(57)【要約】  本発明は、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファ（Ｇα）サブユニットの変異体を提供し、この変異体は、（ｉ）親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスを欠き、（ｉｉ）ヘテロ三量体Ｇタンパク質ベータ（Ｇβ）サブユニット及びヘテロ三量体Ｇタンパク質ガンマ（Ｇγ）サブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができ、（ｉｉｉ）親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットのアミノ酸配列と比較して１つ以上の変異を含むアミノ酸配列を有し、これらの変異は、欠失、置換、及び挿入から選択される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファ（Ｇα）サブユニットの変異体であって、前記変異体が、（ｉ）前記親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスを欠き、（ｉｉ）ヘテロ三量体Ｇタンパク質ベータ（Ｇβ）サブユニット及びヘテロ三量体Ｇタンパク質ガンマ（Ｇγ）サブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができ、（ｉｉｉ）前記親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットのアミノ酸配列と比較して１つ以上の変異を含むアミノ酸配列を有し、前記変異が、欠失、置換、及び挿入から選択される、親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの変異体。
【請求項２】
前記変異体が、前記親ＧαサブユニットのヘリカルドメインのヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦのうちのいずれか１つ以上を欠き、任意に、前記変異体が、前記親ＧαサブユニットのヘリカルドメインのヘリックスＡ〜Ｅを欠くか、またはヘリックスＡ〜Ｆを欠く、請求項１に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３】
前記変異体が、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基７０〜１９３、７１〜１９３、８５〜１９３、または８５〜１９９に対応する前記親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの領域を欠く、請求項１または２に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項４】
前記変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合が、アゴニストに対する前記ＧＰＣＲの親和性を増加させる、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項５】
前記変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合が、前記Ｇαサブユニットを活性化する、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項６】
前記Ｇαサブユニットの活性化が、細胞内にＧαタンパク質シグナルを生成し、任意に、前記Ｇタンパク質シグナルが、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の増加、ｃＡＭＰの減少、または細胞内カルシウム動員である、請求項５に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項７】
前記変異体Ｇαサブユニットが、その親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で増加した安定性を有し、かつ／または細胞内で発現する場合、その親Ｇαサブユニットよりも高いレベルで発現する、請求項１〜６のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項８】
前記変異体Ｇαサブユニットが、前記ＧＰＣＲへの結合時に前記ＧＰＣＲの特定の立体構造を安定化することができ、任意に、前記特定の立体構造が、アゴニスト立体構造である、請求項１〜７のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項９】
前記変異体Ｇαサブユニットが、グアニンヌクレオチド等のヌクレオチドに結合することができ、かつ／または前記変異体Ｇαサブユニットが、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧβ及び／もしくはＧγサブユニットに結合することができる、請求項１〜８のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１０】
前記Ｇαサブユニットが、Ｇαｓ、Ｇαｉ／ｏ、Ｇαｑ／１１、またはＧα１２／１３サブユニットのうちのいずれかである、請求項１〜９のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１１】
前記親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩ領域が欠失していない、請求項１〜１０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１２】
前記親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩ領域が欠失している、請求項１〜１０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１３】
前記親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩ領域が、低分子量ＧＴＰａｓｅのスイッチＩ領域によって置換されている、請求項１２に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１４】
前記親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩ領域が、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基１９４〜２０７に対応する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１５】
前記親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのヘリカルドメインもしくはその一部及び／またはスイッチＩ領域もしくはその一部が、リンカー配列によって置換されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１６】
図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６５〜２０３に対応する前記親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの領域が欠失しており、任意に、前記領域が、リンカー配列によって置換されている、請求項１〜１５のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１７】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、Ｎ末端切断アミノ酸配列を有し、任意に、前記Ｎ末端切断が、５〜２０または５〜２５アミノ酸残基長である、請求項１〜１６のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１８】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、スイッチＩ領域に１つ以上の変異を含む、請求項１〜１１及び１３〜１６のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項１９】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置、Ｌｅｕ  １９７及びＣｙｓ  ２００のうちのいずれか１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項１８に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２０】
前記親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩＩＩ領域が欠失しており、任意に、前記親ヘテロ三量体ＧαサブユニットのスイッチＩＩＩ領域が、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２５４〜２６３に対応する、請求項１〜１９のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２１】
前記親ヘテロ三量体ＧαサブユニットのスイッチＩＩ領域またはその一部が、リンカー配列によって置換されている、請求項１〜２０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２２】
前記親ヘテロ三量体ＧαサブユニットのスイッチＩＩ領域が、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２２７〜２３０に対応する、請求項２１に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２３】
前記リンカー配列が、１つ以上のグリシン残基及び／または１つ以上のセリン残基を含む、請求項１５、１６、２１、及び２２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２４】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置、Ｖａｌ  ３６、Ｈｉｓ  ４１、Ａｌａ  ４８、Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｍｅｔ  ６０、Ｌｅｕ  ６３、Ｌｅｕ  １９７、Ｃｙｓ  ２００、Ａｒｇ  ２０１、Ｐｈｅ  ２０８、Ａｓｎ  ２１８、Ｇｌｙ  ２２６、Ｇｌｕ  ２３０、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、Ｖａｌ  ３７５のうちのいずれか１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有し、任意に、前記変異体Ｇαサブユニットが、前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置、Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、及びＶａｌ  ３７５に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである、請求項１〜２３のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２５】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、２０アミノ酸残基長のＮ末端切断を有し、スイッチＩＩＩ領域の欠失を有し、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置、Ｈｉｓ  ４１、Ｌｅｕ  １９７、Ｃｙｓ  ２００、Ａｌａ  ２４９、及びＬｅｕ  ２７２のうちの１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項１〜２４のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２６】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置、Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｇｌｙ  ２２６、及びＳｅｒ  ２５２のうちの１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項１〜２５のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２７】
前記変異体Ｇαサブユニットが、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号９１）と少なくとも２０％の配列同一性を有する、請求項１〜２６のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２８】
前記変異体Ｇαサブユニットが、図２６、２９、３５、３６、３７、３８、及び４０のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列のうちのいずれかと少なくとも２０％の配列同一性を有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項２９】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、１つ以上の優性陰性変異を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３０】
前記変異体Ｇαサブユニットが、任意に、Ｇタンパク質βγサブユニットを隔離することによって、活性化受容体を隔離することによって、かつ／または下流結合パートナーを隔離することによって、Ｇタンパク質シグナル伝達を阻害する、請求項２９に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３１】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うＳｅｒ  ５４に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項２９または３０に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３２】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、ＮＫＸＤモチーフ内に１つ以上の異なるアミノ酸を有し、任意に、ＮＫＸＤモチーフのＡｓｎがＡｓｐで置換されており、かつ／またはＮＫＸＤモチーフのＡｓｐがＡｓｎで置換されている、請求項２９〜３１のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３３】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のＧαｓの番号付けに従うＧｌｎ  ２２７に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項２９〜３２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３４】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置、Ｇｌｙ  ２２６、Ｇｌｕ  ２６８、及びＡｌａ  ３６６のうちの１つ以上に対応する位置に１つ以上の異なるアミノ酸を有する、請求項２９〜３３のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３５】
変異体Ｇαｔサブユニット（キメラ６）であり、前記親Ｇαサブユニットと比較して、図２７に記載のＧαｔサブユニット（キメラ６）の番号付けに従うＡｒｇ  ２３８に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項２９〜３４のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３６】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、ＧＰＣＲに対するＧαサブユニットの親和性を増加させることで知られている１つ以上の変異を含む、請求項２９〜３５のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３７】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図２５に記載のＧαｉ１サブユニットの番号付けに従うＩｌｅ  ５６及びＧｌｎ  ３３３に対応する位置の各々にシステイン残基を有する、請求項３６に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３８】
前記親Ｇαサブユニットと比較して、図２５に記載のＧαｉ１サブユニットの番号付けに従うＡｓｐ  ３２８に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、請求項３６または３７に記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項３９】
親Ｇαｓサブユニットのα３／β５ループがＧαｉ２サブユニットのα３／β５ループで置換されている変異体Ｇαｓサブユニットである、請求項３６〜３８のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項４０】
図２５に記載のＧαｔサブユニットの番号付けに従うＣｙｓ  ３４７に対応する位置のアミノ酸残基が化学修飾されており、任意に、前記アミノ酸残基がカルボキシメチル化またはシアニル化されている変異体Ｇαｔサブユニットである、請求項１〜３９のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項４１】
前記変異体Ｇαサブユニットが、ヒスチジンタグまたはマルトース結合タンパク質タグまたは緑色蛍光タンパク質タグ等の検出可能な部分を含み、かつ／またはタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位等のプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１〜４０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項４２】
前記変異体が、その親と比較して、熱、洗剤、カオトロピック剤、及び極度のｐＨのうちのいずれか１つに対する増加した安定性を有する、請求項１〜４１のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット。
【請求項４３】
前記変異体Ｇαが、前記変異体Ｇαサブユニットを超える程度まで前記親Ｇαを不安定化するのに有効な不安定化条件に曝露されることを特徴とする、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットを含む組成物。
【請求項４４】
請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４６〜９０のうちのいずれかのポリヌクレオチド配列と少なくとも２０％の配列同一性を有する、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項４７】
（ｉ）ＧＰＣＲに結合することができる請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたはその一部と、（ｉｉ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲまたはその一部と、を含む、複合体。
【請求項４８】
前記ＧＰＣＲが、クラス１のＧＰＣＲまたはクラス２のＧＰＣＲまたはクラス３のＧＰＣＲであり、任意に、前記ＧＰＣＲが、ベータアドレナリン受容体、アデノシン受容体、ムスカリン受容体、またはニューロテンシン受容体のうちのいずれかである、請求項４７に記載の複合体。
【請求項４９】
前記ＧＰＣＲが、アゴニスト結合立体構造等の特定の立体構造状態で存在する、請求項４７または４８に記載の複合体。
【請求項５０】
前記ＧＰＣＲが、変性条件下での同じ特定の立体構造におけるその親ＧＰＣＲの安定性と比較して、変性条件下での特定の立体構造における増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲである、請求項４７〜４９のいずれかに記載の複合体。
【請求項５１】
（ｉ）及び（ｉｉ）の一方または両方が検出可能に標識されている、請求項４７〜５０のいずれかに記載の複合体。
【請求項５２】
ＧＰＣＲリガンドをさらに含む、請求項４７〜５１のいずれかに記載の複合体。
【請求項５３】
前記ＧＰＣＲリガンドが、小分子、タンパク質、ペプチド、タンパク質足場、核酸、イオン、炭水化物、または抗体のうちのいずれかである、請求項５２に記載の複合体。
【請求項５４】
Ｇタンパク質βγサブユニットをさらに含む、請求項４７〜５３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５５】
ヌクレオチドをさらに含み、任意に、前記ヌクレオチドがＧＤＰまたはＧＴＰ等のグアニンヌクレオチドであるか、または任意に、前記ヌクレオチドがキサンチンヌクレオチドである、請求項４７〜５４のいずれかに記載の複合体。
【請求項５６】
前記複合体が結晶形態である、請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体。
【請求項５７】
（ｉ）ＧＰＣＲに結合することができる請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたはその一部、及び（ｉｉ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲまたはその一部をコードすることができる、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター。
【請求項５８】
可溶化形態である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体。
【請求項５９】
他のタンパク質を実質的に含まない、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体。
【請求項６０】
固体支持体に固定化される、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体。
【請求項６１】
請求項１〜４２のいずれかに記載の１つ以上の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体が固定化される、固体支持体。
【請求項６２】
結晶化のための、請求項１〜４２及び５８〜６０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５及び５８〜６０のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項６３】
創薬における、請求項１〜４２及び５８〜６０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５及び５８〜６０のいずれかに記載の複合体の使用。
【請求項６４】
前記変異体Ｇαサブユニットまたは複合体が、リガンド結合スクリーニングまたはアッセイ開発に使用される、請求項６３に記載の使用。
【請求項６５】
バイオセンサーとしての、請求項１〜４２及び５８〜６０のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５及び５８〜６０のいずれかに記載の複合体の使用であって、任意に、前記バイオセンサーが、インビボでリガンドレベルを測定することができる、使用。
【請求項６６】
ＧＰＣＲ−Ｇαサブユニット複合体の結晶を産生する方法であって、
（ｉ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット、ＧＰＣＲ、及び任意にＧＰＣＲリガンドを提供することと、
（ｉｉ）前記変異体Ｇαサブユニット、前記ＧＰＣＲ、及び任意に前記ＧＰＣＲリガンドの複合体を形成することと、
（ｉｉｉ）前記複合体を結晶化して、結晶を形成することと、を含む、方法。
【請求項６７】
前記ＧＰＣＲが、特定の立体構造に結晶化される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
特定の立体構造におけるＧＰＣＲの構造を決定する方法であって、請求項４７〜５５のいずれかに記載のＧＰＣＲ−Ｇαサブユニット複合体を提供することと、前記複合体の構造を決定することと、を含む、方法。
【請求項６９】
前記ＧＰＣＲ−Ｇαサブユニット複合体が結晶形態で提供され、前記複合体の結晶構造が決定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記方法が、前記結晶から原子座標を得ることをさらに含む、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記複合体のＮＭＲ構造が決定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記特定の立体構造が、アゴニスト立体構造またはアンタゴニスト立体構造である、請求項６７〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの変異体を選択するための方法であって、前記変異体が、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質のベータ及びガンマサブユニットの不在下でＧＰＣＲに共役することができ、前記方法が、
（ａ）親ヘテロ三量体Ｇタンパク質のベータ及びガンマサブユニットの不在下で親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの１つ以上の変異体を提供することと、
（ｂ）ＧＰＣＲを提供することと、
（ｃ）前記または各変異体Ｇαサブユニットが前記ＧＰＣＲに結合することができるかを決定し、前記ＧＰＣＲに結合することができる変異体を選択することと、を含む、方法。
【請求項７４】
ステップ（ｃ）が、前記ＧＰＣＲへの結合時に、前記または各変異体Ｇαサブユニットがアゴニストに対する前記ＧＰＣＲの親和性を増加させるかを決定することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記方法が、前記ＧＰＣＲへの結合時に、前記または各変異体Ｇαサブユニットが前記ＧＰＣＲの特定の立体構造を安定化することができるかを決定することをさらに含み、任意に、前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造である、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
ステップ（ｃ）の前に、前記ＧＰＣＲが、特定の立体構造を安定化することができる薬剤に曝露され、任意に、前記薬剤がナノボディである、請求項７３〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記ＧＰＣＲが、膜含有組成物中に提供される、請求項７３〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記変異体Ｇαサブユニットが、その親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で増加した安定性を有するかを決定すること、及び／または細胞内で発現する場合、前記変異体Ｇαサブユニットがその親Ｇαサブユニットよりも高いレベルで発現するかを決定することをさらに含む、請求項７３〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記ＧＰＣＲが、変性条件下での同じ特定の立体構造におけるその親ＧＰＣＲの安定性と比較して、変性条件下での特定の立体構造における増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲである、請求項７３〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの変異体を調製するための方法であって、前記変異体が、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質のベータ及びガンマサブユニットの不在下でＧＰＣＲに共役することができ、前記方法が、
（ａ）請求項７３〜７９のいずれかに記載の方法を行うことと、
（ｂ）増加した安定性のために選択された前記変異体Ｇαサブユニット（複数可）における変異アミノ酸残基（複数可）の位置（複数可）を特定することと、
（ｃ）特定された前記位置のうちの１つ以上に置換アミノ酸を含む変異体Ｇαサブユニットを合成することと、を含む、方法。
【請求項８１】
請求項８０に記載の方法によって得ることが可能な変異体Ｇαサブユニット。
【請求項８２】
ＧＰＣＲを特定の立体構造で安定化する方法であって、
（ａ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニット及び標的ＧＰＣＲを提供することと、
（ｂ）前記変異体Ｇαサブユニット及び前記ＧＰＣＲの複合体を形成することであって、前記ＧＰＣＲが、特定の立体構造で安定化される、形成することと、を含む、方法。
【請求項８３】
前記変異体Ｇαサブユニットが、固体支持体上に固定化される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記標的ＧＰＣＲが、前記ＧＰＣＲを複数の立体構造状態で含有する溶液として提供される、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記複合体を精製することをさらに含む、請求項８２〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
増加した安定性を有するＧＰＣＲを選択するための方法であって、
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ以上の変異体及び請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットを提供することと、
（ｂ）リガンドを選択することであって、前記ＧＰＣＲが特定の立体構造で存在する場合、前記リガンドが前記親ＧＰＣＲに結合するものである、選択することと、
（ｃ）前記または各変異体ＧＰＣＲが、リガンドへの結合または前記変異体Ｇαサブユニットへの結合に関して前記親ＧＰＣＲの安定性と比較して、前記選択されたリガンドへの結合または前記変異体Ｇαサブユニットへの結合に関して増加した安定性を有するかを決定することと、
（ｄ）前記選択されたリガンドへの結合または前記変異体Ｇαサブユニットへの結合に関して前記親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する変異体を選択することであって、ステップ（ｃ）で前記ＧＰＣＲが存在する前記特定の立体構造が、ステップ（ｂ）で選択されたリガンドのクラスに対応する、選択することと、を含む、方法。
【請求項８７】
親ＧＰＣＲの前記１つ以上の変異体が、ステップ（ｃ）の前に前記選択されたリガンドと接触する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記選択されたリガンドが、リガンドのアゴニストクラス由来であり、前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造である、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
熱、洗剤、カオトロピック剤、及び極度のｐＨのうちのいずれか１つ以上等の変性条件下で増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲが選択される、請求項８６〜８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
変異体ＧＰＣＲを調製するための方法であって、
（ａ）請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法を行うことと、
（ｂ）増加した安定性のために選択された前記変異体ＧＰＣＲ（複数可）における変異アミノ酸残基（複数可）の位置（複数可）を特定することと、
（ｃ）特定された前記位置のうちの１つ以上に置換アミノ酸を含む変異体ＧＰＣＲを合成することと、を含む、方法。
【請求項９１】
請求項９０に記載の方法によって得ることが可能な変異体ＧＰＣＲ。
【請求項９２】
ＧＰＣＲの結合パートナーを特定する方法であって、
ｅ）請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体を提供することと、
ｆ）１つ以上の試験化合物を提供することと、
ｇ）前記または各試験化合物が前記複合体に結合するかを決定することと、
ｈ）前記複合体に結合する１つ以上の試験化合物を単離することと、を含む、前記方法。
【請求項９３】
ステップ（ａ）で提供された前記複合体が、ＧＰＣＲリガンドを含まない、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記方法が、断片ライブラリスクリーニングに使用される、請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記方法が、
（ｉｉｉ）前記または各試験化合物が、請求項４７〜５５のいずれかに記載の異なる複合体に結合するかを決定することと、
（ｉｖ）請求項４７〜５５のいずれかに記載の前記異なる複合体に結合しない前記または各試験化合物を単離することと、をさらに含む、請求項９２〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
前記異なる複合体が、請求項９２に記載のステップ（ａ）の複合体中の前記Ｇαサブユニットのクラスとは異なるクラスのＧαサブユニット、及び／または請求項９２に記載のステップ（ａ）の複合体中の前記ＧＰＣＲとは異なるＧＰＣＲを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
Ｇαサブユニットの結合パートナーを特定する方法であって、
ｅ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットを提供することと、
ｆ）１つ以上の試験化合物を提供することと、
ｇ）前記または各試験化合物が前記変異体Ｇαサブユニットに結合するかを決定することと、
ｈ）前記変異体Ｇαサブユニットに結合する１つ以上の試験化合物を単離することと、を含む、方法。
【請求項９８】
請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体に選択的に結合する抗体。
【請求項９９】
Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間の結合を評価する方法であって、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットと、ＧＰＣＲと、を提供することと、前記変異体Ｇαサブユニットと前記ＧＰＣＲとの間の結合を評価することと、を含む、方法。
【請求項１００】
Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間の共役への薬剤の影響を評価する方法であって、請求項１〜３１のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットと、ＧＰＣＲと、を提供することと、前記変異体Ｇαサブユニットと前記ＧＰＣＲとの間の共役への前記薬剤の影響を評価することと、を含む、方法。
【請求項１０１】
前記変異体Ｇαサブユニットが蛍光標識されている、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記変異体Ｇαサブユニット及び前記ＧＰＣＲが細胞内に提供され、任意に、前記方法がインビボまたはインビトロで行われる、請求項９９〜１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の１つ以上の結合パートナーを選択または設計するための方法であって、
（ａ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体の三次元構造表現を提供することと、
（ｂ）前記ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の１つ以上の結合パートナーを選択または設計するための分子モデル化手段を使用することであって、前記変異体Ｇαサブユニットまたは複合体の少なくとも一部の前記三次元構造表現が、１つ以上の候補結合パートナーの三次元構造表現と比較され、前記ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体と相互作用すると予測される１つ以上の結合パートナーが選択される、使用することと、を含む、方法。
【請求項１０４】
１つ以上の結合パートナーと、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体との相互作用の分析のための方法であって、
（ａ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体の三次元構造表現を提供することと、
（ｂ）前記変異体Ｇαサブユニットまたは複合体の構造または前記構造の一部に適合する１つ以上の結合パートナーの三次元構造表現を提供することと、
（ｃ）前記１つ以上の結合パートナーを前記構造に適合させることと、を含む、方法。
【請求項１０５】
請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体の前記三次元構造表現が、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体を提供することと、前記変異体Ｇαサブユニットまたは複合体の前記三次元構造を決定することとによって得られる、請求項１０３または１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記１つ以上の結合パートナーと、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体との相互作用を増加または減少させるように、前記１つ以上の結合パートナーの前記構造表現を修飾することをさらに含む、請求項１０４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体または請求項９８に記載の抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項１０８】
薬剤に使用するための、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体または請求項９８に記載の抗体。
【請求項１０９】
癌との闘いに使用するための、請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットまたは請求項４７〜５５のいずれかに記載の複合体または請求項９８に記載の抗体。
【請求項１１０】
（ｉ）ＧＰＣＲに結合することができる請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットもしくはその一部、または前記変異体Ｇαサブユニットもしくはその一部をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）請求項１〜４２のいずれかに記載の変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲもしくはその一部、または前記ＧＰＣＲまたはその一部をコードするポリヌクレオチドと、を含む、部品キット。
【請求項１１１】
前記ＧＰＣＲが、請求項４８〜５０のいずれかに定義される通りである、請求項１１０に記載の部品キット。
【請求項１１２】
（ｉ）及び（ｉｉ）の一方または両方が検出可能に標識されている、請求項１１０または１１１に記載の部品キット。
【請求項１１３】
ＧＰＣＲリガンドをさらに含む、請求項１１０〜１１２のいずれかに記載の部品キット。
【請求項１１４】
前記ＧＰＣＲリガンドが、小分子、タンパク質、ペプチド、タンパク質足場、核酸、イオン、炭水化物、または抗体のうちのいずれかである、請求項１１３に記載の部品キット。
【請求項１１５】
Ｇタンパク質βγサブユニットをさらに含む、請求項１１１〜１１４のいずれかに記載の部品キット。
【請求項１１６】
ヌクレオチドをさらに含み、任意に、前記ヌクレオチドがＧＤＰまたはＧＴＰ等のグアニンヌクレオチドであるか、または任意に、前記ヌクレオチドがキサンチンヌクレオチドである、請求項１１０〜１１５のいずれかに記載の部品キット。
【請求項１１７】
実質的に本明細書に開示されるいずれかの新規の変異体Ｇαサブユニット、複合体、ポリヌクレオチド、抗体、組成物、または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異体Ｇタンパク質に関し、具体的には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の変異体アルファサブユニットに関する。本発明は、かかる変異体を含む生成物、かかる変異体の使用、及びかかる変異体を含む方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合し、ＧＤＰ結合不活性状態とＧＴＰ結合活性状態との間を相互変換することによっていくつかのシグナル伝達経路における分子スイッチとして作用する。それらは、２つの主なクラス、単量体低分子量Ｇタンパク質及びヘテロ三量体Ｇタンパク質からなる。低分子量Ｇタンパク質及びヘテロ三量体Ｇタンパク質のアルファサブユニット（Ｇα）の両方がＧＴＰａｓｅドメイン（Ｇ−ドメイン）を含む一方で、Ｇαは、追加のヘリカルドメイン（Ｈ−ドメイン）を含み、Ｇベータ（Ｇβ）サブユニット及びＧガンマ（Ｇγ）サブユニットを有する複合体を形成する。それらは同様のシグナル伝達サイクルを経るが、それらの活性化は、１つの重要な態様の点で異なる。低分子量Ｇタンパク質のグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）が主に細胞質タンパク質である一方で、ＧαサブユニットのＧＥＦは、通常、膜結合型Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）である。低分子量Ｇタンパク質のＧＥＦがＧＤＰ結合領域と直接相互作用する一方で、ＧＰＣＲは、ＧＤＰからほぼ３０Å離れた部位でＧαに結合し、ＧＤＰ放出をアロステリックに誘導して、それらを活性化する。
【０００３】
ＧＰＣＲは、多くの生理学的プロセスを制御するタンパク質の非常に大きなファミリーを構成し、多くの有効な薬物の標的である。したがって、それらは、薬理学的にかなり重要である。現在の薬物の４分の１超がＧＰＣＲを標的として有することを示すＯｖｅｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５，９９３−９９６について言及されている。ＧＰＣＲのリストは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８に提供されている。
【０００４】
３０年間にわたる生化学的及び生物物理学的研究により、ＧＰＣＲによるＧタンパク質活性化のモデルが生成された。ＧＰＣＲへのアゴニスト結合は、受容体構造の細胞の変化を誘導し１〜４、Ｇタンパク質との生産的な相互作用が生じることを可能にする。このプロセスは、少なくとも２つの段階、恐らくＧタンパク質βγサブユニットまたは脂質部分を伴う初期ドッキング相互作用、及びαサブユニットの極端なＣ末端の立体構造変化の誘導を含む可能性がある５、６。主な受容体結合領域７及び受容体特異性８、９の決定因子であるＣ末端は、その後、受容体に完全に会合することができる。この相互作用は、Ｇタンパク質及び受容体の両方に相互に誘導された立体構造変化を引き起こす１０。Ｇタンパク質において、これらの変化は、ヌクレオチド結合ポケットに伝播され、ＧＤＰの放出をもたらす１０、１１。受容体において、立体構造変化は、リガンド結合ポケットにフィードバックし、リガンドの解離速度を低下させ、これにより、著しく増加したアゴニスト結合親和性がもたらされる１２、１３。この親和性シフトの機構は、リガンド結合ポケットのわずかな再編成またはＧタンパク質結合によって付与される立体構造安定化に起因する複合体のより低いエネルギー状態への移行のいずれかに起因する可能性が高い。この三元複合体において、受容体は、シャペロンとして作用し、熱に不安定なヌクレオチドを含まないＧタンパク質を変性から保護する１４、１５。グアニンヌクレオチドの不在下で、この複合体は安定しているが、インビボでは、ＧＴＰは、その高い細胞濃度のため、急速に結合される１２、１４。これにより、立体構造変化が誘導され、受容体からのＧタンパク質の解離１６、１７及びＧαサブユニットとβγサブユニットの分離１４、１６を引き起こす。その後、活性化α−ＧＴＰ及びβγサブユニットは、それらのそれぞれの下流シグナル伝達経路を刺激することができる。
【０００５】
リガンド結合ポケットの原子分解能マッピングは、ＧＰＣＲ活性を調節するための薬物の設計にかなり重要である。したがって、受容体をそれらの高親和性アゴニスト結合立体構造に結晶化するための方法は、アゴニスト化合物の効率的な構造に基づく設計の重要な必須条件である。これまでに、これは、第一に、トランスデューシンのＣ末端ペプチドをオプシン３６及びメタロドプシンＩＩ３７の両方と複合して結晶化し、第二に、高親和性アゴニスト結合状態を誘導するラクダ科抗体（Ｎｂ８０）をβ２ＡＲ３８複合体と複合して結晶化し、第三に、ヘテロ三量体Ｇをβ２ＡＲ１０と複合して結晶化したという３つのアプローチによって達成されている。これらの構造によって提供されたＧＰＣＲ活性化への貴重な洞察にもかかわらず、それらは、より広い構造ベースの薬物設計用途にいくつかの主な不利点を有する。オプシン及びメタロドーシンＩＩ複合体を、それぞれ、３．２Å及び２．８５Åで解き、これらのいずれの場合でも、発色団結合ポケット周囲の電子密度は強かった３６、３７。しかしながら、他のＧＰＣＲの活性立体構造を安定化するためのＧタンパク質Ｃ末端ペプチドの使用は失敗に終わっている１０。さらに、トランスデューシンペプチドによって誘導される立体構造変化は、β２ＡＲ−Ｇ複合体で観察されるものよりもはるかに小さく１０、これらの構造が活性化経路に沿って中間立体構造を表すことを示す。Ｎｂ８０−β２ＡＲ複合体を３．５Åの分解能で解き、リガンド結合ポケットの周囲で良好な電子密度を示した３８。しかしながら、Ｎｂ８０によって誘導される立体構造変化は、β２ＡＲ−Ｇ複合体で観察されるものよりも小さく１０、この構造も中間立体構造を表し得ることを示唆する。さらに、β２ＡＲに特異的に結合するＮｂ８０が得られ、それ故に、他の密接に関連するＧＰＣＲ（例えば、β１ＡＲ）に効率的に共役する可能性があるが、新たなナノボディがより遠位に関連する受容体に対して産生される必要がある可能性がある。β２ＡＲ−Ｇ複合体を３．２Åの分解能で解いたが、この構造では、リガンド結合ポケット周囲の電子密度は非常に不良であった。さらに、結晶化Ｇタンパク質−ＧＰＣＲ複合体の複雑性は、この戦略がより広い構造に基づく薬物設計用途に限定された使用であることを意味する。前述の複合体の全てを中〜高分解能で解いたが、それらは、高親和性アゴニスト結合立体構造に関連する構造変化を正確に定義するのに不十分な詳細しかリガンド結合ポケット周囲に提供しなかった。したがって、これらの変化を正確に定義し、最適な構造に基づく薬物設計を可能にするために、２Å超の分解能でＧタンパク質−ＧＰＣＲ複合体の構造を解く強い要件が存在する。
