(57)【要約】  本発明は、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）のような、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除された非天然細菌を提供する。任意に、細菌はまた、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、または二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼなどのＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除されている。本発明は、細菌をＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含有するガス状基質の存在下で培養することによって、生成物を生成するための方法をさらに提供する。【選択図】図１
2019514441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親細菌と比較して、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除されている、非天然細菌。
【請求項２】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項３】
ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼである、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項４】
前記非天然細菌はさらに、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されている、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項５】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項４に記載の非天然細菌。
【請求項６】
ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項４に記載の非天然細菌。
【請求項７】
前記非天然細菌が、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３−ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択される生成物を生成する、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項８】
前記非天然細菌が、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項９】
前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、請求項１に記載の非天然細菌。
【請求項１０】
ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で請求項１に記載の非天然細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
【請求項１１】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する前記酵素が、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記非天然細菌はさらに、前記親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記非天然細菌が、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する前記酵素が、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物が、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３−ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択されるアセチル−ＣｏＡ誘導生成物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記親細菌が、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３３６，６３９号の利益を主張し、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
エネルギーおよび化学物質のために化石燃料の抽出および利用を継続することによって引き起こされる有害な環境への影響は、それらの固有の有限性と相まって、持続可能な代替手段の開発に対する原動力である。この点に関して、ガス発酵が、産業廃ガスを燃料および化学物質に生物学的に変換するための有望な技術として浮上している。しかしながら、主としてガス発酵細菌について現在開発されている遺伝的ツールおよび酵素経路の欠如により、限られた一式の生成物のみが、ガス発酵を介して現在までに生成されている。したがって、燃料および化学物質の生成のための代替微生物および方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素の活性が低下または排除された非天然細菌を提供する。一般に、非天然細菌は、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を含む。好ましい実施形態では、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素は、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）である。
【０００４】
時には、非天然細菌は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されていて、例えば、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異をさらに有する。ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素は、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から好ましくは選択される。
【０００５】
これらの遺伝子修飾は、非天然細菌を、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３−ブタンジオール、およびラクテートなどの生成物の生成に好適にする。
【０００６】
特定の実施形態では、非天然細菌は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する細菌などの、Ｃ１固定細菌である。
【０００７】
非天然細菌は、典型的には、ＥＣ１．２．７．５によって定義される反応を触媒する酵素を含む親細菌、例えば、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから誘導される。
【０００８】
本発明はさらに、このような非天然細菌を培養することによって生成物を生成する方法を提供する。この培養は、ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるアセトゲン系エタノール生合成経路の図である。左端では、ホスホトランスアセチラーゼ（Ｐｔａ）、アセテートキナーゼ（Ａｃｋ）、およびアルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）を用いたＡＴＰ効率のよい間接エタノール経路が示されている。中間では、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）またはＣｏＡ依存性アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）を利用する直接エタノール生合成経路が示されている。ＡｌｓＳ＝アセトラクテートシンターゼ、２，３−ＢＤＨ＝２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、ＢｕｄＡ＝アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ＣＯＤＨ＝一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ＣｏＦｅＳＰ＝コリノイド鉄硫黄タンパク質、Ｆｄｏｘ＝酸化フェレドキシン、Ｆｄｒｅｄ＝還元フェレドキシン、ＨｙｔＡＢＣＤＥ＝ＮＡＤＰ依存性電子分岐型ヒドロゲナーゼ、Ｎｆｎ＝トランスヒドロゲナーゼ、Ｐｆｏｒ＝ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、Ｒｎｆ＝Ｈ＋−転位フェレドキシン：ＮＡＤ＋−オキシドレダクターゼ。
【図２】ａｏｒ１およびａｏｒ２  ＫＯ株のスクリーニングおよび検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）エクソンスパニングプライマーを用いたＰＣＲのゲル電気泳動、レーン３および４＝ａｏｒ１  ＫＯ株、レーン７〜１６＝ａｏｒ２  ＫＯ株、レーン１および６＝非テンプレート対照、レーン５および１７＝ＷＴ対照、Ｍ＝ｋｂにおけるＮＥＢ  ２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー、（Ｂ）ａｏｒ１  ＫＯ株（レーン１８〜２０）およびａｏｒ２  ＫＯ株（レーン２１〜２３）のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析、Ｌ＝ｂｐにおけるＰｒｏｍｅｇａ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカー。
【図３】ａｄｈＥ１ａ、ａｄｈＥ１ｂ、およびａｄｈＥ２  ＫＯ株のスクリーニングおよび検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）エクソンスパニングプライマーを用いたＰＣＲのゲル電気泳動、レーン２〜４＝ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株、レーン７〜９＝ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株、レーン１２〜１４＝ａｄｈＥ２  ＫＯ株、レーン１、６、および１１＝非テンプレート対照、レーン５、１０、および１５＝ＷＴ対照、Ｍ＝ＮＥＢ  ２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー、（Ｂ）ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株（レーン１６〜１８）、ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株（レーン１９および２０）、ならびにａｄｈＥ２  ＫＯ株（レーン２１〜２３）のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析。Ｌ＝Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカー。
【図４】ｐｙｒＥが回復したａｏｒダブルＫＯ株の検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）Δａｏｒ２およびａｏｒ１  ＫＯ株のＰＣＲスクリーニング、（Ｂ）回復したｐｙｒＥ対立遺伝子のためのウラシル独立栄養性ａｏｒダブルＫＯ株のＰＣＲスクリーニング、（Ｃ）ａｏｒ１  ＫＯ株のサザンブロット分析。Ｍ＝ＮＥＢ  ２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー、１〜６＝ａｏｒ２−ｓｅｑ−Ｆおよびａｏｒ２−ｓｅｑ−Ｒプライマー対、７〜１２＝ａｏｒ１−５５９ｓ−Ｆおよびａｏｒ１−５５９ｓ−Ｒプライマー対、１３〜１８＝ＡＣＥ−ｐｙｒＥ−ＦおよびＡＣＥ−ｐｙｒＥ−Ｒプライマー対、１、７、および１３＝非テンプレート対照、６、１２、１８、および２３＝Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴゲノムＤＮＡ対照、２〜５、８〜１１、１４〜１７＝復元されたｐｙｒＥを有するａｏｒダブルＫＯ株のクローン、１９〜２２＝ａｏｒ１  ＫＯ株のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ。
【図５】Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ、ΔａｄｈＥ１、およびΔａｄｈＥ１＋２株のスクリーニングを示す一連のゲル画像である。（Ａ）ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株のＰＣＲスクリーニング、（Ｂ）ΔａｄｈＥ１株のＰＣＲスクリーニング、（Ｃ）ΔａｄｈＥ１＋２株のＰＣＲスクリーニング。レーン５、８、９、１０、１５、および１６＝ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株、レーン２８、２９、３２、３３、および３８＝ΔａｄｈＥ１株、レーン４７〜５５＝ΔａｄｈＥ１＋２株、レーン１、１９、および４５＝非テンプレート対照、レーン１８、４４、および５６＝ＷＴゲノムＤＮＡ対照、Ｍ＝ｋｂのＮＥＢ  ２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー。
【図６】ＣＯのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ（円形）、ａｏｒ１  ＫＯ（三角形）、ａｏｒ２  ＫＯ（四角形）、およびａｏｒ１＋２  ＫＯ株（ひし形）の増殖、ヘッドスペース圧力変化、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）培養の最初から最後までのヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３−ブタンジオールプロファイル、および（Ｆ）ラクテートプロファイル、各株についてｎ＝４、ａｏｒ２  ＫＯを除いてはｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図７】補完されたａｏｒ１株の検証を示す一連のゲル画像である。（Ａ）エクソンスパニングａｏｒ１プライマーを使用するａｏｒ１補完ａｏｒ１株からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ（レーン２〜４）、Ｍ＝ＮＥＢ  ２−Ｌｏｇ  ＤＮＡラダー、１＝非テンプレート対照、５＝ＷＴゲノムＤＮＡ対照、６＝ａｏｒ１  ＫＯ対照、（Ｂ）補完株からのレスキューされたプラスミドｐＭＴＬ８３１５１−ＰａｃｓＡ−ａｏｒ１のＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ制限消化物（レーン７〜１２）。
【図８】２００ｋＰａ  ＣＯのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ、ａｏｒ１  ＫＯ、および補完されたａｏｒ１株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３−ブタンジオールプロファイル、および（Ｆ）ラクテートプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｏｒ１株（ｎ＝４）、正方形＝補完ａｏｒ１株（ｎ＝３）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図９】フルクトースに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ、ａｏｒ１  ＫＯ、ａｏｒ２  ＫＯ、およびａｏｒ１＋２ＫＯ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３−ブタンジオールプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｏｒ１株（ｎ＝３）、正方形＝ａｏｒ２株（ｎ＝３）、ひし形＝ａｏｒ１＋２  ＫＯ株（ｎ＝４）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１０】Ｈ２＋ＣＯ２上のＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ、およびａｏｒ１＋２  ＫＯ株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、正方形＝ａｏｒ１＋２  ＫＯ株（ｎ＝４）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１１】６０ｍＭアセテートおよび２００ｋＰａのＣＯの存在下で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ、およびａｏｒ１＋２  ＫＯ株ｔの増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３−ブタンジオールプロファイル、および（Ｆ）ラクテートプロファイル。円形＝ＷＴ、正方形＝ａｏｒ１＋２ＫＯ株、ｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１２】４０ｍＭプロピネートおよび２００ｋＰａのＣＯの存在下で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ、およびａｏｒ１＋２  ＫＯ株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３−ブタンジオールプロファイル、（Ｆ）ラクテートプロファイル、（Ｇ）プロピネートプロファイル、および（Ｈ）１−プロパノールプロファイル。円形＝ＷＴ、正方形＝ａｏｒ１＋２ＫＯ株、ｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１３】４０ｍＭブチレートおよび２００ｋＰａのＣＯの存在下で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴ、およびａｏｒ１＋２  ＫＯ株の増殖、ヘッドスペース圧力、および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）ヘッドスペース圧の変化、（Ｃ）アセテートプロファイル、（Ｄ）エタノールプロファイル、（Ｅ）２，３−ブタンジオールプロファイル、（Ｆ）ラクテートプロファイル、（Ｇ）プロピネートプロファイル、および（Ｈ）１−プロパノールプロファイル。円形＝ＷＴ、正方形＝ａｏｒ１＋２ＫＯ株、ｎ＝３、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１４】フルクトースに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴおよびａｄｈＥ  ＫＯ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３−ブタンジオールプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株（ｎ＝３）、逆三角形＝ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株（ｎ＝３）、正方形＝ａｄｈＥ２  ＫＯ株（ｎ＝３）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１５】フルクトースに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖、代謝産物、ａｄｈＥ２転写物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）相対ａｄｈＥ２  ｍＲＮＡプロファイル。円形＝ΔｐｙｒＥ（ｎ＝３）、正方形＝ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ（ｎ＝３）。エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１６】ＣＯに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴおよびａｄｈＥ  ＫＯ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３−ブタンジオールプロファイル。円形＝ＷＴ（ｎ＝４）、三角形＝ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株（ｎ＝３）、逆三角形＝ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株（ｎ＝２）、正方形＝ａｄｈＥ２  ＫＯ株（ｎ＝３）、エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【図１７】２００ｋＰａのＣＯに対するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖および代謝産物プロファイルを示す一連のグラフである。（Ａ）増殖プロファイル、（Ｂ）アセテートプロファイル、（Ｃ）エタノールプロファイル、および（Ｄ）２，３−ブタンジオールプロファイル。円形＝ΔｐｙｒＥ（ｎ＝３）、正方形＝ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ（ｎ＝３）。エラーバー＝標本平均の標準誤差。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
