(57)【要約】本発明は、異なる抗原に結合する第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞であって、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、細胞を提供する。本発明は、異なる抗原に結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含むｔａｎＣＡＲを含む細胞であって、第１の抗原結合ドメインは、抗原の膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、細胞も提供する。本発明は、対応する核酸配列および／または構築物、前記核酸配列および／または構築物、分子を含むキットおよびベクター、ならびにそのような細胞を作製する方法をさらに提供する。細胞は、多発性骨髄腫などの疾患を処置するための細胞免疫療法の手法で使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる抗原に結合する第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞であって、前記第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、細胞。
【請求項２】
前記第２のＣＡＲがＢＣＭＡに結合する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
異なる抗原に結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含む、ｔａｎＣＡＲを含む細胞であって、前記第１の抗原結合ドメインは、前記抗原の膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、細胞。
【請求項４】
前記第２の抗原結合ドメインがＢＣＭＡに結合する、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
請求項３または４で定義されたｔａｎＣＡＲをコードする核酸配列。
【請求項６】
以下の構造：
ＡｇＢ１−リンカー−ＡｇＢ２−スペーサー−ＴＭ−ｅｎｄｏ
（式中、
ＡｇＢ１は、前記ｔａｎＣＡＲの前記第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
リンカーは、前記ｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、前記ｔａｎＣＡＲの前記第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサーは、前記ｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭは、前記ｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、前記ｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し、細胞において発現された場合、前記第１および第２の抗原結合ドメインを細胞表面にタンデムで発現するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸配列。
【請求項７】
リンカーが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ可撓性リンカーを含む配列をコードする、請求項６に記載の核酸配列。
【請求項８】
相同組換えを避けるために、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替のコドンが使用される、請求項５から７のいずれかに記載の核酸配列。
【請求項９】
請求項１または２で定義された第１のＣＡＲ；および請求項１または２で定義された第２のＣＡＲをコードする核酸構築物。
【請求項１０】
以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
（式中、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、前記第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、前記第１および第２のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、前記第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有し、細胞において発現された場合、前記第１および第２のＣＡＲが前記細胞の表面で共発現されるような開裂部位で開裂されるポリペプチドをコードする、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
ｃｏｅｘｐｒが、自己開裂ペプチドを含む配列をコードする、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
相同組換えを避けるために、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替のコドンが使用される、請求項９から１１のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１３】
請求項５から８のいずれか一項に記載の核酸配列、または請求項９から１２のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾン。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１または２で定義された第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１
（式中、
ＡｇＢ１は、前記第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、前記第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、前記第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、前記第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する第１の核酸配列；および
（ｉｉ）請求項１または２で定義された第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
（式中、
ＡｇＢ２は、前記第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、前記第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、前記第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、前記第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する第２の核酸配列
を含むキット。
【請求項１６】
請求項１５で定義された前記第１の核酸配列を含む第１のベクター；および請求項１５で定義された前記第２の核酸配列を含む第２のベクターを含むキット。
【請求項１７】
前記ベクターがウイルスベクターまたはトランスポゾンを組み込んでいる、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項５から８のいずれかに記載の核酸配列；請求項１０から１２のいずれかに記載の核酸構築物；請求項１３もしくは１４に記載のベクター、または請求項１５から１７のいずれかに記載の配列もしくはベクターのキットを細胞に導入するステップを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
【請求項１９】
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複数の、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項２１】
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団；および
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団
を含む医薬組成物であって、前記第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、前記第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防する方法。
【請求項２３】
以下のステップ：
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団を投与するステップ、
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団を投与するステップ
を含む、疾患を処置および／または予防する方法であって、前記第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、前記第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、方法。
【請求項２４】
以下のステップ：
（ｉ）細胞を含有する試料を被験体から単離するステップ；
（ｉｉ）請求項５から８のいずれかに記載の核酸配列；請求項１０から１２のいずれかに記載の核酸構築物；請求項１３もしくは１４に記載のベクター、または請求項１５から１７のいずれかに記載の配列もしくはベクターのキットを細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの前記細胞を前記被験体に投与するステップ
を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法で使用するためのキットであって、前記キットは、
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団
を含み、前記第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、前記第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、キット。
【請求項２６】
前記疾患ががんである、請求項２２から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
疾患が成熟Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が多発性骨髄腫である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
疾患を処置および／または予防することに使用するための請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、請求項１から４のいずれかに記載の細胞の使用。
【請求項３１】
異なる抗原に結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含むｔａｎＣＡＲであって、前記第１の抗原結合ドメインは、前記抗原の膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、ｔａｎＣＡＲ。
【請求項３２】
被験体におけるサイトカイン放出症候群を回避および／または緩和する方法であって、抗ＴＡＣＩ剤を前記被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
前記抗ＴＡＣＩ剤が抗ＴＡＣＩ抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗ＴＡＣＩ剤が、抗ＴＡＣＩキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗ＴＡＣＩ  ＣＡＲが、２つの別の成分：抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分；ならびにエンドドメインを含む細胞内シグナル伝達成分を含み、
前記抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分が、細胞表面で会合して機能性ＣＡＲ複合体を形成する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗ＴＡＣＩ  ＣＡＲが、ＡＰＲＩＬからのＢＣＭＡ結合ドメインを含む抗原結合ドメインを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＴＡＣＩ剤が、請求項１から４のいずれかに記載の細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体が、ＣＡＲに基づく免疫療法を現在受けているかまたは受け入れようとしている、請求項３２から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ＴＡＣＩ剤が、前記被験体における骨髄性細胞によるサイトカイン分泌を阻害する、請求項３２から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＴＡＣＩ剤が前記被験体における骨髄性細胞を死滅させる、請求項３２から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
被験体において、
ａ）サイトカイン放出症候群を回避および／もしくは緩和する；
ｂ）骨髄性細胞によるサイトカイン分泌を阻害する；ならびに／または
ｃ）骨髄性細胞を死滅させる
方法で使用するための抗ＴＡＣＩ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原の膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞に関する。そのような細胞は、多発性骨髄腫などのがん性疾患の処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、その通常の形式では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能につなげたタンパク質である。その通常の形態は、抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインが全て、Ｔ細胞の生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインに接続している、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１参照）。
【０００３】
これらの分子の最も多い形態は、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を使用して標的抗原を認識する。ｓｃＦｖは、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインと融合している。そのような分子は、ｓｃＦｖによるその標的の認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞は、そのようなＣＡＲを発現すると、標的抗原を発現する標的細胞を認識して死滅させる。
【０００４】
