(57)【要約】【課題】大容量イオン交換分離のための不織布の熱誘導グラフト化を提供する。【解決手段】本発明は、分離プロセスに使用するのに適したポリマーグラフト化及び官能化された不織膜を調製する方法を提供する。本発明は更に、そのように形成された膜並びに膜を利用する改良された分離方法を提供する。ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、特に、熱グラフト化を利用して形成される。特に、アクリレート又はメタクリレートポリマーは、ポリマー繊維に共有結合された複数のポリマーセグメントを形成するために、複数のポリマー繊維を含む不織ウェブ上にグラフト化され得る。熱グラフト化は、特に、熱開始剤を使用する工程及び不織ウェブを熱に曝露してアクリレート又はメタクリレートモノマーの重合を開始する工程を含み得る。グラフト化されたポリマー繊維を官能化して、グラフト化されたポリマー繊維のポリマーセグメントに標的分子を結合させるのに適した少なくとも１種の官能基を結合させ得る。【選択図】図７
2019534902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の捕捉における使用のために適したポリマーグラフト化及び官能化された不織膜の製造方法であって、
ｉ）複数のポリマー繊維を含む不織ウェブを受け入れる工程；
ｉｉ）前記複数のポリマー繊維上にアクリレート又はメタクリレートポリマーをグラフト化して、それに共有結合した複数のポリマーセグメントを形成し、それによりグラフト化されたポリマー繊維を形成する工程であって、該グラフト化工程は、
ａ．前記不織ウェブを、熱フリーラジカル開始剤を含む溶液と接触させて、該熱開始剤を前記不織ウェブ内に吸収させる工程、
ｂ．前記不織ウェブを少なくとも１種のアクリレート又はメタクリレートモノマーを含む溶液と接触させる工程、及び
ｃ．前記不織ウェブを熱に曝露して前記アクリレート又はメタクリレートモノマーの重合を開始させる工程
を含み；及び
ｉｉｉ）前記グラフト化されたポリマー繊維を官能化して、前記グラフト化されたポリマー繊維の前記ポリマーセグメントに標的分子を結合させるのに適した少なくとも１種の官能基を結合させる工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリマー繊維は、ポリオレフィン、ポリエステル、熱可塑性ポリマー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマー繊維は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される熱可塑性ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマー繊維は、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド６（ＰＡ６）、ポリアミド６−６（ＰＡ６−６）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、複数のポリブチレンテレフタレート繊維を含む不織ウェブを受け入れる工程及びポリ（グリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ）を含むメタクリレートポリマーをグラフト化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記熱フリーラジカル開始剤は、アクリレート又はメタクリレートモノマーが重合する温度でラジカル種に分解するように設定された物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記熱フリーラジカル開始剤は、過酸化物又はアゾ化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記熱フリーラジカル開始剤は、第三アミルペルオキシベンゾエート、４，４−アキソビス（４−カノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、２，２−ビス（第三ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ビス（１−（第三ブチルペルオキシ）−１−メチルエチル）ベンゼン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、第三ブチルヒドロペルオキシド、第三ブチルペルアセテート、第三ブチルペルオキシド、第三ブチルペルオキシベンゾエート、第三ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、クメンヒドロペルオキシド、シクロヘキサノンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、２，４−ペンタンジオンペルオキシド、過酢酸、過硫酸カリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記熱フリーラジカル開始剤を含む溶液は、約１０乃至約２００ｍＭの熱フリーラジカル開始剤濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記不織ウェブを、約１秒乃至約１０時間の間、前記熱フリーラジカルを含む溶液と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記不織ウェブを熱に曝露する工程は、少なくとも約５０℃の温度で不織ウェブを加熱することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種のアクリレート又はメタクリレートモノマーは、グリシジルメタクリレート、メタクリル酸、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グラフト化されたポリマー繊維は、カチオン又はアニオン交換のために設定された官能基が前記標的分子と結合するように官能化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、前記標的分子の約１，０００ｍｍｏｌ／ｇまでの平衡結合容量を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記不織ウェブは、グラフト化前の不織ウェブの質量に基づいて約１％乃至約５０％のグラフト化による質量増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記不織ウェブは、約１μｍ乃至約２メートルの厚さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記グラフト化は、約０．０５μｍ乃至約１００μｍの厚さを有するグラフト層を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下の時間内に前記標的分子の結合平衡に達するように設定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の方法に従って調製されたポリマーグラフト化及び官能化された不織膜。
【請求項２０】
溶液から標的分子を分離する方法であって、該方法は、前記溶液中の標的分子の少なくとも一部が、前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に結合するように、前記標的分子を伴う溶液を、請求項１９に記載のポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に通過させることを含む方法。
【請求項２１】
溶液からの標的分子の分離において、結合平衡に達するまでの時間を短縮する方法であって、該方法は、不織ウェブを形成する複数のポリマー繊維上へのアクリレート又はメタクリレートポリマーの熱グラフト化により形成されるポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に、前記標的分子を伴う溶液を通過させる工程を含み、それにより形成されたポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下の時間で前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効である、方法。
【請求項２２】
前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１０分以下の時間で前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数のポリマー繊維から形成された不織ウェブを含み、その上にグラフト化されたアクリレート又はメタクリレートポリマーから構成される複数のポリマーセグメントを含むポリマーグラフト化及び官能化された不織膜であって、前記複数のポリマーセグメントは、標的分子と結合するのに適した官能基を有し、前記複数のポリマーセグメントは、前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜が、約１時間以下の時間で前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効であるように、前記不織膜に熱グラフト化される、不織膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の分野
本発明は、分離及び精製プロセスにおける使用のために適したポリマーグラフト化及び官能化された不織膜、並びに、それらを形成及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
膜クロマトグラフィーは、バイオセパレーションのためのプラットフォームとして従来の充填床クロマトグラフィーと比べていくつかの潜在的利点を提供する。
膜の相互接続された細孔は、充填床と比較して、実質的な圧力降下なしに高率の容量処理量を可能にする。クロマトグラフィー樹脂は、充填する必要があるが、それらは通常は使い捨てではなく、結果として、それらは、それらの使用のために有効な洗浄及び再生プロセスを必要とする。他方で、拡張可能な生産技術を用いてポリマーから多くの膜を作製することができ、積み重ね可能で、すぐに使用できる使い捨てのバイオセパレーションフィルターとしてのそれらの使用を可能にする。不織膜は、高速製造技術を使用し、低コスト材料を用いて制御可能な多孔度、繊維直径及び孔径を示すように高度に設計されているため、これらの用途にとってに特に魅力的である。膜へのタンパク質の結合は、流動及び吸着の両方に利用可能な細孔によって形成される表面積に大きく制限される。これは、吸着に対する全ての拡散制限を排除するが、クロマトグラフィー樹脂と比較して膜の結合容量も低下させる。市販の不織布は、クロマトグラフィー樹脂の表面積の一部を有し、その結果、殆どの標的タンパク質捕捉用途に対して低い結合容量しか生じない。不織膜における繊維の表面にポリマーブラシを結合することにより、全体的なタンパク質結合容量を実質的に増加させ得る３次元結合ドメインを作製することができる。ポリマーブラシのグラフト化（接合）は、従来のクロマトグラフィー樹脂、中空繊維膜、キャスト膜、及び不織膜における単層被覆の数倍にタンパク質吸着能力を増加させることが知られている。
【０００３】
ポリマーのグラフト化は、支持体の表面特性を劇的に変化させ得る。それは、生体分子の吸着を減少又は増加させるために表面の極性を調整するのに役立ち得、また、それは、支持界面に導入された３次元微小環境において、リガンド又はスペーサーアーム連結のための官能基を導入するために使用され得る。Ｌｉｕ等により実施された以前の研究において、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）モノマーは、ＵＶグラフト化により、市販で入手可能なポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）不織布に成功裏にグラフト化された。Ｈ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．Ｇｕｒｇｅｌ，Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ＰＢＴ  ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｂｙ  ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒａｆｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．４２８巻（２０１３年）５６２−５７５頁参照。ＵＶ誘起フリーラジカル重合を使用して、均一で且つ共形のポリＧＭＡグラフトが、個々のＰＢＴ繊維を囲んで達成された。開始剤としてベンゾフェノン（ＢＰ）を使用してＧＭＡ重合を開始させるために、ポリＧＭＡが、水素引き抜きを介してＰＢＴ表面に直接結合された。
【０００４】
ＰＢＴは、不織布の製造に一般的に使用される多くのポリオレフィンをグラフト化するのに必要な別個の表面ＵＶ前処理を必要としないので、ポリＧＭＡグラフト化のための出発物質として使用するのに有利である。ＰＢＴ不織布材料は、高度の非特異的なタンパク質の吸着を導く、本質的に疎水性の性質であり、基材自体をバイオセパレーションのための貧弱なプラットフォームとする。酸性条件を使用するＰＢＴ上のポリＧＭＡグラフトの直接加水分解は、繊維表面を完全に親水性にし、非特異的な疎水性タンパク質の吸着を実
質的に減少させる。ＧＭＡの各モノマー単位は、リガンドを、求核置換を介して、利用可能なアミン、チオール、及びヒドロキシル基で共有結合するために使用し得るエポキシ末端基を含む。Ｌｉｕ等による研究において、ポリＧＭＡブラシに共有結合したジエチレングリコールもまた、非特異的な疎水性相互作用により、タンパク質吸着を実質的に排除することが見出された。
【０００５】
ポリＧＭＡグラフト不織布は、効果的なイオン交換膜の開発のための便利なプラットフォームを提供する。Ｓａｉｔｏ等は、ポリプロピレン生地とポリエチレン中空繊維にポリＧＭＡブラシを成功裏にグラフトした。Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｔ．Ｋａｇａ，Ｈ．Ｙａｍａｇｉｓｈｉ，Ｓ．Ｆｕｒａｓａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｇｏ，Ｊ．Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．４３巻（１９８９年）１３１−１４１頁参照。これらのグラフト材料は、リン酸基で官能化されて、２価の金属カチオンを捕捉する強カチオン交換膜を形成した。
【０００６】
Ｚｈｅｎｇ等による研究において、ポリＧＭＡをポリプロピレン不織布にグラフトし、ジエチルアミン（ＤＥＡ）で官能化して弱アニオン交換体を開発した。Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇｕｒｇｅｌ，Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ
ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｆａｂｒｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｏｒｍａｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．３６４巻（２０１０年）３６２−３７１頁参照。この物質は、１２０ｍｇ／ｇ膜のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する平衡結合容量を達成した。
【０００７】
Ｌｉｕ等は、アニオン交換によるＢＳＡの捕捉のために、不織布ＰＢＴ上におけるＵＶグラフト化により様々な割合のポリＧＭＡグラフト化の効果を調査した。Ｈ．Ｌｉｕ，Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ローリー  ノースカロライナ州  米国，ノース  カロライナ  ステート  ユニバーシティー，ＰｈＤ論文，２０１２年参照。その研究において、ポリＧＭＡグラフトはＤＥＡで弱アニオン交換体に変換し、ＢＳＡで接種した。全体のタンパク質結合容量は、グラフト化の程度（質量％の増加）と共に増加することが判明した。８００ｍｇ／ｇの最大平衡結合容量が、１２％のポリＧＭＡの質量増加において観察された。この調査はまた、最大結合に達するために数時間から１日の滞留時間が必要であり、これらの結合時間は、増加したグラフト化の質量％増加と共に増加することを示した。これらの長い滞留時間は、下流加工のための高生産性、高容量のタンパク質捕捉デバイスの開発のための、これらのポリＧＭＡグラフト化不織ＰＢＴ膜の使用を妨げ、いずれの標的分子の捕捉にとっても不利である。
