(57)【要約】本発明は、昆虫防除用途に適したウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができるＲＮＡ構築物に転写された組換えＤＮＡ配列を記載する。具体的には、本開示は、標的昆虫を防除する方法であって、バクテリオファージカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のＤＮＡ配列及びＲＮＡｉ前駆体配列に結合された少なくとも１つのバクテリオファージｐａｃ配列を含むＲＮＡ転写物をコードする第２のＤＮＡ配列にて微生物宿主を形質転換することと、第１及び第２のＤＮＡ配列を発現させるように微生物宿主を誘導することと、微生物宿主からカプシドタンパク質及びＲＮＡｉ前駆体を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することと、単離されたＶＬＰを標的昆虫と接触させることとを含む、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的昆虫を防除する方法であって、バクテリオファージカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のＤＮＡ配列及びＲＮＡｉ前駆体配列に結合された少なくとも１つのバクテリオファージｐａｃ配列を含むＲＮＡ転写物をコードする第２のＤＮＡ配列にて微生物宿主を形質転換することと、前記第１及び第２のＤＮＡ配列を発現するように前記微生物宿主を誘導することと、前記微生物宿主から前記カプシドタンパク質及びＲＮＡｉ前駆体を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することと、前記単離されたＶＬＰを前記標的昆虫と接触させることとを含む、方法。
【請求項２】
前記バクテリオファージカプシドタンパク質がレビウイルスから誘導される、請求項１に記載の第１のＤＮＡ配列。
【請求項３】
前記レビウイルスがＱβである、請求項２に記載の第１のＤＮＡ配列。
【請求項４】
前記レビウイルスがＭＳ２である、請求項２に記載の第１のＤＮＡ配列。
【請求項５】
前記ＲＮＡｉ前駆体がｓｉＲＮＡを形成する、請求項１に記載の第２のＤＮＡ配列。
【請求項６】
前記ＲＮＡｉ前駆体がアンチセンスＲＮＡを形成する、請求項１に記載の第２のＤＮＡ配列。
【請求項７】
前記第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列が別個のエピソーム上にある、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項８】
前記第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列が同じエピソーム上にある、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項９】
前記第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列のうちの一方が細菌宿主染色体に組み込まれる、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１０】
前記第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列の両方が細菌宿主染色体に組み込まれる、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１１】
前記微生物宿主が細菌である、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１２】
前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１３】
前記微生物宿主が酵母である、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１４】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１３に記載の酵母。
【請求項１５】
前記標的昆虫がコウチュウ目昆虫を含む、請求項１に記載の標的昆虫の防除方法。
【請求項１６】
前記標的昆虫がコロラドハムシを含む、請求項１５に記載のコウチュウ目昆虫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月３１日に出願された米国仮出願第６２／２７３，６５４号に対する優先権を主張し、その全開示が参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
