(57)【要約】本発明は、例えば哺乳動物上皮幹細胞などの前駆細胞の分化方法、前記方法で使用するための分化培地、前記方法によって得ることのできるオルガノイドおよび細胞、ならびに治療的使用を含むそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
1つまたは複数のWnt阻害剤が、（1）Wnt分泌の阻害剤、（2）WntもしくはRスポンジンとWnt受容体複合体との間の相互作用の競合的もしくは非競合的阻害剤、（3）Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する阻害剤、（4）Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、（5）分解複合体活性を促進する活性化剤、（6）分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、および/または（7）β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
1つまたは複数のWnt阻害剤が、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP 2、LGK974およびIWP 1から選択されるPorc阻害剤を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
分化培地がGSK-3阻害剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
1つまたは複数のWnt阻害剤が、β-カテニン分解複合体の下流で作用する阻害剤、例えばβ-カテニン標的遺伝子発現を阻害するWnt阻害剤を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびGSK-3阻害剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項７】
GSK-3阻害剤が、CHIR99201、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択される、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
分化培地が、β-カテニン分解複合体の下流で作用する少なくとも1つのWnt阻害剤、例えばβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤をさらに含む、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項９】
β-カテニン標的遺伝子発現のWnt阻害剤が、iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115 584、ZTM000990、PNU 74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、請求項5または請求項8記載の方法。
【請求項１０】
分化培地がAP-1刺激剤をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびAP-1刺激剤をさらに含む分化培地中で、前記細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
AP-1刺激剤がムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、例えばアセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピンから選択されるムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである、請求項10または請求項11記載の方法。
【請求項１３】
1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、RTKクラスI（EGF受容体ファミリー）（ErbBファミリー）のリガンド、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）のリガンド、およびRTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）のリガンドの1つまたは複数、または全部を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドが、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意でDAPTまたはジベンザゼピン（DBZ）またはベンゾジアゼピン（BZ）またはLY-411575である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
糖質コルチコイドが、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾンから選択される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
TGF-β阻害剤が、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511からなる群より任意で選択されるALK4、ALK5またはALK7の阻害剤である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
分化培地が、BMP7、BMP4およびBMP2の1つまたは複数から任意で選択されるBMP経路活性化剤をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
分化培地がガストリンをさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
分化培地が、
受容体チロシンキナーゼリガンドとしてのEGF、FGF19およびHGF、
notch阻害剤としてのDAPT、
Wnt阻害剤としてのIWP2およびiCRT3、
糖質コルチコイドとしてのデキサメタゾン、
GSK-3阻害剤としてのCHIR99021、ならびに
AP-1阻害剤としてのカルバコール
を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
分化培地が、B27、レチノイン酸を含まないB27、およびN2からなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
請求項1〜21のいずれか一項に記載される分化培地。
【請求項２３】
上皮幹細胞を培養するための方法であって、
増殖した上皮幹細胞を得るために、上皮幹細胞用の増殖培地の存在下で上皮幹細胞を培養する工程;およびその後、
請求項21記載の分化培地中で1つまたは複数の前記増殖した細胞を培養する工程
を含む、方法。
【請求項２４】
細胞を細胞外マトリックスと接触させて培養する、請求項1〜21および23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
分化した細胞集団または分化したオルガノイドを取得および/または単離する工程をさらに含む、請求項1〜21および23〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前駆細胞が上皮細胞、例えば肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する上皮細胞である、請求項1〜21および23〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前駆細胞が肝臓または膵臓に由来する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前駆細胞が哺乳動物前駆細胞、例えばヒト前駆細胞である、請求項1〜21および23〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
分化した肝臓オルガノイドを好ましくは得るために、肝上皮幹細胞を培養するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
増殖培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の肝上皮幹細胞を培養する工程であって、好ましくは前記増殖培地が、基礎培地を含み、かつEGF、FGF10、HGF、Wntアゴニスト（例えばRスポンジン）、ニコチンアミド、TGF-β阻害剤、フォルスコリンおよびガストリンをさらに含む、工程;ならびにその後、
請求項21記載の分化培地、好ましくは請求項20記載のような分化培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の前記増殖した肝上皮幹細胞を培養する工程。
【請求項３０】
増殖培地中で少なくとも3日間培養した後、培養物を破砕し、分割して、次いで分化培地中で培養する、請求項22〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
請求項1〜21および23〜29のいずれか一項記載の方法によって得ることのできるまたは得られるオルガノイド。
【請求項３２】
肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、膀胱、耳または甲状腺に由来する、請求項31記載のオルガノイド。
【請求項３３】
ヒト由来であり、かつ少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が肝細胞マーカーを発現する、請求項31または32記載の肝臓オルガノイド。
【請求項３４】
マウスに由来し、かつ少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が肝細胞マーカーを発現する、請求項31〜33のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド。
【請求項３５】
オルガノイド、例えば請求項31〜34のいずれか一項記載のオルガノイドと、請求項21記載の分化培地とを含む、組成物。
【請求項３６】
創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断;組織発生学、細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;組織損傷および修復に関与する機構の研究;炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または細胞形質転換およびがんの病因の機構の検討における、請求項31〜35のいずれか一項に定義されたオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の使用。
【請求項３７】
医療における使用、例えば障害、状態または疾患の治療における使用のための、請求項31〜34のいずれか一項記載のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞。
【請求項３８】
医療が再生医療である、例えば使用がオルガノイドまたは細胞の患者への移植を含む、請求項37記載の使用のためのオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞。
【請求項３９】
1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、デキサメタゾン、TGF-β阻害剤、1つまたは複数のWnt阻害剤、GSK-3阻害剤およびAP-1刺激剤を含む、医薬製剤。
【請求項４０】
治療用または予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法であって、
請求項31〜34のいずれか一項記載の分化したオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性）について前記オルガノイドを評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を、潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において引用されるすべての資料は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞培養培地および方法、特に、例えばヒト上皮幹細胞などの前駆細胞を分化させるための培養培地および方法の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
背景
前駆細胞を分化させるための培地および方法には大きな関心が寄せられている。前駆細胞およびそれらの分化した子孫は、細胞アッセイ、薬物スクリーニングおよび毒性アッセイにおいて使用することができる。前駆細胞およびその分化した子孫はまた、損傷した組織の治療のための再生医療などの、細胞に基づく治療法にも有望である。さらに、効率的な細胞培養培地は、研究目的のための細胞の集団を提供し、維持するために重要である。
【０００４】
いくつかの組織（例えば膵臓、結腸、腸陰窩、胃、肝臓および前立腺）に由来する前駆細胞または組織断片の長期培養のための方法が記載されている（国際公開公報第2010/090513号（特許文献1）、国際公開公報第2012/014076号（特許文献2）、国際公開公報第2012/168930号（特許文献3）および国際公開公報第2015/173425号（特許文献4）参照）。前駆細胞の分化のより高い効率をもたらす、およびインビボでの対応する細胞型をより厳密に反映する分化細胞の生成をもたらす、改善された培養培地および方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報第2010/090513号
【特許文献２】国際公開公報第2012/014076号
【特許文献３】国際公開公報第2012/168930号
【特許文献４】国際公開公報第2015/173425号
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地と、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤および1つまたは複数のWnt阻害剤とを含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地と、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびGSK-3阻害剤とを含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、前駆細胞を分化させるための方法であって、
基礎培地と、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤およびAP-1刺激剤とを含む分化培地中で、細胞を培養する工程
を含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、オルガノイドを好ましくは得るために、上皮幹細胞を培養するための方法であって、
増殖培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の上皮幹細胞を培養する工程であって、好ましくは、増殖培地が、基礎培地を含み、かつ1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、1つまたは複数のWntアゴニスト、TGF-β阻害剤およびcAMP経路活性化剤を含む、工程;ならびに
1つまたは複数の増殖した上皮幹細胞を本発明の分化培地中で培養する工程
を含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、分化した肝臓オルガノイドを好ましくは得るために、肝上皮幹細胞を培養する方法であって、
増殖培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の肝上皮幹細胞を培養する工程であって、好ましくは、増殖培地が、基礎培地を含み、さらに、EGF、FGF10、HGF、Wntアゴニスト（例えばRスポンジン）、ニコチンアミド、TGF-β阻害剤、フォルスコリンおよびガストリンを含む、工程;ならびにその後、
本発明の分化培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の増殖した肝上皮幹細胞培養する工程
を含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の方法によって得ることのできるまたは得られるオルガノイドを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、細胞の少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％が肝細胞マーカーを発現するオルガノイドを提供する。
【００１３】
本発明はさらに、医療において使用するための、本発明のオルガノイドまたは当該オルガノイドに由来する細胞を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;診断;組織発生学、細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現の試験;組織損傷および修復に関与する機構の検討;炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または細胞形質転換およびがんの病因の機構の検討における、本発明のオルガノイドまたは当該オルガノイドに由来する細胞の使用を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、Notch阻害剤、糖質コルチコイド、TGF-β阻害剤、Wnt経路阻害剤、GSK3β阻害剤およびAP-1刺激剤を含む医薬製剤を提供する。
【００１６】
治療用または予防用の医薬薬物または化粧品をスクリーニングする方法であって、
本発明の分化したオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
任意の作用（例えば増殖の減少もしくは喪失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性）に関して前記オルガノイドを評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む、方法。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
様々な組織から前駆細胞を分化させる方法は、これまでに国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号および国際公開公報第2015/173425号に記載されている。本発明者らは、驚くべきことに、Wnt阻害剤を培養培地に添加すると、例えば肝細胞を用いて例示されるように、前駆細胞の分化が改善されることを見出した（実施例1参照）。例えば、培養培地へのWnt阻害剤の添加は、オルガノイド中の細胞集団のより高い割合の分化をもたらすことができる。さらに、Wnt阻害剤の添加は、インビボでの分化した細胞（例えば肝細胞）により密接に類似した分化オルガノイド中の細胞をもたらすことができる。例えば、肝細胞に関連したより高いレベルのCyp3A4発現。パネート細胞の分化はWntを必要とし、成熟肝細胞は活性Wntシグナル伝達を有するので、これは驚くべきことである（例えばFarin et al.（2012）Gastroenterology 143:1518-1529;Yang et al.（2014）Hepatology 60（3）:964-976およびGerbal-Chaloin et al.（2014）Molecular Pharmacology 86:624-634参照）。したがって、この経路をブロックすることによって分化を改善することが可能であるというのは驚くべきことである。本発明者らは、Wnt分泌をブロックすることまたはβ-カテニン標的遺伝子発現を阻害することのような、この経路を任意のレベルでブロックすることが有用であることを示した（「Wnt阻害剤」の項におけるさらなる解説参照）。したがって、本発明は、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのWnt阻害剤の使用を提供する。
【００１８】
本発明者らはまた、意外にも、分化培地へのGSK-3阻害剤の添加が有利な作用を及ぼすことを見出した。例えば、これは前駆細胞の分化を促進する。例えば、培養培地へのGSK-3阻害剤の添加は、オルガノイド中の細胞集団のより高い割合の分化をもたらすことができる。さらに、GSK-3阻害剤の添加は、インビボでの分化した細胞（例えば肝細胞）により密接に類似した分化オルガノイド中の細胞をもたらすことができる。したがって、本発明は、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのGSK-3阻害剤の使用を提供する。分化培地へのGSK-3阻害剤の添加に関連する有利な作用は、β-カテニン分解複合体の下流で働くWnt阻害剤を含めることによって増強される。GSK-3阻害剤はWntアゴニストであることが公知であり、これまで前駆細胞を分化させるのではなく増殖させるために培地中で使用されてきたので（例えば国際公開公報第2010/090513号参照）、これは驚くべきことである。さらに、Wnt阻害剤とWntアゴニストとを組み合わせた使用は明らかではなかった。したがって、本発明は、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるための、β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤と組み合わせたGSK-3阻害剤の使用を提供する。
【００１９】
AP-1は、JunおよびFosファミリーの遺伝子の産物からなる二量体転写因子である。本発明者らは、驚くべきことに、分化培地へのAP-1刺激剤（ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなど）の添加が有利な作用を及ぼすことを見出した。例えば、これは前駆細胞の分化を促進する。例えば、培養培地へのAP-1刺激剤（ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなど）の添加は、オルガノイド中の細胞集団のより高い割合の分化をもたらすことができる。さらに、AP-1刺激剤の添加は、インビボでの分化した細胞（例えば肝細胞）により密接に類似した分化オルガノイド中の細胞をもたらすことができる。AP-1は、これまで、肝再生中の肝細胞増殖などの増殖と関連すると考えられていたので（例えばStepniak et al.2006参照）、これは驚くべきことである。実際に、AP-1は、肝発がんの間、がん遺伝子として働くことが以前に報告されている（例えばTrierweiler et al.（2015）Cell Death and Differentiation 1-7参照）。したがって、AP-1刺激剤が分化を促進できるという本発明者らの観察は極めて予想外であった。したがって、本発明は、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのAP-1刺激剤の使用を提供する。本発明はまた、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストの使用を提供する。
【００２０】
本発明者らはまた、意外にも、分化培地で前駆細胞を培養する前に前駆細胞の培養物を分割することが有利な作用を及ぼすことを見出した。例えば、これは前駆細胞の分化を促進する。例えば、分化培地で前駆細胞を培養する前に前駆細胞を分割することは、オルガノイド中の細胞集団のより高い割合の分化をもたらすことができる。さらに、分化培地で前駆細胞を培養する前に前駆細胞の培養物を分割すると、インビボで分化した細胞（例えば肝細胞）により密接に類似した分化オルガノイド中の細胞をもたらすことができる。
【００２１】
本発明者らは、分化方法に対するこれらの改善が相加的であり、したがって、培地がWnt阻害剤、GSK-3阻害剤およびAP-1刺激剤の2つまたはそれ以上の組み合わせを含む場合、ならびに/または分化前に前駆細胞の培養物を分割した場合に、分化方法が最も改善されることを示した。
【００２２】
したがって、前駆細胞を分化させるための方法が提供され、前記方法は、1つまたは複数の前駆細胞を分化培地中で培養する工程を含み、分化培地は、基礎培地を含み、さらに、（a）1つもしくは複数のWnt阻害剤、（b）1つもしくは複数のGSK-3阻害剤（および好ましくはβ-カテニン分解複合体の下流で作用する1つもしくは複数のWnt阻害剤）ならびに/または（c）1つもしくは複数のAP-1刺激剤（例えば1つもしくは複数のムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）を含む。前記分化培地は、本発明の分化培地である。例えば、一態様では、分化培地は基礎培地を含み、さらに、1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2などのWnt分泌阻害剤および/またはiCRT3などのTCF/LEFの阻害剤）を含む。別の態様では、分化培地は基礎培地を含み、さらに、1つまたは複数のGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）および好ましくはβ-カテニン分解複合体の下流で作用する1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばiCRT3）を含む。別の態様では、分化培地は基礎培地を含み、さらに、1つまたは複数のAP-1刺激剤（例えばカルバコール）を含む。これらの態様は、技術的に両立可能であり、任意の方法で組み合わせることができる。
【００２３】
好ましい態様では、本発明の分化培地は、上記の1つまたは複数の成分に加えて、以下のリストの成分の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む:1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、Notch阻害剤（例えばDAPT）、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）ならびにTGF-β阻害剤（例えばA83-01などのALK5、ALK4またはALK7阻害剤）。分化培地は、任意で、BMP経路活性化剤（例えばBMP7）および/またはガストリンをさらに含む。分化培地には、任意で、N-アセチルシステイン、B27および/またはN2が添加される。いくつかの態様では、本発明の分化培地は緩衝液（例えばHEPES）を含む。好ましい態様では、基礎培地はAdvanced DMEM/F12（Gibco）である。
【００２４】
本発明の分化培地は、例えば実施例1に示すように、肝前駆細胞（例えば肝上皮幹細胞）の分化のために特に有利である。この分化培地はまた、膵臓などの肝臓に密接に関連する組織、および他の上皮組織にも有利であると予想される。分化培地の成分の各々を以下で詳細に説明する。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明の方法は、前駆細胞（例えば上皮幹細胞）を最初に増殖培地で培養し、その後本発明の分化培地で培養する増殖工程をさらに含む。したがって、前駆細胞を培養するための方法であって、（a）1つまたは複数の前駆細胞を増殖培地中で培養して、前駆細胞の増殖した集団（好ましくは増殖オルガノイド）を得る工程、および（b）前駆細胞の増殖した集団または増殖オルガノイドを本発明の分化培地で培養して、前駆細胞の分化した集団（好ましくは分化オルガノイド）を得る工程、を含む、方法が提供される。
【００２６】
また、前駆細胞（例えば上皮幹細胞）を培養するための方法であって、分化培地の存在下で培養する前に前駆細胞の培養物を分割する工程を含む、方法も提供される。いくつかの態様では、この方法は、細胞を分割する前に増殖培地中で前駆細胞を培養し、次いで本発明の分化培地で培養する増殖工程をさらに含む。例えば、前駆細胞を培養するための方法であって、（a）1つまたは複数の前駆細胞を増殖培地中で培養して、前駆細胞の増殖した集団（好ましくは増殖オルガノイド）を得る工程、（b）前駆細胞の増殖した集団または増殖オルガノイドを分割して、分割された前駆細胞を得る工程、および（c）分割された前駆細胞の1つまたは複数を分化培地で培養して、前駆細胞の分化した集団（好ましくは分化オルガノイド）を得る工程、を含む、方法が提供される。使用される分化培地は、好ましくは本明細書に記載の本発明の分化培地である。分化の前に培養物を分割することの有利な作用は、任意の事前の培養培地、例えば増殖培地のより完全な除去をもたらす;および/または上皮オルガノイドを培養する場合、分割は、分化の前にオルガノイドの大きさを縮小させ、分化培地中の分化因子への細胞のより良好なアクセスをもたらし得る、という事実に関連すると考えられる。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化方法は、任意の事前の培養培地の除去、例えば分化前の増殖培地の除去の工程をさらに含む。これは、培養物を分割することによって、および/または当技術分野において公知の任意の他の方法によって達成され得る。いくつかの態様では、前駆細胞を培養するための方法であって、（a）1つまたは複数の前駆細胞を第一の培養培地、例えば増殖培地中で培養する工程、（b）例えば細胞を分割することによって、第一の培養培地を除去する工程、および（c）1つまたは複数の前駆細胞を分化培地で培養して、前駆細胞の分化した集団（好ましくは分化オルガノイド）を得る工程、を含む、方法が提供される。
【００２７】
分化の前に、上皮細胞に適した任意の増殖培地を使用することができる。好ましい態様では、使用される増殖培地は、国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号または国際公開公報第2015/173425号に記載されている任意の増殖培地である。
【００２８】
したがって、1つまたは複数のWnt阻害剤（例えば1、2、3、4または4より多く）、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えば1、2、3、4または4より多く）、Notch阻害剤、糖質コルチコイドおよびTGF-β阻害剤を含む分化培地も提供される。
【００２９】
したがって、1つまたは複数のGSK-3阻害剤（例えば1、2、3、4または4より多く）、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えば1、2、3、4または4より多く）、Notch阻害剤、糖質コルチコイドおよびTGF-β阻害剤を含む分化培地も提供される。いくつかの態様では、培養培地は、β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤をさらに含む。
【００３０】
したがって、1つまたは複数のAP-1刺激剤（例えば1、2、3、4または4より多く）、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えば1、2、3、4または4より多く）、Notch阻害剤、糖質コルチコイドおよびTGF-β阻害剤を含む分化培地も提供される。いくつかの態様では、1つまたは複数のAP-1刺激剤は、1つまたは複数のムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを含む。
【００３１】
いくつかの態様では、分化培地は、1つまたは複数のGSK-3阻害剤（例えば1、2、3、4または4より多く）、β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤を含む1つまたは複数のWnt阻害剤（例えば1、2、3、4または4より多く）、1つまたは複数のAP-1刺激剤（例えば1、2、3、4または4より多く）、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えば1、2、3、4または4より多く）、Notch阻害剤、糖質コルチコイドおよびTGF-β阻害剤を含む。
【００３２】
いくつかの態様では、1つまたは複数のGSK-3阻害剤はCHIR99021を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のWnt阻害剤は、Wnt分泌の阻害剤（例えばIWP-2）およびβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤（例えばiCRT3などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤）を含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のAP-1刺激剤は、カルバコールなどの1つまたは複数のムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、EGF、HGFおよび/またはFGF（例えばFGF19）を含む。いくつかの態様では、Notch阻害剤はDAPTである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドはデキサメタゾンである。いくつかの態様では、TGF-β阻害剤はA83-01である。
