(57)【要約】  本発明は、例えば、ＩｇＥによって引き起こされる障害（アレルギー応答、又はある特定の自己免疫応答など）、特に、ＩｇＥとＦｃεＲＩ受容体との相互作用によって引き起こされる障害の処置における使用のための、ＩｇＥを標的とする改良された抗ＩｇＥ抗体及び抗原結合剤、並びにその組成物の分野に関する。特に、本発明は、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））の新規変異体と関連する改良されたＩｇＥ抗体及び抗原結合剤に関する。本発明の改良された抗ＩｇＥ抗体及び抗原結合剤は、ＩｇＥに対する改良された親和性及び／又はＩｇＥのＣε２ドメインとの改良された相互作用及び／又はＩｇＥ上の改良された改変エピトープ（例えば、ＩｇＥのＣε２ドメインをさらに含む）及び／又は薬学的に関連する濃度で、例えばＦｃεＲＩ受容体からＩｇＥを解離させる能力を有してもよい。一側面では、ＩｇＥが標的化される（例えば、遊離ＩｇＥ及び／又はＦｃεＲＩ受容体と複合体化したＩｇＥ）、ＩｇＥ媒介性障害のための改良された処置又は新規処置が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、配列番号１０８の参照において、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｔ４２１、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８、ならびにＣε２ドメインの残基Ｄ２７８及びＴ２８１を含むエピトープと接触する、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２】
ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｋ３８０をさらに含むエピトープと接触する、請求項１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３】
ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｍ４３０をさらに含むエピトープと接触する、請求項１又は２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４】
ヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ｄ２７６をさらに含むエピトープと接触する、請求項１から３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５】
ヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ｖ２７７をさらに含むエピトープと接触する、請求項１から４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６】
ヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ｌ２７９をさらに含むエピトープと接触する、請求項１から５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７】
ヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ｓ２８０をさらに含むエピトープと接触する、請求項１から６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８】
ヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ａ２８２（及び／又はＴ２９８）をさらに含むエピトープと接触する、請求項１から７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項９】
Ｃε３ドメインとＣε２ドメインとがヒトＩｇＥの異なる鎖上にある、請求項１から８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０】
エピトープに特異的である、請求項１から９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１１】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、任意に請求項１から１０に記載のものであり、
配列番号１８であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と配列番号２９であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１を含む軽鎖可変領域とを含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ３をさらに含み、１、２、３、４、５、６、７個以上のアミノ酸置換を有して前記抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤とヒトＩｇＥのＣε２ドメインとの相互作用が強化されている、
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１２】
ＦＲ−Ｌ３領域が、配列番号１２９を参照して、Ｓ６０、Ｓ６３、Ｓ７６、Ｓ７７、及び／又はＱ７９位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項１１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１３】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６０位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項１１又は１２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１４】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６０位（Ｋａｂａｔ）において、Ｍ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ又はＴに変異される、請求項１１から１３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１５】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６０位（Ｋａｂａｔ）において、Ｍに変異される、請求項１１から１４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１６】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６３位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項１１から１５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１７】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６３位（Ｋａｂａｔ）において、Ｗ又はＹに変異される、請求項１１から１６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１８】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６３位（Ｋａｂａｔ）において、Ｙに変異される、請求項１１から１７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１９】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７６位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項１１から１８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２０】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７６位（Ｋａｂａｔ）において、Ｎに変異される、請求項１１から１９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２１】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７７位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項１１から２０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２２】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７７位（Ｋａｂａｔ）において、Ｒ又はＫに変異される、請求項１１から２１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２３】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７７位（Ｋａｂａｔ）において、Ｒに変異される、請求項１１から２２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２４】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７９位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項１１から２３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２５】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ７９位（Ｋａｂａｔ）において、Ｒ又はＫに変異される、請求項１１から２４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２６】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｑ７９位（Ｋａｂａｔ）において、Ｒに変異される、請求項１１から２５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２７】
変異したＦＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列が、配列番号４３〜４９、６０〜８３、１３１又は１３８から選択される、請求項１１から２６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２８】
ＦＲ−Ｌ３領域が、ヒトＩｇＥに対するその親和性（より低いＫＤ）を改善するためにＳ６７位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つにさらに変異される、請求項１１から２６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２９】
ＦＲ−Ｌ３領域が、Ｓ６７位（Ｋａｂａｔ）において、Ｍ、Ｅ又はＤに変異される、請求項２８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３０】
変異したＦＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列が、配列番号５３〜５９、８４〜１０７、１３１又は１３８から選択される、請求項２９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３１】
配列番号１８であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と配列番号２９であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１を含む軽鎖可変領域とを含み、任意に請求項１から３０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、軽鎖可変領域が、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤と、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインとの相互作用を強化するための１、２、３、４、５、６、７個以上のアミノ酸置換を有する配列番号２８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１をさらに含む、上記抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３２】
ＦＲ−Ｌ１領域が、配列番号２０を参照して、Ｇ１６及び／又はＲ１８位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項３１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３３】
軽鎖可変領域が、配列番号３１であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ２をさらに含む、請求項１１から３２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３４】
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、ヒトＩｇＥに対するその親和性（より低いＫＤ）を改善するために、配列番号１２９を参照して、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、請求項３３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３５】
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）において、Ｅ、Ｄ、Ｑ又はＲに変異される、請求項３４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３６】
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）において、Ｄ（好ましくは）又はＥに変異される、請求項３５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３７】
変異したＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列が、配列番号５０又は配列番号５１から選択される、請求項３４から３６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３８】
重鎖可変領域が、配列番号１４であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１をさらに含む、請求項１１から３７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項３９】
重鎖可変領域が、配列番号１６であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ２をさらに含む、請求項１１から３８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４０】
軽鎖可変領域が、配列番号３３であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３をさらに含む、請求項１１から３９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４１】
重鎖可変領域が、配列番号１３であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１をさらに含む、請求項１１から４０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４２】
重鎖可変領域が、配列番号１５であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ２をさらに含む、請求項１１から４１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４３】
重鎖可変領域が、配列番号１７であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ３をさらに含む、請求項１１から４２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４４】
重鎖可変領域が、配列番号１９であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ４をさらに含む、請求項１１から４３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４５】
軽鎖可変領域が、配列番号３０であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ２をさらに含む、請求項１１から４４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４６】
軽鎖可変領域が、配列番号３４であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ４をさらに含む、請求項１１から４５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４７】
軽鎖可変領域ＶＬが、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、配列番号３５、配列番号１３２、又は配列番号１３４、又は配列番号１３９又は配列番号１４１、又は配列番号１４５〜１４６、又は配列番号１５８〜１５９から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１１から４６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４８】
重鎖可変領域ＶＨが、配列番号１であるアミノ酸配列を有する、請求項１１から４７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４９】
軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１１から４８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５０】
軽鎖定常領域がカッパ定常領域である、請求項４９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５１】
軽鎖定常領域がＬ１５４Ｐ変異（Ｋａｂａｔ）を有する、請求項４９又は５０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５２】
軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、配列番号３９、又は配列番号４１、又は配列番号１１７、又は配列番号１１９、又は配列番号１２５、又は配列番号１２７又は配列番号１３６、又は配列番号１４３から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４９から５１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５３】
重鎖定常領域ＣＨ１をさらに含む、請求項１１から５２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５４】
重鎖可変領域及び重鎖定常領域ＶＨ−ＣＨ１が、配列番号５であるアミノ酸配列を有する、請求項５３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５５】
重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃをさらに含む、請求項１１から５４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５６】
ＦｃがヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４に由来する、請求項５５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５７】
重鎖可変領域、重鎖定常領域及び重鎖Ｆｃ領域、ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃが、配列番号９であるアミノ酸配列を有する、請求項５５又は５６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５８】
配列番号１８であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２９であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、
ａ．軽鎖可変領域が、配列番号３２であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ３をさらに含み、ＦＲ−Ｌ３領域が、ヒトＩｇＥに対する抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤の親和性（より低いＫＤ）を改善するために、Ｓ６７位（Ｋａｂａｔ、配列番号１２９を参照して）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される；及び／又は
ｂ．軽鎖可変領域が、配列番号３１であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ２をさらに含み、ＣＤＲ−Ｌ２領域が、ヒトＩｇＥに対する抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤の親和性（より低いＫＤ）を改善するために、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ、配列番号１２９を参照して）において、他の天然アミノ酸の１つに変異される、
上記抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項５９】
ＦＲ−Ｌ３領域がＳ６７位においてＭ、Ｅ又はＤに変異される、請求項５８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６０】
ＦＲ−Ｌ３領域がＳ６７位（Ｋａｂａｔ）においてＭに変異される、請求項５９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６１】
変異したＦＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列が、配列番号５２〜５９、８４〜１０７、１３１又は１３８から選択される、請求項６０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６２】
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）においてＥ、Ｄ、Ｑ又はＲに変異される、請求項５８から６１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６３】
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）においてＤ又はＥに変異される、請求項６２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６４】
ＣＤＲ−Ｌ２領域が、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）においてＤに変異される、請求項６３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６５】
変異したＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列が、配列番号５０（好ましくは）又は配列番号５１から選択される、請求項６３又は６４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６６】
重鎖可変領域が、配列番号１４であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１をさらに含む、請求項５８から６５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６７】
重鎖可変領域が、配列番号１６であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ２をさらに含む、請求項５８から６６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６８】
軽鎖可変領域が、配列番号３３であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３をさらに含む、請求項５８から６７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項６９】
重鎖可変領域が、配列番号１３であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１をさらに含む、請求項５８から６８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７０】
重鎖可変領域が、配列番号１５であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ２をさらに含む、請求項５８から６９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７１】
重鎖可変領域が、配列番号１７であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ３をさらに含む、請求項５８から７０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７２】
重鎖可変領域が、配列番号１９であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｈ４をさらに含む、請求項５８から７１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７３】
軽鎖可変領域が、配列番号３０であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ２をさらに含む、請求項５８から７２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７４】
軽鎖可変領域が、配列番号３４であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ４をさらに含む、請求項５８から７３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７５】
軽鎖可変領域ＶＬが、連続的なＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４領域を含み、配列番号２０であるアミノ酸配列を有し、ただし前記ＣＤＲ−Ｌ２領域は配列番号５０又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５８から７４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７６】
軽鎖可変領域ＶＬが、連続的なＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４領域を含み、配列番号２０であるアミノ酸配列を有し、ただし前記ＦＲ−Ｌ３領域は配列番号５２であるアミノ酸配列を有する、請求項５８から７４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７７】
軽鎖可変領域ＶＬが、連続的なＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４領域を含み、配列番号２０であるアミノ酸配列を有し、ただし前記ＣＤＲ−Ｌ２領域は配列番号５０又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ＦＲ−Ｌ３領域は配列番号５２、１３１又は１３８から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５８から７４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７８】
重鎖可変領域ＶＨが、配列番号１であるアミノ酸配列を有する、請求項５８から７７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７９】
軽鎖定常領域をさらに含む、請求項５８から７８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８０】
軽鎖定常領域がカッパ定常領域である、請求項７９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８１】
軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、配列番号２４であるアミノ酸配列を有し、ただし前記ＣＤＲ−Ｌ２領域が配列番号５０又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７９又は８０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８２】
軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、配列番号２４であるアミノ酸配列を有し、ただし前記ＦＲ−Ｌ３領域が配列番号５２であるアミノ酸配列を有する、請求項７９又は８０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８３】
軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、配列番号２４であるアミノ酸配列を有し、ただし前記ＣＤＲ−Ｌ２領域は配列番号５０又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有し、前記ＦＲ−Ｌ３領域は配列番号５２、１３１又は１３８から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７９又は８０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８４】
以下を含む、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、
ａ．前記重鎖可変領域は、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３及び配列番号１３１若しくは１３８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＷ−Ｌ３を含むか；又は
ｂ．前記重鎖可変領域は、配列番号１であるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３２若しくは１３９から選択されるアミノ酸配列。
【請求項８５】
軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む配列番号１３７又は１４５から選択されるアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域をさらに含む、請求項８４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８６】
重鎖定常領域ＣＨ１をさらに含む、請求項５８から８５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８７】
重鎖可変領域及び重鎖定常領域ＶＨ−ＣＨ１が、配列番号５であるアミノ酸配列を有する、請求項８６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８８】
重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃをさらに含む、請求項５８から８７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８９】
ＦｃがヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４に由来する、請求項８８に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項９０】
重鎖可変領域、重鎖定常領域及び重鎖Ｆｃ領域ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃが、配列番号９であるアミノ酸配列を有する、請求８８又は８９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項９１】
完全長重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子、又はその断片からなる群から選択される、請求項１から９０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項９２】
Ｆａｂ断片、改変されたＦａｂ’断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ダイアボディ、二特異的抗体、トリアボディ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、トリボディ、又は（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃからなる群から選択される、請求項１から９１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項９３】
ヒト血清アルブミンなどの、血清担体タンパク質に結合するｓｃＦｖに直接的に、又はリンカーを介して結合されるＦａｂ断片である、請求項９２に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項９４】
ｓｃＦｖが重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、好ましくは配列番号１５１を有するリンカーを介して連結され、
前記重鎖可変領域は、配列番号１５２であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号１５５であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１５７であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、
請求項９３に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項９５】
ｓｃＦｖが、配列番号１５０であるアミノ酸配列を有する、請求項９３又は９４に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項９６】
Ｆａｂ断片が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、以下を含む請求項９３又は９４に記載の抗ＩｇＥ抗体：
ａ．前記重鎖可変領域は、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３及び配列番号１３１若しくは１３８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＷ−Ｌ３を含むか；又は
ｂ．前記重鎖可変領域は、配列番号１であるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号１３２若しくは１３９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【請求項９７】
Ｆａｂ断片が重鎖定常領域と軽鎖定常領域とをさらに含み、重鎖可変領域及び重鎖定常領域ＶＬ−ＣＨ１が、配列番号５であるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、配列番号１３６又は１４３から選択されるアミノ酸配列を有し、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、請求項９６に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項９８】
ｓｃＦｖが、配列番号１４９であるアミノ酸配列を有するリンカーを介してＦａｂ断片のＣＨ１に連結される、請求項９３又は９７に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項９９】
重鎖可変領域及び重鎖定常領域、リンカー及びｓｃＦｖが、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む配列番号１４７であるアミノ酸配列を有する、請求項９３又は９８に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項１００】
エフェクター又はリポーター分子がそれに結合した、請求項１から９９に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０１】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、グリコシル化される、及び／又はデンプン、アルブミン、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択されるポリマーにコンジュゲートされる、請求項１から１００に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０２】
ポリマーが５〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧである、請求項１０１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０３】
ヒト化される、請求項１から１０２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項１０４】
請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項１０６】
配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、又は配列番号４２、又は配列番号１３３、又は配列番号１３５、又は配列番号１３７、又は配列番号１４０、又は配列番号１４２、又は配列番号１４４から選択される１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクター。
【請求項１０７】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２又は配列番号１４８から選択される１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１０６に記載のクローニング又は発現ベクター。
【請求項１０８】
請求項１０５から１０７に記載の１つ又は２つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２又は配列番号１４８から選択される１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含む１つ又は２つ以上のクローニング又は発現ベクターをさらに含む、請求項１０８に記載の宿主細胞。
【請求項１１０】
請求項１０８又は１０９に記載の宿主細胞を培養すること、及び抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を単離することを含む、請求項１から９４に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の製造のための方法。
【請求項１１１】
１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を含む医薬組成物。
【請求項１１２】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、希釈剤１ｍＬあたり５０〜２００ｍｇ、好ましくは、１５０ｍｇの用量で存在する、請求項１１１に記載の医薬組成物。
【請求項１１３】
賦形剤がＬ−アルギニンを含む、請求項１１１又は１１２に記載の医薬組成物。
【請求項１１４】
賦形剤がＬ−ヒスチジンを含む、請求項１１１から１１３に記載の医薬組成物。
【請求項１１５】
賦形剤がポリソルベート２０を含む、請求項１１１から１１４に記載の医薬組成物。
【請求項１１６】
希釈剤が水である、請求項１１１から１１５に記載の医薬組成物。
【請求項１１７】
組成物がその皮下投与のための滅菌注射筒内に担持される、請求項１１１から１１６に記載の医薬組成物。
【請求項１１８】
組成物が７５〜６００ｍｇの抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の総用量を含有する、請求項１１１から１１７に記載の医薬組成物。
【請求項１１９】
抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤と一緒に、又は抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤との別々の同時投与のために他の活性成分をさらに含む、請求項１１１から１１８に記載の医薬組成物。
【請求項１２０】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、アレルギーに基づく特異的免疫療法と別々に同時投与される、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２１】
薬剤としての使用のための、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１０２から１１１に記載の組成物。
【請求項１２２】
疾患の処置又は防止における使用のための請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１０２から１１１に記載の組成物。
【請求項１２３】
ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体と関連する障害の処置又は防止における使用のための請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１０２から１１１に記載の組成物。
【請求項１２４】
ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体の解離及び抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤によるヒトＩｇＥの結合による障害の処置又は防止における使用のための請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１０２から１１１に記載の組成物。
【請求項１２５】
請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の使用のための組成物であって、以下のうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止における使用のためのもの：
アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息。
【請求項１２６】
ヒト対象における疾患の処置又は防止のための方法であって、対象に、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１２７】
ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体と関連する障害の処置又は防止のための請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
処置又は防止が、ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体の解離及び抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤によるヒトＩｇＥの結合を介するものである、請求項１２６又は１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
請求項１２６から１２８に記載の方法であって、以下のうちのうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止のためのもの：
アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息。
