(57)【要約】  本開示は、免疫抑制性間葉系間質細胞及び免疫抑制性間葉系間質細胞から分泌されるエキソソーム、並びにそれらの調製方法を記載する。本開示はまた、免疫抑制性間葉系間質細胞又は分泌されたエキソソームを投与することによって、対象を治療するか又は状態の危険性がある対象を予防するための方法を記載する。本開示はまた、免疫抑制性間葉系間質細胞及び免疫抑制性間葉系間質細胞から分泌されるエキソソームを調製するためのキットを記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するための方法であって、
インビトロの低酸素培養条件下で間葉系間質細胞に炎症促進性サイトカインを適用するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
間葉系間質細胞が、低酸素培養条件に１時間〜４８時間曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
間葉系間質細胞が、低酸素培養条件に２４時間曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
間葉系間質細胞が、低酸素培養条件に４８時間曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
炎症促進性サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＦＮ−γが、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＦＮ−γが、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
低酸素培養条件が、間葉系間質細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び約１％Ｏ２〜約５％Ｏ２に曝すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
低酸素培養条件が、間葉系間質細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び１％Ｏ２に曝すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
低酸素培養条件が、間葉系間質細胞を低酸素模倣物に曝すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
低酸素模倣物が、デスフェリオキサミン、塩化コバルト、ヒドララジン、塩化ニッケル、ジアゾキシド、及びジメチルオキサリグリシンからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
低酸素模倣物が、５０μＭ〜２００μＭの濃度の低酸素模倣物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
炎症促進性サイトカイン及び低酸素培養条件に曝した後に、間葉系間質細胞から分泌されたエキソソームを単離するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するための方法であって、
供給源から単離された間葉系間質細胞を得るステップ；及び
低酸素培養条件で前記間葉系間質細胞に炎症促進性サイトカインを適用するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１６】
供給源が、脂肪組織、臍帯、骨髄、歯肉、及びｉＰＳＣからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
間葉系間質細胞が、低酸素培養条件に１時間〜４８時間曝される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
間葉系間質細胞が、低酸素培養条件に２４時間曝される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
間葉系間質細胞が、低酸素培養条件に４８時間曝される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
炎症促進性サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＦＮ−γが、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＦＮ−γが、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
低酸素培養条件が、間葉系間質細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び１％Ｏ２〜５％Ｏ２に曝すことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
低酸素培養条件が、間葉系間質細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び１％Ｏ２に曝すことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
低酸素培養条件が、間葉系間質細胞を低酸素模倣物に曝すことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
低酸素模倣物が、デスフェリオキサミン、塩化コバルト、ヒドララジン、塩化ニッケル、ジアゾキシド、及びジメチルオキサリグリシンからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
低酸素模倣物が、５０μＭ〜２００μＭの濃度の低酸素模倣物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
炎症促進性サイトカイン及び低酸素培養条件に曝した後に、間葉系間質細胞から分泌されたエキソソームを単離するステップをさらに含む、請求項１５〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
プライムされた間葉系間質細胞。
【請求項３１】
請求項１〜１３又は１５〜２８のいずれかに記載の方法によって産生された間葉系間質細胞。
【請求項３２】
請求項３１に記載の間葉系間質細胞から単離されたエキソソーム。
【請求項３３】
プライムされたエキソソーム。
【請求項３４】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している対象を治療する方法であって、
前記対象にプライムされた間葉系間質細胞を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３５】
対象に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
免疫抑制剤が、プライムされた間葉系間質細胞と同時に対象に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
免疫抑制剤が、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノレートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン、シクロホスファミド、イホスファミド、及び免疫抑制に使用されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項３５〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
対象に免疫療法を施すステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞の投与と同時に対象に施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
免疫療法がキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を予防する方法であって、前記状態の危険性がある対象にプライムされた間葉系間質細胞を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項４４】
免疫抑制剤を対象に投与するステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
免疫抑制剤が、プライムされた間葉系間質細胞と同時に対象に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
免疫抑制剤が、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノレートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン、シクロホスファミド、イホスファミド、及び免疫抑制に使用されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
対象に免疫療法を施すステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞の投与と同時に対象に施される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に施される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
免疫療法がキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している対象を治療する方法であって、前記対象に請求項３１に記載の間葉系間質細胞を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項５３】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を予防する方法であって、前記状態の危険性がある対象に請求項３１に記載の間葉系間質細胞を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項５４】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している対象を治療する方法であって、前記対象に請求項３２に記載のエキソソームを投与するステップを含む、前記方法。
【請求項５５】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を予防するための方法であって、前記状態の危険性がある対象に請求項３２に記載のエキソソームを投与するステップを含む、前記方法。
【請求項５６】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している対象を治療する方法であって、前記対象にプライムされたエキソソームを投与するステップを含む、前記方法。
【請求項５７】
対象に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
免疫抑制剤が、プライムされたエキソソームと同時に対象に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫抑制剤が、プライムされたエキソソームを投与する直前又は直後に対象に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノレートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン、シクロホスファミド、イホスファミド、及び免疫抑制に使用されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項５７〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
対象に免疫療法を施すステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞の投与と同時に対象に施される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に施される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
免疫療法がキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む、請求項６１〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、急性組織損傷、糖尿病性潰瘍、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を予防する方法であって、前記状態の危険性がある対象にプライムされたエキソソームを投与するステップを含む、前記方法。
【請求項６６】
対象に免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
免疫抑制剤が、プライムされたエキソソームと同時に対象に投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
免疫抑制剤が、プライムされたエキソソームを投与する直前又は直後に対象に投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
免疫抑制剤が、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノラートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン、シクロホスファミド、イホスファミド、及び免疫抑制に使用されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項６６〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
対象に免疫療法を施すステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞の投与と同時に対象に施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
免疫療法が、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
免疫療法がキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む、請求項７０〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
