(57)【要約】  本明細書において、対象の特定の標的環境、例えば神経系および心臓にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を導くことができるペプチド配列を開示する。また、本開示のペプチド配列を含む非天然カプシドタンパク質を有するＡＡＶ、および疾患を治療するための該ＡＡＶの使用方法も開示する。
2019506141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶベクター。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３】
ベクターのＡＡＶ配列（配列番号４５）のＡＡ５８８とＡＡ５８９との間に配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が挿入されている、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４】
ベクターのＡＡＶ配列（配列番号４５）のＡＡ５８６とＡＡ５９２との間に配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が挿入されている、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５】
配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が、配列番号４５の第５８７位、第５８８位、第５８９位および第５９０位のアミノ酸のうち少なくとも２つをさらに含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６】
連続する１１個のアミノ酸からなる配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＡまたはＮであり；
Ｘ１１は、ＱまたはＰである）を含み、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まないＡＡＶベクター。
【請求項７】
Ｘ１がＤであるか、Ｘ２がＧであるか、Ｘ３がＴであるか、Ｘ４がＬであるか、Ｘ６がＶもしくはＴであるか、またはＸ８がＦである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項８】
Ｘ４がＬであり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＶであり、Ｘ７がＰであり、Ｘ８がＦであり、Ｘ９がＫであり、Ｘ１０がＡであり、かつＸ１１がＱである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項９】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである、請求項８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１０】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２がＡＱであり、Ｘ６がＶであり、Ｘ７がＰであり、Ｘ８がＦであり、Ｘ９がＫであり、Ｘ１０がＡであり、かつＸ１１がＱである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１１】
Ｘ３がＴであり、かつＸ４がＬである、請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１２】
Ｘ５がＡである、請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１３】
Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＱであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＬであり、Ｘ８がＦであり、Ｘ９がＫであり、Ｘ１０がＡであり、かつＸ１１がＱである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１４】
アミノ酸Ｘ５Ｘ６Ｘ７が、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである、請求項１３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１５】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６がＡＱＴＬＡＶであり、かつＸ１０Ｘ１１がＡＱである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１６】
アミノ酸Ｘ７Ｘ８Ｘ９が、ＰＦＫである、請求項１５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１７】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８が、ＡＱＴＬＡＶＰＦである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１８】
アミノ酸Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１が、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである、請求項１０に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列が、ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部である、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２０】
連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列が、配列番号４５に示されるベクターのＡＡＶカプシドタンパク質配列のＡＡ５８６とＡＡ５８９との間に挿入されている、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２１】
連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列が、配列番号１〜３６のいずれかである、請求項６に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のＡＡＶベクターおよび１以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２４】
ナノ粒子、第２の分子、ウイルスカプシドタンパク質またはこれらの組み合わせと結合している、請求項２３に記載のペプチド。
【請求項２５】
ＡＡＶの一部である、請求項２３または２４に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記ＡＡＶのカプシドタンパク質である、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
請求項２３に記載のペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２８】
配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質。
【請求項２９】
連続する１１個のアミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＡまたはＮであり；
Ｘ１１は、ＱまたはＰである）からなる配列を含み、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まないカプシドタンパク質。
【請求項３０】
Ｘ１がＤであるか、Ｘ２がＧであるか、Ｘ３がＴであるか、Ｘ４がＬであるか、Ｘ６がＶもしくはＴであるか、またはＸ８がＦである、請求項２９に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３１】
Ｘ４がＬであり、Ｘ５がＡであり、Ｘ６がＶであり、Ｘ７がＰであり、Ｘ８がＦであり、Ｘ９がＫであり、Ｘ１０がＡであり、かつＸ１１がＱである、請求項２９に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３２】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３が、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである、請求項３１に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３３】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２がＡＱであり、Ｘ６がＶであり、Ｘ７がＰであり、Ｘ８がＦであり、Ｘ９がＫであり、Ｘ１０がＡであり、かつＸ１１がＱである、請求項２９に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３４】
Ｘ３がＴであり、かつＸ４がＬである、請求項３３に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３５】
Ｘ５がＡである、請求項３４に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３６】
Ｘ１がＡであり、Ｘ２がＱであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＬであり、Ｘ８がＦであり、Ｘ９がＫであり、Ｘ１０がＡであり、かつＸ１１がＱである、請求項２９に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３７】
アミノ酸Ｘ５Ｘ６Ｘ７が、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである、請求項３６に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３８】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６がＡＱＴＬＡＶであり、かつＸ１０Ｘ１１がＡＱである、請求項２９に記載のカプシドタンパク質。
【請求項３９】
Ｘ７Ｘ８Ｘ９がＰＦＫである、請求項３８に記載のカプシドタンパク質。
【請求項４０】
アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８が、ＡＱＴＬＡＶＰＦである、請求項２９に記載のカプシドタンパク質。
【請求項４１】
アミノ酸Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１が、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである、請求項４０に記載のカプシドタンパク質。
【請求項４２】
請求項２８〜４１のいずれかに記載のカプシドタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項４３】
必要とする対象の標的環境に核酸を送達する方法であって、ＡＡＶを含む組成物を提供すること、および前記対象に前記組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶが、連続する１１個のアミノ酸からなる配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＡまたはＮであり；
Ｘ１１は、ＱまたはＰである）を含むカプシドタンパク質を含み、該カプシドタンパク質が、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まず、前記ＡＡＶが、前記対象の標的環境に送達される目的の核酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項４４】
必要とする対象の標的環境に核酸を送達する方法であって、ＡＡＶを含む組成物を提供すること、および前記対象に前記組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶが、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むとともに、前記対象の標的環境に送達される目的の核酸を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記標的環境が、心臓、神経系またはこれらの組み合わせである、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記標的環境が、中枢神経系、末梢神経系、心臓またはこれらの組み合わせである、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的環境が、神経細胞、星状細胞、心筋細胞またはこれらの組み合わせである、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記組成物が、医薬組成物である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４９】
神経系に送達される目的の核酸が、
ａ）栄養因子、増殖因子または可溶性タンパク質をコードする核酸配列；
ｂ）遺伝子に１以上の遺伝子突然変異を有するヒトまたは動物のタンパク質機能を回復させるｃＤＮＡ；
ｃ）細胞の活性または状態を調節または変更するために用いることができるタンパク質をコードするｃＤＮＡ；
ｄ）細胞の状態を調べるために用いられるタンパク質または核酸をコードするｃＤＮＡ；
ｅ）ゲノム操作を行うためのｃＤＮＡおよび／または関連するガイドＲＮＡ；
ｆ）相同組換えによりゲノムを編集するための配列；
ｇ）治療用ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；
ｈ）ｓｈＲＮＡまたは人工のｍｉＲＮＡ送達システム；ならびに
ｉ）内因性遺伝子のスプライシングに影響を及ぼすＤＮＡ配列
の１以上を含む、請求項４３〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記必要とする対象が、慢性疼痛、心不全、不整脈、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症Ｉ型およびＩＩ型（ＳＭＡ  ＩおよびＳＭＡ  ＩＩ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、脊髄小脳失調症ならびに中枢神経系細胞に影響を及ぼすライソゾーム病の１以上に罹患している対象またはこれら疾患の１以上の発症リスクを有する対象である、請求項４３〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記ライソゾーム病が、クラッベ病、サンドホフ病、テイ・サックス病、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型）、ニーマン・ピック病（ＮＰＣ１欠損もしくはＮＰＣ２欠損）、ハーラー症候群、ポンペ病またはバッテン病である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＡＡＶが、前記対象に静脈内投与または全身投与される、請求項４３〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記神経系が、中枢神経系である、請求項４３〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸が、前記対象の後根神経節、内臓またはこれらの組み合わせに送達される、請求項４３〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸が、前記対象の星状細胞、神経細胞またはこれらの組み合わせに送達される、請求項４３〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、成体動物である、請求項４３〜５５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１５年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／２６６１８４号および２０１６年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４２１８９１号の優先権を主張する。また、本願は、２０１４年９月１２日に出願された米国特許出願第１４／４８５０２４号の関連出願である。これらの関連出願の内容は、参照により本明細書にその全体が明示的に援用される。
【０００２】
連邦政府の助成による研究開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所の助成番号５Ｒ０１ＡＧ０４７６６４、ＩＤＰ２ＮＳ０８７９４９、５Ｕ０１ＮＳ０９０５７７および１Ｒ２１ＭＨ１０３８２４−０１の助成に基づき、米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。この配列表は、２０１６年１２月９日に作成されたＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴという名称のファイルとして提供されており、該ファイルのサイズは４０ｋｂである。配列表の電子データは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００４】
本願は、全体として、遺伝子送達の分野に関する。詳細には、本願は、標的組織または標的臓器にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を導くことができるペプチド配列、新規の組換えＡＡＶ、および様々な疾患を治療するための該ＡＡＶの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療の実施や、様々な基礎研究に欠かせない遺伝子導入の実施において、ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子導入に使用されているベクターである。ｒＡＡＶは、以下に示すいくつかの特性から、遺伝子送達の媒体として注目されている。
（ｉ）ｒＡＡＶは、導入遺伝子の長期発現が可能である。
（ｉｉ）ｒＡＡＶは、公知のヒト疾患との関連が見られない。
（ｉｉｉ）ｒＡＡＶにより惹起される免疫応答は、比較的弱い。
（ｉｖ）ｒＡＡＶは、様々な分裂細胞種および非分裂細胞種への形質導入を行うことができる。
（ｖ）ｒＡＡＶゲノムは、形質導入特性や組織指向性の異なる様々なカプシド（ウイルスのタンパク質膜）にパッケージングできる。
ｒＡＡＶベクターを用いた遺伝子治療は、レーバー先天性黒内障、第ＩＸ因子欠乏に関連する血友病およびリポタンパク質リパーゼ欠損症の治療を含む臨床試験において成功している。また、ｒＡＡＶ遺伝子を用いた治療は、レット症候群、先天性ＡＬＳ、パーキンソン病、ハンチントン病および脊髄性筋萎縮症を含む様々な疾患の前臨床モデルにおいても成功している。さらに、ｒＡＡＶを用いた治療は、ＨＩＶやインフルエンザなどの感染症を治療するための中和抗体の送達にも成功している。また、光遺伝学などの非治療目的の科学研究においても、ｒＡＡＶは、導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達のためのベクターとしてよく用いられている。しかし、特定の難しい細胞種に効率的に形質導入を行うことができるカプシド血清型が欠如していることや、全身送達で所望の細胞種／臓器に対して効率的かつ選択的に標的送達できる血清型が欠如していることから、疾患の治療や、様々な応用を目指した科学研究のための遺伝子送達に使用できるｒＡＡＶは制限されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書において、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含有するアミノ酸配列を含むＡＡＶベクターを開示する。前記アミノ酸配列は、例えば、前記ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ベクターのＡＡＶ配列（配列番号４５）のＡＡ５８８とＡＡ５８９との間に、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が挿入されている。いくつかの実施形態において、前記ベクターのＡＡＶ配列（配列番号４５）のＡＡ５８６とＡＡ５９２との間に、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が挿入されている。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号４５の第５８７位、第５８８位、第５８９位および第５９０位のアミノ酸のうち少なくとも２つをさらに含む。
【０００７】
また、連続する１１個のアミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＡまたはＮであり；
Ｘ１１は、ＱまたはＰである）からなる配列を含み、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まないＡＡＶベクターを開示する。
いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、標的指向性ペプチドの一部であるか、標的指向性ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤであるか、Ｘ２はＧであるか、Ｘ３はＴであるか、Ｘ４はＬであるか、Ｘ６はＶもしくはＴであるか、Ｘ８はＦであるか、またはこれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤであるか、Ｘ２はＧであるか、Ｘ３はＴであるか、Ｘ４はＬであるか、Ｘ６はＶもしくはＴであるか、またはＸ８はＦである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ６はＶまたはＴであり、かつＸ８はＦである。いくつかの実施形態において、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２はＡＱであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴであり、かつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ５Ｘ６Ｘ７は、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６はＡＱＴＬＡＶであり、かつＸ１０Ｘ１１はＡＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ７Ｘ８Ｘ９は、ＰＦＫである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８は、ＡＱＴＬＡＶＰＦである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、前記ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部である。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、前記ベクターのＡＡＶカプシドタンパク質配列、例えば配列番号４５のＡＡ５８６とＡＡ５８９との間に挿入されている。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、配列番号１〜３６のいずれかである。
【０００８】
本明細書において、本明細書に開示されているＡＡＶベクターを１以上および薬学的に許容される担体を１以上含む医薬組成物を開示する。
【０００９】
また、本明細書において、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および８０〜９３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドを開示する。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、ナノ粒子、第２の分子、ウイルスカプシドタンパク質またはこれらの組み合わせと結合している。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、ＡＡＶの一部である。例えば、前記ペプチドは、ＡＡＶのカプシドタンパク質であってもよい。
【００１０】
本明細書に開示されているいくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドおよびそのフラグメントを含むすべての本発明のペプチドをコードする核酸配列が提供される。
【００１１】
また、本明細書において、本明細書に開示されている１以上の標的指向性ペプチドを含むカプシドタンパク質を開示する。例えば、前記カプシドタンパク質は、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質は、連続する１１個のアミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＡまたはＮであり；
Ｘ１１は、ＱまたはＰである）からなる配列を含み、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まない。
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤであるか、Ｘ２はＧであるか、Ｘ３はＴであるか、Ｘ４はＬであるか、Ｘ６はＶもしくはＴであるか、またはＸ８はＦである。いくつかの実施形態において、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２はＡＱであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴであり、かつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ５Ｘ６Ｘ７は、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６はＡＱＴＬＡＶであり、かつＸ１０Ｘ１１はＡＱである。いくつかの実施形態において、Ｘ７Ｘ８Ｘ９は、ＰＦＫである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８は、ＡＱＴＬＡＶＰＦである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。また、本明細書に開示されているカプシドタンパク質およびそのフラグメントをコードする核酸配列も提供される。
【００１２】
また、必要とする対象の標的環境に核酸を送達する方法も開示する。前記方法は、いくつかの実施形態において、ＡＡＶを含む組成物を提供すること、および前記対象に前記組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶは、連続する１１個のアミノ酸からなる配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０は、ＡまたはＮであり；
Ｘ１１は、ＱまたはＰである）を含むカプシドタンパク質を含み、該カプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まず、前記ＡＡＶは、前記対象の標的環境に送達される目的の核酸を含む。
前記方法は、いくつかの実施形態において、ＡＡＶを含む組成物を提供すること、および前記対象に前記組成物を投与することを含み、前記ＡＡＶは、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を含むとともに、前記対象の標的環境に送達される目的の核酸を含む。前記標的環境としては、例えば、心臓、神経系またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記標的環境は、中枢神経系、末梢神経系、心臓またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記標的環境は、神経細胞、星状細胞、心筋細胞またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、神経系に送達される目的の核酸は、
ａ）栄養因子、増殖因子または可溶性タンパク質をコードする核酸配列；
ｂ）遺伝子に１以上の遺伝子突然変異を有するヒトまたは動物のタンパク質機能を回復させるｃＤＮＡ；
ｃ）細胞の活性または状態を調節または変更するために用いることができるタンパク質をコードするｃＤＮＡ；
ｄ）細胞の状態を調べるために用いられるタンパク質または核酸をコードするｃＤＮＡ；
ｅ）ゲノム操作を行うためのｃＤＮＡおよび／または関連するガイドＲＮＡ；
ｆ）相同組換えによりゲノムを編集するための配列；
ｇ）治療用ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列；
ｈ）ｓｈＲＮＡまたは人工のｍｉＲＮＡ送達システム；ならびに
ｉ）内因性遺伝子のスプライシングに影響を及ぼすＤＮＡ配列
の１以上を含む。
前記必要とする対象としては、例えば、慢性疼痛、心不全、不整脈、フリードライヒ運動失調症、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症Ｉ型およびＩＩ型（ＳＭＡ  ＩおよびＳＭＡ  ＩＩ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、脊髄小脳失調症ならびに中枢神経系細胞に影響を及ぼすライソゾーム病の１以上に罹患している対象またはこれら疾患の１以上の発症リスクを有する対象が挙げられる。ライソゾーム病としては、例えば、クラッベ病、サンドホフ病、テイ・サックス病、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型）、ニーマン・ピック病（ＮＰＣ１欠損もしくはＮＰＣ２欠損）、ハーラー症候群、ポンペ病またはバッテン病が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶは、前記対象に静脈内投与または全身投与される。前記神経系としては、例えば、中枢神経系が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記核酸は、前記対象の後根神経節、内臓またはこれらの組み合わせに送達される。いくつかの実施形態において、前記核酸は、前記対象の星状細胞、神経細胞またはこれらの組み合わせに送達される。いくつかの実施形態において、前記対象は、成体動物である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＸＸＸライブラリーを作製するために用いた多様化手法の概略図である。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長鎖を含むＡＡＶカプシドを、ＸＸＸで示される連続する３つのアミノ酸位置で多様化させた。ＸＸＸは、７アミノ酸長の挿入配列の２個前のアミノ酸（以下「ＡＡ」と表記する）から＋９ＡＡまで続く。各ＸＸＸライブラリーは２ＡＡずつシフトさせた。１１ＡＡに及ぶ合計５つのＸＸＸライブラリーを作製した。次いで、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＸＸＸ  ＰＣＲフラグメントを、米国特許公開第２０１５／００７９０３８号に記載のものと同じｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−アクセプタープラスミドに連結した。次いで、このｒＡＡＶゲノムを用いてＡＡＶウイルスライブラリーを作製し、このＡＡＶウイルスライブラリーを１×１０１１ｖｇ／マウスの用量でＧＦＡＰ−Ｃｒｅ成体マウス、Ｖｇａｔ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ成体マウスおよびＶｇｌｕｔ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ成体マウスに注射し、それぞれ、星状細胞、ＧＡＢＡ作動性神経細胞およびグルタミン酸作動性神経細胞への形質導入が可能な変異体の選別を行った。２回の選別を経て、これら１以上のＣｒｅ系統から回収した配列の中に多数の変異体が濃縮されていることが分かった。これらの配列の１つであるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４））を選択して、変異体としての特性評価を行った。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂから変化させたＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎの３個のアミノ酸はＤＧＴであり、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂと異なっていた配列はＤＧである。
【００１４】
【図２】ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＮによるＣＮＳ神経細胞への形質導入がＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより効率的に行われることを示した画像である。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（上段）またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（下段）にパッケージングしたＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを低用量（３．３×１０１０ｖｇ／マウス）で静脈内注射し、２週間後に画像を取得した。淡色点は、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎタンパク質の発現（したがってＡＡＶが形質導入されている）を示す。画像から、皮質、小脳および歯状回において、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの発現よりＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎの発現が高いことが分かる。したがって、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂと比較して、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎは、複数の脳領域の神経細胞の形態を有する細胞に対して高効率で形質導入を行うことができる。スケールバーは２００μｍである。
【００１５】
