(57)【要約】  本明細書において、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴにおける突然変異を検出するためのキットおよび方法、ならびに肝細胞癌（ＨＣＣ）の検出および管理におけるそれらの使用が提供される。このキットは、第１のＰＣＲ反応においてゲノム領域を増幅するためにゲノム領域に隣接する配列に特異的に結合するように構成された第１のプライマー対と；第１のＰＣＲ反応においてアニール温度で１つの第１の対立遺伝子に結合するがいずれの第２の対立遺伝子にも結合しないようにそれぞれ構成され、それにより１つの第１の対立遺伝子の増幅を選択的に抑制するが、他の第２の対立遺伝子の増幅を依然として可能にする、少なくとも１つのクランプとを含む。ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴにおける突然変異を検出するためのキットおよび方法もまた提供される。ＣＴＮＮＢ１突然変異、ｈＴＥＲＴ突然変異、ＴＰ５３突然変異、ＲＡＳＳＦ１Ａメチル化、およびＧＳＴＰ１メチル化を含む５つのＤＮＡマーカーのレベルを決定することを含む、ＨＣＣの再発を検出または監視する方法がさらに開示される。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の少なくとも１つの第１の対立遺伝子を含有する生物学的試料において、前記遺伝子のゲノム領域内の少なくとも１つの第２の対立遺伝子を特性決定するためのキットであって、
第１のＰＣＲ反応において前記ゲノム領域に隣接する配列に特異的に結合し、それにより前記ゲノム領域を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドの増幅を可能にするように構成される第１のプライマー対と；
前記第１のＰＣＲ反応においてアニール温度で前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つに結合するが前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子のいずれにも結合しないようにそれぞれ構成され、それにより前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つの増幅を選択的に抑制するが、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子の増幅を依然として可能にする、少なくとも１つのクランプとを備えるキット。
【請求項２】
前記少なくとも１つのポリヌクレオチドに対する第２のＰＣＲ反応において前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子の１つ以上の特性決定を可能にするように構成される第２のプライマー対および少なくとも１つのプローブをさらに含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１のプライマー対の少なくとも１つが、その５’末端に人工配列のオリゴヌクレオチドを含み、増幅産物を鋳型として使用して、前記第１のＰＣＲ反応において前記遺伝子のＤＮＡ分子の二次構造を中断するか、または前記少なくとも１つの第１のプライマー対のＴｍを増加させ、それにより前記第１のＰＣＲ反応における前記少なくとも１つのポリヌクレオチドの増幅の効率を増加させるように構成される、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記遺伝子が、ＣＴＮＮＢ１であり、前記ゲノム領域が、ＣＴＮＮＢ１のコドン３２〜３７をコードするホットスポット領域１であり、前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子が、ホットスポット領域１のＣＴＮＮＢ１の野生型対立遺伝子を含み、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子が、ホットスポット領域１内のＣＴＮＮＢ１の１つまたは複数の突然変異対立遺伝子を含み、前記少なくとも１つのクランプが、ＣＴＮＮＢ１の前記野生型対立遺伝子を特異的に標的化する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記ＢＮＡクランプが、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記第１のプライマー対が、それぞれ配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
前記第１のＰＣＲ反応から得られた前記少なくとも１つのポリヌクレオチドに対して、第２のＰＣＲ反応においてＣＴＮＮＢ１の前記１つ以上の突然変異対立遺伝子の検出または定量を可能にするように構成される配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有する加水分解プローブをさらに備える、請求項４に記載のキット。
【請求項８】
前記遺伝子が、ｈＴＥＲＴであり、前記ゲノム領域が、ｈＴＥＲＴの開始コドンの上流のヌクレオチド位置−１２９〜−１１９を含み、前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子が、ｈＴＥＲＴの野生型対立遺伝子を含み、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子が、前記ゲノム領域内のｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子を含み、前記少なくとも１つのクランプが、ｈＴＥＲＴの前記野生型対立遺伝子を特異的に標的とする架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む、請求項３に記載のキット。
【請求項９】
ＤＭＳＯをさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記ＢＮＡクランプが、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記第１のプライマー対が、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記第１のＰＣＲ反応から得られた前記少なくとも１つのポリヌクレオチドに対して、第２のＰＣＲ反応において前記野生型対立遺伝子またはｈＴＥＲＴの前記１つ以上の突然変異対立遺伝子のいずれかの検出または定量をそれぞれ可能にするように構成される、配列番号１５または配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を有する加水分解プローブをさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
前記第２のＰＣＲ反応において使用されるように構成される、配列番号１１および配列番号１４に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ有する第２プライマー対をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１に記載のキットを用いて、遺伝子の少なくとも１つの第１の対立遺伝子を含有する生物学的試料において、前記遺伝子のゲノム領域内の少なくとも１つの第２の対立遺伝子を特性決定するための方法であって、
（ａ）前記生物学的試料、前記第１のプライマー対、および前記少なくとも１つのクランプの混合物に対して前記第１のＰＣＲ反応を行い、それにより第１のＰＣＲ産物を得るステップであって、
前記少なくとも１つのクランプのそれぞれが前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つに結合するが前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子のいずれにも結合しないような期間、アニール温度で前記混合物をアニールし、それにより前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つの増幅を選択的に抑制するが、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子の増幅を依然として可能にするサブステップを含むステップを含む方法。
【請求項１５】
（ｂ）前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子の１つ以上の特性決定を可能にするために、第２のプライマー対および少なくとも１つのプローブを用いて前記第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行うステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）における前記第２のＰＣＲ反応が、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子の１つ以上を定量するように構成され、
前記第１のＰＣＲ反応のための第１のサイクル数および前記第２のＰＣＲ反応のための第２のサイクル数が、非特異的増幅を回避し、増幅が直線性の範囲内にあることを確実にするように構成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子が、ＣＴＮＮＢ１であり、前記ゲノム領域が、ＣＴＮＮＢ１のコドン３２〜３７をコードするホットスポット領域１であり、前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子が、ホットスポット領域１におけるＣＴＮＮＢ１の野生型対立遺伝子を含み、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子は、ホットスポット領域１におけるＣＴＮＮＢ１の１つ以上の突然変異対立遺伝子を含み、前記第１のプライマー対が、それぞれ配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有し、前記少なくとも１つのクランプが、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記混合物をアニール温度である期間アニールするサブステップにおいて、前記アニール温度が５２〜５６℃の範囲を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｂ）配列番号１、配列番号２および配列番号４に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ有する第２のプライマー対およびプローブを用いて、前記第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行うステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子が、ｈＴＥＲＴであり、前記ゲノム領域が、ｈＴＥＲＴの開始コドンの上流のヌクレオチド位置−１２９〜−１１９を含み、前記少なくとも１つの第１の対立遺伝子が、ｈＴＥＲＴの野生型対立遺伝子を含み、前記少なくとも１つの第２の対立遺伝子が、前記ゲノム領域内のｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子を含み、前記第１のプライマー対が、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有し、前記少なくとも１つのクランプが、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記混合物をアニール温度である期間アニールするサブステップにおいて、前記アニール温度は７８〜８２℃の範囲を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）第２のプライマー対およびプローブを用いて前記第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行うステップをさらに含み、
前記第２のプライマー対は、それぞれ配列番号１１および配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を有し、
前記プローブは、前記野生型対立遺伝子またはｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子のいずれかの検出または定量をそれぞれ可能にするように構成される、配列番号１５または配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
それを必要とする対象の生物学的試料から得られたＤＮＡ試料において、肝細胞癌（ＨＣＣ）の再発を検出または監視する方法であって、
（ｉ）前記生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１からなる群からの１つ以上の遺伝子の突然変異またはメチル化のレベルを決定するステップと；
（ｉｉ）前記１つ以上の遺伝子の突然変異またはメチル化の前記レベルに基づいて、ＨＣＣの存在または非存在を検出するステップとを含む方法。
【請求項２４】
ステップ（ｉ）が、
前記生物学的試料中のＣＴＮＮＢ１の突然変異のレベルを決定することを含み、これは、
前記生物学的試料、第１のプライマー対、およびクランプの混合物に対して第１のＰＣＲ反応を行い、それにより第１のＰＣＲ産物を得るサブステップであって、前記第１のプライマー対および前記クランプは、それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップと；
第２のプライマー対およびプローブを用いて前記第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行い、ＣＴＮＮＢ１の突然変異のレベルを決定するサブステップであって、前記第２のプライマー対および前記プローブは、それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップとを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的試料が、尿試料であり、ステップ（ｉｉ）が、
前記尿試料中のＣＴＮＮＢ１の変異のレベルが、ＣＴＮＮＢ１遺伝子１０００コピー当たり１０コピー以上の突然変異ＣＴＮＮＢ１である場合、ＨＣＣの存在を検出することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｉ）が、
前記生物学的試料中のｈＴＥＲＴの突然変異のレベルを決定することを含み、これは、
前記生物学的試料、第１のプライマー対、およびクランプの混合物に対して第１のＰＣＲ反応を行い、それにより第１のＰＣＲ産物を得るサブステップであって、前記第１のプライマー対および前記クランプは、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップと；
第２のプライマー対およびプローブを用いて前記第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行い、ｈＴＥＲＴの突然変異のレベルを決定するサブステップであって、前記第２のプライマー対および前記プローブは、それぞれ配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップとを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的試料が、尿試料であり、ステップ（ｉｉ）が、
前記尿試料中のｈＴＥＲＴの突然変異のレベルが、ｈＴＥＲＴ遺伝子１０００コピー当たり２０コピー以上の突然変異ｈＴＥＲＴである場合、ＨＣＣの存在を検出することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｉ）が、前記生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１のそれぞれの突然変異またはメチル化のレベルを決定することを含み；