【０００８】
したがって、高生産性、高容量のタンパク質捕捉が可能なグラフト化された不織膜の必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．Ｇｕｒｇｅｌ，Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ＰＢＴ  ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｂｙ  ｐｈｏｔｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒａｆｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．４２８巻（２０１３年）５６２−５７５頁
【非特許文献２】Ｋ．Ｓａｉｔｏ，Ｔ．Ｋａｇａ，Ｈ．Ｙａｍａｇｉｓｈｉ，Ｓ．Ｆｕｒａｓａｋｉ，Ｔ．Ｓｕｇｏ，Ｊ．Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｂｙ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．４３巻（１９８９年）１３１−１４１頁
【非特許文献３】Ｙ．Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．Ｌｉｕ，Ｐ．Ｇｕｒｇｅｌ，Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ，Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｆａｂｒｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｏｒｍａｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｇｌｙｃｉｄｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．３６４巻（２０１０年）３６２−３７１頁
【非特許文献４】Ｈ．Ｌｉｕ，Ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｏｎｗｏｖｅｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，ローリー  ノースカロライナ州  米国，ノース  カロライナ  ステート  ユニバーシティー，ＰｈＤ論文，２０１２年
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１態様において、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）不織布は、熱誘導ラジカル重合を介して、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）又は類似のメタクリレートポリマーで容易にグラフト化され得、各繊維の周囲に均一で且つ共形のポリマーブラシネットワークを形成するが、それはアニオン又はカチオン交換体として機能するように化学的に修飾され得る。熱開始プロセスの使用は、その大きな厚さ及び密度のためにＵＶ光の透過を妨げる、不織布、モノリス又は固体上のポリマー層のグラフト化を可能とし、よって、ＵＶグラフト化を不可能にする。加えて、特定の態様において、本発明の熱開始グラフト化不織ウェブは、同等のＵＶ開始グラフト化不織ウェブよりもずっと速く、タンパク質などの標的分子との結合平衡を達成することができる。結合平衡は、結合反応の順方向速度及び逆方向速度が等しい状態を意味すると理解される。幾つかの態様において、親和性リガンドが標的捕捉のために共有結合され得る。更に、熱グラフト化は、様々な形状のウェブ、繊維、及びモノリスを、均一で共形のグラフト層でグラフト化するために使用され得る。加えて、熱誘導グラフト化繊維は、生体系、廃水又は精製されるべき他の水源（場合により淡水化を含む）中の金属汚染物質又は他の荷電汚染物質などの小さな標的分子の高容量捕獲のためにも使用され得る。
【００１１】
１以上の態様において、本開示は、ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜の調製方法に関する。そのように形成された膜は、特に、標的分子の分離における使用のために適し得る。非限定的な例において、この方法は、ｉ）複数のポリマー繊維を含む不織ウェブを受け入れる工程；ｉｉ）前記複数のポリマー繊維上にアクリレート又はメタクリレートポリマーをグラフト化して、それに共有結合した複数のポリマーセグメントを形成し、それによりグラフト化されたポリマー繊維を形成する工程であって、該グラフト化工程は、ａ）前記不織ウェブを、熱フリーラジカル開始剤を含む溶液と接触させて、該熱開始剤を前記不織ウェブ内の繊維に吸着又は吸収させる工程、ｂ）前記不織ウェブを少なくとも１種のアクリレート又はメタクリレートモノマーを含む溶液と接触させる工程、及び、ｃ）前記不織ウェブを熱に曝露して前記アクリレート又はメタクリレートモノマーの重合を開始させる工程を含み；及びｉｉｉ）前記グラフト化されたポリマー繊維を官能化して、前記グラフト化されたポリマー繊維の前記ポリマーセグメントに標的分子を結合させるのに適した少なくとも１種の官能基を結合させる工程を含み得る。
【００１２】
更なる態様において、本方法は、任意の数及び順序で組み合わせることができる、以下の記述の１つ以上に関連して特徴付けることができる。
【００１３】
前記ポリマー繊維は、ポリオレフィン、ポリエステル、熱可塑性ポリマー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
前記ポリマー繊維は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される熱可塑性ポリマーを含む。
【００１５】
前記ポリマー繊維は、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド６（ＰＡ６）、ポリアミド６−６（ＰＡ６−６）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１６】
前記方法は、複数のポリブチレンテレフタレート繊維を含む不織ウェブを受け入れる工程及びポリ（グリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ））を含むメタクリレートポリマーをグラフト化する工程を含む。
【００１７】
前記熱フリーラジカル開始剤は、アクリレート又はメタクリレートモノマーが重合する温度でラジカル種に分解するように設定された物質である。
【００１８】
前記熱フリーラジカル開始剤は、過酸化物又はアゾ化合物である。
【００１９】
前記熱フリーラジカル開始剤は、第三アミルペルオキシベンゾエート、４，４−アキソビス（４−カノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、２，２−ビス（第三ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ビス（１−（第三ブチルペルオキシ）−１−メチルエチル）ベンゼン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、第三ブチルヒドロペルオキシド、第三ブチルペルアセテート、第三ブチルペルオキシド、第三ブチルペルオキシベンゾエート、第三ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、クメンヒドロペルオキシド、シクロヘキサノンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、２，４−ペンタンジオンペルオキシド、過酢酸、過硫酸カリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得るが、それらに限定されるものではない。
【００２０】
前記熱フリーラジカル開始剤を含む溶液は、約１０乃至約２００ｍＭの熱フリーラジカル開始剤濃度を有する。
【００２１】
前記不織ウェブを、約１秒乃至約１０時間の間、前記熱フリーラジカルを含む溶液と接触させる。
【００２２】
前記不織ウェブを熱に曝露する工程は、少なくとも約５０℃の温度で不織ウェブを加熱することを含む。
【００２３】
前記アクリレート又はメタクリレートモノマー又はコモノマーは、グリシジルメタクリレート、メタクリル酸、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチル−アンモニウムクロリド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得るが、それらに限定されるものではない。
【００２４】
前記グラフト化されたポリマー繊維は、カチオン又はアニオン交換のために設定された
官能基が前記標的分子と結合するように官能化される。イオン交換基は、強イオン交換体（アニオン又はカチオン）、弱イオン交換体（アニオン又はカチオン）、荷電マルチモーダルリガンド（アニオン又はカチオン）、又はアニオン若しくはカチオン荷電ポリマーであり得る。
【００２５】
前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、前記標的分子の約１，０００ｍｍｏｌ／ｇまでの平衡結合容量を示す。
【００２６】
前記標的分子は、タンパク質、ウイルス粒子、エキソソーム、微生物又は哺乳動物の細胞、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドのような、しかしこれらに限定されない生体分子、並びに、ＡＴＰ、ビタミン、ステロイドのような小分子及び低分子量の荷電種であり得る。
【００２７】
前記不織ウェブは、グラフト化前の不織ウェブの質量に基づいて約１％乃至約５０％のグラフト化による質量増加を示す。
【００２８】
前記不織ウェブは、約１μｍ乃至約２メートルの厚さを有する。前記不織ウェブは、ＵＶ光の透過距離よりも厚くできるため、該ウェブのグラフト化は、熱誘導グラフト化を介して実施され得るものの、ＵＶグラフト化では実施できない。
【００２９】
前記グラフト化は、約０．０５μｍ乃至約１００μｍの厚さを有する各繊維の周囲に共形且つ均一なグラフト層を形成する。
【００３０】
前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下の時間内に前記標的分子の結合平衡に達するように設定される。幾つかの態様において、前記結合平衡は１０分以内に起こり得る。幾つかの態様において、前記結合平衡は、５分以内に達し得る。
【００３１】
１以上の態様において、本開示は、更に、ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に関し得る。特に、ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、ここで開示される方法に従って調製される膜であり得る。具体的には、ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、熱グラフト化プロセスから生じるときに、ここに別途記載される特性を示すように熱グラフト化され得る。前記特性は、特に、熱グラフト化された膜を、類似の材料であるものの、ＵＶグラフト化のような異なるプロセスにより形成される膜から区別し得る。
【００３２】
例示的な態様において、本開示に従うポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、その上にグラフト化されたアクリレート又はメタクリレートポリマーから構成される複数のポリマーセグメントを含む複数のポリマー繊維で形成された不織ウェブを含むことができ、前記複数のポリマーセグメントは、標的分子と結合するのに適した官能基を有し、前記複数のポリマーセグメントは、前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜が、約１時間以下、幾つかの態様においては好ましくは１０分以下、他の態様においては好ましくは５分以下の時間で、前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効であるように、前記不織膜に熱グラフト化される。
【００３３】
上記に加えて、種々の態様において、本開示はまた、標的分子を溶液から分離する方法にも関し得る。例えば、該方法は、前記溶液中の標的分子の少なくとも一部が、前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に結合するように、前記標的分子を伴う溶液を、記載されたようにポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に通すことを含み得る。
【００３４】
更に、本開示は、溶液からの標的分子の分離において、結合平衡に達するまでの時間を
短縮する方法に関し得る。上述及びここに別途記載されるように、本開示に従って調製されたポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、ＵＶグラフト化方法によって形成された膜では達成されない特性を示し得る。従って、本開示の膜は、高効率で高処理量の分離方法を開発するのに特に有用であり得る。１例において、溶液からの標的分子の分離において、結合平衡に達するまでの時間を短縮する方法は、不織ウェブを形成する複数のポリマー繊維上へのアクリレート又はメタクリレートポリマーの熱グラフト化により形成されるポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に、前記標的分子を伴う溶液を通過させる工程を含むことができ、それにより形成されたポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下、幾つかの態様においては好ましくは１０分以下、また、幾つかの態様においては好ましくは５分以下の時間で、前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効である。本開示は、ＵＶグラフト化技術の使用を妨げるＵＶ光の透過を許さない大きな寸法、厚さ及び密度の不織布又は支持体上でグラフト化を実施することができる方法を記載する。
【００３５】
本発明は、以下の態様を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
態様１：標的分子の捕捉における使用のために適したポリマーグラフト化及び官能化された不織膜の製造方法であって、ｉ）複数のポリマー繊維を含む不織ウェブを受け入れる工程；ｉｉ）前記複数のポリマー繊維上にアクリレート又はメタクリレートポリマーをグラフト化して、それに共有結合した複数のポリマーセグメントを形成し、それによりグラフト化されたポリマー繊維を形成する工程であって、該グラフト化工程は、ａ）前記不織ウェブを、熱フリーラジカル開始剤を含む溶液と接触させて、該熱開始剤を前記不織ウェブ内に吸収させる工程、ｂ）前記不織ウェブを少なくとも１種のアクリレート又はメタクリレートモノマーを含む溶液と接触させる工程、及び、ｃ）前記不織ウェブを熱に曝露して前記アクリレート又はメタクリレートモノマーの重合を開始させる工程を含み；及びｉｉｉ）前記グラフト化されたポリマー繊維を官能化して、前記グラフト化されたポリマー繊維の前記ポリマーセグメントに標的分子を結合させるのに適した少なくとも１種の官能基を結合させる工程を含む方法。
【００３７】
態様２：前記ポリマー繊維は、ポリオレフィン、ポリエステル、熱可塑性ポリマー及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００３８】
