(57)【要約】  癌関連または腫瘍特異的（ネオ）エピトープと、同時刺激分子および／または他の免疫活性化因子との同時発現により癌免疫療法が強化される。必要に応じ、免疫チェックポイント阻害剤の投与により、処置が強化され得る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えウイルスを生成する方法であって、
患者の患者特異的癌関連ネオエピトープを特定すること；
前記ネオエピトープの同じ患者のＨＬＡ型への結合を特定すること、および前記ネオエピトープの発現レベルを決定すること；
少なくとも１個の同時刺激分子を選択すること；および
ウイルスを遺伝子改変し、少なくとも１個の同時刺激分子および前記癌関連ネオエピトープをコードする核酸を組み込むこと、を含む、方法。
【請求項２】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスが複製能欠損型である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスが非免疫原性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の癌関連ネオエピトープが、腫瘍および対応する正常な試料のオミクスデータの位置誘導同期アライメント（ｌｏｃａｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によりコンピュータを用いて特定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者のＨＬＡ型のコンピュータによる予測ステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルが、対応する正常な試料に比べて少なくとも２０％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記同時刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸がサイトカインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が、ＳＭＡＣ（超分子活性化クラスター）の少なくとも１つの成分をコードする配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＭＡＣの少なくとも１つの成分が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、およびＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路の活性化因子をコードする配列をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子が、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも第２の、別個の癌関連ネオエピトープをコードするセグメントを前記核酸中に組み込むステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子改変ウイルスを培養し、少なくとも１０４個のウイルス粒子を得るステップをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子改変ウイルスを培養し、少なくとも１０７個のウイルス粒子を得るステップをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスが複製能欠損型である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスが非免疫原性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者の癌関連ネオエピトープが、腫瘍および対応する正常な試料のオミクスデータの位置誘導同期アライメントによりコンピュータを用いて特定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者のＨＬＡ型のコンピュータによる予測ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現レベルが、対応する正常な試料に比べて少なくとも２０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記同時刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸がサイトカインをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、ＳＭＡＣ（超分子活性化クラスター）の少なくとも１つの成分をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＳＭＡＣの少なくとも１つの成分が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、およびＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路の活性化因子をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子が、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも第２の、別個の疾患関連ネオエピトープをコードするセグメントを前記核酸中に組み込むステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子改変ウイルスを培養し、少なくとも１０４個のウイルス粒子を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子改変ウイルスを培養し、少なくとも１０７個のウイルス粒子を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
組換えウイルスであって、ＨＬＡ適合患者特異的癌ネオエピトープ、ならびに前記組換えウイルスに感染した細胞中で前記ネオエピトープおよび前記同時刺激分子を発現するようにプロモーターに機能的に連結された同時刺激分子、をコードする核酸を含む、組換えウイルス。
【請求項３４】
前記核酸が、少なくとも第２の、別個の疾患関連ネオエピトープをコードするセグメントをさらに含む、請求項３３に記載の組換えウイルス。
【請求項３５】
前記同時刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択される、請求項３３または３４に記載の組換えウイルス。
【請求項３６】
前記核酸がサイトカインをコードする配列をさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項３７】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体からなる群から選択される、請求項３６に記載の組換えウイルス。
【請求項３８】
前記核酸が、ＳＭＡＣ（超分子活性化クラスター）の少なくとも１つの成分をコードする配列をさらに含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項３９】
前記ＳＭＡＣの少なくとも１つの成分が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、およびＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手からなる群から選択される、請求項３８に記載の組換えウイルス。
【請求項４０】
前記核酸が、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路の活性化因子をコードする配列をさらに含む、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項４１】
前記ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子が、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質を含む、請求項４０に記載の組換えウイルス。
【請求項４２】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項４３】
前記アデノウイルスがＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］である、請求項４２に記載の組換えウイルス。
【請求項４４】
前記同時刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択される、請求項３３に記載の組換えウイルス。
【請求項４５】
前記核酸がサイトカインをコードする配列をさらに含む、請求項３３に記載の組換えウイルス。
【請求項４６】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体からなる群から選択される、請求項４５に記載の組換えウイルス。
【請求項４７】
前記核酸が、ＳＭＡＣ（超分子活性化クラスター）の少なくとも１つの成分をコードする配列をさらに含む、請求項３３に記載の組換えウイルス。
【請求項４８】
前記ＳＭＡＣの少なくとも１つの成分が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、およびＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手からなる群から選択される、請求項４７に記載の組換えウイルス。
【請求項４９】
前記核酸が、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路の活性化因子をコードする配列をさらに含む、請求項３３に記載の組換えウイルス。
【請求項５０】
前記ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子が、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質を含む、請求項４９に記載の組換えウイルス。
【請求項５１】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項３３に記載の組換えウイルス。
【請求項５２】
前記アデノウイルスがＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］である、請求項５１に記載の組換えウイルス。
【請求項５３】
請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組換えウイルスを含む医薬組成物。
【請求項５４】
請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の第２の、別個のウイルスをさらに含む、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
請求項４４〜５２のいずれか１項に記載の組換えウイルスの癌の処置における使用。
【請求項５６】
患者の処置方法であって、
前記患者から腫瘍試料および対応する正常な試料を得ること；
前記患者のＨＬＡ型を特定すること、および同じ患者の患者特異的癌関連ネオエピトープを特定すること；
ウイルスを遺伝子改変し、（ｉ）結合親和性が所定の閾値より低い場合、前記ネオエピトープをコードする核酸、および（ｉｉ）少なくとも１個の同時刺激分子をコードする核酸、を組み込むこと；および
前記遺伝子改変ウイルスを前記患者に投与すること、を含む、方法。
【請求項５７】
