(57)【要約】本明細書に開示される様々な実装形態は、核酸の自動処理および電気泳動試料の調製に関する。自動分子処理装置のための例示的な使い捨てカセットは、ベースハウジングと、ハウジング内に配置された中央チャネルと、中央チャネルに受け取られ、中央チャネルを第１のチャンバと第２のチャンバとに分割するように構成された溶出モジュールとを備えてもよい。溶出モジュールは、近位側、遠位側、および近位側から遠位側へ通じる溶出モジュールチャネルを有するハウジングを備える。また溶出モジュールは、溶出モジュールの近位側に取り付けられた第１の膜と、溶出モジュールの遠位側に取り付けられた第２の膜と、溶出モジュールチャネルに流体連通し、試料を受けるように構成されたポートホールとを備える。
2019534698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自動分子処理装置のための使い捨てカセットであって、
ベースハウジングと、
前記ハウジング内に配置された中央チャネルと、
中央チャネルに収容され、前記中央チャネルを第１のチャンバと第２のチャンバとに分割するように構成された溶出モジュールと
を備え、
前記溶出モジュールは、
近位側、遠位側、および前記近位側から前記遠位側へ通じる溶出モジュールチャネルを有する溶出モジュールハウジングと、
前記中央チャネルを横断し、前記第１のチャンバの端部を形成している前記溶出モジュールの近位側に取り付けられた第１の膜と、
前記チャネルの近位側に平行であり、前記第２のチャンバの端部を形成している前記溶出モジュールの遠位側に取り付けられた第２の膜と、
前記溶出モジュールチャネルに流体連通し、試料を受けるように構成されたポートホールと
を備える、使い捨てカセット。
【請求項２】
前記ベースのスロット内にはめ込むように構成され、少なくとも１つの電極が前記第１のチャンバ内に配置され、少なくとも１つの電極が前記第２のチャンバ内に配置されるようにして電極を収容するように構成された、少なくとも２つの電極ホルダーをさらに備える、請求項１に記載のカセット。
【請求項３】
前記第１の膜が、前記第２の膜より多孔性である、請求項１に記載のカセット。
【請求項４】
前記第２の膜が、核酸分子を保持するように構成されている、請求項１に記載のカセット。
【請求項５】
前記核酸分子が、ＤＮＡを含む、請求項４に記載のカセット。
【請求項６】
前記溶出モジュールが、プラスチックを含み、前記第１の膜および前記第２の膜が、前記溶出モジュールの近位側および遠位側のプラスチックにそれぞれ熱融着されている、請求項１に記載のカセット。
【請求項７】
前記第１および第２の膜が、流体の流れを実質的に遮断するように構成されている、請求項１に記載のカセット。
【請求項８】
前記第１および第２の膜が、電流の印加時に分子を通過させるように構成されている、請求項２に記載のカセット。
【請求項９】
前記第１のチャンバおよび前記第２のチャンバが、バッファー溶液を含有する、請求項１に記載のカセット。
【請求項１０】
前記溶出モジュールが、前記カセットに前記モジュールを固定する留め具を収容するように構成された開口部をさらに備える、請求項１に記載のカセット。
【請求項１１】
前記溶出モジュールが、前記カセットにクランプ取り付けするように構成されている、請求項１に記載のカセット。
【請求項１２】
自動分子処理装置で使用される使い捨てカセットのための溶出モジュールであって、前記カセットは、その中に配置された中央チャネルを備え、前記中央チャネルに対して、前記溶出モジュールは、前記チャネルを第１のチャンバと第２のチャンバとに分割するように置かれており、前記モジュールは、
近位側、遠位側、および前記近位側から前記遠位側へ通じる溶出モジュールチャネルを有するハウジングと、
前記第１のチャンバの端部を形成している前記溶出モジュールの近位側に取り付けられた第１の膜と、
前記チャネルの近位側に平行であり、前記第２のチャンバの端部を形成している前記溶出モジュールの遠位側に取り付けられた第２の膜と、
前記溶出モジュールチャネルに流体連通し、試料を受けるように構成されたポートホールと
を備える、溶出モジュール。
【請求項１３】
前記第１の膜の多孔度が、前記第２の膜の多孔度より大きい、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項１４】
前記第２の膜が、核酸分子を保持するように構成されている、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項１５】
前記核酸分子が、ＤＮＡを含む、請求項１４に記載のモジュール。
【請求項１６】
ハウジングが、プラスチックを含み、前記第１の膜および前記第２の膜が、前記ハウジングのそれぞれの側に熱融着されている、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項１７】
前記第１および第２の膜が、流体の流れを実質的に遮断するように構成されている、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項１８】
前記第１および第２の膜が、電流の印加時に分子を通過させるように構成されている、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項１９】
前記カセットに前記モジュールを固定する留め具を収容するように構成された開口部をさらに備える、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項２０】
前記ハウジングが、前記カセットにクランプ取り付けするように構成されている、請求項１２に記載のモジュール。
【請求項２１】
カセットを調製するための方法であって、
第１の端部と第２の端部とを有する中央チャネルを有するベースと、
中央プラスチック片、前記中央プラスチック片の第１の側に取り付けられた第１の膜、および前記中央プラスチック片の第２の側に取り付けられた第２の膜を有する溶出モジュールと、
ワイヤがそれぞれ接続されている少なくとも第１の電極ホルダーおよび第２の電極ホルダーと、
前記中央チャネルの前記第１の端部と前記第１の膜との間の部分を遮断するように構成されたキャスティングダムと、
前記中央チャネルの少なくとも一部を覆うように構成されたカバーと
を用意することと、
前記第１の端部および前記第２の端部から離間した前記溶出モジュールを前記ベースに取り付けることであって、前記第１の膜は、前記中央チャネルの前記第１の端部に面し、前記第２の膜は、前記中央チャネルの前記第２の端部に面している、取り付けることと、
前記キャスティングダムを、前記キャスティングダムの遠位の端部と前記第１の膜との間に隙間が生じるように、前記中央チャネルの前記第１の端部に当接するように置くことと、
前記隙間をアガロースで充填し、前記アガロースをゲル化することによって前記隙間をキャストすることと、
前記キャスティングダムを取り除いて、前記第１の端部と前記アガロースゲルとの間の前記中央チャネルの一部を露出させることと、
前記中央チャネルの前記第１の端部と前記第１の膜との間に前記第１の電極ホルダーを取り付け、前記中央チャネルの前記第２の端部と前記第２の膜との間に前記第２の電極ホルダーを取り付けることと、
前記チャネルの前記一部を電気泳動バッファーで充填することと、
前記第２の膜と前記中央チャネルの前記第２の端部との間の領域を、電気泳動バッファーで充填することと、
前記カバーを前記ベースに取り付けることと
を含む、方法。
【請求項２２】
標的分子を含む試料を、前記溶出モジュールに挿入することと、
少なくとも前記標的分子を前記第１の膜に向けて移動させる電流を、前記電極ホルダーを介して印加することと、
前記標的分子を、前記第１の膜でまたはその近傍で収集することと
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１０月４日に出願された、「Ａｐｐａｒａｔｕｓｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．」とのタイトルの米国仮出願第６２／４０４，１１２号の仮出願ではなく、その優先権を主張する、前述の出願の全てを、本明細書において、その全体を参照により明示的に組み込む。
【０００２】
本開示の一部の実施形態は、核酸の自動処理のための装置、方法およびシステム、ならびに電気泳動試料の調製を提示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一部の実施形態では、インタクトな細胞で開始するＤＮＡの精製のための試薬、使い捨てカセット、器具、およびプロトコールを含む、システム、方法およびデバイスが提供される。一部の実施形態では、ベースと、中央チャネルと、溶出モジュールとを備える使い捨てカセットが提供される。溶出チャネルは、中央チャネルを、第１のチャンバと第２のチャンバとに分割するように構成される。溶出モジュールは、第１および第２の膜を備えることができる。第１の膜は、溶出モジュールの近位側に取り付けられ、中央チャネルを横断し、それによって第１のチャンバの端部を形成することができる。第２の膜は、溶出モジュールの遠位側に取り付けられ、中央チャネルを横断し、それによって第２のチャンバの端部を形成することができる。溶出モジュールは、近位側と遠位側の間の試料を受けるように構成することができる。
【０００４】
一部の実施形態では、自動分子処理装置のための使い捨てカセットは、ベースハウジングと、ハウジング内に配置された中央チャネルと、中央チャネルに収容され、中央チャネルを第１のチャンバと第２のチャンバとに分割するように構成された溶出モジュールとを備える。溶出モジュールは、近位側、遠位側、および近位側から遠位側へ通じる溶出モジュールチャネルを有する溶出モジュールハウジングを備えることができる。第１の膜は、溶出モジュールの近位側に取り付けることができる。溶出チャネルの近位側は、中央チャネルを横断し、第１のチャンバの端部を形成している。第２の膜は、チャネルの近位側に平行であり、第２のチャンバの端部を形成している溶出モジュールの遠位側に取り付けることができる。溶出モジュールはまた、溶出モジュールチャネルに流体連通し、試料を受けるように構成されたポートホールを備える。
【０００５】
ベースはスロットを有してもよく、カセットは、スロット内にはめ込むように構成された少なくとも２つの電極ホルダーをさらに備えてもよい。電極ホルダーは、少なくとも１つの電極が第１のチャンバ内に配置され、少なくとも１つの電極が第２のチャンバ内に配置されるようにして電極を収容するように構成されてもよい。一部の実施形態では、第１および第２の膜は、電流の印加時に分子を通過させるように構成される。
【０００６】
一部の実施形態では、第１の膜は、第２の膜より多孔性である。第２の膜は、核酸分子を保持するように構成されてもよい。核酸分子は、ＤＮＡを含むことができる。
【０００７】
溶出モジュールは、プラスチックを含んでもよい。第１および第２の膜は、溶出モジュールの近位側および遠位側のプラスチックにそれぞれ熱融着されてもよい。第１および第２の膜は、流体の流れを実質的に遮断するように構成されてもよい。
【０００８】
一部の実装形態では、第１のチャンバおよび第２のチャンバは、バッファー溶液を含有する。
【０００９】