腫瘍関連抗原に対する数種類のＣＡＲが開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入手法が、種々のがんを処置するために現在臨床試験中である。例えば、血液悪性腫瘍の処置のために、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞の使用を含む、いくつかの臨床試験が進行中である（Ｐａｒｋら、２０１６年、Ｂｌｏｏｄ  １２７巻（２６号）：３３１２〜３３２０頁）
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）
【０００５】
しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入に関連する重要な欠点は毒性の誘発であり、その最も一般的なものがサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）である。「第１世代」の構築物（共刺激シグナル伝達エレメントなし）を利用する初期のＣＡＲ  Ｔ細胞の試みでは、Ｔ細胞増殖／サイトカイン産生が不十分であり、抗腫瘍応答を欠如することが認められた。第２世代のＣＡＲの設計（例えばＣＤ２８または４１ＢＢ）では共刺激シグナル伝達が加わって、血液悪性腫瘍を有する患者における改善されたＴ細胞活性化／拡大増殖、サイトカイン産生、および最も顕著に劇的な抗腫瘍応答をもたらした。しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与した後の同様に印象的で潜在的に生命を脅かすＣＲＳで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の「両刃の剣」が示されている。
【０００６】
ＣＲＳの顕著な特徴は、炎症性サイトカインの上昇をもたらす免疫活性化である。臨床および実験室での測定では、軽度／中程度のＣＲＳ（全身症状および／または等級２の器官毒性）から重度のＣＲＳ（ｓＣＲＳ；等級≧３の器官毒性、積極的な臨床的介入、および／または潜在的に生命を脅かす）に及ぶ。臨床的特徴には、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、悪心、食欲不振、頻脈／低血圧、毛細血管漏出、心機能不全、腎機能障害、肝不全、および播種性血管内凝固が含まれる。ＣＡＲ  Ｔ細胞注入に続いて、インターフェロン−ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ−１０、およびＩＬ−６を含むサイトカインの劇的な上昇が観察された。
【０００７】
ＣＲＳの存在は、養子移入された細胞の拡大増殖および進行性免疫活性化と一般的に関連する。ＣＲＳを引き起こすサイトカインは、注入されたＴ細胞ならびに単球およびマクロファージを含む周囲の間質細胞から生ずる。ＣＲＳに関与する主要なサイトカインは、骨髄性細胞（単球およびマクロファージ）により主に分泌されるＩＬ−６である。ＩＬ−６は、ＣＲＳの徴候および症状と共に、抗ＩＬ６受容体抗体（例えばｔｏｃｉ）または抗ＩＬ６抗体（例えばシルツキシマブ）を使用することにより中和することができる。
【０００８】
高腫瘍量の患者はより高度のｓＣＲＳを経験するので、ＣＲＳの重症度の程度は、注入時の疾患負荷によって決まることが示されている。再発／難治性Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病の患者をＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した報告では、ｓＣＲＳの発生率は１９から４３％の範囲であり、その変動は、その症候群の臨床的同定、キメラ受容体の設計、および注入される細胞の表現型の差による可能性が高い。患者はこの毒性を生じずに抗腫瘍応答を示すことがあるので、臨床転帰はｓＣＲＳの進展に基づいて予測できない。しかしながら、血液悪性腫瘍の状況で、応答する患者の大部分は、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後に少なくとも軽度のＣＲＳ（発熱）を示す。
【０００９】
ＣＲＳの診断後の課題は、操作された細胞の抗腫瘍効力を低下させずに、制御されない炎症の生理学的症状を軽減する適切な療法を選択することであった。全身性コルチコステロイドは、初期の抗腫瘍応答を損なわずにｓＣＲＳの症状を急速に好転させることを示した。しかしながら、高用量のコルチコステロイドの長期の使用（例えば、１４日より長く）は、養子移入されたＣＡＲ  Ｔ細胞集団の除去も生じさせて、その長期の抗白血病効果を潜在的に限定する。効果的な代替法として、食品医薬品局の承認したｍＡｂであるトシリズマブによるＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）の遮断により、ＣＲＳがほぼ即座に好転することを示した。しかしながら、ＩＬ−６Ｒは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖、持続性、および最も重要なことに抗腫瘍効果に対して負の効果を有することがある。
【００１０】
したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法と関連するＣＲＳを回避および制御する代替機構の必要性がある。
多発性骨髄腫
【００１１】
多発性骨髄腫（骨髄腫）は、形質細胞の骨髄悪性腫瘍である。異常な形質細胞の集まりが骨髄に蓄積して、そこでそれらの細胞は正常な血液細胞の産生に干渉する。骨髄腫は、米国における２番目に多い血液悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫に次ぐ）であり、血液悪性腫瘍の１３％および全てのがんの１％を占める。該疾患は、病理学的骨折、感染に対する感受性、腎不全、次いで死ぬことになる骨髄不全を引き起こすため、苦痛ならびに医療費に関して耐えがたい負担となる。
【００１２】
多くのリンパ腫と異なって、骨髄腫は、現在のところ治癒不能である。リンパ腫で使用される標準的化学療法剤は、大部分が骨髄腫に対して無効である。典型的には、これらの免疫療法剤は、単一の抗原を標的とする。例えば、リツキシマブはＣＤ２０を標的とし、マイロターグはＣＤ３３を標的とし、アレムツズマブはＣＤ５２を標的とする。しかしながら、ＣＤ２０の発現は形質細胞で失われているので、リツキシマブは骨髄腫に対して使用することができない。ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚａｍｉｂ）およびレナリドミド（Ｌｅｎｏｌｉｄｏｍｉｄｅ）などの新しい薬剤は部分的に効果的であるが、長く続く寛解をもたらすことはできない。
ＢＣＭＡ
【００１３】
ＢＣＭＡは、成熟リンパ球、例えば、記憶Ｂ細胞、形質芽球、骨髄形質細胞および骨髄腫細胞中で発現される膜貫通タンパク質である。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞は、骨髄腫患者の形質細胞腫からの骨髄腫細胞を特異的に死滅させることができることが示された（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、２０１３年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９巻（８号）２０４８〜６０頁）。
【００１４】
しかしながら、ＢＣＭＡを標的とする場合の考慮すべき事項は、例えば、リンパ腫細胞上のＣＤ１９と比較して、骨髄腫細胞上でのＢＣＭＡの密度が特に低いことである（図２）。さらに、初期の臨床的データから、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞による処置は、経時的に骨髄腫細胞におけるＢＣＭＡ発現の減少およびＢＣＭＡ陰性骨髄腫の進行と関連することが示唆された（Ａｌｉら、（２０１６年、Ｂｌｏｏｄ  １２８巻（１３号）１６８８〜１７００頁）。それに加えて、ＢＣＭＡ−ＣＡＲを受けた全ての患者は、試験でＣＲＳ（サイトカイン放出症候群）について陽性であった。
【００１５】
したがって、これらの問題に対処する骨髄腫の処置のための改善された治療手法に対する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐａｒｋら、２０１６年、Ｂｌｏｏｄ  １２７巻（２６号）：３３１２〜３３２０頁
【非特許文献２】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、２０１３年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９巻（８号）２０４８〜６０頁
【非特許文献３】Ａｌｉら、（２０１６年、Ｂｌｏｏｄ  １２８巻（１３号）１６８８〜１７００頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）を、別の抗原と一緒に標的とするＣＡＲに基づくシステムに関する。ＣＡＲシステムは、
ａ）２種もしくはそれより多くの異なるＣＡＲを共発現し、それらのうち１種がＴＡＣＩに結合する細胞；
ｂ）２種もしくはそれより多くの抗原結合ドメインを有し、それらのうち１種がＴＡＣＩに結合するｔａｎＣＡＲシステム；
ｃ）各々異なるＣＡＲを発現する２つもしくはそれより多くの細胞集団を含み、それらのうち１つがＴＡＣＩに結合する組成物；または
ｄ）２つもしくはそれより多くの細胞集団を別々の投与ステップで投与することを含む、疾患を処置する方法であって、各細胞集団は異なるＣＡＲを発現し、それらのうち１つがＴＡＣＩに結合する、方法
であり得る。
【００１８】
したがって、本発明の第１の態様の第１の実施形態は、異なる抗原に結合する第１および第２のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞であって、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、細胞を提供する。
【００１９】
第２のＣＡＲは、多発性骨髄腫と関連する別の抗原に結合することができる。例えば、第２のＣＡＲはＢＣＭＡまたはＢＡＦＦに結合することができる。
【００２０】
第１のＣＡＲは、免疫グロブリン様抗原結合ドメインを含むことができる。例えば、第１のＣＡＲは、ＴＡＣＩ結合ｓｃＦｖを含むことができる。第１のＣＡＲは、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ）からのＴＡＣＩ結合ドメインを欠くこともある。
【００２１】
本発明の第１の態様の第２の実施形態は、異なる抗原に結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含むｔａｎＣＡＲを含む細胞であって、第１の抗原結合ドメインは、抗原の膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、細胞を提供する。
【００２２】
第２の抗原結合ドメインは、多発性骨髄腫と関連する別の抗原に結合することができる。例えば、第２の抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦに結合することができる。
【００２３】
第１の抗体結合ドメインは、免疫グロブリン様抗原結合ドメインであってもよい。例えば、第１の抗体結合ドメインは、ＴＡＣＩ結合ｓｃＦｖを含むことができる。第１の抗体結合ドメインは、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ）からのＴＡＣＩ結合ドメインを欠くこともある。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の第２の実施形態で定義されたｔａｎＣＡＲをコードする核酸配列を提供する。
【００２５】
核酸配列は、以下の構造：
ＡｇＢ１−リンカー−ＡｇＢ２−スペーサー−ＴＭ−ｅｎｄｏ
（式中、
ＡｇＢ１は、ｔａｎＣＡＲの第１の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
リンカーは、ｔａｎＣＡＲのリンカーをコードする核酸配列であり；
ＡｇＢ２は、ｔａｎＣＡＲの第２の抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサーは、ｔａｎＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭは、ｔａｎＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏは、ｔａｎＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有することができ、細胞において発現された場合、第１および第２の抗原結合ドメインを細胞表面にタンデムで発現するポリペプチドをコードする。
【００２６】
リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒの可撓性リンカーであってもよくまたはそれを含むこともできる。
【００２７】
相同組換えを避けるために、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替のコドンが使用されることもある。
【００２８】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の第２の実施形態で定義された第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。
【００２９】
核酸構築物は、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１−ｃｏｅｘｐｒ−ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒは、第１および第２のＣＡＲの共発現を可能にする核酸配列であり
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有することができ、細胞において発現された場合、第１および第２のＣＡＲが細胞の表面で共発現されるような開裂部位で開裂されるポリペプチドをコードする。
【００３０】
「ｃｏｅｘｐｒ」は、自己開裂ペプチドを含む配列をコードすることができる。
【００３１】
相同組換えを避けるために、同一または類似のアミノ酸配列をコードする配列の領域で代替のコドンが使用される。
【００３２】
第４の態様では、本発明の第２の態様による核酸配列、または本発明の第３の態様による核酸構築物を含むベクターが提供される。
【００３３】
ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであることもある。
【００３４】
本発明の第５の態様の第１の実施形態では、
（ｉ）本発明の第１の態様の第１の実施形態で定義された第１のＣＡＲをコードする第１の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ１−スペーサー１−ＴＭ１−ｅｎｄｏ１
（式中、
ＡｇＢ１は、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー１は、第１のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ１は、第１のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ１は、第１のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する第１の核酸配列；および
（ｉｉ）請求項１または２で定義された第２のＣＡＲをコードする第２の核酸配列であって、以下の構造：
ＡｇＢ２−スペーサー２−ＴＭ２−ｅｎｄｏ２
（式中、
