(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための方法及びワクチン組成物に関する。ヒトにおけるエプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染は、悪性及び非悪性Ｂ細胞増殖の主要なトリガーである。本発明者らは、ＥＢＶ特異的Ｔリンパ球が、ＣＤ７０欠損ＥＢＶ感染Ｂ細胞を用いて刺激された場合には適切に増殖することができないが、ＣＤ７０の発現は増殖を回復させることを示した。特に、本発明は、ｉ）被験者から得られた悪性Ｂ細胞の試料を準備する工程、ｉｉ）工程ｉ）の試料から悪性Ｂ細胞群を単離及び培養する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉ）の悪性Ｂ細胞群に、ＣＤ７０ポリペプチドをコードしている核酸分子を導入する工程、並びにｉｖ）治療有効量の工程ｉｉｉ）の悪性Ｂ細胞群を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるＢ細胞悪性腫瘍の処置法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）被験者から得られた悪性Ｂ細胞の試料を準備する工程、ｉｉ）工程ｉ）の試料から悪性Ｂ細胞群を単離及び培養する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉ）の悪性Ｂ細胞群に、ＣＤ７０ポリペプチドをコードしている核酸分子を導入する工程、並びにｉｖ）治療有効量の工程ｉｉｉ）の悪性Ｂ細胞群を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるＢ細胞悪性腫瘍の処置法。
【請求項２】
Ｂ細胞悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、ＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ組織）リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば様々な病型のホジキン病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び関連したリンパ腫（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも呼ばれる）又は中枢神経系のリンパ腫）、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病ＢＣＬＬとも呼ばれる）、有毛細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、グレイゾーンリンパ腫、悪性度不明なＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、及び移植後リンパ増殖性障害からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
Ｂ細胞リンパ腫が、エプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされる、請求項２の方法。
【請求項４】
Ｂ細胞リンパ腫が、ＣＤ７０をコードしている遺伝子の突然変異を伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項２の方法。
【請求項５】
悪性Ｂ細胞が、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を用いて形質転換されている、請求項１の方法。
【請求項６】
核酸分子の導入が、レトロウイルスベクターを用いて行なわれる、請求項５の方法。
【請求項７】
ＣＤ７０ポリペプチドをコードしている核酸分子を用いて形質転換された悪性Ｂ細胞群を含む、ワクチン組成物。
【請求項８】
悪性Ｂ細胞が、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を用いて形質転換されている、請求項７のワクチン組成物。
【請求項９】
Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用するための請求項７のワクチン組成物。
【請求項１０】
Ｂ細胞悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、ＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ組織）リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば様々な病型のホジキン病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び関連したリンパ腫（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも呼ばれる）又は中枢神経系のリンパ腫）、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病ＢＣＬＬとも呼ばれる）、有毛細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、グレイゾーンリンパ腫、悪性度不明なＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、及び移植後リンパ増殖性障害からなる群より選択される、請求項７記載の使用のためのワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための方法及びワクチン組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
エプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、殆どのヒトに感染し、かつＢリンパ球に対して顕著な指向性を有するガンマヘルペスウイルスである。重要なことに、ＥＢＶは、内因的に制御不能なＢ細胞増殖及びリンパ腫形成の最も強力なトリガーの１つであることが知られている。稀な遺伝子疾患は、特にＥＢＶ感染の不完全な制御の素因となり、これにより、ウイルスに関連した血球貪食症候群、リンパ増殖性障害（ＬＰＤ）、例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が生じる１、２。現在、ＣＴＰＳ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＭＡＧＴ１、ＩＴＫ、及びＣＤ２７の突然変異が、ＥＢＶ感染の高い表現率に関連し、患者の最大９０％が、ＥＢＶの持続感染に関連した疾患及びリンパ腫を発症している３、４、５、６、７、８。これらの原発性免疫不全症の研究は、ＥＢＶに感染したＢリンパ球に対するＴ細胞応答に関与する、及びより一般的にはＴ細胞の機能に関与する重要な経路を明らかにした。健康な個体では、ＥＢＶに対する免疫応答の有効性は実際に主に、ＥＢＶに感染したＢ細胞を排除する特異的なＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の大量増殖に依存している９、１０。ＣＴＰＳ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、及びＭＡＧＴ１の欠損症では、ＥＢＶに感染したＢリンパ球に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、特異的な細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞媒介性細胞障害活性及び／又は増殖のいずれかの欠陥の結果として損なわれている。ＥＢＶにより誘発される血球貪食症候群及びＢリンパ腫の発生によって特徴付けられる、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）−１という症候群は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）に関連したタンパク質ＳＡＰをコードしているＳＨ２Ｄ１Ａの突然変異によって引き起こされる。ＸＬＰ−１では、ＥＢＶに感染したＢ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害応答は、ＳＬＡＭ受容体の機能に関してＳＡＰに依存しているＳＬＡＭ受容体の活性が損なわれるために、特異的に損なわれかつ異常である１１、１２、１３。ＭＡＧＴ１は、ＴＣＲのシグナル伝達、及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現されている重要な細胞溶解性活性化細胞受容体であるＮＫＧ２Ｄの発現に関与している、膜貫通Ｍｇ２＋輸送体をコードしている１４、１５。したがって、ＮＫＧ２Ｄ及びＳＬＡＭ−ＳＡＰ経路は、ＥＢＶに対する免疫応答の重要な成分を示す。ＩＴＫの欠損症は、ＰＬＣ−γ１を活性化するその能力を通してＴ細胞の活性化に関与しているＢＴＫファミリーの十分に特徴付けられているチロシンキナーゼであるＩＴＫの突然変異によって引き起こされる１６。ＩＴＫの非存在下では、ＴＣＲの活性化に応答したＰＬＣ−γ１の活性化は損なわれ、その結果、Ｃａ２＋の動員は減少する１７、１８。Ｉｔｋ欠損マウスは、抗ウイルス応答中に不完全なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す１９。しかしながら、ＩＴＫ欠損患者におけるＥＢＶに対する不完全な免疫応答の基礎をなす正確な機序は不明である。近年、全員がＥＢＶにより駆り立てられたリンパ増殖性障害を発症した１７人の患者において、ＣＤ２７の欠損症が同定され、このことはＥＢＶに対する免疫におけるＣＤ２７の重要な役割を支持しているが、その正確な作用機序はこれまで描写されていない５、６、２０、２１、２２。ＣＤ２７のリガ��ドであるＣＤ７０は、いくつかのＢリンパ球及び樹状細胞の亜群に発現され、活性化されると殆どの免疫細胞上に一過性に見られる２３。ＣＤ７０はまた、Ｂ細胞を起源とする新生物をはじめとする様々ながん細胞上にも存在する２４。ＣＤ２７及びＣＤ７０は、それぞれ、ホモ二量体Ｉ型及びホモ三量体ＩＩ型の膜タンパク質である２１。どちらも腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属している。マウスモデルの研究により、ＣＤ２７−ＣＤ７０経路が、特に抗ウイルス応答中のＴ細胞免疫の発生及び維持において重要な役割を果たしていることが確立された２２、２５、２６、２７。
【０００３】
発明の要約：
本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための方法及びワクチン組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００４】
発明の詳細な説明：
ヒトにおけるエプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染は、悪性及び非悪性Ｂ細胞増殖の主なトリガーである。ＩＴＫ及びＣＤ２７の先天性欠損症は、ＥＢＶに感染したＢ細胞に対する損なわれた免疫応答によって特徴付けられるが、基礎にある病理学的機序は依然として同定されていない。本明細書では、本発明者らは、Ｔ細胞の共刺激分子であるＣＤ２７のリガンドであるＣＤ７０の欠損症に起因するＥＢＶにより誘発される再発性のＢ細胞増殖を患っている患者を報告する。本発明者らは、ＥＢＶに特異的なＴリンパ球は、ＣＤ７０の欠損したＥＢＶに感染したＢ細胞を用いて刺激されると適切に増殖できないが、ＣＤ７０の発現は増殖を回復させることを示す。ＩＴＫの欠損したリンパ球の分析により、ＣＤ７０によりトリガーされＣＤ２７により媒介されるＴ細胞増殖が、ＣＤ２７をカルシウム動員をはじめとする下流シグナル伝達カスケードに共役させるＩＴＫに完全に依存していることが実証される。したがって、ＣＤ７０−ＣＤ２７−ＩＴＫ経路は、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞免疫の重要な成分、より一般的にはＢ細胞の免疫監視のための重要な成分であるようである。したがって、ＣＤ７０−ＣＤ２７は、抗腫瘍ワクチン接種を誘導するための重要な標的を示す。ＣＤ７０を欠失しているいくつかのリンパ腫細胞におけるＣＤ７０の発現の回復又は誘導は、全体的かつ強力な抗腫瘍免疫を誘導するための治療アプローチを示し得る。
【０００５】
したがって、本発明の第一の目的は、ｉ）被験者から得られた悪性Ｂ細胞の試料を準備する工程、ｉｉ）工程ｉ）の試料から悪性Ｂ細胞群を単離及び培養する工程、ｉｉｉ）工程ｉｉ）の悪性Ｂ細胞群に、ＣＤ７０ポリペプチドをコードしている核酸分子を導入する工程、並びにｉｖ）治療有効量の工程ｉｉｉ）の悪性Ｂ細胞群を被験者に投与する工程を含む、それを必要とする被験者におけるＢ細胞悪性腫瘍の処置法に関する。
【０００６】
本明細書において使用する「Ｂ細胞悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞のあらゆる種類の白血病又はリンパ腫を含む。「Ｂ細胞リンパ腫」という用語は、Ｂ細胞に由来するリンパ系細胞に生じるがんを指す。Ｂ細胞は、骨髄から発生し抗体を産生する白血球である。それらはＢリンパ球としても知られる。Ｂ細胞悪性腫瘍としては、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、ＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ組織）リンパ腫、有毛細胞白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫（例えば様々な病型のホジキン病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び関連したリンパ腫（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症（リンパ形質細胞性リンパ腫又は免疫細胞腫とも呼ばれる）又は中枢神経系のリンパ腫）、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ；Ｂ細胞慢性リンパ性白血病ＢＣＬＬとも呼ばれる）、有毛細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病）、及び骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）が挙げられるがこれらに限定されない。さらなるＢ細胞悪性腫瘍としては、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）の節外性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、結節性周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、グレイゾーンリンパ腫、悪性度不明なＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、及び移植後リンパ増殖性障害が挙げられる。
【０００７】
いくつかの実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫は、エプシュタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、Ｂ細胞リンパ腫は、ＣＤ７０をコードしている遺伝子の突然変異を伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。ＣＤ７０は実際に、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において最も頻繁に突然変異している遺伝子の１つである４２、４４、４５。