溶出モジュールは、カセットにモジュールを固定する留め具を収容するように構成された開口部をさらに備えてもよい。溶出モジュールは、カセットにクランプ取り付けするように構成されてもよい。
【００１０】
溶出モジュールは、自動分子処理装置で使用される使い捨てカセットのために提供されてもよく、カセットは、その中に配置された中央チャネルを備え、中央チャネルに対して、溶出モジュールは、チャネルを第１のチャンバと第２のチャンバとに分割するように置かれる。モジュールは、近位側、遠位側、および近位側から遠位側へ通じる溶出モジュールチャネルを有するハウジングを備える。モジュールはまた、第１のチャンバの端部を形成している溶出モジュールの近位側に取り付けられた第１の膜と、チャネルの近位側に平行であり、第２のチャンバの端部を形成している溶出モジュールの遠位側に取り付けられた第２の膜とを備える。溶出モジュールはまた、溶出モジュールチャネルに流体連通し、試料を受けるように構成されたポートホールを備える。
【００１１】
第１の膜の多孔度は、第２の膜の多孔度より大きくてもよい。第２の膜は、核酸分子を保持するように構成されてもよい。核酸分子は、ＤＮＡを含むことができる。
【００１２】
ハウジングは、プラスチックを含んでもよく、第１の膜および第２の膜は、ハウジングのそれぞれの側に熱融着されてもよい。第１および第２の膜は、流体の流れを実質的に遮断するように構成されてもよい。第１および第２の膜は、電流の印加時に分子が通過するように構成されてもよい。
【００１３】
溶出モジュールは、カセットにモジュールを固定する留め具を収容するように構成された開口部を有してもよい。ハウジングは、カセットにクランプ取り付けするように構成されてもよい。
【００１４】
カセットを調製するための方法は、第１の端部と第２の端部とを有する中央チャネルを有するベースを用意することを含んでもよい。また中央プラスチック片、中央プラスチック片の第１の側に取り付けられた第１の膜、および中央プラスチック片の第２の側に取り付けられた第２の膜を備える溶出モジュールが用意される。ワイヤがそれぞれ接続されている少なくとも２つの電極ホルダーが用意されてもよい。中央チャネルの第１の端部と第１の膜との間の部分を遮断するように構成されたキャスティングダムも用意され、同様に、中央チャネルの少なくとも一部を覆うように構成されたカバーも用意される。第１の端部および第２の端部から離間した溶出モジュールがベースに取り付けられてもよい。第１の端部は、中央チャネルの第１の端部に面し、第２の膜は、中央チャネルの第２の端部に面している。キャスティングダムは、キャスティングダムの遠位の端部と第１の膜との間に隙間が生じるように、中央チャネルの第１の端部に当接するように置かれてもよい。隙間は、隙間をアガロースで充填し、アガロースをゲル化することによってキャストされてもよい。キャスティングダムを取り除いて、第１の端部とアガロースゲルとの間の中央チャネルの一部を露出させてもよい。第１の電極ホルダーを、中央チャネルの第１の端部と第１の膜との間に取り付けてもよく、第２の電極ホルダーを、中央チャネルの第２の端部と第２の膜との間に取り付けてもよい。チャネルの一部、および第２の膜と中央チャネルの第２の端部との間の領域を、電気泳動バッファーで充填してもよく、カバーをベースに取り付けてもよい。
【００１５】
標的分子を含む試料を、溶出モジュールに挿入してもよい。少なくとも標的分子を第１の膜に向けて移動させる電流を、電極ホルダーを介して印加してもよい。標的分子を、第１の膜でまたはその近傍で収集してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、一部の実施形態によるデバイスの様々な断面図を示す。
【００１７】
【図２】図２Ａ〜Ｆは、一部の実施形態によるデバイスの概要を示す。
【００１８】
【図３】図３Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による溶出モジュールを示す。
【００１９】
【図４】図４Ａ〜Ｂは、一部の実施形態によるベースおよび溶出モジュールを示す。
【００２０】
【図５】図５Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による電極ホルダー、ベースおよび溶出モジュールを示す。
【００２１】
【図６】図６Ａ〜Ｂは、一部の実施形態によるデバイスを示す。
【００２２】
【図７】図７Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による、蓋を備えるデバイスを示す。
【００２３】
【図８】図８Ａ〜Ｄは、一部の実施形態によるデバイスおよび溶出モジュールを示す。
【００２４】
【図９Ａ】図９Ａは、一部の実施形態によるデバイスを示す。
【００２５】
【図９Ｂ】図９Ｂは、一部の実施形態による、アガロースを加えるために使用されるピペットを備えるデバイスを示す。
【００２６】
【図９Ｃ】図９Ｃは、一部の実施形態による、加えられたアガロースを有するデバイスを示す。
【００２７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、一部の実施形態による、加えられた第１のバッファーを有するデバイスを示す。
【００２８】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、一部の実施形態による、加えられた第２のバッファーを有するデバイスを示す。
【００２９】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、一部の実施形態による、バッファーチャンバ内に第１および第２のバッファーと電極とを備えるデバイスを示す。
【００３０】
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、一部の実施形態によるデバイスを示す。
【００３１】
【図１２】図１２は、一部の実施形態による、４つの試料を同時に実行することができるデバイスを示す。
【００３２】
【図１３】図１３は、一部の実施形態による、４つの試料を同時に実行することができるデバイスを示す。
【００３３】
【図１４】図１４は、一部の実施形態による、一次元デバイスを使用した精製ＤＮＡのサイズ分画のための表を示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、一部の実施形態による、一次元デバイスを使用した精製ＤＮＡのサイズ分画のためのレーン試料の一例を示す。
【００３５】
【図１６】図１６は、一部の実施形態による精製ＤＮＡのサイズ分画のための表を示す。
【００３６】
【図１７】図１７は、一部の実施形態による精製ＤＮＡのサイズ分画の一例を示す。
【００３７】
【図１８】図１８は、一部の実施形態による精製ＤＮＡのサイズ分画の一例のデータを示す。
【００３８】
【図１９】図１９は、一部の実施形態による細菌ＤＮＡの単離のための表を示す。
【００３９】
【図２０】図２０は、一部の実施形態による細菌ＤＮＡの単離のための表を示す。
【００４０】
【図２１】図２１は、一部の実施形態による細菌ＤＮＡの単離のための表を示す。
【００４１】
【図２２】図２２Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による細菌ＤＮＡの単離の例を示す。
【００４２】
【図２３】図２３は、一部の実施形態による細菌ＤＮＡの単離の一例を示す。
【００４３】
【図２４】図２４は、一部の実施形態による、白血球からの高分子量ＤＮＡの単離の一例を示す。
【００４４】
【図２５】図２５は、一部の実施形態による、白血球からの高分子量ＤＮＡの単離の一例を示す。
【００４５】
【図２６】図２６Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による、白血球からの高分子量ＤＮＡの単離の一例を示す。
【００４６】
【図２７】図２７は、一部の実施形態による、白血球からの高分子量ＤＮＡの単離の一例を示す。
【００４７】
【図２８】図２８は、一部の実施形態によるデバイスの断面図を示す。
【００４８】
【図２９】図２９は、一部の実施形態による、図１７の精製ＤＮＡのサイズ分画の例の別の図を示す。
【００４９】
【図３０】図３０Ａ〜Ｅは、一部の実施形態によるＨＭＷ  ＤＮＡ抽出ワークフローの上面概略図を示す。
【００５０】
【図３１−１】図３１Ａ〜Ｋは、一部の実施形態によるワークフローの上面概略図を示す。
【図３１−２】図３１Ａ〜Ｋは、一部の実施形態によるワークフローの上面概略図を示す。
【図３１−３】図３１Ａ〜Ｋは、一部の実施形態によるワークフローの上面概略図を示す。
【００５１】
【図３２】図３２Ａ〜Ｄは、一部の実施形態によるサイズ選択ワークフローの上面概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本明細書に記載の装置、システム、および方法は、インタクトな細胞で開始するＤＮＡの精製のための試薬、使い捨てカセット、器具、およびプロトコールを含む。これらの装置、システムおよび方法は、哺乳動物白血球またはリゾチーム処理Ｅ  ｃｏｌｉ細胞のいずれかからの高分子量ゲノムＤＮＡの精製ならびに精製ＤＮＡで開始するＤＮＡのサイズ分画を実証する。
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される装置、システム、および方法は、単純で低コストの使い捨て品（「カセット」）、大量または少量の試料を取扱うことができる能力、１つもしくは少数の試料を用いる手動システムまたは多数の試料に適した自動システムのいずれかとして使用するための適性を含む。
【００５４】
複数の逐次的な酵素反応が行われてもよい。そのような反応の間に、ＤＮＡは、アガロースマトリックス内に埋め込まれたままである。これにより、酵素、補因子またはバッファーなどの試薬を追加および除去するために、液体取扱い（ピペット）または電気泳動のいずれかを使用することが可能になりうる。さらに、ＤＮＡは、アガロースマトリックス内に埋め込まれたままであってよいので、ＳＰＲＩビーズなどの粒子を使用する中間精製ステップまたはエタノール沈殿などの他のプロセスが必要でなく、したがってそのようなプロトコールを用いる場合の複雑さ、コスト、および試料の損失を回避しうる。
【００５５】
図１Ａは、溶出モジュール２をはめ込んだベース１を示す。溶出モジュール２は、中央チャネルを、２つの区画３、４に分割する。２つの膜が、試料区画８の境界を形成している。図１Ｂでは、アガロースのブロック５が溶出モジュール２の隣にキャストされ、バッファーが、チャンバ３、４を充填するために加えられる。バッファーレベルが棚７未満である場合には、チャンバ３、４間にバルク流はないが、バッファーが棚７より高い場合には、液体がバッファーチャンバ３、４間を流れ得る。それにもかかわらず、膜はイオンおよび電流に対して透過性であるので、電気泳動のための連続的な流路がある。図１Ｃは、図１Ａ〜Ｂに示す構成に加えられた白金ワイヤを備える電極ホルダー６を示す。白金ワイヤは、電源に接続されている。試料は、ポートホール９を介して試料区画８に加えられる。
【００５６】