【０００６】
刺激Ｇタンパク質（Ｇαｓ）の別個のＧＴＰａｓｅ及びヘリカルドメインが、ＣＯＳ−７細胞に以前にトランスフェクトされている４１。しかしながら、個別では、いずれのタンパク質も細胞ｃＡＭＰ産生を増加させなかった。また、ＧＴＰａｓｅのＧＰＣＲに結合する能力について調査されなかった。
【０００７】
Ｇαサブユニットは、ＧＰＣＲとβγ独立様式で相互作用し、ホロ酵素よりもはるかに遅い反応速度ではあるが、大過剰の受容体の存在下でヌクレオチド交換を経ることも示されている４３、４５、４６。しかしながら、構築物は全て、インタクトなヘリカルドメインを含んだ。
【０００８】
本明細書における以前に公開された文書のリストまたは考察は、その文書が最先端技術の一部であるか、または共通の一般知識であるという承認と必ずしも見なされるべきではない。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において、我々は、ＧＰＣＲに結合し、かつ高親和性アゴニスト結合状態に関連するコア薬理学的及び立体構造変化を誘導することができる最小操作Ｇタンパク質アルファ（Ｍｉｎｉｍａｌ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｐｈａ、ＭＥＧＡ）ドメインの設計について説明する。ＭＥＧＡドメインは、βγ二量体の不在下でさえもＧＰＣＲに共役することができる、ヘリカルドメインの一部または全てを欠くＧαサブユニットの最小バージョンであると見なされ得る。我々は、基本的なグアニンヌクレオチド結合特性及びタンパク質の機能性を保持しながら、ＭＥＧＡドメインの発現及び安定性の両方を改善する変異を特定した。我々が発見した変異は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質間で良好に保存され、αサブユニットの４つ全てのクラスのメンバーに導入されると考えられる。したがって、このアプローチを使用して、異なるＧＰＣＲに共役することができるＧＴＰａｓｅドメインのレパートリーを産生することができる。ＭＥＧＡドメインの代替記述は、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質であり、本発明の変異体Ｇタンパク質を説明するためにこれらの両方の定義が使用される。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファ（Ｇα）サブユニットの変異体を提供し、この変異体は、（ｉ）親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスを欠き、（ｉｉ）ヘテロ三量体Ｇタンパク質ベータ（Ｇβ）サブユニット及びヘテロ三量体Ｇタンパク質ガンマ（Ｇγ）サブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができ、（ｉｉｉ）親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットのアミノ酸配列と比較して１つ以上の変異を含むアミノ酸配列を有し、これらの変異は、欠失、置換、及び挿入から選択される。
【００１１】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質とは、３つのサブユニット、グアニル−ヌクレオチド結合アルファサブユニット（Ｇα）、ベータサブユニット（Ｇβ）、及びガンマサブユニット（Ｇγ）で作製されるタンパク質を意味する。かかるヘテロ三量体タンパク質は、上述のように、ＧＰＣＲから下流エフェクターにシグナルを伝達する。任意のヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットが、本発明の実施に使用され得る。典型的には、Ｇαサブユニットは、３５０〜４００のアミノ酸長であり、４０〜４５ｋＤａの範囲の分子量を有する。配列類似性及び機能の両方に基づいて群分けされた合計１７のＧαサブユニットを含むＧαサブユニットの４つのファミリーが存在し、これらのうちのいずれかを使用して、本発明を実施することができる。
Ｇαｓ：  Ｇαｓ、Ｇαｏｌｆ（嗅覚）
Ｇαｉ／ｏ：  Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇαｔ３（ガストデューシン）
Ｇαｑ／１１：  Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５（１６と呼ばれることもある）
Ｇα１２／１３：  Ｇα１２、Ｇα１３
【００１２】
Ｇｓファミリー及びＧｉファミリーがアデニリルシクラーゼ活性を制御する一方で、Ｇｑは、ホスホリパーゼＣβを活性化し、Ｇ１２／１３は、低分子量ＧＴＰａｓｅファミリーを活性化することができる。
【００１３】
アルファサブユニットの真菌クラス及び植物クラスも存在する。例えば、酵母は、ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質経路を使用することで知られており、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける接合因子シグナル伝達は、Ｇタンパク質アルファ１サブユニット（ＧＰ−１）によって媒介される。Ｕｒａｎｏらは、尿タンパク質シグナル伝達は、主に２つのモデル生物、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ及びコメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）で研究された植物におけるＧタンパク質シグナル伝達を概説する（Ｕｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３（３）：  １２０１８６）。かかるＧαサブユニットは全て、本発明の範囲に含まれる。好適なＧαサブユニット及びそれらの分類のさらなる詳細は、当該技術分野で周知であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ００１０１９、ならびにＦｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５（Ｎａｔｕｒｅ  ５２４：１７３）及びＡｎａｎｔｈａｒａｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１１（Ｇｅｎｅ  ４７５：  ６３−７８）で見つけることができる。所与のＧＰＣＲがどのＧαサブユニットに共役するかの情報は、科学文献及び利用可能なオンラインデータベース、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｕｉｄｅｔｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ＧＲＡＣ／ＲｅｃｅｐｔｏｒＦａｍｉｌｉｅｓＦｏｒｗａｒｄ？ｔｙｐｅ＝ＧＰＣＲを閲覧することによっても見つけることができる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１５）Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ  ２０１５／１６：  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７２：  ５７４４−５８６９も参照のこと）。特定のＧＰＣＲの例を含む本発明の変異体ＧαサブユニットがどのＧＰＣＲに結合することができるかのさらなる詳細は、本発明の第４の態様に関して以下に提供される。
【００１４】
多くのＧαサブユニットのアミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＵｎｉＰｒｏｔを参照することにより容易に利用可能である。具体的には、Ｆｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１５（Ｎａｔｕｒｅ  ５２４：  １７３）は、ＵｎｉＰｒｏｔからの全てのヒトＧαパラログのヒト遺伝子ＩＤを提供する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）。ますます多くのゲノムの配列が完了しているため、Ｇαサブユニットのアミノ酸配列は、それから推定され得ることにも留意されたい。
【００１５】
Ｇαが任意の源に由来し得るが、それが真核生物源由来であることが特に好ましい。それが哺乳動物または鳥等の動物（例えば、脊椎動物）源に由来することが特に好ましい。Ｇαサブユニットがラット、マウス、ウサギ、もしくはイヌ、または非ヒト霊長類、またはニワトリもしくはニワトリに由来することが特に好ましい。誤解を避けるために、「〜に由来する」とは、ｃＤＮＡまたは遺伝子が源由来の遺伝子材料を使用して元来得られたものであるが、そのタンパク質が、その後に任意の宿主細胞内で発現され得ることを意味する。したがって、真核生物Ｇα（鳥または哺乳類Ｇα等）がＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物宿主細胞内で発現され得るが、場合によっては、鳥または哺乳類に由来すると考えられ得る。
【００１６】
Ｇαサブユニットは、２つのドメイン、ＧＴＰ結合ドメイン及びヘリカルドメインを含む。ＧＴＰ結合ドメインは、Ｒａｓ様低分子量ＧＴＰａｓｅと相同であり、スイッチ領域Ｉ及びＩＩを含み、これらは、活性化中に立体構造を変化させる。これらのスイッチ領域は、グアニンヌクレオチド感受性の立体構造を有するアルファ−ヘリックスのループである。
【００１７】
Ｇαサブユニットのヘリカルドメインとは、スイッチ領域Ｉの前のＧＴＰ結合ドメインに挿入され、かつヘテロ三量体Ｇタンパク質に固有のヘリカル挿入ドメインを意味する。このヘリカルドメインは、ＧＴＰ結合ドメインとの界面でグアニンヌクレオチドを隔離するように機能し、ヌクレオチド解離を可能にするように変位されなければならない。Ｆｌｏｃｋら（２０１５）は、様々な生物由来のＧαサブユニットの構造及び配列アライメントを行い、Ｇαサブユニットのヘリカルドメインが、ヘリックスＡ、ヘリックスＢ、ヘリックスＣ、ヘリックスＤ、ヘリックスＥ、及びヘリックスＦで表される６つのアルファヘリックスを含むことを実証した。したがって、ヘリカルドメインは、Ｇαサブユニットのアミノ酸配列内のヘリックスＡの最初のアミノ酸残基とヘリックスＦの最後のアミノ酸残基との間の領域と見なされ得る。しかしながら、ヘリカルドメインの境界が絶対的ではないように、ヘリカルドメインがこれらのアルファヘリックスを超えて延在して、周囲のループ領域、すなわち、ヘリックスＡの前のループ及びヘリックスＦの後のループを包含することもできると理解される。
【００１８】
一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親ヘテロ三量体ＧαサブユニットのアルファヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦのうちの少なくとも１つ、例えば、アルファヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てを欠く。変異体ＧαサブユニットがアルファヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦのうちの１つより多くを欠く場合、変異体Ｇαサブユニットは、典型的には、介在ループも欠く。したがって、変異体ＧαサブユニットがヘリックスＡ及びヘリックスＢである場合、変異体Ｇαは、典型的には、ヘリックスＡとヘリックスＢを接続するループを欠くといった具合である。
【００１９】
好ましい実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親ＧαサブユニットのヘリカルドメインのアルファヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ、ならびに介在ループ領域を欠く。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親ＧαサブユニットのヘリカルドメインのアルファヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、ならびに介在ループ領域を欠く。
【００２１】
１７個のヒトＧαパラログのアミノ酸配列に対するアルファヘリックスＡ〜Ｆの位置付けは、図２５に例証されており（Ｆｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５の図１の延長日に対応する（Ｎａｔｕｒｅ  ５２４：  １７３）、当業者であれば、例えば、タンパク質アライメント及び／または二次構造を予測するコンピュータアルゴリズムの利用によって、他のＧαタンパク質内のそれらの位置を容易に決定することができることが理解される（例えば、Ｆｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１５を参照のこと）。例えば、第２のＧαタンパク質内のヘリックスＡは、図２５に列記されるヒトＧαパラログのうちの１つにおけるヘリックスＡに類似のアルファヘリックスであろう。第２のＧαサブユニット内の類似のヘックスは、例えば、配列アライメントによって、ヒトＧαサブユニットパラログのうちの１つの配列内のヘリックスＡを定義する類似のアミノ酸を検索することによって特定され得る。さらに、アミノ酸配列に基づいてタンパク質モチーフの存在を予測するために使用され得るコンピュータベースのアルゴリズムが、当該技術分野で広く利用可能である。アミノ酸配列内の特定のアルファヘリックスの相対位置及び他のモチーフ及びアルファヘリックスに対するその位置に基づいて、類似のヘリックスが容易に特定され得る。
【００２２】
異なるＧαタンパク質間の任意のアミノ酸残基／位置の比較を可能にするために、Ｆｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１５（Ｎａｔｕｒｅ  ５２４：  １７３）は、共通のＧα番号付け（ＣＧＮ）システムを考案した。ＣＧＮは、（１）ドメイン（Ｄ）、（２）コンセンサス二次配列（Ｓ）、及び（３）二次構造要素内の位置（Ｐ）を指す「アドレス」を全ての残基にＤＳＰ形式で提供する。例えば、Ｇαｉ１内のフェニルアラニン３３６は、Ｇ−ドメインのコンセンサスヘリックスＨ５内の第８のアミノ酸残基としてＰｈｅ３３６Ｇ．Ｈ５．８で表される。Ｇαｓ２内の対応する位置は、Ｐｈｅ３７６Ｇ．Ｈ５．８である。ループは、それらの隣接二次構造要素（ＳＳＥ）の小文字でラベル付けされ、例えば、ｓ６ｈ５は、ヘリックスＨ５を有するループ接続鎖Ｓ６を指す（図２５を参照のこと）。ＣＧＮマッピングウェブサーバが、ｈｔｔｐ：／／ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＣＧＮで利用可能である。
【００２３】
ＣＧＮが任意のＧαサブユニット内のヘリックスＡ〜Ｆの各々の境界を特定するために使用され得ることが理解される。例えば、Ｇαｓ内のヘリックスＡの最初の残基（Ｈ．ＨＡ）は、Ａｓｐ８５Ｈ．ＨＡ．１であり、Ｇαｓ内のヘリックスＦの最後の残基（Ｈ．ＨＦ）は、Ａｒｇ１９９Ｈ．ＨＦ．６である。したがって、変異体Ｇαサブユニットは、図１及び図２５に記載のヒトＧαｓの長いアイソフォームのアミノ酸Ａｓｐ８５〜アミノ酸残基Ａｒｇ１９９によって定義される領域に対応する親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインを欠き得る。
【００２４】
「対応する領域」とは、第１及び第２のＧαサブユニットがアライメントによって、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用することによって比較される場合、第１のＧαサブユニット内の領域とアラインする第２のＧαサブユニットのアミノ酸配列内の領域（例えば、ヒトＧαｓの長いアイソフォームのアミノ酸残基Ａｓｐ８５〜アミノ酸残基Ａｒｇ１９９によって定義される領域）を意味する。例えば、図２５は、ヒトＧαサブユニットの全てのアライメントを示し、それから、他のヒトＧαサブユニット内のヒトＧαｓの長いアイソフォームのアミノ酸Ａｓｐ８５〜アミノ酸残基Ａｒｇ１９９によって定義される領域に対応する領域が特定され得る。ヒトＧαサブユニットの長いアイソフォーム内の異なる領域に対応する他のヒトＧαサブユニット内の領域も特定され得ることが理解される。
【００２５】
特定の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基７０〜１９３、７１〜１９３、８５〜１９３、または８５〜１９９に対応する親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの領域を欠く。
【００２６】
変異体Ｇαサブユニットが全ヘリカルドメインを欠く場合、本発明の変異体Ｇαサブユニットは、そのヘリカルドメインなしの単離ＧＴＰａｓｅドメインまたはＧαサブユニットであると考えられ得る。
【００２７】
所与の変異体Ｇαサブユニットが、親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスを欠くか否かは、例えば、変異体Ｇαサブユニットのアミノ酸配列を親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列とアラインし、親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスに対応するアミノ酸配列が変異体Ｇαサブユニットのアミノ酸配列に存在するか否かを評価することによって、当業者によって決定され得る。同様の分析がヌクレオチド配列レベルで行われ得る。
【００２８】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質ベータ（Ｇβ）サブユニット及びヘテロ三量体Ｇタンパク質ガンマ（Ｇγ）サブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができるとは、ＧαサブユニットがＧＰＣＲに結合するためにＧβサブユニット及びＧγサブユニットの存在を必要としないことを意味する。言い換えれば、本発明の変異体Ｇαサブユニットは、ＧＰＣＲにβγ独立様式で結合することができる。好ましくは、本発明の変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットがβγサブユニットと組み合わせて結合する場合、親Ｇαサブユニットが同じＧＰＣＲに結合するため、同様の親和性（すなわち、典型的には、１〜３倍以内）でＧＰＣＲに結合すべきである。言い換えれば、変異体Ｇαサブユニットは、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質が同じＧＰＣＲに結合するため、同様の親和性でＧＰＣＲに結合すべきである。ＧＰＣＲに結合するとは、そのアゴニストによって結合される場合、ＧＰＣＲへの結合を意味する。
【００２９】
例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップに基づくアッセイ、免疫細胞蛍光、酵母２ハイブリッド技術、及びファージディスプレイを含む様々な方法を使用して、ＧＰＣＲと試験化合物との間の結合を決定することができ、これらの方法は、当該技術分野で共通の慣行であり、例えば、Ｐｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２６（２），３４２−３４８、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。試験化合物とＧＰＣＲとの間の結合を検出する他の方法としては、イオン噴霧質量分析／ＨＰＬＣ法での限外濾過または他の物理的及び分析的方法が挙げられる。例えば、２つの蛍光標識実体の結合が、互いに近接近している場合に、蛍光標識の相互作用を測定することによって測定され得る当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴伝達（ＦＲＥＴ）法が使用され得る。なおさらなる方法が、ＷＯ２００９／０８１１３６に記載されている。
【００３０】
一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下でＧＰＣＲに機能的に結合することができる。「機能的結合」とは、変異体Ｇαサブユニットが細胞の表面上で発現されたＧＰＣＲに結合することができることを意味し、これにより、ＧＰＣＲ（例えば、受容体のリガンド等のモジュレーターに結合したもの）からその細胞のシグナル伝達経路の構成要素を介してその細胞にシグナルを伝達することができるようになる。かかる機能的結合の別の用語は、共役である。上述のように、ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、ＧＰＣＲと共役し、ＧＰＣＲから下流エフェクターにシグナルを効果的に伝達する。具体的には、ホルモン及び神経伝達物質等のリガンドの結合のＧＰＣＲへの結合は、立体構造変化を引き起こすことによって受容体を活性化し、次いで、膜の細胞内側の結合したＧタンパク質を活性化する。活性化された受容体は、結合したＧＤＰのＧＴＰサブユニット上のＧＴＰへの交換を促進する。ＧＴＰ結合は、Ｇα内のスイッチ領域の立体構造を変化させ、これにより、結合した三量体Ｇタンパク質が受容体から放出され、かつ活性Ｇαサブユニット（ＧＴＰ結合）及びβγ二量体に解離することが可能になる。Ｇαサブユニット及びβγ二量体は、アデニリルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼＣ、及びイオンチャネル等の別個の下流エフェクターを活性化し続ける。これらのエフェクターは、次いで、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ジアシルグリセロール、ナトリウムまたはカルシウムカチオン等の二次メッセンジャーの細胞内濃度を制御し、最終的には、通常、遺伝子転写の下流制御により、生理学的応答をもたらす。このサイクルは、アルファサブユニット結合ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解によって完了し、アルファ及びベータ／ガンマサブユニットの再会合ならびに受容体へのそれらの結合をもたらし、これにより、シグナルが終了する。
【００３１】
変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の機能的結合は、Ｇαサブユニットの活性化をもたらすと見なされ得、これにより、Ｇαタンパク質シグナルを細胞内で産生することができるようになる。したがって、一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができ、これにより、ＧαサブユニットがＧＰＣＲによって活性化されるようになり得、例えば、Ｇαタンパク質シグナルの生成またはＧαタンパク質シグナルの基礎レベルの増加により明らかになる。Ｇαタンパク質シグナルとは、問題の特定のＧαサブユニットを介するシグナル伝達に通常関連する任意の下流シグナルを意味し、よって、Ｇαサブユニットの活性化のためのマーカーとして使用され得る。このシグナルは、本明細書に記載のシグナルのうちのいずれかであり得、当該技術分野で任意の好適な技法を使用してアッセイされ得る。
【００３２】
機能的結合は、細胞アッセイで評価され得、シグナルを細胞に伝達することができるＧＰＣＲが変異体Ｇαサブユニットと接触し、ＧＰＣＲの（例えば、リガンドでの）刺激後に、Ｇαタンパク質シグナルが評価される。好ましくは、細胞は、シグナルを強化するように変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲを共発現し、さらにより好ましくは、ＧＰＣＲまたは変異体Ｇαサブユニットの発現は、誘導プロモーターによって制御され、これらの多数の例が当該技術分野で説明されており、一般に入手可能である。しかしながら、ＧαのそのＧＰＣＲへの結合後に、かつＧＰＣＲが一旦刺激された後に、Ｇαタンパク質シグナルが測定されることを可能にする任意のアッセイ形式が使用され得る。好ましくは、このシグナルは、検出可能である。このシグナルは、Ｇαサブユニットのグアニル−ヌクレオチド結合状態（例えば、ＧＤＰ結合またはＧＴＰ結合）に対応し得、これは、例えば、放射標識ＧＴＰγＳの量が検出される場合、精製タンパク質または濃縮タンパク質画分に対して生化学的に評価され得る。このシグナルは、ＧαサブユニットのＧＴＰａｓｅ活性に対応し得るか、または二次メッセンジャーのレベルに対応し得るか、または下流エフェクターの状態（例えば、細胞タンパク質のリン酸化状態または活性）を反映し得る。あるいは、レポーター遺伝子の使用により、読み出しが提供され得、レポーター遺伝子の発現は、Ｇαサブユニットを介して伝達されたシグナルによって制御される。なお別の方法は、ＧＰＣＲのそのリガンドに対する親和性を測定することである。さらに別の方法は、Ｇαサブユニットを介してシグナル伝達することによって制御されることで知られている細胞の表現型（例えば、細胞成長または形態）を測定することである。さらなる詳細が以下に提供される。
【００３３】
典型的には、変異体Ｇαサブユニットは、βγ二量体の存在下と同様またはより高い効力で、そのＧＰＣＲにβγ独立様式で機能的に結合する。典型的には、Ｇαサブユニットがβ二量体の存在下及び不在下でＧＰＣＲに結合するときに生成されるＧαタンパク質シグナルは、２〜３倍以内等の互いに５〜１０倍以内である。典型的には、Ｇαサブユニットがβγ二量体の不在下でＧＰＣＲに結合するときに生成されるＧαタンパク質シグナルは、Ｇαサブユニットがβ二量体の存在下でＧＰＣＲに結合するときに生成されるＧαタンパク質シグナルよりも５倍を超えて弱いことはない。
【００３４】
ＧαとＧＰＣＲとの間の機能的結合（例えば、Ｇαの活性化）から生成される特定のＧαタンパク質シグナルが、多くの場合、問題のＧαサブユニットのタイプに依存することが理解される。例えば、ＧαタイプのＧαサブユニットは、細胞内での環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生を刺激するエフェクターへのシグナル伝達を媒介する。逆に、ＧαｉタイプのＧαサブユニットは、細胞内での環状ＡＭＰの産生を阻害するエフェクターへのシグナル伝達を媒介する。ＧαｑタイプのＧαサブユニットの別のクラスは、ホスホイノシチドの加水分解をもたらすホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路を活性化して、異なる第２のメッセンジャーの２つの異なるクラス、すなわち、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトールリン酸を生成する。ジアシルグリセロールは、ある特定のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化し、ある特定のイノシトールリン酸は、細胞内貯蔵からのカルシウムの動員を刺激する。多種多様の細胞内エフェクターが、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼＣ、及びホスホリパーゼＡ２を含むＧαサブユニットの制御下にあると特定されている。加えて、Ｇα活性化は、イオンチャネルの範囲を調節することができ、ある特定の電圧感受性カルシウムトランジェントを阻害することができ、心カリウムチャネルを刺激することもできる。当業者であれば、所与のＧαサブユニットに適切なアッセイを選択することができるであろう（例えば、Ｎｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：  １６３６−１６３９、及びＣａｂｒｅｒａ−Ｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２４：  ７６５−７８１を参照のこと）。
【００３５】
ｃＡＭＰを調節するＧαサブユニットが試験される場合、非標識ｃＡＭＰの存在下で［３Ｈ］ｃＡＭＰを定量する競合アッセイ等のｃＡＭＰを検出するための標準の技法を使用して、機能的結合を評価することができる。
【００３６】
ＧαサブユニットによるＧＴＰａｓｅ酵素活性は、当該技術分野で周知の技法を使用してγ３２Ｐ  ＧＴＰの分解を決定することによって、例えば、原形質膜調製物において測定され得る（例えば、Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ：  Ｇ  Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと）。
【００３７】
ホスホリパーゼＣを調節するＧαサブユニットが試験される場合、イノシトール脂質が、標準の脂質抽出技法を使用して抽出及び分析され得る。ＤＡＧは、薄層クロマトグラフィーを使用して測定することもできる。３つ全てのイノシトール脂質の水溶性誘導体（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３）は、放射標識技法またはＨＰＬＣを使用して定量化することもできる。ＤＡＧは、ホスファチジルコリンから生産することもできる。Ｇα活性化に応答したこのリン脂質の分解は、放射標識技法を使用して測定することもできる。
【００３８】
細胞内カルシウムの動員または細胞外からのカルシウムの流入は、標準の技法を使用して測定され得る。適切なカルシウム指示薬、蛍光、生物発光、金属クロム、またはカルシウム感受性微小電極の選択は、研究中の細胞型ならびに事象の規模及び時定数に依存する（Ｂｏｒｌｅ（１９９０）Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  ８４：  ４５−５６）。カルシウム検出の例示の方法として、標準の方法を使用して、細胞にカルシウム感受性蛍光色素フラ−２またはヨード−１が装填され、カルシウムのいずれの変化も蛍光光度計を使用して測定される。
【００３９】
好適なアッセイのさらなる例としては、カルシウム動員（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＪＥ，Ｍａｈｅｒ  ＭＰ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｖｏｌｔａｇｅ／ｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＶＩＰＲ）ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ．２００２；８（５−６）：２８３−９５、Ｄｕｐｒｉｅｚ  ＶＪ，Ｍａｅｓ  Ｋ，Ｌｅ  Ｐｏｕｌ  Ｅ，Ｂｕｒｇｅｏｎ  Ｅ，Ｄｅｔｈｅｕｘ  Ｍ．Ａｅｑｕｏｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ，ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ．２００２；８（５−６）：３１９−３０）、ｃＡＭＰレベルの変化（Ｗｅｂｅｒ  Ｍ，Ｆｅｒｒｅｒ  Ｍ，Ｚｈｅｎｇ  Ｗ，Ｉｎｇｌｅｓｅ  Ｊ，Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ  Ｂ，Ｋｕｎａｐｕｌｉ  Ｐ．Ａ  １５３６−ｗｅｌｌ  ｃＡＭＰ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｇｓ−  ａｎｄ  Ｇｉ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  Ｆｅｂ；２（１）：３９−４９．）、活性化キナーゼ経路（Ｌｅｒｏｙ  Ｄ，Ｍｉｓｓｏｔｔｅｎ  Ｍ，Ｗａｌｔｚｉｎｇｅｒ  Ｃ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｔ，Ｓｃｈｅｅｒ  Ａ．Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＥＲＫ１／２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ  ｏｆ  ＧＰＣＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｒｅｃｅｐｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ  Ｒｅｓ．２００７；２７（１）：８３−９７）、例えばレポーター遺伝子の使用による遺伝子転写の制御（Ｌｉｕ  Ｂ，Ｗｕ  Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｇ１２／１３  ｔｏ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２３７：  １４５−９、Ｋｅｎｔ  ＴＣ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＫＳ，Ｎａｙｌｏｒ  ＬＨ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｄｕａｌ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．２００５  Ａｕｇ；１０（５）：４３７−４６）、β−アレスチンの動員（Ｈｕｄｓｏｎ  ＣＣ，Ｏａｋｌｅｙ  ＲＨ，Ｓｊａａｓｔａｄ  ＭＤ，Ｌｏｏｍｉｓ  ＣＲ．Ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｋｎｏｗｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ａｒｒｅｓｔｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００６；４１４：６３−７８）、ＧＴＰａｓｅ活性の測定等のＧタンパク質の活性化（Ｊａｍｅｓｏｎ  ＥＥ，Ｒｏｏｆ  ＲＡ，Ｗｈｏｒｔｏｎ  ＭＲ，Ｍｏｓｂｅｒｇ  ＨＩ，Ｓｕｎａｈａｒａ  ＲＫ，Ｎｅｕｂｉｇ  ��Ｒ，Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＲＴ．Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｓａｌ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＧＴＰ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｒ  ４；２８０（９）：７７１２−９）、または［３５Ｓ］ＧＴＰガンマ（γ）Ｓ結合の測定（Ｒｏｄｇｅｒｓ  Ｇ，Ｈｕｂｅｒｔ  Ｃ，ＭｃＫｉｎｚｉｅ  Ｊ，Ｓｕｔｅｒ  Ｔ，Ｓｔａｔｎｉｃｋ  Ｍ，Ｅｍｍｅｒｓｏｎ  Ｐ，Ｓｔａｎｃａｔｏ  Ｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ＧＴＰｇａｍｍａＳ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏ−ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｏｃｔ；１（５）：６２７−３６）が挙げられる。
【００４０】
一般に、Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲのそのアゴニストに対する親和性を増加させることが示されており（例えば、Ｌｅｆｆ（１９９５）ＴｉＰＳ  １６：  ８９）、よって、例えば、Ｇαタンパク質シグナルを評価することによって変異体Ｇαサブユニットの活性化を評価することに加えて、変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の機能的結合を評価する好ましい方法は、ＧＰＣＲのそのリガンドに対する親和性を測定することによるものである。このようにして、機能的結合は、ＧＰＣＲがＧαサブユニットに結合していないときのＧＰＣＲのそのアゴニストに対する親和性と比較した、ＧＰＣＲがＧαサブユニットに結合しているときのＧＰＣＲのそのアゴニストに対する親和性の増加を特徴とし得る。親和性のかかる増加は、競合結合アッセイ（任意に、競合するリガンドの一方または両方が検出可能に標識されている）を含む当該技術分野で好適な任意の技法を使用して測定され得る。かかるアッセイの例は、実施例に記載されており、アンタゴニスト３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（３Ｈ−ＤＨＡ）とアゴニストイソプレナリンとの間のＧαｓの存在下及び不在下でベータアドレナリン受容体への結合についての競合を測定する。かかるアッセイの感度を増大させるために、ＧＰＣＲ及び／またはＧαサブユニットを、Ｇαサブユニットまたはアゴニスト立体構造を安定化することで既知の薬剤に曝露することも望ましい場合がある。かかる薬剤の例としては、機能が天然アゴニストの機能を模倣する抗体（例えば、ナノボディ）または他のタンパク質が挙げられる。具体的な例は、Ｎａｎｏｂｏｄｙ  ３５（Ｒｅｆ  ４０）及びＮａｎｏｂｏｄｙ  ８０（Ｒｅｆ  ３８）であり、さらなる例が、ＷＯ２０１２００７５９３、ＷＯ２０１５１２１０９２、及びＷＯ２０１４１２２１８３に提供されている。他のかかる抗体／ナノボディが、例えば、精製ＧＰＣＲまたは全細胞内で過剰発現されたＧＰＣＲをマウスまたはラマに注入することによって、ＧＰＣＲに結合する抗体／ナノボディを洗濯することによって、かつ全細胞内でＧＰＣＲを活性化する抗体／ナノボディを選択することによって（例えば、ＧＰＣＲ活性化シグナル伝達経路の下流効果の増加した産生についてスクリーニングすることによって）選択され得ることが理解される。
【００４１】
Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの結合がＧＰＣＲのアゴニストに対する親和性を増加させることで知られている場合、典型的には、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下での変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲのアゴニストに対する親和性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍増加させる。好ましくは、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下での変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲのアゴニストに対する親和性を少なくとも１０倍、５０倍、または１００倍増加させる。
【００４２】
いくつかのＧタンパク質がＧＰＣＲのそれらのアンタゴニストに対する親和性を減少させる場合があり、この場合、変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の機能的結合がこの親和性の減少を測定することによって評価され得ることが理解される。アゴニストに対する親和性の増加を測定するための上述のアッセイと同様のアッセイを使用して、アンタゴニストに対する親和性の減少を測定することができる。Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの結合がＧＰＣＲのアンタゴニストに対する親和性を減少させることで知られている場合、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下での変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲのアンタゴニストに対する親和性を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍減少させる。好ましくは、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下での変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合は、ＧＰＣＲのアンタゴニストに対する親和性を少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、または１５０倍減少させる。
【００４３】
上述のように、ＧＰＣＲとヘテロ三量体Ｇタンパク質との間の相互作用は、Ｇタンパク質及び受容体の両方の立体構造変化を誘導する。具体的には、ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス６の細胞質末端は、受容体のコアから１０Å以上離れて移動する。したがって、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下での変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの機能的結合は、親ＧαサブユニットがＧβサブユニット及びＧγサブユニットと一緒にＧＰＣＲに結合するときに明らかであるこれらの立体構造変化のうちの１つ以上を誘導することが予想されるであろう。別の言い方をすれば、変異体Ｇαサブユニットの結合は、ＧＰＣＲにそのＧタンパク質結合立体構造を採用させることが予想される。したがって、一実施形態では、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下での変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合は、受容体のコアから１０Å以上離れた、例えば、受容体のコアから少なくとも１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、または１６Å離れたＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス６の細胞質末端の移動をもたらす。したがって、これにより、ＧαサブユニットがＧＰＣＲに機能的に結合または共役するかを決定するなお別の方法が提供されることが理解される。タンパク質構造を探査する様々な方法が当該技術分野で既知であり、任意の好適な方法が使用され得る。例えば、ｘ線結晶学等の任意の構造生物学技法が使用され得る。他の方法としては、電子顕微鏡法、ＮＭＲ、ＥＰＲ分光法による直接測定、またはＦＲＥＴが挙げられる。
【００４４】
変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の機能的結合または共役を評価するためのなお別の方法は、変性条件下でＧＰＣＲ／アゴニスト／変異体Ｇαサブユニット複合体の安定性を評価し、これを、変性条件下でＧＰＣＲ／アゴニスト複合体の安定性と比較することである。ＧＰＣＲ／アゴニスト／変異体Ｇαサブユニット複合体の安定性（例えば、熱安定性）は、ＧＰＣＲ／アゴニスト複合体の安定性よりも高く、これは、機能的結合を示すであろう。ＧＰＣＲ／Ｇタンパク質複合体の熱安定性が測定される場合、実験温度は、変異体Ｇαサブユニットによって耐容される温度範囲内で行われるべきである（例えば、それがリガンド結合を検出することが可能であることを確実にするために）ことが理解される。典型的には、これは、実験を３５℃未満で行うことを意味するが、いくつかの特に不安定なＧαサブユニットの場合、温度を非常に低く（例えば、１０℃未満に）保つことが必要であり得る。言うまでもなく、安定性測定がβγサブユニットの存在下で行われ得ることも理解される。例えば、以下及び実施例に記載される安定性を測定する任意の好適な方法が使用され得る（図１０、１１、及び１７も参照のこと）。
【００４５】
変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲに機能的に結合または共役するかを評価するために使用され得るアッセイの例も実施例５に記載されており、これらのアッセイには、（ｉ）アゴニスト親和性シフトアッセイ、（ｉｉ）熱安定性アッセイ、（ｉｉｉ）蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）、（ｉｖ）蛍光ベースの飽和結合分析、及び（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が含まれる。したがって、これらのアッセイのうちのいずれか１つ以上を、単独で、または上述のアッセイのうちの１つ以上と組み合わせて使用して、変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の機能的結合または共役を決定することができる。
【００４６】
好ましい実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で増加した安定性を有し、かつ／または細胞内で発現する場合、その親Ｇαサブユニットよりも高いレベルで発現する。したがって、変異体Ｇαサブユニットが、その親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で変異体Ｇαサブユニットの安定性を増加させ、かつ／または細胞内で発現する場合、その親Ｇαサブユニットと比較して、変異体Ｇαサブユニットの発現レベルを増加させる１つ以上の変異を含むことが理解される。
【００４７】
変異体Ｇαサブユニットは、熱、洗剤、カオトロピック剤、または極度のｐＨのうちのいずれか等の任意の変性因子または変性条件に対して増加した安定性を有するものであり得る。したがって、変異体Ｇαが、その親と比較して、不安定化条件下で延長した寿命を有し得ることが理解される。
【００４８】
熱に対する増加した安定性（すなわち、熱安定性）との関連で、これは、既知の結合パートナー（例えば、ＧＰＣＲ）への結合を測定することによって、または蛍光、ＣＤ、もしくは特定の温度での光散乱等の分光法を使用することによって容易に決定され得る。典型的には、Ｇαサブユニットが結合パートナー（例えば、ＧＰＣＲ）に結合する場合、特定の温度でＧαサブユニットのその結合パートナー（例えば、ＧＰＣＲ）に結合する能力を使用して、変異体の熱安定性を決定することができる。「準Ｔｍ」、すなわち、Ｇαサブユニットの５０％が所与の期間（例えば、３０分間）のインキュベーション後に定められた条件下で不活性化される温度を決定することが好都合である場合がある。より高い熱安定性の変異体Ｇαサブユニットは、それらの親と比較して増加した準Ｔｍを有する。あるいは、熱安定性は、時間の関数として所与の温度で安定性を測定することによって評価され得る。例えば、結合パートナー（例えば、ＧＰＣＲ）結合レベルがゼロ時点の結合パートナー（例えば、ＧＰＣＲ）結合レベルの５０％に減少する所与の温度での期間が決定され得る（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００９  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）。しかしながら、いずれの場合も、温度が変性因子であることが理解される。
【００４９】
洗剤またはカオトロプールに対する増加した安定性に関連して、典型的には、Ｇαサブユニットは、試験洗剤または試験カオトロピック剤の存在下で定義された時間にわたってインキュベートされ、安定性は、例えば、上述の結合パートナー結合または分光法を使用して決定される。