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、マウスの心臓および末梢神経においてＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの形質導入効率がＡＡＶ９より高いことを示した図である。図３Ａは、ｓｓＡＡＶ９：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰ（ＮＬＳ：核移行シグナル）を２×１０１２ｖｇ／マウスの用量で静脈内注射した３週間後に撮影した成体マウスの背側脊髄に入る知覚線維の画像である。ＡＡＶ９を投与したサンプルよりＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓを投与したサンプルでより淡く染色されていることから、ＡＡＶ９よりＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓを投与した方が知覚線維においてＧＦＰの発現レベルが高いことが分かる。図３Ｂは、組換え一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ９：ＣＡＧ−ＧＦＰ−２Ａ−ＬｕｃまたはｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ＧＦＰ−２Ａ−Ｌｕｃを１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／マウスの用量で静脈内投与し、３週間後に撮影した心臓におけるＧＦＰタンパク質の発現による自然蛍光（淡色シグナルで示される）を示す画像である。図３Ｃは、１×１０１２ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎと１×１０１２ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅとの混合物を注射した４週間後に撮影したマウスの後根神経節における自然蛍光を示す３次元投影画像である。２つのチャネルを合わせてグレースケール画像で示す。図３Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの静脈内注射による腸神経系内の細胞への形質導入結果を示した画像である。淡色点は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓにより形質導入された細胞を示す。画像は、ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを１×１０１２ｖｇ／マウスの用量で静脈内投与した３週間後に撮影した成体マウスの腸管の最大値投影像である。淡色点は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＳベクターによるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現を示す（左側のパネルおよび右側上段のパネルを参照）。筋層間神経叢を有する神経細胞は、抗ｐｇｐ９．５抗体で標識されており、右下段のパネルに、ＤＡＰＩで標識された核を示す。
【００１６】
【図４】図４Ａ〜４Ｇは、形質導入された標的細胞からのＡＡＶカプシド配列のＣｒｅ依存性回収を示した図である。図４Ａに、ＣＲＥＡＴＥ選別工程の概要を示す。ＰＣＲを利用して、カプシド遺伝子のフラグメントに多様性（縦帯全体にスペクトル状に表示）を導入する。得られたフラグメントを、残りのカプシド遺伝子を有するｒＡＡＶゲノムにクローニングし、ウイルス変異体のライブラリーを作製する。作製したライブラリーをＣｒｅ遺伝子組換え動物に注射し、ＰＣＲを用いてＣｒｅ＋細胞から選択的にカプシド配列を回収する。図４Ｂに、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘ  ｒＡＡＶゲノムを示す。Ｃｒｅにより、ｌｏｘ７１部位およびｌｏｘ６６部位で挟まれたポリアデニル化（ｐＡ）配列が反転する。ＰＣＲプライマー（片側矢印）を用いて、Ｃｒｅ組換え配列を選択的に増幅する。図４Ｃに、Ｃｒｅ＋マウスおよびＣｒｅ−マウスの２種類のマウスから回収したカプシドライブラリー配列のＣｒｅ組換え依存性増幅（上段）およびＣｒｅ組換え非依存性増幅（下段）により得られたＰＣＲ産物を示す。ＰＣＲ増幅手法を、概略図（一番下）に示す（詳細は図８Ａおよび８Ｂを参照）。図４Ｄに、Ｒｅｐ−ＡＡＰ  ＡＡＶヘルパープラスミド内のＡＡＶ遺伝子と、ｃａｐ遺伝子でコードされるタンパク質とを模式的に示す。ｃａｐ遺伝子に挿入された終止コドンにより、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３カプシドタンパク質の発現が阻止される。図４Ｅに、ＡＡＶ２／９  ｒｅｐ−ＡＡＰとｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノム（上段）とからなる分割システムを用いて産生されたＤＮａｓｅ耐性ＡＡＶベクターゲノム数（ｖｇ）を、標準的なＡＡＶ２／９  ｒｅｐ−ｃａｐヘルパーとｒＡＡＶ−ＵＢＣ−ｍＣｈｅｒｒｙゲノム（中央）とを用いて産生されたＤＮａｓｅ耐性ＡＡＶベクターゲノム数（ｖｇ）、またはＡＡＶ２／９  ｒｅｐ−ＡＡＰとｒＡＡＶ−ＵＢＣ−ｍＣｈｅｒｒｙゲノム（下段）とを用いて産生されたＤＮａｓｅ耐性ＡＡＶベクターゲノム数（ｖｇ）と比較して示す。各群Ｎ＝３の独立試験；平均±標準偏差；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ多重比較検定。図４Ｆに、７アミノ酸長鎖カプシドライブラリーのｒＡＡＶ−ΔＣａｐ−ｉｎ−ｃｉｓベクターへのクローニングを示す。図４Ｇに、ＡＡＶ９の表面モデルを示す。図４Ｆおよび４Ｇに、ＡＡ５８８とＡＡ５８９との間に挿入された７アミノ酸長鎖の位置を示す。
【００１７】
【図５】図５Ａ〜５Ｇは、成体マウスの静脈内に注射したＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢによるＣＮＳ全体への遺伝子送達の結果を示した図である。図５Ａ〜５Ｆでは、ｓｓＡＡＶ９：ＣＡＧ−ＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＧＦＰを、１×１０１２ｖｇ／マウスまたは１×１０１１ｖｇ／マウスの用量で成体マウスに静脈内注射を行った。図５Ａは、ＡＡＶ９を投与したマウス（左側）ならびにＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを投与したマウス（中央および右側）における注射３週間後のＧＦＰ発現（各種カプシドにより送達されたｓｓＡＡＶゲノムの発現量に対応）を示した画像である。ＧＦＰの発現は、淡色シグナルで表示される。図５Ｂに、５０μｍ最大値投影法（ＭＩＰ）による共焦点画像における、皮質または線条体のＧＦＰ発現（淡色シグナルで表示）を示す。図５Ｃに、ＰＡＲＳにより透明化させた腰髄におけるＧＦＰタンパク質の発現（淡色シグナルで表示）を示す。図５Ｄに、網膜におけるＧＦＰタンパク質の発現（淡色シグナルで表示）を示す（左側：２０μｍ  ＭＩＰ、横断面；右側：全載ＭＩＰ）。図５Ｅおよび５Ｆに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにより形質導入された皮質および線条体、ならびにＡＡＶ９（上段）またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（下段）により形質導入されたマウスの各種臓器から得られたＰＡＲＳ透明化組織の３次元ＭＩＰ画像におけるＧＦＰタンパク質の発現（淡色シグナルで表示）を示す。図５Ｆ中、矢印で強調表示されている神経は、カプシドタンパク質を発現する神経である。膵臓の画像中、星印で強調表示されている細胞は、ＧＦＰを発現する膵島細胞である。３次元投影像における主要目盛りは１００μｍである。図５Ｇに、１×１０１１ｖｇの用量で静脈内注射した成体マウスの各種ＣＮＳ領域および各種臓器における注射２５日後のＡＡＶの体内分布を示す。ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢはＮ＝３およびＡＡＶ９はＮ＝４；平均±標準偏差；＊＊ｐ＜．０１、＊＊＊ｐ＜．００１、多重比較のためにＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で補正した対応のないｔ検定。スケールバー：１ｍｍ（図５Ａおよび５Ｃ（左側））；５０μｍ（図５Ｂ、５Ｃ（右側）、５Ｄおよび５Ｅ）。図５Ｃ、５Ｅおよび５Ｆの３次元投影像における主要目盛りは１００μｍである。
【００１８】
【図６】図６Ａ〜６Ｉは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる複数のＣＮＳ細胞種への形質導入がＡＡＶ９より効率的に行われることを示した図である。図６Ａ〜６Ｅは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる星状細胞、オリゴデンドロサイトおよび神経細胞への形質導入結果を示した画像である：ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＧＦＰを１×１０１１（図６Ａ）または１×１０１２（図６Ｂ〜６Ｅ）の用量で静脈内注射した成体マウスにおける注射３週間後のＧＦＰタンパク質の発現を示す。図６Ａは、海馬におけるＭＩＰ染色像を示す。淡色シグナルは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂコンストラクトの発現を示し、濃色シグナルは、ＧＦＡＰの発現を示す。図６Ｂは、皮質におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＣＣ１マーカーの発現を調べた免疫組織化学解析の結果である。番号を付した四角は、二重陽性細胞の例を強調表示したものである。それぞれに対応する単一チャネルの画像を右側に示す。星印により強調表示されている細胞は、ＧＦＰ発現が検出されなかった細胞である。図６Ｃは、各種脳領域におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入およびＮｅｕＮマーカーを調べた免疫組織化学解析の結果である。図６Ｄは、中脳におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入を示すＧＦＰ蛍光およびＴＨ  ＩＨＣのＭＩＰ画像である。図６Ｅは、小脳におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入およびカルビンジン（Ｃａｌｂ）ＩＨＣを示した画像である。図６Ｆ〜６Ｈは、注射３週間後の各種脳領域におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入陽性細胞の割合（％）を定量した結果である。図６Ｉに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる脊髄のＣｈＡＴ運動神経細胞への形質導入結果を示す。淡色点は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの発現を示す。濃色シグナルは、ＣｈＡＴのＩＨＣを示す。画像は、脊髄の横断面全体（左側）の画像および前角のＭＩＰ画像（右側）である。数値は、脊髄の横断面全体（左側）または前角のＭＩＰ画像（右側）におけるＣｈＡＴの割合（％）である。脊髄の各領域におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを発現したＣｈＡＴ神経細胞の割合（％）は、＋／−を付した９５％信頼区間で示したものである。各群Ｎ＝５で定量を行った；平均±標準偏差；多重比較のためにＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で補正した対応のないｔ検定により、ＡＡＶ９の平均値とＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの平均値のいずれのペアにおいても差が認められた（＊＊＊ｐ＜０．００１）。スケールバー：２０μｍ（図６Ａ、６Ｂおよび図６Ｄ）、５０μｍ（図６Ｃおよび６Ｉ（右側））、２００μｍ（図６Ｅ）ならびに１ｍｍ（図６Ｉ（左側））。
【００１９】
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡによるＣＮＳ星状細胞への形質導入結果およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａの末梢臓器に対する指向性の低下を示した図である。図７Ａ〜７Ｃおよび７Ｅに、ｓｓＡＡＶ９：ＣＡＧ−ＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ：ＣＡＧ−ＧＦＰを３×１０１１の用量で静脈内注射した成体マウスにおける３週間後のＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａの発現を示す。図７Ａおよび７Ｂに、ｓｓＡＡＶ９：ＣＡＧ−ＧＦＰおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ：ＣＡＧ−ＧＦＰのＩＨＣの代表的な画像を示す。図７Ｃは、海馬におけるＧＦＰタンパク質のＩＨＣを示す。濃色シグナルは、海馬におけるＧＦＡＰのＩＨＣを示す。番号を付した四角は、ＧＦＰタンパク質とＧＦＡＰの両方を発現する細胞の例を強調表示したものである。それぞれに対応する単一チャネルの画像を右側に示す。図７Ｄでは、ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを２．５×１０１１ｖｇの用量で成体マウスに静脈内注射した。Ａｌｄｈ１ｌ１細胞およびＮｅｕＮ細胞におけるＮＬＳ−ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）の定量結果をグラフに示す。図７Ｅに、肝臓におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａの発現（淡色シグナル）を示す（組織自家蛍光は濃色シグナルで表示される）。図７Ｆに、１×１０１１ｖｇの用量で静脈内注射した成体マウスのＣＮＳ領域および末梢臓器における注射２５日後のＡＡＶの体内分布を示す。図７Ｅおよび７Ｆ、各群Ｎ＝４；平均±標準偏差；＊＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、多重比較のためにＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法で補正した対応のないｔ検定。スケールバー：１ｍｍ（図７Ａ）；１００μｍ（図７Ｂ）；および５０μｍ（図７Ｃ）。
【００２０】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＰＣＲ産物の模式図およびｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓゲノムの模式図である。図８Ａは、第５８８位のアミノ酸の後に挿入された、ランダム化配列（縦帯全体にスペクトル状に表示）の７個のアミノ酸（本明細書において「７ＡＡ」と表記する）を有するＰＣＲ産物の模式図である。ライブラリーの作製に用いられるプライマーを、名称と片側矢印とで示す。ＰＣＲテンプレートに、カプシド遺伝子フラグメント（ｘＥ）内に元来存在するＥａｒｌ制限酵素切断部位を除去する修飾を施した（詳細は実施例を参照）。図８Ｂは、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓゲノムと、ベクターゲノムの定量化およびＣｒｅ発現細胞への形質導入を行う配列の回収に用いるプライマーとを示した模式図である。ＰＣＲによる回収は２段階で行う。第１段階は、下流のポリアデニル化（ｐＡ）配列のＣｒｅ依存性反転が生じたゲノムのＣａｐ配列を選択的に増幅することにより、標的細胞特異的な配列を回収する段階である。第１段階において、９ＣａｐＦはＣｒｅ組換えテンプレートのフォワードプライマーとして機能し、ＣＤＦプライマーはＣｒｅ組換えテンプレートのリバースプライマーとして機能する。第２段階は、プライマーＸＦおよびＡＲを用いてＰＣＲを行い、得られた産物をｒＡＡＶ−ΔＣａｐ−ｉｎ−ｃｉｓプラスミド（第２のライブラリー作製）またはＡＡＶ２／９  ｒｅｐ−ｃａｐ  ｔｒａｎｓプラスミド（変異体特性評価）にクローニングする段階である。表１に、図８Ａおよび８Ｂに示したＰＣＲで使用可能なプライマー配列の例を示す。ただし、これらに限定されない。
【００２１】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、選別段階を経て最も濃縮された上位３種の変異体（すなわちＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ２およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ３）のカプシド特性および産生効率を示した図である。図９Ａは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、２番目に高濃縮された変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ２または３番目に高濃縮された変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ３にパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ファルネシル基（ｍＮｅＧｒｅｅｎ−ｆ）を３．３×１０１０ｖｇ／マウスの用量で注射したマウスにおける２週間後の脳の矢状面の代表的な画像である。淡色シグナルは、ＧＦＰタンパク質の発現を示す。データは、各群２匹（ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）または３匹（ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ２およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ３）のマウスの代表例を示したものである。図９Ｂは、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ選別により回収した各変異体の調製物から得られたＤＮａｓｅ耐性ｖｇ量を示す。収量は、産生細胞を播種した１５０ｍｍのディッシュ当たりの精製ベクターゲノムコピー数として示す；平均±標準偏差；＊ｐ＜０．０５、一元配置分散分析およびＴｕｋｅｙ多重比較検定。バー内に独立して得られた各カプシドの調製物の数を示す。
【００２２】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｇは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにより、複数の介在神経細胞種および内皮細胞への形質導入は行われるが、ミクログリアへの形質導入は行われないことを示した画像である。図１０Ａ〜１０Ｄでは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＧＦＰを１×１０１２ｖｇの用量で成体マウスに注射し、注射３週間後にＧＦＰタンパク質の発現解析を行った。代表的な画像は、各種抗原および各種脳領域のＩＨＣとともに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ発現のＩＨＣ（図１０Ａ〜１０Ｃ）またはＧＦＰタンパク質発現による自然蛍光（図１０Ｄ）を示したものである。図１０Ｅでは、ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ｍＮｅＧｒｎ−ｆを３．３×１０１０ｖｇの用量で成体マウスに注射し、注射２週間後に解析を行った。ｍＮｅＧｒｎ−ｆによる自然蛍光は、ＣＤ３１を発現する一部の内皮細胞と共局在化している。図１０Ｆおよび１０Ｇでは、ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを２×１０１２ｖｇの用量で成体マウスに注射し、注射３週間後に解析を行った。淡色シグナルは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの発現を示し、濃色シグナルは、Ｉｂａ１の発現を示す。星印は、図中に記載の抗原を発現するもののＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの発現が検出されなかった細胞を示す。パルブアルブミン（ＰＶ）、カルビンジン（Ｃａｌｂ）およびカルレチニン（ＣＲ）。スケールバー：２０μｍ（図１０Ａ〜１０Ｄ）；５０μｍ（図１０Ｅ〜１０Ｆ）および５００μｍ（図１０Ｇ）。
【００２３】
【図１１】ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる遺伝子導入が行われた脳における長期のＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ発現を示した図である。ＡＡＶ９またはＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰを各種用量で成体マウスに静脈内注射し、３７７日後にｅＧＦＰ自然蛍光を調べた。淡色シグナルは、ｅＧＦＰの発現を示す。各ベクター各用量Ｎ＝１。
【００２４】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰによる形質導入後の複数の神経細胞およびグリア細胞種におけるＧＦＰタンパク質発現による自然蛍光およびＩＨＣの代表的な画像である。図１２Ａ〜１２Ｄでは、ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを２×１０１２ｖｇの用量で成体マウスに注射し、注射３週間後に解析を行った。画像は、各種脳領域における各種抗原のＩＨＣとともに、ＧＦＰタンパク質発現による自然蛍光を示したものである。すべてのパネルにおいて、矢印は、ＧＦＰ発現と各種抗原のＩＨＣとの共局在化を示す。図１２Ｂおよび１２Ｃは、単一平面共焦点画像である；図１２Ａおよび１２ＤはＭＩＰである。脳梁（ＣＣ）、黒質緻密部（ＳＮｃ）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）。スケールバー：５０μｍ。
【００２５】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ヒトｉＰＳＣ由来の関連培養物中の皮質神経細胞および星状細胞ならびに解離させていないヒトｉＰＳＣ由来の３次元皮質培養物へのＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入の結果である。図１３Ａに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにより、単層培養のヒト神経細胞およびヒト星状細胞への形質導入が高効率に行われることが示されている。代表的な画像は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させたｉＰＳＣ由来ヒト皮質スフェロイドを解離して、ウイルスによる形質導入（ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰ；１×１０９ｖｇ／ウェル）を行い、５日後の、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡカプシドおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂカプシドにより送達されたＧＦＰ  ｃＤＮＡの発現を示している。ＧＦＰタンパク質を発現する細胞は、白色矢印により示されるようなＭＡＰ２免疫染色陽性の神経細胞またはＧＦＡＰ免疫染色陽性の星状細胞と共局在化している。図１３Ｂは、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂに感染したＧＦＡＰ＋細胞またはＭＡＰ２＋細胞の割合（％）を定量した結果である（Ｎ＝３  ２名の個体からそれぞれ得られたヒトｉＰＳＣ株を皮質スフェロイドに分化；二元配置分散分析、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定；平均±標準偏差）。図１３Ｃに、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる、解離させていない３次元ヒト皮質培養物（ヒトｉＰＳＣｓから分化した皮質スフェロイド）への形質導入結果を示す。ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰにより形質導入されたヒトｉＰＳＣ由来皮質スフェロイドの凍結切片（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化から２０５日後）の画像は、ＧＦＡＰおよびＭＡＰ２の免疫染色とともに、ＧＦＰタンパク質発現による自然蛍光を示したものである。挿入画像は、ＧＦＡＰ＋星状細胞（シアン）またはＭＡＰ２＋神経細胞とＧＦＰタンパク質とを同時標識したものである。スケールバー：４０μｍ（図１３Ａ）；および１００μｍ（図１３Ｃ）。
【００２６】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢカプシドおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａカプシドが静脈内注射により脳血管に局在化し、血管に沿った細胞が投与２４時間後までに形質導入されることを示した図である。成体マウスに、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを１×１０１１ｖｇの用量で記載通りに注射した。図１４Ａおよび１４Ｂは、静脈内注射の１時間後に経心灌流により固定したマウス脳において、小脳（図１４Ａ）または線条体（図１４Ｂ）で共有内部エピトープを認識するＢ１抗ＡＡＶ  ＶＰ３抗体を用いて、カプシドを免疫染色した（淡染）代表的な画像である。カプシドの免疫染色は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを注射したマウスの脳全域で確認されたが、同用量のＡＡＶ９を投与したマウスの脳ではほとんど認められなかった。細胞核は、ＤＡＰＩで標識した（濃染）。リポフスチン自家蛍光は、緑色と赤色の両チャネルで確認されることから、カプシド染色と区別することができる。図１４Ａの挿入画像は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの画像中で強調表示されている部分の３次元ＭＩＰ画像である。矢印で強調表示されているのは、カプシドＩＨＣシグナルである；星印は血管内腔を示す。データは、各群２匹（ウイルス非投与およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ）または３匹（ＡＡＶ９およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）のマウスの代表例を示したものである。図１４Ｃは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ投与から２４時間後のＤＡＰＩ（白染）およびＣＤ３１（濃染）とともに、ＧＦＰ発現（淡染）を示した代表的な画像である。矢印で強調表示されている細胞は、ＧＦＰを発現する細胞である。図１４Ｄに、各種脳領域の血管に沿って存在するＧＦＰ発現細胞数を定量した結果を示す。各群Ｎ＝３；平均±標準偏差；ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂと、ＡＡＶ９およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａとの比較、すべての領域で＊＊＊ｐ＜０．００１；ＡＡＶ９とＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａとの比較、有意差なし；二元配置分散分析、スケールバー：２００μｍ（図１４Ａ）；５０μｍ（図１４Ｂおよび１４Ｃ）；高倍率の挿入画像（図１４Ａ）における主要目盛りは５０μｍである。
【００２７】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスから回収した上位３種の変異体によるレポーター発現を示した結果である。図１５Ａに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、２番目に高濃縮された変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ２または３番目に高濃縮された変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ３にパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎ−Ｇｒｅｅｎ−ファルネシル基（ｍＮｅＧｒｎ−ｆ）を３．３×１０１０ｖｇ／マウスの用量で注射したマウスにおける２週間後の脳の矢状面の代表的な画像を示す。淡色シグナルは、３種の濃縮された変異体であるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（左側）、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ２（中央）およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ３（右側）により送達されたｃＤＮＡによるｍＮｅＧｒｎ−ｆ発現を示す。図１５Ｂは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ２またはＡＡＶ−Ｂ３にパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを２×１０１２ｖｇ／マウスの用量で注射した３週間後の脳断面におけるＮＬＳ−ＧＦＰ発現を示した高倍率（４０×）グレースケール画像である。
【００２８】
【図１６】ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体によるレポーター発現を示した画像である。淡色点は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体によるレポーター発現を示す。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂまたは各種ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体を１×１０１１ｖｇ（全量）／マウスの用量で静脈内注射したマウスにおける２週間後の脳切片の単一平面共焦点画像を示す。各変異体を用いて、ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびｍＫａｔｅ２．５を含むレポーター混合物をパッケージングした。ｍＫａｔｅ２．５は、一部の細胞種で凝集が見られ、特に神経細胞および内皮細胞で顕著に凝集が見られることに留意されたい。
【００２９】
【図１７】ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体によるレポーター発現を示した画像である。淡色点は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体によるレポーター発現を示す。各種ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体を３×１０１１ｖｇ（全量）／マウスの用量で注射したマウスにおける３週間後の脳切片の単一平面共焦点画像を示す。各変異体を用いて、ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびｍＲｕｂｙ２を含むレポーター混合物をパッケージングした。
【００３０】
【図１８】ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体によるレポーター発現を示した画像である。淡色点は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体によるレポーター発現を示す。各種ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体を１×１０１１ｖｇ（全量）／マウスの用量で静脈内注射したマウスにおける１１日後の脳切片の単一平面共焦点画像を示す。各変異体を用いて、ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎおよびｍＲｕｂｙ２を含むレポーター混合物をパッケージングした。
【００３１】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴの成体への静脈内投与によるＣＮＳへの形質導入が、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより効率的であることを示した図である。図１９Ａは、各種カプシドにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを１×１０１１ｖｇ／マウスの用量で静脈内投与した３週間後のｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰの発現を示した脳全体画像（背側から見た像）である。ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰの発現は、グレースケールの淡色シグナルで示される。図１９Ｂは、運動野（左側）または線条体（右側）のＧＦＰを発現する核（ＤＡＰＩ＋）総数の割合（％）を示したグラフである。図１９Ｃは、ＧＦＰ＋核当たりのｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰの平均発現量を示したグラフである。各群の動物数Ｎ＝４。
【００３２】
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓによる末梢神経への形質導入結果をＡＡＶ９との比較により示した図である。図２０Ａは、各種カプシドにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを１×１０１２ｖｇ／マウスの用量で静脈内投与した３週間後のＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの発現を示した脳全体画像（左側は背側から見た図、右側は腹側から見た図）である。ＧＦＰの発現をグレースケールで表示する。核局在化ＧＦＰを用いたが、脊髄および脳幹に入る末梢神経細胞軸索におけるＧＦＰ発現が十分に強いため、ＧＦＰ発現をこれらの脳全体画像で視認できることに留意されたい。図２０Ｂは、３×１０１２ｖｇ（全量）のｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ＸＦＰｍｉｘにより形質導入を行った後の脊髄の横断面を示した画像である。図２０Ｃは、１×１０１２ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎと１×１０１２ｖｇのｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅとの混合物を注射した４週間後に撮影したマウスの後根神経節における自然蛍光を示す３次元投影画像である。図２０Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの静脈内注射による腸神経系内の細胞への形質導入結果を示した画像である。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ自然蛍光（淡色シグナル）は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓにより形質導入された細胞を示す。画像は、ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎを１×１０１２ｖｇ／マウスの用量で静脈内投与した３週間後に撮影した成体マウスの腸管の最大値投影像である。神経細胞は、抗ｐｇｐ９．５抗体で標識されており（灰色に染色）、ＤＡＰＩで標識された核は濃く染色されている。各チャネルを右側に示す。右上の画像は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ：ＣＡＧ−ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎによる形質導入を示す腸神経系におけるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎの発現を示している。
