(57)【要約】  本発明は、免疫療法に適用したナチュラルキラー細胞(NK細胞)を培養するための技術に関し、より特定には、血液をサンプリングした後に1日又はそれより長く経った、又はかなり弱くなった免疫細胞を効果的に増幅及び活性化し、同時に、従来の免疫細胞の培養方法と比較して、その中のNK細胞の比率を著しく増加するようにNK細胞を培養することが可能な、無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット、キットを使用することによって免疫細胞を培養するための方法、キット又は培養方法を使用して得られた無血清免疫細胞培養済み培地、及び培養済み培地を含む化粧用組成物に関する。
2019535293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットであって、IL-2、L-グルタミン及び細胞培養培地を含む基礎溶液で構成されるB単位;IL-12が0.5〜5ng/mLの濃度で含まれ、IL-18が2〜50ng/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中にIL-12及びIL-18を溶解させることによって形成されたサイトカイン1-1溶液で構成されるC1-1単位;IL-12が5.1〜15ng/mLの濃度で含まれ、IL-18が30〜120ng/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中にIL-12及びIL-18を溶解させることによって形成されたサイトカイン1-2溶液で構成されるC1-2単位;IL-15が10〜50ng/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中にIL-15を溶解させることによって形成されたサイトカイン2溶液で構成されるC2単位;抗CD16及び抗CD56がそれぞれ0.1〜15μg/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中に抗CD16及び抗CD56を溶解させることによって形成された抗体1溶液で構成されるA1単位;抗体1溶液:基礎溶液を1:6〜10の体積比で含む抗体2溶液で構成されるA2単位;及び抗CD3が1〜12μg/mLの濃度で含まれるように、サイトカイン1溶液中に抗CD3を溶解させることによって形成された抗体-サイトカイン混合物溶液で構成されるD単位を含む、キット。
【請求項２】
D単位の前に、A1単位をリンパ球培養培地に添加することを特徴とする、請求項1に記載の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット。
【請求項３】
A1単位に含有される抗CD16、抗CD56、及び基礎溶液が、別々にパッケージングされており、培地に添加する工程で混合されて、抗体1溶液を形成することを特徴とする、請求項1に記載の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット。
【請求項４】
A2単位に含有される抗体1溶液の抗CD16、抗CD56及び基礎溶液、並びに基礎溶液が、別々にパッケージングされており、培地に添加する工程で混合されて、抗体2溶液を形成することを特徴とする、請求項1に記載の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット。
【請求項５】
D単位に含有される抗CD3及びサイトカイン1溶液が、別々にパッケージングされており、培地に添加する工程で混合されて、抗体-サイトカイン混合物溶液を形成することを特徴とする、請求項1に記載の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット。
【請求項６】
単位が、逐次的にリンパ球培養培地に添加されるように配置され、C1-1単位、C2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、C2単位、C1-1単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、C1-1単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、又はC2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順で使用されることを特徴とする、請求項1に記載の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット。
【請求項７】
免疫細胞を培養する方法であって、単離されたリンパ球に、C1-1単位のサイトカイン1-1溶液及びC2単位のサイトカイン2溶液の少なくとも1つを添加し、続いて自己血漿を添加する第1の工程;第1の工程が実行された培地に、A1単位の抗体1溶液を添加する第2の工程;第2の工程が実行された培地に、D単位の抗体-サイトカイン混合物溶液を添加する第3の工程;第3の工程が実行された培地に、C1-1単位のサイトカイン1-1溶液を添加し、続いて自己血漿を添加する第4の工程;第4の工程が実行された培地に、A2単位の抗体2溶液を添加し、続いて自己血漿又はFBS(ウシ胎児血清)を添加する第5の工程;第5の工程が実行された培地に、C2単位のサイトカイン2溶液を添加し、続いて自己血漿又はFBSを添加する第6の工程;及び第6の工程が実行された培地に、A2単位の抗体2溶液及び自己血漿又はFBSを添加する第7の工程を含む、方法。
【請求項８】
第7の工程が実行された培地に、B単位の基礎溶液及び自己血漿又はFBSを添加し、培養する第8の工程;及び第8の工程が実行された培地に、自己血漿又はFBSを添加し、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、培養する第9の工程を更に含む、請求項7に記載の免疫細胞を培養する方法。
【請求項９】
単離されたリンパ球が、血液収集後に1日又はそれより長く経った血液から単離される、請求項7又は8に記載の免疫細胞を培養する方法。
【請求項１０】
第7の工程又は第9の工程が実行された培地を、細胞と血清含有培養済み培地とに分離する第10の工程;第10の工程で分離された細胞を洗浄する第11の工程;第11の工程で洗浄された細胞を、新しい培養容器に入れ、B単位の基礎溶液を添加し、培養する第12の工程;及び第12の工程が実行された培地を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する第13の工程を更に含む、請求項7又は8に記載の免疫細胞を培養する方法。
【請求項１１】
第13の工程が実行された培地を、細胞と一次無血清培養済み培地とに分離する第14の工程;及び第14の工程で分離された細胞に、B単位の基礎溶液を添加し、細胞を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する第15の工程を更に含む、請求項10に記載の免疫細胞を培養する方法。
【請求項１２】
自己血漿が、血漿1ml当たり40usp単位より多くのヘパリンを含有する、請求項7又は8に記載の免疫細胞を培養する方法。
【請求項１３】
添加される自己血漿又はFBSの含量が、培地の総体積の10%未満である、請求項7又は8に記載の免疫細胞を培養する方法。
【請求項１４】
請求項7又は8に記載の免疫細胞を培養する方法によって培養された、免疫細胞培養済み培地。
【請求項１５】
請求項1又は6に記載の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットを使用して、又は請求項10に記載の免疫細胞を培養する方法によって培養された、免疫細胞培養済み培地から得られた無血清免疫細胞培養済み培地。
【請求項１６】
請求項15に記載の無血清免疫細胞培養済み培地及び化粧用基材を含む化粧用組成物。
【請求項１７】
無血清免疫細胞培養済み培地が、炎症の改善、皮膚のホワイトニング、色素沈着の除去及び皮膚再生の少なくとも1つのための活性成分として機能することを特徴とする、請求項16に記載の化粧用組成物。
【請求項１８】
無血清免疫細胞培養済み培地が、組成物の総質量に対して50質量%又はそれ未満の量で含有されることを特徴とする、請求項16に記載の化粧用組成物。
【請求項１９】
熱傷及び傷害を含む創傷又は皮膚疾患を処置するための、請求項15に記載の無血清免疫細胞培養済み培地を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法に適用したナチュラルキラー細胞(NK細胞)を培養するための技術に関し、より特定には、血液をサンプリングした後に1日又はそれより長く経った、又はかなり弱められた免疫細胞を効果的に増幅及び活性化し、同時に、従来の免疫細胞の培養方法と比較してNK細胞の比率を著しく増加させた後に、目的に従って血清の使用を決定すること、更に任意選択で、血清の存在下又は非存在下で培養することを可能にする、無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット、キットを使用することによる免疫細胞のための培養方法、キット又は培養方法により得られた無血清免疫細胞培養済み培地、及び培養済み培地を含む化粧用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の免疫系は、感染した細菌、ウイルス、毒素、及び他の非宿主物質から宿主を防御するように機能する多数の独特な細胞で構成される。免疫系の特異性において主要な役割を果たす細胞型は、リンパ球と呼ばれ、リンパ球は、B細胞、T細胞及びNK細胞、すなわちナチュラルキラー細胞を含む。T細胞は、胸腺細胞で生産されるためそのように名付けられ、B細胞は、骨髄で生産されるためそのように名付けられ、NK細胞は、それらが産生されたときから自身を他のものから正確に区別する能力をもって産生されるため、ナチュラルキラー(NK)細胞と名付けられる。T細胞集団は、数種のサブタイプ、例えばサプレッサーT細胞、細胞傷害性T細胞、及びTヘルパー細胞を含む。Tヘルパー細胞集団は、2つの免疫経路、Th1及びTh2を決定する。Th1細胞(CD4+細胞の機能的な部分集団)は、細胞性媒介免疫応答を増加させるそれらの能力を特徴とする。Th1細胞は、サイトカインIL-2及びインターフェロン-γを生産する。Th2細胞はCD4+細胞でもあるが、Th1細胞とは異なる。Th2細胞は、抗体産生に関与し、サイトカインIL-4、IL-5、IL-10及びIL-13を生産する。これらのサイトカインは、Th1及びTh2応答にとって互いに干渉する重要な役割を果たす。
