(57)【要約】  新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）及びｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）が提供されている。炎症性障害及びがんの治療方法ならびに予防方法もまた、提供されている。加えて、がん患者における転移の阻害方法も提供されている。炎症性障害もしくは癌を有する患者、またはそれらを発症するリスクに曝されている患者に対しｎＮＩＦ及び／またはＮＲＰを投与することを、本方法に含めてもよい。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者またはがんを発症するリスクに曝されている患者を治療する方法であって、前記方法が、ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）と医薬上許容される担体と含む有効量の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、癌の病理学的影響もしくは徴候を軽減すること、またはがんを発症するリスクを低減する、前記方法。
【請求項２】
前記ＮＩＰが、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＰＲ）、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記がんが、黒色腫、卵巣癌、胃癌、または肺癌のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記医薬組成物が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を実質的に阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
がん患者における転移を阻害する方法であって、前記方法が、ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）と医薬的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記患者における転移リスクを低減する、前記方法。
【請求項７】
前記ＮＩＰが、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＰＲ）、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記がんが、黒色腫、卵巣癌、胃癌、または肺癌のうちの少なくとも１つである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記医薬組成物が好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を実質的に阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）での治療により利益が得られるがん患者を診断する方法であって、前記患者からがん性細胞の試料を採取することと、前記がん性細胞試料中にＮＥＴ形成が存在するかどうかを検出することと、前記がん性細胞試料中にＮＥＴ形成の存在が検出された場合に、前記患者を、ＮＩＰでの治療による利益を受けられる患者として診断することと、を含む前記方法。
【請求項１２】
前記がん性細胞が、メラニン形成細胞、卵巣細胞、胃細胞、または肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）での治療による利益が得られるがん患者を診断及び治療する方法であって、前記患者からがん性細胞の試料を採取することと、前記がん性細胞試料中にＮＥＴ形成が存在するかどうかを検出することと、前記がん性細胞試料中にＮＥＴ形成の存在が検出された場合に、前記患者を、ＮＩＰでの治療による利益を受けられる患者として診断することと、前記診断を受けた患者に対しＮＩＰを含む有効量の医薬組成物を投与することと、を含む前記方法。
【請求項１４】
前記ＮＩＰが、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＰＲ）、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記がん性細胞が、メラニン形成細胞、卵巣細胞、胃細胞、または肺細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬組成物によって実質的にＮＥＴ形成が阻害される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
炎症性障害患者または障害を発症するリスクに曝されている患者の治療方法であって、新生児ＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類縁体、ＮＲＰ類縁体の医薬的に許容される塩、および医薬的に許容される担体のうちの少なくとも１つを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することと、を含み、前記炎症性障害の病理学的影響もしくは徴候を軽減すること、または前記炎症性障害を発症するリスクを低減する、前記方法。
【請求項１９】
前記ＮＲＰが、ＣＲＩＳＰＰ（がん関連ＳＣＭ認識・免疫防御抑制及びセリンプロテアーゼ保護ペプチド）；Ａ１ＡＴの４４アミノ酸カルボキシ末端開裂断片（Ａ１ＡＴｍ358）；またはＡ１ＡＴの高温要件Ａ１（ＨＴＲＡ１）開裂断片（ＨＴＲＡ１−ＣＦ）のうちの少なくとも１つである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記炎症性障害が急性炎症性障害、慢性炎症性障害、または免疫障害のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症性障害が自己免疫障害である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記炎症性障害が、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、がんの炎症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性肺疾患（ＩＬＤ）、インフルエンザ誘発性肺炎、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）、歯周炎、子癇前症、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、血栓症、輸血関連急性肺疾患（ＴＲＡＬＩ）、血管炎、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウェゲナー肉芽腫症（ＷＧ）、または治療抵抗性の炎症の障害のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記血栓症が静脈血栓症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記血栓症が動脈血栓症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記医薬組成物が、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）媒介炎症性組織損傷を実質的に阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
未熟児合併症患者または未熟児合併症を発症するリスクに曝されている患者の治療方法であって、新生児ＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類縁体、またはＮＲＰ類縁体の医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含む有効量の医薬組成物を患者に投与すること、を含み、前記未熟児合併症の病理学的影響もしくは徴候を軽減すること、または前記未熟児合併症を発症するリスクを低減する、前記方法。
【請求項２８】
前記ＮＲＰが、ＣＲＩＳＰＰ（がん関連ＳＣＭ認識・免疫防御抑制及びセリンプロテアーゼ保護ペプチド）；Ａ１ＡＴの４４アミノ酸カルボキシ末端開裂断片（Ａ１ＡＴｍ358）；またはＡ１ＡＴの高温要件Ａ１（ＨＴＲＡ１）開裂断片（ＨＴＲＡ１−ＣＦ）のうちの少なくとも１つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記未熟児合併症が、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）、肺炎、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）、神経発達遅延、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、または敗血症のうちの少なくとも１つから選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物が、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）媒介炎症性組織損傷を実質的に阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
新生児ＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＮＲＰは、ＣＲＩＳＰＰ（がん関連ＳＣＭ認識・免疫防御抑制及びセリンプロテアーゼ保護ペプチド）、Ａ１ＡＴの４４アミノ酸カルボキシ末端開裂断片（Ａ１ＡＴｍ358）、または高温の必要条件Ａ１（ＨＴＲＡ１）開裂断片のＡ１ＡＴ（ＨＴＲＡ１−ＣＦ）のうちの少なくとも１つである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ＮＲＰがＣＲＩＳＰＰまたはその塩であり、且つＣＲＩＳＰＰまたはその塩のアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ＮＲＰがＡ１ＡＴｍ358またはその塩であり、前記Ａ１ＡＴｍ358またはその塩のアミノ酸配列が、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＮＲＰが、ＨＴＲＡ１−ＣＦまたはその塩であり、前記ＨＴＲＡ１−ＣＦのアミノ酸配列またはその塩が、配列番号：４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記ＣＲＩＳＰＰ、Ａ１ＡＴ358、またはＨＴＲＡ１−ＣＦのうちの少なくとも１つのアミノ酸が化学修飾剤に結合しており、前記化学修飾剤が脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または糖類のうちの少なくとも１つから選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ＣＲＩＳＰＰ、Ａ１ＡＴ358、またはＨＴＲＡ１−ＣＦが、炎症性組織損傷もしくは炎症性血管損傷のうちの少なくとも１つから選択される損傷を実質的に阻害するのに有効な量にて存在する、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ＣＲＩＳＰＰ、Ａ１ＡＴ358またはＨＴＲＡ１−ＣＦが、多形核白血球（ＰＭＮ）機能を全体的に低下させない、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記ＣＲＩＳＰＰ、Ａ１ＡＴ358、またはＨＴＲＡ１−ＣＦが、走化性、ケモカインの合成及び分泌、サイトカインの合成及び分泌、細胞外殺菌、細胞内殺菌、食作用、ならびに活性酸素種（ＲＯＳ）生成のうちの少なくとも１つから選択される多形核白血球（ＰＭＮ）のうちの１つもしくは複数の活性を実質的に阻害しない、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記ＣＲＩＳＰＰ、Ａ１ＡＴ358、またはＨＴＲＡ１−ＣＦが天然起源のものでない、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記ＣＲＩＳＰＰ、Ａ１ＡＴ358、またはＨＴＲＡ１−ＣＦが、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成を実質的に阻害するのに有効な量で存在する、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ＮＥＴ形成が、細菌、真菌、寄生虫、またはウイルスのうちの少なくとも１つによって刺激される、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記ウイルスが、出血熱ウィルス、フィロウィルス、アレナウイルス、ハンタウイルス、またはフラビウイルスのうちの少なくとも１つである、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記細菌が、バチルス種、エシェリキア種、フランシセラ種、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種、またはエルシニア種のうちの少なくとも１つである、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記ＮＥＴ形成が、β−デフェンシン１、ＨＩＶ−１、リポ多糖（ＬＰＳ）、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのα−トキシンのうちの少なくとも１つによって刺激される、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）であって、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つの、６個以上の連続アミノ酸を含む、前記ＮＲＰ。
【請求項４８】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つの少なくとも１２個の連続アミノ酸を含む、請求項４７に記載のＮＲＰ。
【請求項４９】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つの少なくとも２４個の連続アミノ酸を含む、請求項４７に記載のＮＲＰ。
【請求項５０】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つを含む、請求項４７に記載のＮＲＰ。
【請求項５１】
前記ＮＲＰの配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つに対して少なくとも２０％同一である、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）。
【請求項５２】
前記ＮＲＰの配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つに対して少なくとも４０％同一である、請求項５１に記載のＮＲＰ。
【請求項５３】
前記ＮＲＰの配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つに対して少なくとも６０％同一である、請求項５１に記載のＮＲＰ。
【請求項５４】
前記ＮＲＰの配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：４のうちの１つに対して少なくとも８０％同一である、請求項５１に記載のＮＲＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４９２，０１９号、及び２０１６年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３８３，２４３号の利益を主張するものであり、これらの各文献は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【０００２】
本開示は、新生児好中球阻害因子（ｎＮＩＦ）及びｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）に関する。本開示はまた、ｎＮＩＦ及びＮＲＰを使用して好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害する方法にも関する。更にまた、炎症性障害及びがんに対する治療ならびに予防の用途に、ｎＮＩＦ及びＮＲＰを使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成は、好中球が細胞外空間の微生物を捕獲し、固定化し、推定上殺滅させることを可能にする防御的装備（多形核白血球；ＰＭＮ）における重要な構成要素であり得る（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４、及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４；３０３（５６６３）：１５３２−５を参照）。ＮＥＴ形成は、ネトーシスと通称される新規な細胞死プロセスによって生起されるが、好中球がすぐには死滅しない「生命維持的」ネトーシスも記載されている（Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４、及びＹｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；１８（９）：１３８６−９３を参照）。ＮＥＴ形成に至る分子メカニズムは必ずしも完全に解明されてきたとは限らず、或る程度は刺激に依存し得る（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４、及びＰａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１を参照）。にもかかわらず、クロマチンの脱凝縮及びＤＮＡの抽出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）は、ヒストン及び顆粒含有量と共に中心的事象である（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；１８（９）：１３８６−９３；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１を参照）。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４）の媒介によるヒストンの除去（Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１８４（２）：２０５−１３；Ｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１０；２０７（９）：１８５３−６２、及びＫｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）を参照）は、核の脱凝縮及びＮＥＴ形成に関して必須条件であると考えられている（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０���参照）。
【０００４】
病原体のＮＥＴ媒介による捕獲及び除去によって、食作用及び細胞内殺滅をはじめとする従来のＰＭＮ抗菌活性を補完することが可能である（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３、及びＮａｕｓｅｅｆ  ＷＭ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．  ２００７；２１９（８８−１０２）を参照）。臨床所見から分かるように、いくつかの実例において、ＮＥＴ形成の欠陥は難治性感染症の一因となる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３、及びＢｉａｎｃｈｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４（１３）：２６１９−２２を参照）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの病原体殺滅におけるＮＥＴの重要性は依然として明らかにされていない（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３、及びＹｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４を参照）。対照的に、実質的な証拠もある。それは、ヒストンと顆粒プロテアーゼとを含むＮＥＴ及びＮＥＴ関連因子が、血管及び組織の損傷を媒介するという点、ならびにＮＥＴを介した損傷が、宿主に対する先天性免疫側副損傷という以前には認識されていなかったメカニズムであるという点である（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）、及びＸｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；１５（１１）：１３１８−２１）を参照。実験モデル、及び一定限度の臨床観察によって示唆されるように、血管内または血管外ＮＥＴ形成は菌血症における組織損傷に寄与する（Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）；Ｃｌａｒｋ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７；１３（４）：４６３−９、及びＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  &  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１２；１２（３）：３２４３３）、輸血関連急性肺損傷（Ｃａｕｄｒｉｌｌｉｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２；１２２（７）２６６１−７１を参照）、肺移植後の原発性移植片機能不全（Ｓａｙａｈ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；１９１（４）：４５５−６３を参照）、無菌性血管障害、及び免疫炎症（Ｃｈｅｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（２４）：３８１８���２７、及びＬｏｏｄ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１６；２２（２）：１４６−５３を参照）、血栓症（Ｆｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０；１０７（３６）：１５８８０−５）及びインフルエンザ（Ｐｉｌｌａｉ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  (Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照），２０１６；３５２（６２８４）：４６３−６を参照）。それゆえ、ＮＥＴ形成が好中球の重要な不適応作用となる可能性がある（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０を参照）のは、不適切に引き起こされた場合、感染症及び炎症において規制されない場合である。
【０００５】
ヒト新生児は、独自且つ複雑な免疫調節、感染に対する感受性、及び炎症性病状を有する。産児は子宮内の無菌環境内にあるが、分娩前または分娩中に病原体及びその生成物に曝露される可能性がある（ＭｃＤｏｎａｇｈ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２００４；１９０（４）：８２６−３４を参照）。更にまた、分娩後に、新生児に細菌が急速に定着する。これは、循環好中球及び骨髄好中球の増加に関連するプロセスである（Ｐａｌｍｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；５（７）：ｅ１７７；Ｊｏｓｔ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１２；７（８）：ｅ４４５９５、及びＤｅｓｈｍｕｋｈ  ＨＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１４；２０（５）：５２４−３０を参照）。複合的な適応が進行したことによって、周産期において、ならびに保護された子宮内環境から継続的な微生物のコロニー形成及び曝露へと突然新生児が遷移した際に、過度の損傷的炎症が予防されたと思われる（Ｄｏｗｌｉｎｇ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３５（７）：２９９３１０；Ａｄｋｉｎｓ  Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；５７（１−３）：２４６−５７、及びＥｌａｈｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０４（７４７８）：１５８−６２を参照）。しかしながら、これらの適応は感染に対する感受性の増強を伴う可能性がある（Ａｄｋｉｎｓ  Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；５７（１−３）：２４６−５７、及びＥｌａｈｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０４（７４７８）：１５８−６２）を参照。これまでに見出されてきたように、早期産児及び正期産児の臍帯血から単離されたＰＭＮは、刺激されてもＮＥＴを形成せず、ＮＥＴ媒介性の殺菌に欠陥を来たす。このことは、そのような適応を示唆している（Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７を参照）。他の研究者らが以後に報告したところによれば、単離された新生児好中球がｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激されると、ＮＥＴ形成が一時的に遅延する（Ｍａｒｃｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４（２３）：４９０８−１１，ａｕｔｈｏｒ  ｒｅｐｌｙ  １１−２を参照）。
【０００６】
