(57)【要約】  試料中の検体（例えば、ＭＲＳＡ）の有無の正確な測定が提供される。例えば、（可能性としては開始試薬を既に添加した後に）試料を活性化試薬に曝す。これにより、時間と共に増加し、その後減少する点滅信号を発生させることができる。検出器を用いて点滅信号から信号データ点を測定してもよい。信号データ点を適合する二次回帰関数を決定してもよい。二次適合の確度と信号対バックグラウンド強度比を決定してもよい。信号対バックグラウンド強度項と確度項の差を閾値と比較するスコアとして用いて、検体が試料に存在するか否かを決定してもよい。
2019507863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が検体に対して陽性であるか否かを判定する方法であって、
検出器を用いて、バックグラウンド時間間隔の間に複数のバックグラウンドデータ点を収集すること、
前記バックグラウンド時間間隔の後であり、前記試料が活性化試薬により活性化された後の時間の一部を含む信号時間間隔の間に前記検出器を用いて複数の信号データ点を収集すること、
前記複数のバックグラウンドデータ点および前記複数の信号データ点を用いて、コンピュータシステムにより信号対バックグラウンド強度比を算出すること、
少なくとも二次多項式を含み、前記複数の信号データ点を適合させる回帰関数を前記コンピュータシステムにより決定すること、
前記複数の信号データ点を適合させる回帰関数の確度値を前記コンピュータシステムにより算出すること、
前記信号対バックグラウンド強度比を含む信号対バックグラウンド強度項を用いて前記確度値を含む確度項を調整することで前記コンピュータシステムによりスコアを計算すること、および
前記スコアを分類閾値と比較して前記試料が前記検体に対して陽性または陰性であるかの分類を決定することを含む、方法。
【請求項２】
前記スコアが前記閾値未満である場合、前記試料は前記検体に対して陰性であると判定され、
前記スコアが前記閾値以上である場合、前記試料は前記検体に対して陽性であると判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の信号データ点に対する前記回帰関数の２乗誤差の加重和を算出すること、および
前記２乗誤差の加重和で前記確度値を乗じて前記確度項を計算することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記確度値は、決定係数、自由度調整済み決定係数、Ｆ検定のｐ値、および予測残差平方和（predicted residual error sum of squares (PRESS)）統計より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記回帰関数は二次項の放物線係数を含み、前記確度項は前記放物線係数で乗じた確度値を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記信号対バックグラウンド強度比を第一の定数の逆数で乗じて前記信号対バックグラウンド強度項を算出することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検体の存在が分かっているデータの代表的な集合を参照して所望の感度および特異性が得られるように閾値が選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出器は光検出器であり、前記複数の信号データ点は発光信号を形成する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検体はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バックグラウンド時間間隔は前記活性化試薬による前記試料の活性化の前であり、前記複数のバックグラウンドデータ点は前記試料の活性化の前に前記試料から収集される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バックグラウンドデータ点の少なくとも一部の中央値を計算すること、
前記中央値を用いて偏差を計算すること、
前記中央値と前記偏差の和を用いて第一のカットオフ値を決定すること、
前記第一のカットオフ値より大きいバックグラウンドデータ点の第一の個数を計測すること、
前記第一の個数を第二のカットオフ値と比較すること、および
前記第一の個数が前記第二のカットオフ値よりも大きい場合に誤差が存在すると判定することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出器に対して前記試料を再配置することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二のカットオフ値以下である第一の個数により判定されるように上記誤差が修正されるまで前記複数の信号データ点は収集されない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バックグラウンドデータ点の少なくとも一部の平均を計算すること、
前記平均を所定の係数と比較すること、および
前記平均が前記所定の係数よりも大きい場合に誤差が存在すると判定することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出器のセンサーが塞がれたときに収集されたデータ点を用いて前記所定の係数を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二のカットオフ値以下である第一の個数により判定されるように上記誤差が修正されるまで前記複数の信号データ点は収集されない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記コンピュータシステムにより前記複数の信号データ点の最大値を決定することをさらに含み、前記回帰関数は前記最大値の時間を用いて決定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記回帰関数は前記最大値の時間に中央が置かれている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の信号データ点を用いて、四次以上の多項式である高次回帰関数を決定すること、
前記高次回帰関数の確度測定値を算出すること、
前記複数の信号データ点の最大値を１個以上の初期閾値と比較すること、
前記１個以上の初期閾値との比較に基づいて確度閾値を選択すること、および
前記確度測定値を前記確度閾値と比較して、前記確度測定値が前記確度閾値より小さいことに基づき前記試料が前記検体に対して陰性であるか否かを決定することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記確度測定値が前記確度閾値よりも大きいことに基づいて前記試料が前記検体に対して陽性である可能性があると判定すること、および
前記スコアの前記分類閾値との比較を用いて前記試料が前記検体に対して陽性または陰性であるかの分類を判定することを開始することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の信号データ点をフィルターにかけて、前記複数の信号データ点に統計的平滑化関数を当てはめることでフィルター済みデータ集合を得ること、および
前記フィルター済みデータ集合を用いて前記高次回帰関数を決定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の信号データ点のフィルタリングは、前記複数の信号データ点の少なくとも一部をそれぞれ含み、
前記信号データ点とその隣接するデータ点との中央値を計算すること、および
前記信号データ点を前記中央値で置換することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記中央値のそれぞれは、３つの信号データ点から決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記信号データ点の一部は前記信号時間間隔の開始信号データ点から１個のデータ点と、前記信号時間間隔の終止信号データ点の前の１個のデータ点により埋め合わせられ、
前記終止信号データ点は最後の２個の信号データ点の中央値で置換され、
前記開始信号データ点が前記高次回帰関数からの対応する値と標準偏差の指定倍数の値の和よりも大きい場合は、前記開始信号データ点は前記対応する値で置換され、
前記高次回帰関数の確度測定値は前記フィルター済みデータ集合に適合されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１個以上の初期閾値は、第一の初期閾値および第二の初期閾値を含み、前記最大値が前記第一の初期閾値より大きい場合、前記確度閾値は第一の定数であり、前記最大値が前記第一の初期閾値より小さくかつ前記第二の初期閾値より大きい場合、前記確度閾値は第二の定数であり、前記最大値が前記第二の初期閾値より小さい場合、前記確度閾値は経験関数から決定され、前記経験関数は前記複数の信号データ点の最大値に基づいて前記確度閾値を提供する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
陽性と分かっている信号の複数の異なる最大値のそれぞれについて、
統計分布を示すノイズで前記信号を畳み込んでモンテカルロシミュレーションの繰り返しを行うこと（ここで、前記繰り返しのそれぞれでのノイズ量は前記信号で観察されたノイズに依存する）、
前記繰り返しのそれぞれについて高次回帰関数の確度測定値をそれぞれ決定すること、
前記確度測定値の平均および標準偏差を決定すること、
倍率をかけた標準偏差を前記平均から引いて確度データ点を決定すること、および
前記確度データ点に経験関数のパラメータを適合させて、信号の入力ピーク値に確度閾値を与える経験関数を得ることにより前記経験関数を決定することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の信号データ点の直線回帰を行うこと、
前記直線回帰の傾きの信頼区間の下限および上限がゼロを含むか否かを決定すること、および
前記信頼区間の下限および上限がゼロを含む場合、前記試料を陰性として見なすことをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記信頼区間は１０％が選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
コンピュータシステムを制御して前記方法のいずれかの操作を行う複数の指示を格納するコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品。
【請求項３０】
請求項２９に記載のコンピュータ製品、および
前記コンピュータ可読媒体上に格納された指示を実行する１つ以上のプロセッサを含む、システム。
【請求項３１】
前記方法のいずれかを実行する手段を含むシステム。
【請求項３２】
検出器、および前記方法のいずれかを実行するようになっている１つ以上のプロセッサを含むシステム。
【請求項３３】
前記方法のいずれかの工程をそれぞれ実行するモジュールを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
計量化学などの多くの用途において、試料の間接測定値と直接測定値（例えば濃度）を用いて校正曲線を作成し、この校正曲線を用いて間接測定値から直接測定値を予測することができる。場合によっては、Ｙは１つ以上の間接測定値（例えば、多変量データ）であり、Ｘはその直接測定値であることがある。ＸとＹの間で校正曲線を作成して、ＸとＹの分布に関して正規性仮定（誤差は正規分布に従うという仮定）を行ってもよい。
【０００２】
多くの例で、直接変数Ｘは連続しており、残差分析を用いて校正曲線を決定してもよい。このような予測は、Ｘがクラス変数、すなわち、Ｘが２個（二値）以上のクラスに対応するような状況には当てはめられない。多くの用途で、直接測定値はクラス変数の可能性がある。この場合、間接測定値および間接測定値と直接測定値との関係に基づいてクラスを予測するためにロジスティック回帰または判別分析を用いることができる。
【０００３】
ロジスティック回帰では、分類は各クラスに存在する尤度／確率に基づき付与される。間接測定値に関しては正規性仮定がなされ、分類はオッズ比計算の単位として達成される。
【０００４】
判別分析では、異なるクラスからの間接測定値の直線距離を算出して、そのクラスを最短距離に基づいて付与する。この場合も間接測定値の分布に関して正規性仮定がなされる。特定の用途では、例えば、試料中の検体の有無の判別など、カットオフ値に近いクラスを互いに判別することに関心がある。