免疫調節剤の活性をスクリーニングする方法であって、
プライムされた間葉系間質細胞を前記免疫調節剤で処理するステップ；
前記免疫調節剤で処理した後、前記プライムされた間葉系間質細胞を単離するステップ；及び
前記プライムされた間葉系間質細胞を免疫活性アッセイに供し、前記免疫調節剤が前記プライムされた間葉系間質細胞の免疫抑制活性を変化させたか否かを判定するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項７５】
免疫調節剤が、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノレートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン、シクロホスファミド、イホスファミド、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、及び免疫抑制に使用されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
免疫調節剤の活性をスクリーニングする方法であって、
請求項３１に記載の間葉系間質細胞を前記免疫調節剤で処理するステップ；
前記免疫調節剤で処理した後、プライムされた間葉系間質細胞を単離するステップ；及び
前記プライムされた間葉系間質細胞を免疫活性アッセイに供し、前記免疫調節剤が前記プライムされた間葉系間質細胞の免疫抑制活性を変化させたか否かを判定するステップ
を含む、前記方法。
【請求項７７】
免疫調節剤が、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノレートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン、シクロホスファミド、イホスファミド、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、及び免疫抑制に使用されるモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
プライムされた間葉系間質細胞を薬学的に許容される担体中に含む組成物。
【請求項７９】
請求項３１に記載の間葉系間質細胞を含む組成物。
【請求項８０】
請求項３２に記載のエキソソームを含む組成物。
【請求項８１】
プライムされたエキソソームを薬学的に許容される担体中に含む組成物。
【請求項８２】
免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するための方法であって、
プライムされたエキソソームの存在下で間葉系間質細胞を培養するステップ；及び
培養した前記間葉系間質細胞を単離するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項８３】
免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するための方法であって、
請求項３２に記載のエキソソームの存在下で間葉系間質細胞を培養するステップ；及び
培養した前記間葉系間質細胞を単離するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項８４】
第１の成分と第２の成分とを含む免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するためのキットであって、
前記第１の成分が、炎症促進性サイトカインと低酸素模倣物との混合物を含み、
前記第２の成分が、凍結した間葉系間質細胞を含む、前記キット。
【請求項８５】
炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項８６に記載のキット。
【請求項８６】
炎症促進性サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項８４に記載のキット。
【請求項８７】
ＩＦＮ−γが、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項８６に記載のキット。
【請求項８８】
ＩＦＮ−γが、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項８６に記載のキット。
【請求項８９】
低酸素模倣物が、デスフェリオキサミン、塩化コバルト、ヒドララジン、塩化ニッケル、ジアゾキシド、及びジメチルオキサリグリシンからなる群から選択される、請求項８４に記載のキット。
【請求項９０】
低酸素模倣物が、５０μＭ〜２００μＭの濃度の低酸素模倣物である、請求項８４に記載のキット。
【請求項９１】
凍結した間葉系間質細胞が、請求項３１に記載の間葉系間質細胞である、請求項８４に記載のキット。
【請求項９２】
第１の成分、第２の成分、及び第３の成分を含む免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するためのキットであって、
前記第１の成分が炎症促進性サイトカインを含み、
前記第２の成分が低酸素模倣物を含み、及び
前記第３の成分が凍結した間葉系間質細胞を含む、前記キット。
【請求項９３】
炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
炎症促進性サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項９３に記載のキット。
【請求項９５】
ＩＦＮ−γが、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項９３に記載のキット。
【請求項９６】
ＩＦＮ−γが、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
低酸素模倣物が、デスフェリオキサミン、塩化コバルト、ヒドララジン、塩化ニッケル、ジアゾキシド、及びジメチルオキサリグリシンからなる群から選択される、請求項９２に記載のキット。
【請求項９８】
低酸素模倣物が、５０μＭ〜２００μＭの濃度の低酸素模倣物である、請求項９２に記載のキット。
【請求項９９】
凍結した間葉系間質細胞が、請求項３１に記載の間葉系間質細胞である、請求項９２に記載のキット。
【請求項１００】
第１の成分と、第２の成分とを含む免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するためのキットであって、
前記第１の成分が、炎症促進性サイトカインを含み、
前記第２の成分が、凍結した間葉系間質細胞を含む、前記キット。
【請求項１０１】
炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
炎症促進性サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
ＩＦＮ−γが、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０４】
ＩＦＮ−γが、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＦＮ−γである、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０５】
凍結した間葉系間質細胞が、請求項３１に記載の間葉系間質細胞である、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０６】
免疫抑制性間葉系間質細胞を投与するための準備に使用するためのキットであって、プライムされた間葉系間質細胞を含む、前記キット。
【請求項１０７】
免疫抑制性間葉系間質細胞を投与するための準備に使用するためのキットであって、請求項３１に記載の間葉系間質細胞を含むキット。
【請求項１０８】
免疫抑制療法を施すための準備に使用するためのキットであって、プライムされたエキソソームを含む、前記キット。
【請求項１０９】
免疫抑制療法を施すための準備に使用するためのキットであって、請求項３２に記載のエキソソームを含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１３，６９６号、及び２０１７年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３０，６１７号の利益を主張し、両者は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明は、国立生物医学画像化生物工学研究所（National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering）によって授与された認可番号ＵＨ３ＥＢ１７１０３及びＥＢ００２５２０の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１７年１０月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、16-50199-WO_SL.txtという名前で、サイズは７５６８バイトである。
【背景技術】
【０００４】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ，Mesenchymal stromal cell）は、免疫抑制及び寛容を促進するそれらの能力、並びにアロジェニックに使用されるそれらの能力のために、免疫障害の治療における応用について研究されている。過去１０年にわたり、炎症、移植拒絶反応、自己免疫疾患などの状態における病理学的免疫反応の治療におけるＭＳＣの使用が数多くの臨床試験により評価されてきている（clinicaltrials.gov）。これらの試験は、ＭＳＣが低免疫原性であり、免疫応答の発生を阻害することができ、そして多様な免疫細胞集団を炎症促進性から抗炎症性／調節性表現型へと偏らせ得ることを実証する、インビトロ及び動物モデルにおける有望な研究が動機付けとなっている。本発明者らは、投与前にＭＳＣでより強く、より均質な免疫抑制表現型を誘導することはより良い臨床転帰につながると仮説を立て、効果的なインビトロプライミングレジメンを特定しようとした。
【０００５】
臨床試験はＭＳＣが安全であることを示す一方で、ＭＳＣは投与後数日以内に死滅するが、それでもなお治療効果を誘発することもまた明らかになった。これはＭＳＣが注射後の最初の数日の間にパラクリン因子を分泌し、それがＭＳＣ自身よりも長く持続する周囲組織への免疫調節変化を引き起こすという「ヒットエンドラン（hit-and-run）」仮説を導いた。
【０００６】
たとえ持続的な生着がＭＳＣに影響を与えるために必要でないかもしれないとしても、細胞療法の改善のための多くの余地が残っている。例えば、臨床試験では単純に培養増殖ＭＳＣを使用しているが、ＭＳＣはベースラインでは免疫抑制性は非常にわずかであり、特定の環境キュー（cue）に曝された後にのみ免疫抑制表現型となることは十分に確立されている。その後、個々の患者の内的キューに応じて、これらのナイーブなＭＳＣのほんの一部だけが注射後に免疫抑制性になる。細胞のごく一部のみが誘導され、誘導に遅延があると仮定すると、ヒットインラン（hit-in-run）パラダイムにおける「ヒット」は、細胞が注射の時に均一に免疫抑制性の状態で開始した場合ほど効果的ではない。このため、それらの投与前に、より均一な免疫抑制性のＭＳＣ表現型を誘導するためのインビトロプライミングレジメンが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、免疫抑制性間葉系間質細胞及びそれを形成するための方法に関する。
【０００８】
一実施形態では、免疫抑制性間葉系間質細胞を調製する方法が提供される。この方法は、インビトロの低酸素培養条件で間葉系間質細胞に炎症促進性サイトカイン（pro-inflammatory cytokine）を適用する（apply）ステップを含む。
【０００９】
別の実施形態では、免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するための方法が提供される。この方法は、供給源から単離された間葉系間質細胞を得るステップと、次に低酸素培養条件で間葉系間質細胞に炎症促進性サイトカインを適用するステップとを含む。
【００１０】
別の実施形態では、プライムされた（primed）間葉系間質細胞が提供される。
【００１１】
他の実施形態では、プライムされたエキソソームが提供される。
【００１２】
別の実施形態では、サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している対象を治療する方法が提供される。この方法は、プライムされた間葉系間質細胞を対象に投与するステップを含む。
【００１３】
別の実施形態では、サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を予防するための方法が提供される。この方法は、プライムされた間葉系間質細胞を対象に投与するステップを含む。
【００１４】
別の実施形態では、サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を経験している対象を治療するための方法が提供される。この方法は、プライムされたエキソソームを対象に投与するステップを含む。
【００１５】
別の実施形態では、サイトカインストーム、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主病、及び炎症性疾患からなる群から選択される状態を予防するための方法が提供される。この方法は、プライムされたエキソソームを対象に投与するステップを含む。
【００１６】
別の実施形態では、免疫調節剤の活性をスクリーニングするための方法が提供される。この方法は、プライムされた間葉系間質細胞を免疫調節剤で処理し、免疫調節剤での前記処理の後にプライムされた間葉系間質細胞を単離し；その後、免疫調節剤がプライムされた間葉系間質細胞の免疫抑制活性を変化させたかどうかを決定するために、プライムされた間葉系間質細胞を免疫活性アッセイに供するステップを含む。
【００１７】
別の実施形態では、プライムされた間葉系間質細胞を薬学的に許容される担体中に含む組成物が提供される。
【００１８】
別の実施形態では、プライムされたエキソソームを薬学的に許容される担体中に含む組成物が提供される。
【００１９】
別の実施形態では、免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するための方法が提供される。この方法は、プライムされたエキソソームの存在下で間葉系間質細胞を培養し、次いで培養した間葉系間質細胞を単離するステップを含む。
