(57)【要約】  本発明は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア株、及び診断又は治療におけるその使用に関する。更に本発明は、下痢性疾患、特に豚赤痢に対するワクチンを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、及び配列番号15、又はそれらと少なくとも95%の同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子を含む、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（B.ヒオディセンテリア）の分離株。
【請求項２】
前記遺伝子は、以下の核酸配列：配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6、又はそれらと少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の株。
【請求項３】
前記株は、プラスミドにコードされる病原性関連遺伝子BHWA1_02678、BHWA1_02679、BHWA1_02680、及びBHWA1_02681を更に含む、請求項1又は2に記載の株。
【請求項４】
前記株は、2015年10月23日にベルギー総合微生物収集所でBCCM寄託番号LMG P-29184として寄託された株である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の株。
【請求項５】
少なくとも1種の請求項1〜4のいずれか一項に記載のB.ヒオディセンテリア株と、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、及び／又は希釈剤とを含む組成物。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に記載の株又は組成物の、ワクチンの製造における使用。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の株又は組成物。
【請求項８】
被験体におけるB.ヒオディセンテリアによる感染の治療又は予防において使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の株又は組成物。
【請求項９】
被験体における下痢性疾患、特に豚赤痢の治療において、その症状／重症度の軽減において、又はその予防において使用するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の株又は組成物。
【請求項１０】
前記株又は組成物は、前記被験体に経口的又は非経口的に投与される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の使用のための株又は組成物。
【請求項１１】
前記被験体は、ブタである、請求項8〜10のいずれか一項に記載の使用のための株又は組成物。
【請求項１２】
B.ヒオディセンテリア感染に対する動物のワクチン接種のためのキットであって、（a）少なくとも1種の請求項1〜4のいずれか一項に記載のワクチン株を含む組成物と、（b）動物のワクチン接種のための説明書とを含む、キット。
【請求項１３】
B.ヒオディセンテリアの候補ワクチン株を同定するin vitroでの方法であって、（a）B.ヒオディセンテリアの試料を取得する工程と、（b）配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6に示される核酸分子の有無、及び／又は相応のmRNA若しくはタンパク質産物の発現を測定する工程とを含み、前記核酸の存在、又は相応のmRNA若しくはタンパク質の発現が、B.ヒオディセンテリアのワクチン株の指標である、方法。
【請求項１４】
被験体における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着を診断するin vitroでの方法であって、（a）上記被験体から試料を取得する工程と、（b）配列番号1〜6に示される核酸配列の1種以上と本質的に同一の1種以上の核酸配列の有無、及び／又は相応のmRNA若しくはコードされるタンパク質産物の発現を測定する工程とを含み、前記核酸又は相応のmRNA若しくはタンパク質産物の存在が、被験体における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着の存在の指標である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Brachyspira hyodysenteriae）株、及び下痢性疾患、特に豚赤痢に対するワクチンにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（B.ヒオディセンテリア；以前はセルプラ・ヒオディセンテリア（Serpula hyodysenteriae）、セルプリナ・ヒオディセンテリア（Serpulina hyodysenteriae）、又はトレポネーマ・ヒオディセンテリア（Treponema hyodysenteriae））は、多くの哺乳動物及び鳥類の動物種に感染し、時として下痢性疾患を引き起こす嫌気性腸管スピロヘータである。よく研究された例は、豚赤痢（SD）であり、それはブタでのB.ヒオディセンテリア感染により引き起こされる世界中に広がるブタの重大な風土病である。SDは、大腸の上皮表面の広範な炎症及び壊死を特徴とする伝染性の粘膜出血性の下痢性疾患である。SDによる経済的損失は、主として発育遅延、投薬代、及び死亡率に起因する。SDが豚舎において確認されると、その疾患スペクトラムは、軽度、一過性又は不顕性から、重度、そして致死性にまで及ぶことがある。
【０００３】
個別の豚舎における投薬戦略により、臨床症候が不顕化されることがあり、一部の豚舎においては、SDが見過ごされることがあるか、又はそれが疑われるにすぎないことがある。明白なSDが発生するかどうかにかかわらず、B.ヒオディセンテリアは、感染したブタに、又はその他の齧歯動物のような保有宿主に、又は環境内に存続していることがある。これらの全ての起源は、感染していない群にB.ヒオディセンテリアを伝染させる可能性を有している。
【０００４】
抗微生物剤の予防的使用から、感染した群の完全な頭数調整、そして感染した保菌ブタの再立入の防止に及ぶ数多くの方法が、豚赤痢を抑制するために使用される。これらの全ての選択肢には高い費用がかかり、それらが十分に有効であるとしても、経過を確認するために高性能な診断的試験の使用が必要とされる。目下、無症状感染を伴う群及び個別の健康な保菌動物における豚赤痢の検出はいまだ大きな問題であり、有効な抑制措置の実現を阻んでいる。従来では、豚赤痢の確定診断には、罹患したブタの糞便又は粘膜からB.ヒオディセンテリアを単離及び同定することが必要とされていた。関係する大きな問題には、これらの嫌気性細菌の遅い増殖及び選好性の栄養要求、並びにブタの腸の正常細菌叢における形態学的に類似したスピロヘータの存在による混乱が含まれる。罹患したブタの診断における著しい改善は、糞便からB.ヒオディセンテリアを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイの開発により達成された。残念なことに実際の利用においては、PCRの検出限界が、無症状感染を伴う保菌動物の検出を不可能にした。これらの診断的問題の結果として、B.ヒオディセンテリア感染を少なくとも群レベルで検出可能にする簡単かつ有効な診断ツールを開発することが明らかに求められている。
【０００５】
豚赤痢の古典的な治療は、抗微生物剤からなる。抗微生物耐性の獲得がB.ヒオディセンテリアの場合には高まっているので、抗生物質の単独使用は、治療の失敗をもたらし得る。さらに、抗微生物薬の使用は、抗微生物耐性が発生するためますます社会的に懸念されている事項である。消費者は、抗微生物製品の使用を最小限にして生産された安全な豚肉を望んでいる。
【０００６】
免疫学的応答はB.ヒオディセンテリアによる定着後に誘発され、SDから回復したブタは再感染から防御される。それにもかかわらず、豚赤痢を抑えるワクチンを開発する試みが非常に限られた成功しか収めていないのは、それらのワクチンが、群ベースでの不十分な防御をもたらし、又はそれらのワクチンには費用がかかりすぎ、生産して商業的に採算をとることが難しいからである。
【０００７】
不活化されたB.ヒオディセンテリアを基礎とするワクチンは、限られた成功を収めることが報告されているものの、その不活化ワクチンの主な不利点は、それらのワクチンが、実際の感染の回復後に起こることとは対照的に、種々の血清型に対する防御をもたらさなかったことである（非特許文献1、非特許文献2）。さらに、それらのワクチンは、大規模に生産することが難しく、費用がかかる。
【０００８】
豚赤痢のための弱毒化ワクチンの開発のために幾つかの試みがなされている（特許文献1、特許文献2、特許文献3）。これらのワクチンの殆どは、1つ以上の病原性因子又はヘモリジン関連遺伝子に欠陥がある突然変異B.ヒオディセンテリア株を基礎としている。生弱毒化ワクチンは、それらが不活化ワクチンよりも近く自然感染を模倣するという利点を有する。結果として、生弱毒化ワクチンは一般に、その不活化された対照物と比べてより高い水準の防御を提供する。しかしながら、幾つかの場合には、ワクチンとしての非病原性株の使用が、感染に対する大きな防御の獲得を保証しないことが示された（非特許文献3、非特許文献4）。また、疾患の臨床症候は（部分的に）軽減される可能性はあるが、ワクチン接種された動物の感染性の程度は高いままであるため、（再）感染の危険性の増大が引き起こされる（非特許文献5）。さらに、遺伝子改変された生物は、遺伝子突然変異に関連する安全性の問題のため、より広範囲にわたる登録手続きを必要とする。