ＡｇＢ２は、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり；
スペーサー２は、第２のＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり；
ＴＭ２は、第２のＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり；
ｅｎｄｏ２は、第２のＣＡＲのエンドドメインをコードする核酸配列である）
を有する第２の核酸配列を含むキットが提供される。
【００３５】
本発明の第５の態様の第２の実施形態では、キットは、請求項１５で定義された第１の核酸配列を含む第１のベクター；および請求項１５で定義された第２の核酸配列を含む第２のベクターを含む。
【００３６】
ベクターは、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはトランスポゾンを組み込んでいることもできる。
【００３７】
第６の態様では、本発明の第１の態様による細胞を作製する方法が提供され、方法は、本発明の第２の態様による核酸配列；本発明の第３の態様による核酸構築物；本発明の第４の態様によるベクターまたは本発明の第５の態様による配列もしくはベクターのキットを、細胞に導入するステップを含む。
【００３８】
細胞は、被験体から単離された試料に由来してもよい。
【００３９】
本発明の第７の態様の第１の実施形態では、本発明の複数の第１の態様による細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００４０】
本発明の第７の態様の第２の実施形態では、
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団；および
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団
を含む医薬組成物であって、
第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、医薬組成物を提供する。
【００４１】
第８の態様の第１の実施形態では、本発明は、本発明の第７の態様による医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防する方法を提供する。
【００４２】
第８の態様の第２の実施形態では、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団を投与するステップ、
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団を投与するステップ
を含む、疾患を処置および／または予防する方法であって、第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、方法を提供する。
【００４３】
方法は、以下のステップ：
（ｉ）細胞を含有する試料を被験体から単離するステップ；
（ｉｉ）本発明の第２の態様による核酸配列；本発明の第３の態様による核酸構築物；本発明の第４の態様によるベクターまたは本発明の第５の態様による配列もしくはベクターのキットを、細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を被験体に投与するステップ
を含むことができる。
【００４４】
第９の態様では、本発明の第８の態様による方法で使用するためのキットであって、キットは、
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団、
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団
を含み、第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、キットが提供される。
【００４５】
第１０の態様では、疾患を処置および／または予防することに使用するための、本発明の第７の態様による医薬組成物が提供される。
【００４６】
第１１の態様では、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、本発明の第１の態様による細胞の使用が提供される。
【００４７】
本発明の第８、第１０および第１１の態様に関して、疾患は、成熟Ｂ細胞悪性腫瘍などのがんであってもよい。疾患は、例えば、多発性骨髄腫であってもよい。
【００４８】
第１２の態様では、異なる抗原に結合する第１および第２の抗原結合ドメインを含むｔａｎＣＡＲが提供され、第１の抗原結合ドメインは、抗原の膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する。
【００４９】
第１３の態様では、抗ＴＡＣＩ剤を被験体に投与するステップを含む、被験体におけるサイトカイン放出症候群を回避および／または緩和する方法が提供される。
【００５０】
抗ＴＡＣＩ剤は、抗ＴＡＣＩ抗体であるかまたはそれを含むこともできる。該薬品は、例えば、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、二重特異性抗体または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であってもよい。
【００５１】
抗ＴＡＣＩ剤は、抗ＴＡＣＩキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞であってもよくまたはそれを含むこともできる。
【００５２】
抗ＴＡＣＩ  ＣＡＲは、２つの別の成分：抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分；ならびにエンドドメインを含む細胞内シグナル伝達成分を含むことができる。抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分は、細胞表面で会合して、機能性ＣＡＲ複合体を形成する。
【００５３】
抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分は、ＷＯ２０１５／１５０７７１およびＷＯ２０１６／０３０６９１にそれぞれ記載された、ある特定の分子の存在または不在下においてのみ会合することができる。分子、例えばテトラサイクリンは、抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分の解離を引き起こし、ＣＡＲ機能を低下または停止させることができる。
【００５４】
抗ＴＡＣＩ  ＣＡＲは、ＷＯ２０１５／０５２５３８に記載されたＡＰＲＩＬからのＢＣＭＡ結合ドメインを含む抗原結合ドメインを有することができる。抗原結合ドメインは、上で配列番号２で示された配列またはＴＡＣＩ結合能力を保持するそれらの断片もしくはバリアントを含むこともできる。
【００５５】
抗ＴＡＣＩ剤は、本発明の第１の態様による細胞であってもよくまたはそれを含むこともできる。
【００５６】
抗ＴＡＣＩ剤は、被験体における骨髄性細胞によるサイトカイン分泌を阻害することができる。抗ＴＡＣＩ剤は、被験体における骨髄性細胞を、例えばアポトーシスにより死滅させることができる。
【００５７】
被験体におけるサイトカイン放出症候群を回避および／または緩和する方法で使用するための、上で定義された抗ＴＡＣＩ剤も提供される。
【００５８】
被験体におけるサイトカイン放出症候群を回避および／または緩和することに使用するための医薬の製造における、上で定義された抗ＴＡＣＩ剤の使用も提供される。
【００５９】
単一の抗原を唯一の標的とすることは、がんに固有の高い突然変異速度に基づく抗原の改変による腫瘍の逃避を生じさせ得る。ＣＡＲ手法を用いてＢＣＭＡのみを標的とすることは、ＢＣＭＡ陰性の骨髄腫の再発を生ずることが示された（Ａｌｉら、２０１６年）。ＴＡＣＩと別の骨髄腫に関連する抗原を共に標的とすれば、そのような逃避は回避されるはずである。
【００６０】
２種の抗原を共に標的とすることも、多発性骨髄腫細胞の表面における低いＢＣＭＡ発現の問題に対する対処であり：別の抗原に加えてＴＡＣＩを標的とすれば、ＣＡＲシステムにより認識され得る、標的細胞における有効な抗原濃度が全体として増大する。
【００６１】
ＢＣＭＡは、胚中心Ｂ細胞により発現され、一方、ＴＡＣＩは、主に脾臓の遷移型２および辺縁帯のＢ細胞、ならびに活性化されたＢ細胞により発現される（図５を参照されたい）。ＣＡＲ  Ｔ細胞手法を用いてＢＣＭＡのみを標的とすることは、骨髄腫前駆体細胞を残存させる（ｓｐａｒｅ）ようである。それに加えて、ＢＣＭＡのみを標的とすることは、間質細胞によるＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ分泌を増大させる結果となり、それにより骨髄腫前駆体細胞の生存および成長を促進し得る。これらの２つの理由で、ＢＣＭＡのみを標的とすることは、永続性が劣る結果を生ずるようであり、ＣＡＲ−Ｔ細胞が持続する間だけ持続する。
【００６２】
それに反して、ＴＡＣＩを標的とすると、形質芽球および後期のプレｂ細胞のクレアランスが向上して、応答の永続性の向上を導く結果となるはずである。
【００６３】
ＴＡＣＩは、ＣＲＳの原因となり得るＩＬ−６などのサイトカインを分泌する単球およびマクロファージで発現される。
【００６４】
したがって、抗ＴＡＣＩ剤を用いる前処置、共処置または後処置は、ＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法におけるＣＲＳを回避および／または緩和するために使用することができる。この手法は、抗ＩＬ６抗体または抗ＩＬ６受容体抗体を用いる患者の処置よりも良好であり、それは、この手法が、より長く持続して、ＩＬ６だけでなく、単球およびマクロファージにより産生される他のＣＲＳに関連するサイトカインも減少させるからである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、キメラ抗原受容体の標準設計を示す。キメラ抗原受容体の典型的な形式を示す。これらは、Ｉ型膜貫通タンパク質である。エクトドメインが抗原を認識する。これは、スペーサードメインに結びついた、抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成されている。これは、順送りで分子を膜に固定するように作用する膜貫通ドメインに接続している。最終的に、これは、細胞内シグナルを細胞に伝達するように作用するエンドドメインに接続している。これは１つまたは複数のシグナル伝達ドメインで構成されている。
【００６６】
【図２】図２は、骨髄腫におけるＢＣＭＡの発現データを示す。３９名の多発性骨髄腫患者の骨髄試料からの骨髄腫細胞を、ＣＤ１３８＋磁性ビーズ選択により単離した。これらの細胞を、ＰＥとコンジュゲートした抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体Ｊ６ＭＯ（ＧＳＫ）で染色した。抗原のコピー数を、ＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）をメーカーの使用説明書に従って使用して定量した。抗原コピー数の箱ひげ図は、範囲に沿って示して四分位間および中央値をプロットする。本発明者らは、範囲は１細胞当たり３４８．７〜４２６８．４のＢＣＭＡコピーであり、平均は１１８１、中央値は１０８４．９であることを見出した。
【００６７】
【図３】図３は、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦのリガンドの特異性および機能の割り当てを示す。Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）は、ＢＡＦＦ−受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ、ＴＮＦＲＳＦ１７）ならびに膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）と相互作用するが、それに対して、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦＳＦ１３）は、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩとだけ相互作用する。ＢＡＦＦ−Ｒの活性化は、末梢Ｂ細胞の生存に影響し、一方、ＢＣＭＡは形質細胞の生存に影響し得る。
【００６８】
【図４】図４は、生理学的Ｂ細胞の発達中の表面マーカーを示す。発達中に、Ｂ細胞は、種々の表面マーカーを発現し、それらのうちいくつかは示されたように治療用モノクローナル抗体により標的とされる。骨髄中における初期の発達の後、成熟Ｂ細胞は、血流を通って二次リンパ器官に移動して、胚中心反応およびクラススイッチ組換えを受けることができる。それらは記憶Ｂ細胞および抗体分泌細胞を形成し、それらは短寿命の形質芽球または長寿命の形質細胞である。薄れてゆくバーは、表面マーカーの発現についての報告は均一でないことを示す。略記号：ＢＡＦＦ−Ｒは、ＴＮＦファミリー受容体（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）のＢ細胞活性化因子；ＢＣＭＡは、Ｂ細胞成熟抗原（ＴＮＦＲＳＦ１７）；ＴＡＣＩは、膜貫通活性化因子とＣＡＭＬの相互作用因子（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）。
【００６９】
【図５】図５は、３通りの可能なＴＡＣＩ  ＣＡＲ設計を例示する模式図である。第１のＣＡＲ（Ａ）で、ヒトＣＤ８ストークドメインは、スペーサードメインとして使用される。第２のＣＡＲ（Ｂ）で、ＩｇＧ１のヒンジは、スペーサードメインとして使用される。第３のＣＡＲ（Ｃ）で、Ｆｃ受容体への結合を弱める、Ｈｏｍｂａｃｈら（２０１０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７巻：１２０６〜１２１３頁）により記載されたｐｖａ／ａ突然変異で改変された、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインはスペーサーとして使用される。全てのＣＡＲにおいて、これらのスペーサーは、ＣＤ２８膜貫通ドメインに、次にＣＤ２８、ＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインの融合体を含有する３部からなるエンドドメインに接続している。
【００７０】
【図６−１】図６は、ＴＡＣＩ特異的バインダーの産生を示す。ａ）ＴＡＣＩ陽性の抗体を分泌するハイブリドーマを同定するためのＥＬＩＳＡスクリーニング。親ハイブリドーマ系統の合計で１０枚のプレートをスクリーニングしてＴＡＣＩ結合について試験した。ｂ）フローサイトメトリーによるＴＡＣＩ結合の確認分析。ハイブリドーマ系統を、ＴＡＣＩ陽性およびＢＣＭＡ陽性ＳｕｐＴ１細胞についてスクリーニングした。ＳｕｐＴ１  ＴＡＣＩ細胞に対する反応性が最高の４つのハイブリドーマを、サブクローニングおよび特徴付けのために選んだ。
【図６−２】図６は、ＴＡＣＩ特異的バインダーの産生を示す。ａ）ＴＡＣＩ陽性の抗体を分泌するハイブリドーマを同定するためのＥＬＩＳＡスクリーニング。親ハイブリドーマ系統の合計で１０枚のプレートをスクリーニングしてＴＡＣＩ結合について試験した。ｂ）フローサイトメトリーによるＴＡＣＩ結合の確認分析。ハイブリドーマ系統を、ＴＡＣＩ陽性およびＢＣＭＡ陽性ＳｕｐＴ１細胞についてスクリーニングした。ＳｕｐＴ１  ＴＡＣＩ細胞に対する反応性が最高の４つのハイブリドーマを、サブクローニングおよび特徴付けのために選んだ。
【００７１】