【０００３】
免疫療法によって活性化される免疫細胞の中でも特に、NK細胞は、リンパ球の特徴的な形態の大顆粒リンパ球(LGL)であり、これは、感染したウイルス及び腫瘍細胞を致死させ、特徴的なことにほとんどの正常細胞を致死させないという優れた能力を有する。抗腫瘍活性は、壊死、アポトーシス、又は同時に起こる両方の作用機序により得られる。NK細胞は、細胞傷害性、分泌、及び増殖性の機能を強化するサイトカイン、例えばIL-2、IL-12、インターフェロン等に応答する。NK細胞の表現型は、ヒトにおいてCD16(FcγRIII)及びCD56であり、CD16及びCD56は、細胞表面はTRC(T細胞受容体複合体)を含有しないため、NK細胞のマーカーとして使用される。
【０００４】
このようなNK細胞は、人体の初期の生物学的な防御機構及び腫瘍免疫において重要な役割を果たすことがわかっている。言い換えれば、NK細胞は、主要組織適合複合体(MHC)の発現による獲得免疫プロセスを起こすことなく、特異的な自己細胞、同種細胞を致死させることができ、更には異種のがん細胞も致死させることができ、特に、クラス1MHCをわずかしか発現しないか又は発現しない標的細胞を致死させることができる。したがって、NK細胞は、MHCを発現しないほとんどのがん細胞に加えて一部のウイルス感染細胞及び細菌、例えばチフス菌(Salmonella typhi)を効果的に致死させることができる。
【０００５】
しかしながら、NK細胞は、上述したようにがん細胞を致死させる優れた作用を発揮するが、正常なヒトのケースであっても末梢血リンパ球の5〜25%しか占めていない。特定には、がん患者のケースではその比率は5%未満に低下し、したがって免疫療法を介した別の増幅プロセスなしにがん細胞を効果的に攻撃するには限界がある。
【０００６】
免疫細胞、特にNK細胞の活性化及び増殖には、IL-2等のサイトカイン、及びCD3等の抗体が使用される。現在の技術では、CD3抗体は、免疫細胞の増殖において非常に重要な役割を果たすが、この抗体を使用して免疫細胞を活性化することが非常に難しいという問題がある。すなわち、免疫細胞を培養するための現在の一般的な技術は、フラスコ中にCD3抗体を固定し、所定期間にわたり細胞を刺激することである。しかしながら、個体ごとに免疫細胞に対する感受性は異なっており、感受性は、細胞培養条件又は技術者の能力レベルに応じて大きく変動する可能性がある。例えば、CD3抗体の刺激があまりにも少ないか、又はほとんど刺激されない場合、免疫細胞は十分に増殖しない。加えて、刺激があまりにも多い場合も、NK細胞はほとんど増殖せず、NKT細胞又はT細胞が過剰に増殖する。このケースにおいて、T細胞が過剰に増殖するため、NK細胞を増殖させ多数のNK細胞を得ることは簡単ではない。
【０００７】
特定には、初期にCD3抗体の強い刺激が適用される場合、未成熟の前駆細胞がT細胞に成熟することになる。それゆえに、一般的に使用される現在の方法は、初期にCD3抗体をわずかに刺激する手順を採用する。しかしながら、活性化NK細胞は個体差等の環境条件の影響を大いに受けるため、大量に増殖した活性化NK細胞を得ることは難しい。
【０００８】
現在のところ、末梢血液からリンパ球を分離した後に、高濃度のIL-2及び例えばCD3、CD16、CD56等の抗体を使用して免疫細胞がインビトロで培養される場合、様々なサイトカインが分泌され、同時にNK細胞及びTh1型細胞が増殖し、免疫細胞が分裂し、成長する。これらのサイトカイン(γ-インターフェロン、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18等)は、Th2サイトカインの過剰生産を阻害し、それに加えて皮膚の免疫性を改善することから、皮膚炎症の処置に非常に効果的に使用することができる。
【０００９】
これらのサイトカインの中でも、IL-8は、NK細胞で大量に生産され、血液中における単核細胞の凝集及びそれらのマクロファージへの分化を誘導する。マクロファージは最初に、抗原を除去するように作用するが、除去すべき抗原がもう存在しない場合、又はIL-4の作用によって、マクロファージはM2a型に変換される。M2a型のマクロファージは、数種の関連因子(TGF-β、bFGF、PDGF、VEGF、MMP、TIMP)を生産して、創傷又は炎症によって破壊された組織を復活させる。最終的には、NK細胞で大量に生産されるIL-8によりマクロファージ(M2a型)を増加させることによって、炎症又は創傷を迅速に処置することができる。更に、IL-8は、表皮にケラチノサイトを収集すること、したがって外部からの侵入を効果的に防ぐことにより表皮を強く健康に維持することによって、皮膚疾患の改善又は処置において有効であり得る。加えて、容易に利用可能な遺伝子組換え技術を介して得られたIL-8単独又はIL-8及びIL-4又はインターフェロンγ等が一緒に使用される場合、IL-8によって著しく増殖したマクロファージは、IL-8によってM2a型のマクロファージに変換され、したがって創傷を処置する作用及びスキンケア作用を改善することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、免疫細胞が、公知の免疫細胞のための培養方法に従って培養される場合、培養の開始点から2週間後に免疫細胞の致死速度は、免疫細胞の増殖速度より速くなり、3から4週間後には免疫細胞を培養培地中で発見することが難しくなる。それゆえに、免疫細胞は通常、血液からリンパ球を抽出すること、抽出されたリンパ球を2週間培養し、増殖した免疫細胞を得ること、及び得られた免疫細胞又は培養済み培地を、そのまま、又は貯蔵のために凍結した後に使用することによって得られる。そのため、多数の免疫細胞又は大量の免疫細胞培養済み培地を得るために、大量の血液が必要になるという問題がある。
【００１１】
加えて、血清は、一般的に、免疫細胞培養で使用される。このケースにおいて、別のヒト又は動物の血清を使用することにより得られた培養済み培地を化粧用組成物又は治療剤として使用する場合、血清の使用による何らかの未知の疾患の感染リスクのために、使用しにくいという問題がある。したがって、血清非含有の培養培地が強く求められている。
【００１２】
更に、免疫細胞の使用の有効性は、血液収集後24時間以内である。すなわち寿命は短く、血液収集後1日で、細胞は急速に弱くなり、細胞培養が難しくなる。これらの問題が、献血を得ることを難しくしている。血液をサンプリングした後に長時間経った、若しくは免疫が低下したヒトから得られた免疫細胞、又は輸注血液の調製で廃棄される白血球除去フィルター中に残った免疫細胞を回復させ培養するために、弱くなった免疫細胞を活性化及び培養することが可能な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の詳細な説明
技術的な課題
上記の問題を解決しようとする努力の結果として、本発明の発明者らは、抗CD3抗体を固定した後に所定期間インキュベートし、続いて抗体を除去する工程を実行することなく、リンパ球培養培地中でNK細胞を安定して増幅させる方法、更に、元々弱い免疫細胞、又は例えば高齢者からの免疫細胞、又は更にはがん患者の免疫細胞から、NK細胞を安定して増幅させる方法を開発することによって本発明を完成させた。
【００１４】
したがって、本発明の1つの目的は、培養容器中に抗CD3抗体を固定し、所定期間にわたりリンパ球(免疫細胞)を培養してリンパ球を刺激する不便な工程を行うことなく、大量培養プロセス中に培養するための血清が任意選択で含まれるかどうかを決定することを可能にする、更に、最終的に得られたリンパ球培養済み培地中でNK細胞を大量に安定して増幅及び増殖することが可能な組成物を含有する無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、最終的に得られたリンパ球培養済み培地が、培地に添加するためのキットに含有される単位を構成する添加剤を逐次的に使用することによって、すなわち、リンパ球を刺激する順序を特定することによって、元々弱い免疫細胞又は例えば高齢者若しくは重度のがん患者の免疫細胞が培養される場合であっても、低い比率のT細胞及び著しく高い比率のNK細胞を含有する免疫細胞を安定して培養するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、リンパ球培養において著しく高い比率でNK細胞を増殖させるために、培養プロセス中に添加される培地の添加剤を標準化することによってNK細胞を非常に容易に培養することが可能な、無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットを提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、皮膚再生作用による皮膚のホワイトニング又は皮膚のしわの改善に極めて有効な、有効成分として高濃度のインターロイキン-8、インターフェロンγ等を含む無血清免疫細胞培養済み培地を含有する化粧用組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる別の目的は、傷害、熱傷等の創傷治癒、及び皮膚疾患の処置に極めて有効な、有効成分として高濃度のインターロイキン-8、インターフェロンγ等を含む無血清免疫細胞培養済み培地を含有する医薬組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の目的は、上述した目的に限定されず、明示的に述べられていないが、後述される本発明の詳細な説明から当業者によって認識できる本発明の目的を明確に含み得る。
【００２０】
技術的な解決法
