(57)【要約】本発明は、試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出する方法に関し、この方法は、ｉ）試料を対象となる分子に特異的に結合するリガンドと接触させるステップであって、前記リガンドは、フィコエリトリンまたはその誘導体からなる蛍光色素にコンジュゲートされた、接触させるステップ、ｉｉ）ステップｉ）からの混合物の、３３０および４２５ｎｍの間の波長範囲をもつ少なくとも１つの光源による励起するステップ、ｉｉｉ）ステップｉｉ）において励起された混合物による５５０ｎｍ以上の波長における光の放出を検出するステップ、およびｉｖ）対象となる分子が試料中に存在するかどうかをステップｉｉｉ）の結果に基づいて決定するステップを備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出するための方法であって、
ｉ）前記試料を対象となる前記分子を特異的に結合するリガンドと接触させるステップであって、前記リガンドは、フィコエリトリンまたはその誘導体からなる蛍光色素にコンジュゲートされた、前記接触させるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の混合物を３３０および４２５ｎｍの間の波長範囲をもつ少なくとも１つの光源によって励起するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において励起された前記混合物によって５５０ｎｍ以上の波長で放出された光を検出するステップと、
ｉｖ）前記試料中の対象となる前記分子の有無をステップｉｉｉ）の結果に基づいて決定するステップと
を備える方法。
【請求項２】
対象となる前記少なくとも１つの分子は、タンパク質、脂質、炭水化物、脂質もしくは糖脂質構造または炭水化物ユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は、細胞を備えるか、または備える可能性がある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象となる前記少なくとも１つの分子の特異的リガンドは、抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光色素は、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉ）の前記混合物を励起するために用いられる前記少なくとも１つの光源は、４００および４１０ｎｍの間の波長範囲を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｉ）の前記混合物を励起するために用いられる前記少なくとも１つの光源は、４０５ｎｍの波長で放出するバイオレットレーザまたはバイオレットレーザダイオードである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中の対象となる少なくとも１つの第２の分子の同時同定をさらに備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
フローサイトメータ上で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出するためのフィコエリトリンまたはその誘導体からなる蛍光色素の使用であって、前記蛍光色素の励起波長が３３０および４２５ｎｍの間であることを特徴とする、使用。
【請求項１１】
生体試料中の細胞または微粒子亜集団の分離、解析または計数のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１２】
前記細胞または微粒子亜集団は、造血起源である、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月１８日出願の仏国特許出願第１６／００７９２号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の範囲
本発明は、蛍光マーカーの分野、より具体的には、試料中の生物学的標的の検出のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体試料中の細胞亜集団の同定および計数は、現在、基礎研究ならびに診断目的の医療試験機関の両方において決定的に重要な要素である。
【０００４】
これを目指して、様々な同定方法が開発され、その中でも、特に、フローサイトメトリー（ＦＣＭ：ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）技術が最近は広く用いられている。
【０００５】
フローサイトフルオロメトリー（Ｆ−ＣＦＭ：ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）は、単細胞解析のために現在採用されている技術である。この技術は、細胞亜集団をそれらのサイズ、および特異的細胞表面マーカーの有無に従って分離することを可能にする。これらの表面マーカーの検出は、それゆえに、フルオロフォアに連結された特異的リガンドを用いて達成される。
【０００６】
特に、ＦＣＭは、白血病およびリンパ腫のイムノフェノタイピングなど多くの診断用途において血液細胞の免疫学的解析のために現在用いられている。これらのアプローチは、蛍光コンジュゲートされたモノクローナル抗体（ｍＡｂ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、および可視光スペクトル内の広い色（波長）配列における様々な蛍光色素にコンジュゲートされた他の特異的プローブの使用を必要とする。
【０００７】
赤色（例えば、６３３ｎｍまたは６４５ｎｍ）で、およびより最近にはバイオレット（４０５ｎｍ）で利用可能な小型で経済的に存立できる新しいレーザ源によって、ＦＣＭ技術は、現在、３つのレーザ、青色（４８８ｎｍ）、赤色（６４５ｎｍ）およびバイオレット（４０５ｎｍ）が装備され、結果として、蛍光色素の使用を支援する機器へ進化した。実際、これらのレーザは、空間的および時間的に分離されるので、各レーザによって誘起される様々な蛍光＜色＞を独立して干渉なしに測定することが可能である。
【０００８】
この技術的な進化と並行して、対象となる細胞または微粒子亜集団のますます多くの新しい表面マーカーが次第に同定された。これは、様々な標的集団を区別できるようにするために、それらの光学的特性が異なるフルオロフォアを処理することを必要とした。
【０００９】
しかしながら、鑑別診断に有用な新しいフルオロフォアを得ることは、複雑な研究作業を必要とする。確かに、＜良好な＞フルオロフォアは、厳密な基準、例えば：
１）著しい吸光係数
２）高い量子収率（０．８〜０．９）
３）不十分なトリプレット収率
４）励起状態（単数または複数）の短寿命
５）大きいストークスシフト
６）低い光退色
を満たす分子を除いて、特定の波長で光を吸収でき、次に光を再放出できる単純な分子を同一視しない。
【００１０】
これらの必要条件を考えると、特に、ある励起波長（４０５ｎｍレーザ）に関しては、現在利用可能なフルオロフォアのパネルが依然として限られる。
【００１１】
初期のＦＣＭ応用から細胞フェノタイピングに用いられたフルオロフォアのうちにフィコビリタンパク質がある。
【００１２】
このタンパク質は、光を取り込む（そして免疫調節、抗炎症、抗酸化、および栄養特性も有する）補助色素の群であり、特に特許文献１／特許文献２／特許文献３および特許文献４においてそれらの特性が広く解明された。
【００１３】
現在でも、これらのフルオロフォアは、ＦＣＭ解析および他の細胞同定方法にしばしば用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第４，５４２，１０４号
【特許文献２】米国特許第５，０５５，５５６号
【特許文献３】米国特許第４，８５９，５８２号
【特許文献４】欧州特許第００７６６９５（Ｂ１）号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
確かに、これらの分子は、フルオレセイン、４８８ｎｍ青色レーザによって励起可能なことが知られる主要な蛍光色素の蛍光に相補的な蛍光スペクトル信号を発生させることが可能である。しかしながら、このタイプのレーザが長らく第１のサイトフルオロメータが装備された唯一の励起光源であった。
【００１６】
フィコビリタンパク質のうちでも、特にフィコエリトリン（ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）は、その高い量子収率（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）の量子収率よりずっと高い）、（約５６０ｎｍにおける、より高いピークに加えて）約４８８ｎｍにおける非常に有用な２次励起ピーク、およびＦＩＴＣの放出スペクトルと比較して優れたその放出スペクトルの相補性に起因して、急速に、より大きな興味を呼んでいる。これらの特性が、今日に至るまで、フィコエリトリンをＦＣＭベースのイムノフェノタイピングにおける主要な蛍光色素にした。
【００１７】
そのうえ、４８８ｎｍレーザに適合する新しい蛍光＜色＞に対する需要の高まりが、単一のレーザを用いて５色のイムノフェノタイピングを可能にするＰＥタンデム（例えば、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄまたはＥＣＤ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７．．．）の開発を助長した。最後に、ＦＣＭにおけるこのより大きい用途に、ＦＣＭベースの多重イムノアッセイの最新の１つが追加され、このイムノアッセイでは、ｍＡｂコンジュゲート（＜レポーターコンジュゲート＞）の形態のすべての単一蛍光イムノアッセイの指標としてＰＥがより頻繁に用いられる。
【００１８】
それゆえに、ＰＥは、何年もの間、ＦＣＭのみならず、より広く、レセプタ／リガンド分子相互作用に基づくすべての分析、検出または分離方法について特に興味深い蛍光色素であった。
【００１９】
図１に示されるように、ＰＥの励起（吸収）スペクトルは、一般に、４５０ｎｍより記述され、まず初めに４９０ｎｍにおける２次ピークを含み、５６０ｎｍにおけるより大きいピークがそれに続く。従って、ＰＥは、４８８および５６１ｎｍの間の波長をもつ励起光源とともに常に用いられ、ＰＥが、約４０５ｎｍに励起波長をもつ満足すべき蛍光色素を構成するであろうことを示唆するものは何もなかった。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
しかしながら、驚くべきことに、本発明の発明者らは、今や、フィコエリトリンを蛍光色素として、４８８および５６１ｎｍの間を放出するレーザのみならず、バイオレットレーザ（４０５ｎｍ）とも一緒に用いることが可能なことを強調した。
【００２１】