【０００９】
組換えサブユニットワクチンの使用が1つの選択肢であるのは、その生産物が明確に定義され、大規模に生産することが比較的容易であるからである。組換えワクチンの候補の例は、38キロダルトンの鞭毛タンパク質flaB1（非特許文献6）、外膜タンパク質BmpB（非特許文献7）、smpBタンパク質（非特許文献8）及びftnAタンパク質（非特許文献9）である。しかしながら、これらのサブユニットワクチンは、組換えタンパク質とアジュバントとの組み合わせでも、組換えタンパク質についてのDNAを有するDNAワクチンでも、マウスモデルにおいてB.ヒオディセンテリア感染症の重症度を軽減させることが報告されただけであり、ブタモデルにおいては、感染した動物の頭数を大幅に減らすことも、又は臨床疾患の重症度を大幅に軽減させることもできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第9820899号
【特許文献２】国際公開第2010054437号
【特許文献３】米国特許第5882655号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Olson et al., 1994
【非特許文献２】Diego et al., 1995
【非特許文献３】Hudson MJ. et al., 1974
【非特許文献４】Lysons R. et al., 1982
【非特許文献５】Hyatt et al., 1994
【非特許文献６】Gabe et al., 1995
【非特許文献７】La et al., 2004
【非特許文献８】Holden et al., 2008
【非特許文献９】Davis et al., 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
B.ヒオディセンテリアにより引き起こされる疾患を抑えるための「ゴールドスタンダード（gold standard：標準法）」は、ワクチンを使用して動物に免疫を与えることで、B.ヒオディセンテリアの定着及び／又は疾患を予防することであると考えられる。現在、B.ヒオディセンテリアに対する防御のために利用可能な有効なワクチンは存在しない。効果的なワクチンは今後、豚赤痢を管理するための重要なツールとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ブラキスピラ感染に対する防御を誘導するための生弱毒化ワクチンとして有用であるブラキスピラ株、特にブラキスピラ・ヒオディセンテリア株を提供する。
【００１４】
1つの実施の形態において、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9からなる群から選択される核酸配列を含む又は該核酸配列からなる1種以上の遺伝子、好ましくは該遺伝子の全てが存在することを特徴とする、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（B.ヒオディセンテリア）分離株を提供する。特に、上記株は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる1種以上のタンパク質、好ましくは該タンパク質の全てを含む。更なる実施の形態において、上記株は、本明細書に規定される4種のプラスミドベースの病原性関連遺伝子を含む。更により具体的には、上記株は、2015年10月23日にベルギー総合微生物収集所（Belgian Co-ordinated Collections of Micro-Organisms）でBCCM寄託番号LMG P-29184として寄託されており、本発明はまた、同じ若しくは殆ど同じ有利な特性を有する株、又はその株から誘導される突然変異体を含む。さらに、本発明の株は、免疫原性特性を維持するが、もはや病原性ではない弱毒化された株である。
【００１５】
本発明は更に、組成物、特にワクチン組成物の製造における上記株の使用を含む。上記組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を更に含む。
【００１６】
1つの実施の形態において、本発明は、医薬として使用するための、より具体的には被験体におけるB.ヒオディセンテリアによる感染、及び上記感染の関連した臨床症候、例えば（粘膜出血性）下痢性疾患の治療、その危険性の低下、又はその予防において使用するための、本明細書に記載される株又は組成物を提供する。
【００１７】
一般的には、上記株又は組成物は、被験体へと治療的有効量において経口的に又は非経口的に投与される。
【００１８】
本発明は更に、本明細書に記載される株又は組成物を被験体に投与することにより、該被験体をB.ヒオディセンテリア感染に対して免疫するための方法及びキットを提供する。より具体的には、本発明は、B.ヒオディセンテリア感染症の治療、予防、抑制、又は（その危険性の）低下のための方法及びキットであって、その方法が、それを必要とする被験体に本明細書に規定される株又は組成物を投与することを含む、方法及びキットを包含する。
【００１９】
更なる実施の形態において、B.ヒオディセンテリア感染に対する被験体のワクチン接種のためのキットは、（a）本発明による少なくとも1種のワクチン株を含むワクチン組成物と、（b）被験体のワクチン接種のための説明書とを含む。
【００２０】
本発明は更に、B.ヒオディセンテリアの候補ワクチン株を同定する方法であって、（a）B.ヒオディセンテリアの試料を取得する工程と、（b）配列番号1〜6に示される核酸分子の1種以上（全てを含む）、又はそれと本質的に同一の配列の存在若しくは不存在、及び／又は相応のmRNA若しくはタンパク質産物、例えば配列番号10〜15により表されるタンパク質産物、又はそれと本質的に同一の配列の発現を測定する工程とを含み、上記核酸の存在又は相応のmRNA若しくはタンパク質の発現が、B.ヒオディセンテリアのワクチン株の指標である、方法を提供する。
【００２１】
更なる実施の形態において、本発明は、ワクチン株と病原性野外株とを区別する方法（DIVA原理）を提供する。さらに、本発明は、動物における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着を診断する方法であって、（a）上記動物から試料を取得する工程と、（b）配列番号1〜6に示される核酸配列を含む1種以上若しくは全てのポリヌクレオチド配列、又はそれと本質的に同一の配列の存在若しくは不存在、及び／又は相応のmRNA若しくはコードされるタンパク質産物、例えば配列番号10〜15に示されるタンパク質産物、又はそれと本質的に同一の配列の発現を測定する工程とを含み、上記核酸又は相応のmRNA若しくはタンパク質産物の存在が、動物における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着の存在の指標である、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】種々のB.ヒオディセンテリア株のin vitroでの溶血能を示す図である。溶血は、赤血球懸濁液を種々のB.ヒオディセンテリア株の上清と一緒にインキュベートした後の450 nmでの吸光度の平均値により表される。PC：ポジティブコントロール、NC：ネガティブコントロール。B.ヒオディセンテリア株と参照株B204との間には有意差が認められる（*P<0.01）。
【図２】溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株及びBVF1株についての糞便中排泄と糞便スコアとの間の相関を示す図である。糞便スコアは、糞便中排泄と相関している。パネル（a）：溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株、パネル（b）：BVF1株。糞便スコア0：正常、1：より軟質であるが有形、2：無形で半濡れ、3：流動性、3.5：流動性で粘液又は血液を伴う、4：流動性で粘液及び血液を伴う。
【図３】ワクチン接種された動物及びワクチン接種されていない動物についての平均糞便スコアを示す図である。ワクチン接種されたグループ及びワクチン接種されていないグループについての平均糞便スコア。左軸に日間平均（棒）、右軸に累積平均（線）。
【図４−１】B.ヒオディセンテリアBVF1株の遺伝子BHWA1_RS02195、BHWA1_RS02885、BHWA1_RS09085、tlyA、tlyB、tlyC、hlyA、NADHオキシダーゼ、及び16S rRNAについての核酸及び推定アミノ酸配列を示す図である。
【図４−２】同上
【図４−３】同上
【図４−４】同上
【図４−５】同上
【図４−６】同上
【図４−７】同上