【０００５】
しかし、そのような判別を正確に行うのは難しく、それにより感度および特異性が低下する場合がある。そのような判別は、点滅反応（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡを含む）で起こりうるような経時的に複数の間接測定値が存在する場合に正確な決定を行うのがさらに困難な場合がある。
【発明の概要】
【０００６】
各態様は、試料中の検体（例えば、ＭＲＳＡ）の有無の正確な測定を提供することができる。例えば、この試料を、（可能性としては開始試薬を既に添加した後に）活性化試薬に曝してもよい。これにより、時間と共に増加し、その後減少する点滅信号を発生させることができる。検出器を用いてこの点滅信号から信号データ点を測定してもよい。これら態様は、信号データ点を適合させる回帰関数を決定してもよい。回帰関数の確度項と、信号対バックグラウンド強度項を決定してもよい。信号対バックグラウンド強度項と確度項の差を、試料に検体が存在するか否かを決定するための閾値と比較するスコアとして用いてもよい。
【０００７】
一側面では、試料が検体に対して陽性であるか否かを判定する方法が提供される。この方法は、検出器を用いてバックグラウンド時間間隔の間に複数のバックグラウンドデータ点を収集すること；前記バックグラウンド時間間隔の後であり、前記試料が活性化試薬により活性化された後の時間の一部を含む信号時間間隔の間に前記検出器を用いて収集された複数の信号データ点を収集すること；前記複数のバックグラウンドデータ点および前記複数の信号データ点を用いてコンピュータシステムにより信号対バックグラウンド強度比を算出すること；少なくとも二次多項式を含み、前記複数の信号データ点を適合させる回帰関数を前記コンピュータシステムにより決定すること；前記複数の信号データ点を適合させる回帰関数の確度値を前記コンピュータシステムにより算出すること；前記信号対バックグラウンド強度比を含む信号対バックグラウンド強度項を用いて前記確度値を含む確度項を調整することで前記コンピュータシステムによりスコアを計算すること；および前記スコアを分類閾値と比較して前記試料が前記検体に対して陽性または陰性であるかの分類を決定することを含む。上記方法の一態様では、前記スコアが前記閾値未満である場合、前記試料は前記検体に対して陰性であると判定され、前記スコアが前記閾値以上である場合、前記試料は前記検体に対して陽性であると判定される。一態様では、上記方法は、前記複数の信号データ点に対する前記回帰関数の２乗誤差の加重和を算出すること、および前記２乗誤差の加重和で前記確度値を乗じて前記確度項を計算することをさらに含む。一態様では、前記確度値は、決定係数、自由度調整済み決定係数、Ｆ検定のｐ値、および予測残差平方和（predicted residual error sum of squares (PRESS)）統計より選択される。一態様では、前記回帰関数は二次項の放物線係数を含み、前記確度項は前記放物線係数で乗じた確度値を含む。一態様では、上記方法は、前記信号対バックグラウンド強度比を第一の定数の逆数で乗じて前記信号対バックグラウンド強度項を算出することをさらに含む。一態様では、前記検体の存在が分かっているデータの代表的な集合を参照して所望の感度および特異性が得られるように閾値が選択される。一態様では、前記検体はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である。一態様では、前記検出器は光検出器であり、前記複数の信号データ点は発光信号を形成する。一態様では、前記検体はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である。一態様では、前記バックグラウンド時間間隔は前記活性化試薬による前記試料の活性化の前であり、前記複数のバックグラウンドデータ点は前記試料の活性化の前に前記試料から収集される。一態様では、上記方法は、前記バックグラウンドデータ点の少なくとも一部の中央値を計算すること、前記中央値を用いて偏差を計算すること、前記中央値と前記偏差の和を用いて第一のカットオフ値を決定すること、第一のカットオフ値より大きいバックグラウンドデータ点の第一の個数を計測すること、前記第一の個数を第二のカットオフ値と比較すること、および前記第一の個数が前記第二のカットオフ値よりも大きい場合に誤差が存在すると判定することをさらに含む。一態様では、上記方法は、前記検出器に対し���前記試料を再配置することをさらに含む。一態様では、前記第二のカットオフ値以下である第一の個数により判定されるように上記誤差が修正されるまで前記複数の信号データ点は収集されない。一態様では、上記方法は、前記バックグラウンドデータ点の少なくとも一部の平均を計算すること、前記平均を所定の係数と比較すること、および前記平均が前記所定の係数よりも大きい場合に誤差が存在すると判定することをさらに含む。一態様では、上記方法は、前記検出器のセンサーが塞がれたときに収集されたデータ点を用いて前記所定の係数を決定することをさらに含む。一態様では、前記第二のカットオフ値以下である第一の個数により判定されるように上記誤差が修正されるまで前記複数の信号データ点は収集されない。一態様では、上記方法は、前記コンピュータシステムにより前記複数の信号データ点の最大値を決定することをさらに含み、前記回帰関数は前記最大値の時間を用いて決定される。本明細書の一態様では、前記回帰関数は最大値の時間に中央が置かれている。一態様では、上記方法は、前記複数の信号データ点を用いて、四次以上の多項式である高次回帰関数を決定すること；前記高次回帰関数の確度測定値を算出すること；前記複数の信号データ点の最大値を１個以上の初期閾値と比較すること；前記１個以上の初期閾値との比較に基づいて確度閾値を選択すること；および前記確度測定値を前記確度閾値と比較して、前記確度測定値が前記確度閾値より小さいことに基づき前記試料が前記検体に対して陰性であるか否かを決定することをさらに含む。一態様では、上記方法は、前記確度測定値が前記確度閾値よりも大きいことに基づいて前記試料が前記検体に対して陽性である可能性があると判定すること；および前記スコアの前記分類閾値との比較を用いて前記試料が前記検体に対して陽性または陰性であるかの分類を判定することを開始することをさらに含む。一態様では、上記方法は、前記複数の信号データ点をフィルターにかけて、前記複数の信号データ点に統計的平滑化関数を当てはめることでフィルター済みデータ集合を得ること；および前記フィルター済みデータ集合を用いて前記高次回帰関数を決定することをさらに含む。一態様では、前記複数の信号データ点のフィルタリングは、前記複数の信号データ点の少なくとも一部をそれぞれ含み、前記信号データ点とその隣接するデータ点との中央値を計算すること、および前記信号データ点を前記中央値で置換することを含む。一態様では、前記中央値のそれぞれは、３個の信号データ点から決定される。本明細書の一態様では、前記信号データ点の一部は、信号時間間隔の開始信号データ点から１個のデータ点と、信号時間間隔の終止信号データ点の前の１個のデータ点により埋め合わせられ、前記終止信号データ点は最後の２個の信号データ点の中央値で置換される。前記開始信号データ点が前記高次回帰関数からの対応する値と標準偏差の指定倍の数の値の和よりも大きい場合は、前記開始信号データ点は前記対応する値で置換される。前記高次回帰関数の確度測定値は前記フィルター済みデータ集合に適合されている。一態様では、前記１個以上の初期閾値は、第一の初期閾値および第二の初期閾値を含む。前記最大値が���記第一の初期閾値より大きい場合、前記確度閾値は第一の定数である。前記最大値が前記第一の初期閾値より小さくかつ前記第二の初期閾値より大きい場合、前記確度閾値は第二の定数である。前記最大値が前記第二の初期閾値より小さい場合、前記確度閾値は経験関数から決定される。前記経験関数は、前記複数の信号データ点の最大値に基づいて前記確度閾値を提供する。一態様では、上記方法は、陽性と分かっている信号の複数の異なる最大値のそれぞれについて、統計分布を示すノイズで前記信号を畳み込んでモンテカルロシミュレーションの繰り返しを行うこと（ここで、前記繰り返しのそれぞれでのノイズ量は前記信号で観察されたノイズに依存する）、前記繰り返しのそれぞれについて高次回帰関数の確度測定値をそれぞれ決定すること、前記確度測定値の平均および標準偏差を決定すること、倍率をかけた標準偏差を前記平均から引いて確度データ点を決定すること、および前記確度データ点に経験関数のパラメータを適合させて、信号の入力ピーク値に確度閾値を与える経験関数を得ることにより前記経験関数を決定することをさらに含む。一態様では、上記方法は、前記複数の信号データ点の直線回帰を行うこと、前記直線回帰の傾きの信頼区間の下限および上限がゼロを含むか否かを決定すること、および前記信頼区間の下限および上限がゼロを含む場合、前記試料を陰性と見なすことをさらに含む。一態様では、前記信頼区間は１０％が選択される。
【０００８】
他の態様は、本明細書で記載する方法に関連付けられるシステムおよびコンピュータ可読媒体に関する。
【０００９】
他の態様は、本明細書で記載する方法に関連付けられるシステムおよびコンピュータ可能媒体に関する。
【００１０】
本明細書の他の側面では、上記の方法のいずれかの操作を行うためのコンピュータシステムを制御する複数の指示を格納するコンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品が提供される。他の側面では、上記のコンピュータ製品、および前記コンピュータ可読媒体に格納された指示を実行する１つ以上のプロセッサを含むシステムが提供される。他の側面では、上記の方法のいずれかを行う手段を含むシステムが提供される。他の側面では、検出器、および上記の方法のいずれかを行うようになっている１つ以上のプロセッサを含むシステムが提供される。他の側面では、上記の方法のいずれかの工程をそれぞれ行うモジュールを含むシステムが提供される。
【００１１】
本発明の態様の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することでより理解が進む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、態様によるバクテリア同定システムのブロック図である。
【図２】図２は、本発明の態様によるそれぞれの試料からのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）信号およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）信号の典型的なプロット２００を示す。
【図３】図３は、本発明の態様による、ＭＲＳＡ陽性の試料とＭＲＳＡ陰性の試料から得られた代表的なデータを示すプロット３００を示す。
【図４】図４は、本発明の態様による試料中の標的検体を検出する方法４００のフローチャートである。
【図５】図５は、本発明の態様による閾値（Ｔ）値に対する感度および特異性の値との例を示す。
【図６】図６は、本発明の態様による試料が検体に対して陽性であるか否かを決定する方法のフローチャートである。
【図７】図７は、本発明の態様による最大信号の使用とスコアの使用とでの確度の結果の比較を示す表７００である。
【図８Ａ】図８Ａは、本発明の態様による、最大信号を用いた分類の確度の結果とスコアを用いた確度の結果を比較したグラフを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本発明の態様による、最大信号を用いた分類の確度の結果とスコアを用いた確度の結果を比較したグラフを示す。
【図９】図９は、本発明の態様によるシステムおよび方法で使用可能な一例としてのコンピュータシステムのブロック図を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）とメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を判別するのが困難な場合がある。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／１６０４１８、ＷＯ２０１４／１６４７６８、およびＷＯ２０１５／１６４７４６で記載されているように、ＭＲＳＡが試料中に存在するか否かを決定するいくつか試験は点滅反応を含む。このような点滅信号は、例えば、様々な時間で検出された信号データ点として検出器により検出することができる。このような点滅信号は様々な検体の様々な反応で起こる場合がある。検体の例としては、生細胞の発光アッセイに基づくものが挙げられる。
【００１４】