前記患者のＨＬＡ型の特定および癌関連ネオエピトープの特定ステップが、前記腫瘍試料および前記対応する正常な試料由来のゲノム情報を用いて、コンピュータにより実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記同時刺激分子が、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウイルスが、サイトカインをコードする核酸をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルスが、ＳＭＡＣ（超分子活性化クラスター）の少なくとも１つの成分をコードする核酸をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＳＭＡＣの少なくとも１つの成分が、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、およびＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ウイルスが、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路の活性化因子をコードする核酸をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＳＴＩＮＧ経路の活性化因子が、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記アデノウイルスがＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ウイルスが、少なくとも１個の追加の癌関連ネオエピトープをコードする核酸をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記遺伝子改変ウイルスが、皮下または腫瘍内投与により投与される、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１２月７日に出願された我々の同時係属の米国特許仮出願第６２／２６３８１２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、腫瘍疾患の処置に関し、特に、組換えウイルスを使った腫瘍疾患の予防と処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明の理解に有用であると思われる情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが本請求発明に対する先行技術であるということ、もしくはこれに関連するということ、または、明確にもしくは暗示的に参照されるいずれかの出版物が先行技術であるということを認めるものではない。
【０００４】
全ての出版物が、あたかもそれぞれの出版物または特許出願が具体的かつ個々に、参照により組み込まれると示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献中の用語の定義または使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と矛盾するまたは相容れない場合には、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【０００５】
全てでないにしてもほとんどの腫瘍疾患には、点変異、挿入、欠失、および転座を含む比較的多数の変異が付随する。したがって、新生細胞はまた、１つまたは複数の変異タンパク質の存在により特徴付けられるはずであると仮定することは妥当である。都合の悪いことに、このような単純な前提にもかかわらず、診断および治療に好適する変異タンパク質の研究は、異なる癌型が異なる変異タンパク質を有し、さらに悪いことには、同じ腫瘍型を有する異なる患者が、変異タンパク質の大幅に異なる蓄積を有するという事実により、困難な状態になっている。
【０００６】
最近になって、多数の研究努力の結果として、Ｔ細胞認識ヒト腫瘍抗原の比較的小さなコレクションが利用可能になってきた（例えば、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１５  Ｊｕｌｙ  ２０１３）Ｖｏｌ．１３，ｐ．１５を参照）が、これらの抗原からは単一の効果的な治療薬が得られていない。さらに、これらの抗原は癌と診断された患者中に既に存在しているので、免疫療法におけるこれらの抗原の使用は、少なくとも概念上疑わしい。なぜなら、これらの抗原は、適切な免疫応答を起こすべきであったのにそうではなかったからである。さらに、たとえ、腫瘍特異的抗原が特定され、癌ワクチンに使用されたとしても、このような抗原に対する免疫応答は、治療効果を誘発するほど十分に強力ではない可能性がある。
【０００７】
したがって、少なくとも理論的に全ての腫瘍抗原が特定されたとしても、特定により、意味のある、すぐに実施可能なデータセットを得ることはできないであろう。したがって、迅速な特定、癌ネオエピトープの診断および／または治療的使用を可能とする新しい系および方法に対する必要性があるだけでなく、このような抗原に対する予防的および／または治療的に効果のある免疫応答を誘発する必要性も存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明者らは、今では、ネオエピトープベース癌免疫療法が、最初に、癌ネオエピトープを特定して、患者のＨＬＡ型とネオエピトープとの間のＨＬＡ型の適合を確認し、その後、ネオエピトープをコードする拡散を患者の免疫担当細胞に送達するのみでなく、同時刺激分子をも与える発現系（通常、ウイルス送達／発現系）を使用する、オミクス解析の使用により合理的に誘導できることを発見した。さらに、このような処置は、強い免疫応答をさらに高めるまたは刺激する１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤の投与も含み得る。
【０００９】
本発明の主題の一態様では、発明者らは、患者の癌関連ネオエピトープを特定する１つのステップ、ネオエピトープの患者ＨＬＡ型への結合を特定し、ネオエピトープの発現レベルを決定するさらなるステップ、少なくとも１個の同時刺激分子を選択するまたさらなるステップ、およびウイルスの遺伝子を改変して少なくとも１個の同時刺激分子および癌関連ネオエピトープをコードする核酸を組み込むステップを含む組換えウイルスの生成方法を意図している。
【００１０】
ウイルスに関しては、通常、ウイルスはアデノウイルスまたは複製能欠損ウイルスとされる。加えて、ウイルスは非免疫原性であるのがさらに好ましい。したがって、特に好ましいウイルスには、アデノウイルス、特にＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］が挙げられる。
【００１１】
患者の癌関連ネオエピトープは、好ましくは、腫瘍および対応する正常な試料のオミクスデータの位置誘導同期アライメント（ｌｏｃａｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によりコンピュータで特定され、また、意図される方法は、患者のＨＬＡ型のコンピュータによる予測ステップをさらに含み得る。本発明の主題に限らないが、ネオエピトープの発現レベルは、対応する正常な試料に比べて少なくとも２０％であるのが好ましい。
【００１２】
同時刺激分子は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択されることがさらに意図されている。さらに、核酸は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、および／またはＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体）をコードする配列をさらに含み得る。あるいは、または追加して、核酸はまた、ＳＭＡＣの少なくとも１種の成分（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、および／またはＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手）をコードする配列も含み得る。必要に応じ、核酸は、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質などのＳＴＩＮＧ経路の活性化因子をコードする配列をさらに含んでよい。
【００１３】
さらに、少なくとも第２の（または第３の、または第４の、など）別の癌関連ネオエピトープをコードするセグメントが核酸中に含まれ得ることがさらに意図されている。このように生成された組換えウイルスはその後培養されて、少なくとも１０４個を超える、通常は１０７個のウイルス粒子が得られる。
【００１４】
したがって、発明者らはまた、１個または複数のＨＬＡ適合癌ネオエピトープ、ならびに組換えウイルスに感染した細胞中でネオエピトープおよび同時刺激分子を発現するようにプロモーターに機能的に連結された１個または複数の同時刺激分子、をコードする核酸を含む組換えウイルスも意図している。好ましくは、ウイルスはアデノウイルスであり、最も好ましくはＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］である。
【００１５】
本発明の主題のいくつかの態様では、同時刺激分子は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ−Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ−Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ３（ＣＤ５８）からなる群から選択される。さらに、意図されたウイルス中の核酸は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）、および／またはＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体）をコードする配列、ＳＭＡＣの少なくとも１種の成分（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＬＦＡ−１，ＣＤ４３、および／またはＣＤ４５またはこれらそれぞれの結合相手）をコードする配列、および／またはＳＴＩＮＧ経路の活性化因子（例えば、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがＩＰＳ−１のシグナル伝達ドメインに融合されているキメラタンパク質）をコードする配列をさらに含み得る。
【００１６】
またさらに意図された態様では、本明細書で提供される１つまたは複数の（可能限り別々の）組換えウイルスを含む医薬組成物が意図されている。その他の使用の内で、本明細書で提供される組換えウイルスは、患者の癌の処置に使用されることが通常意図されている。
【００１７】
したがって、発明者らは患者を処置する方法も意図し、該方法は、腫瘍試料および対応する正常な試料を患者から得るステップ、患者のＨＬＡ型を特定し、患者の癌関連ネオエピトープを特定する別のステップ、（ｉ）結合親和性が所定の閾値よりも小さい場合、ネオエピトープをコードする核酸、および（ｉｉ）少なくとも１種の同時刺激分子をコードする核酸、を含むようにウイルスを遺伝子改変するさらなるステップ、ならびに遺伝子改変ウイルスを患者に投与するまたは投与させる（例えば、皮下または腫瘍内投与により）ステップを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、患者のＨＬＡ型の特定および癌関連ネオエピトープの特定のステップは、腫瘍試料および対応する正常な試料由来のゲノム情報を用いて、コンピュータにより実施される。好適な同時刺激分子、サイトカイン、ＳＭＡＣの成分、およびＳＴＩＮＧ経路の活性化因子に関しては、上記考察と同じ考え方が当てはまる。同様に、投与用として好ましいウイルスには、アデノウイルス、特にＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］が挙げられる。必要に応じ、意図された方法は、免疫チェックポイント阻害剤を投与するステップをさらに含んでよい。
