(57)【要約】  本明細書には、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物及び製剤が開示される。また、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡを含むベクターからＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質を作製する方法、並びにＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡを含むベクター及びＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質で細胞を形質導入する方法も開示される。また、融合タンパク質の全身投与又は静脈内投与によってＣＤＫＬ５欠損症を治療するためのＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質の使用も開示される。【選択図】図７０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身投与される、且つ
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む、ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントの治療における使用のための融合タンパク質。
【請求項２】
Ｉｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項３】
レポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１又は２に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項４】
タンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項６】
対照と比較して対象の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項７】
対照と比較して対象の脳内の神経細胞アポトーシスを低減する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項８】
静脈内投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントの治療における使用のための医薬製剤であって、薬学的に許容可能な担体と、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質の有効量とを含む医薬製剤。
【請求項１０】
全身投与される、且つ
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む、ＣＤＫＬ５欠損症を有する患者の視覚野内の神経活動を増加させることにおける使用のための融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｉｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１０に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１２】
レポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１０又は１１に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１３】
タンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１５】
対照と比較して対象の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させる、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１６】
対照と比較して対象の脳内の神経細胞アポトーシスを低減する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１７】
静脈内投与される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質。
【請求項１８】
ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントを有する患者の視覚野内の神経活動を増加させることにおける使用のための医薬製剤であって、薬学的に許容可能な担体と、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質の有効量とを含む医薬製剤。
【請求項１９】
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む融合タンパク質をそれを必要としている患者に全身投与することを含む、ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントを治療する方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質がＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質がレポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記融合タンパク質がタンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記融合タンパク質が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質の全身投与が、対照と比較して対象の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させる、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質の全身投与が、対照と比較して対象の脳内の神経細胞アポトーシスを低減する、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む融合タンパク質をそれを必要としている患者に全身投与することを含む、ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントを有する患者の視覚野内の神経活動を増加させる方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質がＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記融合タンパク質がレポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質がタンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質の全身投与が、対照と比較して対象の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させる、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質の全身投与が、対照と比較して対象の脳内の神経細胞アポトーシスを低減する、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む融合タンパク質をそれを必要としている患者に全身投与することを含む、ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントを有する患者の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させる方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質がＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質がレポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記融合タンパク質がタンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記融合タンパク質が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む融合タンパク質をそれを必要としている患者に全身投与することを含む、ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントを有する患者の脳内の神経細胞アポトーシスを低減する方法。
【請求項４２】
前記融合タンパク質がＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記融合タンパク質がレポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記融合タンパク質がタンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列であって、配列番号２又は配列番号１６と約９８％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列；及び
ＴＡＴκポリペプチド配列であって、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列（前記ＴＡＴκポリペプチドは前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される）
を含む融合タンパク質をそれを必要としている患者に全身投与することを含む、ＣＤＫＬ５欠損症又はレット症候群バリアントを有する患者の運動機能を改善する方法。
【請求項４８】
前記融合タンパク質がＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを更に含み、前記Ｉｇｋ鎖リーダー配列が前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記融合タンパク質がレポータータンパク質ポリペプチドを更に含み、前記レポータータンパク質ポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記融合タンパク質がタンパク質タグポリペプチドを更に含み、前記タンパク質タグポリペプチドが前記ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合される、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記融合タンパク質が、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４によるポリペプチド配列を有する、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記融合タンパク質が静脈内投与される、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
実質的に本明細書に記載されるとおりのポリヌクレオチド。
【請求項５４】
実質的に本明細書に記載されるとおりのポリペプチド。
【請求項５５】
実質的に本明細書に記載されるとおりのベクター。
【請求項５６】
実質的に本明細書に記載されるとおりの医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）変異／欠損症、別名非典型的レット症候群は、世界中で１７，０００〜３８，０００例の女児出生につき１例起こる消耗性の出生後神経障害である。発生率は低いが、男児にも発症する。この障害は出身民族又は人種に限定されない。ＣＤＫＬ５変異／欠損症の症状は軽度から重度まで様々であり、早発性発作、認知障害、筋緊張低下並びに自律神経障害、睡眠障害及び胃腸障害として現れる。疾患の症状は、機能性ＣＤＫＬ５タンパク質の欠損によって生じる。
【０００２】
個体におけるＸ連鎖性ＣＤＫＬ５遺伝子の突然変異又はＣＤＫＬ５タンパク質の欠損は、非典型的又は先天性レット症候群の発症に関係があるとされる。Ｂｅｒｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，２８１：３２０４８−３２０  ５６、Ｓｃａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎ．，２００５．４２：１０３−１０７、及びＫａｌｓｃｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００３．７２：１４０１−１４１１を参照のこと。ＣＤＫＬ５遺伝子はＸ染色体上にあり、正常な脳の発達及び機能に不可欠なタンパク質をコードする。ＣＤＫＬ５タンパク質は、神経細胞に複数の効果を及ぼす多機能タンパク質である。例えば、ＣＤＫＬ５はキナーゼとして働き、ＭｅＣＰ２をリン酸化し得る。ＭｅＣＰ２は非典型でないレット症候群（ｎｏｎ−ａｔｙｐｉｃａｌ  Ｒｅｔｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の標的である。ＣＤＫＬ５変異又は欠損症に罹患した女児は、典型的には通常の出生前既往歴；周産期における被刺激性及び嗜眠状態；生後５ヵ月よりも前に発症する早発性てんかん、レット症候群様の特徴、例えば、頭部成長の減速、常同症、自発的な手の使用が少ない乃至全くない、及び睡眠障害、並びにアイコンタクトの困難及び事実上の言語の欠如を伴う重度精神遅滞を有する。Ｂａｈｉ−Ｂｕｉｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｅｎｖｅｎｕ．２０１２．Ｍｏｌ．Ｓｙｎｄｒｏｍｏｌ．２：１３７−１５２を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＣＤＫＬ５変異／欠損症に対する現行の治療は、主として症状の管理に重点が置かれている。しかしながら、現在、ＣＤＫＬ５変異又は欠損症患者の神経学的転帰を改善する治療はない。従って、ＣＤＫＬ５変異及び欠損症を治療するための療法の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書には、配列番号２又は配列番号１６と約５０％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列と、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列とを有する融合タンパク質であって、ＴＡＴκポリペプチドがＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している融合タンパク質が記載される。一部の態様において、ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列は配列番号２又は配列番号１６と少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。一部の態様において、本融合タンパク質はＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを含むことができ、ここでＩｇκ鎖リーダー配列はＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している。更なる態様において、本融合タンパク質はレポータータンパク質ポリペプチドを含むことができ、ここでレポータータンパク質ポリペプチドはＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している。他の態様において、本融合タンパク質はタンパク質タグポリペプチドを含むことができ、ここでタンパク質タグポリペプチドはＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している。一部の態様において、本融合タンパク質は、対照と比較して対象の脳における神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させることができる。他の態様において、本融合タンパク質は、対照と比較して対象の脳におけるニューロンアポトーシスを減少させることができる。一部の態様において、本融合タンパク質は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４に従うポリペプチド配列を有する。
【０００５】
また、本明細書には、配列番号２又は配列番号１６と約５０％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列と、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列とを有する融合タンパク質であって、ＴＡＴκポリペプチドがＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している融合タンパク質の治療有効量と、薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬製剤も提供される。一部の態様において、ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列は配列番号２又は配列番号１６と少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。一部の態様において、本医薬製剤中に含まれる融合タンパク質はＩｇｋ鎖リーダー配列ポリペプチドを含むことができ、ここでＩｇｋ鎖リーダー配列はＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している。一部の態様において、本医薬製剤中に含まれる融合タンパク質はレポータータンパク質ポリペプチドを含むことができ、ここでレポータータンパク質ポリペプチドはＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している。更なる態様において、本医薬製剤中に含まれる融合タンパク質は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４に従うポリペプチド配列を有することができる。更なる態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象におけるＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントの１つ以上の症状を治療することができる。更なる態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象の脳における神経突起成長、伸長、分枝数、又は分枝密度を増加させることができる。他の態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象の脳におけるニューロンアポトーシスを減少させることができる。更なる態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象における運動機能を改善することができる。一部の態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象における認知機能を改善することができる。更なる態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象の視覚野内の神経活動を増加させることができる。
【０００６】
本明細書には、配列番号２又は配列番号１６と約５０％〜１００％の配列同一性を有するＣＤＫＬ５ポリペプチド配列と、配列番号４と約９０％〜約１００％の配列同一性を有するＴＡＴκポリペプチド配列とを含むある量の融合タンパク質であって、ＴＡＴκポリペプチドがＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合している融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬製剤の治療有効量を、それを必要としている対象に投与する方法が提供される。一部の態様において、それを必要としている対象は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントに罹っているか、又はそれに罹っている疑いがある。一部の態様において、ＣＤＫＬ５ポリペプチド配列は配列番号２又は配列番号１６と少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の配列同一性を有する。医薬製剤の治療有効量を投与する方法の他の態様において、融合タンパク質の治療有効量は、対照と比較して対象におけるＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントの１つ以上の症状を治療することができる。
【０００７】
また、本明細書には、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤を全身投与することによる、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントを治療するための融合タンパク質の使用も提供される。一部の態様において、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤は静脈内投与される。
【０００８】
また、本明細書には、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤を全身投与することによる、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントを有する患者の視覚野内の神経活動を増加させるための融合タンパク質の使用も提供される。一部の態様において、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤は静脈内投与される。
【０００９】
また、本明細書には、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤を全身投与することによる、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントを有する患者の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させるための融合タンパク質の使用も提供される。一部の態様において、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤は静脈内投与される。
【００１０】
また、本明細書には、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤を全身投与することによる、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントを有する患者の脳内の神経細胞アポトーシスを低減するための融合タンパク質の使用も提供される。一部の態様において、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤は静脈内投与される。
【００１１】
また、本明細書には、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤を全身投与することによる、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、又はレット症候群バリアントを有する患者の運動機能を改善するための融合タンパク質の使用も提供される。一部の態様において、融合タンパク質又は融合タンパク質を含む医薬製剤は静脈内投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を作製する方法の一実施形態を示し、ここでＣＤＫＬ５融合タンパク質は培養細胞によって作製され、周囲の培養培地中に分泌される。
【図２】図２は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を作製する方法の一実施形態を示し、ここでＣＤＫＬ５融合タンパク質は周囲の細胞培養培地中に分泌されない。
【図３】図３は、形質導入又はトランスフェクトした（具体的に図示せず）自己細胞によって対象にＣＤＫＬ５融合タンパク質を送達する方法の一実施形態を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、トランスフェクトＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞におけるＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質発現のウエスタンブロット分析結果を示す。ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質にｅＧＦＰタンパク質タグを付加して、抗ＧＦＰ抗体を使用したウエスタンブロット分析を可能にした。図４Ａは、トランスフェクトＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞からの細胞抽出物におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質発現を示す。図４Ｂは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５をトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の２０倍濃縮細胞培養培地からのＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質精製を示す。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ及び図５Ｂは、ＴＡＴ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質がＣＤＫＬ５自己リン酸化活性を保持していることを実証するキナーゼ活性アッセイ（図５Ａ）の結果を示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質はＮｉ−ＮＴＡ樹脂上の培養培地から精製した。
【図６】図６は、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の一実施形態の形質導入効率に対するインキュベーション時間の効果を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ及び図７Ｂは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処理したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（図７Ｂ）におけるＣＤＫＬ５の局在を示す。図７Ａ及び図７Ｂは、対照（図７Ａ）（左側のパネル）と比較したときのＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質によるＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の形質導入効率を示す。免疫検出は抗ＧＦＰ抗体を使用して行い、細胞はＤＡＰＩで対比染色した。白色の矢印は形質導入されたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を指す。
【図８】図８は、精製ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質で３０分間処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５形質導入（ｔｒａｓｄｕｃｔｉｏｎ）を実証する共焦点顕微鏡法による一連の１２枚の画像（１〜１２）を示す画像である。Ｚスタックサイズは０．４μｍであった。図８は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の形質導入効率を実証する。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ及び図９Ｂは、神経芽腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）における形質導入されたＣＤＫＬ５が細胞増殖に及ぼす効果を示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処理した細胞（図９Ｂ）は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（対照）で処理した細胞（図９Ａ）と比較して増殖が低下したことが観察された。白色の矢印は有糸分裂核を指す。
【図１０】図１０は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の分裂指数を表すグラフを示す。ｙ軸は、％ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ単位で表される有糸分裂細胞／総細胞を示す。データは平均値±Ｓ．Ｅ．として示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｔ検定）。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｂは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処理した（対照）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図１１Ａ）及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（図１１Ｂ）の代表的な位相差像を表す画像である。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞では、対照細胞と比較して神経突起成長が大きいことが観察された。
【図１２】図１２は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ融合タンパク質（対照）、又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の神経突起伸長の定量を表すグラフを示す。データは平均値±Ｓ．Ｅ．として示す。＊Ｐ＜０．０５（ｔ検定）。ｙ軸は神経突起長／細胞をミクロン単位で示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ〜図１３Ｂは、４５日齢雄ＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）（図１３Ａ）及びＣＤＫＬ５ノックアウト（ＫＯ）雄マウス（−／Ｙ）（これらは半接合体である）（図１３Ｂ）におけるダブルコルチン（ＤＣＸ）の免疫組織化学によって示されるとおりの樹状形態及び新生海馬顆粒細胞数を表す画像を示す。スケールバー＝５０μｍ。略語：ＧＲ、顆粒層；Ｈ、門。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ〜図１４Ｂは、雌野生型（＋／＋）（図１４Ａ）ニューロン培養物と比較したときの２日齢ホモ接合体雌ＣＤＫＬ５ノックアウトマウス（−／−）（図１４Ｂ）に由来するニューロン培養物における新生ニューロン（赤色の細胞）の生成及び成熟の低下を実証する分化したニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）の二重蛍光像を示す。ニューロン表現型を有する細胞はβ−チューブリンＩＩＩ（赤色）に関して免疫陽性であり、アストロサイト表現型を有する細胞はＧＦＡＰ（緑色）に関して免疫陽性である。細胞核はヘキスト色素（青色）を使用して染色した。スケールバー＝２５μｍ。
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜図１５Ｃは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（図１５Ｂ）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５（図１５Ｃ）で形質導入した２日齢ホモ接合体ＣＤＫＬ５ノックアウトマウス（−／−）由来の細胞から作成したニューロン前駆体培養物（図１５Ｂ及び図１５Ｃ）、並びに野生型マウス（＋／＋）からのニューロン前駆体培養物（図１５Ａ）の代表的な画像を示す。スケールバー＝２０μｍ。
【図１６】図１６は、新生仔（２日齢）野生型雌（＋／＋）及びホモ接合体ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／−）マウス由来のニューロン前駆体培養物中における分化したニューロン（β−チューブリンＩＩＩ陽性ニューロン）の総神経突起長によって測定したときの神経成熟の定量を表すグラフを示す。培養して分化させた細胞は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５のいずれかで処理した。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０１  対未処理ＫＯ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図１７Ａ−１７Ｆ】図１７Ａ〜図１７Ｆは、濃縮培養培地（媒体）（図１７Ａ及び図１７Ｄ）、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（図１７Ｂ及び図１７Ｅ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５（図１７Ｃ及び図１７Ｆ）で全身処置（１回の単回皮下注射）したマウス（生後７日）の脳におけるＣＤＫＬ５の免疫検出を表す画像を示す。試料は注射後４時間で採取した。図１７Ｄ〜図１７Ｆは、それぞれ図１７Ａ〜図１７Ｃの点線で囲んだ範囲の拡大像を示す。脳におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰの局在は、抗ＧＦＰ抗体（赤色）を使用した免疫組織化学によって評価した。画像は感覚運動皮質レベルで撮った。スケールバー＝６０μｍ（低倍率）及び２０μｍ（高倍率）。
【図１８Ａ−１８Ｄ】図１８Ａ〜図１８Ｄは、培養培地（媒体）（図１８Ａ及び図１８Ｂ）及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５（図１８Ｃ及び図１８Ｄ）で図１７Ａ〜図１７Ｆにあるように全身処置したマウス（生後７日）の脳におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５の免疫検出を示す小脳切片の画像を示す。試料は注射後４時間で採取した。脳におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５の局在は、抗ＧＦＰ抗体を使用した免疫組織化学によって評価した（図１８Ａ〜図１８Ｂ）。スライドは細胞核を染色するためＤＡＰＩでマウントした（図１８Ｂ、図１８Ｃ）。略語：ＥＧＬ、外顆粒層；ＩＧＬ、内顆粒層；ＭＬ、分子層；ＰＬ、プルキンエ層。スケールバー＝６０μｍ。
【図１９】図１９は、マウスにＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質を脳室内投与するためのカニューレの配置を示す。
【図２０】図２０は、図２１〜図３４に示す試験に関する植込み及び融合タンパク質注射スケジュールを表す略画を示す。マウスは植込み時点で４〜６ヵ月齢である。
【図２１Ａ−２１Ｃ】図２１Ａ〜図２１Ｃは、雄野生型マウス（＋／Ｙ）と比較したときのＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）（それぞれ図２１Ａ及び図２１Ｂ）における神経突起長及び新生顆粒細胞数の低下を実証するＤＣＸに関して免疫染色した海馬歯状回切片の画像を示す。５日間連続で脳室内投与したＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質は、雄ＣＤＫＬ５ノックアウトマウス（図２１Ｃ）における神経突起長及び新生顆粒細胞数を野生型（図２１Ａ）と同程度まで増加させたことが観察された。スケールバー＝７０μｍ。
【図２２Ａ−２２Ｃ】図２２Ａ〜図２２Ｃは、歯状回の顆粒層レベルにおける図２１の画像の拡大像を示す。スケールバー＝２５μｍ。
【図２３Ａ−２３Ｃ】図２３Ａ〜図２３Ｃは、ＣＤＫＬ５野生型（ＷＴ）雄マウス（本明細書ではＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ又は＋／Ｙとも称される）（図２３Ａ）、ＣＤＫＬ５ノックアウト（ＫＯ）雄マウス（本明細書ではＣＤＫＬ５  −／Ｙ又は−／Ｙとも称される）（図２３Ｂ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５）（図２３Ｃ）の新生顆粒細胞の再構成された樹状突起樹の例を示す。