【図５】ワクチン接種されたグループ及びワクチン接種されていないグループにおけるレシーバー動物についての累積平均糞便スコアを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書で使用される数量を特定していない単数形（"a", "an", and "the"）は、文脈により明確に指示されない限り、単数及び複数の両方の指示物を含む。本明細書で使用される「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含まれる（comprised of）」という用語は、「含んでいる、挙げられている（including）」、「含む、挙げられる（includes）」又は「含有している（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又はオープンエンド（open-ended）であり、追加的な、列挙されていないメンバー、要素又は方法工程を除外するものではない。本明細書で使用される「約」という用語は、パラメーター、量、時間的期間等の測定可能な値を指す場合、具体的な値の及びその値からの変量を包含し、かかる変量が開示される発明を実施するのに適切である限り、±10％以下、好ましくは±5％以下、より好ましくは±1％以下の変量を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値は、その値自体も具体的に、また好ましくは、開示される。一群のメンバーの1以上又は少なくとも1つのメンバーといった「1以上」又は「少なくとも1つ」という用語が、更なる例示によりそれ自体明確であるが、とりわけこの用語は、例えば、上記メンバーの任意の1つ、又は上記メンバーの任意の3超、4超、5超、6超、若しくは7超等、また上記メンバーの全てに及ぶ上記メンバーの任意の2以上に対する言及を包含する。本明細書に具体的に言及され、引用される全ての参考文献及び教示は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。別段の定めがない限り、技術用語及び科学用語を含む本発明の開示に使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。更なる指示により、用語の定義は、本発明の教示をよりよく理解するために含まれ得る。以下の節では、本発明の種々の態様を更に詳細に規定する。そこで規定された各々の態様は、そうではないことが明確に示されていない限り、他の任意の態様（単数又は複数）と組み合わせてもよい。特に、好ましい又は有益であると示される任意の特徴を、好ましい又は有益であると示される任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせてもよい。本明細書を通じての「一実施形態」又は「或る実施形態」という言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特質が、本発明の少なくとも1つの実施形態に包含されることを意味する。
【００２４】
本発明の1つの実施形態は、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（B.ヒオディセンテリア）の分離株を提供する。B.ヒオディセンテリアは、スピロヘータ綱に属する嫌気性のグラム陰性の化学栄養細菌であり、その長くて細い螺旋形状を特徴とする。B.ヒオディセンテリアに感染した動物は、下痢性疾患を発症する。B.ヒオディセンテリアに感染したブタ動物は、大腸の上皮表面の広範な炎症及び壊死を特徴とする豚赤痢（SD）を発症する。したがって、特に本発明の株、組成物、キット及び方法は、ブタ動物（小豚及び大豚）において使用するために適していると考えられている一方で、それらはまた、その他の、ヒト、伴侶動物、例えばイヌ及びネコ、並びに家畜、例えばニワトリ及びガチョウ、ウマ、ウシ及びヒツジ、又は動物園の哺乳動物、例えば非ヒト霊長類動物、ネコ科の動物、イヌ科の動物、及びウシ科の動物を含む哺乳類及び鳥類の動物種に適用することも可能である。本明細書で使用される「被験体」は、ヒト又は動物、特にブタ動物、例えば小豚、大豚及び子豚を含む。
【００２５】
本発明は、新規のB.ヒオディセンテリア株、及びその使用に関する。驚くべきことに、上記株を被験体に投与することにより、定着の大幅な抑制及び糞便排出の抑制が、病原性B.ヒオディセンテリア株によるチャレンジ後に達成され、それにより（再）感染の機会が本質的に低下することが判明した。本発明の株は、下痢の臨床症状が認められず、ワクチン接種された被験体の成長に対して悪影響が観察されなかったので安全である。上記株は、能動免疫（該株が、被験体において体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答の発生を引き起こす能力）を刺激するだけでなく、感染に対しても防御する（すなわち、定着に成功することがより少ない）ため、防御免疫がもたらされる。さらに、上記株は、表現型的にだけでなく遺伝的にもB.ヒオディセンテリアの病原性野外株と容易に区別することができる。
【００２６】
本発明の株は、B.ヒオディセンテリアの生分離株である。特定の実施形態においては、上記株は、弱毒化された非病原性の分離株である。用語「病原性の」及び「病原性」は、本明細書では、下痢性疾患と関連する臨床症状を引き起こす能力を有するB.ヒオディセンテリア株を記載するために使用される。用語「生」は、本明細書では、増殖及び生殖が可能なB.ヒオディセンテリアを記載するために使用される。したがって、本発明の生B.ヒオディセンテリア株は、被験体の結腸に定着可能であるが、B.ヒオディセンテリア感染と関連する臨床症状（例えば、本明細書に記載される症状）を引き起こすべきではない。さらに、本発明の株は、ワクチン接種された被験体において限られた複製のみが可能であり、B.ヒオディセンテリアの病原性株に対して（少なくとも部分的に又は大幅に）防御的である免疫応答を誘導することが可能である。
【００２７】
本明細書で使用される用語「株」は、1種以上の特徴、例えばリボソームRNA配列の多様性、DNA多型、血清型分別、又は毒素産生により、その種内の他の株と区別することができる細菌種の変異体を記載している。本発明においては、B.ヒオディセンテリア株は、それらの病原性状態により区別することができる。すなわち、株は、病原性又は非病原性として分類される。病原性B.ヒオディセンテリア株の例としては、WA1、B204、Vic2、BW1、NSW5、QH17、及びNSW15が挙げられるが、一方で非病原性株の例としては、B78T、SA2206、VS1、A1、B234、R301、B6933、及びFM 88.90が挙げられる（La et al., 2014）。病原性B.ヒオディセンテリア参照株WA1の全ゲノム配列は、Bellgard et al., 2009により提供される。
【００２８】
ブラキスピラは、溶血能力があり、溶血の程度は、それらを特徴付けるために使用されており、ここでB.ヒオディセンテリアは、強いβ溶血を示す。本発明において、幾つかの溶血関連遺伝子の配列を、10種の異なるB.ヒオディセンテリア株の間で比較した。本発明の株は、配列番号1、配列番号2若しくは配列番号3に示される核酸配列を含む又は該配列からなる遺伝子の少なくとも1種（2種又は3種を含む）を有することを特徴としている。更なる実施形態において、本発明の株は、配列番号4、配列番号5若しくは配列番号6に示される核酸配列を含む又は該配列からなる更なる遺伝子の1種以上（2種又は3種を含む）が存在することを特徴としている。より具体的には、上記株は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5及び配列番号6により表される溶血関連遺伝子が存在することを特徴とし、任意に配列番号7、配列番号8若しくは配列番号9に示される核酸配列を含む又は該配列からなる遺伝子の1種以上を更に含む。より具体的には、本発明の株は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、及び配列番号9に示される核酸配列を有する遺伝子を含む。さらに、本発明はまた、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9に示される核酸配列と本質的に同一の核酸配列を有する1種以上の（2種、3種、4種、5種、6種、7種又は8種を含む）遺伝子、好ましくは全ての遺伝子を含む株を包含する。本明細書で使用される場合に、用語「本質的に同一」は、配列番号1〜9のいずれか1種又は全てに示される配列と同等であるが、1つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失により相違し（例えばアレル変異体）、そしてまた遺伝暗号の縮重により相違する核酸も含むものとする核酸配列に適用する。したがって、本質的に同一の配列は、本明細書に規定される特定の配列番号のいずれか1種（又は組み合わせ）により表される核酸配列の全長にわたって、少なくとも約90%又は95%同一、すなわち少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を含む。注目すべきことに、本発明の非病原性株は、プラスミドベースの病原性関連遺伝子を含み、その点で、現在知られている一般的に上記プラスミドベースの病原性関連遺伝子を欠いた非病原性株とは相違している。プラスミドにコードされる病原性関連遺伝子の核酸配列は、参照株WA1において特徴的なBHWA1_02678、BHWA1_02679、BHWA1_02680、及びBHWA1_02681と本質的に同一又は同一である。
【００２９】
