(57)【要約】  悪性疾患の治療のための組成物および方法が、開示される。詳細には、本開示は、がんを治療するための方法であって、対象由来のがん細胞を含む生物学的試料におけるｐ２７のチロシン８８（Ｙ８８）リン酸化（ｐＹ８８）レベルを評価することおよびコントロール組織において観察されるｐＹ８８リン酸化レベルと比較して、ｐＹ８８リン酸化レベルを０、１、２、または３として階層化することを含み、０のレベルは、サイクリン依存性キナーゼ４（ｃｄ４ｋ）阻害に対する検出可能な感受性を示さず、１のレベルは、検出可能な感受性が低くまたはなく、２または３のレベルは、ｃｄｋ４阻害に対する検出可能な感受性を示す方法を提供する。方法を実施するためのキットが、さらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるがんを治療するための方法であって、
ａ）対象由来のがん細胞を含む生物学的試料においてｐ２７におけるｐＹ８８リン酸化レベルを評価すること及びコントロール組織において観察されるｐＹ８８リン酸化レベルと比較して、Ｙ８８リン酸化レベルを０、１、２、または３として階層化すること
ｂ）０のレベルをｃｄ４ｋ阻害剤非感受性に、及び１、２、または３のレベルをｃｄｋ４阻害に対する感受性に相関させること、ならびに
ｃ）がんによる負担または症状を軽減するために、治療有効量の少なくとも１つのｃｄｋ４阻害剤を、工程ｂ）においてｃｄｋ４阻害に感受性であると同定された対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記Ｙ８８リン酸化レベルが１であり、前記対象がｃｄｋ４阻害剤療法に応答性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｙ８８リン酸化レベルが２であり、前記対象がｃｄｋ４阻害剤療法に応答性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｙ８８リン酸化レベルが３であり、前記対象がｃｄｋ４阻害剤療法に応答性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記がんが、乳房、脳、甲状腺、前立腺、結腸直腸、膵臓、頸部、胃、子宮内膜、肝臓、膀胱、卵巣、精巣、頭部、首、皮膚、中皮内層、白血球、食道、筋肉、結合組織、肺、副腎、甲状腺、腎臓、骨、および胃の少なくとも１つのがんである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが乳がんである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記対象がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ｃｄｋ４阻害剤が、表２に列挙されるｃｄｋ４阻害剤から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｃｄｋ２阻害剤の投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗がん剤の投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃｄｋ４阻害剤が、Ａｌｔ−Ｂｒｋミメティックである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害剤がパルボシクリブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
がん細胞を殺すために前記パルボシクリブと相乗的に働くＡｌｔ−Ｂｒｋミメティックの投与をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ａｌｔ−ｂｒｋミメティックが、エクソン２を欠き、ＢｒｋのＳＨ３ドメインを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
がん治療においてｃｄｋ４活性の阻害の効能を評価するための方法であって、１つ以上のｃｄｋ阻害剤サンプルを含む抗がん剤による治療の前および後に前記対象由来のがん細胞を含む生物学的サンプルにおけるｐ２７のｐＹ８８リン酸化レベルを比較すること、ならびに０または１、２、もしくは≧３としてレベルを階層化することを含み、Ｙ８８リン酸化レベルの低下はｃｄｋ４阻害およびがん細胞増殖の低下の効能と相関し、Ｙ８８の増加はｃｄｋ４阻害剤療法の効能の低下または減少と相関する、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットはｐ２７におけるＹ８８及び／又はＹ８９のリン酸化レベルを決定するのに適した試薬を含み、該試薬はリン酸化および非リン酸化Ｙ８８及び／又はＹ８９の検出に免疫学的に特異的な抗体を含み、前記抗体は天然に存在しない検出可能な標識を含みかつ／または固体支持体に任意選択的に付けられており、該キットはリン酸化および非リン酸化Ｙ８８及び／又はＹ８９抗原を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月２３日に提出された米国仮特許出願第６２／２９８，５８４号明細書に対する優先権を主張し、その全開示が、本明細書において参照によって完全に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、がんならびにがん治療および管理の分野に関する。より詳細には、本発明は、ｃｄｋ４／ｃｄｋ２の調整から恩恵を受ける可能性が最も高い対象を同定するための診断方法およびそのように同定された対象を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの刊行物および特許文献が、本発明に関係する技術的現状を説明するために本明細書の全体にわたって引用される。これらの引用のそれぞれが、全て記載されるのと同様に本明細書において参照によって組み込まれる。
【０００４】
乳がんは、アメリカ合衆国の女性においてがんによる死亡率が２番目に高い原因となっており、毎年約４０，０００人が死亡している。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙは、侵襲性乳がんの２３２，０００の新たな症例および非浸潤性乳管がんの約６０，０００の症例が今年発生するだろうと推測している。分子診断学の進歩により、乳がんが単一の疾病ではないことが明らかにされ、正確に言うと、乳がんは、多様な疾患であり、広範な腫瘍間および腫瘍内の異質性がある（すなわち、異なる遺伝的な、後成的な、及び／又は表現型の特徴を有する細胞のサブクローン）。この異質性は、患者の予後ならびに化学療法に対する応答に加えてホルモン療法および標的療法に対する応答の点から、重要な臨床上および治療上の重要性を有する。
【０００５】
がんの病因を含め、分子的な基礎についての知識がますます増すことによって、特異的な腫瘍の特徴を同定し、これらの疾病に対する標的療法を開発することによってこれらの特色を活用するための、個人化または「高精度」医療の分野が推進されてきた。特定の療法に対する個人の応答を予測することができることは、現代の高精度医療の最終目標である。個人の腫瘍の特徴についてのより詳細な遺伝的および臨床上の理解の結果として、いくつかの標的がん療法が、標準的な腫瘍のケアにおいて現在利用されている。予測的な臨床上のおよび薬理学的な関連性を有する分子バイオマーカーの治療上の使用は、標的療法の安全で有効な治療を指示するために、これらのバイオマーカーを正確に検出しかつ／または定量化することに依存する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腫瘍に存在する特定のタイプのがん細胞を標的にするために設計された高感度診断アッセイおよび治療レジメンを提供する緊急の必要性があるのは明らかである。本発明は、そのようなアッセイおよび治療プロトコールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に従って、対象のがんを治療するための方法が、提供される。例示的な方法は、対象由来のがん細胞を含む生物学的試料におけるｐ２７のｐＹ８８リン酸化レベルを評価することおよびコントロール組織において観察されるｐＹ８８リン酸化レベルと比較して、ｐＹ８８リン酸化レベルを０、１、２、または３として階層化することを含み、０のレベルはｃｄｋ４阻害に対する検出可能な感受性を示さず、１のレベルは検出可能な感受性が低くまたはなく、２または３はｃｄｋ４阻害に対する検出可能な感受性を示す。
【０００８】
ｃｄｋ４阻害に感受性の腫瘍を有すると同定された対象は、次いで、がんによる負担または症状を軽減するために、治療有効量の少なくとも１つのｃｄｋ４阻害剤により治療される。ｃｄｋ４阻害剤は、単独でまたは他の抗がん剤と組み合わせて投与されてもよい。本発明に従って治療されるがんは、限定を伴うことなく、乳房、脳、甲状腺、前立腺、結腸直腸、膵臓、頸部、胃、子宮内膜、肝臓、膀胱、卵巣、精巣、頭部、首、皮膚、中皮内層（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）、白血球、食道、筋肉、結合組織、肺、副腎、甲状腺、腎臓、骨、および胃のがんを含む。好ましい実施形態では、本発明の試験および治療方法が、乳がんの治療に使用される。本発明は様々な哺乳動物の治療を包含するが、好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０００９】
本発明の実施において用いることができるｃｄｋ阻害剤は、本明細書において記載され、表２に列挙されるｃｄｋ阻害剤を含む。ある実施形態では、ｃｄｋ４阻害剤およびｃｄｋ２阻害剤が、組み合わせて投与される。この組み合わせに、抗がん剤をさらに含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本発明で使用するための好ましい治療薬は、ｐ２７ミメティックまたはＡｌｔ−Ｂｒｋミメティックを含む。特に好ましい実施形態では、ｃｄｋ４阻害剤が、パルボシクリブである。さらなる好ましい実施形態では、がん細胞を死滅させるためにパルボシクリブと相乗的に作用するＡｌｔ−Ｂｒｋミメティックもまた、投与される。
【００１０】
本発明はまた、がん治療においてｃｄｋ４活性の阻害の効能を評価するための方法であって、１つ以上のｃｄｋ阻害剤サンプルを含む抗がん剤による治療の前および後に前記対象由来のがん細胞を含む生物学的試料におけるｐ２７のｐＹ８８リン酸化レベルを比較することならびに０、１、２、または３としてレベルを階層化することを含み、Ｙ８８リン酸化レベルの低下はｃｄｋ４阻害およびがん細胞増殖の低下の効能と相関し、Ｙ８８リン酸化レベルの増加はｃｄｋ４阻害剤療法の効能の低下または減少と相関する、方法をも提供する。
【００１１】
本明細書において開示される方法を実施するためのキットもまた、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】Ｂｒｋは、インビトロにおいて高い親和性でｐ２７に結合する。（図１Ａ）３つの推定上のＳＨ３ドメイン動員部位のプロリン領域（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ＰｘｘＰ）：Ｋ１（９０〜９６）、Ｋ２（１１４〜１１７）、およびＫ３（１８８〜１９５）についてハイライトしているｐ２７配列（配列番号１）。ｐ２７（図１Ｂ）またはｐ２７のＰｘｘＰモチーフ（図１Ｃ）とのＳＦＫ  ＳＨ３相互作用についてのファージ−ＥＬＩＳＡ分析。示すデータは、正規化およびＧＳＴへのバックグラウンド結合の減算の後の、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。（図１Ｃ）組換えで産生したＧＳＴ−Ｋ１、−Ｋ２、−Ｋ３（それぞれ配列番号２、３、および４）またはＧＳＴを、９６ウェルプレートに固定し、Ｂｒｋ−、Ｆｒｋ−、Ｙｅｓ、またはＡｂｌ−ＳＨ３ドメインとのファージの結合について分析した。エクソン２の発現を欠き、より短い１５ｋＤａタンパク質をコードするＢｒｋの代替のスプライスバリアント、Ａｌｔ  Ｂｒｋを図１Ｄに示す。ＰＤＢ＋ｊＦＡＴＣＡＴ  ｒｉｇｉｄデータベースから得たＢｒｋ（配列番号５）およびＳｒｃ  ＳＨ３（配列番号６）ドメインの３Ｄ構造のアライメント。Ｂｒｋ  ＳＨ３はオレンジ色で、Ｓｒｃ  ＳＨ３は青色で示す。このＡｌｔ  Ｂｒｋは、ＢｒｋとＮ−末端ＳＨ３ドメインを共有し、特有のプロリンリッチカルボキシ末端を有するが、触媒として活性なＳＨ１キナーゼドメインを欠く。
【図１Ｂ】Ｂｒｋは、インビトロにおいて高い親和性でｐ２７に結合する。（図１Ａ）３つの推定上のＳＨ３ドメイン動員部位のプロリン領域（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ＰｘｘＰ）：Ｋ１（９０〜９６）、Ｋ２（１１４〜１１７）、およびＫ３（１８８〜１９５）についてハイライトしているｐ２７配列（配列番号１）。ｐ２７（図１Ｂ）またはｐ２７のＰｘｘＰモチーフ（図１Ｃ）とのＳＦＫ  ＳＨ３相互作用についてのファージ−ＥＬＩＳＡ分析。示すデータは、正規化およびＧＳＴへのバックグラウンド結合の減算の後の、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。（図１Ｃ）組換えで産生したＧＳＴ−Ｋ１、−Ｋ２、−Ｋ３（それぞれ配列番号２、３、および４）またはＧＳＴを、９６ウェルプレートに固定し、Ｂｒｋ−、Ｆｒｋ−、Ｙｅｓ、またはＡｂｌ−ＳＨ３ドメインとのファージの結合について分析した。エクソン２の発現を欠き、より短い１５ｋＤａタンパク質をコードするＢｒｋの代替のスプライスバリアント、Ａｌｔ  Ｂｒｋを図１Ｄに示す。ＰＤＢ＋ｊＦＡＴＣＡＴ  ｒｉｇｉｄデータベースから得たＢｒｋ（配列番号５）およびＳｒｃ  ＳＨ３（配列番号６）ドメインの３Ｄ構造のアライメント。Ｂｒｋ  ＳＨ３はオレンジ色で、Ｓｒｃ  ＳＨ３は青色で示す。このＡｌｔ  Ｂｒｋは、ＢｒｋとＮ−末端ＳＨ３ドメインを共有し、特有のプロリンリッチカルボキシ末端を有するが、触媒として活性なＳＨ１キナーゼドメインを欠く。
