(57)【要約】  収量の増加をもたらす、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドの製造法が提供される。該方法は、宿主内の１つ以上の補助タンパク質の同時増強に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドの生成方法であって、該方法は、ピキア宿主において該ポリペプチドを発現させる工程、及び該ピキア宿主において補助タンパク質ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）の発現を同時に増強させる工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ポリペプチドを単離及び／又は精製する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
緩衝液中でポリペプチドを製剤化する工程をさらに含む、請求項１又は２のいずれかの方法。
【請求項４】
ポリペプチドを医薬組成物として製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドを発現するか又は適切な環境下で発現することのできるピキア宿主であって、ここでは補助タンパク質ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）の発現が増強されている、前記宿主。
【請求項６】
ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が、ピキア宿主に、
−ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸（群）；及び／又は
−ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を制御している１つ以上の強力なプロモーター（群）
の導入によって増強される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は請求項５記載のピキア宿主。
【請求項７】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドと、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質が、同じ遺伝子構築物から発現される、請求項６記載の方法又はピキア宿主。
【請求項８】
ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸が、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の下流の遺伝子構築物上に位置する、請求項７記載の方法又はピキア宿主。
【請求項９】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、同じプロモーターによって制御される、請求項７又は８のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１０】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、異なるプロモーターによって制御される、請求項７又は８のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１１】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質が、異なる遺伝子構築物から発現される、請求項６記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１２】
異なる遺伝子構築物からの、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、同じである別々のプロモーターによって制御される、請求項１１記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１３】
異なる遺伝子構築物からの、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、異なる別々のプロモーターによって制御される、請求項１１記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１４】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか若しくは実質的にからなるポリペプチド及び／又はＨＡＣ１スプライシング型タンパク質が、染色体から発現される、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１５】
ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が、ピキア宿主の染色体への強力なプロモーターの導入によって増強される、請求項１４記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１６】
強力なプロモーターによって制御されるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸が、ピキア宿主の染色体に導入される、請求項１４記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１７】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、ピキア宿主の染色体に導入される、請求項１４記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１８】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）のコピー数が１である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
【請求項１９】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）のコピー数が２又はそれ以上である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
【請求項２０】
ピキア宿主がピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
【請求項２１】
ピキア・パストリス株が、Ｘ３３及びＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０から選択される、請求項２０記載の方法又はピキア宿主。
【請求項２２】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしかつＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）をコードしている核酸。
【請求項２３】
遺伝子構築物の形態である、請求項２２記載の核酸。
【請求項２４】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸と、ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）をコードしている核酸とを含む、遺伝子構築物。
【請求項２５】
ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸が、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の下流に位置する、請求項２４記載の遺伝子構築物。
【請求項２６】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の発現、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現が、同じプロモーターによって制御される、請求項２４又は２５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２７】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の発現、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現が、異なるプロモーターによって制御される、請求項２４又は２５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
【請求項２８】
請求項２４〜２７のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む、請求項５〜２１のいずれかに記載のピキア宿主。
【請求項２９】
１つ以上の追加の補助的タンパク質の発現が増強されている、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３０】
追加の補助的タンパク質が、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、及びＲＰＰ０から選択される、請求項２９記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３１】
補助的タンパク質の数が２である、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３２】
２つの補助的タンパク質が、以下の２つの補助的タンパク質の組合せ：
−ＰＤＩ１（配列番号５）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）
から選択される、請求項３１記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３３】
補助的タンパク質の数が３である、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３４】
３つの補助的タンパク質が、以下の３つの補助的タンパク質の組合せ：
−ＰＤＩ１（配列番号５）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）
から選択される、請求項３３記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３５】
ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）の発現が増強される、請求項２９記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３６】
ポリペプチドが一価ポリペプチドである、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３７】
免疫グロブリン単一可変ドメインが、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になり、ＣＤＲ１は配列番号５８であり、ＣＤＲ２は配列番号６０であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である、請求項１〜３６に記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３８】
免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号５６である、請求項１〜３７に記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項３９】
ポリペプチドが、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された、１つ以上の他の残基又は結合単位をさらに含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４０】
前記の１つ以上の他の残基又は結合単位が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項３９記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４１】
ポリペプチドが多価構築物である、請求項３９又は４０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４２】
ポリペプチドが、二価、三価、又は四価ポリペプチドである、請求項４１記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４３】
前記の１つ以上の他の結合単位が、前記の１つ以上の結合単位を含まないポリペプチドと比較して、延長された半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４４】
延長された半減期を有するポリペプチドを提供する前記の１つ以上の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合することのできる結合単位からなる群より選択される、請求項４３記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４５】
ポリペプチドが、血清アルブミンに結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項４４記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４６】
ポリペプチドがＣ末端伸長Ｘ（ｎ）をさらに含み、ｎは１〜５、例えば１、２、３、４又は５であり、Ｘは天然アミノ酸であり、好ましくはシステインを全く含まない、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４７】
ポリペプチドが配列番号５５を含むか又は実質的にからなる、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４８】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディから選択される、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項４９】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、２つ以上のジスルフィド架橋を含む、請求項４８記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項５０】
１つ以上の結合単位が、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディから選択される、請求項３９〜４９のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項５１】
ナノボディが、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、及びラクダ化重鎖可変ドメインから選択される、請求項４８又は５０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項５２】
ＶＨＨが、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群に属する、請求項５１記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項５３】
ポリペプチドが、標準的なピキア発現条件下でピキア宿主において発現させた場合に得られる収量が、ピキア宿主内の該ポリペプチドをコードしている核酸のコピー数と逆相関を示す、ポリペプチドの群から選択される、請求項１〜５２のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
【請求項５４】
請求項１〜４、６〜２１、又は２９〜５３の方法のいずれかによって得ることのできる、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド。
【請求項５５】
請求項５４のポリペプチドを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの製造法に関する。より具体的には、本発明は、増加した収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメインを生成する改善された方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法に使用するための核酸、遺伝子構築物及び宿主細胞、並びに、本発明の方法によって得ることのできる免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
【０００２】
背景技術
治療的適用のために、抗体又は抗体断片の製品の品質は非常に高くなければならない。これにより、生物学的治療剤の生産プロセスに対して高い要求が課される。これらの治療用化合物の生産費用は、生産プロセス中に遭遇する困難によって強い影響を受ける。低収量又は均一性の欠如は、生産プロセスの経済に影響を及ぼし、したがって、全体的に治療薬の費用に影響を及ぼすだろう。
【０００３】
機能的な製品の適切な収量を得る限界が、インビトロにおける翻訳、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、並びに昆虫細胞におけるバキュロウイルス系をはじめとする広範な発現系における慣用的な免疫グロブリン及びそれらの断片において報告されている。とりわけ、抗体発現における支障は、軽鎖の不十分な供給、小胞体（ＥＲ）における不適切なプロセシング及びフォールディング、並びに重鎖断片の細胞内蓄積であるようである（Lange et al. 2001, J. Immunol. Methods 255: 103; Gasser et al. 2006, Biotechnol Bioeng. 94: 353; Gach et al. 2007, J. Biotechnol. 128: 735; Jenkins et al. 2009, Biotechnol. Appl. Biochem. 53: 73）。
【０００４】
タンパク質のフォールディング及び分泌経路への介入が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）などの組換えタンパク質の発現及び品質を改善させるための様々な戦略の１つとして記載されている。しかしながら、ＥＲ分泌機構の１つ以上の成分の過剰発現により、生産性の向上に関して混合した結果がもたらされた。バイオ医薬品の生産において一貫して高い収量を達成するには多くの課題が依然として存在している（Jenkins et al. 2009, Biotechnol. Appl. Biochem. 53: 73）。
【０００５】
ピキア・パストリスは、異種タンパク質の生成のための宿主として開発された。この宿主は高度に効率的な発現系として知られているが、特に複雑なタンパク質の生成は、かなり低い成功率を示すことが判明した。Ｐ．パストリスでは、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）の共過剰発現により、ｓｃＦｖ（Ａ３３ｓｃＦｖ）の分泌レベルは約３倍増加した。これに対し、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）の共過剰発現は、Ａ３３ｓｃＦｖの分泌に対して明らかな効果を全く及ぼさなかった。Ｐ．パストリスにおけるＢｉＰ及びＰＤＩ１の共過剰発現は、Ａ３３ｓｃＦｖの分泌を増加させず、タンパク質レベルは対照株と依然として同じであった（Damasceno et al. 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74: 381）。対照株と比較して、Ｐ．パストリスにおける２Ｆ５ Ｆａｂ断片の生産性は、ＢＦＲ２との共過剰発現の場合の１．２倍から、ＳＳＥ１又はＫＩＮ２を過剰発現させた場合の２．３倍まで改善させることができた（Gasser et al. 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499）。塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写因子ＨＡＣ１の過剰発現は、Ｐ．パストリスにおけるＭａｂ ２Ｆ５ Ｆａｂ断片の分泌に対して僅かな効果しか及ぼさなかったが（１．３倍）、ＰＤＩ１の過剰発現は、Ｆａｂレベルの１．９倍の増加を可能とした（Gasser et al. 2006, Biotechnol Bioeng. 94: 353）。著者は、十分な軽鎖の供給及び鎖間ジスルフィド結合の形成が、Ｆａｂの会合及びその後の分泌に対する主要な律速因子として認められ得ると結論する。
【０００６】
従来の４本鎖抗体又はその断片（Ｆａｂ及びｓｃＦｖを含む）で観察されるこれらの困難とは対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．パストリスのような宿主から十分な速度及びレベルで容易に発現及び分泌されることが知られている。免疫グロブリン単一可変ドメインは鎖間ジスルフィド架橋を有さず、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合部位の形成によって特徴付けられ、これは抗原の認識のためにさらなるドメインとの相互作用（例えば、ＶＨ／ＶＬ相互作用の形態で）を必要としない。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主における、免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの具体例としてのナノボディの生成が数多く記載されている（例えば、Ghahroudi et al. 1997, FEBS Letters 414: 521-526; Muyldermans 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302; Vranken et al. 2002, Biochemistry 41: 8570-8579を参照）。
【０００７】
Ｐ．パストリスなどの低級真核生物宿主におけるナノボディの生成は、Frenken et al. 2000（J. Biotechnol. 78: 11-21）、国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第２０１０／１２５１８７号、国際公開公報第２０１２／０５６０００号及び国際公開公報第２０１２／１５２８２３号に記載されている。
【０００８】
