Ｔｒｉａｚｏｌ）をホモジネートに添加し、それを数秒間にわたり激しく混合した。
続いて、１００μｌのクロロホルムをホモジネート−トリアゾル（Ｔｒｉａｚｏｌ）の混合物に添加し、それを１５秒間にわたり激しく混合し、１２０００ｇにおいて４℃で１５分間にわたり遠心分離した。
この処理は、３つの区別される相：水相（表面）、中間相（中間）およびフェノール相（底部）の形成をもたらす。
水相を廃棄する。
ＤＮＡを含有する残りの相（中間相およびフェノール相）に１５０μｌの１００％のエタノールを添加する。試料を反転によって混合し、室温において２〜３分間インキュベートする。
続いて、ＤＮＡを２０００ｇにおいて４℃で２分間にわたり遠心分離することによって沈降させる。
次いで、タンパク質を含有する表面相を除去し、１ｍｌのクエン酸ナトリウムをＤＮＡペレットに添加し、それを室温において３０分間インキュベートする。この処理後、試料を２０００ｇにおいて４℃で５分間にわたり遠心分離し、上清を除去する。
このクエン酸ナトリウムステップを２回繰り返す。
次いで、２ｍｌの７５％のエタノールをペレットに添加し、それを室温において２０分間インキュベートし、２０００ｇにおいて４℃で５分間にわたり遠心分離する。エタノールを完全に除去し、ＤＮＡペレットを１５〜２０分間乾燥させておく。
ＤＮＡペレットを５００μｌの８ｍＭのＮａＯＨ中で溶解させる。次いで、溶解させた試料を１４０００ｇにおいて室温で１０分間にわたり遠心分離して不溶性材料を除去する。遠心分離ステップの終了時、上清を新たな試験管中に移し、ＤＮＡを６０μｌの０．１ＭのＨＥＰＥＳおよび５．５μｌの１００ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁させる。
【００５０】
ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ配列の一次アセンブリ（ヌクレオチド配列）
配列番号１は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
この配列は、クラリスロマイシンに対する耐性を担う点突然変異の部位である。
ゲノタイピング実験は、不明試料のゲノタイプの判定に使用される終点実験である。このタイプの実験を用いると、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の場合のように、単一ヌクレオチドの突然変異に起因する多型（ＳＮＰ）を区別することが可能である。
特にクラリスロマイシンに対する耐性の場合、ゲノタイピング実験は、不明試料が、
・Ａについてホモ接合型（突然変異を担持しないヌクレオチド配列を有する試料）であるか、
・Ｇについてホモ接合型（突然変異を担持するヌクレオチド配列を有する試料）であるか、
・ヘテロ接合型（一方のアレル上の突然変異を担持し、他方のアレル上の突然変異を担持しないヌクレオチド配列を有する試料）であるか
を判定する目的を有する。
【００５１】
ゲノタイピング実験のためのＰＣＲ反応は、以下の構成要素を含む：
・陰性対照  −  試料の代わりに水または緩衝液を含有する標本（テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）としても公知）。陰性対照は、増幅を受けないはずである。
・陽性対照  −  既知のゲノタイプを含有する標本。
・試料  −  標的ゲノタイプが既知でない標本。
・レプリケート  −  同一の構成要素および容量を含有する同一反応物。
【００５２】
ゲノタイピング実験は、２つのステップ：
（ｉ）熱サイクル（ＰＣＲ増幅）、および
（ｉｉ）シグナル終点検出
を必要とする。
ラージスケールでの突然変異のゲノタイピングのため、ＴａｑＭａｎ（登録商標）化学物質を用いるリアルタイムＰＣＲの方法を使用した。標的配列は、好適なプライマーで予備増幅させなければならない。２つのプライマー間に位置するプローブは、目的の突然変異を含有する配列を同定する。
【００５３】
配列番号２、すなわちＨｐのクラリスロマイシン耐性を誘発するＡ／Ｇ突然変異の位置を含有する２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の部分を以下に示す。
プライマーの位置を太字で示し、プローブを灰色で強調する。理解され得るとおり、プライマーは、クラリスロマイシン耐性を担うと考えられる突然変異の部位を含有する領域を跨ぎ、プローブは、考えられる突然変異の部位が存在するこの領域の部分に正確に相補的である（すなわち、それと対合する）。
【化１】
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【００５４】
したがって、ＰＣＲに使用されるプライマーは、以下のとおりである。
【表２】
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使用されるプローブは、以下のものである。
【表３】
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特に、フルオロフォアＶＩＣで標識されたプローブを使用して塩基Ａを区別した一方、フルオロフォアＦＡＭで標識されたプローブを使用して塩基Ｇを区別した（突然変異の場合）。
２アレル系において、対象の場合のように、同一反応において異なるフルオロフォア（この場合、正常アレルについてＦＡＭ（商標）および突然変異アレルについてＶＩＣ（商標））で標識された２つの異なるプローブが存在し、それぞれは分析中のＳＮＰのアレルの１つに相補的である。対合（アニーリング）段階中、プローブのそれぞれは、その特異的鎖とハイブリダイズする。結果は、その所与のアレルについてのホモ接合型の状態と同等の２つの蛍光マーカー（フルオロフォア）の１つの特異的波長における蛍光の増加である一方、両方の波長における蛍光発光は、ヘテロ接合型の状態と同等である。
【００５５】
一般に、アレル区別アッセイは、それらが品質管理試験をパスする場合にのみ合成する：