本発明は、それゆえに、４８８ｎｍまたは５６０ｎｍに近い従来の波長の代わりに４０５ｎｍに近い励起波長を用いることによる、ＰＥおよびその誘導体、例えば、そのタンデム誘導体の新しい使用に関する。
【００２２】
第１の目的によれば、本発明は、試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出するための方法に関し、方法は、
ｉ）試料を対象となる分子を特異的に結合するリガンドと接触させるステップであって、前記リガンドは、フィコエリトリンまたはその誘導体からなる蛍光色素に連結された、接触させるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の混合物を３３０ｎｍおよび４２５ｎｍの間の波長範囲をもつ少なくとも１つの光源によって励起するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において励起された混合物によって５５０ｎｍ以上の波長で放出された光を検出するステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）において得られた結果に基づいて試料中の対象となる分子の有無を決定するステップと
を備える。
【００２３】
本発明の方法は、それゆえに、フィコエリトリンまたはその誘導体のうちの１つからなる蛍光色素にコンジュゲートされた少なくとも１つのリガンド、３３０ｎｍおよび４２５ｎｍの間の波長をもつ光を放出する少なくとも１つの光源、ならびに励起された蛍光色素によって放出される光の少なくとも１つの検出器を備える適切なシステム上で実施できる。
【００２４】
そのうえ、本方法は、同じ試料中の第２、第３、第４および第５の（または何番目もの）対象となる分子の同時検出も目指してよい。
【００２５】
本発明の別の目的は、試料中の対象となる少なくとも１つの分子の検出のためのフィコエリトリンまたはその誘導体のうちの１つからなる蛍光色素の使用に関し、用いられる励起波長は、３３０ｎｍと４２５ｎｍの間にあり、好ましくは４０５ｎｍにあることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）ならびにそのタンデムのうちの３つ、すなわちＲ−ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ、Ｒ−ＰＥ−Ｃｙ５．５およびＲ−ＰＥ−Ｃｙ７の吸収／励起スペクトル（一点鎖線）および放出スペクトル（実線、曲線下影付き領域）を示す（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ＳｐｅｃｔｒａＶｉｅｗｅｒ，  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから改編した）。ｘ軸上には波長（ｎｍ単位）が提示され、ｙ軸は、相対吸光度または放出強度（％単位）を示す。曲線は、４００〜４５０ｎｍからのみ概略が示され、Ｒ−ＰＥについては約４９０、５３０および５６０ｎｍに明らかな励起ピークをもつ。これら３つの励起ピークに加えて、追加の励起ピークをＲ−ＰＥ−Ｃｙ５．５（６６０ｎｍ）およびＲ−ＰＥ−Ｃｙ７（７６０ｎｍ）について視認できる。Ｒ−ＰＥの放出スペクトルは、５７５ｎｍに中心があるガウス関数である。タンデムの放出スペクトルは、最長波長へシフトして、６１５ｎｍ（Ｒ−ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ）、６９４ｎｍ（Ｒ−ＰＥ−Ｃｙ５．５）および７７６ｎｍ（Ｒ−ＰＥ−Ｃｙ７）に中心がある。
【図２】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。青色およびバイオレットレーザの公称パワーは、それぞれ２２ｍＷおよび４０ｍＷに等しい。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光が相関した仕方で解析される。
【図３】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。青色レーザの公称パワーが１０ｍＷへ減少されるのに対して、バイオレットレーザの公称パワーは、４０ｍＷに維持される。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光が相関した仕方で解析される。
【図４】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。青色レーザの公称パワーが次に５ｍＷへ減少されるのに対して、バイオレットレーザの公称パワーは、４０ｍＷに維持される。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光が相関した仕方で解析される。
【図５】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。青色およびバイオレットレーザの公称パワーは、それぞれ２２ｍＷおよび４０ｍＷに等しい。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光が相関した仕方で解析される。
【図６】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。バイオレットレーザの公称パワーが１０ｍＷへ減少されるのに対して、青色レーザの公称パワーは、２２ｍＷに維持される。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光が相関した仕方で解析される。
【図７】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。バイオレットレーザの公称パワーが次に５ｍＷへ減少されるのに対して、青色レーザの公称パワーは、２２ｍＷに維持される。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光が相関した仕方で解析される。
【図８】青色レーザによって励起されたフィコエリトリンのバイオレットレーザの読出しチャンネルにおける洩れがないことを示す。増加する量のＲ−ＰＥでコーティングされたポリスチレンビーズがキャリブレータとしての機能を果たし、青色およびバイオレットレーザによって励起される。ＦＬ２は、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。分析の間にバイオレットレーザをアイリスにより遮光して、その公称パワーを４０ｍＷから０ｍＷへ人為的に低下させることを可能にし、青色レーザの公称パワーは、２２ｍＷで一定に保たれる。最初に、ビーズシングレットが２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択され、それらのＦＬ２およびＦＬ１０が相関した仕方で解析される。
【図９】強く染色した試料と軽く染色した試料とを区別する、バイオレットレーザによって励起されたＰＥ−Ｃｙ５．５の能力を示す。可変量のヤギ抗マウス抗体でコーティングされたまたはされないいくつかのキャプチャービーズが、ＰＥ−Ｃｙ５．５にコンジュゲートされた抗ＣＤ−４５抗体に曝露される。試料がバイオレットおよび青色レーザによって継続的に励起され、それによって、空間的および時間的な分離が各レーザから放出された蛍光信号の差次的な解析を可能にする。ＦＬ４は、ＰＥ−Ｃｙ５．５の蛍光を集光するために、７３０ＤＣＳＰダイクロイックミラーの背後で６９５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からの信号に対応する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーによる偏向後に同一のフィルタ（６９５ＢＰ３０）を通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からの信号に対応する。
【図１０】ＣＤ４５マーカーを用いたフローサイトメトリーを通じての正常造血細胞の血液細胞亜集団の同定を示す。４８８ｎｍにおける抗ＣＤ４５−ＰＥコンジュゲート抗体の励起は、図（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）に概略が示される。４０５ｎｍにおける抗ＣＤ４５−ＰＥ−コンジュゲート抗体の励起は、図（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）に概略が示される。血液細胞亜集団の追跡および定量化が図（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）によって表される。図（Ｅ）および（Ｆ）は、４つの亜集団：リンパ球（Ｌｙ）、単球（Ｍｏ）、顆粒球（ＰＭＮ）および残存赤血球（Ｅｒｙ）を組み合わせた単一パラメータ・ヒストグラムにおける表現である。
【図１１】ＣＤ４５マーカーを用いたフローサイトメトリーを通じての正常造血細胞および白血病の血液細胞亜集団の同定を示す。低レベルのＣＤ４５発現を有する異常細胞のモデルとして役立つ、ＬＰ１細胞が、正常白血球と比較して１０％の比で加えられた。４８８ｎｍにおける抗ＣＤ４５−ＰＥコンジュゲート抗体の励起は、図（Ａ）、（Ｃ）および（Ｅ）に概略が示される。４０５ｎｍにおける抗ＣＤ４５−ＰＥ−コンジュゲート抗体の励起は、図（Ｂ）、（Ｄ）および（Ｆ）に概略が示される。ＬＰ１細胞が補充された血液細胞亜集団の追跡および定量化が図（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）によって表される。図（Ｃ）および（Ｄ）は、白血病芽球のみを表示する。図（Ｅ）および（Ｆ）は、５つの亜集団：ＬＰ１細胞株（ＬＰ１）のリンパ球（Ｌｙ）、単球（Ｍｏ）、顆粒球（ＰＭＮ）、残存赤血球（Ｅｒｙ）および白血病細胞を組み合わせた単一パラメータ・ヒストグラムにおける表現である。
【図１２】ＣＤ４５およびＣＤ３３マーカーを用いたフローサイトメトリーを通じての正常および白血病造細胞の血液細胞亜集団の同定を示す。低レベルのＣＤ４５発現（ＣＤ４５  ｌｏｗ）を有する異常な急性骨髄性白血病（ＡＭＬ：Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）のモデルとして役立つ、ＨＬ６０およびＮＢ４細胞が、５０，０００細胞／試料の量で加えられた。４８８ｎｍにおける抗ＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗体の励起は、図（Ａ）に概略が示される。４０５ｎｍにおける抗ＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗体の励起は、図（Ｂ）に概略が示される。ＨＬ６０およびＮＢ４細胞が補充された血液細胞亜集団と関連する追跡および統計が図（Ａ）および（Ｂ）によって表される。図（Ｃ）および（Ｄ）は、好中球（ＮｅｕおよびＰＭＮ２）、リンパ球（Ｌｙ）、残存赤血球（ＲＢＣ）および追加された白血病細胞（ＨＬ６０およびＮＢ４）を含んだ正常血液細胞亜集団の分布の２色２パラメータ表現である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第１の目的は、試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出するための方法に関し、方法は、
