(57)【要約】  正電荷への突然変異などの少なくとも１つの突然変異を有するアルファ溶血素のバリアントを、本明細書において記載する。特定の実施形態においては、変異は、成熟野生型アルファ溶血素アミノ酸配列中のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａまたはそれらの組合せから選択される。α−溶血素バリアントはまた、成熟野生型アルファ溶血素におけるＨ１４４Ａおよび／または残基１２７から１３１に広がる一連のグリシン残基での置換を含み得る。アルファ溶血素バリアントを含むナノポア会合体であって、低減された通り抜ける時間を有する会合体も提供する。低減された通り抜ける時間は、例えば、ＤＮＡシーケンシング効率および正確性を増大する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａのうちいずれか１つまたはそれらの組合せに対応する位置にアミノ酸置換を含む、アルファ溶血素バリアント。
【請求項２】
前記置換が、１または複数の正電荷を含む、請求項１に記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項３】
Ｈ１４４Ａに置換をさらに含む、請求項１または２に記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項４】
残基１２７〜１３１に１個または複数のグリシン残基をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項５】
前記置換がＶ１４９Ｋである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項６】
前記置換がＥ２８７Ｒである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項７】
前記置換がＨ３５Ｇである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項８】
前記置換がＴ１０９Ｋである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項９】
前記置換がＰ１５１Ｋである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１０】
前記置換がＫ１４７Ｎである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１１】
前記置換がＥ１１１Ｎである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１２】
前記置換がＭ１１３Ａである、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１３】
配列番号１４として示される配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する、請求項５〜１２のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１４】
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３として示される配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１５】
ＤＮＡポリメラーゼに共有結合によって結合している、請求項１〜１４のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１６】
ＤＮＡポリメラーゼにイソペプチド結合によって結合している、請求項１５に記載のアルファ溶血素バリアント。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのアルファ溶血素バリアントを含む七量体ナノポア会合体。
【請求項１８】
天然アルファ溶血素からなる細孔複合体に対して、変更された通り抜ける時間（ＴＴＴ）を有する、請求項１７に記載の七量体ナノポア会合体。
【請求項１９】
前記ＴＴＴが低減される、請求項１８に記載の七量体ナノポア会合体。
【請求項２０】
前記ＴＴＴが、天然アルファ溶血素からなる七量体ナノポア会合体と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上低減される、請求項１９に記載の七量体ナノポア会合体。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアルファ溶血素バリアントをコードする核酸。
【請求項２２】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（配列番号１）に由来する、請求項２１または２０に記載の核酸分子。
【請求項２３】
請求項２１〜２２のいずれか一項に記載のアルファ溶血素バリアントをコードする核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
アルファ溶血素バリアントを作製する方法であって、
（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞を、アルファ溶血素バリアントを産生するのに好適な条件下、好適な培養培地中で培養するステップ、および、
（ｂ）前記産生されたアルファ溶血素バリアントを得るステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
標的分子を検出するための方法であって、
（ａ）検出電極に隣接して、またはその近傍に配置された膜中に、請求項１７〜２０に記載のナノポアを含むチップを設置するステップ、
（ｂ）核酸分子を前記ナノポア中に通過させるステップであって、前記核酸分子が、リポーター分子と会合され、前記核酸分子が、アドレス領域およびプローブ領域を含み、前記リポーター分子が、前記プローブ領域で前記核酸分子と会合され、前記リポーター分子が、標的分子と連結されるステップ、
（ｃ）前記核酸分子が前記ナノポア中を通過させられる間に前記アドレス領域をシーケンシングして、前記アドレス領域の核酸配列を調べるステップ、および、
（ｄ）（ｃ）において調べられた前記アドレス領域の核酸配列に基づいて、コンピュータプロセッサーを利用して前記標的分子を同定するステップ、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[000]本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全文が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１７年４月１７日に作製された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ３３５５１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４３，１２４バイトの大きさである。
【０００２】
[001]黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅaｕｓ）アルファ溶血素バリアントに関する組成物および方法を開示する。アルファ溶血素（α−ＨＬ）バリアントは、例えば、ポリマー配列情報を調べるためのデバイスにおいてナノポア成分として有用である。本明細書において記載されるナノポア、方法およびシステムは、特徴が改善されたナノポアを用いる単一分子技術を使用して、一本鎖核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの定量的検出を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[002]溶血素は、さまざまな生物によって産生されるタンパク質毒素のファミリーのメンバーである。一部の溶血素、例えば、アルファ溶血素は、膜中に細孔またはチャネルを形成することによって、細胞膜（例えば、宿主細胞膜）の統合性を破壊できる。細孔形成タンパク質によって膜中に形成される細孔またはチャネルを使用して、膜の一方の側からもう一方に特定のポリマー（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を輸送できる。
【０００４】
[003]アルファ溶血素（α−ＨＬ、ａ−ＨＬまたはα−ＨＬ）は、宿主細胞の膜中に水性チャネルを形成する自己構築毒素である。α−ＨＬは、ナノポアシーケンシングコミュニティの主成分となった。高い安定性、自己構築および一本鎖ＤＮＡを収容するのには十分に広いが二本鎖ＤＮＡを収容するには十分に広くない細孔直径を含む、多数の有利な特性を有する（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６）。
【０００５】
[004]ａ−ＨＬ細孔におけるＤＮＡ検出に関するこれまでの研究は、ＤＮＡが細孔を通って転位置するときにイオン電流性質を解析すること（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６、Ａｋｅｓｏｎら、１９９９、Ｍｅｌｌｅｒら、２００１）、転位置速度（１００ｍＶで１ｎｔ／μｓ）およびイオン電流シグナル中の固有のノイズを考えると、極めて困難な課題に集中してきた。より高い特異性が、細孔の内部に恒久的につながれたプローブ分子の組込みによって、ナノポアを用いるセンサーにおいて達成された（Ｈｏｗｏｒｋａら、２００１ａおよびＨｏｗｏｒｋａら、２００１ｂ；Ｍｏｖｉｌｅａｎｕら、２０００）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[005]野生型ａ−ＨＬは、著しい数の欠失エラー、すなわち、測定されない塩基をもたらす。したがって、特性の改善されたα−ＨＬナノポアが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[006]本明細書において記載されるように、通り抜ける時間を増強する、例えば、目的の分子の捕獲のための時間を低減するアミノ酸変動を含有する変異体ブドウ球菌アルファ溶血素（αＨＬ）ポリペプチドを提供する。例えば、開示されるバリアントは、対象の分子、例えば、種々のタグ付きヌクレオチドまたは配列決定されるヌクレオチドの通り抜ける時間を低減する。
【０００８】
[007]特定の例示的態様では、α−溶血素（α−ＨＬ）バリアントは、配列番号１４（成熟野生型アルファ溶血素配列）のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａのうちいずれか１つまたはそれらの組合せに対応する位置に置換を含む。α−溶血素の置換はまた、正電荷であり得る。α−溶血素バリアントはまた、配列番号１４のＨ１４４Ａに置換を含み得る。α−溶血素バリアントはまた、特定の態様においては、配列番号１４の残基１２７〜１３１に１個または複数のグリシン残基、例えば、配列番号１４の残基１２７から１３１の全長に広がる一連のグリシン残基を含み得る。
【０００９】
[008]特定の例示的態様では、α−溶血素バリアントは、本明細書において記載される置換のうち少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含み、α−溶血素バリアントの配列は、配列番号１４として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。特定の例示的態様では、α−溶血素バリアントは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
[009]特定の例示的態様では、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ＋Ｈ３５Ｇに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＴ１０９Ｋ＋Ｈ３５Ｇに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＰ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＴ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ３５Ｇに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ＋Ｈ３５Ｇに対応する位置に置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａに対応する置換を含み得る。さらに、またはあるいは、アルファ溶血素バリアントは、Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇに対応する置換を含み得る。特定の例示的態様では、任意のこのような置換はまた、配列番号１４のＨ１４４Ａの置換を含み得る。