【図１Ｃ】Ｂｒｋは、インビトロにおいて高い親和性でｐ２７に結合する。（図１Ａ）３つの推定上のＳＨ３ドメイン動員部位のプロリン領域（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ＰｘｘＰ）：Ｋ１（９０〜９６）、Ｋ２（１１４〜１１７）、およびＫ３（１８８〜１９５）についてハイライトしているｐ２７配列（配列番号１）。ｐ２７（図１Ｂ）またはｐ２７のＰｘｘＰモチーフ（図１Ｃ）とのＳＦＫ  ＳＨ３相互作用についてのファージ−ＥＬＩＳＡ分析。示すデータは、正規化およびＧＳＴへのバックグラウンド結合の減算の後の、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。（図１Ｃ）組換えで産生したＧＳＴ−Ｋ１、−Ｋ２、−Ｋ３（それぞれ配列番号２、３、および４）またはＧＳＴを、９６ウェルプレートに固定し、Ｂｒｋ−、Ｆｒｋ−、Ｙｅｓ、またはＡｂｌ−ＳＨ３ドメインとのファージの結合について分析した。エクソン２の発現を欠き、より短い１５ｋＤａタンパク質をコードするＢｒｋの代替のスプライスバリアント、Ａｌｔ  Ｂｒｋを図１Ｄに示す。ＰＤＢ＋ｊＦＡＴＣＡＴ  ｒｉｇｉｄデータベースから得たＢｒｋ（配列番号５）およびＳｒｃ  ＳＨ３（配列番号６）ドメインの３Ｄ構造のアライメント。Ｂｒｋ  ＳＨ３はオレンジ色で、Ｓｒｃ  ＳＨ３は青色で示す。このＡｌｔ  Ｂｒｋは、ＢｒｋとＮ−末端ＳＨ３ドメインを共有し、特有のプロリンリッチカルボキシ末端を有するが、触媒として活性なＳＨ１キナーゼドメインを欠く。
【図１Ｄ】Ｂｒｋは、インビトロにおいて高い親和性でｐ２７に結合する。（図１Ａ）３つの推定上のＳＨ３ドメイン動員部位のプロリン領域（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）（ＰｘｘＰ）：Ｋ１（９０〜９６）、Ｋ２（１１４〜１１７）、およびＫ３（１８８〜１９５）についてハイライトしているｐ２７配列（配列番号１）。ｐ２７（図１Ｂ）またはｐ２７のＰｘｘＰモチーフ（図１Ｃ）とのＳＦＫ  ＳＨ３相互作用についてのファージ−ＥＬＩＳＡ分析。示すデータは、正規化およびＧＳＴへのバックグラウンド結合の減算の後の、３つの独立した実験の平均値±標準偏差である。（図１Ｃ）組換えで産生したＧＳＴ−Ｋ１、−Ｋ２、−Ｋ３（それぞれ配列番号２、３、および４）またはＧＳＴを、９６ウェルプレートに固定し、Ｂｒｋ−、Ｆｒｋ−、Ｙｅｓ、またはＡｂｌ−ＳＨ３ドメインとのファージの結合について分析した。エクソン２の発現を欠き、より短い１５ｋＤａタンパク質をコードするＢｒｋの代替のスプライスバリアント、Ａｌｔ  Ｂｒｋを図１Ｄに示す。ＰＤＢ＋ｊＦＡＴＣＡＴ  ｒｉｇｉｄデータベースから得たＢｒｋ（配列番号５）およびＳｒｃ  ＳＨ３（配列番号６）ドメインの３Ｄ構造のアライメント。Ｂｒｋ  ＳＨ３はオレンジ色で、Ｓｒｃ  ＳＨ３は青色で示す。このＡｌｔ  Ｂｒｋは、ＢｒｋとＮ−末端ＳＨ３ドメインを共有し、特有のプロリンリッチカルボキシ末端を有するが、触媒として活性なＳＨ１キナーゼドメインを欠く。
【図２】ＷＴ  Ｂｒｋまたは触媒不活性バージョン（ＫＭ）を過剰発現するＭＣＦ７細胞を生成した。ｐ２７をこれらの細胞から免疫沈降させると、抗ｐＹ８８抗体、抗ｐＹ７４抗体、または抗ｐ２７抗体による免疫ブロット分析を実行し、ｐＹ８８の増加が、Ｂｒｋを過剰発現した細胞において検出されたことが実証された。ｃｄｋ４をこれらの細胞から免疫沈降させ、組換えＲＢによるインビトロＲＢキナーゼアッセイに使用し、ｃｄｋ４キナーゼ活性の増加が、ＷＴ  Ｂｒｋを発現した細胞から検出された。ＷＴ  Ｂｒｋを発現した細胞は、偽発現細胞よりも速く増殖した。Ｂｒｋの増加、ｐＹ８８の増加、ｃｄｋ４キナーゼ活性の増加、およびＰＤ抵抗性の増加。ＭＣＦ７−Ｗｔ  Ｂｒｋ発現細胞は、約６００ｎＭ  ＰＤのＩＣ50値を有した。
【図３】パルボシクリブ感受性を示す乳がん細胞パネル。ＩＣ５０値をｎＭでプロットした（Ｆｉｎｎ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００９．１１（５）：ｐ．Ｒ７７より）。
【図４】ｐ２７（茶色）抗体およびｐＹ８８（赤色）抗体による、低度の（図３Ａ）、中程度の（図３Ｂ）、および高度の（図４Ｃ）ｐＹ８８レベルを示す高度なレスポンダーＭＣＦ７（図４Ａ）、中程度のＭＤＡ  ＭＢ  ２３１（図４Ｂ）、または非レスポンダーＨＣＣ１９５４（図４Ｃ）からのパラフィン包埋セルブロックデータ。
【図５Ａ】ｐ２７  Ｙ８８は、ｃｄｋ４バイオマーカーとしての機能を果たす。（図５Ａ）非同調ＭＣＦ７、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、もしくはＨＣＣ１９５４細胞をＤＭＳＯにより処置したまたはＭＣＦ７細胞を４００ｎＭ  ＰＤにより処置した。セルブロックは、細胞を回収し、１０％ホルマリンにより固定した後に作製した。免疫組織化学的検査を実行し、ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）によりスライドを染色した。（図５Ｂ）正常乳房上皮またはＥＲ／ＰＲ＋ＨＥＲ２−乳がん患者由来の針生検材料を、ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）抗体により染色した。患者はｐＹ８８＋細胞％（緑色、黄色、茶色）およびｐＹ８８の染色が強いかどうか（紫色、灰色、赤色）に基づいて分類した。染色は、２人の外部の病理学者によって盲目的に分析された。（図５Ｃ）染色結果を要約する表を示す。
【図５Ｂ】ｐ２７  Ｙ８８は、ｃｄｋ４バイオマーカーとしての機能を果たす。（図５Ａ）非同調ＭＣＦ７、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、もしくはＨＣＣ１９５４細胞をＤＭＳＯにより処置したまたはＭＣＦ７細胞を４００ｎＭ  ＰＤにより処置した。セルブロックは、細胞を回収し、１０％ホルマリンにより固定した後に作製した。免疫組織化学的検査を実行し、ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）によりスライドを染色した。（図５Ｂ）正常乳房上皮またはＥＲ／ＰＲ＋ＨＥＲ２−乳がん患者由来の針生検材料を、ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）抗体により染色した。患者はｐＹ８８＋細胞％（緑色、黄色、茶色）およびｐＹ８８の染色が強いかどうか（紫色、灰色、赤色）に基づいて分類した。染色は、２人の外部の病理学者によって盲目的に分析された。（図５Ｃ）染色結果を要約する表を示す。
【図５Ｃ】ｐ２７  Ｙ８８は、ｃｄｋ４バイオマーカーとしての機能を果たす。（図５Ａ）非同調ＭＣＦ７、ＭＤＡ  ＭＢ２３１、もしくはＨＣＣ１９５４細胞をＤＭＳＯにより処置したまたはＭＣＦ７細胞を４００ｎＭ  ＰＤにより処置した。セルブロックは、細胞を回収し、１０％ホルマリンにより固定した後に作製した。免疫組織化学的検査を実行し、ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）によりスライドを染色した。（図５Ｂ）正常乳房上皮またはＥＲ／ＰＲ＋ＨＥＲ２−乳がん患者由来の針生検材料を、ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）抗体により染色した。患者はｐＹ８８＋細胞％（緑色、黄色、茶色）およびｐＹ８８の染色が強いかどうか（紫色、灰色、赤色）に基づいて分類した。染色は、２人の外部の病理学者によって盲目的に分析された。（図５Ｃ）染色結果を要約する表を示す。
【図６】大学病院のＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−患者の乳腺切除術または乳房切除術で廃棄処分された材料を、ＤＭＳＯ（緑色）、高非生理学的パルボシクリブ（赤色）、または生理学的濃度のパルボシクリブ（紫色）中で４８時間、外植片培養で成長させた。４８時間後、材料を固定し、パラフィン包埋し、増殖のマーカーとしてのＫｉ６７について染色した。高濃度の薬剤（紫色）を、増殖を阻害することができる内部標準とした。それぞれの患者は、未処置サンプル（ＤＭＳＯ）における異なるＫｉ６７レベルによって測定されるように、固有の異なる増殖速度を有した。パルボシクリブ応答は、生理学的濃度の薬剤（赤色）の存在下におけるＫｉ６７の減少として測定された。患者１および３は応答した。それぞれのデータポイントは、４つのサンプルの平均である（２つの別個の外植片サンプルおよび２つの別個の免疫組織化学的検査染色）。それぞれのサンプルは、２人の病理学者によって盲目的に読み取られた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
サイクリンＤ−ｃｄｋ４（ＤＫ４）は、ＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−乳がんを含む大多数のヒト腫瘍においてがん増殖を推進するので、理想的な治療標的を提供する。サイクリンＤおよびｃｄｋ４は、様々な腫瘍において過剰発現されるが、この不安定な二量体を三元複合体にするのに付随的な因子、たとえばｐ２７Ｋｉｐ１が必要とされるので、それらのレベルは、腫瘍形成活性の正確な指標とならない。そのうえ、ｐ２７のチロシン（Ｙ）リン酸化（ｐＹ８８）が、ｃｄｋ４を活性化するために必要とされ、ＯＮ／ＯＦＦ「スイッチ」として働く。本発明は、ｐＹ８８を調整し、それによってｃｄｋ４活性を調整するｐ２７内のＳＨ３動員ドメインを同定する。ＳＨ３：ＰｘｘＰ相互作用スクリーニングを使用し、Ｂｒｋ（乳房腫瘍キナーゼ）を高親和性ｐ２７キナーゼとして同定した。ｐ２７のさらなる突然変異研究によって、本発明者らは、インビトロおよびインビボにおいてＹリン酸化を可能にするのに必要とされるＳＨ３動員ドメインを同定することができた。乳がん細胞のＢｒｋを調整すると、ｐＹ８８が調整され、ｃｄｋ４阻害剤、ＰＤ０３３２９９１（パルボシクリブ）に対する抵抗性が増加する。Ｂｒｋの選択的スプライス形態（Ａｌｔ  Ｂｒｋ）は、ＢｒｋのＳＨ３ドメインを含有し、ｐＹ８８をブロックし、内因性ｃｄｋ４阻害剤として働き、ｐ２７内の、標的にすることができる可能性がある調節領域を同定する。Ｂｒｋは、６０％の乳がんで過剰発現され、これが、ｐ２７  Ｙリン酸化によってｃｄｋ４を調整することによって細胞周期進行を促進することを示唆する。ｐ２７は、腫瘍抑制因子と考えられてきたが、本明細書のデータは、ｐ２７もまた、サイクリンＤ−ｃｄｋ４活性を担うがん遺伝子と考えられるべきであるという考えを強める。ｐ２７の３10ヘリックスにおけるＴｙｒ−８８／Ｔｙｒ−８９のリン酸化は、そのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害活性を低下させる。この修飾は、サイクリン−ＣＤＫ複合体とｐ２７の相互作用に影響を与えないが、ｐ２７およびＣＤＫの触媒クレフト中のアミノ酸の間のファンデルワールス結合および水素結合による接触に干渉し、ｐ２７のＣ−末端が触媒部位から離れることを可能にする。サイクリンＤ−ｃｄｋ４複合体は、ｐ２７によって結合しているが、ｐ２７  Ｙリン酸化は、「スイッチ」として働き、触媒活性を可能にするよう複合体を開いたり閉じたりする。したがって、この部位のリン酸化によって、腫瘍抑制性ＣＤＫ阻害活性を腫瘍形成活性に切り替えることができることが示唆された。
【００１４】
現在、いくつかのｃｄｋ４阻害療法（ｃｄｋ４ｉ）が開発されており、様々なＦＤＡ承認段階にある。あいにく、ｃｄｋ４阻害療法に応答性であろう腫瘍および患者を特定するバイオマーカーは存在しない。上記に記載されるように、ｐ２７の残基Ｙ８８及び／又はＹ８９のチロシンリン酸化は、この三元複合体を阻害性の複合体から活性な複合体に変換するのに必要とされる。したがって、本明細書において同定されたｐＹ結合ｐ２７は、ｃｄｋ４活性のマーカーとして有利に使用される。したがって、本発明は、本発明者らがｃｄｋ４阻害剤による治療に応答性であると同定したｃｄｋ４活性の範囲を特定の腫瘍が有するかどうかを決定するために、ヒト患者材料におけるマーカーとしてｐＹを使用する組成物および方法を包含する。発明者らは、ｐＹ  ｐ２７に対するリン酸化部位特異的抗体を開発し、この抗体が、パラフィン包埋長期保存ヒト乳がん材料（ＥＲ／ＰＲ＋／Ｈｅｒ２−）においてｐＹを認識したことを示した。１００％の浸透度で、抗体は、ヒト乳房縮小術から得られた良性組織を染色しなかった。分析したＥＲ／ＰＲ＋／Ｈｅｒ−２乳がんサンプルのおよそ７５％がｐＹについてポジティブに染色された（４７％高度の染色、２５％中程度の染色）。
【００１５】
本発明の診断試験および治療方法によって、臨床医は、ｃｄｋ阻害剤療法から恩恵を受けるであろう患者をより正確に同定することができる。療法に適したレベルのｃｄｋ４活性を有すると同定された患者は、次いで、単独でまたは他の化学療法もしくは抗増殖剤と組み合わせてｃｄｋ４阻害剤療法により治療される。
【００１６】
特に、ｐＹはまた、そのような患者における抗がん治療の効能を評価するための代用マーカーとして使用することもできる。たとえば、ｃｄｋ４ｉ療法が有効で、サイクリンＤ−ｃｄ４活性がオフである場合、ｐＹはリン酸化されていないであろう。ｃｄｋ４ｉ療法が有効でなくなり、それによってサイクリンＤ−ｃｄｋ４活性が回復する場合、ｐＹは再び存在しているであろう。
【００１７】
Ｉ．定義