【００３３】
いくつかの態様では、分化培地は、BMP7などのBMP経路活性化剤をさらに含む。
【００３４】
いくつかの態様では、分化培地はガストリンをさらに含む。
【００３５】
いくつかの態様では、分化培地はN-アセチルシステインをさらに含む。いくつかの態様では、分化培地は、B27、好ましくはビタミンAを含まないB27をさらに含む。いくつかの態様では、分化培地はN2をさらに含む。いくつかの態様では、分化培地は、Advanced DMEM/F12（Gibco）である、動物細胞またはヒト細胞用の基礎培地をさらに含む。
【００３６】
本発明は、したがって、前駆細胞を分化させるための、Wnt阻害剤、GSK-3阻害剤および/またはAP-1刺激剤の使用を提供する。いくつかの態様では、前駆細胞（例えば上皮幹細胞）は、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺に由来する。いくつかの態様では、前駆細胞は、肝臓または膵臓由来である。いくつかの態様では、上皮細胞は肝臓由来である。
【００３７】
本発明はまた、少なくとも1つ（例えば1、2、3、4または4より多く）のWnt阻害剤、少なくとも1つ（例えば1、2、3、4または4より多く）のGSK-3阻害剤、および/または少なくとも1つ（例えば1、2、3、4または4より多く）のAP-1刺激剤が添加された、国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号または国際公開公報第2015/173425号に記載されている分化培地を使用する、上皮幹細胞を分化させるための方法も提供する。
【００３８】
本発明の様々な態様およびそれらの構成要素を以下で詳細に論じる。当業者が理解するように、これらの態様のいずれもが技術的に両立可能であり、それらの構成要素を組み合わせることが可能である。
【００３９】
Wnt阻害剤
Wntシグナル伝達経路は、活性化された場合、典型的にはβ-カテニン分解を防止し、β-カテニン媒介性シグナル伝達を増強する。この経路は、Frizzled受容体およびLRP5/6を含む細胞表面Wnt受容体複合体が、通常、Wntファミリーのメンバーなどの細胞外シグナル伝達分子によって活性化された場合に生じる一連の事象によって定義される。これは、細胞内β-カテニンを分解するタンパク質の分解複合体を阻害するDishevelledファミリータンパク質の活性化をもたらす。分解複合体は、カゼインキナーゼCK1α、δおよびεならびにGSK-3が動員される、APCおよびアキシンを含む構造成分から形成される。分解複合体は、β-カテニンをリン酸化し、それをユビキチンリガーゼ、β-TrCPに曝露すると考えられる。次いで、β-カテニンのユビキチン化は、プロテアソームにおけるその分解をもたらす。
【００４０】
β-カテニンの主なエフェクター機能は核内にあり、そこで、TCF/LEFファミリーの転写因子（例えばTcf-1、Tcf-3、Tcf-4およびLef1）を含む様々な転写因子との相互作用を介して転写を調節する。
【００４１】
Wnt経路は高度に調節されている。例えば、Rスポンジンがその受容体（Lgr4、Lgr5および/またはLgr6）に結合すると、Wntシグナル伝達が増強される。しかしながら、2つの膜貫通E3ユビキチンリガーゼ、Rnf43およびZnrf3は、細胞表面からRスポンジン受容体（例えばLgr4、Lgr5および/またはLgr6）を除去することが示されている（例えばde Lau et al.2016参照）。Rスポンジンは、脊椎動物特異的Wnt増強剤である。さらに、Dishevelledファミリータンパク質のFrizzled受容体への結合は、Dapperファミリータンパク質（例えばDapper1およびDapper3）によって阻害され得る。さらに、分解複合体の活性は、APC、アキシンおよびGSK-3のリン酸化状態によって部分的に調節されると考えられる。例えば、ホスファターゼ（例えばPP1、PP2CまたはPP2Aなどのセリン/トレオニンホスファターゼ）によるAPCまたはアキシンの脱リン酸化は、β-カテニン分解を阻害し得る。加えて、キナーゼ（例えばp38 MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSKまたはp70S6K）によるGSK-3のリン酸化は、GSK-3活性を阻害し、したがってβ-カテニン分解を阻害し得る。
【００４２】
分解複合体の安定性は、2つのPARP、タンキラーゼ1および2によって部分的に調節されると考えられる。これらのタンキラーゼによるアキシンのポリ（ADP-リボシル）化および自己ポリ（ADP-リボシル）化は、分解複合体の脱オリゴマー化を促進し得る。
【００４３】
核内で、Dishevelledファミリータンパク質は、Wnt標的遺伝子の転写を支援するヒストン脱アセチル化酵素SIRT1と複合体を形成することができる。
【００４４】
Wntの分泌の鍵であると考えられるタンパク質は、マルチパス膜タンパク質、ポーキュパイン（Porc）であり、その喪失は小胞体におけるWntの蓄積をもたらす。
【００４５】
Wntシグナル伝達経路は多くのレベルで阻害することができ、Wnt阻害剤は、Voronkov and Krauss（2013）Current Pharmaceutical Design 19:634-664において詳細に総説されている。
【００４６】
Wnt阻害剤は、細胞または細胞集団におけるTCF/LEF媒介転写を阻害する作用物質と定義される。したがって、本発明における使用に適したWnt阻害剤には以下のものが含まれる:
（1）Wnt分泌の阻害剤（例えばLGK974、IWP-1またはIWP-2などのPorcの阻害剤）、
（2）WntまたはRスポンジンとそれらのそれぞれの受容体との間の相互作用の競合的および非競合的阻害剤（例えばOMP-18R5、OMP54F28）、
（3）LRP（例えばニクロサミド）ならびにZnrf3および/もしくはRnf43などのRスポンジン受容体の分解を促進する因子またはZnrf3および/もしくはRnf43を活性化する因子などの、Wnt受容体複合体の成分の分解を促進する因子、
（4）Frizzled受容体および/もしくは分解複合体の成分へのDishevelledファミリータンパク質の結合を減少させる阻害剤（例えばDapperファミリータンパク質、FJ9、スリンダク、3289-8625、J01-017a、NSC668036）またはDishevelledファミリータンパク質の発現を下方調節する阻害剤（例えばニクロサミド）などの、Dishevelledファミリータンパク質の阻害剤、
（5）（a）アキシンおよび/またはAPCなどの分解複合体の成分を脱リン酸化するホスファターゼ（例えばPP1、PP2Aおよび/またはPP2C）の阻害剤（例えばオカダ酸またはトートマイシン）ならびに（b）GSK-3をリン酸化するキナーゼ（例えばp38 MAPK、PKA、PKB、PKC、p90RSKまたはp70S6K）の阻害剤（例えばSB239063、SB203580またはRp-8-Br-cAMP）を含む、分解複合体活性を促進する因子、
（6）タンキラーゼ1および/または2の阻害剤（例えばXAV939、IWR1、JW74、JW55、2-[4-(4-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オンまたはPJ34）などの、分解複合体の脱オリゴマー化の阻害剤、ならびに
（7）β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤（例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14またはFH535）などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）を含む、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤。
【００４７】
本発明者らは、驚くべきことに、分化培地中にWnt阻害剤を含めることにより、上皮幹細胞の分化を増強し得ることを見出した。例えば、本発明者らは、分化培地中にWnt分泌の阻害剤（IWP-2）を含めると、肝臓オルガノイドにおける肝細胞マーカー（例えばアルブミンおよびcyp3A4）の発現が上昇することを見出した（図2D参照）。対照的に、分化培地にWntを添加すると、アルブミン発現の低下を生じさせることが認められた（図2C参照）。本発明者らは、Wntアゴニストが存在しないことはこれらの有利な作用を達成するのに十分ではなく、Wnt経路の活性阻害が必要であることを認めたので、この所見は特に驚くべきものであった。いくつかの細胞型（例えばパネート細胞）は、生存のためにインビボで自己分泌Wnt経路シグナル伝達を必要とするので、これは極めて予想外であった。
【００４８】
したがって、本発明の分化培地は、好ましくはWnt阻害剤を含む。上記の（1）〜（7）に記載されているような、任意の適切なWnt阻害剤を使用し得る。例えば、1つの好ましい態様では、Wnt阻害剤は、例えばIWP-2、IWP-1およびLGK974から選択されるPorc阻害剤などの、Wnt分泌の阻害剤である。別の好ましい態様では、Wnt阻害剤は、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、例えばβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤またはヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）である。いくつかの態様では、β-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤は、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される阻害剤である。
【００４９】
いくつかの態様では、Wnt阻害剤は、IWP-2、OMP-18R5、OMP54F28、LGK974、3289-8625、FJ9、NSC 668036、IWR1およびXAV939から選択される。
【００５０】
いくつかの態様では、Wnt阻害剤は、iCRT3、PFK115-584、CGP049090、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される。
【００５１】
いくつかの態様では、Wnt阻害剤は、以下の表1に列挙される化合物の1つである。
【００５２】
（表１）Wnt阻害剤
2019514345.tif 000002
2019514345.tif 000003
2019514345.tif 000004
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【００５３】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、表1に列挙されるWnt阻害剤の任意の1つまたは複数を含む。
【００５４】
Wnt阻害剤は、好ましくは、細胞中のWnt活性を、同じ細胞型で評価した場合、当該分子の不在下での前記Wnt活性のレベルと比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するのに有効な量で培地に添加される。当業者に公知のように、Wntの活性は、例えばpTOPFLASHおよびpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーター構築物（Korinek et al.,1997.Science 275:1784-1787）により、Wntの転写活性を測定することによって決定できる。したがって、新規Wnt阻害剤は、当技術分野で公知のアッセイを用いて当業者によって容易に同定され得る。
【００５５】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01〜150μM、0.1〜150μM、0.5〜100μM、0.1〜100μM、0.5〜50μM、1〜100μMまたは10〜80μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度でWnt阻害剤を含む。
【００５６】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01〜150μM、0.1〜100μM、0.5〜50μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度のIWP-2を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約3μMの濃度のIWP-2を含む。
【００５７】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.05〜150μM、0.1〜150μM、0.5〜100μM、1〜100μMまたは10〜80μMの濃度のiCRT3を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約50μMの濃度のiCRT3を含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01〜150μM、0.1〜100μM、0.5〜50μM、1〜20μM、1〜5μMまたは約3μMの濃度のIWP-2をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約50μMの濃度のiCRT3および約3μMの濃度のIWP-2を含む。
【００５８】
いくつかの態様では、分化培地は、ありとあらゆるWntファミリータンパク質およびRスポンジンを含むWnt受容体複合体に結合してこれを活性化するWntアゴニストを含まない。
【００５９】
GSK-3阻害剤
上記で論じたように、本発明者らは、驚くべきことに、分化培地中にWnt阻害剤を含めることにより、上皮幹細胞の分化を増強し得ることを見出した。予想外に、本発明者らはまた、GSK-3阻害剤（実施例1のCHIR99021）を含めることも上皮幹細胞の分化を改善することを見出した。上記で説明したように、GSK-3はβ-カテニン分解複合体の成分である。GSK-3活性を阻害するとβ-カテニンの分解の減少をもたらすので、GSK-3阻害剤はWntアゴニストである。GSK-3阻害剤を分化培地に含めることによって誘発される増強された分化は、分解複合体の下流でTCF/LEF媒介転写を阻害するWnt阻害剤（iCRT3）の添加によって大きく増加した（図2E参照）。したがって、本発明者らは、Wntアゴニスト（CHIR99021）およびWnt阻害剤（iCRT3）の両方が分化培地中に含まれる場合、肝細胞マーカー（アルブミンおよびCyp3A4）の発現に顕著な改善が生じることを見出した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではいが、本発明者らは、GSK-3阻害剤が上皮幹細胞における分化の刺激と阻害の両方を行う（刺激が阻害よりも強い）と考える。GSK-3阻害剤による分化の阻害は、β-カテニン分解の促進によって起こると考えられる。対照的に、GSK-3阻害剤による分化の促進は、別個のエフェクター機構によって起こると考えられる。したがって、本発明者らは、GSK-3阻害剤を含有する分化培地中に、分解複合体の下流でTCF/LEF媒介転写を阻害するWnt阻害剤を含めることが、GSK-3阻害剤の分化阻害作用に対抗すると考える。分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤には、上記のクラス（7）のWnt阻害剤、すなわち、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤（例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14またはFH535）およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）を含む、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤が含まれる。
【００６０】
したがって、GSK-3阻害剤の分化促進作用は影響を受けないままであり、Wnt阻害剤の分化促進作用によって増強される。
【００６１】
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地はGSK-3阻害剤を含む。任意の適切なGSK-3阻害剤を使用し得る。GSK-3阻害剤は、GSK-3キナーゼ活性を低下させる作用物質であると定義される。
【００６２】
GSK-3の2つの異なるアイソフォームがヒトにおいて認められる（GSK-3αおよびGSK-3β）。これらのアイソフォームの一方または両方を阻害する阻害剤が公知である。したがって、いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、GSK-3αおよびGSK-3βを阻害する。いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、GSK-3αを阻害するが、GSK-3βは阻害しない。いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、GSK-3βを阻害するが、GSK-3αは阻害しない。
【００６３】
いくつかの態様では、分化培地は、複数のGSK-3阻害剤（例えば2、3、4、5またはそれより多くのGSK-3阻害剤）を含む。
【００６４】
いくつかの態様では、GSK-3阻害剤はCHIR99021である。
【００６５】
GSK-3阻害剤は、好ましくは、細胞中のGSK-3活性を、同じ細胞型で評価した場合、当該分子の不在下での前記GSK-3活性のレベルと比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは100％阻害するのに有効な量で培地に添加される。当業者に公知のように、GSK-3活性は、特定のGSK-3基質、例えばβ-カテニンのリン酸化をモニタすることによって測定できる（例えばCole et al.（2008）Methods Mol Biol.468:45-65参照）。したがって、新規GSK-3阻害剤は、当技術分野で公知のアッセイを用いて当業者によって容易に同定され得る。
【００６６】
いくつかの態様では、GSK-3阻害剤は、CHIR99201、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsの1つまたは複数から選択される。
【００６７】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.001〜500μM、0.01〜150μM、0.1〜100μM、1〜100μM、0.5〜50μM、1〜50μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度のGSK-3阻害剤を含む。
【００６８】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01〜150μM、0.1〜100μM、1〜100μM、0.5〜50μM、1〜50μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度のCHIR99021を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約3μMの濃度のCHIR99021を含む。
【００６９】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、GSK-3阻害剤と、先に記載したβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤などの分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤とを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、GSK-3阻害剤およびβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤を含む。β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤には、β-カテニン:TCF-4複合体を分解する阻害剤などのβ-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤（例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654またはBC21）およびヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の阻害剤（例えばカンビノール）が含まれる。
【００７０】
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、GSK-3阻害剤（例えば0.001〜500μM、0.01〜150μM、0.1〜100μM、0.5〜50μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度）およびβ-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤（例えば0.001〜500μM、0.01〜150μM、0.1〜100μM、0.5〜50μM、1〜500μM、1〜150μM、1〜100μM、1〜50μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度）を含む。いくつかの態様では、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤は、β-カテニン:TCF/Lef転写複合体の阻害剤である。
【００７１】
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、CHIR99021（例えば0.01〜150μM、0.1〜100μM、0.5〜50μM、1〜20μMまたは1〜5μMの濃度）およびiCRT3（例えば0.05〜150μM、0.1〜150μM、1〜150μM、0.5〜100μM、1〜100μMまたは10〜80μMの濃度）を含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約3μMの濃度のCHIR99021および約50μMの濃度のiCRT3を含む。
【００７２】
CHIR99021アゴニスト
上記で説明したように、本発明者らは、意外にも、WntアゴニストCHIR99021を分化培地に含めると分化を促進することを見出した。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、CHIR99021またはCHIR99021アゴニストを含む。CHIR99021アゴニストは、本明細書では、CHIR99021と1つまたは複数の生物学的活性を共有する作用物質であると定義される。
【００７３】
したがって、前駆細胞を分化させるための方法が提供され、前記方法は、1つまたは複数の前駆細胞を分化培地中で培養する工程を含み、分化培地は、基礎培地を含み、さらに、CHIR99021またはCHIR99021アゴニストおよび好ましくはβ-カテニン分解複合体の下流で作用する1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばiCRT3）を含む。好ましい態様では、この分化培地は、以下のリストの構成要素:1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、Notch阻害剤（例えばDAPT）、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）、ならびにTGF-β阻害剤（例えばA83-01などのALK5、ALK4またはALK7阻害剤）、の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む。分化培地は、任意で、以下のリストの構成要素:BMP経路活性化剤（例えばBMP7）、ガストリン、N-アセチルシステイン、B27、の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む。いくつかの態様では、分化培地は緩衝液（例えばHEPES）を含む。好ましい態様では、ヒトまたは動物細胞用の基礎培地はAdvanced DMEM/F12（Gibco）である。
【００７４】
本発明はまた、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのCHIR99021またはCHIR99021アゴニストの使用も提供する。
【００７５】
AP-1刺激剤
活性化タンパク質1（AP-1）複合体は、Fosタンパク質ファミリー、Jun、ATFおよびJDPファミリーに属するタンパク質からなるヘテロ二量体である転写因子である。この転写因子は、サイトカイン、増殖因子、ストレス、細菌感染およびウイルス感染を含む様々な刺激に応答して遺伝子発現を調節する。
【００７６】
本発明者らは、予想外に、ヒト肝臓オルガノイドが、初代肝細胞と比較してAP-1複合体の成分の発現低下を有することを認めた。この所見に基づき、本発明者らは、AP-1複合体の形成を刺激することが、肝臓オルガノイド中の上皮幹細胞の肝細胞運命への分化を促進すると仮定した。本発明者らは、分化培地中にAP-1刺激剤、カルバコール（2-[(アミノカルボニル)オキシ]-N,N,N-トリメチルエタンアミニウムクロリド）を含めることが肝細胞マーカー（Cyp3A4およびアルブミンを含む）の発現を増加させることを見出した。
【００７７】
本発明者らが試験したAP-1刺激剤は、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである。ムスカリン性アセチルコリン受容体の5つのサブタイプが存在する（M1-M5）。これらは、様々な細胞型（例えばニューロン）の細胞膜に認められるG-タンパク質共役受容体である。
【００７８】
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地はAP-1刺激剤を含む。いくつかの態様では、AP-1刺激剤はムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストである。任意の適切なムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを使用し得る。いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、M3ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト（例えばアセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピン）である。
【００７９】
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンの1つまたは複数から選択される。
【００８０】
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストはカルバコールである。
【００８１】
いくつかの態様では、AP-1刺激剤（例えばムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）は、0.001〜500μM、0.01〜500μM、0.01〜250μM、0.01〜150μM、0.1〜500μM、0.1〜100μM、0.5〜500μM、0.5〜100μM、0.5〜50μM、1〜500μM、1〜300μM、1〜200μM、1〜20μM、1〜5μM、10〜300μM、50〜300μM、50〜200μMまたは50〜150μMの濃度で本発明の分化培地中に存在する。
【００８２】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.001〜500μM、0.001〜300μM、0.01〜500μM、0.01〜300μM、0.1〜500μM、0.1〜300μM、1〜500μM、10〜500μM、100〜500μM、1〜300μM、10〜300μM、50〜300μM、50〜200μMまたは50〜150μMの濃度のカルバコールを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は100μMの濃度のカルバコールを含む。
【００８３】
ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト
上記で説明したように、本発明者らは、予想外に、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、すなわちカルバコールを分化培地に含めると分化を促進することを見出した。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを含む。
【００８４】
したがって、前駆細胞を分化させるための方法が提供され、前記方法は、1つまたは複数の前駆細胞を分化培地中で培養する工程を含み、分化培地は、基礎培地を含み、さらに、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストおよび好ましくはβ-カテニン分解複合体の下流で作用する1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばiCRT3）を含む。好ましい態様では、この分化培地は、以下のリストの構成要素:1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、Notch阻害剤（例えばDAPT）、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）、ならびにTGF-β阻害剤（例えばA83-01などのALK5、ALK4またはALK7阻害剤）、の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む。分化培地は、任意で、以下のリストの構成要素:BMP経路活性化剤（例えばBMP7）、ガストリン、N-アセチルシステイン、B27、の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は緩衝液（例えばHEPES）を含む。好ましい態様では、基礎培地はAdvanced DMEM/F12（Gibco）である。
【００８５】
任意の適切なムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストを使用し得る。いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、M3ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト（例えばアセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリンまたはピロカルピン）である。
【００８６】
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストは、アセチルコリン、ベタネコール、カルバコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンの1つまたは複数から選択される。
【００８７】
いくつかの態様では、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストはカルバコールである。
【００８８】
いくつかの態様では、AP-1刺激剤（例えばムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）は、0.001〜500μM、0.01〜500μM、0.01〜250μM、0.01〜150μM、0.1〜500μM、0.1〜100μM、0.5〜500μM、0.5〜100μM、0.5〜50μM、1〜500μM、1〜300μM、1〜200μM、1〜20μM、1〜5μM、10〜300μM、50〜300μM、50〜200μMまたは50〜150μMの濃度で本発明の分化培地中に存在する。
【００８９】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.001〜500μM、0.001〜300μM、0.01〜500μM、0.01〜300μM、0.1〜500μM、0.1〜300μM、1〜500μM、10〜500μM、100〜500μM、1〜300μM、10〜300μM、50〜300μM、50〜200μMまたは50〜150μMの濃度のカルバコールを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は100μMの濃度のカルバコールを含む。
【００９０】
本発明はまた、上皮細胞、例えば肝前駆細胞または幹細胞を分化させるためのムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストの使用も提供する。
【００９１】
カルバコールアゴニスト