【００１１】
[0010]特定の例示的態様では、本明細書において記載されるアミノ酸置換は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの異種分子の付加を可能にする。特定の例示的態様では、ａ−ＨＬ変異体は、１つまたは複数の翻訳後修飾を有する。特定の例示的態様では、置換は、ｐＨ約５〜約８．５で塩基性であり、正電荷を有する非天然アミノ酸である。
【００１２】
[0011]特定の例示的態様では、本明細書において記載されるアルファ溶血素バリアントは、ＤＮＡポリメラーゼに共有結合などによって結合している。例えば、アルファ溶血素バリアントは、ＤＮＡポリメラーゼにＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ連結によって結合している。特定の例示的態様では、アルファ溶血素バリアントは、ＤＮＡポリメラーゼにイソペプチド結合によって結合している。
【００１３】
[0012]特定の例示的態様では、七量体ナノポア会合体を提供する。会合体は、例えば、少なくとも１つまたは複数の、本明細書において記載されるアルファ溶血素バリアントを含む。例えば、七量体ナノポア会合体は、本明細書において記載されるものなどの配列番号１４のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａまたはその組合せに置換を有する１つまたは複数のアルファ溶血素分子を含み得る。
【００１４】
[0013]特定の例示的態様では、変異体αＨＬポリペプチド（Ｍ）を含む七量体細孔会合体、例えば、野生型（ＷＴ）ブドウ球菌のαＨＬポリペプチドおよび変異体αＨＬポリペプチドを含有し、変異体αＨＬポリペプチドのアミノ酸バリアント（本明細書において提供される）が細孔構造の膜貫通チャネル中の位置を占める細孔会合体を提供する。例えば、ＷＴおよびバリアントαＨＬポリペプチドの割合は、式ＷＴ７−ｎＭｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６または７である）によって表される。特定の態様では、ヘテロ七量体中のαＨＬポリペプチドの割合は、ＷＴ７−ｎＭｎである。別の態様では、割合は、ＷＴ６Ｍ１である。七量体の各サブユニットが変異αＨＬポリペプチド（すなわち、ｎ＝７）であるホモマー細孔も、本明細書において提供される本開示に包含される。
【００１５】
[0014]本明細書において記載されるナノポアタンパク質会合体は、例えば、天然（野生型）アルファ溶血素からなる細孔複合体に対して、変更された通り抜ける時間（ＴＴＴ）を有し得る。例えば、ＴＴＴを、天然（野生型）アルファ溶血素を含む七量体ナノポア会合体と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上など低減させることができる。
【００１６】
[0015]特定の例示的態様では、本明細書において記載されるアルファ溶血素バリアントのいずれかをコードする核酸も提供する。例えば、核酸配列は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（配列番号１）に由来し得る。特定の例示的態様では、本明細書において記載される溶血素バリアントのいずれか１種をコードする任意のこのような核酸を含むベクターも提供する。ベクターを用いて形質転換される宿主細胞も提供する。
【００１７】
[0016]特定の例示的態様では、本明細書において記載されるアルファ溶血素バリアントを作製する方法を提供する。方法は、例えば、ベクターを含む宿主細胞を、アルファ溶血素バリアントを産生するのに好適な条件下、好適な培養培地中で培養するステップを含む。バリアントは、次いで、当技術分野で公知の方法を使用して培養物から得る。
【００１８】
[0017]特定の例示的態様では、標的分子を検出する方法を提供する。方法は、例えば、本明細書において記載されるナノポア会合体を含むチップを、検出電極に隣接して、または近接して配置される膜中に提供するステップを含む。次いで、方法は、核酸分子をナノポア中に通過させるステップを含む。核酸分子は、リポーター分子と会合され、アドレス領域およびプローブ領域を含む。リポーター分子は、プローブ領域で核酸分子と会合され、標的分子と連結される。方法は、上記核酸分子が上記ナノポアを通過させられる間にアドレス領域をシーケンシングして、前記アドレス領域の核酸配列を調べるステップをさらに含む。標的分子は、調べられ決定されたアドレス領域の核酸配列に基づいて、コンピュータプロセッサーを利用して同定する。
【００１９】
[0018]本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、この詳細な説明から、本発明の範囲および趣旨内の種々の変法および改変は当業者に明らかとなるので単に例示として示されるということは理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0019]図１は、１つのアルファ溶血素／ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼコンジュゲートおよび６つのアルファ溶血素バリアントを含む七量体ナノポアであって、各バリアントが、配列番号４に示されるＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａに置換を有する七量体ナノポア（すなわち、１：６比）と比較される、対照七量体ナノポアの通り抜ける時間を示すグラフである。対照ナノポア（「ＷＴ」と表示される）は、１：６比のアルファ溶血素／ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼコンジュゲート対６つの野生型アルファ溶血素を含む。これらのデータは、タグ付きヌクレオチドを捕獲していた多数の細孔から組み合わされ、細孔が、ポリメラーゼおよび鋳型ＤＮＡ分子の両方を有していたことを示す。各タグ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対応する）について示されるように、バリアントアルファ溶血素を含むナノポアの通り抜け速度は、対照ナノポアと比較して有意に増大され、したがって、通り抜ける時間の改善（低減）を証明する。Ｃ−ヌクレオチドタグの場合には、通り抜け速度は、２２１．６２ｓ−１（標準偏差１３．６ｓ−１）の平均値から６６３．１５（標準偏差１７２ｓ−１）に増大した。図１に示されるように、その他のヌクレオチドタグは、同様の増大を示した。
【図２】[0020]図２は、図１を作製するために使用された生データを示すグラフである。図２は、本発明者らのＡＣ結合システムのアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）値を表し、印加バイアスが正である場合（１７５ＡＤＣ単位）および印加バイアスが負である場合（４５ＡＤＣ単位）にオープンチャネルのＡＤＣ値を生じさせる。タグ付きヌクレオチドが、細孔中を通り抜けられる時に、正バイアスの印加の際のＡＤＣ値は、オープンチャネルレベルから１４５ＡＤＣ単位に低下する。これのいくつかの例が、図２の拡大された下のパネルにおいて１０２０から１０４０秒で示されている。印加バイアスが負である場合には、タグ付きヌクレオチドは細孔中に存在し、これが負のオープンチャネルレベルが有意に低減されない理由である。通り抜け速度を算出するために、通り抜けられるレベルに到達するためのＡＤＣ値の各正のバイアス期間において必要とされる時間の分布を、その直前のサイクルが、通り抜けられたＡＤＣ値で終了したサイクルについてカウントする。次いで、このヒストグラムを、標準単一指数関数にフィッティングし、その減衰率が通り抜け速度である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
[0021]本発明を、以下の定義および実施例を使用して単に参照によって、以下に詳細に説明する。本明細書において参照されるすべての特許および刊行物は、このような特許および刊行物内で開示されたすべての配列を含めて、参照により明確に組み込まれる。
【００２２】
[0022]本明細書において別段の定めがない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）により、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書が当業者に与えられる。本明細書において記載されるものと類似または等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。当技術分野の定義および用語について、実施者らは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３年を特に参照対象とする。方法、プロトコールおよび試薬は様々であり得るので、本発明は、記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解するべきである。
【００２３】
[0023]数の範囲は、範囲を定める数を含める。「約」という用語は、本明細書において使用する場合は、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するよう使用する。例えば「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を指す。
【００２４】
[0024]別段に示されていない限り、核酸は５’〜３’の方向でそれぞれ左から右に書き、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向でそれぞれ左から右に書く。 
[0025]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照によって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照によってより充分に定義される。
【００２５】
定義
[0026]アルファ溶血素：本明細書において使用する場合、「アルファ溶血素」、「α−溶血素」、「ａ−ＨＬ」および「α−ＨＬ」は、互換的に使用され、モノマー、モノマーのコンカテマーまたはモノマーおよびモノマーのコンカテマーの組合せから、七量体の水が満たされた膜貫通チャネルに自己構築する単量体タンパク質を指す（すなわち、ナノポア）。文脈に応じて、この用語はまた、７つの単量体タンパク質によって形成された膜貫通チャネルを指す場合もある。
【００２６】
[0027]アミノ酸:本明細書において使用する場合、「アミノ酸」という用語は、広義には、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態においては、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態においては、アミノ酸は、天然由来のアミノ酸である。一部の実施形態においては、アミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＤ−アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然由来のペプチドにおいて一般に見出される２０種の標準的なＬ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるものであるか天然源から得られるものであるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「合成アミノ酸」または「非天然アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、化学修飾アミノ酸としては、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換体が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、それらの活性に悪影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または、他の化学物質での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与することができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸、および／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。その用語が遊離アミノ酸、またはペプチドの残基を指すかは、その用語が使用される文脈から明らかになる。本明細書においては、すべてのアミノ酸残基配列は、左右の方向が、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式によって表されていることに留意するべきである。