しかしながら、点滅信号の違いはあるものの、点滅信号はＭＳＳＡ、ＭＲＳＡの両方で発生する。態様によれば、信号対バックグラウンド強度比を決定する部分として複数回で信号データ点を分析してもよい。複数の信号データ点を用いることで、単に最大値を用いる場合よりもより大きな確度を得ることができる。また、回帰を行ってもよい。回帰に二次関数を用いてもよいが、三次、四次、五次、または六次など他の多項関数への回帰を用いてもよい。信号対バックグラウンド強度項を除する、または加算して回帰適合の確度項を調整し、陽性試料と陰性試料を判別する高い感度および特異性をもたらすことができるスコアを得てもよい。
【００１５】
態様によっては、間接測定値の分布に関して何ら仮定をする必要がなく、分類は最適な感度および特異性を達成する目的関数を最適化することができる。態様によれば、間接測定値の平均を用いる場合よりもより大きな感度および／または特異性（あるいはより大きい合計）を得ることができる。ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡで平均を用いるのは最適ではない。というのは、いくつかのＭＲＳＡ試料は非常に高い信号値を有するが、ＭＲＳＡ試料によってはＭＳＳＡ試料に非常に近い信号値を有することがあるためである。
【００１６】
Ｉ．点滅反応
態様によっては、試料中の検体を検出するシステムおよび方法が設計される。検体は、試料と活性化試薬を含む点滅反応から得られた信号に基づいて検出されてもよい。一例では、発光アッセイによりＭＲＳＡの存在を検出するシステムが設計される（活性化試薬を含む例）。このアッセイでは第一の試薬を用いてもよい。生存能力のあるＭＲＳＡ細胞が第二の試薬で活性化されると、第一の試薬により発光信号を生成する。データを収集するため、検出器（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器）が用いられる。
【００１７】
収集されたデータを分析して、収集された特性に基づいてＭＲＳＡの存在とＭＲＳＡの非存在を判別してもよい。この分析を行って、検体の存在に関する試料の正確な測定値を得てもよい。この分析のパラメータは、結果が基準データに対して所望の感度および特異性になるように、ＭＲＳＡに対してそれぞれ陽性および陰性であることが分かっている試料由来の基準データに基づいて選択してもよい。
【００１８】
基準データは、任意の好適な基準アッセイ（標準として受け入れられているものを含む）に基づいてＭＲＳＡに対する陽性／陰性として識別されていてもよい。以下の例では、基準データは、２０１１年１月５日発行された以下のＦＤＡの草稿に記載された増菌培養法に基づいてＭＲＳＡに対する陽性／陰性が分かるとされている：Establishing the Performance Characteristics of Nucleic Acid-Based In vitro Diagnostic Devices for the Detection and Differentiation of Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylococcus aureus (SA)。このような試験は高い確度を有するが、時間がかかり、運転コストが高い。従って、多くの場合では実践的ではない。収集されたデータは、人工の試料または臨床試料を含む様々な供給源に由来していてもよい。例えば、ＭＲＳＡの観察の目的で収集された鼻の拭き取りからの臨床試料データを後の項で記載する実施例で用いる。
【００１９】
Ａ．システム
態様によっては、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／１６４７６８に記載のシステムは、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１５／１６４７４６に記載の消耗品を用いて、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／１６０４１８に記載のＭＲＳＡアッセイを実行してもよい。ＰＣＴ公報ＷＯ２０１４／１６０４１８には上記アッセイと性能が記載されている。
【００２０】
標的細胞（例えば、バクテリア）または他の検体を検出し、同定するシステム、装置、および方法は、形質導入粒子を含んでいてもよい。形質導入粒子は、標的細胞を同定して結合し、標的細胞に操作されたヌクレオチドを送達することができる。図１のブロック図に示すように、態様によっては、システム１００は、遺伝的に操作された形質導入粒子１１０、容器１２０、レポーター１３０、検出装置１４０、およびコンピュータシステム１５０を含む。システム１００は、特定の標的を含む試料Ｓと混合されると形質導入粒子１１０がレポーター１３０を生成するように、容器１２０および／または検出装置１４０を操作、処理、および／または作動させるようになっている。このように、システム１００およびこのシステムに関連付けられる方法は、「切り替え可能」アッセイと見なしてもよい。「切り替え可能」アッセイとは、条件（例えば、標的細胞の存在）がレポーター１３０が生成されるようになるまでは試料中にレポーター１３０が存在しないことを意味する。検出装置１４０は光電子増倍管（ＰＭＴ）であってもよい。ＰＭＴは、反応からの光子を検出して、経時的に信号を生成する。
【００２１】
形質導入粒子１１０は、標的細胞にレポーターＤＮＡおよび／またはＲＮＡを送達することができる任意の好適な粒子であってもよい。例えば、態様によっては、形質導入粒子はバクテリオファージ由来であってもよく、あるいは試料Ｓ中の標的バクテリアに核酸分子を導入することができる非生物学的由来のベクターであってもよい。形質導入粒子１１０は、操作された分子（例えば、組換えＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、プラスミド、リボザイム、アプタマー、および／またはタンパク質）を担持するようにさらに操作および／または構成されている。態様によっては、形質導入粒子１１０は、形質導入粒子が由来するウイルスベクター（例えば、バクテリオファージ）由来の任意のＤＮＡを含んでいない。上述したように、態様によっては、形質導入粒子は、ウイルスベクターが由来するウイルスに関連付けられる野生型ウイルス機能を示すことができる野生型ＤＮＡを欠くウイルスベクターである。
【００２２】
態様によっては、形質導入粒子１１０は、溶菌サイクルまたは溶原サイクルのいずれかで複製することができない。形質導入粒子から複製のすべての形態を除去することで、レポーター分子の生成中に標的細胞は維持される（すなわち、破壊されたり、殺されたり、溶解されたりしない）。これにより、形質導入粒子と共に使用される上記方法の確度および信頼性が向上する。特に、ウイルス粒子の野生型ウイルス機能は溶原複製を示し、溶解複製能を必要とする場合があるので、複製機能（例えば、溶菌サイクル）を抑制する試みは、いくつかのアッセイ集団で溶菌サイクルが発生しないようにするには十分な確実性をもたらさない場合がある。
【００２３】
形質導入粒子１１０は、１種以上の標的細胞に関連付けられ、かつ／または特異的であるという特徴を有していてもよい。上述したように、形質導入粒子１１０は、核酸分子に結合し、核酸分子を標的細胞内に送達するように処方されている。例えば、形質導入粒子は任意のバクテリアに結合するように、選択、操作、および／または生成されていてもよい。任意のバクテリアとしては、例えば、エシェリキア属、マイコバクテリウム属、ブドウ球菌属、リステリア菌、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、レンサ球菌属、ヘリコバクター属、リケッチア属、ヘモフィルス属、ゼノラブダス属、アシネトバクター属、ボルデテラ属、シュードモナス属、アエロモナス属、アクチノバチルス属、パスツレラ属、ビブリオ属、レジオネラ属、バシラス属、カロスリックス属、メタノコックス属、ステノトロフォモナス属、クラミジア属、ナイセリア属、サルモネラ属、赤痢菌属、カンピロバクター属、およびエルシニア属の細菌が挙げられる。
【００２４】
形質導入粒子１１０は、（例えば、装置１４０を介して）検出することができるレポーター１３０を発現させる遺伝子および／または核酸分子を含むようにさらに作製および／または操作されていてもよい。レポーター１３０は、バクテリア発光酵素、真核性発光酵素、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰなど）、比色検出に好適な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、免疫検出に好適なタンパク質（例えば、タンパク質Ａなど）、免疫検出に好適なペプチドまたはペプチドタグ（例えば、３．ｔｉｍｅｓ．ＦＬＡＧなど）、および／またはアプタマーとして機能する核酸または酵素活性を示す核酸のいずれか１つであってもよい。特に、形質導入粒子１１０は、自発的にレポーター１３０を生成しない、かつ／またはレポーター１３０を含まない。その代わり、操作された核酸分子がバクテリアＤＮＡの天然の転写および翻訳機能を用いてレポーター１３０を生成するように、形質導入粒子１１０は、形質導入粒子に含まれて標的細胞（例えば、バクテリア）に送達される操作された核酸分子と通信するようになっている。従って、レポーター１３０は「切り替え可能」レポーターと見なしてもよい。「切り替え可能」レポーターとは、条件（例えば、標的細胞の存在）がレポーター１３０が生成されるようになるまでは試料中にレポーター１３０が存在しないことを意味する。このように、特定の方法は、非結合レポーター１３０の洗浄、レポーターなどの初期量を占める信号の減算を含まない。従って、システム１００およびこのシステムに関連付けられる方法により、均質なアッセイを開発することができる。さらに、温度循環は必要ではなく、例えば、３７℃などの低温で短時間加熱すれば十分な場合がある。
【００２５】
生存能力のあるバクテリアおよび／または標的細胞の存在について報告するために、プロモーターの制御下でレポーター分子に非複製性形質導入粒子１１０（または本明細書で開示されるいずれかの他の形質導入粒子）を組み込むことでレポーター１３０および本明細書で開示されるレポーター系のいずれかを発現させるように組み立てられたレポーター系を開発してもよい。この形質導入粒子１１０がレポーター系を形質導入粒子１１０の宿主範囲内にある細胞に導入すると、プロモーターはレポーター分子の発現を駆動することができる。
【００２６】
一態様では、ＭＳＳＡ／ＭＲＳＡレポーターアッセイは任意の好適な系を用いて開発および／または実行してもよい。そのような態様では、非複製性形質導入粒子（例えば、形質導入粒子１１０など）は黄色ブドウ球菌に特異的なバクテリオファージから開発され、構成プロモーターの制御下でバクテリア発光酵素遺伝子ｌｕｘＡＢが導入される。この形質導入粒子がレポーター系を黄色ブドウ球菌に導入すると、構成プロモーターは、生存能力のある黄色ブドウ球菌の存在を報告するために好適なｌｕｘＡＢを発現することができる。また、形質導入粒子を黄色ブドウ球菌細胞と混合する前あるいはそれと同時に抗生物質セフォキシチンまたは類似の抗生物質を加えた場合、これらの細胞がｍｅｃＡ遺伝子（メチシリン耐性遺伝子）を含まず、かつｍｅｃＡ遺伝子を発現しなければ、アッセイでｌｕｘＡＢは発現されない。従って、細胞はＭＳＳＡである（すなわち、セフォキシチンによる阻害に対して高感度である）ことを示している。しかしながら、これらの細胞がｍｅｃＡ遺伝子を含み、かつｍｅｃＡ遺伝子を発現すると、アッセイでｌｕｘＡＢが発現される。従って、これらの細胞はＭＲＳＡである（すなわちセフォキシチンによる阻害に耐性がある）ことを示している。
【００２７】
生存能力のあるバクテリアの存在を報告するために開発されたレポーターについて記載したが、他の態様では、レポーター１３０およびいずれかの適用可能なレポーター系は、標的バクテリア内の標的遺伝子の存在を報告するために開発されてもよい。この系では、プロモーターのないレポーター遺伝子を、標的遺伝子配列と相同の核酸配列の下流に配置し、このレポーター構築物を非複製性形質導入粒子に組み込む。形質導入粒子がレポーター構築物を標的細胞に組み込む場合、標的細胞が標的遺伝子を含まず、かつレポーター遺伝子が標的細胞内の標的遺伝子プロモーターに操作により結合するように相同組換え事象が標的細胞内の標的遺伝子座位内にレポーター遺伝子を組み込まなければ、レポーター遺伝子は発現されない。
【００２８】