組換えラクダ単一可変ドメインは、条件を全く最適化することなく、振盪培養フラスコ中で増殖させたＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた場合に５〜１０mg/lのレベルで日常的に得られる（Ghahroudi et al. 1997）。他の発現系を用いても、より高い収量のＶＨＨ発現を得ることが可能でさえある。９．３mg/l/ＯＤ６６０又は振盪フラスコ中のサッカロマイセス酵母培養液１リットルあたり約２５０mgの分泌タンパク質という生成レベルがFrenken et al. 2000によって記載されている。より近年には、Ｐ．パストリスにおける発現時に１リットルあたり１ｇを超えるナノボディの収量が記載されている（国際公開公報第２０１０／１３９８０８号、国際公開公報第２０１２／１５２８２３号）。
【０００９】
国際公開公報第２０１０／１２５１８７号は、酵母（例えばＰ．パストリス）における単一可変ドメインを生成するための方法を記載している。国際公開公報第２０１０／１２５１８７号の方法は、単一可変ドメインにおけるジスルフィド架橋の形成を促進する条件を適用している。提案されている条件の１つは、チオールイソメラーゼ（例えばＰＤＩ１）の発現の増強である。
【００１０】
完全に機能的な免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばＥ．ｃｏｌｉ又は酵母において十分な速度及びレベルで容易に生成されるという事実は、従来の免疫グロブリンを上回る、この免疫グロブリンフォーマットの重要な利点を示す。
【００１１】
発明の要約
ＶＨＨ及びナノボディは、その発現のために当技術分野において記載されている発現系を使用して発現され得るが（国際公開公報第１９９４／２５５９１号; Ghahroudi et al. 1997, FEBS Letters 414: 521-526; Frenken et al. 2000, J. Biotechnol. 78: 11-21; Muyldermans 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302; Vranken et al. 2002, Biochemistry 41: 8570-8579; 国際公開公報第２０１０／１２５１８７号；国際公開公報第２０１２／０５６０００号；国際公開公報第２０１２／１５２８２３号及びAblynx N.V.による他の特許出願）、本発明者らは、場合によっては（例えば、多価ＶＨＨ及びナノボディ、並びに／又は、１つを超えるジスルフィド架橋を有するＶＨＨ及びナノボディ）、ＶＨＨ及びナノボディの発現はより難しく、予想されるよりはるかに低い発現レベル及び／又は収量がもたらされることを発見した。例えば、本発明者らは、いくつかの治療用ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの生成についての問題を意外にも観察した。Ｐ．パストリスにおけるこれらの免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時に、本発明者らは、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインを、ＶＨＨ２型及びＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメインで通常得られる収量と比較してはるかにより低い収量で得た。免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて確立されているものとは対照的に、Ｐ．パストリスにおける、例えばＶＨＨ１型の免疫グロブリン単一可変ドメインなどの特定の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現により、多量の機能的な産物は得られなかった。
【００１２】
本発明者らは、本明細書においてさらに示されているような、この問題に対する解決法を提供した。さらに、本発明者らは、免疫グロブリン単一可変ドメインの収量を改善するために提案された解決法は一般的に適用可能であり、すなわち、ＶＨＨ１型の免疫グロブリン単一可変ドメインの収量を改善させるためだけでなく、他の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ２型及びＶＨＨ３型の免疫グロブリン単一可変ドメインを改善させるためにも適用可能であることを観察した。
【００１３】
したがって、１つの態様では、本発明は、Ｐ．パストリスにおける特定の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時の低い収量の観察に関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、得られる産物の収量が増加する、免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法が提供される。これらの方法は本明細書において「本発明の方法（群）」とも称される。したがって、本発明はまた、この意外な問題を克服する免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法を提供する。より特定すると、本発明者らは（補助タンパク質のライブラリーをスクリーニングすることによって）、ピキア宿主における特定の補助タンパク質（ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）、特にＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４））の発現の増強により、該ピキア宿主において発現させた場合に、免疫グロブリン単一可変ドメインの収量が増加したことを発見した。２倍超から１０倍超（またさらにそれ以上）の収量の増加が得られた。
【００１５】
１つの態様では、それ故、本発明は、ピキア（例えばＰ．パストリス）における免疫グロブリン単一可変ドメインの発現及び／又は生成収量を増加させるための方法に関する。本発明の方法では、免疫グロブリン単一可変ドメインが発現されるが、同時にＨＡＣ１スプライシング型の発現も増強される。
【００１６】
本発明の方法に使用される免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチド（「本発明のポリペプチド」とも称される）の一部を形成し得、これは、１つ以上（すなわち少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ場合により１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含み得る。
【００１７】
したがって、本発明は、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド（本明細書では「本発明のポリペプチド」と称される）を生成するための方法を提供し、該方法は、ピキア宿主において、本発明のポリペプチドを発現させる工程、及び該ピキア宿主においてＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現を増強させる工程を含む。本発明の方法はさらに、本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程を含み得る。
【００１８】
本発明の方法は、ピキア（例えばＰ．パストリス）において容易に発現可能ではないか又は標準的な条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させた場合に非常に低い収量で発現され、そのために、ピキア（例えばＰ．パストリス）において本発明のこれらの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを発現させると、十分な量の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを得ることができない、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドに特に適している。したがって、１つの態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において標準的なピキア発現条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させると、０．５ｇ/ｌ又はそれ以下、例えば０．４ｇ/Ｌ、０．３ｇ/Ｌ、０．２ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ、０．０５ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ、又はさらにはそれ以下の収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドから選択される。別の態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）においてピキア発現条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させた場合に得られる収量が、該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸のコピー数と逆相関（本明細書においてさらに定義されているような）を示す、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドから選択される。
【００１９】
本発明の具体的な態様では、本発明の方法は、Ｐ．パストリスなどのピキアにおいて容易に発現可能である本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドに特に適している。したがって、１つの態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）においてピキア発現条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させると、０．５ｇ/ｌ又はそれ以上、例えば１ｇ/Ｌ、２ｇ/Ｌ、３ｇ/Ｌ、４ｇ/Ｌ、５ｇ/Ｌ、６ｇ/Ｌ、又はさらにはそれより高い収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドから選択される。
【００２０】
上記の方法では、本発明のポリペプチドは、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得る。このようなポリペプチドはまた、多価ポリペプチドとも称される。したがって、具体的な態様では、本発明の方法によって発現しようとする本発明のポリペプチドは、多価ポリペプチドである。
【００２１】
あるいは、本発明の方法によって発現されるポリペプチドは、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得る。このようなポリペプチドは本明細書において、一価ポリペプチドとも称されるだろう。したがって、別の具体的な態様では、本発明の方法によって発現しようとする本発明のポリペプチドは、一価ポリペプチドである。
【００２２】
上記の方法では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）は、軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインである免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン、特にドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又は、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むがこれに限定されない）、好ましくはナノボディであり得る（がこれらに限定されない）。
【００２３】
好ましい態様では、本発明の方法において発現されるナノボディは、ＶＨＨ配列（ＶＨＨ）、（部分的に）ヒト化されたＶＨＨ配列（ヒト化ＶＨＨ）、ラクダ化重鎖可変ドメイン（ラクダ化ＶＨ）、又は親和性成熟などの技術によって得られたナノボディである。
【００２４】
本発明の別の具体的な態様では、本発明の方法において発現される免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）は、少なくとも２つのジスルフィド架橋を含む。別の具体的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群に属する。
【００２５】
別の態様では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）は、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群に属さないが、別の群の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ２、ＶＨＨ３、又は任意の他の型の免疫グロブリン単一可変ドメインに属する。
【００２６】
さらに別の具体的な態様では、本発明の方法において発現される免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）、例えば、国際公開公報第２０１２／０４２０２６号及び国際公開公報第２０１３／０４５７０７号に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する。したがって、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ここでの該免疫グロブリン単一可変ドメインは２つのジスルフィド架橋を含む）を含む本発明のポリペプチドは、本発明の具体的であるが非限定的な態様を形成する。本発明の方法に使用するための特定のナノボディは、配列番号４９である。
【００２７】
好ましい態様では、本発明の方法において発現される１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（群）（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）、例えば、Ablynx NVの米国仮出願ＵＳ６２／２５４，３７５号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７７５９５号も参照）に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＴＮＦに特異的に結合する。
【００２８】
したがって、ＴＮＦに特異的に結合する１つ以上の（少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドは、本発明の具体的かつ非限定的な態様を形成する。
【００２９】
具体的な態様では、本発明の方法において発現される本発明のポリペプチドは、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなる。このようなポリペプチドは本明細書において、一価ポリペプチドとも称されるだろう。それ故、好ましい態様では、本発明の方法において、該ポリペプチドは一価ポリペプチドである。
【００３０】
１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるこのような一価ポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド架橋を含み得る。したがって、ＴＮＦに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインに属する。
【００３１】
あるいは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つのジスルフィド架橋を含む。したがって、好ましい態様では、ＴＮＦに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群には属さないが、別の群の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ２、ＶＨＨ３、又は任意の他の型の免疫グロブリン単一可変ドメインに属する。
【００３２】
好ましい態様では、本発明の方法において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になり、ＣＤＲ１は配列番号５８であり、ＣＤＲ２は配列番号６０であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である。
【００３３】
本発明の方法に使用するための特定のナノボディは、配列番号５５及び５６からなる群より選択される。
【００３４】
１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなる本発明のポリペプチドはさらに、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された、１つ以上の他の残基又は結合単位を含み得る。
【００３５】
１つの態様では、前記の１つ以上の他の残基は、本発明のポリペプチド（本明細書においてさらに記載されているような）に対する血清中にすでに存在している抗体（いわゆる「既存抗体」）の結合を妨げるか又は減少させるのに有効であり得る。
【００３６】
別の態様では、前記の１つ以上の他の残基又は結合単位はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸配列、又はナノボディからなる群より選択され得る。２つ以上の結合単位を含むか又は実質的にからなるポリペプチドも、多価構築物と称される。
【００３７】
本発明の具体的な態様では、本発明の方法において発現される１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドは、多価構築物である。
【００３８】
別の具体的な態様では、本発明のポリペプチドは、二価、三価、又は四価ポリペプチドである。
【００３９】
本発明の特定の態様では、前記の１つ以上の他の結合単位は、前記の１つ以上の結合単位を含まないポリペプチドと比較して延長された半減期を有する本発明のポリペプチドを提供し得る。以下に限定されないが、延長された半減期を有するポリペプチドを提供する前記の１つ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合することのできる結合単位からなる群より選択され得る。
【００４０】
本発明の方法において、ＨＡＣ１スプライシング型の発現は、ピキア宿主への、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸（群）の導入によって増強され得る。別の態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現は、ピキア宿主への、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を制御している１つ以上の強力なプロモーター（群）の導入によって増強され得る。
【００４１】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、同じ遺伝子構築物から発現されてもよい。本発明のこの特定の態様では、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写は、同じプロモーターによって又は異なるプロモーターによって制御され得る。ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の下流の遺伝子構築物上に位置し得る。代替的には、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の下流の遺伝子構築物上に位置し得る。
【００４２】
本発明の別の態様では、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、異なる遺伝子構築物から発現されてもよい。本発明のこの特定の態様では、異なる遺伝子構築物からの、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写は、同じでも異なっていてもよい２つの別々のプロモーターによって制御され得る。
【００４３】
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか若しくは実質的にからなるポリペプチド及び／又はＨＡＣ１スプライシング型タンパク質はまた、染色体から発現され得る。この特定の態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現は、ピキア宿主の染色体への強力なプロモーターの導入によって増強され得る。代替的には、強力なプロモーターによって制御されるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸（群）を、ピキア宿主の染色体に導入してもよい。また、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を、ピキア宿主の染色体に導入してもよい。
【００４４】
本発明の１つの態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）の数は１である。本発明の別の態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）の数は２以上である。
【００４５】
別の態様では、本発明はまた、本発明のポリペプチド（又はその適切な断片）をコードしかつＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸に関する。このような核酸は本明細書において「本発明の核酸」とも称され、例えば、本明細書にさらに記載のような遺伝子構築物の形態であり得る。
【００４６】
したがって、本発明はまた、遺伝子構築物の形態である本発明の核酸に関する。このような遺伝子構築物は本明細書において、「本発明の遺伝子構築物」とも称され、したがって、本発明のポリペプチドをコードしている核酸及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸を含む。具体的な態様では、本発明のこのような遺伝子構築物において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の下流に位置する。別の具体的な態様では、本発明のこのような遺伝子構築物において、本発明のポリペプチドをコードしている核酸は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の下流に位置する。本発明の遺伝子構築物において、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の発現及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現は、同じプロモーターによって又は異なるプロモーターによって制御され得る。該プロモーターは、構成性プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。
