(57)【要約】  本発明は、細胞懸濁液中の物質の濃度を決定する方法であって、前記方法は以下のステップ：  前記物質の前記濃度を、    −前記細胞懸濁液を含むチャンバ装置(arrangement)の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積で行われる吸収測定の結果を使用するステップであって、前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度が前記それぞれの吸収測定に基づいて決定される、ステップと、    −チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを使用するステップと、    −前記物質濃度モデルと前記決定された局所物質濃度とを用いて、無限チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップであって、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４である、ステップと、により決定するステップを含み、    任意に(optionally)、前記細胞懸濁液は全血であり、前記物質はＨｂであり、当該方法はさらに、前記決定されたＨｂ濃度及び決定された平均赤血球ヘモグロビン(Ｍｅａｎ  Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，  ＭＣＨ）に基づいてｃＲＢＣを決定することを含む、方法に関する。本発明はまた、当該方法を実行するためのシステムに関する。（選択図）  図１
2019506600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液中の物質の濃度を決定する方法であって、以下のステップ：
−前記細胞懸濁液を含むチャンバ装置(arrangement)の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積で行われる吸収測定の結果を使用するステップであって、前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度が前記それぞれの吸収測定に基づいて決定される、ステップと、
−チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを使用するステップと、
−前記物質濃度モデルと前記決定された局所物質濃度とを用いて、無限チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップであって、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４である、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞懸濁液が全血であり、前記物質がＨｂであり、当該方法が、
前記決定されたＨｂ濃度及び決定された平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）に基づいてｃＲＢＣを決定するステップであって、前記決定されたＭＣＨは、約５μｍ以下の低いチャンバ高さで、少なくとも１つの吸収測定を行うことにより、前記決定されたＭＣＨは決定された、ステップと、及び
前記低いチャンバ高さで前記吸収測定から前記ＭＣＨを決定するステップであって、前記低いチャンバ高さが約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍである、ステップと、
をさらに含む方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の方法であって、前記チャンバ装置が単一のチャンバデバイスであり、前記局所サンプル容積を前記チャンバ高さにキャピラリロードするため、前記細胞懸濁液が前記チャンバ装置に供給され、好ましくは、前記チャンバ高さは、高さを徐々に低くして、前記チャンバ装置の共通流路に沿って配置され、且つ、好ましくは、前記流路は少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含み、少なくとも約２．５μｍ互いに異なる、方法。
【請求項４】
前記チャンバ高さの前記最大高さが約４０μｍ以下、例えば約３０μｍ以下、例えば約２５μｍ以下、例えば約２０μｍ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記吸収測定の各々は、前記光源を使用して前記チャンバ装置の第１の側から前記チャンバ高さで前記細胞懸濁液の前記局所サンプル容積を照射すること、及び前記チャンバ装置の第２の反対側において少なくとも１つの画像を取得することにより透過光を記録することを含み、前記吸収測定は、前記チャンバ高さの２つ以上における局所サンプル容積について同時に任意に実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載の方法であって、前記予め選択された波長は、前記物質の等吸収点における波長を含み、好ましくは前記物質はＨｂであり、前記等吸収点は、波長約４２０ｎｍ、約５３０ｎｍ及び約５７０ｎｍのうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記各局所サンプル容積体積の各々における前記局所物質濃度の決定が、前記局所サンプル容積の取得画像を画像処理することを含み、前記物質がＨｂである場合、前記画像処理は、自由プラズマＨｂによって生成された干渉を除去すること、及び前記チャンバ高さ断面の前記取得された画像の全正規化された光強度を、問題の高さ（ｚ）における局所Ｈｂ濃度に相関させることを含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記物質濃度モデルの決定は、高さＬｃ−物質（ｚ）の関数として前記局所サンプル容積の前記局所物質濃度（Ｌｃ−物質）をマッピングすること、前記マッピングに対する最良フィッティング曲線を計算すること、前記最良フィッティング曲線を高さｚ→∞に外挿すること、前記物質濃度を高さＺ＝∞における前記物質濃度として決定すること、を含む方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞懸濁液が全血であり、前記物質がＨｂであり、当該方法が平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）を決定することをさらに含み、当該方法が、約５μｍ以下の低いチャンバ高さで少なくとも１つの吸収測定を行うこと、及び前記低いチャンバ高さで前記吸収測定から前記ＭＣＨを決定することを含み、前記低いチャンバ高さが約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍである、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記低いチャンバ高さでの前記吸収測定が、少なくとも１つの画像を取得すること、及び複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、及び前記識別された領域の吸収率を決定すること、及び前記決定された吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含み、
好ましくは、当該方法は、前記複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血球の平均吸収率を決定すること、及び血球の前記平均吸収率を前記ＭＣＨと相関させることを含み、好ましくは、前記複数の個々の赤血球は、重複しない赤血球として識別される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、当該方法が、以下のステップ：
−前記細胞懸濁液を前記チャンバ装置に流すステップと、
−前記チャンバ装置の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積の吸収測定を行うステップと、
のうちの少なくとも１つをさらに含む、方法。
【請求項１２】
細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するためのシステムであって、当該システムに請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を実行させるようにプログラムされたコンピュータシステムを含むシステム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシステムであって、当該システムは、
−前記細胞懸濁液が流れることにより負荷されるように構成された、ｎ個の異なるチャンバ高さを含み、及び、少なくとも1つの予め選択された波長に対して、少なくとも部分的に光学的に透明であるチャンバ装置であって、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容する、チャンバ装置と、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射するように構成され、及び、前記ｎ個のサンプル高さのうちの１つにおいて、少なくとも１つの局所サンプル容積を照射するように構成された光源と、
−前記局所サンプル容積を通過する光の画像を取得するように構成された画像取得デバイスと、
をさらに含み、
前記コンピュータシステムはさらに、前記それぞれの局所サンプル容積のそれぞれにおける前記局所物質濃度を決定するため、ｎ個の異なる高さでの局所サンプル容積の前記画像取得デバイスによって得られた画像を処理するようにプログラムされ、
ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば２〜１０である、システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のシステムであって、
最大チャンバ高さが前記画像取得デバイスの焦点深度未満であり、且つ、前記コンピュータシステムが、
−前記焦点深度が、前記それぞれの画像を取得するための前記それぞれのチャンバ高さで局所サンプル容積を含むことを制御するため、前記チャンバ装置と、前記光源と、前記画像取得デバイスとの相対位置を制御すること、
−前記局所サンプル容積を照射し、及び、前記それぞれのチャンバ高さで前記局所サンプル容積を透過した光の画像を取得するため、前記光源及び前記画像取得デバイスを制御すること、
−前記画像取得デバイスにより得られた画像を受信すること、
−前記細胞懸濁液の物質濃度を決定するため、前記画像を処理すること、
をプログラムされた、システム。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４に記載のシステムであって、前記システムは、全血中のＨｂ濃度を決定するように構成されており、前記チャンバ装置の前記チャンバ高さのうちの少なくとも１つは、約５μｍ以下の低チャンバ高さであり、前記コンピュータシステムは、前記低チャンバ高さで局所血液容積の少なくとも１つの画像を取得することにより吸収測定を行うように、及び、前記低チャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定からＭＣＨを決定するようにプログラムされている、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般に、細胞懸濁液中の物質の濃度の決定に関するものであり、特に全血サンプル中のヘモグロビン濃度（ｃＨｂ）の測定のためである。本発明はまた、細胞懸濁液中の細胞濃度を決定するための、特に全血サンプル中のヘモグロビン濃度（ｃＨｂ）を決定するためのシステムを含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液分析方法などの細胞分析方法は、診断領域内の標準的なツールであり、ユーザに利用可能な多くの異なる方法及びシステムが存在する。
【０００３】
生物学的サンプル中の細胞濃度の正確な測定は、様々な医療分野において重要である。例えば、血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）の濃度又は精子細胞の濃度又は精液中の白血球の濃度は、診断指標として使用される。
【０００４】