ｉ）試料を対象となる分子を特異的に結合するリガンドと接触させるステップであって、前記リガンドは、フィコエリトリンまたはその誘導体からなる蛍光色素にコンジュゲートされた、接触させるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の混合物を３３０および４２５ｎｍの間の波長範囲をもつ少なくとも１つの光源によって励起するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において励起された混合物によって５５０ｎｍ以上の波長で放出された光を検出するステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の結果に基づいて試料中の対象となる分子の有無を決定するステップと
を備える。
【００２８】
本発明者らは、以下の実施例に示されるように、フィコエリトリンが、４０５ｎｍにおけるレーザによる励起後に、かかるレーザと関連した蛍光色素としてのその使用を可能にするなどの蛍光特性を有することを強調した。
【００２９】
＜対象となる分子＞という語句は、試料中のその存在が推測される生物学的マーカーを指す。かかる生物学的マーカーは、タンパク質、核、糖質、脂質または糖脂質性とすることができる。
【００３０】
好ましくは、本発明の方法によって検出される生物学的マーカーは、タンパク質、脂質、炭水化物、脂質もしくは糖脂質構造、または炭水化物ユニットである。
【００３１】
好ましくは、本発明の方法によって検出される生物学的マーカーは、タンパク質である。
【００３２】
＜試料＞という用語は、任意のタイプの試料、主に、組織（筋肉、骨、器官など．．．）、体液（血液、唾液、尿、涙、精液、乳、気管支肺胞液、肋膜液、脳脊髄液など．．．）、対象となる分子、具体的には粒子、特に、細胞を含んだ液体懸濁物、真核生物または原核生物、例えば、インビトロ培地または発酵液、浴水または飲料水、注射液からなる生体試料を指す。
【００３３】
好ましくは、本発明の検出方法に用いられる試料は、好ましくは動物の体に、特に人体に由来する細胞、原核生物もしくは真核生物、好ましくは真核生物を含むか、または含むと思われる。かかるケースにおいて、検出される対象となる分子は、細胞内にあるか、または細胞の原形質膜に固着した分子とすることができる。
【００３４】
好ましくは、対象となる分子は、細胞当たり少なくとも１，０００コピーの、より好ましくは細胞当たり少なくとも２，５００コピーの、さらにより好ましくは細胞当たり少なくとも５，０００コピーの濃度で試料中に存在する。
【００３５】
好ましくは、対象となる分子は、細胞当たり１，０００〜２，０００．０００超のコピー、より好ましくは細胞当たり７，５００〜１，５００．０００コピー、より好ましくは細胞当たりさらに１０，０００〜１５０，０００コピーに及ぶ濃度で試料の細胞上／中に存在する。
【００３６】
本発明のある特定の実施形態によれば、対象となる分子は、細胞当たり少なくとも７，５００コピーの濃度で試料の細胞上／中に存在する。
【００３７】
＜リガンド＞という用語は、対象となる標的分子に物理的かつ可逆的に結合することが可能な巨大分子を指す。この相互作用は、対象となる分子とその特異的リガンドとの間の相補性のゾーンの存在により可能である。リガンドと対象となる分子との間の結合は、例として、静電結合、ファンデルワールス力、イオンまたは水素結合を通じて、さらに疎水相互作用により非共有結合を確立することによって行われる。対象となる分子がタンパク質であるときに、リガンドは、このケースでは抗体、抗体フラグメントまたは誘導体構造（Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ナノボディ、アプタマー、アフィマー．．．）であってよい。対象となる分子がグリコシル化された決定因子であるときに、リガンドは、レクチンまたはバクテリア毒素（例えば、多数の膜抗原のグリコシルホスファチジルイノシトール・アンカーへのその親和性のためのＦＬＡＥＲ）とすることができる。対象となる分子が脂質（例えば、ホスファチジルセリン、セラミド、ＧＤ２、ＧＤ３．．．）であるときに、リガンドは、（限定はされないが）アネキシン、ラクタドヘリン、コレラ毒素．．．などのアフィンタンパク質とすることができる。最後に、対象となる分子がハプテン（ビオチン、ＤＮＰ、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ．．．）であるときには、アビジン、抗ハプテン抗体のストレプトアビジンが含まれうる。最後に、任意のリガンドに対して、そのレセプタのうちの１つがプローブとして用いられてよい。リガンドまたは対象となる分子の性質に係わらず、リガンドと対象となる分子との間の会合の安定性は、この結合に固有の会合または平衡係数（Ｋａ）を決定することによって定量可能である。この定数は、対象となる複合体のリガンド−分子の濃度と、遊離リガンド濃度および対象となる遊離分子の積との間の比に対応する。この結合が適格に特異的であるためには、この定数が１０６Ｌｍｏｌ−１以上でなければならない。
【００３８】
好ましくは、本発明の検出方法において試料と接触するリガンドは、抗体である。
【００３９】
＜蛍光色素＞という用語は、紫外から赤外までの波長の範囲内の光ビームによる照射後に、より低エネルギーのフォトンを次に放出することが可能な任意のタイプの化合物を指す。照射は、典型的に照明である蛍光を発生させる。フォトンの放出は、光エネルギーの吸収の結果として生じた励起状態から基底状態への分子の電子遷移（緩和）の間に生じる。従って、蛍光色素によるフォトンの吸収は、励起フォトンと比較して、より長い波長およびより低いエネルギーの別のフォトンの放出につながる。光ビームの波長およびエネルギーに依存して、蛍光色素は、様々な励起状態に達しうる。
【００４０】
各蛍光色素は、それ自体に固有の吸収スペクトル、励起スペクトルおよび放出スペクトルを有する。蛍光色素の吸収スペクトルは、その励起に係わらず、吸収されるその波長範囲によって画定される。蛍光色素の励起スペクトルは、励起を効果的に誘起するその波長範囲によって画定され、蛍光色素が達成できる励起状態の範囲を反映する。蛍光色素がその最大励起に対応する波長で照明（励起）されたときには、蛍光色素の放出が最大である。逆に、蛍光色素がその最大励起以外の波長で励起されるならば、放出長は、それゆえに同じであるが、蛍光強度がより低い。
【００４１】
所与の蛍光色素に対する蛍光効率は、放出されるフォトン数と蛍光色素によって吸収されるフォトン数との間の比によって定義される量子収率ファイ（Φ）によって決定される。従って、この量子収率は、所与の波長における吸収および励起を区別することを許容する。典型的に、蛍光色素は、０．１および１の間の量子収率を有する。量子収率ファイΦが励起波長に依存しないので（Ｋａｓｈａ則）、蛍光色素の放出スペクトル形状は、励起光源の波長に係わらず、不変である。それでもなお、蛍光色素の放出スペクトルの強度は、励起波長に従って変化する。
【００４２】
吸収強度、もしくは消衰係数ε、または比吸光度は、吸収確率を反映し、係数εが高いほど、同じ光強度における蛍光がより高い。
【００４３】
蛍光色素の蛍光強度または輝度は、消衰係数および量子収率の積によって決定される。この積が高いほど、蛍光色素がより明るい。
【００４４】
フルオロフォア、蛍光色素または蛍光プローブという用語は、等価であり、同義で用いられてよい。
【００４５】
＜フィコエリトリン＞という用語は、シアノバクテリア、紅藻類およびある種のクリプト植物から抽出されたフィコビリタンパク質のファミリーに属するタンパク質を指す。フィコビリタンパク質は、フィコビリンとして知られるクロモフォアに共有結合的に結合されたアポタンパク質からなる。アポタンパク質は、三量体（αβ）３または六量体（αβ）６の形態で組織された、サブユニットαおよびβと呼ばれる２つの別個のポリペプチドを備えるモノマーの構造を有する。かかる典型的な複合体は、第３のタイプのサブユニット、γ鎖も有してよい。
【００４６】
フィコビリタンパク質の吸光度特性は、少なくとも１つのポリペプチドのシステイン残基とのチオエーテル結合を通じてサブユニットα、βおよびγに結合された開鎖テトラピロール補欠分子族の存在に起因する。
【００４７】
フィコエリスロビリン(ＰＥＢ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｏｂｉｌｉｎ）およびフィコウロビリン（ＰＵＢ：ｐｈｙｃｏｕｒｏｂｉｌｉｎ）は、紅藻類から抽出されたフィコエリトリンのテトラピロール補欠分子族の２つの主要なタイプを構成する。
【００４８】
ＰＥＢおよびＰＵＢ群の数は、フィコエリトリンの細胞起源によって変化しうる。このように、フィコエリトリンの５つのクラスが同定された、すなわち、Ｃ−フィコエリトリン（Ｃ−ＰＥ）は、サブユニットα当たり２つのＰＥＢおよびサブユニットβ当たり３つのＰＥＢを結合させ、ＣＵ−フィコエリトリン（ＣＵ−ＰＥ）は、サブユニットα当たり２つのＰＥＢならびにサブユニットβ当たり３つのＰＥＢおよび１つのＰＵＢを結合させ、ｂ−フィコエリトリン（ｂ−ＰＥ）は、サブユニットα当たり２つのＰＥＢおよびサブユニットβ当たり４つのＰＥＢを結合させ、Ｂ−フィコエリトリン（Ｂ−ＰＥ）は、サブユニットα当たり２つのＰＥＢ、サブユニットβ当たり３つのＰＥＢ、ならびにサブユニットγ当たり２つのＰＥＢおよび２つのＰＵＢを結合させ、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）は、サブユニットα当たり２つのＰＥＢ、サブユニットβ当たり２つのＰＥＢおよび１つのＰＵＢ、ならびにサブユニットγ当たり１つのＰＥＢおよび３つのＰＵＢを結合させる。
【００４９】
ＰＥＢおよびＰＵＢ群の数の比が様々なフィコエリトリンの分光特性を画定する。それゆえに、ＰＥの最大励起ピークは、一般に、約５４５ｎｍ（ｂ−ＰＥ）から約５６５ｎｍ（Ｒ−ＰＥ）へ変化する。
【００５０】
ある特定の実施形態によれば、蛍光色素は、フィコエリトリン−Ｒ（Ｒ−ＰＥ）であり、好ましくは本発明による検出方法に用いられるＰＥは、紅藻類から抽出される。
【００５１】
