(57)【要約】  本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、前記ＭＳＣ集団から分泌される細胞外小胞、およびこれらの組み合わせを含む医薬組成物、ならびに疾患または障害の治療でのこれらの使用方法を提供する。【選択図】図１Ａ
2019535691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象において疾患または状態を治療する方法であって
（ａ）胎盤絨毛膜由来の間葉系幹細胞（ＣＨ−ＭＳＣ）の富化された集団を提供することと、
（ｂ）治療有効量の
ｉ．前記ＣＨ−ＭＳＣ集団、
ｉｉ．前記ＣＨ−ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
ｉｉｉ．前記ＣＨ−ＭＳＣ集団からの馴化培地、および
ｉｖ．前記ＣＨ−ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス、
の少なくとも１つを含む医薬組成物を前記対象に投与すること
を含み、
それにより前記疾患または状態を治療する、方法。
【請求項２】
前記疾患または状態が神経疾患、筋疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、消化器疾患、エネルギー恒常性疾患、線維性疾患、老化、放射線誘発損傷、細胞移植拒絶および増殖性疾患から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経疾患が脳腫瘍、癌脳転移、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経損傷、放射線誘発脳損傷、低酸素脳損傷およびレット症候群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脳腫瘍が星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫および髄膜腫のいずれか１つである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記神経膠腫が膠芽腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記筋疾患がＭＳ、筋ジストロフィー、筋損傷、筋炎、悪液質およびサルコペニアから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、またはベーカー型筋ジストロフィーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が筋疾患であり、前記細胞外小胞、馴化培地、細胞外マトリックスまたはこれらの組み合わせがｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む、請求項２、６または７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記自己免疫疾患がＭＳ、糖尿病、大腸炎、およびクローン病から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記エネルギー恒常性疾患が糖尿病である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記消化器疾患が過敏性腸症候群（ＩＢＤ）、クローン病、および大腸炎から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記老化が皮膚の老化、筋肉の老化、および脳の老化を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖性疾患が癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が脳腫瘍、脳転移、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および頭頸部癌のいずれか１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脳腫瘍が神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞種および髄膜腫から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経膠腫が膠芽腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象を照射することをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＭＳＣ集団、細胞外小胞、馴化培地、細胞外マトリックスまたはこれらの組み合わせがｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＨ−ＭＳＣの富化された集団が胎盤羊膜由来ＭＳＣ（ＡＭ−ＭＳＣ）を実質的に欠く、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記提供することが細胞混合物または胎盤組織からＣＨ−ＭＳＣを選択することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択することがＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳ、およびＭＩＣ  Ａ／Ｂから選択される少なくとも１つの表面マーカーを発現する少なくとも１つの細胞を選択することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与することが静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、線条体内投与、頭蓋内投与、動脈内投与、および皮下投与の少なくとも１つを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＨ−ＭＳＣ集団が前記対象に対して同種である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＨ−ＭＳＣ集団が前記対象に対して自家である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記選択されたＣＨ−ＭＳＣの表面での前記少なくとも１つの表面マーカーの発現を確認することをさらに含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）亜集団を選択する方法であって、
ａ．ＭＳＣを提供することと、
ｂ．少なくとも１つのＭＳＣの表面で少なくとも１つの表面マーカーを発現する前記少なくとも１つのＭＳＣを選択することであって、ＣＤ１８４、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３１８、ＣＤ２５５、ＣＤ２６８、ｆＭＬＰ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ４、およびＣＤ３２６の少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが臍帯由来ＭＳＣであることを示し、ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳ、およびＭＩＣ  Ａ／Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが胎盤絨毛膜由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ２４、ＣＤ４８、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ３３８、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ２６８、ＦＧＦＬＲ１、ＩＴＧＡ５、ＮＥＳ、およびＰＤＧＦＲＡＡの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが骨髄由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ８４、ＰＤＧＦＲＢＢ、およびＴＮＦＲＳＦ１１Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが脂肪由来ＭＳＣであることを示し、かつＣＤ１５７の発現が、ＭＳＣが胎盤羊膜由来ＭＳＣであることを示す、選択すること
を含み、
それによりＭＳＣ亜集団を選択する、方法。
【請求項２７】
ＭＳＣ増殖培地中でＭＳＣを培養することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記提供することが、組織または細胞混合物を提供することおよび前記組織または細胞混合物からＭＳＣを単離することを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＳＣを単離することがＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３６、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５０、ＣＤ５１/６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７３、β２マイクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ−Ａ２、およびＳＴＲＯ１から選択される複数の表面マーカーを発現する細胞の単離を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織が胎盤、臍帯、脂肪組織および骨髄から選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択されたＭＳＣの表面での前記少なくとも１つの表面マーカーの発現を確認することをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤または担体ならびに
（ａ）ＣＨ−ＭＳＣの単離されかつ富化された集団、
（ｂ）前記ＣＨ−ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
（ｃ）前記ＣＨ−ＭＳＣ集団からの馴化培地、および
（ｄ）前記ＣＨ−ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス
の少なくとも１つを含む疾患または状態を治療することにおける使用のための医薬組成物。
【請求項３３】
前記疾患または状態が神経疾患、筋疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、消化器疾患、エネルギー恒常性疾患、老化、放射線誘発損傷、細胞移植拒絶および増殖性疾患から選択される、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記神経疾患が脳腫瘍、癌脳転移、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経損傷、放射線誘発脳損傷およびレット症候群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記脳腫瘍が神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、および髄膜腫のいずれか１つである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記神経膠腫が膠芽腫である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記筋疾患がＭＳ、筋ジストロフィー、筋損傷、筋炎、悪液質およびサルコペニアから選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記疾患が筋疾患でありかつ前記細胞外小胞、馴化培地、または両方がｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む、請求項３３、３７または３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記自己免疫疾患がＭＳ、糖尿病およびクローン病から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記エネルギー恒常性疾患が糖尿病である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記消化器疾患が過敏性腸症候群（ＩＢＤ）、クローン病、および大腸炎から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記老化が皮膚の老化を含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記増殖性疾患が癌である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記癌が脳腫瘍、脳転移、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、および頭頸部癌のいずれか１つである、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記脳腫瘍が神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、神経芽細胞種または髄膜腫から選択される、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記神経膠腫が膠芽腫である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記対象を照射することをさらに含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記ＭＳＣ集団、細胞外小胞、馴化培地またはこれらの組み合わせがｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記ＣＨ−ＭＳＣの実質的に純粋な集団が胎盤羊膜由来ＭＳＣ（ＡＭ−ＭＳＣ）を実質的に欠く、請求項３２〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
培養物中で幹細胞および初代細胞を維持する方法であって、
（ａ）幹細胞、初代細胞または両方を提供することと、
（ｂ）ＭＳＣ由来の細胞外小胞を含む培養培地中で前記幹細胞、初代細胞または両方を増殖すること
を含み、
それにより培養物中で幹細胞、初代細胞または両方を維持する、方法。
【請求項５２】
前記培養培地が前記ＭＳＣからの馴化培地を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記培養培地が前記ＭＳＣからの細胞外マトリックスを含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記増殖することが前記ＭＳＣとの幹細胞、初代細胞または両方の共培養を含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
初代細胞増殖培地中で前記幹細胞、初代細胞または両方を増殖することをさらに含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記維持することが、前記ＭＳＣからの細胞外小胞を実質的に欠く培養培地中の前記細胞の生存を超えて前記幹細胞、初代細胞または両方の生存を延長することを含む、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記維持することが少なくとも１０継代の間インビトロで前記幹細胞、初代細胞または両方を培養することを含む、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記維持することが対称分裂と非対称分裂の両方を経る能力を前記幹細胞、初代細胞または両方が保持することを含む、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＭＳＣが臍帯由来ＭＳＣ（ＵＳ−ＭＳＣ）、ＣＨ−ＭＳＣまたはこれらの組み合わせである、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＭＳＣがＣＨ−ＭＳＣである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記幹細胞が癌幹細胞でありかつ前記ＭＳＣが骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）、脂肪由来ＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）、ＡＭ−ＭＳＣ、またはこれらの組み合わせである、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、前記ＭＳＣ集団から分泌される細胞外小胞、前記ＭＳＣ集団からの馴化培地およびこれらの組み合わせの少なくとも１つを含み、前記ＭＳＣ集団が表１〜５のいずれか１つから選択される発現プロファイルにより特徴付けられる、医薬組成物。
【請求項６３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項６２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１６年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４１６，８２１号に対して優先権の利益を主張する。あたかもその全体が本明細書に完全に記載されるかのように、前記出願の内容はすべて参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、特定の間葉系幹細胞集団、それらの分泌細胞外小胞および他の生成物、ならびに対象の疾患を治療するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とも呼ばれる間葉系間質細胞は、インビトロ条件下で簡単に操作できる成体幹細胞の一種である。胎生初期に存在する幹細胞は多能性であるが、ＭＳＣはより限られた可塑性を示し、主に骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞（中胚葉細胞）に分化し、骨格筋および内皮細胞にもある程度分化する。ＭＳＣは、骨髄および脂肪組織に存在し、末梢血、胎盤、臍帯血、歯髄および他の組織にも存在する。
【０００４】
ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織または歯髄などの患者自身の組織から簡単に単離でき、インビトロで培養でき、患者に自家移植できるので、細胞療法および操作の魅力的な候補である。さらに、ＭＳＣは、臍帯のワルトンゼリーおよび胎盤などの組織からも得ることができ、同種移植に使用できる。ＭＨＣ−ＩＩの発現はＭＳＣ、特に、臍帯および胎盤由来のＭＳＣでは、比較的低いかまたはなく、このことはＭＳＣを、移植された細胞の免疫拒絶に関連した合併症および問題を最小限に抑えて使用することを可能にする。
【０００５】
ＭＳＣは、高い移動能により特徴付けられ、それらの可塑性と合わせてＭＳＣは標的化された治療応用および組織再生の理想的な手段になり得る。ＭＳＣは、炎症および損傷した組織からならびに腫瘍から生じたシグナルに応答して移動する能力を有する。したがって、ＭＳＣは、罹患した対象の患部に自然に移動する。
【０００６】
しかし、ＭＳＣが腫瘍部位に到達したら、腫瘍誘発的役割を有するのか、または抗腫瘍的役割を有するのかについて大きく議論が分かれている。あるモデルにおいて、ＭＳＣは、腫瘍増殖を阻害し（例えば、肺癌、Ｂ１６メラノーマ）、他のモデルにおいては、腫瘍増殖を増強する（例えば、多発性骨髄腫、乳癌）ことが報告された。これらの差異的な作用はＭＳＣの組織源に依存し、これらの差異的な作用に関わる腫瘍型および因子は、未だ同定されていない。
【０００７】
ＭＳＣ−腫瘍のクロストークを理解することは、腫瘍挙動に対するＭＳＣの作用に関する重要な情報をもたらし得、様々な疾患の治療のために用いられるＭＳＣ供給源の選択に対して重要な意味を持ち得る。したがって、ＭＳＣの様々な供給源および集団のセクレトームおよび各種オミクス分析は、健康な個人において、および病変または腫瘍の存在との関連において免疫修飾および再生能力を誘導するＭＳＣの能力を理解するのにこの上なく重要である。ＭＳＣのセクレトームおよびオミクス分析の特性評価は、一方ではこれらの適合性、ならびに治療可能性と再生可能性の両方の可能性、他方では腫瘍誘発作用または抗腫瘍作用の決定に役立ち得る。
【０００８】
細胞間伝達は、直接細胞間接触を介して、または可溶性因子の分泌を介して行われる。しかし、細胞外小胞（ＥＶ）の放出および取り込みに基づき、短距離および長距離にわたって作動できる新規な機構が最近出現した。細胞外小胞は、３つの主なグループ：エキソソーム、細胞外微小胞およびアポトーシス小体に分類できる膜由来細胞外小胞である。エキソソームは、５０〜１００ｎｍのサイズのエンドサイトーシス起源の小さな膜状の細胞外小胞である。エキソソームは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ＤＮＡフラグメントおよびタンパク質を含有し得、これらは、ドナーとレシピエント細胞との間を往復する。エキソソームは、それらが癌細胞間での発癌性タンパク質の移動に介在することが示されているため、腫瘍微小環境での情報交換において重要な役割を果たすと思われる。一方で、エキソソームは免疫系をプログラムして、抗腫瘍応答を誘発することも示されている。
【０００９】
細胞間相互作用におけるその固有の役割に加えて、エキソソームは、様々な薬物および外因性の核酸またはタンパク質で充填され、このカーゴを別の細胞内に送達することができる。エキソソームは、ＲＮＡに基づく療法を含む様々な療法のための既存の送達小胞に勝る複数の利点を有する。これらは患者自身の細胞に由来し得るため、任意の外来の送達ビヒクルよりも免疫原性が低いはずである。より重要なことに、エキソソームは、ｍｉＲＮＡおよび他の非コードＲＮＡの天然の担体であり、標的細胞との直接膜融合が内容物をサイトゾルに直接送達することを可能にする。このため、エキソソームは、小分子の優れた送達系である。
【００１０】
ｍｉＲＮＡは、部分配列相同性により遺伝子サイレンシングを誘発し、したがって単一のｍｉＲＮＡは数百の標的を有し得る。癌遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子としてのｍｉＲＮＡの役割は、そのｍＲＮＡ標的に依存する。ｍｉＲＮＡは、エキソソームから分泌され、隣接するまたは遠隔の細胞におけるｍＲＮＡの抑制に介在することにより細胞内情報伝達において重要な役割を果たす。さらに、様々な種類の腫瘍においてｍｉＲＮＡの異常発現が説明されている。ｍｉＲＮＡの発現および機能は、腫瘍形成、患者予後に関して、および新規な治療標的として研究されてきた。癌の治療のためにｍｉＲＮＡを使用する最も魅力的な利点は、ネットワークとの関連において複数の標的遺伝子に影響を与えるそれらの能力であり、これによりｍｉＲＮＡは、複雑で不均一な腫瘍である神経膠腫の治療にとりわけ適したものになる。さらに、いくつかのインビトロおよび臨床前試験は、ｍｉＲＮＡを標的化する治療有用性を実証した。
【００１１】
ｍｉＲＮＡに加えて、ヒトゲノムは、何万もの長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を発現する。これらの非コードＲＮＡは、長さ＞２００塩基であるが、意味のあるオープンリーディングフレームを欠く。ｌｎｃＲＮＡは多様な転写パターンを示し、組織特異性を示し、生理的状態と病的状態の両方における様々な細胞プロセスにおいて重要な機能を果たす。