そのような一態様では、黄色ブドウ球菌に特異的な非複製性形質導入粒子（例えば、形質導入粒子１１０、形質導入粒子１６０など）に、プロモーターのないバクテリア発光酵素遺伝子ｌｕｘＡＢの上流のｍｅｃＡ遺伝子に相同な核酸配列からなるレポーター構築物を導入することでＭＲＳＡレポーター系を開発してもよい。形質導入粒子がレポーター構築物を標的黄色ブドウ球菌細胞に導入する場合、標的細胞が標的ｍｅｃＡ遺伝子を含み、かつレポーター遺伝子が標的細胞内のｍｅｃＡ遺伝子プロモーターに操作により結合するように相同組換え事象が標的細胞内のｍｅｃＡ遺伝子座位内のｌｕｘＡＢ遺伝子を組み込む場合を除いて、レポーター遺伝子は発現されない。
【００２９】
態様によっては、形質導入粒子１１０、形質導入粒子１１０内に含まれる核酸分子、および／またはこれに関連付けられるレポーター系は、米国特許公開第２０１０／０１１２５４９号に示し、記載されている組換えバクテリオファージの一部のいずれかを含んでいてもよい。
【００３０】
試料Ｓは、標的検体を含んでいると思われる任意の試料であってもよい。標的検体は、例えば、ヒトの鼻の拭き取り、血液、尿、獣医由来の試料、食品試料、および／または環境試料が挙げられる。態様によっては、試料Ｓは、任意の調製（例えば、任意の分離）または洗浄工程を必要としない供給源から得られたままの未加工の試料であってもよい。従って、システム１００およびこれに関連付けられた方法は均質であってもよい。態様によっては、試料Ｓは少ない量の標的細胞（例えば、ＭＲＳＡ検出用の鼻の拭き取り）を含んでいてもよい。このような試料を用いる場合、システム１００およびこれに関連付けられた方法は、細胞複製を促進するための加熱および／またはインキュベーション期間を含んでいてもよい。これによりレポーター分子１３０の生成量が多くなり、例えば、信号最少閾値よりも大きい信号を生成する。
【００３１】
他の態様では、試料Ｓは多量の標的細胞（例えば、陽性菌血液培養液）を含んでいてもよい。このような場合、標的細胞を同定するのに十分な陽性信号を生成するために細胞複製は必要ではない。そのような態様によっては、特定の条件、例えば、ほぼ室温の２５℃あるいは３７℃以上の温度で、所定の時間、例えば、約４時間未満で試料を維持してもよい。このような態様では、試料Ｓを維持する温度および時間は、生成されるレポーター分子１３０の量が細胞複製とは独立して測定可能な信号を生成するのに十分なものである。このような態様では、試料を所定の温度でより長い時間、例えば、６時間、８時間、１８時間まで、あるいはそれ以上の時間、維持してもよい。
【００３２】
態様によっては、容器１２０は、標的細胞を生存能力のある状態に維持し、バクテリア細胞の成長を促進するために、第一の試薬、例えば、バクテリアの栄養すなわち増殖培地（例えば、最少必須培地）および／または好適な緩衝液（例えば、Ａｍｉｅｓ、ＰＢＳ、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳなど）を含んでいてもよい。態様によっては、例えば、生存能力のある細胞アッセイを意図している場合、第一の試薬はまた抗生物質（例えば、セフォキシチン）を含んでいてもよい。標的細胞を含む試料Ｓを容器１２０に加えて、その後で形質導入粒子１１０を容器１２０に加えてもよい。標的細胞が存在すると、形質導入粒子１１０は、形質導入粒子１１０に含まれるヌクレオチドが標的細胞（例えば、宿主バクテリア）の遺伝子に組み込まれるように形質導入粒子に含まれる核酸配列を標的細胞に導入する。
【００３３】
態様によっては、容器１２０は、試料Ｓを容器１２０の外の領域と流体的に分離するようになっている。このような態様では、形質導入粒子１１０を試料Ｓと混合する前に、形質導入粒子１１０を試料Ｓから流体的に分離して維持する。態様によっては、この維持は、信号を生成するのに十分な量の前記複数のレポーター分子１３０が標的細胞の複製とは独立して生成されるような時間、試料Ｓを維持することを含んでいてもよい。本明細書で記載するように、混合は、領域と容器１２０の分離を維持しつつ、形質導入粒子１１０を試料Ｓに入れることを含む。
【００３４】
態様によっては、容器１２０は、レポーター分子１３０と反応して信号の生成を生成、触媒、および／または向上させるように処方された活性化試薬を含むようになっていてもよい。例えば、レポーター分子１３０は発光酵素であってもよく、容器１２０は信号の生成により検出することができる発光反応を誘発、開始、および／または触媒するように処方されたアルデヒド試薬を含むようになっていてもよい。一実施では、容器１２０のキャップは活性化試薬（例えば、ブリスター中に）を含んでいてもよく、活性化試薬は、システム１００の装置による作動（例えば、ブリスターをはじけさせて）により形質導入された試料と混合される。
【００３５】
様々な態様で、活性化試薬は、６炭素アルデヒド（ヘキサナール）、１３炭素アルデヒド（トリデカナール）および／または１４炭素アルデヒド（テトラデカナール）（この間の炭素分子鎖の長さの異なるすべてのアルデヒドを含む）を含んでいてもよい。態様によっては、容器１２０は、試料Ｓに入れる前に活性化試薬を試料Ｓから流体的に分離して維持するようになっていてもよい。このように、活性化試薬を試料Ｓに送達するタイミングを制御してもよい。態様によっては、システム１００は、任意の好適な時間および／または任意の好適なやり方で活性化試薬を加えて検出可能な信号を誘導する反応機構を含んでいてもよい。例えば、本明細書でより詳細に記載するように、態様によっては、システム１００および／または容器１２０は、所定の速度（すなわち流量）で活性化試薬を試料Ｓに運んで、所望の量の混合を促進する反応機構を含んでいてもよい。
【００３６】
装置１４０は、レポーター分子１３０および／またはレポーター分子１３０で触媒される反応を検出する任意の適切な装置であってもよい。例えば、装置１４０は光学手段（例えば、光電子増倍管、蛍光光度計、分光計、側方流動アッセイの比色検出、画像処理に基づく検出、ＣＣＤ、生物発光を検出する発光検出器、比色分析または蛍光分析マイクロアレイ）および／または電気検出手段（例えば、電気化学電流測定センサー、電位差測定センサー、電気伝導測定センサー、インピーダンス測定センサー、電量分析センサー、および／または任意の他の電気化学化学センサー）を含んでいてもよい。
【００３７】
装置１４０は、測定されたデータを分析するコンピュータシステム１５０に接続されている。この接続は有線または無線であってもよい。無線接続の一例として、装置１４０の取り出し可能なデータ格納装置が測定データを格納してもよく、また格納装置を取り出してコンピュータシステム１５０に挿入してもよい。
【００３８】
態様によっては、システム１００および／またはこれに関連付けられた方法は、標的細胞の何らかの増幅を必要としない高速試験であるようになっていてもよい。システム１００および本明細書で記載する方法を用いて、形質導入粒子１１０に由来する核酸配列を含む標的細胞が検出することができる十分な量のレポーター分子１３０を生成するのに必要な時間は、比較的短時間（例えば、１時間、２時間、３時間、または４時間、１８時間まで）であってもよい。態様によっては、システム１００は試料Ｓの収集後および／または形質導入粒子１１０の添加後に閉じるシステムであってもよい。言い換えると、態様によっては、試料Ｓの添加後に容器を外部環境から流体的に分離して維持する。これにより、例えば、汚染の機会を低減することができる。上記のように、システム１００は未加工の試料を収納することができるので、システム１００およびこれに関連付けられた方法は、任意の洗浄工程、あるいは試料Ｓから流体を移す工程を必要としない。従って、システム１００は、操作が容易で、高速で、安価であり、自動化が容易であり得る。態様によっては、システム１００は、様々な形態（例えば、生存能力のある細胞の報告、遺伝子の報告、バクテリア耐性および／または抗生物質への感受性の測定、および／またはバクテリア毒素の検出など）で動作するようになっていてもよいプラットフォームシステムであってもよい。
【００３９】
Ｂ．代表的なデータおよび判別の問題
各態様は点滅型の反応を含み、後の時間で蛍光信号が見られる場合がある領域を含んでいてもよい。発光アッセイは、多くの異なる種類で利用できる。発光アッセイは、基質（活性化試薬）を用いる化学反応すなわち酵素反応である。レポーター分子がバクテリア発光酵素（ＬｕｘＡＢ）の場合、基質は脂肪アルデヒド（例えば、トリデカナール）であってもよい。化学反応すなわち酵素反応により基質が作用を受けると、副生成物として光が放出される。発光反応の主な２つの型は点滅および蛍光である。点滅発光反応は素早く、例えば、数秒または数分の間に起こって、非常に明るい信号を出す場合がある。一方、蛍光発光アッセイは数時間続く場合があるが、典型的には点滅発光アッセイほど明るくない。
【００４０】
上述のように、活性化試薬が形質導入粒子に応答して検体または検体から生成された分子（例えば、バクテリアによって生成されたレポーター分子）を活性化すると、試料により点滅信号が生成される場合がある。しかし、点滅信号は、標的検体と同様、他の類似の検体に対してよっても生成されることがある。例えば、点滅信号はＭＳＳＡとＭＲＳＡでも生成される。これは、試料が標的検体に対して陽性または陰性であることを分類する判別分析において問題となる。
【００４１】
図２は、本発明の態様による各試料に由来するＭＲＳＡ信号およびＭＳＳＡ信号の典型的なプロット２００を示す。横軸は時間に相当する。縦軸は検出器（例えば、ＰＭＴ）で測定した信号強度に相当する。測定されたデータは、ベースライン測定値（活性化試薬を加える前に収集されたデータ）および基質測定値（活性化試薬を加えた後に収集された信号データ）を含む。このような信号は、ＭＲＳＡの他に、別の検体からも得られることがある。
【００４２】
２つの信号は異なる最大値（ＭＳＳＡが約４００、ＭＲＳＡが約１０５０）を有するが、これら最大値はもっと近い場合もある。いくつかのＭＳＳＡ試料は、いくつかのＭＲＳＡ試料の最大値よりも大きい最大信号値（ピーク）を有することがある。正の信号は、非常に低いピークから高いピークまで広い範囲を有することがある。この類似信号のノイズは、陽性試料と陰性試料を判別する際の問題となる場合がある。従って、単に最大値を用いるのみであると、以下に示すように多くの偽陽性、例えば、所望の感度および特異性より低いデータが得られる。さらに、ピークが様々な時点で発生することがある。
【００４３】
これらの困難な問題を処理するため、各態様は、信号データの動力学の範囲を分析するように、単一の値ではなく、経時的に複数の信号値を用いてもよい。また、各態様は、陽性試料と陰性試料を判別する方法としてそのピークの周りの信号の曲率を分析してもよい。このような技術は、所望の感度および特異性が得られるように、互いに非常に近い信号を区別するのに焦点を置くことができる。以下で、このような近いデータについて記述する。
【００４４】
図３は、本発明の態様による、ＭＲＳＡに陽性の試料とＭＲＳＡに陰性の試料から得られた代表的なデータを示すプロット３００を示す。このデータは、ＰＭＴによって生成された発光量（ＲＬＵ）と、１／４秒ごとにＰＭＴからデータが収集された時間からなる。
【００４５】
プロット３００では、Ｎはデータ点１からデータ点１９までのデータの１９個のデータ点領域である。この期間では、シャッター機構はＰＭＴセンサーを遮っており、従って、ＰＭＴにより生成されるデータはＰＭＴのノイズを表している。次いで、シャッターが開いて、次の２０個のデータ点、具体的にはデータ点２０〜３９からなる期間の間、ＰＭＴセンサーがアッセイ管に曝されるようにアッセイ管が挿入される。２０個のデータ点領域内で、Ｂはデータ点２１〜３８を含む１８個のデータ点領域であり、信号の活性化の前に起こる「バックグラウンドデータ点」と見なされる。最後に、データ点４０で信号は活性化される。この活性化は、信号が素早い増加と減少を示す「注入スパイク」で起こる。この注入スパイクはデータ点４０〜４２を含む。注入スパイクの後が信号Ｓｎで、データ点４３〜５９のデータの１７個のデータ点領域である。信号Ｓｎは、ピークを有する点滅領域３１０を含む。
【００４６】
従って、活性化試薬を注入する前にバックグラウンド信号の測定がある。以下で説明するように前信号チェックはこのバックグラウンドデータから行ってもよい。例えば、バックグラウンドは不規則的であり、検出器をリセットする、例えば、容器１２０を置きなおすことが必要な場合がある。また、バックグラウンド領域のデータ点を用いて、バックグラウンド（ベースライン）平均とバックグラウンドの標準偏差を算出し、これらを用いて信号の分類に用いる信号対バックグラウンド強度比を決定してもよい。
【００４７】
他の態様では、０から４．７５秒（例えば、領域Ｎに対応）まで１／４秒ごとに暗計数測定を行う。このような暗計数測定は判別分析では無視してもよい。５〜９．７５秒までバックグラウンド測定を行い、基質（信号）測定を１０〜１９．７５秒まで１／４秒ごとに行ってもよい。暗計数測定を用いて装置安定性を調べてもよいが、判別分析では用いなくてもよい。バックグラウンド測定により、装置ごとの違いに関する情報が得られる。また、バックグラウンド測定を基質（信号）データと共に統計（スコア）に組み入れて、均一な校正を得てもよい（例えば、装置と装置の校正は必要ではない場合がある）。