【００４７】
本発明の１つの態様では、本発明のポリペプチドをコードしている核酸のコピー数は１である。本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドをコードしている核酸のコピー数は２以上である。
【００４８】
本発明の１つの態様では、補助タンパク質の数は１であり、補助タンパク質はＨＡＣ１スプライシング型である。本発明の別の態様では、１つ以上の補助タンパク質の発現は増強されている。さらに別の本発明の態様では、追加の補助タンパク質（群）は、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、及びＲＰＰ０から選択される。さらに別の本発明の態様では、補助タンパク質の数は２である。さらに別の本発明の態様では、補助タンパク質の数は２つを超え、例えば３つ以上である。さらに別の態様では、２つ以上の補助タンパク質は、以下の補助タンパク質の組合せから選択される：
−ＰＤＩ１及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；並びに
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
【００４９】
好ましい態様では、以下の補助タンパク質の発現が増強される：
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；又は
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、補助タンパク質は、ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）である。
【００５１】
別の好ましい態様では、追加の補助タンパク質は、ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）、及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）から選択される。
【００５２】
別の好ましい態様では、２つ以上の補助タンパク質は、以下の補助タンパク質の組合せから選択される：
−ＰＤＩ１（配列番号５）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＰＤＩ１（配列番号５）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）。
【００５３】
別の態様では、本発明は、本明細書では「本発明のピキア宿主」とも称されるピキア宿主への、本発明の核酸及び遺伝子構築物の導入に関する。プラスミド又はベクターによるピキア宿主の形質転換に加えて、ピキア宿主の染色体の形質転換も、本発明によって包含される。強力な（誘導性）プロモーター（天然補助タンパク質の天然プロモーターの代わりに）を、ピキア宿主の染色体に導入しても；又は、別の（強力な）プロモーターの制御下にある別のコピーの補助タンパク質遺伝子配列を染色体に導入してもよい。
【００５４】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを発現する（又は適切な環境下で発現することができる）（ここでＨＡＣ１スプライシング型の発現は増強されている）；並びに／あるいは、本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物を含有している、ピキア宿主に関する。
【００５５】
好ましい態様では、ピキア宿主はピキア・パストリスである。
【００５６】
別の好ましい態様では、ピキア・パストリス株は、ピキア・パストリスＸ３３及びピキア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０から選択される。
【００５７】
本発明はさらに、本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、及び本発明のピキア宿主の調製法；並びに、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びそれを含むポリペプチドの生成のための、前記の本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、及び本発明のピキア宿主の使用に関する。
【００５８】
本発明はさらに、本明細書に示されたいずれかの方法によって得ることのできるポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメイン、このようなポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含む医薬組成物及び他の組成物、並びに、該ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインの治療的使用、あるいは、該ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインの使用を含む処置法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ナノボディＡを、実施例１．２に記載のように作製された２つの異なるピキアクローンにおいて発現させた。あるピキアクローンは、ゲノム内に１コピーのナノボディＡ発現カセットを含有していた。第二のクローンは、ゲノム内に挿入された１コピーを超えるナノボディＡ発現カセットを含有していた。異なるクローンに由来する等容量の上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で比較した。インタクトなナノボディ産物に対応するバンドに対する相対的な定量のための濃度測定分析を実施した。バンドボリュームの定量は、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥヘルスケア社）を使用して実施された。コピー数と収量との間に逆相関が観察された。
【図２】ナノボディＡ及び補助タンパク質ライブラリーを用いて形質転換されたクローンを、ナノボディＡの改善された発現レベルについて試験した。異なるクローンに由来する等容量の上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で比較した。インタクトなナノボディ産物に対応するバンドに対する相対的な定量のための濃度測定分析を実施した。バンドボリュームの定量は、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥヘルスケア社）を使用して実施された。補助タンパク質を含まないそれらの対応する基準クローン（Ｒｅｆのコピー数＝１及びＲｅｆのコピー数＞１）と比較して、４つのクローン（６Ｈ１、４Ｃ２、５Ａ６、９Ｃ４）が、有意により高いレベルのナノボディＡを振盪フラスコにおいて分泌することが判明した。Ｒｅｆ：ゲノム内に挿入された示されたコピー数のナノボディＡ発現カセットを有する基準クローン。
【図３】補助タンパク質Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０、Ｈａｃ１スプライスバリアント、又はＰＤＩ１の１つを用いて形質転換された１コピーを超えるナノボディＡ発現カセットを有する基準クローンの振盪フラスコにおける発現。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でナノボディの収量を分析し、基準クローン（補助タンパク質を含まない）によるナノボディの収量と比較した。インタクトなナノボディ産物に対応するバンドに対する相対的な定量のための濃度測定分析を実施した。バンドボリュームの定量は、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥヘルスケア社）を使用して実施された。
【００６０】
発明の詳細な説明
定義
特に示されない限り又は定義されない限り、使用される全ての用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al. 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Ausubel et al. 1987 (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York)、Lewin 1985 (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)、Old et al. 1981 (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Ed., University of California Press, Berkeley, CA)、Roitt et al. 2001 (Immunology, 6th Ed., Mosby/Elsevier, Edinburgh)、Roitt et al. 2001（Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed., Blackwell Publishing, UK）、及びJaneway et al. 2005 (Immunobiology, 6th Ed., Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York)、並びに、本明細書に引用されている一般的な背景技術を参照する。
【００６１】
特記されない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術、及び操作を、当業者には明らかであるようなそれ自体公知の方法で実施することができそして実施されている。例えば、ここでも、標準的なハンドブック及び本明細書に記載された一般的な背景技術、並びに、そこに引用されているさらなる文献；並びに、例えば、親和性成熟などのタンパク質工学のための技術、及び免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善させるための他の技術を記載した、以下のレビューPresta 2006 (Adv. Drug Deliv. Rev. 58: 640)、Levin and Weiss 2006 (Mol. Biosyst. 2: 49)、Irving et al. 2001 (J. Immunol. Methods 248: 31)、Schmitz et al. 2000 (Placenta 21 Suppl. A: S106)、Gonzales et al. 2005（Tumour Biol. 26: 31）を参照する。
【００６２】
ヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列が、別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列をそれぞれ「含む」と言われるか、又は、別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列「から実質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列が、それぞれ最初に記載されたヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列に取り込まれていることを意味し得るが、通常、これは一般的に、最初に記載されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がその配列内に、最初に記載された配列がどのように実際に作製されたか又は得られたかに関係なく（これは例えば本明細書に記載の任意の適切な方法により得る）、後者の配列とそれぞれ同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有する、それぞれヌクレオチド残基鎖又はアミノ酸残基鎖を含むことを意味する。非限定的な例を用いて、本発明のポリペプチドが免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言われる場合、これは、免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が本発明のポリペプチド配列に取り込まれたことを意味し得るが、通常、これは一般的に、本発明のポリペプチドがその配列内に、前記の本発明のポリペプチドがどのように作製されたか又は得られたかに関係なく、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含有していることを意味する。また、核酸配列又はヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に記載された核酸配列又はヌクレオチド配列は好ましくは、それが発現産物（例えばポリペプチド）へと発現される場合、後者のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が、該発現産物の一部を形成する（換言すれば、後者のヌクレオチド配列が、最初に記載されたより大きな核酸配列又はヌクレオチド配列と同じ読み枠内にある）ようなものである。
【００６３】
「実質的にからなる」によって、本発明の方法に使用される免疫グロブリン単一可変ドメインが本発明のポリペプチドと正に同じであるか、又は、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端、カルボキシ末端、若しくはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加された、少数のアミノ酸残基、例えば１〜２０個のアミノ酸残基、例えば１〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜６個のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、若しくは６個のアミノ酸残基を有する、本発明のポリペプチドに相当することを意味する。
【００６４】
核酸又はアミノ酸は、例えば、それが得られた反応培地又は培養培地と比較して、それが、通常、前記供給源又は培地中において伴う少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分若しくは巨大分子、又は少なくとも１つの混入物、不純物、若しくはマイナーな成分などから分離されている場合に、「（実質的に）単離された（形態）（に）」あると判断される。特に、核酸又はアミノ酸は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特定すると少なくとも１００倍、及び最大で１０００倍、又はそれ以上精製されている場合に「（実質的に）単離されている」と判断される。「（実質的に）単離された形態に」ある核酸又はアミノ酸は好ましくは、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して決定したところ、実質的に均一である。
【００６５】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／若しくはポリペプチド又は補助タンパク質などのポリペプチド「（の）発現」又は「を発現している」という用語は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物（すなわち、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／若しくはポリペプチド又は補助タンパク質）の合成に使用されるプロセスである。補助タンパク質又はポリペプチド、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなどが、核酸、遺伝子構築物、又は染色体「から発現された」と言う場合、それは、核酸、遺伝子構築物、又は染色体からの情報が機能的遺伝子産物（すなわち、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／若しくはポリペプチド又は補助タンパク質）の合成に使用されるプロセスを通して合成される。タンパク質が「共発現」されたと言われる場合、該タンパク質は同時に発現されている。遺伝子の「発現を増強させること」は、遺伝子産物（例えば補助タンパク質）の産生が、遺伝子発現の増強を伴わない遺伝子産物の産生と比較して増加していることを意味する。さらに説明されているように、特定の遺伝子の発現は、例えば強力なプロモーターなどの適切な制御配列の使用、及び／又は例えばそれぞれの遺伝子のコピー数を増加させることによって遺伝子の量を増加させることを含む、様々な手段によって増強させることができる。
【００６６】
本発明において使用される「収量」という用語は、ピキア宿主において発現させた場合に機能的な形態で産生される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの量に関する。収量は、培地１Ｌ（リットル）あたりの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドのｇ（グラム）として表現される。
【００６７】
免疫グロブリン単一可変ドメイン
特記しない限り、「免疫グロブリン配列」という用語は、本明細書において重鎖抗体を指すために使用されるものであれ又は従来の４本鎖抗体を指すために使用されるものであれ、完全サイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、そのドメイン、又はその断片（抗原結合ドメイン又は断片、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインを含むがこれらに限定されない）の双方を含む一般的な用語として使用される。さらに、本明細書において（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語において）使用される「配列」という用語は、脈絡がさらに限定された解釈が必要としない限り、関連したアミノ酸配列、並びにそれをコードしている核酸配列又はヌクレオチド配列の双方を含むと一般的に理解されるべきである。
【００６８】
「単一可変ドメイン」と互換的に使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在しかつそれによって形成されている、分子であると定義する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成している、「従来の」免疫グロブリン又はそれらの断片（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖなど）とは異なっている。典型的には、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成している。この場合、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与し、すなわち、合計で６つのＣＤＲが、抗原結合部位の形成に関与するだろう。
【００６９】
これに対し、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。
【００７０】
したがって、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位の形成のために少なくとも２つの可変ドメインの相互作用を必要とする従来の免疫グロブリン又はそれらの断片を含まない。しかしながら、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインによって形成されている、従来の免疫グロブリンの断片は含む。
【００７１】
一般的に、単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になるアミノ酸；又は、このようなアミノ酸の任意の適切な断片（よってこれは、通常、ＣＤＲの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基の少なくともいくつかを含有しているだろう）であろう。このような単一可変ドメイン及び断片は最も好ましくは、それらが免疫グロブリンフォールドを含むか又は適切な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができるようなものである。したがって、単一可変ドメインは例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその適切な断片；又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列又はＶＨＨ配列）若しくはその適切な断片を；それが単一の抗原結合単位（すなわち、機能的抗原結合ドメインを形成するために、例えばＶＨ／ＶＬの相互作用を通して、別の可変ドメインと相互作用する必要がある例えば従来の抗体及びｓｃＦｖ断片に存在する可変ドメインの場合のように、単一抗原結合ドメインが、機能的抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないような、単一可変ドメインから実質的になる機能的抗原結合単位）を形成することができる限りにおいて含み得る。
【００７２】
本発明の１つの実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００７３】
例えば、単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメイン（又は、免疫グロブリン単一可変ドメインとして使用するのに適したアミノ酸）は、（単一）ドメイン抗体（又は、（単一）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又は、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）、又はナノボディ（本明細書において定義されているようなものであり、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、又はそのいずれか１つの任意の適切な断片であり得る。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明のために、本明細書に引用されている先行技術、並びに、欧州特許第０３６８６８４号も参照する。「ｄＡｂ」という用語については、例えば、Ward et al. 1989 (Nature 341: 544)、Holt et al. 2003（Trends Biotechnol. 21: 484）、並びに、例えば国際公開公報第０４／０６８８２０号、国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号、及び、Domantis Ltdの他の公開された特許出願を参照する。また、それらは哺乳動物起源ではないので、本発明の脈絡においてあまり好ましくはないが、単一可変ドメインは、特定の種のサメに由来してもよいことが注記されるべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開公報第０５／１８６２９号を参照）。