【００３３】
【図２１】ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長ペプチドおよびその隣接配列の進化を示した図である。ＡＡＶ９カプシドのＡＡ５８８とＡＡ５８９との間にＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長鎖を挿入した。ＰＣＲにより５つの飽和ライブラリー（ＸＸＸ１−ＸＸＸ５）を作製し、それぞれを等量で混合し、ＤＮＡの作製に用いた。次いで、このＤＮＡを用いて、ＡＡＶカプシドライブラリーを作製した。
【００３４】
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ  ＶＰ１カプシド（図２２Ａ）およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ  ＶＰ１カプシド（図２２Ｂ）のアミノ酸配列を示した図である。図２２Ａ：ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの７アミノ酸長の挿入配列を下線で示し、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長鎖と異なる２個のアミノ酸を強調表示する。図２２Ｂ：ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの７アミノ酸長鎖を下線で示す。
【００３５】
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｅは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＳおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎの２つのＡＡＶカプシドにおいて、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓは末梢神経系に、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎは中枢神経系にそれぞれ効率的に遺伝子を送達することを示した図である。成体マウスに、各種用量のウイルスを静脈内注射した。図２３Ａは、脳全体のＧＦＰ発現を示した画像である。図２３Ｂおよび２３Ｃは、脳の矢状面におけるＧＦＰ発現を示した画像である。図２３Ｄおよび２３Ｅは、脊髄の横断面におけるＧＦＰ発現を示した画像である。画像中の淡色シグナルは、ＧＦＰ発現を示す。
【００３６】
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｇは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎによる複数の神経細胞集団への形質導入がＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより効率的に行われることを示した図である。図２４Ａ〜２４Ｃは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ（上段）またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（下段）を注射した成体マウスの脳切片において、皮質（図２４Ａ）、線条体（図２４Ｂ）および小脳（図２４Ｃ）におけるＧＦＰタンパク質発現によるＧＦＰ自然蛍光を示した画像である。ＧＦＰの発現は、淡色シグナルで表示される。図２４Ｄに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎの注射後にＧＦＰを発現している核染色（ＤＡＰＩ＋）細胞の割合（％）を示す。図２４Ｅに、ＧＦＰを発現するＮｅｕＮ＋神経細胞（皮質または線条体）およびＧＦＰを発現するカルビンジン＋（Ｃａｌｂ）小脳プルキンエ神経細胞の割合（％）を示す。図２４Ｆに、ＧＦＰを発現するＳ１００ｂ＋細胞の割合（％）を示す。図２４Ｇに、各種脳領域におけるそれぞれのＧＦＰ＋核の平均蛍光強度を示す。データは、各核の蛍光強度の平均値を算出することにより得られたものである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、対応のないスチューデントｔ検定。
【００３７】
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓによる末梢感覚神経への形質導入がＡＡＶ９より効率的に行われることを示した図である。図２５Ａは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ−ＰＨＰ．ＳにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを１×１０１２ｖｇの用量で形質導入を行った後に撮影したＧＦＰ自然蛍光を示す画像である。ＧＦＰの発現は、淡色シグナルで表示される。図２５Ｂは、核内でＧＦＰを発現するＰＧＰ９．５＋ＤＲＧ神経細胞の割合（％）を示したグラフである。図２５Ｃは、各種ベクターにより形質導入されたＧＦＰ＋細胞の蛍光強度の中央値の平均を示したグラフである。図２５Ｄは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓによる心臓神経節および心筋への形質導入結果を示した画像である。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの発現は、淡色シグナルで表示される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、対応のないスチューデントｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下の詳細な説明において、添付図面を参照する。当該添付図面は、本明細書の一部を成すものである。別段の指示がない限り、添付図面において、類似の記号は、通常、類似の構成要素を示す。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載される例証的な実施形態は、本発明を限定するものではない。また、本明細書で示される主題の精神または範囲から逸脱しない限り、その他の実施形態も可能であり、また、その他の変更も可能である。本明細書で概論的に説明されるとともに図面で例証される本開示の態様は、調整したり、置換したり、組み合わせたり、分離したりして別の様々な構成とすることが可能であることは容易に理解されるであろう。当該構成はすべて、本明細書において明示的に想定されるものであり、本開示の一部を成す。
【００３９】
本願は、対象への形質導入を行うことにより、該対象の標的環境、例えば、細胞、細胞集団、組織、臓器またはこれらの組み合わせに、核酸を送達することができるＡＡＶを提供する。例えば、前記ＡＡＶは、対象の神経系、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）および／または末梢神経系（ＰＮＳ）に核酸を送達するために用いることができる。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶは、対象の心臓に核酸を送達するために用いることができる。また、本明細書において、対象の標的環境（例えば、神経系、心臓またはこれらの組み合わせ）にＡＡＶを導くことができるペプチド、前記ペプチドを含むＡＡＶカプシドタンパク質、前記ペプチドを含むカプシドタンパク質を有するＡＡＶベクターを含む組成物（例えば、医薬組成物）、ならびに前記ペプチドおよび前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を開示する。また、前記ＡＡＶベクターの作製方法および使用方法も開示する。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶベクターは、１以上の疾患および障害（例えば、神経系および／または心臓に関わる疾患および障害）を予防および／または治療するために使用される。
【００４０】
定義
別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野において通常の技能を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有するものとする。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照のこと。本開示の目的のために、下記の用語を以下に定義する。
【００４１】
本明細書において、「ベクター」という用語は、核酸を運搬または導入するための媒体を表しうる。前記ベクターとしては、プラスミドおよびウイルス（例えば、ＡＡＶウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書において、「コンストラクト」という用語は、特定のヌクレオチド配列を発現させるために作製された組換え核酸、または、その他の組換えヌクレオチド配列の構築において用いられる組換え核酸を表す。
【００４３】
本明細書において、「プラスミド」という用語は、宿主生物内で組換えＤＮＡ配列を複製するために用いられる核酸を表す。当該配列は、二本鎖ＤＮＡでありうる。
【００４４】
本明細書において、「核酸」と「ポリヌクレオチド」という用語は同じ意味で用いられており、ホスホジエステル結合または修飾結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトイミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホロアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、架橋ホスホロアミデート結合、架橋ホスホロアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、スルホン（ｓｕｌｔｏｎｅ）結合およびこのような結合の組み合わせなどで構成される任意の核酸を表す。また、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には、生物体に存在する５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成される核酸も包含する。
【００４５】
本明細書において、連続する２個以上のアミノ酸からなるペプチド配列のアミノ酸「Ｘｎ」または「Ｂｎ」は、該ペプチド配列の第ｎ位（ｎは正の整数である）に位置するアミノ酸を表す。例えば、連続する１１個のアミノ酸Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１からなるペプチド配列において、Ｘ１は、該ペプチド配列の第１位の（すなわち、１番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ２は、該ペプチド配列の第２位の（すなわち、２番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ３は、該ペプチド配列の第３位の（すなわち、３番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ４は、該ペプチド配列の第４位の（すなわち、４番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ５は、該ペプチド配列の第５位の（すなわち、５番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ６は、該ペプチド配列の第６位の（すなわち６番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ７は、該ペプチド配列の第７位の（すなわち７番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ８は、該ペプチド配列の第８位の（すなわち８番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ９は、該ペプチド配列の第９位の（すなわち９番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ１０は、該ペプチド配列の第１０位の（すなわち１０番目に位置する）アミノ酸であり、Ｘ１１は、該ペプチド配列の第１１位の（すなわち１１番目に位置する）アミノ酸である。例えば、前記ペプチド配列の第９位がＡ、第１０位がＧ、かつ第１１位がＱである場合、アミノ酸Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＡＧＱであると記載する。また別の例として、ＱＡＢ３Ｂ４ＴＳＬというペプチド配列においては、Ｂ３は該ペプチド配列の第３位のアミノ酸であり、Ｂ４は該ペプチド配列の第４位のアミノ酸であることを意味する。
【００４６】
「レコンビナーゼ認識配列」または「レコンビナーゼ認識部位」という用語は、レコンビナーゼにより認識されるとともに、該レコンビナーゼによって触媒される組換えイベントのための基質として機能しうる核酸の配列を表す。当該配列は、例えば、二本鎖ＤＮＡでありうる。
【００４７】
「ウイルスゲノム」という用語は、核酸のウイルスカプシドへのパッケージングを媒介するシス作用性核酸配列で挟まれる核酸配列を表す。ＡＡＶおよびパルボウイルスについては、例えば、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に位置する「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）が上記の機能を有していること、またＩＴＲがウイルスカプシドへの異種ウイルスゲノム、例えば、非野生型のウイルスゲノムのパッケージングを媒介できることが知られている。
【００４８】
「エレメント」という用語は、何かの一部分として他とは異なるまたは区別できる部分を表し、例えば、核酸配列の一部分として個別の機能を有する核酸配列を表す。「調節エレメント」と「発現調節エレメント」という用語は、本明細書において同じ意味で用いられており、特定の宿主生物において、作動可能に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼしうる核酸分子を表す。この２つの用語は、転写を促進または調節するあらゆるエレメントに対して広く用いられるものであり、そのようなエレメントをすべて包含する。転写を促進または調節するエレメントとしては、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要とされるコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび反応エレメント（例えば、Ｌｅｗｉｎ，“Ｇｅｎｅｓ  Ｖ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、８４７〜８７３ページを参照）が挙げられる。原核生物の調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、オペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞で用いられる調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入エレメント（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列などといった、宿主細胞におけるコード配列の発現および／またはコードされたポリペプチドの産生を可能にする、かつ／または調節する転写調節配列および翻訳調節配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書において、「変異体」という用語は、元のポリヌクレオチドまたは元のポリペプチドと実質的に類似した配列を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを表す。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、元のポリヌクレオチドと比較して、５’末端、３’末端または１以上の内部部位に１以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を有しうる。変異体と元のポリヌクレオチドの配列間の類似性および／または相違性は、当技術分野で知られている慣用の手法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション法を用いて検出することができる。また、変異ポリヌクレオチドには、例えば、部位特異的突然変異導入により作製された変異ポリヌクレオチドなどの合成的に創出されたポリヌクレオチドも包含される。一般に、ＤＮＡ（これに限定されない）などのポリヌクレオチドの変異体と元のポリヌクレオチドとの配列同一性は、当業者に公知の配列アラインメントプログラムで決定される配列同一性として、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上でありうる。ポリペプチドの場合、変異体は、元のポリペプチドと比較して、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有しうる。変異体と元のポリペプチドの配列間の類似性および／または相違性は、当技術分野で知られている慣用の手法、例えば、ウェスタンブロットを用いて検出することができる。一般に、ポリペプチドの変異体と元のポリペプチドとの配列同一性は、当業者に公知の配列アラインメントプログラムで決定される配列同一性として、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上でありうる。
【００５０】
「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」という用語は、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に属するパルボウイルスを表す。例えば、ＡＡＶとしては、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子にコードされるカプシドタンパク質に由来するカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムから生じるＡＡＶ、および／または非天然カプシドのｃａｐ遺伝子にコードされるカプシドタンパク質に由来するカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムから生じるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＮおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ）が挙げられる。本開示において、「ＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ」、「ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ」および「ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ」という用語は同じ意味で用いられており、１１個のアミノ酸からなるアミノ酸配列ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４、本明細書において、それぞれ「ＰＨＰ．ｅＢ」配列、「ＰＨＰ．Ｎ」配列および「ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ」配列と呼ぶ）を含む非天然カプシドタンパク質を有するＡＡＶ変異体を表す。
【００５１】
「ｒＡＡＶ」という用語は、「組換えＡＡＶ」を表す。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子の両遺伝子の一部またはすべてが異種配列で置き換えられたＡＡＶゲノムを有する。
【００５２】
「ｒｅｐ−ｃａｐヘルパープラスミド」という用語は、ウイルスのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の機能を付与するプラスミドを表す。このプラスミドは、機能的なｒｅｐ遺伝子配列と機能的なカプシド遺伝子配列のいずれか一方または両方を欠いたｒＡＡＶゲノムからＡＡＶを産生する上で有用となりうる。
【００５３】
「ベクター」という用語は、核酸を運搬または導入するための媒体として定義される。ベクターとしては、例えば、プラスミドおよびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
「ｃａｐ遺伝子」という用語は、ウイルスのタンパク質被膜であるカプシドを形成するか、その形成に寄与するカプシドタンパク質をコードする核酸配列を表す。ＡＡＶの場合、前記カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のいずれであってもよい。その他のパルボウイルスのカプシドタンパク質の名称および数はそれぞれ異なる。
【００５５】
「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、ウイルスの複製および産生に必要とされる非構造タンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０）をコードする核酸配列を表す。
【００５６】
「ライブラリー」とは、多数の直鎖状核酸、プラスミド、ウイルス粒子またはウイルスベクターで構成されていてもよい。ライブラリーには少なくとも２つの直鎖状核酸が包含される。
【００５７】
挿入される核酸配列が無作為に作製される場合、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴであり；Ｋ＝ＧまたはＴであり；Ｍ＝ＡまたはＣである。
【００５８】
特別の定めのない限り、本明細書で説明される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向と呼ぶ。
【００５９】
本明細書において、「天然に存在する」という用語は、自然界に見られる物質、または自然界に見られる物質の形態を表す。
【００６０】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換において、標準的技術（例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクション）を用いることができる。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様書、当技術分野で一般に確立されている方法、または本明細書に記載の方法に従って実施することができる。先の技術および手法は、一般に、当技術分野で周知の常法に従い、本明細書を通して引用され説明されている様々な一般的および具体的な参考資料に記載されている方法と同様にして実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。本文献は、目的を問わず参照により本明細書に援用されるものとする。特定の定義がなされていなければ、本明細書に記載されている分析化学、有機合成化学および医薬製薬化学に関して使用される命名法、ならびにそれらの実験手法および実験技術は、当技術分野で周知の一般的に用いられているものである。化学合成、化学分析、薬物の調製、製剤化および送達、ならびに患者の治療において、標準的技術を用いることができる。
【００６１】
本明細書において、「対象」は、治療、観察または実験の対象である動物を表す。「動物」には、変温（冷血）脊椎動物、恒温（温血）脊椎動物および魚、甲殻類、爬虫類などの無脊椎動物が包含されるが、特に、哺乳動物が含まれる。本明細書において、「哺乳動物」は、哺乳綱に属する個体を表し、ヒト、家畜、動物園で飼育されている動物、スポーツ用（ｓｐｏｒｔｓ）動物およびペット動物が包含されるが、これらに限定されない。哺乳動物としては、例えば、マウス；ラット；ウサギ；モルモット；イヌ；ネコ；ヒツジ；ヤギ；ウシ；ウマ；およびサル、チンパンジー、類人猿などの霊長類が挙げられ、特にヒトが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。しかし、いくつかの実施形態において、前記哺乳動物は非ヒト動物である。
【００６２】
本明細書において、「治療」という用語は、患者、特に１以上のセロトニン関連疾患に罹患した患者が示す疾病、障害または生理的病態に応じてなされる処置を表す。治療の目的は、症状の緩和または予防；疾病、障害もしくは病態の進行または悪化の遅延または抑止；および疾病、障害または病態の緩解のうち１以上を含みうるが、これらに限定されない。「治療する」および「治療」という用語は、例えば、対象が障害を発症するというリスクまたはそれ以外のリスクファクターを低減させる治療的処置、予防的処置および適用を包含する。治療は、障害を完治させるものでなくてもよく、症状または潜在的なリスクファクターを低減させる実施形態を包含する。いくつかの実施形態において、「治療」は、治療的処置と予防的処置の両方を表す。治療を必要とする人には、疾病、障害または望ましくない生理的病態に既に冒されている人だけでなく、疾病、障害または望ましくない生理的病態を予防する必要がある人が包含される。例えば、いくつかの実施形態において、治療によって対象のセロトニン量を増加または低下させることにより、対象となる疾患の症状が抑制、緩和または解消されうる。本明細書において、「予防」という用語は、個体が後にセロトニン関連疾患の症状を発症するという負荷を軽減する任意の行為を表す。この予防は、一次、二次および／または三次の段階で行われうる。ａ）一次予防は、症状／障害／病態の発症を回避する。ｂ）二次予防行為は、病態／障害／症状の治療の初期段階に行われるものであり、処置を行うことにより、病態／障害／症状の進行および症状の出現を防ぐ可能性を高める。ｃ）三次予防は、既に進行している病態／障害／症状の負の影響を軽減するものであり、例えば、機能の回復および／または任意の病態／障害／症状もしくは関連合併症の軽減により達成される。「予防する」という用語は、ある事象の発生の可能性を１００％排除することを要するものではない。正確にいえば、「予防する」とは、化合物または方法を用いることにより、当該事象の発生確率が抑えられていることを意味する。
【００６３】
本明細書において、「有効量」という用語は、生物学的かつ／または臨床的に有用または望ましい結果をもたらすことのできる十分な量を表す。
【００６４】
「薬学的に許容される」担体とは、細胞または哺乳動物に使用する用量および濃度で細胞または哺乳動物に対して毒性を示さない担体である。「薬学的に許容される」担体としては、経口適用または注射などの選択した使用方法に適した有機もしくは無機の固体または液体の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されず、慣用の医薬製剤の形態で投与される。慣用の医薬製剤としては、錠剤、粒剤、散剤、カプセル剤などの固体製剤、および液剤、乳剤、懸濁剤などの液体製剤が挙げられる。多くの場合、生理学的に許容される担体は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などのｐＨ緩衝水溶液である。また前記生理学的に許容される担体は、アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子（残基数約１０未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンなどの糖；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩成形対イオン；およびＴｗｅｅｎＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭなどの非イオン性界面活性剤のうち１以上を含んでいてもよい。また、助剤、安定化剤、乳化剤、滑沢剤、結合剤、ｐＨ調整・制御剤、等張化剤などの添加剤を前記担体に添加してもよい。
【００６５】
標的指向性配列
本明細書において、対象の標的環境にＡＡＶを導く（例えば、１以上の核酸を送達する目的でＡＡＶを導く）ことができる標的指向性ペプチドを開示する。前記標的環境は、例えば、前記対象の１個の細胞、１つの細胞集団、１以上の組織、１以上の臓器またはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記標的環境は、中枢神経系（ＣＮＳ）である。いくつかの実施形態において、前記標的環境は、末梢神経系（ＰＮＳ）である。いくつかの実施形態において、前記標的環境は、心臓である。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＡＡＶを前記対象のＣＮＳに、または主としてＣＮＳに導くことができる（本明細書において「ＣＮＳ標的指向性ペプチド」と表記する）。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＡＡＶを前記対象のＰＮＳに、または主としてＰＮＳに導くことができる（本明細書において「ＰＮＳ標的指向性ペプチド」と表記する）。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＡＡＶを前記対象の心臓に、または主として心臓に導くことができる（本明細書において「心臓標的指向性ペプチド」と表記する）。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＣＮＳ標的指向性ペプチドである。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＰＮＳ標的指向性ペプチドである。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、心臓標的指向性ペプチドである。例えば、いくつかの実施形態において、前記ＣＮＳ標的指向性ペプチドは、核酸を送達する目的で、ＡＡＶをＣＮＳの神経細胞、グリア、内皮細胞、星状細胞、小脳プルキンエ細胞またはこれらの組み合わせに導くことができる。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、核酸を送達する目的で、ＡＡＶを前記対象のＣＮＳ、心臓（例えば、心臓の心筋細胞）、末梢神経またはこれらの組み合わせに導くことができる。いくつかの実施形態において、前記対象は、成体、例えば、３歳以上の対象である。
【００６６】
前記標的指向性ペプチド（例えば、前記ＣＮＳ標的指向性ペプチド、前記ＰＮＳ標的指向性ペプチドおよび前記心臓標的指向性ペプチド）の長さは様々であってよい。例えば、前記標的指向性ペプチドは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１５個、１８個、２０個、２５個もしくは３０個もしくは少なくともこれらの数のアミノ酸、またはこれらの数から選ばれる任意の２つの数値に挟まれる範囲の数のアミノ酸を有する長さとすることができる。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、７個または約７個のアミノ酸を有する長さである。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、１１個または約１１個のアミノ酸を有する長さである。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、７個〜１１個または約７〜１１個のアミノ酸を有する長さである。