ステップ（ｉｉ）が、前記生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１のそれぞれの突然変異またはメチル化の前記レベルに基づいて、ＨＣＣの存在または非存在を検出することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（ｉ）が、前記生物学的試料中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のレベルを決定することをさらに含み；
ステップ（ｉｉ）が、前記生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１のそれぞれの突然変異またはメチル化の前記レベル、ならびにＡＦＰの前記レベルに基づいて、ＨＣＣの存在または非存在を検出することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年４月２０日に出願された米国仮出願第６２／３２５，４５７号の優先権を主張する。
【０００２】
電子的に提出された配列リストへの参照
電子的に提出された配列リスト（ファイル名ＨＣＣ＿Ｓｅｑ＿ｌｉｓｔ．ｔｘｔ、サイズ５，７５０バイト；作成日２０１７年４月２０日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＲ４３ＣＡ１６５３１２およびＲ４４ＣＡ１６５３１２による政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
本開示は、概してバイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、組織および生体液からの試料を使用してがんに関連する核酸配列における突然変異およびメチル化を検出および定量することを含む早期分子癌検出および疾患管理、より具体的には肝細胞癌（ＨＣＣ）のスクリーニング、検出および疾患管理のための方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、１４％の生存率を有する攻撃的な悪性腫瘍である（Ｓｉｍａｒｄ，Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１７）。ＨＣＣは世界で５番目に多いがんであり、がん死亡率の第２位の原因であり、２５万〜８０万人の年間死亡者数をもたらしている（Ｈｏｗｌａｄｅｒ  Ｎ  ２０１６）。ほとんどのＨＣＣ患者は、従来の検出方法を用いて後期に診断され、診断およびその後の治療後５％未満の生存率である。ＨＣＣ患者が初期段階で診断され、外科的および化学療法的介入で治療される場合、予後はずはるかに良好である。残念なことに、肝臓癌の初期段階はほとんど無症状であり、肝臓癌の早期検出を困難にしている。
【０００６】
ＨＣＣを検出する現在の方法には、ＨＢＶまたはＨＣＶに感染したもの等の高リスク群を定期的（通常は年１回または年２回）の身体検査、血清肝機能検査（ＬＦＴ）、超音波および他の画像化試験で監視することが含まれる。これらの方法には全て欠点がある。例えば、超音波画像化は、小さな肝臓病変を検出するのに高感度ではない。ＣＴスキャンおよびＭＲＩスキャン等の他の画像化方法は非常に高額であり、患者を放射線曝露に供し、そのような方法の日常的な使用は禁止される。
【０００７】
画像化技術に加えて、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血清濃度の上昇は、診断時にＨＣＣ患者の平均５０％が上昇したＡＦＰレベルを有するため、ＨＣＣの有用な代理マーカーである。しかしながら、ＡＦＰのレベルの上昇は、多くの非悪性疾患の影響を受け、その結果として生じる可能性がある。現在の方法を用いて十分早期にＨＣＣを検出することはほぼ不可能である。したがって、ＨＣＣの早期検出のための非侵襲的で高感度の信頼できる方法の明確かつ緊急な必要性が存在する（Ｂｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ  ２０１１）。
【０００８】
ＨＣＣの死亡率が高い（患者の８５％が５年以内に死亡する）のは、主に後期発見および再発率の高さによるものである（Ｓｈｅｒｍａｎ  ２００８，Ｋａｍｉｙａｍａ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｈｕｎｇ，Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）再発率は、肝臓移植の１５％から手術またはアブレーションのほぼ１００％に及ぶ。再発は、２年以内が最も一般的である。
【０００９】
ＨＣＣ再発率が高いのは、（１）不完全な治療、（２）肝臓内の微小転移、（３）デノボ病変（Ｓｈｅｒｍａｎ  ２００８）に起因し得る。
【００１０】
再発性ＨＣＣの早期検出は、現在利用可能な診断方法および連続画像化（Ｋａｍｉｙａｍａ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｍｉｎａｍｉ  ａｎｄ  Ｋｕｄｏ  ２０１５）では困難であった。特に、ＨＣＣの再発をどのように監視すべきかに向けた具体的なガイドラインはない。ＭＲＩ／ＣＴ画像化は高額であり、小さな腫瘍（＜２ｃｍ）、以前に治療された病変（特に局所的アブレーションによる）の存在下での腫瘍、肝硬変、肥満、および異形成小塊の検出における実用性が限られているものの、診断の基準である（Ｗｉｌｌａｔｔ，Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｍｉｎａｍｉ，Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｍｉｎａｍｉ  ａｎｄ  Ｋｕｄｏ  ２０１５）。したがって、ＨＣＣの再発を監視するための高感度の検査を受けるためには、未だ満たされていない医学的必要性が緊急に存在する。
【発明の概要】
【００１１】
第１の態様では、本開示は、遺伝子の少なくとも１つの第１の対立遺伝子を含有する生物学的試料において、遺伝子のゲノム領域内の少なくとも１つの第２の対立遺伝子を特性決定するためのキットを提供する。このキットは、第１のプライマー対および少なくとも１つのクランプを含む。第１のプライマー対は、ゲノム領域に隣接する配列に特異的に結合し、それにより第１のＰＣＲ反応においてゲノム領域を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドの増幅を可能にするように構成され、少なくとも１つのクランプは、第１のＰＣＲ反応においてアニール温度で少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つに結合するが少なくとも１つの第２の対立遺伝子のいずれにも結合しないようにそれぞれ構成され、それにより少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つの増幅を選択的に抑制するが、少なくとも１つの第２の対立遺伝子の増幅を依然として可能にする。
【００１２】
本明細書において、ゲノム領域は、突然変異ホットスポットであってもよく、ＣＴＮＮＢ１遺伝子のホットスポット領域１等の突然変異ホットスポットにおいて複数の突然変異部位が濃縮され、これはβ−カテニンタンパク質（ＣＴＮＮＢ１によってコードされる）のコドン３２〜３７に対応するが、ゲノム領域は、１つの突然変異をカバーする短い領域であってもよい。本明細書において、「特性決定する」は、「検出する／特定する」または「定量する」等であってもよい。本明細書において、「クランプ」は、架橋核酸（ＢＮＡ）クランプ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）クランプ、または他の任意の分子であってもよく、これは、増幅のために抑制される１つ以上の第１対立遺伝子に選択的に結合し得る、したがってそれをクランプし得るが、第１のＰＣＲ反応における増幅のために１つ以上の第２の対立遺伝子をクランプしない。
【００１３】
キットは、少なくとも１つのポリヌクレオチドに対する第２のＰＣＲ反応において少なくとも１つの第２の対立遺伝子の１つ以上の特性決定を可能にするように構成される第２のプライマー対および少なくとも１つのプローブをさらに備えることができる。本明細書において、第２のＰＣＲ反応は、リアルタイムＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ等であってもよく、プローブは、第２のＰＣＲ反応の定量化の目的を可能にする加水分解プローブ（例えば蛍光プローブ）であってもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、第１のプライマー対の少なくとも１つは、その５’末端に人工配列のオリゴヌクレオチドを含み、遺伝子のＤＮＡ分子の二次構造を中断するか、または第１のＰＣＲ反応において増幅産物を鋳型として使用して第１のプライマー対のうちの少なくとも１つのＴｍを増加させ、それにより第１のＰＣＲ反応における少なくとも１つのポリヌクレオチドの増幅の効率を増加させるように構成される。
【００１５】
このキットのいくつかの実施形態では、遺伝子は、ＣＴＮＮＢ１であり、ゲノム領域は、ＣＴＮＮＢ１のコドン３２〜３７をコードするホットスポット領域１であり、少なくとも１つの第１の対立遺伝子は、ホットスポット領域１のＣＴＮＮＢ１の野生型対立遺伝子を含み、少なくとも１つの第２の対立遺伝子は、ホットスポット領域１内のＣＴＮＮＢ１の１つまたは複数の突然変異対立遺伝子を含み、少なくとも１つのクランプは、ＣＴＮＮＢ１の前記野生型対立遺伝子を特異的に標的化する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む第１のＰＣＲ反応のために、ＢＮＡクランプは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有してもよく、第１のプライマー対は、それぞれ配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有してもよい。第２のＰＣＲ反応のために、プローブは、第１のＰＣＲ反応から得られた少なくとも１つのポリヌクレオチドに対して、第２のＰＣＲ反応においてＣＴＮＮＢ１の１つ以上の突然変異対立遺伝子の検出または定量を可能にするように構成される配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有する加水分解プローブであってもよい。
【００１６】
キットのいくつかの他の実施形態において、遺伝子は、ｈＴＥＲＴであり、ゲノム領域はｈＴＥＲＴの開始コドンの上流のヌクレオチド位置−１２９〜−１１９を含み、少なくとも１つの第１の対立遺伝子は、ｈＴＥＲＴの野生型対立遺伝子を含み、少なくとも１つの第２の対立遺伝子は、ゲノム領域内のｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子を含み、少なくとも１つのクランプは、ｈＴＥＲＴの野生型対立遺伝子を特異的に標的化する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む。ＰＣＲ効率を高めるために、キットは、第１のＰＣＲ反応において約５％の濃度を有し得るＤＭＳＯをさらに含んでもよい。第１のＰＣＲ反応のために、ＢＮＡクランプは、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有してもよく、第１のプライマー対は、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有してもよい。第２のＰＣＲ反応のために、プローブは、配列番号１５または配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を有する加水分解プローブであってもよく、これは、第１のＰＣＲ反応から得られた少なくとも１つのポリヌクレオチドに対して、第２のＰＣＲ反応において野生型対立遺伝子またはｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子のいずれかの検出または定量をそれぞれ可能にするように構成される。さらに、第２のＰＣＲ反応において使用されるように構成される、配列番号１１および配列番号１４に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ有する第２のプライマー対がキットに含まれてもよい。
【００１７】
第２の態様では、本開示は、上記のキットを用いて、遺伝子の少なくとも１つの第１の対立遺伝子を含有する生物学的試料において、遺伝子のゲノム領域内の少なくとも１つの第２の対立遺伝子を特性決定するための方法をさらに提供する。
【００１８】
方法は、（ａ）生物学的試料、第１のプライマー対、および少なくとも１つのクランプの混合物に対して第１のＰＣＲ反応を行い、それにより第１のＰＣＲ産物を得るステップを含む。ステップ（ａ）は、少なくとも１つのクランプのそれぞれが少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つに結合するが少なくとも１つの第２の対立遺伝子のいずれにも結合しないような期間、アニール温度で混合物をアニールし、それにより少なくとも１つの第１の対立遺伝子の１つの増幅を選択的に抑制するが、少なくとも１つの第２の対立遺伝子の増幅を依然として可能にするサブステップを含んでもよい。
【００１９】
この方法は、（ｂ）少なくとも１つの第２の対立遺伝子の１つ以上の特性決定を可能にするために、第２のプライマー対および少なくとも１つのプローブを用いて第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行うステップをさらに含んでもよい。
【００２０】
本方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における第２のＰＣＲ反応は、少なくとも１つの第２の対立遺伝子の１つ以上を定量するように構成される。したがって、第１のＰＣＲ反応のための第１のサイクル数および第２のＰＣＲ反応のための第２のサイクル数は、非特異的増幅を回避し、増幅が直線性の範囲内にあることを確実にするように構成される。
【００２１】
この方法のいくつかの実施形態において、遺伝子は、ＣＴＮＮＢ１であり、ゲノム領域は、ＣＴＮＮＢ１のコドン３２〜３７をコードするホットスポット領域１であり、少なくとも１つの第１の対立遺伝子は、ホットスポット領域１におけるＣＴＮＮＢ１の野生型対立遺伝子を含み、少なくとも１つの第２の対立遺伝子は、ホットスポット領域１におけるＣＴＮＮＢ１の１つ以上の突然変異対立遺伝子を含み、第１のプライマー対は、それぞれ配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を有し、少なくとも１つのクランプは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む。したがって、第１のＰＣＲ反応においてアニール温度で混合物をある期間アニールするサブステップにおいて、アニール温度は５２〜５６℃の範囲を有してもよい。ＣＴＮＮＢ１突然変異を定量するために、本方法は、（ｂ）配列番号１、配列番号２および配列番号４に記載のヌクレオチド配列をそれぞれ有する第２のプライマー対およびプローブを用いて、第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行うステップを含む。
【００２２】