【請求項１３０】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、７、３、１、０．６６、０．５又は０．３μＭ未満の濃度（又はピーク血清濃度）でＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させることができる、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物、又は請求項１２１から１２５に記載の使用のための抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は組成物、又は請求項１２６から１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、オマリズマブ（又はその代わりに、オマリズマブＦａｂ）よりも低い濃度（又はピーク血清濃度）でＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させることができる、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物、又は請求項１２１から１２５に記載の使用のための抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は組成物、又は請求項１２６から１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、オマリズマブ（又はその代わりに、オマリズマブＦａｂ）よりも高い、ＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥの解離率（％）が可能な、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物、又は請求項１２１から１２５に記載の使用のための抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は組成物、又は請求項１２６から１２９に記載の方法。
【請求項１３３】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、オマリズマブ（又はその代わりに、オマリズマブＦａｂ）についてよりも高い、ＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥの見かけの解離速度に効果的であることが可能な、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物、又は請求項１２１から１２５に記載の使用のための抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は組成物、又は請求項１２６から１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、オマリズマブ（又はその代わりに、オマリズマブＦａｂ）のものよりも少なくとも１０％低い、ヒトＩｇＥに対する改善された親和性（ＫＤ）（例えば、ＩｇＥ−Ｆｃを使用する）を有する、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物、又は請求項１２１から１２５に記載の使用のための抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は組成物、又は請求項１２６から１２９に記載の方法。
【請求項１３５】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、オマリズマブ又はオマリズマブＦａｂではない、請求項１から１０３に記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１１１から１２０に記載の組成物、又は請求項１２１から１２５に記載の使用のための抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は組成物、又は請求項１２６から１２９に記載の方法。
【請求項１３６】
遊離のヒトＩｇＥ及びＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥに結合する、抗体又は抗原結合剤であって、抗体又は抗原結合剤が、ＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥに結合し、ＩｇＥのコンフォメーションを変化させ、前記コンフォメーションにあるＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥが、抗体又は抗原結合剤の非存在下におけるよりも弱いＦｃεＲＩに対する結合親和性を有し、ＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥがＦｃεＲＩから解離する、上記抗体又は抗原結合剤。
【請求項１３７】
コンフォメーションにあるＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥが、抗体又は抗原結合剤に対するよりも低い、オマリズマブ又はその断片に対する結合親和性を有する、請求項１３６に記載の抗体又は抗原結合剤。
【請求項１３８】
請求項１から１０３、１３０から１３５のいずれかに記載の抗体である、請求項１３６又は１３７に記載の抗体又は抗原結合剤。
【請求項１３９】
薬剤としての使用のための、請求項１３６から１３８に記載の抗体又は抗原結合剤。
【請求項１４０】
ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体と関連する障害の処置又は防止における使用のための請求項１３６から１３８に記載の抗体又は抗原結合剤。
【請求項１４１】
ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体の解離及び抗体又は抗原結合剤によるヒトＩｇＥの結合を介する障害の処置又は防止における使用のための、請求項１３６から１３８に記載の抗体又は抗原結合剤。
【請求項１４２】
請求項１３６から１３８に記載の使用のための抗体又は抗原結合剤であって、以下のうちのうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止のためのもの：
アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息。
【請求項１４３】
ヒト対象における疾患の処置又は防止のための方法であって、対象に、有効量の請求項１３６から１３８に記載の抗体又は抗原結合剤を投与することを含む、上記方法。
【請求項１４４】
ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体と関連する障害の処置又は防止のための、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
処置又は防止が、ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体の解離及び抗体又は抗原結合剤によるヒトＩｇＥの結合を介するものである、請求項１４３又は１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
請求項１４３から１４５に記載の方法であって、以下のうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止のためのもの：
アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息。
【請求項１４７】
請求項１から１０３又は１３０から１３８に記載の抗体又は抗原結合剤を選択するための方法であって、
ａ．試験抗体又は抗原結合剤と、ヒトＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥを含む試料とを接触させるステップ；
ｂ．ヒトＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥの解離に関する、試験抗体又は抗原結合剤の解離定数を測定するステップ；
ｃ．ステップｂ）で測定された解離定数と、ヒトＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥの解離に関するオマリズマブ又はその断片の解離定数とを比較するステップ；
ｄ．前記抗体又は抗原結合剤が、オマリズマブ又はその断片よりも速く、ＦｃεＲＩからＩｇＥを解離させる場合、前記抗体又は抗原結合剤を選択するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１４８】
請求項１から１０３又は１３０から１３８に記載の抗体又は抗原結合剤を選択するための方法であって、以下を含むもの：
ａ．試験抗体又は抗原結合剤と、ヒトＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥを含む試料とを接触させるステップ；
ｂ．ヒトＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥに関する、試験抗体又は抗原結合剤の結合親和性を測定するステップ；
ｃ．ステップｂ）で測定された結合親和性と、ヒトＦｃεＲＩに対するヒトＩｇＥの結合親和性とを比較するステップ；
ｄ．前記抗体又は抗原結合剤が、ＦｃεＲＩに対するＩｇＥよりも高い、ＩｇＥに対する結合親和性を有する場合、前記抗体又は抗原結合剤を選択するステップ。
【請求項１４９】
請求項１４７又は１４８に記載の方法であって以下を含むもの：
選択された抗体又は抗原結合剤が、ＩｇＥに対して、ＦｃεＲＩに結合させたまま、安定化されたコンフォメーションにあるＩｇＥに以下のコンフォメーションを取らせる：
ａ．オマリズマブ若しくはその断片の存在下でＦｃεＲＩに結合したＩｇＥよりも速くＦｃεＲＩから解離する；及び／又は
ｂ．ＦｃεＲＩに対するよりも高い、抗体又は抗原結合剤に対する結合親和性を有する。
【請求項１５０】
以下を含む、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤：
ａ．配列番号１を含む重鎖可変領域と、
ｉ．配列番号１０９；若しくは
ｉｉ．配列番号１１３；若しくは
ｉｉｉ．配列番号１２１；若しくは
ｉｖ．配列番号１３２；若しくは
ｖ．配列番号１３９
を含む軽鎖可変領域；又は
ｂ．配列番号５と、
ｉ．Ｓ７７及びＳ７９がＱで置き換えられた、配列番号２４；
ｉｉ．配列番号１１７；若しくは
ｉｉｉ．配列番号１２５；若しくは
ｉｖ．配列番号１３６；若しくは
ｖ．配列番号１４３。
【請求項１５１】
抗体又は抗原結合剤が、以下を含むエピトープに対して、接触するか又は接触し、特異的であり、前記エピトープは以下を含む、請求項１５０に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤：
配列番号１０８を参照して、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｔ４２１、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８並びにＣε２ドメインの残基Ｄ２７８及びＴ２８１。
【請求項１５２】
第１のポリペプチドに結合する抗体又は抗原結合剤であって、該第１のポリペプチドは第２のポリペプチド（受容体など）への結合によりその生理学的応答を惹起し、
該抗体又は抗原結合剤は、遊離及び結合した前記第１のポリペプチドの両方に結合して第１のポリペプチドのコンフォメーションを安定化することができ、該第１のポリペプチドは安定化されたコンフォメーションにおいて第２のポリペプチドに対する結合親和性が該抗体又は抗原結合剤の存在下において該抗体又は抗原結合剤の非存在下におけるより低く、
該抗体又は抗原結合剤は、第１のポリペプチドの第２のポリペプチドからのより迅速な解離を誘発する、上記抗体又は抗原結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ＩｇＥによって引き起こされる障害（アレルギー応答、又はある特定の自己免疫応答など）、特に、ＩｇＥとＦｃεＲＩ受容体との相互作用によって引き起こされる障害の処置における使用のための、ＩｇＥを標的とする改良された抗ＩｇＥ抗体及び抗原結合剤、並びにその組成物の分野にある。特に、本発明は、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））の新規変異体と関連する改良された抗ＩｇＥ抗体及び抗原結合剤に関する。本発明の改良された抗ＩｇＥ抗体及び抗原結合剤は、ＩｇＥに対する改良された親和性及び／又はＩｇＥのＣε２ドメインとの改良された相互作用及び／又はＩｇＥ上の改良された改変エピトープ（例えば、ＩｇＥのＣε２ドメインをさらに含む）及び／又は薬学的に関連する濃度でＦｃεＲＩ受容体からＩｇＥを解離させる能力を有してもよい。一側面では、ＩｇＥが標的化される（例えば、遊離ＩｇＥ及び／又はＦｃεＲＩ受容体と複合体化したＩｇＥ）、ＩｇＥ媒介性障害の改良された処置又は新規処置が開示される。
発明の背景
【０００２】
ＩｇＥは、喘息、食物アレルギー、１型過敏症及び広い範囲で罹患する家族性副鼻腔炎などのアレルギー応答を媒介する免疫グロブリンファミリーのメンバーである。ＩｇＥは、Ｂ細胞によって分泌され、その表面上に発現される。Ｂ細胞により合成されたＩｇＥは、短い膜結合領域により成熟ＩｇＥ配列に連結された膜貫通ドメインによってＢ細胞膜中に固定される。ＩｇＥはまた、低親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩＩ）に対するそのＦｃ領域を介してＢ細胞（並びに単球、好酸球及び血小板）にも結合する。哺乳動物のアレルゲンへの曝露の際に、アレルゲンに結合するＩｇＥを合成するＢ細胞がクローン増幅される。このＩｇＥは、順に、それがＢ細胞に（ＦｃεＲＩＩを介して）結合しているＢ細胞によって、並びに肥満細胞及び好塩基球の表面上に認められるいわゆる高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）を介して肥満細胞及び好塩基球によって循環中に放出される。そのような肥満細胞及び好塩基球は、それによって、アレルゲンに対して感作される。アレルゲンに対する次の曝露は、これらの細胞上でＦｃεＲＩを架橋し、かくして、臨床過敏症及びアナフィラキシーの原因となるヒスタミン及び他の因子の放出を活性化する。
【０００３】
オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））は、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）［Ｃε３ドメイン］に選択的に結合する組換えＤＮＡ由来ヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。この抗体は、約１４９ｋＤの分子量を有する。Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）は、抗生物質ゲンタマイシンを含有する栄養培地中でのチャイニーズハムスター卵巣細胞懸濁培養によって産生される。Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）は、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、ＵＳＰを用いて（又は、その代わりに、滅菌注射筒中の液体製剤として）再構成され、皮下（ＳＣ）注射として投与される単回使用バイアル中に含有される、滅菌された、白色の、保存剤を含有しない、凍結乾燥粉末である［ＥＰ６０２１２６（及びそれに基づくＳＰＣ／ＧＢ０６／００５）；ＷＯ９３／０４１７３；ＵＳ６２６７９５８（及びこの特許に基づくＸｏｌａｉｒ（登録商標）ＰＴＥ）；ＷＯ９７／０４８０７；ＷＯ９７／０４８０１；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３〜２６３２を参照されたい］。
【０００４】
オマリズマブは、通年性空気アレルゲンに対する皮膚試験陽性又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの反応性を示す患者における中程度から重度の持続型喘息並びに吸入コルチコステロイドによって十分に制御されない症状の処置について現在指示されている（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）の処方情報から）。
【０００５】
オマリズマブに関する問題は、１）それが遊離ＩｇＥを標的化するが、薬学的に関連する用量でＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の病原性種を標的化しない（又は効率的に標的化しない）；２）おそらくＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の病原性種が標的化されないため、「Ｘｏｌａｉｒ処置が有効性を示すためには（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）１５０ｍｇ溶液−Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ２０１４）、又は実際に、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）が特定の患者について作用するかどうか、若しくは異なる処置が必要であるかどうかを確立するためには、少なくとも１２〜１６週間」かかる；３）それが、高レベルのＩｇＥを示す患者のためのものではない（例えば、患者における高レベルの遊離ＩｇＥを考慮すると、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の病原性種が標的化されず、時間と共に消失しないため）；４）「オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）１５０ｍｇ溶液  Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ２０１４）を摂取する場合、アナフィラキシー及びアナフィラキシーショックを包含する、Ｉ型局所又は全身反応が起こることがある」；５）ＩｇＥに対するその親和性が、特に良好ではない（約２ｎＭ）ということである。
【０００６】
本発明の課題は、これらの問題の１つ又は２つ以上を改善するための新規抗体を同定することである。
さらなる課題は、新規エピトープに対する抗体（オマリズマブと比較してＩｇＥ  Ｃε２相互作用が増大した）、並びに／又は親和性が改良された、及び／若しくはＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体を解離させる能力が改良された、オマリズマブの新規変異体に基づく抗体を同定することである。
【０００７】
本発明のさらなる課題は、ＩｇＥと関連する障害、特に、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩの複合体と関連する障害、例えば、アレルギー障害の処置のための新規化合物、方法、及び組成物を同定することである。
発明の概要
【０００８】
本発明の一側面では、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｔ４２１、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８並びにＣε２ドメインの残基Ｄ２７８及びＴ２８１を含むエピトープと接触する、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が提供される。さらなる態様では、エピトープは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｋ３８０及び／若しくはＭ４３０の１つ若しくは２つ以上並びに／又はヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ｄ２７６、Ｖ２７７、Ｌ２７９、Ｓ２８０、Ａ２８２及び／若しくはＴ２９８の１つ若しくは２つ以上をさらに含んでもよい。
【０００９】
本発明は、有意な相互作用が変異領域中のＩｇＥ  Ｃε２ドメインに関して観察された、改良された抗体（オマリズマブに基づく）と、ＩｇＥ−Ｆｃとの相互作用を初めて示す、例１の結晶構造の観察に基づくものである。これは、オマリズマブ及び／又はオマリズマブＦａｂと比較して、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の改良された機能特性をもたらし得る。例えば、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、７、３、１、０．６６、０．５又は０．３μＭ未満の濃度（又はピーク血清濃度）で、ＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させることができる（例えば、例２に記載の方法によって実行される）。例えば、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、オマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂと比較して、ヒトＩｇＥに対する改良された／より強力な親和性（低いＫＤ）（例えば、ＩｇＥ−Ｆｃを使用する）（例えば、例６に記載の方法によって実行される）；並びに／又はオマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂと比較して、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体を解離させる改良された能力（ａｂｉｌｉｔｙ）（例えば、例２に記載の方法によって決定される）；並びに／又はオマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂよりも低い濃度（若しくはピーク血清濃度）でＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させる能力（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）（例えば、例２に記載の方法によって決定される）を有してもよい。改良されたＫＤとは、オマリズマブ及び／又はオマリズマブＦａｂのものよりも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、又は５０％低いことを意味する。本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤のＫＤは、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３ｎＭ未満であってよい。ＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させる改良された能力（ａｂｉｌｉｔｙ）又は能力（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）とは、オマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂより少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは１００％改善されること（例えば、例２及び例７に記載されるような解離率（％）及び／若しくはＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の見かけの解離速度を測定する場合）、並びに／又はオマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂが解離を達成しない濃度での解離の達成を意味する。
【００１０】
疑いを避けるために、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、オマリズマブ又はオマリズマブＦａｂではない。
【００１１】
一態様では、エピトープは、複合体化したＩｇＥ−Ｆｃ／抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の結晶構造中の、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の４又は５Å以内のＩｇＥ残基を決定することによって、結晶学的に（例えば、例１に記載のように）決定される。使用されるＩｇＥ−Ｆｃは、配列番号１０８のものとしてであってよい（追加のＮ２６５Ｑ＆Ｎ３７１Ｑ変異を有する）。
【００１２】
一態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、特定の結合部位で、エピトープのＣε３ドメインとＣε２ドメイン部分とがヒトＩｇＥの異なる鎖上にあるエピトープと接触する。ＩｇＥは、それぞれ、Ｃε３ドメインとＣε２ドメインとを有するＦｃドメイン中に２つの鎖を有する。
一態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、特定の結合部位で、エピトープのＣε３ドメインとＣε２ドメイン部分とがヒトＩｇＥの同じ鎖上にあるエピトープと接触する。
【００１３】
疑いを避けるために、本発明の２つの抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ヒトＩｇＥに結合することができるが、これらのうちの一方だけが、Ｃε３及びＣε２ドメインを含む本発明のエピトープとの相互作用を必要とする（他方は、例えば、他のＣε３ドメインとだけ相互作用することができる）。
【００１４】
一態様では（任意に、本発明の第１の側面の特徴をさらに採用する）、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｔ４２１、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８並びにＣε２ドメインの残基Ｄ２７８及びＴ２８１を含む前記エピトープに特異的である。任意に、前記エピトープは、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｋ３８０及び／若しくはＭ４３０の１つ若しくは２つ以上並びに／又はヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基Ｄ２７６、Ｖ２７７、Ｌ２７９、Ｓ２８０、Ａ２８２及び／若しくはＴ２９８の１つ若しくは２つ以上をさらに含んでもよい。疑いを避けるために、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、それが一般にヒトＩｇＥよりもむしろ前記エピトープを含む特異的なヒトＩｇＥ構造を認識し、これに結合する場合、前記エピトープに特異的である。
【００１５】
さらなる側面では（任意に、本発明の第１の側面の特徴をさらに採用する）、配列番号１８であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２９であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１を含む軽鎖可変領域とを含み、軽鎖可変領域が、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤と、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインとの相互作用を強化する１、２、３、４、５、６、７個以上のアミノ酸置換を有する配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ３をさらに含む、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が提供される。
【００１６】
さらなる側面では（任意に、本発明の前記側面の特徴をさらに採用する）、配列番号１８であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２９であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１を含む軽鎖可変領域とを含み、軽鎖可変領域が、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤と、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインとの相互作用を強化する１、２、３、４、５、６、７個以上のアミノ酸置換を有する配列番号２８であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ１をさらに含む、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が提供される。
【００１７】
ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ１領域が、ＩｇＥ  Ｃε３領域上に、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を固定し、配向させる場合（オマリズマブのように）、ＦＲ−Ｌ３及び／又はＦＲ−Ｌ１配列に対する変化（単数又は複数）は、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインとのより強力な相互作用を可能にする。オマリズマブ又はオマリズマブＦａｂと比較した変異体のより強力な相互作用を、親和性測定［より低いＫＤ］（例えば、例６に記載の方法によって実行される）及び／又はＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の改良された解離の特徴（例えば、例２に記載の方法によって決定される）によって評価することができる。
【００１８】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤と、ヒトＩｇＥのＣε２ドメインとのより強力な相互作用を、オマリズマブ及び／又はオマリズマブＦａｂと比較した、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の改良された機能特性によって特徴付けることができる。例えば、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、７、３、１、０．６６、０．５又は０．３μＭ未満の濃度（又はピーク血清濃度）でＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させることができる（例えば、例２に記載の方法によって実行される）。例えば、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、オマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂと比較して、ヒトＩｇＥに対する改良された／より強力な親和性（低いＫＤ）（例えば、ＩｇＥ−Ｆｃを使用する）（例えば、例６に記載の方法によって実行される）；並びに／又はオマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂと比較して、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体を解離させる改良された能力（ａｂｉｌｉｔｙ）（例えば、例２に記載の方法によって決定される）；並びに／又はオマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂよりも低い濃度（若しくはピーク血清濃度）でＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させる能力（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）（例えば、例２に記載の方法によって決定される）を有してもよい。改良されたＫＤとは、オマリズマブ及び／又はオマリズマブＦａｂのものよりも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、又は５０％低いことを意味する。本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤のＫＤは、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３ｎＭ未満であってよい。ＦｃεＲＩからヒトＩｇＥを解離させる改良された能力（ａｂｉｌｉｔｙ）又は能力（ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）とは、オマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂより少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、若しくは１００％改善されること（例えば、例２及び例７に記載されるような解離率（％）及び／若しくはＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の見かけの解離速度を測定する場合）、並びに／又はオマリズマブ及び／若しくはオマリズマブＦａｂが解離を達成しない濃度での解離の達成を意味する。
【００１９】
疑いを避けるために、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、オマリズマブ、又はオマリズマブＦａｂではない。
一態様では、ＦＲ−Ｌ３領域は、配列番号１２９を参照して、Ｓ６０、Ｓ６３、Ｓ７６、Ｓ７７、及び／又はＱ７９位（Ｋａｂａｔ）の１つ又は２つ以上で、他の天然アミノ酸の１つに変異される。
【００２０】
例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、Ｓ６０位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つ、例えば、Ｍ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ又はＴ、特に、Ｍに変異させてもよい。
例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、Ｓ６３位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つ、例えば、Ｗ又はＹ、特に、Ｙに変異させてもよい。
例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、Ｓ７６位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つ、特に、Ｎに変異させてもよい。
例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、Ｓ７７位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つ、例えば、Ｒ又はＫ、特に、Ｒに変異させてもよい。
【００２１】
例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、Ｑ７９位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つ、例えば、Ｒ又はＫ、特に、Ｒに変異させてもよい。
例えば、ＦＲ−Ｌ１領域を、配列番号２０を参照して、Ｇ１６及び／又はＲ１８（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つに変異させてもよい。
ある特定の態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の変異したＦＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列は、配列番号４３〜４９、６０〜８３、１３１又は１３８から選択される。
【００２２】
さらなる態様では、ＦＲ−Ｌ３領域は、ヒトＩｇＥに対するその親和性（より低いＫＤ）を改良するために、配列番号１２９を参照して、Ｓ６７位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つにさらに変異される。この場合、変異は、ＩｇＥのＣε３ドメインに関して、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の相互作用を強化していてもよい。例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、Ｓ６７位（Ｋａｂａｔ）で、Ｍ（特に）、Ｅ、又はＤに変異させてもよい。ある特定の態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の変異したＦＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列は、配列番号５３〜５９、８４〜１０７、１３１又は１３８から選択される。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３１であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ２をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
【００２３】
一態様では、ＣＤＲ−Ｌ２領域は、ヒトＩｇＥに対するその親和性（より低いＫＤ）を改良するために、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つに変異される。この場合、変異は、ＩｇＥのＣε３ドメインに関して、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の相互作用を強化していてもよい。例えば、ＣＤＲ−Ｌ２領域を、配列番号１２９を参照して、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）で、Ｄ（特に）、Ｅ、Ｑ又はＲに変異させてもよい。ある特定の態様では、変異したＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列は、配列番号５０又は配列番号５１から選択される。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１４であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
【００２４】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１６であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ２をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３３であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１３であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
【００２５】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１５であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ２をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１７であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ３をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１９であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ４をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
【００２６】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３０であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ２をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３４であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ４をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３５、配列番号１３２又は配列番号１３４又は配列番号１４１又は配列番号１４４又は配列番号１４５又は配列番号１５８又は配列番号１５９から選択されるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域ＶＬを有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域ＶＨを有してもよい。
【００２７】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、軽鎖定常領域をさらに含んでもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、カッパ定常領域である軽鎖定常領域を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、Ｌ１５４Ｐ（Ｋａｂａｔ）変異を有する軽鎖定常領域を有してもよい。
【００２８】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、配列番号３９、又は配列番号４１、又は配列番号１１７、又は配列番号１１９、又は配列番号１２５、又は配列番号１２７、又は配列番号１３６、又は配列番号１４３から選択されるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬを有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、重鎖定常領域ＣＨ１をさらに含んでもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号５であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と重鎖定常領域ＶＨ−ＣＨ１を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃをさらに含んでもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４に由来するＦｃを有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号９であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域、重鎖定常領域及び重鎖Ｆｃ領域、ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃを有してもよい。
【００２９】
本発明のさらなる側面では、配列番号１８であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２９であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、
ａ．軽鎖可変領域が、配列番号３２であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ３をさらに含み、ＦＲ−Ｌ３領域が、ヒトＩｇＥに対する抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤の親和性（より低いＫＤ）を改良するために、配列番号１２９を参照して、Ｓ６７位（Ｋａｂａｔ）で、他の天然アミノ酸の１つに変異される；及び／又は
ｂ．軽鎖可変領域が、配列番号３１であるアミノ酸配列を有する相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ２をさらに含み、ＣＤＲ−Ｌ２領域が、ヒトＩｇＥに対する抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤の親和性（より低いＫＤ）を改良するために、配列番号１２９を参照して、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）で他の天然アミノ酸の１つに変異される、
上記抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が提供される。
【００３０】
本発明者らは、これらの変異のいずれか、又は両方が、ヒトＩｇＥに対する、オマリズマブ又はオマリズマブＦａｂに基づく、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の親和性（改良された、又はより低いＫＤ）を驚くほど改良し得ることをここで見出した（例えば、ＩｇＥ−Ｆｃを使用する）（例えば、例６に記載の方法によって実行される）。特に、親和性の改良は、オマリズマブ及び／又はオマリズマブＦａｂと比較してのものである。変異は、ＩｇＥのＣε３ドメインとの相互作用を改良することができる。改良された、又はより低いＫＤとは、オマリズマブ及び／又はオマリズマブＦａｂのものよりも少なくとも５、１０、２０、３０、４０、又は５０％低いことを意味する。本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤のＫＤは、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３ｎＭ未満であってよい。
【００３１】
例えば、ＦＲ−Ｌ３領域を、配列番号１２９を参照して、Ｓ６７位（Ｋａｂａｔ）で、Ｍ（特に）、Ｅ、又はＤに変異させてもよい。
ある特定の態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の変異したＦＲ−Ｌ３領域のアミノ酸配列は、配列番号５２〜５９、８４〜１０７、１３１又は１３８から選択される。
【００３２】
例えば、ＣＤＲ−Ｌ２領域を、配列番号１２９を参照して、Ｓ５２位（Ｋａｂａｔ）で、Ｄ（特に）、Ｅ、Ｑ又はＲに変異させてもよい。
ある特定の態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の変異したＣＤＲ−Ｌ２領域のアミノ酸配列は、配列番号５０（特に）又は配列番号５１から選択される。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１４であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
【００３３】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１６であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ２をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３３であるアミノ酸配列を有する、相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１３であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ１をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１５であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ２をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