【０００９】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、予防的又は防止的処置、並びに、治癒的又は疾患修飾的処置（疾患を罹患するリスクのある又は疾患を罹患したと疑われる患者の処置、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態に罹患していると診断されている患者の処置を含む）の両方を指し、臨床的再発の抑制も含む。処置は、医学的障害を有しているか又は最終的に障害に罹患する可能性がある被験者に、障害若しくは再発している障害の発症を予防、治癒、遅延するために、その重症度を低減するために、又はその１つ以上の症状を寛解するために、あるいは、このような処置を行なわない場合に予想される生存期間を超えるように被験者の生存期間を延長するために投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に患者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は（部分的に又は全体的に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、長期間（数か月又は数年間）にわたり患者を寛解状態に保つために、病気の処置中に患者の維持のために使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、規則的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与する）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば疾患の顕現など］に到達した場合の処置）を使用し得る。
【００１０】
悪性Ｂ細胞の試料は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、及び腫瘍組織をはじめとする、多くの入手源から得ることができる。典型的には、Ｂ細胞は、フィコール（商標）（高密度溶液を調製するために使用され得るスクロースとエピクロロヒドリンのコポリマー）による分離などの当業者には公知である任意の数の技術を使用して、被験者から回収された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施態様では、個体の循環中の血液からの細胞は、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシスの産物は典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板をはじめとする、リンパ球を含有している。いくつかの実施態様では、アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄して血漿画分を除去し得、そしてその後の処理工程のために該細胞を適切な緩衝液又は培地に入れ得る。いくつかの実施態様では、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。いくつかの実施態様では、洗浄溶液はカルシウムを欠失し、かつマグネシウムを欠失していてもよいか又は全ての二価陽イオンではなくても多くの二価陽イオンを欠失していてもよい。当業者は、洗浄工程が、半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ２９９１細胞処理装置）を製造業者の説明書に従って使用することによるなどの当業者には公知である方法によって成し遂げられ得ることを容易に理解するだろう。洗浄後、細胞を、例えばＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁し得る。あるいは、アフェレーシス試料の所望ではない成分を除去し得、細胞を培養培地中に直接再懸濁し得る。Ｂ細胞は、当技術分野において公知である技術を使用して、末梢血又は白血球アフェレーシスから単離され得る。例えば、ＰＢＭＣはフィコール（商標）（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）を使用して単離され得、ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、ロゼッタ四量体複合システム（ステムセルテクノロジーズ社、バンクーバー、カナダ）などの当技術分野において公知である様々な抗体のうちのいずれかを使用して陰性選択又は陽性選択によって精製され得る。Ｒ＆Ｄシステムズ社のヒトＢ細胞単離キット（ミネアポリス、ミネソタ州）などの他の単離キットも市販されている。
【００１１】
本明細書において使用する「ＣＤ７０」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＣＤ２７に対するリガンドを指す（例えば、Bowman M R et al., J. Immunol. 1994 Feb. 15; 152(4):1756-61参照）。ＣＤ７０はまた、「ＣＤ７０分子」、「ＣＤ２７Ｌ」、「ＣＤ２７ＬＧ」、「ＴＮＦＳＦ７」、「腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー７」、「ＣＤ２７リガンド」、「ＣＤ７０抗原」、「表面抗原ＣＤ７０」、「腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー７」、「Ｋｉ−２４抗原」及び「ＣＤ２７−Ｌ」とも称される。ＣＤ７０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属するＩＩ型膜貫通タンパク質である。それは、共刺激されたＴ細胞の増殖を誘導し、細胞障害性Ｔ細胞の生成を増強し、及びＴ細胞の活性化に寄与する、活性化されたＴリンパ球及びＢリンパ球上の表面抗原である。また、ＣＤ７０は、Ｂ細胞の活性化の調節、ナチュラルキラー細胞の細胞障害性機能、及び免疫グロブリンの合成において役割を果たしていることも示唆されている（Hintzen R Q et al., J. Immunol. 1994 Feb. 15; 152(4):1762-73）。ＣＤ７０の例示的なヒトアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ−００１２４３（配列番号１）の下に参照されている：
【００１２】
配列番号１
【化１】
2019514870.tif 000002
【００１３】
いくつかの実施態様では、悪性Ｂ細胞は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一率を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を用いて形質転換されている。
【００１４】
本発明によると、第二のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一率を有する第一のアミノ酸配列とは、第一の配列が、第二のアミノ酸配列に対して９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９又は１００％の同一率を有することを意味する。配列同一性は、同一率（又は類似率又は相同率）の単位で頻繁に測定され；比率が高くなればなるほど、２つの配列はより類似している。比較のための配列のアラインメント法は当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992；及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994は、配列アラインメント法及び相同性の計算に関する詳細な考察を提示している。例えば、アラインメントツールであるＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はＬＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）を使用して配列の比較を行ない得る（インターネットプログラム（登録商標）１９９６、W. R. Pearson及びバージニア大学、fasta20u63バージョン2.0u63、発売日１９９６年１２月）。ＡＬＩＧＮは互いに全配列を比較し、一方、ＬＦＡＳＴＡは局所的類似性領域を比較する。これらのアラインメントツール及びそれらのそれぞれの指導書は、例えばインターネット上のＮＣＳＡウェブサイトで入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸より長いアミノ酸配列の比較では、Ｂｌａｓｔ２配列関数が、デフォールトパラメーター（ギャップ存在コスト１１、及び１残基あたりのギャップコスト１）に設定されたデフォールトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して使用され得る。短いペプチド（約３０アミノ酸よりも短い）をアラインする場合、アラインメントは、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用して、デフォールトパラメーター（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１のペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを使用して実施されるべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトから入手できる；Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997；及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照されたい。
【００１５】
本明細書において使用する「核酸分子」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を指す。しかしながら、該用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列、例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５'−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンであるがこれらに限定されない配列を含む。
【００１６】
本明細書において使用する「形質転換」という用語は、宿主細胞への「外来」（すなわち外的又は細胞外）の遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の導入を意味し、よって、宿主細胞は導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するだろう。ＤＮＡ又はＲＮＡを受け取りそして発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００１７】
典型的には、核酸分子を用いての悪性Ｂ細胞の形質転換は、Ｂ細胞を形質導入するためにウイルスベクターを使用する。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス系ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクター、レトロウイルスベクター、レトロウイルス−アデノウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から誘導されたベクター、例えばアンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶ及び弱毒化ＨＳＶが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、Krisky, Gene Ther. 5: 1517-30, 1998; Pfeifer, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001を参照、その各々はその全体が参照により組み入れられる）。いくつかの実施態様では、Ｂ細胞は、レトロウイルスベクター、又はレトロウイルスから誘導されたベクターを用いて形質導入される。「レトロウイルス」は、動物細胞に感染することができ、感染の初期段階で逆転写酵素を使用してそれらのＲＮＡゲノムからＤＮＡコピーを作成し、次いで典型的には宿主ゲノムに組み込まれる、エンベロープを有するＲＮＡウイルスである。レトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）から誘導されたベクター、造血前駆細胞及びそれらの分化した子孫などの標的細胞において長期の安定な発現を提供するマウス幹細胞ウイルスに基づいたレトロウイルスベクター（例えば、Hawley et al., PNAS USA 93:10297-10302, 1996; Keller et al., Blood 92:877-887, 1998を参照）、ハイブリッドベクター（例えば、Choi, et al., Stem Cells 19:236-246, 2001を参照）及び複雑なレトロウイルスから誘導されたベクター、例えばレンチウイルスベクターである。上記で注記されているように、いくつかの実施態様では、レンチウイルスベクターを使用する。「レンチウイルス」という用語は、分裂中の細胞及び分裂していない細胞の両方に感染することができる複雑なレトロウイルス属を指す。レンチウイルスの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス、ヤギ関節炎腸炎ウイルス、ウマ感染貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、これらのレンチウイルスのいずれか１つ以上から誘導され得る（例えば、Evans et al., Hum Gene Ther. 10:1479-1489, 1999; Case et al., PNAS USA 96:2988-2993, 1999; Uchida et al., PNAS USA 95:11939-11944, 1998; Miyoshi et al., Science 283:682-686, 1999; Sutton et al., J Virol 72:5781-5788, 1998；及びFrecha et al., Blood. 112:4843-52, 2008を参照、その各々はその全体が参照により組み入れられる）。いくつかの実施態様では、レトロウイルスベクターは、ＨＩＶゲノム又はＳＩＶゲノムなどのレンチウイルスゲノムに由来する特定の最小配列を含む。レンチウイルスのゲノムは典型的には、５’末端反復配列（ＬＴＲ）領域、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、補助遺伝子（例えばｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ、ｒｅｖ）及び３’ＬＴＲ領域から構成されている。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ（反復配列）及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域はエンハンサー配列及びプロモーター配列を含有し、Ｕ５領域はポリアデニル化シグナルを含有し、Ｒ領域はＵ３領域とＵ５領域とを分離している。