(57)【要約】  組換えヒト血清アルブミンの高発現のための方法であって、酵母宿主細胞で（ａ）ヒト血清アルブミン遺伝子と（ｂ）１以上のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子を共発現させる工程を含んでなることを特徴とする方法が提供される。
2019516401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒト血清アルブミンを高発現させる方法であって、酵母宿主細胞で（ａ）ヒト血清アルブミン遺伝子と（ｂ）１以上のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子を共発現させる工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
酵母がピキア属である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵母がピキア・パストリスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｒＨＳＡ発現促進因子が転写アクチベーターＨＡＣ１、結合タンパク質ＫＡＲ２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、小胞体オキシドレダクターゼ（ＥＲＯ１）およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
１、２、３またはそれを超えるｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子が酵母宿主細胞に導入される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ヒト血清アルブミン遺伝子がプラスミドにより酵母宿主細胞に形質転換される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子が１、２またはそれを超えるプラスミドにより酵母宿主細胞に形質転換される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組換えヒト血清アルブミンを高発現する遺伝子工学操作された真菌であって、酵母であり、かつ、（ａ）ヒト血清アルブミン遺伝子と（ｂ）１以上のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子を含んでなる、遺伝子工学操作された真菌。
【請求項９】
酵母がピキア属である、請求項９に記載の遺伝子工学操作された真菌。
【請求項１０】
酵母がピキア・パストリスである、請求項９に記載の遺伝子工学操作された真菌。
【請求項１１】
ｒＨＳＡ発現促進因子が転写アクチベーターＨＡＣ１、結合タンパク質ＫＡＲ２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、小胞体オキシドレダクターゼ（ＥＲＯ１）およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）からなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
【請求項１２】
１、２、３またはそれを超えるｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子が遺伝子工学操作された真菌に導入されている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
【請求項１３】
ヒト血清アルブミン遺伝子がプラスミドにより遺伝子工学操作された真菌に形質転換された、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
【請求項１４】
１、２またはそれを超えるプラスミドにより遺伝子工学操作された真菌に形質転換された、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子工学操作された真菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血清アルブミンの組換え生産に関し、特に、本発明は、酵母細胞でヒト血清アルブミンと１以上のヒト血清アルブミン発現促進因子を共発現させることによりヒト血清アルブミンを高生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ヒト血中で最も豊富なタンパク質であり、全血漿タンパク質の約６０％を占める。ＨＳＡは重要な生理学的機能を有し、血液の浸透圧を維持することができ、内因性および外因性物質を輸送するための重要な担体であり、重要な血液バッファー成分である。加えて、ＨＳＡはまた細胞培養培地の添加成分、医薬賦形剤などとして使用することもでき、重要な応用価値を有する。現在のところ、ＨＳＡには２つの主要な供給源があり、一つは血漿からの抽出である。中国での血漿の不足ならびにＡＩＤＳおよび肝炎などのウイルス感染のリスクのために、この方法によって得られるＨＳＡは、巨大な市場需要を満たすことができない。もう一つは生物工学技術を用いた組換え製法である。生物工学技術によって組換え生産されたヒト血清アルブミンは、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）と呼ばれる。この場合、酵母によりｒＨＳＡを発現させる技術が最も広く研究され、完成している。米国特許第５，６８３，８９３号には、酵母でのｒＨＳＡ発現を増強するためにピキア(Pichia)アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターを変異させる方法が開示されている。２００５年４月２９日出願の中国特許出願第２００５１００６８１７１．９号には、ｒＨＳＡ酵母株の構築および発酵の方法が開示され、その発現レベルは１０ｇ／Ｌ培地上清に達し得る。しかしながら、上記の方法はなお低いｒＨＳＡ発現、長い発酵時間および低い生産効率という欠点を持ち、従って、より生産性の高い遺伝子工学操作株を構築するための新たな方法を見つけることが必要である。
【０００３】
ピキア属は、核生物のタンパク質に対して翻訳後修飾を有し、従って、外来タンパク質は発現後に適切に折り畳まれ、組み立てられ、細胞外に分泌され得る。一方、ピキア属は、高密度発酵に関して、単一の炭素源としてメタノールを効果的に利用することができる。従って、ピキア属は、外来タンパク質の発現に広く使用されている。しかしながら、ピキア属は一般に、長い発酵サイクル、高い生産コストを有し、汚染およびタンパク質分解を受けやすい。よって、発酵時間の短縮とコストの軽減がこの発現系の研究のホットスポットとなっている。