上述した本発明の目的を達成するために、本発明は、無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットであって、IL-2、L-グルタミン及び細胞培養培地を含む基礎溶液で構成されるB単位;IL-12が0.5〜5ng/mLの濃度で含まれ、IL-18が2〜50ng/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中にIL-12及びIL-18を溶解させることによって形成されたサイトカイン1-1溶液で構成されるC1-1単位;IL-12が5.1〜15ng/mLの濃度で含まれ、IL-18が30〜120ng/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中にIL-12及びIL-18を溶解させることによって形成されたサイトカイン1-2溶液で構成されるC1-2単位;IL-15が10〜50ng/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中にIL-15を溶解させることによって形成されたサイトカイン2溶液で構成されるC2単位;抗CD16及び抗CD56がそれぞれ0.1〜15μg/mLの濃度で含まれるように、基礎溶液中に抗CD16及び抗CD56を溶解させることによって形成された抗体1溶液で構成されるA1単位;抗体1溶液:基礎溶液を1:6〜10の体積比で含有する抗体2溶液で構成されるA2単位;及び抗CD3が1〜12μg/mLの濃度で含まれるように、サイトカイン1溶液中に抗CD3を溶解させることによって形成された抗体-サイトカイン混合物溶液で構成されるD単位を含有する、キットを提供する。
【００２１】
好ましい実施形態において、A1単位は、D単位の前にリンパ球培養培地に添加される。
【００２２】
好ましい実施形態において、A1単位に含有される抗CD16、抗CD56、及び基礎溶液は、別々にパッケージングされ、培地に添加して抗体1溶液を形成する工程で混合される。
【００２３】
好ましい実施形態において、A2単位に含有される抗体1溶液の抗CD16、抗CD56及び基礎溶液、並びに基礎溶液は、別々にパッケージングされ、培地に添加して抗体2溶液を形成する工程で混合される。
【００２４】
好ましい実施形態において、D単位に含有される抗CD3及びサイトカイン1溶液は、別々にパッケージングされ、培地に添加して抗体-サイトカイン混合物溶液を形成する工程で混合される。
【００２５】
好ましい実施形態において、単位は、逐次的にリンパ球培養培地に添加されるように構成され、C1-1単位、C2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、C2単位、C1-1単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、C1-1単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、又はC2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順で使用される。
【００２６】
本発明はまた、免疫細胞を培養するための方法であって、単離されたリンパ球に、C1-1単位のサイトカイン1-1溶液及びC2単位のサイトカイン2溶液の少なくとも1つを添加し、続いて自己血漿を添加する第1の工程;第1の工程が実行された培地に、A1単位の抗体1溶液を添加する第2の工程;第2の工程が実行された培地に、D単位の抗体-サイトカイン混合物溶液を添加する第3の工程;第3の工程が実行された培地に、C1-1単位のサイトカイン1-1溶液を添加し、続いて自己血漿を添加する第4の工程;第4の工程が実行された培地に、A2単位の抗体2溶液を添加し、続いて自己血漿又はFBS(ウシ胎児血清)を添加する第5の工程;第5の工程が実行された培地に、C2単位のサイトカイン2溶液を添加し、続いて自己血漿又はFBSを添加する第6の工程;及び第6の工程が実行された培地に、A2単位の抗体2溶液及び自己血漿又はFBSを添加する第7の工程を含む方法も提供する。
【００２７】
好ましい実施形態において、方法は更に、第7の工程が実行された培地に、B単位の基礎溶液及び自己血漿又はFBSを添加し、培養する第8の工程;及び第8の工程が実行された培地に、自己血漿又はFBSを添加し、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、培養する第9の工程を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、単離されたリンパ球は、血液収集後に1日又はそれより長く経った血液から単離される。
【００２９】
好ましい実施形態において、方法は更に、第7の工程又は第9の工程が実行された培地を、細胞と血清含有培養済み培地とに分離する第10の工程;第10の工程で分離された細胞を洗浄する第11の工程;第11の工程で洗浄された細胞を、新しい培養容器に入れ、B単位の基礎溶液を添加し、培養する第12の工程;及び第12の工程が実行された培地を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する第13の工程を含む。
【００３０】
好ましい実施形態において、方法は更に、第13の工程が実行された培地を、細胞と一次無血清培養済み培地とに分離する第14の工程;及び第14の工程で分離された細胞に、B単位の基礎溶液を添加し、細胞を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する第15の工程を含む。
【００３１】
好ましい実施形態において、自己血漿は、血漿1ml当たり40usp単位より多くのヘパリンを含有する。
【００３２】
好ましい実施形態において、添加される自己血漿又はFBSの含量は、培地の総体積の10%未満である。
【００３３】
本発明はまた、上述した培養方法のいずれか1つによって培養された免疫細胞培養済み培地も提供する。
【００３４】
本発明はまた、上述した免疫細胞培養培地に添加するためのキットのいずれかを使用して、又は上述した培養方法のいずれか1つによって培養された免疫細胞培養済み培地から得られた無血清免疫細胞培養済み培地も提供する。
【００３５】
本発明はまた、上述した無血清免疫細胞培養済み培地;及び化粧用基材を含有する化粧用組成物も提供する。
【００３６】
好ましい実施形態において、無血清免疫細胞培養済み培地は、炎症の改善、皮膚のホワイトニング、色素沈着の除去及び皮膚再生の少なくとも1つのための活性成分として機能する。
【００３７】
好ましい実施形態において、無血清免疫細胞培養済み培地は、組成物の総質量に対して50質量%又はそれ未満の量で含有される。
【００３８】
本発明はまた、熱傷及び傷害を含む創傷又は皮膚疾患の処置のための、上述した無血清免疫細胞培養済み培地を含有する医薬組成物も提供する。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、以下の優れた作用を有する。
【００４０】
第一に、本発明の免疫細胞培養培地を添加するためのキットは、培養容器中に抗CD3抗体を固定しながら所定期間にわたりリンパ球(免疫細胞)を培養してリンパ球を刺激する厄介なプロセスをなくし、大規模な培養のケースにおいて、本キットは、培養が、血清の存在下又は非存在下で実行されるかどうか、同時に、NK細胞が、最終的に得られたリンパ球培養済み培地中で大量に安定して増幅及び増殖することができるかどうかを選択的に決定することができる。
【００４１】
加えて、本発明の免疫細胞を培養する方法は、培地に添加するためのキットに含有される単位を構成する添加剤を逐次的に使用することによって、すなわち、リンパ球を刺激する順序を特定することによって、元々弱い免疫細胞又は例えば高齢者若しくは重度のがん患者の免疫細胞が培養される場合であっても、最終的に得られたリンパ球培養済み培地中で、T細胞の比率を減少させ、NK細胞の比率を著しく増加させることができる。
【００４２】
加えて、本発明によれば、リンパ球培養において著しく高い比率でNK細胞を増殖させるために、培養プロセス中に添加される培地の添加剤を標準化することによって、NK細胞を非常に容易に培養することができる。
【００４３】
更に、本発明の化粧用組成物によれば、高濃度のインターロイキン-8、インターフェロンγ等を含む無血清免疫細胞培養済み培地が有効成分として含有されているため、皮膚のホワイトニング、皮膚再生作用等による皮膚のしわの改善の作用は優れている。
【００４４】
更に、本発明の医薬組成物によれば、高濃度のインターロイキン-8、インターフェロンγ等を含む無血清免疫細胞培養済み培地が有効成分として含有されるため、例えば傷害、熱傷等の創傷治癒、皮膚疾患の処置等の作用は優れている。
【００４５】
本発明の技術的な利点は、上述した範囲に限定されず、明示的に述べられていないが、後述される本発明の実施例に関する詳細な説明から当業者によって認識できる本発明の作用を明確に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】座瘡を有する部位に本発明の実施形態に係る化粧用組成物を適用することにより達成された炎症の改善及び色素沈着の除去の作用を示す連続写真である。
【図２】座瘡を有する部位に本発明の実施形態に係る化粧用組成物を適用することにより達成された炎症の改善及び色素沈着の除去の作用を示す連続写真である。
【図３】生きた昆虫に噛まれたことにより形成された赤い斑点に本発明の実施形態に係る化粧用組成物を適用することにより達成された炎症の改善及び色素沈着の除去の作用を示す連続写真である。
【図４】アレルギーが発生した部位に本発明の実施形態に係る化粧用組成物を適用することにより達成された炎症の改善及び色素沈着の除去の作用を示す連続写真である。
【図５】異なる時間間隔で数種のアレルギーが起こる広い部位に本発明の実施形態に係る化粧用組成物を適用することにより達成された炎症の改善及び色素沈着の除去の作用を示す連続写真である。