【図７】図７は、ＴＡＣＩ  ＣＡＲを示す。ａ）ＴＡＣＩキメラ抗原受容体カセットの模式的表示。ＴＡＣＩ  ＣＡＲ２Ｈ６をエンドドメインＯＸ４０  ＣＤ２８  ＣＤ３ゼータを組み込んでいる第３世代ＣＡＲ形式中にクローニングした。ｂ）ＴＡＣＩ抗原結合ドメイン（２Ｈ６）を有するＣＡＲおよびトランケート型ＡＰＲＩＬを含む結合ドメインを有する等価のＣＡＲと比較した、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ発現細胞の２４時間死滅アッセイ。４：１のエフェクター：標的比で共培養を実施した。ｃ）ＴＡＣＩを発現するＳｕｐＴ１細胞とＢＣＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞とを４：１で共培養した後のＩＦＮγ放出を比較するアッセイ。
【００７２】
【図８−１】図８は、ＴＡＣＩ結合ドメインについてのＢｉａｃｏｒｅ親和性決定を示す。
【図８−２】図８は、ＴＡＣＩ結合ドメインについてのＢｉａｃｏｒｅ親和性決定を示す。
【００７３】
【図９】図９は、実施例４に記載されたＣＡＲを例示する模式図である。
【００７４】
【図１０】図１０は、標的細胞とのＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の関わりが、高レベルのＩＦＮｇおよびＧＭ−ＣＳＦの産生を生ずることを示す。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴ細胞およびＭＭ１ｓ標的細胞の共培養からの培地中のサイトカイン濃度。ＭＭ１ｓ細胞をＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴ細胞または形質導入されていない（ＮＴ）対照Ｔ細胞のいずれかと１：１の比で播種した。４８時間のインキュベーション後、培地を捕集して、サイトカインのパネルをＬｕｍｉｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイにより（Ａ）ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ−Ｔ細胞；（Ｂ）形質導入されていないＴ細胞を測定した。
【００７５】
【図１１】図１１は、ＩＦＮｇおよびＧＭ−ＣＳＦの組合せが単球におけるＩＬ−６の産生を誘導することを示す。ＩＮＦｇは、ＧＭＣ−ＳＦとの組合せで、ヒトの初代単球および単球様ＴＨＰ１細胞においてＩＬ−６産生を誘導する。（Ａ）３名の健康なドナー（ｎ＝３）から単離されたヒトの初代単球またはＴＨＰ１細胞（ｎ＝１）を、単独あるいはＩＦＮｇ（５０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＧＭＣ−ＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）または両方の存在下のいずれかで４８時間培養した。インキュベーション後、培養培地中におけるＩＬ−６レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。（Ｂ）４８時間のインキュベーション後に、ＩＮＦｇおよびＧＭＣ−ＳＦの組合せに応答して明瞭な形態学的変化を示すヒト初代単球の代表的像である。
【００７６】
【図１２】図１２は、ＡＰＲＩＬ細胞が単球に対して細胞傷害性活動を示すことを示す。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴのＴＨＰ１細胞に対する細胞傷害性効果。（Ａ）細胞傷害性アッセイ結果のまとめ。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴ、ＴＲＢＣ１  ＣＡＲＴおよび形質導入されていない（ＮＴ）対照細胞を、２名のマッチしたドナー（ｎ＝２）から得た。ＴＨＰ１細胞を、ＣＡＲＴ細胞またはそれらのそれぞれのＮＴ対照のいずれかと１：１の比で７２時間共培養した。ＴＨＰ１の溶解をフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）ＴＨＰ１およびＣＡＲＴ細胞による細胞傷害性アッセイの代表的なＦＡＣＳプロット。
【００７７】
【図１３】図１３は、自家サプレッサー細胞の存在下におけるＣＡＲに媒介された腫瘍細胞溶解を示す。（ａ）Ｍ２単球（Ｍ２）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および樹状細胞（ＤＣ）の、刺激されていない単球と比較したＴＡＣＩ発現。（ｂ）非形質導入Ｔ細胞（青色）、またはＡＰＲＩＬ−ＣＡＲ（橙色）もしくは抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体に基づくｓｃＦｖ抗原結合ドメインを有する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（グレイ）のいずれかを形質導入されたＴ細胞を、１：４のＥ：Ｔ比でＭＭ．１ｓ細胞と、自家単球に由来するサプレッサー細胞の存在下で共培養した。Ｍ２単球、ＭＤＳＣおよびＤＣが、ＭＭ１ｓ細胞と１：１０の相対比で含まれた。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に図式的に示したＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、それは抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づくこともできる。スペーサードメインは、バインダーを膜から単離して、それを適当に配向させるために通常必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。よりコンパクトなスペーサーは、抗原に依存して、例えばＣＤ８αのストークおよびＩｇＧ１のヒンジ単独でも十分であることができる。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定して、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【００７９】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。その結果として、これらの第１世代の受容体は、免疫学的シグナル１を伝達して、それはＴ細胞に同起源の標的細胞の死滅を開始させるためには十分であったが、増殖および生存のためにＴ細胞を十分に活性化するには至らなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞の共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζのそれとの融合により、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が生ずる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これが、最も強い共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給して、それがＴ細胞の増殖を開始させる。生存シグナルを伝達する、密接に関係するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む、いくつかの受容体も記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、より強い第３世代ＣＡＲさえ、現在は記載されている。
【００８０】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移すことができる。レンチウイルスベクターを使用することができる。このようにして、多くのがんに特異的なＴ細胞を、養子細胞移入のために生成させることができる。ＣＡＲが標的抗原に結合した場合、活性化シグナルの、ＣＡＲを発現するＴ細胞への伝達がもたらされる。したがって、ＣＡＲは、標的とされる抗原を発現する腫瘍細胞に対して、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を指示する。
ＯＲゲート
【００８１】
第１の実施形態では、本発明の第１の態様は、第１のＣＡＲおよび第２のＣＡＲを共発現する細胞に関し、一方のＣＡＲが抗原ＴＡＣＩに結合して他方のＣＡＲが異なる抗原に結合すると、その結果、細胞は、ＴＡＣＩおよび／または他方の抗原のいずれかをマーカーとして発現する標的細胞を認識することができる。
【００８２】
例えば、第２のＣＡＲは、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦなどの多発性骨髄腫細胞に特徴的な抗原に結合することができる。
【００８３】
したがって、細胞はＯＲゲートを含む。抗原のパターンを認識するキメラ抗原受容体システムのための論理ゲートは、ＷＯ２０１５／０７５４６８に記載されている。
【００８４】
第１および第２のＣＡＲは開裂部位によって隔てられた両方のＣＡＲを含むポリペプチドとして産生され得る。開裂部位における開裂は、２つのＣＡＲが細胞表面で別の実体として発現されることを可能にする。
タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）
【００８５】
タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして公知の二重特異性ＣＡＲは、２種またはそれより多くのがんに特異的なマーカーを同時に標的とするように開発された。ＴａｎＣＡＲでは、エクトドメインは、リンカーによってタンデムに連結された２つの抗原結合の特異性を含む。したがって、２つの結合特異性（ｓｃＦｖ）は両方共単一の膜貫通部分に連結されて、一方のｓｃＦｖは膜に近接して並置され、他方は遠位の位置にある。ＴａｎＣＡＲが標的抗原のいずれかまたは両方に結合した場合、活性化シグナルがＴａｎＣＡＲを発現する細胞に伝達される。
【００８６】
Ｇｒａｄａらは（２０１３年、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２巻：ｅ１０５頁）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、ついでＨＥＲ２に特異的なｓｃＦｖが続くＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖを含むＴａｎＣＡＲを記載している。ＨＥＲ２−ｓｃＦｖは膜に近い位置にあり、ＣＤ１９−ｓｃＦｖは遠位の位置にあった。ＴａｎＣＡＲは、腫瘍に限定された２つの抗原の各々に対して別個のＴ細胞応答を誘導することが示された。ＨＥＲ２（６３２ａａ／１２５Å）およびＣＤ１９（２８０ａａ、６５Å）のそれぞれの長さが、その空間的配置に適しているので、この配置が選択された。ＨＥＲ２のｓｃＦｖがＨＥＲ２の最も遠位の４本のループを結合していることも公知であった。
【００８７】
本発明の第１の態様の第２の実施形態は、第１の抗原結合ドメインは抗原ＴＡＣＩに結合し、第２の抗原結合ドメインは異なる抗原に結合する、２つの抗原結合特異性をタンデムに含むＴａｎＣＡＲを含む細胞に関する。
【００８８】
本発明のＴａｎＣＡＲにおいて、ＴＡＣＩに結合する抗原結合ドメインは、膜に近接して並置され得て、他方の抗原結合ドメインは、遠位の位置にあることができ、または逆も可能である。
【００８９】
第２の抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦ−Ｒなどの骨髄腫細胞で発現された別の抗原に結合することができる。
抗原結合ドメイン
【００９０】
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲの部分である。抗体、抗体模倣体、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む多数の抗原結合ドメインが当技術分野において公知である。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然のリガンド；標的に対する十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）などの人工の単一のバインダー；またはＴ細胞受容体に由来する単鎖を含むことができる。
【００９１】
抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖなどの免疫グロブリン様抗原結合ドメインを含むこともできる。
ＴＡＣＩ
【００９２】
膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド（ＣＡＭＬ）相互作用因子）ＴＡＣＩ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ１４８３６）は、免疫応答における制御因子であり、ＢＣＭＡのように、ＣＤ２７＋記憶Ｂ細胞、特に辺縁帯Ｂ細胞、骨髄形質細胞および骨髄腫細胞などの成熟リンパ球で優先的に発現される。
【００９３】
加えて、ＴＡＣＩは、マクロファージで発現されてマクロファージの生存を媒介する。ＴＡＣＩは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのリンパ球に特異的なメンバーであり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー１３Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）としても公知であり、細胞の表面から脱落して、その可溶形態で循環することができる。ＢＣＭＡと対照的に、ＴＡＣＩは、胚中心Ｂ細胞から不在であることが注目される。ＴＡＣＩは、ＴＮＦＳＦ１３／ＡＰＲＩＬおよびＴＮＦＳＦ１３Ｂ／ＢＡＦＦの受容体として機能して、両方のリガンドに高い親和性で結合することが公知である。ＴＡＣＩは、Ｂ細胞の拡大増殖を阻害して、形質細胞の分化および生存を促進する。
【００９４】
ＴＡＣＩは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、Ｂ細胞機能の非常に重要な制御因子として役立つ。ＴＡＣＩは、２つのリガンド、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦに、高い親和性で結合し、その細胞外領域に２つのシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）を含有する。しかしながら、ＴＡＣＩの別の形態が存在して、そこでは、Ｎ末端のＣＲＤが代替的スプライシングにより除去されている。このより短い形態は、リガンドに誘発された細胞シグナルを伝達することができること、および第２のＣＲＤだけ（ＴＡＣＩ＿ｄ２）が両方のリガンドに十分な親和性を含有することが示された（Ｈｙｍｏｗｉｔｚら、２００５年、Ａｍ  Ｓｏｃ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｉｎｃ  ２８０巻（８号）７２１８〜７２２７頁）。
【００９５】
ＴＡＣＩ＿ｄ２の結晶構造は、ＡＰＲＩＬＴＡＣＩ＿ｄ２およびＡＰＲＩＬ  ＢＣＭＡ複合体の共結晶構造とともに解明されている（Ｈｙｍｏｗｉｔｚら、２００５年、同上）。
【００９６】
ＴＡＣＩのＣＲＤは、他のＴＮＦＲのＣＲＤと一緒に、共通配列の特色、保存された６個の残基配列（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ）−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−（Ｖａｌ／Ｔｈｒ）−（Ａｒｇ／Ｇｌｙ）（配列番号５０）からなるいわゆるＤＸＬモチーフを有する。このモチーフは、ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦのいずれかに結合することが必要である。受容体モチーフは疎水性ポケットで結合して、ＢＡＦＦ表面に保存された２つのアルギニン残基と相互作用する。