【００１２】
特定のＭＳＣ集団を同定、単離および／または調整する方法および治療効果が依然として必要とされている。これらの細胞およびこれらのセクレトームのｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびタンパク質の特性は、広範な疾患に対してより知識に基づき標的化された特定のＭＳＣ療法を可能にする情報を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、異なる供給源および亜集団の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または上記ＭＳＣから分泌される細胞外小胞を含む組成物、上記を含むキット、ならびにこれらの治療的使用を提供する。
【００１４】
本発明は、本明細書に開示される特有の発現プロファイルを有するＭＳＣでの、および上記ＭＳＣから分泌される細胞外小胞での様々な疾患または状態の治療にさらに関する。
【００１５】
第１の態様によれば、それを必要とする対象において疾患または状態を治療する方法であって、
（ａ）胎盤絨毛膜由来の間葉系幹細胞（ＣＨ−ＭＳＣ）の富化された集団を提供することと、
（ｂ）治療有効量の
ｉ．ＣＨ−ＭＳＣ集団、
ｉｉ．ＣＨ−ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
ｉｉｉ．ＣＨ−ＭＳＣ集団からの馴化培地、
ｉｖ．ＣＨ−ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス、
の少なくとも１つを含む医薬組成物を対象に投与すること
を含み、
それにより疾患または状態を治療する、方法が提供される。
【００１６】
別の態様によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）亜集団を選択する方法であって、
（ａ）ＭＳＣを提供することと、
（ｂ）少なくとも１つのＭＳＣの表面で少なくとも１つの表面マーカーを発現する少なくとも１つのＭＳＣを選択することであって、ＣＤ１８４、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３１８、ＣＤ２５５、ＣＤ２６８、ｆＭＬＰ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ４およびＣＤ３２６の少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが臍帯由来ＭＳＣであることを示し、ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳおよびＭＩＣ  Ａ／Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが胎盤絨毛膜由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ２４、ＣＤ４８、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ３３８、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ２６８、ＦＧＦＬＲ１、ＩＴＧＡ５、ＮＥＳおよびＰＤＧＦＲＡＡの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが骨髄由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ８４、ＰＤＧＦＲＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ１１Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが脂肪由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ１５７の発現が、ＭＳＣが胎盤羊膜由来ＭＳＣであることを示す、選択すること
を含み、
それによりＭＳＣ亜集団を選択する、方法が提供される。
【００１７】
別の態様によれば、疾患または状態の治療で使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤または担体、ならびに
（ａ）ＣＨ−ＭＳＣの単離され富化された集団、
（ｂ）ＣＨ−ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
（ｃ）ＣＨ−ＭＳＣ集団からの馴化培地、および
（ｄ）ＣＨ−ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス
の少なくとも１つを含む、医薬組成物が提供される。
【００１８】
別の態様によれば、幹細胞および初代細胞を培養物中で維持する方法であって、
（ａ）幹細胞、初代細胞または両方を提供することと、
（ｂ）幹細胞、初代細胞または両方をＭＳＣ由来の細胞外小胞を含む培養培地中で増殖すること
を含み、
それにより幹細胞、初代細胞または両方を培養物中で維持する、方法が提供される。
【００１９】
いくつかの態様によれば、疾患または状態は神経疾患、筋疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、消化器疾患、エネルギー恒常性疾患、線維性疾患、老化、放射線誘発損傷、細胞移植拒絶および増殖性疾患から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、神経疾患は脳腫瘍、癌脳転移、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経損傷、放射線誘発脳損傷、低酸素脳損傷およびレット症候群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、脳腫瘍は星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫および髄膜腫のいずれか１つである。いくつかの実施形態によれば、神経膠腫は膠芽腫である。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、筋疾患はＭＳ、筋ジストロフィー、筋損傷、筋炎、悪液質およびサルコペニアから選択される。いくつかの実施形態によれば、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベーカー型筋ジストロフィーである。いくつかの実施形態によれば、疾患は筋疾患であり、細胞外小胞、馴化培地、細胞外マトリックスまたはこれらの組み合わせは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、自己免疫疾患はＭＳ、糖尿病、大腸炎およびクローン病から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、エネルギー恒常性疾患は糖尿病である。
【００２５】
いくつかの実施形態によれば、消化器疾患は過敏性腸症候群（ＩＢＤ）、クローン病および大腸炎から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、老化は皮膚の老化、筋肉の老化および脳の老化の少なくとも１つを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、増殖性疾患は癌である。いくつかの実施形態によれば、癌は脳腫瘍、脳転移、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌および頭頸部癌のいずれか１つである。いくつかの実施形態によれば、脳腫瘍は神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞種および髄膜腫から選択される。いくつかの実施形態によれば、神経膠腫は膠芽腫である。いくつかの実施形態よれば、ＭＳＣ集団、細胞外小胞、馴化培地、細胞外マトリックスまたはこれらの組み合わせは、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、対象を照射することをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、ＣＨ−ＭＳＣの富化集団は、胎盤羊膜由来ＭＳＣ（ＡＭ−ＭＳＣ）を実質的に欠く。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、提供することは、細胞混合物または胎盤組織からＣＨ−ＭＳＣを選択することを含む。いくつかの実施形態によれば、選択することは、ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳおよびＭＩＣ  Ａ／Ｂから選択される少なくとも１つの表面マーカーを発現する少なくとも１つの細胞を選択することを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、投与することは、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、線条体内投与、頭蓋内投与、動脈内投与および皮下投与の少なくとも１つを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、ＣＨ−ＭＳＣ集団は、対象に対して同種である。いくつかの実施形態によれば、ＣＨ−ＭＳＣ集団は、対象に対して自家である。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、選択されたＣＨ−ＭＳＣの表面での少なくとも１つの表面マーカーの発現を確認することをさらに含む。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、ＭＳＣをＭＳＣ増殖培地中で培養することをさらに含む。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、提供することは、組織または細胞混合物を提供すること、ならびに組織または細胞混合物からＭＳＣを単離することを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、ＭＳＣを単離することは、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３６、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５０、ＣＤ５１/６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７３、β２マイクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ−Ａ２およびＳＴＲＯ１から選択される複数の表面マーカーを発現する細胞の単離を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、組織は胎盤、臍帯、脂肪組織および骨髄から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、選択されたＭＳＣの表面での少なくとも１つの表面マーカーの発現を確認することをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、培養培地は、ＭＳＣからの馴化培地を含む。いくつかの実施形態によれば、培養培地は、ＭＳＣからの細胞外マトリックスを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、増殖することは、幹細胞、初代細胞または両方をＭＳＣと共培養することを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、幹細胞、初代細胞または両方を初代細胞増殖培地中で増殖することをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、維持することは、ＭＳＣからの細胞外小胞を実質的に欠く培養培地中の細胞の生存を超えて、幹細胞、初代細胞または両方の生存を延長することを含む。いくつかの実施形態によれば、維持することは、幹細胞、初代細胞または両方をインビトロで少なくとも１０継代の間培養することを含む。いくつかの実施形態によれば、維持することは、対称分裂と非対称分裂の両方を経る能力を保持する幹細胞、初代細胞または両方を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは、臍帯由来ＭＳＣ（ＵＳ−ＭＳＣ）、ＣＨ−ＭＳＣまたはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態によれば、ＭＳＣはＣＨ−ＭＳＣである。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、幹細胞は癌幹細胞であり、ＭＳＣは骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）、脂肪由来ＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）、ＡＭ−ＭＳＣまたはこれらの組み合わせである。
【００４４】
別の態様によれば、少なくとも１つの：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、ＭＳＣ集団から分泌される細胞外小胞、ＭＳＣ集団からの馴化培地およびこれらの組み合わせを含み、ＭＳＣ集団が表１〜５のいずれか１つから選択される発現プロファイルにより特徴付けられる、医薬組成物が提供される。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００４６】
本発明のさらなる実施形態および全範囲は、以下に示す詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内の様々な変更形態および修正形態が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示すとともに単なる例示として示されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１Ａ−図１Ｃ。異なるＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、膠芽腫幹細胞に対して相反作用を有する。（１Ａ）ＭＳＣ亜型とのインキュベーション後の膠芽腫細胞の自己再生の棒グラフである。自己再生は、細胞を対照とインキュベートした場合の自己再生率で表される。（１Ｂ）各種ＭＳＣ亜型からのエキソソームとのインキュベーション後の膠芽腫細胞の自己再生の棒グラフである。自己再生は、細胞を対照とインキュベートした場合の自己再生率で表される。（１Ｃ）５つのＭＳＣ亜型における５つの間葉系および幹細胞性マーカーの相対ｍＲＮＡ発現レベルの棒グラフである。対照の発現を１に正規化した。各遺伝子集団は、以下の順番：対照、ＵＣ、ＣＨ、ＡＭ、ＢＭ、ＡＤで示される。
【図２−１】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、膠芽腫を抑制し、生存を延長する。（２Ａ）４つの異なるＭＳＣ亜型または対照細胞を投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｂ）５つの異なるＭＳＣ集団からのエキソソームまたは対照としてＰＢＳを投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｃ）ＭＳＣ亜型からのエキソソームまたは対照を投与した動物の生存曲線を示すグラフである。（２Ｄ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅したＧＳＣの数を示す棒グラフである。（２Ｅ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅した転移性の肺癌および乳癌細胞の数を示す棒グラフである。（２Ｆ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の膠芽腫細胞、ならびに転移性の肺癌および乳癌細胞の自己再生の棒グラフである。（２Ｇ）ＭＳＣの共培養ありまたはなしでの、照射後の死滅したニューロンおよびオリゴデンドロサイトの棒グラフである。（２Ｈ）ＵＣ−ＭＳＣとのトランスウェル共培養、照射または両方の後での炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの相対発現を示す棒グラフである。
【図２−２】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、膠芽腫を抑制し、生存を延長する。（２Ａ）４つの異なるＭＳＣ亜型または対照細胞を投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｂ）５つの異なるＭＳＣ集団からのエキソソームまたは対照としてＰＢＳを投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｃ）ＭＳＣ亜型からのエキソソームまたは対照を投与した動物の生存曲線を示すグラフである。（２Ｄ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅したＧＳＣの数を示す棒グラフである。（２Ｅ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅した転移性の肺癌および乳癌細胞の数を示す棒グラフである。（２Ｆ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の膠芽腫細胞、ならびに転移性の肺癌および乳癌細胞の自己再生の棒グラフである。（２Ｇ）ＭＳＣの共培養ありまたはなしでの、照射後の死滅したニューロンおよびオリゴデンドロサイトの棒グラフである。（２Ｈ）ＵＣ−ＭＳＣとのトランスウェル共培養、照射または両方の後での炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの相対発現を示す棒グラフである。
【図２−３】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、膠芽腫を抑制し、生存を延長する。（２Ａ）４つの異なるＭＳＣ亜型または対照細胞を投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｂ）５つの異なるＭＳＣ集団からのエキソソームまたは対照としてＰＢＳを投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｃ）ＭＳＣ亜型からのエキソソームまたは対照を投与した動物の生存曲線を示すグラフである。（２Ｄ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅したＧＳＣの数を示す棒グラフである。（２Ｅ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅した転移性の肺癌および乳癌細胞の数を示す棒グラフである。（２Ｆ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の膠芽腫細胞、ならびに転移性の肺癌および乳癌細胞の自己再生の棒グラフである。（２Ｇ）ＭＳＣの共培養ありまたはなしでの、照射後の死滅したニューロンおよびオリゴデンドロサイトの棒グラフである。（２Ｈ）ＵＣ−ＭＳＣとのトランスウェル共培養、照射または両方の後での炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの相対発現を示す棒グラフである。
【図２−４】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、膠芽腫を抑制し、生存を延長する。（２Ａ）４つの異なるＭＳＣ亜型または対照細胞を投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｂ）５つの異なるＭＳＣ集団からのエキソソームまたは対照としてＰＢＳを投与したマウスの日数で測定した生存を示す棒グラフである。（２Ｃ）ＭＳＣ亜型からのエキソソームまたは対照を投与した動物の生存曲線を示すグラフである。（２Ｄ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅したＧＳＣの数を示す棒グラフである。（２Ｅ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の死滅した転移性の肺癌および乳癌細胞の数を示す棒グラフである。（２Ｆ）放射線と共にまたはなしでの、ＭＳＣまたはこれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の膠芽腫細胞、ならびに転移性の肺癌および乳癌細胞の自己再生の棒グラフである。（２Ｇ）ＭＳＣの共培養ありまたはなしでの、照射後の死滅したニューロンおよびオリゴデンドロサイトの棒グラフである。（２Ｈ）ＵＣ−ＭＳＣとのトランスウェル共培養、照射または両方の後での炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの相対発現を示す棒グラフである。
【図３】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、脳転移を阻害する。５つの異なるＭＳＣ亜型または対照細胞での治療後の、脳転移の異種移植片を有するマウスの腫瘍サイズの棒グラフである。腫瘍サイズは、対照の腫瘍サイズの割合で示される。
【図４】図４Ａ−図４Ｂ。ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、糖尿病モデルの血中グルコースレベルを低下させる。（４Ａ）ＭＳＣおよび対照細胞の投与後２日ごとにＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを測定した折れ線グラフである。同様の治療効果が、異なる細胞由来のエキソソームで観察された。（４Ｂ）エキソソームおよびＰＢＳ対照の投与の１０日後のＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを示す棒グラフである。
【図５−１】筋疾患を治療するためのＭＳＣ集団およびそれらのエキソソーム。（５Ａ）ＰＢＳ、ＣＨ−ＭＳＣまたはＣＨ−ＭＳＣからのエキソソームの投与後のＭＤＸマウスの隔膜および心筋におけるコラーゲンＩ発現を示す棒グラフである。（５Ｂ）ＰＢＳ、ＣＨ−ＭＳＣまたはＣＨ−ＭＳＣからのエキソソームの投与後のＭＤＸマウスの隔膜および心筋におけるユートロフィン発現を示す棒グラフである。（５Ｃ〜Ｅ）ＭＳＣまたはそれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の（５Ｃ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞、（５Ｄ）ヒト筋芽細胞および（５Ｅ）ＤＭＤ筋芽細胞におけるミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）発現のウェスタンブロット像である。
【図５−２】筋疾患を治療するためのＭＳＣ集団およびそれらのエキソソーム。（５Ａ）ＰＢＳ、ＣＨ−ＭＳＣまたはＣＨ−ＭＳＣからのエキソソームの投与後のＭＤＸマウスの隔膜および心筋におけるコラーゲンＩ発現を示す棒グラフである。（５Ｂ）ＰＢＳ、ＣＨ−ＭＳＣまたはＣＨ−ＭＳＣからのエキソソームの投与後のＭＤＸマウスの隔膜および心筋におけるユートロフィン発現を示す棒グラフである。（５Ｃ〜Ｅ）ＭＳＣまたはそれらのエキソソームとのトランスウェル共培養後の（５Ｃ）Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞、（５Ｄ）ヒト筋芽細胞および（５Ｅ）ＤＭＤ筋芽細胞におけるミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）発現のウェスタンブロット像である。