細胞懸濁液中の細胞濃度又は物質濃度を決定するためによく使用される方法は、例えばフローサイトメーターを用いて、細胞をカウントすることを含む方法である。流量を知ることにより、濃度を計算することができる。
【０００５】
伝統的な血液分析方法の多くは、赤血球又は白血球などの血液成分の分離、高価な試薬の希釈及び／又は添加を必要とする。
【０００６】
光学分析方法はしばしば比較的高速であるので、このようなは非常に有利であることが見出されている。しかしながら、依然として多くの分析方法では、時間を要するサンプル調製、例えばスミア標本(smear  preparation)、を必要とする。
【０００７】
米国特許出願第２０１１１５１５０２号は、全血サンプル中の血球をカウントするための方法を記載している。当該方法は、
（ａ）全血サンプルを提供すること；
（ｂ）前記全血サンプルをスライド上に沈着させること；
（ｃ）血液スミア標本を作製するため、スプレッダを利用すること；
（ｄ）前記スライド上で前記血液スミア標本を乾燥させること；
（ｅ）前記スライド上の前記血液スミア標本における赤血球中のヘモグロビンに起因する光の吸収又は反射を測定すること；
（ｆ）ステップ（ｅ）の測定によって、分析のための好適な厚さであるとして特定された分析領域の拡大された２次元デジタル画像を記録すること；
（ｇ）前記拡大された２次元デジタル画像からデータを収集し、分析し、格納すること；
を含む。
【０００８】
全血サンプルに直接血液分析を行うことも提案されている。米国特許出願第２０１５０２９４９２号は、血液サンプル中の全ヘモグロビン濃度を決定するための方法であって、
２つの波長における血液サンプルの分光光度分析、及び、第１の波長における検出された放射線と、第２の波長における検出された放射線との比率を決定すること；及び、
前記比率に基づいて血液サンプル中の全ヘモグロビンの濃度を決定すること；
を含む方法を記載している。前記サンプルは、複数の波長において光に露光される。吸収率(absorbance)、透過率又は反射率の測定が行われ、２つの波長における前記測定(measurements)の比率は、全ヘモグロビンの量を示す。
【０００９】
しかし、散乱効果に起因して、及び前記サンプルの検出された厚さ層は明確に定義されていないため、反射率の測定は高い不確実性を生じる傾向がある。
【００１０】
吸収率又は透過率を用いた光学的検出は別の問題を引き起こす。全血の層を介してヘモグロビンによって吸収される波長の十分な透過性(transmission)を有するためには、前記層は非常に薄くなければならず、又は前記サンプルの希釈が必要である。
【００１１】
しかしながら、薄い層を使用することは、マイクロ流体デバイスを使用することによって達成することができる簡単な操作(simple  handling)を必要とする。マイクロ流体デバイス内に流入する流体の薄い層は、Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果のために元の流体サンプルに対して粒子濃度の変化をもたらす。Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果は、粒子をチャネル壁に向かって駆動する剪断誘起慣性揚力を生じさせる流れ中の層流速度プロファイルの放物線特性のために、壁から少し離れて蓄積された管内の層流中を流れる粒子の濃度をもたらす。粒子がチャネル壁に近づいて泳動するにつれて、粒子周辺の流れは粒子と壁との間に圧力上昇を誘発する。それにより、粒子がより近くに移動するのを防ぐ。壁により近い流れは壁からより遠い流れよりも遅いため、小さな高さのフローセルのチャンバ中に充填された液体における粒子の濃度は、前記フローセル中に充填される前の前記液体の元の粒子濃度と比較して低減されることになる。従って、低い厚さ、例えば３０μｍ以下、の血液層においてＨｂ濃度を決定することは、血液サンプルに対して正しい結果を与えない。
【００１２】
このＳｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果を回避する方法は、国際公開第２００６０３１０９５号に開示されている。ここでは、高さが比較的低い特殊なチャンバに層流ディスターバ(disturbers)が付いており、Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果を引き起こすことなくチャンバを満たすことができることを確実にする。
【００１３】
国際公開第２０１００７１４３０号は、Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果によって引き起こされる任意の濃度変化を回避するように設計された別のマイクロ流体デバイスを記載している。このマイクロ流体デバイスは、基本要素と、前記基本要素に対して開いた状態及び閉じた状態を有するカバー要素と、前記カバー要素は閉じた状態にある場合、前記基本要素及び前記カバー要素によって境界が定められた明確且つ固定された高さを有する流体チャンバと、を包含する。これにより、Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果を引き起こすことなく前記チャンバを充填することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の概要
本発明の目的は、細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するための方法及びシステムを提供することであり、当該方法及びシステムは比較的単純であり、物質の濃度が比較的高い場合でも、細胞懸濁液の希釈を必要とすることなく、使用することができる。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するための方法及びシステムを提供することであり、当該方法及びシステムは迅速に使用でき(fast  to  use)ル上、非常に正確な濃度測定を得ることができる。
【００１６】
一実施形態では、本発明の目的は、全血サンプル中のヘモグロビン濃度（ｃＨｂ）を決定するための方法及びシステムを提供することであり、その場合その決定は比較的速く、高い精度を有する。
【００１７】
一実施形態では、本発明の目的は、高価な添加剤又は前記血液サンプルの希釈を必要とすることなく、ヘモグロビン濃度（ｃＨｂ）を測定するための方法及びシステムを提供することである。
【００１８】
一実施形態では、本発明の目的は、特に作業負荷に関して非常に費用対効果の高いヘモグロビン濃度（ｃＨｂ）を決定するための方法及びシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
これらの目的及び他の目的は、特許請求の範囲に定義され、以下に記載される本発明又はその実施形態によって解決される。
【００２０】
本発明又はその実施形態は、以下の説明から当業者には明らかになるであろう多くのさらなる利点を有することが見出された。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「comprises/comprising(含む)」並びに「including/included（包含する/含まれる）」は、オープンタームとして解釈されるべきであることが強調されるべきである。すなわち、要素（複数可）、単位（複数可）、整数（複数可）、ステップ（複数可）、成分（複数可）及びそれらの組み合わせ（複数可）など、具体的に記載された特徴（複数可）の存在を特定するために用いられるものの、但し、１以上の他の記載された特徴の存在又は追加を排除するものではない。
【００２２】
「一実施形態」又は「実施形態」に対する言及は、一実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、又は特性が、開示される主題の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所における「一実施形態では」又は「実施形態では」という表現の出現は、必ずしも同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内の任意の適切な方法で組み合わせることができることは当業者には理解される。
【００２３】
「実質的に」という用語は、通常の製品のばらつき及び許容誤差が含まれることを意味すると解釈すべきである。
【００２４】
本発明により、細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するための非常に簡単で迅速な方法が提供される。
【００２５】
当該方法は、
−前記物質の前記濃度を、
−前記細胞懸濁液を含むチャンバ装置(arrangement)の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積(local  sample  volumes)で行われる吸収測定の結果を使用するステップであって、前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度が前記それぞれの吸収測定に基づいて決定される、ステップと、
−チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを使用するステップと、
−前記物質濃度モデルと前記決定された局所物質濃度とを用いて、無限(infinite)チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップであって、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４である、ステップと、
により決定するステップを含む。
【００２６】
当該方法の別の実施形態は、
−前記細胞懸濁液をチャンバ装置(arrangement)に流すステップと、
−前記チャンバ装置の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積の吸収測定を行うステップと、
−前記それぞれの吸収測定に基づいて前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度を決定するステップと、
−チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを生成するステップと、
−前記物質濃度モデルを用いて、無限チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップと、
を含む。
【００２７】
異なる平均高さで局所サンプル容積の数は少なくとも２であるが、有利にはその数はより大きく、例えば少なくとも３、又は好ましくは少なくとも５などである。大部分の決定のために、異なる平均チャンバ高さで含まれる局所サンプル容積の数ｎは２〜１０である。
【００２８】
チャンバ装置(arrangement)は、１つ以上のチャンバデバイス、例えばｎ個までのチャンバデバイスなど、を含むことができることを理解する必要がある。結果として、チャンバ装置は、：
−それぞれが一定の高さのサンプル容積を含むが、異なるチャンバデバイスに対して高さが異なる、複数のチャンバデバイス、
−異なる高さを有する複数の局所サンプル容積を含む単一チャンバデバイスであって、前記高さは連続的に、連続的に（例えばくさび形のサンプル容積）、及び/又は段階的連続的に（すなわち、断面(section)ごとに運ばれる傾斜の角度を有する複数の傾斜した断面）変化する、単一チャンバデバイス、
−上述の装置(arrangements)のいずれか、但し、一定の高さの局所サンプル容積、好ましくは、前記局所サンプル容積が、調査中の粒子タイプの単一層のみが存在する少なくとも１つの領域を含むような高さをも包含するいずれか、
を含むことができるが、但しこれらに限定されるものではない。例えば、赤血球を研究する場合、そのような好ましい高さは約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍである。
【００２９】
前記細胞は、血液細胞、精子細胞、組織細胞及び細菌のような任意の種類の細胞であり得る。前記細胞懸濁液は有利には全血である。前記細胞懸濁液の前記物質は、吸収測定によって光学的に検出することができる任意の種類の物質であり得る。一実施形態において、細胞の少なくともいくつかは、光学的に検出可能なマーカーでマークされる。一実施形態では、検出される物質はＨｂである。一実施形態では、物質は細胞懸濁液の細胞又は細胞懸濁液の細胞の一種である。