本方法のいくつかの他の実施形態において、遺伝子は、ｈＴＥＲＴであり、ゲノム領域は、ｈＴＥＲＴの開始コドンの上流のヌクレオチド位置−１２９〜−１１９を含み、少なくとも１つの第１の対立遺伝子は、ｈＴＥＲＴの野生型対立遺伝子を含み、少なくとも１つの第２の対立遺伝子は、ゲノム領域内のｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子を含み、第１のプライマー対は、それぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を有し、少なくとも１つのクランプは、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有する架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを含む。したがって、第１のＰＣＲ反応において混合物をアニール温度である期間アニールするサブステップにおいて、アニール温度は７８〜８２℃の範囲を有してもよい。ｈＴＥＲＴ突然変異を定量するために、本方法は、（ｂ）第２のプライマー対およびプローブを用いて第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行うステップを含み、第２のプライマー対はそれぞれ配列番号１１および配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を有し、プローブは、野生型対立遺伝子またはｈＴＥＲＴの１つ以上の突然変異対立遺伝子のいずれかの検出または定量をそれぞれ可能にするように構成される、配列番号１５または配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を有する。
【００２３】
第３の態様において、本開示は、それを必要とする対象の生物学的試料から得られたＤＮＡ試料において、肝細胞癌（ＨＣＣ）の再発を検出または監視する方法をさらに提供する。この方法は、（ｉ）生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１からなる群からの１つ以上の遺伝子の突然変異またはメチル化のレベルを決定するステップと；（ｉｉ）１つ以上の遺伝子の突然変異またはメチル化のレベルに基づいて、ＨＣＣの存在または非存在を検出するステップとを含む。
【００２４】
本明細書において、生物学的試料は、生検試料等の組織試料であってもよく、または血液、血清、胃腸液、胆汁、脳脊髄液、心膜、膣液、精液、前立腺液、腹水、胸膜液、尿、滑液、間質液、細胞内液もしくは細胞質およびリンパ液、気管支分泌物、粘液、または硝子体液もしくは房水である。本開示における特に有用な生物学的試料は、尿試料である。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、生物学的試料中のＣＴＮＮＢ１の突然変異のレベルを決定することを含み、これは、
生物学的試料、第１のプライマー対、およびクランプの混合物に対して第１のＰＣＲ反応を行い、それにより第１のＰＣＲ産物を得るサブステップであって、第１のプライマー対およびクランプは、それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップと；
第２のプライマー対およびプローブを用いて第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行い、ＣＴＮＮＢ１の突然変異のレベルを決定するサブステップであって、第２のプライマー対およびプローブは、それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップとを含む。
【００２６】
本明細書において、生物学的試料は、尿試料であってもよく、ステップ（ｉｉ）は、尿試料中のＣＴＮＮＢ１の変異のレベルが、ＣＴＮＮＢ１遺伝子１０００コピー当たり１０コピー以上の突然変異ＣＴＮＮＢ１である場合、ＨＣＣの存在を検出することを含んでもよい。
【００２７】
いくつかの他の実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、生物学的試料中のｈＴＥＲＴの突然変異のレベルを決定することを含み、これは、
生物学的試料、第１のプライマー対、およびクランプの混合物に対して第１のＰＣＲ反応を行い、それにより第１のＰＣＲ産物を得るサブステップであって、第１のプライマー対およびクランプは、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップと；
第２のプライマー対およびプローブを用いて第１のＰＣＲ産物に対して第２のＰＣＲ反応を行い、ｈＴＥＲＴの突然変異のレベルを決定するサブステップであって、第２のプライマー対およびプローブは、それぞれ配列番号１１、配列番号１４、および配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を有するサブステップとを含む。
【００２８】
本明細書において、生物学的試料は、尿試料であってもよく、ステップ（ｉｉ）は、尿試料中のｈＴＥＲＴの変異のレベルが、ｈＴＥＲＴ遺伝子１０００コピー当たり２０コピー以上の突然変異ｈＴＥＲＴである場合、ＨＣＣの存在を検出することを含んでもよい。
【００２９】
本方法のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１のそれぞれの突然変異またはメチル化のレベルを決定することを含み；ステップ（ｉｉ）は、生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１のそれぞれの突然変異またはメチル化のレベルに基づいて、ＨＣＣの存在または非存在を検出することを含む。
【００３０】
本方法のいくつかの他の実施形態によれば、ステップ（ｉ）は、生物学的試料中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のレベルを決定することをさらに含み；ステップ（ｉｉ）は、生物学的試料中のＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１のそれぞれの突然変異またはメチル化のレベル、ならびにＡＦＰのレベルに基づいて、ＨＣＣの存在または非存在を検出することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＨＣＣに関連するＣＴＮＮＢ１（βカテニンをコードする）エキソン３突然変異頻度の概略図である。
【図２Ａ】ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異を検出するためのＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイの開発を示す図である。
【図２Ｂ】ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異を検出するためのＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイの開発を示す図である。
【図２Ｃ】ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異を検出するためのＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイの開発を示す図である。
【図３Ａ】肝疾患組織試料におけるＣＴＮＮＢ１突然変異の分析を示す図である。
【図３Ｂ】肝疾患組織試料におけるＣＴＮＮＢ１突然変異の分析を示す図である。
【図４Ａ】ＳＮＵ３９８ゲノムＤＮＡを用いたＣＴＮＮＢ１アッセイの標準化を示す図である。
【図４Ｂ】ＳＮＵ３９８ゲノムＤＮＡを用いたＣＴＮＮＢ１アッセイの標準化を示す図である。
【図５】未修飾ＲＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）および架橋核酸（ＢＮＡ）を示す化学構造図である。
【図６Ａ】ｈＴＥＲＴ突然変異を検出するためのＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイの開発を示す図である。
【図６Ｂ】ｈＴＥＲＴ突然変異を検出するためのＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイの開発を示す図である。
【図７Ａ】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するために、５種類の尿ＤＮＡバイオマーカー（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴ）を血清ＡＦＰと共に評価したグラフである。
【図７Ｂ】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するために、５種類の尿ＤＮＡバイオマーカー（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴ）を血清ＡＦＰと共に評価したグラフである。
【図７Ｃ】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するために、５種類の尿ＤＮＡバイオマーカー（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴ）を血清ＡＦＰと共に評価したグラフである。
【図７Ｄ】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するために、５種類の尿ＤＮＡバイオマーカー（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴ）を血清ＡＦＰと共に評価したグラフである。
【図７Ｅ】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するために、５種類の尿ＤＮＡバイオマーカー（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴ）を血清ＡＦＰと共に評価したグラフである。
【図７Ｆ】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するために、５種類の尿ＤＮＡバイオマーカー（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１およびｈＴＥＲＴ）を血清ＡＦＰと共に評価したグラフである。
【図８】ＨＣＣと非ＨＣＣとを区別するための変数として、ＨＣＣ尿バイオマーカーパネルおよび血清ＡＦＰを用いた多変量統計分析法を用いて生成されたＲＯＣ曲線を示す図である。
【図９Ａ】ＨＣＣの再発を監視した１０人の患者の連続した尿試料中のＤＮＡバイオマーカーレベルを示すグラフである。
【図９Ｂ】ＨＣＣの再発を監視した１０人の患者の連続した尿試料中のＤＮＡバイオマーカーレベルを示すグラフである。
【図９Ｃ】ＨＣＣの再発を監視した１０人の患者の連続した尿試料中のＤＮＡバイオマーカーレベルを示すグラフである。
【図９Ｄ】ＨＣＣの再発を監視した１０人の患者の連続した尿試料中のＤＮＡバイオマーカーレベルを示すグラフである。
【図９Ｅ】ＨＣＣの再発を監視した１０人の患者の連続した尿試料中のＤＮＡバイオマーカーレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書において、がんの早期検出のための高感度、特異的および定量的試験が開示される。
【００３３】
循環する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、生体液において同定されている（Ａｎｋｅｒ，Ｌｙａｕｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１、Ｃｈａｎ，Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００３、Ｄｉｅｈｌ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。例えば、尿中には、尿路からの剥がれた細胞残屑から主に得られる１ｋｂ超の高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡ、および約１５０〜２５０塩基対（ｂｐ）であり、主にアポトーシス細胞に由来する低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡの２種が見られる（Ｓｕ、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００３４】
断片化したｃｆＤＮＡを含有する尿が実証されている。この尿断片化ＤＮＡは、腫瘍が存在する場合、がん関連ＤＮＡマーカーの検出に使用することができる（Ｓｕ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｓｕ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｓｕ，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｌｉｎ，Ｄｈｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｓｏｎｇ，Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異およびｈＴＥＲＴプロモーター突然変異は、腫瘍の存在の検出に有用かつ適切であることが示唆されている。
【００３５】
より具体的には、本開示は、ＨＣＣの早期検出、ＨＣＣ再発の監視、および疾患管理のためのＤＮＡマーカーを含む遺伝子のパネルの突然変異およびメチル化のレベルを決定することにより、対象におけるＨＣＣを検出することに関する。ＨＣＣの発症には、他の固形腫瘍と同様に、細胞内で少なくとも３つの生化学的経路（増殖、細胞周期、アポトーシス／細胞生存）の調節不全が必要であると考えられている（Ｐｅｐｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ２０００、Ｚｈａｎｇ，Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｇｅｒｓｚｔｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ２００８）。遺伝子突然変異に加えて、腫瘍サプレッサーの異常メチル化は、ＨＣＣ発がん過程を通じて重要な役割を果たす。したがって、尿ＤＮＡパネル試験は、ＴＰ５３突然変異、ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異、ｈＴＥＲＴ突然変異（Ｎａｕｌｔ，Ｍａｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）を含む遺伝子突然変異、ならびにｍＲＡＳＳＦ１Ａ（Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｎａｇａｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｎｅｗｅｌｌ，Ｔｏｆｆａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）およびｍＧＳＴＰ１（Ｙａｎｇ，Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｎｏｍｏｔｏ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｈａｒｄｅｒ，Ｏｐｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｎａｇａｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を含むエピジェネティックメチル化ＤＮＡマーカーの両方を検出し、ＨＣＣスクリーニング、検出、および疾患管理に十分な感度および特異性を得るように設計されている。
【００３６】