上記で説明したように、本発明者らは、予想外に、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、すなわちカルバコールを分化培地に含めると分化を促進することを見出した。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、カルバコールまたはカルバコールアゴニストを含む。カルバコールアゴニストは、本明細書では、カルバコールと1つまたは複数の生物学的活性を共有する作用物質であると定義される。
【００９２】
したがって、上皮細胞を分化させるための方法が提供され、前記方法は、分化培地の存在下で細胞外マトリックスと接触させて1つまたは複数の上皮細胞を培養する工程を含み、分化培地は、動物またはヒト細胞用の基礎培地を含み、さらに、カルバコールまたはカルバコールアゴニストおよび好ましくはβ-カテニン分解複合体の下流で作用する1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばiCRT3）を含む。好ましい態様では、この分化培地は、以下のリストの構成要素:1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、Notch阻害剤（例えばDAPT）、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）、ならびにTGF-β阻害剤（例えばA83-01などのALK5、ALK4またはALK7阻害剤）、の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む。分化培地は、任意で、以下のリストの構成要素:BMP経路活性化剤（例えばBMP7）、ガストリン、N-アセチルシステイン、B27、の1つまたは複数、好ましくは全部をさらに含む。いくつかの態様では、分化培地は緩衝液（例えばHEPES）を含む。好ましい態様では、基礎培地はAdvanced DMEM/F12（Gibco）である。
【００９３】
本発明はまた、前駆細胞、例えば肝上皮幹細胞を分化させるためのカルバコールまたはカルバコールアゴニストの使用も提供する。
【００９４】
受容体チロシンキナーゼリガンド
受容体チロシンキナーゼ（RTK）は、ポリペプチド成長因子、サイトカインおよびホルモンに対する高親和性細胞表面受容体である。RTKは、細胞の維持、成長および発達の鍵となる調節因子であり、また多くの種類のがんの発症および進行においても重要な役割を果たす。本発明の分化培地は、好ましくは1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドを含む。本発明に関連して、受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKを活性化する任意のリガンドである。多くの受容体チロシンキナーゼリガンドは分裂促進性成長因子である。したがって、いくつかの態様では、分化培地中の1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、1つまたは複数の分裂促進性成長因子を含む。
【００９５】
約20の異なる公知のクラスのRTKが存在し、これには、RTKクラスI（EGF受容体ファミリー）（ErbBファミリー）、RTKクラスII（インスリン受容体ファミリー）、RTKクラスIII（PDGF受容体ファミリー）、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）、RTKクラスV（VEGF受容体ファミリー）、RTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）、RTKクラスVII（Trk受容体ファミリー）、RTKクラスVIII（Eph受容体ファミリー）、RTKクラスIX（AXL受容体ファミリー）、RTKクラスX（LTK受容体ファミリー）、RTKクラスXI（TIE受容体ファミリー）、RTKクラスXII（ROR受容体ファミリー）、RTKクラスXIII（DDR受容体ファミリー）、RTKクラスXIV（RET受容体ファミリー）、RTKクラスXV（KLG受容体ファミリー）、RTKクラスXVI（RYK受容体ファミリー）、RTKクラスXVII（MuSK受容体ファミリー）が含まれる。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、これら20のクラスのRTKの1つまたは複数、または全部に対するリガンドを含む。好ましい態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスI（EGF受容体ファミリー）（ErbBファミリー）のリガンド、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）のリガンド、およびRTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）のリガンドの1つまたは複数、または全部を含む。例えば、いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスI（EGF受容体ファミリー）（ErbBファミリー）のリガンドを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスIV（FGF受容体ファミリー）のリガンドを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、RTKクラスVI（HGF受容体ファミリー）のリガンドを含む。
【００９６】
したがって、いくつかの態様では、分化培地中の1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、上皮増殖因子（EGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）および肝細胞増殖因子（HGF）からなる群より選択される。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、EGFおよびFGFを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、EGFおよびHGFを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、FGFおよびHGFを含む。好ましい態様では、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンドは、EGF、FGFおよびHGFを含む。いくつかの態様では、例えば、FGF、HGFおよびEGFから選択される1つの受容体チロシンキナーゼリガンドだけが分化培地に含まれる。
【００９７】
FGFは、好ましくはFGFR2またはFGFR4に結合することができるFGFであり、好ましくはFGF19である。
【００９８】
3つまたはそれより多く、例えば3、4、5またはそれより多くの受容体チロシンキナーゼリガンドを本発明の分化培地において使用し得る。
【００９９】
EGF
EGFは、様々な培養された外胚葉および中胚葉細胞の強力な分裂促進性成長因子であり、インビボおよびインビトロでの特定の細胞の分化ならびに細胞培養下のいくつかの線維芽細胞の分化に重要な影響を及ぼす。EGF前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する53アミノ酸のペプチドホルモンを生成する膜結合分子として存在する。
【０１００】
任意の適切なEGF、例えばPeprotechから入手されるEGFを使用し得る。いくつかの態様では、EGFはヒトEGFである。
【０１０１】
EGFは、好ましくは、0.01〜500ng/ml、0.1〜250ng/ml、1〜200ng/ml、1〜100ng/ml、10〜90ng/mlまたは25〜75ng/mlの濃度で本発明の分化培地中に存在する。好ましい濃度は、少なくとも10、20、25、30、40、45または50ng/mlであり、500、450、400、350、300、250、200、150または100ng/ml以下である。例えば、いくつかの態様では、EGFは、約1〜100ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。いくつかの態様では、EGFは、約50ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。
【０１０２】
FGF
FGFファミリーメンバーは、広範な分裂促進活性および細胞生存活性を有し、胚発生、細胞増殖、形態形成、組織修復、腫瘍増殖および浸潤を含む様々な生物学的過程に関与する。FGFは、細胞表面チロシンキナーゼ受容体（FGFR）と相互作用することによって細胞を刺激する。密接に関連する4つの受容体（FGFR1〜FGFR4）が同定されている。FGFR1〜FGFR3遺伝子は複数のアイソフォームをコードすることが示されており、これらのアイソフォームは、リガンド特異性を決定する上で重要であり得る。いくつかの態様では、FGFは、FGF1〜10のいずれか1つである。
【０１０３】
大部分のFGFは複数の受容体に結合する（Ornitz J Biol Chem.1998 Feb 27;273（9）:5349-57）。いくつかの態様では、FGFは、FGFR2および/またはFGFR4に結合することができるFGFである。いくつかの態様では、FGFは、FGF19などの、FGFR4に結合することができるFGFである。例えば、好ましい態様では、FGF19は、受容体チロシンキナーゼリガンドとして分化培地中に含まれる。
【０１０４】
いくつかの態様では、1つだけのFGFが使用される。他の態様では、2つまたはそれより多く、例えば2、3またはそれより多くのFGFが使用される。いくつかの態様では、FGFは、FGFR2またはFGFR4経路を活性化する化合物（「FGF経路活性化剤」）で置換される。いくつかの態様では、FGFは、FGFRを活性化する選択的な化合物で置換される。したがって、いくつかの態様では、FGFは、FGFRアゴニストで置換される。
【０１０５】
FGFは、好ましくは0.1〜500ng/ml、0.1〜250ng/ml、1〜200ng/ml、10〜200ng/mlまたは20〜150ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。例えば、いくつかの態様では、FGFは、約100ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。
【０１０６】
分化培地の調製において、FGF19は、好ましくは0.1〜500ng/ml、0.1〜250ng/ml、1〜200ng/ml、10〜200ng/mlまたは20〜150ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。FGF19の好ましい濃度は、約20、50、100、250、500ng/mlであり、500ng/ml以下である。例えば、いくつかの態様では、FGF19は、約100ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。
【０１０７】
HGF
肝細胞増殖因子/分散因子（HGF/SF）は、がん原性c-Met受容体に結合した後、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することによって細胞増殖、細胞運動および形態形成を調節する形態形成因子である。任意の適切なHGF、例えばPeprotechから入手されるHGFを使用し得る。いくつかの態様では、HGFは、HGF受容体を活性化する化合物で置換される。したがって、いくつかの態様では、HGFは、HGR受容体アゴニストで置換される。
【０１０８】
HGFは、好ましくは0.01〜500ng/ml、0.1〜250ng/ml、1〜200ng/ml、1〜100ng/ml、10〜90ng/mlまたは25〜75ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。HGFの好ましい濃度は、約1、10、20、25、50ng/mlであり、50ng/ml以下である。例えば、いくつかの態様では、HGFは、約25ng/mlの濃度で基礎培地に添加される。
【０１０９】
Notch阻害剤
Notchは、複数のタンパク質分解的切断を通して活性化され得る膜貫通表面受容体であり、そのうちの1つは、γ-セクレターゼと称される、プロテアーゼ活性を有するタンパク質の複合体による切断である。γ-セクレターゼは、膜内でその切断活性を実行するプロテアーゼである。γ-セクレターゼは多成分酵素であり、少なくとも4つの異なるタンパク質、すなわちプレセニリン（プレセニリン1または2）、ニカストリン、PEN-2およびAPH-1から構成される。プレセニリンはγ-セクレターゼの触媒中心である。リガンドに結合すると、Notch受容体は、メタロプロテアーゼであるADAMプロテアーゼの作用を介してエクトドメインシェディングを可能にする立体配座変化を受ける。これに続いて直ちに、Notch細胞内ドメイン（NICD）の放出をもたらすγ-セクレターゼ複合体の作用が生じる。NICDは核に移行し、そこでCSL（C-プロモータ結合因子/組換えシグナル配列結合タンパク質Jκ/Supressor-of-Hairless/Lagl）と相互作用する。NICDの結合は、CSLを転写リプレッサーから活性化因子に変換し、Notch標的遺伝子の発現をもたらす。
【０１１０】
Notchシグナル伝達経路は、以前はインビボでの胆管細胞運命に関係づけられていた。例えば、Rbpj（活性Notchシグナル伝達を達成するのに必須）の欠失は異常な管形成をもたらす（Zong Y.Development 2009）。さらに、分化培地中にNotch阻害剤を含めると、胆管細胞運命を阻害し、より肝細胞表現型へと向かう細胞の分化を引き起こし得ることが以前に示されている（国際公開公報第2012/168930号参照）。特に、Notch阻害剤（例えばDAPT）を分化培地に含めると、成熟肝細胞マーカーの発現を増強し、肝細胞様細胞の数を増加させることが認められた。
【０１１１】
したがって、好ましくは、分化培地はNotch阻害剤を含む。任意の適切なNotch阻害剤を使用し得る。
【０１１２】
いくつかの態様では、Notch阻害剤は、Notchのリガンド媒介活性化を低下させることができる阻害剤（例えばNotchのドミナントネガティブリガンドによって、もしくはドミナントネガティブNotchによって、もしくはNotchリガンドとNotchとの間の相互作用を少なくとも部分的にブロックすることができる抗体によって）、またはADAMプロテアーゼの阻害剤である。
【０１１３】
いくつかの態様では、Notch阻害剤は、γ-セクレターゼ阻害剤、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）またはLY-411575である。1つまたは複数のNotch阻害剤、例えば2、3、4またはそれより多くのNotch阻害剤を使用し得る。
【０１１４】
いくつかの態様では、Notch阻害剤（例えばDAPT）は、0.001〜200μM、0.01〜100μM、0.1〜50μM、0.1〜20μM、1〜100μM、1〜50μM、1〜30μM、5〜100μM、5〜50μMまたは5〜20μMの濃度で使用される。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、約10μMの濃度のDAPTを含む。
【０１１５】
糖質コルチコイド
糖質コルチコイドは、ステロイドホルモンの1つのクラスである、コルチコステロイドのクラスである。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体に結合するコルチコステロイドである。コルチゾールは最も重要なヒト糖質コルチコイドである。ヒドロコルチゾンはコルチゾールの合成版である。関連する構造を有する多くの他の合成糖質コルチコイド（例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾン）が存在する。糖質コルチコイドは、糖質コルチコイド受容体を活性化するために様々な効力を有する。これは糖質コルチコイド効力と呼ばれ、通常、コルチゾールと比較して測定される。様々な糖質コルチコイドの生化学、薬理学および作用機序は、例えばCecil Textbook of Medicine（1988）,pages 128-130およびThe Science and Practice of Pharmacy 20th Edition（2000）,pages 1363-1370に総説されている。
【０１１６】
好ましくは、分化培地は糖質コルチコイドを含む。任意の適切な糖質コルチコイドを使用し得る。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、コルチゾール、コルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、塩酸ヒドロコルチゾン、吉草酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、フルドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、フルチカゾン、フルチカゾンアセトニド、プロピオン酸フルチカゾン、フルニソリド、ブデソニド、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、ジフロラゾン、二酢酸ジフロラゾン、ハロベタゾール、プロピオン酸ハロベタゾール、アムシノニド、デスオキシメタゾン、フルオシノニド、フルオシノニドアセトニド、ハルシノニド、モメタゾン、フランカルボン酸モメタゾン、フルアンドレノリド、プレドニカルベート、アクロメタゾン、ジプロピオン酸アクロメタゾン、デソニド、フルオシノロン、フルオシノロンアセトニド、プラモキシンおよび塩酸プラモキシンの1つまたは複数から選択される。
【０１１７】
デキサメタゾンは最も強力な糖質コルチコイドの1つであり、本発明の分化培地での使用に好ましい糖質コルチコイドである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、デキサメタゾンと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。
【０１１８】
ベタメタゾンおよび酢酸フルドロコルチゾンも、非常に強力な糖質コルチコイドである。したがって、ベタメタゾンは、本発明の分化培地での使用に好ましい糖質コルチコイドである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、ベタメタゾンと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。したがって、酢酸フルドロコルチゾンは、本発明の分化培地での使用に好ましい糖質コルチコイドである。いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、酢酸フルドロコルチゾンと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。
【０１１９】
いくつかの態様では、糖質コルチコイドは、コルチゾールと同じかまたはより高い糖質コルチコイド効力を有する任意の糖質コルチコイドである。
【０１２０】
本発明の分化培地で使用するための例示的な糖質コルチコイドのリストを以下に示す。示されている効力は経口投与を指す。
2019514345.tif 000009
【０１２１】
いくつかの態様では、糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）は、0.01〜150μM、0.1〜15μM、0.5〜10μMまたは1〜5μMの濃度で使用される。好ましい態様では、糖質コルチコイドはデキサメタゾンである。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、約3μMの濃度のデキサメタゾンを含む。
【０１２２】
TGF-β阻害剤
TGF-βシグナル伝達は、細胞増殖、細胞運命およびアポトーシスを含む多くの細胞機能に関与する。シグナル伝達は、典型的には、I型受容体を動員してリン酸化するII型受容体へのTGF-βスーパーファミリーリガンドの結合から始まる。次いで、I型受容体はSMADをリン酸化し、これが核内の転写因子として働き、標的遺伝子発現を調節する。
【０１２３】
TGF-β阻害剤シグナル伝達経路は、以前はインビボでの胆管細胞運命に関係づけられていた。例えば、肝臓外植片へのTGF-βの添加はインビトロでの胆管分化を促進する（Clotman et al.（2005）Genes Dev.19（16）:1849-54）。加えて、TGF-β阻害剤を分化培地に含めると、胆管細胞運命を阻害し、より肝細胞表現型へと向かう細胞の分化を引き起こし得ることが以前に示されている（国際公開公報第2012/168930号参照）。特に、TGF-β阻害剤（A83-01など）を分化培地に含めると、成熟肝細胞マーカーの発現を増強し、肝細胞様細胞の数を増加させることが認められた。
【０１２４】
したがって、本発明の分化培地は、好ましくはTGF-β阻害剤を含む。
【０１２５】
TGF-βスーパーファミリーリガンドは、骨形成タンパク質（BMP）、増殖および分化因子（GDF）、抗ミュラー管ホルモン（AMH）、アクチビン、ノーダルおよびTGF-βを含む。一般に、Smad2およびSmad3は、TGF-β/アクチビン経路のALK4、5および7受容体によってリン酸化される。対照的に、Smad1、Smad5およびSmad8は、骨形成タンパク質（BMP）経路の一部としてリン酸化される。経路間に多少の交差が存在するが、本発明に関連して、「TGF-β阻害剤」または「TGF-βシグナル伝達の阻害剤」は、好ましくは、Smad2およびSmad3を介してならびに/またはALK4、ALK5もしくはALK7を介して作用するTGF-β経路の阻害剤である。したがって、いくつかの態様では、TGF-β阻害剤はBMP阻害剤ではない、すなわちTGF-β阻害剤はノギンではない。いくつかの態様では、BMP阻害剤は、TGF-β阻害剤に加えて培養培地に添加される。したがって、TGF-β阻害剤は、TGF-βシグナル伝達経路、好ましくはSmad2および/またはSmad3を介して作用するシグナル伝達経路、より好ましくはALK4、ALK5またはALK7を介して作用するシグナル伝達経路の活性を低下させる任意の作用物質であり得る。
【０１２６】
当技術分野で公知であり、本発明と共に使用することができる、TGF-βシグナル伝達経路を破壊する多くの方法がある。例えば、TGF-βシグナル伝達は、低分子干渉RNA戦略によるTGF-β発現の阻害;フーリン（TGF-β活性化プロテアーゼ）の阻害;生理学的阻害剤による経路の阻害;モノクローナル抗体によるTGF-βの中和;TGF-β受容体キナーゼ1（アクチビン受容体様キナーゼ、ALK5としても知られる）、ALK4、ALK6、ALK7または他のTGF-β関連受容体キナーゼの小分子阻害剤による阻害;例えばSmad2およびSmad3の生理学的阻害剤であるSmad7の過剰発現による、またはSmadの活性化を妨げるSmadアンカーとしてチオレドキシンを使用することによる、Smad2およびSmad3シグナル伝達の阻害、によって破壊され得る（Fuchs,O.Inhibition of TGF- Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy,Volume 6,Number 1,January 2011,pp.29-43（15））。
【０１２７】
ある物質がTGF-β阻害剤であるかどうかを決定するための様々な方法が公知であり、本発明と共に使用し得る。例えば、細胞が、ヒトPAI-1プロモータまたはSmad結合部位を含むレポーター構築物で安定にトランスフェクトされ、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を駆動する細胞アッセイを使用し得る。対照群と比較したルシフェラーゼ活性の阻害を、化合物の活性の尺度として用いることができる（De Gouville et al.,Br J Pharmacol.2005 May;145（2）:166-177）。したがって、新規TGF-β阻害剤は、当業者によって容易に同定され得る。
【０１２８】
本発明によるTGF-β阻害剤は、タンパク質、ペプチド、小分子、低分子干渉RNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーまたは抗体であり得る。阻害剤は、天然に存在するものであってもよくまたは合成物であってもよい。一態様では、TGF-β阻害剤は、ALK4、ALK5および/またはALK7の阻害剤である。例えば、TGF-β阻害剤は、ALK4、ALK5および/またはALK7に結合して、直接阻害し得る。本発明に関連して使用できる好ましい小分子TGF-β阻害剤の例には、以下の表2に列挙する小分子阻害剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２９】
（表２）受容体キナーゼを標的とする小分子TGF-β阻害剤
2019514345.tif 000010
【０１３０】
いくつかの態様では、TGF-β阻害剤は、A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511からなる群より任意で選択される小分子阻害剤である。
【０１３１】
いくつかの態様では、1つだけのTGFβ阻害剤が分化培地中に存在する。他の態様では、複数の、例えば2、3、4またはそれより多くのTGFβ阻害剤が分化培地中に存在する。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、表2に列挙される阻害剤のいずれかの1つまたは複数を含む。分化培地は、1つの阻害剤と列挙される別の阻害剤との任意の組み合わせを含み得る。例えば、培地は、SB-525334もしくはSD-208もしくはA83-01を含み得るか、またはSD-208およびA83-01を含み得る。当業者は、主に他のキナーゼを標的とするように設計されているが、高濃度ではTGF-β受容体キナーゼも阻害し得る多数の他の小分子阻害剤が存在することを理解するであろう。例えば、SB-203580は、高濃度（例えば約10μMまたはそれより多く）でALK5を阻害すると考えられるp38 MAPキナーゼ阻害剤である。TGF-βシグナル伝達経路を阻害する任意のそのような阻害剤もまた、本発明に関連して使用することができる。
【０１３２】
いくつかの態様では、TGF-β阻害剤（例えばA83-01）は、少なくとも1nM、例えば少なくとも5nM、少なくとも50nM、少なくとも100nM、少なくとも300nM、少なくとも450nMまたは少なくとも475nMで分化培地中に存在する。例えば、TGF-β阻害剤（例えばA83-01）は、1nM〜200μM、10nM〜200μM、100nM〜200μM、1μM〜200μM、10nM〜100μM、50nM〜100μM、50nM〜10μM、100nM〜1μM、200nM〜800nM、350〜650nMまたは約500nMで分化培地中に存在する。したがって、いくつかの態様では、分化培地は、約500nMの濃度のA83-01を含む。
【０１３３】
BMP経路活性化剤
いくつかの態様では、分化培地はBMP経路活性化剤を含む。いくつかの態様では、BMP経路活性化剤は、BMP7、BMP4およびBMP2から選択される。BMP7が好ましい。BMP7は、SMAD1およびSMAD5のリン酸化を誘導する。したがって、いくつかの態様では、BMP経路活性化剤は、SMAD1およびSMAD5のリン酸化を誘導することができる任意の化合物である。さらに、BMP7が言及される場合、SMAD1またはSMAD5のリン酸化を誘導する任意の化合物をBMP7の代わりに使用することができる。
【０１３４】
いくつかの態様では、BMP7などのBMP経路活性化剤は、少なくとも0.01ng/ml、少なくとも0.1ng/ml、少なくとも1ng/ml、少なくとも10ng/ml、少なくとも20ng/ml、少なくとも25ng/mlで分化培地中に存在する。いくつかの態様では、BMP7などのBMP経路活性化剤は、約0.01ng/ml〜約500ng/ml、約1ng/ml〜約500ng/ml、約10ng/ml〜約500ng/ml、約20ng/ml〜約500ng/mlで分化培地中に存在する。いくつかの態様では、BMP7などのBMP経路活性化剤は、約0.01ng/ml〜約200ng/ml、約0.1ng/ml〜約100ng/ml、約1ng/ml〜約100ng/ml、約10ng/ml〜約100ng/ml、約10ng/ml〜約50ng/ml、約15ng/ml〜約30ng/mlで分化培地中に存在する。いくつかの態様では、BMP7などのBMP経路活性化剤は、約25ng/mlで分化培地中に存在する。
【０１３５】
いくつかの態様では、分化培地はBMP経路活性化剤を含まない。
【０１３６】
追加成分
いくつかの態様では、本発明の分化培地はガストリンを含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、0.01〜500nM、0.1〜100nM、1〜100nM、1〜20nMまたは5〜15nMの濃度のガストリンを含む。例えば、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、約10nMの濃度のガストリンを含む。
【０１３７】
本発明の分化培地には、好ましくは、B27、N-アセチルシステインおよびN2からなる群より選択される化合物の1つまたは複数（例えば1、2、3または全部）が添加される。したがって、いくつかの態様では、分化培地は、B27、N2およびN-アセチルシステインからなる群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、B27、N-アセチルシステインおよびN2をさらに含む。
【０１３８】
B27（Invitrogen）、N-アセチルシステイン（Sigma）およびN2（Invitrogen）およびニコチンアミド（Sigma）は、細胞の増殖を制御し、DNAの安定性を助けると考えられる。
【０１３９】
いくつかの態様では、N-アセチルシステインは、0.1〜200mM、0.1〜100mM、0.1〜50mM、0.1〜10mM、0.1〜5mM、0.5〜200mM、0.5〜100mM、0.5〜50mM、0.5〜10mM、0.5〜5mM、1〜100mM、1〜50mM、1〜10mM、1〜5mMの濃度で分化培地中に存在する。いくつかの態様では、N-アセチルシステインは、約1.25mMの濃度で分化培地中に存在する。
【０１４０】
いくつかの態様では、B27添加物は、「ビタミンAを含まないB27添加物」（本明細書では「ビタミンAを含まないB27」または「B27 wo VitA」とも称される）であり、Invitrogen,Carlsbad,CA; www.invitrogen.com;現在はカタログ番号12587010から、およびPAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria; www.paa.com;カタログ番号F01-002から入手可能である;Brewer et al.,J Neurosci Res.,35（5）:567-76,1993）。いくつかの態様では、B27添加物は、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリ-ヨードサイロニン（T3）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンから選択される成分の1つまたは複数を含むジェネリック製剤で置き換えることができる。
【０１４１】
PAA Laboratories GmbHによって供給されるB27添加物は、数ある成分の中でも特に、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリ-ヨードサイロニン（T3）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンを含む、液体の50倍濃縮物として提供される。これらの成分のうちで、少なくともリノレン酸、レチノール、酢酸レチニルおよびトリ-ヨードサイロニン（T3）は、核内ホルモン受容体アゴニストである。B27添加物は、濃縮物としてまたは分化培地への添加前に希釈して、分化培地に添加され得る。B27添加物は、1x最終濃度または他の最終濃度（例えば0.1x〜4x濃度、0.1x〜2x濃度、0.5x〜2x濃度、1x〜4x濃度または1x〜2x濃度）で使用され得る。B27添加物の使用は、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリ-ヨードサイロニン（T3）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、アルブミン、インスリンおよびトランスフェリンを本発明の分化培地に組み込むための好都合な方法である。これらの成分の一部または全部を、B27添加物を使用する代わりに分化培地に別々に添加し得ることも想定される。したがって、分化培地は、これらの成分のいくつかまたは全部を含み得る。
【０１４２】
いくつかの態様では、レチノイン酸は、分化培地に使用されるB27添加物には存在しないおよび/または分化培地には存在しない。
【０１４３】