【００１９】
本発明の主題の種々の目的、特徴、態様および利点は、類似の構成要素が類似の数字で表される添付図面と共に、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からさらに明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ヒト染色体、アレル多様性（図１Ａ）ならびに発現および膜の位置（図１Ｂ）に対するＨＬＡ型の位置の代表的模式図である。
【図１Ｂ】ヒト染色体、アレル多様性（図１Ａ）ならびに発現および膜の位置（図１Ｂ）に対するＨＬＡ型の位置の代表的模式図である。
【図２】計算ネオエピトープの選別結果を示す代表的プロットである。
【図３】Ｔ細胞の活性化中の同時刺激受容体とリガンドとの代表的相互作用のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明者らは、これまでに、免疫療法組成物の効力が、好ましくは、非または低免疫原性ウイルス送達ベクターを用いて、同時刺激分子の同時送達と合わせて、患者特異的ＨＬＡ適合ネオエピトープを標的とすることにより改善できることを発見した。好ましい態様における同時送達は、単一組換え送達システムからのネオ抗原（単一または複数）および同時刺激分子のモノ、バイ、またはマルチシストロン発現により達成し得る。
【００２２】
その目的のために、免疫療法の種々の系、組成物、および方法が提供され、ウイルスベクターまたはその他の発現系が採用されて、１種または複数の患者および疾患特異的抗原（例えば、ネオエピトープ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなどの癌特異的抗原またはブラキュリ、ＣＥＡＣＡＭ、などの癌関連抗原）が癌に罹患した個体に送達されて治療効果がもたらされる。この効果は、同じ細胞中での１個または複数の同時刺激分子の同時発現によりさらに強化される。特定の理論または仮説に束縛されることを望むものではないが、発明者らは、同時刺激分子の同時発現が、Ｔ細胞を活性化するための十分な期間にわたり、抗原提示細胞とＴ細胞との間の免疫シナプスの形成と維持を手助けすることを意図している。したがって、治療効果は、抗原を保有する癌細胞に対する防御免疫応答であることが意図されている。
【００２３】
本発明の主題の１つの特に意図された態様では、以下でより詳細に考察されるように、好ましくは、患者の腫瘍および対応する正常（すなわち、非癌）組織試料由来の核酸配列情報を使って、癌と診断された個体の患者および癌特異的ネオエピトープが特定される。これに関して、腫瘍および対応する正常な試料を使ってネオエピトープが特定される場所では、全てのまたはほぼ全てのそれ以外の観察された患者試料と参照ゲノムとの間の非腫瘍関連変化は、除外されることを理解されたい。したがって、別の観点からは、腫瘍と同じ患者の対応する正常な試料との間の比較は、そうしないと比較的高頻度に発生することになる、ヒト間または患者−参照間変異を全て取り除き、それにより、多量の擬陽性ネオエピトープ発生の可能性を取り除くことになろう。
【００２４】
さらに追加して、このように特定された患者および癌特異的ネオエピトープの適切な提示および認識の可能性を高めるために、患者の特定のＨＬＡ型が決定され（例えば、以降でより詳細に記載されるコンピュータ予測を使って）、特定されたネオエピトープの確定したＨＬＡ型に対する結合親和性がコンピュータにより試験される。最も典型的には、ＨＬＡ型決定には、少なくとも３種のＭＨＣ−Ｉ亜型（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）および少なくとも３種のＭＨＣ−ＩＩ亜型（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）を含み、それぞれの亜型は少なくとも４桁まで決定されるのが好ましい。このように特定された高親和性結合剤の配列は、それぞれの対応する核酸配列に逆翻訳され、それが次に、ウイルスによる感染後、宿主細胞中の１つまたは複数の発現用調節配列の制御下で、組換え体発現系（例えば、アデノウイルスＡｄ５［Ｅ１−Ｅ２ｂ−］）に挿入される。またさらに、好ましい発現系は、ネオエピトープ配列（単一または複数）に関連して、発現したネオエピトープ（単一または複数）を、それらが高親和性を有するＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ亜型の方に向ける、１つまたは複数の配列要素を含むことを理解されたい。
【００２５】
したがって、組換えウイルスまたはその他の発現系は、ネオエピトープに対し高親和性を有することが確定しているＨＬＡ提示に好適なだけでなく、そのＨＬＡ提示の方に向けることも行う真の患者および癌特異的ネオエピトープの細胞内発現をもたらすことが予測され、これが、次に、免疫応答を生成する高い可能性が期待され、宿主中の腫瘍に対する治療的に有効な免疫応答に繋がる。腫瘍に対する治療的に効果的な免疫応答の確率をさらに高めるために、ネオエピトープは、抗原および同時刺激分子を同時発現している抗原提示細胞とＴ細胞との間で活性化免疫シナプスを構築するのに必要な１個または複数の同時刺激分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１、ＣＤ４８およびＣＤ８４、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９および／またはＣＤ２４４などの他のＳＬＡＭタンパク質）および／またはＴ細胞活性化に必要な１個または複数の同時刺激分子（例えば、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、および／またはＴＬ１Ａ）と同時発現される。
【００２６】
無論、本明細書で示された教示を踏まえて、複数のネオエピトープおよび同時刺激分子を用いることができ、特に好ましい態様では、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、または少なくとも５個の異なるネオエピトープおよび少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、または少なくとも５個の異なる同時刺激分子を用いるであろう（例えば、同じ組換えウイルス中に、または別々のウイルス中にコードして）ということに留意されたい。最終的に、好適な発現系は、ネオエピトープが発現される細胞環境中で免疫応答を助けるタンパク質をコードする追加の配列をさらに含み得る。例えば、好適なタンパク質には、免疫促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはＩＬ−１５スーパーアゴニスト、など）、および／またはチェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ１シグナル伝達の阻害剤）が挙げられる。
【００２７】
組換えウイルスまたはその他の発現系に関しては、このような系を用いて抗原提示細胞を遺伝子操作し、特に樹状細胞に遺伝子導入することが意図されている。あるいは、以降でもさらに詳細に記載されるように、組換えウイルスまたはその他の発現系は、ＤＮＡワクチンとして、または皮下または腫瘍内投与により投与してもよい。同様に、組換えウイルスまたはその他の発現系を使って、後で個体に投与される種々細胞にインビトロで遺伝子導入し得る。
【００２８】
ネオエピトープの選択
ネオエピトープは、特有の腫瘍特異的抗原を作り出した、腫瘍細胞中で発現したランダム変異として特徴付けることができる。したがって、異なる観点から見ると、ネオエピトープは、変異の型（例えば、欠失、挿入、塩基転換、遷移、転座）および変異の影響（例えば、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフト、など）を考慮することにより特定し得る。これは、従って、サイレントおよびその他の無関係の（例えば、非発現）変異を除外する、最初の内容選別として機能し得る。さらに、ネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、７〜１１ｍｅｒ）を有する配列ストレッチとして定義できることを理解されたい。このようなストレッチは、アミノ酸配列の変化（単一または複数）を含むであろう。最も典型的には、変化したアミノ酸は、中心アミノ酸位置であるかその近傍であろう。例えば、典型的なネオエピトープは、構造：Ａ４−Ｎ−Ａ４、またはＡ３−Ｎ−Ａ５、またはＡ２−Ｎ−Ａ７、またはＡ５−Ｎ−Ａ３、またはＡ７−Ｎ−Ａ２を有し得る。式中Ａは、タンパク質を構成するアミノ酸であり、Ｎは、変化した（野生型に対して、または対応する正常型に対して）アミノ酸である。例えば、本明細書で意図されているネオエピトープ配列は、比較的短い長さ（例えば、５〜３０ｍｅｒ、より典型的には７〜１１ｍｅｒ、または１２〜２５ｍｅｒ）を有する配列ストレッチを含み、このようなストレッチは、アミノ酸配列の変化（単一または複数）を含む。
【００２９】
したがって、単一アミノ酸変化は、変化したアミノ酸の位置に応じて、変化したアミノ酸を含む多くのネオエピトープ配列中に現れ得ることを理解されたい。好都合にも、このような配列変動は、ネオエピトープの複数の選択を可能とし、そのため、次に、１つまたは複数の望ましい形質（例えば、患者ＨＬＡ型に対する最高親和性、最大構造安定性、など）を基準にして選択可能な潜在的に有用な標的の数が増える。最も典型的には、ネオエピトープは、２〜５０アミノ酸長さ、より典型的には５〜３０アミノ酸、最も典型的には９〜１５アミノ酸となるように計算され、アミノ酸変化は、好ましくは中央位置であるか、または他の方法でネオエピトープのＭＨＣへの結合を向上させるように配置する。例えば、エピトープがＭＨＣ−Ｉ複合体により提示される場合、典型的なネオエピトープ長さは、約８〜１１アミノ酸であり、一方、ＭＨＣ−ＩＩ複合体を介して提示するための典型的なネオエピトープ長さは、約１３〜１７アミノ酸長さである。容易に分かるように、ネオエピトープ中の変化したアミノ酸の位置は中央位置以外であってよいので、実際のペプチド配列およびそれに伴うネオエピトープの配置はかなり変わってもよい。
【００３０】
無論、ネオエピトープの識別または発見は、新しい生検材料、凍結または別の方法で保存した組織または細胞試料、循環性腫瘍細胞、エキソソーム、種々の体液（および特に血液）、などを含む種々の生体物質から初めてよいことを理解されたい。したがって、好適なオミクス分析の方法には、核酸シーケンシング、および特にＤＮＡに対し操作するＮＧＳ法（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング、イオントレントシーケンシング、４５４パイロシーケンス、ナノポアシークエンシング、など）、ＲＮＡシーケンシング（例えば、ＲＮＡｓｅｑ、逆転写ベースシーケンシング、など）、およびタンパク質シーケンシングまたは質量分析ベースシーケンシング（例えば、ＳＲＭ、ＭＲＭ、ＣＲＭ、など）が挙げられる。
【００３１】
従って、核酸ベースシーケンシング用としては特に、腫瘍組織の高スループットゲノムシーケンシングは、ネオエピトープの迅速な特定を可能とすることを特に認識されたい。しかし、このようにして得られた配列情報は、標準的基準に対し比較する場合、通常発生する患者間変異（例えば、ＳＮＰ、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｄｅｌ、異なる反復数、などに起因する）ならびにヘテロ接合性が比較的多数の擬陽性のネオエピトープの可能性をもたらすことになるということを理解する必要がある。したがって、特定ネオエピトープの内の多くは、好結果を得る免疫戦略用の候補とはならないであろう。特に、このような不正確さは、患者の腫瘍試料が、対応する同じ患者の正常（すなわち、非腫瘍）試料に対して比較される場合は取り除くことができる。
【００３２】