【図６】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、多発性硬化症モデルにおいて治療効果を発揮する。ＭＳＣまたはこれらのエキソソームの投与後のＭＯＧ投与マウスの臨床スコアを示す棒グラフである。
【図７−１】脳疾患を治療するためのＭＳＣ集団およびそれらのエキソソーム。（７Ａ）ＭＳＣの投与後のＡＬＳラットモデルにおけるニューロンの生存（日数）を示す棒グラフである。（７Ｂ）エキソソームの投与後のＡＬＳラットモデルにおけるニューロンの生存（日数）を示す棒グラフである。（７Ｃ）ＭＳＣまたはこれらのエキソソームの投与後の６−ＯＨＤＡ注入マウスにおける回転スコアを示す棒グラフである。（７Ｄ）対照およびＭｅＣＰ２−サイレントニューロンの末端数を示す棒グラフである。（７Ｅ）脊髄損傷を有するおよび有さない、ならびにＣＨ−ＭＳＣまたはこれらのエキソソームで治療された損傷を有するラットのバッソ、ビーティーとブレスナハン（ＢＢＢ）運動評価尺度での平均スコアを示す棒グラフである。
【図７−２】脳疾患を治療するためのＭＳＣ集団およびそれらのエキソソーム。（７Ａ）ＭＳＣの投与後のＡＬＳラットモデルにおけるニューロンの生存（日数）を示す棒グラフである。（７Ｂ）エキソソームの投与後のＡＬＳラットモデルにおけるニューロンの生存（日数）を示す棒グラフである。（７Ｃ）ＭＳＣまたはこれらのエキソソームの投与後の６−ＯＨＤＡ注入マウスにおける回転スコアを示す棒グラフである。（７Ｄ）対照およびＭｅＣＰ２−サイレントニューロンの末端数を示す棒グラフである。（７Ｅ）脊髄損傷を有するおよび有さない、ならびにＣＨ−ＭＳＣまたはこれらのエキソソームで治療された損傷を有するラットのバッソ、ビーティーとブレスナハン（ＢＢＢ）運動評価尺度での平均スコアを示す棒グラフである。
【図８】図８Ａ−図８Ｂ。ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、放射線後のニューロンを保護する。（８Ａ）全線量４〜５Ｇｙを分割照射した３０、６０および９０日後の対照および照射した成体雄ラットの脳室下帯（ＳＶＺ）中のダブルコルチン陽性（ＤＣＸ＋）細胞（未成熟ニューロンを示す）の密度を示す棒グラフである。各時点で投与されるＭＳＣ集団は、以下の順番：対照、ＢＭ、ＡＤ、ＵＣ、ＣＨ、ＤＰで示される。（８Ｂ）全線量４〜５Ｇｙを分割照射した６０日後の対照および照射した成体雄ラットの脳室下帯（ＳＶＺ）中のダブルコルチン陽性（ＤＣＸ＋）細胞の密度を示す棒グラフである。エキソソームを投与した。
【図９】ＭＳＣ集団およびそれらのエキソソームは、低酸素状態からニューロンを保護する。ＣＨ−ＭＳＣまたはそれらのエキソソームありおよびなしでの、酸素正常状態および重度の低酸素状態におけるニューロンおよびオリゴデンドロサイト死を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、特定のおよび特有の発現プロファイルを有するＭＳＣ集団、ならびに上記ＭＳＣ集団から分泌される細胞外小胞を提供する。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書で開示されるＭＳＣ集団を選択することまたは提供すること、およびＭＳＣ集団、ＭＳＣから分泌される細胞外小胞、ＭＳＣからの馴化培地、ＭＳＣから分泌される細胞外マトリックスまたはこれらの組み合わせを上記対象に投与することにより、それを必要とする対象の疾患または状態を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、提供されるＭＳＣ集団は単離された集団である。いくつかの実施形態において、提供されるＭＳＣ集団は富化された集団である。いくつかの実施形態において、提供されるＭＳＣ集団は実質的に純粋な集団である。いくつかの実施形態において、提供されるＭＳＣ集団は単離されかつ富化された集団である。いくつかの実施形態において、提供されるＭＳＣ集団は単離されかつ実質的に純粋な集団である。
【００５０】
本発明は、一部には、異なる供給源のＭＳＣが、コードおよび非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡ）を含む、実質的に様々な発現プロファイル、表面マーカー、ならびにエキソソームおよび細胞外小胞を含むが、これらに限定されない様々な因子の分泌物を有するという予想外の知見に基づく。さらに、様々なＭＳＣ亜集団から分泌されるエキソソームおよび細胞外小胞は、特有のおよび特定のタンパク質、表面マーカーおよび非コードＲＮＡプロファイルを有していた。
【００５１】
本発明は、一部には、本明細書に記載する特定のＭＳＣ集団が特定の疾患および障害の治療に適しており、一方で他のＭＳＣ集団は効果がないか、あまり効果がないか、またはさらには疾患状態を進行させることが判明したという予想外の知見にさらに基づく。非限定的例として本明細書に例示されるように、特定のＭＳＣ集団のみが膠芽腫を治療および抑制し、他のＭＳＣ集団は治療および抑制しないどころか、腫瘍増殖を促進することが判明した。
【００５２】
本明細書で使用する「ＭＳＣ」は、骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨芽細胞、ならびにいくつかの条件下で骨格筋および内皮細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を指す。用語「多能性」は、多数の細胞種を生み出すことができる幹細胞を指す。ＭＳＣは、骨髄および脂肪組織中に存在し、また、他の組織の中でも特に末梢血、胎盤、臍帯血、歯髄に存在する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＭＳＣは、胎盤羊膜、胎盤絨毛膜、臍帯、骨髄、脂肪組織、羊水もしくは歯髄に由来するか、および／またはこれらから単離される。
【００５３】
本明細書で使用する「ＭＳＣ集団」は、１つ以上の特有のタンパク質（例えば、表面マーカーおよび分泌タンパク質）、遺伝子、ならびに１つ以上のコードおよび非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない、特有のプロファイル、特に発現プロファイルを有するＭＳＣ集団を指す。ＭＳＣ集団は、エキソソームおよび細胞外小胞などの、上記ＭＳＣから分泌される特有のプロファイルを有する細胞外小胞によっても特徴付けられ得る。
【００５４】
以下に詳細に示すように、本発明は、特有の発現プロファイルを有する少なくとも５つのＭＳＣ集団を提供する。各ＭＳＣ集団は、特定の供給源から単離され得るか、当業者に公知の様々な因子により操作されて、本明細書の以下に示す特有のプロファイルを包含し、これにより定義され得る。
【００５５】
本明細書で用いられる「集団」は、細胞培養物の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはすべての細胞が同様のプロファイルを有する細胞培養物を指す。いくつかの実施形態において、集団は富化された集団である。本明細書で使用する「亜集団」は本明細書に定義されるＭＳＣ集団の１つを指し、これは、さらに特有の発現プロファイルを上記ＭＳＣに与えるように、様々な増殖条件によりさらに操作される。各集団は、様々な組み合わせの発現プロファイルまたは様々なレベルの発現を示すさらなる亜集団からなる。本明細書で使用する「様々な増殖条件」は、１つ以上のタンパク質（例えば、増殖因子）、１つ以上のコードまたは非コードＲＮＡ、ならびに選択条件および／または培地（例えば、足場、低酸素状態、グルコース濃度、共培養）での増殖による富化を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する「表面マーカー」は、ＭＳＣの原形質膜表面の任意の種類の抗原決定基を指す。
【００５７】
本明細書で使用する「非コードＲＮＡ」は、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ分子を指す。非コードＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）および長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む。これらの非コードＲＮＡはいずれも、ｍＲＮＡの安定性および翻訳、したがってタンパク質の発現を調節することが知られている。本明細書に示されるｍｉＲの配列は、ｍｉＲデータベース「ｍｉＲｂａｓｅ」（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）およびｍｉＲＤＢ（ｗｗｗ．ｍｉｒｄｂ．ｏｒｇ）などの資料中に見出すことができる。本明細書に示されるｌｎｃＲＮＡの配列は、ｌｎｃＲＮＡｄｂ（ｗｗｗ.ｌｎｃｒｎａｄｂ.ｏｒｇ）およびＬＮＣｉｐｅｄｉａ（ｈｔｔｐ://ｌｎｃｉｐｅｄｉａ.ｏｒｇ）などのｌｎｃＲＮＡデータベース中に見出すことができる。
【００５８】
本明細書で使用する「細胞外小胞」は、エキソソームおよび細胞外微小胞を含むがこれらに限定されない、ＭＳＣから分泌される全細胞由来の細胞外小胞を指す。本明細書で使用する「エキソソーム」は、５０〜１００ｎｍのサイズを有し、ＭＳＣから分泌される、エンドサイトーシス起源の細胞由来の細胞外小胞を指す。非限定的実施形態として、エキソソームを生成するために、細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、およびエキソソームが枯渇されたヒト血清アルブミンまたは５％ＦＢＳで維持する。本明細書で使用する「細胞外微小胞」は、１００〜１０００ｎｍのサイズを有し、ＭＳＣから分泌される、原形質膜に由来する細胞由来の細胞外小胞を指す。
【００５９】
本明細書で使用する「馴化培地」は、その中で本発明のＭＳＣ集団を増殖させた培地を指す。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、培地中で少なくとも１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間または７２時間増殖されている。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、馴化培地は、ＭＳＣから分泌される細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態において、馴化培地は、ＭＳＣから分泌されるタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、馴化培地は、ＭＳＣの「セクレトーム」を含む。本明細書で使用する用語「セクレトーム」は、細胞から分泌される任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、セクレトームは、分泌タンパク質、分泌核酸分子および分泌小胞のいずれかまたはすべてを含む。
【００６０】
本明細書で使用する「細胞外マトリックス」および「ＥＣＭ」は互換的であり、ＭＳＣにより分泌される細胞外分子を指し、これは、周囲の細胞に構造的および生化学的な支持を提供する。いくつかの実施形態において、ＥＣＭは膜を含む。いくつかの実施形態において、ＥＣＭは構造化される。
【００６１】
臍帯由来ＭＳＣ（ＵＣ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＵＣ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＵＣ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、これらのＭＳＣおよび／または細胞外小胞が、
（ｉ）ＤＧＣＲ５、Ｈ１９、ＨＡＲ１Ａ、ＨＯＸＡ６ＡＳ、ＫＲＡＳＰ１、ＳＴＯＴ３、ＴＵ−００１７６ならびに任意でＧＡＳ５、ＭＥＲ１１Ｃ、ＨＯＸＡ３ＡＳおよびＰＣＡＴ−３２からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）表１０から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＡＮＧ、ＰＤＦＲＡＡ、ＮＴ−４、ＦＧＦ４、ＴＩＭＰ１、ＩＬ−８、ＨＡＰＬＮ１、ＤＭＰ１、スタニオカルシン１、ＡＤＡＭ２３、ＳＣＧ５ならびに任意でＢＤＮＦおよびＩＧＦ−１からなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｖ）ＣＤ１８４、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３１８、ＣＤ２５５、ＣＤ２６８、ｆＭＬＰ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ４およびＣＤ３２６からなる群から選択される１つ以上の表面マーカーを含む、ＭＳＣ集団、
（ｖ）表１１から選択されるアップレギュレートされた遺伝子の１つ以上を含むＭＳＣ集団、
（ｖｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：低ＹＫＬ４０、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４、
（ｖｉｉ）ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰＢ１、ＡＴＰＢ３、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＢＳＧ、ＣＳＰＧ４、ＥＰＨＡ２、ＧＰＣ１、ＧＰＲＣ５Ａ、ＭＭＥ、ＭＭＰ１４、ＭＰＺＬ１、ＮＣＳＴＮ、ＰＬＡＵＲ、ＰＶＲ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＬＣ３９Ａ１４およびＳＬＣ７Ａ１からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含むＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖｉｉｉ）Ｙ４ならびに任意でＮＥＡＴ１およびＰＴＥＮＰ１からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含むＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｉｘ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＵＣ−ＭＳＣ集団は、ＣＡＳＫ、ＣＯＬ３Ａ１、Ｂ２Ｍ、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＤＬＧ１、ＥＧＦＲ、Ｆ３、ＦＡＲＰ１、ＧＰＣ１、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＨＡＰＬＮ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＰＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＯＸＬ２、ＭＣＡＭ、ＮＩＤ１、ＯＬＸＮＢ２、Ｓ１００Ａ６、ＴＮＣ、ＷＮＴ５ＡおよびＰＬＸＮＢ２からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む細胞由来の細胞外小胞も発現し得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療する、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、脳腫瘍およびその脳転移、糖尿病、筋疾患（例えば、ＤＭＤ）、ＡＬＳ、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、レット症候群、自閉症、老化に伴う障害、同種移植、脳損傷、脊髄損傷、軟骨損傷、骨格損傷、心疾患、移植片対宿主疾患、同種細胞および組織移植拒絶、放射線誘発損傷、線維障害、喘息、自己免疫疾患、腹腔疾患、炎症性腸疾患、損傷、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、筋障害、白血球欠損症、内分泌疾患、嚢胞性線維症、パーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中、統合失調症、薬物中毒、心障害、ＣＮＳでの希少疾患、脳性麻痺、血管誘発認知症、癲癇および新生児虚血性損傷から選択される。
【００６４】
胎盤絨毛膜由来ＭＳＣ（ＣＨ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＣＨ−ＭＳＣ、ＣＨ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＣＨ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＣＨ−ＭＳＣおよび／または細胞外小胞が、
（ｉ）ＳＣＡ８、ＴＵ００１７６、ＬＩＮＣ−ＶＬＤＬＲおよび任意でＲＯＲからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）表１０から選択される、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）ＨＧＦ、ｗｎｔ２、ＧＤＮＦ、オステオプロテゲリン、ＭＩＰ３α、ＮＴ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＦＧＦ７、ＮＴ−４、ＥＧＦＬ６ならびに任意でＬＩＦおよびＢＤＮＦからなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｖ）表面マーカー：ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲおよびＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳを含む、ＭＳＣ集団、
（ｖ）表１１から選択されるアップレギュレートされた遺伝子の１つ以上を含む、ＭＳＣ集団、
（ｖｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：低ＹＫＬ４０およびＫＬＦ４、
（ｖｉｉ）ＣＯＬ４Ａ２、ＬＧＡＬＳ３、ＳＣＵＢＥ１、ＬＧＡＳ３およびＳ１００Ａ１０からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖｉｉｉ）ＢＣＭＳ、ＢＩＣおよび任意でＨＡＲ１Ｂからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｉｘ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＣＨ−ＭＳＣ集団は、ＣＡＳＫ、ＣＯＬ３Ａ１、Ｂ２Ｍ、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＤＬＧ１、ＥＧＦＲ、Ｆ３、ＦＡＲＰ１、ＧＰＣ１、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＨＡＰＬＮ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＰＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＯＸＬ２、ＭＣＡＭ、ＮＩＤ１、ＯＬＸＮＢ２、Ｓ１００Ａ６、ＴＮＣ、ＷＮＴ５ＡおよびＰＬＸＮＢ２からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、細胞由来の細胞外小胞も発現し得る。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療許容量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、脳腫瘍およびその脳転移、糖尿病、筋疾患（例えば、ＤＭＤ）、ＡＬＳ、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、レット症候群、自閉症、老化に伴う障害、同種移植、脳損傷、脊髄損傷、軟骨損傷、骨格損傷、心疾患、移植片対宿主疾患、同種細胞および組織移植拒絶、放射線誘発損傷、線維障害、喘息、自己免疫疾患、腹腔疾患、炎症性腸疾患、損傷、関節炎、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、筋障害、白血球欠損症、内分泌疾患、嚢胞性線維症、パーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中、統合失調症、薬物中毒、心障害、ＣＮＳでの希少疾患、脳性麻痺、血管誘発認知症、癲癇および新生児虚血性損傷から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらの細胞から得られる細胞外小胞は、そのまま使える治療薬として用いられ得、液体窒素中で凍結状態で維持され、使用直前に解凍され得る。
【００６８】
骨髄由来ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＢＭ−ＭＳＣ集団、ＢＭ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＢＭ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＢＭ−ＭＳＣおよび／または細胞外小胞が
（ｉ）ａＨＩＦ、ＡＮＲＩＬ、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＡＮＤＡ、ＳＡＦならびに任意でＬＩＴおよびＨＯＸＡ３ＡＳからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）表１０から選択される、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ−４、ＡＬＰＬ、ＴＳＬＣ１、ＰＧＦ、ＣＯＬ５Ａ３、ＤＳＧ２、ＰＥＮＫ前駆体および任意でＴＧＦβベータ、ＩＧＦ−１からなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｖ）ＣＤ４８、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ３３８、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ２６８、ＦＧＦＬＲ１およびＩＴＧＡ５、ＮＥＳ、ＰＤＧＦＲＡＡからなる群から選択される１つ以上の表面マーカーを含む、ＭＳＣ集団、
（ｖ）表１１から選択されるアップレギュレートされた遺伝子の１つ以上を含むＭＳＣ集団、
（ｖｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：高ＹＫＬ４０、低ＳＯＸ２、
（ｖｉｉ）ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＴＣ、ＣＯＲＯ１Ｃ、ＤＭＢＴ１、ＩＧＨＡ１およびＩＧＨＡ２からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖｉｉｉ）ＢＣ０１７７４３、ＢＩＣならびに任意でＴＵＧおよびＮＥＡＴ１からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｉｘ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療許容量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患は、筋疾患、骨格疾患、骨損傷、軟骨損傷、脳損傷、脊髄損傷、糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、ＣＮＳでの希少疾患、脳性麻痺、新生児虚血性損傷、移植片対宿主疾患および放射線誘発損傷から選択される。