「配列表」のハードコピーと、２７キロバイトのサイズであり、２０１６年１２月７日に作成されたＩｎｓｅｃｔ＿Ｃｏｎｔｒｏｌ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられた配列表のコンピュータ可読形式の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、標的昆虫に対してＲＮＡｉ媒介性遺伝子抑制効果を生じさせることができる異種カーゴ分子を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する方法及び組成物を含む。このような組成物及び方法は、作物保護及び昆虫防除の他の態様に用途を有する。
【背景技術】
【０００４】
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初に記載されたＲＮＡｉ媒介性遺伝子抑制は、多くの他の生物における遺伝子発現を調節する有効な方法であることが示されている。Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６（１９９８）。作物に影響を及ぼす昆虫の増殖を防除するＲＮＡｉの役割は、いくつかの研究グループによって二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて示されている。Ｉｖａｓｈｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｏｕｓ  ｉｎｓｅｃｔｓ．ＲＮＡ  ２１：８４０（２０１５）に概説される。先行技術に記載されたＲＮＡｉ目的のために使用される組換えＲＮＡ構築物は、一般に、約１８〜約２５塩基対（ｓｉＲＮＡ）のｄｓＲＮＡからなるが、通常約１００〜約１０００塩基対（ｂｐ）のより長いｄｓＲＮＡ（長いｄｓＲＮＡ）も含む。昆虫にｄｓＲＮＡをうまく導入するためには、昆虫の食餌で供給されたときに効率的に取り込まれるよう、約６０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡが必要とされる。Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｎｆ７  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｌａｒｖａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  Ｌｅ  Ｃｏｎｔｅ）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４７５３４（２０１２）。長いｄｓＲＮＡ分子は、インビボで、宿主のＤｉｃｅｒ酵素複合体によってｓｉＲＮＡの多様な集団に切断される。あるいは、ＲＮＡｉ遺伝子抑制は、関連するプロセスを介して特定の配列に向けられたアンチセンスＲＮＡの作用によっても起こり得る。野外での昆虫の防除のためのＲＮＡｉ法の実際的な施用は、インビトロＲＮＡ合成のコストによって、またｄｓＲＮＡでさえＲＮＡの環境及び酵素分解に対する化学的脆弱性によって制限される。
毒素及び造影剤のヒト癌細胞へのバクテリオファージＭＳ２カプシド介在性の送達は、そのような薬剤をインビトロで真核細胞に送達するための有効な方法であることが示されている。Ａｓｈｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ５：５７２９（２０１１）。そのようなバクテリオファージカプシドが、ＲＮＡｉ前駆体を野外の昆虫に送達するために同様の機能を果たすことができるかどうかは不明である。標的昆虫へのＲＮＡｉ前駆体の有効な送達は、ＲＮＡｉ前駆体が昆虫によって取り込まれ、適切にプロセシングされるように、非特異的ＲＮＡ分解を防止すること、容易な投与経路、及び標的昆虫内の適切な点でＲＮＡｉ前駆体を放出する能力を必要とする。理想的には、ＲＮＡｉ前駆体及び送達システムは、経済的で、生産及び分配するのが比較的簡単でなければならない。本明細書に記載された発明は、これらのすべての基準を満たし、新しいＲＮＡｉ分子の迅速な発見、プロトタイピング、及び商業規模の生産を可能にするという追加の利点を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６（１９９８）
【非特許文献２】Ｉｖａｓｈｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｏｕｓ  ｉｎｓｅｃｔｓ．ＲＮＡ  ２１：８４０（２０１５）
【非特許文献３】Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｎｆ７  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｌａｒｖａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  Ｌｅ  Ｃｏｎｔｅ）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４７５３４（２０１２）