【００２０】
別の実施形態では、第１の成分と第２の成分とを含む免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するためのキットが提供される。第１の成分は炎症促進性サイトカイン及び低酸素模倣物（hypoxia mimetic）を含む。第２の成分は凍結した間葉系間質細胞を含む。
【００２１】
別の実施形態では、第１の成分、第２の成分、及び第３の成分を含む免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するためのキットが提供される。第１の成分は炎症促進性サイトカインを含む。第２の成分は低酸素模倣物を含む。第３の成分は凍結した間葉系間質細胞を含む。
【００２２】
別の実施形態では、第１の成分と第２の成分とを含む免疫抑制性間葉系間質細胞を調製するためのキットが提供される。第１の成分は炎症促進性サイトカインを含む。第２の成分は凍結した間葉系間質細胞を含む。
【００２３】
別の実施形態では、免疫抑制性間葉系間質細胞を投与するための準備（preparing）に使用するためのキットが提供される。キットは、プライムされた間葉系間質細胞を含む。
【００２４】
別の実施形態では、免疫抑制療法を施すための準備に使用するためのキットが提供される。このキットはプライムされたエキソソームを含む。
【００２５】
上記の実施形態のいずれかにおいて、間葉系間質細胞は、１時間から４８時間低酸素培養条件に曝される。
【００２６】
上記の実施形態のいずれかにおいて、間葉系間質細胞は、低酸素培養条件に２４時間、曝される。
【００２７】
上記の実施形態のいずれかにおいて、間葉系間質細胞は低酸素培養条件に４８時間、曝される。
【００２８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１Ｂ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７及びＩＬ−２３からなる群から選択される。
【００２９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、炎症促進性サイトカインはＩＦＮ−γである。
【００３０】
上記の実施形態のいずれかにおいて、ＩＦＮ−γは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【００３１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、ＩＦＮ−γは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【００３２】
上記の実施形態のいずれかにおいて、低酸素培養条件は、間葉系間質細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び約１％Ｏ２〜約５％Ｏ２に曝すことを含む。
【００３３】
上記の実施形態のいずれかにおいて、低酸素培養条件は、間葉系間質細胞を３７℃、５％ＣＯ２、及び１％Ｏ２に曝すことを含む。
【００３４】
上記の実施形態のいずれかにおいて、低酸素培養条件は低酸素模倣物を含む。
【００３５】
上記の実施形態のいずれかにおいて、低酸素模倣物は、デスフェリオキサミン（desferrioxamine）、塩化コバルト、ヒドララジン（hydralazine）、塩化ニッケル、ジアゾキシド（diazoxide）、及びジメチルオキサリグリシン（dimethyloxalyglycine）からなる群から選択される。
【００３６】
上記の実施形態のいずれかにおいて、低酸素模倣物は、５０μＭ〜２００μＭの濃度である。
【００３７】
上記の実施形態のいずれかにおいて、炎症促進性サイトカイン及び低酸素培養条件への曝露後に間葉系間質細胞から分泌されたエキソソームを単離するステップをさらに含む。
【００３８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、供給源は、脂肪組織、臍帯、骨髄、歯肉、及びｉＰＳＣからなる群から選択される。
【００３９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫抑制剤を対象に投与することをさらに含む。
【００４０】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫抑制剤は、プライムされた間葉系間質細胞と同時に対象に投与される。
【００４１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫抑制剤は、プライムされたＭＳＣを投与する直前又は直後に対象に投与される。
【００４２】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ステロイド、ミクロフェノレートモフェチル、抗ＣＤ３抗体、アザチオプリン（aziothioprine）、シクロホスファミド、イホスファミド、及び免疫抑制に使用される他のモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【００４３】
上記の実施形態のいずれかにおいて、対象に対する免疫療法をさらに含む。
【００４４】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫療法は、プライムされた間葉系間質細胞の投与と同時に対象に施される。
【００４５】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫療法は、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に対象に施される。
【００４６】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫療法はキメラ抗原受容体Ｔ細胞を含む。
【００４７】
上記の実施形態のいずれかにおいて、キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、プライムされた間葉系間質細胞と同時に対象に投与される。
【００４８】
上記の実施形態のいずれかにおいて、プライムされた間葉系間質細胞を投与する直前又は直後に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を対象に投与する。
【００４９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫抑制剤は、プライムされたエキソソームと同時に対象に投与される。
【００５０】
上記の実施形態のいずれかにおいて、免疫抑制剤は、プライムされたエキソソームを投与する直前又は直後に対象に投与される。
【００５１】
上記の実施形態のいずれかにおいて、キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、プライムされたエキソソームと同時に対象に投与される。
【００５２】
上記の実施形態のいずれかにおいて、キメラ抗原受容体Ｔ細胞は、プライムされたエキソソームを投与する直前又は直後に対象に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】図１Ａは、対照脂肪由来ＭＳＣの三系統分化能を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、異なるプライミング条件への曝露時のＭＳＣ表面マーカー及びＨＬＡ−ＤＲの発現を示す図である。
【図２】ＭＬＲ（上）又はＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって活性化されたＴ細胞（下）のいずれかを阻害する際の対照及び二重でプライムされたＭＳＣの様々な比率の試験を示す図である。
【図３】４８時間のプライミング後の免疫抑制に関連する遺伝子の誘導を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、二重ＩＦＮ−γ／低酸素プライミングへのＭＳＣ曝露後の遺伝子上方制御の動態を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、３人のドナーからのＭＳＣを二重ＩＦＮ−γ／低酸素プライミングに４８時間、曝露し、次いで正常酸素圧に戻し、そして酸素正常状態に戻った後に発現定量した後の遺伝子発現の動態を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、４８時間の二重ＩＦＮ−γ／低酸素プライミングに曝されたＭＳＣの後の遺伝子発現（２日目）の動態を、正常状態で７日後に２回目の刺激に曝されたＭＳＣの遺伝子発現（１１日目）と比較して示す図である。
【図５】初期時点での対照ＭＳＣにおける発現に対して正規化した、２日間対４日間の二重プライミングを介して刺激されたＭＳＣについてのｍＲＮＡ転写変化を示す図である。
【図６】４８時間のプライミング後のＭＳＣにおけるタンパク質発現を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、陽性対照（ＭＳＣなしのＭＬＲ）に対して正規化した混合リンパ球反応（ＭＬＲ）との共培養における、異なるプライムされたＭＳＣの免疫抑制効果を示す図である。全ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中のＣＤ１０７＋細胞の％もまた、陽性対照に対して正規化して示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、対照ＭＳＣ共培養物について増殖％、ＣＤ２５＋、又はＣＤ１０７＋に対して正規化した、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）との共培養物中の異なるプライムされたＭＳＣの免疫抑制効果を示す図である（ｎ＝７〜１１）。
【図８】ＭＬＲとの共培養における、異なるプライムされたＭＳＣの免疫調節効果を示す図である。
【図９】（ＥＬＩＳＡによる）培地中に分泌されたＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１αの量を示す図である。
【図１０】混合リンパ球反応共培養物（ＭＳＣ−ＭＬＲ）においてプライムされたＭＳＣがＴ細胞を阻害する能力を評価するための実験デザインを示す図である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞における％分裂、％ＣＤ２５＋、％ＣＤ１０７＋で示される、対照及びプライムされたＭＳＣによる可変阻害を示すＭＳＣ−ＭＬＲ共培養実験を示す図である（ｎ＝７〜１１）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＭＳＣ−ＭＬＲ共培養の１日目及び３日目でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＬＵＴ１発現を示すＭＳＣ−ＭＬＲ共培養実験を示す図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＭＳＣ−ＭＬＲ共培養の１日目及び３日目に測定された炎症促進性サイトカインレベルを示すＭＳＣ−ＭＬＲ共培養実験を示す図である。
【図１２】ＭＳＣ−ＭＬＲ共培養実験からのＣＤ４＋Ｔ細胞メモリパネルの特徴付けを示す図である。
【図１３】４８時間プライミングしたＭＳＣからの馴化培地中の相対的可溶性ＨＧＦレベルを示す図である。
【図１４】４８時間の単一又は二重プライミング後のタンパク質発現を示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、異なるプライミングレジメンの４８時間後のＭＳＣにおける相対的なＩＤＯ活性を示す、タンパク質レベル傾向に対する異種ｍＲＮＡの確認を示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、４８時間の異なるプライミングレジメンの後のＭＳＣ溶解物中の相対的なＨＬＡ−Ｇタンパク質レベルを表す、タンパク質レベル傾向に対する異種ｍＲＮＡの確認を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、プライミング条件で培養し、次いでシーホース（Seahorse）ＴＣプレート（１００００／ウェル）で２４時間培養したＭＳＣについてのシーホースミトコンドリアストレス試験データを示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、１日目及び３日目のＭＳＣ：ＭＬＲ共培養上清中のグルコースレベルを示す図である（２回の読み取りについての標準平均値を示す）。
【図１７Ａ】図１７Ａは、細胞代謝におけるＭＳＣプライミングの影響を示す図である。ここで、４８時間のプライミングの後、ＭＳＣを１ウェルあたり１００００細胞でシーホース組織培養プレートに再播種し、そしてシーホースMitostressキットによって評価した。ｎ＝５。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、４８時間のプライミング後のＭＳＣにおけるＧＬＵＴ１発現を示す、細胞代謝におけるＭＳＣプライミングの影響を示す図である。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、細胞代謝におけるＭＳＣプライミングの影響を示す図であり、１日目及び３日目のＭＳＣ−ＭＬＲ共培養実験におけるグルコース及び乳酸塩レベルを表す。ｎ＝２。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ｎ＝３についてｐＨが低下すると色素強度が増大することによって明らかにされた、細胞内ｐＨに対する外部Ｌ−乳酸濃度の影響を示す図である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、外部Ｌ−乳酸濃度が３０Ｍｍに達したときのＰＢＭＣ散乱特性の変化を示す図である。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、コンカナバリンＡに応答したＴ細胞分裂に対する乳酸濃度の影響を示す図である。
【図１９】対照、ＩＦＮ−γ、低酸素、及び二重刺激ＭＳＣにおけるエキソソームのサイズ分布を示す図である。
【図２０】活性化ＰＢＭＣへのＭＳＣ由来エキソソームの用量依存的取り込みを示す図である。
【図２１】強力で均一な免疫抑制表現型を促進する能力について評価されたＭＳＣ単一（ＩＦＮ−γ又は低酸素）及び二重（ＩＦＮ−γ＋低酸素）インビトロプライミングレジメンの概略図を示す図である。