【図６】熱傷の部位に本発明の実施形態に係る医薬組成物を適用することにより達成された皮膚再生作用を示す連続写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明を限定することは意図されない。単数形の表現は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の表現を包含する。本出願において、用語「含む(comprising)」又は「有する(having)」等は、本出願に記載される特徴、数、工程、操作、要素、パーツ、又はそれらの組合せの存在を示すことが意図されるが、1つ又は複数の他の特徴、数、工程、操作、要素、パーツ、又はそれらの組合せの存在又は追加を排除することは意図されない。
【００４８】
第1、第2等の用語は、様々な要素を記載するために使用できるが、要素は、その用語によって限定されないものとする。このような用語は、単にある成分を別の成分と区別する目的で使用される。例えば、本発明の権利範囲から逸脱することなく、第1の成分が、第2の成分と称される場合もあり、同様に、第2の成分も、第1の成分と称される場合もある。
【００４９】
別段の指定がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、技術的又は科学的な用語を含めて、本発明が関与する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されたもの等の用語は、関連分野における文脈の意味と一致する意味を有すると解釈されることとし、本発明で明示的に定義されない限り、観念的な、又は過度に形式ばった意味で解釈されないこととする。
【００５０】
用語「無血清免疫細胞培養済み培地」は、本発明で使用される場合、血清の非存在下で免疫細胞培養培地から免疫細胞を分離することにより得られた残留物を意味する。それゆえに、無血清免疫細胞培養済み培地は、血清の非存在下で増幅した免疫細胞培養培地から免疫細胞を分離することにより得ることができ、免疫細胞の二次代謝産物、例えばサイトカインを含む。加えて、「NK細胞」は、NK細胞及びNKT細胞の両方を含むものとして使用された。
【００５１】
以下、添付の図面及び好ましい実施形態を参照しながら本発明の技術的な構造を詳細に説明する。
【００５２】
しかしながら、本発明は、本明細書に記載される実施形態に限定されないが、他の様式で具体化されてもよい。明細書中で本発明を記載するのに使用される同じ参照番号は、同じ要素を識別する。
【００５３】
本発明の技術的な特徴は、培養容器中に抗CD3抗体を固定し、所定期間にわたりリンパ球(免疫細胞)を培養してリンパ球を刺激する厄介な工程を行うことなく、大量培養プロセス中に培養するための血清が任意選択で含まれるかどうかを決定することを可能にする、更に、元々弱い免疫細胞、又は例えば高齢者又は重度のがん患者の免疫細胞が培養される場合であっても、最終的に得られたリンパ球培養済み培地中でNK細胞を大量に安定して増幅及び増殖することが可能な組成物を含有する無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキット、無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットを使用する培養方法、及び培養済み培地から得られた生成物を使用する方法である。
【００５４】
一般的に、NK細胞ベースの免疫細胞が培養される場合、CD3、CD16及びCD56等の抗体が慣習的に使用される。弱くなった細胞が抗体によって直接刺激されると、細胞は、より迅速に致死することが多い。弱くなった細胞が強く直接刺激されると、アポトーシスが誘導されると考えられる。
【００５５】
この問題を解決するために、本発明は、NK細胞ベースの免疫細胞が培養される場合、弱くなった細胞を最初に強く活性化し、次いで抗体によって刺激すれば、細胞は致死することなくよく増殖するという事実に注目したものである。
【００５６】
言い換えれば、NK細胞ベースの免疫細胞が培養される場合、抗体での刺激の前に12〜24時間又はそれより長く、特定の濃度のIL-2の存在下で、IL-12及びIL-18の混合物、IL-12及びIL-15の混合物、又はIL-15単独等のサイトカインで、細胞を最初に刺激すれば、インターフェロンγ等を含む多くのサイトカインが分泌され、免疫細胞が多量に回復し、分泌されたサイトカインによって活性化されることが確認されている。また、細胞を、活性化された状態の抗体で刺激すると(抗CD16及び抗CD56で刺激し、続いて抗CD3で刺激するか、又は抗CD3単独で刺激すると)、NK細胞、NKT細胞、T細胞等が目的通りによく増殖することも確認されている。この段階において、固定された抗体を使用しなくても、培地に抗体を添加するだけで免疫細胞を刺激することができる。
【００５７】
本発明において開発された原理によれば、まだ成熟していない未成熟の前駆細胞が、抗CD16及び抗CD56抗体で刺激されて、NK細胞への分化が誘導される。すでに成熟したNK細胞の活性化の後に、抗CD3抗体でT細胞を刺激することによって活性化されたT細胞がNK細胞を活性化すると、培養培地中で抗CD3抗体が劣化し消失するまでの連続刺激によるいかなる問題も生じることなくNK細胞が大量に増殖する。実験結果に基づいて、本発明の培養方法において、リンパ球を刺激するために培養容器中に抗CD3抗体を固定して、所定期間にわたりリンパ球(免疫細胞)を培養する厄介なプロセスを行うことなく、NK細胞の比率を非常に高くしてリンパ球を培養することができる。
【００５８】
この方法を使用して、免疫細胞が元々弱い免疫細胞又は例えば高齢者又は重度のがん患者の免疫細胞であっても、それらをよく培養することができる。特定には、輸注血液の調製において白血球をろ過し除去する一方で、廃棄される白血球除去フィルター中のリンパ球を回復させ培養することが非常に有用である。
【００５９】
それゆえに、本発明の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットは、それをリンパ球培養の各工程で培地に添加することができるように個々にパッケージングされ、区別可能な内容物、すなわち区別可能な要素と共に、B単位、C1-1単位、C1-2単位、C2単位、A1単位、A2単位及びD単位を含有する。ここで、単位中に含まれる要素は、リンパ球培養において弱くなったリンパ球が培養される場合であっても、培養細胞のほとんどがNK細胞になるように、リンパ球培養培地への影響を考慮して決定される。特定には、本発明の無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットは、血液収集後に1日又はそれより長く経った血液から単離されたリンパ球が培養される場合、NK細胞が従来の培養方法と比較して少なくとも500倍から5000倍に安定して増殖できるように、使用されるリンパ球培養培地に単位を添加する以下の4つの順のいずれか1つに従うように設計される。
【００６０】
(1)C1-1単位、C2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、(2)C2単位、C1-1単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、(3)C1-1単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順、(4)C2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順。
【００６１】
最初に、B単位は、IL-2、L-グルタミン及び細胞培養培地を含有する基礎溶液で構成される。このケースにおいて、IL-2の含量は、100ng/mL〜300ng/mL、好ましくは200〜250ng/mL(3240IU/mL〜4000IU/mL)の濃度であり得る。
【００６２】
周知の通り、IL-2は、14〜17kDaの分子量を有する糖タンパク質であり、これは、T細胞が認識し、抗原によって活性化されると生産される。IL-2は、T細胞の外側に分泌されると、IL-2を生産するT細胞と相互作用し、T細胞の成長を促進する。またIL-2は、NK細胞に対しても、成長を促進し、NK細胞の致死能力を強化するように作用し、B細胞にもそれらの成長を促進するように作用する。L-グルタミンは、免疫細胞培養のための栄養素として作用する成分であり、細胞培養培地は、浮遊細胞培養のための基礎培地として公知の培地であってもよい。
【００６３】
B単位の具体的な例として、2mgのIL-2及び100mlの500mMのL-グルタミン溶液を、浮遊細胞培養のための基礎培養培地(市販の細胞培養培地であり、IL-2又はL-グルタミンがすでに基礎培地中に存在する場合、添加される量は、最終濃度になるように調整される)に添加し、溶解させ、最終的な溶液を10Lに調整して、基礎溶液(B単位)を調製する。
【００６４】
C1-1単位は、IL-12、IL-18及び基礎溶液を含有するサイトカイン1-1溶液で構成される。本明細書において、サイトカイン1-1溶液中のIL-12は、0.5ng/mL〜5ug/mLの濃度で、好ましくは1〜3ng/mLの濃度で、より好ましくは1.5ng/mL〜2.5ng/mLで含有されていてもよい。IL-18は、2ng/mL〜50ng/mLの濃度で、好ましくは6ng/mL〜20ng/mLの濃度で、より好ましくは11ng/mL〜15ng/mLの濃度で含まれていてもよい。
【００６５】
C1-2単位は、各成分の含量が異なることを除いてサイトカイン1-1溶液と同様にしてIL-12、IL-18及び基礎溶液を含有するサイトカイン1-2溶液で構成される。サイトカイン1-2溶液中のIL-12は、5.1ng/mL〜15ug/mLの濃度で、好ましくは6〜12ng/mLの濃度で、より好ましくは8ng/mLから10.5ug/mLで含有されていてもよい。IL-18は、30ng/mL〜120ng/mLの濃度で、好ましくは40ng/mLから80ng/mLの濃度で、より好ましくは50ng/mLから70ng/mLの濃度で含まれていてもよい。
【００６６】