転写されたＲ領域配列は、ウイルスＲＮＡの５’末端及び３’末端の両方に出現する（例えば、“RNA Viruses: A Practical Approach” (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, 2000); O Narayan, J. Gen. Virology. 70:1617-1639, 1989; Fields et al., Fundamental Virology Raven Press., 1990; Miyoshi et al., J Virol. 72:8150-7, 1998；及び米国特許第６，０１３，５１６号を参照、その各々はその全体が参照により組み入れられる）。レンチウイルスベクターは、望むようにベクターの活性を調節するためにレンチウイルスゲノムのこれらの配列のいずれか１つ以上を含み得るか、あるいは、それらは、レンチウイルス複製の病的作用を低減するために又はレンチウイルスベクターを１回の感染に制限するために、これらの中の１つ以上の配列に欠失、挿入、置換、又は突然変異を含有し得る。典型的には、最小レトロウイルスベクターは、特定の５’ＬＴＲ配列及び３’ＬＴＲ配列、（標的細胞において発現される予定の）関心対象の１つ以上の遺伝子、１つ以上のプロモーター、及びＲＮＡのパッケージングのためのシス作用配列を含む。他の調節配列も、本明細書に記載されそして当技術分野において公知であるように含められてもよい。ウイルスベクターは典型的には、真核細胞（例えば２９３−ＨＥＫ）などのパッケージング細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミドにクローニングされ、そしてまた典型的には細菌中でのプラスミドの複製に有用な配列も含む。典型的には、関心対象の核酸分子は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置する。さらに、関心対象の核酸分子は好ましくは、一旦遺伝子が標的細胞に取り込まれたら、特定の様式で関心対象の遺伝子の発現を調節するための、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの例えば転写調節配列などの他の遺伝子配列と機能的関係にある。いくつかの実施態様では、有用な転写調節配列は、一時的かつ空間的にの両方において活性に関して高度に調節されている配列である。いくつかの実施態様では、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターは、１つ以上の異種プロモーター、エンハンサー、又はその両方を使用する。いくつかの実施態様では、レトロウイルス又はレンチウイルスの５’ＬＴＲに由来するＵ３配列は、ウイルス構築物においてプロモーター配列又はエンハンサー配列で置換されていてもよい。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターの５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に位置する「内部」プロモーター／エンハンサーを使用し、そして関心対象の遺伝子に作動可能に連結されている。「機能的関係」及び「作動可能に連結」は、遺伝子が、プロモーター及び／又はエンハンサーに関して正しい位置及び方向にあることを意味するがこれに限定されず、よって遺伝子の発現は、プロモーター及び／又はエンハンサーが適切な調節分子と接触した場合に起こるだろう。パッケージング細胞株におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を調節（例えば増加、減少）するか、感染した標的細胞における関心対象の選択された遺伝子の発現を調節するかのいずれか、又はその両方である任意のエンハンサー／プロモーターの組合せを使用し得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写が起こることを可能とするＤＮＡ配列によって形成された発現制御配列である。プロモーターは、関心対象の選択された遺伝子の開始コドンの上流（５'）に位置し（典型的には約１００から１０００ｂｐ以内）、それらが作動可能に連結されているコードしているポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を制御する、非翻訳配列である。プロモーターは、誘導性であっても、構成性であってもよい。誘導性プロモーターは、温度変化などの培養条件のいくつかの変化に応答して、それらのプロモーターの制御下にあるＤＮＡから増加したレベルの転写を開始する。プロモーターをポリヌクレオチドコード配列に作動可能に連結させるための方法と同様に、様々なプロモーターが当技術分野において公知である。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方が、関心対象の選択された遺伝子の発現を指令するために使用され得る。いくつかの実施態様では、プロモーターは異種プロモーターである。なぜなら、それらは一般的に天然プロモーターと比較して所望のタンパク質のより多くの転写及びより高い収量を可能とするからである。いくつかの実施態様では、プロモーターは、異種ウイルスプロモーターの中から選択される。このようなプロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーターが挙げられる。いくつかの実施態様では、プロモーターは、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、又は関心対象の遺伝子の天然配列に関連したプロモーターである。典型的には、プロモーターは、休止Ｂリンパ球、活性化Ｂリンパ球、形質Ｂ細胞、又は記憶Ｂ細胞などの標的細胞と適合性である。使用され得る構成性プロモーターの非制限的な例としては、ユビキチン用プロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169:13, 1989を参照）、β−アクチン（例えば、Gunning et al., PNAS USA 84:4831-4835, 1987を参照）、及びｐｇｋプロモーター（例えば、Adra et al., Gene 60:65-74, 1987; Singer-Sam et al., Gene 32:409-417, 1984；及びDobson et al., Nucleic Acids Res. 10:2635-2637, 1982を参照、その各々が参照により組み入れられる）が挙げられる。組織特異的プロモーターの非制限的な例としては、Ｉｃｋプロモーター（例えば、Garvin et al., Mol. Cell Biol. 8:3058-3064, 1988；及びTakadera et al., Mol. Cell Biol. 9:2173-2180, 1989を参照）、ミオゲニンプロモーター（Yee et al., Genes and Development 7:1277-1289. 1993）、及びｔｈｙ１（例えば、Gundersen et al., Gene 113:207-214, 1992を参照）が挙げられる。プロモーターのさらなる例としては、ユビキチン−Ｃプロモーター、ヒトμ重鎖プロモーター又はＩｇ重鎖プロモーター（例えばＭＨ−ｂ１２）、及びヒトκ軽鎖プロモーター又はＩｇ軽鎖プロモーター（例えばＥＥＫ−ｂ１２）（これはＢリンパ球において機能的である）が挙げられる。いくつかの実施態様では、プロモーターは、遺伝子の誘導性発現を可能とするように選択され得る。誘導性発現のための多くの系が当技術分野において公知であり、これにはテトラサイクリン応答系及びｌａｃオペレーター−リプレッサー系が含まれる。また、プロモーターの組合せを使��して、所望の関心対象の遺伝子の発現を得ることができると考えられる。当業者は、関心対象の生物及び／又は標的細胞において所望の遺伝子発現パターンに基づいてプロモーターを選択することができるだろう。
【００１８】
いくつかの実施態様では、本明細書に提供されたウイルスベクター（例えばレトロウイルス、レンチウイルス）は、主に選択された細胞型を標的化するために、１つ以上の選択されたウイルス糖タンパク質又はエンベロープタンパク質を用いて「シュードタイプ化」される。シュードタイピングは一般的に、しばしばウイルス粒子がその正常な標的細胞とは異なる選択された細胞を感染することを可能とする、細胞表面ウイルス粒子上への１つ以上の異種ウイルス糖タンパク質の取り込みを指す。「異種」配列は、ウイルスベクターのＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来する。典型的には、ウイルスベクターの糖タンパク質コード領域は、それ自身の糖タンパク質の発現を防止するために欠失などによって遺伝子的に改変されている。単に説明のためだけに、ＨＩＶから誘導されたレンチウイルスベクターに由来するエンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１及び／又はｇｐ１２０は典型的には、異種ウイルス糖タンパク質を用いてシュードタイプ化する前に欠失させている。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、Ｂリンパ球などの形質細胞を標的化する異種ウイルス糖タンパク質を用いてシュードタイプ化されている。いくつかの実施態様では、ウイルス糖タンパク質は、休止中または静止状態のＢリンパ球の選択的感染又は形質導入を可能とする。いくつかの実施態様では、ウイルス糖タンパク質は、活性化Ｂリンパ球の選択的感染を可能とする。いくつかの実施態様では、ウイルス糖タンパク質は、静止状態のＢリンパ球及び活性化Ｂリンパ球の両方の感染又は形質導入を可能とする。いくつかの実施態様では、ウイルス糖タンパク質は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病細胞の感染を可能とする。いくつかの実施態様では、異種ウイルス糖タンパク質は、麻疹ウイルス、例えばEdmonton株の麻疹ウイルスの糖タンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、麻疹ウイルスの糖タンパク質のヘマグルチニン（Ｈ）、融合タンパク質（Ｆ）、又はその両方をシュードタイプ化する（例えば、Frecha et al., Blood. 112:4843-52, 2008；及びFrecha et al., Blood. 114:3173-80, 2009を参照、その各々のその全体が参照により組み入れられる）。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、ベクターを特定の細胞型へと標的化する役目を果たす、１つ以上の可変領域（例えば重鎖可変領域及び軽鎖可変領域）などの包埋された抗体結合ドメインを含む。
【００１９】
ウイルスベクターの作成は、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))、Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)）及び“RNA Viruses: A Practical Approach”（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)）に記載のような、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＰＣＲ増幅、及びＤＮＡシークエンスの標準的な技術を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知である任意の適切な遺伝子工学操作技術を使用して成し遂げられ得る。
【００２０】
典型的には、Ｂ細胞は、当技術分野における様々な公知の技術のいずれかを使用して本明細書に記載のウイルスベクターを用いて形質導入され得る（例えば、Science 12 Apr. 1996 272: 263-267; Blood 2007, 99:2342-2350; Blood 2009, 113:1422-1431; Blood 2009 Oct. 8; 114(15):3173-80; Blood. 2003; 101(6):2167-2174; Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009)を参照）。例えば、ドナーからのＰＢＭＣ、Ｂリンパ球又はＴリンパ球、及び他のＢ細胞がん細胞、例えばＢ−ＣＬＬを単離し、そして無血清であるか又は１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン及び／若しくは他の適切な補助物質の補充されているかのいずれかである、ＲＰＭＩ １６４０（ギブコＢＲＬインビトロジェン社、オークランド、ニュージーランド）又は他の適切な培地中で培養し得る。いくつかの実施態様では、細胞を４８ウェルプレートに１０５個の細胞で播種し、濃縮されたベクターを、慣用的な方法を使用して当業者によって慣用的に最適化され得る様々な用量で添加する。いくつかの実施態様では、Ｂ細胞を、１０％ＡＢ型血清、５％ＦＣＳ、５０ng/mlのｒｈＳＣＦ、１０ng/mlのｒｈＩＬ−１５、及び５ng/mlのｒｈＩＬ−２の補充されたＲＰＭＩ、並びに必要に応じて周期的にリフレッシュされた培地中のＭＳ５細胞単層に移し得る。当業者によって認識されているであろうように、他の適切な培地及び補助物質も、所望であれば使用してもよい。
【００２１】
いくつかの実施態様では、Ｂ細胞を、Ｂ細胞の少なくとも一部を形質導入するに十分な条件下で、プロモーターに作動可能に連結させた関心対象の核酸を含む本明細書に記載のようなレトロウイルスベクターと接触させる。いくつかの実施態様では、Ｂ細胞を、Ｂ細胞の少なくとも２０％を形質導入するに十分な条件下で、プロモーターに作動可能に連結させた関心対象の核酸を含む本明細書に記載のようなレトロウイルスベクターと接触させる。いくつかの実施態様では、Ｂ細胞を、Ｂ細胞の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％を形質導入するに十分な条件下で本明細書に記載のようなベクターと接触させる。
【００２２】
様々な培養培地のいずれかを、当業者には公知であろうように本発明の方法に使用し得る（例えば、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社によるCurrent Protocols in Cell Culture, 2000-2009を参照）。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の方法に使用するための培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（胎仔ウシ血清又は他の適切な血清を含む又は含まない）が挙げられるがこれに限定されない。例示的な培地としては、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、及びＸ−Ｖｉｖｏ２０も挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、培地は、界面活性剤、抗体、プラスマネート、又は還元剤（例えば、Ｎ−アセチル−システイン、２−メルカプトエタノール）、又は１つ以上の抗生物質を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、ＩＬ−６、可溶性ＣＤ４０Ｌ、及び架橋増強剤も使用してもよい。
【００２３】
いくつかの実施態様では、細胞を１〜７日間培養する。いくつかの実施態様では、細胞を７、１４、２１日間又はそれ以上培養する。したがって、細胞を、適切な条件下で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又はそれ以上の日数をかけて培養し得る。細胞を再び蒔き、培地及び補助物質を、当技術分野において公知である技術を使用して必要に応じて添加又は交換し得る。いくつかの実施態様では、形質導入されたＢ細胞を、細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が関心対象の導入遺伝子を発現するような条件下で及び十分な時間をかけて培養し得る。