【図２２】ＭＳＣを異なる濃度のＩＦＮ−γに４８時間曝露し、次いでフローサイトメトリーによりＩＤＯ発現について分析したＩＦＮ−γ滴定を示す図である。
【図２３】ＭＳＣを１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γに曝露し、免疫抑制タンパク質ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１の発現を分析するために異なる時点で試料を採取した場合の開始動態を示す図である。
【図２４】ＭＳＣを、異なる濃度の塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）又はデフェロキサミンメシレート／デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）のいずれかに曝露し、次いで解糖増強のマーカーであるＧＬＵＴ１について分析した低酸素模倣滴定実験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本開示は、病理学的免疫応答（炎症、自己免疫疾患、移植片拒絶反応）を含む複数の疾患に対する細胞療法として成功する可能性が高い免疫抑制性ＭＳＣ表現型の作製を記載する。現在のＭＳＣ療法は、プライムされていないＭＳＣを使用しており、これはベースラインで免疫抑制性ではなく、ＭＳＣも注射の後まもなく死滅する。本発明者らは、注射の前にＭＳＣをプライミングするための生物学的に触発された戦略、すなわち低酸素及び炎症促進性サイトカインを用いてこれらの課題を克服しようとした。
【００５５】
炎症と低酸素を組み合わせることの利点についての本発明者らの仮説は本発明者らのデータによって支持されている。ＩＦＮ−γ及び低酸素は、ｍＲＮＡで別個の免疫抑制タンパク質を上方制御し、組み合わせた場合、タンパク質レベルで複数の免疫抑制タンパク質の発現を相乗的に改善することが見出された。重要なことに、これらのキューのいずれか単独でＭＳＣをプライミングすると、プライムされていないＭＳＣよりも免疫抑制性ＭＳＣ表現型をもたらす一方、ＩＦＮ−γと低酸素を組み合わせると、はるかに抑制性である表現型がもたらされた。これは、これら２つのキューが組み合わされたとき、低酸素がＭＳＣに及ぼす代謝作用のために起こる免疫抑制タンパク質の発現増強に関連していると考えられる。本発明者らは、低酸素プライミングがＭＳＣをより強く解糖系に依存させ、それらのグルコース消費及び乳酸産生を非常に増加させることを示した。炎症性／活性化Ｔ細胞及びマクロファージもまたグルコース及び解糖系に依存しているので、本発明者らのＭＳＣは栄養素をめぐってそれらと競合している可能性があり、これは腫瘍における免疫回避のメカニズムとして記載されているシナリオである。同様に、高い乳酸レベルによる炎症細胞の抑制は、免疫回避の他の手段である。最後に、低酸素（単独又はＩＦＮ−γと組み合わせて）に遭遇したＭＳＣによる酸化的リン酸化から解糖系へのスイッチは、それらの酸素依存性が低いことを意味し、これは（酸素が制限されている）虚血性損傷の動物モデルにおける低酸素でプライムされたＭＳＣのより良い生存率の説明と一致している。
【００５６】
要約すると、本発明者らは、インターフェロン／炎症促進性サイトカイン（ＴＬＲ３リガンドではない）及び低酸素を抗炎症性の生存促進性ＭＳＣ表現型を誘導するために使用しているが、それは、従来技術におけるインターフェロンの枠組みとは反対であり、単に幹細胞性を可能にする要因としての低酸素の役割の説明の範囲を超えている。
【００５７】
上記のように、一態様において、望ましくない免疫応答の障害（例えば自己免疫疾患、炎症、移植片拒絶反応）の治療又は予防における細胞療法として使用するための間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）の可能性を高めるための細胞培養レジメンが提供される。
【００５８】
プライムされたＭＳＣ又はプライムされたエキソソームのヒトへの投与は、緩衝液、基礎培地、又は他の製剤中に懸濁されたＭＳＣ又はエキソソームの局所的又は全身的投与によるものであり得る。局所投与は、糖尿病性潰瘍又は火傷のような創傷部位での投与、筋肉内注射、脊髄注射、心臓への心臓パッチの投与、又は上大静脈、腸間膜血管若しくは冠状動脈への注射を含み得るが、これらに限定されない。全身投与は、静脈内注射、動脈内注射、又は腹腔内注射を含み得るが、これらに限定されない。ＭＳＣ又はエキソソームの用量及び投与のタイミングは、日常的な方法を用いて最適化されるだろう。ヒトにおける細胞ベースの治療としてのＭＳＣの使用についての一般的な議論は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるJun Zhang et al., The Challenges and Promises of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells for Use as a Cell-based Therapy, STEM CELL RESEARCH & THERAPY, Dec. 1, 2015を参照されたい。
【００５９】
ＭＳＣは臨床医のためにキットで調製することができる。キットは、プレプライムされたＭＳＣ又はエキソソームを含み得る。或いは、キットには、医師／病院がＭＳＣ自体をプライミングするために使用することができる材料と共に、凍結ＭＳＣを含めることができる。材料は、炎症促進性サイトカイン及び／又は低酸素模倣剤の組み合わせ又は混合物を含み得る。
【００６０】
本開示のＭＳＣは、脂肪組織、臍帯、骨髄、歯肉、ｉＰＳＣ、又はＭＳＣを誘導するための当該分野で公知の任意の他の供給源に由来し得る。多能性成体前駆細胞などのＭＳＣと同様の細胞もまた、本開示に従ってプライミングされ得る。
【００６１】
低酸素培養条件は様々な方法で作り出すことができることを理解すべきである。低酸素培養条件は、培養環境中の酸素を下げることによって作ることができる（１％〜５％Ｏ２で培養するなど）。低酸素培養条件を作り出す別の方法は、デスフェリオキサミン／デフェロキサミンメシレート、塩化コバルト、ヒドララジン、塩化ニッケル、ジアゾキシド、又はジメチルオキサリグリシンのような低酸素模倣剤を培養環境に添加することであろう。低酸素培養条件はまた、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）のような因子を培地に適用することによっても作ることができ、環境低酸素のものと同様の細胞応答を誘発する。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「プライムされた間葉系間質細胞」は、炎症促進性サイトカイン及び低酸素培養条件にインビトロで曝露された間葉系間質細胞として定義される。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「プライムされたエキソソーム」は、プライムされた間葉系間質細胞由来のエキソソームである。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「低酸素模倣物」は、低酸素誘導因子を安定化するか、又は関連する低酸素応答を誘導する任意の製剤である。
［実施例］
【００６５】
本発明を以下の実施例で説明するが、これらは説明目的のためのみであり、本発明はそれに限定されることを意図しないことが理解されよう。
【００６６】
材料及び方法
本明細書の全ての実施例について、以下の材料及び方法を使用した：
【００６７】
ＭＳＣ培養及びプライミング。完全に匿名化されたヒト脂肪吸引物からのＭＳＣの凍結バイアルはJeffrey Gimble博士（Tulane大学）から親切に提供され、インビトロＭＳＣマーカーの陽性表面発現及び抗原提示細胞マーカーの陰性発現と同様に三系統分化の成功について試験された（図１Ａ及び１Ｂ）。プライミングレジメンに対する細胞応答の一般化可能性を実証するために、３人の異なるドナーからのＭＳＣを実験に使用した。細胞をＭＳＣ培地（１０％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むDMEM 11965）中で培養し、そしてプライミング実験のために継代５で６ウェルプレートに播種した。図１Ａは、軟骨細胞（アルシアンブルー）、骨芽細胞（アルカリホスファターゼ）、及び脂肪細胞（オイルレッド）の組織学的染色で示される対照脂肪由来ＭＳＣの三系統分化能を示す。図１Ｂは、４８時間のプライミング後の、ＭＳＣマーカー：ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５、並びに抗原提示細胞マーカー：ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ４０についての相対的表面タンパク質発現を示す。存在する唯一の抗原提示細胞マーカーはＨＬＡ−ＤＲであり、これはそれらのプライミングレジメンにおいてＩＦＮ−γを経験したＭＳＣにおいて見られた（ＩＦＮ−γプライミングから３９．２％＋、二重プライミングから３０．２％＋）。
【００６８】
ＭＳＣを６ウェルプレート中でコンフルエントになるまで増殖させ、続いて：対照条件（酸素正常状態、通常のＭＳＣ培地）、それぞれのＩＦＮ−γ若しくは低酸素プライミング、又は二重ＩＦＮ−γ／低酸素プライミングに曝した（４つの異なる条件）。ＩＦＮ−γ（Peprotech社）を１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。低酸素培養環境は、New Brunswick Galaxy 145インキュベーターを使用して３７℃、５％ＣＯ２、及び１％Ｏ２で達成された。特に注釈のない限り、プライミングは４８時間適用し、次いでＭＳＣを遺伝子及びタンパク質の発現について分析するか、又は機能研究で評価した。回収されたＭＳＣは常に９５％を超える生存率を有し、プライミング群間で生存率に差はなかった。
【００６９】
ｑＲＴ−ＰＣＲ。公表された研究に基づいて、ＭＳＣベースの免疫抑制／防御に関与する１５の遺伝子の包括的なリストが確立された。３人の異なるドナーからのＭＳＣを使用してＭＳＣプライミング実験を４回繰り返した。
【００７０】
RNAqueous Micro Kit（Life Technologies社）を用いてＲＮＡを単離し、Nanodrop ND1000を用いて定量した。RNAをDNase I、Amplification Grade Kit（Invitrogen社）で処理し、製造者のプロトコルに従ってHigh Capacity ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems社）を使用してｃＤＮＡに変換した。
【００７１】
反応あたり２０ｎｇのｃＤＮＡ、及びSYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を行った。各時点での標的遺伝子の発現を、そのベースライン時点でのＧＡＰＤＨ、続いてプライムされていない表現型に対して正規化した（２−ΔΔＣｔ）。NCBI Primer-BLASTを用いて全てのプライマー（表１）の理論的標的遺伝子特異性を調べた。
【００７２】
【表１】
2019534015.tif 000003
【００７３】
動態研究のために、遺伝子のサブセットを評価した（ＨＬＡ−Ｇ、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＯＸ−２）。遺伝子上方制御の開始動態を研究するために、ＭＳＣを、０、４、１２、２４及び４８時間で回収したＲＮＡ試料を用いて、４８時間の二重プライミングによって刺激（又は対照条件下で維持）した。オフセット動態研究のために、同じ４８時間レジメンに従ったが、その後細胞は新鮮なＭＳＣ培地中で酸素正常状態に戻された。試験の途中で標準培地を交換して、対照条件に戻した後、４日目と７日目の両方に試料を採取した。遺伝子発現の変化が再誘導され得るかどうかを評価するために、２回目の４８時間の刺激後に実験を繰り返した。
【００７４】
ＭＳＣタンパク質発現研究。プライミングの直後に、BD FACS CANTOIIフローサイトメーターを用いてＭＳＣを細胞内及び表面マーカーについて分析した（常に２００００を超えるイベントカウント）。細胞内タンパク質については、細胞を固定し、BD Cytofix/Cytopermキットを用いて透過処理した。細胞を４℃で２０分間ＢＤ  ＢＳＡ染色緩衝液中で染色し、次いで染色緩衝液で２回洗浄した。抗体クローン及び希釈物の完全なリストは表２及び表３に見出すことができる。
【００７５】
【表２】
2019534015.tif 000004
【００７６】
【表３】
2019534015.tif 000005
【００７７】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。ＭＬＲについては、凍結保存細胞の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）バンクを、１０人の異なるドナーからの完全な匿名化試料を用いて作製し、一組のスティミュレーター−レスポンダー対を生成した。Histopaque-1077（Sigma社）ベースの密度勾配遠心分離を用いて新鮮なleukopaks（New York Blood Center）からＰＢＭＣを単離し、骨髄培地（ＢＭＭ；１％HEPES、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び２０ｋＵ  DNAse Iを含むMedia 199）で２回洗浄し、赤血球溶解のためにＡＣＫ溶解緩衝液（Thermo Fisher社）で処理し、凍結保存した。
【００７８】
ＭＳＣを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いた４８時間のプライミング後に回収し、４０μＬ中１×１０６／ｍＬ又は２×１０６／ｍＬのいずれかで（すなわち、合計４００００又は８００００細胞）９６ウェルＵ底プレート中に５％の熱不活性化ヒトＡＢ血清、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％のHEPES、及び５０μＭの２−メルカプトエタノール（ｃＡＩＭ−Ｖ）を補充した完全ＡＩＭ−Ｖ中で播種した。
【００７９】