【００３０】
以下では、血液中のヘモグロビンＨｂの測定に関して本発明を主に説明する。それは単なる好ましい例であることを理解すべきであり、当該方法及びシステムが同様の方法で他の分散体中の他の物質を決定するために適用することは同等の又は対応する方法である。
【００３１】
一実施形態では、全血サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度（ｃＨｂ）を決定するための非常に簡単で迅速な方法が提供される。全血サンプル中のＨｂ濃度を決定する当該方法は好ましくは、
−局所容積を保持するためのｎ個の異なるチャンバ高さを含むチャンバ装置(arrangement)を提供するステップであって、その場合、前記チャンバ装置は、前記チャンバ高さで少なくとも１つの予め選択された波長の光に対して少なくとも部分的に光学的に透明である、ステップと、
−前記異なるチャンバ高さで局所サンプル容積を提供するために前記血液サンプルを前記チャンバ装置に流すステップと、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射する光源を使用して、異なるチャンバ高さで含まれる前記局所サンプル容積の吸収測定を行うステップと、
−後記それぞれの局所サンプル容積における後記局所Ｈｂ濃度を決定するステップと、
−チャンバ高さの関数としての局所Ｈｂ濃度を含むＨｂ濃度モデルを生成するステップと、
−前記Ｈｂ濃度モデルを用いて前記Ｈｂ濃度を前記無限高さＨｂ濃度として決定するステップと、
を含む。
【００３２】
異なるチャンバ高さでの局所サンプル容積の数ｎが大きいほど、一般により高い精度があるレベルまで得られるが、実際には、異なるチャンバ高さでの３つの局所サンプル容積が、全血についてＨＢ測定を行う場合、大部分の目的には十分であることが示されている。
【００３３】
異なるチャンバ高さで局所サンプル容積の数が２である場合、局所サンプル容積の内壁と接触する血液の量はあまり高くなく、その結果、Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果による流入血液の断面にわたる速度差による複合的影響があまり大きくないようにすることを確実にするため、異なるチャンバ高さで局所サンプル容積の少なくとも１つの高さは、好ましくは、２０μｍを超える高さ、例えば３０μｍを超える高さの局所容積でなければならい。数ｎが２より大きい場合、これは必須ではない。
【００３４】
有利には、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも４、例えば２〜１０である。
【００３５】
「局所容積(local  volume)」及び「局所サンプル容積(local  sample  volume)」という用語は、別段の指定がない限り、交換可能に使用される。チャンバ高さに含まれる局所容積は、その局所的サンプル容積の吸収測定が測定される容積を指定する。
【００３６】
用語「高さ」は、高さが均一である実際の高さを意味するか、又は高さが均一でない平均高さを意味すると解釈されるべきである。「平均高さ」という用語は、特に明記しない限り、それが均一である場合の実際の高さと同一である。
【００３７】
局所的容積がチャンバ構成に含まれるチャンバ高さは、高さ断面(height  section)又は高さ断面の一部であってもよい。
【００３８】
「前記チャンバ装置の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積」という語句は、ｎ個のローカル容積のそれぞれについてのチャンバ装置の平均高さが互いに異なることを意味する。当該方法は、例えば二重又は三重の吸収測定によって、吸収測定誤差を増加させるために同一平均高さでいくつかの局所容積を実行することを含むことができる。当該方法が同一平均高さでいくつかの局所容積を実行することを含む場合、この高さ（平均高さ）に対応する局所物質濃度の決定は有利には、同一平均高さでこれらの局所サンプル容積の決定された平均吸収に基づく。
【００３９】
局所容積が前記チャンバ装置(arrangement)に含まれる前記チャンバ高さは、前記チャンバ装置の前記チャンバの第１の対向する内側表面と第２の対向する内側表面との間の平均最小高さとして決定される。前記第１（例えば最上部）の対向する内側表面及び前記第２（例えば最下部）の対向する内側表面はより大きな表面である。比較的低い高さ、すなわち好ましくは約４０μｍ未満、に起因して、前記第１の対向する内側表面及び前記第２の対向する内側表面を接続する両側面(side  surfaces)は非常に狭いものとなり、これらの両側面によるＳｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果によって引き起こされるいかなる影響も無視することができる。なぜなら、これらの両側面の近くにある前記局所サンプル容積の相対量は有意ではないからである。
【００４０】
前記細胞は、血液細胞、精子細胞、組織細胞及び細菌のような任意の種類の細胞であり得る。前記細胞懸濁液は有利には全血である。前記細胞懸濁液の前記物質は、吸収測定によって光学的に検出することができる任意の種類の物質であり得る。一実施形態において、細胞の少なくともいくつかは、光学的に検出可能なマーカーでマークされる。一実施形態では、検出される物質はＨｂである。一実施形態では、物質は細胞懸濁液の細胞又は細胞懸濁液の細胞の一種である。前記細胞懸濁液が全血である場合、当該方法で使用される前記サンプルは、有利には、希釈されていない全血サンプルである。
【００４１】
全血は、細胞成分及び細胞外成分の濃度及び特性が、それらのin  vivo状態と比較して比較的変化しないままである、静脈、動脈又は毛細血管の血液サンプルとして定義される。
【００４２】
一実施形態では、前記全血サンプルはいかなる添加物も含まない。
【００４３】
一実施形態では、前記全血サンプルは抗凝固剤を含む。抗凝固剤は周知であり、例えばヘパリン、クエン酸塩又はＥＤＴＡを包含する。
【００４４】
前記チャンバ装置は、原理的には、前記局所サンプル容積について前記様々な平均高さを提供するため、任意の形状を有することができる。一般的に、前記チャンバ装置は、異なるチャンバ高さですべての前記ｎ個の局所サンプル容積が共通の入口から充填されるように、前記チャンバ装置に適用される同一の血液サンプルからの血液容積が、異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積で前記様々な高さを満たすように、成形されることが望ましい。有利には、前記チャンバ装置は、異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積を満たすための単一の入口を有する。好ましいチャンバ装置の例を添付の図に示す。前記チャンバ装置は、有利には、１つ以上のマイクロ流体デバイスの形態である。
【００４５】
一実施形態では、前記チャンバ装置は単一のチャンバであり、且つ、前記細胞懸濁液は、前記チャンバ高さまで前記局所サンプル容積をキャピラリ負荷するため、前記チャンバ装置に供給される。好ましくは、前記チャンバ高さは、高さが徐々に低くなるように、前記チャンバ装置の共通流路に沿って配置され、好ましくは、前記流路は少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含み、少なくとも約２．５μｍ互いに異なる。
【００４６】
一実施形態では、異なるチャンバ高さで前記異なる局所サンプル容積が、前記チャンバ装置の共通流路に沿って、好ましくは徐々に高さが低くなるように配置される。
【００４７】
徐々に減少する高さは、連続的に減少すること及び／又は下流に段階的に減少することを包含し得る。
【００４８】
用語「下流に」とは、前記チャンバ装置のチャンバ（流路）の入口からガス抜き(gas  escape)までの方向を意味する。前記ガス抜き装置(arrangement)は、フローセルの技術分野で知られているようなベント又は同様のものであってもよい。
【００４９】
一実施形態では、異なるチャンバ高さで前記ｎ個の異なる局所サンプル容積のうちの２つ以上が別々のフローチャンバ内に、例えば前記チャンバ装置の同一流路、例えば前記血液サンプル用の共通の入口を有する別個の流路に沿って、及び／又は並列配置された流路内に配置される。前記別個の流路は、有利には、簡単な方法で、異なるチャンバ高さでいくつかの局所サンプル容積について画像取得を同時に行うことを可能にする並列構成(configuration)で配置することができる。
【００５０】
本明細書において、画像は光センサのアレイに対して解釈されるべきであり、各光センサは画素(pixel)によって表される。有利には、前記画像は少なくとも１０００画素、例えば少なくとも１０,０００画素、又はさらには数メガピクセルまでのＮｘＭ画素の解像度を有する。
【００５１】
一実施形態では、異なるチャンバ高さで前記ｎ個の異なる局所サンプル容積のうちの２つ以上が、分岐構成に配置されている。前記分岐構成は、例えば、下流方向に、第１の高さｈ１を有するチャンバ高さで第１の局所サンプル容積と、それぞれ第２の高さｈ２と第３の高さｈ３とを有する異なるチャンバ高さで第２の局所サンプル容積と第３の局所サンプル容積とを含む。その場合ｈ１＞ｈ２＞ｈ３である。
【００５２】
異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積は、等しい又は異なる局所容積サイズを有することができる。実際には、より高い高さを有する異なるチャンバ高さで局所サンプル容積は、有利には、より低い高さを有する異なるチャンバ高さで局所サンプル容積よりも大きいサイズの局所容積を含むことになる。
【００５３】
前記局所サンプル容積について前記高さを含む前記チャンバ（複数可）は、原則的には任意の形状を有することができる流れ方向に垂直な断面形状をそれぞれ有する。有利には、前記チャンバ（複数可）を充填する場合、前記流れ方向に垂直な前記断面形状は、説明が困難な場合がある不規則なバックグラウンドノイズを生じる凹凸(irregularities)に起因する望ましくないぼやけ(blurring)なしに画像を取得することを可能にする規則的な形状である。
【００５４】
有利には、前記チャンバ装置の前記チャンバ（複数可）の流れ方向に垂直な前記断面形状は、円形、楕円形、正方形又は長方形である。好ましくは、前記チャンバ装置の前記チャンバ（複数可）の流れ方向に垂直な前記断面形状は、実質的に高さよりも大きな幅、例えば幅／高さ比が２以上、例えば少なくとも約５、例えば少なくとも約１００、例えば少なくとも約５００又はそれ以上、を有する長方形である。
【００５５】
前記チャンバ装置は、前記予め選択された波長の光に対して少なくとも部分的に光学的に透明である任意の材料とすることができる。前記チャンバ装置は、前記局所サンプル容積が収容される場所以外の位置において非透明材料を含むことができることに留意する必要がある。
【００５６】
有利には、前記チャンバ装置は光学グレードの高品質材料、例えば非晶質熱可塑性ポリマー、及び例えば射出成形による高精度ユニットの製造に使用することができる同様の材料のような、例えばガラス又はポリマーで構成される。
【００５７】
前記チャンバ装置は、その内側表面によって画定される１つ以上の流路を有する。前記フローチャンバ装置の内側表面は、任意の表面張力を有することができる。前記表面張力は、前記チャンバ装置が製造される材料から生じる。異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積の各々を規定する前記表面張力（複数可）（例えば、最上部壁断面(section)における１つの表面張力、及び異なるチャンバ高さで前記それぞれのローカルサンプル容積の最底部壁断面(section)におけるもう１つの表面張力）は、異なるチャンバ高さで一方の局所サンプル容積ともう一方の局所サンプル容積とが実質的に同一であることが望ましい。
【００５８】
表面張力は、ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨによって市販されている張力計、例えばＳＶＴ２０、Ｓｐｉｎｎｉｎｇドロップビデオテンシオメータなどを使用して測定することができる。この出願では、用語「表面張力」は巨視的表面エネルギーを示し、すなわち水に対する接触角によって測定された表面の親水性特性に直接比例する。