【非特許文献４】Ａｓｈｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ  ５：５７２９（２０１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載される本発明は、ＶＬＰ（あるいは、ＡＰＳＥ  ＲＮＡコンテナ、または「ＡＲＣ」として知られている）の特異的な性質を用いて、好ましくは昆虫宿主の、より好ましくはコウチュウ目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）またはチョウ目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）の害虫の、標的遺伝子の発現を抑制するため細胞内でプロセシングすることができる、長いｄｓＲＮＡ及びＲＮＡｉ前駆体（ｄｓＲＮＡｉ）を送達するための改善されたシステムを提供する。特に興味深いのは、キクイムシ、ニレハムシ、ツヤハダゴマダラカミキリムシ、シバンムシ、アメリカマツノキクイムシ、キムネクロナガハムシ、各種コーンルートワーム及びコロラドハムシなどのコウチュウ目である。コロラドハムシを防除するＲＮＡｉ法は、これらの甲虫が事実上すべての既知の殺虫剤に対して耐性を発達させているので特に望ましい。
【０００７】
コウチュウ目害虫は、直接注入またはＲＮＡｉ前駆体で処理された植物への摂食のいずれかにより、腸を介して導入されたＲＮＡｉに対して感受性であることが知られている。裸のＲＮＡの野外施用は、環境特異的及び非特異的な分解に対するＲＮＡの感受性のために、一般的に非実用的である。さらに、ＲＮＡは、摂食中及び昆虫の腸を通過する間に分解されやすい。ＶＬＰの非常に安定な形態は、インビトロでＶＬＰ内に担持されたＲＮＡを保護するのに役立つ。ＶＬＰは標的昆虫のＤｉｃｅｒのようなＲＮＡｉプロセシング経路にＲＮＡｉ前駆体を有効に送達することができるのか、特に、ＶＬＰは昆虫の消化管内のＲＮＡｉ前駆体を保護することができ、依然としてインタクトなＲＮＡｉ前駆体を標的昆虫のＲＮＡｉプロセシング経路に送達することができるのか、という問題が残っている。本明細書に示した結果は、ＶＬＰがＲＮＡｉ前駆体を標的昆虫内に送達するのに極めて有効であることを示している。
【０００８】
本明細書に記載の方法によりＲＮＡｉ前駆体を生成することの重要な利点は、ＲＮＡ前駆体の高価で複雑なインビトロ合成が回避され、単純かつ経済的な発酵方法によって所望のＲＮＡ構築物を産生できることである。大量のＲＮＡｉ前駆体の産生及び精製は、所望のポリヌクレオチドの合成とバクテリオファージＱβまたはＭＳ２などの自己組織化バクテリオファージカプシドタンパク質の発現とを任意に組み合わせて、標的とする昆虫害虫が摂食する植物表面に、例えば噴霧によって直接施用することができる、容易に精製され比較的安定なＡＲＣ（ＶＬＰ）の産生を容易にする。
【０００９】
一旦摂取されると、ＡＲＣは昆虫宿主の腸を通過する過程で消化され、ＲＮＡ分子は腸内面の細胞に吸収される。標的昆虫細胞内で、ＲＮＡｉ前駆体は、とりわけ、宿主Ｄｉｃｅｒ酵素複合体によってプロセシングされ、宿主遺伝子転写物を標的とする有効なＲＮＡｉ形態を生成し、必須宿主遺伝子の発現を抑制する。このような必須遺伝子の例としては、脱皮または他の幼虫生育事象、アクチンまたは他の細胞構造成分の制御に関与する遺伝子、ならびに生存に必要な複製、転写、もしくは翻訳、または他の基本的プロセスに関係する実質的にいずれの遺伝子も含むが、これらに限定されない。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、転写されたときにＲＮＡｉ前駆体分子を産生し、バクテリオファージコートタンパク質に翻訳されたｍＲＮＡを一緒にして比類なく安定なＶＬＰに組み込むＤＮＡ配列を含む。ＶＬＰは、摂食する昆虫による摂取に適した形態に精製することができる。標的昆虫によって摂取されると、ＶＬＰは腸を通過し、そこで昆虫細胞に吸収され、そこでＲＮＡｉ前駆体は、昆虫の生存能力にとって重要な標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉの形態にプロセシングされる。いくつかの実施形態では、そのような標的遺伝子の抑制は、標的昆虫の死をもたらすように設計される。別の実施形態において、標的遺伝子の抑制は、繁殖不能な子孫を産生するように設計される。ＶＬＰの重要な特徴は、それらが、カプシド形成されたＲＮＡｉ前駆体を非特異的環境要因または昆虫標的細胞ＲＮＡｓｅ酵素による分解から保護するのに十分安定であるが、それらが摂取された後にＲＮＡｉ前駆体を標的昆虫細胞のＲＮＡｉ経路に導入する能力を保っていることである。
【００１１】