本発明の主題の１つの特に好ましい態様では、ＤＮＡ解析は、腫瘍および対応する正常な試料の全ゲノムシーケンシングおよび／またはエクソームシーケンシング（通常、少なくとも１０ｘ、より典型的には少なくとも２０ｘの読み深度で）により実施される。あるいは、ＤＮＡデータはまた、以前の配列決定に由来する既に確立した配列レコード（例えば、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、またはＶＣＦファイル）から得てもよい。したがって、データセットは、未加工または加工データセットを含んでよく、代表的データセットには、ＢＡＭＢＡＭフォーマット、ＳＡＭＢＡＭフォーマット、ＦＡＳＴＱフォーマット、またはＦＡＳＴＡフォーマットを有するものが含まれる。しかし、データセットは、ＢＡＭＢＡＭフォーマットまたはＢＡＭＢＡＭ  ｄｉｆｆ  ｏｂｊｅｃｔ（例えば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号および米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号を参照）として提供されるのが特に好ましい。さらに、データセットは、患者および腫瘍特異的情報をそのようにして得るための、同じ患者の腫瘍および対応する正常な試料の反映であることに留意されたい。したがって、腫瘍を生じない（例えば、サイレント変異、ＳＮＰ、など）遺伝的生殖細胞系列の変化は除外できる。無論、腫瘍試料は、初期腫瘍由来、処置の開始時腫瘍由来、再発腫瘍または転移部由来、などであってよいことは認識されるべきである。ほとんどの場合、患者の対応する正常な試料は、血液、または腫瘍と同じ組織型由来の非患部組織であり得る。
【００３３】
同様に、配列データの計算処理解析は、多くの方式で実施し得る。しかし、最も好ましい方法では、解析は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号および米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号に開示のような、ＢＡＭファイルおよびＢＡＭサーバーを使った腫瘍および対応する正常な（同じ患者の健康な組織由来の）試料のオミクスデータの位置誘導同期アライメントにより、コンピュータで実施される。好都合にも、このような解析は、擬陽性ネオエピトープを減らし、メモリーおよび計算資源に対する要求を大きく低減させる。
【００３４】
いずれのコンピュータ向け言語も、サーバー、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、制御装置、または個々にまたはまとめて動作するその他のタイプのコンピューティングデバイスなどのコンピューティングデバイスの任意の好適な組み合わせを含むように読み込む必要があるということに留意されたい。コンピューティングデバイスは、有形の非一時的コンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭ、など）に保存されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサーを含むということを理解すべきである。ソフトウェア命令は、コンピューティングデバイスを、開示装置に関連して以下に考察する役割、信頼性、またはその他の機能を備えるように構成するのが好ましい。さらに開示技術は、コンピュータベースアルゴリズム、プロセス、方法、またはその他の命令の実施態様に関連する開示ステップをプロセッサーに実行させるソフトウェア命令を保存した非一時的コンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として実施できる。特に好ましい実施形態では、種々のサーバー、系、データベース、またはインターフェースは、できる限り、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開秘密鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、既知の金融取引プロトコル、またはその他の電子工学的情報交換方法に基づいて、規格化プロトコルまたはアルゴリズムを使ってデータを交換する。デバイス内でのデータ交換は、パケット交換網、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、またはその他のタイプのパケット交換網；回線交換網；セル交換網；またはその他のタイプのネットワークを介して実施できる。
【００３５】
計算処理解析をさらに促進し、ネオエピトープベース治療の処置結果を向上させるために、ネオエピトープ配列は、ＭＨＣ−Ｉ結合に必要な最小寸法（例えば、少なくとも５〜６アミノ酸）およびＭＨＣ−Ｉ結合に有利な最大寸法（例えば、９〜１１アミノ酸）を有する比較的小さい断片またはＭＨＣ−ＩＩ結合に必要な最小寸法（例えば、少なくとも１２〜１４アミノ酸）およびＭＨＣ−ＩＩ結合に有利な最大寸法（例えば、１９〜２１アミノ酸）を有する比較的小さい断片に限定される。したがって、ネオエピトープは通常、ＭＨＣ−Ｉ結合に対しては７〜１２アミノ酸およびＭＨＣ−ＩＩ結合に対しては１４〜２０アミノ酸を有することになる。例えば、好適なネオエピトープは、変化したアミノ酸を含む９アミノ酸の長さを有してよく（ＭＨＣ−Ｉに結合するのが明確な場合）、また、変化したアミノ酸を含む２０アミノ酸の長さを有してよい（ＭＨＣ−ＩＩに結合するのが明確な場合）。
【００３６】
異なる観点から見た場合、患者および癌特異的配列のコンピュータによる収集物は、５〜２５アミノ酸の所定長さを有し、少なくとも１つの変化したアミノ酸を含むように、設定することができる。このような収集物は通常、それぞれの変化したアミノ酸に対し、変化したアミノ酸の位置が同じでない、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、または少なくとも６個のメンバーを含むであろう。その後、このような収集物を使って、以降でより詳細に記載されるように、さらに選別できる（例えば、細胞内の位置、転写／発現レベル、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＩＩ親和性、などで）。
【００３７】
例えば、および腫瘍および対応する正常な配列データに対する同期位置誘導解析を使って、発明者らは以前、次の癌型：ＢＬＣＡ、ＢＲＣＡ、ＣＥＳＣ、ＣＯＡＤ、ＤＬＢＣ、ＧＢＭ、ＨＮＳＣ、ＫＩＣＨ、ＫＩＲＣ、ＫＩＲＰ、ＬＡＭＬ、ＬＧＧ、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＯＶ、ＰＲＡＤ、ＲＥＡＤ、ＳＡＲＣ、ＳＫＣＭ、ＳＴＡＤ、ＴＨＣＡ、およびＵＣＥＣ、を含む種々の癌および患者由来の種々の癌ネオエピトープを特定した。全てのネオエピトープデータは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／２９２４４号で見つけることができる。この特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
癌の型とステージに応じて、ネオエピトープの数は、免疫療法での使用に実用的な数を大きく超える場合があることに留意されたい。さらに、そのように特定されたネオエピトープの全てが、必ずしも治療的に有効な患者の反応をもたらすとは限らないであろう。実際に、一部のネオエピトープのみが免疫応答を生成することは、当該技術分野において周知である。治療的に望ましい応答の可能性を高めるために、ネオエピトープをさらに選別できる。無論、本明細書で提示された方法では、下流解析でサイレント変異を考慮する必要がないことを理解されたい。しかし、好ましい変異分析は、変異の型（例えば、欠失、挿入、塩基転換、遷移、転座）に加えて、変異の影響の情報（例えば、ナンセンス、ミスセンス、など）も提供し、従って、サイレント変異が除去される最初の内容選別として機能し得る。例えば、ネオエピトープは、変異がフレームシフト、ナンセンスおよび／またはミスセンス変異である場合のさらなる考察に関し選択できる。
【００３９】
さらなる選別手法では、ネオエピトープは、細胞内位置パラメーターに関する詳細解析にも供し得る。例えば、ネオエピトープ配列は、ネオエピトープが膜結合位置として特定される（例えば、細胞の細胞膜の外側に位置する）かどうか、および／またはコンピュータによる構造計算はネオエピトープが溶媒曝露状態である可能性が高いかどうか、または構造的に安定なエピトープ（例えば、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１４）であるかどうかのさらなる考察に関して選択し得る。
【００４０】
ネオエピトープの選別に関して、本明細書では、オミクス（または他の）解析によりネオエピトープが実際に発現したことが示される場合、ネオエピトープは使用に特に好適するということが通常意図されている。ネオエピトープの発現および発現レベルの特定は、当該技術分野において既知の全ての方法で実施でき、好ましい方法には、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ）分析および／または定量的プロテオミクス解析が挙げられる。最も典型的には、ネオエピトープの含有のための閾値レベルは、対応する正常な配列の発現レベルの少なくとも２０％、より典型的には少なくとも５０％であり、これにより、（ネオ）エピトープは、少なくとも可能性として、免疫系に「見える」ことを確実にする。これに関して、ネオエピトープの発現レベルは、ネオエピトープを含まない対応する（「野生型」、対応する正常）配列の発現レベルと比較される。したがって、オミクス解析はまた、遺伝子発現解析（トランスクリプトーム解析）を含み、それにより、変異を有する遺伝子の発現レベルの特定を助けるのが、通常好ましい。
【００４１】
当該技術分野において既知の多くのトランスクリプトーム解析の方法があり、全ての既知の方法は、本明細書に用いるのに好適すると考えられる。例えば、好ましい材料には、ｍＲＮＡおよび一次転写産物（ｈｎＲＮＡ）が含まれ、ＲＮＡ配列情報は、逆転写ポリＡ＋−ＲＮＡから得られ、これは、次に、腫瘍試料および同じ患者の対応する正常な（健康な）試料から得られる。同様に、ポリＡ＋−ＲＮＡは通常、トランスクリプトームの表現としては好ましいが、その他の形態のＲＮＡ（ｈｎ−ＲＮＡ、非ポリアデニル化ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、など）も同様に本明細書に用いるのに好適すると考えられることに留意されたい。好ましい方法には、定量的ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡ）分析および／または特にＲＮＡｓｅｑを含む定量的プロテオミクス解析が挙げられる。他の態様では、ＲＮＡ定量化およびシーケンシングは、ｑＰＣＲおよび／またはｒｔＰＣＲベース方法を使って実施されるが、種々の代替法（例えば、固相ハイブリダイゼーションベース方法）も同様に好適すると考えられる。別の観点から見た場合、トランスクリプトーム解析は（単独でまたはゲノム解析と組み合わせて）、癌および患者特異的変異を有する遺伝子を特定および定量するのに好適し得る。
【００４２】
同様に、プロテオミクス解析は、ネオエピトープのＲＮＡの実際の翻訳を確認するために、多くの方法で実施でき、また、全ての既知のプロテオミクス解析の方法が本明細書で意図されている。しかし、特に好ましいプロテオミクス方法には、抗体ベース方法および質量分析法が挙げられる。さらに、プロテオミクス解析は、タンパク質それ自体の定性的または定量的情報を与えるのみでなく、タンパク質が触媒的または他の機能活性を有する場合、タンパク質活性データも含み得ることに留意されたい。プロテオミクスアッセイを実施するための１つの代表的技術は、米国特許第７４７３５３２号に記載されている。この特許は参照により本明細書に組み込まれる。さらに好適なタンパク質発現の特定およびさらには定量化の方法には、種々の質量分析法（例えば、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および連続反応モニタリング（ＣＲＭ））が含まれる。
