(57)【要約】  本発明は、概して、腫瘍学、ウイルス学、および免疫療法の分野に関する。より具体的には、ポックスウイルス、特に、チミジンキナーゼの欠失を伴い（ＶＣ−ＴＫ-）、Ｆｌｔ３ＬまたはＧＭ−ＣＳＦの発現を伴うかまたは伴わない、複製可能な弱毒化されたワクシニアウイルスの、腫瘍溶解性または免疫療法としての使用に関する。上述のポックスウイルスはまた、免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせて使用することもできる。上述のポックスウイルスは、熱またはＵＶ処理によって不活化することもでき、不活化ウイルスは、単独または免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせてのいずれかで免疫療法として使用することができる。
2019506427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性固形腫瘍に対する免疫療法薬としての使用に好適な、複製性または不活化形態でのＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌを含む、単離および精製された活性物質。
【請求項２】
１つ以上の固形悪性腫瘍に罹患した対象を治療する方法であって、前記腫瘍の細胞に複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを送達し、それによって前記腫瘍を治療することを含む方法。
【請求項３】
量が、以下の：
・前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
・前記腫瘍のサイズの低減、
・前記腫瘍の根絶、
・前記腫瘍の増殖の阻害、
・前記腫瘍の転移の阻害、および
・転移性腫瘍の低減または根絶
の１つ以上を達成するのに効果的である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍が、送達部位に位置する腫瘍、または前記部位と前記対象の体内のどこかとの両方に位置する腫瘍を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫応答が、以下の：
・前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟の誘導、
・前記対象における、前記腫瘍内または全身の腫瘍細胞を認識する活性化ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の誘導、
・前記対象の注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３＋樹状細胞の増加、
の１つ以上を含む、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍が、原発性もしくは転移性の、黒色腫、または乳癌、または結腸癌である、請求項２から５に記載の方法。
【請求項７】
対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象の前記腫瘍細胞に、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量の複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを送達することを含む方法。
【請求項８】
前記免疫応答が全身性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫応答が、以下の：前記腫瘍のサイズの低減、前記腫瘍の根絶、腫瘍または転移性増殖の阻害の１つ以上に影響を与えるかまたは寄与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが、以下の：
・前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
・前記腫瘍のサイズの低減、
・前記腫瘍の根絶、
・前記腫瘍の増殖の阻害、
・前記腫瘍の転移の阻害、および
・転移性腫瘍の低減または根絶
の１つ以上を達成するのに効果的である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
対象における悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象の腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達することと、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍湿潤免疫細胞によって前記腫瘍内に引き起こされる免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で免疫チェックポイント遮断剤を補助的に投与するか、または投与してあることとを含む方法。
【請求項１２】
対象における悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象の腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達するか、または送達してあることと、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍湿潤免疫細胞によって前記腫瘍内に引き起こされる免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で免疫チェックポイント遮断剤を補助的に投与するか、または投与してあることとを含む方法。
【請求項１３】
前記補助的な投与が、以下の：
・前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
・前記腫瘍のサイズの低減、
・前記腫瘍の根絶、
・前記腫瘍の増殖の阻害、
・前記腫瘍の転移の阻害、および
・転移性腫瘍の低減または根絶
の１つ以上を達成するのに効果的である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が、原発性もしくは転移性の、悪性の黒色腫、または乳癌、または結腸癌である、請求項１１から１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが熱不活化されている、請求項２から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
固形悪性腫瘍に罹患した患者を治療するのに有効な量の複製性もしくは不活化形態の、またはその両方の形態のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３を含む活性成分と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物。
【請求項１７】
前記量が以下の：前記腫瘍のサイズの低減、前記腫瘍の根絶、前記腫瘍の増殖の阻害、または前記腫瘍の転移または転移性増殖の阻害、およびそれによる前記腫瘍の治療の１つ以上を達成するのに効果的である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記量が、前記治療される対象において、前記対象の腫瘍細胞への局所送達の際に、前記腫瘍、およびそれらの任意の転移に対する免疫応答を引き起こすのに効果的である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫応答が、以下の：
・腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
・前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・前記対象における、前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導、
・前記対象の注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３＋樹状細胞の増加、
の１つ以上を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
悪性固形腫瘍に対する免疫療法薬としての使用に好適な、複製性または不活化形態のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−Ｆｌｔ３Ｌからなる群より選択される、単離され、精製された活性物質。
【請求項２１】
固形悪性腫瘍に罹患した患者を治療するのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ−ＴＫ−−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物の１つ以上と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物。
【請求項２２】
前記ウイルスおよびウイルス構築物の２つ以上を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記量が以下の：前記腫瘍のサイズの低減、前記腫瘍の根絶、前記腫瘍の増殖の阻害、または前記腫瘍の転移または転移性増殖の阻害、およびそれによる前記腫瘍の治療の１つ以上を達成するのに効果的である、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記量が、前記治療される対象において、前記対象の腫瘍細胞への局所送達の際に、前記治療される対象の生体内の前記腫瘍、および他の腫瘍に対する免疫応答を引き起こすのに効果的である、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫応答が、以下の：
・腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
・前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・前記対象における、前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導、
・前記対象の注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３＋樹状細胞の増加、
の１つ以上を含んでもよい、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象の腫瘍細胞に、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物の１つ以上を送達することを含む方法。
【請求項２７】
対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象の腫瘍細胞に、以下の：
・前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
・前記腫瘍のサイズの低減、
・前記腫瘍の根絶、
・前記腫瘍の増殖の阻害、
・前記腫瘍の転移の阻害、および
・転移性腫瘍の低減または根絶
の１つ以上を（順序に関係なく）達成するのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、上述の各々の複製性バージョンおよび不活化バージョンを含むウイルス構築物の１つ以上を送達することを含む方法。
【請求項２８】
前記免疫応答が、以下の：
・腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
・前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・前記対象における、前記腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＴ細胞の誘導、
・前記対象の注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３＋樹状細胞の増加、
の免疫学的効果の１つ以上を含んでもよい、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
対象における悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象の腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスまたはウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物を、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達することと、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍湿潤免疫細胞によって前記腫瘍内に引き起こされる免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で免疫チェックポイント遮断剤を補助的に投与することとを含む方法。
【請求項３０】
前記補助的な投与が、以下の：
・前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
・前記腫瘍のサイズの低減、
・前記腫瘍の根絶、
・前記腫瘍の増殖の阻害、
・前記腫瘍の転移の阻害、および
・転移性腫瘍の低減または根絶
の１つ以上を達成するのに効果的である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象が以前に、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスまたはウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物によって治療されているかそれらを投与されており、
前記対象の対象腫瘍細胞に、腫瘍細胞、間質細胞、または腫瘍湿潤免疫細胞によって引き起こされる前記腫瘍内の免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な量の免疫チェックポイント遮断剤を送達することを含む方法。
【請求項３２】
対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、前記対象が以前に、腫瘍細胞、間質細胞、または腫瘍湿潤免疫細胞によって引き起こされる腫瘍内の免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な量の免疫チェックポイント遮断剤によって治療されているか、または投与されており、
前記対象の対象腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスまたはウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物を、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達することを含む方法。
【請求項３３】
前記免疫チェックポイント遮断剤が、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＩＩ  ＤＬＢＣＬ阻害剤、ＢＴＬＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２９、３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫チェックポイント遮断剤が、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の助成
本発明は、国立保健研究所によって授与された助成金ＡＩ０７３７３６、ＡＩ０９５６９２、ＣＡ００８７４８、およびＣＡ５６８２１のもとで一部分政府の助成を受けてなされた。米国政府は、本発明において権利を有する。
関連出願
本国際出願は、２０１６年２月２５日に出願された米国仮出願連続番号第６２／３００，０６６号の優先権を主張する。上述の仮出願の全ての開示は、参照により、あたかも実際に本明細書中に存在するかのように、全ての目的のために本明細書に組み入れる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。２０１７年２月２３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、１１０００＿００５１５４−ＷＯ０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２，６５８バイトのサイズである。
【０００２】
本発明は、概して、腫瘍学、ウイルス学、および免疫療法の分野に関する。より具体的には、ポックスウイルス、特に、チミジンキナーゼの欠失を伴い（ＶＣ−ＴＫ-）、ヒトＦｌｔ３ＬまたはＧＭ−ＣＳＦの発現を伴うかまたは伴わない、複製可能であるが、弱毒化されたワクシニアウイルス（野生型のワクシニアに比べて１０００倍弱毒化され、したがって安全である）の、腫瘍溶解性または免疫療法としての使用に関する。（ＶＣ−ＴＫ-は、野生型のワクシニアに比べて１０００倍低い毒性であり、したがって安全である）上述のポックスウイルスはまた、免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせて使用することもできる。上述のポックスウイルスは、熱またはＵＶ処理によって不活化することもでき、不活化ウイルスは、単独または免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせてのいずれかで免疫療法として使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
免疫系と癌
悪性腫瘍は、本質的に従来の治療法に対して抵抗性であり、重大な治療上の課題を提示する。免疫療法は、発展する研究分野となってきており、ある種の癌の治療のためのさらなる選択肢となってきている。免疫療法のアプローチは、免疫系が刺激されて腫瘍細胞を認識し、それらを破壊のための標的とし得るという基本原理に基づく。
【０００４】
数多くの研究が、癌の進行において、免疫系構成要素の差異的な存在の重要性を裏付ける（Jochems and Schlom, Exp Biol Med, 236(5): 567-579 (2011)）。臨床データは、高密度の腫瘍浸潤リンパ球が改善した臨床成績と相関することを示唆する（Mlecnik et al., Cancer Metastasis Rev.; 30: 5-12, (2011)）。強力なリンパ球浸潤と患者の生存との間の相関は、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌、乳癌、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、胆嚢癌、および食道癌を含む、様々な型の癌において報告されている（Angell and Galon, Current Opinion in Immunology, 25:1-7, (2013)）。腫瘍免疫浸潤はマクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、マスト細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナイーブリンパ球およびメモリーリンパ球、Ｂ細胞ならびにエフェクターＴ細胞（Ｔリンパ球）を含み、それらは腫瘍細胞が発現する抗原認識および後続のＴ細胞による腫瘍細胞の破壊を主に担う。
癌細胞による抗原の提示および腫瘍細胞に対して潜在的に応答することができる免疫細胞の存在にもかかわらず、多くの場合、免疫系は活性化されず、または積極的に抑制されている。この現象の鍵は、免疫系の細胞を支配して免疫系の他の細胞を阻害するようにさせることによって、腫瘍がそれら自身を免疫応答から防御する能力である。腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を回避するための多くの免疫調節メカニズムを発達させる。例えば、腫瘍細胞は、免疫阻害性サイトカイン（ＴＧＦ−βなど）を分泌するか、または腫瘍病巣においてＣＤ４+制御性Ｔ細胞およびマクロファージなどの免疫細胞がこれらのサイトカインを分泌するように誘導する。腫瘍はまた、ＣＤ４+Ｔ細胞が制御性の表現型を発現するようなバイアスをもたらす能力をも有する。全体的な結果は、損なわれたＴ細胞応答およびアポトーシスの誘導またはＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の低減した抗腫瘍免疫能力である。さらに、腫瘍細胞の表面のＭＨＣクラスＩの、腫瘍に関連する変更された発現はそれらを免疫応答に対し「不可視」にする（Garrido et al. Cancer Immunol. Immunother. 59(10), 1601-1606 (2010）。抗原提示機能および樹状細胞（ＤＣ）の阻害は、抗腫瘍免疫の回避にさらに寄与する（Gerlini et al. Am. J. Pathol. 165(6), 1853-1863 (2004)。
【０００５】
さらに、腫瘍微小環境の局所的な免疫抑制性の性質は、免疫編集と共に、標的抗原を発現しない癌細胞亜集団の逃避を導き得る。したがって、免疫系の抗腫瘍活性の保持および／または回復を促進するアプローチの発見は、相当な治療上の有益性をもたらすであろう。
【０００６】
免疫チェックポイントは、抗腫瘍免疫の腫瘍媒介性下方制御に関与してきている。Ｔ細胞の機能不全は、ＣＤ２８ファミリーの受容体のメンバーである阻害性受容体、ＣＴＬＡ−４およびプログラム細胞死１ポリペプチド（ＰＤ−１）の誘導された発現と並行して起きることが実証されている。しかし、近年の大規模な研究にもかかわらず、臨床環境における免疫療法の成功は限られている。いくつかの治療薬が規制当局によって承認されており、それらの中でとりわけ、少数の患者においてのみ恩恵が観察されている。ここ数年、免疫チェックポイントは、抗腫瘍免疫の下方制御に関与しており、治療標的として使用されている。Ｔ細胞の機能不全が阻害性受容体、プログラム細胞死１ポリペプチド（ＰＤ−１）の誘導された発現と並行して起きることを研究が示している。ＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーであり、それは、ＰＤ−１に加えて、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡを非限定的に含む。しかしながら、今日まで、これらのアプローチは限られた成功しかもたらしていない。黒色腫の治療における免疫療法の使用に関する有望性が臨床使用によって強調されており、そして抗ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）および抗ＰＤ−１剤（ペンブロリズマブおよびニボルマブ）の規制当局による承認さえもあるが、これらの免疫療法に対する患者の応答は限定されている。これらのＴ細胞における阻害シグナル（例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＰＤ−１のリガンドＰＤ−Ｌ１）の遮断に焦点を当てた最近の臨床治験は、Ｔ細胞の抑制を反転することが、免疫療法の成功にとって極めて重要であることを示している（Sharma and Allison, Science 348(6230), 56-61 (2015)、Topalian et al., Curr Opin Immunol. 24(2), 202-217 (2012)）。これらの観察は、癌に対する免疫系を利用するための新規の治療アプローチの開発の必要性を強調する。
【０００７】
黒色腫
死亡率が最も高い癌の１つである黒色腫は、米国および世界中において最も急速に増加している癌である。その発生率は、主に太陽への過剰曝露および日焼けベッドの使用により、若い白人の女性において、１９８０年から５０％増加している。アメリカ癌学会によると、２０１６年において米国のおよそ７６，３８０人の人々が黒色腫であると診断され、１０，１３０人の人々（または１時間当たり１人）が、黒色腫により死亡すると予想される。多くの場合、進行性黒色腫は、化学療法および放射線療法を含む従来の治療法に抵抗性である。結果として、転移性黒色腫を有する人々は、６〜１０カ月のみの期待余命の非常に悪い予後を有する。約５０％の黒色腫がＢＲＡＦ（重要な腫瘍促進性遺伝子）に変異を有するという発見は、この疾患の標的化療法への扉を開いた。ＢＲＡＦ阻害剤による初期の臨床治験は、ＢＲＡＦ変異を有する黒色腫の患者において、顕著ではあるが、残念なことに持続可能でない応答を示した。したがって、これらの患者および他のＢＲＡＦ変異を有さない黒色腫の患者に対する代替的な治療戦略が喫緊に必要である。