【００３４】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１７であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ３をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１９であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｈ４をさらに含む重鎖可変領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３０であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ２をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号３４であるアミノ酸配列を有する、フレームワーク領域ＦＲ−Ｌ４をさらに含む軽鎖可変領域を有してもよい。
【００３５】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ−Ｌ２領域が配列番号５０（特に）又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有すること以外は、連続するＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３、及びＦＲ−Ｌ４領域を含み、配列番号２０であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＶＬを有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ＦＲ−Ｌ３領域が配列番号５２であるアミノ酸配列を有すること以外は、連続するＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３、及びＦＲ−Ｌ４領域を含み、配列番号２０であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＶＬを有してもよい。
【００３６】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ−Ｌ２領域が配列番号５０（特に）又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有し、ＦＲ−Ｌ３領域が配列番号５２、１３１又は１３８から選択されるアミノ酸配列を有すること以外は、連続するＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３、及びＦＲ−Ｌ４領域を含み、配列番号２０であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域ＶＬを有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域ＶＨを有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、軽鎖定常領域をさらに含んでもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、カッパ定常領域である軽鎖定常領域を有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ−Ｌ２領域が配列番号５０（特に）又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有すること以外は、配列番号２４であるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬを有してもよい。
【００３７】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ＦＲ−Ｌ３領域が配列番号５２であるアミノ酸配列を有すること以外は、配列番号２４であるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬを有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ＣＤＲ−Ｌ２領域が配列番号５０（特に）又は配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を有し、ＦＲ−Ｌ３領域が配列番号５２、１３１又は１３８から選択されるアミノ酸配列を有すること以外は、配列番号２４であるアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬを有してもよい。
【００３８】
さらなる側面では、本発明は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、
ａ．重鎖可変領域が、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３及び配列番号１３１若しくは１３８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＷ−Ｌ３を含む；又は
ｂ．重鎖可変領域が、配列番号１であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１３２若しくは１３９から選択されるアミノ酸配列を含む、
上記抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を提供する。
【００３９】
一態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、配列番号１３６又は１４３から選択されるアミノ酸配列を有し、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、軽鎖定常領域をさらに含んでもよい。
本明細書に記載の全ての態様において、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、重鎖定常領域ＣＨ１をさらに含んでもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号５であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と重鎖定常領域ＶＨ−ＣＨ１を有してもよい。
【００４０】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃをさらに含んでもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４に由来するＦｃを有してもよい。
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号９であるアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域、重鎖定常領域及び重鎖Ｆｃ領域ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃを有してもよい。
本発明の全側面の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を、全長重鎖及び軽鎖、又はその断片を有する完全な抗体分子からなる群から選択することができる。
【００４１】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を、Ｆａｂ断片、改変されたＦａｂ’断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ダイアボディ、二特異的抗体、トリアボディ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、トリボディ、又は（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃからなる群から選択することができる。理論によって束縛されるものではないが、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、それが複数よりもむしろただ１つの抗ＩｇＥ抗原結合部位を有する場合、それと関連するアナフィラキシーの低いリスクを有してもよい。
一態様では、抗ＩｇＥ抗体は、ヒト血清アルブミンなどの、血清担体タンパク質に結合するｓｃＦｖに、直接的に、又はリンカーを介して連結されるＦａｂ断片である。
【００４２】
一態様では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域が配列番号１５２であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が配列番号１５５であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１５７であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む、好ましくは配列番号１５１を有するリンカーを介して連結された、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含んでもよい。
【００４３】
一態様では、ｓｃＦｖは、配列番号１５０であるアミノ酸配列を有する。１つの好ましい態様では、Ｆａｂ断片は、
ａ．重鎖可変領域が、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３及び配列番号１３１若しくは１３８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＷ−Ｌ３を含む；又は
ｂ．重鎖可変領域が、配列番号１であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、配列番号１３２若しくは１３９から選択されるアミノ酸配列を含む、
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。
【００４４】
別の態様では、Ｆａｂ断片は、重鎖可変領域と重鎖定常領域ＶＬ−ＣＨ１が、配列番号５であるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが配列番号１３６又は１４３から選択されるアミノ酸配列を有し、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、重鎖定常領域と軽鎖定常領域とをさらに含む。
別の態様では、ｓｃＦｖは、配列番号１４９であるアミノ酸配列を有するリンカーを介してＦａｂ断片のＣＨ１に連結される。
一態様では、重鎖可変領域及び重鎖定常領域、リンカー及びｓｃＦｖは、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む、配列番号１４７であるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
１つの他の態様では、配列番号１４７を有するｓｃＦｖに連結されたＦａｂ断片の重鎖は、配列番号１３６又は１４３を有する軽鎖可変及び定常領域と対形成する。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、それに結合するエフェクター又はリポーター分子を有してもよい。
【００４６】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を、グリコシル化する（例えば、Ｆｃドメイン内で）、並びに／又はデンプン、アルブミン、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択されるポリマーにコンジュゲートすることができる。一態様では、コンジュゲートされるＰＥＧは、５〜５０ｋＤａの範囲の分子量を有してもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤をヒト化することができる。
【００４７】
本発明のさらなる側面は、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列に関する。さらに、本発明の１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。例えば、クローニング又は発現ベクターは、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、又は配列番号４２、又は配列番号１３３、又は配列番号１３５、又は配列番号１３７、又は配列番号１４０、又は配列番号１４２、又は配列番号１４４から選択される１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含んでもよく、任意に、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２又は配列番号１４８から選択される１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列をさらに含んでもよい。
【００４８】
本発明のさらなる側面は、本発明の１つ又は２つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞である。本発明の宿主細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２又は配列番号１４８から選択される１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含む１つ又は２つ以上のクローニング又は発現ベクターを任意でさらに含んでもよい。
本発明の宿主細胞を培養すること、及び抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を単離することを含む、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の製造のためのプロセスも提供される。
【００４９】
さらなる側面は、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を含む医薬組成物に関する。好適には、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、希釈剤１ｍＬあたり５０〜２００、好ましくは、約、又は正確に１５０ｍｇの用量で存在する。ある特定の態様では、賦形剤は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンの一方又は両方を含む。賦形剤は、ポリソルベート２０を別々に、又は一緒に含んでもよい。希釈剤は、水又は水性等張溶液であってもよい。
本発明の医薬組成物を、皮下投与前の再構成のために粉末として滅菌バイアル内に、又はその即時的な皮下投与のために滅菌注射筒内に担持させることができる。
本発明の医薬組成物は、７５〜６００ｍｇ、例えば、約又は正確に１００又は１５０ｍｇの総用量の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を含有してもよい。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤と一緒に含有されるか、又は抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤との別々の同時投与のための他の活性成分をさらに含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物を、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が、アレルゲンと別々に同時投与される（が、同時包装してもよい）、アレルギーに基づく特異的免疫療法の文脈で使用することができる。かくして、本発明の医薬組成物は、患者が、治療的アレルゲンとして７、６、５、４、３、２、又は１日前（又は同日）に、本発明の医薬組成物を受容する、アレルギーに基づく特異的免疫療法における使用のためのものであってよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤、又は組成物は、薬剤としての使用のためのものであってもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤、又は組成物は、疾患の処置又は防止における使用のためのものであってもよい。
【００５１】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤、又は組成物は、ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体と関連する障害の処置又は防止における使用のためのものであってもよい。
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤、又は組成物は、ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体の解離及び抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤によるヒトＩｇＥの結合による障害の処置又は防止における使用のためのものであってもよい。
【００５２】
本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤、又は組成物は、アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息のうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止における使用のためのものであってもよい。
【００５３】
対象に、有効量の本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤、又は組成物を投与することを含む、ヒト対象における疾患の処置又は防止のための方法がさらに提供される。この方法は、ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体と関連する障害の処置又は防止のためのものであってもよい。本発明の方法は、ヒトＩｇＥとＦｃεＲＩとの複合体の解離及び本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤によるヒトＩｇＥの結合により、疾患を処置又は防止することができる。
【００５４】
本発明の方法は、アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息のうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止のためのものであってもよい。
【００５５】
本発明において、ポリペプチドが第２のポリペプチド（受容体など）への結合のためその生理学的応答を惹起する第１のポリペプチドに対する抗体又は抗原結合剤が、遊離及び結合した第１のポリペプチドの両方に結合し、そのような第１のポリペプチドのコンフォメーションを安定化することができることが解明された。そのような安定化されたコンフォメーションは、抗体又は抗原結合剤の非存在下におけるよりも弱い第２のポリペプチドに対する結合親和性を有し、したがって、第２のポリペプチドからの第１のポリペプチドのより迅速な解離を誘発する。
【００５６】
これに関して、本発明は、遊離及びＦｃεＲＩ結合ヒトＩｇＥに結合し、ＩｇＥのコンフォメーションを安定化することができる、抗体又は抗原結合剤に関するさらなる側面を提供する。ＩｇＥがそのようなコンフォメーションにある場合、それは、抗体又は抗原結合剤の非存在下におけるよりも弱いＦｃεＲＩに対する結合親和性を有し、そこで、ヒトＩｇＥに結合したＦｃεＲＩは、ＦｃεＲＩから解離する。任意に、ＩｇＥがそのようなコンフォメーションにある場合、ＩｇＥは、本発明の抗体又は抗原結合剤よりも低い、オマリズマブ又はその断片に対する結合親和性を有する。例えば、抗体又は抗原結合剤は、本明細書に記載の抗体である。
【００５７】
さらなる側面では、本発明は、本明細書に記載のそのような抗体又は抗原結合剤を選択するためのプロセスに関する。このプロセスは、
ａ．試験抗体又は抗原結合剤と、ヒトＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥを含む試料とを接触させるステップ；
ｂ．ヒトＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥの解離に関する試験抗体又は抗原結合剤の解離定数を測定するステップ；
ｃ．ステップｂ）で測定された解離定数と、ヒトＦｃεＲＩからのヒトＩｇＥの解離に関するオマリズマブ又はその断片の解離定数とを比較するステップ；
ｄ．抗体又は抗原結合剤がオマリズマブ又はその断片よりも速くＦｃεＲＩからＩｇＥを解離させる場合、前記抗体又は抗原結合剤を選択するステップ
を含む。
【００５８】
或いは、本発明による抗体又は抗原結合剤を選択するためのプロセスは、
ａ．試験抗体又は抗原結合剤と、ヒトＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥを含む試料とを接触させるステップ；
ｂ．ヒトＦｃεＲＩに由来するヒトＩｇＥに対する試験抗体又は抗原結合剤の結合親和性を測定するステップ；
ｃ．ステップｂ）で測定された結合親和性と、ＦｃεＲＩに対するヒトＩｇＥの結合親和性とを比較するステップ；
ｄ．抗体又は抗原結合剤が、ＦｃεＲＩに対するＩｇＥよりも、ＩｇＥに対する高い結合親和性を有する場合、前記抗体又は抗原結合剤を選択するステップ
を含む。
【００５９】
任意に、選択される抗体又は抗原結合剤は、ＦｃεＲＩに依然として結合しながら、ＩｇＥに、安定化されたコンフォメーションのＩｇＥが、オマリズマブ若しくはその断片の存在下でＦｃεＲＩに結合したＩｇＥよりも速くＦｃεＲＩから解離してもよい；及び／又はＦｃεＲＩに対するよりも高い、抗体若しくは抗原結合剤に対する結合親和性を有してもよい前記コンフォメーションを採用させる。
【００６０】
最後の側面では、本発明は、
ａ．配列番号１を含む重鎖可変領域と、
ｉ．配列番号１０９；若しくは
ｉｉ．配列番号１１３；若しくは
ｉｉｉ．配列番号１２１；若しくは
ｉｖ．配列番号１３２；若しくは
ｖ．配列番号１３９
を含む軽鎖可変領域と；又は
ｂ．配列番号５と、
ｉ．Ｓ７７及びＳ７９がＱで置き換えられた、配列番号２４；
ｉｉ．配列番号１１７；若しくは
ｉｉｉ．配列番号１２５；若しくは
ｉｖ．配列番号１３６；若しくは
ｖ．配列番号１４３
とを含む、特異的抗体又は抗原結合剤に関する。
【００６１】
本発明のこの最後の側面の一態様では、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１０８を参照して、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｔ４２１、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８並びにＣε２ドメインの残基Ｄ２７８及びＴ２８１を含むエピトープと接触する、又は接触し、これに特異的である。
【００６２】
参考文献及び配列番号は、図面に言及する例に見出される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】オマリズマブＦａｂ３が３つの点変異を含有することを示す図である。オマリズマブＦａｂ３はオマリズマブに由来し、抗原結合ＣＤＲに対して遠位に３つの点変異を含有し、そのうちの２つはＶＬドメインフレームワーク領域中にあり（Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｇｌｎ８３Ａｒｇ）、１つはＣκドメイン中にある（Ｌｅｕ１５８Ｐｒｏ）。重鎖及び軽鎖は、それぞれ、白色及び青色に着色されている。Ｆａｂの向きを示すために、変異した残基は赤色に、ＣＲＤＬ１は緑色に着色されている。
【図２】オマリズマブＦａｂ３と複合体を形成したＩｇＥ−Ｆｃの全体的構造を示す図である。（Ａ）オマリズマブＦａｂ３は、２：１の化学量論比でＩｇＥ−Ｆｃに結合する。Ｆａｂ１（緑色）は、専らＣε３ドメインを介して、ＩｇＥ−Ｆｃ鎖Ｂ（ピンク色）と係合する。Ｆａｂ２（青色）は、Ｃε３ドメインを介してＩｇＥ−Ｆｃ鎖Ａ（黄色）と相互作用し、ＩｇＥ−Ｆｃ鎖Ｂ（ピンク色）に由来するＣε２ドメインとの弱い相互作用を形成する。（Ｂ）２つのＦａｂは、Ｆｃε３−４領域の約２フォールドアクシスで偽対称性複合体を形成する。明確性のため、Ｃε２ドメインは示されない。（Ｃ）ＩｇＥ−Ｆｃは、オマリズマブＦａｂ３複合体中で非対称的に湾曲している。鎖Ｂ（ピンク色）に由来するＣε２ドメインはＦａｂ２（青色）と接触する。
【図３】オマリズマブＦａｂ３とＩｇＥ−Ｆｃとの境界面を示す図である。オマリズマブＦａｂ３  Ｆａｂ２（それぞれ、緑色及び黄色に着色される重鎖及び軽鎖）と、ＩｇＥ−Ｆｃに由来するＣε３ドメイン（ピンク色）との境界面が示される。オマリズマブＦａｂ３及びＣε３ドメイン残基標識は、それぞれ、青色及び黒色に着色される。境界面は、水素結合及びファンデルワールス相互作用を含む。境界面の顕著な特徴は、Ａｒｇ４１９（Ｃε３ドメイン）とＰｈｅ１０３（オマリズマブＦａｂ３  ＣＤＲＨ３）とのカチオン−π相互作用である。Ｐｈｅ１０３側鎖は、Ｔｈｒ３７３、Ｔｒｐ３７４、Ｓｅｒ３７５、Ｇｌｎ４１７及びＡｒｇ４１９（Ｃε３ドメイン）によって作られるポケットに大部分が埋没している。
【図４】オマリズマブＦａｂ３及びＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９が重複境界面に結合することを示す図である。オマリズマブＦａｂ３とＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９２０は両方とも、Ｃε３ドメインに結合する。オマリズマブＦａｂ３境界面の一部のみを形成するＩｇＥ−Ｆｃ残基は橙色に着色されるが、Ｃε３−Ｃε４リンカーの一部を包含するＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９境界面の一部のみを形成するものは青色に着色される。Ａｒｇ４１９及びＭｅｔ４３０を包含する、ピンク色に着色されるＩｇＥ−Ｆｃ残基は、オマリズマブＦａｂ３とＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９の両方の境界面に共通である。
【図５】ＩｇＥ−Ｆｃにおけるコンフォメーションの可撓性を示す図である。（Ａ）その鋭い非対称性湾曲を示す遊離ＩｇＥ−Ｆｃ８の側面図。（Ｂ）遊離ＩｇＥ−Ｆｃの前面図（（Ａ）に示された図から反時計回りに９０°回転）。（Ｃ）部分的に湾曲したコンフォメーションを示す、オマリズマブＦａｂ３複合体中のＩｇＥ−Ｆｃの側面図。（Ｄ）オマリズマブＦａｂ３複合体中のＩｇＥ−Ｆｃの前面図（（Ｃ）に示された図から反時計回りに９０°回転）。（Ｅ）抗ＩｇＥ−Ｆｃ  Ｆａｂ（オマリズマブＦａｂ３）１６により捕捉された完全に伸長したＩｇＥ−Ｆｃの側面図。（Ｆ）伸長したＩｇＥ−Ｆｃの前面図（（Ｅ）に示された図から反時計回りに９０°回転）。
【図６】ＩｇＥ−Ｆｃにおけるコンフォメーションの可撓性を示す図である。ＩｇＥ−Ｆｃの可撓性、及び湾曲したコンフォメーションから完全に伸長したコンフォメーションへの脱湾曲化は、分子力学によって以前に探査された１６。ＩｇＥ−Ｆｃの脱湾曲化は、以前に探査された１６ように、自由エネルギー表面として表される。（Ａ）オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体の結晶構造中に捕捉されたＩｇＥ−Ｆｃの伸長したコンフォメーション１６。（Ｂ）オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体の結晶構造中で観察された部分的に湾曲したＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーション。（Ｃ）遊離ＩｇＥ−Ｆｃ７、８の湾曲したコンフォメーション。ＩｇＥ−Ｆｃの湾曲したコンフォメーションは、最も低いエネルギーボウル（ｂａｓｉｎ）を占有するが、オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体中で観察された部分的に湾曲したコンフォメーションは、明確に異なるエネルギーボウル（Ｂ）を占有する。
【図７】ＩｇＥ−ＦｃとＦｃεＲＩとの相互作用の破壊を示す図である。オマリズマブＦａｂ３複合体において、Ｃε３ドメインは、ＩｇＥ−Ｆｃについてこれまでのところ報告されている最も開いたコンフォメーションを採り、ＦｃεＲＩαとの係合を不可能にする。ＦｃεＲＩα８と複合体を形成したＩｇＥ−Ｆｃの構造は黄色に着色され、受容体係合の２つのサブ部位が示される。ＩｇＥ−Ｆｃと複合体を形成したオマリズマブＦａｂ３の構造は、Ｃε４ドメイン上に重なり、Ｃε３ドメインは青色に着色される。２つの構造中のＨｉｓ４２４及びＰｒｏ４２６の位置を、Ｃε３ドメインにより採用される異なる位置を強調するために示す。
【図８】ＩｇＥ−ＦｃとＣＤ２３との相互作用の破壊を示す図である。（Ａ）オマリズマブＦａｂ３とＣＤ２３の両方の境界面に共通であるＣε３ドメイン残基はピンク色に着色される。（Ｂ）オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体及びＣＤ２３／Ｆｃε３−４複合体１１に由来するＣε３ドメイン（暗灰色）の重ね合わせは、ＣＤ２３（黄色）とオマリズマブＦａｂ３（ピンク色）との衝突を示す。
【図９】オマリズマブＦａｂ３とＩｇＥ−Ｆｃとの相互作用試験を示す図である。（Ａ）Ｃ末端Ｈｉｓタグにより捕捉されたオマリズマブＦａｂ３のＩｇＥ−Ｆｃへの結合；オマリズマブＦａｂ３を、以下の濃度：１００ｎＭ（黒色）、５０ｎＭ（赤色）、２５ｎＭ（緑色）、１２．５ｎＭ（青色）、６．２ｎＭ（シアン色）、３．１ｎＭ（紫色）、１．６ｎＭ（マゼンタ色）及び０．８ｎＭ（暗赤色）でＩｇＥ−Ｆｃ上に流した。標準的な二重参照法を使用した３６；それぞれの濃度を２回実行した。（Ｂ）第２のオマリズマブＦａｂ３結合部位の結合を、ＳＰＲサンドイッチ結合実験を使用して特徴付けた。ＩｇＥ−Ｆｃを、オマリズマブＦａｂ３表面上に捕捉させた後、第２のオマリズマブＦａｂ３分子を、１０００ｎＭ（黒色）、５００ｎＭ（赤色）、２５０ｎＭ（緑色）、１２５ｎＭ（青色）、６２．５ｎＭ（シアン色）、３１．２ｎＭ（紫色）、１５．６ｎＭ（マゼンタ色）、７．８ｎＭ（暗赤色）及び０ｎＭ（ネイビー色）の濃度で、ＩｇＥ−Ｆｃ／オマリズマブＦａｂ３複合体に添加した。（Ｃ）Ｃ末端Ｈｉｓタグにより捕捉されたＩｇＥ−Ｆｃ（赤色）及びＦｃεＲＩαへの結合によって捕捉されたＩｇＥ−Ｆｃ（青色）に結合するオマリズマブＦａｂ３の能力の比較；それぞれについて、１０００ｎＭの最高濃度を用いて、２倍希釈系列を試験した。差込図は、オマリズマブＦａｂ３が、ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体に依然として結合するが、Ｂｍａｘ値が低いことを示す。（Ｄ）オマリズマブＦａｂ３の濃度を増加させることにより媒介されるＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体の加速された解離。固定されたＦｃεＲＩα上にＩｇＥ−Ｆｃを捕捉した後、以下の濃度：５０００ｎＭ（マゼンタ色）、１０００ｎＭ（紫色）、２００ｎＭ（シアン色）、４０ｎＭ（青色）、８ｎＭ（緑色）、１．６ｎＭ（赤色）及び０ｎＭ（黒色）でオマリズマブＦａｂ３に結合させることによって、１：１のＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体を最初に確立した。差込図は、加速された解離プロセスの拡大図を示す。全ての濃度を２回実行した。２つの部位間のアロステリック伝達を最小化するために５℃で行った、第２のオマリズマブＦａｂ３結合部位（図４Ｂ）を特徴付けるものを除いて、全ての結合実験を２５℃で実施した。
【図１０】直接結合、競合実験及び加速された解離の分析を示す図である。固定されたオマリズマブＦａｂ３（Ａ）、オマリズマブＦａｂ（Ｂ）、及びインタクトなオマリズマブ（Ｃ）への直接結合を、ＩｇＥ−Ｆｃについて測定した。Ｆａｂ又はインタクト抗体を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して低密度で共有的に固定した；ＩｇＥ−Ｆｃを、１００ｎＭの最高濃度を用いる２倍希釈系列を使用して、様々な濃度でこれらの表面上に流した。全ての濃度を２回実行した。（Ｄ）ＩｇＥ−Ｆｃに関するオマリズマブＦａｂ３とαγ−融合タンパク質との間のＴＲ−ＦＲＥＴ競合結合実験。テルビウム標識されたαγ−融合タンパク質と、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識されたＩｇＥ−Ｆｃとの結合を、阻害剤として増加する濃度の未標識オマリズマブＦａｂ３：０μＭ（黒色）、２．５ｎＭ（青色）、５ｎＭ（緑色）、１０ｎＭ（マゼンタ色）、２０ｎＭ（赤色）を用いて測定した。阻害剤として、オマリズマブＦａｂは、ＩｇＥ−Ｆｃとαγ−融合タンパク質との相互作用の見かけのＫＤとＢｍａｘの両方に影響し、これは、いくらかのアロステリック阻害特性を示している。（Ｅ）それぞれ、５μＭの濃度での、インタクトなオマリズマブ（黒色）、オマリズマブＦａｂ（赤色）又はオマリズマブＦａｂ３（青色）により媒介されたＩｇＥ−Ｆｃ／ｓＦｃεＲＩα複合体の加速された解離の比較。
【図１１】代表的な電子密度マップを示す図である。１．１σで等高線を示された、２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップの立体図を、鎖Ａ  Ｃε３ドメインの一部、及びＡｓｎ３９４で共有的にＮ結合したオリゴ糖部分について示す。
【図１２】固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す図である。解離を、泳動バッファー（実線）又はＩｇＥ結合パートナー（他の全てのセンサーグラム）の存在下でモニタリングした。アッセイは、アッセイ方法（１）例２に記載のように実施された。
【図１３】固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離のＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す図である。解離を、対照上清（実線）又はＩｇＥ結合パートナー（他の全てのセンサーグラム）の存在下でモニタリングした。アッセイは、アッセイ方法（２）例２に記載のように実施された。
【図１４】ＲＢＬ−ＳＸ３８細胞の表面からのＡｌｅｘａ４８８標識されたＩｇＥ−Ｆｃの解離の分析を示す図である。測定された結合データをｔ＝０で１００％に標準化し、解離データを、時間の関数として、結合したままのＩｇＥ−Ｆｃの割合の変化としてプロットした。
【図１５】７２時間のＰＣＡモデルにおける治療用量の野生型オマリズマブＦａｂ及びオマリズマブＦａｂ３の効果の分析を示す図である。
【図１６】野生型ヒトＩｇＥ−Ｆｃ配列の残基２２４〜５４７（配列番号１０８に示される）を示す図であり、残基２２４と５４７を太字で示す。番号付けは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ及びＢｅｎｎｉｃｈ（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．４１：３〜２５によるものであり、ここで、Ｌ２５３後のＬ（Ｌｅｕ；ロイシン）はＬ２３５ａとして番号付けられ（囲み）、その後の残基はＣ２５４である。残りの残基は、さらなる付加なしに連続的に番号付けられる。エピトープ残基は、星印（＊）で示される。発明の詳細な説明
【００６４】
本明細書における抗体アミノ酸の番号付けは、抗体の連続的アミノ酸配列（例えば、配列番号１のＶＨ配列と、配列番号２０若しくは配列番号１２９のＶＬ配列とを含むオマリズマブ）−いわゆる、「ｐｄｂ」番号付けに由来するか、又は一般的なＫａｂａｔの番号付けスキームを使用してもよい。ＶＨ又はＶＬ配列の共通の免疫グロブリン部分（ＣＤＲ−相補性決定領域、又はＦＲ−フレームワーク領域）が記載される場合、それらは標準的な順序で連結される（ＶＨ＝ＦＲ−Ｈ１．ＣＤＲ−Ｈ１．ＦＲ−Ｈ２．ＣＤＲ−Ｈ２．ＦＲ−Ｈ３．ＣＤＲ−Ｈ３．ＦＲ−Ｈ４；ＶＬ＝ＦＲ−Ｌ１．ＣＤＲ−Ｌ１．ＦＲ−Ｌ２．ＣＤＲ−Ｌ２．ＦＲ−Ｌ３．ＣＤＲ−Ｌ３．ＦＲ−Ｌ４）。オマリズマブについては、ＶＨ（配列番号１）部分の「ｐｄｂ」番号付けは、ＦＲ−Ｈ１（アミノ酸１〜２５）、ＣＤＲ−Ｈ１（２６〜３６）、ＦＲ−Ｈ２（３７〜５０）、ＣＤＲ−Ｈ２（５１〜６６）、ＦＲ−Ｈ３（６７〜９８）、ＣＤＲ−Ｈ３（９９〜１１０）、ＦＲ−Ｈ４（１１１〜１２１）であるが、Ｋａｂａｔの番号付けは、ＦＲ−Ｈ１（アミノ酸１〜２５）、ＣＤＲ−Ｈ１（２６〜３５）、ＦＲ−Ｈ２（３６〜４９）、ＣＤＲ−Ｈ２（５０〜６５）、ＦＲ−Ｈ３（６６〜９４）、ＣＤＲ−Ｈ３（９５〜１０２）、ＦＲ−Ｈ４（１０３〜１１３）である。オマリズマブについては、ＶＬ（配列番号２０）部分の「ｐｄｂ」番号付けは、ＦＲ−Ｌ１（アミノ酸１〜２３）、ＣＤＲ−Ｌ１（２４〜３８）、ＦＲ−Ｌ２（３９〜５３）、ＣＤＲ−Ｌ２（５４〜６０）、ＦＲ−Ｌ３（６１〜９２）、ＣＤＲ−Ｌ３（９３〜１０１）、ＦＲ−Ｌ４（１０２〜１１１）であるが、Ｋａｂａｔの番号付けは、ＦＲ−Ｌ１（アミノ酸１〜２３）、ＣＤＲ−Ｌ１（２４〜３４）、ＦＲ−Ｌ２（３５〜４９）、ＣＤＲ−Ｌ２（５０〜５６）、ＦＲ−Ｌ３（５７〜８８）、ＣＤＲ−Ｌ３（８９〜９７）、ＦＲ−Ｌ４（９８〜１０７）である。
【００６５】
ＩｇＥ抗体の番号付けは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｂｅｎｎｉｃｈ（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．４１：３〜２５により報告された通りである。かくして、本発明において使用されるＩｇＥ−Ｆｃポリペプチド（配列番号１０８を参照されたい）は、Ｖ２２４−Ｋ５４７に由来する（Ｃ２２５Ａ変異を包含する）。図１６に示されるように、以下の番号付けは、Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｉｃｈ（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．４１：３〜２５に記載の通りであり、ここで、２５３位の後のＬ（Ｌｅｕ、ロイシン）は、Ｌ２５３ａと番号付けられ、残りの残基はＣ２５４などとしてＬ２５３ａから連続的に番号付けられる。結晶学的実験において、以下の変異もＩｇＥ−Ｆｃ中に挿入して、グリコシル化パターンを単純化した：Ｎ２６５Ｑ  ＆  Ｎ３７１Ｑ。ＩｇＥ−ＦｃのＣε２領域は、一般的には、配列Ｓ２２６−Ｄ３３０を占有することが受け入れられる。本明細書のＩｇＥに対する参照は、ヒトＩｇＥに対する参照（及びその逆）であってもよく、また、本明細書に記載のアッセイ及び方法の文脈においてＩｇＥ−Ｆｃに対する参照を構成してもよい。完全長ヒトＩｇＥ抗体のＦａｂアームの配列は、結晶構造中には存在しないため、この説明には包含されない。
【００６６】
「オマリズマブ」に対する本明細書における参照は、市販のＸｏｌａｉｒ（登録商標）製品；又は配列番号１であるＶＨアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０であるＶＬアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ完全長抗体又は配列番号５であるＶＨ−ＣＨ１アミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２４であるＶＬ−ＣＬアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ完全長抗体又は配列番号９であるＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２４であるＶＬ−ＣＬアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＩｇＧ完全長抗体に対する参照である。「オマリズマブＦａｂ」に対する参照は、配列番号１であるＶＨアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２０であるＶＬアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂ断片；又は（特に）配列番号５であるＶＨ−ＣＨ１アミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２４であるＶＬ−ＣＬアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂ断片に対する参照である。
【００６７】
一般的定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業界における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似する、又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００６８】
文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含する。本出願において、「又は」の使用は、別途記述しない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、用語「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「包含される（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定ではない。また、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」又は「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、別途具体的に記述しない限り、１つの単位を含む要素及び成分と、１より多いサブ単位を含む要素及び成分との両方を包含する。
【００６９】
一般的には、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法、及びその技術は、当業界で周知且つ一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、当業界で周知であり、別途指摘しない限り、本明細書を通して引用及び考察される様々な一般的な、及びより具体的な参考文献に記載された従来の方法に従って一般的に実施される。酵素反応及び精製技術を、当業界で一般的に達成されるか、又は本明細書に記載されるように、製造業者の明細書に従って実行することができる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される命名法、並びにその実験手順及び技術は、当業界で周知且つ一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、及び送達、並びに患者の処置のための標準的な技術が使用される。
本発明をより容易に理解することができるように、選択された用語を以下に定義する。
【００７０】
本明細書で使用される用語「宿主」は、典型的には、特に、ヒト又はヒト化フレームワークがアクセプター構造として使用される場合、ヒト対象を指す。別の宿主が処置される場合、抗体又は抗原結合剤をその宿主に対して調整して、拒絶を回避する、又はより適合性の高いものにする必要があり得ることが、当業者によって理解される。本発明においてＣＤＲを使用する方法及び所望の送達のためにそれらを適切なフレームワーク又はペプチド配列中に操作する方法及び様々な宿主のために機能させる方法が公知である。他の宿主は、他の哺乳動物又は脊椎動物種を包含してもよい。したがって、用語「宿主」は、或いは、抗体又は抗原結合剤が、必要に応じて、宿主との適合性のために好適に設計された、マウス、サル、イヌ、ブタ、ウサギ、家畜化されたブタ類（ブタ及びイノシシ）、反芻動物、ウマ類、家禽類、ネコ類、ネズミ類、ウシ類、イヌ類などの動物を指してもよい。
【００７１】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、用語ポリペプチドと互換的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖も指す。用語「ポリペプチド」は、天然又は人工のタンパク質、タンパク質断片、及びタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマー又はポリマーであってもよい。
【００７２】
本明細書で使用される用語「回収すること」とは、例えば、当業界で周知のタンパク質精製技術を使用する単離により、ポリペプチドなどの化学種が、天然に会合する成分を実質的に含まないようにするプロセスを指す。
【００７３】
本明細書で使用される用語「特異的結合」又は「特異的に結合すること」は、抗体、タンパク質、又はペプチドと、第２の化学種との相互作用を参照して、その相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、以下に定義される「抗原決定基」又は「エピトープ」）の存在に依存することを意味する；例えば、抗体は、タンパク質全体よりもむしろ、特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含む反応における、エピトープＡ（又は遊離の、未標識のＡ）を含む分子の存在は、抗体に結合する標識されたＡの量を減少させるであろう。本明細書で本発明のエピトープに言及する場合、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、前記エピトープに特異的である。
【００７４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又はそれをＩｇＥに特異的に結合させるＩｇ分子のエピトープ結合特徴の少なくともいくらかの部分を保持する、その任意の機能性断片、変異体、バリアント、若しくは誘導体を指す。そのような変異体、バリアント、又は誘導体抗体形式は、当業界で公知であり、以下に記載される。その非限定的態様は、以下に考察される。抗体は、それが分子（又はエピトープ）と特異的に反応することによってその分子（又はエピトープ）を抗体に結合させることができる場合、それは分子（又はエピトープ）に「結合することができる」と言われる。