ＣＴＮＮＢ１遺伝子において生じる突然変異は多くのがんと関連しており、多くの場合、全症例のほぼ１０〜４０％を占める。ＨＣＣでは、ＣＴＮＮＢ１遺伝子の突然変異は全症例のほぼ２０〜４０％で生じ、大多数はコドン３２〜３７のホットスポット領域に見られる。ＣＴＮＮＢ１突然変異を検出するための現在の方法は、主に、ＰＣＲに基づくアッセイに続くＤＮＡ配列決定に依存し、これは感度が低く、時間がかかり、労働集約的である。したがって、ＨＣＣの早期検出のためのスクリーニング試験として機能する、堅牢で信頼できるＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異の定量的測定が必要である。
【００３７】
ｈＴＥＲＴプロモーター領域における体細胞突然変異は、いくつかの腫瘍型で報告されている。ｈＴＥＲＴ突然変異は、ＡＴＧ開始部位からＧ／ＡまたはＧ／Ｔ置換として最も頻繁に観察される−１２４ｎｔである。改変されたｈＴＥＲＴ転写の下流の結果は未知であるが、この突然変異はＨＣＣにおいて最も頻繁に生じるものの１つと考えられている。現在の方法は、主にＰＣＲに基づくアッセイに続くＤＮＡ配列決定に依存しており、ＨＣＣの早期検出のためのスクリーニング試験として役立つ、堅牢で信頼できるｈＴＥＲＴ突然変異の定量的測定の必要性が存在する。
【００３８】
ＨＣＣスクリーニング、早期疾患検出、および疾患管理のためのＣＴＮＮＢ１遺伝子の突然変異レベルおよびｈＴＥＲＴ遺伝子の突然変異レベルをより一貫して正確に決定する方法が必要とされている。また、ＨＣＣに由来する突然変異ＤＮＡが尿、血漿または他の体液中で検出され得るか否かについての必要性が依然として存在する。
【００３９】
本主題は、本開示の一部をなす添付の実施例に関連して行われる以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。本発明は、本明細書において説明および／または示された特定のデバイス、方法、用途、条件またはパラメータに限定されないこと、ならびに、本明細書において使用される用語は単なる例示として特定の実施形態を説明するためのものであり、請求された発明の限定を意図するものではないことを理解されたい。
【００４０】
また、添付の特許請求の範囲を含む明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数形を含み、特定の数値への言及は、文脈により別の意味が明確に示されない限り、少なくともその特定の値を含む。「複数」という用語は、本明細書において使用される場合、２つ以上を意味する。ある範囲の値が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。全ての範囲は包括的であり、組み合わせ可能である。
【００４１】
別段に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、以下の用語および語句は、別段に指定されない限り、それらに帰する意味を有する。
【００４２】
「ゲノム」および「ゲノム性」という用語は、任意の生きた、または生きていない生物または単一細胞に由来する任意の核酸配列（コード化および非コード化）を指す。これらの用語はまた、生物学的または人為的な影響を介した突然変異または組換えによって生じ得る任意の自然発生的変異にも適用される。一例はヒトゲノムであり、染色体にパッケージングされた約３×１０９塩基対のＤＮＡで構成され、そのうち２２対の常染色体と１対の異質染色体がある。
【００４３】
「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において使用される場合、ワトソン−クリック相互作用を介して相補配列と塩基対合することができる反復核酸（アデニン、グアニン、チミン、およびシトシン、およびウラシル）のポリマーを示す。このポリマーは、合成的に製造されてもよく、または生物源に由来してもよい。
【００４４】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびその相補体を指す。ヌクレオチドのサイズは、塩基対「ｂｐ」で表される。ポリヌクレオチドは、核酸およびその相補体の一本鎖または二本鎖のポリマーである。
【００４５】
「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」という用語は、反復デオキシリボ核酸のポリマーを指す。
【００４６】
「リボ核酸」および「ＲＮＡ」という用語は、反復リボ核酸のポリマーを指す。
【００４７】
生体液は、例えば、生検試料等の組織全体を含んでもよい。生体液の他の例は、これらに限定されないが、唾液、鼻咽頭、血液、血漿、血清、胃腸液、胆汁、脳脊髄液、心膜、膣液、精液、前立腺液、腹水、胸膜液、尿、滑液、間質液、細胞内液もしくは細胞質およびリンパ液、気管支分泌物、粘液、または硝子体液もしくは房水を含む。生体液はまた、培地を含んでもよい。本方法における特に有用な生体液は尿である。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「がん」は、腺腫、化生、異型、異形成、新形成、過形成および非形成を含むがこれらに限定されないがん細胞の前がん性および全段階を含む、細胞または組織の異常な成長または移動の任意の段階を指す。
【００４９】
「バイオマーカー」という用語は、生物学的状態の指標として使用される薬剤である。これは、正常な生物学的プロセス、病原性プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標として客観的に測定および評価される特性であってもよい。バイオマーカーは、疾患を引き起こすか、または疾患に対する感受性に関連するゲノムＤＮＡ配列の断片であってもよく、また遺伝子を含んでもよく、または含まなくてもよい。
【００５０】
ある特定の実施形態において、プラットフォームは、「低分子量」（ＬＭＷ）ＤＮＡとして知られている断片化された循環由来ＤＮＡを含有する生物学的試料を使用する。ＤＮＡは、一般に３００塩基対未満のサイズであるため、低分子量である。このＬＭＷ  ＤＮＡは、正常細胞およびがん細胞の両方によって壊死またはアポトーシスを介して循環系に放出される。ＬＷＭ  ＤＮＡは尿中に排泄され、腫瘍由来ＤＮＡを検出するために使用でき、検出が利用可能な短い鋳型アッセイ等の適切なアッセイを提供したことが示されている（Ｓｕ，Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ヌクレオチド増幅反応アッセイにおいて野生型配列の増幅を防止するようにＬＭＷ核酸配列を改変する方法の現在の発見に基づいて、生物学的試料、例えば尿からのＬＭＷ  ＤＮＡを、高度の特異性を有する野生型対照ＤＮＡと比較することができる。
【００５１】
「ロックされた核酸」ＬＮＡは、そのリボースが２’−酸素および４’−炭素を接続するメチレン架橋で修飾された化学修飾ＲＮＡヌクレオチドである。
【００５２】
「架橋核酸」ＢＮＡは、そのリボースが２’−酸素および４’−炭素を接続するアミノエチレン架橋で修飾された化学修飾ＲＮＡヌクレオチドである。
【００５３】
用語「ヌクレオチド増幅反応」は、プライマーを用いてポリヌクレオチド（標的）の特定の領域を増幅する任意の適切な手順を指す。
【００５４】
「検出可能な標識」は、診断に有用な分子を生成するために抗体部分にコンジュゲートされ得る分子または原子である。検出可能な標識の例は、キレート剤、光活性剤、放射性同位元素、蛍光剤、常磁性イオン、または他のマーカー部分を含む。
【００５５】
疾患または障害の治療の文脈における「有効量」という用語は、対象における疾患または障害の１つ以上の臨床的または診断的症状の発生を阻害または緩和するのに十分なそのような分子の量を指す。「有効な投与計画」という用語は、投与される薬剤の量と、疾患または障害の治療または予防を達成するのに十分な投薬頻度との組合せを指す。
【００５６】
標準的分析方法の不正確さに起因して、ポリマーの分子量および長さはおおよその値であると理解される。そのような値が「約」Ｘまたは「およそ」Ｘとして表される場合、記述されたＸの値は±１０％まで正確であると理解される。
【００５７】
実施例は、本発明のさらなる理解を助けるために提供される。使用される特定の材料、プロトコルおよび条件は、本発明をさらに例示することを意図しており、その合理的な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００５８】
本開示は、ＨＣＣスクリーニング、がんの進行、およびＨＢＶ疾患の監視のために、遺伝子のパネルの突然変異またはメチル化のレベルを非侵襲的に検出する方法を含む。
【００５９】
本明細書において、個体からの遺伝子のパネルの突然変異およびメチル化のレベルを決定し、突然変異およびメチル化のレベルを、がんを有さないことが知られている個体からの１つ以上の対照試料において見られる突然変異およびメチル化のベースラインレベルと比較し、個体における上昇した突然変異またはメチル化の所見を、個体ががんを有する上昇した可能性と相関させるステップにより、個体におけるがんの生む有無を検出するための方法が提供される。がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）であってもよく、対照は、非ＨＣＣであってもよい。腫瘍関連遺伝子は、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＧＳＴＰ１であってもよい。調節領域は、ｈＴＥＲＴ、ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター、ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＧＳＴＰ１遺伝子の第１エキソン、またはその両方であってもよい。個体は、人間であってもよい。
【００６０】
また、本明細書において、組織または体液等の生物学的試料からの野生型ＣＴＮＮＢ１配列と比較して、単離された核酸配列を用いて、ＣＴＮＮＢ１遺伝子のエキソン３のコドン３２〜３７領域における突然変異を検出するための高感度で特異的な定量的アッセイを提供する方法が記載される。ＰＣＲ等のヌクレオチド増幅反応における、野生型配列ではなく突然変異ＤＮＡ配列の選択的増幅のために、患者から単離された任意の腫瘍由来ＤＮＡが本方法において使用され得る。この方法は、野生型配列の増幅を抑制するように設計された１７ヌクレオチド架橋核酸（ＢＮＡ）クランプを使用し、ＢＮＡクランプとのいかなるミスマッチも含有しない選択的ＣＴＮＮＢ１テンプレートを増幅する。ＰＣＲ産物は、第２ステップのＰＣＲにおいて加水分解プローブにより定量された。アッセイの実行時間はおよそ６時間であり、ＨＣＣスクリーニングのための血液または尿検査のためのハイスループット形式として毎日使用され得る。突然変異の保有率が低い領域では、このスクリーニングアッセイは、アルファ−フェトプロテイン血液検査および超音波画像化等の他の相補的スクリーニング検査と組み合わされてもよい。ＨＣＣを検出するためのカットオフＣＴＮＮＢ１突然変異レベルは、尿１ｍＬ当たり１０コピーの突然変異ＣＴＮＮＢ１であってもよい。
【００６１】
本明細書において、ＣＴＮＮＢ１コドン３２〜３７領域における突然変異核酸の量を定量する方法も記載されている。２ステップＰＣＲアッセイの第１のステップは、野生型ＤＮＡ鋳型の増幅を抑制するために使用されるＢＮＡクランプ、配列番号３に加えて、配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列のプライマーを使用する小さなアンプリコンを標的とする。第２のＰＣＲステップのために、増幅に使用されるプライマーは、コドン３２〜３７の領域を検出する加水分解プローブ、配列番号４に加えて、配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。このアッセイは高い感度および特異性を有する。ＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイは、１：１，０００（０．１％）の突然変異対野生型配列の高い特異性比を有する突然変異配列の数コピーまで検出する。ＢＮＡクランプによる野生型鋳型増幅の抑制は、野生型配列に対するＢＮＡクランプの完全一致に基づく。ＤＮＡに対するＢＮＡの塩基対形成は、ＤＮＡ対ＤＮＡの熱安定性よりも高い熱安定性を発揮し、完全一致と単一塩基対不一致との間の広範囲のＴｍ差（６〜１０℃）をもたらす。Ｔｍの差異に基づいて、本発明者らは、野生型配列ではなく突然変異配列のみを選択的に増幅するようにＰＣＲ条件を最適化した。重要なことに、アッセイは、ＣＴＮＮＢ１のコドン３２〜３７の領域における任意の突然変異を検出することができる。
【００６２】
高い感度および特異性に加えて、このプロセスはまた、ＣＴＮＮＢ１コドン３２〜３７領域における突然変異核酸の正確な定量も達成した。突然変異核酸の定量化は、少なくとも以下の３つの理由から特に困難である：（１）増幅の２つのステップの後に直線内の増幅を確実にするために第１ラウンドＰＣＲのサイクル数を決定することが困難である；（２）非特異的増幅を避け、増幅が直線性の範囲内にあることを確実にするために、第２ラウンドＰＣＲのサイクル数を正確にする必要がある；（３）この領域にはある程度の二次構造が存在し、増幅のための独特の課題を呈すると考えられる。配列番号２の５’末端に人工タグ配列を付加することにより、（１）ＰＣＲ反応から生成された鋳型に対するプライマーのＴｍの増加、ならびに（２）鋳型の二次構造形成の潜在的な干渉のために、目的の配列のＰＣＲ増幅の成功が可能となった。
【００６３】
本明細書に記載される方法は、対象において特定された既存の疾患の状態を決定するために使用され得る。例えば、ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異について陽性であった１３の尿試料を試験した場合、これらの試料のうち７つは、ＨＣＣを外科的に除去した後に検出されたＣＴＮＮＢ１突然変異が検出できないことを示した。他の６人の患者は皆再発した。したがって、ＨＣＣ腫瘍の外科的除去後に採取された尿中で突然変異を有するＬＭＷ核酸がもはや検出不可能であるかどうかを評価することによって、患者の状態が変化したかどうかを決定するために、手術前および後に採取された尿中に検出された突然変異を試験することができる。
【００６４】
また、本明細書において、体液を含む生物学的試料からの野生型ｈＴＥＲＴ配列と比較して、単離された核酸配列を使用して、ＡＴＧ開始コドンのｎｔ．−１２９〜−１１９上流に位置するｈＴＥＲＴ遺伝子のプロモーター領域における突然変異を検出するための高感度の特異的および定量的アッセイを提供する方法が記載される。ＰＣＲ等のヌクレオチド増幅反応における、野生型配列ではなく突然変異ＤＮＡ配列の選択的増幅のために、患者から単離された任意の腫瘍由来ＤＮＡが本方法において使用され得る。この方法は、野生型配列の増幅を抑制するように設計された１１ヌクレオチドＢＮＡクランプを使用し、ＢＮＡクランプとのいかなるミスマッチも含有しない選択的ｈＴＥＲＴテンプレートを増幅する。ＰＣＲ産物は、第２のステップのＰＣＲ反応において加水分解プローブによりを定量された。アッセイの実行時間はおよそ６時間であり、ＨＣＣスクリーニングのための血液または尿検査のためのハイスループット形式として毎日使用され得る。突然変異の保有率が低い領域では、このスクリーニングアッセイは、アルファ−フェトプロテイン血液検査および超音波画像化等の他の相補的スクリーニング検査と組み合わされてもよい。ＨＣＣを検出するためのカットオフｈＴＥＲＴ突然変異レベルは、尿１ｍＬ当たり２０コピーの突然変異ｈＴＥＲＴであってもよい。
【００６５】