【００５０】
極度のｐＨに関連して、典型的な試験ｐＨが選択されるであろう（例えば、４．５〜５．５の範囲（低ｐＨ）または８．５〜９．５の範囲（高ｐＨ））。
【００５１】
比較的粗い洗剤が結晶化手技中に使用されるため、変異体Ｇαサブユニットがかかる洗剤の存在下で安定していることが好ましい。ある特定の洗剤の「粗さ」の順序は、ＤＤＭ、Ｃ１１→Ｃ１０→Ｃ９→Ｃ８マルトシドまたはグルコシド、ラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）、及びＳＤＳである。変異体ＧαサブユニットがＣ９マルトシドまたはグルコシド、Ｃ８マルトシドまたはグルコシド、ＬＤＡＯ、及びＳＤＳのうちのいずれかに対してより安定していることが特に好ましく、よって、これらの洗剤が安定性試験に使用されることが好ましい。
【００５２】
決定の容易さのため、変異体Ｇαがその親タンパク質と比較して増加した熱安定性を有することが好ましい。熱が変性因子として作用し、これが、例えば、氷上に置くことによって試料を冷却することによって容易に除去され得ることが理解される。熱安定性が他の変性因子または変性条件に対する安定性の指針である場合もあると考えられる。したがって、増加した熱安定性は、変性洗剤、特に、ＤＤＭよりも変性するもの、例えば、より小さい頭部基及び／またはより短いアルキル鎖及び／または荷電頭部基を有する洗剤中での安定性に転換される可能性がある。
【００５３】
極度のｐＨが変性条件としてが使用される場合、これが中和剤を添加することによって迅速に除去され得ることが理解される。同様に、カオトロープが変性因子として使用される場合、変性効果は、カオトロプールがそのカオトロピック効果を発揮する濃度未満に試料を希釈することによって除去され得る。
【００５４】
変異体Ｇαサブユニットは、その親Ｇαサブユニットよりも高いレベルで、細胞内で発現されるものであり得る。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、同じ条件下で、細胞内で発現されるその親Ｇαサブユニットのレベルよりも少なくとも１倍高い、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、または５倍、より好ましくは、少なくとも１０倍または５０倍高いレベルで、細胞内で発現される。好適な発現系が以下及び実施例にさらに詳細に記載されており、細菌もしくは酵母における構成的発現系もしくは誘導性発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、及びレンチウイルス等のウイルス発現系、または昆虫もしくは哺乳類細胞における一過性トランスフェクションが含まれる。タンパク質発現を評価するための方法は、当該技術分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウエスタンブロット法、ゲル濾過、及びＨＰＬＣ等の技法が含まれる。
【００５５】
本発明の第１の態様のいくつかの変異体Ｇαサブユニットが、細胞内でより低いレベルで発現し得、かつ／またはそれらの親Ｇαサブユニットよりも変性条件下で不安定であり得るが、かかる変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲと複合体を形成することができ、この複合体がそれらの親ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間で形成される複合体よりも変性条件下で安定していることが理解される。
【００５６】
ＧＰＣＲがアゴニスト及びアンタゴニスト等のリガンドの異なる薬理学的クラスに関連する複数の別個の立体構造で存在し、かつ機能するためにこれらの立体構造間をサイクルすると考えられている（Ｋｅｎａｋｉｎ  Ｔ．（１９９７）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１２，１１６−１２５）。立体構造間の切り替えは、受容体の結晶構造の取得困難に寄与する。したがって、特定の立体構造を安定化する能力が、結晶化研究に非常に望ましい。実施例で論じられるように、本発明人は、本明細書に記載の変異体Ｇαサブユニットが、アゴニスト結合形態でのＧＰＣＲの熱安定性を増加させることを見出した。したがって、さらなる実施形態では、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは、ＧＰＣＲへの結合時にＧＰＣＲの特定の立体構造を安定化することができる。特定の立体構造を安定化するとは、その立体構造が変性条件下で安定化されることを意味する。言い換えれば、この立体構造は、変性条件下でリガンド結合能力を保持するにより明らかになる延長した寿命を有する。好ましくは、特定の立体構造は、アゴニスト立体構造である。変性条件下での安定性を評価するための方法としては、上述のものが挙げられ、当該技術分野で周知である（例えば、ＷＯ２００８／１１４０２０を参照のこと）。簡潔には、それらは、リガンドの不在下または存在下のいずれかでＧＰＣＲを変性条件に供することと、その後、リガンド結合の保持を測定することとを含み得る。ＧＰＣＲがリガンドの不在下で変性条件に供されると、ＧＰＣＲがリガンドと接触して、ＧＰＣＲが依然としてリガンドに結合する程度を評価する。特定の立体構造の安定性を測定するために、安定性実験においてその立体構造クラスのリガンドを使用する（例えば、アゴニスト立体構造のためにアゴニストを使用する等）必要がある。安定化されている立体構造が典型的にはアゴニスト立体構造であるため、安定性を測定するために使用されるリガンドは、典型的にはアゴニストであるが、部分アゴニストも使用され得ることが理解される。
【００５７】
典型的には、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは、それらの親Ｇαサブユニットがヌクレオチドに結合する能力を保持するように、ヌクレオチド（例えば、ＧＤＰ、ＧＴＰ等のグアニンヌクレオチド、またはＧＴＰγＳもしくはＧｐｐＮｐ等のヌクレオチド誘導体）に結合する能力を保持すべきである。同様に、変異体Ｇαサブユニットは、それらの親ＧαサブユニットがＧβ及び／またはＧγサブユニットに結合する能力を保持するように、Ｇβ及び／またはＧγサブユニットに結合する能力を保持すべきである。ヌクレオチドへの結合が変異体Ｇαサブユニットを安定化し得るため、これらの能力の保持は、以下にさらに記載されるように、Ｇタンパク質−ＧＰＣＲ複合体の構造分析（例えば、低温電子顕微鏡法）に特に望ましい。
【００５８】
しかしながら、誤解を避けるために、これらの活性のうちの１つ以上を保持しない変異体Ｇαサブユニットも依然として本発明の変異体Ｇαサブユニットによって包含される。
【００５９】
ＧαサブユニットのスイッチＩ領域は、ヘリカルドメインとＧＴＰａｓｅドメインのベータ鎖２との間のループ（ＣＧＮ：  Ｇ．ｈｆｓ２）から成るが、ヘリカルドメインのヘリックスＦとも重複する。スイッチＩは、ＣＧＮシステムを使用して、ヘリックスＦ（Ｈ．ＨＦ）の最初のアミノ酸残基とベータ鎖２（Ｇ．Ｓ２）の最初のアミノ酸残基との間に位置する領域（例えば、ヒトＧαｓにおいて、これは、これらの２つの特定のアミノ酸残基を含むＤ１９４Ｈ．ＨＦ．１−Ｉ２０７Ｇ．Ｓ２．１である）と定義され得る。
【００６０】
一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、その親ＧαサブユニットのスイッチＩ領域、例えば、図１に記載のヒトＧαｓの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ａｓｐ  １９４〜Ｉｌｅ  ２０７に対応する領域を保持する。この実施形態が、親ＧαサブユニットのヘリカルドメインのヘリックスＡ〜Ｅに対応する領域が欠失されている実施形態に対応し得ることが理解される。本発明人は、その親Ｇαサブユニットと比較して、変異体Ｇαサブユニットの安定性及び／または発現レベルを増加させる他の変異の不在下で、スイッチＩ領域が重要であることを見出した。しかしながら、その親Ｇαサブユニットと比較して、変異体Ｇαサブユニットの安定性及び／または発現レベルを増加させる１つ以上の変異の存在下で、スイッチＩ領域が切断されているか、または欠失していてもよい。したがって、別の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親ＧαサブユニットのスイッチＩ領域（例えば、図１に記載のヒトＧαｓの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ａｓｐ  １９４〜Ｉｌｅ  ２０７に対応する領域）またはその一部が欠失しているものである。その一部とは、図１に記載のヒトＧαｓの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ａｓｐ  １９４〜Ｉｌｅ  ２０７に対応する領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のアミノ酸残基を意味する。好ましくは、欠失しているスイッチＩ領域の一部は、欠失した一続きの連続したアミノ酸残基を含む。
【００６１】
なお別の実施形態では、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩ領域は、低分子量ＧＴＰａｓｅのスイッチＩ領域によって置換される。低分子量ＧＴＰａｓｅのスイッチＩ領域は、例えば、本明細書に記載の構造的アラインメント及び配列アラインメントによって容易に特定され得る。
【００６２】
本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットの特に好ましい実施形態では、親Ｇαドメインのヘリカルドメイン、スイッチＩ領域、及びＧＴＰａｓｅドメインをヘリカルドメインのＮ末端に連結するリンカー１領域は全て欠失している。リンカー１領域（ＣＧＮ：  Ｇ．ｓ１ｈ１）の長さが異なるＧαサブユニット間で異なるが、ＣＧＮシステムを使用して、ヘリックス１／ヘリックスＡループ（Ｇ．ｈ１ｈａ）の最初の残基と最後の残基との間の領域、例えば、ヒトＧαｓ  Ｖ６５Ｇ．ｈ１ｈａ．１〜Ｓ８４Ｇ．ｈ１ｈａ．２０（これらの２つの特定の残基を含む）と定義され得る。あるいは、ヘリックス１（Ｇ．Ｈ１）の最後の残基とヘリックスＡ（Ｈ．ＨＡ）の最初の残基との間に位置する領域、例えば、ヒトＧαｓ  Ｈ６４Ｇ．Ｈ１．１２〜Ｄ８５Ｈ．ＨＡ．１（これらの２つの特定の残基を除く）と定義され得る。
【００６３】
したがって、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６５〜２０７に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。
【００６４】
しかしながら、この領域のいずれかの末端または両方の末端に１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸残基を保持することが望ましい場合があることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６６〜２０７、６７〜２０７、６８〜２０７、６９〜２０７、７０〜２０７、６５〜２０６、６５〜２０５、６５〜２０４、６５〜２０３、または６５〜２０２に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。
【００６５】
本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットの特に好ましい実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６５〜２０３に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものである。あるいは、この領域は、ヘリックス１（Ｇ．Ｈ１）の最後の残基とベータシート（Ｇ．Ｓ２）の最初のアミノ酸残基のＮ末端のアミノ酸残基の３つの残基との間の領域、例えば、ヒトＧαＳ  Ｈ６４Ｇ．Ｈ１．１２〜Ｔ２０４Ｇ．ｈｆｓ２．５（これらの２つの特定の残基を含む）と定義され得る。この領域が、以下にさらに記載されるように、アミノ酸リンカーで置換されることが特に好ましい。好ましい例としては、ＧＧＳＧＧＳＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＧＧ等の８アミノ酸長のリンカーが挙げられる。
【００６６】
この領域のいずれかの末端または両方の末端の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の追加のアミノ酸残基を欠失させることが望ましい場合があることも理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６０〜２０７、６１〜２０７、６２〜２０７、６３〜２０７、６４〜２０７、６５〜２０８、６５〜２０９、６５〜２１０、６５〜２１１、または６５〜２１２に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。
【００６７】
本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットの別の実施形態では、親Ｇαサブユニットのヘリカルドメイン及びＧＴＰａｓｅドメインをヘリカルドメインのＮ末端に連結するリンカー１領域が欠失しているが、親ＧαサブユニットのスイッチＩ領域が欠失しているか、さもなければ低分子量ＧＴＰａｓｅのスイッチＩ領域で置換される。
【００６８】
変異体Ｇαサブユニットの結晶化、発現、及び／または精製を容易にするために、が望ましくあり得る。親ＧαサブユニットのＮ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させることが望ましい場合がある。したがって、一実施形態では、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、Ｎ末端切断アミノ酸配列を有する。例えば、最大１０個のアミノ酸、例えば、最大９、８、７、６、５、４、３、もしくは２個のアミノ酸、または１つののアミノ酸がＮ末端から欠失している場合がある。別の例では、最大１５、２０、２５、３０、３５、または４０個のアミノ酸が、Ｎ末端から欠失している場合がある。典型的には、Ｎ末端からの欠失は、５〜２０個のアミノ酸である。Ｎ末端の欠失が結晶化目的に特に好適であると考えられるため、変異体Ｇαサブユニットが結晶化される場合、その親ＧαサブユニットのＮ末端から最大４０個のアミノ酸を欠失させることが望ましい場合がある。対照的に、βγ二量体への結合が望ましい場合、Ｎ末端が欠失していてはならず、または最大５つのＮ末端残基のみが欠失しているべきである（例えば、Ｎ末端の１、２、３、４、または５つの残基）。特に好ましい実施形態では、親ＧαサブユニットのＮ末端の５つのアミノ酸が欠失しているか、または親ＧαサブユニットのＮ末端の２０個のアミノ酸が欠失しているか、または親ＧαサブユニットのＮ末端の２１個のアミノ酸が欠失しているか、またはＮ末端の２５個のアミノ酸が欠失している。
【００６９】
さらに好ましい実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図２９に示されるように、アミノ酸残基Ｉｌｅ／ＬｅｕＨＮ４３のアミノ酸残基Ｎ末端の全てが欠失しているものである。例えば、変異体Ｇαサブユニットが変異体Ｇαｓサブユニットである場合、これは、図２９に示されるヒトＧαｓの番号付けに従うヒトＧαｓの最初の２５個のアミノ酸に対応する最初の２５個のアミノ酸の欠失に対応する。
【００７０】
変異体Ｇαサブユニットが、上述のヘリカルドメイン、リンカー１領域、及びスイッチＩ領域の欠失のうちのいずれかと組み合わせて本明細書に定義されるＮ末端切断のうちのいずれかを含み得ることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、本明細書に定義されるＮ末端切断のうちのいずれかを含み得、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６５〜２０３に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失している変異体Ｇαサブユニットであり得る。
【００７１】
親ＧαサブユニットのスイッチＩ領域またはその一部が維持される本発明の第１の態様の実施形態では、本発明人は、親Ｇαサブユニットにおける以下のアミノ酸残基：  図１に示されるヒトＧαｓの長いアイソフォームのＬｅｕ  １９７及びＣｙｓ  ２００の個々の置換が発現の増加をもたらすことを見出した。したがって、一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、スイッチＩ領域に１つ以上の変異を含むものであり、より具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：Ｌｅｕ  １９７及びＣｙｓ  ２００のうちのいずれか１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。ＣＧＮシステムを使用して、これらのアミノ酸残基は、Ｌ１９７Ｈ．ＨＦ．４及びＣ２００Ｇ．ｈｆｓ２．１と特定される。Ｌ１９７Ｈ．ＨＦ．４位のアミノ酸残基がロイシンである場合、それは、好ましくは、アラニン残基に置換され、Ｃ２００Ｇ．ｈｆｓ２．１位のアミノ酸残基がシステインである場合、それは、好ましくは、セリン残基に置換される。
【００７２】
別の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩＩＩ領域またはその一部が欠失しているものである。スイッチＩＩＩ領域は、ＣＧＮシステムを使用して、ベータシート４（Ｇ．Ｓ４）の最後の残基とヘリックス３（Ｇ．Ｈ３）の最初の残基との間に位置する領域、例えば、ヒトＧαｓ  Ａｌａ２４９Ｇ．Ｓ４．７〜Ａｒｇ２６５Ｇ．Ｈ３．１（これらの２つの特定の残基を除く）と定義され得る。したがって、図１に記載のヒトＧα−ｓの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ｓｅｒ  ２５０〜Ａｓｎ  ２６４に対応する親Ｇαサブユニットの領域またはその一部が欠失しているものであり得る。その一部とは、図１に記載のヒトＧαｓの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ｓｅｒ  ２５０〜Ａｓｎ  ２６４に対応する領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸残基を意味する。好ましくは、欠失しているスイッチＩＩＩ領域の一部は、欠失した一続きの連続したアミノ酸残基を含む。例えば、本発明人は、Ａｓｎ２５４Ｇ．ｓ４ｈ３．５〜Ｔｈｒ２６３Ｇ．ｓ４ｈ３．１４に対応する一続きのアミノ酸を欠失させることにより、特に良好な特性（例えば、ＧＰＣＲへの共役及び改善された安定性／発現レベルの観点から）を有する変異体Ｇαサブユニットが提供されることを見出し、よって、特定の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２５４〜２６３に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものである。しかしながら、この領域のいずれかの末端または両方の末端に１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸残基を保持することが望ましい場合があることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２５５〜２６３、２５６〜２６３、２５７〜２６３、２５８〜２６３、２５９〜２６３、２５４〜２６２、２５４〜２６１、２５４〜２６０、２５４〜２５９、または２５４〜２５８に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。同様に、この領域のいずれかの末端または両方の末端の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の追加のアミノ酸残基を欠失させることが望ましい場合があることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２５３〜２６３、２５２〜２６３、２５１〜２６３、２５０〜２６３、２４９〜２６３、２５４〜２６４、２５４〜２６５、２５４〜２６６、２５４〜２６７、または２５４〜２６８に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。
【００７３】
変異体Ｇαサブユニットが、上で定義されるように、親ＧαサブユニットのスイッチＩＩＩ領域またはその一部が欠失しているものであり得、本明細書に定義されるＮ末端切断のうちのいずれか、ならびに上述のヘリカルドメイン、リンカー１領域、及びスイッチＩ領域の欠失のうちのいずれかを含み得ることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、本明細書に定義されるＮ末端切断のうちのいずれかを含み得、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６５〜２０３及びアミノ酸残基２５４〜２６３に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失している変異体Ｇαサブユニットであり得る。
【００７４】
別の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファサブユニットのスイッチＩＩ領域またはその一部が欠失しているものである。スイッチＩＩ領域は、ＣＧＮシステムを使用して、ベータシート３（Ｇ．Ｓ３）の最後のアミノ酸残基とベータシート４（Ｇ．Ｓ４）の最初のアミノ酸残基との間の領域、例えば、Ｇαｓ  Ｖａｌ２２４Ｇ．Ｓ３．８〜Ａｌａ２４３Ｇ．Ｓ４．１（これらの２つの特定の残基を除く）と定義され得る。したがって、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ｇｌｙ  ２２５〜Ｔｈｒ  ２４２に対応する親Ｇαサブユニットの領域またはその一部が欠失しているものであり得る。その一部とは、図１に記載のヒトＧαｓの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基Ｇｌｙ  ２２５〜Ｔｈｒ  ２４２に対応する領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のアミノ酸残基を意味する。好ましくは、欠失しているスイッチＩＩ領域の一部は、欠失した一続きの連続したアミノ酸残基を含む。好ましい実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番番号付けに従うアミノ酸残基２２７〜２３０に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものである。好ましくは、スイッチＩＩ領域またはその一部（例えば、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２２７〜２３０に対応する領域）が以下にさらに記載されるリンカー配列によって置換されるが、かかるリンカーは不必須ではない。
【００７５】
スイッチＩＩ領域のいずれかの末端または両方の末端に１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）のアミノ酸残基を保持することが望ましい場合があることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２２６〜２４２、２２７〜２４２、２２８〜２４２、２２９〜２４２、２３０〜２４２、２２５〜２４１、２２５〜２４０、２２５〜２３９、２２５〜２３８、または２２５〜２３７に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。同様に、この領域のいずれかの末端または両方の末端の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）の追加のアミノ酸残基を欠失させることが望ましい場合があることが理解される。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基２２４〜２４２、２２３〜２４２、２２２〜２４２、２２１〜２４２、２２０〜２４２、２２５〜２４３、２２５〜２４４、２２５〜２４５、２２５〜２４６、または２２５〜２４７に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しているものであり得る。
【００７６】
変異体Ｇαサブユニットが、上で定義されるように、親ＧαサブユニットのスイッチＩＩ領域またはその一部が欠失しているものであり得、本明細書に定義されるＮ末端切断のうちのいずれか、ならびに上述のヘリカルドメイン、リンカー１領域、スイッチＩ領域、及びスイッチＩＩＩ領域のうちのいずれかを含み得る。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、本明細書に定義されるＮ末端切断のうちのいずれかを含み得、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うアミノ酸残基６５〜２０３及びアミノ酸残基２２７〜２３０に対応する親Ｇαサブユニットの領域が欠失しており、任意に、アミノ酸残基２５４〜２６３に対応する親Ｇαサブユニットの領域も欠失している変異体Ｇαサブユニットであり得る。
【００７７】
親Ｇαサブユニットのいずれか一部（例えば、ヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックス、またはスイッチＩ領域、スイッチＩＩ領域、もしくはスイッチＩＩＩ領域のいずれか、またはその一部）が欠失している場合、Ｇαサブユニットの残りの部分（すなわち、欠失のＮ末端に対する部分及び欠失のＣ末端に対する部分）は、リンカー配列によって一緒に結合され得る。「リンカー配列」とは、欠失によって作り出された２つの部分を一緒に結合する任意の化学部分を意味する好ましくは、リンカーは、ペプチドである。好適なリンカーペプチドは、ランダムコイル立体構造を典型的に採用するものであり、例えば、ペプチドは、グリシン残基もしくはセリン残基、またはグリシン残基とセリン残基との混合物を含み得る。好ましくは、リンカーは、２〜５０個、より好ましくは２〜３０個、さらにより好ましくは３〜２０個、例えば、３〜８個のアミノ酸残基を含む。好適なリンカーの例は、以下の表２に提供される。ヘリカルドメイン、スイッチＩ領域、及びスイッチＩＩ領域のうちのいずれかがリンカーによって置換されることが好ましい。リンカーの要件は、欠失のサイズに依存し得る。例えば、１０個以下のアミノ酸の領域等における小さい欠失は、リンカーを必要としない場合があり、欠失によって作り出された２つの部分は、直接一緒に結合され得る。しかしながら、１０個を超えるアミノ酸の領域等におけるより大きい欠失は、一般に、リンカーを必要とする。
【００７８】
実施例で実証されるように、本発明人は、その親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で変異体Ｇαサブユニットの安定性を増加させ、かつ／または細胞内で発現する場合、変異体Ｇαサブユニットの発現を増加させる様々な変異を特定し、よって、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットがかかる安定性及び／または発現を増加させる１つ以上の変異を含むことが好ましい。かかる変異の例は、以下の表２〜５に列記され、よって、変異体Ｇαサブユニットは、以下の表２〜５に列記される変異のうちのいずれか１つ以上を含み得る。
【００７９】
一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｖａｌ  ３６、Ｈｉｓ  ４１、Ａｌａ  ４８、Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｍｅｔ  ６０、Ｌｅｕ  ６３、Ｌｅｕ  １９７、Ｌｙｓ  ２００、Ａｒｇ  ２０１、Ｐｈｅ  ２０８、Ａｓｎ  ２１８、Ｇｌｙ  ２２６、Ｇｌｕ  ２３０、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、Ｖａｌ  ３７５のうちのいずれか１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７）に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。好ましくは、これらのアミノ酸は各々、表２〜５に示される特定のアミノ酸残基によって置換される。例えば、３６位のバリンは、アスパラギン酸塩によって置換され、４１位のヒスチジンは、イソロイシンまたはバリンによって置換されるといった具合である。しかしながら、それらが任意の他のアミノ酸によって置換され得るが、但し、変異体ＧαサブユニットがＧβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができることを条件とすることが理解される。
【００８０】
本発明のいずれかの態様では、特定の位置の所与のアミノ酸を置換するために使用されるアミノ酸が、典型的には天然に存在するアミノ酸、典型的には「コード可能な」アミノ酸であるが、それは、非天然アミノ酸であり得る（その場合、タンパク質が、典型的には、化学合成によって、または非天然アミノ−アシルｔＲＮＡの使用によって作製される）。「コード可能な」アミノ酸は、ｍＲＮＡの翻訳によってポリペプチドに組み込まれるものである。非天然アミノ酸を作製するか、または共有結合化学修飾によって、例えば、タンパク質の翻訳後処理または半合成によって、所与の位置に非ペプチド結合を導入することも可能である。リン酸化、グリコシル化もしくはパルミトイル化、または合成もしくは生合成等の翻訳後修飾は、天然であり得る。
【００８１】
特定の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列と比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の変異：  Ｖ３６Ｄ、Ｈ４１ＩまたはＨ４１Ｖ、Ａ４８Ｌ、Ｇ４９Ｄ、Ｅ５０Ｎ、Ｍ６０ＡまたはＭ６０Ｃ、Ｌ６３ＹまたはＬ６３ＲまたはＬ６３Ｋ、Ｌ２９７Ａ、Ｃ２００Ｓ、Ｒ２０１Ａ、Ｆ２０８Ｎ、Ｎ２１８Ｋ、Ｇ２２６Ａ、Ｅ２３０Ａ、Ａ２４９ＤまたはＡ２４９Ｅ、Ｓ２５２ＤまたはＳ２５２Ｅ、Ｌ２７２ＤまたはＬ２７２Ｅ、Ｉ３７２ＡまたはＩ３７２Ｃ、及びＶ３７５Ｉのうちの１つ以上を有するアミノ酸配列を有する変異体Ｇαサブユニットである。
【００８２】
具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、５〜２０または５〜２５アミノ酸残基長のＮ末端切断を有し、スイッチＩＩＩ領域の欠失を有し、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｈｉｓ  ４１、Ｌｅｕ  １９７、Ｃｙｓ  ２００、Ａｌａ  ２４９、及びＬｅｕ  ２７２のうちの１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ）に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。
【００８３】
さらに具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、５〜２０または５〜２５アミノ酸残基長のＮ末端切断を有し、スイッチＩＩＩ領域の欠失を有し、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｌｅｕ  ６３、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、及びＶａｌ  ３７５のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８つ）に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。
【００８４】
さらに別の具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｇｌｙ  ２２６、及びＳｅｒ  ２５２のうちの１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。
【００８５】
なお別の具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、（ｉ）Ｉｌｅ／ＬｅｕＨＮ４３の全てのアミノ酸残基Ｎ末端の欠失、（ｉｉ）ヘリックス１（Ｇ．Ｈ１）の最後の残基とベータシート（Ｇ．Ｓ２）の最初のアミノ酸残基のＮ末端のアミノ酸残基の３つの残基との間の領域の欠失（任意に、この領域は、アミノ酸リンカー（例えば、ＧＧＳＧＧＳＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＧＧ等の８アミノ酸リンカー）によって置換される）、（ｉｉｉ）ＴｙｒＳ４Ｈ３．４とＡｓｎ／ＳｅｒＳ４Ｈ３．１５との間の１０個のアミノ酸残基の欠失、（ｉｖ）以下の位置：Ｇｌｙ４９ＳＩＨ１．３、Ｇｌｕ５０ＳＩＨ１．４、Ａｌａ２４９Ｓ４．７、Ｓｅｒ２５２Ｓ４Ｈ３．３、Ｌｅｕ２７２Ｈ３．８、Ｉｌｅ３７２Ｈ５．４、及びＶａｌ３７５Ｈ５．７（任意に、これらの残基は、それぞれ、Ｄ４９ＳＩＨ１．３、Ｎ５０ＳＩＨ１．４、Ｄ２４９Ｓ４．７、Ｄ２５２Ｓ４Ｈ３．３、Ｄ２７２Ｈ３．８、Ａ３７２Ｈ５．４、及びＩ３７５Ｈ５．７に変異される）のうちのいずれか１つ以上（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７つ）に対応する位置に異なるアミノ酸を有する。
【００８６】
典型的には、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームのアミノ酸配列（配列番号９１）と少なくとも２０％の配列同一性、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の配列同一性、より典型的には、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。
【００８７】
さらに具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、配列番号１〜４５に対応する図２６のアミノ酸配列のうちのいずれかと少なくとも２０％の配列同一性、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するものである。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、配列番号１〜４５に対応する図２６のアミノ酸配列のうちのいずれかを含むものである。
【００８８】
さらに具体的な実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図２９、３５、３６、３７、３８、及び４０のうちのいずれかのアミノ酸配列のうちのいずれかと少なくとも２０％の配列同一性、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するものである。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、図２９、３５、３６、３７、３８、及び４０のうちのいずれかのアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むものである。
【００８９】
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、任意の好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定され得、同一性パーセントは、配列が最適にアラインされたポリペプチドとの関連で計算されることが理解される。あるいは、アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを使用して行われ得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２２）：４６７３−８０）。使用されるパラメータは、以下の通りである。高速対アラインメントパラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ１、ウィンドウサイズ５、ギャップペナルティ３、上方対角線の数５。スコアリング方法：ｘパーセント。多重アライメントパラメータ：ギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．０５．スコアリングマトリックス：  ＢＬＯＳＵＭ。
【００９０】
多数の優性陰性変異がヘテロ三量体Ｇタンパク質（Ｂａｒｒｅｎ  ＆  Ａｒｔｅｍｙｅｖ４９によって概説されている）及び低分子量Ｇタンパク質（Ｆｅｉｇ５０によって概説されている）の両方について報告されている。優性陰性変異体は、βγサブユニット、活性化ＧＰＣＲ（例えば、Ｇタンパク質に結合することができるＧＰＣＲ）、または下流結合パートナーを隔離することによってＧタンパク質シグナル伝達を阻害し得る４９、５０。ＧＰＣＲを隔離する変異体は、三元複合体（すなわち、ＧαサブユニットとＧＰＣＲとβγサブユニットとの間）の解離を防止するのに役立ち得るため、ＭＥＧＡドメインの設計に特に望ましい。したがって、一実施形態では、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、１つ以上の優性陰性変異を含むものである。当該技術分野で既知の任意のかかる優性陰性変異は、本発明の変異体Ｇαサブユニットに組み込まれてもよく、いくつかの具体的な例が以下に含まれる。
【００９１】
Ｓ１７Ｎ変異は、ｒａｓについて記載の最初の優性陰性変異のうちの１つであり５１、対応する変異が（Ｓ５４Ｎ）５２〜５４及びＧαｔ（Ｓ４３Ｎ）５５、５６において特徴付けられた。したがって、一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓの長いアイソフォームの番号付けに従うＳｅｒ  ５４に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。変異体ＧαサブユニットがＧαｓサブユニットである場合、変異体は、好ましくは、変異Ｓ５４Ｎを含み、変異体ＧαサブユニットがＧαｔサブユニットである場合、変異体は、好ましくは、変異Ｓ４３Ｎを含む。
【００９２】
ＮＫＸＤモチーフ内に位置するＮ３３８Ｄ変異は、酵母Ｇタンパク質Ｇｐａ１における優性陰性変異体として特定された５８。Ｒａｓ  Ｓ１７Ｎに類似して、Ｇｐａ１  Ｎ３３８Ｄ変異体は、受容体と不可逆的空結合ポケット複合体を形成するように見え、これは、グアニンヌクレオチドによる解離に耐性を示した５８。著者は、変異体タンパク質が熱に不安定であり、受容体結合が変性に対する保護を提供したことに言及した５８。Ｓｉｍｏｎ及び同僚は、同様にＮＫＸＤモチーフ内に位置するＤ２７３Ｎ変異が、受容体隔離優性陰性表現型（βγ依存性）を呈するヌクレオチド枯渇Ｇαｏ、Ｇα１１、及びＧα１２サブユニットをもたらしたことを報告した６２〜６４。したがって、別の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、ＮＫＸＤモチーフ内に１つ以上の異なるアミノ酸を有するものであり、任意に、ＮＫＸＤモチーフのＡｓｎがＡｓｐで置換されており、かつ／またはＮＫＸＤモチーフのＡｓｐがＡｓｎで置換されている。ＮＫＸＤモチーフは、全てのＧタンパク質に高度に保存されたＧ−ボックスモチーフ群に属し、科学文献に詳細に記載されている。ＧαｓにおけるＮＫＸＤモチーフのＣＧＮコードは、Ｎ２９２Ｇ．Ｓ５．７、Ｋ２９３Ｇｓｈｇ．１、Ｑ２９４Ｇ．ＨＧ．１、及びＤ２９５Ｇ．ＨＧ．２である。変異体Ｇαサブユニットが酵母Ｇｐａ１である場合、変異体は、好ましくは、変異Ｎ３３８Ｄを含み、変異体ＧαサブユニットがＧαｏ、Ｇα１１、またはＧα１２のうちのいずれかである場合、変異体は、好ましくは、変異Ｄ２７３Ｎを含む。
【００９３】
Ｓｉｍｏｎ及び同僚は、Ｇαｏにおける第２の変異Ｑ２０５Ｌの付加が、Ｇαサブユニットのヌクレオチド特異性をグアノシンからキサンチンヌクレオチドに切り替えたことも見出した６２〜６４。これらの二重変異体Ｇαサブユニット（Ｄ２７３Ｎ／Ｑ２０５Ｌ）は、キサンチンヌクレオチドは本質的に不在である生理学的条件下で受容体隔離優性陰性変異体としても作用した。しかしながら、キサンチンヌクレオチドが補充される場合、それらは、完全な生物学的機能を取り戻し、インビボでＧタンパク質シグナル伝達経路を研究するのに有用なツールにする。さらに、Ｄ２７３Ｎ変異体もＤ２７３Ｎ／Ｑ２０５Ｌ変異体もいずれも、それらの受容体共役選択性を保持した。ＧαｏにおけるＤ２７３は、ＧαｓにおけるＱ２２７Ｇ．ｓ３ｈ２．３に対応する。したがって、さらなる実施形態では、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のＧαｓの番号付けに従うＧｌｎ  ２２７に対応する位置に異なるアミノ酸を有し、任意に、図１に記載のＧαｓの番号付けに従うＡｓｐ  ２９５に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。変異体ＧαサブユニットがＧαｏである場合、変異体は、好ましくは、変異Ｑ２０５Ｌを含み、任意に、変異Ｄ２７３Ｎも含む。
【００９４】
Ｂｏｕｒｎｅ及び同僚は、優性陰性表現型を呈する三重変異体を設計した６５。Ｇ２２６Ａ変異とＥ２６８Ａ変異とＡ３６６Ｓ変異との組み合わせによりＧαｓサブユニットが産生され、これは、安定したヌクレオチド不含三元複合体において受容体及びβサブユニットの両方を効率的に隔離した６５。したがって、一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｇｌｙ  ２２６、Ｇｌｕ  ２６８、及びＡｌａ  ３６６のうちの１つ以上または全てに対応する位置に１つ以上の異なるアミノ酸を有するものである。変異体Ｇαサブユニットが変異体Ｇαサブユニットである場合、変異体は、好ましくは、変異Ｇ２２６Ａ、Ｅ２６８Ａ、及びＡ３６６Ｓのうちの１つ以上または全てを含む。
【００９５】
Ｐｅｒｅｉｒａ及びＣｅｒｉｏｎｅは、スイッチＩＩＩ領域における変異を報告し、これにより、受容体隔離優性陰性表現型が産生された５９。Ｇαｔ（キメラ６４４）のＲ２３８Ｅ変異がヌクレオチド欠損状態で存在することが見出された。この変異体は、恐らくそれが部分的に活性な立体構造を採用したため、他のヌクレオチド欠損Ｇα変異体よりも熱的に安定しているとも報告された５９。しかしながら、Ｇαｓにおける同じ変異も、優性陰性表現型を産生することができなかった。したがって、一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、その親Ｇαサブユニットと比較して、図２７に記載のＧαｔサブユニット（キメラ６）の番号付けに従うＡｒｇ  ２３８に対応する位置に異なるアミノ酸を有する変異体Ｇαｔサブユニット（キメラ６）である。
【００９６】
多くのヌクレオチド不含Ｇαサブユニット２４、２５、６６、６７と同様に、この三重変異体は、熱的に不安定である６５。したがって、これらの変異のうちの２つ（Ｇ２２６Ａ及びＡ３６６Ｓ）を追加の変異と組み合わせて、より安定した優性陰性変異体を産生した６８。ここで、Ｇαｓのα３／β５ループを、前項に記載されるように、Ｇαｉ２の対応する領域で置換した４８。合計７つの変異を含むこの構築物が著しく改善された熱安定性を有すると報告された４８。
【００９７】
優性陰性変異に加えて、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットに組み込むことが望ましい場合がある他の変異には、ＧαサブユニットのＧＰＣＲに対する親和性を増加させることで知られている変異が含まれる。それ故に、変異体Ｇαサブユニットが、親Ｇαサブユニットと比較して、ＧαサブユニットのＧＰＣＲに対する親和性を増加させることで知られている１つ以上の変異を含むものであり得ることが理解される。当該技術分野で既知の任意のかかる親和性増加変異は、本発明の変異体Ｇαサブユニットに組み込まれてもよく、いくつかの具体的な例が以下に含まれる。
【００９８】
Ｉｖｅｒｓｏｎ及び同僚は、受容体結合２９によって誘導されると予測されるα５ヘリックスの回転及び転位を模倣するために２つのＧαｉ１構築物３０を設計し、第一に、α５ヘリックスのシフトを誘導するためにジスルフィド結合を残基Ｉ５６とＱ３３３との間で操作し（システインに変異させ）、第二に、ヌクレオチドの周りの局所静電分布を撹乱させるために正電荷をα５ヘリックス（Ｄ３２８Ｒ）のＮ末端に導入した。ジスルフィド操作タンパク質の結晶構造を解き、ジスルフィド結合の存在及びα５ヘリックスの位置のシフトを確認した３０。両変異体が増加したヌクレオチド交換レベルを示し、両方ともにロドプシンと相互作用することができたが、受容体は、ヌクレオチド交換速度をさらに加速することができなかった３０。Ｄ３２８Ｒ変異体は、野生型Ｇαｉ１と比較してロドプシンとの強化された相互作用も示した３０。したがって、一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図２５に記載のＧαｉ１サブユニットの番号付けに従うＩｌｅ  ５６及びＧｌｎ  ３３３に対応する位置の各々にシステイン残基を有するものである。加えて、またはあるいは、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと比較して、図２５に記載のＧαｉ１サブユニットの番号付けに従うＡｓｐ  ３２８に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものである。変異体ＧαサブユニットがＧαｉサブユニットである場合、好ましくは、変異体は、変異Ｄ３２８Ｒを含む。
【００９９】
Ｇｒｉｓｈｉｎａ及びＢｅｒｌｏｔは、潜在的な受容体接触部位として、Ｇαｓのα３／β５ループ（すなわち、ヘリックス３とベータ鎖５との間のループ）を特定した４８。Ｇαｉ２の対応するループでのこの領域の置換は、β２ＡＲに対する親和性を増加させ、受容体触媒ヌクレオチド交換速度を低減することが報告された４８。したがって、なおさらなる実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαｓサブユニットのα３／β５ループがＧαｉ２サブユニットのα３／β５で置換される変異体Ｇαｓサブユニットであり得る。α３／β５ループとは、Ｇαｉ２のＫ２４９Ｇ．Ｈ３．７〜Ｔ２６３Ｇ．ｈ３ｓ５．３に対応するＧαｓのアミノ酸配列Ｎ２７１Ｇ．Ｈ３．８〜Ｉ２８５Ｇ．ｈ３ｓ５．３によって定義される領域を意味する。Ｇαｓにおけるこのループの置換は、以下の変異：  Ｎ２７１Ｋ、Ｋ２７４Ｄ、Ｒ２８０Ｋ、Ｔ２８４Ｄ、及びＩ２８５Ｔに対応し、よって、変異体Ｇαサブユニットが、親Ｇαサブユニットと比較して、図１に記載のヒトＧαｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従うＡｓｎ  ２７１、Ｌｙｓ  ２７４、Ａｒｇ  ２８０、Ｔｈｒ  ２８４、及びＩｌｅ  ２８５のうちのいずれか１つ以上に対応する位置に異なるアミノ酸を有するものであり得ることが理解される。変異体ＧαサブユニットがＧαｓサブユニットである場合、好ましくは、変異体は、変異Ｎ２７１Ｋ、Ｋ２７４Ｄ、Ｒ２８０Ｋ、Ｔ２８４Ｄ、及びＩ２８５Ｔのうちの１つ以上を含む。
【０１００】