２バッチの同種異系ＰＢＭＣを１：１のＢＭＭ：ｃＡＩＭ−Ｖ中で解凍し、２回洗浄した。製造者の使用説明書に従って、レスポンダーＰＢＭＣをＢＤバイオレット増殖色素で染色した（最終濃度：１μＭ）。スティミュレーターＰＢＭＣを、３０ＧｙのＸ線照射（Ｘ−ＲＡＤ  ３２０）又は１０ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを用いて不活性化した（比較研究において常に同様の結果が得られた）。スティミュレーター及びレスポンダーのＰＢＭＣ細胞濃度を２．５×１０６／ｍＬに調整し、８０ｋｉＬの各細胞懸濁液（すなわち２０００００細胞）を以前播種したＭＳＣの上に重層した。したがって、スティミュレーター対レスポンダーの比は１：１であり、ＭＳＣ対レスポンダーＰＢＭＣの比は１：２．５又は１：５であり、これらはパイロット試験において比較に最適であると同定された比であった（図２）。
【００８０】
ＭＬＲ実験を５日間行い、途中で５０μＬのｃＡＩＭ−Ｖを添加した。エンドポイント分析のために、２つの抗体パネルを使用した：ＣＤ３／４／８／２５／１０７ａ（活性化／細胞毒性）及びＣＤ３／４／８／４５ＲＡ／１９７（ナイーブ対メモリー）。一次結合抗体（BD Pharmingen社）を推奨される試験サイズで使用し、ＣＤ４及びＣＤ８を除いて、それぞれ１：８０及び１：４０希釈で使用した（クローンについても表２及び表３を参照）。全ての表面染色は、ＢＤ  ＢＳＡ染色緩衝液中で固定することなく行われた。フローサイトメトリー分析は染色の３０分以内に行った。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団を分析するとき、各実験の％分裂（バイオレット陰性）、％ＣＤ２５＋、又は％ＣＤ１０７＋をＭＬＲのみの条件についての対応する値で割ることによって、各群をＭＳＣの無いＭＬＲのもの（陽性対照を１００％に設定）に正規化した。これらの群のデータを７〜１１回の実験にわたって平均した。
【００８１】
いくつかの実験では、追加のＭＬＲ−ＭＳＣ反応を様々な１日目及び３日目の分析用に設定した。炎症促進性サイトカインレベルは、Human Cytokine 16-Plex ELISAキット（PBL Assay Science社, Piscataway, NJ）を用いて検出した。上清のグルコースレベルは、コロンビア大学メディカルセンターのホルモン及び代謝産物コア研究所によって決定された。最初の除タンパク質ステップ（指示通り）及び１：３の希釈がキットの範囲内になるようにして、上清の乳酸レベルを比色Ｌ−乳酸アッセイキット（Ａｂｃａｍ社, Cambridge, MA）によって決定した。１日目及び３日目のＭＳＣ−ＭＬＲ実験からの細胞も回収し、固定し、透過処理し、そしてＧＬＵＴ１トランスポーターについて染色した。
【００８２】
代謝アッセイ（シーホース）。プライミング後、異なるプライミングレジメンからのＭＳＣをシーホース組織培養プレート（１００μＬ中に１００００細胞）上に播種し、標準的な５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、終夜インキュベートした。翌日、ウェルを、（１ｍｌの２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍｌの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び４００μＬの４５％Ｄ−グルコース；ｐＨ７．４）を含むシーホースアッセイ培地（１００ｍＬ）で２回洗浄し、Ｍｉｔｏストレスアッセイ（オリゴマイシン１μＭ、ＦＣＣＰ  １μＭ、Rotenone／アンチマイシン１μＭ）を試行の前に、プレートを非ＣＯ２インキュベーター内で２時間保持した。Ｗａｖｅソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００８３】
ＭＳＣタンパク質についてのフローサイトメトリー。プライミングの前後の両方で、まずＭＳＣを標準的なＭＳＣマーカー（ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）及び抗原提示能を示唆し得るもの（ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ）について染色した。ＭＳＣを２４〜４８時間プライミングした。次にそれらを、ｑＲＴ−ＰＣＲからのｍＲＮＡレベルで上方制御を示した免疫調節タンパク質（ＨＬＡ−Ｇ、ＣＯＸ−２、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｅ；代謝研究用のＧＬＵＴ１）について染色した。細胞内タンパク質については、BD Cytofix/Cytopermキットの試薬を用いて細胞を固定し、透過処理し、そして染色した。表面染色のために、細胞を４℃で２０分間ＢＤ  ＢＳＡ染色緩衝液中で染色し、次いで染色緩衝液で２回洗浄した。全てのデータ収集はBD FACS CANTOIIフローサイトメーターで行い、その後FlowJo（Ashland, OR）で分析した。抗体クローン及び希釈物の完全なリストは表３に見出すことができる。
【００８４】
ＩＤＯ活性アッセイ。４８時間プライミングされたばかりのＭＳＣを、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００００細胞で新鮮な対照ＡＳＣ培地に再播種し、付着させるために終夜放置した。ＩＤＯ活性の測定は、ＩＤＯのトランスフェクションは行わない改変を施した製造業者のプロトコルに従ってキット（BPS Bioscience社, San Diego, CA）を介して行い、異なるプライミング条件のＭＳＣにおいて単純に測定した。試料を６連で行った。
【００８５】
ＨＬＡ−Ｇウエスタンブロット。ＰＢＳで２回洗浄した後、プライムされたＭＳＣを、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を各１：５０の比で含むＮＰ−４０溶解緩衝液（Thermo Fisher社）を用い３０分間氷上で溶解した。溶解物を４℃、１３６００×ｇで１５分間遠心分離した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Thermo Fisher社）を介して決定した。異なるＭＳＣプライミング群からのタンパク質濃度を正規化した後、上清を２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファー（Bio-Rad社, Hercules, CA）を用いて１：１で希釈し、９５℃で５分間煮沸した。タンパク質試料を、４〜２０％のプレキャストポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad社）中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に電気転写した。転写後、膜を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ＴＢＳＴで１時間ブロッキングし、次いで抗ＨＬＡ−Ｇ一次抗体（１：５００、OriGene Technologies社）を用い４℃で終夜プローブした。次に膜をＴＢＳＴ  ３×で洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  AlexaFluor 680二次抗体（１：１００００、Thermo Fisher社）に１時間曝した。３回の最後の洗浄の後、膜をLicor Odysseyスキャナー（Lincoln, NE）で画像化した。
【００８６】
ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡ。４８時間のプライミングの終わりに集められたＭＳＣ上清を回収し、ペレット状の細胞破片になるまでスピンダウンし、次いで−８０℃で貯蔵するために新しいチューブに移した。ＥＬＩＳＡ試料を室温にし、Invitrogen Human HGF ELISAキット（Carlsbad, CA）を用いて製造者の使用説明書に従って希釈せずに使用した。
【００８７】
乳酸滴定。前述のようにＰＢＭＣを解凍し、ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Red AM（Thermo Fisher社）を用い、製造者の使用説明書に従ってHEPES緩衝食塩水中で３７℃、３０分間染色した（色素の１０００倍希釈）。HEPES緩衝液で１回洗浄した後、試料を５つのエッペンドルフチューブに分け、遠心し、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、及び３０ｍＭの濃度になるようにＬ−乳酸（Sigma社）を添加したｃＡＩＭ−Ｖ中に再懸濁した。細胞をこれらの新しい培地に再懸濁し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。各フローサイトメトリーの読み取り直前に、各試料をＢＤ染色緩衝液で１：９に希釈し、よく混合した。このことにより外部ｐＨ及び希釈培地成分を細胞内の乳酸塩が搬出される時間無く中和させた。リンパ球増殖実験のために、ＰＢＭＣを解凍し、以前に記載されたようにＢＤバイオレット増殖色素で染色し、上記の濃度になるようにＬ−乳酸を添加したｃＡＩＭ−Ｖ中に再懸濁した。細胞を９６ウェルＵ底プレート中に２０００００細胞／ウェルで播種した。ＣｏｎＡを５μｇ／ｍＬとなるように添加し、３日目にＰＢＭＣをフローサイトメトリーにより分析した。
【００８８】
質量分析。ＭＳＣプレートを氷冷ＰＢＳで３回洗浄して残留ＦＢＳを除去し、サイトカインを添加した。３％ＳＤＳを含むＴＢＳ及び５０μＬのプロテアーゼ阻害剤（Sigma社）からなる溶解緩衝液を各ＭＳＣプレートに添加した。溶解物を回収し、タンパク質をクロロホルム／メタノール中で沈殿させた。コロンビア大学の定量的プロテオミクス・メタボロミクスセンター（Quantitative Proteomics and Metabolomics Center）にて、Q Exactive HF（Orbitrap）質量分析計（Thermo Fisher社, Bremen, Germany）とカップリングさせたUltiMate 3000 RSLCNano超高圧液体クロマトグラフを用いて質量分析を行った。
【００８９】
統計解析。GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用して、異なるプライミング群からのＰＣＲ、ＭＬＲ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、乳酸塩及びグルコースの結果を比較するために、Ｔｕｋｅｙ事後検定と組み合わせた一元配置ＡＮＯＶＡ分析を使用した。データは平均値±標準偏差として表した。；ｐ＜０．０５を統計学的に有意と見なした。
【実施例１】
【００９０】
ここで本発明者らは、それらの免疫抑制特性を高めることができるＭＳＣの特定のインビトロプライミングプロトコルを提案する。低酸素（１％Ｏ２）、ＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−１０（１０ｎｇ／ｍＬ）の３つの異なる刺激の組み合わせを最初に比較した。１２を超える免疫抑制／防御因子についての遺伝子発現研究に基づいて、２日間のＩＦＮ−γ及び低酸素の組み合わせの条件付けレジメンは、免疫抑制を誘導することが知られている遺伝子の標的発現をもたらした。刺激後最大の倍数増加を有するものには、ＰＤＬ１、ＩＤＯ、ＨＬＡ−Ｇ、及びＣＯＸ２が含まれ、最初の２つはＩＦＮ−γ成分に応答性であり、一方、後者の２つは低酸素によって主に上方制御された。重要なことには、これらの遺伝子の発現は、刺激後１週間以上にわたってベースラインを超えて増加したままであったが、これは再刺激時に再び起こり得る現象である。
【００９１】
ここで、本発明者らは、ＩＦＮ−γとヒトＭＳＣの低酸素プライミングとの組み合わせを検討した。刺激の４８時間後、いくつかの免疫抑制因子が上方制御されたが、最も劇的にはＩＤＯ及びＰＤＬ１（ＩＦＮ−γによる）並びにＣＯＸ２及びＨＬＡ−Ｇ（低酸素による）であった。遺伝子発現の変化は刺激除去後１週間持続した。ＩＦＮ−γ刺激は古典的なＭＨＣタンパク質の発現を上方制御したが、ヒトＰＢＭＣとの同種異系反応は観察されなかった。事実、ＩＦＮ−γ／低酸素で予め条件付けしたＭＳＣは、条件付けしていないＭＳＣよりも大きな程度でＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激に応答してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方の増殖を抑制した。これらのインビトロデータは、細胞療法におけるＭＳＣの一様な免疫抑制集団の使用を示唆している。複合刺激後の細胞ホーミングについてもまた、より大きい可能性があるかどうかを調べるため、本発明者らはケモカイン受容体発現の変化を研究し、他のケモカイン受容体と比較してＣＣＲ１及びＣＣＲ７の発現が一貫してより大きいことを観察した。
【００９２】
二重プライミングは、ＩＦＮ−γ及び低酸素からの明確な寄与を伴って上方制御されている複数の免疫調節因子をもたらす。ＩＦＮ−γ又は低酸素のいずれかによる２日間のプライミングは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって証明されるように、異なる免疫調節遺伝子の上方制御をもたらした（図３）。図３は、代表的な実験において、ＩＦＮ−γ、低酸素、又は二重ＩＦＮ−γ／低酸素による４８時間のプライミング後にｑＲＴ−ＰＣＲによって得られたｍＲＮＡデータを表す。図３のデータは、対照ＭＳＣ（酸素正常状態及び通常のＭＳＣ培地、ｎ＝４〜６）における発現に対して正規化されている。バーは倍率差を０．０１〜１００の範囲で縮尺する（そして両端で飽和する）。ＡＮＯＶＡ及びTukey事後検定（ｐ＜０．０５）によって決定される、群間の有意差は、示されるように各遺伝子の右側に示される：ａ，ＩＦＮ−γ対低酸素刺激；ｂ，ＩＦＮ−γ対二重刺激；及びｃ，低酸素対二重刺激。ＩＦＮ−γによって誘導された遺伝子は、ＨＧＦ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ−Ｅ、並びに最も重要なことには、ＰＤ−Ｌ１及びＩＤＯを含み、それらの発現は、対照条件下でのＭＳＣと比較した場合、それぞれ１０２倍及び１０４倍増加した。ＩＦＮ−γプライミングは、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＧＦ、ｉＮＯＳが５倍を超える誘導をもたらし、並びに最も顕著にはＰＤ−Ｌ１及びＩＤＯがそれぞれ７３０倍及び３１０００倍まで誘導された。対照的に、低酸素プライミングは、ＩＦＮ−γプライミングよりも高いＨＬＡ−Ｇの誘導（１００倍対５倍）及びＣＯＸ−２の誘導をもたらした。ＩＦＮ−γによるＣＯＸ−２及びＨＬＡ−Ｇのいくらかの穏やかな誘導があったが、これらの遺伝子は低酸素によりさらに強く誘導された。ＩＦＮ−γ及び低酸素によって個別に上方制御された全ての因子は、これら２つのプライミング刺激が組み合わされたときに誘導され、７／１５の因子が有意に上方制御された。ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１の発現は、単一プライミングのみの場合ほど二重プライミングの場合は高くなかったが、誘導レベルは依然として同じオーダーの規模であった。対照的に、ＨＬＡ−Ｇは、どちらかの刺激のみを用いた単一プライミングよりも二重プライミングによってより誘導された。全体として、２つのプライミング条件の組み合わせは、ＩＦＮ−γ及び低酸素によって個別に得られた２つの転写上方制御パターンの増強をもたらした（図３）。この効果は完全には相加的ではなく、ＩＦＮ−γによって誘導された、いくつかの遺伝子（例えばＩＤＯ、ＨＬＡ−Ｅ、ＰＤ−Ｌ１）の発現は二重プライミングによって部分的に抑制されたが、代わりに他（例えばＨＬＡ−Ｇ）の誘導は増強した。