本明細書中に提示される例示的な配列は、ＡｓｉＳＩ−ＮｏｔＩ消化ＤＮＡ断片として適切な細菌プラスミドベクターに連結されるように設計される。そのようなＤＮＡ配列断片は、当業者に周知の技術を用いて、構成断片を直接合成するか、またはサブクローニングすることによって製造することができる。特定の配列を所望のように改変してもよく、特異的制限酵素部位を操作し、別のリボザイム結合部位を組み込み、別のバクテリオファージｐａｃ配列を収容し、ＲＮＡｉ配列の特異性を改変して異なる遺伝子及び昆虫宿主を標的とすることができる。これらのＤＮＡ配列を誘導的に転写することができる転写プロモーターを含有する細菌プラスミドベクターには、バクテリオファージＴ７遺伝子１プロモーター、バクテリオファージＴ５プロモーター及びバクテリオファージλＰＬ及びＰＲプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。細菌プラスミドベクターはまた、誘導性プロモーターから発現されるバクテリオファージＱβまたはバクテリオファージＭＳ２カプシドタンパク質コード配列を含み得る。あるいは、そのような誘導的に発現されるカプシドタンパク質は、誘導性のカーゴＲＮＡ配列を担持する細菌プラスミドと適合する別個の細菌プラスミド上に存在し得る。
【００１２】
ＲＮＡカーゴ分子を含有するＶＬＰの産生及び精製ならびにＲＮＡカーゴ分子の回収は、米国特許出願公開第２０１３／０２０８２２１号（少なくとも段落００１３及び００１４）、同第２０１４／０３０２５９３号（少なくとも段落００１６、００５２、００６５、及び００８５〜００８６に記載されている）及び米国特許第９，１８１，５３１号（随所）に詳細に記載されており、それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、関連する方法は、また米国特許出願公開第２０１０／０１６７９８１号及び同第２０１２／００４６３４０号、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０７１４１９及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１１１１、ならびに米国特許第５，４４３，９６９号及び同第６，２１４，９８２号に記載されており、それぞれの内容はまた、参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法によって産生されたＶＬＰは、当業者に知られているいくつかの異なる方法で加工され、そのような物質の植物への施用及び、野外での使用を容易にすることができる。一実施形態では、精製されたＡＲＣは、噴霧操作のためにさらに加工される。そのような加工は、噴霧乾燥、安定化剤または湿潤剤の導入、または施用前に他の所望の薬剤とのＶＬＰの混合物の形成を含み得る。野外施用には、用地または航空散布法またはスポット施用が含まれ得る。
【００１３】
当業者は、標的宿主生物における標的遺伝子の配列を反映するように、配列を実施例に記載のものから改変することにより、異なる昆虫宿主中の異なる遺伝子を標的とすることができることを理解するであろう。したがって、本発明は、任意の所与の宿主細胞における特定の遺伝子を抑制するための最良のＲＮＡｉ標的を決定するためのツール及びそのようなＲＮＡｉを大量に産生するための手段を当業者に提供する。さらに、本発明は、どの遺伝子または遺伝子群が単一の昆虫または昆虫群内で最も有効なＲＮＡｉ標的を構成し得るかを、コンビナトリアルクローニング法により、そのような昆虫における特定の遺伝子または遺伝子の組み合わせを標的とする種々のＲＮＡｉ前駆体を含むＶＬＰの有効性をスクリーニングすることにより、経験的に決定する方法を提供する。本発明はまた、昆虫防除特性を施用時点で下記の関係する特性に合わせるために、施用時点で野外の特定の昆虫の防除に有効なＶＬＰを、他の昆虫の防除に有効な異なるＶＬＰと組み合わせる方法も支持する。異なる昆虫は、元のＶＬＰが標的とするものとは異なる目、属または種であってもよく、または、ＲＮＡｉ耐性集団またはＲＮＡｉ耐性集団の組み合わせであって、標的昆虫集団内の異なる遺伝子を標的とする１つ以上のＶＬＰの組み合わせが、ＲＮＡｉ耐性の組み合わせを生じさせないことを確実にするものを含んでもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態では、細菌宿主内の第１のＤＮＡ配列を転写して、バクテリオファージコートタンパク質をコードする第１のＲＮＡ分子を産生し、前記細菌宿主内の第２のＤＮＡ配列を転写してバクテリオファージｐａｃ部位を含む第２のＲＮＡ分子を産生し、続いて昆虫由来の標的遺伝子のアンチセンス配列、続いて一本鎖ループを形成することができる特異的なＲＮＡ配列、続いて標的遺伝子配列のアンチセンス配列に相補的なセンス配列、続いて第２のバクテリオファージｐａｃ部位を産生する。第１のＲＮＡ分子は、細菌宿主によって翻訳されてバクテリオファージｐａｃ配列を含む第２のＲＮＡ分子と組み合わせて、自発的にＶＬＰを形成する複数のバクテリオファージコートタンパク質を産生するｍＲＮＡであり、ここで第２のＲＮＡ分子は、ＶＬＰ内にパッケージされる。ＶＬＰは、植物の外表面に施用する前に単離及び精製される。