【００５９】
有利には、前記チャンバ装置の前記内側表面の少なくとも一部は親水性である。
【００６０】
異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積の最大高さが、前記予め選択された波長が完全に吸収されないように選択されることが一般に望ましい。
【００６１】
前記吸収測定に適用される前記画像取得デバイスの焦点深度に依存して、前記局所サンプル容積のための前記チャンバ高さの最大高さを選択することが非常に有利であることが分かった。それによって、前記チャンバ高さで前記局所容積から離れて異なる深度におけるいくつかの画像を取得する必要なく、高品質の吸収測定値を得ることができる。前記画像取得デバイスは、例えば、ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳ検出器であってもよい。
【００６２】
一実施形態では、前記チャンバ高さの最大高さは、前記吸収測定に適用される画像取得デバイスの焦点深度よりも小さい。前記局所容積の良好な吸収測定を保証するために、前記チャンバ高さの最大高さは、約４０μｍ以下、例えば約３０μｍ以下、例えば約２５μｍ以下、例えば約２０μｍ以下であることが一般に望ましい。
【００６３】
一実施形態では、前記チャンバ装置は、局所サンプル容積に対して少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含み、前記それぞれのチャンバ高さは約２μｍ〜約２５μｍの間隔にある。好ましいチャンバ高さは、約２．５μｍ〜約２０μｍの間隔にある。
【００６４】
高精度を確実にするためには、局所サンプル容積を含む前記２つ以上、及び好ましくは少なくとも３つのチャンバ高さが実質的に高さの差を有することが望ましい。有利には、前記チャンバ装置は、局所サンプル容積を含む少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含む。前記チャンバ高さは互いに異なり、高さで少なくとも約２．５μｍ、例えば少なくとも約３μｍ高さで異なる。
【００６５】
有利には、前記血液サンプルは、毛細管力によって入口を介して異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積を満たすため、前記チャンバ装置に供給される。あるいは、前記血液サンプルを前記チャンバ装置内に充填し、例えば、前記チャンバ装置の流路の下流端に吸引を用いることにより、又は血液サンプルを注入することにより、強制的な流れにより異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積を充填してもよい。簡単な取り扱いのために、毛管充填(capillary  filling)が好ましい。
【００６６】
有利には、前記血液サンプル及び特に前記血液試料の局所容積は、前記吸収測定の実行中に静止状態に保持される。
【００６７】
一実施形態では、前記チャンバ装置は、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容するために、少なくとも１つの予め選択された波長の光に対して少なくとも部分的に光学的に透明である。好ましくは、前記それぞれのチャンバ高さで含まれる局所サンプル容積の前記吸収測定は、少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射する光源を使用することを含む。
【００６８】
前記局所サンプル容積に向かって放射される光の光軸は、前記チャンバ装置の上面に実質的に垂直であり得る。一実施形態では、前記局所サンプル容積に向かって放出される光の光軸は、前記チャンバ装置の前記上面に対する角度を有する。それは、臨界角（光が反射する角度）まで、例えば約６０度まで、例えば約３０度まで、好ましくは約２０度未満までである。
【００６９】
有利には、前記予め選択された波長は、前記物質の、例えばＨｂの、の等吸収点(isobestic  point)における波長を含む。好ましくは、前記予め選択された波長は、波長約４２０ｎｍ、約５３０ｎｍ及び約５７０ｎｍのうちの少なくとも１つを含む。Ｈｂの等吸収点における波長を含む予め選択された波長を使用することにより、Ｈｂの前記吸収測定が酸素飽和度とは無関係であることが保証される。前記Ｈｂ（オキシヘモグロビン及びデオキシヘモグロビン）の状態。
【００７０】
異なる高さで前記チャンバ装置に含まれる局所サンプル容積の前記吸収測定は、少なくとも前記予め選択された波長を光源として用いて行われる。
【００７１】
一実施形態では、当該方法は、前記予め選択された波長、約５ｎｍ、例えば少なくとも約１０ｎｍ、例えば少なくとも約２５ｎｍ、例えば約２００ｎｍまでを含む波長の範囲を含む光を放射する光源を使用して、異なるチャンバ高さで前記それぞれの局所サンプル容積に含まれる局所サンプル容積の前記吸収測定を実施するステップを含む。
【００７２】
一実施形態では、当該方法は、前記測定のそれぞれに対して異なる波長又は波長の範囲を使用して、異なるチャンバ高さで含まれる各局所サンプル容積の２つ以上の吸収測定を行うことを含む。これにより、Ｈｂ濃度の決定がさらに正確になることができるか、及び／又は酸素化／脱酸素化Ｈｂの割合(fraction)が同時に決定され得る。
【００７３】
一実施形態では、前記吸収測定の各々は、前記光源を使用して前記チャンバ装置の第１の側から前記チャンバ高さで前記細胞懸濁液の前記局所サンプル容積を照射すること、及び、前記チャンバ装置の第２の反対側において少なくとも１つの画像を取得することにより透過光を記録することを含む。この場合、前記吸収測定は任意には、前記チャンバ高さの２つ以上で局所サンプル容積について同時に行われる。
【００７４】
前記吸収測定は、異なるチャンバ高さで前記それぞれの局所サンプル容積について１つずつ実施することができる。任意には、吸収測定は、結果を改善するために同一の(identical)高さを有する異なる(different)チャンバ高さで２つ以上の局所サンプル体積に対して実施される。迅速な測定のために、前記吸収測定の２つ以上が同時に行われることが有利であり得る。前記光源は有利には、前記高さ（又は、高さ断面(section)全体において高さが同一でない最短高さ）の方向に実質的に垂直な方向に光を放射することができる。一変形例では、前記光源は、前記高さ（又は、高さ断面(section)全体において高さが同一ではない最短高さ）の方向に対して垂直でない方向に、但し、例えば前記高さの方向に対し約３０度までの角度で、光を放射する。後者の実施形態では、前記高さ断面の前記局所サンプル容積は、光によって照らされる容積である。
【００７５】
一実施形態では、前記それぞれの局所サンプル容積の各々における前記局所Ｈｂ濃度の決定は、バックグラウンド強度に関して正規化されるべき問題の異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積の前記取得された画像（複数可）の画像を画像処理することを含む。結果として、ＲＢＣを含まない領域は１つに(to  unity)マッピングされる一方、ＲＢＣは１(unity)未満の正規化強度にまでマッピングされる。前記背景照明プロファイルのそのような正規化は、周知の方法によって達成することができる。
【００７６】
一実施形態では、前記画像処理は、バックグラウンド正規化を適用することにより、遊離血漿Ｈｂにより生じた干渉を除去すること、及び、異なるチャンバ高さで前記局所試料容積の前記取得された画像の全正規化光強度を問題の高さ（ｚ）における局所Ｈｂ濃度（すなわち、赤血球に結合した部分）と相関させることを含む。
【００７７】
一実施形態では、前記取得された画像はＨｂ濃度マップに変換され、且つ、理想的にはゼロレベルにおいてＲＢＣを含まない領域を量子化することを可能にする一方、ＲＢＣの占有領域は非ゼロであり、血液細胞に結合したＨｂに由来する。
【００７８】
干渉の除去は、有利には、例えば基準光強度Ｉｒｅｆを決定することによって、又は計算によって、及び／又は較正によって、バックグラウンド強度を補償することを含むことができる。
【数１】
2019506600.tif 000003
式中、ｉｊは画像Θの画素位置（ｉ、ｊ）を示し、
Ｉｉｊは画素ｉｊの測定光強度であり、
Ｉｉｊｒｅｆは画素ｉｊの基準（背景照明）強度であり、
γは較正によって算出又は決定される定数であり、
ｚは問題の局所サンプル容積を含むチャンバ高さであり、
ＬＶ（ｚ）は高さｚは領域θで定義される高さｚを有するチャンバ高さで局所容積である。
【００７９】
チャンバ高さの関数としての局所Ｈｂ濃度を含む前記Ｈｂ濃度モデルの生成は、多数のプロットに基づいてカーブフィッティングソフトウェアを使用することによって行うことができる。
【００８０】
一実施形態では、前記Ｈｂ濃度モデルの生成は、高さｚの関数として局所Ｈｂ濃度（ＬｃＨｂ）をマッピングすること（ｃＨｂ（ｚ））、前記ｃＨｂ（ｚ）マッピングへの最適線（ｂｅｓｔ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を計算すること、生成ｚ→∞の高さ及び前記Ｈｂ濃度まで前記最適線を外挿することを含む。前記最適線（ｂｅｓｔ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）は計算されてもよく、又は最小二乗などの標準カーブフィッティング技術を用いて決定してもよい。
【００８１】
一実施形態では、当該方法は、平均赤血球ヘモグロビン（Ｍｅａｎ  Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）（ＭＣＨ）を決定するステップをさらに含む。本発明の方法はＭＣＨの決定に非常に適していることが分かった。ＭＣＨを測定するための方法は、約５μｍ以下の低いチャンバ高さで局所サンプル容積の少なくとも１回の吸収測定を行うこと、前記低いチャンバ高さで前記局所サンプル容積の前記吸収測定からＭＣＨを決定することを含む。
【００８２】
前記低いチャンバ高さで前記局所サンプル容積は、前記Ｈｂ決定に使用される異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積の１つとすることができるか、又は前記チャンバ装置の異なる且つ低いチャンバ高さで追加の局所サンプル容積とすることができる。
【００８３】
高品質のＭＣＨ決定を確実にするために、前記赤血球の少なくともいくつかが重複しない(non-overlapping)赤血球であることを確実にするために、前記低チャンバ高さが十分に低いことが望ましい。好ましくは、異なるチャンバ高さで前記低局所サンプル容積は、約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍの高さを有する。
【００８４】
一実施形態では、前記低チャンバ高さで前記局所サンプル容積の前記吸収測定は、少なくとも１つの画像を取得すること、複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、前記識別された領域の吸収率を決定すること、前記決定された吸収率を前記ＭＣＨに相関させること、を含む。好ましくは、当該方法は、複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血液細胞の平均吸収率を決定すること、血液細胞の前記平均吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含む。
【００８５】
単一の赤血球のＨｂ  ｍＨｂ質量は、+ｃＨｂを決定するために記載したのと同様のアプローチで決定することができる。
【数２】
2019506600.tif 000004
式中、Ωは、画像内の赤血球を形成する画素位置の集合である。したがって、平均赤血球ヘモグロビン（Ｍｅａｎ  Ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）（ＭＣＨ）は、赤血球の代表的アンサンブルに対するｍＨｂの平均である。
【００８６】
血液サンプルが採取される患者の状態に依存して、ヘモグロビンの赤血球濃度は、細胞によって多かれ少なかれ変化し得る。高品質のＭＣＨ決定を確実にするため、相対的に多数の血液細胞の吸収を決定に使用することが望ましい。有利には、前記複数の個々の赤血球は、少なくとも約１０００個の細胞、例えば少なくとも約２０００個の細胞、例えば少なくとも約４０００個の細胞、例えば少なくとも約４２００個の細胞、例えば少なくとも約４４００個の細胞を含む。