【００２４】
したがって、ＣＤ７０ポリペプチドをコードしている核酸分子を用いて形質転換された悪性Ｂ細胞群は、抗腫瘍ワクチン接種を誘導するのに特に適している。特に、該細胞群は、腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫を促進するだろう。
【００２５】
本発明に従って形質転換された悪性細胞群は、単独で、あるいは、希釈剤と及び／又は他の成分、例えばサイトカイン若しくは細胞群と組み合わせたワクチン組成物として投与され得る。簡潔に言えば、本発明のワクチン組成物は、１つ以上の薬学的に又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせた、形質転換された悪性Ｂ細胞群である。このような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；糖質、例えばグルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；及び保存剤を含み得る。本発明の組成物は好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。本発明のワクチン組成物は、処置される予定のＢ細胞悪性腫瘍に適切な様式で投与され得る。投与量及び投与頻度は、患者の容態、並びに患者の悪性腫瘍の種類及び重症度などのこのような因子によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定され得る。「治療有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される予定の本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度における個体差、及び患者（被験者）の容態を考慮して医師によって決定され得る。一般的に、本明細書に記載のＢ細胞を含むワクチン組成物は、１０４〜１０７個の細胞/kg（体重）、好ましくは１０５〜１０６個の細胞/kg（体重）の用量（そのような範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得る。ワクチン組成物はまた、これらの用量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般的に公知である注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照）。特定の患者に対する最適な用量及び処置処方計画は、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて処置を調整することによって、医学分野の専門家によって容易に決定され得る。典型的には、関連した養子免疫療法の試験において、抗原特異的Ｔ細胞を、約２×１０９から２×１０１１個の細胞で患者に投与する（例えば、米国特許第５，０５７，４２３号参照）。いくつかの実施態様では、１０６/kg（患者１人あたり１０６〜１０１１個）の範囲の、より少ない数の本発明の形質導入されたＢ細胞を投与してもよい。いくつかの実施態様では、Ｂ細胞は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２個の細胞が被験者に投与される。ワクチン組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与され得る。ワクチン組成物の被験者への投与は、エアゾール吸入、注射、消化、輸液、埋込、又は移植によるなどの任意の簡便な方法で行なわれ得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内（i.v.）注射、又は腹腔内に投与され得る。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のようなワクチン組成物は好ましくは静脈内注射によって投与される。ワクチン組成物は、腫瘍又はリンパ節内に直接注射され得る。
【００２６】
いくつかの実施態様では、ワクチン組成物は、抗ウイルス剤などの薬剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６、抗体、又は他の免疫除去剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、又は他の抗体療法、細胞毒、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び放射線照射などを用いての処置を含むがこれらに限定されない、任意の数の関連した処置法と共に（例えばその前、同時に、又はその後）被験者に投与される。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリン及びＦＫ５０６）、又は、増殖因子により誘発されるシグナル伝達にとって重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993; Isoniemi（同上））。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、骨髄移植、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、又は抗体、例えばＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨと共に（例えばその前、同時に、又はその後）患者に投与される。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤などのＢ細胞除去療法後に投与される。ＣＤ２０に対する特異性を有する抗体の例としては、今では「リツキシマブ」（「リツキサン（登録商標）」）と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」（米国特許第５，７３６，１３７号、参照により本明細書にはっきりと組み入れられる）、ＣＤ２０を標的化するキメラパン−Ｂ抗体；「Ｙ２Ｂ８」と称されるイットリウム−［９０］で標識された２Ｂ８マウス抗体、又はイットリウム−［９０］へのキレート形成のためにＭＸ−ＤＴＰＡに共有結合させたマウスＩｇＧ１κｍＡｂである「イブリツモマブチウキセタン」ゼバリン（登録商標）（米国特許第５，７３６，１３７号、参照により本明細書にはっきりと組み入れられる）；「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ「ＢＩ」、「１３１１−Ｂ１」抗体を作成するために放射性１３１Ｉを用いて場合により標識されている（ヨウ素１３１トシツモマブ、ベキサール（商標））（米国特許第５，５９５，７２１号、参照により本明細書にはっきりと組み入れられる）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Press et al. Blood 69 (2):584-591（1987））及びその変異体、例えば「フレームワークの継ぎ接ぎされたもの」又はヒト化１Ｆ５（国際公開公報第０３／００２６０７号、Leung, S.；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６４５０）；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体（米国特許第５，６７７，１８０号、参照により本明細書にはっきりと組み入れられる）；ヒト化２Ｈ７、オクレリズマブ（ＰＲＯ−７０７６９）としても知られる；ＣＤ２０上の新規エピトープに対する完全ヒトＩｇＧ１（ｈｕＭａｘ−ＣＤ２０）であるオファツムマブ（アーゼラ）（ジェンマブ社、デンマーク；国際公開公報第２００４／０３５６０７号（米国出願番号第１０／６８７，７９９号、参照により本明細書にはっきりと組み入れられる））；ＣＤ２０に対する完全ヒト化及び最適化ＩｇＧ１ｍＡｂであるＡＭ���−１３３（オクラツズマブ；アプライドモレキュラーエボリューション社）；Ａ２０抗体又はその変異体、例えばキメラ化又はヒト化Ａ２０抗体（それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０）（米国出願番号第１０／３６６，７０９号、参照により本明細書にはっきりと組み入れられる、イミュノメディクス社）；白血球分類国際ワークショップから入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−ＣＩ、又はＮＵ−Ｂ２（Valentine et al、白血球分類ＩＩＩ（McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)）が挙げられる。さらに、適切な抗体としては、例えば、バイオジェン・アイデック社／ジェネンテック社／ロシュ社の第三世代ヒト化抗ＣＤ２０抗体である抗体ＧＡ１０１（オビヌツズマブ）が挙げられる。さらに、グリコシル化の最適化されたヒト化ＣＤ２０抗体であるバイオレックス・セラピューティクス社のＢＬＸ−３０１、又はイミュノメディクス社のＣＤ２０に対して特異的である第２世代のヒト化抗体であるベルツズマブ（ｈＡ２０）、又は、ベルツズマブの二価抗ＣＤ２０ｍＡｂと、Inexus Biotechnology社のInNexusダイナミック架橋技術を用いて増強された抗ＣＤ２０ｍＡｂであるミラツズマブに由来する一対の安定化されたＦａｂの二量体から構成される（両方共がヒト化抗ＣＤ２０抗体である）、ＩＢＣファーマシューティカルズ社（イミュノメディクス社）の二重特異的六価抗体などの、ベルツズマブの誘導体であるＤＸＬ６２５が適切である。さらに適した抗体は、ＢＭ−ｃａ（ＣＤ２０に対して特異的なヒト化抗体（Int J. Oncol. 2011 February; 38(2):335-44)）、Ｃ２Ｈ７（ＣＤ２０に対して特異的なキメラ抗体（Mol Immunol. 2008 May; 45(10):2861-8)））、ＰＲＯ１３１９２１（ジェネンテック社によって開発されたＣＤ２０に対して特異的な第三世代の抗体）、レディタクス（ドクター・レッディーズ・ラボラトリーズ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ＰＢＯ−３２６（Ｐｒｏｂｉｏｍｅｄ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ゼノーテック社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、ＴＬ−０１１（テバ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ＣＭＡＢ３０４（上海ＣＰ Ｇｕｏｊｉａｎ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ＧＰ−２０１３（サンド社（ノバルティス社）によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ＳＡＩＴ−１０１（サムスン・バイオロジクス社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、インタス・バイオファーマシューティカルズ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、ＣＴ−Ｐ１０（セルトリオン社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、バイオカッド社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、ウブリツキシマブ（ＬＦＢ−Ｒ６０３、ＧＴＣバイオセラピューティクス社（ＬＦＢバイオテクノロジーズ社）によって開発されたＣＤ２０を標的化する遺伝子導入により作製されたｍＡｂ）、ＰＦ−０５２８０５８６（ファイザー社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形であると推定される）、Lymphomun（Ｂｉ−２０、トリオン・ファーマ社によって開発された三官能性抗ＣＤ２０抗体及び抗ＣＤ３抗��）、ナトコ・ファーマ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、アイ・バイオ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、ゲデオン・リヒター社／スタダ社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、Curaxys社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、コヒーラス・バイオサイエンシーズ社／第一三共社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、BioXpress社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形、ＢＴ−Ｄ００４（Protheon社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ＡＰ−０５２（アプロジェン社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、BioXpress社によって開発されたオファツムマブのバイオシミラー形、ＭＧ−１１０６（グリーン・クロス社によって開発されたリツキシマブのバイオシミラー形）、ＩＢＩ−３０１（イノベント・バイオロジクス社によって開発されたＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体）、ＢＶＸ−２０（バクシネックス社によって開発されたＣＤ２０に対するヒト化ｍＡｂ）、２０−Ｃ２−２ｂ（イミュノメディクス社によって開発されたＣＤ２０及びヒト白血球抗原−ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）を標的化する二重特異的ｍＡｂ−ＩＦＮα）、ＭＥＤＩ−５５２（メデユミューン社／アストラゼネカ社によって開発された）、NeoRx社（現在、ポニアード・ファーマシューティカルズ社）によって開発された抗ＣＤ２０抗体／ストレプトアビジンコンジュゲート、ファブリル社（現在MMRGlobal社）によって開発された第２世代抗ＣＤ２０ヒト抗体、トルビオン社／エマージェント・バイオソリューションズ社によって開発されたＣＤ２０断片に対して特異的な抗体であるＴＲＵ−０１５、並びに、様々な会社及び機関による他の臨床前アプローチが挙げられる。