【００４８】
ＩＩ．一般的な流れ
実際に、検出システムは、標的検体以外の因子に由来するデータを生成することがある。これらのデータは、交差反応性検体（例えば、ＭＳＳＡ）、システムノイズ、外部供給源からの異常な光などによって生成される非特異的信号に由来する場合がある。このようなデータは、偽陽性、偽陰性、および空値という結果になる場合がある。各態様は、このような異常データを補って偽陽性、偽陰性、および空値という結果を制限するために開発された。陽性の結果と陰性の結果を判別するために信号チェックを行う他、前信号チェックおよび後信号チェックを行ってもよい。例えば、異常を取り除く試みで前信号チェックは、試料を検出器に再配置するという旗を立ててもよい。実施によっては、このような前信号チェックを３回まで行って、その後、偏りがない状態で測定に進んでもよい。後信号チェックの場合は、旗付きの試料を不適合または陰性として示してもよい。
【００４９】
図４は、本発明の態様による試料中の標的検体を検出する方法４００のフローチャートである。方法４００は、システム１００を用いて実行されてもよい。例えば、コンピュータシステムを用いて方法４００の一部を実行してもよい。
【００５０】
ブロック４１０で、検出器によりバックグラウンドデータ点を検出する。バックグラウンドデータ点は、例えば、容器１２０などに試料が挿入された後で検出されてもよい。初期分析のため、例えば、前信号チェックの一部として、バックグラウンドデータを検出装置からコンピュータシステムに送信してもよい。
【００５１】
ブロック４２０で、前信号チェックを行う。このチェックは、任意の反応を開始して信号データ点が回収される前に行われる。従って、このチェックを「前信号」チェックと言う。１回以上の前信号チェックを行ってもよい。例示的な前信号チェックは以下でより詳細に記載される。例示的な前信号チェックは、システムの構造的な側面が存在するか否か、例えば、検出装置が適切に接続されていないかどうかなどを決定してもよい。態様によっては、前信号チェックで問題がなければ方法４００を開始してもよい。
【００５２】
ブロック４３０で、試料に活性化剤を加えて反応を開始する。この反応により、例えば、光信号など、信号が放出される場合がある。この反応は、上述のように、例えば、ＭＲＳＡを検出するためのものであってもよい。
【００５３】
ブロック４４０で、信号データ点を検出器により検出する。信号データ点は、例えば、信号が検体に対して陽性であるときに点滅領域内でピークを有することがある。この信号データ点を分析して、検体が試料中に存在するか否かを決定してもよい。
【００５４】
ブロック４５０で、後信号チェックを行う。このチェックは、信号データ点が回収された後に行われる。従って、このチェックを「後信号」チェックと言う。１回以上の後信号チェックを行ってもよい。例示的な後信号チェックは以下でより詳細に記載される。例示的な後信号チェックは、信号データ点が異常を示しているか否か、従ってエラーを示しているか否かを決定してもよい。他の例示的な後信号チェックは、低い陽性信号を同定するように適合させた基準を用いてもよい。態様によっては、後信号チェックに問題がなければ、方法４００を開始してもよい。
【００５５】
ブロック４６０で、信号データ点とバックグラウンドデータ点に基づいて、試料が標的検体に対して陽性であるか否かを決定する。一例として、信号対バックグラウンド強度項を決定してもよい。回帰（例えば、少なくとも二次多項式）を行って、回帰適合の品質に関する確度項を用いて回帰適合の悪い信号を無視してもよい。
【００５６】
この決定は、試料の分類の一例である。例えば、各態様は信号対バックグラウンド強度項および確度項を用いて、閾値と比較されるスコアを決定して、分類を決定してもよい。分類の例としては、検体の有無、判定不能、または有無の信頼性の程度が挙げられる。
【００５７】
ＩＩＩ．分類
各態様は、点滅反応で試料が標的検体に対して陽性であるか否かを決定する分類仮定を最適化してもよい。この最適化を行って、最適な感度および特異性を得てもよい。例えば、スコアの１つ以上のパラメータを選択して、感度および特異性の合計を最適化し、潜在的に感度および特異性が９５％以上であるという要件を満足させてもよい。
【００５８】
典型的には、判別分析では、間接測定値（Ｙ）の線形結合が導出されて、間接測定値の未来の観察がクラス間の平均距離に基づいて分類されるように直接測定値（Ｘ）のクラスを分離する。これに対して、各態様は、あるクラスのＸについてデータの上９５パーセンタイル（百分位数）のＹと他のクラスについてのＹデータの下９５パーセンタイルとの分離を最大にするスコアおよび閾値を導出してもよい。この手法は、Ｘが複数のクラスに対応し、Ｙが単変量または多変量である場合に拡大してもよい。態様によっては、Ｙの理論的確率分布について仮設を立てない。
【００５９】
それぞれ９５％の特異性および９５％の感度が得られるように、ＭＳＳＡ試料の上９５パーセンタイルとＭＲＳＡ試料の下９５パーセンタイルとの分離（判別）に異なる統計を考慮した。この分類の統計は単変量または多変量であってもよい。統計の例としては、（１）基質データの部分試料（例えば、１０〜１９．７５秒の異なる期間の）を利用した切片と傾き、（２）基質およびベースラインデータの部分試料（１０〜１９．７５秒および５〜９．７５秒の異なる期間の）を利用した切片と傾き、（３）基質データの部分試料の和／ベースラインデータの和、および（４）基質データの部分試料の和／ベースラインデータの最大値が挙げられる。（１）の場合、１０〜１９．７５秒のデータ点の直線回帰に基づいて、試料ごとに切片と傾きを決定してもよい。次いで、これらの切片と傾きを２つのクラスのパーセンタイルについて分析してもよい。（２）も同様である。単変量統計が以下で規定される。
【００６０】
単変量統計を決定する一部として、各種試料の間接測定値および直接測定値に関する第一のデータを得る。間接測定値の多変量データを単純化して１つの統計値にした。例えば、各態様は、収集されたＮ個のデータ点を２つの分類（群）に分離する１つの測定基準に抽出してもよい。以下の実施例では、ＭＳＳＡの上９５パーセンタイルがＭＲＳＡの下９５パーセンタイルを下回るように１つの測定基準（スコア）が間接測定値を２つのクラスに分離してもよい。従って、各態様は、特定の感度および特異性目標を達成する分類システムを提供することができる。
【００６１】
Ａ．信号対バックグラウンド強度および曲率の使用
試料が標的検体（例えば、ＭＲＳＡ）を含むか否かを決定するために、各態様は、スコア（Ｓ）を算出し、このスコアの値を分類閾値（Ｔ）と比較してもよい。スコアが閾値以上であれば、試料は標的検体に対して陽性であると見なされ、スコアが閾値未満であれば、試料は標的検体に対して陰性であると決定される。また、スコアおよび閾値は、陰性および陽性であると決定される対象に関して反対の関係を有すると定義してもよい。
【００６２】
態様によっては、スコアは式Ｓ＝Ｒｓｎ−Ｃｘｓ≧Ｔより算出される。項Ｒｓｎは信号対バックグラウンド強度項である。項Ｃｘｓは、回帰関数の信号データ点への適合の確度の測定値である確度項である。Ｒｓｎは、式Ｒｓｎ＝（Ｙ−ＢＭ）／ＢＳにより算出されてもよい。ここで、Ｙは信号データ点（Ｓｎ）、例えば、ＰＫｓｔとＰＫｅｎｄの間のデータ点の和であり、ＰＫｓｔ＝４３かつＰＫｅｎｄ＝５９である。従って、Ｙは
2019507863.tif 000003
として定義してもよい。項Ｙは、ピークの周りに有効に積分される。
【００６３】
ＢＭをＢＭ＝ＰＳ＊Ｂｍとして定義してもよい。従って、ＢＭは、バックグラウンドデータ点Ｂｍの平均（あるいは異なる項の中央値、モード、または和）と信号データ点（例えば、ＰＳ＝１７を包含する合計データ点）の積である。ＢＳは、バックグラウンドデータ点Ｂｓの標準偏差（または範囲あるいは四分位数）と定数Ｗの積ＢＳ＝Ｗ＊Ｂｓである。Ｃｘｓは、二次最小二乗回帰（Ｘ２）の放物線係数と二次最小二乗回帰の決定係数Ｒ２（または確度の任意の測定値）との積Ｃｘｓ＝Ｒ２＊Ｘ２である。凹関数の場合、点滅領域などでは、Ｘ２は負である。従って、良好な凹適合はＳの値を増加させる。というのは、項ＣｘｓをＲｓｎから減じるからである。確度項が放物線係数を含む態様では、放物線係数は、どの程度確度値がスコアを減じるかに関する重み付け係数として作用してもよい。
【００６４】
回帰適合が悪いとき、すなわち、信号の動力学が主に二次式ではないとき、確度測定値（例えば、Ｒ２）は小さくなる。正の信号は主に二次式であり、従って良好な適合がスコアを増加させる。Ｘ２の値は、図３に存在するように、下に凹の信号（すなわち、放物線が下に開いている）の場合は負である。Ｘ２以外の異なる重み付け係数を用いると（例えば、単に１）、確度項を信号対バックグラウンド強度項に加算してもよい。同等に、重み付け係数は−１であってもよく、この場合もＳ＝Ｒｓｎ−Ｃｘｓを用いてもよい。
【００６５】
指定された感度および特異性（例えば、感度が≧９０％、および特異性が≧９５％）を達成するために、標的検体（例えば、ＭＲＳＡ）に陽性および陰性となる既知の試料に由来する代表的なデータ集合を用いて計算して定数ＷおよびＴを選択してもよい。カットオフに近いデータ、すなわち標的検体の含有量が最少である試料のアルゴリズムを最適化するため、標的検体に対して陰性であると分かっているデータの上９５パーセンタイルと、標的検体に対して陽性であると分かっているデータの下９５パーセンタイルを用いてもよい。
【００６６】
次いで、以下の基準に基づいてデータを分析してもよい。
【００６７】
真陽性（ＴＰ）：Ｓ≧Ｔとなる既知のＭＲＳＡ陽性試料、
真陰性（ＴＮ）：Ｓ＜Ｔとなる既知のＭＲＳＡ陰性試料、
偽陽性（ＦＰ）：Ｓ≧Ｔとなる既知のＭＲＳＡ陰性試料、および
偽陰性（ＦＮ）：Ｓ＜Ｔとなる既知のＭＲＳＡ陽性試料
【００６８】
既知の試料および下記式：感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）および特異性＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）に由来する代表的なデータ集合を用いて感度および特異性を算出してもよい。この方法では、アルゴリズムが所望の感度および特異性を達成するように定数ＷおよびＴを選択してもよい。一実施では、所望の感度は≧９０％であり、所望の特異性は≧９５％である。
【００６９】
図５は、本発明の態様による、パラメータＷの値が１５であるときの感度および特異性の値と閾値（Ｔ）値の例を示す。このデータ分析に基づいて、Ｔが感度および特異性を最適化するために値１８を選択する。他の例示的なＴ値は１２である。
【００７０】
Ｂ．例
一例として、スコアを以下のように決定してもよい。
【数１】
2019507863.tif 000004
【００７１】
この和は、時間１０．７５と１４．７５の間の信号データ点のものである。平均は、５．２５と９．５０の間のバックグラウンドデータのものである。ＳｔＤｅｖは、５．２５と９．５０の間のバックグラウンドデータの標準偏差である。
【００７２】
放物線適合は、１０．７５と１４．７５の間の９個のデータ点について二次最小二乗回帰が生成されることを意味する。Ｘ２係数は最小二乗回帰曲線の二次係数に相当する。放物線適合データ点＃５は、極大（１０．７５〜１４．７５）にあり、極大に対して放物線を有効に中央に揃えて、いずれかの側に４個のデータ点（時間は１秒）を有している。態様によっては、同じ値を有する複数の点（例えば、同じ極大値を有する２個の隣接する点）がある場合、注入ピークに最も近い１個の点を選択してもよい。
【００７３】
極大（１０．７５〜１４．７５）が１０．７５と１１．５の間にある場合、放物線適合は１１．７５を中央とする。極大（１０．７５〜１４．７５）が１４．０と１４．７５の間にある場合、放物線適合は１３．７５を中央とする。
【００７４】
従って、態様によっては、標的検体の存在の分類は、信号対バックグラウンド強度項および放物線適合法の両方を用いてもよい。信号対バックグラウンド強度項（Ｒｓｎ）を算出するため、Ｐｉｓ−（注入スパイク（例えば、３に設定）に広がるデータ点の数）およびＰｓｓ−（指定範囲（１７に設定）を形成するデータ点の数）という２つの構成可能なパラメータを用いて信号データの和（Ｙ）を算出してもよい。信号データは、第一の基質データ点の開始後にＰｉｓデータ点で開始する検出された基質データ点のＰｓｓデータ点である。最初のデータ点および最後のデータ点を除くバックグラウンドデータ点の平均（ＢＭ）を算出し、Ｐｓｓで乗ずる。最初のデータ点および最後のデータ点を除くベースライン読み取りの標準偏差（ＢＳ）をパラメータＷ（例えば、固定定数１５）で乗ずる。信号対バックグラウンド強度項をＲｓｎ＝（Ｙ−ＢＭ）／（Ｗ＊ＢＳ）として算出してもよい。