【０００８】
ヒトの病理学的データは、黒色腫病巣内のＴ細胞浸潤の存在が、より長い患者の生存期間と正に相関することを示す（Oble et al. Cancer Immun. 9, 3 (2009)）。黒色腫に対する防御における免疫系の重要性は、免疫活性因子ＩＦＮ−α２ｂおよびＩＬ−２のような免疫療法の部分的な成功（Lacy et al. Expert Rev Dermatol 7(1):51-68 (2012)）、ならびに、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の単独または併用療法のいずれかを含む免疫チェックポイント療法に対する転移性黒色腫の患者の前例がない臨床的応答（Sharma and Allison, Science 348(6230), 56-61 (2015)、Hodi et al., NEJM 363(8), 711-723 (2010)、Wolchok et al., Lancet Oncol. 11(6), 155-164 (2010)、Topalian et al., NEJM 366(26), 2443-2454 (2012)、Wolchok et al., NEJM 369(2), 122-133 (2013)、Hamid et al., NEJM 369(2), 134-144 (2013)、Tumeh et al., Nature 515(7528), 568-571 (2014)）によってさらに裏付けられる。しかしながら、多くの患者は、免疫チェックポイント遮断療法単独に応答しない。ウイルス療法の追加が免疫チェックポイント遮断剤に対する抵抗性を克服する可能性があり、これは動物腫瘍モデルによって裏付けられた（Zamarin et al., Sci Transl Med 6(226), 2014）。
【０００９】
ポックスウイルス
操作されたワクシニアウイルスのようなポックスウイルスは、転移性癌の腫瘍溶解性療法としての最前線にある（Kirn et al., 2009）。ワクシニアウイルスは大きなＤＮＡウイルスであり、速いライフサイクルを有する（Moss et al., 2007)。ポックスウイルスは、癌細胞において複数の導入遺伝子を発現し、これによって治療効果を増強するベクターとして非常に好適である（Breitbach et al., 2012)。前臨床試験および臨床治験は、従来の療法に対して難治性の進行癌の治療に対して腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび他のウイルスを用いることの有効性を実証している（Park et al., 2008、Kirn et al., 2007、Thorne et al., 2007）。ポックスウイルスに基づく腫瘍溶解性療法は、細胞溶解、アポトーシス、およびネクローシスの組み合わせを通じて癌細胞を殺傷する利点を有する。それはまた、免疫細胞の腫瘍への動員および抗腫瘍適応免疫応答の進行を促進する、自然免疫感知経路を誘導する。現在の、臨床治験における腫瘍溶解性ワクシニア株（例えばＪＸ−５９４）は、腫瘍選択性を高めるためのチミジンキナーゼの欠失を伴い、免疫応答を刺激するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような導入遺伝子の発現を伴う野生型ワクシニアを用いる（Breitbach et al., 2012, Curr Pharm Biotechnol）。しかしながら、多くの研究は、野生型ワクシニアが抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する免疫抑制効果を有することを示しており（Engelmayer et al., 1999、Jenne et al., 2000、Deng et al., 2006、Li et al., 2005、Deng et al., J VI 2006の論文からの参考文献）、これにより、腫瘍自体の免疫抑制効果および免疫回避効果を増強することを示している。
【００１０】
しかしながら、ポックスウイルスは、複数の自然免疫シグナル伝達経路を、これらの経路の細胞外および細胞内構成要素を阻害するタンパク質をコードすることによって回避およびそれに拮抗する点において、非常に長けている（Seet et al. Annu. Rev. Immunol. 21377-423 (2003)）。細胞内自然免疫シグナル伝達のポックスウイルスのアンタゴニストの中での主たるものは、ワクシニアウイルスのデュエル（ｄｕｅｌ）Ｚ−ＤＮＡおよびｄｓＲＮＡ結合タンパク質Ｅ３であり、これは、それがなければワクシニアウイルス感染によって活性化されるであろうＰＫＲおよびＮＦ−κＢ経路を阻害することができる（Cheng et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 894825-4829 (1992);Deng et al. J. Virol. 809977-9987 (2006)）。Ｅ３Ｌ遺伝子を欠く変異ワクシニアウイルス（ΔＥ３Ｌ）は、限られた宿主範囲を有し、ＩＦＮに対して非常に感受性であり、致死性のポックスウイルス感染の動物モデルにおいて非常に低減した毒性を有する（Beattie et al. Virus Genes. 1289-94 (1996)、Brandt et al. Virology 333263-270 (2004)）。近年の研究は、培養細胞株のΔＥ３Ｌウイルスの感染は、野生型ワクシニアウイルスによる感染中においては遮蔽されている炎症誘発性応答を引き起こすことを示している（Deng et al. J. Virol. 809977-9987 (2006)、Langland et al. J. Virol. 8010083-10095）。本発明者らは、マウス表皮樹状細胞株の野生型ワクシニアウイルスによる感染がＴＬＲアゴニストリポ多糖類（ＬＰＳ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）に対する炎症誘発性応答を弱め、効果がＥ３Ｌの欠失により低減されたことを報告している。さらに、樹状細胞のΔＥ３Ｌウイルスによる感染は、外来性アゴニストの非存在下でのＮＦ−κＢ活性化を引き起こした（Deng et al. J. Virol. 809977-9987 (2006)）。本開示の発明者らはまた、マウスケラチノサイトの野生型ワクシニアウイルス感染が、炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの産生を誘導しないが、一方で、ΔＥ３Ｌウイルスによる感染が、マウスケラチノサイトからのＩＦＮ−β、ＩＬ−６、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５の産生を誘導し、これがミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質（ＭＡＶＳ、細胞質ＲＮＡセンサーであるＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５に対するアダプター）および転写因子ＩＲＦ３によって媒介される細胞質ｄｓＲＮＡ感知経路に依存することを示している（Deng et al., J Virol. 2008 Nov;82(21): 10735-10746）。２０１６年２月２５日に本願発明者とその同僚によって出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１９６６３、ならびに２０１５年４月１７日に出願された仮出願第６２１４９４８４号、およびその対応する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２８１８４をもまた参照されたい。これらの出願は参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【００１１】
Ｚ−ＤＮＡ結合ドメインの欠失を伴うＥ３ＬΔ８３Ｎウイルスは、経鼻感染モデルにおいて、野生型ワクシニアウイルスよりも１，０００倍弱毒化されている（Brandt et al., 2001）。Ｅ３ＬΔ８３Ｎはまた、頭蓋内接種モデルにおいて、野生型ワクシニアと比較して低減した神経毒性を有する（Brandt et al., 2005）。減少したＺ−ＤＮＡ結合をもたらすＥ３のＺ−ＤＮＡ結合ドメイン内の変異（Ｙ４８Ａ）は、減少した神経毒性をもたらす（Kim et al., 2003）。Ｅ３のＮ末端Ｚ−ＤＮＡ結合ドメインはウイルスの病原性において重要であるが、それがどのように宿主の自然免疫によるワクシニアウイルスの感知に影響を与えるかについてはよく理解されていない。本発明者らは、以前に、マウス形質細胞様樹状細胞の野生型ワクシニア感染ではなく、粘液腫ウイルス感染が、ＴＬＲ９／ＭｙＤ８８／ＩＲＦ５／ＩＲＦ７依存的経路を介してＩ型ＩＦＮ産生を誘導することを示している（Dai et al., 2011）。粘液腫ウイルスＥ３相同分子種Ｍ０２９は、Ｅ３のｄｓＲＮＡ結合ドメインを保持するが、Ｅ３のＺ−ＤＮＡ結合ドメインを欠いている。Ｅ３のＺ−ＤＮＡ結合ドメインが（しかし、おそらくＺ−ＤＮＡ結合活性自体によるものではない）、マウスおよびヒトｐＤＣにおいて、ポックスウイルス感知の阻害に重要な役割を果たす（Dai et al., 2011、Cao et al., 2012）。
【００１２】
Ｅ３Ｌの欠失が、許容的なＲＫ１３細胞におけるワクシニアウイルス複製をＩＦＮ阻害に対して感受性にし、ΔＥ３ＬがＨｅＬａ細胞またはＢＳＣ４０細胞において複製できないような宿主範囲の表現型をもたらす（Chang et al., 1995）。Ｅ３のＣ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメインは宿主範囲効果を担い、一方で、Ｎ末端Ｚ−ＤＮＡ結合ドメインの欠失を伴うＥ３ＬΔ８３Ｎウイルスは、ＨｅＬａ細胞およびＢＳＣ４０細胞において複製可能である（Brandt et al., 2001）。Ｅ３ＬΔ８３Ｎが野生型ワクシニアよりも１０００倍弱毒化されているため、本出願において、本発明者らは、様々な癌に対する免疫刺激免疫療法薬のさらなる構築のための複製可能なワクシニアウイルスベクターとしてのその使用を探索した。
【００１３】
チミジンキナーゼの欠失を伴うワクシニアウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株、ＷＲ）は、非分裂細胞において非常に弱毒化されているが、形質転換細胞において複製可能である（Buller et al., 1988）。ＴＫ欠失ワクシニアウイルスは、インビボで腫瘍細胞において選択的に複製する（Puhlmann et al., 2000）。Ｔｈｏｒｎｅらは、他のワクシニア株と比べて、ＷＲ株が、正常細胞と比べて腫瘍細胞株において最も高いバースト比を有することを示した（Thorne et al., 2007）。本発明者らは、さらなる改変のためのそれらのベクターとして、この株の誘導体、ワクシニアＥ３ＬΔ８３Ｎ  ＷＲ株を選択した。
【００１４】
骨髄細胞の増殖を刺激するＩ型膜貫通タンパク質であるヒトＦｌｔ３Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）は、１９９４年にクローニングされた（Lyman et al., 1994）。ｈＦｌｔ３Ｌの用途は、骨髄移植のための製剤における幹細胞移動（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、樹状細胞の増殖のような癌免疫療法、およびワクチンアジュバントを含む様々な前臨床および臨床の場において探索されている。組換えヒトＦｌｔ３Ｌ（ｒｈｕＦｌｔ３Ｌ）は、５００人を超えるヒト対象において試験され、生物活性であり、安全であり、良好な耐容性を示す（Fong et al., 1998、Maraskovsky et al., 2000、Shackleton et al., 2004、He et al., 2014、Anandasabapathy et al., 2015）。ＣＤ８α+／ＣＤ１０３+のＤＣおよびｐＤＣを含む、ＤＣ亜集団の発達における増殖因子Ｆｌｔ３Ｌの極めて重要な役割の理解についての多くの進展が最近なされた（McKenna et al., 2000、Waskow et al., 2008、Liu et al., 2007、2009、Naik et al., 2006、Ginhoux et al., 2009）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示において、本発明者らは、組換えＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-ウイルスを作製し、さらにヒトＦｌｔ３Ｌを発現する同ウイルスの構築物をも構築し、この増殖因子を腫瘍微小環境に送達してＣＤ１０３+／ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）を含む免疫細胞の動員、分化、および機能を促進することを目的とした。同様の目的は、ＧＭ−ＣＳＦを発現するＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-によって追及された。しかしながら、実験はまた、「ありのままの」Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-および不活化（特に熱不活化）ウイルス、ならびに、特にチェックポイント遮断阻害療法と組み合わせて投与したときに好ましい結果を伴うウイルス構築物によって実施された。
本開示は、単独でまたは免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせてのいずれかで複製可能な弱毒化ワクシニアウイルスを用いる固形腫瘍の治療のための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、方法および組成物は、野生型ワクシニア（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株、ＷＲ）からのＥ３ＬのＺ−ＤＮＡ結合ドメインおよびチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の欠失、ならびにワクシニアプロモーター下でのＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３Ｌの発現を含む。
【００１６】
本発明は、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-がインビトロおよびインビボにおいて弱毒化され、したがって、ＴＫの欠失のみを含むワクシニアと比べてより安全な腫瘍溶解性ウイルスであるという発見に関する。ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３Ｌのいずれかを発現する組換えＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−ウイルスは、免疫刺激の付加的な利益を有し得る。これらのウイルスによる感染は、癌細胞死を誘導し、これは腫瘍抗原放出をもたらす。Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-（ＶＣ−ＴＫ-）、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ）、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ）の腫瘍内注射は、注射された腫瘍の腫瘍退縮および根絶をもたらし、抗腫瘍免疫の生成をもたらす。さらに、免疫チェックポイント遮断剤と、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかの腫瘍内送達の組み合わせは、ウイルス療法単独と比べて生存期間（生存数と生存期間の両方）を劇的に改善した。最終的に、ウイルスを５５℃で加熱後の不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ）の腫瘍内送達は、反対側の注射されていない部位において生ウイルスよりも効果的な腫瘍根絶をもたらした。生ウイルスと不活化ウイルスとの交互の腫瘍内送達は、いずれかの薬剤単独よりも優れた有効性を達成するかもしれないという可能性がある。
【００１７】
したがって、複製性または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスは、固形腫瘍の治療のための腫瘍溶解性療法および免疫療法として使用できる。（ヒトＧＭ−ＣＳＦは、ヒトでの使用のためのウイルス構築物中で使用されることは理解されよう。マウスＧＭ−ＣＳＦによるマウスでの結果は、本明細書で使用される動物モデルが非常に受け入れられているので、本発明の物質および組成物のヒトでの適応と相関する。）さらに、本開示の発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内送達と免疫チェックポイント遮断剤との組み合わせがいずれかの剤単独よりも効果的な腫瘍根絶と優れた生存期間をもたらすことを示した。
【００１８】
組換えワクシニアウイルスは、腫瘍内、静脈内、腹腔内、もしくは頭蓋内、または局所（例えば腫瘍内）注射と全身性もしくは任意のとにかくより拡散する注射との組み合わせで投与することができる。ウイルスの局所（例えば腫瘍内）注射は、腫瘍の様々なステージに対して使用することができる。初期ステージの癌に対して、腫瘍の外科的除去の前の２〜３週間、ウイルス療法を使用することができる。その時間枠の間、宿主は全身抗腫瘍適応免疫を発達させているであろう。進行癌に対して、ウイルス療法を、以下に詳述する外科手術、化学療法、標的療法、放射線照射、免疫チェックポイント療法を含む他の治療法を組み合わせて使用できる。
【００１９】
本発明者らは、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の腫瘍内注射が、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４標的化のアプローチに対して、樹状細胞およびマクロファージを含む免疫細胞の活性化、ならびに腫瘍抗原提示の促進を介する腫瘍免疫抑制的環境の改変を経る、さらなる有益な効果をもたらすとの仮説を立てた。実際、ＶＣ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦとチェックポイント遮断阻害剤との組み合わせが、後に続く異種腫瘍による負荷に対する免疫の発達を導いたことが観察された。同様の結果が、免疫チェックポイント遮断療法と組み合わせて、または驚くべきことに、それと組み合わせない場合においても、熱不活化ウイルス構築物において観察された。
さらなる研究において、ＴＫ-ウイルス、およびより大きな度合いでのウイルス−ｈＦｌｔ３Ｌ構築物の抗腫瘍免疫が、エフェクターＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を含む（構築物がより効果的である）ことが見出され、質的に同様の結果がウイルスＧＭ−ＣＳＦ構築物の注射後に観察されるであろうとの予想が導かれた。さらに、ウイルス−ｈＦｌｔ３Ｌ構築物の抗腫瘍免疫はまた、ＣＤ１０３+樹状細胞の増加をもたらした。
【００２０】
上述の抗腫瘍の結果は、黒色腫に限定されず、乳癌や結腸癌のような他の固形腫瘍にも拡張される。興味深いことに、あるウイルスは、１つの型の癌においてより効果的であり、他のウイルスは別の癌に対してより効果的である。したがって、本発明の療法の使用は最適化の対象である。しかしながら、これは、本発明の療法の有用性を損なうものではなく、多くの治療法に対する癌の応答が、疾患、腫瘍浸潤免疫細胞の有無、遺伝的および後成的な因子、以前の療法の使用または非使用における相違に依存したケースバイケースの変動の対象であるのでなおさらそうである。さらに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦＬｔ３Ｌウイルス構築物が、進行ステージの腫瘍をモデル化する確立された腫瘍モデルに対して効果的であることを示しているか、または上述の研究に照らしてそれらを示すと予想される。
一態様において、本開示は、対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、例えば以下の、腫瘍のサイズの低減、腫瘍の根絶、腫瘍の増殖の阻害、または腫瘍の転移もしくは転移性増殖の阻害、およびそれによる腫瘍の治療の１つ以上を達成するために、この発明の概要に上述されるように、対象の腫瘍細胞に、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、それらの複製性（生）バージョンおよび不活化バージョンを含むウイルス構築物の１つ以上を送達することを含む方法に関する。
【００２１】
別の態様において、本開示は、複製性または不活化形態のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌからなる群より選択される活性物質を対象とする。これらの物質は、腫瘍に対する局所投与の際に固形悪性腫瘍を治療するか、または治療する対象に腫瘍に対する免疫応答を引き起こすのに有効な量で、単独の活性成分としてまたは任意選択で他の治療法との組み合わせで各々有用である。免疫応答は、以下の免疫学的効果の１つ以上を含み得る。
・腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
・腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか、または患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・対象における、腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＣＤ４+Ｔ細胞の誘導。
【００２２】
関連する態様において、本開示は、固形悪性腫瘍を治療するのに、または患者に腫瘍に対する免疫応答を引き起こすのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、それらの複製性バージョンおよび不活化バージョンを含むウイルス構築物の１つ以上を含む活性成分、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。
【００２３】
別の態様において、本開示は、以下を含む悪性腫瘍を治療する方法に関する：
対象の腫瘍細胞に、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量の生または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を送達すること。
【００２４】
いくつかの実施形態において、以下の特定の特徴の１つ以上もまた存在する。
・エフェクターＣＤ４+およびＣＤ８+のＴ細胞の動員および活性化が伴う、
・腫瘍が黒色腫または結腸癌または乳癌である、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の定期的な送達のレジメンが、それが腫瘍の退縮または根絶を誘導するまで継続する、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の定期的な送達のレジメンが、恩恵が持続する限り数週間、数か月間または数年間継続する、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の定期的な送達のレジメンが、最大許容用量に達するまで無期限に継続する、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の送達が、非経口注射による、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の送達が、腫瘍内注射による、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の送達が、静脈内注射による、