「N2添加物」（本明細書では「N2」とも称される）は、Invitrogen,Carlsbad,CA;www.invitrogen.com;カタログ番号17502-048;およびPAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria;www.paa.com;カタログ番号F005-004から入手可能である;Bottenstein＆Sato,PNAS,76（1）:514-517,1979。PAA Laboratories GmbHによって供給されるN2添加物は、500μg/mlのヒトトランスフェリン、500μg/mlのウシインスリン、0.63μg/mlのプロゲステロン、1611μg/mlのプトレシンおよび0.52μg/mlの亜セレン酸ナトリウムを含む、100倍の液体濃縮物として提供される。N2添加物は、濃縮物としてまたは分化培地への添加前に希釈して、分化培地に添加され得る。B27添加物は、1x最終濃度または他の最終濃度（例えば0.1x〜4x濃度、0.1x〜2x濃度、0.5x〜2x濃度、1x〜4x濃度または1x〜2x濃度）で使用され得る。N2添加物の使用は、トランスフェリン、インスリン、プロゲステロン、プトレシンおよび亜セレン酸ナトリウムを本発明の分化培地に組み込むための好都合な方法である。言うまでもなく、これらの成分の一部または全部を、N2添加物を使用する代わりに分化培地に別々に添加し得ることも想定される。したがって、分化培地は、これらの成分のいくつかまたは全部を含み得る。
【０１４４】
培地がB27を含むいくつかの態様では、培地はN2を同時には含まない。したがって、本発明の態様は、所望する場合、B27が存在する場合はN2を排除するように適合させることができる。
【０１４５】
いくつかの態様では、N2は分化培地中に存在しない。
【０１４６】
培地がN2を含むいくつかの態様では、培地はB27を同時には含まない。したがって、本発明の態様は、所望する場合、N2が存在する場合はB27を排除するように適合させることができる。
【０１４７】
いくつかの態様では、B27は分化培地中に存在しない。
【０１４８】
いくつかの態様では、分化培地はB27および/またはN2を添加される。
【０１４９】
いくつかの態様では、基礎培地は150ng/ml〜250ng/mlのN-アセチルシステインを添加され、好ましくは、基礎培地は約200ng/mlのN-アセチルシステインを添加される。
【０１５０】
任意の適切なpHを使用し得る。例えば、培地のpHは、約7.0〜7.8の範囲、約7.2〜7.6の範囲、または約7.4であり得る。pHは、緩衝液を用いて維持し得る。適切な緩衝液は、当業者によって容易に選択され得る。使用し得る緩衝液には、炭酸緩衝液（例えばNaHCO3）およびリン酸緩衝液（例えばNaH2PO4）が含まれる。これらの緩衝液は、一般に約50〜約500mg/lで使用される。N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]（HEPES）および3-[N-モルホリノ]-プロパンスルホン酸（MOPS）などの他の緩衝液も、通常約1000〜約10,000mg/lで使用し得る。いくつかの態様では、緩衝液は、リン酸緩衝液（例えばKH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaCl、NaH2PO4）、酢酸緩衝液（例えばHOAcもしくはNaOAc）、クエン酸緩衝液（例えばクエン酸もしくはクエン酸Na）、またはTRIS緩衝液（例えばTRIS、TRIS-HCl）または有機緩衝液の1つまたは複数から選択される。いくつかの態様では、有機緩衝液は、グッド緩衝液などの両性イオン緩衝液であり、例えばHEPES、MOPS、MES、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、コラミンクロリド、BES、TES、DIPSO、アセトアミドグリシン、TAPSO、POPSO、HEPPSO、HEPPS、トリシン、グリシンアミド、ビシン、TAPS、AMPSO、CABS、CHES、CAPSおよびCAPSOから選択される。好ましい緩衝液は、例えば0.1〜100mM、0.1〜50mM、0.5〜50mM、1〜50mM、1〜20mMまたは5〜15mMの濃度のHEPESである。いくつかの態様では、HEPESは、約10mMで培養培地に添加される。分化培地はまた、培地のpH状態を容易にモニタできるように（例えば約5〜約50mg/リットルで）、フェノールレッドなどのpH指示薬も含み得る。
【０１５１】
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数のアミノ酸を含み得る。当業者は、分化培地における使用のためのアミノ酸の適切な種類および量を理解する。存在し得るアミノ酸には、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリンおよびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの分化培地は、これらのアミノ酸のすべてを含む。一般に、存在する場合各々のアミノ酸は、約0.05〜約1g/L培地（通常約0.1〜約0.75g/L）で存在するL-グルタミンを除き、約0.001〜約1g/L培地（通常約0.01〜約0.15g/L）で存在する。アミノ酸は合成起源のものであってもよい。
【０１５２】
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数のビタミンを含み得る。当業者は、分化培地における使用のためのビタミンの適切な種類および量を理解する。存在し得るビタミンには、チアミン（ビタミンB1）、リボフラビン（ビタミンB2）、ナイアシン（ビタミンB3）、パントテン酸D-カルシウム（ビタミンB5）、ピリドキサール/ピリドキサミン/ピリドキシン（ビタミンB6）、葉酸（ビタミンB9）、シアノコバラミン（ビタミンB12）、アスコルビン酸（ビタミンC）、カルシフェロール（ビタミンD2）、DL-αトコフェロール（ビタミンE）、ビオチン（ビタミンH）およびメナジオン（ビタミンK）が含まれる。
【０１５３】
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数の無機塩を含み得る。当業者は、分化培地における使用のための無機塩の適切な種類および量を理解する。無機塩は、典型的には、細胞の浸透圧バランスの維持を助け、膜電位を調節するのを助けるために分化培地に含まれる。存在し得る無機塩には、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛の塩が含まれる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩および重炭酸塩の形態で使用される。使用し得る具体的な塩には、CaCl2、CuSO4-5H2O、Fe(NO3)-9H2O、FeSO4-7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4-H2OおよびZnSO4-7H2Oが含まれる。
【０１５４】
培地の浸透圧モル濃度は、約200〜約400mOsm/kgの範囲、約290〜約350mOsm/kgの範囲、または約280〜約310mOsm/kgの範囲であり得る。培地の浸透圧モル濃度は、約300mOsm/kg未満（例えば約280mOsm/kg）であり得る。
【０１５５】
本発明で使用するための分化培地は、1つまたは複数の糖の形態の炭素エネルギー源を含み得る。当業者は、分化培地で使用するための糖の適切な種類および量を理解する。存在し得る糖には、グルコース、ガラクトース、マルトースおよびフルクトースが含まれる。糖は、好ましくはグルコース、特にD-グルコース（デキストロース）である。炭素エネルギー源は、通常、約1〜約10g/Lで存在する。
【０１５６】
本発明の分化培地は血清を含み得る。ウシ胎仔血清（FBS）、ヤギ血清またはヒト血清を含む、任意の適切な供給源から得られる血清を使用し得る。好ましくは、ヒト血清が使用される。血清は、従来技術に従って、培地の約1体積％〜約30体積％で使用され得る。
【０１５７】
他の態様では、本発明の分化培地は血清代替物を含み得る。様々な異なる血清代替物製剤が市販されており、当業者に公知である。血清代替物が使用される場合、従来の技術に従って、培地の約1体積％〜約30体積％で使用され得る。
【０１５８】
他の態様では、本発明の分化培地は、無血清および/または血清代替物不含であり得る。無血清培地は、いかなる種類の動物血清も含まない培地である。幹細胞の起こり得る異種成分混入を避けるために、無血清培地が好ましいと考えられる。血清代替物不含培地は、市販の血清代替物製剤が添加されていない培地である。
【０１５９】
好ましい態様では、分化培地は、精製、天然、半合成および/または合成増殖因子が添加されており、ウシ胎仔血清などの未定義の成分を含まない。例えば、B27（Invitrogen）、N-アセチルシステイン（Sigma）およびN2（Invitrogen）などの添加物は、いくつかの細胞の増殖を刺激する。いくつかの態様では、分化培地は、これらの添加物の1つまたは複数、例えばこれらの添加物の1つ、任意の2つまたは3つ全部を添加される。
【０１６０】
本発明で使用するための分化培地は、バリウム、臭素、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、銅、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛および/またはアルミニウムのイオンなどの1つまたは複数の微量元素を含み得る。
【０１６１】
培地は、約0.1mMの濃度のβ-メルカプトエタノールなどの還元剤を含み得る。
【０１６２】
本発明の分化培地は、幹細胞培養を改善することが以前に報告されている栄養素または成長因子、例えばコレステロール/トランスフェリン/アルブミン/インスリン/プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸塩/他の因子などの、1つまたは複数のさらなる作用物質を含み得る。
【０１６３】
基礎培地
本発明の方法において使用される分化培地は基礎培地を含む。基礎培地は、本明細書で提供される制限に従う、動物またはヒト細胞用の任意の適切な基礎培地である。
【０１６４】
動物またはヒト細胞培養用の基礎培地は、典型的には、培養細胞の維持を支援するのに必要な多数の成分を含む。成分の適切な組み合わせは、以下の開示を考慮して、当業者によって容易に製剤化され得る。本発明における使用のための基礎培地は、一般に、文献および上記により詳細に記載されるように、アミノ酸、ビタミン、脂質添加物、無機塩、炭素エネルギー源および緩衝液などの標準的な細胞培養成分を含む栄養溶液を含む。いくつかの態様では、培養培地は、例えばアミノ酸、ビタミン、脂質添加物、無機塩、炭素エネルギー源および緩衝液から選択される1つまたは複数の標準的な細胞培養成分をさらに添加される。
【０１６５】
当業者は、共通の一般知識から、本発明の分化培地中の基礎培地として使用し得る培養培地の種類を理解するであろう。潜在的に適切な細胞培養培地は市販されており、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（MEM）、ノックアウトDMEM（KO-DMEM）、グラスゴー最小必須培地（G-MEM）、イーグル基礎培地（BME）、DMEM/ハムF12、Advanced DMEM/ハムF12、イスコフ改変ダルベッコ培地および最小必須培地（MEM）、ハムF-10、ハムF-12、199培地およびRPMI 1640培地を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１６６】
例えば、基礎培地は、グルタミン、インスリン、ペニシリン/ストレプトマイシンおよびトランスフェリンを添加したDMEM/F12およびRPMI 1640から選択され得る。さらなる好ましい態様では、無血清培養用に最適化され、インスリンを既に含む、Advanced DMEM/F12またはAdvanced RPMIが使用される。この場合、前記Advanced DMEM/F12またはAdvanced RPMI培地は、好ましくはグルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加される。N2およびB27を添加したAdDMEM/12（Invitrogen）も好ましい。好ましくは、基礎培地はAdvanced DMEM/F12である。より好ましくは、基礎培地は、Advanced DMEM/F12、グルタミンおよびB27を含む。
【０１６７】
いくつかの態様では、基礎培地は、Advanced DMEM/F12、HEPES、ペニシリン/ストレプトマイシン、グルタミン、N-アセチルシステイン、B27、N2およびガストリンを含む。
【０１６８】
いくつかの態様では、基礎培地は、ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、Glutamax、1×N2、1×B27（すべてInvitrogenより）および約1.25mM N-アセチルシステイン（Sigma）を添加したAdvanced DMEM/F12を含むかまたはこれからなる。
【０１６９】
前記基礎培地が、精製、天然、半合成および/または合成増殖因子を添加されており、ウシ胎仔血清などの未定義成分を含まないことがさらに好ましい。様々な異なる血清代替物製剤が市販されており、当業者に公知である。血清代替物が使用される場合、従来の技術に従って、培地の約1体積％〜約30体積％で使用され得る。
【０１７０】
本発明で使用される分化培地は、本明細書の他の箇所に記載されているように、血清を含み得るか、または無血清および/もしくは血清代替物不含であり得る。培養培地および細胞の調製は、好ましくは、生物学的製品に関してFDAによって要求される基準に合致し、製品の一貫性を保証するGMP工程である。
【０１７１】
本発明の分化培地は、通常、脱イオン蒸留水中で製剤化される。本発明の分化培地は、典型的には、例えば紫外光、加熱、照射または濾過によって、汚染を防止するために使用前に滅菌される。分化培地は、貯蔵または輸送のために凍結され得る（例えば-20℃または-80℃で）。培地は、汚染を防止するために1つまたは複数の抗生物質を含み得る。培地は、1mlあたり0.1エンドトキシン単位未満のエンドトキシン含量を有し得るか、または1mlあたり0.05エンドトキシン単位未満のエンドトキシン含量を有し得る。培地のエンドトキシン含量を決定するための方法は当技術分野において公知である。
【０１７２】
好ましい基礎培地は、炭酸塩ベースの緩衝液でpH7.4（好ましくはpH7.2〜7.6または少なくとも7.2で7.6以下）で緩衝された規定の合成培地であり、細胞は、5％〜10％CO2、または少なくとも5％で10％以下のCO2、好ましくは5％CO2を含む雰囲気中で培養される。
【０１７３】
いくつかの態様では、分化培地は、分化方法において使用できる状態の基礎培地を含んで提供される。他の態様では、分化培地は、基礎培地なしで、例えば培養培地添加物として提供され、分化方法における使用の前に基礎培地（または他の成分）が添加され得る。したがって、基礎培地が存在しないかまたは基礎培地が単なる任意成分である、本明細書に記載の任意の分化培地が提供される。
【０１７４】
組成物および容器
本発明はまた、上記の本発明の局面のいずれか1つによる細胞および/またはオルガノイドを含む組成物または細胞培養容器、ならびに上記の本発明の局面のいずれか1つによる分化培地を提供する。例えば、そのような組成物または細胞培養容器は、上記の分化培地中に、本発明の方法に従って培養された任意の数の細胞またはオルガノイドを含み得る。
【０１７５】
本発明のさらなる局面によれば、本発明の分化培地を含む密閉容器が提供される。密閉容器は、汚染を防止するために、分化培地の輸送または貯蔵のために好ましいと考えられる。容器は、フラスコ、プレート、ビン、広口ビン、バイアルまたはバッグなどの任意の適切な容器であり得る。
【０１７６】
本発明の例示的な培養培地
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択されるALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、ならびに
（iv）1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、（a）好ましくは0.01〜150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または（b）好ましくは0.05〜150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤
を含む。
【０１７７】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、ならびに
（iv）GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01〜150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤
を含む。
【０１７８】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
（iv）1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、（a）好ましくは0.01〜150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または（b）好ましくは0.05〜150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤、ならびに
（v）GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01〜150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤
を含む。
【０１７９】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
（iv）GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01〜150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤、ならびに
（v）β-カテニン分解複合体の下流で作用する1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、好ましくは0.05〜150μMの濃度の、例えば iCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤などの、β-カテニン分解複合体の下流で作用するWnt阻害剤
を含む。
【０１８０】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、ならびに
（iv）AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001〜300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
【０１８１】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択されるALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
（iv）1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、（a）好ましくは0.01〜150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または（b）好ましくは0.05〜150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤、ならびに
（v）AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001〜300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
【０１８２】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択される、ALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
（iv）GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01〜150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤、ならびに
（v）AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001〜300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
【０１８３】
いくつかの態様では、本発明の分化培地は、
（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド、例えば、それぞれ好ましくは1〜200ng/mlの濃度の、例えばRTKクラスI（例えばEGF）のリガンド、RTKクラスIV（例えばFGF）のリガンドおよびRTKクラスVI（例えばHGF）のリガンドから選択される受容体チロシンキナーゼリガンド、
（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤、例えば、好ましくは100nM〜200μMの濃度の、例えばA83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY 364947、SD-208およびSJN 2511から選択されるALK5、ALK4またはALK7の1つまたは複数の阻害剤などのTGF-β阻害剤、
（iii）Notch阻害剤、例えば、好ましくは0.001〜100μMの濃度の、例えばDAPT、ジベンザゼピン（DBZ）、ベンゾジアゼピン（BZ）およびLY-411575から選択される、γ-セクレターゼ阻害剤などのNotch阻害剤、
（iv）1つまたは複数のWnt阻害剤、例えば、（a）好ましくは0.01〜150μMの濃度の、Wnt分泌の阻害剤、例えばIWP-2、LGK974およびIWP-1から選択されるPorc阻害剤ならびに/または（b）好ましくは0.05〜150μMの濃度の、例えばiCRT3、CGP049090、PKF118310、PKF115-584、ZTM000990、PNU-74654、BC21、iCRT5、iCRT14およびFH535から選択される、β-カテニン標的遺伝子発現の阻害剤、などのWnt阻害剤、
（v）GSK-3阻害剤、例えば、好ましくは0.01〜150μMの濃度の、例えばCHIR99021、6-BIO、ジブロモカンタレリン、ヒメニアルデシン、インジルビン、メリジアニン、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、SB-216763、SB-41528、AR-A014418、AZD-1080、アルステルパウロン、カズパウロン、ケンパウロン、アロイジン、マンザミンA、パリヌリン、トリカンチン、TDZD-8、NP00111、NP031115、チデグルシブ、HMK-32およびL803-mtsから選択されるGSK-3阻害剤、ならびに
（vi）AP-1刺激剤、例えば、好ましくは0.001〜300μMの濃度の、例えばカルバコール、アセチルコリン、ベタネコール、オキソトレモリン、L-689,660（1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン,3-(6-クロロピラジニル)マレエート）、ピロカルピン、ムスカリン、McN-A 343（4-[[[(3-クロロフェニル)アミノ]カルボニル]オキシ]-N,N,N-トリメチル-2-ブチン-1-アミニウムクロリド）、77-LH-218-1（1-[3-(4-ブチル-1-ピペリジニル)プロピル]-3,4-ジヒドロ-2(1H)-キノリノン）およびメタコリンから選択される、ムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニストなどのAP-1刺激剤
を含む。
【０１８４】
これらの態様のいずれかでは、分化培地は、好ましくは0.01ng/ml〜500ng/mlの濃度のBMP経路活性化剤（例えばBMP7）および/または、好ましくは0.01nM〜500nMの濃度のガストリンをさらに含み得る。
【０１８５】
好ましい態様では、本発明の分化培地は、（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）、（iii）Notch阻害剤（例えばDAPTおよび/またはDBZ）、（iv）糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）、（v）1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2および/またはiCRT3）、（vi）GSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）ならびに（vii）AP-1刺激剤（例えばカルバコールなどのムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）を含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、（viii）BMP経路活性化剤（例えばBMP7）および/または（ix）ガストリンをさらに含む。
【０１８６】
したがって、いくつかの態様では、本発明の分化培地は、（i）EGF（例えば約50ng/mlの濃度）、HGF（例えば約25ng/mlの濃度）およびFGF19（例えば約100ng/mlの濃度）、（ii）A83-01（例えば約0.5μMの濃度）、（iii）DAPT（例えば約10μMの濃度）、（iv）デキサメタゾン（例えば約3μMの濃度）、（v）IWP-2（例えば約3μMの濃度）およびiCRT3（例えば約50μMの濃度）、（vi）CHIR99021（例えば約3μMの濃度）、（vii）カルバコール（例えば約100μMの濃度）、（viii）BMP7（例えば約25ng/mlの濃度）ならびに（ix）ガストリン（例えば約10nMの濃度）を含む。
【０１８７】
これらの分化培地は、肝細胞を分化させるのに特に適する。これらの培地はまた、膵臓などの密接に関連する組織にも有用であると想定される。これらの培地はまた、より一般的に上皮細胞の分化に有用であると想定される。
【０１８８】
分割
本発明者らは、驚くべきことに、より小さなオルガノイドを分化培地中で培養すると、分化が改善されることを見出した。特に、本発明者らは、オルガノイドを分化培地に添加する前に肝臓オルガノイド培養物を分割すると、より高い分化効率をもたらすことを見出した（図2F参照）。したがって、細胞集団のより大きな割合が肝細胞マーカー（例えばアルブミンおよびCyp3A4）を示し、分化した細胞はより高いレベルの肝細胞マーカーを示した。
【０１８９】
したがって、いくつかの態様では、前駆細胞の培養物を分割した後に分化培地中で前駆細胞を培養する。いくつかの態様では、この分割は、増殖培地での少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間または少なくとも7日間の培養後に行う。例えば、いくつかの態様では、前駆細胞、例えば上皮幹細胞を増殖培地で5日間培養した後、培養物を分割し、次いで本発明の分化培地で培養する。
【０１９０】
一態様では、本発明は、好ましくはオルガノイドを生成するために、単一の上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を培養するための方法を提供し、この方法は、
1個の上皮細胞、上皮細胞の集団または単離された組織断片を増殖培地で培養して、増殖した細胞集団を得る工程（好ましくは、1つまたは複数のオルガノイドを得る工程）;
増殖培地での少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間または少なくとも7日間の培養後に増殖培養物を分割する工程;および
増殖した細胞集団または1つもしくは複数のオルガノイドを分化培地で培養する工程
を含む。
【０１９１】
いくつかの態様では、本明細書に記載のBMP経路活性化剤（例えばBMP7）を、分割の前に増殖培地に添加する。例えば、いくつかの態様では、増殖培地での少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間または少なくとも7日間の培養後にBMP7を増殖培地に添加する。
【０１９２】
細胞外マトリックス
いくつかの態様では、細胞を培養するための方法、例えば細胞を増殖させるおよび/または分化させるための方法は、細胞を細胞外マトリックス（ECM）と接触させて培養する工程を含む。任意の適切なECMを使用し得る。細胞は、好ましくは、前記細胞が天然に存在する細胞のニッチを少なくとも部分的に模倣する微小環境下で培養される。細胞のニッチは、一部には、細胞によっておよび前記ニッチ内の細胞によって分泌されるECMによって決定される。細胞のニッチは、インテグリンなどの細胞膜タンパク質との相互作用を提供する生体材料または合成材料の存在下で前記細胞を培養することによって模倣され得る。したがって、本明細書に記載のECMは、例えばインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによって、インビボでの細胞のニッチを模倣する任意の生体材料または合成材料またはそれらの組み合わせである。
【０１９３】
本発明の好ましい方法では、細胞をECMと接触させて培養する。「接触して」とは、物理的または機械的または化学的接触を意味し、これは、得られたオルガノイドまたは上皮細胞の集団を前記細胞外マトリックスから分離するために力を使用する必要があることを意味する。いくつかの態様では、ECMは三次元マトリックスである。いくつかの態様では、細胞はECMに埋め込まれる。いくつかの態様では、細胞はECMに付着する。本発明の培養培地は、三次元ECM中に拡散し得る。
【０１９４】
別の態様では、ECMは懸濁状態であり、すなわち細胞は懸濁系においてECMと接触している。いくつかの態様では、ECMは、少なくとも1％、少なくとも2％または少なくとも3％の濃度で懸濁液中に存在する。いくつかの態様では、ECMは、1％〜約10％または1％〜約5％の濃度で懸濁液中に存在する。懸濁方法は、洗練された方法の利点を有し得る。
【０１９５】
1つの種類のECMは、上皮細胞、内皮細胞、壁内胚葉様細胞（例えばHayashi et al.（2004）Matrix Biology 23:47-62に記載されているEnglebreth-Holm-Swarm壁内胚葉様細胞）および結合組織細胞によって分泌される。このECMは、様々な多糖、水、エラスチンおよび糖タンパク質を含み、前記糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチンおよびラミニンを含む。したがって、いくつかの態様では、本発明の方法における使用のためのECMは、多糖、エラスチンおよび糖タンパク質から選択される成分の1つまたは複数を含み、例えば糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチンおよび/またはラミニンを含む。例えば、いくつかの態様では、コラーゲンがECMとして使用される。種々の種類の糖タンパク質および/または糖タンパク質の種々の組み合わせを含む種々の組成物を含む、種々の種類のECMが公知である。
【０１９６】
ECMは、例えば上皮細胞、内皮細胞、壁内胚葉様細胞または線維芽細胞などのECM産生細胞を容器中で培養した後、これらの細胞を取り出し、単離された組織断片または単離された上皮細胞を添加することによって提供され得る。細胞外マトリックス産生細胞の例は、主にコラーゲンおよびプロテオグリカンを産生する軟骨細胞、主にIV型コラーゲン、ラミニン、間質プロコラーゲンおよびフィブロネクチンを産生する線維芽細胞、ならびに主にコラーゲン（I型、III型およびV型）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチンおよびテネイシン-Cを産生する結腸筋線維芽細胞である。これらは「天然に産生されるECM」である。天然に産生されるECMは、商業的に提供され得る。市販の細胞外マトリックスの例には、細胞外マトリックスタンパク質（Invitrogen）およびEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞からの基底膜調製物（例えばCultrex（登録商標）Basement Membrane Extract（Trevigen,Inc.）またはMatrigel（商標）（BD Biosciences））が含まれる。
【０１９７】
したがって、いくつかの態様では、ECMは、天然に産生されるECMである。いくつかの態様では、ECMは、Matrigel（商標）（BD Biosciences）などのラミニン含有ECMである。いくつかの態様では、ECMは、ラミニン、エンタクチンおよびIV型コラーゲンを含むMatrigel（商標）（BD Biosciences）である。いくつかの態様では、ECMは、ラミニン、エンタクチン、IV型コラーゲンおよびヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む（例えばCultrex（登録商標）Basement Membrane Extract Type 2（Trevigen,Inc.））。いくつかの態様では、ECMは、コラーゲンおよび/またはラミニンなどの少なくとも1つの糖タンパク質を含む。本発明の方法における使用のための好ましいECMは、コラーゲンおよびラミニンを含む。さらなる好ましいECMは、ラミニン、エンタクチンおよびIV型コラーゲンを含む。所望する場合は、天然に産生されるECMまたは合成ECM材料の混合物を使用し得る。
