(57)【要約】  関心のある発現産物を発現させる方法が提供される。したがって、関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドと細胞を接触させることを含み、このＡｉｍＰペプチドがＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である、方法が提供される。製品、単離ペプチド、ポリヌクレオチドおよび核酸コンストラクトもまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心のある発現産物を発現させる方法であって、
（ｉ）前記関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここで前記ＡｉｍＲが、前記ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含むこと；および
（ｉｉ）ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドと前記細胞を接触させ、ここで前記ＡｉｍＰペプチドが前記ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、前記ＡｉｍＲ応答配列から前記ＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能であること、
を含み、
それにより前記関心のある発現産物を発現させる、方法。
【請求項２】
関心のある発現産物を発現させる方法であって、前記関心のある発現産物をコードする異種核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、前記ＡｉｍＲが、前記ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み、それにより前記関心のある発現産物を発現させる、方法。
【請求項３】
関心のある発現産物を発現させる方法であって、前記関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み；核酸コンストラクトが、ＡｉｍＲポリヌクレオチドおよび前記ＡｉｍＲポリヌクレオチドの発現を指示するための前記ＡｉｍＲにとって異種のシス作用性制御エレメントを含み、
前記ＡｉｍＲが、前記ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み、それにより前記関心のある発現産物を発現させる、方法。
【請求項４】
前記ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む、請求項１〜２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＡｉｍＰペプチドまたはこれをコードする核酸配列と前記細胞を接触させることを含み、前記ＡｉｍＰペプチドが、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含み、前記ＡｉｍＰペプチドが前記ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、前記ＡｉｍＲ応答配列から前記ＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である、請求項２〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御することが可能な物質と前記細胞を接触させることを含む、請求項２〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記関心のある発現産物が前記細胞にとって内因性である、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記関心のある発現産物が前記細胞にとって外来性である、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
関心のある発現産物を発現させるために特定される製品であって、
（ｉ）ＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＡｉｍＲが、前記ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）前記ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）前記ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、前記ＡｉｍＲ応答配列から前記ＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列含むＡｉｍＰペプチドまたはこれをコードする核酸配列；および／または
（ｉｖ）前記ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御することが可能な物質
のうち少なくとも２つを包装する包装材料を含む、製品。
【請求項１０】
請求項９に記載の製品であって、前記ＡｉｍＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ＡｉｍＲポリヌクレオチドの発現を指示するための前記ＡｉｍＲにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトに含まれる、製品。
【請求項１１】
マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む、請求項９〜１０の何れか１項に記載の製品。
【請求項１２】
前記関心のある発現産物をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項９〜１１の何れか１項に記載の製品。
【請求項１３】
前記関心のある発現産物がＤＮＡ編集剤である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法または請求項９〜１２の何れか１項に記載の製品。
【請求項１４】
前記ＡｉｍＲ応答配列が、前記ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列およびＡｉｍＸポリヌクレオチドを含み、前記ＡｉｍＸポリヌクレオチドまたは前記ＡｉｍＸポリヌクレオチドによりコードされるＡｉｍＸポリペプチドが、宿主細菌において前記ＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法または請求項９〜１２の何れか１項に記載の製品。
【請求項１５】
前記関心のある発現産物がＡｉｍＸ依存性ＤＮＡ編集剤である、請求項１４に記載の方法または製品。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ編集剤によって前記細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を前記細胞に導入することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ編集剤がインテグラーゼである、請求項１３または１５の何れか１項に記載の方法または製品。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ編集剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのエフェクタータンパク質（例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）およびＴＡＬＥＮからなる群から選択される、請求項１３または１５の何れか１項に記載の方法または製品。
【請求項１９】
ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含む単離ＡｉｍＰペプチドであって、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含むＡｉｍＲポリペプチドを結合させることが可能であり、前記ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み；前記ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である、単離ＡｉｍＰペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含む単離ＡｉｍＲポリペプチドであって、前記ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、単離ＡｉｍＰペプチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ＡｉｍＲ応答配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＡｉｍＲが、前記ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ＡｉｍＲ応答配列が、前記ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列およびＡｉｍＸポリヌクレオチドを含み、前記ＡｉｍＸポリヌクレオチドまたは前記ＡｉｍＸポリヌクレオチドによりコードされるＡｉｍＸポリペプチドが、宿主細菌において前記ＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である、請求項２３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２２および２３または２２および２４に記載のポリヌクレオチドを含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２０、２２および２４に記載のポリヌクレオチドを含むアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系が、宿主細菌において前記アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系を発現するファージの溶原性を調節可能である、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２０、２２、２３または２４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む、核酸コンストラクト。
【請求項２９】
請求項２６〜２７の何れか１項に記載のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む、核酸コンストラクト。
【請求項３０】
請求項２０、２２、２３または２４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８に記載の核酸コンストラクトと、前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための、前記ＡｉｍＰ、前記ＡｉｍＲ、前記ＡｉｍＲ応答配列および／または前記ＡｉｍＸにとって異種であるシス作用制御エレメントと、を含む、核酸コンストラクト。
【請求項３１】
請求項２６〜２７の何れか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２９に記載の核酸コンストラクトと、前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための、前記ＡｉｍＰ、前記ＡｉｍＲ、前記ＡｉｍＲ応答配列および／または前記ＡｉｍＸにとって異種であるシス作用制御エレメントと、を含む、核酸コンストラクト。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドの少なくとも１つをそれぞれ発現する少なくとも２つの核酸コンストラクトを含む核酸コンストラクト系である、請求項２９または３１の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドを含むポリシストロニックｍＲＮＡをコードする、請求項２８〜３２の何れか１項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３４】
ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御可能である単離核酸物質であって、前記ＡｉｍＲが、前記ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、単離核酸物質。
【請求項３５】
関心のある発現産物を発現させるために特定される製品であって、
（ａ）（ｉ）請求項２２〜２４または２６の何れか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、
（ａ）（ｉｉ）請求項２２〜２４または２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む核酸コンストラクトおよびまたは
（ａ）（ｉｉｉ）請求項２２〜２４または２６の何れか１項に記載のポリヌクレオチドおよび、前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための前記ＡｉｍＲまたは前記ＡｉｍＸにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクト
のうち少なくとも１つと；
（ｂ）（ｉ）請求項１９に記載の単離ペプチド、
（ｂ）（ｉｉ）請求項２０に記載の単離ポリヌクレオチド、
（ｂ）（ｉｉｉ）請求項２０に記載のポリヌクレオチドおよびＭＣＳを含む核酸コンストラクト、
（ｂ）（ｉｖ）請求項２０に記載のポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドの発現を指示するための前記ＡｉｍＰにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトおよび／または
（ｂ）（ｖ）請求項３４に記載の単離物質
のうち少なくとも１つと、
を包装する包装材料を含む、製品。
【請求項３６】
関心のある発現産物をコードする核酸配列を含む、請求項２２、２３〜２４または２６〜２７の何れか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項２８〜３３の何れか１項に記載の核酸コンストラクトまたは請求項３５に記載の製品。
【請求項３７】
前記関心のある発現産物がＤＮＡ編集剤である、請求項３５または３６の何れか１項に記載の、単離ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトまたは製品。
【請求項３８】
前記ＡｉｍＰが、宿主細菌において前記ＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性をもたらすことが可能である、請求項１、４〜５、７〜２０または２７〜３３または３５〜３７の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項３９】
前記ＡｉｍＰが、配列番号２６９〜２８３または２８５〜２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１、４〜５、７〜２０または２７〜３３または３５〜３８の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４０】
前記ＡｉｍＲが、配列番号１〜１１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列および／または配列番号１１４〜２２６からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３９の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４１】
前記ＡｉｍＲが、１〜１１３からなる群から選択される核酸配列および／または配列番号１１４〜２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３９の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４２】
前記ＡｉｍＲ応答配列が、配列番号２８７〜３３４からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１〜１８または２３〜４１の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４３】
前記ＡｉｍＲ応答配列が配列番号３７８を含む、請求項１〜１８または２３〜４１の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４４】
前記ＡｉｍＸが、配列番号３３６で示されるような核酸配列を含む、請求項１４〜１８または２４〜３３または３５〜４３の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４５】
前記ＡｉｍＲおよび前記ＡｉｍＰおよび／または前記ＡｉｍＲ応答配列が、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される、請求項１〜４４の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４６】
前記ＡｉｍＰおよび前記ＡｉｍＲ応答配列が、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される、請求項１〜４５の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４７】
前記ＡｉｍＲおよび前記ＡｉｍＰおよび／または前記ＡｉｍＲ応答配列が、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される、請求項１〜４４の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【請求項４８】
前記ＡｉｍＰおよび前記ＡｉｍＲ応答配列が、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される、請求項１〜４５の何れか１項に記載の、方法、製品、単離ポリペプチド、単離ポリヌクレオチドまたは核酸コンストラクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに関心のある発現産物を発現させるためにそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導性遺伝子発現およびゲノム編集技術を含む組み換えＤＮＡ技術は、植物および動物を含む多くのタイプの生物において遺伝子発現の調節およびゲノム配列に対する正確な標的化修飾のための機会を提供してきた。一般的に合理的な遺伝子発現、および特にゲノム編集は、特定の遺伝形質を挿入または除去することによって、基礎研究、薬物探索および細胞に基づく医薬にわたり非常に大きな潜在力を有する。これには、疾患を引き起こす突然変異の補正、ゲノムにおける特異的な部位への治療遺伝子の付加、有害な遺伝子またはゲノム配列の除去および改善作物を生成させるための植物ゲノムの変更が含まれる。ゲノム編集のための既存の方法としては、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の使用が挙げられる。
【発明の概要】
【０００３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、
（ｉ）関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここでＡｉｍＲがＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含むこと；および
（ｉｉ）ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドと細胞を接触させ、ここでＡｉｍＰペプチドが、ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能であること
を含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
【０００４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする異種核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、ＡｉｍＲがＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み；核酸コンストラクトが、ＡｉｍＲポリヌクレオチドおよびＡｉｍＲポリヌクレオチドの発現を指示するためのＡｉｍＲにとって異種のシス作用性制御エレメントを含み、
ＡｉｍＲが、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、ＡｉｍＰペプチドまたはこれをコードする核酸配列と細胞を接触させることを含み、ＡｉｍＰペプチドは、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含み、ＡｉｍＰペプチドは、ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御することが可能な物質と細胞を接触させることを含む。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、細胞に対して内因性である。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、細胞に対して外来性である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、次のうち少なくとも２つ：
（ｉ）ＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドであって、ＡｉｍＲが、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、ポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドまたはこれをコードする核酸配列；および／または
（ｉｖ）ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御することが可能な物質
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させるために特定される製品が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチドは、ＡｉｍＲポリヌクレオチドの発現を指示するためのＡｉｍＲにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトに含まれる。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本製品は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本製品は、関心のある発現産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、ＤＮＡ編集剤である。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列およびＡｉｍＸポリヌクレオチドを含み、ＡｉｍＸポリヌクレオチドまたはＡｉｍＸポリヌクレオチドによりコードされるＡｉｍＸポリペプチドは、宿主細菌においてＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、ＡｉｍＸ依存性ＤＮＡ編集剤である。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、ＤＮＡ編集剤によって細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を細胞に導入することを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はインテグラーゼである。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのエフェクタータンパク質（例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）およびＴＡＬＥＮからなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含む単離ＡｉｍＰペプチドが提供され、このペプチドは、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含むＡｉｍＲポリペプチドを結合させることが可能であり、ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み；ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含む単離ＡｉｍＲポリペプチドが提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ＡｉｍＲ応答配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供され、ＡｉｍＲは、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲは、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列およびＡｉｍＸポリヌクレオチドを含み、ＡｉｍＸポリヌクレオチドまたはＡｉｍＸポリヌクレオチドによりコードされるＡｉｍＸポリペプチドは、宿主細菌においてＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドが提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドを含むアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系をコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このアービトリウム（アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ））系は、宿主細菌においてアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系を発現するファージの溶原性を制御可能である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む核酸コンストラクトが提供される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む核酸コンストラクトが提供される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト、または本発明の核酸コンストラクトおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するための、ＡｉｍＰ、ＡｉｍＲ、ＡｉｍＲ応答配列および／またはＡｉｍＸにとって異種のシス作用性制御エレメントが提供される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の核酸コンストラクトは、ポリヌクレオチドの少なくとも１つをそれぞれ発現する少なくとも２つの核酸コンストラクトを含む核酸コンストラクト系である。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本コンストラクトは、本ポリヌクレオチドを含むポリシストロニックなｍＲＮＡをコードする。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御可能な単離核酸剤が提供され、ここでＡｉｍＲは、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲは、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、