周知の通り、IL-12は、樹状細胞(DC)、マクロファージ、及びB細胞で生産される。IL-12は、NK細胞及びTリンパ球においてIFN-γ及びTNF-αの生産を誘導し、IL-4の生産を低減して、IFN-γを阻害する。IL-12はまた、NK細胞及びCD8+細胞傷害性Tリンパ球の細胞傷害性も増加させる。IL-12は、NK細胞におけるIL-2シグナル伝達経路に密接に関連する。加えて、IL-2は、NK細胞におけるIL-12受容体β1及びIL-12受容体β2の発現を誘導して、IL-12シグナル伝達関連タンパク質を発現し、活性化する。このメカニズムは、IFN-γ生産能力及びNK細胞の標的細胞を致死させる能力によって十分実証された。IL-12受容体β2は、Th2の発生を阻害すると同時にTh1の発生を促進することが報告されているIL-12の機能において重要な役割を果たすと考えられる。T細胞及びNK細胞におけるIL-12シグナル伝達は、JAK-STATシグナル伝達経路に関与し、IL-12受容体β2の活性は、リン酸化の誘導、したがって転写因子STAT4の活性化において重要な役割を果たす。
【００６７】
IL-18はまた、マクロファージによっても生産され、炎症促進性サイトカイン遺伝子である。IL-18は、IL-12と共にIL-18受容体に結合し、細菌又はウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を引き起こし、NK細胞及びT細胞におけるIFN-γの生産を増加させる。
【００６８】
C1-1単位の具体的な例として、10ugのIL-12及び50ugのIL-18を水中に溶解させて10mlにし、サイトカイン溶液(1ug/mlの濃度のIL-12、5ug/mlの濃度のIL-18)を調製する。次いで、1mLのサイトカイン溶液を500mLの基礎溶液中に溶解させて、2ng/mLの濃度でIL-12及び10ng/mLの濃度でIL-18を含有するサイトカイン1-1溶液(C1-1単位)を調製する。
【００６９】
C2単位は、IL-15及び基礎溶液を含む構成を有するサイトカイン2溶液で構成される。サイトカイン2溶液中のIL-15の量は、10〜50ng/mL、好ましくは15ng/mL〜25ng/mLであり得る。
【００７０】
周知の通り、IL-15は、4つのヘリックスバンドルを有するサイトカインファミリーに属する、複数種によって発現されるサイトカインである。IL-15は、多くのタイプの細胞に作用することによって増殖、生存及び分化において重要な役割を果たすことがわかっている。加えて、IL-15は、多種多様な細胞で発現され、したがってIL-2と比較してより広範に、より多様に制御することができる。特定には、IL-15は、免疫応答の各相に影響を与え、免疫応答の各段階に関与する多くのタイプの細胞に作用する。一連の研究からの結果によれば、IL-15は、メモリーT細胞の形成に直接関与することが論じられている。
【００７１】
C2単位の具体的な例として、サイトカイン2溶液(C2単位)は、基礎溶液中にIL-15を20ng/mLの濃度で溶解させることによって調製することができる。
【００７２】
A1単位は、抗CD16、抗CD56及び基礎溶液を含有する抗体1溶液で構成される。この時点で、A1単位を構成する抗体1溶液中の抗CD16及び抗CD56の含量は、それぞれ0.1〜2.0ug/mL、好ましくは0.5〜0.7ug/mLであり得る。
【００７３】
周知の通り、CD16及びCD56は、NK細胞の表面タンパク質である。リンパ球が抗CD16抗体又は抗原-抗体複合体の存在下で培養される場合、CD16抗原はNK細胞に添加されて、シグナル伝達を誘導する。これらの刺激によって、NK細胞は、トランスフェリン受容体、例えばIL-2受容体のα鎖を発現するか、又は腫瘍壊死因子(TNF)又はIFN-γを生産する。また抗CD56抗体は、抗CD16抗体の機能に類似した機能も発揮する。
【００７４】
A1単位の具体的な例として、6μlの抗CD16及び抗CD56溶液(1mg/ml)をそれぞれ10mlの基礎溶液中に溶解させて、抗体1溶液(A1単位)を調製する。
【００７５】
A2単位は抗体2溶液で構成され、抗体2溶液は、抗体1溶液:基礎溶液を1:fの体積比で含有してもよく、したがって、A2単位の具体的な例として、6.5mlの抗体1溶液を30mlの基礎溶液と混合して、抗体2溶液を調製することができる。
【００７６】
基礎溶液に抗体がすでに添加されている状況で調製されたA1単位及びA2単位は、使用期間を延長するために冷蔵庫で貯蔵すれば1〜2ヶ月使用することができるため、A1単位及びA2単位を構成する抗CD16、抗CD56及び基礎溶液を別々にパッケージングし、培地に添加される工程で混合して、それぞれ抗体1溶液及び抗体2溶液を形成してもよい。
【００７７】
D単位は、抗体-サイトカイン混合物溶液で構成され、抗体-サイトカイン混合物溶液は、抗CD3及びサイトカイン1溶液を含有してもよい。このケースにおいて、抗CD3の含量は、1ug/mL〜12ug/mL、好ましくは3ug/mL〜8ug/mL、より好ましくは4ug/mL〜5ug/mLであり得る。
【００７８】
周知の通り、T細胞は、TCRを介してシグナルを受け取ると活性化されるが、TCRα又はβ鎖が活性化シグナルをそれ自身で保持できず、TCR周辺のCD3鎖を介してシグナルを送達する。言い換えれば、TCRがCD3抗原を認識すると、CD3抗原は、シグナルを細胞に透過させるように作用する。例えば、TRCがMHC+抗原に結合すると、CD3抗原は、シグナルを細胞に与えTCRは、CD3抗原(γ、δ、ε、ζ、ζ又はη)と複合体を形成する。
【００７９】
D単位の具体的な例として、抗体-サイトカイン混合物溶液(D単位)は、1mLのサイトカイン1溶液中に5uLの抗CD3溶液(1mg/mL)を溶解させることによって調製することができる。
【００８０】
D単位のケースにおいて、サイトカイン1溶液に抗体がすでに添加されている場合、D単位は、冷蔵庫で貯蔵すれば1〜2ヶ月使用することができる。それゆえに、使用期間を延長するために、D単位を構成する抗CD3及びサイトカイン1溶液を別々にパッケージングし、培地に添加する工程で混合して、抗体-サイトカイン混合物溶液を形成してもよい。このケースにおいて、使用期間は、6ヶ月より長く延長することができる。
【００８１】
次に、本発明の血清の非存在下で免疫細胞を培養するために、培地に添加するためのキットを使用することによって免疫細胞を培養する方法は、単離されたリンパ球に、C1-1単位のサイトカイン1-1溶液及びC2単位のサイトカイン2溶液の少なくとも1つを添加し、続いて自己血漿を添加する工程1;工程1が実行される培地に、A1単位の抗体1溶液を添加する工程2;工程2が実行される培地に、D単位の抗体-サイトカイン混合物溶液を添加する工程3;工程3が実行される培地に、C1-1単位のサイトカイン1-1溶液を添加し、続いて自己血漿を添加する工程4;工程4が実行される培地に、A2単位の抗体2溶液を添加し、続いて自己血漿又はFBSを添加する工程5;工程5が実行される培地に、C2単位のサイトカイン2溶液を添加し、続いて自己血漿又はFBSを添加する工程6;及び工程6が実行される培地に、A2単位の抗体2溶液及び自己血漿又はFBSを添加する工程7を含む。
【００８２】
上述した本発明の免疫細胞を培養する方法は、最終的に得られた免疫細胞培養済み培地に用途に応じて血清が含有され得るように、又は含有され得ないように、以下の2つの方法によって行うことができる。
【００８３】
免疫細胞培養済み培地中に血清が含有されるケースにおいて、本方法は更に、工程7が実行される培地に、B単位の基礎溶液及び自己血漿又はFBSを添加し、培養する工程8;及び工程8が実行される培地に、自己血漿又はFBSを添加し、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、培養する工程9を含んでもよい。
【００８４】
加えて、免疫細胞培養済み培地が血清を含有しない場合、本方法は更に、工程7又は工程9が実行される培地を、細胞と血清を含有する培養培地とに分離する工程10;工程10で分離された細胞を洗浄する工程11;工程11で洗浄された細胞を新しい培養容器に入れ、B単位の基礎溶液を添加し、培養する工程12;及び工程12が実行される培地を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する工程13を含んでもよい。必要に応じて、本方法は更に、工程13が実行される培地を、細胞と一次無血清培養培地とに分離する工程14;及び工程14で分離された細胞に、B単位の基礎溶液を添加し、細胞を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する工程15を含んでもよい。必要に応じて、工程14及び15を1回又は複数回繰り返して、二次無血清培養済み培地、三次無血清培養済み培地等を得ることができる。無血清培養済み培地は、培養された細胞の状態に応じて更に1回又は複数回繰り返すことによって、バッチ1つにつき3〜4リットル又はそれより多く得ることができる。
【００８５】
このケースにおいて、第1の工程で単離されたリンパ球は、血液をサンプリングした後に1日又はそれより長く経った血液から分離したものでもよいし、又は弱い免疫細胞、例えば高齢者又は重度のがん患者の免疫細胞であってもよい。自己血漿又はFBSの含量は、培地の総体積の10%未満である。
【００８６】
工程1を実行した後、工程2が行われるまで、24時間又はそれより長いインターバルは、弱くなった免疫細胞を十分に活性化することができる。工程2を実行した後、工程3が行われるまで、工程3は、培養培地中で抗CD3抗体が劣化するまで固定及び刺激を行うことなく、D溶液中に含まれる抗CD3抗体が培地に添加されるにもかかわらず、NK細胞がいかなる特定の問題も起こすことなく増殖するように、抗体1溶液の存在下で、すなわちIL-2の存在下で、抗CD16及び抗CD56によりリンパ球を十分に刺激した後に実行されると予想される。
【００８７】