【００８７】
また、少なくとも前記低チャンバ高さで前記局所サンプル容積は、少なくとも約０．１ｍｍ２、例えば少なくとも約０．２ｍｍ２、例えば少なくとも約０．４ｍｍ２、例えば少なくとも約０．３ｍｍ２である高さに垂直な２Ｄ伸長を有する。
【００８８】
前記複数の個々の赤血球は、有利には重複しない(non-overlapping)赤血球として識別される。
【００８９】
一実施形態では、当該方法はさらに、前記血液サンプルの赤血球の濃度ｃＲＢＣを決定することを含み、当該方法は、前記決定されたＨｂ濃度を前記ＭＣＨに相関させること、それによって前記ｃＲＢＣを決定することを含む。
【００９０】
前記ｃＲＢＣを決定するため、前記決定されたＨｂ濃度を前記ＭＣＨに相関させることは、以下のように単に実施され得る。：
【数３】
2019506600.tif 000005
【００９１】
有利には、当該方法は、ヘマトクリット値（Ｈｃｔ）を決定することをさらに含み、当該方法は、前記Ｈｂ濃度から経験的に前記Ｈｃｔ値を導き出すことを含む。例えば、
【数４】
2019506600.tif 000006
【００９２】
当該方法は、導出されたパラメータ値として見出され得る多数の他の血液パラメータを決定するのに好適であることも見出されている。好ましい血液パラメータは、以下の１つ以上を包含する。：
平均赤血球容積（ＭＣＶ）、
赤血球ヘモグロビン質量(Corpuscular  Hemoglobin  mass)（ｍＨｂ）分布、
赤血球容積分布（ＲＤＷ−ＳＤ）又は
前記ＲＢＣ細胞容積の変動係数（ＲＤＷ−ＳＤ）。
【００９３】
ＭＣＶは、以下のように決定することができる。：
【数５】
2019506600.tif 000007
式中、ＭＣＨＣは、上述の経験的関係を仮定して一定になる平均赤血球ヘモグロビン濃度(Mean  Corpuscular  Hemoglobin  Concentration)である。
【００９４】
ＲＤＷ−ＳＤは、以下のように決定されてもよい。：
【数６】
2019506600.tif 000008
【００９５】
ＲＤＷ−ＳＤは、以下のように決定されてもよい。：
ＲＤＷ−ＳＤ  ＝  前記ＲＢＣ細胞Ｈｂ質量の変動係数
【００９６】
本発明はまた、全血サンプル、例えば上述の全血サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度（ｃＨｂ）を決定するためのシステムを含む。
【００９７】
細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するための当該システムは、当該システムに当該方法を実行させるようにプログラムされたコンピュータシステムを含む。
【００９８】
一実施形態では、細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するための当該システムは、チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを生成すること、及び、前記物質濃度モデルを用いて、前記無限高さ物質濃度として前記物質濃度を決定することをプログラムされたコンピュータシステムを含む。
【００９９】
当該システムは、好ましくは、本発明の方法及び上述のその実施形態を実施するように構成されている。
【０１００】
一実施形態では、当該システムは、
−前記細胞懸濁液が流れることにより負荷されるように構成されたｎ個の異なるチャンバ高さを含むチャンバ装置であって、及び、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容するため、少なくとも1つの予め選択された波長に対して、少なくとも部分的に光学的に透明である、チャンバ装置と、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射するように構成された光源であって、及び、前記ｎ個のサンプル高さのうちの１つにおいて局所サンプル容積の少なくとも１つを照射するように構成された光源と、
−前記局所サンプル容積を通過する光の画像を取得するように構成された画像取得デバイスと、
を含む。
【０１０１】
有利には、前記コンピュータシステムは、前記それぞれの局所サンプル容積の各々において前記局所物質濃度を決定するため、ｎ個の異なる高さでの局所サンプル容積について前記画像取得デバイスによって得られた画像を処理するために、さらにプログラムされる。整数「ｎ」は、有利には、上記の方法について記載した通りである。
【０１０２】
当該システムが全血サンプル中のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度（ｃＨｂ）を決定するのに好適である一実施形態において、当該システムは有利には、
−局所サンプル容積に対してｎ個の異なるチャンバ高さを含むチャンバ装置(arrangement)であって、及び、前記チャンバ装置は、異なるチャンバ高さで前記局所サンプル容積において前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容するため、少なくとも１つの予め選択された波長に対して少なくとも部分的に透明である、チャンバ装置と、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射するように構成された光源であって、及び、サンプル領域を照射するように構成された、光源と、
−前記サンプル領域を通過する光を取得するように位置決めされ、且つ、構成された画像取得デバイスと、
−前記サンプル領域内前記にチャンバ装置を保持するように適合されたサンプルホルダと、
−コンピュータシステムと、
を含む。
【０１０３】
前記コンピュータシステムは有利には、
−前記チャンバ装置、前記光源及び前記画像取得デバイスの相対位置を制御する、
−前記サンプル領域を照明するための前記光源及び前記画像取得デバイスを制御し、及び、異なるチャンバ高さで前記それぞれの局所サンプル容積を透過した光の画像を取得する、
−前記画像取得デバイスによって取得された画像を取得する、
−前記血液サンプルの前記Ｈｂ濃度を決定するため、前記画像を処理する、
ようにプログラムされる。
【０１０４】
前記チャンバ装置は、上述のように有利である。
【０１０５】
前記光源は、有利には波長又は波長範囲がユーザによって選択可能であるように調整可能な光源であるか、又は、前記コンピュータシステムは、有利には、なくとも前記選択された波長を含むように前記波長又は前記波長範囲を選択するようにプログラムすることができる。
【０１０６】
前記光源は、少なくとも前記予め選択された波長における光を放射するように構成されており、及びサンプル領域を照らすように構成されている。有利には、前記コンピュータシステムは、前記吸収測定を実行するために、前記チャンバ配置が前記サンプルホルダによって保持されるサンプル領域が、十分に照射されることを確実にするようにプログラムされる。
【０１０７】
前記画像取得デバイスは、原理的には、任意の種類の画像取得デバイスであってもよく、好ましくは高分解能、例えば少なくとも１０．０００ピクセルの、例えば少なくとも１メガピクセルのピクセル分解能を有する。前記画像取得デバイスは、好ましくは、少なくともほぼ最大チャンバ高さである被写界深度(depthofview)を有する。
【０１０８】
前記画像取得デバイスは、前記サンプル領域を通過する光を取得するように位置決めされ、且つ、構成され、及び好ましくは、前記それぞれのチャンバ高さで前記局所容積の焦点にある画像を、同時又は順次に、１つずつ又は２つずつ、又は他のいずれか構成で取得するように配置される。
【０１０９】
前記コンピュータシステムは、データ接続、無線、有線及び／又はインターネットを介して、単一のコンピュータ又は複数のコンピュータを含むことができる。
【０１１０】
前記コンピュータシステムは、有利には、前記コンピュータシステムによって実行される場合、前記コンピュータシステムに
−前記チャンバ装置、前記光源及び前記画像取得デバイスの相対位置を制御させる、
−前記それぞれの局所サンプル容積を介して伝送された光の画像の取得を制御することによって、異なるチャンバ高さで局所血液容積の吸収測定を実行させる、及び
−前記血液サンプルの前記Ｈｂ濃度を決定するため、前記画像をさせる、
命令を含む前記コンピュータプログラムを含む記憶媒体を含む。
【０１１１】
有利には、前記画像の前記処理は、
−前記それぞれの局所サンプル容積における前記局所Ｈｂ濃度を決定すること、
−チャンバ高さの関数としての局所Ｈｂ濃度を含むＨｂ濃度モデルを生成すること、
−前記Ｈｂ濃度モデルを用いて前記Ｈｂ濃度を前記無限高さＨｂ濃度として決定すること、
を含む。
【０１１２】
前記それぞれの局所サンプル容積の各々における前記局所Ｈｂ濃度の決定のための各画像の前記処理は、有利には、例えば上記の方法で説明したように、好ましくはバックグラウンド強度（Ｉｒｅｆ）を決定及び／又は監視することによって、バックグラウンドノイズに関して前記画像を補正することを含む。
【０１１３】
一実施形態では、当該システムは全血中の前記Ｈｂ濃度を決定するように構成され、前記チャンバ装置の前記チャンバ高さのうちの少なくとも１つは約５μｍ以下の低チャンバ高さであり、前記コンピュータシステムは、前記低いチャンバ高さで局所血液容積の少なくとも１つの画像を取得することにより吸収測定を行うように、及び、前記低いチャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定から前記ＭＣＨを決定するように、プログラムされる。
【０１１４】
一実施形態では、前記低チャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定は、複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、前記識別された領域の吸収率を決定すること、前記決定された吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含み、好ましくは、前記吸収測定は、前記複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血液細胞の平均吸収率を決定すること、血液細胞の前記平均吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含む。
【０１１５】
ＭＣＨを決定する方法は上述した通りである。
【０１１６】
コンピュータは、有利には、前記複数の個々の赤血球を重複しない赤血球として識別するようにプログラムされる。
【０１１７】
一実施形態では、当該システムはさらに、前記血液サンプルの赤血球の濃度ｃＲＢＣを決定するように構成される。前記コンピュータシステムは、それにより前記ｃＲＢＣを決定するため、前記決定されたＨｂ濃度を前記ＭＣＨに相関させることによって前記血液サンプルの赤血球の濃度ｃＲＢＣを決定するようにプログラムされる。
【０１１８】
一実施形態では、前記コンピュータシステムはさらに、例えば上記の方法を使用して、前記Ｈｂ濃度から経験的に前記Ｈｃｔ値を導出することを含む方法によって、前記ヘマトクリット値（Ｈｃｔ）を決定するようにプログラムされる。
【０１１９】
一実施形態では、前記コンピュータシステムは、さらに、
平均赤血球容積（Mean  Corpuscular  volume）（ＭＣＶ）、
赤血球ヘモグロビン質量（Corpuscular  Hemoglobin  mass）（ｍＨｂ）分布、
赤血球容積分布（ＲＤＷ−ＳＤ）又は
ＲＢＣ細胞容積の変動係数（ＲＤＷ−ＳＤ）、
のうちの少なくとも１つを決定することを含む。
【０１２０】
適用される方法は、上記の通りであり得る。
【０１２１】
範囲及び好ましい範囲を包含する本発明の全ての特徴は、そのような特徴を組み合わせない特定の理由がない限り、本発明の範囲内で様々な方法で組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい実施形態を、図面を参照してさらに説明する。
【図１】図１は、本発明の方法及びシステムにおける使用に好適な下流方向において高さを連続的に減少させるチャンバ流路を備えたチャンバ装置の一実施形態の概略側面図である。
【図２】図２は、本発明の方法及びシステムにおける使用に好適な下流方向において段階的に減少する高さを有するチャンバ流路を備えたチャンバ装置の一実施形態の概略側面図である。