（ａ）（ｉ）本発明の単離ポリヌクレオチド、
（ａ）（ｉｉ）本発明のポリヌクレオチドおよびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む核酸コンストラクトおよびまたは
（ａ）（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチドおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するためのＡｉｍＲまたはＡｉｍＸにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクト
のうち少なくとも１つと；
（ｂ）（ｉ）本発明の単離ペプチド、
（ｂ）（ｉｉ）本発明の単離ポリヌクレオチド、
（ｂ）（ｉｉｉ）本発明のポリヌクレオチドおよびＭＣＳを含む核酸コンストラクト、
（ｂ）（ｉｖ）本発明のポリヌクレオチドおよび本ポリヌクレオチドの発現を指示するためのＡｉｍＰにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトおよび／または
（ｂ）（ｖ）本発明の単離剤
のうち少なくとも１つと、
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させるために特定される製品が提供される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の、単離ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトまたは製品は、関心のある発現産物をコードする核酸配列を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、関心のある発現産物は、ＤＮＡ編集剤である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＰペプチドは、宿主細菌においてＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を引き起こすことが可能である。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＰは、配列番号２６９〜２８３および２８５〜２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲは、配列番号１〜１１３からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列および／または配列番号１１４〜２２６からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲは、１〜１１３からなる群から選択される核酸配列および／または配列番号１１４〜２２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、配列番号２８７〜３３４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は配列番号３７８を含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＸは、配列番号３３６で示されるような核酸配列を含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＲ応答配列は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＲ応答配列は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される。
【００５０】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術および／または科学用語は全て、本発明が属する技術分野の熟練者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施形態の実際にまたは試験において使用され得るが、代表的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾がある場合、定義を含め、本特許の明細書が優先する。さらに、材料、方法および例は単なる例示であり、必ずしも限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
添付の図面を参照して、本発明のいくつかの実施形態を単なる例として本明細書中に記載する。ここで詳細に図面を具体的に参照して、示される特定のものは例であり、本発明の実施形態の例示的な考察のためであることが強調される。この点に関して、図面とともに行われる説明によって、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。
【００５２】
図面において以下のとおりである。
【００５３】
【図１Ａ】、
【図１Ｂ】、
【図１Ｃ】、
【図１Ｄ】、
【図１Ｅ】図１Ａ〜Ｅは、ファージｐｈｉ３Ｔの感染動態に対する馴化培地の効果を示す。
【図１Ａ】図１Ａは、対照および馴化培地の調製プロトコールの略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、対照および馴化培地中で、感染多重度（ＭＯＩ）＝０．１でｐｈｉ３Ｔを感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の増殖曲線を示すグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、対照および馴化培地中で、ＭＯＩ＝０．１でｐｈｉ３Ｔを感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株ＤＳ４９７９５（ｏｐｐＤ：：ｋａｎ）の増殖曲線を示すグラフである。図１Ｂ〜Ｃについて、データは、それぞれ３回のテクニカルレプリケートを行った３回のバイオロジカルレプリケートの平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、対照および馴化培地中のｐｈｉ３ＴでのＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の感染時間経過中のファージ溶原性を実証する半定量的ＰＣＲの写真である。
【図１Ｅ】図１Ｅは、プロテイナーゼＫでの前処理ありおよびなしで、対照および馴化培地中にて、ＭＯＩ＝０．１でｐｈｉ３Ｔに感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の増殖曲線を示すグラフである。データは３回のテクニカルレプリケートの平均を表し、エラーバーは標準誤差を表す。
【図２Ａ】、
【図２Ｂ】、
【図２Ｃ】、
【図２Ｄ】、
【図２Ｅ】、
【図２Ｆ】、
【図２Ｇ】図２Ａ〜Ｇは、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドおよびその受容体を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ｐｈｉ３Ｔファージゲノム中のアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）遺伝子座の略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＡｉｍＰプレプロペプチドにおける細胞外プロテアーゼによる切断に対するシグナルを表す。それらのドメインに対して分けられたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クオラムセンシングＰｈｒ遺伝子のアミノ酸配列を示す１。各配列中のＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞外プロテアーゼの認識シグナルに緑色で印を付す。ｐｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＰタンパク質中のシグナルペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰ  ４．１ウェブサーバによって予測した８。右側の配列番号は、それぞれシグナルペプチド、プロペプチドおよび成熟ペプチドの配列を表す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、馴化培地中のＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドの存在を検証するマススペクトロメトリーヒストグラムを示す。左パネルは、ＬＢ中１００ｎＭ濃度の参照合成ＳＡＩＲＧＡペプチドを示す。Ｂ２、Ｙ３、Ｙ４およびＹ５はペプチドフラグメントイオンである。中央パネルは対照培地を示し、右パネルは馴化培地を示す。全パネルにおいて、矢印はＳＡＩＲＧＡペプチドの予想される保持時間を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、合成ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドを補充したＬＢ培地中で、ＭＯＩ＝０．１にてｐｈｉ３Ｔに感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の増殖曲線を示すグラフである。数字はペプチド濃度を表す。それぞれ３回のテクニカルレプリケートがある３回のバイオロジカルレプリケートの平均を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、６アミノ酸アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの５アミノ酸型が溶原性を導かないことを実証するグラフを示す。合成ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９、左パネル）、ＡＩＲＧＡ（配列番号３３５、中央パネル）またはＳＡＩＲＧ（配列番号３５５）ペプチドを補充したＬＢ培地中で、ＭＯＩ＝０．１にてｐｈｉ３Ｔに感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の増殖曲線を示す。それぞれ３回のテクニカルレプリケートがある３回のバイオロジカルレプリケートの平均を示す。エラーバーは標準誤差を表す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、溶原化細菌の分画の配列決定に基づく定量を表す。上−分析の概略図：感染中に細胞から全ＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ全ゲノム配列決定を行った。％溶原性は、この接合部を包含する全読み取りデータからの、ファージ／細菌組み込み接合部にまたがる読み取りデータの割合として計算した。組み込み接合部は赤で印を付し；組み込まれたファージＤＮＡは緑色とする。下−ＭＯＩ＝２でのｐｈｉ３ＴによるＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の感染中の４つの時点での％溶原化細菌。標準誤差を示すエラーバーとともに、３回のバイオロジカルレプリケートの平均を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、精製ＡｉｍＲ（Ｃ末端６ｘＨｉｓタグ、濃度２００ｎＭ）と合成ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）またはＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチド（９〜４０００ｎＭの濃度範囲）との間の結合のマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）分析を示すグラフである。３回の反復試験の平均および標準誤差を示す。
【図３Ａ】、
【図３Ｂ】、
【図３Ｃ】、
【図３Ｄ】、
【図３Ｅ】、
【図３Ｆ】図３Ａ〜Ｆは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージにおける溶原性を導く保存ペプチドコミュニケーションコード（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｄｅ）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、配列決定したゲノムにおけるＡｉｍＲ相同体の選択例の略図である（赤で表示）。ｐｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＲに対する％同一性とともに、ＡｉｍＲ相同体に対して遺伝子座タグを示す。成熟アービトリウム（アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ））ペプチド（ＡｉｍＰ  ＯＲＦの最後の６アミノ酸）をＡｉｍＰ相同体の下に示す（オレンジ色で表示）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡｉｍＰの１１２個の相同体間のアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの分布を示す円グラフである（表３参照）。示されるペプチドは、ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）、ＧＦＴＶＧＡ（配列番号２７３）、ＳＡＳＲＧＡ（配列番号２７５）、ＧＦＧＲＧＡ（配列番号２７２）、ＧＶＶＲＧＡ（配列番号２７６）、ＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）、ＡＭＧＮＧＧ（配列番号２７８）、ＤＰＧＲＧＧ（配列番号２７４）、ＧＦＧＨＧＡ（配列番号２８２）、ＧＦＰＲＧＡ（配列番号２８１）、ＧＩＶＲＧＡ（配列番号２８６）、ＳＩＩＲＧＡ（配列番号２７０）、ＴＩＧＲＧＧ（配列番号２８０）、ＮＰＧＲＧＡ（配列番号２８５）、ＳＩＧＨＧＡ（配列番号２８３）、ＳＰＳＲＧＡ（配列番号２７７）およびＴＩＧＲＧ（配列番号２７９）である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチド型のアミノ酸プロファイルを示す。
【図３Ｄ】、
【図３Ｅ】図３Ｄ〜Ｅは、合成ＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１、図３Ｄ）およびＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９、図３Ｅ）ペプチドを補充したＬＢ培地中で、ＭＯＩ＝０．１にてｓｐＢｅｔａに感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３の増殖曲線を示すグラフである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、合成ＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチドを補充したＬＢ培地中で、ＭＯＩ＝０．１にてｐｈｉ３Ｔに感染させたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の増殖曲線を示すグラフである。図３Ｄ〜Ｆのデータは、それぞれ３回のテクニカルレプリケートがある３回のバイオロジカルレプリケートの平均を示す。エラーバーは標準誤差を表す。
【図４Ａ】、
【図４Ｂ】、
【図４Ｃ】、
【図４Ｄ】、
【図４Ｅ】、
【図４Ｆ】、
【図４Ｇ】、
【図４Ｈ】、
【図４Ｉ】図４Ａ〜Ｉは、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系におけるＤＮＡ結合および転写制御を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１μＭのＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドありまたはなしでの、感染１５分後のＨｉｓタグ付加ＡｉｍＲのＣｈＩＰ−ｓｅｑを示すグラフである。ファージゲノム中の各ヌクレオチドについて、ペプチドなしで感染中の配列決定プルダウンＤＮＡの量と、ペプチドが培地中に存在したときにプルダウンされたＤＮＡの量との間の比を示す。比は各ライブラリ中の配列決定読み取りデータの量に対して正規化した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａで提示されるグラフのファージゲノム中のズームイン領域を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）またはＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチドの何れかの存在下または非存在下での精製ＡｉｍＲのゲルろ過の結果を示すグラフである。挿入図は、既知のサイズのタンパク質を用いたゲルろ過に対する検量線を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、感染中のＡｉｍＸ遺伝子の発現を示す棒グラフである。ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りデータカウントは、各ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ中のファージゲノムにヒットする読み取りデータ数に対して正規化した。正規化は２つの時点に対して個別に行った。データは個々のバイオロジカルレプリケートに対して提示した（野生型細菌を用いた各実験について３回、およびＡｉｍＲノックダウン株について２回）。
【図４Ｅ】、
【図４Ｆ】、
【図４Ｇ】図４Ｅ〜Ｇは、感染の５分後（図４Ｅ）、１０分後（図４Ｆ）および２０分後（図４Ｇ）でのアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）遺伝子座のＲＮＡ−ｓｅｑの適用範囲を示す。ＲＮＡ−ｓｅｑの適用範囲は、各ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリ中のファージゲノムにヒットする読み取りデータ数に対して正規化した。
【図４Ｈ】図４Ｈは、ｐｈｉ３Ｔ感染中の野生型およびｄＣａｓ９−発現抑制細菌株の増殖曲線を示すグラフである。ｔ＝０にてＭＯＩ＝０．１で菌株を感染させた。ｄＣａｓ９はキシロース０．２％により誘導した。ａｉｍＸ遺伝子（紫色の線）をキシロースプロモーター下でもクローニングした。それぞれ３回のテクニカルレプリケートがある３回のバイオロジカルレプリケートの平均を示す。エラーバーは標準誤差を表す。
【図４Ｉ】図４Ｉは感染の２０分後のファージ遺伝子発現を示す。各点は単一のファージ遺伝子を表す。軸は、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリサイズに対して調節するための正規化後の、３回の反復実験からの１遺伝子あたりの平均ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りデータカウントを表す。Ｘ軸はファージ感染が１μＭのＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドの存在下であった場合の発現を示し；Ｙ軸はペプチドの非存在下での発現を示す。
【図５Ａ】、
【図５Ｂ】、
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、コミュニケーションに基づく溶菌−溶原性決定のための、提案される機序モデルの概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ファージによる細菌培養物の感染中のアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）蓄積の動態を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、細菌集団とのファージの最初の遭遇時に、培地中にアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）がないことを示す。初期遺伝子ａｉｍＲおよびａｉｍＰは感染するとすぐに発現される。ＡｉｍＲは、二量体として、ａｉｍＸの上流でファージＤＮＡを結合させ、ＡｉｍＸ発現を活性化する。ＡｉｍＸは溶原性の阻害剤であり、ファージを溶菌サイクルに向かわせる。同時に、成熟ペプチドを産生させるために、ＡｉｍＰが発現され、分泌され、細胞外でプロセシングされる。
【図５Ｃ】図５Ｃは、感染動態の後期段階で、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドが培地中で蓄積し、ＯＰＰトランスポーターによって細菌に取り込まれることを示す。ファージが細菌に感染するこの段階では、発現されたＡｉｍＲ受容体がアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）分子と結合し、ＡｉｍＸの発現を活性化することができず、溶原性が優先されることになる。
【図６】図６はコンストラクト＃１の略図である：バクテリオファージＰｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＲ−ＡｉｍＰ−ＡｉｍＸ遺伝子座（赤色の長方形）を蛍光レポーター遺伝子（ｇｆｐ）に遺伝子融合させ、ｐＤＲ１１１プラスミドのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断部位内に挿入し、ｐＤＲ１１１−コンストラクト＃１を得た。
【図７】図７は、抗生物質耐性遺伝子がａｍｙＥ遺伝子内でバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３染色体に挿入された、コンストラクト＃１の略図である。
【図８】図８は、抗生物質耐性遺伝子がａｍｙＥ遺伝子内でバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３染色体に挿入された、コンストラクト＃２の略図である。
【図９Ａ】、
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｂは、指定濃度のＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドを補充したＬＢ増殖培地中で培養した後の、野生型バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３（ＷＴ）およびコンストラクト＃１（図９Ａ）またはコンストラクト＃２（図９Ｂ）を含有するバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３の増殖曲線およびＧＦＰ蛍光レベルを示すグラフである。テクニカルレプリケートの平均値を示す（ｎ＝３）。蛍光は任意単位（ａ．ｕ）で示す。
【本発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに関心のある発現産物を発現させるためにそれらを使用する方法に関する。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その用途において、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実施または実行することが可能である。
【００５６】
近年発展した誘導性遺伝子発現およびゲノム編集技術を含む組み換えＤＮＡ技術によって、植物および動物を含む多くのタイプの生物において遺伝子発現の調節およびゲノム配列に対する正確で標的化された修飾が可能となる。
【００５７】
本発明の実施形態を想起し、実施化する一方で、発明者らは、溶菌性−溶原性決定を協調させるためにテンペレートウイルスによって利用される新たに明らかになったコミュニケーション系に基づく新規の発現ツールを考案した。
【００５８】
続く、本明細書中の以下で、および実施例のセクションで例示されるように、発明者らは、そのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の感染中に、ウイルス（ｓｐＢｅｔａファミリーファージ）が、培地に放出される６アミノ酸長ペプチドを産生することを示す（実施例１〜２、図１Ａ〜Ｅおよび２Ａ〜Ｆ）。このペプチドは、その感染宿主において濃度依存的にファージの溶原性を引き起こす（実施例２、図２Ｄ）。続いて、発明者らは、ファージファミリーの異なる種によりコードされるペプチド中の共有モチーフを同定することができた；５位にグリシン残基、６位にグリシンまたはアラニン、および場合によっては４位に正荷電残基（実施例３、図２Ｇおよび３Ａ〜Ｃ）。発明者らは、発明者らが「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」系と呼ぶこの新規コミュニケーション系が、本明細書では以下のように呼ばれる３個のファージ遺伝子：ＡｉｍＰ、ペプチドを産生；ＡｉｍＲ、細胞内ペプチド受容体；およびＡｉｍＸ、溶原性の負の制御因子によってコードされることをさらに示す（実施例２〜４、図２Ａ〜Ｇ、３Ａ〜Ｃおよび４Ａ〜Ｉおよび表３）。ＡｉｍＲは、ホモ二量体としては、ＡｉｍＸの転写活性化因子であり；ペプチドが結合すると、ＡｉｍＲは単量体となり、ＡｉｍＸの転写が抑制され、溶原性がもたらされる。理論により束縛されないが、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系により、子孫ファージ粒子がその祖先とコミュニケーションすること、すなわち少し前の先行する感染の量を推定し、ゆえに溶菌または溶原性サイクルの何れを採用するかを決定することが可能になることが示唆される（実施例４、図５Ａ〜Ｃ）。
【００５９】
まとめると、本教示から、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系およびその機能的断片が、例えば一般的に関心のある発現産物の発現を調節し、特に標的ゲノムへのＤＮＡ配列の組み込みを調節するために使用され得ることが示唆される。本明細書中以下および続く実施例セクションでさらに説明するように、ＡｉｍＲはＡｉｍＲ応答配列を結合させて、それによってＡｉｍＲ応答配列（例えばＡｉｍＲ結合部位）に操作可能に連結された関心のある発現産物の転写の活性化をもたらし得；一方でＡｉｍＰがＡｉｍＲに結合すると、関心のある発現産物の転写が抑制される。
【００６０】
発明者らは、ＡｉｍＲ−ＡｉｍＰ系が、ファージ非依存的にバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３におけるＡｉｍＲ結合部位に操作可能に連結されるＧＦＰレポーター遺伝子の発現を調節するように機能し得ることをさらに示す（実施例５、図６〜８および９Ａ〜Ｂ）。したがって、本発明の第１の態様によれば、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含む単離ＡｉｍＰペプチドが提供され、このペプチドは、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含むＡｉｍＲポリペプチドを結合させることが可能であり、このＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み；ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である。
【００６１】