【０００４】
酵母の小胞体（ＥＲ）は、本来の立体配座へのタンパク質の折りたたみとグリコシル化およびリン酸化などの翻訳後修飾の重要なサイトである。小胞体に多数の折り畳まれてないタンパク質が存在すると、アンフォールディングタンパク質応答（ＵＰＲ）が誘導され、これが次に分子シャペロンおよび折りたたみ酵素の下流発現、ならびに小胞体関連タンパク質分解経路を活性化する。自己調節機構として、ＵＰＲは酵母成長および分泌タンパク質の発現に重要な役割を果たす(Graham Whyteside, et al. FEBS Letters 2011; 585: 1037-1041)。転写アクチベーターＨＡＣ１は、酵母ＵＰＲのレギュレーターとして働き、対象タンパク質の発現および分泌の補助に重要な役割を果たす結合タンパク質ＫＡＲ２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、小胞体オキシドレダクチン−１（ＥＲＯ１）、およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）などの、ＵＰＲに関連する一連のタンパク質の発現を調節する。２０１３年３月２２日出願の中国特許出願第２０１３１００９５９７１．４号には、対象タンパク質の発現レベルを増強するためにＰＤＩをアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼと共発現させる方法が開示されている。２００７年５月１６日出願の中国特許出願第２００７８００２６８６４．９号には、メタノール資化酵母オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)のＨＡＣ１の発現を増強する方法が開示され、得られた遺伝子工学操作株は高タンパク質分泌能を有する。Ｔｉｚｉａｎａ  Ｌｏｄｉらは、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)におけるｒＨＳＡの分泌に寄与することを報告している(Tiziana Lodi. et al. AEM 2005; 71: 4359-4363)。さらに、ピキア属でのＫＡＲ２との共発現は、ヒト単鎖抗体フラグメント（Ａ３３ｓｃＦｖ）の発現を倍加させた(Leonardo M. Damasceno, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2007; 74: 381-389)。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、組換えヒト血清アルブミンを高発現させる方法であって、酵母宿主細胞で（ａ）ヒト血清アルブミン遺伝子と（ｂ）１以上のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子を共発現させる工程を含んでなる方法を提供する。
【０００６】
外因性のヒト血清アルブミン遺伝子とｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子が酵母宿主細胞に導入されると、ｒＨＳＡの発現レベルが著しく増強される。
【０００７】
本発明はまた、組換えヒト血清アルブミンを高発現させるための遺伝子工学操作された真菌であって、酵母であり、（ａ）ヒト血清アルブミン遺伝子と（ｂ）１以上のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子を含んでなる遺伝子工学操作された真菌も提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、酵母はピキア属であり、好ましくは、酵母はピキア・パストリス(Pichia pastoris)である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ｒＨＳＡ発現促進因子は、転写アクチベーターＨＡＣ１、結合タンパク質ＫＡＲ２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、小胞体オキシドレダクターゼ（ＥＲＯ１）、およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）からなる群から選択される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態では、以下の組合せが酵母宿主細胞で共発現される：
ｒＨＳＡとＥＲＯ１；
ｒＨＳＡとＰＤＩ；
ｒＨＳＡとＰＤＩとＨＡＣ１；
ｒＨＳＡとＰＰＩとＫＡＲ２；または
ｒＨＳＡとＰＤＩとＰＰＩとＨＡＣ１。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト血清アルブミン遺伝子は、プラスミドにより酵母宿主細胞に形質転換され得、ｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子は１、２またはそれを超えるプラスミドにより酵母宿主細胞に形質転換され得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子工学操作された真菌内の宿主ゲノムにおいて元のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子を不活化する必要はなく、従って、得られた遺伝子工学操作された真菌は、宿主細胞内に移入されたＨＳＡ遺伝子およびｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子と元のｒＨＳＡ発現促進因子遺伝子の両方を含むことができる。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の遺伝子工学操作された真菌はｒＨＳＡを高発現することができ、共発現株におけるｒＨＳＡの発現レベルは１８．２ｇ／Ｌ発酵上清まで著しく増大し、これはｒＨＳＡの大規模工業生産の確かな基盤を築くものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＨＳＡをコードするＤＮＡ配列を示す。