更なる実施形態において、B.ヒオディセンテリア分離株は、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又は該配列からなる1種以上のポリペプチド（タンパク質）をコードするDNAゲノム（又は遺伝子）を含む。より具体的には、B.ヒオディセンテリア分離株は、配列番号10、配列番号11、及び配列番号12からなるアミノ酸配列の群から選択されるポリペプチドの1種以上（2種又は3種を含む）をコードするDNAゲノムを含む。より具体的には、上記株は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、又は配列番号15により表されるアミノ酸配列を含む又は該配列からなる1種以上の（全てを含む）ヘモリジン関連ポリペプチドをコードするDNAゲノム（又は遺伝子）を含み、かつ任意に配列番号16、配列番号17又は配列番号18により表されるアミノ酸配列を含む又は該配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の1種以上を更に含む。さらに、本発明はまた、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び／又は配列番号17に示されるアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列を有する1種以上の（2種、3種、4種、5種、6種、7種又は8種を含む）ポリペプチド、好ましくは全てのポリペプチドを特徴とする株を包含する。「本質的に同一」は、配列番号10〜17のいずれか1種又は全てにより表されるアミノ酸配列と、少なくとも約90%又は95%の、すなわち少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する配列に適用する。本明細書で使用される、代わりに「同一性」とも呼ばれる用語「配列同一性」は、2種のポリペプチド配列及び／又は2種のポリヌクレオチド配列の間の配列同一性のパーセンテージを指し、その測定方法は、当該技術分野で知られている（例えば、NCBI／BLAST）。
【００３０】
更なる実施形態において、本発明は、国際寄託当局：ベルギー総合微生物収集所（BCCM/LMG細菌収集所（Bacteria Collection））、Laboratorium voor Microbiologie（ゲント大学（UGent）、K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent、ベルギー）で2015年10月23日に寄託された寄託番号LMG P-29184を有する細菌株に関する。特に、上記株は、既知の株であるB78T、SA2206、VS1、A1、B234、R301、B6933、FM88.90、及びBlack et al., 2015に記載されるその他の株とは遺伝的に及び／又は機能的に異なる。例えば、BVF1株における遺伝子BHWA1_RS02195のヌクレオチド配列は、B78T株（JXNF01000009.1）におけるそのヌクレオチド配列とは41ヌクレオチド異なり、BVF1株における遺伝子BHWA1_RS02195のヌクレオチド配列は、B6933株（JXNE01000029.1）におけるそのヌクレオチド配列とは41ヌクレオチド異なり、BVF1株における遺伝子BHWA1_RS02195は、FM88.90株（JXNJ01000024.1）におけるそのヌクレオチド配列とは37ヌクレオチド異なる。
【００３１】
本発明の株はまた、医薬組成物、特にワクチン組成物の製造において使用することもできる。幾つかの実施形態においては、上記組成物は、本明細書に記載されるB.ヒオディセンテリア株の少なくとも1種と、薬学的に許容可能な担体とを含む。したがって、本発明の1つの課題は、
本発明による株と、
薬学的に許容可能な担体と、
を含む、ブラキスピラ、特にブラキスピラ・ヒオディセンテリアに対する、（医薬）組成物又はワクチンを提供することである。
【００３２】
文言「薬学的に許容可能」は、生理学的に許容性であり、かつ被験体に投与した時に腹痛等のようなアレルギー反応又は同様に有害な反応を一般的に生じない分子種及び組成物に適用する。より具体的には、本発明のブラキスピラ株は、ワクチン、例えば生弱毒化ワクチンとして使用される。生弱毒化微生物は、非常に有効なワクチンであることが定着しており、そのようなワクチンにより誘発される免疫応答はしばしば、複製しない免疫原により生ずる免疫応答よりも規模が大きく、かつ期間が長い。このための1つの説明としては、生弱毒化株が、宿主において限定的な感染を確立し、自然感染の初期段階を模倣するからであると言うことができる。さらに、死滅化調製物とは違って、生ワクチンはしばしば、粘膜免疫応答及び細胞媒介性応答の誘導の点でより効力が高いが、それは上皮細胞及び抗原提示細胞、例えばマクロファージにおけるその複製能力と関係しているのかもしれない。しかしながら、生弱毒化ワクチンを使用することに対しては安全性において幾つかの懸念が残る。驚くべきことに、本明細書に記載されるワクチン株及び方法は、下痢の臨床症状を引き起こさず、かつワクチン接種された被験体の発育に影響を及ぼさないことが本発明において裏付けられ、それによりそのような生ワクチンの安全性は大きく改善される。用語「ワクチン」とは、ワクチンが投与された被験体における免疫応答を誘発する生物学的調製物を意味する。好ましくは、その免疫応答は、感染因子によるその後のチャレンジに対して被験体に幾つかの有用な又は防御的な効果を授ける。より好ましくは、上記免疫応答は、その後のチャレンジに際して、感染因子、特にB.ヒオディセンテリアと関連する疾患の発症を予防するか、又はその少なくとも1つの症状を改善するか、又は感染因子（例えばB.ヒオディセンテリア）と関連する疾患の少なくとも1つの症状の重症度を軽減させる。
【００３３】
本発明の株は、医術又は獣医術における当業者によく知られた投与量及び技術において、受容被験体の年齢、性別、体重、種及び状態、並びに投与経路のような要因を考慮に入れて投与することができる。投与経路は、粘膜投与（例えば、経口、経鼻、経肛門、経膣）を介した、非経口経路（皮内、筋内、皮下、静脈内、又は腹腔内）を介した、又は経皮的な経路とすることができる。株は、単独で投与することができ、又はその他の治療若しくは療法と共に同時投与されても、又は連続投与されてもよい。投与形は、懸濁液剤、シロップ剤又はエリキシル剤、及び非経口投与、皮下投与、皮内投与、筋内投与、又は静脈内投与（例えば注射用投与）のための調剤、例えば滅菌懸濁液剤又はエマルジョン剤を含み得る。
【００３４】
株は、スプレー剤として投与することもでき、又は食物及び／又は水中に混ぜることもでき、又は適切な担体との混合物で送達することもできる。用語「担体」とは、株と一緒に投与される希釈剤、助剤、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような医薬品用担体は、滅菌液体、例えば水及び石油由来、動物由来、植物由来又は合成由来の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ごま油等を含む油とすることができる。水又は（生理学的）食塩溶液及びデキストロース水溶液並びにグリセロール水溶液は、好ましくは担体として、特に注射用溶液のために使用される。上記組成物は、所望の投与経路及び製造に応じて、補助物質、例えば湿潤剤若しくは乳化剤、pH緩衝剤（例えば、ショ糖を含有するクエン酸緩衝液（pH 7.0）、重炭酸緩衝液（pH 7.0）単独、又はアスコルビン酸、ラクトース及び任意にアスパルテームを含有する重炭酸緩衝液（pH 7.0））、アジュバント、ゲル化添加剤若しくは粘度上昇添加剤、保存剤、フレーバー剤、着色剤（colors）等を含有し得る。標準的な医薬教科書、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」（1990年）, 第18版（Mack Publishing Co.社）を調べることで、過度の実験を行うことなく適切な調剤を製造することができる。使用される特定の薬学的に許容可能な賦形剤又は希釈剤は、本発明には決定的なものではなく、当該技術分野では慣例的なものである。該組成物は、液体形で製造することができ、又は乾燥粉体形、例えば凍結乾燥形であってもよい。
【００３５】
更なる実施形態において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載される株又は組成物を含む医薬組成物又はワクチンを提供する。文言「治療的有効量」は、本明細書では、感染と関連する1種以上の臨床症状、例えば限定されるものではないが、粘膜出血性下痢、大腸（盲腸及び／又は結腸）の炎症、及び減量を（大幅に）軽減若しくは予防するために、及び／又は感染した被験体の数を減少させるために、及び／又は被験体についての感染の度合いを低下させるために十分な量を意味するために使用される。
【００３６】
上記組成物は、経口投与、非経口投与、筋内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与、又は経皮投与のために製剤化され得る。特に、本明細書に記載される株又は組成物は、被験体へと経口投与により送達され、例えば食物及び／又は水と混合されるものとする。記載される投与経路は、手引きとして解釈されるにすぎない。それというのも、熟練の従業者であれば、任意の特定の被験体及び状態のために最適な投与経路及び任意の投与量を容易に決定することが可能であるからである。
【００３７】
当業者に知られるように、その用量又は量は、投与経路に従って変動する。当業者は、非経口投与されるワクチンのために有効な用量が、飲料水等を介して投与される同様のワクチンよりも少量であり得ることを理解することができる。上記製剤中に存在する必要がある微生物数は、当業者によって決定され、最適化され得る。しかしながら、一般的に被験体には、約106コロニー形成単位（CFU）〜1012 CFU、好ましくは107 CFU、108 CFU、109 CFU、1010 CFU、又は1011 CFUが単独投与単位で投与され得る。
【００３８】
本発明の実施形態に開示される組成物は、キットの一部であってもよい。より具体的には、該キットは、凍結乾燥された又はフリーズドライされたワクチン株製剤を含む。本明細書に記載される1種以上のB.ヒオディセンテリア株は、適切な培地中で培養することができ、かつ所望の程度にまで増殖させることが可能である。プールされた細菌ブロスを、安定化剤組成物（例えば、トレハロース、ソルビトール、ショ糖、ウシ胎児血清、酸化防止剤）と一緒に適切な比率で混合することができ、次いでそれを乾燥法に供することができる。その乾燥は、凍結乾燥機又は噴霧乾燥機により行うことができる。一般的に上記キットは、使用のための説明書も含むものとする。