【００７５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」は、異なる抗体の混合物を含む「ポリクローナル」抗体調製物とは対照的に、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子の調製物、又はＩｇ分子の少なくとも軽鎖エピトープ結合特徴を保持するその任意の機能性断片、変異体、バリアント、若しくは誘導体を指すことが意図される。モノクローナル抗体を、ファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイのようないくつかの公知の技術、並びにハイブリドーマ由来抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）などの、ハイブリドーマ技術により調製されたハイブリドーマによって分泌される抗体）により例示される古典的方法によって生成することができる。
【００７６】
完全長抗体では、それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと省略される）と、重鎖定常領域（ＣＨ）とを含む。重鎖定常領域は、４個のドメイン−ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３（重鎖γ、α及びδ）、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４（重鎖μ及びε）のいずれかを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと省略される）と、軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含む。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域を、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された、３個のＣＤＲと４個のＦＲとを含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであってもよい。
【００７７】
本明細書で使用される用語「抗原結合剤」とは、抗原（例えば、ＩｇＥ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ若しくは２つ以上の断片若しくは部分、又は抗原に対する所望の結合能力を保持する抗体断片の合成改変体を指す。抗体の抗原結合機能を、完全長抗体又はその改変体の断片又はある特定の部分によって実行することができることが示されている。態様は、２つ以上の異なる抗原又は抗原のいくつかのエピトープ若しくは不連続エピトープ領域に特異的に結合し得る二特異的、二重特異的及び多特異的形式を包含する。抗原結合剤の非限定例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込まれるＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４  Ａ１）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｖｉｉ）特性が免疫グロブリンであるものなどの抗体断片の融合物、例えば、ダイアボディ、ｓｃａｂ、二特異的抗体、トリアボディ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、トリボディ、（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃ、並びに（ｖｉｉｉ）ＣＤＲ又はフィブロネクチン若しくはロイシンジッパーなどの非免疫グロブリンフレームワーク上に移植された抗体ループなどの抗体部分（本明細書に組み込まれるＢｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１２５７〜１２６８を参照されたい）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらを、組換え又は他の方法を使用して、それらを、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して、一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照されたい）を形成する単一タンパク質鎖として作られるのを可能にする合成又は天然のリンカーによって連結することができる。そのような単鎖抗体もまた、抗原結合剤の用語の範囲内に包含されることが意図される。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２個ドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することによって、そのドメインに別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、２個の抗原結合部位を作出する二価の二特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照されたい）。そのような抗体結合部分は、当業界で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ  ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．７９０ｐｐ．（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５））。
【００７８】
本明細書で使用される用語「抗体構築物」とは、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結された１つ又は２つ以上の本発明の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つ又は２つ以上の抗原結合部分を連結するために使用される。そのようなリンカーポリペプチドは、当業界で周知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１〜１１２３を参照されたい）。免疫グロブリン定常ドメインとは、重鎖又は軽鎖定常ドメイン、例えば、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ定常ドメインを指す。重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当業界で公知である。Ｉｇ重鎖γ１定常領域並びにＩｇ軽鎖λ及びκ鎖の非限定例は、それぞれ、表８及び表６に提供される。
【００７９】
さらに、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と、１つ又は２つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有的又は非共有的会合により形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。そのような免疫接着分子の例としては、テトラマーｓｃＦｖ分子を作るためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３〜１０１）並びに二価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作るためのシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７〜１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を、全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）の、それぞれ、パパイン又はペプシン消化などの従来の技術を使用して、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を、本明細書に記載のように、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＩｇＥに特異的に結合する単離された抗体は、ＩｇＥ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、例えば、ヒトＩｇＥに特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来するＩｇＥ分子などの他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００８１】
用語「ＣＤＲ移植抗体」とは、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬの１つ又は２つ以上のＣＤＲ領域の配列が、１つ又は２つ以上のヒトＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）がマウスＣＤＲ配列で置き換えられたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体などの、別の種のＣＤＲ配列で置き換えられる抗体を指す。
【００８２】
用語「Ｋａｂａｔの番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔ標識化」は、本明細書では互換的に使用される。当業界で認識されるこれらの用語は、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりも可変性（すなわち、超可変性）であるアミノ酸残基を番号付けるシステムを指す（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２〜３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域については、超可変領域は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムによるアミノ酸位置３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）の範囲である。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａによれば（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１〜９１７（１９８７））、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは、残基２６から残基３２までに及ぶ。かくして、別途指摘しない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムと、Ｃｈｏｔｈｉａのトポロジーループ定義との組合せにより記載される通り、残基２６〜３５を指すことが意図される。軽鎖可変領域については、超可変領域は、ＣＤＲＬ１についてはアミノ酸位置２４〜３４、ＣＤＲＬ２についてはアミノ酸位置５０〜５６、及びＣＤＲＬ３についてはアミノ酸位置８９〜９７の範囲である。
【００８３】
本明細書で使用される用語「アクセプター」及び「アクセプター抗体」とは、１つ又は２つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％を提供する、又はコードする抗体又は核酸配列を指す。一部の態様では、用語「アクセプター」は、定常領域（単数又は複数）を提供する、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。さらに別の態様では、用語「アクセプター」は、１つ又は２つ以上のフレームワーク領域と定常領域（単数又は複数）とを提供する、又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。特定の態様では、用語「アクセプター」は、１つ又は２つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％を提供する、又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この態様によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１つ又は２つ以上の特定部分に存在しない少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有してもよい。アクセプターフレームワーク領域及び／又はアクセプター定常領域（単数又は複数）を、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当業界で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体）から誘導又は取得することができる。
【００８４】
本明細書で使用される用語「ＣＤＲ」とは、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域中には３個のＣＤＲが存在し、重鎖ＣＤＲについてはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３と指定され、軽鎖ＣＤＲについてはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３と指定されている。本明細書で使用される用語「ＣＤＲセット」とは、抗原に結合することができる単一の可変領域中に存在する３個のＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なるように定義されている。Ｋａｂａｔにより記載されたシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲを、ＫａｂａｔのＣＤＲと呼んでもよい。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７〜８８３（１９８９））は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内のある特定のサブ部分が、アミノ酸配列のレベルで高い多様性を有するにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを採用することを見出した。これらのサブ部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３と指定されたが、ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖及び重鎖領域を指定する。これらの領域を、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する境界を有する、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと呼んでもよい。ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３〜１３９（１９９５）及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２（５）：７３２〜４５（１９９６））によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記のシステムの１つに厳密に従わなくてもよいが、それにも拘わらず、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するが、特定の残基若しくは残基群又はさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響しないという予測又は実験的知見を考慮して、それらを短縮するか、又は伸長させることができる。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されるＣＤＲを使用してもよいが、好ましい態様は、Ｋａｂａｔ若しくはＣｈｏｔｈｉａ、又はその組合せの定義されたＣＤＲを使用する。
【００８５】
本明細書で使用される用語「標準」残基とは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９０７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９（１９９２）、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）によって定義された特定の標準的なＣＤＲ構造を定義するＣＤＲ又はフレームワーク中の残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．によれば、多くの抗体のＣＤＲの重要部分は、アミノ酸配列のレベルでの高い多様性にも拘わらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを有する。それぞれの標準構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続するセグメントに関する主としてペプチド骨格ねじれ角のセットを特定する。
【００８６】
本明細書で使用される用語「ドナー」及び「ドナー抗体」とは、１つ又は２つ以上のＣＤＲを提供する抗体を指す。好ましい態様では、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られる、又は誘導される抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体の文脈では、用語「ドナー抗体」とは、１つ又は２つ以上のＣＤＲを提供する非ヒト抗体を指す。
【００８７】
本明細書で使用される用語「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」とは、ＣＤＲを除く可変領域の残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義を異なるシステムによって決定することができるため、フレームワーク配列の意味は、それに応じて異なる解釈に付される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２及び−Ｌ３並びに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２及び−Ｈ３）はまた、軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を、各鎖上の４つのサブ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間に、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間に、及びＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に位置する。特定のサブ領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３又はＦＲ４として特定しないが、他者によって呼ばれるフレームワーク領域は、単一の天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせたＦＲを表す。本明細書で使用される場合、ＦＲは、４つのサブ領域の１つを表し、ＦＲ（複数）は、フレームワーク領域を構成する４つのサブ領域のうちの２つ以上を表す。
【００８８】
本明細書で使用される用語「生殖系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」とは、特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝子再配置及び変異をもたらす成熟プロセスを受けていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す。例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１８３〜２００（２００２）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．４８４：１３〜３０（２００１）を参照されたい。本発明の様々な態様により提供される利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、その種における個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存する可能性が高く、したがって、その種において治療的に使用された場合に外来起源に由来すると認識される可能性が低いという認識を利用するものである。
【００８９】
本明細書で使用される用語「重要」残基とは、抗体、特に、ヒト化抗体の結合特異性及び／又は親和性により多く影響する可変領域内のある特定の残基を指す。重要残基としては、限定されるものではないが、以下のうちの１つ又は２つ以上：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−又はＯ−グリコシル化部位であってもよい）、稀な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、標準的な残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基、及び可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａの定義と、第１の重鎖フレームワークのＫａｂａｔの定義との間で重複する領域中の残基が挙げられる。
【００９０】
用語「ヒト化抗体」は、一般的には、非ヒト種（例えば、ウサギ、マウスなど）に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒトのように」、すなわち、ヒト生殖系列可変配列とより類似するように変化している抗体を指す。１つの型のヒト化抗体は、ヒトＣＤＲ配列が、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えるために非ヒトＶＨ及びＶＬ配列中に導入された、ＣＤＲ移植抗体である。別の型のヒト化抗体は、少なくとも１つの非ヒトＣＤＲが、ヒトフレームワーク中に挿入された、ＣＤＲ移植抗体である。後者は、典型的には、本発明の焦点である。
【００９１】
特に、本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体又はそのバリアント、誘導体、類似体若しくは断片である。本明細書で使用される場合、ＣＤＲの文脈における用語「実質的に」とは、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。一態様では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体ＣＤＲと比較して１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有するＣＤＲ領域を有する。さらに、非ヒトＣＤＲを、公知の技術を使用して、より「ヒトのように」又はヒト身体と適合するように操作することができる。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに一致し（すなわち、ドナー抗体）、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）ｃ、Ｆｖ）の実質的に全部を含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。一部の態様では、ヒト化抗体は、軽鎖並びに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３、又はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４を包含してもよい。一部の態様では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。一部の態様では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の態様では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び／又はヒト化重鎖のみを含有する。本明細書で考察される一部の変異は一般的には「ヒト」でなくてもよいが、これらのものは「ヒト化」されていない本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤にとって不十分である。
【００９２】
ヒト化抗体を、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを包含する任意のクラスの免疫グロブリン、並びに限定されるものではないが、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を包含する任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１より多いクラス又はアイソタイプに由来する配列を含んでもよく、特定の定常ドメインを選択して、当業界で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化することができる。
【００９３】
ヒト化抗体のフレームワーク及びＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークを、その部位のＣＤＲ又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれかと正確に一致しないように、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって変異誘発することができる。しかしながら、好ましい態様では、そのような変異は広範囲に及ばないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５又は８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列のものと一致するであろう。一態様では、１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失が、親ＦＲ及びＣＤＲ配列と比較して（例えば、オマリズマブ又はオマリズマブＦａｂ配列と比較して）ヒト化抗体中に存在してもよい。本明細書で使用される用語「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書で使用される用語「コンセンサス免疫グロブリン配列」とは、関連する免疫グロブリン配列のファミリー中に最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７）を参照されたい）。免疫グロブリンファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は、ファミリー中にその位置で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占められる。２つのアミノ酸が同等に頻繁に存在する場合、いずれかをコンセンサス配列中に包含させることができる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「Ｖｅｒｎｉｅｒ」ゾーンとは、ＣＤＲ構造を調整し、Ｆｏｏｔｅ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７〜４９９、参照により本明細書に組み込まれる）により記載されたように抗原に対する適合を微調整することができるフレームワーク残基のサブセットを指す。Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン残基は、ＣＤＲの下にある層を形成し、ＣＤＲの構造及び抗体の親和性に影響し得る。
【００９５】
本明細書で使用される用語「中和」とは、本明細書に記載の発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤がＩｇＥタンパク質に特異的に結合する場合の、ＩｇＥの生物活性の中和を指す。中和は、前記抗体のＩｇＥへの結合の異なる様式の結果であってもよい。好ましくは、中和抗体は、ＩｇＥへの結合は、ＩｇＥの生物活性の中和をもたらす抗体である。好ましくは、中和結合タンパク質は、ＩｇＥに結合し、ＩｇＥの生物活性を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、８０％、８５％、又はそれ以上低下させる。中和抗体によるＩｇＥの生物活性の中和を、本明細書に記載のＩｇＥ生物活性の１つ又は２つ以上の指標を測定することによって評価することができる。
【００９６】
本明細書で使用される「中和モノクローナル抗体」は、ＩｇＥへの結合の際に、ＩｇＥの生物活性を部分的又は完全に阻害するか、又は減少させることができる、抗体分子の調製物を指すことが意図される。
本明細書で使用される用語「減弱」、「減弱させる」などは、血清ＩｇＥレベルの上昇により引き起こされる症状又は状態の重症度の低下又は減少を指す。
【００９７】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定基を包含する。ある特定の態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を包含し、ある特定の態様では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の電荷特性を有してもよい。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。ある特定の態様では、抗体は、それがタンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００９８】
本明細書で使用される用語「ｋｏｎ」は、当業界で公知のように抗体／抗原複合体を形成する、抗体の抗原への結合に関する結合速度定数を指すことが意図される。
本明細書で使用される用語「ｋｏｆｆ」は、当業界で公知のように抗体／抗原複合体からの抗体の解離に関する解離速度定数を指すことが意図される。
本明細書で使用される用語「ｋｄ」又は「ｋＤ」は、当業界で公知のように特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことが意図される。
【００９９】
免疫学的結合相互作用の強度、又は親和性を、相互作用の解離定数（ｋＤ又はｋｄ）を単位として表すことができ、ｋｄが小さいほど、親和性が大きい、又は高いことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性を、当業界で周知の方法を使用して定量することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定することを含み、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に同等に影響する幾何学的パラメータに依存する。かくして、「結合速度定数」（「ｋｏｎ」）と、「解離速度定数」（「ｋｏｆｆ」）とを、濃度の算出並びに結合及び解離の実際の速度によって決定することができる（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６〜８７（１９９３））。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、親和性とは関連しない全パラメータの取り消しを可能にし、解離定数ｋｄに等しい。Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９〜４７３。
【０１００】
用語「抗体コンジュゲート」は、治療剤又は細胞傷害剤などの第２の化学部分に化学的に連結された、抗体又は抗体断片又はその結合部分などの結合タンパク質を指す。本明細書で使用される用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、又は生体物質から作製された抽出物を指す。
【０１０１】
本明細書で使用される用語「結晶」及び「結晶化された」とは、結晶の形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は、固体状態の物質の１形態であり、アモルファス固体状態又は液体結晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）、又は分子集合体（例えば、抗原／抗体複合体）の規則的な、反復する三次元アレイから構成される。これらの三次元アレイは、当業界でよく理解される特定の数的関係に従って配置される。結晶中で反復される基本単位、又は構成要素は、非対称単位と呼ばれる。所与の明確に定義された結晶学的対称に従う配置にある非対称単位の反復は、結晶の「単位格子」を提供する。全ての三次元における規則的変換による単位格子の反復は、結晶を提供する。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、「核酸及びタンパク質の結晶化、実際の手法（Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、２ｎｄ  ｅａ．，ｐｐ．２０  １〜１６，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９９）を参照されたい。
【０１０２】
本明細書に記載される用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかの２個以上のヌクレオチドのポリマー形態又はいずれかの型のヌクレオチドの改変された形態を意味する。この用語は、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡを包含するが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「単離されたポリヌクレオチド」は、その起源のため、「単離されたポリヌクレオチド」が、「単離されたポリヌクレオチド」が自然に見られる；それが自然に連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結される；又はより大きい配列の一部として自然に存在しないポリヌクレオチドの全部又は一部と結合していないポリヌクレオチド（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源、又はそのいくつかの組合せの）を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。１つの型のベクターは、さらなるＤＮＡ断片をライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の型のベクターは、さらなるＤＮＡ断片をウイルスゲノム中にライゲートすることができるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって、それは宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。本明細書では、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターであるため、「プラスミド」及び「ベクター」を互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの、そのような他の形態の発現ベクターを包含することが意図される。
【０１０５】
用語「作動可能に連結された」とは、記載される成分が、その意図される様式で機能するのを可能にする関係にある並置（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合する条件下で達成されるような様式でライゲートされる。「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスに、又は遠くで作用する発現制御配列との両方を包含する。本明細書で使用される用語「発現制御配列」とは、それらがライゲートされるコード配列の発現及びプロセッシングを行うのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；並びに必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列を包含する。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を包含する；真核生物では、一般に、そのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を包含する。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセッシングにとって必須である成分を包含することが意図され、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列をさらに包含してもよい。
【０１０６】
本明細書で定義される「形質転換」とは、外因性ＤＮＡが宿主細胞に進入する任意のプロセスを指す。形質転換は、当業界で周知の様々な方法を使用して自然又は人工条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞中への外来核酸配列の挿入のための任意の公知の方法に依拠してもよい。この方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定されるものではないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、及び粒子ボンバードメントを包含してもよい。そのような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが、自己複製性プラスミドとして、又は宿主染色体の一部として複製することができる安定に形質転換された細胞を包含する。それらはまた、限られた時間にわたって、挿入されたＤＮＡ又はＲＮＡを一過的に発現する細胞も包含する。
【０１０７】
本明細書で使用される用語「組換え宿主細胞」（又は単に、「宿主細胞」）は、外因性ＤＮＡが導入された細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることが理解されるべきである。ある特定の改変が、変異又は環境的影響のためその後の世代に生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として包含される。好ましくは、宿主細胞は、任意の生物界から選択される原核及び真核細胞を包含する。好ましい真核細胞は、原生生物、真菌、植物及び動物細胞を包含する。最も好ましくは、宿主細胞は、限定されるものではないが、原核細胞系である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；哺乳動物細胞系ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ；昆虫細胞系Ｓｆ９；並びに真菌細胞サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を包含する。
【０１０８】
標準的な技術を、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用することができる。酵素反応及び精製技術を、製造業者の明細書に従って、又は当業界で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載のように実施することができる。前記技術及び手順を、一般的には、当業界で周知であり、本明細書を通して引用及び考察される様々な一般的且つより具体的な参考文献に記載されたような従来の方法に従って実施することができる。例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
【０１０９】
本明細書で使用される用語「有効量」とは、障害又はその１つ若しくは２つ以上の症状の重症度及び／若しくは持続期間を軽減する、若しくは改善する、障害の進行を防止する、障害の退縮を引き起こす、障害と関連する１つ若しくは２つ以上の症状の再発、発達、開始若しくは進行を防止する、障害を検出する、又は別の療法（例えば、予防剤若しくは治療剤）の予防若しくは治療効果（単数又は複数）を増強若しくは改善するのに十分なものである療法の量を指す。
【０１１０】
本明細書に提供されるヒトＩｇＥタンパク質の特定の領域又はエピトープマッピングを、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと共に当業界で公知の任意の好適なエピトープマッピング法によって同定することができる。そのような方法の例は、抗体によって認識されるエピトープの配列を含有する抗体に特異的に結合することができる最小の断片を用いて、本発明の抗体への結合についてＩｇＥに由来する様々な長さのペプチドをスクリーニングすることを包含する。ＩｇＥペプチドを、合成的に、又はＩｇＥタンパク質のタンパク質分解的消化によって生成することができる。抗体に結合するペプチドを、例えば、質量分析によって同定することができる。別の例では、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶解析を使用して、本発明の抗体により結合されるエピトープを同定することができる。ＩｇＥの構造及び本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤が結合するＩｇＥ上のエピトープを決定するためには、結晶化及びＸ線結晶解析技術が好ましい。
【０１１１】
本発明における使用のための抗体を、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３〜７８４８ｌ；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願ＷＯ２００４／１０６３７７により記載された方法により、特異的抗体の産生のために選択された単一のリンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる単一リンパ球抗体法を使用して生成することができる。抗体のためのスクリーニングを、ヒトＩｇＥへの結合を測定するためのアッセイ及び／又はＩｇＥがその天然の受容体に結合するのを遮断する能力を測定するためのアッセイを使用して実施することができる。結合アッセイの例は、ＥＬＩＳＡである。
【０１１２】
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を包含する）は、非ヒト種（例えば、ウサギ又はマウス）に由来する１つ又は２つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する抗体分子である（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体よりもむしろ、ＣＤＲの特異性決定残基を導入することだけが必要であることが理解されるであろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５〜３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、任意に、ＣＤＲが誘導された非ヒト種から誘導される１つ又は２つ以上のフレームワーク残基をさらに含んでもよい。後者は、ドナー残基と呼ばれることが多い。本発明の抗体分子は、好適には、２ｎＭ未満の結合親和性（ＫＤ）を有する。単離された天然若しくは組換えＩｇＥ又は好適な融合タンパク質／ポリペプチドを使用する、本明細書の例（例６を参照されたい）に記載されるような、ＢＩＡｃｏｒｅを包含する、当業界で公知の任意の好適な方法を使用して、親和性を測定することができる。
【０１１３】
当業者であれば、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０〜６７２（１９４９））により記載されたものを使用して、又はＢＩＡｃｏｒｅなどのシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、本発明の抗体又は抗原結合剤の親和性、並びに結合剤（抗体など）が結合を阻害する程度を決定することができる。表面プラズモン共鳴については、標的分子を固相上に固定し、フローセルと共に泳動する移動相中のリガンドに曝露する。固定された標的へのリガンド結合が起こる場合、部分屈折率が変化し、ＳＰＲ角の変化をもたらし、反射した光の強度の変化を検出することにより、リアルタイムでモニタリングすることができる。ＳＰＲシグナルの変化の速度を分析して、結合反応の結合相及び解離相に関する見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０〜６５（１９９３）を参照されたい）。
【０１１４】
本発明により提供される抗体の親和性を、当業界で公知の任意の好適な方法を使用して変化させることができることが理解されるであろう。したがって、本発明は、ＩｇＥに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。そのようなバリアントを、ＣＤＲの変異（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２〜４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９〜７８３，１９９２）、大腸菌の変異株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９〜３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４〜７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７〜８８，１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８〜２９１，１９９８）を包含するいくつかの親和性成熟プロトコールによって取得することができる。Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）は、親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【０１１５】
ヒト化抗体及び抗原結合剤
本発明の一側面では、ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体及び抗原結合剤が本明細書で提供される。ヒト化抗体は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワーク中に移植されたドナー抗体（例えば、マウス又はウサギモノクローナル抗体などの非ヒト抗体）に由来する１つ又は２つ以上のＣＤＲ（必要に応じて、１つ又は２つ以上の改変されたＣＤＲを包含する）を含有する抗体である。概説については、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５〜５３９，１９９８を参照されたい。
【０１１６】