【００９７】
ＴＡＣＩに結合するＣＡＲまたはｔａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＴＡＣＩに結合することができる任意のドメインであってもよい。例えば、抗原結合ドメインは、以下の表のリストに挙げた市販の抗ＴＡＣＩ抗体の１つに由来するＴＡＣＩバインダーを含むことができる：
【表１】
2019535262.tif 000002
【００９８】
抗原結合ドメインは、実施例２に記載したＴＡＣＩバインダー、すなわちクローン２Ｈ６、２Ｇ２、１Ｇ６または４Ｂ１１から１つを含むことができる。
【００９９】
これらのＴＡＣＩバインダーは、以下の配列を有する：
【化１】
2019535262.tif 000003
【化２】
2019535262.tif 000004
【０１００】
本発明は、抗ＴＡＣＩ剤、例えば、抗体、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ、またはクローン２Ｈ６、２Ｇ２、１Ｇ６もしくは４Ｂ１１のうちの１つに基づくＴＣＩ結合ドメインを含むｔａｎＣＡＲを提供する。抗ＴＡＣＩ剤は、配列番号３７〜４２；４４〜４９；５５〜５７；５９〜６１；６３〜６５；６７〜６９として示される配列を有する１種または複数のＣＤＲを含むことができる。該薬品は、以下の６種のＣＤＲの群の１つを含むことができる：
配列番号３７〜４２；配列番号４４〜４９；配列番号５５〜５７および５９〜６１；または配列番号６３〜６５および６７〜６９。
【０１０１】
抗ＴＡＣＩ剤は、配列番号３６または４３で示されるＶＨおよび／またはＶＬ配列を含むことができる（ＶＨは、セリン−グリシンリンカーの前にあり、ＶＬは、セリン−グリシンリンカーの後にある）。抗ＴＡＣＩ剤は、配列番号５４もしくは６２で示されるＶＨ配列および／または配列番号５８もしくは６６で示されるＶＬ配列を含むことができる。抗ＴＡＣＩ剤は、配列番号３６もしくは４３で示されるｓｃＦｖまたは配列番号５４を配列番号５８と、もしくは配列番号６２を配列番号６６と連結することにより形成されるｓｃＦｖを含むことができる。
【０１０２】
全ての上記の配列で、抗ＴＡＣＩ剤は、所与の配列と８０％、８５％、９０％、９５％または９８％の同一性を有する配列を含むことができるが、ただし、バリアント配列はＴＡＣＩに結合する能力を保持することが条件である。
【０１０３】
本発明のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲ中のＴＡＣＩに特異的な抗原結合ドメインは、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ）の全てまたは一部を欠いてもよい。ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩに対する天然のリガンドである（図４を参照されたい）。
【０１０４】
本発明のＣＡＲのＢＣＭＡ結合ドメインは、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ）の任意の部分を欠いてもよい。ＡＰＲＩＬはＴＮＦＳＦ１３としても公知である。
【０１０５】
ＡＰＲＩＬの野生型配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ／Ｏ７５８８８で入手可能であり、下で示される（配列番号１）。ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合を保持しているが、プロテオグリカン結合を喪失しているトランケート型のＡＰＲＩＬは、配列番号２として示される。配列番号２は、配列番号１として示される野生型ＡＰＲＩＬ分子のアミノ末端側の１１６アミノ酸を欠いている。
【化３】
2019535262.tif 000005
【０１０６】
本発明のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲ中のＴＡＣＩに特異的な抗原結合ドメインは、増殖を誘導するリガンド（ＡＰＲＩＬ）の任意の部分を欠いてもよい。例えば、それは、配列番号１または配列番号２の任意の１０、２０、３０または４０アミノ酸長の区間の連続したアミノ酸を欠いてもよい。それは、配列番号２として示された完全な配列を欠いてもよい。
【０１０７】
ＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲ中のＴＡＣＩに特異的な抗原結合ドメインは、ＡＰＲＩＬのＢＣＭＡ結合ドメインを欠いてもよい。
ＢＡＦＦ−Ｒ
【０１０８】
ＢＦ３としても公知のＢＡＦＦ−Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９６ＲＪ３）の主な役割は、末梢Ｂ細胞の生存および成熟を媒介することである。コードされるタンパク質は、ＢＡＦＦの受容体であり、フェニルアラニンに富む単一のエクトドメインを含有するＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。この受容体は、ＢＡＦＦに媒介される成熟Ｂ細胞生存のために必要な主たる受容体であると考えられる。
【０１０９】
ＢＡＦＦ−Ｒ欠損マウスで実施された研究は、ＢＡＦＦ−Ｒは、ＢＡＦＦに媒介されるＢリンパ球生存シグナルを伝達する主たる受容体であると指摘している。
【０１１０】
ＢＡＦＦ−Ｒに結合する第１および／もしくは第２のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、以下の表のリストに挙げた市販の抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の１つに由来する配列を含むことができる：
【表２】
2019535262.tif 000006
ＢＡＦＦ
【０１１１】
ＢＬｙＳ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬｌ−１またはｚＴＮＦ４）ともいわれるＴＮＦファミリー（ＢＡＦＦ）のＢ細胞活性化因子は、Ｂ細胞の応答で炎症誘発性機能を果たすと考えられる骨髄性細胞により発現されるサイトカインである。Ｗａｌｔｅｒｓら（２００９年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８２巻：７９３〜８０１頁）は、ＢＡＦＦも、特定の条件下においてＴ細胞応答で抗炎症性役割を担うことを示している。これらの役割の調節は、サイトカイン応答の調整による。ＢＡＦＦは、主として単球などの骨髄性細胞によって産生される。
【０１１２】
ＢＡＦＦは、成熟過程中のＢリンパ球のＴ１からＴ２段階への転移を容易にすることにより、Ｂリンパ球のホメオスタシスを維持することに決定的に重要であることが示された。Ｂリンパ球の生存および成熟におけるＢＡＦＦの必要不可欠な役割は、可溶性ＢＣＭＡ分子をｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、成熟Ｂ細胞の低下したレベルならびにＴ依存性抗原およびＴに独立な抗原に対するひどく損傷した抗体応答を有する、ＢＡＦＦを発現しない遺伝子操作されたマウスで示された。対照的に、高レベルのＢＡＦＦを発現するトランスジェニックマウスは、増大した数の循環する成熟Ｂ細胞を有することが示された。
【０１１３】
ＢＡＦＦは、ＡＰＲＩＬとの構造類似性、および重なり合うがそれでも別個の受容体結合特異性を示す。ＢＡＦＦのＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩに対する同等の結合は、転写因子ＮＦ−κＢを活性化して、生存を支持するＢｃｌ−２ファミリーのメンバー（例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ａ１）の発現およびプロアポトーシス因子（例えばＢｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、その他）の下方制御を強化し、したがってアポトーシスを阻害して生存を促進する。この組み合わされた作用がＢ細胞の分化、増殖、生存および抗体産生を促進する（Ｒｉｃｋｅｒｔ  ＲＣら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ（２０１１年）２４４巻（１号）：１１５〜１３３頁に総説されているように）。
【０１１４】
本発明のＴＡＣＩに特異的なＣＡＲまたはｔａｎＣＡＲは、ＢＡＦＦの全てまたは一部を含む抗原結合ドメインを含むことができる。抗原結合ドメインは、例えば、ＢＡＦＦのＴＡＣＩ結合ドメインを含むことができる。
【０１１５】
ＢＡＦＦおよびＴＡＣＩの３Ｄ結晶構造が得られて、ＴＡＣＩにより識別されたＢＡＦＦ中の非常に重要なドメインは、Ｉｌｅ２３３からＧｌｕ２３８およびＡｓｐ２０５からＬｅｕ２１１のドメインであることを示した（Ｗａｎｇら、Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｓｙｎｄｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１２年、３巻：３頁）。
【０１１６】
ＢＡＦＦのアミノ酸配列を下に示す。
【化４】
2019535262.tif 000007
【化５】
2019535262.tif 000008
【０１１７】
ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩに結合するＣＡＲまたはｔａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号３の全てまたは一部を含むことができる。例えば、それは、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩの結合を保持する、配列番号３のトランケート型を含むことができる。それは、ＢＡＦＦのＢＡＦＦ−Ｒ、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩ結合部位を含むことができる。ＴＡＣＩに結合する抗原結合ドメインは、配列番号３の残基２０５〜２１１および２３３〜２３８を含むことができる。ＴＡＣＩに結合する抗原結合ドメインは、配列番号３の残基２０５〜２３８を含むことができる。
ＢＣＭＡ
【０１１８】
ＢＣＭＡ；ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｑ０２２２３）としても公知のＢ細胞成熟の標的は、成熟リンパ球、例えば、記憶Ｂ細胞、形質芽球および骨髄形質細胞で発現された膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、骨髄腫細胞でも発現される。ＢＣＭＡは、グリコシル化されていないＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、それは、Ｂ細胞の成熟、成長および生存に関与する。
【０１１９】
ＢＣＭＡに結合するＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡに結合することができる任意のドメインであってもよい。例えば、抗原結合ドメインは、以下の表のリストに挙げた市販の抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体の１つに由来する配列であってもよい：
【表３】
2019535262.tif 000009
【０１２０】
３種の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨおよびＶＬ配列を、ＣＤＲの配列に下線を引いて、下に示す。
【化６】
2019535262.tif 000010
【０１２１】
ＢＣＭＡに結合するＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、上に記載した抗ＢＣＭＡ  Ａｂ１、２または３からのＣＤＲを含むことができる。
【０１２２】
ＢＣＭＡに結合するＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲの抗原結合ドメインは、上に記載した抗ＢＣＭＡ  Ａｂ１、２もしくは３からのＶＨおよび／もしくはＶＬ配列、またはＢＣＭＡに結合する能力を保持する、少なくとも７０、８０、９０もしくは９０％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むことができる。
膜貫通ドメイン
【０１２３】
本発明のＣＡＲおよび／またはＴａｎＣＡＲは、膜の両側に及ぶ膜貫通ドメインを含む。それは、疎水性のアルファヘリックスを含むことができる。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来してもよく、そのことは優れた受容体安定性を与える。
【０１２４】
膜貫通ドメインは、配列番号１０として示される配列を含むことができる。
配列番号１０
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
細胞内のＴ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
【０１２５】
本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの活性化エンドドメイン、シグナル伝達部分を含むかまたはそれと会合することができる。抗原認識後、受容体がクラスター化してシグナルが細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３−ゼータの成分である。抗原が結合した後に、これが活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供することができず、追加の共刺激シグナル伝達が必要なこともある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３ゼータと共に増殖性／生存のシグナルを伝達するために使用することができ、または３者全てを一緒に使用することもできる。
【０１２６】
本発明のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８のエンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータのエンドドメインを含むことができる。
【０１２７】
エンドドメインは、
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータからのエンドドメイン；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８からのエンドドメイン；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーのＯＸ−４０もしくは４−１ＢＢなどのエンドドメイン
を含むことができる。
【０１２８】