【００７４】
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（本明細書に定義されているような）又はその適切な断片であり得る。［注記：ナノボディ、ナノボディーズ及びナノクローンは、Ablynx N.V.の登録商標である］。ナノボディの一般的な説明については、本明細書に引用されている、例えば国際公開公報第０８／０２００７９号（１６頁）に記載されている先行技術を参照する。
【００７５】
免疫グロブリン配列、特にナノボディのアミノ酸配列及び構造は、しかしながらそれに限定されないが、当技術分野において及び本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」すなわち「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」すなわち「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」すなわち「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」すなわち「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」から構成されると考えられ得；該フレームワーク領域は、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」すなわち「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」すなわち「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」すなわち「ＣＤＲ３」と称される３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」によって中断されている。
【００７６】
ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０の領域内であり得、好ましくは１１２〜１１５であり、最も好ましくは１１３である。しかしながら、ナノボディの部分、断片、類似体、又は誘導体（本明細書にさらに記載されているような）は、このような部分、断片、類似体、又は誘導体が、本明細書に概略が示されているさらなる必要条件を満たし、かつまた好ましくは本明細書に記載の目的に適している限り、それらの長さ及び／又はサイズに関して特に限定されない。
【００７７】
ＶＨＨ及びナノボディのさらなる説明のために、Muyldermans 2001（Rev. Mol. Biotechnol. 74: 277）によるレビュー記事、並びに、一般的な背景技術として記載されている以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開公報第９４／０４６７８号、国際公開公報第９５／０４０７９号及び国際公開公報第９６／３４１０３号；ユニリーバ社の国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第９９／３７６８１号、国際公開公報第００／４０９６８号、国際公開公報第００／４３５０７号、国際公開公報第００／６５０５７号、国際公開公報第０１／４０３１０号、国際公開公報第０１/４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号、及び国際公開公報第０２／４８１９３号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)の国際公開公報第９７／４９８０５号、国際公開公報第０１／２１８１７号、国際公開公報第０３／０３５６９４号、国際公開公報第０３／０５４０１６号、及び国際公開公報第０３／０５５５２７号；Algonomics N.V.及びAblynx N.V.の国際公開公報第０３／０５０５３１号；カナダ国立研究機関による国際公開公報第０１／９０１９０号；the Institute of Antibodiesによる国際公開公報第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号）；並びに、Ablynx N.V.による国際公開公報第０４／０４１８６７号、国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第０４／０４１８６５号、国際公開公報第０４／０４１８６３号、国際公開公報第０４／０６２５５１号、国際公開公報第０５／０４４８５８号、国際公開公報第０６／４０１５３号、国際公開公報第０６／０７９３７２号、国際公開公報第０６／１２２７８６号、国際公開公報第０６／１２２７８７号及び国際公開公報第０６／１２２８２５号、並びにAblynx N.V.によるさらに他の公開された特許出願を参照する。また、これらの出願に記載のさらに他の先行技術、特に国際出願の国際公開公報第０６／０４０１５３号の４１〜４３頁に記載の文献のリストを参照し、このリスト及び文献は、参照により本明細書に組み入れられる。これらの文献に記載のように、ナノボディ（特にＶＨＨ及び部分的にヒト化されたナノボディ）は特に、１つ以上のフレームワーク配列内の１つ以上の「特徴的な残基」の存在によって特徴付けられ得る。ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化、並びに、他の修飾、部分又は断片、誘導体、又は「ナノボディ融合体」、多価構築物（いくつかの非限定的なリンカー配列の例を含む）及びナノボディの半減期を延長させるための様々な修飾、並びにそれらの調製をはじめとする、ナノボディのさらなる説明が、例えば、国際公開公報第０８／１０１９８５号及び国際公開公報第０８／１４２１６４号に見い出され得る。
【００７８】
したがって、本発明の意味において、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」という用語は、ヒト以外の供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。それらは、以前に記載されているようにヒト化されていてもよい。さらに、該用語は、例えばDavies and Riechmann 1994 (FEBS 339: 285)、1995（Biotechonol. 13: 475）及び1996（Prot. Eng. 9: 531）並びにRiechmann and Muyldermans 1999（J. Immunol. Methods 231: 25）に記載のような、「ラクダ化」されている、ラクダ以外の供給源、例えばマウス又はヒトに由来するポリペプチドも含む。
【００７９】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、及びラクダの免疫グロブリン配列を含む、様々な起源の免疫グロブリン配列を包含する。それはまた、完全なヒト免疫グロブリン配列、ヒト化免疫グロブリン配列、又はキメラ免疫グロブリン配列も含む。例えば、それは、ラクダ免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、又はラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばWard et al（例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号並びにDavies and Riechmann 1994、1995及び1996を参照）によって記載のようなラクダ化ｄＡｂを含む。
【００８０】
本発明は、本明細書に記載のいずれかの免疫グロブリン単一可変ドメインの発現又は産生のために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリペプチド（すなわち、このような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド）の発現又は産生のために使用され得る。特定の態様では、本発明は、２つのジスルフィド架橋を含む免疫グロブリン単一可変ドメインの発現又は産生のために使用され得る。本発明はまた、２つのジスルフィド架橋を有する本発明のポリペプチド（すなわち、このような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド）の発現又は産生のために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリペプチド（すなわち、２つのジスルフィド架橋を有するこのような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド）の発現又は産生のために使用され得る。
【００８１】
全てのＶＨＨは、２２位のシステイン残基と、９２位のシステイン残基との間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含有していることが知られている（番号付けはＫａｂａｔによる、Ablynx N.V.の特許出願及びMuyldermans and Lauwereys 1999, J. Mol. Recognit. 12: 131を参照）。大半のＶＨＨはこの単一のジスルフィド架橋しか含有していないが、いくつかのＶＨＨは、合計で２つの（又は例外の場合には３つの）ジスルフィド架橋を含有していることが知られている。例えば、「ＶＨＨ−１型」、「ＶＨＨ−１クラス」又はその他（本明細書においてさらに定義されているような）と称されるＶＨＨ（及びナノボディ）のクラスは一般的に、ＣＤＲ２内の５０位のシステイン残基と、ＣＤＲ３内（又は例外的な場合には、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２内）に存在するシステイン残基との間に第二のジスルフィド架橋を有する。また、ラクダ又はヒトコブラクダ由来のいくつかのＶＨＨは、ＣＤＲ１内（又はＦＲ２内の４５位）に存在するシステイン残基と、ＣＤＲ３内に存在するシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有することが多い（Vu et al. 1997, Mol. Immunol. 34: 1121; Muyldermans and Lauwereys 1999）。ラマに由来するいくつかのＶＨＨは時に、ＣＤＲ１内（例えば３３位）に存在するシステイン残基と、ＣＤＲ３内に存在するシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有する（Vu et al., 1997）。
【００８２】
１つの具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク領域の１つにあるシステイン残基と、ＣＤＲ領域の１つにあるシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００８３】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク領域の１つにあるシステイン残基と、ＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００８４】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク２（ＦＲ２）内のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００８５】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク２（ＦＲ２）内の４５位のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラクダ及びヒトコブラクダに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
【００８６】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、１つのＣＤＲ内のシステイン残基と別のＣＤＲ内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００８７】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ３内のシステイン残基と別のＣＤＲ内（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマに由来するいくつかのＶＨＨのように、特にＣＤＲ１内）のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００８８】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ１内のシステイン残基と別のＣＤＲ内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００８９】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ１内のシステイン残基とＣＤＲ１内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００９０】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ１内のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
【００９１】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、３３位のシステインとＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
【００９２】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ２内のシステイン残基と別のＣＤＲ内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００９３】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ２内のシステイン残基とＣＤＲ２内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
【００９４】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ２内のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラマに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
【００９５】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、５０位のシステイン残基と別のＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ＶＨＨ１型のＶＨＨ及びナノボディのように）。
【００９６】
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、５０位のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ＶＨＨ１型のＶＨＨ及びナノボディのように）。
【００９７】
好ましいが非限定的な実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」であり得る。例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドなどのアミノ酸は、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン又はＶＨＨ１型配列が、ＶＨＨ１共通配列（配列番号４６）：
【化１】
2019507748.tif 000002
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有しかつ必修的に５０位にシステインを、すなわちＣｙｓ５０（Ｋａｂａｔの番号付けを使用して）を有する場合に、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ１型配列」であると言われる。これらのＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインは一般的に、Ｃｙｓ５０と、ＣＤＲ３内（又は例外的な場合にはＣＤＲ１又はＣＤＲ２内）のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有する（又は形成することができる）。
【００９８】
アミノ酸配列、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、ＶＨＨ２型免疫グロブリン単一可変ドメイン又はＶＨＨ２型配列が、ＶＨＨ２共通配列（配列番号４７）：
【化２】
2019507748.tif 000003
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有する場合に、「ＶＨＨ２型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ２型配列」であると言われる。
【００９９】
アミノ酸配列、例えば本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、ＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメイン又はＶＨＨ３型配列が、ＶＨＨ３共通配列（配列番号４８）：
【化３】
2019507748.tif 000004
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有する場合に、「ＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ３型配列」であると言われる。
【０１００】
本発明は、ＶＨＨ１（ここでは２つのジスルフィド架橋の存在が非常に一般的である）の発現に特に適しているが、本発明はまたＶＨＨ２又はＶＨＨ３（これは２つのジスルフィド架橋を含んでいても含んでいなくてもよいが、これはあまり一般的ではない）の発現にも適用することができることが注記されるべきである。
【０１０１】
一般的な説明について、及びｃ−Ｍｅｔに対して指向されかつ本明細書に記載の方法を使用して発現／産生され得るナノボディ（及びそれを含むポリペプチド）のいくつかの非限定的な例については、国際公開公報第２０１２／０４２０２６号及び国際公開公報第２０１３／０４５７０７号を参照する。
【０１０２】
一般的な説明については、及びＴＮＦに対して指向されかつ本明細書に記載の方法を使用して発現／産生され得るナノボディ（及びそれを含むポリペプチド）のいくつかの非限定的な例については、Ablynx NVの米国仮出願のＵＳ６２／２５４，３７５号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７７５９５号も参照）を参照する。
【０１０３】
本発明者らはまた、この教義が、ＶＨＨ−１などの２つ以上のジスルフィド架橋を有するＶＨＨ及びナノボディに特に適用可能であるだけでなく、２つ以上のジスルフィド架橋を含む他の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、（単一）ドメイン抗体、ｄＡｂ、サメ由来のＩｇＮＡＲドメインなど）にも適用可能であると予期する。
【０１０４】
本発明のポリペプチド
本発明の方法で調製された免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つ以上の（少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ、場合により１つ以上のさらなるアミノ酸配列をさらに含み得る（全てが場合により１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）、タンパク質又はポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド」と称される）の一部を形成し得る。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語はまた、このような本発明のポリペプチドも包含し得る。１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、このようなタンパク質又はポリペプチドにおいて結合単位として使用されてもよく、これは場合により、結合単位としての役目を果たし得る１つ以上のさらなるアミノ酸を含有していてもよく、これにより、それぞれ本発明の一価、多価、又は多重特異的なポリペプチドが提供される（１つ以上のＶＨＨドメインを含有している多価及び多重特異的なポリペプチド並びにそれらの調製については、Conrath et al. 2001（J. Biol. Chem. 276: 7346）並びに例えば国際公開公報第９６／３４１０３号、国際公開公報第９９／２３２２１号及び国際公開公報第２０１０／１１５９９８号も参照する）。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、上記に概略が示されているような、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得る。このようなポリペプチドは本明細書において一価ポリペプチドとも称される。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、上記に概略が示されているような、単一可変ドメインの形態の、２つ以上の抗原結合部位を含む構築物も包含し得る。例えば、同じ又は異なる抗原特異性を有する２つ（又はそれ以上）の免疫グロブリン単一可変ドメインを連結させることにより、例えば二価、三価、又は多価の構築物を形成することができる。２つ以上の特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを組み合わせることによって、二重特異的、三重特異的などの構築物を形成することができる。例えば、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じ標的に対して指向される２つ若しくは３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は、標的Ａに対して指向される１つ若しくは２つの免疫グロブリン単一可変ドメインと標的Ｂに対して指向される１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。当業者が容易に想像することのできるこのような構築物及びその改変は、本明細書に使用されるような本発明のポリペプチドという用語によって全て包含される。