【００７５】
放物線適合に対する信号データの確度項Ｃｘｓを以下のように算出してもよい。信号データの最大データ点（Ｍ）を見つける。信号データの９個のデータ点の二次最少二乗回帰とＭのいずれかの側の４個のデータ点を用いて放物線適合を算出してもよい。Ｍの時点が信号データから３データ点以内である場合、放物線適合は信号データの開始後から４データ点の時点を中央としてもよい。Ｍの時点が信号データの終わりから３データ点以内である場合、放物線適合は信号データの終わりから４データ点の時点を中央としてもよい。放物線適合からの項Ｘ２の係数を確度値（例えば、決定係数値Ｒ２（決定係数）で乗じてＣｘｓを算出してもよい。確度値の他の例は、自由度調整済み決定係数、Ｆ検定のｐ値、および予測残差平方和（ＰＲＥＳＳ）統計である。
【００７６】
生スコアＳをＳ＝Ｒｓｎ−Ｃｘｓとして算出してもよい。試料が陽性／陰性であるかを決定するために閾値Ｔ（例えば、１２）の構成可能なパラメータを用いてもよい。Ｓ≧Ｔであれば、試料は陽性（ＭＲＳＡ）であり、そうでなければ試料は陰性である（ＭＲＳＡではない）。
【００７７】
Ｃ．方法
図６は、本発明の態様による、試料が検体に対して陽性であるか否かを決定する方法６００のフローチャートである。方法６００は、少なくとも部分的にコンピュータシステムにより行われてもよい。
【００７８】
ブロック６１０で、検出器を用いて複数のバックグラウンドデータ点を収集する。一例として、検出器は光検出器（例えば、ＰＭＴであってもよい。検出器の他の例としては、ｐＨまたはイオン／電荷型の検出器が挙げられる。バックグラウンド時間間隔の間にバックグラウンドデータ点を収集する。図３の領域Ｂに示すように、バックグラウンド時間間隔は信号を受信する前に発生する場合がある。
【００７９】
ブロック６２０で、検出器を用いて複数の信号データ点を収集する。複数の信号データ点を信号時間間隔の間に収集する。この信号時間間隔はバックグラウンド時間間隔の後であってもよい。信号時間間隔は、活性化試薬により試料が活性化された後の時間の一部を含む。例えば、信号時間間隔は図３のＳｎ領域に対応していてもよい。
【００８０】
ブロック６３０で、コンピュータシステムは、これら複数のバックグラウンドデータ点および複数の信号データ点を用いて信号対バックグラウンド強度比を算出してもよい。一態様では、信号対バックグラウンド強度比は、バックグラウンドの平均未満の信号曲線の下の面積の比率として算出され、その結果をバックグラウンドの標準偏差で除する。例えば、信号対バックグラウンド強度比は（Ｙ−ＢＭ）／Ｂｓとして算出されてもよい。ここで、Ｂｓはバックグラウンドの標準偏差である。さらに、信号対バックグラウンド強度比の例はセクションＩＩＩで記載される。例えば、信号対バックグラウンド強度比ＲｓｎはＲｓｎ＝（Ｙ−ＢＭ）／ＢＳ＝（Ｙ−ＢＭ）／（Ｗ＊Ｂｓ）として決定されてもよい。平均以外の他の統計値、例えば、異なる項の中央値、モード、または和をＢＭに用いてよい。標準偏差以外の他の偏差の測定値をＢＳに用いてもよい。例えば、値の特定の範囲、値の百分率、値のランク、または値の四分位数などである。他の例では、項ＢＭを除外してもよく、これにより異なる分類閾値が得られる。
【００８１】
ブロック６４０で、コンピュータシステムは任意に前記複数の信号データ点の最大値を決定してもよい。この最大値は、信号曲線のピークに対応していてもよい。例えば、図３は点滅領域３１０のピークを示す。２個の信号データ点が等しく、最も高い場合、態様によってはいずれか一方を最大値として用いてもよい。さらなる一態様では、そのような信号データ点の間にピークがあると解釈してもよい。
【００８２】
ブロック６５０で、コンピュータシステムは、前記複数の信号データ点を適合する回帰関数を決定する。この回帰関数は少なくとも二次多項式を含む。例えば、回帰関数の中央揃えのための最大値の時間を用いて回帰を決定してもよい。回帰は、回帰関数の３つのパラメータに最も適合するものを決定する測定基準として最少二乗を用いてもよい。
【００８３】
回帰を決定するのに用いられる複数の信号データ点は、特定の間隔にあると規定されてもよい。すなわち、すべての信号データ点を用いなくてもよい。例えば、信号データの最大値を決定して、これを用いて最大値およびデータ点（例えば、４）の前、最大値の後のデータ点（例えば、４）を用いてデータの回帰を行ってもよい。従って、最大値に隣接する点を用いてもよい。４個のデータ点を最大のいずれかの側で用いる態様では、最大値が信号データの開始から３個以内のデータ点にあれば、放物線適合は信号データの開始後から４個目のデータ点の時点を中央としてもよい。最大値が信号データの終わりからデータ点以内にあれば、放物線適合は信号データの終わり前から４個目のデータ点の時点を中央としてもよい。一実施では、２つ以上のデータ点が同じ最大値を有する場合、１つ目のデータ点が用いられる。
【００８４】
実施によっては、信号の最大値が所定量未満である場合、回帰の中央を最少の所定量に設定してもよい。他の実施では、信号の最大値が所定量よりも大きい場合、回帰の中心を最大の所定量に設定してもよい。
【００８５】
ブロック６６０で、コンピュータシステムは前記複数の信号データ点を適合する回帰関数の確度値を算出してもよい。態様によっては、確度値は決定係数Ｒ２である。他の態様は、信号データ点と回帰関数の差の２乗の和を用いてもよい。ここで、例えば、データ点の数、データの分散などで２乗の和を正規化してもよい。
【００８６】
ブロック６７０で、信号対バックグラウンド強度項で確度項を調整してコンピュータシステムはスコアを算出する。この調整は減算または加算により行ってもよい。確度項は確度値を含む。例えば、確度項は、回帰関数の二次項の放物線係数を含む。具体的には、確度項は、Ｃｘｓについて上述したように、放物線係数で乗じた確度値を含んでいてもよい。信号対バックグラウンド強度項は、信号対バックグラウンド比を含む。例えば、第一の定数の逆数で信号対バックグラウンド強度比を乗じて信号対バックグラウンド強度項を算出してもよい。
【００８７】
ブロック６８０で、スコアを分類閾値と比較して、試料が検体に対して陽性または陰性であるかの分類を決定する。分類閾値（例えば、上述のＴ）により、陽性試料と陰性試料を判別してもよい。例えば、図５に示すように達成された感度および特異性を最適化するようにＴの値を選択してもよい。
【００８８】
２つ以上の分類閾値を用いてもよい。そのような態様では、分類は、陽性または陰性以外の他の分類（例えば、陽性または陰性の異なる信頼度）を含んでいてもよい。判定不能は分類の一例である。
【００８９】
Ｄ．信号対バックグラウンド強度項
信号対バックグラウンド強度項Ｓｎを決定することの一部として、経時的に発生する複数のデータ点（例えば、新しいデータ点に関して１／４秒ごとに検出されるデータ点）を積分して、縦モード解析を行ってもよい。この縦モード解析は、信号の部分に相当していてもよい。ここで、持続した値は、素早く上昇して降下する高いピークよりも好ましい場合がある。平均バックグラウンドを用いて、所与の測定値（例えば、異なる検出器は異なるゲインを有することがある）に特異的な増加信号を補ってもよい。分母の偏差項は、ノイズを表していてもよい（例えば、あるシステムは他のシステムよりもノイズが多いことがある）。
【００９０】
また、信号対バックグラウンド強度項は倍率を含んでいてもよい。例えば、信号対バックグラウンド強度比に１／Ｗで乗じてもよい。ここでＷは定数（例えば、１５）である。達成された感度および特異性を最適化してパラメータＷの値を決定してもよい。態様によっては、このようにして２つのパラメータＷおよびＴを決定してもよい。ＷおよびＴを次元とし、かつ第三の次元を感度および特異性のパーセントのプロットとして、三次元プロットを決定してもよい。従って、図５でＷの固定値について行ったように、ＷおよびＴの最適な値の両方を同時に決定してもよい。
【００９１】
様々な態様で、信号Ｓｎ（例えば、注入ピークの後の１７点）は、信号の点滅部分に広がっている限り１７個より小さいあるいは大きい領域であってもよい。この領域は、上述の項Ｙとして組み込まれる。Ｓｎのいくつかの点で、上述のようにピークの積分を中央揃えすることが重要な場合がある。同様に、平均バックグラウンド（上述の項ＢＭ）は、上の例よりも大きいまたは小さい領域であってもよく、これを用いて平均バックグラウンドと標準偏差（上述の項ＢＳ）の両方を得てもよい。より小さい領域は、測定は速いが幾分精度を犠牲にし、相応に、より大きい領域は、測定は遅いが幾分精度が高い場合がある。
【００９２】
Ｅ．確度項
確度項は、信号データ点のピークの動態、すなわち、ピークが点滅反応の特性を有するか否かを測定してもよい。具体的には、確度項は、陽性試料と陰性試料の判別を助けるようにピークの動態を二次回帰関数または他の回帰関数と関連付ける。信号のピークが選択された回帰関数に似ている場合は、試料は陽性である傾向が高い。というのは、回帰関数は陽性信号に似るように選択されるからである。確度値は、信号データ点（または信号データ点の一部）が回帰関数にどの程度近いかを測定する。
【００９３】
実施によっては、確度項は、決定係数Ｒ２を有する回帰（上でＸ２と言われている）から得られた二次係数の積である。確度項にはこれら２つの測定基準に対する代りがある。例えば、項Ｘ２は、データ（例えば、四次または五次）のより高次の多項式適合から導かれてもよい。また、回帰で分析されるデータ領域は、上で示した例示的な領域よりも小さいか大きい場合がある。項Ｒ２と同様に、例えば、いわゆる調整済みＲ２および予測Ｒ２など、代わりの確度測定値を用いてもよい。
【００９４】
確度項が放物線係数を含む態様では、確度値がどの程度スコアを減ずるかに関する重み付け係数として放物線係数が作用してもよい。陽性信号は、通常、下に凹であり、放物線係数は負の値である。従って、確度項は典型的には負であり、確度項が信号対バックグラウンド強度項で調整される場合はスコアが増加する。任意の好適な重み付け係数、例えば、単に−１を用いてもよい。放物線係数が正であれば、スコアを低下させる。というのは、この場合陽性信号が上に凸になることはもっとも可能性が低いからである。
【００９５】
ＩＶ．前信号チェック
これらのチェックは、点滅反応の前の基質の注入前に行われる。
【００９６】
Ａ．異常バックグラウンドデータの同定
一定しないデータは、ＰＭＴの機能不良の結果で、ＰＭＴは信頼性の低いデータを生成しているかもしれない。よく機能しているＰＭＴでは、システムのノイズはポアソン統計を示すことが予測され、ノイズの標準偏差はノイズの平均の平方根に等しいことが予測される。この洞察に基づいて、各態様は予測されないデータがバックグラウンドから収集されるか否かをチェックしてもよい。例えば、ポアソン分布以外の統計分布を異なる種類の検出器に用いてもよい。
【００９７】
従って、例えば、図３の領域Ｂのバックグラウンドデータ点など注入前のバックグラウンドデータ点を分析してもよい。中央値を決定する。分布では中央値と平均は当然同じである。ポアソン分布の場合、分散は平均と同じである。バックグラウンドのデータ点は当然、ポアソン分布に従う。従って、中央値が平均とは異なる特性を示すと、例えば、試料容器を検出器に適切に設置していないなど、バックグラウンドが異常と同定される場合がある。
【００９８】
チェックの一部として、中央値は平均であると見なしてもよい。中央値は異常値に対しては高感度ではない。中央値を用いてバックグラウンドデータ点の標準偏差（ＳＴＤ）を決定する。２＊ＳＴＤに中央値を加えた値より大きいデータ点の数を数える。データ点の数が閾値（例えば、５）より大きいと、バックグラウンドが大きすぎて、試料容器を設置し直す必要がある。大きいノイズは、読み取りを上昇させる信号の作為的な結果を示している。
【００９９】
一例としての実施では、バックグラウンドの各データ点からバックグラウンドの中央値を減じて、残りをバックグラウンドの中央値の平方根と第一の定数の積と比較する。異常信号に存在し得るデータ点の異常値に無反応とするために、この計算に平均の代わりに中央値を用いる。中央値と平均は、異常ではないデータに対して同じ統計値を有する。式の左辺が式の右辺より大きい数になるデータ点の数を列挙する。この和が第二の定数より大きい場合、バックグラウンドは予測されないデータを生成していると決定され、システムはさらなるデータ分析に適していないと見なされる。そのような状況では、試料容器をＰＭＴに対して置き直してもよい。この和が第二の定数以下である場合、バックグラウンドは予測されないデータを生成していないと決定され、システムはさらなるデータ分析に適していると見なされる。第一の定数および第二の定数は実験的に決定されてもよく、それぞれ、２および５が選択された。