多くの微生物は、酸のアルデヒドへの酵素変換に依拠して、中心的な代謝機能を支えている。アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＡＯＲ）（ＥＣ１．２．７．５）は、いくつかの古細菌および細菌で、この機能を果たし、酢酸（アセテート）などの酸と還元フェレドキシンとの反応を触媒して、アセトアルデヒドなどのアルデヒドおよび酸化フェレドキシンを形成する。
【００１１】
ＡＯＲは、エタノールを生成するウッド・ユングダール微生物において特に重要である。還元的アセチル−ＣｏＡ経路としても知られているウッド・ユングダール経路は、アセチル−ＣｏＡへの唯一の直線的ＣＯ２固定経路であり（Ｄｒａｋｅ，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１１２５：１００−１２８，２００８）、最も効率的な非光合成炭素固定機構であると考えられている（Ｆａｓｔ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｅｎｇ，１：３８０−３９５，２０１２）。簡単に述べると、ウッド・ユングダール経路は、メチル分岐（東）およびカルボニル分岐（西）の２つの分岐からなる（図１）。メチル分岐では、ＣＯ２が還元されてホルマートになる。次に、ホルマートはテトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）との縮合により活性化され、１分子のＡＴＰを消費してホルミル−ＴＨＦを形成する。いくつかの反応にわたって、ホルミル−ＴＨＦはメチル−ＴＨＦに還元される。メチル分岐の最終段階において、メチル基は、コリノイド鉄−硫黄含有タンパク質（ＣｏＦｅＳＰ）に転移され、次いで、カルボニル分岐からのＣＯ分子に結合されて、二官能性一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）複合体を形成する。ＣＯで独立栄養的に増殖される場合、メチル分岐に必要なＣＯ２は、ＣＯＤＨ触媒水性ガスシフト反応により生成される。同様に、ＣＯ２で独立栄養的に増殖される間、ＣＯが、カルボニル分岐においてＣＯＤＨによってＣＯ２から形成される。
【００１２】
特に、アセトゲン系エタノール生成菌のエタノール生合成経路は、２つの主要経路（図１）：（ｉ）二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡｄｈＥ）またはＥ．ｃｏｌｉを含む他のエタノール生成細菌（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８１：７５７１−７５７９，１９９９）に見出されるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｌｄ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）を用いたアセトアルデヒドを介したエタノールへのアセチル−ＣｏＡの直接的な２段階逐次還元、ならびに（ｉｉ）アセテートを介して進行し、アルデヒド：フェレドキシンオキシドレダクターゼを使用して、Ａｄｈを介したエタノール合成の前に最初にアセテートをアセトアルデヒドに還元する、間接的な経路（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０７：１３０８７−１３０９２，２０１０；Ｍｏｃｋ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５−２９８０，２０１５）を含む。
【００１３】
２つのエタノール生合成経路の間の１つの重要な違いは、間接的な経路が、生成物の収率を制限し、高濃度で有毒であることが知られているので、一般に工業的発酵における望ましくない副産物と考えられるアセテートを還元することである。基質レベルのリン酸化（ＳＬＰ）を介したアセテート１モルあたり１つのＡＴＰの節約により利点を提供するように、全ての天然に単離されたアセトゲンはアセテートを形成し、これは独立栄養増殖のＡＴＰ制限条件下で重要である。熱力学的および化学量論的分析は、Ｈ２＋ＣＯ２でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのアセトゲンの増殖の間、エタノールへのアセテート還元を介した１．２ＡＴＰ／モルエタノールと比較して、アセトアルデヒドへのアセチル−ＣｏＡ還元を介したＡＴＰ収率は、たった０．５ＡＴＰ／モルエタノールであると推定した（Ｍｏｃｋ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５−２９８０，２０１５）。
【００１４】
したがって、ＡＯＲを介した間接的なエタノール生成は、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを介した直接的なエタノール生成と比較して、省エネルギーおよびアセテート還元の両方に関して利益を提供する。この酵素は代謝においてこのような重要な役割を果たすので、ＡＯＲの破壊はこれまでいかなる細菌種においても証明されていない。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、ＡＯＲ活性を低下または排除するために細菌を遺伝的に修飾することが、細菌を特定の種類の生成物の生成により好適にすることを発見した。
【００１５】
特に、ＡＯＲ活性の低下または排除は、エタノールへの炭素の流入を低減させ、他の非エタノール生成物への炭素の流入を増大させる。例えば、本発明の微生物は、アセチル−ＣｏＡ、アセトアセチル−ＣｏＡ、アセトアセテート、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソプレン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ピルベート、アセトラクテート、アセトイン、２，３−ブタンジオール、およびラクテートからなる群から選択される１つ以上の生成物を生成するために使用され得る。
定義と背景
【００１６】
微生物に関して使用される場合、「非天然」という用語は、微生物がヒトの手によって修飾され、言及された種の天然株には見出されない、すなわち、言及された種の野生型株には見出されない、少なくとも１つの遺伝子修飾を有することを意味することが意図される。
【００１７】
「遺伝子修飾」、「遺伝子改変」、または「遺伝子操作」という用語は、幅広く微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子操作された」という用語は、操作されたゲノムまたは核酸を含む微生物を指す。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモーターの挿入または欠失、核酸変異、修飾遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。
【００１８】
「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子修飾、操作、または組換えの生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、また、内在性核酸またはタンパク質の変異形態を含む、変異した核酸またはタンパク質を含む微生物を記載するために使用され得る。
【００１９】
「野生型」は、変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
【００２０】
「内在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在または発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の発現は、外在性プロモーターなどの外在性調節エレメントによって制御され得る。
【００２１】
「外在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在しない核酸またはタンパク質を指す。一実施形態では、外在性遺伝子または酵素は、異種（すなわち、異なる）株または種から誘導されて、本発明の微生物に導入または発現され得る。別の実施形態では、外在性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に、人工的にまたは組換えられて作製および導入されるか、または発現され得る。外在性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態にとどまるように適合され得る。
【００２２】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との接合により、さらに修飾され得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。
【００２４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素との接合などの任意の他の操作を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。
【００２５】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応を触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。したがって、酵素活性を「増大させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増大させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を増大させることを含む。同様に、酵素活性を「低下させること」は、酵素の活性を低下させること、酵素の量を低下させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を低下させることを含む。
【００２６】
「変異した」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【００２７】
特に、「破壊的変異」は、遺伝子または酵素の発現または活性を低下または排除する（すなわち、「破壊する」）変異である。破壊的変異は、遺伝子または酵素を、部分的に不活性にし得るか、完全に不活性にし得るか、または欠失し得る。破壊的変異は、ノックアウト（ＫＯ）変異であり得る。破壊的変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を低減する、防ぐ、または妨害する任意の変異であり得る。酵素の複数のアイソフォームを有する微生物において、１つ以上の破壊的変異が、酵素の単一のアイソフォーム、２つ以上のアイソフォーム、または全てのアイソフォームの発現または活性を低下または排除するために導入され得る。破壊的変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活性を低下または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の導入を含み得る。破壊的変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入され得る。
【００２８】
破壊的変異の導入は、本発明の微生物が誘導される親微生物と比較して、アセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成しない、または実質的にアセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成しない、または低減された量のアセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成する、本発明の微生物をもたらす。例えば、本発明の微生物は、アセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成しないか、または親微生物よりも、少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％少ないアセトアルデヒドおよび／もしくはエタノールを生成し得る。例えば、本発明の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０、０．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満のアセトアルデヒドおよび／またはエタノールを生成することができる。
【００２９】
「変異形」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列などの、参照核酸およびタンパク質の配列から変化する、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異形核酸またはタンパク質を使用して実施されてもよい。例えば、変異形タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異形遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異形プロモーターは、参照プロモーターと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
【００３０】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
【００３１】
「親微生物」は、本発明の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物において発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように修飾され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物によって含有されなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本発明の微生物は、また、親微生物において発現された１つ以上の酵素を発現しないまたはより少ない量を発現させるように修飾され得る。
【００３２】
本発明の微生物は、機能特性および／または構造特性に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物、および／またはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから誘導され得る。表１は、微生物の代表的な一覧を提供し、それらの機能および構造特性のうちいくつかを特定する。
【表１】
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【００３３】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるＣ１固定微生物から誘導される。
【００３４】
「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、もしくは死滅し得る。典型的には、本発明の微生物は嫌気性細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される嫌気性細菌から誘導される。
【００３５】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物としてアセテート（または酢酸）を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、ならびにアセチル−ＣｏＡおよびアセテートなどのアセチル−ＣｏＡ誘導生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物はアセトゲンである。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるアセトゲンから誘導される。
【００３６】
「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、または生成することが可能である微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンから誘導される。しかしながら、ＡＯＲおよびＡｄｈＥはエタノール生合成に関与するので、微生物のＡＯＲおよび／またはＡｄｈＥの破壊は、エタノール生成に関して変異した表現型をもたらし得る。
【００３７】
「独立栄養生物」は、有機炭素がなくても増殖することが可能な微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される独立栄養生物から誘導される。
【００３８】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素の唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な微生物である。典型的には、本発明の微生物はカルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物から誘導される。
【００３９】
「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが可能な微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物はメタン資化性菌であるか、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本発明の微生物はメタン資化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
【００４０】
本発明の微生物が誘導される親微生物は、一般に、ＥＣ１．２．７．５で定義される反応を触媒する酵素を含む。この酵素は、それらの対応するアルデヒドへの酸の変換を担う。より具体的には、この酵素は、カルボキシレート＋２Ｈ＋＋２還元フェレドキシンの、アルデヒド＋Ｈ２Ｏ＋２酸化フェレドキシンへの変換を触媒する。好ましい実施形態では、この反応を触媒する酵素はＡＯＲである。
【００４１】