Ｍｏｌｌｅｒ及び同僚は、トランスデューシンのＣ末端領域内でのＣｙｓ−３４７の修飾がロドプシン−トランスデューシン複合体の解離を防止したことを報告した４７。興味深いことに、使用された修飾試薬の種類は、複合体のヌクレオチド結合状態を決定するように見え、Ｃｙｓ−３４７のヨード酢酸（ＩＡＡ）カルボキシメチル化が、ロドプシン−トランスデューシン空ポケット複合体を捕捉し、グアニンヌクレオチド媒介解離への耐性を付与し４７、２−ニトロ５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢＡ）処理が、ロドプシン−トランスデューシン複合体をＧＤＰ結合状態で捕捉した４７。これは、ヌクレオチド結合三元複合体がヌクレオチド枯渇複合体よりも安定し得るため、ＭＥＧＡドメインの設計に重要であり得る。したがって、なお別の実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、図２５に記載のＧαｔサブユニットの番号付けに従うＣｙｓ  ３４７に対応する位置のアミノ酸残基が化学修飾されているものであり得、任意に、前記アミノ酸残基がカルボキシメチル化されている（例えば、ＩＡＡで処理されている）か、またはシアン化されている（例えば、ＮＴＣＢＡで処理されている）。
【０１０１】
親Ｇαサブユニットの変異体は、任意の好適な方法で産生され得、任意の好適な形態で提供され得る。従来の部位特異的変異誘発が用いられてもよく、または当該技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応に基づく手技が使用されてもよい。
【０１０２】
親Ｇαサブユニットの変異体は、アミノ酸配列が、親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列と比較して、欠失、アミノ酸置換、及び／または挿入のうちの１つ以上を含むものである。欠失は、親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列内（すなわち、配列の末端ではない）の欠失であり得るが、欠失が、親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方または両方にあり得ることが理解される。同様に、挿入は、親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列内（すなわち、配列の末端ではない）の１つ以上（例えば、２、３、４、または５つ以上）のアミノ酸の挿入であり得るが、親Ｇαサブユニットのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端の一方または両方での挿入、例えば、融合も含まれる。
【０１０３】
誤解を避けるために、本発明の変異体Ｇαサブユニットは、第１のＧαサブユニットの１つ以上の部分及び第２のＧαサブユニットの１つ以上の部分で構成されたキメラでもあり得る。キメラは、１つのクラスのＧαサブユニット（例えば、Ｇαｓ）を変換して、別のクラス（例えば、ＧｑまたはＧｉ）のように挙動させるのに有用であり得る。例えば、ＧＳのＣ末端の最後の１８個のアミノ酸のＧｑのＣ末端の最後の１８個のアミノ酸への置換により、ＧαサブユニットがＧｑにのみ共役する受容体に結合することが可能になる。近年のインビボＦＲＥＴ研究は、アルファ５ヘリックス内にあるが、５つのＣ末端残基の遠位にある残基が特異性に強く影響を与えることも示唆している（実施例５も参照のこと）。実施例５により詳細に説明されるように、本発明人は、Ｇｓで特定された変異の他のＧタンパク質タイプへの導入が単独でそれらの他のＧタンパク質タイプのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を生成することができないことを見出し、別のアプローチは、ｍｉｎｉ−Ｇｓの特異性を所望のＧタンパク質の特性に変換することによってキメラを作製することである。したがって、Ｇβサブユニット及びＧγサブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができる本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットが開発されると、その変異体ＧαサブユニットがＧαサブユニットの特定のファミリーまたはタイプ（例えば、Ｇαｓ）の変異体である場合、変異体Ｇαサブユニットの特異性を異なるファミリーまたはタイプ（例えば、Ｇαｑ）の特異性にさらに変換するように変異体Ｇαサブユニットを変異させることが望ましい場合がある。かかるキメラの例は、実施例５及び添付の図面に提供され、本発明の範囲内に含まれる。実施例５で特定されるＧｓからＧｑへの特異性の変化を与える変異のうちのいずれかが、本明細書に記載のｍｉｎｉ−Ｇαｓタンパク質のうちのいずれかとの関連で作製され得ることが理解される。
【０１０４】
一般に、変異体Ｇαサブユニットは、その親Ｇαサブユニットと比較して、少なくとも１つの変異（すなわち、欠失、置換、または挿入）、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の変異を有する。典型的には、変異体Ｇαサブユニットは、２５個以下、例えば、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、または１５個以下の変異を有する。最も典型的には、変異体Ｇαは、５〜１５個の変異、例えば、５〜１０個の変異（例えば、５〜９個の変異または５〜８個の変異）を有する。
【０１０５】
一実施形態では、変異体Ｇαサブユニットは、１つまたは２つの欠失、及び少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸置換を含む。典型的には、変異体Ｇαサブユニットは、１０個以上のアミノ酸置換を含まない。
【０１０６】
好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、３つの欠失（例えば、Ｎ末端欠失、ヘリカルドメイン内の欠失、及びスイッチＩＩＩ領域欠失）を含むが、より少ないまたはより多い欠失が行われ得ることが理解される（例えば、スイッチＩＩＩ領域内の１つのみの欠失に加えて、ヘリカルドメイン内の少なくとも１つのヘリックスの欠失）。
【０１０７】
親Ｇαサブユニットは、天然に存在するタンパク質である必要はない。好都合には、それは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の好適な宿主生物で発現することができる操作されたバージョンであり得る。例えば、親Ｇαサブユニットは、天然に存在するタンパク質の切断形態（いずれかの末端または両方の末端で切断されたもの）であり得るか、またはそれは、天然に存在するタンパク質またはその断片への融合物であり得る。あるいは、または加えて、親Ｇαは、天然に存在するＧαと比較して、例えば、溶解性、タンパク質分解安定性を改善するために修飾され得る（例えば、切断、ループの欠失、グリコシル化部位の変異、またはシステイン等の反応性アミノ酸側鎖の変異によって）。いずれの場合も、親Ｇαは、天然に存在するＧαに結合することで知られている１つ以上のＧＰＣＲに結合することができるタンパク質である。したがって、変異体Ｇαサブユニットも親Ｇαサブユニットもいずれも、同じＧＰＣＲ（複数可）に結合すべきである。親Ｇαサブユニットが１つよりも多くのＧＰＣＲに結合することで知られている場合、変異体Ｇαサブユニットが、親Ｇαサブユニットと同等の広がり及び／または順位の親和性を有する複数のＧＰＣＲに結合することができることが好ましい。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、親Ｇαサブユニットと同じβサブユニット（複数可）及びγサブユニット（複数可）にも結合すべきである。変異体Ｇαサブユニットが親Ｇαサブユニットと同じ下流エフェクター（複数可）に結合することも好ましい。しかしながら、変異体Ｇαサブユニットが、上述のようなキメラの状況でその親Ｇαサブユニットとは異なるＧＰＣＲに結合し得ることが理解される（例えば、親Ｇαサブユニットの特異性が所望のＧタンパク質の特異性に変換された場合）。同様に、変異体Ｇαタンパク質は、親Ｇαサブユニットとは異なる下流エフェクターに結合し得る。
【０１０８】
好都合には、変異体Ｇαサブユニットは、好適な核酸分子によってコードされ、好適な宿主細胞内で発現される。変異体Ｇαサブユニットをコードする好適な核酸分子は、当該技術分野で周知の標準のクローニング技法、部位特異的変異誘発、及びＰＣＲを使用して作製され得る。好適な発現系としては、細菌または酵母における構成的発現系もしくは誘導性発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、及びレンチウイルス等のウイルス発現系、または昆虫もしくは哺乳類細胞における一過性トランスフェクションが挙げられる。好適な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ細胞が挙げられる。好適な動物宿主細胞としては、ＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０等が挙げられる。いくつかのＧαサブユニットが機能するために特定の脂質を必要とすることで知られている。その場合、脂質化反応を行う宿主細胞を選択することが望ましい。加えて、またはあるいは、その反応は、変異体Ｇαサブユニットの単離及び精製中に精製された成分を使用して行われ得る。したがって、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットが脂質化され得ることが理解される。例えば、Ｇαは、Ｇｌｙ２及びＣｙｓ３のパルミトイル基に共有結合していることで知られており、よって、変異体Ｇαサブユニットは、パルミトイル基によって脂質化され得る。これは、液晶相における結晶化、またはＧαサブユニットが全細胞アッセイで研究される場合に望ましくあり得る。しかしながら、他の実施形態では、本発明の第１の態様の変異体Ｇαサブユニットは脂質化されず、これは、洗剤溶液の構造研究、薬物スクリーニング、結合研究（例えば、表面プラモン共鳴）等に好ましい場合がある。
【０１０９】
参照により本明細書に組み込まれる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（ｅｄｓ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに例証される、遺伝子及びｃＤＮＡをクローニング及び操作し、かつ宿主細胞内でポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための分子生物学的方法は、当該技術分野で周知である。
【０１１０】
好都合には、本発明の変異体Ｇαサブユニットは、親和性タグ（例えば、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ）、または直接検出可能な標識（フルオロフォア、放射性同位体、造影剤、もしくは発光標識等）、または間接的に検出可能な標識（酵素、酵素基質、抗体、抗体断片、抗原、ハプテン、リガンド、親和性分子、発色基質、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、及び脂質等）等の検出可能な部分を含む。検出可能な標識の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられ、よって、本発明がＧＦＰと本発明の変異体Ｇαサブユニットとの間に融合タンパク質を含むことが理解される。かかる融合タンパク質の例は、実施例５及び図３６に記載されている。変異体Ｇαサブユニットが、例えば、精製中の検出可能な部分の除去を可能にするために、切断部位を含み得ることが理解される。当該技術分野で既知の任意の好適な切断部位が使用され得る。一例には、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位がある。
【０１１１】
本発明の第２の態様は、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質アルファ（Ｇα）サブユニットの変異体を提供し、この変異体は、（ｉ）ヘテロ三量体Ｇタンパク質ベータ（Ｇβ）サブユニット及びヘテロ三量体Ｇタンパク質ガンマ（Ｇγ）サブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができ、（ｉｉ）図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｖａｌ  ３６、Ｈｉｓ  ４１、Ａｌａ  ４８、Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｍｅｔ  ６０、Ｌｅｕ  ６３、Ｌｅｕ  １９７、Ｃｙｓ  ２００、Ａｒｇ  ２０１、Ｐｈｅ  ２０８、Ａｓｎ  ２１８、Ｇｌｙ  ２２６、Ｇｌｕ  ２３０、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、及びＶａｌ  ３７５のうちのいずれか１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個）に対応する位置に異なるアミノ酸を有する。
【０１１２】
本発明の第２の態様の変異体Ｇαサブユニットに存在し得る追加の変異の選好には、前記第１の態様との関連で上述されるものが含まれる。
【０１１３】
したがって、変異体Ｇαサブユニットは、本発明の第１の態様との関連で上述されるヘリカルドメイン、スイッチＩ領域、スイッチＩＩ領域、及びスイッチＩＩＩ領域の１つ以上の欠失をさらに含み得る。
【０１１４】
変異（例えば、欠失、挿入、及び置換）の数の選好も、本発明の第１の態様との関連で上に定義される通りである。これらの変異体Ｇαサブユニットは、１つの欠失のみを含み得る（例えば、スイッチＩＩＩ領域に）。
【０１１５】
例えば、変異体Ｇαサブユニットは、５〜２０または５〜２５アミノ酸残基長のＮ末端切断、スイッチＩＩＩ領域の欠失、及び図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｈｉｓ  ４１、Ｌｅｕ  １９７、Ｃｙｓ  ２００、Ａｌａ  ２４９、及びＬｅｕ  ２７２のうちのいずれか１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、または５）に対応する位置に異なるアミノ酸を有し得、親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスも欠失している。
【０１１６】
変異体Ｇαサブユニットの特に好ましいＮ末端切断は、図２９に示されるアミノ酸残基Ｉｌｅ／ＬｅｕＨＮ４３のＮ末端のアミノ酸残基が全て欠失しているものである。例えば、変異体Ｇαサブユニットが変異体Ｇαｓサブユニットである場合、これは、図２９に示されるヒトＧαｓの番号付けに従うヒトＧαｓの最初の２５個のアミノ酸に対応する最初の２５個のアミノ酸の欠失に対応する。
【０１１７】
別の例では、変異体Ｇαサブユニットは、５〜２０または５〜２５アミノ酸残基長、スイッチＩＩＩ領域の欠失、及び図１に記載のヒトＧα−ｓサブユニットの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：  Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ｌｅｕ  ６３、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、及びＶａｌ  ３７５のうちのいずれか１つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８個）に対応する位置に異なるアミノ酸を有し得、任意に、親Ｇαサブユニットのヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスも欠失している。例えば、変異体Ｇαサブユニットは、図１に記載のヒトＧα  ｓの長いアイソフォームの番号付けに従う以下の位置：Ｇｌｙ  ４９、Ｇｌｕ  ５０、Ａｌａ  ２４９、Ｓｅｒ  ２５２、Ｌｅｕ  ２７２、Ｉｌｅ  ３７２、及びＶａｌ  ３７５のうちのいずれかに異なるアミノ酸を有し得る。
【０１１８】
本発明の第２の態様の変異体Ｇαサブユニットは、本発明の第１の態様との関連で上述されるように、１つ以上の優性陰性変異及び／またはＧαタンパク質とＧＰＣＲとの間の親和性を増加させることで知られている１つ以上の変異も含み得る。
【０１１９】
実施例に示されるように、本発明人は、それらの親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で増加した安定性を有する変異体Ｇαサブユニットを特定した。したがって、本発明が、変異体Ｇαが安定化条件に曝露されることを特徴とする、本発明の第１または第２の態様の変異体Ｇαサブユニットを含む組成物の産生を可能にすることも理解される。かかる組成物は、様々な用途、例えば、結晶化、薬物スクリーニング、バイオアッセイ、及びバイオセンサー用途を有する。したがって、本発明は、変異体Ｇαが変異体Ｇαサブユニットよりも高い程度まで親Ｇαを不安定化するのに有効な安定化条件に曝露されることを特徴とする、本発明の第１または第２の態様の変異体Ｇαサブユニットを含む組成物も提供する。
【０１２０】
「不安定化条件」とは、Ｇαタンパク質集団の平衡を細胞内の折り畳まれた天然の状態から折り畳まれていない状態にシフトすることができる任意の条件を意味する。このようにして、折り畳まれていない状態で存在するＧαタンパク質の割合が増加し、細胞内の折り畳まれた天然の状態で存在する割合が減少する。折り畳まれた状態から折り畳まれていない状態へのこの構造変化は、Ｇαタンパク質集団の構造の検出可能な変化をもたらす。さらに、この構造変化は、Ｇαタンパク質集団の生物学的活性の検出可能な減少をもたらし得る。したがって、一実施形態では、不安定化条件とは、不安定化条件の不在下でのＧαタンパク質集団の構造と比較して、Ｇαタンパク質集団の構造における著しい混乱をもたらすのに有効なものである。
【０１２１】
「Ｇαサブユニット集団の構造における著しい混乱」とは、混乱を検出するために使用される測定の統計的変動と比較して評価される場合、混乱が、１０回の測定で１回未満、より好ましくは２０回の測定で１回、さらにより好ましくは５０回の測定で１回または１００回の測定で１回偶然に起こるであろうことを意味する。
【０１２２】
タンパク質構造を探査する様々な方法が当該技術分野で既知であり、任意の好適な方法が使用され得る。例えば、構造的混乱は、例えば、共有結合した蛍光標識もしくはＥＳＲスピン標識で立体構造を直接探査することによって、またはタンパク質内での天然または意図的に導入されたアミノ酸側鎖の到達可能性を測定することによってアッセイされ得る（Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ．６３，２４３−２９０（２００３）、Ｂａｎｅｒｅｓ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２０２５３−２０２６０（２００５）、Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．ａｎｄ  Ｄｅｕｐｉ，Ｘ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２８，３９７−４０６（２００７））。タンパク質分解安定性、質量分析または核磁気共鳴分光法によって測定される重水素／水素交換、ブルーネイティブゲル、キャピラリーゾーン電気泳動、円偏光二色性（ＣＤ）または線二色性（ＬＤ）スペクトル、及び光散乱を使用して、二次構造及び三次構造の立体構造変化を測定することもできる。同様に、Ｇα活性を評価するための任意の好適な方法が、本発明の第１の態様との関連で上述されるように使用され得る。
【０１２３】
本発明の第３の態様は、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得るか、またはＲＮＡであり得る。典型的には、それは、前記変異体Ｇαサブユニットを発現するために使用され得るベクター等のベクターに含まれる。好適なベクターは、細菌細胞または哺乳類細胞または昆虫細胞内での発現を伝播及び／または可能にするものである。本発明は、変異体Ｇαサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む細菌細胞または真核細胞等の宿主細胞等の細胞も含む。好適な細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。
【０１２４】
本発明の変異体Ｇαサブユニットをコードするポリヌクレオチドの例は、図２６に提供されており、配列番号４６〜９０に列記されるポリヌクレオチド配列を有する。したがって、一実施形態では、本発明の第３の態様のポリヌクレオチドは、配列番号４６〜９０のうちのいずれかのポリヌクレオチド配列と少なくとも２０％の配列同一性、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号４６〜９０のうちのいずれかのポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
本発明の第４の態様は、（ｉ）ＧＰＣＲに結合することができる本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたはその一部、及び（ｉｉ）本発明の第１または第２の態様の変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲまたはその一部を含む複合体を提供する。
【０１２６】
変異体Ｇαサブユニットの選好には、本発明の第１及び第２の態様について上述されるものが含まれる。変異体Ｇαサブユニットが、配列番号１〜４５のうちのいずれかのアミノ酸と少なくとも２０％の配列同一性、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するものであることが好ましい。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、配列番号１〜４５に対応する図２６のアミノ酸配列のうちのいずれかを含むものである。変異体Ｇαサブユニットが、図２９、３５、３６、３７、３８、及び４０のうちのいずれかにおけるアミノ酸配列のうちのいずれかと少なくとも２０％の配列同一性、例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するものであることが好ましい。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットは、図２９、３５、３６、３７、３８、及び４０のうちのいずれかにおけるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含むものである。
【０１２７】
複合体が、上述のようにＧＰＣＲに機能的に結合することができるもの等のＧＰＣＲに結合することができる変異体Ｇαサブユニットの一部を含み得ることが理解される。ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の結合の評価は、当該技術分野で標準の慣行であり、上述の方法を含む。一般に、この一部は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、または３００アミノ酸長である。
【０１２８】
ＧＰＣＲとは、ＧＰＣＲスーパーファミリー内の７つ全てのＴＭＲを意味する。本発明の実施における使用に好適なＧＰＣＲとしては、アデノシン受容体、具体的には、アデノシンＡ２Ａ受容体（遺伝子名：  ＡＤＯＲＡ２Ａ）、ムスカリン受容体、セロトニン受容体（例えば、５ＨＴ２Ｃ、遺伝子名：ＨＴＲ２Ｃ）、β−アドレナリン受容体（例えば、βＡＲ−１、遺伝子名：  ＡＤＲＢ１）、ニューロテンシン受容体（ＮＴＳ１、遺伝子名：  ＮＴＳＲ１）、及びオレキシン受容体（例えば、ＯＸ２、遺伝子名：  ＨＴＲ２Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙは、ＧＰＣＲのリストを作成している（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８、このリストは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｐｈａｒ−ｄｂ．ｏｒｇ／ＧＰＣＲ／ＲｅｃｅｐｔｏｒＦａｍｉｌｉｅｓＦｏｒｗａｒｄで定期的に更新される）。ヒトにおける８００個を超えるＧＰＣＲが主にそれらのアミノ酸配列類似性に基づいて異なるクラス、例えば、クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、例えば、ロドプシン様受容体（クラスＡ）、セクレチン受容体（クラスＢ）、代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体（クラスＣ）、及びフリズルド／スムーズンド受容体（クラスＦ）に分けられることに留意されたい（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６３：  １２５６−１２７２）。ＧＰＣＲは、それらが結合する天然リガンドを参照することによりファミリーにも分けられる。全てのＧＰＣＲ、具体的には、Ｇタンパク質に共役することで知られているＧＰＣＲが、本発明の範囲内に含まれる。したがって、ＧＰＣＲは、アデノシン受容体、β−アドレナリン受容体、ニューロテンシン受容体、ムスカリン酸受容体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体、アドレナリン受容体、アナフィラトキシン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、遊離脂肪酸受容体、胆汁酸受容体、ガラニン受容体、モチリン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ＧｎＲＨ受容体、ヒスタミン受容体、ＫｉＳＳ１由来ペプチド受容体、ロイコトリエン及びリポキシン受容体、リゾリン脂質受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、ニューロメジンＵ受容体、神経ペプチド受容体、Ｎ−ホルミルペプチドファミリー受容体、ニコチン酸受容体、オピオド受容体、オプシン様受容体、オレキシン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、ペプチドＰ５１８受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、レラキシン受容体、ソマトスタチン受容体、ＳＰＣ／ＬＰＣ受容体、タキキニン受容体、トレースアミノ受容体、サイロトロピン放出ホルモン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシン／オキシトシン受容体、オーファンＧＰＣＲ、カルシトニン受容体、コルチコ��ロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体（例えば、グルカゴン様ペプチド１受容体、ＧＬＰ１Ｒ）、副甲状腺受容体、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体、ＬＮＢ７ＴＭ受容体、ＧＡＢＡ受容体、代謝型グルタミン酸受容体、及びカルシウムセンサー受容体のうちのいずれかであり得る（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８の表１を参照のこと）。
【０１２９】
複合体が、上述のようにＧαサブユニットに機能的に結合することができるもの等の変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲの一部を含み得ることが理解される。この一部は、ＧＰＣＲの膜貫通部分のみを含み得る。一般に、この一部は、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、または３００アミノ酸長である。
【０１３０】
多くのＧＰＣＲのアミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを参照することにより容易に入手可能である。具体的には、Ｆｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（上記参照）は、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ）からのヒト遺伝子記号、ならびにヒト、マウス、及びラット遺伝子ＩＤを提供する。ヒトゲノムの配列が実質的に完全であるため、ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列がそれから推定され得ることにも留意されたい。
【０１３１】
ＧＰＣＲが任意の源に由来し得るが、ＧＰＣＲが真核生物源由来であることが特に好ましい。ＧＰＣＲが哺乳動物または鳥等の脊椎動物源に由来することが特に好ましい。ＧＰＣＲが、ラット、マウス、ウサギ、もしくはイヌ、または非ヒト霊長類もしくは人類、またはニワトリもしくはシチメンチョウに由来することが特に好ましい。誤解を避けるために、「〜に由来する」とは、ｃＤＮＡまたは遺伝子が源由来の遺伝子材料を使用して元来得られたものであるが、そのタンパク質が、その後に任意の宿主細胞内で発現され得ることを意味する。したがって、真核生物ＧＰＣＲ（鳥または哺乳類ＧＰＣＲ等）がＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物宿主細胞内で発現され得るが、場合によっては、鳥または哺乳類に由来すると考えられ得ることが明白である。
【０１３２】
いくつかの事例では、ＧＰＣＲは、１つより多くの異なるサブユニットから成り得る。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体は、その生理学的リガンド結合特性を得るために、単一膜貫通ヘリックタンパク質（ＲＡＭＰ１）を必要とする。ＧＰＣＲと組み合わせて機能的複合体を形成または調節するエフェクタータンパク質、付属タンパク質、補助タンパク質、またはＧＰＣＲ相互作用タンパク質は、当該技術分野で周知であり、例えば、受容体キナーゼ、Ｇタンパク質、及びアレスチンが含まれる（Ｂｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ７，  ６４９−６５７）。
【０１３３】
上述のように、ＧＰＣＲは、アゴニスト及びアンタゴニスト等のリガンドの異なる薬理学的クラスに関連する複数の別個の立体構造で存在し、かつ機能するためにこれらの立体構造間をサイクルすると考えられている（Ｋｅｎａｋｉｎ  Ｔ．（１９９７）Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１２，１１６−１２５）。したがって、一実施形態では、ＧＰＣＲは、アゴニスト立体構造またはアンタゴニスト立体構造等の特定の立体構造状態で存在するものである。例えば、ＧＰＣＲは、変性条件下での同じ特定の立体構造におけるその親ＧＰＣＲの安定性と比較して、変性条件下での特定の立体構造（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト立体構造）における増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲであり得る。かかる安定化変異体ＧＰＣＲの例、及びそれらを作製するための方法は、当該技術分野で周知であり、ＷＯ２００８／１１４０２０、ＷＯ２００９／０７１９１４、ＷＯ２００９／０８１１３６、及びＷＯ２０１０／１４９９６４で言及されている。さらに、またはあるいは、変異体Ｇαサブユニットと特定の立体構造におけるＧＰＣＲとの間の複合体の形成を容易にするために、ＧＰＣＲは、その立体構造を安定化することで知られている薬剤に曝露され得る。アゴニスト立体構造を安定化する薬剤の例としては、ナノボディ等の本発明の第１の態様との関連で上述されるものが挙げられる。
【０１３４】
本発明の第１または第２の態様の変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲと複合体を形成し、ＧＰＣＲがそのＧタンパク質結合状態を採用し、これは、ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス６の細胞質末端が受容体のコアから１０Å以上、例えば、少なくとも１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、または１６Å離れて移動するものであることが理解される。
【０１３５】
変異体ＧαサブユニットまたはＧＰＣＲの一方もしくは他方またはその一部を検出可能に標識して、それらの結合の検出を容易にすることが好都合であり得ることが理解される。好適な標識の例としては、ペプチド標識、核酸標識（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）ＪＡＣＳ  ｖｏｌ．１１５，ｐ．２５２９−２５３１、及びＢｒｅｎｎｅｒ  ＆  Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．８９，ｐ．５３８１−５３８３）、化学標識（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９０，ｐ．１０９２２２−１０９２６、及びＭａｃｌｅａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４，ｐ．２８０５−２８１０）、蛍光標識（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ＆  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），ＷＯ９５／３２４２５（１９９５）、及びＳｅｂｅｓｔｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．２２ｎｄ  １９９２，ｐ．６３−６４）、または無線周波数タグ（Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．ｖｏｌ．３４，ｐ．２２８９−２２９１、及びＭｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）ＪＡＣＳ  ｖｏｌ．１１７，ｐ．１０７８７−１０７８８）が挙げられる。本発明の第１の態様にとの関連で上述される検出可能な部分のうちのいずれかも使用され得る。
【０１３６】
リガンド結合ポケットのマッピングがＧＰＣＲ活性を調節するための薬物の設計に著しく重要であることを考慮して、複合体がＧＰＣＲリガンドをさらに含むことが望ましい場合がある。リガンドを含むことにより、アゴニスト立体構造またはアンタゴニスト立体構造等のＧＰＣＲの特定の立体構造を安定化する助けにもなる。
【０１３７】
典型的には、リガンドは、完全アゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することができ、例えば、Ｇタンパク質共役、下流シグナル伝達事象、または血管拡張等の生理学的出力によって測定される、完全な（１００％の）生物学的応答を誘発することができる。リガンドは、部分アゴニストでもあり得、ＧＰＣＲに結合することができ、部分的な（１００％未満の）生物学的応答を誘発することができる。
【０１３８】
リガンドは、逆アゴニストでもあり得、これは、受容体に結合し、かつその基礎（すなわち、アゴニストによって刺激されていない）活性を時にはゼロに低減する分子である。
【０１３９】
リガンドは、アンタゴニストでもあり得、これは、受容体に結合し、かつアゴニストの結合を阻止して、生物学的応答を防止する分子である。逆アゴニスト及び部分アゴニストは、ある特定のアッセイ条件下でアンタゴニストであり得る。
【０１４０】
上記のリガンドは、オルソステリックであり得、オルソステリックとは、それらが内因性アゴニストと同じ部位と組み合わさることを意味し、または、上記のリガンドは、アロステリックまたは異地性であり得、アロステリックまたは異地性とは、それらがオルソステリック部位とは別個の部位と組み合わさることを意味する。上記のリガンドは、同地性であり得、同地性とは、それらが同じ部位または重複部位で他のリガンド（複数可）と相互作用することを意味する。それらは、可逆的または不可逆的であり得る。
【０１４１】
本発明に使用するためのリガンドは、アロステリックモジュレーター、例えば、陽性アロステリックモジュレーター、ポテンシエーター、陰性アロステリックモジュレーター、及び阻害剤であり得る。それらは、それら自体でアゴニストもしくは逆アゴニストとして活性を有し得るか、またはそれらは、アゴニストもしくは逆アゴニストの存在下で活性を有し得、その場合、それらは、ＧＰＣＲに結合するためにかかる分子と組み合わせて使用される。
【０１４２】
参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｅｕｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５，５９７−６０６は、様々なクラスのリガンドについて説明している。
【０１４３】
リガンドは、小分子、タンパク質、ペプチド、タンパク質足場、核酸、イオン、炭水化物、または抗体のうちのいずれかであり得る。
【０１４４】
好ましくは、リガンドは、小有機または無機部分であるが、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。典型的には、リガンドが小有機または有機部分である場合、それは、１００〜１０００等の５０〜２０００、例えば、１００〜５００のＭｒを有する。
【０１４５】
典型的には、リガンドは、μＭ（マイクロモル）〜ｎＭの範囲等のｍＭ〜ｐＭのＫｄでＧＰＣＲに結合する。一般に、最も低いＫｄを有するリガンドが好ましい。
【０１４６】
小有機分子リガンドは、当該技術分野で周知であり、例えば、以下の実施例を参照されたい。他の小分子リガンドとしては、５ＨＴ１Ａ受容体で完全アゴニストである５ＨＴ、５ＨＴ１Ａ受容体で部分アゴニストであるエルトプラジン（Ｎｅｗｍａｎ−Ｔａｎｃｒｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｎｅｕｒｏｐｈａｍａｃｏｌｏｇｙ  ３６，４５１−４５９を参照のこと）、ドーパミンＤ２受容体逆アゴニストである（＋）−ブタクラモール及びスピペロン（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＆  Ｓｔｒａｎｇｅ（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４５，３４−４２を参照のこと）、ならびにＣＢ２の中性アンタゴニストであるＷＩＮ５５２１２−３（Ｓａｖｉｎａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４５，６３６−６４５）が挙げられる。
【０１４７】
リガンドは、ペプチド模倣薬、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはアプタマーであり得る。リガンドは、Ｎａ＋もしくはＺｎ２＋等のイオン、オレアミド等の脂質、またはヘパリン等の炭水化物であり得る。
【０１４８】
リガンドは、ＧＰＣＲに結合するポリペプチドであり得る。かかるポリペプチド（それにはオリゴペプチドが含まれる）は、典型的には、Ｍｒ５００〜Ｍｒ５０，０００であるが、より大きい場合がある。ポリペプチドは、天然に存在するＧＰＣＲ相互作用タンパク質もしくはＧＰＣＲと相互作用する他のタンパク質、またはその誘導体もしくは断片であり得るが、但し、それが特定の立体構造でＧＰＣＲに選択的に結合することを条件とする。ＧＰＣＲ相互作用タンパク質には、シグナル伝達に関連するもの及び輸送に関連するものが含まれ、これらは、多くの場合、ＧＰＣＲのＣ末端部分のＰＤＺドメインを介して作用する。
【０１４９】
ある特定のＧＰＣＲに結合することで知られているポリペプチドとしては、Ｇタンパク質、アレスチン、ＲＧＳタンパク質、Ｇタンパク質受容体キナーゼ、ＲＡＭＰ、１４−３−３タンパク質、ＮＳＦ、ペリプラキン、スピノフィリン、ＧＰＣＲキナーゼ、受容体チロシンキナーゼ、イオンチャネルまたはそのサブユニット、アンキリン、及びＳｈａｎｋｓまたはＨｏｍｅｒタンパク質が挙げられる。他のポリペプチドとしては、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１もしくはＮＲ２ａ、カルシオン、またはフィブロネクチンドメインフレームワークが挙げられる。ポリペプチドは、フィブリン−１等のＧＰＣＲの細胞外ドメインに結合するものであり得る。ポリペプチドは、ヘテロオリゴマーにおける選択されたＧＰＣＲに結合する別のＧＰＣＲであり得る。ＧＰＣＲでのタンパク質−タンパク質相互作用の概説は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｗｈｉｔｅ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２２，５１３−５１８、またはＢｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．７，６４９−６５７で見つけられる。
【０１５０】
ポリペプチドリガンドは、好都合には、ＧＰＣＲに結合する抗体であり得る。「抗体」という用語には、天然に存在する抗体、モノクローナル抗体、及びその断片が含まれる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子及びドメイン抗体（ｄＡｂ）等のそれらの結合特性の点で抗体と同様の操作された抗体及び分子も含む。ラクダ科抗体及び操作されたラクダ科抗体にも言及する。ＧＰＣＲに結合するかかる分子は、当該技術分野で既知であり、いずれの場合も、周知の技術を使用して作製され得る。好適な抗体としては、それらが立体構造エピトープを認識する傾向があるため、ＧＰＣＲに対する放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）で現在使用されているものが挙げられる。
【０１５１】
ポリペプチドは、モジュールフレームワークに基づく結合タンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、アルマジロ反復タンパク質、ロイシンに富んだタンパク質、テトラトリオペプチド反復タンパク質、または設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、またはリポカリンもしくはフィブロネクチンドメインに基づくタンパク質、またはヒトガンマ結晶もしくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリン足場でもあり得る。
【０１５２】
本発明の一実施形態では、リガンドは、Ｇタンパク質またはアレスチン融合タンパク質等のＧＰＣＲに共有結合している。いくつかのＧＰＣＲ（例えば、トロンビン受容体）がプロテアーゼによってＮ末端で切断され、新たなＮ末端がアゴニスト部位に結合する。したがって、かかるＧＰＣＲは、天然ＧＰＣＲ−リガンド融合物である。
【０１５３】
抗体または他の「普遍的な」結合ポリペプチド（多くの異なるＧＰＣＲに共役することで知られているＧタンパク質等）の使用が、天然リガンド及び小分子リガンドが知られていない「オーファン」ＧＰＣＲに特に有利であり得ることが理解される。
【０１５４】
本発明の第４の態様の一実施形態では、複合体は、Ｇタンパク質βサブユニットまたはＧタンパク質γサブユニットまたはＧタンパク質βγサブユニットをさらに含む。５つのβサブユニット（Ｇβ１、Ｇβ２、Ｇβ３、Ｇβ４、Ｇβ５）及び１２のγサブユニット（Ｇγ１、Ｇγ２、Ｇγ３、Ｇγ４、Ｇγ５、Ｇγ７、Ｇγ８、Ｇγ９、Ｇγ１０、Ｇγ１１、Ｇγ１２、Ｇγ１３）が存在し、これらは、１つのＧβサブユニットと１つのＧγサブユニットとの任意の組み合わせで潜在的に二量体化することができ、これらの二量体のうちのいずれかは、任意のＧαサブユニットに潜在的に結合し得る。
【０１５５】
特に異なるＧＰＣＲへの結合に関する好ましい組み合わせ（例えば、Ｇαｓβ１γ２が好ましくはβ２ＡＲに結合し、Ｇαｓβ２γ７またはＧαｓβ４γ５が好ましくはＡ２Ａに結合する）に関する報告が文献内に多数存在し、よって、所与のＧαまたはＧＰＣＲについて、当業者であれば、好ましいβ及び／またはγサブユニット結合パートナーを特定することができるであろう。Ｇタンパク質αサブユニットとβサブユニットとγサブユニットとの間の結合は、多くの場合、組織特異的発現または膜局在化等の他の要因によって制御される。インビボで、任意の組み合わせが可能である。多くのＧβサブユニット及びＧγサブユニットのアミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを参照することにより容易に入手可能である。
【０１５６】
一実施形態では、複合体は、ヌクレオチドをさらに含む。例えば、複合体は、ＧＤＰもしくはＧＴＰ等のグアニンヌクレオチド、またはキサンチンヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ＧＴＰγＳまたはＧｐｐＮｐ等の天然に存在するヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドの誘導体であり得る。したがって、複合体がヌクレオチド及びリガンドを含み得ることが理解される。マグネシウムイオンがヌクレオチド結合にとって重要であり得ることが周知であり、よって、さらなる実施形態では、複合体がマグネシウムイオンをさらに含む。例えば、複合体は、マグネシウムイオン及びヌクレオチドを含み得る。
【０１５７】
好都合には、複合体は、変異体Ｇαサブユニットまたはその一部を発現させ、ＧＰＣＲまたはその一部を別々に発現させ、発現後に複合体形成に適切な条件下でこれらの２つのタンパク質を一緒に添加することによって産生される。あるいは、細胞は、ＧＰＣＲ／変異体Ｇαサブユニットが細胞から回収され得るように、標準の分子生物学技法を使用して変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲを発現または過剰発現させるように操作され得る。したがって、本発明が、（ｉ）ＧＰＣＲに結合することができる本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたはその一部、及び（ｉｉ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲまたはその一部をコードすることができるポリヌクレオチドまたは発現ベクターも提供する。ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、（ｉ）及び（ｉｉ）を別個のポリペプチドとして発現させ得るか、または（ｉ）及び（ｉｉ）は、同じポリペプチド鎖の一部であり得、すなわち、（ｉ）及び（ｉｉ）は、融合ポリペプチドとして発現し得る。
【０１５８】