・対象がヒトである、
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスが、約１０5〜１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内の１回投与当たりの投与量で送達される。
・Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスが、約１０6〜約１０9プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内の１回投与当たりの投与量で送達される。
・送達される量が、全ての腫瘍細胞に感染するのに十分である、
・送達が、月に１回から週に２回までの範囲の頻度で繰り返される、
・治療が、数週間、数ヶ月間または数年間の期間継続する、
・送達が、月に１回から週に２回までの範囲内の頻度で繰り返される、
・黒色腫が転移性黒色腫である。
【００２５】
腫瘍の場所におけるＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの送達は、悪性固形腫瘍に罹患した対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導する。対象の腫瘍に対する免疫系の刺激は、以下の免疫学的効果の１つ以上によって顕在化され得る（および実際に検査し得る）
・腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
・腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、
・腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
・対象における、腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＴ細胞の誘導。
ある実施形態において、本発明は、悪性固形腫瘍に対する免疫療法薬としての使用に好適な、複製性または不活化形態のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌを含む、単離および精製された活性物質に関する。
さらに別の態様において、本発明は、１つ以上の固形悪性腫瘍に罹患した対象を治療する方法であって、腫瘍の細胞に複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを送達し、それによって腫瘍を治療することを含む方法に関する。
【００２６】
ある実施形態において、量は以下の１つ以上を達成するのに効果的である：
ａ．対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
ｂ．腫瘍のサイズの低減、
ｃ．腫瘍の根絶、
ｄ．腫瘍の増殖の阻害、
ｅ．腫瘍の転移の阻害、および
ｆ．転移性腫瘍の低減または根絶。
他の実施形態において、腫瘍は、送達部位に位置する腫瘍、または上記部位と対象の体内のどこかとの両方に位置する腫瘍を含む。
【００２７】
さらに別の実施形態において、免疫応答は以下の１つ以上を含む。
ａ．腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、
ｂ．腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、
ｃ．Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟の誘導、
ｄ．対象における、腫瘍内または全身の腫瘍細胞を認識する活性化ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の誘導。
さらなる実施形態において、腫瘍は、原発性もしくは転移性の黒色腫または乳癌または結腸癌である。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の腫瘍細胞に、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量の複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを送達することを含む方法に関する。
ある実施形態において、免疫応答は全身性である。
さらなる実施形態において、免疫応答は、以下の１つ以上に影響を与えるかまたは寄与する：腫瘍のサイズの低減、腫瘍の根絶、腫瘍または転移性増殖の阻害。
【００２９】
さらなる実施形態において、ウイルスは以下の１つ以上を達成するのに効果的である。
ａ．対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
ｇ．  ｂ．腫瘍のサイズの低減、
ｈ．  ｃ．腫瘍の根絶、
ｉ．  ｄ．腫瘍の増殖の阻害、
ｊ．  ｅ．腫瘍の転移の阻害、および
転移性腫瘍の低減または根絶。
さらに別の態様において、本発明は、対象における悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達することと、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍湿潤免疫細胞によって腫瘍内に引き起こされる免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で免疫チェックポイント遮断剤を補助的に投与するか、または投与してあることとを含む方法に関する。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明は、対象における悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達するか、または送達してあることと、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍湿潤免疫細胞によって腫瘍内に引き起こされる免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で免疫チェックポイント遮断剤を補助的に投与するか、または投与してあることとを含む方法に関する。
【００３１】
ある実施形態において、補助的な投与は以下の１つ以上を達成するのに効果的である：
ａ．対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
ｂ．腫瘍のサイズの低減、
ｃ．腫瘍の根絶、
ｄ．腫瘍の増殖の阻害、
ｅ．腫瘍の転移の阻害、および
ｆ．転移性腫瘍の低減または根絶。
さらに別の態様において、腫瘍は、原発性もしくは転移性の悪性の黒色腫または乳癌または結腸癌である。さらに別の態様において、ウイルスは熱不活化されている。
さらに別の態様において、本発明は、固形悪性腫瘍に罹患した患者を治療するのに有効な量の複製性もしくは不活化形態の、またはその両方の形態のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌを含む活性成分と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物に関する。
さらに別の態様において、量は以下の１つ以上を達成するのに効果的である：腫瘍のサイズの低減、腫瘍の根絶、腫瘍の増殖の阻害、または腫瘍の転移または転移性増殖の阻害、およびそれによる腫瘍の治療。
さらに別の態様において、量は、治療される対象において、対象の腫瘍細胞への局所送達の際に、腫瘍、およびそれらの任意の転移に対する免疫応答を引き起こすのに効果的である。
【００３２】
さらに別の態様において、免疫応答は以下の１つ以上を含む：
・腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか、または患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・対象における、腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＣＤ４+Ｔ細胞の誘導。
さらに別の態様において、本発明は、悪性固形腫瘍に対する免疫療法薬としての使用に好適な、複製性または不活化形態のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−Ｆｌｔ３Ｌからなる群より選択される、単離され、精製された活性物質に関する。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、固形悪性腫瘍に罹患した患者を治療するのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物の１つ以上と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物に関する。
さらに別の態様において、組成物は、上記ウイルスおよびウイルス構築物の２つ以上を含む。
さらに別の態様において、量は以下の１つ以上を達成するのに効果的である：腫瘍のサイズの低減、腫瘍の根絶、腫瘍の増殖の阻害、または腫瘍の転移または転移性増殖の阻害、およびそれによる腫瘍の治療。
さらに別の態様において、量は、治療される対象において、対象の腫瘍細胞への局所送達の際に、治療される対象の生体内の腫瘍、および他の腫瘍に対する免疫応答を引き起こすのに効果的である。
【００３４】
さらに別の態様において、免疫応答は以下の１つ以上を含み得る：
・腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・対象における、腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＣＤ４+Ｔ細胞の誘導。
さらに別の態様において、本発明は、対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の腫瘍細胞に、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物の１つ以上を送達することを含む方法に関する。
【００３５】
さらに別の態様において、本発明は、対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の腫瘍細胞に、以下の１つ以上を（順序に関係なく）達成するのに有効な量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスならびにウイルス構築物であって、上述の各々の複製可性バージョンおよび不活化バージョンを含むウイルス構築物の１つ以上を送達することを含む方法に関する：
ａ．対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
ｂ．腫瘍のサイズの低減、
ｃ．腫瘍の根絶、
ｄ．腫瘍の増殖の阻害、
ｅ．腫瘍の転移の阻害、および
ｆ．転移性腫瘍の低減または根絶。
【００３６】
さらに別の態様において、免疫応答は以下の免疫学的効果の１つ以上を含み得る
・腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、
・Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤するか患者の生体内の遠隔箇所を循環する樹状細胞の成熟の誘導、
・対象における、腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識するエフェクターＴ細胞の誘導。
【００３７】
さらに別の態様において、本発明は、対象における悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の対象腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスまたはウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物を、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達するか、または送達してあることと、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍湿潤免疫細胞によって腫瘍内に引き起こされる免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で免疫チェックポイント遮断剤を補助的に投与するか、または投与してあることとを含む方法に関する。
【００３８】
さらに別の態様において、補助的な投与は以下の１つ以上を達成するのに効果的である：
ａ）対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導、
ｂ）腫瘍のサイズの低減、
ｃ）腫瘍の根絶、
ｄ）腫瘍の増殖の阻害、
ｅ）腫瘍の転移の阻害、および
ｆ）転移性腫瘍の低減または根絶。
さらに別の態様において、本発明は、対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、対象が以前に、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスまたはウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物によって治療されているかそれらを投与されている、方法に関する。
さらに別の実施形態において、方法は、対象の対象腫瘍細胞に、腫瘍細胞、間質細胞、または腫瘍湿潤免疫細胞によって引き起こされる腫瘍内の免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な量の免疫チェックポイント遮断剤を送達することを含む。
さらに別の態様において、本発明は対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、対象が以前に、腫瘍細胞、間質細胞、または腫瘍湿潤免疫細胞によって引き起こされる腫瘍内の免疫抑制メカニズムを遮断するのに有効な量の免疫チェックポイント遮断剤によって治療されているか、または投与されている、方法に関する。
【００３９】
さらに別の実施形態において、方法は、対象の対象腫瘍細胞に、複製可能または不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスまたはウイルス構築物であって、各々が複製性または不活化形態であってよいウイルス構築物を、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で送達するか、または送達してあることを含む。
さらに別の態様において、免疫チェックポイント遮断剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＩＩ  ＤＬＢＣＬ阻害剤、ＢＴＬＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４０】
さらに別の態様において、免疫チェックポイント遮断剤は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８０、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ−Ｄ】マウスおよびヒトの黒色腫細胞株における、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ（ＶＣ）およびΔＥ３Ｌ（ＶＩ）のワクシニアウイルスの一段増殖を示す一連のグラフである。マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞およびヒト黒色腫細胞ＳＫ−ＭＥＬ３９、ＳＫ−ＭＥＬ１８８、およびＳＫ−ＭＥＬ９０を、５のＭＯＩでＥ３ＬΔ８３Ｎ（ＶＣ）またはΔＥ３Ｌ（ＶＩ）のいずれかによって感染させた。細胞を感染後の様々な時間で回収し、ウイルス収量（ログｐｆｕ）を決定した。
【図２】プラスミドＤＮＡとウイルスゲノムＤＮＡとの間の、チミジンキナーゼ（ＴＫ）座位における相同組換えの概略図である。ｐＣＢプラスミドは、対象の特定の遺伝子（ＳＧ）、この場合マウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）およびヒトＦｌｔ３Ｌ（ｈＦｌｔ３Ｌ）を、ワクシニア合成初期および後期プロモーター（Ｐｓｅ／ｌ）の制御下に挿入するのに使用された。ワクシニアＰ７．５プロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉのキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）が薬剤選択マーカーとして使用された。これら２つの発現カセットは、各々の側でＴＫ遺伝子の部分配列（ＴＫ−ＬおよびＴＫ−Ｒ）によって隣接されていた。ＳＧを欠如するプラスミドＤＮＡは、ベクターコントロールとして使用された。プラスミドＤＮＡとＶＣゲノムＤＮＡとのＴＫ座位で起きた相同組換えはＳＧおよびｇｐｔ発現カセットまたはｇｐｔ単独の、ＶＣゲノムＤＮＡへの挿入をもたらし、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＶＣ−ＴＫ-を生成する。組換えウイルスは、ＭＰＡ、キサンチンおよびヒポキサンチンを含むｇｐｔ選択培地の存在下で濃縮され、ＶＣの混入していない適切な組換えウイルスが得られるまで薬剤選択培地の存在下で４〜５ラウンド、プラーク精製された。
【図３】組換えウイルスのＰＣＲ解析の画像であり、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの成功裏の生成を示す。ＶＣ組換えウイルスのゲノムＤＮＡをＰＣＲで解析し、挿入を検証し、親ウイルス粒子（ＶＣ）の混入がないことを確認した。
【図４Ａ−Ｂ】ウェスタンブロットの結果を示す。図４Ａは、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ感染させた、マウスＢ１６黒色腫細胞およびヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８黒色腫細胞におけるｍＧＭ−ＣＳＦ発現のウェスタンブロット解析を示す。図４Ａは、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによって感染させたか、またはモック感染させたＢ１６−Ｆ１０およびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞からのデータを示す。細胞溶解物および上清を、感染後の様々な時間で回収した。ウェスタンブロット解析を、抗ｍＧＭ−ＣＳＦ抗体および添加コントロールとしての抗ＧＡＰＤＨを用いて実施した。図４Ｂは、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ感染させた、マウスおよびヒトの黒色腫細胞におけるｈＦｌｔ３Ｌ発現のウェスタンブロット解析を示す。Ｂ１６−Ｆ１０、ＳＫ−ＭＥＬ−１４６、およびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞をＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによって感染させたか、またはモック感染させた。細胞溶解物を、感染後の様々な時間で回収した。細胞溶解物のウェスタンブロット解析を、抗ｈＦｌｔ３Ｌ抗体およびコントロールとしての抗ＧＡＰＤＨを用いて実施した。
【図５Ａ−Ｂ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるＶＣ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの一段増殖を示す。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を、０．１のＭＯＩで、ＶＣ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによって感染させた。細胞を感染後の様々な時間で回収し、ウイルス収量をＢＳＣ４０細胞における力価測定によって決定した。ウイルス収量（ログｐｆｕ）を、（図５Ａ）において感染後の時間に対してプロットした。感染後７２時間におけるウイルス収量の、１時間のそれに対する倍率変化を（図５Ｂ）にプロットした。
【図６】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫が、免疫チェックポイント遮断の存在または非存在下において、ウイルスの腫瘍内注射によって処理される処理計画の概略である。手短に、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5細胞、および左側に１×１０5細胞）。腫瘍移植後の７日目に、１週間に２回、免疫チェックポイント遮断抗体の腹腔内送達を伴うかまたは伴わずに、ウイルスの腫瘍内注射でマウスを処理した。その次の８週間、腫瘍サイズを測定し、生存を観察した。
【図７Ａ−Ｌ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫両側移植モデルにおけるＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射単独または抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内送達との組み合わせの一連のグラフ表示を示す。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０5）を右側の剃毛した皮膚へと皮下移植し、左側に（１×１０5）の細胞を移植した。移植後７日目において、右側の腫瘍（直径約３ｍｍ）に、週に２回、ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）のいずれかを注射した。いくつかの群のマウスが、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）のいずれかの腫瘍内送達と、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１００μｇ／マウス１匹当たり）の腹腔内送達の組み合わせで週に２回処理された。腫瘍サイズを測定し、マウスの生存を経時的にモニターした。（図７Ａ、Ｂ）ＰＢＳによる注射（ｎ＝１０）後の様々な日における注射された腫瘍（図７Ａ）および注射されていない腫瘍（図７Ｂ）の容積のグラフ。（図７Ｃ、Ｄ）ＶＣ−ＴＫ-による注射（ｎ＝１０）後の様々な日における注射された腫瘍（図７Ｃ）および注射されていない腫瘍（図７Ｄ）の容積のグラフ。（図７Ｅ、Ｆ）ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝１０）後の様々な日における注射された腫瘍（図７Ｅ）および注射されていない腫瘍（図７Ｆ）の容積のグラフ。（図７Ｇ、Ｈ）ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによる注射後の様々な日における注射された腫瘍（図７Ｇ）および注射されていない腫瘍（図７Ｈ）の容積のグラフ。（図７Ｉ、Ｊ）抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内送達を伴うＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝１０）後の様々な日における注射された腫瘍（図７Ｉ）および注射されていない腫瘍（図７Ｊ）の容積のグラフ。（図７Ｋ、Ｌ）抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内送達を伴うＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによる注射（ｎ＝１０）後の様々な日における注射された腫瘍（図７Ｋ）および注射されていない腫瘍（図７Ｌ）の容積のグラフ。（図７Ｍ）ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＣＴＬＡ−４、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＣＴＬＡ−４で処理されたマウスのカプランマイヤー生存曲線。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した。*、Ｐ＜０．０５、****、Ｐ＜０．０００１