本発明の別の態様によれば、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含む単離ＡｉｍＲポリペプチドが提供される。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「単離」という用語は、自然環境、生理学的環境、例えば微生物または例えばファージから少なくとも部分的に分離されていることを指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ＡｉｍＲ」という用語は、ポリヌクレオチドおよび発現産物、例えばＡｉｍＲ遺伝子のポリペプチドを指す。ＡｉｍＲ遺伝子の産物は、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含有する。  ＡｉｍＲ遺伝子の産物は、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含有する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）」という句は、特定の核酸配列（例えばＡｉｍＲ応答配列）を認識し、それに結合し得るモチーフを指す。ＤＢＤは、配列特異的に２本鎖核酸配列（例えばＤＮＡ）を認識し、それに結合し得る。典型的には、ＤＢＤはタンパク質ドメインにおける構造モチーフである。具体的な実施形態によれば、ＤＢＤはヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフを含む。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、「へリックス−ターン−へリックス（ＨＴＨ）モチーフ」という用語は、ｍｆａｐ番号ＩＰＲ００００４７を有する、ＤＮＡ主溝の形状を補完する周知のＤＮＡ結合モチーフを指す（例えばＡｎｎ  Ｒｅｖ．ｏｆＢｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）５３：２９３およびＢｒｕｎｅｌｌｅおよびＳｃｈｌｅｉｆ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）２０９：６０７を参照）。このドメインは、配列ＸＸＸＰｈｏＡｌａＸＸＰｈｏＧｌｙＰｈｏＸＸＸＸＰｈｏＸＸＰｈｏＸＸ（配列番号３３５）によって例示され得、ここでＸは何らかのアミノ酸であり、Ｐｈｏは疎水性アミノ酸である。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「テトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメイン」という用語は、タンパク質−タンパク質結合ファミリー：ＴＰＲ＿１（ＰＦ００５１５）を媒介すると考えられる３〜１６個のモチーフのタンデムアレイにおいて見出される縮重３４アミノ酸コンセンサス配列を指す。ＴＰＲドメインは、ターンによって分離される２個の逆平行α−ヘリックスを形成して、両親媒性の溝を有する構造を形成する［例えばＨｉｒａｎｏら（１９９０），Ｃｅｌｌ，６０：３１９−３２８を参照］。
【００６７】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリヌクレオチドは、配列番号１〜１１３からなる群から選択される核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
【００６８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリヌクレオチドは、配列番号１〜１１３からなる群から選択される核酸に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する。
【００６９】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリペプチドは、配列番号１１４〜２２６からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する。
【００７０】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリペプチドは、配列番号１１４〜２２６からなる群から選択されるアミノ酸に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する。
【００７１】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリペプチドは、配列番号１１４に対して、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または１００％の同一性を有する。
【００７２】
配列同一性は、Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＵＳＣＬＥおよびＨＨｐｒｅｄなどのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に基づく何らかのタンパク質アライメントアルゴリズムまたは何らかの核酸配列アライメントアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００７３】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲアミノ酸は、配列番号１１４〜２２６からなる群から選択される。
【００７４】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ核酸配列は、配列番号１〜１１３からなる群から選択される。
【００７５】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲは配列番号１１４を含む。
【００７６】
発明者らは、ＡｉｍＲが、ＡｉｍＰペプチドの非存在下で、二量体としてファージＤＮＡを結合させ、例えばＡｉｍＸの転写活性化因子として機能することを明らかにした。ＡｉｍＰペプチドに結合すると、ＡｉｍＲはそのオリゴマー状態を活性二量体から不活性単量体に変化させ、これが例えばＡｉｍＸの転写の低下を引き起こす。
【００７７】
ゆえに、いくつかの実施形態によるＡｉｍＲポリペプチドは、（本明細書中で以下にさらに記載のように）ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドを結合させることが可能であり；ＡｉｍＰ結合ＤＮＡ（すなわちＡｉｍＲ応答配列）および活性化遺伝子発現（すなわち転写因子）の非存在下である。
【００７８】
転写因子（例えばＡｉｍＲ）のＤＮＡ（例えばＡｉｍＲ応答配列）への結合を決定する方法は当技術分野で周知であり、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ、ＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡプルダウンアッセイおよびマイクロプレート捕捉および検出アッセイが挙げられるが限定されない。
【００７９】
特定の実施形態によれば、ＡｉｍＲは二量体としてＤＮＡを結合させる。二量体化を評価する方法は当技術分野で周知であり、続く実施例セクションでさらに記載し、ゲルろ過カラム上での移動を含む。
【００８０】
具体的な実施形態によれば、「ＡｉｍＲ」という用語は全長ＡｉｍＲを指す。他の具体的な実施形態によれば、「ＡｉｍＲ」という用語は、本明細書中に記載のように活性を維持するＡｉｍＲの断片を指す。
【００８１】
「ＡｉｍＲ」という用語はまた、本明細書中に記載のように所望の活性を示す機能的ＡｉｍＲ相同体も指す。このような相同体は、例えば、ポリペプチド配列番号１１４〜２２６に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一もしくは相同であるか、またはそれをコードするポリヌクレオチドに対して、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である（本明細書中、上記および下記にさらに記載のとおり）。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
【００８２】
配列同一性または相同性は、Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＵＳＣＬＥおよびＨＨｐｒｅｄなどの何らかのタンパク質または核酸配列アライメントアルゴリズムを使用して決定され得る。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「操作可能に連結される」という用語は、ある核酸配列が別の核酸配列と機能的関係を有することを指す。具体的な実施形態によれば、制御配列（例えばＡｉｍＲ結合部位）がその核酸配列の転写および／または翻訳を調節および制御する場合、核酸配列は制御配列に「操作可能に連結」されている。一実施形態によれば、制御エレメントはそれが制御する核酸配列においてシスに作用する。別の実施形態によれば、制御エレメントはそれが制御する核酸配列においてトランスに作用する。具体的な実施形態によれば、制御配列はそれが制御する核酸配列に対して上流に配置される。具体的な実施形態によれば、「操作可能に連結される」という用語は、発現させようとする核酸配列の上流の適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有すること、および正しい読み枠を維持して、制御配列の調節下での核酸配列の発現およびその核酸配列によりコードされる所望の産物の発現を可能にすることを含む。
【００８４】
具体的な実施形態によれば、「ＡｉｍＲ応答配列」という用語は、全長ＡｉｍＲ応答配列を指す。他の具体的な実施形態によれば、「ＡｉｍＲ応答配列」という用語は、本明細書中に記載のように活性を維持するＡｉｍＲ応答配列の断片を指す。  具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、４〜１００、４〜５０、４〜３０または４〜１０核酸長である。
【００８５】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列（すなわちＡｉｍＲ結合部位）を含む。
【００８６】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、配列番号２８７〜３３４からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００８７】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、配列番号２８７〜３３４からなる群から選択される核酸配列中に含まれる。
【００８８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、配列番号３７８を含む。
【００８９】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、配列番号３７８中に含まれる。
【００９０】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、例えばクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ、ＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、マイクロプレート捕捉および検出アッセイまたはＤＮＡプルダウンアッセイによって決定される場合、ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列（すなわちＡｉｍＲ結合部位）として配列番号２８７〜３３４または３７８の活性を維持する配列番号２８７〜３３４または３７８の断片を含む。
【００９１】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列（すなわちＡｉｍＲ結合部位）およびＡｉｍＸを含む。ゆえに、本発明の具体的な実施形態は、ＡｉｍＲの、その結合部位への結合が、ＡｉｍＸの発現を調節し、それが次に関心のある発現産物の発現を調節することを開示する。
【００９２】
「ＡｉｍＲ応答配列」という用語はまた、所望の活性を示す（すなわちＡｉｍＲを結合させる）機能的ＡｉｍＲ応答配列相同体も指す。このような相同体は、例えば、ポリヌクレオチド配列番号２８７〜３３４および３７８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるかまたは相同であり得る。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
【００９３】
いくつかの実施形態に従って使用し得るＡｉｍＲおよびＡｉｍＲ応答配列を含むそれらの同族配列を本明細書中で以下の表３に列挙する。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、「ＡｉｍＰ」という用語は、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を有するペプチドを指し、ここでＸは何れかのアミノ酸またはそれをコードする核酸である。具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰは、ＸＸＸＸ１ＧＧ／Ａのアミノ酸配列を有し、式中、Ｘは何れかのアミノ酸であり、Ｘ１は正荷電アミノ酸である。具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰはＡｉｍＰ遺伝子の産物である。
【００９５】
本ペプチドは、例えば５０アミノ酸より長い（例えば５１〜８０アミノ酸、５１〜１００アミノ酸、１００〜２００アミノ酸）、または短い、例えば６〜５０アミノ酸長であり得る。具体的な実施形態によれば、本ペプチドは６アミノ酸長である。
【００９６】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰは、配列番号２６９〜２８３および２８５〜２８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９７】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰペプチドは、ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）またはＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）アミノ酸配列を含む。
【００９８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰペプチドは、ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）アミノ酸配列を含む。
【００９９】
機能的ＡｉｍＰペプチドは、ＡｉｍＲポリペプチドを結合させ得、ＡｉｍＲポリペプチドをＤＮＡから、具体的にはＡｉｍＲ応答配列から解離させ得る。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「解離させること」および「解離させる」という用語は、当技術分野で公知のアッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ、ＤＮＡ電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡプルダウンアッセイおよびマイクロプレート捕捉および検出アッセイによって証明されるように、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＲ応答配列を含む複合体中の少なくとも３０％の減少を指す。
【０１０１】
具体的な実施形態によれば、機能的ＡｉｍＰは、宿主細菌中でＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を引き起こし得る。ファージ溶原性を分析する方法は本明細書中で以下に記載する。
【０１０２】
「ＡｉｍＰ」という用語はまた、本明細書中に記載のように所望の活性を示す機能的ＡｉｍＰ相同体も指す。このような相同体は、例えば、ペプチド配列番号２６９〜２８３および２８５〜２８６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるかまたは相同であり得る。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態に従って使用し得るＡｉｍＰおよびそれらの同族ＡｉｍＲを本明細書中で以下の表３に列挙する。
【０１０４】
ＡｉｍＲへのペプチド結合を認定するための結合アッセイは当技術分野で周知であり、例えば、ウエスタンブロット、ＢｉａＣｏｒｅ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはフローサイトメトリーが挙げられる。
【０１０５】
ＤＮＡからＡｉｍＲを解離させるペプチドの能力を認定するための結合アッセイは当技術分野で周知であり、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ、ＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、ＤＮＡプルダウンアッセイおよびマイクロプレート捕捉および検出アッセイが挙げられるが限定されない。
【０１０６】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰペプチドのＡｉｍＲポリペプチドへの結合によって、ＡｉｍＲポリペプチドの二量体化が阻害される。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、「阻害する」および「阻害すること」という用語は、活性（例えば二量体化、結合、溶原性）の低下を指す。具体的な実施形態によれば、低下は、ＡｉｍＰペプチドまたはＡｉｍＸの非存在下での低下と比較した場合、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍である。
【０１０８】
他の具体的な実施形態によれば、低下はＡｉｍＰペプチドまたはＡｉｍＸの非存在下の場合と比較したとき、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９９％または１００％である。
【０１０９】
溶原ファージは溶原性経路に入ることが可能なものであり、そこでファージはその溶解サイクルの完了前に完全に細胞のゲノムの休止状態の受動部分になる。
【０１１０】
具体的な実施形態によれば、ファージはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌に感染させることが可能である。
【０１１１】
具体的な実施形態によれば、ファージはプロファージである。
【０１１２】
以下の表３は、本発明の具体的な実施形態に従って使用し得るファージおよびプロファージを示す。具体的な実施形態によれば、ファージはｓｐＢｅｔａファージである。具体的な実施形態によれば、ファージはＰｈｉ３Ｔである。
【０１１３】
同じ培養条件に対して、溶原性の程度は一般に同じ種の細菌であるが、指定の物質（例えばＡｉｍＰ、ＡｉｍＸ）と接触させないか、または対照とも呼ばれるビヒクル対照と接触させないものにおける溶原性と比較して表される。
【０１１４】
ファージ溶原性を分析する方法は当技術分野で周知であり、ＤＮＡ配列決定およびＰＣＲ分析が挙げられるが、限定されない。溶原ファージは溶原性経路または溶菌性経路を使用し得るので、ファージの溶原性活性は、光学密度、プラークアッセイおよび生死指示薬を含むが限定されない当技術分野で周知の方法によってファージの溶菌性活性の低下を判定することにより間接的に評価され得る。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「溶原性を引き起こすこと」および「溶原性を引き起こす」という句は、溶原性の増加を指す。
【０１１６】
具体的な実施形態によれば、増加は、ＡｉｍＰペプチドまたはＡｉｍＸ下方制御剤の非存在下の場合と比較したとき、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または少なくとも２０倍である。
【０１１７】
他の具体的な実施形態によれば、増加はＡｉｍＰペプチドまたはＡｉｍＸ下方制御剤の非存在下の場合と比較したとき、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９９％または１００％である。
【０１１８】
具体的な実施形態によれば、細菌は、以下の表３で示されるファージから選択される溶原ファージに感染させ得る。具体的な実施形態によれば、細菌をｓｐＢｅｔａファージに感染させ得る。具体的な実施形態によれば、細菌はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌である。具体的な実施形態によれば、細菌は、以下の表３で列挙される細菌からなる群から選択される。
【０１１９】
本発明はまた、本明細書中に記載のようなアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系の構成成分およびその機能的断片をコードする単離ポリヌクレオチドも企図する。
【０１２０】
したがって、本発明の一態様によれば、ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このペプチドは、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含むＡｉｍＲポリペプチドを結合させることが可能であり、このＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み；ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能である。
【０１２１】
本発明の別の態様によれば、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含むＡｉｍＲポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このＡｉｍＲは、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む。
【０１２２】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜１１３からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の同一性を有する配列を含む。
【０１２３】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜１１３からなる群から選択される配列を含む。
【０１２４】
本発明の別の態様によれば、ＡｉｍＲ応答配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供され、ここでＡｉｍＲは、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲは、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含む。
【０１２５】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、ＡｉｍＲを結合させるための核酸配列およびＡｉｍＸポリヌクレオチドを含み、ＡｉｍＸポリヌクレオチドまたはＡｉｍＸポリヌクレオチドによりコードされるＡｉｍＸポリペプチドは、宿主細菌においてＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を阻害可能である。
【０１２６】
本発明の別の態様によれば、単離ＡｉｍＸポリヌクレオチドが提供される。
【０１２７】
本発明の別の態様によれば、ＡｉｍＸポリヌクレオチドによりコードされる単離ＡｉｍＸポリペプチドが提供される。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「ＡｉｍＸ」という用語は、ポリヌクレオチドおよび発現産物、例えばＡｉｍＸ遺伝子のポリペプチドを指す。具体的な実施形態によれば、「ＡｉｍＸ」は、ＡｉｍＸ遺伝子のポリヌクレオチドを指す。具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ結合部位はＡｉｍＸポリヌクレオチドに操作可能に連結される。機能的ＡｉｍＸは、宿主細菌中でそれぞれのＡｉｍＲを発現する溶原ファージの溶原性を阻害することが可能である。具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＸおよびＡｉｍＲ結合部位はＡｉｍＲ応答配列を含む。
【０１２９】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＸは、配列番号３３６で示される核酸配列を含む。
【０１３０】
具体的な実施形態によれば、「ＡｉｍＸ」という用語は全長ＡｉｍＸを指す。他の特定の実施形態によれば、「ＡｉｍＸ」という用語は、本明細書中に記載のように活性を維持するＡｉｍＸの断片を指す。
【０１３１】
「ＡｉｍＸ」という用語はまた、本明細書中に記載のように所望の活性を示す機能的ＡｉｍＸ相同体も指す。このような相同体は、例えば、ポリヌクレオチド配列番号３３６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるかまたは相同であり得る。相同体はまた、アミノ酸置換を含む、オルソログ、欠失、挿入または置換変異体も指し得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態に従って使用し得るＡｉｍＲおよびそれらの同族ＡｉｍＸを本明細書中で以下の表３に列挙する。
【０１３３】
本発明の別の態様によれば、ＡｉｍＰペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡｉｍＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドおよび／またはＡｉｍＸポリヌクレオチドおよびそれらの何れかの組み合わせを含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【０１３４】
本発明の別の態様によれば、ＡｉｍＰペプチドをコードする核酸配列、ＡｉｍＲポリペプチドをコードする核酸配列、およびＡｉｍＸ核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲを結合させるための核酸配列を含むアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系をコードする単離ポリヌクレオチドが提供され、このアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系は、宿主細菌においてこのアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系を発現するファージの溶原性を制御可能である。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系」または「機能的アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」は、本明細書中に記載のようなＡｉｍＰ、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＸを含み、その活性がその宿主ゲノムにおけるファージ溶原性を調節する多遺伝子系を指す。
【０１３６】
いくつかの実施形態に従って使用し得るアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系構成成分の組み合わせは、本明細書中の以下の表３で列挙する。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系の構成成分」という用語は、ＡｉｍＰ、ＡｉｍＲ、ＡｉｍＲ応答配列、ＡｉｍＸおよび本明細書中上記のものなど、それらまたはそれらの機能的な断片の何らかの組み合わせを指す。
【０１３８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲは、溶原ファージのゲノム中のＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列をコードする遺伝子（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）の１〜１０個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。
【０１３９】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰは、溶原ファージのゲノム中のＡｉｍＲ応答配列をコードする遺伝子（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）の１〜１０個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される。
【０１４０】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される。