【０１０７】
さらに、本発明の方法で、タグ又は他の機能的な部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む、融合させた免疫グロブリン配列も調製される。
【０１０８】
別の態様では、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（又はその適切な断片）を含むか又は実質的にからなる本発明のポリペプチドは、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含み得る。このようなさらなる基、残基、部分、結合単位、又はアミノ酸配列は、免疫グロブリン単一可変ドメインに（及び／又はそれが存在するポリペプチドに）さらなる機能を提供しても提供しなくてもよく、免疫グロブリン単一可変ドメインの特性を改変しても改変しなくてもよい。
【０１０９】
例えば、このようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、１つ以上の追加のアミノ酸であり得、よって該化合物、構築物、又はポリペプチドは、（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドである。好ましいが非限定的な態様では、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、免疫グロブリンである。さらにより好ましくは、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸、又はナノボディからなる群より選択される。
【０１１０】
あるいは、このような基、残基、部分、又は結合単位は、例えば、それ自体が生物学的に及び／又は薬理学的に活性であってもなくてもよい、化学基、残基、部分であり得る。例えばであって限定するものではないが、このような基を１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインに連結させることにより、免疫グロブリン単一可変ドメインの「誘導体」を提供し得る。
【０１１１】
好ましいが非限定的な態様では、前記のさらなる残基は、本発明のポリペプチドに対するいわゆる「既存抗体」の結合を妨げるか又は減少させるのに有効であり得る。この目的のために、本発明のポリペプチド及び構築物は、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（ここで、ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４、又は５（好ましくは１又は２、例えば１）であり；各Ｘは、独立して選択された、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）又はイソロイシン（Ｉ）からなる群より独立して選択された（好ましくは天然）アミノ酸残基である）を含有し得、これは、全て題名が「Improved immunoglobulin variable domains」である以下の同時係属中の米国仮出願：２０１４年５月１６日に出願された米国特許第６１／９９４５５２号、；２０１４年６月１８日に出願された米国特許第６１／０１４，０１５号；２０１４年８月２１日に出願された米国特許第６２／０４０，１６７号；及び２０１４年９月８日に出願された米国特許第６２／０４７，５６０号（全てAblynx N.V.に帰属する）並びにこれらの仮出願に基づきかつ２０１５年１１月１９日に公開された国際出願の国際公開公報第２０１５／１７３３２５号を参照する。
【０１１２】
したがって、本発明の方法において、前記ポリペプチドはさらに、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（ここで、ｎは１〜５、例えば１、２、３、４、又は５であり、Ｘは、天然アミノ酸であり、好ましくはシステインを全く含まない）を含み得る。
【０１１３】
好ましい態様では、本発明の方法において発現される本発明のポリペプチドは、配列番号５５を含むか又は実質的にからなる。特定の態様では、このようなポリペプチドは配列番号５５からなる。
【０１１４】
上記のポリペプチドにおいて、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つ以上の基、残基、部分、又は結合単位を、互いに直接及び／又は１つ以上の適切なリンカー若しくはスペーサーを介して連結させ得る。例えば、１つ以上の基、残基、部分、又は結合単位がアミノ酸である場合、リンカーもアミノ酸であってもよく、よって得られたポリペプチドは融合タンパク質又は融合ポリペプチドである。
【０１１５】
本発明の１つの具体的な態様では、対応する免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して延長された半減期を有する本発明のポリペプチドが調製される。例えばこのような半減期を延長させる部分を含む本発明のポリペプチドとしては、免疫グロブリン単一可変ドメインが１つ以上の血清タンパク質若しくはその断片（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適切な断片）に、又は、血清タンパク質に結合することのできる１つ以上の結合単位に適切に連結されているポリペプチド（例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、又は血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）若しくはトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合することのできるナノボディ）；免疫グロブリン単一可変ドメインがＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）又はその適切な部分若しくは断片に連結されているポリペプチド；又は、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（群）が、血清タンパク質（例えば、国際公開公報第９１／０１７４３号、国際公開公報第０１／４５７４６号、又は国際公開公報第０２／０７６４８９号に記載のタンパク質及びペプチであるがこれらに限定されない）に結合することのできる１つ以上の小型タンパク質若しくはペプチドに適切に連結されているポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１６】
一般的に、延長された半減期を有する本発明のポリペプチドは好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド単独での半減期の、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超である半減期を有する。
【０１１７】
好ましいが非限定的な態様では、このような本発明のポリペプチドは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド単独と比較して、１時間以上、好ましくは２時間以上、より好ましくは６時間以上、例えば１２時間以上、又はさらには２４、４８、若しくは７２時間以上延長された血清中半減期を有する。
【０１１８】
別の好ましいが非限定的な態様では、このような本発明のポリペプチドは、ヒトにおいて少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日間（例えば約５〜１０日間）、好ましくは少なくとも９日間（例えば約９〜１４日間）、より好ましくは少なくとも約１０日間（例えば約１０〜１５日間）、又は少なくとも約１１日間（例えば約１１〜１６日間）、より好ましくは少なくとも約１２日間（例えば約１２〜１８日間又はそれ以上）、又は１４日間以上（例えば約１４〜１９日間）の半減期を有し得る。
【０１１９】
本発明の方法は、Ｐ．パストリスなどのピキアにおいて容易に発現可能ではないか、又はこれらの宿主での使用に適用可能な発現条件下で発現させた場合に非常に低い収量であり、そのために、Ｐ．パストリスなどのピキアにおいて本発明のこれらの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを発現させると十分な量を得ることができない、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに特に適している。したがって、本発明の方法は、標準的なピキア発現条件下（本明細書において定義されているような）でピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において発現させると低い収量が得られる、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに特に適している。本発明に使用される「低い収量」は、得られる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量が、０．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、例えば０．４ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．３ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．２ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．１ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．０５ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．０１ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、又はさらに低い［培地１Ｌ（リットル）あたりの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドのｇ（グラム）として表現される］ことを意味する。
【０１２０】
本発明の方法はまた、標準的なピキア発現条件下（本明細書において定義されているような）でピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において発現させた場合に得られる収量が、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸のコピー数とは逆相関（本明細書において定義されているような）を示す、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドに特に適している。「逆相関」を示す収量とは、得られる該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量が、該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている１コピーを超える核酸を有するピキア宿主において該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを（本明細書に定義されているような標準的なピキア発現条件下で）発現させた場合に得られる該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量よりも、該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている１コピーの核酸を有するピキア宿主において該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを（本明細書に定義されているような標準的なピキア発現条件下で）発現させた場合の方がより高いことを意味する。
【０１２１】
本発明の方法に使用するのに好ましいポリペプチドとしては、配列番号４９〜５４が挙げられる。この配列はまた、本発明の別々の態様を形成する。したがって、本発明はまた、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、又は５６を有するポリペプチドにも関する。
【０１２２】
本発明の方法に使用するのに特に好ましい他のポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）（ここで、ＣＤＲ１は配列番号５８であり、ＣＤＲ２は配列番号６０であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である）から実質的になる免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号５５又は５６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなる。
【０１２３】
補助タンパク質
本明細書において使用する「補助タンパク質」という用語は、他の分子構造及び／又はタンパク質が、それらの生物学的機能を遂行する際に支援するが、これらの他の分子構造及び／又はタンパク質がそれらの通常の生物学的機能を遂行する時に、それ自体はこれらの他の分子構造及び／又はタンパク質の構造には出現しない、タンパク質を指す。補助タンパク質は、例えば、他の分子構造及び／又はタンパク質の、生物物理学的特性、薬理学的特性、及び／又は発現特性を改変し得る。以下に限定されないが、補助タンパク質は、他の分子構造及び／又はタンパク質を安定化させ得（例えば複合体の形成を通して）、それらは、他の分子構造及び／又はタンパク質の活性を調節し得、それらは他の分子構造及び／又はタンパク質の（表面）発現を増加させ得、並びに／あるいは、それらはフォールディング及び／又は会合を支援し得る。
【０１２４】
その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質は、機能的ＨＡＣ１タンパク質である。ＨＡＣ１タンパク質は、任意の種を起源とし得るが、好ましくは酵母起源、最も好ましくはサッカロマイセス由来の酵母、例えばサッカロマイセス属、コマガタエラ属（Komagataella）又はピキア（ハンゼヌラ）属由来の酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリスである。具体的な態様では、機能的ＨＡＣ１タンパク質は「ＨＡＣ１スプライシング型」又は「ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質」である（両用語は本明細書において互換的に使用される）。ＨＡＣ１スプライシング型は、Guerfal et al. 2010（Microbial Cell Factories 9: 49）に記載のようなＨＡＣ１ ｍＲＮＡ上でのスプライシング事象（イントロンの除去）後に得られたＨＡＣ１タンパク質である。より具体的な態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、ピキア起源である。好ましい態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、Guerfal et al. 2010（Microbial Cell Factories 9: 49；配列番号１４）に記載のような配列を有する。
【０１２５】
本発明の方法では、ＨＡＣ１タンパク質に加えて、場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１；ＥＣ５．３．４．１）、Ｋａｒ２ｐ及び保存リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）から選択された１つ以上の追加の補助タンパク質の発現が増強される。ピキア宿主におけるそれらの発現の増強が、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの増加した収量を与える限り、これらの補助タンパク質はどのような種を起源としていてもよい。好ましい態様では、補助タンパク質は、真菌、例えば酵母；好ましくはサッカロマイセス由来の酵母、例えばサッカロマイセス属、コマガタエラ属、又はピキア（ハンゼヌラ）属に由来する酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリスを起源とする。
【０１２６】
好ましい態様では、補助タンパク質は、以下：
−Ｐ．パストリスのＨＡＣ１スプライシング型
【化４】
2019507748.tif 000005
及び場合により、以下の１つ以上：
−Ｐ．パストリスのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）：
【化５】
2019507748.tif 000006
−Ｐ．パストリスのＫａｒ２ｐ：
【化６】
2019507748.tif 000007
及び
−Ｐ．パストリスの６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）：
【化７】
2019507748.tif 000008
から選択される。
【０１２７】
本発明の方法
本発明は、ピキア宿主において免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドを発現及び／又は産生するための方法に関する。本発明の方法では、ピキア宿主におけるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強される。本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸（群）の発現を増強させる工程；
場合により続いて；
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程。
【０１２８】
したがって、本発明の方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
【０１２９】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現を産生するために／得るために、形質転換されたピキア宿主は一般的に、本発明の（所望の）免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが発現されるような／産生されるような条件下で保持、維持、及び／又は培養され得る。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用されるピキア宿主株、並びに、本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節配列に依存するだろう。
【０１３０】
一般的に、適切な条件としては、適切な培地の使用、適切な食物源及び／又は適切な栄養分の存在、適切な温度の使用、並びに場合により適切な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列（群）が誘導性プロモーターの制御下にある場合）が挙げられ得；これらは全て、当業者によって選択され得る。ここでも、このような条件下、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、構成的に発現されても、一過性に発現されても、又は適切に誘導された場合にのみ発現されてもよい。
【０１３１】
ピキアにおける異種タンパク質の組換え産生のための培養条件は、例えば、Higgins and Cregg 1998（Eds, Methods in Molecular Biology, Pichia protocols, Volume 103, 2nd Ed., Humana Press）によって及びインビトロジェン（商標）（インビトロジェン（商標）ピキア発現キット；ピキア・パストリスにおける組換えタンパク質の発現用；カタログ番号Ｋ１７１０−０１）によって記載されている。Ｐ．パストリスにおける免疫グロブリン単一可変ドメインの産生は、国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第２０１０／１２５１８７号、国際公開公報第２０１２／０５６０００号及び国際公開公報第２０１２／１５２８２３号に数多く記載されている。これらの文献の内容を、適切な培地及び条件をはじめとする一般的な培養技術及び方法に関連させてはっきりと言及する。これらの文書の内容は参照により組み込まれる。本発明はまた、当技術分野において記載されている具体的な条件、例えば国際公開公報第９４／２５５９１号、Gasser et al. 2006 (Biotechnol. Bioeng. 94: 535)；Gasser et al. 2007（Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499）、又はDamasceno et al. 2007（Microbiol. Biotechnol. 74: 381）に記載の一般的な培養法にも関する。
【０１３２】
ピキア、特にＰ．パストリスは、典型的には、炭素源としてグリセロールを使用して３０℃の流加発酵で培養される。このような培地は一般的には、緩衝剤、グリセロール、微量元素及び水酸化アンモニウムを含む。緩衝剤の例としては、Ｈ３ＰＯ４、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及びＫＯＨが挙げられる（がこれらに限定されない）。一般的な増殖培地（例えば基礎塩類培地）は、（１Ｌあたり）２６．７mLの８５％Ｈ３ＰＯ４、０．９３ｇのＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、１８．２ｇのＫ２ＳＯ４、１４．９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．１３ｇのＫＯＨ、４０ｇのグリセロール、２mLの微量元素［６g/Lの硫酸銅・５Ｈ２Ｏ；０．８ｇ/Ｌのヨウ化カリウム；３ｇ/Ｌの硫酸マンガン・Ｈ２Ｏ；０．２ｇ/Ｌのモリブデン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ；０．２ｇ/Ｌのホウ酸；０．５ｇ/Ｌの硫酸銅；２０ｇ/Ｌの塩化亜鉛；６５ｇ/Ｌの硫酸鉄・７Ｈ２Ｏ；０．２ｇ/Ｌのビオチン、及び５mLの濃硫酸から構成される］からなる。水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）は、ｐＨの調節のために（例えばｐＨ５）及び窒素源として使用される。流加培養期間中に、グリセロール（例えば５０％ｖ／ｖ）を数時間かけて例えば１５mL/Ｌ/ｈのフィード速度でフィードする。ＡＯＸ１プロモーターを使用して、本発明の所望の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている関心対象の遺伝子の発現を駆動する。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現は、４〜１０mL/Ｌ/ｈ（例えば４mL/Ｌ/ｈ）のメタノールフィード速度で３０℃で実施される。これらの条件は本明細書において「標準的なピキア発現条件」とも称される。