ＩＴＡＭモチーフを含有するエンドドメインは、本発明では、活性化エンドドメインとして作用することができる。数種のタンパク質が、エンドドメインを１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフと共に含有することが公知である。そのようなタンパク質の例は、２〜３の名を挙げれば、ＣＤ３のイプシロン鎖、ＣＤ３のガンマ鎖およびＣＤ３のデルタ鎖が挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、ＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号５１）という署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を与える、ロイシンまたはイソロイシンから任意の２個の他のアミノ酸により隔てられたチロシンとして容易に認識され得る。典型的には、ただし常にではなく、これらのモチーフのうちの２つは、分子の末尾で、６個と８個の間のアミノ酸により隔てられている（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６〜８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。したがって、当業者は、１つまたは複数のＩＴＡＭを含有して活性化シグナルを伝達する、存在するタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが単純で、複合体の二次構造が必要とされなければ、当業者は、活性化シグナルを伝達する人工ＩＴＡＭを含有するポリペプチドを設計することができる（合成シグナル伝達分子に関するＷＯ２０００／０６３３７２を参照されたい）。
【０１２９】
いくつかのエンドドメインおよび共刺激ドメインの配列を下に示す。
【化７】
2019535262.tif 000011
【０１３０】
ＣＡＲは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号１１〜１４として示される配列の任意のバリアントを含むことができるが、ただし、バリアント配列が、抗原認識時に、Ｔ細胞シグナル伝達を誘導する、すなわち、関係する活性化／増殖または生存シグナルをＴ細胞に提供する能力を保持することが条件である。
【０１３１】
例えば、ＷＯ０１５／１５０７７１；ＷＯ２０１６／１２４９３０およびＷＯ２０１６／０３０６９１などに記載されているものなど、抗原認識部分がシグナル伝達部分と別の分子にある多くのシステムが、記載されている。本発明のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲは、シグナル伝達エンドドメインを欠いてもよい。
【０１３２】
本発明は、ＴＡＣＩに結合する抗原結合ドメイン、および膜貫通ドメインを含み；シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達成分と相互作用することができる抗原結合成分も提供する。本発明は、そのような抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分を含むＣＡＲシグナル伝達システムも提供する。
シグナルペプチド
【０１３３】
本発明の細胞は、シグナルペプチドを含むことができて、その結果、ＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲが細胞の内側で発現された場合、発生したばかりのタンパク質は、それが発現された小胞体に、その後細胞表面に向かう。
【０１３４】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファ−ヘリックスを形成する傾向がある疎水性アミノ酸の長い区間を含有することができる。シグナルペプチドは、短い正に荷電した区間のアミノ酸で開始することができて、移動中にポリペプチドの適当な形態を強制することに役立つ。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼに認識されて開裂されるアミノ酸の区間がある。シグナルペプチダーゼは、移動中または移動の完了後のいずれかに開裂されて、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を発生することができる。次いで、遊離のシグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
【０１３５】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあることができる。
【０１３６】
本発明のＣＡＲは、一般式：
【０１３７】
シグナルペプチド−抗原結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内のＴ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を有することができる。
【０１３８】
シグナルペプチドは、配列番号１５、または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸の突然変異（挿入、置換または付加）を有するそれらのバリアントを含むことができるが、ただし、シグナルペプチドは、それでもＣＡＲの細胞表面発現を生じさせるように機能する。
配列番号１５：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ
【０１３９】
配列番号１５のシグナルペプチドは、コンパクトであり、高度に効率的である。それは、末端グリシンの後で約９５％の開裂を生じさせて、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去を生じさせると予測される。
スペーサー
【０１４０】
本発明のＣＡＲおよび／またはＴａｎＣＡＲは、抗原結合ドメインを、膜貫通ドメインと接続して、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含むことができる。可撓性スペーサーは、抗原結合ドメインがいろいろな方向に向いて抗原を結合することが可能になるようにする。例として、スペーサー配列は、膜貫通ドメインをＴＡＣＩ結合ドメインと接続して、ＴＡＣＩ結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離することができる。あるいは、スペーサー配列は、ＢＣＭＡ結合ドメインを膜貫通ドメインと接続して、ＢＣＭＡ結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離することができる。あるいは、本発明のスペーサー配列は、ＢＡＦＦ−Ｒ結合ドメインを膜貫通ドメインと接続して、ＢＡＦＦ−Ｒ結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離することができる。
【０１４１】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストーク、またはそれらの組合せを含むことができる。あるいは、スペーサーは、類似の長さおよび／またはＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストークのようなドメインの間隔を空ける性質を有する代替配列を含むこともできる。
【０１４２】
ヒトＩｇＧ１のスペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更することができる。これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を、下に示す：
【化８】
2019535262.tif 000012
【化９】
2019535262.tif 000013
【０１４３】
改変された残基に下線を引いた；＊は欠失を表す。
リンカー
【０１４４】
本発明の第１の態様の第２の実施形態のＴａｎＣＡＲは、２つの抗原結合ドメインをタンデムに連結しているリンカー配列を含む。例として、リンカーにより連結されて一緒になった２つの抗原結合ドメインは、抗原ＴＡＣＩおよび抗原ＢＣＭＡを結合することができる。あるいは、リンカーにより連結されて一緒になった２つの抗原結合ドメインは、抗原ＴＡＣＩおよび抗原ＢＡＦＦ−Ｒを結合することができる。高度に可撓性のリンカーの例を下に示す：
配列番号２１（Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー）
ＳＧＧＧＳ
核酸配列
【０１４５】
本発明の第２の態様は、ＴａｎＣＡＲをコードする核酸配列に関する。
【０１４６】
核酸は、標的細胞により発現された場合、コードされたＴａｎＣＡＲを標的細胞の細胞表面に発現させる。
【０１４７】
核酸配列はＲＮＡまたはｃＤＮＡなどのＤＮＡであってもよい。
核酸構築物
【０１４８】
本発明は、２種またはそれより多くの核酸配列を含む核酸構築物を提供する。例えば、核酸構築物は、
−  ＴＡＣＩに結合する第１のＣＡＲおよびＴＡＣＩ以外の抗原に結合する第２のＣＡＲ；
−  ＴＡＣＩに結合する第１のＣＡＲ、ＴＡＣＩ以外の抗原に結合する第２のＣＡＲ、および自殺遺伝子；または
−  ＴａｎＣＡＲおよび自殺遺伝子
をコードすることができる。
【０１４９】
核酸は、標的細胞により発現された場合、コードされたポリペプチドを標的細胞の内または表面に独立に発現させる。
【０１５０】
核酸構築物における核酸配列は、２種のポリペプチドが、一度翻訳されると、細胞内または細胞で別々に発現されることを可能にする「共発現」配列により分離され得る。
【０１５１】
上の構造で、「ｃｏｅｘｐｒ」は、２種のポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列である。それは、核酸構築物が、開裂部位により連結された２種またはそれより多くのポリペプチドを生じて含むような開裂部位をコードする配列であってもよい。開裂部位は、ポリペプチドが産生されたときに、それが、いかなる外部の開裂活性も必要とせずに、直ちに開裂されて個々のポリペプチドになるような自己開裂であることができる。
【０１５２】
開裂部位は、２種またはそれより多くのポリペプチドが分離されることを可能にするどのような配列であってもよい。
【０１５３】
用語「開裂」は、本明細書では便宜上使用されるが、開裂部位は、古典的開裂以外の機構により、ポリペプチドを個々の実体に分離させることができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａの自己開裂ペプチドについて（下を参照されたい）、種々のモデルが、「開裂」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）効果を説明するために提案されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．８２巻：１０２７〜１０４１頁）。そのような「開裂」の厳密な機構は、開裂部位が、タンパク質をコードする核酸配列間に位置する場合に、タンパク質を別の実体として発現させる限り、本発明の目的にとって重要ではない。
【０１５４】
開裂部位は、フーリン開裂部位であることもできる。
【０１５５】
フーリンは、サブチリシン様プロタンパク質変換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的前駆体タンパク質を加工してそれらの生物学的に活性な生成物にするプロタンパク質変換酵素である。フーリンは、前駆体タンパク質を、それらの対化された塩基性アミノ酸プロセシング部位で効率的に開裂することができるカルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼである。フーリンの基質の例は、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ−ベータ−セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ、プロ神経増殖因子のベータサブユニットおよびフォン・ウィルブラント因子を含む。フーリンは、タンパク質を、塩基性アミノ酸の標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’（配列番号５２））の直ぐ下流で開裂して、ゴルジ体において富化されている。
【０１５６】
開裂部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）開裂部位であってもよい。
【０１５７】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列に特異的なシステインプロテアーゼであり、それはキモトリプシン様プロテアーゼである。それは、その標的開裂部位に非常に特異的であり、それ故、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で融合タンパク質の制御された開裂のためにしばしば使用される。コンセンサスＴＥＶ開裂部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓである（ここで、「＼」は開裂されるペプチド結合を表す）（配列番号５３）。ヒト細胞などの哺乳動物の細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ開裂部位を含み、哺乳動物の細胞で発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼも哺乳動物の細胞中で発現されなければならない。
【０１５８】
開裂部位は、自己開裂ペプチドをコードすることもできる。
【０１５９】
「自己開裂ペプチド」は、タンパク質および自己開裂ペプチドを含むポリペプチドが産生される場合に、いかなる外部の開裂活性も必要とせずに、それが直ちに「開裂される」かまたは別個のおよび離散的な第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドを指す。
【０１６０】
自己開裂ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルスからの２Ａ自己開裂ペプチドであることができる。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの主要な２Ａ／２Ｂ開裂は、それ自体のＣ末端で２Ａ「開裂」により媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い区画であり、それは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）と一緒に、それ自体のＣ末端における「開裂」を媒介することができる自律性のエレメントを代表する（Ｄｏｎｅｌｌｙら（２００１年）、同上）。
【０１６１】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ内の反復配列および細菌の配列で見出されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）、同上）。開裂部位は、
【化１０】
2019535262.tif 000014
などのこれらの２Ａ様配列の１つを含むことができる。
【０１６２】
開裂部位は、配列番号２７（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示される２Ａ様配列を含むこともできる。
自殺遺伝子
【０１６３】