【図２】図２は、図１に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＨＳＡのアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ピキアＥＲＯ１をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図４】図４は、図３に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＥＲＯ１のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ピキアＨＡＣ１をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図６】図６は、図５に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＨＡＣ１のアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、ピキアＰＤＩをコードするＤＮＡ配列を示す。
【図８】図８は、図７に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＰＤＩのアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、ピキアＰＰＩをコードするＤＮＡ配列を示す。
【図１０】図１０は、図９に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＰＰＩのアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、ピキアＫＡＲ２をコードするＤＮＡ配列を示す。
【図１２】図１２は、図１１に示されるＤＮＡ配列によりコードされるＫＡＲ２のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、ｒＨＳＡピキア分泌発現ベクターを示す。
【図１４】図１４は、ｐＰＩＣＺα−ＥＲＯ１ピキア発現ベクターを示す。
【図１５】図１５は、ｐＰＩＣ６−ＨＡＣ１ピキア発現ベクターを示す。
【図１６】図１６は、ｐＰＩＣＺα−ＰＤＩピキア発現ベクターを示す。
【図１７】図１７は、ｐＰＩＣ６−ＰＰＩピキア発現ベクターを示す。
【図１８】図１８は、ｐＰＩＣ６−ＫＡＲ２ピキア発現ベクターを示す。
【図１９】図１９は、ｒＨＳＡ共発現株の振盪フラスコ発現の電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
用語「ｒＨＳＡ発現促進因子」は、本明細書で使用する場合、ｒＨＳＡの発現を促進し得る種々のタンパク質因子を指し、その供給源は特定の種に限定されない。具体的には、分子シャペロン活性を有するタンパク質、例えば、ＫＡＲ２；折りたたみ酵素、例えば、ＰＤＩ；および転写レギュレーター、例えば、ＨＡＣ１などが含まれる。
【００１６】
本発明に特に好適な特定のｒＨＳＡ発現促進因子としては、転写アクチベーターＨＡＣ１、結合タンパク質ＫＡＲ２、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、小胞体オキシドレダクターゼ（ＥＲＯ１）、およびペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）などが含まれる。
【００１７】
「ｒＨＳＡ発現促進因子」の供給源は、特定の種に限定されない。例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のｒＨＳＡ発現促進因子，例えば、ＰＤＩがピキア属で十分に機能し得る。
【００１８】
当業者ならば、「ｒＨＳＡ発現促進因子」がまた、上記発現促進因子に比べてアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸残基の置換、付加または欠失を有し、かつ、実質的に類似の生物学的機能を有するタンパク質または活性フラグメントも含むことを認識するであろう。それにはまた、これらのタンパク質またはそれらの活性フラグメントを含有する修飾産物、融合タンパク質および複合体も含まれる。
【００１９】
好ましくは、ｒＨＳＡ発現促進因子は、宿主細胞に由来する。例えば、ピキア由来のｒＨＳＡ発現促進因子は、発現のためにピキア宿主細胞に好ましく導入される。
【００２０】
当業者ならば、異なるタイプの促進因子の異なる組合せは異なる技術的効果を生み得ることを認識するであろう。例えば、転写レギュレーターＨＡＣ１と折りたたみ酵素ＰＤＩの同時付加はＰＤＩ単独よりも良好なｒＨＳＡ発現をもたらす。
【００２１】
ｒＨＳＡ発現促進因子は、単独でまたは組み合わせて導入され得る。
【００２２】
例えば、本発明のいくつかの実施形態では、ｒＨＳＡ発現促進因子（ＥＲＯ１、ＨＡＣ１、ＫＡＲ２、ＰＤＩ、ＰＰＩなどを含む）は、宿主細胞に単独で導入され、ｒＨＳＡと共発現され、発現を著しく増強する。例えば、ＰＤＩとｒＨＳＡの共発現は、ｒＨＳＡの発現レベルに、発現促進因子が使用されない場合の発現レベルに比べて１６０％の増強をもたらす。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、ｒＨＳＡ発現促進因子は、対で宿主細胞に導入され得る。例えば、ＰＤＩとＨＡＣ１の組合せは、ｒＨＳＡの発現レベルに、発現促進因子が使用されない場合の発現レベルに比べて２倍近くの増強をもたらした。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、３以上のｒＨＳＡ発現促進因子が宿主細胞に導入され得る。例えば、本発明の特定の実施形態では、ｒＨＳＡは、宿主細胞で３つの発現促進因子ＰＤＩ、ＰＰＩおよびＨＡＣ１とともに共発現され、ｒＨＳＡの発現レベルを著しく増強する。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明者は、ピキアＧＳ１１５株のＥＲＯ１、ＨＡＣ１、ＫＡＲ２、ＰＤＩ、およびＰＰＩ遺伝子を遺伝子工学技術によりクローニングし、誘導発現ベクターを構築した。これらのタンパク質とｒＨＳＡの共発現により、高発現および高効率を有する遺伝子工学操作された酵母真菌を得るために多様な組合せがスクリーニングされた。
【実施例】
【００２６】
１．ＨＳＡのクローニングおよび発現ベクターの構築
発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）は、外来タンパク質分泌および発現させるために使用できる酵母α−因子シグナルペプチドを保持している。以下のプライマーをＧｅｎＢａｎｋによって公開されているＮＭ＿０００４７７．５の配列に従って設計した：（酵素切断部位に下線が施されている）