図１に示されるように、フィコエリトリンの吸収スペクトルは、４００〜４５０ｎｍと６００ｎｍとの間の範囲にわたって測定され、約４９０ｎｍ、５３０ｎｍおよび５６０ｎｍにおける極大吸収強度に対応する３つの主な吸収のピークを呈する。ＦＣＭ文献およびすべての教科書がユーザに教えるのは、ＦＣＭに用いられる最も入手し易いレーザ源を利用してこれら３つの吸収ピークのうちの１つを選択することであり、これらのレーザ源は、市場で現在入手できるデバイスの謂わば全体に存在する４８８ｎｍにおける青色レーザ、５３０ｎｍにおける緑色レーザ、およびより最近では５６０ｎｍにおける黄色レーザである。しかしながら、今までのところ知られていなかったのは、約４００ｎｍにおける非常に低い吸収が、ＰＥの満足すべき十分な励起と、それゆえに、ヒト血液中の白血病芽球などの、潜在的に診断上の関心がある血液学的細胞亜集団の同定に適用可能であり、かつ繰り返すこともできる蛍光の達成とを許容するであろうということである。確かに、所与の波長で光を吸収する蛍光色素が必ずしもこの波長で効率的に励起されるわけではない。物質の励起スペクトルは、一定の波長で放出される蛍光を分光蛍光光度計を用いて測定し、励起波長を変化させることによって得られる。
【００５２】
蛍光放出スペクトルは、吸収スペクトルと比較してより長い波長へ常にシフトする。物質の放出スペクトルは、種々の放出波長で放出された蛍光を測定することによって得られ、物質は、一定波長で励起される。ほとんどの蛍光色素とは違って、ＰＥの放出スペクトルは、その吸収スペクトルのより長い波長への単なるシフトには対応しない。図１に詳しく示されるように、ＰＥの放出スペクトルが５７５ｎｍ上に中心があるガウス関数であるのに対して、励起スペクトルは、複数の極大をもつ複雑な形状を示す。しかしながら、時にはＰＥの放出を５５０ｎｍから検出できる。蛍光放出スペクトルの形状が励起波長に依存しないのに対して、蛍光放出の強度は、フルオロフォアによって吸収される励起ビームパワーに直接比例する。
【００５３】
このスペクトルに基づいて、当業者は、４８０ｎｍと５００ｎｍとの間の波長をもつ、青色光源か、または５３０および５６５ｎｍの間の波長をもつ、緑色／黄色光源のいずれかによる、このフルオロフォアに最適かまたはわずかに準最適な励起強度に対応する波長を常に用いた。
【００５４】
クリプト植物から抽出されたＰＥのクロモフォアは、クリプトビオリン（ＣＶ：ｃｒｙｐｔｏｎｖｉｏｌｉｎ）も含む。サブユニットα当たり２つのＰＥＢおよび２つのＣＶ、ならびにサブユニットβ当たり１つのＰＥＢを結合させるフィコエリトリン−５４４（ＰＥ−５４４）が特にこのケースである。フィコエリトリン−５５５（ＰＥ−５５５）およびフィコエリトリン−５６８（ＰＥ−５６８）は、ＰＥＢを２つのサブユニット・タイプαおよびβに結合させる。クリプト植物から抽出されたＰＥは、サブユニットγを何も有さないと思われる。クリプト植物から抽出されたＰＥの励起スペクトルは、一般に、５４４ｎｍ（ＰＥ−５４４）と５６８ｎｍ（ＰＥ−５６８）との間で変化する。
【００５５】
ある具体的な実施形態によれば、蛍光色素は、フィコエリトリン−Ｒ（Ｒ−ＰＥ）であり、好ましくは本発明による検出方法に用いられるＰＥは、紅藻類から抽出される。
【００５６】
商業形態のＲ−ＰＥは、すでに活性化された形態の凍結乾燥品として（例えば、Ｌｙｏ（ＳＭＣＣ）−ＲＰＥ，参照．ＦＥＢＩＣＯによって供給されるＬ１もしくはＬ１ＳＭ）、または、液体形態で（例えば、ＰｈｙｃｏＰｒｏ（商標）ＲＰＥ，参照．ＰＲＯＺＹＭＥによって供給されるＰＢ３２、もしくはＲ−フィコエリトリン，参照．ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮによって供給されるＰ８０１）、あるいはさらにしばしば、使用直前に再可溶化され、活性化される硫酸アンモニウム沈殿物の形態でも（ＦＥＢＩＣＯ、ＰＲＯＺＹＭＥ）入手できる。
【００５７】
蛍光色素のリガンドとの連結は、当業者によく知られた技術に従って実行される（Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ａｕｇｕｓｔ，２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｍｒ．ｃｏｍ／ａｂｃｏｎ／））。端的には、ＰＥの抽出および精製後に、後者が化学的に活性化され、チオール基に対して反応性になることを可能にする。リガンドは、還元相を経て、反応する準備ができたチオール基の放出を可能にする。従って、リガンドのＰＥとの共有結合を実行できる。
【００５８】
ＰＥのリガンドとのコンジュゲーションを実行するために必要なすべての試薬を含む商業キット（例えば、ＰｈｙｃｏＬｉｎｋ（登録商標）Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲーション・キット，参照．ＰＲＯＺＹＭＥによって市販されるＰＪ３１Ｋ，Ｒ−フィコエリトリン・コンジュゲーション・キット，参照．ＡｂＣＡＭによって市販されるａｂ１０２９１８）を入手できる。
【００５９】
＜フィコエリトリン誘導体＞という語句は、ＰＥと別の蛍光化合物との間で形成されたタンデム複合体を指す。ＰＥとこの第２の蛍光化合物との間の共有結合の確立は、ＰＥからこの第２の蛍光化合物への共鳴によるエネルギー転移を許容する。このケースでは、ＰＥがドナー蛍光色素と呼ばれ、第２の蛍光化合物がアクセプタ蛍光色素と呼ばれる。これらのタンデムの目的は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、およびそれに応じて、ドナー蛍光色素の一次励起と、アクセプタ蛍光色素の放出との間の大規模なシフト（Ｓｔｏｋｅｓシフト）を得ることである。このように、ＰＥタンデム複合体は、ＰＥのものに対応する励起／吸収スペクトルおよび第２の蛍光化合物のものに対応する放出スペクトルを有する。市場で現在入手できるかかるタンデム複合体は、ＰＥ−ＴＥＸＡＳ−ＲＥＤ（商標）、ＰＥ−Ｃｙ５（商標）、ＰＥ−Ｃｙ５．５（商標）、ＰＥ−Ｃｙ７（商標）、ＰＥ−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（商標）６１０、ＰＥ−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（商標）６４７、ＰＥ−ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５９４、ＰＥ−Ｄｙｏｍｉｃｓ（商標）５９０およびＲＴ６６５（商標）、ならびに全てのＰＥ−Ｘタンデムから選択され、ここでＸ＝ＰＥによって放出されたフォトンの吸収による励起後に、ＰＥのみによって放出されるものより高い（すなわち、５７５ｎｍより高い）波長をもつフォトンを放出することが可能な、任意の蛍光化合物である。
【００６０】
Ｙ−ＰＥタンデム複合体、ここでＹ＝ＰＥ（すなわち、アクセプタ蛍光色素）によって取り込まれたフォトンを、励起後に、放出する任意のドナー蛍光色素）は、本発明の目的上、フィコエリトリン誘導体の定義から除外される。言い換えれば、本発明によるＰＥ−Ｘタンデムにおいて、ＰＥは、常にドナー蛍光色素である。
【００６１】
好ましくは、試料を対象となる分子の特異的リガンドと接触させるステップは、液体媒質中で、好ましくは水溶液中で実行される。
【００６２】
＜光源＞という用語は、単色光のビームを放出することが可能なデバイスを指す。光源は、レーザ、アークランプまたは発光ダイオード（ＬＥＤ：ｌｉｇｈｔ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）とすることができる。アークランプ（例えば、水銀、キセノン−水銀）は、数ミリワットのインコヒーレント光を供給する光源である。それらは、必要な波長を選択するためにフィルタしなければならない複数の波長を放出する。このような理由で、大部分のフローサイトメータは、光源／光源群として１つ以上のレーザを有する。レーザは、狭い、よく定義された特定の波長をもつ２、３ミリワット〜数ワットのコヒーレント光を供給する。多くの異なるレーザ・タイプを現在入手できる。ＦＣＭにおいて現在用いられ、歴史的に用いられたいくつかのレーザは、アルゴンレーザ（３５１、４５４、４８８、５１４ｎｍ）、クリプトンレーザ（４０６、４８８、５３２、６３０ｎｍ）、ヘリウムネオンレーザ（６３２ｎｍ）、ヘリウムカドミウムレーザ（３２５、４４１ｎｍ）、ＹＡＧレーザ（５３２ｎｍ）およびバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）を含む。最近の技術的進歩は、今日では従来のガスレーザと同様の広い波長列において見られる、＜固体＞またはＤＰＳＳ（ダイオードポンプ固体：ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ  ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ）技術と呼ばれる技術により、ずっとより扱い易く、長寿命が付与されたレーザ、特に４８８ｎｍ、６３５ｎｍおよび４０５ｎｍにおけるＤＰＳＳレーザの利用可能性をもたらした。近頃、市場で入手できるフローサイトフルオロメータは、青色、バイオレット、および赤色の３つレーザが現在は装備され、この進化は、ＰＥおよびそのタンデムを含めて、青色レーザによって励起可能な蛍光色素の過去のリストに加えて、赤色およびバイオレットレーザによって理想的に励起される新しい蛍光色素の開発をもたらした。最後に、ＣＤ−ＲＯＭドライブおよびＤＶＤプレイヤの急速な最近の進化は、ＤＰＳＳレーザに代わる励起源としてそれらを使用可能にする特性およびパワーが付与され、それらの工業量産シリーズのゆえに非常により低コスト（１：１００、またはさらに１：１，０００比）のレーザダイオードシステムを後押しした。このように、市場では、赤色レーザダイオード（６３５ｎｍ、ＣＤ−ＲＯＭドライブに含まれる）、青色レーザダイオード（４５０ｎｍ、ＤＶＤプレイヤに含まれる）および今や青紫色レーザ（４０５ｎｍ、ブルーレイプレイヤに含まれる）を見付けることが可能である。適切なのは、４８８ｎｍに中心がある高性能で安価なダイオードレーザが市場にはなく、結果として、３７０ｎｍまたは４０５ｎｍにおける１つのみのレーザ源（もしくはレーザダイオード）、または２つのバイオレットおよび赤色源（４０５および６３５ｎｍ）を備えるデバイスが、４８８ｎｍもしくは５３０ｎｍまたは５６０ｎｍにおけるレーザの存在を主張するデバイスよりも、コンパクト（コンパクトな設計のレーザダイオード）かつ安価になることに気付くことである。例えば、ＦＣＭなどの、多様な生物医学的方法論については、青紫色ダイオードレーザの使用（４０５ｎｍにおけるライン，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌａｓｅｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．ｃｏｍ／ｆｉ���ｅａｄｍｉｎ／ｕｓｅｒ＿ｕｐｌｏａｄ／ｈｏｍｅ／Ｄａｔａｓｈｅｅｔｓ／ｋｉｍｍｏｎ／ｂｌｕｅ−ｖｉｏｌｅｔ−ｌａｓｅｒ−ｓｐｅｃｓ．ｐｄｆ）も考慮される。具体的な経済上および産業上の考察（信頼性、より小型、一体化の容易さ）は、生物医学的分析機器の開発にとって赤色およびバイオレットレーザダイオード（６３５および４０５ｎｍ）を特に魅力的にする。患者に近接して、医療センターにおいて、薬局または他のヘルスケア施設において行うための新しい＜ポイントオブケア＞診断テストの開発に伴って、結果が速やかに入手できるならば、なおさらにこのことが興味深くなった。かかるテストは、迅速な患者看護および適切な処置の即時の処方を促進することを目指す。