【０１００】
従って、態様によっては、バックグラウンドデータ点の少なくとも一部の中央値を算出して、次いで、この中央値を用いて偏差を算出してもよい。例えば、この偏差は、ポアソン分布の標準偏差に対応する中央値の平方根であってもよい。中央値と偏差の和を用いて第一のカットオフ値を決定してもよい。この第一のカットオフ値は、中央値を減じて、得られたデータ点を偏差項（例えば、偏差の２倍）と比較したものに相当する。２は、上記の第一の定数の一例である。第一のカットオフ値よりも大きいバックグラウンドデータ点の第一の個数を数えて、第二のカットオフ値（例えば、上記の第二の定数として５とした）と比較してもよい。第一の個数が第二のカットオフ値よりも大きい場合、エラーが存在すると決定される。このエラーは、システム（例えば、検出器）に関する問題の結果である場合がある。エラーの指標として、警告をユーザに送ってもよい。
【０１０１】
前記複数の信号データ点を収集する前にテストを行って、試料が無駄にならないようにシステムを再接続してもよい。エラーが存在しないことを確実にするため、再度前信号チェックを行ってもよい。従って、一態様では、前記第二のカットオフ値以下である第一の個数により判定されるように上記誤差が修正されるまで前記複数の信号データ点は収集されない。他の態様では、所定の回数（例えば、３回）まで置き直しして、それでも解決しなければ方法を開始してもよい。
【０１０２】
Ｂ．中央値は閾値より大きい
上昇したバックグラウンド信号は、機能不良のＰＭＴの結果で、信頼性の低いデータを生成しているかもしれない。あるいは、外部供給源からの異常光、アッセイにおける信号の未成熟活性化（これらは信頼性の低い結果になり得る）を含む他の要因であるかもしれない。各態様は、上昇したバックグラウンドが観察されるか否かをチェックしてもよい。バックグラウンドの平均を所定の係数（例えば、４０）と比較してもよい。
【０１０３】
バックグラウンドの平均が所定の係数より大きい場合、バックグラウンドは上昇していると決定され、システムはさらなるデータ分析に適していないと見なされる。このような状況では、試料容器をＰＭＴに対して置き直してもよい。バックグラウンドの平均が所定の係数以下である場合、バックグラウンドは上昇していないと決定され、システムはさらなるデータ分析に適していると見なされる。
【０１０４】
所定の係数は、検出器のノイズの分析から選択されてもよい。検出器を試料に曝す前にデータ収集の前期間（例えば、図３の領域Ｎ）を得てもよい。この前期間では、シャッター機構は検出器センサーからの光を遮断していてもよい。この「暗部」データの統計を用いて、所定の係数を動的に選択してもよい。例えば、所定の係数は、暗部データの平均、または暗部データの平均と定数との積として算出されてもよい。
【０１０５】
Ｖ．後信号チェック
信号データを収集した後で以下のチェックを行う。スコアを用いて検体に対して関する分類を（例えば、方法６００により）を決定する前または後で後信号チェックを行ってもよい。
【０１０６】
Ａ．動的閾値を用いたスクリーニング
ピークが小さい信号の場合、感度および特異性をさらに高めてもよい。個別閾値分析を行ってもよい。信号がこの初期閾値を越えると、他の閾値テストで方法６００を行ってもよい。標的検体に対してより生成された信号が特定の動的特性を示すので、標的検体から生成されない非特異的信号は、信号の動的特性の分析に基づいて標的検体に対してより生成される特定の信号と区別することができる。
【０１０７】
態様によっては、ピークが非常に小さいので動的（適応）閾値を用いる。この初期閾値テストを用いて、開始するか否かを決定する。この初期閾値は、信号の大きさに基づいていてもよい。ピークの大きさが固定された閾値より小さい場合、適応閾値を用いてもよい。信号がこのテストを合格すれば、上記のスコア付けを行ってもよい。しかし、合格しなければ、信号は陰性として同定される。
【０１０８】
ピークが小さいので、データ点のポアソン変動はより大きな影響を有する。従って、実際の小さい陽性信号はノイズが多く見えるかもしれない。最大が特定のレベルの間にある場合に基づき、小さい陽性信号に予測されるノイズの量を決定する。小さい陽性信号のノイズの量は、既知の陽性信号に基づいて決定される。
【０１０９】
所定のピーク値の場合、例えば、実際の信号に見られるノイズの予測量に基づいてモンテカルロ技術を用いて予測ノイズ量が決定される。例えば、実際の信号を同定して、信号値を低減してもよい。ポアソン統計に基づいて各ピーク値に予測されるノイズ量に対してモンテカルロ法が実施される。このモンテカルロ技術は、単一のノイズのない特徴的なアッセイ信号を用いてもよい。この単一のノイズのない信号は、予測される低いレベルの信号を含む異なる信号レベルまで数学的に増加させてもよい。それぞれの増加させたレベルで、モンテカルロ技術を用いて予測されるノイズ量が決定される。この決定は、増加させた信号レベルの範囲が様々な信号レベルで予測されたノイズを特徴付けるように行われてもよい。
【０１１０】
ノイズのシミュレーションに基づいて、関数適合（例えば、四次適合）の予測確度（例えば、Ｒ２）を決定してもよい。これは複数のピーク値に対して行われ、これらピーク値間で内挿が行われる。内挿は対数尺度（例えば、２）に基づいていてもよく、ピークが小さくなるにつれて勾配が細かくなっていく。従って、任意のピーク値に対して、最大値に基づき確度閾値を決定してもよい。電流信号の確度値が閾値より大きいと、信号は通過し、各態様はスコア付け閾値（例えば、ブロック４６０）に進んでもよい。
【０１１１】
一例では、各態様は以下のチェックを行ってもよい。Ｓｎ領域の直線回帰の標準誤差が閾値より大きい（すなわち強い信号である）場合、この信号の形状は平滑であることが予測され、上に凹の形状を示すことができない。信号が閾値より小さい（すなわち弱い信号である）場合、ピークの形状は「ノイズ」であると予測され、ポアソン分布または他の統計分布（例えば、ＰＭＴ以外の検出器を用いた場合）のノイズで畳み込んだ四次多項式によりモデル化されてもよい。信号がこれらの特性を示さない場合は、特異的な信号ではないとして旗を立てて、上記のスコア付け方法はこのデータを処理しない。
【０１１２】
一実施では、Ｓｎ信号領域（例えば、４３〜５９）に亘るデータ点が分析される。このデータはまず、Ｓｎ領域の開始より１つ目から始まりＳｎ領域の終わりの１つ前で終わる（従って両端の点は飛ばされている）隣接する３つのデータ点ごとにその中央値を計算することでフィルターされる。両端は異なる処理がされる。得られた中央値は、３つのデータ点の真ん中と置き換えられる。
【０１１３】
右端のデータ点は、残りの２つのデータ点の中央値で置換される。このデータ点は末尾にあるので、これは好ましい近似である。左端のデータ点は注入ピークＰｉｓ領域に隣接している。この左端の点をフィルターするため、この点が孤立値（例えば、フィルター済みデータと特定の数（例えば、３）にその標準偏差を掛けた値との合計値の四次多項式適合から算出された左端の点の値より大きい）か否かについて試験をする。左端の点が孤立値の場合、外挿値（フィルター済みデータの四次多項式適合から算出された左端の点の値）が代入される。次いで、処理済みの両端の点を含むフィルター済みデータの四次多項式適合が行われて、この適合の決定係数値が算出される。
【０１１４】
ピーク値はＳｎ信号領域（例えば、４３〜５９に亘る）の最大値として決定される。ピーク値が高ピーク閾値（例えば、８１０ＲＬＵ）より大きく、適合の決定係数が閾値（例えば、０．９７）より小さい場合、データは異常として旗が立てられる。適合の決定係数（または他の確度測定基準）が閾値より大きい場合は、処理を進めてスコアを決定してもよい。
【０１１５】
ピーク値が低ピーク閾値（２００ＲＬＵと選択）よりも小さい場合は、適応確度閾値（例えば、決定係数閾値）を算出してもよい。そうでなければ、定数決定係数閾値（例えば、０．９３０４８）を用いてもよい。適応閾値をピークの高さ（最大値）の様々な累乗の線型結合として算出してもよい。ここで、累乗はピークの高さの対数であってもよい。異なるピークで決定された確度測定値（例えば、Ｒ２）を適合して線型結合の係数を決定してもよい。例えば、以下の式を用いて適応決定係数閾値を算出してもよい。
【数２】
2019507863.tif 000005
ここで、ピークはピーク値である。
【０１１６】
一例として、Ｂ０＝−０．６９６５０、Ｂ１＝１．３７００９、およびＢ２＝−０．２８８１４を以下のように実験的に決定してもよい。検体に対して陽性であると決定されかつ低ピーク閾値未満のピークを示すデータの四次多項式適合を行って式の定数Ｂの値を決定する。次いで、ポアソン分布を示すノイズの１０，０００個の繰り返しで畳み込んだ適合データにモンテカルロシミュレーションを行う。一実施では、単一スケールのノイズのない信号からのそれぞれの個別の値は平均値である。この平均値を用いて、信号のその点に対して単一のポアソン分布値（ノイズ値）を生成する。これを信号の各点に対して行って、１０，０００回のモンテカルロ繰り返しの各繰り返しに必要な信号をシミュレートする。
【０１１７】
低ピーク閾値未満のピーク値を変化させるように調整された適合データからなる模擬データについてシミュレーションが行われる。このシミュレーションからの決定係数の平均および標準偏差は、ピーク値ごとに算出される。次いで、これらの小さいピーク値と平均決定係数から決定係数の標準偏差の３倍を引いたもの（適応閾値）との数学的関係が確立される。定数Ｂ０、Ｂ１、およびＢ２はこの数学的関係を表している。この数学的関係は小さいピークの適応決定係数閾値である。
【０１１８】
信号データの決定係数が決定係数適応閾値より小さい場合、その信号データは異常（すなわち陰性）として旗が立てられる。また、信号データの四次多項式適合の二次パラメータが陽性であり、信号データの標準誤差が所定の値（例えば、２５）より小さい場合、この信号データは異常として旗が立てられてもよい。この試験の場合、決定係数閾値は、２００ＲＬＵ未満のピークの場合は適応決定係数閾値であるか、それより大きいが高ピーク閾値よりも小さいピークの場合は定数決定係数閾値０．９３０４８のいずれかである。
【０１１９】
従って、高次回帰関数が四次またはそれ以上の多項式である前記複数の信号データ点を用いて高次回帰関数を決定してもよい。これら信号データ点のいくつかまたはすべてを用いてもよい。高次回帰関数の確度測定値、例えば、Ｒ２値を算出する。前記複数の信号データ点の最大値を１個以上の初期閾値（例えば、上記の高ピーク閾値および低ピーク閾値）と比較してもよい。この１個以上の初期閾値との比較に基づいて確度閾値が選択される。例えば、上述のように、異なる初期閾値に対して経験関数または定数を用いることを含めて異なるピーク値に対して異なるＲ２閾値を用いてもよい。この確度測定値を確度閾値と比較して、確度閾値より小さい確度測定値に基づき試料が検体に対して陰性であるか否かを決定する。確度測定値が確度閾値に等しいかそれ以上である場合は、各態様はスコアの決定に進み、例えば、図６で記述したようにスコアと分類閾値を比較してもよい。
【０１２０】
Ｂ．直線性のチェック
信号が直線性と平坦な形状を示す場合、この信号を異常として旗を立ててもよい。各態様は、４３〜７９に広がるＳｎ領域のデータ点の直線回帰を行ってもよい。直線回帰の傾きの信頼区間（例えば、１０％）の下限および上限が値ゼロを含む場合、そのデータは異常として旗が立てられる。従って、信号がゼロに近い傾きを有する場合、そのデータは異常、例えば、ピークなしとして旗を立ててもよい。
【０１２１】
ＶＩ．結果
Ａ．感度および特異性
匿名の病院患者から供与された１８２個の鼻の拭き取り試料を収集して、ＷＯ２０１４／１６４７６８に記載のシステムおよびＰＣＴ／ＵＳ１５／２７５１９に記載のカートリッジを用いてＷＯ２０１４／１６０４１８に記載のＭＲＳＡ非複製性形質導入粒子アッセイにより処理した。このアッセイでは、例えば、図３に示すようにデータはＲＬＵ値対時間として生成される。次いで、本発明の一態様のスコア付けアルゴリズム（Ｓ／Ｂ−ｑｕａｄとして示す）および最大ＲＬＵの分析を用いてこのデータを分析した。
【０１２２】
最大ＲＬＵ分析の場合、試料中に表皮ブドウ球菌を含み、ＭＲＳＡを含まない試料からなる１２０個の陰性対照試料に由来する最大ＲＬＵを分析してカットオフ値を生成した。カットオフ値は陰性対照試料の平均最大ＲＬＵ、この平均と陰性対照試料の最大ＲＬＵの標準偏差の１倍を足した値、この平均と陰性対照試料の最大ＲＬＵの標準偏差の２倍を足した値、およびこの平均と陰性対照試料の最大ＲＬＵの標準偏差の３倍を足した値からなっていた。臨床試料がＭＲＳＡに陽性であると決定するために、この臨床試料に由来する最大ＲＬＵをカットオフ値と比較した。臨床試料の最大ＲＬＵがカットオフ値未満である場合、この試料はＭＲＳＡに陰性であると見なされる。それ以外、すなわち最大ＲＬＵがカットオフ値以上である場合は、試料はＭＲＳＡに陽性であると見なされる。