ＨＳＡフォワード：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＣＴＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴ（配列番号１）
ＨＳＡリバース：ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣ（配列番号２）
【００２７】
ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを、特定の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うために鋳型として使用した：９４℃で３分変性；９４℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、７２℃で２分伸長、合計３０サイクル；対で、７２℃で１０分伸長。得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで酵素消化し、ｐＰＩＣ９Ｋベクターに挿入してベクターｐＰＩＣ９Ｋ−ＨＳＡを得、構造を図１３に示す。ＨＳＡ  ＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認し、結果を図１に示す。対応するアミノ酸配列を図２に示す。
【００２８】
２．ｒＨＳＡ酵母分泌および発現株の構築およびスクリーニング
本発明では、ピキアＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を宿主株として使用し、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＨＳＡベクターをＳａｌＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５染色体のＨＩＳ４遺伝子座に組み込まれ、形質転換株に対し、２ｍｇ／ｍＬジェネティシン（Ｇ４１８）を含有するＹＰＤ（酵母抽出物ペプトンデキストロース）固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ｒＨＳＡを分泌可能な酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡを得た。
【００２９】
３．ピキアＥＲＯ１遺伝子のクローニングおよびベクター構築
ピキアＥＲＯ１遺伝子のＤＮＡ配列をＮＣＢＩデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した：（酵素切断部位に下線が施されている）
ＥＲＯフォワード：ＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＴＴＴ（配列番号３）
ＥＲＯリバース：ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＡＧＴＣＴＡＣＴＣＴＡＴＡＴＧＴＧＧ（配列番号４）
【００３０】
ピキアＧＳ１１５株のゲノミクスを鋳型として用い、ＥＲＯ１遺伝子をＰＣＲにより得、ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩの両方で酵素消化し、発現ベクターｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入してベクターｐＰＩＣＺα−ＥＲＯ１を得、構造を図１４に示す。図３に示されるように、ＥＲＯ１  ＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認した。対応するアミノ酸配列を図４に示す。
【００３１】
４．ピキアＨＡＣ１遺伝子のクローニングおよびベクター構築
ピキアＨＡＣ１遺伝子のＤＮＡ配列をＮＣＢＩデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した：（酵素切断部位に下線が施されている）
ＨＡＣフォワード：ＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＣＧＴＡＧＡＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号５）
ＨＡＣリバース：ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＣ（配列番号６）
【００３２】
酵母ＲＮＡ抽出および逆転写の方法は文献を参照した(J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版)。ピキアＧＳ１１５のｃＤＮＡを鋳型として用い、ＨＡＣ１遺伝子をＰＣＲにより得、ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩの両方で酵素消化し、発現ベクターｐＰＩＣ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入してベクターｐＰＩＣ６−ＨＡＣ１を得、構造を図１５に示す。ＨＡＣ１  ＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認し、結果を図５に示す。対応するアミノ酸配列を図６に示す。
【００３３】
５．ピキアＰＤＩ遺伝子のクローニングおよびベクター構築
ピキアＰＤＩ遺伝子のＤＮＡ配列をＮＣＢＩデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した：（酵素切断部位に下線が施されている）
ＰＤＩフォワード：ＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＣＧＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴ（配列番号７）
ＰＤＩリバース：ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣ（配列番号８）
【００３４】