図２Ａ〜Ｆに示されるように、カセットは、溶出モジュール、ベース、および電極ホルダーからなってもよい。図２Ａは、膜１Ａ、１Ｃおよびアクリル溶出モジュール１Ｂを示す溶出モジュールの分解図を示す。組み立てられた溶出モジュールを図２Ｂに示しており、膜（１Ａ、１Ｃ）は、熱融着によってアクリル溶出モジュール（１Ｃ）に封止されている。例示的なベースを図２Ｃに示しており、一方、図２Ｄは、（図２Ｂの）溶出モジュールが中に挿入されたベースを示す。一部の実施形態では、溶出モジュールは、図２Ｄに示されるように、２つのねじによって押さえることができる。図２Ｅは、電極ホルダー６を示す。図２Ｅの電極ホルダーは、図２Ｆに示されるように、ベースに挿入されてもよい。示されるように、いくつかの電極ホルダー６が、ベースに挿入されてもよい。例示的な実施形態では、１つまたは複数の電極ホルダーが溶出モジュールの第１の側に置かれてもよく、１つまたは複数の電極ホルダーが溶出モジュールの第２の側に置かれてもよい。キャスティングダムは、カセットにアガロースゲルをキャスティングできるように用意されてもよい（図９）。
【００５７】
溶出モジュールは、図３に示されるように、中央プラスチック片に熱融着されている（および／または他の方法で取り付けられている）２つの長方形の膜の片からなってもよい。第１の膜１は、ＤＮＡおよびタンパク質を通過させることができる（例えばＤｕｒａｐｏｒ）。中央片は、溶出モジュール本体２を含んでもよい。溶出モジュール本体は、機械加工アクリルであってもよい。本体２は、Ｍ２またはＭ３ねじなどのねじを通すように構成された少なくとも１つの穴３を有してもよい。ねじは、溶出モジュールが本体（例えば、図２Ｃ）にねじ留めされるとき溶出モジュールを所定の位置に保持するために使用することができる。また本体は、ポートホール４および中央チャネル５を有してもよい。第２の膜６は、ＤＮＡ分子を保持するように構成されたもの、例えば、１０ｋｄカットオフＰＥＳを有する膜であってもよい。膜１、６は、組み立てられたとき、図３Ｂに示されるようにチャネル５を囲み、膜によって両側の境界を形成された空間を形成する。この場合を、図４Ｂ（６）に、断面図で示す。
【００５８】
上述のように、溶出モジュールに結合された２つの膜は異なる特性を有してもよい。１つの膜は、目的の分子を保持するように選択される。例えば、第１の膜は、質量で１０，０００ダルトンより大きい分子を保持する定格のＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）膜であってもよく、他方の膜は、ＤＮＡ分子が膜を通過することができるように選択されてもよく、例えば、公称０．５ミクロンサイズの孔を有する定格の膜であってもよい。
【００５９】
膜の公称または定格特性は、様々でありうる。電界が溶出モジュールを通過できるように、両方の膜は、水およびイオンに対して透過性であってもよい。下記に説明されるように、１つの膜は、目的の分子を保持することができ、一方で、他方の膜は相対的に浸透性であってもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、多孔性膜は、０．４５ミクロン孔を持つＤｕｒａｐｏｒ  ＰＶＤＦ  ＨＶＰＰ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬ  ６０６７３）、または５．０ミクロン孔を持つＤｕｒａｐｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｔＳＶＰＰ型、カタログ番号：ＳＶＬＰ０９０５０）であってもよい。非多孔性膜は、Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ、カタログＳＦ１Ｊ００７Ａ１であってもよい。再生セルロース膜を含む、他の膜を使用してもよい。一部のそのような膜は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMillipore: Ultrafiltration Membranes: Ultrafiltration membranes forMacromolecule Processing Product Selection Guide、２００８年４月、Millipore Corporationに記載されている。
【００６１】
図３Ａ〜Ｂに示されるように、溶出モジュールは、液体を膜に境界を形成された空間に加えまたはそこから取り出すことを可能にするポートホール４を備える；またモジュールは、（図２Ｄ、２Ｆ、７に示されるように）、ねじでモジュールをベースに取り付けることを可能にする穴３を備える。
【００６２】
電極ホルダーは白金ワイヤがはめ込まれ、ベース内のスロットに挿入される（図２Ｆ、６）。
【００６３】
図４Ａに示されるように、ベース１は、中央チャネル４、溶出モジュールを保持するための楕円形スロット５、および電極ホルダーを保持するためのスロット２を有する。また、ベースは、蓋のためのカットアウト３を有してもよい。
【００６４】
図４Ｂは、ベース１に挿入された溶出モジュール６を示す。ベースにおける中央チャネルは、溶出モジュール６によって２つのバッファーチャンバ４ａおよび４ｂに分割される。溶出モジュール６には、膜によって境界を形成された試料区画７がある。液体を加えると、バッファーチャンバ４ａおよび４ｂならびに試料区画７は、線形液体経路を形成する。膜は、バルク流体の流れを実質的に遮断するが、電流が印加されるとき、イオンおよび他の分子を通過させる。
【００６５】
図５Ａは、一部の実施形態による電極ホルダー１を示す。電極ホルダー１は、電極ワイヤを保持するためのタブ３を備えて構成されてもよく、タブはまた、電極ワイヤを受けるための少なくとも１つの穴２を有してもよい。図５Ｂは、タブに巻き付いたワイヤ５と、貫通穴２を備えるタブを示す。一部の実施形態では、電極ワイヤは、白金である。電極ホルダー１は、図５Ｃに示されるように、ベース８におけるスロット７の１つにはめ込まれるように構成されたタブ４（図５Ａ、Ｂ）を備えるように構成されてもよい。
【００６６】
図６Ａは、電極ホルダー２と、中に挿入された溶出モジュール３とを備えるベース１を示す。図６Ｂは、溶出モジュール３に固定された膜６を示し、溶出モジュール３は、ねじ４を使用して所定の位置に保持される。示されるように、溶出モジュール３は、ポートホール５を有する。
【００６７】
図７Ａは、図７Ｂに示されるベース２にはめ込むように構成された蓋１（本明細書で「カバー」とも称される）を示す。一部の実施形態では、蓋は、ベースの実質的に全てを覆ってもよい。示されている実施形態では、カバー１は、ベース１の挿入部にはめ込むように構成されている。ベース１００は、溶出モジュールの周囲をはめ込むように構成された開口部、および電極ホルダータブ３を収容するように構成された開口部を有してもよい（図５Ａ）。図７Ｃは、溶出モジュール、カバー、および電極ホルダーを備えて構成されたベースを示す。
【００６８】
図８Ａ〜Ｄは、溶出モジュールの分解図（図８Ａ）、溶出モジュール（図８Ｂ）、ベース（図８Ｃ）およびベース内に構成された溶出モジュール（図８Ｄ）の一実施形態を示す。
【００６９】
図９Ａは、アガロースのキャスティングのための用意ができたデバイスを示す。溶出モジュール１は、ベース２に挿入され、キャスティングダム３がはめ込まれている。一部の実施形態では、キャスティングダム３は、キャスティングダム３と溶出モジュール１との間に約１ｃｍの隙間４を作る大きさにすることができる。図９Ｂに示されるように、パスツールピペット５を使用して、キャスティングダム３と溶出モジュール１との間の空間４にアガロースを加えることができる。図９Ｃは、キャスティングダム３が取り除かれ、アガロース６のブロックは、隙間４に留まっていることを示す。任意の余分なアガロース７は、使用前にトリミングすることができる。
【００７０】
一部の実施形態では、溶出膜をベース内（図１Ａ）に挿入してもよく、キャスティングダム３（図９）を加え、次いで溶融アガロース溶液を加えることによって、アガロースのブロックをキャストしてもよい（図９Ｂおよび実施例１）；アガロースゲルは、隣接する膜と連続するハイドロゲルを形成する。上述のように、２つの膜は異なってもよい。例えば、１つの膜は比較的多孔性（公称０．５ミクロン孔）であり、１つの膜はＤＮＡ分子を保持する（１０，０００ダルトン公称定格）。アガロースのブロックは、多孔性膜の隣にキャストされてもよい。
【００７１】
バッファーチャンバ３、４（図１Ｃ）は、電気泳動バッファーで充填してもよく、試料は、ポートホール９を通じて溶出モジュールに加えられてもよい。図１０Ａは、アガロースがゲル化した後に加えられるバッファーを示す。バッファーは、アガロースの隣のバッファーチャンバに加えられてもよい。バッファーは、図１０Ｂに示されるように、他方のバッファーチャンバに加えられてもよい。図１０Ｃに示されるように、電極ホルダー（導電体として白金ワイヤを備える）を加えてもよく、ワイヤは電源に取り付けられる。
【００７２】
これは、図１１Ａ〜Ｃにも示されている。図１１Ａでは、ベース１に溶出モジュール２がはめ込まれる。溶出モジュールは、溶出モジュール２の各膜が各区画３、４の端部を形成するように、中央チャネルを２つの区画３、４に分割する。アガロースのブロック５は、図１１Ｂに示されるように、溶出モジュールの隣にキャストされる。図１１Ｃに示されるように、電極ホルダー６を加えてもよい。一部の実施形態では、１つの電極ホルダーが溶出モジュール３の各側に構成され、各電極ホルダーのタブがそれぞれのチャンバ３、４に挿入される。他の実施形態では、複数の電極ホルダーが、片側または両側に構成される。液体は、液体レベルが棚７の高さを上回る場合のみ、バッファーチャンバ３、４間を流れることができる。
【００７３】
電流が、例えば、チャンバ３の陽極で印加されるとき、細胞またはＤＮＡなどの負に荷電された粒子が、試料区画のアガロース／膜側に向かって移動する。アガロースゲルの孔は細胞より小さいので、細胞はアガロース被覆膜の表面の近傍または表面で絡まる。次いで、ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）を、ポートホール（図１Ｃ、９）を介して溶出モジュールに加え、電気泳動を継続する。
【００７４】
ＳＤＳは、陽極に向かって移動するとき、アガロース膜表面で、絡まった細胞に遭遇する。ＳＤＳは、細胞を溶解し、タンパク質はＳＤＳで被覆され、そして細胞デブリおよびＳＤＳ被覆タンパク質は、アガロースゲルを通って、バッファーチャンバ３へと移動する。
【００７５】
しかし、インタクトな染色体は、哺乳動物であっても細菌であっても、ゲルに適切に移動しない場合がある。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Pulsed-Field Gel Electrophoresis」、MBurmeisterおよびL Ulanovsky編、HuumanPress、Totowa New Jersey、１９９２年の第７章「preparation, manipulation, and pulse strategy for one-dimensionalPulsed-field gel Electrophoresis (OFPFGE)」で説明されているように、インタクトな哺乳動物または細菌の染色体は、ＤＣ電場でアガロースゲル内に適切に移動しない；最大６メガベース対のＤＮＡ分子は、特別な条件下の場合のみ、移動する。
【００７６】