植物を十分摂食させている標的昆虫は、ＶＬＰを摂取し、ＶＬＰ内に担持されたＲＮＡ分子を宿主昆虫細胞に順次導入し、そこでは宿主昆虫細胞の内因性ＲＮＡｉ経路によってプロセシングされ、宿主昆虫標的遺伝子の遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性抑制をもたらす。一実施形態では、昆虫はコウチュウ目である。好ましい実施形態において、コウチュウ目昆虫は、コロラドハムシである。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、細菌宿主内の第１のＤＮＡ配列を転写して、バクテリオファージコートタンパク質をコードする第１のＲＮＡ分子を産生し、前記細菌宿主内の第２のＤＮＡ配列を転写してバクテリオファージｐａｃ部位を含む第２のＲＮＡ分子を産生し、続いて昆虫由来の標的遺伝子のアンチセンス配列を、任意には続いて１つ以上のバクテリオファージｐａｃ部位を産生する。第１のＲＮＡ分子は、細菌宿主によって翻訳されてバクテリオファージｐａｃ配列を含む第２のＲＮＡ分子と組み合わせて、自発的にＶＬＰを形成する複数のバクテリオファージコートタンパク質を産生するｍＲＮＡであり、ここで第２のＲＮＡ分子は、ＶＬＰ内にパッケージされる。ＶＬＰは、植物の外表面に施用する前に単離及び精製される。植物を十分摂食させている標的昆虫はＶＬＰを摂取し、ＶＬＰ内に担持されたＲＮＡ分子を宿主昆虫細胞に順次導入し、宿主昆虫標的遺伝子の遺伝子発現のアンチセンスＲＮＡ媒介性抑制をもたらす。一実施形態では、昆虫はコウチュウ目である。好ましい実施形態において、コウチュウ目昆虫は、コロラドハムシである。
【００１６】
別の実施形態では、バクテリオファージコートタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列及び種々のＲＮＡｉ配列をコードする異なる第２のＤＮＡ配列を含む一連の宿主細菌が単離される。各単離された宿主細菌はクローン的に増殖され、細菌細胞株は保存される。その後、各細菌細胞株の試料を増殖させ、第１及び第２のＤＮＡ配列を転写するように誘導し、ＶＬＰを宿主細菌内で組み立てさせ、そこからこのＶＬＰを単離することができる。得られた一連のＶＬＰ内のＲＮＡ配列は各々、異なる昆虫標的遺伝子に相同に、または所与の昆虫標的遺伝子の異なる領域上に、または完全に異なる昆虫標的の標的遺伝子上に、異なるアンチセンス及び場合により相補的なセンス配列をコードする。一連の宿主細菌によって産生された異なるＶＬＰの各々は、標的昆虫に供給され、宿主昆虫遺伝子発現を抑制するそれらの能力は、例えば標的昆虫死虫率を評価することによって測定される。遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性抑制の最大レベルを生み出すこれらのＶＬＰは、その特定の標的昆虫または所与の標的昆虫遺伝子内の位置を標的にする最も有効なＲＮＡである。各ＶＬＰを産生した対応する細菌細胞株によって、対応する標的配列または遺伝子の迅速な同定が可能になる。同様に、対応する宿主細菌細胞株によって、野外施用またはさらなる実験研究のための宿主昆虫標的遺伝子の遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性抑制のための所望のＶＬＰの迅速なスケールアップが容易になる。当業者であれば、昆虫ゲノム配列データに基づいた相補的ＤＮＡ配列のランダムまたは疑似ランダムコレクション、または可能性のある必須遺伝子をコードするそのようなゲノム配列のサブセットを、マルチプレックスまたは自動クローニング技術を用いてスクリーニングできることを認識するであろう。
【００１７】
以下の実施例は、本発明の例示であり、上記に詳細に記載され、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１８】
実施例１
ＲＮＡｉ前駆体を含むＶＬＰによるコロラドハムシ防除の効果
コロラドハムシ（別の甲虫類）のβ−アクチン遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡｉ前駆体を含むＶＬＰが、裸のｄｓＲＮＡｉ前駆体と同様に有効にβ−アクチン発現を抑制できるかどうかを決定するために、以下の研究を行った。コロラドハムシ由来のβアクチンの２９４ｂｐ断片（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ株ＦｒｅｅｖｉｌｌｅアクチンｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＩＤ：ｇｂ｜ＫＪ５７７６１６．１、ヌクレオチド１〜２９４）を、ｐＡＰＳＥ１０１３６（配列番号１）にクローニングして非相同配列の短いループによって分離された対応するセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む配列を有する転写物を産生することができる。このＲＮＡは、βアクチンを標的とする２９４ｂｐ  ｄｓＲＮＡｉ前駆体を表す。