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａ〜図２４Ｂは、ＣＤＫＬ５  ＷＴ雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）の歯状回の新生顆粒細胞（ＤＣＸ陽性細胞）の平均総樹状突起長（図２４Ａ）、及び平均樹状突起セグメント数（図２４Ｂ）の定量を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図２５Ａ−２５Ｂ】図２５Ａ〜図２５Ｂは、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）の歯状回の新生顆粒細胞の種々の次数の分枝の平均長さ（図２５Ａ）及び平均数（図２５Ｂ）の定量を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図２６】図２６は、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）におけるアポトーシス細胞（カスパーゼ３陽性細胞）の定量を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊Ｐ＜０．０５  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図２７】図２７は、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）のＤＧにおけるＤＣＸ陽性細胞数の定量を表すグラフを示す。データは細胞数／ｍｍ２として表す。＊ｐ＜０．０５  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図２８Ａ−２８Ｃ】図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）（図２８Ａ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）（図２８Ｂ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）（図２８Ｃ）の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｒｙｒｕｓ）（ＤＧ）の分子層からのシナプトフィジン（ＳＹＮ）免疫蛍光に関して処理した脳切片を表す代表的な画像を示す。スケールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒｅ）＝８０μｍ。略語：ＧＲ、顆粒層；Ｍｏｌ、分子層。
【図２９Ａ−２９Ｃ】図２９Ａ〜図２９Ｃは、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）（図２９Ａ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）（図２９Ｂ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）（図２９Ｃ）の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｒｙｒｕｓ）（ＤＧ）の分子層からのホスホ−ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）免疫蛍光に関して処理した脳切片を表す代表的な画像を示す。スケールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒｅ）＝８０μｍ。略語：ＧＲ、顆粒層；Ｍｏｌ、分子層。
【図３０Ａ−３０Ｂ】図３０Ａ〜図３０Ｂは、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）の海馬分子層（図３０Ａ）及び皮質第ＩＩＩ層（図３０Ｂ）におけるシナプトフィジン（ＳＹＮ）光学濃度の定量を表すグラフを示す。データは野生型マウスの分子層又は皮質の対応する領域に対する倍数差として提供する。値は平均値±ＳＤを表す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図３１Ａ−３１Ｂ】図３１Ａ〜図３１Ｂは、野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）の海馬分子層（図３１Ａ）及び皮質第Ｖ層（図３１Ｂ）におけるＳｅｒ４３７リン酸化ＡＫＴ（ＰＡＫＴ）の光学濃度の定量を表すグラフを示す。データは野生型マウスの分子層又は皮質の対応する領域に対する倍数差として提供する。値は平均値±ＳＤを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０１  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図３２】図３２は、媒体又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）及びＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）におけるゴルジ染色した顆粒細胞の樹状突起平均総樹状突起長を表すグラフを示す。右側は、種々の層並びにＣＡ１錐体細胞及び顆粒細胞の位置を示す海馬スライスの模式図。歯状回（ＤＧ）の分子層（Ｍｏｌ）が顆粒細胞樹状突起を含む。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図３３】図３３は、媒体又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）及びＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）の顆粒細胞のゴルジ染色した樹状突起分枝の画像を示す。
【図３４】図３４は、媒体又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）及びＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）の顆粒細胞の樹状突起スパイン数の定量を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図３５】図３５は、図３６〜図３８に示す行動試験に関する植込み及び融合タンパク質注射スケジュールを表す略画を示す。マウスは植込み時点で４〜６ヵ月齢である。
【図３６】図３６は、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ；ｎ＝８匹）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ；ｎ＝８匹）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５；ｎ＝６匹）におけるモーリス水迷路試験によって決定したときの学習段階の定量を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１  対未処置野生型条件及び＃Ｐ＜０．０１  対未処置ＣＤＫＬ５ノックアウト条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤで検定したとき）。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｂは、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ；ｎ＝８匹）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ；ｎ＝８匹）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５；ｎ＝６匹）における受動回避試験によって決定したときの記憶能力を表すグラフを示す。グラフは、行動試験手順の１日目（図３７Ａ）及び２日目（図３７Ｂ）に暗室に入るまでの潜時を示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１  対未処置野生型条件及び＃Ｐ＜０．０１  対未処置ＣＤＫＬ５ノックアウトマウス（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤで検定したとき）。
【図３８】図３８Ａ〜図３８Ｂは、ＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ；ｎ＝８匹）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ；ｎ＝８匹）、及び図３５の注射スケジュールに従いＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５；ｎ＝８匹）において２分の時間間隔の間に肢のクラスピングに費やされた合計時間を計測したクラスピング試験によって決定したときの運動能力の定量を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＤを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１  対＋／Ｙ；＃ｐ＜０．００１  対−／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図３９】図３９は、図２０（＋／Ｙ；ｎ＝８匹）又は図３５（−／Ｙ；ｎ＝６匹）の処置スケジュールに従いＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）及びＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）の体重（グラム単位）を示す。マウスはカニューレ植込み後７日間回復させた。
【図４０Ａ−４０Ｆ】図４０Ａ〜図４０Ｆは、未処置動物及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で脳室内注射によって５日間又は１０日間処置した動物における同種移植炎症因子１（ＡＩＦ−１）染色の比較を示す。注射を受けたマウスは４〜６ヵ月齢であった。
【図４１】図４１は、ＤＭＥＭ中で培養したＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質の分泌（レーン１〜４）及び発現（レーン５〜８）並びにＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７の発現及び分泌パターンの比較を表すウエスタンブロットの画像を示す。抽出物は、一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞又は培養ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞からの培地から作製した。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞については約１５μｇ総タンパク質抽出物をゲルにロードし、２０μＬの４０倍濃縮ＤＭＥＭ培地をロードしてタンパク質分泌を明らかにした。矢印はそれぞれのＣＤＫＬ５融合タンパク質を指示する。
【図４２Ａ−４２Ｂ】図４２Ａ〜図４２Ｂは、ＨＥＫ  ２９３Ｔ（図４２Ａ）及び神経芽腫細胞（図４２Ｂ）におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の安定性を表すグラフを示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドをＨＥＫ  ２９３Ｔ又は神経芽腫細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を指示される時間（３、６又は８時間）にわたってシクロヘキシミド（Ｃｈｘ；５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。異所的に発現したＣＤＫＬ５をＣＤＫＬ５イムノブロッティングにより検出した。
【図４３】図４３は、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７のタンパク質安定性を表すウエスタンブロットの画像を示す。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞にＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を指示される時間（３及び６時間）にわたってシクロヘキシミド（Ｃｈｘ；５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。
【図４４】図４４は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７が神経芽腫細胞増殖に及ぼす効果を比較するグラフを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＴＡＴκ−ｅＧＦＰ、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処理した。トランスフェクションから２４時間後、％ＴＡＴκ−ｅＧＦＰと表されるとおり総細胞数に対する有糸分裂細胞数として分裂指数を評価した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処理対照細胞と比較して２つのＣＤＫＬ５アイソフォームが同様のＳＨ−ＳＹ５Ｙ有糸分裂阻害活性を示すことに留意されたい。値は平均値±ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処理細胞（ｔ検定）。
【図４５Ａ−４５Ｄ】図４５Ａ〜図４５Ｄは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７処理した海馬ニューロン培養物におけるＣＤＫＬ５の局在を示す。図４５Ａ及び図４５ＣはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ対照タンパク質の形質導入効率及び細胞内局在を示す。図４５Ｂ及び図４５ＤはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７タンパク質の形質導入効率及び細胞内局在を示す。免疫検出は抗ＧＦＰ抗体を使用して行い、細胞はＤＡＰＩで対比染色した。高倍率は樹状突起セグメントの拡大像を示す。
【図４６Ａ−４６Ｃ】図４６Ａ〜図４６Ｃは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処理した海馬ニューロンの樹状突起セグメントのレーザー共焦点顕微鏡法による画像を示す。画像はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７タンパク質とシナプス後タンパク質（ＰＳＤ−９５）との共局在を示す。ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５免疫検出は抗ＧＦＰ抗体を使用して行った（図４５Ａ）。
【図４７】図４７は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質による処理後のＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）海馬ニューロンの樹状突起長を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１  対ＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）ニューロン；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙニューロン（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図４８】図４８は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質による処理後のＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）海馬ニューロンの海馬ニューロンにおけるシナプトフィジンパンクタ数を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥＭを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１  対ＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）ニューロン；＃ｐ＜０．０５  対−／Ｙニューロン（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図４９Ａ】図４９Ａ〜図４９Ｂは、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の処置スケジュール及び投与経路を描いた略画を示す。上に示すとおり、雄ＣＤＫＬ５野生型（ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ；＋／Ｙ）マウスがＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）による処置を受けた一方、ＫＯ（ＣＤＫＬ５  −／Ｙ；−／Ｙ）マウスがＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝６匹）で処置された。処置期間は、５日間連続の毎日の単回注射（１０μｌ注射、約５０ｎｇ／注射）、続く２日間の休止期間、次に更に５日間の単回注射からなった。合計１０回の注射があり、これらの注射は１２日間の期間に行われた。マウスは植込み時点で４〜６ヵ月齢であった。図４９Ａ〜図４９Ｂで用いる処置スケジュール、投与経路、及びマウスの年齢は図５１〜図５９にも適用される。
【図４９Ｂ】図４９Ａ〜図４９Ｂは、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の処置スケジュール及び投与経路を描いた略画を示す。上に示すとおり、雄ＣＤＫＬ５野生型（ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ；＋／Ｙ）マウスがＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）による処置を受けた一方、ＫＯ（ＣＤＫＬ５  −／Ｙ；−／Ｙ）マウスがＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝６匹）で処置された。処置期間は、５日間連続の毎日の単回注射（１０μｌ注射、約５０ｎｇ／注射）、続く２日間の休止期間、次に更に５日間の単回注射からなった。合計１０回の注射があり、これらの注射は１２日間の期間に行われた。マウスは植込み時点で４〜６ヵ月齢であった。図４９Ａ〜図４９Ｂで用いる処置スケジュール、投与経路、及びマウスの年齢は図５１〜図５９にも適用される。
【図５０】図５０は、図４９Ａ〜図４９Ｂに記載されるとおりＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質を投与した後のモーリス水迷路試験の結果を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５野生型マウス（＋／Ｙ）（＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（−／Ｙ）（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図５１Ａ−５１Ｃ】図５１Ａ〜図５１Ｃは、（図５１Ａ）元のプラットフォーム象限に入るまでの潜時、図５１Ｂ）元のプラットフォーム象限に入る頻度、（図５１Ｃ）元のプラットフォーム象限に滞在した時間の割合を測定することによる空間記憶を表すグラフを示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）では全てのパラメータの成績が著しく悪化した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７処置ＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）は全てのパラメータの統計的に有意な改善を示した、図５１Ａ、図５１Ｂ、及び図５１Ｃ。値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  対ＣＤＫＬ５野生型マウス；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図５２Ａ−５２Ｂ】図５２Ａ〜図５２Ｂは、受動回避（ＰＡ）試験を用いた学習及び記憶に対する処置効果を表すグラフを示す。処置期間及び２日間の休止期間後、マウスは受動回避（ＰＡ）試験を受けた。実験には２室（明室及び暗室）を備えるテストケージを利用した。１日目、動物を明室に置くと、本能的に暗室に進入し、そこで単一の有害事象（フットショック）によって動物を条件付ける。図５２Ａは、全ての群で暗室に進入するまでの潜時が同程度であったことを示す。２日目（試験期間）、動物を再び明室に置く。有害事象の記憶を暗室に進入するまでの潜時によって測定し、図５２Ｂに表した。この課題において、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）と比較した暗室に進入するまでの潜時の減少によって示されるとおり著しく悪化した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）は野生型雄マウスと比較して同程度の潜時を示した（図５２Ｂ）。これらの差はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）と比較して統計的に有意であった。＊＊ｐ＜０．０１  対ＣＤＫＬ５野生型雄条件；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図５３Ａ−５３Ｂ】図５３Ａ〜図５３Ｂは、（図５３Ａ）学習及び記憶に対する処置効果の評価に使用されるＹ迷路の略画、及び（図５３Ｂ）Ｙ迷路試験の結果を表すグラフを示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５野生型マウス（＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）と同様の成績を示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０５  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ条件（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図５４Ａ−５４Ｂ】図５４Ａ〜図５４Ｂは、運動機能に対する処置効果の評価に用いた後肢クラスピング試験におけるクラスピングあり（右のマウス）対クラスピングなし（左のマウス）を表す（図５４Ａ）グラフ及び（図５４Ｂ）画像を示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７によるＣＤＫＬ５  ＫＯマウスの処置（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）と比較したときのクラスピング時間の統計的に有意な減少につながった。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１  対野生型条件（＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）；＃＃ｐ＜０．００１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図５５Ａ−５５Ｂ】図５５Ａ及び図５５Ｂは、ノンレム（ＮＲＥＭ）（図５５Ａ）及びレム（ＲＥＭ）（図５５Ｂ）睡眠中の無呼吸回数によって測定したときの処置済みＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）及び未処置（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）ＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）又はＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウスの呼吸障害を表すグラフを示す。無呼吸は全身プレチスモグラフィーを用いて測定した。＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．０１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０１  対ＣＤＫＬ５  ＫＯ  −／Ｙ条件（ｔ検定）。
【図５６Ａ−５６Ｄ】図５６Ａ〜図５６Ｄは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）による処置がＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）又はＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウスに及ぼす効果を表すグラフ（図５６Ａ）及び（図５６Ｂ〜図５６Ｄ）新生顆粒細胞の再構成された樹状突起樹を示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ条件（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図５７】図５７は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）（＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）の海馬（歯状回）におけるＤＣＸ陽性細胞数の定量を示す。処置期間は、１日１回の脳室内注射を５日間、続く２日間の休止期間、次に更なる５回の注射からなった。動物は最終回の注射の１０日後に犠牲にした。データは細胞数／ｍｍとして表す。＊＊ｐ＜０．０１  対＋／Ｙ；＃＃ｐ＜０．００１  対ＣＤＫＬ５  ＫＯ試料（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。データから、ＤＣＸ陽性細胞数に対するＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５による処置の正の影響が処置完了後１０日維持されることが示唆される。
【図５８】図５８は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５野生型雄マウス（＋／Ｙ）（＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）の海馬（歯状回）における切断型カスパーゼ３陽性細胞の総数の定量を示す。処置プロトコルは、１日１回の脳室内注射の５日間の投与、続く２日間の休止期間、次に更なる５回の注射であった。動物は最終回の注射の１０日後に犠牲にした。
【図５９】図５９は、１日１回の脳室内注射によってＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）及びＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）マウス（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）の体重を表すグラフを示す。マウスはカニューレ植込み後７日間回復させ、最終回の注射の１０日後に犠牲にした。
【図６０Ａ−６０Ｃ】図６０Ａ〜図６０Ｃは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７を形質導入した海馬ニューロンの樹状突起セグメントのレーザー共焦点顕微鏡法による画像を示す。画像は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７タンパク質とシナプス前タンパク質（シナプトフィジン；ＳＹＮ）との共局在を示す。ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５免疫検出は抗ＧＦＰ抗体を使用して行った（図６４Ａ）。図６０Ａ〜図６０Ｃは、図４５に関して記載されるとおりのプロトコルを用いて作製した。
【図６１】図６１は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ）、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７）融合タンパク質による処置後のゴルジ染色切片におけるＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）又はＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）海馬ニューロンの樹状突起スパイン数を表すグラフを示す。値は平均値±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対野生型（＋／Ｙ）ニューロン；＃ｐ＜０．０５  対ＣＤＫＬ５（−／Ｙ）ニューロン（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【図６２】図６２は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与の処置スケジュールを示す。毎日のヒト用量投与を模擬するため、本発明者らは、補充可能なリザーバ付きの皮下に植え込んだプログラム可能ポンプに基づく注入方法を用いた。ＣＤＫＬ５  −／ＹマウスをＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置した。タンパク質はカニューレを通じて内頸動脈に直接注入する。このシステムにより、１０日間の継続期間にわたる１日２回注入プロトコル（朝及び夜；２０μｌ注射、約５０ｎｇ／注射）の適用が可能となった。マウスは植込み時点で４〜６ヵ月齢であった。図６２に関して記載される処置スケジュール及びマウスの年齢は図６３Ａ〜図７２にも適用される。
【図６３Ａ−６３Ｂ】図６３Ａ〜図６３Ｂは、ＤＣＸ免疫染色した海馬歯状回切片の画像を示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質を４〜６ヵ月齢のマウスに１０日間連続で全身投与したところ、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスにおいて神経突起長及び新生顆粒細胞数の増加が認められた（図６３Ｂ）。
【図６４】図６４は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質による４〜６ヵ月齢のマウスの全身的処置がＮＲＥＭ睡眠中の無呼吸回数によって測定したときの呼吸障害に及ぼす効果を表すグラフを示す。
【図６５】図６５は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ及びＣＤＫＬ５  −／Ｙマウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの新生（ダブルコルチン陽性）顆粒細胞の平均総樹状突起長を示すグラフである。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図６６】図６６は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ及びＣＤＫＬ５  −／Ｙマウス及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスのゴルジ染色した顆粒細胞の平均総樹状突起長を示すグラフである。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図６７】図６７は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／及びＣＤＫＬ５  −／Ｙマウス及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの穴掘り発作回数を示すグラフである。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１；対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図６８】図６８は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／及びＣＤＫＬ５  −／Ｙマウス及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの巣の品質を示すグラフである。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１；対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図６９】図６９は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７のいずれかで処置した１匹のＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスにおける種々の時点で収集した視覚野内の神経活動の一連の代表的画像である。
【図７０】図７０は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７のいずれかで処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスにおける６及び１０日間の処置前及び処置後に測定した視覚誘発反応の平均振幅を示すグラフである。処置中止後６〜１０日（ウォッシュアウト）の更なる測定によって効果の持続を評価した。参考として、経時的な未処置野生型反応振幅の９５％信頼区間を網かけ範囲で示す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。二元配置ＡＮＯＶＡ（因子時間に関して反復測定）により時間×処置相互作用ｐ＜０．０５が明らかになった；ホルム・シダックの事後多重比較検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図７１】図７１は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ及びＣＤＫＬ５  −／Ｙマウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置して（ｎ＝５匹）処置終了時に犠牲にした（短期）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置して処置中止後１０日で犠牲にした（長期）ＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスからの一次視覚野（Ｖ１）錐体ニューロン（第２／３層）の樹状突起スパイン密度を示すグラフである。値は平均値±ＳＥとして表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【図７２】図７２は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ（ｎ＝３匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝３匹）マウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝４匹）若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝６匹）で処置して処置終了時に犠牲にした（短期）、又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝４匹）若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝４匹）で処置して処置中止後１０日で犠牲にした（長期）ＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの一次視覚野（Ｖ１）におけるＰＳＤ−９５免疫反応性を呈する蛍光パンクタ数／μｍ２を示すグラフである。値は平均値±ＳＥとして表す。＊＊ｐ＜０．０１  対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書には、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質組成物及び製剤、並びにＣＤＫＬ５媒介性疾患及び障害、特にＣＤＫＬ５変異及び／又は欠損に起因する障害及び疾患の治療におけるそれらの使用方法が提供される。また、本明細書には、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質組成物及び製剤の作製方法も提供される。これらの方法は、ＣＤＫＬ５媒介性神経障害の研究に対して改良された実験ツールを提供すると共に、ＣＤＫＬ５機能不全に関連する障害に罹患している患者に対して改良された治療選択肢を提供する。また、本明細書には、ＣＤＫＬ５媒介性疾患及び障害を治療するためのかかるＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質組成物及び製剤の使用方法も提供される。また、本明細書には、ＣＤＫＬ５媒介性疾患又は障害を有する患者の視覚野内の神経活動を増加させる方法も提供される。また、本明細書には、ＣＤＫＬ５媒介性疾患又は障害を有する患者の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させる方法も提供される。また、本明細書には、ＣＤＫＬ５媒介性疾患又は障害を有する患者の脳内の神経細胞アポトーシスを低減する方法も提供される。また、本明細書には、ＣＤＫＬ５媒介性疾患又は障害を有する患者の運動機能を改善する方法も提供される。