【００９３】
ほとんどの高度に誘導された遺伝子は４８時間でピーク発現にある。遺伝子誘導の動態を決定するために、対照ＭＳＣ及び二重でプライムされたＭＳＣについて、サブセットの遺伝子を４８時間追跡した：２つの遺伝子がＩＦＮ−γによって強く誘導され（ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１）、２つの遺伝子が低酸素によって誘導された（ＨＬＡ−Ｇ、ＣＯＸ−２）。プライミングの最初の４８時間にわたって複数の時点で採取された試料に対してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。遺伝子発現の誘導は、４時間までに既に明らかであったが、ｍＲＮＡのピークレベルに達するまで一般に８〜１２時間かかった（図４Ａ）。ピーク発現は、ＨＬＡ−Ｇ及びＰＤ−Ｌ１においては４８時間にわたって維持されたが、ＩＤＯは上昇傾向を続け、ＣＯＸ−２は一過性な発現であった。意外なことに、ＣＯＸ−２は４８時間よりも８時間後にサンプリングした際、１０倍を超えるｍＲＮＡ発現を有し、４８時間のプライミング実験から最初に推測されたよりもはるかに大きな誘導が明らかになった。しかしながら、追跡された他の遺伝子は４８時間でそれらのピークにあり、タンパク質翻訳においてはｍＲＮＡ転写に対して遅延があるので、全てのＭＳＣプライミング実験については４８時間の持続が維持された。４８時間より長いプライミングが有益であるとは示されなかった（図５）。
【実施例２】
【００９４】
二重プライミングによって誘導された遺伝子は、１週間上方制御されたままであり、再誘導することができる。治療用途の設定において遺伝子発現の変化がどのように持続するかをよりよく理解するために、二重でプライムされたＭＳＣを対照条件に戻し、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＯＸ−２のｑＲＴ−ＰＣＲを４日後及び７日後に行った。注目すべきことに、そして予想外に、３つのＭＳＣドナー全てについて、ＨＬＡ−Ｇ、ＩＤＯ、及びＰＤ−Ｌ１は、４日目までにそれらのピーク発現からの顕著な低下が見られたものの、７日間対照条件に戻した後にも有意な上方制御を維持したままであった（図４Ｂ）。４８時間までＣＯＸ−２発現の減少を示した動態研究と一致して、ＣＯＸ−２発現は、以前に対照又はプライミング条件のいずれかに保たれていたＭＳＣについては穏やかに減少し続けた。プライムされたＭＳＣは患者において炎症性及び低酸素性のキューに再び曝露される可能性があるので、プライミングレジメンは７日間対照条件に戻された後に繰り返され、そしてラウンド１（２日目）及びラウンド２（１１日目）後の４８時間のプライミングの誘導を比較した。４つ全ての遺伝子が再誘導され得、ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１についてのｍＲＮＡレベルは、同じプライミングキューへの再曝露の際に有意に高かった（図４Ｃ）。
【実施例３】
【００９５】
二重プライミングはタンパク質レベルで免疫調節因子を誘導する。図６においては、様々な４８時間プライミングレジメンについてのデータが示されている。ヒストグラムは代表的な実験からのものである。明確のために、対照ＭＳＣ対二重プライムされたＭＳＣのみが左側に示されており、全ての条件が右側に示されている。図６の下部の表は、ｎ＝３の実験に関して対照ＭＳＣのＭＦＩに対して正規化されたプライムされたＭＳＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。有意性は、ＩＦＮ−γ対低酸素刺激について（＊）及びＩＦＮ−γ対二重刺激について（ｔ）として示される。ＨＬＡ−Ｇ、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＯＸ−２について、それらが４８時間の二重プライミング後にタンパク質レベルで上方制御されたことがフローサイトメトリーにより確認された（図６、上）。単一因子及び二重因子プライミングレジメンの両方を考慮すると、最初のＰＣＲ所見と比較してタンパク質レベルでいくつかの異なるパターンがあった（図６、下）。タンパク質レベルでは、ＩＤＯは、ＩＦＮ−γ単独によるよりも二重プライミングによる方がわずかに多い誘導であったが（有意ではないが）、これは二重プライミングの設定においてｍＲＮＡ発現の低下を示したＰＣＲ所見とは異なる。ｍＲＮＡレベルで低酸素によって、より大きく誘導されたＨＬＡ−Ｇは、タンパク質レベルでは低酸素よりもＩＦＮ−γにより強く誘導された。ＰＣＲ所見と一致して、ＰＤ−Ｌ１はＩＦＮ−γ及び二重プライミングによってより強く上方制御されたが、ＣＯＸ−２は低酸素によってより強く誘導された。注目すべきことに、低酸素／二重でプライムされたＭＳＣとＩＦＮ−γでプライムされたＭＳＣとの間のＣＯＸ−２のタンパク質レベルの差は、中程度であるが統計的に有意であった。４つの遺伝子についてのタンパク質発現は、ＩＦＮ−γでプライムされたＭＳＣ及び二重でプライムされたＭＳＣについて類似していた。
【実施例４】
【００９６】
二重でプライムされたＭＳＣは、Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害する点で単一でプライムされたＭＳＣよりも優れている。図７Ａ及び７Ｂは、５日目のＭＳＣとＰＢＭＣとの間の示した比率について示される、異なるプライミングレジメンがＣＤ４及びＣＤ８について陽性のＴ細胞のパーセンテージにどのように影響するかを示す。ＭＬＲをＭＳＣと共培養した場合、以前に対照条件に保持していたＭＳＣはＴ細胞活性化（ＣＤ２５＋発現）及び増殖（％バイオレット陰性）を依然として阻害することができたが、以前にＩＦＮ−γ又は低酸素のいずれかでプライミングした場合、この効果はより強くなり、細胞が二重プライミングに曝された後に最も強くなった（図７Ａ）。阻害効果は用量依存的であり、全てのＭＳＣが１：２．５のＭＳＣ：ＰＢＭＣ比で使用したときに最も強い阻害を示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方で群差異が見られたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞でより明白であった。プライムされたＭＳＣはまた、１：５の比でＣＤ８＋Ｔ細胞ＣＤ１０７＋表面発現（細胞毒性の尺度）をよりよく阻害したが、１：２．５の比では群差異はもはや存在しなかった。
【００９７】
対照ＭＳＣのベースライン阻害能は使用したスティミュレーター−レスポンダーＰＢＭＣ対にある程度依存していたため、実験を通して全てのプライミング群についての分裂細胞の割合にわずかなシフトがあった（ＭＬＲに対して正規化した場合）。これらのシフトは、全ての群と人為的にマスクされた群の差異についてより大きな標準偏差をもたらした。ベースラインＭＳＣ阻害におけるこれらのシフトの影響を排除するために、データを各実験について対照ＭＳＣの％分裂に対してさらに正規化し、次いで平均した（図７Ｂ）。この正規化は群の差異を明らかにし、最も免疫抑制性のＭＳＣを作製するためには、二重プライミングが単一プライミングより優れており、低酸素又はＩＦＮ−γのいずれかによる単一プライミングが未プライミングよりも依然として優れていることを明らかにした。単一のプライミングレジメンのみを比較すると、低酸素又はＩＦＮ−γによりＭＳＣを予め条件付けすることによって、有意に異なる効果を生じることは示されなかったが、個々の実験は低酸素のわずかな利点を示唆した。
【実施例５】
【００９８】
二重プライミングは、Ｔ細胞をよりナイーブな表現型へシフトさせる。Ｔ細胞集団に対する異なるプライムされたＭＳＣの効果をさらに分析するために、対照ＭＳＣ又は二重でプライムされたＭＳＣのいずれかを有するＭＬＲを、ナイーブ、メモリー及びエフェクターＴ細胞集団を区別するためにＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現についてさらに評価した（図８）。図８は、メモリーパネルマーカーにより評価された、５日目の１：５  ＭＳＣ：ＰＢＭＣ比を示す。ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、及びエフェクターＴ細胞の様々な比率が、右上から反時計回りで象限に示されている。これらのデータは、下に積み上げ棒グラフでさらに要約されている。予想通り、ＭＬＲ（ＭＳＣなし）は、レスポンダーＰＢＭＣのみ（同種異系刺激なし）からなる陰性対照よりも少ないナイーブＴ細胞を有した。ナイーブ画分のこの喪失は、セントラルメモリー（ＣＭ）、エフェクターメモリー（ＥＭ）、及びエフェクターＴ細胞（ＥＴ）の集団の増加に対応していた。対照ＭＳＣとのＭＬＲ共培養は、主にナイーブ細胞にバランスを再シフトした。特に、二重でプライムされたＭＳＣとの共培養は、より大きな画分のナイーブＴ細胞をもたらし、エフェクターからセントラルメモリー細胞へのシフトをもたらした。Ｔ細胞は、それらがナイーブ表現型→ＣＭ→ＥＭ→ＥＴに進行するにつれてより活性化されるようになると考えられるので、二重でプライムされたＭＳＣは最も活性化されていない状態にこのバランスをシフトさせた。
【実施例６】
【００９９】
二重でプライムされたＭＳＣは、混合リンパ球反応において炎症促進性サイトカインの分泌を阻害する。多重ＥＬＩＳＡ分析は、対照、単一、又は二重でプライムされたＭＳＣとの共培養におけるＭＬＲの炎症促進性サイトカイン上清レベルにおける群差異を実証した（図９）。図９において、様々なプライミングレジメンを受け、そしてＭＬＲと共培養されたＭＳＣについてのデータが示される。定量的ＥＬＩＳＡの結果が、ＭＬＲ実験の１日目又は３日目のいずれかに回収された細胞上清について示されている（ｎ＝４）。群差異は１日目においては小さいか又は有意ではなかったが、これらの差異は３日目でより顕著であり、これはＭＬＲ実験におけるいくつかの炎症促進性サイトカインについてのピークのサイトカイン分泌期間を反映する。対照ＭＳＣを有するＭＬＲは最高レベルの炎症促進性サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１α）を示し、時にはＭＬＲのみについて測定されたものよりもさらに高い。この分泌はＭＳＣプライミングによって大きく抑制され、二重プライミングは３日目までに４つ全てのサイトカインの最低レベルをもたらした。
【実施例７】
【０１００】
ＩＦＮ−γ又は低酸素を用いたＭＳＣの単一プライミングはＴ細胞阻害の改善をもたらす一方で、二重プライミングは増強された免疫抑制効果をもたらす。実験的アプローチの概要を図１０に示す。予備試験（４８時間）においてプライミングレジメンの最適期間が決定された後、本発明者らは免疫抑制のための機能的アッセイを用いてＭＳＣの単一及び二重プライミングの有効性を試験した。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）への対照ＭＳＣ（酸素正常状態での基礎培地中の培養）の添加は、ＭＳＣ−ＭＬＲ共培養の６日目において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の両方の低から中程度の阻害（図１１Ａヒストグラム、バイオレット−）及び活性化（ＣＤ２５＋；示さず）をもたらした。このベースラインは、既知の生物学的変動と一致して、ＭＬＲにおいて使用されたドナーＰＢＭＣ対と共にわずかに変動した。したがって、対照ＭＳＣとの共培養後の増殖の程度を実験にわたる比較のためのベースラインとして使用した。
【０１０１】
ＩＦＮ−γ又は低酸素でプライムされたＭＳＣを有するＭＬＲは、同様のレベルの阻害を示し、対照ＭＳＣを有するＭＬＲよりも、一貫してＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（バイオレット−）及び活性化（ＣＤ２５＋）の阻害において２５〜３０％より有効であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害において２０％より有効であった（図１１Ａ）。図１１Ａにおいて、対照及びプライムされたＭＳＣによる可変阻害は、それらの％分裂集団を５日目のＭＬＲ単独条件のもの（１００％分裂に設定）と比較することにより明らかである。Ｔ細胞活性化状態（％ＣＤ２５＋）及び細胞毒性能力（％ＣＤ１０７＋）は５日目に同様に決定された。「レスポンダーのみ」群は、同種異系スティミュレーターＰＢＭＣを欠く陰性対照であった。この抑制の利点は、二重でプライムされたＭＳＣでのＭＬＲで約２倍になった。１：２．５のＭＳＣ／ＰＢＭＣ比を使用することによってＭＳＣの用量を２倍にすることによって、条件付けレジメンにかかわらずより大きなＴ細胞阻害をもたらしたが、プライミング群間の相対的阻害能力は維持された（図１１Ａ）。プライミング群間の差異は有意ではなかったものの、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性（ＣＤ１０７＋）の阻害はＭＳＣの存在下で増加する傾向がある（図１１Ａ）。図１１Ｃにおいては、示されている場合を除いて、全ての対比較が有意であった。レスポンダーのみの群のサイトカイン濃度は検出限界以下であった。ｎ＝４  ｐ＜０．０５＊、＜０．０１＊＊、ｐ＜０．００１＊＊＊、＜０．０００１＊＊＊＊。
【０１０２】