・正確な合成を確認するため、それぞれのプライマーおよびそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが質量分析によって個々に試験され、
・少なくとも１つの容易に解釈可能なアレル区別クラスタ、すなわち組成および／または位置の観点から互いに類似または近い少なくとも１つの単位群を産生しなければならず、例えば、この場合、それは同一の遺伝子構成を有する遺伝子クラスタまたは類似もしくは密接に相関する産物の群（例えば、突然変異ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐ．）を示す試料の群および／または正常／野生型ヘリコバクター・ピロリを有する群）であり、
・プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブが性能標準に達し得ないアッセイは、品質管理試験をパスせず、
・関連ＳＮＰに並行する配列は、フォーマット化され、バリデートされ、かつ順序付けられている。
【００５６】
前記のとおり、ゲノタイピング実験において、ＰＣＲは、それぞれのアレルについての蛍光マーカー（フルオロフォア）で標識された特異的プローブ（多型の部位を含む短いヌクレオチド配列）を含む。プローブは、それぞれのアレルを区別する目的のために異なる高強度蛍光マーカー（蛍光レポーター）をそれぞれ含有する。
【００５７】
本出願人らが所有するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴシステム上でＴａｑＭａｎ（登録商標）マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）プローブを使用することが可能である。
それぞれのＭＧＢ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、
・全てのプローブの５’末端における蛍光色素レポーターであって、
−  この場合、蛍光色素ＶＩＣ（登録商標）は、野生型アレルのプローブの５’末端に結合しており、
−  蛍光色素ＦＡＭ（商標）は、突然変異アレルのプローブの５’末端に結合している、蛍光色素レポーター、
・マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）（ＭＧＢ化学物質は、プローブの融解温度（Ｔｍ）をそれらの長さを増加させずに増加させ（Ａｆｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋｕｔｙａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、したがってより短鎖のプローブの設計を可能にする。したがって、ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブは、対合および非対合プローブ間のＴｍの値のより大きい差を示し、Ｔｍの値のより大きい差は正確なゲノタイピングを提供する）、
・プローブの３’末端における非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）
を含有する。
対象の場合において、以下の量の試料をそれぞれのウェルについて添加した９６ウェル光学式読取プレート上でリアルタイムＰＣＲを設定した。
【表４】
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【００５８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、緩衝液、ｄＮＴＰおよびＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含有する。
ＳＮＰゲノタイピングアッセイは、２つのプライマー（フォワードおよびリバース）およびそれぞれのアレルについて特異的な２つのプローブを含有し、プローブの一方は、５’末端において蛍光マーカーＦＡＭ（商標）（赤色蛍光を有する）で標識されており、他方は、蛍光マーカーＶＩＣ（登録商標）（緑色蛍光を有する）で標識されている。
【００５９】
ＤＮＡを以下の実験条件下で増幅させた：
−  ６０℃において１分間、プレリード：初期の蛍光の発光を検出するため、
−  ５０℃において２分間、
−  ９５℃において１０分間、
−  ９５℃において１５秒間、
−  ６０℃において１分間、４０サイクル、
−  ６０℃において１分間、ポストリード：３つの異なるゲノタイプのクラスタリングを検出するため。
提供されるＳＤＳソフトウェアを使用して結果を分析し、読み取った。
上記試験を、Ｈ．ｐ．感染の診断に現在利用可能な侵襲および非侵襲試験と比較することにより、本方法の感度および特異度を評価した。
Ｈｐについて組織学的に陽性である患者群を分析した。
この目的のため、上記方法を、現在、Ｈｐの診断における判断基準とみなされている試験、すなわち組織学的試験、および組織から抽出されたＤＮＡと比較した。７２人のＨｐ陽性患者を分析した。
パラフィン中で封入された組織から細菌ＤＮＡを抽出し、耐性を担う突然変異の同定のために上記分子分析に供した。
２つの分子分析間の一致率は１００％であった。
分子分析によってのみ検出可能であった数例の偽陰性の存在を考慮すると、組織学的診断との一致率は９２％であった。
【００６０】
本出願人らの試験と、糞便抗原（Ａｇ）についての試験との比較は、６８％の一致率を示した。
したがって、本発明の分子的方法は、使用される組織学的試験および他の方法（糞便Ａｇ）から生じる数例であるが有意な偽陰性の同定も可能にした。
Ａ２１４３Ｇ突然変異の頻度は２６％であり、文献中のデータと一致した。
【表５】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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