化合物または医薬組成物の「治療有効量」は、限定を伴うことなく、腫瘍成長もしくはサイズを減少させることまたは投与、すなわち予防的な投与より以前にいかなる腫瘍も形成されていない動物において腫瘍成長が形になるのを妨げることを含め、動物、とりわけヒトにおいて腫瘍成長または転移を調整するのに十分な量を指す。
【００１８】
「医薬として許容される」は、動物、特にヒトで使用するための、連邦政府もしくは州政府のまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に載っている監督機関による承認を示す。
【００１９】
「キャリヤ」は、たとえば希釈剤、補助剤、賦形剤、助剤、またはビヒクルを指し、本発明の活性薬剤は、これと共に投与される。そのような医薬キャリヤは、水ならびにラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、およびその他同種のものなどのような石油、動物、野菜、または合成起源のものを含む油などのような無菌の液体とすることができる。水または生理食塩溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液は、好ましくは、特に注射用溶液用のキャリヤとして使用される。適した医薬キャリヤは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」において記載される。
【００２０】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合性活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（たとえば二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。本明細書において使用されるように、用語は、重鎖の少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに軽鎖の少なくともＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む分子を指し、分子は抗原に結合することができる。抗体という用語は、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2などのような、抗原に結合することができる断片を含むが、これらに限定されない。抗体という用語はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびマウス、カニクイザルなどのような様々な種の抗体なども含むが、これらに限定されない。
【００２１】
用語「重鎖」は、リーダー配列ありまたはなしの少なくとも１つの重鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、重鎖は、重鎖定常領域の少なくとも１つの部分を含む。用語「完全長重鎖」は、リーダー配列ありまたはなしの重鎖可変領域および重鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。
【００２２】
用語「重鎖可変領域」は、重鎖の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、フレームワーク領域（ＦＲ）２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、およびＣＤＲ３を含む領域を指す。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域はまた、ＦＲ１の少なくとも１つの部分及び／又はＦＲ４の少なくとも１つの部分をも含む。いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５に相当し、重鎖ＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５に相当し、重鎖ＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２に相当する。たとえばＫａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）を参照されたい。
【００２３】
用語「軽鎖」は、リーダー配列ありまたはなしの少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、軽鎖は、軽鎖定常領域の少なくとも１つの部分を含む。用語「完全長軽鎖」は、リーダー配列ありまたはなしの軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含むポリペプチドを指す。用語「軽鎖可変領域」は、軽鎖ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、およびＨＶＲ３を含む領域を指す。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域はまた、ＦＲ１及び／又はＦＲ４をも含む。いくつかの実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４に相当し、軽鎖ＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６に相当し、軽鎖ＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７に相当する。たとえばＫａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）を参照されたい。
【００２４】
「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、第１の種（マウス、ラット、カニクイザルなど）由来の少なくとも１つの可変領域および第２の種（ヒト、カニクイザルなど）由来の少なくとも１つの定常領域を含む抗体を指す。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、少なくとも１つのマウス可変領域および少なくとも１つのヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、少なくとも１つのカニクイザル可変領域および少なくとも１つのヒト定常領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗体の可変領域はすべて、第１の種に由来し、キメラ抗体の定常領域はすべて、第２の種に由来する。
【００２５】
「ヒト化抗体」は、非ヒト可変領域のフレームワーク領域の少なくとも１つのアミノ酸が、ヒト可変領域由来の相当するアミノ酸と交換された抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つのヒト定常領域またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）2などである。
【００２６】
本明細書において使用される「ヒト抗体」は、ヒトにおいて産生される抗体、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）などのような、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒト動物において産生される抗体、およびファージディスプレーなどのようなインビトロ方法を使用して選択される抗体を指し、抗体レパートリーは、ヒト免疫グロブリン配列に基づく。
【００２７】
本明細書における「抗がん剤」は、がん細胞に対して細胞傷害性または抗増殖効果を有する化学物質を指す。
【００２８】
本明細書における「化学療法」は、生きている身体の中に抗がん剤を投与することによる、生きている身体における悪性腫瘍に対する療法である。
【００２９】
乳がんに対する化学療法は、たとえばＣＭＦ療法（３つの薬剤の組み合わせを投与することによる療法であり、薬剤は、シクロホスファミド、メトトレキサート、およびフルオロウラシルである）、ドセタキセル、パクリタキセルなどのようなタキサンベースの抗がん剤を使用する療法、ＣＥ療法（２つの薬剤、すなわちシクロホスファミドおよびエピルビシンの組み合わせを投与することによる療法）、ＡＣ療法（２つの薬剤、すなわちドキソルビシンおよびシクロホスファミドを投与することによる療法）、ＣＡＦ療法（３つの薬剤、すなわちフルオロウラシル、ドキソルビシン、およびシクロホスファミドの組み合わせを投与することによる療法）、ＦＥＣ療法（３つの薬剤、すなわちフルオロウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミドの組み合わせを投与することによる療法）、２つの薬剤、すなわちトラスツズマブおよびパクリタキセルの組み合わせを投与することによる療法、ならびにカペシタビンを使用する療法を含む。他の治療法は、ハーセプチンを単独でおよび他の抗がん剤と組み合わせて使用することを含む。特に、ｃｄｋ４阻害療法もまた、ある乳がん患者が利益を受けるよう使用することができる。ｃｄｋ４指向性化学療法に対する感受性は、Ｙ８８が応答性についての予測因子としての機能を果たすので、治療の前に患者におけるｐＹ８８リン酸化のレベルを比較することによって決定することができる。
【００３０】
「ｓｉＲＮＡ」は、標的遺伝子の配列と相同性を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を提供することによる配列特異的転写後遺伝子サイレンシングまたは遺伝子ノックダウンのためのＲＮＡ干渉プロセスに関与する分子を指す。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インビトロにおいて合成するまたはより長いｄｓＲＮＡからリボヌクレアーゼＩＩＩ切断によって生成することができ、配列特異的ｍＲＮＡ分解の媒介物質となる。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的ＲＮＡ分子としてまたは２つの相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の民間のサプライヤーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．，ＵＳＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ｐａｒｔ  ｏｆ  Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．，ＵＳＡ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）、およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）を含む。ｐ２７  ｍＲＮＡを阻害するための特異的なｓｉＲＮＡ構築物は、長さが１５〜３５ヌクレオチド、より典型的には長さが約２１ヌクレオチドであってもよい。
【００３１】
本明細書において使用されるように、「ｐ２７のミメティック」は、ｐ２７内のｃｄｋ４調整ドメインと同じ機能／構造活性を有するペプチド変異体、その断片、有機化合物、または小分子を指すことができる。Ｂｒｋの代替の転写物、Ａｌｔ−Ｂｒｋは、１３４アミノ酸タンパク質をコードし、これは、完全長Ｂｒｋと、ＳＨ３ドメインを含む最初の７７アミノ酸残基を共有する。ＢＲＫ−ａｌｔ（またはそのＳＨ３ドメイン）のミメティックもまた、本明細書において提供される。「ミメティック」がペプチド変異体である場合、そのアミノ酸配列の長さは、通常、Ｋ１含有ペプチド、ｐ２７中のＳＨ３結合ペプチド、またはＡｌｔ−Ｂｒｋ中のＳＨ３含有ペプチドの長さと同様である。その代わりに、そのような「ミメティック」は、より長さが短いアミノ酸配列を有するペプチド変異体とすることができる。
【００３２】
適したミメティックまたは類似体は、当技術分野において一般に知られているモデリング技術によって生成することができる。これは、機能的な相互作用の研究を伴う「ミメティック」の設計および相互作用を再現することができるように配置された官能基を含有する化合物の設計を含む。
【００３３】
用語「ベクター」は、細胞に感染させる、トランスフェクトする、または形質転換することができ、独立してまたは宿主細胞ゲノム内で複製することができる一本鎖または二本鎖環状核酸分子に関する。環状二本鎖核酸分子は、カットし、それによって、制限酵素による処置で直線化することができる。種々様々のベクター、制限酵素、および制限酵素によって標的にされるヌクレオチド配列についての情報は、当業者らに容易に入手可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスなどのような任意のレプリコンを含み、これに別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が、それが付けられた配列またはエレメントの複製をもたらすように付けられてもよい。本発明の核酸分子は、制限酵素によりベクターをカットし、２本を互いにライゲーションすることによってベクターに挿入することができる。
【００３４】
多くの技術が、原核生物または真核生物への発現構築物の形質転換、トランスフェクション、または形質導入を促進するために当業者らに入手可能である。用語「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」は、細胞または宿主生物に核酸及び／又は発現構築物を挿入する方法を指す。これらの方法は、宿主細胞外膜または壁を興味のある核酸分子に対して浸透性にするための高濃度の塩、電場、または洗浄剤による細胞の処置、マイクロインジェクション、ペプチドテザリング、ＰＥＧ融合、およびその他同種のものなどのような様々な技術を含む。