ＭＬＲにおける応答性Ｔ細胞の分化に対する共培養の効果を、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現を分析することによって調査した。５日目の１：５のＭＳＣ：ＰＢＭＣ比についての代表的な実験からのデータを図１２において示す。様々な比のナイーブ（Ｎ）、セントラルメモリー（ＣＭ）、エフェクターメモリー（ＥＭ）、及び末端エフェクター（ＴＥＭＲＡ）Ｔ細胞が、右上から反時計回りに進む象限に示される。６日目までに、レスポンダーのみの群（ＭＳＣと共培養した同種異系ＰＢＭＣを含まない陰性対照）は、ナイーブサブセット（ＣＣＲ７＋  ＣＤ４５ＲＡ＋）において４８％のＣＤ４＋Ｔ細胞を有したが、ＭＬＲ（陽性対照）はこのサブセットにおいて１５．７％細胞のみであった。ＭＳＣとの共培養は、ナイーブ表現型の喪失を阻害し（図１２）、それぞれ対照ＭＳＣ、ＩＦＮ−γでプライムされたＭＳＣ、低酸素でプライムされたＭＳＣ、及び二重でプライムされたＭＳＣとの培養後にナイーブサブセットに２４．７％、３１％、３３．５％、及び３９．３％の応答ＣＤ４＋Ｔ細胞が残った。ＭＳＣ−ＭＬＲ共培養物におけるナイーブ画分のこれらの差異は、ナイーブ画分が増加するにつれてこの画分が減少したので、セントラルメモリーＴ細胞区画からのシフトを反映していた。
【０１０３】
ＭＳＣ−ＭＬＲ実験のどのくらい早い時期にＴ細胞が異なる活性化パターンを示したかを調べるために、本発明者らは、６日目のエンドポイント分析に先行するＴ細胞活性化の２つの指標（すなわち、％分裂）を調べた：ＧＬＵＴ１発現及び上清中の炎症促進性サイトカインレベル。グルコーストランスポーター、ＧＬＵＴ１は、解糖を促進するために活性化Ｔ細胞において上方制御された。予想通り、ＭＬＲ（ＭＳＣなし）状態のＴ細胞は、３日目までレスポンダーのみの群よりもＧＬＵＴ１を上方制御しなかったが、これは活性化の遅延を反映している。ＭＬＲを代わりにＭＳＣと共培養した場合、１日目でもＴ細胞ＧＬＵＴ１発現が急速に増加した。それにもかかわらず、１日目と３日目では、ＭＳＣプライミングに依存して違いがあり、単一でプライムされたＭＳＣは依然として対照ＭＳＣよりも少ないＴ細胞ＧＬＵＴ１発現をもたらしたが、二重でプライムされたＭＳＣは最も低いＴ細胞ＧＬＵＴ１発現（レスポンダーのみのＴ細胞レベルと同様に）をもたらした（図１１Ｂ）。炎症促進性サイトカインレベルの差異は３日目までに明らかになり、二重でプライムされたＭＳＣを有するＭＳＣ−ＭＬＲは単一でプライムされたＭＳＣよりも低いレベルを有していた（図１１Ｃ）。奇妙なことに、対照ＭＳＣは、初期の同種異系性を示唆するＭＬＲ（ＭＳＣなし）状態さえもよりも高い炎症促進性サイトカインの上清濃度をもたらした。しかしながら、対照ＭＳＣは、おそらく局所的な炎症促進性サイトカインに対する免疫抑制反応性のために、依然としてＭＬＲにおいて阻害性であった。
【実施例８】
【０１０４】
ｍＲＮＡレベルで二重プライミングによって上方制御された遺伝子は、タンパク質レベルで強い誘導を示す。本発明者らは次にタンパク質レベルでのＭＳＣプライミングからのｍＲＮＡ傾向を調べた。いくつかの傾向が確認された。例えば、ＨＧＦタンパク質は、ＩＦＮ−γでプライムされた細胞の上清中でのみ検出可能であった（図１３）。特に、ＩＦＮ−プライミングよりも二重プライミングからのｍＲＮＡ誘導が少なかったＰＤ−Ｌ１、ＩＤＯ、及びＨＬＡ−Ｅは、二重プライミングによる同様の又はより大きな誘導を示した（図１６及び表３）。図１４において、ヒストグラムは、２００００の事象を用いた代表的な実験（ｎ＝３回行った同じ実験）から示されている。ＩＤＯ、ＨＬＡ−−−Ｇ、ＨＬＡ−−−Ｅ、及びＰＤ−−−Ｌ１の全ての対の比較は、対照対低酸素を除いて有意であった（ｐ＜０．０００１）。対照的に、対照対低酸素のみがＣＯＸ−−−２に対して有意であった（ｐ＜０．０１）。事実、ＩＤＯタンパク質発現は、ＩＦＮ−γのみへの曝露後よりも二重プライミング後の方が有意に大きかった。この予想外の結果は、フローサイトメトリーデータと一致して、二重でプライムされたＭＳＣがＩＦＮ−γでプライムされたＭＳＣを超えるＩＤＯ活性の有意な増強を示したＩＤＯ活性アッセイによって確認された（図１５Ａ）。図１５Ａでは、終夜のＩＤＯ活性の評価のために、プライムされた細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００００細胞で再播種したが、これは、４８０ｎｍでの吸光度によるトリプトファン副産物キヌレニンの検出に対応する。１条件につき６ウェルを平均した。
【０１０５】
ｍＲＮＡレベルで低酸素によってさらに誘導された２つの遺伝子（ＣＯＸ−２及びＨＬＡ−Ｇ）の増強もまたフローサイトメトリーによって確認された。しかしながら、ＣＯＸ−２タンパク質発現は、全てのプライミングレジメンによって等しく増強され、そしてタンパク質レベルは、対照ＭＳＣのものよりわずかに大きいだけであった。ＭＳＣ  ＨＬＡ−Ｇタンパク質レベルは二重プライミング後に最大であり、ＰＣＲデータと一致したが、タンパク質レベルは、ＰＣＲ所見とは反対に、低酸素によるよりもＩＦＮ−γによるプライミングの方が大きかった。この結果は、ＨＬＡ−Ｇがタンパク質レベルでＩＦＮ−γ及び二重プライミングの両方によって実質的に誘導されたことを示すウエスタンブロット分析によって確認された（図１５Ｂ）。図１５Ｂは、各レーンに最初に同量のタンパク質をロードしたウエスタンブロットを示す（ＢＣＡアッセイ）。ｐ＜０．０００１＊＊＊＊。全体として、低酸素は、調査したタンパク質のいずれもＩＦＮ−γよりも高い程度までは上方制御しなかった。
【実施例９】
【０１０６】
低酸素プライミング及び二重ＩＦＮ−γ／低酸素プライミングは、代謝を酸化的リン酸化から解糖へとシフトさせる。タンパク質レベルの研究からは、ＭＳＣの低酸素プライミングがＩＦＮ−γプライミングと同程度のレベルのＭＬＲ阻害をもたらした理由が明らかではなかったので、代謝についての研究を進めた。シーホースアッセイの結果は、ＭＳＣの低酸素プライミングがそれらを酸化的代謝（より低い酸素消費速度）から解糖（より高い細胞外酸性化速度、ＥＣＡＲ）へとシフトさせることを示している（図１６Ａ）。この所見は、低酸素症及び二重でプライムされたＭＳＣを有するＭＬＲについて最も低いグルコースレベルを示した１日目及び３日目のＭＬＲ−ＭＳＣ共培養上清のグルコースレベルの分析によって支持された（図１６Ｂ；表４）。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
本発明者らは、ＭＳＣの免疫抑制表現型が、免疫寛容に関連したいくつかの状態に存在する２つの微小環境的キュー：ＩＦＮ−γ及び低酸素を使用する細胞プライミングによって促進され得るか否かを調査した。本発明者らの目標は３つであった：（ｉ）他の点では同様の条件下でのＭＳＣにおけるＩＦＮ−γと低酸素の影響を比較すること、（ii）２つのプライミングキューを同時に適用することでどちらかの因子のみで達成可能なレベルを超えてＭＳＣにおける免疫抑制表現型を促進できるかどうかを決定すること、及び（iii）ＭＳＣプライミングによって促進される免疫抑制メカニズムを特定すること。
【０１０９】
ＰＣＲデータに基づいて、４８時間のプライミングレジメンを選択し、ＩＦＮ−γ（ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１）及び低酸素（ＨＬＡ−Ｇ及びＣＯＸ−２）によって最も高く上方制御されるようになった２つの遺伝子をさらに研究した。転写動態の分析は、ＣＯＸ−２を除いて、これらの遺伝子がプライミング条件からの除去後１週間上方制御されたままであり、同じプライミングレジメンに再曝露されると「ブースト」され得ることを実証した。ＭＳＣが患者への投与のためのプライミング条件から外されたとしても、発現の変化は失われず、細胞はインビボで炎症性及び低酸素のキューに応答する能力を維持することを示唆しているため、この発見は重要である。
【０１１０】
これらの発現変化の機能的意義を実証するために、本発明者らは細胞をそれらのプライミング条件から除去し同種異系ＰＢＭＣと共培養した後の、ＭＬＲ共培養実験における対照（プライムされていない）、単一でプライムされた、及び二重でプライムされたＭＳＣを評価した。Ｔ細胞の活性化は最終的に炎症促進性サイトカインの放出をもたらし、それが「対照ＭＳＣ」において免疫抑制挙動を誘導し得るので、対照条件下で培養されたＭＳＣがＭＬＲ応答を減弱させることができたことは驚くべきことではない。
【０１１１】
単一及び二重プライミングレジメンは、ＭＬＲ共培養実験におけるＭＳＣの免疫抑制能力を明らかに増強し、これらの効果は、一連のリンパ球ドナーを用いて示された。ＩＦＮ−γ及び低酸素による単一プライミングについてのＭＳＣベースのＴ細胞抑制に有意差はなかった。しかしながら、これら２つのレジメンは臨床応用に対して異なる実用的価値を有する。細胞療法は何億もの細胞を使用するため、ＩＦＮ−γベースのレジメンの費用は細胞数に比例して増加するが、低酸素ベースの戦略は低酸素インキュベーターの使用のみを必要とするであろう。２つの刺激を組み合わせることは明らかに、どちらかの刺激のみで使用するよりも強い免疫抑制効果をもたらした。本発明者らは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性、及び炎症促進性サイトカイン分泌の阻害を含む複数のアッセイを用いてこの所見を記載している。二重でプライムされたＭＳＣはさらにＴ細胞集団をよりナイーブで静止期の細胞型にシフトさせた。
【０１１２】
ＰＣＲデータから、ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１を上方制御するＩＦＮ−γ、並びにＣＯＸ−２及びＨＬＡ−Ｇを上方制御する低酸素に基づいて、観察された二重プライミングの優位性を説明することができる。この説明は、免疫抑制タンパク質のフローサイトメトリーデータによってチャレンジされる。二重プライミングがタンパク質レベルでこれらの因子全ての発現をもたらしたのは事実であるが、ＩＦＮ−γのみでほぼ同等のタンパク質レベルをもたらした。ＩＦＮ−γ単一プライミングに対する二重プライミングからのＩＤＯのわずかな増加は、低酸素とＩＦＮ−γ誘導経路との間の相互作用を示唆しており、細胞をＩＦＮ−γシグナル伝達に対してより感受性にしている。
【０１１３】
フローサイトメトリーデータは、なぜ低酸素単一プライミングがとても効果的であり、ＩＦＮ−γでプライミングされたものと同程度の免疫抑制性であるＭＳＣをもたらすことを説明していない。表面マーカーについてのフローサイトメトリーによると、低酸素は、ＣＯＸ−２発現に関してＩＦＮ−γよりほんのわずかに優れていたが、それは他の３つ全てのタンパク質についてＩＦＮ−γよりも少ない誘導をもたらした。確かに、本発明者らの研究においては遺伝子とタンパク質のサブセットのみが広範囲に分析されており、低酸素は他の免疫抑制タンパク質を上方制御している可能性がある。しかしながら、最初のＰＣＲスクリーニングにおける免疫抑制に関与する他の遺伝子は、どちらの刺激からも変化しなかったか、又はそれらはＩＦＮ−γによって誘導されたが低酸素（すなわちｉＮＯＳ、ＨＧＦ、及びＨＬＡ−Ｅ）では誘導されなかったことに留意されたい。
【０１１４】
低酸素プライミングの機能的効果についての説得力のある理由はタンパク質発現研究によって提供されなかったので、本発明者らは代謝変化の調査を開始した。ナイーブＴ細胞は代謝要求が低く、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）を介して満たす。しかしながら、活性化すると、それらは好気的解糖を介して高代謝性に切り替わる。これはＯＸＰＨＯＳよりも少ないグルコースあたりのＡＴＰを生成するが、ＡＴＰをより素早く提供し、細胞増殖を維持するのに必要とされる同化代謝のための重要な生体分子の産生をもたらす。この好気的解糖への切り替えにより、増殖するＴ細胞が高いグルコース依存性となる。
【０１１５】
腫瘍は、栄養素についてＴ細胞と競合することによって免疫細胞の攻撃を抑制し得る。腫瘍も解糖を使用し、腫瘍がより解糖性であるほど、グルコースを枯渇させ、乳酸を産生することによりエフェクターＴ細胞をより多く阻害し得る。環境栄養素のこれらの変化は、Ｔ細胞が活性化（及び分裂）エフェクター細胞に分化しないように、ラパマイシンのメカニズム上の標的（ｍＴＯＲ,mechanistic-target-of-rapamycin）経路を介したシグナル伝達に影響を与える。本発明者らはさらに、低酸素に曝されたＭＳＣ（単独又は二重プライミングレジメンのいずれか）が酸素依存性ＯＸＰＨＯＳから解糖に切り替わるであろうと仮定した。本発明者らは、Ｔ細胞が活性化されているがまだ分裂していない期間である１日目及び３日目のＭＬＲについてのシーホースアッセイ及びグルコース測定によってこれを実証した（フローサイトメトリーにおける非分裂集団のみの存在によって確認される）。
【０１１６】
低酸素でプライムされたＭＳＣははるかに多くのグルコースを消費し、それによってＭＬＲの最初の３日間にわたる初期のナイーブなリンパ球の細胞運命決定に影響を及ぼし得る。５０ｋｉＬの新鮮培地を細胞培養物に供給したため（培地添加前に３日目の試料をグルコース分析のために採取した）、活性化Ｔ細胞はいずれも分裂の燃料となるよう新鮮な栄養素を有していたであろう。しかしながら、もし、より少ない周囲の栄養素がそれらの活性化及びエフェクターＴ細胞への分化に既に影響を及ぼしていたならば、それらは依然として増殖していなかったであろう。これはまた、低酸素がＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の阻害にさらにより効果的であった理由を説明し得るだろう。ＣＤ４＋Ｔ細胞は活性化の際の解糖と共にＯＸＰＨＯＳを増加させることが示されているが、これはＣＤ８＋Ｔ細胞については示されておらず、より高いＣＤ８＋Ｔ細胞解糖フラックスのため、ＣＤ８＋Ｔ細胞はグルコース欠乏による阻害をより受けやすい可能性がある。ＭＳＣの低酸素曝露から解糖への切り替えは、他の意味合いを持つかもしれない。血管新生因子の上方制御に加えて、この切り替えは、低酸素でプライムされたＭＳＣがいくつかの動物モデルにおいて虚血環境においてより良好に生存する理由を説明するのに役立ち得る。それはまた、あらゆる種類の治療において、それらの分泌産物よりも細胞自体を使用することが有益であることを意味し得る。
【０１１７】
この研究からの重要な結論は、単回用量のＭＳＣが、進行中の免疫細胞活性化がある慢性状態よりも急性状態の治療においてより影響力があるであろうということである。
【実施例１０】
【０１１８】
低酸素及び二重プライミングは、迅速な乳酸産生を伴う解糖への代謝シフトを誘導する。本発明者らは次に、様々なプライミングレジメンがＭＳＣの主要な代謝経路にどのように影響を与えるかを調べることにより、低酸素ベースの免疫抑制についての代謝の説明の可能性を調べた。ＩＦＮ−γでプライムされたＭＳＣは最も高い酸素消費率（ＯＣＲ、シーホース分析による）を有し、これは酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）のマーカーであると考えられている。ＯＣＲは、対照ＭＳＣから二重でプライムされたＭＳＣまで減少し、低酸素でプライムされたＭＳＣについて最も低かった（図１７Ａ）。重要なことに、これら２つの群についての細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）の増加によって示されるように、低酸素でプライムされた及び二重でプライムされたＭＳＣにおけるＯＣＲの低下は解糖代謝の増強と相関していた（図１７Ａ）。低酸素でプライムされた及び二重でプライムされたＭＳＣにおける解糖へのシフトは、Ｔ細胞解糖にも必要とされる誘導性グルコーストランスポーター、ＧＬＵＴ１の独特な上方制御によってさらに支持された（図１７Ｂ）。