【０１９８】
別の態様では、ECMは合成ECMであり得る。例えば、ProNectin（Sigma Z378666）などの合成ECMを使用し得る。さらなる例では、ECMは、プラスチック、例えばポリエステル、またはヒドロゲルであり得る。いくつかの態様では、合成マトリックスは、生体材料、例えばコラーゲンまたはラミニンなどの1つまたは複数の糖タンパク質で被覆され得る。
【０１９９】
三次元ECMは、三次元上皮オルガノイドの培養を支援する。細胞外マトリックス材料は、通常、細胞が懸濁されている皿の底部の滴である。典型的には、マトリックスが37℃で固化すると、培地が添加されてECM中に拡散する。培地中の細胞は、その表面構造との相互作用、例えばインテグリンとの相互作用によってECMに固着する。
【０２００】
培地および/または細胞は、ECM上に配置され得る、ECM中に埋め込まれ得るまたはECMと混合され得る。
【０２０１】
例えば、いくつかの態様では、単一細胞、細胞の集団または組織断片は、任意で増殖因子が低減されているおよび/またはフェノールレッドを含まない、Matrigel（商標）に埋め込まれる。
【０２０２】
いくつかの態様では、培養培地はECMの上に配置される。次いで、必要に応じておよび必要なときに、培養培地を除去および補充することができる。いくつかの態様では、培養培地は、1、2、3、4、5、6または7日ごとに補充される。成分が培地に「添加される」または培地から「除去される」場合、これは、いくつかの態様では、培地自体がECMから取り出され、次いで、「添加される」成分を含む新しい培地または「除去される」成分が排除された新しい培地がECM上に配置されることを意味し得る。
【０２０３】
培養のための前駆細胞および幹細胞、ならびに前記細胞の入手
本分化方法は前駆細胞に有用である。前駆細胞は、本明細書では、分化能を有する任意の細胞と定義される。したがって、「前駆細胞」という用語は、成体幹細胞、胚性幹細胞およびiPS細胞を含むがこれらに限定されるわけではない幹細胞を包含する。前駆細胞は、例えば初代幹細胞または増殖幹細胞または部分分化幹細胞であり得る。いくつかの態様では、前駆細胞は初代細胞であり、生きている組織から直接得られたことを意味する。他の態様では、前駆細胞は二次細胞、すなわち培養および/または継代された細胞である。いくつかの態様では、前駆細胞は増殖細胞である。「増殖された」という用語は、細胞が、分化よりも細胞の拡大（例えば増殖）を促進する培養培地においてインビトロで培養されたことを意味する。
【０２０４】
好ましい態様では、前駆細胞は成体前駆細胞であり、すなわち成体組織に由来する。いくつかの態様では、成体前駆細胞は成体幹細胞（例えば成体上皮幹細胞）である。これに関連して、「成体」は、新生児または小児を含むが、胚または胎児は除外する。いくつかの態様では、前駆細胞は、胚性幹細胞または胚性幹細胞株、例えばヒト胚性幹細胞またはヒト胚性幹細胞株に由来しない。いくつかの態様では、前駆細胞は、臍帯および/または胎盤組織に由来しない。
【０２０５】
好ましい態様では、前駆細胞は上皮前駆細胞である。例えば、好ましい態様では、前駆細胞は上皮組織、より好ましくは成体上皮組織に由来する。上皮組織には、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺が含まれる。したがって、いくつかの態様では、前駆細胞は、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺から得られる。いくつかの態様では、前駆細胞は、肝臓または膵臓から得られる。好ましい態様では、前駆細胞は肝臓から得られる。
【０２０６】
好ましい態様では、前駆細胞は哺乳動物細胞である。例えば、好ましい態様では、細胞は哺乳動物組織に由来する。例えば、いくつかの態様では、前駆細胞はヒト細胞である。いくつかの態様では、前駆細胞は、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオン動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ）または家畜（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）由来である。
【０２０７】
初代細胞は、インビボ状況の最良の実験モデルである。本発明の好ましい態様では、前駆細胞は、初代前駆細胞（例えば初代上皮幹細胞）である（または初代前駆細胞に由来する）。初代細胞培養物を継代して二次細胞培養物を形成することができる。がん細胞を除き、従来の二次上皮細胞培養物は寿命に限りがある。一定の数の集団倍加（例えば50〜100世代）の後、細胞は老化の過程を経て分裂を停止する。二次培養物からの細胞は、不死化して連続細胞株になることができる。不死化は、自発的に起こり得るか、またはウイルスによってもしくは化学的に誘導され得る。不死化細胞株は形質転換細胞としても知られる。本発明の好ましい態様では、細胞は、不死化または形質転換なしで増殖および/または継代された、増殖された上皮幹細胞培養物、好ましくは増殖されたオルガノイドから得られる。いくつかの態様では、これらの増殖された上皮培養物またはオルガノイドは、（従来の細胞株とは異なり）遺伝的に不均一であり得る。したがって、いくつかの態様では、前駆細胞は、不死化細胞または形質転換細胞ではなく、または、不死化細胞株または形質転換細胞株に由来しない。
【０２０８】
前駆細胞は、例えば国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号または国際公開公報第2015/173425号に記載されているような任意の適切な方法によって入手し得る。いくつかの態様では、細胞は、例えば実施例およびDorell et al.,2008（Hepatology.2008 Oct; 48（4）:1282-91.Surface markers for the murine oval cell response.Dorrell C,Erker L,Lanxon-Cookson KM,Abraham SL,Victoroff T,Ro S,Canaday PS,Streeter PR,Grompe M）に記載されているように、コラゲナーゼ消化によって単離される。いくつかの態様では、組織生検材料に関してコラゲナーゼ消化が行われる。いくつかの態様では、本発明で使用する前駆細胞を得るためにコラゲナーゼおよびアキュターゼ消化が用いられる。
【０２０９】
いくつかの態様では、前駆細胞は、Lgr5を発現する上皮幹細胞である。オルガノイドは、好ましくは、成体組織由来の細胞、好ましくは成体組織由来の上皮幹細胞、より好ましくはLgr5を発現する上皮幹細胞を用いて得られる。
【０２１０】
いくつかの態様では、前駆細胞は正常細胞であり、細胞が正常な核型、遺伝子型および/または表現型を有することを意味する。代替的な態様では、前駆細胞は疾患細胞であり、それらが疾患核型、遺伝子型および/または表現型を有することを意味する。例えば、いくつかの態様では、前駆細胞はがん細胞である。したがって、例えば、上皮幹細胞はLgr5陽性がん幹細胞であり得ることが想定される。したがって、細胞は、必要に応じて、腫瘍から入手し得る。代替的な態様では、前駆細胞は病的前駆細胞、例えば細胞内病原体（例えば細菌、ウイルスまたは寄生生物）に感染した前駆細胞である。
【０２１１】
例示的な方法
本発明は、前駆細胞を分化させるための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載の分化培地中で細胞を培養する工程を含む。好ましい態様では、細胞を、本明細書に記載のようにECMと接触させて培養する。
【０２１２】
本発明はまた、前駆細胞を培養するための方法を提供し、前記方法は、増殖培地中で細胞を培養し、その後本明細書に記載の分化培地中で細胞を培養する工程を含む。いくつかの態様では、細胞を、増殖工程および/または分化工程の間、本明細書に記載のようにECMと接触させて培養する。いくつかの態様では、分化培地中で細胞を培養する前に、例えば繰り返し洗浄することによってまたは細胞培養物を分割することによって、増殖培地を除去する。
【０２１３】
本発明は、好ましくはオルガノイドを得るために、単一の上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を培養するための方法を提供し、この方法は、
1個の上皮幹細胞、上皮幹細胞の集団または単離された組織断片を増殖培地で培養して、増殖した細胞集団を提供する工程;および
増殖した細胞集団を分化培地で培養する工程
を含む。
【０２１４】
本発明はまた、単一の前駆細胞または前駆細胞の集団を分化させるための方法も提供し、この方法は、
1個の前駆細胞または前駆細胞の集団を分化培地で培養する工程
を含む。
【０２１５】
分化培地は、本明細書に記載される任意の分化培地であり得る。例えば、いくつかの態様では、分化培地は、（i）1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、（ii）1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）、（iii）Notch阻害剤（例えばDAPTおよび/またはDBZ）、（iv）糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）、（v）1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2および/またはiCRT3）、（vi）GSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）ならびに（vii）AP-1刺激剤（例えばカルバコールなどのムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト）を含む。いくつかの態様では、本発明の分化培地は、（viii）BMP経路活性化剤（例えばBMP7）および/または（ix）ガストリンをさらに含む。
【０２１６】
増殖培地は、上皮幹細胞または前駆細胞のための任意の適切な増殖培地、好ましくは上皮幹細胞のための適切な増殖培地（例えば国際公開公報第2010/090513号、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号または国際公開公報第2015/173425号に記載されているような）であり得る。
【０２１７】
いくつかの態様では、増殖培地は、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF10）、ニコチンアミドならびに1つまたは複数のWntアゴニスト（例えばRスポンジン馴化培地および/またはWnt馴化培地）を含む。
【０２１８】
いくつかの態様では、増殖培地は、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF10）、1つまたは複数のWntアゴニスト（例えばRスポンジン馴化培地および/またはWnt馴化培地）ならびに1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）を含む。
【０２１９】
いくつかの態様では、増殖培地は、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF10）、ニコチンアミド、1つまたは複数のWntアゴニスト（例えばRスポンジン馴化培地および/またはWnt馴化培地）ならびに1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）を含む。
【０２２０】
これらの態様のいずれかでは、増殖培地は、cAMP経路活性化剤（例えばフォルスコリン）、ガストリンおよび/またはBMP阻害剤（例えばノギン）をさらに含み得る。
【０２２１】
例えば、いくつかの態様では（例えば肝臓についての好ましい態様では）、増殖培地は、（i）EGF（例えば約50ng/ml）、HGF（例えば約25ng/ml）およびFGF10（例えば約100ng/ml）;（ii）A83-01（例えば約5μM）;（iii）Rスポンジン馴化培地（例えば約10％）;（iv）ニコチンアミド（例えば約0.01M）;（v）フォルスコリン（例えば約10μM）ならびに（vi）ガストリン（例えば約10nM）を含む。いくつかの態様では、増殖培地は、n-アセチルシステイン（例えば約1.25mM）、1×N2および1×B27（任意でビタミンAを含まない1×B27）をさらに含む。
【０２２２】
好ましくは、分化の前に細胞を増殖させて1つまたは複数（例えば少なくとも2、3、4、5、6、10、15、20または20より多く）のオルガノイドを生成する。
【０２２３】
いくつかの態様では、細胞を最初に本明細書に記載の増殖培地で培養し、ひとたびオルガノイドが成功裏に確立されれば、増殖培地を本明細書に記載の分化培地と置き換える。したがって、いくつかの態様では、1継代または複数（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多く）の継代後に、増殖培地を分化培地と置き換える。
【０２２４】
当業者には明らかなように、本発明の好ましい培養方法は、フィーダー細胞を必要としないので有利である。フィーダー細胞層は、しばしば、幹細胞の培養を支援し、それらの分化を阻害するために使用される。フィーダー細胞層は、一般に、関心対象の細胞と共培養され、関心対象の細胞の増殖に適した表面を提供する細胞の単層である。フィーダー細胞層は、関心対象の細胞が増殖することができる環境を提供する。フィーダー細胞は、増殖を防止するために有糸分裂を不活性化されることが多い（例えば照射またはマイトマイシンCでの処理によって）。フィーダー細胞の使用は、細胞の継代を複雑にする（細胞を各継代でフィーダー細胞から分離しなければならず、各継代ごとに新たなフィーダー細胞が必要である）ので、望ましくない。フィーダー細胞の使用はまた、所望の細胞へのフィーダー細胞の混入をもたらすこともある。これは、いかなる医学的用途にとっても明らかに問題であり、研究状況においてさえも、細胞に対して行われた任意の実験の結果の分析を複雑にする。本明細書の他の箇所に記載されているように、本発明の培養培地は、フィーダー細胞と接触せずに細胞を培養するために使用できる、すなわち本発明の方法は、増殖が援助される細胞を支持するためにフィーダー細胞の層を必要としないので、特に有利である。
【０２２５】
したがって、本発明の組成物はフィーダー細胞不含の組成物であり得る。組成物は、通常、組成物中の細胞がフィーダー細胞層の不在下で少なくとも1継代培養されていれば、フィーダー細胞不含であるとみなされる。本発明のフィーダー細胞不含の組成物は、通常、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満のフィーダー細胞（組成物中の細胞の総数の％として表す）を含むか、または好ましくはフィーダー細胞を全く含まない。
【０２２６】
さらなる態様では、本発明の分化培地中で前駆細胞を培養する工程を含む、分化した細胞の集団またはオルガノイドを得るための方法が提供される。好ましくは、この方法は、本明細書に記載の分化方法を用いて本発明の分化培地中で前駆細胞を培養する工程を含む。
【０２２７】
いくつかの態様では、本発明の方法は、単一の上皮幹細胞からオルガノイド/分化した細胞の集団を得る工程を含む。別の態様では、本発明の方法は、上皮幹細胞の集団または上皮組織断片からオルガノイド/分化した細胞の集団を得る工程を含む。
【０２２８】
特定の態様では、分化したオルガノイドを得るための方法が提供され、この方法は、好ましくは上皮前駆細胞をECM、好ましくは三次元ECMと接触させて、本発明の分化培地中で上皮前駆細胞（例えば、任意でLgr5を発現する、上皮幹細胞）を培養する工程を含む。
【０２２９】
いくつかの態様では、本発明の方法は、前駆細胞を増殖培地中で一定の期間、例えば3日間〜10週間、1〜10週間、1〜4週間または10日間〜3週間にわたって培養する工程、次いで細胞を継代する工程（例えば、細胞を単一の細胞密度に解離させ、1つの容器あたり（例えば1ウェルあたり）1個の細胞の割合で1つまたは複数の細胞を播種する）、増殖培地を用いて細胞を一定の期間、例えば3日間〜10週間、1〜10週間、1〜4週間または10日間〜3週間にわたって増殖させ続ける工程、ならびに継代および増殖の工程を少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回または少なくとも14回繰り返した後、細胞を分化させる工程を含む。
【０２３０】
いくつかの態様では、本発明の方法は、分化培地中で前駆細胞を少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間培養する工程を含む。いくつかの態様では、この方法は、分化培地中で前駆細胞を約1〜約20日間、約1〜約10日間または約1〜約5日間培養する工程を含む。
【０２３１】
分化後、本発明の方法はさらに、1つまたは複数の分化した細胞または分化したオルガノイドを取得および/または単離する工程を含み得る。例えば、前駆細胞の培養後に、培養培地中で培養した1つもしくは複数の細胞および/または1つもしくは複数のオルガノイドを、その後の適用に使用するために培養培地から取り出すことが有用であり得る。当技術分野で公知の多数の物理的分離方法のいずれか1つを使用して、本発明の細胞を選択し、これらを他の細胞型と区別し得る。そのような物理的方法は、本発明の細胞によって特異的に発現されるマーカーに基づくFACSおよび様々な免疫親和性方法を含み得る。
【０２３２】
一態様では、細胞は、例えばこれらのマーカーの1つに対する抗体を利用したFACSによって単離し得る。当業者には明らかなように、これは、蛍光標識抗体を介して、または一次抗体に結合特異性を有する蛍光標識二次抗体を介して達成され得る。適切な蛍光標識の例には、FITC、Alexa Fluor（登録商標）488、GFP、CFSE、CFDA-SE、DyLight 488、PE、PerCP、PE-Alexa Fluor（登録商標）700、PE-Cy5（TRI-COLOR（登録商標））、PE-Cy5.5、PI、PE-Alexa Fluor（登録商標）750およびPE-Cy7が含まれるが、これらに限定されるわけではない。このリストは単なる例として提供されるものであり、限定を意図しない。
【０２３３】
あるいは、当技術分野で周知の分離方法である免疫親和性精製によって細胞を単離し得る。この方法は、精製カラムへの抗体の固定化に基づく。次いで、細胞試料をカラムに負荷し、適切な細胞を抗体に結合させ、したがってカラムに結合させる。洗浄工程後、固定化された抗体に選択的に結合する競合物質を用いて細胞をカラムから溶出させ、カラムから放出させる。
【０２３４】
固定化された抗体を使用する免疫親和性精製が、精製された細胞集団を提供することは、当業者には明らかであろう。しかし、いくつかの態様では、他の同定可能なマーカーの1つまたは複数を用いてさらに1回の免疫親和性精製を実施することによって細胞集団をさらに精製し、単離されたクローンのアリコートを使用して他の関連する細胞内マーカーの発現を確認することが好ましいと考えられる。
【０２３５】
同じ物理的分離方法を含む連続的な精製工程が必ずしも必要とされないことは、当業者には明らかであろう。
【０２３６】
分化した細胞およびオルガノイド
本発明はさらに、分化したオルガノイドまたは1つもしくは複数の分化した細胞の集団を提供する。
【０２３７】
分化したオルガノイドは、分化した上皮細胞型を含む三次元構造体である。分化したオルガノイドは、典型的には自己組織化しており、細胞が分化すると共にオルガノイド中の細胞の三次元配置が自発的に生じることを意味する。いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、任意でLgr5を発現する、上皮幹細胞に由来する。
【０２３８】
一態様では、本発明は、例えば、好ましくは前駆細胞を三次元ECMと接触させて、本発明の分化培地中で前駆細胞を培養する工程を含む、本発明の方法によって得ることのできるまたは得られる分化したオルガノイドまたは1つもしくは複数の分化した細胞の集団を提供する。
【０２３９】
細胞の「集団」は、1より大きい任意の数の細胞であるが、好ましくは少なくとも10個の細胞、少なくとも50個の細胞、少なくとも100個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも1x103個の細胞、少なくとも1x104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1×107個の細胞、少なくとも1×108個の細胞、または少なくとも1×109個の細胞である。
【０２４０】
本発明による分化したオルガノイドは、少なくとも10個の細胞、少なくとも50個の細胞、少なくとも100個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも1x103個の細胞、少なくとも1x104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1×107個の細胞またはそれより多くの細胞の集団を含み得る。いくつかの態様では、各々のオルガノイドは、約1x103個の細胞〜5×103個の細胞を含み、一般に、10〜20個のオルガノイドを、例えば24ウェルプレートの、1つのウェル中で一緒に成長させ得る。
【０２４１】
本発明のオルガノイドは天然に存在する組織断片ではなく、および/または血管を含まないことは、当業者に明らかである。例えば、本発明の肝臓オルガノイドの場合、天然に存在する肝小葉または天然に存在する胆管を含まない。
【０２４２】
本発明のオルガノイドは、例えば、上皮細胞型だけを含む（間葉細胞または他の構造細胞型を含まない）ため、天然に存在する組織とは区別される。したがって、いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは上皮細胞だけを含む。いくつかの態様では、分化したオルガノイドは非上皮細胞を含まない。例えば、特定の態様では、分化したオルガノイドは間葉細胞を含まない。
【０２４３】
本明細書に記載の分化培地は、好ましくは、培養の少なくとも5日間、細胞の特異的分化を誘導または促進する。分化は、特定の組織系統、例えば本明細書で定義される肝臓系統に関連する特異的マーカーの存在を検出することによって測定し得る。分化は、組織系統、例えば本明細書で定義される肝臓系統に関連する特異的マーカーの存在を検出することによって測定し得る。マーカーの同一性に依存して、前記マーカーの発現は、本明細書で定義される分化培地での少なくとも5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16日間またはそれ以上の培養後に、RTPCRまたは免疫組織化学によって評価し得る。
【０２４４】
「発現される」という用語は、細胞内のマーカーの存在を表すために使用される。発現されるとみなされるためには、マーカーが検出可能なレベルで存在しなければならない。「検出可能なレベル」とは、マーカーが、PCR、ブロッティングまたはFACS分析などの標準的な実験室方法の1つを使用して検出できることを意味する。遺伝子は、1個の細胞につき少なくとも約100コピーの細胞における発現レベルに対応する、30回のPCRサイクル後に発現が合理的に検出され得る場合、本発明の集団の細胞によって発現されるとみなされる。「発現する」および「発現」という用語は対応する意味を有する。この閾値より低い発現レベルでは、マーカーは発現されないとみなされる。本発明の細胞におけるマーカーの発現レベルと、例えば胚性幹細胞などの別の細胞における同じマーカーの発現レベルとの比較は、好ましくは、同じ種から単離された2つの細胞型を比較することによって実施され得る。好ましくは、この種は哺乳動物であり、より好ましくはこの種はヒトである。そのような比較は、好都合には、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）実験を用いて実施され得る。
【０２４５】
本発明の分化したオルガノイドまたは本発明の分化した細胞の集団は、好ましくは、少なくとも50％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも60％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも70％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも80％の生存可能な細胞、より好ましくは少なくとも90％の生存可能な細胞を含む。細胞の生存率は、FACSにおけるHoechst染色またはヨウ化プロピジウム染色を用いて評価し得る。生存可能な細胞は、好ましくは対応するインビボ機能または特徴を有する。例えば、生存可能な肝細胞は、好ましくは肝細胞の肝機能または特徴を有する。
【０２４６】
いくつかの態様では、オルガノイドは、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺オルガノイドである。これは、オルガノイドが、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺細胞に由来することを意味する。いくつかの態様では、オルガノイドは、肝臓または膵臓オルガノイドである。好ましい態様では、オルガノイドは肝臓オルガノイドである。
【０２４７】
いくつかの態様では、本発明の分化細胞の集団は、肝臓、膵臓、腸、胃、前立腺、肺、乳房、卵巣、唾液腺、毛包、皮膚、食道、耳、膀胱または甲状腺細胞に由来する。いくつかの態様では、分化細胞の集団は、肝細胞または膵細胞に由来する。好ましい態様では、細胞の分化した集団は肝細胞に由来する。
【０２４８】
本発明者らは、本発明の方法によって得られる肝臓オルガノイドは、以前に国際公開公報第2012/014076号および国際公開公報第2015/173425号に記載された分化肝臓オルガノイドにおけるよりも、これらのオルガノイド中の細胞のより大きな割合が分化し、実施例1記載の旧分化培地（DM）で分化した肝臓オルガノイドにおけるよりも、これらのオルガノイド中の細胞のより大きな割合が分化する（例えば本発明のオルガノイド中の細胞集団のより大きな割合が肝細胞マーカーを発現する）ので、改善されていることを示した。加えて、本発明のオルガノイド中の分化細胞は、以前に国際公開公報第2012/014076号および国際公開公報第2015/173425号に記載された分化肝臓オルガノイド中の分化細胞よりも肝細胞に密接に類似し、本発明のオルガノイド中の分化細胞は、実施例1記載の旧分化培地（DM）で分化した肝臓オルガノイド中の分化細胞よりも肝細胞に密接に類似する（例えば、本発明のオルガノイド中の個々の分化細胞における肝細胞マーカーの平均発現レベルがより高い）。さらに、肝臓オルガノイドは、以前に国際公開公報第2012/014076号および国際公開公報第2015/173425号に記載された肝臓オルガノイド、または実施例1記載の旧分化培地（DM）で分化した肝臓オルガノイドと比較して、低下した胆管運命拘束を有する。
【０２４９】
いくつかの態様では、本発明の分化オルガノイドは、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が肝細胞マーカー（例えばアルブミン、HNF4a、ASGPR、CYP1A2および/またはCYP3A4）を発現する、分化した肝臓オルガノイドである。いくつかの態様では、mRNA発現は、免疫蛍光染色によって測定される。
【０２５０】
いくつかの態様では、分化した細胞の集団は、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％の細胞が肝細胞マーカー（例えばアルブミン、HNF4a、ASGPR、CYP1A2および/またはCYP3A4）を発現する、分化した肝細胞の集団である。いくつかの態様では、mRNA発現は、免疫蛍光染色によって測定される。
【０２５１】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドよりも、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも200％または少なくとも300％多い細胞が肝細胞マーカー（例えばアルブミン、HNF4a、ASGPR、CYP1A2および/またはCYP3A4）を発現する、分化した肝臓オルガノイドである。いくつかの態様では、mRNA発現は、免疫蛍光染色によって測定される。これに関連して、「対応する肝臓オルガノイド」は、同じ供給源からの、例えば同じオルガノイド培養物および同じ個体の細胞に由来する肝臓オルガノイドを意味する。この項の他の箇所でも同じ定義が適用される。
【０２５２】
いくつかの態様では、分化した細胞の集団は、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した肝細胞の対応する集団よりも、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも200％または少なくとも300％多い細胞が肝細胞マーカー（例えばアルブミン、HNF4a、ASGPR、CYP1A2および/またはCYP3A4）を発現する、分化した肝細胞の集団である。いくつかの態様では、mRNA発現は、免疫蛍光染色によって測定される。これに関連して、「対応する肝細胞の集団」は、同じ供給源からの、すなわち同じ細胞培養物および同じ個体の細胞に由来する肝細胞の集団を意味する。この項の他の箇所でも同じ定義が適用される。
【０２５３】
以下に詳述するように、分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、ハウスキーピング遺伝子（例えばGAPDH）のmRNA発現レベルと比較した、様々なマーカー（例えばアルブミン、HNF4、セルピンA1、ASPGR、Cyp1A2、Cyp3A4、CK7および/またはCK19）のmRNA発現レベルに基づいて定義され得る。いくつかの態様では、これらのマーカーの1つまたは複数およびハウスキーピング遺伝子のmRNA発現レベルを、RT-PCRを用いて決定する。いくつかの態様では、決定は以下を含む:（a）本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは本発明の分化した肝細胞の集団からのmRNAの単離、（b）単離されたmRNAのcDNAへの逆転写、（c）（i）関心対象のマーカー（例えばアルブミン、HNF4、セルピンA1、ASPGR、Cyp1A2、Cyp3A4、CK7またはCK19）および（ii）ハウスキーピング遺伝子（例えばGAPDH）に対応するcDNAのPCR増幅、ならびに（d）ハウスキーピング遺伝子（例えばGAPDH）に対応するcDNAのPCR増幅から得られたPCR産物の量と比較した、関心対象のマーカー（例えばアルブミン、HNF4、セルピンA1、ASPGR、Cyp1A2、Cyp3A4、CK7またはCK19）に対応するcDNAのPCR増幅から得られたPCR産物の量の定量化。
【０２５４】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、アルブミンのmRNA発現レベルが、少なくとも1.0x10-2、少なくとも1.0x10-1、少なくとも1.0x100、少なくとも1.0x101または少なくとも5.0×101（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２５５】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、アルブミンのmRNA発現レベルが、少なくとも1.0x10-2、少なくとも1.0x10-1、少なくとも1.0x100、少なくとも1.0x101または少なくとも5.0×101（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝細胞の集団である。
【０２５６】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、HNF4aのmRNA発現レベルが、少なくとも0.002、少なくとも0.003、少なくとも0.004、少なくとも0.005、少なくとも0.006、少なくとも0.007、少なくとも0.008、少なくとも0.009または少なくとも0.01（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２５７】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、HNF4aのmRNA発現レベルが、少なくとも0.002、少なくとも0.003、少なくとも0.004、少なくとも0.005、少なくとも0.006、少なくとも0.007、少なくとも0.008、少なくとも0.009または少なくとも0.01（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝細胞の集団である。