アセトゲンにおいて、ＡＯＲの活性は、（ＣＯデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．２．７．４を介して）酸化ＣＯまたは（フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．１２．７．２または１．１２．１．４を介して）水素に連結され得て、両方とも還元フェレドキシンを得る（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２０−３２５，２０１１；Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０７：１３０８７−１３０９２，２０１０）。例えば、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムは、タンデムに現れ、潜在的に遺伝子重複の結果である２つのａｏｒアイソフォーム（ＣＡＥＴＨＧ＿００９２および０１０２）および２つのａｄｈＥ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿３７４７および３７４８）をコードする（Ｂｒｏｗｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，７：１−１８，２０１４）。Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋｏｐｋｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，１０７：１３０８７−１３０９２，２０１０；Ｌｅａｎｇ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７９：１１０２−１１０９，２０１３）にも同じ配置が見られる。
【００４２】
好ましくは、親微生物は、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される細菌である。一実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉである。好ましい実施形態において、親微生物は、２０１０年６月７日にドイツのＤ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ  ７Ｂに位置するＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）にブダペスト条約の条項下で２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１である。
【００４３】
「〜から誘導される」という用語は、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成するように、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されることを示す。そのような修飾または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に、本発明の微生物は、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ、Ｂｌａｕｔｉａ生成物、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｅｇｅｌｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｙｅｌｌｏｗｓｔｏｎｉｉ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される親微生物から誘導される。一実施形態では、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉから誘導される。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１から誘導される。
【００４４】
以下の表は、ＡＯＲ遺伝子／酵素を含む微生物の例示的な一覧を提供する。
【表Ａ】
2019514441.tif 000004
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから誘導される。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって最初に報告され、かつ特徴付けられた。
【００４６】
これらの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約および発酵代謝のモードを有する。さらには、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、約２２〜３０モル％の含有量でＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態およびサイズを有し（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖する）、約４〜７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことには、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成し、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【００４７】
しかしながら、これらの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これらの種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらには、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、ウッド・ユングダール経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種において同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。
【００４８】
したがって、要するに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉの特徴の多くは、その種に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【００４９】
本発明の微生物はまた、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉの分離株または変異体から誘導され得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの分離株および変異体としては、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの分離株および変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株および変異体としては、ＰＩ１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が挙げられる。
【００５０】
加えてまたはあるいは、本発明の微生物が誘導される親微生物は、ＥＣ１．２．１．１０／ＥＣ１．１．１．１で定義される反応を触媒する酵素、例えばＡｄｈＥを含み得る。本発明の微生物は、親細菌と比較して、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する少なくとも１つの酵素の活性が低下または排除されていて、例えば、ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、少なくとも１つの破壊的変異を有し得る。ＥＣ１．２．１．１０および／またはＥＣ１．１．１．１によって定義される反応を触媒する酵素は、二官能性アルデヒド／アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群から好ましくは選択される。これらの酵素のうち１つ以上の発現を破壊することが、さらに、炭素流入をエタノールから離して非エタノール生成物に向けることができる。
【００５１】
「基質」は、本発明の微生物のための炭素および／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子などの他の非炭素構成要素をさらに含み得る。特定の実施形態では、基質は、グルコースまたはリグノセルロースなどの炭水化物も含み得る。
【００５２】
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０〜７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼または高炉ガス）、約２０〜３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、または約１５〜４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１〜１０または１〜２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００５３】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００５４】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００５５】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替の形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００５６】
基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副産物として得られる、または何らかの他の源からの廃ガスであってもよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の従来の方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【００５７】
基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど、合成ガスであってもよい。別の実施形態において、合成ガスは、一般廃棄物または産業廃棄物のガス化から得てもよい。
【００５８】
基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの任意の望ましくない不純物を除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００５９】
本発明の微生物は、１つ以上の生成物を生成するように培養され得る。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍは、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレンおよび他のテルペン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、メバロン酸（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、ならびに１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、パラヒドロキシ安息香酸（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、サリチラート（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、２−アミノベンゾエイト（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、ジヒドロキシベンゾエイト（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３−ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１，３−ブタンジオール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、２−ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、アジピン酸（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、３−メチル−２−ブタノール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、２−ブテン−１−オール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、イソバレレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、またはイソアミルアルコール（ＷＯ２０１７／０６６４９８）を生成するか、または生成するように操作され得る。これらの生成物の１つ以上に加えて、本発明の微生物はまた、エタノール、アセテート、および／または２，３−ブタンジオールを生成することもできる。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。
【００６０】
「天然生成物」は、遺伝子修飾されていない微生物によって生成される生成物である。例えば、エタノール、アセテート、および２，３−ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉの天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子修飾された微生物によって生成されるが、遺伝子修飾された微生物が誘導された遺伝子修飾されていない（例えば、親の）微生物によって生成されていない生成物である。非天然生成物を生成するための経路および酵素は、先に参照したように当該分野で見出すことができる。
【００６１】
「選択性」は、微生物によって生成される全ての発酵生成物の生成に対する所望の生成物の生成の比率を指す。本発明の微生物は、特定の選択性で、または最小の選択性で生成物を生成するように操作され得る。一実施形態において、所望の生成物は、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、または７５％を占める。一実施形態において、所望の生成物は、本発明の微生物が少なくとも１０％の所望の生成物への選択性を有するように、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態において、所望の生成物は、本発明の微生物が少なくとも３０％の所望の生成物への選択性を有するように、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占める。
【００６２】
「効率を増大させること」、「増大した効率」などは、増殖速度、生成物生成速度もしくは体積、消費される基質の体積あたりの生成物体積、または生成物選択性を増大させることを含むが、これらに限定されない。効率は、本発明の微生物が誘導される親微生物の性能に対して測定され得る。
【００６３】
典型的には、培養はバイオリアクタ中で実施される。「バイオリアクタ」という用語は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、「培養」および「発酵」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期および生成物生合成期の両方を包含する。
【００６４】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知である。
【００６５】
培養／発酵は、望ましくは、所望の生成物の生成のために適切な条件下で実施されるべきである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【００６６】
上昇した圧力でバイオリアクタを動作させることは、気相から液相へのガス物質移動の増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。
【００６７】
特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。
【００６８】
生成物は、例えば、分留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、および、例えば、液−液抽出などの抽出発酵など、当該技術分野で既知の任意の方法またはその組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製され得る。特定の実施形態において、生成物は、ブロスの一部分をバイオリアクタから連続除去し、微生物細胞をブロスから分離し（濾過により簡便に）、かつ１つ以上の生成物をブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコールおよび／またはアセトンは、例えば、蒸留によって回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、バイオリアクタに戻される。生成物が除去された後に残っている無細胞浸透水も、好ましくは、バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）が、無細胞浸透水に添加されて、それがバイオリアクタに戻される前に培地を補充し得る。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００７０】
実施例１
この実施例は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡＯＲおよびアルコールデヒドロゲナーゼにおける破壊的変異の成功した導入を実証する。
【００７１】
１．１  細菌株および増殖条件
この実施例で使用した細菌株を、表２に記載する。
【表２】
2019514441.tif 000005
【００７２】
一般的なプラスミドの増殖、クローニング、および接合に使用されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を、抗生物質（２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン）の存在下、ＬＢ培地中３７℃で培養した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ  １００６１は、ドイツ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）ＧｍｂＨから購入し、ＣａＧＭ培地中で厳密な嫌気的条件下で慣習的に培養した。
【００７３】
増殖培地ＣａＧＭは、（Ｌあたり）０．２５ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．１ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇの酵母エキス、０．５ｍｌの２ｇ／Ｌのレサズリン、２０ｇの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．０５ｇのＦｅ（ＳＯ４）２・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇの酢酸ナトリウム・３Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのニトリオロ三酢酸（ＮＴＡ）および１０ｇのフルクトース（従属栄養性の増殖用のみ）、１０ｍＬの微量元素溶液（ＴＳＥ）、ならびに１０ｍＬのＷｏｌｆｅのビタミン溶液を含有した。ＴＳＥ溶液の組成は、（Ｌあたり）２ｇのＮＴＡ、１ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｇのＮａ２ＳｅＯ３、０．０２ｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および０．０２ｇのＮａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏである。ビタミン溶液の組成は、（Ｌあたり）２ｍｇのビオチン、２ｍｇの葉酸、１０ｍｇの塩酸ピリドキシン、５ｍｇのチアミンＨＣｌ、５ｍｇのリボフラビン、５ｍｇのニコチン酸、５ｍｇのパントテン酸カルシウム、０．１ｍｇのビタミンＢ１２、５ｍｇのｐ−アミノ安息香酸、および５ｍｇのチオクト酸である。培地を嫌気的に調製し、培地のｐＨを滅菌前に５．８に調整した。接種の前に、１００ｍＬのＣａＧＭ培地を、１ｍＬの還元剤１（１００ｍＬの水あたり４ｇのシステインＨＣｌ）および１ｍＬの還元剤２（１００ｍＬの水あたり７．６４ｇのＮＴＡ、５．３３ｇのＮａ２ＣＯ３、および８．５ｍＬのＴｉＣｌ３）で還元した。
【００７４】
