(57)【要約】本発明は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能な化合物およびそれらの使用に関する。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能な化合物であって、前記化合物は、式１による部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、
式１：［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−］
ここで、Ｘ１は、ＰＡＲＰ−１の開裂を阻害することが可能なペプチド部分であり、
Ｘ２は、存在しなくてもしてもよく、Ｘ２が存在するときには、Ｘ２は、ＶａｌまたはＳｅｒから選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの一方は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの他方は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択されて、
ここで
Ｈｃａは、ホモシステイン酸のアミノ酸残基を表し、
Ｇｐａは、グアニジノフェニルアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３およびＡｒ４は、アリール側鎖を有するアミノ酸残基を各々が表し、アリール側鎖は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から独立に選択されて、
Ａｚａは、アジドホモアラニンのアミノ酸残基を表す、
化合物。
【請求項２】
少なくとも１つの標識化部分を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１は、配列番号２１（式２）、配列番号２２（式３）、配列番号２３（式４）および配列番号２４（式５）から選択され、
配列番号２１（式２）：−Ｐｒｏ−Ｘ５−Ｘ６−Ｐｒｏ−Ｘ７−Ｐｒｏ−
ここで、Ｘ５およびＸ７の両方は、酸性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはＸ５およびＸ７の両方は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基であり、
酸性側鎖を有する前記アミノ酸残基は、Ｇｌｕ、ＡｚａおよびＨｃａから各々が独立に選択されて、
Ｘ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙおよび（ＣＨ２）３から選択され、
配列番号２２（式３）：−Ｐｒｏ−Ｘ８−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ９−Ｐｒｏ−
ここでＸ８およびＸ９は、ＡｓｐおよびＧｌｕから各々が独立に選択され、
配列番号２３（式４）：−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−、
配列番号２４（式５）：−Ｇｌｙ−Ｘ１１−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｘ１２−Ｘ１３−
ここで、Ｘ１１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択され、
Ｘ１２は、Ａｓｐ、Ｎ−アルキルアスパラギン酸残基、Ｎ−アリールアスパラギン酸残基、Ｇｌｕ、Ｎ−アルキルグルタミン酸残基およびＮ−アリールグルタミン酸残基から選択され、
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ｎ−アルキルグリシン残基、およびＮ−アリールグリシン残基から選択され、
Ｘ１２がＡｓｐであるという条件では、Ｘ１３は、Ｎ−アルキルグルタミン酸残基またはＮ−アリールグルタミン酸残基である、
請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１は、配列番号２１（式２）である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ５は、ＧｌｕもしくはＨｃａであるか、および／またはＸ７は、ＧｌｕもしくはＨｃａである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ１は、以下
ｉ．  配列番号２  −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−；
ｉｉ．  配列番号４  −Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−；
ｉｉｉ．  配列番号２５  −Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−；
ｉｖ．  配列番号２６  −Ｐｒｏ−Ｈｃａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−；
ｖ．  配列番号２７  −Ｐｒｏ−Ａｚａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−；
ｖｉ．  配列番号２８  −Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−；
ｖｉｉ．  配列番号４１  −Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−；および
ｖｉｉｉ．  配列番号４２  −Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ
から選択される、
請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ１は、配列番号２２（式３）であり、Ｘ８がＡｓｐであってＸ９がＡｓｐであるか、またはＸ１は、配列番号２４（式５）である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ１は、配列番号２４（式５）であり、Ｘ１１は、Ａｓｐであり、Ｘ１２は、ＡｓｐまたはＮ−アルキルアスパラギン酸残基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ１は、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＭｅＡｓｐ−ＭｅＧｌｙ−Ｖａｌ（配列番号２９）であり、ＮＭｅＡｓｐは、Ｎ−メチルアスパラギン酸残基である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ２が存在して、Ｘ２は、Ｖａｌである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ３は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、Ｘ４は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、およびＨｃａ−Ｈｃａから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａｒ１および／またはＡｒ２は、置換されていてもよいナフチル基を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａｒ１および／またはＡｒ２は、グルタミン酸−ガンマ−［２−（１−スルホニル−５−ナフチル）−アミノエチルアミド（「Ｅｄａ」）のアミノ酸残基である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ４は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、またはＨｃａ−Ｈｃａである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘ３は、Ａｒ１−Ａｒ２であり、Ｘ４は、Ａｒ３−Ａｒ４である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ａｒ１およびＡｒ２は、各々がＥｄａであり、Ａｒ３およびＡｒ４は、各々がＮａｐであり、「Ｎａｐ」は、３−アミノ−３−（−２−ナフチル）−プロピオン酸のアミノ酸残基を表す、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性を調節するのに用いるための化合物であって、その化合物は、式６による部分を含み、
式６：−Ｐｒｏ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｐｒｏ−Ｘ１６−Ｐｒｏ−
ここでＸ１４およびＸ１６は、側鎖を有するアミノ酸残基、置換基を有するナフチル基、置換基である１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、および置換基を有するプロピル基から各々が独立に選択され、各側鎖または置換基は、酸性官能基を含み、
Ｘ１５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙ、および（ＣＨ２）３から選択される、
化合物。
【請求項１８】
Ｘ１４およびＸ１６は、各々がアミノ酸残基である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｘ１４およびＸ１６のうちの少なくとも１つは、Ａｓｐである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘ１４および／またはＸ１６は、スルホン酸基を含む、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物は、全部で１６〜１８単位を含むペプチド化合物であり、各単位は、アミノ酸残基、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基または置換されていてもよいプロピル基である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
式８による構造を含み、
式８：［Ｘ１７−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］
ここで、Ｘ１７は、式６による部分であり、
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、請求項１に定義される通りであり、任意に、Ｘ３およびＸ４は、請求項１１に定義された通りである、
請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
標識化部分を含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
実質的に上述されたようにポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能なアニオン性部分を含む化合物。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物、および医薬担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
さらなる治療薬を含む、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記さらな治療薬は、好気的解糖阻害薬である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコースである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
医薬品に使用するための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物または請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記化合物または組成物は、癌の処置における使用のためである、請求項２９に記載の使用のための化合物または医薬組成物。
【請求項３１】
前記化合物または組成物は、さらなる治療薬とともに投与される、請求項３０に記載の使用のための化合物または医薬組成物。
【請求項３２】
前記さらなる治療薬は、好気的解糖阻害薬である、請求項３１に記載の使用のための化合物または医薬組成物。
【請求項３３】
前記化合物または組成物は、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに使用される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の使用のための化合物または医薬組成物。
【請求項３４】
癌の処置のための薬物の製造における請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３５】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよび／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性をインビトロで調節するための請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３６】
癌を処置する方法であって、その方法は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物を患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
好気的解糖阻害薬を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
化学療法、放射線療法、および外科手術のうちの１つ以上の使用をさら含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物は、標識化部分を含み、前記方法は、前記化合物を検出するステップを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
分析の方法であって、その方法は、
ｉ．細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物と接触させるステップ、および
ｉｉ．前記化合物を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項４１】
前記細胞は、少なくとも１つの癌細胞を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法は、ウェスタンブロットアッセイを含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ｉｉ）は、蛍光検出を含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能な化合物であって、前記化合物は、式１による部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、
式１：［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−］
ここでＸ１は、ＰＡＲＰ−１の開裂を阻害することが可能な部分であり、
Ｘ２は、存在しなくてもしてもよく、Ｘ２が存在するときには、Ｘ２は、ＶａｌまたはＳｅｒから選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの一方は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの他方は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択されて、
ここで
Ｈｃａは、ホモシステイン酸のアミノ酸残基を表し、
Ｇｐａは、グアニジノフェニルアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３およびＡｒ４は、アリール側鎖を有するアミノ酸残基を各々が表し、アリール側鎖は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から独立に選択されて、
Ａｚａは、アジドホモアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ｘ１は、
【化１】
2019512462.tif 000008
または
【化２】
2019512462.tif 000009
の構造を有するか、またはいずれかの構造の誘導体である、
化合物。
【請求項４５】
少なくとも１つの標識化部分を含む、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの標識化部分は、蛍光標識を含む、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４７】
前記化合物は、
シクロ−［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］
からなる化合物か、またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックである、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４８】
前記化合物は、１つ以上のペプチドリンクのＮＨ基がＣＨ２基によって置き換えられたミメティックである、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４９】
前記化合物は、１つ以上のアミノ酸残基がアリール基によって置き換えられたミメティックである、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５０】
前記アリール基は、ナフチル基である、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５１】
前記化合物は、ミメティックであり、前記アミノ酸残基のうちの１つ以上は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、または置換されていてもよいプロピル基によって置き換えられた、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５２】
前記化合物は、２３個のタンパク質原性アミノ酸のうちのいずれかの側鎖を形成する基から選択された置換基を含むミメティック化合物である、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５３】
前記化合物は、前記アミノ酸残基のうちの５０％以下が前記基によって置き換えられたミメティック化合物である、請求項５２に記載の化合物。
【請求項５４】
好気的解糖阻害薬をさらに含む、請求項４３〜５３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５５】
前記好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）である、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】
医薬品に使用するための請求項４３〜５５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５７】
前記組成物は、癌の処置に使用するためである、請求項５６に記載の化合物。
【請求項５８】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）作動薬および乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）阻害薬を含む癌の処置のための化合物。
【請求項５９】
前記ＰＡＲＰ−１作動薬およびＬＤＨＡ阻害薬は、単一の治療薬である、請求項５８に記載の化合物。
【請求項６０】
前記化合物は、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を開裂から保護することが可能である、請求項５８または５９に記載の化合物。
【請求項６１】
前記化合物は、１６個〜１８個のアミノ酸を有するペプチドまたはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６２】
配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の化合物。
【請求項６３】
前記ペプチドは、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ開裂を阻害する４〜６個のアミノ酸配列を含む、請求項６１または６２に記載の化合物。
【請求項６４】
前記化合物は、請求項１〜２３および請求項４４〜５３に記載の化合物である、請求項５８〜６３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６５】
好気的解糖阻害薬を含むか、または好気的解糖阻害薬をさらに含む、請求項５８〜６４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６６】
前記好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を含む、請求項６５に記載の化合物。
【請求項６７】