【００２７】
[0028]塩基対（ｂｐ）：本明細書において使用する場合、塩基対は、２本鎖核酸におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との結び付きを指す。
【００２８】
[0029]相補的：本明細書において使用する場合、「相補的」という用語は、塩基対形成による２本のポリヌクレオチド鎖の領域間、または２つのヌクレオチド間の配列相補性の広範な概念を指す。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることは公知である。同様に、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドと塩基対形成することができることは公知である。
【００２９】
[0030]発現カセット：「発現カセット」または「発現ベクター」は、標的細胞中の個々の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて組換えによってまたは合成によって作製された核酸構築物である。組換え発現カセットを、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片中に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写されるべき核酸配列およびプロモーターを含む。
【００３０】
[0031]異種：「異種」核酸構築物または配列は、それが発現される細胞にとって天然ではない配列の部分を有する。異種とは、制御配列に関して、天然には、その発現を現在調節している同遺伝子を調節するように機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞またはゲノムの一部にとって内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、天然細胞において見出される制御配列／ＤＮＡコード配列組合せと同一であるか、または異なっている制御配列／ＤＮＡコード配列組合せを含有し得る。
【００３１】
[0032]宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、ベクターを含有し、発現構築物の複製および／もしくは転写または転写および翻訳（発現）を支持する細胞を意味する。本発明において使用するための宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）などの原核細胞または酵母、植物、昆虫、両生類もしくは哺乳類細胞などの真核細胞であり得る。一般に、宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００３２】
[0033]単離された:「単離された」分子は、通常、例えば分子の自然環境で会合している少なくとも１種の他の分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子としては、その核酸分子を通常発現する細胞に含有された核酸分子が挙げられるが、その核酸分子は、染色体外、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００３３】
[0034]改変アルファ溶血素：本明細書において使用する場合、「改変アルファ溶血素」という用語は、別の（すなわち、親の）アルファ溶血素から生じ、親アルファ溶血素と比較して１つまたは複数のアミノ酸の変化（例えば、アミノ酸の置換、欠失または挿入）を含有するアルファ溶血素を指す。一部の実施形態において、本発明の改変アルファ溶血素は、天然由来のアルファ溶血素、または野生型アルファ溶血素から生じるか、またはそれから改変されている。一部の実施形態において、本発明の改変アルファ溶血素は、組換えアルファ溶血素または操作されたアルファ溶血素から生じるか、またはそれから改変されており、組換えアルファ溶血素または操作されたアルファ溶血素としては、キメラアルファ溶血素、融合アルファ溶血素、または別の改変アルファ溶血素が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、改変アルファ溶血素は、親アルファ溶血素と比較して変更された表現型を少なくとも１つ有する。
【００３４】
[0035]変異:本明細書において使用する場合、「変異」という用語は、親配列に導入された変更を指し、その変更としては、置換、挿入、欠失（切り詰めを含める）が挙げられるが、これらに限定されない。変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質では見出されない新しい特性、特質、機能、表現型、または形質の創造が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
[0036]ナノポア:本明細書において使用する場合、「ナノポア」という用語は概して、膜に形成された、または他の方法で膜に与えられたポア、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、ポリマー材料で形成された膜などの合成膜であってもよい。膜はポリマー材料としてもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などの検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。一部の例においては、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。一部のナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素、タンパク質ナノポアの例である。
【００３６】
[0037]核酸分子：「核酸分子」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を含む。遺伝暗号の縮重の結果として、アルファ溶血素および／またはそのバリアントなどの、所与のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が生成され得るということは理解されよう。本発明は、バリアントアルファ溶血素をコードするあらゆるあり得るバリアントヌクレオチド配列を考慮し、それらのすべては、遺伝暗号の縮重を考えると可能性がある。
【００３７】
[0038]プロモーター：本明細書において使用する場合、用語「プロモーター」とは、下流の遺伝子の転写を指示するよう機能する核酸配列を指す。プロモーターは、一般に、標的遺伝子が発現されている宿主細胞にとって適当である。プロモーターは、その他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と一緒に、所与の遺伝子を発現するために必要である。一般に、転写および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列並びにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
[0039]精製された：本明細書において使用する場合、「精製された」は、分子が、含有されている試料の少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。
【００３９】
[0040]精製すること：本明細書において使用する場合、「精製すること」という用語は、一般に、トランスジェニック核酸またはタンパク質を含有する細胞を、生化学的精製および／またはカラムクロマトグラフィーに付すことを指す。
【００４０】
[0041]タグ：本明細書において使用する場合、「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または、原子もしくは分子の集団としてもよい検出可能な部分を指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導的、容量的）性状を示すことができ、その性質は、ナノポアを利用して検出することができる。典型的には、ヌクレオチドがタグに付けられる場合には、「タグ付きヌクレオチド」と呼ばれる。タグは、リン酸部分を介してヌクレオチドに付けることができる。
【００４１】
[0042]通り抜ける時間：「通り抜ける時間」または「ＴＴＴ」という用語は、ポリメラーゼ−タグ複合体または核酸鎖が、ナノポアのバレル中にタグを通すのにかかる時間を意味する。
【００４２】
[0043]バリアント：本明細書において使用する場合、「バリアント」という用語は、親タンパク質と比較した場合に変化した特性、例えば、変化したイオンコンダクタンスを示す改変タンパク質を指す。
【００４３】
[0044]バリアント溶血素：「バリアント溶血素遺伝子」または「バリアント溶血素」という用語は、それぞれ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のアルファ溶血素遺伝子の核酸配列が、本明細書において記載される本発明と一致して、コード配列または発現されたタンパク質のアミノ酸配列を除去、付加および／または操作することによって変更されていることを意味する。
【００４４】
[0045]ベクター：本明細書において使用する場合、「ベクター」という用語は、異なる宿主細胞間の移動用に設計された核酸構造物を指す。「発現ベクター」は、外来性細胞において異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者に知られている。
【００４５】
[0046]野生型：本明細書において使用する場合、「野生型」という用語は、天然由来の供給源から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００４６】
[0047]相同性％：本明細書においては、「相同性％」という用語は、本明細書の「同一性％」という用語と互換的に使用し、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の間での、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。例えば、本明細書において使用する場合、相同性８０％は、定義済みのアルゴリズムによって決定される配列同一性８０％と同じことを意味し、したがって所与の配列の相同体は、所与の配列の、ある長さにわたって８０％超の配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、所与の配列、例えば本明細書に記載する本発明のポリペプチドのいずれか１つのコード配列との８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
[0048]２つの配列間の同一性を決定するのに使用することができる例示的なコンピュータプログラムとしては、インターネット上で公開されている一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、も参照のこと。
【００４８】
[0049]配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列および他の公開データベースの核酸配列と比較して所与の核酸配列を評価する場合には、典型的にはＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋのタンパク質配列および他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、すべての読み枠で翻訳されている核酸配列を検索することに好ましい。ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティー、および１．０のエクステンディッドギャップペナルティーのデフォルトパラメータを使用し、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用して走らせる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２、１９９７年を参照のこと。）
[0050]２つ以上の配列間での「同一性％」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムを使用し、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１のエクステンディッドギャップペナルティーを含むデフォルトパラメータ、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似度マトリックスを用いて動作させて行う。
【００４９】
命名法
[0051]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字表記および３文字表記を使用する。