【００７０】
脂肪由来ＭＳＣ（ＡＤ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＡＤ−ＭＳＣ集団、ＡＤ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＡＤ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＡＤ−ＭＳＣおよび／または細胞外小胞が
（ｉ）ｌｎｃＲＮＡ  ＰＣＡＴ−２９を任意で含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）表１０から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）ＩＬ−４、ＣＣＬ２、ＣＦＲＰ１、ＣＯＭＰ、ＣＴＳＫ、ＭＦＡＰ５、ＭＭＰ１、ＣＸＣＬ６、ＩＧＦＢＰ６ならびに任意でＴＧＦβおよびＧＤＮＦからなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｖ）ＣＤ８４、ＰＤＧＦＲＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ１１から選択される１つ以上の表面マーカーを含む、ＭＳＣ集団、
（ｖ）表１１から選択されるアップレギュレートされた遺伝子の１つ以上を含む、ＭＳＣ集団、
（ｖｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：中ＹＫＬ４０、高ＳＯＸ２およびＫＬＦ４、
（ｖｉｉ）ＳＯＤ３、ＴＧＭ３、ＩＧＦ２Ｒ、ＦＧＦＲ１およびＡＤＡＭＴＳ１３からなる群から選択される１つ以上のタンパク質を含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖｉｉｉ）ＡＡＡ１、ＧＯＭＡＦＵおよびＨＯＴＡＩＲからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｉｘ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療許容量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患は糖尿病、筋疾患、骨格疾患、骨損傷および軟骨損傷から選択される。
【００７２】
胎盤羊膜由来ＭＳＣ（ＡＭ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＡＭ−ＭＳＣ集団、ＡＭ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＡＭ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＡＭ−ＭＳＣおよび／または細胞外小胞が
（ｉ）ＧＯＭＡＦＵ、ＮＤＭ２９、７ＳＫ、ＢＩＣ、ＣＭＰＤＨＯＡＩＲ、Ｈ１９−ＡＳ  および任意で２１Ａからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）表１０から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）ＲＡＮＴＥＳ、ＶＴＮ、ＭＦＡＰ５、ＦＭＯＤ、ＩＬ−４、ＰＲＳＳ３５、ＮＰＴＸ２、ＣＰＡ４、ＧＬＳ、ニューロメジンならびに任意でＬＩＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦおよびＶＥＧＦからなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｖ）ＣＤ１５７表面マーカーを含む、ＭＳＣ集団、
（ｖ）表１１から選択されるアップレギュレートされた遺伝子の１つ以上を含む、ＭＳＣ集団、
（ｖｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：高ＹＫＬ４０およびＳＯＸ２、
（ｖｉｉ）ａＨＩＦ、ＣＭＰＤ、ＤＩＳＣ２、ＨＯＴＴＩＰ、ＨＵＬＣ、ＫＲＡＳＰ１、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＰＣＧＥＭ１、ＳＣＡ８、ならびに任意でＴＵＧおよびＢＡＣＥ１ＡＳからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖｉｉｉ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療許容量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患はアルツハイマー病、骨損傷および軟骨損傷から選択される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＡＤおよびＡＭ−ＭＳＣは、マウスなどのモデルにおいてヒト腫瘍の生成を促進するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、これは、培養物またはインビボでの腫瘍細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）を増強することにより達成される。いくつかの実施形態において、用いられるモデルは、非免疫不全である。典型的には、ヒト異種移植片が、腫瘍の拒絶のリスクを回避するために免疫不全マウスにおいて生成される。本明細書に詳述されるように、ＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣは、非免疫不全マウスにおけるヒト細胞の拒絶を防止し、さらに腫瘍生着および増殖を増強する。
【００７５】
本明細書で使用する用語「ＥＭＴ」は、それにより細胞が細胞極性および細胞接着などのそれらの上皮細胞特性を喪失し、移動性および侵襲性などの間葉細胞特性を獲得するプロセスを指す。腫瘍細胞のＥＭＴは、癌の進行および転移を促進することが知られている。非上皮性腫瘍についても同様のプロセスが知られており、間葉転換も考えられる。
【００７６】
本明細書で使用する用語「免疫不全（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ、ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ、ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）」は、障害された免疫系を有するマウスまたはマウス由来の細胞を指す。この障害は、障害された先天性免疫応答、障害された適応免疫応答またはその両方の形態であり得る。このようなマウスの例は、文献において一般的であり、ヌードマウス、Ｓｃｉｄマウス、Ｒａｇマウス、ＮＳＧマウスおよびＮＲＧマウスを含み得るが、これらに限定されない。
【００７７】
歯髄由来ＭＳＣ（ＤＰ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＤＰ−ＭＳＣ集団、ＤＰ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＤＰ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＤＰ−ＭＳＣまたはこれらの細胞外小胞が
（ｉ）ＰＣＡＴ−１、ＩＰＷ、ＭＡＬＡＴ−１、ＳＴ７ＯＴ１および任意でＬＩＴからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦからなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：ＹＫＬ４０なし、高ＳＯＸ２、
（ｖｉ）ＥＧＯ、Ｈ１９−ＡＳ、ＬＯＣ２８５１４９  ＬＯＣ２８５１９４、ＬｉｎｃＲＮＡ−ＶＬＤＬＲ、ＬｉｎｃＲＮＡ−ＳＦＭＢＴ２、ＰＳＦ−抑制ＲＮＡ、ＲＯＲ、ＳＴ７０Ｔ３、ＵＣＡ１、Ｙ５および任意でＨＡＲ１Ｂからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療許容量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患はアルツハイマー病、神経障害、癌、骨損傷、軟骨損傷、歯移植骨生着から選択される。
【００７９】
剥離脱落歯由来ＭＳＣ（ＤＤ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＤＤ−ＭＳＣ集団、ＤＤ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＤＤ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＤＤ−ＭＳＣまたはこれらの細胞外小胞が
（ｉ）ＢＣＯ１７７４３、ＢＣＯ４３４３Ｃ、ＨＯＴＡＩＲＭ、Ｙ３、Ｙ５ＳＴ７ＯＴ４、ならびに任意でＧＡＳ５、ＲＯＲおよびＰＣＡＴ−３２からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦからなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：ＹＫＬ４０およびＫＬＦ４なし、高ＳＯＸ２、
（ｖｉ）ＢＣ２００および任意でＢＡＣＥ１ＡＳからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含むＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療許容量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患はアルツハイマー病、神経障害、癌、骨損傷、軟骨損傷および歯移植骨生着から選択される。
【００８１】
歯小嚢由来ＭＳＣ（ＤＦ−ＭＳＣ）集団およびそれらに由来する細胞外小胞
別の実施形態において、ＤＦ−ＭＳＣ集団、ＤＦ−ＭＳＣ由来の細胞外小胞、ＤＦ−ＭＳＣからの馴化培地またはこれらの組み合わせを含み、ＤＦ−ＭＳＣまたは細胞外小胞が
（ｉ）ＤＬＧ２ＡＳ、ＨＵＬＣ、ＩＧＦ２ＡＳ、ＵＣＡ１、ＷＴ−１ＡＳ、ならびに任意で２１Ａ、ＨＯＸＡ３ＡＳおよびＭＥＲ１１Ｃからなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉ）ＮＧＦからなる群から選択される１つ以上の分泌因子を含む、ＭＳＣ集団、
（ｉｉｉ）幹細胞性および間葉系マーカー：ＹＫＬ４０およびＳＯＸ２なし、ＫＬＦ４、Ｎｏｔｃｈ１、
（ｉｖ）ＬＵＳＴ、ＰＣＡＴ−１、ＰＣＡＴ−２９、Ｙ３、Ｔｕ＿００１７６２９および任意でＰＴＥＮＰ１からなる群から選択される１つ以上のｌｎｃＲＮＡを含むＭＳＣ由来の細胞外小胞、
（ｖ）これらの組み合わせ、
から選択される発現プロファイルを有する、医薬組成物が提供される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量のこの医薬組成物を対象に投与し、それにより疾患を治療することによる、疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患はアルツハイマー病、神経障害、癌、骨損傷、軟骨損傷および歯移植骨生着から選択される。
【００８３】
細胞の選択
別の態様によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）亜集団を選択する方法であって、
ａ．少なくとも１つのＭＳＣを含む細胞混合物を提供することと、
ｂ．ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３６、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５０、ＣＤ５１/６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７３、β２マイクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ−Ａ２およびＳＴＲＯ１から選択される複数の表面マーカーを発現する少なくとも１つの細胞を選択することを含み、
それにより細胞混合物からＭＳＣを選択する、方法が提供される。
【００８４】
別の態様によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）亜集団を選択する方法であって
ａ．ＭＳＣを提供することと、
ｂ．上記少なくとも１つのＭＳＣの表面で少なくとも１つの表面マーカーを発現する少なくとも１つのＭＳＣを選択することであって、ＣＤ１８４、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３１８、ＣＤ２５５、ＣＤ２６８、ｆＭＬＰ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ４およびＣＤ３２６の少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが臍帯由来ＭＳＣであることを示し、ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳおよびＭＩＣ  Ａ／Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが胎盤絨毛膜由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ２４、ＣＤ４８、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ３３８、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ２６８、ＦＧＦＬＲ１、ＩＴＧＡ５、ＮＥＳおよびＰＤＧＦＲＡＡの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが骨髄由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ８４、ＰＤＧＦＲＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ１１Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが脂肪由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ１５７の発現が、ＭＳＣが胎盤羊膜由来ＭＳＣであることを示す、選択することと、
ｃ．所望される起源組織から少なくとも１つのＭＳＣを選択すること、
を含み、
それによりＭＳＣ亜集団を選択する、方法が提供される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、細胞混合物は培養物中にある。いくつかの実施形態において、細胞混合物は、組織または器官の一部または全部である。いくつかの実施形態において、組織は胎盤、臍帯、脂肪組織および骨髄から選択される。いくつかの実施形態において、組織は胎盤であり、本発明の方法は、ＣＨ−ＭＳＣまたはＡＭ−ＭＳＣのみの選択を可能にする。
【００８６】
治療用途
別の態様によれば、それを必要とする対象において疾患または状態を治療する方法であって、
ａ．ＭＳＣの単離集団を提供することと、
ｂ．治療有効量の
ｉ．単離ＭＳＣ集団、
ｉｉ．単離ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
ｉｉｉ．単離ＭＳＣ集団からの馴化培地、および
ｉｖ．単離ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス
の少なくとも１つを含む医薬組成物を対象に投与すること、
を含み、
それにより疾患または状態を治療する、方法が提供される。
【００８７】
別の態様によれば、それを必要とする対象において疾患または状態を治療する方法であって、
ａ．ＣＨ−ＭＳＣの単離集団を提供することと、
ｂ．治療有効量の
ｉ．単離ＣＨ−ＭＳＣ集団、
ｉｉ．単離ＣＨ−ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
ｉｉｉ．単離ＣＨ−ＭＳＣ集団からの馴化培地、および
ｉｖ．単離ＣＨ−ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス
の少なくとも１つを含む医薬組成物を対象に投与すること、
を含み、
それにより疾患または状態を治療する、方法が提供される。
【００８８】
本明細書で使用する用語「単離された」は、細胞混合物、組織または器官から選択された集団を指す。いくつかの実施形態において、単離された集団は富化された集団である。いくつかの実施形態において、単離された集団は、純粋なまたは実質的に純粋な集団である。いくつかの実施形態において、集団は、臍帯、胎盤、骨髄、脂肪組織、歯髄、歯および歯小嚢のいずれか１つから単離される。いくつかの実施形態において、単離された集団は、ＭＳＣでない細胞を含まない。いくつかの実施形態において、単離された集団は、異なる組織由来のＭＳＣを含まない。いくつかの実施形態において、単離された集団は、本明細書に記載の異なるＭＳＣ集団を含まない。いくつかの実施形態において、ＣＨ−ＭＳＣ集団は胎盤から単離される。いくつかの実施形態において、胎盤は、ＣＨ−ＭＳＣおよびＡＭ−ＭＳＣを含む。いくつかの実施形態において、単離されたＣＨ−ＭＳＣ集団はＣＨ−ＭＳＣに富む。いくつかの実施形態において、単離されたＣＨ−ＭＳＣ集団はＡＭ−ＭＳＣを欠くか、または実質的に欠く。いくつかの実施形態において、単離されたＣＨ−ＭＳＣ集団は、ＭＳＣでない胎盤細胞を欠くか、または実質的に欠く。いくつかの実施形態において、単離されたＣＨ−ＭＳＣ集団は、ＭＳＣでない胎盤細胞およびＡＭ−ＭＳＣを欠くか、または実質的に欠く。
【００８９】
いくつかの実施形態において、富化されたＣＨ−ＭＳＣ集団は、ＣＨ−ＭＳＣを少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９０】
本明細書で使用する「実質的に欠く」は、望まれない細胞の混入がごくわずかにすぎないことを指す。いくつかの実施形態において、実質的に純粋な集団は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％未満の混入細胞を有する。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９１】
いくつかの実施形態において、提供することは、細胞混合物、組織または器官からＭＳＣ集団を選択することを含む。いくつかの実施形態において、選択することは、細胞混合物の細胞、組織または器官の表面での少なくとも１つの表面マーカーの発現を測定することであって、ＣＤ１８４、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３１８、ＣＤ２５５、ＣＤ２６８、ｆＭＬＰ、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ４およびＣＤ３２６の少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが臍帯由来ＭＳＣであることを示し、ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳおよびＭＩＣ  Ａ／Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが胎盤絨毛膜由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ２４、ＣＤ４８、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ３３８、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ２６８、ＦＧＦＬＲ１、ＩＴＧＡ５、ＮＥＳおよびＰＤＧＦＲＡＡの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが骨髄由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ８４、ＰＤＧＦＲＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ１１Ｂの少なくとも１つの発現が、ＭＳＣが脂肪由来ＭＳＣであることを示し、ＣＤ１５７の発現が、ＭＳＣが胎盤羊膜由来ＭＳＣであることを示す、測定することを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、提供することは、細胞混合物または胎盤組織からＣＨ−ＭＳＣを選択することを含む。いくつかの実施形態において、選択することは、細胞がＣＨ−ＭＳＣであることを示す、ＴＣＲαβ、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳおよびＭＩＣ  Ａ／Ｂから選択される少なくとも１つの表面マーカーを発現する、少なくとも１つの細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、選択されたＣＨ−ＭＳＣの表面での少なくとも１つの表面マーカーの発現を確認することをさらに含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、提供することは、ＭＳＣを培養することを含む。いくつかの実施形態において、培養することは、接着細胞用の標準培地中で行われる。いくつかの実施形態において、培養することは、ＭＳＣ増殖培地中で行われる。いくつかの実施形態において、培養することは、ＭＳＣの起源の組織用の特異的な増殖培地中で行われる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、提供することは、細胞混合物、組織または器官を提供することおよび、その混合物、組織または器官からＭＳＣを単離することを含む。いくつかの実施形態において、ＭＳＣを単離することは、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３６、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５０、ＣＤ５１/６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７３、β２マイクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ−Ａ２およびＳＴＲＯ１から選択される複数の表面マーカーを発現する細胞の単離を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、疾患または状態は神経疾患、筋疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、消化器疾患、エネルギー恒常性疾患、老化、放射線誘発損傷、細胞移植拒絶および増殖性疾患から選択される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は神経疾患である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は筋疾患である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は神経筋疾患である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は老化である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は放射線誘発損傷である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は細胞移植拒絶である。いくつかの実施形態において、疾患または状態は増殖性疾患である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、増殖性疾患は癌である。用語「癌」は、任意の種類の癌を指す。いくつかの実施形態において、癌は脳腫瘍である。いくつかの実施形態において、脳腫瘍は星細胞腫、神経膠腫、髄芽腫、神経芽細胞種および髄膜腫から選択される。いくつかの実施形態において、脳腫瘍は膠芽腫（ＧＢＭ）である。いくつかの実施形態において、神経膠腫はＧＢＭである。いくつかの実施形態において、星細胞腫はＧＢＭである。いくつかの実施形態において、癌は脳腫瘍、脳転移、乳癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌のいずれか１つである。
【００９７】
用語「脳転移」は、身体の他の器官（例えば、肺、胸、黒色腫、結腸および肝臓）の原発腫瘍から脳に広がった腫瘍細胞を指す。転移性腫瘍は、脳において最も一般的な腫瘤性病変を表す。
【００９８】
いくつかの実施形態において、癌は乳癌、肺癌、神経芽細胞種および膵臓癌のいずれか１つであり、医薬組成物を製造するために用いられるＭＳＣ集団はＵＣ−ＭＳＣである。いくつかの実施形態において、癌は結腸癌、前立腺癌、脳転移、神経膠腫、髄膜種、髄芽腫または頭頚部癌のいずれか１つであり、医薬組成物を製造するために用いられるＭＳＣ集団はＣＨ−ＭＳＣである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、疾患は癌であり、ＣＨ−ＭＳＣ集団、細胞外小胞、馴化培地、細胞外マトリックスまたはこれらの組み合わせは、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む。
【０１００】
他の実施形態において、方法は、ＭＳＣ馴化培地、ＥＣＭまたは細胞外小胞と共に抗癌剤の投与と組み合わせてさらに行われ得る。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物による癌の治療は、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、ウイルス療法、遺伝子療法またはこれらの組み合わせと組み合わせて行われ得る。いくつかの実施形態において、増殖性疾患を治療するための本発明の方法は、対象の照射をさらに含む。いくつかの実施形態において、増殖性疾患は脳腫瘍であり、方法は脳の照射をさらに含む。いくつかの実施形態において、脳の照射は、健康な脳細胞に対する本発明の医薬組成物の保護効果を含む。
【０１０１】
典型的には、放射は癌の一般的な治療であるが、身体に損傷を与える恐れがある。本明細書で実証されるように、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびに比較的程度は低いがＤＰ−ＭＳＣおよびこれらの分泌細胞外エキソソームは、一般に特定のミクログリア表現型、血管損傷、脱髄および炎症反応を抑制することにより部分的に脳において、放射線誘発損傷に対し保護することが見出された。さらに、それらは、放射線誘発損傷に対し腫瘍および癌幹細胞を感作し得る。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、放射線療法前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、放射線療法と共にまたはその後で対象に投与される。
【０１０２】
用語「糖尿病」は、代謝性疾患糖尿病を指す。いくつかの実施形態において、これは、インスリン依存性糖尿病としても知られる、Ｉ型糖尿病を指す。他の実施形態において、これは、成人発症型糖尿病としても知られる、ＩＩ型糖尿病を指す。
【０１０３】
用語「筋疾患または神経筋疾患」は、対象の筋肉に直接または間接的に影響を及ぼす任意の疾患を指す。いくつかの実施形態において、筋疾患は、筋ジストロフィー、悪液質、サルコペニア、筋損傷および筋炎症性障害のいずれか１つである。筋炎症性障害の例としては、炎症性ミオパシー、筋ジストロフィーおよびＨＩＢＭなどの遺伝性障害、脊髄損傷、ＡＬＳ、脊髄性筋萎縮症、重症筋無力症などの末梢神経および神経筋接合部疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベーカー型筋ジストロフィーから選択される。いくつかの実施形態において、筋ジストロフィーはＤＭＤである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、疾患は筋疾患であり、細胞外小胞、馴化培地、ＥＣＭまたはこれらの組み合わせは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、疾患は筋疾患であり、細胞外小胞、馴化培地、ＥＣＭまたはこれらの組み合わせは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃおよびｍｉＲ−６５６の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、疾患は筋疾患であり、細胞外小胞、馴化培地、ＥＣＭまたはこれらの組み合わせはｍｉＲ−６５６を含む。
【０１０５】
用語「老化」または「老化に伴う障害」は、体内の生理的変性により、対象の年齢特異的な健康要素が持続的に低下することを指す。健康要素をいくつか挙げると、筋肉老化、心血管機能、精神鋭敏性、皮膚弾力性、代謝性、視力鋭敏性、聴力鋭敏性または肺機能を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、老化は、皮膚の老化、筋肉の老化および脳の老化の少なくとも１つを含む。
【０１０６】
用語「神経障害」および「神経疾患」は互換的であり、神経系で生じる疾患のいずれかを指す。いくつかの実施形態において、神経疾患は、脳腫瘍、癌脳転移、パーキンソン病、アルツハイマー病、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、神経損傷、低酸素誘発損傷および放射線誘発損傷から選択される。いくつかの実施形態において、神経疾患は、脳腫瘍、癌脳転移、パーキンソン病、アルツハイマー病、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、神経損傷、放射線誘発損傷、低酸素誘発損傷、血管誘発認知症、自閉症、鬱、脳卒中、脳性麻痺および様々なＣＮＳでの希少疾患から選択される。
【０１０７】
用語「自己免疫疾患」は、免疫応答が対象の健康な細胞を標的にする任意の疾患を指す。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はＭＳ、糖尿病およびクローン病から選択される。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は異常な炎症に関連する。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患はＭＳ、糖尿病、クローン病、ループス、大腸炎およびリウマチ性関節炎から選択される。
【０１０８】
用語「エネルギー恒常性疾患」は、対象においてエネルギー生成が異常または病的である、任意の疾患または状態を指す。いくつかの実施形態において、エネルギー恒常性疾患は糖尿病である。
【０１０９】
用語「消化器疾患」は、消化管の任意の疾患または障害を指す。いくつかの実施形態において、消化器疾患は過敏性腸症候群（ＩＢＤ）、クローン病および大腸炎から選択される。
【０１１０】
用語「同種移植」は、細胞が別の人に由来する場合の、患者への細胞（例えば、神経、神経幹またはグリア細胞）の移植を指す。いくつかの実施形態において、この他の人は、兄弟姉妹、親、子供または他の近親者である。他の実施形態において、他の人は、非血縁ドナーである。いくつかの実施形態において、ＣＨ−ＭＳＣ集団は対象に対して同種である。いくつかの実施形態において、ＣＨ−ＭＳＣ集団は対象に対して自家である。当業者は、胎盤絨毛膜細胞が低免疫原性または非免疫原性であり、したがって自家供給源に由来し得ることを理解するであろう。さらに、エキソソーム、馴化培地またはＥＣＭが投与される場合、これらは低免疫原性または非免疫原性であり、したがって自家供給源に由来し得る。
【０１１１】
本発明は、細胞生成物としてＭＳＣに由来し、かつそこから単離される細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび／または細胞外微小胞）も提供する。ＭＳＣは、上記の任意の種類であり得る。
【０１１２】
エキソソーム、細胞外小胞または細胞外微小胞は、エキソソームが枯渇された血清を含む培養培地中で、またはＯｐｔｉＭＥＭなどの無血清培地中でＭＳＣを増殖し、次いで、超遠心分離によりエキソソームを単離することにより得られ得る。ビーズ、カラム、フィルターおよび抗体に関連する他の方法も利用される。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、エキソソームの収率を増加させるために、低酸素条件下で増殖されるか、または低ｐＨ培地中でインキュベートされる。他の実施形態において、ＭＳＣは、エキソソームの分泌および収率を増加させるために、放射線に曝露される。ＭＳＣはまた、それらのニューロン特性を高め得るスフェロイドとして低接着性プレート上でも増殖できる。エキソソームは次いで、投与用の適当な培地に懸濁され得る。いくつかの実施形態において、特定のＭＳＣ集団が用いられてよく、その集団からのエキソソームも用いられてよい任意の治療方法。
【０１１３】
本発明は、ＭＳＣ、エキソソーム、細胞外小胞または細胞外微小胞の少なくとも１つを使用して、物質を個人に送達する送達方法も提供する。特定のＭＳＣまたはこれらのエキソソーム／細胞外小胞／細胞外微小胞はまた、ウイルス、薬物、プラスミドおよび精製タンパク質に加えて、修飾ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、ｍｉＲＮＡおよび長鎖非コードＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡを送達するために利用できる。この送達は、腫瘍部位または罹患および標的組織にｉｖ、動脈内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、頭蓋内および局所的に注入することにより行われ得る。さらに、エキソソーム／細胞外小胞および細胞外微小胞は、特定のペプチドを用いて、特定の部位または組織および器官に標的化され得る。
【０１１４】
本発明は、特定のＭＳＣ集団を特徴づけることにより、かつそれらに由来する細胞外小胞を使用することにより、それらの影響がより特異的で効率的であり得、不要な作用が少なく、様々な臨床的意味について予測できるという利点を提供する。現在、特定の疾患の治療に対するＭＳＣの選択は、何らかの知識に基づく根拠によるものではない。ＭＳＣは同種供給源から得られ得るため、これらのＭＳＣの使用は、遺伝子障害を有する患者において、または患者を直ちに治療する緊急の必要性があり自家細胞を生成する能力がない状況において有用である。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、ＭＨＣＩＩ発現の欠損により拒絶されない。したがって、これらのＭＳＣは、「そのまま使える」生成物として使用できる。さらに、これらのＭＳＣ集団のエキソソームもＭＨＣＩＩ分子を発現しないので、これらもまた「そのまま使える」細胞外小胞として使用できる。
【０１１５】
本発明はまた、様々な療法中の免疫応答を抑制することにより利点を提供する。修飾ｍＲＮＡ療法および他の療法は、免疫原性であり、したがって、不要な副作用が生じる恐れがある。ＭＳＣは免疫応答をダウンレギュレートするので、ＭＳＣまたはこれらの分泌エキソソーム（特に、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ）と共にこれらの療法を送達することは、標的化された送達と、特定の治療に対する免疫応答を抑制する細胞固有の能力とを組み合わせることができる。
【０１１６】
標的細胞へのミトコンドリアのＭＳＣ移動は、様々な病的状態において損傷を防止し細胞を保護する治療効果を与え得る。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、ＢＭ−、ＡＤ−およびＤＰ−ＭＳＣと比較して、ミトコンドリア移動の増加した量を示す。いくつかの実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、ミトコンドリアに基づく療法を必要とする対象に投与され得る。
【０１１７】
実験用途
別の態様によれば、幹細胞および初代細胞を培養物中で維持する方法であって、
（ａ）幹細胞、初代細胞または両方を提供することと、
（ｂ）幹細胞、初代細胞または両方をＭＳＣ由来の細胞外小胞を含む培養培地中で増殖すること
を含み、
それにより幹細胞、初代細胞または両方を培養物中で維持する、方法が提供される。
【０１１８】
本明細書で使用する「初代細胞」は、生体から直接採取される任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、初代細胞は哺乳類初代細胞である。いくつかの実施形態において、初代細胞は齧歯類またはマウス初代細胞である。いくつかの実施形態において、初代細胞はヒト初代細胞である。初代細胞は血液、脳、心臓、肝臓、肺、膵臓、結腸、胃、上皮、精巣、卵巣および筋肉を含むが、これらに限定されない任意の器官または組織からのものであり得る。いくつかの実施形態において、初代細胞はニューロンである。いくつかの実施形態において、初代細胞はオリゴデンドロサイトである。
【０１１９】
本明細書で使用する「幹細胞」は、１超の細胞種に分化する能力を有する任意の細胞を指す。いくつかの実施形態において、幹細胞は哺乳類幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は齧歯類またはマウス幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。幹細胞は血液、脳、心臓、肝臓、肺、膵臓、結腸、胃、上皮、精巣、卵巣および筋肉を含むが、これらに限定されない任意の器官または組織からのものであり得る。いくつかの実施形態において、幹細胞は多能性または複能性である。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、幹細胞は癌幹細胞（ＣＳＣ）である。
【０１２０】
当業者は、初代細胞および幹細胞が、培養物中で長期間生存しないことを認識するであろう。いくつかの実施形態において、ＭＳＣなしでの培養物中の幹細胞または初代細胞の生存は、最大３継代、５継代、７継代または９継代である。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、維持することは、幹細胞、初代細胞または両方をインビトロで少なくとも８、１０、１２、１４、１５、１６、１８または２０継代培養することを含む。各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態において、維持することは、ＭＳＣからの細胞外小胞を実質的に欠く培養培地中での細胞の生存よりも幹細胞、初代細胞または両方の生存を延長することを含む。いくつかの実施形態によれば、維持することは、幹細胞、初代細胞または両方が対称分裂と非対称分裂の両方を経る能力を保持することを含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、培養培地は、ＭＳＣからの馴化培地を含む。いくつかの実施形態において、培養培地は、ＭＳＣからの細胞外マトリックスを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、幹細胞、初代細胞または両方を初代細胞増殖培地中で増殖することをさらに含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、細胞は健康な細胞である。いくつかの実施形態において、健康な細胞は、癌細胞以外の任意の初代または幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は健康な細胞であり、ＭＳＣはＵＣ−、ＣＨ−、ＡＤ−、ＢＭ−、ＤＰ−ＭＳＣおよびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、細胞は健康な細胞であり、ＭＳＣはＵＣ−、ＣＨ−ＭＳＣおよびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、細胞は健康な細胞であり、ＭＳＣは、ＣＨ−ＭＳＣである。いくつかの実施形態において、幹細胞は癌幹細胞であり、ＭＳＣはＢＭ−、ＡＤ−、ＡＭ−ＭＳＣおよびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、幹細胞は癌幹細胞であり、ＭＳＣはＡＭ−ＭＳＣである。
【０１２３】
亜集団
以下、本明細書で実証されるように、本明細書で定義されるＭＳＣ亜集団は、特定の疾患または状態を治療するために、一般的なＭＳＣ集団に修正できるか、および／またはそれより優れていることが示された。一実施形態において、本明細書に記載のＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、筋または神経疾患において治療効果をさらに支持する表現型を促進するために、以下の：５−アザ、バルプロ酸、ＴＧＦβ阻害剤、ＷＮＴ３タンパク質またはアゴニスト、ＳＨＨ阻害剤、レチノイン酸、メトホルミン、酪酸またはプロスタグランジンＥ２、の１つ以上の存在下で増殖され、次いで、ウマ血清を含む培地中または無血清培地中で維持され得る。いくつかの実施形態において、ＷＮＴ３アゴニストはＣＡＳ８５３２２０−５２−７（ＢＭＬ−２８４とも称される）である。本明細書で実証されるように、これらのＭＳＣ亜集団は、運動ニューロンの生存を支持する高レベルのＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＩＧＦ−１も分泌し、したがって、筋肉内または髄腔内に埋め込まれた場合など、ＡＬＳの治療にも利用できる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、標的組織への投与前に標的組織の存在下でインキュベートされる。組織とのＭＳＣのインキュベーションは、ＭＳＣおよびそれらの細胞外小胞をその組織に対してプライミングし、その標的組織で直接的な再生効果を提供するＭＳＣまたは小胞の能力を増強する。
【０１２５】
本明細書で使用する用語「ＴＧＦ−β阻害剤」は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）に対する生理学的応答を抑制する、任意の化合物、治療薬または薬物を指す。これは、ＴＧＦβシグナル経路の任意の段階を標的とすることにより達成され得る。この抑制は、このシグナルの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の抑制であり得る。多くのよく特徴付けられたＴＧＦβ阻害剤が、当技術分野で知られている。
【０１２６】
本明細書で使用する用語「ＷＮＴ３アゴニスト」は、ＷＮＴ３活性化活性を模倣する任意の化合物、治療薬または薬物を指す。ＷＮＴ３アゴニストの例は、文献から入手でき、いくつかの非限定的例は、組換えＷＮＴ３Ａタンパク質またはＷＮＴ３ＡアゴニストＣＡＳ８５３２２０−５２−７（ＢＭＬ−２８４とも呼ばれる）である。
【０１２７】
本明細書で使用する用語「ＳＨＨ阻害剤」は、ソニックヘッジホッグタンパク質（ＳＨＨ）に対する生理学的応答を抑制する任意の化合物、治療薬または薬物を指す。これは、ＳＨＨシグナル経路の任意の段階を標的とすることにより達成され得る。この抑制は、このシグナルの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の抑制であり得る。多くのよく特徴付けられたＳＨＨ阻害剤が、当技術分野で知られている。
【０１２８】
一実施形態において、本明細書に記載のＭＳＣ集団は、スフェロイドとして、例えば、低接着性プレート中で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中および２％ＦＢＳもしくはヒト血清アルブミン中で、または無血清培地中にてＢＤＮＦの存在下で増殖され得る。いくつかの実施形態において、上記ＭＳＣは、アドレナリン受容体アゴニスト、メトホルミン、レチノイン酸、ＨＤＡＣ阻害剤、ＧＳＫ−３阻害剤、ＴＧＦ−β経路阻害剤またはこれらの組み合わせの存在下でさらに増殖され、低酸素条件下で約１〜２４時間維持される。いくつかの実施形態において、上記増殖は、ニューロンの生存および再生をさらに支持する表現型を促進する。この増殖条件は、ＵＣ−、ＣＨ−、ＢＭ−、ＡＤ−およびＤＰ−ＭＳＣに適用された場合、ニューロンの生存および再生を特に支持する表現型を促進した。本明細書で実証されるように、これらのＭＳＣ亜集団は、様々な神経学的障害の治療のために利用できる。
【０１２９】
本明細書で使用する用語「３Ｄ細胞培養」は、細胞が全３次元で増殖するか、またはその周囲と相互作用することが許される、細胞培養を指す。いくつかの実施形態において、これは、細胞を低接着性プレート、バイオリアクターまたは小さなカプセルで増殖することにより達成され得る。いくつかの実施形態において、３Ｄ培養で増殖された細胞は、増殖するにつれスフェロイドの形状を取る。他の実施形態において、細胞はオルガノイドの形状を取る。本明細書で使用する用語「オルガノイド」はインビトロで増殖する３次元器官原基を指し、それは、それがモデル化する器官に類似した実際の微小解剖構造を示す。
【０１３０】
本明細書で使用する用語「アドレナリン受容体アゴニスト」は、アドレナリン受容体を活性化する任意の化合物、治療薬または薬物を指す。アドレナリン受容体アゴニストの例は文献から入手できる。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「ＨＤＡＣ阻害剤」は、ヒストン脱アセチル化酵素の機能を妨害しかつ、ヒストンを脱アセチル化するそれらの能力を抑制する任意の化合物、治療薬または薬物を指す。この抑制は、脱アセチル化酵素活性の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の抑制であり得る。多くのよく特徴付けられたＨＤＡＣ阻害剤が当技術分野で知られている。
【０１３２】
本明細書で使用する用語「ＧＳＫ−３阻害剤」は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ＡまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼＢのキナーゼ機能を妨害し、標的をリン酸化するそれらの能力を抑制する任意の化合物、治療薬または薬物を指す。この抑制は、脱アセチル化酵素活性の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の抑制であり得る。多くのよく特徴付けられたＧＳＫ−３阻害剤が当技術分野で知られている。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「低酸素状態」または「低酸素条件」は、身体、身体の部位または細胞が適切な酸素供給を欠く状態を指す。いくつかの実施形態において、細胞は、酸素量を厳密に制御できる低酸素制御室で、培養物中で増殖される。低酸素状態において、酸素量は、５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満であり得る。
【０１３４】
一実施形態において、本明細書に記載のＭＳＣ集団は、糖尿病において治療効果をさらに支持する表現型を促進するために、低酸素状態、ＰＤＧＦ、アクチビンＡおよび低グルコースの１つ以上と共にスフェロイドとして増殖され得る。本明細書で実証されるように、これらのＭＳＣ亜集団は、膵島細胞の再生を支持するために利用でき、これらの増殖条件により、集団１、２、３および４ならびにこれらの細胞外小胞からとりわけ有効な細胞が生成される。
【０１３５】