医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６８】
前記化合物は、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに使用される、請求項５８〜６７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６９】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含む、請求項５８〜６８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７０】
前記癌は、多発癌または転移癌を含む、請求項５８〜６９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７１】
癌の処置のための薬物の製造における請求項５８〜７０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項７２】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）作動薬および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）阻害薬を含む第１の治療薬と好気的解糖阻害薬を含む第２の治療薬とを含む癌の処置のための組み合わせ療法。
【請求項７３】
前記第１および第２の治療薬は、同時投与用である、請求項７２に記載の組み合わせ。
【請求項７４】
前記化合物は、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を開裂から保護することが可能である、請求項７２または７３に記載の組み合わせ。
【請求項７５】
前記化合物は、１６個〜１８個のアミノ酸を有するペプチドまたはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含む、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項７６】
配列番号１６または配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項７５に記載の組み合わせ。
【請求項７７】
前記ペプチドは、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ開裂を阻害する４〜６個のアミノ酸配列を含む、請求項７５または７６に記載の組み合わせ。
【請求項７８】
前記組み合わせは、請求項１〜２３および請求項４４〜５３に記載の化合物を含む、請求項７２〜７７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項７９】
前記好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を含む、請求項７２〜７８のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項８０】
前記第１および第２の治療薬は、医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項７２〜７９のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項８１】
前記組み合わせは、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに使用される、請求項７２〜８０のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項８２】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含む、請求項７２〜８１のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項８３】
前記癌は、多発癌または転移癌を含む、請求項７２〜８４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項８４】
癌の処置のための薬物の製造における請求項７２〜８３のいずれか一項に記載の組み合わせの使用。
【請求項８５】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）作動薬またはＰＡＲＰ−１プロテアーゼ競合的阻害薬を含む癌の処置のための化合物であって、前記化合物は、全部で５または６個のアミノ酸残基の部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、前記部分は、
ｉ．生理的ｐＨにおいて正電荷を有することが可能な側鎖を有するいずれかの塩基性天然または非天然アミノ酸残基を含む第２および第５のアミノ酸残基位置、または
ｉｉ．生理的ｐＨにおいて負電荷を有することが可能な側鎖を有するいずれかの酸性天然または非天然アミノ酸残基を含む第２および第５のアミノ酸残基位置
のいずれかを有する、化合物。
【請求項８６】
ｉの第２および／または第５のアミノ酸残基位置は、Ａｒｇを含む、請求項８５に記載の化合物。
【請求項８７】
ｉｉの第２および／または第５のアミノ酸残基位置は、Ａｓｐを含む、請求項８５または８６に記載の化合物。
【請求項８８】
ｉｉの第２および／または第５のアミノ酸残基位置は、Ｇｌｘおよび／またはＨｃａを含む、請求項８５または８６に記載の化合物。
【請求項８９】
前記化合物は、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を開裂から保護する、あるいはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を模倣することが可能である、請求項８５〜８８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９０】
前記化合物は、１６個〜１８個のアミノ酸を有するペプチドまたはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含む、請求項８５〜８９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９１】
前記ＰＡＲＰ−１プロテアーゼは、カスパーゼを含む、請求項８５〜９０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９２】
前記カスパーゼは、カスパーゼ−３である、請求項９１に記載の化合物。
【請求項９３】
前記化合物は、請求項１〜２３および請求項４４〜５３に記載の化合物である、請求項８５〜９０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９４】
好気的解糖阻害薬を含むか、または好気的解糖阻害薬をさらに含む、請求項８５〜８３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９５】
前記好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を含む、請求項８４に記載の化合物。
【請求項９６】
医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項８５〜９５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９７】
前記化合物は、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに使用される、請求項８５〜９６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９８】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含む、請求項８５〜９６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９９】
前記癌は、多発癌または転移癌を含む、請求項８５〜９８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１００】
癌の処置のための薬物の製造における請求項８５〜９９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置に有用な組成物に関し、特に、ＡＴＰ枯渇を伴う癌細胞ネクローシスを選択的に生じさせる化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の抗癌剤開発における主な推進力は、いくつかの一般的なヒト癌のゲノム研究によって最近さらに牽引された、細胞表面受容体ならびに正および負のシグナル伝達因子の知識の急増に由来する［非特許文献１〜５］。これらの研究は、多くの遺伝子突然変異を明らかにし、それらの変異のうちの何百もが、自律性癌細胞増殖の進化に寄与するシグナル伝達経路上の重要タンパク質を伴うドライバー変異であると思われる。
【０００３】
いくつかの異なる薬剤がいずれか１つの標的に対して活性を示しうるので、多くの潜在的な創薬標的が、さらにより多数の潜在的な治療薬とともに、このアプローチによって明らかにされつつある。
【０００４】
本抗癌治療パラダイムは、それらのゲノム変異パターンに基づいて個別的に選択された癌に対するオーダーメイド薬物処置に向けた進展を思い描く。結果として生じた治療法が速やかに診療所に導入されつつある。これらの新薬は、しかしながら、一般に不十分な単剤効果を有し、腫瘍の完全奏功が極めて少なく、奏功期間中央値が大部分のケースでは１年未満である。
【０００５】
従って、より包括的な抗癌治療薬が必要である。
【０００６】
変異由来のシグナル伝達標的の多重性および多様性とは対照的に、好気的解糖および異数性などの、ある種の全般的な異常が多年にわたって癌細胞中で観測されてきた。これらの変化は、治療上の利用にとって依然として潜在的、包括的な「アキレス腱」である。
【０００７】
好気的解糖は、癌細胞と正常細胞との間の全般的な差異としてＯｔｔｏ  Ｗａｒｂｕｇ［非特許文献６］によって最初に記載された。彼は、十分な酸素の存在下においてさえ癌細胞における好気的解糖の特徴を示す、グルコースの取り込みおよび乳酸塩の産生の増加を確認した。この知見は、正常細胞と比較して異常な癌細胞中の炭水化物代謝を示唆し、包括的な抗癌標的を提供することができると考えられ、活発に研究が続けられている［非特許文献７で概説される］。
【０００８】
癌細胞中の炭水化物代謝を治療標的とすることができる２つの主要な分子部位は、酵素ヘキソキナーゼ２および乳酸脱水素酵素である。
【０００９】
ヘキソキナーゼ２は、細胞膜を通してグルコースを取り込んだ後にそれをリン酸化し、結果として、グルコースを解糖のために細胞内にトラップする。近年、ヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）の潜在的に選択的な全身性癌標的としての重要性がマウスにおけるＨｋ２欠失実験によって脚光を浴びた［非特許文献８］。抗癌処置として、ヘキソキナーゼ２の阻害がマウス異種移植モデルにおいてインビボで試みられた［非特許文献９］。２−デオキシグルコースは、単独では弱い腫瘍阻害薬であるが、メトホルミンと組み合わせて用いたときには広い範囲の前臨床癌モデルに対して効果があることが示された［非特許文献１０］。ヘキソキナーゼ２のさらなる癌治療用阻害薬は、３−ブロモピルビン酸である［非特許文献１１］が、この阻害薬には正常組織毒性の問題がある。
【００１０】
乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ：ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａ）は、腫瘍中で増加することが多年にわたって知られ、ｃ−Ｍｙｃ発癌性転写因子の直接標的として同定された［非特許文献１２］。抗癌治療法として、ＬＤＨＡの阻害薬を設計するための医薬品化学プログラムが現在進行中である［非特許文献１３］。
【００１１】
解糖障害に加えて、癌細胞におけるエネルギーレベルは、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼの活性によっても影響される。
【００１２】
ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１［ＰＡＲＰ−１：ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １］は、ポリ（ＡＤＰ−リボシル化）触媒活性を保有する酵素ファミリーの主要メンバーである［非特許文献１４］。この酵素は、３つの保存された主要ドメイン、すなわち、３つの亜鉛フィンガーを含んだＮＨ２末端ＤＮＡ損傷センシングおよび結合ドメイン、自己修飾ドメイン、およびＣ末端触媒ドメインからなる［非特許文献１５］。
【００１３】
ＰＡＲＰ−１は、一本鎖および二本鎖の両方のＤＮＡ切断に迅速かつ直接に結合する能力を有するクロマチン結合され、保存された核タンパク質である［非特許文献１６］。両方のタイプのＤＮＡ切断がこの酵素の触媒能を活性化し、次にはそれがＡＤＰリボース部分の分岐鎖の共有結合によって広範囲の核タンパク質の活性を調節する［非特許文献１４］。ポリＡＤＰリボース鎖の主要な機能は、ＤＮＡ損傷の部位を修復酵素に警告することである。
【００１４】
ＤＮＡ切断によってＰＡＲＰ−１が活性化されたときに、ＰＡＲＰ−１がＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を開裂し、ニコチンアミドおよびＡＤＰ−リボースを発生させて、ＡＤＰ−リボースは、鎖切断に隣接したＤＮＡに付着する鎖を形成する［非特許文献１５］。ＤＮＡ上にＡＤＰリボース鎖を形成するためのＰＡＲＰによるＮＡＤ＋の開裂は、細胞に不可欠なエネルギー源であるＡＴＰを発生させるために利用可能なＮＡＤ＋を結果として減少させる。従って、ＰＡＲＰ活性は、細胞のＡＴＰレベルの低下につながりうる。
【００１５】
アポトーシスは、能動的な「細胞自死」であり、エネルギーに依存する過程である。ＰＡＲＰ活性の結果としてのＡＴＰの枯渇は、アポトーシスを実行するために必須のエネルギーを細胞から奪いうる。アポトーシス過程の成功の重要な構成要素は、従って、ＡＴＰ枯渇を防ぐためのＰＡＲＰの開裂である。開裂は、ポリ（ＡＤＰリボシル化）を不活性化し、いくつかのカスパーゼ、特にカスパーゼ−３によって実施される［非特許文献１７］。カスパーゼ−３は、１１３ｋＤａのＰＡＲＰタンパク質をＤＥＶＤ部位［Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ２１４−Ｇｌｙ２１５（配列番号１）］においてＡｓｐ２１４およびＧｌｙ２１５アミノ酸との間で開裂して、２つのフラグメント８９および２４ｋＤａのポリペプチドを生じさせる。
【００１６】
ｐ８９およびｐ２４が、それぞれ、インタクトなＰＡＲＰのホモ会合およびＤＮＡ結合を阻害するため、ＰＡＲＰからの開裂フラグメントがＰＡＲＰ活性の抑制に寄与するように見える［非特許文献１８］。
【００１７】
高レベルのＡＴＰが細胞がアポトーシスを受けることを可能にするのに対して、低レベルのＡＴＰは、細胞をアポトーシスからネクローシスの方へシフトさせる［非特許文献１９］。ＰＡＲＰは、ＡＴＰ枯渇によるネクローシス死のメディエーターであることがマウス線維芽細胞で示された。ＰＡＲＰ欠損マウス（ＰＡＲＰ−／−）からの線維芽細胞は、ＡＴＰ枯渇およびネクローシス死から保護される［非特許文献２０］。
【００１８】
要約すると、ＰＡＲＰは、修復酵素による認識のために、ＤＮＡ切断をポリＡＤＰリボース鎖でフラグ付けする１１３ｋＤａのタンパク質である。ＮＡＤの分解によりポリＡＤＰリボースが形成されて、これがアポトーシスに必要なＡＴＰの枯渇につながり、ネクローシスによる細胞死を潜在的にもたらすことができる。
【００１９】
異数性は、癌細胞の特徴を示す別の包括的な変化であり、正常細胞には存在しない［非特許文献２１］。異数性は、正常細胞中に見られる染色体のハプロイド数の倍数から逸脱した異常な染色体数として厳密に定義される［非特許文献２２］。
【００２０】
異数性は、正常細胞の悪性転換の原因の本質的な構成要素であるか、またはこの悪性変化にしばしば付随する遺伝子不安定性の結果であるかどうかの疑問に相当な量の研究が向けられてきた［非特許文献２３、２４］。要点は、しかしながら、異数性が著しいＤＮＡ損傷の顕性化であり、異数性に先行する異常有糸分裂［非特許文献２５］または異数染色体の分離エラー［非特許文献２６］のいずれかの並行した結果として癌細胞に見られるということである。
【００２１】
癌細胞と正常細胞との間の明確な差異は、ゲノムがひどく損傷した癌細胞が正常細胞よりはるかに多くのＤＮＡ修復を必要とすることである。ＤＮＡ修復過程の主要な構成要素は、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１［ＰＡＲＰ−１］によるＤＮＡ損傷のフラグ付けである。
【００２２】
従って、ｍＲＮＡ発現によって測定されるように、広範囲の異なるヒト癌において、それらをもたらした正常細胞と比較して、増加したＰＡＲＰ活性が観測されたことは驚くに当たらない［非特許文献２７］。
【００２３】
癌細胞は、それゆえに、炭水化物代謝障害の結果として、正常細胞と比べてエネルギー欠損状態で動作し、細胞倍化の繰り返しおよびそれらの大量のＤＮＡ損傷修復のために高いエネルギー需要が必要とされる。加えて、癌細胞分裂の各繰り返しを達成するために必要とされるエネルギーがこのエネルギー欠損にさらに負担をかけることが予想されよう。
【００２４】
癌細胞に存在するが正常細胞には存在しない上記の包括的なエネルギー欠損標的を利用することが可能な、まだ達成されていない、抗癌治療法の役割がある。
【００２５】
ＤＮＡ損傷を生じさせるアスコルビン酸塩／メナジオン誘導酸化ストレス後のＰＡＲＰ活性の増加が細胞ネクローシスにつながることが、ｋ５６２細胞において［非特許文献２８］、およびシアン化物によって毒され、カスパーゼ・カスケードがｚＶＡＤ−ｆｍｋで阻害されたＣＸ細胞において［非特許文献２９］示された。これらのケースでは、しかしながら、細胞ネクローシスを生じるために、ＰＡＲＰ機能を維持するのに加えて、ＤＮＡ損傷または酸化ストレスも必要とされる。カスパーゼ阻害薬ｚＶＡＤ−ｆｍｋ単独ではネクローシスを生じなかった。同様に、サバイビン［非特許文献３０］およびＤＥＶＤ−ＣＨＯ［非特許文献３１］などの他のカスパーゼ阻害薬もそれら自体はネクローシスを生じさせない。そのうえ、ＸＩＡＰカスパーゼ阻害薬の小分子拮抗薬は、カスパーゼ活性を刺激するが、ネクローシスではなくむしろアポトーシスを誘導する［非特許文献３２］。
【００２６】
従って、カスパーゼ阻害薬などの、ＰＡＲＰ作動薬は、活性なＰＡＲＰを維持するにも係わらず、それら自体では細胞ネクローシスを誘導しないように見える。加えて、ＤＥＶＤ部位におけるＰＡＲＰを点変異によりカスパーゼ開裂に対して非感受性にしても、それ自体はネクローシスを生じさせなかった。ネクローシスは、ＴＮＦ−αが加えられたときにのみ生じた［非特許文献３３］。
【００２７】
要約すると、いくつかのＰＡＲＰ作動薬が記載され、それら自体ではいずれも細胞ネクローシスを生じさせないが、他の薬剤と組み合わせるとネクローシスを生じさせることができる。本明細書では、初めて、第２の薬剤を必要とせずにそれら自体で、ＡＴＰ枯渇によって、癌細胞死を生じさせることができるＰＡＲＰ作動薬が記載される。
【００２８】
ＰＡＲＰ機能を治療に利用するための現在の試みは、ポリ（ＡＤＰ−リボシル化）を防止し、結果として、ＤＮＡ損傷用治療薬の効果を高めて、ネクローシスではなくむしろアポトーシスにつながるであろうＰＡＲＰ阻害薬の開発に注力してきた［非特許文献１４、３４、１８］。
【００２９】
最初の市販ＰＡＲＰ阻害薬の１つは、オラパリブ（ＡＺＤ２２８１）（４−［３−（４−シクロプロパンカルボニルピペラジン−１−カルボニル）−４−フルオロベンジル］−２Ｈ−フタラジン−１−オン）であった。［非特許文献３５］。オラパリブは、ＤＮＡ損傷薬テモゾロミドの潜在的なエンハンサーとして前臨床的および臨床的に研究された［非特許文献３６］。
【００３０】
低分子ペプチド内の配列番号２（ＰＲＧＰＲＰ）の含有は、広範囲のヒト・インビトロ癌細胞株に対して選択的に殺癌性であるが、正常な二倍体ヒト角化細胞、線維芽細胞または不死化ＭＲＣ５−ｈＴＥＲＴ細胞に対してはそうでないことが示された［非特許文献３７および特許文献１］。
【００３１】
これらの環状ペプチドのユビキタスな選択的抗癌活性は、ヘキサペプチド配列内のアルギニンに大きく依存することが報告され、その理由は、アミノ酸配列の配列番号３（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）への変化が、Ｌ−ＮＧ−モノメチル−アルギニンまたはグルタミン酸をいずれかのアルギニンへ置換するのと同様に、殺癌能力を取り除くためである。
【００３２】
プロテオームにおけるペプチド配列の多重性を前提として、配列ＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）またはごく類似した配列がいくつかのタンパク質のペプチド鎖内にランダムに生じることがありそうに思われる。例えば、Ｄ−アミノ酸配列ＰＲＫＰＲＰ（配列番号５）をＪｕｎ結合ペプチド（ＪＢＰ：Ｊｕｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）中に見出すことができ［特許文献２］、ヘキサペプチドＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）もｂｂｃ３遺伝子の推定アミノ酸配列中に見出すことができる［特許文献３、非特許文献３８］。