本明細書中に開示されている実施形態は、添付の図面と併せて参照することにより、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面には、典型的な実施形態のみが描かれている。これらの実施形態の更なる具体性及び詳細については、添付の図面を使用して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａは、早期新生児７人に由来する好中球を描画した一連の画像である。これらは、生後の初期２８日間の長期にわたって検診された。グラフに示すように、生細胞撮像（ＮＥＴ＝赤色蛍光、黄色矢印；核ＤＮＡ＝灰色；倍率２０倍、スケールバー＝１００μｍ）により評価されたリポ多糖（ＬＰＳ）（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）に応じて、ＮＥＴ形成のためＮＥＴ関連ヒストンＨ３を放出した（ベースラインに対する倍数変化；平均±ＳＥＭ）。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。任意に１に設定された対照ヒストンＨ３放出と比較して、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１（赤い破線）。図１Ｂは、出産日における健常正期新生児の臍帯血から単離された好中球（左パネル）、または生後２日目に静脈血から単離された好中球（右パネル）を表す２つの画像である。これをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）で刺激し、図１Ａのように撮像した。第２正期新生児に由来する好中球によるＮＥＴ形成を分析し、同じパターンが得られた。図１Ｃは、出産当日における健常妊婦の静脈血から単離された好中球を描画した、２つの画像である。これらの好中球を培地単独中でインキュベートするかまたはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で１時間刺激して、図１Ａのように撮像した（倍率６０倍、スケールバー＝１００μｍ）。第２の健常正期の母親に由来する好中球もまた、ＬＰＳに応答して堅牢にＮＥＴを形成した。図１Ｄは、６０日齢の早期新生児（ｎ＝５）の静脈血から単離し、６０日目の自家血漿または保存した自家臍帯血血漿と一緒に１時間プレインキュベートし、ＬＰＳで刺激して、図１ＡのようなＮＥＴ形成（倍率６０倍、スケールバー＝１００μｍ）に関して評価した、好中球を描画した一連の画像である。健常成人の静脈血から単離されて自家臍帯血血漿または貯留臍帯血血漿中でプレインキュベートされた好中球を、並行して研究した。ＮＥＴ関連ヒストンＨ３の放出（ベースラインに対する倍数変化；平均±ＳＥＭ）が、グラフに描画されている。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。成人ＬＰＳは、新生児ＬＰＳと比較して*Ｐ＜０．０５であり、新生児の自家血漿中ＰＭＮは、臍帯血血漿と比較して**Ｐ＜０．０１であり、成人の自家血漿中ＰＭＮは、臍帯血血漿漿と比較して†Ｐ＜０．００１であり、である。図１Ａ〜図１Ｄに、ヒト臍帯血中にＮＥＴ阻害因子が存在することが示されている。
【図２】図２Ａは、質量分析法によるｎＮＩＦの暫定部分配列、及び公開されているＣＲＩＳＰＰ配列（引用元：Ｃｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９２；１６（５−６）：３０５−１９）、ならびにＡ１ＡＴである。図２Ｂは、健常正期新生児臍帯血血漿（ｎ＝４）及び成人静脈血血漿（ｎ＝４）の試料が描画されている。これらの試料は、Ａ１ＡＴのカルボキシ末端に対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングで分析されたものである（左パネル）（完全なゲルは後述の図１０に図示されている）。右パネルに描画されているのは、完全長Ａ１ＡＴのサイズ排除、Ａ１ＡＴカルボキシ末端に対する同じポリクローナル抗体による定量的ウェスタンブロッティング、ならびに合成ｎＮＩＦを用いて生成した標準曲線（下表２を参照）を使用して、早期新生児に由来する臍帯血血漿及び健常成人に由来する静脈血血漿中ｎＮＩＦ濃度の測定値（各群中ｎ＝８）である。スチューデントのｔ検定、**Ｐ＜０．０１。図２Ｃは、ＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）成人好中球によるＮＥＴ形成を描画した、一連の画像である。対照培地、臍帯血血漿漿、アフィニティービーズに結合したポリクローナルカルボキシ末端Ａ１ＡＴ抗体を用いてｎＮＩＦが除去された臍帯血血漿中でＰＭＮをプレインキュベートした後、またはアフィニティービーズから溶出した後、図１Ａと同様に評価した（倍率６０倍、スケールバー＝５０μｍ）。この結果は、種々のドナーからの好中球を用いた３つの実験で一致していた。図２Ｄは、全長Ａ１ＡＴ、合成ｎＮＩＦ、及び枯渇臍帯血血漿試料、図２Ｃで研究された溶出液を、カルボキシ末端Ａ１ＡＴ抗体と共にウェスタンブロッティングに供したものを描画した画像である。全長Ａ１ＡＴは、サイズが５２ｋＤａのため、この１６．５％トリス−トリシンゲル上に検出されなかった。図２Ｅは、ＬＰＳ活性化成人ＰＭＮによるＮＥＴ形成を描画した、一連の画像である。図１Ａと同様、対照培地中（第２のパネル）で、または完全長のＡ１ＡＴ（２μＭ）もしくは合成ｎＮＩＦ（１ｎＭ）（ｎ＝３）と共に１時間プレインキュベーションした後で、評価された。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。ｎＮＩＦは、対照培地／ＬＰＳ及びＡ１ＡＴ／ＬＰＳの両方と比較して*Ｐ＜０．０５。ＮＥＴ関連ヒストンＨ３含量（ベースラインに対する倍数変化）が、グラフに描画されている。図２Ａ〜図２Ｅに、ｎＮＩＦ及び関連ＮＲＰがＮＥＴ阻害ペプチドのファミリーを表すことが示されている。
【図３】図３Ａは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）の活性化が描画されている。ＬＰＳ及びＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／ＬＰＳは対照と比較して**Ｐ＜０．０５。ＣＲＩＳＰＰ／ＬＰＳ及びｎＮＩＦ／ＬＰＳはＬＰＳ及びＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／ＬＰＳの両方と比較して†Ｐ＜０．０５。図３Ｂは、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（２０ｎＭ）活性化を描画した図である。ｎＮＩＦ／ＰＭＡ及びＣＲＩＳＰＰ／ＰＭＡの両方は、ＰＭＡまたはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／ＰＭＡと比較して*Ｐ＜０．０５。ＣＲＩＳＰＰ／ＰＭＡは、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／ＰＭＡと比較して**Ｐ＜０．０１である。図３Ｃは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ；ＭＯＩ  １００：１）の活性化を表す。ＣＲＩＳＰＰ／ＳＡに対して*Ｐ＜０．０５（ＳＡまたはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／ＳＡと比較した場合）。図３Ｄには、デング熱ウイルス（ＭＯＩ  ０．０５：１）の活性化が描画されている。ウイルス培養培地単独で、デング熱ウイルスに対する「偽」対照（左パネル）としての役目を果たした。インキュベーションに続いて、直ちにＰＭＮをインキュベーション培地（２％パラホルムアルデヒド）中に固定した後、撮像したが、ヒストンＨ３の放出を定量化することは不可能であった。図３Ｅには、ヘム（１μＭ）が描画されている。ヘム、ＬＰＳ及びＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／ヘムは、対照と比較して*Ｐ＜０．０５。ＣＲＩＳＰＰ／ヘムは、ヘムと比較して†Ｐ＜０．０５。図３Ａ〜図３Ｅから分かるように、ＮＥＴ誘導アゴニストにより引き起こされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＥＴ形成は、ｎＮＩＦ及びＮＲＰ  ＣＲＩＳＰＰによって阻害される。健常成人の静脈血に由来する好中球を培地単独で、またはｎＮＩＦ、ＣＲＩＳＰＰもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（全て１ｎＭ）と共に１時間プレインキュベートし、指示されたアゴニストで活性化し（それぞれｎ≧３）、１時間インキュベーションした後、図１Ａと同様にＮＥＴ形成を評価した（倍率２０倍；スケールバー＝５０μｍ）。いずれのデータも±ＳＥＭである。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｅにおいて、任意に１に設定された対照値は、赤い破線で示されている。図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｅにおいて、テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡが適用された。図３Ｃまたは図３Ｄでは、ｎＮＩＦを研究の対象から除外した。
【図４】図４Ａは、健常成人の静脈血から単離された後、培地単独で培養された好中球（対照）、またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で活性化された好中球を描画した、一連の画像である。ＬＰＳの０分後、３０分後または６０分後にＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）を加え、更に１時間インキュベートした後、図１Ａと同様、生細胞撮像（倍率２０倍、スケールバー＝１００μｍ）によってＮＥＴの存在を評価した。これらの画像は、３つの別々の実験を表したものである。図４Ｂは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）、ＤＮアーゼ（３．７８Ｕ／ｍＬ）、ｎＮＩＦ（１ｎＭ）またはＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）で刺激された、単離された成人好中球を描画し、ＮＥＴは、更に１時間インキュベートした後、図４Ａと同様に撮像した（倍率６０倍、スケールバー＝２０μｍ）。第２の実験では、ＮＥＴはｎＮＩＦまたはＣＲＩＳＰＰによる治療後も無傷であったが、ＤＮアーゼによって分解した。図４Ａ及び図４Ｂは、ＮＲＰがＮＥＴを分解しないことを示す図である。
【図５】図５Ａは、単離された成人好中球を、培地中（１時間）でプレインキュベートし、次いで単独でインキュベートするか（対照）またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）と共にインキュベートしてから、図１Ａと同様、生細胞を撮像したもの（倍率６０倍、スケールバー＝２０μｍ）を描画した、２つの画像である。図５Ｂは、合成されたＡ１ＡＴｍ358またはスクランブルされたＡ１ＡＴｍ358（Ａ１ＡＴｍ358−ＳＣＲ）（１ｎＭ、１０ｎＭもしくは１００ｎＭ、１時間）と共にプレインキュベートしてからＬＰＳで活性化された好中球と、１時間インキュベートした後で生細胞撮像により評価されたＮＥＴと、を並列して描画した一連の画像である。第２の実験では、Ａ１ＡＴｍ358使用時に同様の濃度依存的な阻害パターンが得られたのに対して、Ａ１ＡＴｍ358−ＳＣＲ使用時には得られなかった。図５Ａ及び図５Ｂに、ＮＥＴ形成がＡ１ＡＴｍ358によって阻害されることが示されている。
【図６】図６Ａは、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激してＮＥＴ形成を引き起こして病原性Ｅ．ｃｏｌｉ単離株とインキュベートした好中球のプレインキュベーション後の結果を描画した、グラフである。貪食性殺菌及びＮＥＴ媒介性殺菌の総数について測定を行った（Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７を参照）。ボンフェローニの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。図６Ｂは、ＬＰＳ刺激後（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）のジヒドロローダミン検出によって測定された活性酸素種の生成を描画したグラフである。図６Ｃは、４時間のインキュベーション後に顕微鏡検査によって測定された、蛍光タグ付きＥ．ｃｏｌｉバイオ粒子の食作用を描画した、グラフである。サイトカラシンＢ及びＤでの処置は、食作用の阻害に対する対照としての役目を果たした。スチューデントのｔ検定、*Ｐ＜０．０５。図６Ｄは、ボイデンチャンバーアッセイにおいて検査されたＩＬ−８（２ｎｇ／ｍＬ）に応答した走化性を描画したグラフである。破線は、任意に１に設定されたＩＬ−８単独に対する応答を示す。図６Ｅは、フローサイトメトリーで測定されたトロンビン（０．１Ｕ／ｍＬ）により活性化された血小板上のＰ−セレクチンの表面転座を描画した、グラフである。破線は、刺激されていない血小板上の表面Ｐ−セレクチンを示す。図６Ｆは、トロンビン（０．１Ｕ／ｍＬ）で活性化された血小板とＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で活性化された好中球とを混合した後に測定された、血小板中球凝集体の形成を描画したグラフである。破線は、ＰＭＮ単独のＬＰＳ刺激に応答した、対照凝集体の形成を示す。ＣＲＩＳＰＰ及びＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲは、対照と比較して、*Ｐ＜０．０５。図６Ａ〜図６Ｆの一連のグラフには、緩衝液またはＣＲＩＳＰＰ、ｎＮＩＦもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲと共に（それぞれ１ｎＭを１時間）プレインキュベートし、続いて機能的応答を測定した、単離された成人好中球または血小板が描画されている。反応ごとに、最低３回の別々のアッセイを行った。エラーバー＝ＳＥＭ。図６Ｂ、図６Ｄ、図６Ｅ及び図６Ｆには、テューキーの事後テストが適用されている。図６Ａ〜図６Ｆには、ＮＥＴ形成がＮＲＰによって選択的に阻害されることが示されている。
【図７】図７Ａは、培地単独で、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ−ＳＣＲ、ＣＲＩＳＰＰもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（全て１ｎＭ）、または不可逆的ＰＡＤ４阻害剤であるＣｌ−アミジン（１０μＭ）と１時間プレインキュベートし、ＰＭＡ（２０ｎＭ）で処置した後、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップ上で２時間インキュベートした後、生細胞撮像（緑色蛍光＝核ＤＮＡ；６０倍、スケールバー＝２０μｍ）により核の脱凝縮（矢印）を検査した好中球を描画した、一連の画像である。図７Ｂは、ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェアを使用して測定された核面積（ｎ＝４）を示すグラフ（細胞当たりの平均核画素面積±ＳＥＭ）である。対応のあるスチューデントのｔ検定、*Ｐ＜０．０５、§Ｐ＝０５７。図７Ｃは、組み換えＰＡＤ４及び合成基質を用いた無細胞脱離アッセイにおいて検査されたｎＮＩＦ（１ｎＭ）、ｎＮＩＦ−ＳＣＲ（１ｎＭ）及びＣｌ−アミジン（１０μＭ）を描画したグラフである。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。***Ｐ＜０．００１。図７Ｄは、左パネルに、ｎＮＩＦもしくはｎＮＩＦ−ＳＣＲ（両方とも１ｎＭ）、またはＣｌ−アミジン（１０μＭ）と共に３０分間培地中でプレインキュベートした好中球を、ＰＭＡ（２０ｎＭ）で１５分間活性化し、シトルリン化ヒストンＨ３を免疫細胞化学法により検出したもの（ｎ＝３）を描画した、一連の画像である。緑色蛍光＝シトルリン化ヒストンＨ３、マゼンタ蛍光＝核ＤＮＡ（倍率６０倍；スケールバー＝２０μｍ）。右パネルは、ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェアを用いて定量されたＦｌｉｓｔｏｎｅ  Ｈ  ３シトルリン化（細胞当たりの平均シトルリン化ヒストンＨ３ピクセル面積±ＳＥＭ）（ｎ＝３）が描画されている。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ、*Ｐ＜０．０５。図７Ｅは、好中球をＦＬＡＧタグ付きＣＲＩＳＰＰ−ＦＬＡＧまたはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ−ＦＬＡＧ（両方とも１ｎＭ）と共に１時間インキュベートし、更に２時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で活性化し、抗ＦＬＡＧ抗体（ｎ＝３）を用いて共焦点顕微鏡により検査したものを描画した、一連の画像である。黄色蛍光＝ＦＬＡＧタグ付き。青色蛍光＝核対比染色（倍率６０倍、スケールバー＝２０μｍ）。単離されたヒト血小板を介してＦＬＡＧタグ付きペプチドが内在化されなかった（未公開実験）。図７Ａ〜図７Ｅに、活性化された好中球において核の脱凝縮及びヒストンのシトルリン化がＮＲＰにより阻害されることが示されている。
【図８】図８Ａには、生細胞撮像（倍率６０倍、スケールバー＝５０μｍ）及びヒストンＨ３放出（赤色の破線＝任意に１に設定されたベースライン）により評価された腹腔液ＮＥＴ形成（赤色の蛍光、黄色の矢印）の結果が、描画されている。１群当たりマウス３匹。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ、ＣＲＩＳＰＰ及びｎＮＩＦではＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲと比較して***Ｐ＜０．００１である。図８Ｂは、ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェアを使用して、４つのランダムな顕微鏡視野で標準化されたグリッド線を横断するＮＥＴの数を計数することにより定量された（倍率６０倍；スケールバー＝５０μｍ）腹膜の表面上のＮＥＴ形成の結果（赤色蛍光、黄色矢印）を描画した図である。第２の実験においても同様のパターンが得られた。図８Ａ及び図８Ｂは、前処置されていないか、またはｎＮＩＦ、ＣＲＩＳＰＰもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与；１時間）で前処置され、Ｅ．ｃｏｌｉ（４．５ｘ１０7細菌の腹腔内投与）を接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスを描画する。これらの動物を３時間後に屠殺し、腹腔液（図８Ａ）及び膜（図８Ｂ）を分析用に採取した。図８Ｃは、前処置なし（左側の２つのバー）、またはＣＲＩＳＰＰ、ｎＮＩＦもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲで前処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスを、図８Ａ及び図８Ｂと同様、Ｅ．ｃｏｌｉを接種したものを描画した図である。３時間後に、腹腔液中の好中球数を計数した（マウス３〜５匹／群）。ニューマンクールズの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。ＣＲＩＳＰＰは、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲまたは前処置なしと比較して†Ｐ＜０．０５。対照は、他の全てのグループと比較して*Ｐ＜０．０５。図８Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＣＲＩＳＰＰまたはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲで前処置したもの、ならびに図８Ａ及び図８Ｂと同様にＥ．ｃｏｌｉを接種したもの（動物５匹／群）を描画した図である。３時間後に、腹腔液中の細菌コロニー形成単位（ｃｆｕ）を算定した（片側マンホイットニー検定；*Ｐ＜０．０５）。図８Ｅは、図８Ａと同様に、撮像して測定した腹腔液ＮＥＴ形成を描画した図である（マウス１０匹／群）。ＣＲＩＳＰＰ／Ｅ．ｃｏｌｉ及びｎＮＩＦ／Ｅ．ｃｏｌｉは、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ／Ｅ．ｃｏｌｉ及びＥ．ｃｏｌｉと比較して、*Ｐ＜０．０５。図８Ｆは、図８Ｂと同様に撮像して定量した腹膜表面上のＮＥＴ形成を描画した図である（マウス３匹／群）。Ｅ．ｃｏｌｉは、対照と比較して*Ｐ＜０．０５（赤い破線）。ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ  ＩＥ．ｃｏｌｉは、対照と比較して**Ｐ＜０．０１である。ＣＲＩＳＰＰ／Ｅ．ｃｏｌｉ及びｎＮＩＦ／Ｅ．ｃｏｌｉは、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＦＲ／Ｅ．ｃｏｌｉと比較して†Ｐ＜０．０５。図８Ｅ及び図８Ｆには、テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡが、適用されている。図８Ｅ及び図８Ｆでは、図８Ａ及び図８Ｂと同様、前処置されていないかまたはｎＮＩＦ、ＣＲＩＳＰＰもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲで前処置されたスイスウェブスターマウスに対し、Ｅ．ｃｏｌｉを腹腔内接種した。３時間後に、腹腔液及び腹膜を採取した。図８Ａ〜図８Ｆに、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＥＴ形成がｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰで阻害されるこ���が示されている。
【図９】図９Ａは、ＬＰＳ（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）に曝露されたＣ５７ＢＬ／６マウスを描画したグラフである。ＣＲＩＳＰＰ、ｎＮＩＦ、またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）をＬＰＳの１時間前及びＬＰＳの６時間後に投与した。未処置動物、またはＬＰＳのみ給餌した動物を、並行して試験した（条件ごとにｎ≧１０匹のマウス）。**Ｐ＜０．０１、ログランク（マンテル・コックス）統計ツールを使用した。ｎＮＩＦ−ＬＰＳとＣＲＩＳＰＰ−ＬＰＳの生存率の差異は、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ−ＬＰＳと比較して、有意性に向かう傾向が見られた（§Ｐ＝０．０５１）。図９Ｂは、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）に供したＣ５７ＢＬ／６マウスを描画したグラフである。外科手術の１時間前及び６時間後に、ｎＮＩＦまたはｎＮＩＦ−ＳＣＲ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）を投与した（各群において≧７）。偽外科手術に供したマウスを、並行して検査した（各群においてｎ＝３）。臨床疾患重篤度スコア（引用元：Ａｒａｕｊｏ  ＣＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２０１６；４５（４）：３９３−４０３）を、２４時間目に算定した。ニューマン・クールの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ。ｎＮＩＦは、ｎＮＩＦ−ＳＣＲ群と比較して**Ｐ＜０．０１である。図９Ｃは、図９Ｂにおいて全身性疾患の重篤度を評価し、次いで１４４時間目に生存マウスを屠殺した場合、毎日追跡されたマウスを描画した、グラフである。ログランク（マンテル・コックス）統計ツールを使用した。**Ｐ＜０．０１。図９Ａ〜図９Ｃに、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰが実験的全身性炎症における生存率を改善することが示されている。
【図１０】Ａ１ＡＴのカルボキシ末端に対する抗体によって認識された低分子量ペプチドが、臍帯血試料中に検出される一方で、成人由来の血漿中には検出されないことを描画した、画像である。健常正期新生児４人に由来する臍帯血血漿の試料、及び健常成人志願者４人に由来する静脈血の試料を、ウェスタンブロッティングによって検査した。この試料は、上述したように、図２Ｂの左パネルの調製に用いられた完全ゲルである。
【図１１】ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰがナノモル濃度でＮＥＴ形成を阻害することを描画した、一連の画像である。健常成人志願者に由来するＰＭＮを培地単独で、または指示濃度のｎＮＩＦもしくはＣＲＩＳＰＰと共に、１時間プレインキュベートした。次に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え、白血球を１時間インキュベートした後、図１Ａと同様に生細胞を撮像した（赤色蛍光＝ＮＥＴ；緑色蛍光＝核ＤＮＡ；倍率２０倍）。種々のドナーに由来する好中球を用いた３つの実験において、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰによるＮＥＴ形成のこの濃度依存的阻害が見られた。
【図１２】図１２Ａは、培地単独で１時間プレインキュベートした後、好中球エラスターゼ（ＮＥ）阻害剤シベレスタット（ＳＩＶＬ；２００ｎＭ）、またはＣＲＩＳＰＰもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（両方とも１ｎＭ）、続いてＰＭＡ（２０ｎＭ）で処置し、更に１時間インキュベートして（ｎ＝３）、図７Ａ〜７Ｅと同様に評価された、核の脱凝縮（白い矢印及び拡大画像）を描画した図である。緑色蛍光＝核ＤＮＡ（倍率６０倍、スケールバー＝２０μｍ）。核面積は、ＩＭＡＧＥ（商標）ソフトウェア（細胞当たりの核ピクセル面積±ＳＥＭ）を使用して定量した。テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡ；**Ｐ＜０．０１，***Ｐ＜０．００１。図１２Ｂは、液体クロマトグラフィーで検出された生成物としての合成基質（ＭｅＯＳｕｃ）−ＡＡＰＶ−（ｐＮＡ）から（ＭｅＯＳｕｃ）−ＡＡＰＶ及び（ｐＮＡ）への開裂、ならびに質量分析によりクロマトグラムピークを同定することによって検査された、ＮＥ酵素活性を描画した図である。（ＭｅＯＳｕｃ）−ＡＡＰＶ−（ｐＮＡ）（１６０μｍ）を３７℃にて３時間、ＮＥ（２ｍＵ）、シベレスタット（１６０μｍ）、またはＮＥ及びシベレスタット（左パネル）またはＮＥ（２ｍＵ）、ｎＮＩＦ（１０ｎＭ）、またはＮＥ及びｎＮＩＦ（右パネル）と共にインキュベートした。クロマトグラムはＸ軸及びＹ軸上でオフセットされており、これにより比較が容易となっている。ＮＥ単独の存在下にて、（ＭｅＯＳｖｃ）−ＡＡＰＶ−（ｐＮＡ）ピークがほぼ完全に排除され、（ＭｅＯＳｖｃ）−ＡＡＰＶ及び（ｐＮＡ）ピークが生成された。この基質の開裂は、シベレスタットの存在下にて阻害された反面で排除されず、対照的に、ｎＮＩＦでは阻害されなかった。このパターンは、３つの別々の実験で見られた。種々のプロトコール、ＮＥ基質、及び検出方法を用いた更に２つのアッセイを使用したが、複数の実験において、ｎＮＩＦまたはＣＲＩＳＰＰのいずれも、ＮＥ活性を阻害しなかった。図１２Ａ及び図１２Ｂには、ＮＥは核の脱凝縮を媒介する一方、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥ活性を阻害しないことが示されている。
【図１３】ＬＰＳ活性化好中球によるＮＥＴ形成が、ＦＬＡＧタグ付きＣＲＩＳＰＰによって阻害されることを描画した、一連の画像である。成人好中球を培地単独で、またはＣＲＩＳＰＰ、ＦＬＡＧタグ付きＣＲＩＳＰＰ（ＣＲＩＳＰＰ−ＦＬＡＧ）、またはＦＬＡＧタグ付きＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ−ＦＬＡＧ）（全て１ｎＭ）と共に３０分間プレインキュベートし、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で刺激して、１時間インキュベートしてから、図１Ａのように生細胞を撮像して、ＮＥＴ形成を評価した（赤色蛍光＝ＮＥＴ；緑色蛍光＝核ＤＮＡ；２０倍）。種々のドナーに由来する好中球を用いた３つの別々の実験において、ＣＲＩＳＰＰ−ＦＬＡＧ及びＣＲＩＳＰＰによるＮＥＴ形成が阻害されたのに対し、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ−ＦＬＡＧによるＮＥＴ形成の阻害が見られなかった。