【００４３】
選別のさらに別の態様では、ネオエピトープは、（例えば、患者または患者収集物の）既知のヒト配列を含むデータベースと比較し、それにより、ヒト同一配列の使用を回避し得る。さらに、選別は、ＳＮＰが腫瘍および対応する正常な配列の両方に存在する場合、患者中のＳＮＰに起因するネオエピトープ配列の除去も含み得る。例えば、ｄｂＳＮＰ（一塩基多型データベース）は、米国立ヒトゲノム研究所（ＮＨＧＲＩ）と連携して米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が運営する、異なる種内および種間の遺伝的変異に対する無料の公開アーカイブである。データベースの名称は、１つのクラスの多型（一塩基多型（ＳＮＰ））のみの収集物を意味するが、実際には、比較的広い範囲の分子変異：（１）ＳＮＰ、（２）短い欠失および挿入多型（ｉｎｄｅｌ／ＤＩＰ）、（３）マイクロサテライトマーカーまたは短いタンデム反復（ＳＴＲ）、（４）マルチヌクレオチド多型（ＭＮＰ）、（５）ヘテロ接合配列、および（６）名前付きバリアントを含む。ｄｂＳＮＰは、明らかに中性の多型、既知の表現型に対応する多型、および変異のない領域を受け入れる。このようなデータベースおよび上述の他の選別オプションを用いて、患者および腫瘍特異的ネオエピトープを選別して、それらの既知の配列を取り除き、実質的に擬陽性を減らした複数のネオエピトープ配列を有する配列セットが得られる。
【００４４】
あまり好ましくない態様では、癌および患者特異的ネオエピトープは、より一般的なネオエピトープで強化し得るか、あるいはそのネオエピトープで置き換え得る。例えば、意図された一般的なネオエピトープは、種々の癌関連および癌特異的抗原（例えば、少なくとも０．１％、または少なくとも０．５％、または少なくとも１％、または少なくとも５％の頻度を有する）を含む。あるいは、好適なネオ抗原はまた、所定の最低頻度（例えば、少なくとも０．１％、または少なくとも０．５％、または少なくとも１％、または少なくとも５％の頻度を有する）で少なくとも１種の特異的ＭＨＣ亜型で発生すると特定されたものを同様に含み得る。ネオエピトープ、方法およびこれらに関連するシステムのさらなる態様は、同一所有者の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／２６７９８号およびＰＣＴ／ＵＳ１６／２９２４４号に開示されている。これら両出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
ＨＬＡ決定および適合
ヒト主要組織適合抗原（ＭＨＣ）、またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体は、２つの別々のクラスの同時発現する高度多形性細胞表面抗原をコードする少なくとも７つの座位を含む多くの遺伝子座を含む。これらの分子は、プロセッシングを受けたペプチドに結合し、これを循環Ｔ細胞リンパ球に提示し、細胞および液性免疫応答の両方にとって不可欠である。したがって、免疫療法においては、ネオエピトープがＭＨＣ複合体に結合し、提示される場合、ネオエピトープが効果的である可能性がより高いことは容易に明らかになるはずである。
【００４６】
しかし、都合の悪いことに、ＭＨＣ複合体は、極めて多様性であり、異なる患者間で全く異なり、ネオエピトープの結合予測を困難にする。クラスＩ分子、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ、およびクラスＩＩ分子、ＤＲ、ＤＱおよびＤＰは、染色体６ｐ２１．３１の短腕の約３５００ｋｂｐセグメント中にコードされている（図１Ａおよび１Ｂに概略的に図示されている）。クラスＩ抗原は、全ての有核細胞上に存在し、それらは、主にサイトゾル由来のペプチド（ウイルス性および自己ペプチド）を循環ＣＤ８＋Ｔ細胞に対し提示する細胞表面ヘテロダイマーとして機能する。クラスＩ細胞表面ヘテロダイマーは、１つの極めて多形性のアルファ鎖を有し、変動性残基がペプチド結合溝内でクラスター形成しており、これは遺伝子のエキソン２および３によりコードされている。ＨＬＡクラスＩ分子はまた、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）に対するリガンドとして機能し、これは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞傷害活性を調節する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、Ｂ細胞、マクロファージおよびその他の抗原提示細胞の表面上に認められ、α−βヘテロダイマーが主に外因的に誘導されたペプチド（細菌および化学的毒素）を循環ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。クラスＩＩ分子では、ベータ鎖は、極めて多形性領域を含み、これらは、遺伝子のエキソン２に局在化し、ペプチド結合溝をコードする。
【００４７】
したがって、有効な結合および提示は、ネオエピトープの配列と、患者の特定のＨＬＡ型の組み合わせ機能であることを理解されたい。最も典型的には、ＨＬＡ型決定には、少なくとも３種のＭＨＣ−Ｉ亜型（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）および少なくとも３種のＭＨＣ−ＩＩ亜型（例えば、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）を含み、それぞれの亜型は少なくとも４桁まで決定されるのが好ましい。しかし、さらに大きい深度（例えば、６桁、８桁）も本明細書で意図されている。
【００４８】
患者の１つのＨＬＡ型が確認され（既知の化学またはコンピュータによる決定を使って）、ＨＬＡ型に対する構造解が計算されるか、またはデータベースから取得され、これが、その後、コンピュータによる結合モデルで使用され、（通常、選別された）ネオエピトープのＨＬＡ構造解に対する結合親和性が決定される。以降でさらに考察されるように、結合親和性を決定するために好適なシステムには、ＮｅｔＭＨＣプラットフォーム（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８  Ｊｕｌ  １；３６（ウェブサーバー版）：Ｗ５０９−Ｗ５１２．）が含まれる。以前に明確にしたＨＬＡ型に対する高親和性を有する（例えば、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満）ネオエピトープを、その後、ＭＨＣ−Ｉ／ＩＩ亜型の知識を加味して、治療薬創出に関して、選択する。
【００４９】
ＨＬＡ決定は、当該技術分野において周知の湿式化学の各種方法を使って実施でき、すべてのこれらの方法は、本明細書で用いるのに好適すると考えられる。しかし、特に好ましい方法では、ＨＬＡ型はまた、以降でより詳細に示すような、ほとんどのまたは全ての既知のおよび／または一般的なＨＬＡ型を含む基準配列を使ったオミクスデータからもコンピュータにより予測できる。
【００５０】
例えば、本発明の主題による１つの好ましい方法では、染色体６ｐ２１．３（またはＨＬＡアレルが見つかるいずれか他の位置またはその近傍）に対する比較的大きな数の患者の配列リードマッピングがデータベースまたはシーケンシング装置により得られる。最も典型的には、配列リードは、約１００〜３００塩基の長さを有し、リード品質、アラインメント情報、配向、位置、などを含むメタデータを含む。例えば、好適なフォーマットには、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＧＡＲ、などが挙げられる。本発明の主題に限らないが、患者配列リードが少なくとも５ｘ、より典型的には少なくとも１０ｘ、さらにより典型的には少なくとも２０ｘ、および最も典型的には少なくとも３０ｘのカバレッジ深度を提供することが一般的に望ましい。
【００５１】
患者配列リードに加えて、意図した方法は、既知の、異なるＨＬＡアレルの複数の配列を含む１つまたは複数の基準配列をさらに用いる。例えば、典型的な基準配列は、そのＨＬＡ型の複数のＨＬＡアレルを有する少なくとも１種のＨＬＡ型の配列セグメントを含む合成（対応するヒトまたはその他の哺乳動物の相当物のない）配列であってよい。例えば、好適な基準配列には、ＨＬＡ−Ａの少なくとも５０個の異なるアレルに対する既知のゲノム配列の収集物が含まれる。あるいは、またはさらに追加して、基準配列はまた、ＨＬＡ−Ａの少なくとも５０個の異なるアレルに対する既知のＲＮＡ配列の収集物を含んでもよい。無論、および以降でより詳細にさらに考察されるように、基準配列は、ＨＬＡ−Ａの５０個のアレルに限定されないが、ＨＬＡ型に関する代わりの組成物およびアレルの数／組成物を有してもよい。最も典型的には、基準配列は、コンピュータ可読フォーマットであり、データベースまたはその他のデータ保存装置から提供されるであろう。例えば、好適な基準配列フォーマットには、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、ＥＭＢＬ、ＧＣＧ、またはジェンバンクフォーマットが含まれ、直接に取得してもまたは公開データリポジトリ（例えば、ＩＭＧＴ、ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、またはＴｈｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｎｅｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＥＵＲＯＳＴＡＭ、ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔ）のデータから作製してもよい。あるいは、基準配列は、アレル頻度、人種のアレル分布、一般的または希なアレル型などの１つまたは複数の所定の判定基準に基づいて、個体の既知のＨＬＡアレルから作製してもよい。
【００５２】
基準配列を使って、ここで、患者配列リードをドブルイングラフに通し、最良適合アレルを特定することができる。これに関して、それぞれの個体は、それぞれのＨＬＡ型に対し２個のアレルを保持すること、およびこれらのアレルは、類似であってよく、または場合によっては、同一でさえあってもよいことに留意されたい。このような高い類似度は、従来のアラインメント方式に対し深刻な問題を提起する。これまでに、発明者は、ＨＬＡアレル、および非常に密接に関係したアレルでも、ドブルイングラフが、配列リードを比較的小さいｋ−ｍｅｒ（通常、１０〜２０塩基の長さを有する）に分解することにより、およびアレルの配列に一致するｋ−ｍｅｒのその配列リードに基づいて、それぞれのアレルに対しそれぞれの患者配列リードが投票（「定量的リード支持」）をする、重み付け投票（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｖｏｔｅ）法を組み込むことにより作成される手法を使って分離できることを発見した。アレルに対する累積最高投票が、最も可能性の高い予測ＨＬＡアレルを示す。さらに、アレルに一致するそれぞれの断片が、そのアレルに対する全体カバレッジおよびカバレッジ深度を計算するためにも使われることが一般的に望ましい。
【００５３】