【０１３３】
補助タンパク質の発現は、例えば強力なプロモーターなどの適切な制御配列の使用、及び／又は例えばそれぞれの遺伝子のコピー数を増加させることによって遺伝子の量を増加させることを含む、一般的に知られている手段によって増強させることができる。コピー数は、例えば、補助タンパク質の発現に適した遺伝子構築物（プラスミド又はベクター）を導入することによって増加させることができる。プラスミド又はベクターの追加の存在は、総コピー数を増加させるだろう。さらに、ピキア宿主ゲノムとは独立して増幅し得かつピキア宿主内に複数のコピーで存在する遺伝子構築物を使用してもよい。例えば、ピキア宿主細胞内に５〜５０のコピー数のマルチコピープラスミド又はベクターが存在し得る。
【０１３４】
プラスミド又はベクターによるピキア宿主の形質転換に加えて、ピキア宿主の染色体の形質転換も本発明に包含される。強力な（誘導性）プロモーター（天然補助タンパク質の天然プロモーターの代わりに）を宿主の染色体に導入しても；又は、別の（強力な）プロモーターの制御下にある別のコピーの補助タンパク質遺伝子配列を染色体に導入してもよい。当業者は、補助タンパク質の発現を増強させる多くの可能性を知っており、それらは全て本発明によって包含される。
【０１３５】
補助タンパク質（群）並びに本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、同じ又は異なる核酸から発現され得る。２つ以上のタンパク質の共発現は、同じ遺伝子構築物（プラスミド又はベクター又は宿主の染色体に組み込まれた）上の２つ以上のタンパク質の発現によって；又は、異なる遺伝子構築物（プラスミド又はベクター又は宿主の染色体に組み込まれた）上の２つ以上のタンパク質の発現によって達成され得る。
【０１３６】
同じ遺伝子構築物上で発現される場合、前記の２つ以上のタンパク質をコードしている核酸は好ましくは互いに隣に位置する。前記の２つ以上のタンパク質をコードしている核酸の転写は、１つのプロモーター（両方の遺伝子の前に位置する）によって制御されても；又は、前記の２つ以上のうち１つのタンパク質をコードしているそれぞれの核酸は、同じ又は異なるプロモーターであり得る、別々のプロモーターによって制御されていてもよい。
【０１３７】
異なる遺伝子構築物から発現される場合、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の転写、及び１つ以上の補助タンパク質（群）をコードしている核酸の転写は、同じでも異なっていてもよい２つの別々のプロモーターによって制御されていてもよい。
【０１３８】
前記プロモーターは構成性プロモーターでも誘導性プロモーターでもよい。好ましい態様では、該プロモーターは誘導性プロモーターである。
【０１３９】
その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質の数は１（ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）であっても、又は、１つを超えていても、例えば２、３、４、５、若しくはそれ以上であってもよい。好ましい態様では、その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質の数は１（ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）である。
【０１４０】
別の好ましい態様では、その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質の数は２、３、４、又はさらにはそれ以上である。この好ましい態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現は増強され、さらに１つ以上の追加の補助タンパク質の発現が増強される。追加の補助タンパク質は、当技術分野において利用可能及び／又は公知である任意の補助タンパク質であり得る。好ましくは、追加の補助タンパク質は、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０のいずれかから選択される。
【０１４１】
したがって、本発明の方法には、ピキア宿主における免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの発現及び／又は産生も包含され、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された１つ以上の追加の補助タンパク質の発現が増強される。したがって、本発明はまた、以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現させる工程；
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された補助タンパク質をコードしている１つ、２つ、３つ（又はそれ以上）の核酸の発現とを増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む方法にも関する。
【０１４２】
具体的な態様では、本発明の方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された補助タンパク質をコードしている１つ、２つ、３つ（又はそれ以上）の核酸の発現とを増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
【０１４３】
したがって、本発明の方法のこの特定の態様では、以下の補助タンパク質（群）の組合せが増強され得る：
−ＰＤＩ１及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；並びに
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
【０１４４】
補助タンパク質の数が２つ以上である場合、補助タンパク質は、１つのプラスミド若しくはベクター上での２つ以上の補助タンパク質の発現などの、同じ遺伝子構築物の作用によって；又は、異なるプラスミド若しくはベクター上での２つ以上の補助タンパク質の発現によって発現され得る。プラスミド又はベクターによるピキア宿主の形質転換に加えて、ピキア宿主の染色体の形質転換も本発明に包含される。強力な（誘導性）プロモーター（天然補助タンパク質の天然プロモーターの代わりに）を、ピキア宿主の染色体に導入しても；別の（強力な）プロモーターの制御下にある別のコピーの補助タンパク質遺伝子配列を染色体に導入してもよい。同じ遺伝子構築物上で発現される場合、２つ以上の補助タンパク質は、同じプロモーターによって制御されても異なるプロモーターによって制御されてもよい。異なる遺伝子構築物から発現される場合、２つ以上の補助タンパク質は、同じであっても異なっていてもよい２つの別々のプロモーターによって制御され得る。該プロモーターは構成性プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよい。
【０１４５】
上記の方法の使用によって、本発明者らは、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドで時々観察される意外にも低い収量を増加させることができた。低い収量は、２つのジスルフィド架橋を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインである免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）、及び／又は、標準的なピキア発現条件下でピキア宿主において発現させた場合に得られる収量が、該免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）をコードしている核酸のコピー数と逆相関を示す、免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）において特に観察された。
【０１４６】
したがって、本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法も提供し、これは以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む。
【０１４７】
したがって、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
【０１４８】
好ましい態様では、本発明の方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
【０１４９】
したがって、好ましい態様では、本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法も提供し、これは以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
【０１５０】
したがって、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
【０１５１】
別の好ましい態様では、本発明の方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
【０１５２】
したがって、別の好ましい態様では、本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法も提供し、これは以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
【０１５３】
したがって、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
【０１５４】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは細胞外で産生され、ピキア宿主細胞が培養された培地から単離される。
【０１５５】
通常であって必ずしもではないが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを周辺質へと指向させる少なくとも１つの輸送シグナルを有するだろう。本発明において、ピキア宿主は、日常的な手段によって培養培地から除去され得る。例えば、ピキア宿主は、遠心分離又はろ過によって除去され得る。培養培地からのピキア宿主の除去によって得られた溶液は培養上清又は清澄化された培養上清とも称される。
【０１５６】
また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、（まず）未成熟形（上記のような）で生成され得、次いで、使用されるピキア宿主に応じて翻訳後修飾にかけられ得ることが当業者には明らかであろう。また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ここでもまた使用されるピキア宿主細胞に応じてグリコシル化されていてもよい。
【０１５７】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、続いて、ピキア宿主から、及び／又は該ピキア宿主が培養された培地から、標準的な方法によって単離され得る。標準的な方法としては、クロマトグラフィー法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法は、単独で、あるいは、他の精製法、例えば分別沈降技術、ゲル電気泳動、親和性技術（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに融合させた特異的で切断可能なアミノ酸配列を使用して）及び／又は免疫学的分取技術（すなわち、単離しようとする本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに対する抗体を使用して）と組み合わせて実施され得る。当業者は、一般的な知識に基づいて免疫グロブリン単一可変ドメインについての適切な精製法の組合せを考案することができる。具体例については本明細書に引用された技術を参照する。
【０１５８】
免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドは、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの組合せによって培養上清から精製され得る。あらゆる「精製工程」への言及は、これらの特定の方法を含むがこれらに限定されない。より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドは、清澄化された上清（遠心分離によって得られた）をプロテインＡ樹脂上に捕捉し；続いて、ＳＯＵＲＣＥ１５Ｓ（ＧＥヘルスケア社）陽イオン交換クロマトグラフィー工程及びスーパーデックス７５（ＧＥヘルスケア社）サイズ排除クロマトグラフィー工程にかけるプロセスを使用して、培養上清から精製され得る。
【０１５９】
ピキア宿主の除去後、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを、多種多様な適切な緩衝液中に存在させ得る。例としては、ＰＢＳ、トリス−ＨＣｌ、ヒスチジン又はリン酸緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを生理食塩水中に存在させてもよい。
【０１６０】
一般的には、薬学的使用のために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又は補助剤と、場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物とを含む、医薬調製物又は医薬組成物として製剤化され得る。非限定的な例を用いて、このような製剤は、経口投与、非経口投与（例えば静脈内注射、筋肉内注射、若しくは皮下注射、又は静脈内点滴による）、局所投与、吸入による、皮膚パッチによる、埋込剤による、坐剤による投与などに適した剤形であり得る。このような適した投与剤形（これは、投与法に応じて、固形、半固形、又は液体形であり得る）並びにその調製に使用するための方法及び担体は当業者には明らかであろう。
【０１６１】
本発明の核酸及び遺伝子構築物
本発明はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型をコードしている核酸に関する。これらの核酸は本明細書において「本発明の核酸（群）」とも称される。
【０１６２】
本発明の核酸は、当業者には明らかであろうように、遺伝子構築物の形態であり得、遺伝子構築物中に存在し得、及び／又は遺伝子構築物の一部であり得る。このような遺伝子構築物は一般的に、それ自体公知である遺伝子構築物の１つ以上の配列、例えば１つ以上の適切な制御配列（例えば適切なプロモーター（群）、エンハンサー（群）、終結因子（群）など）及び本明細書に言及されている遺伝子構築物のさらに他の配列などに場合により連結されている、少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は本明細書において、「本発明の遺伝子構築物（群）」とも称される。したがって、本発明の遺伝子構築物は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型を少なくともコードしている。
【０１６３】
本発明の核酸（群）及び遺伝子構築物（群）によってコードされる補助タンパク質の数は１（すなわちＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）であっても、又は、１つを超えてもよく、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、若しくはそれ以上であってもよい。好ましい態様では、本発明の核酸及び遺伝子構築物によってコードされる補助タンパク質の数は１（すなわちＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）である。別の好ましい態様では、本発明の核酸（群）及び遺伝子構築物（群）によってコードされる補助タンパク質の数は、２又はそれ以上である。
【０１６４】
したがって、本発明はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドと、２つ以上の補助タンパク質（ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質を含む）とをコードしている核酸又は遺伝子構築物を包含する。
【０１６５】
上記に考察されているように、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びに補助タンパク質（群）は、１つの単一の核酸及び／又は遺伝子構築物から共発現されても；あるいは、異なる（別々の）核酸及び／又は遺伝子構築物（おそらく、宿主の染色体からの発現も含む）から共発現されてもよい。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている、並びに／あるいは補助タンパク質（群）をコードしている（１つの構築物として又は別々の構築物として）、これら全ての核酸及び／又は遺伝子構築物は、「本発明の核酸（群）」及び「本発明の遺伝子構築物（群）」という用語に包含される。
【０１６６】
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、ピキア宿主細胞における発現に特に適応させたコドン使用頻度を有するＤＮＡなど）であり得る。
【０１６７】
本発明の１つの実施態様によると、本発明の核酸は、本明細書において定義されているような実質的に単離された形態である。本発明の核酸はまた、例えばプラスミド、コスミド、若しくはＹＡＣなどのベクターの形態であり得るか、該ベクター内に存在し得るか、及び／又は該ベクターの一部であり得、これはここでも実質的に単離された形態であり得る。
【０１６８】
本発明の核酸は、発現させようとする免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びに共発現のために使用される補助タンパク質（群）に関する情報に基づいて、それ自体公知である方法で調製することができるか又は得ることができる。また、当業者には明らかであろうように、本発明の核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列を、例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列を、補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列と、適切な方法で互いに連結させてもよい。
【０１６９】
本発明の核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、例えば、これには自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然配列及び／又は合成配列（又は２つ以上のその部分）の組合せ、切断短縮された発現産物の発現をもたらす突然変異の導入、１つ以上の制限酵素部位の導入（例えば適切な制限酵素を使用して容易に消化及び／又は連結させ得るカセット及び／又は領域を作り出すために）、並びに／あるいは、１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応を用いての突然変異の導入、が挙げられるがこれらに限定されない。これらの技術及び他の技術は当業者には明らかであり、ここでも、標準的なハンドブック、例えば本明細書に記載されているSambrook et al. and Ausubel et al.及び以下の実施例を参照する。
【０１７０】
本発明の遺伝子構築物はＤＮＡ又はＲＮＡであり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、ピキア宿主の形質転換に適した形態、ピキア宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みに適した形態、あるいはピキア宿主における独立的な複製、維持及び／又は遺伝に適した形態であり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えばプラスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンの形態であり得る。特に、該ベクターは、発現ベクター、すなわちピキア宿主において発現を与え得るベクターであり得る。
【０１７１】
好ましいが非限定的な実施態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）以下のｂ）に作動可能に接続された少なくとも１つの本発明の核酸、
ｂ）１つ以上の制御配列、例えばプロモーター及び場合により適切な終結因子；
及び場合によりまた
ｃ）それ自体公知である遺伝子構築物の１つ以上のさらなる配列
を含み、「制御配列」、「プロモーター」、「終結因子」及び「作動可能に接続された」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し（本明細書にさらに記載されているように）；遺伝子構築物に存在する前記の「さらなる配列」は、例えば、３’−若しくは５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進若しくは増加させ得る配列であり得る。このような遺伝子構築物のためのこれらの配列及び他の適切な配列は当業者には明らかであり、これは例えば、使用される構築物の種類、ピキア宿主株、関心対象の本発明のヌクレオチド配列を発現させようとする様式（例えば、構成的発現、一過的発現、又は誘導的発現を介して）、及び／又は使用しようとする形質転換技術に依存する。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現及び産生のためのそれ自体公知である制御配列、プロモーター、及び終結因子は、実質的に同じような様式で使用され得る。