【００６７】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、連続する１１個のアミノ酸からなる配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれ独立した任意のアミノ酸である）を含むか、該配列からなる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）ではなく、該配列を含まない。前記標的指向性ペプチドのいくつかの実施形態において、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれ独立した任意のアミノ酸、例えば任意の標準的なアミノ酸であってよい。本明細書において、標準的なアミノ酸には、アラニン（「Ａｌａ」または「Ａ」と略記する）、アルギニン（「Ａｒｇ」または「Ｒ」と略記する）、アスパラギン（「Ａｓｎ」または「Ｎ」と略記する）、アスパラギン酸（「Ａｓｐ」または「Ｄ」と略記する）、システイン（「Ｃｙｓ」または「Ｃ」と略記する）、グルタミン酸（「Ｇｌｕ」または「Ｅ」と略記する）、グルタミン（「Ｇｌｎ」または「Ｑ」と略記する）、グリシン（「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と略記する）、ヒスチジン（「Ｈｉｓ」または「Ｈ」と略記する）、イソロイシン（「Ｉｌｅ」または「Ｉ」と略記する）、ロイシン（「Ｌｅｕ」または「Ｌ」と略記する）、リジン（「Ｌｙｓ」または「Ｋ」と略記する）、メチオニン（「Ｍｅｔ」または「Ｍ」と略記する）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」または「Ｆ」と略記する）、プロリン（「Ｐｒｏ」または「Ｐ」と略記する）、セリン（「Ｓｅｒ」または「Ｓ」と略記する）、トレオニン（「Ｔｈｒ」または「Ｔ」と略記する）、トリプトファン（「Ｔｒｐ」または「Ｗ」と略記する）、チロシン（「Ｔｙｒ」または「Ｙ」と略記する）およびバリン（「Ｖａｌ」または「Ｖ」と略記する）が包含される。いくつかの実施形態において、Ｘ１０は、ＡまたはＮである。いくつかの実施形態において、Ｘ１１は、ＱまたはＰである。Ｘ１０およびＸ１１は、同一または異なるアミノ酸であってよい。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤである。いくつかの実施形態において、Ｘ２はＧである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ６は、ＶまたはＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ８はＦである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号８０）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２はＡＱであり、かつアミノ酸Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＶＰＦＫＡＱ（配列番号８１）である。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴであり、かつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２はＡＱであり、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４はＴＬであり、かつアミノ酸配列Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＦＫＡＱ（配列番号８２）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７は、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６はＡＱＴＬＡＶ（配列番号８３）であり、かつアミノ酸配列Ｘ１０Ｘ１１はＡＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ７Ｘ８Ｘ９は、ＰＦＫである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８は、ＡＱＴＬＡＶＰＦ（配列番号８４）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＤＧＴＬＡＴＰＦＫＸＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であってよい。配列番号６８）である。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＧＧＴＬＡＴＰＦＫＡＱ（配列番号１０）である。本明細書に記載された実施形態を様々に組み合わせたものも、本開示の範囲に包含される。例えば、Ｘ１０がＡである場合、Ｘ１１はＱまたはＰであってもよく、Ｘ１がＤである場合、Ｘ２はＧ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＶのいずれであってもよい。別の例として、Ｘ３がＴかつＸ４がＬである場合、Ｘ５はＡであってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれＬ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｋ、ＡおよびＱであり、かつＸ３はＴ、ＳまたはＮである。いくつかの実施形態において、Ｘ３がＴであることは有利である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＡＱＴ、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡかつＸ２はＱであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれＶ、Ｐ、Ｆ、Ｋ、ＡおよびＱであり、かつ、Ｘ３はＴかつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４Ｘ５は、ＴＬＡである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、Ｘ１１はＱであり、かつアミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７はＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、かつアミノ酸配列Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。
【００７４】
また、前記標的指向性ペプチドは、本明細書に開示されている任意の標的指向性ペプチド、例えば、配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかで示される標的指向性ペプチドの連続する少なくとも４個のアミノ酸を含んでいてもよく、該アミノ酸からなっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、配列番号３７〜４４および６５〜６８のいずれかで示される配列の連続する４個、５個または６個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、配列番号１〜３６のいずれかで示される配列の連続する４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸からなる。
【００７５】
また、前記標的指向性ペプチドは、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個アミノ酸を含んでいてもよく、該アミノ酸からなっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する４個、５個または６個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸からなる。例えば、前記標的指向性ペプチドは、ＱＡＶＲ（配列番号８５）、ＡＶＲＴ（配列番号８６）、ＶＲＴＳ（配列番号８７）、ＲＴＳＬ（配列番号８８）、ＱＡＶＲＴ（配列番号８９）、ＡＶＲＴＳ（配列番号９０）、ＶＲＴＳＬ（配列番号９１）、ＱＡＶＲＴＳ（配列番号９２）およびＡＶＲＴＳＬ（配列番号９３）から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよく、該アミノ酸配列からなっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、配列番号３７とのミスマッチを１つまたは２つ有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、該アミノ酸配列からなっていてもよい。例えば、前記標的指向性ペプチドは、アミノ酸配列ＱＡＢ３Ｂ４ＴＳＬ（式中、Ｂ３およびＢ４はそれぞれ独立した任意の標準的なアミノ酸であってよい）を含んでいてもよく、該アミノ酸配列からなっていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｂ３はＶでない、Ｂ４はＲでないのいずれか一方であるか、またはその両方である。別の例として、前記標的指向性ペプチドは、アミノ酸配列ＱＡＶＲＢ５ＳＬ（式中、Ｂ５は任意の標準的なアミノ酸であってよい）を含んでいてもよく、該アミノ酸配列からなっていてもよい。いくつかの実施形態において、Ｂ５はＴではない。
【００７６】
本明細書に開示されている標的指向性ペプチドは、ペプチド単体であってもよく、ナノ粒子、第２の分子、ウイルスカプシドタンパク質またはこれらの組み合わせと結合していてもよく、ナノ粒子、第２の分子、ウイルスカプシドタンパク質またはこれらの組み合わせの一部であってもよい。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＡＡＶ９カプシド配列（配列番号４５）の第５８８位と第５８９位のアミノ酸の間に挿入されている。
【００７７】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかで示される配列の連続する４個以上のアミノ酸を含むか、該アミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記ＣＮＳ標的指向性ペプチドは、配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかで示される配列の連続する４個、５個または６個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかで示される配列の２個以下のアミノ酸が変更されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記変更は、（本明細書で提供される任意の標的指向性配列内における）保存的変更である。いくつかの実施形態において、前記変更は、（本明細書で提供される任意の標的指向性配列内における）１個または２個のアミノ酸の欠失または挿入である。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、本明細書で提供される任意の標的指向性配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有しうる。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、本明細書で開示されている任意の標的指向性配列とは１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上のアミノ酸が異なる配列を有していてもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、上記配列の任意の１以上を含むか、上記配列の任意の１以上からなるか、上記配列の任意の１以上から本質的になる。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、本明細書に記載されているように、該ペプチドより長いペプチドに挿入されている。表１において、標的指向性ペプチドの非限定的な例を提示する。
【表１】
2019506141.tif 000003
2019506141.tif 000004
【００７９】
また、本明細書において、本明細書に開示されている標的指向性ペプチドの１以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を開示する。
【００８０】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、ＡＡＶの一部、例えばＡＡＶカプシドタンパク質（配列番号４５）の一部である。本明細書において、本明細書で開示されている標的指向性ペプチドの１以上を含むＡＡＶカプシドタンパク質が提供される。例えば、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含む標的指向性ペプチド部分を含みうる。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する４個、５個もしくは６個のアミノ酸を含む標的指向性ペプチド部分、または該アミノ酸からなる標的指向性ペプチド部分を含む。
【００８１】
また、本明細書において、連続する１１個のアミノ酸からなる配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれ独立した任意のアミノ酸である）を含む標的指向性ペプチド部分を含むＡＡＶカプシドタンパク質を開示する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）ではなく、該配列を含まない。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まない。本明細書に記載されているように、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれ独立した任意のアミノ酸、例えば任意の標準的なアミノ酸であってよい。いくつかの実施形態において、Ｘ１０は、ＡまたはＮである。いくつかの実施形態において、Ｘ１１は、ＱまたはＰである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤである。いくつかの実施形態において、Ｘ２はＧである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ６は、ＶまたはＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ８はＦである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号８０）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、かつアミノ酸配列Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＶＰＦＫＡＱ（配列番号８１）である。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴであり、かつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、かつアミノ酸配列Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＦＫＡＱ（配列番号８２）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７は、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６はＡＱＴＬＡＶ（配列番号８３）であり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ７Ｘ８Ｘ９は、ＰＦＫである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８は、ＡＱＴＬＡＶＰＦ（配列番号８４）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＤＧＴＬＡＴＰＦＫＸＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であってよい。配列番号６８）である。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＧＧＴＬＡＴＰＦＫＡＱ（配列番号１０）である。本明細書に記載された実施形態を様々に組み合わせたものも、本開示の範囲に包含される。例えば、Ｘ１０がＡである場合、Ｘ１１はＱまたはＰであってもよく、Ｘ１がＤである場合、Ｘ２はＧ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＶのいずれであってもよい。別の例として、Ｘ３がＴかつＸ４がＬである場合、Ｘ５はＡであってもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態において、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれＬ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｋ、ＡおよびＱであり、かつＸ３はＴ、ＳまたはＮである。いくつかの実施形態において、Ｘ３がＴであることは有利である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＡＱＴ、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。
【００８４】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡかつＸ２はＱであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれＶ、Ｐ、Ｆ、Ｋ、ＡおよびＱであり、かつ、Ｘ３はＴかつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４Ｘ５は、ＴＬＡである。
【００８５】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、Ｘ１１はＱであり、かつアミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７はＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。
【００８６】
いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、かつアミノ酸配列Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。
【００８８】
前記カプシドタンパク質の標的指向性ペプチド部分は、本明細書に開示されている任意の標的指向性ペプチドの全長配列を含んでいてもよく、該全長配列からなっていてもよく、本明細書に開示されている任意の標的指向性ペプチドの連続する少なくとも４個のアミノ酸を含んでいてもよく、該アミノ酸からなっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかで示される配列の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含む標的指向性ペプチド部分、または該アミノ酸からなる標的指向性ペプチド部分を含む。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号３７〜４４および６５〜６８のいずれかで示される配列の連続する４個、５個もしくは６個のアミノ酸を含む標的指向性ペプチド部分、または該アミノ酸からなる標的指向性ペプチド部分を含む。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号１〜３６のいずれかで示される配列の連続する４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のアミノ酸を含む標的指向性ペプチド部分、または該アミノ酸からなる標的指向性ペプチド部分を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、配列番号４５で示されるＡＡＶ９カプシド配列の一部である。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、所望により、標的送達する目的の任意の分子に連結させることができる。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、以下に限定されないが、組換えタンパク質、抗体、細胞、診断薬、治療薬、ナノ分子またはこれらの組み合わせに連結または結合させることができる。いくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質は、配列番号４６または配列番号４７の配列を含むか、該配列からなる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、タンパク質の任意の所望の部位に挿入されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、カプシドタンパク質に挿入されていてもよい。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、前記所望のタンパク質の表面に存在するよう挿入されている。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、前記タンパク質の主要配列に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、前記タンパク質に連結されている。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、前記タンパク質に共有結合で連結されている。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、前記所望のタンパク質の非構造ループ領域に挿入されている。いくつかの実施形態において、前記非構造ループ領域は、前記タンパク質の構造モデルで同定されている非構造ループ領域であってよい。
【００９１】
また、本明細書において、本明細書に開示されているＡＡＶカプシドタンパク質の１以上をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
【００９２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよび組換えＡＡＶ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製能を欠損したパルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは全長約４．７ｋｂで、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲは、宿主細胞のゲノム内へのＡＡＶ  ＤＮＡの組込みに関与する。ＡＡＶが宿主細胞に感染すると、宿主の染色体にＡＡＶウイルスゲノムが組み込まれ、宿主細胞は潜伏感染の状態になる。自然のシステムでは、ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が、感染細胞においてＡＡＶウイルスの産生を可能にする遺伝子を提供する。アデノウイルスの場合は、遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡが、ヘルパー機能を付与する。ヘルパーウイルスの感染により、ＡＡＶプロウイルスは救助されて増幅し、ＡＡＶとアデノウイルスの両方が産生される。Ｒｅｐ遺伝子とＣａｐ遺伝子のいずれか一方または両方を有しない組換えＡＡＶベクターの場合には、ＡＡＶは組み込みを行うことができない。
【００９３】
１以上の目的タンパク質のコーディング領域を含むＡＡＶベクターが提供される。このＡＡＶベクターは、ＡＡＶの５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、３’ＡＡＶ  ＩＴＲおよびプロモーターを含むとともに、さらにプロモーターの下流に、１以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するための制限酵素切断部位を含んでいてもよい。なお、前記プロモーターおよび前記制限酵素切断部位は、５’ＡＡＶ  ＩＴＲの下流かつ３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に位置する。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶベクターは、制限酵素切断部位の下流かつ３’ＡＡＶ  ＩＴＲの上流に、転写後調節エレメントを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されているＡＡＶベクターは、目的タンパク質をコードする導入遺伝子を有するＡＡＶ遺伝子導入ベクターとして用いることができ、該ベクターにより、宿主細胞で目的タンパク質を発現することができる組換えＡＡＶウイルスが産生される。
【００９４】
本明細書において、ｒＡＡＶゲノムが提供される。前記ゲノムは、例えば、ベクターへのパッケージングを可能にするよう構成された少なくとも１つの逆方向末端反復配列およびｃａｐ遺伝子を含みうる。いくつかの実施形態において、前記ゲノムは、ｃａｐ遺伝子の発現およびスプライシングに必要な配列をｒｅｐ遺伝子内にさらに含みうる。いくつかの実施形態において、前記ゲノムは、ＶＰ３を発現することができる配列をさらに含みうる。いくつかの実施形態において、発現される唯一のタンパク質はＶＰ３である（ＶＰ３は、カプシド構造タンパク質の中で最も小さいタンパク質であり、カプシド構造タンパク質の集合体であるカプシドの大部分を占めるタンパク質である。カプシド構造タンパクの集合体であるカプシドは、６０ユニットのＶＰタンパク質で構成され、そのうちの約５０ユニットがＶＰ３である）。いくつかの実施形態において、ＶＰ３さえ発現していればスクリーニング方法として必要条件は満たされる。
【００９５】
ウイルスベクターの作製は、当技術分野で周知の任意の適当な遺伝子工学技術を用いることにより達成することができる。該遺伝子工学技術としては、以下に限定されないが、制限エンドヌクレアーゼ消化、核酸連結、形質転換、プラスミド精製およびＤＮＡシークエンシングの標準的技術が挙げられ、これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載されている。
【００９６】
前記ウイルスベクターに、任意の公知の生物のゲノムの配列を組み込むことができる。前記配列は、そのまま組み込んでもよく、所望の活性が得られるように任意の方法で修飾されていてもよい。例えば、前記配列は、挿入、欠失または置換を含んでいてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、真核生物内での複製および組込みに適したベクターとして、その他の配列を含んでいてもよい。別のいくつかの実施形態において、本明細書に開示されているウイルスベクターは、原核生物と真核生物の両方における複製および組込みに適したベクターとして、シャトルエレメントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、プロモーター、エンハンサーなどの追加の転写開始配列および翻訳開始配列；ならびにポリアデニル化シグナルなどの追加の転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーターを含んでいてもよい。ＡＡＶベクターに含まれる様々な調節エレメントについては、米国特許公開第２０１２／０２３２１３３号に詳細に記載されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００９８】
本明細書において、対象の標的環境（例えば、ＣＮＳ、ＰＮＳおよび心臓）にＡＡＶを導くことができる標的指向性ペプチドを含むＡＡＶベクターを開示する。いくつかの実施形態において、前記標的指向性ペプチドは、前記ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部である。前記ＡＡＶベクターは、いくつかの実施形態において、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むタンパク質を含みうる。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶのカプシドは、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含みうる。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、前記ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部である。いくつかの実施形態において、前記ベクターのＡＡＶ配列（配列番号４５）のＡＡ５８８とＡＡ５８９との間に、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が挿入されている。いくつかの実施形態において、前記ベクターのＡＡＶ配列（配列番号４５）のＡＡ５８６とＡＡ５９２との間に、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）が挿入されている。いくつかの実施形態において、配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）は、配列番号４５の第５８７位、第５８８位、第５８９位および第５９０位のアミノ酸のうち少なくとも２つをさらに含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶベクター、例えば前記ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質は、連続する１１個のアミノ酸からなる配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１
（式中、Ｘ１は、Ｄ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＧまたはＳであり；
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、ＱまたはＶであり；
Ｘ３は、Ｔ、ＳまたはＮであり；
Ｘ４は、ＬまたはＶであり；
Ｘ５は、Ａ、Ｓ、Ｑ、ＰまたはＴであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、ＬまたはＭであり；
Ｘ７は、Ｐであり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、ＣまたはＳであり；
Ｘ９は、Ｋ、ＲまたはＳであり；
Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれ独立した任意のアミノ酸である）を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）ではなく、該配列を含まない。いくつかの実施形態において、前記カプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）を含まない。本明細書に記載されているように、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれ独立した任意のアミノ酸、例えば任意の標準的なアミノ酸であってよい。いくつかの実施形態において、Ｘ１０は、ＡまたはＮである。いくつかの実施形態において、Ｘ１１は、ＱまたはＰである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＤである。いくつかの実施形態において、Ｘ２はＧである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ６は、ＶまたはＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ８はＦである。いくつかの実施形態において、アミノ酸Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号８０）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、かつアミノ酸配列Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＶＰＦＫＡＱである。いくつかの実施形態において、Ｘ３はＴであり、かつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、かつアミノ酸配列Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＦＫＡＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７は、ＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６はＡＱＴＬＡＶ（配列番号８３）であり、Ｘ１０はＡであり、かつＸ１１はＱである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ７Ｘ８Ｘ９は、ＰＦＫである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８は、ＡＱＴＬＡＶＰＦ（配列番号８４）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＤＧＴＬＡＴＰＦＫＸＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸であってよい。配列番号６８）である。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１は、ＧＧＴＬＡＴＰＦＫＡＱ（配列番号１０）である。本明細書に記載された実施形態を様々に組み合わせたものも、本開示の範囲に包含される。例えば、Ｘ１０がＡである場合、Ｘ１１はＱまたはＰであってもよく、Ｘ１がＤである場合、Ｘ２はＧ、Ｎ、Ｓ、ＴおよびＶのいずれであってもよい。別の例として、Ｘ３がＴかつＸ４がＬである場合、Ｘ５はＡであってもよい。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれＬ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｋ、ＡおよびＱであり、かつＸ３はＴ、ＳまたはＮである。いくつかの実施形態において、Ｘ３がＴであることは有利である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３は、ＡＱＴ、ＤＧＴ、ＧＧＴ、ＥＧＴ、ＤＳＴ、ＥＳＴ、ＱＧＴ、ＮＱＴ、ＳＧＳ、ＳＧＮ、ＡＴＴ、ＡＶＴまたはＡＲＴである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡかつＸ２はＱであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１はそれぞれＶ、Ｐ、Ｆ、Ｋ、ＡおよびＱであり、かつ、Ｘ３はＴかつＸ４はＬである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列Ｘ３Ｘ４Ｘ５は、ＴＬＡである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ８はＦであり、Ｘ９はＫであり、Ｘ１０はＡであり、Ｘ１１はＱであり、かつアミノ酸配列Ｘ５Ｘ６Ｘ７はＡＶＰ、ＡＴＰ、ＡＱＰ、ＱＱＰ、ＰＱＰ、ＳＮＰ、ＳＴＰ、ＳＱＰ、ＱＬＰ、ＴＭＰまたはＴＴＰである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、ＡＱＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号１）である。
【０１０５】
Ｘ１はＡであり、Ｘ２はＱであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＬであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＰであり、Ｘ８はＦであり、かつアミノ酸配列Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＫＡＱ、ＫＡＰまたはＳＮＰである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、前記ＡＡＶベクターのカプシドタンパク質の一部である。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、前記ベクターのＡＡＶカプシドタンパク質配列である配列番号４５のＡＡ５８６とＡＡ５８９との間に挿入されている。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、配列番号４５の第５８７位、第５８８位、第５８９位および第５９０位のアミノ酸のうち少なくとも２つをさらに含む。いくつかの実施形態において、連続する１１個のアミノ酸からなる前記配列は、配列番号１〜３６のいずれかである。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３および６５〜６８のいずれかで示される配列の連続する少なくとも４個のアミノ酸を含む。
【０１０７】