【図１４】高温要件Ａ１（ＨＴＲＡ１）というプロテアーゼが描画されている。このＨＴＲＡ１は、妊娠第３期のヒト胎盤において上方制御され、Ｃ末端でＡ１ＡＴを開裂し、サイズが幾分大きいがｎＮＩＦの配列を含んだ断片を生成している（引用元：Ｆｒｏｃｈａｕｘ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ．９（１０）：ｅ１０９４８３．ｄｏｉ：１０．１３７１）。ＨＴＲＡ１を介してＡ１ＡＴが開裂されたことによって生成されたペプチドを合成した。それにより、ＮＥＴ形成がペプチドによって阻害されることが判明した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、新生児好中球阻害因子（ｎＮＩＦ）及びｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）に関する。本開示はまた、ｎＮＩＦ及びＮＲＰを使用して好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害する方法にも関する。
炎症性障害及びがんに対する治療ならびに予防の用途に、ｎＮＩＦ及びＮＲＰを使用することができる。本明細書中に概説されている実施形態が例示的なものであることは、容易に理解されるであろう。以下様々な実施形態についてより詳しく説明するが、これらの説明は、本開示の範囲を限定することを意図したものではなく、寧ろ様々な実施形態の代表的な例であるにすぎない。そのうえ、本明細書中に開示されている方法の工程または行為の順序は、本開示の範囲から逸脱することなしに、当業者が変更を施すことができる。言い換えれば、実施形態を好適に運用するうえで特定の工程または行為の順序が義務付けられない限り、特定の工程または行為の順序または使用を修正しても差し支えない。
【０００９】
本明細書中に引用されているありとあらゆる特許、報告書、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に援用されている。
【００１０】
「ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）」は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害する、抗炎症剤である。ＮＩＰの例としては、限定されるものではないが、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）；ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩；ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成を阻害し、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、または置換によって、またはブロッキング基を有する１つ以上のアミノ酸の取り込みによって、構造的に改変されるｎＮＩＦの天然型の類似体；ｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩；ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）；ＮＲＰの医薬的に許容される塩；ＮＲＰ類似体；またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩が挙げられる。
【００１１】
本明細書において「新生児好中球阻害因子ペプチド」または「ｎＮＩＦペプチド」は、哺乳動物中に天然に存在するｎＮＩＦとして定義されている。
【００１２】
本明細書において「新生児ｎＮＩＦ関連ペプチド」または「ＮＲＰ」は、ヒトにおいて天然に存在するＣＲＩＳＰＰ（がん関連ＳＣＭ認識・免疫防御抑制及びセリンプロテアーゼ保護ペプチド）；ＮＥＴ形成を阻害することが明らかにされてきたＡ１ＡＴｍ358；ＨＴＲＡ１−ＣＦ；他のｎＮＩＦ関連ペプチド；ならびに、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によるか、またはブロッキング基を有する１つ以上のアミノ酸の組み込みによって、ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成を阻害し、所与のヒトＮＲＰと比較して構造的に改変されている天然に存在する形態のＮＲＰの類似体として定義されている。
【００１３】
本明細書において「炎症性障害」は、病理学的炎症を特徴とする障害として定義されている。炎症性障害としては、限定されるものではないが、感染症、自己免疫、及びアレルギーに関連する病態が挙げられる。本明細書中に定義されている炎症性障害としては、限定されるものではないが、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；気管支肺異形成症（ＢＰＤ）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；がんの炎症及びその合併症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；炎症性肺疾患（ＩＬＤ）；インフルエンザ誘発性肺炎；壊死性腸炎（ＮＥＣ）；新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）；歯周炎；子癇前症；未熟児網膜症（ＲＯＰ）；敗血症；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；血栓症；輸血関連急性肺疾患（ＴＲＡＬＩ）；血管炎のほか；関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びウェゲナー肉芽腫症（ＷＧ）を含むがこれらに限定されない自己免疫症候群；ならびに治療抵抗性の炎症の障害を挙げることができる。本明細書中には記載されていないが、当業者に公知である他の炎症性障害も存在する。例えば、Ｋｕｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｔｒａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｐ．４３−７７，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｎａｔｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４２０：８４６−８５２、及びＡｍｕｌｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，３０：４５９−４８９を参照。
【００１４】
「多形核白血球（ＰＭＮ）機能を全体的に低下させない」という語句は、ＮＩＰと関連して使用されている場合、ネトーシスがＮＩＰによって阻害または実質的に阻害される可能性がある一方で、他のＰＭＮ機能がＮＩＰによって阻害または実質的に阻害されないことを意味する。他のＰＭＮ機能としては、限定されるものではないが、走化性、ケモカインの合成及び分泌、サイトカインの合成及び分泌、細胞外殺菌、細胞内殺菌、食作用、及び／または活性酸素種（ＲＯＳ）生成が挙げられる。これらの機能のアッセイ方法は、当該技術分野において公知である。例えば、実施例１６には、貪食性殺菌のアッセイ方法が記載されている。
【００１５】
本開示は、ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）及びＮＲＰ類似体の治療的使用、ならびに関連する使用に関する。いくつかの実施形態では、ネトーシス及び／または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の形成を阻害する用途に、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体を使用する場合がある。
【００１６】
新生児ＮＥＴ展開の鈍化メカニズムを探究するに際して、臍帯血からペプチドが発見された。このペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴ形成を阻害し、ＮＥＴ生成の内因性調節因子であると思われる。また、ネトーシスを阻害する関連ペプチドも同定された。これらの以前には認識されていなかったＮＥＴ形成の調節因子は、特定の炎症状況または組織区画における調節活性だけでなく、選択的抗炎症剤としての可能性も有し得る。
【００１７】
本開示の第１の態様は、炎症性障害の治療方法に関する。或る実施形態において、本開示は、ＮＩＰまたはＮＩＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を有する患者の治療方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。病理学的影響または徴候としては、疼痛、熱、発赤、腫脹及び／または浮腫、低血圧、線維症及び／または炎症後線維症、末端器官障害（すなわち、腎臓、心臓、肝臓）、組織の損傷、及び／または機能の喪失のうちの１つ以上を挙げることができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦ、またはｎＮＩＦの医薬的に許容される塩と医薬的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を有する患者の治療方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００１９】
他の実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦ類似体またはｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を有する患者の治療方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００２０】
更なる他の実施形態において、本開示は、ＮＲＰまたはＮＲＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を有する患者の治療方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００２１】
なお他の実施形態において、ＮＲＰ類似体またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を有する患者の治療方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００２２】
いくつかの実施形態において、患者は哺乳動物であり得る。或る実施形態において、患者はヒトであり得る。ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成の阻害を必要とする任意の患者または被験者は、潜在的にＮＩＰ、ＮＩＰの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩、ＮＲＰ  ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、及び／またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩での治療を受ける候補となり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態において、炎症性障害は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成及び／またはネトーシスに少なくとも或る程度は関与しているか、あるいはそれらに少なくとも或る程度は誘発される可能性がある。いくつかの実施形態において、炎症性障害は、急性炎症性障害、慢性炎症性障害、及び／または免疫障害であり得る。他の実施形態において、炎症性障害自己免疫障害であり得る。更なる他の実施形態において、炎症性障害は凝固障害であり得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、炎症性障害は、限定されるものではないが、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；気管支肺異形成症（ＢＰＤ）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；嚢胞性線維症；がんの炎症及びその合併症；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；炎症性肺疾患（ＩＬＤ）；インフルエンザ誘発性肺炎；壊死性腸炎（ＮＥＣ）；新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）；歯周炎；子癇前症；未熟児網膜症（ＲＯＰ）；敗血症；全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；血栓症；輸血関連急性肺疾患（ＴＲＡＬＩ）；血管炎のほか；関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びウェゲナー肉芽腫症（ＷＧ）を含むがこれらに限定されない自己免疫症候群；ならびに治療抵抗性の炎症の障害のうちの１つ以上であり得る。本明細書中には記載されていないが、当業者に公知である他の炎症性障害も存在する。例えば、Ｋｕｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｔｒａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｐ．４３−７７，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｎａｔｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４２０：８４６−８５２、及びＡｍｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２，３０：４５９−４８９を参照。
【００２５】
別の態様において、本開示は、がん患者を治療するための方法に関する。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫、卵巣癌、胃癌、肺癌、または別の好適ながんのうちの少なくとも１つであり得る。或る実施形態では、がん患者を治療する方法に、ＮＩＰを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含める場合がある。また、医薬組成物中に、ＮＩＰと、医薬的に許容される担体と、を含めてもよい。様々な実施形態において、医薬組成物は、がんの病理学的影響または徴候を軽減することも可能であるし、あるいは低減するように構成することも可能である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ＮＲＰ、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、及び／またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つであり得る。或る実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。例えば、医薬組成物は、少なくとも或る程度は、がん患者におけるＮＥＴ形成を阻害することによって、がんの病理学的影響または徴候を軽減することが可能である。上述したように、患者は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。
【００２７】
別の態様において、本開示は、がんを発症するリスクに曝されている患者の治療方法に関する。上記に考察されているように、がんは、黒色腫、卵巣癌、胃癌、肺癌、または別の好適ながんのうちの少なくとも１つであり得る。或る実施形態では、がんを発症するリスクに曝されている患者の治療方法に、ＮＩＰを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含める場合がある。また、医薬組成物中に、ＮＩＰと、医薬的に許容される担体と、を含めてもよい。様々な実施形態において、医薬組成物は、がんを発症するリスクを低減することも可能であるし、あるいは低減するように構成することも可能である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ＮＲＰ、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、及び／またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つであり得る。或る実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。例えば、医薬組成物は、少なくとも或る程度は、がんを発症するリスクに曝されている患者におけるＮＥＴ形成を阻害することによって、がんを発症するリスクを低減することが可能である。上述したように、患者は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。
【００２９】
別の態様において、本開示は、がん患者における転移を阻害するかまたは実質的に阻害するための方法に関する。がんは、黒色腫、卵巣癌、胃癌、肺癌、または別の好適ながんのうちの少なくとも１つであり得る。或る実施形態では、転移を阻害する方法に、ＮＩＰを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含める場合がある。また、医薬組成物中に、ＮＩＰと、医薬的に許容される担体と、を含めてもよい。様々な実施形態において、医薬組成物は、患者における転移のリスクを低減することも可能であるし、あるいは低減するように構成することも可能である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ＮＲＰ、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、及び／またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つであり得る。或る実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。例えば、医薬組成物は、少なくとも或る程度は、がん患者におけるＮＥＴ形成を阻害することによって、転移リスクを低減することが可能である。上述したように、患者は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。
【００３１】
或る実施形態において、ＮＩＰを含む医薬組成物は、ＰＭＮの機能を全体的に低下させない可能性がある。ＰＭＮの機能としては、限定されるものではないが、走化性、食作用、活性酸素種（ＲＯＳ）生成、サイトカイン／ケモカインの合成及び分泌、ＮＥＴ形成／ネトーシス、及び／または細胞内／細胞外殺菌が挙げられる。或る実施形態において、医薬組成物は、ＰＭＮ食作用を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害しない場合もある。他の実施形態において、医薬組成物は、ＰＭＮ走化性を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。更なる他の実施形態において、医薬組成物はＲＯＳの生成を阻害しない場合もあればまたは実質的に阻害しない場合もある。他の実施形態において、医薬組成物は、ＰＭＮ細胞内殺菌を阻害しない場合もあればまたは実質的に阻害しない場合もある。したがって、ＮＩＰを含む医薬組成物を投与して、がん患者またはがんを発症するリスクに曝されている患者を治療することによって、がんの治療または予防に使用される化学療法レジメンのいくつかの副作用を回避することが可能である。
【００３２】
別の態様において、本開示は、患者のがん性細胞内または隣接するがん性細胞内のＮＥＴ形成を同定することを含む、がん患者を治療するための方法に関する。いくつかの実施形態では、がんの病理学的影響または徴候を軽減することを目的に、本方法は更に、ＮＥＴ形成を有する患者（例えば、ＮＥＴ形成が同定された患者）に、ＮＩＰと医薬的に許容される担体とを含む、有効量の医薬組成物を投与することを含める場合がある。或る実施形態では、本方法に、患者からがん性細胞の試料を得ることを含める場合がある。がん性細胞、またはがん性細胞を含む試料を検査し、及び／あるいは試験することによって、ＮＥＴ形成の存在を同定することが可能である。
【００３３】
別の態様において、本開示は、がんを発症するリスクに曝されている患者の治療方法に関する。様々な実施形態では、本方法に、患者におけるＮＥＴ形成を同定することを含める場合がある。がんを発症するリスクに曝されている患者におけるＮＥＴ形成が同定された際、患者ががんを発症するリスクを低減することを目的に、本方法に、ＮＩＰと医薬的に許容される担体とを含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含めてもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを実質的に阻害し得る。他の実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ媒介による炎症性組織損傷を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。
【００３５】
別の態様において、本開示は、ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）で治療することによる利益が得られるがん患者を診断する方法に関する。或る実施形態では、本方法に、患者からがん性細胞の試料を採取すること、がん性細胞の試料中にＮＥＴ形成が存在するかどうかを検出すること、及び／またはがん性細胞の試料中にＮＥＴ形成の存在が検出された場合に患者をＮＩＰでの治療による利益を受けられる患者として診断すること、を含める場合がある。
【００３６】
様々な実施形態において、がん性細胞は、メラニン形成細胞、卵巣細胞、胃細胞、肺細胞、または別の好適な種類のがん性細胞のうちの少なくとも１つを含む場合がある。
【００３７】
別の態様において、本開示は、ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）で治療することによる利益が得られるがん患者の診断及び治療方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法に、患者からがん性細胞の試料を採取すること、がん性細胞の試料中にＮＥＴ形成が存在するかどうかを検出すること、及び／またはがん性細胞の試料中にＮＥＴ形成の存在が検出された場合に患者をＮＩＰでの治療による利益を受けられる患者として診断すること、及び／または診断を受けた患者に対しＮＩＰを含む有効量の医薬組成物を投与することを含める場合がある。
【００３８】
或る実施形態において、ＮＩＰは、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類縁体、ｎＮＩＦ類縁体の医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ），ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、及び／またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩のうちの１つであり得る。様々な実施形態において、がん性細胞は、メラニン形成細胞、卵巣細胞、胃細胞、肺細胞、または別の好適な種類のがん性細胞のうちの少なくとも１つを含む場合がある。上記に考察されているように、医薬組成物は実質的にＮＥＴ形成を阻害し得る。更にまた、患者は哺乳動物であり得るいくつかの実施形態において、患者はヒトであり得る。
【００３９】
ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成を阻害するために選択されたＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩の特定の形態は、ペプチド生成物を生成するための公知の多様な技法によって調製できる。例えば、ｎＮＩＦ及びＮＲＰの脊椎動物形態は、タンパク質単離技法の好適な組み合わせを使用して、天然供給源からの抽出によって得ることができる。他の技法もまた、本開示の範囲内にある。
【００４０】
或る実施形態において、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩は、ペプチド化学の標準技法を用いて合成される場合もあれば、ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成活性の阻害に関して評価の対象とされる場合もある。合成に関して言うと、選択されたＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩は、ペプチド生成物を生成するための多様な技法によって調製することが可能である。組み換えＤＮＡ技術を適用して、これらのＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体及び／またはそれらの塩に、Ｌ−アミノ酸のみを配合することにより、商業的な量で製造することが可能である。この目的に向けて、所望のＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、宿主細胞（例えば、酵母、細菌もしくは哺乳動物細胞）に形質転換してから、これを、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体を発現するうえで適した条件下で培養する。この目的に向けて、様々な遺伝子発現系が適合されており、典型的には選択された宿主により天然に使用される発現調節要素から所望の遺伝子の発現を駆動する。
【００４１】
選択されたＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体、のほか、遺伝的にコードされていないアミノ酸、ならびにＮ及びＣ末端誘導体化形態を組み込んだＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体を製造するために使用され得るものの製造に適用可能な取り組みにおいて、ペプチド自動合成技法を使用できる。その概説は、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ，１９８７，ＡＢＩ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡにおいて見られる。これらの技法において、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体は、例えばＯｒｓｋｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８９，２４７（２）：１９３−１９６に記載されているように、９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）プロトコールのいずれかを用い、そのＣ末端の樹脂共役残基から、好適に保護されたアミノ酸の逐次付加によって成長する。
【００４２】