【０２５８】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、セルピンA1のmRNA発現レベルが、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9または少なくとも10（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２５９】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、セルピンA1のmRNA発現レベルが、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9または少なくとも10（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝細胞の集団である。
【０２６０】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、ASPGRのmRNA発現レベルが、少なくとも0.001、少なくとも0.002、少なくとも0.003、少なくとも0.004、少なくとも0.005、少なくとも0.006、少なくとも0.007、少なくとも0.008、少なくとも0.009、少なくとも0.01、少なくとも0.02、少なくとも0.03、少なくとも0.04、少なくとも0.05、少なくとも0.06、少なくとも0.07、少なくとも0.08、少なくとも0.09または少なくとも0.1（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２６１】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、分化した肝細胞の集団である。
【０２６２】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、Cyp1A2のmRNA発現レベルが、少なくとも2.0x10-5、少なくとも3.0x10-5、少なくとも4.0x10-5、少なくとも5.0x10-5、少なくとも6.0×10-5、少なくとも7.0×10-5、少なくとも8.0×10-5、少なくとも9.0×10-5、少なくとも1.0×10-4、少なくとも2.0×10-4、少なくとも3.0×10-4、少なくとも4.0×10-4、少なくとも5.0×10-4、少なくとも7.0×10-4、少なくとも1.0×10-3、少なくとも5.0×10-3、少なくとも1.0×10-2または少なくとも5.0×10-2（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２６３】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、Cyp1A2のmRNA発現レベルが、少なくとも2.0x10-5、少なくとも3.0x10-5、少なくとも4.0x10-5、少なくとも5.0x10-5、少なくとも6.0×10-5、少なくとも7.0×10-5、少なくとも8.0×10-5、少なくとも9.0×10-5、少なくとも1.0×10-4、少なくとも2.0×10-4、少なくとも3.0×10-4、少なくとも4.0×10-4、少なくとも5.0×10-4、少なくとも7.0×10-4、少なくとも1.0×10-3、少なくとも5.0×10-3、少なくとも1.0×10-2または少なくとも5.0×10-2（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝細胞の集団である。
【０２６４】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、Cyp3A4のmRNA発現レベルが、少なくとも0.1、少なくとも0.2、少なくとも0.3、少なくとも0.4、少なくとも0.5、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9または少なくとも1.0（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、Cyp3A4のmRNA発現レベルが、正常ヒト肝細胞で認められる発現レベルの少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２６５】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、Cyp3A4のmRNA発現レベルが、少なくとも0.1、少なくとも0.2、少なくとも0.3、少なくとも0.4、少なくとも0.5、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9、または少なくとも1.0（GAPDH発現に対して）である、分化した肝細胞の集団である。いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、Cyp3A4のmRNA発現レベルが、正常ヒト肝細胞で認められる発現レベルの少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２６６】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、CK7のmRNA発現レベルが、0.08未満、0.07未満、0.06未満、0.05未満、0.04未満、0.03未満、 0.02未満、0.01未満、0.009未満、0.008未満、0.007未満、0.006未満、0.005未満、0.004未満、0.003未満または0.002未満（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２６７】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、CK7のmRNA発現レベルが、0.08未満、0.07未満、0.06未満、0.05未満、0.04未満、0.03未満、0.02未満、0.01未満、0.009未満、0.008未満、0.007未満、0.006未満、0.005未満、0.004未満、0.003未満または0.002未満（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝細胞の集団である。
【０２６８】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、CK19のmRNA発現レベルが、0.03未満、0.02未満、0.01未満、0.009未満、0.008未満、0.007未満、0.006未満、0.005未満、0.004未満、0.003未満または0.002未満（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝臓オルガノイドである。いくつかの態様では、CK19のmRNA発現レベルは、正常ヒト肝細胞におけるCK19のmRNA発現レベルよりも10倍未満、9倍未満、8倍未満、7倍未満、6倍未満、5倍未満、4倍未満、3倍未満または2倍未満高い。
【０２６９】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、CK19のmRNA発現レベルが、0.03未満、0.02未満、0.01未満、0.009未満、0.008未満、0.007未満、0.006未満、0.005未満、0.004未満、0.003未満または0.002未満（GAPDH発現と比較して）である、分化した肝細胞の集団である。いくつかの態様では、CK19のmRNA発現レベルは、正常ヒト肝細胞におけるCK19のmRNA発現レベルよりも10倍未満、9倍未満、8倍未満、7倍未満、6倍未満、5倍未満、4倍未満、3倍未満または2倍未満高い。
【０２７０】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、平均Cyp3A4活性が、正常ヒト肝細胞で認められる平均Cyp3A4活性の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２７１】
いくつかの態様では、分化した細胞の集団は、平均Cyp3A4活性が、正常ヒト肝細胞で認められる平均Cyp3A4活性の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％である、分化した肝細胞の集団である。
【０２７２】
いくつかの態様では、Cyp3A4活性は、P450-Glo（商標）アッセイ（Promega）を用いて測定される。P450-Glo（商標）アッセイは、シトクロムP450活性を測定するための発光方法を含む。特に、従来のシトクロムP450反応は、シトクロムP450および発光性シトクロムP450基質をインキュベートすることによって行われる。P450-Glo（商標）アッセイの基質は、甲虫ルシフェリンの誘導体である。誘導体はシトクロムP450によってルシフェリンに変換され、次にルシフェリンがルシフェラーゼと反応して光を生成する。生成される光の量は、シトクロムP450活性に正比例する。いくつかの態様では、Cyp3A4活性の測定単位は、発光/ml/1000細胞である。
【０２７３】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、アルブミン分泌のレベルが、正常ヒト肝細胞で認められるアルブミン分泌のレベルの少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも30％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％である、分化した肝臓オルガノイドである。いくつかの態様では、アルブミン分泌の測定単位は、ng/106細胞/24時間である。いくつかの態様では、アルブミン分泌のレベルは、少なくとも100ng/106細胞/24時間、少なくとも200ng/106細胞/24時間、少なくとも500ng/106細胞/24時間、少なくとも1000ng/106細胞/24時間または少なくとも2000ng/106細胞/24時間である。
【０２７４】
いくつかの態様では、アルブミン分泌は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって測定される。例えば、サンドイッチELISAに基づく、ヒトアルブミンELISAキット（Bethyl Laboratories,Inc.）を使用し得る。ヒトアルブミンELISAキットの基礎となる原理を次の段落に示す。しかし、任意の適切なELISAキットを使用し得る。
【０２７５】
試験試料中に存在するヒトアルブミンは、マイクロタイターウェルの表面に予め吸着された抗ヒトアルブミン抗体によって捕捉され得る。試料の結合後、結合していないタンパク質および分子を洗い流し、ビオチン化検出抗体をウェルに添加して、捕捉されたアルブミンに結合させる。次いで、発色基質TMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）との比色反応を触媒するために、ストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（SA-HRP）を添加する。比色反応は青色の生成物を生じ、希硫酸の添加によって反応を終了させると生成物が黄色に変わる。450nmでの黄色生成物の吸光度は、試料中に存在するアルブミン被検体の量に比例し、4パラメータ標準曲線を作成することができる。次いで、試験試料中のアルブミン濃度を、試料と並行して作成した標準曲線からのそれらの吸光度を補間することによって定量化することができる。試料希釈を因数分解した後、最終的に元の試料中のアルブミン濃度を計算することができる。
【０２７６】
ヒトアルブミンELISAキットの例示的な手順の概要を以下に示す:
（1）標準物質または試料100μlを指定のウェルに添加する。各標準物質または試料を二重に検定する。
（2）プレートを覆い、室温（20〜25℃）で1時間インキュベートする。
（3）プレートを4回洗浄する。
（4）抗アルブミン検出抗体100μlを各ウェルに添加する。
（5）プレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。
（6）プレートを4回洗浄する。
（7）HRP溶液A 100μlを各ウェルに添加する。
（8）プレートを覆い、室温で30分間インキュベートする。
（9）プレートを4回洗浄する。
（10）TMB基質溶液100μlを各ウェルに添加する。
（11）暗所にてプレートを室温で30分間インキュベートする。
（12）停止液100μlを各ウェルに添加して反応を停止させる。
（13）450nmのプレートリーダーで吸光度を測定する。
【０２７７】
いくつかの態様では、分化細胞の集団は、ミダゾラムの1-OH-ミダゾラムへの変換のレベルが、少なくとも1mg/L/106細胞、少なくとも1.5mg/L/106細胞、少なくとも2mg/L/106細胞、少なくとも2.5mg/L/106細胞、少なくとも3mg/L/106細胞、少なくとも3.5mg/L/106細胞または少なくとも4mg/L/106細胞である、分化した肝細胞の集団である。
【０２７８】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、ミダゾラムの1-OH-ミダゾラムへの変換のレベルが、少なくとも1mg/L/106細胞、少なくとも1.5mg/L/106細胞、少なくとも2mg/L/106細胞、少なくとも2.5mg/L/106細胞、少なくとも3mg/L/106細胞、少なくとも3.5mg/L/106細胞または少なくとも4mg/L/106細胞である、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２７９】
いくつかの態様では、本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、（例えば本明細書記載のような）適切なmRNA発現アッセイを用いて決定した場合、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドまたは分化肝細胞の集団と比較して、アルブミン、HNF4a、ASGPR、CYP1A2およびCYP3A4から選択される1つまたは複数の（または全部の）肝細胞マーカーの、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも100倍高い発現を有する。
【０２８０】
いくつかの態様では、本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、（例えば本明細書記載のような）適切なmRNA発現アッセイを用いて決定した場合、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドまたは分化肝細胞の集団と比較して、CK7および/またはCK19から選択される1つまたは複数の胆管マーカーの、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも100倍低い発現を有する。
【０２８１】
いくつかの態様では、本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、（例えば当技術分野で公知のような）ミダゾラム代謝についての適切なアッセイを用いて決定した場合、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドまたは分化肝細胞の集団と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍または少なくとも5倍高いミダゾラム代謝を有する。
【０２８２】
いくつかの態様では、本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、Cyp3A4活性についての適切なアッセイを用いて（例えば本明細書記載のP450-Glo（商標）アッセイ（Promega）を用いて）決定した場合、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドまたは分化肝細胞の集団と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも100倍である平均Cyp3A4活性を有する。
【０２８３】
いくつかの態様では、本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、Cyp1A2活性についての適切なアッセイを用いて（例えば本明細書記載のP450-Glo（商標）アッセイ（Promega）を用いて）決定した場合、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドまたは分化肝細胞の集団と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも100倍である平均Cyp1A2活性を有する。
【０２８４】
いくつかの態様では、本発明の分化した肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、アルブミン分泌についての適切なアッセイ（例えば本発明記載のヒトアルブミンELISAキット（Bethyl Laboratories,Inc.））を用いて決定した場合、以前のDM培地（実施例1に記載）で分化した対応する肝臓オルガノイドまたは分化肝細胞の集団と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍または少なくとも100倍であるアルブミン分泌のレベルを有する。
【０２８５】
いくつかの態様では、本発明の分化したオルガノイドは、以下の細胞型:肝マクロファージ、クップファー細胞、肝星細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の1つまたは複数（例えば1、2、3、4または5つ）が存在しない、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２８６】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、中心管腔を備えた嚢胞構造を有する。いくつかの態様では、中心管腔は上皮単層によって取り囲まれている。
【０２８７】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、血管または形成された胆管を含まない、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２８８】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、肝細胞が上皮単層に組み込まれている、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２８９】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、以下の特徴の1つまたは複数を有する分化した肝臓オルガノイドである:（a）上皮単層によって取り囲まれた中心管腔を備えた嚢胞構造を有する;（b）以下の細胞型:肝マクロファージ、クップファー細胞、肝星細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞の1つまたは複数（例えば1、2、3、4または5つ）が存在しない;（c）血管または形成された胆管を含まない;ならびに（d）肝細胞が上皮単層に組み込まれている。
【０２９０】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、球状の分化した肝臓オルガノイドである。
【０２９１】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、直径が0.02〜3mmである分化した肝臓オルガノイドである。
【０２９２】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、（i）分泌、代謝および/または同化肝細胞機能、ならびに（ii）分泌、代謝および/または同化胆管細胞機能、の1つまたは複数を示す、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２９３】
いくつかの態様では、分化したオルガノイドは、以下の機能:（i）胆汁産生;（ii）胆汁輸送;および（iii）血液濾過、の1つまたは複数を示さない、分化した肝臓オルガノイドである。
【０２９４】
また、本発明の分化培地中の本発明の肝上皮細胞の分化したオルガノイドまたは分化した集団も提供される。
【０２９５】
一態様では、例えば本明細書に記載のような、分化培地中のオルガノイドが提供される。
【０２９６】
一態様では、分化したオルガノイドは、本発明の方法を用いて培養中であり、したがって、細胞外マトリックスと接触しているオルガノイドである。好ましくは、分化したオルガノイドは非間充織細胞外マトリックスに埋め込まれている。
【０２９７】
オルガノイドまたは前駆細胞の集団は、任意の哺乳動物組織に由来し得るが、好ましくはヒト由来である。いくつかの態様では、オルガノイドまたは前駆細胞の集団は、マウス、ウサギ、ラット、モルモットまたは他の非ヒト哺乳動物由来である。
【０２９８】
（表３）分化した肝臓オルガノイドと一次肝組織との相違
2019514345.tif 000011
【０２９９】
分化したオルガノイドの使用
本明細書に記載のオルガノイドおよびオルガノイドに由来する細胞の使用も同様に提供される。この項でオルガノイドに言及する場合、これらは本発明に従う分化したオルガノイドである。用途の多くが本発明の方法によって得られるおよび/または得ることのできる分化細胞の集団にも適用できることは、当業者に理解されるであろう。本発明の方法によって得られるおよび/または得ることのできる分化細胞の集団のそのような使用も提供される。
【０３００】
例えば、本発明は、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;組織発生学、細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現の検討;組織損傷および修復に関与する機構の研究;炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または細胞形質転換およびがんの病因の機構の検討における、分化したオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の使用を提供する。
【０３０１】
本発明はまた、医療において使用するための、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供する。
【０３０２】
本発明はまた、障害、状態または疾患を治療する際に使用するための、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供する。
【０３０３】
本発明はまた、再生医療において使用するための本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供し、例えばこの使用には、オルガノイドまたは細胞の患者への移植が含まれる。
【０３０４】
本発明は、薬物スクリーニング、（薬物）標的検証、（薬物）標的発見、毒物学および毒性スクリーニング、個別化医療、再生医療における、ならびに/または疾患モデルなどのエクスビボ細胞/臓器モデルとしての、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の使用を提供する。
【０３０５】
本発明の培地および方法に従って培養された細胞およびオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表すと考えられる。これは、正常組織から増殖した細胞の分化した集団およびオルガノイド、ならびに病的組織から増殖した細胞の分化した集団およびオルガノイドの両方に当てはまる。したがって、正常エクスビボ細胞/臓器モデルを提供するだけでなく、本発明のオルガノイドはエクスビボ疾患モデルとしても使用することができる。
【０３０６】
本発明のオルガノイドはまた、病原体の培養にも使用することができ、したがって、エクスビボ感染モデルとして使用することができる。本発明のオルガノイドを使用して培養し得る病原体の例には、その動物宿主において疾患を引き起こすウイルス、細菌、プリオンまたは真菌が含まれる。したがって、本発明のオルガノイドは、感染状態を表す疾患モデルとして使用することができる。本発明のいくつかの態様では、オルガノイドは、ワクチンの開発および/または製造に使用することができる。
【０３０７】
したがって、本発明のオルガノイドによって検討することができる疾患には、例えば、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患（クローン病など）、がん腫、腺腫、腺がん、結腸がん、糖尿病（I型またはII型など）、バレット食道、ゴーシェ病、α-1-アンチトリプシン欠乏症、レッシュ-ナイハン症候群、貧血、シュバッハマン-ボディアン-ダイアモンド症候群、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、糖原病、家族性高コレステロール血症、クリグラー-ナジャー症候群、遺伝性高チロシン血症、ポンペ病、進行性家族性胆汁うっ滞、ハーラー症候群、SCIDまたは漏出SCID、オーメン症候群、軟骨毛髪形成不全症、単純ヘルペス脳炎、強皮症、骨形成不全症、ベッカー型筋ジストロフィ、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、先天性角化異常症等を含むがこれらに限定されるわけではない、遺伝性疾患、代謝性疾患、病原性疾患、炎症性疾患等が含まれる。
【０３０８】
従来から、細胞株およびより最近ではiPS細胞がエクスビボ細胞/臓器および/または疾患モデルとして使用されてきた（例えばRobinton et al.Nature 481,295,2012参照）。しかし、これらの方法には多くの課題と欠点がある。例えば、すべての患者から細胞株を得ることはできず（特定の生検材料だけが成功した細胞株になる）、したがって、個別化された診断および医療において細胞株を使用することができない。iPS細胞は、通常、細胞を特定の細胞運命に再プログラムするためにある程度の遺伝子操作を必要とする。あるいは、iPS細胞は、核型完全性に影響を及ぼす培養条件にさらされるため、培養時間を最小限に抑えなければならない（これはヒト胚性幹細胞の場合にも当てはまる）。これは、iPS細胞が、インビボ状況を正確に表すことはできないが、その代わりにインビボ細胞の挙動を模倣しようとする試みであることを意味する。細胞株およびiPS細胞はまた、遺伝的不安定性も抱える。
【０３０９】
対照的に、本発明のオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表す遺伝的に安定なプラットフォームを提供する。いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、対応するインビボ状況に存在するすべての分化した細胞型を含む。他の態様では、本発明のオルガノイドは、インビボで存在するすべての分化した細胞型を提供するためにさらに分化させ得る。したがって、本発明のオルガノイドは、様々な疾患および治療薬に対する機構的洞察を得るため、インビトロ薬物スクリーニングを実施するため、潜在的治療薬を評価するため、将来の新規（薬物）療法開発のための可能な標的（例えばタンパク質）を同定するため、ならびに/または細胞置換療法と組み合わせた遺伝子修復を探索するために使用することができる。
【０３１０】
本発明のオルガノイドは、それらの遺伝的完全性または表現型特性を失うことなく、ならびに増殖能力を喪失することなく、凍結および解凍して、培養することができる。したがって、オルガノイドは容易に保存および輸送することができる。したがって、いくつかの態様では、本発明は凍結オルガノイドを提供する。
【０３１１】
これらの理由から、本発明のオルガノイドまたは細胞の分化した集団は、薬物スクリーニング、標的検証、標的発見、毒物学および毒性スクリーニングならびに個別化医療のためのツールとなり得る。
【０３１２】
したがって、さらなる局面では、本発明は、本発明によるオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞の、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療などの医療における使用を提供する。例えば、小腸、結腸、膵臓、胃、肝臓または前立腺オルガノイドのいずれか1つを、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療などの医療において使用し得る。
【０３１３】
粘膜ワクチン
オルガノイドのさらなる重要な用途は、粘膜ワクチン接種の開発における使用である。粘膜ワクチンは、粘膜を介して投与されるワクチンである。これは、鼻、口または直腸などの任意の粘膜表面であり得る。粘膜ワクチンは、吸入器、スプレーまたは他の外部補助器具を介して投与することができる。これには、ワクチンの投与に医療スタッフが必要でないなどの、注射に比べていくつかの明確な利点があり、これは、例えば発展途上国において重要であり得る。
【０３１４】
腸において、M細胞（または「ミクロフォールド細胞」）は、回腸の集合リンパ小節の濾胞関連上皮に見出される細胞である。M細胞は、生物および粒子を、腸内腔から上皮障壁を横切って免疫細胞に輸送し、したがって、粘膜免疫を刺激する上で重要である。それらは、エンドサイトーシスまたは食作用を介して小腸の内腔から抗原を取り込み、次いでそれを、トランスサイトーシスを介して、基底外側の独特のポケット様構造に位置する樹状細胞（抗原提示細胞）およびリンパ球（すなわちT細胞）に送達するユニークな能力を有する。
【０３１５】
オルガノイドは、場合によっては、RANKリガンドで刺激されるとM細胞に発達することができる（例えば国際公開公報第2012/169830号の図49参照）。したがって、本発明のいくつかの態様では、分化細胞集団はM細胞を含む。本発明のいくつかの態様では、オルガノイドはM細胞を含む。いくつかの態様では、RANKリガンドでオルガノイドを刺激する工程を含む、M細胞またはM細胞を含むオルガノイドを得るための方法が提供される。
【０３１６】
粘膜ワクチンがM細胞を標的とする場合、粘膜ワクチンの効率は実質的に上昇し得る。したがって、本発明の分化した細胞集団またはオルガノイドは、M細胞が病原体または抗原を取り込み、それらを免疫系に提示する能力を試験するために使用することができる。したがって、いくつかの態様では、本発明は、薬物スクリーニング、例えばワクチン開発および/またはワクチン製造における本発明のオルガノイドの使用を提供する。例えば、いくつかの態様では、オルガノイドは、ウイルス、細菌、真菌または他の寄生生物感染、例えば（限定されることなく）、コレラ、RSウイルス（RSV）、ロタウイルスおよびHIVに対するワクチンの開発または製造のために使用し得る。特定の態様では、本発明は、粘膜ワクチン開発に使用するための、RANKLを含む本発明の培養培地で分化したオルガノイドを提供する。
【０３１７】
薬物スクリーニング
好ましくはハイスループットの目的のために、本発明の前記オルガノイドは、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレートなどのマルチウェルプレートで培養される。前記オルガノイドに影響を及ぼす分子を同定するために、分子のライブラリが使用される。好ましいライブラリには、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばLOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質ライブラリ（BioMol）、合成化合物ライブラリ（例えばLOP AC（商標）、Sigma Aldrich）または天然化合物ライブラリ（Specs、TimTec）が含まれる。さらに、幹細胞の子孫において1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導するまたは抑制する遺伝子ライブラリを使用することができる。これらの遺伝子ライブラリには、cDNAライブラリ、アンチセンスライブラリおよびsiRNAまたは他の非コードRNAライブラリが含まれる。細胞は、好ましくは、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。曝露期間の終わりに、培養物を評価する。「影響を及ぼす」という用語は、増殖の減少または消失、形態変化および細胞死を含むがこれらに限定されるわけではない、細胞の任意の変化をカバーするために使用される。本発明の前記オルガノイドは、上皮がん細胞を特異的に標的とするが、本発明の前記オルガノイドは標的としない薬物を同定するためにも使用できる。
【０３１８】
短期間（数日）で本発明の有用なオルガノイドが得られることは、特定の薬物に対する個々の患者の応答を試験し、応答性に従って治療を調整するためにオルガノイドが極めて有用であることを示す。オルガノイドが患者由来の生検材料から得られるいくつかの態様では、オルガノイドは、21日未満、例えば14日未満、13日未満、12日未満、11日未満、10日未満、9日未満、8日未満、7日未満（等）で培養される。
【０３１９】