【０１４１】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して５’から３’に配置される。
【０１４２】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、溶原ファージのゲノムにおいて近接して５’から３’に配置される。
【０１４３】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される。
【０１４４】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される。
【０１４５】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、それらを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して５’から３’に配置される。
【０１４６】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＲ応答配列（例えば配列番号２８７〜３３４、３７８）は、溶原ファージのゲノムにおいて近接して５’から３’に配置される。
【０１４７】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲは、溶原ファージのゲノム中のＡｉｍＸをコードする遺伝子の１〜１０個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。
【０１４８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰは、溶原ファージのゲノム中のＡｉｍＸをコードする遺伝子の１〜１０個の遺伝子内に配置される遺伝子によってコードされる。
【０１４９】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＸは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される。
【０１５０】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＸは、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される。
【０１５１】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＸは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して５’から３’に配置される。
【０１５２】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲおよびＡｉｍＰおよび／またはＡｉｍＸは、溶原ファージのゲノムにおいて近接して５’から３’に配置される。
【０１５３】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＸは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で連続的に５’から３’に配置される。
【０１５４】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＸは、溶原ファージのゲノムにおいて連続的に５’から３’に配置される。
【０１５５】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＸは、それを発現する溶原ファージの核酸分子上で近接して５’から３’に配置される。
【０１５６】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰおよびＡｉｍＸは、溶原ファージのゲノムにおいて近接して５’から３’に配置される。
【０１５７】
したがって、具体的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、
（１）ＡｉｍＰペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（２）ＡｉｍＲポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（３）ＡｉｍＲ応答配列の核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（４）ＡｉｍＸポリヌクレオチド
（５）（２）および（３）を含むポリヌクレオチド；
（６）（２）および（４）を含むポリヌクレオチド；
（７）（１）、（２）および（３）を含むポリヌクレオチド；
（８）（１）、（２）および（４）を含むポリヌクレオチド；
（９）（１）および（２）を含むポリヌクレオチド；
（１０）（１）および（３）を含むポリヌクレオチド；または
（１１）（１）および（４）を含むポリヌクレオチド
を含む。
【０１５８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリヌクレオチドは、ＡｉｍＰポリヌクレオチドに対して上流にある。
【０１５９】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリヌクレオチドは、ＡｉｍＲ応答配列ポリヌクレオチドに対して上流にある。
【０１６０】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲポリヌクレオチドは、ＡｉｍＸポリヌクレオチドに対して上流にある。
【０１６１】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲ応答配列は、ＡｉｍＸポリヌクレオチドに対して上流にある。
【０１６２】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰポリヌクレオチドは、ＡｉｍＲ応答配列ポリヌクレオチドに対して上流にある。
【０１６３】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＰポリヌクレオチドは、ＡｉｍＸポリヌクレオチドに対して上流にある。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、交換可能に使用される「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、ネイティブペプチド（分解産物、合成的合成ペプチドまたは組み換えペプチドの何れか）およびペプチド模倣物（典型的には合成的合成ペプチド）ならびに、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを包含し、これは、例えば、体内でペプチドをより安定にする、または細胞に浸透する能力をより高める修飾を有し得る。このような修飾としては、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾および残基修飾が挙げられるが、限定されない。ペプチド模倣化合物を調製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、本明細書中で完全に示されるかのように参照により組み込まれる、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）で特定される。この点でのさらなる詳細を本明細書中、以下で提供する。
【０１６５】
本ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えばＮ−メチル化アミド結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、スルフィニルメチレン結合（−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは、何らかのアルキル（例えばメチル）である。）、アミン結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、スルフィド結合（−ＣＨ２−Ｓ−）、エチレン結合（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、フッ素化オレフィン二重結合（−ＣＦ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に天然に存在する「通常の」側鎖である。）により置換され得る。
【０１６６】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合の何れかにおいて、および同時にいくつかの（２〜３個の）結合においてさえも起こり得る。
【０１６７】
天然の芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅは、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、ナフチルアラニン、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体またはＯ−メチル−Ｔｙｒなどの非天然の芳香族アミノ酸により置換され得る。
【０１６８】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドはまた、１つ以上の修飾アミノ酸または１つ以上の非アミノ酸単量体（例えば脂肪酸、複合炭水化物など）も含み得る。
【０１６９】
「アミノ酸（単数）」または「アミノ酸（複数）」という用語は、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホスレオニンを含め、インビボで翻訳後に修飾されることが多い２０個の天然アミノ酸；および２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ノル−バリン、ノル−ロイシンおよびオルニチンを含むが限定されない他の通常でないアミノ酸を含むと理解される。さらに、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の両方を含む。
【０１７０】
以下の表１および２は、天然アミノ酸（表１）および非従来型または修飾アミノ酸（例えば合成、表２）を列挙しており、これらは本発明のいくつかの実施形態とともに使用し得る。
【０１７１】
【表１】
2019535298.tif 000002
【０１７２】
【表２】
2019535298.tif 000003
2019535298.tif 000004
【０１７３】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、好ましくは直鎖形態で利用されるが、環化がペプチド特性を著しく妨げない場合、ペプチドの環状形態も利用され得ることが理解されよう。
【０１７４】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、好ましくは、それらのヒドロキシル含有側鎖に起因してペプチド溶解度を上昇させることが可能な、セリンおよびスレオニンを含むが限定されない１個以上の非天然または天然極性アミノ酸を含む。
【０１７５】
本発明のペプチドのアミノ酸は、保存的に、または非保存的に、の何れかで置換され得る。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」という用語は、ペプチド中のネイティブ配列に存在するアミノ酸を、類似の立体的性質を有する天然もしくは非天然のアミノまたはペプチド模倣物と置き換えることを指す。置換しようとするネイティブアミノ酸の側鎖が極性または疎水性の何れかである場合、保存的置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体的性質を有することに加えて）天然アミノ酸、非天然アミノ酸によるか、または極性もしくは疎水性でもあるペプチド模倣部分によるものであるべきである。
【０１７７】
天然アミノ酸は典型的にはそれらの特性に従って分類されるので、本発明に従い、立体的に類似の非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換が保存的置換とみなされるという事実を踏まえれば、天然アミノ酸による保存的置換は、容易に確定され得る。
【０１７８】
非天然アミノ酸による保存的置換を生じさせるために、当技術分野において周知のアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然アミノ酸のペプチド模倣物は、当業者にとって公知の文献に十分に記述されている。
【０１７９】
保存的置換に影響を与える場合、アミノ酸置換は、側鎖において元のアミノ酸と同じまたは類似の官能基を有するべきである。
【０１８０】
本明細書中で使用される「非保存的置換」という句は、異なる電気化学的および／または立体的性質を有する別の天然または非天然アミノ酸による、親配列中に存在するようなアミノ酸の置換を指す。したがって、置換するアミノ酸の側鎖は、置換されるネイティブアミノ酸の側鎖よりも著しく大きい（または小さい）ものであり得、および／または置換されるアミノ酸とは著しく異なる電子特性を有する官能基を有し得る。このタイプの非保存的置換の例としては、アラニンに対するフェニルアラニンもしくはシクロヘキシルメチルグリシン、グリシンに対するイソロイシンまたは、アスパラギン酸に対するＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−の置換が挙げられる。本発明の範囲下に入るこれらの非保存的置換は、依然として抗菌特性を有するペプチドを構成するものである。
【０１８１】
本発明のペプチドのＮおよびＣ末端は官能基によって保護され得る。適切な官能基は、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５  ａｎｄ  ７，１９９１に記載されており、その教示は参照により本明細書中に組み込まれる。好ましい保護基は、例えば化合物の親水性を低下させ、親油性を上昇させることによって、それに連結された化合物の細胞への輸送を促進するものである。
【０１８２】
本発明のペプチドは浸透剤に（共有結合または非共有結合の何れかで）連結され得る。
【０１８３】
本明細書中で使用される場合、「浸透剤」という句は、細胞膜を横切る連結ペプチドの何れかの移行を促進する異種物質を指す。
【０１８４】
一実施形態によれば、浸透剤はペプチドであり、ペプチド結合を介して（直接または非直接の何れかで）ペプチドに連結される。
【０１８５】
典型的には、ペプチド浸透剤は、リジンまたはアルギニンなどの正荷電アミノ酸の高い相対的存在量の何れかを含有するアミノ酸組成を有するか、または極性／荷電アミノ酸および非極性、疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有する。無毒性かつ効率的に細胞に浸透し得、本発明のいくつかの実施形態に従って使用するのに適し得るＣＰＰの非限定例としては、ＴＡＴ（ＨＩＶ−１由来の転写活性化因子）、ｐＡｎｔｐ（ペネトラチンとも呼ばれる、ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメイン転写因子）およびＶＰ２２（単純ヘルペスウイルス由来）が挙げられる。ＣＰＰ−カーゴ接合体を生成させるための、およびこのような接合体を細胞に感染させるためのプロトコールは、例えば、Ｌ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅら［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９５）１５（１１）：７１５８−７１６７］、Ｆａｗｅｌｌ  Ｓら［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，（１９９４）９１：６６４−６６８］およびＪｉｎｇ  Ｂｉａｎら［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（２００７）１００：１６２６−１６３３］で見られ得る。
【０１８６】
本発明のペプチドはまた、非アミノ酸部分、例えば、ペプチドに連結される疎水性部分（様々な直鎖、分岐鎖、環状、多環式または複素環式炭化水素および炭化水素誘導体）；非ペプチド浸透剤；特に化合物が直鎖状である場合、化合物の末端に連結させて分解を抑える様々な保護基も含み得る。本化合物に存在する化学（非アミノ酸）基は、分解またはクリアランスの減少；様々な細胞ポンプによる反発の減少、免疫原性活性の改善、様々な投与方式の改善（腸を通じるなど、様々な障壁を通じた浸透を可能にする様々な配列の連結など）；特異性改善、親和性改善、毒性低下などの様々な生理学的特性の改善のために含まれ得る。
【０１８７】
本発明のペプチドのアミノ酸配列構成成分を他の非アミノ酸剤に連結させることは、共有結合による、非共有コンプレクション（ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ）による、例えば分解または開裂して、持続放出可能な化合物を生成させ得る疎水性ポリマーとコンプレクション（ｃｏｍｐｌｅｘｉｏｎ）することによる；リポソームまたはミセル中にペプチドのアミノ酸部分を封入して、本発明の最終ペプチドを生成させることによるものであり得る。会合は、他の成分（リポソーム、ミセル）内のアミノ酸配列の封入または本発明の最終ペプチドを生成させるためのポリマー内のアミノ酸配列の浸透によるものであり得る。
【０１８８】
本発明のいくつかの実施形態のペプチドは、ペプチド合成の技術分野の熟練者にとって公知の何らかの技術、例えば、本明細書中で以下にさらに記載するものなど、固相技術および組み換え技術など（限定されない）によって合成および精製され得る。
【０１８９】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば上記の組み合わせ）の形態で提供される、１本鎖または２本鎖核酸配列を指す。
【０１９０】
新規の「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」系は、宿主のゲノムへのＤＮＡの組み込みの調節に関与するので、本教示は、本明細書中に記載の「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」系の構成成分が、標的ゲノムへの関心のある発現産物の組み込みの調節のために使用され得ることを示唆する。
【０１９１】
したがって、具体的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは関心のある発現産物をコードする核酸配列を含む。
【０１９２】
本明細書中で使用される場合、「関心のある発現産物」という用語は、関心のあるＲＮＡおよび／またはタンパク質を指す。
【０１９３】
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物の発現および／または活性はＡｉｍＸに依存し；すなわち、ＡｉｍＸの発現は、関心のある発現産物の発現および／または活性を調節する。
【０１９４】
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物は、抗体、成長因子、サイトカインなどの治療用発現産物である。
【０１９５】
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物はＤＮＡ編集剤である。
【０１９６】
具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤発現および／または活性はＡｉｍＸに依存し；すなわち、ＡｉｍＸの発現は、ＤＮＡ編集剤の発現および／または活性を調節する。
【０１９７】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ編集剤」という用語は、細胞のゲノムにおいて配列変化を導入可能である薬剤を指す。これらの標的配列の改変は、機能喪失または機能獲得の改変を含み得る。このような改変の非限定例としては、ミスセンス突然変異、すなわちタンパク質中のあるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基により変化させ、それによりタンパク質の活性を調整する突然変異；ナンセンス突然変異、すなわちタンパク質において停止コドン、例えばタンパク質が短縮され活性を欠くようにさせる早期停止コドン、を導入する突然変異；フレームシフト突然変異、すなわちタンパク質の読み枠を変化させ、その結果、読み枠に停止コドンを導入することによって早期の終結を引き起こし得る（例えば活性を欠く短縮タンパク質）、核酸（１つまたは複数）の突然変異、通常は欠失もしくは挿入、またはアミノ酸配列がより長くなり（例えば読み過ごしタンパク質）、タンパク質の二次または三次構造に影響を及ぼし、その結果、タンパク質の活性が調整されるもの；活性が調整される、フレームシフト突然変異または停止コドン突然変異の修飾（すなわち停止コドンがアミノ酸コドンに突然変異される場合）ゆえの読み過ごし突然変異；欠失突然変異、すなわち、遺伝子配列中でコード核酸が欠失し、その結果、フレームシフト突然変異またはインフレーム突然変異（コード配列内での１つ以上のアミノ酸コドンの欠失）が起こり得る突然変異；挿入突然変異、すなわち、遺伝子配列にコードまたは非コード核酸が挿入され、その結果、１つ以上のアミノ酸コドンのフレームシフト突然変異またはインフレーム挿入を生じさせ得る突然変異；反転、すなわち反転したコードまたは非コード配列を生じさせる突然変異；スプライシング突然変異、すなわち、異常なスプライシングまたはスプライシング不良を引き起こす突然変異；および重複突然変異、すなわち、重複コードまたは非コード配列を生じさせ、インフレームであり得るかまたはフレームシフトを引き起こし得る突然変異が挙げられる。
【０１９８】
具体的な実施形態によれば、遺伝子のＤＮＡ配列改変は、その遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を含み得る。
【０１９９】
他の具体的な実施形態によれば、遺伝子配列の改変は、遺伝子の両対立遺伝子を含む。このような例において、遺伝子はホモ接合型またはヘテロ接合型であり得る。
【０２００】
具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ゲノムへの外来核酸配列の組み込みを可能にする。
【０２０１】
したがって、具体的な実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ編集剤によって細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を含む。
【０２０２】
ＤＮＡゲノム編集の方法は当技術分野で周知であり［例えば、その内容がそれらの全体において参照により組み込まれる、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｍａｒｔｉｎら“Ｎｅｗ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｓａｆｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（２０１１）ＤＯＩ：１０．５７７２／１０６２２；Ｍｅｎｋｅ  Ｄ．Ｇｅｎｅｓｉｓ（２０１３）５１：−６１８；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１２８８−１２９２；Ｓａｎｔｉａｇｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００８）１０５：５８０９−５８１４；国際公開第２０１４０８５５９３号パンフレット、同第２００９０７１３３４号パンフレットおよび同第２０１１１４６１２１号パンフレット；米国特許第８７７１９４５号明細書、同第８５８６５２６号明細書、同第６７７４２７９号明細書および米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書、同第２００５００２６１５７号明細書、同第２００６００１４２６４号明細書を参照］、インテグラーゼおよび改変ヌクレアーゼを含むが限定されない。ＤＮＡゲノム編集のための物質は、公的に利用可能な源から設計し得る（ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｐｕｂｌｉｃａｌｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ）か、またはＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ，Ａｄｄｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し得る。
【０２０３】
本発明の具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はインテグラーゼである。
【０２０４】
本明細書中で使用される場合、「インテグラーゼ」という用語は、核酸配列を別の核酸配列（例えば細胞のゲノム）に組み込むことが可能であるリコンビナーゼを指す。具体的な実施形態によれば、インテグラーゼは部位特異的リコンビナーゼであり、すなわち、各核酸がリコンビナーゼに対する少なくとも１個の認識部位を含む、２個の核酸間の配列の組み込みがもたらされる。このようなインテグラーゼは当技術分野で公知であり［例えば、その内容がそれらの全体において参照により組み込まれる、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｍａｒｔｉｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（２０１１）ＤＯＩ：１０．５７７２／１０６２２，Ｒｅｃｃｈｉａ  Ａら、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０１１）１１（５）：３９９−４０５，Ｌｉｍ  ＫＩ，ＢＭＢ  Ｒｅｐ．（２０１５）４８（１）：６−１２および米国特許出願公開第２００７０１９０６０１号明細書を参照］、例えば、レトロウイルスインテグラーゼ（ＨＩＶインテグラーゼ）およびファージインテグラーゼ（例えばｐｈｉＣ３１インテグラーゼ、ラムダインテグラーゼ）が挙げられる。
【０２０５】
具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は改変インテグラーゼである。
【０２０６】
メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）、転写−活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などの改変エンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集は当技術分野で周知であり、例えばその内容がそれらの全体において参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１５／０３３３４３号パンフレットに記載されている。
【０２０７】
他の具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのエフェクタータンパク質（例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）およびＴＡＬＥＮからなる群から選択される。
【０２０８】
具体的な実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、（本明細書中で「発現ベクター」とも呼ばれる）核酸コンストラクトの一部である。
【０２０９】
本明細書中で使用される場合、「核酸コンストラクト」および「発現ベクター」という用語は、宿主細胞中で関心のある具体的な発現産物（すなわち遺伝子）を導入するために設計された核酸ベクターを指す。発現は、一過性もしくは一貫性で、エピソーム性であり得るか、または宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。具体的な実施形態によれば、発現はプラスミドなどの伝染性の遺伝要素上にある。
【０２１０】