いったん所望されるＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体を合成し、樹脂から開裂して完全に脱保護した後、ペプチドを精製して選択されたアミノ酸配列を有する単一オリゴペプチドを確実に回収できる。アルキル化シリカカラム（例えば、Ｃ４−、Ｃ８−、またはＣ８−シリカ）での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含むがこれらに限定されない標準的な手法のいずれかを使用して、精製を達成できる。そのようなカラム分画は、通常少量（例えば、０．１％）の対合剤、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）を含有する有機溶媒（例えば、アセトニトリル）の有機溶媒のパーセンテージを直線的に（例えば、１０〜９０％）漸増させる直線勾配により、達成される。代替的に、イオン交換ＨＰＬＣを使用して、ペプチド種をその電荷特性に基づいて分離することが可能である。カラム画分を回収し、所望される及び／または必要な純度のペプチドを含有するものを、任意選択的にプールする。いくつかの実施形態では、次いで、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体を確立された方法で処置して、開裂酸（例えば、ＴＦＡ）を酢酸、塩酸、リン酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸などの医薬的に許容される酸と交換し、ペプチドの医薬的に許容される酸付加塩を生成し得る。
【００４３】
ペプチド化学の標準技法を使用して、ヒトＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰの類似体を生成することができる。それらの類似体のネトーシス及び／またはＮＥＴ形成活性の阻害については、いずれも本明細書に提供される指針に従って、評価することができる。いくつかの実施形態において、この類似体は、以下の通り、少なくとも或る程度は、ヒトｎＮＩＦ（配列番号：１）；ＣＲＩＳＰＰ（配列番号：２）、Ａ１ＡＴｍ358（配列番号：３）、及び／またはＨＴＲＡ１−ＣＦ（配列番号：４）の配列に基づく（式中、Ｘは任意の天然アミノ酸であり得る）。
ＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＷＮＰＴＱ（配列番号：１）
ＭＸＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＤＱＮＴＫＶＰＬＦＭＧＫ（配列番号：２）
ＭＦＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＬＫＶＶＳ（配列番号：３）
ＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＷＮＰＴＱＫ（配列番号：４）
【００４４】
ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰの１つもしくは複数のアミノ酸の任意の置換、付加、または欠失は、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰのＮＥＴ阻害活性を破壊しない限り、本開示において有用であり得る。或る実施形態において、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰ類似体は、天然型ヒトＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰと少なくとも同程度に活性である。ＮＥＴ阻害活性は、本開示に記載されているようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで判別できる。他の実施形態において、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰ類似体は、天然型ヒトＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰと比較して、１つ以上の強化された特性を有する。例えば、そのような類似体には、血清安定性の増強、受容体結合の増強、及びシグナル伝達活性の増強が見られる場合がある。ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体に対する他の修飾で、本開示において有用に使用可能なものは、分子を酸化耐性にする。
【００４５】
炎症性疾患を有する個々人に対しペプチドまたは類似体を投与することにより、特定のＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩を炎症性疾患の治療に使用できるかどうかは、研究者であれば判定できるであろう。次いで、研究者は、このように治療された個々人に炎症の低減及び炎症状態の改善が見られるかどうかを、診断バイオマーカーを使用して判定できる。
【００４６】
本開示はまた、異なる種から単離されたＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰにおいて異なることが知られているアミノ酸位置で起こると仮定すると、非保存的置換には、任意の脊椎動物のＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰ配列中のアミノ酸の非保存的置換も包含される。非保存残基位置は、公知の脊椎動物ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰ配列を整列させることによって、容易に特定される。
【００４７】
患者への投与に対応するように、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはその塩を、医薬的に許容される形態で（例えば、０．２２μフィルターを通して、実質的に発熱物質不含の、無菌濾過された製剤として）提供してもよい。ＨＰＬＣ上の単一または個別化されたピークが、その分析の際に、均一且つ本物のアミノ酸組成及び配列を呈するときに、処方の対象となるＮＩＰ、ｎＮＩＦ、及び／またはＮＲＰペプチドが遊走し、その他、医薬品の品質を規制する様々な国内機関によって設定された基準を満たすことが所望される場合がある。
【００４８】
水性担体またはビヒクルを補給することにより、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはその塩を、所望される作用部位に徐放されるよう、注射部位またはその近くに、蓄積させるのに有用なゼラチンと共に、注射剤として使用可能である。デポ効果を達成するのに有効なゼラチンの濃度は、１０％〜２０％の範囲にあると予期される。ヒアルロン酸（ＨＡ）のような代替のゲル化剤も、デポ剤として有用であり得る。
【００４９】
また、本開示のＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩を、徐放性インプラント製剤として製剤化することによって、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体及び／またはそれらの塩を投与して徐放化し且つ持続放出させることが可能である。そのような持続放出製剤の例としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどのような生体適合性ポリマーの複合物が挙げられる。薬物送達媒体における分解性ポリマーの構造、選択、及び使用は、Ｄｏｍｂ  ｅｔ  ａｉ，Ｐｏｌｙｍ  Ａｄｖａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９２，３：２７９−２９２をはじめとするいくつかの刊行物中に概説されている。医薬製剤中のポリマーの選択及び使用における更なる指針は、Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．４５  ｏｆ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ文献中に見出すことができる。また、リポソームを使用して、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体及び／またはそれらの塩の持続放出を実現できる。関心対象の薬物のリポソーム製剤の使用方法及び製造方法に関する詳細は、とりわけ、米国特許第４，９４４，９４８号、同第５，００８，０５０号、同第４，９２１，７０６号、同第４，９２７，６３７号、同第４，４５２，７４７号、同第４，０１６，１００号、同第４，３１１，７１２号、同第４，３７０，３４９号、同第４，３７２，９４９号、同第４，５２９，５６１号、同第５，００９，９５６号、同第４，７２５，４４２号、同第４，７３７，３２３号、及び同第４，９２０，０１６号に見出すことができる。局所濃度の高いＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩を（例えば、ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成を阻害するための炎症部位付近などに）提供することが所望される場合、徐放製剤は特に興味深いものであり得る。
【００５０】
また、本開示のＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩を、埋め込み型または局所型の両方のデバイスに組み込むことによって、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体及び／またはそれらの塩を投与して徐放化し且つ持続放出させることが可能である。
【００５１】
治療的用途のため、選択されたＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩を、医薬的に許容される担体であって、選択された投与経路を介してペプチドを送達するのに好適な担体と共に、製剤化してもよい。好適な医薬的に許容される担体は、希釈剤、賦形剤などのようなペプチド系の薬物と共に従来から使用されている担体である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい。或る実施形態において、化合物は、注入または注射（例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内）で投与のために処方でき、それに応じて滅菌且つ発熱物質不含形態の水溶液として利用することができ、任意選択的に、生理学的に許容されるｐＨ（例えば、わずかに酸性または生理学的ｐＨ）に緩衝される。ゆえに、化合物は、ビヒクル（例えば、蒸留水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、または５％デキストロース）溶液で投与できる。ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩の水溶性は、所望される場合、酢酸のような溶解度促進剤を取り込むことにより、向上させることができる。
【００５２】
本開示の別の態様は、未熟児合併症の治療方法に関する。
【００５３】
実施形態において、本開示は、ＮＩＰまたはＮＩＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児の合併症患者を治療する方法を提供するものであり、新生児慢性肺疾患に伴う酸素補給の長期にわたる必要性、または壊死性腸炎を発症する産児における外科的介入もしくは長期非経口栄養の必要性など、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦまたはｎＮＩＦの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症患者を治療する方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００５５】
他の実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦ類似体、またはｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症患者を治療する方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００５６】
更なる他の実施形態において、本開示は、ＮＲＰまたはＮＲＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症患者を治療する方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００５７】
なお他の実施形態において、本開示は、ＮＲＦ類似体またはＮＲＦ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症患者を治療する方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００５８】
いくつかの実施形態において、患者は哺乳動物であり得る。或る実施形態において、患者はヒトであり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、未熟児合併症は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成及び／またはネトーシスに少なくとも或る程度は関与しているか、あるいはそれらに少なくとも或る程度は誘発される可能性がある。或る実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを実質的に阻害し得る。他の実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ媒介による炎症性組織損傷を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。
【００６０】
いくつかの実施形態において、未熟児合併症は、限定されるものではないが、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）、肺炎、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）、神経発達遅延、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、及び／または敗血症のうちの１つ以上であり得る。
【００６１】
本開示の更なる態様は、炎症性障害に対する予防方法に関する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＮＩＰまたはＮＩＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を発症するリスクに曝されている患者における炎症性障害に対する予防方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦまたはｎＮＩＦの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を発症するリスクに曝されている患者における炎症性障害に対する予防方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００６４】
他の実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦ類似体またはｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を発症するリスクに曝されている患者における炎症性障害に対する予防方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００６５】
更に他の実施形態において、本開示は、ＮＲＰまたはＮＲＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を発症するリスクに曝されている患者における炎症性障害に対する予防方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００６６】
なお他の実施形態では、本開示は、ＮＲＰ類似体またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性障害を発症するリスクに曝されている患者における炎症性障害に対する予防方法を提供するものであり、炎症性障害の病理学的影響または徴候を軽減することを目的とする。
【００６７】
いくつかの実施形態において、患者は、ヒトをはじめとする哺乳動物であり得る。
【００６８】
いくつかの実施形態において、炎症性障害は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成及び／またはネトーシスに少なくとも或る程度は関与しているか、あるいはそれらに少なくとも或る程度は誘発される可能性がある。いくつかの実施形態において、炎症性障害は、急性炎症性障害であり得る。他の実施形態において、炎症性障害は、慢性炎症性障害であり得る。他の実施形態において、炎症性障害は自己免疫障害であり得る。更なる他の実施形態において、炎症性障害は凝固障害であり得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、炎症性障害は、限定されるものではないが、上記に定義及び／または列挙されたている炎症性障害のうちの１つ以上であり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを実質的に阻害し得る。他の実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ媒介による炎症性組織損傷を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。
【００７１】
本開示の別の態様は、未熟児合併症に対する予防方法に関する。
【００７２】
実施形態において、本開示は、新生児ＮＩＰまたはＮＩＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症を発症するリスクに曝されている患者における未熟児合併症に対する予防方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を発症するリスクを低減することを目的とする。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本開示は、新生児ｎＮＩＦ、またはｎＮＩＦの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症を発症するリスクに曝されている患者における未熟児合併症に対する予防方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を発症するリスクを低減することを目的とする。
【００７４】
或る実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦ類似体、またはｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症を発症するリスクに曝されている患者における未熟児合併症に対する予防方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を発症するリスクを低減することを目的とする。
【００７５】
更なる他の実施形態において、本開示は、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）、またはＮＲＰの医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症を発症するリスクに曝されている患者における未熟児合併症に対する予防方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を発症するリスクを低減することを目的とする。
【００７６】
なお他の実施形態において、本開示は、ＮＲＰ類似体またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩と、医薬的に許容される担体と、を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む、未熟児合併症を発症するリスクに曝されている患者における未熟児合併症に対する予防方法を提供するものであり、未熟児合併症の病理学的影響または徴候を発症するリスクを低減することを目的とする。
【００７７】
いくつかの実施形態において、患者は、ヒトをはじめとする哺乳動物であり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、未熟児合併症は、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）形成及び／またはネトーシスに少なくとも或る程度は関与しているか、あるいはそれらに少なくとも或る程度は誘発される可能性がある。他の実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを実質的に阻害し得る。更なる他の実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ媒介による炎症性組織損傷を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。
【００７９】
他の実施形態において、未熟児合併症は、限定されるものではないが、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）、肺炎、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）、神経発達遅延、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、及び／または敗血症のうちの１つ以上であり得る。
【００８０】
更なる態様において、本開示は、ＮＩＰを含む医薬組成物に関する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物に、新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）、またはｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含める場合もある。別の実施形態では、医薬組成物に、ｎＮＩＦ類似体、またはｎＮＩＦ類似体の医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含める場合もある。更なる他の実施形態では、医薬組成物に、ｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）、またはＮＲＰの医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含める場合もある。なお他の実施形態では、医薬組成物に、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰの医薬的に許容される塩類似体、及び医薬的に許容される担体を含める場合もある。
【００８２】
或る実施形態において、医薬組成物はｎＮＩＦ（例えば、ヒトｎＮＩＦ）またはその塩を含む場合があり、ｎＮＩＦまたはその塩は以下のアミノ酸配列：
ＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＶＶＮＰＴＱ（配列番号：１）
の少なくとも一部を含む場合がある。
【００８３】
様々な実施形態において、医薬組成物は、ＣＲＩＳＰＰまたはその塩を含む場合があり、ＣＲＩＳＰＰまたはその塩は以下のアミノ酸配列：
ＭＸＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＤＱＮＴＫＶＰＬＦＭＧＫ（配列番号：２）
の少なくとも一部を含む場合がある。
【００８４】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、Ａ１ＡＴｍ358またはその塩、及びＡ１ＡＴｍ358、またはその塩は以下のアミノ酸配列：
ＭＦＬＥＡＩＰＭＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＬＫＷＳ（配列番号：３）
の少なくとも一部を含む場合がある。
【００８５】
或る実施形態において、医薬組成物は、ＨＴＲＡ１−ＣＦまたはその塩、及びＨＴＲＡ１−ＣＦまたはその塩は以下のアミノ酸配列：
ＳＩＰＰＥＶＫＦＮＫＰＦＶＦＬＭＩＥＱＮＴＫＳＰＬＦＭＧＫＷＮＰＴＱＫ（配列番号：４）
の少なくとも一部を含む場合がある。
【００８６】
他の実施形態では、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの塩、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦ類似体の塩、ＮＲＰ、ＮＲＰの塩、ＮＲＰ類似体、ＮＲＰ類似体の塩、ＣＲＩＳＰＰ、ＣＲＩＳＰＰの塩、Ａ１ＡＴｍ358、Ａ１ＡＴｍ358の塩、ＨＴＲＡ１−ＣＦ、またはＨＴＲＡ１−ＣＦの塩の少なくとも１つのアミノ酸を、化学修飾剤に結合する場合がある。いくつかの実施形態において、化学修飾剤は、脂質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖類、または任意の他の好適な分子のうちの少なくとも１つから選択される場合がある。医薬組成物に対する他の化学修飾、例えばカチオン化、メチル化、及び環化もまた、本開示の範囲内に含まれる。
【００８７】
ペプチドに脂質を付着させること（すなわち脂質化）によって、医薬組成物の親油性を増強させることが可能である。
【００８８】
ペプチドにＰＥＧが結合すること（すなわちＰＥＧ化）によって、ペプチドの分子量が増大する。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ化は、医薬組成物の溶解性を改善し得る。他の実施形態では、ＰＥＧ化によって、医薬組成物の投薬頻度及び／または毒性を低減させる場合がある。他の実施形態では、ＰＥＧ化によって、医薬組成物の循環寿命を延ばし、及び／または医薬組成物の安定性を高め、及び／またはタンパク質分解に対する医薬組成物の防護を強化する場合がある。また、ＰＥＧ化によって、医薬組成物の免疫原性及び／または抗原性を低下させる場合もある。
【００８９】
ペプチドに対する１つ以上の糖類の付着（すなわちグリコシル化）は、医薬組成物における様々な機能的及び／または構造的役割を果たし得る。グリコシル化によって、選定された標的（１つまたは複数）に対する医薬組成物の送達を改善することが可能である。また、グリコシル化によって、医薬組成物の毒性を低減させることも可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの塩、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦ類似体の塩、ＮＲＰ、ＮＲＰの塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の塩を含む医薬組成物は、炎症性組織損傷及び／または炎症性血管損傷のうちの少なくとも１つから選択される損傷を阻害するかまたは実質的に阻害するのに有効な量にて存在し得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの塩、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦ類似体の塩、ＮＲＰ、ＮＲＰの塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の塩を医薬組成物中に含めることによって、ＰＭＮ機能が全体的に低下するのを回避し得る。上記に考察されているように、ＰＭＮの機能としては、限定されるものではないが、走化性、食作用、活性酸素種（ＲＯＳ）生成、サイトカイン／ケモカインの合成及び分泌、ＮＥＴ形成／ネトーシス、及び／または細胞内／細胞外殺菌が挙げられる。或る実施形態において、医薬組成物は、ＰＭＮ食作用を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害しない場合もある。他の実施形態において、医薬組成物は、ＰＭＮ走化性を阻害する場合もあればまたは実質的に阻害する場合もある。更なる他の実施形態において、医薬組成物はＲＯＳの生成を阻害しない場合もあればまたは実質的に阻害しない場合もある。他の実施形態において、医薬組成物は、ＰＭＮ細胞内殺菌を阻害しない場合もあればまたは実質的に阻害しない場合もある。