好ましくは、ＧＰＣＲ／変異体Ｇαサブユニット複合体は、可溶性である。典型的には、タンパク質は、Ｅ．Ｃｏｌｉまたは昆虫細胞で製造され、それらを、例えば、６つのＨｉｓタグでタグ付けし、ニッケルビーズを使用することによって精製されて、組換えタンパク質を単離する。例えば、典型的には、変異体Ｇαサブユニットは、Ｅ．Ｃｏｌｉで発現され、ＧＰＣＲは、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞で発現される。同様に、タンパク質の異なるエピトープタグ付けバージョンは、細胞で発現され、細胞から精製され得る。典型的には、ヌクレオチド、リガンド、及び／またはマグネシウムイオンのうちのいずれかが、単離または精製された複合体に添加され、ヌクレオチド、リガンド、及び／またはマグネシウムを複合体に結合することを可能にする条件下でインキュベートされる。
【０１５９】
実施例から明らかであるように、本発明の第４の態様の複合体は、結晶化を受け入れ、よって、本発明が本発明の第４の態様の複合体を結晶形態でも提供することが理解される。具体的には、実施例４は、Ｇタンパク質（ｍｉｎｉ−Ｇ４１４）結合アデノシンＡ２ａ受容体のそのアゴニスト（ＮＥＣＡ）結合形態での構造を説明し、よって、好ましい実施形態では、複合体は、アデノシンＡ２ａ及び変異体Ｇαサブユニット、ｍｉｎｉ−Ｇ４１４を含む結晶複合体である。
【０１６０】
本明細書に開示される変異体Ｇαサブユニット及び組成物は、結晶化研究に有用であり、創薬プログラムにおいて有用である。それらは、例えば、表面プラズモン共鳴または蛍光ベース技法による受容体／リガンド動力学的及び熱力学的パラメータの生物物理学測定に使用され得る。それらは、リガンド結合スクリーニングに使用され得、ハイスループットスクリーニングで、またはバイオセンサーチップとして使用するために固体表面に共役され得る。変異体Ｇαサブユニットまたは複合体を含むバイオセンサーチップを使用して、分子、具体的には、生体分子を検出することができる。かかる方法及び使用のさらなる詳細が以下に提供される。
【０１６１】
本発明は、可溶化形態（例えば、洗剤での水可溶化後）であり、かつ／または他のタンパク質を実質的に含まない、本発明の第１もしくは第２の態様の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う複合体を提供する。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットまたは複合体は、可溶化されると、それらの天然の折り畳まれた状態で留まるか、または天然の折り畳まれた状態で存在する変異体Ｇαサブユニットもしくはその変異体Ｇαサブユニットを含む複合体の集団の割合は、親Ｇαサブユニットまたはその親Ｇαサブユニットを含む複合体の集団の割合を超える。好ましくは、変異体Ｇαサブユニットまたは変異体Ｇαサブユニット／ＧＰＣＲを含む複合体は、その構造的完全性を維持し、機能的形態にある（例えば、リガンドまたはその天然結合パートナー（例えば、Ｇタンパク質またはＧＰＣＲ）に結合することができる）。
【０１６２】
本発明は、固体支持体に固定化される、本発明の第１もしくは第２の態様の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う複合体を提供する。同様に、本発明は、本発明の第１もしくは第２の態様に従う１つ以上の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う複合体が固定化される固体支持体を提供する。例えば、固体支持体は、変異体Ｇαサブユニット、または変異体Ｇα／ＧＰＣＲ複合体のアレイ（例えば、２個以上、例えば、５個以上、１０個以上、５０個以上、９６個以上、または１００個以上）を含み得る。アレイ内の変異体Ｇαサブユニット及び／またはＧＰＣＲの同一性は、同じであっても異なってもよい。かかる固体支持体は、結合スクリーニングに有用であり、バイオセンサーとしても有用である。
【０１６３】
本発明は、結晶化のための、本発明の第１もしくは第２の態様の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う複合体の使用を提供する。
【０１６４】
本発明は、創薬における、本発明の第１もしくは第２の態様の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う記載の複合体の使用を提供する。
【０１６５】
本発明は、リガンド結合スクリーニングまたはアッセイ開発における、本発明の第１もしくは第２の態様の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う複合体の使用を提供する。
【０１６６】
本発明は、バイオセンサーとしての、本発明の第１もしくは第２の態様の変異体Ｇαサブユニット、または本発明の第４の態様に従う複合体の使用を提供する。好ましい実施形態では、バイオセンサーは、インビボでリガンドレベルを測定するために使用され得るものである。
【０１６７】
本発明の第５の態様は、ＧＰＣＲ−Ｇαサブユニット複合体の結晶を生産する方法であって、
（ｉ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニット、ＧＰＣＲ、及び任意にＧＰＣＲリガンドを提供することと、
（ｉｉ）変異体Ｇαサブユニット、ＧＰＣＲ、及び任意にＧＰＣＲリガンドの複合体を形成することと、
（ｉｉｉ）複合体を結晶化して、結晶を形成することと、を含む、方法が提供される。
【０１６８】
変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲの選好には、本発明の第１、第２、及び第４の態様との関連で上述されるものが含まれる。ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）が、本発明の第４の態様に従う複合体を提供することを含み得ることが理解される。
【０１６９】
参照により本明細書に組み込まれる、「Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；ＩＳＢＮ：  ０−８７９６９−６１７−６）に概説されるもののうちのいずれか等の任意の好適な結晶化方法を使用して、融合タンパク質を結晶化することができる。好ましくは、結晶化は、実施例に概要される蒸気拡散方法を使用して行われる。
【０１７０】
好都合には、ＧＰＣＲは、特定の立体構造（例えば、アゴニスト立体構造）で変異体Ｇαサブユニットと複合して結晶化され、よって、本方法が、ＧＰＣＲを、適切なリガンド（アゴニストもしくはアンタゴニスト）等の所望の立体構造を安定化することで知られている薬剤または上述の他の薬剤（例えば、ナノボディ）と接触させることをさらに含み得ることが理解される。結晶を使用して、以下に記載されるように、例えば、Ｘ線結晶学を使用して、複合体の構造を解くことができる。
【０１７１】
本発明の第６の態様は、特定の立体構造（例えば、アゴニスト立体構造）におけるＧＰＣＲの構造を決定する方法であって、本発明の第４の態様の複合体を提供することと、複合体の構造を決定することと、を含む、方法を提供する。
【０１７２】
タンパク質の構造は、タンパク質の一次構造、二次構造、三次構造、及び該当する場合には四次構造を含む。本明細書で使用される構造を決定することとは、タンパク質の原子の配置または原子座標を決定することを意味し、これは、多くの場合、Ｘ線結晶学等の生物物理学的方法によって行われる。
【０１７３】
一実施形態では、ＧＰＣＲ−Ｇαサブユニット複合体は、結晶形態で提供され、複合体の結晶構造は、例えば、Ｘ線結晶学等の生物物理学的方法によって決定される。Ｘ線結晶学は、当該技術分野で周知である。簡潔に記載されるように、Ｘ線回折パターンは、Ｘ線を結晶から回折させることによって得られる。回折データを使用して、結晶を含む単位セルの電子密度マップを計算することができ、このマップは、単位セル内の原子の位置（すなわち、原子座標）を確立するために使用される。したがって、本方法は、結晶から原子座標を得ることをさらに含み得る。代替の実施形態では、複合体のＮＭＲ構造が決定される。なお代替の実施形態では、この構造は、低温電子顕微鏡法によって決定される。
【０１７４】
本発明の第７の態様は、親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの変異体を選択するための方法であって、この変異体が、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質のベータ及びガンマサブユニットの不在下でＧＰＣＲに結合することができ、本方法が、
（ａ）親ヘテロ三量体Ｇタンパク質のベータ及びガンマサブユニットの不在下で親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの１つ以上の変異体を提供することと、
（ｂ）ＧＰＣＲを提供することと、
（ｃ）前述のまたは各々の変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲに結合することができるかを決定し、ＧＰＣＲに結合することができる変異体を選択することと、を含む、方法を提供する。
【０１７５】
変異体Ｇαサブユニット、それらを作製する方法、及びＧＰＣＲの選好には、本発明の第１の態様との関連で上述されるものが含まれる。したがって、変異体は、欠失、挿入、及び置換から選択される１つ以上の変異を含むものである。典型的には、変異体Ｇαサブユニットは、ヘリカルドメインの少なくとも１つのヘリックスを欠く。好都合には、ＧＰＣＲは、変性条件下での同じ特定の立体構造におけるその親ＧＰＣＲの安定性と比較して、変性条件下での特定の立体構造における増加した安定性を有するものである。
【０１７６】
変異体ＧαサブユニットのＧＰＣＲへの結合を評価するための方法も、本発明の第１の態様との関連で上述されている。
【０１７７】
ステップ（ｃ）が、前述のまたは各々のＧαサブユニットがＧＰＣＲに機能的に結合する（または「共役する」）ことができるかを決定することと、ＧＰＣＲに結合することができる変異体を選択することとを含むことが好ましい。
【０１７８】
好都合には、ステップ（ｃ）は、前述のまたは各々の変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲへの結合時にＧＰＣＲのアゴニストに対する親和性を増加させるかを決定すること、または前述のまたは各々のＧαサブユニットがＧＰＣＲへの結合時に活性化されるかを決定することを含む。あるいは、ステップ（ｃ）は、前述のまたは各々の変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲへの結合時にＧＰＣＲのアンタゴニストに対する親和性を減少させるかを決定すること、または前述のまたは各々のＧαサブユニットがＧＰＣＲへの結合時に活性化されるかを決定することを含み得る。
【０１７９】
ステップ（ｃ）が、本発明の第１の態様との関連で上述されるように、変異体Ｇαサブユニット機能がＧＰＣＲに機能的に結合または共役するかを評価するためのアッセイ、すなわち、（ｉ）アゴニスト親和性シフトアッセイ、（ｉｉ）熱安定性アッセイ、（ｉｉｉ）蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）、（ｉｖ）蛍光ベースの飽和結合分析、及び（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のうちのいずれか１つ以上を含み得ることが理解される。
【０１８０】
本発明人は、本発明のいくつかの変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲを特定の立体構造で安定化することを見出し、かかる変異体を選択することが望ましい場合があることが理解される。したがって、本発明の第５の態様の方法は、前述のまたは各々の変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲへの結合時にＧＰＣＲの特定の立体構造（例えば、アゴニスト立体構造）を安定化することができるかを決定することと、そうすることができるかかる変異体を選択することとをさらに含み得る。特定の立体構造の安定性を試験するための好適な方法は、当該技術分野で周知であり、上述のもの及びＷＯ２００８／１１４０２０に記載のものを含む。簡潔には、変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲの複合体が変性条件（リガンドの存在または不在下）に供され得、変性条件に供された後の複合体中のＧＰＣＲがリガンドに結合することができる程度が評価される。
【０１８１】
一実施形態では、ステップ（ｃ）の前に、ＧＰＣＲは、特定の立体構造を安定化することができる薬剤に曝露される。好適な薬剤は。当該技術分野で既知であり、リガンド（例えばアゴニスト）または上述の他の薬剤（例えば、機能が天然アゴニストの機能を模倣する抗体、ナノボディ、もしくは他の薬剤）を含む。
【０１８２】
変異体Ｇαサブユニット及び／またはＧＰＣＲは、それらが構造的完全性を維持し、かつ機能形態である（例えば、Ｇαの場合にはＧＰＣＲ、またはＧＰＣＲの場合にはリガンドまたはＧタンパク質等のそれらのそれぞれの結合パートナーに結合することができる）可溶化形態で好都合に提供される。好適な洗剤（または他の両親媒性剤）及び緩衝系等の適切な可溶化系が使用され、これは、当業者によって特定のタンパク質に有効であるように選択され得る。使用され得る典型的な洗剤としては、例えば、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）またはＣＨＡＰＳまたはオクチルグルコシド（ＯＧ）または多くの他の物が挙げられる。ヘミコハク酸コレステロールまたはコレステロール自体またはヘプタン−１，２，３−トリオール等の他の化合物を含むことが好都合であり得る。グリセロールまたはプロリンまたはベタインの存在が有用であり得る。
【０１８３】
典型的には、変異体Ｇαサブユニット及び／またはＧＰＣＲは、（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳類細胞等のそれらが発現された宿主細胞由来の膜画分の）粗抽出物中に提供される。それらは、試料中に存在するタンパク質の典型的には少なくとも７５％、より典型的には少なくとも８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％を含む形態で提供され得る。言うまでもなく、それらが典型的には上で論じられるように可溶化されるため、それらは、通常、洗剤分子及び／または脂質分子に関連する。
【０１８４】
一実施形態では、本発明の第７の態様の方法は、変異体Ｇαサブユニットが、その親Ｇαサブユニットと比較して、変性条件下で増加した安定性を有するかを決定すること、及び／または細胞内で発現する場合、変異体Ｇαサブユニットがその親Ｇαサブユニットよりも高いレベルで発現するかを決定することをさらに含む。かかる変異体Ｇαサブユニットがより実験的に扱い易いため、その方法がかかる変異体を選択することが好ましい。安定性及び発現レベルを評価するための好適な方法は、上述及び実施例に記載される通りである。いくつかの変異体Ｇαサブユニットが、変性条件下でそれらの親Ｇαサブユニットよりも低いレベルで発現し、かつ／またはそれらの親Ｇαサブユニットよりも不安定であるが、それらがＧＰＣＲと複合体化されると、その複合体は、変性条件下で親Ｇαサブユニットを含む対応する複合体よりも安定していることに留意されたい。したがって、変異体Ｇαサブユニットがその親Ｇαサブユニットと比較して変性条件下で増加した安定性を有するかを決定することが、変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲと複合したときの前記安定性を決定することを含み得ることが理解される。
【０１８５】
本発明の第８の態様は、親ヘテロ三量体Ｇαサブユニットの変異体を産生するための方法であって、この変異体が、親ヘテロ三量体Ｇタンパク質のベータ及びガンマサブユニットの不在下でＧＰＣＲに共役することができ、本方法が、
（ａ）本発明の第７の態様の方法を実行することと、
（ｂ）増加した安定性のために選択された変異体Ｇαサブユニット（複数可）における変異（例えば、欠失、挿入、及び／または置換）の位置（複数可）を特定することと、
（ｃ）特定された位置のうちの１つ以上に変異（例えば、欠失、挿入、及び／または置換）を含む変異体Ｇαサブユニットを合成することと、を含む、方法を提供する。
【０１８６】
本発明は、本発明の第８の態様の方法によって得ることができる変異体Ｇαサブユニットを提供する。
【０１８７】
実施例に示されるように、本発明人は、本発明の変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲに結合しているときに、変異体ＧαサブユニットがＧＰＣＲの特定の立体構造を安定化することができることを見出した。したがって、本発明の第９の態様は、ＧＰＣＲを特定の立体構造で安定化する方法であって、
（ａ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニット及び標的ＧＰＣＲを提供することと、
（ｂ）変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲの複合体を形成することであって、ＧＰＣＲが、特定の立体構造で安定化される、形成することと、を含む、方法を提供する。
【０１８８】
変異体Ｇαサブユニットの選好には、本発明の第１または第２の態様について上述されるものが含まれる。標的ＧＰＣＲは、任意の好適なＧＰＣＲ、好ましくは、Ｇαサブユニットに結合することで知られているＧＰＣＲと同じＧＰＣＲクラスまたはファミリーのもの、最も好ましくは、Ｇαサブユニットに結合することで知られているものであり得る。適切なＧＰＣＲの例は、上述の通りである。
【０１８９】
好都合には、変異体Ｇαサブユニットは、固体支持体上に固定化される。
【０１９０】
典型的には、標的ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲを複数の立体構造状態で含有する溶液として提供される。したがって、本方法は、
（ｉ）複数の立体構造状態のＧＰＣＲを含有する溶液を、１つ以上の固定化された変異体Ｇαサブユニットを含む固体支持体に適用するステップと、
（ｉｉ）１つ以上の変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲの複合体を形成するステップと、
（ｉｉｉ）弱く結合した分子または非結合分子を除去するステップであって、ＧＰＣＲが特定の立体構造で捕捉される、除去するステップと、を含み得る。このようにして、本発明の第９の態様の方法が、ＧＰＣＲを特定の立体構造状態で捕捉する方法であると見なされ得ることが理解される。
【０１９１】
一実施形態では、本方法は、複合体を精製することをさらに含む。
【０１９２】
本発明の第１０の態様は、増加した安定性を有するＧＰＣＲを選択するための方法であって、
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ以上のの変異体、及び本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットを提供することと、
（ｂ）リガンドを選択することであって、ＧＰＣＲが特定の立体構造で存在する場合、リガンドが親ＧＰＣＲに結合するものである、選択することと、
（ｃ）前述のまたは各々の変異体ＧＰＣＲが、選択されたリガンドへの結合または変異体Ｇαサブユニットへの結合に関して親ＧＰＣＲの安定性と比較して、選択されたリガンドへの結合または変異体Ｇαサブユニットへの結合に関して増加した安定性を有するかを決定することと、
（ｄ）選択されたリガンドへの結合または変異体Ｇαサブユニットへの結合に関して親ＧＰＣＲと比較して増加した安定性を有する変異体を選択することであって、ステップ（ｃ）でＧＰＣＲが存在する特定の立体構造が、ステップ（ｂ）で選択されたリガンドのクラスに対応する、選択することと、を含む、方法を提供する。
【０１９３】
親ＧＰＣＲの変異体は、任意の好適な方法で産生され、任意の好適な形態で提供され得る。したがって、例えば、親タンパク質の全てまたは一部中の各アミノ酸残基が独立して別のアミノ酸残基に変化する親タンパク質の一連の特定の変異体が作製され得る。例えば、膜貫通になると予測されるタンパク質のそれらの部分に変異を作製することが好都合であり得る。したがって、好都合には、変異させるＧＰＣＲの部分はモデル化に基づき得る。同様に、疎水性に基づくＧＰＣＲの膜貫通領域をモデル化するコンピュータプログラムが利用可能であり（Ｋｙｌｅ  ＆  Ｄｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２）、変異させるタンパク質の部分を選択する際に、かかるモデルが使用され得る。従来の部位特異的変異誘発が用いられてもよく、または当該技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応に基づく手技が使用されてもよい。変異体タンパク質の選択時にリボソームディスプレイ法を使用することが可能であるが、あまり望ましくない。
【０１９４】
典型的には、各選択されたアミノ酸は、Ａｌａによって置換される（すなわち、Ａｌａスキャニング変異誘発）が、これは、任意の他のアミノ酸によって置換されてもよい。選択されたアミノ酸がＡｌａである場合、それは、Ｌｅｕによって好都合に置換されてもよい。あるいは、そのアミノ酸は、Ｇｌｙによって置換されてもよく（すなわち、Ｇｌｙスキャニング変異誘発）、これにより、タンパク質を特定の立体構造にロックする隣接するヘリックスのより密接な充填が可能になり得る。選択されたアミノ酸がＧｌｙである場合、それは、Ａｌａによって好都合に置換されてもよい。
【０１９５】
あるいは、変異体は、ランダム変異誘発手順によって産生され得、それらは、全タンパク質またはその選択された部分のものであり得る。ランダム変異誘発手順は、当該技術分野で周知である。
【０１９６】
好都合には、変異体ＧＰＣＲは、親タンパク質と比較して１つの置換アミノ酸を有する（すなわち、それは、１つのアミノ酸位置で変異している）。このようにして、単一のアミノ酸置換の安定性への寄与が評価され得る。しかしながら、安定性についてアッセイされる変異体ＧＰＣＲは、親タンパク質と比較して、少なくとも２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２個の置換等の１つより多くの置換アミノ酸を有し得る。
【０１９７】
親ＧＰＣＲは、天然に存在するタンパク質である必要はない。好都合には、それは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等の好適な宿主生物で発現することができる操作されたバージョンであり得る。親ＧＰＣＲは、天然に存在するタンパク質の切断形態（いずれかの末端または両方の末端で切断されたもの）であり得るか、またはそれは、天然に存在するタンパク質またはその断片への融合物であり得る。あるいは、または加えて、親ＧＰＣＲは、天然に存在するＧＰＣＲと比較して、例えば、溶解性、タンパク質分解安定性を改善するために修飾され得る（例えば、切断、ループの欠失、グリコシル化部位の変異、またはシステイン等の反応性アミノ酸側鎖の変異によって）。いずれの場合も、親ＧＰＣＲは、天然に存在するＧＰＣＲに結合することで知られているリガンドである選択されたリガンドに結合することができるタンパク質である。好都合には、親ＧＰＣＲは、適切なリガンドの付加について、Ｇタンパク質活性化の影響を受けることが一般に知られている下流活性のうちのいずれか１つ以上に影響を及ぼし得るものである。しかしながら、変異体の安定性が、安定性の増加を評価することができるように親と比較されることが理解される。
【０１９８】
典型的には、特定の立体構造は、アゴニスト立体構造であり、よって、選択されたリガンドは、アゴニストである。所与のＧＰＣＲのアゴニストリガンドの例は、当該技術分野で既知であり、上述及び実施例に記載されるものを含む。
【０１９９】
変異体Ｇαサブユニットに結合したときにＧＰＣＲが安定化されることを考慮して、特定の立体構造（例えば、アゴニスト立体構造）がＧタンパク質結合の立体構造特性を有する特定の立体構造（例えば、アゴニスト立体構造）であることが理解される。例えば、立体構造は、ＧＰＣＲの膜貫通ヘリックス６の細胞質末端が、受容体のコアから１０Å以上、例えば、少なくとも１１Å、１２Å、１３Å、１４Å、１５Å、または１６Å離れて移動するものであり得る。
【０２００】
変異体Ｇαサブユニット及び／または変異体ＧＰＣＲは、それらが構造的完全性を維持する可溶化形態で好都合に提供され、例えば、本発明の第７の態様との関連で上述される機能形態である。しかしながら、変異体ＧＰＣＲが膜含有組成物（すなわち、脂質膜中に存在する）中に提供され、選択されたリガンド及び変異体Ｇαサブユニットと接触し、その後、膜が、例えば、洗剤で可溶化され得ることが理解される。
【０２０１】
リガンドが選択されると、前述のまたは各々の変異体ＧＰＣＲが、そのリガンドまたは変異体Ｇαサブユニットへの結合に対する親ＧＰＣＲと比較して、選択されたリガンドへの結合に対する、または変異体Ｇαサブユニットへの結合に対する増加した安定性を有するかが決定される。このステップ（ｃ）が、前述のまたは各々の変異体ＧＰＣＲが選択されたリガンドによって決定される特定の立体構造について（その親と比較して）増加した安定性を有するかを決定するステップであることが理解される。したがって、変異体ＧＰＣＲは、リガンド結合によって測定される選択されたリガンドへの結合に対して、または変異体Ｇαサブユニットに結合している間に増加した安定性を有するか、または変異体Ｇαサブユニット結合によって測定される変異体Ｇαサブユニットへの結合に対して、または選択されたリガンドに結合している間に増加した安定性を有する。以下で論じられるように、選択されたリガンドに結合している間に増加した安定性が評価されることが特に好ましい。
【０２０２】
増加した安定性は、不安定性をもたらし得る強制条件（例えば、熱、過酷な洗剤条件、カオトロピック剤等）下で変異体の延長寿命によって好都合に測定される。強制条件下での不安定化は、典型的には、構造の変性または損失を測定することによって決定される。以下で論じられるように、これは、リガンド結合能力の損失、またはＧαサブユニット結合能力の損失、または二次もしくは三次構造指標の損失として現れ得る。
【０２０３】
選択されたリガンドへの結合が増加した安定性を決定するために使用される場合、変異体ＧＰＣＲの安定性を決定するために使用され得る異なるアッセイ形式が存在する。
【０２０４】
一実施形態では、変異体ＧＰＣＲは、変異体の安定性が決定される手順に供される前に、リガンドと接触させられ得る（試験期間中、変異体ＧＰＣＲ及びリガンドは接触したままである）。したがって、例えば、この方法を使用して、１つの立体構造でリガンドに結合し、かつ改善された熱安定性を有する変異体ＧＰＣＲを選択する場合、受容体は、加熱される前にリガンドと接触させられ、その後、親受容体と比較した加熱後の受容体に結合したリガンドの量を使用して、熱安定性を表現することができる。これは、変性条件（例えば、熱）への曝露後にリガンド結合能力を保持するＧＰＣＲの量の尺度を提供し、それは、言い換えると、安定性の指標である。
【０２０５】
代替の（あまり好ましくない）実施形態では、変異体ＧＰＣＲは、変異体の安定性がリガンドと接触する前に決定される手順に供される。したがって、例えば、この方法を使用して、１つの立体構造でリガンドに結合し、かつ改善された熱安定性を有する変異膜受容体を選択する場合、受容体は、リガンドと接触させられる前に最初に加熱され、その後、受容体に結合したリガンドの量を使用して、熱安定性を表現することができる。この場合も同様に、これは、変性条件への曝露後にリガンド結合能力を保持するＧＰＣＲの量の尺度を提供する。
【０２０６】
変異体Ｇαサブユニットへの結合を使用して、増加した安定性を決定するために、変異体ＧＰＣＲ及び変異体Ｇαサブユニットは、変異体の安定性が決定される手順に供される前に、リガンドと接触させられ得ることが理解される（試験期間中、変異体ＧＰＣＲ及びリガンドは接触したままである）。
【０２０７】
全ての実施形態では、変異体の安定性の比較が、同じ条件下で親分子を参照することによって行われることが理解される。
【０２０８】
これらの全て実施形態では、選択された変異体が、親タンパク質と比較して、特定の立体構造で存在するときに増加した安定性を有するものであることが理解される。本発明の第１０の方法の方法の例は、実施例４に提供される。
【０２０９】
好ましくは、熱、洗剤、カオトロピック剤、及び極度のｐＨのうちのいずれか１つ以上等の変性条件下で増加した安定性を有する変異体ＧＰＣＲが選択される。
【０２１０】
変性条件下での安定性を評価するための方法としては、本発明の第１の態様との関連で上述されるものが挙げられ、ＷＯ２００８／１１４０２０にも記載されている。
【０２１１】
好都合には、リガンドまたは変異体Ｇαサブユニット結合がＧＰＣＲをアッセイするために使用される（すなわち、非変性状態であるかを決定するために使用される）場合、リガンドまたは変異体Ｇαサブユニットは、検出可能に標識されている、例えば、放射標識または蛍光標識されている。
【０２１２】
上記から、本発明が、増加した熱安定性を有する変異体ＧＰＣＲを選択するための方法であって、（ａ）親ＧＰＣＲの１つ以上の変異体を提供することであって、１つ以上の変異体が膜含有組成物中に存在する、提供することと、（ｂ）１つ以上の変異体を、親ＧＰＣＲに結合する選択されたリガンド（例えば、アゴニスト）及び本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットと接触させることと、（ｃ）膜含有組成物を可溶化することと、（ｄ）親ＧＰＣＲと比較して、特定の温度で特定の時間後に、変異体ＧＰＣＲが選択された前記リガンド（例えば、アゴニスト）または変異体Ｇαサブユニットに結合する能力を測定することによって、親ＧＰＣＲの前述のまたは各々の変異体が前記リガンド（例えば、アゴニスト）の存在下にあるときに増加した熱安定性を有するかを決定することと、（ｄ）前記特定の温度で前記特定の時間後に、同じ条件下で親ＧＰＣＲよりも多くの選択された前記リガンド（例えば、アゴニスト）に結合する変異体ＧＰＣＲを選択することと、を含む、方法を含むことが理解される。ステップ（ｄ）で、前記特定の温度での固定期間は、典型的には、選択された前記リガンド（例えば、アゴニスト）または変異体Ｇαサブユニットに結合する変異体ＧＰＣＲの能力を測定する際に使用される。ステップ（ｄ）で、典型的には、親ＧＰＣＲによる選択されたリガンド（例えば、アゴニスト）または変異体Ｇαサブユニットの結合が、その温度（受容体の５０％が不活性化されることを示す、「準」Ｔｍ）でその固定期間中、５０％低減される温度及び時間が選択される。
【０２１３】
本発明の第４の態様に従うＧＰＣＲ／Ｇαサブユニット複合体を安定化するさらなる薬剤を特定することが望ましい場合があることが理解される。したがって、本方法は、変性条件下で本発明の第４の態様に従う複合体の安定性を増加させる１つ以上の薬剤を特定する方法であって、本発明の第４の態様に従う複合体を提供することと、この複合体を候補薬剤と接触させることと、変性条件下で本発明の第４の態様に従う複合体の安定性への候補薬剤の影響を決定することと、を含む、方法も提供する。候補薬剤は、ヌクレオチド、リン酸類似体、またはマグネシウムイオンを含み得る。
【０２１４】
本発明の第１１の態様は、変異体ＧＰＣＲを調製するための方法であって、
（ａ）本発明の第１０の態様の方法を実行することと、
（ｂ）増加した安定性のために選択された変異ＧＰＣＲ（複数可）における変異アミノ酸残基（複数可）の位置（複数可）を特定することと、
（ｃ）特定された位置のうちの１つ以上に置換アミノ酸を含む変異体ＧＰＣＲを合成することと、を含む、方法を提供する。
【０２１５】
本発明は、本発明の第１１の態様の方法によって得ることができる変異体ＧＰＣＲを提供する。
【０２１６】
ＭＥＧＡドメインは、構造的方法及び非構造的方法の両方を使用する断片ライブラリスクリーニングのための有益なツールでもあり得る。したがって、本発明の第１２の態様は、ＧＰＣＲの結合パートナーを特定する方法であって、
ａ）本発明の第４の態様に従う複合体を提供することと、
ｂ）１つ以上の試験化合物を提供することと、
ｃ）前述のまたは各々の試験化合物が複合体に結合するかを決定することと、
ｄ）複合体に結合する１つ以上の試験化合物を単離することと、を含む、方法を提供する。
【０２１７】
本発明の第４の態様に従う複合体の選好には、上述のものが含まれる。
【０２１８】
三元Ｇタンパク質−ＧＰＣＲ複合体が形成されると、リガンドが複合体の解離を引き起こすことなく結合ポケットから除去され得ることを示唆する有力な証拠が存在し、ヌクレオチド不含ロドプシン−トランスデューシン複合体のヒドロキシルアミン処理がロドプシンとレチナールとの間のシッフ塩基結合の加水分解を引き起こし、レチナールオキシムの放出をもたらす１４。したがって、一実施形態では、ステップ（ａ）で提供される複合体は、ＧＰＣＲリガンドを含有しない。しかしながら、他の実施形態では、例えば、リガンド結合を調節することよりも他の結合パートナーを特定するために、リガンドを結合させることが有用であり得ることが理解される。
【０２１９】
一実施形態では、本複合体は、全細胞調製物もしくは細胞膜断片中に提供され得るか、洗剤中で可溶化され得るか、または脂質単層中、脂質二重層、ビーズ結合脂質粒子、別の固体支持脂質層、もしくはプロテオリポソーム中に組み込まれ得る。
【０２２０】
本発明人であれば、ハイスループット膜複合体スクリーニングが、アレイまたはさもなければ多重化され得るビーズまたは表面上に膜を固定化することによって促進されることを認識する。典型的には、膜複合体は、プロテオリポソームの形態で脂質と一緒に表面上に堆積する。本複合体の洗剤可溶化形態は、部分的に純粋または高度に純粋な調製物であり得る。改善された安定性及び可溶化条件の最適化によって可能になる精製は、例えば、ファージが粘着し得る外来性の「粘着性」抗原ならびに脂質及び炭水化物等の他の細胞表面材料を除去するという利点を持つ。
【０２２１】
本複合体のＧＰＣＲ及び／または変異体Ｇαサブユニットが、当該技術分野で周知のように、Ｃ末端またはＮ末端に分子タグを含むように操作され得ることが理解される。タグは、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＤＤＤＤＫタグ、ＨＳＶタグ、Ｈａｌｏタグ、またはビオチンタグのうちのいずれかであり得る。かかるタグを使用して、溶液中でのファージベースの選択プロトコルを容易にすることができ、かかるタグを使用して、結合を固体支持体に付与することもできる。
【０２２２】
様々な洗剤及び可溶化緩衝液及び添加物中での変異体Ｇαサブユニット及び／または変異体ＧＰＣＲの増加した安定性は、それらが固体表面上に固定化されるのに特に役立つ。したがって、一実施形態では、本複合体は、固体支持体上に固定化される。様々な支持体が当該技術分野で既知であり、例えば、ビーズ、カラム、スライド、チップ、またはプレートを含む。固定化は、共有結合性または非共有結合性相互作用によるものであり得る。
【０２２３】
ＧＰＣＲの結合パートナーについてスクリーニングするための様々な形式が、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０８１１３６に提供されており、任意のかかる形式が使用され得る。
【０２２４】
試験化合物は、生物学的試料として提供され得る。具体的には、試料は、個体から得られる任意の好適な試料であり得る。例えば、試料は、血液、血清、血漿、または髄液等の流体試料であり得る。あるいは、試料は、組織または細胞抽出物であり得る。
【０２２５】
一実施形態では、１つ以上の試験化合物は、ポリペプチドである。例えば、試験化合物は、ある特定のＧＰＣＲまたはＧαサブユニットに結合することで知られているが、立体構造特異的ポリペプチドの特定が所望される場合、特定のタイプのポリペプチドであり得る。あるいは、ポリペプチドは、候補治療分子、例えば、アンチカリンであり得る（Ｓｋｅｒｒａ  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００１）７４（４）：２５７−７５）。
【０２２６】
一実施形態では、１つ以上の試験化合物は、ペプチドである。
【０２２７】
一実施形態では、１つ以上の試験化合物は、アフィボディ、ペプチド模倣薬、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはアプタマー、または脂質もしくは炭水化物である。
【０２２８】
一実施形態では、１つ以上の試験化合物は、モジュールフレームワークに基づく結合タンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、アルマジロ反復タンパク質、ロイシンに富んだタンパク質、テトラリオペプチド反復タンパク質、もしくは設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、またはリポカリンもしくはフィブロネクチンドメインに基づくタンパク質、またはヒトガンマ結晶もしくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリン足場である。
【０２２９】
一実施形態では、１つ以上の試験化合物は、小分子、例えば、５０００ダルトン未満の分子であるか、または１つ以上の試験化合物は、天然産物である。
【０２３０】
一実施形態では、１つ以上の試験化合物は、抗体である。例えば、試験化合物は、変異体Ｇαサブユニット、ＧＰＣＲ、または変異体Ｇαサブユニット／ＧＰＣＲ複合体に対して産生された抗体であり得る。
【０２３１】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリによって生産される断片が含まれるが、これらに限定されない。かかる断片には、標的物質に対するそれらの結合活性を保持する全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）、及びＦ（ａｂ’）２断片、ならびに抗体の遺伝子操作された誘導体、例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、及びダイアボディが含まれる。例えば、元の抗体の結合特異性を保持するさらなる抗体またはキメラ分子を産生するために組換えＤＮＡ技術が使用され得ることが理解される。かかる技術は、例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ、またはＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されるように、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域及びフレームワーク領域に融合することを含み得る。さらに、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、産生された抗体の結合特異性を変化させることができるか変化させることができない遺伝変異または他の変化に曝される場合がある。したがって、抗体がいくつかの方法で修飾され得るため、「抗体」という用語は、必要な特異性を有する結合ドメインを有する任意の特定の結合メンバーまたは物質を包含すると解釈されるべきである。したがって、この用語には、天然であるか、完全にまたは部分的に合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物、及び相同体が含まれる。したがって、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子、または別のポリペプチドに融合している等価物も含まれる。さらに、抗体及びその断片は、当該技術分野で周知のように、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。
【０２３２】
当該技術分野で既知の様々な手順を使用して、変異体Ｇαサブユニット、ＧＰＣＲ、もしくは変異体Ｇαサブユニット／ＧＰＣＲ複合体、またはそれらの断片もしくは融合物に対する抗体を産生することができる。例えば、インビボ免疫化及びインビトロ免疫化の両方が含まれる。
【０２３３】
いくつかの事例では、試験化合物のハスループットスクリーニングが好ましく、本方法が当業者に周知の用語である「ライブラリスクリーニング」法として使用され得ることが理解される。したがって、試験化合物は、試験化合物のライブラリであり得る。例えば、このライブラリは、例えば、リボソームディスプレイによって産生されたペプチドもしくはタンパク質ライブラリ、またはインビボ、エクスビボ、もしくはインビトロのいずれかで調製された抗体ライブラリであり得る。かかるライブラリを調製及びスクリーニングするための方法論は、当該技術分野で既知である。好都合には、本方法は、例えば、生物物理学的方法または結晶浸漬技法を使用して、断片ライブラリスクリーニングに使用される。
【０２３４】
本発明は、疾患または状態の治療に使用するための薬物またはリード化合物を特定するためのスクリーニング方法を含む。ハイスループット操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことが理解される。
【０２３５】
薬物スクリーニング方法であり得る本明細書に記載される方法では、当業者に周知の用語である試験化合物は、薬物様化合物または薬物様化合物の開発のためのリード化合物であり得ることが理解される。したがって、一実施形態では、本方法は、複合体に結合することが示されている試験化合物を修飾することと、修飾された試験化合物が複合体に結合するかを決定することとをさらに含む。
【０２３６】
例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光、酵母２ハイブリッド技術、及びファージディスプレイを含む様々な方法が、変異体Ｇαサブユニット／ＧＰＣＲ複合体と試験化合物との間の結合を決定するために使用され得る。試験化合物と本複合体との間の結合を検出する他の方法としては、イオン噴霧質量分析／ＨＰＬＣ法での限外濾過または他の物理的及び分析的方法が挙げられる。例えば、２つの蛍光標識実体の結合が、互いに近接近している場合に、蛍光標識の相互作用を測定することによって測定され得る当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴伝達（ＦＲＥＴ）法が使用され得る。さらなる方法が、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０８１１３６に記載されている。
【０２３７】
変異体Ｇα／ＧＰＣＲ複合体に対する高親和性特異的結合パートナーを生成する能力により、治療用結合パートナーの産生が促進される。したがって、本複合体への結合を確立することに加えて、本複合体への結合パートナーの機能的影響を決定することも望ましいことが理解される。したがって、本方法の一実施形態では、本方法は、結合パートナーが、それが結合する複合体の機能に影響を及ぼすかを決定することと、本複合体の機能に影響を及ぼす試験化合物を単離することとをさらに含む。
【０２３８】
例えば、一実施形態では、結合パートナーが本複合体中のＧＰＣＲのそのリガンドへの結合を変化させるかが決定される。例えば、結合パートナーは、正または負のアロステリックモジュレーターであり得る。
【０２３９】
別の実施形態では、結合パートナーがＧＰＣＲまたは変異体Ｇαサブユニットの活性化を調節するかが決定される。例えば、結合パートナーは、正または負のアロステリックモジュレーターであるＧＰＣＲリガンドであり得る。このアッセイでは、本複合体は、本複合体が周知のＧＰＣＲシグナル伝達経路に共役することが許可される場合に、全細胞、例えば、哺乳類または昆虫細胞内で発現され（Ｅｇｌｅｎ  Ｒ．ＭＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．２００５  Ｊｕｎ；８（４）：３１１−８）、かかる経路を通るシグナル伝達が評価される。かかるアッセイのさらなる詳細は、本発明の第１の態様との関連で上記に提供されている。
【０２４０】
一実施形態では、本方法は、
（ｉ）前述のまたは各々の試験化合物が本発明の第４の態様に従う異なる複合体に結合するかを決定することと、
（ｉｉ）本発明の第４の態様に従う異なる複合体に結合しない前述のまたは各々の試験化合物を単離することと、をさらに含む。
【０２４１】
このようにして、本方法が、特定のＧＰＣＲ−Ｇαサブユニット対の活性を調節するが、他のシグナル伝達カスケードにおいて受容体及びＧαサブユニットの両方を調節しない結合パートナーを特定するために使用され得ることが理解される。異なる複合体とは、本方法のステップ（ａ）で提供される複合体内に含まれるものと異なるＧαサブユニット（例えば、異なるクラスまたはアイソフォームのもの）及び／または異なるＧＰＣＲを含有する複合体を意味する。例えば、異なる複合体は、本発明の第１２の態様の方法のステップ（ａ）の複合体中のＧαサブユニットのクラスとは異なるクラスのＧαサブユニット及び／または本発明の第１２の態様の方法のステップ（ａ）の複合体中のＧＰＣＲとは異なるＧＰＣＲを含み得る。
【０２４２】
結合パートナーが結合し得る特定の界面の例は、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体のＡｒｇ１０２（３．５０）、Ａｌａ１０５（３．５３）、Ｉｌｅ１０６（３．５４）、Ａｒｇ１０７（３．５５）、Ｐｒｏ１０９、Ｌｅｕ１１０、Ａｒｇ１１１、Ｔｙｒ１１２、Ｉｌｅ２００（５．６１）、Ａｌａ２０３（５．６４）、Ｑ２０７（５．６７）、Ｌｅｕ２０８（５．６８）、Ｑ２１０（５．７０）、Ｌｙｓ２２７（６．２９）、Ａｌａ２３１（６．３３）、Ｌｅｕ２３５（６．３７）、Ａｒｇ２９１（７．５６）、Ｉｌｅ２９２（Ｈ７とＨ８との間のループ）、Ａｒｇ２９３（Ｈ８）、及びＡｒｇ２９６（Ｈ８）（括弧内はＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号）、ならびにヒトＧｓのＨｉｓ４１（ｓ１．２）、Ａｓｐ２１５（ｓ２ｓ３．１）、Ｖａｌ２１７（ｓ３．１）、Ｐｈｅ３７６（ｈ５．８）、Ｃｙｓ３７９（ｈ５．１１）、Ａｒｇ３８０（ｈ５．１２）、Ａｓｐ３８１（ｈ５１３）、Ｉｌｅ３８３（ｈ５．１５）、Ｇｌｎ３８４（ｈ５．１６）、Ａｒｇ３８５（ｈ５．１７）、Ｈｉｓ３８７（ｈ５．１９）、Ｌｅｕ３８８（ｈ５．２０）、Ｇｌｎ３９０（ｈ５．２２）、Ｔｙｒ３９１（ｈ５．２３）、Ｇｌｕ３９２（ｈ５．２４）、Ｌｅｕ３９３（ｈ５．２５）、Ｌｅｕ３９４（ｈ５．２６）を含む。Ｂ−Ｗ及びＣＧＮシステムを使用して、他のＧＰＣＲ及びＧαサブユニットにおける対応する残基が決定され得る。
【０２４３】
本発明の第１３の態様は、Ｇαサブユニットの結合パートナーを特定する方法であって、
ａ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットを提供することと、
ｂ）１つ以上の試験化合物を提供することと、
ｃ）前述のまたは各々の試験化合物が変異体Ｇαサブユニットに結合するかを決定することと、
ｄ）変異体Ｇαサブユニットに結合する１つ以上の試験化合物を単離することと、を含む、方法を提供する。
【０２４４】
変異体Ｇαサブユニットの選好には、本発明の第１の態様との関連で上述されるものが含まれ、本方法の試験化合物及びアッセイ形式／ステップの選好には、本発明の第１２の態様との関連で上述されるものが含まれる。
【０２４５】
本発明の第１４の態様は、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたは本発明の第４の態様に従う複合体に選択的に結合する抗体を提供する。かかる抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【０２４６】