Ｔ細胞は、合体し（ｅｎｇｒａｆｔ）および自律性であるので、患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞を選択的に欠失させる手段が望ましい。自殺遺伝子は、許容されない毒性にさらされて、注入されたＴ細胞の選択的破壊を生ずる遺伝的にコードされ得る機構である。自殺遺伝子についての最も初期の臨床的経験は、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）についてであり、これは、Ｔ細胞をガンシクロビルに感受性にする。ＨＳＶ−ＴＫは高度に効果的な自殺遺伝子である。しかしながら、予め形成された免疫応答は、ハプロタイプ一致の幹細胞移植などの考慮され得る免疫抑制の臨床的設定にその使用を限定し得る。誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）は、カスパーゼ９の活性化ドメインを、改変されたＦＫＢＰ１２で置き換えることにより構築された自殺遺伝子である。ｉＣａｓｐ９は、そうでなければ不活性な二量化の低分子化学誘導物質（ＣＩＤ）により活性化される。ｉＣａｓｐ９は、最近ハプロタイプ一致のＨＳＣＴの設定で試験されてＧｖＨＤを中断することができる。ｉＣａｓｐ９の最大の限界は、臨床的等級の特許権のあるＣＩＤの利用可能性に対する依存性である。ｉＣａｓｐ９およびＨＳＶ−ＴＫは両方共細胞内タンパク質であり、したがって唯一の導入遺伝子として使用される場合には、それらは、マーカー遺伝子と共発現されて、形質導入される細胞の選択を可能にする。
【０１６４】
ｉＣａｓｐ９という自殺遺伝子は、配列番号３４として示される配列または少なくとも８０、９０、９５もしくは９８％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むことができる。
【化１１】
2019535262.tif 000015
【０１６５】
ＷＯ２０１３／１５３３９１は、抗体ＱＢＥｎｄ１０で検出することができるＲＱＲ８として公知のマーカー／自殺遺伝子、および治療用抗体リツキシマブで溶解される発現する細胞を記載している。
【０１６６】
自殺遺伝子は、配列番号３５として示される配列または少なくとも８０、９０、９５もしくは９８％の配列同一性を有するそれらのバリアントを含むことができる。
【化１２】
2019535262.tif 000016
【０１６７】
自殺遺伝子は、例えば、２つの配列間で自己開裂ペプチドを使用することにより、ＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲを有する単一のポリペプチドとして発現させることができる。
ベクター
【０１６８】
本発明は、本発明による核酸配列または核酸構築物を含むベクターも提供する。そのようなベクターは、核酸配列または構築物を宿主細胞に導入するために使用することができて、その結果それが発現して１種もしくは複数のＣＡＲ、ｔａｎＣＡＲおよび／または自殺遺伝子を産生する。
【０１６９】
ベクターは、例えば、プラスミドまたは合成ｍＲＮＡまたは、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。
【０１７０】
ベクターは、エフェクター細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができる。
細胞
本発明は、１種または複数のＣＡＲ／ＴａｎＣＡＲを任意選択で自殺遺伝子と一緒に発現する細胞を提供する。
【０１７１】
細胞は、本発明による核酸配列または構築物を含むことができる。
【０１７２】
宿主細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞であってもよい。宿主細胞は細胞を溶解する免疫細胞であってもよい。
【０１７３】
Ｔ細胞以外の細胞、例えばＮＫＴ細胞について、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞のシグナル伝達ドメインと異なってもよく、その特定の細胞型のために誂えることもできる。
【０１７４】
細胞は、細胞にＣＡＲをコードするまたはＴａｎＣＡＲをコードする核酸を形質導入またはトランスフェクトすることにより作製することができる。
【０１７５】
細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏのＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）試料由来であってもよい。Ｔ細胞は、ＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲをコードする核酸を形質導入する前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体で処置することにより、活性化および／または拡大増殖させることも可能である。
医薬組成物
【０１７６】
本発明は、複数の本発明の第１の態様による細胞を含む医薬組成物にも関する。
【０１７７】
本発明は、以下：
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団；および
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団
の混合物を含む医薬組成物であって、第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、医薬組成物も提供する。
【０１７８】
第２のＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合することができる。
【０１７９】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、ならびに必要に応じて１種または複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含むこともできる。そのような製剤は、例えば、静脈内点滴のために適当な形態であることができる。
処置する方法
【０１８０】
本発明の細胞は、後期段階のＢ細胞悪性腫瘍などのがん細胞を死滅させることができることもある。
【０１８１】
細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、患者自身の末梢血液（第１の集合）から、または供与者の末梢血液（第２の集合）、もしくは無縁の供与者からの末梢血液（第３の集合）からの造血性幹細胞移植の設定のいずれかで創ることができる。あるいは、細胞は、誘導性の親細胞または胚の親細胞の分化からｅｘ  ｖｉｖｏで誘導することもできる。これらの場合には、細胞は、ＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって導入することにより生成される。
【０１８２】
本発明は、以下のステップ：
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団を投与するステップ
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団を投与するステップ
を含む、疾患を処置および／または予防する方法であって、第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、第１のまたは第２のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、方法も提供する。
【０１８３】
ＴＡＣＩ−ＣＡＲ細胞集団は、ＴＡＣＩ以外の抗原に対する結合特異性を有する細胞集団の投与の前、後または同時に患者に投与することができる。
【０１８４】
上記のような方法で使用するためのキットであって、キットは、
（ｉ）第１のＣＡＲを発現する第１の細胞集団
（ｉｉ）第２のＣＡＲを発現する第２の細胞集団
を含み、第１および第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合し、第１のＣＡＲは、膜貫通活性化因子およびカルシウム調節因子およびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する、キットも提供される。
【０１８５】
第１および第２の細胞集団は、その後の、別のまたは同時の投与のために、キットで別々に（例えば別の容器で）提供することができる。第１の細胞集団は、第２の細胞集団の前に、後でまたは同時に、患者に投与することができる。
【０１８６】
本発明の方法は、がん性疾患、特に増大したＴＡＣＩ／ＢＣＭＡ発現と相関する形質細胞障害またはＢ細胞障害を処置するためであることができる。
【０１８７】
形質細胞障害は、形質細胞腫、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、アミロイドーシス、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、孤立性骨形質細胞腫、延髄外形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）および重鎖病ならびに臨床的に不明の意義不明／くすぶり型多発性骨髄腫のモノクローナル高ガンマグロブリン血症を含む。
【０１８８】
疾患は多発性骨髄腫であることもある。
【０１８９】
上昇したＴＡＣＩ／ＢＣＭＡの発現レベルと相関するＢ細胞障害の例は、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
【０１９０】
疾患を処置する方法は、本発明の医薬組成物の治療的使用に関する。このことに関して、医薬組成物は、既存の疾患または状態を有する被験体に、疾患と関連する少なくとも１つの症状を軽減、緩和もしくは改善するために、および／または疾患の進行を遅延、緩和もしくは阻止するために投与することができる。本発明の方法は、形質細胞などのＴＡＣＩを発現するかまたはＴＡＣＩ／ＢＣＭＡを発現する細胞の、細胞に媒介される死滅を引き起こし、または促進することができる。
サイトカイン放出症候群の阻害
【０１９１】
本発明の第１３の態様は、被験体におけるサイトカイン放出症候群を回避および／または緩和する方法に関する。
【０１９２】
本発明者らは、ＴＡＣＩが、ＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカインを分泌する単球およびマクロファージなどの骨髄性細胞で発現されることを見出した。これらのサイトカインはサイトカイン放出症候群と関連する。したがって、患者におけるＣＲＳを、単球およびマクロファージを、ＴＡＣＩにより標的とすることにより予防、緩和または処置することは可能である。
【０１９３】
ＩＬ−６などのサイトカインの分泌は、がん、特に固形腫瘍と関連する敵対的微小環境の一因になるとも考えられる。ＴＡＣＩは、微小環境を改良して、それを効果的な抗がん免疫学的応答にさらに寄与させるために、骨髄性細胞によるサイトカイン分泌を予防または緩和するための標的とすることもあり得る。
【０１９４】
抗ＴＡＣＩ剤は、被験体における骨髄性細胞によるサイトカイン分泌を阻害することができる。抗ＴＡＣＩ剤は、被験体における骨髄性細胞を、例えばアポトーシスまたは他の機構の細胞死により死滅させることができる。抗ＴＡＣＩ剤は腫瘍微小環境を改良することができる。
【０１９５】
ＴＡＣＩは、抗ＴＡＣＩ抗体を使用して標的とすることができる。該薬品は、例えば、抗ＴＡＣＩ抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ、二重特異性抗体または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であることもできる。
【０１９６】
あるいはＴＡＣＩは、抗ＴＡＣＩキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用して標的とすることもできる。ＷＯ２０１５／０５２５３８に記載されたように、ＣＡＲは、ＡＰＲＩＬというＴＡＣＩの天然のリガンドに基づく結合ドメインを含むことができ；またはそれは抗ＴＡＣＩ  ｓｃＦｖを含むことができる。
【０１９７】
抗ＴＡＣＩ  ＣＡＲは、２つの別の成分：抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合成分；ならびにエンドドメインを含む細胞内シグナル伝達成分を含む。抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分は、細胞表面で会合して機能性ＣＡＲ複合体を形成する。
【０１９８】
抗原結合成分および細胞内シグナル伝達成分は、ＷＯ２０１５／１５０７７１およびＷＯ２０１６／０３０６９１にそれぞれ記載されたある特定の分子の存在または不在下でのみ会合することができる。分子、例えばテトラサイクリンは、抗原結合成分と細胞内シグナル伝達成分の解離を生じさせて、ＣＡＲ機能を低下または停止させることができる。
【０１９９】
抗ＴＡＣＩ剤は、本発明の第１の態様による細胞であってもよくまたはそれを含むこともできる。
【０２００】
細胞がＯＲゲート（本発明の第１の態様の第１の実施形態）またはＴａｎＣＡＲ（本発明の第１の態様の第２の実施形態）を含む場合、第２の抗原結合ドメインは、任意の他の抗原、例えば任意の他の腫瘍関連抗原に結合することができる。
【０２０１】
第２の抗原結合ドメインは、以下の腫瘍関連抗原の１つに結合することができる：
【表４】
2019535262.tif 000017
【０２０２】
ＣＲＳは、がんの処置の間緩和または回避され得る。第２の抗原結合ドメインは、そのがんと関連する抗原を標的とすることができる。がんは、多発性骨髄腫、血液悪性腫瘍または固形腫瘍であってもよい。がんは、上の表のリストに挙げたもの１つであってもよい。
【０２０３】
抗ＴＡＣＩ剤は、ＣＲＳを処置するために使用することができる。ＣＲＳを処置する方法は、本発明の薬品（例えば細胞）の治療的使用に関する。本明細書では、該薬品は、既存のＣＲＳまたはＣＲＳに関連する状態を有する被験体に、ＣＲＳと関連する少なくとも１つの症状を軽減、緩和もしくは改善するために、および／またはＣＲＳの進行を、遅延、緩和もしくは阻止するために投与することができる。
【０２０４】
被験体は、以前ＣＡＲ発現細胞で処置されていてもよい。
【０２０５】
ＣＲＳを予防する方法は、本発明の薬品（例えば細胞）の予防的使用に関する。この使用のために、該薬品を、どのようなＣＲＳの症状も示していない被験体に、ＣＲＳの原因を予防するかもしくは減ずるために、またはＣＲＳと関連する少なくとも１つの症状の発症を緩和するかもしくは予防するために投与することもできる。被験体は、ＣＡＲに基づく処置などの免疫療法を受け入れようとしていてもよい。
【０２０６】
予防的使用のために、抗ＴＡＣＩ剤は、ＣＡＲに基づく療法の前に、例えば前処置のレジメンで投与されてもよい。あるいは、抗ＴＡＣＩ剤は、ＣＡＲに基づく療法と共投与されてもよい。
【０２０７】
ここで、本発明を、実施例により、さらに記載することにするが、実施例は本発明の実施で当業者を助けることに役立つことを意図するもので、本発明の範囲を限定することは決して意図されない。
【実施例】
【０２０８】
（実施例１）骨髄腫細胞の表面におけるＢＣＭＡの発現
初代の骨髄腫細胞を、随伴疾患を有することが知られている多発性骨髄腫患者からの新鮮骨髄試料で、ＣＤ１３８免疫磁性選択を行うことにより単離した。これらの細胞を、ＰＥとコンジュゲートされたＢＣＭＡ特異的Ｊ６ＭＯ  ｍＡｂ（ＧＳＫ）を用いて染色した。同時に、結合部位の数が知られている標準のビーズを、ＰＥ  Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ  ｂｅａｄ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）をメーカーの使用説明書に従って使用して生成させた。ビーズから導いた標準曲線と、骨髄腫細胞からの平均蛍光性強度を関連付けることにより、骨髄腫細胞上のＢＣＭＡコピー数を導き出した。骨髄腫細胞表面上のＢＣＭＡのコピー数の範囲は、低いことが見出され、１細胞当たり３４８．７〜４２６８．４ＢＣＭＡコピーで、平均は１１８１および中央値は１０８４．９であった（図２）。これは、例えばＣＡＲの古典的な標的であるＣＤ１９およびＧＤ２よりも相当低い。
（実施例２）ＴＡＣＩ  ＣＡＲの設計および生成
免疫化およびハイブリドーマの生成
【０２０９】