【００９２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物が、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦ類似体の塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の塩を含む場合もあれば、類似体または類似体の塩が天然類似体または類似体の塩でない場合もある。
【００９３】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを阻害するかまたは実質的に阻害するための有効な量にて存在し得る。いくつかの実施形態では、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを、細菌、真菌、寄生虫、ウイルス、及び／またはＮＥＴ形成及び／またはネトーシスの他の任意な好適な刺激物質で刺激する場合がある。或る実施形態において、ウイルスは出血熱ウイルスであり得る。出血熱ウイルスは、例えば、Ｂｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ，２００２，２８７（１８）：２３９１−２４０５に記載されており、限定されるものではないが、エボラウイルス及びマールブルクウイルスなどのフィロウイルス；ラッサウイルスなどのアレナウイルス；ハンタウイルス；ならびにデング熱ウイルス及び黄熱病ウイルスなどのフラビウイルスが挙げられる。他の実施形態において、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスは、としては、限定されるものではないが、バチルス種、エシェリキア種、フランシセラ種、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、エルシニア種、及び／または任意の他の好適なグラム陰性もしくはグラム陽性細菌もしくは細菌を含む、１つもしくは複数の細菌種で刺激することが可能である。実施形態において、バチルス種はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽菌）であり得る。実施形態において、エシェリキア種はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉであり得る。実施形態において、フランシセラ種はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ツラレミア）であり得る。実施形態において、スタフィロコッカス種はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓであり得る。
【００９４】
他の実施形態では、ＮＥＴ形成及び／またはネトーシスを、β−ディフェンシン１、ＨＩＶ−１、リポ多糖（ＬＰＳ）、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、及び／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのα−トキシンで刺激する場合がある。
【００９５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物に、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体を含める場合がある。或る実施形態では、医薬組成物に、ＣＲＩＳＰＰ（がん関連ＳＣＭ認識・免疫防御抑制及びセリンプロテアーゼ保護ペプチド）及び／またはＣＲＩＳＰＰ類似体を含める場合がある。様々な実施形態では、医薬組成物に、Ａ１ＡＴｍ358及び／またはＡ１ＡＴｍ358類似体を含める場合がある。いくつかの実施形態では、医薬組成物に、ＨＴＲＡ１−ＣＦ及び／またはＨＴＲＡ１−ＣＦ類似体を含める場合がある。いくつかの他の実施形態では、薬剤に別のＮＲＰを含める場合がある。或る実施形態において、ＮＲＰは、臍帯血の単離成分及び精製成分であり得る。
【００９６】
追加的な態様において、本開示は、哺乳動物におけるＮＥＴの形成及び／またはネトーシスを阻害するための組成物に関する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、哺乳動物におけるＮＥＴの形成及び／またはネトーシスを阻害するための組成物に、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩、ｎＮＩＦ類似体、ｎＮＩＦの医薬的に許容される塩類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰの医薬的に許容される塩、ＮＲＰ類似体、またはＮＲＰ類似体の医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含める場合がある。或る実施形態において、哺乳動物はヒトであり得る。
【００９８】
更なる態様において、本開示は、ＮＥＴ阻害ペプチド（ＮＩＰ）に関する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、配列番号：１を含む単離及び精製ｎＮＩＦタンパク質であり得る。他の或る実施形態において、単離及び精製ｎＮＩＦタンパク質は、配列番号：１の少なくとも２４個の連続アミノ酸を含み得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製ｎＮＩＦタンパク質は、配列番号：１の少なくとも１２個の連続アミノ酸を含み得る。なお他の実施形態において、単離及び精製ｎＮＩＦタンパク質は、配列番号：１の少なくとも６個の連続アミノ酸を含み得る。
【０１００】
或る実施形態において、ＮＩＰは、配列が配列番号：１に対して少なくとも８０％同一であり得る、単離及び精製ｎＮＩＦタンパク質であってもよい。他の実施形態において、単離及び精製ｎＮＩＦは、配列番号：１に対して少なくとも６０％同一であり得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製ｎＮＩＦは、配列番号：１に対して少なくとも４０％同一であり得る。なお他の実施形態において、単離及び精製ｎＮＩＦは、配列番号：１に対して少なくとも２０％同一であり得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、配列番号：２を含む単離及び精製ＣＲＩＳＰＰタンパク質であり得る。他の或る実施形態において、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰタンパク質は、配列番号：２の少なくとも２４個の連続アミノ酸を含み得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰタンパク質は、配列番号：２の少なくとも１２個の連続アミノ酸を含み得る。なお他の実施形態において、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰタンパク質は、配列番号：２の少なくとも６個の連続アミノ酸を含み得る。
【０１０２】
或る実施形態において、ＮＩＰは、配列が配列番号：２に対して少なくとも８０％同一であり得る、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰタンパク質であってもよい。他の実施形態において、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰは、配列番号：２に対して少なくとも６０％同一であり得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰは、配列番号：２に対して少なくとも４０％同一であり得る。なお他の実施形態において、単離及び精製ＣＲＩＳＰＰは、配列番号：２に対して少なくとも２０％同一であり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、配列番号：３を含む単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358タンパク質であり得る。他の或る実施形態において、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358タンパク質は、配列番号：３の少なくとも２４個の連続アミノ酸を含み得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358タンパク質は、配列番号：３の少なくとも１２個の連続アミノ酸を含み得る。なお他の実施形態において、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358タンパク質は、配列番号：３の少なくとも６個の連続アミノ酸を含み得る。
【０１０４】
或る実施形態において、ＮＩＰは、配列が配列番号：３に対して少なくとも８０％同一であり得る、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358タンパク質であってもよい。他の実施形態において、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358は、配列番号：３に対して少なくとも６０％同一であり得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358は、配列番号：３に対して少なくとも４０％同一であり得る。なお他の実施形態において、単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358は、配列番号：３に対して少なくとも２０％同一であり得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ＮＩＰは、配列番号：４を含む単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦタンパク質であり得る。他の或る実施形態において、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦタンパク質は、配列番号：４の少なくとも２４個の連続アミノ酸を含み得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦタンパク質は、配列番号：４の少なくとも１２個の連続アミノ酸を含み得る。なお他の実施形態において、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦタンパク質は、配列番号：４の少なくとも６個の連続アミノ酸を含み得る。
【０１０６】
或る実施形態において、ＮＩＰは、配列が配列番号：４に対して少なくとも８０％同一であり得る、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦタンパク質であってもよい。他の実施形態において、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦは、配列番号：４に対して少なくとも６０％同一であり得る。更なる他の実施形態において、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦは、配列番号：４に対して少なくとも４０％同一であり得る。なお他の実施形態において、単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦは、配列番号：４に対して少なくとも２０％同一であり得る。
【０１０７】
別の態様において、本開示は、ｎＮＩＦタンパク質類似体、ＣＲＩＳＰＰタンパク質類似体、Ａ１ＡＴｍ358類似体、及び／またはＨＴＲＡ１−ＣＦ類似体に関する。いくつかの実施形態では、ｎＮＩＦタンパク質類似体が単離及び精製ｎＮＩＦ類似体である場合もあれば、ＣＲＩＳＰＰタンパク質類似体が単離及び精製ＣＲＩＳＰＰ類似体である場合もあれば、Ａ１ＡＴｍ358タンパク質類似体が単離及び精製Ａ１ＡＴｍ358類似体である場合もあれば、及び／またはＨＴＲＡ１−ＣＦタンパク質類似体が単離及び精製ＨＴＲＡ１−ＣＦ類似体である場合もある。
【０１０８】
有効な投薬量及び治療プロトコールは、従来の手段によって、例えば実験動物における低用量から開始し、次いで効果をモニターしながら投薬量を漸増していき、投薬量レジメンも系統的に変えることによって決定できる。臨床医は、所与の被験者に見合った最適な投薬量を決定する際に、多数の要因を考慮に入れる場合がある。これらの要因のなかで最も重要とされるのは、血漿中を正常に循環しているＮＩＰが存在するかどうか、及びそのようなＮＩＰが存在する場合は当該のＮＩＰ量である。追加的な要因としては、患者のサイズ、患者の年齢、患者の全身状態、治療の対象となる特定の障害、障害の重篤度、患者における他の薬物の存在のほか、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、それらの塩などのｉｎ  ｖｉｖｏ活性が挙げられる。動物実験の結果及び臨床文献を考慮したうえで、治験投薬量を選択することができる。
【０１０９】
分子が所望の効果を有するかどうかを評価することを目的に用いられる特定の治療レジメンは、多岐にわたっている。特定のＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ及び／またはＮＲＰ類似体がネトーシス及び／またはＮＥＴ形成の阻害に使用できるかどうかを決定する課題に直面した研究者は、好適なレジメンを選択することによって、この決定を下すことができる。
【０１１０】
個々人に対しペプチドを投与するのに有用な送達方法及び製剤は、当該技術分野において公知であり、特定の状況に合わせてペプチドを個人に送達する任意の特定の方法の適合性は、当業者であれば判別できるであろう。専ら例証を目的として、ペプチドを個々人に投与するための方法及び製剤の例を、以下に提供する。
【０１１１】
個々人にペプチドが経口投与される場合があるが、消化器系の作用によってペプチドのバイオアベイラビリティが低下してしまう恐れがある。ペプチドの経口バイオアベイラビリティを増強させることを目的に、酵素阻害剤を含有する製剤にてペプチドを投与する場合もあれば、あるいは、ペプチドを消化作用から保護することを目的に、ミセル、ナノ粒子またはエマルジョンの一部としてペプチドを投与する場合もある。
【０１１２】
また、ペプチドを注射で投与することもできる。ペプチドは、皮下に、筋肉内に、または静脈内に注射することが可能である。ペプチドを注射で投与する方法に関する更なる開示は、例えば、米国特許第５，９５２，３０１号において見出される。
【０１１３】
ペプチドは更に肺送達により投与することが可能である。肺の組織を通してペプチドが吸収される乾燥粉末吸入システムを使用してもよい。それにより、経口投与で見られるバイオアベイラビリティが低下する可能性を回避しながら、注射なしでの送達が可能となる。Ｏｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ，２００８，１８：４２９を参照。
【０１１４】
ヒトを含む哺乳動物におけるネトーシス及び／またはＮＥＴ形成を阻害するのに使用するため、本開示は、その態様の１つにおいて、ネトーシス及び／またはＮＥＴ形成を含む滅菌充填バイアルもしくはアンプルの形態のパッケージまたはキットを提供する。ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類縁体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類縁体、及び／またはそれらの塩の単位用量もしくは複数回投与量の量を阻害する。パッケージまたはキットには、そのようなネトーシス及び／またはＮＥＴ形成の阻害のための内容物の使用法を説明したラベルが組み込まれている。様々な実施形態において、パッケージまたはキットは、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体、及び／またはそれらの塩、ならびに所望の担体を投与用製剤として収容している。代替的に、及びいくつかの他の実施形態によると、パッケージまたはキットには、ＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体及び／またはその塩が、凍結乾燥形態などの、リン酸緩衝食塩水などの好適な担体中での再構成に適した形態にて提供されている。
【０１１５】
一実施形態において、パッケージまたはキットは、有効なネトーシス及び／またはＮＥＴ形成阻害量を含むＮＩＰ、ｎＮＩＦ、ｎＮＩＦ類似体、ＮＲＰ、ＮＲＰ類似体及び／またはそれらの塩を水性ビヒクル中に溶解した注射用溶液を収容した、滅菌充填バイアルもしくはアンプルである。
【０１１６】
炎症経路及び免疫機構には、チェックポイント及び調節ブレーキが備わっていて、エフェクター事象が不好適に開始するかまたは無秩序に伝播するのを防いでいる。これらが備わっていなければ、宿主に対し病理学的付随的な損傷が及ぶ恐れがある（引用元：Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００２，４２０（６９１７）：８４６−５２、及びＭｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５４（７２０３）：４２８−３５）。炎症反応の厳密な制御及び調節は、胎児及び新生児において特に重要であるように思われるが、関与する細胞及び分子メカニズムは不完全に定義された状態のままに維持される（引用元：Ｄｏｗｌｉｎｇ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３５（７）：２９９３１０；Ａｄｋｉｎｓ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；５７（１−３）：２４６−５７；Ｅｌａｈｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０４（７４７８）：１５８−６２；Ａｒｃｋ  ＰＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；１９（５）：５４８−５６、及びＬｅｖｙ  Ｏ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７，７（５）：３７９−９０）。臍帯血中のｎＮＩＦ及び胎盤マトリックス中のＡ１ＡＴｍ358は、周産期環境におけるネトーシスを調節する調節因子を表し得る。胎盤性ＩＬ−８、ネトーシス誘発性ケモカイン（引用元：Ｆｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；１７６（２）：２３１−４１）及び合胞体栄養芽層微粒子によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＴ形成が引き起こされ、子癇前症の女性の胎盤中にＮＥＴが存在することになる（引用元：Ｇｕｐｔａ  ＡＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；６６（１１）：１１４６−５４）。ゆえに、ＮＥＴ誘発性の刺激は、母親と胎児との間の境界面で発生すると思われる。このことは、規制されていないＮＥＴ形成は、胎児の母親の環境に炎症性病状を誘発する可能性があることを示唆する。また、過度の分娩時のＮＥＴ形成によって、長期の新生児免疫調節異常をはじめとする、更なる悪影響を招来する恐れがある（引用元：Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｄｏｗｌｉｎｇ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４；３５（７）：２９９３１０；Ａｄｋｉｎｓ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；５７（１−３）：２４６−５７；Ａｒｃｋ  ＰＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３；１９（５）：５４８−５６、及びＳａｎｇａｌｅｔｔｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（１５）：３００７−１８）。分娩直後、新生児はＮＥＴ媒介による血管傷害及び血栓症のリスクに曝される（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−��３、及びＹｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）；Ｃｌａｒｋ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７；１３（４）：４６３−９；Ｆｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０；１０７（３６）：１５８８０−５、及びＳａｆｆａｒｚａｄｅｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１３；２０（１）：３−９）。このリスクが、微生物のコロニー形成（引用元：Ｐａｌｍｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；５（７）：ｅ１７７、及びＪｏｓｔ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１２；７（８）：ｅ４４５９５）、及び結果として生ずる好中球の動態化によって引き起こされる（引用元：Ｄｅｓｈｍｕｋｈ  ＨＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１４；２０（５）：５２４−３０）のは、ＮＥＴ形成が厳密に制御されていない場合である。新生児血漿中のｎＮＩＦ及び胎盤中の関連ＮＲＰ  Ａ１ＡＴｍ358（引用元：Ｎｉｅｍａｎｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７；６６（３）：３４６−５７）は、潜在的な「停止信号」を表し（引用元：Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００２；４２０（６９１７）：８４６−５２）、この停止信号は出生前後のＮＥＴ形成を選択的に制限するものである。新生児ＰＭＮを介して完全なＮＥＴ能力が急速に発達し（図１Ａ〜図１Ｄを参照）、ヒト産児の常在微生物叢の子宮外生命の並行確立の最初の数日間で、新生児の血中ｎＮＩＦが減少した（引用元：Ｐａｌｍｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；５（７）：ｅ１７７、及びＪｏｓｔ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１２；７（８）：ｅ４４５９５）。このことは、それらが免疫発達の調節機能であることを示唆する。初期スクリーニングでは、ｎＮＩＦは、健常成人または慢性炎症症候群の成人患者に由来する血漿試料では検出されなかったかあるいは最小限しか存在しなかった（図２Ｂを参照）。このことから示唆されるように、特定の理論に束縛されるものではないが、ｎＮＩＦ発現は、他の或る免疫調節機構と同様、主に胎児及び新生児の特徴であり得る（引用元：Ｄｏｗｌｉｎｇ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３５（７）：２９９３１０；Ａｄｋｉｎｓ  Ｂ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１３；５７（１−３）：２４６−５７、及びＥｌａｈｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０４（７４７８）：１５８−６２）。
【０１１７】
研究及び以前の観察によって示唆されるように、胎盤内でＡ１ＡＴによるタンパク質分解的開裂によって、ｎＮＩＦ及びＡ１ＡＴｍ358が生成された。Ａ１ＡＴはヒト胎盤組織区画内に豊富に存在する（引用元：Ｃａｓｔｅｌｌｕｃｃｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９４；２７８（２）：２８３−９、及びＦｒｏｃｈａｕｘ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１４；９（１０）：ｅ１０９４８３）。これまで提案されてきたように、Ａ１ＡＴの進行性タンパク質分解開裂は胎盤内で起こり、Ａ１ＡＴをＡ１ＡＴｍ358にｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に断片化するのを媒介するプロテアーゼが公知となっている（引用元：Ｎｉｅｍａｎｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ．１９９２；１２（３）：２３３−４１；Ｎｉｅｍａｎｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７；１３４０（１）：１２３３０、及びＰｅｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（４１）：２５８４９−５５）が、特定の胎盤プロテアーゼは同定されていない。妊娠第３期のヒト胎盤合胞体栄養芽層で増加するプロテアーゼである高温要求プロテアーゼ１は、カルボキシ末端にてＡ１ＡＴを開裂する
（引用元：Ｆｒｏｃｈａｕｘ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１４；９（１０）：ｅ１０９４８３）。これらの所見は、特定の理論に束縛されるものではないが、新生児の出産及び分娩後にもはや有効でなくなる胎盤におけるＡ１ＡＴの、生物学的に活性な断片生成のメカニズムを示唆している。
【０１１８】
ｎＮＩＦ及びＡ１ＡＴｍ358だけでなくＣＲＩＳＰＰも、ＮＲＰとして同定された。ＣＲＩＳＰＰ関連ペプチドは、複数の種類のがん患者の血漿から検出されてきた（引用元：Ｃｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９２；１６（５−６）：３０５−１９；Ｃｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９３；１７（３）：４３３−４５、及びＣｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９３；１７（３）：４４７−５４）が、ネトーシスの規制には連携していない。ＮＥＴ形成によって、実験的転移が促進される（引用元：Ｃｏｏｌｓ−Ｌａｒｔｉｇｕｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３（８）：３４４６−５８）だけでなく、癌関連の感染症及び敗血症の転帰にも寄与する。ゆえに、内因性のＣＲＩＳＰＰ関連ペプチドは、ＮＥＴ形成の阻害によって腫瘍性合併症に重大な影響を及ぼし得る。
【０１１９】