【００１４】
定義
本明細書で使用されるとき、「約」、「およそ」などは、数値変数に関係して使用されるとき、概してその変数の値及び実験誤差（例えば、平均値の９５％信頼区間）又は指示値の±１０％のいずれか大きい方の範囲内にあるその変数の全ての値を指す。
【００１５】
本明細書で使用されるとき、「活性薬剤」又は「活性成分」は、生物学的に活性な又は他の形でその投与対象に生物学的又は生理学的効果を生じさせる物質、化合物、又は分子を指す。換言すれば、「活性薬剤」又は「活性成分」は、組成物の効果の全体又は一部をもたらす組成物の１つ又は複数の構成成分を指す。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「相加効果」は、２つ以上の分子、化合物、物質、因子、又は組成物の間に生じる効果であって、それらの個々の効果の合計と等しい又は同じである効果を指す。
【００１７】
用語「両親媒性」は、本明細書で使用されるとき、親水特性と親油（疎水）特性とを合わせ持つ分子を指す。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域とを含む。各軽鎖は軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は抗原に対する結合特異性を保持しており、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。ＣＤＲ間には、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのフレームワーク領域を含み、これらがアミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で並んでいる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「抗感染薬」は、感染病原体を死滅させるか、或いはそれが広がるのを阻止することができる化合物又は分子を指す。抗感染薬としては、限定はされないが、抗生物質、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、及び抗原虫薬が挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「アプタマー」は、タンパク質を含め、予め選択された標的に高い親和性及び特異性で結合することのできる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。その特異性及び特徴は、その一次配列によって直接決まるのでなく、その三次構造によって決まる。
【００２１】
用語「生体適合性」は、本明細書で使用されるとき、任意の代謝産物又はその分解産物に加えて、概してレシピエントにとって非毒性の、且つレシピエントにいかなる重大な有害作用も引き起こさない材料を指す。一般的に言えば、生体適合性材料は、患者に投与したときに重大な炎症反応又は免疫反応を誘発しない材料である。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、「生分解性」は、概して生理的条件下で分解又は侵食して対象による代謝、除去、又は排泄が可能な小さい単位又は化学種となる材料を指す。分解時間は組成及び形態に応じて変わる。分解時間は数時間乃至数週間であり得る。
【００２３】
用語「親水性」は、本明細書で使用されるとき、水と相互作用し易い強極性基を有する物質を指す。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「ｃＤＮＡ」は、細胞におけるＲＮＡ転写物に相補的なＤＮＡ配列を指す。これは人工分子である。典型的には、ｃＤＮＡは逆転写酵素と呼ばれる酵素によってＲＮＡ転写物を鋳型として使用してインビトロで作製される。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤＫＬ５欠損」は、このタンパク質の生物学的機能の任意の欠損を指す。欠損は、野生型又は正常対象と比較したときの、タンパク質をコードするＤＮＡ又はＤＮＡ関連調節領域における任意のＤＮＡ突然変異、又は後成的なＤＮＡ修飾、例えば、限定はされないが、ＤＮＡメチル化又はヒストン修飾における任意の変化に起因するタンパク質機能の任意の変化、ＣＤＫＬ５タンパク質の二次、三次、又は四次構造の任意の変化、又はＣＤＫＬ５タンパク質がその生物学的機能を果たす能力の任意の変化によって生じ得る。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤＫＬ５変異」は、ＣＤＫＬ５タンパク質のコード領域のヌクレオチド配列の任意の変化を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」には子孫が含まれる。また、意図的又は偶発的な突然変異に起因して、ＤＮＡ内容の点で全ての子孫が正確に同一であるとは限らないことも理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングしたときと同じ機能又は生物学的特性を有する変異体子孫が包含される。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「組成物」は、活性薬剤と、不活性な（例えば、検出可能な薬剤又は標識）又はアジュバントなど活性な少なくとも１つの他の化合物又は分子との組み合わせを指す。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「濃縮された」は、容積当たりの分子の濃度又は数がその天然に存在する対応物の濃度又は数を上回る点でその天然に存在する対応物と区別可能な分子、例えば、限定はされないが、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片を指す。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「対照」は、実験で比較のために使用され、且つ独立変数以外の変数の効果を最小限に抑え又は区別するために含められる代替的な対象又は試料である。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「化学療法剤」又は「化学療法薬」は、癌の予防又は治療に利用される治療剤を指す。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「培養する」は、細胞が一群の細胞として増殖し、且つ老化を回避することのできる条件下に細胞を維持することを指す。「培養する」にはまた、それに加えて又は代えて細胞が分化する条件も含まれ得る。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」及び「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、概して、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであっても、又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を指す。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉コンストラクト）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、又はリボザイムの形態であってもよい。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡ分子」は、ＤＮＡで作られた核酸／ポリヌクレオチドを含む。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「誘導体」は、その化合物と同じ又は類似したコア構造を有するが、１つ以上の原子又は官能基の置換、欠失、及び／又は付加を含めた、少なくとも１つの構造的違いを有する任意の化合物を指す。用語「誘導体」は、その誘導体が出発物質或いは中間体としての親化合物から合成されることを意味するものではなく、しかしこれも該当し得る。用語「誘導体」には、プロドラッグ、又は親化合物の代謝産物が含まれ得る。誘導体は、親化合物中の遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩類、ｐ−トルエンスルホンアミド類（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅ  ｓｕｌｆｏａｍｉｄｅｓ）、ベンゾキシカルボアミド類、ｔ−ブチルオキシカルボアミド類、チオウレタン系誘導体、トリフルオロアセチルアミド類、クロロアセチルアミド類、又はホルムアミド類を形成している化合物を含む。誘導体は、親化合物のカルボキシル基が誘導体化されてメチル及びエチルエステル類、又は他の種類のエステル類又はヒドラジド類を形成している化合物を含む。誘導体は、親化合物のヒドロキシル基が誘導体化されてＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成している化合物を含む。誘導体は、親化合物の水素結合供与基が別の水素結合供与基、例えば、ＯＨ、ＮＨ、又はＳＨに置換されている化合物を含む。誘導体は、親化合物の水素結合アクセプター基を別の水素結合アクセプター基、例えばエステル類、エーテル類、ケトン類、炭酸塩類、第三級アミン類、イミン、チオン類、スルホン類、第三級アミド類、及び硫化物に置換することを含む。「誘導体」はまた、飽和又は不飽和シクロヘキサン又は他のより複雑な、例えば窒素含有環によるシクロペンタン環の置換の拡張、及び様々な側鎖を有するこれらの環の拡張も含む。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「分化する」又は「分化」は、前駆体又は前駆細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）が特定の細胞型（例えば、ニューロン）に分化する過程を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「差次的に発現した」は、正常細胞又は対照細胞の同じ遺伝子又は調節領域によるＲＮＡの産生レベルと比較したときの、ゲノムの遺伝子又は調節領域から転写されるＲＮＡ、例えば、限定はされないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、及びｐｉＲＮＡ、又は遺伝子によってコードされるタンパク質産物の差次的産生を指す。別の文脈では、「差次的に発現した」はまた、正常細胞又は対照細胞と比較したとき異なる時間的及び／又は空間的発現プロファイルを有する細胞又は組織中のヌクレオチド配列又はタンパク質も指す。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「希釈された」は、容積当たりの分子の濃度又は数がその天然に存在する対応物の濃度又は数を下回る点でその天然に存在する対応物と区別可能な分子、例えば、限定はされないが、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片を指す。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「用量」、「単位用量」、又は「投薬量」は、対象における使用に好適な物理的に個別の単位であって、各々がその投与に伴い所望の１つ又は複数の反応を生じるように計算された所定の分量のＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及び／又はその医薬製剤を含む単位を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「有効量」は、細胞、組織、系、動物、又はヒトの有益な又は所望の生物学的、感情的、医学的、又は臨床的反応を生じさせるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用、又は投薬で投与することができる。この用語はまた、その範囲内に、正常な生理学的機能を増進するのに有効な量も含む。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、細胞との関連において「拡大」又は「拡大した」は、同一であるか否かに関わらず、初期細胞集団からの特徴的な１つ又は複数の細胞型の数の増加を指す。拡大に使用される初期細胞は、拡大により生成される細胞と同じでなくてもよい。例えば、拡大細胞は、初期細胞集団のエキソビボ又はインビトロ成長及び分化によって作製し得る。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「発現」は、ポリヌクレオチドがＲＮＡ転写物に転写されるプロセスを指す。ｍＲＮＡ及び他の翻訳されたＲＮＡ種との関連では、「発現」はまた、転写されたＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される１つ又は複数のプロセスも指す。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異なるタンパク質又はタンパク質断片の組み合わせで形成されるタンパク質を指す。融合タンパク質は組換えＤＮＡ分子によってコードされる。従って、「ＣＤＫＬ５融合タンパク質」は、ヒトＣＤＫＬ５ポリペプチド又はその変異体が他のポリペプチド配列に作動可能に連結されている組換えタンパク質を指す。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を占有し、且つ生物における１つ又は複数の特性又は１つ又は複数の形質の遺伝命令を含むＤＮＡの配列に対応する遺伝単位を指す。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「緑色蛍光タンパク質」、「黄色蛍光タンパク質」、「赤色蛍光タンパク質」など及びこれらの略語には、限定なしに、ルーチンで修飾され、誘導体化されている、且つ概して当業者に公知のとおりのあらゆる形態のかかるタンパク質が含まれる。例えば「緑色蛍光タンパク質」には、限定なしに、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、レドックス感受性ＧＦＰ（ｒｏＧＦＰ）、及びあらゆるカラー突然変異体が含まれる。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「ＨＥＫ  ２９３Ｔ」は、ラージＴ抗原を発現し、且つ概して当該技術分野において公知で、アメリカン・ティッシュー・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）などの供給業者から市販されているヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を指す専門用語である。
【００４７】
用語「疎水性」は、本明細書で使用されるとき、水に対する親和性を欠き；撥水して水を吸収しないと共に水中に溶解せず又は水と混合しない傾向がある物質を指す。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、「同一性」は、配列を比較することによって決定したときの２つ以上のポリペプチド配列間の関係である。当該技術分野では、「同一性」はまた、かかる配列のストリング間のマッチによって決定したときのポリペプチド間の配列関連性の程度も指す。「同一性」は、限定はされないが、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．１９８８，４８：１０７３に記載されるものを含め、公知の方法により容易に計算することができる。好ましい同一性の決定方法は、調べる配列間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性の決定方法は公的に利用可能なコンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の同一性パーセントは、ニードルマン−ブンシュ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，４８：４４３−４５３）アルゴリズム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴ）を組み込んだ解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．の配列解析ソフトウェアパッケージ）を使用して決定することができる。本開示のポリペプチドについて同一性を決定する際には、デフォルトパラメータが使用される。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、「免疫調節薬」は、１つ以上の免疫機能又は反応を調整又は調節する能力を有する薬剤、例えば治療剤を指す。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、「誘導する」、「誘導」、又は「誘導された」は、エンドサイトーシス、分泌、及びエキソサイトーシスなど、細胞内の過程又は経路を活性化又は刺激することを指す。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、「単離された」は、そのポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片が自然中では通常結び付いている細胞構成物及び他の形の構成物から分離されていることを意味する。天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片は、それをその天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。
【００５２】
用語「親油性」は、本明細書で使用されるとき、脂質に親和性を有する化合物を指す。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、治療目的上の「哺乳類」は、ヒト、家畜動物及び農業動物、非ヒト霊長類、及び動物園動物、競技動物、又は愛玩動物、例えば、限定はされないが、イヌ、ウマ、ネコ、及び雌ウシを含めた、哺乳類に分類される任意の動物を指す。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、「マトリックス」は、１つ以上の特殊な構造、分子、又は組成物が埋め込まれる材料を指す。
【００５５】
用語「分子量」は、本明細書で使用されるとき、概して材料の質量又は平均質量を指す。ポリマー又はオリゴマーの場合、分子量はバルクポリマーの相対平均鎖長又は相対鎖質量を指し得る。実際には、ポリマー及びオリゴマーの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又は毛細管粘度測定法を含めた様々な方法で推定し又は特徴付けることができる。ＧＰＣ分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）とは対照的に、重量平均分子量（Ｍｗ）として報告される。毛細管粘度測定法は分子量の推定値を、特定の一組の濃度、温度、及び溶媒条件を用いて希薄ポリマー溶液から決定される固有粘度として提供する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「陰性対照」は、全ての試薬が正しく機能していて、且つ実験が正しく行われる限りにおいて何ら効果又は結果を生じないように設計された「対照」を指す。「陰性対照」と同義の他の用語には、「シャム」、「プラセボ」、及び「モック」がある。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、概して少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの連なりを指し、とりわけ、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、又は典型的には二本鎖か又は一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。また、ポリヌクレオチドは、本明細書で使用されるとき、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域を指す。かかる領域の鎖は同じ分子由来であっても、又は異なる分子由来であってもよい。この領域は分子の１つ以上の全てを含み得るが、より典型的には分子の一部の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは多くの場合にオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」にはまた、かかる化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、並びに、数ある中でも特に、ウイルス及び細胞、例えば単純及び複雑細胞に特徴的な化学的形態のＤＮＡ及びＲＮＡも包含される。例えば、用語のポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有する上記に記載したとおりのＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。従って、２つだけ例を挙げれば、イノシンなどの普通でない塩基、又はトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、この用語が本明細書で使用されるとおりのポリヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」にはまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート類、及び天然核酸のリン酸骨格の他の変異体も含まれる。天然核酸はリン酸骨格を有し、人工核酸は他の種類の骨格を含有するが、同じ塩基を含有し得る。従って、安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡは、この用語が本明細書で意図するとおりの「核酸」又は「ポリヌクレオチド」である。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、「核酸配列」及び「オリゴヌクレオチド」にはまた、上記に定義するとおりの核酸及びポリヌクレオチドも包含される。本明細書で使用されるとき、「生物」、「宿主」、及び「対象」は、少なくとも１つの細胞を含む任意の生きている実体を指す。生きている生物は、例えば、単一の単離された真核細胞又は培養細胞又は細胞株のように単純であることも、又はヒトを含めた哺乳類、及び動物（例えば、脊椎動物、両生類、魚類、哺乳類、例えば、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、げっ歯類、ウサギ、リス、クマ、霊長類（例えば、チンパンジー、ゴリラ、及びヒト）のように複雑であることもある。「対象」はまた、細胞、細胞集団、組織、臓器、又は生物、好ましくはヒト及びその構成物であってもよい。本明細書で使用されるとき、「過剰発現した」又は「過剰発現」は、正常細胞又は対照細胞におけるＲＮＡ又はタンパク質産物の発現レベルと比較したときの、遺伝子によってコードされるＲＮＡ又はタンパク質産物の発現レベルの増加を指す。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」は、コード配列の発現を生じさせるため核酸のコード配列の発現に有用な調節配列が核酸分子内でコード配列に対して適切な位置に置かれることを示し得る。この同じ定義が、時に発現ベクター中のコード配列及び／又は転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び終結エレメント）、及び／又は選択可能なマーカーの配置に適用される。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を必要としている生物、宿主、又は対象を指す。
【００６１】
本明細書で使用されるとき「ペプチド」は、タンパク質又はポリペプチドと比べて短い少なくとも２アミノ酸の鎖を指す。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、「医薬製剤」は、活性薬剤、化合物、又は成分と、組成物をインビトロ、インビボ、又はエキソビボでの診断、治療、又は予防用途に好適なものにする薬学的に許容可能な担体又は賦形剤との組み合わせを指す。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」は、概して安全で非毒性の、且つ生物学的にも又は他の面でも望ましくないものでない医薬製剤の調製において有用な担体又は賦形剤を指し、動物への使用並びにヒト医薬品としての使用が許容される担体又は賦形剤が含まれる。「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」は、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、１つ及び２つ以上のかかる担体又は賦形剤の両方を含む。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、その塩が薬学的用量で投与される対象にとって対イオンが非毒性の任意の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、「プラスミド」は、本明細書で使用されるとき、宿主細胞でプラスミドが複製するようにインタクトな「レプリコン」を含む非染色体性二本鎖ＤＮＡ配列を指す。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、「陽性対照」は、全ての試薬が正しく機能していて、且つ実験が正しく行われる限りにおいて所望の結果を生じるように設計された「対照」を指す。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「予防的」及び「予防する」は、診断が未確定であっても、又は疾患若しくは病態がまだ無症状段階にあっても、疾患又は病態をその発生前に妨げる又は止めることを指す。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、特定の順序のアミノ酸の鎖を１つ以上含む大型分子を指す。用語のタンパク質は「ポリペプチド」と同義的に使用される。順序は、そのタンパク質をコードする遺伝子中のヌクレオチドの塩基配列によって決まる。タンパク質は、体の細胞、組織、及び臓器の構造、機能、及び調節に必要である。各タンパク質がユニークな機能を有する。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「精製された」又は「精製する」は、天然環境と比べて高い純度を有する核酸配列、ペプチド、又はポリペプチドを参照して使用される。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、用語「組換え」は、概して、天然に存在しない核酸、核酸コンストラクト、又はポリペプチドを指す。かかる天然に存在しない核酸には、修飾されている天然核酸、例えば欠失、置換、逆位、挿入等を有する天然核酸、及び／又は分子生物学的技術を用いてつなぎ合わされる異なる起源の核酸配列の組み合わせ（例えば、融合タンパク質（例えば、２つの異なるタンパク質又はタンパク質断片の組み合わせで形成されるタンパク質又はポリペプチド）をコードする核酸配列、ポリペプチドをコードする核酸とプロモーター配列の組み合わせであって、コード配列とプロモーター配列とが異なる供給源に由来するか又はその他、典型的には天然で一緒に存在しないもの（例えば、核酸と構成的プロモーター）等）が含まれ得る。組換えはまた、組換え核酸によってコードされるポリペプチドも指す。天然に存在しない核酸又はポリペプチドは、人為的に修飾された核酸及びポリペプチドを含む。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「レット症候群バリアント」、「レット症候群のバリアント」などは、レット症候群と類似した臨床徴候を有するが病因が不明の非典型型のレット症候群を指す。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、「分離された」は、元の供給源又は集団から物理的に分かれていて、分離された化合物、薬剤、粒子、又は分子をもはや元の供給源又は集団の一部と見なすことができない状態を指す。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、酵素／基質、受容体／アゴニスト又はアンタゴニスト、抗体／抗原、レクチン／炭水化物、オリゴＤＮＡプライマー／ＤＮＡ、酵素又はタンパク質／ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ分子と他の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はアミノ酸など、対をなす種の間に起こる結合を指し、これは共有結合性若しくは非共有結合性相互作用又は共有結合性及び非共有結合性相互作用の組み合わせによって媒介され得る。２つの種の相互作用が非共有結合的に結合した複合体を生じるとき、起こる結合は典型的には静電結合、水素結合、又は親油性相互作用の結果である。従って、「特異的結合」は、抗体／抗原、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／タンパク質、ＲＮＡ／タンパク質、ＲＮＡ／アミノ酸、受容体／基質相互作用の特性を有する結合複合体を生じる相互作用が２つの間にあるような対をなす種の間に起こる。詳細には、特異的結合は、対の一方のメンバーが特定の種と結合し、且つその結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物ファミリー内の他の種とは結合しないことを特徴とする。従って、例えば、抗体は好ましくは単一のエピトープに結合し、タンパク質のファミリー内の他のエピトープには結合しない。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「特異的結合パートナー」又は「結合パートナー」は、第２の化合物又は分子が他のいずれの分子又は化合物よりも高い親和性で結合する化合物又は分子である。
【００７５】
本明細書では同義的に使用されるとおり、「対象」、「個体」、又は「患者」は脊椎動物生物を指す。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」は、対象種が、存在する優勢種である（即ち、モル基準でそれが組成物中の他のいずれの個別種よりも豊富である）ことを意味し、及び好ましくは実質的に精製された画分は、存在する全ての種の約５０パーセントを対象種が占める組成物である。概して、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての種の約８０パーセント超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、及び９９％超を占め得る。最も好ましくは、対象種は、組成物が本質的に単一種からなる本質的な均一性（従来の検出方法によっては組成物中に夾雑種を検出することができない）に至るまで精製される。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋な細胞集団」は、全細胞集団を構成する細胞の約５０％、好ましくは約７５〜８０％、より好ましくは約８５〜９０％、及び最も好ましくは約９５％が特定の細胞マーカー特徴及び分化能を有する細胞集団を指す。従って、「実質的に純粋な細胞集団」は、指定のアッセイ条件下で特定のマーカー特徴及び分化能を呈しない細胞が約５０％未満、好ましくは約２０〜２５％未満、より好ましくは約１０〜１５％未満、及び最も好ましくは約５％未満だけ含まれる細胞集団を指す。
【００７８】
本明細書では同義的に使用されるとおりの用語「十分」及び「有効」は、１つ以上の所望の結果を達成するのに必要な量（例えば、質量、容積、投薬量、濃度、及び／又は時間）を指す。例えば、治療有効量は、１つ以上の治療効果を達成するのに必要な量を指す。
【００７９】
本明細書で使用されるとき、「相乗効果」、「相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ）」、又は「相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｙ）」は、２つ以上の分子、化合物、物質、因子、又は組成物の間に生じる効果であって、それらの個々の効果の合計と比べて大きい又は異なる効果を指す。
【００８０】
本明細書で使用されるとき、「治療的」は、疾患、障害、病態、又は副作用を治療、治癒、及び／又は改善すること、又は疾患、障害、病態、又は副作用の進行を減速させることを指す。この用語にはまた、その範囲内に、正常な生理学的機能を増進すること、緩和処置、及び疾患、障害、病態、副作用、又はその症状の部分的改善も含まれる。疾患又は障害はＣＤＫＬ５欠損症及び／又はレット症候群であり得る。
【００８１】
本明細書で使用されるとき、「治療有効量」は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医が求める組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的反応を誘発し得るＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤、本明細書に記載される補助薬剤、又は二次的薬剤の量を指す。「治療有効量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、ＣＤＫＬ５欠損症及び／又はレット症候群の症状の１つ以上の発症を予防し、それをある程度軽減又は緩和するのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。「治療効果量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、対照と比較して対象の脳のある領域におけるニューロン生存率、ニューロン数、神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、及び／又は分枝密度を増加させるのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。「治療効果量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、対照と比較して対象における学習能力を増加させるのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。「治療効果量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、対照と比較して対象における記憶能力を増加させるのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。「治療効果量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、対照と比較して対象における運動機能を改善するのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。「治療効果量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、学習能力、記憶能力、及び／又は運動機能を野生型又は正常レベルと実質的に同様のレベルまで回復させるのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。「治療効果量」には、単独で投与するか又は二次的薬剤と共投与したとき、脳のある領域におけるニューロン数、ニューロン生存率、神経突起成長、神経突起伸長、樹状突起スパイン数、神経突起分枝数、及び／又は神経突起分枝密度を野生型又は正常レベルと実質的に同様のレベルまで回復させるのに十分なＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の量が含まれる。治療有効量は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、その医薬製剤の正確な化学構造、治療下のＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群又はその症状、投与経路、投与時間、排泄速度、薬物併用、治療を行う医師の判断、投薬形態、並びに治療対象の年齢、体重、全般的な健康、性別及び／又は食事に応じて異なり得る。
【００８２】