したがって、インタクトな染色体は、アガロース／膜表面で絡まったままである。染色体ＤＮＡは、アガロース／膜表面の近傍または表面にあるので、試料区画に加えられた酵素に接近可能である。そのような酵素は、アガロース層内に短い距離で拡散することができ、絡まったＤＮＡ分子に作用することができる。アガロースゲル中のタンパク質の拡散は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるPluen、Alainら、「Diffusionof Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and GlobularConfigurations」、Biophysical Journal、第７７巻、１９９９年７月、５４２〜５５２頁で考察されている（１００，０００ダルトンまでのタンパク質が、アガロースゲルに拡散することを示す図２参照）。したがって、ＤＮＡにおいて二本鎖切断をなす酵素の添加は、動かない絡まった染色体を、可動性の絡まった短い断片に変換させる；つまり、断片がおよそ２メガベース対未満であれば、断片はアガロースゲル電気泳動の間にいくらかの可動性を示す。
【００７７】
したがって、細胞、次いでＳＤＳ、次いで酵素を加えた後、切断されたＤＮＡを、バッファーチャンバ４内の陽極を用いた電気泳動により、溶出モジュール内で回収することができる（図１Ａ）。ＤＮＡ分子は、ゲルから出て試料区画内に移動し、非アガロース被覆膜に向かって移動する。上述したように、この膜は、ＤＮＡ分子が試料区画内に保持され、膜を通過しないように選択される。
溶出モジュールの例
【００７８】
図３Ａ〜Ｂに示されるように、溶出モジュールは、中央チャネル５、穴３、およびポートホール４を備えたプラスチック本体（２）を有してもよい。膜１および６は、組み立てられた溶出モジュール７を製造するために、プラスチック本体に熱固定されてもよい。ベースに挿入された溶出モジュールの断面を図４Ｂに示す；試料区画７は、膜によって両側の境界を形成され、ポートホールを介して接近可能であるものであってもよい。
【００７９】
溶出モジュールは、ベースに固定されてもよく、これは、例えば、接着、超音波溶接、圧入などによって行うことができる。以下の具体的な例では、溶出モジュールは、２つの異なる方法でベースに固定した。
【００８０】
第１の方法では、ねじを使用した。図６Ａ〜Ｂに示されるように、穴（図３、３）により、２つの非導電性ねじ４（ナイロンＭ２）は、溶出モジュールを通って、ベースのねじ付き穴内に入ることができる。代替的に、穴のない溶出モジュールを、クランプでベースに固定してもよい。この場合を図２６に示す。
【００８１】
上述したように、膜１、６（図３）は異なっていてもよい。１つの膜は、ＤＮＡおよびタンパク質分子が比較的障害なく膜を移行できるように選択してもよい。一部の実施形態では、０．４５ミクロン孔を持つＤｕｒａｐｏｒ  ＰＶＤＦ  ＨＶＰＰ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬ  ６０６７３）が使用され得る；他の実施形態では、５．０ミクロン孔を持つＤｕｒａｐｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＶＰＰ型、カタログ番号：ＳＶＬＰ０９０５０）を使用され得る。第２の膜は、目的の分子を保持するがそれに結合しないように選択してもよい。一部の実施形態では、Ｂｉｏｍａｘ  ＰＥＳ、カタログＳＦ１Ｊ００７Ａ１０が使用され得る。膜は、サイズ選択ＰＥＳ表面が、内側で、試料区画に面するように貼り合わされる。
【００８２】
一部の実施形態では、バッファーを加えるときに気泡が捕捉されないように、ＰＥＳ膜は、使用前に、親水性にされる。例えば、グリセロールエタノール溶液（グリセロールとエタノールが同じ重量部）の滴を、ＰＥＳ膜の外表面に添加してもよく、溶出モジュールを少なくとも数時間室温で放置させる。
【００８３】
以下の実施例は、上述の実施形態の少なくとも一部に対応し、またステップ／プロセスは、さらなる実施形態に対応する。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
カセット組み立ておよびアガロースのキャスト
【００８５】
ＤｕｒａｐｏｒおよびＰＥＳ膜を備えた溶出モジュールを、最初に、ＰＥＳをグリセロール／エタノール溶液で処理することにより調製した。数時間後、溶出モジュールを、ピペットを使用して、バッファー（０．５Ｘ  ＫＢＢ、ｓａｇｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ；５１ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基；２４ｍＭ  Ｔａｐｓ；０．０８ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．５Ｘ  ＫＢＢ）で充填し、ポートホールを通じて中央区画に液体を加えた。
【００８６】
膜が溶出モジュールにしっかりと結合していることを実証するために、ポートホールの上部で液体を押圧することによって、僅かな圧力をかけた。
【００８７】
バッファーを、ピペッターを使用して吸引し、溶出モジュールを、ペーパータオルでのプラスチックおよびＤｕｒａｐｏｒの吸い取りにより注意深く乾燥させる；ＰＥＳ表面には触れなかった。
【００８８】
Ｄｕｒａｐｏｒが乾燥している場合は、溶融アガロース溶液が添加されるとき、アガロースが毛細管作用によってＤｕｒａｐｏｒ内に取り込まれ、それによってアガロースと膜との間に耐久性のあるタイトなシールが形成されると考えられる。
【００８９】
図９Ａは、溶出モジュール１およびキャスティングダム３を備えたベース２を示す。キャスティングダムは、ダムと溶出モジュールとの間の隙間４が１０ｍｍとなるような大きさにする。
【００９０】
図９Ｂは、使い捨てパスツールピペット５で加えられる溶融アガロース溶液（０．５Ｘ  ＫＢＢバッファー（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中の０．７５％ｗｔ／ｖ  ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロース（Ｌｏｎｚａ）；アガロースは加熱により溶解され、溶液は、摂氏６５度で、使用前に数日間まで保管される）を示す。
【００９１】
アガロースを、棚３のレベルになるように加える（図４Ａ〜Ｂ、さらに図１Ａ〜Ｃ、７、図１１Ａ〜Ｃ、７を参照）。
【００９２】
アガロースが冷却してゲルを形成した後、キャスティングダムを取り除き（図９Ｃ）、キャスティングダムとベースとの間の狭い空間に埋まった余分なアガロース７を使い捨てメスで取り除く。
【００９３】
この実施例では、溶出モジュールを、単にベース内に押圧した；同一の手順を、モジュールが２本のねじでベースに固定されることを除く、ねじ穴を有するモジュールに使用する。
（実施例２）一次元デバイスを使用した精製ＤＮＡのサイズ分画
【００９４】
この実施例では、精製ＤＮＡを単純で迅速なハイスループット線形デバイスを使用してサイズ分画できることを実証する。
カセットの調製
【００９５】
溶出モジュールを、Ｍ２ねじでベースを固定したことを除いて、実施例１に記載されるように調製した。
【００９６】
膜は、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ  ＨＶＰＰ  ０．４５μｍ  Ｒｏｌｌ  Ｓｔｏｃｋ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬ）およびＰＥＳ  Ｂｉｏｍａｘ  １０ｋＤ  ２７インチＳＦ１Ｊ００７Ａ１０）である。アガロースを、実施例１に記載されるようにキャストし、アガロースがゲル化後、キャスティングダムを取り除き、０．５Ｘ  ＫＢＢバッファーをバッファーチャンバ（図４Ｂ、４ａ  ４ｂ）に加え、バッファーを溶出モジュールの試料区画に加えた。
【００９７】
電極を加え、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ電源（Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続した。
【００９８】
デバイスを、５０Ｖ  ＤＣでＤｕｒａｐｏｒ側の陽極で数分間実行させて、デバイスを調整した。電流（ＢＫ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｕｌｔｉｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２４０５Ａで測定）は、４．５ｍＡであった。
試料の調製
【００９９】
２０マイクロリットルのラムダＤＮＡ（カタログ番号Ｎ３０１３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、５００マイクログラム／ｍＬ）と、２０マイクロリットルの２ログラダー（カタログ番号Ｎ３２００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、１，０００マイクログラム／ｍＬ）と、４１０マイクロリットルのＴＥバッファー（ＴＥバッファーは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む）とを混合する。ＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔ  ＨＳアッセイ（カタログ番号：Ｑ３２８５１  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で決定した；結果は、５２ナノグラム／マイクロリットルであり、ベンダーの仕様に基づいて予測される値の７８％である。
試料ローディングおよびＤＮＡ分画
【０１００】
溶出モジュール試料区画を、ピペットを使用して空にし、４３０マイクロリットルの試料、２マイクロリットルのキシレンシアノール色素溶液（１０ミリグラム／ｍＬ）および１００マイクロリットルのＴＥを試料区画に加え、溶液を穏やかに混合した。
【０１０１】
電気泳動を、５０Ｖ  ＤＣで、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ電源を使用して、アガロース被覆Ｄｕｒａｐｏｒの隣のバッファーチャンバ内の陽極を用いて、４０分間行った。
【０１０２】
１５分間で、キシレンシアノール色素がＤｕｒａｐｏｒの隣のアガロースゲル内に広域バンドを形成していることが観察される：バンドは４０分間でゲルの端部に移動する。電流は、実行の間に４．５ｍＡから２．５ｍＡへと低下する。
【０１０３】
溶出モジュールのバッファーを回収した（画分１）；溶出モジュールを０．５ｘ  ＫＢＢでリンスした（画分２）；溶出モジュールを０．５Ｘ  ＫＢＢで充填し、ポートホールをゴム栓で封止した。
【０１０４】
バッファーチャンバを０．５Ｘ  ＫＢＢで２回リンスし、次いで新鮮なバッファーで再充填した。
【０１０５】
依然としてアガロースゲルにあるＤＮＡは、電気泳動によって回収した：ＰＥＳ側を陽極で５０Ｖ  ＤＣを１０分間、次いで４ミリ秒フォワード／４ミリ秒リバースのパルスプログラムを使用して１分間（Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅソフトウェアにおいて、波形パラメータの値は４／４／０／０／０／０／１０００であった）、次いで、ＤＮＡを膜から引き離すために、ＰＥＳ側を陰極で２５Ｖ  ＤＣを８秒間。