【０１７２】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、前記の少なくとも１つの本発明の核酸及び前記の制御配列、及び場合により前記の１つ以上のさらなる配列は、互いに「作動可能に連結」され、これにより、それらは互いに機能的な関係にあることを一般的に意味する。例えば、プロモーターは、該プロモーターがコード配列の転写及び／又は発現を開始又は別様に制御／調節することができる場合に（該コード配列は、該プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）、コード配列に「作動可能に連結されている」と判断される。一般的に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結されている場合、それらは同じ方向であり、通常、同じ読み枠内にある。それらはまた通常、実質的に連続的であるが、これもまた要求されるわけでなない。本発明の１つの態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、補助タンパク質（群）をコードしているヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。それらは、同じプロモーターの制御下にあっても、又はそれらは各々、別々の（同じ又は異なる）プロモーターの制御下にあってもよい。
【０１７３】
発現のための核酸配列を設計、作製、若しくは得る方法、適切なベクターを構築し、核酸配列を該ベクターに挿入し、適切なピキア宿主株を選択し、該ベクターを該ピキア宿主株に導入し、ポリペプチド若しくはタンパク質の発現を引き起こすか若しくは可能とし、該ピキア宿主株から核酸を単離するか、又は核酸配列及び対応するタンパク質配列を同定する方法は、当技術分野における通常の技能を有する当業者には誰にも周知である標準的な方法（Sambrook et al. 1989）である。当業者はまた、一般的な知識に基づいて、ピキア宿主において本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現させるのに適した遺伝子構築物を考案することができる。本発明はまた、当技術分野において記載されている遺伝子構築物、例えば、国際公開公報第９４／２５５９１号、Cereghino and Cregg 2000 (Curr. Opinion Biotechnol. 10: 422)、Gasser et al. 2006 (Biotechnol. Bioeng. 94: 535)、Gasser et al. 2007（Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499）又はDamasceno et al. 2007（Microbiol. Biotechnol. 74: 381）に記載のプラスミド、プロモーター、及びリーダー配列にも言及する。
【０１７４】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の制御配列及びさらなる配列は、それらが、ピキア宿主においてその目的とする生物学的機能を与えることができるようなものである。
【０１７５】
例えば、プロモーター、エンハンサー、又は終結因子は、ピキア宿主において「作動可能」であるべきであり、これにより、（例えば）該プロモーターは、それが作動可能に連結されている（本明細書において定義されているように）ヌクレオチド配列、例えばコード配列の転写及び／又は発現を開始又は別様に制御／調節することができるはずであることを意味する。
【０１７６】
適切なプロモーター、終結因子、及びさらなる配列のいくつかの好ましいが非限定的な例としては、ピキア宿主における発現に使用することができるもの；特に、本明細書に記載されているもの及び／又は以下の実施例に使用されているものが挙げられる。
【０１７７】
いくつかの特に好ましいプロモーターとしては、ピキア宿主における発現のためにそれ自体公知であるプロモーター；特に、本明細書に記載されているもの及び／又は実施例に使用されているものが挙げられる。プロモーターの具体的な配列は、プロモーターの強度を決定する（「強力なプロモーター」は、高い転写開始率をもたらす）。補助タンパク質をコードしている核酸の発現が「強力なプロモーター」によって制御されていると言われる場合、それは、該補助タンパク質をコードしている核酸の発現が、天然補助タンパク質の転写開始を制御する天然プロモーターよりも高い転写開始率をもたらすプロモーターによって制御されていることを意味する。転写を「促進する」配列に加えて、プロモーターは、プロモーターの強度を制御するオペレーターとして知られる追加の配列を含み得る。例えば、プロモーターは、プロモーターへのＲＮＡの結合を誘引又は妨害するタンパク質の結合部位を含み得る。このタンパク質の有無は、プロモーターの強度に影響を及ぼすだろう。このようなプロモーターは、調節プロモーターとして知られている。
【０１７８】
Ｐ．パストリスのアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターは、知られている中で最も強力で最も調節されているプロモーターの１つである。逆に、Ｐ．パストリスの第二のアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ２）は、はるかに弱いプロモーターによって制御されている。Ｐ．パストリスのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターは、グルコース培地、グリセロール培地、及びメタノール培地上で恒常的に高いレベルの発現を与える（Waterham et al. 1997, Gene 186: 37）。Ｐ．パストリスのホルミルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモーターは、メタノール又はメチルアミンのいずれかによって誘導され得、その発現レベルはメタノール中でＡＯＸ１プロモーターを用いて得られたのと同等である（Shen et al. 1998, Gene 216: 93）。ペルオキシン８（ＰＥＸ８）プロモーターはグルコース上で低い発現を与え、細胞をメタノールに変更すると中程度に（約１０倍）誘導される（Johnson et al. 1999, Genetics 151: 1379）。
【０１７９】
ハンゼヌラ・ポリモルファ（H.polymorpha）における強力なプロモーターは、メタノールオキシダーゼ遺伝子（ＭＯＸ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＭＤ）、及びジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＨＡＳ）に由来する配列を含む（Song et al. 2006, Biotechnol. Lett. 25: 1999）。ハンゼヌラ・ポリモルファにおける、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ１）プロモーター（Sohn et al. 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 800）及びＰＭＡ１プロモーター（Cox et al. 2000, Yeast 16: 1191）は、構成的配列である。ＰＭＡ１プロモーターは、高い発現レベルのためにＭＯＸプロモーターと競合する。
【０１８０】
ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）のアルコールオキシダーゼ（ＡＵＧ１）プロモーターであるＰ（ＭＯＤ１）及びＰ（ＭＯＤ２）は、メタノール（Ｐ（ＭＯＤ１）及びＰ（ＭＯＤ２））及びグリセロール（Ｐ（ＭＯＤ１）のみ）によって強力かつ堅固に調節される（Nakagawa et al. 2006, Yeast 23: 15）。
【０１８１】
カンジダ・ボイディニイ（C.boidinii）由来の強力なプロモーターとしては、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）プロモーター及びジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）プロモーターが挙げられる（Yurimoto et al. 2000, Biochim. Biophys. Acta 1493: 56）。ＤＡＳ１プロモーター及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターのどちらも、カンジダ・ボイディニイ（Sakai et al. 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 860; 1996, Biochim. Biophys. Acta 1308: 81）及びハンゼヌラ・ポリモルファ（Hollenberg and Gellissen 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 554）において利用可能である。
【０１８２】
選択マーカーは、それが、すなわち適切な選択条件下で、本発明の核酸を用いて（成功裡に）形質転換されているピキア宿主細胞を、（成功裡に）形質転換されなかったピキア宿主細胞と区別することを可能とするようなものであるべきである。このようなマーカーのいくつかの好ましいが非限定的な例は、抗生物質（例えば、ゼオシン、ブラストサイジン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、フレオマイシン、カナマイシン、又はアンピシリンなど）に対する抵抗性を与える遺伝子、温度に対する抵抗性を与える遺伝子、あるいは、ピキア宿主が、形質転換されていない細胞の生存にとって必須である培地中の特定の因子、化合物及び／又は（食物）成分の非存在下で維持されることを可能とする遺伝子である。
【０１８３】
リーダー配列は、ピキア宿主において、それが所望の翻訳後修飾及び／又は該細胞からの発現産物の分泌を可能とするようなものであるべきである。したがって、リーダー配列は、ピキア宿主において作動可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であり得る。しかしながら、通常であって必ずしもではないが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はタンパク質を周辺質へと指向させる少なくとも１つの輸送シグナルを有するだろう。例えば、抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現及び産生のためのそれ自体公知であるリーダー配列は、実質的に同じような方法で使用され得る。
【０１８４】
いくつかの好ましいが非限定的な分泌配列としては、サッカロマイセス・セレビシエ由来のα−接合因子シグナル配列、Ｐ．パストリス由来の酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列、Ｐ．パストリス由来のホスファターゼ（ｐｈｏ１）リーダー配列、酵母インベルターゼの分泌シグナル（Ｓｕｃ）、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド、シュワニオミセス・オクシデンタリス（S. occidentalis）由来のＧＡＭ１シグナル配列、及びヨーロッパミドリガニ（Carcinus maenas）由来の高血糖ホルモン（ＣＨＨ）配列などが挙げられる。
【０１８５】
当業者はまた、ゲノムシークエンス実験から導かれた予測されたシグナルペプチドの使用を想定し得る。これらの予測されたシグナルペプチド配列は任意の種を起源とし得るが、好ましくは酵母起源であり、最も好ましくはサッカロマイセス由来の酵母、例えばサッカロマイセス属、コマガタエラ属、又はピキア属（ハンゼヌラ）由来の酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリスに由来する。Ｐ．パストリス由来のいくつかの好ましいが非限定的な予測されるシグナルペプチドは、De Schutter et al. 2009（Nature Biotech 27(6): 561-566）に記載されている。免疫グロブリン単一可変ドメインの生成のためのこのような予測されるシグナルペプチドの使用については、国際公開公報第２０１２／１５２８２３号をさらに参照する。
【０１８６】
また、生成される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの特性を改善するために、公知の又は予測される分泌配列を改変してもよい。このような改変は、例えば、プロセシング効率を改善することによって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの純度を改善し得る。プロセシング効率の改善のためのα−接合因子シグナル配列の改変は、例えば国際公開公報第２０１２／１５２８２３号に記載されている。
【０１８７】
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、ピキア宿主において、それが遺伝子構築物（上に存在する遺伝子配列又はヌクレオチド配列）の発現の検出を可能とするようなものであるべきである。このようなレポーター遺伝子はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドとのタンパク質融合体として発現されてもよい。いくつかの好ましいが非限定的な例としては、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ及びルシフェラーゼＬＵＣ）が挙げられる。
【０１８８】
本発明の遺伝子構築物は一般的に、例えば上記のSambrook et al.及びAusubel et al.などの一般的なハンドブックに記載された技術を使用して、上記の１つ以上のさらなる配列に、本発明の核酸及び／又はヌクレオチド配列（群）を適切に連結させることによって提供され得る。
【０１８９】
しばしば、本発明の遺伝子構築物は、それ自体公知である適切な（発現）ベクターに本発明の核酸配列又はヌクレオチド配列を挿入することによって得られるだろう。適切な発現ベクターのいくつかの好ましいが非限定的な例は、以下の実施例に使用されたもの、並びに、本明細書に記載されているものである。
【０１９０】
本発明の遺伝子構築物に使用するためのいくつかの好ましいが非限定的なベクターとしては、酵母又は他の真菌細胞における発現のためのベクター、例えばｐＹＥＳ２（インビトロジェン社）、ｐＵＲ３５１５及びｐＵＲ３５０１（Sierkstra et al. 1991, Curr. Genet. 19: 81）、並びにピキア発現ベクター、例えば（以下に限定されないが）Ｐ．パストリスにおける発現のためのｐＰＩＣＺベクター、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ６ａ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、インビトロジェン社によって提供されたＰ．メタノリカにおける発現のためのｐＭＥＴ、ｐＭＥＴαが挙げられる。ピキア発現ベクターの網羅的ではないリストについては、Daly and Hearn 2004 (J. Mol. Recognition 18: 119)、ピキアプロトコール2007（Ed. Cregg, 2nd Ed., Humana Press, NJ）及びGelissen 2000（Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741）も参照する。
【０１９１】
また本発明には、補助タンパク質遺伝子（群）並びに／あるいは本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、適切なベクターにクローニングする工程を含む、本発明の核酸及び遺伝子構築物の調製法が包含される。
【０１９２】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物を使用して、すなわち本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現及び／又は産生のために、ピキア宿主を形質転換し得る。ピキア宿主を形質転換するのに適した技術は当業者には明らかであろう。ここでも、上記のハンドブック及び特許出願を参照する。形質転換手順に関するより詳しいことについては、インビトロジェン社のＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）ピキア発現マニュアル、Wu and Letchworth 2004（BioTechniques 36: 152）、ピキアプロトコール2007（Ed. Cregg, 2nd Ed., Humana Press, NJ）及びFaber 1994（Curr. Genet. 25: 305）を参照する。形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物を用いて成功裡に形質転換されたピキア宿主細胞を検出及び選択するための工程を実施し得る。これは例えば、本発明の遺伝子構築物に存在する選択マーカーに基づいた選択工程、又は、例えば特異的抗体を使用した本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であり得る。
【０１９３】
したがって、本発明はさらに、本発明の遺伝子構築物又は核酸を含む、ピキア宿主細胞の調製に関する。当業者は、本発明の核酸又は遺伝子構築物をピキア宿主に日常的な措置によって、例えば形質転換によって導入することができる。次いで、当業者は、例えば補助タンパク質の発現を核酸レベル及び／又はタンパク質レベルでモニタリングすることによって、核酸又は遺伝子構築物を含む適切なピキア宿主細胞を選択することができる。満足できる発現レベルを有する株が選択されるだろう。高い発現の補助タンパク質が望ましいが、しかしながら、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現と競合するほど高いものであるべきではない。これは日常的な方法によって決定され得る。
【０１９４】
形質転換されたピキア宿主細胞（これは、安定な細胞系の形態であり得る）は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１９５】
ピキア宿主
したがって、本発明はまた、上記のようなこのような遺伝子構築物又は核酸を含むピキア宿主にも関する。「ピキア宿主」及び「ピキア宿主細胞」という用語は互換的に使用され、球状、楕円形、又は長方形の尖鋭形細胞を有するサッカロマイセス科ピキア属（ハンゼヌラ及びヒフォピキア（Hyphopichia）は廃れた同義語である）の酵母を指す。ピキアはテレオモルフであり、有性生殖中に帽子形状、半球状、又は円形の子嚢胞子を形成する。いくつかのピキア種の無性世代はカンジダ種である。無性生殖は多側方性出芽による。
【０１９６】
本発明は、ピキア宿主に関するがこれに限定されず、ただしそれらは免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの産生に適したものである。本発明の目的のために、「ピキア宿主」という用語はまた、ハンゼヌラ種及びカンジダ種も含む。
【０１９７】
本発明のピキア宿主は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型タンパク質、並びに場合により１つ以上の追加の補助タンパク質（群）、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）、Ｋａｒ２ｐ又は保存リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）を産生することができるだろう。それは典型的には、それが本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を含むように、かつＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されるように、遺伝子的に改変されているだろう。遺伝子的改変の非限定的な例としては、例えばプラスミド若しくはベクターを用いての形質転換、又はウイルスベクターを用いての形質導入が挙げられる。いくつかの宿主は、融合技術によって遺伝子的に改変されてもよい。遺伝子的改変としては、宿主への別々の核酸分子、例えばプラスミド又はベクターの導入、並びに、例えば宿主の染色体への組み込みによる、例えば相同的組換えによる宿主の遺伝子材料の直接的改変が挙げられる。しばしば、両方の組合せが起こり、例えば宿主をプラスミドを用いて形質転換すると、このプラスミドは、相同的組換えにより（少なくとも部分的に）宿主の染色体に組み込まれるだろう。当業者は、宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを産生することを可能とする、宿主の適切な遺伝子的改変法を知っている。
【０１９８】
適切なピキア宿主は当業者には明らかであり、これは、例えばピキア、ハンゼヌラ、又はカンジダ、例えばメタノトローフ酵母、例えばピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ハンゼヌラ・ポリモルファ（ピキア・アングスタ（Pichia angusta））及びカンジダ・ボイディニイが挙げられるがこれらに限定されない酵母であり得る。ピキア株の網羅的ではないリストについては、例えば、Gelissen 2000（Appl. Microbiol. Biotechno. 54: 741）を参照する。限定するものではないが、Ｐ．パストリス株は、Daly and Hearn 2004（J. Mol. Recognition, 18: 119）及びピキアプロトコール2007（Ed. Cregg, 2nd Ed., Humana Press, NJ）に列挙されている。Ｐ．パストリス株の例としては、インビトロジェン社によって提供され、Cereghino and Cregg 2004（FEMS Microbiol. Rev. 24: 45)）によって、Macauley-Patrick et al. 2005（Yeast 22: 249）及び／又はDamasceno et al. 2007 （Appl. Microbiol. Biotechno. 74: 381）によって記載された、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６３、ＳＭＤ１１６５、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０、ＧＳ２００が挙げられる（がこれらに限定されない）。
【０１９９】
ハンゼヌラ・ポリモルファ株の例としては、Ａ１６（Veale et al. 1992, Yeast 8: 361）、ＧＦ１６（Faber 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12985）、ＣＢＳ４７３２（ＣＣＹ３８−２２−２；ＡＴＣＣ３４４３８、ＮＲＲＬ−Ｙ−５４４５）、ＤＬ−１（ＮＲＲＬ−Ｙ−７５６０；ＡＴＣＣ２６０１２）、及びＮＣＹＣ４９５株（ＣＢＳ１９７６；ＡＴＡＡ１４７５４、ＮＲＬＬ−Ｙ−１７９８）が挙げられる（がこれらに限定されない）。