【００６３】
好ましくは、本発明の方法においてステップｉ）に略述される混合物の励起のために用いられる前記少なくとも１つの光源は、３３０および４２５ｎｍの間、好ましくは３５０および４２０ｎｍの間、さらに好ましくは３６０および４１０ｎｍの間の波長を有する。
【００６４】
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法においてステップｉ）の混合物の励起のために用いられる前記少なくとも１つの光源は、４００および４１０ｎｍの間、より好ましくは４０５ｎｍの波長を有する。
【００６５】
別の実施形態によれば、本発明の方法においてステップｉ）の混合物の励起のために用いられる前記少なくとも１つの光源は、４０５ｎｍの波長で放出するバイオレットレーザまたはバイオレットレーザダイオードである。
【００６６】
ステップｉ）の混合物の励起に関係するステップｉｉ）は、少なくとも１つの光源による後者の照明に対応する。
【００６７】
試料が対象となる分子を含むときに、蛍光色素にコンジュゲートされたリガンドは、それ自体が後者上に結合し、ステップｉｉ）後に混合物によって放出された光は、ＰＥのみの放出スペクトルの始まりに対応する、５５０ｎｍ以上の波長で集光される。例として、ＰＥ−ＴＥＸＡＳＲＥＤ（商標）、ＰＥ−Ｃｙ５（商標）、ＰＥ−Ｃｙ５．５（商標）、ＰＥ−Ｃｙ７（商標）、ＰＥ−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（商標）６１０、ＰＥ−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（商標）６４７、ＰＥ−ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５９４、ＰＥ−Ｄｙｏｍｉｃｓ（商標）５９０およびＲＴ６６５（商標）タンデムの最大放出波長は、それぞれ、６１３ｎｍ、６７０ｎｍ、６９０ｎｍ、７７５ｎｍ、６２８ｎｍ、６６５ｎｍ、６１８ｎｍ、５９９ｎｍおよび６８０ｎｍに等しい。これらの放出波長は、光源、およびフルオロフォア抽出／精製のプロトコルに依存して数ｎｍ変化しうる。これらの波長は、最適蛍光集光区域の中心を表し、その幅は、分析における他の蛍光色素の近接スペクトルの有無に基づいて、しばしば２０および５０ｎｍの間にあり、大部分のケースでは３０ｎｍである。
【００６８】
３６０および４１０ｎｍの間、好ましくは４０５ｎｍにおける波長の光源を用いた、ＰＥおよびその誘導体の励起に起因する少なからぬ利点は、これが、励起波長と放出波長との間の非常に顕著なＳｔｏｋｅｓシフトを発生させ、結果として、４８８ｎｍにおける、またはさらに５３０ｎｍもしくは５６０ｎｍにおける波長の光源を用いた励起によって主張されるよりもずっと低効率で安価な蛍光フィルタ（ＰＥ用）を用いることを可能にすることである。
【００６９】
ステップｉｉ）における励起後に混合物によって放出された光を検出するステップｉｉｉ）は、光電子増倍管（ＰＭＴ：ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ）とすることができる光検知器を用いて行われる。このケースでは、フォトンの形態で放出された信号が光電子増倍管によって定量可能な電気信号へ変換される。
【００７０】
本発明の方法は、試料中の対象となる少なくとも第２のみならず、潜在的に少なくとも第３、第４、およびさらに第５の（または何番目かの）分子の同時同定をさらに備える。
【００７１】
かかる同定は、特に、ＰＥに結合された第１のリガンドの、ならびにそのタンデムのうちの１つにコンジュゲートされた第２、第３、第４、またはさらに第５のリガンドの使用に依存する。３３０および４２５ｎｍの間の、好ましくは４０５ｎｍにおける波長の光源は、シフトした蛍光スペクトルを提供するＰＥおよびそのタンデムを同時に励起することを可能する。
【００７２】
ある特定の実施形態によれば、ＰＥまたはその誘導体のうちの１つを励起するのに用いられるものと同じ波長の光源によって励起可能であるが、ＰＥまたはその誘導体のうちの１つのものとは異なる放出スペクトルをもつ第２のフルオロフォアを活用して、対象となる第２の分子の同時同定を実行できる。
【００７３】
従って、３３０および４２５ｎｍの間の、好ましくは４０５ｎｍにおける波長の光源は、ＰＥおよび／またはそのタンデムのうちの１つ、ならびにかかる波長で励起可能であるように特異的に設計された蛍光色素を同時に励起することを可能にする。これらの蛍光色素は、特に、ＳＹＴＯ４０、ＤＡＰＩ、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４０５、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（商標）、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４０５、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ｃａｓｃａｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０、ＢＤ（商標）Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｖ４５０、ＶｉｏＢｌｕｅ（登録商標）、ＶｉｏＧｒｅｅｎ（商標）、Ｋｒｏｍｅ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４５０  ＡＭ（商標）、Ｚｏｍｂｉｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ（ＡＭＣＡ）またはさらにある種のＱ−ｄｏｔ（登録商標）５６５／６０５／６２５／６５５／７０５／８００を備える。
【００７４】
この方策は、それゆえに、４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザと連携するために最近開発された蛍光色素より安価で産業用途により利用し易い、ＤＡＰＩ、およびＰＥまたはそのタンデムなどの、ロイヤリティーフリーの蛍光色素を組み合わせることも可能にする。
【００７５】
さらに別の特定の実施形態によれば、ＰＥまたはその誘導体のうちの１つを励起するのに用いられるものとは異なる波長の光源によって励起できて、ＰＥまたはその誘導体のうちの１つのものからオフセットした放出スペクトルを有する第２のフルオロフォアを用いて、対象となる第２の分子の同定を実行できる。
【００７６】
この特定の実施形態は、少なくとも２つの光源を必要とし、３３０および４２５ｎｍの間の、好ましくは４０５ｎｍにおける、波長のうちの１つが、ＰＥおよび／またはそのタンデムのうちの１つを同時に励起することを可能とし、例として、５３０ｎｍもしくは５６０ｎｍにおけるレーザ、またはさらに６３５／６４０ｎｍにおけるレーザ／ダイオードなどの、より長い波長の第２の光源が、ＰＥおよび／またはその誘導体のうちの１つとは異なる第２のフルオロフォアを励起することを可能にする。
【００７７】
すべてのケースにおいて、当業者は、あるフルオロフォアによって放出された光信号が、別の蛍光色素によって放出された信号を記録すべき検出チャンネル中にオーバーフローすることをできる限り回避するかまたは最小限に抑えるであろう。２つ、３つ、４つ、５つまたはたくさんの蛍光色素のスペクトルの重なりを制限することが、対象となるいくつかの分子の確かな検出を可能にする。現在、特に、異なる抗体および蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ−ＲｅｄまたはＥＣＤ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７）によって染色された５つの異なる分子の日常的な測定を可能にする４８８ｎｍにおけるレーザを用いて、この方法が適用される。
【００７８】
試料中の対象となる分子の有無を決定するステップｉｖ）は、ステップｉｉｉ）においてこの試料中で得られた結果を、対象となる分子を含まないことが知られている参照試料について得られたものと比較するステップに基づく。
【００７９】
対象となる分子の存在が一旦決定されると、試料中の対象となる分子のコピーの数を算出するためにステップｉｖ）を用いることもできる。増加する既知量の対象となる標的分子を含んだ標準範囲と比較して、この定量化ステップを実行できる。
【００８０】
本発明による試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出するための方法は、フローサイトメータ上で実施できる。
【００８１】
本発明の検出方法は、生体試料中の細胞または微粒子亜集団の分離、解析または計数のために用いられてよい。
【００８２】
本発明の検出方法は、造血起源の細胞または微粒子亜集団の分離、解析または計数のために用いられてよい。
【００８３】
本発明の第２の目的は、試料中の対象となる少なくとも１つの分子の検出のためのフィコエリトリンまたはその誘導体のうちの１つからなる蛍光色素の使用に関し、蛍光色素の励起波長が３３０ｎｍおよび４２５ｎｍの間、好ましくは３５０および４２０ｎｍの間、またはさらにより好ましくは３６０および４１０ｎｍの間にあることを特徴とする。
【００８４】
ある特定の実施形態によれば、蛍光色素の励起波長は、４００および４１０ｎｍの間にあり、好ましくは４０５ｎｍである。
【００８５】
本発明が、それらの教示内容なしには発明の範囲を制限し、またはある種の限定を構成する実施例によって以下に説明される。
【実施例】
【００８６】
１−本発明の起源
何気ない観測が本発明を喚起した。より具体的には、３つのレーザをもつこのタイプのフローサイトメータ（ＢＣ  Ｇａｌｌｉｏｓ（商標））を扱う専門家によって行われた蛍光補償の設定に関連する典型的な経験の間に、本発明者らは、バイオレットレーザと関連する検出器のうちの１つ（ＦＬ１０チャンネル）における低寄生漏れを観測した。この特定のケースでは、実施例２に記載するＰＥコンジュゲートのみで染色したタイプのマウスＩｇキャプチャービーズが、ＦＬ１０（５３０および５７０ｎｍの間の蛍光、５５０ＢＰ４０フィルタ）において有意な信号レベルを提供したが、理論が予想したのは、この範囲の励起および放出波長と適合するフルオロフォアであるＫｒｏｍｅ−Ｏｒａｎｇｅ（商標）で染色したコンジュゲートがない場合にＦＬ１０では蛍光が完全に欠如することであった。本発明者らは、この観測が些細であるとは感じず、この漏れの背後にある理由を収集することを目指した。
【００８７】