本発明のインキュベーション工程で添加される自己血漿は、公知の培養方法で使用される自己血漿に含有されるヘパリンの量より少なくとも3倍多くのヘパリンを含有する。言い換えれば、血液収集中に血液10mL当たり158usp単位もの濃度でヘパリンが使用されたとしても、血液は凝固しない。しかしながら、それがおよそ血漿5ml当たり158usp単位で細胞培養に添加される場合、凝血のために、細胞はよく培養されない。しかしながら、本発明によれば、通常の量より少なくとも3倍多くのヘパリンを使用した場合、凝血を起こすことなく細胞をよく培養することができたこと、更に一般的に公知の量より3〜4倍多くヘパリンを使用する場合、培養において問題はないことが確認された。加えて、一般的に使用される血漿不活性化方法において、補体等のタンパク質が56℃で30分加熱することによって除去される場合、細胞培養に必要な有効成分も同様に除去される。しかしながら、本発明の場合のように約3倍又はより多くのヘパリンが使用され、血漿不活性化方法が使用されない場合、細胞培養に必要な有効成分の損失がないため、少量の血漿を使用することができる。これまでに、例えば培養培地の10体積%又はそれより多くが使用されたが、10体積%より少ない培地のわずか3体積%から7体積%が本発明で使用されたとしても、培養はよく実行されることが確認された。それゆえに、本発明の培養方法で使用される自己血漿は、血漿1ml当たり、40usp単位又はそれより多く、好ましくは50〜60usp単位又はそれより多くのヘパリンを含有してもよい。
【００８８】
このようにして免疫細胞を培養する場合、細胞培養工程によって培養された免疫細胞の30〜80%がNK細胞になるように、NK細胞の比率を増加させることができる。NK細胞の比率が増加する場合、大量のサイトカイン、例えばインターロイキン-8、様々な増殖因子、インターフェロンγ等が、培養済み培地の混合物中に含まれ得る。例えば、インターロイキン-8の濃度は、100〜20000pg/mLであってもよく、インターフェロンγの濃度は、400〜400000pg/mLであってもよい。無血清培養培地がこのような大量のインターロイキン-8又はインターフェロンγを含有する場合、無血清培養培地から免疫細胞のみを分離することにより得られた無血清免疫細胞培養済み培地は、傷害及び熱傷を含む創傷治癒、アレルギーによる皮膚炎を含む皮膚疾患の処置、及びスキンケアに極めて有効な活性成分として作用することができる。
【００８９】
本発明の化粧用組成物は、無血清免疫細胞培養済み培地及び化粧用成分を含むことによるインターロイキン-8及びインターフェロンγの作用のために、皮膚のホワイトニング、色素沈着の除去及びしわの改善の少なくとも1つに効果的である。特に、無血清免疫細胞培養済み培地は、化粧用組成物の総質量に対して0.1質量%から50質量%の量で使用することができ、IL-8は、1pg/ml〜1200pg/mlの量で含有されていてもよく、インターフェロンγは、5pg/mlから15000pg/mlの量で含有されていてもよい。後述される実験例から明らかなように、炎症を改善する作用は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、座瘡、昆虫に噛まれたことによる炎症等において優れており、特に、痒みを急速に消去することにおいて有効であった。熱傷、傷害等の処置による皮膚再生作用及び色素沈着の除去の作用は、非常に優れており、皮膚のホワイトニングにも有効であったことが見出された。
【００９０】
本発明の化粧用組成物は、エマルジョン、リポソーム、塩等を含む化粧用組成物を作製して、本発明の免疫細胞培養方法により得られた免疫細胞培養済み培地が特定の質量で含まれること以外は当業界において周知のボディローション、スキンローション、エッセンス、クリーム等として生産するための当業界において公知の方法を使用することによって調製することができる。したがってそれらの詳細な説明は省略される。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、有効成分として無血清免疫細胞培養済み培地を含ませることにより、熱傷及び傷害を含む創傷又は皮膚疾患をインターロイキン-8及びインターフェロンγの作用によって処置するのに効果的である。本発明の医薬組成物は、様々な形態の非経口投与で投与することができる。組成物を製剤化する場合、本発明の医薬組成物は通常、希釈剤又は賦形剤等、例えば医薬的に許容されることが公知であるフィラー、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等を使用して製剤化される。
【００９２】
非経口投与のための医薬配合物としては、滅菌水溶液、非水性溶媒、懸濁液、乳剤及び凍結乾燥剤が挙げられる。例えば、皮膚に適用できる薬剤として、懸濁剤、液剤、発泡剤、乳剤(例えば、水/油(W/O)及び油/水(O/W)乳剤)、ゲル製剤等を使用することができる。
【００９３】
特定には、無血清免疫細胞培養済み培地は、医薬組成物の総質量に対して10wt%から80wt%の量で使用することができ、その場合、IL-8は、およそ100pg/mL〜8000pg/mLの量で含まれてもよいインターフェロンγは、およそ300pg/mL〜50000pg/mLの量で含まれてもよい。
【実施例１】
【００９４】
無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットを以下のように調製した。
【００９５】
1.  B単位の調製工程
2.2mgのIL-2及び100mlの500mMのL-グルタミン溶液を、浮遊細胞培養のための基礎培養培地(IL-2又はL-グルタミンがすでに基礎培地中に存在する場合、添加される量は、最終濃度になるように調整される)に添加し、溶解させ、最終的な溶液を10Lに調整して、基礎溶液(B溶液)を調製した。3.8Lのこの溶液を使用して、容器中に各36mLのこの溶液を入れ、ストッパーで閉じ、事前に用意した「B溶液」のラベルで標識することによってB単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。残りの6.2Lを使用して、他の単位を調製した。
【００９６】
2.  C1-1単位の調製工程
20ugのIL-12及び125ugのIL-18を蒸留水中に溶解させて、10mLにして、サイトカイン溶液(C溶液)を調製した。1mlのC溶液を1000mLの基礎溶液(B溶液)中に溶解させて、サイトカイン1-1溶液(C1-1溶液)を調製した。容器中に各4.5mLのこの溶液を入れ、ストッパーで閉じ、事前に用意した「C1-1溶液」のラベルで標識することによってC1-1単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。残りの110mLを使用して、D単位を調製した。
【００９７】
3.  C1-2単位の調製工程
5mlのC溶液を1000mLの基礎溶液中に溶解させて、サイトカイン1-2溶液(C1-2溶液)を調製した。容器中に各50mLのこの溶液を入れ、ストッパーで閉じ、事前に用意した「C1-2溶液」のラベルで標識することによってC1-2単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。
【００９８】
3.  C2単位の調製工程
20ugのIL-15をB溶液に添加して、1000mlにして、サイトカイン2溶液(C2溶液)を調製した。容器中に各9mLのC2溶液を入れ、ストッパーで閉じ、事前に用意した「C2溶液」のラベルで標識することによってC2単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。
【００９９】
4.  A1単位の調製工程
0.5mgの抗CD16及び抗CD56抗体のそれぞれを300mLのB溶液中に溶解させて、抗体1溶液(A1溶液)を調製した。容器中に各1mLの100mLの抗体1溶液を入れ、事前に用意した「A1溶液」のラベルで標識することによってA1単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。残りの200mLを使用して、A2単位を調製した。
【０１００】
5.  A2単位の調製工程
200mLのA1溶液及び3400mLのB溶液を混合して、抗体2溶液(A2溶液)を調製した。容器中にそれぞれ9mL及び27mLを入れ、事前に用意した「A2溶液」のラベルで標識することによってA2単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。この時点で、A1溶液及びA2溶液は、1ヶ月以内の短い有効期間を有するため、それらを以下のように調製し使用してもよい。
【０１０１】
6uLの抗CD16(1mg/mL)及び抗CD56(1mg/mL)抗体溶液のそれぞれ並びに3mLのB溶液を別々にパッケージングし、混合し、溶解させて、A1及びA2溶液を調製し、細胞を培養するときに使用することができる。
【０１０２】
すなわち、最初に、3mLのB溶液容器中に、6uLの別々にパッケージングされた抗CD16及び抗CD56抗体のそれぞれを溶解し、事前に用意した「A1溶液」のラベルで標識することによって調製された1mLのA1溶液を入れることによってA1単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵する。A2単位を、およそ2mLの残りの溶液及び34mLのB溶液を混合して、A2溶液を作製し、9mL及び27mLの調製されたA2溶液を別々に入れ、「A2溶液」のラベルで標識することによって調製し、冷蔵した状態で貯蔵して使用される。このケースにおいて、それらの有効期間を6ヶ月より長く延長することができる。
【０１０３】
6.  D単位の調製工程
C1-1溶液に500ugの抗CD3抗体を添加し、105mLにして、抗体-サイトカイン混合物溶液(D溶液)を調製し、各容器中に1mLを入れ、事前に用意した「D溶液」のラベルで標識することによってD単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵した。この時点で、D溶液は、1ヶ月以内の短い有効期間を有するため、それを以下のように調製し使用してもよい。
【０１０４】
5uLの抗CD3抗体溶液(1mg/mL)及び1mLのC1-1溶液を、個々の容器に別々にパッケージングしてD単位を調製し、D溶液は、使用時にそれらを混合することによって調製することができる。すなわち、使用前に、1mLのC1-1溶液中に5μLの抗CD3抗体を添加し溶解させ、「D1溶液、1日目」のラベルで標識することによってD単位を調製し、冷蔵した状態で貯蔵する。このケースにおいて、それらの有効期間を6ヶ月より長く延長することができる。
【０１０５】
7.無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットの調製