【００５０】
[0052]参照を容易にするため、本出願のバリアントは、以下の命名法を使用して記載する:元のアミノ酸（１つまたは複数）：位置（１つまたは複数）：置換したアミノ酸（１つまたは複数）。この命名法によれば、例えば、位置１４９におけるリジンによるバリン置換は、以下として示される：
Ｖａｌ１４９ＬｙｓまたはＶ１４９Ｋ
複数の変異は、＋記号によって分けられる、例えば、それぞれ、グリジンをヒスチジンと、およびリジンをバリンと置換する位置３５および１４９における変異を表す：
Ｈｉｓ３５Ｇｌｙ＋Ｖａｌ１４９ＬｙｓまたはＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ
アミノ酸置換のスパンは、ダッシュによって表される、例えば、残基１２７〜１３１のグリシン残基のスパンである：１２７−１３１Ｇｌｙまたは１２７−１３３Ｇ。
【００５１】
アルファ溶血素の部位特異的突然変異誘発
[0053]黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）アルファ溶血素野生型配列は、本明細書において示しており（配列番号１、核酸コード領域；配列番号１４、タンパク質コード領域）、他の場所で入手可能である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓまたはＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ９０５３６およびＡＡＡ２６５９８）。
【００５２】
[0054]点変異は、当技術分野で公知の任意の方法によって導入することができる。例えば、点突然変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ２キット（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を製造業者の説明書に従って使用して行うことができる。
【００５３】
[0055]プライマーは、営利会社、例えばＩＤＴ  ＤＮＡに注文することができる。
アルファ溶血素バリアント
[0056]本明細書において提供されるアルファ溶血素バリアントは、ナノポアベースのシーケンシング反応において通り抜ける時間を改善する特定の置換または１つもしくは複数の置換の組合せを含む。通り抜ける時間を改善することによって、決定された配列に、より少ない欠失しか伴わない、高精度ＤＮＡシーケンシングを達成できる。
【００５４】
[0057]特定の例示的実施形態では、本明細書において提供されるアルファ溶血素バリアントは、配列番号１４として示されるアミノ酸配列の位置のうち１つまたは複数に１つまたは複数の変異を含む。例えば、表１において同定される残基のうち任意の１個またはそれらの組合せを変異させて、アルファ溶血素バリアントを形成できる。特定の例示的実施形態では、表１において同定される配列番号１４のアミノ酸のうち１個または複数を変異することから形成されるアルファ溶血素バリアントは、配列番号１４として示される配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。特定の例示的実施形態では、変異は、正電荷の付加をもたらす。例えば、変異は、表１において同定されるアミノ酸残基の、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギンまたは正電荷を保持し得るその他のアミノ酸への置換をもたらし得る。
【００５５】
[0058]特定の例示的実施形態では、変異は、特定の置換を含む。例えば、バリアントは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａのうち任意の１つまたはそれらの組合せのアミノ酸置換を含み得る。その他の例示的実施形態では、バリアントは、１つまたは複数のこれらの同一の置換を含み得るが、全体的な配列は、配列番号１４として示されるアミノ酸配列に対して最大８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有し得る。特定の例示的実施形態では、配列番号１４の最初の１７個のアミノ酸のうち１個または複数が、Ａ、Ｎ、Ｋのいずれかまたはそれらの組合せに変異した。
【００５６】
[0059]ナノポア安定性を改善するために、例えば、本明細書において記載されるアルファ溶血素バリアントのいずれかはまた、配列番号１４のＨ１４４Ａにアミノ酸置換を含み得る。さらに、またはあるいは、バリアントのいずれかは、配列番号１４として示される配列の残基１２７から残基１３１に広がる一連のグリシン残基置換を含み得る。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
[0060]α−溶血素バリアントは、本明細書において記載される置換の種々の組合せを含み得るが、特定の例示的実施形態では、α−溶血素バリアントは、置換の特定の組合せを含む。例えば、α−溶血素バリアントは、配列番号１４として示される配列のアミノ酸置換の以下の組合せを含み得る：
Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ；
Ｔ１０９Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ＋Ｈ３５Ｇ；
Ｖ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ；または
Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ。
【００５９】
このような組合せはまた、例えば、配列番号１４のＨ１４４Ａでの置換および／または配列番号１４のアミノ酸１２７〜１３１での一連のグリシン残基を含み得る。特定の例示的実施形態では、α−溶血素バリアントは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、各配列において同定される、例えば、バリアントにおいて保存されている置換を有する。
【００６０】
[0061]バリアントおよびＷＴアルファ溶血素を操作できるように、特定の例示的実施形態では、配列番号４〜１４として示されるものなどの本明細書において記載されるアミノ酸配列のいずれかはまた、Ｃ末端に、配列ＧＬＳＡＥＮＬＹＦＱＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６、これでは、ＴＥＶ配列に下線が引かれている）を有するリンカー／ＴＥＶ／ＨｉｓＴＡＧ配列を含み得る。当業者は理解するであろうが、このような配列は、バリアントの精製を可能にする。
【００６１】
ナノポア会合および挿入
[0062]本明細書において記載する方法は、ポリメラーゼがナノポアに付いたナノポアを使用することができる。特定の例示的な実施形態においては、（例えば、各ナノポアで１つのみの核酸分子がシーケンシングされるように）ナノポア１つ当たりただ１つのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、アルファ溶血素（ａＨＬ）を含めた多くのナノポアは、複数のサブユニット（例えば、ａＨＬでは７サブユニット）を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一複製物であり得る。本明細書においては、無改変サブユニット（例えば、ａ−ＨＬ）に対する改変サブユニット（例えば、ａ−ＨＬバリアント）の規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を提供する。
【００６２】
[0063]無改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポアまたはナノポア会合体）を作製する方法も本明細書において提供する。例えば、ナノポア会合体は、本明細書において記載されるアルファ溶血素バリアントのいずれかを含み得る。七量体ナノポア会合体は、例えば、配列番号１４のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａのうちいずれか１つまたはそれらの組合せの置換に対応するアミノ酸配列を有する１つまたは複数のアルファ溶血素サブユニットを含み得る。特定の例示的実施形態では、サブユニットのうち１つまたは複数は、本明細書において記載される置換の特定の組合せを含み得る。ナノポア会合体において、例えば、七量体会合体において使用されるバリアントのいずれかは、配列番号１４のＨ１４４Ａ置換を含み得る。
【００６３】
[0064]ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７を参照すると、複数のサブユニットを有するタンパク質を会合する方法は、複数の第１のサブユニット２７０５を用意すること、および複数の第２のサブユニット２７１０を用意することを含み、第２のサブユニットは第１のサブユニットと比較すると改変されている。一部の場合においては、第１のサブユニットは野生型（例えば、天然源から精製したもの、または組換えで作製したもの）である。第２のサブユニットは、任意の好適な方法で改変することができる。一部の場合においては、第２のサブユニットは、（例えば、融合タンパク質として）付けられたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を有する。
【００６４】
[0065]特定の例示的な実施形態においては、化学反応性部分（例えば、連結の形成に好適なアジド基またはアルキン基）を含むことができる。一部の場合においては、本方法は、反応（例えば、Ｃｌｉｃｋ化学付加環化）を行って、実在物（例えば、ポリメラーゼ）を化学反応性部分に付けることをさらに含む。
【００６５】
[0066]特定の例示的な実施形態においては、第１のサブユニットを第２のサブユニット２７１５と第１の比で接触させて、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを有する複数のタンパク質２７２０を形成させることをさらに含むことができる。例えば、ポリメラーゼを付けるのに好適な反応基を有する改変ａＨＬサブユニット１部を、野生型ａＨＬサブユニット６部と混合することができる（すなわち、第１の比は１：６である）。複数のタンパク質は、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの複数の比を有することができる。例えば、混合したサブユニットは、改変サブユニット：無改変サブユニットの化学量論比（例えば、１：６、２：５、３：４）の分布を有するいくつかのナノポアを形成させることができる。
【００６６】
[0067]特定の例示的な実施形態においては、タンパク質は、サブユニットを単純に混合することによって形成させる。例えばａＨＬナノポアの場合においては、界面活性剤（例えば、デオキシコール酸）は、ａＨＬ単量体が細孔構造をとることを引き起こすことができる。ナノポアは、例えば、脂質（例えば、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）または１，２−ジ−０−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））、および中温（例えば、約１００℃未満）を用いて形成させることもできる。一部の場合においては、ＤＰｈＰＣを緩衝溶液と混合すると、大きな多重膜ベシクル（ＬＭＶ）が生じ、この溶液にａＨＬサブユニットを加えて、混合物を４０℃で３０分間インキュベートすると、細孔が形成する。
【００６７】
[0068]異なる２種類のサブユニット（例えば、天然野生型タンパク質と、単一点変異を含有することができる第２のａＨＬ単量体）を使用する場合、得られるタンパク質は、（例えば野生型と変異体タンパク質の）混合化学量論比を有することができる。これらのタンパク質の化学量論比は、特定の例示的な実施形態においては、細孔形成反応において使用する２種のタンパク質の濃度比に依存した式に従うことができる。この式は以下のとおりである。
１００Ｐｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ−ｍ）！］・ｆｍｕｔｍ・ｆｗｔｎ〜ｍ、式中
Ｐｍ＝ｍ個の変異体サブユニットを有する細孔の確率
ｎ＝サブユニットの総数（例えば、ａＨＬでは７個）
ｍ＝「変異体」サブユニットの数
ｆｍｕｔ＝一緒に混合した変異体サブユニットの割合または比
ｆｗｔ＝一緒に混合した野生型サブユニットの割合または比