オルガノイドはまた、より広範囲の創薬目的（例えば、嚢胞性線維症またはコレラのための薬物のスクリーニングを記載する国際公開公報第2013/093812号参照）にも有用である。したがって、いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症薬のスクリーニングに使用することができる。しかし、本発明のオルガノイドは、ヒト胃腸管の感染性、炎症性および新生物性病変および胃腸管の他の疾患、ならびに膵臓、肝臓および前立腺を含む本明細書記載の他の組織の感染性、炎症性および新生物性病変および他の疾患のための薬物スクリーニングツールとして広く適用できることが当業者に理解されるであろう。いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、がん薬剤のスクリーニングに使用することができる。
【０３２０】
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、化学物質、抗体、天然産物（植物抽出物）等のライブラリを、薬物、化粧品および/または予防薬としての使用の適切性に関して試験するために使用することができる。例えば、いくつかの態様では、がん患者由来の腫瘍細胞などの関心対象の患者からの細胞生検材料を、本発明の培養培地および方法を用いて培養し、次いで化学化合物または化学物質ライブラリで処理することができる。次に、どの化合物が患者の細胞を有効に改変、死滅および/または治療するかを決定することが可能である。これは、特定の薬物に対する特定の患者の応答性を試験することを可能にし、したがって、特定の患者に治療を適合させることを可能にする。したがって、これは個別化医療アプローチを可能にする。
【０３２１】
このようにして薬物を同定するためにオルガノイドを使用することのさらなる利点は、どの薬物および化合物が健常組織に対して最小限の影響しか及ぼさないかを調べるために、正常なオルガノイド（健常組織に由来するオルガノイド）をスクリーニングすることも可能であることである。これにより、最小限のオフターゲット活性または望ましくない副作用を有する薬物のスクリーニングが可能になる。
【０３２２】
このようにして、任意の数の疾患に対する薬物をスクリーニングすることができる。例えば、本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症、バレット食道、がん腫、腺がん、腺腫、炎症性腸疾患（クローン病など）、肝疾患等に対する薬物のスクリーニングに使用することができる。試験パラメータは、関心対象の疾患に依存する。例えば、抗がん剤をスクリーニングする場合、通常、がん細胞死が最終的な目的である。嚢胞性線維症については、薬物およびCFTRの刺激に応答したオルガノイドの拡大を測定することが関心対象である。他の態様では、関心対象の細胞またはオルガノイドに対するスクリーニングの化合物および薬物の作用を試験するために代謝または遺伝子発現を評価し得る。
【０３２３】
したがって、本発明は、治療的または予防的な医薬薬物または化粧品をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、
分化した細胞集団またはオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
前記分化細胞集団またはオルガノイドを任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性）について評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む。
【０３２４】
いくつかの態様では、本発明は、医薬または化粧品を調製するための方法を提供し、この方法は、
分化した細胞集団またはオルガノイドを候補分子（または候補分子のライブラリ）と接触させる工程;
前記分化細胞集団またはオルガノイドを任意の作用（例えば増殖の減少もしくは消失、形態学的変化および/もしくは細胞死などの細胞の任意の変化）またはオルガノイドの変化（例えばオルガノイドの大きさもしくは運動性）について評価する工程;
前記作用を生じさせる候補分子を潜在的な薬物または化粧品として同定する工程;ならびに任意で、
前記候補分子を医薬または化粧品として調製する工程
を含む。
【０３２５】
いくつかの態様では、スクリーニングのスループットを高めるためにコンピュータまたはロボット支援培養およびデータ収集方法が用いられる。いくつかの態様では、オルガノイドは患者の生検材料に由来する。いくつかの態様では、培養した分化細胞集団（例えばオルガノイド）に所望の作用を生じさせる候補分子を前記患者に投与する。
【０３２６】
したがって、一局面では、患者を治療する方法であって、
（a）患者における関心対象の病的組織から生検材料を得る工程;
（b）生検材料を培養してオルガノイドを得る工程;
（c）本発明のスクリーニング方法を用いて適切な薬物をスクリーニングする工程;および
（d）工程（c）で得られた薬物により前記患者を治療する工程
を含む、方法が提供される。
【０３２７】
いくつかの態様では、薬物または化粧品は、例えば、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患（クローン病など）、がん腫、腺腫、腺がん、結腸がん、糖尿病（I型またはII型など）、バレット食道、ゴーシェ病、α-1-アンチトリプシン欠乏症、レッシュ-ナイハン症候群、貧血、シュバッハマン-ボディアン-ダイアモンド症候群、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、糖原病、家族性高コレステロール血症、クリグラー-ナジャー症候群、遺伝性高チロシン血症、ポンペ病、進行性家族性胆汁うっ滞、ハーラー症候群、SCIDまたは漏出SCID、オーメン症候群、軟骨毛髪形成不全症、単純ヘルペス脳炎、強皮症、骨形成不全症、ベッカー型筋ジストロフィ、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、先天性角化異常症等を含むがこれらに限定されるわけではない、遺伝性疾患、代謝性疾患、病原性疾患、炎症性疾患等の症状を治療する、予防するまたは改善するために使用される。
【０３２８】
いくつかの態様では、本発明は、再生医療のための薬物、例えば肝臓を再生するための薬物をスクリーニングするための方法を提供する。
【０３２９】
標的発見
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは標的発見のために使用することができる。健常組織または病的組織に由来するオルガノイドの細胞は、標的同定のために使用し得る。本発明のオルガノイドは、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患（クローン病など）、がん腫、腺腫、腺がん、結腸がん、糖尿病（I型またはII型など）、バレット食道、ゴーシェ病、α-1-アンチトリプシン欠乏症、レッシュ-ナイハン症候群、貧血、シュバッハマン-ボディアン-ダイアモンド症候群、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、糖原病、家族性高コレステロール血症、クリグラー-ナジャー症候群、遺伝性高チロシン血症、ポンペ病、進行性家族性胆汁うっ滞、ハーラー症候群、SCIDまたは漏出SCID、オーメン症候群、軟骨毛髪形成不全症、単純ヘルペス脳炎、強皮症、骨形成不全症、ベッカー型筋ジストロフィ、デュシェンヌ型筋ジストロフィ、先天性角化異常症等についての薬物標的の発見のために使用し得る。本発明の培地および方法に従って培養されたオルガノイドは、インビボ状況を忠実に表すと考えられる。この理由から、前記オルガノイドは、特定の疾患における新規（分子）標的を見出すためのツールとなり得る。
【０３３０】
新たな薬物標的を探索するために、化合物（siRNAなど）のライブラリを用いて細胞に形質導入し、特定の遺伝子を不活性化し得る。いくつかの態様では、（大きな）遺伝子群の機能を阻害するために、siRNAを細胞に形質導入する。遺伝子群または特定の細胞機能の任意の機能的読み取りを用いて、標的が試験に適切であるかどうかを判定することができる。疾患特異的読み取りは、当技術分野で周知のアッセイを用いて決定することができる。例えば、がんに関与する遺伝子を試験するために細胞増殖をアッセイする。例えば、本明細書に記載のTopflashアッセイを用いて、siRNA阻害によって引き起こされるWnt活性の変化を検出し得る。増殖の減少または細胞死が起こる場合、対応するsiRNA関連遺伝子は、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。これらの遺伝子は、これらの細胞の増殖を阻害するための可能性のある標的である。同定に際して、試験した細胞工程について同定された標的の特異性を、当技術分野で周知の方法によって決定する必要がある。これらの方法を用いて、新しい分子を、治療のための可能性のある薬物標的として同定することができる。
【０３３１】
標的および薬物検証スクリーニング
病的および/または正常組織から得られた患者特異的オルガノイドは、ハイスループットスクリーニングで同定された分子の標的検証のために使用することができる。同じことが、ハイスループットスクリーニングにおいて可能性のある治療薬として同定された化合物の検証にも当てはまる。オルガノイド培養系で分化させた一次患者材料の使用は、ハイスループット創薬細胞株試験からの偽陽性等を試験するのに有用であり得る。
【０３３２】
いくつかの態様では、本発明のオルガノイドは、ハイスループットスクリーニングにおいて可能性のある薬物または化粧品として同定された化合物の検証に使用することができる。
【０３３３】
毒性アッセイ
肝臓、腸オルガノイドまたは膵臓オルガノイドなどの前記分化幹細胞集団（例えば本発明のオルガノイド）は、さらに、潜在的な新規薬物または公知もしくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおいてCaco-2細胞などの細胞株の使用に取って代わることができる。
【０３３４】
毒性スクリーニングは薬物スクリーニングと同様に機能するが（上記のように）、薬物の毒性作用を試験するものであり、治療効果は試験しない。したがって、いくつかの態様では、候補化合物の作用は毒性作用である。
【０３３５】
病原体の培養
さらに、本発明のオルガノイドは、現在適切な組織培養または動物モデルが存在しないノロウイルスなどの病原体の培養に使用することができる。
【０３３６】
再生医療および移植
本発明は、再生医療および/または移植におけるオルガノイドの使用を提供する。本発明はまた、動物またはヒトにオルガノイドを移植することを含む治療方法を提供する。
【０３３７】
肝臓、腸オルガノイドまたは膵臓オルガノイドなどの本発明のオルガノイドは、再生医療において、例えば肝硬変の治療、腸管上皮の放射線後および/または手術後修復、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患に罹患している患者における腸上皮の修復、ならびに短腸症候群に罹患している患者における腸上皮の修復において有用である。小腸/結腸の遺伝性疾患の患者における腸上皮の修復において、さらなる使用が存在する。膵臓オルガノイドを含む培養物はまた、再生医療において、例えば膵臓またはその一部の切除後のインプラントとして、ならびにI型糖尿病およびII型糖尿病などの糖尿病の治療のためにも有用である。
【０３３８】
代替的な態様では、オルガノイドまたはオルガノイドから単離された細胞は、例えば膵β細胞を含む膵臓細胞または肝臓の肝細胞もしくは管細胞などの関連する組織運命に再プログラムし得る。本発明の培養方法は、密接に関連する上皮幹細胞を、膵β細胞を含む膵臓細胞または肝細胞に分化転換させる因子を分析することを可能にする。
【０３３９】
遺伝子治療を、損傷した組織または病的組織の修復を目的とする方法において付加的に使用できることは当業者に明らかであろう。例えば、DNAおよび/またはRNAのような遺伝情報を幹細胞に送達するために、アデノウイルスまたはレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを使用することができる。当業者は、遺伝子治療において標的とされる特定の遺伝子を置換または修復することができる。例えば、機能していない遺伝子を置換するために、正常遺伝子をゲノム内の非特異的位置に挿入し得る。別の例では、異常な遺伝子配列を、相同組換えを介して正常な遺伝子配列に置き換えることができる。あるいは、選択的復帰突然変異は、遺伝子をその正常な機能に戻すことができる。さらなる例は、特定の遺伝子の調節（遺伝子がオンまたはオフになる程度）を変更することである。好ましくは、オルガノイドの細胞またはオルガノイドに由来する細胞は、遺伝子治療アプローチによってエクスビボで処理され、その後治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに移入される。
【０３４０】
成体ドナーから採取された小さな生検材料は、明らかな制限または遺伝的悪影響を伴わずに増殖させることができるので、本発明の技術は、再生目的で移植可能な上皮を生成するのに役立ち得る。オルガノイドが、その3D構造および完全性を失うことなくならびに有意な細胞死を伴わずに凍結および解凍され、培養され得るという事実は、移植目的でのオルガノイドの適用性をさらに高める。さらに、いくつかの態様では、ECMに埋め込まれているまたはECMと接触しているオルガノイドを、哺乳動物、好ましくはヒトに移植することができる。別の態様では、オルガノイドとECMを同時に哺乳動物、好ましくはヒトに移植することができる。
【０３４１】
当業者は、ECMが、本発明による細胞の増殖した集団またはオルガノイドを含む組織様構造体を得るための3D足場として使用できることを理解するであろう。次いで、そのような構造体を、当技術分野で周知の方法によって患者に移植することができる。ECM足場は、コラーゲンおよび/またはラミニンなどのECMタンパク質を用いて合成的に作製することができ、あるいは、単離された臓器または組織断片を、ECMからなる足場を残すように「脱細胞化する」ことによって得ることができる（例えばMacchiarini et al.The Lancet,Volume 372,Issue 9655,Pages 2023-2030,2008参照）。いくつかの態様では、ECM足場は、臓器または組織断片を脱細胞化することによって得ることができ、任意で、前記臓器または組織断片は膵臓、肝臓、腸、胃または前立腺由来である。
【０３４２】
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトへの移植に使用するための、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を提供する。また、本発明のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を、移植を必要とする患者に移植する工程を含む、前記患者を治療する方法が提供され、前記患者は哺乳動物、好ましくはヒトである。いくつかの態様では、オルガノイドを、前記患者に移植する前にさらに分化させる。
【０３４３】
例えば、成体ドナーから採取され、増殖方法によって増殖され、その後本発明に従って分化された小さな生検材料。したがって、本明細書で提供される技術は、再生目的で移植可能な上皮を生成するのに役立ち得る。
【０３４４】
本発明は、本発明の膵臓オルガノイドまたは本発明の膵臓オルガノイドからの細胞を患者に移植する工程を含む、患者における糖尿病などのインスリン欠乏障害または機能不全の膵臓を有する患者を治療する方法を提供する。本発明はまた、本発明の肝臓オルガノイドまたは本発明の肝臓オルガノイドからの細胞を患者に移植する工程を含む、患者における肝臓疾患または状態を治療する方法を提供する。
【０３４５】
いくつかの態様では、細胞またはオルガノイドは、患者への移植時にはインスリンを発現または分泌しないが、インスリンを分泌するように患者の体内で分化する。例えば、インスリンを分泌する能力は、移植直後には検出可能でない場合があるが、移植後約1ヶ月、例えば移植後6週間、2ヶ月または3ヶ月までに存在し得る。
【０３４６】
患者は、好ましくはヒトであるが、代替的にネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギまたはマウスなどの非ヒト哺乳動物であり得る。
【０３４７】
したがって、細胞療法によるヒトまたは非ヒト動物患者の治療方法は本発明の範囲内に含まれる。そのような細胞療法は、任意の適切な手段を介して本発明の幹細胞またはオルガノイドを患者に適用することを包含する。具体的には、そのような治療方法は、損傷した組織の再生を含む。本発明に従って、患者を同種異系または自己由来の幹細胞またはオルガノイドで治療することができる。「自己由来」細胞は、例えば組織再生を可能にするために、それらが細胞療法のために再導入される同じ生物に由来する細胞である。しかし、細胞は、必ずしもそれらが導入される組織と同じ組織から単離されていない。自己由来細胞は、拒絶反応の問題を克服するための患者とのマッチングを必要としない。「同種異系」細胞は、同じ種であるが、例えば組織再生を可能にするために、細胞が細胞療法のために導入される個体とは異なる個体に由来する細胞である。拒絶反応の問題を防ぐために、ある程度の患者のマッチングが依然として必要であり得る。したがって、いくつかの態様では、移植は自己由来細胞を含む。いくつかの態様では、移植は同種異系細胞を含む。
【０３４８】
一般に、本発明の細胞またはオルガノイドは、注射または移植によって患者の体内に導入される。一般に、細胞は、それらが作用することを意図されている組織に直接注射される。あるいは、細胞は門脈を介して注射される。本発明の細胞および薬学的に許容される担体を含有する注射器は、本発明の範囲内に含まれる。本発明の細胞および薬学的に許容される担体を含有する注射器に取り付けられたカテーテルは、本発明の範囲内に含まれる。
【０３４９】
当業者は、移植される物質（すなわち、細胞の集団、細胞懸濁液中の単一細胞、オルガノイドまたはオルガノイドの断片）ならびに治療される臓器に依存して、適切な方法および投与経路を選択することができるであろう。
【０３５０】
上記で論じたように、本発明のオルガノイドまたは細胞は、組織の再生に使用することができる。この機能を達成するために、損傷した組織に細胞を直接注射または移植することができ、細胞は、体内でのそれらの位置に応じて、増殖し、最終的に必要な細胞型に分化し得る。あるいは、オルガノイドを、損傷した組織に直接注射または移植することができる。治療に感受性の組織には、特に疾患、傷害、外傷、自己免疫反応によって、またはウイルスもしくは細菌感染によって損傷を受けた可能性があるものを含む、すべての損傷組織が含まれる。本発明のいくつかの態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、結腸、小腸、膵臓、食道または胃系を再生するために使用される。
【０３５１】
例えば、一態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、ハミルトンシリンジを用いて患者に注射される。
【０３５２】
当業者は、治療される特定の状態について、本発明の細胞またはオルガノイドの適切な投与量がどのくらいであるかを認識するであろう。
【０３５３】
一態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、様々な組成物の溶液中、ミクロスフェア中または微粒子中のいずれかで、再生を必要とする組織または損傷した臓器の一部を灌流する動脈に投与される。一般に、そのような投与はカテーテルを用いて行われる。カテーテルは、血管形成術および/もしくは細胞送達のために使用される多種多様なバルーンカテーテルの1つ、または細胞を身体の特定の位置に送達する特定の目的のために設計されたカテーテルであり得る。特定の用途では、細胞またはオルガノイドは、多数の異なる生分解性化合物でできた直径約15μmのミクロスフェアに封入され得る。この方法は、血管内投与された細胞またはオルガノイドが損傷の部位に留まり、初回通過で毛細管ネットワークおよび全身循環に入らないようにし得る。毛細管ネットワークの動脈側での保持は、血管外空間への細胞またはオルガノイドの転移も促進し得る。
【０３５４】
別の態様では、オルガノイドまたは細胞は、全身に送達するために静脈を介して、または細胞もしくはオルガノイドが差し向けられる組織または身体部分に流入する特定の静脈内に局所的に、血管樹に逆行的に注射され得る。この態様のために、上記の調製物の多くが使用され得る。
【０３５５】
別の態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、生体適合性インプラントに接着した損傷組織に移植され得る。この態様では、細胞を、患者に移植する前にインビトロで生体適合性インプラントに接着させ得る。当業者には明らかなように、移植の前に、多くの接着剤のいずれか1つを使用して細胞をインプラントに接着させ得る。単なる例として、そのような接着剤には、フィブリン、インテグリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、カドヘリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、セレクチンファミリーの1つまたは複数のメンバー、1つまたは複数の細胞接着分子（CAM）、免疫グロブリンファミリーの1つまたは複数、および1つまたは複数の人工接着剤が含まれ得る。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。1つまたは複数の接着剤の任意の組み合わせを使用し得ることは、当業者には明らかであろう。
【０３５６】
別の態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、マトリックスを患者に移植する前に、マトリックスに埋め込まれ得る。一般に、マトリックスは患者の損傷組織に移植される。マトリックスの例には、コラーゲンベースのマトリックス、フィブリンベースのマトリックス、ラミニンベースのマトリックス、フィブロネクチンベースのマトリックスおよび人工マトリックスが含まれる。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。
【０３５７】
さらなる態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、マトリックス形成成分と共に患者に移植または注射され得る。これは、注射または移植後に細胞がマトリックスを形成することを可能にし、細胞またはオルガノイドが患者の体内の適切な位置に留まることを確実にし得る。マトリックス形成成分の例には、フィブリン糊液体アルキル、シアノアクリレートモノマー、可塑剤、デキストランなどの多糖、エチレンオキシド含有オリゴマー、ポロキサマーおよびPluronicなどのブロックコポリマー、TweenおよびTriton'8'などの非イオン性界面活性剤、ならびに人工マトリックス形成成分が含まれる。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。1つまたは複数のマトリックス形成成分の任意の組み合わせを使用し得ることは、当業者には明らかであろう。
【０３５８】
さらなる態様では、本発明のオルガノイドまたは細胞は、ミクロスフェア内に含まれ得る。この態様内では、細胞はミクロスフェアの中心内に封入され得る。またこの態様内では、細胞は、ミクロスフェアのマトリックス材料に埋め込まれ得る。マトリックス材料は、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール（PLGA）およびポリウレタンを含むがこれらに限定されるわけではない任意の適切な生分解性ポリマーを含み得る。このリストは単なる例として提供されるものであり、限定を意図しない。
【０３５９】
さらなる態様では、本発明の細胞またはオルガノイドは、移植を意図した医療装置に付着され得る。そのような医療装置の例には、ステント、ピン、ステッチ、スプリット、ペースメーカー、人工関節、人工皮膚およびロッドが含まれる。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。様々な方法によって細胞を医療装置に付着させ得ることは、当業者には明らかであろう。例えば、細胞またはオルガノイドは、フィブリン、インテグリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、カドヘリンファミリーの1つまたは複数のメンバー、セレクチンファミリーの1つまたは複数のメンバー、1つまたは複数の細胞接着分子（CAM）、免疫グロブリンファミリーの1つまたは複数、および1つまたは複数の人工接着剤を用いて医療装置に付着させ得る。このリストは説明のためのみに提供されるものであり、限定することを意図しない。1つまたは複数の接着剤の任意の組み合わせを使用し得ることは、当業者には明らかであろう。
【０３６０】
本発明の方法を用いて得られるオルガノイドまたは上皮幹細胞の集団または分化した細胞の集団は、様々な用途を有する。例えば、本発明は、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;発生学、細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現の検討;損傷および修復に関与する機構の研究;炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または細胞形質転換およびがんの病因の機構の検討における、本明細書記載のオルガノイドまたは上皮幹細胞/分化細胞の集団の使用を提供する。
【０３６１】
一局面では、本発明は、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療における本明細書記載のオルガノイドまたは上皮幹細胞/分化細胞の集団の使用を提供する。同様に、本発明は、これらの用途のための本発明のオルガノイドの子孫の使用を提供する。
【０３６２】
毒性アッセイは、オルガノイドまたはその一部またはオルガノイドに由来する細胞を用いるインビトロアッセイであり得る。そのような子孫およびオルガノイドは、例えば、毒性アッセイにおいて現在使用されているCaco-2（ATCC HTB-37）、I-407（ATCC CCL6）およびXBF（ATCC CRL 8808）などの上皮細胞株よりも培養が容易であり、初代上皮細胞により密接に類似する。オルガノイドを用いて得られる毒性結果は、患者で得られる結果により密接に類似すると予想される。細胞に基づく毒性試験は、臓器特異的細胞傷害性を測定するために使用される。前記試験において試験される化合物は、がんの化学予防剤、環境化学物質、栄養補助食品および潜在的な毒物を含む。細胞は、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。アッセイにおける試験作用物質の濃度範囲は、5日間の曝露および最も高い可溶性濃度からの対数希釈を用いる予備アッセイにおいて決定される。曝露期間の終わりに、培養物を増殖の阻害について評価する。データを分析して、エンドポイントを50％阻害した濃度（TC50）を決定する。
【０３６３】
例えば、本発明のこの局面によれば、候補化合物を本明細書に記載の細胞またはオルガノイドと接触させることができ、細胞に対する任意の変化または細胞の活性における変化をモニタし得る。
【０３６４】
ハイスループットの目的のために、前記オルガノイドは、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレートなどのマルチウェルプレートで培養される。前記オルガノイドに影響を及ぼす分子を同定するために、分子のライブラリが使用される。好ましいライブラリには、抗体断片ライブラリ、ペプチドファージディスプレイライブラリ、ペプチドライブラリ（例えばLOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質ライブラリ（BioMol）、合成化合物ライブラリ（例えばLOP AC（商標）、Sigma Aldrich）または天然化合物ライブラリ（Specs、TimTec）が含まれる。さらに、腺腫細胞の子孫において1つまたは複数の遺伝子の発現を誘導または抑制する遺伝子ライブラリを使用することができる。これらの遺伝子ライブラリには、cDNAライブラリ、アンチセンスライブラリおよびsiRNAまたは他の非コードRNAライブラリが含まれる。細胞は、好ましくは、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。曝露期間の終わりに、培養物を評価する。「影響を及ぼす」という用語は、増殖の減少または消失、形態変化および細胞死を含むがこれらに限定されるわけではない、細胞の任意の変化をカバーするために使用される。前記オルガノイドは、上皮がん細胞を特異的に標的とするが、前記オルガノイドを標的としない薬物を同定するためにも使用することができる。
【０３６５】
本発明によるオルガノイドは、さらに、創薬スクリーニングおよび潜在的な新規薬物または公知の薬物または公知もしくは新規の栄養補助食品の毒性アッセイにおいてCaco-2細胞などの細胞株の使用を置き換えることができる。
【０３６６】
さらに、そのようなオルガノイドは、病原体の培養に使用することができる。
【０３６７】
本発明はさらに、治療における使用のための本発明の分化したオルガノイドまたは本発明の分化した細胞の集団を提供する。また、本明細書に記載の疾患または状態を治療する際に使用するための、本発明の分化したオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞も提供される。
【０３６８】
同様に、本発明の1つまたは複数のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を投与する工程を含む、本明細書に記載の疾患または状態を治療する方法が提供される。
【０３６９】
本発明者らはまた、免疫不全マウスへのオルガノイドの移植に成功したことを実証しており（例えば国際公開公報第2012/014076号の実施例7参照）、移植された肝臓オルガノイド由来の細胞は、インビボで胆管細胞および肝細胞の両方を産生した。したがって、一態様では、本発明は、ヒトまたは動物に移植するための本発明のオルガノイドまたはオルガノイド由来の細胞を提供する。
【０３７０】
本発明のオルガノイドの利点は、それらを凍結させ、後で機能を失うことなく解凍できることである。これにより、細胞バンキング、容易な保管、および急な使用のための迅速な入手が可能になる。これは、例えば、「既製の」製品、例えば肝臓の場合、急性肝毒性の治療に使用し得る製品の調製において有用であり得る。オルガノイドはまた、生きているドナーから小さな生検材料として採取された細胞または組織断片から増殖させることもでき、治療に対する倫理的反対を最小限に抑えられる。ドナーは、治療される患者からのものであってもよく、これにより外来細胞および臓器の移植に関連する負の副作用を低減し、免疫抑制薬の必要性を減らすことができる。
【０３７１】
いくつかの態様では、本発明はまた、本明細書に記載の分化培地の成分ならびに薬学的に許容される希釈剤および/または賦形剤を含有する医薬製剤を提供する。例えば、1つまたは複数のWnt阻害剤（例えばIWP-2および/またはiCRT3）、1つまたは複数のGSK-3阻害剤（例えばCHIR99021）、1つまたは複数のAP-1刺激剤（例えばカルバコール）、1つまたは複数の受容体チロシンキナーゼリガンド（例えばEGF、HGFおよび/またはFGF19）、1つまたは複数のTGF-β阻害剤（例えばA83-01）、1つまたは複数のNotch阻害剤（例えばDAPT）、1つまたは複数の糖質コルチコイド（例えばデキサメタゾン）ならびに薬学的に許容される希釈剤および/または賦形剤を含有する医薬製剤が提供される。好ましい態様では、医薬製剤は基礎培地を含まない。いくつかの態様では、医薬製剤は細胞外マトリックスを含まない。そのような製剤は、インビボでの幹細胞の分化の促進、例えば再生療法に適し得ると想定される。そのような製剤は、インサイチューで（例えば組織損傷の部位で）または全身的に投与され得る。あるいは、製剤は、当技術分野で公知の任意の投与経路、例えば静脈内、皮下、筋肉内投与、粘膜、皮内、皮内、経口および眼経路による投与に適するように製剤化され得る。したがって、医薬製剤は、そのような投与に適した任意の形態、例えば錠剤、注入液、カプセル、シロップ等であり得る。
【０３７２】
したがって、細胞療法によるヒトまたは非ヒト動物患者の治療方法は、本発明の範囲内に含まれる。本明細書での「動物」という用語は、すべての哺乳動物を意味する。患者は、胎芽期および胎児期を含む任意の発生段階にあり得る。例えば、患者は成体であってもよく、または治療は小児用（例えば新生児、小児または青年）であってもよい。そのような細胞療法は、任意の適切な手段による、本発明に従って生成された細胞またはオルガノイドの患者への投与を包含する。具体的には、そのような治療方法は、損傷した組織の再生を含む。本明細書で使用される「投与」という用語は、静脈内投与または注射などのよく知られた形態の投与、ならびに移植による投与、例えば手術による移植、グラフティングまたは本発明による細胞もしくはオルガノイドに由来する組織工学的に作製された細胞集団の移植による投与を指す。細胞の場合、個体への全身投与は、例えば、上腸間膜動脈、腹腔動脈、胸管を介した鎖骨下静脈への注入、上大静脈を介した心臓への注入、または腹腔への注入と横隔膜下リンパ管を介したその後の細胞移動、または肝動脈血液供給もしくは門脈への注入を介した肝臓部位への直接の注入によって可能であり得る。
【０３７３】