ｄｓＲＮＡｉ前駆体ＤＮＡ配列は、プライマー１１７４（配列番号２）及び１１７５（配列番号３）を用いるコロラドハムシ染色体ＤＮＡ由来の２９４ｂｐの関心領域のＰＣＲ増幅によって産生され、このＰＣＲ産物は、ベクターにコードしたＴ７遺伝子１プロモーターの１つに対してセンス方向で制限エンドヌクレアーゼＡｓｉＳＩ及びＰｍｅＩによりＰＣＲ断片及びベクターを消化することによって、中間プラスミドに連結した。プライマー１２１３（配列番号４）及び１２０３（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅によって、センス鎖ＤＮＡ断片からループ及びアンチセンス配列を作製した。得られたＰＣＲ断片及び中間プラスミドをＰｍｅＩ及びＲｓｒＩＩで消化し、一緒に連結した。Ｔ７遺伝子プロモーターから発現された短いリンカーによって連結されたβ−アクチンセンス及びアンチセンス鎖配列をコードする所望の組換えプラスミドを、制限消化スクリーニングによって同定した。所望のプラスミドｐＡＰＳＥ１０２１６（配列番号６）を化学的コンピテントＨＴＥ１１５（ＤＥ３）細胞に形質転換し、個々のクローンをアンピシリン耐性形質転換体について選択した。
【００１９】
アンピシリン耐性形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。次いで、選択されたクローンを、培養物がＯＤ６００で０．８に達するまで、アンピシリンを含有する１００ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で増殖させ、その時点でイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度１ｍＭになるように添加して、ＭＳ２カプシドタンパク質及び２９４ｂｐ  ｓｉＲＮＡ前駆体のＴ７ポリメラーゼ指向性転写を誘導した。誘導培養物を誘導後少なくとも４時間増殖させＶＬＰ形成のための十分な時間にした。４Ｃで３０００ｇでの遠心分離によって細胞を集めた。処理するまで各ペレットを４℃で保存した。
【００２０】
１０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）約１０倍容量に各ペレットを再懸濁させることにより、２９４ｂｐ  ｓｉＲＮＡ前駆体を含むＶＬＰを精製し、超音波処理して細胞を溶解させた。１６，０００ｇでの遠心分離により細胞破片を除去した。各試料を、約１００単位／ｍＬの最終濃度になるように加えられるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の添加によってさらに処理し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、プロテイナーゼＫを１５０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。最終濃度が４．１Ｍになるように水に硫酸アンモニウムを添加することにより、飽和硫酸アンモニウム溶液を調製した。飽和硫酸アンモニウムを最終濃度が１８６ｍＭ（約１：２２希釈）になるように酵素処理したＶＬＰに添加し、２時間氷上に置いた。望ましくない沈殿物を、１６，０００ｇでの遠心分離によって溶解物から除去した。２回目の沈殿は、清澄化した溶解物の各ｍＬに乾燥硫酸アンモニウム１５５ｍｇを直接加えることによって行った。各試料をボルテックスし、氷上で２時間インキュベートした。各沈殿物を１６，０００ｇで沈降させ、固体沈殿物を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０の元の容量の１０分の１に再懸濁した。
【００２１】
再懸濁したＶＬＰを使用して、対応する裸のＲＮＡｉと比較して、コロラドハムシ幼虫に対するカプシド形成されたＲＮＡｉの有効性を試験した。各実験及び対照コホートには、１０の同一の処理を受けた１０個体の甲虫を含んでいた。各処理または対照試料を、直径１ｃｍのジャガイモ葉ディスクの表面に５０μｌの液滴で施用した。施用がなされる度に、清潔なピペットチップを使用した。処理は、幼虫に提供される前に葉表面上で乾燥させた。前処理期間中、すべての食物を幼生の容器から取り出し、処理した葉を幼虫に導入する前に幼虫を２時間飢餓させた。飢餓期間の後、ペトリ皿中の各処理されたジャガイモ葉上に１匹の幼虫を置き、そこでは葉組織が完全に食い尽くされるまでディスクを摂食させた。幼虫は、２日に１度、３回に分けて処理されたジャガイモ葉を摂食させ、その合間に通常のジャガイモ葉の食餌を与え、処置後２１日まで死虫率を毎日モニターした。最終処理後、生きた幼生を非処理のジャガイモ葉にさらに２１日間保持した。
【００２２】
表１は、裸のＲＮＡまたはｐＡＰＳＥ１０２１６から製造したＡＲＣにカプシド形成されたものとして投与した試験ＲＮＡｉでコロラドハムシ幼虫を処理した結果をまとめたものである。さらに、コロラドハムシベータアクチンと有意な相同性を持たないランダムなＥ．ｃｏｌｉ由来ＲＮＡを含有するＶＬＰを、一般的な非特異的ＶＬＰ毒性の対照として含めた。これらの結果は、カプシド形成されていないＲＮＡｉと同様に、必須アクチン遺伝子の発現を抑制することによって、これらのＶＬＰカプシド形成されたＲＮＡが、コロラドハムシ幼虫を死滅させるのに有効であることを示す。