【００３９】
本発明の組成物又はワクチンは、ブラキスピラ感染、特にB.ヒオディセンテリアによる感染に対して動物を防御するために非常に適している。本発明のブラキスピラ・ヒオディセンテリア株、及び該株を含む組成物又はワクチンは、家畜種、特にブタを免疫するために非常に適している。その関連で、上記株又は組成物は、例えば早期離乳ブタに投与することができる。上記投与は、単独用量で行われ、又は或る用量で或る特定期間後に1回若しくは数回繰り返して行われる。
【００４０】
したがって、本発明の1つの課題は、本発明のB.ヒオディセンテリア株の、被験体、より具体的には動物、更により具体的にはブタにおけるブラキスピラ・ヒオディセンテリア感染の予防的処置のために使用される医薬の製造のための使用を提供することである。したがって、本発明はまた、下痢、特に粘膜出血性下痢、更により具体的には豚赤痢と関連する下痢の治療、（その危険性の）低下、及び／又は予防のための、本明細書に記載されるB.ヒオディセンテリア株を包含する。したがって、本発明はまた、豚赤痢の治療方法、及びブタ集団におけるB.ヒオディセンテリアの蔓延の予防方法又は低減方法を提供する。
【００４１】
本明細書に記載される株は、定量的リアルタイムPCR（qPCR）により病原性野外株と簡単に区別することができる。本発明はまた、被験体における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着を診断又はスクリーニングする方法に関する。幾つかの実施形態において、上記方法は、B.ヒオディセンテリア感染を伴うことが疑われる被験体から試料を取得することを含む。「試料」とは、B.ヒオディセンテリア、又はそのポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチドを含むことが疑われる組織、生体液、又はその他の材料を指す。そのような組織、生体液、又は材料の例には、限定されるものではないが、血漿、血清、糞便材料、尿、胃及び腸の試料を含む生検材料が含まれる。該試料はまた、in vitroでの細胞培養成分も含み得る。
【００４２】
被験体にB.ヒオディセンテリアの非病原性株が定着しているかどうかは、本明細書に記載されるポリヌクレオチド／遺伝子若しくはタンパク質の有無を評価することにより、又は本明細書に記載される特定の突然変異の存在を測定することにより決定することができる。遺伝子の存在は、限定されるものではないが、RNA発現レベル及びタンパク質発現レベルを含む、遺伝子の転写及び翻訳と関連する任意の要素、又は遺伝子の指標である任意の要素の分析により、並びにゲノム内でのDNA配列の存在の分析により測定することができる。試料における遺伝子又はその産物の存在の同定のための技術は、当業者に知られている。慣例の技術、例えばノーザンブロッティング及びウェスタンブロッティング、PCR、マイクロアレイ並びにELISAは当該技術分野で知られている。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着を診断する方法であって、（a）上記被験体から試料を取得する工程と、（b）配列番号1〜6のいずれか1つ若しくは全てに示される1種以上の核酸配列を含む1種以上のポリヌクレオチド配列、又はそれと本質的に同一の配列の有無、及び／又は1種以上の相応のmRNA若しくは1種以上のコードされるタンパク質産物、例えば配列番号10〜15に示されるタンパク質産物、又はそれと本質的に同一の配列の発現を測定する工程とを含み、上記核酸又は相応のmRNA若しくはタンパク質産物の存在が、被験体における非病原性B.ヒオディセンテリアの定着の存在の指標である、方法を提供する。
【００４４】
更なる実施形態において本発明は、B.ヒオディセンテリアの候補ワクチン株を同定する方法であって、（a）B.ヒオディセンテリアの試料を取得する工程と、（b）配列番号1〜6に示される核酸分子の1種以上若しくは全て、又はそれと本質的に同一の配列の有無、及び／又は相応のmRNA若しくはタンパク質産物、例えば配列番号10〜15により表されるタンパク質産物、又はそれと本質的に同一の配列の発現を測定する工程とを含み、上記１種以上の核酸の存在又は相応のmRNA若しくはタンパク質の発現が、B.ヒオディセンテリアのワクチン株の指標である、方法を提供する。
【００４５】
以下の実施例を、開示される発明主題による方法、組成物、及び結果を説明するために以下に示す。これらの実施例は、本明細書に開示される発明主題の全ての態様を含むものとは解釈されずに、代表的な方法、組成物、及び結果を説明するものと解釈される。これらの実施例は、当業者に明白な本発明の均等物及び変形形態を除外するものとは解釈されない。
【実施例】
【００４６】
材料及び方法
1.  BVF1の単離及び同定
新鮮な糞便試料を、フランダースにある飼養場でブタから採集し、試料採取後12時間にわたり5%のヒツジ血液、1%の酵母エキス、25 μg／mlのバンコマイシン、400 μg／mlのスペクチノマイシン及び25 μg／mlのコリスチンを補ったトリプチケースソイ寒天（TSA）からなる選択プレート上で培養した。分離株を、5%のヒツジ血液及び1%の酵母エキスを補ったトリプチケースソイ寒天（TSA）プレート上での3回〜5回の継代培養により純化し、最終的に更に使用するまで-70℃で貯蔵した。
【００４７】
表現型のキャラクタリゼーションは、純粋な4日培養物で行われ、β溶血、インドール産生、馬尿酸加水分解、並びにα-ガラクトシダーゼ及びβ-グルコシダーゼの有無を基礎とするものであった。インドール産生は、スポットインドール試験（Remel BactiDrop、英国、ダートフォード）を使用して測定した。その他の生化学的特徴のためには、市販のディスクを製造元の説明書に従って使用した（Rosco Diatabs、デンマーク、トストルプ）。B.ヒオディセンテリア（ATCC 27164）、B.ピロシコリ（B.pilosicoli）（ATCC 51139）、及びB.イノセンス（B.innocens）（ATCC 29796）の基準株を、測定される全ての表現型の特徴に関するポジティブコントロールの提供のために含めた。
【００４８】
幾つかの種特異的PCRを、以下の遺伝子：tlyA、23S rRNA、及びnoxに基づいて実施した。NADHオキシダーゼ（nox）遺伝子及び16S rRNA遺伝子を、以下の16Sのためのプライマー：kag-007 フォワード 5'GTTTGATYCTGGCTCAGARCKAACG3'（配列番号18）、kag-009 リバース 5'CTTCCGGTACGGMTGCCTTGTTACG3'（配列番号19）、及び以下のnoxのためのプライマー：Br-NOX1-F 5'TAGCYTGCGGTATYGCWCTTT3'（配列番号20）、Br-NOX3-R 5'GCMTGWATAGCTTCRGCATGRT3'（配列番号21）を使用することにより部分的にシーケンシングした（Johansson K. et al., 2004、Weissenboeck H. et al., 2005）。BVF1株から回収された配列を、BLAST解析によりB.ヒオディセンテリアの基準株及び参照株の既知の配列と比較した。BVF1株は、国際寄託当局：ベルギー総合微生物収集所（BCCM/LMG細菌収集所）、Laboratorium voor Microbiologie（ゲント大学（UGent）、K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, ベルギー）で2015年10月23日に寄託され、寄託番号LMG P-29184を有する。
【００４９】
2.  in vitroでの溶血アッセイ
B.ヒオディセンテリアBVF1株及びベルギーのブタ群から分離された9種のその他のB.ヒオディセンテリア野外株の溶血能力を、in vitroでの溶血アッセイにおいて比較した。新鮮な血液を、8週齢のブタから採集し、一定容量の血液を等容量のアルセバー液と直ちに混合した（50／50（容量／容量））。この血液-アルセバー混合物を、デキストロース−グルコース−ベロナール（DGV）緩衝溶液で3回洗浄し、該懸濁液のヘマトクリット値を、マイクロヘマトクリット遠心分離器及びリーダを使用して測定した。DGV緩衝溶液を、赤血球の10%の懸濁液が得られるまで添加した。
【００５０】
種々のB.ヒオディセンテリア分離株の新鮮な培養物を調製し、嫌気的条件下で37℃において振盪台上で24時間にわたりインキュベートした。各々の株につき3種の培養物を作製した。インキュベート後に、培養物を純度について顕微鏡検査し、620 nmでの光学密度（OD620）を測定した。培養物は、そのOD620が0.30から0.35の間で測定された場合にのみ確保した。上清を500 gでの20分間の遠心分離により回収し、濾過滅菌した。溶血性の強いB204株（ATCC 31212）を、in vitroでの溶血アッセイにおける参照株として用いた。
【００５１】
溶血アッセイは、96ウェルのU底型マイクロタイタープレート中で実施した。100 μlの10%の赤血球懸濁液を各々のウェル中にピペッティングした後に、100 μlの濾過したB.ヒオディセンテリア培養上清を添加した。2%のTriton-Xを、ポジティブコントロール（完全な溶血）として用い、DGVを、ネガティブコントロール（溶血なし）として用いた。プレートを、5%のCO2雰囲気中にて37℃で2時間にわたりインキュベートした。インキュベート後に、上澄み液の吸光度を、ELISAリーダ（450 nm）を使用して測定した。全てのアッセイは、3つ組で実施し、それらを3回繰り返した。
【００５２】
3.  溶血関連遺伝子のシーケンシング