【００３３】
タンパク質内のあるペプチド配列の存在は、しかしながら、タンパク質全体の特定の機能活性を担うのが、ペプチドまたはタンパク質内の他のアミノ酸配列とは異なり、特にこの配列であるということを意味するものではない。特定のアミノ酸配列の機能性は、仮定されるのではなく、むしろ証明される必要がある。ＣＤＫ４におけるヘキサペプチドＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）のケースでは、このペプチドがタンパク質の外部ループ上に位置し、この機能性がネクローシスによる選択的な癌細胞死滅であり、この活性は、配列をＰＲＲＰＧＰ（配列番号３）へ変化させるなど、ＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）における特定の変化によって、またはいずれかのアルギニンのグアニジウム領域におけるＮ−モノ−メチル化によって除去される。しかしながら、ＪＢＰのＰＲＫＰＲＰ（配列番号５）領域またはＢＢＣ３のＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）領域については機能性の具体的な実験的証拠がない。そのうえ、ＪＰＢ分子全体が正常神経細胞を虚血性ネクローシスから保護する。これは、ネクローシスをもたらすＣＤＫ４由来のＰＲＧＰＲＰベース環状ペプチドとは反対の活性である。加えて、ＢＢＣ３は、ＰＲＧＰＲＰ配列（配列番号２）を含むが、タンパク質全体がＢＣＬ抗アポトーシスタンパク質ファミリーメンバーの機能を妨害することによって正常神経細胞にアポトーシスを生じさせる。ＪＢＰもＢＢＣ３もＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）と相同または同一に近い配列を含むが、正常細胞と比較して癌細胞の選択的なネクローシスを生じさせることは示されなかった。
【００３４】
前述の環状ペプチド（特許文献１）は、活性なＰＲＧＰＲＰ部位（配列番号２）（「弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）」）と、ＰＲＧＰＲＰアミノ酸配列（配列番号２）を含んだＣＤＫ４中の外在化ループ（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｓｅｄ  ｌｏｏｐ）と同様の大きさの１６〜１８個のアミノ酸の環状ペプチドを形成する「骨格」とからなった。
【００３５】
ＰＲＧＰＲＰ（配列番号１）「弾頭」は、それ自体が両親媒性である。環状ペプチド中で「骨格」における非両親媒性アミノ酸配列と組み合わせた場合、得られた環状ペプチドは不活性であった［非特許文献３７］、すなわち、
配列番号６：Ｃｙｃ−［ＡＡＡＧＧＧＰＲＧＰＲＰＧＧＧＡＡＡ］  不活性
配列番号７：Ｃｙｃ−［ＧＧＧＧＧＧＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧ］  不活性
配列番号８：Ｃｙｃ−［ＧＧＧＧＧＧＰＲＧＰＲＰＧＧＧＧＧＧ］  不活性
配列番号９：Ｃｙｃ−［ＡＡＧＰＧＧＰＲＧＰＲＰＧＧＰＧＡＡ］  不活性
【００３６】
対照的に、両親媒性ＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬ「骨格」（配列番号１０）の導入は、活性なＰＲＧＰＲＰ環状ペプチドを首尾よく産生した。
【００３７】
両親媒性「骨格」の長さおよび組成におけるわずかな差異が、しかしながら、生理活性における大きな差異となりうる。従って、ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞を死滅させることに関して、よく似た環状ペプチドが反対の活性を実証した。すなわち、
配列番号１１：Ｃｙｃ−［ＰＲＧＰＲＰＶＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬ］（「ＴＨＲ５２」）  不活性
配列番号１２：Ｃｙｃ−［ＰＲＧＰＲＰＶＫＬＡＬＫＬＡＬＫＦＰ］（「ＴＨＲ５３」）  活性
配列番号１３：Ｃｙｃ−［ＰＲＧＰＲＰＶＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬ］（「ＴＨＲ５４」）  活性
【００３８】
理論によって束縛されることなく、両親媒性「骨格」のらせん構造は、「弾頭」を生理活性に最適な構造に制限すると思われる。加えて、「骨格」および「弾頭」におけるアミノ酸配列の精密な組み合わせがペプチド全体の生理活性に影響を及ぼすことができる。従って、最適な「骨格」／「弾頭」の組み合わせが予想され、本明細書に記載される請求項に係る化合物が完全な環状ペプチドとして最も効果的に働くことが期待されよう。
【００３９】
環状ペプチドＴＨＲ５３、その類似体ＴＨＲ５４（本明細書ではＨＩＬＲ−００１とも呼ばれる）、およびＴＨＲ７９（Ｃｙｃ−［ＰＲＧＰＲＰｖａｌｋｌａｌｋａｌａｌ］（配列番号１４）［非特許文献３７および特許文献１］は、広範囲のヒト癌細胞株を選択的に死滅させたが、低比活性の問題があり、ＩＣ５０が１００〜２００μＭの範囲内にあった。インビトロでは有望な抗癌治療可能性を示したが、所要の全身用量がマウスに許容可能な量より高くなるため、異種移植ヒト癌に対してインビボで試験することをこれらの低比活性が妨げた。
【００４０】
それゆえに、ＴＨＲ５３およびＴＨＲ５４の選択的な癌細胞死滅能力を維持し、より高い比活性を有する新しい環状ペプチドが必要である。さらなる活性ペプチド部分も必要である。
【００４１】
特許文献２は、プロテインキナーゼ阻害薬、より具体的にはプロテインキナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害薬を開示する。
【００４２】
特許文献４は、ＰＡＲＰ活性化剤をスクリーニングするための方法を開示する。
【００４３】
特許文献１は、ＣＤＫ４ペプチド領域および細胞貫通領域を備える環状ペプチドを開示する。
【００４４】
非特許文献３９は、サイクリン依存性キナーゼ４の非キナーゼ・ドメインと配列相同性をもつヘキサペプチドの選択的な抗癌活性を開示する。
【００４５】
非特許文献４０は、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ：ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）阻害薬ＸＧ−１０２が成体ラットにおける脳虚血後に高圧酸素の神経保護を強化することを述べる。
【００４６】
非特許文献４１は、カスパーゼによるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ開裂の障害がネクローシス誘導およびアポトーシス亢進につながることを述べる。
【００４７】
特許文献５は、例えば、薬物もしくは他の治療薬または診断薬などの、水不溶性物質をパッケージングする方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４８】
【特許文献１】国際公開第２００９／１１２５３６号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／００６０５１４（Ａ１）号
【特許文献３】国際公開第００／２６２２８号
【特許文献４】国際公開第２００６／０７８５０３号
【特許文献５】国際公開第９９／１８９９８号
【非特許文献】
【００４９】
【非特許文献１】Ｐｌｅａｓａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９）４６３：１９１−１９６
【非特許文献２】Ｓｊｏｂｌｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１４：２６８−２７４
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４４６：１５３−１５８
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）３２１：１８０１−１８０６
【非特許文献５】Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１２）３６６：８８３−８９２
【非特許文献６】Ｗａｒｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９２７）８：５１９−５３０
【非特許文献７】Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ（２０１１）８９：２０５−２１２
【非特許文献８】Ｒｏｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｚｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ；（２０１３）３：１１０５−１１０７
【非特許文献９】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；（２００５）６５：６１３−６２１
【非特許文献１０】Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ（２０１１）１０：２３５０−２３６２
【非特許文献１１】Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ（２００１）１７３：８３−９１
【非特許文献１２】Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１０）１０７：２０３７−２０４２
【非特許文献１３】Ｇｒａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２０１１）５４：１５９９−１６１２
【非特許文献１４】Ｍｕｎｏｚ−Ｇａｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（２００５）；３８６：１１９−１２５
【非特許文献１５】Ｊａｖｌｅ  ａｎｄ  Ｃｕｒｔｉｎ，Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）：１０５：１１４−１２２
【非特許文献１６】Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８７；８４：８３７０−８３７４
【非特許文献１７】Ｈｅｒｃｅｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９）；１９：５１２４−５１３３
【非特許文献１８】Ｇｒａｚｉａｎｉ  ａｎｄ  Ｓｚａｂｏ  ２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ．（２００５）；５２：１０９−１１８
【非特許文献１９】Ｅｇｕｃｈｉ  Ｙ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ，Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  Ｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９７）；５７：１８３５−１８４０
【非特許文献２０】Ｈａ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ  １９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９９）：９６：１３９７８−１３９８２
【非特許文献２１】Ｄｕｅｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒａｓｎｉｋ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ（２０００）４７：８１−１０７
【非特許文献２２】Ｈｏｌｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１２）１３：５０１−５１４
【非特許文献２３】Ｌｉ  ＰＮＡＳ（２０００）９７：３２３６−３２４１
【非特許文献２４】Ｋｎａｕｓ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ（２０１２）３７：２１１−２２０
【非特許文献２５】Ｇａｎｅｍ  ａｎｄ  Ｐｅｌｌｍａｎ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２０１２）１９９：８７１−８８１
【非特許文献２６】Ｊｅｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９２０１１）３３３：１８９５−１８９８
【非特許文献２７】Ｏｓｓｏｖｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１０）１：８１２−８２１
【非特許文献２８】Ｖｅｒｒａｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２００７）１２０：１１９２−１１９７
【非特許文献２９】Ｐｒａｂｈａｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２００４）１９５：１９４−２０２
【非特許文献３０】Ｈｅｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０１３）３９４：８３１−８４３
【非特許文献３１】Ｃｏｅｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８３：６４２−６２９
【非特許文献３２】Ｓｃｈｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ９２００４）５：２５−３５
【非特許文献３３】Ｈｅｒｃｅｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９）２１９：５１２４−５１３３
【非特許文献３４】Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００５）；６：３６４−３６８
【非特許文献３５】Ｍｅｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）；５１：６５８１−９１
【非特許文献３６】Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）；１０４：７５０−７５５
【非特許文献３７】Ｗａｒｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）；１０：７２−８８
【非特許文献３８】Ｒｅｉｍｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００３）１６２：５８７−５９８
【非特許文献３９】Ｗａｒｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１，１０−７２
【非特許文献４０】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０），３６，２１１−２２４
【非特許文献４１】Ｈｅｒｃｅｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌｙ  １９９９，ｐｐ．５１２４−５１３３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００５０】
本発明のある態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能な化合物が提供され、本化合物は、式１による部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、
式１：［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−］
ここで、Ｘ１は、ＰＡＲＰ−１の開裂を阻害することが可能なペプチド部分であり、
Ｘ２は、存在しなくてもしてもよく、Ｘ２が存在するときには、Ｘ２は、ＶａｌまたはＳｅｒから選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの一方は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの他方は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択されて、
ここで
Ｈｃａは、ホモシステイン酸のアミノ酸残基を表し、
Ｇｐａは、グアニジノフェニルアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３およびＡｒ４は、アリール側鎖を有するアミノ酸残基を各々が表し、アリール側鎖は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から独立に選択されて、
Ａｚａは、アジドホモアラニンのアミノ酸残基を表す。
【００５１】
本化合物は、少なくとも１つの標識化部分を含んでよい。
【００５２】
本化合物において、Ｘ１は、配列番号２１（式２）、配列番号２２（式３）、配列番号２３（式４）および配列番号２４（式５）から選択されてよく、
配列番号２１（式２）：−Ｐｒｏ−Ｘ５−Ｘ６−Ｐｒｏ−Ｘ７−Ｐｒｏ−
ここで、Ｘ５およびＸ７の両方は、酸性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはＸ５およびＸ７の両方は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基であり、
酸性側鎖を有するアミノ酸残基は、Ｇｌｕ、ＡｚａおよびＨｃａから各々が独立に選択されて、
Ｘ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙおよび（ＣＨ２）３から選択され、
配列番号２２（式３）：−Ｐｒｏ−Ｘ８−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ９−Ｐｒｏ−
ここでＸ８およびＸ９は、ＡｓｐおよびＧｌｕから各々が独立に選択され、
配列番号２３（式４）：−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−、
配列番号２４（式５）：−Ｇｌｙ−Ｘ１１−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｘ１２−Ｘ１３−、
ここで、Ｘ１１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択され、
Ｘ１２は、Ａｓｐ、Ｎ−アルキルアスパラギン酸残基、Ｎ−アリールアスパラギン酸残基、Ｇｌｕ、Ｎ−アルキルグルタミン酸残基およびＮ−アリールグルタミン酸残基から選択され、
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ｎ−アルキルグリシン残基、およびＮ−アリールグリシン残基から選択され、
Ｘ１２がＡｓｐであるという条件では、Ｘ１３は、Ｎ−アルキルグルタミン酸残基またはＮ−アリールグルタミン酸残基である。
【００５３】
Ｘ１は、配列番号２１（式２）であってよい。
【００５４】
Ｘ５は、ＧｌｕもしくはＨｃａであってよいか、および／またはＸ７は、ＧｌｕもしくはＨｃａである。
【００５５】
Ｘ１は、以下から選択されてよい。
ｉ．  配列番号２  −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−；
ｉｉ．  配列番号４  −Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−；
ｉｉｉ．  配列番号２５  −Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−；
ｉｖ．  配列番号２６  −Ｐｒｏ−Ｈｃａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−；
ｖ．  配列番号２７  −Ｐｒｏ−Ａｚａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−；
ｖｉ．  配列番号２８  −Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−；
ｖｉｉ．  配列番号４１  −Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−；および
ｖｉｉｉ．  配列番号４２  −Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ。
【００５６】
Ｘ１は、配列番号２２（式３）であってよく、Ｘ８がＡｓｐであってＸ９がＡｓｐであるか、またはＸ１は、配列番号２４（式５）である。
【００５７】
Ｘ１は、配列番号２４（式５）であってよく、Ｘ１１がＡｓｐであってＸ１２がＡｓｐまたはＮ−アルキルアスパラギン酸残基である。
【００５８】
Ｘ１は、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＭｅＡｓｐ−ＭｅＧｌｙ−Ｖａｌ（配列番号２９）であってよく、ＮＭｅＡｓｐがＮ−メチルアスパラギン酸残基である。
【００５９】
Ｘ２が存在してもよく、Ｘ２は、Ｖａｌである。
【００６０】
Ｘ３は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択されてよく、Ｘ４がＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、およびＨｃａ−Ｈｃａから選択される。