ピキアＧＳ１１５のゲノミクスを鋳型として用い、ＰＤＩ遺伝子をＰＣＲにより得、ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩの両方で酵素消化し、発現ベクターｐＰＩＣＺα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入してベクターｐＰＩＣＺα−ＰＤＩを得、構造を図１６に示す。ＰＤＩ  ＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認し、結果を図７に示す。対応するアミノ酸配列を図８に示す。
【００３５】
６．ピキアＰＰＩ遺伝子のクローニングおよびベクター構築
ピキアＰＰＩ遺伝子のＤＮＡ配列をＮＣＢＩデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した：（酵素切断部位に下線が施されている）
ＰＰＩフォワード：ＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＣＧＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＡＧＣ（配列番号９）
ＰＰＩリバース：ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＴＣＡＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＣ（配列番号１０）
【００３６】
ピキアＧＳ１１５株を鋳型として用い、ＰＰＩ遺伝子をＰＣＲにより得、ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩの両方で酵素消化し、発現ベクターｐＰＩＣ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入してベクターｐＰＩＣ６−ＰＰＩを得、構造を図１７に示す。ＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認し、配列を図９に示す。対応するアミノ酸配列図１０に示す。
【００３７】
７．ピキアＫＡＲ２遺伝子のクローニングおよびベクター構築
ピキアＫＡＲ２遺伝子のＤＮＡ配列をＮＣＢＩデータベースから取得し、遺伝子増幅のために以下のプライマーを設計した：（酵素切断部位に下線が施されている）
ＫＡＲ２フォワード：ＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＧＴＣＧＴＴＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１１）
ＫＡＲ２リバース：ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧＴＡＧ（配列番号１２）
【００３８】
ピキアＧＳ１１５株のゲノミクスを鋳型として用い、ＫＡＲ２遺伝子をＰＣＲにより得、ＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩの両方で酵素消化し、発現ベクターｐＰＩＣ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に挿入してベクターｐＰＩＣ６−ＫＡＲ２を得、構造を図１８に示す。ＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認し、配列を図１１に示す。対応するアミノ酸配列を図１２に示す。
【００３９】
８．ＥＲＯ１およびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
ｒＨＳＡ分泌および発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡを原株として使用し、上記で構築したｐＰＩＣＺα−ＥＲＯ１ベクターをＳａｃＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、２ｍｇ／ｍＬゼオシンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＥＲＯ１およびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＥＲＯ１を得た。
【００４０】
９．ＨＡＣ１およびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
ｒＨＳＡ分泌および発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡを原株として使用し、実施例４で構築されたｐＰＩＣ６−ＨＡＣ１ベクターをＳａｃＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、１ｍｇ／ｍＬブラストサイジンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＨＡＣ１およびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＨＡＣ１を得た。
【００４１】
１０．ＰＤＩおよびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
ｒＨＳＡ分泌および発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡを原株として使用し、上記で構築されたｐＰＩＣＺα−ＰＤＩベクターをＳａｃＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、２ｍｇ／ｍＬゼオシンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＰＤＩおよびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩを得た。
【００４２】
１１．ＰＰＩおよびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
ｒＨＳＡ分泌および発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡを原株として使用し、実施例６で構築されたｐＰＩＣ６−ＰＰＩベクターをＰｍｅＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、１ｍｇ／ｍＬブラストサイジンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＰＰＩおよびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＰＩを得た。
【００４３】