用語「治療する」及び「治療」は、本明細書で使用されるとき、概して所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。この効果は、疾患、その症状又は病態、例えばＣＤＫＬ５変異及び／又は欠損によって生じる疾患又は障害、レット症候群のＣＤＫＬ５バリアント、又は他のＣＤＫＬ５媒介性神経障害を防ぐ又は部分的に防ぐ点で予防的であってもよく、及び／又は疾患、病態、症状又は疾患、障害、若しくは病態に起因する有害作用を部分的又は完全に治癒する点で治療的であってもよい。用語「治療」には、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおけるＣＤＫＬ５媒介性神経障害の任意の治療が包含され、以下が含まれる：（ａ）疾患に罹り易い可能性があるものの、まだそれに罹っているとの診断は受けていない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻止すること、即ちその発症を止めること；又は（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患及び／又はその症状又は病態を緩和し又は改善すること。用語「治療」は、本明細書で使用されるとき、治療的処置及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）方策の両方を指す。治療を必要としている者には、既に障害を有する者並びに障害を防ぐべきである者が含まれる。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、「有形的表現媒体」は、物理的に有形の、単なる抽象的思考又は記録されていない話し言葉でない媒体を指す。有形的表現媒体には、限定はされないが、セルロース系材料若しくはプラスチック材料上の言葉又はフラッシュメモリ若しくはＣＤ−ＲＯＭなどの好適な装置に記憶されたデータが含まれる。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、「形質導入された」は、タンパク質を細胞に直接導入することを指す。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「トランスフェクション」は、外因性及び／又は組換え核酸配列を生細胞の膜に囲まれた空間の内部に導入すること、例えば、核酸配列を細胞のサイトゾル内並びにミトコンドリア、核、又は葉緑体の内部空間内に導入することを指す。核酸はネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡの形態であってもよく、それが様々なタンパク質又は調節エレメント（例えば、プロモーター及び／又はシグナルエレメント）と関連付けられていてもよく、或いは核酸はベクター又は染色体に組み込まれてもよい。核酸はウイルス粒子に組み込まれてもよい。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「形質転換」又は「形質転換された」は、導入された核酸のコード部分の発現が可能となるように核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を細胞に導入することを指す。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、「過小発現した」又は「過小発現」は、正常細胞又は対照細胞におけるＲＮＡ又はタンパク質産物の発現レベルと比較したときの、遺伝子によってコードされるＲＮＡ又はタンパク質産物の発現レベルの低下を指す。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、「変異体」は、基準ポリペプチドと異なるが、本質的な特性は保持しているポリペプチドを指す。あるポリペプチドの典型的な変異体は、別の基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。概して違いは、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列とが全体的には極めて類似していて、多くの領域で同一であるように限られている。変異体と基準ポリペプチドとは、１つ以上の修飾（例えば、置換、付加、及び／又は欠失）だけアミノ酸配列が異なり得る。置換又は挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるものであっても、又はそうでなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、アレル変異体のように天然に存在するものであってもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。「変異体」には、機能的及び構造的変異体が含まれる。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、細胞に外来性核酸配列を導入するために使用される媒体を参照して使用される。ベクターには、ＤＮＡ分子であって、線状又は環状（例えばプラスミド）の、宿主細胞又は宿主細胞小器官への導入時に転写及び翻訳をもたらす追加的なセグメントに作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードするセグメントを含むものが含まれ得る。かかる追加的なセグメントはプロモーター及びターミネーター配列を含むことができ、また、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等も含み得る。発現ベクターは、概して酵母又は細菌ゲノム又はプラスミドＤＮＡ、又はウイルスＤＮＡに由来し、又は両方のエレメントを含有し得る。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、「野生型」は、選抜育種又はトランス遺伝子による形質転換によって生じ得る突然変異形態と区別するときの、それが天然で存在するとおりの典型的な形態の生物、変種、株、遺伝子、タンパク質、又は特徴である。
【００９１】
本明細書において特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００９２】
考察
ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合遺伝子及びタンパク質
ヒトＣＤＫＬ５において、既報告の最初の２つのスプライス変異体は５’ＵＴＲが異なり、同じ１１５ｋＤａタンパク質を産生する。これらは、アイソフォームＩ（エクソン１を含む。これは幅広い組織で転写される）、及びアイソフォームＩＩ（エクソン１ａ及び１ｂを含む。これは精巣及び胎児脳に限局される）と称される（Ｋａｌｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，７２：１４０１−１１及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，１３１：１８７−２００）。得られるＣＤＫＬ５転写物は、分子量が１１５ｋＤａの１０３０アミノ酸のタンパク質（ＣＤＫＬ５１１５）を生成し、主として精巣に発現する。最近になって、少なくとも３つの個別的なヒトタンパク質アイソフォームにつながる選択的スプライシングイベントが同定された。それらのアイソフォームのうちの１つは、改変されたＣ末端領域によって特徴付けられ、ＣＤＫＬ５１０７と称される。（Ｆｉｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，５６：５２−５７、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｈｅｃｔｏｒ  ｅｔ．ａｌ．２０１６．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．１１（６）：ｅ０１５７７５８）。ＣＤＫＬ５１０７は、ヒト及びマウス脳における優勢なアイソフォームである。あらゆるヒト組織でＣＤＫＬ５１０７が最も豊富な転写物であり、組織はＣＤＫＬ５１１５の１０〜１００倍又はそれ以上のＣＤＫＬ５１０７を発現する。詳細には、全脳では、ＣＤＫＬ５１０７がＣＤＫＬ５１１５よりも３７倍多い。精巣は例外で、ＣＤＫＬ５１０７がＣＤＫＬ５１１５よりも２．５倍多いに過ぎず、この組織にＣＤＫＬ５１１５が相対的に豊富であることを反映している。２つのアイソフォームで異なるＣＤＫＬ５のＣ末端が、その細胞内局在の調節、及び核内へのトランケート型タンパク質の蓄積において重要である。（Ｂｅｒｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３２０４８−５６及びＲｕｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８３：３０１０１−１１）。
【００９３】
ＣＤＫＬ５１０７アイソフォームの細胞分布が調査されており、細胞内局在及び触媒活性が先行研究のヒトＣＤＫＬ５１１５タンパク質と、完全ではないが、大幅に重複することが明らかとなっている。インビトロデータからは、ＣＤＫＬ５１１５アイソフォームのプロテアソーム分解が、このアイソフォームにのみ存在するアミノ酸９０４〜１０３０の間のシグナルによって媒介される一方、ＣＤＫＬ５１０７は安定性がより高く、プロテアソーム経路で分解しにくいことが指摘される。
【００９４】
融合遺伝子及びタンパク質
本明細書には、修飾ＴＡＴ（ＴＡＴκ）配列を含む様々なＣＤＫＬ５融合タンパク質をコードする組換えｃＤＮＡ配列が開示される。融合タンパク質に含まれるＣＤＫＬ５は、ＣＤＫＬ５１１５アイソフォームであってもよい。融合タンパク質に含まれるＣＤＫＬ５は、ＣＤＫＬ５１０７アイソフォームであってもよい。配列番号２がＣＤＫＬ５１１５アイソフォームポリペプチドに対応し、配列番号１６がＣＤＫＬ５１０７アイソフォームポリペプチドに対応する。一実施形態において、この融合タンパク質は、ＴＡＴκポリペプチドに作動可能に結合しているヒトＣＤＫＬ５ポリペプチドを含む。ＣＤＫＬ５融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１、７、９、１１、１３のいずれか一つに従う配列、又は本明細書に記載されるその変異体を有し得る。ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、配列番号８、１０、１２、１４のいずれか一つに従うポリペプチド配列、又は本明細書に記載されるその変異体を有し得る。
【００９５】
一部の実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は配列番号１又は１５に従い得る。更なる実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡは、配列番号１又は１５と約９０％〜約１００％、８０％〜約９０％、又は約５０％〜約８０％同一であり得る。一部の実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は、配列番号２又は１６に従うアミノ酸配列をコードし得る。更なる実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は、配列番号２又は１６と約９０％〜約１００％、８０％〜約９０％、又は約５０％〜約８０％同一のアミノ酸配列をコードし得る。
【００９６】
一部の実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は、配列番号１内の１２連続ヌクレオチドと約９０％〜１００％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であり得る。一部の実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は、配列番号１内の１２連続ヌクレオチドと約８０％〜９０％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であり得る。一部の実施形態において、ｃＤＮＡ配列は、配列番号１内の１２連続ヌクレオチドと約５０％〜８０％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であり得る。
【００９７】
一部の実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は、配列番号１５内の１２連続ヌクレオチドと約９０％〜１００％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であり得る。一部の実施形態において、ヒトＣＤＫＬ５  ｃＤＮＡ配列は、配列番号１５内の１２連続ヌクレオチドと約８０％〜９０％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であり得る。一部の実施形態において、ｃＤＮＡ配列は、配列番号１５内の１２連続ヌクレオチドと約５０％〜８０％同一の少なくとも１２連続ヌクレオチドの断片であり得る。
【００９８】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、ヒトＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合した修飾トランス作用転写活性化（ＴＡＴ）タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）（ＴＡＴκ）を含む。ＴＡＴκは、配列番号３に従うｃＤＮＡ配列及び配列番号４に従うアミノ酸配列を有し得る。ＴＡＴκは修飾ＴＡＴ−ＰＴＤである。非修飾ＴＡＴ−ＰＴＤは細胞へのペプチド及びタンパク質の形質導入を媒介する。しかしながら、非修飾ＴＡＴ−ＰＴＤによっては、細胞によるＴＡＴ−ＰＴＤ融合タンパク質の分泌は可能とならない。非修飾ＴＡＴ−ＰＴＤは非修飾ＴＡＴ−ＰＴＤ内に位置するフューリン認識配列でフューリンエンドプロテアーゼによって融合タンパク質から切断される。対照的に、ＴＡＴκはフューリン認識配列を含まないように修飾される。そのため、ＴＡＴκを含む本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質は、その完全な形態で真核細胞によって分泌され得る。
【００９９】
一部の実施形態において、ＴＡＴκ  ｃＤＮＡ配列は配列番号３と約９０％〜１００％又は約８０％〜約９０％同一であり得る。一部の実施形態において、ＴＡＴκ  ｃＤＮＡは、配列番号４と約９０％〜１００％又は約８０％〜約９０％同一のポリペプチド配列をコードし得る。ＴＡＴκ  ｃＤＮＡは、ＣＤＫＬ５融合タンパク質をコードするｃＤＮＡに作動可能に結合されてもよい。
【０１００】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、任意選択で、細胞による産生中にポリペプチドを下流の分泌経路に導くＩｇκ鎖リーダー配列を含み得る。一部の実施形態において、Ｉｇκ鎖リーダー配列はヒトＣＤＫＬ５ポリペプチドのＮ末端に作動可能に結合していてもよい。Ｉｇκ鎖リーダー配列は、配列番号５に従うｃＤＮＡ配列又は本明細書に記載されるその変異体を有することができ、及び配列番号６に従うアミノ酸配列又は本明細書に記載されるその変異体を有することができる。Ｉｇκ鎖リーダー配列ｃＤＮＡは、ＣＤＫＬ５融合タンパク質をコードするｃＤＮＡに作動可能に結合されてもよい。
【０１０１】
他の実施形態において、Ｉｇκ鎖リーダー配列ｃＤＮＡは、配列番号５と約９０％〜１００％、約８０％〜約９０％、又は約８０％〜９０％同一であり得る。一部の実施形態において、Ｉｇκ鎖リーダー配列は、配列番号６と約９０％〜約１００％、約８０％〜約９０％、又は約５０％〜約８０％同一のアミノ酸配列を有し得る。
【０１０２】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、任意選択で、ＣＤＫＬ５融合タンパク質に作動可能に結合した１つ以上のタンパク質タグを含み得る。こうした種類のタグは、融合タンパク質のアフィニティー精製、可溶化、クロマトグラフ分離、及び／又は免疫検出を可能にするアミノ酸配列である。好適なタンパク質タグとしては、限定はされないが、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧタグ（任意のＦＬＡＧタグ変種、例えば３ｘ  ＦＬＡＧを含む）、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｔｃタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｔｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）、及びＮｕｓタグが挙げられる。それぞれ配列番号８、１０、又は１２に従うアミノ酸配列を有する配列番号７、９、又は１１に従うＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡは、ＴＡＴκ、及びＭｙｃタグ及びポリ（ＨＩＳ）タグを含むＣＤＫＬ５融合タンパク質の非限定的な実施形態を表す。配列番号１４に従うアミノ酸配列を有する配列番号１３に従うＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡは、ＦＬＡＧタグを有するＣＤＫＬ５融合タンパク質の非限定的な実施形態を表す。
【０１０３】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、任意選択で、ＣＤＫＬ５ポリペプチドに作動可能に結合した１つ以上のレポータータンパク質を含み得る。好適なレポーター遺伝子としては、限定はされないが、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ））、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ（細菌性、ホタル、及びウミシイタケルシフェラーゼ）、抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びＮＰＴ−ＩＩ）、ｐ−グルクロニダーゼ、及びアルカリホスファターゼが挙げられる。レポータータンパク質を含めることにより、とりわけ、融合タンパク質及び融合タンパク質機能の直接的及び／又は間接的な特徴付け、並びにタンパク質のアフィニティー精製が可能となる。レポータータンパク質は、ヒトＣＤＫＬ５ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に作動可能に連結されてもよい。他の実施形態において、レポータータンパク質は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に作動可能に連結されてもよい。それぞれ配列番号１０又は１２に従うアミノ酸配列を有する配列番号９又は１１に従うＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡは、蛍光レポータータンパク質を含むＣＤＫＬ５融合タンパク質の非限定的な実施形態を表す。
【０１０４】
組換えベクター
ＣＤＫＬ５融合ｃＤＮＡ配列は、好適な発現ベクターに導入することができる。発現ベクターは、ＣＤＫＬ５融合ｃＤＮＡの発現を促進するために使用される１つ以上の調節配列又は１つ以上の他の配列を含み得る。発現ベクターは、ＣＤＫＬ５融合発現ベクターの複製を促進するために使用される１つ以上の調節配列又は１つ以上の他の配列を含み得る。発現ベクターは細菌細胞におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現に好適であり得る。他の実施形態において、発現ベクターは酵母細胞におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現に好適であり得る。更なる実施形態において、発現ベクターは植物細胞におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現に好適であり得る。他の実施形態において、発現ベクターは哺乳類細胞におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現に好適であり得る。別の実施形態において、ベクターは真菌細胞におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現に好適であり得る。更なる実施形態において、ベクターは昆虫細胞におけるＣＤＫＬ５融合タンパク質の発現に好適であり得る。好適な発現ベクターは、概して当業者に公知である。
【０１０５】
ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５タンパク質の作製
一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は細胞培養系においてインビトロで作製される。細胞培養系は１つ以上の細菌、酵母、昆虫、真菌、植物、又は哺乳類細胞を含み得る。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は１つ又は複数の培養細胞によって細胞培養培地中に分泌される。他の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は１つ又は複数の培養細胞の細胞質内又は膜内に含まれる。
【０１０６】
従って、図１を見ると、図１は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を作製する方法の一実施形態を示し、ここでＣＤＫＬ５融合タンパク質は培養細胞によって作製され、周囲の培養培地中に分泌される。この方法は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡ配列を含む好適なベクターを培養液中の１つ又は複数の細胞にトランスフェクトし又は他の形で送達することから始まる（６０００）。次に概して公知の方法を用いて細胞を培養し（６０１０）、トランスフェクト細胞にベクターからＣＤＫＬ５融合タンパク質を産生させて、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を周囲の細胞培養培地中に分泌させる。他の実施形態では、一般に当業者に公知の技法を用いてＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡを含むベクターのうちの１つ以上を発現する安定にトランスフェクトされた細胞株が作成されてもよい。こうした細胞は、細胞にＣＤＫＬ５融合タンパク質を産生させる一般に公知の方法を用いて培養することができる（６０１０）。
【０１０７】
好適な時間が経った後、分泌されたＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する培養培地を回収する（６０２０）。一部の実施形態において、細胞は約１２時間〜約９６時間培養される。この時点で、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を培養培地から更に精製する必要があるか否かが決まる（６０３０）。一部の実施形態では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する培地はそれ以上精製せず、１つ以上の細胞の形質導入に直接使用する（６０５０）。他の実施形態では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を培養培地から更に精製し、及び／又はそこで濃縮する。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は好適な方法を用いて精製及び／又は濃縮される。好適な方法としては、限定はされないが、溶媒分配法、塩溶又は塩析、アフィニティーベースの方法、並びに疎水性相互作用、イオン交換、混合モード、色素結合、及びサイズ排除などのクロマトグラフ分離法が挙げられ、Ｋａｍｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３７７，１１６２−１１６７（２００８））、Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ５３５，２５７−２６７（２０１３））、及びＫａｔａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，２９７５−２９８７（２０１５））（これらは参照によって援用される）に例示されるとおりである。
【０１０８】
分泌による作製方法の理解を念頭に置いて図２を見ると、図２は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を作製する方法の一実施形態を示し、ここでＣＤＫＬ５融合タンパク質は周囲の細胞培養培地中に分泌されない。この方法は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡ配列を含む好適なベクターを培養液中の１つ又は複数の細胞にトランスフェクトし又は他の形で送達することから始まる（６０００）。次に概して公知の方法を用いて細胞を培養し（６０１０）、トランスフェクト細胞にベクターからＣＤＫＬ５融合タンパク質を産生させる。好適な時間が経った後、標準方法を用いて細胞を溶解させる（７０００）。一部の実施形態において、細胞は溶解前に１２時間〜９６時間培養される。
【０１０９】
次に、ＣＤＫＬ５融合タンパク質が細胞膜内に取り込まれたか、それとも細胞質内に取り込まれたかを決定する（７０１０）。ＣＤＫＬ５融合タンパク質が膜画分にある場合、その膜画分を回収する（７０２０）。膜画分を回収（７０２０）した後、好適な方法を用いてＣＤＫＬ５融合タンパク質を膜画分から分離して（６０４０）、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を精製及び／又は濃縮する。
【０１１０】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質が細胞質に存在する実施形態では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する上清を回収する（７０３０）。上清を回収（７０３０）した後、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を更に精製及び／又は濃縮するべきかどうかを決定する。ＣＤＫＬ５融合タンパク質を更に精製及び／又は濃縮するべきであると決定された場合、好適な方法を用いてＣＤＫＬ５融合タンパク質を精製及び／又は濃縮する（６０４０）。好適な方法としては、限定はされないが、アフィニティー精製法、サイズ排除分離法、及びクロマトグラフ分離法が挙げられる。ＣＤＫＬ５を上清から更に精製及び／又は濃縮するべきではないと決定される他の実施形態では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する上清を細胞の形質導入に直接使用する（６０５０）。
【０１１１】
ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物及び製剤
本開示の範囲内にはまた、本明細書に記載されるとおりのＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物及び製剤もある。本組成物は、本明細書に記載される方法に従い作製することができるＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する培地又は上清であってもよい。
【０１１２】
本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質は、それを必要としている対象に単独で又は医薬製剤において活性成分などとして提供することができる。そのため、本明細書にはまた、ある量のＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する医薬製剤も記載される。一部の実施形態において、医薬製剤はＣＤＫＬ５融合タンパク質の治療有効量を含有する。本明細書に記載される医薬製剤は、それを必要としている対象に投与され得る。それを必要としている対象は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、及び／又はその症状を有し得る。他の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、及び／又はその症状の治療又は予防用薬物の製造において使用することができる。
【０１１３】
薬学的に許容可能な担体並びに補助成分及び薬剤
本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質の治療有効量を含有する医薬製剤は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。好適な薬学的に許容可能な担体としては、限定はされないが、活性組成物と有害な反応を起こすことのない水、塩溶液、アルコール類、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール類、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトース、アミロース又はデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル類、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。
【０１１４】
医薬製剤は滅菌し、及び必要であれば、活性組成物と有害な反応を起こすことのない補助薬剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香味料及び／又は芳香物質などと混合することができる。
【０１１５】
本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質の治療有効量に加えて、医薬製剤はまた、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、必須腫瘍タンパク質及び遺伝子の翻訳又は転写を阻害するリボザイムのガイド配列、ホルモン類、免疫調節薬、解熱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮痛薬、鎮痙剤、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、抗感染薬、及び化学療法薬を含めた補助活性薬剤の有効量も含むことができる。
【０１１６】
好適なホルモン類としては、限定はされないが、アミノ酸誘導体ホルモン類（例えば、メラトニン及びサイロキシン）、小ペプチドホルモン類及びタンパク質ホルモン類（例えば、サイロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、インスリン、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン）、エイコサノイド類（ｅｉｃｏｎｓａｎｏｉｄ）（例えば、アラキドン酸、リポキシン類、及びプロスタグランジン類）、及びステロイドホルモン類（例えば、エストラジオール、テストステロン、テトラヒドロテストステロンコルチゾール）が挙げられる。
【０１１７】
好適な免疫調節薬としては、限定はされないが、プレドニゾン、アザチオプリン、６−ＭＰ、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１２）、サイトカイン類（例えば、インターフェロン類（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子、及びイミキモド）、ケモカイン類（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６及びＣＸＣＬ７）、シトシンリン酸グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド類、グルカン類、抗体、及びアプタマー）が挙げられる。
【０１１８】
好適な解熱薬としては、限定はされないが、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、アスピリン及び関連サリチル酸塩類（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓａｌｉｃｙｌａｅ）、及びサリチル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｉｃａｙｌａｔｅ））、パラセタモール／アセトアミノフェン、メタミゾール、ナブメトン、フェナゾン、及びキニーネが挙げられる。
【０１１９】
好適な抗不安薬としては、限定はされないが、ベンゾジアゼピン系（例えば、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼパート、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、及びトフィソパム）、セロトニン系抗うつ薬（ｓｅｒｏｔｅｎｅｒｇｉｃ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ）（例えば、選択的セロトニン再取込み阻害薬、三環系抗うつ薬（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｅｎｔ）、及びモノアミンオキシダーゼ阻害薬）、メビカール、アホバゾール、セランク（ｓｅｌａｎｋ）、ブロマンタン、エモキシピン、アザピロン、バルビツール酸系薬、ヒドロキシジン、プレガバリン、バリドール、及びβ遮断薬が挙げられる。
【０１２０】
好適な抗精神病薬としては、限定はされないが、ベンペリドール、ブロムペリドール（ｂｒｏｍｏｐｅｒｉｄｏｌ）、ドロペリドール、ハロペリドール、モペロン、ピパンペロン（ｐｉｐａｐｅｒｏｎｅ）、チミペロン、フルスピリレン、ペンフルリドール、ピモジド、アセプロマジン、クロルプロマジン、シアメマジン、ジキシラジン（ｄｉｚｙｒａｚｉｎｅ）、フルフェナジン、レボメプロマジン、メソリダジン、ペラジン、ペリシアジン、ペルフェナジン、ピポチアジン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロチペンジル、チオプロペラジン、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、クロルプロチキセン、クロペンチキソール、フルペンチキソール、チオチキセン、ズクロペンチキソール、クロチアピン、ロキサピン、プロチペンジル、カルピプラミン、クロカプラミン、モリンドン、モサプラミン、スルピリド、ベラリプリド、アミスルプリド、アモキサピン、アリピプラゾール、アセナピン、クロザピン、ブロナンセリン、イロペリドン、ルラシドン、メルペロン、ネモナプリド、オランザピン（ｏｌａｎｚａｐｒｉｎｅ）、パリペリドン、ペロスピロン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、トリミプラミン、ジプラシドン、ゾテピン、アルストニン（ａｌｓｔｏｎｉｅ）、ビフェプルノックス（ｂｅｆｅｐｒｕｎｏｘ）、ビトペルチン、ブレクスピプラゾール、カンナビジオール、カリプラジン、ピマバンセリン、ポマグルメタッドメチオニル、バビカセリン、キサノメリン、及びジクロナピンが挙げられる。
【０１２１】
好適な鎮痛薬としては、限定はされないが、パラセタモール／アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ−２阻害薬（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、オピオイド系（例えば、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジヒドロモルフィン、ペチジン、ブプレノルフィン）、トラマドール、ノルエピネフリン、フルピルチン（ｆｌｕｐｉｒｅｔｉｎｅ）、ネホパム、オルフェナドリン、プレガバリン、ガバペンチン、シクロベンザプリン、スコポラミン、メサドン、ケトベミドン、ピリトラミド、及びアスピリン及び関連サリチル酸塩類（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）が挙げられる。
【０１２２】
好適な鎮痙剤としては、限定はされないが、メベベリン、パパベリン（ｐａｐｖｅｒｉｎｅ）、シクロベンザプリン、カリソプロドール、オルフェナドリン、チザニジン、メタキサロン、メトカルバモール（ｍｅｔｈｏｄｃａｒｂａｍｏｌ）、クロルゾキサゾン、バクロフェン、ダントロレン、バクロフェン、チザニジン、及びダントロレンが挙げられる。
【０１２３】
好適な抗炎症薬としては、限定はされないが、プレドニゾン、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ−２阻害薬（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、及び免疫選択的抗炎症誘導体（例えば、顎下腺ペプチドＴ及びその誘導体）が挙げられる。
【０１２４】
好適な抗ヒスタミン薬としては、限定はされないが、Ｈ１受容体拮抗薬（例えば、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、ブロモジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、セチリジン、クロルプロマジン、シクリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスブロムフェニラミン（ｄｅｘｂｒｏｍａｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシラミン、エバスチン（ｅｂａｓｉｎｅ）、エンブラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、レボセチリジン（ｌｅｖｏｃｅｔｉｒｚｉｎｅ）、ロラタジン、メクロジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、ピリラミン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、及びトリプロリジン）、Ｈ２受容体拮抗薬（例えば、シメチジン、ファモチジン、ラフチジン、ニザチジン、ラニチジン（ｒａｆｉｔｉｄｉｎｅ）、及びロキサチジン）、トリトクアリン、カテキン、クロモグリク酸、ネドクロミル、及びβ２−アドレナリン作動薬が挙げられる。
【０１２５】