[0069]本方法は、複数のタンパク質を分画して、第２のサブユニット２７２５に対する第１のサブユニットの第２の比を有するタンパク質を増やすことをさらに含むことができる。例えば、ただ１つの改変サブユニットを有するナノポアタンパク質を単離することができる（例えば、第２の比は１：６）。しかしながら、いずれの第２の比も好適である。第２の比の分布も分画することができ、例えば、１つまたは２つのいずれかの改変サブユニットを有するタンパク質を増やすことができる。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７に示されているように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は、常に７個であるとは限らない（例えば、異なるナノポアを使用することができ、または６個のサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアが形成し得る）。一部の場合においては、１つのみの改変サブユニットを有するタンパク質を増やす。このような場合においては、第２の比は、第１のサブユニット（ｎ−１）個当たり、第２のサブユニット１個であり、ｎはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
【００６８】
[0070]第１の比は、第２の比と同じものとすることができるが、必要とされるものではない。一部の場合においては、変異単量体を有するタンパク質は、変異サブユニットを有しないタンパク質よりも低い効率で形成し得る。この場合は、第１の比は、第２の比よりも大きいものとすることができる（例えば、変異サブユニット１：無変異サブユニット６の第２の比がナノポアで所望される場合、好適な数の１：６タンパク質を形成させるには、１：６よりも大きい比でサブユニットを混合することが必要とされてもよい）。
【００６９】
[0071]異なる第２のサブユニット比を有するタンパク質は、分離において、異なる挙動を示す（例えば、異なる保持時間を有する）ことができる。特定の例示的な実施形態においては、タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを使用して分画する。第１および第２のサブユニットは、改変を除いては同一とすることができるので、タンパク質における改変の数は、分離の根拠として役割を果たすことができる。一部の場合においては、第１または第２のサブユニットのいずれかは、分画を可能にするか、または分画の効率を改良するよう、（例えば、改変に加えて）精製タグを有する。一部の場合においては、ポリヒスチジンタグ（ＨｉｓＴａｇ）、ストレプトアビジンタグ（ＳｔｒｅｐＴａｇ）、または他のペプチドタグを使用する。一部の例においては、第１および第２のサブユニットはそれぞれ異なるタグを含み、分画工程では、各タグに基づき分画される。ＨｉｓＴａｇの場合には、低いｐＨでタグに電荷を生じさせる（ヒスチジン残基は、側鎖のｐＫａ未満で正に荷電する）。他のものと比較してａＨＬ分子の１つにおいて電荷が有意に異なることにより、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、０、１、２、３、４、５、６、または７個の「電荷タグ付き」ａＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離することができる。原則的に、この電荷タグは、均一電荷を運ぶ任意のアミノ酸が糸状に連なるものとすることができる。図２８および図２９では、ＨｉｓＴａｇに基づくナノポアの分画の例が示されている。図２８では、２８０ナノメートルにおける紫外吸光度、２６０ナノメートルにおける紫外吸光度、および伝導率のプロットが示されている。ピークは、改変サブユニットと無改変サブユニットの様々な比を有するナノポアに一致する。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２９では、ＨｉｓＴａｇとＳｔｒｅｐＴａｇの両方を使用した、ａＨＬナノポアおよびその変異体の分画が示されている。
【００７０】
[0072]特定の例示的な実施形態においては、分画後に、実在物（例えば、ポリメラーゼ）をタンパク質に付ける。タンパク質はナノポアとすることができ、実在物はポリメラーゼとすることができる。一部の例においては、本方法は、第２の比のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入することをさらに含む。
【００７１】
[0073]特定の例示的な実施形態においては、ナノポアは、複数のサブユニットを含むことができる。本明細書において記載されるように、ポリメラーゼは、サブユニットの１つに付けることができ、サブユニットの少なくとも１つかつ全部未満が、第１の精製タグを含む。一部の例示的な実施形態においては、ナノポアはアルファ溶血素またはそのバリアントである。一部の例においては、サブユニットのすべてが第１の精製タグまたは第２の精製タグを含む。第１の精製タグは、例えば、（例えば、ポリメラーゼが付いたサブユニットにおける）ポリヒスチジンタグとすることができる。
【００７２】
ナノポアに付けられたポリメラーゼ
[0074]特定の例示的な実施形態においては、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアに付けられ、かつ／または、ナノポアの近傍に配置される。ＤＮＡ合成反応の間にＤＮＡを合成可能な任意のＤＮＡポリメラーゼを、本明細書において記載される方法および組成物と一致して使用できる。例示的ＤＮＡポリメラーゼとして、それだけには限らないが、ｐｈｉ２９（バチルスバクテリオファージφ２９）、ｐｏｌ６（クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ファージｐｈｉＣＰＶ４；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）またはｐｏｌ７（アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）ファージＡｖ−１；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＲ６７６７１．１）が挙げられる。特定の例示的実施形態では、リガーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼまたはトポイソメラーゼなどのＤＮＡ操作酵素または修飾酵素をナノポア会合体に付ける。
【００７３】
[0075]特定の例示的実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼバリアントである。例えば、ポリメラーゼバリアントは、米国特許出願第１５／０１２，３１７号（「‘３１７出願」）において同定されたポリメラーゼバリアントのいずれかを含み得る。このようなバリアントは、例えば、配列番号１５（‘３１７出願の配列番号２に対応する）のＨ２２３Ａ、Ｎ２２４Ｙ／Ｌ、Ｙ２２５Ｌ／Ｔ／Ｉ／Ｆ／Ａ、Ｈ２２７Ｐ、Ｉ２９５Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｅ、Ｙ３４２Ｌ／Ｆ、Ｔ３４３Ｎ／Ｆ、Ｉ３５７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｈ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｅ／Ｙ／Ｐ、Ｓ３６０Ｇ、Ｌ３６１Ｍ／Ｗ／Ｖ、Ｉ３６３Ｖ、Ｓ３６５Ｑ／Ｗ／Ｍ／Ａ／Ｇ、Ｓ３６６Ａ／Ｌ、Ｙ３６７Ｌ／Ｅ／Ｍ／Ｐ／Ｎ、Ｐ３６８Ｇ、Ｄ４１７Ｐ、Ｅ４７５Ｄ、Ｙ４７６Ｖ、Ｆ４７８Ｌ、Ｋ５１８Ｑ、Ｈ５２７Ｗ／Ｒ／Ｌ、Ｔ５２９Ｍ／Ｆ、Ｍ５３１Ｈ／Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｔ／Ｌ／Ｖ、Ｎ５３５Ｌ／Ｙ／Ｍ／Ｋ／Ｉ、Ｇ５３９Ｙ／Ｆ、Ｐ５４２Ｅ／Ｓ、Ｎ５４５Ｋ／Ｄ／Ｓ／Ｌ／Ｒ、Ｑ５４６Ｗ／Ｆ、Ａ５４７Ｍ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｓ、Ｌ５４９Ｑ／Ｙ／Ｈ／Ｇ／Ｒ、Ｉ５５０Ａ／Ｗ／Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｓ、Ｎ５５２Ｌ／Ｍ／Ｓ、Ｇ５５３Ｓ／Ｔ、Ｆ５５８Ｐ／Ｔ、Ａ５９６Ｓ、Ｇ６０３Ｔ、Ａ６１０Ｔ／Ｅ、Ｖ６１５Ａ／Ｔ、Ｙ６２２Ａ／Ｍ、Ｃ６２３Ｇ／Ｓ／Ｙ、Ｄ６２４Ｆ、Ｉ６２８Ｙ／Ｖ／Ｆ、Ｙ６２９Ｗ／Ｈ／Ｍ、Ｒ６３２Ｌ／Ｃ、Ｎ６３５Ｄ、Ｍ６４１Ｌ／Ｙ、Ａ６４３Ｌ、Ｉ６４４Ｈ／Ｍ／Ｙ、Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｓ、Ｉ６４８Ｋ／Ｒ／Ｖ／Ｎ／Ｔ、Ｔ６５１Ｙ／Ｆ／Ｍ、Ｉ６５２Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｎ／Ｆ／Ｔ、Ｋ６５５Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｎ、Ｗ６５６Ｅ、Ｄ６５７Ｒ／Ｐ／Ａ、Ｖ６５８Ｌ、Ｈ６６０Ａ／Ｙ、Ｆ６６２Ｉ／Ｌ、Ｌ６９０Ｍまたはそれらの組合せの１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。特定の例示的実施形態では、ポリメラーゼは、１つまたは複数のこのような置換を含み、配列番号１５として示されるアミノ酸配列に対して８０％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の配列同一性を有する。‘３１７出願に記載されるように、ポリメラーゼバリアントは、親ポリメラーゼに対して変更された酵素活性、忠実度、処理能力、伸長速度、シーケンシング精度、長い連続読み取り能力、安定性または溶解度を有する。
【００７４】
[0076]ポリメラーゼを、任意の公的な方法でナノポアに付けることができる。ポリメラーゼを、例えば、当技術分野で公知の任意の好適な方法でナノポア会合体に付けることができる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開される；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開される）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９；コロンビア大学として公開される）を参照のこと。特定の例示的な実施形態においては、ポリメラーゼは、ナノポア（例えば、溶血素）タンパク質単量体に付け、その後、（例えば、ポリメラーゼが付いていないナノポア（例えば、溶血素）単量体６つに対し、ポリメラーゼが付いた単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を会合する。次いでナノポア七量体を膜に挿入することができる。
【００７５】
[0077]ポリメラーゼをナノポアに付ける別の方法は、溶血素単量体にリンカー分子を付けるか、または溶血素単量体を、取付け部位を有するよう変異させること、ならびに、その後、（例えば、リンカーおよび／または取付け部位を有しない溶血素単量体６つに対し、リンカーおよび／または取付け部位を有する単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を会合することを含む。次いでポリメラーゼを、（例えば、膜への挿入前に、大量で）取付け部位または取付けリンカーに付けることができる。ポリメラーゼは、（例えば、七量体の）ナノポアを膜に形成させた後で、取付け部位または取付けリンカーに付けることもできる。一部の場合においては、複数のナノポア−ポリメラーゼペアを、バイオチップの（例えば、ウェルおよび／または電極に配置した）複数の膜に挿入する。一部の例においては、ポリメラーゼのナノポア複合体への取付けは、各電極上のバイオチップにおいて行う。
【００７６】
[0078]ポリメラーゼは、任意の好適な化学作用（例えば、共有結合および／またはリンカー）を用いてナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、分子ステープル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔａｐｌｅ）を用いてナノポアに付ける。一部の例においては、分子ステープルは、３種のアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、およびＣで示す）を含む。リンカーＡは溶血素単量体から延びることができ、リンカーＢはポリメラーゼから延びることができ、その場合にリンカーＣは、リンカーＡとリンカーＢを（例えば、リンカーＡとリンカーＢの両方に巻き付くことによって）つなぐことができ、したがってポリメラーゼをナノポアとつなぐことができる。リンカーＣは、リンカーＡまたはリンカーＢの一部分となるよう会合することもでき、したがってリンカー分子の数は減る。
【００７７】