また、本明細書において、ｈＴＥＲＴプロモーター突然変異の突然変異核酸の量を定量化する方法も記載されている。２ステップＰＣＲアッセイの第１のステップは、野生型ＤＮＡ鋳型の増幅を抑制するために使用されるＢＮＡクランプ、配列番号１３に加えて、配列番号１１および配列番号１２に記載のヌクレオチド配列のプライマーを使用する小さなアンプリコンを標的とする。第２のＰＣＲステップのために、増幅に使用されるプライマーは、それぞれｈＴＥＲＴのＷＴおよび−１２４プロモーター突然変異を検出する加水分解プローブ、配列番号１５または配列番号１６に加えて、配列番号１１および配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む。このアッセイは高い感度および特異性を有する。ＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイは、１：１，０００（０．１％）の突然変異対野生型配列の高い特異性比を有する突然変異配列の数コピーまで検出する。ＢＮＡクランプによる野生型鋳型増幅の抑制は、野生型配列に対するＢＮＡクランプの完全一致に基づく。ＤＮＡに対するＢＮＡの塩基対形成は、ＤＮＡ対ＤＮＡの熱安定性よりも高い熱安定性を発揮し、完全一致と単一塩基対不一致との間の広範囲のＴｍ差（６〜１０℃）をもたらす。Ｔｍの差異に基づいて、本発明者らは、野生型配列ではなく突然変異配列のみを選択的に増幅するようにＰＣＲ条件を発明および最適化した。ＰＣＲ選択性は、この２段階ＰＣＲアッセイの第１ステップＰＣＲにおいて達成される。鋳型を変性する従来の９５℃の後、ＢＮＡが野生型鋳型に結合するが突然変異鋳型には結合しないアニールステップ（７８〜８２℃）が行われ、次いでプライマーアニールおよび７０〜７４℃での伸長が行われる。この高いプライマーアニール温度は、プライマーがアニールするための一本鎖変性形態の増幅領域鋳型の高いＧＣ含量（この５０塩基対増幅領域において８４％のＧＣ）を維持するように設計された。さらに、この極端な高ＧＣ含量のＰＣＲ反応を克服するために５％ＤＭＳＯが添加され、配列番号１１の５’末端に人工タグ配列を付加することにより、目的の配列の高効率ＰＣＲ増幅が可能になったが、これは、ＰＣＲ反応から生成された鋳型に対するプライマーのＴｍの増加による。
【００６６】
本明細書中に記載の方法は、治療のために対象患者を特定し、特定の突然変異ＣＴＮＮＢ１または突然変異ｈＴＥＲＴ関連がんに関連する危険因子を決定するために使用され得る。そのような方法は、例えば、個体が、特定の疾患と診断された親族を有するかどうかを判定することを含んでもよい。スクリーニング方法はまた、例えば、遺伝的構成要素を有することが知られている特定の疾患の家族性状態を決定するための従来の後処理を含んでもよい。スクリーニングは、既知の患者の症候、年齢因子、関連する危険因子等により示されるように実施され得る。これらの方法は、臨床医が、治療のために本明細書に記載の方法を必要とする患者を日常的に選択することを可能にする。これらの方法に従って、スクリーニングは、独立したプログラムとして、またはフォローアップ、補助剤として、または他の治療と調整するために実施され得る。したがって、本明細書において開示される方法は、がんスクリーニング、特に早期検出、再発の監視、疾患管理、およびがん患者のための個人化された薬剤投与計画を開発するために使用され得る。
【００６７】
ＨＣＣと肝硬変および肝炎とを区別するために、５−ＤＮＡマーカーパネル（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＰ５３、ｍＧＳＴＰ１、ＣＴＮＮＢ１、およびｈＴＥＲＴ）の作用を、単独またはＡＦＰとの組み合わせで試験したところ、ＤＮＡマーカーパネル＋ＡＦＰが、表１に記載された研究コホートにおいて９０％の特異性で８９％のＨＣＣを検出した。
【００６８】
【表１】
2019514372.tif 000003
【００６９】
上述の実施形態は、本発明の原理の応用を構成し得る多数の様々な他の実施形態の単なる例示であることを理解されたい。そのような他の実施形態は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく当業者によって容易に考案され得、それらは本発明の範囲内であるとみなされることが意図される。
【００７０】
本発明は、以下の限定されない実施例によってさらに例示される。
【００７１】
研究対象および方法
本研究のための試料は、ＩＲＢ（施設審査委員会）の承認の下、台湾のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ−Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから入手され、外科的切除を受けたがん患者からの７３の組織試料と共に、ＨＣＣの病理全体にわたってメチル化を追跡するための非がん性の隣接組織が提供された。また、ＩＲＢの承認の下、台湾花蓮県のＢｕｄｄｈｉｓｔ  Ｔｚｕ  Ｃｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌセンターから、さらなる疾患組織（３５の肝炎および３５の肝硬変）が得られた。これらの試料の臨床病理学的特徴を表１に示す。尿試料は施設審査委員会のガイドラインに従ってＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ−Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで採取された。
【００７２】
組織および尿からのＤＮＡ単離
Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を製造者の指示に従って使用することにより、組織ＤＮＡを単離した。２６０ｎｍの吸光度でＮａｎｏｄｒｏｐ  １０００（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用して、ＤＮＡ濃度を測定した。尿採取および尿ＤＮＡ単離の手順は、以前に説明されたように行った（Ｌｉｎ，Ｄｈｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。簡潔には、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を、新鮮な尿試料に１０ｍＭ  ＥＤＴＡの最終濃度まで添加して、可能性のあるヌクレアーゼ活性を阻害し、−７０℃で保存した。全尿ＤＮＡを単離するために、凍結した尿試料を室温で解凍し、次いでＤＮＡ単離の前に氷中に直ちに置いた。解凍した尿からＤＮＡを１時間以内に単離した。尿試料を１倍量の６Ｍグアニジンチオシアネートと８回転倒混和した。次いで、１ｍｌの樹脂（Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ精製キット、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を尿溶解物に添加し、穏やかに混合しながら室温で２時間から一晩インキュベートした。樹脂−ＤＮＡ複合体を遠心分離し、ミニカラム（キットに同梱）に移し、製造者により提供された緩衝液で洗浄し、次いでＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で溶出した。カルボキシル化磁気ビーズ（ＣＭＢ）（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）および以前に我々の研究室によって開発された結合方法（Ｓｕ，Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を使用して、ＬＭＷ尿ＤＮＡ画分を得た。総尿ＤＮＡ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁）を、５Ｍ  ＮａＣｌおよび２０％ポリエチレングリコール８０００（ＡＭＲＥＳＣＯ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）と、それぞれ０．３Ｍおよび８％の最終濃度で混合した。ＣＭＢ懸濁液（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を洗浄し、使用前にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で再懸濁した。予め洗浄したＣＭＢ懸濁液１０マイクロリットルをＤＮＡ混合物に加え、室温で１〜２時間インキュベートしてＨＭＷ  ＤＮＡをビーズに結合させた。磁気プレート（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ＨＭＷ  ＤＮＡと結合したビーズを懸濁液から除去した。１．２Ｍ  ＮａＣｌおよび１０％ポリエチレングリコール８０００の溶液中に予め洗浄したＣＭＢ  １０μｌを添加することによって、懸濁液中に残っているＬＭＷ  ＤＮＡを採取した。次いで、ＬＭＷまたはＨＭＷ  ＤＮＡと結合したビーズを７５％エタノールで洗浄し、ＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で溶出した。
【００７３】
ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異の頻度
がんにおけるＣＴＮＮＢ１遺伝子の突然変異頻度は、１０〜４０％の頻度で生じることが知られている。図１は、ＨＣＣに関連するＣＴＮＮＢ１エキソン３突然変異頻度の概略図を示す。ＨＣＣ患者のＣＴＮＮＢ１エキソン３を配列決定したいくつかの研究からのデータが集計され、このグラフに示されている。図１に示すように、ＣＴＮＮＢ１に突然変異を有する全てのＨＣＣ腫瘍のほぼ９０％は、領域１（コドン３２〜３７；５４．６％）および領域２（コドン４１〜４５；３４．３％）の２つのホットスポット領域の１つに存在する。
【００７４】
ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異アッセイおよびｈＴＥＲＴプロモーター突然変異アッセイに使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド。ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異アッセイおよびｈＴＥＲＴプロモーター突然変異アッセイを含む本出願において請求されるＰＣＲアッセイで使用されるプライマー、プローブおよびＢＮＡクランプ配列を、表２および表３に列挙する。
【００７５】
【表２】
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【００７６】
【表３】
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【００７７】
実施例１：ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異アッセイ
ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異のためのｑＰＣＲアッセイの開発。
【００７８】
ＣＴＮＮＢ１突然変異ホットスポット領域１アッセイを、図２Ａに示される２ステップＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイを用いて開発した。このアッセイでは、このホットスポット領域を標的化するＢＮＡクランプの存在下でホットスポット領域１に隣接するプライマーを設計した（ステップ１）。次いで、ステップ１からの増幅産物を、ホットスポット領域１を標的化する加水分解プローブを用いてｑＰＣＲにより分析した（ステップ２）。
【００７９】
具体的には、ＣＴＮＮＢ１のホットスポット領域（コドン３２〜３７）は、この領域のすぐ外側のＢＮＡクランプで標的化された。第１のＰＣＲ反応は、プライマー配列番号１および配列番号２（０．５μＭ）、ＢＮＡクランプ配列番号３（２μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、およびＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、ポリメラーゼを活性化するために９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒間、７０℃で２０秒間、および６０℃で３０秒間の１５回サイクル、続いて７２℃で４分間の条件下で行った。
【００８０】
次に、最初のＰＣＲステップからの増幅ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲステップによって定量した。プライマーセット配列番号１および配列番号２（１μＭ）、加水分解プローブ（配列番号４；０．２μＭ）、ならびに１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する混合物に、ＤＮＡ鋳型（１μｌ）を添加した。ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、ポリメラーゼを活性化するために９５℃で５分間、次いで９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、および７２℃で１０秒間の４０回サイクルの条件下で行った。
【００８１】
ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異アッセイの感度の決定
図２Ｂは、ＢＮＡクランプ媒介ＣＴＮＮＢ１アッセイにおける標準の増幅曲線を示す。超音波処理後のＨｅｐ３Ｂ細胞株ＤＮＡの再構成標準におけるＳ３７Ｃ−ｅｘ３プラスミドの様々な希釈物により曲線を作成した。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアを用いて分析を行った。具体的には、定量値および感度を決定するために、コドン３７（３７Ｃｙｓ３）でＴＣＴからＴＧＴへの突然変異を有するＣＴＮＮＢ１遺伝子を含有するプラスミドの連続希釈物を、１０〜１０，０００コピーの範囲で使用した。超音波処理後のＨｅｐ３Ｂ  ＤＮＡ（１０，０００コピー）およびＨｕＧ  ＤＮＡ（１０，０００コピー）を陰性対照として使用した。
【００８２】
ｑＰＣＲ結果を検証するための試料の配列決定
図２Ｃに示されるように、再構成ＷＴ標準におけるＳ３７Ｃ−ｅｘ３プラスミドの希釈物を配列決定して、ＢＮＡが存在する場合の改善された感度と対比させた。具体的には、ＰＣＲ緩衝液中のＢ−Ｃａｔ  Ｆ（５’−ｃｔｇａｔｔｔｇａｔｇｇａｇｔｔｔｔ−３’）およびＢ−ＣＡＴ  Ｒ１（５’−ｇａｇｔｇａａｇｇａｃｔｇａｇａａａａ−３’）プライマーセット（０．５μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ならびにＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ポリメラーゼを活性するために９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒間、５２〜５６℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の４０回サイクル、続いて７２℃で４分間の条件下で、ＰＣＲ反応において単離組織ＤＮＡ（１ｎｇ）を増幅した。ＢＮＡクランプを使用した配列決定のために、ＰＣＲ緩衝液中のＢ−Ｃａｔ  Ｆ３２ＡおよびＲ３７Ａプライマーセット（０．５μＭ）、Ｂ−Ｃａｔ  ＢＮＡ、ｄＮＴＰならびにＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ポリメラーゼを活性化するために９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒間、７０℃で２０秒間、および６０℃で３０秒間の２５回サイクル、続いて７２℃で４分間の条件下で、ＰＣＲ反応において単離組織ＤＮＡ（２ｎｇ）を増幅した。次に、ＰＣＲ緩衝液中のＢ−Ｃａｔ  Ｆ１＿ＡＭＰおよびＲ３７＿ＡＭＰ＿ｔａｇプライマーセット（０．２μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ならびにＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ポリメラーゼを活性化するために９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃３０秒間の５回サイクル、次いで９５℃で３０秒間、および７０℃３０秒間の５回サイクル、続いて７２℃で４分間の条件下で、第２のＰＣＲ反応を行った。
【００８３】