ゆえに、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトは、このベクターを原核生物、真核生物または好ましくはその両方における複製および組み込みに適したものにするさらなる配列を含む（例えばシャトルベクター）。    さらに、典型的なクローニングベクターは、制御エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳終結因子、ポリアデニル化シグナル転写終結シグナルなど、および関心のある発現産物のクローニングのための少なくとも１つのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有し得る。例として、このようなコンストラクトは典型的には５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲまたはその一部を含む。
【０２１１】
したがって、本発明の態様によれば、ＡｉｍＰペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡｉｍＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドおよび／またはＡｉｍＸポリヌクレオチドおよびそれらの何れかの組み合わせ；およびＭＣＳを含む核酸コンストラクトが提供される。
【０２１２】
本発明の別の態様によれば、ＡｉｍＰペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡｉｍＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドおよび／またはＡｉｍＸポリヌクレオチドおよびそれらの何れかの組み合わせ；およびポリヌクレオチドの発現を指示するための、ＡｉｍＰ、ＡｉｍＲ、ＡｉｍＲ応答配列および／またはＡｉｍＸにとって異種であるシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトが提供される。
【０２１３】
したがって、具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクトは本明細書中、上記のポリヌクレオチド（１）〜（１１）の何れかを含み得る。
【０２１４】
本発明の教示はさらに、ポリヌクレオチドが核酸コンストラクト系の一部であり、それによってアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系の構成成分が異なるコンストラクトから発現されることを企図する。
【０２１５】
したがって、本発明の具体的な実施形態によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１つをそれぞれ発現する少なくとも２つの核酸コンストラクトを含む核酸コンストラクト系を提供する。
【０２１６】
したがって、具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクト系は、本発明の各ポリヌクレオチドに対する個々の核酸コンストラクト（すなわち、ＡｉｍＰ、ＡｉｍＲ、ＡｉｍＲ応答配列およびＡｉｍＸ）を含む。
【０２１７】
他の具体的な実施形態によれば、単一のコンストラクトは、本明細書中、上記のように、本発明のいくつかのポリヌクレオチドを含む。
【０２１８】
具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクト系は、細胞の染色体へのポリヌクレオチドの組み込みを可能にする少なくとも１つのコンストラクトおよびポリヌクレオチドのエピソーム発現を可能にする少なくとも１つのコンストラクトを含む。
【０２１９】
本明細書中で使用される場合、「マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）」という用語は、核酸配列を発現ベクターにクローニングする目的で、少なくとも１つの制限部位、およびより典型的にはいくつかの制限部位を含む核酸配列を指す。ＭＣＳは、関心のある標的発現産物を消化ＭＣＳ部位に挿入し得るように、具体的な制限酵素によって認識され消化される。当技術分野で公知の何らかのＭＣＳが、本発明の核酸コンストラクトにおいて使用され得る。これは、ＭＣＳを有する当技術分野において公知の様々な市販のベクター（例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など）から得られ得る。
【０２２０】
シス作用性制御配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、ならびにある種の条件下でのみヌクレオチド配列の誘導性発現を指示するものを含む。
【０２２１】
本発明のシス制御配列は、本発明のポリヌクレオチド（すなわちＡｉｍＰ、ＡｉｍＲ、ＡｉｍＲ応答配列およびＡｉｍＸ）にとって異種である。
【０２２２】
本明細書中で使用される場合、「異種」という用語は、異なる遺伝的位置に由来することを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、遺伝子工学的手法により、異なる供給源に由来するベクターに配置され得、それは異種ポリヌクレオチドであり；そのナイーブコード配列から取り除かれ、ネイティブ配列以外のコード配列に操作可能に連結されるプロモーターは、異種プロモーターである。
【０２２３】
具体的な実施形態によれば、核酸コンストラクトは、構成的または誘導的に細胞中のポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。
【０２２４】
真核プロモーターは、典型的には、２種類の認識配列、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。転写開始部位の上流の２５〜３０塩基対に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始させるよう指示することに関与すると考えられる。他の上流プロモーターエレメントは転写が開始される際の速度を決定する。
【０２２５】
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトによって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。細胞型特異的および／または組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的なアルブミンなどのプロモーター［Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７］、リンパ系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅら、（１９８８）Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５］；特にＴ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏら、（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３］および免疫グロブリン；［Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３７２９−７４０］、ニューロフィラメントプロモーターなどのニューロン特異的プロモーター［Ｂｙｒｎｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６］または乳清プロモーターなどの乳腺特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。
【０２２６】
エンハンサーエレメントは、連結された相同または異種プロモーターから最大１，０００倍まで転写を刺激し得る。エンハンサーは、転写開始部位から下流または上流に配置されたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞型に適している。本発明のいくつかの実施形態に適している他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせは、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなどの様々なレトロウイルスからの長期反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｒｅｐｅａｔ）由来のものを含む。参照により本明細書中に組み込まれる、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８３を参照のこと。
【０２２７】
具体的な実施形態によれば、プロモーターはウイルス（例えばファージ）プロモーターである。
【０２２８】
具体的な実施形態によれば、プロモーターは細菌性プロモーターである。
【０２２９】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、異種転写開始部位から、その天然の設定における転写開始部位からである場合とほぼ同じ距離に配置される。しかし、当技術分野で公知であるように、この距離の幾分かの変動はプロモーター機能を喪失させることなく適応させ得る。
【０２３０】
ｍＲＮＡ翻訳の効率を高めるために、ポリアデニル化配列も発現ベクターに付加し得る。正確かつ効率的なポリアデニル化には、２つの異なる配列エレメント：ポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵまたはＵに富む配列および１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する６ヌクレオチドの高度に保存された配列、ＡＡＵＡＡＡが必要である。本発明のいくつかの実施形態に適している終結およびポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０由来のものを含む。
【０２３１】
既に記載のエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、典型的には、クローン化核酸の発現レベルを向上させること、または組み換えＤＮＡを保有する細胞の同定を容易にすることを目的とする他の特殊化エレメントを含有し得る。例えば、多くの動物ウイルスは、許容細胞型においてウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを保有するプラスミドは、適切な因子がプラスミド上に担持されているかまたは宿主細胞のゲノムとともに担持されているかの何れかの遺伝子によって提供される限り、エピソーム的に複製される。
【０２３２】
本ベクターは真核レプリコンを含んでいてもよいし、または含まなくてもよい。真核レプリコンが存在する場合、適切な選択可能マーカーを用いて真核細胞中でベクターを増幅可能である。ベクターが真核レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。代わりに、組み換えＤＮＡは、改変細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を指示する。
【０２３３】
本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、本明細書中の上記および下記に詳細に記載のように、例えば単一ｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列およびプロモーター−キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含み得る。
【０２３４】
具体的な実施形態によれば、本コンストラクトは、本発明のポリヌクレオチドを含むポリシストロニックなｍＲＮＡをコードする。
【０２３５】
単一の核酸コンストラクトから少数の遺伝子を発現させるために様々なコンストラクトスキームを利用し得る。具体的な実施形態によれば、本コンストラクトは本発明のポリヌクレオチドを含むポリシストロニックなｍＲＮＡをコードし；すなわち、本ポリヌクレオチドは、核酸コンストラクトの単一プロモーター配列からのポリシストロニックなメッセージとして同時転写され得る。単一のポリシストロニックなメッセージから全ての遺伝子の同時翻訳を可能にするために、ＩＲＥＳ配列の下流のポリヌクレオチドセグメントの翻訳を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むリンカー配列を介して異なるポリヌクレオチドセグメントを転写的に融合し得る。この場合、本発明のポリヌクレオチドの異なる組み合わせのコード配列を含む転写されたポリシストロニックなＲＮＡ分子は、ポリシストロニックなＲＮＡ分子のキャップ付加５’末端および内部ＩＲＥＳ配列の両方から翻訳される。
【０２３６】
あるいは、各２つのポリヌクレオチドセグメントは、核酸コンストラクトで形質転換しようとする細胞により発現されるプロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ認識部位を介して翻訳的に融合され得る。この場合、翻訳されたキメラポリペプチドは細胞により発現されたプロテアーゼによって切断される。
【０２３７】
さらにあるいは、本発明のいくつかの実施形態の核酸コンストラクトは、各々が別個のポリヌクレオチドを個々に発現するためのものである少なくとも２つのプロモーター配列を含み得る。同一であってもよいし、または異なっていてもよいこれらの少なくとも２つのプロモーターは、１つ以上の細胞型において機能的な、構成的、組織特異的または制御可能（例えば誘導性）プロモーターであり得る。
【０２３８】
ポリペプチドの分泌が所望される場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、分泌をもたらすシグナルペプチドをコードする核酸配列に対してインフレームで連結される「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」系（例えばＡｉｍＰ）の構成成分をコードする核酸配列を含む融合ポリペプチドとして発現され得る。具体的な実施形態によれば、シグナル配列はＮ末端シグナル配列である。具体的な実施形態によれば、シグナルペプチドはペプチド分泌の際に切断される。
【０２３９】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１５１（１）：１５９−１６４；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２４３７−２４４２）およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）などの分泌型細菌タンパク質に対する遺伝子由来であり得る。他の原核シグナルとしては、例えば、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー由来のシグナル配列およびクオラムセンシング系のＰｈｒファミリーのシグナル配列が挙げられる［例えば、Ｐｏｔｔａｔｈｉｌ，Ｍ．＆Ｌａｚａｚｚｅｒａ，Ｂ．Ａ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．８，ｄ３２−４５（２００３）に記載］。
【０２４０】
具体的な実施形態によれば、シグナル配列は配列番号３４２に記載のとおりである。
【０２４１】
細胞でのベクターの維持を確実にする選択可能マーカー遺伝子も発現ベクターに含まれ得る。好ましい選択可能マーカーとしては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）およびテトラサイクリンなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択可能マーカーはまた、最少培地上または毒性代謝産物の存在下で細胞が増殖することも可能にし得、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるものなどの生合成遺伝子も含み得る。
【０２４２】
挿入されたコード配列の転写および翻訳に対して必要なエレメントを含有すること以外に、本発明のいくつかの実施形態の発現コンストラクトはまた、発現されるポリペプチドの安定性、産生、精製、収率または毒性を増強するために改変されている配列も含み得る。したがって、例えば、本発明のいくつかの実施形態のペプチド（例えばＡｉｍＰ）は、成熟ペプチドを産生するために細胞外プロテアーゼによって処理される配列を含有するプロペプチドであり得る。具体的な実施形態によれば、細胞外プロセシングのためのシグナルは、配列番号３４８で示されるとおりである。
【０２４３】
または、例えば、本発明のいくつかの実施形態のタンパク質（例えばＡｉｍＰ）および異種タンパク質を含む融合タンパク質または切断可能な融合タンパク質の発現を操作し得る。このような融合タンパク質は、融合タンパク質がアフィニティークロマトグラフィーによって；例えば異種タンパク質に特異的なカラム上での固定化によって容易に単離され得るように設計され得る。切断部位が本発明のいくつかの実施形態のタンパク質と異種タンパク質との間で操作される場合、本発明のいくつかの実施形態のタンパク質は、切断部位を破壊する適切な酵素または薬剤での処理によってクロマトグラフィーカラムから放出され得る［例えば、Ｂｏｏｔｈら（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：６５〜７０；およびＧａｒｄｅｌｌａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５８５４−１５８５９］。
【０２４４】
必要に応じて、組み換えポリペプチドの回収は培養中の適切な時間の後に行われる。「組み換えポリペプチドを回収する」という句は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を回収することを指し、分離または精製のさらなる段階を意味する必要はない。上記にもかかわらず、本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよびディファレンシャル・ソルビライゼーション（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）などであるが限定されない様々な標準的タンパク質精製技術を使用して精製され得る。
【０２４５】
適切な場合には、本ポリヌクレオチドは形質転換された生物における発現増加のために最適化され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、発現改善のために好ましいコドンを用いて合成され得る。
【０２４６】
発現ベクター中に含まれる個々のエレメントは様々な立体配置で配置され得ることが認められよう。例えば、エンハンサーエレメント、プロモーターなど、および「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」系の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列（１つまたは複数）でさえも、「頭−尾」立体配置で配置され得、逆相補体（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として、または相補的立体配置で、逆平行鎖として存在し得る。このような様々な立体配置が発現ベクターの非コードエレメントで生じる可能性がより高い一方で、発現ベクター内のコード配列の代替的立体配置も想定される。
【０２４７】
哺乳動物発現ベクターに対する例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳおよびそれらの誘導体が挙げられるが限定されない。
【０２４８】
細菌コンストラクトの例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターのｐＥＴシリーズが挙げられる［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）。
【０２４９】
酵母において、米国特許出願第５，９３２，４４７号明細書に記載のように、構成的または誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを使用し得る。あるいは、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用し得る。
【０２５０】
植物発現ベクターを使用する場合、コード配列の発現は多くのプロモーターによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４］またはＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１］を使用し得る。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター［Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０およびＢｒｏｇｌｉら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３］または熱ショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５］が使用され得る。これらのコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび当業者にとって周知の他の技術を用いて植物細胞に導入され得る。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ  ４２１−４６３を参照のこと。
【０２５１】
当技術分野で周知である昆虫および哺乳動物宿主細胞系などの他の発現系もまた、本発明のいくつかの実施形態により使用され得る。
【０２５２】
レトロウイルスなどの真核ウイルスからの制御エレメントを含有する発現ベクターも使用され得る。ＳＶ４０ベクターは、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２を含む。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしてはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥおよび、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞での発現に有効であることが示される他のプロモーターの指揮下でのタンパク質の発現を可能にする何らかの他のベクターが挙げられる。
【０２５３】
上記のように、ウイルスは、多くの場合、宿主防御機序を回避するために進化した非常に特殊化された感染病原体である。典型的には、ウイルスは特定の細胞型に感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、その天然の特異性を利用して、所定の細胞型を特異的に標的とし、それによって感染細胞に組み換え遺伝子を導入する。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される細胞のタイプに依存する。形質転換される細胞型に従い適切なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内であり、したがって、選択の考慮事項の一般的な説明は本明細書中では提供しない。組み換えウイルスベクターは、側方感染（ｌａｔｅｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）および標的特異性などの利点をもたらすので、本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのインビボ発現に有用である。
【０２５４】
本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチド、発現ベクターおよびポリペプチドを細胞に導入するために様々な方法を使用し得る。本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよび核酸コンストラクトは、本明細書中で以下に詳細にさらに記載のように、当技術分野で公知の何らかの方法によって細胞に導入され得る。あるいはまたはさらに、本明細書中に記載のポリペプチドを細胞自体と接触させ得る。
【０２５５】
細胞は特定の生物の内部、例えば哺乳動物の体内または植物の内部に含まれ得ることが認められよう。
【０２５６】
したがって、具体的な実施形態によれば、導入および／または接触はインビボで行われる。
【０２５７】
別の具体的な実施形態によれば、導入および／または接触はエクスビボまたはインビトロで行われる。
【０２５８】
本発明のいくつかの実施形態のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法を使用し得る。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９），Ｃｈａｎｇら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８およびＧｉｌｂｏａら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］で全般的に記載され、例えば、安定的または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組み換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。加えて、正−負選択法については、米国特許第５，４６４，７６４号明細書および同第５，４８７，９９２号明細書を参照のこと。
【０２５９】
ウイルス感染による核酸の導入は、ウイルスの感染性ゆえにより高い遺伝子移入効率が得られ得るので、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなどの他の方法を超えるいくつかの長所がある。
【０２６０】
現在好ましいインビボ核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）および脂質に基づく系など、ウイルスまたは非ウイルスコンストラクトによる遺伝子移入が挙げられる。遺伝子の脂質介在性移入に対する有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１４（１）：５４−６５（１９９６）］。遺伝子治療での使用に最も好ましいコンストラクトはウイルスであり、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスまたはレトロウイルスである。レトロウイルスコンストラクトなどのウイルスコンストラクトは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント（１つまたは複数）、またはオルタナティブスプライシング、核ＲＮＡ輸出もしくはメッセンジャーの翻訳後修飾などの他の手段によって遺伝子発現を調節する他のエレメントを含む。このようなベクターコンストラクトはまた、ウイルスコンストラクト中に既に存在しない限り、パッケージングシグナル、長い末端反復配列（ＬＴＲ）またはその一部、ならびに使用されるウイルスに適切な正および負鎖プライマー結合部位も含む。陽イオン性脂質、ポリリジンおよびデンドリマーなどの、非ウイルス性である他のベクターが使用され得る。
【０２６１】
導入方法にかかわらず、本教示は、本明細書中に記載のように、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトおよび／またはポリペプチドを含む単離細胞を提供する。
【０２６２】
本明細書中で使用される場合、「細胞」という用語は、原核または真核細胞を指す。本発明のいくつかの実施形態において使用され得る細胞の非限定例としては、コード配列を含有する、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；コード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、またはコード配列を含有するＴｉプラスミドなどの組み換え発現ベクターにより形質転換された植物細胞系が挙げられるが限定されない。
【０２６３】
具体的な実施形態によれば、細胞は細菌である。
【０２６４】
具体的な実施形態によれば、細胞は哺乳動物細胞である。
【０２６５】