液体培地上での細胞増殖を６００ｎｍで分光光度的にモニターした（ＯＤ６００）。ヘッドスペース圧力の変化は、Ｒｕｇｇｅｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｇａｕｇｅ  ＤＰＧ１２０（Ｏｍｅｇａ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて測定した。寒天プレート上でのＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの増殖のために、必要に応じて抗生物質（７．５μｇ／ｍＬチアンフェニコール、６μｇ／ｍＬクラリスロマイシン）を有するＹＴＦ固体培地（１０ｇ／Ｌフルクトース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１６ｇ／Ｌトリプトン、０．２ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ細菌寒天（ｏｘｏｉｄ）、ｐＨ５．８）を用いた。全ての変異誘発作業は、３７℃の嫌気性ワークステーション内で行った（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｌｅｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）。株の比較のために、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ野生型（ＷＴ）または組換え株を含有する３〜４の生物学的複製物を、増殖基質として１０ｇ／Ｌのフルクトース、２００ｋＰａのＣＯ、または１５０ｋＰａのＨ２＋５０ｋＰａのＣＯ２のいずれかを有する５０ｍＬのＣａＧＭ培地を含有する２５０ｍＬの血清ボトル中で増殖した。Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｉｎｎｏｖａシェーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）の内部で攪拌（２２５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。標準化された０．５  ＯＤ６００当量の指数関数的に増殖する培養物を接種材料として使用した。
【００７５】
１．２  ＤＮＡ操作
ＤＮＡ操作およびクローニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）による標準的な技術に従って実施した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ診断のためにＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。サザンブロット分析のために、ＢｅｒｔｒａｍおよびＤｕｒｒｅ（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：５５１−５５７，１９８９）に従って、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムＤＮＡを抽出した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのプラスミドＤＮＡを、２０ｍｇ／ｍＬのニワトリリゾチームの補充を有するＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶解バッファーに単離し、３７℃で３０分間インキュベートした後、下流の手順に進んだ。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）またはＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この例で使用したプライマーを表３に列挙する。プライマーは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ）を用いて設計し、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＥｕｒｏｆｉｎｓによって合成した。プラスミドおよびアンプリコンのサンガー配列決定は、Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｌｃ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、英国）によって行った。
【表３】
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2019514441.tif 000007
【００７６】
１．３  プラスミドベクターおよび対立遺伝子交換カセット
この実施例（表４）で使用される全てのプラスミドは、モジュラーのｐＭＴＬ８００００シリーズ、Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍシャトルベクター（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，７８：７９−８５，２００９）から誘導される。
【表４】
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【００７７】
ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘発、およびイントロン再標的化ツールは、一般に最も広く使用されているクロストリジウム変異原の１つを表す。それは、標的遺伝子を挿入により破壊する移動性のグループＩＩイントロンを使用する（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，８０：４９−５５，２０１０；Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，７０：４５２−４６４，２００７）。ここで、ＣｌｏｓＴｒｏｎは、遺伝子ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ２、ａｏｒ１およびａｏｒ２において安定なＫＯ株の単離を介して、アセトゲン、特にＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにうまく適用できることが示されている。
【００７８】
プラスミド「ｐＭＴＬ８３１５１−ＰａｃｓＡ」の構築のために、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのａｃｓＡ（ＣＡＥＴＨＧ＿１６２１）のプロモーター領域をオリゴヌクレオチド「ＰａｃｓＡ−ＮｏｔＩ−Ｆ」および「ＰａｃｓＡ−ＮｄｅＩ−Ｒ」を用いて増幅し、続いてプラスミドｐＭＴＬ８３１５１（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，７８：７９−８５，２００９）内に、制限部位ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩを用いてクローニングした。ａｏｒ１発現プラスミド「ｐＭＴＬ８３１５１−ＰａｃｓＡ−ａｏｒ１」を構築するために、プライマーを用いてａｏｒ１を２回のスプライス重複伸長（ＳＯＥ−ＰＣＲ）（Ｗａｒｒｅｎｓ，Ｇｅｎｅ，１８６：２９−３５，１９９７）に晒して、制限部位ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いてクローニングする前に２つの干渉ＮｄｅＩ部位を除去した。両方の干渉部位（ヌクレオチド９７５および１２８４）において、ヌクレオチド「ＣＡＴ」は、同じアミノ酸を保持しながら「ＣＴＴ」に変異した。ＣｌｏｓＴｒｏｎ再標的化プラスミドの構築のために、Ｐｅｒｕｔｋａアルゴリズム（Ｐｅｒｕｔｋａ，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ，３３６：４２１−４３９，２００４）を使用して、ＣｌｏｓＴｒｏｎウェブサイトからａｄｈＥ１、ａｄｈＥ２、ａｏｒ１、およびａｏｒ２内の適切なイントロン標的化領域を、コンピュータを用いて生成した。次いで、ＤＮＡ２．０Ｉｎｃ．は、３４４ｂｐイントロン標的化領域を合成し、それを制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｒＧＩを用いてＣｌｏｓＴｒｏｎベクターｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，８０：４９−５５，２０１０）内にクローニングして、プラスミド「ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２：：ａｄｈＥ１ａ＿１１５ｓ」（ａｄｈＥ１の標的化上流Ａｌｄドメイン）、「ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２：：ａｄｈＥ１ｂ＿５４１ｓ」（ａｄｈＥ１の標的化下流Ａｄｈドメイン）、「ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２：：ａｄｈＥ２＿６６２ｓ」、「ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２：：ａｏｒ１＿３６１ｓ」、および「ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２：：ａｏｒ２＿３７０ｓ」をもたらした。
【００７９】
対立遺伝子交換プラスミドを、「ｐＭＴＬ−ＡＭＨ１０１」と呼ばれるＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ｐｙｒＥ（ＣＡＥＴＨＧ＿１４７６）のＣ末端の２２７ｂｐを欠失させるために使用した。簡単に述べると、これは（カウンター選択マーカーとして使用される）Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４からの異種ｐｙｒＥ（ｃａｃ＿００２７）を含有し、その間にｌａｃＺαを有する３０３ｂｐの短いホモロジーアーム（ＳＨＡ）および１２１９ｂｐの大きなホモロジーアーム（ＧＨＡ）を対立遺伝子交換カセットとして含む。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ１＋２、およびａｏｒ２のインフレーム欠失（ＩＦＤ）対立遺伝子交換カセットは、類似の長さ（５１８〜５８０ｂｐ）の２つのホモロジーアームからなり、ＳＯＥ−ＰＣＲおよびオリゴヌクレオチドを用いてアセンブリングされる。全てのＩＦＤカセットは、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’−ＵＴＲに影響を与えることなく、標的遺伝子座の開始および終止コドンのみを保持した。ＳＯＥ−ＰＣＲについて、ＩＦＤカセットをＳａｃＩＩおよびＡｓｃＩで消化し、プラスミド「ｐＭＴＬ８４１５１−ΔａｄｈＥ１」、「ｐＭＴＬ８４１５１−ΔａｄｈＥ１＋２」、および「ｐＭＴＬ８４１５１−ΔＡＯＲ２」を生成するために、プラスミドｐＭＴＬ−ＡＭＨ１０１にクローニングした。ｐｙｒＥの回復のために、プラスミドは５２６ｂｐのＳＨＡおよび１２１３ｂｐのＧＨＡを有するｐｙｒＥ修復対立遺伝子交換カセットからなるｐＭＴＬ−ＡＭＨ１０２をコールした。
【００８０】
１．４  Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍへのプラスミド転移
プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉドナー株ＣＡ４３４（接合プラスミドＲ７０２を含有するＨＢ１０１）に形質転換し、その後、以前に確立された方法（Ｍｏｃｋ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７：２９６５−２９８０，２０１５；Ｐｕｒｄｙ，Ｍｏｌｅｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４６：４３９−４５２，２００２；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３６：８１９−８２６，１９９０）を用いて、接合を介してＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに転移した。チアンフェニコール（７．５μｇ／ｍＬ）を使用して、ｃａｔＰ系プラスミドを選択した。トリメトプリム（１０μｇ／ｍＬ）を使用して、接合後にＥ．ｃｏｌｉ  ＣＡ４３４に対する選択に対抗した。プラスミド補完株の検証のために、プラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ接合完了体から単離し、続いてＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した後、制限消化分析を「レスキューされた」プラスミドで行った。１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子はまた、オリゴヌクレオチド「ｕｎｉｖ−００２７−Ｆ」および「ｕｎｉｖ−１４９２−Ｒ」を用いて接合完了体のゲノムＤＮＡから増幅され、続いて検証のためにサンガー配列決定された。
【００８１】
１．５  Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＣｌｏｓＴｒｏｎ株の構築
ＣｌｏｓＴｒｏｎ再標的化プラスミドをＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに接合した後、６μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを補充した固体ＹＴＦ培地にチアンフェニコールおよびトリメトプリム耐性コロニーを転移し、標的遺伝子座にイントロン挿入を選択し、プラスミド損失がチアンフェニコールを補充した培地で増殖する能力の喪失が明らかであることを示すまで、同じ選択的培地の上で繰り返し再培養した。クラリスロマイシン耐性コロニーからゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子座特異的隣接プライマーを用いてＰＣＲスクリーニングに供し、ＷＴ対照より１．８ｋｂ大きいアンプリコンを生成するクローンを同定した（特定のＤＮＡ座でのＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入を示す）（図２および図３）。ＣｌｏｓＴｒｏｎアンプリコンのサンガー配列決定を行い、ＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入の位置を確認した。最終検証として、製造者の指示に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）Ｈｉｇｈ−Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡラベリングおよび検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてサザンブロット分析を行い、各変異体に１つだけのＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入が確実に起こるようにした（図２および図３）。
【００８２】
１．６  対立遺伝子交換手順
１．６．１  ΔｐｙｒＥ株の作製
ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘発は迅速かつ再現性があるが、いくつかの制限を有する。最も注目すべきことに、イントロン挿入は、下流遺伝子に極性効果を有することができる。ここで、疑似自殺ベクターとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｙｒＥ）遺伝子からなるプラスミドコードカウンター選択マーカーの使用に基づいて、ＩＦＤを作ることができるＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの対立遺伝子交換方法を開発した。これは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，８，２０１３）およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｅｈｓａａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，９：１−２０，２０１６）で取られるものと同等のアプローチであり、そこでは、チアンフェニコールを補充した培地上でのより速い増殖（より大きなコロニー）に基づいて、擬似自殺ノックアウトプラスミドの単一交差染色体組み込み体が検出される。疑似自殺プラスミドは、結果的に娘細胞間の分離が不十分な複製欠損プラスミド（この場合、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１のレプリコン）を利用し、抗生物質の存在下での細胞集団の増殖を制限する。したがって、単一のクロスオーバー組み込み体は、増殖優位性を有し、そしてカウンター選択剤である５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）上にプレーティングすることにより、ダブルクロスオーバープラスミド抽出誘導体を選択するために使用されることができる。後者は、プラスミドにコードされたＰｙｒＥ酵素の作用により、毒性の高い化合物５−フルオロウラシル（ＦＵ）に代謝される。プラスミド切除後にｐｙｒＥ遺伝子を失うそれらの細胞のみが生き残ることができる。切除事象は、元のＷＴ対立遺伝子または所望の変異型ＩＦＤ対立遺伝子のいずれかを有する細胞をもたらす。２つの集団は、適切なＰＣＲスクリーニングによって区別することができる。
【００８３】
ｐｙｒＥがカウンター選択マーカーとして使用されるためには、宿主はｐｙｒＥ陰性株でなければならない。そのような宿主は、対立連結交換（ＡＣＥ）を用いて比較的容易に作製される（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２）。したがって、ｐＭＴＬ−ＹＮ１８（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，８，２０１３）に相当するＡＣＥベクターを作製して、天然ｐｙｒＥ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿１４７６）の３’末端（２２７ｂｐ）を欠くＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ誘導体を生成した。ａｏｒ２のＩＦＤがｐｙｒＥベースＫＯベクター（ｐＭＴＬ８４１５１−Δａｏｒ２）およびＦＯＡを用いた対抗選択を用いて対立遺伝子交換される前に、遺伝子ａｏｒ１を、このΔｐｙｒＥ株においてＣｌｏｓＴｒｏｎ変異誘発を用いて、まず不活性化した。ａｏｒ１＋２ＫＯ株の作製後、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのｐＭＴＬ−ＹＮ１に類似した特別に構築されたＡＣＥ補正ベクターを用いて、変異体ｐｙｒＥ対立遺伝子をＷＴ（ウラシル原栄養性）に回復させた（Ｎｇ，Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ，ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ，８，２０１３）。
【００８４】