本明細書で使用する用語「低グルコース」は、組織培養に用いられる増殖培地のグルコース濃度が、基準の１グラム／リットル（５．５ｍＭ）またはこれ未満である状態を指す。これは、インビボでの正常血糖値のグルコース濃度またはこれ未満に相当する。低グルコース状態において、グルコース濃度は、１ｇ／Ｌ未満、０．９ｇ／Ｌ未満、０．８ｇ／Ｌ未満、０．７ｇ／Ｌ未満、０．６ｇ／Ｌ未満、０．５ｇ／Ｌ未満、０．４ｇ／Ｌ未満、０．３ｇ／Ｌ未満、０．２ｇ／Ｌ未満、０．１ｇ／Ｌ未満であり得る。
【０１３６】
一実施形態において、本明細書に記載のＵＣ−、ＣＨ−、ＢＭ−およびＤＰ−ＭＳＣは、低酸素状態への曝露と共にアドレナリン受容体アゴニストを含有する培地中で増殖され得る。本明細書で実証されるように、これらのＭＳＣ亜集団およびこれらの細胞外小胞は、脳腫瘍および神経芽細胞種を含む、様々な癌状態の治療に利用できる。
【０１３７】
一実施形態において、本明細書に記載のすべてのＭＳＣ集団は、様々な神経学的障害、放射線誘発損傷、糖尿病、脳腫瘍および脳性麻痺において治療効果をさらに支持するＭＳＣおよびこれらの細胞外小胞の表現型を促進するために、メトホルミンもしくはフェンホルミンを含有する培地中で、ＯｐｔｉＭｅｍもしくは他の無血清培地中で、または血清のみを含むＤＭＥＭもしくはＭＥＭ／Ｆ１２で、またはアドレナリン受容体アゴニストおよび低酸素への曝露と共に増殖され得る。
【０１３８】
一実施形態において、本明細書に記載のＭＳＣのすべての集団は、神経学的状態において治療効果をさらに支持するＭＳＣおよびこれらの細胞外小胞の表現型を促進するために、ｐＨ５．０〜６．０の培地中で短時間（１時間）増殖され、次いでＥＧＦおよびＦＧＦなどの増殖因子を含有する培地中でスフェロイドとして増殖され、次いで、アドレナリン受容体アゴニスト、メトホルミン、フェンホルミン、レチノイン酸またはこれらの組み合わせで処理され得る。低ｐＨで短時間の処理により、ＭＳＣは上記の治療により適したものになり、したがって特定の障害において治療効果をさらに支持する表現型をいっそう促進する。
【０１３９】
本明細書で使用する用語「低ｐＨ」は、増殖培地のｐＨが６．０またはそれ未満である条件を指す。低ｐＨでは、増殖培地は６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０のｐＨを有し得る。
【０１４０】
一実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらの細胞外小胞は、治療効果および生着を増強するために、高圧酸素療法の前に、それと同時にまたはその後に対象に投与される。いくつかの実施形態において、これは、Ｇ−ＣＳＦまたはメトホルミンと共に行われ、いくつかの実施形態において、Ｇ−ＣＳＦまたはメトホルミンなしで行われる。いくつかの実施形態において、ＭＳＣまたはこれらの細胞外小胞と組み合わせた高圧酸素療法は、筋障害、脳および脊椎損傷、神経学的障害、糖尿病および放射線誘発損傷の治療に利用できる。
【０１４１】
本明細書で使用する用語「高圧酸素療法」は、絶対（１００％）酸素の１〜３、１〜２．５、１〜２、１〜１．５、１．５〜３、１．５〜２．５、１．５〜２、２〜３、２．５〜３気圧を指す。
【０１４２】
一実施形態において、ＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣならびにこれらの分泌エキソソームは、腫瘍細胞のＥＭＴおよび幹細胞性を増加し、ＥＭＴのインビトロモデルを生成するためおよび培養物中で腫瘍細胞および癌幹細胞を維持するために利用できる。ミクログリアおよび脳腫瘍細胞のＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣならびにこれらの分泌エキソソームとの共培養は、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の形成の有効性を高め、癌幹細胞表現型を有する細胞に対して分化型腫瘍細胞の脱分化を誘導する。
【０１４３】
一実施形態において、ＭＳＣ集団のいずれかは、骨格、筋疾患、運動および末梢神経疾患ならびに心疾患の治療効果をさらに支持する表現型を促進するために、筋肉または心臓への移植前に、低出力レーザー光、パルス集束超音波、機械刺激衝撃波療法で処理される。
【０１４４】
一実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらのエキソソームは、低出力レーザー光、パルス集束超音波および衝撃波療法により特定の器官に標的化され得る。脳深部刺激は、パーキンソン病、ならびに他の運動障害および精神障害の治療のために、ＭＳＣおよびこれらのエキソソームを脳に標的化するために利用できる。
【０１４５】
本明細書で使用する用語「低出力レーザー光」は、１〜１０００ｍＷの範囲および３９０〜１１００ｎｍの波長での低出力レーザーまたは発光ダイオードによる組織または細胞の治療を指す。治療は、連続波またはパルスであり得る。不活性ガスレーザーおよび半導体レーザーダイオードを含むが、これらに限定されない、様々な光源が用いられ得る。
【０１４６】
一実施形態において、ＭＳＣ集団は、欠損した骨または健の生成において治療効果をさらに支持する表現型を促進するために、３Ｄオルガノイドとして維持され得る。低酸素状態への短時間の曝露と組み合わせたアドレナリン受容体アゴニストを含有する培地中の細胞のさらなる増殖は、脊髄損傷において治療効果をさらに支持する表現型を促進する。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ＭＳＣの任意の集団は、治療的投与前にヒト細胞とインキュベートされ得る。疾患または状態に関連する組織由来のヒト細胞は、その疾患または状態の治療においてＭＳＣの治療効果を高める。例えば、ＭＳＣの、可溶性因子の移動が可能であるヒト筋肉細胞とのインキュベートは、ＭＳＣおよびこれらのエキソソームを筋疾患の治療における良好な治療効果のためにあらかじめ調整する。いくつかの実施形態において、ヒト細胞は筋肉、神経、膵臓、肝臓または心臓組織に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、疾患または状態が存在する任意の組織に由来する。
【０１４８】
治療効果を高めるすべてのこれらの治療に関して、エキソソームは、得られるＭＳＣ亜集団から抽出され得、このＭＳＣ亜集団はまたＭＳＣそれ自体と同じ増強された表現型を有する。ＭＳＣの短時間の照射は、高レベルのエキソソームの生成をもたらす。
【０１４９】
本明細書で使用する用語「短時間の照射」は、エキソソーム抽出前の１〜１０Ｇｙの照射を指す。上記抽出は、照射の１〜２４時間後に行われる。
【０１５０】
一実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびにこれらの細胞外小胞は、椎間板再生の治療に用いられ得る。
【０１５１】
一実施形態において、ＣＨ−、ＢＭ−、ＡＤ−、ＤＰ−ＭＳＣは、骨の損傷の治療のためにＵＣ−ＭＳＣと組み合わせて用いられて骨修復および血管新生をもたらす。
【０１５２】
他の実施形態において、本発明の方法は、追加の化合物とのＭＳＣのインキュベーションと組み合わせてさらに行われ得る。いくつかの実施形態において、このインキュベーションは、５−アザ、バルプロ酸、アドレナリン受容体アゴニスト、ＧＳＫ−３キナーゼ阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＷＮＴ３タンパク質またはアゴニスト、ＳＨＨ阻害剤、レチノイン酸、ＡＴＲＡ、メトホルミン、フェンホルミン、酪酸、コパキソン、ステロイド、タモキシフェン、クルクミンまたはプロスタグランジンＥ２とのインキュベーションであり得るが、これらに限定されない。本明細書で実証されるように、得られるＭＳＣ亜集団は、膵島細胞、ニューロン、筋肉の再生を支持するために利用でき、この増殖条件により、とりわけＵＣ−、ＣＨ−、ＢＭ−、ＡＤ−、ＤＰ−ＭＳＣからの細胞が生成される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｇ−ＣＳＦ治療と組み合わせてさらに行われ得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｇ−ＣＳＦ治療、ならびに以下の：メトホルミン、ステロイド、メラトニン、クルクミン、タモキシフェン、コパキソンまたはパルス集束超音波治療の１つ以上と組み合わせて行われ得る。いくつかの実施形態において、この組み合わせ治療は、他の状態に加えて、筋疾患、神経筋障害、運動および末梢筋肉障害、神経障害、ならびにＡＬＳを治療するために用いられる。
【０１５４】
本明細書で使用する用語「Ｇ−ＣＳＦ治療」は、Ｇ−ＣＳＦの対象への投与を指し、そこで治療は骨髄から内因性ＭＳＣを動員して、損傷または疾患部位に誘導する。
【０１５５】
一実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらの細胞外小胞は、疾患組織からの細胞であらかじめ調整され、次いでＧ−ＣＳＦと共に投与され得る。いくつかの実施形態において、治療は、高圧酸素療法による前治療をさらに含む。
【０１５６】
一実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、ウイルスベクターまたは修飾ｍＲＮＡにより、ＩＧＦ−１、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦなどの栄養因子を過剰発現するように作製され得る。いくつかの実施形態において、これらのＭＳＣまたはこれらの細胞外小胞は、ＡＬＳ、脳および脊椎損傷、放射線誘発損傷および神経障害の治療のために、メトホルミンと共にまたはそれなしで、Ｇ−ＣＳＦまたは高圧酸素療法の前、その後またはそれと一緒に投与され得る。
【０１５７】
一実施形態において、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、膜状ＴＲＡＩＬまたはＣＤ４０Ｌを過剰発現するように作製され得る。いくつかの実施形態において、これらのＭＳＣまたはこれらの細胞外小胞は、脳腫瘍および様々な他の腫瘍の治療のために投与され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本明細書に列挙される疾患および状態の治療のためのＭＳＣの使用は、ヒト療法について記載された様々な治療の組み合わせと共にまたはそれなしで、獣医学的動物において行われ得る。いくつかの実施形態において、ヒトＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームは、これらの動物において用いられ得る。いくつかの実施形態において、ＭＳＣ集団は、獣医学的動物に由来し得、同じ品種からのＭＳＣを使用する必要なしに、異なる種類の動物を治療するために用いられ得る。
【０１５９】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、個々の患者の臨床状態、投与部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重、ならびに医療従事者に知られている他の因子を考慮して、製造品質管理基準に従って投与および服薬される。
【０１６０】
別の態様によれば、疾患または状態の治療で使用するための医薬組成物であって、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤または担体、ならびに
（ａ）ＣＨ−ＭＳＣの単離され富化された集団、
（ｂ）ＣＨ−ＭＳＣ集団由来の細胞外小胞、
（ｃ）ＣＨ−ＭＳＣ集団からの馴化培地、および
（ｄ）ＣＨ−ＭＳＣ集団により分泌される細胞外マトリックス、
の少なくとも１つを含む、医薬組成物が提供される。
【０１６１】
本明細書の目的のための医薬的「有効量」は、当技術分野で知られているような考慮事項により決定される。量は、生存率の改善もしくはより速やかな回復を含むがこれに限定されない改善、または症状および当業者により適切な基準として選択されるような他の指標の改善もしくは排除を達成するのに有効でなくてはならない。
【０１６２】
投与は、身体の任意の所望の部位への注入であり得る。しかし、特定の足場ありまたはなしでの移植または輸血などの、他の投与方法も用いられ得る。用量は、０．１×１０６細胞／ｋｇ〜５×１０６細胞／ｋｇ、または０．１〜１μｇの精製されたエキソソームなど、当業者により決定され得る。ＭＳＣは、当技術分野で公知の方法によりまたは本明細書に記載の方法により任意の起源から採取され得る。ＭＳＣは、本明細書に記載のＭＳＣ亜集団の発現プロファイルを有するように特定の条件下で維持され得る。
【０１６３】
ＭＳＣおよびこれらのエキソソームは、組成物として投与され得、単独で、または有効成分として薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて投与され得ることに、留意すべきである。組成物はまた、経口で、皮下で、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、扁桃内および鼻腔内投与、ならびに髄腔内および点滴技術を含む非経口で投与され得る。組成物の埋め込みも有用である。治療される患者は、温血動物、特に、ヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントおよびビヒクル、ならびに埋め込み担体は、本発明の有効成分と反応しない不活性で、無毒の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入剤を一般に指す。
【０１６４】
用量は、単回用量、または数日間、数週間、数か月間もしくは数年間にわたる複数回用量であり得る。治療は一般に、疾患プロセスの長さおよび薬物の有効性ならびに治療される患者の人種に合った長さを有する。
【０１６５】
本発明の組成物を非経口投与する場合、それは一般に単位投与注入形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で処方される。注入に好適な医薬組成物は、無菌の注入可能溶液または分散液への再構成のための無菌の水溶液または分散液および無菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散培地であり得る。
【０１６６】
適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油またはピーナツ油、およびミリスチン酸イソプロピルなどのエステルなどの非水性ビヒクルも、化合物組成物の溶媒系として用いられ得る。さらに、抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝剤を含む、組成物の安定性、滅菌性および等張性を強化する様々な添加剤が添加され得る。様々な抗菌剤および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより、微生物の作用を確実に防止できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましいであろう。注入可能な医薬品の形態の長期間にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤の使用によりもたらされ得る。本発明によれば、しかし、用いられる任意のビヒクル、希釈剤または添加剤は、化合物と適合しなくてはならない。
【０１６７】
無菌の注入可能溶液は、本発明を実施するのに利用される化合物を、所望により様々な他の成分と共に、必要量の適切な溶媒に組み込むことにより調製され得る。
【０１６８】
本発明の薬理製剤は、様々なビヒクル、アジュバント、添加剤および希釈剤などの任意の適合性のある担体を含有する注入可能製剤で患者に投与され得る。または、本発明で利用される化合物は、徐放性皮下埋め込み物または、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソームおよびマイクロスフェアなどの標的送達系の形態で患者に非経口投与され得る。本発明で有用な送達系の例としては、米国特許第５，２２５，１８２号、第５，１６９，３８３号、第５，１６７，６１６号、第４，９５９，２１７号、第４，９２５，６７８号、第４，４８７，６０３号、第４，４８６，１９４号、第４，４４７，２３３号、第４，４４７，２２４号、第４，４３９，１９６号および第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のこのような埋め込み物、送達系およびモジュールは、当業者によく知られている。
【０１６９】
本発明を、以下の実験実施例について参照することによりさらに詳細に説明する。これらの実施例は、別段の記載のない限り、例示のためだけに提供され、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいずれかおよびすべての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
【０１７０】
本明細書で使用する用語「投与する」、「投与」などは、健全な医療行為において、治療効果を与えるような方式で対象に活性剤を含有する組成物を送達する、任意の方法を指す。本主題の一態様は、本主題の治療有効量の組成物を、それを必要とする患者に経口投与することを提供する。他の好適な投与経路としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内が挙げられ得る。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に依存する。いくつかの実施形態において、投与することは、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与、線条体内投与、頭蓋内投与、動脈内投与および皮下投与の少なくとも１つを含む。
【０１７１】
本明細書で使用する用語「担体」、「賦形剤」または「アジュバント」は、活性剤ではない、医薬組成物の任意の成分を指す。本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、無毒、不活性の固体、半固体、液体の充填剤、希釈剤、封入剤、任意の種類の処方補助剤、または単に塩水などの滅菌水性培地を指す。薬学的に許容される担体として利用できる物質のいくつかの例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末状トラガカント；麦芽、ゼラチン、タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含水；等張性食塩水、リンゲル溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬製剤で用いられる他の無毒の相溶性の物質である。
【０１７２】
本明細書で担体として利用できる物質のいくつかの非限定的例としては、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、粉末状トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質不含水、等張性食塩水、リン酸緩衝液、ココアバター（坐剤ベース）、乳化剤、ならびに他の医薬製剤で用いられる他の無毒の薬学的に相溶性の物質が挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤および潤滑剤、ならびに着色剤、芳香剤、賦形剤、安定剤、抗酸化剤および保存剤も存在し得る。
【０１７３】
任意の毒性でない不活性で有効な担体が、本明細書で企図される組成物を処方するために用いられ得る。この関連で、好適な薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第３版、Ｂｕｄａｖａｒｉら編、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）；ｔｈｅ  ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１０版（２００４）；およびｔｈｅ“Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ，”アメリカ合衆国食品医薬品局（ＦＤＡ）医薬品評価研究センター（ＣＤＥＲ）管理局に記載のものなど、当業者によく知られており、そのすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の組成物に有用な薬学的に許容される賦形剤、担体および希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液およびＤＭＳＯが挙げられる。
【０１７４】
これらの追加の不活性成分、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野でよく知られており、標準的なテキスト、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｍａｎ‘ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｇｉｌｍａｎら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，（２００５）に記載されており、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
担体は合計で、本明細書に提供される医薬組成物の約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％を構成し得る。
【０１７６】
本明細書で使用する特定の用語の定義は、本明細書中に提供される。別段の定義のない限り、本明細書で使用する技術および化学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を一般に有する。当業者は、本明細書に記載されるものと同様または同等の多くの方法および物質を本発明の実施に使用できることを認識するであろう。実際に、本発明は決して記載される方法および材料を限定するものではない。
【０１７７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の文脈による明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」についての言及は、２つ以上の核酸の組み合わせなどを含む。
【０１７８】
本明細書で使用する「約」は、当業者により理解され、それが用いられる文脈に応じてある程度変動する。当業者に明確でない用語が用いられる場合、それが用いられる文脈を考慮すると、「約」は、列挙した値の±１０％までを意味する。
【０１７９】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、限定することを意図するものではない、以下の実施例を精査することにより、当業者に明らかになるであろう。さらに、上記に概説され、以下の特許請求の範囲の項で請求される本発明の様々な実施形態および態様は各々、以下の実施例において実験による裏付けを得る。
【０１８０】
［実施例］
一般に、本明細書で使用する命名法および本発明で利用される検査法は、分子的、生化学的、微生物学的な技術および組換えＤＮＡの技術を含む。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）； “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”第Ｉ〜ＩＩＩ巻Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻Ｃｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｅ．編（１９９４）； “Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版； “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”第Ｉ〜ＩＩＩ巻Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編）、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ‐Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい：これらはすべて、参照により組み込まれる。他の一般的な参照は、この文献全体を通じて提供される。