黄色ブドウ球菌、細菌毒素ＬＰＳ、以前は認識されていなかったウイルス性の誘発因子であるデング、宿主由来ＤＡＭＰであるヘム、及び強力な薬理学的アゴニスト、ＰＭＡによって誘導されるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＥＴ展開が、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰによって阻害されることが、見出された。この分析から分かるように、異なる活性化経路によって媒介され得る多様な刺激（例えば、真菌アゴニストなど）によって引き起こされるＮＥＴ形成は、ＮＲＰによって中断される（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０）。更にまた、Ｅ．ｃｏｌｉ腹膜炎のマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＥＴ形成はｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰによって阻害された（図８Ａ〜図８Ｆを参照）。ここでは、ＮＥＴの形成は、細菌、ＬＰＳ、及び宿主由来の媒体を介して誘発される可能性が高いことから示唆されるように、複雑な炎症環境において組み合わせ様式で作用しておそらく同時に１つ以上の経路を介してＮＥＴ形成を誘導する複数のアゴニストによって刺激された好中球によるＮＥＴ展開は、ＮＲＰによって阻害される可能性がある（引用元：Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４）。ＮＥＴ形成への経路はｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なることが示唆されることから、このモデルにおけるＮＥＴ展開の阻害剤としてのｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰの検証（図８Ａ〜図８Ｆを参照）もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害の分析を補足するものとなっている（図３Ａ〜図３Ｅを参照）（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０）。
【０１２０】
ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰをプローブとして利用して、ＮＲＰがＮＥＴ形成を阻害するメカニズムを探究した。いくつかのアゴニストにより誘発されたネトーシスは、ＲＯＳ生成を伴う（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４；３０３（５６６３）：１５３２−５；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１；Ｌｏｏｄ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１６；２２（２）：１４６−５３；Ｂｒａｎｚｋ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１３；３５（４）：５１３−３０、及びＳｃｈａｕｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；２０（５）：５１１−７を参照）、現在（図６Ｂを参照）、ならびに以前（Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７を参照）の実験から分かるように、ＮＲＰは異なる１つまたは複数の工程で作用する。現在に至るまでの研究に基づいて言うと、クロマチン脱凝縮は、アゴニストとは無関係にＮＥＴ展開における役目を果たすということである（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；１８（９）：１３８６−９３；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１；Ｆａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１；Ｐｉｌｓｃｚｅｋ  ＦＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１０；１８５（１２）：７４１３−２５、及びＢｒａｎｚｋ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１３；３５（４）：５１３−３０を参照）。ネトーシスにおけるクロマチン脱凝縮の以前の研究に基づくアッセイにおいて、ＰＭＡで刺激された好中球における小葉の喪失及び核の拡大はｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰによって阻害されることが見出された（図７Ａ、図１２Ａ及び図１２Ｂを参照）（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１を参照）。好中球ヘテロクロマチン脱凝縮はＰＡＤ４によって媒介され、このＰＡＤ４によって、ヒストンアルギニンからシトルリンへの変換が触媒され、その結果として、ヒストン−ＤＮＡ結合が減弱し、ヌ���レオソームが巻き戻される（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１８４（２）：２０５−１３；Ｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１０；２０７（９）：１８５３−６２、及びＫｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２０１５；６（６６７３）を参照））。合成基質の除去に基づくＰＡＤ４活性の無細胞アッセイにおいて、確立済みＰＡＤ４阻害剤であるＣｌ−アミジンと並行して、ｎＮＩＦによる阻害が見出された（図７Ｃを参照）。このことは、各薬剤による核の脱凝縮の阻害と一貫している（図７Ａを参照）。ＰＭＡで活性化された生存中の無傷ヒト好中球において、核の脱凝縮の前に起こる核ヒストンのシトルリン化は、ｎＮＩＦ及びＣｌ−アミジンによって阻害された（図７Ｄを参照）。予備アッセイでは、ＣＲＩＳＰＰによってＰＡＤ４活性及び核ヒストンシトルリン化も阻害された。これらの所見を併せ考えれば分かるように、ＮＲＰは、少なくとも或る程度はＰＡＤ４活性及び核ヒストン除去を阻害することによって核脱凝縮及びＮＥＴ形成を阻害する。ＮＥはまた、ネトーシスにおける役目を果たすと考えられている（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０）。ＮＥによってＰＭＡ活性化好中球における核ヒストン開裂が媒介され（引用元：Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１）；ＮＥ活性の阻害剤によって核の脱凝縮が阻止される（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１、及びＦａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１）（図１２Ａ及び図１２Ｂを参照）と共に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＥＴ形成も阻止され（引用元：Ｃｏｏｌｓ−Ｌａｒｔｉｇｕｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３（８）：３４４６−５８）；ＮＥの内因性調節因子はネトーシスに対し影響を及ぼす（引用元：Ｆａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１、及びＺａｂｉｅｇｌｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；９８（１）：９９−１０６）、ＮＥ欠損マウスにおいてはＮＥＴ発生が損なわれる（引用元：Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３））。にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＲＰはＮＥ活性を直接阻害しないことが見出された（図１２Ａ及び図１２Ｂを参照）。一方、他の方法でネトーシス経路のＮＥ媒介性事象をＮＲＰが中断する可能性もある。ＮＥＴ形成を阻害するＣＲＩＳＰＰのＦＬＡＧタグ付き構築物（図１３を参照）は活性化ＰＭＮによって内在化され（図７Ｅを参照）、好中球細胞質中のＮＥの付近に接近して局在していた。特定の理論に束縛されるものではないが、このことから示唆されるように、ＮＲＰに複数の部位と作用機序がある可能性がある。
【０１２１】
ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰは、ヒトとマウスの両方の好中球によるＮＥＴ形成を効果的に阻害する（図３Ａ〜図３Ｅ、及び８Ａ〜図８Ｆを参照）一方、ＰＡＤ４の合成阻害剤は、ヒト及びマウスの好中球によるネトーシスの阻害剤として示差的な有効性を有することが報告されてきた（引用元：Ｌｅｗｉｓ  ＨＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５）。ＮＲＰがｉｎ  ｖｉｖｏで投与された場合の転帰の初期分析では、ＬＰＳに曝露し、それにより無菌性全身性炎症、ＮＥＴ形成、臓器損傷、及び死亡を誘発させたマウスにおいてｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰを検査した（引用元：Ｃｌａｒｋ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７；１３（４）：４６３−９；ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  &  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１２；１２（３）：３２４３３；Ｔａｎａｋａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１４；９（１１）：ｅ１１１８８８、及びＷｉｌｄｈａｇｅｎ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（７）：１０９８１０１）。このモデルにおいてＮＲＰは早期生存という利点をもたらした（図９Ａを参照）。このことから示唆されるように、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ＮＥＴは病原体の非存在下にて炎症性損傷の原因となる。ｎＮＩＦはまた、ＣＬＰモデルの多菌性敗血症においても死亡率を改善した（図９Ｂ及び図９Ｃを参照）。これは、この実験的症候群において、ＮＥＴが側副血管及び組織損傷のエフェクターであるという既存の証拠を裏付けるものである（引用元：Ｃｚａｉｋｏｓｋｉ  ＰＧ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１６；１１（２）：ｅ０１４８１４２）。両方のモデルにおける結果から示唆されるように、ＮＥＴ生成は、他の好中球エフェクター機能と同様に展開され（引用元：Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００２，４２０（６９１７）：８４６−５２）、病原体が封じ込めれらて排除された。一方、感染の不在下で病理学的炎症シグナルを介して、または微生物を介して制御されない方法で活性化された場合には、宿主が傷害を受ける恐れもある。ＮＲＰはまた、ＮＥＴ形成が急性または進行性の病理学的炎症の誘引となる特定の症候群において抗炎症療法としての可能性もある（引用元：Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；６（３）：１７３−８２）。
【実施例】
【０１２２】
これらの実施形態を更に説明するために、以下の実施例が提供される。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定することを意図するものではなく、特許請求の範囲に基づいてのみ決定されるべきである。
【０１２３】
実施例１：フルマン新生児好中球によるＮＥＴ形成を、臍帯血中のペプチドにより調節する
分娩日の臍帯血由来の好中球、及び生後数日に採取された産児の末梢血由来の好中球による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＥＴ展開を検査した。ＳＹＴＯ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（細胞透過性）及びＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（細胞不透過性）ＤＮＡ染色を使用し、ＮＥＴ形成を生細胞撮像を用いて定性的に評価すると共に、上清ＮＥＴ関連ヒストンＨ３測定によって定量的に評価した（引用元：Ｍｃｌｎｔｕｒｆｆ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（１５）：３１１８−２５）。臍帯血から単離されたＰＭＮ（０日目）は、早期産児（Ｎ＝８）または健常正期産児（Ｎ＝２）のいずれかに由来するかを問わず、刺激を受けたときにＮＥＴを形成しなかった（図１Ａ及び１Ｂを参照）。この観測は以前の観測と一貫していた（引用元：Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７）。にもかかわらず、正期新生児及び早期新生児は、ＮＥＴを形成するための恒久的能力を急速に発達させた（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。未熟児7人の子宮外寿命の初期６０日間にわたるNET形成を、連続して評価した。最早時期に生まれた産児においてさえ、３日目の子宮外刺激によるＮＥＴ形成が実証され（下表１を参照）、３日目から１４日目の間にＮＥＴ形成能力が最大限に達成された（図１Ａを参照）。周産期のＮＥＴ形成障害は、新生児の特徴である。健常妊婦から分娩直前に単離されたＰＭＮは、ＮＥＴを堅牢に形成した（図１Ｃを参照）。
表１：早期産児の臨床的特徴と感染性合併症
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【０１２４】
ＮＥＴ能力が急速に発症していること（図１Ａを参照）は、ＮＥＴ形成が臍帯血中の因子によって調節されることを示している。「スイッチ」実験を実施し、この実験で、６０日齢の早期新生児由来のＰＭＮを、貯留臍帯血血漿、０日目の自家臍帯血血漿、または新たに採取された自家日齢６０日目の静脈血血漿と共にプレインキュベートした。０日目の臍帯血血漿中で、または並行して自己由来成人血漿中で、健常成人に由来するＰＭＮをプレインキュベートした。０日目の臍帯血血漿をプレインキュベーションすることによって、ＬＰＳで刺激された６０日目の新生児ＰＭＮ及び対照成人ＰＭＮによるＮＥＴ形成が抑制されたのに対し、新たに単離された自家血漿では抑制されなかった（図１Ｄを参照）。この結果、及びＮＥＴ能力の時間経過（図１Ａを参照）は、ＮＥＴ形成を阻害し、出産後の産児の循環を急速に減少させる臍帯血血漿因子と一貫している。
【０１２５】
熱変性、プロテイナーゼＫ処置、及び臍帯血血漿の脂質抽出を含む、ＮＥＴ阻害因子の同定を目的とする実験から、それはタンパク質であることが同定された。図１Ａに要約されている実験で、ＮＥＴ形成能力が判別された早期産児由来の０日目の臍帯血血漿、及び２８日目の静脈血血漿のプロテオームを検査した。二次元ゲル電気泳動によって実証されたように、臍帯血試料及び２８日目の血漿試料中の、タンパク質及びペプチドクラスターは示差的外観を呈する。ＮＣＢＩヒトトリプシン特異的データベースを用い、クラスターのうちの１つからのタンパク質をトリプシン消化及びタンデム質量分析して、予測分子量がおよそ４ｋＤａの、臍帯血血漿中ペプチドを含む部分的または完全な配列が得られた。その配列は、α１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）のカルボキシ末端中の配列と同一である（図２Ａを参照）。このＡ１ＡＴは、抗炎症性及び免疫調節特性を有する公知の５２ｋＤａの血漿プロテアーゼ阻害剤である（Ｊａｎｃｉａｕｓｋｉｅｎｅ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ．２０１１；１０５（８）：１１２９−３９、及びＪｏｎｉｇｋ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３；１１０（３７）：１５００７−１２を参照）。Ａ１ＡＴのカルボキシ末端１８アミノ酸に対して産生させたポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングを使用して、凡そ４〜６ｋＤａのペプチドが、正期産児臍帯血血漿中に、健常成人に由来する静脈血漿中よりもはるかに豊富に見出された（図２Ｂの左パネルを参照）、これは暫定的に新生児ＮＥＴ阻害因子（ｎＮＩＦ）と呼ばれた。次いで、アフィニティー樹脂ビーズ上に不動化された抗Ａ１ＡＴカルボキシ末端抗体を用いて、臍帯血血漿を免疫除去した。アフィニティービーズから溶出された枯渇血漿及びペプチドの、ＮＥＴ阻害活性を検査した。前回の実験と同じく（図１Ｃを参照）、未改変の臍帯血血漿は、イムノアフィニティービーズから溶出したペプチドと同様、ＬＰＳで刺激された成人ＰＭＮによるＮＥＴ形成を阻害した。一方、免疫枯渇血漿は阻害しなかった（図２Ｃを参照）。４〜６ｋＤａ候補ｎＮＩＦペプチドは、枯渇血漿と比較してアフィニティー精製溶出液中にはるかに多量に見られた（図２Ｄを参照）。並行して、臍帯血血漿中に検出された２９アミノ酸ペプチドを合成した（図２Ａを参照）。それにより、この合成ｎＮＩＦが強力なＮＥＴ阻害活性を有することが見出された（図２Ｅを参照）一方、スクランブルド対照ペプチド（ｎＮＩＦ−ＳＣＲ；下表２を参照）は見出されなかった。これらの結果から実証できるように、ｎＮＩＦまたはそれを包含するより大きなタンパク質は、早期新生児及び正期新生児由来の臍帯血血漿におけるＮＥＴ形成に対する内因性阻害剤とされている（図２Ｂを参照）。ヒト血漿から精製された市販の活性全長Ａ１ＡＴ及び組み換えＡ１ＡＴを用いて、前報と一貫して、ＮＥＴ形成が阻害されなかった（図２Ｅを参照）（引用元：Ｆａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１、及びＦｒｅｎｚｅｌ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２０１２；８（７）：１０２３−５）。こ���ことから分かるように、無傷のＡ１ＡＴはＮＥＴ阻害活性に寄与しない。
【０１２６】
表２：ＮＥＴ阻害ペプチドとその特異的スクランブルドペプチド対照の配列
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抗Ａ１ＡＴのカルボキシ末端抗体を用いた定量的ウェスタンブロッティングを利用したアッセイ、及び種々の濃度の合成ｎＮＩＦで構築された標準曲線により、ｎＮＩＦが、早産児帯血血漿試料中に検出された一方、健常成人に由来する血漿中には検出できないかまたは微量レベルでのみ検出可能であった（図２Ｂの右パネルを参照）。同じアッセイを使用した場合、成人被験者に由来する血漿試料中に、好適な分子量のペプチドが検出されなかった（Ｎ＝１０）。おそらく慢性炎症性症候群（多発性血管炎、巨細胞性動脈炎、または慢性関節リウマチを伴う肉芽腫症）によってＮＥＴ規制因子が誘発される可能性がある。ゆえに、ｎＮＩＦは、胎盤血、及び生後数日の新生児血液だけに制限される場合がある。
【０１２７】
実施例２：以前に認識されていなかったＰＭＮ調節因子のファミリーである、ｎＮＩＦ及びｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）
ｎＮＩＦの配列分析に基づいて、更にＮＥＴ阻害ペプチドを同定した。ｎＮＩＦは、がん患者の血液中に存在する因子に基づくコンセンサスペプチドである、ＣＲＩＳＰＰ（がん関連ＳＣＭ認識・免疫防御抑制及びセリンプロテアーゼ保護ペプチド）に対して実質的に類似している（図２Ａを参照）（引用元：Ｃｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９２；１６（５−６）：３０５−１９；Ｃｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９３；１７（３）：４３３−４５、及びＣｅｒｃｅｋ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｙ．１９９３；１７（３）：４４７−５４）。ＣＲＩＳＰＰ及びスクランブル対照ペプチド（ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ）を合成し、その際、ＣＲＩＳＰＰは、ｎＮＩＦと同様にＬＰＳにより引き起こされたＮＥＴ形成を阻害するのに対して、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲは阻害しないことが、見出された（図３Ａを参照）。陽性免疫選択により単離されたＰＭＮに加えて、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ及び示差遠心単離で単離された好中球によるＮＥＴ形成は、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰによって阻害された。処置後のプロトコールによって実証されたように、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰは、以前に形成されたＮＥＴを劣化または分解させない（図４Ａ及び図４Ｂを参照）という点で、ＮＥＴ形成後にＮＥＴを破壊することが明らかにされてきたＤＮＡアーゼとは異なる（引用元：Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）；Ｃａｕｄｒｉｌｌｉｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２；１２２（７）：２６６１−７１、及びＳａｆｆａｒｚａｄｅｈ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１３；２０（１）：３−９）。Ａ１ＡＴ及びＡ１ＡＴｍ358の、上記４４アミノ酸カルボキシ末端開裂断片についても同様に、ヒト胎盤中のマトリックスに結合し且つ配列中でｎＮＩＦと重複しているのを検査した（引用元：Ｎｉｅｍａｎｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ．１９９２；１２（３）：２３３−４１、及びＮｉｅｍａｎｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７；６６（３）：３４６−５７）（上の表２を参照）。Ａ１ＡＴｍ358は合成され、ｎＮＩＦよりも低い効力ではあるが、ＮＥＴ形成を阻害することが見出された（図５Ａ及び図５Ｂを参照）。
【０１２８】
特定の理論に束縛されるものではないが、これらの観察から分かるように、ｎＮＩＦ、ＣＲＩＳＰＰ、及びＡ１ＡＴｍ358は、以前には認識されていなかったｎＮＩＦ関連ペプチド（ＮＲＰ）のファミリーを表したものである。これらＮＲＰのファミリーによって、ＮＥＴ形成が調節される（図１Ａ〜図５Ｂを参照）。臍帯血（ｎＮＩＦ）、胎盤（Ａ１ＡＴｍ358）、及びいくつかの事例においては成人血漿（ＣＲＩＳＰＰ関連ペプチド）にＮＲＰが存在することから示唆されるように、ＮＥＴ阻害要因が広く分布している可能性があると共に、他のＮＲＰが同定される可能性もある。
【０１２９】
実施例３：ＮＥＴ誘発アゴニストのスペクトルにより引き起こされたＮＥＴ形成をＣＲＩＳＰＰ及びｎＮＩＦで阻害する
多様なアゴニストによってＮＥＴ形成が誘発された場合のＮＲＰの阻害活性を、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰに焦点を合わせて検査した。複数の実験において、これら両方によってＬＰＳで刺激されたＮＥＴ展開が阻害された（図２Ｅ、図３Ａ及び図１１を参照）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＥＴ形成を誘導するための強力な非生理学的アゴニストとしてよく用いられているのが、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）である（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１；Ｆａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１、及びＦｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；１７６（２）：２３１−４１）。ＰＭＡで刺激されたＮＥＴ展開は、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰにより阻止された一方、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲでは阻止されなかった（図３Ｂを参照）。また、生存中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにより誘発されたＮＥＴ形成は、ＣＲＩＳＰＰによって阻害された（引用元：Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）；Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７、及びＦｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；１７６（２）：２３１−４１）（図３Ｃを参照）。この結果は、ＰＭＡによって引き起こされる「自殺的」ネトーシスに加えて、ＮＲＰが「生命維持的」ネトーシスを阻害することも示唆し得る（引用元：Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４、及びＦｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；１７６（２）：２３１−４１）のは、好中球なしのクロマチン脱凝縮及び小胞輸送によって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓがＮＥＴを放出することが報告されている（引用元：Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｆ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；１８（９）：１３８６−９３、及びＰｉｌｓｃｚｅｋ  ＦＨ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１０；１８５（１２）：７４１３−２５）。他の病原体により誘発されたネトーシスをＮＲＰが阻害できるかどうかについても検査し、デング熱ウイルスにより刺激されたＮＥＴ生成がＣＲＩＳＰＰによって阻害されたことが見出された（図３Ｄを参照）。一部のウイルスは、ＮＥＴ配備を誘発する（引用元：Ｓａｉｔｏｈ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  &  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１２；１２（１）：１０９−１６；Ｊｅｎｎｅ  ＣＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  &  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１３；１３（２）：１６９−８０、及びＲａｆｔｅｒｙ  ＭＪ，ｅ��  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１４；２１１（７）：１４８５−９７４３−４５）が、骨髄細胞上のリガンドと相互作用するデング熱（引用元：Ｃｈｅｕｎｇ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１（１１）：４４４６−６１）は以前にこの活性を有していたという報告はなかった。ｎＮＩＦ及びＮＲＰの阻害活性を更に探求するために、ヘムを検査した。ヘムは、内因性損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）及びトキシンである（引用元：Ｇｌａｄｗｉｎ  ＭＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（２４）：３６８９−９０）ｔｈａｔ  ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｓｈｏｗｎ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＮＥＴｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ（引用元：Ｃｈｅｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（２４）：３８１８−２７）。ヘムがヒトＰＭＮによるＮＥＴ形成を引き起こしてｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰがこの応答を阻害することが、見出された（図３Ｅを参照）。ゆえに、微生物及び微生物毒素、宿主由来のＤＡＭＰ、ならびに薬理学的アゴニストにより誘発されたＮＥＴ展開は、ＮＲＰによって阻害される。