好適な抗感染薬としては、限定はされないが、抗アメーバ薬（例えば、ニタゾキサニド、パロモマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、クロロキン、ミルテホシン、アムホテリシンＢ、及びヨードキノール）、アミノグリコシド系（例えば、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、及びネオマイシン）、駆虫薬（例えば、ピランテル、メベンダゾール、イベルメクチン、プラジカンテル、アベンダゾール（ａｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、チアベンダゾール、オキサムニキン）、抗真菌薬（例えば、アゾール系抗真菌薬（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、ポサコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、及びボリコナゾール）、エキノキャンディン系（例えば、カスポファンギン、アニデュラファンギン、及びミカファンギン）、グリセオフルビン、テルビナフィン、フルシトシン、及びポリエン系（例えば、ナイスタチン、及びアムホテリシンＢ）、抗マラリア剤（例えば、ピリメタミン／スルファドキシン、アルテメーテル／ルメファントリン、アトバコン／プログアニル（ｐｒｏｑｕａｎｉｌ）、キニーネ、ヒドロキシクロロキン、メフロキン、クロロキン、ドキシサイクリン、ピリメタミン、及びハロファントリン）、抗結核剤（例えば、アミノサリチル酸塩類（例えば、アミノサリチル酸）、イソニアジド／リファンピン、イソニアジド／ピラジナミド／リファンピン、ベダキリン、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、及びサイクロセリン）、抗ウイルス薬（例えば、アマンタジン、リマンタジン、アバカビル／ラミブジン、エムトリシタビン／テノホビル、コビシスタット／エルビテグラビル／エムトリシタビン／テノホビル、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノホビル、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン、ラミブジン／ジドブジン、エムトリシタビン／テノホビル、エムトリシタビン／ロピナビル（ｏｐｉｎａｖｉｒ）／リトナビル／テノホビル、インターフェロンα−２ｖ／リバビリン、ペグインターフェロンα−２ｂ、マラビロク、ラルテグラビル、ドルテグラビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン、オセルタミビル、ザナミビル、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリン、リルピビリン、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｉｄｉｎｅ）、ネビラピン、エンテカビル、ラミブジン、アデホビル、ソホスブビル、ジダノシン、テノホビル、アバシブル（ａｖａｃｉｖｒ）、ジドブジン、スタブジン、エムトリシタビン、ザルシタビン（ｘａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、テルビブジン、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、ロピナビル／リトナビル、ホスアンプレナビル（ｆｏｓａｍｐｒｅｎｖｉｒ）、ドラヌアビル（ｄｒａｎｕａｖｉｒ）、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル、サキナビル（ｓａｗｕｉｎａｖｉｒ）、リバビリン、バラシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、及びバルガンシクロビル）、カルバペネム系（例えば、ドリペネム、メロペネム、エルタペネム、及びシラスタチン／イミペネム）、セファロスポ��ン系（例えば、セファドロキシル、セフラジン、セファゾリン、セファレキシン、セフェピム、セフタロリン（ｃｅｆｌａｒｏｌｉｎｅ）、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セファクロル、セフチブテン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフジニル、セフィキシム、セフジトレン、セフチゾキシム（ｃｅｆｉｚｏｘｉｍｅ）、及びセフタジジム）、グリコペプチド系抗生物質（例えば、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、及びテラバンシン（ｔｅｌｖａｎｃｉｎ））、グリシルサイクリン系（例えば、チゲサイクリン）、抗らい菌薬（例えば、クロファジミン及びサリドマイド）、リンコマイシン及びその誘導体（例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン）、マクロライド系及びその誘導体（例えば、テリスロマイシン、フィダキソマイシン、エリスロマイシン（ｅｒｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、及びトロレアンドマイシン）、リネゾリド、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、リファキシミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、メトロニダゾール、アズトレオナム、バシトラシン、ペニシリン系（アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、クラブラン酸塩／チカルシリン、ペニシリン、プロカインペニシリン、オキサシリン（ｏｘａｘｉｌｌｉｎ）、ジクロキサシリン、及びナフシリン）、キノロン系（例えば、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン（ｑａｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、トロバフロキサシン、及びスパルフロキサシン）、スルホンアミド系（例えば、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、スルファサラジン、及びスルフイソキサゾール（ｓｕｌｆａｓｏｘａｚｏｌｅ））、テトラサイクリン系（例えば、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン／サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ドキシサイクリン／ω−３多価不飽和脂肪酸、及びテトラサイクリン）、及び尿路感染症薬（例えば、ニトロフラントイン、メテナミン、ホスホマイシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びメチレンブルー）が挙げられる。
【０１２６】
好適な化学療法薬としては、限定はされないが、パクリタキセル、ブレンツキシマブベドチン、ドキソルビシン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、エベロリムス、ペメトレキセド、メルファラン、パミドロネート、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、オファツムマブ、ベバシズマブ、ベリノスタット、トシツモマブ、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、ブスルファン、アレムツズマブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、ダウノルビシン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、ラムシルマブ、シタラビン、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ヒドロキシウレア、デカルバジン、ロイプロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｇｉｎａｓｅ）、アミホスチン、エトポシド、フルタミド、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、プララトレキサート、メトトレキサート、フロクスウリジン、オビヌツズマブ、ゲムシタビン、アファチニブ、メシル酸イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅｍ）、カルムスチン、エリブリン、トラスツズマブ、アルトレタミン、トポテカン、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、インターフェロンα−２ａ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イクサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、カルフィルゾミブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、ミトタン、ビンクリスチン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、塩化ストロンチウム−８９、メクロレタミン、マイトマイシン、ブスルファン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ビノレルビン、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、タモキシフェン、ミトキサントロン、ペグアスパラガーゼ、デニロイキンジフチトクス、アリトレチノイン、カルボプラチン、ペルツズマブ、シスプラチン、ポマリドミド、プレドニゾン、アルデスロイキン、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドマイド、リツキシマブ、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｔｉｄｅ）、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、シルツキシマブ、オマセタキシン、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（チオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ））、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、ＢＣＧ、テムシロリムス、塩酸ベンダムスチン、トリプトレリン、三酸化ヒ素（ａｒｅｓｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、ラパチニブ、バルルビシン、パニツムマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、トレチノイン、アザシチジン、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、イピリムマブ、ゴセレリン、ボリノスタット、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、エポチロン、タフルポシド、アザチオプリン、ドキシフルリジン、ビンデシン、及びオールトランス型レチノイン酸が挙げられる���
【０１２７】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質及び補助薬剤の有効量
医薬製剤は、治療有効量のＣＤＫＬ５融合タンパク質と、任意選択で治療有効量の補助薬剤とを含有し得る。正確な投薬量は、対象の年齢、サイズ、性別及び状態、治療しようとする障害の性質及び重症度などによって異なり得る；従って、正確な有効量を前もって特定することはできず、医療従事者が決定することになる。しかしながら、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の治療有効量は一般的に約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。さらなる実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の治療有効量は１ｎｇ／ｇ体重〜約０．１ｍｇ／ｇ体重の範囲であり得る。ＣＤＫＬ５融合タンパク質の治療有効量は約１ｐｇ〜約１０ｇの範囲であり得る。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する医薬組成物の治療有効量は約１０ｎＬ〜約１０ｍＬの範囲であり得る。他の実施形態においてＣＤＫＬ５融合タンパク質又は医薬組成物の治療有効量約１０ｎＬ〜約１μＬ。
【０１２８】
一部の実施形態において、治療有効量はまた、例えば脳室内注射に関して注射１回当たり約２０〜約５０ｎｇの範囲であり得る。他の実施形態において、治療有効量は例えば脳室内注射に関して注射１回当たり約１０マイクロリットルであり得る。更なる実施形態において、治療有効量は例えば脳室内注射に関して約５ｎｇ／μＬであり得る。更に別の実施形態において、治療有効量は脳室内注射に関して約１．９μｇ／体重ｋｇであり得る。他の実施形態において、治療有効量は脳室内注射に関して約１〜３μｇ／体重ｋｇであり得る。
【０１２９】
他の実施形態において、治療有効量は例えば全身投与注射に関して注射１回当たり約１〜約２マイクログラムであり得る。一部の実施形態において、治療有効量は例えば全身注射に関して約５ｎｇ／μＬであり得る。一部の実施形態について、治療有効量は体重５ｇ当たり約１〜約１．５μｇであり得る。
【０１３０】
１つ以上の実施形態において、全身投与は静脈内投与である。静脈内製剤は、直接的な静脈内注射（ｉ．ｖ．ボーラス）によって投与されてもよく、又は０．９％塩化ナトリウム注射液又は他の適合性のある注入溶液など、適切な注入溶液に加えることにより注入によって投与されてもよい。最も一般的に用いられる静脈内注入システムは、静脈内輸液が充填されたバッグ、点滴チャンバ、流量制御用のローラークランプ（可変抵抗制御器）及び静脈内カテーテルに接続される管類からなる。このシステムでは高所にある静脈内輸液バッグが圧力源として働き、ローラークランプがユーザー制御の抵抗として働き、及び静脈内カテーテルが固定抵抗として働く。
【０１３１】
最も一般的には、静脈内輸液の流速は、点滴チャンバを通じた液滴の滴下が観察される速度によって決まる。非経口溶液の重力注入は、溶液容器を患者の数フィート上に吊るし、点滴チャンバ及び可撓性送達チューブを含む使い捨て静脈内投与セットを用いて溶液容器を静脈穿刺部位に接続することにより達成される。
【０１３２】
医薬製剤中にＣＤＫＬ５融合タンパク質に加えて補助活性薬剤が含まれる実施形態において、補助活性薬剤の治療有効量は、その補助活性薬剤に応じて異なり得る。一部の実施形態において、補助活性薬剤の有効量は０．００１マイクログラム〜約１ミリグラムの範囲である。他の実施形態において、補助活性薬剤の有効量は約０．０１ＩＵ〜約１０００ＩＵの範囲である。更なる実施形態において、補助活性薬剤の有効量は０．００１ｍＬ〜約１ｍＬの範囲である。更に他の実施形態において、補助活性薬剤の有効量は医薬製剤全体の約１％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗの範囲である。更なる実施形態において、補助活性薬剤の有効量は医薬製剤全体の約１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖの範囲である。更に他の実施形態において、補助活性薬剤の有効量は医薬製剤全体の約１％ｗ／ｖ〜約５０％ｗ／ｖの範囲である。
【０１３３】
投薬形態
一部の実施形態において、本明細書に記載される医薬製剤は投薬形態であり得る。投薬形態は、任意の適切な経路による投与に適合され得る。適切な経路としては、限定はされないが、経口（頬側又は舌下を含む）、直腸、硬膜外、頭蓋内、眼内、吸入、鼻腔内、局所（頬側、舌下、又は経皮を含む）、腟内、尿道内、非経口、頭蓋内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、骨内、心臓内、関節内、空洞内、くも膜下腔内、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｒｅａｌ）、脳内、及び脳室内及び皮内が挙げられる。かかる製剤は、当該技術分野において公知の任意の方法によって調製し得る。
【０１３４】
経口投与に適合された投薬形態は、個別の投薬量単位、例えば、カプセル、ペレット又は錠剤、粉末又は顆粒、溶液、又は懸濁物であって、水性若しくは非水性液体中；食用の泡又はホイップ、又は水中油液体エマルション若しくは油中水液体エマルション中のものであり得る。一部の実施形態において、経口投与に適合された医薬製剤はまた、医薬製剤を香味付けし、保存し、着色し、又はその分散を助ける１つ以上の薬剤も含む。経口投与用に調製された投薬形態はまた、泡、スプレー、又は液体溶液として送達することのできる液体溶液の形態であってもよい。一部の実施形態において、経口投薬形態は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物の治療有効量又はその適切な一部を含有する医薬製剤を約１ｎｇ〜１０００ｇ含有し得る。経口投薬形態は、それを必要としている対象に投与することができる。
【０１３５】
適切な場合には、本明細書に記載される投薬形態はマイクロカプセル化することができる。投薬形態はまた、任意の成分の放出が延長され又は持続するように調製することもできる。一部の実施形態では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質が、放出を遅延させる成分である。他の実施形態では、任意選択で含められる補助成分の放出が遅延される。成分の放出を遅延させる好適な方法としては、限定はされないが、ポリマー、ワックス、ゲルなどの材料に成分をコーティングするか又は埋め込むことが挙げられる。遅延放出投薬製剤は、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｔａｂｌｅｔｓ，”  ｅｄｓ．Ｌｉｂｅｒｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９）、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  −  Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０００、及び“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）に記載されるとおり調製することができる。これらの文献は、錠剤及びカプセル並びに遅延放出投薬形態の錠剤及びペレット、カプセル、及び顆粒を調製するための賦形剤、材料、設備、及び方法に関する情報を提供する。遅延放出は約１時間から約３ヵ月又はそれ以上の範囲であり得る。
【０１３６】
好適なコーティング材料の例としては、限定はされないが、セルロースポリマー、例えば、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及び酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース；酢酸フタル酸ポリビニル、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、及び商標名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（Ｒｏｔｈ  Ｐｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ、独国）で市販されているメタクリル樹脂、ゼイン、シェラック、及び多糖類が挙げられる。
【０１３７】
コーティングは、所望の放出プロファイルを生じさせるため、水不溶性／水溶性非ポリマー賦形剤を伴い又は伴わず、異なる比率の水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、及び／又はｐＨ依存性ポリマーで形成され得る。コーティングは、限定はされないが、錠剤（コーティングされたビーズを伴う又は伴わない圧縮されたもの）、カプセル（コーティングされたビーズを伴う又は伴わない）、ビーズ、粒子組成物、限定はされないが懸濁液形態又はふりかける投薬形態として製剤化された「成分そのまま」を含む投薬形態（マトリックス又は単純）の上に施すことができる。
【０１３８】
局所投与に適合された投薬形態は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又は油として製剤化することができる。眼又は他の外部組織、例えば口又は皮膚の治療に関する一部の実施形態では、医薬製剤は局所軟膏又はクリームとして適用される。軟膏として製剤化される場合、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、補助活性成分、及び／又はその薬学的に許容可能な塩は、パラフィン系又は水混和性軟膏基剤と共に製剤化することができる。他の実施形態では、活性成分は、水中油クリーム基剤又は油中水基剤を含むクリームとして製剤化することができる。口内の局所投与に適合された投薬形態としては、ロゼンジ、トローチ、及び洗口液が挙げられる。
【０１３９】
鼻内又は吸入投与に適合された投薬形態としては、エアロゾル、溶液、懸濁液滴、ゲル、又は乾燥粉末が挙げられる。一部の実施形態において、吸入に適合された投薬形態のＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、補助活性成分、及び／又はその薬学的に許容可能な塩は、マイクロナイゼーションによって得られる又は得ることのできる低粒径化された形態である。一部の実施形態において、低粒径化された（例えば、マイクロナイズされた）化合物又はその塩若しくは溶媒和物の粒径は、当該技術分野において公知の適切な方法で計測したとき約０．５〜約１０ミクロンであるＤ５０値によって定義される。吸入による投与に適合された投薬形態としてはまた、粒子ダスト又はミストも挙げられる。担体又は賦形剤が鼻腔内スプレー又は点鼻薬として投与するための液体である好適な投薬形態としては、活性成分の水性又は油性溶液／懸濁液が挙げられ、これは各種の定量式加圧エアロゾル、ネブライザー、又はインサフレーターによって生成され得る。
【０１４０】
一部の実施形態において、投薬形態は、吸入による投与に好適なエアロゾル製剤である。これらの実施形態の一部では、エアロゾル製剤は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及び／又はその薬学的に許容可能な塩の溶液又は微細懸濁液と、薬学的に許容可能な水性又は非水性溶媒とを含有する。エアロゾル製剤は密封容器に無菌形態で単一用量又は複数用量の分量で提供され得る。これらの実施形態の一部について、密封容器は、定量弁を備えた単一用量又は複数用量鼻内又はエアロゾルディスペンサー（例えば、定量噴霧式吸入器）であり、これは容器の内容物が吐き出された後に廃棄することが意図される。
【０１４１】
エアロゾル投薬形態をエアロゾルディスペンサーに入れる場合、ディスペンサーは圧縮空気、二酸化炭素、又は限定はされないがヒドロフルオロカーボンを含めた有機噴射剤など、圧力下にある好適な噴射剤を含む。他の実施形態におけるエアロゾル製剤投薬形態はポンプ式アトマイザーに入れられる。加圧エアロゾル製剤はまた、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、又はその医薬製剤の溶液又は懸濁液も含有し得る。更なる実施形態において、エアロゾル製剤はまた、例えば製剤の安定性及び／又は味及び／又は微粒子集団特性（量及び／又はプロファイル）を改善するために配合される共溶媒及び／又は調整剤も含有する。エアロゾル製剤の投与は１日１回又は１日数回、例えば１日２、３、４、又は８回であってもよく、ここで１回につき１、２、又は３用量が送達される。
【０１４２】
吸入投与に好適な及び／又は適合された一部の投薬形態について、医薬製剤は乾燥粉末吸入可能製剤である。ＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、補助活性成分、及び／又はその薬学的に許容可能な塩に加えて、かかる投薬形態は、粉末基剤、例えば、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、及び／又はデンプンを含有することができる。これらの実施形態の一部では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、補助活性成分、及び／又はその薬学的に許容可能な塩は低粒径化された形態である。更なる実施形態において、パフォーマンス調整剤、例えば、Ｌ−ロイシン又は別のアミノ酸、セロビオースオクタアセテート、及び／又はステアリン酸の金属塩、例えばステアリン酸マグネシウム又はカルシウム。
【０１４３】
一部の実施形態において、エアロゾル製剤は、定量されるエアロゾルのそれぞれに所定量の活性成分、例えば、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物の１つ以上が含まれるように構成される。
【０１４４】
腟内投与に適合された投薬形態は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、又はスプレー製剤として提供され得る。直腸投与に適合された投薬形態としては、坐薬又は浣腸が挙げられる。
【０１４５】
非経口投与に適合された、及び／又は任意の種類の注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、骨内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、くも膜下腔内、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｒｅａｌ）、脳内、及び脳室内）に適合された投薬形態としては、水性及び／又は非水性滅菌注射溶液を挙げることができ、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、組成物を対象の血液と等張にする溶質、並びに水性及び非水性滅菌懸濁液（これには懸濁剤及び増粘剤が含まれ得る）を含有し得る。非経口投与に適合された投薬形態は、限定はされないが密封アンプル又はバイアルを含めた、単一単位用量又は複数単位用量容器に提供されてもよい。用量は凍結乾燥し、投与前に滅菌担体に再懸濁して用量を再構成することができる。一部の実施形態では、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から即時調合注射溶液及び懸濁液を調製することができる。
【０１４６】
眼球投与に適合された投薬形態としては、任意選択で注射に適合されてもよい、且つ任意選択で抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、組成物を眼又はそこに含まれる若しくは対象の眼の周りにある体液と等張性にする溶質を含有し得る水性及び／又は非水性滅菌溶液、並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を挙げることができる。
【０１４７】
一部の実施形態について、投薬形態は、単位用量当たり所定量のＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物を含有する。ある実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物の所定量は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、及び／又はその症状の治療又は予防に治療上有効なＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物の量である。他の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質又はＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物の所定量は、活性成分の治療有効量の適切な一部であり得る。従ってかかる単位用量は、１日１回又は１回より多く投与され得る。かかる医薬製剤は、当該技術分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。
【０１４８】
ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５組成物及び製剤による神経障害の治療
本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその医薬製剤は、対象における疾患、障害、症候群、又はその症状の治療及び／又は予防に使用することができる。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその医薬製剤は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、レット症候群のバリアント、及び／又はその症状の治療及び／又は予防に使用することができる。一部の実施形態において、対象は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、レット症候群のバリアント、及び／又はその症状を有する。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその医薬製剤を使用して、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、レット症候群のバリアント、及び／又はその症状を有する患者の視覚野内の神経活動を増加させることができる。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその医薬製剤を使用して、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、レット症候群のバリアント、及び／又はその症状を有する患者の脳内の神経突起成長、伸長、樹状突起スパイン数、分枝数、又は分枝密度を増加させることができる。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその医薬製剤を使用して、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、レット症候群のバリアント、及び／又はその症状を有する患者の脳内の神経細胞アポトーシスを減少させることができる。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその医薬製剤を使用して、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、レット症候群のバリアント、及び／又はその症状を有する患者の運動機能を改善することができる。
【０１４９】
本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤のある量が、それを必要としている対象に１日、１週間、１ヵ月、又は１年に１回以上投与され得る。一部の実施形態において、投与される量は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤の治療有効量であり得る。例えば、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤は１日用量で投与することができる。この量は、１日につき単一用量で与えられてもよい。他の実施形態において、１日用量は、１日につき複数の用量で投与されてもよく、ここで各々は総１日投与用量の一部（サブ用量）を含有する。一部の実施形態において、１日当たりに送達される用量の量は、２、３、４、５、又は６である。更なる実施形態において、化合物、製剤、又はその塩は、週１回以上、例えば週１、２、３、４、５、又は６回投与される。他の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤は、月１回以上、例えば月１〜５回投与され得る。更に別の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤は、年１回以上、例えば年１〜１１回投与され得る。
【０１５０】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤は、任意の従来の経路によって二次的薬剤と共投与することができる。二次的薬剤は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤と別個の化合物及び／又は製剤である。二次的薬剤は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤と同時に投与することができる。二次的薬剤は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤と逐次的に投与することができる。二次的薬剤はＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤との相加効果又は相乗効果を有し得る。好適な二次的薬剤としては、限定はされないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、必須腫瘍タンパク質及び遺伝子の翻訳又は転写を阻害するリボザイムのガイド配列、ホルモン類、免疫調節薬、解熱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮痛薬、鎮痙剤、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、抗感染薬、及び化学療法薬が挙げられる。一部の実施形態では、二次的薬剤はＤＣＡである。
【０１５１】
好適なホルモン類としては、限定はされないが、アミノ酸誘導体ホルモン類（例えば、メラトニン及びサイロキシン）、小ペプチドホルモン類及びタンパク質ホルモン類（例えば、サイロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、インスリン、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン）、エイコサノイド類（ｅｉｃｏｎｓａｎｏｉｄ）（例えば、アラキドン酸、リポキシン類、及びプロスタグランジン類）、及びステロイドホルモン類（例えば、エストラジオール、テストステロン、テトラヒドロテストステロンコルチゾール）が挙げられる。
【０１５２】
好適な免疫調節薬としては、限定はされないが、プレドニゾン、アザチオプリン、６−ＭＰ、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１２）、サイトカイン類（例えば、インターフェロン類（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子、及びイミキモド）、ケモカイン類（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６及びＣＸＣＬ７）、シトシンリン酸グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド類、グルカン類、抗体、及びアプタマー）が挙げられる。
【０１５３】
好適な解熱薬としては、限定はされないが、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、アスピリン及び関連サリチル酸塩類（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓａｌｉｃｙｌａｅ）、及びサリチル酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｉｃａｙｌａｔｅ））、パラセタモール／アセトアミノフェン、メタミゾール、ナブメトン、フェナゾン、及びキニーネが挙げられる。
【０１５４】
好適な抗不安薬としては、限定はされないが、ベンゾジアゼピン系（例えば、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼパート、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、及びトフィソパム）、セロトニン系抗うつ薬（ｓｅｒｏｔｅｎｅｒｇｉｃ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ）（例えば、選択的セロトニン再取込み阻害薬、三環系抗うつ薬（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｅｎｔ）、及びモノアミンオキシダーゼ阻害薬）、メビカール、アホバゾール、セランク（ｓｅｌａｎｋ）、ブロマンタン、エモキシピン、アザピロン、バルビツール酸系薬、ヒドロキシジン、プレガバリン、バリドール、及びβ遮断薬が挙げられる。
【０１５５】