ヒトＴＡＣＩをコードする遺伝子をベクターｐＶＡＣ２中にクローニングした。５匹のＢａｌＢＣマウスを、金ナノ粒子に吸着されたＴＡＣＩをコードするプラスミドＤＮＡを用いて免疫した。Ｇｅｎｅ−Ｇｕｎ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）システムを使用してコートされた金ナノ粒子を筋肉内に送達した。マウスを２１日のコースの間に３回追加免疫した。マウスからの試験採血を、抗ＴＡＣＩ抗体の力価についてＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによりスクリーニングした。
【０２１０】
血清がＴＡＣＩ陽性の５匹のマウスを最終の追加免疫のために選択した後、Ｂ細胞の単離およびハイブリドーマ産生のために脾臓を採取した。１０×９６ウェルのプレートで、選択されたマウスのリンパ球とのハイブリドーマ融合を実施した。ハイブリドーマの上清を、組換えヒトＴＡＣＩの精製タンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３１０−１７）に対するＥＬＩＳＡスクリーニングにより、反応性の抗ＴＡＣＩ抗体についてスクリーニングして、代表的データを図６ａに示す。ＥＬＩＳＡ陽性のハイブリドーマ上清を、操作されてＴＡＣＩを過発現するＳｕｐＴ１細胞について、フローサイトメトリーにより試験した。対照としてＢＣＭＡを発現するＳｕｐＴ１細胞を使用した、図６ｂ。候補のハイブリドーマを拡大増殖した。
ハイブリドーマの拡大増殖およびクローニング
【０２１１】
最も強いおよび最も特異的な抗ＴＡＣＩ応答を発現する４種の親クローンハイブリドーマを、フローサイトメトリー（２Ｈ６、２Ｇ２、１Ｇ６、４Ｂ１１）により同定して拡大増殖させ、ストックをクローニングしてモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成させた。ハイブリドーマのクローンを限界希釈により得た。
モノクローナルハイブリドーマ細胞系統からの抗体の配列決定
【０２１２】
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬をメーカーの使用説明書に従って使用して、モノクローナルハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析して、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００Ｃを使用して濃度を評価した。全ＲＮＡを、アイソタイプに特異的な抗センスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔをメーカーの使用説明書に従って使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。ＶＨおよびＶＬの抗体断片を５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ方法を使用して増幅した。ＤＮＡ断片を、平滑末端でＴオーバーハングを含有するベクター（ＴＯＰＯ−Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中にクローニングした。重鎖および軽鎖の各々について５つのコロニーをスクリーニングして、コンセンサス配列を得た。クローンの配列が、ＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲ配列と一緒に、上の１７〜１９頁に示されている。
【０２１３】
タグ付き可溶性のＦｃおよびＣＡＲ形式におけるＴＡＣＩ結合抗体のクローニング
【０２１４】
可変重鎖および軽鎖を、標準的分子生物学技法を使用してｓｃＦｖ形式にクローニングした。ＴＡＣＩ  ｓｃＦｖを、細胞に結合するそれらの能力についてフローサイトメトリーにより、およびそれらの結合の反応速度についてＢＩＡｃｏｒｅにより試験した、図８。
【０２１５】
ｓｃＦｖ抗体を、キメラ抗原受容体形式におけるように操作した。ＣＡＲ形式における発現を示すために、各ＣＡＲのｓｃＦｖを、ＳＦＧレトロウイルスベクターにおいてヒトヒンジ、ＴＹＲＰ膜貫通ドメインならびにＣＤ２８  ＯＸ４０およびＣＤ３ゼータエンドドメインを有する単一のオープンリーディングフレームでクローニングした、図７ａ。Ｔ細胞にこのベクターを形質導入して、カセットを発現するＴ細胞表面で、ウサギＩｇＧ１のＦｃドメインと融合した組換えＴＡＣＩを用いる染色により、ＣＡＲを検出した。
（実施例３）ＴＡＣＩ−ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的細胞の死滅
【０２１６】
２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質ＲＤ１１４をコードするプラスミドを、一過性でトランスフェクトすることにより、レトロウイルスを産生した。３日後に上清を捕集して、レトロネクチンをコートしたプレートで、ＰＨＡ／ＩＬ２で活性化されたＰＢＭＣに等力価のレトロウイルスを形質導入するために使用した。形質導入の６日後にＣＡＲの発現をフローサイトメトリーにより確認して、ＰＢＭＣを、ＴＡＣＩ＋ＢＦＰ  ＳｕｐＴ１細胞またはＢＣＭＡ＋ＢＦＰ  ＳｕｐＴ１細胞のいずれかと１：１の比で共培養した。標的細胞の死滅を１日および３日後にアッセイした。１日および３日後に、上清を取り出して、インターフェロン−γのレベルもＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を図７ｂおよびｃに示す。
（実施例４）骨髄性細胞によるＩＬ−６産生に対するＴＡＣＩ−ＣＡＲの効果
【０２１７】
骨髄性細胞、末梢血から単離された細胞系統および初代細胞の両方を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的細胞に曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞からの馴化培地で処置して、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞により産生されるサイトカインに応答した骨髄性細胞によるＩＬ−６の分泌を研究する。
【０２１８】
骨髄性細胞によるＴＡＣＩの発現も、標的細胞に曝露したＣＡＲ−Ｔ細胞からの馴化培地を用いる処置の前におよび後で研究する。
【０２１９】
ＣＡＲ−Ｔ細胞、標的細胞および骨髄性細胞で共培養を確立して、ＴＡＣＩに媒介されるＣＡＲ−Ｔ細胞による骨髄性細胞の死滅のＩＬ−６産生に対する効果を研究する。ＣＡＲ−Ｔ細胞の２種の異なった型：ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲを発現するＴ細胞（図９Ａを参照されたい）およびＣＤ１９／２２  ＣＡＲを発現するＴ細胞（図９Ｂを参照されたい）を試験する。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲは、トランケート型のＡＰＲＩＬを抗原結合ドメインとして含む。これの配列は上で配列番号２として与えられている。トランケート型ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩ結合を保持するが、プロテオグリカン結合の能力は最早ない。ＣＤ１９／ＣＤ２２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２種のＣＡＲ、１つはＣＤ１９に対するものおよび１つはＣＤ２２に対するものを発現する。ＣＤ１９／２２  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、骨髄性細胞を死滅させないので陰性対照として働く。
【０２２０】
標的細胞で活性化されたときに、ＣＡＲ−Ｔ細胞により分泌されたサイトカインの存在下で、骨髄性細胞によるＩＬ−６を阻害するトラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤の潜在能力も研究する。
（実施例５）ＡＰＲＩＬに基づくＣＡＲは、ＩＬ−６を産生する単球を死滅させることができる
【０２２１】
ＣＲＳは、高レベルのＩＬ−６などのサイトカインにより惹起されるＣＡＲＴ療法の主な有害な効果の１つである。患者でＣＲＳが開始される可能な機構を研究するために、本発明者らは、１：１の比で播種されたＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴ細胞のＭＭ１ｓ標的細胞との４８時間の共培養からの上清中における炎症誘発性サイトカインの濃度を分析した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイにより実施されたこの分析により、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮｇは、試験されたサイトカインパネルの中で最も豊富な２種のサイトカインであることが明らかになった（図１０Ａ）。これらのサイトカインは、形質導入されていないＴ細胞とＭＭ１ｓ細胞の共培養からの上清には存在しなかった（図１０Ｂ）。単球におけるＩＬ−６産生に対するＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮｇの効果を研究するために、３名の健康なドナーから単離されたヒト初代単球またはＴＨＰ１単球様細胞を、単独あるいはＩＦＮｇ（５０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）または両方の組合せの存在下のいずれかで４８時間培養した。インキュベーションに続いて、培養培地中のＩＬ−６レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１１に示す。初代単球およびＴＨＰ１細胞の両方共、未処置の対照または単一のサイトカイン処置と比較した場合、ＩＦＮｇとＧＭ−ＣＳＦの組合せに応答してＩＬ−６の産生を増大したことが見出された。ヒト初代単球は、４８時間のインキュベーション後に、ＩＦＮｇとＧＭ−ＣＳＦの組合せに応答して、明瞭な形態学的変化を示すことも見出された（図１１Ｂ）。
【０２２２】
単球に対するＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害活性を研究するために、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲＴをＴＨＰ１細胞と７２時間共培養した。ＣＡＲがＴ細胞抗原ＴＲＢＣ１に特異的である対照のＣＡＲを発現するＴ細胞も試験した。形質導入されていない細胞でもＴＲＢＣ１  ＣＡＲ−Ｔ細胞でもなく、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、これらの単球細胞に対して、ＦＡＣＳにより決定される高度に細胞傷害性効果を示した（図１２）。
（実施例６）ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲは、単球由来のサプレッサー細胞の存在下で標的細胞の優れた死滅を生ずる
【０２２３】
悪性の形質細胞の生存は、骨髄の微小環境との相互作用により支持される（Ｋａｗａｎｏら（２０１５年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．２６３巻：１６０〜１７２頁）。これらの相互作用は、腫瘍に関連するマクロファージ、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）および樹状細胞（ＤＣ）を含む。これらの細胞のタイプは、骨髄腫細胞集団の支持および腫瘍に向けられる免疫応答の抑制の両方に作用する。骨髄マクロファージによる高レベルの骨髄浸潤を有する患者は、予後不良を有し（Ｓｕｙａｎｉら（２０１３年）Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９２巻：６６９〜６７７頁）、ＭＤＳＣの数は、多発性骨髄腫患者の末梢血および骨髄で大きく増加している（Ｇｏｒｇｕｎら（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ  １２１巻：２９７５〜２９８７頁）。
【０２２４】
免疫抑制骨髄の微小環境が内因性Ｔ細胞活性を低下させることが示されたことと同様に、養子移入されたＣＡＲ−Ｔ細胞は骨髄腫患者の骨髄の微小環境中の免疫抑制細胞により影響される。ＭＤＳＣ、マクロファージおよびＤＣは、単球から誘導されるので、本発明者らは、自家末梢血液の単核細胞（ＰＢＭＣ）から培養されたこれらの単球誘導体の存在下で、ＣＡＲに媒介される腫瘍細胞溶解を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを開発した。
【０２２５】
単球を、ＰＢＭＣから全単球単離マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）を使用して単離して、サイトカイン中で１週間培養して、Ｍ２単球、ＭＤＳＣおよびＤＣを誘導した。これらの細胞は、骨髄腫患者の骨髄で見出される腫瘍浸潤マクロファージに類似の抑制的表現型を有する（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら（２０１６年）Ｂｌｏｏｄ  １２８巻：２２４１〜２２５２頁）。したがって同じドナーに由来するＣＡＲ  Ｔ細胞を、ヒト骨髄腫細胞系統（ＨＭＣＬ）ＭＭ．１ｓとこれらの抑制細胞型の不在または存在下で共培養した。
【０２２６】
ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲおよび抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖに基づく抗原結合ドメインを含む抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＢＣＭＡｓｃＦｖ  ＣＡＲ）という２つのタイプのＣＡＲを試験した。このシステムでは、Ｍ２単球、ＭＤＳＣおよびＤＣの存在下におけるＢＣＭＡｓｃＦｖ  ＣＡＲによる有意に減弱した腫瘍死滅が見られた（図１３）。対照的に、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲに媒介される死滅は単球由来のサプレッサー細胞の存在下で維持された。
【０２２７】
ＦＡＣＳ分析により、本発明者らは、Ｍ２単球、ＭＤＳＣおよびＤＣが、ＴＡＣＩを発現することを確立した（図１３ａ）。ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の二重の標的を有する能力は、ＴＡＣＩを発現する免疫抑制細胞を直接標的とすることを可能にする。したがって、これらの単球誘導体は、ＢＣＭＡのみを標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍死滅を抑制し、一方、ＡＰＲＩＬ  ＣＡＲに媒介される死滅は維持される。
【０２２８】
上の明細書で言及した全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されたが、特許請求された本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連する分野における当業者には明白な、本発明を実施するための記載の様式の種々の改変は、以下の請求項の範囲内であることが意図されている。
【図１】
2019535262.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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