【００６１】
Ａｒ１および／またはＡｒ２は、置換されていてもよいナフチル基を含んでよい。
【００６２】
Ａｒ１および／またはＡｒ２は、グルタミン酸−ガンマ−［２−（１−スルホニル−５−ナフチル）−アミノエチルアミド（「Ｅｄａ」）のアミノ酸残基であってよい。
【００６３】
Ｘ４は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、またはＨｃａ−Ｈｃａであってよい。
【００６４】
Ｘ３は、Ａｒ１−Ａｒ２であってよく、Ｘ４がＡｒ３−Ａｒ４である。
【００６５】
Ａｒ１およびＡｒ２は、各々がＥｄａであってよく、Ａｒ３およびＡｒ４は、各々がＮａｐであり、「Ｎａｐ」は、３−アミノ−３−（−２−ナフチル）−プロピオン酸のアミノ酸残基を表す。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性を調節するのに用いるための化合物が提供され、その化合物は、式６による部分を含み、
式６：−Ｐｒｏ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｐｒｏ−Ｘ１６−Ｐｒｏ−
ここでＸ１４およびＸ１６は、側鎖を有するアミノ酸残基、置換基を有するナフチル基、置換基である１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、および置換基を有するプロピル基から各々が独立に選択され、各側鎖または置換基は、酸性官能基を含み、
Ｘ１５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙ、および（ＣＨ２）３から選択される。
【００６７】
Ｘ１４およびＸ１６は、各々がアミノ酸残基であってよい。
【００６８】
Ｘ１４およびＸ１６のうちの少なくとも一方は、Ａｓｐであってよい。
【００６９】
Ｘ１４および／またはＸ１６は、スルホン酸基を含んでよい。
【００７０】
本化合物は、全部で１６〜１８単位を含むペプチド化合物であってよく、各単位は、アミノ酸残基、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基または置換されていてもよいプロピル基である。
【００７１】
本化合物は、式８による構造を含んでよく：
式８：［Ｘ１７−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］
ここで、Ｘ１７は、式６による部分であり、
Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、請求項１に定義される通りであり、任意に、Ｘ３およびＸ４は、本発明の第１の態様を参照して先に定義された通りである。
【００７２】
本化合物は、標識化部分を含んでよい。
【００７３】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上述されたようにポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能なアニオン性部分を含む化合物が提供される。
【００７４】
本発明のなおさらなる態様によれば、上述されたような化合物、および医薬担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００７５】
医薬組成物は、さらなる治療薬を含んでよい。
【００７６】
さらなる治療薬は、好気的解糖阻害薬であってよい。かかる好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコースであってよい。
【００７７】
上記の化合物または医薬組成物は、医薬品に使用するためであってよい。
【００７８】
化合物または組成物は、癌の処置に使用するためであってよい。
【００７９】
化合物または組成物は、さらなる治療薬とともに投与されてよい。
【００８０】
さらなる治療薬は、好気的解糖阻害薬であってよい。
【００８１】
化合物または医薬組成物は、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに用いられてよい。
【００８２】
本発明のさらなる態様によれば、癌の処置のための薬物の製造における上述されたような化合物の使用が提供される。
【００８３】
本発明のなおさらなる態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよび／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性をインビトロで調節するための上述されたような化合物の使用が提供される。
【００８４】
本発明のなおさらなる態様によれば、癌を処置する方法が提供され、その方法は、上述されたような化合物または医薬組成物を患者に投与するステップを含む。
【００８５】
方法は、好気的解糖阻害薬を患者に投与するステップをさらに含んでよい。
【００８６】
方法は、化学療法、放射線療法および外科手術のうちの１つ以上の使用をさら含んでよい。
【００８７】
方法は、標識化部分を有する化合物を用いることをさらに含んでよく、方法は、その化合物を検出するステップを含む。
【００８８】
本発明のなおさらなる態様によれば、分析の方法が提供され、その方法は、
ｉ．細胞を本明細書に先述されたような化合物と接触させるステップ、および
ｉｉ．その化合物を検出するステップ
を含む。
【００８９】
細胞は、少なくとも１つの癌細胞を含んでよい。方法は、ウェスタンブロットアッセイを含んでよい。ステップ（ｉｉ）は、蛍光検出を含んでよい。
【００９０】
本発明のさらなる態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）の活性を調節することが可能な化合物が提供され、本化合物は、式１による部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、
式１：［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−］
ここでＸ１は、ＰＡＲＰ−１の開裂を阻害することが可能な部分であり、
Ｘ２は、存在しなくてもしてもよく、Ｘ２が存在するときには、Ｘ２は、ＶａｌまたはＳｅｒから選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの一方は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの他方は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択されて、
ここで
Ｈｃａは、ホモシステイン酸のアミノ酸残基を表し、
Ｇｐａは、グアニジノフェニルアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３およびＡｒ４は、アリール側鎖を有するアミノ酸残基を各々が表し、アリール側鎖は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から独立に選択され、
Ａｚａは、アジドホモアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ｘ１は、以下のいずれかの構造を有するか、またはいずれかの構造の誘導体である。
【００９１】
【化１】
2019512462.tif 000003
または
【化２】
2019512462.tif 000004
【００９２】
本化合物は、少なくとも１つの標識化部分を含んでよい。少なくとも１つの標識化部分は、蛍光標識を含んでよい。
【００９３】
本化合物は、
シクロ−［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］
からなる化合物であってよく、またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックである。
【００９４】
本化合物は、１つ以上のペプチドリンクのＮＨ基がＣＨ２基によって置き換えられたミメティックであってよい。
【００９５】
本化合物は、１つ以上のアミノ酸残基がアリール基によって置き換えられたミメティックであってよい。アリール基は、ナフチル基であってよい。
【００９６】
本化合物は、ミメティックであってよく、アミノ酸残基のうちの１つ以上は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、または置換されていてもよいプロピル基によって置き換えられる。
【００９７】
本化合物は、２３個のタンパク質原性アミノ酸のうちのいずれかの側鎖を形成する基から選択された置換基を含むミメティック化合物であってよい。
【００９８】
本化合物は、アミノ酸残基のうちの５０％以下がそれらの基によって置き換えられたミメティック化合物であってよい。
【００９９】
本化合物は、好気的解糖阻害薬をさらに含んでよい。好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ：２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）であってよい。
【０１００】
本明細書に先述されたような化合物は、医薬品に使用するためであってよい。
【０１０１】
組成物は、癌の処置に使用するためであってよい。
【０１０２】
さらなる態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）作動薬および乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）阻害薬を含む癌の処置のための化合物が提供される。
【０１０３】
ＰＡＲＰ−１作動薬およびＬＤＨＡ阻害薬は、単一の治療薬であってよい。
【０１０４】
本化合物は、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を開裂から保護することが可能であってよい。
【０１０５】
本化合物は、１６個〜１８個のアミノ酸を有するペプチドまたはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含んでよい。
【０１０６】
本化合物は、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を有してよい。
【０１０７】
本化合物がペプチドである場合、ペプチドは、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ開裂を阻害する４〜６個のアミノ酸配列を含んでよい。
【０１０８】
本化合物は、先の態様を参照して、上述されたような化合物であってよい。
【０１０９】
本化合物は、好気的解糖阻害薬を含んでよいか、または好気的解糖阻害薬をさらに含んでいる。かかる好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を含んでよい。
【０１１０】
本化合物は、医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでよい。
【０１１１】
本化合物は、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに用いられてよい。
【０１１２】
癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含んでよい。
【０１１３】
癌は、多発癌または転移癌を含む。
【０１１４】
別の態様によれば、癌の処置のための薬物の製造における化合物の使用が提供される。
【０１１５】
さらに別の態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）作動薬および／または乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨＡ）阻害薬を含む第１の治療薬と、好気的解糖阻害薬を含む第２の治療薬とを含む癌の処置のための併用療法が提供される。
【０１１６】
第１および第２の治療薬は、同時投与のためであってよい。
【０１１７】
本化合物は、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を開裂から保護することが可能であってよい。
【０１１８】
本化合物は、１６個と１８個との間のアミノ酸を有するペプチドまたはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含んでよい。本化合物は、配列番号１６または配列番号３０のアミノ酸配列を含んでよい。ペプチドは、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ開裂を阻害する４〜６個のアミノ酸配列を含んでよい。
【０１１９】
組み合わせは、先の態様を参照して、上述されたような化合物を含んでよい。
【０１２０】
好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を含んでよい。
【０１２１】
第１および第２の治療薬は、医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでよい。
【０１２２】
組み合わせは、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに用いられてよい。
【０１２３】
癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含む。
【０１２４】
癌は、多発癌または転移癌を含む。
【０１２５】
本発明のなおさらなる態様によれば、癌の処置のための薬物の製造における組み合わせの使用が提供される。
【０１２６】
本発明のなおさらなる態様によれば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）作動薬またはＰＡＲＰ−１プロテアーゼ競合的阻害薬を含む癌の処置のための化合物が提供され、その化合物は、全部で５または６個のアミノ酸残基の部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、その部分は、
ｉ．生理的ｐＨにおいて正電荷を有することが可能な側鎖を有するいずれかの塩基性天然または非天然アミノ酸残基を含む第２および第５のアミノ酸残基位置、または
ｉｉ．生理的ｐＨにおいて負電荷を有することが可能な側鎖を有するいずれかの酸性天然または非天然アミノ酸残基を含む第２および第５のアミノ酸残基位置
のいずれかを有する。
【０１２７】
ｉ．の第２および／または第５のアミノ酸残基位置は、Ａｒｇを含んでよい。ｉｉ．の第２および／または第５のアミノ酸残基位置は、Ａｓｐを含んでよい。ｉｉ．の第２および／または第５のアミノ酸残基位置は、Ｇｌｘおよび／またはＨｃａを含む。本化合物は、ＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域に結合するか、および／またはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を開裂から保護する、あるいはＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤもしくはＧＤＥＶＤＧ領域を模倣することが可能であってよい。本化合物は、１６個〜１８個のアミノ酸を有するペプチドまたはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含んでよい。ＰＡＲＰ−１プロテアーゼは、カスパーゼを含んでよい。カスパーゼは、カスパーゼ−３であってよい。
【０１２８】
本化合物は、好気的解糖阻害薬を含んでよいか、または好気的解糖阻害薬をさらに含んでよい。好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を含んでよい。
【０１２９】
本化合物は、医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでよい。
【０１３０】
本化合物は、放射線療法および／または外科手術の使用をさらに含む処置レジームに用いられてよい。
【０１３１】
癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含んでよい。
【０１３２】
癌は、多発癌または転移癌を含んでよい。
【０１３３】
なおさらなる態様によれば、癌の処置のための薬物の製造における上述されたような化合物の使用が提供される。
【０１３４】
本発明の適用可能性のさらなる領域は、以下に示される詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明および具体例が本発明の好ましい実施形態を示す。
【０１３５】
本発明は、詳細な説明および添付図面からさらに十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】自動化されたペプチド合成によるペプチド中への組み込みのための保護されたグアニジノフェニルアラニン（Ｇｐａ）およびホモシステイン酸（Ｈｃａ）の構造を示す。
【図２】自動化されたペプチド合成による環状ペプチド中への組み込みのための保護されたアジドホモアラニンおよび３−アミノ−３−（−２−ナフチル）−プロピオン酸の構造を示す。
【図３】ＨＩＬＲ−００１（配列番号１３）、ＨＩＬＲ−０２５（配列番号１５）およびＨＩＬＲ−０３０（配列番号１６）に関するＩＣ５０プロット（対照に対する％対Ｌｏｇ［Ｍ］）を示し、ＷＷＲＲＷＷＲＲＷＷ両親媒性カセット（配列番号１７）を含むＨＩＬＲ−０２５配列（配列番号１５）の活性のＨＩＬＲ−００１に対する増加、およびＴｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ（配列番号１８）カセットを有するＨＩＬＲ−０３０の活性のＨＩＬＲ−０２５（配列番号１５）に対するなおさらなる増加を実証し、ＨＩＬＲ−Ｄ−０８（配列番号３１）に関するＩＣ５０プロットも示される。
【図４】ＨＩＬＲ−Ｄ−０２（Ｃｙｃ−［Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］（配列番号１９）およびＨＩＬＲ−Ｄ−０６（Ｃｙｃ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］）（配列番号２０）に関するＩＣ５０プロット（対照に対する％対Ｌｏｇ［Ｍ］）を示し、「弾頭」中のアニオン基が効果的であることを実証する。
【図５】ＰＡＲＰ標準活性曲線（光出力対精製されたＰＡＲＰ酵素の単位のプロット）である。
【図６】ＰＡＲＰ活性に対するオラパリブおよび３−アミノベンズアミドの効果を示す。
【図７】ＰＡＲＰ活性に対する異なる濃度のオラパリブの効果を９６時間の時間経過にわたって示す。
【図８】オラパリブおよびパクリタキセルに関するＩＣ５０分析を示す。
【図９】ＮＣＩ−ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対するＰＡＲＰ阻害薬オラパリブと組み合わせたＨＩＬＲ−００１の効果を９６時間の時間経過にわたって示す。オラパリブは、ＨＩＬＲ−００１により誘導されたＡＴＰの低下を部分的に逆転させて、その結果として、癌細胞ネクローシスの度合いを低減する。
【図１０】Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯに対するカスパーゼ−３の用量反応を示す。
【図１１】カスパーゼ−３の活性に対するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯおよびＨＩＬＲ−０３０の効果を示す。
【図１２】カスパーゼ−３の活性に対するＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯおよびＨＩＬＲ−０３０の効果をさらに示す。
【図１３】ＣＤＫ４外部ループのＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）領域とＰＡＲＰのＤＥＶＤ領域とのアラインメント、およびＧＤＥＶＤＧホモログ（ＨＩＬＲ−Ｄ−０１）によるＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の緩やかであるが著しい死滅を示す。
【図１４】記載された環状ペプチドのペプチドミメティック・ホモログを示す。
【図１５】２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）を本発明による環状化合物とともに同時投与する効果を示す。
【図１６】ＨＩＬＲ−０２５、ＨＩＬＲ−Ｄ−０７、またはＤＭＳＯ対照を用いて処置されたＮＣ１  Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞における形態変化を示す。
【図１７】ＬＤＨ活性に対するＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−０３０のＩＣ５０用量の２４および９６時間における阻害効果を示す。
【図１８】ＨＩＬＲ化合物の作用の推定部位を示す細胞呼吸の簡略図である。ＰＡＲＰに対する作動薬の作用に伴うＬＤＨＡの阻害は、細胞ＡＴＰレベルの低下をもたらすことができる。６デオキシグルコースによるヘキソキナーゼの阻害は、ＨＩＬＲ環状ペプチドのＡＴＰ低下活性を追加的に高めるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
配列表フリーテキスト