【００３５】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、長さが典型的に８〜３５ヌクレオチドのＤＮＡもしくはＤＮＡ誘導体の短い配列、プライマー、またはプローブを意味する。オリゴヌクレオチドは、クローニングによってまたは増幅によって合成して得ることができる。オリゴは、２つ以上の、好ましくは３つを超えるリボまたはデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子として定義される。オリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、様々な因子ならびにオリゴヌクレオチドの特定の応用および使用に依存するであろう。用語「誘導体」は、通常はこれらの分子の一部ではないさらなる化学成分を含む場合、上記の記載される変異体のいずれかを含むことが意図される。これらの化学成分は、溶解度、吸収、生物学的半減期の改善、毒性の減少、および望ましくない副作用の排除または減少を含むさまざまな目的を有し得る。
【００３６】
「並行して」は、共通の治療スケジュールの過程の間の（１）同時の時間または（２）異なる時間を意味する。
【００３７】
「連続して」は、方法で使用される一方の活性薬剤の投与、その後に続く別の活性薬剤の投与を指す。一方の活性薬剤の投与の後に、次の活性薬剤を、最初の投与の実質的に直後に投与することができ、または次の活性薬剤は、第１の活性薬剤後の有効期間の後に投与することができ、有効期間は、第１の活性薬剤の投与から最大の恩恵を受けるのを実現するために与えられる時間である。
【００３８】
用語「対象」は、ヒト、イヌ、家畜、ウマ、ネコ、ウサギ、およびその他同種のものを含むが、これらに限定されない哺乳動物対象を指す。好ましくは、対象は、ヒト対象である。
【００３９】
「ｃｄｋ４阻害剤」または「ｃｄｋｉ」は、ｃｄｋ４キナーゼ活性を破壊するまたはそれに介入する薬剤（たとえば核酸、タンパク質／ペプチド、小分子）である。そのような阻害剤は、限定を伴うことなく、表２に列挙される薬剤、パルボシクリブ、アベマシクリブ、およびリボシクリブを含む。米国特許第８，５６６，０７２号明細書および米国特許第６，９６２，７９２号明細書もまた参照されたい。
【００４０】
ＩＩ．がんの治療のための療法
本発明はまた、少なくとも１つの薬剤を含む医薬組成物をも提供し、少なくとも１つの薬剤は、ｐ２７Ｋｉｐ１およびＢｒｋの間の相互作用に干渉する化合物であり、医薬として許容されるキャリヤにおいてｐ２７を「オン」にするリン酸化イベントを阻害する。本発明において使用される好ましい薬剤は、小分子、表２に列挙されるものなどのようなｃｄｋ４阻害剤、図１に提供される配列に基づくミメティック、およびｓｉＲＮＡを含む。そのような医薬組成物は、がん治療を必要とする患者に治療有効量で投与されてもよい。
【００４１】
本発明のミメティック／ｓｉＲＮＡ／阻害剤は、悪性疾患の治療のための様々な治療レジメンにおいて使用されてもよい。本発明のプロトコールを使用して処置されてもよいがんは、乳房、脳、甲状腺、前立腺、結腸直腸、膵臓、頸部、胃、子宮内膜、肝臓、膀胱、卵巣、精巣、頭部、首、皮膚（黒色腫および基底がんを含む）、中皮内層、白血球（リンパ腫および白血病を含む）、食道、筋肉、結合組織、肺（小細胞肺がんおよび非小細胞がんを含む）、副腎、甲状腺、腎臓、または骨のがん；膠芽腫、中皮腫、腎細胞がん、胃がん、肉腫、絨毛がん、皮膚基底細胞がん、ならびに精巣セミノーマを含むが、これらに限定されない。
【００４２】
治療は、たとえば腫瘍切除より以前にまたは腫瘍切除後に行われてもよいことが理解されるべきである。
【００４３】
ＩＩＩ．がんの治療のための併用療法
本発明に従って、ある既知の、化学療法として有効な薬剤と本明細書において記載される薬剤および小分子／ミメティック／ｓｉＲＮＡの組み合わせは、腫瘍成長を抑制するよう相乗的に働くこともまた、発見された。したがって、本発明は、医薬として許容されるキャリヤにおいて、特定のチロシン（Ｙ）リン酸化に干渉し、それによってｐ２７を「オフ」の位置に維持する少なくとも１つの薬剤および少なくとも１つの化学療法剤を含む、患者におけるがんの治療のための医薬組成物を提供する。有効量の少なくとも１つのＹ８８リン酸化阻害薬を投与することによって患者におけるがんを治療するための方法もまた、提供される。そのような薬剤は、単独でまたは少なくとも１つの他の抗がん剤と組み合わせて使用することができる。適した薬剤は、パルボシクリブ、アベマシクリブ、リボシクリブ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、シスプラチン、ドセタキセル、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ＣＰＴ−１１、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、エストラムスチン、カルムスチン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、エトポシド、三酸化ヒ素、イリノテカン、およびエポチロン誘導体を含むが、これらに限定されない。そのような薬剤は、同時にまたは連続して投与することができる。
【００４４】
ＩＶ．医薬組成物および化合物の投与
本発明の医薬組成物は、任意の適したルートによって、たとえば注射によって、経口、肺、経鼻、または投与の他の方法によって投与することができる。一般に、本発明の医薬組成物は、中でも、医薬として許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤、及び／又はキャリヤを含む。ある場合には、キャリヤは、ナノ粒子である。そのような組成物はまた、様々なバッファー内容物（たとえばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤；ならびに洗浄剤および可溶化剤（たとえばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（たとえばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（たとえばチメロサール、ベンジルアルコール）、ならびに増量剤（たとえばラクトース、マンニトール）などのような添加剤を含むことができる。組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのような高分子化合物の粒子調製物の中にまたはリポソームの中に組み込むことができる。そのような組成物は、本発明の医薬組成物の構成成分の物理的状態、安定性、インビボにおける放出の速度、およびインビボにおける排除の速度に影響を及ぼしてもよい。たとえば、本明細書において参照によって組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １８０４２）ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２を参照されたい。本発明の医薬組成物は、たとえば液体の形態で調製することができるまたは乾燥した粉末の形態（たとえば凍結乾燥させた）とすることができる。医薬組成物を投与する特定の方法は、上記に記載される。
【００４５】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または投与の他のモードの使用など、制御放出系で送達することができる。特定の実施形態では、ポンプが、使用されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．（１９８７）１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９８０）８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９８９）３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー物質が、用いられてもよい（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９８９）２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．（１９８９）７１：１０５もまた参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出系は、動物の標的組織の近くに置くことができ、したがって、全身用の用量のごく一部分しか必要としない（たとえばＧｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、前掲、（１９８４）ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。特に、制御放出デバイスは、動物の不適切に免疫が活性化した部位または腫瘍の近くに導入することができる。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒの総説において議論されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２７−１５３３）。
【００４６】
Ｖ．キットおよび製品
前述の産物のいずれも、天然に存在しない検出可能な標識により任意選択で検出可能に標識されているまたは任意選択で固体支持体に付けられているもしくは固定されている、リン酸化および非リン酸化形態をしたＹ８８およびＹ８９に対して免疫特異的な（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）１つ以上の抗体、Ｙ８８およびＹ８９抗原、ｐ２７コード核酸による増幅もしくはそれとの特異的なハイブリダイゼーションに適したオリゴヌクレオチド、ｐ２７およびＡｌｔ−ｂｒｋの天然に存在しないポリペプチドミメティック、医薬として許容されるキャリヤ、使用のための説明書、容器、投与のための器、アッセイ基質、ｃｄｋ阻害剤、抗がん剤、またはその任意の組み合わせを含むことができるキットの中に組み込むことができる。
【００４７】
以下の材料および方法は、本発明の実施を促進するために提供される。
【００４８】
抗体。マウス抗ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６１０２４２．Ｃｄｋ４（ＤＣＳ−３５）、ｐ２７（Ｎ−２０）、Ｃ−末端Ｂｒｋ（Ｃ−１８）、Ｂｒｋ（Ｄ−６）、Ｎ−末端Ｂｒｋ（Ｎ−２０）、ｃ−Ｓｒｃ（ＳＣ−１８）、サイクリンＤ１（Ｈ  ２９５）、ＡＲＨＧＤＩＡ（Ａ−２０）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。ホスホチロシン（Ｐ−Ｔｙｒ−１００）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。Ｃｄｋ４（Ｃ−末、カタログ番号ＡＰ７５２０ｂ）、Ａｂｇｅｎｔ。ＧＳＴ（ＰＲＢ−１１２Ｃ）、Ｃｏｖａｎｃｅ。Ｆｌａｇ（Ｆ３１６５）、アクチン（Ａ２０６６）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ。ホスホＢｒｋ（Ｔｙｒ３４２）、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。ｐＹ７４、Ｙ８８、およびＹ８９リン酸化部位特異的抗体は、リン特異的（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ｐ２７ペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるウサギの免疫によって生成した。それぞれ、非リン酸化ペプチドおよびリン酸化ペプチドによるネガティブアフィニティークロマトグラフィーおよびポジティブアフィニティークロマトグラフィーを、抗体を精製するために実行した。抗体は、それぞれＹ８８、Ｙ８９、Ｙ７４のリン酸化に対してのみ特異的である。
【００４９】
酵素。Ｇｓｔ−ＰＴＫ６／Ｂｒｋ、ＧＳＴ−Ｓｒｃ（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）、Ｈｉｓ−Ａｂｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｈｉｓ−ＰＴＫ６／Ｂｒｋ、Ｈｉｓ−Ｓｒｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの説明書に従って使用した。酵素は、ほぼ等価な比活性を有した。
【００５０】
ファージ−ＥＬＩＳＡ。ファージ上清を生成し、組換え産生Ｈｉｓタグつきｐ２７またはＧＳＴ−ＰｘｘＰペプチドに対するＳＨ３−ファージの結合を記載されるように分析した（Ａｓｂａｃｈ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ３８５４０）。
【００５１】