【００２７】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに例示されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】患者の自己ＣＤ７０欠損リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）に対する減少した細胞溶解応答及び増殖応答は、ＬＣＬにおけるＣＤ７０の発現によって回復する。（ａ）示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比においてＣｒ５１遊離によって測定される、自己ＬＣＬに対する、２人の対照個体（対照１及び対照２）及びＣＤ７０欠損患者（患者）のＴ細胞の細胞障害性応答。Ｔ細胞を、試験前に自己ＬＣＬと共に４週間共培養した。１つ１つは、２回の独立した実験の代表を示す。標準偏差は３回測定。（ｂ）空のレンチウイルスベクター（空ベクター）又は野生型ＣＤ７０をコードしているｃＤＮＡを含有しているベクター（ｐＬｅｎｔｉベクター）を用いて感染させておいた患者のＬＣＬ上のＣＤ７０発現のＦＡＣＳヒストグラム。１つ１つは、５回の独立した実験の代表である。（ｃ）患者由来のＴ細胞を、空のレンチウイルスベクター（空ベクター）又は野生型ＣＤ７０をコードしているｃＤＮＡを含有しているベクター（ｐＬｅｎｔｉ−ＣＤ７０）を用いて感染させた自己ＬＣＬと共培養した以外は（ａ）と同じ。標準偏差は２回測定。（ｄ）放射線照射されたＣＤ７０欠損ＬＣＬ（空ベクター）又はＣＤ７０の発現を回復させたＬＣＬ（ｐＬｅｎｔｉ−ＣＤ７０）の存在下で８日間共培養された、患者、ＨＬＡ−Ａの一致した（対照１ＨＬＡ−Ａ０１＊）又は一致していない（対照２ＨＬＡ−Ａ０２＊及び対照３ＨＬＡ−Ａ０３＊）健康な対照のＰＢＭＣに由来するＴ細胞の増殖。バイオレット色素の希釈率及びＣＤ３＋細胞にゲートを設定したＣＤ２５の発現の代表的なドットプロット。１つ１つは、５回の独立した実験の代表である。
【図２】放射線照射された自己ＣＤ７０発現ＬＣＬ細胞（空のＣＲＩＳＰＲ又はｐＬｅｎｔｉ−ＣＤ７０）又はＣＤ７０欠損ＬＣＬ細胞（ＣＤ７０−ＣＲＩＳＰＲ又は空のベクター）を用いて１人の健康な対照（対照）及びＣＤ７０欠損患者（患者）のＰＢＭＣから８〜１５日間かけて増殖させたＴ細胞の細胞溶解活性の分析。次いで、Ｔ細胞の細胞溶解活性を、１の１：１比のエフェクター対標的で標的細胞としての自己ＣＤ７０発現ＬＣＬ細胞（青色）又はＣＤ７０欠損ＬＣＬ細胞（赤色）の混合物に対して０、４、及び１２時間かけて試験した。残留標的細胞を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。データは、時点０における比率に対して標準化された細胞の比率で示される。
【００２９】
実施例
材料及び方法
倫理。インフォームドコンセントを、ドナー、患者、及び患者の家族から得た。試験及びプロトコールは、１９７５年のヘルシンキ宣言、並びに、Comite de Protection des Personnes de l'Ile de France II（Hopital Necker-Enfants Malade、パリ）の現地の法令及び倫理指針に準拠する。
【００３０】
患者。伝染性単核球症を有する個体は扁桃生検材料で診断され、抗ＶＣＡ及び抗ＥＢＮＡ ＩｇＭ陽性血清検査を用いて確認された。ＩＴＫ及びＣＤ２７欠損症を有する患者の主な臨床表現型は、ＥＢＶにより駆動されたリンパ増殖であった。ＩＴＫにおけるホモ接合型ｃ．１１３Ｔ＞Ｃ、ｐ．Ｌ３８Ｐの患者保因者は、クルド人を起源とする血族の両親から生まれ、低い免疫グロブリンレベルを伴う再発性の呼吸器感染に苦しみ、ＥＢＶに関連したリンパ腫を発症した。彼女の弟及び母方の叔父も同じ有害な対立遺伝子を保有し、同じ臨床表現型を示した。ＩＴＫにおけるホモ接合型ｃ．８５Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｒ２９Ｃの２人の患者保因者は、アルジェリア人を起源とする血族の両親から生まれている。ＩＴＫ遺伝子の異常はＷＥＳによって同定され、同定された突然変異はさらに直接的なＤＮＡシークエンスによって検証された。ＣＤ２７におけるホモ接合型ｃ．３２９Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｗ１１０Ｘの患者保因者はチュニジア人を起源とする血族の両親から生まれ、再発性のＥＢＶにより駆り立てられるリンパ増殖疾患に罹患した。ＣＤ２７の異常は、Ｂ細胞上のＣＤ２７の発現の欠失に基づいて診断された。ＣＤ２７の４つのエキソンをさらにシークエンスにかけた。
【００３１】
エキソームのシークエンス及び分析。エキソームの取得は、製造業者のプロトコールに従って、イルミナ社のＴｒｕＳｅｑエキソーム濃縮キット及びイルミナ社のＨｉＳｅｑでの１００ｂｐのペアエンドリードのシークエンスを使用して実施された。各被験者について約１０Ｇｂの配列が得られ、これにより、共通コード配列（ＣＣＤＳ）プロジェクトによって規定されたエキソームのコード塩基の９０％が、少なくとも１０回の解読によって網羅された。アダプター配列及びクオリティトリミングリードをＦａｓｔｘツールキット（http://hannonlab. cshl.edu/fastx_toolkit/）を使用して除去し、次いで、カスタムスクリプトを使用することにより、続いて両方の仲間が存在しているリード対のみを確実に使用するようにした。リードを、ＢＷＡ３１を用いてｈｇ１９に対してアラインさせ、重複しているリードをＰｉｃａｒｄ（http://picard.sourceforge.net/）を使用して印を付け、下流分析から除外した。一塩基多型（ＳＮＶ）並びに短い挿入及び欠失（ｉｎｄｅｌ）が、ｓａｍツール（http://samtools.sourceforge.net/）パイルアップ及びｖａｒＦｉｌｔｅｒ３２を使用して、塩基アラインメントクオリティ（ＢＡＱ）調整を無効化して決定され、次いで、リードの少なくとも２０％がバリアントコールをサポートすることを必要とするためにそれらをクオリティに関するフィルターにかけた。変異体をＡＮＮＯＶＡＲ３３及びカスタムスクリプトの両方を使用してアノテーションし、それらがタンパク質コード配列に影響を及ぼしているかどうか、並びにそれらが以前に、エキソームの公共データベース及び本発明者らの施設で以前にシークエンスされた７５６６個のエキソームに見られるかどうかを同定した。患者において同定されたＣＤ７０変異（１９：６５８６０７８Ｇ／Ａ）、すなわちホモ接合型ナンセンス突然変異ｃ．５３５Ｃ＞Ｔ ｐ．Ａｒｇ１７９Ｘは、エキソーム集約コンソーシアム（ＥｘＡＣ）（http://exac.broadinstitute.org）のデータベース及び本発明者らの研究所のデータベースに、１．４８×１０−５（１３４５４２個中２個の対立遺伝子）の頻度でヘテロ接合型突然変異として存在していた。エキソームの他の利用可能な公共データベースには報告されていなかった（ｄｂＳＮＰ、１０００個のゲノム、ＮＨＬＢＩエキソームシークエンスプロジェクト（http://evs.gs.washington.edu/EVS/））。
【００３２】
ＤＮＡシークエンス。患者、その両親、及び他の家族メンバーの末梢血細胞に由来するゲノムＤＮＡを、標準的な方法に従って単離した。ＣＤ７０のエキソン３、ＩＴＫのエキソン１、及びＣＤ２７のエキソン３にフランキングするイントロン内のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物を、高忠実度のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社）を使用して製造業者の推奨に従って増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（パーキンエルマー社）を使用して製造業者の推奨に従ってシークエンスにかけ、３５００ｘＬジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて分析した。全ての回収された配列を、４ｐｅａｋｓソフトウェア（バージョン１．７．２；A. Griekspoor及びT. Groothuis、http://mekentosj.com/4peaks/）又はＤＮＡＤｙｎａｍｏ（ブルートラクターソフトウェア）を使用して分析した。
【００３３】
免疫化学検査。染色及びインサイツハイブリダイゼーションは、ライカ社のＢｏｎｄ Ｍａｘ自動染色装置（ライカバイオシステムズ社）で実施された。ＥＢＶの存在は、領域１及び２（ＥＢＥＲ）をコードしている小型ＲＮＡについてインサイツハイブリダイゼーションによって実証された。使用された抗体及び希釈率：抗ＣＤ７０抗体（ウサギポリクローナル、１/２００、アブジェント社製）、抗ＰＡＸ５抗体（クローンＤＡＫ−ＰＡＸ５、１/３０、ダコ社製）、抗ＣＤ２７抗体（クローン１３７Ｂ４、１/５０、アブカム社製）、抗ＣＤ８抗体（クローンＣ８／１４４Ｂ、１/２００、ダコ社製）、及び抗ＬＭＰ１抗体（クローンＣＳ．１−４、１/２００、ダコ社製）。
【００３４】
細胞培養液。全血試料を、患者及び対照ドナーから回集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な手順を使用して血液試料からフィコールパック密度勾配（リンホプレップ、プロテオジェニックス社）によって単離した。Ｔ細胞芽球の増殖は、５％ヒト男性ＡＢ型血清（バイオウェスト社）、ペニシリン（１００Ｕ/ml）、及びストレプトマイシン（１００μg/ml）の補充されたパンセリン（Panserin）４０１（パンバイオテック社）中でＰＢＭＣをフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（２．５μg/ml、シグマ・アルドリッチ社）と共に７２時間インキュベートすることによって得られた。３日後、死滅細胞をフィコールパック密度勾配によって除去し、芽球を、ＩＬ−２（１００又は１０００ＵＩ/ml）を含む培養液中で維持した。ＡＴＣＣから入手したバーキットリンパ腫ラージ細胞株及びマウス胸腺腫Ｌ１２１０を、熱で失活させた１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）、ペニシリン（１００Ｕ/ml）及びストレプトマイシン（１００μg/ml）の補充されたＲＰＭＩ １６４０グルタマックス培地（インビトロジェン社）中で培養した。細胞はマイコプラズマを含まず、定期的にマイコプラズマ混入について試験した。
【００３５】
ＥＢＶにより形質転換されたＬＣＬ及びＥＢＶ特異的なＴ細胞株。ＥＢＶにより形質転換されたリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）は、患者及び対照ドナーの新鮮な又は凍結させたＰＢＭＣから作製された。ＰＢＭＣを、以前に記載されているように４９、１μg/mlのシクロスポリンＡ（シグマ・アルドリッチ社）の存在下でＢ９５−８細胞由来の上清と共にインキュベートした。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞株は、患者及び対照健康ドナーから作製された。ＰＢＭＣを、４０：１のエフェクター対刺激因子（Ｅ／Ｓ）の比で４０Ｇｙで放射線照射された自己ＬＣＬと共培養した。９〜１４日後、生細胞を、４：１のＥ／Ｓ比で４０Ｇｙで放射線照射された自己ＬＣＬを用いて５〜７日間刺激した。次いで、細胞障害性について分析した。
【００３６】
遺伝子発現分析。全ｍＲＮＡをＥＢＶ−Ｂ細胞株から抽出し、患者及び対照ドナーのＴ細胞株をＰｕｒｅ Ｌｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（ライフテクノロジーズ社）を用いて活性化し、ＤＮａｓｅＩを用いて処理した。逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩファーストストランド合成システム（ライフテクノロジーズ社）を用いて実施された。ＣＤ７０及びアクチンについてのリアルタイム定量ＰＣＲは、ＶｉｉＡ ７リアルタイムＰＣＲシステム（ライフテクノロジーズ社）、ＳＹＢＲセレクトマスターミックス（ライフテクノロジーズ社）を使用して３通り実施された。
【００３７】
細胞の細胞障害性アッセイ。ＣＴＬの細胞障害活性は、標準的な４時間のＣｒ５１遊離アッセイを用いて評価された。簡潔に言えば、Ｃｒ５１で標識された１×１０５個の細胞の標的細胞を、エフェクター細胞と共に、示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で３７℃で４時間インキュベートした。次いで、３０μlの上清を回収し、１８０μlのＯｐｔｉＰｈａｓｅスーパーミックスカクテル（パーキンエルマー社）を用いてＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉｌｕｘ及びＪＥＴカウンター（パーキンエルマー社）で計数した。溶解比（％）を、式：１００×（実験での遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）に従って計算した。ＰＢＭＣから８日間かけて増殖させたＴ細胞の細胞障害活性はまた、１：１のエフェクター対標的の比で、自己のcell traceバイオレットで標識されたＣＤ７０を発現しているＬＣＬ及びＣＦＳＥで標識されたＣＤ７０を欠損しているＬＣＬに対して共培養液中で０、４及び１２時間かけて評価された。残留標的細胞はＦＡＣＳ分析によって評価された。データは、時点０における比率に対して標準化された細胞の比率で示される。ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒は、以前に記載のような溶解性顆粒のエキソサイトーシスのマーカーであるＣＤ１０７／ＬＡＭＰの発現の分析によって決定された８。
【００３８】
刺激及び増殖アッセイ。ＰＨＡにより刺激されたＴ細胞を洗浄し、細胞を同期化するためにＩＬ−２と共に７２時間培養した。次いで、ＰＨＡにより刺激されたＴ細胞又はＰＢＭＣを、単独で又は抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズ（インビトロジェン社）の存在下で完全培地中で４〜８日間培養した。共培養増殖実験では、ＰＨＡにより刺激されたＴ細胞又はＰＢＭＣに、抗ＣＤ２７抗体（イーバイオサイエンス社製のクローンＬＧ．３Ａ１０又はバイオレジェンド社製のＯ３２３）（１０μg/ml）又はイブルチニブ（５〜５００nM）（セレックケム社）を加えたもの又は加えないものを、１μg/mlの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）と共に又はその非存在下で事前に１時間インキュベートしておいた、４５Ｇｙで放射線照射された自己又は同種のＬＣＬの存在下で共培養した。細胞を、１０のＬＣＬに対して１のＴ細胞又はＰＢＭＣの比（１/１０の比）で共培養した。製造業者の説明書に従って、刺激する前に又はＬＣＬと共培養する前に、Ｔ細胞又はＰＢＭＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット色素（Violet Proliferation Dye 450、ＢＤバイオサイエンシーズ社）を用いて標識することによって細胞増殖をモニタリングした。８日間培養した後、細胞を収集し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット色素希釈率をフローサイトメトリーによって評価した。
【００３９】