具体的な実施形態によれば、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ１０８０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＢＨＫ、ナマルバ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される。
【０２６６】
別の具体的な実施形態によれば、細胞は初代細胞である。
【０２６７】
具体的な実施形態によれば、細胞は細胞株である。
【０２６８】
細胞は、血液、筋肉、神経、脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、胸腺、食道、胃、腸、腎臓、精巣、卵巣、毛髪、皮膚、骨、乳房、子宮、膀胱、脊髄または様々な種類の体液を含むが限定されない適切な組織由来であり得る。
【０２６９】
具体的な実施形態によれば、細胞は本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを内因的に発現しない。
【０２７０】
具体的な実施形態によれば、細胞は内因性にＡｉｍＲを発現する。
【０２７１】
本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、その天然の位置におけるネイティブ遺伝子の発現および生物のゲノムにおける発現レベルを指す。
【０２７２】
以下の実施例のセクションで示されるように、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系は、特定の標的部位への特定のＤＮＡの組み込みを調節するためにペプチドを使用する遺伝学的系ある。したがって、本教示は、一般的に誘導性遺伝子発現について本明細書上記で記載される、および特にゲノム編集を調節するための、ポリヌクレオチド、核酸コンストラクトおよび／またはポリペプチドの使用を示唆する。
【０２７３】
したがって、本発明の一態様によれば、関心のある発現産物を発現する方法であって、
（ｉ）関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、ここでＡｉｍＲがＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含むこと；および
（ｉｉ）ＸＸＸＸＧＧ／Ａのアミノ酸配列を含むＡｉｍＰペプチドと細胞を接触させ、ここでＡｉｍＰペプチドがＡｉｍＲポリペプチドを結合させ、ＡｉｍＲ応答配列からＡｉｍＲポリペプチドを解離させることが可能であること、
を含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
【０２７４】
本発明の別の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする異種核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、このＡｉｍＲがＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲがヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
【０２７５】
具体的な実施形態によれば、本方法は、ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。
【０２７６】
本発明の別の態様によれば、関心のある発現産物を発現させる方法であって、関心のある発現産物をコードする核酸配列に操作可能に連結されるＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み；核酸コンストラクトが、ＡｉｍＲポリヌクレオチドの発現を指示するためのＡｉｍＲポリヌクレオチドおよびＡｉｍＲにとって異種のシス作用性制御エレメントを含み、
ＡｉｍＲが、ＡｉｍＲ応答配列を結合させるためのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＡｉｍＲが、ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフおよびテトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインを含み、それにより関心のある発現産物を発現させる、方法が提供される。
【０２７７】
具体的な実施形態によれば、本方法は、細胞をＡｉｍＰペプチドまたはそれをコードする核酸配列と接触させることを含む。
【０２７８】
具体的な実施形態によれば、本方法は、ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御することが可能な物質と細胞を接触させることを含む。
【０２７９】
本明細書中で使用される場合、「発現を下方制御する」という句は、転写および／または翻訳を妨害する様々な分子を使用してゲノムレベル（例えば相同組み換えおよび部位特異的エンドヌクレアーゼ）および／または転写レベル（例えばＲＮＡサイレンシング剤、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、同時抑制および翻訳抑制）で、またはタンパク質レベル（例えばアプタマー、低分子および阻害ペプチド、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素、抗体など）で発現を下方制御することを指す。
【０２８０】
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は核酸剤である。
【０２８１】
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのエフェクタータンパク質（例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３）である。
【０２８２】
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡである。
【０２８３】
具体的な実施形態によれば、下方制御剤はＲＮＡｉである。
【０２８４】
具体的な実施形態によれば、発現を下方制御することは、それぞれＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロットによって検出される場合にｍＲＮＡおよび／またはタンパク質が存在しないことを指す。
【０２８５】
他の具体的な実施形態によれば、発現を下方制御することは、それぞれ下方制御剤の非存在下での場合と比較したときの、ＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロットによって検出される場合のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下を指す。減少は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％減少であり得る。
【０２８６】
以下の実施例のセクションで開示されるＡｉｍＸの発現および／または活性を下方制御するために発明者らによって使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は新規であるので；本発明の一態様によれば、ＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御可能である単離核酸剤が提供される。
【０２８７】
具体的な実施形態によれば、下方制御剤は、ＡｉｍＸの発現および／または活性を下方制御可能である。
【０２８８】
本明細書中で使用される場合、「発現する」または「発現」は、核酸および／またはタンパク質レベルでの遺伝子発現を指す。発現は当技術分野で公知の方法を用いて判定し得るが、例えば選択可能マーカー遺伝子、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ分析、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡ配列決定、ウエスタンブロット分析および免疫組織化学に限定されない。
【０２８９】
関心のある発現産物の発現の結果、活性が調整される場合、ＤＮＡ組み込みの有効性の認定はまた、活性を決定することによっても判定され得る。
【０２９０】
さらに、当業者は、ポリヌクレオチドまたはコンストラクトでのＤＮＡ組み込み事象を受けた形質転換細胞を効率的に選択するための陽性および／または陰性選択マーカーを含むノックイン／ノックアウトコンストラクトを容易に設計し得る。陽性選択は、外来ＤＮＡを取り込んだクローンの集団を濃縮するための手段を提供する。このような陽性マーカーの非限定例としては、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、グルタミンシンテターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧペプチドおよび、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンおよびブラスチシジンＳ耐性カセットなどの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。陰性選択マーカーは、ランダムな組み込みおよび／またはマーカー配列（例えば陽性マーカー）の排除に対して選択するために必要である。このような陰性マーカーの非限定例としては、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を細胞傷害性ヌクレオシド類似体に変換する単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＰＴ）が挙げられる。
【０２９１】
具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物は細胞に対して内因性である。
【０２９２】
他の具体的な実施形態によれば、関心のある発現産物は細胞に対して外来性である。
【０２９３】
上記のように、関心のある発現産物はＤＮＡ編集剤であり得る。したがって、具体的な実施形態によれば、本方法は、ＤＮＡ編集剤によって細胞のゲノムに組み込もうとする核酸配列を細胞に導入することを含む。
【０２９４】
有効性を認定し、細胞のゲノムへの核酸配列の組み込みを検出するための方法は当技術分野で周知であり、これには、ＤＮＡ配列決定、電気泳動、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイおよびハイブリッド形成アッセイ、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、インシトゥハイブリッド形成、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロット分析が含まれるが限定されない。
【０２９５】
別の態様によれば、
（ｉ）ＡｉｍＲ応答配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉ）このＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＡｉｍＰペプチド；および／または
（ｉｖ）このＡｉｍＲ応答配列の発現および／または活性を下方制御可能である物質
のうちの少なくとも２つを包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させることが特定される製品が提供される。
【０２９６】
本製品は、２つ、３つまたは全て；すなわち（ｉ）＋（ｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉ）＋（ｉｖ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）、（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｖ）、（ｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）または（ｉ）＋（ｉｉ）＋（ｉｉｉ）＋（ｉｖ）を含み得る。
【０２９７】
別の態様によれば、
（ａ）本発明の（２）〜（６）ポリヌクレオチドまたはその機能的断片または本明細書中の上記に記載のものを含む核酸コンストラクトのうち少なくとも１つ；および
（ｂ）ＡｉｍＰペプチド、ＡｉｍＰポリヌクレオチド、その機能的断片、それらを含む核酸コンストラクトまたは本明細書中の上記に記載のようなＡｉｍＲ応答配列下方制御剤のうち少なくとも１つ
を包装する包装材料を含む、関心のある発現産物を発現させることが特定される製品が提供される。
【０２９８】
具体的な実施形態によれば、ＡｉｍＲをコードするポリヌクレオチドは、ＡｉｍＲポリヌクレオチドの発現を指示するためのＡｉｍＲにとって異種のシス作用性制御エレメントを含む核酸コンストラクトに含まれる。
【０２９９】
具体的な実施形態によれば、本製品はマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む。
【０３００】
具体的な実施形態によれば、本製品は関心のある発現産物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０１】
本発明のこれらの態様の具体的な実施形態によれば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および／または（ｉｖ）または（ａ）および（ｂ）は別個の容器に包装される。
【０３０２】
本発明のこれらの態様のさらに他の具体的な実施形態によれば、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および／または（ｉｖ）または（ａ）および（ｂ）はｃ−処方中にある。
【０３０３】
本願から練られた特許の存続期間中に、多くの関連するＤＮＡ編集剤が開発されることが予想され、ＤＮＡ編集剤という用語の範囲は、全てのこのような新しい技術を先験的に含むものとする。
【０３０４】
本明細書中で使用される場合、「約」という用語は±１０％を指す。
【０３０５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびそれらの活用形は、「含むが限定されない」を意味する。
【０３０６】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「含み、それに限定される」ことを意味する。
【０３０７】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、組成物、方法または構造がさらなる成分、段階および／または部分を含み得るが、さらなる成分、段階および／または部分が特許請求の範囲の組成物、方法または構造の基本的および新規な特徴を実質的に変えない場合に限る。
【０３０８】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈からの明らかな別段の指示がない限り、複数形への言及を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【０３０９】
本出願を通じて、本発明の様々な実施形態は範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な部分的範囲ならびにその範囲内の個々の数値全てを具体的に開示しているとみなすべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびに例えば１、２、３、４、５および６のようなその範囲内の個々の数など、部分的範囲を具体的に開示しているとみなすべきである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
【０３１０】
本明細書中で数値範囲が示されるときはいつでも、それは示された範囲内の何らかの引用される数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指定数と第２の指定数の「範囲にあること／その間の範囲にある」および第１の指定数から第２の指定数までの「範囲にあること／範囲にある」は、本明細書中で交換可能に使用され、第１および第２の指定数およびその間の分数および整数の数の全てを含むものとする。
【０３１１】
本明細書中で使用される場合、「方法」という用語は、所与の課題を達成するための、方式、手段、技術および手順を指し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者により、公知であるか、または公知の方式、手段、技術および手順から容易に開発されるかの何れかの、方式、手段、技術および手順が挙げられるが限定されない。
【０３１２】
特定の配列リストを参照するとき、このような参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラーまたは、塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変から生じる小さな配列変異を含む場合、その相補的配列に実質的に対応する配列も包含すると理解されるべきであるが、ただし、このような変異の頻度は、５０ヌクレオチド中１個未満、あるいは１００ヌクレオチド中１個未満、あるいは２００ヌクレオチド中１個未満、あるいは５００ヌクレオチドに１個未満、あるいは１０００ヌクレオチド中１個未満、あるいは５，０００ヌクレオチド中１個未満、あるいは１０，０００ヌクレオチド中１個未満であるものとする。
【０３１３】
【表３】
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2019535298.tif 000006
2019535298.tif 000007
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【０３１４】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特性は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることを理解されたい。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈に記載の本発明の様々な特性は、別個にまたは何らかの適切なサブコンビネーションで、または本発明の何らかの他の記載の実施形態で適切なようにも提供され得る。様々な実施形態の文脈に記載の特定の特性は、実施形態がそれらの要素なしでは操作不能でない限り、これらの実施形態の必須の特性と見なされるべきではない。
本明細書中、上記で描かれるような、および特許請求の範囲のセクションで主張される本発明の様々な実施形態および態様は、次の実施例で実験的な裏付けを得る。
実施例
【０３１５】
ここで、上記の説明と一緒に本発明のいくつかの実施形態を非限定的に例示する以下の実施例を参照する。
【０３１６】
一般に、本明細書中で使用される命名法および本発明で利用される実験方法には、分子的、生化学的、微生物学的および組み換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、全て、本明細書中で完全に示されるかのように参照により組み込まれる、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８０１，５３１号明細書；同第５，１９２，６５９号明細書および同第５，２７２，０５７号明細書で示されるような方法；”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照し；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献で広範に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８３９，１５３号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，８５０，５７８号明細書；同第３，８５３，９８７号明細書；同第３，８６７，５１７号明細書；同第３，８７９，２６２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；同第３，９３５，０７４号明細書；同第３，９８４，５３３号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，０３４，０７４号明細書；同第４，０９８，８７６号明細書；同第４，８７９，２１９号明細書；同第５，０１１，７７１号明細書および同第５，２８１，５２１号明細書；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．  Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと。他の一般的な参考文献はこの文書を通じて提供する。その中の手順は当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。そこに含有される情報は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。
材料および方法
【０３１７】
オリゴおよび試薬−オリゴは全て、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。合成ペプチドは、脱塩、純度９８％で、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ２．０Ｉｎｃ．（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。
【０３１８】
馴化培地の調製−手順の概略図を図１Ａで示す。具体的には、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充したＬＢ培地中でＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８の一晩培養物を１：５０希釈し、振盪しながら３７℃で光学密度（Ｏ．Ｄ）６００ｎｍ＝０．５に達するまで温置した。ファージ（ｐｈｉ２９、ｐｈｉ１０５、ｒｈｏ１４またはｐｈｉ３Ｔ）をＭＯＩ＝１で細菌培養物に添加し、３時間温置した。培地を４℃にて１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を０．２μｍフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｈａｔｍａｎ，ＣＡＴ＃１０４６２２００）でろ過した。３，０００ＮＭＷＬ（３ｋＤａ）のカットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，ＣＡＴ＃ＵＦＣ９００３２４）を使用することによって、ファージおよび大きい分子を培地からさらにろ過して除去した。培地中にファージが残存していないことを検証するためにプラークアッセイを行った。
【０３１９】
プロテイナーゼＫ処理−トリトリアキウム・アルブム（Ｔｒｉｔｒｉａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）由来のプロテイナーゼＫ−アガロース（Ｓｉｇｍａ，ＣＡＴ＃Ｐ９２９０）７．５ｍｇ（１回の反応あたり）を７５０μＬの滅菌水で２回洗浄し、次いで０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充した７５０μＬのＬＢで再懸濁した。その後、試験管を再度遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄したプロテイナーゼＫを含有する試験管に、１．５ｍＬのｐｈｉ３Ｔ由来の馴化培地または対照培地を添加した。培地をプロテイナーゼＫとともに３７℃で２時間温置した。培地を遠心分離し、上清を感染アッセイのために回収した。
【０３２０】
ファージ感染培養物の増殖動態−細菌の一晩培養物をＬＢ培地で１：１００希釈し、振盪しながら３７℃でＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．１に達するまで温置した。細菌培養物を室温で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、初期体積の１０％で０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充したＬＢ培地中でペレットを再懸濁した。馴化培地または合成アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドを補充した培地に、１：９（細菌対培地）の比で濃縮細菌培養物を添加し、室温で１時間温置した。その後、培養物にＭＯＩ＝０．１でファージを感染させた。９６ウェルプレート中でＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００プレートリーダーを使用して、６００ｎｍの波長で光学密度測定を行った。馴化培地または合成ペプチド添加を含まなかった感染実験については、希釈した一晩培養物を初期対数期まで増殖させ、次いで上記のように感染させた。
【０３２１】
溶原性に対する半定量的ＰＣＲアッセイ−細菌の一晩培養物をＯ．Ｄ６００ｎｍ＝０．１に達するまで１：１００希釈した。培地を上記のように（馴化培地または対照培地と）交換し、培養物を室温で１時間温置した。細菌にＭＯＩ＝５でｐｈｉ３Ｔを感染させた。馴化培地または対照培地の存在下で感染の０、１５、３０、４０および６０分後に細胞ペレットを回収した。ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（ＣＡＴ＃６９５０４）を用いてＤＮＡを抽出した。ファージｐｈｉ３Ｔ  ＤＮＡ、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡおよび組み込まれたファージと細菌ゲノムとの間の接合部を検出するための多重ＰＣＲアッセイは、Ｇｏｌｄｆａｒｂら２９において以前記載されたように行った。
【０３２２】
マススペクトロメトリー−３ｋＤａのＭＷカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて馴化培地をろ過し、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  ｕＥｌｕｔｉｏｎプレート（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて低分子量分画を脱塩した。試料を乾燥させ、分析まで−８０℃で保存した。全てのクロマトグラフィー段階に対してＵＬＣ／ＭＳグレードの溶媒を使用した。スプリットレスｎａｎｏ−Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（１０ｋｐｓｉ  ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ；Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて各試料を充填した。移動相は、Ａ）Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸およびＢ）アセトニトリル＋０．１％ギ酸であった。逆相Ｃ１８トラッピングカラム（内径１８０μｍ、長さ２０ｍｍ、粒径５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して試料の脱塩をオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）で行った。続いて、０．３５μＬ／分でＴ３  ＨＳＳナノカラム（内径７５μｍ、長さ２５０ｍｍ、粒径１．８μｍ；Ｗａｔｅｒｓ）を用いてペプチドを分離した。以下の勾配を用いて、カラムから質量分析計にペプチドを溶出させた：６５分で４％から３５％Ｂ、５分で３５％から９０％Ｂ、５分間９０％で維持し、次いで初期条件に戻した。ＦｌｅｘＩｏｎナノスプレー装置（Ｐｒｏｘｅｏｎ）を使用して、ナノＥＳＩエミッタ（１０μｍチップ；Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を通じて四重極オービトラップ質量分析計（Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）でｎａｎｏＵＰＬＣを連結させた。前駆体質量５７４．３３および２８７．６７、一価および二価形態のペプチドＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）を標的とする並行反応モニタリング（ＰＲＭ）モードでデータを取得した。ＭＳ２分解能を３５，０００に設定し、最大注入時間を２００ミリ秒に設定し、自動ゲインコントロールを２ｅ５に設定した。生データをＳｋｙｌｉｎｅソフトウェア３０バージョン３．５にインポートした。生成物イオン強度を抽出し、総曲線下面積を計算した。