突然変異体およびペプチドの構築。ＰｘｘＰペプチドＫ１、Ｋ２、およびＫ３をコードするオリゴヌクレオチドをアニールし、Ｎ−末端ＧＳＴタグつきペプチドの産生のためにｐＧＥＸ−ＫＧ発現ベクターに直接ライゲーションした。ＧＳＴ、ＧＳＴ−Ｂｒｋ  ＳＨ３、ＧＳＴ−Ｂｒｋ  ＳＨ２発現プラスミドは記載された（Ｖａｓｉｏｕｋｈｉｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ；（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１４４７７−８２）。これらのプラスミドにより形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞を、０．６のＯＤに達するまで、ＬＢ−アンピシリン中で成長させ、タンパク質産生を、１ｍＭ  ＩＰＴＧの追加によって誘発した。２時間後、細胞を、遠心分離によって回収した。細胞溶解およびＧＳＴセファロースでのタンパク質の精製は、ＧＳＴタンパク質精製マニュアル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って実行した。タンパク質は、過剰量のグルタチオンにより溶出し、さらなる使用のためにＰＢＳに対して透析した。精製Ｃ−末端ヒスチジンタグつきまたはＮ−末端Ｆｌａｇタグつきｐ２７は、以前に記載されたように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から生成した（Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４９８−５１０）。ヒトｐ２７  ｃＤＮＡは、点突然変異を持つオリゴヌクレオチドによるＰＣＲ突然変異誘発において鋳型として使用した：ＰＰＰＰ（配列番号７）  ９１，９２，９４，９５ＡＡＡＡ（配列番号８）（ΔＫ１）；ＰＫＫＰ（配列番号９）  １８８，１８９，１９０，１９１  ＡＡＡＡ（配列番号８）（ΔＫ３）；またはＰＰＰＰ（配列番号７）  ９１，９２，９４，  ９５ＡＡＡＡ（配列番号８）およびＰＫＫＰ（配列番号９）  １８８，１８９，１９０，１９１  ＡＡＡＡ（配列番号８（ΔＫ１／Ｋ３）。
【００５２】
５８〜１０６を生成するために使用したオリゴヌクレオチドは、
フォワードプライマー  ５’−ＧＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１０）
リバースプライマー  ５’ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧ
ＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＡ  ＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１１）
であった。
【００５３】
ＰＣＲ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために、Ｔ７ｐＧＥＭＥＸヒトＨｉｓ−ｐ２７またはＴ７ｐＧＥＭＥＸヒトＦｌａｇ−ｐ２７プラスミドにライゲーションした。突然変異体Ｙ７４Ｆ、Ｙ８８Ｆ、およびＹ８８／８９Ｆは、以前に記載された（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照されたい）。Ｆｌａｇタグつきｐ２７突然変異体は、Ｆｌａｇ抗体（Ｍ−２、Ｓｉｇｍａ  Ｆ−１８Ｃ９）によりＦｌａｇ免疫沈降によって精製し、メーカーのプロトコールに従ってＦｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ  Ｆ−４７９９）により溶出した。Ｈｉｓタグつきｐ２７突然変異体は、ｈｉｓ−ｔｒａｐアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ７１−５２４７−０１）を介してＦＰＬＣによって精製した。アフィニティーカラムを、メーカーのプロトコールに従って取り外し、次いで、５カラム体積の１００ｍＭ  ＣｏＣｌ2により洗浄した。粗製物に、６Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および２０％グリセロールからなるローディングバッファーを加えた。物質を、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および１０％グリセロールにより洗浄した。精製した物質を、５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、および１Ｍ  ＫＣｌにより溶出した。次いで、タンパク質を、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．０５％  ＮＰ４０の溶液中で一晩透析した。精製タンパク質はすべて、クーマシーおよび免疫ブロット分析によって分析した。ｐ２７、ΔＫ１、ΔＫ３、ΔＫ１／Ｋ３、Ｙ７４Ｆ、およびＹ８８／８９Ｆカセットを、Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ｐＴＲＥ３Ｇテトラサイクリン誘発性レトロウイルス発現構築物の中にクローニングした。Ａｌｔ  Ｂｒｋは、鋳型としてＰＣＤＮＡ３ベクター（３８）においてヒトＡｌｔ−Ｂｒｋを使用して、ＰＣＲによって生成し、続いて、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを使用して、Ｔ７ｐＧＥＭＥＸヒトＦｌａｇタグつきプラスミドおよびｐＴＲＥ３Ｇの中にクローニングした。Ａｌｔ−Ｂｒｋのアミノ酸配列を、下記に示す。
ＭＶＳＲＤＱＡＨＬＧＰＫＹＶＧＬＷＤＦＫＳＲＴＤＥＥＬＳＦＲＡＧＤＶＦＨＶＡＲＫＥＥＱＷＷＷＡＴＬＬＤＥＡＧＧＡＶＡＱＧ
ＹＶＰＨＮＹＬＡＥＲＥＴＶＥＳＥＰＡＧＨＡＧＣＡＡＬＱＤＬＡＡＣＲＧＰＡＡＰＥＲＧＧＶＬＰＱＰＡＲＡＣＥＬＰＱＧＰＥＰＶ
ＰＲＰＡＡＧＲＡＬＰＥＡＲＡ（配列番号１２）
【００５４】
この配列のミメティックおよび突然変異体は、３、５、１０、１５  ２０、２５、５０、またはそれ以上のアミノ酸を切り詰めることによって生成することができる。個々のアミノ酸を近い関係にある他のアミノ酸によって置換することができる変異体もまた、生成することができる。たとえば、個々のアミノ酸は、以下のように置換されてもよい。任意の疎水性脂肪族アミノ酸は、任意の他の疎水性脂肪族アミノ酸の代わりに置換されてもよく、任意の疎水性芳香族アミノ酸は、任意の他の疎水性芳香族アミノ酸の代わりに置換されてもよく、極性の側鎖を有する任意の中性アミノ酸は、極性の側鎖を有する任意の他の中性アミノ酸の代わりに置換されてもよく、酸性アミノ酸は、酸性アミノ酸の代わりに置換されてもよく、塩基性アミノ酸は、塩基性アミノ酸の代わりに置換されてもよい。好ましい特性および活性を有する変異体および突然変異体はまた、あるアミノ酸をあまり関係のないアミノ酸と置換することによって、たとえば荷電アミノ酸を中性アミノ酸と交換することによっても生成することができる。連続していないアミノ酸の融合タンパク質もまた、生成することができる。特異的な改変は、様々なＳｒｃファミリーチロシンキナーゼについて以前に解明された３Ｄ構造から入手可能な情報を使用して行うことができる。それぞれのミメティックは、ｐＹリン酸化に干渉するのに有効であるはずである。
【００５５】
組換えサイクリンＤ１−ｃｄｋ４。組換えＨｉｓサイクリンＤ１−ｃｄｋ４は、同時感染Ｈｉｇｈ５細胞から回収し、以前に記載されたように精製した（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。組換えＧＳＴ−Ｒｂ（８６Ｋｄバージョン）を精製し、インビトロキナーゼアッセイにおいて使用した。
【００５６】
ｐ２７−サイクリンＤ１−Ｃｄｋ４三元複合体のインビトロにおけるリン酸化。組換えＨｉｓ−ｐ２７および突然変異体は、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４においてサイクリンＤ１−Ｃｄｋ４と共に室温で１時間インキュベートした。この三元複合体を、抗Ｃｄｋ４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＤＣＳ  ３５）およびプロテインＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０００４Ｄ）により免疫沈降させた。次いで、複合体を、ＳＦＫリン酸化にかけかつ／またはインビトロＲｂキナーゼアッセイにおいて使用した。
【００５７】
細胞株。ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１、ＭＤＡ  ＭＢ  ４６８、Ｔ４７Ｄ、ＰＣ３、Ｍｖ１Ｌｕ、およびＨＥＫ  ２９３を、ＡＴＣＣから購入し、ベンダーの指示に従って維持した。インスリンレベルを、０（−）、１０（＋）、または５０（＋＋＋）μｇ／ｍｌに調節し、細胞を、記載されるようにアッセイする前に２週間、成長させた。接触によって止まるまで、細胞を、コンフルエンスまで増殖させ、培地を一日おきに補充して６日間維持した。免疫沈降、免疫蛍光、ＰＩ染色を、材料および方法の部で記載されるように実行した。ＦＡＣＳ分析は、記載されるように実行した（Ｎｇｕｙｅｎ  Ｋ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｔｅｒｏｌ．Ｎｕｔｒ．５，５５６−６２）。細胞は、自動セルカウンター（ＢｉｏＲａｄ  ＴＣ−２０）を使用して数えた。生存率は、トリパンブルー染色によって測定し、セルカウンターを使用して数えた。
【００５８】
免疫沈降。細胞は、Ｔｒｉｔｏｎ溶解バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはＴｗｅｅｎ溶解バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）により溶解した。溶解バッファーに、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＮａＶ、１０ｎｇ／ｍｌロイペプチン、および１ｎｇ／ｍｌアプロチニンを補足した。溶解物（１ｍｇ）は、４℃で１時間、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＡまたはＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とのインキュベーションによってあらかじめきれいにした。免疫沈降は、記載されるように進めた（Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。
【００５９】
免疫蛍光。細胞株は、０日目にサブコンフルエント状態に分け、室温で１５分間、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中４％パラホルムアルデヒドを使用し、２日目に、マイクロウェルプレート中で固定した。細胞株を、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理し、室温で１時間、５％  ＢＳＡによりブロックした。細胞株を、室温で１時間、ＰＢＳ中の１回目の一次抗体と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄し、適切な二次抗体（１：５００）と共にインキュベートし、室温で１時間、３％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈した。次いで、細胞をＰＢＳにより洗浄し、抗体との２回目のインキュベーションに向けて細胞を調製するために、室温で３０分間、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／３％  ＢＳＡと共にインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳにより洗浄し、室温で１５分間、ＰＢＳ中ヘキスト染色剤（１ｍｇ／ｍｌ）１：５０００と共にインキュベートした。細胞を水ですすぎ、９０％グリセロールを有するスライドにマウントした。サンプルを共焦点顕微鏡によって分析する前に、サンプルを、４℃でインキュベートした。
【００６０】
阻害剤による処置。細胞を、６つのウェルプレートに二通り、ウェル当たり５．０×１０4で接種した。接種の２４時間後、それぞれのプレートの１つのウェルをトリプシンにより処置し、Ｂｉｏｒａｄ自動セルカウンターを使用して数えた。接種の４８時間後、別のウェルをトリプシンにより処置し、数え、残りのウェルを、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、および４００ｎＭのパルボシクリブ（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）により処置した。ＤＭＳＯはネガティブコントロールとして使用した。細胞は、処置の２４および４８時間後に再び数えた。処置の４８時間後のそれぞれの細胞株について、ＤＭＳＯにより処置した生細胞の数に対して、様々な濃度のパルボシクリブにより処置した生細胞の数を正規化することによってＩＣ50値を決定した。ＤＭＳＯにより処置した生細胞の数は、１００％と見なした。生存率の値の対数を得て、データを非線形回帰曲線にフィットさせ、これを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、ＩＣ50値を生成するために使用した。
【００６１】
Ｂｒｋノックダウン。レンチウイルスｓｉＲＮＡ粒子をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した：ＮＭ＿００５９７５．２−１０６４ｓｃ１およびＮＭ＿００４３８３．ｘ−２１１７ｓ１ｃ１。ＭＣＦ７細胞を０日目に平板培養し、１日目に、培地を吸引し、細胞をｓｉＲＮＡレンチウイルス粒子により感染させた。臭化ヘキサジメトリンは、感染効率を増強するために、メーカーの指示に従って使用した。細胞を一晩インキュベートし、培地を２日目に補充し、細胞を７２時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドにより固定し、免疫蛍光を記載されるように実行した。
【００６２】