【０１１９】
次に、観察された代謝変化がＭＳＣ−ＭＬＲ共培養物に見られる傾向を説明できるか（図１１Ａ〜１１Ｃ）、特に（ｉ）なぜ、低酸素でプライムされたＭＳＣがＩＦＮ−γでプライムされたＭＳＣと同じように抑制的なのか、及び（ii）代謝の変化が二重でプライムされたＭＳＣの免疫抑制効果の増強を説明できるかについて調べた。グルコース及び乳酸レベルは、（群間で一貫した細胞数を維持するために）Ｔ細胞分裂に先行するが、Ｔ細胞が活性化となり得る時点である１及び３日目に測定した。予想通り、３日目までに、ＭＬＲ（ＭＳＣなし）状態の活性化ＰＢＭＣは、レスポンダーのみの群よりも高いグルコース消費及び乳酸産生を示した（図１７Ｃ）。図１７Ａ〜１７Ｃにおいて、示されている場合を除いて、全ての対の比較はｐ＜０．００１で有意である。
【０１２０】
全体として、ＭＳＣは代謝環境に大きな影響を及ぼした。二重でプライムされた及び低酸素でプライムされたＭＳＣは、１日目までに最大のグルコース枯渇及び乳酸産生をもたらし、これはより高いＧＬＵＴ１発現及び解糖の誘導と一致していた。特に、二重でプライムされた及び低酸素でプライムされたＭＳＣは、対照ＭＳＣと比較して、上清中の乳酸塩をそれぞれ３倍及び２倍（約１５ｍＭ及び１０ｍＭ対５ｍＭ）増加させた。グルコースレベルは１日目と３日目との間で減少し続けたが、この段階での消費率はＭＳＣ−ＭＬＲ群間でほぼ同じであった（対照、ＩＦＮ−γ及び低酸素でプライムされたＭＳＣ−ＭＬＲ共培養で約４０ｍｇ／ｄｌの低下；二重でプライムされたでは４５ｍｇ／ｄｌ；表５）。二重でプライムされたＭＳＣを用いたＭＳＣ−ＭＬＲ反応において依然として最高レベルが見出されたが、乳酸蓄積は１日目と３日目との間にプラトーに達し始めた。
【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
高い細胞外乳酸濃度がもたらす結果を調べるために、細胞内ｐＨ及びＴ細胞の増殖に対するそれらの影響を調べた。新鮮な完全ＡＩＭ−Ｖ培地（方法参照）における細胞外乳酸レベルの増加は、Ｔ細胞ｐＨｉの用量依存的な低下をもたらし、それは１５ｍＭで顕著になり始め、そして培地のｐＨと共に３０ｍＭまでに劇的に低下した（図１８Ａ）。乳酸濃度が２０ｍＭから３０ｍＭに増加するにつれて、アポトーシスを受けている細胞と一致して、Ｔ細胞の散乱特性にも顕著な変化があった（図１８Ｂ）。培地への乳酸の滴定はまた、強力な分裂促進因子コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に応答してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞分裂の両方を減弱させた（図１８Ｃ）。Ｔ細胞分裂は最大速度の３０〜４５％に減少し、Ｔ細胞分裂は１５ｍＭの乳酸濃度でほとんど完全に排除された（図１８Ｃ）。
【０１２３】
要約すると、結果は、ＩＦＮ−γ及び低酸素が、ＭＳＣにおける免疫抑制の明らかに異なるメカニズムを誘発することを実証している。本発明者らは、ＭＳＣを両方のプライミングキューへ曝露させることによるこれらの別々の経路を組み合わせが免疫抑制効果の増強をもたらすことを示す。ＩＦＮ−γは最も頻繁に研究されているＭＳＣプライミングレジメンであるが、低酸素は解糖を促進するだけでなくＩＤＯ、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＥのＩＦＮ−γ誘導発現も増強する比較的低コストの付加であると本発明者らは考える。このようなＭＳＣプライミングは、ＭＳＣ免疫調節のヒットアンドランパラダイムにおいてより有意な「ヒット」をもたらし、数十の自己免疫性及び炎症性障害の治療についてより有効な療法を促進し得る。
【実施例１１】
【０１２４】
低酸素はＭＳＣ代謝に影響を与えるが直接的な免疫抑制能力を伴うタンパク質を上方制御しないことが、質量分析により確証される。低酸素誘導性ＭＳＣ免疫抑制について、及び二重でプライムされたＭＳＣが単一プライミングと比較して免疫抑制の増強された改善を示した理由について、本発明者らの代謝仮説をさらに評価するために、質量分析を行った。これは、低酸素に曝された細胞が、ＰＣＲ又はフローサイトメトリー分析で見逃された免疫抑制能力を有するタンパク質を上方制御しなかったことを確認するためであった。
【０１２５】
低酸素プライミングにより発現が変化したタンパク質は、主に細胞代謝に関与するミトコンドリアタンパク質であった。具体的には、酸化的リン酸化及びＴＣＡサイクルに関与するタンパク質は、ミトコンドリアリボソームタンパク質と同様に下方制御されていた。低酸素プライミングから２倍を超えて変化したタンパク質のリスト（対照ＭＳＣに対して）でＳＴＲＩＮＧ分析を実行したが、いかなるタンパク質も免疫調節に関連しなかった。
【０１２６】
二重でプライムされた細胞は、低酸素のみによって変化した代謝経路において同様の変化を示したが、一部の場合において、低酸素と二重でプライムされた細胞との間で下方制御されたタンパク質のリストにおいて１００％重複がないように、タンパク質は２倍未満にわずかに下方制御された（表６）。
【０１２７】
【表６】
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【実施例１２】
【０１２８】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、それらの免疫抑制能力のために自己免疫疾患及び炎症性疾患の療法として研究されている。病理に応じて、それらは血管内又は局所的に導入される。両方の場合において、それらは特定の環境的キューに応答してのみ免疫抑制性になる。本発明者らは最近、インビトロでのＭＳＣの免疫抑制能力におけるＩＦＮ−γプライミングの効果と低酸素プライミングの効果を比較した。本発明者らは、ＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）又は低酸素（１％Ｏ２）のみでプライミングしたＭＳＣが、２つのキューを組み合わせることにより２倍の免疫抑制のＭＳＣをもたらす一方で、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞分裂の阻害に同等に有効であることを見出した。ＩＦＮ−γは明らかに免疫抑制タンパク質（ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｅ）を上方制御したが、低酸素はこれらを上方制御しなかった。したがって、本発明者らは低酸素ベースの抑制の免疫代謝メカニズムの可能性を調査した。解糖代謝へのシフト（シーホースアッセイ）、ＧＬＵＴ１発現の上昇（フローサイトメトリー）、及びＭＳＣ−ＭＬＲ共培養におけるより速いグルコース消費及び乳酸産生が、ＭＳＣの低酸素への曝露によりもたらされた。実際、ＭＳＣ−ＭＬＲ共培養の１日目までに、細胞外乳酸塩は低酸素曝露ＭＳＣが組み込まれたときにＴ細胞分裂を阻害することができるレベルに既に達していた。したがって、本発明者らは、低酸素プライミングは、局所的に移植されたＭＳＣのＩＦＮ−γプライミングにさらなる利点を提供し得、ＭＳＣは近くの代謝環境において優勢になって、免疫の抑制のための別のメカニズムを提供し得ることを提唱する。
【実施例１３】
【０１２９】
本発明者らは、ポリマー方法を用いて、プライムされていないＭＳＣ又は４８時間の低酸素／ＩＦＮ−γの組み合わせでプライミングされたものの上清からエキソソームを単離した。ＭＳＣの上清からエキソソームを単離する他の可能性のある方法としては、免疫沈降、超遠心分離、及びサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。プライムされたＭＳＣから分泌されたエキソソームは常に２〜４倍多い。本発明者らはこれらのエキソソームを標識し、１０、５０、１２５及び２５０μｇ／ｍＬの濃度で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）にそれらを投与した。これは、単核細胞（ＰＢＭＣ）へのエキソソームの用量依存的な取り込みを示したが、エキソソームがプライムされたＭＳＣに由来する場合、その取り込みはそれほど深くなかった。エキソソームをレスポンダーＰＢＭＣのみに添加した場合、分裂は起こらなかったが、完全なＭＬＲでは、エキソソームは用量依存的にＴ細胞分裂を減弱させた。５０μｇ／ｍＬを超える用量では、両方のエキソソーム供給源からのＴ細胞分裂が悪化したが、プライムされたＭＳＣからのエキソソームは、濃度が５０μｇ／ｍＬに低下するとＴ細胞分裂を阻害することができた。本発明者らは依然この用量と供給源依存の減衰のメカニズムを調査しているものの、単球（Ｔ細胞ではない）が主にエキソソームを占めることは明らかである。
【０１３０】
ＭＳＣプライミングに関与する作用のメカニズムについてのこの仮説を検証するために、５代継代のＭＳＣを６ウェルプレート中で密集するまで増殖させ、４８時間のＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ  Peprotech）又は低酸素（３７℃、５％ＣＯ２、１％Ｏ２）、二重刺激（ＩＦＮ−γ及び低酸素）、又は対照条件（酸素正常状態；基本ＭＳＣ培地）による刺激にさらした。続いて、ポリマーベースのExoQuick TC試薬を使用して、各条件からの５ｍＬの細胞培養上清からエキソソームを単離した。単離された粒子は、抗ＣＤ６３磁気マイクロビーズ上で蛍光標識された粒子を捕捉すること及びフローサイトメトリーによって決定され、ＣＤ６３テトラスパニンエキソソーム表面マーカーについては陽性であった。エキソソームを同定する可能性のある他のマーカーはＣＤ９及びＣＤ８１である。様々なＭＳＣ培養条件で単離されたエキソソームの濃度及びサイズ分布をＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析によって測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるエキソソームの取り込みは、最初にエキソソームをＤｉＩ試薬（２５μｇ／ｍｌ）で標識し、スピンカラムを介して過剰の試薬を除去し、そしてエキソソームを活性化ＰＢＭＣ培養物に加えることによって確認した。２４時間後、ＰＢＭＣによるエキソソームの内在化をフローサイトメトリー分析によって調べた。
【０１３１】
ＭＳＣをＩＦＮ−γ及び／又は低酸素刺激に供した場合、分泌されたエキソソームの量（ＭＳＣの数に対して正規化された）は、対照培養と比較して１．８〜２．５倍高かった（図１９）。ＭＳＣ培養条件はまた、エキソソームのサイズ分布に影響を及ぼし、２００ｎｍ及び５５０ｎｍ直径付近で最も顕著な差があった（図１９）。全てのＭＳＣ由来エキソソーム集団について、エキソソーム添加の２４時間後に活性化ＰＢＭＣ内に用量依存性エキソソーム内在化が観察された（図２０）。
【０１３２】
本発明者らは、別々に刺激されたＭＳＣからのＣＤ６３＋エキソソームは集団濃度及びサイズ分布が異なり、用量依存的にＰＢＭＣに内在化されることを報告する。異なる刺激は、特定の免疫調節エキソソームを分泌するためにＭＳＣを活性化し得るので、これらの違いは、刺激されたＭＳＣによる免疫調節の本発明者らの理解に情報を与え得る。これらの差異の本質を理解するために、エキソソームＲＮＡ含有量の次世代配列決定が行われており、配列アラインメントによりＭＳＣ培養条件特異的ＲＮＡカーゴの同定が可能となるであろう。機能的関連性については、１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの濃度のプライムされたエキソソームを用いた、混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖に対するエキソソームの効果も研究中である。
【実施例１４】
【０１３３】
滴定試験を行って、ＩＦＮ−γが異なる濃度で又は異なる期間でＩＤＯ及び／又はＰＤ−Ｌ１のＭＳＣ発現に対して異なる効果を及ぼしたか否かを決定した（図２２及び２３）。図２２は、ＩＤＯは４８時間の曝露後の最大誘導のために少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを必要とするが、０．１ｎｇ／ｍＬでさえもなお有意な誘導をもたらし得ることを示す。したがって、ＩＦＮ−γ用量は、同じ有益な表現型をなお再現しながら、将来の動物及びヒトの研究のために０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で使用することができ、その範囲の下限はヒトにおける生理学的条件を模倣する可能性が高い。図２３は、最大ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１発現には４８時間が必要であるものの、ＩＤＯ及びＰＤ−Ｌ１はわずか６時間の曝露後に既に上方制御されていることを示している。それ故、ＭＳＣのプライミングは、生物学的効果を達成するために４８時間未満の間、実行され得る。
【実施例１５】
【０１３４】
ＭＳＣに対する低酸素模倣剤ＣｏＣｌ２及びＤＦＯの効果を決定するために研究を行った（図２４）。図２４は、ＣｏＣｌ２及びＤＦＯが両方ともＧＬＵＴ１を上方制御することができることを示しており、これは解糖への代謝切り替えを示す低酸素経路についての尺度である。低酸素により予め条件付けすることによってＭＳＣが免疫細胞を阻害することを可能とする主な方法の１つがこの代謝切り替えであると本発明者らは考えており、５０μＭ〜２００μＭの濃度の低酸素模倣剤が本発明者らのプライミングレジメンにおける３７℃、５％ＣＯ２、及び１％〜５％Ｏ２の低酸素条件に代用できることが、図２４に示すデータにより示唆される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
2019534015.tif 000039
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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2019534015.tif 000046
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