【図８Ａ−Ｏ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫両側移植モデルにおける、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の腹腔内送達を伴うかまたは伴わない、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、生＋熱不活化Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内送達の一連のグラフ表示を示す。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を、図６に上述するように両側に移植した。移植後７日目に、右側の腫瘍（直径約３ｍｍ）を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２００μｇ／マウス１匹当たり）の腹腔内送達を伴うかまたは伴わずに、ＰＢＳ、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（２×１０7ｐｆｕ）、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（２×１０7ｐｆｕの同等量）、生（１×１０7ｐｆｕ）＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（１×１０7ｐｆｕの同等量）のいずれかで週に２回注射した。腫瘍サイズを測定し、マウスの生存を経時的に観察した。図８Ａ〜Ｂは、ＰＢＳによる注射（ｎ＝５）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ａ）および注射されていない腫瘍（図８Ｂ）の容積を示すグラフである。図８Ｃ、Ｄは、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝９）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ｃ）および注射されていない腫瘍（図８Ｄ）の容積を示すグラフである。図８Ｅ、Ｆは、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝９）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ｅ）および注射されていない腫瘍（図８Ｆ）の容積を示すグラフである。図８Ｇ、Ｈは、生＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝９）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ｇ）および注射されていない腫瘍（図８Ｈ）の容積を示すグラフである。図８Ｉ、Ｊは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達の存在下でのＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝９）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ｉ）および注射されていない腫瘍（図８Ｊ）の容積を示すグラフである。図８Ｋ、Ｌは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達の存在下での熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝９）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ｋ）および注射されていない腫瘍（図８Ｌ）の容積を示すグラフである。図８Ｍ、Ｎは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達の存在下での生＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによる注射（ｎ＝９）後の様々な日における注射された腫瘍（図８Ｍ）および注射されていない腫瘍（図８Ｎ）の容積を示すグラフである。図８Ｏは、ＰＢＳ、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、生＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１、または生＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処理されたマウスのカプランマイヤー生存曲線である。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した。*、Ｐ＜０．０５、****、Ｐ＜０．０００１
【図９】異種腫瘍ＭＣ３８による腫瘍再負荷後のマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。これらのマウスは、以下のＢ１６−Ｆ１０黒色腫のためのレジメンによって最初に処理され、サーブされた（ｓｕｒｖｅｄ）。これらの剤は、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、生＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１、または生＋熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。ウイルスまたは腫瘍のいずれにもまったく曝露されていないナイーブマウスの群をコントロールとして使用した。ＭＣ３８（１×１０5細胞）を皮下移植した。腫瘍増殖およびマウス生存期間を厳密にモニターした。
【図１０Ａ−Ｄ】ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の後に収集されたデータの一連のグラフ表示であり、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌが、両側黒色腫モデル内の注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の活性化の点で、ＶＣ−ＴＫ-ウイルスよりも効果的であることを示す。図１０Ａは、ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによって様々に処理されたマウスの注射された腫瘍（右側プロット）および注射されていない腫瘍（左側プロット）におけるＣＤ８+グランザイムＢ+細胞の代表的なフローサイトメトリーのドットプロットからなる。図１０Ｂは、ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによって様々に処理されたマウスの注射された腫瘍（右側プロット）および注射されていない腫瘍（左側プロット）におけるＣＤ４+グランザイムＢ+細胞のドットプロットからなる。図１０Ｃは、ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによって様々に処理されたマウスの注射された腫瘍（右側）および注射されていない腫瘍（左側）におけるＣＤ８+グランザイムＢ+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる。（*、ｐ＜０．０５、***、ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。図１０Ｄは、ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌによって様々に処理されたマウスの注射された腫瘍（右側）および注射されていない腫瘍（左側）におけるＣＤ４+グランザイムＢ+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる。（**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図１１】腫瘍浸潤ＣＤ４５+ＭＨＣＩＩ＋細胞においてＣＤ１０３+ＤＣからＣＤ１１ｂ+ＤＣを分離するためのゲーティング戦略である。腫瘍関連ＣＤ２４+のＤＣは、それらのＣＤ１１ｂおよびＣＤ１０３の発現によってさらに分けることができる。ＣＤ１１ｂ+のＤＣ（ＤＣ１）は高レベルのＣＤ１１ｂを発現し、一方でＣＤ１０３+のＤＣ（ＤＣ２）は高レベルのＣＤ１０３を発現する。Ｆ４／８０+腫瘍関連マクロファージはさらに、それらのＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂの相対発現に基づいて、ＴＡＭ１とＴＡＭ２に分離することができる。
【図１２Ａ−Ｂ】ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射されていない腫瘍においてＣＤ１０３+ＤＣの穏やかな増加もたらすことを示す一連のグラフ表示である。図１２Ａは、ＰＢＳ、熱−ＭＶＡ、ＶＣ−ＴＫ−、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌで処理されたマウスの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方における、ＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ１０３+ＤＣのパーセンテージを示すグラフである（*、ｐ＜０．０５）。データは平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３〜４）である。図１２Ｂは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ１１ｂ+のＤＣのパーセンテージを示すグラフである（*、ｐ＜０．０５）。データは平均＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３〜４）である。
【図１３Ａ−Ｅ】４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）両側移植モデルにおける、ＶＣ−ＴＫまたは熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射の一連のグラフ表示を示す。４Ｔ１細胞（２．５×１０5）を右側の剃毛した皮膚へと皮下移植し、左側に（５×１０4）の細胞を移植した。移植後５日目において、右側の腫瘍（直径約３ｍｍ）に、週に２回、ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-（２×１０7ｐｆｕ）または同等量の熱不活化ＭＶＡを注射した。図１３Ａ〜Ｂは、最初の注射前の最初のそれぞれの腫瘍容積（注射されたおよび注射されていない）のグラフである。図１３Ｃ、Ｄは、最初の注射後１８日目のそれぞれの腫瘍容積（注射されたおよび注射されていない）のグラフである。（*、Ｐ＜０．０５、****、Ｐ＜０．０００１）。（Ｅ）ＰＢＳ、ＶＣ−ＴＫ-、または熱−ｉＭＶＡで処理されたマウスのカプランマイヤー生存曲線。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した。（***、Ｐ＜０．００１）
【図１４Ａ−Ｅ】確立された大きいＢ１６−Ｆ１０黒色腫片側移植モデル内のＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ、熱不活化ＭＶＡ（熱−ｉＭＶＡ）の腫瘍内送達の一連のグラフ表示を示す。Ｂ１６−Ｆ１０細胞（５×１０5細胞）を、Ｃ５７Ｂ／６マウスの右側に皮下移植した。移植後９日目に、平均の最初の腫瘍容積が７０ｍｍ3に到達するとき、腫瘍を週に２回、２×１０７ｐｆｕのＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌまたは同等量の熱−ｉＭＶＡで注射した。ＰＢＳをコントロールとして使用した。（図１４Ａ、Ｂ、Ｃ）は、ＰＢＳ（Ａ、ｎ＝１０）または熱処理−ｉＭＶＡ（Ｂ、ｎ＝１０）またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（Ｃ、ｎ＝８）で注射後の様々な日における、注射された腫瘍の容積のグラフである。図１４Ｄは、最初の注射時の注射された腫瘍の最初の腫瘍容積のグラフである。図１４Ｅは、ＰＢＳ、熱処理−ｉＭＶＡ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌで処理されたマウスのカプランマイヤー生存曲線である。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した。（ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳについて***、Ｐ＜０．００１、熱処理−ｉＭＶＡ対ＰＢＳについて****、Ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
定義
本発明で使用されるとき、以下の用語は、文脈が他を明確に示さない限り、以下のそれらに帰属する意味を有するものとする。
【００４３】
「癌」は、制御不能な細胞増殖を特徴とするヒトおよび動物の疾患のクラスを指す。他に明示的に示されない限り、用語「癌」は、用語「腫瘍」、「悪性腫瘍」、「過剰増殖」、および「新生物」と交換可能に本明細書で使用することができ、用語「癌細胞」は、用語「腫瘍細胞」、「悪性腫瘍細胞」、「過剰増殖細胞」、および「新生物細胞」と交換可能である。
「黒色腫」は、メラニンを産生可能な細胞を起源とする悪性新生物を指す。用語、黒色腫は、「悪性黒色腫」と同義である。黒色腫は、患者のリンパ節、皮膚、肝臓、肺、および脳の組織を含む広範囲に転移する。
【００４４】
「固形腫瘍」は、全ての新生物細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指し、リンパ腫、白血病、および多発性骨髄腫のような血液癌を除く。固形腫瘍の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫を含むがこれらに限定されない。本開示の組成物および方法が有用であろう最も一般的な固形腫瘍のいくつかは、頭頸部癌、直腸腺癌、神経膠腫、髄芽腫、尿路上皮癌、膵臓腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺腺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌）、小細胞肺癌、黒色腫、乳癌、腎細胞癌、および肝細胞癌を含む。
【００４５】
「転移」は、癌の原発部位から生体内の隣接する組織または遠位の位置への拡散を指す。癌細胞は、原発腫瘍から分離して、リンパ管および血管へと浸透し、血流を介して循環して、生体内のどこかの正常組織内で増殖することができる。転移は、原発腫瘍から分離し、血流またはリンパ液を介して移動し、遠位部位でとどまる、癌細胞（または癌幹細胞）に付随する連続的なプロセスである。別の部位にあるとき、癌細胞は血管またはリンパ壁を通って再浸透し、増殖を続け、最終的に新しい腫瘍（転移性腫瘍）を形成する。いくつかの実施形態において、この新しい腫瘍は、転移性（または二次）腫瘍と呼ぶ。
【００４６】
「免疫応答」は、癌性細胞、転移性腫瘍細胞などへの選択的障害、それらの破壊、またはそれらのヒト体内からの排除を生じる、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上述の細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）のうちの１つ以上の作用を指す。免疫応答は、細胞の作用、すなわちＴ細胞の作用の改変（調節、例えば顕著な増強、刺激、活性化、減衰、または阻害）である、Ｔ細胞応答のような細胞応答を含んでもよい。Ｔ細胞応答は、特定の型のＴ細胞、またはＴ細胞の亜集団、例えば、ＣＤ４+ヘルパー、ＣＤ８+細胞傷害性、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の、生成、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）もしくは増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、または刺激を含んでもよい。そのようなＴ細胞亜集団は、細胞受容体または細胞表面分子（例えば、ＣＤ、または分化抗原群分子）の１つ以上を検出することによって同定できる。Ｔ細胞応答はまた、他の細胞の分化または増殖に影響を及ぼす可溶性メディエーターなどの細胞因子（例えばサイトカイン、リンホカイン、サイトカイン結合タンパク質、またはインターロイキン）の変更された発現（統計学的に有意な増加または低減）をも含んでもよい。例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）は、自然免疫の極めて重要な調節因子である（Huber et al. Immunology 132(4):466-474 (2011）。動物およびヒトの研究は、抗原認識および抗腫瘍免疫応答の初期段階の間におけるＣＤ４＋およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方の運命に直接影響をもたらすＩＦＮ−α／βの役割を示している。Ｉ型ＩＦＮは、樹状細胞の活性化に対する応答において誘導され、この樹状細胞は自然免疫系の番人である。
【００４７】
「腫瘍免疫」は、それにより腫瘍が免疫系による認識および排除を回避する１つ以上のプロセスを指す。したがって、治療の構想として、そのような回避が弱められるかまたは排除され、腫瘍が免疫系によって認識され攻撃されるとき（後者は本明細書において「抗腫瘍免疫」と呼ぶ）、腫瘍免疫は「治療」される。腫瘍認識の例は、腫瘍結合であり、腫瘍攻撃の例は腫瘍低減（数、サイズまたはその両方）および腫瘍排除である。
「Ｔ細胞」は、様々な細胞媒介性適応免疫応答に参加する胸腺由来リンパ球を指す。
「ヘルパーＴ細胞」は、ＣＤ４+Ｔ細胞を指し、ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子へと結合した抗原を認識する。少なくとも２つの型のヘルパーＴＥ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２が存在し、それらは異なるサイトカインを産生する。
【００４８】
「細胞傷害性Ｔ細胞」は、その表面に通常ＣＤ８分子マーカーを担持（ＣＤ８＋）し（しかし、ＣＤ４＋であってもよい）、その表面に特異的抗原分子を有する標的細胞を破壊することによって、細胞媒介性免疫において機能するＴ細胞を指す。細胞傷害性Ｔ細胞はまた、パーフォリンが形成した孔を介して標的細胞に侵入してアポトーシス（細胞死）を誘導することができるセリンプロテアーゼであるグランザイムを放出する。グランザイムは、細胞傷害性表現型のマーカーとしての役割を果たす。細胞傷害性Ｔ細胞の他の名称は、ＣＴＬ、細胞溶解性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔリンパ球、キラーＴ細胞、またはキラーＴリンパ球を含む。細胞傷害性Ｔ細胞の標的はまた、ウイルス感染細胞、細菌もしくは原虫寄生虫の感染細胞、または癌細胞を含み得る。多くの細胞傷害性Ｔ細胞は、それらの細胞表面に存在するタンパク質ＣＤ８を有する。ＣＤ８はクラスＩ  ＭＨＣ分子の一部に引きつけられる。典型的には、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞である。
「腫瘍浸潤リンパ球」は、循環（血液またはリンパ液）に存在するか、またはさもなくばそこを去った、および腫瘍に移動した、癌（黒色腫など）に罹患した対象の白血球を指す。
【００４９】
「免疫チェックポイント阻害剤」、または「免疫チェックポイント遮断剤」は、チェックポイントタンパク質の１つ以上の活性を、完全にまたは部分的に、低減、阻害、干渉、または調節する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節する。チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４ならびにそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６、ＰＤ−１ならびにそのリガンドＰＤＬ１およびＰＤＬ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ならびにＢＴＬＡを含むがこれらに限定されない（Pardoll et al. Nature Reviews Cancer 12: 252-264 (2012)）。
治療物質の投与の文脈において使用するとき、「非経口」は、消化管を介する投与以外の任意の投与経路を含む。本明細書に開示される方法に特に関連するのは、静脈内（例えば関門脈を介するものを含む）、腫瘍内または髄腔内投与である。
【００５０】
「抗体」は、抗原に結合する免疫グロブリン分子、またはそのような分子の抗原結合フラグメントを指す。したがって、抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、および無傷の免疫グロブリンの免疫反応性（抗原結合）フラグメントまたは一部であり得る。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト組換え抗体、ならびに二重特異性および三重特異性抗体を含む様々な形態で存在してよい。
【００５１】
「腫瘍溶解性ウイルス」は、癌細胞に優先的に感染し、そのような細胞内で複製し、その複製プロセスを通じて癌細胞の溶解を誘導するウイルスを指す。天然に発生する腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例は、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ならびに腫瘍選択的であるよう操作された、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのようなウイルスを含む（例えばNemunaitis, J. Invest New Drugs. 17(4):375-86 (1999); Kirn, DH et al. Nat Rev Cancer. 9(1):64-71(2009); Kirn et al. Nat. Med. 7:781 (2001); Coffey et al. Science 282:1332(1998)を参照）。ワクシニアウイルスは多くの型の細胞に感染するが、腫瘍細胞が（ｉ）複製に助力する代謝産物を有し、また（ｉｉ）複製に助力するある経路の活性化を示し、また（ｉｉｉ）ウイルス複製を助力する自然免疫系を回避する環境を作り出すという事実によって、腫瘍細胞内で優先的に複製する。
【００５２】
特に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌのような異種遺伝子を有するウイルス構築物を含むワクシニアウイルスを参照して、「熱不活化」は、免疫原性または標的細胞（腫瘍細胞）に侵入するその能力を破壊しないが、ウイルスに残存する複製能、および宿主の免疫応答を阻害する因子（例えば、感染細胞においてＩ型ＩＦＮの誘導を阻害するような因子）を除去するような条件下で熱に対する曝露によってさらに処理されているウイルスを指す。そのような条件の例は、約１時間の期間の、約５０〜約６０℃の範囲内の温度への曝露である。他の時間および温度は日常的な実験によって決定することができ、感染したｃＤＣにおけるＩ型ＩＦＮの誘導は、本明細書に記載される実験において使用される熱不活化ウイルスと比較することができ、ワクシニアウイルスのものより高くあるべきである。
【００５３】
特に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＦｌｔ３Ｌのような異種遺伝子を有するウイルス構築物を含むワクシニアウイルスを参照して、「ＵＶ不活化」は、免疫原性または標的細胞（腫瘍細胞）に侵入するその能力を破壊しないが、ウイルスに残存する複製能を除去するような条件下でＵＶに対する曝露によって不活化されているウイルスを指す。そのような条件の例は、本方法においても有用であり得、約３０分〜約１時間の期間の、例えば３６５ｎｍのＵＶバルブを用いるＵＶへの曝露である（Tsung et al. J Virol 70, 165-71 (1996)、Drillien, R. et al. J Gen Virol 85: 2167-2175 (2004)）。