スコアリングは、必要に応じ、特に、トップヒットの多くが類似である場合（例えば、それらのスコアのかなりの部分が高度に共有されたｋ−ｍｅｒセットから来る場合）、さらに改善または精緻化し得る。例えば、スコア精密化は、現在のトップヒットに対し実質的に類似性（例えば、９９％またはその他の所定の値超）のアレルをその後の考慮から除外する、重み付けスキームを含み得る。現在のトップヒットにより使用されたｋ−ｍｅｒのカウントは、その後、因子（例えば、０．５）により再重み付けされ、これらの重み付けしたカウントを合計することにより、それぞれのＨＬＡアレルに対するスコアが再計算される。この選択プロセスは、反復されて、新しいトップヒットが見つけられる。方法の精度は、腫瘍により発現されたアレルの特定を可能とするＲＮＡ配列データを使って、さらに改善できる。このアレルは、ＤＮＡ中に存在する２個の内のただの１個に過ぎない場合もある。意図された系および方法のさらなる有利な態様では、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方の組み合わせは、極めて正確なＨＬＡ予測をするように処理でき、また、腫瘍または血液ＤＮＡまたはＲＮＡから誘導することができる。さらなる態様、好適な方法およびコンピュータによる高精度ＨＬＡ型判定については、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／４８７６８号に記載されている。この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
必要に応じ、ネオエピトープは、アレル頻度をベースに、これに１００万リードあたりの転写物を乗じてスコア化／順位付けして、尤度スコアを得ることができる。このスコアはその後、ＨＬＡ情報を使ってさらに増やし、患者のＨＬＡ型に対する実際の結合親和性を計算することができる。例えば、代表的順位付けフォーマットは、下記であってよい：
＞２５４  ＮＭ＿００１０００．３  ＲＰＬ３９  Ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｐ．Ｍ２９Ｋ  Ａ−＞Ｔ  Ｎｏｒｍａｌ：ＷＩＲＭＫＴＧＮＫ，ＡＦ：０．１７９１０４４７７６１２ＴＰＭ：１０２３．９６  ＴＰＭ＿ＭＥＤＩＡＮ：７．３５  ＬＬ：１８３．３９５８２０８９６  ｎｅｔＭＨＣ：２４２．９６  Ａｌｌｅｌｅ：ＨＬＡ−Ａ０３０１  ＷＩＲＫＫＴＧＮＫ。
【００５５】
ここで、ファイルはＦＡＳＴＡフォーマットファイルであり、登録項目は「＞」キャラクターで始まり、この行は、試料情報を報告するだけである。次の行はネオエピトープである。試料情報行には、試料識別番号（例えば、２５４）、Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子ＩＤ（例えば、ＮＭ＿００１０００．３）、ＨＵＧＯ慣用名（例えば、ＲＰＬ３９）、バリアント分類（例えば、ミスセンス）、タンパク質変化（例えば、ｐ．Ｍ２９Ｋ）、塩基対変化（例えば、Ａ−＞Ｔ）、正常エピトープ（例えば、正常：ＷＩＲＭＫＴＧＮＫ）、アレル頻度（例えば、ＡＦ：０．１７９１０４４７７６１２）、この遺伝子の１００万リードあたりの転写物（例えば、ＴＰＭ：１０２３．９６）、ＴＰＭ＿ＭＥＤＩＡＮ、これは全ての遺伝子の発現レベル中央値（ＴＰＭ＿ＭＥＤＩＡＮ：７．３５）、ＬＬスコア、これは丁度ＡＦｘＴＰＭである（例えば、ＬＬ：１８３．３９５８２０８９６）、ｎｅｔＭＨＣ予測結合値（例えば、ｎｅｔＭＨＣ：２４２．９６）、およびネオエピトープが結合する特異的ＨＬＡアレル（例えば、アレル：ＨＬＡ−Ａ０３０１）が含まれる。次の行は、従って、ネオエピトープ（例えば、ＷＩＲＫＫＴＧＮＫ）である。
【００５６】
患者および腫瘍特異的ネオエピトープおよびＨＬＡ型が特定されると、さらなる計算処理解析は、ネオエピトープをＨＬＡに結合させることにより実施され、最良の結合剤（例えば、最小ＫＤ、例えば、５００ｎＭ未満、または２５０ｎＭ未満、または１５０ｎＭ未満、または５０ｎＭ未満）が、例えば、ＮｅｔＭＨＣを使って決定される。このような手法は、患者および腫瘍に対し真に特異的ネオエピトープを特定するのみでなく、細胞上に提示される可能性が最も高く、従って、治療効果のある免疫応答を誘発する可能性が最も高いネオエピトープを特定するものでもあることを理解されたい。無論、このように特定されたＨＬＡ適合ネオエピトープは、以降でさらに考察するように、そのエピトープをコードする核酸をウイルス中にペイロードとして含める前に、インビトロで生化学的に確認できることも理解されたい。
【００５７】
無論、患者ＨＬＡ型の患者および癌特異的ネオエピトープとの適合を、ＮｅｔＭＨＣ以外のシステムを使って行うことができること、および好適なシステムには、ＮｅｔＭＨＣ  ＩＩ、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ、ＩＥＤＢ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＵＲＬ  ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ）、ＲａｎｋＰｅｐ、ＰＲＥＤＥＰ、ＳＶＭＨＣ、Ｅｐｉｐｒｅｄｉｃｔ、ＨＬＡＢｉｎｄｉｎｇ、およびその他（例えば、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１；３７４：１−４を参照）が含まれることを理解されたい。最高親和性の計算では、変化したアミノ酸の位置が移動している（上記を参照）ネオエピトープ配列の収集物を使用できることに留意されたい。あるいは、またはさらに追加して、ネオエピトープに対する修飾を、Ｎおよび／またはＣ末端修飾を付加することにより組み込んで、発現したネオエピトープの患者ＨＬＡ型に対する結合をさらに強化し得る。したがって、ネオエピトープは、特定されたままの未変性であってもよく、またはさらに修飾して特定のＨＬＡ型により良好に適合させてもよい。
【００５８】
さらに、必要に応じて、対応する野生型配列（すなわち、アミノ酸変化のないネオエピトープ配列）の結合を計算して、親和性の差を確かなものにすることができる。例えば、ネオエピトープとその対応する野生型配列との間のＭＨＣ結合における特に好ましい親和性の差異の大きさは、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、などである。
【００５９】
図２は、一連の選別ステップの典型的な結果の代表例を示す。この場合、対応する正常な試料に対する（すなわち、同じ患者の非患部組織に対する比較）同期位置誘導アライメントによるトリプルネガティブ乳癌試料の全ゲノムシーケンシング解析により、腫瘍試料中の比較的大きな数（約１８，０００）のネオエピトープが明らかになった。特に、第１の選別ステップにより、発現強度を基準にして、全特定ネオエピトープの５０％超が取り除かれた。ここで、対応する正常な試料に比べて、２０％より低い発現レベルを有するネオエピトープ配列が取り除かれた。残りの配列をコンピュータによる解析に供し、同じ試料の単一の特異的ＨＬＡ型に結合するはずの（例えば、５００ｎＭ未満の親和性）配列を決定した。繰り返して、かなりの比率のネオエピトープが除去されたこと、および最終的に全ネオエピトープの１．３％のみが使用に好適することが分かったことに留意されたい。
【００６０】
このような解析は、それぞれのＨＬＡ型は多数の、多くの場合極めて類似したアレルを有するため、また、配列が高度の類似性を有する場合、従来のアライメント法は通常大きな識別能力を持つことができないので、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡシーケンシング情報からのＨＬＡ特定に特に有利であることに留意されたい。さらに、このような解析は、好都合にも、専用の検査室機器の必要性のない患者から既に得られているシーケンシングオミクスデータから実施されることを理解されたい。異なる観点から見ると、ネオエピトープの発見、選別、ＨＬＡ型決定、さらにはそのようにして特定されたネオエピトープの患者の特定のＨＬＡ型への結合でさえも、全てコンピュータで実行できる。
【００６１】
同時刺激分子の選択
好適な同時刺激分子に関しては、同時刺激分子が抗原提示細胞中で発現される場合、Ｔ細胞活性化に関して上方制御効果を有する限り、全ての同時刺激分子が適切であると考えられることが通常意図されている。例えば、図３は、樹状細胞上の同時刺激分子およびそれらのＴ細胞上の受容体を例示する。
【００６２】
意図される上方制御効果は、同時抑制（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ１６０、またはＢＴＬＡにより媒介される）の抑止に起因するもの、および／またはＴ細胞の同時刺激受容体（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ガレクチン９、ＴＩＭ１、ＬＦＡ、ＣＤ２、などを介した）の活性化に起因するものであり得る。したがって、好適な同時刺激分子には、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、ＣＤ４０、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＩＣＡＭ１、およびＬＦＡ３が挙げられる。代わりにまたは追加して、意図される同時刺激分子は、それらの活性化における特定の機能によっても選択し得る。例えば、同時刺激分子は、免疫シナプスの形成および／または維持におけるそれらの役割、および／または下流の活性化イベントにおけるそれらの役割により選択してもよい。したがって、好適な同時刺激分子には、ｃＳＭＡＣ（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、Ｌｃｋ、および／またはＦｙｎ、またはこれらの結合相手）、ｐＳＭＡＣ（例えば、ＬＦＡ１またはその結合相手）、およびｄ−ＳＭＡＣ（例えば、ＣＤ４３、ＣＤ４５またはこれらの結合相手）の構成要素を含む超分子活性化クラスター（ＳＭＡＣ）の１つまたは複数の成分が挙げられる。例えば、２個以上の同時刺激分子が用いられる場合、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ６０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、および／またはＣＤ４８の内の少なくとも２個が特に望ましいものであり得る。
【００６３】
最も典型的には、細胞（および特に樹状細胞などの抗原提示細胞）の遺伝子導入のために意図される組換え核酸には、１個または複数のネオエピトープ配列に加えて、上記で考察したような同時刺激分子をコードする２個以上の配列要素が含まれるのが好ましい。実際に、好適な組換え核酸は、少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個の同時刺激分子をコードする配列要素を含むことが通常意図されている。最も典型的には、複数の同時刺激分子が存在する場合には、同時刺激分子がＴ細胞活性化／活性に関して相乗的効果をもたらすことが意図されている。したがって、組換え核酸は、同時刺激分子およびネオエピトープが同時に発現される（これは、例えば、単一プロモーターまたは複数の誘導性プロモーターを用いて達成され得る）ように構成されることを理解されたい。さらに、同時刺激分子は、好適なリガンドまたは受容体と共に、単一ポリペプチド鎖上に、または２個の別々の分子上に発現され得ることも理解されたい。例えば、発現される受容体がＯＸ４０である場合、受容体はＯＸ４０Ｌと同時に発現され得る。同様に、発現されるリガンドが４−１ＢＢＬである場合、リガンドは４−１ＢＢと同時に発現され得る。さらに、通常、同時刺激分子がそれぞれの膜ドメインと発現され、それにより同時刺激分子を発現する細胞中で膜固定を可能とするのが好ましいが、同時刺激分子をコードする核酸は、リガンド（およびいくつかの事例では、受容体）が可溶型で発現され得るように改変される場合があることに留意されたい。
【００６４】
さらに、組換え核酸は、１個または複数のサイトカインもコードし得、特に好ましいサイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（例えば、ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ）、およびＩＬ−１５スーパーアゴニスト／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ融合複合体（例えば、ＡＬＴ８０３）が含まれることを理解されたい。このようなサイトカインは通常、ネオエピトープおよび同時刺激分子と同時発現され、免疫活性化をさらに高める。さらに意図される態様では、同時刺激分子は、種々の追加の免疫促進剤成分も含み、意図される追加の成分には、ＣＤ８４、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、および／またはＣＤ２４４などの種々のＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）タンパク質を含み、これらは、選択ネオエピトープおよび／または同時刺激分子と同時発現されるのが好ましい。