【０２００】
Ｐ．メタノリカ株の例としては、インビトロジェン社によって提供されたＰＭＡＤ１１及びＰＭＡＤ１６が挙げられる（がこれらに限定されない）。Ｐ．メタノリカ株（ＩＡＭ１２９０１及びＩＡＭ１２４８１）及びＣ．ボイディニイ株（ＩＡＭ１２８７５）が、Nakagawa et al. 1996（J. Fermentation Bioeng. 81: 498）によって記載されている。
【０２０１】
また、本明細書において上記に引用された一般的な背景技術、並びに、例えば国際公開公報第９４／２９４５７号、Frenken et al. 1998（Res. Immunol. 149: 589）、van der Linden 2000（J. Biotechnol. 80: 261）、Joosten et al. 2003（Microb. Cell Fact. 2: 1）及び本明細書に引用されたさらなる文献も参照する。
【０２０２】
工業的規模での生産について、免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するタンパク質治療薬の（工業的）生産のために好ましい異種宿主としては、大規模な発現／生産／発酵、特に大規模な医薬品の発現／生産／発酵に適している、ピキア・パストリス株が挙げられる。このような株の適切な例は当業者には明らかであろう。このような株及び産生／発現系もまた、アビシア・バイオロジクス社（ビリンガム、ノース・イースト・イングランド、英国）、バイオミーバ有限会社（ハイデルベルク、ドイツ）、PharmedArtis有限会社（アーヘン、ドイツ）、Richter-Helm社（ハンブルク、ドイツ）、及びＣＭＣバイオロジクス社（コペンハーゲン、デンマーク）などの会社によって入手可能となっている。
【０２０３】
本発明はまた、本発明のピキア宿主細胞のさらに他の世代、後代、及び／又は子孫も含み、これは例えば細胞分裂によって得ることができる。
【０２０４】
医薬調製物
本発明はまた、本明細書に記載のような本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドにも関する。
【０２０５】
したがって、本発明はまた、本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを含む、医薬調製物及び他の組成物にも関する。本発明はまた、本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの医療使用にも関する。
【０２０６】
当業者は、一般的な知識に基づいて薬学的に適切な製剤を容易に製剤化することができる。さらに、本明細書に引用されている、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はナノボディを特に扱う文献を明示的に参照する。限定するものではないが、鼻腔内、口腔内、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、膣内、直腸適用、局所適用、又は吸入による適用のための製剤を含む、標準的な適用経路用の製剤が調製され得る。
【０２０７】
本発明に基づいて、当業者は、本発明の方法によって得ることのできる治療有効量の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの使用によって特徴付けられる、適切な処置法を容易に考案することもできる。
【０２０８】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これは決してさらなる限定と捉えられるべきではない。本出願全体を通して引用された全ての文献（参考文献、交付済み特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全内容が、特に本明細書で上記に参照された教義について、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２０９】
実施例
実験章は、ピキア・パストリスにおける一価及び多価の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時に、驚くべきことに低い収量が観察されたことを記載する。本発明者らはまた、１コピーを超える発現カセットがＰ．パストリスのゲノム内に存在する場合には収量はさらに減少することを観察した。また、ＨＡＣ１スプライシング型の発現を増強させることによって、該免疫グロブリン単一可変ドメインの発現収量を増加させるための方法も記載する。
【０２１０】
実施例１：ピキア・パストリスにおけるナノボディの発現を増加させる、補助タンパク質の同定
１．１  発現ベクターの構築
国際公開公報第２０１３／０４５７０７号に配列番号７として以前に記載されたナノボディＡは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＡにおけるＮ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ｃ−Ｍｅｔへの結合に特異的であるが、Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは９Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＡの配列（配列番号４９）は表Ａ−１に示されている。ナノボディＡは、Ｐ．パストリスにおいて発酵させると非常に低い収量（０．２ｇ/Ｌ又はそれ以下）をもたらすことが以前に示された。
【０２１１】
ナノボディＡのコード情報を含有しているＤＮＡ断片を、ブラストサイジン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有するピキア発現ベクター（ｐＰＩＣ６ａの誘導体、インビトロジェン社）のマルチクローニングサイトに、ナノボディ配列がａＭＦシグナルペプチド配列の下流かつ読み枠内となるようにクローニングした。ゲノム内に１コピー数を超える発現カセットを有するピキアクローンを生成するために、ピキア発現ベクター内の独特なＢｇｌＩＩ部位を使用して、ナノボディＡの第二の発現カセットを導入した。
【０２１２】
表Ａ−２に示される補助タンパク質のコード配列を、ゼオシン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有しているピキア発現ベクター（ｐＰＩＣＺａの誘導体、インビトロジェン社）に（制限酵素のＢｓｔＢＩ及びＮｏｔＩを使用して）クローニングした。そのコード配列内にＢｓｔＢＩ部位を含有している補助タンパク質を、制限酵素のＡｆｅＩ及びＮｏｔＩを使用してクローニングした。ｐＰＩＣ６ａ及びｐＰＩＣＺａベクター内のナノボディ及び補助タンパク質は両方共に、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下にあった。
【０２１３】
１．２  ナノボディコード配列の形質転換、並びにピキア宿主における該ナノボディの発現及び分泌
野生型ピキアＸ３３の形質転換及び発現研究を、標準的な技術によって及び「User manual for pPicZalphaA, B and C」（バージョンＤ、１１０８０１、マニュアル部分の番号２５−０１４８：インビトロジェン社）及びMethods in Molecular Biology 2007（Humana Press Inc.）に従って実施した。まず、Ｐ．パストリス株を、ナノボディＡの単一の又は２つの発現カセットを有する適切な発現ベクターを用いて形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。多くの個々のコロニーをｑＰＣＲによって特徴付けることにより、ゲノムに組み込まれた１コピーの発現ベクターを有するクローン、及びゲノムに組み込まれた１コピーを超えるの発現カセットを有するクローンを選択した。ナノボディの発現及び培地中への分泌を確認した（図１）。
【０２１４】
１．３  補助タンパク質コード配列の形質転換、並びにピキア・パストリスにおけるナノボディの発現及び分泌
一旦、適切なナノボディを発現しているコロニーが同定されたら、その接種菌液をコンピテント細胞として増幅及び調製した。次いで、これらの細胞を、表Ａ−２で示された２２個の補助タンパク質を含有している発現ベクターライブラリーを用いて形質転換した。形質転換体を、様々な選択マーカー（ゼオシン（商標））を含有している選択培地上で増殖させ、このようにして、関心対象のナノボディ及び表Ａ−２の１つ以上の補助タンパク質の両方を含有している共形質転換体が得られた。振盪フラスコでの発現を、５mLのＢＭＣＭ培地の培養液中で実施し、ピキアプロトコール（例えば、Methods in molecular biology 2007, Humana Press Inc.を参照）に記載されているようなメタノールの添加によって誘導した。
【０２１５】
各々の設定において、１１２８個のクローンを、改善された発現についてスクリーニングし、ゲノムに組み込まれたたった１コピーの又は１コピーを超えるナノボディ発現カセットを含有しているが、１つ以上の補助タンパク質をコードしている発現ベクターは含まないそれらの対応する基準クローンと比較した。各々の設定において、本発明者らは、それらの基準クローンより有意により高い収量を有する２つのクローンを発見した。クローン６Ｈ１及び４Ｃ２は、ゲノムに組み込まれた１コピーのナノボディコード配列を有し（コピー数＝１）、クローン５Ａ６及び９Ｃ４は、ゲノムに組み込まれた１コピーを超えるナノボディコード配列を有していた（コピー数＞１）（図２）。
【０２１６】
１．４  発現収量に対してプラスの効果を及ぼす補助タンパク質の同定
Ｐ．パストリスにおけるナノボディの発現収量に対してプラスの効果を発揮する補助タンパク質の同定は、配列特異的ＰＣＲプライマーを使用したゲノムＤＮＡ ＰＣＲを用いて実施された。使用されたプライマーのリストを表Ａ−３に示す。同定された補助タンパク質を表１に示す。
【０２１７】
【表１】
2019507748.tif 000009
【０２１８】
１．５  様々なクローンの発現収量の決定
ナノボディ／補助タンパク質（群）の共形質転換体の発現収量を、培地中に発現及び分泌されたナノボディの収量の定量によって、発現実験における対照（１つ以上の補助タンパク質（群）の発現の増強を伴わないナノボディ形質転換体）の発現収量と比較した。標準的な流加発酵条件を使用した。グリセロール流加培養を実施し、メタノールの添加によって誘導を開始した。生産を、２Ｌの規模でｐＨ６で３０℃で複合培地中で４ml/Ｌ/ｈのメタノールフィード速度で実施した。
【０２１９】
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表２）。
【０２２０】
【表２】
2019507748.tif 000010
【０２２１】
クローン４Ｃ２及び６Ｈ１は、それらの基準クローン（ゲノムに組み込まれた１コピー数の発現カセット）と比較して、発現の顕著な増加を示した。この発現の増加は、両方のクローンに存在するＰＤＩ１の共発現の結果のようであった。同様に、クローン５Ａ６及び９Ｃ４は、それらの基準クローンと比較して、収量の巨大な増加を示した。クローン５Ａ６及び９Ｃ４の両方において発現されていた補助タンパク質は、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型である。そうした補助タンパク質が、ナノボディＡの改善された発現に関与している可能性が最も高い。興味深いことに、クローン４Ｃ２の発現レベルは、クローン６Ｈ１よりも顕著により高く、これは、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型の共発現の結果のようであり、これらはまた、最も高い発現を示すクローンである５Ａ６及び９Ｃ４にも存在している。最も高い収量を示したクローンは全て、ＨＡＣ１スプライシング型を共発現していた（表１及び２）。
【０２２２】
実施例２：個々の補助タンパク質の発現を増強させた場合のナノボディＡの収量の評価
個々の補助タンパク質ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型を、実施例１．３に記載のようなゲノム内に１コピーを超えるナノボディ発現カセットを有する基準クローンに形質転換した。形質転換体を、ゼオシン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。ナノボディＡと特定の補助タンパク質の両方を含有している共形質転換体が得られた。振盪フラスコでの発現を、５mLのＢＭＣＭ培地の培養液中で実施し、ピキアプロトコール（例えば、Methods in molecular biology 2007, Humana Press Inc.を参照）に記載されているようなメタノールの添加によって誘導した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（図３）。補助タンパク質の１つを共発現している全てのクローンが、ナノボディＡの収量の有意な増加を示した。ここでも、本発明者らは、ＨＡＣ１スプライシング型を含有しているクローンが、収量の最大の改善を示したことを観察した。
【０２２３】
実施例３：個々の補助タンパク質の発現を増強させた場合のナノボディＢの収量の評価
３．１  発現ベクターの構築
ナノボディＢは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＢ内のサブユニットは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではなく、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しない。該サブユニットは、３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＢは、Ｐ．パストリスにおいて発酵させると非常に低い収量（０．２９ｇ/Ｌ又はそれ以下）を与えることが示された。
【０２２４】
ナノボディＢのコード情報を含有しているＤＮＡ断片を、ゼオシン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有しているピキア発現ベクター（ｐＰｐＴ４＿Ａｌｐｈａ＿Ｓの誘導体：Naatsaari et al. 2012, PLoS One 7: e39720）のマルチクローニングサイトに、ナノボディ配列が、ａＭＦシグナルペプチド配列の下流かつ読み枠内となるようにクローニングした。補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型、Ｋａｒ２ｐ、ＰＤＩ１及びＲＰＰ０のコード配列を、ブラストサイジン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有しているピキア発現ベクターにクローニングした。ナノボディと補助タンパク質の両方が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下にあった。
【０２２５】
３．２  形質転換
個々の補助タンパク質のＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型を、ピキア・パストリス株のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０（ＡＴＣＣ番号７６２７３）に形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いて、ナノボディＢを用いて形質転換した。
【０２２６】
３．３  個々のクローンの発現収量の決定
発現分析を、実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表３）。ＨＡＣ１スプライシング型補助タンパク質を共発現しているクローンのみが、ナノボディＢの収量の大きな増加を示し、ここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現が、収量を最も効果的に改善することを示す。
【０２２７】
【表３】
2019507748.tif 000011
【０２２８】
実施例４：個々の補助タンパク質の発現を増強させた場合の良好な発現を示すナノボディＣの収量の評価
ナノボディＣは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＣ内のサブユニットは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではない。Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは、３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。個々の補助タンパク質のＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型は、実施例３に記載のようにクローニングされ、ピキア・パストリス株のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０に形質転換された。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いて、ナノボディＣを用いて形質転換した。発現分析を実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表４）。
【０２２９】
ＨＡＣ１スプライシング型と補助タンパク質とを共発現しているクローンのみが、ナノボディＣの収量の有意な増加を示した。このことはここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現が、ナノボディの収量の改善に最も効果的であることを示す。このことは、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現がまた、良好な発現を示すナノボディの収量も増加させることができることを示す。
【０２３０】
【表４】
2019507748.tif 000012
【０２３１】
実施例５：補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の発現を増強させた場合の様々なナノボディ（ナノボディＤ、ナノボディＥ、ナノボディＦ、ナノボディＧ、及びナノボディＨ）の発現収量の評価
ナノボディＤは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＤ内のＮ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ｃ−Ｍｅｔへの結合に対して特異的であるが、Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは９Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＤの配列（配列番号５０）を表Ａ−１に示す。ナノボディＥは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＥ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであるが、中央のサブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットはＧ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＥの配列（配列番号５１）を表Ａ−１に示す。ナノボディＦは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＦ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインである。ナノボディＦ内のサブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しない。該サブユニットは３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＦの配列（配列番号５２）を表Ａ−１に示す。ナノボディＧ及びＨは、重鎖ラマ抗体の４つの配列の最適化された可変ドメインからなる四価ナノボディである。ナノボディＧ及びＨ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであるが、中央のサブユニットの１つはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＧ及びＨの配列（それぞれ配列番号５３及び配列番号５４）を表Ａ−１に示す。ナノボディＩはＴＮＦに特異的に結合する一価ナノボディである。ナノボディＩは、Ｃ末端伸長として１つのアラニン残基をさらに含む、１つの配列の最適化された可変ドメインから実質的になる。ナノボディＩは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではない。ナノボディＩの配列（配列番号５５）を表Ａ−１に示す。
【０２３２】
個々の補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型を３．１に記載のようにクローニングし、ピキア・パストリス株ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０に形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いてナノボディＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ又はＨを用いて形質転換した。発現分析を、実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表５）。ＨＡＣ１スプライシング型補助タンパク質の発現の増強は、全てのナノボディの収量を改善した。このことはここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の発現の増強が、ナノボディの収量を効果的に改善することを実証する。
【０２３３】
【表５】
2019507748.tif 000013
【０２３４】
【表６】
2019507748.tif 000014
2019507748.tif 000015
【０２３５】
【表７】
2019507748.tif 000016
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【０２３６】
【表８】
2019507748.tif 000021
【０２３７】
【表９】
2019507748.tif 000022
【図１】
2019507748.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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