抗体の例としては、本発明の第１２の態様との関連で上述されるものが挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、ＳｃＦｖ等の抗体断片または上述のもののうちのいずれかであり得る。抗体を作製する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ポリクローナル抗体の産生の場合、様々な好適な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、ニワトリ、マウス、または他の哺乳動物）が、１回以上の注入によって免疫原で免疫化され得る。免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクローナル抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血清または卵黄から）単離され、免疫血清のＩｇＧ画分を主に提供するタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを使用する親和性クロマトグラフィー等の周知の技法によってさらに精製され得る。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるもの等のハイブリドーマ法を使用して調製され得る。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、典型的には、免疫剤で免疫化されて、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、またはそれを生産することができるリンパ球を誘発する。
【０２４７】
本複合体に対する抗体が変性条件下で複合体を安定化するのに役立ち得ることが理解される。また、本複合体に対する抗体は、それらがＧＰＣＲ／リガンド複合体のみに対して産生された抗体よりも受容体を活性化する可能性が高いため、治療的価値を有し得る。
【０２４８】
本発明の第１５の態様は、Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間の結合を評価する方法であって、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットと、ＧＰＣＲと、を提供することと、変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の結合を評価することと、を含む、方法を提供する。
【０２４９】
変異体Ｇαサブユニットの選好には、本発明の第１または第２の態様との関連で上述されるものが含まれる。任意の好適なＧＰＣＲが、上述のように使用され得る。
【０２５０】
変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の結合を評価するための方法は、当該技術分野で周知であり、上述の方法、例えば、本発明の第１及び第１２の態様に記載のタンパク質結合を評価するための方法を含む。
【０２５１】
一実施形態では、本方法は、変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の機能的結合または共役を評価することを含む。この場合も同様に、それを行うのに好適な方法が上述されている。
【０２５２】
好都合には、変異体Ｇα及びＧＰＣＲの一方または両方が、検出可能に標識されている、例えば、蛍光標識されている。ＦＲＥＴが使用され得る。
【０２５３】
一実施形態では、変異体Ｇαサブユニット及びＧＰＣＲは、細胞内に提供され、任意に、本方法は、インビボまたはインビトロで行われる。
【０２５４】
本発明の第１６の態様は、Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間の結合への薬剤の影響を評価する方法であって、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットを提供することと、変異体ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の共役への薬剤の影響を評価することと、を含む、方法を提供する。
【０２５５】
アッセイの選好には、本発明の第１５の態様との関連で上述されるものが含まれる。本発明の第１５の態様と同様に、評価される結合は、機能的結合または共役であり得る。この方法が、ＧαサブユニットとＧＰＣＲとの間の相互作用に正または負の影響を及ぼす薬剤を特定するのに有用であり得ることが理解される。例えば、アッセイから生成されたシグナルの減少は、複合体形成を阻害する薬剤を示すであろう。一般に、本方法は、相互作用への薬剤の影響が評価され得るように、薬剤の存在及び不在下で行われる。
【０２５６】
本発明の第１７の態様は、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の１つ以上の結合パートナーを選択または設計するための方法であって、
（ａ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたは本発明の第４の態様に従う複合体の三次元構造表現を提供することと、
（ｂ）ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の１つ以上の結合パートナーを選択または設計するための分子モデル化手段を使用することであって、変異体Ｇαサブユニットまたは複合体の少なくとも一部の三次元構造表現が、１つ以上の候補結合パートナーの三次元構造表現と比較され、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体と相互作用すると予測される１つ以上の結合パートナーが選択される、使用することと、を含む、方法を提供する。
【０２５７】
「三次元構造表現」には、コンピュータで生成された表現または物理的表現が含まれる。典型的には、、その表現は、コンピュータで生成される。コンピュータ表現は、市販のソフトウェアプログラムによって生成または表示され得る。ソフトウェアプログラムの例としては、参照により本明細書に組み込まれる、ＱＵＡＮＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ．ＣＯＰＹＲＩＧＨＴ．２００１，２００２）、Ｏ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７，ｐｐ．１１０−１１９（１９９１））、及びＲＩＢＢＯＮＳ（Ｃａｒｓｏｎ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２４，ｐｐ．９５８９−９６１（１９９１））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
「結合パートナー」とは、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体に結合する任意の分子を意味する。好ましくは、分子は、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体に選択的に結合する。例えば、結合パートナーが少なくとも１つの他のＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体よりも少なくとも５倍または１０倍低い、好ましくは、１００倍または５００倍低いＫｄ値（解離定数）を有する（すなわち、より高い親和性を有する）ことが好ましい
【０２５９】
結合パートナーは、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体に結合する、小分子（例えば、５０００ダルトン未満、例えば、４０００、３０００、２０００、１０００、または５００ダルトン未満の分子量を有するもの）；ポリペプチド；アンチカリン；ペプチド；抗体；キメラ抗体；一本鎖抗体；アプタマー；ダルピン；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、もしくはｄＡｂ抗体断片；小分子；天然産物；アフィボディ；ペプチド模倣薬；核酸；ペプチド核酸分子；脂質；炭水化物；モジュールフレームワークに基づくタンパク質、例えば、アンキリン反復タンパク質、アルマジロ反復タンパク質、ロイシンに富んだタンパク質、テトラリオペプチド反復タンパク質、もしくは設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；リポカリンもしくはフィブロネクチンドメインに基づくタンパク質；ヒトガンマクリスタリンもしくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリン足場；Ｇタンパク質；ＲＧＳタンパク質；アレスチン；ＧＰＣＲキナーゼ；受容体チロシンキナーゼ；ＲＡＭＰ；ＮＳＦ；ＧＰＣＲ；ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１もしくはＮＲ２ａ；カルシオン；またはそれらの断片もしくは誘導体のうちのいずれかであり得る。
【０２６０】
結合パートナーを選択または設計するための方法及び分子モデル化を使用するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＷＯ２００８／０６８５３４に記載されている。例えば、本発明に従って用いられ得る分子モデル化技法としては、例えば、Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，ｐｐ．８８３−８９４（１９９０）が挙げられ、Ｍ．Ａ．Ｎａｖｉａ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，ｐｐ．２０２−２１０（１９９２）、Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，ｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５，Ｋ．Ｂ．Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｂｏｙｄ，Ｅｄｓ．，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３３７−３８０（１９９４）も参照されたく、Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，“Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐｐ．７７７−７８１（１９９４）も参照されたい。
【０２６１】
結合パートナーの設計は、一般に、結合パートナーの段階的アセンブリまたは結合パートナーのデノボ合成のいずれかの２つの方法によって達成され得る。加えて、結合パートナーを選択するための他のコンピュータに基づく方法が利用可能である。したがって、本方法が、断片スクリーニング、生物物理学的スクリーニング方法、及びＤＮＡコードライブラリのスクリーニングに使用され得ることが理解される。
【０２６２】
本発明の第１８の態様は、１つ以上の結合パートナーと、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体との相互作用の分析のための方法であって、
（ａ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたは本発明の第４の態様に従う複合体の三次元構造表現を提供することと、
（ｂ）変異体Ｇαサブユニットまたは複合体の構造または前記構造の一部に適合する１つ以上の結合パートナーの三次元構造表現を提供することと、
（ｃ）１つ以上の結合パートナーを前記構造に適合させることと、を含む、方法を提供する。
【０２６３】
「適合」とは、自動手段または半自動手段によって、候補結合パートナーの１つ以上の原子と、本発明のＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体構造の少なくとも１つの原子との間の相互作用を決定することと、かかる相互作用が安定している程度を計算することとを意味する。相互作用には、電荷、立体性、親油性、考慮すべき事項等によってもたらされる引力及び反発が含まれる。この種の電荷相互作用及び立体相互作用は、コンピュータでモデル化され得る。かかる算出の一例は、タンパク質及び結合パートナー上の原子に部分電荷を割り当て、クーロンポテンシャルを使用してタンパク質原子と結合パートナー原子との間の静電相互作用エネルギーを評価するＡｍｂｅｒ（Ｃｏｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（１９９５），１１７（１９），５１７９−９７）等の力場を介するものであろう。Ａｍｂｅｒ力場は、ファンデルワールスエネルギー項を割り当てて、２つの原子間の引力及び反発立体相互作用を評価するであろう。親油性相互作用は、様々な手段を使用してモデル化され得る。リガンド結合への疎水性寄与を評価する他の方法が利用可能であり、これらは、当業者に既知であろう。相互作用を評価する他の方法が利用可能であり、上述の分子を設計する当業者に既知である。適合のための様々なコンピュータに基づく方法が当該技術分野で既知であり、ＷＯ２００８／０６８５３４に記載されている。
【０２６４】
本発明の第１７または第１８の態様の一実施形態では、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたは本発明の第４の態様に従う複合体の三次元構造表現は、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットまたは本発明の第４の態様に従う複合体を提供することと、変異体Ｇαサブユニットまたは複合体の三次元構造を決定することとによって得られる。
【０２６５】
本発明の第１７または第１８の態様の一実施形態では、本方法は、１つ以上の結合パートナーの構造表現を修飾して、ＧＰＣＲ、Ｇタンパク質、またはＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体とのそれらの相互作用を増加または減少させることをさらに含み得る。
【０２６６】
本発明の第１９の態様は、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニット、本発明の第４の態様に従う複合体、または本発明の第１４の態様に従う抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【０２６７】
本発明は、薬剤での使用のための、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニット、本発明の第４の態様に従う複合体、または本発明の第１４の態様に従う抗体も提供する。
【０２６８】
本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニット、本発明の第４の態様に従う複合体、または本発明の第１４の態様に従う抗体のいずれかが、異常なＧタンパク質シグナル伝達（例えば、上方制御Ｇタンパク質シグナル伝達）に関連する疾患または状態と闘う際に治癒的価値を有し得ることが理解される。異常なＧタンパク質シグナル伝達（例えば、上方制御Ｇタンパク質シグナル伝達）に関連する疾患または状態とは、病変の少なくとも一部が、異常なＧタンパク質シグナル伝達（例えば、上方制御Ｇタンパク質シグナル伝達）によって媒介される任意の生物学的または医学的状態または障害を意味する。状態は、望ましくない細胞の存在によって引き起こされ得るか、あるいは、望ましくない細胞の存在が状態の影響であり得る。かかる疾患は、当該技術分野で周知であり、科学文献を閲覧することによって特定され得る。かかる状態の例は、癌である。疾患または状態と闘うとは、患者における症状の低減もしくは軽減（すなわち、緩和的使用）、症状の悪化もしくは進行の予防、障害の治療（例えば、原因病原体の阻害もしくは排除）、またはそれらに罹患していない対象における状態または障害の予防を意味する。
【０２６９】
したがって、本発明は、異常なＧタンパク質シグナル伝達（例えば、上方制御Ｇタンパク質シグナル伝達）に関連する疾患または状態と闘う際に使用するための、本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニット、本発明の第４の態様に従う複合体、または本発明の第１４の態様に従う抗体も提供する。好ましくは、疾患または状態は、癌である。
【０２７０】
本発明の第４の態様に従う複合体との関連で、これが過剰なリガンドを掃討（ｍｏｐ  ｕｐ）するための高親和性のデコイ受容体として潜在的に使用され得るため、不適切に高いＧタンパク質応答を下方制御するのに有用であり得ることが理解される。
【０２７１】
本発明の変異体Ｇαサブユニット、複合体、または抗体が単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の許容される担体と一緒に、それを薬学的製剤として提示することが好ましい。担体（複数可）は、治療剤と適合性であり、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で「許容される」ものであるべきである。典型的には、担体は、水または生理食塩水であり、無菌であり、発熱物質を含まない。
【０２７２】
適切な場合、製剤は、好都合に単位剤形で提示され得、当該技術分野で周知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。かかる方法は、活性成分（望ましくない細胞を特徴とする状態を治療または予防するための薬剤）を、１つ以上の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微粉固体担体またはそれらの両方と均一かつ密接に会合させ、その後、必要に応じて、その生成物を成形することによって調製される。
【０２７３】
経口投与に好適な本発明に従う製剤は、各々が所定量の活性成分を含むカプセル、カシェー、もしくは錠剤等の別個の単位として、粉末もしくは顆粒として、水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油液体エマルションもしくは油中水液体エマルションとして提示され得る。活性成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとしても提示され得る。
【０２７４】
好ましい単位投薬量製剤は、活性成分の１日用量または単位、１日下位用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適切な画分を含むものである。
【０２７５】
上で具体的に論じられる成分に加えて、本発明の製剤が、問題の製剤の種類を考慮して、当該技術分野で慣行の他の薬剤を含み得ること、例えば、経口投与に好適なものが香味剤を含み得ることを理解されたい。
【０２７６】
個体に投与される本発明の変異体Ｇαサブユニット、複合体、または抗体の量は、その特定の個体の状態と闘うのに有効な量である。その量は、医師によって決定され得る。
【０２７７】
好ましくは、本明細書に記載の任意の医学的用途では、治療される対象は、ヒトである。あるいは、対象は、動物、例えば、家畜（例えば、イヌもしくはネコ）、実験動物（例えば、実験室齧歯類、例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）、または農業に重要な動物（すなわち、家畜）、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、もしくはヤギであり得る。
【０２７８】
本発明の第２０の態様は、（ｉ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットと、（ｉｉ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲまたはその一部と、を含む部品キットを提供する。本発明が、（ｉ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）本発明の第１または第２の態様に従う変異体Ｇαサブユニットに結合することができるＧＰＣＲまたはその一部をコードするポリヌクレオチドと、を含む部品キットも含むことが理解される。
【０２７９】
変異体Ｇαサブユニット、ＧＰＣＲ、及びそれらをコードするポリヌクレオチドの選好には、本発明の第１、第２、第３、及び第４の態様との関連で上記に概説されるものが含まれる。
【０２８０】
好都合には、部品キット中の（ｉ）及び（ｉｉ）の一方または両方が検出可能に標識されている。
【０２８１】
一実施形態では、本キットは、ＧＰＣＲリガンドをさらに含み、その好適な例には、上述のものが含まれる。例えば、ＧＰＣＲリガンドは、小分子、タンパク質、ペプチド、タンパク質足場、核酸、イオン、炭水化物、または抗体のうちのいずれかであり得る。
【０２８２】
さらなる実施形態では、部品キットは、Ｇタンパク質β及び／またはＧタンパク質γサブユニットをさらに含む。この場合も同様に、好適なＧタンパク質βγサブユニットの例が上述される。例えば、本キットは、５個のβサブユニットのうちのいずれか及び／または１２個のγサブユニットのうちのいずれかを含み得る。具体的な例では、本キットは、β１及び／またはγ２を含み得る。
【０２８３】
なおさらなる実施形態では、部品キットは、ヌクレオチドをさらに含み、任意に、ヌクレオチドがＧＤＰまたはＧＴＰ等のグアニンヌクレオチドであるか、または任意に、ヌクレオチドがキサンチンヌクレオチドである。他の可能なヌクレオチドとしては、本発明の他の態様との関連で上述されるもの（例えば、ＧＴＰγＳまたはＧｐｐＮｐ）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
本発明は、これから、以下の図面及び実施例を参照することにより説明される。
【０２８５】
【図１】ｍｉｎｉ−Ｇｓアミノ酸配列とヒトＧアルファ配列とのアライメント。灰色で強調されているアミノ酸欠失及び置換は、ベータ及びガンマサブユニットの不在下で機能し得る最小ＧＴＰａｓｅドメインの開発に重要であった。ヘリカルドメインの欠失のように、Ｎ末端欠失が結晶化に必要であった。明瞭さのために、全ての番号付けは、完全なヒトＧＮＡＳＬ配列の数字を使用する（１〜３９４）が、ｍｉｎｉ−Ｇｓは、２２９個のみのアミノ酸残基を含む。
【図２】β１ＡＲ構築物の飽和結合データ。（ａ）β１ＡＲ−ＷＴへの３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（３Ｈ−ＤＨＡ）結合のβ解離定数（Ｋｄ）は、５．０±０．６ｎＭであった。（ｂ）β１ＡＲ−８４への３Ｈ−ＤＨＡ結合のＫｄは、２０±３ｎＭであった。データは、３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。示される曲線は、二連で実施した代表的な実験からのものである。
【図３】競合結合アッセイを使用した膜包埋β１ＡＲへのＧタンパク質共役の測定。（ａ）明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｎｂ８０（Ｋｉ：５．８±０．８ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：６．８±０．６ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ（Ｋｉ：１７±２ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｖ）β１ＡＲ−ＷＴ（４０±０ｎＭ、ｎ＝２）。（ｂ）明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：１６±４ｎＭ、ｎ＝３）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｎｂ８０（Ｋｉ：２８±１ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｇｓ（Ｋｉ：２７１±５４ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｖ）β１ＡＲ−８４（２．６±０．３μＭ、ｎ＝２）。（ｃ）２０℃で行われる実験。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７−βγ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：３．６±０．８ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７（Ｋｉ：１．９±０．２μＭ、ｎ＝３）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：２．６±０．３μＭ、ｎ＝１５）。（ｄ）４℃で行われる実験。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７−βγ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：１０ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７（Ｋｉ：１１７ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：２．１±０．２μＭ、ｎ＝１２）。
【図４】β２ＡＲ−ＷＴ−Ｇｓ複合体１０の結晶構造。（ａ）ヘテロ三量体Ｇｓは、α、β、及びγサブユニットから成り、Ｎｂ３５によってＧＰＣＲ結合立体構造で安定化される。（ｂ）Ｇｓ形態からの２５ＫＤａのＧαＧＴＰａｓｅドメインのみがβ１ＡＲ−ＷＴとの著しい相互作用を形成する。
【図５】ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７精製のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析。（１）分子量マーカー、（２）ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７、（３）２５ｎｇのＢＳＡ、（４）５０ｎｇのＢＳＡ、（５）１００ｎｇのＢＳＡ、（６）２５０ｎｇのＢＳＡ、（７）５００ｎｇのＢＳＡ、（８）１μｇのＢＳＡ、（９）２．５μｇのＢＳＡ。ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７（矢印で示す）を、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物１リットル当たりおよそ２００μｇの収率及びおよそ１０〜２０パーセントの純度で部分的に精製することができた。
【図６】ｍｉｎｉ−Ｇｓを安定化するための変異の設計。（ａ）Ｇαｓ８１（濃灰色）及びＡｒｌ−２９８（薄灰色）の構造的アライメント。ＧαｓＧＴＰａｓｅドメインは、２５パーセント（Ｄａｌｉサーバー１９を使用して決定される）のみの配列同一性を共有するにもかかわらず、１．９ÅのＲＭＳＤでＡｒｌ−２とアラインする。（ｂ）Ｇαｓ（濃灰色）及びＡｒｌ−２（薄灰色）のヌクレオチド結合ポケット間のアライメント。Ａｒｌ−２における対応する残基と一致するように変異されたｍｉｎｉ−Ｇｓ残基（Ｇ４９Ｄ、Ｅ５０Ｎ、Ａ２４９Ｄ、及びＳ２５２Ｄ）を、スティック及び下線で示す。変異が潜在的に相互作用する残基を、スティックで示す。（ｃ）α３ヘリックス内に位置するＬｅｕ−２７２のアスパラギン酸への変異は、スイッチＩＩのＮ末端領域における荷電残基及び極性残基（２２７〜２３３）のクラスターとの潜在的な相互作用を可能にする。（ｄ）ＧαｓのそのＧＴＰ結合立体構造（濃灰色）及びＧＰＣＲ結合立体構造（薄灰色）におけるアライメント。ＧＰＣＲ結合立体構造において、Ｉｌｅ−３７２（α５ヘリックス）がＭｅｔ−６０及びＨｉｓ−６４（α１ヘリックス）と立体的に衝突し、ＧαＧＴＰａｓｅドメインのコアに対するα１ヘリックスの密接充填を防止する。（ｅ）Ｖ３７５Ｉ変異（ＰｙＭｏｌの変異機能を使用してモデル化されたもの）を、ＧαＧＴＰａｓｅドメインのコアとＧＰＣＲ結合立体構造におけるα５ヘリックスとの間の疎水性接触を増加させるように設計した。Ｖａｌ−３７５と相互作用する残基をスティックで示し、イソロイシン変異のδ−炭素（＊）によって形成されると予測される追加の接触（４．２Å未満）を破線で示す。これらの図を、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．７．４  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）を使用して作製した。
【図７】アゴニストノルエピネフリンを使用したβ１ＡＲ−ＷＴ競合結合アッセイ。本アッセイを、熱安定性アッセイに使用される同一の緩衝液条件下で行った。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：０．３６±０．０２ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｎｂ８０（Ｋｉ：０．７０±０．１１ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ（Ｋｉ：１５８±６ｎＭ、ｎ＝２）。
【図８】ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３の配列。ヒスチジンタグ（ＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴによってコードされたＨＨＨＨＨＨ）を濃灰色で強調し、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴによってコードされたＥＮＬＹＦＱＧ）を薄灰色で強調し、ＧαＡＨドメインを置換するために使用されたリンカーを灰色で強調している（ＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＴによってコードされたＧＧＳＧＧＳＧＧ）。変異を太字及び下線で示す。この構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のためにＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）及びＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）制限部位を使用してｐＥＴ１５ｂベクターにクローニングした。終止コドンも強調している（ＴＡＡＴＡＧ）。
【図９】ｍｉｎｉ−Ｇｓの検証：β１ＡＲ薬理学及びｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体、（ａ〜ｃ）競合結合アッセイを使用したβ１ＡＲへのＧタンパク質結合の測定、（ａ）膜中の受容体。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｋｉ：４．１±１．１ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：６．８±０．６ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ（Ｋｉ：４０±０ｎＭ、ｎ＝２）。（ｂ）膜中の受容体。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｋｉ：３．６±０．０ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：１６±４ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：２．６±０．３μＭ、ｎ＝１５）。（ｃ）ＤＤＭ中で可溶化した受容体。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｋｉ：４．７±０．４ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｋｉ：２３±７ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：２．８±０．２μＭ、ｎ＝２）。（ｄ〜ｆ）ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の分析的ゲル濾過分析。（ｄ）ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３を、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物（挿入図）１リットル当たり１００ｍｇの収率で精製し、ゲル濾過によって１７．２ｍＬの保持体積を有する単一ピークとして分解した。（ｅ）Ｎ末端残基６〜２５を置換し、Ｌ２７２Ｄ変異を逆転させてＧβ１γ２に結合するその能力を保持した構築物であるｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９。ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９及びＧβ１γ２の等モル混合物は、それぞれ、Ｇβ１γ２またはｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９の１５．８ｍＬまたは１６．４ｍＬの保持体積と比較して、１４．６ｍＬの保持体積を有する単一ピークとして分解した。（ｆ）ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３は、ＬＭＮＧ洗剤中の精製β１ＡＲ−ＷＴに結合することができた。ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３及びβ１ＡＲ−ＷＴの等モル混合物は、それぞれ、β１ＡＲ−ＷＴまたはｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３の１３．６ｍＬまたは１７．１ｍＬの保持体積と比較して、１３．２ｍＬの保持体積を有する優性ピークとして分解した。
【図１０】ｍｉｎｉ−Ｇｓの検証：熱安定性及びＧＴＰ応答性（ａ〜ｂ）β１ＡＲ−ＷＴ複合体の熱安定性。（ａ）ドデシルマルトシド中での熱安定性。明瞭さのために、熱安定性曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（見かけのＴｍを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ（Ｔｍ：２５．９±０．０℃、ｎ＝３）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｎｂ８０（Ｔｍ：３２．０±０．０℃、ｎ＝３）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｔｍ：３４．１±０．５℃、ｎ＝３）、（ｉｖ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｔｍ：３５．８±０．１℃、ｎ＝３）。（ｂ）オクチルグルコシド中での熱安定性：非共役β１ＡＲ−ＷＴは、ＯＧ洗剤中での可溶化に耐え抜くことができなかった。明瞭さのために、熱安定性曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（見かけのＴｍを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｔｍ：１３．６±０．２℃、ｎ＝３）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｎｂ８０（Ｔｍ：１４．３±０．２℃、ｎ＝３）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｔｍ：１９．７±０．５℃、ｎ＝３）。（ｃ〜ｄ）膜中での競合結合アッセイによって測定したβ１ＡＲ−８４複合体のＧＴＰ媒介解離。ｍｉｎｉ−Ｇｓ４０４は、Ｉ３７２Ａ及びＶ３７５Ｉ変異が逆転したことを除いてＧｓ３９３と同一の構築物である。（ｃ）本アッセイにおいてＧＴＰγＳが存在しなかった。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｋｉ：３．６±０．０ｎＭ、ｎ＝３）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ４０４（Ｋｉ：１８±２ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｇｓ（Ｋｉ：２７１±５４ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｖ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：  ２．６±０．３μＭ、ｎ＝１５）。（ｄ）本アッセイにおける０．２５ｍＭのＧＴＰγＳの存在下。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｋｉ：５．２±０．７ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ４０４（Ｋｉ：７００±６０ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−８４＋Ｇｓ（Ｋｉ：２．７±０．１μＭ、ｎ＝２）、（ｉｖ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：３．０±０．１μＭ、ｎ＝２）。ＧＴＰγＳの存在下または不在下でのβ１ＡＲ−ＷＴとｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３のイソプレナリン親和性の統計的差異は見られなかった。示される曲線は、二連で実施した代表的な実験からのものである。
【図１１】ＤＭまたはＮＧ中でのβ１ＡＲ−ＷＴ複合体の熱安定性（見かけのＴｍ）。（ａ）ドデシルマルトシド中での熱安定性。明瞭さのために、熱安定性曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（見かけのＴｍを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ（Ｔｍ：２０．４±０．４℃、ｎ＝３）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｎｂ８０（Ｔｍ：２８．６±０．３℃、ｎ＝３）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｔｍ：３０．５±０．４℃、ｎ＝３）、（ｉｖ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｔｍ：３１．１±０．４℃、ｎ＝３）。（ｂ）ノニルグルコシド中での熱安定性：非共役β１ＡＲ−ＷＴは、ＮＧ洗剤中での可溶化に耐え抜くことができなかった。明瞭さのために、熱安定性曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（見かけのＴｍを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｎｂ８０（Ｔｍ：１６．７±０．７℃、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋Ｇｓ−Ｎｂ３５（Ｔｍ：１９．０±０．２℃、ｎ＝２）、（ｉｉｉ）β１ＡＲ−ＷＴ＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３（Ｔｍ：２４．７±０．４℃、ｎ＝２）。データは、説明文に示される独立した実験の数（ｎ）の平均±標準誤差を表す。示される曲線は、二連で実施した代表的な実験からのものである。
【図１２】競合結合アッセイによって測定したβ１ＡＲ−８４−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９１複合体のＧＴＰ媒介解離。ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９１は、Ｖ３７５ＩＩ変異が逆転したことを除いてｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３と同一の構築物である。（ａ）ＧＴＰγＳの不在。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９１（Ｋｉ：３．０±０．４ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：２．６±０．３μＭ、ｎ＝１５）。（ｂ）ＧＴＰγＳ（０．２５ｍＭ）の存在下。明瞭さのために、結合反応を表す曲線を、グラフの左側からグラフの右側の順に記載する（イソプレナリン結合のＫｉを括弧内に示し、独立した実験の数（ｎ）も示す）：  （ｉ）β１ＡＲ−８４＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９１（Ｋｉ：４．７±０．１ｎＭ、ｎ＝２）、（ｉｉ）β１ＡＲ−８４（Ｋｉ：３．０±０．１μＭ、ｎ＝２）。ＧＴＰγＳの存在下または不在下でのβ１ＡＲ−ＷＴとｍｉｎｉ−Ｇｓ３９１のイソプレナリン親和性の統計的差異は見られなかった。示される曲線は、二連で実施した代表的な実験からのものである。
【図１３】Ｎｂ８０またはＧｓの存在下でのβ１ＡＲ競合結合曲線。異なるβ１ＡＲ構築物に対するイソプレナリン結合の親和性（ＩＣ５０）をＮｂ８０及びＧｓの存在下で測定した。（Ａ）近接する野生型β１ＡＲ構築物（β６）は、細胞内結合パートナー（右側の曲線）の不在下で高イソプレナリン親和性（１８０ｎＭ）を示した。Ｎｂ８０（左側の曲線）の存在下で、イソプレナリン親和性は、５１ｎＭにしか増加しなかった。（Ｂ）最小熱安定化受容体構築物（β８４）は、細胞内結合パートナー（右側の曲線）の不在下でより低いイソプレナリン親和性（７．１μＭ）を示した。Ｎｂ８０（右側の曲線）の存在下で、イソプレナリン親和性が１６ｎＭに劇的にシフトした。（Ｃ）非脂質化Ｇｓの存在下で、β８４のイソプレナリン親和性のみが６．９μＭ（右側の曲線）から１．４μＭ（左側の曲線）に増加した。（Ｄ）非脂質化Ｇｓ及びＮｂ３５の存在下で、β８４のイソプレナリン親和性が６．９μＭ（右側の曲線）から６８ｎＭ（左側の曲線）に劇的にシフトした。示されるデータは、単一の代表的な実験からのものであり、エラーバーは、二連測定間の標準誤差を表す。
【図１４】ＧＴＰａｓｅドメインの存在下でのβ１ＡＲ競合結合曲線。β１ＡＲに対するイソプレナリン結合の親和性（ＩＣ５０）をＧαｓ  ＧＴＰａｓｅドメインの存在下で測定した。（Ａ）２０℃で、β８４のイソプレナリン親和性（中間の曲線）は３．３μＭであり、ＧＴＰａｓｅドメイン（右側上の曲線）の存在下で増加しなかった（３．４μＭ）しかしながら、ＧＴＰａｓｅドメイン、βγ二量体、及びＮｂ３５の組み合わせは、イソプレナリン親和性の２０６ｎＭ（左側の曲線）へのシフトを誘導した。（Ｂ）４℃で、β８４のイソプレナリン親和性（右側の曲線）はＧＴＰａｓｅドメイン（緑色）の存在下で３．９μＭであり、親和性が２５３ｎＭ（左側の曲線）に増加した。示されるデータは、単一の代表的な実験からのものであり、エラーバーは、二連測定間の標準誤差を表す。
【図１５】ｍｉｎｉ−Ｇｓ結合Ａ２ＡＲのリガンド結合及び全体構造。ａ：ｍｉｎｉ−Ｇｓは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質によって観察されたものと同様に、Ａ２ＡＲへのアゴニスト結合の親和性を増加させる。競合結合曲線を、アゴニストＮＥＣＡの増加濃度で逆アゴニスト３Ｈ−ＺＭ２４１３８５の変位を測定することによって三連で行った（括弧内はＫｉ値であり、全データについては図１６を参照のこと）。明瞭さのために、曲線をグラフの左側からグラフの右側に記載する。（ｉ）Ａ２ＡＲ及びヘテロ三量体Ｇタンパク質及びナノボディＮｂ３５（Ｋｉ：３４０±７０ｎＭ）、（ｉｉ）Ａ２ＡＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｓ（Ｋｉ：４３０±８０ｎＭ）、（ｉｉｉ）Ａ２ＡＲ（Ｋｉ：４．６±０．３μＭ）。全てのＧタンパク質を、Ａ２ＡＲを含有する膜に添加して最終濃度２５μＭにし、ＮａＣｌの最終濃度は１００ｍＭであった。ｂ：Ａ２ＡＲの構造を、濃灰色のｍｉｎｉ−Ｇｓとともに薄灰色の絵画で描写する。Ａ２ＡＲに結合したアゴニストＮＥＣＡ及びｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したＧＤＰを空間充填モデルとして描写する。関連二次構造特徴をラベル付けする。
【図１６】競合アッセイを、アゴニストＮＥＣＡが放射標識逆アゴニスト３Ｈ−ＺＭ２４１３８５の結合について競合するＨＥＫ２９３細胞膜で発現したＡ２ＡＲで行った。１００ｍＭのＫＣｌ（ａ、ｂ）、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｃ、ｄ）、または５００ｍＭのＮａＣｌ（ｅ、ｆ）のいずれかの存在下で実験を行い、本複合体の安定化についてｍｉｎｉ−Ｇｓ及びヘテロ三量体ＧｓのナノボディＮｂ３５と同様の挙動を確認した。結果を表（ｇ）に要約する。少なくとも３つの独立した実験からのデータを、統計的有意性について対応のないｔ検定で分析した。
【図１７】ｍｉｎｉ−Ｇｓ４１４の存在下または不在下での洗剤可溶化３Ｈ−ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲの熱安定性。未精製Ａ２ＡＲを、以下の濃度で、洗剤中で可溶化した：  （ａ）０．１％ＤＤＭ、（ｂ）０．１３％ＤＭ、（ｃ）０．８％ＯＧ。試料を３０分間加熱し、氷上でクエンチし、３Ｈ−ＮＥＣＡ結合の量を決定した。各パネルにおいて、Ａ２ＡＲのみが左側の曲線であり、ｍｉｎｉ−Ｇｓ４１４に結合したＡ２ＡＲが右側の曲線である。データを非線形によって分析し、見かけのＴｍをシグモイド用量応答曲線当てはめの分析（ｄ）から決定した。
【図１８】Ａ２ＡＲ鎖Ａ内のＮＥＣＡ（ａ及びｂ）、Ａ２ＡＲ鎖Ｂ内のＮＥＣＡ（ｃ及びｄ）、及びｍｉｎｉ−Ｇｓ鎖Ｃ内のＧＤＰ（ｅ及びｆ）の省略マップ差密度（ｏｍｉｔ  ｍａｐ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ）の直交図。輪郭レベルは、パネルａ〜ｄでは２．５シグマであり、パネルｅ及びｆでは３．０シグマである。
【図１９】ＣＧＮシステムを参照したβ２ＡＲ−Ｇｓ構造に使用したウシＧＮＡＳ２（Ｐ０４８９６）に対するｍｉｎｉ−Ｇｓのアライメント（鎖Ｃ及びＤ）。Ｇｓ−β２ＡＲ複合体中のβ２ＡＲまたはｍｉｎｉ−Ｇｓ−Ａ２ＡＲ複合体中のＡ２ＡＲのいずれかの３．９Å内にある残基を、灰色で強調している。
【図２０】Ａ２ＡＲとｍｉｎｉ−Ｇｓとの間の充填相互作用。ａ：Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造におけるその二次構造を描写するＡ２ＡＲの図。薄灰色の影付きの残基は、鎖Ａ及び／または鎖Ｂのいずれかで不規則である。ジスルフィド結合を黒色の破線で描写している。ｂ：ｍｉｎｉ−Ｇｓトポロジーの絵画。ｃ、ｍｉｎｉ−ＧｓとＡ２ＡＲとの間の接触の図であり、線の太さがアミノ酸残基間の相互作用の相対数を表す。
【図２１】結晶化Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造の鎖Ａ及び鎖Ｂとのヒトβ２−アドレナリン受容体（ａｄｒｂ２＿ヒト）のアライメント、ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体（ＡＡ２ＡＲ＿ヒト）。主要なＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号を配列の上に示し、精製及び結晶化を促進する結晶化Ａ２ＡＲにおける変異には下線を引いてある。薄灰色のバーは、β２ＡＲ−Ｇｓ構造におけるアルファ−ヘリックスの位置を示し、濃灰色のバーは、Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造におけるこれらの領域を表す。