このような目的で、ｉ）同様のシステムを、すなわち、ＰＥのみで染色したビーズを捨てること、およびｉｉ）いくつかのフィルタを移動させることによって、このデバイスのオプティカルベンチの標準構造を変えることが必要であった。４０５ｎｍにおける励起と関連するＦＬ１０検出器の前を各フィルタが通るようにするために、オプティカルベンチの異なるフィルタを手作業で別の位置へ移動させた。これらの修正は、４８８ｎｍにおける青色レーザとともに標準的に設置するＰＥに対して最適化したフィルタ（５７５ＢＰ３０）を用いて、ＦＬ２検出器上で最大信号を確実に得ることを可能にした。それに応じて、このテストの結果が示唆したのは、信号はこのタイプのビーズ上に存在する唯一の蛍光色素であるＰＥからの蛍光信号ではあるが、４０５ｎｍにおける励起という意外な状況での蛍光信号であろうということである。
【００８８】
その後の検証のために、デバイスのいくつかの従来とは異なる修正が必要であった。これらの修正は、２つの同様のデバイスの同じ個所での利用可能性を伴ってのみ実行可能でありうる、チャンネルＦＬ２（取扱説明書に指示されるような、４８８ｎｍにおける励起と関連した標準位置）およびＦＬ１０（４０５ｎｍにおける励起と関連した異常位置）上で同時にＰＥ蛍光を読み取るのを可能することを目指し、それによって、第２のＧａｌｌｉｏｓ（商標）サイトメータのＰＥフィルタを即座に借りて、第１のＧａｌｌｉｏｓ（商標）サイトメータのＦＬ１０位置に置いた。これらのアナクロニックな操作が、実施例によって以下に示すように、４０５ｎｍにおける励起下で様々なレベルのＰＥ蛍光を、著しい効率かつ４８８ｎｍにおいて従来の励起で得られたのに近い分解能で、測定する可能性を示すことを可能にした。
【００８９】
２−レーザ蛍光間クロスコンタミネーションの研究
フローサイトメータまたはセルソータなどの、いくつかの分析デバイスは、４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザに加えて６つまでの追加のレーザを有することができる。今日、これらの機器は、３つのレーザ、すなわちｉ）時間参照を提供するレーザと見做され、複数の蛍光とともに散乱を解析する４８８ｎｍにおける青色レーザ、ｉｉ）参照照明点の下／後で細胞を照明する６４０ｎｍにおける赤色レーザ、ｉｉｉ）青色レーザの参照照明点の上／前で細胞を照明する４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザが現在は装備されている。複数点におけるこの照明は、各照明点からの蛍光の光学的および時間的な二重分離を可能にする。確かに、３つのレーザの各々からの信号がｉ）時間におけるおよそ数１０マイクロ秒（典型的に３０および４０μｓの間）のシフト、ならびにｉｉ）空間におけるおよそ数１００マイクロメートル（典型的に１００μｍ）に等しい距離のシフトを受けて、集光光学系を介した異なる光ファイバ（レーザごとに１つ）へのそれらの差次的な集束を可能にする。このように、多色ＦＣＭでは、通常、３つのレーザのうちの１つからの蛍光に本質的に他の２つのレーザのうちの１つからの光学的コンタミネーションはないと考えられる。
【００９０】
２．１−原理
マルチレーザサイトメータの動作は、各レーザに対して空間的および時間的にシフトした分析されることになる粒子の励起を伴う。各細胞／粒子は、いくつかの光ビームを順次に通過する。（バイオレット−青色−赤色、すなわち、４０５−４８８−６４０ｎｍにおける）３つのレーザが装備されたＧＡＬＬＩＯＳ（商標）／ＮＡＶＩＯＳサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，ヴィルパント，フランス）については、順序は、次の通り：バイオレット−青色−赤色であり、衝撃点間の距離が約１００μｍに等しく、時間が約３０μｓに等しい。光信号を９０°で集光するレンズ（＜ピックアップ・レンズ＞）が３つの衝撃点で放出された光を差次的に集光し、３つの独立した光ファイバ入口へ集束させて、それらが次に光を各光ファイバからの波長を独立して分離することが可能な光システムの方へ導く。
【００９１】
各レーザは、通常、一定の公称パワーで（バイオレットが４０ｍＷ−青色が２２ｍＷ−赤色が２５ｍＷで）動作する。ＧＡＬＬＩＯＳ（商標）Ｓｅｒｖｉｃｅモジュール上に介入することによって、各レーザのパワーを意図的に修正し、それゆえに、サイトメータによって測定される信号に対する励起パワーの影響を調べることが可能である。
【００９２】
ＰＥがバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）によって確かに励起可能であることを証明するため、およびレーザ蛍光間のクロスコンタミネーションに由来するであろう任意のリスク、具体的には、青色レーザによって誘起される、バイオレットレーザに連結した検出器への蛍光漏れを排除するために、この原理を利用した。
【００９３】
２．２−キャリブレータ
様々な量のＰＥで覆った１０μｍ直径のポリスチレンビーズがキャリブレータとしての役割を果たす：ビーズＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４は、それぞれ９００、７，５００、１１５，０００および１，２５０．０００個のＲ−ＰＥ分子／ビーズを有する。ビーズの２つのロットを合成して、ＰＢＳ＋ＢＳＡ  ０．１％＋アジ化ナトリウム０．１％からなる溶液中に懸濁させた。
【００９４】
２．３−プロトコル
青色レーザの信号は、１つの粒子に対してｔ０を与え、他のレーザによるこの同じ粒子と関連した信号がそれぞれｔ０−３０μｓ（バイオレットレーザ）およびｔ０＋３０μｓ（赤色レーザ）にあると見做した。
【００９５】
標準条件で行ったベンチマーク解析とは別に、レーザパワー値（バイオレット４０ｍＷ−青色２２ｍＷ−赤色２５ｍＷ）の観点から、以下の多様なパワー値をテストした、すなわち、
・青色レーザ：２２−２０−１０−５−３−１ｍＷ
・バイオレットレーザ：４０−３０−２０−５−１ｍＷ
【００９６】
いくつかのケースでは、分析の間に（ソフトウェアで制御したアイリスを介して）バイオレットレーザをオフにすることも可能である。この時点で、青色レーザは、それをｔ０として用いるという点で常に機能的なままでなくてはならない。他の２つのレーザとは違って、青色レーザのパワーを減少させることができるが、完全に遮光はできない。
【００９７】
青色およびバイオレットレーザのそれぞれの焦点に結合されたファイバを介して透過したＰＥ蛍光信号の検出を最適化するために、オプティカルベンチのフィルタの配置を修正した。この特定の設置では、ＰＥにとって最適な５７５ＢＰ３０バンドパスフィルタの２つの同一のコピーを並行して、一方はＦＬ２検出器の前におよび他方はＦＬ１０の前に用いた。ＦＬ２チャンネルは、それゆえに、５９５ＤＣＳＰダイクロイックミラーの後ろで、５７５ＢＰ３０フィルタを通過した青色レーザ（４８８ｎｍ）からのＰＥ信号を測定する。ＦＬ１０は、４８０ＤＣＳＰダイクロイックミラーを介した偏向後に、同一の５７５ＢＰ３０フィルタを通過したバイオレットレーザ（４０５ｎｍ）からのＰＥ信号に対応する。
【００９８】
２．４−結果
青色およびバイオレットレーザの公称パワーは、それぞれ２２ｍＷおよび４０ｍＷに等しい（図２、４デカードのスケールおよび図５、５デカードのスケール）。最初にビーズシングレットを２重散乱解析における＜ビーズ＞領域によって予め選択し、適宜に、それらのＦＬ２およびＦＬ１０蛍光を解析する。
【００９９】
青色レーザ（４８８ｎｍ）の変調
青色レーザの公称パワーを１０ｍＷ（図３）および次に５ｍＷ（図４）へ減少させるのに対して、バイオレットレーザの公称パワーを４０ｍＷに維持する。
【０１００】
図２に示すように、
−  ＦＬ２では、メジアン比が１０以上の、４つのピークの極めて明確な分離。
−  ＦＬ１０では効果的であるが、わずかにより明白でなく（最大メジアン比＝８であり）、特に最低ＰＥ密度レベルでは明白でない分離。
を観測することが可能である。
【０１０１】
青色レーザのパワーにおける２２ｍＷから１０ｍＷへの（図３）、次に５ｍＷへの（図４）低下は、ＦＬ１０（バイオレットレーザ）における蛍光に対する影響は何もなしに、ＦＬ２（青色レーザ）におけるすべてのピークの強度を減少させる。この効果を５ｍＷ未満、特に３ｍＷまたはさらに１ｍＷ（図示しない）のパワー値について確認する。
【０１０２】
キャリブレーション・ビーズの第２のロット上で同様の結果を得た（図示しない）。青色レーザの最大公称パワーにおける（１ｍＷへ減少させた）低下は、最適な解析に対するヒストグラム上のスケールの変化（４の代わりに５デカード）をもたらす。
【０１０３】
バイオレットレーザ（４０５ｎｍ）の変調
バイオレットレーザの公称パワーを１０ｍＷ（図６）および次に５ｍＷ（図７）へ減少させるのに対して、青色レーザの公称パワーを２２ｍＷに維持する。
【０１０４】
参照（図５）は、図２と同一のままであるが、５デカードのスケールを用いる。
【０１０５】
図６および７に示すように、バイオレットレーザのパワーにおける４０ｍＷ（図５）から１０ｍＷ（図６）への、および次に５ｍＷ（図７）への低下は、ＦＬ２（青色レーザからのＰＥ）における蛍光に対する影響は何もなしに、ＦＬ１０（バイオレットレーザからのＰＥ）におけるすべてのピークの強度を減少させる。
【０１０６】
そのうえ、解析の間のアイリスを介したバイオレットレーザの０ｍＷへの遮光（図８）は、遮光前後の２つの状態において視られるＰＥ蛍光の組み合わせ（ＦＬ２およびＦＬ１０）をまとめた画像をもたらす。ＰＥビーズのサブファミリーごとに、バイオレットレーザの開閉を対比すると、ＦＬ１０の強度における急激な低下を観測することが可能であるのに対して、ＦＬ２の強度は、変化しないままである。
【０１０７】
結論として、４つのＰＥ担持レベルをもつキャリブラントのＰＥ蛍光の分布に対するレーザパワーの影響の研究は、
１）青色レーザの変調がＦＬ２の分解能（青色レーザからのＰＥ）のみに影響を与えること
２）バイオレットレーザの変調がＦＬ１０の分解能（バイオレットレーザからのＰＥ）のみに影響を与えること
を示す。
【０１０８】
これは、レーザ蛍光間のクロスコンタミネーションに由来するであろうアーチファクトの任意のリスク、具体的には、青色レーザによって誘起されるバイオレットレーザに結合した検出器へのＰＥ蛍光漏れをなくす。
【０１０９】
最後に、得られたプロファイルの線形性は、ＰＥ蛍光が４０５ｎｍにおける励起の結果であるという事実を検証することを可能にし、それゆえに、蛍光色素としてＰＥを４０５ｎｍにおけるレーザとともに使用可能であることを確認する。
【０１１０】
３−４０５ｎｍ（および／または４８８ｎｍ）におけるレーザを用いたＰＥ上のタンデムの励起に関連する調査研究
３．１−原理
異なるＰＥコンジュゲートおよび／またはＰＥタンデムを用いてマウスＩｇ（免疫グロブリン）キャプチャービーズを染色する。このようにして得た３つの染色レベルを、それぞれＦＬ２、ＦＬ４またはＦＬ５（それぞれＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ５およびＰＥ−Ｃｙ７に対する、４８８ｎｍにおける参照励起）上、ならびにＦＬ１０（それぞれＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ５およびＰＥ−Ｃｙ７に用いたものと同じフィルタでフィルタした、４０５ｎｍにおけるテスト励起）上で同じ通過帯域フィルタを用いることによって解析する。
【０１１１】