hlyA遺伝子、tlyA遺伝子、tlyB遺伝子、tlyC遺伝子、BHWA1_RS02885遺伝子（ヘモリジン活性化タンパク質）、BHWA1_RS02195遺伝子（ヘモリジンIII）及びBHWA1_RS09085遺伝子（ヘモリジンIIIチャネルタンパク質）の完全配列を、in vitroでの溶血アッセイで使用した全てのB.ヒオディセンテリア株について測定した。hlyAについては、ACP1-Foプライマー及びACP1-ReプライマーをBarth et al., 2012により記載されるように使用し、tlyAについては、それらのプライマーは、Muir et al., 1992により寄託されたtly（tlyAは、それがブラキスピラのヘモリジンだけであろうと思われていたので、元はtlyと呼ばれていた）の配列（GenBank：X61684.1 GI:296624）、及びB.ヒオディセンテリアWA1の全ゲノム配列（GenBank：NC_012225.1 GI:225618950）に基づいて設計された。tlyBプライマー及びtlyCプライマーは、配列（GenBank：X73140.1 GI:511144）（tlyB）、（GenBank：X73141.1 GI:511146）（tlyC）、及びWA1の全ゲノム配列とのそれぞれのアライメントを基礎とするものであった。BHWA1_RS02885、BHWA1_RS02195、及びBHWA1_RS09085についてのプライマーは、GenBankに寄託されたそれらの配列（GenBank：NC_012225.1 GI:225618950）に基づいて設計された。プライマー、WA1の全ゲノム配列（GenBank：NC_012225.1 GI:225618950）中に示される位置、産物の長さ、及びアニーリング温度を、表1に示す。
【００５３】
表1：溶血関連遺伝子tlyA、tlyB、tlyC、BHWA1_RS02885、BHWA1_RS02195、及びBHWA1_RS09085の検出のためのプライマー、位置、産物のサイズ、及びアニーリング条件
【表１−１】
2019500884.tif 000002
【表１−２】
2019500884.tif 000003
【００５４】
PCRを、標準的条件下で25 μlの反応容量でTaqポリメラーゼ（Bioline社、米国、トーントン）を用いて実施した。PCRプログラムは、95℃で15分間から開始し、それに続き、95℃で30秒間を35サイクル、プライマー特異的なアニーリング温度で1分間、そして72℃で1分間であった。最終伸長工程は、72℃で2分間であり、その後に試料を4℃に冷却した。至適アニーリング温度は、各々のプライマー対について表1に示される。全ての株について、それらの配列を、互いに、そして以前に寄託された配列とBLAST解析により比較した。
【００５５】
4.  B.ヒオディセンテリアBVF1株及び幾つかの溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株のブタに対する病原性の比較
これらの3種の溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株及び溶血性の弱いB.ヒオディセンテリアBVF1株を使用して、5つの独立した実験の感染試験においてブタに接種した。実験モデル、接種経路、株、及びブタの頭数を、表2に示す。
【００５６】
表2：in vivo試験の実験構成
【表２】
2019500884.tif 000004
【００５７】
全てのブタは、豚赤痢歴のない商業飼養場から購入した。ブタを少なくとも1週間にわたり順化させ、水及び市販のスターター飼料を自由に摂取させた。幾つかの試験においては、感染の発生を促すために接種の時間に大豆飼料養生法を適用した。この大豆飼料養生法の間には、それぞれの1日の後半に上記市販のスターター食餌を純粋な大豆かすに置き換えた。全ての接種の前には、12時間の断食期間を設けた。接種培養物を、嫌気的条件下において振盪台上にて37℃で48時間にわたり増殖させた。
【００５８】
全ての実験において、糞便飼料を、接種後1週間の間に3回収集した。DNAを、糞便飼料からQIAamp Fast DNA Stoolキット（Qiagen社、ドイツ、ヒルデン）を使用して抽出し、その抽出されたDNAを使用して、B.ヒオディセンテリアDNAの存在及び量をqPCRで測定した。試料採取の時点で、糞便をスコア付けした。糞便スコアは、0：正常、1：より軟質であるが有形、2：無形で半濡れ、3：流動性、3.5：流動性で粘液又は血液を伴う、4：流動性で粘液及び血液を伴うとして決定された。
【００５９】
糞便中排泄と糞便スコアとの相関を、溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株でのin vivo実験について、そしてBVF1株でのin vivo実験について測定した。
【００６０】
5.  プラスミド遺伝子の存在に関するPCR
プラスミドにコードされる遺伝子の有無を、上記in vivo試験で使用した全ての分離株について測定した。B204株（ATCC 31212）は、ポジティブコントロールとして使用した。PCRを、プラスミドの複製起点の周りに位置する3つのプラスミド遺伝子：BHWA1_02686、BHWA1_02687、及びBHWA1_02688（La et al., 2011）について実施した。さらに、PCRを、プラスミドにコードされる病原性関連遺伝子BHWA1_02678、BHWA1_02679、BHWA1_02680、及びBHWA1_02681についても同様に実施した。これらの病原性関連遺伝子は、それぞれラジカルS-アデノシルメチオニンタンパク質、グリコシルトランスフェラーゼ、NAD依存性エピメラーゼ、及びdTDP-4-デヒドロラムノース3,5エピメラーゼ（rfbC）をコードする（La et al.,2011、La et al., 2014）。これらの7種のプラスミド遺伝子のそれぞれに、Laら（2011, 2014）により以前に記載された3種のプライマー対を使用した。その以前に記載されたプライマー対の他にも、該当する場合には3種のプライマー対の組み合わせ、例えばフォワードプライマーBHWA1_02680a-FとリバースプライマーBHWA1_02680b-Rとの組み合わせを使用した。
【００６１】
【表Ａ】
2019500884.tif 000005
【００６２】
6.  ブタワクチン接種モデルにおけるB.ヒオディセンテリアBVF1株の防御能
このワクチン接種実験において、5週齢の21頭のブタを、豚赤痢を伴わない商業飼養場から購入した。動物を無作為に2つのグループに割り当てた：動物1〜12はワクチン接種グループ、動物A〜Iは非ワクチン接種グループ。動物の体重を1週間に1回（weekly）量り、市販のスターター飼料を与えた。
【００６３】
-2日目、-1日目、及び0日目に、ワクチン接種グループに、1 ml当たりに約109個の細菌を含有するBVF1株の20 mlの接種物を胃内に接種した。同日に、非ワクチン接種グループに、20 mlの滅菌培養培地を胃内に偽接種した。19日目、20日目、及び21日目に、全ての動物に、病原性B.ヒオディセンテリアB204株を胃内で接種した。全ての動物に、1 ml当たりに約109個の細菌を含有するB204株の20 mlの接種物を3日連続で与えた。
【００６４】
全ての動物を、臨床症候の存在について毎日監視した。1週間に3回、糞便試料を収集し、糞便をスコア付けした。DNAを、全ての糞便飼料からQIAamp Fast DNA Stoolキット（Qiagen社、ドイツ、ヒルデン）を使用して抽出し、その抽出されたDNAを使用して、B.ヒオディセンテリアDNAの量をqPCRで測定した。動物を、豚赤痢の初発症候の24時間後に安楽死させた。赤痢症候を示さなかった動物は、40日目（B.ヒオディセンテリアB204によるチャレンジの19日後）に安楽死させた。
【００６５】
ワクチン接種され、チャレンジされた動物の糞便におけるワクチン株BVF1及びチャレンジ株B204のB.ヒオディセンテリアDNAの量を特異的に測定するために、BVF1株又はB204株のいずれかのDNAと特異的にアニーリングするようにプライマーを設計した。各々の株に特異的なプライマーは、BHWA1_RS02885遺伝子（ヘモリジン活性化タンパク質）を基礎とするものであった。BVF1株を検出するプライマーは、HlyVacFo 5'TGGTGAAATACTGCCAAA3'（配列番号40）及びHlyVacRe 5'TGTTGTTATATCGTCCATAC3'（配列番号41）であり、B204株（及びin vitroでの溶血研究で使用した全ての溶血性の強い株）を検出するプライマーは、HlyInfFo 5'GTTAATGCTGAAAAAATGATG3'（配列番号42）及びHlyInfRe 5'AAGCTCTTGTATGGAATATAC3'（配列番号43）である。両方のプライマー対は、別々のqPCR反応で使用された。それというのも、両方のプライマー対は、74.5℃の融解温度を呈し、それらの融解温度に基づいて区別することができないからである。
【００６６】
標準の作製のために、BHWA1_RS02885遺伝子の部分を（636 bp）、プライマーHlysSTFo 5'CAAGTTCTATGATACCTAC3'（配列番号44）及びHlysSTRe 5'GCCGCCTTTAACATAYTCTTT3'（配列番号45）を使用して増幅させた。各々のB.ヒオディセンテリア株のために、別々の標準を調製した。その標準は、それぞれ10 μLの反応混合物について108個のPCRアンプリコンから出発する10倍希釈物からなっていた。2 μLの抽出されたDNA鋳型を、0.25 μLの両方のプライマー、3.5 μLのHPLC水、及び5 μLのSensiMix（商標）SYBR No-ROX（Bioline Reagents Ltd社、英国）からなる10 μLの反応混合物中に懸濁した。PCRプログラムは、95℃での10分間にわたる変性に続き、95℃での30秒間にわたる増幅サイクル、60℃での30秒間にわたるアニーリング、そして73℃での30秒間にわたる伸長からなっていた。