１２．ＫＡＲ２およびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
ｒＨＳＡ分泌および発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡを原株として使用し、実施例７で構築されたｐＰＩＣ６−ＫＡＲ２ベクターをＰｍｅＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、１ｍｇ／ｍＬブラストサイジンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＫＡＲ２およびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＫＡＲ２を得た。
【００４４】
１３．ＨＡＣ１、ＰＤＩおよびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩを原株として使用し、上記で構築されたｐＰＩＣ６−ＨＡＣ１ベクターをＳａｃＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、１ｍｇ／ｍＬブラストサイジンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＨＡＣ１、ＰＤＩおよびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ−ＨＡＣ１を得た。
【００４５】
１４．ＰＰＩ、ＰＤＩおよびｒＨＳＡ共発現株の構築およびスクリーニング
実施例１０でスクリーニングされた発現株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩを原株として使用し、実施例６で構築されたｐＰＩＣ６−ＰＰＩベクターをＰｍｅＩ消化により線状化し、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ株に電気形質転換した。適格な調製および電気形質転換のための方法は文献を参照した(James M. Cregg, Pichia Protocols, 第2版)。挿入配列はＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ株の染色体５’ＡＯＸ部位に組み込まれた。形質転換株に対し、１ｍｇ／ｍＬブラストサイジンを含有するＹＰＤ固体培地を用いた抗生物質富化スクリーニングを行い、ＰＰＩ、ＰＤＩおよびｒＨＳＡ共発現酵母株ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ−ＰＰＩを得た。
【００４６】
１５．振盪フラスコ内でのｒＨＳＡ共発現株の誘導発現
上記の実施例でスクリーニングされたＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＥＲＯ１、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＨＡＣ１、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＰＩ、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＫＡＲ２、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ−ＨＡＣ１およびＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ−ＰＰＩ株の単一コロニーを個別に採取し、２ｍｌのＭＧＹ培地（１．３４％酵母窒素源ベース；１．０％グリセロール；４．０×１０−５ビオチン）に植え込み、３０℃で１６時間培養した。遠心分離後、葉状体を採取し、培養のために２０ｍｌのＢＭＭＹ培地（１．０％酵母抽出物；２．０％ペプトン；０．１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．０；１．３４％酵母窒素源ベース；０．５％無水メタノール）に打つし、７２時間発現誘導し、１２時間ごとに５０μｌの無水メタノールを加えた。誘導の終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のために培養上清を採取した（図１９）。対照株（ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ）と比較したところ、ｒＨＳＡの発現レベルは７つの共発現株の全てで向上していた。Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを用いて分析を行い、発現比を表１に示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
１６．ｒＨＳＡ共発現株の発酵
ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ株ならびに実施例１５でスクリーニングされたＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＥＲＯ１、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＨＡＣ１、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＰＩ、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＫＡＲ２、ＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ−ＨＡＣ１およびＧＳ１１５−ｒＨＳＡ−ＰＤＩ−ＰＰＩ株を、５リットル発酵槽を用いて発酵させ、発酵条件はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより公開されている「ピキア発酵法ガイドライン」を参照した。発酵は８０時間の誘導発現後に終了し、培養上清を採取してｒＨＳＡの発現レベルを分析した。結果を表２に示す。固定発酵時間が８０時間であった場合、共発現株におけるｒＨＳＡの発現レベルは１８．２ｇ／Ｌ発酵上清まで著しく増大し、これはｒＨＳＡの大規模工業生産の基盤を築くものであった。
【００４９】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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