３．２−キャプチャービーズ
ＳＰＨＥＲＯＴＥＣＨ  Ｉｎｃ．によって市販される直径７μｍのマウスＩｇキャプチャービーズ（Ｈ＋Ｌ）（ＳＰＨＥＲＯ−ＣＯＭＰｔｒｏｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、参照ＣＭＩｇＰ−７０−３Ｋ）を供給元の指示に従って用いる。３つのビーズ集団が陰性対照に対応し、ヤギ抗マウス抗体、従って、コンジュゲートマウスＩｇで１つのビーズを不十分に覆い、１つのビーズを大量に覆った。
【０１１２】
３．３−プロトコル
キャプチャービーズを２０μＬのコンジュゲート（ＰＥまたはその誘導体、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５またはＰＥ−Ｃｙ７のうちの１つに連結したマウス抗体）とともに周囲温度、暗所で１時間インキュベートする。次に、５００μＬのＰＢＳ−ＢＳＡバッファを加える。
【０１１３】
青色レーザの最適ＦＬｉ（すなわち、ＦＬ２、４または５）のものと同じ通過帯域フィルタをテストのものと同様の第２のＧａｌｌｉｏｓ（商標）サイトメータから取り、ＦＬ１０チャンネル上に置く。
【０１１４】
３．４−結果
図９に詳しく示すように、ＰＥ−Ｃｙ５．５タンデムにコンジュゲートされたマウス抗体に対して、ＦＬ４のみならず、ＦＬ１０においてもすべての３つのピークの明確な分離を観測することが可能である。ＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ５およびＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートされたマウス抗体に対して、同様の結果を得た。
【０１１５】
以下の表は、テストした４つの抗体に対して得た完全な結果を明らかにする。
【０１１６】
【表１】
2019522181.tif 000002
【０１１７】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３比の算出は、それぞれ、
−  Ｒ１：強く染色した試料対軽く染色した試料、
−  Ｒ１：軽く染色した試料対染色しない試料、
−  Ｒ１：強く染色した試料対染色しない試料、
を区別するための能力を説明する。
【０１１８】
比の値は、バイオレットレーザによるＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５およびＰＥ−Ｃｙ７の励起が、強く染色した試料対軽く染色した試料の間、および特に、強く染色した試料対染色しない試料の間の良好な区別を可能にすることを明確に示す。青色レーザによる励起の際に観測されるものと比べてより少ない程度にではあるが、軽く染色した試料対染色しない試料の間を区別することも可能である。
【０１１９】
４−細胞亜集団の同定
４．１−試料
用いたモデルは、ここではＬＰ１多発性骨髄腫細胞株によって代表される異常細胞タイプを含んだＥＤＴＡ全血（ＷＢ：ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）にある。このモデルは、このケースでは芽球と同様の白血病造血細胞の検出のケースの概略を示す。
【０１２０】
ＬＰ１細胞を全白血球と比較して１０％濃度で全血試料に加えた。
【０１２１】
４．２−細胞マーキング
ＰＥにコンジュゲートされた抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ＢｉｏＣｙｔｅｘ）により、試料中に存在する種々の細胞集団のキャラクタリゼーションを実行した。ＣＤ４５の濃度は、それぞれ、およそ２００，０００分子／リンパ球対１２０，０００分子／単球、ＢＩＫＯＵＥら，（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２６：１３７−１４７（１９９６））によれば、２１７±６４×１０３対１０３±４４×１０３である。
【０１２２】
技術は、全血細胞を抗ＣＤ４５−ＰＥの存在下でインキュベートすることにある。赤血球を次に溶解させて、未結合の蛍光コンジュゲートを除去するために残りの細胞（白血球）を洗浄し、次に、フローサイトメトリーによって分析する。
【０１２３】
４．３−フローサイトメトリー分析
本発明者らの経験および文献では、血球算定において、通常、探索される芽球は、特に、他のパラメータ（体積、ＦＳＣ）がそれに寄与するならば、ほとんどの場合、この実施例のＬＰ１細胞よりもこのＣＤ４５×ＳＳＣシステムによって良好に区別されるであろう。
【０１２４】
ＬＰ１細胞は、ＣＤ４５×ＳＳＣグラフ中で正常顆粒球（ＰＭＮ）から完全に分離されているわけではないので、本発明者らは、相補的なパラメータ、すなわち、正常血液細胞の自己蛍光より高く、ＬＰ１細胞の検出および示される亜集団の電子彩色を容易にする、ＦＬ９におけるＬＰ１細胞の青色光自己蛍光（Ｅｘ４０５ｎｍ／Ｅｍ４６０／２０ｎｍ）を利用した。
【０１２５】
典型的に、＜側方散乱＞（ＳＳ：ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）パラメータは、３つの主要な白血球亜集団−すなわち、リンパ球、単球および顆粒球（ＰＭＮとも呼ばれる多形核好中球）の同定を可能にする。ＬＰ１細胞を通常のスキームに追加し、この細胞は、ＰＭＮと同じＳＳレベルに位置し、＜前方散乱＞（ＦＳ：ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）パラメータとしてはＰＭＮより上に位置する。ＦＳ×ＳＳグラフは、溶解後に残っている残存赤血球（ＲＢＣ：ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）に対する解析ウィンドウを提供するのにも役立つ。
【０１２６】
染色細胞をＧａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で解析した。およそ３０μｌの染色試料上で解析を行い、６０μＬ／分の速度で３０秒間、少なくとも７，０００イベントを取得した。ＫＡＬＵＺＡ（登録商標）コンピュータソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータを解析した。ＦＬ２およびＦＬ１０のＰＭＴの電圧は、それぞれ３５０Ｖおよび４２０Ｖに等しく、４８８ｎｍにおける青色レーザおよび４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザによってそれぞれ励起したＰＥ蛍光をＦＬ２およびＦＬ１０上で集光するために、同じタイプの５７５ｎｍ／３０フィルタ（ＦＬ１０の標準フィルタを５７５ｎｍ／３０フィルタで置き換えた）によって光信号をフィルタした。
【０１２７】
まず第１に、解析方策は、サイズ／構造解析ウィンドウ内のすべての細胞のコンディショニングを含む。種々の細胞亜集団のＰＥ蛍光を、細胞粒度（ＳＳ）と相関し、かつＳＳ強度、すなわち、左から右へ、リンパ球、単球および顆粒球／ＰＭＮ（ならびに、ＬＰ１における過負荷のケースではＬＰ１）の順序で白血球の第１の分類を可能にするパラメータの関数としてｙ軸上に蛍光強度を表し、ｘ軸上にはイベントの数を表すバイパラメトリック・グラフ上に視覚化できる。ソフトウェアは、管ごとの平均蛍光強度（ＭＦＩ：ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を提供する。
【０１２８】
さらに、ＬＰ１細胞株の細胞を２つのパラメータ、すなわち、（他の白血球についてよりも重要な）ＦＳパラメータ上で視たそれらのサイズとＦＬ９（４６０＋／−２０ｎｍ）において検出可能なそれらの自己蛍光との関連付けによって分離した。
【０１２９】
４．４−結果
正常血液
図１０（Ａ）〜（Ｂ）に示すように、ＣＤ４５−ＰＥ対ＳＳグラフの比較は、ＰＥを青色レーザ（４８８ｎｍ／ＦＬ２）によって、またはバイオレットレーザ（４０５ｎｍ／ＦＬ１０）によって励起するかどうかに係わらず、いくぶん同様の細胞分布を示す。この２つの条件が全血の主要な細胞亜集団の良好なＣＤ４５対ＳＳ区別を許容する。
【０１３０】
４つの亜集団を組み合わせたモノパラメトリック・ヒストグラムにおける表現（リンパ球、単球、顆粒球および残存赤血球、図１０（Ｅ）および（Ｆ））は、ＣＤ４５染色強度の順序に従うことを示す。
【０１３１】
２つのレーザのいずれか１つを用いたＰＥ励起、およびＰＥに最適なフィルタ上で放出された光の集光（標準条件ではＥｘ４８８ｎｍ／Ｅｍ５７５／３０ｎｍ、およびテスト条件ではＥｘ４０５ｎｍ／Ｅｍ５７５／３０ｎｍ）後に、細胞亜集団のＭＦＩ間の比を算出し、以下の表に詳細を示す。
【０１３２】
【表２】
2019522181.tif 000003
【０１３３】
これらの比は、それらが４０５ｎｍシステムではたとえわずかにより低くても、維持され、亜集団間のＭＦＩの階層が順守されることがわかるであろう。
【０１３４】
４８８ｎｍおよび４０５ｎｍシステムの両方で同様のこのＭＦＩ階層が非常に近い亜集団間の比をもたらす。４８８ｎｍにおけるＰＥ励起を用いた標準システムの（本明細書において見出した４０５ｎｍにおけるＰＥ励起システムと比較して）より大きいレンジアビリティは、染色しない亜集団（ＲＢＣ）と染色した亜集団とを比較したときにのみ、本当に観測できて、例えば、６８対３７のリンパ球／ＲＢＣ比である。
【０１３５】
白血病芽球でコーティングした血液
白血病芽球（ＬＰ１）を明らかにするためにＣＤ４５対ＳＳ解析をプレコンディションするときに、ＰＭＮの雲形の変化が観測されることがあり、これは、両方のシステム、すなわち、４８８ｎｍ（図１１（Ｃ））または４０５ｎｍ（図１１（Ｄ））におけるＣＤ４５−ＰＥの励起において同様であり、従って、ＣＤ４５発現の異常なレベルによって特徴付けられる血液中に存在する病的細胞を検出する可能性を両方のシステムが提供することを示唆する。そのうえ、血液のＣＤ４５×ＳＳグラフ上の変化は、ＬＰ１細胞が顆粒球のものと同様の雲の中に（部分的に重なって）置かれることを示唆する。
【０１３６】
この血液試料の亜集団のセット上のＣＤ４５−ＰＥ染色に関連するモノパラメトリック・ヒストグラムの重畳（図１１（Ｅ）および（Ｆ））は、４８８ｎｍおよび４０５ｎｍの２つのシステムにおける染色の分布の類似性の概略を示す。ＬＰ１のヒストグラムがＰＭＮヒストグラム上に重なることがわかるであろう。
【０１３７】
２つのレーザのいずれか１つを用いたＰＥ励起、およびＰＥに最適なフィルタ上で放出された光の集光（Ｅｘ４８８ｎｍ／Ｅｍ５７５／３０ｎｍの標準条件、およびＥｘ４０５ｎｍ／Ｅｍ５７５／３０ｎｍのテスト条件）後に、正常および白血病細胞亜集団のＭＦＩ間の比を算出し、以下の表に詳細を示す。
【０１３８】
【表３】
2019522181.tif 000004
【０１３９】
かさねて、芽球と正常血液細胞との間のＭＦＩ比は、４８８ｎｍおよび４０５ｎｍの２つのシステムにおいて先ずは同様であり、従って、血液細胞亜集団の診断上の区別は、ＰＥを４０５ｎｍで励起することによっても実行可能であることを示す。
【０１４０】