態様３：前記ポリマー繊維は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエーテルスルホン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される熱可塑性ポリマーを含む、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００３９】
態様４：前記ポリマー繊維は、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド６（ＰＡ６）、ポリアミド６−６（ＰＡ６−６）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４０】
態様５：前記方法は、複数のポリブチレンテレフタレート繊維を含む不織ウェブを受け入れる工程及びポリ（グリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ）を含むメタクリレートポリマーをグラフト化する工程を含む、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４１】
態様６：前記熱フリーラジカル開始剤は、アクリレート又はメタクリレートモノマーが重合する温度でラジカル種に分解するように設定された物質である、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４２】
態様７：前記熱フリーラジカル開始剤は、過酸化物又はアゾ化合物である、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４３】
態様８：前記熱フリーラジカル開始剤は、第三アミルペルオキシベンゾエート、４，４−アキソビス（４−カノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、２，２−ビス（第三ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ビス（１−（第三ブチルペルオキシ）−１−メチルエチル）ベンゼン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、第三ブチルヒドロペルオキシド、第三ブチルペルアセテート、第三ブチルペルオキシド、第三ブチルペルオキシベンゾエート、第三ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、クメンヒドロペルオキシド、シクロヘキサノンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、２，４−ペンタンジオンペルオキシド、過酢酸、過硫酸カリウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４４】
態様９：前記熱フリーラジカル開始剤を含む溶液は、約１０乃至約２００ｍＭの熱フリーラジカル開始剤濃度を有する、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４５】
態様１０：前記不織ウェブを、約１秒乃至約１０時間の間、前記熱フリーラジカルを含む溶液と接触させる、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４６】
態様１１：前記不織ウェブを熱に曝露する工程は、少なくとも約５０℃の温度で不織ウェブを加熱することを含む、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４７】
態様１２：前記少なくとも１種のアクリレート又はメタクリレートモノマーは、グリシジルメタクリレート、メタクリル酸、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４８】
態様１３：前記グラフト化されたポリマー繊維は、カチオン又はアニオン交換のために設定された官能基が前記標的分子と結合するように官能化される、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００４９】
態様１４：前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、前記標的分子の約１，０００ｍｍｏｌ／ｇまでの平衡結合容量を示す、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００５０】
態様１５：前記不織ウェブは、グラフト化前の不織ウェブの質量に基づいて約１％乃至約５０％のグラフト化による質量増加を示す、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００５１】
態様１６：前記不織ウェブは、約１μｍ乃至約２メートルの厚さを有する、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００５２】
態様１７：前記グラフト化は、約０．０５μｍ乃至約１００μｍの厚さを有するグラフト
層を形成する、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００５３】
態様１８：前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下の時間内に前記標的分子の結合平衡に達するように設定される、先行する又は後続の態様の何れかに記載の方法。
【００５４】
態様１９：先行する態様の何れかに記載の方法に従って調製されたポリマーグラフト化及び官能化された不織膜。
【００５５】
態様２０：溶液から標的分子を分離する方法であって、該方法は、前記溶液中の標的分子の少なくとも一部が、前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に結合するように、前記標的分子を伴う溶液を、先行する態様の何れかに記載のポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に通すことを含む方法。
【００５６】
態様２１：溶液からの標的分子の分離において、結合平衡に達するまでの時間を短縮する方法であって、該方法は、不織ウェブを形成する複数のポリマー繊維上へのアクリレート又はメタクリレートポリマーの熱グラフト化により形成されるポリマーグラフト化及び官能化された不織膜に、前記標的分子を伴う溶液を通過させる工程を含み、それにより形成されたポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下の時間で前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効である、方法。
【００５７】
態様２２：前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１０分以下の時間で前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効である、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５８】
態様２３：複数のポリマー繊維から形成された不織ウェブを含み、その上にグラフト化されたアクリレート又はメタクリレートポリマーから構成される複数のポリマーセグメントを含むポリマーグラフト化及び官能化された不織膜であって、前記複数のポリマーセグメントは、標的分子と結合するのに適した官能基を有し、前記複数のポリマーセグメントは、前記ポリマーグラフト化及び官能化された不織膜が、約１時間以下の時間で前記標的分子の結合平衡に到達するのに有効であるように、前記不織膜に熱グラフト化される、不織膜。
【００５９】
本開示のこれら及び他の特徴、観点、及び利点は、以下で簡潔に記載される添付の図面とともに以下の詳細な説明を読むことにより明らかになるであろう。本発明は、そのような特徴又は要素が、ここにおける特定の態様の記述において明確に組み合わせられているかどうかに拘わらず、上記の態様の２つ，３つ，４つ又はそれ以上の何れの組み合わせ、並びに、本開示に記載された２つ，３つ，４つ又はそれ以上の何れの特徴又は要素の組み合わせをも含む。この開示は、その種々の観点及び態様の何れにおいても、開示された発明の何れの分離可能な特徴又は要素も、文脈上別途明確に指示されない限り、組み合わせ可能であることが意図されていると見做されるよう、全体的に読み取られることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
図面の簡単な説明
本発明の態様の理解を提供するために、必ずしも一定の比率の縮尺ではない添付の図面が参照される。図面は単なる例示であり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】図１は、重合時間の範囲に亘る、異なるＧＭＡ濃度（％ｖ／ｖ）及び異なる重合温度における質量％増加により評価される熱誘導グラフト化をグラフで示し；
【図２】図２Ａ−２Ｆは、質量％増加を増加させるためのＰＢＴ不織布上への熱誘導グラフト化のＳＥＭ顕微鏡写真（４０００×）であり、ここで、（Ａ）はグラフト化前のＰＢＴ不織布を示し、（Ｂ）は１．５質量％増加にグラフト化されたＰＢＴ不織布を示し、（Ｃ）は７．５質量％増加にグラフト化されたＰＢＴ不織布を示し、（Ｄ）は１１．５質量％増加にグラフト化されたＰＢＴ不織布を示し、（Ｅ）は１６質量％増加にグラフト化されたＰＢＴ不織布を示し、そして、（Ｆ）は１９質量％増加にグラフト化されたＰＢＴ不織布を示し；
【図３】図３は、種々の条件で、熱誘導ポリＧＭＡグラフト化不織布をＵＶ誘起ポリＧＭＡグラフト化不織布と比較する、ＤＥＡ官能化ポリＧＭＡグラフト化不織布をグラフで示し（密度は元素分析を介して決定された）；
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、種々のグラフト化条件のためのアニオン交換官能化された熱グラフト化ＰＢＴ不織布の平衡ＢＳＡ結合をグラフで示し、ここで、（Ａ）は、熱グラフト化のために試験された種々の％ＧＭＡ（ｖ／ｖ）モノマー濃度を示し、そして（Ｂ）は、熱グラフト化のために試験された種々の重合温度を示し；
【図５】図５は、ＢＳＡ及びｈＩｇＧをそれぞれ捕捉するためのアニオン及びカチオン交換体として官能化された、熱的に及びＵＶ光によりグラフト化されたＰＢＴ不織布の平衡タンパク質結合容量の比較をグラフで示し（８０℃で３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡを伴ってグラフト化された熱グラフト化不織布）；
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、ＵＶ光（Ａ）及び熱誘導グラフト化（Ｂ）でグラフト化されたＰＢＴ繊維断面のＳＥＭ画像であり；
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＵＶ光誘起グラフト化（Ａ）及び熱誘導グラフト化（Ｂ）の結果として生じるポリＧＭＡグラフト層の概略図であり；
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、（Ａ）熱グラフト化不織布及び（Ｂ）ＵＶグラフト化不織布のポリＧＭＡグラフト化の種々の程度を伴う膜に結合する、膜の質量当たりに結合する質量を単位として報告された、種々の標的分子の平衡結合容量をグラフで示し；
【図９】図９は、熱グラフト化不織布及びＵＶグラフト化不織布のポリＧＭＡグラフト化の種々の程度を伴う膜に結合する、膜の質量当たりに結合するミリモル（ｍｍｏｌ）を単位として報告された、種々の標的分子の平衡結合容量をグラフで示し；
【図１０】６．５質量％、１４質量％及び２５質量％の増加でグラフト化された、ＵＶグラフト化ＰＢＴ不織布及び熱グラフト化ＰＢＴ不織布の両方における標的の分子量の関数としての標的結合をグラフで示し；
【図１１】図１１は、アニオン交換官能化されたグラフト化不織布の種々の接触時間でのＢＳＡ捕捉をグラフで示す：２０質量％及び５．９質量％の増加でＵＶグラフト化された（Ｈｅｌｌｅｒ等．，Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ  ｎｏｎｗｏｖｅｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１４巻，２０１６年，５３−６４頁出典のデータ）、並びに、２４質量％、１５質量％及び６質量％の増加で熱グラフト化された（全ての実験はバッチシステムで行った）；
【図１２】図１２は、カチオン交換官能化されたグラフト化不織布の種々の接触時間でのｈＩｇＧ捕捉をグラフで示す：１８質量％及び５質量％の増加でＵＶグラフト化された（Ｈｅｌｌｅｒ  ２０１５出典のデータ）、並びに、２４質量％、１５質量％及び６質量％の増加で熱グラフト化された（全ての実験はバッチシステムで行った）；及び
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、種々の質量％増加におけるタンパク質結合等温線をグラフで示し、ここで、（Ａ）は、ＢＳＡの捕捉のためのアニオン交換体として、及びｈＩｇＧの捕捉のためのカチオン交換体として官能化された熱グラフト化不織布に関し、（Ｂ）は、ＢＳＡの捕捉のためのアニオン交換体として、及びｈＩｇＧの捕捉のためのカチオン交換体として官能化されたＵＶグラフト化不織布に関する。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明は、これから、添付の図面を参照して以下でより完全に記載される。本発明は、多くの異なる形態で実施され得、そして、ここに示される態様に限定されるものと解釈すべきではなく；むしろ、これらの態様は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
【００６２】
本発明は、イオン交換又はアフィニティークロマトグラフィーを用いる特定の溶液からのタンパク質の分離、生物学的液体からの生体分子の捕捉、ガス、水及び他の溶媒からのイオン種の捕捉又は標的捕捉のために固定相を利用するその他の分離プロセスのような、種々の分離方法のために使用可能な官能化された膜を構築するための基材として、不織ウェブ又は繊維モノリスを利用する。そのような分離プロセスで使用される移動相は、ガス、水、有機溶媒又は生物学的液体であり得る。本発明の不織ウェブは、廃水処理用途にも使用され得る。
【００６３】
不織ウェブは、単一成分又は多成分繊維で構成され得、典型的には約０．１乃至約１００ミクロン（より一般的には約１乃至約１０ミクロン）の範囲内の種々のサイズの平均直径を有し得る。不織ウェブは、約１．０ｍ2／ｇ乃至約２．０ｍ2／ｇのような、約０．５乃至約３０ｍ2／ｇの例示的な特定のＢＥＴ表面積を有し得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「繊維」は、例えば、少なくとも約１００の直径に対する長さの比率の高いアスペクト比を有する織物の基本要素として定義される。さらに、「フィラメント／連続フィラメント」は、非常に高いアスペクト比を有する極めて長い長さの連続繊維である。「多成分繊維」という用語は、２成分繊維を含む物理的又は化学的性質によって異なる２種以上のポリマーを含む繊維を言及する。繊維材料、ウェブ、マット、バット又はシートに関してここで使用される「不織布」という用語は、繊維が不定又は不規則な配向で整列した繊維構造を言及する。本発明による繊維は多様であり、円形、長方形、正方形、楕円形、三角形及び多葉形を含むが、これらに限定されない何れのタイプの断面を有する繊維をも含み得る。特定の態様において、繊維は１つ以上の空隙を有し得、ここで、空隙は、例えば、円形、長方形、正方形、楕円形、三角形、又は多葉形の断面を有し得る。
【００６５】
不織ウェブを製造する手段は様々であり得る。一般に、不織ウェブは、典型的には、ウェブ形成、結合及び仕上げ処理の３段階で製造される。ウェブの形成は、当該技術分野で公知の任意の手段によって達成することができる。例えば、ウェブは、乾式プロセス、スパンボンドプロセス、又は湿式プロセスによって形成され得る。本発明の種々の態様において、不織ウェブは、スパンボンドプロセスによって製造される。スパンボンドは、種々のタイプの繊維紡糸プロセス（例えば、湿式、乾式、溶融、又は乳化）を使用し得る。溶融紡糸が最も一般的に使用され、ここで、ポリマーが液体状態に溶融され、ポリマーストランドがオリフィスの形状に従って凝固するように、小さいオリフィスを通って冷たい空気に押し込まれる。このようにして製造された繊維束が引き伸ばされ、即ち、機械的に引き伸ばされて（例えば３乃至５倍）繊維が配向される。不織ウェブは、その後、延伸された繊維を移動ベルト上に堆積させることによって形成される。一般的なスパンボンドプロセスは、例えば、Ａｐｐｅｌ等の米国特許第４，３４０，５６３号、Ｄｏｒｓｃｈｎｅｒ等の米国特許第３，６９２，６１８号、Ｍａｔｓｕｋｉ等の米国特許第３，８０２，８１７号、Ｋｉｎｎｅｙの米国特許第３，３３８，９９２号及び第３，３４１，３９４号、Ｈａｒｔｍａｎｎの米国特許第３，５０２，７６３号及びＤｏｂｏ等の米国特許第３，５４２，６１５号に記載されているが、それらは全て参照としてここに組み込まれる。スパンボンドは、典型的には、例えば、メルトブローよりも大きな直径のフィラメントを生成する。例えば、幾つかの態様において、スパンボンドは、約１０ミクロン以上の平均直径を