【０１３０】
実施例４：他の重要な好中球の抗菌機能または血小板反応を中断することなしに、ＮＥＴ形成をＮＲＰで選択的に阻害する
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の病原株の総貪食性及びＮＥＴ媒介性ＰＭＮ殺滅を、殺菌アッセイを用いて検査して見出されたように、ＣＲＩＳＰＰによって細胞外ＮＥＴ媒介性殺菌及び全殺菌が抑制された一方、その貪食性細胞内殺滅は改変されなかった（図６Ａを参照）。ｎＮＩＦまたはＣＲＩＳＰＰを用いた更なるインキュベーションにおいて、ボイデンチャンバーにおける活性酸素種（ＲＯＳ）の生成、食作用、またはインターロイキン８（ＩＬ−８）誘導走化性は、ＮＲＰで阻害されなかった（図６Ｂ〜図６Ｄを参照）。各ペプチドは必ずしも全てのアッセイで試験されたとは限らないが、これらの実験から、ＮＲＰによってＮＥＴ形成が選択的に阻害される一方で、ＰＭＮの他の重要な抗菌活性が無傷のままに維持されることが示唆される。加えて、フローサイトメトリーを使用して見出されたように、トロンビン刺激血小板によるＰ−セレクチンの表面転位、または活性化されたヒト血小板及びＰＭＮによる異型凝集体の形成は、ＣＲＩＳＰＰでは阻害されない（図６Ｅ及び図６Ｆを参照）。活性化された血小板のこれら及び他の機能は、抗菌防御における役目を果たすことが報告されてきた（引用元：Ｖｉｅｉｒａ−ｄｅ−Ａｂｒｅｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１２；３４（１）：５−３０）。加えて、活性化血小板と好中球との相互作用によってＮＥＴ形成が誘発される（引用元：Ｃｌａｒｋ  ＳＲ，Ｍａ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＴＬＲ４  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｐｓ  ｔｏ  ｅｎｓｎａｒｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｂｌｏｏｄ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７；１３（４）：４６３−９、及びＣａｕｄｒｉｌｌｉｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２；１２２（７）：２６６１−７１）。図６Ｅ及び図６Ｆから、ＮＲＰの細胞標的は血小板ではなくＰＭＮであり、その血小板炎症活性が、ＮＲＰでは中断されないことが分かった。
【０１３１】
実施例５：活性化されたＮｅにおける核クロマチンの脱凝縮及びヒストンのシトルリン化をｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰで阻害する
ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰを、ＮＲＰの活性メカニズムを解明するためのプローブとして使用した。ＲＯＳの生成は、多くの経路では必須と考えられているが、ＮＥＴ形成を媒介する全ての経路では必ずしも必須とは考えられていていない（引用元：Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１；Ｌｏｏｄ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１６；２２（２）：１４６−５３；Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７；Ｆａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１、及びＢｒａｎｚｋ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１３；３５（４）：５１３−３０）一方で、ＣＲＩＳＰＰでは阻害されなかった（図６Ｂを参照）。この結果と一貫して、以前の観察から示唆されたように、ＲＯＳを補給しただけではＮＥＴ能力を新生児のＰＭＮに回復するうえで十分ではない（引用元：Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７）。このことから示唆されるように、特定の理論に束縛されるものではないが、ＲＯＳの影響を受ける規制段階とは別の規制段階においても、ｎＮＩＦは作用する。核クロマチンの脱凝縮は、ＮＥＴ形成に必要とされる極めて重要な事象として報告されてきた（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４；Ｙｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１２；１８（９）：１３８６−９３；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１；Ｆａｒｌｅｙ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８９（９）：４５７４−８１；Ｆｕｃｈｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；１７６（２）：２３１−４１、及びＢｒａｎｚｋ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３；３５（４）：５１３−３０）。前報と同様、脱凝縮及びＰＭＮ核の小葉形成の喪失（図７Ａを参照）がＰＭＡによって誘導されることが見出された（引用元：Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１）。ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰの併用時には、非凝縮核の数が劇的に減少したが、ｎＮＩＦ−ＳＣＲまたはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ使用時には減少しなかった（図７Ａを参照）。好中球クロマチン脱凝縮はＰＡＤ４により媒介され、ヒストンアルギニンのシトルリンへの変換を触媒することによりヒス��ンＤＮＡ結合を減弱させる（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｗａｎｇ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１８４（２）：２０５−１３、及びＬｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１０；２０７（９）：１８５３−６２）。これと一貫して、不可逆的なＰＡＤ４阻害剤であるＣｌ−アミジン（引用元：Ｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１０；２０７（９）：１８５３−６２）は、本明細書中に開示されている実験の条件下で核脱凝縮を阻止した（図７Ａの下側パネルを参照）。次いで、無細胞ＰＡＤ４アッセイを使用した際、ｎＮＩＦが、対照として使用されたＣｌ−アミジンと同様に、その活性を遮断することが見出された（図７Ｃを参照）。ＮＲＰを最初に比較した際、ＰＡＤ４阻害の効力順位はｎＮＩＦ→ＣＲＩＳＰＰ→Ａ１ＡＴｍ358であり、この効力順位はその相対的なネトーシスの阻害と同じである。並行して、活性化好中球における核ヒストンＨ３シトルリン化を検査し（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６；１２６（５）：１６１２−２０、及びＬｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１０；２０７（９）：１８５３−６２）、ＰＭＡによる活性化の１５分以内に、急速なシトルリン化が検出された。これは、ｎＮＩＦ及びＣｌ−アミジンによって阻害された（図７Ｄを参照）。このことから示唆されるように、この段階でＮＲＰが核の脱凝縮を阻止するように作用する（図７Ａを参照）。
【０１３２】
好中球エラスターゼ（ＮＥ）もまた、核の脱凝縮及びＮＥＴ形成に関与している（引用元：Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ＯＥ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６；１２６（５）：１６１２−２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１；Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）、及びＢｒａｎｚｋ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１３；３５（４）：５１３−３０）。ＮＥ阻害剤であるシベレスタットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核の脱凝縮を阻止する（図１２Ａ及び図１２Ｂを参照）。
ＣＲＩＳＰＰ及びＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲは、各ペプチドのカルボキシ末端に付加されたＦＬＡＧタグ付き（ＣＲＩＳＰＰ−Ｆ、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ−Ｆ）を用いて合成された。その際に見出されたのは、活性化された好中球によってＣＲＩＳＰＰ及びＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲの両方が内在化されること（図７Ｅを参照）、ＣＲＩＳＰＰ−ＦがＮＥＴ形成を阻害すること（図１３を参照）、タンパク質近接アッセイでは最初にＮＥの４０ｎｍ以内にＣＲＩＳＰＰ−Ｆが局在していることであった。このことから示唆されるように、ネトーシスのＮＥの作用はＮＲＰによって阻止される可能性があるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰのいずれによってもＮＥ活性が阻害されなかった（図１２Ａ及び図１２Ｂを参照）。
【０１３３】
ＮＲＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴ形成を阻害し、全身性炎症における転帰を改変させる。ｎＮＩＦ及びＮＲＰがｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴ形成を阻害するかどうかを判別するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＥ．ｃｏｌｉ臨床単離株を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射してｉｎ  ｖｉｖｏ  ネトーシスの新たなモデルを確立した。接種の３時間後、腹腔液試料の生細胞撮像から、ＮＥＴ形成が堅牢なものであることが実証された。加えて、腹膜の漿膜表面上にＮＥＴが堆積するのが観察された。ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰは、腹腔液ＰＭＮによるＮＥＴ形成（図８Ａを参照）及び腹膜表面へのＮＥＴ展開（図８Ｂを参照）を阻害したが、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲは阻害しなかった。好中球数及び細菌数が増加したことから、活性な腹膜炎が実証された（図８Ｃ及び図８Ｄを参照）。ＣＲＩＳＰＰで処置された動物に由来する試料の方が、ＰＭＮの数が多かった。ｎＮＩＦ処置マウスにおいては、溶解性ネトーシスが阻害される可能性があることから、ＰＭＮの数が多くなる傾向があった（図８Ｃを参照）（引用元：Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９８（５）：７７３−８３、及びＹｉｐｐ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２２（１６）：２７８４−９４）。また、Ｅ．ｃｏｌｉコロニー形成単位の数も、ＮＲＰで処置された動物由来の試料の方が、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ対照で処置された動物におけるよりも多かった（図８Ｄを参照）。このことから示唆されるように、ＮＥＴ媒介性殺菌数が減少した。ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰはまた、Ｅ．ｃｏｌｉに感染したスイスウェブスターマウスにおいて腹膜ＮＥＴ形成を阻害した（図８Ｅ及び８Ｆを参照）。この結果はマウスの背景を越えて一般化できることを示唆する。
【０１３４】
第２のモデルにおいて見出されたように、ＬＰＳの腹腔内投与は、生存Ｅ．ｃｏｌｉほど堅牢ではないにしろ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて腹腔内ＮＥＴ形成を誘発する。ＬＰＳ誘発腹膜ＮＥＴ形成はｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰで阻害された一方、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲでは阻害されなかった。腹腔内投与ＬＰＳに曝露されたマウスにおいて、血管内ＮＥＴが観察された（引用元：ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１２；１２（３）：３２４３３、及びＴａｎａｋａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１４；９（１１）：ｅ１１１８８８）。この血管内ＮＥＴは、静脈内ＬＰＳ、細菌、または他のアゴニストによって誘発された際に、組織損傷を引き起こして死亡を一因となる（引用元：Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）；Ｘｕ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；１５（１１）：１３１８−２１；ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  &  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１２；１２（３）：３２４３３；Ｃａｕｄｒｉｌｌｉｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２；１２２（７）：２６６１−７１、及びＣｈｅｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２３（２４）：３８１８−２７）。それゆえ、ＬＰＳを腹腔内投与されたマウスで死亡率を検査した。実験を５０時間経過した時点で終了した際に、ＣＲＩＳＰＰ（ｎ＝６）で処置された全ての動物が生存していたが、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（ｎ＝６）で処置された動物のわずか３０％であった（Ｐ＜０．０２）。第２の実験ではｎＮＩＦも検査し、この検査を７２時間まで延長した。５０時間目に、ＬＰＳに曝露されたＮＲＰ処置群の死亡率は、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲまたはＬＰＳ単独で処置されたマウスと比較して低かった（各群につきｎ＝１０）。図９Ａに、２つの実験からの統合的データを例証する。第２の実験では７２時間目に、ｎＮＩＦによって提供された生存率優位は持続的であった（ＬＰＳ単独と比較してＰ＝０．００７）一方、ＣＲＩＳＰＰの生存率優位は非持続であった。これは、これらの条件下でのｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰの薬物動態または半減期の差異によるものである可能性がある。
【０１３５】
また、同様の実験は、多菌性敗血症の盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルを用いて、実施された（引用元：Ｈｕｂｂａｒｄ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２００５；２４  Ｓｕｐｐｌ  １（５２−７）；Ａｒａｕｊｏ  ＣＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２０１６；４５（４）：３９３−４０３、及びＣｚａｉｋｏｓｋｉ  ＰＧ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１６；１１（２）：ｅ０１４８１４２）。ｎＮＩＦで処置されたマウスは、２４時間目に臨床疾患スコアの低下が見られ（引用元：Ａｒａｕｊｏ  ＣＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２０１６；４５（４）：３９３−４０３）、ｎＮＩＦ−ＳＣＲで処置された動物と比較してＣＬＰ後１４４時間目に生存率が有意に上昇した（図９Ｂ及び図９Ｃを参照）。総合すると、これらの実験（図８Ａ〜図９Ｃを参照）から実証されるように、ｎＮＩＦ及びＣＲＩＳＰＰはｉｎ  ｖｉｖｏでＮＥＴ形成を阻害し、ＮＥＴ形成が組織損傷と死亡率に影響を与える可能性のある全身性無菌性炎症と感染のモデルにおいて、有益な効果を有するという最初の証拠を提供する（引用元：Ｋｏｌａｃｚｋｏｗｓｋａ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２０１５；６（６６７３）；Ｃｌａｒｋ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００７；１３（４）：４６３−９；ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  &  ｍｉｃｒｏｂｅ．２０１２；１２（３）：３２４３３、及びＣｚａｉｋｏｓｋｉ  ＰＧ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．２０１６；１１（２）：ｅ０１４８１４２）。
【０１３６】
実施例６：ＨＴＲＡ１を介して生成されたＡ１ＡＴ開裂断片（ＨＴＲＡ１−ＣＦ）による、ＮＥＴ形成の阻害
胎盤中でＡ１ＡＴの進行性タンパク質分解開裂が起こる場合があり、ヒトストロメリシン−３を介したＡ１ＡＴの開裂によってＡ１ＡＴｍ358が生ずることが報告されてきた（引用元：Ｐｅｉ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（４１）：２５８４９−５５）。加えて、他のプロテアーゼによってＡ１ＡＴが断片化される場合もある。したがって、１つまたは複数の胎盤プロテアーゼによってＡ１ＡＴが開裂され、ｎＮＩＦを生ずる場合があり、これは、プロテアーゼ（複数可）及び基質の局所的利用可能性に応じて、血管外胎盤区画または臍帯血中で起こり得る。高温要件Ａ１（ＨＴＲＡ１）というプロテアーゼが描画されている。このＨＴＲＡ１は、妊娠第３期のヒト胎盤において上方制御され、ＨＴＲＡ１によって、Ｃ末端でＡ１ＡＴが開裂され、サイズが幾分大きいがｎＮＩＦの配列を含んだ断片が生成している（引用元：Ｆｒｏｃｈａｕｘ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ．９（１０）：ｅ１０９４８３．ｄｏｉ：１０．１３７１）。
【０１３７】
ＨＴＲＡ１によるＡ１ＡＴの開裂によって生成されたペプチド（ＨＴＲＡ１−ＣＦ）が、合成された。その際、ＮＥＴ形成がＨＴＲＡ１−ＣＦによって阻害されることが見出された（図１４を参照）。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、１つ以上の胎盤プロテアーゼによってＡ１ＡＴが酵素的に開裂される可能性があることから、そのような開裂は、ｎＮＩＦを生ずるためのメカニズムであると言っても差し支えない。
【０１３８】
実施例７：動物研究
全てのマウス試験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＵｔａｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ、及びＲｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによる承認を受けた。全ての実験用の８〜１２週齢のスイスウェブスター雄マウス及びＣ５７ＢＬ／６雄マウスは、ＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲＳ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（商標）またはＪＡＣＫＳＯＮ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（商標）から購入されたものであった。特定の病原体を含まないマイクロアイソレーターケージに、マウスを収容した。このケージは、一定の温度を維持しながら１２時間の明暗周期で室内に配置されていた。実験開始時に、全ての治療群の体重を照合し、治療に対して無作為化した。実験を実施している研究者は、試験中に実験群に対して盲検化された。実験を設計する際に、組み入れ基準または除外基準をいっさい使用しなかった。
【０１３９】
実施例８：試薬
リポ多糖（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ０１１１：１３４、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ポリ−Ｌ−リジン、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＤ、パラホルムアルデヒド（ｐ−ＦＡ）、シベレスタット、ＮＥ、ＮＥ基質（ＭｅＯＳｕｃ）−ＡＡＰＶ−（ｐＮＡ）、及びトロンビンは、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）から購入されたものであった。追加の試薬は、ＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３染色、ファロイジン、ＳＹＴＯ（登録商標）−Ｇｒｅｅｎ（細胞透過性ＤＮＡ染色）、及びＳＹＴＯＸ（登録商標）−Ｏｒａｎｇｅ（細胞不透過性ＤＮＡ染色）（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標）；Ｃｌ−アミジン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）；ＤＮアーゼ（ＰＲＯＭＥＧＡ（商標））、抗ＣＤ１５−マイクロビーズ（ＭＩＬＴＥＮＹＩ（商標）；Ｍｅｄｉｕｍ−１９９（ＬＯＮＺＡ（商標））、及びミクロコッカルＤＮアーゼ（ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ（登録商標））であった。
【０１４０】
実施例９：ｎＮＩＦ及びＮＲＰの合成
ｎＮＩＦ、ＮＲＰ、及びそれらの特定のスクランブルペプチド対照（上の表２を参照）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＵｔａｈのＨｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＣｏｒｅｓユニットであるＤＮＡ／Pｅｐｔｉｄｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって合成された。
また、その中核的施設によって、提供されたペプチドの配列及び純度の検証も為された。
【０１４１】
実施例１０：ＰＭＮ及び血小板の単離
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによる承認を受けたプロトコール下にて、健常成人、健常正期産児及び早期産児に由来するＡＣＤまたはＥＤＴＡ抗凝固処理静脈血からＰＭＮを単離した（引用元：Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７、及びＭｃｌｎｔｕｒｆｆ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（１５）：３１１８−２５）。生後２か月間にわたる５回の別々の時点において、臍帯血及び末梢血試料を採取した未熟児８人を対象に、臍帯血及び末梢血血漿ならびにＰＭＮ製剤を得た。抗ＣＤ１５被覆マイクロビーズ及びＡＵＴＯ−ＭＡＣＳ（登録商標）セルソーター（ＭＩＬＴＥＮＹＩ（商標））を用い、陽性免疫選択によってＰＭＮ懸濁液（純度＞９６％）を調製し、５％ＣＯ2／９５％空気中３７０℃にて、濃度２×１０6細胞／ｍＬの無血清Ｍ−１９９培地中に再懸濁させた。記載されているようにヒト血小板を単離した（引用元：Ｗｅｙｒｉｃｈ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６；９７（６）：１５２５−３４）。
【０１４２】
実施例１１：ＮＥＴ形成の生細胞撮像