【図２２】ｍｉｎｉ−Ｇｓ結合Ａ２ＡＲとヘテロ三量体Ｇｓ結合β２ＡＲとの比較。ａ：β２ＡＲ−Ｇｓ（ＰＤＢ  ＩＤ：  ３ＳＮ６）１０とＡ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓとの構造アライメントを、受容体のみ、Ａ２ＡＲ（濃灰色）、β２ＡＲ（薄灰色）をアラインすることによって行った。β２ＡＲに結合したＧαｓ（薄灰色）及びＡ２ＡＲに結合したｍｉｎｉ−Ｇｓ（暗灰色）の結果として生じる相対的配置を描写する。ＮＥＣＡ及びＧＤＰを空間充填モデルとして描写する。明瞭にするためにＧαｓのα−ヘリカルドメインをＧα結合Ｎｂ３５及びＧβγとともに省略している。ｂ〜ｅ：それぞれのＧタンパク質と受容体との間の水素結合（破線）の詳細な比較。受容体は、ヘリックスがＨ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、及びＨ８で標識されたパネルの上部であり、ｍｉｎｉ−Ｇｓ及びＧαｓは、残基がＣＧＮシステムを使用して標識されたパネルの下部である。アミノ酸残基の標識は、受容体のＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ（Ｂ−Ｗ）番号及びＧタンパク質のＣＧＮ表記法を示す。ｆ及びｇ：それぞれ、Ａ２ＡＲ及びβ２ＡＲの細胞質表面の図であり、空間充填モデルが濃灰色のそれらのそれぞれのＧタンパク質と接触する原子を有する。ｈ：ｍｉｎｉ−Ｇｓ−Ａ２ＡＲ複合体及びＧｓ−β２ＡＲ複合体中のＧタンパク質と接触する残基の比較。接触する受容体におけるアミノ酸残基は、濃灰色である。白色の残基は、それぞれのＧタンパク質と接触しないが、他の受容体における同等の残基と接触する残基である。Ｂ−Ｗ番号が膜貫通α−ヘリックスの残基に与えられており、ダッシュ記号はループまたはＨ８内の残基である。アミノ酸残基５．７１〜５．７７は、ｍｉｎｉ−Ｇｓ−Ａ２ＡＲ構造で不規則である。
【図２３】Ａ２ＡＲに結合したｍｉｎｉ−Ｇｓ（鎖ｃ、暗灰色）とのβ２ＡＲに結合したＧαｓのＧＴＰａｓｅドメイン（薄灰色）とのアライメント。ｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したＧＤＰを、空間充填モデルとして描写すしている。受容体と相互作用するα５ヘリックスを標識する。
【図２４】Ｇタンパク質結合時のＡ２ＡＲの立体構造変化。ｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したＡ２ＡＲ（暗灰色）を、ＮＥＣＡ（ＰＤＢコード２ＹＤＶ）１またはＵＫ４３２０９７（ＰＤＢコード３ＱＡＫ）４のいずれかに結合した活性中間体立体構造におけるＡ２ＡＲ（薄灰色）とアラインして、Ｇタンパク質結合時の構造変化を強調した。ＮＥＣＡと比較したリガンドＵＫ４３２０９７の大きい伸長がＮＥＣＡ結合構造と比較して細胞外表面を歪め、かつＮＥＣＡ結合構造が熱安定化変異を受容体の細胞内半分に含んだため、いずれの構造も両比較に使用しなかった。ａ：２ＹＤＶとのアライメントであり、受容体の細胞外半分を膜平面に平行に見たものである。ｂ：明瞭さのためにｍｉｎｉ−Ｇｓを取り除いた細胞質表面から見た３ＱＡＫとのアライメント。ｃ：膜に平行に見た３ＱＡＫとのアライメント。Ａ２ＡＲにおける膜貫通α−ヘリックスを、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７で標識し、ｍｉｎｉ−Ｇｓを標識する。残基をそれらのＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号で標識し、矢印は、ｍｉｎｉ−Ｇｓ結合時の移動の方向を描写する。Ａ２ＡＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｓにおけるアミノ酸残基へのＢ−Ｗ及びＣＧＮ番号の変換は、それぞれ、Ｒ３．５０、Ａｒｇ１０２；Ｙ５．５８、Ｔｙｒ１９７；Ｋ６．２９、Ｌｙｓ２２７；Ａ３．３３、Ａｌａ２３１カルボニル；Ｌ６．３７、Ｌｅｕ２３５；Ｙ７．５３、Ｔｙｒ２８８；ＹＨ５．２３、Ｔｙｒ３９１；ＬＨ５．２５、Ｌｅｕ３９３；Ｃ−ｔｅｒｍＨ５．２４、ｍｉｎｉ−ＧｓのＣ末端（Ｌｅｕ３９４）。
【図２５】一般的なＧα番号付けシステム１０３のヒトパラログ参照アラインメント。ａ：全ての基準のヒトＧαパラログの参照アラインメント。ドメイン（Ｄ）、コンセンサス二次構造（Ｓ）、ヒト参照アライメント（Ｐ）のＳＳＥにおける位置をアライメントの上部に示す。ｂ：ＣＧＮ命名法で使用されるＳＳＥの定義の参照表。
【図２６】ｍｉｎｉ−Ｇｓアミノ酸及びヌクレオチド配列。アミノ酸配列を配列番号１〜４５として列記し、ヌクレオチド配列を配列番号４６〜９０として列記する。
【図２７】Ｇａｌｐｈａｔサブユニット（キメラ６）のアミノ酸配列。これは、ウシＧαｔ１の残基２１６〜２９４がラットＧαｉ１の残基２２０〜２９８で置換されたキメラタンパク質である。これは、複合体βγサブユニット（１ＧＯＴ）と複合して結晶化されている。
【図２８】ヒトＧαサブユニットの系統発生学的関係。ファミリー固有の色で強調した全てのＧαサブユニットをｍｉｎｉ−Ｇタンパク質に変換させる試みを行った。系統発生学的関係を、ＴｒｅｅＤｙｎを使用して決定した。
【図２９】Ｇα  ＧＴＰａｓｅドメインタンパク質配列のアラインメント。アラインさせたアミノ酸配列は、初期ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を作製するために本研究で使用されたＧαサブユニットの野生型ＧＴＰａｓｅドメインのものである。ＧαＡＨドメイン（図示せず）を欠失させ、リンカーによって置換した（イタリック体のＧＧＧＧＧＧＧＧまたはＧＧＳＧＧＳＧＧ）。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を構築するために、灰色で強調された残基を欠失させ、太字の残基を以下に変異させた（Ｇαｓ残基番号及び上付き文字のＣＧＮ：  Ｄ４９Ｓ１Ｈ１．３、Ｎ５０Ｓ１Ｈ１．４、Ｄ２４９Ｓ４．７、Ｄ２５２Ｓ４Ｈ３．３、Ｄ２７２Ｈ３．８、Ａ３７２Ｈ５．４、Ｉ３７５Ｈ５．７。発現を改善するためにグリシン変異（Ｇ２１７Ｄ、下線）をＧｉ１のみに組み込んだ（結果及び考察を参照のこと）。配列の上の番号付けは、Ｇαのためのものであり、配列の下のＣＧＮシステムを参照のために使用する。
【図３０】β１ΑＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体及びＡ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体。（ａ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋β１ＡＲのＦＳＥＣトレース（保持体積を括弧内に示す）：  ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（１５．１ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋逆アゴニストＩＣＩ１１８５５１に結合したβ１ＡＲ（１５．１ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋アゴニストイソプレナリンに結合したβ１ＡＲ（８ｍＬ、１２．１ｍＬ、及び１５．１ｍＬ）。少なくとも２つの独立した実験からの代表的なクロマトグラムを示す。（ｂ）蛍光飽和結合アッセイ（ＦＳＢＡ）を使用したＤＤＭ可溶化β１ＡＲに対するＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ親和性の測定。円形：アゴニストイソプレナリンに結合したβ１ＡＲ（合計結合）、四角形：逆アゴニストＩＣＩ１１８５５１に結合したβ１ＡＲ（非特異的結合）、三角形：特異的結合、見かけのＫＤ：２０１±１ｎＭの（平均±標準誤差、ｎ＝２）。示される曲線は、代表的な実験からのものである。（ｃ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋ＤＤＭ可溶化Ａ２ＡＲのＦＳＥＣトレース（保持体積を括弧内に示す）：  ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（１５．１ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋逆アゴニストＺＭ２４１３８５に結合したＡ２ＡＲ（１５．１ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋アゴニストＮＥＣＡに結合したＡ２ＡＲ（１２．５ｍＬ及び１５．１ｍＬ）。少なくとも２つの独立した実験からの代表的なクロマトグラムを示す。（d）ＦＳＢＡを使用したＤＤＭ可溶化Ａ２ＡＲに対するｍｉｎｉ−Ｇｓ親和性の測定。円形：アゴニストＮＥＣＡに結合したＡ２ＡＲ（全結合）、四角形：逆アゴニストＺＭ２４１３８５に結合したＡ２ＡＲ（非特異的結合）、三角形：特異的結合、見かけのＫＤ：４２８±２４ｎＭ（平均±標準誤差、ｎ＝２）。（ｅ）精製Ａ２ＡＲに結合したｍｉｎｉ−Ｇｓの分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（保持体積を括弧内に示す）：  Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体：１５３ｋＤａ（１３ｍＬ）、Ａ２ＡＲ：１３３ｋＤａ（１３．３ｍＬ）、ｍｉｎｉ−Ｇｓ：２２ｋＤａ（１７．２ｍＬ）。ＳＥＣトレースの右側の３つのパネルは、３つの別個のＳＥＣ実験からの画分のクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。上部パネル：ｍｉｎｉ−Ｇｓ、中間パネル：Ａ２ＡＲ、下部パネル：ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲと混合したｍｉｎｉ−Ｇｓ（１．２：１のモル比）。
【図３１】Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ複合体。（Ａ）精製Ａ２ＡＲに結合したｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆの分析的ＳＥＣ（保持体積を括弧内に示す）：  Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ複合体：１５３ｋＤａ（１３ｍＬ）、Ａ２ＡＲ：１３３ｋＤａ（１３．３ｍＬ）、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ：２３ｋＤａ（１７．１ｍＬ）。ＳＥＣトレースの右側の３つのパネルは、３個の別個のＳＥＣ実験からの画分のクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。上部パネル：ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ、中間パネル：Ａ２ＡＲ、下部パネル：ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲと混合したｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ（１．２：１のモル比）。（ｂ）未精製ＤＭ可溶化３Ｈ−ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲの熱安定性。データを非線形回帰によって分析し、見かけのＴｍ値をシグモイド用量応答曲線当てはめの分析から決定した。Ｔｍ値は、各々を二連で行った２つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。円形：ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆなし（２６．９±０．３℃）、四角形：ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ（３２．５±１℃）。示される曲線は、代表的な実験からのものである。
【図３２】ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑキメラとＧＰＣＲとの間の様々な複合体の熱安定性アッセイ。（ａ）未精製ジギトニン可溶化１２５Ｉ−ＡｎｇＩＩ結合ＡＴ１Ｒの熱安定性（Ｔｍ値を括弧内に示す）。円形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑなし（２２．６±０．４℃）、四角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５７、逆三角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０（３０．７±１℃）、三角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７１（３０．２±０．８℃）。（ｂ）未精製ＤＤＭ可溶化３Ｈ−ＮＴＳ結合ＮＴＳＲ１の熱安定性、円形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑなし（２４．９±０．４℃）、四角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５７（２６．７±０．７℃）、六角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８（２５．１±０．４℃）、逆三角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０（３２．５±０．３℃）、菱形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７１（２８．６±１．１℃）。（ｃ）未精製ＤＭ可溶化３Ｈ−ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲの熱安定性。円形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑＧなし（２６．９±０．３℃）、四角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５７（３０．６±０．３℃）、六角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８（２６．９±０．５℃）、逆三角形：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０（２７．５±０．２℃）。全てのパネルにおいて、データ（ｎ＝３）を非線形回帰によって分析し、見かけのＴｍ値を平均±標準誤差として示される値とのシグモイド用量応答曲線当てはめの分析から決定した。示される曲線は、代表的な実験からのものである。
【図３３】５ＨＴ１ＢＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１複合体。（ａ）ｍｉｎｉ−Ｇｉ１共役が５ＨＴ１ＢＲに対するアゴニスト親和性を増加させる。競合結合曲線を、アゴニストスマトリプタンの増加濃度でアンタゴニスト３Ｈ−ＧＲ１２５７４３の変位を測定することによって二連（ｎ＝２）で行った（平均±標準誤差を表す見かけのＫｉ値を括弧内に示す）。円形：５ＨＴ１ＢＲ（Ｋｉ：２７６±１０ｎＭ）、六角形：５ＨＴ１ＢＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｉ１（Ｋｉ：８０±１３ｎＭ）、四角形：５ＨＴ１ＢＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１（Ｋｉ：３６±２ｎＭ）、三角形：５ＨＴ１ＢＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｉ１β１γ２（Ｋｉ：１５±１ｎＭ）、菱形：５ＨＴ１ＢＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１β１γ２（Ｋｉ：７．２±０．８ｎＭ）。エラーバーは、標準誤差を表す。（ｂ）ＦＳＢＡを使用したＤＤＭ可溶化ドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲに対するｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１キメラ親和性の測定。円形：５ＨＴ１ＢＲ及びＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１（合計結合）、四角形：５ＨＴ１ＢＲ及びＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（非特異的結合）、三角形：特異的結合。３８６±４７ｎＭの見かけのＫＤは、２つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。示される曲線は、代表的な実験からのものである。（ｃ）ＤＤＭ中でのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１＋５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース。ＤＤＭ中で精製したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１及びドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲ（１３．５ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１（１３．５ｍＬ）。（ｄ）ＬＭＮＧ中でのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１＋５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース。ＬＭＮＧ中で精製したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１及びドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲ（１２．２ｍＬ及び１４．３ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１（１４．３ｍＬ）。（ｅ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１＋５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース。ＤＤＭ中で精製したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１及びドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲ（１３．２ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１（１５．１ｍＬ）。（ｆ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１β１γ２＋５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース。ＬＭＮＧ中で精製したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１β１γ２及びドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲ（１１．８ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１β１γ２（１４．３ｍＬ）。パネルｃ〜ｆにおいて、保持体積を括弧内に示す。
【図３４】５ＨＴ１ＢＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１複合体。（ａ）競合結合曲線を、アゴニストスマトリプタンの増加濃度でアンタゴニスト３Ｈ−ＧＲ１２５７４３の変位を測定することによって二連（ｎ＝２）で行った（平均±標準誤差を表す見かけのＫｉ値を括弧内に示す）。円形：５ＨＴ１ＢＲ（Ｋｉ：２７６±１０ｎＭ）、四角形：５ＨＴ１ＢＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｏ１（Ｋｉ：３２±３ｎＭ）。エラーバーは、標準誤差を表す。（ｂ）ＦＳＢＡを使用したＤＤＭ可溶化ドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲへのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１親和性の測定。円形：５ＨＴ１ＢＲ及びＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１（合計結合）、四角形：５ＨＴ１ＢＲ及びＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（非特異的結合）、三角形：特異的結合。見かけのＫＤ値（１８４±２４ｎＭ）は、２つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。示される曲線は、代表的な実験からのものである。（ｃ）以下のものに結合したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１＋ＤＤＭ可溶化未精製５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース（保持体積を括弧内に示す）：アンタゴニストＳＢ２２４２８９（１４．９ｍＬ）、アゴニストドニトリプタン（１１．３ｍＬ及び１４．９ｍＬ）。遊離ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１は、１４．９ｍＬの保持体積を有する優性ピークとして分解した。（ｄ）ｍｉｎｉ−Ｇｏ１は、精製５ＨＴ１ＢＲとの複合体を形成する。３つのパネルは、３つの別個のＳＥＣ実験からの画分のクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。上部パネル：ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、中間パネル：５ＨＴ１ＢＲ、下部パネル：ドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲと混合したｍｉｎｉ−Ｇｏ１（１：１のモル比）。（ｅ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１＋精製５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１＋ＤＤＭ中で精製した５ＨＴ１ＢＲ（１３ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１（１４．８ｍＬ）。（ｆ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋精製５ＨＴ１ＢＲのＦＳＥＣトレース。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ＋ＤＤＭ中で精製した５ＨＴ１ＢＲ（陰性対照、１５．１ｍＬ）、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（１５．１ｍＬ）。保持体積を括弧内に示す。
【図３５】この研究で使用したｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の配列。ポリ−ヒスチジンタグに点線の下線を引いており、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を灰色で強調し、ＧαＡＨドメインを置換するために使用したリンカーはイタリック体である。変異を太字及び下線で示す。
【図３６】Ｅ．ｃｏｌｉで発現できなかったｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の配列。ポリ−ヒスチジンタグに点線の下線を引いており、ＴＥＶ部位を灰色で強調し、ＧαＡＨドメインを置換するために使用したリンカーはイタリック体である。変異を太字及び下線で示す。これらの構築物を、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用してＥ．ｃｏｌｉ発現のためにプラスミドｐＥＴ１５ｂにクローニングした。
【図３７】この研究で使用したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の配列。ＧＦＰ（二重下線）を、ＧＧＧＧＳリンカー（イタリック体）を有するｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のＮ末端に融合した。ポリ−ヒスチジンタグに点線の下線を引いており、ＴＥＶ切断部位を灰色で強調し、ＧαＡＨドメインを置換するために使用したリンカーはイタリック体である（ＧＧＳＧＧＳＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＧＧ）。
【図３８】この研究で使用した選択されたｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑキメラの配列アラインメント。太字の残基は、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のシグネチャー変異である。灰色の残基は、Ｇｑに見られるものである。配列の上の菱形は、側鎖がβ２ＡＲ（β２立体構造）またはＡ２ＡＲ（２Ａ立体構造）のいずれかにおける残基と原子接触するＧαｓにおけるアミノ酸残基を特定する。配列の上の楕円形は、主鎖原子のみが受容体と接触するＧαｓにおけるアミノ酸残基を特定する。
【図３９】精製Ａ２ＡＲ＋ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑキメラの分析的ＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。精製Ａ２ＡＲに結合したｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５７（ａ）、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８（ｂ）、及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０（ｃ）の分析的ＳＥＣ：  Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ複合体、Ａ２ＡＲ、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ。ＳＥＣトレースの下の３つのパネルは、３つの別個のＳＥＣ実験からの画分のクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。上部パネル：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ、中間パネル：Ａ２ＡＲ、下部パネル：ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑと混合したＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲ（１：１．２のモル比）。
【図４０】この研究で使用した異なるｍｉｎｉ−Ｇｉ１タンパク質及びｍｉｎｉ−Ｇｏ１タンパク質の配列アライメント。太字の残基は、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のシグネチャー変異である。発現を改善するためのｍｉｎｉ−Ｇｉ１における追加のＧ２１７Ｄ変異（太字：ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質中の残基１１４）に留意されたい。ｍｉｎｉ−Ｇｓ中の残基を、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１またはｍｉｎｉ−Ｇｏ１中のそれらの等価物に変異させて（それぞれ、一重下線または二重下線）、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１キメラまたはｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｏ１キメラを作製した。β１γ２とヘテロ三量体を形成するために使用した構築物（すなわち、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１＿４６、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１＿４３、及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｏ１＿１６）におけるＮ末端（灰色で強調）の再挿入に留意されたい。
【図４１】ｍｉｎｉ−Ｇｓの存在下でのアゴニスト立体構造におけるＧＬＰ１Ｒの安定性。ｍｉｎｉ−Ｇｓは、ｍｉｎｉ−Ｇｓの存在下でＧＬＰ１Ｒの安定性を増加させる。ＧＬＰ１ＲのＴｍは１４．７℃であり、ＧＬＰ１Ｒ＋ｍｉｎｉ−ＧｓのＴｍは１９．３℃である。
【発明を実施するための形態】
【０２８６】
実施例１：Ｇタンパク質共役受容体のそれらの活性立体構造における結晶化を容易にするための最小Ｇタンパク質（ｍｉｎｉｍａｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の操作。
序文
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモン及び神経伝達物質等の刺激物に応答して細胞質シグナル伝達経路を調節する。全ての活性化状態におけるＧＰＣＲの構造決定は、シグナル伝達の正確な機構を解明するためには不可欠である。しかしながら、それらの固有の不安定性のため、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の結晶化は、特に困難である。ここで、我々は、アデニル酸シクラーゼ刺激Ｇタンパク質（Ｇｓ）由来のＧＴＰａｓｅドメインから単独で構成される最小Ｇタンパク質の設計について説明する。ｍｉｎｉ−Ｇｓは、Ｇβγサブユニット不在下でＧＰＣＲに効率的に共役する小さい可溶性タンパク質である。我々は、短鎖洗剤中で可溶化した場合であってもβ１アドレナリン受容体（β１ＡＲ）との安定した複合体を形成するようにｍｉｎｉ−Ｇｓを操作した。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質と同様の薬理学的及び構造的変化をＧＰＣＲに誘導する。したがって、それらは新規のツールであり、これにより、ＧＰＣＲのそれらの活性立体構造におけるハイスループット構造決定が容易になる。
【０２８７】
結果
β１ＡＲへのＧｓ共役を検出するための感受性アッセイの開発。
我々は、アゴニスト結合親和性における応答を測定することによってβ１ＡＲとの異なる結合パートナーの相互作用を検出することができる感受性競争結合アッセイを開発した。この研究中に使用した結合パートナーは、Ｎｂ８０３８（β２ＡＲに結合し、かつ脂質化Ｇｓに対するアゴニスト親和性の同等のシフトを誘導するナノボディ）、Ｎｂ３５４０（ＧｓをそのＧＰＣＲ結合立体構造で安定化するナノボディ）、非脂質化Ｇｓ（Ｇαｓβ１γ２）、及び非脂質化Ｇβγ（Ｇβ１γ２）であった。これらのアッセイで使用した結合タンパク質の濃度を２５μＭに標準化し、これは、β１ＡＲ９６へのＮｂ８０結合の平衡解離定数（ＫＤ）をおよそ３０倍上回る。いずれの親和性データもＧｓに利用可能ではなかったが、我々は、この濃度がＫＤを少なくとも１０倍上回ると予想した。
【０２８８】
異種競合結合アッセイを使用して、アンタゴニスト３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（３Ｈ−ＤＨＡ）とアゴニストイソプレナリンとの間の競合を測定した。阻害定数（Ｋｉ）値を、飽和結合実験（図２を参照のこと）から導出された３Ｈ−ＤＨＡの解離定数（Ｋｄ）を使用して計算した。最初に、野生型様シチメンチョウβ１ＡＲ構築物９７（β１ＡＲ−ＷＴ）をアッセイした（表１を参照のこと）。この構築物は、結合パートナーの不在下で４０±０ｎＭのイソプレナリンＫｉを有した。Ｋｉは、それぞれ、Ｎｂ８０、Ｇｓ、またはＧｓ−Ｎｂ３５に応答して、５．８±０．８ｎＭ（６．９倍）、１７±２ｎＭ（２．４倍）、または６．８±０．６ｎＭ（５．９倍）にシフトした（図３ａ）。アゴニスト親和性のシフトがβ１ＡＲ−ＷＴの場合に比較的小さかったため、我々は、次に、前述の変異３、９６のうちのいくつかを含む最小熱安定化構築物（β１ＡＲ−８４）を試験した（表１を参照のこと）。この構築物は、その非共役状態で著しく低いイソプレナリンＫｉ（２．６±０．３μＭ）を有したが、結合パートナーに応答してβ１ＡＲ−ＷＴよりも大きなシフトをもたらした。Ｎｂ８０、Ｇｓ、またはＧｓ−Ｎｂ３５への共役は、Ｋｉを、それぞれ、２８±１ｎＭ（９３倍）、２７１±５４ｎＭ（９．６倍）、または１６±４ｎＭ（１６３倍）にシフトした（図３ｂ）。競合結合曲線は、単一部位結合パラメータに最も良好に当てはまった。したがって、いくつかの結合パートナー（Ｇｓ等）について観察されたアゴニスト親和性の部分的シフトは、部分的共役または混合受容体集団を示すのではなく、高親和性アゴニスト結合状態の不完全な安定化を反映する可能性が高い。これらの結果は、非脂質化Ｇｓがβ１ＡＲに共役することができたが、その複合体を安定化し、かつＮｂ８０に対するアゴニスト結合親和性における同等の応答を解明するためにＮｂ３５が必要であったことを示した。β１ＡＲ−８４を使用した競合結合アッセイはβ１ＡＲ−ＷＴよりも感受性であり、それ故に、高親和性アゴニスト結合状態を安定化する異なる結合パートナーの能力のわずかな差異を区別するのに有用であった。
【０２８９】
Ｇαｓ  ＧαＧＴＰａｓｅドメインの単離及びβ１ＡＲ−８４への結合の測定。
β２ＡＲ−Ｇｓ複合体１０の構造により、Ｇｓ由来のＧαＧＴＰａｓｅドメインのみが受容体との著しい相互作用を形成することが明らかになった（図４を参照のこと）。我々は、ＧαＡＨに対応する配列を短いグリシンリンカーで置換することによってＧＴＰａｓｅドメインを遺伝子レベルで単離した（表２を参照のこと）。ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７と名付けたこの構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉで十分に発現せず、均質に精製することができず、それが非常に不安定であることを示した。それにもかかわらず、少量のタンパク質（約２００μｇ／Ｌの培養物）をおそよ１０〜２０パーセントの純度で調製することができた（図５を参照のこと）。ＧαＧＴＰａｓｅ及びＧαｓ由来のＧαＡＨドメインが、グアニンヌクレオチド結合及び加水分解４１におけるそれらの役割を決定するために独立したタンパク質として以前に表現されているが、ＧＰＣＲに共役するそれらの能力はこれまでに調査されていない。我々は、Ｇβγ−Ｎｂ３５の存在下または不在下のいずれかでの２０℃の競合結合アッセイにおけるβ１ＡＲ−８４に共役するｍｉｎｉ−Ｇｓ７７の能力を試験した。β１ＡＲ−８４（２．６±０．３μＭ）のアゴニスト結合親和性の著しいシフトがｍｉｎｉ−Ｇｓ７７（１．９±０．２μＭ）の存在下で観察されなかったが、ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７−Ｇβγ−Ｎｂ３５は、３．６±０．８ｎＭ（７１８倍）へのシフトをもたらした（図３ｃ）。これは、部分的に精製されたＧαＧＴＰａｓｅドメインが機能的であることを実証したが、それがＧβγサブユニットの不在下でβ１ＡＲ−８４に共役することができなかったことも示唆した。しかしながら、本アッセイを４℃で繰り返したときに、ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７に応答した非共役受容体の２．１±０．２μＭ（４℃）から９９±１２ｎＭ（２１倍）へのアゴニストＫｉの著しいシフトを観察した（図３ｄ）。これは、単離ＧαＧＴＰａｓｅドメインがＧβγサブユニットの不在下でβ１ＡＲ−８４に結合することができたことを実証したため、重要な結果であった。熱安定性が受容体の高親和性アゴニスト結合状態を安定化するその能力の限定因子であったことも示唆した。
【０２９０】
β１ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の熱安定化。
我々は、β１ＡＲと複合したｍｉｎｉ−Ｇｓを熱安定化した。変異体を、４℃及び２０℃の両方での競合結合アッセイを使用してスクリーニングした。変異体の低く可変の発現レベルのため、これらのアッセイで使用した濃度を標準化することは不可能であった。代わりに、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物１Ｌから精製された全ｍｉｎｉ−Ｇｓを競合曲線毎に使用した（表３）。およそ１００個の変異体を初期スクリーニング中に試験した。β１ＡＲ−８４のアゴニスト親和性をいずれかの温度で親ｍｉｎｉ−Ｇｓ構築物（ｍｉｎｉ−Ｇｓ７７）と比較して２倍超でシフトした変異を陽性に分類した。１１個の固有の位置を網羅する合計１４個の変異を特定した（表３）。
【０２９１】
修飾Ｎ末端及びリンカー領域（表２を参照のこと）を含む新たな親構築物（ｍｉｎｉ−Ｇｓ１６１）を使用して、変異を組み合わせた。陽性変異を第１のスクリーニングラウンドからの最良の変異のうちの１つ（Ａ２４９Ｄ）と組み合わせ、β１ＡＲ−ＷＴと複合したそれらの安定性を、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＤＭ）洗剤における熱安定性アッセイを使用して試験した。アゴニスト３Ｈ−ノルエピネフリン（３Ｈ−ＮＥ））をＴｍアッセイに使用したが、このリガンドに関連する高いバックグラウンドシグナルのため、２００ｎＭの最大濃度を本アッセイで使用することもあり得た。これは、非共役β１ＡＲ−ＷＴのＫｉとほぼ等しかったが、Ｎｂ８０またはＧｓ−Ｎｂ３５と複合体化したβ１ＡＲ−ＷＴのＫｉをおよそ２５０倍上回った（図７を参照のこと）。したがって、非共役β１ＡＲ−ＷＴについて見積もられたＴｍ値は、不飽和アゴニスト条件下であるが、より高いアゴニスト親和性を有するβ１ＡＲ−ＷＴ複合体は、アゴニスト飽和条件下である。
【０２９２】
Ａ２４９Ｄ変異体（ｍｉｎｉ−Ｇｓ１６２）は、２５．１℃の見かけのＴｍを有し（表４）、これは、非共役β１ＡＲ−ＷＴの見かけのＴｍ（２５．９℃）よりも低かった。Ａ２４９Ｄ変異及びスイッチＩＩＩ欠失を含む二重変異体（ｍｉｎｉ−Ｇｓ１６４）は、本複合体の見かけのＴｍを２８．６℃に上昇させた。Ｇ４９Ｄ、Ｅ５０Ｎ、Ｓ２５２Ｄ、及びＬ２７２Ｄ変異の付加により、同様の見かけのＴｍ値がもたらされた（二重変異体の０．２℃以内）。これらの６つの変異を、膜包埋β１ＡＲ−８４のアゴニスト親和性へのそれらの個別のプラスの効果のため、最終構築物で利用した（表３）。第１のスクリーニングラウンドからの他の陽性変異のいずれも本複合体のＴｍをさらに上昇させなかったため、それらを拒否した。示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価されるように、Ｌ２７２Ｄを除く全ての組み合わせも、基礎ＧＤＰ結合状態のＴｍを上昇させた（表４）。
【０２９３】
うまく組み合わせられた６つの変異のうちの５つが、ヌクレオチド結合ポケット及びリン酸塩結合ループ（Ｐループ）の周囲でクラスター化した（図６ｂ）。Ａ２４９Ｄ変異を、ヌクレオチド結合ポケットのベースを安定化するために、Ｌｙｓ−２９３及びＳ２５１と相互作用するように設計した。ＧＰＣＲ結合立体構造において不規則であるスイッチＩＩＩの欠失は、この柔軟なループをＡｒｌ−２９８で見られる定義された二次構造要素（αヘリックス、３１０ヘリックス、及びベーターターン）で置換することによって、ｍｉｎｉ−Ｇｓを安定化するよう意図されたものであった。Ｓ２５２Ｄ変異を、Ａｒｇ−２６５との潜在的相互作用により、スイッチＩＩＩの周囲の領域を安定化するようにも設計した。Ｐループに位置するＧ４９Ｄ及びＥ５０Ｎ変異を、それぞれ、Ａｒｇ−２６５及びＬｙｓ−２９３との潜在的相互作用により、柔軟性を低減し、かつこの領域を立体構造的に制約するように設計した。第６の変異（Ｌ２７２Ｄ）を、そのＮ末端領域内の荷電及び極性残基（２２７〜２３３）のクラスターとの潜在的相互作用により、スイッチＩＩを立体構造的に制約するように設計した（図６ｃ）。
【０２９４】
洗剤中のβ１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体を安定化する変異のスクリーニング
第１のスクリーニングラウンドからの６つの安定化変異を含むｍｉｎｉ−Ｇｓ１８３は、洗剤可溶化β１ＡＲ−ＷＴを完全に安定化することができなかった。Ｎｂ８０またはＧｓ−Ｎｂ３５の複合体は、それぞれ、ｍｉｎｉ−Ｇｓ１８３よりも高い見かけのＴｍ値３．３℃または７．１℃を有した（表４）。したがって、およそ１５０個の変異体の第２のパネルを、変異誘発を使用して、その受容体結合立体構造におけるＧｓの構造１０に基づいて設計した。これらの変異を、修飾リンカー領域を有する親構築物でスクリーニングした（表２を参照のこと）。我々は、洗剤中での本複合体の安定性を増加させた４つのさらなる変異を特定した（表４）。最良の変異体（Ｉ３７２Ａ）は、本複合体の見かけのＴｍを２９．２℃から３４．０℃に増加させ、Ｖ３７５Ｉと付加して組み合わせて、３５．０℃の見かけの最終Ｔｍを得た。これは、Ｎｂ８０よりも３．０℃高く、Ｇｓ−Ｎｂ３５よりも０．８℃だけ低かった。すべての洗剤安定化変異は、ＧＤＰ結合し立体構造におけるｍｉｎｉ−Ｇｓの安定性を減少させた（表４）。
【０２９５】
洗剤安定化変異は、α１−α５ヘリックス界面の周囲に位置した。ＧＴＰ結合構造８１とのＧＰＣＲ結合立体構造１０におけるＧαｓのアライメントは、Ｉｌｅ−３７２（α５ヘリックス内）と残基Ｍｅｔ−６０及びＨｉｓ−６４（α１ヘリックス内）との間の立体衝突を明らかにした（図６ｄ）。この衝突は、タンパク質のコアを溶媒に曝露するＧαＧＴＰａｓｅドメインのコアに対するα１ヘリックスのＣ末端領域の密接充填を防止するように見える。Ｉ３７２Ａ変異を、この衝突を排除し、かつこの領域においてより良好な充填を促進するように設計した。Ｖ３７５Ｉ変異を、α５ヘリックスとＧＰＣＲ結合立体構造におけるタンパク質のコアとの間の充填を改善するように設計した（図６ｅ）。この研究の経過中、Ｉ３７２Ａ変異もロドプシン−Ｇｉ１複合体９２を安定化すると独立して報告された。
【０２９６】
ｍｉｎｉ−Ｇｓの検証
洗剤安定化構築物（ｍｉｎｉ−Ｇｓ３４５）を、リンカーを変化させ、かつＮ末端を短縮することによって、結晶学的用途のために修飾した（表２を参照のこと）。最終安定化構築物を、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３と名付けた（図８を参照）。この構築物は、Ｎｂ８０またはＧｓ−Ｎｂ３５のいずれかと同等またはそれよりも大きいアゴニスト親和性のシフトを解明することができた（図９ａ〜ｃ）：膜包埋β１ＡＲ−ＷＴ（それぞれ、５．８±０．８ｎＭまたは６．８±０．６ｎＭと比較して、４．１±１．１ｎＭ）、膜包埋β１ＡＲ−８４（それぞれ、２８±１ｎＭまたは１６±４ｎＭと比較して、３．６±０．０ｎＭ）、及びＤＤＭ可溶化β１ＡＲ−８４（それぞれ、８３±２ｎＭまたは２３±７ｎＭと比較して、４．７±０．４ｎＭ）。これらのデータは、ｍｉｎｉ−Ｇｓが、Ｎｂ８０もしくはＧ−Ｎｂ３５のいずれかと同等に、またはそれよりも良好に、β１ＡＲの高親和性アゴニスト結合状態を安定化することができたことを実証する。さらに、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３に結合した膜包埋β１ＡＲ−８４または洗剤可溶化β１ＡＲ−８４のアゴニスト結合親和性の有意差はなかった。これは、受容体の薬理学的応答が脂質環境下または洗剤環境下のいずれかで同一であることを実証する。
【０２９７】
ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３をＥ．ｃｏｌｉで高度に発現させ、これを培養物１リットル当たり１００ｍｇの収率で精製し、１００ｍｇ／ｍＬ超で濃縮することができた（図９ｄ）。分析的ゲル濾過を使用して、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３がラウリルマルトースネオペンチルグリコール（ＬＭＮＧ）洗剤中の精製β１ＡＲ−ＷＴに結合することができたことを実証した。ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３とβ１ＡＲ−ＷＴとの１：１の化学量論的混合物は、それぞれ、β１ＡＲ−ＷＴまたはｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３の１３．６ｍＬまたは１７．１ｍＬと比較して、１３．２ｍＬの保持体積を有する優性ピークとして分解した（図９ｅ）。この結果は、これらの結合アッセイが洗剤中の精製タンパク質間の安定した複合体の形成と相関したことを明らかに実証した。さらに、Ｎ末端残基６〜２５を置換し、かつＬ２７２Ｄ変異を逆転させた構築物であるｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９（表２を参照のこと）は、Ｇβγとヘテロ三量体を形成するその能力を保持した。ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９とＧβ１γ２との１：１の化学量論的混合物は、ぞれぞれ、Ｇβγまたはｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９の１５．８ｍＬまたは１６．４ｍＬと比較して、１４．６ｍＬの保持体積を有する単一ピークとして分解した（図９ｆ）。この特性は、より大きいｍｉｎｉ−Ｇｓヘテロ三量体が好ましい用途（低温電子顕微鏡法）に、またはＧタンパク質活性化におけるＧβγの役割の研究に有用であり得る。
【０２９８】
β１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３複合体の安定性を、いくつかの異なる洗剤中で試験した。ＤＤＭ等のより長鎖の洗剤中で、β１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３複合体は、３４．１℃の見かけのＴｍを有し、これは、非共役β１ＡＲ−ＷＴよりも８．２℃高かった。ＤＤＭ中で、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３の安定性は、Ｇｓ−Ｎｂ３５よりもわずかに低かった（１．７℃）が、Ｎｂ８０よりもわずかに高かった（２．１℃）（図１０ａ）。同様のパターンがｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）で観察され、β１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３複合体は、３０．５℃の見かけのＴｍを有し、これは、β１ＡＲ−ＷＴよりも１０．１℃高かった。Ｄｍ中で、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３の安定性は、Ｇｓ−Ｎｂ３５よりもわずかに低かった（０．６℃）が、Ｎｂ８０よりもわずかに高かった（１．９℃）（図１１ａを参照のこと）。ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＯＧ）等の短鎖洗剤中で、β１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３複合体は、１９．７℃の見かけのＴｍを有し、これは、Ｇｓ−Ｎｂ３５（６．１℃）またはＮｂ８０（５．４℃）のいずれよりも安定していた（図１０ｂ）。同様のパターンがｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＧ）で観察され、β１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３複合体は、２４．７℃の見かけのＴｍを有し、これは、Ｇｓ−Ｎｂ３５（５．７℃）またはＮｂ８０（８．０℃）のいずれよりも安定していた（図１１ｂを参照のこと）。非共役β１ＡＲ−ＷＴは、ＮＧまたはＯＧのいずれか中での可溶化後に完全に不活性になり、かなりの熱安定性がｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３共役によって受容体に与えられたことを示した。ＮＧもＯＧもいずれも、蒸気拡散結晶化に好適な洗剤であり、これがＧＰＣＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の構造決定のための実行可能なアプローチであることを強調する。