配列番号２、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３７、４１および４２は、殺癌性基である。
配列番号３および４は、比較用ペプチドである。
配列番号５は、Ｊｕｎ結合ペプチドの部分配列である。
配列番号６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２０、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３９および４３〜４８は、環状ペプチドである。
配列番号１０、１７、１８、３８および３９はカセットである。
添付される配列のうちのいくつかは、非標準非天然アミノ酸残基を含む。配列表で確認される非天然アミノ酸残基は、グアニジノフェニルアラニン、ホモシステイン酸、アジドホモアラニン、Ｎ−メチルアスパラギン酸、３−アミノ−３−（２−ナフチル）−プロピオン酸の残基、およびグルタミン酸−ガンマ−［２−（１−スルホニル−５−ナフチル）−アミノエチルアミドの残基である。
配列番号２１を参照すると、位置（２）を記述するフリーテキストは、「塩基性残基または酸性残基は、ホモシステイン酸、アジドホモアラニンおよびグルタミン酸から選択される」と明記する。位置（３）を記述するフリーテキストは、「Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙ、および（ＣＨ２）３から選択される」と明記する。位置（５）を記述するフリーテキストは、「残基２が酸性である場合、酸性残基は、グルタミン酸およびホモシステイン酸から選択される。残基２が塩基性である場合には、塩基性残基」と明記する。
配列番号２４を参照すると、位置（２）を記述するフリーテキストは、「ＡｓｐおよびＧｌｕから選択される」と明記する。位置（５）を記述するフリーテキストは、「Ａｓｐ、Ｎ−アルキルＡｓｐ、Ｎ−アリールＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｎ−アルキルＧｌｕ、Ｎ−アリールＧｌｕから選択される」と明記する。位置（６）を記述するフリーテキストは、「Ｇｌｙ、Ｎ−アルキルＧｌｙ、Ｎ−アリールＧｌｙから選択される」と明記する。
配列番号３７を参照すると、位置（２）を記述するフリーテキストは、「酸性側鎖を有するいずれかの天然または非天然アミノ酸」と明記する。位置（３）を記述するフリーテキストは、「Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙおよび（ＣＨ２）３から選択される」と明記する。位置（５）を記述するフリーテキストは、「酸性側鎖を有するいずれかの天然または非天然アミノ酸」と明記する。
【０１３８】
本開示は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１の活性を調節することが可能な化合物を提供する。本化合物は、所与の細胞内のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１の全体的な活性を増加させうる。本化合物は、カスパーゼ、特にカスパーゼ３によるＰＡＲＰ−１の開裂を防止しうる。実施例においてより詳細に考察されるように、本明細書に提供される化合物は、癌細胞における好気的解糖を阻害することも考えられる。本発明による環状化合物は、これまでの環状ペプチドと比較して改善された比活性を呈する。
【０１３９】
本開示は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）の活性を調節することが可能な環状化合物を提供し、本化合物は、式１による部分またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックを含み、
式１：［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−］
ここで、Ｘ１は、ＰＡＲＰ−１の開裂を阻害することが可能なペプチド部分であり、
Ｘ２は、存在しなくてもしてもよく、Ｘ２が存在するときには、Ｘ２は、ＶａｌまたはＳｅｒから選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの一方は、Ｔｒｐ−Ｔｒｐ、およびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、
Ｘ３およびＸ４のうちの他方は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択されて、
ここで
Ｈｃａは、ホモシステイン酸のアミノ酸残基を表し、
Ｇｐａは、グアニジノフェニルアラニンのアミノ酸残基を表し、
Ａｒ１およびＡｒ２は、アリール側鎖を有するアミノ酸残基を各々が表し、アリール側鎖は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から各々が独立に選択され、
Ａｚａは、アジドホモアラニンのアミノ酸残基を表す。
【０１４０】
特に好ましくは、Ｘ３は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、Ｘ４は、Ａｒｇ−Ａｒｇ−、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択される。
【０１４１】
本開示を通じて、略語「Ｈｃａ」は、ホモシステイン酸のアミノ酸残基を指す。略語「Ｇｐａ」は、グアニジノフェニルアラニンのアミノ酸残基を指す。「Ａｚａ」は、アジドホモアラニンを指す。「Ｎａｐ」は、３−アミノ−３−（−２−ナフチル）−プロピオン酸のアミノ酸残基を表す。「Ｅｄａ」は、以下のアミノ酸残基を表し、
【０１４２】
【化３】
2019512462.tif 000005
【０１４３】
すなわち、グルタミン酸ガンマ−［２−（１−スルホニル−５−ナフチル）−アミノエチルアミドの残基である。
【０１４４】
Ｈｃａ、Ｇｐａ、およびＡｚａは、ＮａｐおよびＥｄａなどのアリール側鎖を有するアミノ酸残基とともに、本明細書では非天然アミノ酸と呼ばれる。本開示の化合物中に少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むことが好ましい。この理由は、非天然アミノ酸を含む化合物が酵素による分解に対して天然アミノ酸のみからなる化合物より典型的に耐性が高いためである。
【０１４５】
好ましくは、本環状化合物は、シクロ−［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］からなるか、またはその塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックである。
【０１４６】
本環状化合物は、標識化部分を含んでよい。標識化部分は、蛍光標識であってよい。
【０１４７】
標識化部分は、環状化合物の検出を可能にする。標識化部分の例は、蛍光標識、放射標識、質量標識およびビオチンを含む。適切な標識化部分は、タンパク質およびペプチドに対する従来の標識を含む。当業者は、タンパク質およびペプチドのための標識に精通しているであろう。
【０１４８】
標識化部分は、用いられることになる所望の検出方法に依存して選択されてよい。例えば、本環状化合物がＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：酵素結合免疫吸着アッセイ）で検出されることになる場合には、標識化部分は、適切にはビオチンを含む。別の配置において、本環状化合物がウェスタンブロットアッセイ、ゲル電気泳動アッセイまたは同様のもので検出されることになる場合、標識化部分は、適切には蛍光標識である。本明細書では他のクラスの標識および他のアッセイタイプも考慮される。
【０１４９】
本環状化合物がＡｒ１−Ａｒ２および／またはＡｒ３−Ａｒ４を含む配置では、アリール側鎖のうちの１つ以上が置換基を含んでよく、その置換基が蛍光標識、放射標識、質量標識、およびビオチンから選択された標識である。代わりに、アリール側鎖が蛍光標識として機能するように選択された置換基をアリール側鎖のうちの１つ以上が含んでもよい。この配置では、置換基は、スルホン酸基であってよい。アリール側鎖を含む蛍光性非天然アミノ酸の一例は、Ｅｄａである。
【０１５０】
化合物中への標識化部分の含有によって、細胞による化合物の取り込みを分析することができる。標識化部分の含有によって、化合物の作用機序をより詳細に解明することも可能になる。標識化された化合物と接触した細胞の分析は、化合物を含む製剤中への含有のために添加剤、賦形剤、同時活性剤（ｃｏ−ａｃｔｉｖｅ）、薬用量、および剤形を最適化することも許容する。
【０１５１】
本明細書に開示される環状化合物は、しばしば「弾頭」と呼ばれる活性配列と、弾頭を細胞へ送達するためのカセットとを含む。
【０１５２】
Ｘ１は、ＰＡＲＰ−１の開裂を阻害することが可能なペプチド部分である活性配列を表す。本明細書では、用語ペプチド部分は、ペプチドおよびペプチドミメティック部分を指すために用いられる。好ましくは、Ｘ１は、ペプチド部分である。本明細書に定義されるような活性配列Ｘ１は、ＰＡＲＰに結合してその開裂を防止するか、あるいはＰＡＲＰを開裂するプロテアーゼを競合的に阻害すると考えられる。ＰＡＲＰは、ＤＮＡ修復経路に関与する。ＰＡＲＰの作用機序は、ＮＡＤを消費して、ＡＴＰ枯渇につながる。癌細胞は、広範なＤＮＡ損傷を有し、上方制御されたＰＡＲＰ活性を必要とする。癌細胞におけるＰＡＲＰ不活性化の防止は、細胞のＡＴＰを枯渇させて、ネクローシスにつながる。正常細胞は、ＤＮＡ損傷をほとんどもしくはまったく有さないため、ＰＡＲＰ不活性化の防止は、正常細胞のＡＴＰを枯渇させない。理論によって束縛されることなく、本発明は、本開示による化合物がそれゆえにＰＡＲＰの活性を調節することによって癌細胞におけるネクローシスを選択的に生じさせることを発見した。本化合物は、追加的な機序により癌細胞にストレスも与えて、ネクローシスをさらに促進しうると考えられる。理論に束縛しようとするものではないが、実施例に提示される証拠は、追加的な機序が癌細胞における炭水化物代謝経路、特に、好気的解糖経路に関係しうることを示唆する。
【０１５３】
Ｘ１は、適切にはＰＡＲＰのＤＥＶＤ領域に結合することが可能な部分である。この配置では、Ｘ１は、全部で５または６個のアミノ酸残基、好ましくは６個のアミノ酸残基を含むペプチド部分であってよい。配列中の第２および第５のアミノ酸残基は、塩基性アミノ酸残基であってよい。塩基性アミノ酸残基は、生理的ｐＨにおいて正電荷を有することが可能な側鎖を有するいずれかの天然または非天然アミノ酸であってよい。好ましい塩基性アミノ酸は、アルギニンである。理論に束縛しようとするものではないが、配列中の第２および第５のアミノ酸としての正荷電アミノ酸の含有は、図１３に示されるように、その部分がＰＡＲＰ−１のＤＥＶＤ領域に結合することを可能にすると考えられる。
【０１５４】
適切なＸ１部分は、特許文献１にＣＤＫ４ペプチド領域として記載された部分を含む。
【０１５５】
代わりに、Ｘ１は、アニオン性活性部分であってもよい。アニオン性活性部分は、全部で５〜６個のアミノ酸残基、好ましくは全部で６個のアミノ酸残基を含んでよい。第２および第５のアミノ酸残基は、酸性であってよい。アニオン性活性部分は、カスパーゼ−３などの、ＰＡＲＰを開裂するプロテアーゼの競合的阻害薬として作用すると考えられる。
【０１５６】
Ｘ１は、全部で６個のアミノ酸残基を含むペプチド部分を表してよく、第２および第５のアミノ酸残基は、両方ともに塩基性かまたは両方ともに酸性のいずれかである。当業者は、活性剤の存在下で酵素活性を決定するための従来のアッセイに精通しているであろう。Ｘ１部分は、癌細胞を死滅させるのに効果的であろう。それゆえに、適切な活性をもつＸ１基は、細胞生存率アッセイを用いて同定されうる。細胞生存率を測定する方法は、蛍光検出とともにａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（レサズリン）の使用を含む。典型的な実験プロトコルは、以下の実施例に詳述される。癌細胞死滅比活性は、薬剤ごとの５０％阻害濃度（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＩＣ５０）値の比較によって決定される（図３および４を参照）。本環状化合物は、７５μＭ以下、または５０μＭ以下、または３０μＭ以下、または１５μＭ以下または１０μＭ以下のＩＣ５０を有しうる。
【０１５７】
好ましくは、Ｘ１は、配列番号２１（式２）、配列番号２２（式３）、配列番号２３（式４）および配列番号２４（式５）から選択され、
配列番号２１（式２）：−Ｐｒｏ−Ｘ５−Ｘ６−Ｐｒｏ−Ｘ７−Ｐｒｏ−
ここで、Ｘ５およびＸ７の両方は、酸性側鎖を有するアミノ酸残基であるか、またはＸ５およびＸ７の両方は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基であり、
酸性側鎖を有するアミノ酸残基は、Ｇｌｕ、ＡｚａおよびＨｃａから各々が独立に選択され、
そして
Ｘ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙおよび（ＣＨ２）３から選択され、
配列番号２２（式３）：−Ｐｒｏ−Ｘ８−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ９−Ｐｒｏ−
ここでＸ８およびＸ９は、ＡｓｐおよびＧｌｕから各々が独立に選択され、
配列番号２３（式４）：−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
配列番号２４（式５）：−Ｇｌｙ−Ｘ１１−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｘ１２−Ｘ１３−
ここで、Ｘ１１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択され、
Ｘ１２は、Ａｓｐ、Ｎ−アルキルアスパラギン酸残基、Ｎ−アリールアスパラギン酸残基、Ｇｌｕ、Ｎ−アルキルグルタミン酸残基およびＮ−アリールグルタミン酸残基から選択され、
Ｘ１３は、Ｇｌｙ、Ｎ−アルキルグリシン残基、およびＮ−アリールグリシン残基から選択され、
Ｘ１２がＡｓｐであるという条件では、Ｘ１３は、Ｎ−アルキルグルタミン酸残基またはＮ−アリールグルタミン酸残基である。
【０１５８】
式２によるＸ１部分が特に好ましい。
【０１５９】
式２の部分では、Ｘ５およびＸ７は、好ましくはＧｌｕおよびＨｃａから各々が独立に選択される。一配置において、Ｘ５は、Ｇｌｕであり、Ｘ７は、Ｇｌｕである。別の配置では、Ｘ５は、Ｇｌｕであり、Ｘ７は、Ｈｃａである。なおさらなる配置では、Ｘ５は、Ｈｃａであり、Ｘ７は、Ｇｌｕである。別の配置では、Ｘ５は、ＨｃａまたはＡｚａであり、Ｘ７は、ＨｃａまたはＡｚａである。
【０１６０】
別の配置では、Ｘ５およびＸ７は、両方が塩基性側鎖を共有するアミノ酸残基である。塩基性アミノ酸の例は、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓを含む。この配置では、Ｘ５およびＸ７は、好ましくはＡｒｇである。Ｘ６は、好ましくはグリシン残基またはサルコシン（Ｎ−メチルグリシン）残基である。最も好ましくは、Ｘ６は、Ｇｌｙである。
【０１６１】
式２による具体的なＸ１部分は、−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（配列番号２）；−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（配列番号４）；−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−（配列番号２５）；−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−（配列番号２６）；−Ｐｒｏ−Ａｚａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−（配列番号２７）；−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−（配列番号２８）；−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−（配列番号４１）；および−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ（配列番号４２）を含む。これらの部分のうちで、−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（配列番号２）および−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（配列番号４）が好ましく、Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ（配列番号２５）が特に好ましい。
【０１６２】
代わりに、Ｘ１部分は、式３（配列番号２２）による部分であってもよい。
式３：−Ｐｒｏ−Ｘ８−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ９−Ｐｒｏ−
Ｘ８およびＸ９は、ＡｓｐおよびＧｌｕから独立に選択され、好ましくはＡｓｐである。Ｘ１部分は、代わりに式５（配列番号２５）：−Ｇｌｙ−Ｘ１１−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｘ１２−Ｘ１３−による部分であってもよい。
【０１６３】
アミノ酸残基Ｘ１２およびＸ１３のうちの少なくとも一方は、カスパーゼ１によるＸ１２−Ｘ１３ペプチド結合の開裂を防止するかまたは減少させる化学修飾を含まなければならない。それゆえに、Ｘ１２がＡｓｐである場合、Ｘ１３は、Ｎ−アルキルまたはＮ−アリールグルタミン酸残基である。Ｘ１２またはＸ１３残基中に存在してよい適切なＮ−アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分岐アルキル基およびＣ４〜Ｃ６シクロアルキル基を含む。好ましくは、Ｎ−アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ３直鎖アルキル基、最も好ましくはメチルである。
【０１６４】
好ましくは、Ｘ１１は、Ａｓｐであり、Ｘ１２は、ＡｓｐまたはＮ−メチルＡｓｐである。最も好ましくは、式５による部分は、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＭｅＡｓｐ−ＭｅＧｌｙ−Ｖａｌ−（配列番号２９）である。
【０１６５】
なおさらなる代わりの配置では、Ｘ１は、本開示の第２の態様の考察において以下に記載されるような式６の部分である。
【０１６６】
式１による部分は、Ｘ２基を任意に含む。Ｘ２基は、リンカーとして機能すると考えられる。Ｘ２基は、存在するならば、適切にはＶａｌまたはＳｅｒから選択される。Ｘ２基は、好ましくは存在して、好ましくはＶａｌである。式１による部分の誘導体では、Ｘ２は、存在するならば、いずれかのアミノ酸残基であってよい。
【０１６７】
式１に列挙されるような配列Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３は、カセットを表す。カセットは、化合物の細胞取り込みを改善するか、および／または弾頭を生理活性に最適な構造（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）に制限しうる。適切には、カセットは、両親媒性である。カセットは、本環状化合物が水溶するのに十分に親水性であり、一方では細胞による環状化合物の取り込みを許容するために十分に親油性であることが望ましい。
【０１６８】
Ｘ３およびＸ４のうちの一方は、Ｔｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択される。Ｘ３およびＸ４のうちの他方は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−Ｈｃａ、およびＡｒ３−Ａｒ４から選択される。
【０１６９】
Ｘ３およびＸ４の具体的な配置が以下に記載されるが、すべての記述される配置に対する選択肢は、Ｘ３とＸ４とを単に交換することによって達成されうることが理解されよう。簡単のために、Ｘ３とＸ４とを交換することによって得られる選択肢は、以下にすべては提示されない。それらは、それでもなお本開示の一部を形成する。説明として、特に好ましい配置では、Ｘ３がＴｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択され、Ｘ４がＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、およびＨｃａ−Ｈｃａから選択される。Ｘ４がＡｒ３−Ａｒ４であることも可能である。これらの配置に相補的な交換された構成では、Ｘ３が代わりにＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、Ｈｃａ−ＨｃａおよびＡｒ３−Ａｒ４から選択され、Ｘ４が代わりにＴｒｐ−ＴｒｐおよびＡｒ１−Ａｒ２から選択される。
【０１７０】
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３およびＡｒ４は、アリール側鎖を有する非天然アミノ酸残基を各々が表す。各アリール側鎖は、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から独立に選択されてよい。好ましいアリール基は、置換されていてもよいナフチル基である。１つ以上のアリール側鎖が標識化部分として作用するように任意に構成されてよい。
【０１７１】