フローサイトメトリー。ＰＢＭＣ、芽球Ｔ細胞、及び細胞株の細胞染色及びフローサイトメトリーに基づいた表現型分析を、標準的なフローサイトメトリー法に従って実施した。以下のｍＡｂ（括弧内にその識別番号を示す）を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリン−シアニン５（ＰＥ−Ｃｙ５）、フィコエリトリン−シアニン５．５（ＰＥ−Ｃｙ５．５）、フィコエリトリン−シアニン７（ＰＥ−Ｃｙ７）、ペリジニン−クロロフィル（ＰｅｒＣＰ）、ペリジニン−クロロフィル−シアニン５．５（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニン−シアニン７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）、アロフィコシアニン−Ｖｉｏ７（ＡＰＣ−Ｖｉｏ７）、ａｌｅｘａ−７００、ブリリアントバイオレット４２１（ＢＶ４２１）、ブリリアントバイオレット５１０（ＢＶ５１０）、ブリリアントバイオレット６５０（ＢＶ６５０）、ブリリアントバイオレット７８５（ＢＶ７８５）：抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４抗体（ＯＫＴ４）、抗ＣＤ８抗体（ＲＰＡ−Ｔ８）、抗ＣＤ１４抗体（Ｍ５Ｅ２）、抗ＣＤ１９抗体（ＨＩＢ１９）、抗ＣＤ２５抗体（ＢＣ９６）、抗ＣＤ２７抗体（ＬＧ．３Ａ１０、Ｍ−Ｔ２７１、Ｏ３２３）、抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）、抗ＣＤ３１抗体（ＷＭ５９）、抗ＣＤ５６抗体（ＨＣＤ５６）、抗ＣＤ７０抗体（１１３−１６）、抗ＣＤ１０７ａ／ｂ抗体（Ｈ４Ａ３／ＨＡＢ４）、抗ＣＤ１６１抗体（ＨＰ−３Ｇ１０）、抗ＣＤ１９７抗体（Ｇ０４３Ｈ７）、抗ＴＣＲ Ｖ ７．２抗体（３Ｃ１０）（全てソニーバイオテクノロジー社から購入）、抗ＣＤ１６抗体（３Ｇ８）、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（ＨＩ１００）、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＵＣＨＬ１）、抗ＣＤ９５抗体（ＤＸ２）、抗ＴＣＲαβ抗体、ＩｇＤ（ＩＡ６−２）、ＩｇＭ（Ｇ２０−１２７）（ＢＤバイオサイエンシーズ社製）、及び抗ＣＤ２１抗体（ＢＬ１３）、抗ＴＣＲγδ抗体、抗ＴＣＲＶα２４抗体（Ｃ１５）、抗ＴＣＲＶβ（ベックマンコールター社製）にコンジュゲートさせた。ＣＤ７０を発現している細胞に対するＣＤ２７の結合は、製造業者のプロトコール及び標準的なフローサイトメトリー法に従って、ヒトＣＤ２７−ｍｕＩｇ／ビオチン融合タンパク質（アンセル社）とのインキュベートによって評価された。細胞に対するＣＤ２７−ｍｕＩｇの結合は、ＰＥにコンジュゲートさせたストレプトアビジン（ＢＤバイオサイエンシーズ社）を用いて検出された。全てのデータは、ＦＡＣＳ−ＣａｎｔｏＩＩ又はＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（どちらもＢＤバイオサイエンシーズ社製）で回収し、Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．０．８ｒ１ソフトウェア（ツリースター社）を使用して分析した。
【００４０】
カルシウム流入分析。Ｃａ２＋応答は、以前に記載されているようにフローサイトメトリーによって評価された８。簡潔に言えば、細胞に、１×ＰｏｗｅｒＬｏａｄ（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及び５０nMのイブルチニブの存在下又は非存在下において５μMのＩｎｄｏ−１ＡＭ（モレキュラープローブ社）を負荷し、洗浄し、抗ＣＤ４−ＡＰＣ ｍＡｂ及び抗ＣＤ８−ＰＥ ｍＡｂと共にインキュベートし、５０nMのイブルチニブの存在下又は非存在下において、ヒトにのみ吸着する１０μg/mlのＦ（ａｂ'）２ウサギ−抗マウスＩｇＧと架橋している５μg/mlの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ２７抗体（クローンＬＧ．３Ａ１０、ＬＧ．７Ｆ９（イーバイオサイエンス社）又はＯ３２３）又は抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２）によって刺激し、次いで、イオノマイシン（５μM）と共にインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンシーズ社）を用いて分析した。細胞内カルシウム濃度の変化は、結合していない色素における４８５nmのｉｎｄｏ−１発光ピーク（ｉｎｄｏ−ブルー）から、ｉｎｄｏ−１分子がカルシウムに結合した時の４０５nmのｉｎｄｏ−１発光ピーク（ｉｎｄｏ−バイオレット）へのシフトによって定量される。Ｃａ２＋流入データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（ツリースター社）の動態分析を使用して得られた。細胞内Ｃａ２＋レベルは、４０５nm／４８５nmのｉｎｄｏ−１発光ピークの標準化された比に対応する。
【００４１】
サイトカインの生成及び検出。サイトカインの細胞内染色のために、細胞を、事前に１μg/mlのＯＫＴ３と共に及びブレフェルディンＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、ＢＤ社）の存在下においてインキュベートしておいた放射線照射されたＬＣＬを用いて一晩かけて再刺激した。次いで、細胞を固定し、製造業者の説明書に従ってＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ/ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｐｌｕｓキット（ＢＤファーミンゲン社）を使用して透過性処理した。次に、細胞を、ＰＥ／Ｃｙ７−抗ＴＮＦα抗体（マウスＩｇＧ１；ＭＡｂ１１）、ＡＰＣ−抗ＩＦＮγ抗体（マウスＩｇＧ１、４Ｓ．Ｂ３）、及びバイオ・レジェンド社から購入したアイソタイプの一致するモノクローナル抗体を用いて標識し、フローサイトメトリーによって分析する。その後、細胞を回収し、洗浄し、ＢＶ７８５−抗ＣＤ３ｍＡｂ、ＢＶ６５０−ＰＥ−抗ＣＤ８ｍＡｂ、及びＢＶ５１０−抗ＣＤ４ｍＡｂを用いて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【００４２】
ＥＢＶに特異的なＴ細胞の検出。ＰＢＭＣに由来するＥＢＶに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、４５Ｇｙで放射線照射されたＬＣＬと共に８〜１０日間共培養し、ＢＶ７８５−抗ＣＤ３モノクローナル抗体、ＢＶ６５０−ＰＥ−抗ＣＤ８モノクローナル抗体、及びＢＶ５１０−抗ＣＤ４モノクローナル抗体に加えてＲ−ＰＥ Ｐｒｏ５（登録商標）フルオロタグと混合した、未標識のＥＢＶ ＨＬＡ−Ａ２：０１ Ｐｒｏ５（登録商標）ペンタマー（プロイミュン社）の混合物を使用して検出した。ＥＢＶ ＨＬＡ−Ａ２：０１ Ｐｒｏ５（登録商標）ペンタマー混合物は、ＥＢＶのＬＭＰ２タンパク質及びＢＭＬＦ１タンパク質に由来する、FLYALLALLL（ＬＭＰ２由来の残基３５６〜３６４）、CLGGLLTMV（ＬＭＰ２由来の残基４２６〜４３４）、又はGLCTLVAML（ＢＭＬＦ−１由来の残基２５９〜２６７）を提示する３つの異なるペンタマーを含有している。それらの単離後、ＥＢＶ特異的なＴ細胞の活性化された表現型は、ＰＥ／Ｃｙ７−抗ＣＤ２５抗体及びＦＩＴＣ−ＣＤ４５ＲＡ抗体を使用して特徴付けられる。全ての染色は、製造業者の説明書に従って実施される。
【００４３】
細胞のトランスフェクション及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ゲノム編集。野生型ＣＤ７０及びＣＤ７０ Ｒ１７９Ｘをコードしている完全長ｃＤＮＡは、それぞれ対照ドナー及び患者の芽球からＲＴ−ＰＣＲによって得られた。ｃＤＮＡはシークエンスによって確認され、レポーターとして緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしているビシストロン性レンチウイルス発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ７．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ、インビトロジェン社）又はＮ末端Ｆｌａｇタグ化発現ベクター（ｐ３ＸＦＬＡＧ−ｍｙｃ−ＣＭＶ−２６、シグマアルドリッチ社）に挿入した。患者のＬＣＬを、以前に記載のような野生型ＣＤ７０を含有しているｐＬｅｎｔｉ７．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ又は空ベクターを用いて形質導入した４。ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ（アドジーン社のプラスミド番号４９５３５）からの贈り物であった。全てのｓｇＲＮＡは、ＭＩＴ ＣＲＩＳＰＲ設計ツール（http://crispr.mit.edu）を使用して設計された。ＣＤ７０のエキソン３内の異なる配列に標的化する３つの対の２４ｂｐの正方向（Ｆ）オリゴヌクレオチド及び逆方向（Ｒ）オリゴヌクレオチドが、逆方向オリゴヌクレオチド内のＢｓｍｂＩ部位へのｓｇＲＮＡ配列のクローニングを可能とするための４ｂｐのオーバーハング、及び正方向オリゴヌクレオチド内にＰＡＭ配列を含有している４ｂｐのオーバーハングと共に合成（ユーロジェンテック社）された。合成されたオリゴヌクレオチドの対をアニーリングし、リン酸化し、鎖状ベクターにライゲートし、Ｓｔｂｌ３細菌（ライフテクノロジーズ社）に形質転換した。ｓｇＲＮＡ挿入は、シークエンス用プライマーを使用してサンガーシークエンスによって確認された。ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲプラスミドを、ＬＣＬへの感染によって形質導入し、ラージ細胞へのＮｅｐａ２１エレクトロポレーター（ネッパジーン社）を用いての電気穿孔によってトランスフェクトした。ＬＣＬ ＣＤ７０陽性群及びＣＤ７０陰性群は選別によって濃縮された。
【００４４】
イムノブロット及びプルダウンアッセイ。細胞（５×１０６個の細胞/ml）を、ウサギ−抗マウスＩｇＧ（２μg/ml）と架橋している抗ＣＤ２７抗体（モノクローナル抗体ＬＧ．３Ａ１０）又は抗ＣＤ３抗体（モノクローナル抗体ＯＫＴ３）（１μg/ml）によって、示された時間をかけて刺激した。次いで、細胞を、以前に記載されているように８、１％ＮＰ４０、５０mMトリス（ｐＨ８）、１５０mM ＮａＣｌ、２０mM ＥＤＴＡ、１mM Ｎａ３ＶＯ４、１mM ＮａＦ、及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ社）中に溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（バイオラッド社）によって定量された。８０μgのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。試験のためにｅｘｐｒｅｓｓｉ膜を、一次抗体との９０分間のインキュベーション前にミルク又はＢＳＡを用いて１時間かけてブロッキングした。以下のｍＡｂ及びウサギポリクローナル抗体を、イムノブロットのために使用した：抗ＩＴＫ抗体（クローン２Ｆ１２）、抗リン酸化ＰＬＣ−γ１抗体（クローンＤ６Ｍ９Ｓ）、抗リン酸化ＥＲＫ１/２（クローンＤ１３．１４．４Ｅ）及び抗リン酸化チロシン抗体（クローンＰＹ−１００）はセルシグナリング社から購入し、抗ＦＬＡＧ抗体（クローンＭ２）及びウサギポリクローナル抗ＡＣＴＩＮ抗体はシグマ社製であった。次いで、膜を洗浄し、それぞれセルシグナリング社製及びＧＥヘルスケア社製のＨＲＰにコンジュゲートさせた抗マウス又は抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした。ピアス社のＥＣＬウェスタンブロット基質を、検出のために使用した。ＧＳＴタンパク質を使用した結合アッセイを、以前に概略が示されている通りに５０、未刺激の細胞、抗ＣＤ３抗体又は過バナジン酸塩で刺激された細胞に由来する溶解液を使用して実施した。ヒトＦＹＮ、ＩＴＫ及びＬＣＫのＳＨ３ドメインとＧＳＴの融合タンパク質をＲＴ−ＰＣＲによって得、ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（ＧＥヘルスケア社）にサブクローニングした。
【００４５】
結果：
臨床的及び免疫学的特色
本発明者らは、慢性ＥＢＶ感染及びリンパ腫を有するエジプト人を起源とする８歳の男性を調べた。彼の両親はいとこであった。彼は３歳８か月の時にＥＢＶ陽性の結節硬化型ホジキンリンパ腫と診断された。彼は化学療法及び放射線療法を受け、完全寛解を達成し、それ以来再発していない。４.５歳の時に、反復性発熱、リンパ節腫脹、及び肝脾腫を患い、これは、血液中のＥＢＶの高い負荷量、並びにリンパ節及び脾臓におけるＢ細胞のポリクローン性増殖を伴っていた。抗ＣＤ２０抗体療法の開始後に症状は寛解し、これによりＥＢＶのウイルス負荷量は減少したが、再発したので抗ＣＤ２０抗体の反復注入及び最終的には同種造血幹細胞移植が必要となった。他のウイルス感染及び細菌感染は認められなかった。
【００４６】
５歳の時に抗ＣＤ２０抗体療法の前に免疫学的検査を実施し、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、ＭＡＩＴ細胞、及び記憶Ｂ細胞の数の減少及び血清中ＩｇＭ及びＩｇＡレベルの低下をはじめとする有意であるが少数の異常が明らかとなった。ＣＤ３、ＰＨＡ及び抗原の刺激に対するＴ細胞の増殖は正常であった。これらの観察に基づいて、早期発症ホジキンリンパ腫に関連したＥＢＶ感染への高い易罹患性は、先天的異常の結果であり、これにより患者に免疫不全が起こることが疑われた。
【００４７】
ＣＤ７０におけるホモ接合型ナンセンス突然変異の同定
患者における免疫不全症の遺伝的基礎を同定するために、本発明者らはまず、ＥＢＶ感染に対する易罹患性を引き起こす公知の常染色体遺伝子異常を試験した。ＩＴＫ、ＣＤ２７、ＭＡＧＴ１、及びＣＴＰＳ１における突然変異は全く検出されず、それらが原因となる役割を果たすことは除外された。本発明者らは次に、全エキソームシークエンス（ＷＥＳ）を実施した。両親が血縁であるために、本発明者らは本発明者らの分析をホモ接合型遺伝子変異に焦点を当てた。有害でありかつＣＤ７０遺伝子に局在すると予測されるたった１つのホモ接合型変異が発見された。第３エキソン内のナンセンス突然変異（ｐ．Ｒ１７９Ｘ、ｃ．５３５Ｃ＞Ｔ）からなるこの変異は、１．４８×１０−５の頻度で、エキソームの公共データベース及び本発明者らの研究室のデータベースにおいてヘテロ接合型突然変異としてのみ存在していた５（方法を参照）。サンガー法による家系内のＣＤ７０のシークエンスにより、患者はｃ．５３５Ｃ＞Ｔ突然変異についてはホモ接合型であるが、彼の両親及び二人の健康な姉妹はヘテロ接合型保因者であることが確認された。タンパク質レベルでは、ｐ．Ｒ１７９Ｘ突然変異は、ＣＤ７０のＣ末端の最後の１５アミノ酸を除去する。鋳型としてＴＮＦ様受容体Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの３次元構造（ｐｄｂ １ＤＧ６及びｐｄｂ １Ｄ０Ｇ）を使用したヒトＣＤ７０タンパク質の３次元構造モデリングにより、最後の内部β鎖Ｈが、切断短縮されたＣＤ７０Ｒ１７９Ｘタンパク質において欠失していることが示された。特に、Ａｐｏ２Ｌでは、この鎖は、ホモトリマーの様々なサブユニット間で形成される接触に関与している２８。重要なことには、ＣＤ７０は、ＣＤ２７分子のリガンドであることが知られている。ＣＤ２７の欠損症は、ＥＢＶ感染及び関連するリンパ増殖障害に対する高い易罹患性を引き起こす５、６、２０。したがって、本発明者らはＣＤ７０が、患者の免疫不全症の基礎となる強力な候補遺伝子であると判断した。
【００４８】
発現消失及びＣＤ７０突然変異タンパク質のＣＤ２７に対する結合の欠失