一態様では、ＣＤＲ全体を導入するよりもむしろ、上記のＣＤＲのいずれか１つに由来する１つ又は２つ以上の特異性決定残基だけをヒト抗体フレームワークに導入する（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５〜３４を参照されたい）。一態様では、本明細書に記載の１つ又は２つ以上のＣＤＲに由来する特異性決定残基だけを、ヒト抗体フレームワークに導入する。別の態様では、本明細書に記載のそれぞれのＣＤＲに由来する特異性決定残基だけを、ヒト抗体フレームワークに導入する。
ＣＤＲ又は特異性決定残基を移植する場合、マウス、ウサギ、霊長類及びヒトフレームワーク領域を包含する、ＣＤＲが誘導されるドナー抗体のクラス／型を考慮した任意の好適なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。
【０１１７】
好適には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書に具体的に提供される１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。かくして、一態様では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域（本明細書に記載の任意の変異を有する）と、非ヒトドナーＣＤＲとを含むヒトＩｇＥに結合するヒト化モノクローナル抗体が提供される。
【０１１８】
ＣＤＲ移植抗体の構築は、一般的には、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲが、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的変異誘発によりヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域上に移植されるプロセスを開示し、本明細書に組み込まれる欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０２３９４００に記載されている。ＣＤＲは、抗体の抗原結合特異性を決定付け、可変ドメインのフレームワーク領域上に担持される比較的短いペプチド配列である。
【０１１９】
ＣＤＲ移植によるモノクローナル抗体のヒト化に関する最初期の研究は、ＮＰなどの合成抗原を認識するモノクローナル抗体に関して実行された。しかしながら、リゾチームを認識するマウスモノクローナル抗体及びヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットモノクローナル抗体を、ＣＤＲ移植によってヒト化した例が、それぞれ、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４〜１５３６，１９８８）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３〜３２４，１９８８）に記載されている。抗体ヒト化は、マウス、ラット、ヤギ、又はウサギ抗体などの非ヒト抗体のＣＤＲを、「類似する」ヒトフレームワーク（アクセプター）上に移植すること、及びドナーモノクローナル抗体から手動で選択され、元のＣＤＲコンフォメーションを維持するためにヒトアクセプターフレームワーク中に組み込まれる最小数の重要フレームワーク残基（復帰変異）を選択することによって達成される。そのような方法は、当業界で公知であり、本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：９６９〜９７３（１９９４）；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、ＰＣＴ／：ＵＳ９８／１６２８０、ＵＳ９６／１８９７８、ＵＳ９１／０９６３０、ＵＳ９１／０５９３９、ＵＳ９４／０１２３４、ＧＢ８９／０１３３４、ＧＢ９１／０１１３４、ＧＢ９２／０１７５５；ＷＯ９０／１４４４３、ＷＯ９０／１４４２４、ＷＯ９０／１４４３０、ＥＰ２２９２４６、ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６、ＥＰ２３９，４００、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、第４，８１６，５６７号に記載されたものを包含する。
【０１２０】
ヒト可変重鎖及び軽鎖生殖系列サブファミリー分類を、Ｋａｂａｔの生殖系列サブグループ指定から誘導することができる：特定のＶＨ配列については、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６若しくはＶＨ７並びにフレームワーク４のための特定の可変重鎖連結群については、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、及びＪＨ６；フレームワーク１、２及び３のための特定のＶＬカッパ配列については、ＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４、ＶＫ５若しくはＶＫ６並びにフレームワーク４のための特定のカッパ連結群については、ＪＫ１、ＪＫ２、ＪＫ３、ＪＫ４若しくはＪＫ５；又はフレームワーク１、２及び３のための特定のＶＬラムダ配列については、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、ＶＬ８、ＶＬ９若しくはＶＬ１０並びにフレームワーク４のための特定のラムダ連結群については、ＪＬ１、ＪＬ２、ＪＬ３若しくはＪＬ７。
【０１２１】
存在する場合、本発明の抗体分子の定常領域ドメインを、抗体分子の提唱された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択することができる。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特定の態様では、抗体分子が治療的使用を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプの、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。或いは、抗体分子が治療目的を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列バリアントを使用することもできることが理解されるであろう。例えば、Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５〜１０８に記載されたように、２４１位のセリンがプロリンに変化したＩｇＧ４分子を使用することができる。また、抗体が様々な翻訳後修飾を受けてもよいことも当業者によって理解されるであろう。これらの修飾の型及び程度は、抗体を発現させるのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に依存することが多い。そのような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変化を包含してもよい。よくある修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因するカルボキシ末端塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９〜１３４，１９９５に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは存在しなくてもよい。
【０１２２】
ＣＤＲ及びヒトフレームワーク改変
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，は、ＣＤＲのみの導入（Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）及びＷｕ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３２，２１１〜２５０，１９７０）により定義されたもの）では、ＣＤＲ移植産物において満足のいく抗原結合活性を提供するには十分ではないことを見出した。いくつかのフレームワーク残基が、ドナーフレームワーク領域のものに対応するように、それらを変化させる必要があることが見出された。どのフレームワーク残基を変化させる必要があるかを選択するための提唱された基準は、本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ９０／０７８６１に記載されている。
【０１２３】
ヒト可変ドメインフレームワークが、ＣＤＲが起源とする非ヒト可変フレームワークと同じか、又は類似するコンフォメーションを採用する場合、非ヒトＣＤＲの、ヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、十中八九、ＣＤＲの正確な空間定位の保持をもたらす。これは、フレームワーク配列が、ＣＤＲが誘導された非ヒト可変フレームワークドメインと高い程度の配列同一性を示すヒト抗体に由来するヒト可変ドメインを取得することによって達成される。上記のように、重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域を、同じか、又は異なるヒト抗体配列から誘導することができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってよいか、又はいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３（１９９１）；Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９７１（１９９３）及びＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＷＯ９２／２２６５３を参照されたい。
【０１２４】
非ヒトドナー免疫グロブリン及び適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決定領域を同定したら、次のステップは、もしあれば、得られるヒト化抗体の特性を最適化するために置換すべきであるこれらの成分に由来する残基を決定することである。一般に、非ヒト残基の導入はヒトにおいてヒト抗ドナー抗体（ＨＡＤＡ）応答を惹起する抗体のリスクを増大させるため、ヒトアミノ酸残基の、非ヒトアミノ酸残基による置換を最小化するべきである。免疫応答を決定する当業界で認識された方法を実行して、特定の宿主において、又は臨床試験中にＨＡＤＡ応答をモニタリングすることができる。ヒト化抗体を投与された宿主に、前記療法の投与の開始時に、及びそれを通して、免疫原性評価を与えることができる。ＨＡＤＡ応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）及び／又は固相ＥＬＩＳＡ分析を包含する、当業者には公知の方法を使用して、宿主に由来する血清試料中の、ヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定される。
【０１２５】
置換（本明細書では「変異」とも言う）のためのアミノ酸残基の選択は、部分的には、コンピュータモデリングによって決定される。免疫グロブリン分子の三次元画像を生成するためのコンピュータハードウェア及びソフトウェアは、本明細書に記載される。一般に、免疫グロブリン鎖又はそのドメインの解明された構造から出発して、分子モデルを生成する。モデリングされる鎖を、解明された三次元構造の鎖又はドメインとのアミノ酸配列類似性について比較し、最も高い配列類似性を示す鎖又はドメインを、分子モデルの構築のための出発点として選択する。少なくとも５０％の配列同一性を有する鎖又はドメインをモデリングのために選択し、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の配列同一性を有するものを、モデリングのために選択する。解明された出発構造を改変して、モデリングされる免疫グロブリン鎖又はドメイン中の実際のアミノ酸と、出発構造中のものとの差異を可能にする。次いで、改変された構造を、複合免疫グロブリンに集合させる。最後に、エネルギー最小化によって、また、全ての原子が、互いに適切な距離にあること、並びに結合の長さ及び角度が化学的に許容される限界の範囲内にあることを検証することによって、モデルを精緻化する。
【０１２６】
置換のためのアミノ酸残基の選択を、部分的には、特定の位置のアミノ酸の特徴の検査、又は特定のアミノ酸の置換若しくは変異誘発の効果の経験的観察によって決定することもできる。例えば、アミノ酸が、ドナー可変領域フレームワーク残基と、選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、通常、ヒトフレームワークアミノ酸を、アミノ酸が、
（１）抗原に直接的に非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）そうでなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、コンピュータモデリングによって決定された場合にＣＤＲ領域の約３〜６オングストローム以内にある）、又は
（４）ＶＬ−ＶＨ境界面に関与する
ことが合理的に予測される場合、ドナー抗体に由来する等価なフレームワークアミノ酸によって置換するべきである。
【０１２７】
「抗原に直接的に非共有結合する」残基は、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などにより、確立された化学的な力に従って抗原上のアミノ酸と直接的に相互作用する良好な確率を有するフレームワーク領域中の位置のアミノ酸を包含する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．又はＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，上掲によって定義される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，上掲により定義されるフレームワーク残基が、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，上掲により定義される構造ループ残基を構成する場合、ドナー抗体中に存在するアミノ酸を、ヒト化抗体中での置換のために選択することができる。「ＣＤＲ領域に隣接する」残基は、ヒト化免疫グロブリン鎖の一次配列中の１つ又は２つ以上のＣＤＲに直接隣接する位置、例えば、Ｋａｂａｔにより定義されるＣＤＲ、又はＣｈｏｔｈｉａにより定義されるＣＤＲに直接隣接する位置のアミノ酸残基を包含する（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  １ＭＢ  １９６：９０１（１９８７）を参照されたい）。これらのアミノ酸は、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用し、アクセプターから選択される場合、ドナーＣＤＲを変形させ、親和性を減少させる可能性が特に高い。さらに、隣接アミノ酸は、抗原と直接相互作用してもよく（参照により本明細書に組み込まれるＡｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７（１９８６））、ドナーからのこれらのアミノ酸の選択は、元の抗体における親和性を提供する全ての抗原接触を保持することが望ましい。本明細書に記載されるように、ＦＲ配列を置換／変異させて、ＩｇＥに対する本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の親和性を改善する（及び／又はＩｇＥのＣε２上のその相互作用若しくはエピトープを延長させる）こともできる。
【０１２８】
「そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する」残基は、ＣＤＲ領域をもたらすのに十分な空間定位にある二次構造分析によって決定されるものを包含する。一態様では、「そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する」残基は、ドナー免疫グロブリンの三次元モデル（例えば、コンピュータにより生成されたモデル）を分析することによって同定される。典型的には、元のドナー抗体の三次元モデルは、ＣＤＲの外部のある特定のアミノ酸が、ＣＤＲに近く、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などによりＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する良好な確率を有することを示す。これらのアミノ酸位置で、アクセプター免疫グロブリンアミノ酸よりもむしろドナー免疫グロブリンアミノ酸を選択することができる。この基準によるアミノ酸は、一般に、ＣＤＲ中のいくつかの原子の約３オングストローム単位（Ａ）以内に側鎖原子を有し、上記に列挙されたものなどの、確立された化学的な力に従ってＣＤＲ原子と相互作用することができる原子を含有しなければならない。水素結合を形成し得る原子の場合、３Åは、その核の間で測定されるが、結合を形成しない原子については、３Åは、そのファンデルワールス表面間で測定される。したがって、後者の場合、核は、相互作用することができると考えられる原子については、約６Å（３Ａ＋ファンデルワールス半径の和）以内になければならない。多くの場合、核は、４又は５〜６Å間隔であろう。アミノ酸がＣＤＲと相互作用することができるかどうかを決定する際に、構造の観点から、重鎖ＣＤＲ２の最後の８個のアミノ酸はフレームワークの部分としてより多く振る舞うため、これらのアミノ酸をＣＤＲの部分とは考えないことが好ましい。
【０１２９】
ＣＤＲ（又はＦＲ）中のアミノ酸と相互作用することができるアミノ酸を、さらに別の方法で同定することができる。各フレームワークアミノ酸の溶媒接近表面積は、２つの方法で：（１）インタクトな抗体中で、及び（２）ＣＤＲが除去された抗体からなる仮説分子中で算出される。約１０平方オングストローム以上のこれらの数字間の有意差は、溶媒へのフレームワークアミノ酸の接近が、ＣＤＲによって少なくとも一部遮断され、したがって、そのアミノ酸がＣＤＲとの接触していることを示す。アミノ酸の溶媒接近表面積を、当業界で公知のアルゴリズム（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６：５４８（１９８３）及びＬｅｅ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９（１９７１））を使用して、抗体の三次元モデルに基づいて算出することができる。フレームワークアミノ酸はまた、場合により、順にＣＤＲと接触する別のフレームワークアミノ酸のコンフォメーションに影響することにより、ＣＤＲと間接的に相互作用してもよい。
【０１３０】
フレームワーク中のいくつかの位置の特定のアミノ酸は、多くの抗体においてＣＤＲと相互作用することができることが知られている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，上掲、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，上掲及びＴｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５（１９９０）、全て参照により本明細書に組み込まれる）。注目すべきことに，軽鎖の２、４８、６４及び７１位並びに重鎖の７１及び９４位のアミノ酸（Ｋａｂａｔによる番号付け）は、多くの抗体においてＣＤＲと相互作用することができることが知られている。軽鎖中の３５位並びに重鎖中の９３及び１０３位のアミノ酸も、ＣＤＲと相互作用する可能性が高い。これらの全ての番号付けられた位置で、アクセプターアミノ酸よりもむしろドナーアミノ酸の選択（それらが異なる場合）がヒト化免疫グロブリン中で行われることが好ましい。他方、軽鎖の最初の５アミノ酸などの、ＣＤＲ領域と相互作用することができるある特定の残基は、ヒト化免疫グロブリン中の親和性を失うことなくアクセプター免疫グロブリンから選択されることもある。
【０１３１】
「ＶＬ−ＶＨ境界面に関与する」残基又は「パッキング残基」は、例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４５９２〜６６（１９８５）又はＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，上掲によって定義されたＶＬとＶＨとの境界面にある残基を包含する。一般に、通常ではないパッキング残基を、それらがヒトフレームワーク中にあるものと異なる場合、ヒト化抗体中で保持するべきである。
【０１３２】
一般に、上記の基準を満たす１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換される。一部の態様では、上記の基準を満たすアミノ酸の全部又は多くが置換される。場合により、特定のアミノ酸が上記の基準を満たすかどうか、また、一方がその特定の置換を有し、他方が有さない代替的なバリアント免疫グロブリンが産生されるかどうかに関するいくらかの不明確性がある。そのように産生された代替的なバリアント免疫グロブリンを、所望の活性について本明細書に記載のアッセイのいずれかにおいて試験し、好ましい免疫グロブリンを選択することができる。
【０１３３】
通常、ヒト化抗体中のＣＤＲ領域は実質的に同一であり、より通常は、ドナー抗体の対応するＣＤＲ領域と同一である。通常は望ましいものではないが、得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に検知できるほどに影響することなく、ＣＤＲ残基の１つ又は２つ以上の保存的アミノ酸置換を作ることができる場合もある。保存的又は類似的置換は、例えば、イソロイシン又はバリンに置換されるロイシンなどの組合せが意図される。互いに置換することができることが多い他のアミノ酸としては、限定されるものではないが、
フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに、
システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が挙げられる。
【０１３４】
置換のためのさらなる候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって通常ではない、又は「稀」であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸を、ドナー抗体の等価な位置に由来する、又はより典型的なヒト免疫グロブリンの等価な位置に由来するアミノ酸で置換することができる。例えば、アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置にとって稀であり、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸がヒト免疫グロブリン配列中のその位置にとって共通である場合；又は他のヒト配列と比較して、アクセプター免疫グロブリン中のアミノ酸がその位置にとって稀であり、ドナー免疫グロブリン中の対応するアミノ酸も稀である場合、置換が望ましい。これらの基準は、ヒトフレームワーク中の標準でないアミノ酸が抗体構造を破壊しないことを確保するのに役立つ。さらに、異常なヒトアクセプターアミノ酸を、ヒト抗体にとって偶然に典型的であるドナー抗体に由来するアミノ酸で置き換えることにより、ヒト化抗体の免疫原性を低くすることができる。
【０１３５】
本明細書で使用される用語「稀」とは、配列の代表試料中の配列の約２０％未満であるが、通常は約１０％未満でその位置に存在するアミノ酸を示し、本明細書で使用される用語「共通」とは、代表試料中の配列の約２５％を超えるが、通常は、約５０％を超えて存在するアミノ酸を示す。例えば、全てのヒト軽鎖及び重鎖可変領域配列は、それぞれ、互いに特に相同であり、ある特定の重要な位置に同じアミノ酸を有する配列の「サブグループ」にグループ化される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，上掲）。ヒトアクセプター配列中のアミノ酸がヒト配列間で「稀」又は「共通」であるかどうかを決定する場合、アクセプター配列と同じサブグループ中のこれらのヒト配列のみを考慮することが好ましいことが多い。
【０１３６】
置換のためのさらなる候補は、稀な、又は通常でないドナーフレームワーク残基に対応するアクセプターフレームワーク残基である。稀な、又は通常でないドナーフレームワーク残基は、その位置でドナー抗体にとって稀であるか、又は通常ではない（本明細書に定義される）ものである。ドナー抗体については、サブグループを、Ｋａｂａｔに従って決定し、コンセンサスとは異なる残基位置を同定することができる。これらのドナー特異的差異は、活性を増強する、ドナー配列中の体細胞変異を示し得る。結合に影響すると予測される通常でない残基は保持されるが、結合にとって重要ではないと予測される残基を置換することができる。
【０１３７】
置換のためのさらなる候補は、アクセプターフレームワーク領域中に存在する非生殖系列残基である。例えば、アクセプター抗体鎖（すなわち、ドナー抗体鎖と有意な配列同一性を有するヒト抗体鎖）を、生殖系列抗体鎖（同様に、ドナー抗体と有意な配列同一性を有する）と整列させる場合、アクセプター鎖フレームワークと生殖系列鎖フレームワークとの間で一致しない残基を、生殖系列配列に由来する対応する残基と置換することができる。
【０１３８】
上記で考察された特定のアミノ酸置換以外に、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、それらが誘導されたヒト抗体のフレームワーク領域と通常は実質的に同一であり、より通常は、同一である（本発明のために本明細書に記載のものを除く）。勿論、フレームワーク領域中の多くのアミノ酸は、抗体の特異性又は親和性にほとんど寄与しないか、又は直接寄与しない。かくして、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、得られるヒト化免疫グロブリンの特異性又は親和性の検知できる変化なしに許容され得る。かくして、一態様では、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列又はそのような配列のコンセンサスに対して少なくとも６５、７５又は８５％の配列類似性又は同一性を有する。別の態様では、ヒト化免疫グロブリンの可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列又はそのような配列のコンセンサスに対して少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列類似性又は同一性を有する。一般に、しかしながら、そのような置換は望ましくない（本明細書に記載のものを除く）。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、同一性及び類似性の程度を、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．  ＆  Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２．  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．  ＆  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６に記載のように容易に算出することができる。
【０１４０】
参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５〜５３９，１９９８）を包含する、ＣＤＲ移植抗体を考察するいくつかの概説が公開されている。
【０１４１】
本発明の抗ＩｇＥ抗体は、例えば、ＷＯ２００７／０２４７１５に開示されたＤＶＤ−Ｉｇ分子、又はＷＯ２０１１／０３０１０７に記載されたいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃのように、さらなる追加の結合ドメインを包含してもよい。かくして、本明細書で使用される抗体は、二価、三価又は四価完全長抗体を包含する。
【０１４２】
抗原結合剤
抗原結合剤として、単鎖抗体（すなわち、完全長重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、例えば、ＷＯ２００１０９０１９０に記載された単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ−抗原結合剤（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３），２０９〜２１７を参照されたい）が挙げられる。これらの抗体断片を作出し、製造するための方法は、当業界で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５〜１８１を参照されたい）。Ｆａｂ−Ｆｖ形式は、ＷＯ２００９／０４０５６２に初めて開示され、そのジスルフィド安定化バージョンであるＦａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０３５０１２に初めて開示された。本発明における使用のための他の抗体断片としては、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多特異性、例えば、二特異性を含んでもよいか、又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２５８３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。後者の１つのそのような例は、ＷＯ９２／２２５８３に記載されたＴｒｉ−Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
【０１４３】
典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及び天然の、又は改変されたヒンジ領域を含み、軽鎖が可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む、重鎖と軽鎖の対を含む。
【０１４４】
一態様では、Ｆ（ａｂ’）２を作出するために本開示によるＦａｂ’のダイマーが提供され、例えば、ダイマー化は、本明細書に記載の天然ヒンジ配列、若しくはその誘導体、又は合成ヒンジ配列を介するものであってよい。
抗体結合ドメインは、一般的には、３個は重鎖に由来し、３個は軽鎖に由来する６個のＣＤＲを含むであろう。一態様では、ＣＤＲは、フレームワーク中にあり、一緒になって可変領域を形成する。かくして、一態様では、抗原結合剤は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含むＩｇＥに特異的な結合ドメインを包含する。
【０１４５】
ＩｇＥに結合する抗体の能力を有意に変化させることなく、上記又は下記に記載される本発明により提供されるＣＤＲ又は他の配列（例えば、可変ドメイン）に対して、１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を加えることができることが理解されよう。当業者であれば、例えば、本明細書、特に、例に記載の方法を使用することにより、任意のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失の効果を容易に試験することができる。
【０１４６】
一態様では、本発明の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の、ＩｇＥに対する結合親和性（ＫＤ）が、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３ｎＭ未満となるように、本発明により提供される抗体又は断片において使用されるＣＤＲ又はフレームワーク領域に対して、１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３又は４つ）のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を加えることができる。一態様では、ＫＤを、例えば、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３ｎＭ未満に低下させるために、ＣＤＲ、フレームワーク領域、又はその両方に対して改変が加えられた改変されたヒト化抗体が提供される。
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃＦＡｂ、ｄＦｖ、単一ドメイン軽鎖抗体、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【０１４７】
Ｆａｂは、ＩｇＧをプロテアーゼであるパパインで処理すること（Ｈ鎖の２２４位のアミノ酸残基で切断される）によって得られる断片のうち、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分と、Ｌ鎖全体が、ジスルフィド結合を介して一緒に結合された、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片である。
ＩｇＥと特異的に反応する本発明のヒト化ＣＤＲ移植抗体を、プロテアーゼであるパパインで処理することによって、本発明のＦａｂを取得することができる。また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、及びそのベクターを、原核生物又は真核生物に導入して、Ｆａｂを発現させることによって、Ｆａｂを産生することもできる。
【０１４８】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをプロテアーゼであるペプシンで処理することによって得られる断片のうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりもわずかに大きい、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１４９】
ＩｇＥと特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体を、プロテアーゼ、ペプシンで処理することによって、本発明のＦ（ａｂ’）２を取得することができる。また、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、以下に記載されるＦａｂ’を結合させることによって、Ｆ（ａｂ’）２を産生することができる。
Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１５０】
ＩｇＥと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤であるジチオトレイトールで処理することによって、本発明のＦａｂ’を取得することができる。また、ＩｇＥと特異的に反応する本発明のヒトＣＤＲ移植抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、及びそのベクターを、原核生物又は真核生物に導入して、Ｆａｂ’を発現させることによって、本発明のＦａｂ’を産生することもできる。
ｓｃＦｖは、１個の鎖のＶＨと１個の鎖のＶＬとが、１２個以上の残基の適切なペプチドリンカー（Ｐ）を使用して連結され、抗原結合活性を有する、ＶＨ−Ｐ−ＶＬ又はＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドである。
【０１５１】
本発明のＩｇＥと特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得すること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、そのＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、発現ベクターを、原核生物又は真核生物に導入して、ｓｃＦｖを発現させることによって、本発明のｓｃＦｖを産生することができる。
【０１５２】
本発明のＦａｂ断片を、直接的に、又はリンカーを介して、ｓｃＦｖに連結することができる。本明細書で使用される「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、ＶＨとＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカー、例えば、配列番号１５１であるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって安定化される単鎖可変断片を指す。Ｆａｂ断片への連結は、化学的コンジュゲーションであってもよいが、最も好ましくは、翻訳融合物、すなわち、それぞれの配列が発現ベクターによって配列中でコードされる遺伝子融合物である。したがって、リンカーは、典型的には、本明細書に記載のアミノ酸リンカーである。Ｆａｂ断片に連結された本発明のｓｃＦｖは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体融合タンパク質の半減期を延長させるために、血清担体タンパク質に結合することができる。そのような方法での半減期の延長は、ＩｇＥ結合とは無関係であり、有利であり得る。
【０１５３】
本明細書で使用される「血清担体タンパク質」とは、ｓｃＦｖが結合し得る任意の好適な血漿担体タンパク質を指し、一例では、血清担体タンパク質は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲン及びアルブミン、又はそのいずれかの断片から選択される。典型的には、ｓｃＦｖは、アルブミン、好ましくは、ヒト血清アルブミンに結合する。
任意の好適なアルブミン結合ｓｃＦｖを、本発明の抗体融合タンパク質中に組み込むことができる。好適なアルブミン結合ドメインは、当業界で以前に記載されている。
ダイアボディは、同じか、又は異なる抗原結合特異性を有するｓｃＦｖ’がダイマーを形成し、同じ抗原に対する二価抗原結合活性又は異なる抗原に対する２つの特異的抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１５４】
ＩｇＥと特異的に反応する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得すること、３〜１０個の残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、そのＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、発現ベクターを、原核生物又は真核生物に導入して、ダイアボディを発現させることによって、本発明のダイアボディ、例えば、ＩｇＥと特異的に反応する二価ダイアボディを産生することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬのそれぞれの１個のアミノ酸残基が、システイン残基間のジスルフィド結合によってシステイン残基で置換されたポリペプチドを結合させることによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基を、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））によって示された方法による抗体の三次元構造評価に基づいて選択することができる。
【０１５５】
本発明のＩｇＥと特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得すること、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、そのＤＮＡを原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、発現ベクターを、原核生物又は真核生物に導入して、ｄｓＦｖを発現させることによって、本発明のｄｓＦｖを産生することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖及びＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１つの領域を包含させることによって構成される。複数のＣＤＲを、直接的に、又は適切なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【０１５６】
ＩｇＥと特異的に反応するヒトＣＤＲ移植抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを取得すること、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築すること、そのＤＮＡを原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、発現ベクターを、原核生物又は真核生物に導入して、ペプチドを発現させることによって、本発明のＣＤＲを含むペプチドを産生することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメトキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法により産生することができる。
本発明の抗体は、放射性同位体、タンパク質、薬剤などが本発明の抗体に化学的又は遺伝的にコンジュゲートされた抗体誘導体を包含する。
【０１５７】
放射性同位体、タンパク質又は薬剤を、ＩｇＥと特異的に反応する抗体若しくは抗体断片のＨ鎖若しくはＬ鎖のＮ末端若しくはＣ末端側に、抗体若しくは抗体断片の適切な置換基若しくは側鎖に、又は抗体若しくは抗体断片中の糖鎖に化学的にコンジュゲートすることによって、本発明の抗体誘導体を産生することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｓａｍｕ  Ｋａｎｅｍｉｔｓｕ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｃｈｉｊｉｎ  Ｓｈｏｋａｎ（１９９４））。
【０１５８】
また、ＩｇＥと特異的に反応する本発明の抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡを、結合されるタンパク質をコードする他のＤＮＡと連結すること、そのＤＮＡを発現ベクターに挿入すること、及び発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、それを遺伝的に産生することができる。
放射性同位体としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどが挙げられ、それを、例えば、クロラミンＴ法によって抗体にコンジュゲートすることができる。
【０１５９】
薬剤は、好ましくは、低分子量化合物である。例としては、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、メトトレキサート）、抗生物質（例えば、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシン）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、ホルモン薬（例えば、タモキシフェン、デキサメタゾン）などの抗がん剤（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９６））；ステロイド剤（例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン）、非ステロイド薬（例えば、アスピリン、インドメタシン）、免疫調節剤（例えば、アウロチオマラート、ペニシラミン）、免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド、アザチオプリン）及び抗ヒスタミン剤（例えば、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマスチン）などの抗炎症剤（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｓｈｉｙａｋｕ  Ｓｈｕｐｐａｎ（１９８２））などが挙げられる。ダウノマイシンを抗体にコンジュゲートさせるための方法としては、ダウノマイシンと抗体のアミノ基とを、グルタルアルデヒドを介してコンジュゲートする方法、ダウノマイシンのアミノ基と、抗体のカルボキシル基とを、水溶性カルボジイミドを介してコンジュゲートする方法などが挙げられる。
【０１６０】
また、がん細胞を直接的に阻害するために、リシン、ジフテリア毒素などの毒素を使用することができる。例えば、抗体又は抗体断片をコードするｃＤＮＡを、タンパク質をコードする他のｃＤＮＡに連結すること、融合抗体をコードするＤＮＡを構築すること、そのＤＮＡを、原核生物のための発現ベクター又は真核生物のための発現ベクター中に挿入すること、次いで、それを、原核生物又は真核生物に導入して、融合抗体を発現させることによって、タンパク質との融合抗体を産生することができる。
【０１６１】
全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１２５７〜１２６８に記載のような、フィブロネクチン又はロイシンジッパーなどの非Ｉｇフレームワーク上に移植された、結合剤の融合物、例えば、免疫グロブリン様断片と、ダイアボディ、ｓｃＡｂ、二特異的断片、トリアボディ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、トリボディ、（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃなどの薬剤、及びＣＤＲ又はＣＤＲを包含する抗体ループなどの抗体断片又は部分を包含する抗体断片又は抗原結合剤が本明細書でさらに企図される。
【０１６２】
コンジュゲートされた抗ＩｇＥモノクローナル抗体及び抗原結合剤
必要に応じて、本発明における使用のための抗体又は抗原結合剤を、１つ又は２つ以上のエフェクター分子にコンジュゲートさせることができる。エフェクター分子は、本発明の抗体に結合させることができる単一の部分を形成するために連結された単一のエフェクター分子又は２つ以上のそのような分子を含んでもよいことが理解されるであろう。エフェクター分子に連結された抗体断片を取得することが望ましい場合、抗体断片が直接的に、又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって、これを調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当業界で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３〜５３；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９〜５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７〜１２３を参照されたい）。特定の化学的手順としては、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載のものが挙げられる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結を、組換えＤＮＡ手順を使用して、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載のように達成することができる。