Ａｒ１、Ａｒ２、Ａｒ３およびＡｒ４は、３−アミノ−３−アリールプロピオン酸または２−アミノ−２−アリール酢酸のアミノ酸残基から選択されてよい。代わりのアミノ酸残基は、以下の構造を有するグルタミン酸誘導体を含み、
【０１７２】
【化４】
2019512462.tif 000006
【０１７３】
ここでＲは、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、および置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基から選択される。
【０１７４】
一般に、アリール基が置換基を含む場合には、親油性置換基が好ましい。親油性置換基の例は、アルキル基、アルケン基、およびアルキン基を含む。かかる基は、例えば、全部で１〜５個の炭素原子を含んでよく、直鎖または分岐であってよい。極性または荷電置換基は、容認されるが、細胞による化合物の取り込み速度を低下させることがある。典型的に、極性または荷電側鎖は、アリール側鎖が標識化部分として作用することになる配置にのみ含まれる。
【０１７５】
本化合物が標識化部分を含む配置では、置換基は、存在するならば、標識化部分としてアリール側鎖が作用するように構成されてよい。この配置では、アリール側鎖は、好ましくは蛍光標識として作用するように構成される。例えば、Ａｒ1および／またはＡｒ２は、Ｅｄａ残基であってよい。Ｅｄａ残基は、蛍光性である。
【０１７６】
好ましくは、Ａｒ１およびＡｒ２は、３−アミノ−３−アリール−プロピオン酸のアミノ酸残基である。最も好ましくは、Ａｒ１およびＡｒ２は、３−アミノ−３−（−２−ナフチル）−プロピオン酸のアミノ酸残基（「Ｎａｐ」）である。ナフチル側鎖を有する市販のＦｍｏｃ保護された非天然アミノ酸の構造が図２に示される。
【０１７７】
一配置においては、Ｘ３は、Ａｒ１−Ａｒ２であり、Ｘ４は、Ａｒ３−Ａｒ４であり、Ａｒ１およびＡｒ２は、各々がＥｄａであり、Ａｒ３およびＡｒ４は、各々がＮａｐである。
【０１７８】
一配置において、Ｘ３は、Ｔｒｐ−Ｔｒｐであり、Ｘ４は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｇｐａ−Ｇｐａ、およびＨｃａ−Ｈｃａから選択される。この配置では、Ｘ４は、好ましくはＡｒｇ−ＡｒｇまたはＧｐａ−Ｇｐａである。
【０１７９】
特に好ましい配置では、Ｘ３は、Ｎａｐ−Ｎａｐであり、Ｘ４は、Ａｒｇ−Ａｒｇである。
【０１８０】
適切には、式１の部分を含む本環状化合物は、全部で１００個以下のアミノ酸残基、好ましくは５０個以下のアミノ酸残基、より好ましくは２５個以下のアミノ酸残基を含む。さらにより好ましくは、本環状化合物は、全部で１６〜１８個のアミノ酸残基を含む。本環状化合物は、シクロ−［Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］からなってよい。好ましい化合物の例は、以下の通りである：
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号１５）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号１６）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号１９）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号２０）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号３０）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｐ−Ｎａｐ］  （配列番号３１）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｅｄａ−Ｅｄａ］  （配列番号３２）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号３３）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｈｃａ−Ｈｃａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｈｃａ−Ｈｃａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ］  （配列番号３４）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｈｃａ−Ｈｃａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｈｃａ−Ｈｃａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ］  （配列番号３５）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｚａ−ＭｅＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｈｃａ−Ｈｃａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｈｃａ−Ｈｃａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ］  （配列番号３６）；および
シクロ−［Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＭｅＡｓｐ−ＭｅＧｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］  （配列番号４０）。
【０１８１】
好ましい化合物の追加の例は、以下の通りである：
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ］  （配列番号４３）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ］  （配列番号４４）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ］  （配列番号４５）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｃａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｅｄａ−Ｅｄａ］  （配列番号４６）；
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｚａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｅｄａ−Ｅｄａ］  （配列番号４７）；および
シクロ−［Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｅｄａ−Ｅｄａ−Ｎａｐ−Ｎａｐ−Ｅｄａ−Ｅｄａ］  （配列番号４８）。
【０１８２】
本明細書において同様に考慮されるのは、本明細書に定義される環状化合物の塩、誘導体、プロドラッグもしくはミメティックである化合物である。
【０１８３】
本環状化合物がイオン化可能な官能基を含むときには、本化合物が適切な対イオンとの塩の形態で提供されてよい。対イオンは、好ましくは医薬として容認できる対イオンである。当業者は、塩の調製に精通しているであろう。
【０１８４】
本化合物が酸性官能基を含む場合、対イオンは、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土類金属イオンであってよい。酸性化合物の好ましい対イオンは、ナトリウムである。
【０１８５】
本環状化合物が塩基性アミノ酸残基を含む場合、塩は、強酸または弱酸を用いて形成されてよい。例えば、化合物を塩酸塩、クエン酸水素塩、トシル酸水素塩（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｔｏｓｙｌａｔｅ  ｓａｌｔ）または同様のものとして提供できるであろう。
【０１８６】
本明細書に記載される化合物の誘導体も考慮される。
【０１８７】
誘導体は、本明細書に定義される化合物と実質的に同様の構造および機能を有するが、例えば、１つ以上の保護基を含むか、および／またはアミノ酸残基の２つまでの追加、削除、もしくは置換によって、定義された構造からわずかにずれた化合物である。
【０１８８】
本明細書では、用語「誘導体」は、化合物中に存在するアミノ酸側鎖が保護されたアミノ酸側鎖として提供される化合物を包含する。当業者は、保護基の使用に精通しているであろう。
【０１８９】
誘導体は、本明細書に定義される化合物に対して８７％、８８％、９３％、９４％、または９９％より大きい配列相同性を有する化合物をさらに包含する。本明細書に定義される化合物の誘導体を形成するために、１つのアミノ酸残基が削除、置換、または挿入されてよい。２つのアミノ酸残基が削除、置換または挿入されてもよい。
【０１９０】
本明細書に定義されるいくつかの化合物は、Ｎ−アルキルおよび／またはＮ−アリール基を有するアミノ酸残基を含む。誘導体は、１つ以上のＮ−アルキルまたはＮ−アリール基が修飾された化合物を包含する。Ｎ−アリールまたはＮ−アルキル基は、（例えば、アルキル−ＣＨ２−をエーテル酸素で置き換えることによって）ヘテロ原子を、または（例えば、アルキル−ＣＨ２−を−ＣＨＣｌ−で置き換えることによって）ハロゲンまたはヒドロキシル基などの置換基を含むように修飾されてよい。
【０１９１】
本明細書において同様に考慮されるのは、環状化合物のプロドラッグである。プロドラッグは、環状化合物を産生するためにインビボで代謝される化合物である。当業者は、プロドラッグの調製に精通しているであろう。
【０１９２】
本明細書において同様に考慮されるのは、ペプチドミメティックである。ペプチドミメティックは、本明細書に定義される化合物と同様のジオメトリーおよび極性を有し、実質的に同様の機能を有する有機化合物である。ミメティックは、１つ以上のペプチドリンクのＮＨ基がＣＨ２基によって置き換えられた化合物であってよい。ミメティックは、１つ以上のアミノ酸残基が、ナフチル基などの、アリール基によって置き換えられた化合物であってもよい。
【０１９３】
一般に、ペプチドミメティックは、アミノ酸残基のうちの１つ以上が、置換されていてもよいナフチル基、置換されていてもよい１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する置換されていてもよい１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、または置換されていてもよいプロピル基によって置き換えられたペプチドの誘導体であると考えられてよい。置換基は、存在するならば、２３個のタンパク質原性アミノ酸のうちのいずれかの側鎖を形成するそれらの基から典型的に選択される。適切には、アミノ酸残基のうちの５０％以下、好ましくは２５％以下がこれらの基によって置き換えられる。
【０１９４】
Ｘ１基のミメティックの例が図１３に示される。
【０１９５】
第２の態様では、本開示は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１の活性を調節することが可能な化合物を提供し、その化合物は、式６による部分を含み、
式６：−Ｐｒｏ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｐｒｏ−Ｘ１６−Ｐｒｏ−
ここでＸ１４およびＸ１６は、側鎖を有するアミノ酸残基、置換基を有するナフチル基、置換基である１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、および置換基を有するプロピル基から各々が独立に選択され、各側鎖または置換基は、酸性官能基を含み、
Ｘ１５は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＭｅＧｌｙ、および（ＣＨ２）３から選択される。
【０１９６】
式６による部分は、アニオン性弾頭部分であり、すなわち、式６の部分は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１の活性を調節してよい。理論に束縛しようとするものではないが、アニオン性弾頭部分は、ＰＡＲＰを開裂するプロテアーゼの競合的阻害薬として作用すると考えられる。驚くべきことに、アニオン性弾頭基が有用な活性を呈することがわかった。
【０１９７】
好ましくは、Ｘ１４、Ｘ１５およびＸ１６は、各々がアミノ酸残基である。この配置では、式６は、配列番号３７を表す。Ｘ１４およびＸ１６は、例えば、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＨｃａから独立に選択されてよい。好ましくは、Ｘ１５がＧｌｙであるときに、Ｘ１４およびＸ１６のうちの１つ以上は、Ｇｌｕではない。
【０１９８】
Ｘ１４およびＸ１６のうちの１つ以上は、スルホン酸基を含んでよい。スルホン酸基を含む化合物が特に効果的であることがわかった。スルホン酸基を含むアミノ酸残基の例は、Ｈｃａである。
【０１９９】
代わりに、スルホン酸基は、ナフチル基、１，２−ジヒドロナフチル基、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、またはプロピル基上に置換基として存在してもよい。
【０２００】
式６の部分が主鎖中に置換基を有するナフチル基、置換基である１，２−ジヒドロナフチル基、置換基を有する１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、および置換基を有するプロピル基のうちの１つ以上を含む配置では、結果として生じた化合物がペプチドミメティックと見做されてよい。
【０２０１】
本化合物は、全部で１６〜１８単位を含む環状化合物であってよく、各単位は、アミノ酸残基、置換されていてもよいナフチル、１，２−ジヒドロナフチルもしくは１，２，３，４−テトラヒドロナフチル基、または置換されていてもよいプロピル基である。好ましくは、化合物中の各々の単位は、アミノ酸残基である。最も好ましくは、本化合物は、式８の化合物であり、
式８：シクロ−［Ｘ１７−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ３］
ここで、Ｘ１７は、式６による部分であり、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、先に定義された通りである。
【０２０２】
同様に提供されるのは、式６の部分を含む環状化合物の塩、誘導体、プロドラッグおよびミメティックである。
【０２０３】
第３の態様では、本開示は、本明細書に定義される化合物を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。当業者は、医薬組成物の製剤に精通しているであろう。いずれかの適切なキャリア、希釈剤または賦形剤が用いられてよい。キャリア、希釈剤および賦形剤の組み合わせが用いられてよい。
【０２０４】
組成物は、いずれかの所望の投与方法のため、例えば、経口投与または非経口投与のために処方されてよい。
【０２０５】
一配置において、組成物は、米国特許出願公開２００３０１６１８８３号において定義されるような送達構成要素である賦形剤を含んでよい。
【０２０６】
任意に、医薬組成物は、さらなる治療薬を含む。好ましくは、さらなる治療薬は、好気的解糖阻害薬である。本開示の組成物の好気的解糖阻害薬との同時投与は、癌の処置に用いられたときに相加または相乗効果をもたらす。好ましい好気的解糖阻害薬は、２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）である。２−デオキシグルコースは、一般に、インビボで良好な忍容性を示す。２−デオキシグルコースを本開示の組成物と組み合わせて投与すると、本開示の化合物の薬用量を削減しうる。
【０２０７】
好ましくは、本開示の化合物および医薬組成物は、医薬品における使用のためである。好ましくは、化合物および組成物は、癌を処置する方法における使用のためであり、その方法は、化合物または組成物を患者に投与するステップを含む。方法は、放射線療法および／または外科手術の使用などの癌の処置のための従来の方法の使用をさらに含んでよい。本発明の化合物および組成物は、他の化学療法薬の使用を含む方法の一部としての投与のために処方されてよい。
【０２０８】
以下にさらに詳細に考察される本開示の化合物の推定作用機序は、これらの化合物が広範囲の癌の処置に有用であろうということを示す。従って、本化合物は、多発癌または転移癌を患う患者の処置に有用でありうることになる。
【０２０９】
本開示の化合物がＰＡＲＰ−１の活性を調節するので、本開示の化合物および組成物は、ＰＡＲＰ−１が非癌細胞と比較して上方制御される癌細胞を含む癌の処置に用いるのに特によく適合する。ＰＡＲＰ−１が上方制御されうる癌は、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌および精巣癌を含む。
【０２１０】
本開示の化合物および組成物は、癌を患う患者の処置に用いられてよく、癌は、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、リンパ腫、肉腫または神経膠腫のうちの１つ以上を含む。好ましくは、癌は、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌および精巣癌から選択される。
【０２１１】
本明細書において同様に提供されるのは、ＰＡＲＰ−１の活性をインビトロで調節するための本明細書に定義される化合物の使用である。使用は、例えば、細胞培養物もしくは組織試料を本明細書に定義されるような化合物と接触させるステップを含んでよい。細胞培養物もしくは組織試料は、不死化ヒト細胞、任意に癌細胞を含んでよい。組織試料は、例えば、癌を患う患者からのバイオプシーであってよい。
【０２１２】
なおさらなる態様では、本発明は、分析方法を提供し、その方法は、細胞を本開示の化合物と接触させるステップおよび化合物を検出するステップを含む。適切には、本化合物は、標識化部分を含む。
【０２１３】
細胞は、添加剤、賦形剤、または同時活性剤と接触してよい。これによって、例えば、細胞による化合物の取り込みに対する添加剤、賦形剤および同時活性剤の効果を調べることができる。
【０２１４】
検出方法は、適宜に選択されてよい。本化合物が標識化部分を含むときに、適切な検出方法は、その部分の性質に依存して選択される。もちろん、方法は、追加の中間ステップを含んでよい。分析方法は、例えば、細胞を調べるために従来のアッセイに用いられるステップを含んでよい。一配置において、方法は、ウエスタンブロット分析を含む。
【０２１５】
化合物を検出するための１つの説明的な方法は、蛍光検出である。この配置において、本化合物は、適切には蛍光性である標識化部分を含む。トリプトファン残基も蛍光が可能である。
【０２１６】
典型的に、分析方法は、インビトロで行われる。試料は、細胞培養物であってよい。試料は、患者から得られたバイオプシーであってもよく、またはかかるバイオプシーに由来してもよい。細胞が患者から得られる配置では、分析は、診断アプリケーションを有してよい。
【０２１７】
理論に束縛されることなく、本開示の化合物の作用様式を説明するために以下の機序が示唆される。
【０２１８】
正常細胞におけるＰＲＧＰＲＰ機能：
Ｃｄｋ４は、そのサイクリンＤパートナーとともに分子過程を惹起し、その分子過程が網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）および関連するｐＲｂファミリーメンバーをリン酸化して（Ｈａｒｂｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９９９）；９８：８５９−８６９）、ＤＮＡ合成のための関連酵素の誘導に関与する、Ｅ２Ｆ−１および関連タンパク質の放出をもたらし（Ｃｌａｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ（２００２）２：９１０−９１７）、それによって細胞分裂を開始させる。しかしながら、Ｅ２Ｆは、細胞増殖を促進するのに加えて、アポトーシスを誘導する可能性がある（Ｎｅｖｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．（２００１）；１０：６９９−７０３）。
【０２１９】
正常二倍体細胞では、Ｃｄｋ４のキナーゼ領域がＲｂタンパク質および関連ファミリーメンバーをリン酸化するときに、Ｃｄｋ４のＰＲＧＰＲＰ領域（配列番号２）がＥ２Ｆ−１によるアポトーシスを防ぐことが提案されている。アポトーシスに対する保護は、ＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）がＰＡＲＰのＤＥＶＤ領域（配列番号１）に結合し、結果として、ＰＡＲＰが開裂されないようにその部位におけるカスパーゼ−３（その他）の結合を妨げることによって達成される。カスパーゼによるＰＡＲＰ−１の開裂は、アポトーシスのホールマークであると考えられる［Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＳＨ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの特異的タンパク質開裂：化学療法誘導アポトーシスの初期マーカー）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３，５３：３９７６−３９８５．Ｔｅｗａｒｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２  ｂｅｔａ，ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ＣＥＤ−３，ｉｓ  ａ  ＣｒｍＡ  ｉｎｈｉｂｉｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２ベータ、ＣＥＤ−３の哺乳類ホモログは、死基質ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼを開裂するＣｒｍＡ阻害可能なプロテアーゼである）．Ｃｅｌｌ  １９９５，８１：８０１−８０９］。従って、ＰＡＲＰ開裂に「歯止めをかける」ことによって、ＣＤＫ４のＰＲＧＰＲＰドメインが過剰なアポトーシスに対して影響を与える。