前報と同様、ＮＥＴ形成の定性的評価を行った（引用元：Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７、及びＭｃｌｎｔｕｒｆｆ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（１５）：３１１８−２５）。概略説明すると、早期産児、健常正期産児及び健常成人（２×１０6細胞／ｍＬ）から単離された一次ＰＭＮを、５％ＣＯ2／９５％空気中、３７℃にて１時間、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたガラス製カバースリップ上で対照緩衝液と共にインキュベートするか、または指示されたアゴニストもしくは細菌で刺激した。選択された実験用に、一次ＰＭＮを、刺激前の１時間、自家血漿、臍帯血血漿、ｎＮＩＦ（０．２〜７０ｎＭ）、ＣＲＩＳＰＰ（０．２〜７０ｎＭ）、ｎＮＩＦ−ＳＣＲ（１ｎＭ）またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）と共にプレインキュベートした。プレインキュベーション及び／または刺激の後、ＰＭＮをＰＢＳで丁寧に洗浄し、細胞透過性（ＳＹＴＯ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標）及び不透過性（ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｏｒａｎｅ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標））ＤＮＡ蛍光染料の混合物と共にインキュベートした。共焦点顕微鏡検査は、ＦＶ１０００  lＸ８１共焦点顕微鏡及びＦＬＵＯＶＩＥＷ（商標）ソフトウェア（ＯＬＹＭＰＵＳ（商標））を使用して達成された。２０倍対物レンズ及び６０倍対物レンズの両方を使用した。視野ごとに２０μｍの範囲にわたって刻み幅１μｍにてＺシリーズ画像を得た。画像処理用に、ＦＬＵＯＶＩＥＷ（商標）及びＡＤＯＢＥ（商標）ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（商標）ＣＳ２ソフトウェアを使用した。
【０１４３】
実施例１２：デング熱ウイルスによるＮＥＴ形成の撮像
ＢＳＬ２安全プロトコールを使用して、健常成人から単離した一次ＰＭＮ（２×１０6細胞／ｍＬ）を、生細胞撮像用に偽感染緩衝液または生デング熱ウイルス（Ｍ０１０．０５）と共にインキュベートした。１時間インキュベーションした後、感染したＰＭＮを２％のｐ−ＦＡで１０分間固定してから、蛍光タグ付きした細胞透過性及び細胞不透過性ＤＮＡ色素と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡を用いた生細胞撮像に関して撮像した。
【０１４４】
実施例１３：ＮＥＴ形成の定量化：ＮＥＴ関連ヒストンＨ３含量
前述のようにして、ＮＥＴ関連ヒストンＨ３含有量を算定した（引用元：Ｍｃｌｎｔｕｒｆｆ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（１５）：３１１８−２５）。対照及び刺激された一次ＰＭＮ（２×１０6／ｍＬ；様々なアゴニスト）の生細胞撮像の後、細胞をＤＮアーゼ（４０Ｕ／ｍＬ）を含有するＰＢＳと共に室温で１５分間インキュベートし、刺激に反応して形成されたＮＥＴを分解して放出した。上清を丁寧に除去し、４２０×ｇで５分間遠心分離した。次いで、無細胞上清を４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と３：１で混合した後、ウェスタンブロッティングした。ヒトヒストンＨ３タンパク質に対するポリクローナル一次抗体（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ（登録商標））、及び赤外共役二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標））を使用した。撮像及びデンシトメトリーは、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）赤外線撮像システム（ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標））で行った。このアッセイは、現在の研究で採用されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下にてＮＥＴ形成の代用として以前に検証されていた（引用元：Ｍｃｌｎｔｕｒｆｆ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０（１５）：３１１８−２５）。
【０１４５】
実施例１４：臍帯血血漿中ｎＮＩＦの単離及び同定
２Ｄ電気泳動の前に、等電点電気泳動（ｐＨ範囲３〜８）、続いてサイズ（ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル、ＢＩＯ−ＲＡＤ（商標））を用いて、早期産児１人に由来する２つの血漿試料（一方は臍帯血由来、他方は末梢血試料由来、２８日目に子宮外採取されたもの）を、十分に血漿タンパク質除去に供した（ＮＯＲＧＥＮ（商標））。結果として得られたゲル同士の示差的タンパク質含有量を比較した。示差的に発現した６つのタンパク質クラスター（「スポット」）を、分析用にＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅに送付した。ＬＴＱ−ＦＴイオントラップ／ＦＴＭＳハイブリッド質量分析計（ＴＨＥＲＭＯ  ＥＬＥＣＴＲＯＮ（商標））を使用してトリプシン消化及びタンデム質量分析した後、候補タンパク質／ペプチドを潜在的ＮＥＴ阻害因子として同定した。
【０１４６】
実施例１５：ｎＮＩＦのアフィニティー除去
血漿試料を大量血漿タンパク質除去に供した（ＮＯＲＧＥＮ（商標））。Ａ１ＡＴのカルボキシ末端１８アミノ酸に対して生じたポリクローナル抗体（ＬＩＦＥＳＰＡＮ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標））を、ＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）から購入された免疫沈降キットからの樹脂ビーズに結合させ、これを用いて試料を免疫除去した。樹脂ビーズに結合された非免疫ＩｇＧを、対照として並行して使用した。血漿をキットからの溶解緩衝液で希釈し、抗Ａ１ＡＴのＣ末端抗体結合ビーズまたは対照ビーズと共に４℃にて一晩インキュベートした。次いで、ビーズを遠心分離によって分離し、免疫枯渇血漿試料及び対照血漿試料を収集した。Ａ１ＡＴのＣ末端抗体結合ビーズ及び対照ビーズをキットに収録された溶出緩衝液に室温で１０分間再懸濁させ、続いて遠心分離し、溶出液及び対照上清を回収した。Ａ１ＡＴのＣ末端抗体を用いたウェスタンブロッティング（１６．５％トリス−トリシンゲル、ＢＩＯ−ＲＡＤ（商標））、及びタンデム質量分析によって、溶出液を分析した。免疫枯渇血漿及び溶出液試料を、ＮＥＴ形成のアッセイで検査した。活性全長天然型Ａ１ＡＴ及び組み換え型Ａ１ＡＴ（両方ともＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）製）を溶出緩衝液中に懸濁させ、並行して試験を行った。
【０１４７】
実施例１６：殺菌アッセイ
前述のように、初代ヒトＰＭＮによるＮＥＴ媒介性及び貪食性の殺菌を判別した（引用元：Ｙｏｓｔ  ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２５）：６４１９−２７）。
【０１４８】
実施例１７：走化性アッセイ
ｎＮＩＦ（１ｎＭ）、ＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）との±１時間のプレインキュベーションで、修正ボイデンチャンバーアッセイを用い、健常成人ドナーから単離されたＰＭＮによる走化性を評価した。化学誘引物質として、組み換えヒトＩＬ−８（２ｎｇ／ｍＬ）を使用した。前述のように、ランダムに選択された１０個の強拡大視野内のＰＭＮを計数することによって、５ミクロンフィルターによる走化性を算定した（引用元：Ｈｉｌｌ  ＨＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．１９７４；２（７８８１）：６１７−９）。別の実験で、同じシステムを使用して、ｎＮＩＦ、ＣＲＩＳＰＰ、またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（全て１ｎＭ）の化学誘引物質活性を評価した。
【０１４９】
実施例１８：食作用アッセイ
ＰＭＮを健常成人ドナーの血液から単離し、２×１０6細胞／ｍＬの濃度でＭ−１９９中に再懸濁させた。標準条件下にて白血球をサイトカラシンＤ及びＢ（１０μＭ）、ｎＮＩＦ（１ｎＭ）、ＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）と共に６０分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、ＰＭＮを５％ＣＯ2／９５％空気中、３７℃にて４時間、回転子上で６×１０6個のＥ．ｃｏｌｉバイオ粒子（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標））と共にインキュベートした。次いで、ＰＭＮを洗浄し、出発容量のＭ−１９９中に再懸濁させた後、ガラス製カバースリップ上にスピンダウンさせ、２％ｐ−ＦＡで１０分間固定して、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で１０分間透過処理した。ＷＧＡ５５５（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））及びＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標））で白血球を染色し、共焦点顕微鏡を使用して、無作為に選択された高倍率視野画像を捕捉した。ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して、４８８ｎｍにて検出された蛍光タグ付きＥ．ｃｏｌｉバイオ粒子に対して陽性であるＰＭＮの割合を算定した。
【０１５０】
実施例１９：Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
健常成人全血から単離されたヒトＰＭＮをＭ−１９９培地中に２×１０6細胞／ｍＬの濃度になるまで再懸濁させた。５％ＣＯ2／９５％空気中、３７℃にて１時間、±ＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）ペプチドをプレインキュベートした。次いで、ＰＭＮをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で１時間刺激し、洗浄してジヒドロローダミン（７．２５ｍＭ；ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標））及びカタラーゼ（１０００単位／ｍＬ；ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））混合物と共に再懸濁させ、３７℃にて１０分間インキュベートした。インキュベーション後に、試料を４℃の所に置き、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈの中核的施設（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ（商標）、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ（商標）ソフトウェア）で実施されたように、フローサイトメトリーを用いてＲＯＳ依存性蛍光の分析を行った。
【０１５１】
実施例２０：血小板活性化アッセイ
活性化された血小板による、Ｐ‐セレクチン転座及び表面提示（引用元：ｖａｎ  Ｖｅｌｚｅｎ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．２０１２；１３０（１）：９２−８）、ならびに血小板−好中球凝集体の形成（引用元：Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８８（１１）：４１８３−９４）を、記載されているようにして測定した。
【０１５２】
実施例２１：核凝縮アッセイ
ＰＭＮを単離し、２×１０6細胞／ｍＬになるまでＭ−１９９培地中に再懸濁させてから、ｎＮＩＦ（１ｎＭ）、ＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）、ｎＮＩＦ−ＳＣＲ（１ｎＭ）、ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）、またはＰＡＤ４阻害剤であるＣｌ−アミジン（１０μＭ）と共に、５％ＣＯ2／９５％空気中３７℃にて１時間プレインキュベートして、ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラス製カバースリップ上で±ＰＭＡ（２０ｎＭ）を２時間処置した。核の脱凝縮を、記載されているように同定した（引用元：Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９１（３）：６７７−９１）。試料当たり５つの無作為に選択された高倍率視野を共焦点顕微鏡で捕捉し、細胞透過性蛍光ＤＮＡ色素ＳＹＴＯ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを使用して、核面積を分析した。高倍率視野当たり１００個超の個々の細胞の核ピクセル面積を、ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して算定した。
【０１５３】
実施例２２：ＰＡＤ４活性アッセイ
ＰＡＤ４阻害剤スクリーニングアッセイキット（ＣＡＹＭＡＮ（商標））を使用して、ＰＡＤ４活性がｎＮＩＦ阻害によって測定されるかどうかを判別した。概略説明すると、ｎＮＩＦ（１ｎＭ）を、ＰＡＤ４アッセイ試薬中に溶かした組み換えＰＡＤ４及びＰＡＤ４酵素基質（２ｍＭ）と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。ＰＡＤ４阻害の陽性対照としてＰＡＤ４阻害剤であるＣｌ−アミジン（１０μＭ）を使用した。反応をＰＡＤ４ストップ溶液で停止させ、付属のアンモニア検出器アッセイを用いて検出した。ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（商標）Ｍ５蛍光プレートリーダー（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＤＥＶＩＣＥＳ（商標））で４０５ｎｍにて励起した後、アンモニア検出器の蛍光を４７０ｎｍにて測定した。
【０１５４】
実施例２３：ヒストンＨ３シトルリン化の判別
ｎＮＩＦ、ＣＲＩＳＰＰ、ｎＮＩＦ−ＳＣＲもしくはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）と共に、またはＣｌアミジン（１０μＭ）と共に１５分間プレインキュベートした後、成人ＰＭＮを５％ＣＯ2／９５％空気中で３７℃にて１５分間ＰＭＡ（２０ｎＭ）で刺激し、ポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上にスピンし、免疫細胞化学法により試験して、一次抗体（ＡＢＣＡＭ（商標））を用いてヒトシトルリン化ヒストンＨ３を検出した。ＦＶ１０００  １Ｘ８１共焦点顕微鏡及びＦＬＵＯＶＩＥＷ（商標）ソフトウェア（ＯＬＹＭＰＵＳ（商標））を使用して、共焦点顕微鏡を介して撮像を達成した。ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して半定量化を遂行し、細胞当たりの平均シトルリン化ヒストンＨ３含有量を定量する。
【０１５５】
実施例２４：ＣＲＩＳＰＰペプチド細胞局在
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈの中核的施設で合成されたＦＬＡＧタグ付きＣＲＩＳＰＰ（Ｆ−ＣＲＩＳＰＰ）及びＦＬＡＧタグ付きＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（Ｆ−ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ）ペプチドを、免疫細胞化学法を用いて検出した。成人好中球をＦ−ＣＲＩＳＰＰ（１ｎＭ）またはＦ−ＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１ｎＭ）のいずれかと共に５％ＣＯ2／９５％空気中３７℃にて１時間プレインキュベートし、続いて、ＬＰＳ（１００ｎｇ  ／ｍＬ）２時間で刺激した。次いで、ＰＭＮを２％ｐ−ＦＡ固定及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００透過処理でガラス製カバースリップ上にスピンダウンした。核対比染色として用いたＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）−３と共にモノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））を使用して、ＦＬＡＧタグ化ペプチドを検出した。
【０１５６】
実施例２５：Ｅ．ｃｏｌｉ及びＬＰＳ誘発性腹膜炎のマウスモデル
感染（Ｅ．ｃｏｌｉ、４．５×１０7ｃｆｕ／マウス、腹腔内投与）または接種（ＬＰＳ、２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））に先立って、Ｃ５７／ＢＬ６またはＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、腹腔内注射によって１時間、ＣＲＩＳＰＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｎＮＩＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲ（１０ｍｇ／ｋｇ）で盲検的に前処置した。
対照マウスに生理食塩水のみを注射した。感染／接種後３時間経たマウスをＣＯ2チャンバー内で屠殺し、腹腔液及び腹膜試料を採取した。概略説明すると、腹部を消毒して、筋肉を損傷させずに正中線で切開した。腹腔を滅菌食塩水（１ｍＬ）で洗浄し、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＥＴ形成、バクテリオロジー、及び白血球蓄積について分析した。共焦点顕微鏡による生細胞撮像及びＮＥＴ関連ヒストンＨ３放出アッセイを用いて、腹腔液中のＮＥＴを定性的及び定量的に分析した。腹膜の漿膜表面上のＮＥＴを、生細胞撮像を用いて定量的に評価し、続いて、組織試料当たり５つの無作為に選択された高倍率視野の標準化グリッド分析（ＩＭＡＧＥＪ（商標）ソフトウェア、ＮＩＨ）を実施した。回収された全白血球を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、５％ヒツジ血液寒天プレート（ＨＡＲＤＹ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ（商標））上で段階希釈及び細菌培養を行うことにより、腹膜細菌コロニー形成単位（ｃｆｕ）数を定量した。２４時間インキュベートした後、細菌数を算定した。チュルク液（２％酢酸）で希釈された後の腹腔洗浄液中の総白血球数を、光学顕微鏡を使用してノイバウエルチャンバー内で測定した。６０倍油浸対物レンズを使用して示差的白血球分析を行い、メイ・グリュンワルド・ギムザ色素で染色された細胞遠心分離細胞の形態を評価した。最終分析では全てのマウスが分析の対象とされた。
【０１５７】
実施例２６：ＬＰＳにより誘発される全身性炎症（「内毒素血症」）のマウスモデル
ＬＰＳ（２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）を接種する前及び接種後６時間目に、１時間腹腔内注射により（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ５７／ＢＬ６マウスをＣＲＩＳＰＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｎＮＩＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＣＲＩＳＰＰ−ＳＣＲで盲検法で前処置した。対照マウスに生理食塩水のみを腹腔内注射した。これらの実験では、輸液蘇生術及び抗生物質治療は使用しなかった。生存率を５０時間または７２時間の間隔で評価した。最終的な生存分析では、全てのマウスを分析の対象とした。
【０１５８】
実施例２７：盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）を用いた多菌性敗血症のマウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをケタミン／キシラジン（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔し、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）を前述のように実施した（引用元：Ａｒａｕｊｏ  ＣＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２０１６；４５（４）：３９３−４０３）。ＣＬＰの１時間前及び６時間後に、ｎＮＩＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはｎＮＩＦ−ＳＣＲ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。外科手術直後に輸液蘇生用の皮下滅菌等張食塩水（１ｍＬ）を、動物に投与した。疑似手術したマウスを、ＣＬＰを施術しなかったことを除き同一の手技に供した。ＣＬＰの２４時間後、前述したように全ての動物の臨床疾患重篤度をスコアした（引用元：Ａｒａｕｊｏ  ＣＶ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２０１６；４５（４）：３９３−４０３）。この評価では、スコアが高いほど疾患重篤度が高いことが反映される。手術後５日間ｎＮＩＦ／ＣＬＰ（ｎ＝７）、ｎＮＩＦ−ＳＣＲ／ＣＬＰ（ｎ＝８）、ｎＮＩＦ／偽手術（ｎ＝３）、またはｎＮＩＦ−ＳＣＲ／偽手術（ｎ＝３）群のマウスの生存率を追跡した。
【０１５９】
実施例２８：好中球エラスターゼ活性アッセイ
ＮＥの合成蛍光基質、（ＭｅＯＳｕｃ）−ＡＡＰＶ−（ｐＮＡ）（１６０μＭ）を、生物活性ＮＥ（５００ｎＭ）±ＮＥ阻害剤、シベレスタット（１６０μＭ）またはｎＮＩＦ（５０ｎＭ）と共に、３７℃にて３時間インキュベートした。５％氷酢酸で反応を停止させ、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＡＧＩＬＥＮＴ（商標）１１００シリーズＨＰＬＣ及びＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）５μｍ  Ｃ１８  ＬＵＮＡ（登録商標）カラム（１００Å、４．６×１５０ｍｍ）を使用して、３０分間１０％から９０％Ｂの勾配（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ  Ｈ2Ｏ溶液、緩衝液Ｂ：０．１％ＴＦＡ  ＡＣＮ溶液）によって、クロマトグラムが得られた。ＡＰＩ（登録商標）３５００三連四重極質量分析計を使用して、反応生成物の二次検証用に質量スペクトルを得た。視認性を良好化するため、Ｘ軸及びＹ軸の両方でクロマトグラムを（それぞれ０．５分及び０．１Ａ214）オフセットした。全てのデータを各グラフに表示されている最も高いＨＰＬＣピークに正規化して、相対的Ａ214を算定した。
【０１６０】
実施例２９：統計
ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（商標）統計ソフトウェア（バージョン５）を使用して、結果を分析した。実験変数ごとに、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を算定した。図２Ｂ、図６Ｃ及び図７Ｂでは、スチューデントｔ検定が使用された。複数の実験群間に存在する差異を、ＡＮＯＶＡを使用して同定した。有意差が見い出された場合、チューキーの事後検定（図１Ａ、図１Ｄ、図２Ｅ、図３Ａ〜図３Ｃ、図３Ｅ、図６Ｂ〜図６Ｆ、図７Ｃ、図７Ｄ、図８Ａ、図８Ｅ、及び図８Ｆ）、ボンフェローニの多重比較検定（図６Ａ）、または、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後手順（図８Ｃ及び図９Ｂ）を使用して、有意差のあるグループを特定した。図８Ｄには、片側マンホイットニー統計ツールが使用された。図９Ａ及び図９Ｃでは、ログランク（マンテル・コックス）統計ツールを用いて群間の生存曲線を比較し、事後ボンフェローニの補正を用いた。各統計検定に使用された全てのデータが、特定の検定の想定条件を満たし、正規分布していた。０．０５未満のＰ値はいずれも、統計的に有意であると見なされた。
【０１６１】
実施例３０：研究の承認
本研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによる承認（ＩＲＢ＃ｓ：０３９２、１１９１９、及び３９６２１）を受け、全てのヒト被験者がヘルシンキ宣言に準拠してインフォームドコンセントを提供した。全てのマウス実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによる承認（＃１２−１１０１７）を受け、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより承認された施設において実施された。
【０１６２】
実施例３１：胎盤ＨＴＲＡ１プロテアーゼによるα１抗トリプシンの開裂、及び新生児ＮＥＴ阻害因子の生成
いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、胎盤で発現されたＨＴＲＡ１というセリンプロテアーゼは、ＡＡＴの開裂によってＮＥＴ阻害ペプチドの形成を調節するものと仮定された。この仮説を検証するために、ウェスタンブロッティングによって正期胎盤及び早期胎盤のＨＴＲＡ１発現を評価した。正期産児、早期産児、及び成人に由来するＨＴＲＡ１及びＡＡＴ血漿発現を、ＥＬＩＳＡによって特定した。生物活性（０．５μｇ）または胎盤溶出ＨＴＲＡ１を、ＡＡＴ（８μＭ）と共に３７℃にて１８時間インキュベートし、ウェスタンブロッティング及び質量分析法を用いてＡＡＴのカルボキシ末端断片を検出した。反応生成物を、健常成人から単離されたＰＭＮと共に１時間インキュベートした後、ＬＰＳで刺激（１００ｎｇ／ｍＬ）して、生細胞撮像を用いてＮＥＴ形成の評価を行った。活性酸素種はフローサイトメトリーを用いて評価し、走化性は改良ボイデンチャンバーアッセイを用いて評価し、殺菌はＥ．ｃｏｌｉを用いて評価した。
【０１６３】
正期及び早期産児胎盤はＨＴＲＡ１を発現し、正期（４６５．１±７１．８μｇ／ｍＬ）及び早期産児（３８５．９±７１．３μｇ／ｍＬ）に由来する血漿中ＨＴＲＡ１レベルの方が、成人（５８．６±１１．６μｇ／ｍＬ）に比べて有意に高かった。生物活性を有する胎盤由来のＨＴＲＡ１をＡＡＴと共にインキュベートすると、４ｋＤのＡＡＴ断片が生成された。更にまた、この断片のプレインキュベーション、及びＬＰＳ刺激ＰＭＮによって、ＮＥＴ形成が阻害された。ＨＴＲＡ１−ＡＡＴ由来の開裂断片は、活性酸素種の生成、走化性、または食作用に影響を及ぼさなかったが、この断片をＬＰＳで刺激されたＰＭＮと共にインキュベートすると、スクランブルドＨＴＲＡ１−ＡＡＴ断片と比較してＮＥＴ関連の殺菌率が有意に低下した。
【０１６４】
胎盤内で発現したＨＴＲＡ１は、ＡＡＴとの相互作用によって、ｎＮＩＦと同一のＮＥＴ阻害特性を有するカルボキシ末端開裂断片を生成する。
したがって、胎盤ＨＴＲＡ１は、妊娠中の耐性メカニズムとして胎児循環中にｎＮＩＦを生成する可能性がある。
【０１６５】
本発明の基本原理から逸脱することなしに、上述の実施形態の詳細に対し多くの変更を施すことが可能であることは、当業者に明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ決定すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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