好適な抗精神病薬としては、限定はされないが、ベンペリドール、ブロムペリドール（ｂｒｏｍｏｐｅｒｉｄｏｌ）、ドロペリドール、ハロペリドール、モペロン、ピパンペロン（ｐｉｐａｐｅｒｏｎｅ）、チミペロン、フルスピリレン、ペンフルリドール、ピモジド、アセプロマジン、クロルプロマジン、シアメマジン、ジキシラジン（ｄｉｚｙｒａｚｉｎｅ）、フルフェナジン、レボメプロマジン、メソリダジン、ペラジン、ペリシアジン、ペルフェナジン、ピポチアジン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロチペンジル、チオプロペラジン、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、クロルプロチキセン、クロペンチキソール、フルペンチキソール、チオチキセン、ズクロペンチキソール、クロチアピン、ロキサピン、プロチペンジル、カルピプラミン、クロカプラミン、モリンドン、モサプラミン、スルピリド、ベラリプリド、アミスルプリド、アモキサピン、アリピプラゾール、アセナピン、クロザピン、ブロナンセリン、イロペリドン、ルラシドン、メルペロン、ネモナプリド、オランザピン（ｏｌａｎｚａｐｒｉｎｅ）、パリペリドン、ペロスピロン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、トリミプラミン、ジプラシドン、ゾテピン、アルストニン（ａｌｓｔｏｎｉｅ）、ビフェプルノックス（ｂｅｆｅｐｒｕｎｏｘ）、ビトペルチン、ブレクスピプラゾール、カンナビジオール、カリプラジン、ピマバンセリン、ポマグルメタッドメチオニル、バビカセリン、キサノメリン、及びジクロナピンが挙げられる。
【０１５６】
好適な鎮痛薬としては、限定はされないが、パラセタモール／アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ−２阻害薬（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、オピオイド系（例えば、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジヒドロモルフィン、ペチジン、ブプレノルフィン）、トラマドール、ノルエピネフリン、フルピルチン（ｆｌｕｐｉｒｅｔｉｎｅ）、ネホパム、オルフェナドリン、プレガバリン、ガバペンチン、シクロベンザプリン、スコポラミン、メサドン、ケトベミドン、ピリトラミド、及びアスピリン及び関連サリチル酸塩類（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）が挙げられる。
【０１５７】
好適な鎮痙剤としては、限定はされないが、メベベリン、パパベリン（ｐａｐｖｅｒｉｎｅ）、シクロベンザプリン、カリソプロドール、オルフェナドリン、チザニジン、メタキサロン、メトカルバモール（ｍｅｔｈｏｄｃａｒｂａｍｏｌ）、クロルゾキサゾン、バクロフェン、ダントロレン、バクロフェン、チザニジン、及びダントロレンが挙げられる。
【０１５８】
好適な抗炎症薬としては、限定はされないが、プレドニゾン、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ−２阻害薬（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、及び免疫選択的抗炎症誘導体（例えば、顎下腺ペプチドＴ及びその誘導体）が挙げられる。
【０１５９】
好適な抗ヒスタミン薬としては、限定はされないが、Ｈ１受容体拮抗薬（例えば、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、ブロモジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、セチリジン、クロルプロマジン、シクリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスブロムフェニラミン（ｄｅｘｂｒｏｍａｐｈｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシラミン、エバスチン（ｅｂａｓｉｎｅ）、エンブラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、レボセチリジン（ｌｅｖｏｃｅｔｉｒｚｉｎｅ）、ロラタジン、メクロジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、ピリラミン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、及びトリプロリジン）、Ｈ２受容体拮抗薬（例えば、シメチジン、ファモチジン、ラフチジン、ニザチジン、ラニチジン（ｒａｆｉｔｉｄｉｎｅ）、及びロキサチジン）、トリトクアリン、カテキン、クロモグリク酸、ネドクロミル、及びβ２−アドレナリン作動薬が挙げられる。
【０１６０】
好適な抗感染薬としては、限定はされないが、抗アメーバ薬（例えば、ニタゾキサニド、パロモマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、クロロキン、ミルテホシン、アムホテリシンＢ、及びヨードキノール）、アミノグリコシド系（例えば、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、及びネオマイシン）、駆虫薬（例えば、ピランテル、メベンダゾール、イベルメクチン、プラジカンテル、アベンダゾール（ａｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、チアベンダゾール、オキサムニキン）、抗真菌薬（例えば、アゾール系抗真菌薬（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、ポサコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、及びボリコナゾール）、エキノキャンディン系（例えば、カスポファンギン、アニデュラファンギン、及びミカファンギン）、グリセオフルビン、テルビナフィン、フルシトシン、及びポリエン系（例えば、ナイスタチン、及びアムホテリシンＢ）、抗マラリア剤（例えば、ピリメタミン／スルファドキシン、アルテメーテル／ルメファントリン、アトバコン／プログアニル（ｐｒｏｑｕａｎｉｌ）、キニーネ、ヒドロキシクロロキン、メフロキン、クロロキン、ドキシサイクリン、ピリメタミン、及びハロファントリン）、抗結核剤（例えば、アミノサリチル酸塩類（例えば、アミノサリチル酸）、イソニアジド／リファンピン、イソニアジド／ピラジナミド／リファンピン、ベダキリン、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、及びサイクロセリン）、抗ウイルス薬（例えば、アマンタジン、リマンタジン、アバカビル／ラミブジン、エムトリシタビン／テノホビル、コビシスタット／エルビテグラビル／エムトリシタビン／テノホビル、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノホビル、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン、ラミブジン／ジドブジン、エムトリシタビン／テノホビル、エムトリシタビン／ロピナビル（ｏｐｉｎａｖｉｒ）／リトナビル／テノホビル、インターフェロンα−２ｖ／リバビリン、ペグインターフェロンα−２ｂ、マラビロク、ラルテグラビル、ドルテグラビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン、オセルタミビル、ザナミビル、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリン、リルピビリン、デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｉｄｉｎｅ）、ネビラピン、エンテカビル、ラミブジン、アデホビル、ソホスブビル、ジダノシン、テノホビル、アバシブル（ａｖａｃｉｖｒ）、ジドブジン、スタブジン、エムトリシタビン、ザルシタビン（ｘａｌｃｉｔａｂｉｎｅ）、テルビブジン、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、ロピナビル／リトナビル、ホスアンプレナビル（ｆｏｓａｍｐｒｅｎｖｉｒ）、ドラヌアビル（ｄｒａｎｕａｖｉｒ）、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル、サキナビル（ｓａｗｕｉｎａｖｉｒ）、リバビリン、バラシクロビル（ｖａｌｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、及びバルガンシクロビル）、カルバペネム系（例えば、ドリペネム、メロペネム、エルタペネム、及びシラスタチン／イミペネム）、セファロスポ��ン系（例えば、セファドロキシル、セフラジン、セファゾリン、セファレキシン、セフェピム、セフタロリン（ｃｅｆｌａｒｏｌｉｎｅ）、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セファクロル、セフチブテン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフジニル、セフィキシム、セフジトレン、セフチゾキシム（ｃｅｆｉｚｏｘｉｍｅ）、及びセフタジジム）、グリコペプチド系抗生物質（例えば、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、及びテラバンシン（ｔｅｌｖａｎｃｉｎ））、グリシルサイクリン系（例えば、チゲサイクリン）、抗らい菌薬（例えば、クロファジミン及びサリドマイド）、リンコマイシン及びその誘導体（例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン）、マクロライド系及びその誘導体（例えば、テリスロマイシン、フィダキソマイシン、エリスロマイシン（ｅｒｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、及びトロレアンドマイシン）、リネゾリド、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、リファキシミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、メトロニダゾール、アズトレオナム、バシトラシン、ペニシリン系（アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、クラブラン酸塩／チカルシリン、ペニシリン、プロカインペニシリン、オキサシリン（ｏｘａｘｉｌｌｉｎ）、ジクロキサシリン、及びナフシリン）、キノロン系（例えば、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン（ｑａｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、トロバフロキサシン、及びスパルフロキサシン）、スルホンアミド系（例えば、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、スルファサラジン、及びスルフイソキサゾール（ｓｕｌｆａｓｏｘａｚｏｌｅ））、テトラサイクリン系（例えば、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン／サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ドキシサイクリン／ω−３多価不飽和脂肪酸、及びテトラサイクリン）、及び尿路感染症薬（例えば、ニトロフラントイン、メテナミン、ホスホマイシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びメチレンブルー）が挙げられる。
【０１６１】
好適な化学療法薬としては、限定はされないが、パクリタキセル、ブレンツキシマブベドチン、ドキソルビシン、５−ＦＵ（フルオロウラシル）、エベロリムス、ペメトレキセド、メルファラン、パミドロネート、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、オファツムマブ、ベバシズマブ、ベリノスタット、トシツモマブ、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、ブスルファン、アレムツズマブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、ダウノルビシン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、ラムシルマブ、シタラビン、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ヒドロキシウレア、デカルバジン、ロイプロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）由来アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒｇｉｎａｓｅ）、アミホスチン、エトポシド、フルタミド、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、プララトレキサート、メトトレキサート、フロクスウリジン、オビヌツズマブ、ゲムシタビン、アファチニブ、メシル酸イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅｍ）、カルムスチン、エリブリン、トラスツズマブ、アルトレタミン、トポテカン、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、インターフェロンα−２ａ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イクサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシン、カルフィルゾミブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、ミトタン、ビンクリスチン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、塩化ストロンチウム−８９、メクロレタミン、マイトマイシン、ブスルファン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ビノレルビン、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、タモキシフェン、ミトキサントロン、ペグアスパラガーゼ、デニロイキンジフチトクス、アリトレチノイン、カルボプラチン、ペルツズマブ、シスプラチン、ポマリドミド、プレドニゾン、アルデスロイキン、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドマイド、リツキシマブ、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｔｉｄｅ）、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、シルツキシマブ、オマセタキシン、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（チオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ））、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、ＢＣＧ、テムシロリムス、塩酸ベンダムスチン、トリプトレリン、三酸化ヒ素（ａｒｅｓｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、ラパチニブ、バルルビシン、パニツムマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、トレチノイン、アザシチジン、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、イピリムマブ、ゴセレリン、ボリノスタット、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、エポチロン、タフルポシド、アザチオプリン、ドキシフルリジン、ビンデシン、及びオールトランス型レチノイン酸が挙げられる���
【０１６２】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤が二次的薬剤と同時に共投与される実施形態では、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤は二次的薬剤と実質的に同じ時点で対象に投与することができる。これに関連して使用されるとき、「実質的に同じ時点」は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、又はその医薬製剤の投与と二次的薬剤の投与との間の時間が０〜１０分であるようなＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、及びその医薬製剤と二次的薬剤との投与を指す。
【０１６３】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、又はその医薬製剤が二次的薬剤と逐次的に共投与される実施形態では、初めにＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、又はその医薬製剤が投与され、続いてある時間が経った後に二次的薬剤が投与され得る。ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、又はその医薬製剤が二次的薬剤と逐次的に共投与される他の実施形態では、初めに二次的薬剤が投与され、続いてある時間が経った後にＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、又はその医薬製剤が投与され得る。任意の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、又はその医薬製剤の投与と二次的薬剤の投与との間の時間は１０分〜約９６時間の範囲であり得る。一部の実施形態において、この時間は約１０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、又は約１２時間であり得る。逐次投与は治療期間の間に必要に応じて繰り返され得る。
【０１６４】
投与することのできるＣＤＫＬ５融合タンパク質、組成物、その医薬製剤の量は、本明細書の他の部分に記載される。二次的薬剤の量は、その二次的薬剤に応じて異なり得る。二次的薬剤の量は治療有効量であり得る。一部の実施形態において、二次的薬剤の有効量は０．００１マイクログラム〜約１ミリグラムの範囲である。他の実施形態において、二次的薬剤の量は約０．０１ＩＵ〜約１０００ＩＵの範囲である。更なる実施形態において、二次的薬剤の量は０．００１ｍＬ〜約１ｍＬの範囲である。更に他の実施形態において、二次的薬剤の量は医薬製剤全体の約１％ｗ／ｗ〜約５０％ｗ／ｗの範囲である。更なる実施形態において、二次的薬剤の量は医薬製剤全体の約１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖの範囲である。更に他の実施形態において、二次的薬剤の量は二次的薬剤組成物又は医薬製剤全体の約１％ｗ／ｖ〜約５０％ｗ／ｖの範囲である。
【０１６５】
一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物又は製剤は、注射によって患者に投与される。好適な注射方法としては、限定はされないが、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、骨内、硬膜外、心臓内、関節内、空洞内、くも膜下腔内、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｒｅａｌ）、脳内、及び脳室内注射が挙げられる。ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物又は製剤の他の好適な投与方法としては、限定はされないが、局所、経皮、鼻内、又は経口送達が挙げられる。一部の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の投薬量は約０．０１μｇ／ｇ体重〜約１０ｍｇ／ｇ体重の範囲である。
【０１６６】
他の実施形態において、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、細胞療法による治療を必要としている患者に送達することができる。このことを考慮して図３を見ると、図３は、自己細胞を介してＣＤＫＬ５融合タンパク質を送達する方法の一実施形態を示している。この方法は、インビトロで細胞を培養することから始まる（８０００）。好ましくは、細胞は自己細胞である。一実施形態において、自己細胞はニューロン又はニューロン前駆細胞、例えば神経幹細胞である。一部の実施形態において、自己細胞は、人工多能性幹細胞に由来するニューロンである。他の実施形態において、自己細胞は、臍帯血幹細胞に由来するニューロンである。
【０１６７】
次に、培養細胞を精製ＣＤＫＬ５融合タンパク質によって形質導入する（８０１０）。他の実施形態では、培養細胞は、先述のとおりＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する培地に培養細胞を曝露することによって形質導入する。更なる実施形態では、培養細胞は、ＣＤＫＬ５融合タンパク質ｃＤＮＡを含有する好適なベクターでトランスフェクトする。次に細胞を好適な時間にわたり培養してＣＤＫＬ５融合タンパク質を発現させる（８０２０）。一部の実施形態において、細胞は約６時間〜約９６時間培養される。細胞の培養後、１つ以上の形質導入細胞を患者に投与する。
【０１６８】
一実施形態において、形質導入される自己ニューロンは外科手術技法を用いて脳に送達される。一部の実施形態において、１つ以上の形質導入細胞は注射によって患者に投与される。一部の実施形態において、１つ以上の形質導入細胞は製剤中に含まれる。一実施形態において、１つ以上の形質導入細胞を含有する製剤はまた、薬学的に許容可能な担体及び／又は活性薬剤も含む。一部の実施形態において、１つ以上の形質導入細胞を含有する製剤は、注射によるか又は外科手術技法を用いて患者に投与される。
【０１６９】
ＣＤＫＬ５融合タンパク質及びその製剤を含むキット
本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及びその医薬製剤は、組み合わせキットとして提供され得る。本明細書で使用されるとき、用語「組み合わせキット」又は「パーツのキット」は、本明細書に記載されるＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及びその医薬製剤、並びにそこに含まれる要素の組み合わせ又は単一の要素、例えば活性成分の包装、販売、流通、送達、及び／又は投与に使用される更なる構成要素を指す。かかる更なる構成要素には、限定はされないが、パッケージング、シリンジ、ブリスターパッケージ、ボトルなどが含まれる。キットに含まれる構成要素（例えば、活性薬剤）の１つ以上が同時に投与される場合、組み合わせキットは活性薬剤を単一の医薬製剤（例えば、錠剤）又は別個の医薬製剤中に含み得る。
【０１７０】
組み合わせキットは、各薬剤、化合物、医薬製剤又はその構成要素を別個の組成物又は医薬製剤中に含み得る。別個の組成物又は医薬製剤はキット内の単一のパッケージ又は別個のパッケージに含まれ得る。また、一部の実施形態では、緩衝剤、希釈剤、可溶化試薬、細胞培養培地及び他の試薬も提供される。これらの更なる構成要素はキット内の単一のパッケージ又は別個のパッケージに含まれ得る。
【０１７１】
一部の実施形態において、組み合わせキットはまた、有形的表現媒体に印刷されるか又は他の形でそこに含まれる取扱説明書も含む。取扱説明書は、そこに含まれるＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及びその医薬製剤及び／又は他の補助薬剤及び／又は二次的薬剤の内容に関する情報、そこに含まれるＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及びその医薬製剤及び／又は他の補助薬剤及び／又は二次的薬剤の内容に関する安全情報、そこに含まれるＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及びその医薬製剤及び／又は他の補助薬剤及び／又は二次的薬剤の投薬量、用法指示、及び／又は推奨される１つ又は複数の治療レジメンに関する情報を提供することができる。一部の実施形態において、取扱説明書は、ＣＤＫＬ５欠損症、レット症候群、及び／又はその症状を有する対象に対するＣＤＫＬ５融合タンパク質、ＣＤＫＬ５融合タンパク質を含有する組成物、及びその医薬製剤及び／又は他の補助薬剤及び／又は二次的薬剤の投与についての指図を提供し得る。
【０１７２】
これ以上の詳細はなしに、当業者は本明細書の記載に基づき本開示を最大限に利用し得ると考えられる。本開示の実施形態、特に任意の「好ましい」実施形態は、単に本開示の原理の理解を明確にするために示される単なる可能な実現例であることが強調される。本開示の開示される１つ又は複数の実施形態に対し、本開示の趣旨及び原理から実質的に逸脱することなく多くの変形及び改良が行われ得る。かかる改良及び変形は全て、本開示の範囲内にある。
【０１７３】
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許は、個別の刊行物又は特許のそれぞれが参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとして本明細書において参照により援用され、刊行物の引用が関係する方法及び／又は材料を開示及び記載するため参照により本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示についての引用であり、先行する開示であるという理由で本開示がかかる刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されてはならない。更に、提供される刊行物の日付は実際の刊行日と異なることがあり、別途確認する必要があり得る。
【０１７４】
本開示を読むと当業者には明らかであろうとおり、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離し又はそれと組み合わせ得る個別的な構成要素及び特徴を有する。任意の記載される方法は、記載されるイベントの順序でも、又は論理的に可能な任意の他の順序でも実施することができる。
【０１７５】
本開示の実施形態は、特に指示されない限り、当該技術分野の範囲内にある分子生物学、微生物学、ナノテクノロジー、有機化学、生化学、植物学などの技術を用い得る。かかる技術は文献に十全に説明されている。
【実施例】
【０１７６】
以下の例は、本明細書に開示され及び特許請求される方法をどのように実施し、組成物及び化合物をどのように使用すればよいかに関する完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示される。以下の具体的な例は単に例示と解釈されるべきであり、いかなる形であれ残りの開示を限定するものとして解釈されてはならない。数値（例えば、量、温度等）に関しては正確を期すようと努めているが、幾らかの誤差及び偏差が考慮されなければならない。特に指示がない限り、部数は重量部であり、温度は℃であり、及び圧力は大気圧又はその近傍である。標準温度及び標準気圧は２０℃及び１気圧として定義される。
【０１７７】
実施例１：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質の作製及び精製
送達可能なＴＡＴ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質を作製するため、ＴＡＴドメイン中のフューリン認識配列の突然変異によって組換えタンパク質の分泌が可能となる合成ＴＡＴκ−ＰＴＤを使用した。この分泌タンパク質は、標的細胞による取込みの成功が観察された。ヒトＣＤＫＬ５１１５又はＣＤＫＬ５１０７を含有するＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１０７融合遺伝子を発現プラスミドｐＳｅｃＴａｇ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。このプラスミドは、哺乳類宿主における遺伝子の発現及び標的タンパク質の高発現レベルが可能となるように設計されている。ｐＳｅｃＴａｇ２から発現したタンパク質は、培養培地中におけるタンパク質分泌のためＮ末端でマウスＩｇκ鎖リーダー配列に融合される。ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質にｅＧＦＰタンパク質タグを付加して、抗ＧＦＰ抗体を使用したウエスタンブロット分析を可能にした。タンパク質精製を容易にするため、ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７遺伝子のＣ末端領域にｍｙｃタグ、６ｘＨｉｓタグ、及び／又はＦＬＡＧタグを含むように構成した。標準プラスミド送達方法を用いてＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞にＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を無血清培地（高グルコースダルベッコ変法イーグル培地）で成長させた。４８時間後、培地を回収し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心ろ過機（５０ｋＤａカットオフ）でダイアフィルトレーション及び濃縮を行った。この方法により、緩衝液交換及び分泌タンパク質の濃縮が可能である。
【０１７８】
図４Ａ及び図４Ｂは、トランスフェクトＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質発現のウエスタンブロット分析結果を示す。図４Ａは、トランスフェクトＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の細胞ホモジネートにおけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質発現を示す。図４Ｂは、トランスフェクトＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞からの濃縮（２０倍）細胞培養培地におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の蓄積を示す。図４Ａ〜図４Ｂには図示されないが、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質でも同様の結果が得られた。
【０１７９】
実施例２：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５キナーゼ活性の検証
ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質を精製するため、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５遺伝子のＣ末端領域にｍｙｃタグ及び６ｘＨｉｓタグを付加した。培養培地からＮｉ−ＮＴＡ樹脂でＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質を精製した。ＣＤＫＬ５キナーゼは高い自己リン酸化活性を有することが示されている。インビトロキナーゼ活性アッセイの結果を示す図５Ａ及び図５Ｂに示されるとおり、精製ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質はその自己リン酸化活性を維持している。これは、精製した融合タンパク質がそのキナーゼ活性を保持していることを実証している。
【０１８０】
実施例３：ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞によるＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５のインターナリゼーション
ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の形質導入効率を評価するため、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を精製／濃縮した融合タンパク質と共にインキュベートした。簡潔に言えば、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質を実施例１に記載されるとおり作製し、精製した。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、融合タンパク質を含有する濃縮培地中でインキュベートした。種々のインキュベーション時間後、細胞を溶解し、全タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜に移して免疫ブロット法によりＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質を定量化した。図６に示すとおり、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５は僅か約３０分のインキュベーション後に細胞にインターナライズされる。並行して他の培養物を処理し、固定化し、抗ＧＦＰ特異抗体で免疫染色して、形質導入されたＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質を可視化した。図７Ａ〜図７Ｂに示されるとおり、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質は効率的に細胞内に移行した。標的細胞におけるインターナリゼーションは共焦点顕微鏡法によって確認された（図８）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞を、融合タンパク質を含有する濃縮培地中で３０分間インキュベートした。図８は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５形質導入ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の一連の共焦点像（１〜１２）の画像を示し、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質が標的細胞によってインターナライズされ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の核及び細胞質の両方に局在していることを実証している（図８）。
【０１８１】
実施例４：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５は分化を誘導し、ＳＨＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞株の増殖を阻害する
中枢神経系にとってのＣＤＫＬ５の重要性は明らかであるにも関わらず、このキナーゼの生物学的機能はほとんど分かっていない。ＣＤＫＬ５タンパク質は神経細胞の増殖及び分化の両方に影響を及ぼし得る（例えば、Ｖａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１８１９：１１７３−１１８５、及びＲｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１４１５：２３−３３を参照のこと）。神経芽腫細胞は正常なニューロンと幾つかの特徴を共有し、従って、特にレチノイン酸（ＲＡ）などの薬剤による処理で分化を誘導する場合に、神経細胞の生化学的及び機能的特性の研究に良好なインビトロモデルと考えられている（例えば、Ｓｉｎｇｈ，２００７  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１１５４  ｐ  ８−２１；Ｍｅｌｉｎｏ，１９９７  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．３１  ｐｐ  ６５−８３を参照のこと）。このような理由で、ＣＤＫＬ５機能のインビトロ試験には神経芽腫細胞（ｎｅｕｒｏｂａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）を用いた。
【０１８２】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、実施例３に記載する処理と同様に精製ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５で処理した。ここで、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、精製ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質を含有する濃縮培地と共に約２４時間インキュベートした。ヘキスト（Ｈｏｅｃｓｈｔ）核染色を使用して、細胞増殖を分裂指数（集団中の細胞の総数に対する有糸分裂が起こる細胞の数の比）として評価した。ニューロン分化の表れである神経突起成長を調べることにより、分化を評価した。神経突起成長を分析するため、分化促進剤ＲＡの存在下又は非存在下で細胞を更に１〜２日間成長させた。画像解析システムを使用して神経突起伸長を計測した。
【０１８３】