【００６７】
両方の標準及び試料を、2つ組でC1000サーマルサイクラーを備えたCFX96（商標）RT-PCRシステム（Bio-Rad社、米国、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に通した。Bio-Rad CFX Manager（バージョン1.6）ソフトウェアを、増幅されたDNAの閾値サイクル（Ct）数の計算及び融解曲線分析のために使用した。上記2つ組の平均値を、糞便試料におけるB.ヒオディセンテリアBVF1株又はB204株のDNAの定量のために使用した。
【００６８】
7.  ブタに関するシーダーモデルにおけるブラキスピラ・ヒオディセンテリアBVF1株の防御能の実証
ワクチン接種されたブタとワクチン接種されていないブタとの間の豚赤痢の感染及び疾患動態を、シーダーモデルで比較した。このシーダーモデルにおいては、上記ブタの半分には、B.ヒオディセンテリアのチャレンジ株を接種する（「シーダー」）。これらのシーダーを、接種されていないため感染した飼養場と同様に感染症に罹り得るブタ（レシーバー）と一緒にさせる。6週齢の60頭のブタを、豚赤痢を伴わない商業飼養場から購入した。該動物を、無作為に6つのグループに分け、1つの処置につき3つ組とした。各々のグループは、5頭のシーダー動物及び5頭のレシーバー動物を含んでいた。
【００６９】
【表Ｂ】
2019500884.tif 000006
【００７０】
-2日目、-1日目、及び0日目に、ワクチン接種グループ1V、2V、3V中の全てのブタに、1 ml当たりに約109個の細菌を含有するBVF1株の20 mlの接種物を経口で接種（ワクチン接種）した。同日に、非ワクチン接種グループNV1、NV2及びNV3中の全てのブタに20 mlの滅菌培養培地を経口で偽ワクチン接種した。1週間につき3回、糞便試料を収集し、糞便の粘稠性をスコア付けした。DNAを、全ての糞便飼料からQIAamp Fast DNA Stoolキット（Qiagen社、ドイツ、ヒルデン）を使用して抽出し、その抽出されたDNAを使用して、B.ヒオディセンテリアのワクチン株BVF1のDNAの量をqPCRで測定した。
【００７１】
19日目、20日目、及び21日目に、各々のグループ（V1、V2、V3、NV1、NV2、NV3）における全てのシーダー動物に、病原性B.ヒオディセンテリアB204株を経口で接種した（「チャレンジ」）。全てのシーダー動物に、1 ml当たりに約109個の細菌を含有するB204株の20 mlの接種物を3日連続で与えた。これらの動物は、B.ヒオディセンテリアをその同居動物に蔓延させ得る「シーダー動物」として働いた。病原性チャレンジ株が接種されていない同居動物は、「レシーバー動物」と呼称する。
【００７２】
全ての動物を毎日監視し、そして1週間につき2回、糞便試料を収集し、糞便の粘稠性をスコア付けした。DNAを、全ての糞便飼料からQIAamp Fast DNA Stoolキット（Qiagen社、ドイツ、ヒルデン）を使用して抽出し、その抽出されたDNAを使用して、B.ヒオディセンテリアB204株の量をqPCRで測定した。
【００７３】
動物を、病原性B.ヒオディセンテリアB204株によるチャレンジの31日後、32日後、又は33日後である52日目、53日目、又は54日目に安楽死させた。動物は、重度の食欲減退、重度の無気力（apathy：アパシー）、又は40℃を超える発熱があった場合には、実験が終わる前に安楽死させた。
【００７４】
結果
1.  BVF1株の種の特定
表現型のキャラクタリゼーション及び種特異的PCRについての結果は、表3及び表4に示される。表現型的には、BVF1株は、寒天プレート上で示される弱い溶血のためB.インテルメディア（B.intermedia）として特定されることとなる。しかしながら、種特異的PCRは、BVF1株をB.ヒオディセンテリアとして特定する。BVF1株の16S rRNA及びnox遺伝子と、B.ヒオディセンテリアの基準株及び参照株の既知の配列との配列比較は、最終的にBVF1株をB.ヒオディセンテリアとして特定する：16S rRNA及びnoxは、B.ヒオディセンテリアの以前に寄託された株と100%の類似性を示す。
【００７５】
表3：B.ヒオディセンテリア及びB.インテルメディアの基準株と比較された、BVF1株の表現型のキャラクタリゼーション
【表３】
2019500884.tif 000007
【００７６】
表4：B.ヒオディセンテリア及びB.インテルメディアの基準株と比較した、BVF1株についての種特異的PCRの結果。PCRによりターゲティングされた遺伝子を、それぞれの種ごとに示す。
【表４】
2019500884.tif 000008
【００７７】
2.  BVF1株は、有意により低いin vitroでの溶血能を有する
図1は、記載されたB.ヒオディセンテリア株のin vitroでの溶血性を示す。溶血性の強度は段階的な変動を示したが、それでも殆どの株はB204参照株と同じ範囲内の溶血性の強度を示した。BVF1株について、溶血性は、B204参照株よりも有意に低かった（P<0.01）。
【００７８】
本発明者らはここで、溶血性の程度が、B.ヒオディセンテリア株間でも様々であるという証拠を提供する。実験的接種の後に、多数（糞便1 g当たり108コピー）の溶血性の弱いBVF1株を排出する動物は、実験的接種後に臨床症候又は病変を一切示さなかった。B.ヒオディセンテリア株間の病原性の差が、溶血性と関係なく同様に裏付けられた（Achacha et al., 1996、La et al., 2014）。例えば、プラスミドにコードされた一式の遺伝子が存在しないことは、低減された病原性の指標であり得る。それにもかかわらず、豚赤痢の診断及び抑制のために、低溶血性株及び低病原性株の存在は、広範囲にわたって影響を及ぼすこととなる。
【００７９】
B.ヒオディセンテリアの有無は、現在では、豚赤痢診断及び立入管理のための唯一の基準として使用される。群検査がB.ヒオディセンテリアについて陽性であれば、これは、明白な臨床症候が存在しなくても、豚赤痢保菌動物の潜在的な危険性があるため、対象となる飼養場の取引の可能性に影響を及ぼすことがある。診断が主に微生物培養手順を基礎とするものである場合に、溶血性の弱いB.ヒオディセンテリア株は、B.インテルメディアと間違えられることがある。診断が主に最近のPCR試験を基礎とするものである場合には、特定の株の溶血性の程度を見積もることができない。
【００８０】
3.  BVF1株は、幾つかの溶血関連遺伝子にヌクレオチド変化及びアミノ酸変化を示す
ヌクレオチド配列の違い及びアミノ酸配列の違いは、表5及び表6にまとめられている
【００８１】
表5：この研究で使用されたB.ヒオディセンテリア株の溶血関連遺伝子に関するヌクレオチド及びアミノ酸の違い。B.ヒオディセンテリアWA1株のゲノム配列と比較した違い。アミノ酸変化の数は、括弧内に示される。
【表５】
2019500884.tif 000009
【００８２】
表6：B.ヒオディセンテリアBVF1株の溶血関連遺伝子に関する、B.ヒオディセンテリアの幾つかの非病原性株のゲノム配列と比較したヌクレオチドの違い
【表６】
2019500884.tif 000010
【００８３】
hlyAに関する配列は、2個のヌクレオチドに関して相違した3bIII株及び4cI株を除いて、全ての株に関して同様であった。しかしながら、これらのヌクレオチドの違いは、異なるアミノ酸配列への翻訳をもたらさない。BVF1株は、tlyA遺伝子中に核酸置換を有する唯一の株であった。その置換は、Muir et al., 1992によるTly（GenBank：X61684.1 GI:296624）に示される位置501（G→T）に位置するか、又はWA1のゲノム配列（GenBank：NC_012225.1 GI:225618950）中の位置267228に位置していた（Bellgard et al., 1992）。この核酸置換は、アミノ酸配列中の位置10において異なるアミノ酸への翻訳をもたらした（グリシン→システイン）。
【００８４】
tlyB遺伝子の配列は、分離株間で違いを示し、ヌクレオチド変化の数は、表5に示されるように1個から7個にまで及ぶ。BVF1株を除く全ての株に関して、これらのヌクレオチドの違いは、参照株WA1と異なるアミノ酸配列への翻訳をもたらさなかった。溶血性の弱いBVF1株の配列は2つの位置で相違しており、そのうち位置1416206でのヌクレオチド変化（C→T）は、アミノ酸配列における位置384でのアミノ酸置換への翻訳をもたらす（アラニン→トレオニン）。
【００８５】
tlyC遺伝子に関しては、tlyC配列の4ヌクレオチドが相違した溶血性の弱いBVF1株を除いて、全ての株が同一であった。それにもかかわらず、この変化されたヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列をコードしなかった。
【００８６】
BHWA1_RS02885（ヘモリジン活性化タンパク質）遺伝子配列は、6種の株に関してヌクレオチドの違いを示さなかった。8dII株及びM1株は、B.ヒオディセンテリア参照株WA1の配列と比べて10ヌクレオチドが相違する同一の配列を共にしている。しかしながら、これらのヌクレオチドの違いは、異なるアミノ酸配列への翻訳をもたらさない。BVF1株は、B.ヒオディセンテリア参照株WA1の配列と比べて63ヌクレオチドもの違いを示した。これらのヌクレオチドの違いは、以下の位置で5つのアミノ酸置換をもたらす：81（バリン→イソロイシン）、113（メチオニン→バリン）、164（グルタミン酸→アスパラギン酸）、227（トレオニン→セリン）、264（バリン→イソロイシン）。
【００８７】