本明細書に記載されているように、ＡＡＶカプシドタンパク質のＡＡ５８８とＡＡ５８９との間に７個のアミノ酸（ＡＡ）からなるランダム化配列を挿入することにより作製された複数の変異体を含むカプシドのライブラリーからｒＡＡＶを同定することができる。前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、いくつかの実施形態において、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、Ｋ４４９Ｒ置換、Ａ５８７Ｄ置換、Ｑ５８８Ｇ置換、Ａ５８７Ｇ置換、Ｑ５８８Ｇ置換、Ｖ５９２Ｔ置換、Ｋ５９５Ｓ置換、Ａ５９５Ｎ置換、Ｑ５９７Ｐ置換およびこれらの任意の組み合わせを含む様々な置換を有しうるが、置換の種類はこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｋ４４９Ｒ置換を含み、それ以外は野生型ＡＡＶ９カプシドと同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶ９カプシドタンパク質は、Ａ５８７ＤおよびＱ５８８Ｇのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶ９カプシドタンパク質は、Ａ５８７ＧおよびＱ５８８Ｇのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶ９カプシドタンパク質は、Ｖ５９２Ｔのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶ９カプシドタンパク質は、Ｋ５９５Ｓ、Ａ５９５ＮおよびＱ５９７Ｐのアミノ酸置換を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、１つのシステム（例えば、１つのＡＡＶベクター、１つのＡＡＶカプシドタンパク質または１つのｒＡＡＶ）で、１以上の標的指向性ペプチドを用いてもよい。例えば、１以上の標的指向性配列を用いるとともに、ヒトなどの対象の既存の抗体によるＡＡＶの認識を減弱させるために別の領域に修飾を施してもよい。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶベクターはカプシドを含んでいてもよく、該カプシドは、指向性／標的指向性、発現の速度および起こり得る免疫応答に影響を及ぼす。また、前記ベクターは、ゲノム上に調節配列とともに導入遺伝子／治療的特徴（例えば配列）を有する前記ｒＡＡＶを含みうる。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、前記標的指向性配列を、所望の分子（治療用分子、診断用分子など）であるか、該分子を輸送する基質内または基質上に含んでいてもよい。
【０１０９】
本明細書に開示されている標的指向性ペプチドは、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶによる前記対象の標的環境（例えば、ＣＮＳ、ＰＮＳ、心臓またはこれらの組み合わせ）への形質導入効率を、該標的指向性ペプチドを含有していないＡＡＶより向上させることができる。例えば、本明細書に開示されている１以上の標的指向性ペプチドがｒＡＡＶに含まれることにより、該標的指向性ペプチドを含まないＡＡＶと比較して、形質導入効率は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍もしくは１００倍または少なくともこれらの倍率で向上するか、これらの倍率から選ばれる任意の２つの倍率に挟まれる範囲の倍率で向上しうる。いくつかの実施形態において、前記形質導入効率の向上率は、少なくとも２倍である。いくつかの実施形態において、前記形質導入効率の向上率は、４０〜９０倍である。いくつかの実施形態において、前記形質導入効率の向上は、ｒＡＡＶによるＣＮＳへの形質導入効率の向上である。いくつかの実施形態において、前記形質導入効率の向上は、ｒＡＡＶによるＰＮＳへの形質導入効率の向上である。いくつかの実施形態において、前記形質導入効率の向上は、ｒＡＡＶによる心臓への形質導入効率の向上である。いくつかの実施形態において、前記形質導入効率の向上は、ｒＡＡＶの心筋細胞、感覚神経細胞、後根神経節、内臓またはこれらの任意の組み合わせへの形質導入効率の向上である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、カプシドライブラリーが提供される。前記カプシドライブラリーは、通常複製可能な条件下（アデノウイルスなどのヘルパーウイルスも一緒に哺乳動物細胞に同時感染させる）でウイルス複製が妨げられないよう修飾が施されたｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の各全長配列を含むＡＡＶゲノムを含む。偽野生型（「ｗｔ」）ゲノムは、遺伝子操作されたｃａｐ遺伝子を「ｗｔ」ＡＡＶゲノム内に有するゲノムであってもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、前記カプシドライブラリーは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたウイルス複製遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）およびカプシド遺伝子（ｃａｐ遺伝子）を有する「偽野生型」ＡＡＶゲノム内に作製される。いくつかの実施形態において、前記カプシドライブラリーは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたウイルス複製遺伝子（ｒｅｐ遺伝子）およびカプシド遺伝子（ｃａｐ遺伝子）を有する「偽野生型」ＡＡＶゲノム内に作製されない。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶゲノムは、ｃａｐ遺伝子を含むとともに、ｒｅｐ遺伝子内にｃａｐ遺伝子産物の発現およびスプライシングに必要な配列のみを含む。いくつかの実施形態において、これらの配列を挟む逆方向末端反復配列とともに、カプシド遺伝子レコンビナーゼ認識配列が提供される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、当該システムは、特定の細胞および／または臓器に対して高い標的指向性を示すカプシドを開発するために、免疫を回避するカプシドを選択するために、相同組換えでより多くのゲノムを選択するために、細胞内における一本鎖ＡＡＶゲノムから二本鎖ＤＮＡゲノムへの変換効率を向上させるゲノムエレメントを選択するために、および／または該細胞内でＡＡＶゲノムが持続性を有する環状形態へと変換する率を向上させるゲノムエレメントを選択するために使用することができる。
【０１１４】
ＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶの使用
本明細書に開示されているＡＡＶベクターは、例えば、核酸の送達を目的とした、対象の標的環境（例えば、ＣＮＳ、ＰＮＳ、心臓、これらの任意の組み合わせ、およびその他の所望の系）への効果的な形質導入を行うことができる。いくつかの実施形態において、核酸配列を神経系に送達する方法が提供される。前記方法は、本明細書で提供される１以上の標的指向性配列を含むタンパク質を提供することを含みうる。前記タンパク質は、ＡＡＶのカプシドの一部であってもよい。前記ＡＡＶは、神経系に送達される目的の核酸配列を含んでいてもよい。次いで、前記対象にこのようなＡＡＶを投与してもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、標的環境（例えば、神経系）に送達される目的の核酸配列は、送達部位である神経系および／もしくは局所、またはその周囲の組織もしくは環境にとって有用または有益である１以上の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、目的タンパク質をコードする核酸であってもよい。該目的タンパク質としては、栄養因子、増殖因子、または形質導入された細胞から分泌され、該細胞および／もしくはその周囲の細胞の生存もしくは機能に影響を及ぼしうるその他の可溶性因子などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、遺伝子に１以上の遺伝子突然変異を有するヒトまたは動物のタンパク質機能を回復させるｃＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、細胞の活性または状態を調節または変更するために用いることができるタンパク質をコードするｃＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、細胞の状態を調べるために用いられるタンパク質または核酸をコードするｃＤＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、ゲノム操作を行うためのｃＤＮＡおよび／または関連するＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、相同組換えによりゲノムを編集するための配列であってよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、治療用ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列であってよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、ｓｈＲＮＡまたは人工のｍｉＲＮＡ送達システムであってよい。いくつかの実施形態において、前記核酸配列は、内因性遺伝子のスプライシングに影響を及ぼすＤＮＡ配列であってよい。
【０１１６】
本明細書において、「目的タンパク質」は、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパク質を含む任意のタンパク質であってよい。いくつかの実施形態において、１以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、本明細書に開示されているＡＡＶベクターに含まれていてもよく、該ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの場合において、前記プロモーターは、宿主細胞（例えば、ヒト神経細胞）において目的タンパク質の発現を駆動することができる。いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は、抗ｔａｕ抗体、抗ＡＢ抗体またはＡｐｏＥ異性体である。
【０１１７】
前記目的タンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ；蛍光性タンパク質（例えば、ＧＦＰ）；成長ホルモン（ＧＨ）およびその変異体；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびその変異体；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびその変異体；エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびその変異体；プロインスリン、プレプロインスリン、インスリン、インスリン類似体などのインスリン類；ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体などの抗体およびその変異体；抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメント）および抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶフラグメント）；ジストロフィンおよびその変異体；凝固因子およびその変異体；嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）およびその変異体；ならびにインターフェロンおよびその変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は、治療用タンパク質またはその変異体である。前記治療用タンパク質としては、例えば、β−グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子、凝固因子などの血液因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９などのインターロイキン；角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦなど）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子９（ＧＤＦ−９）、肝癌由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）などの増殖因子；可溶性ＴＮＦ−α受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ−１受容体および可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体）、可溶性γ／δＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合フラグメントなどの可溶性受容体；α−グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、アルグルセラーゼなどの酵素；組織プラスミノーゲン活性化因子などの酵素活性化剤；ＩＰ−１０、インターフェロンγ誘導モノカイン（Ｍｉｇ）、Ｇｒｏα／ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＰＦ−４などのケモカイン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ；例えば、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子β、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリオーマ由来増殖因子、アンジオゲニン、アンジオゲニン２などの血管新生剤；可溶性ＶＥＧＦ受容体などの抗血管新生剤；タンパク質ワクチン；神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン（ｇａｓｔｉｎ）、セクレチン、オキシトシン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、β−エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、チロトロピン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、睡眠ペプチドなどの向神経活性ペプチド；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア線維性酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトα１−アンチトリプシン；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；組織因子、黄体形成ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球走化因子（ＮＣＦ）；神経成長因子；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害物質；血管作用性小腸ペプチド；アンジオゲニン；アンジオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）；フィブリン；ヒルジン；ＩＬ−１受容体アンタゴニストなどが挙げ��れるが、これらに限定されない。また、前記目的タンパク質のその他の例として、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−３およびＮＴ−４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子などの血友病関連凝固タンパク質；ジストロフィンまたはミニジストロフィン（ｎｉｎｉ−ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）；リソソーム酸リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；グルコース−６−フォスファターゼ、酸性マルターゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋肉ホスホフクルトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えば、ＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えばＧＬＵＴ２）、アルドラーゼＡ、β−エノラーゼおよびグリコーゲン合成酵素などの糖原病関連酵素；リソソーム酵素（例えば、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；ならびにこれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は、タンパク質の活性フラグメント、例えば上述のタンパク質などの活性フラグメントである。いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は、２つ以上のタンパク質の一部または全体を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、前記融合タンパク質は、上述のタンパク質から選ばれる任意のタンパク質の全体または一部を含んでいてもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターは、２つ以上の目的タンパク質のコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含む。前記２つ以上の目的タンパク質は、同一であってもよく、異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記２つ以上の目的タンパク質は、関連するポリペプチドであり、例えば、同一抗体の軽鎖と重鎖である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は、マルチサブユニットタンパク質である。例えば、前記目的タンパク質は、２つ以上のサブユニット、または２つ以上の独立したポリペプチド鎖を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は抗体であってもよい。前記抗体としては、例えば、抗体の様々なアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）；当業者に公知の任意の方法により作製されたモノクローナル抗体（モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントも含まれる）；ヒト化抗体；キメラ抗体；一本鎖抗体；ならびにＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｃｂ、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントが挙げられるが、抗原に結合できるものであれば、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記抗体は、全長の抗体である。いくつかの実施形態において、前記目的タンパク質は、イムノアドヘシンではない。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、得られた標的指向性分子は、長命の細胞集団へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入適用に関する方法および／または治療に利用することができる。いくつかの実施形態において、これらの標的指向性分子は、ｒＡＡＶを用いる任意の遺伝子治療に適用することができ、該遺伝子治療としては、例えば脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、フリードライヒ運動失調症、ポンペ病、ハンチントン病、アルツハイマー病、バッテン病、ライソゾーム病、多形神経膠芽腫、レット症候群、レーバー先天性黒内障、慢性疼痛、脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷およびライソゾーム病が挙げられる。また、ｒＡＡＶは、非治療目的の科学研究における導入遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に用いることができる。前記非治療目的の科学研究としては、例えば、光遺伝学、遺伝子過剰発現、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを用いた遺伝子ノックダウン、ｍｉＲＮＡスポンジまたはｍｉＲＮＡデコイを用いた内在性ｍｉＲＮＡの調節、条件的遺伝子欠失のためのレコンビナーゼ送達、条件的（レコンビナーゼ依存性）発現またはＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた遺伝子編集が挙げられる。
【０１２３】
本明細書において、本明細書に記載されている方法および組成物を用いた、ハンチントン病の治療方法および／または予防方法が提供される。前記ハンチントン病の治療方法および／または予防方法は、対象を同定すること、本明細書で提供されるような、前記対象の神経系にポリヌクレオチドを送達するためのベクターを提供すること、ならびに有効量の前記ベクターを前記対象に投与することによって、前記対象のハンチントン病を治療および／または予防することを含みうる。いくつかの実施形態において、前記ハンチントン病の対象を治療する方法は、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の転写を抑制するよう設計・作製されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を含むポリヌクレオチド組成物を用い、該ポリヌクレオチド組成物は前記ベクターにより送達される。いくつかの実施形態において、前記ＺＦＰは、ＣＡＧリピート長依存的にＨＴＴ遺伝子のＣＡＧリピート領域に結合することにより、前記対象においてハンチントン病の原因となるＨＴＴ遺伝子の対立遺伝子の転写を選択的に抑制する。いくつかの実施形態において、ＺＮＦＴＲは、選択的にＨＴＴ遺伝子の両方の対立遺伝子の転写を抑制する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｔｅｍ）は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、該低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＣＡＧリピートに結合して、病因となるＨＴＴ対立遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の選択的分解を誘導または翻訳を抑制することにより、ハンチンチン発現をノックダウンする。いくつかの実施形態において、ハンチントン病の患者を治療する方法は、ハンチンチンに特異的なマイクロＲＮＡ発現カセットをｒＡＶＶゲノム内に組み込むことを含む。これを、本開示の血管送達用の配列変異体の１つにパッケージングすることが可能である。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、該低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＨＴＴ遺伝子の一方または両方の対立遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の分解を誘導または翻訳を抑制することにより、ハンチンチン発現をノックダウンする。いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、該低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または該マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、病因となる対立遺伝子内に存在する１以上のヌクレオチド多型を選択的に認識して、病因となるＨＴＴ対立遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の選択的分解を誘導または翻訳を抑制することにより、ハンチンチン発現をノックダウンする。当業者は、ヌクレオチド多型を用いることにより、正常な対立遺伝子と病因となる対立遺伝子とを区別することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、ＨＴＴ  ＲＮＡのスプライシングまたは産生を変化させるＲＮＡまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたは群生性等間隔短回文反復配列／ｃａｓ９遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｐ９）系を用いたゲノム編集のためのポリヌクレオチドであって、ＨＴＴ遺伝子の配列内または隣接配列でＤＮＡニックまたは二本鎖ＤＮＡ切断を誘導してＨＴＴ遺伝子配列を変化させるよう当業者により設計・作製された１以上のポリペプチドおよび／またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、ＨＴＴ遺伝子由来のポリペプチドに結合してＨＴＴ遺伝子由来のポリペプチドのコンホーメーション、凝集または半減期に変化をもたらすポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、ＨＴＴ遺伝子由来のポリペプチドの転写後修飾を誘導または阻止するＲＮＡまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、ＨＴＴ遺伝子由来のポリペプチドのコンホーメーションおよび／または安定性に影響を及ぼす、当業者に公知のシャペロンタンパク質由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、前記対象の所望の細胞内において、前記ポリヌクレオチドによりコードされたＲＮＡ産物および／またはタンパク質産物の発現に影響を及ぼす、当業者に公知の調節エレメントを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、前記対象に投与される治療用品は、選択した任意の疾病または障害に適用可能な治療用品を含む。いくつかの実施形態において、この治療用品には、本明細書で記載の方法および組成物を用いてアルツハイマー病を治療および／もしくは予防するための組成物、例えば、アルツハイマー病のためのＡｐｏＥ２もしくはＡｐｏＥ３；ＳＭＡの治療のためのＳＭＮ；フリードライヒ運動失調症の治療のためのフラタキシン送達；ならびに／またはＡＬＳの治療のためのｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡが含まれる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている変異体は、心筋へ遺伝子導入するための有効な手段として用いることができる。前記変異体を用いた心筋への遺伝子導入は、フリードライヒ運動失調症、心不全、虚血性心疾患、心臓肥大、慢性疼痛、末梢神経損傷などの様々な疾病および損傷の研究および治療に有用でありうる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている変異体は、血管投与による末梢神経への形質導入に用いることができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、送達される前記治療用品は、タンパク質（タンパク質をコードしたもの）またはＲＮＡを用いてシヌクレイン凝集を抑制するパーキンソン病の治療方法である。例えば、内在性シヌクレインの凝集を妨げる非凝集性シヌクレイン変異体をコードするポリヌクレオチドが送達する方法が挙げられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、前記治療用品は、ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＳＭＡまたはＨＤを治療するための栄養因子をコードする導入遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態において、栄養因子を用いてもよく、該栄養因子としては、例えば、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＬＩＦおよび／またはＣＮＴＦが挙げられる。
【０１３２】
ウイルスベクターの用量は、主として治療対象となる病態、患者の年齢、体重および健康状態などの要因によって決定されるため、患者によって異なる可能性がある。例えば、ヒトに対するウイルスベクターの治療有効量は、一般に、約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの溶液中に約１×１０９〜１×１０１６のウイルスベクターゲノム数が含まれる量である。好ましいヒト用量のＡＡＶゲノム数は、約１×１０１３〜１×１０１６の範囲でありうる。ウイルスベクターの用量は、治療上の有益性と副作用とのバランスを取るよう調節されるものであるから、上記の用量は、当該組換えベクターを用いた治療用途に応じて異なる可能性がある。投与頻度を決定するために、前記ベクターによる導入遺伝子の発現量をモニターすることも可能である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、前記ベクターは、前記対象の所望の細胞内で前記ポリヌクレオチドにコードされたＲＮＡ産物および／またはタンパク質産物の発現に影響を及ぼす、当業者に公知の調節エレメント（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含んでいてもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの発現は、機能上、作動可能に連結されている調節エレメントによって少なくとも部分的に制御可能であり、該エレメントにより、前記ポリヌクレオチドの転写、前記ポリヌクレオチドによりコードされたＲＮＡの輸送、プロセッシングおよび安定性、ならびに所望により転写物の翻訳が調節される。発現調節エレメントの具体例としては、プロモーターが挙げられ、プロモーターは、通常、転写される配列の５’末端に位置する。発現調節エレメントの別の例としては、エンハンサーが挙げられ、エンハンサーは、転写される配列の５’末端もしくは３’末端に、または転写される配列内に位置しうる。調節エレメントのさらに別の例としては、マイクロＲＮＡ認識配列が挙げられる。調節エレメントのさらに別の例としては、イントロン、ならびに該イントロンのスプライシングを調節するスプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列が挙げられる。調節エレメントのさらに別の例としては、転写終結シグナルおよび／またはポリアデニル化配列が挙げられる。
【０１３５】
発現調節エレメントおよびプロモーターには、特定の組織または特定の細胞種で活性を有する発現調節エレメントおよびプロモーターが含まれる。本明細書において、このような発現調節エレメントおよびプロモーターを「組織特異的発現調節エレメント／プロモーター」と記載する。組織特異的発現調節エレメントは、通常、特定の細胞または特定の組織（例えば、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜または肺）で活性を有する。発現調節エレメントが通常これらの細胞、組織または臓器で活性を有する理由としては、発現調節エレメントが、特定の細胞、組織または臓器に特有の転写活性化因子タンパク質またはその他の転写調節因子により認識されることが挙げられる。
【０１３６】
また発現調節エレメントには、多様な細胞種でポリヌクレオチドの発現を駆動することができる遍在性または広汎性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）プロモーター／エンハンサーも含まれる。このようなエレメントとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター配列／エンハンサー配列、および様々な哺乳動物細胞種で活性を有するその他のウイルスプロモーター／ウイルスエンハンサー；遍在的もしくは広汎に発現する哺乳動物遺伝子、例えば、以下に限定されないが、β−アクチン、ユビキチン、ＥＦ１α等のプロモーター配列／エンハンサー配列；または自然界に存在しない合成エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
また発現調節エレメントは、調節可能な方法で、すなわち、作動可能に連結されているポリヌクレオチドの発現をシグナルまたは刺激によって増減させるという方法で、発現を付与することができる。シグナルまたは刺激により、作動可能に連結されているポリヌクレオチドの発現を増大させる調節性エレメントを、「誘導性エレメント」（すなわち、シグナルにより発現が誘導される）と呼ぶ。具体的な例としては、ホルモン（例えば、ステロイド）誘導性プロモーターが挙げられるが、これに限定されない。シグナルまたは刺激により、作動可能に連結されているポリヌクレオチドの発現を低減させる調節性エレメントを「抑制性エレメント」（すなわち、シグナルにより発現は低減するが、シグナルが除去されたり、存在しない場合は、発現は高い状態で維持される）と呼ぶ。通常、このようなエレメントにより付与される発現の増減量は、存在するシグナルまたは刺激の量に比例する。すなわち、シグナルまたは刺激の量が多いほど、発現の増減量は大きくなる。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている標的指向性ペプチドを１以上含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、神経系への効果的な形質導入に用いることができる。したがって、前記ｒＡＡＶは、例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症Ｉ型およびＩＩ型、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、ならびにＣＮＳ細胞に影響を及ぼすライソゾーム病、例えば、以下に限定されないが、クラッベ病、サンドホフ病、テイ・サックス病、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型）、ニーマン・ピック病（ＮＰＣ１欠損もしくはＮＰＣ２欠損）、ハーラー症候群、ポンペ病および／またはバッテン病などを治療するための治療薬の送達に有用である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている標的指向性ペプチドを１以上含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、心筋、末梢神経またはこれらの任意の組み合わせへの効果的な形質導入に用いることができる。したがって、前記ｒＡＡＶは、例えば、フリードライヒ運動失調症、心不全、虚血性心疾患、心臓肥大、慢性疼痛および／または末梢神経損傷を治療するための治療薬の送達に有用である。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されている標的指向性ペプチドを１以上含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、対象の標的環境における特定の細胞種への遺伝子送達に用いることができる。例えば、前記ｒＡＡＶは、対象（例えば、哺乳動物）の神経系（ＰＮＳ、ＣＮＳまたは両方を含む）における神経細胞およびグリアへの遺伝子送達に用いることができる。前記標的指向性ペプチドとしては、例えば、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）が挙げられる。本明細書で開示されている組成物および方法は、例えば、