「対象」は、癌に罹患し得る、任意の動物（哺乳動物、ヒトまたはその他）の患者を意味する。
【００５４】
「治療有効量」または「有効量」は、疾患の軽減、治癒、または緩和において所望の生物学的結果をもたらすのに、１回以上の投与量で投与されるときの十分な量の薬剤、および十分な期間を指す。本開示において、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌならびに対応する不活化ウイルスの有効量は、（好適な期間および好適な頻度で投与され、）以下の１つ以上を達成する量である：癌細胞の数を低減する、または腫瘍サイズを低減するかもしくは腫瘍を根絶する、癌細胞の末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、遅延もしくは停止する）する、転移性増殖を阻害（すなわち、遅延もしくは停止する）する、腫瘍増殖を阻害（すなわち、安定化もしくは止める）する、腫瘍の治療を可能にする、および腫瘍に対する免疫応答を誘導する。任意の個別の場合における適切な治療量は、当業者によって本開示に照らして日常的な実験を用いて決定され得る。そのような決定は、インビトロで効果的であると見出された量および動物で効果的であると見出された量から開始するであろう。治療有効量は、培養中の細胞に恩恵を与えることが見出された濃度または複数の濃度に基づいて最初に決定されるであろう。有効量は、細胞培養におけるデータから推定でき、本明細書に詳述されるような要因に基づいて上方または下方に調整できる。有効量の範囲の例は、投与当たり１０5ウイルス粒子〜約１０12ウイルス粒子である。
【００５５】
本明細書に開示されるウイルスに基づく免疫刺激剤を特に参照して、「治療有効量」または「有効量」は、腫瘍細胞増殖を低減、阻害、または廃止して、それによって腫瘍を低減または排除するのに十分な、またはインビトロまたは対象のいずれかにおいて、転移性拡散を阻害、低減、または廃止するのに十分な、または場合によっては低減、阻害および／もしくは廃止の１つ以上を最終的にもたらす腫瘍に対する免疫応答を引き起こすのに十分な、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌおよび／または対応する不活化ウイルスを含む組成物の量を指す。腫瘍細胞増殖の低減、阻害、または根絶は、ネクローシス、アポトーシス、もしくは免疫応答、または上述のうちの２つ以上の組み合わせの結果であり得る。治療有効である量は、組成物において使用される特定のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌおよび／または対応する不活化ウイルス、治療される対象の年齢および状態、腫瘍形成の度合い、他の治療法の有無などのような要因に応じて変動し得る。同様に、投与される組成物の投与量およびその投与頻度は、活性成分の能力、投与されたときのその活性の継続期間、投与経路、対象のサイズ、年齢、性別、および体調、副作用のリスク、ならびに医師の判断のような様々な要因に依存するであろう。組成物は、注射可能な溶液などの様々な剤形で投与される。
【００５６】
免疫チェックポイント阻害剤との併用療法を特に参照して、「免疫チェックポイント遮断または遮断剤」についての「治療有効量」は、免疫チェックポイントが治療される対象の腫瘍細胞におけるアポトーシス応答を回避させることから遮断するのに十分な免疫チェックポイント遮断剤の量を意味するものとする。ＣＤ２８阻害剤、例えば、ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えばイピリムマブ）、ＰＤ−１阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ランブロリズマブ）、ＩＩ  ＤＬＢＣＬ阻害剤、例えば、ＡＭＰ−２２４、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ  ００１０７１８０）ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡまたはそれらのデコイ分子を含む、いくつかの承認されるか、臨床治験中であるか、または他の未だ開発中である免疫チェックポイント遮断剤が存在する。上述の投与量範囲は、いくつかの投与臨床治験が完了しており、当業者の間で知られているかまたは容易であり、他の剤への推測を可能にしている。
好ましくは、腫瘍は特定のチェックポイントを発現する。これが望ましいが、免疫チェックポイント遮断剤が腫瘍内で腫瘍細胞、間質細胞、および腫瘍浸潤免疫細胞によって引き起こされる免疫抑制メカニズムを一般的に遮断するのでこれは厳密に必要ではない。
【００５７】
例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、黒色腫の手術後にアジュバント療法として投与されるとき、３週間ごとに全部で４回の投与のために、３ｍｇ／ｋｇの総輸液量で９０分間にわたって１〜２ｍｇ／ｍＬで投与される。この療法はしばしば、重篤で生命を脅かしさえする、免疫媒介性副作用を伴い、これは投与できる許容用量および累積量を制限する。単独で投与されるこれおよび他のチェックポイント遮断剤は、（以下に示すように）１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲の、１投与当たりの量で一般的に投与される。Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を補助的に投与するとき、イピリムマブの用量および／または累積量を低減することができるであろうことは理解される。特に、以下に叙述される実験結果に照らして、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルス、ならびに対応する不活化ウイルス構築物の１つ以上と同時にまたは連続的に腫瘍に対して直接的に投与される場合、ＣＴＬＡ４阻害剤の用量をさらに低減することができるであろうことは理解される。したがって、イピリムマブに関して上に提示される量は、補助的投与について患者にもたらされるべき特定の投与量および累積量を決定するための開始点となるであろうが、最適量を決定するための投与研究は必要であろう。
ペンブロリズマブは、２５ｍｇ／ｍＬに希釈された黒色腫におけるアジュバント療法としての投与のために処方され、３週間ごとに３０分間にわたり２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。
【００５８】
ニボルマブは、２週間ごとの６０分間にわたる静脈内注入として３ｍｇ／ｋｇでの投与のために処方される。治療での使用／適用のために、ヒトＧＭ−ＣＳＦが使用されるであろう。本明細書に記載される例において、ｍＧＭ−ＣＳＦとして記載されるマウスＧＭ−ＣＳＦが、モデル／実験系において使用される。さらに、本開示のウイルスの任意の１つ以上による複数の治療を、腫瘍が消散するか、またはもはや処置に応答しなくなるまで複数の用量で投与することができる。
上述の１つ以上のウイルスとチェックポイント遮断阻害剤との併用療法を、１人以上の医師が互いの指示に従って行動するかまたはチームとして行動することによって投与することができることは理解されよう。
【００５９】
「薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤」は、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。生物学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。抗菌剤のような補助的な活性成分もまた組成物に組み入れることができる。
「送達すること」は、本開示のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−Ｆｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を腫瘍微小環境に配置することに関連して使用され、腫瘍に対する局所投与、または例えば静脈内経路によってなされる。用語は、腫瘍それ自体に到達するＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスに焦点を当てる。「送達すること」は、投与することと同義語であるが、それは、例えば腫瘍内のような特定の投与場所を念頭に置いて使用する。
【００６０】
本開示において、本発明者らは、ヒトＦｌｔ３Ｌを発現する組換えＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-ウイルスを作製し、この増殖因子を腫瘍微小環境に送達してＣＤ１０３+／ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）を含む免疫細胞の動員、分化、および機能を促進することを目的とした。ワクシニアウイルスが、腫瘍選択性を増加させるためのワクシニアチミジンキナーゼ（ＴＫ）の欠失を伴い、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする導入遺伝子を発現するよう操作されるような、いくらか類似した戦略が使用されており、ＪｅｎｎｅｒｅｘによるＪＸ−５９４の臨床開発において効果的であることが証明されている。ＧＭ−ＣＳＦは、末梢非リンパ組織においてＤＣホメオスタシスに重要な別の増殖因子である（King et al., 2010、Greter et al., 2012）。黒色腫ワクチン（ＧＶＡＸ）はＧＭ−ＣＳＦを分泌する致死的に放射線照射された同種黒色腫細胞を含み、いくらかの臨床的利益を示している（Dranoff et al., 2003）。ＣｕｒｒａｎおよびＡｌｌｉｓｏｎは、Ｂ１６−ＧＭＣＳＦ（ＧＶＡＸ）またはＢ１６−Ｆｌｔ３Ｌ（Ｆｌ３ＶＡＸ）とＣＴＬＡ−４遮断剤との組み合わせが、ワクチンが腫瘍から遠位の部位に投与された場合に、マウスの約６０％において確立された黒色腫を根絶することを示した（Curran and Allison, 2009）。しかしながら、ワクチンがＣＴＬＡ−４遮断剤と組み合わせて腫瘍に投与されたとき、ＧＶＡＸは、腫瘍根絶に効果的でなく、一方でＦＩ３ＶＡＸ処理は、７５％の腫瘍がないマウスをもたらした。１つの可能性がある説明は、腫瘍に対するＧＭ−ＣＳＦ投与が腫瘍内に骨髄抑制細胞生成を誘導するかもしれないというものである（Serafini et al., 2004）。ＧＭ−ＣＳＦの腫瘍への投与が免疫寛容を誘導するかもしれないとの懸念から、本開示の発明者らは、Ｂ１６黒色腫の確立の根絶について、ｈＦｌｔ３ＬまたはＧＭ−ＣＳＦを発現するベクターとしてのＶＣ−ＴＫ-の２つの組換えウイルス、およびベクター単独の、一対一の比較を実施した。本発明者らは、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌが、腫瘍増殖の根絶または制御において、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはベクター単独より効果的であることを発見した（例６）。例６に記載されるように、本発明者らは、弱毒化複製可能ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍を効果的に根絶することができるが、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、反対側の腫瘍の増殖の遅延および生存期間の延長の点において、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的であることを示した。このＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの全身性効果は、注射されていない腫瘍の治療に対してのみでなく、転移性疾患の治療に対してもまた重要である。
【００６１】
さらに、本開示の発明者らは、細胞溶解ウイルスの腫瘍内送達が、免疫チェックポイント遮断剤に対する抵抗性を克服できることを示した。例７に示されるように、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかの腫瘍内送達と、抗ＣＴＬＡ−４抗体の全身性送達との組み合わせが、１０／１０の注射された腫瘍の根絶、および反対側の注射されていない腫瘍の増殖の有意な遅延、ならびに事例の４０〜６０％の腫瘍における完全な根絶をもたらす。しかしながら、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達は、反対側の腫瘍の増殖の遅延および処理されたマウスの生存期間の延長の点において、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的であった。これらの結果は、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌが、単独でも、免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせても、黒色腫患者の治療に対して、成功し、確かにより優れた選択肢を提供できることを最初に示す。
【００６２】
本開示において、本発明者らは、不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ株を癌免疫療法薬として使用できるかをさらに探索した。実際、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内送達が、腫瘍の根絶および抗腫瘍適用免疫の生成の点において、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的であることを観察した（例８）。したがって、治療選択肢として、改善された治療結果を達成するために、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによって患者を治療することができる。ウイルスの熱不活化の代わりに、紫外線照射（ＵＶ）不活化を代わりに利用する場合、同様の結果が観察されることが予想される。
さらに、本開示の発明者らは、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたは熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断剤の腹腔内送達との組み合わせが、相乗治療効果をもたらすことを示している（例９）。
【００６３】
一実施形態において、本開示は、腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫応答を引き起こす方法であって、腫瘍に対して、有効量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を送達することを含む方法に関する。免疫系の刺激は、以下の免疫学的効果の１つ以上によって顕在化され得る：
腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、
Ｉ型ＩＦＮの誘導を通じての、前記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟の誘導、
対象における、腫瘍内および／または腫瘍流入領域リンパ節の腫瘍細胞を認識する活性化Ｔヘルパー細胞の誘導、
対象の注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３+樹状細胞の増加（特にｈＦＬＴ３Ｌ構築物について）。
上述の１つ以上の免疫学的効果は、対象の治療に対する応答の初期の指標としての機能を果たすことができ、そしてその継続する効果のモニターとして機能を果たすことができる。
一実施形態において、本開示は、固形腫瘍と診断された対象を治療する方法であって、腫瘍に対して、治療有効量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を送達することを含む方法を提供する。
【００６４】
一実施形態において、本開示は、癌と診断された対象において、抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、対象に、治療有効量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を投与することを含む方法を提供する。本開示の方法は、（未治療または従来の治療を受けた対象と比べて）腫瘍のサイズを低減するか、腫瘍を根絶するか、腫瘍の増殖を阻害するか、転移もしくは腫瘍の転移性増殖を阻害するか、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するか、または対象の生存期間を延長することができる抗腫瘍免疫を誘導することを含む。
【００６５】
別の実施形態において、本開示は、固形悪性腫瘍と診断された対象において、Ｔ細胞応答のような自然免疫応答および／または適応免疫応答を含み得る抗腫瘍免疫応答を、治療有効量のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上に腫瘍を曝露することによって増強、刺激、または引き起こす方法を提供する。
【００６６】
具体的な実施形態において、本開示は、腫瘍細胞に対するＴ細胞傷害性の点と、やはり腫瘍細胞に対するＴヘルパー細胞を引き起こす点の両方の、適応免疫応答を媒介する免疫応答を引き起こす方法を提供する。本方法は、固形腫瘍に罹患した対象に対して、腫瘍内または静脈内にＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を含む組成物を投与することを含み、上記組成物の投与は、腫瘍に対する腫瘍特異的免疫応答をもたらし、そして最終的に腫瘍増殖の低減、阻害、または根絶をもたらし、転移性増殖の阻害、腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または対象の生存期間の延長をもたらす。実際、本発明者らは、癌細胞が殺傷されること、および転移を伴う場合に免疫応答が遠隔箇所に移行できることを示している。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本開示は、腫瘍細胞に対するＴ細胞傷害性の点と、やはり腫瘍細胞に対するＴヘルパー細胞を引き起こす点の両方の、適応免疫応答を媒介する免疫応答を引き起こす方法を提供する。本方法は、対象に対して、非経口でＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上を含む組成物を投与することを含み、上記組成物の投与は、腫瘍に対する腫瘍特異的免疫応答をもたらし、そして最終的に、腫瘍増殖の低減、阻害、もしくは根絶、および／または転移性増殖の阻害、腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または治療された対象の生存期間の延長をもたらす。腹腔内転移に対し、ウイルスを腹腔内注射できる。脳転移に対して、ウイルスを、定位誘導のもと、腫瘍内注射することができ、または髄腔内に注射することができる。
実際、本発明者らは、癌細胞が殺傷されること、および転移を伴う場合に免疫応答が遠隔箇所に移行できることを示している。
したがって、本開示は、固形悪性腫瘍を治療する方法であって、固形腫瘍と診断された対象において腫瘍に対する治療的免疫応答を誘導するのに有効な量で、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを対象の腫瘍に対して送達する方法を提供する。
【００６８】
したがって、本明細書、現在の文献に示されるように、かつ理論に拘束されることを望まずに、以下のメカニズムが、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの抗腫瘍効果に寄与すると考えられる：（ｉ）腫瘍細胞の腫瘍溶解および腫瘍抗原の放出、（ｉｉ）腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＤ８＋およびエフェクターＣＤ４+Ｔ細胞の誘導、（ｉｉｉ）ウイルスＤＮＡおよびＲＮＡの放出を通じた腫瘍免疫抑制環境の改変、（ｉｖ）抗腫瘍抗体の誘導。
【００６９】
免疫応答
特定の免疫系の活性（例えば抗体および／またはサイトカイン産生、または細胞媒介性免疫の活性化）の上方制御による免疫応答の誘導に加えて、免疫応答はまた、ホメオスタシスの再確立および宿主自身の器官および組織への過剰な損傷の防御のための、検出可能な免疫の抑制、減衰または任意の他の下方制御を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって誘導される免疫応答は、腫瘍細胞の直接的もしくは間接的な死、または増殖する能力の消失をもたらすことができる、細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞、または活性化Ｔヘルパー細胞、またはその両方を生成する。
本開示の方法による免疫応答の誘導は、様々なよく知られている免疫学的パラメーターの任意のものを検出することによって決定することができる（Takaoka et al., Cancer Sci. 94:405-11 (2003); Nagorsen et al., Crit. Rev. Immunol. 22:449-62 (2002)）。したがって、免疫応答の誘導は免疫学的アッセイを含む、数多くのよく知られているアッセイの任意のものによって確認することができ、そのようなアッセイは、可溶性免疫グロブリンまたは抗体、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などの可溶性メディエーター、および他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドならびに／または脂質メディエーターのインビボ、エクスビボ、またはインビトロ測定、免疫系の細胞の機能的または構造的特性の変化によって決定される細胞の活性化状態の変化、例えば、細胞増殖、変化した運動性、変化した細胞内カチオン勾配もしくは濃度（例えばカルシウム）、細胞ポリペプチドのリン酸化もしくは脱リン酸化、変化した表面抗原発現プロファイルを含む、特定の遺伝子発現のような特殊な活性の誘導、免疫系の細胞による細胞分化、またはアポトーシス（プログラム細胞死）の発生、または免疫応答の存在を検出することができる任意の他の基準を含むがこれらに限定されない。例えば、免疫細胞型を区別することができる細胞表面マーカーは、ＣＤ４+、ＣＤ８+、またはＮＫ細胞に結合する特定の抗体によって検出することができる。検出することができる他のマーカーおよび細胞成分は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６、およびＣＣＬ５を含むがこれらに限定されない。免疫応答を検出するための一般的な方法は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学を含むがこれらに限定されない。これらのアッセイおよび同様のアッセイを実施するための手順は広く知られ、例えばＬｅｔｋｏｖｉｔｓ（Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998）に見出すことができる。
【００７０】
薬学的組成物および調製
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを含む薬学的組成物は、担体または希釈剤を含んでもよく、それは例えば、水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物における、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【００７１】