いくつかの態様では、1回の注入につき、100kgのヒトあたり104〜1013個の細胞が投与される。好ましくは、100kgのヒトあたり、約1〜5×104個から1〜5×107個の間の細胞が静脈内に注入され得る。より好ましくは、100kgのヒトあたり、約1×104〜10×106個の細胞が静脈内に注入され得る。いくつかの態様では、細胞またはオルガノイドの単回投与が提供される。他の態様では、複数回投与が用いられる。初期治療レジメンにわたって、例えば連続3〜7日間、複数回投与を提供し、その後また別の時点で繰り返すことができる。
【０３７４】
本明細書で説明されるように、Lgr5を発現する単一の細胞からオルガノイドを得ることも可能である。この単一細胞は、例えば遺伝的欠損または突然変異を修正するために、本明細書で定義される核酸構築物の導入によって改変されていてもよい。所望に応じて、例えばsiRNAを用いて、発現を特異的に消失させることも可能であろう。発現させる潜在的なポリペプチドは、例えばAAT（αアンチトリプシン）などの代謝性肝疾患におけるポリペプチド欠損を含む、代謝性疾患において欠損しているもののいずれかであり得る。生理学を解明するために、Wnt、EGF、FGF、BMPまたはnotch経路に関与する遺伝子を発現させ得るまたは不活性化し得る。また、薬物の毒性をスクリーニングするために、肝臓の薬物代謝を担う遺伝子（例えばCYPファミリーの遺伝子）の発現または不活性化は極めて興味深い。これは、本発明の細胞が肝細胞である場合に特に当てはまる。
【０３７５】
一態様では、増殖した上皮幹細胞を、例えば肝細胞および胆管細胞を含む肝臓細胞などの関連する組織運命に再プログラムし得る。本発明の培養方法は、密接に関連する上皮幹細胞を、肝細胞および胆管細胞を含む肝臓細胞に分化転換させる因子を分析することを可能にする。
【０３７６】
遺伝子治療を、損傷した組織または病的組織の修復を目的とする方法において付加的に使用できることは当業者に明らかであろう。例えば、DNAおよび/またはRNAのような遺伝情報を幹細胞に送達するために、アデノウイルスまたはレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを使用することができる。当業者は、遺伝子治療において標的とされる特定の遺伝子を置換または修復することができる。例えば、機能していない遺伝子を置換するために、正常遺伝子をゲノム内の非特異的位置に挿入し得る。別の例では、異常な遺伝子配列を、相同組換えを介して正常な遺伝子配列に置き換えることができる。あるいは、選択的復帰突然変異は、遺伝子をその正常な機能に戻すことができる。さらなる例は、特定の遺伝子の調節（遺伝子がオンまたはオフになる程度）を変更することである。好ましくは、幹細胞は、遺伝子治療アプローチによってエクスビボで処理され、その後治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに移入される。例えば、オルガノイド由来細胞は、患者に移植する前に培養下で遺伝的に改変されてもよい。
【０３７７】
したがって、いくつかの態様では、上皮幹細胞のオルガノイドまたは集団は、医療において使用するため、例えば障害、状態もしくは疾患を治療するため、および/または再生医療において使用するためのものである。
【０３７８】
1つの好ましい態様では、例えば、オルガノイドが再生医療に使用される場合、本方法は、細胞または組織断片が自己由来または同種異系である上皮細胞または組織断片から出発し得る。拒絶反応の問題を防ぐために、ある程度の患者のマッチングが依然として必要であり得る。組織拒絶反応を最小限に抑えるための技術は、当業者に公知である。
【０３７９】
オルガノイドおよび/または細胞を患者に移植する態様では、細胞を足場中で投与することが有利であり得る。したがって、本発明の1つまたは複数のオルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を含む足場が提供される。足場は、二次元または三次元ネットワークを提供する。そのような足場のための適切な合成材料には、多孔性固体、ナノファイバーならびにヒドロゲル、例えば自己組織化ペプチドを含むペプチド、ポリエチレングリコールホスフェート、ポリエチレングリコールフマレート、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリセルロースアセテートおよび/またはそれらのコポリマーからなるヒドロゲルから選択されるポリマーが含まれる（例えば、Saha et al.,2007.Curr Opin Chem Biol.11（4）:381-387;Saha et al.,2008.Biophysical Journal 95:4426-4438;Little et al.,2008.Chem.Rev 108,1787-1796参照）。当業者に公知のように、例えば足場の弾性などの機械的特性は、幹細胞の増殖、分化および移動に影響を与える。好ましい足場は、例えば組織再生および/または創傷治癒を促進するために、対象への移植後に天然に存在する成分によって置換される生分解性（コ）ポリマーを含む。前記足場は、対象への移植後に免疫原性応答を実質的に誘導しないことがさらに好ましい。前記足場には、幹細胞の増殖および/または分化および/または移動に必要なシグナルを提供する天然、半合成または合成リガンドが添加される。好ましい態様では、前記リガンドは規定されたアミノ酸断片を含む。前記合成ポリマーの例には、Pluronic（登録商標）F127ブロックコポリマー界面活性剤（BASF）およびEthisorb（登録商標）（Johnson and Johnson）が含まれる。いくつかの態様では、細胞を足場中で培養する。他の態様では、細胞を培養し、その後足場に加える。
【０３８０】
本発明の用途は、単一のオルガノイドを使用してもよく、または複数のオルガノイド、例えば2、3、4、5、10、15、20、30、50、100、200もしくはそれより多くのオルガノイドを使用してもよい。有利には、本発明の方法は指数増殖をもたらし、それにより関心対象の適用における使用のために十分な細胞が利用可能になることを確実にするので、本発明の方法は、多数のオルガノイドおよび上皮幹細胞が短期間で生成されることを可能にする。本明細書で、例えば本発明のオルガノイドまたは本発明のオルガノイドから得られる細胞を含む、「治療方法」または「治療のための方法」に言及される場合、これはまた、「治療における使用のための」オルガノイドまたは細胞、および「医薬の製造における使用のための」オルガノイドまたは細胞を等しく意味する。
【０３８１】
人工臓器
いくつかの態様では、分化したオルガノイドまたは分化したオルガノイドに由来する細胞の人工臓器における使用が提供される。人工臓器は、他の場所で説明される方法によってインビボで移植され得る。あるいは、人工臓器はエクスビボであり得る。いくつかの態様では、エクスビボ人工臓器は、例えば血液供給を介して患者に接続され得る。例えば、分化したオルガノイドを含む人工臓器は、透析装置の一部として使用し得る。したがって、分化したオルガノイドは、病的または損傷上皮組織を有する患者を支援するために使用することができる。
【０３８２】
本発明の使用を、肝臓および膵臓に関して以下に例示する。
【０３８３】
肝臓オルガノイドおよび細胞集団の使用
本発明の方法を用いて得られる肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団は、様々な用途を有する。例えば、本発明は、創薬スクリーニング;毒性アッセイ;肝臓発生学、肝細胞系列および分化経路の研究;組換え遺伝子発現を含む遺伝子発現試験;肝臓の損傷および修復に関与する機構の研究;肝臓の炎症性および感染性疾患の研究;発症機構の検討;または肝細胞形質転換および肝臓がんの病因の機構の検討における、本明細書記載の肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団の使用を提供する。
【０３８４】
一局面では、本発明は、創薬スクリーニング、毒性アッセイまたは再生医療における本明細書記載の肝臓オルガノイドまたは分化した肝細胞の集団の使用を提供する。同様に、本発明は、これらの用途のための本発明の肝臓オルガノイドの子孫の使用を提供する。
【０３８５】
毒性アッセイは、肝臓オルガノイドまたはその一部または肝臓オルガノイドに由来する細胞を用いるインビトロアッセイであり得る。そのような子孫および肝臓オルガノイドは、例えば、毒性アッセイにおいて現在使用されているCaco-2（ATCC HTB-37）、I-407（ATCC CCL6）およびXBF（ATCC CRL 8808）などの上皮細胞株よりも培養が容易であり、初代上皮細胞により密接に類似する。肝臓オルガノイドを用いて得られる毒性結果は、患者において得られる結果により密接に類似すると予想される。細胞に基づく毒性試験は、臓器特異的細胞傷害性を測定するために使用される。前記試験において試験される化合物は、がんの化学予防剤、環境化学物質、栄養補助食品および潜在的な毒物を含む。細胞は、複数の濃度の試験作用物質に一定期間曝露される。アッセイにおける試験作用物質の濃度範囲は、5日間の曝露および最も高い可溶性濃度からの対数希釈を用いる予備アッセイにおいて決定される。曝露期間の終わりに、培養物を増殖の阻害について評価する。データを分析して、エンドポイントを50％阻害した濃度（TC50）を決定する。
【０３８６】
例えば、肝臓の肝細胞におけるシトクロムP450酵素の誘導は、薬物の有効性および毒性を決定する重要な因子である。特に、P450の誘導は、厄介な薬物-薬物相互作用の重要な機構であり、また、薬物の有効性を制限し、薬物毒性を支配する重要な因子でもある。シトクロムP450誘導アッセイは、無傷の正常ヒト肝細胞を必要とするため、開発が困難であった。これらの細胞は、ハイスループットアッセイのための量産を維持するのに十分な数を生産することが困難であることが判明している。
【０３８７】
本発明は、医療または診断における使用のための本発明による肝臓オルガノイドまたは肝細胞の集団の使用を提供する。一態様では、本発明は、再生医療において、例えば肝臓上皮の放射線後および/または手術後修復、慢性または急性肝不全または疾患に罹患している患者の上皮の修復において使用するための、本発明による肝臓オルガノイドまたは肝細胞の集団の使用を提供する。肝臓オルガノイドまたは前記オルガノイドに由来する細胞を使用し得る肝疾患には、肝細胞がん、アラジール症候群、α-1-アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、慢性肝炎、肝臓がん、肝硬変、肝嚢胞、脂肪肝疾患、ガラクトース血症、ジルベール症候群、原発性胆汁性肝硬変、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、原発性硬化性胆管炎、ライ症候群、サルコイドーシス、チロシン血症、I型糖原病、ウィルソン病、新生児肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、ポルフィリン症およびヘモクロマトーシスが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０３８８】
いくつかの態様では、肝臓オルガノイドまたは肝細胞の集団は、遺伝的状態の治療に使用される。肝不全をもたらす遺伝的状態は、本発明の培地および/または方法に従って培養された細胞を用いた部分的または完全な細胞置換の形態での細胞療法から利益を得ることができる。肝不全をもたらす、本発明によって治療可能な遺伝的状態の非限定的なリストには、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、III型糖原病、チロシン血症、デオキシグアノシンキナーゼ欠損症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、先天性赤血球異形成貧血、多嚢胞性肝疾患、多発性嚢胞腎、α-1-アンチトリプシン欠損症、尿素サイクル異常症、有機酸血症、リソソーム蓄積症および脂肪酸酸化障害が含まれる。細胞療法から恩恵を受ける可能性がある他の状態には、ウィルソン病および遺伝性アミロイドーシス（FAP）も含まれる。
【０３８９】
完全な治療効果に到達するために肝臓全移植を必要とする肝不全の、他の肝細胞に関連しない原因も、本発明の培地および/または方法に従って培養された細胞を使用する細胞療法を用いたある程度の一時的な機能回復から利益を得られる可能性がある。本発明のオルガノイドおよび/または細胞の集団によって治療可能であり得るそのような状態の例の非限定的なリストには、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、アラジール症候群、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、肝硬変を伴うB型肝炎、肝硬変を伴うC型肝炎、バッド-キアリ症候群、原発性高シュウ酸尿症、自己免疫性肝炎およびアルコール性肝疾患が含まれる。
【０３９０】
本発明の肝臓オルガノイドは、機能不全の肝細胞を含む遺伝性疾患を治療する方法に使用し得る。そのような疾患は、早期発症または後期発症であり得る。早期発症疾患には、代謝産物に関連する臓器不全（例えばα-1-アンチトリプシン欠損症）、糖原病（例えばGSD II、ポンペ病）、チロシン血症、軽度DGUOK、CDA I型、尿素サイクル異常症（例えばOTC欠損症）、有機酸血症および脂肪酸酸化障害が含まれる。後期発症疾患には、原発性高シュウ酸尿症、家族性高コレステロール血症、ウィルソン病、遺伝性アミロイドーシスおよび多嚢胞性肝疾患が含まれる。本発明の肝臓オルガノイドから生じる健常肝細胞による部分的または完全な置換は、肝機能を回復させるためまたは肝不全を遅らせるために使用し得る。したがって、本発明は、肝機能の回復または肝不全の遅延のための、肝臓オルガノイドおよび/または肝細胞の集団の使用を提供する。
【０３９１】
本発明の肝臓オルガノイドは、遺伝性代謝性疾患に起因してまたは肝細胞感染症の結果として生じる慢性肝不全を治療する方法において使用し得る。遺伝性代謝性疾患の治療は、本発明の遺伝的に改変された自己由来肝臓オルガノイドの投与を含み得る。肝細胞感染症の治療は、本発明の同種異系肝臓オルガノイドの投与を含み得る。いくつかの態様では、肝臓オルガノイドは2〜3ヶ月の期間にわたって投与される。
【０３９２】
本発明の肝臓オルガノイドは、例えば、パラセタモール、薬物またはアルコールの使用から生じ得る肝臓中毒の結果としての急性肝不全を治療するために使用し得る。いくつかの態様では、肝機能を回復させる治療は、本発明のオルガノイドから得られる、凍結された即時使用できる同種異系肝細胞からの肝細胞懸濁液を注射することを含む。適切なオルガノイドを凍結できることは、オルガノイドを即時に送達することができ、そのため輸血を待つ必要がないことを意味する。
【０３９３】
欠損している肝機能を置換または修正する場合、本発明に従って生成された1つまたは複数の肝臓オルガノイドから細胞-マトリックス構造を構築することが可能であり得る。したがって、いくつかの態様では、肝臓オルガノイドに由来し、本明細書記載の治療における使用に適した細胞-マトリックス構造が提供される。
【０３９４】
適切な機能のためには肝臓細胞塊の約10％しか必要としないと考えられている。このことから、オルガノイド単位組成物の小児への移植は、ドナーが現れるのが比較的限られていることおよび若齢者の臓器の小さなサイズのために、臓器全体の移植よりも特に好ましい。例えば、8ヶ月齢の小児は約250gの重さの正常な肝臓を有する。したがって、この小児は約25gの組織を必要とする。成人の肝臓の重量は約1500gである;したがって、必要なインプラントは成人の肝臓の約1.5％に過ぎない。したがって、いくつかの態様では、この項に記載されている治療は小児用である。他の態様では、治療は成人向けである。
【０３９５】
いくつかの態様では、移植工程は、ポリマー足場などの足場を含む。本発明によるオルガノイド単位を移植し、任意でポリマー足場に付着させると、新しい宿主における増殖が起こり、結果として生じる肝細胞塊が、欠損した宿主機能に置き換わる。本発明者らは、成体肝臓幹細胞または非ヒト動物またはヒトへの移植に適した幹細胞を含む肝組織断片から成熟肝細胞を生成することが可能であることを示した。本発明による分化培地を用いて、本発明者らは、肝芽細胞を移植目的に適した成熟肝細胞にインビボで分化させることができることを示した。したがって、本発明者らは、肝臓の再生、欠損している肝機能の置換または修正のための肝細胞の新しい供給源を提供する。
【０３９６】
いくつかの態様では、患者の肝臓の10〜20％を、本発明の肝臓オルガノイドから生じる健常肝細胞で再配置/置換することが望ましい。
【０３９７】
いくつかの態様では、本発明は、治療における使用のための、分化培地から得られる肝臓オルガノイドまたは肝細胞の集団を提供する。そのようなオルガノイドおよび細胞の集団は、管細胞疾患を治療するために有用である。例えば、そのようなオルガノイドおよび細胞の集団は、管樹（ductal tree）の疾患、例えばJagged1（JAG1）における突然変異によって引き起こされる疾患、例えばアラジール症候群、または輸送体ABCB4における突然変異によって引き起こされる疾患、例えば低リン脂質関連胆石症を治療するために使用し得る。原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎およびカロリ病などの他の非遺伝性胆管症もまた、本発明の肝臓オルガノイドまたは肝細胞の増殖した集団を用いて治療し得る。そのような疾患は、管細胞を培養下で増殖させることから利益を得ることができる。本発明のオルガノイドまたは肝細胞の増殖した集団で治療することができる他の疾患には、ビリルビン代謝が影響を受ける遺伝性肝疾患が含まれる。そのような疾患は、肝細胞移植から恩恵を受ける。ビリルビン代謝の公知の遺伝的欠陥の例は、クリグラー-ナジャー症候群（UGT1A1遺伝子における突然変異）、デュービン-ジョンソン症候群（cMOATにおける突然変異）およびローター症候群（SLCO1B1およびSLCO1B3における突然変異）である。
【０３９８】
したがって、いくつかの態様では、肝臓オルガノイドまたは肝上皮細胞の集団は、肝臓の障害、状態もしくは疾患を治療するのに使用するため、または再生医療において使用するためのものである。
【０３９９】
膵臓オルガノイドおよび細胞集団の使用
膵臓細胞を培養するための方法は、国際公開公報第2010/090513号に記載されている。本発明の分化培地および方法は、膵臓から得られる上皮幹細胞の分化を増強すると想定される。
【０４００】
したがって、いくつかの態様では、本発明は、医療において使用するため、例えば膵臓の障害、状態もしくは疾患を治療するのに使用するためまたは再生医療において使用するための、膵臓オルガノイドまたは膵臓オルガノイドから得られる細胞を提供する。
【０４０１】
本発明はさらに、糖尿病（例えばI型もしくはII型糖尿病）、膵炎、膵臓がんまたは嚢胞性線維症の治療において使用するための膵臓オルガノイドまたは膵臓オルガノイドから得られる細胞を提供し、前記治療は、任意で、オルガノイドまたは膵臓オルガノイドから得られる細胞を、移植を必要とする患者に移植することを含む。いくつかの態様では、移植される細胞はインスリン分泌細胞である。他の態様では、細胞は、インスリン分泌細胞への移植後にさらに成熟する前駆細胞である。
【０４０２】
略語
β-TrCP:β-トランスデューシンリピート含有タンパク質
GSK-3:グリコーゲンシンターゼキナーゼ3
LGR:ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体
LRP:低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質
PP1:プロテインホスファターゼ1
PP2A:プロテインホスファターゼ2A
PP2C:プロテインホスファターゼ2C
【０４０３】
定義
本明細書で使用される場合、「含む」という動詞およびその活用形は、この語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されないことを意味する非限定的な意味で用いられる。さらに、「からなる」という動詞は、必要に応じて、本明細書で定義される産物が、具体的に特定される成分以外のさらなる成分（1つまたは複数）を含んでもよいことを意味する「から本質的になる」に置き換えることができ、前記のさらなる成分は本発明の固有の特徴を変化させない。さらに、本明細書で定義される方法は、具体的に特定される工程以外のさらなる工程（1つまたは複数）を含んでもよく、前記のさらなる工程は本発明の固有の特徴を変化させない。さらに、不定冠詞「1つの（「a」または「an」）」によるある要素への言及は、文脈上要素の1つだけが存在することが明確に要求されない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「1つの」は、通常、「少なくとも1つ」を意味する。
【０４０４】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、提示される値が＋/-10％変動し得ることを意味する。値はまた、正確な値として読み取ることもでき、そのため「約」という用語が省かれ得る。例えば、「約100」という用語は、90〜110およびまた100も包含する。
【０４０５】
本明細書において引用されるすべての特許および参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０６】
下記の実施例は例示のみを目的として提供されるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図されない。
【図面の簡単な説明】
【０４０７】
【図１】（A）肝上皮幹細胞の集団を増殖および分化させるための改善された方法。肝上皮幹細胞を、EM＋BMP7培地（EM＋BMP7は、Gibco Advanced DMEM/F12を基礎培地として含み、これに、N2、レチノイン酸を含まないB27、EGF、HGF、TGF-β阻害剤、ニコチンアミド、Rスポンジン、フォルスコリン、ガストリン、N-アセチルシステイン、FGF10およびBMP7が添加されている）において5日間増殖させる。この前処理の後、オルガノイド培養物を破砕し、分割して、DM＋培地に移す。肝上皮幹細胞の集団を増殖および分化させるための以前の方法は、肝上皮幹細胞をEM＋BMP7培地で5日間増殖させ、その後、破砕または分割せずにDM培地に移すことを含んだ。（B）DMおよびDM＋培地の成分。DM＋培地は、Gibco Advanced DMEM/F12を基礎培地として含み、これに、10mMのHEPES、1×B27-VitA、1×N2、1.25mMのN-アセチルシステイン、50ng/mlのhEGF、10nMのガストリン、25ng/mlのHGF、0.5μMのA83.01、25ng/mlのBMP7、100ng/mlのFGF19、10μMのDAPT、3μMのデキサメタゾン、3μMのIWP-2、3μMのChir、50μMのiCRT3および100μMのカルバコールが添加されている。DM培地は、Gibco Advanced DMEM/F12を基礎培地として含み、これに、10mMのHEPES、1×B27-VitA、1×N2、1.25mMのN-アセチルシステイン、50ng/mlのhEGF、10nMのガストリン、25ng/mlのHGF、0.5μMのA83.01、25ng/mlのBMP7、100ng/mlのFGF19、10μMのDAPTおよび3μMのデキサメタゾンが添加されている。
【図２Ａ】肝細胞の分化に正の作用を示さなかった因子のリスト。
【図２Ｂ】分化培地（DM）中での11日後またはDMプラス改変培地中での11日後の、増殖培地（EM）中のオルガノイドのqRT-PCR分析。DM培地へのAP-1刺激剤カルバコールの添加は、肝細胞マーカーであるアルブミンおよびCyp3A4の発現を改善する。
【図２Ｃ】分化培地（DM）中での11日後またはDMプラス改変培地中での11日後の、増殖培地（EM）中のオルガノイドのqRT-PCR分析。DM培地へのWntの添加は、アルブミンおよびCyp3A4の発現を減少させる。
【図２Ｄ】分化培地（DM）中での11日後またはDMプラス改変培地中での11日後の、増殖培地（EM）中のオルガノイドのqRT-PCR分析。DM培地への、Wnt分泌の阻害剤であるIWP-2の添加は、アルブミンおよびCyp3A4の発現を増強する。
【図２Ｅ】分化培地（DM）中での11日後またはDMプラス改変培地中での11日後の、増殖培地（EM）中のオルガノイドのqRT-PCR分析。DM培地へのCHIR99021（β-カテニン分解複合体の活性を妨げることによってWntシグナル伝達を強力に増加させるGSK3β阻害剤）の添加は、アルブミンおよびCyp3A4の発現を増加させる。CHIR99021およびiCRT3（β-カテニンのTCF4への結合をブロックすることができ、したがってβ-カテニン分解複合体の下流でWntシグナル伝達をブロックすることができる小分子）を添加すると、アルブミンおよびCyp3A4発現の有意な増加をもたらすが、CK19（胆管細胞マーカー）の発現を減少させる。
【図２Ｆ】分化培地（DM）中での11日後またはDMプラス改変培地中での11日後の、増殖培地（EM）中のオルガノイドのqRT-PCR分析。EM＋BMP7での前処理の5日後にオルガノイド培養物を破砕および分割し、直接DM培地に変更することにより、アルブミンおよびCyp3A4レベルの両方が改善される。
【図２Ｇ】標準条件（標準DM）下でのまたは新しい分割技術（分割DM）を用いた11日間の分化後のヒト肝臓オルガノイド。オルガノイド培養物の分割は、オルガノイドのサイズを減少させ、これは、分化の増強に寄与し得る。分解手順中のすべての増殖培地増殖因子の完全な除去も、分化を促進し得る。
【図３】増殖培地（EM）中の、または標準的な分化プロトコル（DM）もしくはDM＋培地と分割手順とを組み合わせた改良された手順（DM＋）のいずれかに従った11日間の分化後の、初代肝細胞またはオルガノイドのqRT-PCT分析。示されている遺伝子の発現レベルは、GAPDHと比較して表示されている。各々の点は独立した実験を表す。分割手順と組み合わせたDM＋培地は、（A）アルブミン、（B）HNFa、（C）セルピンA1および（D）ASPGRなどの肝細胞マーカーの発現の実質的な改善をもたらす。しかし、最も注目すべきは、（E）Cyp1A2および（F）Cyp3A4などのシトクロムの発現が強力に増加することである。Cyp3A4の発現は、DMプロトコル（分割なし）と比較して平均で50倍高く、初代肝細胞のレベルに達する。（G）CK7および（H）CK19などの胆管マーカーの発現は、新しいDM＋プロトコルでは明らかに減少し、肝細胞系列への分化の増加を裏付ける。
【図４Ａ】DM＋分化後のヒト肝臓オルガノイドにおける肝細胞機能の改善。標準（DM）または改良（DM＋）プロトコルに従った11日間の分化後のアルブミンの免疫蛍光染色。各々のプロトコルを用いて得られた例示的なオルガノイドの3つの図が示されている:アルブミン、DAPIおよび明視野。DM＋プロトコルは、肝細胞運命に分化する細胞の数を有意に増加させる。
【図４Ｂ】DM＋分化後のヒト肝臓オルガノイドにおける肝細胞機能の改善。HepG2、初代肝細胞、および、増殖培地（EM）中、標準分化培地（DM）中、または改良された分化手順（DM＋）に従ったヒト肝臓オルガノイドの、11日目のCyp3A4活性の測定（P450-Gloアッセイ）。DM＋プロトコルを用いて分化した細胞のCyp3A4活性は、初代肝細胞のレベルであり、HepG2細胞または旧DM条件によって達成されるレベルをはるかに上回る。各々の点は独立したドナーを表す。
【図４Ｃ】DM＋分化後のヒト肝臓オルガノイドにおける肝細胞機能の改善。HepG2、初代肝細胞、および、EM中、DM中、または改良された分化手順（DM＋）に従ったヒト肝臓オルガノイドによる、11日目のアルブミン分泌。各々の点は独立したドナーを表す。
【図４Ｄ】DM＋分化後のヒト肝臓オルガノイドにおける肝細胞機能の改善。HepG2、EM中、DM中、または改良された分化手順（DM＋）に従ったヒト肝臓オルガノイドによる、11日目のミダゾラム（薬物）の1-OH-ミダゾラムへの変換。DM＋プロトコルを用いて分化した細胞において、改善された薬物処理活性が認められる。各々の点は独立したドナーを表す。
【実施例】
【０４０８】
実施例1
本発明者らは、ヒト肝臓オルガノイドを両能性幹細胞から肝細胞状態に分化させる能力を有意に改善した。以前に確立された（旧）分化プロトコル（DM）を基にして、本発明者らは、4つのさらなる分化因子による処理と、分化工程における変更された分割プロトコルとを組み合わせた新しい改良された手順（DM＋）を開発した（図1AおよびB）。以前の分化培地および改良された分化培地中の成分を以下の表に要約する。DM＋プロトコルは、試験したすべての肝細胞マーカーの発現を増加させ、分化工程の間の胆管運命拘束を減少させる。最も注目すべきは、DM＋が、肝細胞における薬物代謝の重要な酵素であるシトクロムの発現および活性の有意な改善（例えば初代肝細胞のレベルのCyp3A4）をもたらすことである。したがって、DM＋は、ヒト肝臓オルガノイドを毒性アッセイおよび創薬などの商業用途に適合させるための大きな前進である。
【０４０９】
ヒト肝臓オルガノイドは、国際公開公報第2012/014076号、国際公開公報第2012/168930号および国際公開公報第2015/173425号に以前に記載されている方法に従って増殖培地（例えば以下の表参照）で培養したヒト肝幹細胞から得た。ヒト肝臓オルガノイドの分化を改善するために、有益な作用を有する可能性のある多数の異なる因子を試験した。しかし、これらの大部分は分化の改善に寄与しなかった（図2A参照）。ヒト肝臓オルガノイドは、初代肝細胞と比較してAP-1複合体の成分の発現を減少させたので（データは示していない）、本発明者らの標準的な分化培地にAP-1刺激剤カルバコールを加えて試験し、アルブミンおよびCyp3A4の発現のわずかな改善を認めた（図2B）。分化培地へのWNTの添加は、反対の作用を及ぼし、アルブミンの発現を減少させた（図2C）。したがって、内因性WNTシグナル伝達をブロックするWNT分泌の阻害剤（IWP-2）を試験し、アルブミンおよびCyp3A4の両方の発現増加を観察した。同じ一連の実験において、β-カテニン分解複合体の活性を妨げることによってWNTシグナル伝達を強力に増加させる、GSK3βの阻害剤であるCHIRも試験した。予想に反して、CHIR99021の添加は（WNTによる刺激のように）分化をブロックしなかったが、アルブミンおよびCyp3A4の両発現のわずかな増加が観察された。このことから、本発明者らは、CHIR99021刺激が分化促進成分と分化阻害成分との二重作用を有するという結論に至った。以前の実験から、WNTシグナル伝達は阻害成分であろうということが分かっている。したがって、阻害成分を相殺するために、CHIR99021刺激を分解複合体の下流でのWNTシグナル伝達のブロックと組み合わせる可能性を検討した。実際に、CHIR99021と、β-カテニンのTCF4への結合をブロックすることができる小分子であるiCRT3との組み合わせは、アルブミンおよびCyp3A4発現を有意に増加させたが、胆管マーカーCK19の発現を減少させた（図2E）。培地添加物に加えて、分化工程の技術的最適化も検討した。本発明者らは、EM＋BMP7前処理の5日後にオルガノイド培養物を破砕し、分割して、直接分化培地に変更することが、アルブミンおよびCyp3A4レベルの両方を改善することを見出した（図2F）。これは、オルガノイドのサイズの減少（図2G）と、分割手順中のすべての増殖培地増殖因子の完全な除去との複合効果である可能性が高い。
【０４１０】
本発明者らは、カルバコール、IWP-2、CHIR99021＋iCRT3による分化の改善と新たな分割手順とが相加的であるかどうかを試験し、実際にその通りであることが判明した。したがって、本発明者らは、新しい分化プロトコルDM＋を上記の組み合わせとして定義した（図1AおよびB）。DM＋は、アルブミン（図3A）、HNFa（図3B）、セルピンA1（図3C）およびASGPR（図3D）などの肝細胞マーカーの発現のさらに高い改善を導く。しかし、最も注目すべきは、Cyp1A2およびCyp3A4などのシトクロムの発現が強力に増加することである（図3EおよびF）。Cyp3A4の発現は、旧DMプロトコルと比較して平均50倍高く、初代肝細胞のレベルに達する。CK7およびCK19などの胆管マーカーの発現は、新しいDM＋プロトコルでは明らかに減少し（図3GおよびH）、肝細胞系列への分化の増加を裏付ける。
【０４１１】
概して、DM＋プロトコルは、肝細胞運命に分化する細胞の数を有意に増加させる（図4A）。これは、Cyp3A4活性アッセイおよびアルブミン分泌などの機能的アッセイにおいても明らかである（図4BおよびC）。DM＋プロトコルに従って分化した細胞のCyp3A4活性は初代肝細胞のレベルであり、HepG2細胞または旧DM条件によって達成されるレベルをはるかに上回る。これはまた、ミダゾラムから1-OH-ミダゾラムへの処理などの改善された薬物処理活性にも反映される（図4D）。要約すると、DM＋は、ヒト肝臓オルガノイドの肝細胞運命への分化における重要な前進であり、様々な薬物代謝および毒性アッセイにおけるそれらの性能を改善する。これらの適用以外にも、改善された分化プロフィールは、疾患モデリングおよび移植においてもより良好な性能を示し得る。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【国際調査報告】
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