採用された手順は以前に記載された通りであった（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２）。ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ１＋２、および正および負の選択マーカーとしてｐｙｒＥを用いるａｏｒ２のさらなるＩＦＤのホストとして働くΔｐｙｒＥ株の構築のために、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１−ΔｐｙｒＥが、接合を介してＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換した。接合完了体は、チアンフェニコールおよびトリメトプリムを補充したＹＴＦ固体培地上で再培養し、急速に増殖する一重交差組込み体クローンを濃縮および同定した。ゲノムＤＮＡを単離し、適切な座位特異的隣接プライマーと共にプラスミド特異的配列にアニーリングする２つの異なるプライマー（ＡＣＥ−プラスミド−ＦおよびＡＣＥ−プラスミド−Ｒ）を用いてＰＣＲ分析に供した。ＤＮＡ断片の存在は、クローンが実際には一重交差組込み体であることを示したが、その大きさはどのホモロジーアームで組換え事象が起こったかを示した。ＰＣＲで検証された一重交差組込み体を、１０ｇ／Ｌのフルクトースおよびチアンフェニコールを補充したＣａＧＭ液体培地に接種し、嫌気性ワークステーション内で２日間増殖させた後、段階希釈してプレーティングした。希少な第２組換え事象のスクリーニングを容易にするために、ＣａＧＭ固体培地は、１ｇ／Ｌの酵母エキスを１ｇ／Ｌのカゼイン酸加水分解物に置き換え、１．５ｍｇ／ｍＬのフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）および５μｇ／ｍＬのウラシルを補充した。３７℃でのインキュベーションを嫌気性ワークステーション内で行い、２〜３日以内に出現したＦＯＡ耐性コロニーを同じ選択培地に再培養した後、遺伝子座特異的隣接プライマーを用いたＰＣＲスクリーニングを行い、二重交差組換えクローンを野生型復帰クローンと区別した。サンガー配列決定を用いて、予想される遺伝子型を確認した（図４）。
【００８５】
１．６．２  ΔａｄｈＥ１、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ、およびΔａｄｈＥ１＋２株の作製
ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２に並んでａｄｈＥ１の両方のドメインの欠失の結果を調べるために、Ｃ．ａｌｅｔｅｔｈｏｄｏｇｅｎｕｍの適切なインフレーム欠失変異体を、ｐｙｒＥ指向性対立遺伝子交換を用いて探索した。ΔａｄｈＥ１株を作製するための最初の試みでは、株ΔａｄｈＥ１ｍｕｔが得られた。この株のＰＣＲスクリーンおよびサンガー配列決定により、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのａｄｈＥ１が欠失し、ａｄｈＥ２のプロモーター領域における８４ｂｐの意図しない欠失も明らかになった（図５）。ＷＴ配列におけるこのプロモーター領域の試験は、８４ｂｐ欠失に隣接する２つの９ｂｐ反復の存在を明らかにした（図５）。８４ｂｐ配列は、推定ターミネーターおよびａｄｈＥ２プロモーターの−１０ボックスおよび−３５ボックスを含む。意図しない８４ｂｐの欠失無しでａｄｈＥ１の「完全な」ＩＦＤ株を生成する第二の試みは成功し、株ΔａｄｈＥ１を得た（図５）。しかしながら、この株は、これらのプラスミドの株を治癒しようと繰り返し試みられたにもかかわらず、ＩＦＤを生成するために使用されたプラスミドを持続的に保持していた。ａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２ダブルＩＦＤ株、ΔａｄｈＥ１＋２の作製は、ＰＣＲスクリーンにより確認され（図５）、サンガー配列決定は、ａｄｈＥ１の５｀−ＵＴＲおよびａｄｈＥ２の３−｀ＵＴＲにおける複雑化無しに両方の遺伝子が成功して削除されたことを示した。ＩＦＤの後、株ΔａｄｈＥ１＋２のチアンフェニコール感受性クローンは得られなかった。ΔａｄｈＥ１およびΔａｄｈＥ１＋２株は、それらを遺伝的に不安定にするＩＦＤ株を生成するために使用されるプラスミドの保持によって、さらに特徴付けられなかった。
【００８６】
プラスミドの損失がチアムフェニコール耐性の喪失によって実証された後、ΔｐｙｒＥ株は、プラスミドｐＭＴＬ８４１５１−ΔａｄｈＥ１、およびΔａｄｈＥ１およびΔａｄｈＥ１＋２株の構築のための接合を介したｐＭＴＬ８４１５１−ΔａｄｈＥ１＋２、それぞれの受信者のための宿主として役立ち得た。一重交差組込み体および二重交差ＦＯＡ耐性ウラシル栄養要求性クローンを（上記ΔｐｙｒＥ株と同様の方法で）両方の標的に対して得た。最初の試みでは、サンガー配列決定により、ａｄｈＥ１のＩＦＤに加えて、ａｄｈＥ２のプロモーター領域に意図しない８４ｂｐの欠失が生じたことが明らかになった。「ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ」と呼ばれるこの株はまた、チアンフェニコール抵抗性の喪失によって実証されたプラスミドの損失を有した。意図しない８４ｂｐの欠失無しで「完全な」「ΔａｄｈＥ１」株を生成する第二の試みは成功したが、（永続的なチアンフェニコール抵抗によって示される）プラスミドを失う繰り返された試みは失敗した。ΔａｄｈＥ１＋２株について、サンガー配列決定は、ａｄｈＥ１の５｀−ＵＴＲおよびａｄｈＥ２の３｀−ＵＴＲにおける複雑化無しでａｄｈＥ１およびａｄｈＥ２の成功した欠失を明らかにした。しかしながら、再培養の繰り返しによって、この株のチアンフェニコール感受性コロニーを単離することはできなかった。
【００８７】
１．６．３  ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の作製
ａｏｒ１＋２ダブルノックアウト株の構築のために（ここでは「ａｏｒ１＋２ＫＯ」と呼ばれる）、ａｏｒ１遺伝子座を、ΔｐｙｒＥ株でＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２：：ａｏｒ１＿３６１ｓを使用して最初に不活性化した。プラスミドが失われた後、ＩＦＤプラスミドｐＭＴＬ８４１５１−Δａｏｒ２を形質転換し、一重交差組込みクローンおよび二重交差組換えクローンの単離を上記のように行った。これらのａｏｒ１およびａｏｒ２ダブルＫＯであるがウラシル栄養要求性クローンを、プラスミドｐＭＴＬ−ＡＭＨ１０２で形質転換してウラシル原栄養性を回復した。急速に増殖するチアンフェニコール耐性コロニーを、１０ｇ／Ｌのフルクトースを補充したＣａＧＭ固体培地上にプレーティングしたが、１ｇ／Ｌの酵母エキスを、ウラシル補充無しの１ｇ／Ｌのカゼイン酸加水分解物で置き換えた。最終的な検証として、ａｏｒ１におけるＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入事象、ａｏｒ２のＩＦＤおよびｐｙｒＥの回復を検証するために、隣接プライマーを用いてＰＣＲスクリーンおよびその後のサンガー配列決定を行った。チアンフェニコール感受性の形態のプラスミド損失をさらに実証した。
【００８８】
１．７  遺伝子発現解析のための細胞収穫
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ組換え株を、それぞれが１０ｇ／Ｌのフルクトースを補充した２００ｍＬのＣａＧＭを含有する５００ｍＬの圧力＋実験室ボトル（Ｄｕｒａｎ）の３連で培養した。株ΔｐｙｒＥおよびΔａｄｈＥ１ｍｕｔについて、１０μｇ／ｍＬのウラシルを補充した。プラスミドｐＭＴＬ８３１５１−ＰａｃｓＡおよびｐＭＴＬ８３１５１−ＰａｃｓＡ−ａｏｒ１を含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにプラスミドを維持するために、７．５μｇ／  ｍＬのチアンフェニコールを補充した。約１２のＯＤ６００相当の細胞を、４℃、３，２２０×ｇ、１０分間の遠心分離により、様々な増殖期で収穫した。上澄みを除去し、細胞ペレットをピペットで１ｍＬのＲＮＡｌａｔｅｒ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁した。４℃で一晩インキュベートした後、細胞懸濁液を３，２２０×ｇで、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた後、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で保存した。
【００８９】
１．８  全ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
１．５ｍＬの冷たいＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を添加した後、融解した細胞ペレットを、１ｇのｄｎａｔｕｒｅ  ０．１ｍｍ直径のジルコニア／シリカビーズ（Ｄｎａｔｕｒｅ  Ｌｔｄ）を含む予め冷却した２ｍＬ微量遠心管に移した。細胞破壊は、Ｍｉｎｉ  Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ−１６（ｄｎａｔｕｒｅ  Ｌｔｄ）を使用して１分間ビーズ粉砕を３サイクル行い、サイクルの間、氷上で１分間冷却した。２０，２３８×ｇでの４℃の１分間の遠心分離後、上澄みを採取し、１００μＬのクロロホルムを添加し、２０秒間ボルテックスし、次いで時折混合しながら室温で１５分間インキュベートした。２０，２３８×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離後、水相を回収し、０．７容量のイソプロパノールを添加した。試料を室温で１０分間インキュベートした後、２０，２３８×ｇ（４℃）で１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、７００μＬの氷冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールでＤＮＡペレットを洗浄した後、２０，２３８ｘｇ（４℃）の遠心分離をもう一度１０分間行った。上澄みを除去した後、ＲＮＡペレットを１５分間風乾した後、１００μＬのＲＮａｓｅフリー水および１μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。
【００９０】
ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ酵素（Ａｍｂｉｏｎ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅ処理されたＲＮＡを、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、製造元の指示によって精製し、−８０℃で保存した。単離したＲＮＡの濃度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光光度的に分析した。単離されたＲＮＡ中に残留ゲノムＤＮＡが存在しないことを確実にするために、１μＬの各ＲＮＡサンプルを、プライマー対「ａｄｈＥ２−６６２ｓ−Ｆ」および「ａｄｈＥ２−６６２ｓ−Ｒ」を用いてＰＣＲ分析に供した。２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡの品質を調べ、ＲＮＡ合成番号（ＲＩＮ）が７より大きいＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に使用した。２０μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）あたり２μｇの全ＲＮＡを使用し、ｑＰＣＲ分析の前にＲＮａｓｅフリー水で１０倍に希釈した。
【００９１】
１．９  定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
標的遺伝子（ａｄｈＥ２）およびハウスキーピング遺伝子に対するプライマーおよびプローブの組（ｇｙｒＡおよびｒｈｏ）（表５）を、Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌを用いて設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからＳｉｎｇｌｅ−Ｔｕｂｅ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙとして購入した。ｇｙｒＡ（ＣＡＥＴＨＧ＿２１３０、ＤＮＡジャイレースサブユニットＡをコードする）およびｒｈｏ（ＣＡＥＴＨＧ＿２３２７、転写終結因子をコードする）を、それらが密接に関連したアセトゲンＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ１３５２８において異なる炭素源およびストレスにおいて最も安定な遺伝子発現レベルを示したため（Ｌｉｕ，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１６：４６０−４６４，２０１３）、ハウスキーピング遺伝子として選択した。ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーの増幅効率は、テンプレート（データは示していない）のような連続希釈したｃＤＮＡを用いて標準曲線を構築することによって（Ｒ２は≧０．９９８）９４．２〜９９．７％であることが経験的に決定された。
【表５】
2019514441.tif 000009
【００９２】
全てのｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、９６ウェルＭｉｃｒｏｓｅａｌ  ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内で準備し、１μＬの希釈ｃＤＮＡを含む２０μＬ容量の３連で、１μＬの２０ｘ  Ｃｕｓｔｏｍ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、１０μＬの２ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および８μＬのヌクレアーゼフリー水内で実行した。各ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーｑＲＴ−ＰＣＲマスターミックスについて、非テンプレート対照（ＮＴＣ）を含めた。各ｑＲＴ−ＰＣＲの実行は、９５℃で１２分間の最初の変性およびポリメラーゼ活性化、続いて４０サイクルの９５℃で１５秒間の変性と６０℃で６０秒間の複合アニーリングおよび伸長とを含んだ。ＰＣＲプレート内の各ウェルにシグナルの蓄積を記録するためにＴｈｅ  ＣＦＸ  ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、付随するＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して正規化遺伝子発現分析を実施した。
【００９３】
１．１０  分析化学
代謝物の分析は、３０℃で動作されるＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）および３０℃に維持されるＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（１３００×７．８ｍｍ、粒径９μｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。わずかに酸性化した水（０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を流速０．５ｍＬ／分の移動相として使用した。タンパク質および他の細胞残渣を除去するため、試料を２０，２３８ｘｇで５分間遠心分離し、上澄みをＳｐａｒｔａｎ１３／０．２ＲＣフィルタで濾過した。次いで、１０μＬの上澄みを分析のためにＨＰＬＣに注入した。
【００９４】
１．１１  データ分析とプレゼンテーション
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して、統計分析およびグラフ表示結果を得た。両側の、対になっていないパラメトリックスチューデントのｔ検定を平均値の比較に用いた。
【００９５】
１．１２  間接エタノール経路の代謝操作
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのようなアセトゲンの化学量論的および熱力学的分析は、独立栄養増殖条件下では、ＡＴＰが制限され、アセテート形成の初期ＡＴＰ生成段階およびその後のＡＯＲの作用を介したアセトアルデヒドへの変換無しで非常に少量のエタノールしか形成できないことが予期された（ＦａｓｔおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ、２０１２；Ｍｏｃｋら、２０１５）。ＡＯＲ活性に必要な還元フェレドキシンは、ＣＯ（一酸化炭素デヒドロゲナーゼによる）またはＨ２（電子分岐およびＮＡＤＰ依存性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（Ｗａｎｇら、２０１３）による）の酸化から生成することができる。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムは、ａｏｒ：ａｏｒ１（ＣＡＥＴＨＧ＿００９２）およびａｏｒ２（ＣＡＥＴＨＧ＿０１０２）の２つのアイソフォームをコードする。
【００９６】
単一遺伝子変異体の自家栄養性増殖について、ＣＯによるａｏｒ１  ＫＯ株の血清ボトル増殖は、延長された誘導期（１０日）によって特徴付けられ、最終的にＷＴのたった半分の細胞密度に達した（ｐ値＜０．０００１）（図６）。しかしながら、この株によって作製されたアセテートの濃度は、ＷＴのものと同様であった。対照的に、ａｏｒ１  ＫＯ株は、ＷＴによって生成されたエタノールのたった４３％（ｐ値＝０．０１９）および２３％の２，３−ブタンジオールを作った（ｐ値＜０．０００１）（図６）。ａｏｒ１  ＫＯ株は２．６ｍＭのラクテートを合成したが、これはＷＴレベル（ｐ値＝０．００１）のものよりも１１倍高かった（図６）。増殖速度および細胞密度に関して、ａｏｒ２  ＫＯ株は、ａｏｒ１  ＫＯ株と非常に類似した挙動だったが、この場合、増殖誘導期は２５日間に延長された（図６）。しかしながら、ＷＴと比較して、ａｏｒ２株は、１７０％多いエタノール（ｐ値＝０．００９）、３６％少ないアセテート（ｐ値＝０．０００１）、および類似のレベルの２，３−ブタンジオールおよびラクテートを生成した（図６）。
【００９７】
ａｏｒ１  ＫＯ株を補完する試みにおいて、プラスミドｐＭＴＬ８３１５１−ＰａｃｓＡ−ａｏｒ１をこの株に形質転換した（図７）。増殖誘導期に関しては、補完された株はＷＴのように挙動した。培養物は、ａｏｒ１  ＫＯ株（ｐ値＝０．０１０）によって達成された０．８５と比較して、１．２８のＯＤ６００の最終細胞密度に達した（ｐ値＝０．０１０）（図８）。対照的に、生成されたエタノールおよびラクテートのレベルは、補完された株においてＷＴレベルに回復した（図８）。
【００９８】
単一遺伝子ａｏｒ変異体の従属栄養増殖について、従属栄養増殖に対するａｏｒ不活化の影響の評価のために、ａｏｒ１  ＫＯおよびａｏｒ２  ＫＯ株をＷＴと一緒に、炭素源としてフルクトース上で増殖した。図９に示すように、ａｏｒ  ＫＯ株は両方ともＷＴと同等の細胞密度に達した。ＷＴと比較して、ａｏｒ１  ＫＯ株は、２１％多いアセテート（統計的に有意ではない）、３３％少ないエタノール（ｐ値＝０．０１４）、および６１％少ない２，３−ブタンジオールを生成した（ｐ値＝０．０１８）（図９）。対照的に、ａｏｒ２  ＫＯ株は、ＷＴに類似したアセテートおよび２，３−ブタンジオールの量を合成したが、４７％多いエタノールを合成した（ｐ値＝０．００３）（図９）。ＨＰＬＣ結果は、３つの株全てが、提供されたフルクトースを完全に枯渇させ、ラクテートはほとんどまたは全く生成しなかったことを示した（データ示さず）。
【００９９】
２つのＡＯＲアイソザイムの異なる役割について、２つのＡＯＲアイソザイムは同じ長さであり、それらは７８％の同一性を共有するが、トランスクリプトームデータは、ａｏｒ１がＣＯでの増殖中にａｏｒ２よりも５〜１０倍高いレベルで発現されることを示し（Ｍｏｃｋら、２０１５）、従属栄養増殖と比較して独立栄養増殖の間に両方のａｏｒ遺伝子がより高いレベルで発現される。発現データと一致して、（ｉ）Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるより高い発現ａｏｒ１の不活性化は、ＣＯの存在下でのエタノールおよび２，３−ブタンジオールの増殖および形成に対する衰弱作用を有し、（ｉｉ）ａｏｒ１  ＫＯ株の増殖は、炭素源としてのフルクトースにはあまり影響されなかったが、エタノール生成は有意に減少した。対照的に、ａｏｒ２の不活性化は、一貫してＣＯまたはフルクトースでの増殖中のエタノール生成を増加させた。対照的な表現型の１つの可能な説明は、ＡＯＲ２が主としてアセトアルデヒドの酸化において機能するのに対して、ＡＯＲ１は主に酢酸の還元において機能するということである。あるいは、ａｏｒ２の不活性化は、高度に発現されたおそらくより効率的なＡＯＲ１における基質へのアクセスの競合を減少させ、エタノール生成の増加をもたらすことができる。これらの結果は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるエタノール生成におけるａｏｒ１とａｏｒ２との間の対照的な役割を総括的に示唆している。