【０１６３】
本明細書で使用されるフェクタ−分子という用語は、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、抗原結合剤、合成（ＰＥＧを包含する）又は天然ポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ素、放射性同位体、キレートされた金属、ナノ粒子及び蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出することができる化合物などのリポーター基を包含する。
【０１６４】
エフェクター分子の例は、細胞にとって有害である（例えば、殺傷する）任意の薬剤を包含する細胞毒素又は細胞傷害剤を包含してもよい。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにその類似体又は相同体が挙げられる。
【０１６５】
エフェクター分子としては、限定されるものではないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も挙げられる。
【０１６６】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又は限定されるものではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を包含してもよい。
【０１６７】
他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素としては、限定されるものではないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられる。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、限定されるものではないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤若しくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の増殖因子及び免疫グロブリンなどの生物応答改変剤が挙げられる。
【０１６８】
他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用な検出可能物質を包含してもよい。検出可能物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影における使用のため）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断剤としての使用のために抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、一般的には米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられる；好適な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられる；好適な発光物質としては、ルミノールが挙げられる；好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに好適な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
【０１６９】
別の例では、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体の半減期を増加させる、及び／又は抗体の免疫原性を減少させる、及び／又は上皮バリアを通る免疫系への抗体の送達を増強することができる。この型の好適なエフェクター分子の例としては、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されたものなどのポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物が挙げられる。
一態様では、ＩｇＥ又は抗ヒトＩｇＥ抗体とは無関係であるエフェクター分子により提供される半減期が有利である。
【０１７０】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的には、合成又は天然ポリマー、例えば、置換されていてもよい直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分枝状若しくは非分枝状多糖、例えば、ホモ−若しくはヘテロ−多糖であってもよい。
上記の合成ポリマー上に存在してもよい特定の任意の置換基としては、１つ又は２つ以上のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。
【０１７１】
合成ポリマーの特定例としては、置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
特定の天然ポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が挙げられる。
一態様では、ポリマーは、ヒト血清アルブミン又はその断片などの、アルブミン又はその断片である。一態様では、ポリマーはＰＥＧ分子である。
【０１７２】
コンジュゲートに関して本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択性反応基を包含することが意図される。反応基を、直接的に、又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結することができる。そのような基の残基は、一部の例では、抗体断片とポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されるであろう。
【０１７３】
天然又は合成ポリマーのサイズを必要に応じて変化させてもよいが、一般的には、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、５０００〜４００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａの平均分子量の範囲にあるであろう。ポリマーのサイズは、特に、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍などのある特定の組織に局在化する能力又は長い循環半減期に基づいて選択することができる（概説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１〜５４５を参照されたい）。かくして、例えば、腫瘍の処置における使用のために、例えば、生成物が循環を離脱し、組織に浸透することを意図される場合、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する、低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に残存する適用については、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、より高分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
【０１７４】
好適なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）などの又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、特に、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、ポリアルキレンポリマーが挙げられる。
【０１７５】
一例では、本発明における使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合される。１つの特定の例では、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子を、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合させることができる。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在してもよいか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）を使用して断片中に操作することができる。一例では、本発明の抗体分子は、改変が、エフェクター分子の結合を可能にする１つ又は２つ以上のアミノ酸のその重鎖のＣ末端への付加である改変されたＦａｂ断片である。好適には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子を結合させることができる１つ又は２つ以上のシステイン残基を含有する改変されたヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。
【０１７６】
好適には、ＰＥＧ分子を、抗体断片中に位置する少なくとも１個のシステイン残基のチオール基を介して共有的に連結する。改変された抗体断片に結合されるそれぞれのポリマー分子を、断片中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有的に連結することができる。共有的連結は、一般的には、ジスルフィド結合、又は特に、硫黄−炭素結合であろう。チオール基を、適切に活性化されたエフェクター分子の結合点として使用する場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。活性化されたポリマーを、上記のポリマー改変抗体断片の調製における出発材料として使用することができる。
【０１７７】
活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセタミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応基を含有する任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料を、商業的に取得する（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡから）か、又は従来の化学的手順を使用して商業的に入手可能な出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから取得可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから取得可能）が挙げられる。
【０１７８】
一態様では、抗体は、ＰＥＧ化された、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示された方法［「ポリ（エチレングリコール）の化学、生物技術及び生物医学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、「ポリ（エチレングリコール）の化学及び生物学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び「生物医学のためのバイオコンジュゲーションタンパク質カップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，５４：５３１〜５４５も参照されたい］に従って、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））がそれに結合している改変されたＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂである。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域中のシステインに結合される。一例では、ＰＥＧにより改変されたＦａｂ断片は、改変されたヒンジ領域中の単一のチオール基に共有的に連結されたマレイミド基を有する。リシン残基を、マレイミド基に共有的に連結することができ、リシン残基上のアミン基のそれぞれを、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合させることができる。Ｆａｂ断片に結合されるＰＥＧの総分子量は、したがって、約４０，０００Ｄａであってよい。
【０１７９】
特定のＰＥＧ分子としては、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから取得可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００の２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドで改変されたリシンが挙げられる。
【０１８０】
ＰＥＧリンカーの代替的な供給源としては、ＧＬ２−４００ＭＡ３（ここで、下記の構造中のｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ここで、ｍは２である）及びｎが約４５０である、
【化１】
2019522470.tif 000002
を供給するＮＯＦが挙げられる。すなわち、それぞれのＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。
【０１８１】
かくして、一態様では、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られる、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２分枝ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬ、Ｍｗ４０，０００である。
【０１８２】
以下の型のさらに代替的なＰＥＧエフェクター分子：
【化２】
2019522470.tif 000003
は、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ，ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。
【０１８３】
一態様では、鎖中のアミノ酸２２６の、又はその近く、例えば、重鎖のアミノ酸２２６（連続的番号付けによる）のシステインアミノ酸残基を介して結合した、ＰＥＧ化された（例えば、本明細書に記載のＰＥＧを用いる）本発明の抗体が提供される。
一態様では、本開示は、１つ又は２つ以上のＰＥＧポリマー、例えば、４０ｋＤａのポリマー又は複数のポリマーなどの１つ又は２つのポリマーを含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。
【０１８４】
本開示によるＦａｂ’−ＰＥＧ分子は、それらがＦｃ断片とは無関係の半減期を有する点で特に有利であり得る。一例では、本発明は、抗体又はその抗原結合剤がＩｇＥに結合するＦｃとは無関係である半減期を有する治療有効量の抗ＩｇＥ抗体又はその抗原結合剤を投与することを含む、ヒトＩｇＥ生物活性をモジュレートすることにより改善される疾患を処置する方法を提供する。
一態様では、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートされたＦａｂ’が提供される。
一態様では、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーにコンジュゲートされたｓｃＦｖが提供される。
一態様では、抗体又は断片は、例えば、半減期を増加させるために、デンプン分子にコンジュゲートされる。米国特許第８，０１７，７３９号に記載された、デンプンをタンパク質にコンジュゲートする方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。好適には、ＤＮＡ配列は、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的プロセッシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその任意の組合せにより産生された合成ＤＮＡを含んでもよい。
【０１８６】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を、当業者には周知の方法によって取得することができる。例えば、抗体重鎖及び軽鎖の一部又は全部をコードするＤＮＡ配列を、必要に応じて決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、その既知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
分子生物学の標準的な技術を使用して、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全に、又は部分的に合成することができる。必要に応じて、部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用してもよい。
【０１８７】
本発明はまた、本発明の１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターが提供される。好適には、クローニング又は発現ベクターは、それぞれ、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖と、好適なシグナル配列とをコードする２つのＤＮＡ配列を含む。一例では、ベクターは、重鎖と軽鎖との間に遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。
【０１８８】
ベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者には周知である。これに関しては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより製造されるＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０１８９】
抗ＩｇＥ抗体又はその断片を発現する宿主細胞
また、本発明の抗体をコードする１つ又は２つ以上のＤＮＡ配列を含む１つ又は２つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために、任意の好適な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば、大腸菌、及び他の微生物系を使用するか、又は真核生物、例えば、哺乳動物の宿主細胞発現系を使用することもできる。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【０１９０】
本発明における使用のための好適な型のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用することができる、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などの、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を包含するＣＨＯ及びＣＨＯ−Ｋ１細胞又はグルタミン合成酵素選択マーカーと共に使用することができるＣＨＯＫ１−ＳＶ細胞を包含してもよい。抗体を発現させる際に使用するための他の細胞型としては、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳＯミエローマ細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が挙げられる。他の好適な細胞は、当業界で公知である、ヒト胚性腎（ｈｅｋ）線維芽細胞、例えば、ｈｅｋ２９３Ｆ及びＥｘｐｉＨｅｋ細胞を包含してもよい。
ＣＨＯは、オマリズマブの産生のための標準的な宿主であることを考慮すれば、これが本発明の完全長Ａｂにとって好ましい（本発明の抗体を考慮する一態様では、オマリズマブの標準的なグリコシル化パターン）［ＷＯ２０１３／１８１５７７も参照されたい］。
【０１９１】
抗ＩｇＥ抗体又はその断片の産生
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに好適な条件下で本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養すること、及び抗体分子を単離することを含む、本発明による抗体分子の産生のためのプロセスも提供する。
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含んでもよく、その場合、重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみを、宿主細胞をトランスフェクトするために使用することが必要である。重鎖と軽鎖の両方を含む生成物の産生のためには、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターと、重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターとの２つのベクターを細胞系にトランスフェクトすることができる。或いは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を包含する単一のベクターを使用してもよい。
【０１９２】
宿主細胞を培養する、及び抗体又はその断片を発現させる、後者を単離する、及び任意に、それを精製して、単離された抗体又は断片を提供するためのプロセスが提供される。一態様では、プロセスは、エフェクター分子を単離された抗体又は断片にコンジュゲートするステップ、例えば、特に、本明細書に記載のＰＥＧポリマーにコンジュゲートするステップをさらに含む。
一態様では、不純物がカラム上に保持され、抗体が溶出されるような非結合様式で陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む、抗体（特に、本発明による抗体又は断片）を精製するためのプロセスが提供される。
一態様では、精製は、プロテインＡカラム上での親和性捕捉、次いで、滴定を使用する。一態様では、精製は、プロテインＧカラム上での親和性捕捉、次いで、ＨＰＬＣ滴定を使用する。一態様では、精製は、ＩｇＥカラム上での親和性捕捉、次いで、滴定を使用する。
一態様では、精製は、アルブミン融合物又はコンジュゲート分子の精製のためにシバクロンブルー又は類似のものを使用する。
【０１９３】
前記プロセスにおける使用のための好適なイオン交換樹脂としては、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）が挙げられる。このステップは、例えば、約８のｐＨで実施してもよい。
【０１９４】
前記プロセスは、例えば、４．５などの、約４〜５のｐＨで実施される、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する初期捕捉ステップをさらに含んでもよい。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）などの樹脂を使用してもよい。次いで、抗体又は断片を、例えば、２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウムなどのイオン性塩溶液を使用して樹脂から溶出させることができる。
かくして、クロマトグラフィーステップ又は複数のステップは、必要に応じて、１つ又は２つ以上の洗浄ステップを包含してもよい。
また、精製プロセスは、透析濾過ステップ又はＨＰＬＣ濾過ステップなどの、１つ又は２つ以上の濾過ステップを含んでもよい。
【０１９５】
かくして、一態様では、内毒素及び／又は宿主細胞タンパク質又はＤＮＡから実質的に精製された、特に、それを含まない、又は実質的に含まない、精製された抗ＩｇＥ抗体又は断片、例えば、ヒト化抗体又は断片、特に、本発明による抗体又は断片が提供される。
上記で使用された、から精製されたとは、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれより純粋などの、少なくとも９０％の純度を指すことが意図される。
内毒素を実質的に含まないとは、一般的には、抗体生成物１ｍｇあたり１ＥＵ又は生成物１ｍｇあたり１ＥＵ未満、例えば０．５若しくは０．１ＥＵなどの内毒素含量を指すことが意図される。
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、一般的には、抗体生成物１ｍｇあたり４００μｇ又は必要に応じて、１ｍｇあたり１００μｇなど４００μｇ未満若しくはそれ未満、特に、１ｍｇあたり２０μｇ未満などの宿主細胞タンパク質及び／若しくはＤＮＡ含量を指すことが意図される。
【０１９６】
医薬組成物
本発明の抗体は病状の処置及び／又は予防において有用であるため、本発明は、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と共に、本発明の抗体又は抗原結合剤を含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、薬剤の製造のための本発明の抗体又は抗原結合剤の使用が提供される。組成物は、通常、薬学的に許容される担体を包含する滅菌された医薬組成物の一部として通常は供給されるであろう。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。
【０１９７】
本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合剤を、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と一緒に添加及び混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のためのプロセスも提供する。
抗体又は抗原結合剤は、医薬若しくは診断組成物中の唯一の活性成分であってもよく、又は他の抗体成分若しくは非抗体成分、例えば、ステロイド若しくは他の薬物分子、特に、半減期がＩｇＥ結合とは無関係である薬物分子を包含する他の活性分子を伴ってもよい。
【０１９８】
医薬組成物は、好適には、治療有効量の本発明の抗体又は抗原結合剤を含む。本明細書で使用される用語「治療有効量」とは、標的となる疾患若しくは状態を処置する、改善する、若しくは防止する、又は検出可能な治療若しくは防止効果を示すのに必要とされる治療剤の量を指す。任意の開示された抗体又は抗原結合剤について、治療有効量を、最初に、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類において見積もることができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。
【０１９９】
ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（単数又は複数）、療法に対する反応感度及び許容性／応答に依存するであろう。この量は、日常的な実験によって決定することができ、医師の判断の範囲内にある。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇであろう。医薬組成物を、用量あたり所定量の本発明の活性薬剤を含有する単位剤形中で都合良く提供することができる。
本開示による抗体又は抗原結合剤の治療用量は、ｉｎ  ｖｉｖｏで明白な毒性効果を示さない。
有利には、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩｇＥ活性のレベルを、本開示による抗体又は結合剤の連続用量の投与によって適切に低下したレベルに維持することができる。
組成物を患者に個別に投与するか、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続的に、又は別々に）投与することができる。
【０２００】
医薬組成物はまた、抗体又は抗原結合剤の投与のための薬学的に許容される担体を含有してもよい。担体は、それ自体、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきではなく、毒性であるべきではない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの、大きく、ゆっくりと代謝される高分子であってよい。
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
【０２０１】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有してもよい。さらに、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような組成物中に存在してもよい。そのような担体により、医薬組成物を、患者による摂取のために、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として製剤化することができる。
【０２０２】
投与のための好ましい形態としては、例えば、注射又は輸注による、例えば、ボーラス注射又は連続輸注による非経口投与にとって好適な形態が挙げられる。生成物が注射又は輸注のためのものである場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形態を取ってもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有してもよい。或いは、抗体分子は、適切な滅菌液体と共に使用する前の再構成のために、乾燥形態にあってもよい。
一度製剤化されたら、本発明の組成物を、対象に直接投与することができる。処置される対象は、動物であってもよい。しかしながら、組成物はヒト対象への投与に適合するのが好ましい。
【０２０３】
本発明の医薬組成物を、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下、脳室内、経真皮、経皮（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を包含する任意数の経路によって投与することができる。皮下噴射器を使用して、本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物を、液体溶液又は懸濁液として、注射剤として調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液にとって好適な固体形態を調製することもできる。
【０２０４】
組成物の直接送達は、一般的には、注射により、皮下的（特に）、腹腔内的、静脈内的若しくは筋肉内的に達成されるか、又は組織の間質腔に送達されるであろう。組成物を、病変に投与することもできる。用量処置は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールであってもよい。
【０２０５】
組成物中の活性成分は抗体分子であることが理解される。そのようなものとして、それは消化管における分解を受けやすいであろう。かくして、組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、それが消化管から吸収されたら抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。
薬学的に許容される担体の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
【０２０６】
構造−機能特性
本発明の一側面では、抗体又は抗原結合剤は、遊離の、及びＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥに結合する。本発明の抗体（又は抗原結合剤）がＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥに結合する場合、それはＩｇＥのコンフォメーションを安定化する。そのような安定化されたコンフォメーションでは、ＩｇＥは、本発明の抗体又は抗原結合剤の非存在下よりも弱い、ＦｃεＲＩ又はオマリズマブ（又はその断片）に対する結合親和性を有し、ＦｃεＲＩに結合したヒトＩｇＥは、ＦｃεＲＩから解離する。好ましくは、ＩｇＥは、ＦｃεＲＩからの解離時に、本明細書に記載の抗体又は抗原結合剤に結合したままである。本明細書の以後（例えば、例１及び図２）に示されるように、本発明の抗体又は抗原結合剤は、オマリズマブに結合した場合にＩｇＥが有するコンフォメーションとは異なるコンフォメーションでＩｇＥに結合する。
【０２０７】
理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明の抗体は、ＩｇＥに部分的に湾曲したコンフォメーション（図２Ｃ及び図５Ｃ＆Ｄ）を採用させ、したがって、遊離又はＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ構造から脱湾曲化している。そのような脱湾曲化は、ＩｇＥがＦｃεＲＩに結合するか、又はそれへの結合を保持する能力を損なわせる。例のセクションに示されるように、本発明の抗体はＦｃεＲＩへの結合についてＩｇＥ上の結合部位と競合するため、抗体はＦｃεＲＩに結合したＩｇＥと複合体を形成することができ、ＦｃεＲＩに結合した場合、ＩｇＥの構造を変化させ、ＦｃεＲＩからそれを解離させると考えられる。これらの特性を有する本発明による抗体は、
ａ．配列番号１を含む重鎖可変領域と、
ｉ．配列番号１０９；若しくは
ｉｉ．配列番号１１３；若しくは
ｉｉｉ．配列番号１２１；若しくは
ｉｖ．配列番号１３２；若しくは
ｖ．配列番号１３９
を含む軽鎖可変領域と；又は
ｂ．配列番号５と、
ｉ．Ｓ７７及びＳ７９がＱで置き換えられた、配列番号２４；
ｉｉ．配列番号１１７；若しくは
ｉｉｉ．配列番号１２５；若しくは
ｉｖ．配列番号１３６；若しくは
ｖ．配列番号１４３
とを含む抗体又は抗原結合剤などの、本明細書に記載のものである。
【０２０８】
そのような特性を有する抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤は、配列番号１０８を参照して、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインのＴ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８残基並びにＣε２ドメインのＤ２７８及びＴ２８１残基を含むエピトープに接触するか、又は接触し、特異的である。
【０２０９】
本発明の抗体は、いくつかの位置に、メチオニン残基を有する。メチオニン残基の酸化は、中でも最も一般的なタンパク質分解経路である。メチオニン残基が配列番号２０を参照してＳ６４及びＳ７１位に導入された本発明の抗体は、抗体がＩｇＥ−Ｆｃ：ｓＦｃＲＩα複合体の解離を促進する能力に影響することなく、完全な酸化を受け得る。
【０２１０】
したがって、本発明はまた、配列番号１であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号５０であるアミノ酸配列を有し、ＦＷ−Ｌ３が配列番号１３１又は１３８であるアミノ酸配列を有することを除いて、配列番号２０であるアミノ酸配列を有し、配列番号２０を参照して、６４及び／又は７１位のメチオニン残基が酸化された、ＣＤＲ−Ｌ２及びＦＷ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤も提供する。
【０２１１】
本発明はまた、配列番号１であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１３２又は１３９であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含み、配列番号１３２又は１３９を参照して、６４及び／又は７１位のメチオニン残基が酸化された、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤も提供する。
本発明の抗体中のさらなるメチオニン残基を、抗体がＩｇＥ−Ｆｃ：ｓＦｃＲＩα複合体の解離を促進する能力に影響することなく酸化することができる。ここで、本発明を、添付の図面に例示される態様を参照して、例によってさらに説明する。
【０２１２】
例
（例１）
ＩｇＥ−Ｆｃに結合した治療的抗ＩｇＥ抗体オマリズマブの変異体の構造はその作用機構を示す
要約
免疫グロブリンＥ並びに受容体ＦｃεＲＩ及びＣＤ２３とのその相互作用は、アレルギー疾患において中心的な役割を果たしている。臨床的に認可された治療抗体であるオマリズマブは、肥満細胞及び好塩基球の活性化を防止する、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの相互作用を阻害し、ＣＤ２３へのＩｇＥ結合を遮断する。本発明者らは、オマリズマブ由来ＦａｂとＩｇＥ−Ｆｃとの２：１の複合体の結晶構造を解明し、１つのＦａｂがそれぞれのＣε３ドメインに結合した（しかし、Ｆａｂのうちの１つのみがＣε２ドメインに結合した）。遊離ＩｇＥ−Ｆｃは溶液中で主として鋭く湾曲するが、複合体中では、それは部分的に湾曲するに過ぎず、ＦｃεＲＩとの相互作用を不可能にする；ＣＤ２３結合は、それぞれのＣε３ドメイン上の結合部位の重複のため立体的に阻害される。溶液状態の相互作用分析は、両方の受容体相互作用の阻害に関するオルトステリック及びアロステリックな基礎を証明し、構造と一緒に、オマリズマブ（特に、記載されたオマリズマブ変異体）が、ＩｇＥの内在する力学及びアロステリック能力を利用して、ＦｃεＲＩからの受容体に結合したＩｇＥの解離を促進することができる方法を示す。
【０２１３】
はじめに
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体は、アレルギー疾患において重要な役割を果たし、そのＦａｂアームを介してアレルゲンに結合し、Ｆｃ領域のための受容体に結合することによってそのエフェクター機能を発現する１。２つの主要なＩｇＥ受容体は、それぞれ、高親和性及び低親和性受容体と一般的に呼ばれる、ＦｃεＲＩ及びＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩである。肥満細胞及び好塩基球上で、ＩｇＥは、そのような細胞が予め結合したＩｇＥで感作され、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体を架橋し、即時反応を惹起するためにアレルゲンの存在のみを必要とする程度に固く（約１０−１０Ｍ−１のＫＤ）、ＦｃεＲＩに結合する。ＣＤ２３は、ホモトリマーであり、かくして、それぞれのＩｇＥ結合性Ｃ型レクチン様「頭部」ドメインの本質的に低い親和性（約１０−７Ｍ−１のＫＤ）を、免疫複合体中の凝集したＩｇＥに結合する場合、ＩｇＥに対するＦｃεＲＩのものとほぼ一致するアビディティ効果によって増強することができる２。Ｂ細胞上に発現されるＣＤ２３は、ＩｇＥの調節に関与し、気道及び腸上皮細胞上での発現は、ＩｇＥ／アレルゲン複合体のトランスサイトーシスを媒介する１、２。ＦｃεＲＩ及びＣＤ２３は両方とも、一定範囲の抗原提示細胞上でも発現される。かくして、ＩｇＥ−受容体相互作用は、アレルギー応答の複数の側面に関与し、ＩｇＥは治療的介入のための長年の標的である３。
【０２１４】
ＩｇＥのＦｃ領域は、３個のドメイン：Ｃε２、Ｃε３及びＣε４のジスルフィド結合ダイマーを含む。キメラＩｇＥの初期のＦＲＥＴ試験４、５、及びＩｇＥ−ＦｃのＸ線溶液散乱試験６は、コンパクトな湾曲した構造を示し、ＩｇＥ−Ｆｃの結晶構造は後に、鋭く非対称的に湾曲したコンフォメーションを示したが、（Ｃε２）２ドメイン対は、Ｃε３及びＣε４ドメイン上で折り返った７。（Ｃε２）２ドメイン対の部分的２フォールドアクシスと、Ｆｃε３−４（Ｃε３及びＣε４ドメインのみを含む領域）のものとの間の角度と定義される湾曲は、受容体のＩｇＥ結合α鎖の可溶性細胞外ドメインであるｓＦｃεＲＩαに結合したＩｇＥ−Ｆｃの結晶構造においてさらにより鋭くなる（６２°から５４°）ことがわかった８。Ｎ及びＣ末端標識されたＩｇＥ−Ｆｃを用いる最近のＦＲＥＴ試験により、ｓＦｃεＲＩα結合の際のこの増強された湾曲が確認された９。
【０２１５】
ＦｃεＲＩ結合部位は、Ｃε２−近位領域中の両方のＣε３ドメインに広がるが８、１０、Ｃε２ドメインは直接関与しない；両方の鎖の係合は、１：１の結合化学量論の原因となる。対照的に、２つのＣＤ２３分子は、一方はそれぞれの鎖中で、他方では、Ｃε３ドメインのＣε４−近位末端で、ＩｇＥ−Ｆｃに結合する１１、１２、１３。ＣＤ２３結合はまた、ＩｇＥ−Ｆｃのコンフォメーション変化を引き起こすが１４、湾曲に有意に影響するものではない９。しかしながら、遊離ＩｇＥ−Ｆｃと比較して、ＣＤ２３の可溶性頭部ドメイン（ｓＣＤ２３）と複合体を形成したＣε３ドメインの相対的に「閉じた」配置は、ＦｃεＲＩ結合にとって必要とされるこれらのドメインのより「開いた」配置と適合しない。これは、ＦｃεＲＩ及びＣＤ２３結合の相互排除を部分的に説明するものであるが１１、１２、部分的コンフォメーション変化及びコンフォメーション力学の改変などの他の因子１５もまた、２つの受容体結合部位間のアロステリックな連絡に寄与する可能性がある２。
【０２１６】
より極端な程度のＩｇＥ−Ｆｃの可撓性が、ａεＦａｂと呼ばれる、抗ＩｇＥ−Ｆｃ  Ｆａｂとの複合体の研究により最近発見された１６。２つのａεＦａｂ分子は、それぞれのＣε３ドメイン上で一方が、（Ｃε２）２ドメイン及びＦｃε３−４領域の部分２フォールドアクシスが実質的に一致する完全に伸長したコンフォメーションを捕捉する対称様式でＩｇＥ−Ｆｃに結合した。遊離ＩｇＥ−Ｆｃの分子力学的シミュレーションと共に、溶液中での複合体形成の分析により、（Ｃε２）２ドメイン対が、他方のＦｃε３−４領域の一方の側から「フリップする」ことができることが示唆された１６。この抗ＩｇＥ抗体により安定化されるＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションは、ＦｃεＲＩ結合と適合せず、その阻害活性を説明する。
【０２１７】
オマリズマブは、治療的使用について認可されている抗ＩｇＥモノクローナルＩｇＧ１抗体（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である１７。それは、遊離ＩｇＥに結合し、ＦｃεＲＩとＣＤ２３結合の両方を阻害する；結合部位は、ペプチド阻害及び分子モデリングによってＣε３ドメインにマッピングされているが１８、１９、その作用機構は不明である。しかしながら、ＦＲＥＴ標識されたＩｇＥ−Ｆｃへの結合は、わずかな程度の脱湾曲化９及びかくして、直接的阻害よりもむしろアロステリックの可能性を示した。
【０２１８】
最近、予め形成されたＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体を活発に破壊するある型の阻害剤が発見された：設計アンキリン反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ））が、受容体に結合したＩｇＥのＣε３ドメインに結合し、ＦｃεＲＩからのその解離を促進することがわかった２０。操作されたジスルフィド結合により拘束されたＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９とＦｃε３−４分子との２：１複合体の結晶構造は、結合部位の性質及び位置を示したが、その作用機構は不明のままであった。オマリズマブはＦｃεＲＩに結合したＩｇＥの解離を同様に容易にすることができるが、治療的使用において達成されるものよりも実質的に高い非常に高濃度でのみであることがその後報告された２１、２２。
【０２１９】
本発明者らはここで、ＩｇＥ−Ｆｃと、新しい抗体断片、抗原（ＩｇＥ−Ｆｃ）結合相補性決定領域（ＣＤＲ）から遠位である３点変異を含有するオマリズマブに由来するＦａｂ（オマリズマブＦａｂ３）との複合体の結晶構造を報告する。変異は、配列番号１２５を参照して、Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ及びＬ１５８Ｐ（又は配列番号１２９を参照して、Ｓ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ及びＬ１５４Ｐ）である。複合体の構造は、オマリズマブの作用機構を示し、溶液試験は、この機構がＩｇＥの内在する力学を利用することを証明する。
【０２２０】
結果
大きな努力にも拘わらず、オマリズマブＦａｂと複合体を形成したＩｇＥ−Ｆｃに関する結晶化試験は、Ｆａｂ断片のみの選択的結晶化をもたらした。他者は、この複合体を結晶化することに同様に失敗したと報告している２３。したがって、本発明者らは、オマリズマブＦａｂ結晶構造において観察された好ましい結晶接触を破壊する目的で、２つはＶＬドメインフレームワーク領域中にあり（Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｇｌｎ８３Ａｒｇ）、１つはＣκドメイン中にある（Ｌｅｕ１５８Ｐｒｏ）（配列番号１２５、ＰＤＢ番号付け）（図１）、３点変異を有する、オマリズマブに由来するＦａｂである新規抗体を設計した（結果は他の場所に報告される）。本発明者らは、このオマリズマブ由来Ｆａｂを「オマリズマブＦａｂ３」と呼ぶ。
【０２２１】
ＩｇＥ−Ｆｃ／オマリズマブＦａｂ３複合体の全体構造
本発明者らは、ＩｇＥ−Ｆｃと、オマリズマブＦａｂ３との複合体の結晶構造を、３．７Åの解像度で決定した（図２Ａ）。２つのオマリズマブＦａｂ３分子（Ｆａｂ１及びＦａｂ２）が、それぞれのＦａｂが１つのＣε３ドメインと係合する、非対称性の部分的に湾曲したＩｇＥ−Ｆｃ分子に結合する（図２Ｂ＆Ｃ）。Ｆａｂ１はＩｇＥ−Ｆｃ鎖ＢのＣε３ドメインと係合するが、Ｆａｂ２はＩｇＥ−Ｆｃ鎖ＡのＣε３ドメインと係合する。複合体におけるＩｇＥ−Ｆｃの部分的に湾曲したコンフォメーションのため、Ｆａｂ２の軽鎖はまた、ＩｇＥ−Ｆｃ鎖Ｂに由来するＣε２ドメインとの小さい相互作用を形成する（この相互作用に関する詳細についてはこの例の後部を参照されたい）。
【０２２２】
ＩｇＥ−ＦｃとオマリズマブＦａｂ３との境界面
それぞれのオマリズマブＦａｂ３分子は、Ｃε３ドメインの露出した面の一方の端部と係合する（Ｃ、Ｃ’、Ｆ及びＧ鎖、並びにＦｃεＲＩ受容体結合ＦＧループの基部）。オマリズマブＦａｂ３の重鎖と軽鎖の両方が関与し、前者は約７１５Å２の界面面積に約６０％寄与する（図２＆３）。
【０２２３】