【０３２３】
ＡｉｍＲ精製−Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ＰＣＲ（ＴＰＣＲ）３１を用いて、以下のプライマーを使用して、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にＡｉｍＲ（配列番号１）をクローニングした。
【０３２４】
【表４】
2019535298.tif 000009
【０３２５】
続いて、Ｃ末端６ｘＨｉｓタグとともにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞においてＡｉｍＲを発現させた。誘導剤として２００μＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を用いて１５℃で約〜１８時間、発現を行った。細胞ペレットを溶解緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１μｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）］中で再懸濁し、４℃で細胞破壊装置により破壊し、１５，０００ｇで３０分間清澄化した。清澄化した溶解物をＨｉｓＴｒａｐ＿ＦＦ＿５ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に載せ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールおよび２ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液で洗浄した。０．５Ｍイミダゾールを含有する同じ緩衝液を用いてＡｉｍＲを一段階でカラムから溶出させた。ＡｉｍＲを含有する分画をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＴＣＥＰで平衡化したサイズ排除カラム（ＨｉＬｏａｄ＿１６／６０＿Ｓｕｐｅｒｄｅｘ＿２００＿ｐｒｅｐｇｒａｄｅ，ＧＥ＿Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。純粋なＡｉｍＲを含有する分画をプールし、液体窒素を使用してアリコートで瞬間凍結した。
【０３２６】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＴＣＥＰを含有する緩衝液で平衡化した分析用ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ＿２００＿Ｉｎｃｒｅａｓｅ＿１０／３０  ＧＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に純粋なＡｉｍＲを注入した。純粋なＡｉｍＲの移動位置を以下のモル比でＡｉｍＲ−ペプチド混合物の移動位置と比較した：ＡｉｍＲおよびＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチド（１：２）、ＡｉｍＲおよびＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチド（１：１）。以下の既知のタンパク質／ポリマーの移動位置を監視することによってカラムを較正した（図４Ｃの挿入図）：ブルーデキストラン（２０００ｋＤａ）、サイログロブリン（６６９ｋＤａ）、アポフェリチン（４４３ｋＤａ）、β−アミラーゼ（２００ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、アルブミン（６６ｋＤＡ）および炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）。
【０３２７】
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）−−８０℃でＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で保存した２段階精製６ｘＨｉｓタグ付加ＡｉｍＲを氷上で融解させ、分析前に４℃で１０分間、２１，０００ｇで遠心分離した。ペプチド［ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）およびＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）］を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で最終濃度１００μＭまで可溶化した。ＡｉｍＲを２００ｎＭに希釈し、０．１％［ｖ／ｖ］プルロン酸（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）を含有するＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中で調製した、９〜４０００ｎＭの間で変動する１６種類の異なるペプチド濃度とともに温置した。およそ３μＬをＮＴ．ＬａｂｅｌＦｒｅｅ  Ｚｅｒｏ−Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）に充填し、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．ＬａｂｅｌＦｒｅｅデバイス（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ）に挿入した。Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．ＬａｂｅｌＦｒｅｅ機器（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して、２３℃で６０％ＭＳＴ出力（赤外線レーザー）および２０％ＬＥＤ出力でＭＳＴ実験を行った。正規化した初期蛍光と温度ジャンプおよび熱泳動後との間の比を計算し、３回の独立した実験操作から平均値を求めた（実験操作物は測定前に室温で２０分間温置した。）。ペプチド濃度に対する蛍光比のプロットを使用して、ファージタンパク質およびその同族ペプチドリガンドの結合能を評価した。
【０３２８】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ−ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ実験のために、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞培養物を１００ｍＬ中でＬＢ中０．１のＯ．Ｄまで３７℃で増殖させた。その後、５０ｍＬの培養物を室温で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、最終濃度１μＭでペプチド（ＳＡＩＲＧＡ、配列番号２６９）を含有するかまたはこれを欠くかの何れかの２５ｍＬのＬＢを用いてペレットを懸濁した。振盪しながら室温でのさらなる温置のために、培養物を置いた。次に培養物に、５ｘ１０７ＰＦＵ／ｍＬファージの最終プラーク形成単位（ＰＦＵ）を有するファージ（ＭＯＩ＝０．５）を感染させた。ファージ感染の１５分後、培養物を４℃で５分間、３０００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍＬの氷冷１ｘＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中で再懸濁した。
【０３２９】
ＤＮＡに対するタンパク質のホルムアルデヒド固定のために、１ｍＬのＰＢＳ再懸濁ペレットを６２．５μＬのホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １６％ホルムアルデヒド溶液（ｗ／ｖ）メタノール不含アンプル）と混合して、溶液内で１％（ｗ／ｖ）の最終ホルムアルデヒド濃度を得た。ホルムアルデヒド含有細胞懸濁液を穏やかに撹拌しながら室温で１０分間温置した。その後、７５μＬの２Ｍグリシン（ｆ．ｃ．１５０ｍＭ）を添加して残留ホルムアルデヒドを不活性化した。グリシン含有試料をさらに１０分間氷上で維持し、続いて４℃にて１分間、５５００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１ｍＬの氷冷１ｘＰＢＳで洗浄した。各試料について遠心分離および洗浄を３回反復した。
【０３３０】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよびプロテアーゼ阻害剤混合物（ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＵＬＴＲＡ  Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｒｏｃｈｅ）を含有する６００μＬの溶解緩衝液中で細胞ペレットを懸濁した。溶解緩衝液含有細胞を溶解マトリックスＢ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）０．１ｍｍシリカビーズ上に適用した。混合物およびビーズをＦａｓｔＰｒｅｐ−２４（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）装置に入れ、４℃で２０秒間、６ｍ／秒で激しく振盪した。次いで、製造者の説明書に従って、４℃にて１０，０００ｇで１分間の遠心分離によって、溶解させた細胞からビーズを分離した。続いて、溶解させた細胞混合物を含有する３００μＬの上清を１．５ｍＬのＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＴＰＸマイクロチューブ（ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）に移し、（製造者の説明書に従って）１０分間氷上で維持した。ＢｉｏＲｕｐｔｏｒ  ｐｌｕｓ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）装置を使用して、試料を４℃にて１５分間フルパワーで超音波処理した（３０秒オフ／オンサイクル）。超音波処理により、ＤＮＡを〜５００ｂｐの平均サイズにせん断した。超音波処理後、試料を４℃で１０分間、２０，０００ｇで遠心分離した。
【０３３１】
ＩＰ実験のために、溶解緩衝液および細胞内容物を含有する上清をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびデオキシコール酸塩と混合し、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＵＬＴＲＡ  Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｒｏｃｈｅ）を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％［ｗｔ／ｖｏｌ］デオキシコール酸ナトリウムを含有する最終ＩＰ−緩衝組成物を得た。次いで、抗６ｘＨｉｓタグ（登録商標）ＣｈＩＰグレード抗体（ａｂｃａｍ（ａｂ９１０８））を超音波処理した試料に添加し、４℃で一晩穏やかに混合した。並行して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（１００．０４Ｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＩＰ緩衝液で３回洗浄した。
【０３３２】
回転させながら室温で１時間混合することにより、１００μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧを用いて、ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体（３００μＬ）を捕捉した。０．７２μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｆ．ｃ．１ｍＭ）をその混合物に添加して、室温でＤＮａｓｅ活性を妨げた。ビーズを磁気スタンド（Ｑｉａｇｅｎ）に適用し、室温にてＩＰ緩衝液（２００μＬ）で３回洗浄した。ロッキングプラットフォーム上で６５℃にて１５分間、１００μＬおよび５０μＬの溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％［ｗｔ／ｖｏｌ］ＳＤＳ）を用いて２回の溶出段階を適用した。溶出液（１００μＬ）を５μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ  ｍＬ−１）とともに５０℃で１時間、続いて６５℃で６時間温置した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて免疫沈降ＤＮＡを回収した。次に、既存のプロトコール３２を用いて免疫沈降ＤＮＡをＮＧＳライブラリに変換し、７５ｎｔ長の読み取りデータを生成させるＮｅｘｔＳｅｑ５００  Ｉｌｌｕｍｉｎａ装置上で配列決定した。
【０３３３】
溶原性に対する配列決定に基づくアッセイ−細菌の一晩培養物をＯ．Ｄ６００ｎｍ＝０．１に達するまで１／１００希釈した。培地を上記のように交換して［ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）を含むかまたは含まない０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充したＬＢ］、室温で１時間温置した。感染多重度（ＭＯＩ）＝２で細菌にｐｈｉ３Ｔを感染させた。培地中の最終濃度１μＭのＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドの存在下または非存在下で感染の５、１０、２０および６０分後に細胞ペレットを回収した。ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（ＣＡＴ＃６９５０４）を用いてＤＮＡを抽出し、ＮｅｘｔＳｅｑ５００上でＩｌｌｕｍｉｎａに基づく全ゲノム配列決定に供した。各試料中の溶原菌の相対存在量は、一方の末端でプロファージＤＮＡに、および他方の末端で細菌ＤＮＡにまたがる組み込み接合部にマッピングされた読み取りデータに対する、連続した組み込み部位にマッピングされた読み取りデータの数を用いて推定した。
【０３３４】
ＣＲＩＳＰＲｉ実験−ファージ遺伝子を発現抑制する菌株の構築は、キシロースプロモーター２２によって調節されるｄＣａｓ９コンストラクトをＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８ゲノムのｌａｃＡ領域に挿入し、ｔｈｒＣ領域に対する構成的プロモーター下で選択遺伝子を標的とするスペーサーとともにｓｇＲＮＡを挿入することによって行った［ａｉｍＲを標的とするスペーサー：ＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣ（配列番号３５８）、ａｉｍＸを標的とするスペーサー：ＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＡ（配列番号３５９）］。ＣＲＩＳＰＲｉ株における感染アッセイは、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．２％キシロースを補充したＬＢ中で行った。
【０３３５】
ａｉｍＲ発現抑制ＣＲＩＳＰＲｉ株を背景としたａｉｍＲの相補性アッセイのために、以下のプライマーを使用して、ａｉｍＲをｐｈｉ３Ｔゲノムから増幅させた。
【０３３６】
【表５】
2019535298.tif 000010
【０３３７】
これらのプライマーは、それから上流領域の１５８塩基と一緒に、そのＣ末端の６ｘＨｉｓとともに、ａｉｍＲを増幅する。増幅断片をｐＢＳ１Ｃプラスミド（ＢＧＳＣから入手）にクローニングした。続いて、点突然変異およびギブソンアセンブリを含有するプライマーセットを用いて、補完されるａｉｍＲ遺伝子中のネイティブプロトスペーサー隣接モチーフを同義の点突然変異（ａｉｍＲ遺伝子のコドン＃２０でＣ−＞Ａ）によって変化させた。次いで、修飾遺伝子をＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムにおいてａｍｙＥ遺伝子座に組み込んだ。ａｉｍＲ発現抑制ＣＲＩＳＰＲｉ株の背景でａｉｍＸ相補性を構築した。このために、以下のプライマーを使用して、ａｉｍＸをｐｈｉ３Ｔゲノムから増幅させた。
【０３３８】
【表６】
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【０３３９】
これらのプライマーはその上流領域から６０塩基およびその下流領域から１０７塩基（遺伝子終結因子を含有）と一緒にａｉｍＸを増幅する。キシロースプロモーターを含有するように修飾されたｐＢＳ１Ｃプラスミドに増幅ａｉｍＸをクローニングし、次にＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノム中のａｍｙＥ遺伝子座に組み込んだ。
【０３４０】
ＲＮＡ−ｓｅｑ−ペプチドありおよびなしでの遺伝子発現の差を決定するために、１μＭ合成ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドの存在下または非存在下で、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充したＬＢ培地中で細菌を１時間温置した。その後、細菌にｐｈｉ３Ｔを感染させ（ＭＯＩ＝０．１）；感染の０、５、１０および２０分後に細胞ペレットを回収した。
【０３４１】
ＲＮＡ抽出およびＲＮＡ−ｓｅｑは、Ｄａｒら３３に記載のように行った。簡単に述べると、Ｆａｓｔｐｒｅｐホモジナイザー（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてペレットを溶解させ、ＦａｓｔＲＮＡ  ＰＲＯ  ｂｌｕｅキット（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，１１６０２５０５０）を用いて製造者の説明書に従ってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料をＴＵＲＢＯデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＭ２２３８）で処理し、断片化緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）で７２℃にて１：４５分間断片化した。２．５ｘＳＰＲＩビーズを添加することによって反応物を浄化した。ビーズを８０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、５分間風乾した。Ｈ２Ｏを用いてＲＮＡを溶出させた。Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＭＲＺＢ１２４２４）を使用することによってｒＲＮＡを枯渇させた。ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ、Ｅ７４２０）を用いて以下の調整を行い、鎖特異的ＲＮＡ−ｓｅｑを実施した：全てのクリーンアップ段階はｘ１．８ＳＰＲＩビーズを用いて行い、最終修復段階後に１回だけクリーンアップ段階を行った。
【０３４２】
ａｉｍＲ遺伝子のＣＲＩＳＰＲｉ発現抑制の効果を判定するために、初期対数期の細菌にｐｈｉ３Ｔを感染させ（ＭＯＩ＝０．１）、感染の２０分後に細胞ペレットを回収した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリを上記のように準備した。
【０３４３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００プラットフォームを用いてＲＮＡ−ｓｅｑライブラリの配列決定を行った。配列決定した読み取りデータをデマルチプレックス化し、アダプタは初期設定のパラメータでｆａｓｔｘ＿ｃｌｉｐｐｅｒを使用してトリミングした。初期設定パラメータとともにＮｏｖｏ  Ａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ）Ｖ３．０２．０２を用いて、読み取りデータを参照ゲノムにマッピングした（遺伝子アノテーションおよび配列は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｔｒ．１６８に対してはＧｅｎｂａｎｋ：ＮＣ＿０００９６４、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３に対してはＡＰ０１２４９６からダウンロードした。）。下流の分析および正規化されたゲノムワイドＲＮＡ−ｓｅｑを包含するマップは全て、Ｄａｒら３３に記載のとおりに作製した。
【０３４４】
示差的発現分析−合成ペプチドありおよびなしで感染の２０分後に各バイオロジカルレプリケートについて遺伝子あたりの読み取りデータを計算し、各レプリケートにおいてファージゲノムにヒットする全マッピング読み取りデータに対して正規化した。各条件における１遺伝子あたり平均３個のレプリケートのｌｏｇ１０変換を使用して、図４Ｉをプロットし、遺伝子ＡｉｍＸの倍率変化を計算した。
【０３４５】
ＡｉｍＲ相同体およびアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドコードの同定−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＩＭＧ）ウェブサーバ（ｉｍｇ（ｄｏｔ）ｊｇｉ（ｄｏｔ）ｄｏｅ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｅｒ／ｍａｉｎ（ｄｏｔ）ｃｇｉ）でＢＬＡＳＴオプションを用いてｐｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＲ受容体に対する相同体を検索した。ｐｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＲ（配列番号１１４）をクエリ配列として提供し、１ｅ−３５のｅ値閾値を有する全ての単離ゲノムに対して検索した。各ＡｉｍＲ相同体の遺伝子近隣は、ＩＭＧ「遺伝子近隣」という表示を介して目視で検査し、ファージタンパク質としてアノテーションされたタンパク質の隣に位置することが分かった遺伝子はプロファージで見られるものと見なした。各ＡｉｍＲ相同体に対してすぐ下流の遺伝子は、それがＩＭＧウェブサーバによって予測されるようにシグナルペプチドを含有した場合、それぞれのＡｉｍＰ遺伝子と見なした。すぐ下流の遺伝子にアノテーションされなかった場合、Ｅｘｐａｓｙ  Ｔｒａｎｓｌａｔｅ  Ｔｏｏｌ（ｗｅｂ（ｄｏｔ）ｅｘｐａｓｙ（ｄｏｔ）ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）を使用してＡｉｍＲ相同体のすぐ下流の遺伝子間領域を翻訳し、短い翻訳ＯＲＦをＡｉｍＰシグネチャについて調べた。この分析の結果を上記の表３で示す。
【０３４６】
プラスミド構築−以下のプライマーおよびオリゴヌクレオチドを用いてベクターを構築した。
【０３４７】
【表７】
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【０３４８】
コンストラクト＃１は、２つの構成成分：バクテリオファージＰｈｉ３ＴウイルスａｉｍＲ−ａｉｍＰ−ａｉｍＸ遺伝子座および本明細書中でＧＦＰと表記する蛍光レポーター遺伝子（Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓｆＧＦＰ（ｓｐ））を含む。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でプラスミドを増殖させ、続いてバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３ゲノムに形質転換することを可能にする標的シャトルプラスミド（ｐＤＲ１１１）に、両構成成分を挿入した。ｐＤＲ１１１は２つの配列を含有し、それぞれが、相同組み換えを通じてコンストラクト＃１の挿入を可能にする標的遺伝子（ａｍｙＥ）の５’末端または３’末端の何れかに適合する。さらに、ｐＤＲ１１１は、所望の挿入物、すなわちコンストラクト＃１、の選択を可能にするスペクチノマイシン抗生物質耐性（ｓｐｅｃ）遺伝子も含む。
【０３４９】
具体的には、ａｉｍＲ、ａｉｍＰおよびａｉｍＸコード遺伝子の遺伝子間スペースを含む、ａｉｍＲ、ａｉｍＰおよびａｉｍＸコード遺伝子を含有するバクテリオファージＰｈｉ３Ｔゲノムから、プライマーＡ＋Ｂを用いて、ａｉｍＲ−ａｉｍＰ−ａｉｍＸ遺伝子座（配列番号３７２）を直接増幅させた（Ｅｒｅｚ  Ｚら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１７；５４１（７６３８）：４８８−４９３）。
【０３５０】
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）最適化スーパーフォルダ−ＧＦＰを含有するプラスミドｐＤＲ１１１−ｓｆＧＦＰ（ｓｐ）から、プライマーＣ＋Ｄを用いてレポーターＧＦＰ遺伝子（配列番号３７３）を増幅させた（Ｏｖｅｒｋａｍｐ  Ｗら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ；７９（２０）：６４８１−９０）。
【０３５１】
ａｉｍＸの３７ｂｐ長の３’ＵＴＲのすぐ下流に、３個の停止コドン、続いてリボソーム結合部位（本明細書中でｒｂｓとして表示）を挿入することによって、Ｐｈｉ３Ｔ  ａｉｍＲ−ａｉｍＰ−ａｉｍＸ遺伝子座にレポーター遺伝子ＧＦＰを遺伝子融合させた（図６参照）。転写終結因子エレメント（ｒｒｎＢ）をＧＦＰ遺伝子に対して下流に配置した。ａｉｍＲ−ａｉｍＰ−ａｉｍＸ遺伝子座とＧＦＰレポーター遺伝子との遺伝子融合により、コンストラクト＃１（図６、配列番号３７４）が得られた。
【０３５２】
ＮＥＢビルダーＨＩＦＩ  ＤＮＡアセンブリ反応キット（ＮＥＢ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて制限部位ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間でシャトルプラスミドｐＤＲ１１１にこのコンストラクトを挿入し、その結果、プラスミドｐＤＲ１１１−コンストラクト＃１（図６、配列番号３７５）が得られた。
【０３５３】
ｐＤＲ１１１−コンストラクト＃１プラスミドをエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で増殖させ、次にＲＰＸオペロンの上流の逆鎖上のｓｐｅｃ遺伝子と一緒にａｍｙＥ遺伝子内でバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムにコンストラクト＃１オペロンを挿入するためのシャトルベクターとして使用した（図７）。ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ配列決定装置を用いた全ゲノム配列決定を適用して、コンストラクト＃１オペロンの配列および細菌ゲノム内のその正確な位置を検証した。
【０３５４】
最小化発現系を作製するために、プライマーＥ＋Ｆを用いてｐＤＲ１１１−コンストラクト＃１プラスミドを増幅させ、続いてＮＥＢ  ｂｕｉｌｄｅｒ  ＨＩＦＩ  ＤＮＡアセンブリ反応キット（ＮＥＢ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてＤＮＡアセンブリを行い、その結果、ａｉｍＰ遺伝子を欠くプラスミドｐＤＲ１１１−コンストラクト＃１を得た。プライマーＧ＋Ｈを使用してこのコンストラクトをさらに増幅させ、続いて同様にａｉｍＸ遺伝子の欠失をもたらすＤＮＡアセンブリを行った。最終産物であるｐＤＲ１１１−コンストラクト＃２（配列番号３７７）は、コンストラクト＃１の二重遺伝子欠失ΔａｉｍＰ／ΔａｉｍＸ変異体［すなわちコンストラクト＃２（配列番号３７６）］を含有した。ｐＤＲ１１１−コンストラクト＃２をｐＤＲ１１１−コンストラクト＃１と同様にシャトルプラスミドとして使用した。これにより、コンストラクト＃１について上述したように、細菌ゲノムにコンストラクト＃２が挿入された（図８）。
【０３５５】