（ｉ）例えば、ハンチンチン特異的なマイクロＲＮＡ発現カセットをｒＡＡＶゲノムに組み込み、該ｒＡＡＶゲノムをｒＡＡＶ変異体（例えば、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ）にパッケージングして送達、例えば血管送達することにより実施される、ハンチントン病患者の変異ハンチンチン発現の抑制、
（ｉｉ）フリードライヒ運動失調症の患者へのフラタキシン遺伝子の機能的コピーの送達、
（ｉｉｉ）遺伝子突然変異により正常なリソソーム機能に必須な酵素の発現が欠損している患者（例えば、ニーマン・ピック病、ムコ多糖症ＩＩＩ型および／またはゴーシェ病の患者）における該酵素の発現の回復、
（ｉｖ）疾病動物モデルの作製を目的としたｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ）の使用、または
これらの組み合わせに用いることができる。
【０１４１】
医薬組成物および投与方法
また本明細書において、本明細書で開示されているｒＡＡＶウイルスを１以上および薬学的に許容される担体を１以上含む医薬組成物も開示する。前記組成物は、希釈剤、安定化剤、賦形剤、補助剤などの成分をさらに含んでいてもよい。本明細書における「薬学的に許容される」担体、賦形剤、希釈剤、補助剤または安定化剤は、細胞または対象に使用する用量および濃度で細胞または対象に対して毒性を示さない（好ましくは不活性である）ものであるか、熟練した医師により決定される毒性の許容水準を有するものである。
【０１４２】
前記担体、希釈剤および補助剤としては、リン酸塩、クエン酸塩もしくはその他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子ポリペプチド（例えば、約１０残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖類、二糖類およびその他の糖類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎＴＭ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。
【０１４３】
投与されるｒＡＡＶのタイターは、例えば、個々のｒＡＡＶ、投与方法、治療目的、個体および標的とする細胞種によって異なるものであるが、当技術分野の標準的な方法により決定することができる。
【０１４４】
当業者であれば容易に理解できるであろうが、投与される組換えウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ有用量および個々の投与方法は、年齢、体重、病気の重症度、治療対象の動物種、使用する目的タンパク質を発現する個々の組換えウイルス、および該組換えウイルスを利用する特定の用途によって異なるものである。有効量のレベル、すなわち所望の効果を得るために必要とされる量のレベルは、当業者であれば、常用の薬理学的方法によって決定できるものである。一般に、製品をヒトへ臨床適用する際には、低用量から始めて、所望の作用が得られるまで用量を増やしていく。あるいは、容認されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を利用して、本発明の方法により同定された組成物の有用量および投与経路を、確立された薬理学的方法により決定することができる。
【０１４５】
正確な投与量は薬物ごとに決定されるものであるが、多くの場合、投与量は一般化することができる。いくつかの実施形態において、対象の神経系（例えば、ＣＮＳ）への核酸送達を目的としたｒＡＡＶの投与量は、例えば注射で対象に投与する場合、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）〜２×１０１４ＧＣ、例えば、５×１０１１ＧＣ／ｋｇ〜５×１０１２ＧＣ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶの対象への投与量は、２×１０１４ＧＣ／ｋｇ以下である。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶの対象への投与量は、５×１０１２ＧＣ／ｋｇ以下である。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶの対象への投与量は、５×１０１１ＧＣ／ｋｇ以下である。
【０１４６】
本明細書で開示されている組換えウイルスは、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することができる。前記組換えウイルスの投与経路は、特に限定されない。例えば、当技術分野の標準的な経路により、治療有効量の組換えウイルスを対象に投与することができる。前記投与経路としては、筋肉内、膣内、静脈内、腹腔内、皮下、経皮、皮内、直腸内、眼内、経肺、頭蓋内、骨内、経口、頬側、全身、鼻腔内などの経路が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記組換えウイルスは、全身性の形質導入により前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記組換えウイルスは、筋肉内注射により前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記組換えウイルスは、膣内注射により前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶは、非経口経路（例えば、静脈内注射、筋肉内注射または皮下注射）、切皮法、または体腔内接種により前記対象に投与される。前記ｒＡＡＶウイルスの投与経路およびＡＡＶ構成要素の血清型は、当業者であれば、治療対象となる感染および／または病状、ならびに目的タンパク質を発現する標的細胞／組織を考慮することによって容易に決定できるものである。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶの静脈内投与が有利な場合がある。
【０１４７】
前記ｒＡＡＶの実際の投与は、該ｒＡＡＶを前記対象の標的組織に輸送することができる任意の物理的方法を用いることにより達成することができる。例えば、前記ｒＡＡＶは、静脈内に投与してもよい。本明細書で開示されているように、前記ｒＡＡＶが中枢神経系などの個々の目的の標的環境に標的化されるとともに、その標的環境への指向性（例えば、ＣＮＳ指向性）が高まるよう、前記ｒＡＡＶのカプシドタンパク質に修飾を施してもよい。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶは、心臓、末梢神経またはこれらの組み合わせに核酸を送達する。医薬組成物は、例えば注射剤として調製することができる。
【０１４８】
使用される組換えウイルスは、液状形態であってもよく、（凍結乾燥処理時に該ウイルスを保護するための１以上の適当な防腐剤および／または保護剤と組み合わせた）凍結乾燥形態であってもよい。遺伝子治療（例えば、特定遺伝子産物により改善させられるかもしれない神経疾患の遺伝子治療）において、治療用タンパク質を発現する前記組換えウイルスの治療有効量が、当該治療を必要とする宿主に投与される。宿主の免疫を誘導する医薬または宿主に遺伝子治療を提供するための医薬の製造における、本明細書で開示されている組換えウイルスの使用も、本願の範囲に含まれる。
【０１４９】
少なくともある病態に対する前記ｒＡＡＶのヒト用量が決定されている場合は、そのヒト用量と同じ用量を用いてもよく、その用量の約０．１〜５００％の用量、好ましくは、約２５〜２５０％の用量を用いてもよい。新規に発見された医薬組成物の場合のように、ヒト用量が決定されていない場合であれば、適切なヒト用量は、動物を用いた毒性試験および効能試験によって限定するのと同様に、ＥＤ５０値もしくはＩＤ５０値、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ試験から導かれるその他の適当な数値から推定してもよい。
【０１５０】
対象への治療有効量の前記ｒＡＡＶの投与は、様々な時点で実施することができる。例えば、前記ｒＡＡＶは、前記対象が疾病もしくは障害を発症する前、発症している間、または発症した後に該対象に投与することができる。前記ｒＡＡＶは、疾病もしくは障害（例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症Ｉ型およびＩＩ型、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調症、ならびにＣＮＳ細胞に影響を及ぼすライソゾーム病、例えば、以下に限定されないが、クラッベ病、サンドホフ病、テイ・サックス病、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型もしくはＩＩＩ型）、ニーマン・ピック病（ＮＰＣ１欠損もしくはＮＰＣ２欠損）、ハーラー症候群、ポンペ病、バッテン病もしくはこれらの組み合わせ）、慢性疼痛、心不全、不整脈またはこれらの組み合わせの発症前、発症中または発症後に前記対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶは、疾病または障害の緩解中に前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶは、前記対象の疾病または障害の発症前に投与される。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶは、疾病または障害の発症リスクを有する対象に投与される。
【０１５１】
前記ｒＡＡＶウイルスの投与頻度は様々であってよい。例えば、前記ｒＡＡＶウイルスの対象への投与頻度は、週に１回程度、２週に１回程度、月に１回程度、６ヶ月に１回程度、年に１回程度、２年に１回程度、３年に１回程度、４年に１回程度、５年に１回程度、６年に１回程度、７年に１回程度、８年に１回程度、９年に１回程度、１０年に１回程度、または１５年に１回程度であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｒＡＡＶウイルスの対象への投与頻度は、多くても週１回程度、多くても２週に１回程度、多くても月に１回程度多くても６ヶ月に１回程度、多くても年に１回程度、多くても２年に１回程度、多くても３年に１回程度、多くても４年に１回程度、多くても５年に１回程度、多くても６年に１回程度、多くても７年に１回程度、多くても８年に１回程度、多くても９年に１回程度、多くても１０年に１回程度、または多くても１５年に１回程度であってもよい。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例において、上述の実施形態のいくつかの態様をさらに詳細に開示するが、以下の実施例は本発明の開示の範囲を何ら制限するものではない。
【０１５３】
実施例１
変異体作製のためのＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの進化
ＣＮＳへの形質導入効率が高く、神経細胞への形質導入の選択性が高いＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの変異体を進化により得るために、米国特許公開第２０１５／００７９０３８号（この内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載のＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長鎖（配列番号４０）を部分的にランダム化したものを複数作製した。具体的には、上記７アミノ酸長鎖と該７アミノ酸長鎖を挟む２個のアミノ酸のうち３個のアミノ酸をランダムなアミノ酸で置換し、各ライブラリーのランダム化部分が互いにオーバーラップするようにした。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを進化させるこの手法の概要を図１に示す（Ｘは、２０個の標準的なアミノ酸の任意の１つを示す）。
【０１５４】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ
２回の選別を経て、図中に記載の１以上のＣｒｅ系統から回収した配列の中に多数の変異体が濃縮されていることが分かった。これらの配列の１つであるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４））を選択して、変異体としての特性評価を行った。
【０１５５】
配列ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱは、Ｖｇａｔ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅマウスから回収した全配列の８．１％、Ｖｇｌｕｔ２−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅマウスから回収した全配列の４．４％、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスから回収した全配列の０％、肝臓から回収（Ｃｒｅ非依存性回収）した全配列の０％であった。これらのデータから、ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４）は、星状細胞より神経細胞への形質導入において選択的かつ効率的であることが推察された。アミノ酸配列ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４）は、異なる２つのヌクレオチド配列：（ｉ）ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ（配列番号５４）および（ｉｉ）ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ（配列番号５５）からそれぞれ選択された。共通部分を有する配列Ｄ／Ｅ−Ｓ／Ｇ−ＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号４０）は、２回の選別を経た後に、Ｖｇａｔ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅマウスから回収した全配列の１８．９％、Ｖｇｌｕｔ２−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅマウスから回収した全配列の１５．６％、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスから回収した全配列の８．３％、肝臓から回収（Ｃｒｅ非依存性回収）した全配列の０％を占めていた。
【０１５６】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４））に関するデータを図２に示す。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ配列（配列番号４６）を含むカプシドの同定は、本明細書で開示されているＣＲＥＡＴＥ法により可能であり、複数のＣｒｅ遺伝子組換えマウス系統を用いて同時に選別を行った。以上より、（ｉ）ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ配列（配列番号４６）は、ＣＮＳ星状細胞や肝臓ではなく、ＣＮＳ神経細胞から選択的に回収されること、および（ｉｉ）ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎカプシドは、グリアや肝臓ではなく、神経細胞に対して選択的かつ（ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより）高効率な形質導入を行うことができることが明らかとなった。これらの知見は、より望ましい形質導入特性を有する新規のベクターを設計・作製する上で、ｉｎ  ｖｉｖｏで複数の細胞種における選別を行うことが有用であることを示している。
【０１５７】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ
ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ発現細胞に対する標的化効率が高いＡＡＶカプシドの選別により、変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（配列番号４７）が発見された。この変異体は、カプシドタンパク質（ＶＰ１と付番する）の第５８８位と第５８９位のアミノ酸の間にランダム化配列の７ＡＡ（７アミノ酸長鎖）が挿入されたライブラリーから同定された。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓは、核酸配列ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＧ（配列番号５６）でコードされる７アミノ酸長の配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）を有する。
【０１５８】
ＡＡＶ９は、心筋用遺伝子導入ベクターの最有力候補の１つであり、血管投与により末梢神経への形質導入を行うことができる。図３Ａ〜３Ｄに示したデータから、全身送達されたＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（配列番号４７）は、心臓および知覚神経において、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ標的指向性ペプチドを含まないＡＡＶ９（配列番号４５）より顕著に高い発現をもたらすことが分かる。
【０１５９】
実施例２
Ｃｒｅ組換えによるＡＡＶ指向性進化法（ＣＲＥＡＴＥ）を用いた新規のＡＡＶカプシド配列の回収
これまで、指向性進化法を用いて、中和抗体を回避できるＡＡＶ（Ｍａｈｅｓｈｒｉら、２００６）、グリオーマ細胞に対してより高い標的指向性を有するＡＡＶ（ＭｃＧｕｉｒｅら、２０１０）、気道上皮に対してより高い標的指向性を有するＡＡＶ（Ｅｘｃｏｆｆｏｎら、２００９）、および硝子体内注射後に網膜の光受容体に対してより高い標的指向性を有するＡＡＶ（Ｄａｌｋａｒａら、２０１３）が作製されてきた。また、Ｌｉｓｏｗｓｋｉらは、ヒト／マウスキメラ肝臓モデルを用いて、ヒト肝細胞への特異的かつ効率的な標的化が可能なｒＡＡＶを開発した（２０１３）。本明細書に記載のいくつかの実施形態において、配列変異体のライブラリーから望ましい特性を有する配列を、組換え依存性の回収手法を用いて濃縮かつ選択的に回収する方法が提供される。
【０１６０】
組織／細胞種に対する標的指向性が高いｒＡＡＶの開発に用いられている方法として、ＡＡＶカプシド遺伝子に指向性進化法を適用する手法がある。通常、この手法では、まず、組織指向性を決定するカプシドタンパク質をコードする遺伝子であるＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子にランダム変異を導入する修飾を施した、複製能を有するＡＡＶのライブラリーを作製する。次いで、作製したＡＡＶカプシドウイルスライブラリーを動物に注射するか、培養細胞に送達する。所定の時間が経過した後、目的の細胞／組織に含まれるカプシド配列を回収する。次いで、この回収した配列を用いて新たなウイルスプールを作製し、さらにこの工程を繰り返す。選別・配列回収を複数回繰り返すことにより、より優れた機能を有するカプシドを形成する配列（すなわち、選別工程で繰り返し選抜された配列）が濃縮される。次いで、標的形質導入効率が向上したカプシドを回収して、個々のクローンとして評価することもできるが、さらに変異させてさらに選別を繰り返すこともできる。
【０１６１】
この実施例において、Ｃｒｅ組換えによるＡＡＶ指向性進化法（ＣＲＥＡＴＥ）と呼ばれる選別手法で使用する方法および材料を記載する。ＣＲＥＡＴＥは、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定のＣｒｅ発現細胞集団への形質導入をより高効率で行うＡＡＶカプシドの開発を可能にする方法である。本明細書に記載されているように、ＣＲＥＡＴＥを利用して、静脈内注射で成体マウスの中枢神経系（ＣＮＳ）へ効率的かつ広範囲に形質導入を行うＡＡＶ変異体を得た。この方法で得られた変異体は、現在の標準であるＡＡＶ９（１４−１７）より時に４０倍以上の効率でＣＮＳ全体に遺伝子を導入でき、複数のＣＮＳ領域で多数の星状細胞および神経細胞への形質導入を行うことができる。この変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶ９を上回る効率でヒトの神経細胞および星状細胞への形質導入を行うことができることから、ＣＲＥＡＴＥは、生物医学的用途にカスタマイズされたＡＡＶベクターを得るための手法としての可能性を有することが分かる。
【０１６２】
実験材料および実験方法
ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムプラスミドの修飾方法
ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムプラスミドは、ＡＡＶ２  ＩＴＲで挟まれた以下の３つの主要エレメントを含む。
（ｉ）ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセット
当該カセットは、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡの上流にヒトＵＢＣ遺伝子、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｃＤＮＡの下流に合成ポリアデニル化配列（４０）を有する３９８ｂｐのフラグメントで構成されている。
（ｉｉ）ＡＡＶ９カプシド遺伝子および調節配列
該調節配列は、ＡＡＶ５  ｐ４１プロモーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０８５７１６．１の第１６８０位〜第１９７４位）およびＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子由来のスプライシング配列で構成されている。
（ｉｉｉ）Ｃｒｅ依存性スイッチ
該スイッチは、逆向きのｌｏｘ７１部位およびｌｏｘ６６部位で挟まれたＳＶ４０ポリアデニル化配列（ｐＡ）で構成されている。
さらに、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムプラスミドにおいて、カプシド配列内に２つの制限酵素切断部位ＸｂａＩおよびＡｇｅＩを導入する修飾を独自に施した。ランダム化ライブラリーフラグメントで置換された領域（ＡＡ４５０〜５９２）は、これらの制限酵素切断部位で挟まれる。ＸｂａＩ部位の導入により、Ｋ４４９Ｒ変異が導入されているが、この変異は、ベクター産生や形質導入に影響を及ぼさない。ＡｇｅＩ部位の挿入に必要な変異はサイレント変異である。カプシドライブラリークローニングに用いられるｒＡＡＶ−ΔＣａｐ−ｉｎ−ｃｉｓアクセプタープラスミドについては、ライブラリーフラグメントを含まないアクセプタープラスミドからのウイルス産生が起こらないようＸｂａＩ部位とＡｇｅＩ部位との間のコーディング領域を除去した。
【０１６３】
ライブラリーフラグメントのためのテンプレートとして、修飾を施したＡＡＶ９のＸｂａＩ部位からＡｇｅＩ部位までの領域をＰＣＲにより増幅した。この増幅配列に対して、ＥａｒＩ制限酵素切断部位を除去してＫｐｎＩ部位を挿入する修飾（いずれもサイレント変異）を独自に施し、ｘＥフラグメントを作製した。この修飾ｘＥフラグメントをｐＣＲＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にＴＡクローニングして、ｐＣＲＩＩ−９Ｃａｐ−ｘＥを得た。ＥａｒＩ部位の除去により、必要であれば、ライブラリー由来の配列を消化せずに、ＰＣＲによる回収で混入した（ＡＡＶ９）カプシド配列のみを選択的に消化できる第２の方法の選択が可能となった。ｒＡＡＶ−ΔＣａｐ−ｉｎ−ｃｉｓアクセプターを用いてライブラリークローニングを行うとともに、標準的なＰＣＲ実施上の注意（例えば、試薬およびピペットのＵＶ処理）を払うことで混入は十分に防ぐことができた。
【０１６４】
ＡＡＶ９遺伝子のＶＰリーディングフレームのコード配列（ＶＰ１のＡＡ６、ＡＡ１０、ＡＡ１４２、ＡＡ１４８およびＡＡ２１６）に５つの終止コドンを導入することにより、ＡＡＶ２／９  ＲＥＰ−ＡＡＰヘルパープラスミドを構築した。ＡＡ２１６の終止コドンは、オルタナティブリーディングフレームにコードされているＡＡＰタンパク質のコード配列を分断しないように設計された。
【０１６５】
この試験で複数のｒＡＡＶゲノムを使用した。それぞれ、遍在型ＣＭＶ−β−アクチン−イントロン−β−グロビンハイブリッドプロモーター（ＣＡＧ）で駆動されるレポーターを有する一本鎖（ｓｓ）ｒＡＡＶゲノム内に構築した。簡潔にするために、本文中、ベクターの記載は略語で表記した。ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰは、ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｅＧＦＰ−２Ａ−Ｌｕｃ−ＷＰＲＥ−ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを表す。ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰは、ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡを表す。このベクターは、ＧＦＰのＮ末端とＣ末端の両方に核移行配列ＰＫＫＫＲＫＶを挿入することにより構築されたベクターである。ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＮｅＧｒｅｅｎ−ｆは、ヒト成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナルを有するｓｓＡＡＶ−ＣＡＧｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ−ｆ−ＷＰＲＥを表す。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、ｃ−Ｈａ−Ｒａｓ由来の膜指向性（ファルネシル化シグナルおよびパルミトイル化シグナル）配列で修飾を施した。
【０１６６】
カプシドライブラリーの作製方法
（第５８８位と第５８９位のアミノ酸の間に挿入されている）７アミノ酸長のランダム化ライブラリーフラグメントは、Ｑ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社；Ｍ０４９３）、プライマーＸＦおよび７ｘＭＮＮならびにテンプレートとしてｐＣＲＩＩ−９Ｃａｐ−ｘＥを用いてＰＣＲにより作製した。プライマー結合部位の近傍を示す概略図を図８Ａおよび８Ｂに示し、プライマー配列を表１に示す。ｒＡＡＶをベースとするライブラリーを作製するために、ライブラリーを含むＰＣＲ産物と、ＸｂａＩとＡｇｅＩで消化したｒＡＡＶ−ΔＣａｐ−ｉｎ−ｃｉｓアクセプタープラスミドとを、ギブソン・アセンブリ（ＮＥＢ社；Ｅ２６１１）を用いて連結した。次いで、反応産物をＰｌａｓｍｉｄ  Ｓａｆｅ（ＰＳ）  ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社；Ｅ３１０５Ｋ）で処理することにより、連結されず残存しているフラグメントを消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。この反応により、通常通り、１００ｎｇを超える量の連結されたプラスミド（ＰＳ  ＤＮａｓｅ消化工程後に残ったＤＮＡ量により確認）が得られた。１００ｎｇは、１５０ｍｍの組織培養ディッシュ１０枚に対して１０ｎｇ／ディッシュでトランスフェクションを実施するのに十分な量である。核酸連結またはギブソン・アセンブリで構築したライブラリーを大腸菌で増幅させることも可能であるが、細菌による形質転換によりライブラリーの多様性が低下することに留意されたい。ただし、連結された反応産物を直接トランスフェクションする場合、ライブラリーの多様性は、トランスフェクションに成功したＨＥＫ２９３産生細胞の数により制限される。
【表２】
2019506141.tif 000005
【０１６７】
ウイルスの産生方法および精製方法
組換えＡＡＶは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）へのトリプルトランスフェクションを行うことにより作製した。トランスフェクションの７２時間後に培地からウイルス粒子を回収し、トランスフェクションの１２０時間後に細胞および培地からウイルス粒子を回収した。細胞ペレットは、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に再懸濁し、凍結解凍を３回行い、１００Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）で３７℃で少なくとも１時間処理した。ウイルス培地は、８％ポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および５００ｍＭ塩化ナトリウムで沈殿により濃縮し、濃縮物をＴｒｉｓ−ＭｇＣｌ２に再懸濁した後、細胞溶解物に加えた。次いで、合わせた原液を５００ｍＭ  ＮａＣｌになるように調節し、３７℃で３０分間インキュベートした後、２０００×Ｇで遠心分離して清澄化した。次いで、イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ、Ｓｉｇｍａ社；Ｄ１５５６）の段階勾配液（１５％、２５％、４０％および６０％）を用いて清澄化原液を精製した。ウイルスを濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて調製した。ウイルスタイターは、直鎖状ゲノムプラスミドを標準として用い、ｑＰＣＲによりＤＮａｓｅＩ耐性ｖｇ数を測定することにより求めた。
【０１６８】
カプシドライブラリーウイルスの作製については、１つの細胞に複数のカプシド配列が存在することで生じる可能性があるモザイクカプシドの産生を抑制するために、上記ウイルス産生プロトコールに２つの変更を加えた。第１の変更点として、トランスフェクションによりほとんどの細胞が１種のカプシド変異体配列のみを取り込む確率を上げるために、トランスフェクションするｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓライブラリープラスミドの量を（１５０ｍｍディッシュ当たり）１０ｎｇに抑えた。第２の変更点として、培地に放出されたＲａａｖライブラリーウイルスで産生細胞が再び形質導入されることを最小限に抑えるために、ウイルスの回収を、上述した７２時間後や１２０時間後ではなく、４８時間後（培地）および６０時間後（細胞および培地）に行った。
【０１６９】
動物
マウスのＧＦＡＰプロモーターの制御下でＣｒｅを発現するＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウス（０１２８８６）およびＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（０００６６４）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（ＪＡＸ）から購入した。ｒＡＡＶベクターの静脈内投与は、ウイルスの後眼窩洞への注射により行った。マウスの群分けは無作為に行い、各群の匹数は所定のサンプルサイズとした。いずれのマウスも分析から除外されなかった。実験者はサンプル群について盲検化されていなかった。
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ選別
ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスで選別するために、雄性および雌性の成体Ｃｒｅ＋マウスのそれぞれに１×１０１１ｖｇのカプシドライブラリーを静脈内注射した。注射から７〜８日後、マウスを安楽死させて、脳および脊髄を摘出した。４〜５ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；１５５９６）を用いて、脊髄の半分および脳の片方の半球からベクターＤＮＡを回収した。ウイルスＤＮＡを精製するために、メーカーの抽出プロトコールに従って、上層の水性フラクションを回収した。この水性フラクションに、相当量のウイルスＤＮＡゲノムとＲＮＡが含まれていることが分かった。そこで、１μＬのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ社）を加えて３７℃で一晩処理することにより、ＲＮＡを消化した。次いで、Ｃｒｅ組換えゲノムからＣａｐ配列を選択的に回収するために２段階ＰＣＲ増幅法を用いた。第１の増幅段階において、プライマー９ＣａｐＦおよびＣＤＦを用いて、Ｃｒｅ組換えｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘ配列を選択的に増幅する（図８Ａおよび８Ｂを参照）。ＰＣＲは、Ｑ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃２０秒、６０℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを２０〜２６回行った。次いで、得られたＰＣＲ産物を１：１０または１：１００希釈し、これをテンプレートとして、プライマーＸＦおよびＡＲ（図８Ａおよび８Ｂならびに表２）を用いるＣｒｅ非依存性の第２のＰＣＲ反応を行った。第２のＰＣＲにより得られたフラグメントを、上記と同様にしてｒＡＡＶ−ΔＣａｐ−ｉｎ−ｃｉｓアクセプタープラスミドにバッククローニングした。次いで、１μＬのギブソン・アセンブリ反応液をそれぞれ１：１０希釈して、ＳＵＲＥ２コンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ社；２００１５２）に導入し、得られた個々のクローンをシークエンシングに供した。
【０１７１】