[0079]特定の例示的な実施形態においては、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を用いてナノポアに連結する。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）は、ＨｙＮｉｃ（６−ヒドラジノ−ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４−ホルミル安息香酸エステル、芳香族アルデヒド）の間の反応とすることができる。一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｃｌｉｃｋ化学（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を用いてナノポアに連結する。一部の場合においては、溶血素分子にジンクフィンガー変異を導入し、次に分子（例えば、ＤＮＡ中間体分子）を使用してポリメラーゼを溶血素のジンクフィンガー部位に連結する。
【００７８】
[0080]さらに、またはあるいは、生理学的条件下で共有結合イソペプチド連結を自発的に形成するＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用して、アルファ溶血素モノマーをポリメラーゼにつなげることができる。例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜１７を参照のこと。例えば、ＳｐｙＴａｇドメインを有するアルファ溶血素タンパク質を発現させることができる。さらに、アルファ溶血素につなげられるＤＮＡポリメラーゼを、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを有する融合タンパク質として別個に発現させることができる。アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質をＤＮＡポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質と混合することによって、ＳｐｙＴａｇタンパク質とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が相互作用して、ＤＮＡポリメラーゼに共有結合イソペプチド連結によって連結しているアルファ溶血素モノマーを形成する。
【００７９】
[0081]特定の例示的実施形態では、ナノポアモノマーをナノポア会合体中に組み込む前に、ポリメラーゼをナノポアモノマーに付けることができる。例えば、アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現および精製後、精製されたアルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質を精製されたポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質と混合することにより、ＳｐｙＴａｇタンパク質とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が互いに結合して、アルファ溶血素／ポリメラーゼモノマーを形成することが可能になる。次いで、七量体会合体を形成するように、モノマーを、本明細書において記載されるナノポア会合体中に組み込むことができる。
【００８０】
[0082]特定の例示的実施形態では、ナノポア会合体の形成後、ポリメラーゼをナノポア会合体に付ける。例えば、アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇ融合タンパク質の発現および精製後、七量体ナノポア会合体を形成するように、融合タンパク質をナノポア会合体中に組み込む。次いで、ポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質を七量体会合体と混合することにより、ＳｐｙＴａｇタンパク質とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が互いに結合して、ポリメラーゼがナノポア会合体に結合することが可能になる。
【００８１】
[0083]ナノポアベースのシーケンシング反応の性質のために、当業者ならば、各ナノポア会合体と会合された単一ポリメラーゼのみ（複数のポリメラーゼではなく）を有することは有益であるということは理解するであろう。このような会合体を達成するために、ナノポア会合体は、例えば、単一ＳｐｙＴａｇのみを有し、従って、単一ポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒの取付けを可能にするように構成されていてもよい。
【００８２】
[0084]アルファ溶血素の場合には、例えば、アルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇタンパク質をさらなるアルファ溶血素タンパク質と混合することにより、０、１、２、３、４、５、６または７つのアルファ溶血素／ＳｐｙＴａｇサブユニットを有する七量体が得られる。しかし、各七量体と会合したＳｐｙＴａｇ配列の数が異なる（０、１、２、３、４、５、６または７つ）ため、七量体は、種々の電荷を有する。したがって、特定の例示的実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる溶出などによって、当技術分野で公知の方法によって七量体を分けることができる。次いで、溶出された画分を調べて、どの画分が単一ＳｐｙＴａｇを有する会合体を含むかを決定することができる。次いで、単一ＳｐｙＴａｇを有する画分を使用して、単一ポリメラーゼを各会合体に付け、それによって、単一ポリメラーゼが付けられたナノポア会合体を作製することができる。
【００８３】
[0085]どの七量体画分が単一ＳｐｙＴａｇを含有する（したがって、七量体１つ当たり単一のポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質のみを結合可能である）かを決定するために、種々の方法が好適であり得るが、特定の例示的実施形態では、種々の七量体画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって分子量に基づいて分けることができる。次いで、試薬を使用して、各画分と会合したＳｐｙＴａｇの存在を確認できる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の前にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を画分に添加することができる。
【００８４】
[0086]より少ない数のＳｐｙＴａｇを有する七量体は、より多い数のＳｐｙＴａｇを有する七量体よりも小さいので、単一ＳｐｙＴａｇを有する画分は、バンドに対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて最も遠いバンド移動およびＧＦＰ蛍光の存在によって証明されるように同定できる。例えば、７つのアルファ溶血素モノマーとＳｐｙＴａｇなしの融合タンパク質を含有する画分は、最も遠くに移動するが、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰと混合しても七量体と結合するＳｐｙＴａｇがないことから蛍光を発しない。しかし、単一ＳｐｙＴａｇを含有する画分は、その次に遠くに（その他の蛍光バンドと比較して）移動して蛍光を発し、それによって、七量体に結合した単一ＳｐｙＴａｇを有する画分の同定を可能にする。七量体に結合した単一ＳｐｙＴａｇを有する画分の同定後、次いで、ポリメラーゼ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合タンパク質をこの画分に添加し、それによって、ポリメラーゼをナノポア会合体に連結することができる。
【００８５】
[0087]本明細書において記載される方法および組成物を使用することによって、単一ＤＮＡポリメラーゼにつながれた、本明細書において記載される１つまたは複数のアルファ溶血素バリアントを含む、ナノポア会合体を達成することができる。例えば、七量体ナノポアは、配列番号１４のＶ１４９Ｋ、Ｅ２８７Ｒ、Ｈ３５Ｇ、Ｔ１０９Ｋ、Ｐ１５１Ｋ、Ｋ１４７Ｎ、Ｅ１１１Ｎ、Ｍ１１３Ａのうちいずれか１つまたはそれらの組合せに対応する置換を有する１つのアルファ溶血素バリアントと、５つの成熟野生型アルファ溶血素モノマーと、ポリメラーゼと融合している７つ目のアルファ溶血素モノマーとを含み得る（七量体の合計７つのサブユニットについて）。特定の例示的実施形態では、ナノポア七量体会合体は、１、２、３、４、５、６または７つの本明細書において記載されるバリアントであって、サブユニットのうち１つが、本明細書において記載されるポリメラーゼに付けられているバリアントを含み得る。
【００８６】
装置のセットアップ
[0088]ナノポアは、集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成するか、または他の方法で埋め込んでもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）としてもよい。一部の例においては、集積回路は、電界効果トランジスターまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、ナノポアを有するチップもしくは他のデバイスに位置するか、または、チップもしくはデバイスの外部に、例えばオフチップ配置などで位置することができる。半導体は任意の半導体とすることができ、ＩＶ族半導体（例えば、ケイ素）、およびＩＩＩ−Ｖ族半導体（例えば、ヒ化ガリウム）が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスのセットアップについては、例えば、ＷＯ２０１３／１２３４５０を参照のこと。
【００８７】
[0089]細孔を用いたセンサー（例えば、バイオチップ）は、単一分子の電子照合に使用することができる。細孔を用いたセンサーは、検出電極に隣接して、またはその近傍に配置された膜に形成された本開示のナノポアを含むことができる。センサーは対電極を含むことができる。膜は、トランス側（すなわち、検出電極に面する側）およびシス側（すなわち、対電極に面する側）を含む。
【００８８】
[0090]特定の例示的実施形態では、本明細書において記載される１つまたは複数のアルファ溶血素バリアントを含むナノポアは、野生型アルファ溶血素を含むナノポア（すなわち、本明細書において記載される置換を全く有さないナノポア）に対して、変更された通り抜ける時間を有する。例えば、細孔を通り抜けるためのタグの時間（通り抜ける時間またはＴＴＴ）は、低減することができる。特定の例示的実施形態では、本明細書において記載される１つまたは複数のバリアントを含むナノポアのＴＴＴを、天然アルファ溶血素からなる七量体ナノポア会合体と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上低減することができる。
【００８９】
[0091]この後の実験に関する開示においては、以下の略記が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）。
【実施例】
【００９０】
[0092]本発明を以下の実施例においてさらに説明する。実施例は、いかなる方法でも、特許請求する本発明の範囲を限定することを意図するものではない。添付の図は、本発明の明細書および説明の一部をなす部分としてみなされることを意図している。引用されるすべての参考文献は、そこに記載されているすべてが参照によって本明細書に明確に組み込まれる。以下の実施例は、説明するために提供するものであり、特許請求する本発明を限定するために提供するものではない。
【００９１】
実施例１
発現および回収
[0093]この実施例は、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するタンパク質の発現および回収を例示する。
【００９２】
[0094]野生型ａ−ＨＬをコードするＤＮＡを、商業的供給源から購入した。配列をシーケンシングによって検証した。
[0095]プラスミド構築。野生型またはバリアントα−溶血素のいずれかをコードする遺伝子を、ｐＰＲ−ＩＢＡ２プラスミド（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、Ｔ７プロモーターの制御下に挿入した。
【００９３】
[0096]形質転換。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）細胞を、当技術分野で周知の技術を使用し、野生型またはバリアントα−溶血素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて形質転換した。手短には、細胞を氷上で解凍した（凍結された場合には）。次いで、所望のＤＮＡ（好適なベクター／プラスミド中の）を、コンピテント細胞中に直接添加し（コンピテント細胞のものの５％を超えてはならない）、チューブを軽くはじくことによって混合した。チューブを氷上に２０分間置いた。次いで、細胞を混合せずに４２℃の水浴中に４５秒間入れ、続いて、チューブを氷上に２分間置いた。次いで、細胞を、０．９ｍｌのＳＯＣ培地（室温に予め加温した）を含有する１５ｍｌの滅菌培養チューブに移し、シェーカー中、３７℃で１時間培養した。最後に、細胞のアリコートを、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上に広げ、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。