BHWA1_RS02195遺伝子（ヘモリジンIII）に関しては、全ての株が、B.ヒオディセンテリア参照株WA1の配列と14ヌクレオチド又は15ヌクレオチドの違いを示すことが分かった（表5）。これらの配列全ては、以下の位置で5つのアミノ酸の違いを有するアミノ酸配列への翻訳をもたらした：51（プロリン→セリン）、56（バリン→イソロイシン）、59（バリン→ロイシン）、82（ロイシン→イソロイシン）、93（バリン→イソロイシン）。B.ヒオディセンテリア参照株B204のBHWA1_RS02195を同様にシーケンシングし、その配列は、10cI株、25cI株、及びD1株の配列と同一であった。これは、B.ヒオディセンテリア参照株WA1の配列と比べて5つの違いを有する同様のアミノ酸をもたらす。BVF1株は、B.ヒオディセンテリア参照株WA1の配列と比べて44ヌクレオチドの違いを示し（表5）、それは、WA1株の配列と8アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列への翻訳をもたらす：47（トレオニン→イソロイシン）、49（バリン→メチオニン）、56（バリン→イソロイシン）、79（バリン→イソロイシン）、82（ロイシン→イソロイシン）、111（バリン→イソロイシン）、114（ロイシン→プロリン）、133（メチオニン→イソロイシン）。
【００８８】
この研究における株のヘモリジンIIIチャネルタンパク質遺伝子BHWA1_RS09085についての配列は、B.ヒオディセンテリア参照株WA1の配列と等しいか、又は1ヌクレオチド若しくは2ヌクレオチドだけ異なり（表5）、BVF1株では12ヌクレオチドだけ異なっていた。3bIII株及び4cI株に関しては、それらのヌクレオチドの違いは、位置217でのアミノ酸置換（アルギニン→イソロイシン）をもたらし、BVF1に関しては、位置209でのアミノ酸置換（イソロイシン→バリン）をもたらした。
【００８９】
低溶血性のBVF1株は、殆どの溶血関連遺伝子において、この研究におけるその他の全ての株及びB.ヒオディセンテリア参照株WA1と比較して顕著な配列の違いを示した。B.ヒオディセンテリアM2株はまた、中程度の溶血性である。しかしながら、M2株の溶血関連遺伝子についての殆どのアミノ酸配列は、溶血性の強いB.ヒオディセンテリア参照株WA1と同一である。BHWA1_RS02195についてのアミノ酸配列は、WA1と比較して5つの違いを示す。それにもかかわらず、該アミノ酸配列は、この研究において使用される殆どの株の配列及びB.ヒオディセンテリア参照株B204のアミノ酸配列と同一である。タンパク質の機能に影響を及ぼし得るアミノ酸配列の違いは、溶血能における段階的変化に影響するかもしれないだけでなく、より幅広い変動性、例えば特定の環境下でin vitroでもin vivoでもプロモーター領域の活性の改変又は遺伝子の転写の改変をも生ずるかもしれない。繰り返しの継代培養は、表現型変化、例えば溶血性の喪失（Peppler et al., 1982）を、既にBVF1株及びM2株の一次分離の間にもたらし得るが、溶血性は常に、それぞれ弱い及び中程度であった。
【００９０】
4.  B.ヒオディセンテリアBVF1の糞便中排泄は、豚赤痢の臨床症候と相関していない
溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株を使用する全ての実験的試験において、赤痢の症候は、糞便中にB.ヒオディセンテリアを排泄した動物について示された。実験番号1においては、糞便中排泄は、最初に接種から平均11日後に示され、そして糞便中排泄は、25日間（試験の終わり）にわたり継続した。実験2においては、チャレンジされた動物の糞便中排泄が、最初に7日後に示された。この試験において、動物はそれらが臨床的赤痢を発症したらすぐに安楽死させたので、排泄の継続は時間と共に続かなかった。実験3においては、糞便中排泄は、最初に接種から20日後に見られ、21日間（試験の終わり）にわたり継続した。
【００９１】
実験4及び5においては、BVF1株の糞便中排泄は、最初にそれぞれ接種から7日後又は5日後に示され得た。しかしながら、赤痢の臨床症候は顕著ではなかった。BVF1株の糞便中排泄には時間が限られており、それは14日間（実験4）又は10日間（実験5）にわたり継続した。
【００９２】
実験的試験1、2及び3において使用される溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株に関しては、その株の糞便中排泄と臨床症状との発生の間に強い相関（p<0.001）がある。これは、図2のパネルAに示されている。この図のパネルBに示されるように、BVF1株に関しては糞便中排泄と臨床症状との間に相関は存在しない。BVF1株の糞便中排泄は、溶血性の強いB.ヒオディセンテリア株の排泄と比較して同様の濃度に達するが、BVF1が接種された動物の糞便スコアは、決して1を超えない。
【００９３】
5.  プラスミド（plasmid）にコードされる遺伝子は、BVF1株に存在する
プラスミドの複製起点の周りに位置する3つの遺伝子は、種々のin vivo試験で使用される全てのB.ヒオディセンテリア株において存在した。各々の株は、各々の遺伝子に利用可能なプライマー対のいずれか1つを使用したPCRにおいて陽性であった。4種のプラスミドベースの病原性関連遺伝子はまた、in vivo試験のために使用される種々の株全てにおいて存在していた。8dII株では、各々の遺伝子のための3種の利用可能なプライマー対のいずれか1つを使用したPCRにおいて陽性の結果が得られ、BVF1株及び49株では、プライマー：BHWA1_02678a-F/BHWA1_02678a-R、BHWA1_02679a-F/BHWA1_02679a-R及びBHWA1_02679b-F/BHWA1_02679b-R、BHWA1_02680a-F/BHWA1_02680a-R及びBHWA1_02680a-F/BHWA1_02680b-R、BHWA1_02681a-F/BHWA1_02681b-R及びBHWA1_02681a-F/BHWA1_02681c-Rを使用することで陽性の結果が得られた。
【００９４】
これにより、BVF1株が、現在知られている非病原性株、例えば4種のプラスミドベースの病原性関連遺伝子の全てを欠いているB78T、SA2206、VS1、A1、B234、R301、B6933、及びFM 88.90（La et al., 2014）とは異なることが裏付けられる。
【００９５】
6.  ワクチン接種された動物は、病原性B.ヒオディセンテリア株によるチャレンジ後に有意により低い糞便スコアを示す
ワクチン接種されていない動物のグループにおいて、9頭の動物のうち5頭は、剖検における典型的な病変（粘膜出血性の結腸内容物を伴う線維性壊死性大腸炎）を伴う豚赤痢を発症した。ワクチン接種されたグループにおいては、11頭のうち2頭が豚赤痢を発症した。結果は、表7に示される。
【００９６】
表7：最高糞便スコア、剖検における赤痢病変、及び結腸におけるB.ヒオディセンテリアのチャレンジ株B204の存在
【表７】
2019500884.tif 000011
a：m=粘液あり、b=血液あり。
【００９７】
図3は、ワクチン接種されたグループ及びワクチン接種されていないグループについての平均糞便スコアを示す。日間平均糞便スコア（棒）及び累積糞便スコア（線）を示す。ワクチン接種されたグループの累積糞便スコアは、ワクチン接種されていないグループと比較して有意により低い（p<0.05）。
【００９８】
7.  ワクチン接種は、豚赤痢の伝染を減らし、糞便粘稠性を改善する
ワクチン接種されていない動物のグループにおいて、シーダー動物及びレシーバー動物は、ワクチン接種されたグループにおけるシーダー動物及びレシーバー動物と比較して有意により高い糞便スコア（＝より悪い糞便粘稠性）を示した。これは、ワクチン接種された動物での高い糞便スコアが得られる確率が、ワクチン接種されていない動物と比べてより低いことにより実証された（β=-1.67±0.43標準誤差）。さらに、ワクチン接種された動物に関しては、B.ヒオディセンテリアのチャレンジ株B204と接触した後により高い糞便スコアになるまでに有意により多くの時間が費やされた（β=0.07±0.02標準誤差）。
【００９９】
図5は、ワクチン接種されたグループ及びワクチン接種されていないグループにおけるレシーバー動物についての累積平均糞便スコアを示す。
【０１００】
まとめると、本発明により、ブタに一過性に定着することができ、かつ病原性野外株と簡単に区別することができる非病原性のワクチン株が提供される。ワクチン接種に引き続き病原性B.ヒオディセンテリア株によるチャレンジ後に、病原性株の定着及び糞便排出が低減され、臨床症候の重症度がより低くなることが裏付けられた。さらに、該ワクチン株は、自然感染に対して発育及び飼料効率に悪影響を及ぼさずに赤痢の症状を軽減する。
【０１０１】
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【図１】
2019500884.tif 000012
【図２】
2019500884.tif 000013
【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
2019500884.tif 000018
【図４−５】
2019500884.tif 000019
【図４−６】
2019500884.tif 000020
【図４−７】
2019500884.tif 000021
【図５】
2019500884.tif 000022
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019500884.tif 000024
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