２つの境界面間でわずかに異なる、オマリズマブＦａｂ３重鎖（配列番号５）接触は、以下のようにまとめることができる：Ｇｌｙ３２及びＴｙｒ３３（ＣＤＲＨ１）は、Ａｌａ３７７及びＳｅｒ３７８（Ｃε３）とファンデルワールス相互作用を形成する（配列番号１０８及び図１６に示されるＩｇＥ−Ｆｃ配列）が、Ｔｙｒ５４（ＣＤＲＨ２）はＧｌｙ３７９−Ｐｒｏ３８１（Ｃε３）と接触する。ＣＤＲＨ３残基は、最大の接触面積に寄与し、未結合のＦａｂ構造と比較した場合、複合体形成時に有意なコンフォメーション変化を受ける（非公開の結果、１９、２３）。ＣＤＲＨ３残基Ｓｅｒ１００、Ｈｉｓ１０１、Ｔｙｒ１０２及びＴｒｐ１０６は全て、Ｓｅｒ３７５−Ｇｌｙ３７９、Ｇｌｎ４１７及びＡｒｇ４１９（Ｃε３）を包含するＣε３ドメイン残基とファンデルワールス相互作用を形成する。しかしながら、境界面のこの部分の最も驚くべき特徴は、Ｐｈｅ１０３（ＣＤＲＨ３）との相互作用である。Ｐｈｅ１０３は、Ｔｈｒ３７３、Ｔｒｐ３７４主鎖、Ｓｅｒ３７５、Ｇｌｎ４１７及びＡｒｇ４１９（Ｃε３）によって作られるポケット中に大部分が埋没し、Ａｒｇ４１９とのカチオン／πスタッキング相互作用を形成する（図３）。
【０２２４】
Ａｒｇ４１９（Ｃε３）はまた、オマリズマブＦａｂ３軽鎖（配列番号１２５）との相互作用においても重要な役割を果たす（図３）。Ａｒｇ４１９（Ｃε３）は、Ｔｒｙ３１（ＣＤＲＬ１）及びＡｓｐ３２（ＣＤＲＬ１）主鎖カルボニル酸素原子の水素結合距離内にあり、さらに、Ａｓｐ３２、Ａｓｐ３４及びＴｙｒ３６側鎖と接触する（Ｔｙｒ３６のヒドロキシル基と水素結合を形成する）。Ａｓｐ３２はまた、Ｔｈｒ３７３及びＴｈｒ４２１（Ｃε３）とファンデルワールス相互作用を形成する。対照的に、２つのＣＤＲＬ２残基のみが、境界面に寄与する：Ｔｙｒ５３（ＣＤＲＬ２）はＧｌｎ４１７（Ｃε３）と接触し、Ｔｙｒ５３とＴｙｒ５７は両方ともＭｅｔ４３０（Ｃε３）とファンデルワールス相互作用を形成する；Ｔｙｒ５７もまたＭｅｔ４３０骨格と水素結合を形成する。重鎖相互作用に関しては、Ｆａｂ１とＦａｂ２に関する軽鎖接触においてわずかな差異がある。
【０２２５】
フォーマット（ｐｄｂ／Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ）におけるオマリズマブＦａｂ３番号付けにおけるＣＤＲ接触残基
重鎖配列：配列番号５；軽鎖配列：配列番号１２５
ＣＤＲＨ１：Ｓｅｒ（３１／３１／３１）、Ｇｌｙ（３２／３２／３１ａ）、Ｔｙｒ（３３／３３／３２）
ＣＤＲＨ２：Ｔｈｙ（５４／５３／５３）
ＣＤＲＨ３：Ｓｅｒ（１００／９６／９６）、Ｈｉｓ（１０１／９７／９７）、Ｔｙｒ（１０２／９８／９８）、Ｐｈｅ（１０３／９９／９９）、Ｔｒｐ（１０６／１０１Ｂ／１０１Ｂ）
ＣＤＲＬ１：Ａｓｐ（３０／２７Ｃ／３０）、Ｔｙｒ（３１／２７Ｄ／３０Ａ）、Ａｓｐ（３２／２８／３０Ｂ）、Ｇｌｙ（３３／２９／３０Ｃ）、Ａｓｐ（３４／３０／３０Ｄ）、Ｔｙｒ（３６／３２／３２）
ＣＤＲＬ２：Ｔｙｒ（５３／４９／４９）、Ｓｅｒ（５６／５２／５２）、Ｔｙｒ（５７／５３／５３）、Ｓｅｒ（６０／５６／５６）
ＣＤＲＬ１及びＣＤＲＨ３は相互作用に関与するほとんどの残基を有し、したがって、オマリズマブがＩｇＥ−Ｆｃに対してどのように結合し、自身を適応させるかを特徴付ける。ＣＤＲＬ３はＩｇＥ−Ｆｃへの結合には関与しない。
【０２２６】
他の抗ＩｇＥ複合体とのオマリズマブＦａｂ３境界面の比較
オマリズマブＦａｂ３のＣε３ドメイン上の結合部位及び最近記載されたＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９２０は重なり合い（図４）、それぞれ、約７１５Å２及び約７５３Å２の類似するサイズを有する。２つの境界面間で共有されるＣε３ドメイン残基は、Ｓｅｒ３７５−Ｇｌｙ３７９、Ｇｌｎ４１７、Ａｒｇ４１９、Ａｒｇ４２７及びＭｅｔ４３０を包含し、オマリズマブＦａｂ３は受容体結合Ｃε３ＦＧループとより緊密な接触を形成するが、ＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９境界面はＣε３−４ドメインリンカーを包含するように反対方向に伸長する。
【０２２７】
オマリズマブＦａｂ３とＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９との重なり合う結合部位は、完全に伸長したコンフォメーション中にＩｇＥ−Ｆｃを捕捉した、オマリズマブＦａｂ３について最近記載された境界面とは顕著に異なる１６（図５）。オマリズマブＦａｂ３界面面積は、約１４００Å２で、オマリズマブＦａｂ３とＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９の約２倍であるだけでなく、オマリズマブＦａｂ３はＣε３中のＡｒｇ３９３上に中心がある部位でＩｇＥ−Ｆｃと係合し、また、Ｃε２ドメイン及びＣε２−Ｃε３リンカー中の残基と接触する１６。Ｆｃε３−４との２：１の複合体中の、別の抗ＩｇＥ抗体Ｆａｂ、ＭＥＤＩ４２１２の結晶構造は、Ｃε３ドメイン内での抗体係合のためのさらに別の部位を示し、この１つはＡｓｎ３９４にＮ結合オリゴ糖部分を含む２４。
【０２２８】
ＩｇＥ−Ｆｃは、オマリズマブＦａｂ３に結合した場合、部分的に湾曲したコンフォメーションを採用する
ＩｇＥ−Ｆｃは、溶液中では主として湾曲しており５、６、９、２５、２６、２７、２８、遊離ＩｇＥ−Ｆｃの結晶構造は、（Ｃε２）２ドメイン対がＣε３及びＣε４ドメイン上で折り返され（図５Ａ＆Ｂ）、一方の鎖（鎖Ｂ）のＣε２ドメインが他方（鎖Ａ）のＣε４ドメインと接触する、大きく湾曲した（６２°）、非対称のコンフォメーションを示した７、８。ＩｇＥ−Ｆｃは、ＦｃεＲＩα係合時にさらにより大きく湾曲するようになり（５４°）８、９、関連するコンフォメーション変化は、鎖ＢのＣε３ドメインから遠い、固い単位として、（Ｃε２）２ドメイン対と共に、鎖ＡのＣε３ドメインの回転を含む８。
【０２２９】
ＩｇＥ−Ｆｃが完全に伸長した、直鎖状のコンフォメーションを採用するオマリズマブＦａｂ３複合体１６とは対照的に、ＩｇＥ−Ｆｃは、オマリズマブがＩｇＥ−Ｆｃの脱湾曲化を引き起こすことを示した初期のＦＲＥＴ試験９と一致して、オマリズマブＦａｂ３複合体中で部分的に湾曲したコンフォメーションを採用する（図２Ｃ及び図５Ｃ＆Ｄ）。Ｆａｂ１が結合する部位は、遊離の、大きく湾曲したＩｇＥ−Ｆｃ中で露出するが、Ｆａｂ２により占有される部位を接近可能にするためには、９０°をちょうど超える、ＩｇＥ−Ｆｃのさらなる脱湾曲化が必要である。オマリズマブＦａｂ３複合体中のＩｇＥ−Ｆｃのこの脱湾曲化は、ほぼ対称性のＦｃε３−４領域を作る、両方のＣε３ドメインの開口と関連する（図２Ｂ）。（Ｃε２）２ドメイン対は、各鎖に由来するＣε３とＣε４ドメインの間に位置し、鎖Ａに由来するＣε３ドメインと最早それほど密接に関連しない。
【０２３０】
伸びた構造へのＩｇＥ−Ｆｃの脱湾曲化を調査する最近の分子力学的シミュレーションにおいて、遊離ＩｇＥ−Ｆｃの結晶構造中で観察される大きく湾曲したコンフォメーションは最も低いエネルギーボウルを占有するが、部分的に湾曲したＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションに対応する、別の異なる明確に定義されたエネルギーボウルが観察されることがわかった１６。オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体中のＩｇＥ−Ｆｃにより採用される部分的に湾曲したコンフォメーションは、この特定のエネルギーボウルを占有する（図６）。
【０２３１】
Ｃε３ドメインはオマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体中で顕著に開いたコンフォメーションを採用する
ＩｇＥ−Ｆｃ及びＦｃε３−４サブ断片の結晶構造において、Ｃε３ドメインは、その２つの主要な受容体であるＦｃεＲＩ及びＣＤ２３８、１１、１２、１４へのＩｇＥの結合のアロステリックな調節と関連する特性である、一定範囲の異なる方向を採用する７、８、１０、１１、１３、１４、１６、２４、２９。Ｆｃε３−４領域について観察される様々なコンフォメーションを記載するために、Ｃε３ドメイン間の距離と、Ｃε４ドメインに関するその位置との両方が使用されてきた２９（これらの測定値に関する完全な記載はこの例の後部に提供される）。オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体において、Ｃε３ドメインは、ＩｇＥ−Ｆｃ又はＦｃε３−４を含有する任意の他の結晶構造におけるよりも、互いに、また、Ｃε４ドメインから離れたところに位置し、かくして、これまでのところ観察された最も開いたコンフォメーションを採用する（図５）；このコンフォメーションは、ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ−Ｆｃに関するコンフォメーションよりも有意に開いている（図７）。
【０２３２】
ＦｃεＲＩ及びＣＤ２３受容体結合に対するオマリズマブＦａｂ３の効果
オマリズマブは、ＩｇＥ−ＦｃとＦｃεＲＩとの相互作用を阻害するだけでなく、ＩｇＥ−ＦｃとＣＤ２３との相互作用も阻害する３０。後者と一致して、オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ及びＣＤ２３／Ｆｃε３−４複合体の比較１１により、Ｆｃε３−４上のＣＤ２３係合の両方の部位でのオマリズマブＦａｂ３とＣＤ２３との衝突が示される。さらに、Ｃε３ドメイン残基Ａｒｇ３７６、Ｓｅｒ３７８及びＬｙｓ３８０は、オマリズマブＦａｂ３とＣＤ２３結合の両方に関与する１１、３１。
【０２３３】
ＩｇＥへのＣＤ２３結合とは対照的に、ＦｃεＲＩαは、両方のＣε３ドメインにわたって結合する。しかしながら、オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体において、Ｃε３ドメインは、両方の鎖の同時的係合を可能にするには開きすぎているコンフォメーションを採用する（図８）。さらに、オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−ＦｃとｓＦｃεＲＩα／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体とを、順にそれぞれのＣε３ドメイン上で重ね合わせた場合、いずれの場合も立体的衝突の可能性が生じる。鎖ＡのＣε３ドメイン上で重ね合わせた場合、オマリズマブＦａｂ３  Ｆａｂ２は、ＦｃεＲＩα複合体中の（Ｃε２）２ドメイン対と衝突し、オマリズマブＦａｂ３複合体に由来するＣε２−Ｃε３リンカーはＦｃεＲＩαと衝突する可能性がある。鎖ＢのＣε３ドメイン上で重ね合わせた場合、オマリズマブＦａｂ３  Ｆａｂ１とＣε２−Ｃε３リンカー（オマリズマブＦａｂ３複合体の）との間で、ＦｃεＲＩαと衝突する可能性があるが、Ｆａｂ１及びＦｃεＲＩαの結合部位は実際には重ならない。
【０２３４】
しかしながら、オマリズマブＦａｂ３  ＣＤＲＬ１残基は、ＦｃεＲＩαに結合するＣε３ドメインＦＧループにすぐ隣接して位置する。鎖Ｂ中のこのループは、Ｃε３中のＰｒｏ４２６がＦｃεＲＩαの２個のトリプトファン残基間を包む、疎水性「プロリンサンドイッチ」相互作用に寄与する。Ａｓｐ３２（ＣＤＲＬ１）はＴｈｒ４２１に接触し、Ｇｌｙ３３（ＣＤＲＬ１）はＰｒｏ４２６、Ａｒｇ４２７及びＡｌａ４２８に接触し、Ａｓｐ３４（ＣＤＲＬ１）はＡｒｇ４２７及びＡｌａ４２８に接触する。これらの相互作用は、Ｃε３ドメインＦＧループの位置を変化させ、さらに、ＩｇＥのＦｃεＲＩへの結合を損なわせる。最近、オマリズマブのＦｃεＲＩα結合ＩｇＥへの結合が報告された２１、３２が、オマリズマブが、ｓＦｃεＲＩα８及びオマリズマブＦａｂ３との複合体中のＩｇＥ−Ｆｃの静的結晶構造に基づいてＦｃεＲＩ結合ＩｇＥとどのように係合するかを見るのは困難である。したがって、本発明者らは、オマリズマブＦａｂ３のＩｇＥ−Ｆｃへの結合を試験し、オマリズマブＦａｂ３とＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ複合体との相互作用を特徴付けた。本発明者らの結果は、オマリズマブの作用機構に関する洞察を提供する。
【０２３５】
溶液中でのオマリズマブＦａｂ３とＩｇＥ−Ｆｃとの相互作用
本発明者らは、表面上にオマリズマブＦａｂ３を直接固定し、ＩｇＥ−Ｆｃに結合させること、又はＳＰＲセンサー表面上でオマリズマブＦａｂ３をＨｉｓタグ付きの捕捉されたＩｇＥ−Ｆｃに結合させることにより、２つの異なる方法でＩｇＥ−Ｆｃ／オマリズマブＦａｂ３相互作用を特徴付けた。Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きＩｇＥ−Ｆｃ構築物を、抗Ｈｉｓタグ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕捉し、オマリズマブＦａｂ３、インタクトなオマリズマブ及びオマリズマブＦａｂの結合特性を比較した。驚くべきことではないが、競合結合実験において、３つ全ての分子が、同じ結合部位について競合し、広く類似する結合親和性を示した（データは示さない）。オマリズマブＦａｂ３構築物は、オマリズマブＦａｂ３及びインタクトなオマリズマブと比較してわずかに高い親和性を示す（図８Ａ〜Ｃ）。結晶構造と一致して、２個のオマリズマブＦａｂ３分子が、ＩｇＥ−Ｆｃに結合する：結合は、明らかに二相性であり、低いリガンド濃度では高い親和性（約１ｎＭ）相互作用が観察されより高い濃度では第２の（より弱い）結合部位（約３０ｎＭ）が観察される（図９Ａ）。
【０２３６】
サンドイッチＳＰＲ実験により、２つのＩｇＥ−Ｆｃ／オマリズマブＦａｂ３結合部位を別々に特徴付けることができる。この手法を使用して、オマリズマブＦａｂ３を、センサー表面上に共有的に固定し、ＩｇＥ−Ｆｃをこの表面上に流した。低濃度では、これらの条件下で、高親和性部位が相互作用を支配し、結合曲線を、単相相互作用動力学によって説明することができる（約１ｎＭのＫＤ、約１．２ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ、約８ｘ１０−４ｓ−１のｋｏｆｆ）。次いで、ＳＰＲバイオセンサー表面上に捕捉された、この１：１のＩｇＥ−Ｆｃ／オマリズマブＦａｂ３複合体を使用して、結合が第１のものよりも有意に弱い（約３０ｎＭのＫＤ、約２ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ、約６ｘ１０−３ｓ−１のｋｏｆｆ）、第２のオマリズマブＦａｂ３分子の結合を測定することができる（図９Ｂ）。
【０２３７】
オマリズマブＦａｂ３とＦｃεＲＩα結合部位との競合及びオマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体の形成
本発明者らは次に、オマリズマブＦａｂ３がＩｇＥ−ＦｃとＦｃεＲＩαとの相互作用に影響する能力を調査した。溶液競合結合実験において、増大する濃度のオマリズマブＦａｂ３は、ＩｇＥ−ＦｃのＦｃεＲＩαへの結合を阻害した（図８Ｄ）。機構的には、オマリズマブＦａｂ３は、利用可能な結合部位の数（Ｂｍａｘ）と、ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα相互作用の見かけのＫＤとの両方に影響する；これは混合阻害機構の特徴である３３。Ｂｍａｘ値の減少は、アロステリックな阻害プロセスを示し、相互作用の見かけの親和性の低下は、共有の結合部位に関する直接的な競合と最も一般的に関連する（すなわち、オルトステリックな阻害）が、いくつかのアロステリック阻害剤についても見ることができる。結晶構造中に観察される結合部位を考慮すると、オマリズマブＦａｂ３は、オルトステリック機構とアロステリック機構の両方を使用して、ＦｃεＲＩへのＩｇＥ−Ｆｃ結合を阻害する可能性が高い。
【０２３８】
オマリズマブとＦｃεＲＩα結合部位との競合は、多くの刊行物に記載されているが、同一の（又は重複する）結合部位に関する直接的競合と常に解釈されている。この解釈は、オマリズマブが細胞上のＩｇＥ−ＦｃεＲＩ複合体に結合することができない理由を説明するためによく使用されてきた。しかしながら、本発明者らは、オマリズマブＦａｂ３が、ＦｃεＲＩαに予め結合したＩｇＥ−Ｆｃに高い親和性で結合することができることを観察した（図９Ｃ、差込図）。オマリズマブ／ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ複合体の存在は、他の研究２１、３２によって暗示されているが、この複合体は以前には実験的に特徴付けられていなかった。データは、ＩｇＥ−ＦｃのＦｃεＲＩαへの結合は、オマリズマブＦａｂ３のＩｇＥ−Ｆｃに対する親和性を有意に変化させなかったが、それは、ＦｃεＲＩαに結合したＩｇＥ−Ｆｃ分子の集団中のオマリズマブＦａｂ３のための利用可能な結合部位の数を顕著に変化させたことを示す。本発明者らは、抗Ｈｉｓタグ抗体により捕捉されたＩｇＥ−Ｆｃ分子のＫＤ及びＢｍａｘ結合値を、ｓＦｃεＲＩαにより捕捉されたものと比較し、ＦｃεＲＩαに結合したＩｇＥ−Ｆｃが、予想通り、２：１の化学量論と一致する結合レベルを示した、Ｈｉｓタグで捕捉されたＩｇＥ−Ｆｃと比較して、１０％未満のオマリズマブＦａｂ３結合部位を有することを見出した（図９Ｃ）。したがって、ＦｃεＲＩαとオマリズマブ結合部位は重なるため、オマリズマブは肥満細胞に結合したＩｇＥに結合しないと一般的に推定されているが、そうではない。その代わりに、ＦｃεＲＩαはＩｇＥ−Ｆｃに対してアロステリックに作用し、異なるＩｇＥ−Ｆｃコンフォメーションの動的平衡を変化させ１６、ＦｃεＲＩαに結合したＩｇＥ−Ｆｃ分子の集団中のオマリズマブ結合部位の数の実質的な減少をもたらす。
【０２３９】
ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体のオマリズマブＦａｂ３により媒介される解離の促進の機構
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０は、ＤＡＲＰｉｎ  Ｅ２＿７９が、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩの予め形成された複合体の分解を促進することができると報告した。この観察をフォローアップするために、Ｅｇｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２１は、オマリズマブもＦｃεＲＩからのＩｇＥの解離を促進することができることを後に示した。これらの観察と同様、本発明者らは、オマリズマブＦａｂ３がＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体に結合した場合、それがＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離を促進すること（図９Ｄ）、及びオマリズマブＦａｂ３が、オマリズマブＦａｂ３よりも効率的に、また、インタクトなオマリズマブよりもはるかにより効率的にこれを行うことを見出した（図１０Ｅ）。１つのＦａｂはＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα複合体と係合するが、ＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離を促進しない。驚くべきことに、解離の促進は、第２の結合部位（すなわち、低親和性部位）の占有後にのみ起こると考えられる。（オマリズマブＦａｂ３）２／ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα四分子複合体は、ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩα解離のためのエネルギー障壁を顕著に減少させ、この、そうでなければ非常に安定な複合体の急速な解離をもたらすような方法でＩｇＥ−Ｆｃのエネルギーランドスケープを変化させなければならない。
【０２４０】
オマリズマブＦａｂ３軽鎖とＣε２ドメインとの相互作用の詳細
オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体において、１つのＣε２ドメインは、２つの変異した残基（Ｓｅｒ８１Ａｒｇ及びＧｌｎ８３Ａｒｇ）と約２６０Å２の小さい相互作用（オマリズマブＦａｂ３とＣε３ドメインとの間の約７１５Å２の平均相互作用面積と比較して）を形成する。Ｐｒｏ１５８とＩｇＥ−Ｆｃとの間には接触はない。
【０２４１】
Ｆａｂ２軽鎖に由来するＡｒｇ８１側鎖（オマリズマブＦａｂ３中の変異した残基の１つ；（配列番号１２５、ＰＤＢ番号付け））は、鎖Ｂ（配列番号１０８）に由来するＣε２ドメインに由来するＶａｌ２７７及びＡｓｐ２７８に対して包む。Ｓｅｒ８０（オマリズマブＦａｂ３）は、Ａｓｐ２７８、Ｌｅｕ２７９及びＴｈｒ２８１（Ｃε２ドメイン）に対して包むが、Ｓｅｒ６４（オマリズマブＦａｂ３）は、Ａｓｐ２７６及びＡｓｐ２７８に対して包む。Ｓｅｒ６４及びＳｅｒ８０は、オマリズマブ及びオマリズマブＦａｂ３において同一である。
【０２４２】
オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体において、Ａｒｇ８３（オマリズマブＦａｂ３中の変異した残基の１つ）は、Ａｓｐ２７８（Ｃε２ドメイン）側鎖における障害のため、Ｃε２ドメインと見かけ上接触しない。しかしながら、Ａｓｐ２７８側鎖が正しく並べられた場合、水素結合又は塩架橋がＡｒｇ８３とＡｓｐ２７８との間で形成する可能性がある。
【０２４３】
オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体間の結晶学的に決定された接触
結晶構造における４Å以内の抗体と抗原との接触は、典型的には、エピトープ／パラトープ境界面を示す。
オマリズマブＦａｂ３重鎖及び軽鎖ＣＤＲの４Å以内のＩｇＥ−Ｆｃ残基は、以下のエピトープを規定する：
Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８（鎖Ａ上）。
【０２４４】
さらに、オマリズマブＦａｂ３軽鎖ＦＲ１及びＦＲ３残基の４Å以内のＩｇＥ−Ｆｃ残基は、エピトープを、
Ｄ２７８、Ｔ２８１（鎖Ｂ上−Ｃε２ドメイン）［例５に記載される分子力学シミュレーション中に示されるように、抗体のＲ１８、Ｓ６４、Ｓ８０及びＲ８１、さらに、Ｒ８３と接触する］まで伸長させる。
結晶構造における５Å以内の抗体と抗原との接触はまた、抗体／抗原境界面を規定する際に有用である。
オマリズマブＦａｂ３重鎖及び軽鎖ＣＤＲの５Å以内のさらなるＩｇＥ−Ｆｃ残基は、Ｋ３８０、Ｍ４３０（鎖Ａ上）である。
【０２４５】
さらに、オマリズマブＦａｂ３軽鎖ＦＲ１及びＦＲ３残基の５Å以内のさらなるＩｇＥ−Ｆｃ残基は、Ｄ２７６、Ｖ２７７、Ｌ２７９、Ｓ２８０、Ａ２８２（鎖Ｂ上−Ｃε２ドメイン）［ＦＲ１のＧ１６及び位ＦＲ３のＲ６５とさらに接触する］である。
【０２４６】
オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体におけるＣε３ドメインの向きの分析
Ｃε４ドメインに関するＣε３ドメインの位置を分析するための１つの方法において、一方の鎖に由来するＣε３ドメインに由来するＡｓｎ３９４  Ｃα原子と、他方の鎖のＣε４ドメインに由来するＬｙｓ４９７  Ｃα原子との原子間距離が、Ｃε３ドメインの「開口性」を記述するために使用されている２９。Ｖａｌ３３６  Ｃα間の原子間距離は、「揺れ」、又はＣε３ドメインが互いにどれぐらい近いかを記述するために使用されている２９。
【０２４７】
Ｃε３ドメインが開いたコンフォメーションを採用する、ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ−Ｆｃ、及びＦｃεＲＩに結合したＦｃε３−４について、「開口性」の値は、２３．５〜２８．４Åの範囲であるが、「揺れ」値は、平均で２３．３Åである８、１０。オマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体に関する対応する値は、「開口性」については平均で２９．５Å及び「揺れ」については２９．４Åである。オマリズマブＦａｂ３複合体では、Ｃε３ドメインは、これまで記載されたように、最も開いたコンフォメーション（互いに最も離れている）を採用する。
【０２４８】
考察
本発明者らは、治療用抗ＩｇＥ抗体オマリズマブに由来するＩｇＥ−ＦｃとＦａｂ断片との複合体の、３．７Åの解像度での構造を報告する；本発明者らは、抗原結合部位に対して遠位のフレームワーク領域中に３点変異を含有する、このＦａｂ断片を、オマリズマブＦａｂ３と呼ぶ。この構造は、１つが２つのＣε３ドメインのそれぞれに結合した（しかし、ただ１つのＦａｂがＣε２ドメインに結合した）、ＩｇＥ−Ｆｃと複合体を形成した２つもオマリズマブＦａｂ３分子を示し、ＦｃεＲＩとＣＤ２３の両方へのＩｇＥの結合を阻害するオマリズマブの能力に関する説明を提供する。ＩｇＥ−Ｆｃはまた、遊離ＩｇＥ−Ｆｃと比較してわずかな脱湾曲化を示した、ＦＲＥＴで標識されたＩｇＥ−Ｆｃを使用する本発明者らの初期の試験と一致して、オマリズマブＦａｂ３複合体中で部分的に湾曲したコンフォメーションを採用することも見出される９。
【０２４９】
ＩｇＥ−Ｆｃは、溶液中では主として湾曲しており５、６、９、２５、２６、２７、２８、遊離ＩｇＥ−Ｆｃの結晶構造中で、（Ｃε２）２ドメイン対は、Ｃε３及びＣε４ドメインに対して折り返される７、８。最近、ＩｇＥ−Ｆｃのコンフォメーション可撓性の本発明者らの理解は、本発明者らが、抗ＩｇＥ−Ｆｃ  Ｆａｂ（ａεＦａｂ）との複合体中で捕捉された、完全に伸長したコンフォメーションの構造を解明した場合、大いに増強された１６。大きく湾曲したコンフォメーションから伸長したコンフォメーションへのＩｇＥ−Ｆｃの脱湾曲化を調査する分子力学シミュレーションにより、部分的に湾曲したコンフォメーションに対応するエネルギーボウルが示された（図６）。（Ｃε２）２ドメイン対とＦｃε３−４ドメインとの間の湾曲が約９０°である、ここで報告されるオマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体は、このシミュレーションにおいて異なるエネルギーボウルに対応する１６。興味深いことに、オマリズマブＦａｂ３結合部位の位置は、完全に伸長したコンフォメーションへのさらなる脱湾曲化を不可能にせず、したがって、ＩｇＥ−Ｆｃは、オマリズマブと複合体を形成した場合であっても、コンフォメーションの実質的な変化を受け得る。
【０２５０】
Ｃε３及びＣε４ドメインと比較した（Ｃε２）２ドメイン対の湾曲に加えて、様々なＩｇＥ−Ｆｃ、Ｆｃε３−４及び受容体複合体の構造は、Ｃε３ドメインが閉じたものから開いたものまでの相対的な向きの範囲を採用し得ることを証明した７、８、１０、１１、１３、１４、１６、２４、２９。Ｃε３ドメインの開口及び閉口は、ＩｇＥ−Ｆｃにおける受容体結合のアロステリックな調節に寄与する１１、１２：ＣＤ２３複合体中では、それらは相対的に閉じている１１、１３、１４が、ＦｃεＲＩ複合体中では、それらはより開いている８、１０。ＣＤ２３／Ｆｃε３−４及びオマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体の構造の比較は、ＣＤ２３とオマリズマブの部位が重なることを示し、競合結合実験は、オマリズマブによるＣＤ２３へのＩｇＥ結合の阻害が直接にオルトステリックであることを示す。
【０２５１】
しかしながら、ＦｃεＲＩ結合の阻害は、より複雑である。オマリズマブＦａｂ３複合体中では、Ｃε３ドメインは、任意の以前の構造において見られたものよりも開いたコンフォメーションを採用し、非常にそうなので、１つがそれぞれＣε３ドメインを含む、ＩｇＥ−ＦｃとＦｃεＲＩとの相互作用の２つのサブ部位は同時に係合することができない。この阻害への別の寄与は、Ｃε３中の受容体結合ＦＧループに対するオマリズマブＦａｂ３（Ｆａｂ１）分子の近い位置の結果であり、ＦｃεＲＩαの接触残基のコンフォメーションに直接影響し得る。最後に、ＩｇＥ−Ｆｃ上のオマリズマブＦａｂ３とＦｃεＲＩα結合エピトープが厳密に重ならないとしても、２つが同時に結合した場合、立体的衝突の可能性がある。かくして、結晶構造は、オマリズマブの阻害機構は、主としてアロステリックであるが、オルトステリック成分の可能性もあることを示唆する。
【０２５２】
ＳＰＲ試験により、本発明者らは、２つのオマリズマブＦａｂ３結合部位の動力学及び親和性を評価することができた。２つの親和性は顕著に異なり、約１ｎＭ及び約３０ｎＭのＫＤ値を示し、前者は、より速い結合速度定数（約２ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１と比較して約２ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ）及びわずかに遅い解離速度定数（約６ｘ１０−３ｓ−１と比較して約２ｘ１０−３ｓ−１のｋｏｆｆ）と関連する。より高い親和性相互作用は、湾曲したＩｇＥ−Ｆｃ分子への妨げられない接近を有するＦａｂ１の結合に対応するが、より低い親和性及びより遅い結合速度はＦａｂ２に対応すると推測される、但し、本発明者らはこれに関して明確にすることができない。
【０２５３】
オマリズマブＦａｂ３によるＦｃεＲＩαへのＩｇＥ−Ｆｃ結合の阻害の機構を調査するためのさらなるＳＰＲ実験により、ＦｃεＲＩαと複合体形成した場合に、ＩｇＥ−Ｆｃ上のオマリズマブＦａｂ３の利用可能な部位の数の減少（Ｂｍａｘの減少）が示された。オマリズマブによるＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の阻害は、重複部位に関する直接的競合に関して頻繁に解釈されてきたが、オマリズマブが受容体に結合したＩｇＥに結合することができるという報告があった２１、３２。本発明者らは、オマリズマブＦａｂ３がＦｃεＲＩαに既に結合して３分子複合体を形成する場合、それがＩｇＥ−Ｆｃに結合する能力をここに直接証明した。ＩｇＥ−ＦｃのＦｃεＲＩαへの予備結合の効果は、ＩｇＥ−Ｆｃ上のオマリズマブＦａｂ３結合部位の数を、遊離ＩｇＥ−Ｆｃにおいて利用可能なものの１０％未満に減少させることである；この効果は、アロステリックな調節だけに起因するものであり得る。
【０２５４】
オマリズマブＦａｂ３と、ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ複合体との相互作用の性質は、解離の促進機構における洞察を提供する。この現象は、ＤＡＰＲｉｎについて初めて報告され、次いで、オマリズマブについて報告された２０、２１が、後者は治療的に使用される濃度よりも実質的に高い濃度２２であり、ここで、オマリズマブＦａｂ断片について示される。本発明者らはさらに、解離が第２の（低親和性）オマリズマブＦａｂ３分子の最初の結合後にのみ起こることを証明する。換言すれば、解離の有意な促進を起こすためには、四分子複合体−（オマリズマブＦａｂ３）２／ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩαを形成させなければならない。
【０２５５】
オマリズマブＦａｂ３、ＩｇＥ−Ｆｃ及びｓＦｃεＲＩαに関する本発明者らの観察に基づいて、本発明者らは、オマリズマブ、ＩｇＥ及びＦｃεＲＩに関して起こる以下の機構を想定する：ＩｇＥはＦｃεＲＩに結合し、これらの条件下で、これらの結合したＩｇＥ分子の小集団は、オマリズマブ分子が結合することができるコンフォメーションを採用する；第２のオマリズマブ分子が結合してテトラマー複合体を形成する時、ＩｇＥのエネルギーランドスケープは、ＦｃεＲＩとの相互作用が不安定化するように変化し、ＦｃεＲＩからのＩｇＥの急速な解離が起こる。この機構を理解するための鍵は、ＩｇＥに関するエネルギーランドスケープの複雑性、及び動的平衡中に存在する異なるコンフォメーション状態の理解である。
【０２５６】
オマリズマブの阻害活性は、ＩｇＥの固有の可撓性及び、少なくとも解離の促進プロセスについて、ＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の力学を利用すると考えられる。ＩｇＥは、Ｃε２ドメインの存在及びＣε３ドメインのユニークでコンフォメーション的に力学的な、モルテングロビュール様特徴を包含する、他の抗体アイソタイプと比較したいくつかの通常ではない構造特性を有する３４。同時に、これらの特性は、ＣＤ２３とＦｃεＲＩの同時的係合を防止するアロステリックな連絡経路を作る；これは、トリマーＣＤ２３分子によるＦｃεＲＩに結合したＩｇＥの架橋によるアレルゲンとは無関係な肥満細胞活性化を回避するには必須である１２。ＩｇＥの力学と関連する他の機能的な利点は、膜結合ＩｇＥ  Ｂ細胞受容体について提唱されている１６。オマリズマブがＩｇＥ／ＦｃεＲＩ相互作用の阻害に関する予想されるオルトステリックな機構を使用しないという観察は、それがまた、遮断抗体としてのその能力と、肥満細胞に結合したＩｇＥの架橋を回避するその能力との両方において、ＩｇＥの通常ではない力学的特性を活用することを示している。最後に、オマリズマブは、その受容体との複合体中に存在する場合であっても、ＩｇＥのアロステリックで固有の可撓性を使用することにより、治療的に使用されるものよりも高い濃度２１にも拘わらず、ＦｃεＲＩからＩｇＥを活発に解離させることができる。
【０２５７】
方法
クローニング、タンパク質発現及び精製。オマリズマブヒトＩｇＧ１Ｆａｂ及びオマリズマブＦａｂ３を、１６に記載のようにクローニングし、発現させ、精製した。ＩｇＥ−Ｆｃを、以前に記載３５のように生成した。ＩｇＥ−Ｆｃは、配列番号１０８に記載のものであった（Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｂｅｎｎｉｃｈ（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．４１：３〜２５に記載のＶ２２４−Ｋ５４７であるが、グリコシル化パターンを単純化するためにＩｇＥ−Ｆｃに挿入された以下の変異：Ｎ２６５Ｑ  ＆  Ｎ３７１Ｑを有する）。オマリズマブを、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｅｕｒｏｐｈａｒｍ  Ｌｉｍｉｔｅｄから購入した。２：１のオマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３中に溶出させ、２３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０２５８】
表面プラズモン共鳴。ＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実行した。アミンカップリングプロトコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、３００共鳴単位未満のカップリング密度を用いてタンパク質を共有的にカップリングするか、又は抗Ｈｉｓセンサー表面を使用してＨｉｓタグ付タンパク質を捕捉することにより、特異的表面を調製した。Ｈｉｓタグ付リガンドを捕捉するために、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を使用し、製造業者の指示書（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｈｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って固定した。結合実験においては、典型的には１８０〜２４０ｓの結合時間を使用し、解離成分を少なくとも５００ｓにわたってモニタリングした。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．００５％（ｖ／ｖ）サーファクタントＰ−２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の泳動バッファー中、２５μＬ／ｍｉｎ−１の流量で注入を実施した。ほとんどの実験測定を２５℃で実施した；いくつかのサンドイッチ結合実験を５℃で行って、解離促進現象を最小化した。標準的な二重参照データ減算法を使用し３６、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を使用して動的適合を実施した。
【０２５９】
ＴＲ−ＦＲＥＴ。１００ｍＭ重炭酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．３中の４ｍｇ／ｍＬのタンパク質を、５倍モル過剰のテルビウムキレートイソチオシアナート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させることにより、ＩｇＥ−Ｆｃをドナーフルオロフォアで標識した。撹拌しながら室温で３ｈインキュベートした後、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に透析することによって、過剰の未反応のフルオロフォアを除去した。室温で１ｈ、３ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、２．５倍モル過剰のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７スクシンイミジルエステル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応させることによって、ｓＦｃεＲＩα−ＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（α−γ）３７をアクセプターフルオロフォアで標識した。ＰＢＳ中に透析することによって、過剰のフルオロフォアを除去した。
【０２６０】
１ｎＭのテルビウムで標識されたＩｇＥ−Ｆｃ及び０〜２０ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７で標識されたｓＦｃεＲＩα−ＩｇＧ４−Ｆｃを、一定範囲の濃度のオマリズマブＦａｂ３と競合させることにより、ＴＲ−ＦＲＥＴ阻害アッセイを実施した。希釈剤としてＬａｎｔｈａｓｃｒｅｅｎバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、３８４ウェルのｈｉ−ｂａｓｅ白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ）中でアッセイを行った。プレートを、室温で一晩静置してインキュベートし、Ａｒｔｅｍｉｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって読み取った。次いで、ＴＲ−ＦＲＥＴ比を、６２０ｎｍでのドナーの放出で除算した６６５ｎｍでのアクセプターの放出に１０，０００を乗算したものとして、各ウェルについて算出した。
【０２６１】
結晶化。４００μｍまでの長さの、長方形の形態を有する結晶を、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して１８℃で成長させた。容器は、５０μＬの４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００及び０．０３Ｍフッ化ナトリウムを含有し、液滴は１００ｎＬのタンパク質及び３００ｎＬの容器を含有していた。最適化における大きな努力にも拘わらず、結晶の回折品質を、この試験のために使用したものを超えてさらに改善することはできなかった。結晶は、典型的には、数日後に成長し始め、その液滴中に溶解することが多かったが、凍結防止剤として上手く使用される４Ｍ  ＴＭＡＯ（トリメチルアミンＮ−オキシド）中で安定化することができた。
【０２６２】
データ収集及びプロセッシング。Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｈａｒｗｅｌｌ、ＵＫ）にてビーム線Ｉ０２及びＩ０３でデータを収集した。ｘｉａ２パッケージ３９中に実装されたＸＤＳ３８を使用して、積分を実施した。結晶は非等方的に回折し、複数の結晶に由来するデータを統合した。ＣＣＰ４スイート４０、４１に由来するＡＩＭＬＥＳＳを用いてデータを３．７Åの解像度にスケーリングした後、ＵＣＬＡ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  Ｓｅｒｖｅｒ４２を使用して３．７Å（ａ＊）、３．９Å（ｂ＊）及び４．２Å（ｃ＊）の解像限界まで切り捨てた。Ｍａｔｔｈｅｗｓ係数の算出は、非対称ユニット中の単一の２：１のオマリズマブＦａｂ３／ＩｇＥ−Ｆｃ複合体（約１７０ｋＤａの分子量）について、約６２％の溶媒含量を示した。
【０２６３】
構造決定、モデルの構築及び改良。検索モデルとしてＰＤＢエントリー２ｗｑｒ８及び１．９Å解像度のオマリズマブＦａｂ構造（非公開の結果）に由来するタンパク質原子を使用して、ＣＣＰ４スイート４０に由来するＰＨＡＳＥＲ４３及びＭＯＬＲＥＰ４４との分子置き換えにより、構造を解明した。改良を、最初にＲＥＦＭＡＣ４５を用いて、後にＰＨＥＮＩＸ４６を用いて実施し、Ｃｏｏｔ４７における手動のモデル構築と交代した。モデルの品質を、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ４８、ＰＯＬＹＧＯＮ４９、及びＰＨＥＮＩＸグラフィックインタフェース５０内の他の検証ツールを用いて評価した。データプロセッシング及び改良統計値を表１に提示する。電子密度マップの領域を図１１に示す。境界面を、ＰＩＳＡ５１を用いて分析し、ＰｙＭＯＬ５２を用いて図面を調製した。
【表１】
2019522470.tif 000004
【０２６４】
参考文献
2019522470.tif 000005
2019522470.tif 000006
2019522470.tif 000007
2019522470.tif 000008
【０２６５】
（例２）
Ｂｉａｃｏｒｅによる固定されたｓＦｃεＲＩαに由来するＩｇＥ−Ｆｃの解離促進の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ技術は、標識化を必要とすることなく生体分子間の相互作用を測定するものである。リガンドと呼ばれる、一方の相互作用物質は、センサー表面に直接固定されるか、又はそれに捕捉されるが、分析物と呼ばれる、他方は捕捉された表面上、溶液中で流動する。センサーは、分析物がリガンドに結合する時及び分析物がリガンドから解離する時のセンサー表面での質量の変化を検出する。これらのものは、結合及び解離プロセスの両方に対応する。解離促進アッセイでは、ｓＦｃεＲＩαはリガンドであり、センサー表面に固定される。ＩｇＥ−Ｆｃは分析物であり、ｓＦｃεＲＩαによって捕捉される。ｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離は、センサー表面上を流動するバッファー又はセンサー表面上を流動するＩｇＥ結合パートナーの溶液を用いてモニタリングされる。この方法の詳細は、以下の通りである：
【０２６６】
機器：Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ。
センサーチップ：ＣＭ５。カタログ番号ＢＲ１００３９９。
ＢＩＡｎｏｒｍａｌｉｓｉｎｇ溶液：７０％（ｗ／ｗ）グリセロール。ＢＩＡｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｋｉｔの一部。カタログ番号ＢＲ１００６５１。ＢＩＡｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｋｉｔを４℃で保存した。
【０２６７】
アミンカップリングキット：カタログ番号ＢＲ１００６３３。エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を蒸留水中で７５ｍｇ／ｍＬにし、２００μＬアリコート中、−７０℃で保存した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を、蒸留水中で１１．５ｍｇ／ｍＬにし、２００μＬアリコート中、−７０℃で保存した。エタノールアミンヒドロクロリド−ＮａＯＨ  ｐＨ８．５を４℃で保存した。
【０２６８】
ｓＦｃεＲＩαの酸化のための試薬。カルボヒドラジド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ１１００６）を蒸留水中で５ｍＭにした。ナトリウムシアノボロヒドリド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１５６１５９）を、酢酸ナトリウム（ＢＤＨ、カタログ番号Ｓ１１０４−５００ＧＭ）１００ｍＭ  ｐＨ＝４中、１００ｍＭにした。ｍ−過ヨウ素酸ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ−１８７８）を、酢酸ナトリウム（ＢＤＨ、カタログ番号Ｓ１１０４−５００ＧＭ）１００ｍＭ  ｐＨ＝５．５中、５０ｍＭにした。
ｓＦｃεＲＩαを、ｐＨ５．５、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで、４μｌの過ヨウ素酸ナトリウム（５０ｍＭ、１／５０希釈）を、２００μｌの１ｍｇ／ｍｌのｓＦｃεＲＩα溶液に添加した。混合物を氷上に２０ｍｉｎ静置した。固定化の前に、ｓＦｃεＲＩαの溶液を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６６９）、ｐＨ＝４．０で７μｇ／ｍｌに希釈した。
【０２６９】
バッファー：泳動バッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％サーファクタントＰ２０、１０ｘストック溶液から再構成）である：カタログ番号ＢＲ１００６６９。固定化バッファーは、酢酸塩４．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０である）である。カタログ番号ＢＲ１００３４９。バッファーを４℃で保存した。
リガンド：ｓＦｃεＲＩαは、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体のアルファ鎖の細胞外部分である。ＣＨＯ細胞中で組換えタンパク質として発現させ、精製した。
【０２７０】
分析物：ＩｇＥ−Ｆｃは、ヒトＩｇＥのＦｃ部分であり、ＣＨＯ細胞中で組換えタンパク質として発現させ、精製した。Ｃ２２５Ａ変異を担持する野生型ヒトＩｇＥ−Ｆｃ（Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｂｅｎｎｉｃｈ（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．４１：３〜２５による番号Ｖ２２４−Ｋ５４７を含むＣε２−Ｃε４ドメイン）を使用した（配列番号１０８）。
【０２７１】
変異体の命名法：
・オマリズマブＦａｂ１：Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ］（Ｓ７７及びＳ７９がＱで置き換えられた配列番号２４としての可変領域軽鎖＋カッパ定常領域：配列番号５としての可変領域重鎖＋ＣＨ１定常領域）
・オマリズマブＦａｂ２：Ｌ１５８Ｐ［Ｋａｂａｔの番号付けによるＬ１５４Ｐ］（配列番号１１３としての可変領域軽鎖＋カッパ定常領域；配列番号５としての可変領域重鎖＋ＣＨ１定常領域）