有する繊維を生成する。
【００６６】
より小さい直径（例えば、約１．５ミクロン未満、約１．０ミクロン未満、又は約０．５ミクロン未満）を有する繊維を得るために、多成分繊維を加工するための種々の方法が利用可能である。これらの方法は、典型的にはより大きな直径を有するスパンボンド材料に一般的に適用されるものの、それらはまた、メルトブローされた材料及び他の手段によって調製された繊維材料にも適用できることに留意されたい。例えば、幾つかの態様において、分割可能な多成分繊維が生成され（例えば、セグメント化されたパイ、リボン、海島、又は多葉を含むが、これに限定されない）、続いて分割又はフィブリル化されて、より小さな直径を有する２種以上の繊維を提供する。そのような繊維を分割し得る手段は多様であり、そして、水流交絡のような繊維に機械的エネルギーを与える種々のプロセスを含み得る。このプロセスの例示的な方法は、例えばＰｏｕｒｄｅｙｈｉｍｉ等の米国特許第７，９８１，２２６号に記載されているが、これは参照としてここに組み込まれる。
【００６７】
上記のように、特定の態様において、多成分繊維が生成され、続いて（例えば、繊維と溶媒とを接触させることによって）処理されて１つ以上の成分を除去する。 例えば、特定の態様において、海島型の繊維を製造し、処理して海成分を溶解させ、より小さな直径の繊維として島を残すことができる。 このタイプのプロセスの例示的な方法は、例えば、Ｋａｔｏ等の米国特許第４，６１２，２２８号に記載されているが、これは参照としてここに組み込まれる。
【００６８】
このようにして製造された繊維ウェブは、種々の坪量を有し得る。幾つかの態様において、不織ウェブの坪量は、約４００ｇ／ｍ2以下、約１５０ｇ／ｍ2以下、約１００ｇ／ｍ2以下又は約５０ｇ／ｍ2以下である。上記の範囲は、約１０ｇ／ｍ2の最小値で更に規定され得る。特定の態様において、不織布は、約２５ｇ／ｍ2乃至約１２５ｇ／ｍ2の坪量を有する。該布の坪量は、例えば、「Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔｅｓｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ
Ｍａｓｓ  Ｐｅｒ  Ｕｎｉｔ  Ａｒｅａ（Ｗｅｉｇｈｔ）ｏｆ  Ｆａｂｒｉｃ」と題されたＡＳＴＭ  Ｄ  ３７７６  ／  Ｄ  ３７７６Ｍ−０９ａｅ２に概説されている試験方法を用いて測定し得る。この試験は、単位面積当たりの質量の測定値を報告し、測定され、そして、平方メートル当たりのグラム（ｇ／ｍ2）として表される。幾つかの態様において、約１，０００ｇ／ｍ2までの坪量を有する繊維ベースの基材（例えば、不織ウェブ）と共に熱誘導グラフト化が使用され得る。
【００６９】
グラフト化に適した不織ウェブは、約１μｍから数メートル（例えば、約２メートル）の範囲の厚さを有し得る。特定の態様において、不織ウェブは、約１μｍ乃至約１００ｃｍ、約２μｍ乃至約１０ｃｍ、約１０μｍ乃至約１ｃｍ又は約５０μｍ乃至約０．５ｃｍの厚さを有し得る。他の態様において、不織ウェブは、３００μｍ乃至約２メートル、約４００μｍ乃至約１００ｃｍ又は約５００μｍ乃至約１ｃｍの厚さを有し得る。
【００７０】
不織ウェブのポリマーは変化し得るが、典型的には、グラフト化に適した熱可塑性ポリマーを含む。例示的なポリマーは、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン又はポリプロピレン）、ポリエステル及びポリアミドを含む。ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、コポリエステル及びこれらの組み合わせを含むポリエステルが特に有用である。ポリアミドのような熱可塑性樹脂も同様に特に有用であり、ポリアミド６（ＰＡ６）及びポリアミド６−６（ＰＡ６−６）を含み得る。ポリアミドに加えて有用な熱可塑性ポリマーは、例えば、ポリカーボネート及びポリエーテルスルホンを含む。
【００７１】
上記のように、不織ウェブのポリマー繊維は、ポリマーブラシ又はセグメントが繊維に化学的に結合されるグラフト化プロセスに付される。特に熱グラフト化が利用される。こ
こで使用されるように、熱グラフト化は、高分子モノマーを添加する前に熱フリーラジカル開始剤が基材（例えば、不織ウェブ中の繊維）に吸着又は吸収され、該熱フリーラジカル開始剤により開始されるようなポリマーの重合を引き起こすために、加熱が適用されるプロセスに関係するものと理解される。初期の熱グラフト化条件は、材料の全体的な結合容量に影響を及ぼす。グラフト化のための初期モノマー濃度の増加は、典型的には、より多くのタンパク質に結合するグラフト層（例えば、ポリ（グリシジルメタクリレート（“ポリＧＭＡ”）層）を結果として生じ、重合温度の上昇は、典型的には、より少ないタンパク質に結合するグラフト層を結果として生じる。
【００７２】
このプロセスは、典型的には、不織ウェブを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）のような好適な溶媒に溶解した熱フリーラジカル開始剤を含む第１の溶液と接触させ、該熱開始剤を不織ウェブに吸着又は吸収させる。好ましくは、該熱開始剤は、繊維表面に吸着又は吸収してラジカル開始部位を生成するように設定された何れの材料でもあり得る。該熱開始剤は、アクリレート又はメタクリレートモノマーが重合する温度でラジカル種に分解するように構成された何れの材料でもあり得る。種々の過酸化物及びアゾ化合物が特に適し得る。有用な熱開始剤の非限定的な例は、第三アミルペルオキシベンゾエート、４，４−アキソビス（４−カノバレリアン酸）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、過酸化ベンゾイル、２，２−ビス（第三ブチルペルオキシ）ブタン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）シクロヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチルヘキサン、２，５−ビス（第三ブチルペルオキシ）−２，５−ジメチル−３−ヘキシン、ビス（１−（第三ブチルペルオキシ）−１−メチルエチル）ベンゼン、１，１−ビス（第三ブチルペルオキシ）−３，３，５−トリメチルシクロヘキサン、第三ブチルヒドロペルオキシド、第三ブチルペルアセテート、第三ブチルペルオキシド、第三ブチルペルオキシベンゾエート、第三ブチルペルオキシイソプロピルカーボネート、クメンヒドロペルオキシド、シクロヘキサノンペルオキシド、ジクミルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、２，４−ペンタンジオンペルオキシド、過酢酸、過硫酸カリウム、並びに、それらの組み合わせを含む。本開示の態様に従う有用な熱開始剤の一群は、よって、前述の例示的材料の任意の１つ又は任意の組み合わせを含み得、同様に、前述の例示的材料の何れか１つ又は何れの組み合わせも含み得、同様に、前述の例示的材料の何れか１つ又は何れの組み合わせも排除し得る。
【００７３】
熱開始剤を含む溶液は、約１０乃至約２００ｍＭ、約２０乃至約１５０ｍＭ又は約３０乃至約１２０ｍＭの熱開始剤濃度を有し得る。一態様において、不織ウェブ又は他の繊維モノリスは、約５０乃至約９０ｍＭの熱開始剤濃度を有する溶液と接触される。不織ウェブ又は他の繊維モノリスは、室温又は約１５℃乃至約３０℃、約１７℃乃至約２８℃又は約２０℃乃至約２５℃の温度範囲で、約１分以下から約３時間の間、溶液中に浸漬させることができる。幾つかの態様において、グラフト化される不織ウェブ又は他の繊維モノリスは、開始剤溶液にディップされ、約１０秒又は更に少ない僅かな間だけ浸漬され得る。従って、開始剤は、浸漬、ウィッキング又はディッピングにより不織布中の繊維に吸着又は吸収され得、それによって、グラフト化される材料（即ち、不織基材）は、１秒乃至約１０時間、約５秒乃至約５時間又は約１０秒乃至約３時間より少ない時間の間、熱開始剤溶液と接触される。その後、不織ウェブは溶液から取り出され、過剰の溶液は該ウェブから吸い取られて該ウェブが乾燥される。不織ウェブは、その後、適切な溶媒（例えば、ＤＭＦ又はＤＭＡｃ）中に溶解されたアクリレート又はメタクリレートモノマー（例えば、ポリＧＭＡ）を含む溶液と接触させられ、溶液／不織ウェブは、重合を開始するために少なくとも約５０℃（例えば、約５０℃乃至約９０℃又は約６０℃乃至約９０℃）のような高温で加熱される。重合反応は、約５分乃至約２４時間、約１５分乃至約１２時間又は約３０分乃至約６時間のような期間の間継続される。特定の態様において、重合反応は、グラフト化されたポリマーセグメントの質量が、不織ウェブの質量の約１％乃至約５０％（
最も好ましくは、約１５乃至約４５％又は約２０乃至約３０％の質量増加）になるまで進行される。その後、不織ウェブはモノマー溶液から取り出され、洗浄されて非結合／未グラフト化されたモノマー又はポリマーセグメント並びに溶液自体が除去され、乾燥される。洗浄は、超音波処理を伴い得る。
【００７４】
グラフト化に使用されるポリマーは変化し得るが、典型的にはアクリレート又はメタクリレートポリマーであろう。グラフトポリマーは、特定の標的分子に対する親和性を高めるために機能化され得る不織ウェブの繊維にブラシ様の延長部を提供する。グラフトポリマーのためのモノマーの選択は変化され得、部分的に最終的な膜構造のために必要な所望の結合特性に依存するであろう。特定のモノマーは、本質的に、親和性又はイオン交換結合のために使用され得る官能基を有し、一方、他のモノマーは、必要な結合基を付加するためにさらなる官能化を必要とするであろう。例示的なモノマー及びそれらの可能な用途は以下を含む：グリシジルメタクリレート（更なる官能化のために適切）、メタクリル酸（弱カチオン交換膜）、２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリレート（弱アニオン交換膜）、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチル−アンモニウムクロリド（強アニオン交換膜）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ、親水性膜）、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（強カチオン交換膜）、２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（弱アニオン交換膜）、ブチルメタクリレート（疎水性相互作用膜）、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（更なる官能化のために適切）、２−エチルヘキシルメタクリレート（疎水性相互作用膜）及びそれらの組み合わせ。
【００７５】
上述のグラフト化は、その上にグラフト層又はセグメントを有する不織ウェブを結果として生じ得る。このようにして形成されたグラフト化されたセグメントは、約０．０５μｍから約１００μｍまでの範囲の厚さを有し得る。特定の態様において、グラフトポリマーは、約０．１μｍ乃至約１０μｍ、約０．１μｍ乃至約５μｍ又は約０．２μｍ乃至約５μｍの厚さを有し得る。幾つかの態様において、グラフト層は、不織ウェブを形成する複数の個々の繊維上に形成され得る。特に、グラフト層は実質的に全ての繊維上に形成され得る。より特には、グラフト層は、不織ウェブを形成する各繊維上に形成され得る。
【００７６】
必要であれば、ポリマーセグメント又はブラシは、各ポリマーセグメントが標的分子への結合に適する官能基を有するように、官能化され得る。そのような官能基とタンパク質のような標的分子との間で起こり得る例示的な結合は、イオン結合、水素結合及びファンデルワールス力を含み得る。例示的な官能基は、アミン基（第１級、第２級、第３級又は第４級アミンを含む）、スルホン酸基、カルボン酸基、リン酸基等を含む。そのような官能基を結合させる誘導体化反応は、典型的には、ポリマーブラシ上のエポキシ基又は他の反応性基を所望の官能基を含む分子と反応させることを含む。
【００７７】
以下に示すように、本発明のグラフト化された不織布は、ＢＳＡ及びｈＩｇＧの捕捉のために、それぞれ、弱アニオン及び強カチオン交換体に成功裏に誘導体化された。２４％のポリＧＭＡ質量増加に対して２００ｍｇ／ｇという高い平衡静的タンパク質結合容量が達成された。本発明のイオン交換熱グラフト化された不織布の平衡結合容量は、グラフト化のためのＵＶ誘起ラジカル重合を用いてグラフト化された類似のシステムよりも低かった。イオン交換体として官能化されたＵＶグラフト化されたポリＧＭＡ不織布は、特定の質量増加において、本発明の熱グラフト化されたポリＧＭＡ不織布よりも５乃至７倍多いタンパク質と結合した。しかしながら、タンパク質吸着の反応速度は、熱グラフト化された不織布が、平衡結合に達するまでに数時間を要するＵＶグラフト化された不織布と比較して、数分のオーダーの時間で平衡結合を達成することができたことを示した。同様の平衡結合容量は、１，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する小さな標的に関して、熱グラフト化された態様とＵＶグラフト化された態様との間で達成され得る。
【００７８】
グラフト化された不織材料の結合容量は変化し得、結合される標的分子及び／又は材料の特定の最終用途に基づいて所望されるように設定され得る。幾つかの態様において、本開示に従うポリマーグラフト化された膜は、標的分子の１，０００ｍｍｏｌ／ｇまでの、標的分子の平衡結合容量を示し得る（標的分子の少なくとも１ｍｍｏｌ／ｇの最小平衡結合容量を伴って）。より特には、標的分子の平衡結合容量は、標的分子の約１ｍｍｏｌ／ｇ乃至約１，０００ｍｍｏｌ／ｇ、約５ｍｍｏｌ／ｇ乃至約８００ｍｍｏｌ／ｇ又は約１０ｍｍｏｌ／ｇ乃至約６００ｍｍｏｌ／ｇであり得る。幾つかの態様において、平衡結合容量は、標的分子の分子量に基づき得る。例えば、約１００ｇ／ｍｏｌ乃至約１，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する標的分子の平衡結合容量は、標的分子の約５０ｍｍｏｌ／ｇ乃至約１，０００ｍｍｏｌ／ｇ又は約１００ｍｍｏｌ／ｇ乃至約８００ｍｍｏｌ／ｇであり得る。更なる例として、約２，０００ｇ／ｍｏｌ乃至約５０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する標的分子の平衡結合容量は、標的分子の約１０ｍｍｏｌ／ｇ乃至約３００ｍｍｏｌ／ｇ又は約２０ｍｍｏｌ／ｇ乃至約２００ｍｍｏｌ／ｇであり得る。更なる別の例として、約６０，０００ｇ／ｍｏｌ乃至約５００，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する標的分子の平衡結合容量は、標的分子の約２ｍｍｏｌ／ｇ乃至約１００ｍｍｏｌ／ｇ又は約５ｍｍｏｌ／ｇ乃至約８０ｍｍｏｌ／ｇであり得る。
【００７９】
１以上の態様において、本ポリマーグラフト化された膜は、種々の標的に結合するように設定され得る。標的は、荷電基の存在、分子量及び／又は特定の官能基に対する親和性に関して規定され得る。
【００８０】