インビボにおける発現。ＷＴ−Ｂｒｋ、ＫＭ−Ｂｒｋ、およびＹＦ−Ｂｒｋの生成は、記載された（Ｐａｌｋａ−Ｈａｍｂｌｉｎ  Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（０１０）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃ．１２３：２３６−４５）。アンホトロピックレトロウイルスは、ｐＡｍｐｈｏエンベロープおよびｐＢａｂｅまたはｐＴＲＥ３Ｇテトラサイクリン誘発性構築物によるＨＥＫ  ２９３細胞のリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１６６８−０１９）を使用するトランスフェクションによって生成した。ＭＣＦ７細胞のウイルス感染後、安定した組み込み体をピューロマイシン選択によって単離した。コロニーは、安定したピューロマイシン抵抗性クローンを生成するためにプールした。安定した発現は、免疫ブロットおよび免疫蛍光分析によって検証した。テトラサイクリン誘発性の発現は、培地にＴｅｔＥｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を追加することによって実現した。
【００６３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡ抽出は、メーカーの指示によって指示されるようにＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実行した。５００μｇのＲＮＡを、Ｖｅｒｓｏ  ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写にかけた。２５０ｎｇ  ＲＮＡを、ｑＰＣＲを実行するためにｃＤＮＡプライマーおよびＡＢｓｏｌｕｔｅ  Ｂｌｕｅ  ｑＰＣＲ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合した。
【００６４】
以下のプライマーをｑ−ＰＣＲを実行するために使用した：
【００６５】
【表１】
2019512021.tif 000002
【００６６】
ヒト患者材料の分析。ブルックリンの大学病院で患者からインフォームドコンセントにより得た、ＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−患者由来の、乳腺切除術または乳房切除術で廃棄処分された材料を、ＤＭＳＯ、高非生理学的パルボシクリブ、または生理学的濃度のパルボシクリブ（紫色）中で４８時間、外植片培養で成長させた。患者材料の６つの１ｍｍ3切片を、温かい完全ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ中に浸した歯科用スポンジ上、６ウェル皿のウェル中に置いた。インキュベーターにおいて４８時間、サンプルを回復させた。４８時間後、ＤＭＳ０、１００ｎＭパルボシクリブ、または５００ｎＭパルボシクリブを４８時間以上追加した。外植片サンプルをピンセットにより取り出し、材料を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、増殖のマーカーとしてＫｉ６７についてＩＨＣによって染色した。パルボシクリブ応答は、１００ｎＭパルボシクリブの存在下におけるＫｉ６７の減少として測定した。それぞれのデータポイントは、４つのサンプルの平均である（２つの別個の外植片サンプルおよびそれぞれの外植片の２つの別個の免疫組織化学的検査染色（ランＡおよびＢ）。それぞれのサンプルは、２人の病理学者によって盲目的に読み取られた。
【００６７】
乳腺切除術または乳房切除術時に同じ患者から摘出した生検材料または切除材料は、１０％ホルマリン中での固定およびパラフィン包埋のためにＤＭＣ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔに送られた。次いで、材料は、記載されるように二重ｐＹ／ｐ２７  ＩＨＣアッセイにおいて染色した。
【００６８】
スケール：
０＝ｐＹ染色なし
１＝１〜２９％  ｐＹ＋細胞、強い染色は０％
２＝１〜２９％  ｐＹ＋細胞、強い染色は５〜２０％だけ
３＝３０〜１００％  ｐＹ＋細胞、強い染色は＞２０％
【００６９】
セルブロック調製。１×１０12細胞を組織培養で成長させ、遠心沈殿し、１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋し、次いで、記載されるように二重ｐＹ／ｐ２７  ＩＨＣアッセイにおいて分析した。ＭＣＦ７細胞は、セルブロック調製前に４８時間、４００ｎＭパルボシクリブにより処置した。別個の５つの実験は、２人の病理学者によって盲目的に読み取られた。
【００７０】
スケール：
０＝ｐＹ染色なし
１＝弱いｐＹ染色
２＝中程度のｐＹ染色
３＝強いｐＹ染色
【００７１】
ｐ２７／ｐＹ８８抗体による二重免疫組織化学的検査アッセイ。
試薬：
染色キット：Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＤＩ−９５０−１００−０００１）；抗原賦活化溶液：Ｄａｋｏ（Ｓ１６９９）；ＰＡＰペン：Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＸＴ００１−ＰＰ）；プロテインブロック：Ｄａｋｏ（Ｘ０９０９）；抗体希釈剤：Ｄａｋｏ（Ｓ３０２２）；Ｐ２７抗体：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（６１０２４２）；マウント溶液：Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＳＰ１５−１００）
【００７２】
染色プロトコール
１日目に、スライドに鉛筆で標識し、３０分間、６５℃のオーブンで焼き、オーブンからキシレンを含有するコプリンジャーに速やかに移した。スライドを室温でそれぞれ３分間、キシレン４×中ですすぎ、その後、Ｒ．Ｔ．でそれぞれ３分間、３回の１００％−９５％−７５％エタノールの段階的アルコール洗浄を続けた。次いで、スライドは、３分間、１回、Ｈ2Ｏ中でのインキュベーションによって水和した。乾燥後、疎水性バリアを、ＰＡＰペンを使用して組織のまわりに作った。内因性ペルオキシドを、室温で３０分間、ペルオキシドブロックとスライドをインキュベートすることによってブロックした。スライドを、それぞれ３分間、３回、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０により洗浄し、その後、３分間、１×ＰＢＳ中でのインキュベーションを続けた。Ｒ．Ｔでの１時間のプロテインブロックとのインキュベーションの後に、ＤＡＫＯ抗体希釈剤において１：２００に希釈したＰ２７  ｐＹ８８抗体を、４℃での一晩のインキュベーションの間、スライドに追加した。
【００７３】
２日目、抗原賦活化の１×溶液を、１０×ストックから調製し、それを水浴において１００℃で平衡化した。抗原賦活化溶液の温度が１００℃に達したら、スライドを、Ｒ．Ｔ．でそれぞれ３分間、３回、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０により洗浄した。抗原賦活化を３０分間１００℃で実行した。３０分後、コプリンジャーをさらに２０分間、Ｒ．Ｔ．で冷却した。次いで、スライドを３分間、１×ＰＢＳ中でインキュベートした。Ｐ２７ｋｉｐ１抗体（１：１０００）希釈液をＤＡＫＯ抗体希釈剤中で調製した。スライドを４℃で一晩、ｐ２７ｋｉｐ１抗体とインキュベートした。
【００７４】
３日目、スライドを、それぞれ３分間、３回、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０においてインキュベートした。Ｐｏｌｙｖｉｅｗ  ＩＨＣ  Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰおよびＰｏｌｙｖｉｅｗ  ＩＨＣ  Ｒａｂｂｉｔ  ＡＰをエッペンドルフにおいて等容量で混合し、混合物をスライドに追加し、Ｒ．Ｔ．で２０分間インキュベートした。次いで、スライドを、それぞれ３分間、３回、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０においてインキュベートした。このインキュベーション期間に、１ｍｌのマウスＨＲＰクロモゲンバッファーを２０ｕｌ（または一滴）のＤＡＢクロモゲンと混合した。それらを逆さにすることによって混合し、光から保護した。スライドをＲ．Ｔ．で５分間、活性化ＤＡＢ基質とインキュベートした。それらをそれぞれ３分間、３回、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で洗浄した。チューブを逆さにし、光からチューブを保護することによって、１ｍｌ  ウサギＡＰクロモゲンバッファーを２０ｕｌ（または一滴）のＡＰクロモゲンと混合した。次いで、スライドをＲ．Ｔで１５分間、活性化ＡＰ基質とインキュベートし、それぞれ３分間、３回、ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で洗浄し、その後、Ｒ．Ｔ．で５分間、水道水によって洗浄した。次いで、スライドをＲ．Ｔ．でそれぞれ３分間、３回、７５％−９５％−１００％エタノールによりすすぎ、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ溶液を使用してマウントした。
【００７５】
統計。統計分析は、サンプルサイズが等しくなく、分散も等しくないため、スチューデントのｔ検定、ウエルチｔ検定、両側タイプ３検定を使用して実行した。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を例証するために提供される。実施例は、本発明を限定するようには決して意図されない。
【００７７】
実施例Ｉ
ＣＤＫ４阻害剤に対するがん細胞感受性を決定するためのマーカーとしてのＰＹ
この実施例では、ｐＹは、特定の腫瘍がｃｄｋ４阻害剤による阻害に適した、適切な範囲のｃｄｋ４活性を有するかどうかを決定するためのヒト患者材料におけるマーカーとして使用される。発明者らは、ｐＹ  ｐ２７に対するリン酸化部位特異的抗体を開発し、この抗体が、ホルマリン固定パラフィン包埋長期保存ヒト乳がん材料（ＥＲ／ＰＲ＋／Ｈｅｒ２−）においてｐＹを認識したことを示した。１００％の浸透度で、抗体は、ヒト乳房縮小術から得られた良性組織を染色しなかった。分析したＥＲ／ＰＲ＋／Ｈｅｒ−２乳がんサンプルの７５％は、強度は様々であったが、ｐＹに対してポジティブに染色された。
【００７８】
ｐ２７は、Ｋ１、Ｋ２、およびＫ３と呼ばれる共通のＰｘｘＰコアモチーフを含有する３つの推定上のＳＨ３動員配列を含有する（図１Ａ）。Ｋ１は、ＰｘｘＰの後に塩基性残基を含有し、したがって、標準タイプ２Ｋ  ＳＨ３標的部位とみなされる（Ｃｅｓａｒｅｎｉ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１３：３８−４４）。Ｋ２は、ｐ２７のヒトオルソログにだけ存在し、したがって、細胞周期調節において保存された機能に影響しそうにない。Ｋ３は、ｃｄｋとの相互作用にとって重要でないことが示された領域、ｐ２７のＣ−末端にある。Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、およびＬｙｎなどのような非受容体結合チロシンキナーゼ（ＳＦＫ）とｐ２７の相互作用についての報告に基づいて、発明者らは、ファミリーの他のメンバーもまた、ｐ２７と相互作用するかどうか、どの動員配列（Ｋ１、Ｋ２、及び／又はＫ３）が使用されるかを調べた。発明者らは、ＳＦＫファミリーの１１のメンバーおよびインビトロおよびインビボにおいてｐ２７をリン酸化することが報告されたＡｂｌを、完全長ｐ２７またはＧＳＴタグつきＫ１、Ｋ２、もしくはＫ３ペプチドへの結合について、ファージ−ＥＬＩＳＡ手順を使用して試験した（Ａｓｂａｃｈ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ３８５４０．）（図１Ｂ、１Ｃ）。
【００７９】
ほとんどのＳＦＫのＳＨ３ドメインが完全長ｐ２７と相互作用することができたが、発明者らは、ＢｒｋのＳＨ３ドメインが完全長ｐ２７と強く相互作用し（Ｋｄ＝２５０ｎＭ）、ｐ２７と相互作用することが知られている２つのＳＦＫ、ＳｒｃやＡｂｌよりもさらによく結合したことを発見した（図１Ｂ）。このＫｄ値は、ｐ２７およびファージの間の相互作用を反映し、ｐ２７は、多くの同一の反復ＳＨ３ドメインを含有し、これによって結合を増強すると思われる。発明者らは、ＧＳＴ融合ペプチドとしてｐ２７内のＳＨ３動員部位（Ｋ１、Ｋ２、およびＫ３）を個々に発現させ、ＳＨ３ドメインライブラリーに対してそれらを試験した（図１Ｃ）。いかなるｐ２７配列もない状態で発現させたＧＳＴドメインを、ネガティブ結合コントロール（ＧＳＴ）として使用した。ほとんどのＳＦＫ  ＳＨ３ドメインは、個々のＰｘｘＰ含有ペプチドと有意に相互作用することができなかった（データ示さず）。このアッセイでは、Ｂｒｋは、Ｋ３領域と強く、Ｋ１領域と弱く相互作用した（図１Ｃ）。関係のあるキナーゼ、Ｆｒｋは、完全長ｐ２７に対して２番目によいバインダーであったが（図１Ｂ）、個々のＰｘｘＰドメインに対して試験した時、ＧＳＴネガティブコントロールに対する有意な結合が検出され（図１Ｃ）、したがって、発明者らは、ＦｒｋのＳＨ３ドメインがＰｘｘＰドメインペプチドに結合したかどうかを結論づけることができなかった。ＡｂｌおよびＹｅｓのＳＨ３ドメインは、ｐ２７のＫ３ドメインと相互作用したが、この相互作用は、Ｂｒｋと比較すると小さかった（図１Ｃ）。Ｋ２部位と相互作用したＳＨ３ドメインは、なかった（図１Ｃ）。ＳＨ３ドメインをハイライトしたＢｒｋの配列を図１Ｄに提供する。発明者らは、Ｘ線結晶解析から得た、またＰＤＢ＋ｊＦＡＴＣＡＴ  ｒｉｇｉｄデータベースから取ってきた３Ｄ構造を使用して、ＢｒｋおよびＳｒｃ  ＳＨ３ドメインによりインシリコモデリング分析を実行した。発明者らは、ベータシートを結びつけるループにおける差異が、ｐ２７に結合するＢｒｋ  ＳＨ３ドメインおよびｐ２７に結合しないＳｒｃ  ＳＨ３ドメインの間に存在することを決定した。発明者らがＢｒｋ  Ｓｈ３構造の中にＳｒｃ  ＳＨ３ループを入れ替えると、ｐ２７に結合しなかった変異体が作られ、少なくとも部分的に、いくらかの特異性がループに由来することを実証した。発明者らは、この結合に影響するＢｒｋ  ＳＨ３ドメインループ中の残基を同定し、それらを、Ｂｒｋ  ＳＨ３変異体およびｐ２７  Ｋ１ドメインの間の親和性を増加させる残基と置換した。ｐ２７の変異体を改変Ｋ１またはＫ３部位により生成すると、結果は、Ｋ１部位が、インビトロおよびインビボの両方でｐＹ８８リン酸化に必要とされたことを示した。Ｋ３部位は、単量体ペプチドとしてＢｒｋ  ＳＨ３ドメインによりよく結合し得るが、完全長ｐ２７の構成では、結合およびリン酸化は、Ｋ１部位を通して媒介される。