・オマリズマブＦａｂ３：Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ、Ｌ１５８Ｐ［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ、Ｌ１５４Ｐ］（配列番号１２１としての可変領域軽鎖；配列番号５としての可変領域重鎖＋ＣＨ１定常領域）。
【０２７２】
ＩｇＥ結合パートナー（１）：完全長オマリズマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＣＨＯ細胞中で発現され、精製されたオマリズマブの組換えＦａｂ断片。
【０２７３】
ＩｇＥ結合パートナー（２）：ＨＥＫ−２９３細胞中で発現され、培養上清としてアッセイされた、オマリズマブの組換えＦａｂ断片、及びその変異体。培養上清を、分析の前に１０倍濃縮した。
【０２７４】
アッセイ方法（１）：約５００応答単位（ＲＵ）のレベルでのアルデヒドカップリングにより、センサー表面にｓＦｃεＲＩαをカップリングさせた。ＨＢＳ−ＥＰバッファーを、３０μＬ／ｍｉｎの流量で泳動バッファーとして使用した。ＩｇＥ−Ｆｃを、ＨＢＳ−ＥＰ中で１０ｎＭに希釈し、２９０秒間にわたって固定されたｓＦｃεＲＩα上に注入した後、それぞれ６９０秒の期間、泳動バッファーの、又は泳動バッファー中に希釈されたＩｇＥ結合パートナーの３回の注入を行った。ＩｇＥ−Ｆｃの捕捉レベルは約９０ＲＵであった。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５の２回の６０秒間の注入により、表面を再生させた。固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の量を、初期結合量の関数として算出し、解離速度を、固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの喪失の量として算出し、経過時間の関数として初期結合量について標準化した。
【０２７５】
アッセイ方法（２）：約２０００応答単位（ＲＵ）のレベルでのアルデヒドカップリングにより、センサー表面にｓＦｃεＲＩαをカップリングさせた。ＨＢＳ−ＥＰバッファーを、３０μＬ／ｍｉｎの流量で泳動バッファーとして使用した。ＩｇＥ−Ｆｃを、ＨＢＳ−ＥＰ中で１０ｎＭに希釈し、１８０秒間にわたって固定されたｓＦｃεＲＩα上に注入した後、泳動バッファーの、又は泳動バッファー中に希釈されたＩｇＥ結合パートナーの１８０秒の期間の１回の注入を行った。ＩｇＥ−Ｆｃの捕捉レベルは約２７５ＲＵであった。１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５の２回の６０秒間の注入により、表面を再生させた。固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の量を、初期結合量の関数として算出し、解離速度を、固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの喪失の量として算出し、経過時間の関数として初期結合量について標準化した。
【表２】
2019522470.tif 000009
【０２７６】
さらなる変異誘発を実施して、Ｆａｂ３において記載されたものの他に、ｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離を促進するさらなる変異を同定することができるかどうかを決定した。これにより、Ｆａｂ３の文脈で、ｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥの解離をさらに増加させることができるＳ６４Ｍ変異（配列番号２０を参照して）が得られた。これらのデータを、図１３及び表３に記載する。
【表３】
2019522470.tif 000010
【０２７７】
結論：
まとめると、これらのデータは、変異形態のオマリズマブＦａｂが、固定形態の高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩからのＩｇＥの解離を促進することができることを示している。これを可能にする軽鎖中の変異としては、必ずしも限定されるものではないが、配列番号２４を参照したＳ６４Ｍ、Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ及びＬ１５８Ｐが挙げられ、配列番号３９が得られる。
【０２７８】
（例３）
フローサイトメトリーによるＦｃεＲＩからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の促進の測定
機器：ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【０２７９】
細胞系：ヒトＦｃεＲＩを発現するＲＢＬ−ＳＸ３８細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ及び５００μｇ／ｍＬゲネチシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した最少必須培地中で培養した。アッセイの当日、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、剥離するまでアキュターゼ中でインキュベートした後、培養培地中、１ｘ１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。全てのサブ配列インキュベーションステップを、培養培地中で実施した。
【０２８０】
アッセイ方法：１ｘ１０６細胞／ｍＬのＲＢＬ−ＳＸ３８細胞を、３７℃で１時間、５ｎＭのＡｌｅｘａ−４８８標識されたＩｇＥ−Ｆｃと共にインキュベートした。細胞を培養培地中で２回洗浄して、未結合のＩｇＥ−４８８を除去した後、培養培地中に１ｘ１０６細胞／ｍＬで懸濁したか、又は１００μｇ／ｍＬのＩｇＥ結合剤を培養培地中で希釈した。次いで、細胞を、一定に回転させながら３７℃でインキュベートした。それぞれの時点で、０．５ｘ１０５個の細胞を取り出し、氷冷ＰＢＳ中で洗浄した後、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド中に、４℃で１６時間再懸濁することによって固定した。細胞に結合したＡｌｅｘａ−４８８蛍光の量を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用して決定した。
【０２８１】
フローサイトメトリー：固定した細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の０．１％ｗ／ｖ  ＢＳＡ、０．０１％ｗ／ｖ  ＮａＮ３）中で２回洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。標準的な方法を使用してＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター上でフローサイトメトリーを実施し、インタクトな細胞に結合したＡｌｅｘａ−４８８の幾何平均蛍光強度を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して算出した。Ａｌｅｘａ−４８８で標識されたＩｇＥ−Ｆｃの解離速度を、細胞培地中の細胞を、過剰の未標識のＩｇＥ−Ｆｃと共に、又はＩｇＥ結合剤の存在下でインキュベートする結果としての時間の関数としての幾何平均蛍光強度の変化として算出した。
【０２８２】
変異体の命名法：
・オマリズマブＦａｂ１：Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ］（Ｓ７７及びＳ７９がＱで置き換えられた配列番号２４としての可変領域軽鎖＋カッパ定常領域：配列番号５としての可変領域重鎖＋ＣＨ１定常領域）
・オマリズマブＦａｂ２：Ｌ１５８Ｐ［Ｋａｂａｔの番号付けによるＬ１５４Ｐ］（配列番号１１３としての可変領域軽鎖＋カッパ定常領域；配列番号５としての可変領域重鎖＋ＣＨ１定常領域）
・オマリズマブＦａｂ３：Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ、Ｌ１５８Ｐ［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ、Ｌ１５４Ｐ］（配列番号１２１としての可変領域軽鎖＋カッパ定常領域；配列番号５としての可変領域重鎖＋ＣＨ１定常領域）。
【表４】
2019522470.tif 000011
【０２８３】
結論：
まとめると、これらのデータは、変異型のオマリズマブＦａｂが、細胞表面上に発現される、高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩからのＩｇＥの解離を促進することができることを示す。これを可能にする軽鎖中の変異としては、必ずしも限定されるものではないが、Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ及びＬ１５８Ｐが挙げられる。
【０２８４】
（例４）
オマリズマブＦａｂ３が７２時間のＰＣＡモデルにおいて治療的に投与された場合、野生型オマリズマブＦａｂより優れた効能を有することの証明
７．５μＬの６．６８ｍｇ／ｍＬストックを１９９２．５μＬのＰＢＳに添加することにより、２５μｇ／ｍＬのヒト抗ＤＮＰ−ＩｇＥの溶液を調製した。この溶液の２０μＬ注射液は、５００ｎｇ用量のＩｇＥを与える。動物（ｈＩｇＥＲ  Ｔｇマウス）の脇腹の毛を剃った後、０日目の２ｐｍにそれぞれの脇腹にｉ．ｄ．注射した。２０μＬのＰＢＳを、陰性対照として各動物の左脇腹に注射した。抗ＮＤＰ−ＩｇＥ（２０μＬ）を、右脇腹に注射した。合計４０匹のマウスに注射した。野生型オマリズマブＦａｂ又はオマリズマブＦａｂ３（Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ、Ｌ１５８Ｐ変異［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ、Ｌ１５４Ｐ］を有する）による処置を、ＩｇＥの１８時間後（８ａｍ）に開始した。２群のマウス（ｎ＝８匹／群）は、野生型オマリズマブＦａｂ又はオマリズマブＦａｂ３のいずれかの１００ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．を受けた。さらなる群の８匹のマウスは、ＰＢＳ  ｓ．ｃ．を受けた。マウスに、１０時間後（６ｐｍ）に上記のように再度投与した。また、この時点、ＩｇＥの２８時間後で、さらに２群（ｎ＝８匹／群）に、１００ｍｇ／ｋｇ  ｓｃの野生型オマリズマブＦａｂ又はオマリズマブＦａｂ３を投与した。全ての群に、８ａｍ、６ｐｍ及び再度、実験の最終日の８ａｍに再投与した。ｉ．ｄ投与の７２時間後（２ｐｍ）に、全ての動物に、１００μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＰ−ＨＳＡ、１００ＩＵ／ｍｌのヘパリン中で作られた２．５％ｗ／ｖのエバンスブルーをｉ．ｖ．注射した。１時間後、動物を、スケジュール１の方法によって殺傷した。ｉ．ｄ注射部位の周囲の脇腹から皮膚を除去し、パンチ生検を取った。皮膚試料を、７００μＬのホルムアミド中に入れ、５５℃で一晩消化した。消化後、１００μＬｘ２の液体を各試料から取り出し、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート中に入れた。次いで、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２８５】
結論：
これらのデータは、高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩからのＩｇＥの解離を促進することができる変異型のオマリズマブＦａｂが、野生型オマリズマブＦａｂと比較した場合、統計的に有意な様式で受動的皮膚アナフィラキシーを軽減することもできる（反応部位からのエバンスブルー色素の漏出の阻害により示される）ことを示す。これを可能にする軽鎖中の変異としては、必ずしも限定されるものではないが、配列番号２４を参照してＳ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ及びＬ１５８Ｐが挙げられ、配列番号３９をもたらす。
【０２８６】
（例５）
ＩｇＥ  Ｆｃと複合体を形成したオマリズマブＦａｂ３の分子力学的シミュレーション
方法：
ＩｇＥ  Ｆｃ領域と複合体を形成したオマリズマブＦａｂ３の結晶構造（例１を参照）を、分子操作環境（ＭＯＥ）２０１４．０９０１（１）中で、Ａｍｂｅｒ  １４（２）を使用する分子力学（ＭＤ）シミュレーションの前に、いくつかの残基中の失われる側鎖及びＣε２とＣε３ドメイン間の失われるループを完成させることによって調製した。複合体構造を、水素添加し、ボックスのいずかの端部からタンパク質原子まで１０Å伸びたトランケートされた８面体ボックス中の０．１５Ｍ  ＮａＣｌ塩溶質を使用するＴＩＰ３Ｐ明確水モデルを使用して溶媒和させた。システムを、Ａｍｂｅｒ  ｆｆ１２Ｂ及びオリゴ糖ＧＬＹＣＡＭ＿０６ｊ−１（３）力場を使用して設定し、クーロン力及びファンデルワールス相互作用及びグリッドベース近隣リストのために設定された１０．０Åのカットオフで５０，０００ステップについて共役勾配法により最小化した。その後、システムを、一定容量、１２５ｐｓで０〜３００Ｋに徐々に加熱した後、全ての溶質の重原子上での拘束と共にＮＰＴアンサンブル中、２．２５ｎｓで平衡化させた（調和力拘束は５．０である）。静電学については、本発明者らは、デフォルトのフーリエ空間及び許容性設定を用いてクーロン力相互作用について８．０Åのカットオフを有する四次ＰＭＥを使用した。温度を、１．０ｐｓの時間定数を用いてそれぞれタンパク質及び溶媒に適用される弱いカップリングアルゴリズムを用いて制御し、圧力を、１．０ｐｓの時間定数及び４．４６ｘ１０−５ｂａｒ−１の圧縮率を用いる全システムに適用される等方性Ｂｅｒｅｎｓｏｎバロスタットを用いて制御した。最後に、いかなる制限もない１０００ｎｓの生成シミュレーションを、平衡化のために同じパラメータを使用して行った。ＧＰＵインフラストラクチャ上で４ｆｓの時間ステップを可能にするために、タンパク質及び糖の水素質量を、ＰａｒｍＥｄ（４）を使用して３．０２４ダルトンに再分配したが、それらが結合する原子の質量を、総質量を未変化のままにするために必要とされる量で調整した。抗体軽鎖中のＲ８１及びＲ８３を、それぞれ、野生型セリン及びアスパラギンに実際に変異させることにより、ＩｇＥ  Ｆｃ領域と複合体を形成した野生型オマリズマブＦａｂの構造を、ＩｇＥ  Ｆｃとのオマリズマブ変異体３の結晶複合体構造からモデル化した。ＭＤシミュレーションを、変異体３に関するものと同じ設定プロトコールを使用して行った。
【０２８７】
ＡｍｂｅｒＴｏｌｌｓ  ｃｐｐｔｒａｊモジュール（７）を、ＩｇＥ  Ｆｃと複合体を形成したオマリズマブＦａｂ３とオマリズマブＦａｂの両方に関するＭＤ軌道のクラスター分析のために使用した。各クラスター間の平均結合距離が２．０Å未満である階層的凝縮型アルゴリズムを採用した。フレーム間の距離を、抗体軽鎖Ｖ領域残基中のＣα原子間の最良適合配位ＲＭＳＤにより算出した。クラスタリングを、１０フレーム毎のみについて行い、他のフレームは全て、それらがクラスタリング後にクラスターの質量中心にどれぐらい近いかに基づいてクラスターに添加した。
【０２８８】
参考文献
2019522470.tif 000012
【０２８９】
結果：
オマリズマブＦａｂ３の軽鎖中のＳ８１Ｒ及びＱ８３Ｒ変異がＩｇＥとの相互作用にどのように影響するかを試験するために、１マイクロ秒の分子力学的シミュレーションを、それぞれ、ＩｇＥ  Ｆｃ構造と複合体を形成したオマリズマブＦａｂ及びオマリズマブＦａｂ３について実施した。軌道スナップショットをクラスター化し、上２つの多いクラスター中心構造を分析したところ、両クラスターにおいて、変異体３中の２個のアルギニン変異が、それぞれ、隣接するＩｇＥ  Ｃε２ドメイン中の残基Ｄ２７８及びＳ２８０と強い水素結合ネットワークを形成することを明確に示している。軌道の視覚的検査は、Ｒ８１−Ｓ２８０及びＲ８３−Ｄ２７８の対合相互作用が、シミュレーション中に非常に保存されており、安定であり、したがって、結晶構造中の開示されたより近いＣε３ドメインに対する湾曲していないＣε２コンフォメーションは、抗体架橋によって凍結されることを確認する。興味深いことに、二重のアルギニン変異はオマリズマブＦａｂ３の結晶構造中のＣε２  Ｄ２７８及びＳ２８０に空間的に隣接するが、ＭＤシミュレーションにおいて示唆されたように直接的な水素結合は存在しない。オマリズマブＦａｂについては、予想通り、変異体３中に認められるような水素結合ネットワークは、上２つのクラスター中心構造中では失われている。視覚的な軌道検査により、Ｃε２ドメインは抗体軽鎖フレームワークにあまり係留されないようになり、かくして、より近いＣε３ドメインに対するその相対位置は、オマリズマブＦａｂ３のそれよりも可変性であることが示される。これに加えて、同じ複合体中のオマリズマブＦａｂ３とＩｇＥ−Ｆｃとの境界面を、オマリズマブＦａｂ３中の軽鎖位置Ｓ５６、Ｓ６４及びＳ７１（配列番号１１３を参照する）を変異させて、ＩｇＥ−Ｆｃに対するオマリズマブの親和性を増加させ、かくして、上記に詳述されたＳ８１Ｒ及びＱ３８Ｒ変異について見られると予測される効果を増強すると予測する、ＩＯＴＡ分析（ＩＯＴＡはタンパク質境界面又は結合部位での所与の接触原子型の確率を決定するための統計的な潜在的手段である）にかけた。
【０２９０】
結論：
まとめると、ＭＤシミュレーションは、Ｓ８１Ｒ及びＱ３８Ｒ変異が、Ｃε２中の隣接するＤ２７８及びＳ２８０との直接的な静電相互作用及び水素結合相互作用による抗体へのＩｇＥ  Ｃε２ドメインの局在化を容易にし、Ｃε２の湾曲していないコンフォメーションを閉じ込めることによってＩｇＥ可塑性Ｆｃに影響するという仮説を提唱する。これは、Ｓ６４Ｍ変異及びＳ５６（Ｄ、Ｅ、Ｑ、又はＲに変化）及びＳ７１（Ｄ、Ｅ又はＭに変化）が類似する効果を有すると予測する統計的方法と組合わされる。
【０２９１】
（例６）
ＢｉａｃｏｒｅによるＩｇＥ−Ｆｃに対する抗ＩｇＥ  Ｆａｂの親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ技術は、標識化を必要とすることなく生体分子間の相互作用を測定するものである。リガンドと呼ばれる、一方の相互作用因子は、センサー表面上に直接固定されるか、又はそれに捕捉されるが、分析物と呼ばれる他方は、捕捉された表面上を溶液中で流動する。センサーは、分析物がリガンドに結合する時及び分析物がリガンドから解離する時にセンサー表面での質量の変化を検出する。これらは、結合プロセス及び解離プロセスの両方に対応する。動的アッセイでは、抗ＩｇＥ  Ｆａｂはリガンドであり、センサー表面に捕捉される。ＩｇＥ−Ｆｃは分析物であり、抗ＩｇＥ  Ｆａｂによって捕捉される。捕捉された抗ＩｇＥ  ＦａｂからのＩｇＥ−Ｆｃの結合及び解離は、センサー表面を流動するＩｇＥ−Ｆｃ（結合相）又はセンサー表面を流動するバッファー（解離相）を用いてモニタリングされる。この方法の詳細は、以下の通りである：
機器：Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ
センサーチップ：ＣＭ５。カタログ番号ＢＲ１００３９９。
ＢＩＡｎｏｒｍａｌｉｓｉｎｇ溶液：７０％（ｗ／ｗ）グリセロール。ＢＩＡｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅキットの一部。カタログ番号ＢＲ１００６５１。ＢＩＡｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅキットは、４℃で保存した。
【０２９２】
アミンカップリングキット：カタログ番号ＢＲ１００６３３。エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を蒸留水中で７５ｍｇ／ｍＬにし、−７０℃にて２００μＬアリコート中で保存した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を蒸留水中で１１．５ｍｇ／ｍＬにし、−７０℃にて２００μＬアリコート中で保存した。エタノールアミンヒドロクロリド−ＮａＯＨ  ｐＨ８．５を４℃で保存した。
【０２９３】
バッファー：泳動バッファーは、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｘストック溶液から再構成、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％サーファクタントＰ２０）である：カタログ番号ＢＲ１００６６９。固定化バッファーは、酢酸塩４．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０である）である。カタログ番号ＢＲ１００３４９。バッファーを４℃で保存した。
【０２９４】
リガンド：抗ＩｇＥ  Ｆａｂがリガンドであった。これらのものを、ＨＥＫ２９３細胞中で組換えタンパク質として一過的に発現させ、さらに精製することなく使用した。
【０２９５】
分析物：ＩｇＥ−Ｆｃは、ヒトＩｇＥのＦｃ部分であり、ＣＨＯ細胞中で組換えタンパク質として発現させ、精製した。Ｃ２２５Ａ変異を担持する野生型ヒトＩｇＥ−Ｆｃ（Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｂｅｎｎｉｃｈ（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．４１：３〜２５による番号Ｖ２２４−Ｋ５４７を含むＣε２−Ｃε４ドメイン）を使用した（配列番号１０８）。
【０２９６】
ヤギ抗ヒトＩｇＧ１（Ｆａｂ２断片特異的）のＦａｂ２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ、カタログ番号１０９−００６−０９７）を、標準的な方法を使用するアミンカップリングによりセンサー表面に固定した。抗ＩｇＥ  Ｆａｂを泳動バッファー（ＨＢＳ−ＥＰ）中に希釈し、約２００共鳴単位を表面に捕捉させた。ＩｇＥ−Ｆｃを泳動バッファー中に希釈し、２ｎＭ〜１２５ｐＭの連続希釈系列を、捕捉された抗ＩｇＥ  Ｆａｂ上に通過させた。結合相は１８０秒間であり、解離相は３００秒間であった。センサー表面を、４０ｍＭ  ＨＣｌへの６０秒間の曝露、次いで、１０ｍＭ  ＮａＯＨへの６０秒間の曝露、次いで、４０ｍＭ  ＨＣｌへのさらに６０秒間の曝露により再生した。全ての結合データを、標準的な手順に従ってＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用する二重参照によりプロセッシングした。
【表５】
2019522470.tif 000013
【表６】
2019522470.tif 000014
【表７】
2019522470.tif 000015
【表８】
2019522470.tif 000016
【表９】
2019522470.tif 000017
【０２９７】
結論：
これらのデータは、変異型のオマリズマブＦａｂがＩｇＥ−Ｆｃに対するオマリズマブＦａｂの親和性を増加させることができることを示している。親和性の改善に関する変異の最良の組合せは、Ｓ５６Ｄと組み合わせたＳ７１Ｍである。この親和性の増加は、原理的には、ＦａｂのＩｇＥ−Ｆｃからの解離速度の低下によって引き起こされる。非変異型オマリズマブＦａｂと比較した抗体とＩｇＥ−Ｆｃ  Ｃε２との相互作用の改善を考慮すると、オマリズマブＦａｂ１（Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ変異［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ］を有する）及びＦａｂ３（Ｓ８１Ｒ、Ｑ８３Ｒ、Ｌ１５８Ｐ変異［Ｋａｂａｔの番号付けによるＳ７７Ｒ、Ｑ７９Ｒ、Ｌ１５４Ｐ］を有する、配列番号１２５を参照）の親和性も改善される。
【０２９８】
（例７）
Ｂｉａｃｏｒｅによる固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の促進の測定
ｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の際の抗ＩｇＥ  Ｆａｂの効果を、例２に概略された方法（アッセイ方法２）を使用して測定した。全ての抗ＩｇＥ  Ｆａｂを、ＨＥＫ−２９ｓ  Ｆａｂ中で発現させ、標準的な方法により精製し、モル吸光係数計算値を使用して２８０ｎｍでの吸光度により定量した。このアッセイでは、ＩｇＥ−Ｆｃの濃度は２ｎＭであり、解離時間は２００秒であった。固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の量を、初期結合量の関数として算出し、解離速度を、固定されたｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの喪失の量として算出し、経過時間の関数として初期結合量について標準化した。
【０２９９】
Ｓ８０Ｎ（ｐｄｂ番号付け）は、Ｃε２  ＩｇＥのＤ２７８と相互作用すると考えられ、Ｓ６７Ｗ／Ｙ（ｐｄｂ番号付け）は、Ｃε２  ＩｇＥのＴ２９８と相互作用すると考えられる。
【表１０】
2019522470.tif 000018
【０３００】
結論：
これらのデータは、変異型のオマリズマブＦａｂが、固定された形態の高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩからのＩｇＥの解離を促進することができることを示している。これを可能にする軽鎖（配列番号２０）中の変異としては、必ずしも限定されるものではないが、Ｓ５６、Ｓ６４、Ｓ６７、Ｓ７１、Ｓ８０、Ｓ８１、Ｑ８３＆Ｌ１５８位（Ｋａｂａｔの番号付けによる、それぞれ、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｓ６３、Ｓ６７、Ｓ７６、Ｓ７７、Ｑ７９＆Ｌ１５４位）での変異が挙げられる。
【０３０１】
（例８）
変異型オマリズマブＦａｂの強制的酸化）
抗ＩｇＥ  Ｆａｂ試料を、強制的酸化レジメンにかけて、ＩｇＥ−Ｆｃに対するＦａｂの親和性及びＩｇＥ−Ｆｃ：ｓＦｃεＲＩα複合体の解離を促進する能力に対する、軽鎖可変領域中のメチオニンの酸化の効果を確認した。変異型オマリズマブＦａｂを、室温で最大１４日間、０．１％及び１％（ｖ／ｖ）過酸化水素と共にインキュベートした。インキュベーション後、試料をＰＢＳ  ｐＨ７．４にバッファー交換し戻し、吸光係数計算値を使用して２８０ｎｍでの吸光度により濃度を決定した。軽鎖可変領域メチオニンの酸化量を決定するための質量分析を、変性条件下での材料の還元及びアルキル化、次いで、トリプシン消化（３７℃で１８０分間の５０μｇ／ｍＬのトリプシン、次いで、ＴＦＡによるクエンチ）、次いで、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ質量分析計を使用するＬＣ−ＭＳによる分析により実施した。酸化したメチオニンのパーセンテージを、合成時にメチオニン酸化がないという前提と比較して算出し、４℃で保持した参照材料と比較する。
【表１１】
2019522470.tif 000019
【０３０２】
結論：
これらのデータは、重要な軽鎖メチオニン（Ｍ６４及びＭ７１）が本質的に完全に酸化された変異型オマリズマブＦａｂを生成することができることを示している。これらのデータに基づいて、１日目、３日目及び７日目の試料に由来する材料をプールし、これを使用して、ＩｇＥ−Ｆｃに対する変異型オマリズマブＦａｂの親和性に対するメチオニン酸化の影響及びＩｇＥ−Ｆｃ：ｓＦｃεＲＩα複合体の解離を促進する能力を決定した。
【０３０３】
（例９）
ＦＲＥＴによるｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の促進の測定）
ｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離の際の抗ＩｇＥ  Ｆａｂの効果を、均一ＦＲＥＴアッセイにおいて測定した。全ての抗ＩｇＥ  Ｆａｂを、ＨＥＫ−２９３細胞中で発現させ、標準的な方法により精製し、モル吸光法計算値を使用して２８０ｎｍでの吸光度により定量した。ＦＲＥＴアッセイは、ドナーとしてＴｂ標識されたＩｇＥ−Ｆｃを使用し、アクセプターとしてＡｌｅｘａ４８８標識されたｓＦｃεＲＩαを使用した。両試薬を混合し、１ｎＭの最終アッセイ濃度で、室温で６０分間平衡化させた。抗ＩｇＥ  Ｆａｂを、５００ｎＭの最終アッセイ濃度で混合物に添加し、８００分間にわたって２０分毎に蛍光を読み取った（３３０ｎｍで励起、４９５及び５２０ｎｍで放出）。蛍光放出を、時間の関数としてプロットし、ｓＦｃεＲＩαからのＩｇＥ−Ｆｃの解離速度を、複合体の半減期として算出した。これらのデータを、表１０及び表１１に報告する。
【表１２】
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【表１３】
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【０３０４】
結論：
これらのデータは、変異型のオマリズマブが、野生型配列よりも速い速度でｓＦｃεＲＩαからＩｇＥ−Ｆｃを解離させることができることを示している。特に、これを可能にする軽鎖中の変異（配列番号２０を参照する）としては、必ずしも限定されるものではないが、Ｓ６４及びＳ６７位での変異が挙げられる。さらに、メチオニン（Ｍ６４及びＭ７１、配列番号２０）の酸化は、ＩｇＥ−Ｆｃ：ｓＦｃεＲＩα複合体の解離を促進するＦａｂの能力に対する有意な効果がない。
【０３０５】
本明細書を、本発明の態様を参照して説明してきた。しかしながら、当業者であれば、以下の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変及び変更を加えることができることを理解できる。したがって、本明細書は、限定的な意味よりもむしろ例示と見なされるべきであり、全てのそのような改変が本発明の範囲内に包含されることが意図される。
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【配列表フリーテキスト】
【０３０６】
配列番号１〜２：＜２２３＞Ｖ領域
配列番号３〜４：＜２２３＞シグナル配列を含むＶ領域
配列番号５〜６：＜２２３＞Ｖ領域＋ガンマ１ＣＨ１定常領域
配列番号７〜８：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｖ領域＋ガンマ１ＣＨ１定常領域
配列番号９〜１０：＜２２３＞Ｖ領域＋ガンマ１完全長定常領域
配列番号１１〜１２：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｖ領域＋ガンマ１完全長定常領域
配列番号２０〜２１：＜２２３＞Ｖ領域軽鎖
配列番号２２〜２３：＜２２３＞シグナル配列を含むＶ領域軽鎖
配列番号２４：＜２２３＞Ｖ領域軽鎖＋カッパ定常領域
配列番号２５：＜２２３＞Ｖ領域＋カッパ定常領域
配列番号２６〜２７：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｖ領域＋カッパ定常領域
配列番号３５〜３６：＜２２３＞Ｓ６０Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号３７〜３８：＜２２３＞シグナル配列を含むＳ６０Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号３９〜４１：＜２２３＞Ｓ６０Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域＋Ｌ１５４Ｐを包含するカッパ定常領域
配列番号４２：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｓ６０Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域＋Ｌ１５４Ｐを包含するカッパ定常領域
配列番号１０８：＜２２３＞野生型ヒトＩｇＥ−Ｆｃ（Ｄｏｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｂｅｎｎｉｃｈ  （１９７８）による番号Ｖ２２４−Ｋ５４７を有するＣＥ２−ＣＥ４ドメイン）
配列番号１０９：＜２２３＞Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域（Ｆａｂ１）
配列番号１１０：＜２２３＞７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域（Ｆａｂ１）
配列番号１１１〜１１２：＜２２３＞シグナル配列を含むＳ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域（Ｆａｂ１）
配列番号１１３〜１１４：＜２２３＞Ｆａｂ２＿Ｖ領域
配列番号１１５〜１１６：＜２２３＞シグナル配列を含むＦａｂ２＿Ｖ領域
配列番号１１７〜１１８：＜２２３＞Ｆａｂ２＿Ｖ領域＋Ｌ１５４Ｐを包含するカッパ定常領域
配列番号１１９〜１２０：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｆａｂ２＿Ｖ領域＋Ｌ１５４Ｐを包含するカッパ定常領域
配列番号１２１〜１２２：＜２２３＞Ｆａｂ３＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１２３〜１２４：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｆａｂ３＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１２５〜１２６：＜２２３＞Ｆａｂ３＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域＋Ｌ１５４Ｐを包含するカッパ定常領域
配列番号１２７〜１２８：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｆａｂ３＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域＋Ｌ１５４Ｐを包含するカッパ定常領域
配列番号１２９〜１３０：＜２２３＞オマリズマブ＿Ｖ領域
配列番号１３２〜１３３：＜２２３＞Ｓ６０Ｍ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１３４〜１３５：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｓ６０Ｍ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１３６〜１３７：＜２２３＞Ｓ６０Ｍ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域＋カッパ定常領域
配列番号１３９〜１４０：＜２２３＞Ｓ６０Ｒ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１４１〜１４２：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｓ６０Ｒ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１４３〜１４４：＜２２３＞Ｓ６０Ｒ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域＋カッパ定常領域
配列番号１４５：＜２２３＞Ｓ６０Ｋ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１４６：＜２２３＞Ｓ６０Ｑ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｖ領域
配列番号１４７〜１４８：＜２２３＞シグナル配列を含む、Ｖ領域＋ガンマ１ＣＨ１定常領域＋リンカー＋ＣＡ６４５  ｇＬ４ｇＨ５  ｓｃＦｖ
配列番号１４９：＜２２３＞ＣＨ１とＣＡ６４５  ｇＬ４ｇＨ５  ｓｃＦｖとの間のリンカー
配列番号１５１：＜２２３＞ＣＡ６４５  ｇＨ５と、ｓｃＦｖ内のＣＡ６４５  ｇＬ４との間のリンカー
配列番号１５８：＜２２３＞Ｓ６０Ｍ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｓ６３Ｗ＿Ｓ７６Ｎ＿Ｖ領域
配列番号１５９：＜２２３＞Ｓ６０Ｍ＿Ｓ５２Ｄ＿Ｓ６７Ｍ＿Ｓ７７Ｒ＿Ｑ７９Ｒ＿Ｓ６３Ｙ＿Ｓ７６Ｎ＿Ｖ領域
配列番号１６０：＜２２３＞シグナル配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月14日(2019.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、配列番号１０８の参照において、ヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｔ３７３、Ｗ３７４、Ｓ３７５、Ｒ３７６、Ａ３７７、Ｓ３７８、Ｇ３７９、Ｐ３８１、Ｑ４１７、Ｃ４１８、Ｒ４１９、Ｔ４２１、Ｐ４２６、Ｒ４２７、Ａ４２８、ならびにＣε２ドメインの残基Ｄ２７８及びＴ２８１を含むエピトープと接触し、任意にヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｋ３８０をさらに含むエピトープ及び／又はヒトＩｇＥのＣε３ドメインの残基Ｍ４３０をさらに含むエピトープと接触する抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項２】
以下のヒトＩｇＥのＣε２ドメインの残基をさらに含むエピトープと接触する請求項１に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤：Ｄ２７６、Ｖ２７７、Ｌ２７９、Ｓ２８０、Ａ２８２（及び／又はＴ２９８）。
【請求項３】
Ｃε３ドメインとＣε２ドメインとがヒトＩｇＥの異なる鎖上にある、請求項１又は２に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項４】
抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、任意に請求項１から３に記載のいずれかに記載のものであり、
重鎖可変領域として、相補性決定領域である、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、及び
軽鎖可変領域として、相補性決定領域である、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０又は５１であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号３２から選択されるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＲ−Ｌ３をさらに含み、１、２、３、４、５、６、７個以上のアミノ酸置換を有して前記抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤とヒトＩｇＥのＣε２ドメインとの相互作用が強化されていて；
ａ．前記ＦＲ−Ｌ３領域はＳ６０位（Ｋａｂａｔ）においてＭ、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ又はＴに変異されていて；
ｂ．前記ＦＲ−Ｌ３領域はＳ６７位（Ｋａｂａｔ）においてＭに変異されていて；
ｃ．前記ＦＲ−Ｌ３領域はＳ７７位（Ｋａｂａｔ）においてＲに変異されていて；さらに
ｄ．前記ＦＲ−Ｌ３領域はＱ７９位（Ｋａｂａｔ）においてＲに変異されているもの。
【請求項５】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み以下のとおりである、抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤：
ａ．前記重鎖可変領域は、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３及び配列番号１３１若しくは１３８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＷ−Ｌ３を含むか；又は
ｂ．前記重鎖可変領域は、配列番号１であるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３２若しくは１３９から選択されるアミノ酸配列。
【請求項６】
軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域ＶＬ−ＣＬが、任意に、配列番号１６０であるアミノ酸配列を有するシグナル配列を含む配列番号１３７又は１４５から選択されるアミノ酸配列を有する、軽鎖定常領域をさらに含む、請求項５に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項７】
重鎖定常領域ＣＨ１をさらに含む、請求項５又は６に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項８】
重鎖可変領域及び重鎖定常領域ＶＨ−ＣＨ１が、配列番号５であるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤であって、以下からなる群から選択されるもの：
Ｆａｂ断片、改変されたＦａｂ’断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ダイアボディ、二特異的抗体、トリアボディ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ、トリボディ、又は（Ｆａｂ−Ｆｖ）２−Ｆｃ。
【請求項１０】
ヒト血清アルブミンなどの、血清担体タンパク質に結合するｓｃＦｖに直接的に、又はリンカーを介して結合されるＦａｂ断片である、請求項９に記載の抗ＩｇＥ抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗ＩｇＥ抗体であって、ｓｃＦｖが重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、好ましくは配列番号１５１を有するリンカーを介して連結され、
前記重鎖可変領域は、配列番号１５２であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１５３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１５４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、及び
前記軽鎖可変領域は、配列番号１５５であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１５６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号１５７であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含むもの。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の抗ＩｇＥ抗体であって、Ｆａｂ断片が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、以下であるもの：
ａ．前記重鎖可変領域は、配列番号１４であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１６であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ２及び配列番号１８であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２９であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５０であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、配列番号３３であるアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ３及び配列番号１３１若しくは１３８であるアミノ酸配列を有するフレームワーク領域ＦＷ−Ｌ３を含むか；又は
ｂ．前記重鎖可変領域は、配列番号１であるアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号１３２若しくは１３９から選択されるアミノ酸配列を含む。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤の重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ。
【請求項１４】
以下を含むクローニング又は発現ベクターであって、
配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、又は配列番号４２、又は配列番号１３３、又は配列番号１３５、又は配列番号１３７、又は配列番号１４０、又は配列番号１４２、又は配列番号１４４から選択される１つ又は２つ以上の核酸配列を有するＤＮＡ、
任意にさらに以下を含むもの：
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２又は配列番号１４８から選択される１つ又は２つ以上の核酸配列を有するＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の抗ＩｇＥ抗体又は抗原結合剤を、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１６】
薬剤としての使用のための、請求項１から１５のいずれかに記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれかに記載の抗ＩｇＥ抗体、若しくは抗原結合剤、又は請求項１５に記載の組成物であって、以下のうちの１つ又は２つ以上の処置又は防止における使用のためのもの：
アレルギー；アレルギー性喘息；重症喘息；中等度の喘息；慢性自発性蕁麻疹；慢性特発性蕁麻疹；通年性アレルギー性鼻炎；季節性アレルギー性鼻炎；急性喘息増悪；急性気管支痙攣；喘息重積状態；高ＩｇＥ症候群；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；アナフィラキシー反応の防止；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎；アレルギー性鼻炎；蜂毒過敏症；特発性アナフィラキシー；ピーナッツアレルギー；ラテックスアレルギー；炎症性皮膚疾患；蕁麻疹（日光、寒冷誘導性、局所熱誘導性、及び／若しくは遅発性圧誘導性）；皮膚肥満細胞症；全身性肥満細胞症；好酸球関連胃腸障害；水疱性類天疱瘡；間質性膀胱炎；鼻ポリープ；特発性血管性浮腫；又は非アレルギー性喘息。
【国際調査報告】
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