【０１００】
ａｏｒ１  ＫＯ株およびａｏｒ２  ＫＯ株の両方とも、長い増殖誘導期を示し、ＣＯで増殖している間に最終細胞密度を減少させ、ＣＯ酸化から生じる還元フェレドキシンの再利用の欠如を示した。還元型フェレドキシンのオフロードの別の方法は、・アセチル−ＣｏＡおよびＣＯ２をピルベートに変換するピルベート：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）を含む反応であり、その後、２，３−ブタンジオールおよびラクテートなどのピルベートから誘導された生成物の生成を変更し得る（図１）。ＷＴと比較して、ａｏｒ１  ＫＯ株（ａｏｒ２  ＫＯ株ではない）によるラクテート生成の１１倍高いレベルは、２，３−ブタンジオールではなくラクテートの生成が、ａｏｒ１の不活性化事象において酸化還元バランスを達成するための好ましい経路であることを示した。ピルベートから、ラクテートの生成にはただ１つの酵素（ラクテートデヒドロゲナーゼ）が関与するのに対して、２，３−ブタンジオールの生合成には３つの酵素（アセトラクテートシンターゼ、アセトラクテートデカルボキシラーゼ、および２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ）が関与する（Ｋｏｐｋｅら、２０１４；Ｋｏｐｋｅら、２０１１）（図１）。２，３−ブタンジオール（貴重な基盤化学物質）が好ましい生成物である場合、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ；ＣＡＥＴＨＧ＿１１４７）（Ｋｏｐｋｅら、２０１４）は、ａｏｒ１欠損株において不活性化され得る。
【０１０１】
しかしながら、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおける多数のａｏｒ遺伝子は、不活性化されたａｏｒ遺伝子が不活性化遺伝子に関連する活性のいずれかの損失を補い得るため、単一またはＫＯ株からの表現型の解釈を困難にする。この実施例で作製されたａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、機能性ＡＯＲが完全になく、アセトアルデヒドを介してアセチル−ＣｏＡをエタノールに直接還元することに依存しなければならない独自の株を表す。
【０１０２】
ダブルＡＯＲ変異体の独立栄養性増殖について、純粋なＣＯでの増殖中に、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は長い増殖誘導期を示し、最終的にＷＴよりも６９％低い細胞密度を達成し（ｐ値＜０．０００１）、ＷＴ対照における１６３ｋＰａの減少に比べて実験の間にヘッドスペース圧力をたった１０１ｋＰａ減少させることができた（図６）。この遅れた増殖と不十分なガス消費は、ＣＯの増殖と利用を支えるＡＯＲの重要な役割を強調する。
【０１０３】
ＷＴと比較して、ＣＯからの代謝生成に関して、ダブルＫＯ株は、４６％少ないエタノール（ｐ値＝０．０３４）、３８％少ないアセテート（ｐ値＜０．０００１）、６６％少ない２，３−ブタンジオール（ｐ値＜０．０００１）を生成したが、７．５倍高いレベルのラクテートを生成した（ｐ値＜０．０００１）（図６）。これらの結果は、エタノール力価がＡＯＲ不活性化の結果として半減したが、アセチル−ＣｏＡの直接還元を介して残りの半分のエタノールをＣＯからまだ合成できることを示している。ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、ａｏｒ１またはａｏｒ２単一ＫＯ株のいずれかと比較した場合、増殖およびエタノール形成の点でより大きな大きさの欠損を示さなかったことに言及することは価値がある。ＣＯで増殖するａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の表現型は、ａｏｒ１単一ＫＯ株の表現型に最もよく似ており、ａｏｒ１（ａｏｒ２ではなく）がＣＯおよびエタノール生合成における増殖を支持する主な酵素であるという、さらなる証拠を呈去した。
【０１０４】
Ｈ２＋ＣＯ２では、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の増殖誘導期はわずかに増加したが、ＷＴと同様の細胞密度まで増殖することができ、ＷＴ対照と同じ量のヘッドスペース圧を減少させた（図１０）。モルベースでは、還元フェレドキシンの量の半分だけがＣＯよりもＨ２から生成され（図１）、酸化還元不均衡がより少なくなり、ＫＯ株がＨ２＋ＣＯ２に対してほとんど影響を受けずに増殖することができる理由を説明する。アセテート生成は影響を受けなかったが、ＫＯ株はＷＴよりも９．２倍少ないエタノールを生成した（ｐ値＜０．０００１）（図１０）。ラクテートまたは２，３−ブタンジオールは、どちらの株によっても生成されなかった（データ示さず）。
【０１０５】
非常に高い特定のＡｏｒ活性がＨ２＋ＣＯ２で増殖されたＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの細胞抽出物中で検出され、これはまた、ＣＯで増殖された細胞抽出物より４倍高く、フルクトースで培養された細胞より５．３倍高いという発見（Ｍｏｃｋら、２０１５）は、Ｈ２＋ＣＯ２条件下でのエタノール生合成におけるＡｏｒの重要性を強調した。その結果、Ａｏｒの作用無しにＡＴＰ制限Ｈ２＋ＣＯ２条件下でエタノールをほとんど生成することができないというＦａｓｔおよびＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（２０１２）ならびにＭｏｃｋら（２０１５）の予想を確認した。同時に、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｋｏｐｋｅら、２０１０）およびＣ．ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｒｕａｎｔら、２０１０）などの著名なアセトゲン系エタノール生成菌はＡｏｒを保有しているが、Ａｏｒを欠くＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ（Ｐｏｅｈｌｅｉｎら、２０１２）などのアセトゲンを非エタノールは生成する。
【０１０６】
フルクトースに対するＡＴＰが十分な従属栄養成長の下で、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の増殖、エタノールおよび２，３−ブタンジオール生成は有意に影響されなかった（図９）。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓにおいて、唯一のＡｏｒの欠失が、マルトースで増殖する間に最小のエタノール生成をもたらした（Ｂａｓｅｎら、２０１４）。
【０１０７】
１．１３  ａｏｒ１およびａｏｒ２両方の完全な破壊は、カルボキシル酸のアルコールへの還元を無効にする
【０１０８】
Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉおよびＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉのようなＡｏｒを含むアセトゲンは、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、およびカプロン酸のようなカルボン酸の範囲を、電子供与体としてＣＯを用いて、対応する第一級アルコールに触媒的に還元することを示す（Ｉｓｏｍら、２０１５；Ｐｅｒｅｚら、２０１３）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡｏｒがそのような反応を触媒することができるかどうかを調べるために、ＷＴおよびａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株を、補充した６０ｍＭアセテート、４０ｍＭプロピネート、および４０ｍＭブチレートの存在下でＣＯ増殖に供した。
【０１０９】
誘導期が５日から１日に短縮されたことによって（図１１）、６０ｍＭのアセテート（生理学的代謝産物）の補給は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＣＯ増殖に刺激効果を有したが、ＫＯ株では有さなかった。早期の指数関数期においてＷＴにより最大３１．３ｍＭの酢酸塩が消費されたが、定常期で７９．１ｍＭのアセテートの純生成を記録した（図１１）。定常期では、ＷＴによって最大７０．８ｍＭのエタノールが生成された（図１１）。対照的に、ａｏｒ欠損株は、いずれの増殖段階においてもアセテートを消費することができず、わずか７．２ｍＭのエタノールしか生成しなかった（図１１）。非常に低い潜在的反応（Ｅｏ’＝−５８０ｍＶ）のために、酢酸のフェレドキシンを減少させたアルデヒドへの還元は、標準条件（ΔＧｏ’＝３５ｋＪ／ｍｏｌ）（Ｔｈａｕｅｒら、１９７７）下では熱力学的に非常に好ましくない（Ｌｏａｃｈ、１９７６）。しかしながら、６．０の細胞内ｐＨおよびアセトアルデヒド濃度よりも１０００倍高い細胞内アセテートを有する生理学的条件では、反応はエキソ酸性である（Ｍｏｃｋら、２０１５）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの指数関数的増殖の間に付随してエタノールを生成するアセテートの消費は、アセトゲンがＣＯを還元剤として用いて酢酸の還元を容易に触媒することを示している。
【０１１０】
アセテートの補充と同様に、ＣＯ培養中に非生理的基質プロピオネートの添加が、ＷＴの成長誘導期を５日間から２日間に減少したが（図１２）、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株の増殖誘導期は変更されなかった。０．６１（補給なし）〜１．１（プロピオネート補充）の細胞密度（ＯＤ６００）の増加およびＷＴの同レベルに対するヘッドスペース圧力の減少が、ダブルＫＯ株について観察された（図１２）。プロピオネートの濃度は変わらないままで、ダブルＫＯ株の培養物中では１−プロパノールは検出されなかった（図１２）。対照的に、ＷＴ株の培養物では、２４．２ｍＭのプロピオネートが消費され、２０．９ｍＭの１−プロパノールが指数増殖期に生成された（図１２）。
【０１１１】
ＣＯの存在下でのブチレート補充の場合、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、ＷＴと同様のＯＤ６００まで増殖し、ヘッドスペース圧を同程度まで低下させた（図１３）。ＫＯ株は、ＷＴより１７％多いアセテート（ｐ値＝０．０１９）、３６％多い２，３−ブタンジオール（統計学的に有意ではない）、２．８ｍＭのラクテート（ＷＴでは生成しなかった）を生成したが、４４％少ないエタノールを生成した（ｐ値＝０．０１６）。アセテートとプロピオネートを代謝することができないことと一致して、ＫＯ株は補充されたブチレートの消費を示さず、１−ブタノールを生成しなかった（図１３）。対照的に、ＷＴ培養物では７．４ｍＭのブチレートが消費され、定常増殖期には６．０ｍＭの１−ブタノールが生成された（図１３）。
【０１１２】
まとめると、これらの結果は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのＡｏｒがカルボン酸の対応する第一級アルコールへの還元に必要であることを実証した。より高いパーセンテージの酸変換を達成するために、血清ボトルのヘッドスペースをＣＯで再生しなければならないであろう。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＡｏｒの明らかな広い基質範囲は、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓからのＡｏｒの結晶構造が、脂肪族および芳香族アルデヒドを含む基質の範囲を収容するのに十分に広いチャネルを同定したという発見と一致する（Ｃｈａｎら、  １９９５）。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍからのＡｏｒは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ（Ｇｏｓｓｎｅｒら、２００８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ（Ｋｕｓｅｌら、２０００）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ（Ｇｅｎｔｈｎｅｒら、１９８１）、およびＯｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ（ＫｒｕｍｈｏｌｚおよびＢｒｙａｎｔ、１９８５）などのブチレート生成アセトゲンに異種的に発現され得て、１−ブタノールを生成させた。
【０１１３】
１．１４  ａｄｈＥ２の不活性化は、従属栄養条件下でのエタノール生成を減少させる
【０１１４】
溶媒生成経路の一部として、二機能性ＡｄｈＥは、多くの発酵性微生物において一般的である。ＡｄｈＥは、典型的には、Ｎ末端アセチル化Ａｌｄドメインとそれに続くＣ末端Ｆｅ型Ａｄｈドメインからなる（Ｅｘｔａｎｃｅら、２０１３；Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、２０００）。アルコール形成におけるＡｄｈＥの重要な役割は、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｂａｎｅｒｊｅｅら、２０１４；Ｌｅａｎｇら、２０１３）、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２００２）、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｌｏら、２０１５）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、２０００）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ａｒｎａｕら、１９９８）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ（Ｅｘｔａｎｃｅら、２０１３）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ（Ｐｅｎｇら、２００８）において実証されてきた。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの精製ＡｄｈＥ２とＴ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓからのＡｄｈＥは、高いＡｌｄ活性を示したがＡｄｈ活性は低く（Ｆｏｎｔａｉｎｅら、２００２；Ｐｅｎｇら、２００８）、これは多くの発酵微生物が複数のａｄｈ遺伝子を持つ理由を説明することができる。欠失研究および別個のＡｄｈＥドメインの特徴付けは、ＡｌｄドメインおよびＡｄｈドメインが機能的に自律的であることを示すので（Ａｒｎａｕら、１９９８；Ｃｈｅｎら、２００４；Ｅｓｐｉｎｏｓａら、２００１）、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるａｄｈＥ１のＡｌｄドメインおよびＡｄｈドメインは、ＣｌｏｓＴｒｏｎを用いて独立して破壊され、それぞれ「ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ」および「ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ」株を生成した。「ａｄｈＥ２」ＫＯ株については、Ａｌｄドメインのみを標的とした。
【０１１５】
フルクトースに対するａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株とａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株両方の増殖は、ＷＴよりわずかに長い誘導期によって特徴付けられたが、細胞は最終的に同様のＯＤ６００まで増殖した（図１４）。対照的に、ａｄｈＥ２  ＫＯ株の最終ＯＤ６００はＷＴよりも２８％低かった（ｐ値＜０．０００１）（図１４）。インキュベーションの１３日後でさえ、０．９２ｇ／ＬのフルクトースがａｄｈＥ２  ＫＯ株培養物中で検出されたが、他の全ての株は３日目の前に基質を完全に使い果たした（データは示さず）。３つのａｄｈＥ  ＫＯ株全ては７２．２〜７６．５  ｍＭのピークアセテートレベルに達し、これはＷＴよりも３１〜４３％高い（ｐ値＜０．０５）（図１４）。ＷＴと比較すると、両方のａｄｈＥ１  ＫＯ株は同様の量のエタノールを生成したが、ａｄｈＥ２  ＫＯ株はＷＴエタノール力価の３７％しか産生しなかった（ｐ値＝０．００３５）（図１４）。３つのａｄｈＥ  ＫＯ株全てが、ＷＴ培養物中に記録された２，３−ブタンジオールの半分未満を生成した（ｐ値＜０．０５）（図１４）。
【０１１６】
この実施例では、ＩＦＤプラスミドを失ったａｄｈＥ１（ＡｌｄドメインとＡｄｈドメインの両方を欠く）の遺伝的に安定なＩＦＤ株を構築した。しかしながら、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ１とａｄｈＥ２間の遺伝子間領域で８４ｂｐの意図しない欠失が、  不注意にもａｄｈＥ２の転写ターミネーターおよびプロモーターを除去し、株ΔａｄｈＥ１ｍｕｔをもたらした。親株（ΔｐｙｒＥ対照）と比較して、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株の増殖は、より長い誘導期を有していたが、両株は、フルクトースの存在下で同様の最終細胞密度を達成した（図１５）。両方の株は等量のアセテート（図１５）、エタノール（図１５）、および２，３−ブタンジオール（データは示さず）を生成した。
【０１１７】
ａｄｈＥ１の摂動されていないプロモーターが、この再構成の結果としてａｄｈＥ２の発現を媒介する可能性がある。この仮説をテストするために、親株とΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株でａｄｈＥ２  ｍＲＮＡレベルを比較した。初期の指数期、後期指数期、および定常期にフルクトースで増殖した細胞を採取した。ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを生成した。遺伝子発現分析は、親株のａｄｈＥ２転写物レベルが３つの全ての時点で安定していることを示した（３．２倍の差未満）（図１５）。対照的に、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ２  ｍＲＮＡレベルは、定常増殖期における１６倍の増加に続く、後期指数増殖期に初期対数増殖期から１１４倍の初期の減少を有する大きな変動を示した（図１５）。また、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株におけるａｄｈＥ２転写レベルは、また、全ての３つのサンプルの時点での親株の細胞よりも（１５から１３５９倍）有意に高い（ｐ値＜０．０５）（図１５）。Ｈ２＋ＣＯ２での独立栄養成長の間、ａｄｈＥ１は適度に発現される（６１ＦＰＫＭ）一方で、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍではａｄｈＥ２はほとんど発現しない（０．４ＦＰＫＭ）（Ｍｏｃｋら、２０１５）。
【０１１８】
３つのａｄｈＥ１不活性株（ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ、ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ、およびΔａｄｈＥ１ｍｕｔ）全てからのエタノール生成が従属栄養増殖の間に損なわれていなかったという発見は、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ａｄｈＥ１（だがａｄｈＥ２ではない）の欠失は、ＷＴ対照より６倍少ないエタノールを生成する株を生じたという、Ｌｅａｎｇら（２０１３）の発見と矛盾する。さらに、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの結果は、ａｄｈＥ２不活性化がＷＴよりも６３％低いエタノール濃度を生成したことを示した。増殖実験の方法論における１つの違いは、この研究では１０ｇ／Ｌフルクトースを使用するが、Ｌｅａｎｇら（２０１３）の研究では５ｇ／Ｌフルクトースを使用することである。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎら、２０１６）およびＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ（Ｎａｇａｒａｊａｎら、２０１３；Ｔａｎら、２０１３）のＲＮＡ配列決定実験は、独立栄養増殖と比較して、フルクトースで増殖するとａｄｈＥ１が有意により高いレベルで転写されることを示し、これは、従属栄養条件下でこの遺伝子のために重要であることを示唆する。