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを含む薬学的組成物または調製物は、通常の混合、溶解、造粒化、糖衣錠形成、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスの手段によって製造できる。薬学的ウイルス組成物は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボの使用に好適なウイルス調製物の形成を促進する生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または助剤の１つ以上を用いて通常の様式によって製剤化できる。組成物は、１つ以上の追加の生物学的に活性な剤と組み合わせることができ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦの並行投与）、非経口または腫瘍内投与に好適な本開示の薬学的（生物学的を含む）または獣医学的組成物を生成するために薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に製剤化できる。好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、不活性タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、脂肪酸、界面活性剤、非イオン性界面活性剤、炭水化物、デキストリン、ポリオール、キレート剤など、およびそれらの組み合わせを含む。さらに、所望する場合、ビヒクルは、湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤のような少量の補助物質を含んでもよい。そのような剤形調製の実際の方法は公知であり、当業者に明らかであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 17th edition, 1985;Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A.R. Gennaro, (2000) Lippincott, Williams & Wilkinsを参照されたい。
【００７２】
多くの型の製剤が可能であり、周知である。当該技術分野においてよく認識されるように、選択される特定の型は、選択される投与経路に依存する。例えば、全身製剤は、一般的に注射、例えば、静脈内注射による投与のために設計され、および腫瘍内送達のために設計されるものであろう。好ましくは、全身性または腫瘍内製剤は、滅菌されている。
滅菌されている注射可能な溶液は、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを、本明細書に列挙される様々な他の成分と共に必要量の適切な溶媒に混合し、必要とされるとき、その後の好適な滅菌手段によって調製される。一般的に、分散液は様々な滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルス、および以前に滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【００７３】
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの投与量
一般的に、対象は、約１０5〜約１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲のＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの単位用量を投与されるが、より少ないかまたはより多い用量も投与され得る。好ましい実施形態において、投与量は約１０6〜１０9ｐｆｕである。典型的には、単位用量は、１〜１０ｍｌの範囲内の容量で投与される。ウイルス粒子に対するｐｆｕの同等量は、用いる特定のｐｆｕ力価測定法に従って変動し得る。一般的に、ｐｆｕは、約５〜１００ウイルス粒子と同等量である。Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスの治療有効量を、１つ以上の用量に分割して、所定の期間、所定の投与頻度で投与できる。例えば、当業者に明らかであるように、本開示によるＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスの治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重、および全身状態、ならびに特定の対象における所望の免疫応答を引き起こすＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスの能力に従って変動し得る。
【００７４】
癌治療の分野に従事する者にとって明らかであるように、投与量の変動は、例えば、治療される対象の状態、投与経路および療法に対する対象の応答に依存して必然的に生じるであろう。Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの対象への送達において、投与量もまた、全身の医学的状態、以前の病歴、疾患の進行、腫瘍量、免疫応答を開始する能力などのような要因に応じて変動するであろう。
本開示の組成物を、投与が簡単でありかつ投与量の均一である単位投与剤形に製剤化することは有利である。本明細書において使用されるとき、単位投与剤形は治療される哺乳動物対象に対する単位用量として好適な物理的に分離した単位を指し、各々の単位が必要とされる薬学的または獣医学的に許容可能な担体と会合して、所望の治療効果をもたらすよう計算された所定の量の活性物質を含む。
【００７５】
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの投与および治療レジメン
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の投与は、非経口、腫瘍内、髄腔内、または静脈内投与を含む経路の組み合わせを用いて達成できる。一実施形態において、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上は、直接的な局所応答が望まれる場合、例えば腫瘍内注射によって腫瘍内へと直接投与される。さらに、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの投与経路は、例えば、最初の投与が腫瘍内注射を用い、続く投与が静脈内注射を介するか、またはそれらの任意の組み合わせのように変動し得る。Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上の注射の治療有効量を、所定の期間、所定の投与頻度で投与できる。ある実施形態において、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを、他の治療処置と組み合わせて使用できる。例えば、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、および／またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを、巨大原発性腫瘍に罹患した患者のために、ネオアジュバント（術前）またはアジュバント（術後）環境において投与できる。そのような最適化治療レジメンが、手術のような一次療法の前後に、腫瘍に対する免疫応答を誘導し、患者の腫瘍量を低減するであろうことは理解される。さらに、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを、化学療法または放射線照射のような他の治療処置と組み合わせて投与できる。
【００７６】
ある実施形態において、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスは、週または月に少なくとも１回投与されるが、必要な場合より頻繁に、例えば恩恵が持続する限り、数週間、数カ月間、数年間、またはさらに無期限の期間中、週に２回投与できる。耐容される場合、およびそれらが持続するかまたは増加する恩恵を生じる場合、より頻繁な投与が意図される。本方法の恩恵は、以下を含むが、これらに限定されない：癌細胞の数の低減、腫瘍サイズの低減、腫瘍の根絶、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害、転移性増殖の阻害または安定化、腫瘍増殖の阻害または安定化、および生活の質の安定化または改善。さらに、恩恵は、腫瘍に対する免疫応答の誘導、Ｔヘルパー細胞の活性化、細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、または制御性ＣＤ４+細胞の低減を含み得る。例えば、黒色腫の文脈において、恩恵は、最初の黒色腫の診断の１、２、３、４、５またはそれ以上の年における、再発または転移がないことであり得る。結腸癌および他の固形腫瘍についても同様の評価をなし得る。
【００７７】
ある他の実施形態において、腫瘍塊または腫瘍細胞は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロにおいて、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの１つ以上によって治療される。
【００７８】
キット
本開示は、本明細書に記載されるＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ＧＭ−ＣＳＦ、またはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスのうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物を含むキットの供給を意図する。キットは、ウイルスの治療すべき対象への投与のための説明書と共にウイルスの１つまたは複数の容器またはバイアルを含むことができる。説明書は、以下に提供される組成物または複数の組成物を投与するための投与レジメンを示し得る。
いくつかの実施形態において、キットはまた、本明細書に記載されるウイルス組成物の任意のものとの補助的な投与のためのチェックポイント阻害剤を含むさらなる組成物を含んでもよい。
【実施例】
【００７９】
材料および方法
ウイルスおよび細胞株
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ（ＶＣ）およびΔＥ３Ｌ（ＶＩ）ウイルスは、Ｂ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓ（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって親切に提供された。それらは、ＢＳＣ４０細胞において増殖し、ウイルス力価は、ＢＳＣ４０細胞を用いるプラークアッセイによって測定された。ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）座位における相同組換えによって作製された（例２を参照）。これらの組換えウイルスは、ｇｐｔ選択培地における培養および５ラウンド超の選択培地の存在下におけるプラーク精製によって濃縮された。純粋な組換えクローンは選択培地の非存在下で増幅された。検証の後、ウイルスは、３６％スクロースクッションによって精製した。
ＭＶＡウイルスは、Ｇｅｒｄ  Ｓｕｔｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈ）によって親切に提供され、ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）細胞において増殖させた。熱不活化ＭＶＡおよび熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦは、精製されたそれぞれのウイルスを５５℃で１時間インキュベートすることによって作製した。熱不活化は、１，０００倍の感染性の低減をもたらした。
【００８０】
ＢＳＣ４０細胞は、１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するよう補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）において培養した。ＲＫ１３（ウサギ腎臓）細胞は、１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および５０ｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する改変Ｅａｇｌｅ培地において培養した。マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０は、当初はＩ．Ｆｉｄｌｅｒ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）より得た。Ｂ１６−Ｆ１０細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ヒト黒色腫、ＳＫ−ＭＥＬ−３９、ＳＫ−ＭＥＬ−１８８、ＳＫ−ＭＥＬ９０、ＳＫ−ＭＥＬ９０、およびＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞は、１０％のＦＢＳおよび４ｍｍのＬ−グルタミンを補充したＭＥＭ培地において培養した。全ての細胞は３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターで増殖した。
マウストリプルネガティブ乳癌細胞株４Ｔ１は、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で培養した。
【００８１】
細胞培養における一段増殖
Ｂ１６−Ｆ１０細胞およびヒト黒色腫細胞を、ΔＥ３Ｌ（ＶＩ）、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ（ＶＣ）、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ）を含むウイルスの低ＭＯＩでの感染前に一晩培養した。６０分後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで、培地で覆った。最初の感染後、１、４、１２、２４、４８、および、場合により７２時間において、１ｍｌの培地中に細胞をかきとることによって細胞を採取した。３サイクルの凍結融解の後、試料を超音波処理し、（ΔＥ３Ｌ以外の全てのウイルスについて）ウイルス力価を連続希釈およびＢＳＣ４０細胞単層の感染によって測定した。ΔＥ３Ｌウイルス力価はＲＫ１３細胞において測定した。プラークを２０％エタノール中の０．１％クリスタルバイオレットによって染色することによって可視化した。
【００８２】
ウェスタンブロット解析
マウス黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞またはヒト黒色腫細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＫ−ＭＥＬ１４６（１×１０6）を、１０のＭＯＩ（感染多重度）でＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスによって感染した。感染後様々な時間において、上清および細胞溶解物を回収した。同等量のタンパク質を、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電機泳動に供し、ポリペプチドをニトロセルロース膜に転写した。ｍＧＭ−ＣＳＦおよびｈＦｌｔ３Ｌ発現レベルを抗ｍＧＭ−ＣＳＦまたは抗ｈＦｌｔ３Ｌの抗体を使用することによって測定した。抗グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を、添加コントロールとして使用した。
【００８３】
マウス
６〜８週齢の間のメスのＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入し、インビボ腫瘍移植および処理実験に使用した。これらのマウスは、Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設で維持した。全ての手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に厳格に従って実施した。プロトコールはＳｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓによって承認された。
【００８４】
腫瘍移植、および免疫チェックポイント遮断の全身性または腫瘍内投与の存在下または非存在下でのウイルスの腫瘍内注射
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０5）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚へと皮下移植し、一方でより少ない細胞（１×１０5）を同一のマウスの左側に移植した。移植後７〜８日後、腫瘍サイズを測定し、マウスの右側の直径３ｍｍ以上の腫瘍にＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルス（２×１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳを、マウスが麻酔下にあったときに注射した。週に２回ウイルスを注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍容積は、次の式：ｌ（長さ）×ｗ（幅）×ｈ（高さ）／２によって計算した。マウスの生存をモニターした。マウスは、苦痛の兆候を見せたとき、または腫瘍の直径が１０ｍｍに達したとき、安楽死させた。いくつかの実験群において、マウスを、抗ＣＴＬＡ−４（マウス１匹当たり１００μｇ）または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（マウス１匹当たり２５０μｇ）の腹腔内送達によって週に２回処理した。
いくつかの実験において、４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に２．５×１０5、および左側に５×１０4）。腫瘍移植の５日後、右側のより大きな腫瘍に、熱処理−ｉＭＶＡまたはＶＣ−ＴＫ-ウイルスのいずれか（２×１０7ｐｆｕ）を週に２回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。マウスの生存をモニターした。
【００８５】
片側皮下腫瘍移植およびウイルスの腫瘍内注射
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫（５０μｌの容量中の５×１０5細胞）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚に皮下移植した。移植後の９日後、腫瘍サイズを測定し、直径５〜６ｍｍの腫瘍に、週に２回、マウスが麻酔下にあったときに、熱処理−ｉＭＶＡ（５０μｌの容量中、２×１０7ｐｆｕのＭＶＡの同等量）、もしくはＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＰＢＳを注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍容積は、次の式：ｌ（長さ）×ｗ（幅）×ｈ（高さ）／２によって計算した。マウスは、苦痛の兆候を見せたとき、または腫瘍の直径が１５ｍｍに達したとき、安楽死させた。
【００８６】
交差防御抗腫瘍免疫の発達を評価するための腫瘍負荷
異種腫瘍に対する交差防御免疫を評価するために、生存マウス（腫瘍内ウイルス療法の開始後６０日超）およびナイーブマウスを、致死用量のＭＣ３８（１×１０5細胞）の皮下送達によって負荷した。
【００８７】
腫瘍細胞懸濁液の調製
腫瘍の免疫細胞の表現型および特徴を分析するために、本発明者らは次のプロトコールに従ってＦＡＣＳ解析前に細胞懸濁液を作製した（Zamarin et al., Science Translational Medicine 6, 226-232 (2014)）。最初に、本発明者らは、ＰＢＳまたはウイルスによる２回目の処理の３日後、および最初の処理の７日後に、鉗子および外科用ハサミを用いて注射された腫瘍および／または注射されていない腫瘍を単離した。次いで、腫瘍を秤量した。腫瘍を切り刻み、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（１．６７Ｗｕｎｓｃｈ  Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（０．２ｍｇ／ｍｌ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。繰り返しピペッティングして細胞懸濁液を作製し、７０μｍナイロンフィルターを通してろ過し、次いで完全ＲＰＭＩによって洗浄した。
【００８８】
腫瘍浸潤免疫細胞のフローサイトメトリー解析
両側腫瘍移植モデルにおいて、５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞をＣ５７Ｂ／６マウスの右側に、２．５×１０5細胞を左側に皮下移植した。移植後７日で、ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳのいずれかを右側の腫瘍に注射した。注射は３日後に繰り返した。腫瘍は最後の注射の３日後に採取し、細胞懸濁液を作製した。細胞は、抗ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、およびＣＤ８抗体によって表面標識の処理をした。生細胞は、固定性色素ｅＦｌｕｏｒ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて死細胞と区別する。それらはさらに透過キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて透過処理し、グランザイムＢに対して染色した。骨髄細胞集団の染色のために、ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｌｙ−６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）に対する蛍光色素結合抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入した。全ての抗体は、それらの対応するアイソタイプコントロールと共に試験した。データをＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて解析した。
【００８９】
試薬
試薬の商業的供給源は以下の通りであった：抗ｍＧＭ−ＣＳＦおよび抗ｈＦｌｔ３Ｌ抗体はＲ＆Ｄより購入した。治療用抗ＣＴＬＡ４（クローン９Ｈ１０および９Ｄ９）、抗ＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ−９Ｇ２）はＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨより購入した。ｈＦｌｔ３ＬおよびｍＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミドはＧＥより購入した。フローサイトメトリーで使用した抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＤ４５．２  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４  ＡＰＣ−ｅｆｌｕｏｒ７８０、ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ−ｅｆｌｕｏｒ７１０）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＤ４  ＱＤｏｔ  ６０５、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＡＰＣ）より購入した。ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｌｙ−６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）に対する蛍光色素結合抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入した。
【００９０】
統計
研究における２つの群の比較のために、両側独立スチューデントのｔ検定を使用した。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した。有意であるとみなされるｐ値は、次の図によって示す：*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１、****、ｐ＜０．０００１。試験に含まれる動物の数は各々の図の凡例で考察する。