【図３】図３は、本発明の方法及びシステムにおける使用に好適な、異なる高さを有する３つの別個の流路を備えたチャンバ装置の一実施形態の概略平面図である。
【図４】図４は、本発明の方法及びシステムにおける使用に好適なチャンバ高さの分岐構成を備えたチャンバ装置の一実施形態の概略上面図である。
【図５】図５は、異なるチャンバ高さで前記様々な局所サンプル容積が円形構成で配置されているチャンバ装置の一実施形態の概略平面図である。
【図６】図６ａは、４２０ｎｍの背面照明を使用して、焦点で撮像された浅いチャンバ高さの全血の画像であり、前記ＲＢＣは、強い吸収のために暗い物体として現れる。  図６ｂは、図６ａの前記画像から計算されたＨｂ質量密度マップである。
【図７】図７最上部は、４２０ｎｍの背面照明を用いた浅いチャンバ（４．０μｍ）における全血サンプルの画像を示し、図７中央部は、ヘモグロビン２Ｄ濃度にマッピングされた前記最上部画像の対応する画像を示し、図７最下部はＲＢＣセグメンテーションの一例を示す。
【図８】図８は、全血サンプル中の赤血球ヘモグロビン質量ｍＨｂの分布を示す。この特定の血液サンプルの平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）は２８．２ｐｇである。
【０１２３】
【図９】発明を実施するための最良の形態  図９は、血液サンプルが下流方向に満たされたチャンバ装置の断面側面図である。チャンバ高さＣ１（約２０μｍ）では、赤血球がいくつかの層に敷かれている。チャンバ高さＣ２（約１０μｍ）では、赤血球は約３〜４層に敷かれているのに対し、チャンバ高さＣ３（約３μｍ）では赤血球が主に単一層に敷かれている。
【０１２４】
【図１０】図１０は、高さ３μｍ、１０μｍ及び２０μｍの前記異なるチャンバからの前記測定されたＨｂ濃度を示すプロットである。Ｓｅｇｒｅ−Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ効果のために、前記濃度は真の濃度よりも低い。真の値は１２０ｇ／Ｌであり、適合モデル(fitted  model)はｃＨｂ（∞）＝１２０．７ｇ／Ｌと予測する。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
図面は概略的なものであり、縮尺通りに描かれておらず、分かりやすくするために簡略化されてよい。全体を通して、同一又は対応する部分には同一の参照番号が使用されている。
【０１２６】
図１に示すチャンバ装置は、この図において描かれる如何なる側壁もなく、最上部壁１と最低部壁２とを含む非常に簡単な構造である。これらは一緒になって、入口４から下流方向にチャンバ高さを連続的に減少させるフローセルチャンバ３を画定し、それによって、局所試料容積に対して、原則的に無限の数の異なるチャンバ高さを提供する。下流端５において、前記チャンバ装置は、フローセルチャンバ３が血液サンプルで満たされるときにガス（空気）が逃げることを可能にするガス抜き  (escape)開口部を含む。前記ガス抜き開口部は、有利には、血液が前記開口部を通過することができないように構成され、それにより血液漏出の危険性が低減される。前記チャンバ装置は廃棄ユニットであり、一回使用後に廃棄するように配置されている。
【０１２７】
図２に示されるチャンバ構成は、図示されていない側壁と共に、異なるチャンバ高さで局所サンプル容積を収容するための３つの異なるセクション１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、及び、原理的には、局所サンプル容積のためのチャンバ高さとして使用することもできるが、但し好ましくはない、２つの中間セクションを有するフローセルチャンバを画定する最上部壁及び最底部壁を含む。前記中間セクションは、長く又は短かく決定されたイオン下流方向であってもよく、前記中間セクション１６の長さは有利には、チャンバ高さを高精度に生成するため、前記チャンバ装置を簡単にするという観点から選択される。前記チャンバ高さ１３ａ、１３ｂ、１３ｃは、入口１４から下流方向に高さが減少している。図示されていない変形例では、前記チャンバ装置は、４，５もしくは６の、又はそれ以上の異なるチャンバ高さを有し、下流方向に高さが低くなるように配置される。下流端１５において、前記チャンバ装置は、前記局所サンプル容積が前記異なるチャンバ高さ１３ａ、１３ｂ、１３ｃにおける前記チャンバを満たすにつれて、ガス（空気）が逃げることを可能にするガス抜き開口部を含む。
【０１２８】
図３に示す前記チャンバ装置２２は、相互に平行に配置された３つのチャンバ高さ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを有するマイクロ流体チャンバと、入口２４と、前記入口２４からこれらのセクション２３ａ、２３ｃまで血液を案内するための前記それぞれのチャンバ高さ２３ａ、２３ｃとの間の２つの中間セクション２６とを含む。前記中間セクション２６はまた、局所サンプル容積を収容するためのチャンバ高さとして使用することができるが、但しこれは一般に好ましくない。前記中間セクションは、長く又は短く決定されたイオン下流方向であってもよく、前記中間セクション２６の長さは、有利には、局所サンプル容積を収容するための異なるチャンバ高さ２３ａ、２３ｂ、２３ｃの観点から選択され、異なる高さを有するが、前記共通の入口２４から充填されるか、充填可能である。下流端において、前記チャンバ高さ２３ａ、２３ｂ、２３ｃは、前記局所サンプル容積が前記チャンバ高さ２３ａ、２３ｂ、２３ｃに充填されるときに、ガス（空気）が逃げることを可能にするガス抜き開口部２５をそれぞれ有する。
【０１２９】
図４に示す前記チャンバ装置３２は、異なるチャンバ高さで局所サンプル容積に対して５つのチャンバ高さ３３ａ、３３ｂ、３３ｂ’、３３ｃ、３３ｃ’を有するマイクロ流体チャンバを含む。前記チャンバ高さ３３ａ、３３ｂ、３３ｂ’、３３ｃ、３３ｃ’は、部分的に並行して、かつ部分的に下流構成に配置されている。見られるように、すべての前記チャンバ高さ３３ａ、３３ｂ、３３ｂ’、３３ｃ、３３ｃ’は１つの共通の入口３４を有する。前記チャンバ高さ３３ａ、３３ｂ、３３ｂ’、３３ｃ、３３ｃ’はまた、１つ以上の図示されていないガス抜き開口部を有する。前記チャンバ高さ３３ａは、前記チャンバ高さ３３ａの下流の異なるチャンバ高さ３３ｂ及び３３ｂ’の各々の高さよりも高い。前記チャンバ高さ３３ａのすぐ下流の前記チャンバ高さ３３ｂ及び３３ｂ’は、高さが同じであっても異なっていてもよい。前記チャンバ高さ３３ｂは、前記チャンバ高さ３３ｂの下流の前記チャンバ高さ３３ｃ及び３３ｃ’の各々の高さよりも高い高さを有する。前記チャンバ高さ３３ｂのすぐ下流の前記チャンバ高さ３３ｃ及び３３ｃ’は、高さが同じであっても異なっていてもよい。
【０１３０】
図５に示す前記チャンバ装置は、原理的には、その環状延長部に沿って異なるチャンバ高さで任意の数の局所サンプル容積を収容することができるマイクロ流体チャンバを含む。図示された実施形態は、１つの共通入口４４と１つの共通ガス抜き開口部４５とを有する環状構成で配置された異なるチャンバ高さ４３ａ、４４ｂ、４３ｂ、４３ｂ’、４３ｃ、４３ｃ’における６つの局所サンプル容積によって説明される。前記異なるチャンバ高さ４３ａ、４３ｂ、４３ｃは、前記入口４４から前記ガス抜き開口部４５まで下流方向において減少する高さを有する。その場合、例えば前記チャンバ高さ４３ａが大きい高さを有し、前記チャンバ高さ４３ｂが中間の高さを有し、前記チャンバ高さ４３ｃが浅い高さを有する。同じように、前記チャンバ高さ４３ａ’、４３ｂ’、４３ｃ’は、前記入口４４から前記ガス抜き開口部４５まで下流方向において減少する高さを有する。前記チャンバ高さ４３ａ、４４ｂ、４３ｂ、４３ｂ’、４３ｃ、４３ｃ’は、有利には、１つのチャンバ装置のみを使用して二重試験を提供するために対になった(pair  wise)等しい高さを有してもよい。
【０１３１】
図８に示すように、本発明の方法及びシステムは、全血サンプル中の赤血球ヘモグロビン質量ｍＨｂの分布を決定するために適用されてもよい。これは、示されているようなヒストグラムの形態であってもよい。そのようなヒストグラムの結果は、例えば、診断において、及び／又は疾患又は同様のものからの患者の回復を追跡するために使用され得る。
【０１３２】
本発明はまた、以下の態様に関する。：
１．細胞懸濁液中の物質の濃度を決定する方法であって、
前記細胞懸濁液をチャンバ装置(arrangement)に流すステップと、
前記チャンバ装置の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積の吸収測定を行うステップと、
前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度を前記それぞれの吸収測定に基づいて決定するステップと、
チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを生成するステップと、
−前記物質濃度モデルを用いて、無限チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップと、
を含み、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４である、方法。
【０１３３】
２．請求項１に記載の方法であって、前記チャンバ装置が単一のチャンバデバイスであり、前記局所サンプル容積を前記チャンバ高さにキャピラリロードするため、前記細胞懸濁液が前記チャンバ装置に供給され、好ましくは、前記チャンバ高さは、高さを徐々に低くして、前記チャンバ装置の共通流路に沿って配置され、好ましくは、前記流路は少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含み、少なくとも約２．５μｍ互いに異なる、方法。
【０１３４】
３．前記チャンバ高さの前記最大高さが約４０μｍ以下、例えば約３０μｍ以下、例えば約２５μｍ以下、例えば約２０μｍ以下である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【０１３５】
４．請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記チャンバ装置は、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容するため、少なくとも１つの予め選択された波長の光に対して少なくとも部分的に光学的に透明であり、前記それぞれのチャンバ高さで含まれる局所試料容積の前記吸収測定は、少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射する光源を使用することを含む、方法。
【０１３６】
５．前記吸収測定の各々は、前記光源を使用して前記チャンバ装置の第１の側から前記チャンバ高さで前記細胞懸濁液の前記局所サンプル容積を照射すること、及び前記チャンバ装置の第２の反対側において少なくとも１つの画像を取得することにより透過光を記録することを含み、前記吸収測定は、前記チャンバ高さの２つ以上における局所サンプル容積について同時に任意に実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１３７】
６．請求項４又は請求項５に記載の方法であって、前記予め選択された波長は、前記物質の等吸収点における波長を含み、好ましくは前記物質はＨｂであり、前記等吸収点は、波長約４２０ｎｍ、約５３０ｎｍ及び約５７０ｎｍのうちの少なくとも１つを含む、方法。
【０１３８】
７．請求項６に記載の方法であって、前記各局所サンプル容積体積の各々における前記局所物質濃度の決定が、前記局所サンプル容積の取得画像を画像処理することを含み、前記物質がＨｂである場合、前記画像処理は、自由プラズマＨｂによって生成された干渉を除去すること、及び前記チャンバ高さ断面の前記取得された画像の全正規化された光強度を、問題の高さ（ｚ）における局所Ｈｂ濃度に相関させることを含む、方法。
【０１３９】
８．請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記物質濃度モデルの決定は、高さＬｃ−物質（ｚ）の関数として前記局所サンプル容積の前記局所物質濃度（Ｌｃ−物質）をマッピングすること、前記マッピングに対する最良フィッティング曲線を計算すること、前記最良フィッティング曲線を高さｚ→∞に外挿すること、前記物質濃度を高さＺ＝∞における前記物質濃度として決定すること、を含む方法。