ポリＧＭＡグラフト層の同じ質量％増加を伴うＵＶグラフト化及び熱誘導グラフト化材料は、著しく異なる構造特性を有し得る。種々の分子量の生体分子及びタンパク質のイオン交換結合の分析は、２種のグラフト化方法の間の構造的相違を補強する。両方のグラフト化の方法論のために、標的分子の分子量を増加させると、所定の程度のポリＧＭＡ被覆率において結合する分子の数の減少が結果として生じる。しかしながら、この観察は、熱グラフト化されたポリＧＭＡ不織布サンプルにおいてより顕著であり、ポリマーマトリックスが、より少ない利用可能な結合体積、より高い密度、拡散タンパク質の効率的な充填を妨げるより強固な構造、又はより大きなタンパク質によりアクセスできない小さな細孔構造の何れかを有することを示す。これらの構造的な差異は、熱グラフト化方法からの結果として生じるポリマー分岐と架橋の増加された程度に起因し得るが、それは、ＵＶ誘起グラフト化方法では観察されない。提案された２種のグラフト化方法の間の構造的な差異に拘わらず、それらは、１０-6Ｍのオーダーであると計算される解離定数を伴う結合の類似の強度を示し、それは、イオン交換ポリマーネットワーク上のタンパク質結合に矛盾しなかった。
【００８１】
図７に示すように、ＵＶ誘起グラフト化に対する熱グラフト化の差異のために、熱グラフト層は、ＵＶ誘起グラフト化からの層とは明確に異なり得る。分岐及び架橋における差異に加えて、本発明の熱グラフト層は、薄い厚さを有し得る。ｄが不織布中の繊維の厚さであり、ωがポリマー繊維の質量に対するグラフト化されたポリマー層の質量分率である場合、グラフト層の厚さδは数式１を用いて推定し得る。
【数１】
2019534902.tif 000003
ここで、ρ1及びρ2は、それぞれ繊維ポリマー及びグラフトポリマーの密度である。数式は、グラフト化による同一の繊維直径及び部分質量増加において、熱誘導グラフト層の密度がＵＶグラフトポリマー層の密度よりも大きい場合、対応する層の厚さδがより小さいことを示す。
このことは、図７中の構造と一致し、そして、観察された、ＵＶグラフト化された不織布よりも速い、熱誘導グラフト化された不織布における標的分子の平衡結合の達成を説明し得る。
【００８２】
特定の態様において、本発明の不織ウェブは、約１時間以内に平衡結合に達するような、短い接触期間において顕著な量の標的分子に結合するものとして特徴付けられ得る。例えば、特定の態様において、そのような平衡までの時間は、約２４％以下のグラフトポリマー（例えば、ポリＧＭＡ）の質量増加のためであり得る。更なる例において、約６％と約１５％の間の質量増加のような、より低い程度のポリＧＭＡグラフト化において、平衡ＢＳＡ結合が、幾つかの態様において、アニオン交換官能化熱グラフト化された不織布のタンパク質暴露の約１０分以下で達成される。約２４％の質量増加のような高い程度のポリＧＭＡグラフト化において、タンパク質曝露の約５分後に６０％を超える平衡結合容量に達することを伴って、約１時間以下の後に平衡ＢＳＡ結合が達成される。好ましくは、種々の態様において、本開示に従うポリマーグラフト化及び官能化された不織膜は、約１時間以下の時間内に標的分子の結合平衡に達するように設定され得る（即ち、１秒、２秒又は５秒であると理解される下限を伴う）。更なる態様において、標的分子の結合平衡に達する時間は、約１秒乃至約１２０分、約２秒乃至約９０分、約５秒乃至約６０分又は約１０秒乃至約３０分であり得る。
【００８３】
１以上の態様において、本不織ウェブは、標的結合平衡を達成するための短縮された時間と関連して規定され得る。グラフト材料は、種々の標的に結合するように設定され得る。特定の態様において、標的はタンパク質であり得る。結合平衡を達成する時間は、ここで定義される質量％増加に基づき得る、グラフト化の程度に依存し得る。例えば、グラフトポリマーの５質量％までの増加を有する本開示に従うポリマーグラフト化された不織基材は、約２０分以下、約１０分以下又は約５分以下（約１秒、約５秒又は約１５秒の了解された最小時間を伴う）の標的結合平衡を達成するための時間を示し得る。より特には、言及された条件下での標的結合平衡を達成するための時間は、約５秒乃至約２０分、約１０秒乃至約１０分又は約１５秒乃至約８分であり得る。更なる例において、グラフトポリマーの約６％乃至約１５％の質量増加を有する本開示に従うポリマーグラフト化された不織布基材は、約３０分以下、約２０分以下又は約１０分以下（約１秒、約５秒又は約１５秒の了解された最小時間を伴う）の標的結合平衡を達成するための時間を示し得る。より特には、言及された条件下での標的結合平衡を達成するための時間は、約１０秒乃至約３０分、約１５秒乃至約１５分又は約２０秒乃至約１０分であり得る。より更なる例において、グラフトポリマーの約１６％乃至約２５％の質量増加を有する本開示に従うポリマーグラフト化された不織布基材は、約１２０分以下、約９０分以下又は約６０分以下（約５秒、約１０秒又は約１５秒の了解された最小時間を伴う）の標的結合平衡を達成するための時間を示し得る。より特には、言及された条件下での標的結合平衡を達成するための時間は、約１５秒乃至約１２０分、約３０秒乃至約６０分又は約４５秒乃至約４５分であり得る。特定の態様において、上記のような標的結合平衡の時間は、標的としてのタンパク質の使用に基づいて評価され得る。特に、標的結合の時間は、ＢＳＡ又はｈＩｇＧの結合平衡の時間として評価され得る。しかし、更なる態様において、標的結合の時間は、小さな生体分子と関連して評価され得る。例えば、以下に提供される実施例は、ＡＴＰの結合能力を説明する。
【００８４】
上記に照らして、本開示は、幾つかの態様において、標的結合平衡に到達するために短縮された時間を有する分離方法に関連し得ることが理解され得る。例えば、分離方法は、ここに記載されるようなポリマーグラフト化された不織膜を提供すること及び該ポリマーグラフト化された不織膜を、結合するための標的を含む組成物と接触させることを含み得る。ここに記載されるようなポリマーグラフト化された不織膜は、何れの所望の標的にも結合するように官能化され得、そして、ここに別途記載されるような熱開始剤を用いる熱
開始で達成されるグラフトポリマーの特定の性質に照らして、依然として平衡までの短縮された時間を提供し得る。
【実施例】
【００８５】
材料及び試薬
Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ（トゥルコアン、フランス）は、５２ｇ／ｍ2の坪量を有する市販で入手可能なメルトブローされたＰＢＴ不織布を提供した。グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）はＰｆｌａｔｚ＆Ｂａｕｅｒ（ウォーターベリー、コネティカット州）から購入した。ＧＭＡ中の阻害剤を、予め充填した阻害剤除去カラムを通して除去して、ヒドロキノン及びモノメチルエーテルヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を除去した。ベンゾフェノン（ＢＰ）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。過酸化ベンゾイル（７０質量％）（Ｂｚ2Ｏ2）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水酸化ナトリウム、１−ブタノール、イソプロピルアルコール、トリス塩基、塩酸、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウム三水和物は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（フェアローン、ニュージャージー州）から購入した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタノール、硫酸及び酢酸をＢＤＨ（ウェストチェスター、ペンシルベニア州）から購入した。ジエチルアミン（ＤＥＡ）はＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ（ワードヒル、マサチューセッツ州）から購入した。亜硫酸ナトリウムはＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（フェアローン、ニュージャージー州）から購入した。固相抽出チューブはＳｕｐｅｌｃｏ（ベレフォンテ、ペンシルベニア州）から購入した。ウシ血清由来のアルブミン（ＢＳＡ）、卵白リゾチーム及びアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ヒト免疫グロブリンＧ（ｈＩｇＧ）は、Ｅｑｕｉｔｅｋ−Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．（カービル、テキサス州）から購入した。
【００８６】
ＰＢＴ不織布上への熱誘導ポリＧＭＡグラフト化
不織布ＰＢＴを７５×５０ｍｍのサイズの試料に切断し、グラフト化の前に秤量したところ、試料は約２００ｍｇであった。これらの試料をＤＭＦ中に７５ｍＭ  Ｂｚ2Ｏ2を含む熱開始剤溶液２０ｍＬ中に室温で１時間浸漬して、Ｂｚ2Ｏ2をＰＢＴの表面に吸着させた。熱開始剤で飽和された試料を開始剤溶液から取り出し、タオルの上に広げて置いて不織布の細孔から過剰の開始剤溶液を吸い上げた。その後、試料を特定の重合温度で２０ｍＬの熱グラフト化溶液に入れ、所定の時間の間グラフト化させた。グラフト化の溶液は、ＤＭＦ中における５、１０、２０、３０及び４０％（ｖ／ｖ）の種々のＧＭＡモノマー濃度から構成された。重合温度は、熱水浴（Ｉｓｏｔｅｍｐ  １１５、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フェアローン、ニュージャージー州）を用いて、７０℃、８０℃又は９０℃で一定に保った。グラフト化は３０分乃至６時間の何れでも進行させることができた。ポリＧＭＡグラフト化の後、試料を１００ｍＬのＴＨＦを含むフラスコに入れ、ＴＨＦ及び試料を伴うフラスコを超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ３５１０Ｒ−ＭＴ、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネティカット州）で３０分間超音波処理して未反応のグラフト化溶液又は非結合のポリＧＭＡの何れも除去し、１５分の超音波処理後にＴＨＦを１回交換した。ＴＨＦ洗浄に続いて、試料をフラスコから取り出し、１００ｍＬのメタノールを含むフラスコに入れ、試料とメタノールを含むフラスコを超音波浴で１０分間超音波処理して不織布からＴＨＦを除去した。メタノール洗浄に続いて、試料をフラスコから取り出し、空気中で一晩乾燥させた。不織布の最終質量を測定し、ポリＧＭＡグラフト化の程度を、グラフト化に起因する質量％の増加を単位とする数式２を使用して決定した。
【数２】
2019534902.tif 000004
上記の数式において、Ｗiはグラフト化前の初期の不織布の質量であり、ＷfはポリＧＭＡグラフト化後の最終の不織布の質量である。
【００８７】
比較のＰＢＴ不織布上へのＵＶ誘起ポリＧＭＡグラフト化
ＧＭＡグラフト化溶液は、溶媒としての１−ブタノール中の２０％ｖ／ｖ  ＧＭＡモノマーから構成された。光開始剤ベンゾフェノン（ＢＰ）をＢＰ：ＧＭＡ比１：２０（モル：モル）のグラフト化溶液に添加した。不織布ＰＢＴを、７５×５０ｍｍのサイズの試料に切断し、グラフト化前に秤量したところ、約２００ｍｇであった。不織布ＰＢＴ試料を、同様に７５×５０ｍｍのホウケイ酸ガラスの顕微鏡スライド上に設置して、グラフト化のために調製した。シリンジを使用して、１．５乃至２．０ｍＬのグラフト化溶液を膜上に均一に分配し、第２のホウケイ酸ガラススライドを不織布の上に置いた。ＵＶランプ（モデルＥＮ−１８０Ｌ、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ウェストベリー、ニューヨーク州）を使用して、不織布上へのポリＧＭＡのフリーラジカル重合を誘導した。ＵＶランプは、３９５ｎｍの波長、５ｍＷ／ｃｍ2の強度を有し、不織布試料は、光源から３ｍｍの位置に置かれた。試料を種々の曝露時間で照射して、異なる質量％の増加を伴う異なる程度のポリＧＭＡグラフト化を達成した。ポリＧＭＡグラフト化の後、試料を１００ｍＬのＴＨＦを含むフラスコに入れ、フラスコを、超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ３５１０Ｒ−ＭＴ、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネチカット州）で３０分間超音波処理して何れの未反応のグラフト化溶液又は非結合ポリＧＭＡも除去した。ＴＨＦ洗浄後、試料をフラスコから取り出し、１００ｍＬのメタノールを含有するフラスコに入れ、試料とメタノールを含むフラスコを超音波浴で１０分間超音波処理して不織布からＴＨＦを除去した。メタノール洗浄に続いて、試料をフラスコから取り出し、空気中で一晩乾燥させた。不織布の最終質量を測定し、ポリＧＭＡグラフト化の程度を、質量％の増加を単位とする数式２を使用して決定した。
【００８８】
ポリＧＭＡグラフト化ＰＢＴ不織布の官能化
熱及びＵＶ光の両方を用いてグラフト化されたポリＧＭＡグラフト化ＰＢＴ不織布は、５０％ｖ／ｖ  ジエチルアミン（ＤＥＡ）水溶液に浸漬することによって弱アニオン交換体を生成するように官能化され、それによりポリＧＭＡブラシ上に第３級アミンを生成した。約１００ｍｇ（３５×５０ｍｍ）のグラフト化ＰＢＴ不織布試料を１００ｍＬのＤＥＡ溶液に浸漬した。インキュベーションフード（Ｃｅｒｔｏｍａｔ（登録商標）ＨＫ、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、メルズンゲン、ドイツ）中に含まれるインキュベーションシェーカー（Ｃｅｒｔｏｍａｔ（登録商標）ＲＭ、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、メルズンゲン、ドイツ）を用いて、反応を１００ｒｐｍで攪拌しながら３０℃に保った。アミノ化に続いて、試料を１００ｍＬのＤＩ水を含むフラスコに入れ、過剰のＤＥＡを除去するためにフラスコを超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ３５１０Ｒ−ＭＴ、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネチカット州）に５分間置いた。超音波処理に続いて、ＤＩ水洗浄液を新鮮なＤＩ水で置き換え、この工程を、ｐＨ試験紙で７．０の中性ｐＨが確認されるまで繰り返し、１０回の洗浄が、すべてのＤＥＡが不織布から除去されることを確実にした。何れの未反応のエポキシ基も、試料を１００ｍＭの硫酸１００ｍＬに一晩浸漬することによって加水分解された。エポキシ基の加水分解に続いて、試料を１００ｍＬのＤＩ水を含むフラスコに入れ、該フラスコを超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ３５１０Ｒ−ＭＴ、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネチカット州）に５分間入れて、過剰の硫酸を除去した。超音波処理に続いて、ＤＩ水洗浄液を新鮮なＤＩ水で置き換え、この工程を、ｐＨ試験紙で７．０の中性ｐＨが確認されるまで繰り返し、１０回の洗浄が、すべての硫酸が不織布から除去されることを確実にした。次に試料を一晩空気乾燥した。
【００８９】
ポリＧＭＡグラフト化ＰＢＴ不織布は、スルホン酸基をポリＧＭＡブラシに結合させることによって、強カチオン交換体を生成するために官能化された。約１００ｍｇ（３５×５０ｍｍ）のグラフト化ＰＢＴ不織布試料を、亜硫酸ナトリウム、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及び水を含む、２０ｍＬの亜硫酸ナトリウム溶液（Ｎａ2ＳＯ3：ＩＰＡ：水＝１０：１５：７５質量％）中に浸漬した。反応を８０℃で８時間インキュベートした（Ｉｓｏｔｅｍｐ  １１５、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フェアローン、ニュージャージー州）。官能化に続いて、試料を１００ｍＬのＤＩ水を含むフラスコに入れ、フラスコを超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ３５１０Ｒ−ＭＴ、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネチカット州）に５分間入れて過剰の亜硫酸溶液を除去した。超音波処理に続いて、ＤＩ水洗浄液を新鮮なＤＩ水で置き換え、この工程を、ｐＨ試験紙で７．０の中性ｐＨが確認されるまで繰り返し、５回の洗浄が、すべての亜硫酸溶液が不織布から除去されることを確実にした。何れの未反応のエポキシ基も、１０ｍＬの１００ｍＭの硫酸中に試料を一晩浸漬することによって加水分解された。エポキシ基の加水分解に続いて、試料を１００ｍＬのＤＩ水を含むフラスコに入れ、該フラスコを超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ  ３５１０Ｒ−ＭＴ、Ｂｒａｎｓｏｎ
Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ダンベリー、コネチカット州）に５分間入れて、過剰の硫酸を除去した。超音波処理に続いて、ＤＩ水洗浄液を新鮮なＤＩ水で置き換え、この工程を、ｐＨ試験紙で７．０の中性ｐＨが確認されるまで繰り返し、１０回の洗浄が、すべての硫酸が不織布から除去されることを確実にした。その後、試料を一晩空気乾燥した。
【００９０】
材料特性
熱グラフト化及び比較のＵＶグラフト化方法の有効性、適合性及び均一性を評価するために、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−３２００Ｎ変圧走査型電子顕微鏡（ＶＰＳＥＭ）（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．、シャンバーグ、イリノイ州）を用いて走査型電子顕微鏡画像を得た。グラフト化不織布試料を、アルゴンガス中のＰｄ／Ａｕでスパッタコーティングした。作動距離３３ｍｍで、加速電圧５ｋＶを用いる顕微鏡を使用して、画像を捕捉した。４ｐｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（ヒルズバラ、ノースカロライナ州）のＲｅｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを使用してＳＥＭ顕微鏡写真を捕捉した。
【００９１】
ポリＧＭＡグラフト化後のＰＢＴ不織膜の表面化学組成を、ダイヤモンドＨＡＴＲ結晶（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を有するＮｉｃｏｌｅｔ（登録商標）ｉＳ（登録商標）１０  ＦＴ−ＩＲ分光計を使用してＡＴＲ−ＦＴＩＲにより特性決定した。各スペクトルは、４ｃｍ-1の分解能で６４スキャンで収集された。ビーム半径は４０００乃至６７５ｃｍ-1の逆波長の範囲を伴って５ｍｍであり、浸透の分析深さは２０００ｃｍ-1で約０．６７μｍであった。
【００９２】
ＤＥＡ改質の前及び後の試料中の窒素含有量を、試料を元素ガスＣＯ2、Ｈ2Ｏ及びＮ2まで完全に燃焼して、これらを検出することにより、ＰＥ  ２４００  ＣＨＮ元素分析装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて分析した。総窒素含有量の決定は、ＤＥＡリガンド密度の直接測定を提供した。
【００９３】
熱グラフト化ポリＧＭＡ不織布へのモデルタンパク質結合
異なる熱誘導グラフト化条件を用いてグラフト化されたＰＢＴ不織布の平衡タンパク質結合容量を調べて、結果として得られたグラフト層がタンパク質結合に対して変動を示すかどうかを決定することは興味深い。種々のポリＧＭＡ被覆率で、種々のモノマー濃度及び重合温度を用いてグラフト化された熱グラフト化ポリＧＭＡ  ＰＢＴ不織布が、弱アニオン交換膜として官能化された場合のそれらの平衡静的タンパク質結合容量について試験された。ＰＢＴ不織布は、特定の重合時間で、１０、２０及び３０％ＧＭＡ（ｖ／ｖ）の
ＧＭＡモノマー濃度及び７０、８０、９０℃の重合温度を用いてグラフト化されて、５、１０、１５及び２０％質量増加のポリＧＭＡ被覆率を達成した。これらの膜をＤＥＡで官能化して弱アニオン交換体とし、モデルタンパク質としての純粋なＢＳＡで接種して、それらの静的平衡結合容量を確立した。ＢＳＡは、６６．５ｋＤａの分子量及び４．７の等電点を有する［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州］。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬの固相抽出（ＳＰＥ）チューブに入れ、低イオン強度結合緩衝液、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０の３ｍＬで５回洗浄した。試料は、ＢＳＡ結合の前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ  ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間平衡化された。一旦平衡に達すると、２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０中の１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡの３ｍＬを各試料に添加し、１５時間終夜で結合させた。ｐＨ７．０の低イオン強度緩衝液は、ＤＥＡで官能化されたグラフト化ＰＢＴが正に荷電し、ＢＳＡが負に荷電してタンパク質結合を妨害するイオンの最小量で結合を促進することを確実にする。結合後、試料を３ｍＬの２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で洗浄した。全ての非結合タンパク質を除去するために２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０での５回の洗浄が必要であったが、２８０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光法を使用する５回目及び最終洗浄におけるごく僅かな量のタンパク質により検証された。結合したＢＳＡを、高イオン強度溶出緩衝液、３ｍＬの２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを溶出緩衝液として用いて溶出した。溶出緩衝液中の高濃度のイオンは、効果的にイオン相互作用を妨害し、不織布からタンパク質を除去する。溶出画分を集め、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて決定した。数式３を用いて、静的平衡結合容量（ｑ，膜質量当たりのタンパク質質量）値を決定した。
【数３】
2019534902.tif 000005
【００９４】
アニオン及びカチオン交換体として官能化された熱グラフト化及び比較ＵＶグラフト化ＰＢＴ不織布を比較するモデルタンパク質結合
熱及びＵＶ光を用いてポリＧＭＡでグラフト化されたＰＢＴ不織布は、モデルタンパク質の捕捉のために、弱アニオン及び強カチオン交換体として官能化され、２つのグラフト化方法の平衡結合容量におけるそれらの差異を比較した。熱グラフト化ＰＢＴ不織布は、この結合調査及びその後のすべてのタンパク質及び生体分子結合の試みのために、８０℃の重合温度で３０％（ｖ／ｖ）のモノマー濃度でグラフト化された。３乃至２６％の質量増加でグラフト化された、熱グラフト化及びＵＶグラフト化ポリＧＭＡ  ＰＢＧ不織布は、モデルタンパク質ＢＳＡの捕捉のための弱アニオン交換体を創出するＤＥＡで官能化された。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬの固相抽出（ＳＰＥ）チューブに入れ、３ｍＬの低イオン強度結合緩衝液、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で５回洗浄した。試料は、ＢＳＡ結合の前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ  ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間平衡化された。一旦平衡に達すると、２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０中の１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡの３ｍＬを各試料に添加し、１５時間終夜で結合させた。結合後、試料を３ｍＬの２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で洗浄した。全ての非結合タンパク質を除去するために２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０での５回の洗浄が必要であったが、２８０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光法を使用する５回目及び最終洗浄におけるごく僅かな量のタンパク質により検証された。結合したＢＳＡを、高イオン強度溶出緩衝液、３ｍＬの２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを溶出緩衝液として用いて溶出した。溶出画分を集め、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて決定したが、平衡結合容量は、数式３を用いて計算した。
【００９５】
同様の様式で、５乃至２５％の質量増加でグラフト化された熱グラフト化及びＵＶグラフト化ポリＧＭＡ  ＰＢＴ不織布を、モデルタンパク質ｈＩｇＧの捕捉のための強カチオン交換体を創出するスルホン酸で官能化した。これらの膜にモデルタンパク質としての純粋なポリクローナルｈＩｇＧを接種して、これらのカチオン交換膜の平衡結合容量を確立した。ポリクローナルｈＩｇＧは、１５０ｋＤａの分子量及び７乃至９の等電点を有する［Ｅｑｕｉｔｅｋ−Ｂｉｏ、カービル  テキサス州］。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬのＳＰＥチューブに入れ、３ｍＬの低イオン強度結合緩衝液、２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５で５回洗浄した。ｈＩｇＧ結合の前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ  ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間試料を平衡化させた。一旦平衡に達すると、２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５中の１０ｍｇ／ｍＬ  ｈＩｇＧの３ｍＬを各試料に加え、１５時間終夜で結合させた。ｐＨ５．５の低イオン強度緩衝液は、リン酸で官能化されたグラフト化ＰＢＴが負に荷電し、ｈＩｇＧが正に荷電してタンパク質結合を妨害するイオンの最小量で結合を促進することを確実にする。結合後、試料を３ｍＬの２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５で洗浄した。全ての非結合タンパク質を除去するために２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５での５回の洗浄が必要であったが、２８０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光法を使用する５回目及び最終洗浄におけるごく僅かな量のタンパク質により検証された。結合したｈＩｇＧを、３ｍＬの高イオン強度溶出緩衝液、２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。溶出緩衝液中の高濃度のイオンは、効果的にイオン相互作用を妨害し、不織布からタンパク質を除去する。溶出画分を集め、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて決定した。数式３を用いて、静的平衡結合容量を計算した。
【００９６】
イオン交換体として官能化された熱グラフト化及び比較ＵＶグラフト化ＰＢＴ不織布への様々な標的結合
結合における分子サイズの影響を調べるために、ＵＶ及び熱グラフト化ＰＢＴ不織布を、異なる分子量の種々の標的タンパク質及び生体分子で接種した。ＤＥＡでアニオン交換体として官能化された６乃至２６％の質量増加でグラフト化された熱グラフト化及びＵＶグラフト化不織布を、小さな生体分子であるＡＴＰで接種した。ＡＴＰは５０７Ｄａの分子量及び６．５のｐＫaを有し［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州］、アニオン交換クロマトグラフィー媒体によって容易に捕捉されることが知られている。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬの固相抽出（ＳＰＥ）チューブに入れ、３ｍＬの低イオン強度結合緩衝液、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で５回洗浄した。試料を、ＡＴＰ結合の前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ
ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間平衡化させた。一旦平衡に達すると、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０中の１０ｍｇ／ｍＬ  ＡＴＰの３ｍＬを各試料に加え、１５時間終夜で結合させた。結合後、試料を３ｍＬの２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で洗浄した。全ての非結合ＡＴＰを除去するために２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０での５回の洗浄が必要であったが、２５６ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光法を使用する５回目及び最終洗浄におけるごく僅かな量のＡＴＰにより検証された。結合したＡＴＰを、高イオン強度溶出緩衝液、溶出緩衝液としての２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ｍＬを用いて溶出した。溶出画分を集め、ＡＴＰ濃度を、２５６ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて決定し、数式３を用いて、平衡結合容量を計算した。
【００９７】
同様の様式で、６乃至２６％の質量増加でグラフト化された熱グラフト化及びＵＶグラフト化ポリＧＭＡ  ＰＢＴ不織布を、スルホン酸で官能化し、調査された他の生体分子と比較して中程度サイズのタンパク質であるリゾチームタンパク質で、接種した。リゾチームは、１４．３ｋＤａの分子量及び１１．３５の等電点を有する［Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州］。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬのＳＰＥチューブに入れ、３ｍＬの低イオン強度結合緩衝液、２０ｍＭアセテート  
ｐＨ５．５で５回洗浄した。リゾチーム結合の前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ  ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間試料を平衡化させた。一旦平衡に達すると、３ｍＬの２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５中の１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを各試料に加え、１５時間終夜で結合させた。結合後、試料を３ｍＬの２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５で洗浄した。全ての非結合タンパク質を除去するために２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５での５回の洗浄が必要であったが、２８０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光法を使用する５回目及び最終洗浄におけるごく僅かな量のタンパク質により検証された。結合したリゾチームを、３ｍＬの高イオン強度溶出緩衝液、２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。溶出画分を集め、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて決定した。数式３を用いて、静的平衡結合容量を計算した。
【００９８】
タンパク質吸着の動力学