【０１８１】
物質および方法
間葉系幹細胞培養物：骨髄および脂肪由来ＭＳＣを文献に記載されているように生成した。胎盤由来ＭＳＣおよび臍帯由来ＭＳＣを以下のように生成した：組織をＰＢＳで洗浄する。羊膜および絨毛膜を機械で小片に細分し、それらを２段階酵素消化にかける：細胞懸濁液を次いで、１００μＭのフィルターを通して濾過し、遠心分離した細胞を、１５％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなるＤＭＥＤ培地／栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に播種する。２週間後、プレートを洗浄し、ＲＯＣＫ阻害剤と共に１日インキュベートし、次いで、低酸素条件下で２４時間インキュベートする。細胞を次いで、エキソソームが枯渇された１５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で維持する。場合によっては、細胞をＯｐｔｉＭｅｍ中またはＤＭＤＥＭ＋ヒト血清アルブミン中で維持し、ＦＧＦおよびＥＧＦなどの増殖因子、ならびにＣＨＩＲ９９０２１、ＲｅｐｓｏｘおよびＰａｒｎａｔｅのカクテルを捕捉してもよい。
【０１８２】
ＦＡＣＳ分析を用いて、細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に対して陽性であるが、造血マーカーＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ８０およびＣＤ４５に対して陰性であることが判明した。様々な細胞種を、骨芽細胞、軟骨芽細胞および脂肪細胞に分化するそれらの能力についても調べた。すべてのＭＳＣ調製物の純度は９５％超であった。
【０１８３】
臍帯ＭＳＣ−臍帯を滅菌ＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを含むシリンジを使用して、血管から血栓を除去した。臍帯を切開した。セルスクラッチャーを使用して、上皮細胞（ＰＢＳ１で１０スクラッチ）を除去した。血管を除去した。臍帯およびＷＪを小片（５〜８平方ｍｍ）に切断した。各片をプレート上に置いた。組織の良好な接着のために、プレート全体を１０分間乾燥放置した。培地（ＭＥＭα＋１５％ＦＢＳ，１％ＯＳ，Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ）を添加し、７日間交換せずまたは接触しなかった。
【０１８４】
ＲＮＡの精製：ＲＮＡの精製のために、実験を、培地の除去および溶解液（２５０〜５００μｌ）の添加により終了した。その後、ＲＮＡを、製造業者使用説明書（Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、ＳＩＧＭＡ）に従って精製した。精製されたＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を用いて決定した。２６０：２８０ｎｍの比を使用して、ＲＮＡの純度を評価した。
【０１８５】
リアルタイムＰＣＲ：内部対照として、Ｓ１２ｍＲＮＡのレベルを利用した。データを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００ソフトウェアを用いて分析した。ｍＲＮＡレベルの定量化を、デルタデルタＣｔ（ΔΔＣＴ）法を用いて行った。結果を任意単位で表す。
【０１８６】
ニューロスフェア形成アッセイ：ＧＳＣの自己再生能力を、ＭＳＣ−ＣＭとのインキュベーション後に試験した。スフェロイドを収集し、脱凝集し、次いで、限界希釈法により１００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに撒いた。その１４日後に、１ウェルあたりのニューロスフェアの数を、８つの異なるウェルについて測定した。
【０１８７】
超遠心分離によるエキソソームの調製：細胞培養物から収集した上清画分を、２０００ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。上清を２００００ｇで２０分間遠心分離した。エキソソームを次いで、１０００００ｇで４℃にて７０分間の遠心分離により単離した。エキソソームペレットをＰＢＳ１２ｍｌで洗浄した。これはさらなる超遠心分離後使用できる状態にあった。場合によっては、エキソソームを、密度勾配超遠心分離（１０００００〜２０００００ｇ）により単離した。限外濾過などの、サイズベースの単離技術も利用した。
【０１８８】
マイクロアレイ分析
ｍｉＲＮＡアレイ：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＵ  ＧＥＮＥ１．０ｓｔオリゴヌクレオチドアレイを用いて実験を行った。試料プロセシングをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＷＴプロトコルに従って行った。
【０１８９】
異種移植試験：解離したＧＳＣを、ｆＬＵＣを発現するレンチウイルスベクターで形質導入し、これをヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ）に頭蓋内接種した。ＧＳＣを埋め込んだ２週間後、マウスにＭＳＣ（１×１０６細胞）を移植した。すべての動物を毎日監視し、神経学的欠損の最初の徴候時に屠殺した。マウスの腫瘍増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎ撮像システムを用いて監視した。
【０１９０】
生物発光画像：インビボルシフェラーゼアッセイのために、Ｄ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）をヌードマウスに腹腔内接種して、腫瘍サイズを測定した。生物発光画像を、ＩＶＩＳスペクトルシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて得た。
【０１９１】
統計的分析：結果を平均値±ＳＥで示す。データを分散分析およびスチューデントｔ検定を用いて分析した。
【０１９２】
実施例１
異なる組織由来のＭＳＣのプロファイリング
異なる供給源からのＭＳＣは、様々な臨床モデルにおいて差異的な細胞効果および治療効果を有することが実証された。さらに、各供給源からのＭＳＣは、各種亜集団の混合物を表す。より特異的で効率的な臨床応用のために特定の特性および影響を有する異なる供給源および亜集団を特徴付けるために、これらの細胞の様々なパラメーターを比較および分析した。
【０１９３】
８つの異なる組織：骨髄（ＢＭ）、胎盤絨毛膜（ＣＨ）、胎盤羊膜（ＡＭ）、脂肪（ＡＤ）、臍帯（ＵＣ）、歯髄（ＤＰ）、剥離脱落歯（ＤＤ）、歯小嚢（ＤＦ）からのＭＳＣを調べた。
【０１９４】
異なる供給源に由来したＭＳＣ間で主な違いが見出され、またその各組織は様々なプロファイルのマーカーにより特徴付けられる異なる亜集団を含有し得た。例えば、腫瘍増殖の促進または阻害に対する特定のＭＳＣの作用に関して、異なるｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡが異なるＭＳＣにより発現されおよび分泌されることが、驚くべきことに判明した。
【０１９５】
サイトカインおよび増殖因子に加えて、ＭＳＣはエキソソームも分泌する。これらの細胞外小胞はそれ自体ｍｉＲＮＡおよび非コードＲＮＡを含有する。これらは可溶性タンパク質も含有し得、さらに、その外膜内にタンパク質表面マーカーを有することが判明した。
【０１９６】
実施例２
ＭＳＣは共通の発現プロファイルを有する
ＭＳＣおよびこれらのエキソソームをさらに分析して、特有の発現プロファイルを得た。
【０１９７】
フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、ＭＳＣの予想される富化を可能にし、かつ無傷細胞および特定の細胞表面抗原を試験するために利用できる。ＭＳＣの表面で発現する細胞表面タンパク質（すなわち、表面マーカー）を同定するために、ハイスループットフローサイトメトリースクリーニングを行い、これにより、５つの異なる種類のＭＳＣ（ＵＣ、ＣＨ、ＢＭ、ＡＤおよびＤＰ）で特異的に発現される細胞表面抗原を同定できた。各ＭＳＣ集団を３２４の表面マーカーについて分析した。
【０１９８】
３２４個の調査された表面マーカーの５１個は、すべてのＭＳＣで検出された。これらは、以下の：ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３６、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５０、ＣＤ５１/６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７３、β２マイクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＨＬＡ−Ａ２およびＳＴＲＯ１であった。
【０１９９】
すべてのＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ４αまたはＣＤ１９およびＨＬＡクラスＩＩについて陰性であった。これらの細胞から分泌されるエキソソームは、上記マーカーについて同様に陽性または陰性であることが予想される。
【０２００】
ＭＳＣ亜型の違いをさらに調査するために、イルミナチップを用いて遺伝子発現アレイも行った。これらの５つの組織から生成されたＭＳＣからの約３５０００遺伝子の発現を分析した。異なる供給源からのＭＳＣにより分泌される増殖因子の比較試験を行い、異なるＭＳＣから異なるレベルで発現される因子を同定した。ＭＳＣは、様々な増殖因子の分泌を介するパラクリン効果によりそれらの効果のいくつかを発揮する。異なる種類のＭＳＣによる異なる因子の分泌を、２つの手法を用いて分析した。第１に、分泌タンパク質を、遺伝子アレイ分析を用いて抽出した。第２の手法では、タンパク質の分泌を、ＭＳＣ上清について抗体アレイを用いて測定した。上清をＭＳＣ培養物から収集し、それらを、特定の抗体を用いて５０の増殖因子およびサイトカインについて分析した。
【０２０１】
非コードＲＮＡ、分泌タンパク質および表面タンパク質の大部分は、様々なＭＳＣおよびそれらのエキソソームで差異的に発現した。これらの実験結果を表１〜８に要約する。これらのＭＳＣ集団は、特有のｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび表面タンパク質の発現により、ならびに特有の分泌タンパク質により互いに区別され得る。実際に、少なくとも１つの特有の表面タンパク質が、ＵＣ−、ＣＨ−、ＢＭ−、ＡＤ−およびＡＭ−由来のＭＳＣの各々で見出され、これはＦＡＣＳ、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズソーティングまたは任意の他の免疫同定法による直接同定および単離を可能にする。  
【０２０２】
実施例３
各ＭＳＣおよびエキソソーム亜型は特有の発現プロファイルを有する。
ＵＣ−ＭＳＣを、表１に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２０３】
【表１】
2019535691.tif 000003
【０２０４】
ＣＨ−ＭＳＣを、表２に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２０５】
【表２】
2019535691.tif 000004
【０２０６】
ＢＭ−ＭＳＣを、表３に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２０７】
【表３】
2019535691.tif 000005
【０２０８】
ＡＤ−ＭＳＣを、表４に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２０９】
【表４】
2019535691.tif 000006
【０２１０】
ＡＭ−ＭＳＣを、表５に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２１１】
【表５】
2019535691.tif 000007
【０２１２】
ＤＰ−ＭＳＣを、表６に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２１３】
【表６】
2019535691.tif 000008
【０２１４】
ＤＤ−ＭＳＣを、表７に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２１５】
【表７】
2019535691.tif 000009
【０２１６】
ＤＦ−ＭＳＣを、表８に見出される特有の発現プロファイルにより特徴付けた。
【０２１７】
【表８】
2019535691.tif 000010
【０２１８】
実施例４
すべてではないがいくつかのＭＳＣ集団で共有される特性
各集団で見出された特定の因子、およびすべてのＭＳＣ集団で共有されることが見出された共通の因子に加えて、すべてではないがいくつかのＭＳＣ集団で共有される因子の発現を特徴付けた。
【０２１９】
ＣＨ−およびＢＭ−ＭＳＣは、ＣＤ５３表面発現を共有することが判明した。ＵＣ−およびＡＤ−ＭＳＣは、ＣＤ６表面発現を共有することが判明した。ＣＨ−およびＡＤ−ＭＳＣは、ＣＤ４０表面発現を共有することが判明した。ＡＤおよびＡＭ−ＭＳＣは、ＣＤ５０表面発現を共有することが判明した。２超のＭＳＣ集団で共有された表面マーカーは、表６に見出され得る。
【０２２０】
【表９】
2019535691.tif 000011
【０２２１】
５つの集団で見出された富化されたｍｉＲＮＡは、表１０に見出され得る。
【０２２２】
【表１０】
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【０２２３】
５つの集団で見出された富化されたタンパク質は、表１１に見出され得る。
【０２２４】
【表１１】
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2019535691.tif 000019
【０２２５】
実施例５
異なるＭＳＣ集団は、特定の疾患を治療するのに適している。
インビトロおよびインビボ試験を行い、特定のＭＳＣ集団が、他の理由の中でも特にそれらの分泌因子および非コードＲＮＡにより様々な疾患の治療に最適であることが判明した。具体的には、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、膠芽腫、脳転移、多発性硬化症、筋疾患、老化防止、腫瘍、放射線誘発損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療に対して、ならびに移植細胞の拒絶、老化および放射線に関連する状態において優れた治療効果を示した。ＵＣ−、ＣＨ−およびＡＤ−ＭＳＣは、糖尿病および筋疾患の治療に対して優れた治療効果を示した。
【０２２６】
これらの集団由来のエキソソームは、これらが由来する細胞により効果的に治療された同じ状態を治療するのに有効であることが判明した。さらに、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣからのエキソソームは、同種であり（それらが由来する細胞に類似している）、その表面膜でＭＨＣＩＩを発現しないことが判明した。したがって、これらの細胞およびエキソソームは、有効な「そのまま使える」治療薬であり、同種投与された場合、拒絶されない。
【０２２７】
実施例６
異なるＭＳＣ集団は癌に対して差異的な効果を発揮する。
ＡＤ−、ＡＭ−およびＢＭ−ＭＳＣは、神経膠腫細胞および神経膠腫幹細胞（ＧＳＣ）の自己再生および間葉系マーカーを増加させる。対照と比較した自己再生能力を、図１Ａに示す。ＡＤ−、ＡＭ−およびＢＭ−ＭＳＣはこれらの細胞の移動も増加させる。それらのエキソソームも同様の作用を及ぼす（図１Ｂ）。対照的に、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームは、神経膠腫細胞および神経膠腫幹細胞の自己再生を低下させた。間葉系および幹細胞性の５つのマーカーの４つは、ＡＤ−、ＡＭ−およびＢＭ−ＭＳＣでの治療後により高く、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣでの治療後により低いことが判明した（図１Ｂ）。ＤＰ−ＭＳＣは、効果は低いが、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣと同様に挙動する。ＧＳＣの異種移植片を受け次いでＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣまたはそれらのエキソソームで治療された動物は、生存の延長（図２Ａ）および腫瘍量の減少を示した。対照的に、ＢＭ−ＭＳＣでの治療は、生存に効果がなく、ＡＤ−ＭＳＣおよびＡＭ−ＭＳＣでの治療は、実際に生存を低下させた（図２Ａ）。同様に、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームは、これらの同じ抗腫瘍効果を発揮し生存を増加させ（図２Ｂ）、一方でＡＤ−、ＢＭ−およびＡＭ−ＭＳＣからのエキソソームはすべて生存を低下させた（図２Ｂおよび２Ｃ）。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、共通のエキソソーム腫瘍抑制遺伝子ｍｉＲＮＡを共有する。これらのｍｉＲＮＡは、細胞それ自体においては非常に低レベルでしか見出されない場合が多かったが、エキソソームにおいては高レベルで存在した。これらのＭＳＣにおけるこれらのエキソソームｍｉＲ、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−６５６の２つのサイレンシングは、ＧＳＣの自己再生および移動に対するそれらの阻害効果を無効にする。
【０２２８】
他の形態の癌を治療するためのＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームの使用も調査した。様々な組織由来の癌細胞株をトランスウェルプレートに撒き、ＵＣ−またはＣＨ−ＭＳＣのいずれかを他のウェルのトランスウェルに撒いた。癌細胞死の割合をトランスウェル培養の３日後に求めた。いずれのＭＳＣ集団も、癌細胞死に対して明白な効果があったが、いくつかの癌細胞株に対しては、１つの集団が他よりも明らかに優れていた。ＵＣ−ＭＳＣは、乳癌、肺癌、神経芽細胞腫および膵臓癌細胞で優れた効果を有した。一方でＣＨ−ＭＳＣは、結腸癌、前立腺癌、肺癌転移、乳癌転移、神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、髄芽腫および頭頚部癌細胞で優れた効果を有した。細胞をトランスウェルで増殖したため、癌細胞死誘発作用に関与するのは可溶性因子、おそらくエキソソームである。実験の結果は表１２に要約される。
【０２２９】
【表１２】
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【０２３０】
ＧＢＭおよび他の癌に対する治療の１つは、放射線である。２つの異なる初代神経膠腫由来のＧＳＣをＵＣ−ＭＳＣ、それらのエキソソームのいずれか、もしくは放射線単独、またはＭＳＣ／エキソソームと放射線の組み合わせで、トランスウェルプレートで増殖した（図２Ｄ）。細胞またはそれらのエキソソームを放射線と組み合わせた場合、相乗効果が観察された。同じ試験を、肺癌および乳癌由来の脳転移からのＣＳＣで行った（図２Ｅ）。再び、細胞またはそれらのエキソソームならびに照射は、ＣＳＣ死に対して相乗効果を有した。同様に、ＣＳＣの自己再生を測定するアッセイを行ったとき、調査されたすべての３つの癌は、細胞またはエキソソームを照射と組み合わせた場合に、より一層低下された自己再生を示した（図２Ｆ）。同様の結果が、ＣＨ−ＭＳＣおよびＤＰ−ＭＳＣで観察された。４Ｇｙの放射線を併用療法として使用した。
【０２３１】
しかし、放射線は、認識欠損を引き起こす副作用である神経細胞損傷を誘発するので、乳癌を治療するための放射線の線量および有用性は限られている。ＵＣ−、ＤＰ−およびＣＨ−ＭＳＣは、抗腫瘍効果を発揮するだけでなく、一部にはＭ２ミクログリア表現型の抑制により、それらは放射線誘発損傷に対する保護も提供する。初代ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを、各種ＭＳＣと共培養し、次いで、４Ｇｙの放射線に曝露した。初代細胞の生存を５日後に測定した（図２Ｇ）。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびに比較的程度は低いがＤＰ−ＭＳＣは、放射後に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイト死の数を減少させた。重大なことに、放射線に対し癌細胞を感作させたのはこれらの細胞集団であった（図２Ｄ〜Ｆ）。ミクログリアもまた、ＵＣ−ＭＳＣと共にまたはなしのいずれかで培養し、次いで放射線に曝露した。照射は、Ｍ２表現型の特質である炎症誘発性ＩＬ−６およびＩＦＮγの発現を増加させ、ＵＣ−ＭＳＣとのトランスウェル共培養は、Ｍ１抗炎症性表現型の特質であるＩＬ−１０レベルを増加させた（図２Ｈ）。照射と組み合わせたＵＣ−ＭＳＣとの共培養は、サイトカイン３つすべての発現を増加させたが、ＩＬ−６の増加は、放射線単独後の半分ほどで、ＩＦＮγの増加も低減された。同様の効果が、ＣＨ−ＭＳＣおよびそれらの細胞由来のエキソソームで観察された。これらの結果は、健康な細胞の生存が、Ｍ２ミクログリア表現型の抑制によるものであり得、さらに、共培養がトランスウェルプレートを介したため、ＭＳＣからのエキソソームが、少なくとも一部のＭＳＣの作用を介在する可能性があることを示唆する。
【０２３２】
実施例７
異なるＭＳＣ集団は、脳転移に対して異なる効果を発揮する。
脳転移の異種移植片を、肺腫瘍由来の脳転移の新鮮な腫瘍試験片から得た癌幹細胞から生成した。腫瘍細胞を埋め込んだ２１日後、異なるＭＳＣ集団を同側半球（ｎ＝８）に注入し、動物を屠殺するまで追跡した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、腫瘍サイズを減少させ、マウスの生存を統計的に有意に増加させた。ＢＭ−ＭＳＣは、腫瘍サイズまたは生存に対して顕著な効果がなかった。対照的に、ＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣは実際に、腫瘍サイズを増加させ、生存を減少させた。これは、ＡＭ−ＭＳＣで顕著であった（図３）。
【０２３３】
ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらのエキソソームのみが、腫瘍量を減少させ、生存を増加させた。ＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣは、生存を約５日間減少させ、腫瘍量を３０％程度増加させた。このインビボデータは、ＵＣ−ＭＳＣおよびこれらのエキソソームが、転移性細胞の細胞死および自己再生に対して有益な効果を有することを示す、上記の結果を支持する（図２Ｄ〜２Ｅ）。
【０２３４】
さらに、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣにより分泌されるエキソソームの頭蓋内または鼻腔内送達も、動物の生存を延長し、腫瘍量を減少させることが判明した。また、これらのＭＳＣおよびエキソソームでの治療後の腫瘍組織は、細胞増殖の減少を示す低レベルのＰＣＮＡ、および低レベルの間葉形質転換マーカーであるフィブロネクチンおよびマウスＳＭＡを発現することが判明した。