【００９１】
（例１）
Ｅ３ＬΔ８３Ｎウイルス（ＶＣ）はマウスおよびヒトの黒色腫細胞で複製する
Ｅ３ＬΔ８３Ｎ（本発明の実験のための親ＶＣウイルス）またはΔＥ３Ｌがマウスまたはヒト黒色腫細胞において複製するかどうかを試験するために、マウスＢ１６黒色腫細胞、ヒト黒色腫細胞、ＳＫ−ＭＥＬ３９、ＳＫ−ＭＥＬ１８８、およびＳＫ−ＭＥＬ９０を、５の感染多重度（ＭＯＩ）で、Ｅ３ＬΔ８３ＮまたはΔＥ３Ｌウイルスのいずれかで感染させた。感染後の様々な時間（感染後５０時間まで）で細胞を回収した。ウイルスの収量（ログＰＦＵ）を、ＢＳＣ４０細胞単層上における力価測定によって測定した。図１Ａ〜１Ｄに示されるように、Ｅ３ＬΔ８３Ｎウイルス（ＶＣ）は、試験されたマウスおよびヒトの黒色腫細胞の全てにおいて、効果的に複製することができ、一方でΔＥ３Ｌウイルス（ＶＩ）は、それらの細胞株において複製しなかった。
【００９２】
（例２）
ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３Ｌを伴うかまたは伴わない、組換えＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-ウイルスの作製
チミジンキナーゼの欠失（ＴＫ-）を伴う腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＴＫ+ウイルスよりも弱毒化され、かつ腫瘍選択性を有することが以前に示されている（Buller et al. 1988、Puhlmann et al., 2000）。本開示において、本発明者らは、プラスミドＤＮＡとウイルスゲノムＤＮＡ間のＴＫ座位での相同組換えを介する標準的な組換えウイルス技術を用いて、ＴＫ欠失を含み、ワクシニア合成初期／後期プロモーター（Ｐｓｅ／ｌ）の下でのヒトＦｌｔ３Ｌ（ｈＦｌｔ３Ｌ）またはマウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）の発現を伴うかまたは伴わない組換えＶＣウイルスを作製した。最初に、本発明者らは、ワクシニアＰｓｅ／ｌの制御下の特定の目的の遺伝子（ＳＧ）、およびワクシニアＰ７．５プロモーターの制御下の大腸菌のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）を、片側にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を隣接させて含むプラスミドを構築した（図２）。ＢＳＣ４０細胞を０．０５のＭＯＩでＶＣウイルスで１時間感染させ、次いで、上述のプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。感染細胞を４８時間で回収した。ＭＰＡ、キサンチンおよびヒポキサンチンを含むｇｐｔ選択培地中でさらに培養して組換えウイルスを選択し、プラーク精製した（Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。ＰＣＲ解析を実施して、ＴＫ遺伝子の一部を欠失し、かつマウスＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＦｌｔ３Ｌを含むおよび含まない組換えウイルスを同定した（図３）。
【００９３】
オリゴヌクレオチドプライマーは、異なる挿入を伴うＶＣ組換えウイルスを同定するために異なるサイズのＤＮＡフラグメントを増幅するよう設計した（図３中の表）。例えば、ＶＣゲノム上の挿入部位に隣接するプライマーＴＫ−Ｆ２、およびベクター上のｐＣＢ−Ｒ３は、標的遺伝子の相同挿入をチェックするために使用した。組換えウイルスにおいて失われるプライマーＴＫ−Ｒ４、およびＴＫ−Ｆ４は、組換えウイルスと親ウイルスを区別するために使用した。遺伝子特異的プライマーを、マウスＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＦｌｔ３Ｌ遺伝子の挿入をチェックするために使用した。ワクシニアＴＫ遺伝子（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＮＣ＿００６９９８．１（８０７２４．．８１２５７））の隣接領域に位置するプライマーＴＫ−Ｆ５／ＴＫ−Ｒ５を、配列検証のために標的遺伝子を増幅するために使用した。予想されるフラグメントは図３中の表に示す。遺伝子特異的プライマーｍＧＭＣＳＦ−Ｆ１／Ｒ１は、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦウイルスから３１０ｂｐのフラグメントを増幅し、一方でｈＦｌｔ３Ｌ−Ｆ１／Ｒ１は、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌから３１６ｂｐのＰＣＲフラグメントを生成するであろう。
【００９４】
プライマー配列：ＴＫ−Ｆ２（配列番号１）：ＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣ；ＴＫ−Ｆ４（配列番号２）：ＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡ；
ＴＫ−Ｒ４（配列番号３）：ＴＣＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＣＴ；
ＴＫ−Ｆ５（配列番号４）：ＧＡＡＣＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＡＣＧＣＡＴ；
ＴＫ−Ｒ５（配列番号５）：ＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣＧ；
ｐＣＢ−Ｒ３（配列番号６）：ＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＧＣＧ；
ｍＧＭＣＳＦ−Ｆ１（配列番号７）：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴ；
ｍＧＭＣＳＦ−Ｒ１（配列番号８）：ＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧ；
ｈＦｌｔ３Ｌ−Ｆ１（配列番号９）：ＡＡＣＧＡＣＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣ；
ｈＦｌｔ３Ｌ−Ｒ１（配列番号１０）：ＧＧＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＴＴＧＧ。
【００９５】
（例３）
組換えＶＣ−ＴＫ−ｍＧＭ−ＣＳＦウイルスを感染させた黒色腫細胞からのｍＧＭ−ＣＳＦの発現
ＶＣ−ＴＫ-組換えウイルスからのｍＧＭ−ＣＳＦの発現を試験するために、本発明者らは、Ｂ１６マウス黒色腫細胞およびヒト黒色腫細胞（ＳＫ−ｍｅｌ−２８）にＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦを感染させた。細胞溶解物および上清を、感染後の様々な時間（４、８、および２４時間）で回収した。挿入遺伝子の発現のレベルを測定するために、ウェスタンブロット解析を実施した。図４Ｂに示すように、本発明者らは、細胞溶解物と上清の両方においてｍＧＭ−ＣＳＦの豊富なレベルを観察した。
【００９６】
（例４）
組換えＶＣ−ＴＫ−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを感染させた黒色腫細胞からのｈＦｌｔ３Ｌの発現
ＶＣ−ＴＫ-組換えウイルスからのｈＦｌｔ３Ｌの発現を試験するために、本発明者らは、Ｂ１６マウス黒色腫細胞およびヒト黒色腫細胞株にＶＣ−ＴＫ--ｎＦｌｔ３Ｌを感染させた。細胞溶解物および上清を、感染後の様々な時間（４、８、および２４時間）で回収した。挿入遺伝子の発現のレベルを測定するために、ウェスタンブロット解析を実施した。本発明者らは、細胞溶解物においてｈＦｌｔ３Ｌの豊富なレベルを検出したが、上清においては検出しなかった（図４Ｂ）。これは、ｈＦｌｔ３Ｌが主に膜に結合し、分泌されないという概念と一致する。
【００９７】
（例５）
ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌは複製可能である
マウスＢ１６−Ｆ１０細胞におけるＶＣ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの複製能を、０．０１のＭＯＩでそれらを感染させることによって決定した。細胞を感染後の様々な時間（２４、４８、および７２時間）で回収し、ウイルス収量（ログｐｆｕ）をＢＳＣ４０細胞における力価測定によって決定した。ＶＣはＢ１６−Ｆ１０細胞において効果的に複製し、感染後７２時間でウイルス力価は２０，０００倍に増加した。（図５Ａおよび５Ｂ）。ＴＫ遺伝子を欠失させると、Ｂ１６黒色腫細胞においてＶＣと比べてウイルス複製が３分の１に減少した。さらに、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦおよびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌはまた、マウスＢ１６細胞において複製可能であり、感染後７２時間でウイルス力価がそれぞれ２８００倍および１０００倍増加した（図６Ａおよび６Ｂ）。したがって、この例において、本発明者らは、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌが、腫瘍細胞において全て複製可能であることを示している。
【００９８】
（例６）
ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、注射された腫瘍の根絶、および反対側の注射されていない腫瘍の遅延した腫瘍増殖をもたらす
組換えウイルスおよびベクターコントロールのインビボ腫瘍殺傷活性を試験するために、マウスＢ１６黒色腫細胞を、Ｃ５７Ｂ／６マウスに、左側に１×１０5細胞で、右側に５×１０5細胞で移植した。本発明者らは、右側のより大きい腫瘍（直径約３〜４ｍｍ）に対し、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）の腫瘍内注射を週に２回実施した。この試験においてＰＢＳモック処理コントロールを含んだ。両側腫瘍サイズを週に２回測定し、マウスを生存についてモニターした。腫瘍サイズが直径１ｃｍに到達したとき、マウスを安楽死させた。実験の概略を図６に示す。本発明者らは、ＰＢＳモック処理腫瘍が非常に急速に増殖し、マウスが１５日間の生存期間中央値で死亡したことを観察した（図７Ａ、Ｂ）。Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-注射腫瘍の１０／１０が退縮した（図７Ｃ）。しかしながら、反対側の腫瘍は増殖し続け（図７Ｄ）、全てのマウスが、１８日間の生存期間中央値で死亡した（ＰＢＳ処理群と比較して、Ｐ＜０．０５）（図７Ｍ）。ＶＣ−ＴＫ-ベクターへのｍＧＭ−ＣＳＦの添加は、ＶＣ−ＴＫ-ベクターと比べて延長した生存期間をもたらさなかった（図７Ｍ）。しかしながら、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、注射された腫瘍の８／１０を根絶するだけでなく、反対側の腫瘍の腫瘍増殖の遅延もまたもたらし、生存期間中央値を２２日間に延長した（ＰＢＳ処理群と比較して、Ｐ＜０．０１、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ処理群と比較してＰ＝０．０２）（図７Ｅ、Ｆ、Ｍ）。これらの結果は、弱毒化複製可能ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍を効果的に根絶することができるが、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が、反対側の腫瘍の増殖の遅延および生存期間の延長の点において、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的であることを示した。
【００９９】
（例７）
組換えＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達と免疫チェックポイント遮断剤の全身性送達との組み合わせが、いずれかの処理単独より効果的な腫瘍根絶およびより長い生存期間をもたらす
抗ＣＴＬＡ−４抗体の全身性送達が、Ｂ１６黒色腫増殖を制御できないことが示されている。腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内送達が免疫チェックポイント遮断剤に対する抵抗性を克服できるかどうかを試験するために、本発明者らは、マウスの右側のより大きな腫瘍が、抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内送達を伴うかまたは伴わずに、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかを週に２回注射されるマウスＢ１６両側腫瘍移植モデルを用いた。週に２回腫瘍サイズを測定し、マウスの生存をモニターした。本発明者らは、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかの腫瘍内送達と、抗ＣＴＬＡ−４抗体の全身性送達との組み合わせが、１０／１０の注射された腫瘍の根絶、および反対側の注射されていない腫瘍の増殖の有意な遅延、ならびに事例の４０〜６０％の腫瘍における完全な根絶をもたらすことを見出した（図７Ｉ−Ｍ）。例６で観察された結果と同様に、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達は、反対側の腫瘍の増殖の遅延および処理されたマウスの生存期間の延長の点において、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせたＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的であった。
まとめると、これらの結果は、弱毒化複製可能腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内送達が抗腫瘍免疫を誘導でき、これは抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下で増幅されるということを示す。
【０１００】
（例８）
熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内送達は、腫瘍の根絶および抗腫瘍適用免疫の生成の点において、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的である
本発明者らは、以前に、Ｂ１６−Ｆ１０両側腫瘍移植モデルにおいて熱不活化ＭＶＡが、注射された腫瘍の根絶および注射されていない遠位の腫瘍の増殖の阻害または遅延の点においてＭＶＡより効果的であることを報告した。（２０１６年２月２５日に本願発明者とその同僚によって出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／１９６６３、ならびに２０１５年４月１７日に出願された仮出願第６２１４９４８４号、および２０１６年４月１８日に出願された対応する国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２８１８４を参照されたい。これらの出願は参照によりその全体を本明細書に組み入れる。）臨床治験において、転移性黒色腫の治療に対して承認されているＴ−ＶＥＣを含む大多数の腫瘍溶解性ウイルスは、複製可能であるので、本発明者らは、両側Ｂ１６−Ｆ１０移植モデルにおいて、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦと熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ間の一対一の比較を実施した。ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦは、それがＴＫ欠失とＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子を有する点でＪＸ５９４と類似する。ＶＣ−ＴＫ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、Ｂ１６黒色腫細胞において効果的に複製するが、Ｅ３のＺ−ＤＮＡ結合ドメインの欠失により、動物、およびおそらくはヒトにおいて、ＷＴワクシニアより弱毒化されている（BrandtおよびJacobs、 JVI、 2001）。したがって、ＶＣ−ＴＫ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、ヒトでの使用に関して、ＪＸ５９４よりも安全であろうと理解される。本発明者らは、熱処理−ＭＶＡと同様に、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦが、ＤＣおよび癌細胞においてＩ型ＩＦＮを誘導するその能力のために、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも強力な抗腫瘍免疫の活性化剤であるだろうとの仮説を立てた。それを試験するため、本発明者らは、以下の実験を実施した。手短に、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍移植後の７日で、２×１０7ｐｆｕの生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたは同等量の熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦを、右側のより大きな腫瘍に腫瘍内注射した。腫瘍サイズが測定され、腫瘍は週に２回注射された。マウスの生存がモニターされた。ＰＢＳで処理したマウスにおいて、右側で腫瘍が急速に増殖し、早期の死をもたらしたことが見出された（図８Ａ、Ｂ、Ｏ）。熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたは生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦのいずれかの腫瘍内注射は、ＰＢＳと比べて、腫瘍増殖の遅延および改善された生存期間をもたらした（図８Ｏ、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ対ＰＢＳについて、***、Ｐ＜０．００１、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ対ＰＢＳについて、****、Ｐ＜０．０００１）。熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射は、注射された腫瘍を根絶する点において（熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦについて８／９で腫瘍が存在しない、対、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦについて４／９で腫瘍が存在しない）および反対側の注射されていない腫瘍の増殖を遅延または阻害する点において（熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦについて７／９で腫瘍が存在しない、対、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦについて５／９で腫瘍が存在し���い）、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的である（図８Ｃ〜Ｆ）。本発明者らは、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ処理マウスにおいて、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ処理マウスと比べて改善された生存期間を観察した（図８Ｏ、*、Ｐ＝０．０１４）。これらの結果は、抗腫瘍効果を達成するのにウイルス複製が必ずしも必要ないことを示す。この具体例において、本発明者らは、ウイルスを不活化するために熱不活化を使用したが、他の方法による不活化も実施できる。例えば、ウイルス不活化の別の方法は、紫外線照射の使用を含む。
【０１０１】
熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射は、本開示の発明者らが熱処理−ＭＶＡについて実証しているように、おそらくはＳＴＩＮＧ媒介性Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導、Ｂａｔｆ３依存性樹状細胞（ＤＣ）の活性化、ならびに抗腫瘍ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の動員および活性化、ならびにＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＣＤ４+エフェクター／Ｔｒｅｇの比率の増加によって、抗腫瘍免疫をもたらす。
【０１０２】
腫瘍への生および熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの共投与は、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ単独と比べて改善した抗腫瘍応答をもたらさなかった（図８Ｇ、Ｈ、Ｏ）。本発明者らは、生ウイルスが宿主の免疫応答、したがって熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの活性を遮断し、ＧＭ−ＣＳＦの有益な効果を減ずる可能性があると理由付けた。生および熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの共投与が、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ｈＦｌｔ３Ｌ単独よりも効果的であるかもしれないということを評価するための研究は進行中である。細胞質ＤＮＡ感知経路と干渉する候補遺伝子の欠失によって複製可能ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌをさらに弱毒化する研究もまた進行中である。
【０１０３】
（例９）
ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたは熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断剤の腹腔内送達との組み合わせが、相乗治療効果をもたらす
本発明者らは、次に、転移性疾患を有する個人を模倣する両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおいて、生または熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の治療効果を増強するかどうかを調査した。手短に、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍移植後８日で、本発明者らは、アイソタイプコントロールまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗体（マウス１匹当たり２００μｇ）のいずれかの週に２回の腹腔内送達を伴って、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（２×１０7ｐｆｕ）、もしくは同等量の熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、または生（１×１０7ｐｆｕ）と熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（１×１０7ｐｆｕの同等量）との組み合わせを、右側のより大きな腫瘍に、週に２回腹腔内注射した。
【０１０４】