【００９４】
[0097]タンパク質発現。形質転換後、コロニーを選び取り、小容量（例えば、３ｍｌ）の、適切な抗生物質を含有する成長培地（例えば、ＬＢ培養液）中に播種し、３７℃で終夜振盪した。
【００９５】
[0098]翌朝、１ｍｌの終夜培養物を、発現プラスミドを選択するために、新規の１００ｍｌの、適切な抗生物質を含有する自己誘導培地、例えば、Ｍａｇｉｃ  Ｍｅｄｉａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に移した。培養物を振盪しながら２５℃でおよそ１６時間成長させたが、これは、発現プラスミドに左右された。４℃で２０分間、３，０００ｇでの遠心分離によって細胞を回収し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００９６】
[0099]精製。細胞を超音波処理によって溶解した。アルファ溶血素を、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって均一性に精製した。
実施例２
アルファ溶血素バリアント
[00100]以下の実施例は、所望の残基での変異の導入を詳述する。
【００９７】
[00101]変異。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して部位特異的突然変異誘発を実施して、配列番号４に示されるとおりであるが、精製のためのＣ末端リンカー／ＴＥＶ／ＨｉｓＴａｇも含む実施例Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａを調製する。
【００９８】
[00102]実施例１におけるように、バリアントを発現させ、精製した。
実施例３
バリアントを含むナノポアの会合
[00103]この実施例は、６つのａ−ＨＬバリアントサブユニットおよび１つの野生型サブユニットを含むナノポアの会合を説明する。
【００９９】
[00104]野生型ａ−ＨＬを、ＳｐｙＴａｇおよびＨｉｓＴａｇを用いて実施例１に記載したように発現させ、コバルト溶出バッファー（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を使用してコバルトアフィニティーカラムで精製した。Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ  ａ−ＨＬバリアントを、ＨｉｓＴａｇを用いて実施例１に記載されたように発現させ、コバルト親和性カラムでコバルト溶出バッファー（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を使用して精製した。次いで、タンパク質を、タンパク質５ｍｇごとに１ｍｇのＴＥＶプロテアーゼとともに４℃で４時間インキュベートした。ＴＥＶプロテアーゼとともにインキュベートした後、コバルト親和性カラムで混合物を精製して、ＴＥＶプロテアーゼおよび未消化タンパク質を除去する。５日内に使用する場合には、タンパク質を４℃で保存し、そうではない場合は８％トレハロースを添加し、−８０℃で保存した。
【０１００】
[00105]およそ１０ｍｇの総タンパク質を使用して、α−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇを所望のα−ＨＬ−バリアントタンパク質溶液に１：９比で一緒に混合して、七量体の混合物を形成した。このような混合物は、変動する比のα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇおよびα−ＨＬ−バリアントタンパク質（０：７、１：６、２：５、３：４など）を含む種々の画分をもたらし、ここで、ＳｐｙＴａｇ成分は、七量体の０、１、２、３、４、５、６または７つの単量体サブユニットとして存在すると予測される。
【０１０１】
[00106]ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８または１５０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５のいずれかの中に、５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に可溶化し、ａ−ＨＬモノマーの混合物に、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。α−ＨＬモノマーの混合物を、３７℃で少なくとも６０分間インキュベートした。その後、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（βＯＧ）を、５％の最終濃度（重量／容量）に添加して、得られた脂質−タンパク質混合物を可溶化した。サンプルを遠心分離して、タンパク質凝集体および残った脂質複合体を除去し、さらなる精製のために上清を回収した。
【０１０２】
[00107]次いで、七量体の混合物を陽イオン交換精製に付し、溶出画分を回収した。各画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために２サンプルを調製した。第１のサンプルは、１５μＬのα−ＨＬ溶出液単独を含んでおり、第２のサンプルは、３μｇのＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰと組み合わせた。次いで、サンプルを、室温で１〜１６時間インキュベートし、光から保護した。インキュベーション後、５μＬの４ｘＬａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））を各サンプルに添加した。次いで、サンプルおよびＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌｕｓ（商標）Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅタンパク質ラダーを、４〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅタンパク質プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にロードした。ゲルを２００ｍＶで３０分間流した。次いで、Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅフィルターを使用してゲルを画像処理した。
【０１０３】
[00108]ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰの七量体α−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇへのコンジュゲーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの際の分子量バンドシフトによって観察できる。単一ＳｐｙＴａｇを含有する七量体は、単一ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ分子と結合し、したがって、七量体細孔の分子量および単一ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰの分子量に対応するシフトを有するが、２つ以上のＳｐｙＴａｇを有する七量体は、相応により大きな分子量シフトを有するはずである。したがって、上記の七量体α−ＨＬ精製の際に陽イオン交換カラムから溶出されるピークを、ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ対α−ＨＬ−バリアントの比について解析することができる。さらに、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰ取付けの存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを画像処理する時にＧＦＰ−蛍光フィルターを使用して観察することができる。
【０１０４】
[00109]理論的根拠に基づいて、分子量シフトがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ−ＧＦＰの単一付加に対応していた画分を、分子量標準タンパク質ラダーを使用して調べた。Ｂｉｏ−Ｒａｄのｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ画像処理システムを使用して、分子量シフトを調べた。ＧＦＰ蛍光の存在は、青色フィルターを使用して調べた。蛍光の存在を使用して、ＳｐｙＴａｇタンパク質の存在を確認した。次いで、１：６比、すなわち、１つのα−ＨＬ／ＳｐｙＴａｇ対６つのα−ＨＬ−バリアントに対応する溶出画分をさらなる実験に使用した。
【０１０５】
実施例４
ポリメラーゼの取付け
[00110]この実施例は、ナノポアへのポリメラーゼの取付けを提供する。
【０１０６】
[00111]ポリメラーゼは、任意の好適な手段によってナノポアに連結してもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開される；Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開される）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開される；Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖ）を参照のこと。
【０１０７】
[00112]ポリメラーゼ、例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを、リンカー分子を介してタンパク質ナノポア（例えば、アルファ溶血素）に連結させた。詳細には、生理的条件下で共有結合性イソペプチド連結を自発的に形成するＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用した。例えば、Ｌｉら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４年１月２３日；４２６（２）：３０９〜１７を参照のこと。
【０１０８】
[00113]手短には、Ｓｔｉｃｋｙ  ｐｈｉ２９  ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ  ＨｉｓＴａｇを実施例１に従って発現させ、コバルトアフィニティーカラムを使用して精製した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリメラーゼおよびＳｐｙＴａｇオリゴマー化タンパク質を、３ｍＭ  ＳｒＣｌ２中で、モル比１：１で４℃にて終夜インキュベートした。次に１：６−ポリメラーゼ−鋳型複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製する。
【０１０９】
実施例５
バリアントの活性
[00114]この実施例は、実施例４（ポリメラーゼが付けられたナノポア）によって提供されるようなナノポアの活性を示す。
【０１１０】
[00115]野生型およびＨ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａバリアントナノポアをアッセイして、置換の効果を調べた。より特には、交流電圧、すなわち、方形波を使用して、ナノポアに付けられたＤＮＡポリメラーゼによってタグ付き分子を捕獲するのにかかる時間を測定するためにアッセイを設計した。
【０１１１】
[00116]二重層を、２０１４年１０月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／６１８５３に記載されたように形成し、細孔を挿入した。分子（および／または配列核酸）を検出するために使用したナノポアデバイス（またはセンサー）は、ＷＯ２０１３／１２３４５０に記載したようにセットアップした。
【０１１２】