【０１１９】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍとＣ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉとの間のＡｄｈＥ１とＡｄｈＥ２のアミノ酸（ＡＡ）配列を比較すると、ＡｄｈＥ１に３つの置換があり、ＡｄｈＥ２に８つの置換があることが明らかになった。ＡｄｈＥ２におけるＡＡ変化の１つは、ＡｄｈドメインのＮＡＤＨ結合部位において生じる。これらの置換のうちの１つが、Ｆｅ−Ａｄｈドメインにおける１つのＡＡ変化によるＣ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍのＡｄｈＥにおけるＮＡＤＨからＮＡＤＰＨへの補因子の変化によって示されるように、基質および補因子特異性の修飾をもたらす可能性がある（Ｂｒｏｗｎら、２０１１）。補因子特異性の変化は、ＮＡＤＨが異化反応において一般的に使用されるのに対して、ＮＡＤＰＨは同化プロセスにおいて還元剤として通常使用されるため、電子および炭素流に有意な影響を有することが期待される（Ａｌｂｅｒｔｓら、２００２）。矛盾する表現型についての別の考えられる説明は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍが、フルクトース増殖中のＡｄｈＥ活性の喪失を補う他のエタノロゲン系酵素を保有し得ることである。
【０１２０】
１．１５  いずれかのａｄｈＥの不活性化がアセトゲン系エタノール生成を一貫して増加させる
【０１２１】
エタノール生成を増強しようとする従来の戦略は、一般にＡｄｈＥの導入または過剰発現を用いる（Ｐｅｎｇら、２００８；Ｔｈａｐａら、２０１５；ＹａｏおよびＭｉｋｋｅｌｓｅｎ、２０１０）。しかし、アセトゲン増殖中に課された独自のＡＴＰ制限条件、およびＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのようなアセトゲン中のエタノロゲン系Ａｏｒの存在を考慮すると、ａｄｈＥの不活性化は炭素を分裂させ、等価物をＡＴＰ産生アセテート形成に還元し得るという仮説が立てられた。酢酸は、アセトアルデヒド（Ａｏｒおよび還元フェレドキシンを介して）、次いでＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性Ａｄｈ（図１）を介してエタノールに還元されることができる。
【０１２２】
純粋なＣＯで増殖する間に、３つのａｄｈＥ  ＫＯ株（ａｄｈＥ１ａ、ａｄｈＥ１ｂ、およびａｄｈＥ２）は全て、長い誘導期の形態で、かつＷＴよりも４７〜５５％のより低い細胞密度で有意な増殖欠損を示し（ｐ値＜０．０１）（図１６）、還元等価物のリサイクルにおける非効率性を示唆している。低いバイオマスにもかかわらず、３つのａｄｈＥ  ＫＯ株は全て、ＣＯで増殖している間、一貫して１５４〜１８３％のより高い力価のエタノールを生成した。具体的には、ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株は、ＷＴより１８３％高い５３．４ｍＭエタノールを生成した（ｐ値＝０．０００５）。ａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株は、１７１％のより多くのエタノールを生成し（統計的に有意ではない）、ａｄｈＥ２  ＫＯ株は、ＷＴよりも１５４％多いエタノールを生成した（ｐ値＝０．０２１）（図１６）。エタノール生成におけるこれらの実質的な改善は、２，３−ブタンジオール力価（ｐ値＜０．００４）において４８〜６８％の減少によって部分的に相殺された（図１６）。ａｄｈＥ１ａ  ＫＯ株とａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株との間の表現型の類似性を考慮すると、（ＡｌｄドメインまたはＡｄｈドメインにおける）ａｄｈＥ１内のＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入の位置は、変異体の全体的な表現型において重要な役割を果たした。
【０１２３】
ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株では、増強されたａｄｈＥ２の発現は、ＡｄｈＥ１の活性の損失を補償することができる。ａｄｈＥ１ａとａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株の両方と比較した場合にこの仮説と一致して、純粋なＣＯで増殖しながら、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株は、より穏やかな増殖欠損を呈し、親株としてアセテートおよび２，３−ブタンジオールの同様の量を生成した（図１７）。ＣＯ条件下で増強されたエタノール生成表現型と一致して、ΔａｄｈＥ１ｍｕｔ株は、ａｄｈＥ１ａとａｄｈＥ１ｂ  ＫＯ株の両方によって記録された１７１〜１８３％の増加よりも有意でない、親株に比べて２７％多い（統計的に有意ではない）エタノールを生成した。
【０１２４】
ＣＯで増殖する間のａｄｈＥ不活性化株によって示されるエタノール生成物の顕著な増加が、Ａｏｒを使用するＡＴＰ効率的な間接エタノール形成経路がアセトゲン系エタノール生合成にとってより有利であるという仮説と一致する。さらなる証明として、ａｏｒ１＋２ダブルＫＯ株は、同じ増殖条件下でＷＴによって達成されたエタノールのわずか５４％しか生成しなかった。Ｍｏｃｋら（２０１５）は、Ｈ２＋ＣＯ２増殖Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで測定されたＣｏＡ結合アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が、生理学的に形成されたエタノールの再利用を促進するだけであると仮説を立てた。高エタノール濃度および低Ｈ２濃度の間、アセチル−ＣｏＡへのエタノール酸化は、２ＣＯ２のアセテートへの還元に結合すると仮定されている（Ｍｏｃｋら、２０１５）。この概念を支持するために、Ｈ２＋ＣＯ２上で増殖するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＷＴは、指数関数的成長の間に一時的に１０．３ｍＭのエタノールを生成したが、その後固定相の間に１．８ｍＭまで急激に減少した。２つのａｄｈＥ遺伝子に加えて、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノムには３つの他の単機能性ａｌｄ遺伝子（ＣＡＥＴＨＧ＿１８１９、１８３０、および３２８７）がある。したがって、トリプルａｌｄＫＯ株の生成は、炭素および電子をアセテート合成およびＡｏｒを介したエタノール形成にさらに導くことができる。
【０１２５】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０１２６】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（即ち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと解釈するべきではない。
【０１２７】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【０１２８】
参考文献
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９．Ｂｒｕａｎｔ，Ｇ．，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，Ｍ．−Ｊ．，Ｐｅｔｅｒ，Ｃ．，Ｇｕｉｏｔ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａｓｓｏｎ，Ｌ．，２０１０．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｕｔａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｐ７．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．５，ｅ１３０３３．
１０．Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｕｋｕｎｄ，Ｓ．，Ｋｌｅｔｚｉｎ，Ａ．，Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｗ．，Ｒｅｅｓ，Ｄ．Ｃ．，１９９５．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｔｕｎｇｓｔｏｐｔｅｒｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ，ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６７，１４６３−１４６９．
１１．Ｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｅ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｊｒ．，２００４．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ２（ＥｈＡＤＨ２），ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＨＥ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ．１３７，２０１−５．
１２．Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｋｕｉｔ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１６．Ｍｕｔａｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｂｕｔａｎｏｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｆｕｅｌｓ．９，１−２０．
１３．Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ａ．，Ｙａｎ，Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｌ．，Ｃｌａｒｋ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｅ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｊｒ．，２００１．Ｔｈｅ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ２（ＥｈＡＤＨ２）ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ａｍｅｂｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７６，２０１３６−４３．
１４．Ｅｘｔａｎｃｅ，Ｊ．，Ｃｒｅｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｅｌｅｙ，Ｋ．，Ｃｒｉｐｐｓ，Ｒ．，Ｈｏｕｇｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｄａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，２０１３．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．ｖｏｌ．６９，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，ｐｐ．２１０４−１５．
１５．Ｆａｓｔ，Ａ．Ｇ．，Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ，Ｅ．Ｔ．，２０１２．Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＣＯ２−ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１，３８０−３９５．
１６．Ｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｌ．，Ｍｅｙｎｉａｌ−ｓａｌｌｅｓ，Ｉ．，Ｇｉｒｂａｌ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｃｒｏｕｘ，Ｃ．，Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ，Ｐ．，２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｈＥ２，ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ＮＡＤＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｌｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｕｔａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｃｏｈｏｌｏｇｅｎｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１８４，８２１−８３０．
１７．Ｇｅｎｔｈｎｅｒ，Ｂ．Ｒ．Ｓ．，Ｄａｖｉｓ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ｍ．Ｐ．，１９８１．Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｒｕｍｅｎ  ａｎｄ  ｓｅｗａｇｅ  ｓｌｕｄｇｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ，ａ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈ２−ＣＯ２−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４２，１２−１９．
１８．Ｇｏｓｓｎｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｐｉｃａｒｄａｌ，Ｆ．，Ｔａｎｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，２００８．Ｃａｒｂｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ  ａｃｉｄ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ａｃｅｔｏｇｅｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｅａｔ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２８７，２３６−４２．
１９．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｃｏｏｋｓｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１２．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４０，ｅ５９．
２０．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｋｕｅｈｎｅ，Ｓ．ａ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｃｏｏｋｓｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１０．Ｔｈｅ  ＣｌｏｓＴｒｏｎ：Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒｅｆｉｎｅｄ  ａｎｄ  ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．８０，４９−５５．
２１．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００７．Ｔｈｅ  ＣｌｏｓＴｒｏｎ：Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．７０，４５２−４６４．
２２．Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００９．Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．７８，７９−８５．
２３．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，Ｃ．Ｍ．，ＭｃＬｅａｎ，Ｓ．，Ｓｃｈａｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｓ．，Ｍｉｌｌａｔ，Ｔ．，Ｈｅｎｓｔｒａ，Ａ．Ｍ．，Ａｎｎａｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｂｒｅｉｔｋｏｐｆ，Ｒ．，Ｐａｎｄｅｒ，Ｂ．，Ｐｉａｔｅｋ，Ｐ．，Ｒｏｗｅ，Ｐ．，Ｗｉｃｈｌａｃｚ，Ａ．Ｔ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｃ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｒ．，Ｂｌｏｍ，Ｊ．，Ｇｏｅｓｍａｎ，Ａ．，Ｈｏｄｇｍａｎ，Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｄ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｎ．Ｒ．，Ｗｉｎｚｅｒ，Ｋ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１５．Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍａｎｕａｌ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ａｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１６，１−１０．
２４．Ｉｓｏｍ，Ｃ．Ｅ．，Ｎａｎｎｙ，Ｍ．Ａ．，Ｔａｎｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，２０１５．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｆｏｒ  ｎ−ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｌｃｏｈｏｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｅｔｏｇｅｎ  “Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４２，２９−３８．
２５．Ｋｒｕｍｈｏｌｚ，Ｌ．Ｒ．，Ｂｒｙａｎｔ，Ｍ．Ｐ．，１９８５．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ  ｓｐ  ｎｏｖ  ｕｓｅｓ  ｍｅｔｈｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｂｅｎｚｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｂｕｔｙｒａｔｅ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．３５，４５４−４５６．