【０１２３】
この分析からの結果を図７にまとめて示す。この分析は前信号チェックまたは後信号チェックを含まない。従って、これらの結果は、方法６００に起因する向上を示す。
【０１２４】
各分析のＭＲＳＡ陽性／陰性結果と２０１１年１月５日発行された以下のＦＤＡの草稿に記載された基準増菌培養アッセイで決定された各試料の既知のＭＲＳＡの結果を比較して、各測定基準の９５％信頼区間の下限および上限を含む感度、特異性、陽性的中率、陰性的中率、および一致率を算出した：Establishing the Performance Characteristics of Nucleic Acid-Based In vitro Diagnostic Devices for the Detection and Differentiation of Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylococcus aureus (SA)。
【０１２５】
これらの結果から分かるように、スコア付け分析（Ｓ／Ｂ−ｑｕａｄ）では、最大ＲＬＵに基づいて行われた分析よりも優れた結果が得られた。スコア付けの結果ではすべての性能測定基準について９０％を越える値が得られた。
【０１２６】
スコア付けアルゴリズムの態様の優れた性能は、このアルゴリズムがＲＬＵの形状対時間を考慮しているという事実に起因する。一方、最大ＲＬＵ分析ではこれを考慮していない。その結果として、最大ＲＬＵ分析は調和しない結果を生成する傾向にある。
【０１２７】
Ｂ．高いバックグラウンド信号
図８Ａおよび図８Ｂは、最大信号を用いた分類の確度の結果と本発明の態様によるスコアを用いた確度の結果を比較したグラフを示している。
【０１２８】
図８Ａおよび図８Ｂのデータは、最大ＲＬＵに基づく分析と比較した場合、特に、システムが非特異的な光の信号（例えば高いバックグラウンド信号）を示す場合のスコア付けアルゴリズムの優位性を強調するものである。プロットは、ＭＲＳＡの存在について試験をした８個の臨床試料に由来するＲＬＵと時間データを示す。水平の点線は、それぞれＭＲＳＡ陰性対照試料の平均最大ＲＬＵに基づくＲＬＵ閾値、平均最大ＲＬＵにＭＲＳＡ陰性対照試料の最大ＲＬＵの標準偏差を１回、２回、および３回加えたものを示す。試料１〜４は基準の方法によりＭＲＳＡ陽性であることが示され、試料５〜８は基準の方法によりＭＲＳＡ陰性であることが示された。スコア付けアルゴリズムは、試料１〜４をＭＲＳＡ陽性として分類し、試料５〜８をＭＲＳＡ陰性として分類し、基準の方法と１００％の一致を示した。平均最大ＲＬＵに２つの標準偏差を加えたものを用いて試料の分類を決定した場合、試料２、４、５、６、７、および８が陰性として分類され、従って、２つの偽陰性結果と４つの偽陽性結果となった。
【０１２９】
ＶＩＩ．コンピュータシステム
本発明の一例示的態様では、上記方法は、従来のパーソナルコンピュータシステムを用いて実施されてもよい。このパーソナルコンピュータシステムは、これらに限定されないが、データ集合を入力する入力装置（例えば、キーボード、マウスなど）、曲線の領域で対象の特定の点を表す表示装置（例えば、モニタなど）、上記方法の各工程を実行するのに必要な処理装置（例えば、ＣＰＵ）、ネットワークインターフェース（例えば、モデム）、データ集合を格納するデータ格納装置、プロセッサ上で動くコンピュータコードなどを含む。
【０１３０】
上記のコンピュータシステムのいずれかは、任意の好適な数の下位システムを用いてもよい。そのような下位システムの例は、図９のコンピュータシステム１０に示されている。態様によっては、コンピュータシステムは単一のコンピュータ装置を含み、下位システムはそのコンピュータ装置の構成要素であってもよい。他の態様では、コンピュータシステムは複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部構成要素を有する下位システムであってもよい。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、他の携帯機器を含んでいてもよい。
【０１３１】
図９に示す下位システムは、システムバス７５を介して相互接続されている。プリンタ７４、キーボード７８、格納装置７９、モニタ７６（ディスプレイアダプタ８２に接続されている）、およびその他の追加の下位システムが示されている。Ｉ／Ｏ制御装置７１と接続する周辺器機および入出力（Ｉ／Ｏ）装置は、当該分野で既知の任意の数の手段、例えば、入出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などによりコンピュータシステムに接続されていてもよい。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、Ｗｉ−Ｆｉなど）を用いて、コンピュータシステム１０を広域ネットワーク（例えば、インターネット）、マウス入力装置、またはスキャナに接続してもよい。システムバス７５による相互接続により、中央プロセッサ７３は各下位システムと通信して、システムメモリ７２または格納装置７９（例えば、ハードディスクドライブや光学ディスクなど固定ディスク）からの指示の実行や下位システム間の情報交換を制御することができる。システムメモリ７２および／または格納装置７９は、コンピュータ可読媒体を体現してもよい。他の下位システムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計などのデータ収集装置８５である。上記のデータのいずれも、ある構成要素から別の構成要素に出力されて、ユーザに出力されてもよい。
【０１３２】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１または内部インターフェースにより接続されている同じ構成要素または下位システムを含んでいてもよい。態様によっては、コンピュータシステム、下位システム、または装置はネットワークを介して通信してもよい。このような例では、１つのコンピュータをクライアントと見なし、他のコンピュータをサーバと見なしてもよく、それぞれが同じコンピュータシステムの一部であってもよい。クライアントおよびサーバはそれぞれ、複数のシステム、下位システム、または構成要素を含んでいてもよい。
【０１３３】
自明であるが、本発明の態様のいずれも、ハードウェア（例えば、特殊目的半導体またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を用いて、かつ／または一般にモジュラーまたは組み込み形態のプログラム可能なプロセッサでコンピュータソフトウェアを用いて制御論理の形態で実施されてもよい。本明細書で用いられるように、プロセッサは、単一コアプロセッサ、同じ１つの集積チップにマルチコアプロセッサ、あるいは単一の回路基板にまたはネットワーク化された複数の処理単位を含む。一般の当業者には自明であるが、本明細書で提供される開示および教示に基づいて、ハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアの組み合わせを用いて本発明の態様を実施する他のやり方および／または方法が知られている。
【０１３４】
本願で記載されたソフトウェア構成要素または機能のいずれも、従来の技術あるいはオブジェクト指向技術を用いて、プロセッサにより任意の好適なコンピュータ言語（例えば、Ｊａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔ）またはスクリプト言語（例えば、ＰｅｒｌまたはＰｙｔｈｏｎ）を用いて実行されるソフトウェアコードとして実施されてもよい。ソフトウェアコードは、一連の指示または命令として、格納および／または伝送のためにコンピュータ可読媒体に格納されていてもよい。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、磁性媒体（例えば、ハードディスクドライブまたはフロッピーディスク）、光学媒体（例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）またはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）、フラッシュメモリなどを挙げることができる。コンピュータ可読媒体は、このような格納または伝送装置の任意の組み合わせであってもよい。
【０１３５】
また、このようなプログラムは、コード化されて、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線、光学、および／または無線ネットワークによる伝送のためのキャリア信号を用いて伝送されてもよい。従って、本発明の一態様によるコンピュータ可読媒体は、このようなプログラムでコード化されたデータ信号を用いて作製されてもよい。このプログラムコードでコード化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のある装置と共に梱包されていてもよく、あるいは個別に他の装置（例えば、インターネットからのダウンロードを介して）と共に提供されてもよい。そのようなコンピュータ可読媒体はいずれも、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードディスクドライブ、ＣＤ、またはコンピュータシステム全体）に取り付けられてもよく、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品に取り付けられてもよい。コンピュータシステムは、本明細書で記載した結果のいずれかをユーザに提供するモニタ、プリンタ、または他の好適なディスプレイを含んでいてもよい。
【０１３６】
本明細書で記載する方法はいずれも、工程を実施するように構成することができる１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムですべてあるいは部分的に行われてもよい。従って、各態様は、各工程または工程の各群を実行する異なる構成要素を含んでいてもよい、本明細書で記載の方法のいずれかの工程を実行するようになっているコンピュータシステムに関していてもよい。工程には番号を付して示したが、本明細書の方法の工程は、同時に行ってもよく、あるいは異なる順番で行ってもよい。また、これらの工程の一部を他の方法の他の工程の一部と共に用いてもよい。また、ある工程のすべてまたは一部は任意であってもよい。また、これらの方法のいずれかの工程のいずれかは、これらの工程を実行するモジュール、単位、回路、または他の手段により実行されてもよい。
【０１３７】
特定の態様の特定の詳細を任意の好適なやり方と組み合わせてもよい。しかしながら、本発明の他の態様は、それぞれの個々の側面またはこれら個々の側面の特定の組み合わせに関する特定の態様に向けられていてもよい。
【０１３８】
本発明の例示的な態様の上記の記載は、例示および記述の目的で示されたものである。包括的である意図ではなく、また本発明を記述した正確な形態に限定する意図でもない。また、上記の教示に照らして多くの変更および変形が可能である。
【０１３９】
特に断りがなければ、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」の列挙は「１つ以上」を意味することを意図する。特に断りがなければ、「ｏｒ」の用法は、「排他的ｏｒ」ではなく「包括的なｏｒ」を意味することを意図する。「第一の」構成要素への言及は、必ずしも第二の構成要素が提供されることを必要としない。また、特に断りがなければ、「第一の」あるいは「第二の」構成要素への言及は、言及された構成要素を特定の位置に限定するものではない。
【図１】
2019507863.tif 000006
【図２】
2019507863.tif 000007
【図３】
2019507863.tif 000008
【図４】
2019507863.tif 000009
【図５】
2019507863.tif 000010
【図６】
2019507863.tif 000011
【図７】
2019507863.tif 000012
【図８Ａ】
2019507863.tif 000013
【図８Ｂ】
2019507863.tif 000014
【図９】
2019507863.tif 000015
【国際調査報告】
2019507863.tif 000016
2019507863.tif 000017
2019507863.tif 000018