全体として、４８８ｎｍにおける青色レーザによる（参照）および４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザによる独立したＰＥ励起後に、この蛍光色素によって種々のレベルで染色した細胞亜集団間において観測した区別が示すのは、ＰＥを蛍光色素としてバイオレットレーザとともに用いることができ、従って、例として、ＣＤ４５抗体で染色した後の正常血液白血球および白血病細胞の亜集団などの、対象となる細胞亜集団間の有用な区別をＰＥが可能にするということである。
【０１４１】
５．白血病芽球の同定
５．１−試料
用いたモデルは、ここではＬＡＭ  ＨＬ６０およびＮＢ４株によって代表される２つの異常細胞タイプを含んだＥＤＴＡ全血（ＷＢ）にある。これらのモデルは、このケースでは芽球と同様の白血病造血細胞の検出のケースの概略を示す。
【０１４２】
ＨＬ６０およびＮＢ４細胞を５百万個／ｍｌに等しい濃度でＰＢＳ−ＢＡ中に混合した。５０μｌの全血試料に１０μｌのこの混合物、すなわち、５０μｌの全血に対してＨＬ６０およびＮＢ４の混合物の５０，０００個の細胞を加えた。
【０１４３】
５．２−細胞染色
ＰＥにコンジュゲートされた抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ＢｉｏＣｙｔｅｘ）により、試料中に存在する種々の細胞亜集団のキャラクタリゼーションを行い、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体は、単独かまたは他の蛍光試薬の存在下で多色染色して用い、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体をそれらの蛍光試薬のうちでＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートさせた。
【０１４４】
技術は、ＨＬ６０およびＮＢ４細胞を添加した全血を単独かまたはＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートされた抗ＣＤ３３と組み合わせた抗ＣＤ４５−ＰＥの存在下でインキュベートすることにある。次に赤血球を部分的に溶解させて、単数または複数の非結合の蛍光コンジュゲートを除去するために残りの細胞を洗浄し、その後、フローサイトメトリーによって解析を行った。
【０１４５】
実験に有用な残存赤血球の少なからぬ存在を解析中に維持するために、赤血球の溶解の効力を意図的に制限した。確かに、残存赤血球は、すべてのテスト・マーカーにとって当然ながら陰性である。
【０１４６】
５．３−フローサイトメトリー解析
本発明者らの経験では、細胞亜集団（正常細胞および白血病芽球）は、多くの場合、ＣＤ４５×ＳＳＣシステム（ここでは示さない）によって、またはＣＤ３３×ＳＳＣシステム（図１２ＡおよびＢ）ならびにＣＤ３３×ＣＤ４５システム（図１２ＣおよびＤ）によって区別される。
【０１４７】
染色細胞をＧａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で解析した。およそ３０μｌの染色試料上で解析を行い、６０μＬ／分の速度で３０秒間、少なくとも７，０００イベントを取得した。ＫＡＬＵＺＡ（登録商標）コンピュータソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータを解析した。ＦＬ５およびＦＬ１０のＰＭＴ電圧は、それぞれ６００Ｖおよび９００Ｖに等しく、４８８ｎｍにおける青色レーザおよび４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザによってそれぞれ励起したＰＥ−Ｃｙ７蛍光をＦＬ５およびＦＬ１０上で集光するために、同じタイプの７５５ｎｍロングパスフィルタ（ＦＬ１０標準フィルタをＦＬ５に置いたものと同一の第２の７５５ｎｍロングパスフィルタで置き換えた）によって光信号をフィルタした。
【０１４８】
まず第１に、解析方策は、サイズ／構造解析ウィンドウ内のすべての細胞のコンディショニングを含む。種々の細胞亜集団のＰＥまたはＰＥ−Ｃｙ７蛍光を、ｘ軸上の細胞粒度（ＳＳ）と相関したパラメータの関数としてｙ軸上に蛍光強度を表すバイパラメトリック・グラフ上に視覚化できて、ＳＳ強度、すなわち、左から右へ、リンパ球、単球および顆粒球／ＰＭＮ（ならびに、ＨＬ６０＋ＮＢ４における過負荷のケースでは芽球）の順序で白血球の第１の分類を可能にする。対象領域によってグラフ上に画定した細胞タイプごとに、ソフトウェアがグラフ中に存在するすべての細胞のパーセンテージおよび平均蛍光強度（ＭＦＩ、＜Ｙメジアン＞として示す）を提供する。
【０１４９】
多色染色（ＣＤ４５−ＰＥおよびＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７を含む）の間に、対応する蛍光強度をそれぞれｘ軸上およびｙ軸上に表すバイパラメトリック・グラフが、異なる細胞亜集団を視ることも許容する。
【０１５０】
５．４−結果
図１２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＣＤ３３−ＰＣ７）対ＳＳグラフの比較は、ＰＥ−Ｃｙ７（ＰＣ７）を青色レーザ（４８８ｎｍ／ＦＬ５）によって、またはバイオレットレーザ（４０５ｎｍ／ＦＬ１０）によって励起するかどうかに係わらず、同様の細胞分布を呈する。全血ならびに白血病芽球（ＨＬ６０およびＮＢ４）の主要な細胞亜集団（リンパ球、単球、ＰＭＮおよび残存赤血球）の良好なＣＤ３３対ＳＳ区別をこれら２つの励起条件が可能にする。そのうえ、芽球もＣＤ３３発現のレベルによって区別され、すなわち、ＨＬ６０細胞は、ＮＢ４細胞について観測されるよりも高いＣＤ３３発現のレベルを有する。
【０１５１】
２つのレーザのいずれか１つを用いたＰＥ−Ｃｙ７励起、およびＰＥ−Ｃｙ７に最適なフィルタ上で放出された光の集光（標準条件ではＥｘ４８８ｎｍ／Ｅｍ７５５ｎｍロングパス、およびテスト条件ではＥｘ４０５ｎｍ／Ｅｍ７５５ｎｍロングパス）後に、正常および白血病細胞亜集団のＭＦＩ間の比を算出し、以下の表に詳細を示す。
【０１５２】
【表４】
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【０１５３】
かさねて、芽球と正常血液細胞との間のＭＦＩ比は、４８８ｎｍおよび４０５ｎｍにおける２つのシステムで先ずは同様であり、従って、正常および芽球血液細胞亜集団の診断上の区別は、ＰＥ−Ｃｙ７を４０５ｎｍで励起することによっても実行可能であることを示す。
【０１５４】
全体として、４８８ｎｍにおける青色レーザによる（参照）および４０５ｎｍにおけるバイオレットレーザによる独立したＰＥ−Ｃｙ７励起後に、この蛍光色素によって種々のレベルで染色した細胞亜集団間において観測した区別が示すのは、ＰＥ−Ｃｙ７を蛍光色素としてバイオレットレーザとともに用いることができ、例として、ＣＤ３３抗体で染色した後の正常血液白血球および白血病細胞の亜集団などの、対象となる細胞亜集団間の有用な区別をＰＥ−Ｃｙ７が可能にするということである。
【０１５５】
そのうえ、図１２（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、ＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＦＬ５）対ＣＤ４５−ＰＥ（ＦＬ２）グラフ、またはＣＤ３３−ＰＥ−Ｃｙ７（ＦＬ１０）対ＣＤ４５−ＰＥ（ＦＬ２）グラフの比較は、蛍光測定をＦＬ５（励起４８８ｎｍ）において、またはＦＬ１０（励起４０５ｎｍ）において実行するかどうかに係わらず、同様の細胞分布を示す。このバイパラメトリック解析は、好中球（ＮｅｕおよびＰＭＮ２）のＣＤ３３発現レベルに基づくそれら２つの亜集団の区別の強化も可能にする。ＣＤ４５発現のレベルに基づく残存赤血球およびリンパ球の区別も強化する。
【０１５６】
これらの知見は、本明細書ではＰＥ−Ｃｙ７によって例示されるＰＥ誘導体が４０５ｎｍの励起波長において使用可能であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月16日(2019.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の対象となる少なくとも１つの分子を検出するための方法であって、
ｉ）前記試料を対象となる前記分子を特異的に結合するリガンドと接触させるステップであって、前記リガンドは、フィコエリトリンまたはその誘導体からなるフルオロフォアにコンジュゲートされた、前記接触させるステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の混合物を４００および４１０ｎｍの間の波長範囲をもつ少なくとも１つの光源によって励起するステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）において励起された前記混合物によって５５０ｎｍ以上の波長で放出された光を検出するステップと、
ｉｖ）前記試料中の対象となる前記分子の有無をステップｉｉｉ）の結果に基づいて決定するステップと
を備える方法。
【請求項２】
対象となる前記少なくとも１つの分子は、タンパク質、脂質、炭水化物、脂質もしくは糖脂質構造または炭水化物ユニットである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は、細胞を備えるか、または備える可能性がある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象となる前記少なくとも１つの分子の特異的リガンドは、抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記フルオロフォアは、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｉ）の前記混合物を励起するために用いられる前記少なくとも１つの光源は、４０５ｎｍの波長で放出するバイオレットレーザまたはバイオレットレーザダイオードである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中の対象となる少なくとも１つの第２の分子の同時同定をさらに備える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
フローサイトメータ上で実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生体試料中の細胞または微粒子亜集団を分離、解析または計数するステップをさらに備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞または微粒子亜集団は、造血起源である、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
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