【０１０６】
溶出モジュール中のＤＮＡを画分３として回収した。
【０１０７】
溶出ステップをさらに４回繰り返し、材料を画分４〜７として回収した。
【０１０８】
異なる画分中のＤＮＡの濃度をＱｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを使用して決定した−図１４参照。
【０１０９】
ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動（０．７５％  ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄ（Ｌｏｎｚａ）、０．５Ｘ  ＫＢＢバッファー（Ｓａｇｅ）、Ｓａｇｅ  Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ電源１００Ｖ  ＤＣを１２０分間使用）によって調べた；ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ透視法で撮影した。サイズ分画されたＤＮＡのアガロースゲルを図１５に示す。
結果
【０１１０】
アガロースゲル電気泳動によって示されるように、出発材料は、０．１〜４８．５ＫＢｐのサイズの範囲の断片からなる。サイズ分画が生じる場合、より小さい断片の損失があるはずである。見られるように、２Ｋｂｐ未満の断片は溶出ＤＮＡで回収されず、したがって２〜３Ｋｂｐの間のカットオフを有するサイズ分画が実証される。Ｑｕｂｉｔアッセイにより、３９％のインプット試料を回収した。
（実施例３）精製ＤＮＡのサイズ分画
【０１１１】
カセットを、実施例２に記載されるように調製した。
【０１１２】
全体積４５０μＬの試料は、７，０００ナノグラムのＥ  ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１８，０００ナノグラムの２ログラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、０．１〜１０ｋｂｐのサイズの一連の分離したバンド）を含有した；ＤＮＡを、ＴＥバッファーに希釈する（１０ミリモルのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１ミリモルのＥＤＴＡ）。
【０１１３】
試料を溶出モジュールにロードし、１００マイクロリットルのＴＥバッファーを加え、混合後、１５マイクロリットルを取り、画分０（インプット）として保存した。
【０１１４】
ＤＮＡを、電気泳動により、ｐｉｐｐｉｎ  ｐｕｌｓｅコントローラを使用して、ＥＭのＤｕｒａｐｏｒ側を陽極で、以下のスケジュールを使用して、サイズ分画した：
【０１１５】
１０分、ＤＣ、５０Ｖ
【０１１６】
１１０分、パルスフィールド、４０Ｖ。パルスフィールドは、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅソフトウェアに入力された次の値によって定義した：１５０、５０、３０、１０、３、１、８１。
【０１１７】
電気泳動のＤＣ部分の間、溶出モジュール内の体積は減少し、７分で、２４０マイクロリットルの０．５Ｘ  ＫＢＢを加えた。
【０１１８】
サイズ分画ステップの終了時に、溶出モジュールの内容物を回収し、サイズステップの後、画分１として保存した。
【０１１９】
次いで、ＤＮＡを、アガロースゲルから溶出モジュールへ溶出した。
【０１２０】
以下の電気泳動スケジュールを、ＰＥＳ側を陽極で使用した。
【表１】
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溶出モジュール中の材料を回収し、画分３、第１の溶出液として保存した。
溶出プロセスをさらに３回繰り返した。
結果
【０１２１】
Ｑｕｂｉｔアッセイ−図１６。
【０１２２】
ゲル電気泳動−図１７（文字なしの画像を図２９に示す）、図１８。
【０１２３】
このことは、所望の高分子量Ｅ  ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（約３０Ｋｂｐの質量中心）を、所望しない低分子量ＤＮＡ（２ログラダー）と混合し、次いで、サイズ分画したとき、約１２ｋｂｐより小さい断片が除去されたことを示す。
【０１２４】
これは、サイズ分画カットオフが、使用した電気泳動の条件に依存していることを実証する。
（実施例４）細菌ＤＮＡの単離
デバイスの調製
【０１２５】
２つのカセットを、Ｄｕｒａｐｏｒ膜の隣のアガロースゲルカラムが０．５ｃｍ長であることを除いて、実施例１に記載のように調製した。
【０１２６】
細菌増殖およびスフェロプラスト形成のための条件
【０１２７】
ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ  ７００９２６）を、１％グルコース、１ミリモルのチアミン、０．２ミリモルの硫酸マグネシウム、０．１ミリモルの塩化カルシウム、０．１％５−フルオロオロト酸、および２０μｇ／ｍＬのウラシルを含むＭ９最小プレートで増殖させる。
【０１２８】
一晩培養物は、単一コロニーを５〜４０ｍＬのトリプチカーゼ大豆ブロスに接種し、そして細胞を振盪させながら摂氏３７度で一晩増殖させることによって作製される。
【０１２９】
スフェロプラストを、Ｅ  ｃｏｌｉ細胞をリゾチームとインキュベートすることによって調製する。
【０１３０】
リゾチーム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅ（商標）リゾチーム溶液、カタログ番号Ｒ１８０４Ｍ、３７，５００単位／μＬ）を、２．５マイクロリットルのリゾチームを、１００マイクロリットルのＴＥＳ２０＋ＢＳＡバッファーと混合することによって、１：４０希釈した。ＴＥＳ２０は、１０ミリモルのＴｒｉｓ７．５；１ミリモルのＥＤＴＡ；１００ミリモルのＮａＣｌ；２０％ｗ／ｖのスクロースである。ＴＥＳ２０＋ＢＳＡは、１ｍＬのＴＥＳ２０プラス５マイクロリットルのＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ、２０ミリグラム／ｍＬ）である。
【０１３１】
溶解に必要とされるリゾチームの量を以下のように決定した。一連のチューブを以下のように調製した：１．７ｍＬの微量遠心チューブに、８００マイクロリットルのＡＣＰＳ２０バッファー（１０ミリモルのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５；５ミリモルのＥＤＴＡ；２０％ｗｔ／ｖスクロース）を加え、次いで５００マイクロリットルのＥ  ｃｏｌｉの一晩培養物を加えた。チューブを混合し（ボルテックスミキサー）、細胞を遠心分離（１４，０００×ｇで１分間）によってペレット化した。上清をデカントし、細胞ペレットをボルテックスすることによって、１００マイクロリットルのＡＣＰＳ２０に再懸濁した。図１９に示されるように、異なる量のリゾチームを加え、アリコートを取って水に１：１０希釈することによって溶解を確認した；溶解した細胞は透明な溶液を形成するが、未溶解の細胞は希釈に際して濁った溶液を形成した。
【０１３２】
リゾチームおよびアクロモペプチダーゼの混合物中の細胞の溶解（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，９００，６７７号につき）。１ｍＬあたり１ミリグラムのＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）の水溶液、１００マイクロリットルを、アクロモペプチダーゼ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ａ３４２２、２５，０００単位、１ミリグラム）の１つのバイアルに加えた。
【０１３３】
アリコートを作製し、摂氏−２０度で保管した。
【０１３４】
一連のチューブを上述のように調製し、図２０に示されるように、リゾチーム（lysozme）およびアクロモペプチダーゼを加えた。溶解は、水に希釈することにより、上記のように確認される。
【０１３５】
結果は、それ自体（チューブ１２）では、アクロモペプチダーゼは細胞を溶解しないが、ＡＣＰはリゾチームと相乗的であり、例えば、図２０のチューブ７〜９は、図１９のチューブ１〜３より高度に溶解されることを示す。
スフェロプラストの調製およびＤＮＡの単離
【０１３６】
細胞の２本のチューブを上述のように調製した。チューブ１には、１．５マイクロリットルの希釈したリゾチームを加え、チューブ２には、１．５マイクロリットルのリゾチームと１マイクロリットルのＡＣＰを加えた。チューブをボルテックスし、４０分間室温で放置した。
試料
【０１３７】
溶出モジュールに、１００マイクロリットルのスフェロプラストと３００マイクロリットルのＡＣＰＳ２０バッファーとの混合物をローディングした。溶出モジュールを充填した後、１０マイクロリットルを引き抜き、１９０マイクロリットルのＱＬＢ（Ｑｕｂｉｔ溶解バッファー、０．５×  ＫＢＢ、１重量／体積％ＳＤＳ、５ミリモルのＥＤＴＡ、５０ミリモルのＮａＣｌ）中に希釈した；チューブを室温で放置した。
【０１３８】
追跡用色素として、１０ミリグラム／ｍｌのフェノールレッド１マイクロリットルを、各溶出モジュールに加え、内容物を穏やかにピペットで混合した。
【０１３９】
スフェロプラストは、電気泳動（４０Ｖ  ＤＣ、２０分間、Ｄｕｒａｐｏｒ側を陽極）で、アガロース被覆膜に絡まった。この期間の間に、フェノールレッドは、溶出モジュールから出て、広域バンドとしてアガロースに移動した。
【０１４０】
溶出モジュールに、１００マイクロリットルの１０％ＳＤＳを加え、溶液を混合し、上記のように電気泳動を４０分間継続した。
【０１４１】
数分後、溶出モジュール内の液体の体積が増加したことが観察された。溶出モジュールの上部のポートホールを、ゴム栓で封止した。
【０１４２】
ＳＤＳの添加後の体積の増加は、電気浸透によるものであり、液体の正味の変化は、電気浸透の正味のバランスを反映していると考えられる。電気浸透は、固定電荷によるものである。最初のステップの間、電荷の大半は、ＰＥＳ膜上の負電荷である。結果として、水の正味の流れは、ＰＥＳ膜を通り、溶出モジュールを外れる。
【０１４３】
ＳＤＳを加えた後、ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで被覆する正のタンパク質が除去される。長いＤＮＡ分子は、動かず、高い正味の負電荷を有することから、チャンバ内に液体を移動させる電気浸透ポンプとして機能する。
【０１４４】
電気泳動ステップの終了時に、バッファーチャンバを０．５Ｘ  ＫＢＢを除去し、再充填することによって洗浄した。ゴム栓を溶出モジュールから取り外し、内容物を吸引し、画分１として保存した。
【０１４５】
溶出モジュールを０．５ｘ  ＫＢＢで２回リンスし（画分２）、次いで５００マイクロリットルの酵素反応バッファーでリンスした（画分３）。酵素反応バッファー（ＥＲＢ）は、０．５ｘ  ＫＢＢ；３２ミリグラム／ｍＬヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン［ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、９７％、カタログ＃２９７５６０２５０、ＣＡＳ  １２８４４６−３５−５］；１０ミリモルのＭｇ（Ｃｌ）２；５０マイクログラム／ｍＬ  ＢＳＡ）である。