[00117]本発明者らのシーケンシング複合体中のＤＮＡポリメラーゼによってタグ付きヌクレオチドを捕獲するのにかかる時間を測定するために、本発明者らは、交流正および負電圧（方形波）を使用して、これがかかる時間の量を調べるアッセイを考案した。本発明者らのシーケンシング複合体は、単一のＤＮＡポリメラーゼに付けられるタンパク質ナノポア（αＨＬ）からなる（実施例４を参照のこと）。タグ付きヌクレオチドは、負に帯電しており、したがって、かけられる電圧が事実上正である場合にナノポアに付けられ、ナノポアシーケンシング複合体にかけられる電圧が負である場合にはじかれる。したがって、本発明者らは、電圧を正と負電位の間で循環させることによってタグが細孔中を通り抜けるのにかかる時間を測定し、タグが通される場合（低減された電流束）に対して、どの程度の時間ナノポアの電流が遮られないか（開口チャネル）を決定することができる。
【０１１３】
[00118]この「通り抜ける時間」アッセイを実施するために、ＧｅｎｉａシーケンシングチップとともにＧｅｎｉａシーケンシングデバイスを使用する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４において説明されるように電極を調整し、チップ上にリン脂質二重層を確立する。ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２６５１４（ＷＯ２０１３／１２３４５０として刊行された）に記載されるプロトコールに従って、Ｇｅｎｉａのシーケンシング複合体を二重層に挿入する。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、３００ｍＭ  ＫＧｌｕ、３μＭタグ付きヌクレオチド、３ｍＭ  Ｍｇ２＋からなるバッファーシステムを使用し、２３５ｍＶ  ピークツーピークの印加電圧を用い、８０Ｈｚの負荷サイクルを用いて、通り抜ける時間データを集めた。
【０１１４】
[00119]データを集めた後、方形波の正部分の最後まで持続したタグ付きヌクレオチドの捕獲（通されたレベル）を示した方形波について解析し、その後の方形波での別のタグ捕獲が続いた。第２の方形波が遮られない開口チャネル電流を報告した期間を調べることによって、通り抜ける時間を測定した。例として、１０の連続方形波が、方形波の正部分の最後まで持続するタグ付きヌクレオチド捕獲を示した場合には、通り抜ける時間パラメータは、方形波２〜１０から算出される（ポリメラーゼは、前の方形波においてポリメラーゼと結合したタグを有さなかったので、第１の方形波は、算出に組み入れない）。実験における細孔のすべてについてこれらの通り抜ける時間数を集め、それらから統計的パラメータを抽出した（例えば、平均、中央値、標準偏差など）。
【０１１５】
[00120]対照と比較した、Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａバリアントの結果を、図１〜２に示す。
[00121]本明細書において記載される実施例および実施形態は、単に例示目的のものであり、それを鑑みて種々の改変または変法は、当業者には示唆され、本出願の趣旨および管轄ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれものとするということは理解される。本明細書において引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
配列表フリーテキスト
配列番号１（ＷＴ  ａＨＬ  ＤＮＡ）
【０１１６】
【化１】
2019516361.tif 000003
【０１１７】
配列番号２（ＷＴ  ａＨＬアミノ酸）]大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されるような]
【０１１８】
【化２】
2019516361.tif 000004
【０１１９】
配列番号３（精製タグを有する、成熟ＷＴ  ａＨＬ）
【０１２０】
【化３】
2019516361.tif 000005
【０１２１】
配列番号４（Ｈ３５Ｇ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ１４４Ａ）
【０１２２】
【化４】
2019516361.tif 000006
【０１２３】
配列番号５（Ｈ３５Ｇ＋Ｈ１４４Ａ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ）
【０１２４】
【化５】
2019516361.tif 000007
【０１２５】
配列番号６（Ｖ１４９Ｋ＋Ｅ２８７Ｒ）
【０１２６】
【化６】
2019516361.tif 000008
【０１２７】
配列番号７（Ｔ１０９Ｋ＋Ｈ３５Ｇ）
【０１２８】
【化７】
2019516361.tif 000009
【０１２９】
配列番号８（Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ）
【０１３０】
【化８】
2019516361.tif 000010
【０１３１】
配列番号９（Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ）
【０１３２】
【化９】
2019516361.tif 000011
【０１３３】
配列番号１０（Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｈ３５Ｇ）
【０１３４】
【化１０】
2019516361.tif 000012
【０１３５】
配列番号１１（Ｖ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ＋Ｈ３５Ｇ）
【０１３６】
【化１１】
2019516361.tif 000013
【０１３７】
配列番号１２（Ｖ１４９Ｋ＋Ｋ１４７Ｎ＋Ｅ１１１Ｎ＋１２７−１３１Ｇ＋Ｍ１１３Ａ）
【０１３８】
【化１２】
2019516361.tif 000014
【０１３９】
配列番号１３（Ｔ１０９Ｋ＋Ｖ１４９Ｋ＋Ｐ１５１Ｋ＋Ｈ３５Ｇ）
【０１４０】
【化１３】
2019516361.tif 000015
【０１４１】
配列番号１４（成熟ＷＴ  ａＨＬ；ＡＡＡ２６５９８）
【０１４２】
【化１４】
2019516361.tif 000016
【０１４３】
配列番号１５（Ｈｉｓタグを有するＰｏｌ６）
【０１４４】
【化１５】
2019516361.tif 000017
【０１４５】
配列番号１６（リンカー／ＴＥＶ／ＨｉｓＴａｇ（ＴＥＶ部分に下線が引かれている）
【０１４６】
【化１６】
2019516361.tif 000018
【０１４７】
引例リスト
特許文献
[1] PCT/US2013/026514 (published as WO2013/123450) entitled “Methods for Creating Bilayers for Use with Nanopore Sensors”
[2] PCT/US2013/068967 (published as WO 2014/074727) entitled “Nucleic Acid Sequencing Using Tags”
[3] PCT/US14/61853 filed 23 October 2014 entitled “Methods for Forming Lipid Bilayers on Biochips”
非特許文献
[4] Aksimentiev and Schulten, Imaging a-Hemolysin with Molecular Dynamics: Ionic Conductance, Osmotic Permeability, and the Electrostatic Potential Map, Biophysical Journal (2005) 88: 3745-3761.
[5] Butler et al., Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore , PNAS (2008) 105(52): 20647-20652.
[6] Korchev et al., Low Conductance States of a Single Ion Channel are not 'Closed', J. Membrane Biol. (1995) 147:233-239.
[7] Krasilnikov and Sabirov, Ion Transport Through Channels Formed in Lipid Bilayers by Staphylococcus aureus Alpha-Toxin, Gen. Physiol. Biophys. (1989) 8:213-222.
[8] Nakane et al., A Nanosensor for Transmembrane Capture and Identification of Single Nucleic Acid Molecules, Biophys. J. (2004) 87:615-621.
[9] Rhee and Burns, Nanopore sequencing technology: nanopore preparations, TRENDS in Biotech. (2007) 25(4):174-181.
[10] Song et al., Structure of Staphylococcal α-Hemolysin, a Heptameric Transmembrane Pore, Science (1996) 274:1859-1866.
[11] Kasianowicz et al., Nanometer-scale pores: potential applications for analyte detection and DNA characterization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:13770-13773.
[12] Akeson et al., Microsecond timescale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules, Biophys. J. (1999) 77:3227-3233.
[13] Meller et al., Voltage-driven DNA translocations through a nanopore, Phys. Rev. Lett., 86 (2001), pp. 3435-3438.
[14] Howorka et al., Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores, Nat. Biotechnol., 19 (2001a), pp. 636-639.
[15] Howorka et al., Kinetics of duplex formation for individual DNA strands within a single protein nanopore, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (2001b), pp. 12996-13001.
[16] Movileanu et al., Detecting protein analytes that modulate transmembrane movement of a polymer chain within a single protein pore, Nat. Biotechnol., 18 (2000), pp. 1091-1095.
【０１４８】
[00122]本明細書によって本明細書において参照される各特許、特許出願、刊行物、文書、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトおよびその他の公開された材料の全体は、すべての表、図面および図を含めて参照により組み込まれる。すべての特許および刊行物は、各々が具体的に、個別に、参照により組み込まれると示されるかのように同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書の引例は、上記のもののいずれかが、関連先行技術であるという承認ではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付についての何らかの承認を構成しない。本明細書において言及されたすべての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示す。
【図１】
2019516361.tif 000019
【図２】
2019516361.tif 000020
【配列表】
2019516361000001.app
【国際調査報告】
2019516361.tif 000021
2019516361.tif 000022
2019516361.tif 000023
2019516361.tif 000024
2019516361.tif 000025
2019516361.tif 000026
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2019516361.tif 000028