【０２２０】
正常細胞では、ＤＮＡ損傷がほとんどもしくは全くなく、従って、最小限のポリ（ＡＤＰ−リボシル化）しかないことになり、ＰＲＧＰＲＰで保護された非開裂ＰＡＲＰがＮＡＤ＋を枯渇させず、ＮＡＤ＋は、十分に高いレベルのままであろう。
【０２２１】
初期多段階発癌におけるＰＲＧＰＲＰ機能：
Ｃｄｋ４は、Ｃｄｋ２またはＣｄｋ６とは対照的に、その機能的な存在が腫瘍形成の成功にとって必須である唯一のサイクリン依存性キナーゼであるように見えることをいくつかの報告が示す（非特許文献３７）。
【０２２２】
要約すると、マウスにおけるＣｄｋ４遺伝子ノックアウトは、Ｃｄｋ２およびＣｄｋ６の継続的な存在にも係わらず、化学的に誘導された表皮発癌を完全に抑止し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｕｅｂｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００２；Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（２００２）；１６１：４０５−４１１）、正常皮膚角化細胞の増殖には影響がない。加えて、ＣＤＫ２（Ｍａｃｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００７，６７：９７１３−９７２０）ではなく、ＣＤＫ４（Ｍｉｌｉａｎｉ  ｄｅ  Ｍａｒｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００４）；２４：７５３８−７５４７）のアブレーションがｍｙｃを介した口腔腫瘍発生を阻害する。そのうえ、サイクリンＤ１ではなく、Ｃｄｋ４の過剰発現がマウス皮膚発癌を促進し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｕｅｂｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ１９９９，１０：４６７−４７２）、一方で高められたＣｄｋ２活性は、角化細胞増殖を誘導するにも係わらず、腫瘍原性ではない（Ｍａｃｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０２２３】
多段階発癌は、細胞増殖および細胞生存の両方の調節解除の結果として生じる（Ｅｖａｎ  ａｎｄ  Ｖｏｕｓｄｅｎ  ２００１；Ｎａｔｕｒｅ（２００１）；４１１：３４２−３４８）。細胞分裂を促進する遺伝子では活性化変異が生じ、癌抑制遺伝子では不活性化変異が生じる。しかしながら、Ｅ２Ｆ因子の調節解除につながる経路を活性化して細胞増殖の増加を促進できる変異は、アポトーシスも促進できる（Ｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）；９１：１０９１８−１０９２２，Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（１９９４）；１４：８１６６−８１７３）。発癌が首尾よく進行するためには、細胞が増殖を最大にして、一方ではアポトーシスを回避することが可能でなければならない（Ｌｏｗｅ  ａｎｄ  Ｌｉｎ  ２０００；Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２０００）；２１：４８５−４９５）。
【０２２４】
上記の知見に関する説明は、発癌中には細胞増殖だけでなくアポトーシスの尤度も増加するということであろう。ＤＥＶＤに結合して、ＰＡＲＰ開裂を防止することによって、ＰＲＧＰＲＰモチーフは、アポトーシスを阻害して、腫瘍の形成を可能にする。ＰＲＧＰＲＰの不在下ではアポトーシスが増加して、腫瘍形成を防止するであろう。発癌の初期には、ＤＮＡ損傷が最小限であり、細胞分裂が無制限ではなく、細胞が好気的解糖下で作動してはおらず、従って、ＰＡＲＰ開裂を防止することがネクローシスを生じさせるとは思われないであろう。
【０２２５】
Ｃｄｋ４の存在が発癌の成功に必須であるように見えるという所見は、それゆえに、Ｃｄｋ４のキナーゼ活性への言及によってではなく、むしろＰＲＧＰＲＰモチーフを含んだ外在化ループの活性によって説明することができ、ＰＲＧＰＲＰモチーフは、ＰＡＲＰのＤＥＶＤ領域に結合し、アポトーシスを最少限に抑えて、細胞増殖の増加を進行させる。
【０２２６】
Ｃｄｋ４およびそのＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）部位の不在下では、発癌過程が細胞不死化ではなく、むしろアポトーシスに終わると思われる。
【０２２７】
十分に発達した癌細胞におけるＣＤＫ４のＰＲＧＰＲＰ領域の効果：
樹立癌細胞のＤＮＡは、大量に損傷を受けていることが過去１０年にわたって次第に明らかになった（Ｗａｒｅｎｉｕｓ；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００２）；２２：２６５１−２６５６）。この高レベルのＤＮＡ損傷は、初期発癌の特徴ではないが、広範囲の臨床癌にわたって観察された（非特許文献２，Ｇｒｅｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，非特許文献４、５）。ＨｉｌＲｏｓ研究に用いられた細胞株は、同様の進行癌に由来し、従って、やはり同様の大量のＤＮＡ損傷を示すであろう。
【０２２８】
著しいＤＮＡ損傷は、ＰＡＲＰを刺激して、複数の部位でポリ（ＡＤＰ−リボシル化）を実行し、利用可能なＮＡＤ＋を使い果たすことが予想されるであろう。ＰＡＲＰ−１の上方制御は、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌および精巣癌（ｔｅｓｔｉｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ）を含む多くの腫瘍タイプで記載された（非特許文献２７）。細胞もアポトーシス経路を活性化することによってＤＮＡ損傷に反応し、この経路は、ＤＥＶＤ部位におけるＰＡＲＰのカスパーゼ開裂を伴い、結果として、ポリ（ＡＤＰ−リボシル化）を不活性化して、十分なＮＡＤ＋がアポトーシスに必要なＡＴＰを発生させることを許容する。かかる進行癌細胞の生存は、従って、アポトーシス死またはネクローシス死への傾向の間のバランスに依存する。
【０２２９】
加えて、癌細胞の無制限の分裂は、正常細胞とは対照的に、新しい細胞巨大分子の合成および有糸分裂の達成のためにエネルギーの増加を必要とする。
【０２３０】
最後に、癌細胞におけるワールブルグ効果は、それらの細胞がミトコンドリアＡＴＰ発生より好気的解糖にはるかに大きく依存するようにする（２００倍にも増加することがある）。
【０２３１】
ＰＡＲＰ開裂を阻害することによって、本開示の化合物は、細胞エネルギー供給にストレスを及ぼす。しかしながら、ＰＡＲＰ作動薬（およびカスパーゼ阻害薬）は、本化合物で見られる癌細胞ネクローシスを生じさせない。ネクローシスが生じるためには、さらなるストレスが必要である。従って、本開示のペプチドは、癌細胞に特有の好気的解糖に関与する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ：ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）などのＰＡＲＰに対する追加の標的を有すると思われる。
【０２３２】
癌細胞では、好気的解糖への切り換えにより、そのエネルギー系がＬＤＨの作用で産生されるＮＡＤの供給に非常によく依存するようになる［図１８を参照］。この状況では、癌細胞は、ポリＡＤＰ−リボシル化に用いられることになるＮＡＤに対する上方制御された活性なＰＡＲＰの競合的な要求に極めて敏感になるであろう。その作用がＨＩＬＲ環状ペプチドに関して本明細書に記載されるものと同様の化合物は、ＬＤＨを阻害し、ＮＡＤの利用能を低下させると同時にＰＡＲＰを刺激して、そのＮＡＤ利用を増加させ、結果として、グルコース−６リン酸からピルビン酸への解糖エムデン・マイヤーホフ経路のためのＮＡＤを不足させることにより癌細胞に対して選択的に毒性になると思われる。
【０２３３】
理論によって束縛されることなく示唆されるのは、本開示のペプチドが癌細胞の全般的な弱点のうちの２つ、すなわち、大量のＤＮＡ損傷を修復する必要性と好気的解糖への切り換えとを攻撃することにより癌細胞を死滅させうるということである。
【実施例】
【０２３４】
次に、以下の説明的な実施例を参照して本発明をさらに詳細に記載する。
【０２３５】
実施例１：比活性の改善
３つの環状ペプチド（ＨＩＬＲ−００１（配列番号１３）、ＨＩＬＲ−０２５（配列番号１５）およびＨＩＬＲ−０３０（配列番号１６））を従来の自動ペプチド合成技術を用いてに純度＞９５％に調製した。ＨＩＬＲ−００１（配列番号１３）は、非特許文献３７に従って産生した比較化合物である。ＨＩＬＲ−０２５（配列番号１５）およびＨＩＬＲ−０３０（配列番号１６）は、（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）または（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｐａ−Ｇｐａ）リピートを含む環状化合物である。化合物の活性を以下のように試験した。
１）１０％ＦＢＳを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地においてＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を増殖させた。
２）細胞を収集して、９６ウェルプレート中に５００細胞／ウェルで播種した。
３）化合物を原液から調製し、２００μＭから始めて２倍希釈で直接に細胞へ添加した。最終ＤＭＳＯ濃度は０．２％であった。
４）細胞を化合物とともに３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で９６時間増殖させた。
５）レサズリン色素組成物（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））１０％（ｖ／ｖ）を次に添加して、さらに４時間インキュベートし、ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて蛍光産物を検出した。
６）培地のみのバックグラウンド読取値を差し引いた後にＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおける４パラメータロジスティック方程式を用いてデータを分析した。結果を図１１に示す。ＨＩＬＲ−３０のＩＣ５０を６μＭと決定した。
【０２３６】
図３に示すように、新しい「骨格」配列ＷＷＲＲＷＷＲＲＷＷ（配列番号１７）をＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）とともに環状ＨＩＬＲ−０２５に挿入すると、ＴＨＲ５４（ＨＩＬＲ−００１）と比較して比活性が増加し、ＩＣ５０用量が９８μＭから１５μＭに低下した。アルギニンをグアニジノ−フェニルアラニンへ置換することによって「骨格」をより親油性にするさらなる修飾がＨＩＬＲ−０３０を生じさせて、比活性をさらに改善し、６．０μＭのＩＣ５０を示した。
【０２３７】
アルギニンおよびトリプトファンからなるオリゴマーの直線配列は、好結果の細胞内取り込み特性を有することがこれまでに記載された。すなわち、ＲＲＷＲＲＷＷＲＲＷＷＲＲＷＲＲ（配列番号３８）［Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９８）８：８４−８７］。パッセンジャーペプチドの細胞内取り込みを強化する手段としての環状アルギニン／トリプトファンペプチドも記載された［Ｃｙｃ−（ＷＲＷＲＷＲＷＲ）（配列番号３９）Ｓｈｉｒａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（２０１３）１０：２００８−２０２０］。
【０２３８】
しかしながら、細胞内取り込みを改善するためにアルギニンおよびトリプトファンのどの配列が最も効果的であろうかが文献からは明らかでなかった。単量体または二量体トリプトファンと交互するアルギニン二量体は、Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（上記）によりリニア細胞内在化ペプチドで記載されたが、Ｓｈｅｒａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．により記載された環状（ＷＲ）４ペプチドは、単一のアルギニンとトリプトファンとを交互させた。「骨格」中に（ＷＷＲＲ）Ｘ配列をもつ環状ペプチドがＡＬＫＬ配列をもつ環状ペプチドより活性なはずであるという先験的または明白な実験上の理由はなかった。
【０２３９】
そのうえ、図１３に示すように、カスパーゼ−１のＤＥＶＤ領域へのＰＲＧＰＲＰ「弾頭」（配列番号２）の結合は、アルギニン残基の位置に依存する。当初は、骨格中のアルギニン残基の存在がその生物学的標的へのＰＲＧＰＲＰ弾頭（配列番号２）の結合を完成させるか、またはそれを妨害するであろうと考えられた。驚くべきことに、これは、当て嵌まらなかった。
【０２４０】
実施例２：ＰＡＲＰに依存する細胞毒性
本発明者は、ＰＲＧＰＲＰ環状ペプチドによるＰＡＲＰ活性の調節が、少なくとも部分的に、ヒト非小細胞肺癌におけるＡＴＰの低下およびそれに続くネクローシスの原因であろうと仮定した。ＨＩＬＲａ環状ペプチドは、従って、ＰＡＲＰに依存するであろう。そうであれば、これは、オラパリブなどのＰＡＲＰ阻害薬によって逆転するはずであると想定した。
【０２４１】
この状況では、オラパリブは、ＨＩＬＲａ環状ペプチドによって誘導される細胞死を減少させる／防止することになろう。
【０２４２】
従って、ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞のＡＴＰレベルおよび細胞死に対する効果を調べるために研究を実施し、この細胞を単独で、またはオラパリブと共インキュベートしてＨＩＬＲ−００１［ｃｙｃ−（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ］（配列番号１３）（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランス，ＳＡＳ，７  Ｒｕｅ  ｄｅ  Ｂｏｕｌｏｇｎｅ，６７１００，ストラスブール，フランス）］へそれぞれ７２時間および９６時間暴露した。
【０２４３】
インビトロＰＡＲＰ検量線を最初に作成した［図５］。
【０２４４】
プロトコル：
１）１０％ＦＢＳを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地においてＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を増殖させた。
２）細胞を収集して、１０ｃｍディッシュ中にディッシュ当たり１×１０６細胞で播種した。
３）オラパリブを原液から調製し、グラフ上に示された最終濃度を与えるように直接に細胞へ添加した。ＤＭＳＯ含有量を濃度０．１％で一定に維持した。
４）細胞をオラパリブまたは溶媒対照群とともに３７℃、５％ＣＯ２で４時間、２４時間、４８時間または９６時間インキュベートした。
５）細胞を異なる時点で収集して、時間経過が完了するまで細胞ペレットを−８０℃で保存した。
６）細胞ペレットを解凍し、５０μｌのＰＡＲＰ溶解緩衝剤に溶解させた。
７）試料中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量化した。
８）次に、Ｔｒｅｖｉｇｅｎからのヒストン・コート・ストリップウェルをもつ汎用化学発光ＰＡＲＰアッセイキット（Ｃａｔ＃４６７６−０９６−Ｋ）を用いて、４０μｇの試料を細胞および組織抽出物におけるＰＡＲＰ活性に関する製造業者の使用説明書に従って２通りアッセイした。
９）上述のキットを用いて、オラパリブの４つの試験濃度および３−アミノベンズアミドの２つの濃度をＰＡＲＰ阻害薬アッセイ・プロトコルに関する製造業者の使用説明書に従ってインビトロアッセイで２通りアッセイした。
１０）ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて発光産物を検出した。
【０２４５】
９０％超のＰＡＲＰ阻害をもたらすために必要とされるオラパリブの最低濃度を３−アミノベンズアミドと比較して［図６］、オラパリブによるＰＡＲＰ阻害の時間経過をプロットした［図７］。
【０２４６】
次に、ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト非小細胞癌に対するオラパリブ自体のインビトロ細胞毒性を試験した［図８］。
【０２４７】
プロトコル：
１）１０％ＦＢＳを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地においてＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を増殖させた。
２）細胞を収集して、９６ウェルプレート中に５００細胞／ウェルで播種した。
３）オラパリブを原液から調製し、３０μＭから始めて片対数希釈で直接に細胞へ添加した。最終ＤＭＳＯ濃度は、０．３％であった。
４）細胞を化合物とともに３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で９６時間増殖させた。
５）ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）１０％（ｖ／ｖ）を次に添加して、さらに４時間インキュベートし、ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて蛍光産物を検出した。
６）ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおける４パラメータロジスティック方程式を用いてデータを分析した。
【０２４８】
３０ｎＭのオラパリブ用量は、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に無毒であり、細胞ＰＡＲＰ活性の８０％超の阻害を示すことがわかった。ＨＩＬＲ−００１アッセイとの９６時間の共インキュベーションのためにこのオラパリブ用量を選んだ。
【０２４９】
オラパリブの４つの濃度を試験して、細胞ＰＡＲＰ活性の用量に依存する減少をすべての時点で観測した。精製したＰＡＲＰ酵素を用いて、オラパリブの４つの試験濃度および対照化合物３−アミノベンズアミドの２つの濃度をインビトロアッセイで試験した。正の対照として機能するようにこのアッセイを細胞ＰＡＲＰアッセイと並行して実行した。
【０２５０】
ＨＩＬＲ−０３０を介したＮＣＩ−Ｈ４６０におけるＡＴＰ枯渇およびネクローシスに対するオラパリブの効果：
３０ｎＭのオラパリブの存在または非存在下でＨＩＬＲ−００１の４つの濃度を試験した；
各時点で２つのアッセイ読み取りａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）およびＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏによって細胞生存率を測定した。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）から蛍光産物への変換は、細胞の代謝活性の読取値としての役割を果たし、一方でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏは、存在するＡＴＰの定量化に基づく。
【０２５１】
プロトコル：
１）１０％ＦＢＳを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地においてＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を増殖させた。
２）細胞を収集して、９６ウェルプレート中に５００細胞／ウェルで播種した。
３）ＨＩＬＲ−００１を１０ｍＭの原液から調製し、２００μＭから始めて２倍希釈で直接に細胞へ添加した。オラパリブを１０ｍＭの原液から調製し、３０ｎＭで直接に細胞へ添加した。全最終ＤＭＳＯ濃度は、０．２５％であった。
４）細胞を化合物とともに３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で２４、４８、７２または９６時間増殖させた。
５）ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）１０％（ｖ／ｖ）を次に添加して、さらに４時間インキュベートし、ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて蛍光産物を検出した。