【０２３５】
実施例８
異なるＭＳＣ集団は、糖尿病に対して異なる効果を発揮する。
ＮＯＤマウス（糖尿病のマウスモデル）に、マウスのグルコースレベルが４５０ｍｇ／ｄＬ超に到達したとき５０万個の異なるＭＳＣ集団を移植した。血中グルコースレベルを２日おきに分析した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、血中グルコースレベルの顕著な低下を誘発した、一方でＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣ（データなし）は、効果が低かった（図４Ａ）。同様の結果が、異なるＭＳＣ集団に由来するエキソソームで得られた（図４Ｂ）。しかし、この効果は、細胞の効果よりも低かった。エキソソームを静脈内に注入し、グルコースレベルを１０日後に再び測定した。
【０２３６】
インビボ撮像により、投与したＭＳＣすべてが膵臓に移動したが、ＢＭ−ＭＳＣは、グルコースレベルの低下に対して顕著な効果を発揮しなかったことも判明した。また、異なる集団からのエキソソームも注入したところ、尾静脈に注入したエキソソームは、グルコースレベルのいくらかの低下をもたらしたが、より低いレベルであったことが判明した。この場合も同様に、最も顕著な効果は、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣから得たエキソソームにより誘発された。
【０２３７】
実施例９
異なるＭＳＣ集団は、筋疾患に対して異なる効果を発揮する。
筋疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に対するＭＳＣおよびＭＳＣエキソソーム治療薬の効果を、ＤＭＤのＭＤＸマウスモデルを用いて調べた。クレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）レベル（ＤＭＤの診断マーカー）を、大腿四頭筋への筋肉内投与による異なるＭＳＣ集団の移植の４週間後に、ＭＤＸマウスで分析した。ＣＰＫの発現は、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣでの治療後に５０％超減少した。ＡＤ−ＭＳＣもＣＰＫレベルを統計的に有意な量減少させたが、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣの程度ではなかった。筋組織をまた、ＲＴ−ＰＣＲにより、炎症誘発性サイトカインであるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの発現について分析した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣのみが筋組織の炎症を低減し、サイトカインの発現は５０％超減少された。神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）の発現は、ＭＤＸマウスでの筋再生のマーカーである。ＮＣＡＭの発現レベルを、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームの移植後に、ＭＤＸマウスの大腿四頭筋での免疫染色により分析した。いずれの種類のエキソソームも筋再生を増加させ、ＮＣＡＭの陽性細胞の数は、４倍を超えた。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、炎症性サイトカインの減少に加えて、衛星細胞におけるＮＣＡＭの発現に対しても明白な効果を発揮した。この効果は、ＢＭ−およびＡＭ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームの効果を上回るものであった。
【０２３８】
同様に、コラーゲンＩのレベルを分析したとき、明白な結果が観察された。大腿四頭筋への筋肉内投与を介するＣＨ−ＭＳＣの投与は、マウスの隔膜および心筋でのコラーゲンＩの発現を低下させた（図５Ａ）。同じ方法で投与したこれらの細胞からのエキソソームは、同じ結果を有した（図５Ａ）。コラーゲンＩの発現とユートロフィンの発現の間には逆相関が存在するので、ユートロフィンの発現も測定した。ユートロフィンの発現は、ＣＨ−ＭＳＣで治療したＭＤＸマウスの大腿四頭筋および心臓組織で増加した（図５Ｂ）。ＣＨ−エキソソームもユートロフィンの発現を増加させた（図５Ｂ）。
【０２３９】
培養物中で筋芽細胞に対するＭＳＣエキソソームの効果を評価するために、さらに実験を行った。個々の筋芽細胞は、筋組織として機能するために、融合して筋管のシンシチウムを形成する必要がある。健康者およびＤＭＤ患者からの筋芽細胞を、５つのＭＳＣ集団およびこれらのエキソソームを含むトランスウェル培養物中で増殖し、筋管形成の程度である融合指数を求めた。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームはすべて、健康な筋芽細胞とＭＤＭ筋芽細胞の両方の筋管形成を増強した。ＡＤ−ＭＳＣは、筋管形成を増強できたが、これは健康な筋芽細胞においてのみであった。ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の発現は、健康なＣ２Ｃ１２マウス細胞をＣＨ−およびＵＣ−ＭＳＣと共に培養した後に大幅に増加したが、他のＭＳＣではわずかに増加したか（ＡＤ）または全く増加しなかった（ＢＭ）（図５Ｃ）。同様の結果がヒト筋芽細胞でも観察された（図５Ｄ）。また効果は、ＣＨ−ＭＳＣからのエキソソームを使用した場合さらにより顕著であった（図５Ｅ）。骨格筋のマーカーであるミオシン２（ＭＹＨ２）の発現レベルを、ウェスタンブロットにより、対照およびエキソソームで治療した筋芽細胞で測定した。ＭＹＨ２は、対照においてまたはＢＭ−ＭＳＣ由来エキソソーム培養の後では検出されなかったが、他の４つの集団のエキソソームとの培養の後では存在した。ＭｙｏＤは、筋肉修復中に衛星細胞中に蓄積する。ＭｙｏＤの発現を、５つのＭＳＣ集団のエキソソームとの培養後にヒト衛星細胞で分析した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームはＭｙｏＤ発現を誘発した。健康な筋芽細胞および健康な衛星細胞に対するこれらのエキソソームの効果は、とりわけＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣからのエキソソーム（およびそのＭＳＣ）が、他の筋疾患の治療にも効果があり得ることを示唆する。
【０２４０】
ＣＨ−ＭＳＣのエキソソームは、高レベルのｍｉＲ−２９ファミリーのマイクロＲＮＡを含有する。また、ＢＭ−ＭＳＣはそれ自体高レベルのｍｉＲ−２９ファミリーのｍｉＲを含有するが、これらの細胞のエキソソームは低レベルでしか含有しなかった。ＤＭＤ患者からの筋肉細胞培養物中のｍｉＲ−２９ファミリーの発現を調べ、その発現は、健康なドナーから得た筋培養物の発現と比較して顕著に低いことが判明した。低レベルのｍｉＲ−２９ファミリーはＤＭＤ表現型の獲得に関連しており、かつこれらのｍｉＲの過剰発現はＭＤＸマウス由来の筋芽細胞の分化を促進したため、ＣＨ−エキソソームによるｍｉＲ−２９の移動はＣＨ−ＭＳＣにより誘発されるＤＭＤ由来の筋芽細胞のさらなる分化を介在し得ると仮定された。
【０２４１】
さらに、ＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームは、ＤＭＤ筋芽細胞の線維形成特性を低下できることが判明した。ヒトＤＭＤ筋芽細胞を、ＣＨ−エキソソームと４８時間インキュベートし、コラーゲン１Ａおよびコラーゲン２Ａの発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。ＣＨ−エキソソームは、２つのコラーゲンアイソフォームの発現を減少させた。さらに、ＣＨ−エキソソームはこれらの細胞におけるＴＧＦ−βの発現を減少させたことも判明した。
【０２４２】
同様の結果が、カルディオトキシンでの治療後の損傷した筋肉についても得られた。５つのＭＳＣ集団から得たエキソソームを筋肉内に注入し、ＤＭＤモデルで生じたのと同様の結果が得られた。ＭＳＣまたはこれらの分泌エキソソームの大腿四頭筋への注入は、隔膜における細胞の線維化も低減したことが判明した。さらに、すべてのＭＳＣ集団およびこれらの分泌エキソソームは、各組織に対して程度は異なるが、注入された大腿四頭筋、隔膜および心筋においてユートロフィンの発現を顕著に増加させた。ユートロフィンは、神経−筋肉接合部で見出され、適切な筋機能に必須である。
【０２４３】
実施例１０
異なるＭＳＣ集団は多発性硬化症に対して異なる効果を発揮する。
自己免疫、神経炎症、脱髄疾患、多発性硬化症（ＭＳ）に対する異なるＭＳＣおよびこれらのエキソソームの効果を試験するために、ＭＳモデルにミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）と共に百日咳毒素を注入したマウスを使用した。５つの異なるＭＳＣ集団およびこれらのエキソソームを、マウスの尾静脈に注入した。マウスを、以下の評点方式を用いて麻痺レベルについて臨床的に評価した：「０」正常なマウス、疾患の明白な徴候なし；「１」−尾の弛緩または後肢の脱力、両方ではない；「２」−尾の弛緩および後肢の脱力；「３」−後肢の部分麻痺；「４」後肢の完全麻痺；「５」−瀕死状態、ＥＡＥによる死亡：人道的理由により屠殺。
【０２４４】
未治療の動物は、疾患誘発の６日後すでに疾患の進行を示し始め、約１４日後にスコア３の疾患レベルに到達した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびに比較的程度は低いがＢＭ−ＭＳＣは、疾患の発症を１３〜１５日目に遅延させた。しかし、ＢＭ−ＭＳＣは、初期の段階でおよびわずかな程度でしか疾患の重症度を低減しなかった。対照的に、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、疾患の発症と進行の両方を顕著に低減し、これらの細胞で治療したマウスは、最高の臨床スコア１〜２を示した。これらの集団から分泌されるエキソソームも、比較的程度は低いが同様の効果を示した。
【０２４５】
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）注入を用いて、ＭＳをさらにモデル化した。ＭＯＧ注入による誘発の５日後、ＵＣ−もしくはＣＨ−ＭＳＣまたはこれらのエキソソームをマウスに静脈内投与し、臨床スコアを誘発後１５日目に評価した。両方の種類の細胞およびこれらのエキソソームは、マウスの臨床スコアの改善で同等の成功を収めた（図６）。
【０２４６】
実施例１１
異なるＭＳＣ集団は、老化に対して異なる効果を発揮する。
Ｄ−ガラクトース誘発老化マウスモデル（１０００ｍｇ／ｋｇ、皮下）を利用して、老化に対するＭＳＣの効果を調査した。投与後２週間で、マウスにＭＳＣ（１０６細胞）または５つの集団からのエキソソームを注入し、４週間後、マウスを屠殺し、皮膚組織を採取し、真皮厚およびコラーゲン定量について分析した。ＭＳＣ集団のいずれかでのマウスの治療は、Ｄ−ガラクトースの老化作用をある程度抑制した（厚さおよびコラーゲン発現の増加）ことが判明した。しかし、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、最も顕著な効果を誘発した。同様の結果が、これらの集団から分泌されるエキソソームで得られた。
【０２４７】
実施例１２
異なるＭＳＣ集団は、ニューロン疾患および損傷に対して異なる効果を発揮する。
ＳＯＤ１／Ｇ９３Ａラット（筋萎縮性側索硬化症［ＡＬＳ］のモデル）にＭＳＣ（０．５×１０６細胞）を疾患発症後９０日目に埋め込み、ニューロンの生存を分析した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣのみが、細胞の生存を顕著に増加させた（図７Ａ）。同様の結果が、これらの集団のエキソソームで得られた（図７Ｂ）。
【０２４８】
生後５か月の発症前ＡＰＰ／ＰＳ１マウスを利用して、アルツハイマー病をモデル化した。ＭＳＣ（１×１０６細胞）またはエキソソームをマウスに投与した。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、次いでＢＭ−ＭＳＣが最も強力な治療効果を発揮した。具体的には、認識指数％を野生型マウス、およびＰＢＳ治療対照マウスについて求めた。指数スコアはＰＢＳ治療ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて４７％減少した。しかし、ＣＨ−ＭＳＣで治療したマウスではわずか１９％減、ＣＨ−ＭＳＣエキソソームで治療したマウスではわずか２４％減であった。
【０２４９】
パーキンソン病（ＰＤ）に対するＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームの効果を試験するために、６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）をマウスの線条体内に注入し、疾患をモデル化した。ＵＣ−もしくはＣＨ−ＭＳＣまたはこれらのエキソソームを次いで線条体内または鼻腔内のいずれかに注入した。治療の２週間後、マウスを、アポモルフィン誘発回転試験を用いて分析した。そこでの低いスコアは、ＰＤ関連の脳病変が少ないことを示す。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらのエキソソームでの治療はすべて、このＰＤ関連の症状の顕著な改善をもたらした（図７Ｃ）。
【０２５０】
ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームを、レット症候群を治療するそれらの能力を評価するためにＭｅＣＰ２サイレントニューロンおよび対照ニューロンとトランスウェルプレートで共培養した。ＭｅＣＰ２サイレントニューロン（レット症候群は、ＭｅＣＰ２遺伝子の突然変異により生じる）は、共培養なしで増殖した対照ニューロンよりも５９％短いニューロン末端を有した。対照ニューロンのＭＳＣまたはこれらのエキソソームとの共培養は、軸索末端数を４０％程度増加させた（図７Ｄ）。サイレントニューロンにおいて、増加はさらに大きく、ＵＣ−とＣＨ−ＭＳＣの両方で末端が８５％超増加した。これらの細胞からのエキソソームは、低いが同様の効果を有した。
【０２５１】
脊髄損傷を治療するＣＨ−ＭＳＣおよびこれらのエキソソームの能力を試験するために、腹部大動脈を左腎動脈直下で１５分間遮断することにより、野生型ラットに脊髄の再灌流損傷を与えた。損傷したラットを次いで、ＰＢＳ  ＣＨ−ＭＳＣ（１×１０^７細胞）で治療するか、またはこれらのエキソソームを脊椎のＬ５〜Ｌ６セグメントに注入した。４日後にラットの下肢の動きを、バッソ、ビーティーとブレスナハン（ＢＢＢ）運動評価尺度法を用いて評価した。無傷のラットも対照として評価した。ＢＢＢ評価尺度は、挙動結果を測定するため、および脊髄損傷後の治療を評価するための十分に確立された識別法である。評価尺度は０〜２１の範囲であり、高いスコアは優れた動きを示す。採点は、以下の分析結果により要約され得る：
０〜７：分離した関節の動き、後肢の動きほぼなしまたはなし
８〜１３：協調性のない足踏み間隔
１４〜２１：前後肢の協調
【０２５２】
図７Ｅから分かるように、無傷のマウスは、ＢＢＢ評価尺度で１８．６の健全なスコアを有したが、ＰＢＳのみで治療した対照の損傷マウスは、平均スコア３．４６の最も低い分類に記録された。ＣＨ−ＭＳＣで治療したマウスは、平均スコア８．３５で運動の著しい改善を示し、一方でエキソソームでの治療は、若干低いが同等の効果を有した。
【０２５３】
実施例１３
異なるＭＳＣ集団は、放射線および低酸素誘発損傷から保護する。
５つのＭＳＣ集団、またはこれら由来のエキソソームを、脳の照射の１日前にマウスに投与した。未成熟ニューロン（ダブルコルチンに対して陽性）の数を照射およびＭＳＣの投与の３０、６０および９０日後に分析した（図８Ａ）。エキソソームの投与後、未成熟ニューロンを６０日目でのみ測定した（図８Ｂ）。未成熟ニューロンの密度は、照射後に低下し、その作用は経時的により深刻になった。ＵＣ−、ＣＨ−およびＤＰ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームは、未成熟ニューロンに対して保護効果を有し、これらのニューロンの密度は、試験したすべての時点で統計的に有意に増加した。
【０２５４】
照射の１〜６日後の細胞の投与は、活性ミクログリア細胞の増加および未成熟ニューロンの数の減少から判断されるように、依然として放射線誘発損傷から脳を保護できた。照射の１日前に集団を投与した場合に見出されたことと同様に、ＵＣ−、ＣＨ−およびＤＰ−ＭＳＣは、最も強力な保護効果を示した。しかし、ＢＭ−およびＡＤ−ＭＳＣも、照射後に投与したとき、ある程度の効果を発揮した。対照的に、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームだけが、照射後投与したとき顕著な保護効果を発揮した。興味深いことに、ＭＳＣ集団およびこれらの分泌エキソソームはまた、３週間で週１回送達される２０Ｇｙの全線量で脳を照射したとき、放射線誘発損傷から脳を保護した。これらの結果は、図２Ｇに示すものと一致する。
【０２５５】
初代ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを、ＣＨ−ＭＳＣまたはこれらのエキソソームと共培養し、次いで、厳しい低酸素条件（空気０．４７Ｌ／分およびＮ２  ４．２３Ｌ／分の流速）に暴露した。初代細胞の細胞死を３日後に測定した（図９）。ＣＨ−ＭＳＣおよびこれらのエキソソームは、照射後の死滅したニューロンおよびオリゴデンドロサイトの数を減少させた。
【０２５６】
実施例１４
異なるＭＳＣ集団は、移植中の拒絶から細胞を保護する。
同種神経幹細胞、ニューロン、星細胞、ミクログリアおよびオリゴデンドロサイトの投与は、様々なニューロン障害の代替療法として近年利用されてきた。しかしこれらの手順は、細胞の拒絶および生着障害の問題により複雑である。これらの細胞のｔＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびに比較的程度は低いがこれらの分泌エキソソームとの共移植は、同種組織の拒絶を最小限に抑え、生着を改善し、細胞アポトーシスを減少できることが判明した。これらの実験において、異なる遺伝子背景を有するヒト起源またはマウスのいずれかからの、ＧＦＰで標識された同種神経細胞を、レシピエントマウスに移植した。同種モデルＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＦＶＮ／Ｎ  Ｈ２マウスからのＧＦＰで標識された初代星細胞を投与した。マウスまたはヒト星細胞を単独で、またはＵＣ−もしくはＣＨ−ＭＳＣ（各２×１０５）と共に頭蓋内から脊髄に注入し、動物を３週間維持した。マウスを屠殺し、脊髄中のＧＦＰ標識細胞の割合を決定した。ヒトとマウス両方のＭＳＣが、脊髄にごく少量広がったことが判明した（３±０．４６細胞／ｃｍ２）。対照的に、両方の星細胞（マウスまたはヒト）のＵＣ−またはＣＨ−ＭＳＣのいずれかとの共投与は、生存する標識星細胞の数を顕著に増加した（ＵＣ−ＭＳＣでは１９±２．９、ＣＨ−ＭＳＣでは２３±３．７８）。
【０２５７】
ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣ、ならびにこれらのエキソソームについて同様の結果が、糖尿病治療のための同種膵島細胞の移植で観察された。
【０２５８】
同様に、ＧＦＰで標識されたヒト筋芽細胞、衛星細胞またはマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２陽性）を、５つのＭＳＣ集団と共におよびなしでマウスの筋肉内に埋め込んだ。１週間および４週間後に筋肉内に残存するＧＦＰ陽性細胞の数を決定した。ＭＳＣなしでの移植では、外来のヒトおよびマウス細胞が筋肉から１週間後に除去された。細胞をＵＣ−またはＣＨ−ＭＳＣと共に移植すると、拒絶の程度が顕著に減少し、最大４週間の時点で細胞が筋肉で観察された。これらの集団由来のエキソソームとの移植は、同様の効果を有し、４週間後にＧＦＰ陽性細胞が残存していた。
【０２５９】
ＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）プロセスを増強するｍｉＲＮＡを分泌し、一方でＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、腫瘍抑制遺伝子であるｍｉＲＮＡを高いレベルで発現することが観察された。同様に、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは腫瘍抑制遺伝子である長鎖非コードＲＮＡを分泌および発現する。ＡＤ−およびＡＭ−ＭＳＣの腫瘍細胞とのインキュベーションは、ＹＫＬ４０、フィブロネクチンおよびＣＤ４４などのＥＭＴマーカーの発現を増加させた（図１Ａ）。これらのＭＳＣとのインキュベーションは、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４およびＮａｎｏｇなどの幹細胞性マーカーも増加させた。同様の結果が、これらの集団に由来するエキソソームで得られた。ＧＦＰで標識されたヒト腫瘍細胞と共にＡＭ−ＭＳＣを免疫不全マウスに注入すると、腫瘍細胞のみを注入するよりも大きく浸潤性の高い腫瘍をもたらした。ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣでの治療で見られたように、ＡＭ−ＭＳＣとのヒト腫瘍細胞の移植は、腫瘍細胞の拒絶を減少し、免疫不全でないマウスにおいても減少した。
【０２６０】
実施例１５
ＭＳＣは腸内微生物叢を変化させる。
腸内微生物叢は、消化、エネルギー恒常性および神経疾患を含む、様々な疾患において重要な役割を果たす。ＣＨ−およびＵＣ−ＭＳＣならびにこれらのエキソソームをＮＯＤマウスに８週間投与し、対照マウスにＰＢＳを投与した。細胞およびエキソソームは同様に腸内微生物叢を変化させ、バクテロイデス門の存在度を増加させ、フィルミテクス門の存在度を減少させ、フィルミテクス門／バクテロイデス門の比を変化させた。
【０２６１】
実施例１６
ＭＳＣ集団は、幹細胞および初代細胞の増殖を増強する。
拒絶から細胞を保護する能力と同様に、すべてのＭＳＣ、これらのエキソソームおよびこれらの細胞からの培地（ＥＣＭを含む）は、培養物中の幹細胞および初代細胞の生存を増強することが判明した。初代培養物および幹細胞の増殖における主な限界の１つは、これらの細胞が老化、オートファジー、ならびに／または正常および健全な増殖および分化を損なう他のプロセスを受ける前に、これらの細胞を多継代で維持することが困難なことである。初代ニューロン、星細胞および骨格筋細胞をＭＳＣからの馴化培地、これらのエキソソームまたはＭＳＣ由来のＥＣＭのいずれかと共に撒き、増殖および分化する細胞の能力を監視した。すべての３つの細胞腫、およびすべての３つの治療薬で、培養物中の生存が増加し、使用したＭＳＣに関わらず、はるかに多数の継代の健全な維持が可能であることが判明した。しかし、ＵＣ−およびＣＨ−ＭＳＣは、はるかに強力な効果を有した。同様に、神経幹細胞および筋衛星細胞も、生存の増加を示し、対称および非対称分裂を経るそれらの能力をさらに維持した。
【０２６２】
本発明は、その特定の実施形態と組み合わせて説明されてきたが、多くの代替形態、修正形態および変形形態が、当業者に明らかになるであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内に含まれる、すべてのこのような代替形態、修正形態および変形形態を包含することが意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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