【０１４０】
９．請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞懸濁液が全血であり、前記物質がＨｂであり、当該方法が平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）を決定することをさらに含み、当該方法が、約５μｍ以下の低いチャンバ高さで少なくとも１つの吸収測定を行うこと、及び前記低いチャンバ高さで前記吸収測定から前記ＭＣＨを決定することを含み、前記低いチャンバ高さが約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍである、方法。
【０１４１】
１０．請求項９に記載の方法であって、前記低いチャンバ高さでの前記吸収測定が、少なくとも１つの画像を取得すること、及び複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、及び前記識別された領域の吸収率を決定すること、及び前記決定された吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含み、
好ましくは、当該方法は、前記複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血球の平均吸収率を決定すること、及び血球の前記平均吸収率を前記ＭＣＨと相関させることを含み、好ましくは、前記複数の個々の赤血球は、重複しない赤血球として識別される、方法。
【０１４２】
１１．請求項９又は請求項１０に記載の方法であって、当該方法は、前記血液サンプルの赤血球ｃＲＢＣの濃度を決定することをさらに含み、当該方法は、前記決定されたＨｂ濃度を前記ＭＣＨに相関させることによって前記ｃＲＢＣを決定することを含む、方法。
【０１４３】
１２．細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するためのシステムであって、当該システムは、チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを生成する、及び、前記物質濃度モデルを用いて、前記無限高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するようにプログラムされたコンピュータシステムを含む、システム。
【０１４４】
１３．請求項１２に記載のシステムであって、当該システムは、
−前記細胞懸濁液が流れることにより負荷されるように構成された、ｎ個の異なるチャンバ高さを含み、及び、少なくとも1つの予め選択された波長に対して、少なくとも部分的に光学的に透明であるチャンバ装置であって、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容する、チャンバ装置と、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射するように構成され、及び、前記ｎ個のサンプル高さのうちの１つにおいて、少なくとも１つの局所サンプル容積を照射するように構成された光源と、
−前記局所サンプル容積を通過する光の画像を取得するように構成された画像取得デバイスと、
を含み、
前記コンピュータシステムはさらに、前記それぞれの局所サンプル容積のそれぞれにおける前記局所物質濃度を決定するため、ｎ個の異なる高さでの局所サンプル容積の前記画像取得デバイスによって得られた画像を処理するようにプログラムされ、
ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば２〜１０である、システム。
【０１４５】
１４．請求項１３に記載のシステムであって、
前記最大チャンバ高さが前記画像取得デバイスの焦点深度未満であり、且つ、前記コンピュータシステムが、
前記焦点深度が、前記それぞれの画像を取得するための前記それぞれのチャンバ高さで局所サンプル容積を含むことを制御するため、前記チャンバ装置と、前記光源と、前記画像取得デバイスとの相対位置を制御すること、
前記局所サンプル容積を照射し、及び、前記それぞれのチャンバ高さで前記局所サンプル容積を透過した光の画像を取得するため、前記光源及び前記画像取得デバイスを制御すること、
前記画像取得デバイスにより得られた画像を受信すること、
前記細胞懸濁液の物質濃度を決定するため、前記画像を処理すること、
をプログラムされた、システム。
【０１４６】
１５．請求項１３又は請求項１４に記載のシステムであって、前記システムは、全血中のＨｂ濃度を決定するように構成されており、前記チャンバ装置の前記チャンバ高さのうちの少なくとも１つは、約５μｍ以下の低チャンバ高さであり、前記コンピュータシステムは、前記低チャンバ高さで局所血液容積の少なくとも１つの画像を取得することにより吸収測定を行うように、及び、前記低チャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定からＭＣＨを決定するようにプログラムされている、システム。
【０１４７】
１６．請求項１５に記載のシステムであって、前記低チャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定は、複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、前記識別された領域の吸収率を決定すること、前記決定された吸収率をＭＣＨに相関させることを含み、好ましくは、前記吸収測定は、前記複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血液細胞の平均吸収率を決定すること、及び血液細胞の前記平均吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含む、システム。
【０１４８】
１７．請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のシステムであって、当該システムがさらに、前記血液サンプルの赤血球ｃＲＢＣの濃度を決定するように構成され、前記コンピュータシステムは、それにより前記ｃＲＢＣを決定するため、前記決定されたＨｂ濃度を前記ＭＣＨに相関させることにより、前記血液サンプルの赤血球の濃度ｃＲＢＣを決定するようにプログラムされている、システム。
【図１】
2019506600.tif 000009
【図２】
2019506600.tif 000010
【図３】
2019506600.tif 000011
【図４】
2019506600.tif 000012
【図５】
2019506600.tif 000013
【図６ａ】
2019506600.tif 000014
【図６ｂ】
2019506600.tif 000015
【図７】
2019506600.tif 000016
【図８】
2019506600.tif 000017
【図９】
2019506600.tif 000018
【図１０】
2019506600.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月23日(2018.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液中の物質の濃度を決定する方法であって、以下のステップ：
−前記細胞懸濁液を含むチャンバ装置(arrangement)の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積で行われる吸収測定の結果を使用するステップであって、前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度が前記それぞれの吸収測定に基づいて決定される、ステップと、
−チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを使用するステップと、
−前記物質濃度モデルと前記決定された局所物質濃度とを用いて、無限チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップであって、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４である、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記チャンバ装置が単一のチャンバデバイスであり、前記局所サンプル容積を前記チャンバ高さにキャピラリロードするため、前記細胞懸濁液が前記チャンバ装置に供給され、好ましくは、前記チャンバ高さは、高さを徐々に低くして、前記チャンバ装置の共通流路に沿って配置され、好ましくは、前記流路は少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含み、少なくとも約２．５μｍ互いに異なる、方法。
【請求項３】
前記チャンバ高さの前記最大高さが約４０μｍ以下、例えば約３０μｍ以下、例えば約２５μｍ以下、例えば約２０μｍ以下である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記吸収測定の各々は、前記光源を使用して前記チャンバ装置の第１の側から前記チャンバ高さで前記細胞懸濁液の前記局所サンプル容積を照射すること、及び前記チャンバ装置の第２の反対側において少なくとも１つの画像を取得することにより透過光を記録することを含み、前記吸収測定は、前記チャンバ高さの２つ以上における局所サンプル容積について同時に任意に実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の方法であって、前記予め選択された波長は、前記物質の等吸収点における波長を含み、好ましくは前記物質はＨｂであり、前記等吸収点は、波長約４２０ｎｍ、約５３０ｎｍ及び約５７０ｎｍのうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記各局所サンプル容積体積の各々における前記局所物質濃度の決定が、前記局所サンプル容積の取得画像を画像処理することを含み、前記物質がＨｂである場合、前記画像処理は、自由プラズマＨｂによって生成された干渉を除去すること、及び前記チャンバ高さ断面の前記取得された画像の全正規化された光強度を、問題の高さ（ｚ）における局所Ｈｂ濃度に相関させることを含む、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、前記物質濃度モデルの決定は、高さＬｃ−物質（ｚ）の関数として前記局所サンプル容積の前記局所物質濃度（Ｌｃ−物質）をマッピングすること、前記マッピングに対する最良フィッティング曲線を計算すること、前記最良フィッティング曲線を高さｚ→∞に外挿すること、前記物質濃度を高さＺ＝∞における前記物質濃度として決定すること、を含む方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞懸濁液が全血であり、前記物質がＨｂであり、当該方法が平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）を決定することをさらに含み、当該方法が、約５μｍ以下の低いチャンバ高さで少なくとも１つの吸収測定を行うこと、及び前記低いチャンバ高さで前記吸収測定から前記ＭＣＨを決定することを含み、前記低いチャンバ高さが約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、当該方法は前記決定されたＨｂ濃度及び前記決定されたＭＣＨに基づいてｃＲＢＣを決定することをさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記低いチャンバ高さでの前記吸収測定が、少なくとも１つの画像を取得すること、及び複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、及び前記識別された領域の吸収率を決定すること、及び前記決定された吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含み、