生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達との組み合わせは、マウス生存期間の有意な改善をもたらした（図８Ｏ、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１対ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳについて、*、Ｐ＝０．０２）。実験の終了時において、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体で処理したマウスの６７％（６／９）で腫瘍が存在せず、一方で、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理したマウスの２２％（２／９）のみで腫瘍が存在しなかった（図８Ｏ）。実験の終了時（ウイルス注射の６７日後）において、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理したマウスの全て（９／９）、生＋熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理したマウスの８９％（８／９）が生存している（図８Ｏ）。これらの結果は、併用療法の環境において、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦまたは生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで誘導された抗腫瘍免疫が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在下でさらに増幅できることをさらに実証した。
【０１０５】
（例１０）
抗ＰＤ−Ｌ１を伴うかまたは伴わずに、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、または抗ＰＤ−Ｌ１を伴う生ＶＣ−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理した生存マウスが、異種腫瘍に対する交差防御免疫を発達させた
本発明者らは、次に、最初のＢ１６−Ｆ１０腫瘍に対する抗ＰＤ−Ｌ１を伴う抗体を伴うかまたは伴わずに、ウイルスによって成功裏に処理された生存マウスが、異種腫瘍、この場合、ＭＣ３８結腸癌細胞に対する交差防御免疫を発達されているかどうかを試験した。この実験は以下の群のマウスを含んだ：（ｉ）生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理した生存マウス（ｎ＝２）、（ｉｉ）生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理された生存マウス（ｎ＝６）、（ｉｉｉ）熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理された生存マウス（ｎ＝７）、（ｉｖ）熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理された生存マウス（ｎ＝９）、（ｖ）生＋熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理された生存マウス（ｎ＝６）、（ｖｉ）生＋熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理された生存マウス（ｎ＝８）、および（ｖｉｉ）腫瘍またはウイルスのいずれにもまったく曝露されていないナイーブマウス（ｎ＝５）。全てのマウスは、致死量のＭＣ３８（１×１０5細胞）の皮下移植によって負荷され、腫瘍サイズを週に２回測定し、マウスの生存を毎日モニターした。本発明者らは、全てのナイーブマウスがＭＣ３８を発達させて３０日間の生存期間中央値の予想された時間で死亡したが、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理された生存マウスの２／２が４２日間の生存期間中央値のより遅い時間に死亡したことを観察した（図９、ｐ＜０．０５、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ対ナイーブマウス）。驚くべきことに、大多数の残りの生存マウスは、腫瘍移植後１００日目においてＭＣ３８負荷を拒絶した（図９）。これらの結果は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を伴うかまたは伴わずに、熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理された生存マウスが、異種腫瘍に対する全身免疫を発達させていることを示す。このような免疫は、以前に生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦで処理されたマウスにおいてより弱かったが、この群には２匹のマウスのみが存在した。さらなる研究は、片側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルにおいて、生ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ対熱処理−ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦによって成功裏に処理されたマウスの数を拡大し、そして、ＭＣ３８、またはＭＢ４９膀胱癌のような別の異種腫瘍に対する交差防御免疫を評価するであろう。
【０１０６】
（例１１）
ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスの腫瘍内注射は、注射されていない腫瘍において、ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の増殖および活性化の点において、ＶＣ−ＴＫ-ウイルスより効果的である
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫における、ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の活性化および増殖をもたらすかどうかを評価するために、６〜８週齢のＣ５７Ｂ／６に対し、２．５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を左側に、５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を右側に皮下移植した。移植後７日で、ＶＣ−ＴＫ-もしくはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（２ｘ１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳを右側のより大きな腫瘍に注射した。注射は３日後に繰り返した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を、最初の注射後７日で採取し、細胞懸濁液を作製した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍に浸潤した生免疫細胞をＦＡＣＳにより解析した。ＰＢＳ処理腫瘍における５１％から、ＶＣ−ＴＫ-処理腫瘍における８１％またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ処理腫瘍における８３％までの注射された腫瘍における、グランザイムＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞の劇的な増加があった（図１０Ａ、１０Ｃ、ｐ＜０．００１、ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。注射されていない腫瘍においても、ＰＢＳ処理されたマウスにおける４８％からＶＣ−ＴＫ-処理されたマウスにおける５４％およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ処理されたマウスにおける７０％までの、グランザイムＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞の増加があった（図１０Ａ、１０Ｃ、ｐ＜０．０５、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。これらの結果は、ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかの腫瘍内注射が注射された腫瘍における増加した活性化ＣＤ８+Ｔ細胞をもたらし、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が注射されていない細胞における有意に増加した活性化ＣＤ８+Ｔ細胞をもたらすが、ＶＣ−ＴＫ-はそうしないことを示す。
【０１０７】
ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかで処理されたマウスからの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍において、ＰＢＳで処理されたものと比較して、ＣＤ４+Ｔ細胞についても同様の変化が観察された。ＰＢＳ処理腫瘍における９％から、ＶＣ−ＴＫ-処理腫瘍における７４％またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ処理腫瘍における７１％まで、グランザイムＢ+ＣＤ４+Ｔ細胞が増加した（図１０Ｂ、１０Ｄ、ｐ＜０．００１、ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。注射されていない腫瘍においても、ＰＢＳ処理されたマウスにおける１１％からＶＣ−ＴＫ-処理されたマウスにおける１３％およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ処理されたマウスにおける３２％までの、グランザイムＢを発現するＣＤ４+Ｔ細胞の増加があった（図１０Ｂ、１０Ｄ、ｐ＜０．０１、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。これらの結果は、ＶＣ−ＴＫ-またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれかの腫瘍内注射が注射された腫瘍における増加した活性化ＣＤ４+Ｔ細胞をもたらし、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が注射されていない腫瘍における増加した活性化ＣＤ４+Ｔ細胞をもたらすが、ＶＣ−ＴＫ-はそうしないことを示す。
【０１０８】
（例１２）
ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３+樹状細胞の増加をもたらす
本発明者らは次に、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において樹状細胞（ＤＣ）の集団を解析した。腫瘍浸潤ＤＣは、ＣＤ４５+Ｌｙ６Ｃ−ＭＨＣ−ＩＩ＋ＣＤ２４hiＦ４／８０lo細胞を特徴とする（Broz et al., Cancer Cell, 2014）。ＣＤ２４hiのＤＣのうち、ＣＤ１１ｂ+のＤＣ（ＤＣ１として知られる）とＣＤ１０３+のＤＣ（ＤＣ２として知られる）の２つのＤＣ集団が存在する。図１１は、これらのＤＣ集団のためのゲーティング戦略を示す。ＣＤ４５+生細胞は、ＭＨＣ−ＩＩの発現に基づいてさらに分離された。ＭＨＣ−ＩＩhi細胞は、ＤＣマーカーＣＤ２４および腫瘍関連マクロファージマーカーＦ４／８０によって染色された。ＣＤ２４hiＦ４／８０lo細胞は、それらのＣＤ１０３およびＣＤ１１ｂ発現に基づいてＣＤ１０３+ＤＣとＣＤ１１ｂ+ＤＣにさらに分離された。
【０１０９】
ＣＤ１０３＋のＤＣは、末梢ＤＣの亜集団であり、抗原の交差提示に特化している。Ｂａｔｆ３は、ＣＤ１０３＋のＤＣの分化に重要な転写因子である。ＣＤ１０３＋のＤＣは、宿主抗腫瘍免疫において重要な役割を果たす。本開示の発明者らは、以前に、Ｂａｔｆ３依存性のＣＤ１０３+のＤＣが不活化ＭＶＡ媒介抗腫瘍効果に必要であることを示している（ＷＯ２０１６／１６８８６２）。ここで、本発明者らは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージを調べた。
【０１１０】
６〜８週齢のＣ５７Ｂ／６に対し、２．５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（２．５ｘ１０5）を左側に、５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を右側に皮下移植した。移植後７日で、熱処理−ＭＶＡ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、もしくはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ（２ｘ１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳを右側のより大きな腫瘍に注射した。注射は３日後に繰り返した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を、最初の注射後７日で採取し、細胞懸濁液を作製した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍に浸潤した生骨髄細胞をＦＡＣＳにより解析した。本発明者らは、熱処理−ＭＶＡ、またはＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージを、ＰＢＳモック処理腫瘍における０．２％から、熱処理−ＭＶＡ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ処理腫瘍における０．０３％、０．０３％、０．０５％、および０．１２％までの低減をもたらすことを観察した（図１２Ａ、Ｐ＜０．０５、熱処理−ＭＶＡ、またはＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ対ＰＢＳ）。注射されていない腫瘍において、熱処理−ＭＶＡ、またはＶＣ−ＴＫ-、またはＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージを、ＰＢＳモック処理マウスにおける０．１５％から、熱処理−ＭＶＡ、ＶＣ−ＴＫ-、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスにおける０．３２％、０．２６％、０．２１％、および０．３９％までの増加をもたらした（図１２Ａ、Ｐ＜０．０５、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。これらの結果は、ＣＤ１０３+のＤＣが、ウイルスの腫瘍内注射の後に、注射された腫瘍におけるＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージの減少を含む動的な変化を経ること、およびＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が注射されていない腫瘍において、ＣＤ４５＋細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージの有意な増加をもたらすことを示す。これらの結果は、ｈＦｌｔ３Ｌが、ＣＤ１０３+のＤＣの分化および増殖に重要な増殖因子であるという理解と一致する。
【０１１１】
注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１１ｂ+のＤＣのパーセンテージもまた調べた。ＶＣ−ＴＫ-の腫瘍内注射が、ＰＢＳ処理腫瘍における０．５％からＶＣ−ＴＫ−処理腫瘍における０．８％まで、ＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１１ｂ+のＤＣのパーセンテージの増加をもたらしたことを見出した（図１２Ｂ、Ｐ＜０．０５、ＶＣ−ＴＫ-対ＰＢＳ）。ウイルスの腫瘍内注射は、注射されていない腫瘍においてＣＤ１１ｂ+のＤＣ集団に影響を与えないように見える（図１２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、反対側の注射されていない腫瘍において、ＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１１ｂ+のＤＣのパーセンテージに影響を与えることなく、ＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージの有意な増加をもたらすことを示す。
【０１１２】
（例１３）
ＶＣ−ＴＫ-の腫瘍内注射は、両側トリプルネガティブ乳癌４Ｔ１腫瘍移植モデルにおいて効果的である
Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫モデルに加えて、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスＶＣ−ＴＫ−の腫瘍内注射がトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）４Ｔ１両側腫瘍移植モデルの処理において効果を有するかどうかを調べた。手短に、４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に２．５×１０5、および左側に５×１０4）。腫瘍移植後５日で、右側のより大きな腫瘍に、ＶＣ−ＴＫ-ウイルス（２×１０7ｐｆｕ）または同等量の熱不活化ＭＶＡのいずれかを週に２回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。マウスの生存をモニターした。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の最初の腫瘍容積を示した（図１３ＡおよびＢ）。処理後１８日の注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の容積を示した（図１３ＣおよびＤ）。ＶＣ−ＴＫ-の腫瘍内注射がＰＢＳ処理腫瘍と比較して、注射された腫瘍の腫瘍容積の劇的な減少をもたらし（図１３Ｃ、Ｐ＜０．０００１、ＶＣ−ＴＫ-対ＰＢＳ）、ＰＢＳ処理マウスと比較した注射されていない腫瘍容積の減少をももたらすことを見出した（図１３Ｄ、Ｐ＜０．０５、ＶＣ−ＴＫ-対ＰＢＳ）。より重要なことに、マウスの平均生存期間は、ＰＢＳ処理マウスにおける１８日からＶＣ−ＴＫ-処理マウスにおける２１日まで延長した（図１３Ｅ、Ｐ＝０．０００１、ＶＣ−ＴＫ-対ＰＢＳ）。ＶＣ−ＴＫ-の抗腫瘍効果は、この両側４Ｔ１腫瘍移植モデルにおける熱処理−ｉＭＶＡと同等である（図１３、Ａ〜Ｅ）。それは、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦが、熱不活化ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦより効果的でないＢ１６−Ｆ１０両側腫瘍移植モデル（図８、Ｃ〜ＦおよびＯ）において本発明者らが観察したものと異なる。これらは、腫瘍亜型および腫瘍微小環境における免疫細胞の集団の相違に関連するかもしれない。さらなる研究は、前立腺癌および膀胱癌モデルを含む他の腫瘍モデルにおいて、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスと不活化ウイルスの有効性を比較するであろう。例６（図８、Ｅ〜Ｈ、Ｍ）で示されるように、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３ＬがＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦより効果的であるので、腫瘍溶解性ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が４Ｔ１マウス乳癌の治療においてもまた効果的であろうと予測された。
【０１１３】
（例１４）
ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射は、大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０片側腫瘍移植モデルにおいて効果的である
本発明者らは、大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０片側腫瘍移植モデルにおいて、複製可能ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射の抗腫瘍効果を熱不活化ＭＶＡ（熱処理−ｉＭＶＡ）と比較した。この実験において、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫（５０μｌの容量中の５×１０5細胞）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚に皮下移植した。移植後９日後、腫瘍サイズを測定し、直径５〜６ｍｍの腫瘍に、週に２回、熱処理−ｉＭＶＡ（５０μｌの容量中、２×１０7ｐｆｕのＭＶＡの同等量）、もしくはＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ（２×１０7ｐｆｕ）、またはＰＢＳを注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射は、腫瘍増殖の遅延、およびさらには処理されたマウスのわずかなパーセンテージにおける腫瘍の根絶の点において効果的であった。それはまた、ＰＢＳ処理マウスにおける６日からＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ処理マウスにおける１７日まで生存期間中央値を延長した（図１４Ａ、Ｃ〜Ｅ、Ｐ＜０．０００１、ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦ対ＰＢＳ）。大きく確立された腫瘍における熱処理−ｉＭＶＡの腫瘍内注射はまた、効果的であり、熱処理−ｉＭＶＡ処理マウスの生存期間中央値は２７日に延長した（図１４、Ｂ、Ｄ、およびＥ）。これらの結果は、片側移植モデルにおいて、腫瘍溶解性ＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射が、大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０の処理に効果的であることを示す。例６（図８、Ｅ〜Ｈ、Ｍ）で示されるように、ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３ＬがＶＣ−ＴＫ-−ｍＧＭ−ＣＳＦより効果的であるので、腫瘍溶解性ＶＣ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が片側移植モデルの大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０の処理においてもまた効果的であろうと予測された。
本明細書において引用される全ての特許および文献は、参照によりその全体を全ての目的に対して組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｈ】
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【図７Ｉ−Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【図８Ｅ−Ｈ】
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【図８Ｉ−Ｌ】
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【図８Ｍ−Ｏ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｃ】
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【図１４Ｄ−Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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