【００８０】
サイクリンＤ−ｃｄｋ４（ＤＫ４）は、ＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−乳がんを含む大多数のヒト腫瘍においてがん増殖を推進するので、理想的な治療標的として求められた。発明者らは、療法に対する応答性を予測する際のおよび治療のための新たな標的としての、ｐ２７Ｋｉｐ１およびその活性化因子、乳房腫瘍関連キナーゼ（Ｂｒｋ）がＤＫ４に対して及ぼす細胞周期調節について最近発見されたメカニズムの臨床的有用性を調査した。ｐ２７は、ＤＫ４構築因子およびｃｄｋ２阻害剤として知られているが、ｐ２７はまた、ＤＫ４  ＯＮ／ＯＦＦ「スイッチ」としても働く。Ｂｒｋによるｐ２７のチロシン（Ｙ）リン酸化（ｐＹ）は、ｃｄｋ４のＴループのＡＴＰ結合およびＣＡＫリン酸化の両方をコントロールし、これは、ＤＫ４活性化にとって不可欠である。この機能は、ｃｄｋ４に限られており、ｐ２７のｃｄｋ２との結合は、Ｙがリン酸化されているかどうかにかかわらず、阻害性のように思われる。しかしながら、インビボにおけるＹリン酸化ｐ２７は、ｃｄｋ２依存性ユビキチン媒介性の分解の標的であり、ｐ２７のｃｄｋ２との結合を低下させ、間接的にこの複合体を活性化する。これは以下のモデルに結びつく。ｐ２７  ｐＹのブロックは、ｃｄｋ４を直接、およびｃｄｋ２を間接的に不活性化し、したがって、がん細胞増殖をブロックする新規な方法に相当する。ｐＹはまた、ｃｄｋ４阻害剤活性、療法に対する腫瘍応答、および化学療法抵抗性の予測バイオマーカーとしての機能を果たす。
【００８１】
乳がん細胞株においてｐＹをブロックするために、発明者らは、ＢｒｋのＳＨ３ドメインの一部分を含有する、小さなペプチドＡＬＴを使用した。ＡＬＴは、ｐ２７に結合し、Ｂｒｋの結合およびｐ２７をリン酸化する能力をブロックし、ｃｄｋ４を阻害し、ｃｄｋ２を阻害するｐ２７の能力を増加させる。発明者らは、ＡＬＴを発現するテトラサイクリン誘発性細胞株を生成し及び／又は脂質ベースのナノ粒子送達ビヒクル（ＮＰ−ＡＬＴ）を作り、第一世代治療薬としてＡＬＴを試験した。ＡＬＴはまた、併用療法が薬剤抵抗性を低下させるかどうかを決定するためにパルボシクリブと共に使用した。ｐＹの阻害には、効能ならびに応答性の細胞株及び／又は今後の患者の同定のための本来備わっているバイオマーカーが切り離せない。発明者らは、ｐ２７およびｐＹについての二重ＩＨＣアッセイを開発し、これを、以前にパルボシクリブ感受性について階層化した乳がん細胞株パネルおよびパラフィン包埋保存用ヒト腫瘍サンプルの両方を分析するために使用した。
【００８２】
発明者らの結果は、ＡＬＴが、ＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−乳がん細胞株におけるｐＹ、ｃｄｋ４、およびｃｄｋ２の活性ならびに増殖をブロックしたことを示す。いくつかの株におけるパルボシクリブ媒介性の停止は、あまり長続きせず、細胞は直ちに療法に対して抵抗性になり、発明者らは、これは、ｃｄｋ２がｃｄｋ４活性の減少を補う能力によるものであることを実証した。ＡＬＴがｃｄｋ４およびｃｄｋ２の両方を不活性化するので、Ａｌｔ媒介性の停止は、より薬剤抵抗性となる（＞１０日間の停止）。二重療法として、ＡＬＴ治療は、パルボシクリブと相乗作用を示し、＞３０日間、細胞を停止させ、老化を増加させ、薬剤を取り除いた後の回復を妨げる。ｐＹレベルはｃｄｋ４活性と相関し、Ｂｒｋ発現の増加または減少は、それぞれｐＹおよびｃｄｋ４活性を増加させまたは減少させ、これは、パルボシクリブ感受性の増加または減少と相関した。発明者らは、パルボシクリブによく応答する（ＩＣ50＝２００ｎＭ）ＭＣＦ７細胞のｐＹは低度であるが（ｃｄｋ４活性が低いほど、必要とする薬剤が少ない）、Ｒｂ＋細胞は、治療濃度域で投与されたパルボシクリブにあまり応答しなかったＨＣＣ１９５４のように、ｐＹが非常に高く、ｃｄｋ４活性が高いほど、必要とする薬剤の濃度が上昇することを示した（ＩＣ50＝１０００ｎＭ）。図５を参照されたい。ＭＤＡ  ＭＢ２３１のような細胞は、ｐＹのレベルが中程度であり、パルボシクリブの必要量が中程度であった（ＩＣ50＝４００ｎＭ）。保存用の供給源から得られたヒトがんの分析は、ｐＹは静止状態の良性乳房組織においては検出されないが、分析した進行型のＥＲ／ＰＲ＋／Ｈｅｒ２−腫瘍の約半分で、染色強度は様々であったが検出されることを実証した。
【００８３】
発明者らは、ｐ２７  ｐＹのブロックが、ｃｄｋ２もｃｄｋ４も阻害し、老化を誘発し、薬剤抵抗性を妨げるので、Ｃｄ４ｋ阻害剤感受性およびがん細胞増殖を阻害するための強力なアプローチを提供すると結論づける。発明者らのデータは、ｃｄｋ４活性のレベルが、ｐＹによって測定されるように、初期応答性を決定するが、薬剤抵抗性を阻害するために、ｃｄｋ２活性もまた阻害されるべきであることを示唆する。ｐＹ８８レベルをｃｄ４ｋ阻害剤感受性を予測するために使用することができることは、上記から明らかであり、０のレベルは、ｃｄｋ４阻害に対する検出可能な感受性を示さず、１のレベルは、検出可能な感受性が低いまたはないことを示し、２または３は、ｃｄｋ４阻害に対する検出可能な感受性を示す。
【００８４】
Ｂｒｋ−ｐ２７−ＤＫ４軸は、ｃｄｋ４およびｃｄｋ２の活性、腫瘍応答、ならびに抵抗性の予測バイオマーカーである。
パルボシクリブおよび他のｃｄｋ４選択的阻害剤に対して応答するであろう患者を同定する緊急の必要性がある。患者をパルボシクリブおよびレトロゾールにより治療すると、ＰＦＳが有意に改善されたが、全生存率（ＯＳ）は、統計的に異ならなかった。この研究では、全くの非レスポンダーをＯＳデータから排除しなかった。発明者らは、非レスポンダーを同定することができ、治験から取り除いていた場合、よりよい臨床結果であった可能性があると仮定している。パルボシクリブは１年当たり＞＄１００Ｋのコストがかかるので、応答する可能性のある患者の同定は、目標として望ましい。
【００８５】
分子的に特徴付けられた乳がん細胞株のインビトロ大規模パネル分析は、どのサブグループがｃｄｋ４ブロッキング療法から恩恵を受ける可能性がより高いかを見通す。乳がん細胞株をパルボシクリブ感受性について階層化した（図３）。応答のＩＣ50値が示されており、ラインは、高度の、中程度の、または非レスポンダーにさらに分けることができる。この研究において、ＲＢを含有しなかったいくつかの抵抗性の株が同定され、したがって、ｃｄｋ４の阻害は効果がなかった。しかしながら、ＨＣＣ１１８６、ＨＣＣ１９５４、およびＣａｌ５１などのようないくつかのＲｂ＋抵抗性株もまたあった。これらの株では、パルボシクリブは、ｃｄｋ４依存性ＲＢリン酸化を阻害せず、ＣＤＫ４がパルボシクリブ結合を妨げるように突然変異したまたは治療濃度域での薬剤による阻害を可能にするにはｃｄｋ４活性レベルが高すぎた（≧３）またはｃｄｋ２などのような他のキナーゼがｃｄｋ４の減少を補い、Ｒｂリン酸化を可能にすることを示唆する。特に、抗がん剤の効能を予測するために細胞株を使用することができるが、細胞株において得られたデータは、インサイチューの腫瘍やエクスビボの腫瘍で観察されたものと著しく異なり得る。
【００８６】
発明者らは、ｐＹレベルがパルボシクリブ感受性により階層化され得ると仮定した。ｐ２７（茶色）およびｐＹ８８（桃色）発現についての二重ＩＨＣによって（ＡＰＡＡＰとＤＡＢ検出系を組み合わせて）、非レスポンダー（ＨＣＣ１９５４）、中程度（ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１）、および高度のレスポンダー（ＭＣＦ７）細胞株について１つずつ試験した（図４）。３つの株すべてにおいてｐＹ８８を検出したが、高度のレスポンダー（ＭＣＦ７、ＩＣ50＝２００ｎｍ）のｐＹ染色は低度である（染色強度は＋１）ことを発見し、中程度のレスポンダー（ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１、ＩＣ50＝４００ｎｍ）は、中間のレベルのｐＹ（染色強度は＋１〜２）を有し、非レスポンダー（ＨＣＣ１９５４、ＩＣ50＝１０００ｎｍ）は、非常に高レベルのｐＹ８８（染色強度は＋２〜３）を有した。発明者らは、非レスポンダー株がｐＹ８８を全く欠いており、薬剤の標的として存在するｃｄｋ４が少しもないことが観察されると期待していた可能性がある。しかしながら、発明者らは、この株において最も強いｐＹ８８染色を検出した。このデータは、ｃｄｋ４のレベルが停止を決定づけ得ることを示唆し、「制限速度」型モデルは、これらの結果について説明し得る。ｐＹ染色なし（レベル０）によって示されるようにｃｄｋ４が少なすぎると、完全な非レスポンダーとして同定されるが、非常に高度のｐＹ染色によって示されるようにｃｄｋ４が（レベル≧３）多すぎることもまた、インビボにおいて応答を示し、かつこの量のｃｄｋ４を阻害するために必要とされるパルボシクリブの濃度が毒性である（＞１０００ｎｍ）ので、非レスポンダーとして同定され得る。この場合、異なるｃｄｋ４阻害剤（本明細書において下記に記載される）が、がん細胞増殖を阻害するためにパルボシクリブよりも良好に機能し得る。特筆すべきは、ＭＣＦ７細胞を４００ｎＭパルボシクリブにより処置すると、ｐＹ染色は減少し（染色された細胞は０％）、０強度をもたらした。
【００８７】
乳がん細胞は、様々な動態でパルボシクリブ治療に抵抗性になり、発明者らのデータは、長期のパルボシクリブ応答対薬剤抵抗性が、ｃｄｋ２の活性化による可能性があることを示唆する。パルボシクリブは、最初のうちは一時的にｃｄｋ４を阻害することができ得る（細胞周期停止）が、時間とともに、ｃｄｋ２は、この減少を補い、細胞分裂停止を克服することができる（抵抗性）。ｐＹの増加や減少は、パルボシクリブ感受性を「切り換えて」、アップさせたりダウンさせたりするのであろう。発明者らがＭＣＦ７細胞において示したように、Ｂｒｋの阻害は、ｐ２７  ｐＹを低下させ、ｃｄｋ４活性を低下させる。反対に、Ｂｒｋ発現の増加は、ｐ２７  ｐＹを増加させ、ｃｄｋ４活性を増加させる。
【００８８】
発明者らは、針生検によって得たホルマリン固定パラフィン包埋乳房腫瘍の１５の症例についてスクリーニングした（図５）。これらの腫瘍は、ＩＩおよびＩＩＩ度、ＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−、結果が不良なサブグループであった。このサブグループは、乳がん患者のおよそ４０％を占め、それらは、Ｈｅｒ２標的療法の候補ではない。このサブグループは、現在、パルボシクリブＰａｌｏｍａ治験の中心になっている。サンプルはすべて２〜３度で、Ｋｉ６７＋は１０〜５０％の範囲にわたった。病態によって決められたこのサンプルの中に他の差異を検出することはできなかった。しかしながら、ｐ２７／ｐＹ８８アッセイにおいて染色することによって、発明者らは、これらの他の点では区別できないＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−サンプルをそれらのｐＹステータスに基づいてさらに階層化することができた。また、５つの良性乳房生検材料についてもスクリーニングした。ｐ２７（茶色）抗体およびｐＹ８８（桃色）抗体による二重ＩＨＣ分析を実行し、結果は、２人の外部の病理学者によって盲目的に分析された（図５Ｂ、Ｃ）。スライドは、ポジティブに染色された細胞のパーセンテージおよびｐＹ８８染色の強度についてスコア化した（０、１、２、３）。発明者らは、静止状態の組織が不活性なｃｄｋ４を有するというモデルと一致して、非新生物性正常サンプルの１００％が、ｐ２７についてポジティブであり、ｐＹ８８についてネガティブであったことを発見した（図５Ｂ、５Ｃ、クリーム色のボックス）。これらのサンプルは、Ｋｉ６７−（静止状態）であり、ｐＹ染色を欠き、ｃｄｋ４が不活性であり、細胞が周期に入っていないことを示唆した。これはまた、ｐＹ８８抗体がＹリン酸化に特異的であり、非リン酸化ｐ２７を認識しないことを確認した。表１に示されるように、分析したＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−腫瘍の１００％が、ｐ２７染色についてポジティブであった。ｐＹ８８の３つの階層化が、この腫瘍サブグループにおいて検出され、４７％は、高度のｐＹ８８染色を有し、２５．５％は、低度の局所的なｐＹ８８染色を有し、２５．５％は、ｐＹ８８染色がなかった。
【００８９】
表１，Ｈｅｒ２−患者
ｐＹサブグループ
なし      ２５．５％
中程度    ２５．５％
高度      ４７％
なし：細胞の０％が＋ｐＹ
中程度：細胞の１〜２９％が＋ｐＹ
高度：細胞の３０〜１００％が＋ｐＹ
【００９０】
発明者らは、これらの患者について対応するパルボシクリブ感受性データを有していないが、結果は、このサブグループをｐＹレベルに基づいてさらに分けることができることを実証し、これは、パルボシクリブに対する感受性の差異を示すｃｄｋ４活性レベルに言い換えられるであろう。細胞株およびこのデータの間で検出された大きな差異は、患者の２５．５％がｐＹ８８染色を有しなかった（レベル０）ということである。細胞株が増殖性でがん化しているので、これは予想外なことではない。発明者らのデータは、０  ｐＹ８８染色グループが、パルボシクリブに対して応答しないであろうということを示す。