ＣＤＫＬ５発現を（ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質によって）誘導すると、細胞増殖の強力な阻害が生じ（例えば、図９Ａ〜図９Ｂ、及び図１０）、対照と比較してアポトーシス細胞死の増加はなかった（データは示さず）。更に、図１１Ａ〜図１１Ｂ及び図１２に示されるとおり、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の神経突起伸長が示唆するとおり、神経芽腫細胞分化を促進する。これらの結果は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５がインビトロニューロンモデルにおいて機能することを実証している。
【０１８４】
実施例５：ＣＤＫＬ５−ＫＯマウスモデルの特徴付け
ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスモデルは、最近になってＭｏｎｔｅｒｏｔｏｎｄｏ、イタリアのＥＭＢＬにより、Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ  Ｇｒｏｓｓ博士が率いるグループによって作り出された（Ａｍｅｎｄｏｌａ，２０１４  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．９（５）：ｅ９１６１３）。ＣＤＫＬ５機能喪失が新生ニューロンの樹状突起発達に及ぼす効果を確立するため、ＣＤＫＬ５  ＫＯマウスに由来する新生海馬顆粒細胞の樹状形態を調べた。新生ニューロンの樹状形態は、神経突起伸長の間に未成熟ニューロンの細胞質でダブルコルチン（ＤＣＸ）が発現することを利用して、このタンパク質に関する免疫組織化学によって分析した。図１３Ａ〜図１３Ｂに示されるとおり、ＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（−／Ｙ）のＤＣＸ陽性細胞は、ＣＤＫＬ５野生型（＋／Ｙ）対応物（図１３Ａ）と比較して極めて未成熟なパターンの樹状突起樹を呈した（図１３Ｂ）。極めて未成熟なパターンは、分枝形成及び伸長がほとんどないことから明らかであり得る。ＣＤＫＬ５がないことにより、分裂終了未成熟顆粒ニューロン（ＤＣＸ陽性細胞）に影響を及ぼすことが観察されたアポトーシス細胞死の増加（Ｆｕｃｈｓ，２０１４  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．７０  ｐ５３−６８）に起因して（データは示さず）、ＤＣＸ陽性細胞数が低下した（図１３Ｂ）。これらのデータは、ＣＤＫＬ５が新生ニューロンの神経前駆体の生存及び成熟に影響を及ぼすことにより、出生後神経形成において基本的な役割を果たすことを示唆している。Ｃｄｋｌ５ノックアウトマウスの脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｏｌａｒ  ｚｏｎｅ）（ＳＶＺ）由来のニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）の培養物は、小脳顆粒細胞前駆体においてインビボで観察されたものと同じ欠陥を呈することが観察された。即ち、雌野生型マウス（＋／＋）に由来するニューロン前駆細胞の培養物では、ホモ接合体ＣＤＫＬ５  ＫＯ雌マウス（−／−）に由来するニューロン前駆細胞の培養物と比べてより多くのニューロン（β−チューブリンＩＩＩ陽性細胞、赤色の細胞）があった（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。これは、ＣＤＫＬ５が失われると分裂終了ニューロンの生存が低下することを示唆している。β−チューブリンＩＩＩ陽性細胞における神経突起伸長の評価から、Ｃｄｋｌ５ノックアウトＮＰＣから産生されたニューロンは雌野生型（＋／＋）ニューロンと比較して分化が低かったことが実証された（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。これらの結果は、ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスの分裂終了ＮＰＣが細胞生存の点のみならず、ニューロン成熟の点においても固有の欠陥を有することを示唆している。
【０１８５】
実施例６：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質はＣＤＫＬ５  ＫＯマウスに由来する神経細胞（ｎｅｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）前駆体の神経突起発達を回復させる
雌ホモ接合体ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／−）マウス及び野生型（＋／＋）マウス由来のニューロン前駆細胞培養物をＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処理した。分化したニューロン（β−チューブリンＩＩＩ陽性）の総神経突起長を計測することにより、ニューロン成熟を評価した。神経突起長の評価は画像解析システムＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ  ２０９１０、米国）を使用して実施した。総神経突起長を範囲内にカウントされる細胞数で除すことにより、細胞当たりの平均神経突起長を計算した。図１５Ａ〜図１５Ｃ及び図１６に示されるとおり、ＣＤＫＬ５がないことによって新規ニューロンの成熟は低下し、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処理すると神経突起発達が回復する。図１５Ａ〜図１６について、細胞は新生仔（２日齢）マウスの脳室下帯（ＳＶＺ）から単離した。分化分析には、インビトロで３代継代後に得られたニューロスフェアを分離し、１５μｇ／ｍｌポリ−ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたカバーガラス上に密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を２日間成長させて、次に分化培地（ＥＧＦ及びＦＧＦ不含＋１％胎仔ウシ血清）に３日目から７日間移した。ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質は毎日１０倍終濃度でＤＭＥＭ−Ｆ１２による緩衝液交換後（培養培地が完全に入れ替わるのは避けた）に投与した。３日おきに、培地の半分に新鮮な分化培地を補充した。
【０１８６】
実施例７：マウス脳へのＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５の送達
７日齢の仔マウスに、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰによってトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の培養培地又は非トランスフェクト細胞からの培地（媒体）の単一用量（単一用量は約２００μｌの２００倍濃縮培地に相当する；これは約１〜１．５μｇの融合タンパク質を含有した）を皮下注射した。培養培地はトランスフェクションから４８時間後に回収し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心ろ過機（５０ｋＤａカットオフ）でダイアフィルトレーション及び濃縮を行った。処置投与４時間後にマウスを犠牲にした。脳を固定液に２４時間保存し、正中線で切断し、リン酸緩衝液中２０％スクロースに更に２４時間保管した。半球を凍結し、−８０℃で保存した。凍結ミクロトームで右半球を３０μｍ厚の冠状切片に切断した。浮遊切片に対して免疫組織化学を実施した。脳におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰの局在を、抗ＧＦＰ抗体及びＴＳＡ増幅キットを使用した免疫組織化学によって評価した。画像は感覚運動皮質及び小脳レベルで撮った。細胞を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して対比染色した。マウスの感覚運動皮質及び小脳におけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質の存在を表す代表的な画像をそれぞれ図１７Ａ〜図１７Ｆ及び図１８Ａ〜図１８Ｄに示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質は皮下投与されたことを考えると、これらのデータは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質が血液脳関門を通り抜けて有効に輸送され、脳細胞に入ることを実証している。
【０１８７】
実施例８：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質がインビボでニューロン成熟、生存及び結合性に及ぼす効果
成体マウス（４〜６ヵ月齢）に５日間連続で（実験スケジュールに関しては、例えば図２０を参照）ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰを脳室内注射した（図１９）。簡潔に言えば、マウスをケタミン（１００〜１２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０〜１２．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。カニューレ（０．３１ｍｍ径、Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩＩ；Ａｌｚｅｔ  Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）を側脳室（Ａ／Ｐ  −０．４ｍｍ尾側、Ｍ／Ｌ  １．０ｍｍ、Ｄ／Ｖ  −２．０ｍｍ；図１９）に定位的に植え込んだ。植込みから７日後、マウスに５日間連続でＰＢＳ中１０μｌ（約５０ｎｇ）のＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はｅＴＡＴκ−ＧＦＰを、電動ナノインジェクターに接続されたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して（０．５μｌ／分の速度で）注入した。最後の注射の４時間後、動物を犠牲にし、ＤＣＸに関する免疫組織化学で新生海馬顆粒細胞の樹状形態を分析した。図２１Ａ〜２１Ｃ及び図２２Ａ〜２２Ｃは、雄ＣＤＫＬ５  ＫＯマウスのＤＣＸ陽性ニューロンが、それらの野生型対応物と比べて短い突起を有したことを実証している（図２１Ａ〜図２１Ｂ及び図２２Ａ〜図２２Ｂ）。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質を５日間連続で脳室内投与すると、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（図２２Ｃ）における神経突起長及び分枝数が野生型（図２２Ａ）と同程度まで増加したことが観察された。図２３Ａ〜図２３Ｂは、野生型（＋／Ｙ）（図２３Ａ）、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）（図２３Ｂ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスの新生顆粒細胞の再構成された樹状突起樹の例を示す。
【０１８８】
ＤＣＸ陽性細胞の樹状突起サイズの定量化は、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）マウスが野生型雄マウス（図２４Ａ及び図２４Ｂ）と比べてより短い樹状突起長（図２４Ａ）及びより少ないセグメント数（図２４Ｂ）を有したことを実証している。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処置したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスでは両方のパラメータの増加があり、野生型雄マウスとの比較において上回りさえした（図２４Ａ〜図２４Ｂ）。各樹状突起次数を別々に評価することにより、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置が樹状構造の詳細に及ぼす効果を調べた。ＣＤＫＬ５  ＫＯマウスの顕著な特徴は、高次の分枝がないことであった（図２５Ａ〜図２５Ｂ；赤色矢印）。野生型雄マウスは最大１０次の分枝を有したが、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスには８〜１０次の分枝がなかった（図２５Ａ、矢印）。加えて、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスは、５〜８次の分枝長が短く（図２５Ａ）、及び６〜８次の分枝数が少ない（図２５Ｂ）ことを示した。まとめると、これらのデータは、Ｃｄｋｌ５  ＫＯ雄マウスにおいては新生顆粒細胞の樹状突起樹が発育不全であり、この欠陥が中間的な次数の分枝の数及び長さの減少並びに高次の分枝の欠如に起因することを示している。これらの欠陥は全て、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置によって完全にレスキューされたことが観察された（図２５Ａ〜図２５Ｂ）。
【０１８９】
ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置がアポトーシス細胞死に及ぼす効果を評価するため、本発明者らは、海馬歯状回において開裂カスパーゼ３を発現するアポトーシス細胞の数をカウントした（図２６）。開裂カスパーゼ３細胞の定量化は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置がＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）におけるアポトーシス細胞死を完全に正常化したことを示す（図２６）。ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスは野生型雄マウスと比べて海馬歯状回に分裂終了ニューロン（ＤＣＸ陽性細胞）が少ないことが観察された（図２７）。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスでは、分裂終了ニューロン数の増加が起こり、その数は野生型雄マウスと同程度になった（図２７）。これは、ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスを特徴付ける分裂終了（ｐｏｓｍｉｔｏｔｉｃ）未成熟顆粒細胞の死滅の増加がＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置によってレスキューされたことを示している。まとめると、これらのデータは、ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスにおけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５による処置により、海馬の新生細胞の神経突起長及び生存が増加したことを実証しており、注射したＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５が側脳室から海馬に拡散し、分裂終了顆粒細胞の成熟及び生存を回復させたことが示唆される。
【０１９０】
いかなる一つの理論によっても拘束されるものではないが、結合性の低下は、ＣＤＫＬ５  ＫＯマウスの新生顆粒細胞を特徴付ける樹状突起の発育不全に対応したものであり得る。シナプトフィジン（ＳＹＮ；ｐ３８としても知られる）は、シナプス前終末の特異的マーカーであるシナプス小胞糖タンパク質である。ここで、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスにおいては、海馬の分子層においてＳＹＮの光学濃度が野生型雄マウスと比べて有意に低いことが観察されており（図２８及び図３０Ａ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスは歯状回においてシナプス連絡が少なかったことが示唆される。図２８Ａ〜図２８Ｃは、野生型雄マウス（＋／Ｙ）（図２８Ａ）、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）（図２８Ｂ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）（図２８Ｃ）由来の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｒｙｒｕｓ）（ＤＧ）の分子層（Ｍｏｌ）からのシナプトフィジン（ＳＹＮ）免疫蛍光に関して処理した脳切片を表す代表的な画像を示す。動物のＤＧの３０μｍ厚冠状切片６枚中１枚を免疫組織化学用に処理した。免疫組織化学は、凍結脳については浮遊切片で実施した。シナプトフィジン免疫組織化学のため、切片をマウスモノクローナル抗ＳＹＮ（ＳＹ３８）抗体（１：１０００、ＭＡＢ  ５２５８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）と共に４℃で４８時間インキュベートし、及びＣｙ３コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に２時間インキュベートした。免疫活性（ＩＲ）の強度を、免疫組織化学的に染色した切片の光学デンシトメトリーによって決定した。ＮｉｋｏｎデジタルカメラＤＸＭ１２００を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡（ＡＴＩ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して蛍光像を取得した。分子層及び皮質におけるデンシトメトリー分析は、Ｎｉｓ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア３．２１．０３（Ｎｉｋｏｎ）を使用して実施した。各画像について、ＩＲを含まなかった画像範囲内の画素強度の分布を分析することにより、強度閾値を推定した。次にこの値をサブトラクトして各サンプリング範囲のＩＲを計算した。値は対照ＣＤＫＬ５野生型雄マウスの光学濃度のパーセンテージとして提供される（平均＋標準誤差）。
【０１９１】
ＣＤＫＬ５  ＫＯマウスの皮質錐体ニューロンにおける樹状分枝は、その野生型対応物と比較して有意に減少する（Ａｍｅｎｄｏｌａ，２０１４  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．９（５）：ｅ９１６１３）。新皮質第ＩＩＩ層において同様のＳＹＮ免疫活性レベルの低下が観察された（図３０Ｂ）。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスでは、このような欠陥は完全にレスキューされ（図２８及び図３０Ａ及び図３０Ｂ）、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５による処置が樹状構造に与える好ましい影響がニューロンへの入力の回復と並行したことが示唆された。
【０１９２】
実施例９：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質がインビボでＰ−ＡＫＴに及ぼす効果
ＡＫＴは、複数の細胞経路に関連する中心的なシグナル伝達キナーゼである。リン酸化ＡＫＴ（Ｐ−ＡＫＴ）は、ＣＤＫＬ５ノックアウト動物、ＣＤＫＬ５欠損症及びレット症候群において有意に減少する。図２９Ａ〜図２９Ｃは、野生型雄マウス（＋／Ｙ）（図２９Ａ）、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）（図２９Ｂ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を１日１回５日間連続で投与して処置したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）（図２９Ｃ）由来の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｒｙｒｕｓ）（ＤＧ）の分子層（Ｍｏｌ）からのＰ−ＡＫＴ免疫蛍光に関して処理した脳切片を表す代表的な画像を示す。ホスホ−ＡＫＴ免疫組織化学のため、切片をマウスモノクローナル抗ホスホ−ＡＫＴ−Ｓｅｒ４７３抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に４℃で２４時間インキュベートし、及びＣｙ３コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に２時間インキュベートした。免疫活性（ＩＲ）の強度を、免疫組織化学的に染色した切片の光学デンシトメトリーによって決定した。ＮｉｋｏｎデジタルカメラＤＸＭ１２００を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡（ＡＴＩ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して蛍光像を取得した。
【０１９３】
ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）において、ＤＧの分子層（図３１Ａ）及び皮質の第Ｖ層（図３１Ｂ）におけるＰ−ＡＫＴの光学濃度は＋／Ｙマウスと比べて有意に低いことが観察された。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５を５日間連続して脳室内注射したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）では、これらの欠陥は完全にレスキューされ、ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスにおけるＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５による処置がＡＫＴ活性を回復させることが実証された。
【０１９４】
実施例１０：インビボでＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質が成熟ニューロンの樹状突起構造に及ぼす効果
成熟ニューロンの樹状突起構造に対する治療効果を分析した。そのため、顆粒細胞層の中間部分に位置するゴルジ染色した顆粒ニューロンを調べた。ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスは野生型雄マウスと比較して短い長さの樹状突起分枝を示すが、これらの欠陥はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５による処置によって完全にレスキューされた（図３２）。処置した（−／Ｙ）及び（＋／Ｙ）マウスの両方で総樹状突起長は未処置（＋／Ｙ）マウスと比較して長くさえなった。これらの結果は、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスで観察される成熟顆粒ニューロンの損なわれた樹状突起構造がＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質による処置によって回復したことを示している。
【０１９５】
ゴルジ染色切片において顆粒細胞のスパインをカウントし、分子層の内側半分及び外側半分にある樹状突起セグメントでスパイン密度を測定した。未処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ成体雄マウスは野生型マウスと比較して低いスパイン密度を示し、一方、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質で処置すると密度は完全に回復し、ノックアウト条件と野生型条件との差が解消された。代表的な画像を図３３に示し、右側図３４のヒストグラムで相対的定量を観察することができる。
【０１９６】
まとめると、これらのデータは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５による処置によってシナプトフィジン発現が回復し、且つ樹状突起スパイン数及び成熟が修正されることにより、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスにおける結合性が完全に回復することを実証している。
【０１９７】
実施例１１：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質が学習及び記憶能力に及ぼす効果
雄ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して学習及び記憶障害を呈する（例えば図３６、及び図３７Ａ〜図３７Ｂを参照）。
【０１９８】
記憶及び学習能力を調べるため、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスに毎日、１０日間ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質の脳室内注射を投与した（実験スケジュールに関しては、例えば図３５を参照）。１０日間の注射の終わりに２日間の安静期間を置いた後、全ての群のマウスがモーリス水迷路（ＭＷＭ）試験を受けた（図３６）。ＭＷＭは、水面下にある隠れたプラットフォームを見付けてその位置を思い出す能力を測る。マウスをＭＷＭ課題で訓練し、円形プール内の隠された避難プラットフォームの位置を特定させた。この装置は、透明の丸い避難プラットフォーム（１０ｃｍ２）を備えた大型の円形水槽（１．００ｍ直径、５０ｃｍ高さ）からなった。プールは、事実上、北東、北西、南東、及び南西として特定される４つの等しい四分円に分割した。水槽に２２℃の温度の水道水をプラットフォームの上面の０．５ｃｍ上まで満たし、乳液で水を不透明にした。このプラットフォームは水槽内の定位置（北西象限の中央）に置かれた。プールは、幾つもの迷路内（正方形、三角形、円形及び星形）及び迷路外の視覚的手がかりを含む大きい部屋に置いた。訓練後、５日間連続で１日当たり各々４試行の２セッションについて、セッション間に４０分の間隔を置いて（獲得段階）、各マウスを試験した。プール中央の上方にビデオカメラを置き、ビデオトラッキングシステム（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  ３．１；Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂ．Ｖ．、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ）に接続した。マウスは、以下の出発点、即ち北、東、南、又は西のうちの１つからプールの壁に向かって放し、最長６０秒間プラットフォームを探索させた。マウスがプラットフォームを見付けられなかった場合、マウスを優しくプラットフォームへと案内し、そこに１５秒間留まらせた。隠されたプラットフォームを見付けるまでの潜時を学習尺度として用いた。実験セッションは全て、午前９時００分から午後３時００分の間に実施した。
【０１９９】
この試験の結果を図３６に示す。図３６は、野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）におけるモーリス水迷路試験で決定したときの学習段階の定量を表すグラフを示す。野生型マウスは２日目までにプラットフォームを見付けることを学習したが、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスでは有意な学習は認められなかった。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯマウスでは４日目に学習能力が回復し始め、５日目も改善が続いた。
【０２００】
受動回避試験を用いて、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質処置への応答における記憶及び学習能力を更に調べた。１０日間連続して処置し、２日間の安静期間を置いた後、種々の群のマウスが受動回避試験を受けた（図３７）。この実験では、２部屋（明室及び暗室）を備えたテストケージを利用した。１日目（順化期間）、動物を明室に置いた。動物は本能的に暗室に入り、そこで単一の有害事象（フットショック）によって動物を条件付けた。この受動回避試験のため、本発明者らは、スライディングドアによって２つの区画に仕切られた傾斜床の箱（４７×１８×２６ｃｍ）及びショッカーを組み込んだ制御ユニット（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を使用した。パブロフ型条件付けのためのこの古典的装置は、マウスが光に照らされた所から暗い所に逃げようとする性質を利用する（ステップスルー法）。１日目、マウスを照明された区画に個々に置いた。６０秒の馴化期間後、部屋間をつなぐドアを開けた。一般に、マウスは暗所を好むため、マウスは急いでゲートを通り抜け、暗室に入る。暗室に入ったところでマウスに短時間のフットショック（０．７ｍＡで３秒間）を与え、１５秒の待ち時間の後、部屋から取り出した。マウスが試行時間（３５８秒）にわたって明室に留まった場合、ドアを閉め、マウスを明室から取り出した。部屋は個々のマウスの試験間に７０％エタノールで清浄にした。２４時間の記憶保持期間の後、マウスを明室に戻し、マウスが再び暗室に入るまでにかかった時間（潜時）を最長３５８秒まで計測した。
【０２０１】
図３７Ａ〜図３７Ｂは受動回避試験の結果を示す。図３７Ａは、暗室に入るまでの潜時が全ての群について同程度であったことを示す。２日目（試験期間）（図３７Ｂ）、動物を再度明室に置いた。有害事象の記憶を、暗室に入るまでの潜時によって計測した。ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）は、ＣＤＫＬ５雄野生型マウス（＋／Ｙ）と比較したとき、暗室に入るまでの潜時の減少によって実証されるとおりこの課題の遂行が著しく損なわれた。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で処置したＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスは、野生型マウスと比較して同程度の潜時を示した。
【０２０２】
要約すれば、これらのデータは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５によってＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスの学習及び記憶能力が未処置野生型対応物で観察されるレベルと同程度まで増加し及び回復し得ることを実証している。
【０２０３】
実施例１２：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質が運動機能に及ぼす効果
ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウスは、吊り下げたときの肢のクラスピングの長時間化を呈した（例えば図３８Ａ〜図３８Ｂを参照）。
【０２０４】
ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質が運動機能に及ぼす効果を調べるため、マウスに毎日、１０日間連続してＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５の脳室内注射を投与した（図３８）。投薬プロトコルの完了から１０日後、動物を尻尾から空中に吊り下げた（図３８Ａ及び図３８Ｂ）。動物は全て、約２分間吊り下げ、肢のクラスピングの合計時間を計測した。この実験の結果は図３８Ａ〜図３８Ｂに示す。
【０２０５】
図３８Ａ〜図３８Ｂは、野生型雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）、及び図３５の注射スケジュールに従いＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５融合タンパク質で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５）において２分の間隔の間に肢のクラスピングに費やされた時間の合計を計測したクラスピング試験によって決定したときの運動能力の定量を表すグラフを示す。要約すれば、これらのデータは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５による処置によってＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスにおける運動機能が改善されたことを実証している。
【０２０６】
ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質を５日間（＋／Ｙ）又は１０日間（−／Ｙ）にわたり注射した野生型（＋／Ｙ）及びＣｄｋｌ５  ＫＯ（−／Ｙ）雄マウスの体重を計測した。結果は図３９に示す。この注射期間において有意な体重変化は観察されなかったことから、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質投与によって副作用は生じなかったことが示唆される。
【０２０７】
未処置動物及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５で脳室内注射によって５日間又は１０日間処置した動物における同種移植炎症因子１（ＡＩＦ−１）染色の比較を図４０Ａ〜図４０Ｆに示す。データは、処置がミクログリア活性化を引き起こさないことを示し、長期ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５処置に対する炎症反応がないことが示唆される。
【０２０８】
実施例１３：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５アイソフォーム間での発現及び活性の比較
ＣＤＫＬ５遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームが記載されている（Ｋｉｌｓｔｒｕｐ−Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０１２）。当初のＣＤＫＬ５転写物は１０３０アミノ酸のタンパク質を生成する（ＣＤＫＬ５１１５；１１５ｋＤａ）。ＣＤＫＬ５１１５が最初に特徴付けられたＣＤＫＬ５アイソフォームであったが、最近になって同定された１０７ｋＤａアイソフォームは変化したＣ末端領域を含むことが実証されており、脳機能に関わるものと考えられている（ＣＤＫＬ５１０７）（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。上記に記載したとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は任意の好適なアイソフォーム（例えば本明細書の他の部分に記載されるとおりの変異体）を使用して形成されてもよい。本実施例については、ＣＤＫＬ５融合タンパク質は、本明細書の他の部分に記載される同様の方法を用いてＣＤＫＬ５１１５アイソフォーム（配列番号２）又はＣＤＫＬ５１０７アイソフォーム（配列番号１６）をＴＡＴκに作動可能に連結することによって形成した。
【０２０９】
これら２つのＣＤＫＬ５アイソフォーム（１１５及び１０７）の産生及び活性レベルを比較するため、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７をＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞で一過性に又は安定に発現させた。培養培地からの回収率はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質がＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５よりも高いことが観察された（図４１）。
【０２１０】
これら２つのＣＤＫＬ５アイソフォームは同様の細胞内安定性を有することが観察された。図４２Ａ〜図４２Ｂは、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（図４２Ａ）及びＳＫＮＢＥ細胞（図４２Ｂ）における発現したＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質の細胞内安定性を表すグラフを示す。ＨＥＫ  ２９３Ｔ及びＳＫＮＢＥ細胞にＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を指示される時間（３、６又は８時間）にわたってシクロヘキシミド（Ｃｈｘ；５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。異所的に発現したＣＤＫＬ５をＣＤＫＬ５イムノブロッティングにより検出した。
【０２１１】