【表１】
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【００２３】
裸のｄｓＲＮＡ処理対照は、このｄｓＲＮＡによるアクチン遺伝子発現の抑制がそれを食べ尽くす甲虫幼虫の死をもたらすという仮説と一致して、高い死虫率を示す。無関係のＲＮＡを含有するＶＬＰで処理されたコホートは死虫率をほとんどまたは全く示さず、ＶＬＰが本来的に甲虫幼虫に有毒でないことを示している。ＡＲＣは、ＲＮＡｉ活性分子のための有効な送達プラットフォームを提供し、高い死虫率は、ＶＬＰを製造するためのパッケージング及び処理工程が、そのようなｄｓＲＮＡから観察されるＲＮＡｉ応答の有効性を阻害しないことを証明する。
【００２４】
０．５μｇより低い用量例えば、０．０５μｇでのさらなる実験は、アクチンヘアピンＲＮＡを有するＡＲＣが、同じアクチン配列を標的とするより高い用量における裸のｄｓＲＮＡに対しより低い用量で同様の有効性を有することを明らかにする。
【００２５】
コロラドハムシ幼虫を死滅させるこれらの構築物の能力は、これらのＡＲＣが標的ＲＮＡｉ前駆体を昆虫宿主に導入する有効な手段であり、これらの前駆体が、標的遺伝子の遺伝子発現を抑制するために、宿主細胞ＲＮＡｉ経路によって適切にプロセシングできることを確認する。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ前駆体を含むＡＲＣがコロラドハムシ及びコウチュウ目昆虫を一般的に防除するための有効な送達システムであることを直接示している。
【００２６】
実施例２
一本鎖アンチセンスＲＮＡを含むＶＬＰによるコロラドハムシ幼虫の防除の効果
ＶＬＰの使用によってアンチセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）が標的昆虫に有効に送達され得るかどうかを試験するために、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ株、Ｆｒｅｅｖｉｌｌｅ  ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ配列番号：ｇｂ｜ＫＪ５７７６１６．１、ヌクレオチド１〜２９４）のβアクチン遺伝子の一部に対応する２９４ｂｐ  ＤＮＡ配列断片をプライマー１１７６（配列番号７）及び１１７７（配列番号８）から構築した。このプライマーをＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）から取り寄せ、同時にβアクチン配列断片の５’側ＡｓｉＳＩ制限部位及びβアクチン配列断片の３’側ＰｍｅＩ制限部位を添加して、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＰＣＲによってコロラドハムシゲノムＤＮＡ由来のβアクチン配列断片を増幅するのに使用する。得られたＰＣＲ産物をＡｓｉＳＩ及びＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後上流のＴ７プロモーターに対してアンチセンス方向で、ＡｓｉＳＩ及びＰｍｅＩで前処理したｐＡＰＳＥ１０１３６（配列番号１）に連結してｐＡＰＳＥ１０１９０（配列番号９）を形成する。このプラスミドは、転写物にバクテリオファージｐａｃ部位を組み込むことによって、β−アクチンアンチセンス鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）を高効率でＶＬＰにパッケージングすることを可能にする。化学的にコンピテントなＨＴＥ１１５（ＤＥ３）細胞を形質転換し、ＶＬＰを発酵により産生し、続いて実施例２に記載のように単離した。次に、実施例２に記載したようにコロラドハムシ幼虫を抑制する能力についてＶＬＰを試験した。表２は結果をまとめたものである。
【表２】
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【００２７】
これらのデータは、ＶＬＰが、コロラドハムシの幼虫を死滅させることにおいて、必須β−アクチン遺伝子の発現を抑制することに向けられた一本鎖アンチセンスＲＮＡの有効性を改善することを示す。さらに、これらの結果は、これらのＶＬＰが、対応するカプシド形成されていないＲＮＡｉよりも、必須アクチン遺伝子の発現を抑制することによりコロラドハムシ幼虫を死滅させる上でさらに有効であることを示す。これらの結果は、アンチセンスｓｓＲＮＡを含むＡＲＣも、一般的にコウチュウ目昆虫及び特にコロラドハムシを防除するための有効な送達システムとして役立つことを示唆する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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