濃縮が認められた変異体をＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐプラスミドにクローニングし、ＤＨ５αコンピテント細胞（ＮＥＢ）に導入した。次いで、上記のレポーターゲノムの１つを用いて、新規のＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐ変異体、またはコントロールとしてのＡＡＶ２／９  Ｒｅｐ−Ｃａｐの評価を行った。
【０１７２】
ベクターの体内分布
各種ＡＡＶカプシドにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰベクターを１×１０１１ｖｇの用量で６週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに静脈内注射した。マウスの群分けは無作為に行った。注射から２５日後、マウスを安楽死させて、組織および各種脳領域を摘出し、−８０℃で凍結した。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔを用いて、各組織サンプルからＤＮＡを単離した。ＷＰＲＥエレメントに結合するＰＣＲプライマーを用いて、ベクターゲノムを検出し、マウスグルカゴン遺伝子に特異的なプライマーを用いて、マウスゲノムに対する標準化を行った。既知濃度の直鎖状プラスミド標準液の段階希釈液を用いて、絶対定量を行った（４６）。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを注射した動物のうち一匹を無作為に選び、体内分布試験から除外して組織学的解析に供した。
【０１７３】
組織標本、免疫組織化学解析およびイメージング
マウスをネンブタールで麻酔した後、室温の０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）で経心灌流を行い、次いで新鮮な氷冷した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）含有ＰＢで経心灌流を行った。脳を４％ＰＦＡで一晩後固定し、次いで、ビブラトームで切片を作製するか、凍結保護してクライオスタットで切片を作製した。作製した切片を、１０％ヤギ血清または１０％ロバ血清および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＧＡＤ６７染色には界面活性剤は使用せず）を含むＰＢＳに浮遊させ、一次抗体および二次抗体を用いてＩＨＣを行った。一次抗体として、マウス抗ＡＡＶカプシド（１：２０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、０３−６５１５８、クローンＢ１）、ウサギ抗ＧＦＰ（１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ１１１２２）、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００；Ａｂｃａｍ社、ａｂ１３９７０）、マウス抗ＣＣ１（１：２００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ＯＰ８０）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００；Ｄａｋｏ社、Ｚ０３３４）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ３７７）、ウサギ抗ＩｂａＩ（１：５００；Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社、ＣＰ２９０）、マウス抗カルビンジン  Ｄ２８Ｋ（１：２００；Ｓｉｇｍａ社、ＣＢ−９５５）、ウサギ抗カルレチニン（１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、ＡＢ５０５４）、マウス抗ＧＡＤ６７（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡＢ５４０６）、モルモット抗ＭＡＰ２（１：１０００；Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１８８００４）、マウス抗パルブアルブミン（１：１０００；Ｓｉｇｍａ社）、チロシンヒドロキシラーゼ（１：１０００；Ａｖｅｓ社）およびウサギ抗ＣＤ３１（１：５０；Ａｂｃａｍ社、ａｂ２８３６４）を用いた。一次抗体のインキュベーションは、室温で１６〜２４時間行った。次いで、切片を洗浄し、Ａｌｅｘａ結合二次抗体（１：１０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともに２〜１６時間インキュベートした。なお、内部エピトープを認識するＢ１抗体によるカプシド検出については、浮遊切片を２Ｍ塩酸で３７℃で１５分間処理してＰＢＳで充分に洗浄した後で、一次抗体とともにインキュベーションした。いくつかの画像については、同一視野内に存在するＧＦＰを高発現する細胞と低発現する細胞の両方を（サチュレーションが起こらないように）観察できるよう、１６ビットの緑色チャネル（ＧＦＰ）のガンマを補正した。いずれの場合も、ガンマまたはコントラストの変更ならびに顕微鏡設定およびレーザー設定の変更は、画像セット内で維持されていた。以下の対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７８０共焦点顕微鏡を用いて画像を取得した：Ｆｌｕａｒ  ５×／０．２５  Ｍ２７、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  １０×／０．４５  Ｍ２７（作動距離２．０ｍｍ）、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ２５×／０．８  Ｉｍｍ  Ｃｏｒｒ  ＤＩＣ  Ｍ２７  ｍｕｌｔｉ−ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ、ＬＤ  Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ４０×／１．１  Ｗ  Ｋｏｒｒ、およびＰｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  １００×／１．４６  Ｏｉｌ  ＤＩＣ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ。Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）を用いて、３次元ＭＩＰ画像���よび補足動画を作製した。
【０１７４】
細胞種特異的形質導入の定量
６週齢の雌性マウスを無作為に群分けして、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡにパッケージングしたｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを２×１０１２ｖｇの用量で静脈内注射した。３週間後に、上記と同様にして、マウスに灌流処置を行い、脳に必要な処置を行い、各種抗原に対する免疫染色を行った。各群の動物数は所定の数とした。いずれのマウスも分析から除外されなかった。細胞種特異的免疫染色およびＮＬＳ−ＧＦＰ自然蛍光の単一平面共焦点画像を取得した。バイアスを防ぐために、ＧＦＰ発現に基づいて画像を取得するのではなく、画像取得前に細胞種特異的免疫染色チャネルのみを観察し、この観察により確認された領域に合わせて画像を取得した。細胞計数も同様に、まずＩＨＣチャネルを観察し、各細胞特異的抗原で染色された細胞をカウントしてマークを付け、次いで、マークを付けたＩＨＣ＋細胞のうちＧＦＰ自然蛍光が陽性である細胞をカウントした。カプシド間で形質導入効率の差が明確であることから、この計数は、群に関する情報を盲検化せずに行った。
【０１７５】
組織の透明化
６０〜８０ｍＬの氷冷した４％ＰＦＡ含有ＰＢを用いて、上記と同様にしてマウスに流速毎分１４ｍＬで灌流処置を行った。次いで、流速を２〜３ｍＬ／分に下げて、室温で２時間灌流を続けた。次いで、特注のチャンバーにマウスを１匹ずつ入れ、２００ｍＬの室温の４％アクリルアミド含有ＰＢを循環させながら、流速２〜３ｍＬ／分で一晩灌流を行った。続いて、血管に残留するポリマー／モノマーを除去するためにＰＢで血管内を２時間灌流洗浄した。上記チャンバーを４２℃の水浴に設置し、開始剤を送達して重合工程を開始した。開始剤の送達は、開始剤ＶＡ−０４４を０．２５％含有する脱気ＰＢ２００ｍＬを循環させながら２〜４時間灌流（２〜３ｍＬ／分）することにより行った。次いで、８％ＳＤＳ含有ＰＢ（ｐＨ７．５）を用いて、マウスに７日間灌流を行った。ＳＤＳ含有潅流液はこの７日間の間に２回新しいものに交換した。次いで、２ＬのＰＢを用いて非循環で灌流を行い、一晩かけて洗浄した。透明化した組織サンプルをＲＩＭＳ液（屈折率１．４６）でマウントして、イメージングに供した。
【０１７６】
ヒトｉＰＳＣを用いた皮質スフェロイドの作製
既報の方法と同様にして、ｉＰＳＣからヒト皮質のスフェロイドを作製した。以下に方法を簡潔に説明する。２名の健康対照者由来のｉＰＳＣ株を、培地中、不活化マウス胚性線維芽細胞フィーダー上で増殖させた。培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清、１ｍＭ非必須アミノ酸（１：１００）、ＧｌｕｔａＭａｘ（１：２００）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１：１００）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。培養物を定期的に検査して、マイコプラズマに汚染されていない状態で維持した。ｉＰＳＣのコロニーを、コロニーの状態を保ったまま、ディスパーゼ（０．３５ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により剥離し、ドルソモルフィン（５μＭ、Ｓｉｇｍａ社）およびＳＢ−４３１５４２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ社）を含有するｉＰＳＣ培地を加えた低接着性プレートに移した。培地の交換は毎日行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化開始後６日目に、神経スフェロイドを、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＮＰＣ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ、ビタミンＡ不含Ｂ２７、ＧｌｕｔａＭａｘ（１：１００）、ペニシリンおよびストレプトマイシン；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に移し、２４日目までこの培地で培養した。次いで、分化開始後２５〜４２日目まで、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＮＴ３（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＮＰＣ培地で培養した。４３日目以降は、皮質スフェロイドをＮＰＣ培地で維持し、培地を４日おきに交換した。
【０１７７】
皮質スフェロイドの解離およびウイルス感染
酵素による解離と単層培養を行うために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化開始後１７０〜２００日目の皮質スフェロイド（１個体由来の１つのｉＰＳＣ株からそれぞれ分化した２つの独立した神経スフェロイド、および別の個体由来の１つのｉＰＳＣ株から分化した神経スフェロイド）をアキュターゼ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とともに３７℃で２５分間インキュベートし、ＮＰＣ培地で３回洗浄した後、Ｐ−２００ピペットで優しく解離させた。解離させた細胞を、ポリオルニチンとラミニンでコーティングしたガラス製カバーグラス（１５ｍｍ）上に約３００，０００個／ウェルで播種し、初めの２４時間は、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＮＴ３（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＮＰＣ培地で維持し、その後、増殖因子を含まないＮＰＣ培地で維持した。
【０１７８】
カバーグラス上で増殖した培養物に、各ウイルスを１×１０９ｖｇ／ウェルのタイターで感染させ、５日後に培養物を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に１０分間浸漬させて固定した。免疫細胞化学解析を行うために、細胞に０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて１０分間膜透過処理を行い、１０％ヤギ血清を含むＰＢＳで１時間ブロッキングした。次いで、カバーグラスをブロッキング液で希釈した抗体とともに２時間インキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１：１０，０００）を用いて核を可視化した。
【０１７９】
４０倍対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ｍ１  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅを用いて細胞のイメージングを行った。各実験条件で、１枚のカバーグラスにつき１０視野を無作為に選択し、各視野の画像において、ＧＦＡＰまたはＭＡＰ２と同時標識したＧＦＰ＋細胞の割合を定量化した。示した結果は、別々に行った２つの解離・感染実験の平均値である。
【０１８０】
解離させていない３次元培養物にＡＡＶを感染させるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化開始後１９７日目のヒト皮質スフェロイドを１つずつ、４００μＬのＮＰＣ培地に６×１０９ｖｇを含む１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移して一晩インキュベートし、７日後に４％ＰＦＡで一晩固定した。次いで、固定したスフェロイドを３０％スクロースに移して、２４時間浸漬し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に包埋して、１４μｍの切片にカットした。免疫組織化学解析を行うために、１０％ヤギ血清を含む０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有ＰＢＳで切片を１時間ブロッキングした。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８共焦点顕微鏡を用いて画像を収集した。
【０１８１】
ＣＲＥＡＴＥを用いたｒＡＡＶ変異体の作製
ＣＲＥＡＴＥは、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子由来の調節エレメントの制御下にある全長ＡＡＶ  Ｃａｐ遺伝子（図４Ｂ）とＣｒｅ逆転可能スイッチ（図４Ｂ）が連結されているｒＡＡＶカプシドゲノム（ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘ）を用いる。このシステムでは、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘ骨格内にカプシドライブラリーを構築し、ウイルスライブラリーを特定の細胞集団でＣｒｅが発現されている動物に送達することにより、標的細胞集団に形質導入を行った配列を選択的に増幅および回収することができる（図４Ｃ）。ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムには機能的なＲｅｐ遺伝子が存在しないので、ウイルスの産生にはＲｅｐがトランスで提供されなければならない。この目的のために、ＡＡＶ２／９  ｒｅｐ−ｃａｐプラスミドのＶＰ１〜ＶＰ３の各カプシドタンパク質のリーディングフレーム内にインフレームの終止コドンを挿入することにより、カプシドタンパク質発現を阻止する修飾を施すことが可能である（図４Ｄ）。この終止コドンは、Ｃａｐ遺伝子内のオルタナティブリーディングフレームから発現するアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）（２２）のアミノ酸配列を変化させるものではない。このｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘゲノムとＲｅｐ−ＡＡＰ  ＡＡＶヘルパーとからなる分割システムは、ｒＡＡＶの効率的な産生を可能とし（図４Ｅ）、ＣＲＥＡＴＥ選別プラットフォームの基礎をなしている。このシステムにより、種々雑多な組織サンプルにおいて、遺伝子的に特定のＣｒｅ発現細胞集団からカプシド配列を回収することができる（図８Ａおよび８Ｂを参照）。
【０１８２】
ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘアクセプターゲノム内において、ＡＡＶ９カプシドのＡＡ５８８とＡＡ５８９との間（ＶＰ１位置）にランダム化配列の７個のアミノ酸（ＡＡ）（７アミノ酸長鎖）を挿入し、ＡＡＶ変異体のライブラリーを作製した（図４Ｆおよび４Ｇ）。ＢＢＢを通過し、ＣＮＳ全域で細胞への形質導入を行うベクターを選択するために、カプシドライブラリーをＧＦＡＰ−Ｃｒｅ成体マウスに静脈内投与した。ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ成体マウスは、星状細胞でＣｒｅを発現するマウスである。１週間後、脳および脊髄組織からＤＮＡを単離し、Ｃｒｅにより組換えが生じたウイルスゲノムからカプシド配列をＰＣＲにより回収した。回収したＣａｐ配列のライブラリー全体を、ｒＡＡＶ−Ｃａｐ−ｉｎ−ｃｉｓ−ｌｏｘアクセプターゲノムにバッククローニングしてライブラリーＧＦＡＰ１を作製し、１３個のクローンを無作為に選択して、シークエンシングに供した。ＧＦＡＰ１ライブラリーから回収し確認した配列はすべて他には見られない配列だったため、ＧＦＡＰ１プラスミドライブラリーを用いて第２のウイルスライブラリーを作製し、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスを用いてさらなる選別を行った。第２の選別を行った後、複数の変異体が濃縮され（表３を参照）、ＣＮＳへの形質導入効率が向上していることが分かった（図９Ａ）。最も濃縮された変異体（ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）を選択して、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらなる指向性評価を行った。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂは、回収されたライブラリー配列の２５％を占めており、７アミノ酸長の配列ＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号４０）をコードする変異体である。
【０１８３】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢカプシドおよびＡＡＶ９カプシドを用いて、遍在性ＣＡＧプロモーターにより駆動される一本鎖（ｓｓ）ＧＦＰレポーターベクターをパッケージングした（ｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＧＦＰ）。ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９のウイルス産生効率は同等であった（図９Ｂ）。６週齢マウスに各ベクターを１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）の用量で静脈内注射により投与した。３週間後、形質導入結果をＧＦＰ発現で評価した。得られたデータから、ＧＦＰの免疫組織化学解析（ＩＨＣ）（図５Ａ）または複数の脳領域（図５Ｂ）、脊髄（図５Ｃ）および網膜（図５Ｄ）におけるｅＧＦＰ自然蛍光画像解析に示されるように、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにより、成体のＣＮＳ全域への形質導入が高効率で行われることが分かる。全身の組織透明化を可能にする、ＰＡＲＳに基づくＣＬＡＲＩＴＹ法（２４）により、脊髄（図５Ｃ）、皮質および線条体（図５Ｅ）の透明化組織断面におけるｅＧＦＰ自然蛍光が検出された。これらの３次元データから得られる情報より、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢベクターによるＣＮＳへの形質導入は、広範囲かつ効率的に行われていることが分かる。ＣＮＳ以外の領域におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ９の細胞レベルでの指向性は、膵臓ではＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入効率がＡＡＶ９より低いものの、膵臓以外では複数の臓器で同程度であるように見受けられる（図５Ｆ）。
【０１８４】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢによるＣＮＳおよび末梢臓器への遺伝子導入効率をＡＡＶ９との比較により定量化するために、注射後２５日目の複数の脳領域および臓器に存在するウイルスゲノム数を測定した（図５Ｇ）。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂは、調べたＣＮＳのいずれの領域に対してもＡＡＶ９より有意に多くの遺伝子を導入した：皮質（４０倍）、線条体（９２倍）、視床（７６倍）、小脳（４１倍）および脊髄（７５倍）。ＣＮＳ以外の領域におけるベクターゲノムの体内分布から、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの膵臓および副腎への遺伝子導入効率はＡＡＶ９より低いことが分かった（図５Ｇ）。肝臓、心臓、骨格筋および腎臓では、２つのベクター間における有意差は認められなかった。小脳以外のＣＮＳのすべての領域における体内分布データを総合して考えると、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを投与したマウスで検出されたウイルスゲノム数は、肝臓（ＡＡＶ９により効率的に形質導入が行われる臓器（２１、２５））で検出されたウイルスゲノム数と同程度であり、その他の臓器で検出されたウイルスゲノム数をいずれも上回った。一方、ＡＡＶ９による遺伝子導入効率は、調べたＣＮＳのいずれの領域でも肝臓より少なくとも１２０倍低かった。したがって、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの指向性はＣＮＳ特異的ではないが、このベクターの遺伝子導入特性はＣＮＳ特異的に高いことが分かる。
【０１８５】
成体マウスおよび非ヒト霊長動物にＡＡＶ９を静脈内送達した場合、星状細胞への形質導入が優先的に行われるが、複数の領域の神経細胞への形質導入も行われる。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにより形質導入される細胞種を調べるために、複数の細胞種マーカーとＧＦＰとの共局在化分析を行った。形質導入効率が高いため、１×１０１２ｖｇのＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを投与したマウスではＧＦＰ発現星状細胞を個別に識別することは難しかった（図５Ａ）が、１０倍低い用量でウイルスを投与した動物では、ＧＦＰ発現星状細胞は、短く高度に分枝した突起によって容易に形態学的に確認することができ（図５Ａおよび５Ｂ）、ＧＦＡＰのＩＨＣとの共局在化分析（図６Ａ）によっても確認することができた。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入は、星状細胞に加えて、ＣＣ１＋オリゴデンドロサイト（図６Ｂ）および調べたすべての神経細胞のサブタイプ、具体的には、脳全域のＮｅｕＮ＋細胞（図６Ｃ）に加えて、中脳チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）＋ドパミン作動性神経細胞（図６Ｄ）、カルビンジン＋小脳プルキンエ細胞（図６Ｅ）や複数の介在神経細胞集団（図１０Ａ〜１０Ｄ）でも確認された。またＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入は、ＣＤ３１＋内皮細胞（図１０Ｅ）でも確認されたが、Ｉｂａ１＋ミクログリア（図１０Ｆおよび１０Ｇ）では見受けられなかった。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの静脈内送達後に検出されるＧＦＰ＋ミクログリアの数が少ないことは、この細胞集団におけるＡＡＶによる遺伝子発現が認められない、または認められてもごくわずかであるという過去の報告（１４、２７〜３０）と一致する。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ投与後１年間にわたって脳全域でＧＦＰタンパク質発現によるＧＦＰ自然蛍光が確認されたことから、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂが、長期にわたってＣＮＳ特異的に導入遺伝子を発現させること可能であることが示唆された（図１１）。
【０１８６】
次いで、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにより形質導入された複数の細胞種の各量を定量化し、ＡＡＶ９と比較した。細胞を１つずつ確実に計数できるように、ＣＡＧプロモーターの制御下で核局在化ＧＦＰ（ＮＬＳ−ＧＦＰ）を発現するベクターｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを構築した。ｓｓＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ：ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを２×１０１２ｖｇ／マウスの用量で単回投与したところ、調べたすべての脳領域で多数のＡｌｄｈ１Ｌ１＋星状細胞（図６Ｆおよび１２Ａ）ならびに多数のＮｅｕＮ＋神経細胞（図６Ｇおよび１２Ｂ）で形質導入が確認され、これらの細胞よりやや量は少ないが、Ｏｌｉｇ２＋オリゴデンドロサイト系細胞（図６Ｈおよび１２Ｃ）でも形質導入が確認された。いずれの場合も、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入細胞数は、同用量のＡＡＶ９より有意に高かった。特に注目すべきは、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによる形質導入は、脊髄全域のＣｈＡＴ＋運動神経細胞の９４％以上（図３Ｉ）、ＴＨ＋中脳ドパミン作動性神経細胞の９１．４±１．６％（図１２Ｄ）、カルビンジン＋プルキンエ細胞の９１．７±５．８％でも認められた（Ｎ＝５）。以上より、成体マウスに静脈内投与されたＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂは、複数の神経細胞種およびグリア細胞種への効率的な標的化が可能であることが分かる。
【０１８７】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを同定するために用いられる方法は、標的細胞集団への形質導入の有無のみに基づく選別であり、必ずしも特異性に基づいた選別ではない。しかしながら、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスを用いて行った別の試験において、（２回のｉｎ  ｖｉｖｏ選別を経て）別のＡＡＶカプシド変異体としてＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａが同定された。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａは、７アミノ酸長の配列ＹＴＬＳＱＧＷ（配列番号３８）を含んでおり、ＡＡＶ９よりＣＮＳの星状細胞への形質導入の効率および選択性が高く（図７Ａ〜７Ｄ）、肝臓（図７Ｅおよび７Ｆ）およびその他の末梢臓器（図７Ｆ）に対する指向性が低いベクターである。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａの遺伝子導入における肝臓よりＣＮＳへの高い特異性は、ＡＡＶ９に対して４００倍〜１２００倍であり、この値は、成体のＣＮＳへの遺伝子導入効率の向上（各領域により異なるが、２．６倍〜８倍以上）と、肝臓への遺伝子導入効率の低減（１５２倍）とを合わせることにより得られる。この試験で濃縮された他の２つの変異体（図９Ａ）では、ＣＮＳの神経細胞とグリアのいずれにおいても、ＡＡＶ９より強いＧＦＰ発現は認められなかった。
【０１８８】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＡおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂはヒトの神経細胞への形質導入も可能であるかを確認するために、３次元分化法を用いて、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）由来の皮質神経細胞および星状細胞におけるこれらの変異体の形質導入能を調べた。２名の個体から樹立したｈｉＰＳＣ株を、大脳皮質状の３次元構造物（皮質スフェロイド）へと分化させ、最大２００日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持した。長期間維持された皮質スフェロイドは、表層と深層に皮質興奮性神経細胞を含み、星状細胞を最大で２０％含む（３１）。皮質スフェロイドを解離させて単層状態で３種のウイルスに感染させたところ、ＧＦＡＰ発現星状細胞およびＭＡＰ２発現神経細胞のいずれも、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂによって、ＡＡＶ９およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａより効率的に形質導入された（図１２；二元配置分散分析  ｐ＜０．０１，Ｎ＝３）。また、これら３種のウイルスはすべて、解離させていない３次元皮質スフェロイドへの形質導入も可能であった（図５Ｃ）。
【０１８９】
星状細胞を標的とした２つの試験において、変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、Ｂ２およびＢ３が同定された（図９）。これらの変異体は、神経細胞およびグリアのいずれに対しても形質導入を行う幅広いＣＮＳ形質導入能を有し、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａは、星状細胞に対して選択的かつより効率的に形質導入を行う。用いた回収方法では、例えば、脳血管結合、ＢＢＢにおける経細胞輸送または星状細胞への結合／内在化といった任意の特異的な中間過程に基づいた選別ではなく、星状細胞への形質導入の有無に基づいた選別が行われたことを考えると、同じ選別スキームで異なる特性を有するカプシドが同定されることは想定されるものであった。したがって、この選別工程では、これらの中間過程のいずれかにおいてより効率的なカプシド変異体が回収される。
【０１９０】
カプシドの免疫染色により、ＡＡＶ−ＰＨＰカプシドは、ＡＡＶ９と異なり、静脈内投与直後に脳血管に容易に局在化しやすいことが分かった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。また投与から２４時間後までに、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂを投与したマウスでは、ＡＡＶ９またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａを投与したマウスより、脳血管に沿ってＧＦＰ発現細胞が有意に多く存在することが確認された（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ（図５Ａ〜５Ｇ、図６Ａ〜６Ｉおよび図７Ａ〜７Ｆ）ならびにヒト神経培養物（図１３Ａ〜１３Ｃ）におけるＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａの形質導入特性を総合して考えると、これらのデータから、ＡＡＶ−ＰＨＰ．ＢおよびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａはいずれもより効率的に脳血管に結合するが、結合後の細胞種特異的なエントリー過程または輸送過程ではこの２つのベクター間に差異がある可能性が示唆される。
【表３】
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【０１９１】
ＣＲＥＡＴＥの利用によって、静脈内投与により成体マウスのＣＮＳへの効率的かつ広範囲な遺伝子導入が可能な新たなＡＡＶ変異体を開発することに成功した。このシステムの重要な利点は、一本鎖ウイルスゲノムの効率的な細胞内輸送および長期の形質導入に必要な持続性の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態への変換（ｄｓＤＮＡゲノムのみがＣｒｅの基質となる）を媒介するカプシドに対する選択圧を加えるということである。機能的なカプシドに対するこのさらなる選択圧が、独立して行われた試験において、たった２回のｉｎ  ｖｉｖｏ選別でＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａおよび（本明細書に開示されている）ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ変異体の同定へと導いた可能性がある。一方、これまで用いられてきた多くのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＡＶカプシド選別方法では、特性が向上したカプシド変異体を同定するために選別工程を３〜１０回繰り返す必要があった。
【０１９２】
特定の理論に縛られるものではないが、ＣＲＥＡＴＥは、任意の臓器で特定のＣＲＥ発現細胞種を標的とするＡＡＶカプシド変異体の発見に利用できると考えられる。したがって、ＣＲＥＡＴＥは、本明細書で示されるように遺伝子組換え動物に用いることもできるが、さらに以下のＡＡＶ変異体の開発にも用いられる：
（ｉ）スフェロイド培養物またはオルガノイド培養物における特定のＣｒｅ＋細胞種を標的とするＡＡＶ変異体、
（ｉｉ）非遺伝子組換え動物において、例えば、集団ベース、プロジェクションベース（３３）または活性ベースでＣｒｅを発現させるウイルス注射により、Ｃｒｅ＋となった細胞を標的とするＡＡＶ変異体、または
（ｉｉｉ）ヒト／マウスキメラ動物におけるＣｒｅ＋ヒト細胞を標的とするＡＡＶ変異体。