【００９１】
第２の差異は、細胞株がクローンであり、すべての細胞が同様に染色されたが、同じ腫瘍内での本来の腫瘍異質性により、腫瘍ブロックでは、ある細胞は染色され、ある細胞は染色されなかったことであった。発明者らは、＋に染色された細胞のパーセントを計算した（上記）が、また、０〜３のスケールでｐＹ８８強度をも決定し（図５Ａ）、０はＹ８８ネガティブを示し、セルブロックで使用したスケールと、より類似していた。サンプルの２６．７％は、ｐＹ染色についてネガティブであり（図５Ｂ、緑色、０）、正常の材料（クリーム色）に似ていた。これは、このグループが活性なｃｄｋ４を有しておらず、ＰＤ処置に対して応答しないであろうということを示す。残りのサンプルは、ｐＹにより染色された細胞を有し、サンプルの２６．７％は、ｐＹについて染色されている１〜２９％の細胞を有し（図５Ｂ、黄色、レベル１〜２）、４６．６％は、３０〜１００％の染色を有した（図５Ｂ、茶色、レベル３）。グループ３では、細胞の＞３０％がｐＹについて染色され、染色された細胞の約５０％が、ｐＹについて強く染色された（ｐＹ８８強％、赤色）。ある患者（Ｄ２６）は、しかしながら、Ｙ８８＋であった多くの細胞を有していたが、７．５％だけが強いＹ８８であった。グループ１（図５Ｂ、黄色）では、ポジティブな細胞はより少数であり、大部分はｐＹ８８について強くは染色されなかったが（図５Ｂ、紫色）、２つ（Ｄ１８およびＤ２６）は、＜１０％の強く染色された細胞を少し有した（図５Ｂ、灰色）。０および３のグループに入ったサンプルは、容易に区別された：グループ０は、Ｙ８８染色も強いＹ８８染色も有しておらず、グループ３は、＞３０％の細胞がＹ８８により染色され、それらの細胞の＞５０％が強く染色された。１〜２のグループは、より混在しており、それ自体を２つのグループに分けることができた：ポジティブであるが染色が弱い＜１０％の細胞を有するグループ（強いＹ８８染色はない）および２０〜５０％がポジティブに染色され、＜２０％が強く染色されたグループ。データは、これらのサンプルがｐＹを欠き、したがってｃｄｋ４活性を欠いたので、０グループはＰＤ処置に対して応答しないと思われることを示す。グループ３は、「ドラッガブルな」標的が存在し、ｃｄｋ４活性を示すので、ＰＤに対して応答するはずである。グループ３におけるｐＹのレベルは、より高い濃度のパルボシクリブを必要とする可能性があるｃｄｋ４活性レベルと関連し得る。グループ１〜２に入るサンプルは、必要とするパルボシクリブ濃度が、より低いであろう。
【００９２】
図７は、未処置の（ＤＭＳＯ；緑色）、高非生理学的パルボシクリブ（５００ｎＭ、赤色）、または生理学的濃度のパルボシクリブ（１００ｎＭ、紫色）により処置されたＥＲ／ＰＲ＋、Ｈｅｒ２−患者由来の、乳腺切除術または乳房切除術で廃棄処分された材料の外植片培養物からの結果を示す。固定パラフィン包埋ブロックを、増殖のマーカーとしてのＫｉ６７について染色した。高濃度の薬剤（紫色）を、増殖を阻害することができる内部標準とした。それぞれの患者は、未処置サンプル（緑色）における様々なＫｉ６７レベルによって測定されるように、固有の様々な増殖速度を有した。パルボシクリブ応答は、生理学的濃度の薬剤（赤色）の存在下におけるＫｉ６７の減少として測定された。患者１および３は応答した。それぞれのデータポイントは、４つのサンプルの平均である（２つの別個の外植片サンプルおよび２つの別個の免疫組織化学的検査染色）。それぞれのサンプルは、２人の病理学者によって盲目的に読み取られた。
【００９３】
別の実験で、乳腺切除術または乳房切除術時に同じ患者から摘出した材料を、固定およびパラフィン包埋のためにＤＭＣ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔに送った。次いで、材料を、二重ｐＹ／ｐ２７  ＩＨＣアッセイで染色した。サンプルは、図６のようにスコア化した。
０＝ｐＹ染色なし
１＝１〜２９％  ｐＹ＋細胞、強い染色は０％
２＝１〜２９％  ｐＹ＋細胞、強い染色は５〜２０％だけ
３＝３０〜１００％  ｐＹ＋細胞、強い染色は＞２０％
【００９４】
この実験（ｎ＝４人の患者）から、３のｐＹステータス＝応答、０または１のｐＹステータス＝応答なしとした。１の強度を有するサンプル染色において、腫瘍ブロックがｃｄｋ４標的を含む十分な数の細胞を欠いたまたは腫瘍がｃｄｋ４活性に対してそれほど依存性ではない可能性がある。
【００９５】
発明者らは、非常に便利で再現可能なアッセイを開発し、分析は、これらの他の乳がんサブグループおよび他のがん型に速やかに適用することができる。発明者らのアッセイは、切除材料に適用することができ、これは、典型的に、構造的な特徴付けによって定義されるように悪性領域も良性領域も有する。発明者らは、乳がん患者由来の良性領域（特に切除の周辺部分の）が非乳がん患者から得られた材料と同じくらい「良性」であるかを決定するであろう。ｐＹ８８が明らかに良性組織には存在しないので、乳がん患者由来の良性領域でのｐＹ８８の検出は、構造的な特徴付けが示唆するほど周辺部分が「クリーン」ではないことを実証するであろう。
【００９６】
ｐＹはまた、生検および乳腺切除術による手順からＩＲＢの承認により得られた患者材料における応答を予測するためにバイオマーカーとして使用することもできる。３つの濃度のパルボシクリブによる用量応答曲線は、ＩＣ50値を決定するために使用される。ＩＣ50＜２００ｎＭは、高度の応答、２０１ｎＭ〜５００ｎＭのＩＣ50は中程度、５００ｎＭを超えるＩＣ50は非応答性と定義されるであろう。
【００９７】
実施例ＩＩ
がん、特に乳がんに関連する蔓延および症状を回復させるための試験および治療方法
本発明の別の態様では、試験および治療方法が、開示される。最初に、サンプルを腫瘍から取り、Ｙ８８リン酸化レベルをｃｄｋ４活性レベルを決定するために評価した。前の実施例で詳細に記載されたように、正常組織で観察されたレベルに比べてＹ８８リン酸化の検出可能なレベルを有しない患者は、ｃｄｋ４阻害剤療法から恩恵を受けそうにないが、正常組織で観察されたレベルに比べて１、２、または３のレベルのｐＹ８８リン酸化を有する患者は、様々な濃度のｃｄｋ４阻害剤療法から恩恵を受けるはずである。疾患のサインまたは症状を軽減するためにがんを有する個人を治療するために、表２に開示され、上記の実施例において記載される、ｃｄｋ２およびｃｄｋ４を標的にする適した薬剤を、患者における腫瘍量を低下させるために、単独でまたは組み合わせて、恩恵を受ける可能性が最も高い患者に投与することができる。そのような薬剤は、有効用量で投与されるべきである。総治療用量（２つ以上の標的が調整されることになっている場合）は、単一用量として対象に投与することができまたは分割された治療プロトコールを使用して投与することができ、複数の／別々の用量が、より長期間にわたって、たとえば、一日投薬量の投与を可能にするために一日の期間にわたってまたは所望の期間にわたって用量を投与するためにより長い期間にわたって投与される。
【００９８】
当業者は、対象において有効用量を得るために必要とされるｃｄｋ阻害剤の量は、対象の年齢、体重、および全身の健康状態ならびに投与ルートおよび投与される治療の数を含む多くの因子に依存することを知っているであろう。これらの因子を考慮して、当業者は、がん、特に乳がんを有する個人を治療するために、有効用量を得るように特定の用量を調節するであろう。
【００９９】
ｃｄｋ阻害剤の有効用量は、投与のモードおよび治療されている個人の体重に依存するであろう。がん、特にその疾患のより重度の形態に罹患している個人において、ｃｄｋ阻害剤の投与は、たとえばそのような疾患を治療するための従来の薬剤と組み合わせて投与される場合に、特に有用になり得る。当業者は、単独でまたは組み合わせて治療剤を投与するであろう、また、放射線を使ったアッセイ、免疫学的アッセイ、または必要とされる場合、組織病理学的方法などのような通常の方法を使用して、そのような治療の有効性をモニターするであろう。好ましい実施形態では、Ｙ８８リン酸化レベルは、ある期間にわたって治療の有効性をモニターするために使用することができる。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態では、方法は、コンビナトリアルアプローチにおいて本発明の実施例において開示される医薬品を使用するがんの相乗的な治療のために提供される。上記に記載されるように、パルボシクリブと組み合わせたＡｌｔ−Ｂｒｋ（またはＹ８８リン酸化に干渉する別の薬剤）は、乳がん細胞増殖を阻止するために有効に協力する。有利なことに、本発明の相乗的な方法は、哺乳動物宿主においてがんの進行を低下させるまたはがんに関連する症状を低下させる。本明細書において提供される情報は、乳がんの管理のための新たな治療法に臨床医を導くものである。
【０１０１】
これらの薬剤のほとんどについて安全で有効な投与の方法は、当業者らに知られている。そのうえ、それらの投与は、標準的な文献において記載される。たとえば、多くの抗がん剤についての投与は、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」（ＰＤＲ）、たとえば１９９６年版（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ  ０７６４５−１７４２，ＵＳＡ）において記載され、この開示は、本明細書において参照によって組み込まれる。
【０１０２】
本発明はまた、医薬として許容されるキャリヤまたは希釈剤ありまたはなしでの本発明の組み合わせの治療有効量の投与を含む、がんの治療に有用な医薬組成物をも包含する。本発明の相乗的な医薬組成物は、前の実施例に記載されかつ／または下記の表に列挙される２つ以上の薬剤ならびに医薬として許容されるキャリヤを含む。本発明の組成物は、ミョウバン、安定剤、抗菌剤、バッファー、着色料、調味料、補助剤、およびその他同種のものなどのような、１つ以上の医薬として許容されるさらなる成分をさらに含んでいてもよい。本発明の抗がん組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸、および局所投与ルートを含めて経口的にまたは非経口的に投与されてもよい。
【０１０３】
あるがんは、上記に列挙される複数の化合物により有効に治療することができる。そのような３種類のおよび４種類の組み合わせによって、よりすぐれた効能をもたらすことができる。そのような３種類のおよび４種類の組み合わせで使用される場合、投薬量は、既知のプロトコールに従って決定することができる。
【０１０４】
本発明の組み合わせはまた、治療されている状態に対するそれらの特定の有用性について選択された他のよく知られている治療剤と同時投与されてもよい。複数を組み合わせた製剤が不適切である場合、本発明の組み合わせは、その代わりに、既知の医薬として許容される薬剤と連続して使用されてもよい。
【０１０５】
さらに、一般に、本明細書において記載される化合物は、同じ医薬組成物において投与する必要はなく、物理的および化学的な特徴が異なるために、異なるルートによって投与されなければならない可能性がある。たとえば、第１の化合物は、その好適な血中レベルを得、それを維持するために経口的に投与されてもよく、第２の化合物は、静脈内に投与されていてもよい。可能な場合に同じ医薬組成物中での投与のモードの決定および投与の適否は、熟練の臨床医の知識の範囲内に十分にある。初期の投与は、当技術分野において知られている、確立されたプロトコールに従ってなすことができ、次に、観察される効果に基づいて、投薬量、投与のモード、および投与の回数を熟練の臨床医が変更することができる。
【０１０６】
前に記載されるように、本発明者らは、乳がん患者における長期生存およびがん療法に対する応答を予測するための新たなマーカーを同定した。入手可能な既知の薬剤とＣＤＫ標的を表２に示す。これらの薬剤は、がんを相乗的に治療するまたはがん、特に乳がんの症状もしくは進行を同時に低下させるために組み合わせることができる。
【０１０７】
【表２】
2019512021.tif 000003
データはhttp://www.clinicaltrials.govから得た。‡静脈内。*経口。§インジスラムは直接的なCDK阻害剤ではない:インジスラムは、CDK2活性を低下させるサイクリンEレベルの減少およびCDK7活性を低下させるサイクリンHレベルの減少を引き起こす。CDK、サイクリン依存性キナーゼ；CLL、慢性リンパ性白血病；CYC、サイクリン；DYRK1A、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A；ERK、細胞外シグナル調節キナーゼ；G1、第1のギャップ；G2、第2のギャップ；GSK3ベータ、グリコゲンシンターゼキナーゼ3ベータ；IC50、キナーゼ活性(インビトロキナーゼアッセイ)または細胞増殖(細胞増殖アッセイ)の50%の阻害を引き起こした化合物濃度；Ki、阻害定数；M、有糸分裂；NA、入手可能でない；NHL、非ホジキンリンパ腫；NSCLC、非小細胞肺がん；PDGFRベータ、血小板由来増殖因子受容体ベータ；PDXK、ピリドキサールキナーゼ；RB1、網膜芽細胞腫タンパク質；S、合成；VEGFR、血管内皮増殖因子受容体。
【０１０８】
いくつかの本発明の好ましい実施形態を、上記に記載し、詳細に例証したが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されない。以下の請求項において記載されるように、様々な修飾が、本発明の範囲および精神から逸脱することなくなされてもよい。
【図１Ａ】
2019512021.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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