好ましくは、当該方法は、前記複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血球の平均吸収率を決定すること、及び血球の前記平均吸収率を前記ＭＣＨと相関させることを含み、好ましくは、前記複数の個々の赤血球は、重複しない赤血球として識別される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、当該方法が、以下のステップ：
−前記細胞懸濁液を前記チャンバ装置に流すステップと、
−前記チャンバ装置の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積の吸収測定を行うステップと、
のうちの少なくとも１つをさらに含む、方法。
【請求項１２】
細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するためのシステムであって、当該システムに請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を実行させるようにプログラムされたコンピュータシステムを含むシステム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシステムであって、当該システムは、
−前記細胞懸濁液が流れることにより負荷されるように構成された、ｎ個の異なるチャンバ高さを含み、及び、少なくとも1つの予め選択された波長に対して、少なくとも部分的に光学的に透明であるチャンバ装置であって、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容する、チャンバ装置と、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射するように構成され、及び、前記ｎ個のサンプル高さのうちの１つにおいて、少なくとも１つの局所サンプル容積を照射するように構成された光源と、
−前記局所サンプル容積を通過する光の画像を取得するように構成された画像取得デバイスと、
をさらに含み、
前記コンピュータシステムはさらに、前記それぞれの局所サンプル容積のそれぞれにおける前記局所物質濃度を決定するため、ｎ個の異なる高さでの局所サンプル容積の前記画像取得デバイスによって得られた画像を処理するようにプログラムされ、
ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば２〜１０である、システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のシステムであって、
最大チャンバ高さが前記画像取得デバイスの焦点深度未満であり、且つ、前記コンピュータシステムが、
−前記焦点深度が、前記それぞれの画像を取得するための前記それぞれのチャンバ高さで局所サンプル容積を含むことを制御するため、前記チャンバ装置と、前記光源と、前記画像取得デバイスとの相対位置を制御すること、
−前記局所サンプル容積を照射し、及び、前記それぞれのチャンバ高さで前記局所サンプル容積を透過した光の画像を取得するため、前記光源及び前記画像取得デバイスを制御すること、
−前記画像取得デバイスにより得られた画像を受信すること、
−前記細胞懸濁液の物質濃度を決定するため、前記画像を処理すること、
をプログラムされた、システム。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４に記載のシステムであって、前記システムは、全血中のＨｂ濃度を決定するように構成されており、前記チャンバ装置の前記チャンバ高さのうちの少なくとも１つは、約５μｍ以下の低チャンバ高さであり、前記コンピュータシステムは、前記低チャンバ高さで局所血液容積の少なくとも１つの画像を取得することにより吸収測定を行うように、及び、前記低チャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定からＭＣＨを決定するようにプログラムされている、システム。
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月10日(2018.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータで実施される、細胞懸濁液中の物質の濃度を決定する方法であって、当該方法は、以下のステップ：
−前記細胞懸濁液を含むチャンバ装置（２２）の異なる平均チャンバ高さ(１３ａ、ｂ、ｃ)で含まれるｎ個の局所サンプル容積で行われる吸収測定の結果を使用するステップであって、前記それぞれの局所サンプル容積中の局所物質濃度が前記それぞれの吸収測定に基づいて決定される、ステップ、
を含み、且つ、以下のステップ：
−チャンバ高さの関数としての局所物質濃度を含む物質濃度モデルを使用するステップと、
−前記物質濃度モデルと前記決定された局所物質濃度とを用いて、無限チャンバ高さ物質濃度として前記物質濃度を決定するステップであって、ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４である、ステップと、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記チャンバ装置が単一のチャンバデバイスであり、前記局所サンプル容積を前記チャンバ高さにキャピラリロードするため、前記細胞懸濁液が前記チャンバ装置に供給され、好ましくは、前記チャンバ高さは、高さを徐々に低くして、前記チャンバ装置の共通流路に沿って配置され、好ましくは、前記流路は少なくとも３つの異なるチャンバ高さを含み、少なくとも約２．５μｍ互いに異なる、方法。
【請求項３】
前記チャンバ高さの前記最大高さが約４０μｍ以下、例えば約３０μｍ以下、例えば約２５μｍ以下、例えば約２０μｍ以下である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記吸収測定の各々は、前記光源を使用して前記チャンバ装置の第１の側から前記チャンバ高さで前記細胞懸濁液の前記局所サンプル容積を照射すること、及び前記チャンバ装置の第２の反対側において少なくとも１つの画像を取得することにより透過光を記録することを含み、前記吸収測定は、前記チャンバ高さの２つ以上における局所サンプル容積について同時に任意に実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の方法であって、前記予め選択された波長は、前記物質の等吸収点における波長を含み、好ましくは前記物質はＨｂであり、前記等吸収点は、波長約４２０ｎｍ、約５３０ｎｍ及び約５７０ｎｍのうちの少なくとも１つを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記各局所サンプル容積体積の各々における前記局所物質濃度の決定が、前記局所サンプル容積の取得画像を画像処理することを含み、前記物質がＨｂである場合、前記画像処理は、自由プラズマＨｂによって生成された干渉を除去すること、及び前記チャンバ高さ断面の前記取得された画像の全正規化された光強度を、問題の高さ（ｚ）における局所Ｈｂ濃度に相関させることを含む、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、前記物質濃度モデルの決定は、高さＬｃ−物質（ｚ）の関数として前記局所サンプル容積の前記局所物質濃度（Ｌｃ−物質）をマッピングすること、前記マッピングに対する最良フィッティング曲線を計算すること、前記最良フィッティング曲線を高さｚ→∞に外挿すること、前記物質濃度を前記高さＺ＝∞における前記物質濃度として決定すること、を含む方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記細胞懸濁液が全血であり、前記物質がＨｂであり、当該方法が平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）を決定することをさらに含み、当該方法が、約５μｍ以下の低いチャンバ高さで少なくとも１つの吸収測定を行うこと、及び前記低いチャンバ高さで前記吸収測定から前記ＭＣＨを決定することを含み、前記低いチャンバ高さが約２μｍ〜約３．５μｍ、例えば約２．５〜約３μｍである、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、当該方法は前記決定されたＨｂ濃度及び前記決定されたＭＣＨに基づいてｃＲＢＣを決定することをさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記低いチャンバ高さでの前記吸収測定が、少なくとも１つの画像を取得すること、及び複数の個々の赤血球の画像領域を識別すること、及び前記識別された領域の吸収率を決定すること、及び前記決定された吸収率を前記ＭＣＨに相関させることを含み、
好ましくは、当該方法は、前記複数の個々の赤血球の数をカウントすること、血球の平均吸収率を決定すること、及び血球の前記平均吸収率を前記ＭＣＨと相関させることを含み、好ましくは、前記複数の個々の赤血球は、重複しない赤血球として識別される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、当該方法が、以下のステップ：
−前記細胞懸濁液を前記チャンバ装置に流すステップと、
−前記チャンバ装置の異なる平均チャンバ高さで含まれるｎ個の局所サンプル容積の吸収測定を行うステップと、
のうちの少なくとも１つをさらに含む、方法。
【請求項１２】
細胞懸濁液中の物質の濃度を決定するためのシステムであって、当該システムに請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を実行させるようにプログラムされたコンピュータシステムを含むシステム。
【請求項１３】
請求項１２に記載のシステムであって、当該システムは、
−前記細胞懸濁液が流れることにより負荷されるように構成された、ｎ個の異なるチャンバ高さ(１３ａ、ｂ、ｃ)を含み、及び、少なくとも1つの予め選択された波長に対して、少なくとも部分的に光学的に透明であるチャンバ装置（２２）であって、前記チャンバ高さで前記チャンバ装置を通過する前記予め選択された波長の光ビームを少なくとも部分的に許容する、チャンバ装置と、
−少なくとも前記予め選択された波長を含む光を放射するように構成され、及び、前記ｎ個のサンプル高さのうちの１つにおいて、少なくとも１つの局所サンプル容積を照射するように構成された光源と、
−前記局所サンプル容積を通過する光の画像を取得するように構成された画像取得デバイスと、
をさらに含み、
前記コンピュータシステムはさらに、前記それぞれの局所サンプル容積のそれぞれにおける前記局所物質濃度を決定するため、ｎ個の異なる高さでの局所サンプル容積の前記画像取得デバイスによって得られた画像を処理するようにプログラムされ、
ｎは少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば２〜１０である、システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のシステムであって、
最大チャンバ高さが前記画像取得デバイスの焦点深度未満であり、且つ、前記コンピュータシステムが、
−前記焦点深度が、前記それぞれの画像を取得するための前記それぞれのチャンバ高さで局所サンプル容積を含むことを制御するため、前記チャンバ装置と、前記光源と、前記画像取得デバイスとの相対位置を制御すること、
−前記局所サンプル容積を照射し、及び、前記それぞれのチャンバ高さで前記局所サンプル容積を透過した光の画像を取得するため、前記光源及び前記画像取得デバイスを制御すること、
−前記画像取得デバイスにより得られた画像を受信すること、
−前記細胞懸濁液の物質濃度を決定するため、前記画像を処理すること、
をプログラムされた、システム。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４に記載のシステムであって、前記システムは、全血中のＨｂ濃度を決定するように構成されており、前記チャンバ装置の前記チャンバ高さのうちの少なくとも１つは、約５μｍ以下の低チャンバ高さであり、前記コンピュータシステムは、前記低チャンバ高さで局所血液容積の少なくとも１つの画像を取得することにより吸収測定を行うように、及び、前記低チャンバ高さで前記局所血液容積の前記吸収測定からＭＣＨを決定するようにプログラムされている、システム。
【国際調査報告】
2019506600.tif 000020
2019506600.tif 000021
2019506600.tif 000022