これらの実験は、イオン交換体として官能化された熱グラフト化ポリＧＭＡ  ＰＢＴ不織布におけるタンパク質吸着の速度を決定することを目的とした。６、１５及び２４％の質量増加でグラフト化された熱グラフト化ポリＧＭＡ不織ＰＢＴを、ＢＳＡの捕捉のためのＤＥＡ又はｈＩｇＧの捕捉のためのスルホン酸で官能化した。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬのＳＰＥチューブに入れ、ＢＳＡを用いるアニオン交換実験のための２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０又はｈＩｇＧを用いるカチオン交換実験のための２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５である結合緩衝液で広範に洗浄した。タンパク質結合の前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ  ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間試料を平衡化させた。試料が一旦平衡に達すると、それらを、アニオン交換又はカチオン交換不織布のために、それぞれ３ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ又は３ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ｈＩｇＧのいずれかで接種した。タンパク質を５分乃至２４時間の様々な曝露時間で結合させた。結合後、ＢＳＡに結合したアニオン交換試料を３ｍＬの２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で５回洗浄し、ｈＩｇＧに結合したカチオン交換試料を３ｍＬの２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５で５回洗浄して何れの非結合タンパク質をも除去した。ＢＳＡは、高イオン強度溶出緩衝液、２０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．０＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ｍＬを用いて溶出させた。ｈＩｇＧは、高イオン強度溶出緩衝液、２０ｍＭアセテート  ｐＨ５．５＋１Ｍ  ＮａＣｌの３ｍＬを用いて溶出させた。溶出画分を２８０ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて分析し、各材料における結合したタンパク質の量を、数式３を用いて計算した。
【００９９】
タンパク質吸着等温線
アニオン交換及びカチオン交換ＰＢＴ不織布上にそれぞれに結合したＢＳＡ及びｈＩｇＧの吸着等温線を、熱グラフト化方法及び比較ＵＶ光グラフト化方法を用いてグラフト化された不織布のために調査した。約２０ｍｇ（２５×１５ｍｍ）の不織布試料を３ｍＬのＳＰＥチューブに入れ、ＢＳＡに結合するアニオン交換実験のための２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０又はｈＩｇＧに結合するカチオン交換実験のための２０ｍＭアセテートｐＨ５．５である結合緩衝液で広範に洗浄した。タンパク質結合前に、回転器（組織培養回転器、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ、テレ  ホート、インディアナ州）で結合緩衝液中において少なくとも３０分間試料を平衡化させた。試料が一旦平衡に達すると、それらを、アニオン交換膜との結合のためのＢＳＡ又はカチオン交換膜との結合のためのｈＩｇＧの何れかの０．０３ｍｇ／ｍＬ乃至１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度を有する３ｍＬのタンパク質で接種した。タンパク質を室温（２３℃）において１５時間終夜で結合させた。結合後、非結合タンパク質３ｍＬを定量化のために収集して非結合タンパク質濃度を決定した。その後、タンパク質結合アニオン交換不織布試料を３ｍＬの２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０で５回洗浄し、ｈＩｇＧに結合したカチオン交換試料を３ｍＬの２０ｍＭアセテートｐＨ５．５で５回洗浄して何れの非結合タンパク質をも除去した。ＢＳＡを、３ｍＬの高イオン強度溶出緩衝液、２０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出させた
。ｈＩｇＧを、３ｍＬの高イオン強度溶出緩衝液、２０ｍＭアセテートｐＨ５．５＋１Ｍ
ＮａＣｌを用いて溶出させた。非結合及び溶出画分の濃度を、ビシンコニン酸法（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）又は２８０ｎｍにおけるＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて分析した。数式３を使用して、不織材料に結合したタンパク質の量を決定した。特定の遊離タンパク質濃度で結合したタンパク質の量に関するデータを、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（ノーサンプトン、マサチューセッツ州）のＯｒｉｇｉｎ  ９ソフトウェアパッケージを使用して、Ｌａｎｇｍｕｉｒ吸着モデルに適合させた。
【数４】
2019534902.tif 000006
数式４において、ｑは不織布試料に結合したタンパク質の量（ｍｇ／ｇ）であり、ｑmは最大結合容量（ｍｇ／ｇ）であり、Ｃは遊離タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、そして、Ｋdは解離定数（ｍｇ／ｍＬ）である。
【０１００】
ＰＢＴにおけるポリＧＭＡの熱誘導グラフト化
熱開始剤Ｂｚ2Ｏ2、５％乃至４０％（ＤＭＦ中のｖ／ｖ  ＧＭＡ）の範囲のモノマー濃度を使用する市販のＰＢＴ上へのポリ（ＧＭＡ）の熱誘導グラフト化を最適化するために、７０℃乃至９０℃の重合温度を用いて調査した。試験した条件における種々の重合時間にわたるグラフト化の程度の結果を図１に示す。
【０１０１】
図１から、モノマー濃度を増加させると、所定の重合時間においてグラフト化の速度及びグラフト化の全体的な程度が増加することが明らかである。効率的なグラフト化を達成するためのモノマー濃度の好ましい範囲が存在することが決定された。５％（ｖ／ｖ）のＧＭＡモノマー濃度において、効果的にグラフト化は観察されなかった。１０％（ｖ／ｖ）のＧＭＡモノマー濃度において、ポリ（ＧＭＡ）グラフト化は観察されたが、重合の６時間後でさえグラフト化の全体的な程度は、ポリ（ＧＭＡ）の５％の質量増加に到達するだけの、非常に低いものであった。モノマー濃度を２０％（ｖ／ｖ）又は３０％（ｖ／ｖ）に増加させると、わずか２時間後に２０％に達する質量増加でグラフト化が起こった。４０％（ｖ／ｖ）のＧＭＡモノマー濃度において、結果としてグラフト化溶液の完全なる固化を生じる、急速な制御不能の塊状重合が起こったが、これは３０％（ｖ／ｖ）以下のモノマー濃度では観察されなかった。これは、熱誘導重合を用いたポリマー基材上へのビニルポリマーグラフト化の他の研究において観察され、溶液中の閾値濃度を超える重合は、ポリマー表面上への重合に勝る。これらの理由から、この重合スキームでは、ＧＭＡモノマー濃度を２０％乃至３０％（ｖ／ｖ）に保つことが推奨される。所定の温度において、図１に見られるように、３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡモノマー濃度は、２時間未満の重合時間での２０％モノマー濃度と比較して、より速い重合速度を示した。２時間未満の重合時間での２０％及び３０％ＧＭＡ（ｖ／ｖ）を用いた重合の経時的なグラフト化の程度は、図１に見られる直線関係を示したが、これは、モノマー濃度に関するグラフト化の一次速度を示す。従って、モノマー濃度を増加させることは、結果としてグラフト化の速度の増加を生じることを意味する。２時間より長い重合時間では、図１に見られるように、グラフト化の程度のプラトーが、８０℃以上の重合温度での２０％及び３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡで観察される。これは、熱開始剤Ｂｚ2Ｏ2を使用するポリエステル基材上へのビニルポリマーのグラフト化において観察される一般的な現象である。これには多くの潜在的理由、利用可能な開始剤の枯渇、ＰＢＴ繊維上の利用可能な活性部位における減少、溶液中のポリＧＭＡの増加した粘度に起因する拡散障壁の発達、又は開始と比較して増加されたポリＧＭＡグラフト化の終結速度が存在する。
【０１０２】
図１から、より高い温度が結果としてより短い重合時間でより高い観察された質量増加
を生じることを伴って、温度が重合速度において甚大な影響を有することは明らかである。重合温度は、Ｂｚ2Ｏ2から、ＰＢＴ表面で重合を開始することができるそのラジカルの形態への分解速度に影響する。温度を上昇することは、結果としてＢｚ2Ｏ2の増加された分解速度を生じ、ベンゼン中の６０、７８及び１００℃におけるＢｚ2Ｏ2の分解速度は、それぞれ２×１０-6、２．３×１０-5及び５×１０-4ｓ-1である。従って、重合温度における２０℃上昇ごとに、ラジカル形成の速度において１桁の増加を生じ、従って、より速い開始が観察される。７０℃でのグラフト化が、３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡの重合の４時間後に達成される最高値である８％の質量増加を伴って、非常にゆっくりと進行することが、図１において観察される。一方、８０℃及び９０℃で、重合は実質的により速く進行し、８０℃で約３時間、９０℃で２時間において、ポリＧＭＡ被覆の２０％質量増加を達成することができる。８０℃が、Ｂｚ2Ｏ2を使用する熱開始のための推奨される重合温度であることに留意すべきである。８０℃での３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡの熱グラフト化条件は、最も一貫し、そして、再現性のあるＰＢＴ不織布上へのポリＧＭＡグラフト化を提供した。
【０１０３】
不織布ＰＢＴ上へのポリＧＭＡの熱誘導グラフト化は、結果としてＰＢＴ繊維の外側の周囲に、完全で、共形で、高度に均一なポリＧＭＡ被覆を生じた。このことは、図２Ａ乃至図２Ｆ中に示されたＳＥＭ画像において見ることができる。
【０１０４】
図２Ｂ乃至２Ｆは、図２Ａに示す天然のＰＢＴ不織布上に存在しないポリＧＭＡグラフト層に起因する目に見える表面粗さを示す。高い質量増加（１９％の質量増加、図２Ｆ）でグラフト化されたＰＢＴ不織布に対する、低い質量増加（１．５％の質量増加、図２Ｂ）でグラフト化されたＰＢＴ不織布の比較から分かるように、増加したポリＧＭＡグラフト被覆は、結果として繊維の表面粗さの増加を生じる。熱グラフト化のこの方法が、何れの気孔閉塞も起こさずにＰＢＴ表面の全体にグラフト化することができ、結果として高度に均一で、共形で、慎重にグラフト化された繊維を生じることに留意することもまた重要である。
【０１０５】
ポリＧＭＡグラフト化後、ＡＴＲ−ＦＴＩＲを用いてグラフト化ＰＢＴ不織布の表面化学を分析し、熱グラフト化方法がポリＧＭＡに内在するペンダントエポキシ基の完全性を維持することを確認した。ブランクＰＢＴのスペクトルをポリＧＭＡで熱グラフト化されたＰＢＴと比較すると、特徴的なエステルのピーク（１１５０ｃｍ-1）及びエポキシのピーク（８４７ｃｍ-1及び９０７ｃｍ-1）が、グラフト化ＰＢＴ上に存在するものの、天然のＰＢＴ上には存在しないことが観察された。加えて、これらのピークの強度は、質量％の単位の増加においてポリＧＭＡの量に対して相対的に増加する。これらの結果は、熱グラフト化が、さらに官能基化することができる存続可能なエポキシペンダント基でポリＧＭＡを成功裏にグラフト化することを示している。
【０１０６】
種々のモノマー濃度及び重合温度でグラフト化されたＰＢＴ不織布の官能化後のリガンド密度の比較
元素分析を、弱アニオン交換体としてＤＥＡで官能化された熱グラフト化ＰＢＴ不織布において実施し、種々の条件下でグラフト化された膜のリガンド密度を決定した。７０℃乃至９０℃の重合温度、２０％及び３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡのモノマー濃度でグラフト化されたＰＢＴ不織布の質量％増加の関数としてのリガンド密度の結果を図３に示す。
【０１０７】
図３には、種々の質量％増加のためのＵＶ光でグラフト化されたＰＢＴ不織布のＤＥＡリガンド密度も示されている。ＵＶグラフト化は、ポリエステル及びポリオレフィン膜のビニルグラフト化のための主要な方法であり、ＰＢＴ不織布上へのポリＧＭＡのグラフト化のために広範に研究されてきた。これらの理由から、それはこの調査における熱グラフト化ＰＢＴ不織布の比較のための指標である。図３から、リガンド密度がグラフト膜の全
てのポリＧＭＡグラフト化の程度とともに増加することは明らかである。図３中のデータの線形性は、リガンド密度がポリＧＭＡ被覆の量と正比例することを示している。７０℃乃至９０℃の重合温度において、２０％及び３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡのモノマー濃度でグラフト化された不織布のリガンド密度の比較は、ポリＧＭＡグラフト被覆の全範囲に亘るこれらの条件の何れにおいても、ＤＥＡリガンド密度における観察可能な差異が存在しないことを示す。加えて、ポリＧＭＡグラフト被覆の全範囲にわたって、熱グラフト化不織布とＵＶグラフト化不織布との間のリガンド密度に差異は存在しない。このことは、熱グラフト化ポリＧＭＡ不織布及びＵＶグラフト化不織布のために評価された全ての条件において、容易に官能化されて弱アニオン交換結合部位となり得る利用可能なエポキシ基の数が同じであることの強い兆候である。
【０１０８】
誘導体化されたＰＢＴ不織布の平衡タンパク質結合イオン交換容量
これらの材料がイオン交換体として官能化された場合に、種々の熱誘導グラフト化条件が総合的な平衡結合容量にどのように影響するかを評価するために、ＢＳＡがモデルタンパク質として選択された。
図４Ａ及び図４Ｂは、アニオン交換体として官能化された際、特定の程度のポリＧＭＡ被覆で、種々のモノマー濃度及び種々の重合温度でそれぞれ熱グラフト化されたＰＢＴの平衡ＢＳＡ結合容量を示す。
【０１０９】
図４Ａ及び４Ｂの結果は、平衡タンパク質結合容量が、グラフト化溶液中の初期モノマー濃度とともに増加し、グラフト重合温度の上昇とともに減少することを示す。このことは、類似の質量％増加が達成され得るとしても、タンパク質結合のための環境がグラフト化条件に依存して変化することを示す。図３は、ＤＥＡリガンド密度が、殆どポリＧＭＡグラフト化の程度のみに依存し、グラフト化条件に依存していないことを示す；これにはＵＶ誘起グラフト化が含まれる。
このことは、図４Ａ及び４Ｂの両方と対照をなすが、これは平衡タンパク質結合のための特定の熱グラフト化条件における強い依存性を示す。従って、ポリＧＭＡの構造及びその結果としてのタンパク質結合部位の接近可能性は、グラフト化条件に大きく依存する可能性がある。総合的な平衡結合容量がポリＧＭＡグラフト化の程度（質量％増加）とともに増加することも、図４Ａ及び４Ｂの両方から明らかである。この観察は、ＵＶ光を用いてグラフト化されたイオン交換官能化されたポリＧＭＡグラフト化ＰＢＴ不織布において決定された平衡タンパク質結合が、グラフト化の程度に依存するという、前記の調査と一致する。
【０１１０】
熱誘導グラフト化アプローチ及びＵＶ誘起グラフト化アプローチを用いてグラフト化されたイオン交換官能化されたＰＢＴ不織布の平衡タンパク質結合容量を比較することは興味深い。図５は、ＢＳＡ及びｈＩｇＧのそれぞれの捕捉のための、アニオン及びカチオン交換膜の両方として官能化されたＵＶ及び熱グラフト化ＰＢＴ不織布の平衡タンパク質結合を比較する。８０℃の温度において３０％（ｖ／ｖ）ＧＭＡのモノマー濃度でグラフト化された熱グラフト膜は、図４に従う最も高い総合的なタンパク質結合容量を達成し、特に明記しない限り、主に全ての後続の調査のために使用された。
【０１１１】