【００６５】
同様に、さらに意図される態様では、追加の成分は、自然免疫応答経路、特にＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）経路の正の調節因子であってもよい。他の好適な正の調節因子の中で、特に好ましい正の調節因子には、例えば、国際公開第２０１４／０３９９６１号に記載のように、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインが、ＳＴＩＮＧ経路に付随するシグナル伝達タンパク質のシグナル伝達ドメイン、特にＩＰＳ１のシグナル伝達ドメインと融合したキメラタンパク質が含まれる。配列番号１は、代表的キメラ分子を提供し、この分子では、ＥＢＶのＬＭＰ１の膜貫通ドメインがマウスＩＰＳ１のシグナル伝達ドメインに融合されている。
【００６６】
このようなキメラタンパク質では、少なくとも１つの、または少なくとも２つの、または少なくとも３つのＩＰＳシグナル伝達ドメインと融合した、少なくとも１つの、より典型的には少なくとも２つの、より典型的には少なくとも３つの、および最も典型的には少なくとも６つのＬＭＰ１タンパク質の膜貫通ドメインを有するのが通常好ましい。無論、ＩＰＳ１のシグナル伝達ドメインが好ましいが、その他の活性化因子も本明細書に用いるのに好適であると考えられ、これらには、特に、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）中の種々のタンパク質受容体が含まれることに留意されたい。
【００６７】
潜在膜タンパク質−１（ＬＭＰ１）は、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）中の遺伝子である。Ｎ−末端は、タンパク質を膜に固定する６個の近接する膜貫通ドメインを含む。ＬＭＰ１の細胞質内ドメインは、ＣＤ４０受容体、ＴＮＦＲＳＦのシグナル伝達ドメインに類似であり、１つまたは複数のＩＰＳ１シグナル伝達ドメインにより置換され得る。特に、ＬＭＰ１は、その細胞質ドメインを通ってシグナル伝達を開始するのにリガンドまたは抗体を必要としない。理由は、そのＮ末端膜貫通ドメインは細胞膜中にクラスターを自然に形成し、それにより、シグナル伝達ドメインをクラスター化するためである。ＬＭＰ１の細胞質内ドメインをＩＰＳ１シグナル伝達ドメインで置換することにより、ＳＴＩＮＧ経路の恒常的活性化が達成される。無論、このようなキメラタンパク質は、その他の同時刺激分子および／またはネオエピトープと同時発現され、それにより、免疫刺激を高め得ることが認識されるべきである。このような事例では、同時刺激分子とキメラ免疫活性化因子の組み合わせが、２つの別々の経路：ＳＴＩＮＧ関連遺伝子発現および活性化免疫シナプス形成、を介したＴ細胞の活性化に起因して、相乗的に作用し得ることが意図されている。
【００６８】
ウイルス構築
好ましい患者および癌特異的ＨＬＡ適合ネオエピトープ、および好適な同時刺激分子／キメラ活性化因子の選択の際に、細胞内発現およびその後の細胞上でのネオエピトープの提示のための組換え核酸が構築される。組換え核酸は、ネオエピトープが、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩ提示経路およびネオエピトープが高親和性を有することが分かっているＭＨＣ亜型（単一または複数）に向けられるように、配置中に１つまたは複数の患者および癌特異的ネオエピトープをコードする配列部分を含む。さらに、組換え核酸は、適切な同時刺激分子／キメラ活性化因子をコードする配列部分も含む。ＭＨＣ標的化および合理的な提示は、より多くの強い免疫応答を生成すると考えられ、これは、１個または複数の同時刺激分子および／またはキメラ活性化因子の同時発現によりさらに高められる。
【００６９】
無論、このような組換え核酸（単一または複数）の全ての送達方法は安定であると思われること、および組換え核酸（単一または複数）は、ＤＮＡワクチンとして、遺伝子導入組成物中に送達可能な組換えウイルスゲノム、またはＤＮＡもしくはＲＮＡとして、処方され得ることを理解されたい。したがって、当該技術分野において既知の全ての発現系（例えば、細菌発現系、酵母発現系、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ発現系）は、本明細書で用いるのに好適であると思われることに留意されたい。
【００７０】
同様に、および特定の組換え核酸製剤に応じて、遺伝子導入細胞の型は、大幅に変わってよい。しかし、細胞は免疫担当細胞、特に抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージなど）であるのが通常好ましい。このような細胞は、好ましくは、組み換え細胞を受ける患者または個体に対し自己であり、自己細胞は、濃縮細胞または培養細胞であってよい。例えば、樹状細胞は、最初に、全血のＢ細胞および単球枯渇（例えば、ＣＤ１４／  １９マーカーを介して）により、続けて、適切な樹状細胞マーカー（例えば、ＣＤ３０４、ＣＤ１４１、およびＣＤ１ｃ）を用いた樹状細胞の磁気分離により単離し得る。あるいは、樹状細胞は、幹細胞から培養することも可能である（例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１４  Ｊａｎ  ２６；６（１）：１−１０を参照）。またさらに意図される態様では、および特に組換え核酸がウイルス性発現ベクターの場合は、患者は、特にウイルスがアデノウイルスの場合、ウイルスに感染され得る（例えば、皮下または腫瘍内投与を用いて）。
【００７１】
例えば、遺伝子治療で既に確立されている、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス等を含むウイルスを使用するのが特に好ましい。しかし、適切な選択肢の内で、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、一般に、ウイルスは複製能欠損型で、非免疫原性ウイルスであり、これは通常、選択ウィルスタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ３タンパク質）の標的欠失により行われるのがさらに好ましい。本明細書で使用される場合、用語の「非免疫原性」は、ウイルスを根絶する免疫反応を引き起こすことなく、ウイルスを個体に繰り返して投与できることを意味する。このような望ましい特性は、Ｅ２ｂ遺伝子機能を削除することによりさらに高められ得、および組換えウイルスの高い力価は、最近報告されたように（例えば、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；７２（２）：９２６−９３３）、遺伝子改変ヒト２９３細胞を用いて達成できる。最も典型的には、所望の核酸配列（ウイルス感染細胞からの発現のための）は、当該技術分野において周知の適切な調節エレメントの制御下にある。
【００７２】
ネオエピトープおよび同時刺激分子および／またはキメラ活性化因子をコードする配列部分の組み込みに関しては、種々の配列要素を多くの方法で配置し得ることに留意されたい。例えば、転写または翻訳単位は、複数のエピトープの、典型的には短いリンカー（例えば、４〜２０個のアミノ酸を有する可撓性リンカー）により分離され、プロテアーゼ切断部位をさらに含み得る、鎖状体配置を有し得る。このような鎖状体は、１〜２０個のネオエピトープ（通常、ウイルスを介して送達され得る組換え核酸の大きさにより制限される）を含んでよく、また、鎖状体は、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ複合体への送達に関し、同じであっても異なっていてもよいことに留意されたい。したがって、下記のように、種々のペプチドを特定の細胞内区画へ送り、ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩを介してそのような選択的あるいは特異的提示を達成することができることを理解されたい。別の観点から見ると、腫瘍関連抗原およびネオエピトープは、両方の提示経路を介して提示され得、または選択的に１つまたは別の経路に同時に、または引き続く処置ラウンドで提示され得ることが認識されるべきである。同時刺激分子および／またはキメラ活性化因子は、以下でさらに考察されるように、単離ペプチド単位として発現されるのが好ましい。さらに、同時刺激分子および／またはキメラ活性化因子をコードする組換え核酸は通常、タンパク質を膜上に固定するために、組換えタンパク質を細胞膜に向ける配列要素も含む。
【００７３】
遺伝子改変ウイルスの「ペイロード」に関しては、２個以上の、例えば、２個、３個、４個、５個、またはさらに多くのネオエピトープの発現が好ましく、これは、複数の別々の改変ウイルス、または２個以上のネオエピトープ配列（例えば、鎖状体またはキメラ配列として）を有するウイルスを用いて実現できることが意図されている。本発明の主題に限らないが、ネオエピトープ配列は、キメラタンパク質に翻訳されてもされなくてもよい、タンデム型ミニ遺伝子（例えば、ａａ１２−ネオエピトープ１２−ａａ１２）として、または単一転写ユニットとして構成されることが一般に好ましい。したがって、エピトープは、モノマー、マルチマー、個々にまたは鎖状体に、またはＮおよび／またはＣ末端ペプチドを有するハイブリッド配列として提示され得ることを理解されたい。最も典型的には、ウイルスコドン選択および／または宿主コドン選択に対応するための好適なコドン使用法を用いて、核酸配列を逆翻訳することが好ましい。しかし、別のコドン使用法または非適合コドン使用法も適切であると思われる。さらに好適な配置および発現カセットに関しては、同時係属の２０１６年３月２日出願の米国特許仮出願第６２／３０２１６８号、および２０１６年３月２８日出願の米国特許仮出願第６２／３１４３６６号が参照される。これらの仮出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
ネオエピトープ配列（例えば、単一ネオエピトープとして、またはポリトープとして発現される）は、片方または両方のＭＨＣ提示経路に対し構成され、好適な配列要素を用いてその方向に向けられることをさらに理解されたい。そのように発現したネオエピトープの所望のＭＨＣ系への送達に関しては、ＭＨＣ−Ｉ提示ペプチドは通常、プロテアソームプロセッシングおよび小胞体を通る送達を介して細胞質から生じることに留意されたい。したがって、以降でさらに詳細に考察されるように、ＭＨＣ−Ｉ提示に向けたエピトープの発現は通常、細胞質に向けられることになる。他方では、ＭＨＣ−ＩＩ提示ペプチドは通常、細胞膜への送達の前に、酸性プロテアーゼ（例えば、レグマイン、カテプシンＬおよびカテプシンＳ）による分解とプロセッシングを介してエンドソームおよびリソソーム区画から生ずる。したがって、これに関しても以降でさらに詳細に考察されるように、ＭＨＣ−ＩＩ提示に向けたエピトープの発現は通常、エンドソームおよびリソソーム区画に向けられることになる。
【００７５】