動物モデルとヒトとの間でＡＡＶの指向性に差があることが報告されていることを考慮すると、臨床応用に適した改良ベクターの開発には、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＣｒｅ＋細胞を使用する選別スキーム、３次元のｈｉＰＳＣ由来細胞モデルにおける細胞特異的なＣｒｅ発現を使用する選別スキーム、または将来のＣｒｅ遺伝子組換えマーモセットを使用する選別スキームが望ましいかもしれない。また、ＡＡＶを用いる遺伝子治療、特に全身送達を要する遺伝子治療の成功を妨げる要因の１つとして、ヒト集団におけるＡＡＶカプシドに対する中和抗体の存在がある。そこで、ＣＲＥＡＴＥと、ヒト血清プールへのＡＡＶライブラリーの曝露とを併用することにより、抗体による中和の影響を受けにくく、かつ形質導入特性が向上または保持されているカプシドを選別できると考えられる。
【０１９３】
また、ＣＲＥＡＴＥと次世代シークエンシングとを併用することにより、複数の変異体を個別に試験することなく、回収した配列の特性をより正確に予測することが可能である。Ｃｒｅを発現する標的細胞から回収した変異体プール全体と、非選抜のウイルスライブラリーとの両方をシークエンシングに供することにより、回収した各配列の相対的な濃縮度の定量が可能になる。さらに、複数のＣｒｅ発現集団またはＣｒｅ非発現集団から回収したカプシドをシークエンシングに供することにより、１回の実験で複数の細胞種における陽性および陰性のいずれの選別も可能な手段が提供されると考えられる。このようなｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｓｉｌｉｃｏを併用する選別方法は、ＣＲＥＡＴＥの可能性を高め、ＣＮＳや標的とすることが難しいその他の細胞集団への遺伝子導入を向上させるものとなるであろう。
【０１９４】
本明細書において、ＣＲＥＡＴＥ法の利用により開発された新規のＣＮＳ標的指向性配列を開示する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の第５８８位と第５９９位のアミノ酸の間に７アミノ酸長の挿入配列を有するＤＮＡライブラリーを作製した。ＤＮＡライブラリーからウイルスライブラリーを作製した後、投与から１週間後に、Ｃｒｅ発現細胞で形質導入が認められた新規のＡＡＶカプシド配列を、ＣＲＥＡＴＥ法を用いて選別し回収した。選別工程により回収した変異体を表４に示す。
【表４】
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【０１９５】
ＣＲＥＡＴＥを用いて、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ（星状細胞）、Ｖｇａｔ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ（ＧＡＢＡ作動性神経細胞）およびＶｇｌｕｔ２−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ（グルタミン酸作動性神経細胞のサブセット）の３つのＣＮＳ集団への形質導入を調べた。脳および脊髄からＤＮＡを単離し、２回の選別を経て回収した変異体をクローンシークエンシングおよび／または次世代シークエンシングにより評価した。この方法により、ＣＮＳへの効率的な形質導入を行うベクターが同定された（表５を参照）。同定された多くのベクター、例えばＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ（ＰＨＰ．Ｎ）、ＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴおよびＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔは、ＰＨＰ．ＢよりＣＮＳへの形質導入を効果的に行うことが分かった。
【表５】
2019506141.tif 000008
【０１９６】
実施例３
ＣＮＳ神経細胞およびグリアへの効率的な形質導入を行うためのＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの変異体の作製方法
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長ペプチドおよびその隣接配列を、連続する３個のアミノ酸の部位飽和突然変異導入により、さらに進化させた（図１３を参照）。ＰＣＲにより５つの飽和ライブラリー（ＸＸＸ１−ＸＸＸ５）を作製し、それぞれを等量で混合し、ＤＮＡの作製に用いた。このＤＮＡを用いて、ＡＡＶカプシドライブラリーを作製した。ＣＲＥＡＴＥを用いて、ＧＦＡＰ−Ｃｒｅ（星状細胞）、Ｖｇａｔ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ（ＧＡＢＡ作動性神経細胞）およびＶｇｌｕｔ２−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ（グルタミン酸作動性神経細胞のサブセット）の３つのＣＮＳ集団への形質導入を目的とする選別を並行して実行した。脳および脊髄からＤＮＡを単離した。２回の選別を経て回収した変異体をクローンシークエンシングおよび／または次世代シークエンシングで調べた。この方法により、ＣＮＳへの形質導入効率が高いベクターがさらに同定された（表３および表４を参照）。以下の１以上の判定基準に基づいて検証を行い、配列を選択した：（ｉ）２回の選別を経た各変異体の存在頻度（存在頻度が高い配列ほどｉｎ  ｖｉｖｏ選別で濃縮された可能性が高い）、（ｉｉ）同じアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列変異体の存在、および（ｉｉｉ）ウイルスライブラリーと比較して濃縮が認められること。
【０１９７】
実施例４
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの変異体の作製
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの７アミノ酸長鎖（配列番号４０）を部分的にランダム化し、対応する変異体を作製した。具体的には、上記７アミノ酸長鎖と該７アミノ酸長鎖を挟む２個のアミノ酸のうち３個のアミノ酸をランダムなアミノ酸で置換し、各ライブラリーのランダム化部分が互いにオーバーラップするようにした。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの変異体を作製するための手法の概要を図２１に示す。
【０１９８】
２回の選別を経て、ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ（配列番号４）配列を選択し、特性評価に供した。ＤＧＴＬＡＶＰＦＫＡＱ配列（配列番号４）は、異なる２つのアミノ酸配列：（ｉ）ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ（配列番号５４）および（ｉｉ）ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ（配列番号５５）からそれぞれ選択された。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の第５８８位と第５８９位のアミノ酸の間に７ＡＡ（７アミノ酸長鎖）配列が挿入されていた。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓの７アミノ酸長の挿入配列（配列番号３７）は、７アミノ酸長の配列ＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号３７）を有する。この配列は、ヌクレオチド配列：ＣＡＧ  ＧＣＧ  ＧＴＴ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＧ（配列番号５６）から選択された。
【０２００】
実施例５
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（配列番号４７）の特性評価
この実施例において、２つのＡＡＶ変異体ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（配列番号４７）のさらなる特性評価を示す。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎは、２つのアミノ酸置換（Ａ５８７ＤおよびＱ５８８Ｇ）によりＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂと異なる。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂカプシドは、複数のＣＮＳ神経細胞集団への遺伝子送達効率がＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎカプシドより高いことから、低ウイルス用量で、より多くの細胞への遺伝子導入または高効率な形質導入が可能である。
【０２０１】
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）およびＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂの形質導入効率の定量的評価を行うために、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂにパッケージングした一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰを１×１０１１ｖｇの用量で若齢成体マウスに静脈内注射した（図２３Ａ〜２３Ｅ）。投与から３週間後、皮質および線条体で核局在化ＧＦＰを発現するＤＡＰＩ＋細胞数を調べた。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）により形質導入された皮質のＤＡＰＩ＋細胞数は、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより有意に多かった（図２４Ａ、２４Ｄ）。線条体でも同様の傾向が見られた（ｐ＝０．０５４）。次いで、皮質および線条体で各ベクターにより形質導入された神経細胞（Ｎｅｕｎ＋）および小脳プルキンエ神経細胞（カルビンジン＋）（図２４Ｂ、２４Ｅ）の割合（％）を調べた。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎによる形質導入効率は、どの領域の神経細胞に対しても有意に高かった。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎによる形質導入効率がＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂより高いことをさらに裏付けるものとして、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｎ（配列番号４６）を投与したマウスの脳における１細胞あたりのＧＦＰ蛍光強度（１つの核当たりのＧＦＰ蛍光強度の中央値の平均）が有意に高い（図２４Ｇ）ことが確認されている。
【０２０２】
実施例６
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓによる形質導入の定量
ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（配列番号４７）カプシドは、後根神経節（ＤＲＧ）および腸神経系を含む内臓の末梢感覚神経細胞に対して効率的な形質導入を行う。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓ（配列番号４７）による末梢神経細胞への形質導入効率を調べて、ＡＡＶ９（配列番号４５）と比較した。上記で用いたものと同じ一本鎖ＡＡＶ−ＣＡＧ−ＮＬＳ−ＧＦＰゲノムをＡＡＶ−ＰＨＰ．ＳおよびＡＡＶ９にパッケージングし、得られたウイルスを１×１０１２ｖｇの用量で若齢成体マウスに静脈内注射した。３週間後、各ベクターにより形質導入されたＰＧＰ９．５＋ＤＲＧ神経細胞の割合（％）を調べた。ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓを投与したマウスでは、核内でＧＦＰを発現するＰＧＰ９．５＋細胞の割合（％）が有意に高いだけでなく、（蛍光強度により測定される）１細胞当たりのＧＦＰ発現量も有意に高いことが確認された。また、心臓神経節内の細胞における平均ＧＦＰ強度もＡＡＶ９より高かった（図２４Ａ〜２４Ｇ）。
【０２０３】
特定の理論に縛られるものではないが、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｓは、以下に限定されないが、フリードライヒ運動失調症、心不全、虚血性心疾患、心臓肥大、慢性疼痛、末梢神経損傷などの様々な疾病および損傷の研究および治療に有用であると考えられる。
【０２０４】
実施例７
標的指向性ペプチドを用いた治療方法
対象の体内で発現させる核酸の使用により治療可能な障害を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、発現させるポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。このポリヌクレオチドは治療用タンパク質をコードしている。発現させるタンパク質が対象内の適切な系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分または該配列からなる標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、発現させるタンパク質が対象内の適切な系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２０５】
実施例８
ハンチントン病の治療方法
ハンチントン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、発現させるポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。このポリヌクレオチドは治療用タンパク質をコードしている。発現させるタンパク質が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、発現させるタンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２０６】
実施例９
ハンチントン病の治療方法
ハンチントン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、ハンチンチンタンパク質の発現を抑制するよう構成された配列を有する低分子非コードＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。当該ポリヌクレオチドが対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該低分子非コードＲＮＡが対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２０７】
実施例１０
ハンチントン病の治療方法
ハンチントン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子の転写を抑制するよう設計・作製されたジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。当該ＺＦＰが対象内の臓器の中でも特に神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該ＺＦＰが対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２０８】
実施例１１
ハンチントン病の治療方法
ハンチントン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、ハンチンチンタンパク質の発現を抑制するよう当業者により設計された低分子非コードＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。当該ポリヌクレオチドが対象内の臓器の中でも特に神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該低分子非コードＲＮＡが対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２０９】
実施例１２
アルツハイマー病の治療方法
アルツハイマー病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、抗Ａβ抗体または抗Ａβ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。発現させる抗体または抗体フラグメントが対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該抗体または抗体フラグメントが対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１０】
実施例１３
アルツハイマー病の治療方法
アルツハイマー病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）タンパク質、好ましくはヒトａｐｏＥポリペプチドａｐｏＥ２またはａｐｏＥ２の修飾変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。発現させる抗体または抗体フラグメントが対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該ＡｐｏＥタンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１１】
実施例１４
ＳＭＡの治療方法
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、生存運動神経細胞１（ＳＭＮ１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。発現させるＳＭＮタンパク質が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該ＳＭＮタンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１２】
実施例１５
フリードライヒ運動失調症の治療方法
フリードライヒ運動失調症を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、フラタキシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させるフラタキシンタンパク質が対象内の臓器の中でも特に神経系と心臓に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該フラタキシンタンパク質が対象内の神経系と心臓で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１３】
実施例１６
ポンペ病の治療方法
ポンペ病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させるＧＡＡタンパク質が対象内の臓器の中でも特に神経系と心臓に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該ＧＡＡタンパク質が対象内の神経系と心臓で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１４】
実施例１７
乳児後期型神経セロイドリポフスチン症の治療方法
乳児後期型神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ）を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、トリペプチジルペプチダーゼ１タンパク質をコードするＣＬＮ２ポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させるトリペプチジルペプチダーゼ１タンパク質が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該トリペプチジルペプチダーゼ１タンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１５】
実施例１８
バッテン病の治療方法
若年型神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）であるバッテン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、バッテニン（ｂａｔｔｅｎｉｎ）タンパク質をコードするＣＬＮ３ポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させるバッテニンタンパク質が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該バッテニンタンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１６】
実施例１９
カナバン病の治療方法
カナバン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、アスパルトアシラーゼタンパク質をコードするＡＳＰＡポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させるアスパルトアシラーゼタンパク質が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該アスパルトアシラーゼタンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１７】
実施例２０
パーキンソン病の治療方法
パーキンソン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、非ドパミン作動性細胞のドパミン産生量の増加に必要な１以上の酵素をコードする１以上のポリヌクレオチドが個別に含まれる１以上のＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させる１以上の酵素が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該１以上の酵素が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１８】
実施例２１
パーキンソン病の治療方法
パーキンソン病を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、内在性α−シヌクレインの凝集を抑制する耐凝集性α−シヌクレインタンパク質修飾体をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させる耐凝集性α−シヌクレインタンパク質が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該タンパク質が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２１９】
実施例２２
筋萎縮性側索硬化症または前頭型認知症の治療方法
Ｃ９ＯＲＦ７２の変異に起因する筋萎縮性側索硬化症または前頭型認知症を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、６ヌクレオチド伸長（ＧＧＧＧＣＣ）に起因して対象の細胞内で蓄積する核内ＲＮＡ凝集体を減少させる１以上の非コードＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。発現させる１以上のＲＮＡが対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該１以上のＲＮＡが対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２２０】
実施例２３
多発性硬化症の治療方法
多発性硬化症を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、栄養因子または免疫調節因子、例えば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の全身投与を行う。発現させる因子が対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該因子が対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２２１】
実施例２４
筋萎縮性側索硬化症の治療方法
ＳＯＤ１変異に起因する筋萎縮性側索硬化症を有する対象を同定する。次いで、同定した対象に、変異ＳＯＤ１タンパク質の発現を抑制するよう当業者により設計された低分子非コードＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの１回目の投与を行う。発現させる低分子非コードＲＮＡが対象内の神経系に正確にターゲティングされるように、使用するＡＡＶベクターは、配列番号１〜４４、４８〜５３、６５〜６８および７４〜９３のいずれかで示される配列を含む標的指向性ペプチド部分を含むカプシドタンパク質を含む。必要であれば、対象にこのＡＡＶベクターの２回目または３回目の投与を行い、当該低分子非コードＲＮＡが対象内の神経系で発現して治療有効量に到達するようにする。
【０２２２】
本明細書で引用されている特許、特許出願、学術論文、教科書などを含むすべての参考文献、さらに本明細書に記載されていないこれらの参考文献に引用されている参考文献も、参照によりその全体が本明細書に援用される。参照により援用される参考文献で提示されている定義または用語が、本明細書で提示されている用語および説明と異なる場合は、本明細書の用語および定義に従うものとする。
【０２２３】
上記の書面の明細書は、当業者が本発明を十分実施できる程度に十分に記載されているものと考えられる。上記の詳細な説明および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らが想定する最良な方法を説明するものである。しかし、上記が文章でいかに詳述されていても、本発明は様々な方法で実施してもよく、本発明は添付の特許請求の範囲およびその等価物に従って解釈されるべきであることは理解されるであろう。
【０２２４】
先に説明した実施形態の少なくともいくつかにおいて、技術的に実現可能であれば、任意の一実施形態で用いられる１以上の要素を別の一実施形態で同様に用いることも可能である。当業者であれば十分に理解できるであろうが、本発明の主題の範囲から逸脱することなく、上述した方法および構造物に対してその他の様々な省略、追加および変形を行ってもよい。このような変形および変更はすべて、添付の特許請求の範囲により定義される主題の範囲に含まれるものとする。
【０２２５】
本明細書における実質的にすべての複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に合わせて、複数を単数に、かつ／または単数を複数に解釈してもよい。明瞭性を期するため、様々な単数と複数の交換について本明細書に明示的に記載してもよい。
【０２２６】
当業者であれば十分に理解できるであろうが、通常、本明細書で用いられる用語、特に、添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で用いられる用語は、全体を通じて「オープンな」用語として意図されている（例えば、「含む」という用語は、「含むが、これに限定されない」と解釈されるものであり、「有する」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるものであり、「含む」という用語は、「含むが、これに限定されない」と解釈されるものである等）。また、当業者であれば十分に理解できるであろうが、導入される請求項の記載事項において具体的な数が意図される場合、そのような意図は請求項に明記され、そのような記載がない場合は、そのような意図は存在しない。例えば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲では、請求項の記載事項の導入に「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」」および「１以上（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」という導入句を使用してもよい。しかし、このような句を使用した場合、同じ請求項が、「１以上」または「少なくとも１つ」という導入句と「ａ」または［ａｎ」などの不定冠詞とを含む場合であっても、「ａ」または［ａｎ」という不定冠詞による請求項の記載事項の導入により、このような記載事項を含む任意の特定の請求項が、このような記載事項のみを含む実施形態に限定されると解釈すべきでない（例えば、「ａ」および／または［ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１以上」を意味するものと解釈される）。請求項の記載事項の導入に定冠詞を使用する場合についても同様のことが言える。また、導入される請求項の記載事項において具体的な数が明記されていても、当業者であれば、このような記載は、記載された数が最小限の数を意味するものと解釈すべきであることを理解するであろう（例えば、他に修飾語のない、単なる「２つの記載事項」という記載は、少なくとも２つの記載事項、または２つ以上の記載事項を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている例では、通常、そのような構文は、当業者がその慣例表現を理解するであろう意味で意図されている（例えば、「Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢの両方を有するシステム、ＡとＣの両方を有するシステム、ＢとＣの両方を有するシステム、および／またはＡとＢとＣのすべてを有するシステム等を含むが、これらに限定されない）。「Ａ、ＢまたはＣなどの少なくとも１つ」に類似の慣例表現が使用されている例では、通常、そのような構文は、当業者がその慣例表現を理解するであろう意味で意図されている（例えば、「Ａ、ＢまたはＣの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢの両方を有するシステム、ＡとＣの両方を有するシステム、ＢとＣの両方を有するシステム、および／またはＡとＢとＣのすべてを有するシステム等を含むが、これらに限定されない）。また、当業者であれば十分に理解できるであろうが、２つ以上の選択的用語を提示する実質的にすべての離接語および／���たは離接句は、詳細な説明、特許請求の範囲、図面のいずれにおいても、当該用語の一方、当該用語のいずれか、または当該用語の両方を含む可能性を想定しているものと理解される。例えば、「ＡまたはＢ」という表現は、「Ａ」もしくは「Ｂ」、または「ＡおよびＢ」の可能性を含むものと理解される。
【０２２７】
また、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から記載されている場合、本開示もまた、マーカッシュグループの任意の個々の要素またはこれら要素からなるサブグループの観点から記載されているものと当業者であれば理解するであろう。
【０２２８】
当業者であれば十分に理解できるであろうが、書面による説明の付与などのあらゆる目的のために、本明細書において開示されている範囲はすべて、考えられるあらゆる下位範囲およびこれら下位範囲の組み合わせも包含する。記載された範囲はいずれも、その範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分割されることの十分な説明がなされており、そのような分割が可能であるものとして容易に認識することができる。例えば、以下に限定されないが、本明細書において説明されているそれぞれの範囲は、３等分した下部分、３等分した中間部分および３等分した上部分などに容易に分割することができる。また、当業者であれば十分に理解できるであろうが、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などの文言はすべて、記載されている数を含むとともに、上述したように下位範囲に分割できる範囲を表す。最後に、当業者であれば十分に理解できるであろうが、範囲は個々の要素を含む。したがって、例えば、１〜３個の項目を有するグループは、１個、２個または３個の項目を有するグループを意味する。同様に、１〜５個の項目を有するグループは、１個、２個、３個、４個または５個の項目を有するグループを意味し、その他の場合も同様である。
【０２２９】
本明細書において様々な態様および実施形態を開示してきたが、その他の態様および実施形態は当業者には明らかであろう。本明細書において開示されている様々な態様および実施形態は、説明を目的とするものであり、限定を意図するものではない。真の範囲および趣旨は以下の特許請求の範囲により示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図４Ｅ−Ｇ】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図５Ｅ−Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｅ】
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【図６Ｆ−Ｇ】
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【図６Ｈ−Ｉ】
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【図７Ａ−Ｃ】
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【図７Ｄ−Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｅ】
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【図１０Ｆ−Ｇ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｄ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ−Ｄ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−Ｃ】
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【図２０Ａ−Ｄ】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ−Ｅ】
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【図２４Ａ−Ｃ】
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【図２４Ｄ−Ｇ】
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【図２５Ａ−Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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