６）２通りのプレート上で細胞から培地を除去し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏをＰＢＳで希釈して（１：１０）、１００μｌを細胞に添加した。
７）プレートをオービタルシェーカー上で２分間混合して、さらに室温で１０分間インキュベートした。次に、ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて発光シグナルを測定した。
【０２５２】
ＨＩＬＲ−００１を単一の薬剤として試験したときに、代謝活性（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））の用量依存的減少を観測した。これは、遅い方の時点で特に明らかであり、先に発表された結果（非特許文献３７）と一貫性があった。
【０２５３】
３０ｎＭのオラパリブは、ＡＴＰレベル（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｇｌｏ）を部分的に回復させ、５０μＭのＨＩＬＲ−００１を介した細胞死（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））を逆転させて［図９］、その活性がこの用量レベルではＰＡＲＰに依存することを実証した。高い方のＨＩＬＲ−００１用量（１００μＭおよび２００μＭ）では、オラパリブがＡＴＰレベルまたは癌細胞死に影響を及ぼさず、ＨＩＬＲ−００１の殺癌作用は、ＰＡＲＰ機能に対するその効果を伴う機序によってのみ部分的に説明されると思われることを示した。
【０２５４】
上記の実験は、ＰＲＧＰＲＰペプチドが癌細胞ネクローシスを生じさせる機序においてＰＡＲＰ活性が重要な役割を果たし、特異的なＰＡＲＰ阻害薬によってこの活性を部分的に逆転できるという驚くべき知見を実証する。ＰＲＧＰＲＰペプチドのＰＡＲＰとの相互作用は、従って、癌細胞ネクローシスにとって十分ではないが必要な要件である。
【０２５５】
実施例３：ＤＥＶＤの競合阻害
ＰＡＲＰ活性は、ＤＥＶＤ部位に開裂があったか否かによって制御される。開裂されたＰＡＲＰは、そのポリ（ＡＤＰ−リボース）リン酸化活性に関して不活性化される。オラパリブなどのポリ（ＡＤＰ−リボース）リン酸化阻害薬は、開裂されたＰＡＲＰに対して何も効果を有さないと予想されよう。したがって、ＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）は、インタクトＤＥＶＤ領域を有するであろうインタクトＰＡＲＰに作用すると思われる。そのうえ、ＨＩＬＲ−００１の活性は、ＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）がＰＡＲＰのＤＥＶＤ領域に結合し、結果として、カスパーゼ結合およびタンパク質開裂からこの領域を保護することによって説明されうることが提案されている。
【０２５６】
ペプチド内の領域の２次および３次構造の配向性全般を考慮することなく、注目されるのは、ＰＡＲＰのＧＤＥＶＤＧ領域（配列番号１）におけるアスパラギン酸アニオンのリニア配置がカチオン性アルギニンとかなり近接して整列し［図１３］、これらのアルギニンがＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）の制癌効果の鍵となることが示されたことである（非特許文献３７）。
【０２５７】
ＤＥＶＤがＰＲＧＰＲＰ（配列番号２）の下流標的である場合には、ＰＡＲＰ開裂をＤＥＶＤ部位において保護しうる、ＰＲＧＰＲＰと無関係な分子もＮＣＩ−Ｈ４６０細胞毒性に寄与するであろう。
【０２５８】
ＧＤＥＶＤＧ（配列番号１）との相同性によって、カスパーゼおよび関連分子に競合的に結合しうる環状ペプチドを設計し、これらのペプチドがＤＥＶＤ部位［Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ２１４−Ｇｌｙ２１５］（配列番号１）においてＰＡＲＰを開裂した。開裂は、Ａｓｐ２１４およびＧｌｙ２１５アミノ酸の間で発生して、２つのフラグメント、８９および２４ｋＤａのポリペプチドを生じさせる。
【０２５９】
開裂部位にメチルアミド結合をもつＧＤＥＶＤＧヘキサペプチドＨＩＬＲ−Ｄ−０１（Ｃｙｃ−［Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＭｅＡｓｐ−Ｓａｒｃ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］（配列番号４０）をこのように構築して、これを、ＰＲＧＰＲＰ（配列番号１）の代わりに、ＰＲＧＰＲＰ比活性を高めることを先に見出した（実施例１）改善されたカセット中に挿入した。
【０２６０】
ＨＩＬＲ−Ｄ−０１は、弱いが有意な用量関連の細胞死滅を示し、ＰＡＲＰ開裂を阻止することが癌細胞ネクローシスの誘導に寄与できることを実証した［図１３］。
【０２６１】
実施例４：カスパーゼ阻害
ＨＩＬＲペプチドのＰＡＲＰ依存性は、ＰＡＲＰ活性がＰＡＲＰ開裂の阻害によって維持されたためかどうかをさらに試験するために、ＰｒｏｍｅｇａからのＡｐｏ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７試薬を用いてある範囲のＨＩＬＲ−０３０用量の存在下でアッセイを行った。正の対照としてＤＥＶＤーＣＨＯを用いた。
【０２６２】
Ｐｒｏｍｅｇａキットは、カスパーゼ３／７酵素活性を支える緩衝剤、およびカスパーゼ−３／７基質ローダミン１１０、ビス−（Ｎ−ＣＢＺＬ−アスパルチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−バリル−Ｌ−アスパラギン酸アミド；Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）からなる。Ｚ−ＤＥＶＤ−Ｒ１１０は、アッセイ前にプロ蛍光基質として存在し、カスパーゼ−３／７活性によるＤＥＶＤペプチドの逐次的な開裂および除去ならびに４９９ｎｍにおける励起の際に、ローダミン１１０脱離基が蛍光性になる。発生する蛍光性生成物の量は、試料中で生じるカスパーゼ−３／７開裂の量に比例すると報告されている。（試薬の供給源は、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔ  Ｎｏ：ＢＭＬ−ＳＥ１６９−５０００）；Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ  Ｎｏ：Ｇ７７９０）；対照化合物Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ  Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  Ｎｏ：Ａ０８３５であった）。
【０２６３】
３８４ウェルプレート・フォーマットを用いると、用いたすべてのプレートリーダー利得設定において酵素反応を検出可能であり、１０Ｕの酵素が反応中に存在するときには、１０００の利得設定で最大検出可能シグナルを超過した。用いた最高利得設定では、０．０１〜１０単位のカスパーゼ−３を反応に用いたときに、蛍光シグナルにおける経時的な増加が観測可能であった。この範囲内で、反応の初速度が反応中に存在する酵素の総量に正比例した。０．３Ｕ、０．１Ｕおよび０．０３Ｕの酵素をプレートリーダー利得設定１０００を用いて次の最適化フェーズへ進めた。
【０２６４】
最適な組み換えヒトカスパーゼ３酵素活性を滴定によって決定し、０．０３〜０．３０単位の酵素用量の間で初期組み換え酵素カイネティクスの直線性を実証した。この範囲内で、反応の初速度が反応中に存在する酵素の総量に正比例した。ＤＭＳＯ耐性アッセイも実施し、最終アッセイにおける１％超のＤＭＳＯ濃度が反応の初速度を減少させるように見えるが、しかし、速度は、５０分にわたって直線的なままであることを実証した。
【０２６５】
これらのパラメータ内で、蛍光シグナルにおける増加は、およそ５０分にわたって直線的なままであり、強い相関係数を用いて初速度を計算することを許容し、一方で用いた酵素量は、経済的なままであった。
【０２６６】
Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、カスパーゼ−３の活性を用量依存的に阻害し、阻害薬の仕様書に従って予想される範囲内のＩＣ５０をもたらした［図１０］。０．１または０．３Ｕのいずれの酵素に対してアッセイしたときにも同様の阻害薬ＩＣ５０を達成した。すべての後続の実験では、０．１Ｕの酵素を用いて、２時間にわたって５分ごとに読み取るようにプレートリーダー設定を調整した。
【０２６７】
ＤＥＶＤ−ＣＨＯ対照またはＨＩＬＲ−０３０を基質またはヒト組み換えカスパーゼ−３とともに以下の表中のプロトコルに従って２時間共インキュベートした。
【０２６８】
【表１】
2019512462.tif 000007
【０２６９】
ＤＥＶＤ−ＣＨＯもＨＩＬＲ−０３０もカスパーゼ−３活性を用量依存的に阻害した［図１１、１２］。
【０２７０】
実施例５：アニオン性／カチオン性「弾頭」
ＨＩＬＲ−Ｄ−０２（Ｃｙｃ−［Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ］）（配列番号１９）をＨＩＬＲ−０２５のための負の対照として設計し、ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト非小細胞癌細胞に対してインビトロで試験した。
【０２７１】
驚くべきことに、ＨＩＬＲ−Ｄ−０２は、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に対して細胞毒性であり、ＩＣ５０が３８μＭであった。［図４Ａ］。アニオン基をアルギニンの高荷電カチオン性グアニジウム基へ置換することも、一般に、殺癌性分子をもたらしうることを確認するために、ＨＩＬＲ−０２５のアルギニンをホモシステイン酸残基で置き換えることによって、グアニジウム基の代わりにスルホン酸基をもつさらなるＨＩＬＲ−０２５環状ペプチド・カチオン性類似体を合成した。この環状ペプチドＨＩＬＲ−Ｄ−０６は、ＨＩＬＲ−Ｄ−０２よりさらに効果的にＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を死滅させて、ＩＣ５０が２５μＭであった［図４Ｂ］。従って、事実であると思われるのは、本明細書に記載される環状ペプチド内の同じ部位におけるアニオンおよびカチオン基の両方が癌細胞の死滅をインビトロで生じさせうるということである。
【０２７２】
アニオン性ヘキサペプチドＰＥＧＰＥＰ（配列番号４）は不活性であると以前に報告されたので［非特許文献３７］、この結果は驚くべきである。これまでの試験ではアニオン性ヘキサペプチドと癌細胞の接触時間が十分でなく、用いたＰＥＧＰＥＰ（配列番号４）の濃度が十分でなかったために、活性アニオン基の活性が観測されなかったと考えられる。しばしば、短いリニアペプチドを利用するときには高薬用量が必要である。本開示の環状ペプチドに含まれるカセット配列は、細胞への活性部分の送達を強化して、より低い薬用量の使用を許容すると考えられる。
【０２７３】
理論によって束縛されることなく、提案されるのは、これらの環状ペプチドがそれらの推定標的（単数または複数）へ静電気結合することによって相互作用し、競合阻害または「デコイ」機序の両方で作用できるということであり、延いては、アニオン性およびカチオン性「弾頭」の両方の同様の効果を説明する。
【０２７４】
ＨＩＬＲ環状ペプチドは、ＰＡＲＰのＤＥＶＤ領域と相互作用し、それを開裂から保護して、ＰＡＲＰ活性を保存すると思われる。これは、これらの薬剤の癌細胞ネクローシス活性に必要ではあるが、それらの完全な作用機序を説明するには十分ではない。これらのＨＩＬＲペプチドが部分的なＰＡＲＰ作動薬であるという提案は、他のＰＡＲＰ作動薬に関するこれまで報告されているものと一貫性がある（上記を参照）。従って、ＨＩＬＲ環状ペプチドは、ａ）ＰＡＲＰに対する、およびｂ）細胞ＡＴＰレベルの非ＰＡＲＰエフェクターに対する潜在的な二重活性を有するように見えるであろう。理論によって拘束されることなく、この追加のＰＡＲＰ活性のための２つの可能な候補を、活性酵素部位内にアセチルＣｏＡを結合するためにアルギニンが重要な役割を果たす酵素乳酸デヒドロゲナーゼ、およびヘキソキナーゼ２とすることができるであろう。
【０２７５】
実施例６：２−デオキシグルコースと組み合わせた本発明の化合物の効果
本発明による化合物は、ＮＡＤ／ＡＴＰ枯渇の結果としてネクローシスによる細胞死を生じさせるように見えたので、本化合物を解糖阻害薬とともに投与することによってそれらの活性を増強できるであろうと仮定した。それゆえに、解糖阻害薬２−デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）の存在および非存在下においてＨＩＬＲ−０２５（配列番号１５）およびＨＩＬＲ−Ｄ−０７ナトリウム塩（配列番号３０）の細胞死滅能力をアッセイした。
【０２７６】
ＨＩＬＲ−０２５（配列番号１５）は、カチオン性ＰＲＧＰＲＧＰ（配列番号２）弾頭を含み、一方でＨＩＬＲ−Ｄ−０７（配列番号３０）は、アニオン性弾頭を有する。
【０２７７】
ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌細胞を単体で、または３．１２５ミリモルの２−ＤＯＧと組み合わせてＨＩＬＲ−０２５またはＨＩＬＲ−Ｄ−０７と接触させて、細胞生存をＡｌａｍａＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて製造者の使用説明書に従って決定した。これらの試験の結果を図１５に示す。
【０２７８】
ＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−Ｄ０７の両方の細胞死滅能力が２−ＤＯＧとの同時投与によって強化されることがわかった。２−ＤＯＧは、インビボで忍容性が良好であり、本明細書に開示される環状ペプチドの活性を強化するためにこれを用いることができるであろう。ＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−Ｄ−０７について得た同様の結果は、これらのペプチドが関連する作用機序を有することを示唆する。
【０２７９】
アニオン性弾頭の作用機序をさらに調べるために、ＮＣＩ  Ｈ４６０ヒト非小細胞肺癌の培養物をＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−Ｄ−０７に曝露し、光学顕微鏡法を用いて観察した。負の対照を提供するために比較細胞培養物をＤＭＳＯで処置した。細胞培養物の光学顕微鏡写真を図１６に示す。
【０２８０】
本開示による環状化合物に曝露した細胞培養物では著しいモフォロジー変化を観察した。ＴＨＲ５３によって生じたことが非特許文献３７に報告されたものに相当するリング状モフォロジーを観察した。これは、ＴＨＲ５３、ＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−Ｄ−０７が関連する作用機序を有しうることを示唆する。
【０２８１】
実施例７：乳酸デヒドロゲナーゼＡ［ＬＤＨＡ］の活性に対するＴＨＲ環状ペプチドＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−０３０の効果。
ＬＤＨＡは、１分子のＮＡＤの産生を伴ってピルビン酸を乳酸に変換する（図１８参照）。このＮＡＤは、ＡＴＰの産生が存在するグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ・ステップにおいてエムデン・マイヤーホフ経路に再び入る。ＮＡＤがなければ、嫌気的解糖経路にこのステップが生じることはできず、主にこの経路に依存する癌細胞は、エネルギーが豊富なＡＴＰ分子を奪われる。このような理由で、ＬＤＨ活性の可能な阻害薬として２つの環状ペプチドＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−０３０を調べた。
【０２８２】
２つの試験化合物（ＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−０３０）を用いて２４時間または９６時間処置したＮＣＩ−Ｈ４６０細胞由来の試料に対してＬＤＨ活性アッセイを行った。高い方の濃度の試験化合物において特に遅い方の時点で有意な細胞死を観察した。それゆえに、各ＬＤＨアッセイ・ライセート中に存在するタンパク質の総量を推定するためにＢＣＡアッセイを行い、酵素活性データを規格化するためにこれを用いた。追加の基準点として役立たせるために、細胞生存率の指標としてＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅアッセイも実施した。
【０２８３】
以下のプロトコルを用いた。
１）１０％ＦＢＳを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地においてＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を増殖させた。
２）細胞を収集して、９６ウェルプレート中に５００細胞／ウェル（９６ｈ時点について）または２４ｈ時点について５０００細胞／ウェルで播種した。
３）Ｈｉｌｒｏｓ化合物をＤＭＳＯ原液から調製し、４０、２０、１０、５、および２．５μＭの濃度で直接に細胞へ添加した。
４）平行プレートをセットアップした：
・ＬＤＨアッセイのためにアッセイ濃度当たり１０個のレプリケートウェルを用いた。
・Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイのためにトリプリケートウェルを用いた
・すべてのウェル中の最終ＤＭＳＯ濃度は、０．２％であった。
５）細胞を化合物とともに３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で２４または９６時間増殖させた。
６）アッセイ（２４または９６ｈ）の最後に、Ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ１０％（ｖ／ｖ）をプレートの１セットに添加して、さらに４時間インキュベートし、ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを用いて蛍光産物を検出した。
７）ＬＤＨアッセイのために、細胞をトリプシン処理によって各ウェルから収集して、複製ウェルからの細胞をプールし、次に遠心分離によってペレット化した。
８）細胞ペレットを氷冷ＰＢＳでリンスして、（キット中に提供された）１５０μｌのＬＤＨアッセイ緩衝剤中に再懸濁し、細胞溶解を促進するために液体窒素中で瞬間凍結した。
９）試料を急速解凍して、細胞ライセートを４℃で１０分間、１０，０００×ｇの遠心分離によって透明化した。
１０）透明化したライセートのＬＤＨ活性をＬＤＨ活性キット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０２５２６）を用いて測定した。
１１）ＬＤＨ活性アッセイ反応の調製後に、製造業者の使用説明書に従って、（Ａ４５０）ｉｎｉｔｉａｌを決定するために初期時間に４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
１２）さらなる吸光度読取値を３分間隔で１５分まで取得した。
１３）最も活性な試料が検量線の直線範囲を超えたときの最後から２番目の時点の読取値から酵素活性を計算するための最終測定値［（Ａ４５０）ｆｉｎａｌ］を取得した。
１４）ＴｉｎｉｔｉａｌからＴｆｉｎａｌまでの測定値における変化を試料ごとに計算した：ｌ１Ａ４５０＝（Ａ４５０）ｆｉｎａｌ−（Ａ４５０）ｉｎｉｔｉａｌ
１５）ＴｉｎｉｔｉａｌとＴｆｉｎａｌとの間にキナーゼアッセイによって発生したＮＡＤＨ量（Ｂ）を決定するために、ＮＡＤＨ検量線を用いてｌ１Ａ４５０を試料ごとに内挿した。
１６）各試料のＬＤＨ活性を以下の式によって決定した。
ＬＤＨ活性＝（Ｂ×試料希釈係数）／{（反応時間）×Ｖ}
Ｂ＝ＴｉｎｉｔｉａｌとＴｆｉｎａｌとの間に発生したＮＡＤＨの量（ｎモル）
反応時間＝Ｔｆｉｎａｌ−Ｔｉｎｉｔｉａｌ（分）
Ｖ=ウェルに添加した試料体積（ｍＬ）  
ａ．ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、残った透明化ライセート中のタンパク質含有量を決定した。
ｂ．ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータを分析した。
【０２８４】
上記のアッセイの結果を図１７に示す。データは、ＨＩＬＲ−０２５およびＨＩＬＲ−０３０がＬＤＨの活性を阻害するのに効果的であり、ＨＩＬＲ−０２５が１６μＭのＩＣ５０を有し、ＨＩＬＲ−０３０が２２μＭのＩＣ５０を有することを示す。これは、本発明の環状ペプチドが癌細胞の嫌気的解糖経路を追加的に標的とすることを示唆する。
【０２８５】
ＬＤＨ活性を典型的にミリ単位／ｍｌで表す。３７℃で毎分１．０μモルのＮＡＤＨを発生させるために乳酸のピルビン酸への変換を触媒する酵素の量としてＬＤＨ活性の１単位を定義し、それゆえに１ｍＵ／ｍｌ＝１ｎモル／分／ｍｌである。この試験からのＬＤＨ活性データをｍＵ／ｍｌフォーマットで提示して、さらに各ライセートの総タンパク質濃度に対して規格化する（ｍＵ／ｍｇ）。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを用いて細胞生存率を並行してモニターした。
【図１】
2019512462.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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