２６．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｇｅｒｔｈ，Ｍ．Ｌ．，Ｍａｄｄｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｌｉｅｗ，Ｆ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｗ．Ｍ．，２０１４．Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＮＡＤＰＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｉｍａｒｙ−ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８０，３３９４−３３０３．
２７．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｈｅｌｄ，Ｃ．，Ｈｕｊｅｒ，Ｓ．，Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，Ｈ．，Ｗｉｅｚｅｒ，Ａ．，Ｗｏｌｌｈｅｒｒ，Ａ．，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ，Ａ．，Ｌｉｅｂｌ，Ｗ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．，Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．，２０１０．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ  ａ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｙｎｇａｓ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．１０７，１３０８７−１３０９２．
２８．Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｍｉｈａｌｃｅａ，Ｃ．，Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｍ．，Ｔｉｚａｒｄ，Ｊ．Ｈ．，Ａｌｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｏｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．，Ａｌ−Ｓｉｎａｗｉ，Ｂ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，２０１１．２，３−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｕｓｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｗａｓｔｅ  ｇａｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７７，５４６７−５４７５．
２９．Ｋｕｓｅｌ，Ｋ．，Ｄｏｒｓｃｈ，Ｔ．，Ａｃｋｅｒ，Ｇ．，Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｅ．，Ｄｒａｋｅ，Ｈ．Ｌ．，２０００．Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＳＬ１  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ａｓ  ａｎ  ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ａｃｉｄｉｃ  ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５０  Ｐｔ２，５３７−５４６．
３０．Ｌｅａｎｇ，Ｃ．，Ｕｅｋｉ，Ｔ．，Ｎｅｖｉｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｌｏｖｌｅｙ，Ｄ．Ｒ．，２０１３．Ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ：Ａ  ｃｈａｓｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｃｏｍｍｏｄｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｈｏｍｏａｃｅｔｏｇｅｎ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７９，１１０２−１１０９．
３１．Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｔａｎ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｆ．，２０１３．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ  １３５２８  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｂｙ  ｑＲＴ−ＰＣＲ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１１６，４６０−４６４．
３２．Ｌｏ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｔ．，Ｈｏｎ，Ｓ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，２０１５．Ｔｈｅ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ａｎｄ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ，ａｄｈＥ，ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９７，１３８６−９３．
３３．Ｌｏａｃｈ，Ｐ．Ａ．，１９７６．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ，ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｂａｎｄｓ  ａｎｄ  ｍｏｌａｒ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ｆａｓｍａｎ，Ｇ．Ｄ．，（Ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．１．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ｐｐ．１２２−１３０．
３４．Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ，Ｅ．，Ｂｅｈｒｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｂ．，Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｓ．，ＤｅＴｉｓｓｅｒａ，Ｓ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｐａｌｆｒｅｙｍａｎ，Ｒ．，Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｊ．，Ｌｉｃｏｎａ−Ｃａｓｓａｎｉ，Ｃ．，Ｑｕｅｋ，Ｌ．−ｅ．，Ｓｐｅｉｇｈｔ，Ｒ．，Ｈｏｄｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．Ｐ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．，２０１６．Ｌｏｗ  ｃａｒｂｏｎ  ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｄｉｔｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｗａｓｔｅ  ｇａｓｅｓ−Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ａｃｅｔｏｇｅｎ．Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
３５．Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．，Ｅｃｈａｖｅ，Ｐ．，Ｃａｂｉｓｃｏｌ，Ｅ．，Ｔａｍａｒｉｔ，Ｊ．，Ｒｏｓ，Ｊ．，Ｌｉｎ，Ｅ．Ｃ．，２０００．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｈＥ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｒｏｍ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｔｏ  ａ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７５，３３８６９−７５．
３６．Ｍｏｃｋ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｌｙ，Ｓ．，Ｔｒａｎ，Ｌ．，Ｓｅｇｏｖｉａ，Ｓ．，Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｓ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，２０１５．Ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｈ２  ａｎｄ  ＣＯ２  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９７，２９６５−２９８０．
３７．Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｈ．，Ｓａｈｉｎ，Ｍ．，Ｎｏｇａｌｅｓ，Ｊ．，Ｌａｔｉｆ，Ｈ．，Ｌｏｖｌｅｙ，Ｄ．，Ｅｂｒａｈｉｍ，Ａ．，Ｚｅｎｇｌｅｒ，Ｋ．，２０１３．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．１２，１１８．
３８．Ｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｅｈｓａａｎ，Ｍ．，Ｐｈｉｌｉｐ，Ｓ．，Ｃｏｌｌｅｒｙ，Ｍ．Ｍ．，Ｊａｎｏｉｒ，Ｃ．，Ｃｏｌｌｉｇｎｏｎ，Ａ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２０１３．Ｅｘｐｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ：Ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｙｒＥ  ａｌｌｅｌｅｓ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ．８．
３９．Ｐｅｎｇ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｈａｏ，Ｗ．Ｌ．，２００８．Ｔｈｅ  ａｌｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＡｄｈＥ）ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ  ＪＷ２００．Ａｎａｅｒｏｂｅ．１４，１２５−１２７．
４０．Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｆｔｕｓ，Ｓ．Ｅ．，Ａｎｇｅｎｅｎｔ，Ｌ．Ｔ．，２０１３．Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ａｌｃｏｈｏｌｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｉｎｅｅｒｉｎｇ．１１０，１０６６−７７．
４１．Ｐｅｒｕｔｋａ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｇｏｅｒｌｉｔｚ，Ｄ．，Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，Ａ．Ｍ．，２００４．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩ  ｉｎｔｒｏｎｓ  ｔｏ  ｄｉｓｒｕｐｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＥｘＨ／Ｄ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．３３６，４２１−４３９．
４２．Ｐｏｅｈｌｅｉｎ，Ａ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｓ．，Ｋａｓｔｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｇｏｅｎｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｊ．，Ｔｈｕｒｍｅｒ，Ａ．，Ｂｅｒｔｓｃｈ，Ｊ．，Ｓｃｈｕｃｈｍａｎｎ，Ｋ．，Ｖｏｉｇｔ，Ｂ．，Ｈｅｃｋｅｒ，Ｍ．，Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｇ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｖ．，２０１２．Ａｎ  ａｎｃｉｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ．７．
４３．Ｐｕｒｄｙ，Ｄ．，Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，Ｔ．Ａ．Ｔ．，Ｅｌｍｏｒｅ，Ｍ．，Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｍ．，ＭｃＬｅｏｄ，Ａ．，Ｂｏｋｏｒｉ−Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ａ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，２００２．Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４６，４３９−４５２．
４４．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
４５．Ｔａｎ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｊ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｈ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｆ．Ｌ．，２０１３．ＲＮＡ−ｓｅｑ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｎｇａｓ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ  ＤＳＭ  １３５２８  ｇｒｏｗｎ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃａｌｌｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．９，２７７５−２７８４．
４６．Ｔｈａｐａ，Ｌ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．，２０１５．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２９００７．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
４７．Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ，Ｋ．，Ｄｅｃｋｅｒ，Ｋ．，１９７７．Ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｎｅｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．４１，１００−１８０．
４８．Ｕｔｔｕｒｋａｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂｒｕｎｏ−Ｂａｒｃｅｎａ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｉｎｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｒｕｎｄｅｎ，Ａ．Ｍ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｄ．，２０１５．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｒｅｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄａｔａ．２，１−９．
４９．Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，Ｋａｈｎｔ，Ｈ．Ｈ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｋｏｐｋｅ，Ｍ．，Ｔｈａｕｅｒ，Ｒ．Ｋ．，２０１３．ＮＡＤＰ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｂｉｆｕｒｃａｔｉｎｇ  ［ＦｅＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ｇｒｏｗｎ  ｏｎ  ＣＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１９５，４３７３−４３８６．
５０．Ｗａｒｒｅｎｓ，Ａ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｅｃｈｌｅｒａ，Ｒ．Ｉ．，１９９７．Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｂｙ  ＰＣＲ  ｕｓｉｎｇ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｇｅｎｅ．１８６，２９−３５．
５１．Ｗｅｉｓｂｕｒｇ  ＷＧ，Ｂａｒｎｓ  ＳＭ，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ＤＡ，Ｌａｎｅ  ＤＪ．１９９１．１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：６９７−７０３．
５２．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｉ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．，１９９０．Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１３６，８１９−８２６．
５３．Ｙａｏ，Ｓ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，２０１０．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｄｅｈｙｄｅ／ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｍａｔｈｒａｎｉｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９，１２３−１３３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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