全ての調製物を、製造者の指示に従ってＺｙｍｏ  ＤＮＡ（ＰＣＲ）Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して洗浄し、Ｌｏｎｚａゲルを使用して正しいサイズを確認した。全ての試料を高速真空で乾燥させ、配列決定のためにＮＡＰＣｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＣＨＯＰ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）に提出した。
【００８４】
ＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異アッセイは、ＨＣＣおよび非ＨＣＣ疾患組織を区別する。
【００８５】
ＨＣＣ、肝炎および肝硬変を有する患者の組織生検を試験するために、ｑＰＣＲ  ＣＴＮＮＢ１アッセイを使用した。図３Ａに示されるように、ＨＣＣサブセット（ｎ＝７３）では、１８人の患者がヒトゲノムＤＮＡ標準を超える様々な程度で陽性結果であったが、肝炎（ｎ＝３５）または肝硬変（ｎ＝３５）試料のいずれも陽性結果ではなかった。次に、ホットスポット領域１の突然変異を確認するために、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によってＨＣＣ集団の選択をさらに分析した。図３Ｂに示されるように、選択された２３個の陰性試料のうち、いずれも配列分析後に突然変異を含有しなかった。これらの患者の１人（Ａ４７Ｋ）について、ＣＴＮＮＢ１ホットスポット領域２の突然変異を特定したが、これは設計されたＢＮＡクランプがホットスポット領域１のみを標的化しているため検出されなかった。ｑＰＣＲアッセイによって陽性であると特定された試料については、検証のためにＳａｎｇｅｒ配列決定によって１１個を分析した。１１個の試料のうち４つはＳａｎｇｅｒ配列決定によって確認され、これらはほとんどがＡ５３Ｋを除いてより高い突然変異体コピー数と相関したが、これは検出結果は低かったが配列決定の結果から明らかに突然変異していた。ＢＮＡを増幅反応に添加すると検出が改善され、３つの追加の試料を確認することができた。
【００８６】
図４は、ＳＮＵ３９８ゲノムＤＮＡを使用したＣＴＮＮＢ１アッセイの標準化を示す。ｐＣＴＮＮＢ１＿Ｓ３７Ｃ等のより小さいサイズのプラスミド（３〜５Ｋｂ）は、ヒトゲノムＤＮＡ（３，０００Ｍｂ）における同じ突然変異と比較して、ＰＣＲ増幅のより容易な標的となる。図４Ａに示されるように、この現象を強調するために、我々は、ＳＮＵ３９８株の一部を取り出し、それを超音波処理により断片化し、２００〜５００ｂｐのゲノム断片を生成させた。図４Ｂに示されるように、並べて比較すると、音波処理された細胞株は、無傷ゲノムＤＮＡの７倍過大評価された。さらに、ＳＮＵ３９８細胞株はＳ３７Ｃ変異に関してヘテロ接合であり、これらの観察がプラスミド対照と比較して２倍過小評価されることを意味する。これは、超音波処理後のゲノムＤＮＡが、およそ３倍過大評価され、無傷ゲノムＤＮＡがおよそ２．２倍過小評価されることを意味する。
【００８７】
図５は、未修飾ＲＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）および架橋核酸（ＢＮＡ）を示す化学構造図である。ＬＮＡでは、架橋は２’−Ｏ−４’−メチレン架橋であり、ＢＮＡでは、架橋は２’−Ｏ−４’−アミノエチレン架橋である。
【００８８】
尿中のｃｆＤＮＡからのＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異の検出は、ＨＣＣ腫瘍に由来する。
【００８９】
１３人の患者からの総尿ＤＮＡを単離し、ＬＭＷ  ＤＮＡに分画し、上述のＣＴＮＮＢ１ホットスポット突然変異についてｑＰＣＲにより定量した。ＨＣＣと診断された患者におけるＣＴＮＮＢ１突然変異分析の我々の研究から、我々は、このアッセイで陽性を示した１３人の患者のサブセットを特定した（表４）。これは、このアッセイが、尿中に見られる短い低濃度のＤＮＡに適用可能であることを示した。組織は特定された腫瘍由来の局在化したＤＮＡを含有するが、尿は異種ＤＮＡ断片の源である。ＣＴＮＮＢ１突然変異に関して陽性として尿中に検出されたＤＮＡが肝臓における腫瘍に由来することを示すために、肝臓癌切除後にこれらの患者を追跡調査した。手術の１日以内に尿を検査し、次いで、術後再び追跡調査訪問時に検査した。これらの患者のうち７人において、突然変異体コピー検出が最も高かった患者ＵＡ６１を含め、腫瘍の外科的除去後にＣＴＮＮＢ１突然変異をもはや検出することができなかった。他の６人の患者は、手術後にＣＴＮＮＢ１突然変異について陽性のままであり、６人の全てが５年以内にＨＣＣの再発を有した。興味深いことに、１人の患者が手術後にＣＴＮＮＢ１突然変異について非常に高い結果であり、手術後１年近くで肺転移と診断された。この研究において再発のない患者はわずか４人（３１％）であり、４人は全て手術後にＣＴＮＮＢ１突然変異もなかった。まとめると、このデータは、尿ｃｆＤＮＡから特定されたＣＴＮＮＢ１突然変異がＨＣＣ患者の肝腫瘍に由来することを裏付ける証拠を提供する。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
実施例２：ｈＴＥＲＴプロモーター変異アッセイ。
【００９２】
ｈＴＥＲＴプロモーター突然変異のためのｑＰＣＲアッセイの開発。
【００９３】
ｈＴＥＲＴプロモーター突然変異定量アッセイを、２ステップＢＮＡクランプ媒介ＰＣＲアッセイを用いて開発した。アッセイの概略を図６Ａに示す。このホットスポット領域を標的化するＢＮＡクランプの存在下で、ホットスポット領域１に隣接するプライマーを設計した（ステップ１）。次いで、ステップ１からの増幅産物を、−１２４Ｇ／Ａ突然変異を標的化する加水分解プローブを用いてｑＰＣＲにより分析した（ステップ２）。具体的には、ｈＴＥＲＴ遺伝子（ＮＧ＿００９２６５：４３９２７〜４３９７６）の開始コドンの上流の領域−１２９〜−１１９ｎｔは、非突然変異の完全相補性一致であるＢＮＡクランププライマーで標的化された。第１のＰＣＲ反応は、配列番号１１および配列番号１２（０．２５μＭ）のこのプライマーセット、ＢＮＡクランプ配列番号１３（１μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ＤＭＳＯ（５％）、およびＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で、ポリメラーゼを活性化するために９５℃で５分間、次いで９５℃で３０秒間、７８〜８２℃で２０秒間、および７０〜７４℃で４５秒間の３５回サイクル、続いて７２℃で４分間の条件下で、７２℃で４分行った。次に、最初のＰＣＲステップからの増幅ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲステップによって定量した。ステップ１からのプライマーセット（１μＭ）、加水分解プローブ（配列番号１６；０．２μＭ）、および１×ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を含有する混合物に、ＤＮＡ鋳型（１μｌ）を添加した。ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、ポリメラーゼを活性化するために９５℃で５分間、次いで９５℃で１０秒間、６１℃で１０秒間、および７２℃で１０秒間の４０回サイクルの条件下で行った。
【００９４】
ｈＴＥＲＴプロモーター突然変異アッセイの感度の決定
図６Ｂは、ＢＮＡクランプ媒介ｈＴＥＲＴ突然変異アッセイにおける標準の増幅曲線を示す。再構成された超音波処理後のＨｅｐ３Ｂ細胞株における超音波処理後のＳＮＵ３９８細胞株（既知の−１２４Ｇ／Ａ突然変異）の様々な希釈物により曲線を作成した。具体的には、定量値および感度を決定するために、超音波処理後のＳＮＵ３９８細胞株ＤＮＡ（ｈＴＥＲＴプロモーター突然変異を有する）の連続希釈物を、１０〜１０００コピーの範囲で使用した。超音波処理後のＨｅｐ３Ｂ細胞株ＤＮＡ（１０，０００コピー）を陰性対照として用いた。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ソフトウェアを用いて分析を行った。
【００９５】
ｈＴＥＲＴプロモーター突然変異アッセイは、ＨＣＣおよび非ＨＣＣ疾患組織を区別する
試験した７２個ＨＣＣ組織試料のうち２６個が、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって決定されるように、ｈＴＥＲＴ遺伝子においてＧ／Ａ−１２４プロモーター突然変異を有することが判明した（表５）。これらの試料を全て、ｈＴＥＲＴ−１２４プロモーター突然変異アッセイで試験した。既知のＧ／Ａ−１２４突然変異を有する２６個の試料のうち２１個が、アッセイによって検出された。Ｇ／Ａ−１２４突然変異を有さない４６個の試料については、アッセイによって４０個が陰性であることが判明した。このアッセイで陽性結果であった６つの試料は、突然変異体を富化するのを助けるためにＢＮＡが使用された場合、配列決定によって突然変異を保持することが実際に判明した。これは、いくつかの組織試料中の突然変異は組織中の検出には低すぎるが、ｈＴＥＲＴ突然変異アッセイによって突き止めることができることを示している。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
実施例３：ＨＣＣを非ＨＣＣと区別するための５つのＤＮＡバイオマーカーの評価
表１に記載の研究対象集団における、ＨＣＣと非ＨＣＣを区別するための各バイオマーカーの性能。
【００９８】
図７は、ＨＣＣ（ｎ＝８４）を非ＨＣＣ（９７例の肝炎および１０６例の肝硬変）対象から区別するための、２つの疾患群ＨＣＣおよび非ＨＣＣにおけるバイオマーカー値、ならびに２つの疾患群間のバイオマーカー値間のｐ値のボックスプロットの概要（Ａ〜Ｃ）と、表１に記載の研究対象集団の単変量ＲＯＣ（Ｄ〜Ｆ）とを示す。各マーカーのＲＯＣ曲線下面積が示されている。ＨＣＣの状態と関連して各尿バイオマーカーを評価するためのボックスプロットを作成した。図７Ａ〜７Ｃに示されるように、血清ＡＦＰ、ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、およびＴＰ５３、ならびにｈＴＥＲＴは、非ＨＣＣと比較してＨＣＣにおいて統計的に有意に高いレベルを有していた（ウィルコクソン順位和検定Ｐ＜０．０００１）。次に、ＨＣＣを検出する際の各マーカーの性能を評価するために、データセット全体の個々のバイオマーカーそれぞれについて単変量ロジスティック回帰モデルを作成した。図７Ｄ〜７Ｆに示されるように、ＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＣを計算した。この研究コホートでは、尿バイオマーカーのいずれも血清ＡＦＰ（ＡＵＣ０．８５６１）より良好に個々に機能せず、ＡＵＣは０．５１〜０．７４６１の範囲であった。
【００９９】
ＨＣＣを非ＨＣＣと区別するための尿ＤＮＡバイオマーカーパネルの性能。
【０１００】
図８は、ＨＣＣ（ｎ＝８４）を非ＨＣＣ（９７例の肝炎および１０６例の硬変）対象から区別するためにプロットされた、血清ＡＦＰ、尿ＤＮＡマーカーパネルおよび尿ＤＮＡマーカーパネル＋血清ＡＦＰのＲＯＣ曲線を示す。ＲＯＣ曲線下面積は、括弧内に示されている。垂直線は９０％の特異性でＸ軸と交差する。各試験の感度は、挿入された表の示された特異性について列挙されている。ＡＦＰ単独では、この研究コホート（ｎ＝２８７）において９０％の特異性で６３．１％のＨＣＣを検出することができるが、尿ＤＮＡマーカーパネル（図８では、以下の５つのＤＮＡマーカーを含む「尿ＤＮＡマーカー」と呼ばれ、示されている：ｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、およびＴＰ５３、ｈＴＥＲＴ、ならびにＣＴＮＮＢ１）は、９０％の特異性でＨＣＣの８４．５％を検出することができ、ＡＦＰを有する尿ＤＮＡマーカーパネル（図８では「尿ＤＮＡマーカーＡＦＰ」と呼ばれ、示されている）は、９０％の特異性でＨＣＣの８９．３％を検出することができる。
【０１０１】
実施例４：再発性肝細胞癌を監視するための尿ＤＮＡマーカーの検出。
【０１０２】
この研究では、小規模（ｎ＝１０）盲検前向き研究におけるＭＲＩ画像化と比較して、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、およびｈＴＥＲＴ突然変異の５つの既知のＨＣＣ関連ＤＮＡ修飾、ならびに尿中のｍＧＳＴＰ１およびｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーを検出することによって再発性ＨＣＣの早期検出の例を示す。本研究では、１０人のＨＣＣ患者が、フィラデルフィアのＴｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＬｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙで試験された。治癒的腫瘍アブレーション後、患者をＭＲＩおよび血清ＡＦＰにより再発について監視した。利用可能な場合には、尿検体は予め入手された。５つのＨＣＣ  ＤＮＡバイオマーカーの存在について尿を遡及的に検査した。
【０１０３】
尿採取、保存およびＤＮＡ単離は、実施例１において前述したように、患者からの書面による同意を得て行われた。尿検体からのＤＮＡを単離し、分画して低分子量（ＬＭＷ）尿ＤＮＡ（＜１ｋｂのサイズ）を得た。ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（商標）Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を製造者のガイドラインに従って使用して、ＤＮＡの亜硫酸水素（ＢＳ）処理を行った。前述のように、アッセイキット、ＴＰ５３  ｑＰＣＲキット、ＣＴＮＮＢ１突然変異ｑＰＣＲキット、ｈＴＥＲＴ突然変異ｑＰＣＲキット、ｍＧＳＴＰ１  ｑＰＣＲキット、およびｍＲＡＳＳＦ１Ａ  ｑＰＣＲキット（ＪＢＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｄｏｙｌｅｓｔｏｗｎ、ＰＡ）を使用して、５つのＤＮＡ修飾、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、およびｈＴＥＲＴ突然変異、ＧＳＴＰ１の異常なプロモーターメチル化（ｍＧＳＴＰ１）、ならびにＲＡＳＳＦ１Ａの異常なプロモーターメチル化（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ）を２回定量した。
【０１０４】
図９Ａ〜９Ｅは、１０人の患者からの連続した尿試料中のＤＮＡバイオマーカーレベルを示す。全ての患者を、ＭＲＩおよび血清ＡＦＰによりＨＣＣ再発について監視した。尿試料は、治癒的治療（矢印で示される）後および追跡調査訪問時に、ＨＣＣ患者から予め採取された（利用可能な場合）。再発が検出されたか否かの追跡ＭＲＩ診断により、盲検様式でＨＣＣ  ＤＮＡバイオマーカーについて試料を遡及的に測定した。血清ＡＦＰ（ｎｇ／ｍＬ血清）と共に、５つのＤＮＡバイオマーカー値（尿１ｍｌ当たりのコピー数）、ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、およびｈＴＥＲＴ突然変異、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ（ｍＲＡＳＳＦ１Ａ）ならびにメチル化ＧＳＴＰ１（ｍＧＳＴＰ１）を、ＭＲＩが行われた最後の可能な訪問まで、オフィス訪問時にプロットした。「Ｐｏｓ」は、ＭＲＩによるＨＣＣ再発の検出を表し、「Ｎｅｇ」は、訪問時にＭＲＩによって再発が検出されなかったことを表す。
【０１０５】
具体的には、ＨＣＣ再発の診断のために尿ＤＮＡマーカーの検出を現在利用可能な診断方法（血清ＡＦＰおよびＭＲＩ画像化）と比較するために、尿ＤＮＡマーカー値を盲検的に測定し、各採取時点で血清ＡＦＰと共にプロットした（図９Ａ〜９Ｅの各パネルに示されるように）。要約すると、追跡調査訪問時の治癒的治療後に、ＨＣＣ患者から尿試料を予め採取した（利用可能な場合）。試料をＨＣＣ  ＤＮＡバイオマーカーについて遡及的に分析した。