ｃ．５３５Ｃ＞Ｔ突然変異は、患者に由来するＰＨＡにより刺激されたＴ細胞及びＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞（さらにリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とも称される）における、ｑＰＣＲによって検出されたＣＤ７０ｍＲＮＡの量に対して全く影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。タンパク質レベルでは、抗ＣＤ７０抗体は、患者のＰＨＡにより刺激されたＴ細胞の細胞表面においてフローサイトメトリーによってＣＤ７０を検出することができなかった。これに対し、ＣＤ７０の発現は、８日目に健康なドナーに由来するＰＨＡにより刺激されたＴ細胞の画分では検出することができた。ＣＤ７０＋Ｔ細胞のこの比率は培養液中で増加し、１５日目には高い比率のＴ細胞がＣＤ７０を発現していた。同様に、ＣＤ７０は、患者に由来するＬＣＬでは検出されず、これに対して、健康なドナーに由来するＬＣＬは、それらの表面上に高いレベルのＣＤ７０を発現していた。ＣＤ７０の不完全な発現は、ＣＤ２７に対するＣＤ７０Ｒ１７９Ｘの結合能を分析することによって確認された。ＣＤ２７の細胞外ドメインを含有している融合タンパク質（Ｆｃ−ＣＤ２７）は、患者に由来するＰＨＡ−Ｔ細胞芽球及びＬＣＬの表面上に結合することができなかったが、一方、対照細胞上へのその結合は検出された。同様な結果が、野生型ＣＤ７０又はＣＤ７０Ｒ１７９Ｘタンパク質をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に一過性に発現させた場合に得られた。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＣＤ７０及びＣＤ７０Ｒ１７９Ｘの発現は、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ化ＣＤ７０形を使用してウェスタンブロットによってさらに調べられた。突然変異体のＣＤ７０Ｒ１７９Ｘは、野生型ＣＤ７０と比較して弱く発現していた。要するに、これらの結果は、ＣＤ７０におけるｐ．Ｒ１７９Ｘ突然変異がその発現を損なわせ、その同族リガンドであるＣＤ２７を認識するその能力に対して有害な作用を及ぼすことを示す。それ故、本発明者らは、ＣＤ７０欠損症がＣＤ２７欠損症を擬態し、したがって、患者のＥＢＶ感染に対する高い易罹患性の原因となる可能性があると結論付ける。
【００４９】
活性化Ｂ細胞及びＥＢＶに感染したＢ細胞上の高いレベルのＣＤ７０
抗ＥＢＶ免疫におけるＣＤ７０の役割をより良く理解するために、本発明者らはまず、幾人かの健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＣＤ７０の発現を分析した。ヒトにおいて、ＣＤ７０の発現は、いくつかの樹状細胞及びＢ細胞サブセットに限定されることが示されているが、ＣＤ２７は殆どのＴ細胞及び記憶Ｂ細胞に発現されている２３、２９。実際に、ＣＤ７０の発現は、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞、単球、樹状細胞、並びに好中球においては殆ど検出できず、例外としてＢ細胞の少数の画分に認めることができる。これは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球並びにＢ細胞の少数の画分の表面上における高いレベルのＣＤ２７とは対照的である。Ｂ細胞上のＣＤ７０の発現は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）とイオノマイシン（Ｉｏｎｏ）の組合せによる活性化時に迅速にアップレギュレートされた。刺激後３日目に、Ｂ細胞の８０％超が、Ｔ細胞とは対照的に大量のＣＤ７０を発現した。活性化されたＢ細胞と同様に、本発明者が試験した全てのＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞株が、高いレベルのＣＤ７０を発現した。これらのデータは、ＣＤ７０の発現が、ＥＢＶ感染の経過中にＢ細胞において誘導可能であることを示唆する。この可能性を試験するために、本発明者らは、伝染性単核球症を有する２人の個体の扁桃におけるＣＤ７０の発現を分析した。ＣＤ７０の染色は、エプシュタイン・バーによりコードされるＲＮＡ（ＥＢＥＲ）及びＰＡＸ５というＥＢＶ特異的マーカーについて陽性であった大型細胞上並びにＢ細胞上のそれぞれに見られ、ＥＢＶに感染したＢ細胞に対応していた。これに対して、ＣＤ２７の発現は、ＰＡＸ５及びＥＢＥＲの染色とは関連せず、Ｔ細胞領域に局在する細胞に蓄積した。これらのデータにより、ＣＤ７０の発現は、活性化されたＢ細胞及びＥＢＶに感染したＢ細胞においてアップレギュレートされるが、大半のＴ細胞は、休止状態において多量のＣＤ２７を発現することが示される。それ故、ＣＤ２７−ＣＤ７０の相互作用は、ＣＤ２７を発現しているＴ細胞とＣＤ７０を発現しているＢ細胞との間で、ＥＢＶ感染の経過中に起こり得、ＥＢＶにより活性化されたＢ細胞のＴ細胞による制御において重要な役割を果たし得る。
【００５０】
ＥＢＶにより形質転換された自己Ｂ細胞に対する、患者のＴ細胞の低下した細胞溶解応答
マウスでは、ＣＤ７０及びＣＤ２７は、抗原特異的なＴ細胞応答において、特に抗ウイルス応答中に重要な役割を果たす２６、３０。したがって、ＥＢＶに対するＴ細胞応答は、ＣＤ７０の非存在下においては損なわれる可能性がある。この仮説を試験するために、本発明者らは、放射線照射されたＬＣＬと共培養された患者又は健康な対照のＰＢＭＣからのＥＢＶに対するＴ細胞応答を分析した。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋の比率並びに活性化マーカーの発現は、４〜５週間共培養した後に分析した場合には同等であった。４週間共培養した後、Ｔ細胞による細胞の細胞障害性応答及びＩＦＮ−γ産生を、ＥＢＶにより形質転換された自己Ｂ細胞株に対して評価した（図１ａ）。対照Ｔ細胞培養液と比較して、患者のＴ細胞は、顕著に減少した細胞障害活性及びＩＦＮ−γ産生を示し、このことは、ＥＢＶに対する損なわれたＴ細胞応答を示す。ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞上のＣＤ７０の欠損と、ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞に対する不完全なＴ細胞応答との間の連関を公式に証明するために、本発明者らは、患者のＬＣＬを、野生型ＣＤ７０をコードしているｃＤＮＡを含有しているレンチウイルスベクター（又は空ベクター）を用いて形質導入することによって復元実験を実施し、これにより対照ドナーに由来するＬＣＬに見られるのと同等なレベルまでＣＤ７０の表面発現が誘導された（図１ｂ）。これらの条件において、ＣＤ７０を発現している自己ＬＣＬに対する患者のＴ細胞の細胞溶解応答は、対照Ｔ細胞と同じような大きさまで回復した（図１ｃ）。要するに、これらの結果は、患者のＢ細胞上のＣＤ７０の欠失により、ＥＢＶに感染したＢ細胞に対するＴ細胞溶解応答が損なわれることを実証する。しかしながら、患者のＴ細胞の本来の細胞障害性機能は保存されたが、標的細胞上での異所的なＣＤ７０の発現は、Ｔ細胞による死滅を増加させなかった。
【００５１】
患者のＥＢＶに特異的なＴ細胞の損なわれた増殖
本発明者らは次に、患者におけるＣＤ７０欠損自己ＬＣＬに対する、損なわれたＴ細胞障害性及びサイトカイン産生が、ＥＢＶに特異的なＴ細胞増殖の欠陥の結果であった可能性を試験した。患者のＨＬＡ遺伝子型判定により、彼はＨＬＡ−Ａ＊０１の保因者であることが示され、ＥＢＶに特異的なＴ細胞を直接的に評価するためのテトラマー試薬は入手できなかった。しかしながら、患者のＰＢＭＣの中の、ＥＢＶにより誘発される増殖中のＴ細胞は、ＣＤ７０の発現を回復させた自己ＬＣＬと共培養した場合には、ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅバイオレット色素希釈及び活性化マーカーＣＤ２５の発現によって検出可能であったが、ＣＤ７０の欠損した親ＬＣＬと共培養した場合には検出可能ではなかった（図１ｄ、上のパネル）。ＨＬＡ−Ａ＊０１を発現している健康なドナーに由来する増殖中のＴ細胞もまた、患者のＨＬＡ−Ａ＊０１のＣＤ７０を発現しているＬＣＬと共培養した場合には観察されたが、ＨＬＡ−Ａ＊０１のＣＤ７０を欠損しているＬＣＬと共培養した場合には観察されなかった（中央の上のパネル）。これに対して、非自己条件では、ＨＬＡ−Ａ＊０２及びＨＬＡ−Ａ＊０３対立遺伝子の健康なドナー保因者に由来するＰＢＭＣの中にはほんの僅かな増殖中のＴ細胞しか検出されなかった（中央の下及び下のパネル）。
【００５２】
Ｂ細胞上のＣＤ７０の非存在下におけるＥＢＶ特異的Ｔ細胞の不完全なＴ細胞増殖
次に抗ＥＢＶ免疫におけるＣＤ７０の役割を証明するために、ＣＤ７０欠損ＬＣＬを、遺伝子不活性化によって健康なＨＬＡ−Ａ＊０２個体のＰＢＭＣから誘導した。殆どのＨＬＡ−Ａ＊０２個体が、ＥＢＶ溶菌サイクルタンパク質ＢＭＬＦ１に由来する、GLCTLVAMVペプチド（ＧＬＣエピトープとも呼ばれる）に対するＥＢＶ特異的Ｔ細胞を発達させる３１。ＣＤ７０欠損ＬＣＬは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的な間隔があいた短い回文構造の繰り返し）に関連したヌクレアーゼＣａｓ９技術を使用してＣＤ７０の発現を鈍らせることによって得られた。ＣＤ７０のエキソン３を標的化するＲＮＡガイドを含有している３つの異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を、ＬＣＬに一過性にトランスフェクトした。選択及び選別することによりＣＤ７０陰性細胞について濃縮した後に、３つの安定なＣＤ７０欠損（ＣＤ７０ＫＯ）ＬＣＬ細胞株が得られた（本明細書では以後、ＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ１、ＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ２、及びＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ３と称される）。これらの細胞株は、野生型親ＬＣＬ又は空のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を用いてトランスフェクトされたＬＣＬと比較して、同等な量のＨＬＡ−Ａ＊０２分子をそれらの表面上に発現していた。次いで、本発明者らは、放射線照射された自己野生型ＬＣＬ（空のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を用いてトランスフェクトされた）又はＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ１ ＬＣＬとの共培養実験において、ＨＬＡ−Ａ＊０２の健康ドナーのＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖を調べた。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞は、ＧＬＣ、ＣＬＧ、及びＦＬＹエピトープのためのペンタマーの混合物を使用して０日目に、及びＣＤ７０を発現している野生型ＬＣＬ（空のＣＲＩＳＰＲ ＬＣＬ）との共培養後に検出可能であり、その比率は、培養８日目には５倍増加した。これらの大半の細胞はＣＤ２５を発現し、強力に増殖性であった（データは示されていない）。著しく対照的には、自己ＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ１ ＬＣＬとＴ細胞の培養により、ＥＢＶ特異的なＴ細胞の増殖は全く起こらなかった。類似した結果が、２人の他の健康なＨＬＡ−Ａ＊０２ドナー（対照２及び対照３）に由来するＰＢＭＣを用いて得られた。ＥＢＶナイーブドナー（対照４）に由来するＴ細胞ではこのような増殖は全く観察されなかった。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２ ＰＢＭＣを、両方の他のＣＤ７０欠損ＬＣＬ、ＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ２及びＣＤ７０ＫＯ−ＣＲＩＳＰＲ３と共培養した場合にも、増殖が起こらないことが観察された。したがって、本発明者らの観察は、ＣＤ７０が、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増殖に必要とされる重要な因子であることを実証する。さらに、ＣＤ７０を発現している自己ＬＣＬの存在下で増殖させた、対照及び患者のＴ細胞は、ＣＤ７０を発現しているＬＣＬ及びＣＤ７０を欠損しているＬＣＬの両方を効率的に死滅させることができ、このことは、ＣＤ７０の欠損それ自体が、Ｔ細胞の細胞障害活性を排除するわけではないことを示す（図２）。これに対し、ＣＤ７０欠損自己ＬＣＬと共培養されたＴ細胞は死滅活性を全く示さず、このことは、特異的なエフェクターＴ細胞が増殖のためにＣＤ７０を必要とすることを実証する。
【００５３】
Ｂ細胞上のＣＤ７０は、ＴＣＲにより媒介される増殖に必要とされる共刺激シグナルを提供する
本発明者らの観察をさらに進展させ、ＣＤ７０の欠損によりＢ−ＬＣＬによるＴＣＲの刺激に応答した増殖及び活性化が鈍ることを公式に証明するために、本発明者らは、抗ＣＤ３抗体の存在下でＣＤ７０を発現している又は発現していない放射線照射されたＬＣＬを用いての刺激後のＴ細胞増殖応答を分析した。重要なことには、これらの条件においてＴ細胞の活性化は、放射線照射されたＬＣＬによって発現されるＨＬＡ−Ａ分子に限定されなかった。８日目に、患者又は健康なドナーに由来するほんの僅かな比率のＴ細胞が、ＣＲＩＳＰＲによって得られたＣＤ７０欠損ＬＣＬ（ＣＤ７０−ＣＲＩＳＰＲ１ ＬＣＬ）又は患者に由来するＣＤ７０欠損ＬＣＬとの共培養液中に検出可能であった。これに対し、ＰＢＭＣを、ＣＤ７０の発現を回復させた患者に由来するＬＣＬ、又は健康なドナーに由来するＣＤ７０を発現しているＬＣＬ（空のＣＲＩＳＰＲ ＬＣＬ）と共培養した場合、患者及び健康なドナーの両方に由来するＴ細胞の大半が分裂することができた。これらの増殖中のＴ細胞の大部分が、高いレベルのＣＤ２７及びＣＤ２５を発現した。分裂中のＴ細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含んでいたが、ＣＤ８＋細胞の比率の方が高かった。これらの増殖中のＴ細胞はエフェクター表現型を示した。なぜなら、それらの大半が、再刺激時にＩＦＮ−γαを分泌する能力を有していたからである。結果を、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ３を含む異なるＨＬＡハプロタイプを有する異なる健康なドナーに由来するＴ細胞を用いて復元及び進展させた。これらの条件下において、Ｔ細胞の増殖はＣＤ３の刺激に依存し、大半の個体において、大半のＴ細胞が、ＣＤ７０を発現しているＬＣＬと共培養した場合には少なくとも１回の分裂を達成したが、ＣＤ７０欠損ＬＣＬと共培養した場合には達成しなかった。さらに、この増殖は、予想された通り抗ＣＤ２７抗体の添加によって実質的に減少した。これらの結果は、ＣＤ７０が、Ｂ細胞上に発現された場合にＴＣＲにより媒介されるＴ細胞の増殖に対して不可欠な共刺激シグナルを提供することを実証する。
【００５４】
ＣＤ２７により媒介されるＴ細胞増殖は、ＩＴＫに依存している
ＣＤ２７、ＩＴＫ、及びＣＤ７０の欠損は表現型模写として出現するので、本発明者らは、ＣＤ２７−ＣＤ７０及びＩＴＫが機能的かつ分子的なクラスターを形成することができると仮設した。それを試験するために、本発明者らはまず、ＣＤ２７欠損患者及びＩＴＫ欠損患者（ＣＤ２７におけるホモ接合型突然変異ｐ．Ｗ１１０Ｘの患者保因者１名、ＩＴＫにおけるホモ接合型突然変異ｐ．Ｒ２９Ｃを有する患者２名（患者１ ＩＴＫ−及び患者２ ＩＴＫ−）、及びＩＴＫにおけるホモ接合型突然変異ｐ．Ｌ３８Ｐを有する患者１名（患者３ ＩＴＫ−）を含む、４名の新たに記載された患者）に由来するＰＢＭＣのＣＤ７０依存性Ｔ細胞増殖を調べた。ＢＴＫの３次元構造（ｐｄｂ：１Ｂ５５）に基づいて作成された、ＩＴＫの３次元構造モデルに対するこれらの突然変異の起こり得る影響を評価することにより、それらが、以前に報告１７されているようなＲ２９Ｈ突然変異と同じように、ＰＨドメインがホスホイノシトールと相互作用する能力を損ない得ることが示された。
【００５５】