プラスミド含有培養物の増殖動態−野生型（ＷＴ）バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３株およびコンストラクト＃１またはコンストラクト＃２を含有するバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３株のスターター増殖物を増殖曲線が定常相を示すまで３ｍＬのルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス中で培養した。続いて、ＬＢブロスまたは、６２．５ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度範囲でＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドを補充したＬＢブロス中で１／１００の比で細菌細胞を希釈した。ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００プレートリーダーを使用して、９６ウェルプレート中で光学密度（６００ｎｍでのＯ．Ｄ．）およびＧＦＰ蛍光レベル（４８８ｎｍ励起／５１８ｎｍ発光）を経時的に測定した。
【実施例１】
【０３５６】
溶菌／溶原性決定に影響するＰＨＩ３Ｔファージ感染後に短いペプチドが培地に放出される。
【０３５７】
対照培地中で、およびファージ由来馴化培地中で、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｔｒ．１６８の培養物に４つの異なるファージ：ｐｈｉ２９（ポドウイルス科、絶対溶菌型（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｌｙｔｉｃ））、ｐｈｉ１０５（シフォウイルス科、テンペレート、ラムダ様）、ｒｈｏ１４（シフォウイルス科、テンペレート、ラムダ様）またはｐｈｉ３Ｔ（シフォウイルス科、テンペレート、ｓｐＢｅｔａ様）のうちの１つを感染させた（図１Ａ参照）。驚くべきことに、試験したファージの１つ、ｐｈｉ３Ｔに対して、細菌増殖曲線から推測されるように、馴化培地中の感染動態が対照培地中の動態と劇的に異なっていた。図１Ｂで示されるように、感染の２時間後に、ｐｈｉ３Ｔ感染細菌培養物のかなりの割合が対照培地中で溶菌した一方で、馴化培地中で増殖させた培養物は大部分が溶菌から保護されていると思われた。この効果は、試験した他の３つのファージの何れについても検出されず、対照培地と馴化培地との間の感染動態の差は観察されなかった。さらに、ｐｈｉ３Ｔ感染から調製された馴化培地は、他のファージの感染動態に影響を及ぼさず、逆もまた同じく、他のファージから調製された馴化培地はｐｈｉ３Ｔの感染動態に影響を及ぼさなかった。
【０３５８】
まとめると、これらの結果から、ｐｈｉ３ＴによるＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の感染中に小分子が培地に放出され、この分子がこのファージの下流感染の感染動態に影響を及ぼし得ることが示唆される。
【０３５９】
バチルス属および他のフィルミクテス門におけるクオラムセンシング（ＱＳ）は、典型的には培地に分泌され、細胞内または膜結合受容体によって感知される短いペプチドに基づくことが知られている１−３。したがって、培地中の活性物質がタンパク質性であるか否かを試験するために、馴化培地をプロテイナーゼＫで処理した。図１Ｅで示されるように、プロテイナーゼ処理した馴化培地中の感染動態は、対照培地中の動態と同様であり、このことから、培地中の活性構成成分が実際にタンパク質性であることが示唆された。バチルス属クオラムセンシング系におけるコミュニケーションペプチドは頻繁にオリゴペプチドパーミアーゼトランスポーター（ＯＰＰ）によって細胞に取り込まれるので、ＯＰＰトランスポーターの必須サブユニットであるｏｐｐＤが欠失した細菌においてファージ感染動態を試験した（図１Ｃ）。機能的ＯＰＰを欠く細菌にｐｈｉ３Ｔを感染させた場合、ファージ由来の馴化培地はその効果を失い、このことから、馴化培地中の活性物質が３ａａ〜２０ａａ長ペプチドであることが示唆されたが、これは、グラム陽性細菌のＯＰＰトランスポーターによりインポートされ得るペプチドのサイズ範囲である４。
【０３６０】
ｏｐｐＤ突然変異体におけるファージ感染動態の綿密な試験から、野生型細菌の感染と比較した場合、対照培地および馴化培地の両方において培養物溶菌の増大が示された（図１Ｂ−Ｃ）。ファージｐｈｉ３Ｔは、溶菌性または溶原性サイクルの何れかを通じて感染することを選択し得る溶原ファージである６，７。溶菌サイクルが細菌細胞の溶菌につながる一方で、溶原性サイクルではファージゲノムが細菌ゲノムに組み込まれ、溶原化された細菌は同じファージによるさらなる感染から防御されるようになる７。したがって、対照培地中でｐｈｉ３Ｔを感染させた細菌の増殖曲線は、培養物の部分的な、しかし完全ではない溶菌、続いて溶原化細菌の増殖ゆえの培養物の回復を示す。ｏｐｐＤ突然変異体の感染動態曲線が培養物の完全な溶菌を示すという観察から、培地に放出された活性ペプチドがファージの溶原性を促進し得ることが示唆される。したがって、ファージ由来馴化培地中での感染中に観察された溶菌の減少が、溶原性向上ゆえであるか否かを試験するために、半定量的ＰＣＲアッセイを使用して、感染中のＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムへのファージｐｈｉ３Ｔの組み込みを調べた。実際、図１Ｄで示されるように、細菌培養物を馴化培地中で感染させると、溶原性の向上が観察された。
【０３６１】
まとめると、これらの結果から、ｐｈｉ３Ｔ感染中に短いペプチドが培地に放出され、このペプチドが蓄積するにつれて、それがファージ子孫の後の世代の溶菌／溶原性の決定に影響を及ぼすコミュニケーション物質として作用することが示唆される。この新たに発見された推定上のコミュニケーション分子は、本明細書中で「アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）」（ラテン語の「決定」）として示される。
【実施例２】
【０３６２】
溶菌／溶原性決定に影響を与えるペプチドは、ａｉｍＰ遺伝子によってコードされる。
【０３６３】
ｐｈｉ３Ｔは４０年前に単離され、ファージのｓｐＢｅｔａファミリーに属すると位置付けられたが、今日までそのゲノムは配列決定されていなかった６。アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドをコードする、可能性のある遺伝子系を探索するために、ｐｈｉ３Ｔのゲノムを配列決定し、分析した。このゲノムは、１８５個の予測遺伝子を含有する単一の１２８ｋｂｐコンティグになった。培地に分泌されると思われるタンパク質を探索するために、ｓｉｇｎａｌＰソフトウェアを使用して、ｐｈｉ３Ｔ中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全てをＮ末端シグナルペプチドの有無についてスクリーニングした８。３つのＯＲＦがシグナルペプチドを有すると予測され、このことから、それらが分泌されるかまたは膜局在することが示唆される。これらの遺伝子のうち２つは無関係に見えたが（一方は複合的な膜タンパク質であり、他方は大きなヌクレアーゼであった。）、第３の遺伝子はバチルス属クオラムセンシングペプチドを連想させる特性を示した（図２Ａ〜Ｂ）。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるクオラムセンシング系のＰｈｒファミリーに属するペプチドは、典型的にはＮ末端シグナル配列を含有するプレプロペプチドからプロセシングされ、これはＳｅｃ系によって認識され、分泌時に切断される１。細胞外に出ると、プロペプチドはさらにＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞外プロテアーゼによってプロセシングされ、プロペプチドのＣ末端で通常見られる成熟短鎖（５〜６アミノ酸）ペプチドが生成される１。選択された候補遺伝子は短いＯＲＦ（４３アミノ酸、配列番号２２７）をコードし、Ｎ末端シグナル配列およびそのＣ末端のペプチド成熟のための共通切断部位の両方を示した（図２Ａ〜Ｂ）。このｐｈｉ３Ｔコードタンパク質が分泌され、細胞外で成熟させられる場合、プロペプチド切断後の予測成熟コミュニケーションペプチドは、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（ＳＡＩＲＧＡ、配列番号２６９）である。実際、マススペクトロメトリー分析により、馴化培地中にＳＡＩＲＧＡペプチドが存在するが、対照培地中には存在しないことが確認された（図２Ｃ）。
【０３６４】
予測された成熟ペプチドが実際にファージ溶原性決定に影響を与えるアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）分子であるか否かを試験するために、合成ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドの量を増加させながら補充したＬＢ培地中で細菌にｐｈｉ３Ｔを感染させた。培地がより高濃度の合成ペプチドを含有していた場合、培養物溶菌の減少が明らかであったように、ファージ感染動態に対する明確な濃度依存的効果が観察された（図２Ｄ）。これらの効果はそのペプチドに特異的であり、ペプチドのより短い５アミノ酸型（ＳＡＩＲＧまたはＡＩＲＧＡ、それぞれ配列番号３５５および３５４）に対しても、ＰｈｒＣ（配列番号３５０）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の既知のクオラムセンシングペプチド、に対しても、これらの効果は観察されなかった（図２Ｄ〜Ｅ）。培養増殖曲線に対する最大効果は５００ｎＭのＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチド濃度で観察され、それを超えると効果は飽和したように見えた（図２Ｄ）。
【０３６５】
感染培養物の動態に対する観察されたＳＡＩＲＧＡペプチドの効果が溶原性向上の結果であることを検証するために、本ペプチドありまたはなしで、ｐｈｉ３Ｔ感染中の経時実験から回収した細菌の全ＤＮＡを直接配列決定した。細菌ゲノム中のインタクトなファージ組み込み部位を通過する配列決定読み取りデータの割合をその部位でのファージ組み込みを示す読み取りデータと比較することによって、各時点での溶原化細菌の割合を直接定量した。注目すべきことに、ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドの存在下で一貫した溶原性の上昇が観察され、ペプチドなしで増殖させた細菌の１８％（±３．３％）と比較したとき、４８％（±７．９％）の細菌が感染後６０分で溶原化された（図２Ｆ）。これらの結果から、同定されたファージコード遺伝子が分泌され、ファージ溶菌／溶原性決定にさらに影響を与える成熟アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）コミュニケーションペプチドにプロセシングされることが示唆される。この遺伝子を本明細書ではａｉｍＰと表示した。
【０３６６】
ａｉｍＰ遺伝子は、３７８アミノ酸長のオープンリーディングフレーム（配列番号１１４）をコードする遺伝子（配列番号１）のすぐ下流に位置し、これら２つの遺伝子がファージゲノムからポリシストロンとして同時転写され得ることが示唆される。この上流遺伝子は、グラム陽性細菌のＱＳ系におけるＲＲＮＰＰファミリーの細胞内ペプチド受容体に典型的な、予測テトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）ドメインをコードする９−１１（図２Ａ）。したがって、ａｉｍＲと表示されたこの上流遺伝子が、ＡｉｍＰ由来のアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの受容体であるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加ＡｉｍＲを精製し、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を使用して、精製受容体と合成アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドとの間の結合を測定した。この分析から、ｐｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＲ受容体と同族ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドとの間の、ＥＣ５０＝１３８ｎＭの有効ペプチド濃度（９５％の信頼区間で１１８〜１６２ｎＭ）で高親和性結合を示し（図２Ｇ）、このことから、ＡｉｍＲがほぼ、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ＳＡＩＲＧＡペプチドの細胞内受容体として機能することが確認された。
【実施例３】
【０３６７】
バチルス属ファージにおいて溶原性をもたらす保存ペプチドコミュニケーションコード
【０３６８】
この系の存在度を本質的に理解するため、利用可能な配列決定されたゲノムにおいてａｉｍＲ遺伝子の相同体を見つけるために相同性検索を行った。この検索を使用して、ＡｉｍＲ相同体の１１２個の実例が検出され、バチルス属ファージにおけるか、またはプロファージにおけるそれらの全てが事実上、バチルスゲノム内に組み込まれていることが分かり、このことから、この遺伝子が主にファージ関連機能を果たすことが示唆される（図３Ａおよび上の表３）。全ての場合において、ａｉｍＲ相同体は、ａｉｍＰ候補遺伝子、すなわちＮ末端シグナルペプチドをコードする短いポリペプチド、続いてバチルス属細胞外プロテアーゼのプロセシング成熟シグナルと一致するプロペプチド、の上流で見られた（上の表３；図２Ｂ）。予想される成熟ペプチドの配列は多様であったが、それらは全て、それらの配列組成について厳密な規則を維持し、５番目の位置に必須のグリシン残基、６番目の位置にグリシンまたはアラニン、および４番目の位置では正荷電残基が優先された（図３Ｂ〜Ｃ）。
【０３６９】
ファージにコードされるコミュニケーションペプチドが配列特異的にファージ溶原性を導くという仮説を試験するために、ＡｉｍＲ−ＡｉｍＰ系の相同体が同定されたｓｐＢｅｔａファージの感染動態を評価した。ｓｐＢｅｔａの予想成熟ＡｉｍＰ由来アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドはＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）であり、これはｐｈｉ３ＴのＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドとは３個のＮ末端アミノ酸が異なる配列であった。図３Ｄ〜Ｆで示されるように、ＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチドはｓｐＢｅｔａの溶原性を促進した一方で、それはｐｈｉ３Ｔの溶原性プロファイルに影響を及ぼさず；同様にｐｈｉ３Ｔ由来のＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドはｓｐＢｅｔａの感染動態に影響を及ぼさなかった。したがって、ｓｐＢｅｔａ由来ＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチドは、ｐｈｉ３Ｔ  ＡｉｍＲ受容体への特異的結合を示さなかった（図２Ｇ）。
【０３７０】
まとめると、これらの結果から、ファージ種特異的にファージ溶原性を導く配列特異的ペプチドコードが実証される。
【実施例４】
【０３７１】
ＡｉｍＰペプチエ（ＰＥＰＴＩＥ）はそのＡｉｍＲのオリゴマー状態を変化させ、ＡｉｍＸの発現を変化させる。
【０３７２】
グラム陽性細菌のコミュニケーション系において、コミュニケーションペプチドのその受容体への結合は通常、転写反応の再プログラム化につながる。これは、受容体が腸球菌におけるＰｒｇＸ１２，１３、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）群のＰｌｃＲ１４−１６および他の系１７，１８の場合など、転写制御因子である場合に、直接；または受容体が脱リン酸化によって下流の転写制御因子を制御するホスファターゼ１９，２０であるバチルス属のＲａｐ／Ｐｈｒ系の場合のように、または立体障害２１の場合にように、間接的に、の何れかで起こり得る。ＡｉｍＲのＮ末端における予測されるヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフの存在から、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系の受容体が直接ＤＮＡを結合させることが示唆される。ＡｉｍＲがインビボでファージＤＮＡを結合させるか否かを試験するために、ｄＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲｉ）技術２２を使用してファージＡｉｍＲ遺伝子の発現を抑制するがクローニングされたＨｉｓタグ付加ＡｉｍＲを抑制しないようにしたＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８菌株へとＨｉｓタグ付加ａｉｍＲ遺伝子を操作した（本明細書中、上記の材料および方法を参照のこと）。続いて、ファージ感染の１５分後に、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの存在下および非存在下で、ＣｈＩＰ−ｓｅｑアッセイを行った。ＡｉｍＲに結合したＤＮＡの配列決定から、ＡｉｍＲが、ａｉｍＰ遺伝子のすぐ下流で、ファージゲノム中の単一部位を結合させることが明らかに示された（図４Ａ−Ｂ）。さらに、この結合は、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドが培地中に存在しない場合にのみ起こり、このことから、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドのそのＡｉｍＲ受容体への結合が、ファージＤＮＡ上のその結合部位からの受容体の解離につながることが示唆された。
【０３７３】
ＡｉｍＲ精製の工程中、タンパク質がゲルろ過カラムにおいてホモ二量体として移動することが注目された。しかし、ｐｈｉ３Ｔ由来のＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドを添加すると、タンパク質は単量体として忠実に移動した（図４Ｃ）。これらの結果から、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドが、ＤＮＡ結合二量体からペプチド結合解離単量体への、そのＡｉｍＲ受容体のオリゴマー状態の変化を介して、シグナルを伝達することが示唆される。ｓｐＢｅｔａ  ＧＭＰＲＧＡ（配列番号２７１）ペプチドを添加しても、ＡｉｍＲオリゴマー状態の変化にはつながらず、これによってもまた、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系におけるペプチドとその受容体との間の高い特異性が指摘された（図４Ｃ）。
【０３７４】
そのＡｉｍＲ受容体へのアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの結合がファージゲノムにおける転写反応につながるか否かを調べるために、ペプチドありおよびなしで、感染の時間経過中に細菌から抽出されたＲＮＡに対してＲＮＡ−ｓｅｑを適用した。図４Ｄ〜Ｉで示されるように、発現における最も劇的な変化が単一の遺伝子について観察されたが、これは本明細書中でａｉｍＸと呼ばれ、ＡｉｍＲ  ＤＮＡ結合部位のすぐ下流にあった。この遺伝子は、感染後１０分で開始して、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの非存在下で実質的な発現を示したが、培地に１μＭのＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチドを補充した場合、その発現は２０倍超、減少した（図４Ｄ〜Ｇ）。
【０３７５】
これらの結果から、ＡｉｍＲが、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの非存在下で二量体としてファージＤＮＡに結合した場合、ＡｉｍＸの転写活性化因子となることが示唆される。実際、ＡｉｍＲがｄＣａｓ９を用いて発現抑制されたとき、ＡｉｍＸの発現が劇的に減少した（図４Ｄ）。さらに、ＡｉｍＲの発現抑制の結果、溶原性が上昇したが、このことから、おそらくＡｉｍＸの発現を活性化することによって、ファージＤＮＡへのＡｉｍＲの結合により溶原性が阻害される（または溶菌が促進される）ことが示唆された（図４Ｈ）。
【０３７６】
ＡｉｍＲノックダウンは感染の２０分後にＡｉｍＸ以外の何れの遺伝子に対しても劇的な転写効果をもたらさなかったので（図４Ｉ）、ＡｉｍＲの主な機能がａｉｍＸ遺伝子の発現を調節することであり、ＡｉｍＸ遺伝子産物が、ＡｉｍＲ−ＡｉｍＰコミュニケーション系に対して下流で働き、溶菌−溶原性決定を実行するという仮説を立てた。この仮説と一致して、ｄＣａｓ９を用いたＡｉｍＸのノックダウンの結果、溶原性向上が起こった（図４Ｈ）。さらに、ＡｉｍＲノックダウンの背景において異所性ＡｉｍＸで補完すると（ＡｉｍＸ発現は自然に抑制される、図４Ｄ）、その結果、培養物溶菌が起こり、ＡｉｍＸがＡｉｍＲに対して下流で機能し、溶原性の阻害剤または溶菌サイクルの促進剤として働くことが実証された（図４Ｈ）。
【０３７７】
まとめると、発明者らは、溶菌サイクルに入るかまたは感染細菌を溶原化するかを決定するために、ファージの大きなファミリーがコミュニケーションペプチドを使用することを示した。ある意味で、記載されるコミュニケーション機序は、子孫ファージ粒子がその祖先とコミュニケーションをとること、すなわち前のサイクルで良好な感染を完了した先行ファージの量を測定することを可能にする。このストラテジーの背後にある生物学的論理は明らかである：１個のファージが細菌コロニーに遭遇すると、感染の最初のサイクルから産生される子孫ファージのための十二分なプレイがあり、それゆえに溶菌サイクルが好ましい。感染動態の後期段階において、細菌細胞の数は、子孫ファージをもはや新たな宿主に感染させられなくなるリスクがある点まで減少する。次いで、実行可能な複製に対する機会を保つために溶原性に切り替わることはファージにとって理に適っている。
【０３７８】
アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系によって、少し前の先行する感染の量を推定し、それによって溶菌サイクルを使用するかまたは溶菌サイクルを使用するかを決定するための洗練された機序がファージ粒子に対して提供される。理論により縛られることなく、この結果から、以下のモデルが指摘される（図５Ａ〜Ｃ）：細菌培養物の初期感染時に、ｐｈｉ３Ｔは初期オペロンＡｉｍＲ−ＡｉｍＰを発現する。二量体としてのＡｉｍＲは、ＡｉｍＸの発現を活性化し、次に、溶原性への経路を遮断し、溶菌サイクルを促進する。同時に、ＡｉｍＰは培地に分泌され、成熟アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドにプロセシングされる。感染の数サイクル後、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドは培地中で蓄積する。この段階で、ファージ粒子が、まだ感染していない細菌に感染する場合、ＯＰＰトランスポーターによって細菌に内部移行させられるアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチドの濃度はＡｉｍＲ受容体を結合させるのに十分に高くなる。結合時に、ＡｉｍＲ受容体はそのオリゴマー状態を活性二量体から不活性単量体に変化させ、ＡｉｍＸ溶原性阻害剤を発現抑制し、溶原性に導く。
【実施例５】
【０３７９】
関心のある発現産物を発現させるための系としてのアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）系
【０３８０】
ＡｉｍＲ−ＡｉｍＰ系がファージ非依存的状況で異種発現系として機能し得ることを実証するため、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３におけるＧＦＰレポーター遺伝子の発現を調節するためにそれを利用した。
【０３８１】
この目的で、アービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）遺伝子座（ＡｉｍＲ−ＡｉｍＰ−ＡｉｍＲ結合部位−ＡｉｍＸ）を改変し、ＡｉｍＸ遺伝子がＧＦＰレポーター遺伝子に融合されるようにした（コンストラクト＃１、図６）。このコンストラクトをＡｍｙＥ遺伝子座でバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３のゲノムに組み込んだ（図７）。図９Ａで示されるように、コンストラクト＃１の組み込みの結果、おそらくコンストラクトによってコードされるＡｉｍＰペプチドの発現ゆえに、細菌の液体培養物中でＧＦＰの顕著な発現が起こり、約６時間の培養後にプラトーに達した。さらに、様々な濃度のアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチド（ＳＡＩＲＧＡ、配列番号２６９）の存在下において液体培地中で細菌を増殖させた場合、ＧＦＰ蛍光の濃度依存性発現が観察され、ペプチドの非存在下で最大蛍光が検出され；増殖培地中のペプチド濃度に比例して蛍光が徐々に抑制されるようになった。
【０３８２】
続いて、ＡｉｍＲ遺伝子と、ＡｉｍＲ結合部位と、ＡｉｍＲ結合部位に対して下流のＧＦＰと、のみを含有する最小化発現系を改変し（コンストラクト＃２、図８）、ＡｍｙＥ遺伝子座でバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥＳＴ７００３のゲノムに組み込んだ（すなわちこの系はＡｉｍＰおよびＡｉｍＸ遺伝子を含有しなかった。）。コンストラクト＃１を含有する細菌と同様に、最小化コンストラクト＃２の組み込みの結果、細菌の液体培養物中でＧＦＰの顕著な発現が起こり；様々な濃度のアービトリウム（ａｒｂｉｔｒｉｕｍ）ペプチド（ＳＡＩＲＧＡ、配列番号２６９）の存在下で細菌を増殖させると、培地中のペプチドの濃度に依存したＧＦＰの異なる発現が観察された（図９Ｂ）。
【０３８３】
重要なこととして、ＳＡＩＲＧＡ（配列番号２６９）ペプチド濃度またはＧＦＰ発現は細菌の増殖速度に影響を及ぼさなかった（図９Ａ〜Ｂ）。
【０３８４】
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替形態、変更形態および変形形態が当業者にとって明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に含まれる全てのこのような代替形態、変更形態および変形形態を包含するものとする。
【０３８５】
本願で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書中に組み込まれることが示されるのと同程度にその全体において参照により本明細書中に組み込まれる。さらに、本願におけるあらゆる参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用される範囲で、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図２Ｄ−２Ｅ】
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【図２Ｆ−２Ｇ】
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【図３Ａ−３Ｆ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図４Ｅ−４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６】
2019535298.tif 000024
【図７】
2019535298.tif 000025
【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019535298.tif 000029
2019535298.tif 000030
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