【０１４６】
次いで、溶出モジュールを、５００マイクロリットルのＥＲＢで充填し、これに５マイクロリットルの２０ミリグラム／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  Ｍ））、１．５マイクロリットルのｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）；および１マイクロリットルのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）を加えた。室温で３０分後、１５マイクロリットルの５００ミリモルのＥＤＴＡを溶出モジュールに加え、内容物を混合し、溶液を取り出した（画分４）。溶出モジュールを０．５Ｘ  ＫＢＢでリンスし（画分５）、同じバッファーで再充填した。消化したＤＮＡを、電気泳動（５０Ｖ  ＤＣ、２分、ＰＥＳ側が陽極；４ミリ秒のフォワード／４ミリ秒のリバースのパルス列で３０秒）によって回収した。溶出モジュールの内容物を取り出し、画分６／溶出１として保存した。
【０１４７】
溶出プロセスをさらに２回繰り返し、画分７／溶出２および画分８／溶出３を生成した。
画分のＱｕｂｉｔ分析
【０１４８】
各画分中のＤＮＡの濃度を、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを使用して測定した。
【０１４９】
画分０、インプットのＱｕｂｉｔ  ＨＳアッセイから、溶出モジュールに加えられたスフェロプラストのＤＮＡの全量は４０マイクログラムであった。
【０１５０】
図２１に示されるように、リゾチームで処理した細胞から溶出画分に回収されたＤＮＡの量は、５，４９２ナノグラム、インプットの１１％であった。
【０１５１】
他の画分で回収されたＤＮＡの量は７％であった。画分４および５に回収されたＤＮＡは非常に少なかった（１％）；このことは、ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅで消化した後、ＤＮＡが依然としてアガロースに絡まっており、試料区画に拡散されるように遊離していないことを示す。
【０１５２】
同様の結果が、リゾチームおよびアクロモペプチダーゼの両方で処理した細胞で得られた（図２１）。
アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡの分析
【０１５３】
図２２Ａ：アガロースゲル電気泳動によるＥ  ｃｏｌｉＤＮＡの分析。
【０１５４】
０．７５％  ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロース（Ｌｏｎｚａ）；０．５Ｘ  ＫＢＢ（Ｓａｇｅ）；Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ（Ｓａｇｅ）を、以下の波形パラメータで使用した：１５０；５０；３０；１０；３；１；４８。
【０１５５】
ゲルを、８０ボルトで８時間、実行させた。
【表２】
2019534698.tif 000004
【０１５６】
ＤＮＡの大部分は、約４５Ｋｂｐの限界移動度でバンドとして移動する。
【０１５７】
図２２Ｂ：アガロースゲル電気泳動によるＥ  ｃｏｌｉＤＮＡの分析。
【０１５８】
０．７５％  ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロース（Ｌｏｎｚａ）；０．５Ｘ  ＫＢＢ（Ｓａｇｅ）；Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｕｌｓｅ（Ｓａｇｅ）を、以下の波形パラメータで使用した：３００；１００；３０；１０；３０；１０；４５。
【０１５９】
ゲルを、８０ボルトで１２時間、実行させた。
【表３】
2019534698.tif 000005
【０１６０】
図２３を参照。
【０１６１】
アガロースゲル電気泳動によって分析したｏｎｅＤからのＥ  ｃｏｌｉＤＮＡ。
【０１６２】
１％  ＳＧＫゲル、ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＥＦ  ｍａｐｐｅｒを含む０．５Ｘ  ＫＢＢ、プログラム分子量：低５０Ｋ、高１０００Ｋ；勾配：６Ｖ／ｃｍ；角度：１２０；実行時間：１４：５４；初期切り替え時間：６．７５秒；最終切り替え時間：１分３３．６９秒；ランピング要因：リニア
【表４】
2019534698.tif 000006
（実施例５）白血球からの高分子量ＤＮＡの単離。
デバイス
【０１６３】
図７Ａ〜Ｂに示されるように、蓋１をベース２にはめ込む；シリコーングリースを棚４に塗布する。蓋は、バッファーチャンバを、溶出モジュールを介してのみ連絡することができる別個の陽極および陰極区画に分割する役割を果たす。
【０１６４】
また蓋は、アガロースゲルの上部表面を確定する役割を果たす。
組み立て体
【０１６５】
グリセロール／ＥｔＯＨの溶液を、溶出モジュールのＰＥＳ膜に適用する。ＥｔＯＨの蒸発後、溶出モジュールに０．５Ｘ  ＫＢＢバッファーを充填し、漏れについて調べる。次いで、溶出モジュールを、バッファーを除去し、ペーパータオルで注意深く吸い取り乾燥することによって乾燥させる；溶出モジュールをベースに置く。
【０１６６】
少量のシリコーングリースをベースの棚に塗布し、蓋を追加する；組み立て体をばねクランプで一緒に保持する。キャスティングダムを使用して、Ｄｕｒａｐｏｒ膜の隣にアガロースブロックを形成する；アガロースがゲル化後、５ｍｍ長のブロックにトリミングする。
【０１６７】
次いで、デバイスにバッファーを充填し、５０Ｖ  ＤＣで、Ｄｕｒａｐｏｒ側を陽極で、数分間、実行させる。電流は４．３ｍＡであることが観察される。
白血球
【０１６８】
全てのステップは、摂氏４度。
【０１６９】
白血球（本明細書で「ＷＢＣ」とも称される）をヤギ全血（Ｌａｍｐｉｒｅ、３５９９  Ｆａｒｍ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｒｄ、Ｏｔｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ  １８９４２）からＡＣＤ抗凝固剤を用いて調製する。３７ｍＬの冷ＲＢＣ溶解バッファー（１Ｘバッファーは、１５５ミリモルの塩化アンモニウム；１０ミリモルのＮａＨＣＯ３；１ミリモルのＮａ２ＥＤＴＡである）に１０ｍＬの全血を添加した；チューブを反転により混合し、時々混合しながら摂氏４度で５分間インキュベートした。ＷＢＣを、遠心分離（２，４００×ｇで４分）により回収する。
【０１７０】
上清をデカントし、白血球の赤みがかったペレットを２０ｍＬのＲＢＣ溶解バッファー中に再懸濁（ボルテックス）することによって洗浄し、２，２００×ｇで２分間、遠心分離した。
【０１７１】
細胞ペレットが赤色のトレースのみを有するまで、洗浄ステップを２〜３回繰り返す。
【０１７２】
細胞を、１．５ｍＬのＦＳＥ（５０％ｖ／ｖ  Ｓａｇｅ  Ｆｉｃｏｌｌローディングバッファー；８０ミリグラム／ｍＬスクロース；１０ミリモルのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、濾過する（４０ミクロン滅菌セルストレーナー、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃２２３６３５４７）。
【０１７３】
白血球は、数日間、摂氏４度で保管することができる。細胞懸濁液が、均質なクリーム状の溶液でない場合には、ボルテックスまたは再濾過する。再濾過した場合、細胞またはＤＮＡの濃度は再測定する必要がある。
Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを用いたＤＮＡの定量
【０１７４】
チューブを回転させることによってＷＢＣを穏やかに混合し、１０マイクロリットルを微量遠心チューブに移し；次いで１９０マイクロリットルのＱｕｂｉｔ溶解バッファーを加え、ピペッティングで混合する；溶液はスノッティになる。摂氏５８度で１０分間インキュベートする。室温まで冷却し、６００マイクロリットルのＴＥを加え、フルスピードで１０秒間ボルテックスする。
【０１７５】
０．５〜１マイクロリットルの溶解した細胞ミックスをＱｕｂｉｔ  ＨＳアッセイでアッセイする。ＤＮＡの予想濃度は、２００〜３００ナノグラム／μＬである。
細胞計数による細胞の定量
【０１７６】
ＢｉｏＲａｄ  ＴＣ２０自動細胞計数器を使用して、全細胞数および生存パーセントを、トリパンブルーを用い、ベンダーの指示にしたがって決定した。
細胞をロードし、ＤＮＡを単離する
【０１７７】
試料を調製するために、７５マイクロリットルのＷＢＣ（６９，０００細胞／μＬ、ＤＮＡ１マイクロリットルあたり公称４１６ナノグラム、６ピコグラム／細胞と推定）を、３５０マイクロリットルのＳＥＫバッファー（０．５ｘ  ＫＢＢ；５ミリモルのＥＤＴＡ；８０ミリグラム／ｍＬのスクロース；１０マイクログラム／ｍＬフェノールレッド）と混合し、溶出モジュールに加える。
【０１７８】
この溶液中のＤＮＡ（インプット）の濃度を決定するために、２つの１０マイクロリットルのアリコートを引き抜き、１９０マイクロリットルのｑｕｂｉｔ溶解バッファーに加えた；溶液をボルテックスし、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを用いてアッセイするまで室温で保管した。
【０１７９】
試料を、５０Ｖ  ＤＣで、Ｄｕｒａｐｏｒ側を陽極で、１３分間、電気泳動した。１３分後、１５０マイクロリットルの１０％ＳＤＳを溶出モジュールに加え、溶液を穏やかに混合した。２０マイクロリットルのアリコート（画分０）を取り、１９０マイクロリットルのｑｕｂｉｔ溶解バッファーに加え、ＤＮＡの濃度を決定した。
【０１８０】
溶出モジュールを栓で封止し、電気泳動を５０Ｖ  ＤＣでさらに１０分間継続した。バッファーチャンバ内のバッファーを交換し、電気泳動をさらに１０分間継続した。
【０１８１】
溶出モジュールの内容物を取り出し、１２マイクロリットルの５００ミリモルのＥＤＴＡを加えた；これを画分１、ＳＤＳ後とする。溶出モジュールをＫＢＢでリンスし、液体を、画分２、ＳＤＳリンス後として保存した。
【０１８２】
バッファーチャンバを３回リンスしてＳＤＳを除去し、新鮮なバッファーをバッファーチャンバに置いた。溶出モジュールを、５００マイクロリットルのＥＲＢでリンスした（画分３、ＥＲＢリンス）。ＤＮＡを、５００マイクロリットルのＥＲＢを加えることによって消化し、これに５マイクロリットルの２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  Ｍ））、１．５マイクロリットルのＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）、および０．５マイクロリットルのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ）を加えた；インキュベーションを、摂氏３７度で１０分間行った（デバイス全体を、恒温アルミニウム板（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、「ｍｙＢｌｏｃｋ」ドライブロックヒータユニット）上に置いた）。インキュベーションの最後に、１５マイクロリットルの０．５ＭのＥＤＴＡを溶出モジュールに加え、内容物を穏やかに混合し、溶液を溶出モジュールから吸引し、画分４、ＥＲＢとして保存した。