【０１０６】
尿ＤＮＡマーカーで６ヶ月超監視された１０人の患者のうち、症例＃１〜５は、ＭＲＩによって確認されたＨＣＣの再発を有していた。再発した患者には、ＭＲＩ診断の前または診断時に検査された５つのＤＮＡマーカーのうちの１つ以上が尿中に存在した。１つの再発例（＃５）が進行性ＨＣＣで死亡した。症例６は、研究期間中、追跡調査不可能であった。４人の患者（症例＃７〜１０）は、ＭＲＩによって再発が確認されなかった。彼らの尿ＤＮＡマーカーは検出されなかった（症例＃７）、変動した（症例＃８）、または低レベルで検出された（症例＃９および＃１０）。
【０１０７】
症例＃１  ６８歳の男性が、ＨＣＣの動脈内化学塞栓術（ＴＡＣＥ）を受けた。６年後、ＭＲＩによる腫瘍再発（Ｐｏｓ）を示した。尿検体は、ＭＲＩによる再発確認の６および３ヶ月前に得られた（図９Ａの上のパネル、Ｘ軸上に−６、−３と示されている）。尿検体では、ＴＰ５３突然変異およびｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーは、ＭＲＩ再発検出の６ヶ月前に検出され、３ヶ月前に増加した。残念ながら、ＭＲＩ画像化の時点での尿はない。彼の血清ＡＦＰレベルは、この研究を通じて２ｎｇ／ｍｌであり、腫瘍がＡＦＰ陰性であることを示した（Ｂｒｕｉｘ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ  ２００５）。その後、彼は肝臓移植を受けた。
【０１０８】
症例＃２  ７３歳の男性がＨＣＣのＴＡＣＥを受けた。尿試料は、治療の後および腫瘍が再発した１２ヶ月の追跡期間中に採取した（図９Ａの下のパネルを参照されたい）。最初のＴＡＣＥ治療の３ヶ月後（Ｘ軸上に黒矢印で示される）、ＴＰ５３突然変異およびｍＲＡＳＳＦ１Ａレベルは上昇したが、血清ＡＦＰは、ＴＡＣＥ治療の時点で８８．９ｎｇ／ｍｌから５．３ｎｇ／ｍｌのベースラインレベルに戻った。これらの２つの尿ＤＮＡマーカーは、３ヶ月後の次回訪問時にベースラインまで低下した。ＴＰ５３突然変異および血清ＡＦＰレベルは、ＭＲＩによる再発の検出の約３ヶ月前に再び上昇した。２回目の再発（「Ｐｏｓ」と記されている）の検出の時点で、ＴＰ５３突然変異およびｍＲＡＳＳＦ１Ａレベルの両方が上昇した。血清ＡＦＰレベルは３６．４ｎｇ／ｍｌであり、ベースラインからの上昇を示す。２回目の治療から２ヶ月後、血清ＡＦＰ、ＴＰ５３突然変異、およびｍＲＡＳＳＦ１Ａは全て減少した。この訪問の後、患者は戻らなかった。
【０１０９】
症例＃３  ４ｃｍのＨＣＣを有する５５歳の男性がＴＡＣＥを受けた。腫瘍は５年後に再発し、マイクロ波アブレーション（Ｘ軸上の黒矢印で示される；図９Ｂの上のパネル）で治療された。３ヶ月後に追跡調査の予定中に再び腫瘍が再発した（「Ｐｏｓ」と記される；図９Ｂの上部パネル）。最初の再発前の２回の訪問時の尿ＤＮＡマーカーは、検出レベル未満であった。しかしながら、ｍＧＳＴＰ１は、マイクロ波治療の１ヶ月後に上昇した。興味深いことに、治療の３ヶ月後に２回目の腫瘍（１．６ｃｍ）が再発した際、ｍＧＳＴＰ１は検出不可能であり、ＴＰ５３突然変異は上昇した。これは、ＨＣＣの異質性を示し得る。血清ＡＦＰレベルは、研究期間中２０ｎｇ／ｍＬ未満であったことに留意されたい。
【０１１０】
症例＃４  ＨＣＣと診断され、ＡＦＰが上昇した５４歳の男性。診断およびマイクロ波アブレーションによる治療時に尿を採取した（図９Ｂの下のパネル）。ＤＮＡマーカーｍＧＳＴＰ１は、ＨＣＣ診断時に尿中で極めて上昇した。治療の２ヶ月後、尿ｍＧＳＴＰ１および血清ＡＦＰレベルは正常範囲に減少したが、尿ｍＲＡＳＳＦ１Ａは上昇した。これは、マイクロ波治療後のアポトーシス腫瘍細胞に起因し得る。３ヶ月後の次回の訪問時に、ｍＲＡＳＳＦ１Ａは減少したが検出可能なままであり、一方他の２つのＤＮＡマーカー、ＴＰ５３突然変異およびｍＧＳＴＰ１は増加した。４ヶ月後、ＭＲＩは再発性の腫瘍（固形病変）を検出した。残念ながら、尿は「−２」および診断「Ｐｏｓ」の時点で採取されなかったため、これらの時点で利用可能なマーカーデータは存在しない。
【０１１１】
症例＃５  ５６歳の男性がＨＣＣのＴＡＣＥを受けた。治療日および１ヶ月後の追跡調査訪問で尿を採取した（図９Ｃの上のパネル）。ＴＡＣＥ治療日に尿中にｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーが検出され、ＴＡＣＥ治療日に尿中にｍＲＡＳＳＦ１ＡおよびｈＴＥＲＴ突然変異のレベルが検出され、ｍＲＡＳＳＦ１ＡおよびｈＴＥＲＴ突然変異のレベルは治療後１ヶ月で減少した。同様に、血清ＡＦＰレベルは３７７０ｎｇ／ｍｌから３２３ｎｇ／ｍｌにほぼ１０分の１に低下した。しかしながら、４ヶ月後、ＭＲＩはＨＣＣ再発を検出し、血清ＡＦＰレベルを上昇させた（１５２２ｎｇ／ｍｌ）。患者はＣＴＮＮＢ１突然変異およびｍＲＡＳＳＦ１Ａが検出可能な活性型ＨＣＣを維持し続けた。別のＴＡＣＥ治療を受けたにもかかわらず、患者は８ヶ月後に亡くなった。
【０１１２】
症例＃６  ＨＣＣを有する５６歳の男性がＴＡＣＥを受けた。尿試料は、ＴＡＣＥから３年および４年後に採取された。ｍＲＡＳＳＦ１Ａは３年後に上昇し、ＴＡＣＥ後４年で陰性であることが判明した。患者は再発を有さなかった（図９Ｃの下のパネル）。ＡＦＰは正常範囲内であった。患者は追跡調査不可能であった。
【０１１３】
症例＃７  ＨＣＣを有する５８歳の男性がＴＡＣＥを受け、続いて高周波アブレーション（ＲＦＡ）を受けた。ＲＦＡの１年後に尿採取を開始した。ＲＦＡの２年後、患者に再発がないため、バイオマーカーは検出されなかった（図９Ｄの上部パネル）。
【０１１４】
症例＃８  ＨＣＣを有する６２歳の男性がＲＦＡを受けた。治療日およびその後３ヶ月ごとに９ヶ月間尿試料を採取した（図９Ｄの下部パネル）。血清ＡＦＰ、ＴＰ５３突然変異、およびｍＲＡＳＳＦ１Ａレベルは全て、ＲＦＡの日に上昇し、治療の３および６ヶ月後に検出限界未満まで減少した。ＭＲＩでは再発はなかった。
【０１１５】
症例＃９  ２７歳の女性が２０歳でＨＣＣと診断され、元の腫瘍を３年間で３回ＴＡＣＥで治療した。最後のＴＡＣＥの４年後から６ヶ月ごとに尿を採取した。ＴＰ５３突然変異は、第２回目の訪問で採取された尿中に検出され、減少したが、図９Ｅの上のパネルに示されるように、３回目の尿試料において検出可能なままであった。ＭＲＩは肝臓における腫瘤を示唆したが、その腫瘤は再発性ＨＣＣとは確認されなかった。血清ＡＦＰレベルは、研究期間中２０ｎｇ／ｍＬ未満であった。患者は、ＨＣＣの診断以来、抗ウイルス治療を受けている。
【０１１６】
症例＃１０  ＨＣＣを有する６６歳の男性がＲＦＡを受け、その後切除を受けた。彼は過去１０年間再発していない。切除後８年（−１８）および９年（−６）に２つの尿試料を採取した（図１０Ｅの下部パネル）。血清ＡＦＰは正常であり、ＴＰ５３突然変異およびｍＲＡＳＳＦ１Ａマーカーが上昇したＭＲＩの６ヶ月前まで、ＤＮＡマーカーは検出されなかった（図９Ｅの下のパネル）。ＴＰ５３突然変異はベースラインに戻り、ｍＲＡＳＳＦ１Ａレベルは３ヶ月後に低下した（−３）。ＭＲＩ検査の時点では、訪問からＨＣＣ再発は検出されなかった。
【０１１７】
この研究は、小規模な１０例の研究において、ＨＣＣ再発の早期検出のために血清ＡＦＰと組み合わせて尿ＤＮＡマーカーを用いることの適用性を実証している。ＨＣＣ再発は予後不良の主な要因であることが知られている。この小規模な１０例の研究では、ＭＲＩは１０人の患者のうち５人（症例１〜５）に再発が確認された。有望にも、研究に残っている４人の再発患者（症例１〜４）の全てについて、尿ＤＮＡマーカーは、ＭＲＩによる確認の９ヶ月前に尿試料中で上昇することが判明した。
【０１１８】
これは長期的な１０例の小規模研究であるが、ＨＣＣ再発の管理およびＨＣＣ再発の重要な特徴のためのこれらの尿ＤＮＡマーカーの使用が実証されている。まず、残りの全ての再発症例（症例＃１〜４）について、ＭＲＩ画像化による診断の前または診断時にＤＮＡマーカーが上昇した。ＭＲＩ／ＣＴ画像化は、再発性ＨＣＣの診断のための基準であるが、以前に治療された領域（特に局所的アブレーションの後）における早期再発を検出することが困難である。これは、ＤＮＡマーカーがＭＲＩ診断よりも早期に尿中に見出された理由を説明し得る。第２に、他のがんと同様に、ＨＣＣはゲノムの疾患である。ＨＣＣの遺伝的要因の検出は、ＨＣＣ再発をモニターするための高感度かつ早期の検出を提供し得るだけでなく、患者管理を支援するためのＨＣＣ遺伝情報を提供し得る。さらに、尿の採取は潜在的に自宅で行い、検査のために公認の検査室に送ることができるため、尿のスクリーニングは医師の診察を必要としない一方で、より良好なコンプライアンスをもたらし得る。最後に、尿中のＤＮＡバイオマーカーのレベルはまた、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するがん治療の有効性を測定するために有用となり得る。我々は、尿中に見られる循環腫瘍ＤＮＡが、主にアポトーシス腫瘍細胞に由来することを示した。アポトーシスを誘発する治療は、血液中に堆積し、尿中に分泌される腫瘍由来ＤＮＡの量を増加させるはずである。これは、治療後にｍＲＡＳＳＦ１Ａ、ｍＧＳＴＰ１、ＣＴＮＮＢ１突然変異およびｈＴＥＲＴ突然変異マーカーの上昇が検出された＃２、＃３、＃４および＃５の症例の状況となり得、尿ＤＮＡマーカーを使用して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する療法の有効性を監視する可能性を示唆している。
【０１１９】
最後に、ＨＣＣはしばしばマルチクローンであると認識されている。興味深いことに、再発症例＃３において、ｍＧＳＴＰ１レベルは尿中で検出不可能に戻り、一方ＴＰ５３突然変異は、１．６ｃｍの病変のＭＲＩ報告と共に３ヶ月後に採取された尿中で上昇した。我々は、ＴＰ５３突然変異クローンの上昇が、以前に治療された腫瘍結節とは異なり、治療に応答しなかったか、または腫瘍進化に由来していると推測している。
【０１２０】
尿ＤＮＡマーカーのレベルは、採取時に患者の水分補給を含むいくつかの理由により変動する可能性があることに留意することが重要である（これは、尿中に希釈されたＤＮＡをもたらし得る）。したがって、内部対照の使用は、尿マーカー値のカットオフを適切に設定するために重要である。
【０１２１】
結論として、我々は、尿ＤＮＡバイオマーカー試験がＨＣＣ再発の早期検出に使用可能であり、画像化技術の固有の限界を克服することができ、したがってＨＣＣ再発を監視するための極めて高感度のツールを提供することができることを実証した。
【０１２２】
参考文献
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１７）．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ”．
Ａｎｋｅｒ，Ｐ．，Ｊ．Ｌｙａｕｔｅｙ，Ｃ．Ｌｅｄｅｒｒｅｙ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｔｒｏｕｎ（２００１）．”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｏｒ  ｓｅｒｕｍ．”Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３１３：１４３−１４６．
Ｂｒｕｉｘ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓｈｅｒｍａｎ（２００５）．”Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４２（５）：１２０８−１２３６．
Ｂｒｕｉｘ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓｈｅｒｍａｎ（２０１１）．”Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．”Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５３（３）：１０２０−１０２２．
Ｃｈａｎ，Ａ．Ｋ．Ｃ．，Ｒ．Ｗ．Ｋ．Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｙ．Ｍ．Ｄ．Ｌｏ（２００３）．”Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ，ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ：ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．”Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０（２）：１２２−１３０．
Ｄｉｅｈｌ，Ｆ．，Ｋ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．Ａ．Ｃｈｏｔｉ，Ｋ．Ｒｏｍａｎｓ，Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｍ．Ｌｉ，Ｋ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｎ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｌ．Ｓｏｋｏｌｌ，Ｓ．Ａ．Ｓｚａｂｏ，Ｋ．Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ａ．Ｄｉａｚ  Ｊｒ（２００８）．”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ＤＮＡ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｔｕｍｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４（９）：９８５−９９０．
Ｇｅｒｓｚｔｅｎ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｗａｎｇ（２００８）．Ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４５：９４９−９５２．
Ｈａｒｄｅｒ，Ｊ．，Ｏ．Ｇ．Ｏｐｉｔｚ，Ｊ．Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ，Ｍ．Ｏｌｓｃｈｅｗｓｋｉ，Ｈ．Ｅ．Ｂｌｕｍ，Ｓ．Ｎｏｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｈ．Ｕｓａｄｅｌ（２００８）．”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｉｖｅｒ．”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １２２（１２）：２８００−２８０４．
Ｈｏｗｌａｄｅｒ  Ｎ，Ｎ．Ａ．，Ｋｒａｐｃｈｏ  Ｍ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｄ，Ｂｉｓｈｏｐ  Ｋ，Ａｌｔｅｋｒｕｓｅ  ＳＦ，Ｋｏｓａｒｙ  ＣＬ，Ｙｕ  Ｍ，Ｒｕｈｌ  Ｊ，Ｔａｔａｌｏｖｉｃｈ  Ｚ，Ｍａｒｉｏｔｔｏ  Ａ，Ｌｅｗｉｓ  ＤＲ，Ｃｈｅｎ  ＨＳ，Ｆｅｕｅｒ  ＥＪ，Ｃｒｏｎｉｎ  ＫＡ（ｅｄｓ）（２０１６）．”ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１３，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２０１３／，ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１５  ＳＥＥＲ  ｄａｔａ  ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ，ｐｏｓｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＳＥＥＲ  ｗｅｂ  ｓｉｔｅ，Ａｐｒｉｌ  ２０１６．”．