最も好ましい態様では、シグナルペプチドを、ネオエピトープをエンドソームおよびリソソーム区画への輸送の（およびネオエピトープ提示をＭＨＣ−ＩＩの方に向ける）ために、または細胞質空間で保持する（およびネオエピトープ提示をＭＨＣ−Ｉに向ける）ために、使用し得る。例えば、ペプチドがエンドソームおよびリソソーム区画に送出される場合、標的化シグナルペプチドおよび内部標的化ペプチドを用いることができる。標的化ペプチドのシグナルペプチドは、好ましくはＮ末端に付加され、６〜１３６の塩基性および疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソーム標的化の場合には、標的化配列はＣ末端にあってもよい。その他のシグナル（例えば、シグナルパッチ）を使用してよく、ペプチド配列中で離れて存在する配列要素を含み、適切なペプチド折り畳み時に機能的になる。さらに、グリコシル化などのタンパク質修飾は、標的化を誘導できる。特に好適な標的化シグナルとしては、発明者らは、ペルオキシソーム標的化シグナル１（ＰＴＳ１）、Ｃ末端トリペプチド、およびＮ−末端近傍に位置するノナペプチドのペルオキシソーム標的化シグナル２（ＰＴＳ２）を意図している。さらに、エンドソームおよびリソソームへのタンパク質の選別輸送はまた、通常短い直鎖配列を含むタンパク質の細胞質ドメイン内のシグナルにより媒介され得る。いくつかのシグナルは、チロシンベース選別シグナルと呼ばれ、ＮＰＸＹまたはＹＸＸＯコンセンサスモチーフへ適合する。ジロイシンベースシグナルとして知られるその他のシグナルは、［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］またはＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフに適合する。全てのこれらのシグナルは、膜の細胞質側表面周辺部に結合したタンパク質コート成分により認識される。ＹＸＸＯおよび［ＤＥ］ＸＸＸＬ［ＬＩ］シグナルは、アダプター蛋白質（ＡＰ）複合体ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、およびＡＰ−４により、特徴的な、わずかな特異性で認識され、一方、ＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして知られる別のファミリーのアダプターにより認識される。また、ＦＹＶＥドメインを付加することができ、これは、液胞タンパク質選別およびエンドソーム機能と関連付けられてきた。またさらなる態様では、エンドソーム区画はまた、ヒトＣＤ１末端配列を使って標的化することもできる（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２，５２２−５３１、参照）。
【００７６】
細胞基質区画への輸送またはその中での保持は、１つまたは複数の特異的配列要素を必ずしも必要としない場合がある。しかし、少なくともいくつかの態様では、膜係留タンパク質または膜係留タンパク質の膜係留ドメインを含む、ＮまたはＣ末端細胞質の保持シグナルを付加し得る。例えば、膜係留タンパク質には、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、シナプトブレビン、シナプトタグミン、ベシクル結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）、シナプス小胞糖タンパク質（ＳＶ２）、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位作動型カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼ、およびＮＯＴＣＨが挙げられる。
【００７７】
さらに、ウイルス送達担体はまた、感染樹状細胞とＴ細胞との間の相互作用を高めるために、少なくとも１個の、より典型的には、少なくとも２個の、さらにより典型的には、少なくとも３個の、最も典型的には少なくとも４個の同時刺激分子をコードすることが意図されている。例えば、好適な同時刺激分子には、特に、Ｂ７．１（ＣＤ８０）および／またはＢ７．２（ＣＤ８６）と組み合わせた、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＯＳ−Ｌ、およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）が挙げられる。さらに意図されている同時刺激分子には、４−１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、およびＴＬ１Ａが挙げられる。さらに、同時刺激分子の発現は、抗原および／またはネオエピトープが１つまたは複数の同時刺激分子と共に提示されるように、連携されるのが好ましいことを理解されたい。したがって、同時刺激分子は、単一転写物から、例えば、配列内リボソーム進入部位または２Ａ配列を使って、または複数の転写物から産生されることが通常意図されている。
【００７８】
同様に、ウイルスベクターは、チェックポイント受容体に結合する１つまたは複数のペプチドリガンドをコードする配列部分をさらに含むことが意図されている。最も典型的には、結合は、その受容体を介したシグナル伝達を阻害するか、少なくとも低減させ、特に、意図されている受容体には、ＣＴＬＡ−４（特にＣＤ８＋細胞に対し）、ＰＤ−１（特にＣＤ４＋細胞に対し）が挙げられる。例えば、ペプチド結合剤は、抗体断片および特にｓｃＦｖを含むことができるが、受容体に特異的に結合する小分子ペプチドリガンドも含むことができる。再度、ペプチド分子の発現は、抗原および／またはネオエピトープが１つまたは複数のペプチド分子と共に提示されるように、連携されるのが好ましいことを理解されたい。したがって、ペプチド分子は、単一転写物から、例えば、配列内リボソーム進入部位または２Ａ配列を使って、または複数の転写物から産生されることが通常意図されている。
【００７９】
その後、ウイルスを、個々にまたは組み合わせて、通常、投与単位当たり１０４〜１０１１のウイルス力価のウイルス粒子を有する無菌の注射可能組成物として処方される医薬組成物の治療ワクチンとして使用され得る。あるいは、ウイルスを用いて、患者（または他のＨＬＡ適合）細胞にエクスビボで感染させて、その後この感染細胞は患者に注入される。さらなる例では、患者のウイルスによる処置は、裸の形の、またはネオエピトープ（単一または複数）、腫瘍関連抗原またはウイルスと同じペイロードを標的とする抗体を発現しているキメラ抗原受容体を保持した、同種移植または自己ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞が同時に生じ得る。患者由来のＮＫ−９２細胞株を含むナチュラルキラー細胞はまた、ＣＤ１６を発現し得、抗体と結合できる。本明細書で使用される場合、医薬組成物または薬物の「投与」という用語は、医薬組成物または薬物の直接および間接投与を意味し、医薬組成物または薬物の直接投与は通常、医療専門家（例えば、医師、看護師、など）により実施され、間接投与は、医薬組成物または薬物を直接投与（例えば、注射、点滴、経口送達、局所送達、などを介して）するために医療専門家に提供するステップまたは利用可能にするステップを含む。必要に応じ、組換えウイルスの投与が免疫チェックポイント阻害剤の投与と一緒に実施され得ることも意図されている。例えば、好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ−１標的化剤（例えば、ニボルバム、ペムブロリズマブ）、ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ）、またはリガンド結合時にＴ細胞活性を下方制御する他の受容体が挙げられる。
【００８０】
最後に、ウイルスが、複数のネオエピトープをコードする核酸ペイロードを含む場合、複数のネオエピトープは、少なくとも付加的にまたは相乗的に宿主免疫応答を高め得ることが意図されていることに留意されたい。同様に、それぞれのウイルスが異なるネオエピトープを有する複数のウイルスが使用される場合、複数のネオエピトープは、少なくとも付加的にまたは相乗的に宿主免疫応答を高め得ることが意図されている。このような付加的または相乗的効果は、特定の腫瘍またはステージに対し実際に起こり得る、または特定の患者パラメーター（例えば、年齢、性別、以前の処置、など）に特異的なものであり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明し、請求するために使用される成分の発現量、濃度、反応条件などの特性を表す数字は、いくつかの事例では、「約」という用語により修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは、特定の実施形態により得ようとする所望の特性に応じて、変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメーターは、記載される有効数字の数を考慮し、通常の丸め技術を適用して解釈すべきである。
【００８２】
本記述および特許請求の範囲全体で使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照対象を包含する。また、本明細書の記述で使用される場合、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、「の中に（ｉｎ）」の意味は、「の中に（ｉｎ）」および「の上に（ｏｎ）」を含む。文脈がそうでないことを明確に示さない限り、本明細書で記載される全ての範囲は、それらの端点を含むと解釈されるべきであり、オープンエンド型の範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈されるべきである。同様に、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、全ての値のリストは、中間値を含むと見なされるべきである。
【００８３】
本明細書で記載の全ての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾することがない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関し、提供されるいずれかのおよび全ての例、または例示的表現（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をより明らかにする意図によるものに過ぎず、別に請求される本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書に記載されているいずれの用語も、本発明の実施に不可欠であるいずれかの非請求要素を表すものとして解釈されるべきではない。
【００８４】
本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に記載されたものに加えて、さらに多くの変更が可能であることは、当業者には明らかでなければならない。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて、限定されるものではない。さらに、規格値および特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈に適合させて可能な限り最も広くなるように解釈されるべきである。特に、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非排他的な要素、成分、またはステップを意味し、言及された要素、成分、またはステップが、明示的に言及されないその他の要素、成分、またはステップと共に、存在、または利用、または組み合わせられ得ると解釈されるべきである。本明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・およびＮからなる群より選択される少なくともいずれか１つに言及する場合、文言は、ＡプラスＮ、またはＢプラスＮ、などではなく、その群からの１つの要素のみを要求すると解釈されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月5日(2018.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019500057.tif 000008
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