Ｗ１１０Ｘ突然変異は、患者のＰＢＭＣ及びＴ細胞芽球上のＣＤ２７の表面発現を消失させた。予想された通り、抗ＣＤ３抗体の存在下における、放射線照射されたＣＤ７０を発現しているＢ−ＬＣＬに応答した、ＣＤ２７欠損Ｔ細胞芽球の増殖は顕著に減少した。ＩＴＫの発現は、Ｒ２９Ｃ及びＬ３８Ｐ突然変異を有する患者のＴ細胞に由来する溶解液中で強く減少した。調べたところ、抗ＣＤ３抗体の存在下における、放射線照射されたＣＤ７０を発現しているＬＣＬに応答した、ＩＴＫ欠損ＰＢＭＣ又はＴ細胞芽球のＴ細胞増殖は顕著に減少した。重要なことには、ＩＴＫ欠損Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞又はＣＤ７０欠損Ｔ細胞と同等なＣＤ２７レベルを発現し、ＣＤ３又はＣＤ３＋ＣＤ２８の刺激に応答して正常な増殖を示した。まとめると、これらのデータは、Ｂ細胞上のＣＤ７０と結合した場合の、Ｔ細胞上のＣＤ２７によってトリガーされた共刺激シグナルは、チロシンキナーゼＩＴＫに依存する。したがって、ＩＴＫをはじめとするＴＥＣキナーゼ３２の阻害剤であるイブルチニブの添加は、ＣＤ７０を発現しているＬＣＬにより媒介されるＴ細胞増殖を阻害した。
【００５６】
ＣＤ２７のシグナル伝達におけるＩＴＫの役割をさらに解読するために、本発明者らは次に、ＣＤ２７と結合した後に起こる活性化事象を分析した。抗ＣＤ２７抗体又は可溶性ＣＤ７０を用いたヒトＴ細胞の刺激により、ナイーブＴ細胞及びγδＴ細胞にカルシウムが動員されることが報告されている３３、３４。マウスでは、ＩＴＫはまた、ＴＣＲ活性化後にＰＬＣ−γ１を活性化し、続いてカルシウム流入を活性化することが知られている１６、１８。したがって、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ２７抗体による刺激に応答したＴ細胞におけるカルシウム動員を調べた。ＩＴＫ欠損ＰＢＭＣに由来するＴ細胞及びＴ細胞芽球は、健康なドナー、ＣＤ７０欠損患者又はＣＤ２７欠損患者に由来する細胞と比較して、ＣＤ３による刺激時に減少したカルシウム動員を示した。ＣＤ２７の刺激も、ＣＤ７０欠損患者及び健康なドナーに由来するＴ細胞及びＴ細胞芽球におけるカルシウム動員を誘導した。ＣＤ２７によってトリガーされるカルシウムシグナルの大きさはしばしばあまり重要ではなく、ＣＤ３による刺激によってトリガーされるシグナルと比較して一貫して遅かった。これらの条件において、抗ＣＤ２８抗体による刺激は、カルシウム流入を全く誘発しなかった。これに対して、ＣＤ２７によるＩＴＫ欠損Ｔ細胞又はＣＤ２７欠損Ｔ細胞の刺激により、非常に弱いカルシウム動員が行なわれた。同様に、イブルチニブは、健康なドナーに由来するＴ細胞及びＴ細胞芽球においてＣＤ２７により媒介されるカルシウム動員を完全に阻害したが、ＣＤ３により媒介されるカルシウム動員は、ＩＴＫ欠損細胞で観察されたものと等価な大きさまで部分的に遮断された。これらの結果は、ＩＴＫが、ＣＤ２７により媒介されるカルシウム動員に必要とされることを実証する。
【００５７】
ＣＤ２７のシグナル伝達に関与する正確な機序は依然として明らかに定義されていないが、ＴＲＡＦ分子の役割は報告されている３５。興味深いことに、ＣＤ２７は、その細胞内ドメイン内にいくつかのプロリン残基及びチロシン残基を含有し、これはそれぞれＩＴＫのＳＨ３ドメイン及びＳＨ２ドメインに対する可能性あるドッキング部位を形成している可能性がある。特に、ＮＨ２末端領域は、ＩＴＫのＳＨ３ドメインとの相互作用に関与する共通配列と類似性を共有しているプロリン含有配列を有する３６。ＣＤ２７におけるこれらの配列は哺乳動物において高度に保存されている。したがって、本発明者らはＩＴＫがＣＤ２７と機能的又は直接的に相互作用することができるかどうかを調べた。本発明者らはまず、ＣＤ２７がチロシンリン酸化事象をトリガーする能力について試験した。チロシンリン酸化タンパク質が、抗ＣＤ２７抗体による刺激から１５分後に、健康なドナーの対照Ｔ細胞芽球に由来する溶解液中に検出された。これらのリン酸化シグナルは、ＣＤ３による刺激に応答して観察されたシグナルと比較して部分的に明確に異なりかつ遅かった。興味深いことに、ＩＴＫのサイズを有するタンパク質は、ＣＤ２７による刺激時にはリン酸化されたが、ＣＤ３による刺激時にはリン酸化されなかった。ＩＴＫに依存していることが知られるシグナル１６、例えばＰＬＣ−γ１及びＥＲＫ１／２のリン酸化などのさらなる分析により、どちらの経路も、ＣＤ２７による刺激時には、ＣＤ３による刺激に応答したものよりも強度は低いけれども、活性化されたことが示された。次いで、ＩＴＫとＣＤ２７との間の直接的な関連の証拠を、ＴＣＲ活性化に関与する最も重要なＳＨ３含有チロシンキナーゼである、ＩＴＫ、ＦＹＮ、又はＬＣＫのＳＨ３ドメインを含有しているＧＳＴ融合タンパク質を用いてのプルダウンアッセイによって探索した。ＣＤ２７を、ＩＴＫのＳＨ３ドメインを含有しているＧＳＴを用いて、ＰＢＭＣ及びＴ細胞芽球溶解液から沈降させた。これに対して、ＧＳＴ単独との、又はＦＹＮ若しくはＬＣＫのＳＨ３ドメインを含有しているＧＳＴとの会合は全く観察されなかったか、あるいはほんの中程度の会合しか観察されなかった。これらのデータは、ＩＴＫが、そのＳＨ３ドメインを介してＣＤ２７と直接相互作用し、ＣＤ２７を下流のシグナル伝達経路に共役させる能力を有することを強く示唆する。
【００５８】
考察：
この研究において、本発明者らは初めて、感染Ｂ細胞の制御不能なリンパ増殖を伴う、ＥＢＶ感染に対する不完全な免疫を有する患者における、ＣＤ７０の遺伝子欠損を報告する。本発明者らは、ＣＤ７０及びそのリガンドであるＣＤ２７の関与する経路を解読し、ＣＤ７０分子、ＣＤ２７分子及びＩＴＫ分子が、Ｔ細胞によるＢ細胞の免疫監視において重要な役割を果たしている機能的クラスターを形成しているという証拠を提供する。Ｂ細胞上に発現されると、ＣＤ７０は、ＣＤ２７及びＩＴＫを通してＴ細胞にシグナルを送達し、これらは、Ｔ細胞の増殖の維持及びしたがってエフェクタープログラムの実行に必要である。
【００５９】
患者は、ＥＢＶの高いウイルス負荷を伴う再発性Ｂ細胞リンパ増殖を示し、ＥＢＶに関連したホジキンリンパ腫を発症した。感染への易罹患性は、ＥＢＶに限定されているようである。なぜなら今日まで、他のウイルス感染又は細菌感染に罹患していないからである。一人の、加えてまだ若い患者に基づいているので、ＣＤ７０の欠損に関連した臨床結果に基づいて堅く結論付けることは明らかに困難である。しかしながら、ＣＤ７０の唯一公知のリガンドであるＣＤ２７の遺伝子の欠陥が、１７人の患者において報告されている５、６、２０。特に、彼ら全員が、ホジキンリンパ腫及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のようなリンパ増殖障害をはじめとする、初期及び主要な臨床徴候としてＥＢＶに関連した障害を発症した。それ故、ＣＤ７０欠損患者の臨床症状は、ＣＤ２７の欠損に伴う臨床症状と同一ではなくても類似している。したがって、ＣＤ７０の欠損は、ＣＤ２７の欠損の表現型模写であるようである。ＣＤ２７欠損マウス及びＣＤ７０欠損マウスの表現型も同等であり、両方共が消失した抗ウイルス応答によって特徴付けられる２２、２５、２７。十分に興味深いことには、ＩＴＫ欠損に関連した臨床表現型もまた、ＣＤ２７欠損及びＣＤ７０欠損のそれに非常に似ている７。
【００６０】
本発明者らの結果は、ＣＤ７０−ＣＤ２７系が、ヒトにおけるＥＢＶに対する免疫応答の重要な因子を代表することを示す。本発明者らは、ＥＢＶに感染したＢ細胞上のＣＤ７０が、ＣＴＬの増殖のためにＥＢＶ特異的ＣＴＬに対して重要なシグナルを提供することを示した。本発明者らは、ＣＤ７０が、活性化Ｂ細胞及びＥＢＶ感染Ｂ細胞において強力にアップレギュレートされていることを観察した。ＣＤ７０はまた、多くのＥＢＶ依存性及びＥＢＶ非依存性Ｂ細胞悪性腫瘍によって恒常的に発現されている２４。ＣＤ２７欠損、ＣＤ７０欠損、及びＩＴＫ欠損を伴うＥＢＶ感染の特有の素因は、Ｂ細胞に対するＥＢＶの独特な指向性、並びにＥＢＶがＢ細胞の増殖及び形質転換を誘発する能力から生じるようである。ＥＢＶに対する効率的なインビボにおける免疫応答は、高度に増殖中のＥＢＶ感染Ｂ細胞を排除するのに釣り合う量のＣＴＬを提供するために、エフェクター細胞の迅速かつ大量の増殖を必要とする。したがって、ＣＤ７０−ＣＤ２７−ＩＴＫ系は、この応答の重要な成分である。
【００６１】
マウスにおける多くの研究は、長期記憶の確立をはじめとするＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生及び維持におけるＣＤ２７−ＣＤ７０系の役割を記述している。ＣＤ７０欠損マウスの近年の記載により、初期ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の開始においてＣＤ７０が特に重要であることが確認された２６。したがって、ＥＢＶ感染Ｂ細胞に対するＴ細胞免疫の獲得は、ＣＤ７０欠損患者において不完全であるようであり、これは、インビトロにおけるＥＢＶ特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の適切な増幅及び増殖が行なわれないことに相関している。しかしながら、ＥＢＶに対する記憶Ｔ細胞免疫は、ＣＤ７０の非存在下において保存されているようである。なぜなら、特異的な抗ＥＢＶ Ｔ細胞は、ＣＤ７０を発現している自己ＬＣＬと共培養した場合に患者のＰＢＭＣから増幅され得るからである。まとめると、これらの結果は、Ｔ細胞の細胞障害性機能及びＩＦＮ−γ産生機能を実行しかつ記憶細胞へと分化させるそれらの内在的能力に影響を及ぼすことなく、活性化Ｔ細胞の細胞分裂をトリガーする際のＣＤ７０−ＣＤ２７相互作用の具体的な役割を指摘する。
【００６２】
以前の研究にしたがって、本発明者らの観察は、ＣＤ２７が、ＴＣＲ依存的リンパ球活性化の共刺激分子として振る舞うことを実証する２９。ＣＤ２７によって送達された共シグナルは、近年強調されているような持続的なＴ細胞の増殖に必須である３７。さらに、本発明者らは、ＣＤ２７の下流にある増殖関連共シグナルが、ＩＴＫのＳＨ３ドメインを介してＣＤ２７の細胞質内尾部に結合することのできるＩＴＫに厳密に依存していることを示した。ＩＴＫが、ＰＬＣ−γ１、Ｃａ２＋流入、及びＥＲＫキナーゼを活性化するその能力によって、ＴＣＲシグナル伝達に直接的に関与していることは十分に確立されている１６、１８。したがって、ＣＤ２７の結合はまた、ＰＬＣ−γ１、Ｃａ２＋流入、及びＥＲＫキナーゼの活性化をトリガーし、このことは、示唆されているようなＣＤ２７によるＴＣＲの強度の定量的増幅を示唆する２９、３７。ＣＤ２７シグナル伝達におけるＩＴＫの正確な分子的必要条件、及びそれがＴＣＲシグナル伝達とどのように協力して細胞分裂を駆動するかを解読するために、より多くの研究が是認される。
【００６３】
本発明者らの観察は、Ｂ細胞上のＣＤ７０が、増殖中のＢ細胞に対するＴ細胞免疫における重要な役者であることを確立しているが、ＣＤ７０はまた、活性化Ｔ細胞の亜群及び樹状細胞を含む、他の造血細胞上にも発現されている。以前に試験された様々なモデルにおいて、ＣＤ２７依存的なＴ細胞応答のプライミング及び維持は、樹状細胞上に発現されているＣＤ７０との相互作用に関与していることが示された３８、３９。したがって、また、樹状細胞上にＣＤ７０が存在しないことが、特にプライミング期中の、患者におけるＥＢＶ感染が制御されないことの原因であると考えられ得る。ＣＤ２７欠損患者及びＩＴＫ欠損患者は、他の感染に対する大きな易罹患性を発達させなかったので、樹状細胞上のＣＤ７０は、他の病原体に対する免疫応答に絶対的に必要とされるわけではないようである。Ｔ細胞によって発現される４−１ＢＢ及びＯＸ４０などの他のＴＮＦＲファミリーメンバーとの部分的な重複は、樹状細胞との相互作用中にそれらのリガンドと結合した場合に、ＣＤ２７によって送達されるシグナルと類似したシグナルをＴ細胞に提供することができた２９、４０。
【００６４】
十分に興味深いことは、ＳＨ２Ｄ１Ａの突然変異によって引き起こされるＳＡＰ欠損症（すなわちＸＬＰ−１症候群）におけるＥＢＶに対する不完全な免疫の基礎にある機序は明確に異なり、ＣＤ２７−ＣＤ７０−ＩＴＫ−欠損症に伴うものとは異なる臨床表現型を伴う。ＳＡＰ欠損症では、ＳＬＡＭ受容体を通したＴ細胞とＢ細胞の損なわれた相互作用が、ＥＢＶ感染に対する易罹患性において中心的な役割を果たし、その結果、大半の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅を伴う血球貪食症候群（すなわちＨＬＨ）がもたらされる３。本発明者らの結果は、ＣＤ２７−ＣＤ７０−ＩＴＫ系もまた、ＥＢＶ感染の経過中にＴ細胞−Ｂ細胞の相互作用中に重要な役割を果たしていることを示す。しかしながら、ＣＤ２７−ＣＤ７０−ＩＴＫ−欠損症を有する患者におけるＥＢＶ感染の損なわれた制御は、直ちにＨＬＨを引き起こすわけではなかった。ＳＡＰの非存在下において、エフェクター−記憶ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞を死滅させる低下した能力を示すことが示され１１、１２、一方、細胞増殖は、不完全な活性化により誘発された細胞死のために正常であるか又はさらには増加し１３、これはＣＤ２７−ＣＤ７０−ＩＴＫ−欠損症とは鋭く対照的である。Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群の病気発生は、Ｂ細胞標的を死滅させることができないＣＤ８＋Ｔ細胞によって引き起こされる免疫病態から生じると考えられる。これは、感染した細胞を死滅させることができない結果として大量のＩＦＮ−γを産生している活性化Ｔ細胞の蓄積に依存していることが知られている、ＨＬＨの病態生理と一致している４１。逆に、ＣＤ２７−ＣＤ７０−ＩＴＫ−欠損症では、ＥＢＶ感染の経過中の活性化Ｔ細胞の蓄積は不十分であり、これはその増殖能が損なわれていることから生じる。これらの明確に異なる分子的欠陥は、ＥＢＶに対するＴ細胞応答の誘導における２つの重要な工程、すなわち、それらの実行のためにそれぞれ異なる分子／経路であるＣＤ７０／ＣＤ２７／ＩＴＫ及びＳＬＡＭ／ＳＡＰに依存している、細胞増殖及び細胞障害性エフェクター機能を指摘する。
【００６５】
まとめると、本発明者らの観察は、Ｂ細胞上のＣＤ７０が、Ｂ細胞増殖のトリガーとして、ＥＢＶの非存在下でさえも、Ｔ細胞に対して異常なＢ細胞増殖のシグナルを伝達するためのセマフォとして作用することを示唆する。これは、大きな欠失をはじめとするＣＤ７０における体細胞突然変異が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫などのＢ細胞リンパ腫において同定されているという観察とよく適合する４２、４３、４４。特に、近年の報告は、一連のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において最も頻繁に突然変異した遺伝子の１つとしてＣＤ７０を同定した４５。ＣＤ７０における突然変異の蓄積は、Ｔ細胞による免疫監視を回避する悪性Ｂ細胞の機序を示し得る。本発明者らのデータ及び以前のマウスにおける研究は、非リンパ球系腫瘍細胞上のＣＤ７０の異所的発現又はＢ細胞におけるＣＤ７０の発現（本発明者らの報告）が、それらによるＣＤ７０の発現に関係なく、腫瘍細胞に対するＴ細胞により媒介される免疫を惹起し得ることを示す４６、４７、４８。したがって、ＣＤ７０−ＣＤ２７は、抗腫瘍ワクチン接種を誘導するための重要な標的を示し得る。ＣＤ７０を欠失しているいくつかのリンパ腫細胞におけるＣＤ７０の発現の回復又は誘導は、全体的かつ強力な抗腫瘍免疫を誘発するための治療アプローチを示し得る。
【００６６】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書中に組み入れられる。
【００６７】
【表１】
2019514870.tif 000003
2019514870.tif 000004
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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