【０１８３】
次いで、ＤＮＡを電気溶出によって回収した；溶出モジュールを、５００マイクロリットルの０．５Ｘ  ＫＢＢおよび５マイクロリットルの０．５Ｍ  ＥＤＴＡで充填し、電圧を印加した（５０Ｖ  ＤＣ、９０秒、Ｄｕｒａｐｏｒ側を陽極）；溶液を、画分５、溶出１として回収した。
【０１８４】
溶出モジュールを、０．５ｘ  ＫＢＢで再充填し、ＤＮＡを、２分間、５０Ｖ  ＤＣで溶出した。
【０１８５】
溶液を保存した（画分６、溶出２）。溶出モジュールを再充填し、電気泳動を４分間適用し、２５Ｖ  ＤＣで、Ｄｕｒａｐｏｒ側を陽極で５秒間印加した（逆電流パルス、ＤＮＡをＰＥＳ膜から引き離すため）。デバイスを、蒸発を防ぐために覆って、一晩室温で放置し、溶出モジュール中の材料を翌日回収した（画分７、溶出３）。
結果
【０１８６】
各画分中のＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを使用して決定した。
【０１８７】
図２４を参照。
【０１８８】
図２５に示されるように、２０，６６３ｎｇのＤＮＡを溶出モジュールにロードし、５０Ｖ  ＤＣ、Ｄｕｒａｐｏｒ側を陽極で１３分間の電気泳動後、３３％のＤＮＡ（６，８００ｎｇ）のみが、ＳＤＳを加えた後に回収しうる形態で溶出モジュールに存在した。このことは、ＤＮＡが、何らかの形態でＤｕｒａｐｏｒまたはアガロースのいずれかまたはその両方に結合したかまたは絡まり、このＤＮＡが、洗浄（画分２、３）または酵素による処置（画分４）では放出されなかったことを示唆する。
【０１８９】
結果は、３９％（８，１００ｎｇ）のインプットＤＮＡが溶出で回収できたことを示している。
【０１９０】
各画分のＤＮＡのサイズを、アガロースゲル電気泳動によって決定した。
【０１９１】
３０マイクロリットルの画分４、５、６および７をパルスフィールドアガロースゲル（ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＥＦ  ｍａｐｐｅｒ；プログラムは５０〜１，０００ＫＢｐ断片の分離のためのデフォルトであり、時間係数は０．５である）で分析した；ゲルは、０．５Ｘ  ＫＢＢバッファー（Ｓａｇｅ）中０．７５％  ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロース（Ｌｏｎｚａ）である；実行温度は摂氏１４度である。
【表５】
2019534698.tif 000007
【０１９２】
結果は、およそ１６０（画分５）〜３００ｋｂ（画分６）に質量中心を有する高分子量ＤＮＡが得られたことを示す。画分７では、一部のＤＮＡが、限界移動度（このゲルシステムでは約２Ｍｂｐ）で視認される。
（実施例６）白血球からの高分子量ＤＮＡの単離
【０１９３】
この実施例では、バッファーチャンバが１つである−つまり陽極バッファーチャンバと陰極バッファーチャンバとの間に障壁が存在しない−デバイス構成を使用して、白血球からの迅速で高収率のＤＮＡ回収が実証される。
デバイス組み立て体
【０１９４】
図２６Ａに示されるように、溶出モジュールをベースに挿入し、キャスティングダムを溶出モジュールからおよそ５ｍｍに手動で置いた；アガロースをピペットで加え、蓋棚までの空間を充填した。
【０１９５】
アガロースがゲル化後、ダムを取り除き、バッファー（０．５ｘ  ＫＢＢ）を加え、溶出物のほぼ頂部までバッファーチャンバを充填した；バッファーは棚上の溶出モジュールの側面周りを自由に流動する。
【０１９６】
溶出モジュールは、使用前にバッファーで充填されている。
【０１９７】
溶出モジュールがしっかりと所定の位置にあることを確実にするために、図２６Ｂに示されるように、ばねクランプを加えた。
【０１９８】
使用中のデバイス；ベースは、冷却のために金属ブロックの上に載せている；白金ワイヤを備える２つの電極ホルダーが示される；クランプは、溶出モジュールを所定の位置に保持している。
【０１９９】
バッファーは、溶出モジュールの側面周りの２つの電極の間を流動することができる。
試料
【０２００】
実施例３に記載したように、ヤギ全血からＷＢＣを調製した。細胞の２つのアリコートをＴＢＳ中に希釈し、製造業者の説明書にしたがって、ＢｉｏＲａｄ細胞計数器で計数した。結果は以下の通りであった：
【表６】
2019534698.tif 000008
（１）細胞あたり６ｐｇのＤＮＡと推定
細胞を摂氏４度で一晩保管し、次いで、再計数した。
【表７】
2019534698.tif 000009
【０２０１】
４１マイクロリットルの細胞（２０マイクログラムのＤＮＡ）を、２９０マイクロリットルのＳＥＫバッファー（０．５ｘ  ＫＢＢ；５ミリモルのＥＤＴＡ；８０ミリグラム／ｍＬのスクロース；１０マイクログラム／ｍＬのフェノールレッド）と混合し、溶出モジュールに加えた。ＤＮＡ（「インプット」）の開始濃度を決定するために、２つの１０マイクロリットルのアリコートを取り、各アリコートを１９０マイクロリットルのＱＬＢ（Ｑｕｂｉｔ溶解バッファー、０．５ｘ  ＫＢＢ、１％ＳＤＳ、５ミリモルのＥＤＴＡ、５０ミリモルのＮａＣｌ）に希釈した；試料を混合し、室温で保管した。
【０２０２】
細胞を、アガロース被覆Ｄｕｒａｐｏｒに電気泳動した；電気泳動は、５０Ｖ  ＤＣ、溶出モジュールのＤｕｒａｐｏｒ側を陽極で行った。電流は、６．２ｍＡであった。
【０２０３】
８分３０秒後、電気泳動を一時停止した；ＳＥＫ中のフェノールレッド色素は、溶出モジュールから出てアガロースを広域バンドとして通って途中まで移動した。
【０２０４】
溶出モジュールに、８０マイクロリットルの１０％ＳＤＳおよび１６０マイクロリットルの０．５Ｘ  ＫＢＢを加えた；溶出モジュール内容物を穏やかに混合し、ポートホールをゴム栓で封止した。
【０２０５】
電気泳動を５０Ｖで再開；電流は、９．８ｍＡであった；４０Ｖに切り替えた；電流は、７．６ｍＡであった。
【０２０６】
ＳＤＳの溶出モジュールへの添加は、通常、電流を上昇させることが観察される。ジュール熱は電流に比例するので、電圧を、過熱を回避するために減少させる。
【０２０７】
電気泳動を合計で２０分間継続し、次いで、一時停止する。
【０２０８】
ゴム栓を外し、溶出モジュールから１０マイクロリットルを取る；９０マイクロリットルのＱＬＢに画分１として加える、「ＳＤＳ溶解後ステップ」。
【０２０９】
バッファーチャンバを新鮮なバッファーで３回リンスし、ＳＤＳをデバイスから取り除く。
【０２１０】
溶出モジュールをバッファーで２回リンスし、画分２、「ＳＤＳリンス後」として保存する。
【０２１１】
３回目をＫＢＢでリンスし、画分３として保存する、「ＳＤＳリンス後」。
【０２１２】
５００マイクロリットルのＥＲＢ（５ｘ  ＫＢＢ；３２ミリグラム／ｍＬヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン；１０ミリモルのＭｇ（Ｃｌ）２；５０マイクログラム／ｍＬ  ＢＳＡ）を、５マイクロリットルの２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ））、１マイクロリットルのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ））、および１マイクロリットルのＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ））と混合する；ＥＲＢ／酵素カクテルを溶出モジュールに加え、３６分間室温で放置する。
【０２１３】
溶液を回収する；１５マイクロリットルの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加え、画分４「酵素ミックス」として保存する。
【０２１４】
５００マイクロリットルの０．５Ｘ  ＫＢＢに、ＥＤＴＡを２５ミリモルまで、およびＤＴＴを５ミリモルまで加える；溶出モジュールに加え、５分間放置する；回収し、画分５、「酵素洗浄後」として保存する。
【０２１５】
４００マイクロリットルのＫＢＢを加え、ＤＮＡを電気泳動で溶出する（２分間、４０Ｖ  ＤＣ、Ｄｕｒａｐｏｒ側が陰極）。試料を回収し、画分６、「溶出１」として保存する。
【０２１６】
溶出プロセスを繰り返す；第２の溶出が「スノッティ」であること、および高分子量ＤＮＡの指示を観察する；画分７、「溶出２」として保存する。
【０２１７】
４００マイクロリットルのＫＢＢを溶出モジュールに加え、Ｐｉｐｐｉｎ  ｐｕｌｓｅコントローラを使用して、以下のプログラムでＤＮＡを溶出した。
【表８】
2019534698.tif 000010
溶出モジュール中の材料を、画分８、「溶出３」として回収する。
結果
【０２１８】
各画分中のＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳアッセイを使用して決定した。
【０２１９】
図２７を参照。
結論
【０２２０】
データは、陽極および陰極区画に分割されていない単一のバッファーチャンバがある様式を使用して、インプットＤＮＡの３０％を回収できることを示す。
【０２２１】
さらに、データは、溶出モジュール試料区画中の液体の体積が、電気泳動の間に変化することを示す。第１のステップの間に、細胞がアガロース被覆膜に移動し、それに絡まるとき、試料区画内の体積が減少する。
【０２２２】
第２ステップの間に、ＳＤＳを加えた後、数分後に体積が増加し始めることが観察される。
【０２２３】
本発明者らは、この体積の変化が、電気浸透によるものと考える。第１のステップにおいて、本発明者らは、固定電荷の大半がＰＥＳ膜上の負電荷であると考える；これにより、水は、ＰＥＳを通って、溶出モジュールの外へ排出される。
【０２２４】
ＳＤＳの添加の後、染色体ＤＮＡは、正に荷電されたタンパク質（例えば、ヒストン）から解放される；結果として、動かない絡まった染色体ＤＮＡは、固定負電荷として作用し、バッファーを溶出モジュールへ送り込む。
（実施例７）仮想例：複数の試料を同時に実行するように設計されたデバイス
【０２２５】
ＤＮＡを精製するための本発明者らのシステムの１つの利点は、多数の試料の取扱うために適応可能ということである。
【０２２６】
多数の試料は共通しており（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLedford、Heidi、「AstraZeneca launches project tosequence 2 million genomes」、Nature: InternationalWeekly Journal of Science、５３２巻、４２７号、２０１６年４月２８日）、したがって、数百または数千の試料を、確実に、迅速に、低コストで取扱うことができるシステムが必要とされている。
【０２２７】
大きい試料容量に関する需要は、実験室の自動化のために販売されている多数の製品から明らかである（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｅｃａｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ製品ライン）。
【０２２８】