Ｈｕｎｇ，Ｉ．Ｆ．−Ｎ．，Ｄ．Ｋ．−Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｒ．Ｔ．−Ｐ．Ｐｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．−Ｔ．Ｆｏｎｇ，Ａ．Ｈ．−Ｗ．Ｃｈｕｉ，Ｗ．−Ｋ．Ｓｅｔｏ，Ｊ．Ｙ．−Ｙ．Ｆｕｎｇ，Ａ．Ｃ．−Ｙ．Ｃｈａｎ，Ｊ．Ｃ．−Ｈ．Ｙｕｅｎ，Ｒ．Ｔｉｕ，Ｏ．Ｃｈｏｉ，Ｃ．−Ｌ．Ｌａｉ  ａｎｄ  Ｍ．−Ｆ．Ｙｕｅｎ（２０１６）．”Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔ−Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １１（２）：ｅ０１４８４９３．
Ｋａｍｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｋ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｈ．Ｙｏｋｏｏ，Ｈ．Ｋａｍａｃｈｉ，Ｍ．Ｔａｈａｒａ，Ｔ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．Ｓｈｉｍａｍｕｒａ，Ｈ．Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｍ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｔｏｄｏ（２００９）．”Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｌａｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．”Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６（６）：１５６０−１５７１．
Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．，Ｖ．Ｄｈｉｌｌｏｎ，Ｓ．Ｊａｉｎ，Ｔ．Ｔ．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｔ．Ｈｕ，Ｙ．Ｊ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｗ．Ｓｏｎｇ，Ｌ．Ｙｕ，Ｔ．Ｍ．Ｂｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｙ．Ｈ．Ｓｕ（２０１１）．”Ａ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｌａｍｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐ５３  ｃｏｄｏｎ  ２４９  ｈｏｔｓｐｏｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  １３（５）：４７４−４８４．＿
Ｍｉｎａｍｉ，Ｙ．ａｎｄ  Ｍ．Ｋｕｄｏ（２０１５）．”Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｎｏｎｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｏｎｔｒａｓｔ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＵＳ，ＣＴ，ａｎｄ  ＭＲＩ．”Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ４（２）：１０６−１１４．
Ｍｉｎａｍｉ，Ｙ．，Ｎ．Ｎｉｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｋｕｄｏ（２０１４）．”Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＲＦＡ  ｆｏｒ  ＨＣＣ：Ｃｏｎｔｒａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＵＳ，ＣＴ  ａｎｄ  ＭＲＩ．”Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ：ＷＪＧ  ２０（１５）：４１６０−４１６６．
Ｎａｕｌｔ，Ｊ．Ｃ．，Ｍ．Ｍａｌｌｅｔ，Ｃ．Ｐｉｌａｔｉ，Ｊ．Ｃａｌｄｅｒａｒｏ，Ｐ．Ｂｉｏｕｌａｃ−Ｓａｇｅ，Ｃ．Ｌａｕｒｅｎｔ，Ａ．Ｌａｕｒｅｎｔ，Ｄ．Ｃｈｅｒｑｕｉ，Ｃ．Ｂａｌａｂａｕｄ  ａｎｄＪ．Ｚｕｃｍａｎ−Ｒｏｓｓｉ（２０１３）．”Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．”Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４．
Ｎｅｗｅｌｌ，Ｐ．，Ｓ．Ｔｏｆｆａｎｉｎ，Ａ．Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，Ｄ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇ，Ｂ．Ｍｉｎｇｕｅｚ，Ｌ．Ｃａｂｅｌｌｏｓ，Ｒ．Ｓａｖｉｃ，Ｙ．Ｈｏｓｈｉｄａ，Ｋ．Ｈ．Ｌｉｍ，Ｐ．Ｍｅｌｇａｒ−Ｌｅｓｍｅｓ，Ｓ．Ｙｅａ，Ｊ．Ｐｅｉｘ，Ｋ．Ｄｅｎｉｚ，Ｍ．Ｉ．Ｆｉｅｌ，Ｓ．Ｔｈｕｎｇ，Ｃ．Ａｌｓｉｎｅｔ，Ｖ．Ｔｏｖａｒ，Ｖ．Ｍａｚｚａｆｅｒｒｏ，Ｊ．Ｂｒｕｉｘ，Ｓ．Ｒｏａｙａｉｅ，Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｓ．Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄＪ．Ｍ．Ｌｌｏｖｅｔ（２００９）．”Ｒａｓ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  ａｎｄ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１（４）：７２５−７３３．
Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｔ．Ｎａｇａｓａｋａ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．Ｉｋａｉ，Ｃ．Ｒ．Ｂｏｌａｎｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｇｏｅｌ（２００８）．”Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ，ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４７：９０８−９１８．
Ｎｏｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｔ．Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｔｏ（２００７）．”Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ｃｌｏｎａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９７（９）：１２６０，１２６５．
Ｐｅｐｅ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（２０００）．”Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ．”Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １：１２３−１４０．
Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍ．（２００８）．”Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５９（１９）：２０４５−２０４７．
Ｓｉｍａｒｄ，Ｅ．Ｐ．，Ｅ．Ｍ．Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｓｉｅｇｅｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｊｅｍａｌ（２０１２）．”Ｃａｎｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：１９９９  ｔｈｒｏｕｇｈ  ２００８．”ＣＡ：Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ６２（２）：１１８−１２８．
Ｓｏｎｇ，Ｂ．Ｐ．，Ｓ．Ｊａｉｎ，Ｓ．Ｙ．Ｌｉｎ，Ｑ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｂｌｏｃｋ，Ｗ．Ｓｏｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｙ．Ｈ．Ｓｕ（２０１２）．”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｖｉｍｅｎｔｉｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  １４（２）：１１２−１１９．
Ｓｕ，Ｙ．Ｈ．，Ｊ．Ｓｏｎｇ，Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｂｌｏｃｋ（２００８）．”Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  ＤＮＡ  ｂｙ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｅｄ  Ｋ−ｒａｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ．”Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １１３７（１）：８２−９１．
Ｓｕ，Ｙ．Ｈ．，Ｍ．Ｗａｎｇ，Ｂ．Ａｉａｍｋｉｔｓｕｍｒｉｔ，Ｄ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｂｌｏｃｋ（２００５）．”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｋ−ｒａｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｍａｒｋ  １（２−３）：１７７−１８２．
Ｓｕ，Ｙ．Ｈ．，Ｍ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ａ．Ｎｇ，Ｈ．Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ，Ｓ．Ｕｍａｎｓｋｙ，Ｓ．Ｓｙｎｇａｌ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｂｌｏｃｋ（２００４）．”Ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｓｍａｌｌ，１５０  ｔｏ  ２５０  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｉｚｅｄ，ｓｏｌｕｂｌｅ  ＤＮＡ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｂｅ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ６（２）：１０１−１０７．
Ｓｕ，Ｙ．Ｈ．，Ｍ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｎｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｂｌｏｃｋ（２００８）．”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ  Ｋ−ｒａｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ，ｐｌａｓｍａ，ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｒ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｓ．”Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１３７：１９７−２０６．
Ｗｉｌｌａｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｈ．Ｋ．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｓ．Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ  ａｎｄＪ．Ａ．Ｍａｒｒｅｒｏ（２００８）．”ＭＲ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｒｈｏｔｉｃ  Ｌｉｖｅｒ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ．”Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２４７（２）：３１１−３３０．
Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｍ．Ｇｕｏ，Ｊ．Ｇ．Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｐ．Ｃｌａｒｋ（２００３）．”Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６３（３）：１１０１−１１０７．
Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｙ．Ｙｕ，Ｆ．Ｘｕ，Ａ．Ｂｅｒｃｈｕｃｋ，Ｃ．ｖａｎ  Ｈａａｆｔｅｎ−Ｄａｙ，Ｌ．Ｊ．Ｈａｖｒｉｌｅｓｋｙ，Ｈ．Ｗ．Ａ．ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，Ａ．Ｇ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ，Ｒ．Ｐ．Ｗｏｏｌａｓ，Ｉ．Ｊ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｓ．Ｓｋａｔｅｓ，Ｄ．Ｗ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｂａｓｔ  Ｊｒ（２００７）．”Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｒｕｍ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｇｅ  Ｉ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １０７（３）：５２６−５３１．
【図１】
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【図２Ａ】
2019514372.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2019514372.tif 000020
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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