図５は、平衡結合容量が、どのようにＵＶグラフト化ＰＢＴ不織布及び熱グラフト化ＰＢＴ不織布の両方のグラフト化の程度に正比例するかを示す。しかしながら、観察された平衡タンパク質結合容量は、アニオン及びカチオン交換体としてそれぞれ官能化されたＵＶグラフト化不織布で、それらの熱グラフト化された対応物と比較して、平均４．８及び６．７倍高い。図３は、熱グラフト化不織布及びＵＶグラフト化不織布の両方が、アニオン交換体として官能化された際、非常に類似したリガンド密度を有することを示した。しかしながら、図５中に示される平衡結合容量は、ＵＶグラフト化不織布において数倍高くなっている。この観察は、ポリＧＭＡグラフトの構造が、グラフト化の条件及び方法に依
存することを更に強固なものとする。ＵＶグラフト化が、熱誘導グラフト化アプローチを使用して得られたポリＧＭＡ構造よりも多くのタンパク質結合に対応し得るポリＧＭＡ構造を創出することが、図５から明らかである。ＵＶ光でグラフト化及び熱的にグラフト化されたＰＢＴ繊維断面の視覚的な比較を、それぞれ図６Ａ及び６Ｂに示す。
【０１１２】
図６Ａにおいて、ＵＶグラフト化不織布のポリＧＭＡグラフト層とＰＢＴ繊維との間には目に見える差異が存在する。この差異は、熱グラフト化ＰＢＴ不織布を表す図６Ｂ中には存在しない。熱グラフト化ポリＧＭＡ層の密度は、ＰＢＴの密度に近く、従って、ＳＥＭ顕微鏡法を用いて解像することができない可能性がある。
【０１１３】
放射線に基づく遊離ラジカル重合によるポリマー支持体上へのビニルグラフト化は、ポリマー表面に固定されるビニルポリマーブラシを創出することが知られている。これらのポリマーブラシは、その性質上、高度に線形で柔軟な触手となる傾向がある。このことは、ポリマーブラシの再配列能力に起因して、タンパク質がグラフト層の全体積にわたって効率的に充填され得る３次元結合環境を生じる。一方、熱誘導遊離ラジカル重合によるビニルグラフト化は、遥かに制御されていない。熱ベースの重合は、ＵＶ光による重合と比較してより速い連鎖移動の速度を生じる。連鎖移動の速度が速いと、高度に分岐したポリマー鎖ならびに高度に架橋されたポリマーネットワークが生じ、それらの両方は、グラフト化ポリＧＭＡ層の密度に顕著な影響を及ぼし得る。ＵＶ光誘起グラフト化及び熱誘導グラフト化から生じるポリＧＭＡマトリックスの構造における提案された差異の視覚的な模式図を図７に示す。
【０１１４】
この現象は、２つの方法でタンパク質に結合するグラフト層の能力を制限するだろう：第１に、より高い観察密度を有するグラフト化ポリＧＭＡ層は、特定の質量％増加のためのタンパク質に対応するためにより小さな体積を有し、第２に、高度に架橋されたポリマーネットワークは、その性質において、実質的により堅固であり、結果としてサイズ排除に起因するグラフト層の深さ内へのタンパク質拡散の問題及びより多くのタンパク質に対応するためのグラフトポリマーの再配列の欠如を生じ得る。連鎖移動速度は温度の関数であり、これは、図４Ｂで示されるような、重合温度を上昇させるためにタンパク質結合の観察された減少が起こった理由であり得、９０℃で合成されたポリＧＭＡグラフトは、７０℃で合成されたポリＧＭＡグラフトよりも高度に分岐し且つ架橋しやすい。
【０１１５】
種々の標的平衡結合
異なる分子量を有する標的分子を、熱グラフト化及び比較ＵＶグラフト化イオン交換不織布に結合させて、２つのグラフト化方法の間の結合環境を調査及び比較した。０．５ｋＤａの最も小さな分子量を有するＡＴＰをアニオン交換官能化不織布に結合させ、１４．３ｋＤａの２番目に小さな分子量を有するリゾチームをカチオン交換官能化不織布に結合させ、６６．５ｋＤａの２番目に大きな分子量を有するＢＳＡをアニオン交換官能化不織布に結合させ、１５０ｋＤａの最も大きな分子量を有するｈＩｇＧをカチオン交換官能化不織布に結合させた。種々の程度のポリＧＭＡグラフト化のこれらの分子の平衡結合（ｍｇ／ｇ）の結果は、熱グラフト化ＰＢＴ不織布及びＵＶグラフト化不織布において、それぞれ図８Ａ及び８Ｂに示された。
【０１１６】
図８Ａから、熱グラフト化不織布が、結合した質量を単位として、類似の平衡容量（２５％の質量増加で１００乃至１２０ｍｇ／ｇ）でＢＳＡ及びリゾチームに結合できることが明らかである。熱グラフト化不織布は、類似の容量でｈＩｇＧ及びＡＴＰに結合し、両方の分子は、ＢＳＡ及びリゾチームよりも顕著に多く結合した。これは、ＡＴＰがｈＩｇＧよりも３桁小さいものの、質量ベース（ｐｅｒ  ｍａｓｓ  ｂａｓｉｓ）で、殆ど同じ量で結合していることを考慮すると興味深い。ＢＳＡ及びリゾチームは、ＡＴＰとｈＩｇＧの間の分子量を有するが、質量ベースでは、顕著に少なく結合した。一方、図８Ｂは、
標的分子量及び質量当たりベースで結合する量に強い依存性を示す。ＵＶグラフト化不織布において、分子量が増加すると、図８Ｂで示されるように、質量ベースでの結合容量における増加を生じる。
【０１１７】
ポリＧＭＡグラフト化不織布の平衡結合容量がサイズ排除及び結合のために利用可能なポリＧＭＡ層の体積によって制限されるか、又は、結合部位の数によって制限されるかどうかを決定するために、図８の結合容量が図９においてモルベースで報告されている。
【０１１８】
標的分子量における桁数の違いに起因して、モル結合容量は図９において対数正規の尺度で示される。図９において、ＵＶグラフト化不織イオン交換体は、標的のサイズ及び結合モル数に強い依存性を示す。最も大きな標的であるｈＩｇＧは５乃至７ｍｍｏｌ／ｇで結合し、２番目に大きな標的であるＢＳＡは９乃至１７ｍｍｏｌ／ｇで結合し、２番目に小さな標的であるリゾチームは３０乃至６０ｍｍｏｌ／ｇで結合し、そして、最も小さな標的であるＡＴＰは１７０乃至６００ｍｍｏｌ／ｇで結合した。熱グラフトされた不織布は、試験した２種の最も大きな標的が、ほぼ同数の分子を結合したことを除いて、図１０で示したのと類似の傾向を示した。熱処理された不織布は、ＢＳＡ及びｈＩｇＧの両方を０．１乃至２ｍｍｏｌ／ｇ、リゾチームを１乃至１０ｍｍｏｌ／ｇ、そして、ＡＴＰを７０乃至４００ｍｍｏｌ／ｇで結合した。ＵＶグラフト化及び熱グラフト化不織布の両方が、特定の質量％増加のために類似の量のＡＴＰを結合することは、図９からも明らかである。結合したタンパク質の量（ｍｍｏｌ／ｇ）は、試験されたより大きなタンパク質において、ＵＶグラフト化及び熱グラフト化不織布の間で、劇的に変化する。このことは、ＡＴＰが両方の材料におけるポリＧＭＡ結合層全体に接近することができるほど十分に小さく、従って、質量％増加に依存することを示す。更に、このことは、ＵＶグラフト不織布と比較した際、タンパク質結合における大きな不一致を創出する熱グラフト化不織布中で発生するサイズ排除が存在するかもしれないことを示す。この可能性を評価するために、標的結合が、特定の質量％増加でグラフト化されたＵＶグラフト化及び熱グラフト化不織布の両方における標的分子量の関数として評価され、図１０に示された。
【０１１９】
図１０は、桁の異なる分子量及びモル結合容量を有する標的の結合におけるＵＶグラフト化及び熱グラフト化不織布の間の傾向を視覚化するのに役立つ対数−対数の尺度で示された。ＵＶグラフト化及び熱グラフト化不織布の両方において、分子量が増加すると、結果として平衡モル結合容量において劇的な減少を生じる。必然的に、所定のポリＧＭＡ結合体積中に限られた数の分子を納めることしかできず、従って、それらの分子量が増加するにつれて、より少ない分子を結合することになる。しかしながら、この効果の程度は、熱グラフト化不織布とＵＶグラフト化不織布の間で異なる。ＡＴＰ結合において、熱グラフト化及びＵＶグラフト化不織布の両方は、図１０に示されるように、特定の質量増加において、非常に類似した数のＡＴＰ分子を結合した。しかしながら、標的分子の分子量が増加するにつれて、結合分子数（ｍｍｏｌ／ｇ）は図１０において見られるように、２つのグラフト化方法の間で分岐する。より大きな標的の結合容量において生じる分岐は、熱グラフト化不織布がより少ない利用可能な結合体積を有するか、又は、ポリマーネットワークがＵＶグラフト化不織布に比べてより大きなサイズに排他的であることの何れかであることを示す。この結果は更に、熱誘導及び熱駆動重合を用いたグラフト化が、ＵＶグラフト化ポリＧＭＡネットワークと比較して高度に分岐及び架橋されたポリＧＭＡネットワークを提供する可能性があることを立証している。高度に枝分／架橋したポリＧＭＡネットワークは、その増加した密度に起因して、生体分子及びタンパク質に対応するために、より少ない体積しか有さない可能性がある。加えて、高度の架橋は、マトリックスをより堅固にし、タンパク質を効率的に充填するためのポリマーブラシの再配列を防止する可能性があり、同様に、より大きな分子にアクセスできない細孔も形成し得る。
【０１２０】
イオン交換体として官能化される熱及びＵＶポリＧＭＡグラフト化不織布への吸着速度
ＵＶ−光でグラフト化されたイオン交換官能化ポリＧＭＡグラフト化されたＰＢＴ不織布は、ポリＧＭＡ層の厚さの関数である非常に遅いタンパク質吸着速度を示す。タンパク質吸着の速度が、熱グラフト化方法及びＵＶグラフト化方法を用いてグラフト化されたアニオン交換官能化不織布上でのＢＳＡ吸着において異なるかどうかを調べるために、両方の材料を種々の接触時間でＢＳＡに曝露し、結合したタンパク質の量を評価した。アニオン交換熱グラフト化及びＵＶグラフト化不織布における種々の接触時間に亘るＢＳＡ結合の結果を図１１に示す。
【０１２１】
図１１から、ＵＶグラフト化ポリＧＭＡアニオン交換不織布が、極端に遅い吸着速度を示すことが示されている。５．９％の質量増加でグラフト化されたＵＶグラフト化ポリＧＭＡ不織布は、約４時間のタンパク質接触時間後に平衡に達することができ、２０％の質量増加において、平衡結合に達するのに８時間以上が必要であった。アニオン交換体として官能化された熱グラフト化不織布は、ＵＶグラフト化アニオン交換体と比較して、遥かに速い結合速度論を示した。より低い程度のポリＧＭＡグラフト化である、６％及び１５％の質量増加において、アニオン交換官能化熱グラフト化不織布におけるタンパク質曝露の５分後に平衡結合が達成された。高い程度のポリＧＭＡグラフト化である、２４％の質量増加において、タンパク質曝露の５分後に到達した６０％を超える平衡結合容量を伴って、１時間後に平衡ＢＳＡ結合に達した。
【０１２２】
ＵＶグラフト化方法及び熱グラフト化方法を用いてグラフト化されたポリＧＭＡグラフト不織布へのカチオン交換によるｈＩｇＧ吸着の速度論もまた調査した。図１２は、両方の方法でグラフト化されたカチオン交換不織布における種々の接触時間でのｈＩｇＧ捕捉の結果を示す。
【０１２３】
アニオン交換官能化不織布と同様に；ＵＶ法によってグラフト化されたカチオン交換官能化不織布は、熱でグラフト化されたカチオン交換官能化不織布と比較して、より遅いｈＩｇＧ吸着の速度を示した。１８％の質量増加において、カチオン交換ＵＶグラフト化ポリＧＭＡ不織布における平衡に達するのにほぼ１日かかる。低い被覆の程度である、５％の質量増加にＵＶグラフト化されたＰＢＴ不織布は、１時間後に到達した８０％を超える平衡容量を伴って、４時間後にｈＩｇＧ結合平衡に達したが、これは図１２から分るように、ＵＶグラフト化で２０％質量増加した不織布よりも実質的に速い。カチオン交換体として官能化された熱グラフト化ポリＧＭＡ不織布は、図１２に示すように、ＵＶグラフト化不織布と比較して、より速いｈＩｇＧ捕捉の速度を示した。６％及び１５％の質量増加でグラフト化された熱グラフト化不織布は、ｈＩｇＧ結合において、５分後に平衡に達した。２４％の質量増加において、熱グラフト化不織布は、タンパク質曝露の５分後に到達した６０％を超える平衡結合を伴って、１時間後に平衡に達する。
【０１２４】
不織ＰＢＴ上へのポリＧＭＡの熱グラフト化は、図１１及び１２に示されるように、イオン交換体として官能化された際、不織ＰＢＴ上へのポリＧＭＡのＵＶグラフト化と比較して、総合的により速いタンパク質吸着の速度を生じる。しかしながら、平衡結合容量は、図５、１１及び１２から分るように、イオン交換官能化ＵＶグラフト化された不織布と比較して、イオン交換官能化熱グラフト化不織布において著しく低い。熱グラフト化及びＵＶグラフト化によって作製されたポリＧＭＡ層の構造的な差異は、タンパク質吸着の速度において観察された差異の原因である可能性がある。熱グラフト化ポリＧＭＡ層が、ＵＶグラフト化ポリＧＭＡ層と比較して、より密度が高く、より堅固であり且つマトリックス中にアクセスできない細孔を含む場合、平衡に達するためにＵＶグラフト層中に生じなければならないものよりも少ないタンパク質に対応するためのタンパク質の拡散及び再配列しか存在していない。タンパク質の拡散及び再配列は、対流よりも実質的に遅い現象である。従って、イオン交換体として官能化された熱グラフト化不織布上のタンパク質結合の速度は、ＵＶグラフト化不織布が、タンパク質結合の遅い速度を生じる拡散制限を順守
する、対流的な物質移行によって主に支配されると考えられている。加えて、熱グラフト化ポリＧＭＡ層は、ポリマー分岐から生じる潜在的なより高い密度に起因して、より小さな体積を有すると考えられる。結合のために利用可能なより小さなポリＧＭＡ体積は、特定の質量％増加におけるより低い総合的な結合容量及びより短い距離（それを通ってタンパク質が拡散しなければならない）を結果として生じ、平衡結合に達するためのより短い時間も結果として生じ得る。
【０１２５】
吸着等温線
アニオン交換不織布上のＢＳＡ結合並びにカチオン交換不織布上のｈＩｇＧ結合における吸着等温線を、両方のグラフト化方法において実施した。種々の質量増加でグラフト化され、ＢＳＡの捕獲のためのアニオン交換体として及びｈＩｇＧの捕獲のためのカチオン交換体として官能化された、熱グラフト化及びＵＶグラフト化不織布におけるタンパク質吸着等温線を、図１３に示す。
【０１２６】
両方のグラフト化方法及び両方のイオン交換官能性における全てのタンパク質吸着は、図１３Ａ及び１３Ｂが示すように、Ｌａｎｇｍｕｉｒの挙動を示す。Ｌａｎｇｍｕｉｒ吸着モデル（数式４）を、図１３中に示されるデータに適合させた。
イオン交換体として官能化されたポリマーグラフト化不織布は、それらがグラフト化される表面に関して多層結合を示すものの、ポリマー層自体は、結合部位の数が電荷密度によって決定される単一サイト（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉｔｅ）の吸着剤として挙動する。見かけの最大結合容量（ｑm）及び解離定数（Ｋd）を、数式４を用いて計算した。これらの値を、熱グラフト化方法を用いてグラフト化された試料においては表１に、ＵＶグラフト化方法を用いてグラフト化された試料においては表２に示した。特に、以下の表１は、イオン交換体として官能化された熱グラフト化不織布における、図１３Ａ中に示される等温線データへのＬａｎｇｍｕｉｒモデルの直接適合を用いて得られた見かけの解離定数（Ｋd）及び最大結合容量（ｑm）を提供する。
【０１２７】
【表１】
2019534902.tif 000007
【０１２８】
以下の表２は、イオン交換体として官能化されたＵＶグラフト化不織布における、図１３Ｂ中に示される等温線データへのＬａｎｇｍｕｉｒモデルの直接適合を用いて得られた見かけの解離定数（Ｋd）及び最大結合容量（ｑm）を提供する。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
計算された解離定数（Ｋd）は、ＢＳＡ及びｈＩｇＧの捕捉に使用された両方のグラフト化の方法及び両方のイオン交換官能性を含む、試験された全ての試料において、１．２−７．５×１０-6Ｍの間である。これらの値は、×１０-6Ｍのオーダーにおける解離定数を有する、イオン交換官能化ポリマーブラシ及びイオン交換官能化ポリマーネットワークにおけるタンパク質結合において報告された値と一致する。これらのタイプの結合環境は、それらの低いＫd値から分るように、強いタンパク質−マトリックス相互作用を示す。しかしながら、溶離剤としての塩の添加は、イオン交換マトリックスとのタンパク質結合を効果的に分断し、イオン交換ポリマーブラシを崩壊させてタンパク質の置換を強制し、結合タンパク質の１００％回収を生じる。
【０１３１】
本発明の多くの変更及び他の態様は、本発明が関連する当業者に、前述の明細書中に提示された教示の利益を想起させるだろう。従って、本発明が、開示された特定の態様に限定されるものではなく、その変更及び他の態様は、添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されていることを理解されたい。ここでは特定の用語を使用しているが、それらは一般的且つ説明的な意味でのみ使用され、限定を目的とするものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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