重要なことに、機能レベルで、本発明者らは、これら２つのアイソフォームが同等の生理活性を有することを見出した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５のインビトロ活性をＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５と並行して試験した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を播種翌日に精製ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（対照として）で処理した。詳細には、濃縮／精製タンパク質を含有する濃縮培地と共に細胞を約２４時間インキュベートした。細胞増殖を分裂指数（有糸分裂を起こしている集団内の細胞数の細胞総数に対する比）としてヘキスト核染色を用いて評価した。図５２に示されるとおり、本発明者らは、両方のＣＤＫＬ５アイソフォームが増殖阻害の点でＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞に同じ効果を及ぼすことを実証した。本発明者らは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１１５のインビトロ活性をｅＧＦＰのないＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１１５タンパク質と並行して試験した。図５２に示されるとおり、本発明者らは、両方のタンパク質が増殖阻害の点でＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞に同じ効果を及ぼすことを実証し、ｅＧＦＰタグによってＣＤＫＬ５活性が変化しないことが指摘された。
【０２１２】
実施例１４：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５タンパク質は天然ＣＤＫＬ５と同じ細胞内局在性を有し、及びＣＤＫＬ５  ＫＯマウスに由来する海馬ニューロンの神経突起発達を回復させる
海馬ニューロンではＣＤＫＬ５は主として細胞質局在を有し、シナプス後区画にエンリッチされることが示されている。本発明者らは、これらのニューロンにおいてインターナライズされたＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７が主として細胞質に局在し、詳細には、樹状突起レベルではそれが樹状突起スパインに特異的に局在することを見出した（図４５Ａ〜図４５Ｄ）。共焦点イメージング（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｅ）によれば、シナプス前（シナプトフィジン；ＳＹＮ  図６０Ａ〜図６０Ｃ）及びシナプス後（ＰＳＤ−９５；図４６Ａ〜図４６Ｄ）でのＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５共局在が示される。これは、この外因性タンパク質が天然ＣＤＫＬ５と同じ細胞内部位に局在することを示している。
【０２１３】
ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７がＣＤＫＬ５生理活性を保持しているかどうかを確立するため、ＣＤＫＬ５ノックアウト雄マウス（−／Ｙ）からの海馬ニューロン培養物をＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（培養培地に加えた）の存在下で８日間成長させた。これらのニューロンでは、ＣＤＫＬ５が存在しないため、樹状突起長（図４７）、シナプス結合数（図４８）及びスパイン密度（図６１）の低下によって示されるとおり、ニューロン成熟の低下が起こる。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５で処理すると神経突起発達が回復し（図４７〜図４８及び図６１）、この融合タンパク質がＣＤＫＬ５の生理活性を保持していることが示される。
【０２１４】
実施例１５：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質が行動に及ぼす効果
図４９Ａ〜図４９Ｂは、行動試験についてのＣＤＫＬ５融合タンパク質の処置スケジュール及び投与経路を描いた略画を示す。雄ＣＤＫＬ５野生型マウス（＋／Ｙ）がＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）による処置を受け、一方、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）が、上記に示したとおり、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝６匹）で処置された。処置期間は、５日間連続の毎日の単回注射（１０μｌ注射、約５０ｎｇ／注射）、続く２日間の休止期間、次に更に５日間の単回注射からなった。合計１０回の注射があり、これらの注射は１２日間の期間で行われた。
【０２１５】
図５０は、図４９Ａ〜図４９Ｂに記載されるとおりＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７融合タンパク質を投与した後のモーリス水迷路試験の結果を表すグラフを示す。処置期間及び２日間の休止期間後、マウスはモーリス水迷路（ＭＷＭ）試験を受けた。この試験は、水面下に隠れたプラットフォームを見付けてその位置を思い出す能力を測る。マウスはその学習能力に関して５日間試験し（学習段階）、６日目に探索試験に供した（ページ４）。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置した野生型（＋／Ｙ）雄マウスはプラットフォームを見付けることを３日目までに学習したが、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスには有意な学習は認められず、学習欠損が示唆された。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスは３日目に学習能力を回復し始め、４及び５日目にはＷＴと同程度の成績に達した。値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【０２１６】
図５１Ａ〜図５１Ｃは、（図５１Ａ）元のプラットフォーム象限に入るまでの潜時、（図５１Ｂ）元のプラットフォーム象限に入る頻度、（図５１Ｃ）元のプラットフォーム象限に滞在した時間の割合を測定することによる空間記憶を表すグラフを示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスでは全てのパラメータの成績が著しく悪化した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスは全てのパラメータの統計的に有意な改善を示した、図Ａ、Ｂ及びＣ。値は平均値±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置Ｃｄｋｌ５  ＫＯ  −／Ｙ条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【０２１７】
図５２Ａ〜図５２Ｂは、受動回避（ＰＡ）試験を用いた学習及び記憶に対する処置効果を表すグラフを示す。処置期間及び２日間の休止期間後、マウスは受動回避（ＰＡ）試験を受けた。実験には２室（明室及び暗室）を備えるテストケージを利用した。１日目、動物を明室に置くと、本能的に暗室に進入し、そこで単一の有害事象（フットショック）によって動物を条件付ける。図５２Ａは、全ての群で暗室に進入するまでの潜時が同程度であったことを示す。２日目（試験期間）、動物を再び明室に置く。有害事象の記憶を暗室に進入するまでの潜時によって測定し、図５２Ｂに表した。この課題において、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄（−／Ｙ）マウスは、野生型雄（＋／Ｙ）マウスと比較した暗室に進入するまでの潜時の減少によって示されるとおり著しく悪化した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスは野生型マウスと比較して同程度の潜時を示した（図５２Ｂ）。これらの差はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスと比較して統計的に有意であった。＊＊ｐ＜０．０１  対野生型雄条件；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ  −／Ｙ条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【０２１８】
図５３Ａ〜図４２Ｂは、（図５３Ａ）学習及び記憶に対する処置効果の評価に使用されるＹ迷路の略画、及び（図５３Ｂ）Ｙ迷路試験の結果を表すグラフを示す。処置期間及び２日間の休止期間後、マウスはＹ迷路試験を受けた。マウスが新しい環境を探索しようとする意思の測定にはＹ迷路自発的交替行動を使用し、これは海馬依存的空間参照記憶に相当する。各マウスを１つのアームの遠位部分に迷路の中心に向けて置いた。３つのアームの各々は、３４ｃｍ×５ｃｍ×１０ｃｍ高さで、他と１２０°の角度をなし、灰色の不透明プラスチック製であった。迷路への導入後、動物には３つのアームを８分間にわたって自由に探索させる。複数のアームに進入するうちに、対象は直近に訪れたアームには進入したがらない傾向を示すはずである。アームへの進入は、４本の足全てがアーム内にあることと定義した。自発的交替行動の割合は、（交替行動総数／アーム進入総数−２）×１００として定義される。１回の交替行動は、連続した３つの異なるアームへの進入として定義される。この課題において、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄（−／Ｙ）マウスは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置野生型雄（＋／Ｙ）マウスと比較した自発的交替行動割合の低下によって示されるとおり悪化した。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＷＴと同程度の成績を示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  対野生型雄条件；＃ｐ＜０．０５  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【０２１９】
図５４Ａ〜図５４Ｂは、運動機能に対する処置効果の評価に用いた後肢クラスピング試験におけるクラスピングあり（右のマウス）対クラスピングなし（左のマウス）を表す（図５４Ａ）グラフ及び（図５４Ｂ）画像を示す。処置期間後、動物の尾をつかんで宙に吊るした。全ての動物について２分間吊るし、総後肢クラスピング時間を測定した。上の図は、吊るした総時間に対する割合としての後肢クラスピング時間を報告する。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７による処置は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄（−／Ｙ）マウスと比較したときのクラスピング時間の統計的に有意な減少につながった。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊＊ｐ＜０．００１  対野生型条件；＃＃ｐ＜０．００１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄条件（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【０２２０】
図５５Ａ及び図５５Ｂは、ノンレム（ＮＲＥＭ）（図５５Ａ）及びレム（図５５Ｂ）睡眠中の無呼吸回数によって測定したときのＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）雄マウスの呼吸障害を表すグラフを示す。ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７による処置は、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスにおけるノンレム（ＮＲＥＭ）（図５５Ａ）及びレム（図５５Ｂ）睡眠中の無呼吸回数の大幅な減少につながった。
【０２２１】
雄野生型（＋／Ｙ）及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７タンパク質を１０日間にわたって注射したＣＤＫＬ５  ＫＯマウス（−／Ｙ）の体重を測定した。結果は図５９に示す。注射期間中に有意な体重変化は観察されなかったことから、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５タンパク質投与によって引き起こされた副作用はなかったことが示唆される。
【０２２２】
実施例１６：ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１０７インビボ処置がニューロン成熟及び生存に及ぼす持続的効果
タンパク質補充療法は患者の生涯にわたって継続する必要がある。ヒトにおける将来の治療プロトコルに鑑みて注射頻度を減らし得る可能性を念頭に置き、本発明者らは治療中止後の正の効果の持続性を評価した。
【０２２３】
図５６Ａ〜図５６Ｄは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫ５１０７融合タンパク質による処置の効果を実証するグラフ（図５６Ａ）及び（図５６Ｂ〜図５６Ｄ）新生顆粒細胞の再構成された樹状突起樹を示す。処置期間の終了後１２日で、神経突起伸長期間（ニューロン誕生後１〜４週間）に細胞質に存在するタンパク質であるＤＣＸに関する免疫組織化学によって顆粒細胞樹状形態を分析した。図Ａは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置した雄野生型（＋／Ｙ）（ＷＴ）及び雄ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウス及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置した雄ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウスの平均総樹状突起長を表す。図５６Ｂ、図５６Ｃ及び図５６Ｄは、それぞれ、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置した雄野生型（＋／Ｙ）マウス、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置した雄ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウス及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置した雄ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウスの新生顆粒細胞の再構成された樹状突起樹の例を示す。データは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７による処置が、投与中断時点から少なくとも１２日間持続する形態学的変化につながることを示す。値は平均値±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１  対野生型条件；＃ｐ＜０．０１  対ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ処置（−／Ｙ）条件（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。
【０２２４】
図５７は、野生型（ＷＴ）雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスの海馬（歯状回）におけるＤＣＸ陽性細胞数の定量を示す。処置期間は、１日１回の脳室内注射を５日間、続く２日間の休止期間、次に更なる１日１回の注射を５日間からなった。動物は最終回の注射の１０日後に犠牲にした。データは細胞数／μｍとして表す。＊＊ｐ＜０．０１  対＋／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ試料の細胞数／μｍ；＃＃ｐ＜０．００１  対−／Ｙ＋ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ試料の細胞数／μｍ（ＡＮＯＶＡ後ボンフェローニ検定）。データから、ＤＣＸ陽性細胞数に対するＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５による処置の正の影響が処置完了後１０日維持されることが示唆される。
【０２２５】
図５８は、野生型（ＷＴ）雄マウス（＋／Ｙ）、ＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウス（−／Ｙ）、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  ＫＯ雄マウスの海馬（歯状回）における切断型カスパーゼ３陽性細胞の総数の定量を示す。処置期間は、１日１回の脳室内注射を５日間、続く２日間の休止期間、次に更なる１日１回の注射を５日間からなった。動物は最終回の注射の１０日後に犠牲にした。
【０２２６】
実施例１７：全身投与したＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５１０７タンパク質が神経発達及び行動に及ぼす効果
図６２はＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与の処置スケジュールを示す。毎日のヒト用量投与を模擬するため、本発明者らは、補充可能なリザーバ付きの皮下に植え込んだプログラム可能ポンプに基づく革新的注入方法を用いた。このポンプを頸動脈に植え込んだカニューレに接続した。このシステムにより、１０日間の継続期間にわたる１日２回注入プロトコル（朝及び夜）の適用が可能となった。雄ＣＤＫＬ５  ＫＯ（−／Ｙ）マウスに１日２回、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（２０μｌ＋２０μｌ）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（２０μｌ＋２０μｌ）を１０日間の継続期間にわたって注入した。２回の注入時間帯は午前９〜１０時及び午後９〜１０時であった。この処置スケジュールを用いて、図６３Ａ〜図７２に示すデータを作成した。図６５〜図６８及び図７０〜図７２では、値は平均値±ＳＥとして表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１  対未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ条件；＃ｐ＜０．０５  対未処置ＣＤＫＬ５  −／Ｙ試料（ＡＮＯＶＡ後フィッシャーＬＳＤ検定）。
【０２２７】
図１７Ａ〜図１７Ｆに示されるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質１１５アイソフォームは全身投与したとき血液脳関門を通過することができる。図６３Ａ〜図６３Ｂは、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７による全身的処置が新生顆粒細胞成熟に及ぼす効果を示す。最終回の注射後１時間で動物を犠牲にし、新生海馬顆粒細胞の樹状形態をＤＣＸ免疫組織化学で分析した。図６３Ａ〜図６３Ｂは、処置した雄ＣＤＫＬ５ノックアウトマウスのＤＣＸ陽性ニューロンが未処置雄ＣＤＫＬ５  ＫＯマウスよりも長い突起を有したことを実証している。図６４は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７によって処置したマウスでは睡眠中の無呼吸が大幅に減少することを示し、処置の正の効果が指摘される。
【０２２８】
図６５は、未処置ＣＤＫＬ  ＋／Ｙ（ｎ＝５匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝５匹）マウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝６匹）で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの新生（ダブルコルチン陽性）顆粒細胞の総樹状突起長を示す。図６６は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ（ｎ＝５匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝５匹）マウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝４匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝５匹）で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスのゴルジ染色した顆粒細胞の総樹状突起長を示す。図６５及び図６６から分かるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与により、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙマウスと比較して樹状突起長が有意に増加した。
【０２２９】
図６７は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ（ｎ＝２４匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝１１匹）マウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝５匹）で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの穴掘り発作回数を示す。図６７から分かるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与により、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙマウスと比較して穴掘り発作回数が有意に増加した。
【０２３０】
図６８は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ（ｎ＝６匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝２０匹）マウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝６匹）又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝５匹）で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの巣の品質を示す。図６８から分かるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与により、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙマウスと比較して巣の品質が有意に増加した。
【０２３１】
図６９は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７のいずれかで処置した１匹のＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスにおける種々の時点で収集した視覚野内の神経活動の代表的な画像を示す。図６９では、画像が濃いほど高いレベルの神経活動を示し、画像が薄いほど低いレベルの神経活動を示す。図６９から分かるとおり、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したマウスは視覚野内の神経活動がほとんどなかった一方、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したマウスは１０日間の処置期間を通じて視覚活動を取り戻し、ウォッシュアウト期間も視覚活動を維持した。
【０２３２】
図７０は、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７で処置したＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスにおける６及び１０日間の処置前及び処置後に測定した視覚誘発反応の平均振幅を示す。処置中止後６〜１０日（ウォッシュアウト）の更なる測定によって効果の持続性を評価した。参考として、経時的な未処置野生型反応振幅の９５％信頼区間を網かけ範囲で示す。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。二元配置ＡＮＯＶＡ（因子時間に関して反復測定）により時間×処置相互作用ｐ＜０．０５が明らかになった；ホルム・シダックの事後多重比較検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図７０から分かるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の６及び１０日間にわたる全身投与により、ＴＡＴκ−ｅＧＦＰで処置したＣＤＫＬ５  ＋／Ｙマウスと比較して視覚誘発反応の平均振幅が大幅に低下した。この傾向は処置中止後も続いた。
【０２３３】
図７１は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ（ｎ＝５匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝５匹）マウス及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝４匹）若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝５匹）で処置して処置終了時に犠牲にした（短期）、又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝３匹）若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝３匹）で処置して処置中止後１０日で犠牲にした（長期）ＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスからの一次視覚野（Ｖ１）錐体ニューロン（第２／３層）の樹状突起スパイン密度を示す。図７１から分かるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与により、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙマウスと比較して樹状突起スパイン密度が有意に増加した。この傾向は処置中止後も続いた。
【０２３４】
図７２は、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙ（ｎ＝３匹）及びＣＤＫＬ５  −／Ｙ（ｎ＝３匹）マウス、及びＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝４匹）若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝６匹）で処置して処置終了時に犠牲にした（短期）、又はＴＡＴκ−ｅＧＦＰ（ｎ＝４匹）若しくはＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５１０７（ｎ＝４匹）で処置して処置中止後１０日で犠牲にした（長期）ＣＤＫＬ５  −／Ｙマウスの一次視覚野（Ｖ１）におけるＰＳＤ−９５免疫反応性を呈する蛍光パンクタ数／μｍ２を示す。図７２から分かるとおり、ＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身投与により、未処置ＣＤＫＬ５  ＋／Ｙマウスと比較してＰＳＤ−９５蛍光パンクタ数／μｍ２が有意に増加した。この傾向は処置中止後も続いた。
【０２３５】
これらのデータは、ＣＤＫＬ５欠損症の治療のためのＣＤＫＬ５融合タンパク質の全身（例えば静脈内）投与により、樹状突起長さが増加し、視覚野内の神経活動が増加し、及び行動が改善されることを裏付けている。
【０２３６】
配列表
配列番号１  ＣＤＫＬ５  １１５アイソフォームｃＤＮＡ  （イニシエーターメチオニンのＡＴＧ開始コドンなし）
【化１】
2019522989.tif 000003
【化２】
2019522989.tif 000004
配列番号２  ＣＤＫＬ５アイソフォーム１１５ポリペプチド（イニシエーターメチオニンなし）
【化３】
2019522989.tif 000005
配列番号３  ＴＡＴκポリヌクレオチド配列
ｔａｃｇｃｃａｇａａａｇｇｃｃｇｃｃａｇｇｃａｇｇｃｃａｇｇｇｃａ    
配列番号４  ＴＡＴκポリペプチド配列
ＹＡＲＫＡＡＲＱＡＲＡ
配列番号５  Ｉｇκ鎖リーダーポリヌクレオチド配列
ａｔｇｇａｇａｃａｇａｃａｃａｃｔｃｃｔｇｃｔａｔｇｇｇｔａｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｔｔｃｃａｇｇｔｔｃｃａｃｔｇｇｔ
配列番号６  Ｉｇκ鎖リーダーポリペプチド  
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
配列番号７  ＣＤＫＬ５  １１５アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇκ−ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５（１１５）−ＭＹＣ−ＨＩＳ）ポリヌクレオチド
【化４】
2019522989.tif 000006
【化５】
2019522989.tif 000007
配列番号８  ＣＤＫＬ５  １１５アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇκ−ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５（１１５）−ＭＹＣ−ＨＩＳ）ポリペプチド
【化６】
2019522989.tif 000008
配列番号９  ＣＤＫＬ５  １１５アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇｋ−ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５（１１５）−ＭＹＣ−ＨＩＳ）ポリヌクレオチド。下線はイニシエーターメチオニンのコドンを示す。
【化７】
2019522989.tif 000009
【化８】
2019522989.tif 000010
配列番号１０  ＣＤＫＬ５  １１５アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇκ−ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５（１１５）−ＭＹＣ−ＨＩＳ）ポリペプチド。配列番号９のヌクレオチド１１  （イニシエーターメチオニン）から翻訳される。
【化９】
2019522989.tif 000011
配列番号１１  ＣＤＫＬ５  １０７アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇκ−ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５（１０７）−ＭＹＣ−ＨＩＳ）ポリヌクレオチド
【化１０】
2019522989.tif 000012
【化１１】
2019522989.tif 000013
配列番号１２  ＣＤＫＬ５  １０７アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇκ−ＴＡＴκ−ｅＧＦＰ−ＣＤＫＬ５（１０７）−ＭＹＣ−ＨＩＳ）ポリペプチド
【化１２】
2019522989.tif 000014
配列番号１３  ＣＤＫＬ５  １０７アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇｋ−ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５（１０７）−３ＸＦＬＡＧポリヌクレオチド。下線はイニシエーターメチオニンのコドンを示す。
【化１３】
2019522989.tif 000015
配列番号１４  ＣＤＫＬ５  １０７アイソフォーム融合タンパク質（Ｉｇκ−ＴＡＴκ−ＣＤＫＬ５（１０７）−３ＸＦＬＡＧポリヌクレオチド
【化１４】
2019522989.tif 000016
配列番号１５  ＣＤＫＬ５  １０７アイソフォームポリヌクレオチド。配列にはイニシエーターメチオニンのコドンがない。
【化１５】
2019522989.tif 000017
【化１６】
2019522989.tif 000018
配列番号１６  ＣＤＫＬ５  １０７アイソフォームポリペプチド。配列にはイニシエーターメチオニンがない。
【化１７】
2019522989.tif 000019
【図１】
2019522989.tif 000020
【図２】
2019522989.tif 000021
【図３】
2019522989.tif 000022
【図４Ａ】
2019522989.tif 000023
【図４Ｂ】
2019522989.tif 000024
【図５Ａ−５Ｂ】
2019522989.tif 000025
【図６】
2019522989.tif 000026
【図７Ａ−７Ｂ】
2019522989.tif 000027
【図８】
2019522989.tif 000028
【図９Ａ−９Ｂ】
2019522989.tif 000029
【図１０】
2019522989.tif 000030
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2019522989.tif 000031
【図１２】
2019522989.tif 000032
【図１３Ａ】
2019522989.tif 000033
【図１３Ｂ】
2019522989.tif 000034
【図１４Ａ】
2019522989.tif 000035
【図１４Ｂ】
2019522989.tif 000036
【図１５Ａ】
2019522989.tif 000037
【図１５Ｂ】
2019522989.tif 000038
【図１５Ｃ】
2019522989.tif 000039
【図１６】
2019522989.tif 000040
【図１７Ａ−１７Ｆ】
2019522989.tif 000041
【図１８Ａ−１８Ｄ】
2019522989.tif 000042
【図１９】
2019522989.tif 000043
【図２０】
2019522989.tif 000044
【図２１Ａ】
2019522989.tif 000045
【図２１Ｂ】
2019522989.tif 000046
【図２１Ｃ】
2019522989.tif 000047
【図２２Ａ】
2019522989.tif 000048
【図２２Ｂ】
2019522989.tif 000049
【図２２Ｃ】
2019522989.tif 000050
【図２３Ａ−２３Ｃ】
2019522989.tif 000051
【図２４Ａ−２４Ｂ】
2019522989.tif 000052
【図２５Ａ−２５Ｂ】
2019522989.tif 000053
【図２６】
2019522989.tif 000054
【図２７】
2019522989.tif 000055
【図２８Ａ−２８Ｃ】
2019522989.tif 000056
【図２９Ａ−２９Ｃ】
2019522989.tif 000057
【図３０Ａ−３０Ｂ】
2019522989.tif 000058
【図３１Ａ−３１Ｂ】
2019522989.tif 000059
【図３２】
2019522989.tif 000060
【図３３】
2019522989.tif 000061
【図３４】
2019522989.tif 000062
【図３５】
2019522989.tif 000063
【図３６】
2019522989.tif 000064
【図３７】
2019522989.tif 000065
【図３８Ａ】
2019522989.tif 000066
【図３８Ｂ】
2019522989.tif 000067
【図３９】
2019522989.tif 000068
【図４０Ａ−４０Ｆ】
2019522989.tif 000069
【図４１】
2019522989.tif 000070
【図４２Ａ−４２Ｂ】
2019522989.tif 000071
【図４３】
2019522989.tif 000072
【図４４】
2019522989.tif 000073
【図４５Ａ−４５Ｄ】
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【図４６Ａ−４６Ｃ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１Ａ−５１Ｃ】
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【図５２Ａ−５２Ｂ】
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【図５３Ａ−５３Ｂ】
2019522989.tif 000083
【図５４Ａ−５４Ｂ】
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【図５５Ａ−５５Ｂ】
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【図５６Ａ−５６Ｄ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ−６０Ｃ】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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