無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットは、調製されたB単位、C1-1単位、C1-2単位、C2単位、A1単位、A2単位及びD単位を入れることによって調製することができる。必要に応じて、それらは、使用順に従って、C1-1単位、C2単位、A1単位、D単位、C1-1単位、A2単位、C2単位、A2単位、B単位及びC1-2単位の順で配置することができる。
【実施例２】
【０１０６】
患者の血液からリンパ球及び自己血漿を調製した後、実施例1で得られた無血清免疫細胞培養培地に添加するためのキットを以下のように使用することによって、免疫細胞を培養した。
【０１０７】
1.リンパ球抽出及び自己血漿の調製工程
血液の単核細胞、例えばヒトリンパ球又は単核細胞は1.077より低い比重を有するという特徴に基づき、処置される患者の血液を、1.077の比重を有するフィコール-パックプラス溶液上に載せ、一定の遠心力で遠心分離した。比重の差に応じて、1.077より高い比重を有する赤血球及び顆粒球の層を下に分離し、1.077又はそれ未満の比重を有する単核細胞の層、血小板等を上に分離して、リンパ球を含有する単核細胞の層を得た。分離された単核細胞の層から、リンパ球のみを抽出した。
【０１０８】
より具体的には、50mLコニカルチューブ中に、血液をサンプリングした後に1日経過した患者Aからの30mLの末梢血液を入れ、遠心分離した後、自己血漿の上の層をヘパリンチューブ中に入れ、処置し、新しい50mLコニカルチューブ中に入れた。遠心分離後、上の層の血漿成分を自己血漿として調製した。
【０１０９】
次いで、PBSを血漿チューブに添加し、それから血漿を除去して、体積を30mlに調整し、よく混合した。混合物をフィコール-パックプラスを含有するチューブに移し、800×gで15分遠心分離した。リンパ球の第2の層を含有する軟膜層を分離し、50mlコニカルチューブ中に収集し、PBSで50mlの体積に調整し、混合した。その後、2〜3回遠心分離することによって上清を捨て、リンパ球を単離した。この時点で得られたリンパ球の数は、細胞1.0×107個であった。
【０１１０】
2.  0日目:単離されたリンパ球にC1-1単位のサイトカイン1-1溶液及びC2単位のサイトカイン2溶液の少なくとも1つを添加した後に自己血漿を添加する第1の工程を、以下のように実行した。
【０１１１】
単離されたリンパ球を、C1-1溶液1のバイアル(4.5mL)及び血清0.5mLで処置し、T25フラスコ中に入れ、CO2インキュベーター(インキュベーター)中で培養した。
【０１１２】
3.  1日目:第1の工程が実行された培地に、A1単位の抗体1溶液を添加する第2の工程を、以下のように実行した。
【０１１３】
A1溶液1のバイアル(1mL)をインキュベートしながらT25フラスコに添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１１４】
4.  2日目:第2の工程が実行された培地に、D単位の抗体-サイトカイン混合物溶液を添加する第3の工程を、以下のように実行した。
【０１１５】
D溶液1のバイアル(1mL)をインキュベートしながらT25フラスコに添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１１６】
5.  3日目:第3の工程が実行された培地にC1-1単位のサイトカイン1-1溶液を添加した後に、自己血漿を添加する第4の工程を、以下のように実行した。
【０１１７】
C1-1溶液(3日目)1のバイアル(4.5mL)をインキュベートしながらT25フラスコに添加し、0.5mlの自己血漿を添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１１８】
6.  4日目:第4の工程が実行された培地にA2単位の抗体2溶液を添加した後に、自己血漿又はFBSを添加する第5の工程を、以下のように実行した。
【０１１９】
インキュベートしたT25フラスコの底をスクレーパーで慎重に掻き取ることによって、全ての細胞をT75フラスコに移した。ここにA2溶液(4日目)1のバイアル(9mL)及び1mlの自己血漿又はFBS(又はそれに類似するもの)を添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１２０】
7.  5日目:第5の工程が実行された培地にC2単位のサイトカイン2溶液を添加した後に、自己血漿又はFBSを添加する第6の工程を、以下のように実行した。
【０１２１】
C2溶液1のバイアル(9mL)及び1mLの自己血漿又はFBS(又はそれに類似するもの)をインキュベートしながらT75フラスコに添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１２２】
8.  6日目:第6の工程が実行された培地に、A2単位の抗体2溶液及び自己血漿又はFBSを添加する第7の工程を、以下のように実行した。
【０１２３】
インキュベートしたT75フラスコの底をスクレーパーで慎重に掻き取ることによって、全ての細胞をT150フラスコに移した。ここにA2溶液1のバイアル(27mL)及び3mlの自己血漿又はFBS(又はそれに類似するもの)を添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１２４】
9.  7日目:第7の工程が実行された培地に、B単位の基礎溶液及び自己血漿又はFBSを添加する第8の工程を、以下のように実行した。
【０１２５】
B溶液1のバイアル(36mL)及び4mLの自己血漿又はFBS(又はそれに類似するもの)をインキュベートしながらT150フラスコに添加し、穏やかに振盪し、続いてインキュベーター中でインキュベートし続けた。
【０１２６】
10.  8日目〜14日目:第8の工程が実行された培地に、自己血漿又はFBSを添加し、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、培養する第9の工程を、以下のように実行した。
【０１２７】
8日目:この段階で培養されたT150フラスコの底をスクレーパーで掻き取ることによって、細胞を収穫することができる。しかしながら、この研究では、細胞を同定した直後に、10mlの自己血漿又はFBS(又はそれに類似するもの)のいずれかを添加して、細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液を、その3分の1が鉗子でホールドされている細胞培養培地を含有する1LのCO2透過性培養バッグに添加し、マッサージして細胞培養培地とよく混合し、均一に塗り広げ、5%CO2インキュベーター中37℃でインキュベートした。
【０１２８】
9日目:培養バッグを十分にマッサージして、細胞をよく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃でインキュベートした。
【０１２９】
10日目:3分の1で培養バッグをホールドする鉗子をバッグの3分の2まではずし、培養バッグを十分にマッサージし、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１３０】
11日目:バッグの3分の2で培養バッグをホールドする鉗子を完全にはずし、培養バッグを十分にマッサージし、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１３１】
14日目:遠心管中に最終的な培養済み培地を入れ、数回遠心分離することによって細胞を収穫した。収穫した細胞は、生理的食塩水バッグ中にパッケージングし、冷蔵又は凍結した状態で貯蔵してもよい。
【実施例３】
【０１３２】
実施例2で実行された第1から第7の工程を同様にして行った後に、以下の工程を更に行った。
【０１３３】
1.  7日目:第7の工程が実行された培地を、細胞と血清を含有する培養培地とに分離する第10の工程を、以下のように実行した。
【０１３４】
培養されたT150フラスコの培養済み培地を遠心分離して、免疫細胞と血清を含有する培養培地とに分離した。
【０１３５】
2.  7日目:第10の工程で分離された細胞を洗浄する第11の工程を、以下のように実行した。
【０１３６】
遠心分離した免疫細胞を、PBSで3回より多く洗浄した。
【０１３７】
3.  7日目:第11の工程で洗浄された細胞を、新しい培養容器に入れ、B単位の基礎溶液を添加し、培養する第12の工程を、以下のように実行した。
【０１３８】
洗浄した免疫細胞をT150フラスコ中に入れ、そこに100mlのB溶液を添加し、次いで細胞をCO2インキュベーター中で培養した。
【０１３９】
4.  8日目〜11日目:第12の工程が実行された培地を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する第13の工程を、以下のように実行した。
【０１４０】
8日目:T150フラスコで培養された細胞を含有する培養培地を、細胞培養培地を含有する1Lの培養バッグに移し、その2分の1を鉗子によってホールドし、50mLのC1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、バッグを5%CO2インキュベーター中37℃でインキュベートした。
【０１４１】
9日目:培養バッグを十分にマッサージして、細胞をよく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートした。
【０１４２】
10日目:バッグの2分の1で培養バッグをホールドする鉗子を除去し、培養バッグを連続的にインキュベートした。
【０１４３】
5.  11日目から14日目:第13の工程が実行された培地を、細胞と一次無血清培養済み培地とに分離する第14の工程;及び第14の工程で分離された細胞に、B単位の基礎溶液を添加し、細胞を、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、C1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培養する第15の工程を、以下のように実行した。
【０１４４】
11日目:細胞を含有する一次培養済み培地を、遠心分離(400×g)によって免疫細胞と一次無血清培養済み培地とに分離し、一次無血清培養済み培地を収集し、冷蔵する。