そのような製品は、液体の取扱い、カセットなどの使い捨て品の移動、データの収集および分析などのステップを自動化している。
【０２２９】
図１２〜１３は、４つの試料を一度に分析することを可能にする４つの溶出モジュールを保持するように構成されたカセットを示す。カセットに４つの溶出モジュールをはめ込み、各溶出モジュールに１つで４つのアガロースゲルをキャストする；バッファーを加え、カセットを封止する。自動化されたアガロースゲルのキャスティング、カセットのバッファー充填およびカセット封止のための手順は、ＰｉｐｐｉｎおよびＥＬＦ器具のためのカセットの製造に関してＳａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅで利用されている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｇｅＨＬＳ高分子量ライブラリーシステム、ＰｉｐｐｉｎＨＴ  ＤＮＡサイズ選択システム、ＳａｇｅＥＬＦ試料分画システム、ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎサイズ選択システム、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡサイズ選択システム、ＳａｇｅＨＬＳ、ＰｉｐｐｉｎＨＴ、ＳａｇｅＥＬＦ、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐ、ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ）。
【０２３０】
バッファーで充填され、封止されるカセットは、必要になるまで保管するために適している。
【０２３１】
図１３に示されるカセットのようなデバイスのための液体取扱ステップの自動化は、液体取扱ロボット（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ）を用いて達成することができる。そのようなロボットは、図１３に示されるもののように、様々な試料および試薬を保持し、使い捨てカセットに試薬を送達するように構成することができる。
【０２３２】
これにより、ＤＮＡの単離に必要な全ての液体取扱ステップの自動化が可能である。
【０２３３】
さらに、電極を提供する手段を使用してもよい。Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅは、可動蓋の上に電極を有する（ＨＬＳ）器具を実証している。
（実施例８）３つのバッファーチャンバを備えるカセットでのＳＤＳの電気泳動
【０２３４】
図２８を参照。
【０２３５】
ベース４を、試料区画５およびポートホール６を備える溶出モジュール１３にはめ込んだ。アガロース７のブロックを、実施例６に記載されるように、キャスティングダムを使用して溶出モジュールの隣にキャストした。
【０２３６】
Ｍ２ねじ（ナイロン）８を、ねじ付き穴１４に入れ、次いで、２つのキャスティングダムをベース４のねじ８の周りに置き、溶融アガロースを加えた：アガロースが固まってブロック９を形成した後、キャスティングダムを取り除き、バッファーチャンバ１１をバッファーで充填した。
【０２３７】
２０分後、バッファーチャンバ１０中に液体が非常に少ししか存在しないことが観察された。本発明者らは、アガロースブロック９が、バッファーチャンバ１０と１１とを分離するシールを形成していると推測する。
【０２３８】
ねじ８およびねじ穴１４のない同様の実験は、アガロースのブロック８がシールを形成しなかった。
【０２３９】
試料区画５およびバッファーチャンバ１０、１１、１２をバッファーで充填し、電極１、２、３を加えた。
【０２４０】
少量の追跡用色素（キシレンシアノール）を、溶液が肉眼で容易に見ることができるように、試料区画に加えた。
【０２４１】
Ｐｉｐｐｉｎ  ｐｕｌｓｅ電源を使用して、電極２と３の間に、電極２を陽極で、５０Ｖ  ＤＣを供給した。キシレンシアノール追跡用色素は、試料区画２から、アガロースブロック７を通って、バッファーチャンバ１１内に移動したことが観察された。
【０２４２】
次いで、ｐｉｐｐｉｎ  ｐｕｌｓｅ電源を、電極１および２に電極１を陽極で接続し、５０Ｖ  ＤＣを印加した。追跡用色素は、バッファーチャンバ１１を出て、アガロースブロック７を通り、バッファーチャンバ１０内へ移動することが観察された；バッファーチャンバ１１中の溶液は、濃青色から透明に変化した。
【０２４３】
本発明者らは、この逐次的な電気泳動が、負に荷電されたキシレンシアノール分子を電気泳動によって試料区画から輸送させ（キシレンシアノールは正味の負電荷を有する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるTer Ming Tan, Timothyら、「Gel Electrophoresis:DNA Science without the DNA!」、Biochemistry andMolecular Biology Education、第３５巻、第５号、３４２〜３４９頁、２００７年）、バッファーチャンバ１０内に隔離させると推論する。
（実施例９）仮想例：カセットの洗浄なしのＤＮＡの単離
【０２４４】
実施例６では、高分子量ＤＮＡの単離を記載している。その例では、ＳＤＳを使用して細胞を除タンパクし、そしてＳＤＳおよびＳＤＳ被覆タンパク質を、酵素消化が起こりうるように、ならびにＳＤＳおよびＳＤＳ被覆タンパク質が溶出ステップの間に精製ＤＮＡを汚染しないように、カセットから除去する。
【０２４５】
そのプロセスでは、ＳＤＳおよびＳＤＳ被覆タンパク質が溶出の間にＤＮＡを汚染しないように、洗浄を使用して、ＳＤＳおよびＳＤＳ被覆タンパク質をバッファーチャンバから除去した。
【０２４６】
この例では、洗浄が必要でないように、電気泳動輸送を使用して、ＳＤＳおよびＳＤＳ被覆タンパク質を隔離する。
【０２４７】
カセットを、図２８に関して説明されたように調製し、試料を、実施例６に記載されるように調製し、ロードする。
【０２４８】
アガロース被覆膜に細胞を絡ませる電気泳動は、電極２、３（図２８）を使用することを除いて、実施例６に記載される通りである。ＳＤＳを実施例６に記載のように加え、電気泳動を、電極２、３を使用する以外は実施例６に記載のように使用して、細胞溶解および除タンパクを生じさせる。
【０２４９】
次いで、電流（５０Ｖ  ＤＣ）を、電極１と２の間に、電極１を陽極で、１時間印加し、ＳＤＳおよびＳＤＣ被覆タンパク質を、バッファーチャンバ１１から、アガロースゲル９を通って、バッファーチャンバ１０内へと輸送させる。
【０２５０】
次いで、アガロース被覆膜に絡まっているＤＮＡを、バッファーチャンバをＳＤＳ除去のために洗浄していないことを除いて、実施例６に記載されるように、ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅで処理する。ＤＮＡを、電極２、３を電極３が陽極で使用することを除いて、実施例６に記載されるように回収する。
【０２５１】
この実施例は、ＳＤＳまたは他の汚染物質を除去するためにカセットを洗浄する必要のない、細胞試料からの高分子量ＤＮＡの精製を示す。
他の出願
【０２５２】
この出願は、さらに以下に関連している：
２０１６年６月１５日に出願された米国特許出願第１５／１８３，０９７号、
２０１４年６月５日に出願された米国特許出願第１４／２９７，００１号、
２０１３年１月２８日に出願された米国特許出願第１３／７５１，６０６号、
２０１０年４月１４日に出願された米国特許出願第１２／７６０，５４８号、
２００９年１０月８日に出願された米国特許出願第１２／５７６，１４８号、
２００９年２月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１５０，２４３号、
２００８年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１９５，５６６号、
２０１７年３月２０日に出願された米国特許出願第１５／４６４，２７８号、
２０１３年１０月１０日に出願された米国特許出願第１４／０５１，３００号、
２０１３年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７６６，９１０号、
２０１２年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７１３，９１６号、
２０１２年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７１３，１５６号、
２０１７年４月１４日に出願された米国特許出願第１５／５１９，５１６号、
２０１５年１０月１５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５５８３３号、
２０１５年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１８３，５１４号、
２０１４年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０６４，４５４号
【０２５３】
前述の出願は、参照によりその全体が本明細書に全て明示的に組み込まれる。
【０２５４】
本出願において提示されている特許、特許出願、論文、ウェブページ、書籍などを含むがこれらに限定されない刊行物および他の文献の全ての参照は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
デバイス、システムおよび方法の例示的な実施形態が本明細書に記載される。他の箇所で述べたように、これらの実施形態は、例示の目的のためのみに記載されており、限定するものではない。本明細書に含まれる教示から明らかな他の実施形態も可能であり、本開示によって包含される。したがって、本開示の広さおよび範囲は、上述の実施形態のいずれによっても制限されるべきではなく、本開示によって支持される特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義されるべきである。さらに、本開示の実施形態は、分子処理に対応する全ての要素を含む任意の他の開示された方法、システムおよびデバイスから全ての要素をさらに含むことができる方法、システムおよびデバイスを含むことができる。換言すれば、１つまたは別の開示された実施形態からの要素は、他の開示された実施形態からの要素と交換することができる。さらに、開示された実施形態のうちの１つまたは複数の特徴／要素を削除して、依然として特許性のある主題をもたらすことができる（したがって、本開示のさらなる実施形態をもたらすことができる）。これに対応して、本開示の一部の実施形態は、１つおよび／または別の参照／従来技術に開示されたシステム、デバイスおよび／または方法の１つまたは複数の要素／特徴を特異的に欠いていることにより、そのような先行技術と特許的に区別することができる。換言すれば、ある特定の実施形態への主張は、１つまたは複数の要素／特徴を特異的に排除して、そのような特徴／要素を含む先行技術と特許的に区別される実施形態をもたらす、負の限定を含むことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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