【０１４５】
二次細胞培養:一次培養培地から収穫した免疫細胞を、100mlのB溶液に懸濁する。細胞を含有する培養培地を、その2分の1が鉗子でホールドされている細胞培養培地を含有する1Lの培養バッグに移し、50mLのC1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培地を5%CO2インキュベーター中37℃でインキュベートする。
【０１４６】
12日目:細胞を十分にマッサージして、よく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１４７】
13日目:バッグの2分の1で培養バッグをホールドする鉗子を除去し、培養バッグを連続的にインキュベートする。
【０１４８】
14日目:細胞を十分にマッサージして、よく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１４９】
6.  15日目〜18日目:二次細胞収穫及び無血清免疫細胞培養済み培地の収集後の三次培養
【０１５０】
15日目:第15の工程に供された細胞を含有する二次培養済み培地を、遠心分離(400×g)によって免疫細胞と培養済み培地とに分離する。分離された培養済み培地を、無血清免疫細胞培養済み培地として冷蔵した状態で貯蔵する。
【０１５１】
三次細胞培養:二次培養培地から収穫した免疫細胞を100mlのB溶液に懸濁する。細胞を含有する培養培地を、その2分の1が鉗子でホールドされている細胞培養培地を含有する1Lの培養バッグに移し、50mLのC1-2単位のサイトカイン1-2溶液を添加し、培地を5%CO2インキュベーター中37℃でインキュベートする。
【０１５２】
16日目:細胞を十分にマッサージして、よく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１５３】
17日目:1LのCO2透過性バッグをバッグの2分の1でホールドする鉗子を除去し、培養バッグを連続的にインキュベートする。
【０１５４】
18日目:細胞を十分にマッサージして、よく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１５５】
7.  培養される細胞の状態に応じて6に記載した工程を更に1回又は複数回繰り返すことによって、1つのバッチで合計4リットル又はそれより多くの無血清培養済み培地を得ることができる。
【実施例４】
【０１５６】
実施例2で実行された第1から第8の工程を同様にして実行した後、以下の工程を更に実行した。
【０１５７】
1.  8日目〜10日目:第8の工程が実行された培地に、自己血漿又はFBSを添加し、細胞培養培地を含有する大容量細胞培養容器に入れ、培養する第9の工程(大量培養後に細胞を収穫する工程)を、以下のように実行した。
【０１５８】
8日目:全ての残りの自己血漿又はFBS(又はそれに類似するもの)を培養培地に添加する。培養中の細胞を含有する細胞を、その2分の1が鉗子でホールドされている細胞培養培地を含有する1LのCO2透過性培養バッグに移し、細胞を5%CO2インキュベーター中37℃でインキュベートする。
【０１５９】
9日目:培養バッグを十分にマッサージして、細胞をよく成長させ、次いで5%CO2インキュベーター中37℃で連続的にインキュベートする。
【０１６０】
10日目:1LのCO2透過性バッグをバッグの2分の1でホールドする鉗子を除去し、培養バッグを十分にマッサージし、培養バッグを連続的にインキュベートする。
【０１６１】
2.  11日目から、実施例3で実行された第10の工程から第15の工程を同様にして実行して、血清含有培養済み培地、及び一次無血清培養済み培地から四次無血清培養済み培地を得た。
【０１６２】
比較例
実施例2で第1の工程を行わずに比較培養済み培地を得たことを除き、実施例2に記載されたのと同じ方法を行った。
【０１６３】
実験例1
実施例2で得られた培養済み培地及び比較例で得られた比較培養済み培地における総細胞数及びNK細胞の比率を分析し、Table 1(表1)に結果を示す。
【０１６４】
【表１】
2019535293.tif 000003
【０１６５】
Table 1(表1)は、弱くなった免疫細胞、例えば患者から血液をサンプリングした後に1日経った血液から単離されたリンパ球に関して、リンパ球が活性化され、サイトカインによって回復し、次いで抗CD16及び抗CD56で刺激されると、増殖した細胞の数に加えてNK細胞の比率は、増加することを示す。
【０１６６】
実験例2
実施例3で得られた血清含有培養済み培地、一次無血清培養済み培地、二次無血清培養済み培地、三次無血清培養済み培地、及び四次無血清培養済み培地中の、培養された細胞の総数、インターロイキン-8及びインターフェロンγの含量、並びにNK細胞の比率を分析した。Table 2(表2)に結果を示す。
【０１６７】
Table 2(表2)は、細胞が4回まで培養される場合であっても、総細胞数、インターロイキン-8及びインターフェロンγの含量、並びにNK細胞の比率に関して好適な性能を有する培養済み培地を得ることができることを示す。
【０１６８】
【表２】
2019535293.tif 000004
【０１６９】
実験例3
実施例4で得られた血清含有培養済み培地、一次無血清培養済み培地、二次無血清培養済み培地、三次無血清培養済み培地、及び四次無血清培養済み培地中の、培養された細胞の総数、インターロイキン-8及びインターフェロンγの含量、並びにNK細胞の比率を分析した。Table 3(表3)に結果を示す。
【０１７０】
上記のTable 2(表2)及び下記のTable 3(表3)で示されるように、四次無血清培養済み培地が、実施例3と比較して7日より長い培養の後に得られる場合、総細胞数又はNK細胞の比率においては差がなかったが、インターロイキン-8及びインターフェロンγの含量は、おそらく免疫細胞の活性が低下するため約半分レベルに減少する。しかしながら、本発明によれば、従来の方法により得られた培養済み培地と比較して、血清の非存在下で好適な量のサイトカインを有する無血清免疫細胞培養済み培地を得ることができる。
【０１７１】
【表３】
2019535293.tif 000005
【０１７２】
上記の実験結果から、免疫細胞の二次代謝産物である様々なサイトカインの含量が、培地を交換した約2日後に鋭く増加し、約3日でほぼピークに達することが確認される。それゆえに、本発明において、サイトカインの含量が高い免疫細胞培養済み培地は、3〜4日のインターバルで二次培養済み培地から培養培地を換えることにより得ることができる。本発明の免疫細胞培養済み培地は大量のサイトカインを含有し、したがって皮膚のホワイトニング、色素沈着の除去及び皮膚再生作用において非常に有効であるため、それらは、治療剤として、又は化粧用資源として競争力のある資源であり得る。
【実施例５】
【０１７３】
実施例3で得られた5質量%の無血清免疫細胞培養済み培地を含有する以下のTable 4(表4)で示される組成物を有する化粧用組成物を調製した。
【０１７４】
【表４】
2019535293.tif 000006
【０１７５】
実験例4
実施例5で得られた化粧用組成物の炎症を改善し色素沈着を改善する作用を確認するために、化粧用組成物を、洗浄した後の2人のヒトの座瘡部位に午前と午後に2回適用した。7日目及び16日目に進行を示す写真をそれぞれ図1及び図2として示す。
【０１７６】
図1及び図2から、最初のうち座瘡は非常に重度であったが、経時的に座瘡は大幅に改善し、多くの沈着した色素も除去されたことが見出された。
【０１７７】
実験例5
実施例5で得られた化粧用組成物の炎症を改善し色素沈着を改善する作用を確認するために、化粧用組成物を、生きた昆虫に噛まれた赤い斑点の部位に午前と午後に2回適用した。進行を示す写真を、図3として示す。
【０１７８】
図3で示されるように、2日以内に炎症が迅速に除去され、痒みがなくなり、赤い斑点が消失したことが確認された。
【０１７９】
実験例6
実施例5で得られた化粧用組成物の炎症を改善し色素沈着を改善する作用を確認するために、化粧用組成物を、アレルギーを有する部位に午前と午後に2回適用した。進行を示す写真を、図4として示す。
【０１８０】
図4で示されるように、適用の1日以内に膿が除去されたが、示されていないが色素の除去には約1週間かかったことが確認された。
【０１８１】
実験例7
実施例5で得られた化粧用組成物の炎症を改善し色素沈着を改善する作用を確認するために、化粧用組成物を、時間差で様々なアレルギーが起こる広い部位に午前と午後に2回適用した。進行を示す写真を、図5として示す。
【０１８２】
図5で示されるように、炎症及び色素沈着が消失するまで約1週間かかった。
【実施例６】
【０１８３】
20質量%の実施例3で得られた無血清免疫細胞培養済み培地を含有する医薬組成物を調製した。20質量%の無血清免疫細胞培養済み培地を使用したことを除き、実施例3の Table 4(表4)と同様にして組成物を調製した。
【０１８４】
実験例8
実施例6で得られた医薬組成物の皮膚再生作用を確認するために、医薬組成物を、熱傷の部位に午前と午後に2回適用した。進行を示す写真を、図6として示す。
【０１８５】
具体的には、図6に示される斜めの創傷は、2016年6月の終わりにパン屋のオーブンで最初に熱傷した腕の結果であり、縦の創傷は、8月31日の2回目の熱傷の結果であった。医薬組成物を熱傷の部位に16日間午前と午後に2回適用した後、傷害を受けた表皮が回復し、沈着した色素が消失したことが確認された。熱傷の直後に医薬組成物を適用した場合、処置作用はより一層優れていた。
【０１８６】
上述したような好ましい例示的な実施形態を参照しながら本発明を具体的に示し説明したが、本発明は上述した例示的な実施形態に限定されず、当業者によって、本発明の本質から逸脱しない範囲内で様々な変更及び改変をなすことが可能であることが明確に理解される。
【図１】
2019535293.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2019535293.tif 000015
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