【０２９９】
変異体のヌクレオチド結合特性をこの研究で広範囲にわたって研究しなかったが、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３を含むβ１ＡＲ−８４複合体が、ＧＴＰ媒介解離に完全に耐性を示したという１つの興味深い観察が行われた（図１０ｃ及び図１０ｄ）。ＧＴＰγＳを、正常ヒト細胞９９におけるＧＴＰの生理学的範囲内である０．２５ｍＭの濃度で（複合体形成後に）競合結合アッセイに添加した。非共役β１ＡＲ−８４は、ＧＴＰγＳの存在下で３．０±０．１μＭのイソプレナリンＫｉを有した。
【０３００】
ＧＴＰγＳでの本複合体の処理は、Ｇｓによって誘導されるアゴニスト結合親和性のシフトを２７１±５４ｎＭから２．７±０．１μＭに完全に逆転させた（図１０ｃ）。ｍｉｎｉ−Ｇｓ４０４によって誘導されたアゴニスト結合親和性のシフト（Ｉ３７２Ａ及びＶ３７５Ｉ変異が逆転したことを除いてｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３と同一の構築物）（表２を参照のこと）は、ＧＴＰγＳによってほぼ完全に逆転した（１８±２ｎＭから７００±６０ｎＭ）。しかしながら、ＧＴＰγＳの存在下または不在下のいずれかでのβ１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３複合体のアゴニスト結合親和性に有意差はなかった（５．２±０．７ｎＭと比較して、３．６±０．０ｎＭ）。ＧＴＰγＳへのこの無応答性をＩ３７２Ａ変異トレースし、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３８９（Ｖ３７５Ｉ変異が逆転したことを除いてｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３と同一の構築物）（表２を参照のこと）がｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３とほぼ同一の様式で挙動した（図１２を参照のこと）。したがって、Ｉ３７２Ａ変異は、ＧＰＣＲ結合からヌクレオチド結合ポケットの占有を脱共役するように見える（考察を参照のこと）。これは、生存細胞における安定したＧＰＣＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の形成を可能にし得るため、興味深い所見である。ＧＰＣＲ上でのｍｉｎｉ−Ｇｓ３９３共役の熱安定化効果と組み合わせて、これは、従来の技法を使用して精製するには不安定なＧＰＣＲの可溶化及び精製を可能にし得る。
【０３０１】
考察
活性様立体構造においてＧＰＣＲを安定化及び結晶化するためのいくつかの新規のアプローチが開発されており、これらには、Ｇタンパク質由来ペプチド３６、３７、Ｇタンパク質模倣ナノボディ３８、１００、１０１、及びナノボディ安定化ヘテロ三量体Ｇタンパク質１０との複合体化が挙げられる。しかしながら、これらのアプローチは、Ｇタンパク質由来ペプチドがヘテロ三量体Ｇタンパク質と同じ立体構造変化を受容体に誘導するようには見えず、Ｇタンパク質模倣ナノボディが天然ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質界面を再作製することができず、ヘテロ三量体Ｇタンパク質複合体が、大きく、動的であり、洗剤中で不安定であり、それらを結晶化に特に困難な対象にするため、理想的ではない。したがって、我々は、天然様ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体のハイスループット結晶化に従順な最小Ｇタンパク質を設計した。近年、我々は、３．４Åの分解能で野生型ヒトアデノシンＡ２ａ受容体と複合したｍｉｎｉ−Ｇｓの構造を解いた（実施例４を参照のこと）。Ａ２ａ複合体の分子組織は、β２ＡＲ−Ｇｓ複合体１０の分子組織と非常に類似しており、それが天然シグナル伝達複合体の正確な反映であることを強く示唆する。
【０３０２】
Ｇタンパク質操作研究により、Ｇタンパク質活性化の機構に関する特有の見識も提供された。我々は、受容体結合立体構造内のα１ヘリックスとα５ヘリックスとの間の立体衝突を特定し、これは、ＧαＧＴＰａｓｅドメインのコアに対するα１ヘリックスの密接充填を防止するように見える（図６ｄ）。ＧＰＣＲによるα１ヘリックスのアロステリック不安定化が、ＧαＧＴＰａｓｅ−ＧαＡＨドメイン界面の開口及びヌクレオチド結合ポケットの不安定化における主要な事象であり得ることが以前に示唆されている８９、９０、９２。我々は、α１ヘリックスとα５ヘリックスとの間の立体衝突を排除すると予測されたＩｌｅ−３７２のアラニンへの変異が、複合体のＧＴＰ媒介解離をほぼ完全に阻止したことを実証した。これらのデータは、Ｉｌｅ−３７２がＧＰＣＲ結合部位とヌクレオチド結合ポケットとの間の主要な中継であり、かつその変異がＧＰＣＲ結合をヌクレオチド占有から効果的にアン共役することを示す。シグナル伝達における主要な残基としてのＩｌｅ−３７２の特定は、Ｇタンパク質活性化の機構を研究するためのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質、具体的には、最小安定化変異体の多用途性も実証する。
【０３０３】
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は、受容体薬理学の特徴付け、結合反応速度研究、それらの活性立体構造におけるＧＰＣＲの熱安定化、創薬、及び天然様ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の結晶化を含む、多くの潜在的な用途を有する新規のツールである。さらに、本明細書に報告される変異は全て、Ｇαサブユニットの保存領域内に位置する。したがって、この概念は、任意のＧＰＣＲに共役することができるｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のパネルの産生を可能にするであろうヘテロ三量体Ｇタンパク質の全てのクラスに移行可能であると考えられる。
【０３０４】
材料及び方法
この研究で使用した全ての構築物のクローニング詳細を表１及び表２に提供する。部位特異的変異誘発を、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。挿入及び欠失を、前述の方法１０２の修正版を使用して行った。
【０３０５】
Ｇタンパク質のバキュロウイルス発現。Ｇタンパク質遺伝子を、移送ベクターｐＢａｃＰＡＫ８（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングし、バキュロウイルスを、ｆｌａｓｈＢＡＣ  ＵＬＴＲＡシステム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製した。Ｔｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、５ＬのＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆｌａｓｋ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）内のＥＳＦ９２１無血清培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で成長させた。感染直前に、熱不活性化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を添加して、最終濃度５％にした。細胞を最終濃度３％で第３継代のウイルスに感染させた。複数のウイルスとの共感染（ヘテロ三量体ＧｓまたはＧβγ）の場合、各ウイルスを添加して、最終濃度３％にした。培養物の最終体積は、１フラスコ当たり３Ｌであり、最終細胞密度は、３×１０６細胞／ｍＬであった。感染の４８時間後に細胞を５０００ｇで５分間の遠心分離によって収集し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【０３０６】
非脂質化Ｇαｓの精製。６Ｌの昆虫細胞培養物由来の細胞ペレットを、４００ｍＬの緩衝液Ａ（３０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのイミダゾール、５０μＭのＧＤＰ）中に再懸濁させた。ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、ペプスタチン−Ａ（２．５μＭ）、ロイペプチン（１０μＭ）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ（５０μｇ／ｍＬ）、及びＤＴＴ（１００μＭ）を添加した。細胞を超音波処理（７０％振幅で１０分間）によって分解し、遠心分離（３８，０００ｇで１時間）によって浄化した。上清を５ｍＬのＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に５ｍＬ／分で装填した。カラムを、２５ｍＬの緩衝液Ａ、５０ｍＬの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）、及び２５ｍＬの緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）で、５ｍＬ／分で連続して洗浄した。カラムを、２５ｍＬの緩衝液Ｄ（２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）で溶出した。溶出液を、緩衝液Ｅ（２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ、１ｍＭのＤＴＴ）中２５０ｍＬに希釈し、５ｍＬのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に５ｍＬ／分で装填した。カラムを５０ｍＬの緩衝液Ｅで洗浄し、（緩衝液Ｅ中）５０〜３００ｍＭのＮａＣｌの線形勾配で溶出した。ピーク画分をプールし、ＴＥＶプロテアーゼを添加して、１：２０ｗ／ｗ（ＴＥＶ：Ｇαｓ）の最終比を得た。この試料を、１Ｌの緩衝液Ｆ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＧＤＰ）に対して一晩透析した。イミダゾール（２０ｍＭ）及びＮｉ−ＮＴＡ樹脂（４ｍＬ）を試料に添加し、１時間混合した。混合物を、１ｍのＮｉ−ＮＴＡ樹脂を含有する使い捨てカラム上に注ぎ、貫流物を収集した。カラムを１０ｍＬの緩衝液で洗浄し、この洗浄物を貫流物とともにプールした。プールした試料を、１０ＫＤａのＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１．５ｍＬに濃縮した。この試料を、緩衝液Ｇ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＧＤＰ、０．１ｍＭのＴＣＥＰ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ２６／６００ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。ピーク画分をプールし、５０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。純粋なタンパク質をアリコートし、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なＧαｓ６．５ｍｇであった。
【０３０７】
非脂質化Ｇｓヘテロ三量体の精製。非脂質化ヘテロ三量体Ｇｓの精製を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを２５ｍＬの代わりに５０ｍＬの緩衝液Ｃで洗浄し、緩衝液Ｄが５００ｍＭの代わりに３００ｍＭのイミダゾールを含有し、緩衝液Ｄ及びＥのｐＨが９．０の代わりに８．５であり、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを５０〜３００ｍＭの代わりに５０〜２００ｍＭのＮａＣｌの線形勾配で溶出し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム由来の画分を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム上に装填した代わりに、ＴＥＶ切断ステップを行わなかったことを除いて、本質的に非脂質化Ｇαｓについて記載されるように行った。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なＧｓ７ｍｇであった。
【０３０８】
非脂質化Ｇβγ二量体の精製。非脂質化Ｇβγ二量体の精製を、ＧＤＰを全ての緩衝液から除き、ＭｇＣｌ２を緩衝液Ｂ〜Ｇから除き、緩衝液Ｂ及びＣが３００ｍＭの代わりに２５０ｍＭのＮａＣｌを含有し、緩衝液Ｄが５０ｍＭの代わりに２５ｍＭのＮａＣｌを含有し、緩衝液Ｄが５００ｍＭの代わりに３００ｍＭのイミダゾールを含有し、緩衝液Ｅ及びＦに１ｍＭのＥＤＴＡを補充し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを５０〜３００ｍＭの代わりに２５〜２００ｍＭのＮａＣｌの線形勾配で溶出し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム由来の画分を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム上に装填した代わりに、ＴＥＶ切断ステップを行わなかったことを除いて、本質的に非脂質化Ｇαｓについて記載されるように行った。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なＧβγ７．５ｍｇであった。
【０３０９】
ナノボディの発現及び精製。Ｎｂ８０及びＮｂ３５の合成遺伝子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でのペリプラズム発現のためにｐＥＴ２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。細胞を超音波処理（７０％振幅で１０分間）によって溶解した。Ｎｂ８０をＩＭＡＣ及びゲル濾過によって精製し、典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なタンパク質１２ｍｇであった。Ｎｂ３５を、ＩＭＡＣ、カチオン交換クロマトグラフィー、及びゲル濾過によって精製し、典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なタンパク質２６ｍｇであった。
【０３１０】
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の発現及び精製（スクリーニングのため）。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質変異体をｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でクローニングした。発現をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬで行った。細胞を、グルコース（０．１％）を補充した２ＴＹ培地中で成長させた。培養物をＩＰＴＧ（１００μＭ）で、１５℃で２０時間にわたって誘導した。細胞を超音波処理（７０％振幅で２分間）によって溶解した。変異体をＩＭＡＣによって部分的に精製した。イミダゾールをＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で除去し、試料を２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。部分的に純粋なタンパク質をアリコートし、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【０３１１】
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の発現及び精製（最終プロトコル）。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質構築物で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ細胞を、グルコース（０．２％）及びＭｇＳＯ４（５ｍＭ）及び消泡剤（０．０１％）を補充したＴＢ培地内で成長させた。細胞を２Ｌのバッフルフラスコ（Ｓｉｍａｘ）内で培養し、１４０ｒｐｍで振盪した。ＯＤ６００が０．８に到達するまで培養物を３０℃で成長させた。発現をＩＰＴＧ（５０μＭ）で誘導し、温度を２５度に低下させた。誘導の２０時間後に細胞を５０００ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【０３１２】
１Ｌの培養物由来の細胞ペレットを、２００ｍＬの緩衝液Ａ（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）中に再懸濁させた。ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、ペプスタチン−Ａ（２．５μＭ）、ロイペプチン（１０μＭ）、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔａｂｌｅｔｓ、ＤＮａｓｅ  Ｉ（５０μｇ／ｍＬ）、及びＤＴＴ（１００μＭ）を添加した。細胞を超音波処理（７０％振幅で１０分間）によって分解し、遠心分離（３８，０００ｇで４５分間）によって浄化した。上清を１０ｍＬのＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム上に５ｍＬ／分で装填した。カラムを、１００ｍＬの緩衝液Ｈ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）で、５ｍＬ／分で洗浄した。カラムを、３０ｍＬの緩衝液Ｉ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）で溶出した。ＴＥＶプロテアーゼを添加して、１：２０ｗ／ｗ（ＴＥＶ：Ｇαｓ）の最終比を得た。ＤＴＴ（１ｍＭ）を添加し、試料を２Ｌの緩衝液Ｊ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＧＤＰ）に対して一晩透析した。イミダゾール（２０ｍＭ）及びＮｉ−ＮＴＡ樹脂（４ｍＬ）を試料に添加し、１時間混合した。混合物を、１ｍのＮｉ−ＮＴＡ樹脂を含有する使い捨てカラム上に注ぎ、貫流物を収集した。カラムを１０ｍＬの緩衝液で洗浄し、この洗浄物を貫流物とともにプールした。プールした試料を１．５ｍＬに濃縮し、緩衝液Ｋ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＧＤＰ、０．１ｍＭのＴＣＥＰ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ２６／６００ゲル濾過カラム上に装填した。ピーク画分をプールし、１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。純粋なタンパク質をアリコートし、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なタンパク質１００ｍｇであった。
【０３１３】
飽和結合アッセイ。β１ＡＲを発現する昆虫細胞を、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した１ｍＬのアッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁させた。細胞を、曲げ２６Ｇ針を１０回通過させることによって分解した。細胞残屑を遠心分離（４℃及び３０００ｇで５分間）によって除去した。上清を希釈し、試料毎に２×０．９６ｍＬのアリコートを得た。アルプレノロール（１２０μＬ）を陰性試料に添加し（最終濃度１ｍＭ）、アッセイ緩衝液（１２０μＬ）を陽性試料に添加した。試料をＰＣＲプレート中にアリコートした（１２×１０８μＬ）。［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノロール（１２μＬ）を各ウェルに添加した（２．５ｎＭ〜２．５６μＭの範囲の最終濃度を得た）。資料を混合し、２０℃で２時間インキュベートした。試料（２×５０μＬの二連物）を、ＰＥＩ（０．１％）を予め浸漬した９６ウェルガラス繊維濾過プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して真空濾過した。各ウェルをアッセイ緩衝液で洗浄した（３×２００μＬ）。フィルターを乾燥させ、穿孔してシンチレーションバイアル内に入れ、４ｍＬのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチラント（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加した。放射活性を、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してシンチレーション計数（１試料当たり１分間）によって定量化した。陰性試料のデータを陽性試料から差し引いた。データをグラフ（Ｐｒｉｓｍ）でプロットし、Ｋｄ値を一部位飽和結合分析から導出した。
【０３１４】
競合結合アッセイ。β１ＡＲを発現する昆虫細胞を、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した１ｍＬのアッセイ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのアスコルビン酸塩）中に再懸濁させた。細胞を、曲げ２６Ｇ針を１０回通過させることによって分解した。細胞残屑を遠心分離（４℃及び３０００ｇで５分間）によって除去した。上清を希釈し、試料毎に１．６８ｍＬの単一アリコートを得た。結合パートナー（２４０μＬ）を添加した（最終濃度２５μＭ）。混合物を２０℃の０．２ｍＬのＰＣＲプレート中にアリコートした（１７×９６Ｌ）。１Ｕ／ｍＬのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液中で調製したイソプレナリン（１２μＬ）を各ウェルに添加した（１ｐＭ〜１０ｍＭの範囲の最終濃度）。アルプレノロール（１２μＬ）を陰性試料に添加した（最終濃度１００μＭ）。試料を混合し、２０℃で１．５時間インキュベートした。［３Ｈ］−ジヒドロアルプレノール（１２μＬ）を各ウェルに添加した（最終濃度５ｎＭ（β１ＡＲ−ＷＴ）または２０ｎＭ（β１ＡＲ−８４））。試料を混合し、２０℃で１．５時間インキュベートした。試料（２×５０μＬの二連物）を飽和結合アッセイプロトコルに記載される通りに真空濾過した。データをグラフでプロットし、Ｋｉ値を一部位適合Ｋｉ分析から導出した。
【０３１５】
洗剤可溶化β１ＡＲ−８４を使用した競合結合アッセイを、全てのステップを４℃で行い、膜を結合パートナーの添加前にＤＤＭ（最終濃度０．１％）で３０分間可溶化し、遊離リガンドからの結合分離（ゲル濾過による）を熱安定性アッセイプロトコルに記載される通りに行ったことを除いて、同様のプロトコルを使用して行った。
【０３１６】
β１ＡＲ−ＷＴ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の熱安定性測定。野生型β１ＡＲ−ＷＴを発現する昆虫細胞を、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した１ｍＬのアッセイ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのアスコルビン酸塩、０．１％ＢＳＡ、０．００４％バシトラシン）中に再懸濁させた。細胞を、曲げ２６Ｇ針を１０回通過させることによって分解した。細胞残屑を遠心分離（４℃及び３０００ｇで５分間）によって除去した。上清を希釈し、試料毎に２×０．７８ｍＬのアリコートを得た。ノルエピネフリン（１２０μＬｌ）を陰性試料に添加し（最終濃度２００μＭ）、アッセイ緩衝液（１２０μＬ）を陽性試料に添加した。結合パートナー（１２０μＬ）を両方の試料に添加した（最終濃度２５μＭ）。１Ｕ／ｍＬのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液中で調製した３Ｈ−ノルエピネフリン（１２０μＬ）を両方の試料に添加した（最終濃度２００ｎＭ）。試料を混合し、４℃で１時間インキュベートした。洗剤（６０μＬ）を両方の試料に添加した（最終濃度：  ＤＤＭ＝０．１％、ＤＭ＝０．１３％、ＯＧ＝０．８％）。試料を混合し、氷上で１時間インキュベートした。不溶性材料を遠心分離（４℃及び１７０００ｇで５分間）によって除去した。上清を０．２ｍＬのＰＣＲ管中にアリコートした（９×１２０μＬ）。各試料を所望の温度（４〜５０℃）まで正確に３０分間加熱し、その後、氷上で３０分間クエンチした。試料（２×５０μＬの二連物）を、予め平衡化（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２５％ＤＤＭ）し、かつ９６ウェル濾過プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に充填（２２５μＬの床体積）したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｆ樹脂に適用した。プレートを遠心分離（４℃及び１８００ｒｐｍで５分間）した。濾液をＩｓｏｐｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に移し、２００μＬのＯｐｔｉｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチラント（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を各ウェルに添加した。放射活性を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してシンチレーション計数（１ウェル当たり１分間）によって定量化した。陰性試料のデータを陽性試料から差し引いた。データをグラフでプロットし、見かけの融解温度（Ｔｍ）値をシグモイド用量応答（可変勾配）分析から導出した。
【０３１７】
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によるＧＤＰ結合ｍｉｎｉ−Ｇｓ変異体の熱安定性測定。ｍｉｎｉ−Ｇｓ変異体（３０μｇ）をアッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＧＤＰ、２ｍＭのＤＴＴ）で１３５μＬに希釈した。ＳＹＰＲＯ−ｏｒａｎｇｅ（１５μＬ）を２０倍ストック溶液から添加して、２倍の最終濃度を得た。試料を混合し、２×５０μＬのアリコート（二連）を０．２ｍＬのＰＣＲ管（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。熱安定性測定を、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。試料を２５℃で９０秒間平衡化した後に、４秒／℃で２５℃から９９℃に上昇させた。曲線の変曲点に対応する融解温度（Ｔｍ）を、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑソフトウェアを使用して分析から導出した。Ｔｍ値を、３つの独立した実験から平均±標準誤差として計算した。
【０３１８】
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体のゲル濾過分析。ｍｉｎｉ−Ｇｓ−βγ複合体を、ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９（Ｎ末端残基６〜２５が置換され、Ｌ２７２Ｄ変異が逆転した構築物（表２を参照のこと））を使用して調製した。精製ｍｉｎｉ−Ｇｓ３９９を非脂質化Ｇβ１γ２サブユニットと等モル比（各々６．７ｎｍｏｌ）で混合し、緩衝液Ｌ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＧＤＰ、０．１ｍＭのＴＣＥＰ）で２００μＬに希釈し、氷上で４時間インキュベートした。全試料（２００μＬ）を、緩衝液Ｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  １０／３００ゲル濾過カラム上に装填した。
【０３１９】
β１ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体を、ＬＭＮＧ洗剤中で精製した野生型β１ＡＲ−ＷＴを使用して調製した。精製β１ＡＲ−ＷＴ及びｍｉｎｉ−Ｇｓを等モル比（各々３．３ｎｍｏｌ）で混合し、緩衝液Ｍ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのアスコルビン酸、１μＭのイソプレナリン、０．００２％ＬＭＮＧ）で２００μＬに希釈し、氷上で４時間インキュベートした。全試料（２００μＬ）を、緩衝液Ｍで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  １０／３００ゲル濾過カラム上に装填した。
【０３２０】
実施例２：非脂質化Ｇｓのβ１ＡＲへの共役を検出するためのアッセイの開発
序文
無数の構造的及び生物物理学的データにより、Ｇタンパク質−ＧＰＣＲ複合体の高分解能構造を得ることが困難であると判明している理由についての手がかりが提供されており、ヌクレオチド不含Ｇタンパク質内の柔軟性が主な問題であるように見える７、２４、４２、６１。我々は、ＧＰＣＲに依然として共役するが、本複合体の結晶化をそれほど困難にした柔軟性の大半を除去する最小ＧＰＣＲ結合タンパク質を操作した。最初に、我々は、非脂質化Ｇｓのβ１ＡＲへの共役を検出することができるアッセイを開発した。次に、Ｇαｓ由来の単離ＧＴＰａｓｅドメインを発現させ、それがβγ二量体の不在下でさえもβ１ＡＲに共役することができたことを示した。しかしながら、ＧＴＰａｓｅドメインの産生は、不良な発現及び深刻な熱不安定性のため、困難であった。したがって、我々は、変異誘発スクリーニングを行い、基本的なグアニンヌクレオチド結合特性及びタンパク質の機能性を保持しながら単離ＧＴＰａｓｅドメインの発現及び安定性の両方を改善した変異を特定した。我々が発見した変異は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質間で十分に保存され、αサブユニットの４つ全てのクラスのメンバーへの移行が予想される。したがって、このアプローチを使用して、ほぼ全てのＧＰＣＲを共役することができるＧＴＰａｓｅドメインのレパートリーを産生することができる。本明細書において、活性化ＧＰＣＲに共役し、かつ高親和性アゴニスト結合状態に関連するコア薬理学的及び立体構造的変化を誘導する最小操作Ｇタンパク質アルファ（Ｍｉｎｉｍａｌ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｌｐｈａ、ＭＥＧＡ）ドメインの設計について説明する。
【０３２１】
結果
非脂質化Ｇｓのβ１ＡＲへの共役を検出するためのアッセイの開発
我々は、β１ＡＲ受容体を含む細胞膜への精製された非脂質化Ｇｓの共役を検出することができる競合結合アッセイ（実験手順を参照のこと）を開発した。最初に、我々は、Ｎｂ８０３８結合に応答してアゴニスト親和性の大幅な増加を示した受容体を特定するために、異なるβ１ＡＲ構築物をスクリーニングした。近接する野生型β１ＡＲ構築物（β６）は、イソプレナリンに対して比較的高い親和性（およそ１８０ｎＭ）を有し、これは、Ｎｂ８０結合に応答して３．５倍しか増加しなかった（図１３ａ）。しかしながら、一連の最小熱安定化受容体は、Ｎｂ８０結合に応答してはるかにより大きなシフトを示した。４つの熱安定化変異（実験手順を参照のこと）を含むこれらの構築物のうちの１つ（β８４）を選択して、Ｎｂ８０とＧｓとの共役をさらに特徴付けた。β８４は、イソプレナリンに対してはるかにより低い親和性（およそ７．１μＭ）を有したが、Ｎｂ  ８０結合時により著しいシフトを示し、およそ１６ｎＭの親和性をもたらした（図１３ｂ）。しかしながら、Ｇｓ共役は、およそ６．９μＭから１．４μＭへのアゴニスト親和性の小さいシフトしかもたらさなかった（図１３ｃ）。したがって、我々は、β２ＡＲ−Ｇｓ複合体７の結晶化を容易にするために使用したＮｂ３５の添加が、この複合体を安定化し、アゴニスト親和性のより大きなシフトをもたらすことができると仮定した。ここで、Ｎｂ８０で得た親和性と同様に、およそ６．９μＭから６８ｎＭのイソプレナリン親和性のシフトを観察した（図１３ｄ）。
【０３２２】
Ｇαｓの単離ＧＴＰａｓｅドメインの発現及び特徴付け
ＧＴＰａｓｅドメインをＧαｓから単離する最良の方法を見出すために、多数の構築物を試験した。このプロセスは、ヘリカルドメインのスイッチＩ領域内のその位置からの欠失を本質的に含んだ。評価した戦略は、（１）ヘリカルドメイン及びβ２ＡＲ−Ｇｓ複合体７の結晶構造において不規則であった任意の関連領域（残基５７〜２０７）の欠失、（２）ヘリカルドメイン（残基７０〜１９３）の欠失、及び近接する天然スイッチＩ領域を保持するための結果として生じる末端の短いグリシンリンカーとの連結、（３）ヘリカルドメイン及びスイッチＩ（残基６５〜２０３）の欠失、ならびに結果として生じる末端とより長いグリシンリンカーとの連結、（４）ヘリカルドメイン及びスイッチＩ（残基６７〜２０５）の欠失、ならびに構造的に関連した低分子量ＧＴＰａｓｅ由来のスイッチＩ領域の挿入であった。各戦略のいくつかの変形を試験したため、見積もった残基の範囲は近似値である。我々は、戦略（１）が受容体の不在下でのその安定性にとって不可欠なＧＴＰａｓｅドメインの領域を除去し、それ故に、不適切であったことを見出した。戦略２〜４は全て成功し、Ｅ．ｃｏｌｉ（およそ１００μｇ／Ｌの培養物）における少量の単離ＧＴＰａｓｅドメインの発現をもたらした。異なる構築物間の発現レベルは可変であったが、定量化は困難であった。概して、ヘリカルドメイン及びスイッチＩの完全な除去（戦略３）が最も高い発現レベルをもたらした。
【０３２３】
単離ＧＴＰａｓｅドメインをＥ．ｃｏｌｉから部分的に精製し、βを結合するβ１ＡＲに共役するその能力を、上述のアゴニストシフトアッセイを使用して決定した。第一に、我々は、ＧＴＰａｓｅドメインの共役を試験したが、親和性の増加は観察されなかった（図１４ａ）。第二に、我々は、βγサブユニット及びＮｂ３５の存在下でＧＴＰａｓｅドメインを試験し（図１４ａ）、ここで、親和性のシフト（およそ３．３μＭから２０６ｎＭ）が観察された。最後に、我々は、４℃でＧＴＰａｓｅドメインの共役を試験し（図１４ｂ）、ここで、親和性のシフト（およそ３．９μＭから２５３ｎＭ）が観察された。これは、単離ＧＴＰａｓｅドメインが活性であり、βγサブユニットの不在下で受容体に共役することができることを実証した。しかしながら、ＧＴＰａｓｅドメインが熱不安定であり、結晶化用途に好適な安定したタンパク質を産生するように操作される必要があることを示した。
【０３２４】
変異誘発によるＧＴＰａｓｅドメインの安定化
およそ５０個の修飾（変異、欠失、及びキメラ）の初期スクリーニングを行った。これらの修飾を、（低分子量ＧＴＰａｓｅｓと比較して）余分な配列を除去するか、ヌクレオチド結合部位を安定化するか、立体構造的に動的なスイッチ領域を制約するか、Ｇタンパク質の不活性状態を安定化するか、またはＧタンパク質の活性立体構造を安定化するように設計した。受容体と直接相互作用する領域に修飾を加えなかった。変異誘発に使用した親構築物は、Ｎ末端の２０個のアミノ酸欠失、ヘリカルドメインの完全欠失、及びわずかに修飾されたスイッチＩ領域の保持（実験手順を参照のこと）からなった。
【０３２５】
変異体をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ＩＭＡＣによって部分的に精製した。各修飾の安定化効果を推定するために、アゴニストシフトアッセイを４℃及び２０℃で行い、アッセイデータの要約を表５に提示する。変異体の発現レベルが広く異なったため、本アッセイに使用した各変異体の濃度を標準化することができなかった。代わりに、１リットルの培養物から精製されたタンパク質の全量を各アッセイに含めた。重要なことに、本アッセイに使用したタンパク質の濃度は、アゴニスト親和性のシフトの程度に影響を及ぼす。したがって、データは、発現レベルと安定化効果との組み合わせとして解釈されなければならない。単離ＧＴＰａｓｅドメインの発現及び／または安定性を劇的に改善した４つの主要な修飾（ΔスイッチＩＩＩ、Ａ２４９Ｄ、Ｌ２７２Ｄ、及びＨ４１Ｉ）を特定した（表５）。Ａ２４９Ｄ変異及びスイッチＩＩＩの欠失の両方が著しく改善された発現レベルをもたらし（およそ１〜２ｍｇ／Ｌの培養物）、Ｌ２７２Ｄ変異及びＨ４１Ｉ変異は、発現レベルを著しく改善しなかった。４℃でアッセイしたときに（表５）、全ての変異体がアゴニスト親和性の大きなシフトを誘導した（最終イソプレナリン親和性１０〜６０ｎＭ）。さらに、２０℃でアッセイしたときに（表５）、Ａ２４９Ｄ変異体及びΔスイッチＩＩＩ変異体は、アゴニスト親和性の大きなシフトを誘導した（最終イソプレナリン親和性５３ｎＭ及び３０ｎＭ）。２０℃でアッセイしたときに（表５）、Ａ２４９Ｄ変異体及びΔスイッチＩＩＩ変異体ほど大きくないが、Ｌ２７２Ｄ変異体及びＨ４１Ｉ変異体もアゴニスト親和性のシフトを誘導した（最終イソプレナリン親和性４６４ｎＭ及び５８９ｎＭ）。しかしながら、本アッセイに使用したＡ２４９Ｄ変異体及びΔスイッチＩＩＩ変異体の濃度がおよそ５倍高かったことに留意されたい。ＧＴＰａｓｅドメインの安定性を改善した４つの追加の変異（Ｇ４９Ｄ、Ｅ５０Ｎ、Ｇ２２６Ａ、及びＳ２５２Ｄ）も特定した（表５）。しかしながら、前述の部位へのこれらの変異の近接性は、それらの作用機構が同様である可能性が高いことを示し、それ故に、それらの付加特性が実験的に決定されなければならないことを示す。
【０３２６】
考察
ＧＰＣＲのそれらの完全活性立体構造における高分解能構造解は、新規のアゴニスト化合物の設計に極めて重要である。我々は、Ｇタンパク質αサブユニットの単離ＧＴＰａｓｅドメインを操作して立体構造的に活性なＧＰＣＲに共役させるための特有の戦略を開発した。
【０３２７】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、それらの脂質化膜結合状態５でＧＰＣＲに効率的に共役することができる。ＭＥＧＡドメインは、非脂質化変異体Ｇαサブユニットを含み、その受容体結合機構は、ホロ酵素の機構と同様であると予想される。したがって、ＭＥＧＡドメインの設計への必須条件は、非脂質化Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの共役を検出することができるアッセイの開発であった。最初に、我々は、非脂質化Ｇｓが、最小熱安定化β１ＡＲに対するアゴニスト親和性のわずかなシフトのみを誘導したことを見出した。しかしながら、β２ＡＲ−Ｇｓ複合体７の結晶化を容易にするために使用したＮｂ３５の添加により、はるかにより大きな応答がもたらされた。Ｎｂ３５は、スイッチＩＩ領域を立体構造的に制約し、かつα／βサブユニット界面を安定化することによって、Ｇタンパク質ヘテロ三量体の解離を阻害するように見える。したがって、Ｎｂ３５は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質三元複合体の立体構造動力を低減する可能性があり、異なる機構によるにもかかわらず、膜係留の安定化効果を模倣する可能性がある。
【０３２８】
我々は、ＧＴＰａｓｅドメインをＧｓから単離するいくつかの異なる戦略を評価した。我々は、ヘリカルドメイン及びスイッチＩの完全な除去がわずかにより良好な発現及び安定性をもたらしたことを見出した。最初に、我々は、ＧＴＰａｓｅドメインが、βγ二量体及びＮｂ３５の存在下でのみアゴニスト親和性の著しいシフトを誘導し、βγサブユニットが効率的な共役に依然として必要とされたことを示唆したことを見出した。しかしながら、我々は、βγ二量体及びＮｂ３５が単に熱不安定性ＧＴＰａｓｅドメイン２８を安定化するように作用することができると仮定した。したがって、我々は、本アッセイを４℃で繰り返し、ＧＴＰａｓｅドメインがβγ独立様式で受容体に効率的に共役することができたことを見出した。ＧＰＣＲは、Ｇαサブユニットで低レベルのヌクレオチド交換を触媒し得る４が、βγ二量体は、迅速な交換、ひいてはシグナル増幅を容易にするために必要とされている５６、５７。ヘリカルドメインの欠失により、βγ独立様式でＧＴＰａｓｅドメインの受容体への効率的な共役が可能になる。これは、恐らく、ＧＴＰａｓｅドメインからのより迅速なＧＤＰ解離に起因し、受容体へのより効率的な共役をもたらす。総じて、これらのデータは、受容体と単離ＧＴＰａｓｅドメインとの間の相互作用の機構がホロ酵素の機構と同様であることを示唆する。したがって、ＭＥＧＡドメインは、受容体の天然様立体構造変化を誘導する可能性があり、それ故に、Ｇタンパク質共役の真の模倣を表す。
【０３２９】
我々は、ＧＴＰａｓｅドメインの安定性及び発現を改善するための変異誘発を使用した。ＧＴＰａｓｅドメインの発現レベル及び／または安定性を劇的に改善したいくつかの主要な変異を特定し、その機構を以下で論じる。Ａ２４９Ｄ変異は、ＧＴＰａｓｅドメインの発現及び安定性の両方を改善した。低分子量ＧＴＰａｓｅにおいて、アスパラギン酸は、多くの場合、この位置に見られ、ここで、それは、塩−架橋相互作用によってＮＫＸＤモチーフのリジンを安定化する。このリジン残基は、ヌクレオチド結合ポケットの塩基を形成し、グアニン環とのπ−カチオンスタッキング相互作用に関与する９２。この位置は、低分子量ＧＴＰａｓｅ中のアスパラギン酸によって排他的に占有されていないが、各クラス内で、それは、概ね保存または非保存であり、それがある特定のＧＴＰａｓｅファミリーの安定性に固有であり得ることを示す。ヘテロ三量体Ｇタンパク質において、この位置は、アラニン残基またはセリン残基のいずれかによって占有されており、ここで、グルタミン酸残基が存在する。しかしながら、ＮＫＸＤモチーフ由来のリジンは、ヘリカルドメイン由来のアスパラギン酸（ＧαｓにおけるＡｓｐ−１７３）またはグルタミン酸との塩−架橋相互作用によって安定化される。この相互作用は、活性化中にドメイン界面が分離するときに破壊される７。Ａ２４９Ｄ変異は、これまでに試験されていないが、ヌクレオチド結合ポケットを安定化し、ＧＤＰ結合親和性を増加させると考えられる。
【０３３０】
スイッチＩＩＩの欠失は、ＧＴＰａｓｅドメインの発現及び安定性の両方を改善した。ヘテロ三量体Ｇタンパク質において、スイッチＩＩＩは、ＧＴＰ取り込みによって誘導される立体構造変化の媒介に関与し、エフェクター結合に必要とされている９３。低分子量ＧＴＰａｓｅにおいて、スイッチＩＩＩは不在であり、対応する領域は、別個の二次構造要素からなり、β４鎖は、Ｉ型ターンで終端し、α３ヘリックスに先行する３１０ヘリカルセグメントに直接連結する（ＳＴＲＩＤＥウェブサーバを使用して二次構造帰属を行った９４、９５）。スイッチＩＩＩの欠失によって達成された安定性の改善は、高度に柔軟なループをより規則的な二次構造要素で置換した結果である可能性が高い。発現レベルの増加は、改善された安定性とよりエネルギー的に好ましい折り畳み経路との組み合わせに起因する可能性が高い。
【０３３１】
Ｈ４１Ｉ変異は、単離ＧＴＰａｓｅドメインの安定性を著しく改善した。ヒスチジン４１が、Ｇｔと比較してＧαｓで観察された基礎ヌクレオチド交換の上昇レベルに著しく寄与することが報告されている９６。Ｇｔにおけるこの位置に見られるヒスチジン４１のバリンへの変異が、Ｇαｓの基礎ヌクレオチド交換のレベル半減したことが以前に報告された９６。我々は、Ｈ４１Ｖ変異がＭＥＧＡドメインの安定性を改善したことを示した（表５を参照のこと）が、Ｈ４１Ｉ変異は、この位置で最適であった。この変異は、α５ヘリックスとαＮ／β１ループとの間の相互作用を強化するため、ＧＴＰａｓｅドメインの安定性を改善する。この領域における密接充填がα５ヘリックスを安定化するため、ＧＤＰ解離速度を低減する９６。
【０３３２】
α２ヘリックスに位置する（スイッチＩＩに隣接する）Ｌ２７２Ｄ変異は、単離ＧＴＰａｓｅドメインの安定性を著しく改善した。スイッチＩＩは、ＧＤＰ結合状態とＧＴＰ結合状態との間で構造を劇的に変化させ９７、ＧＤＰ結合状態で、スイッチＩＩはより動的であり、多くの場合、結晶構造において不規則的であり９８、ＧＴＰ結合状態で、スイッチＩＩは、高度に規則的であり３０、９９、Ｇｓにおいて、この領域は、主なエフェクター結合部位を形成する１００。Ｌ２７２Ｄ変異は、スイッチＩＩと直接相互作用し、全領域を立体構造的に制約する可能性がある。興味深いことに、それは、スイッチＩＩにおいて高度に保存されたアルギニン残基（Ａｒｇ−２３１）との塩架橋相互作用を形成することができ、理想的には、かかる相互作用のためにＧＴＰ結合状態で位置付けられる３０。これは、スイッチＩＩの下の疎水性残基の水性環境への曝露を制限することによって、ＧＴＰａｓｅドメインの安定性を改善する可能性がある。
【０３３３】
要約すると、我々は、不安定であり、不十分にしか発現しないにもかかわらず、Ｇαｓから単離されたＧＴＰａｓｅドメインがβγ独立様式でβ１ＡＲに効率的に共役することができることを実証した。我々は、広範な変異誘発スクリーニングを行い、ドメインの発現及び／または安定性を劇的に増加させる４つの主要な変異を特定した。
【０３３４】
方法及び材料
β１ＡＲ構築物。Ｇタンパク質結合アッセイに使用したβ８４構築物は、いくつかの修飾：Ｎ末端ＭＢＰ融合タンパク質、Ｎ末端切断（残基１〜３２）、細胞内ループ３欠失（残基２４４〜２７１）、残基３６７でのＣ末端切断、Ｃ末端ヘキサンヒスチジンタグ、Ｃ１１６Ｌ変異、操作ジスルフィド結合（Ｍ４０Ｃ−Ｌ１０３Ｃ）、及び４つの熱安定化変異（Ｍ９０Ｖ、Ｄ３２２Ｋ、Ｆ３２７Ａ、及びＦ３３８Ｍ）を含んだ。受容体を、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄバキュロウイルス発現系（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＴｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）細胞株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現させた。
【０３３５】
Ｇαｓ  ＧＴＰａｓｅドメイン構築物。初期変異誘発スクリーニングに使用した親ＧＴＰａｓｅドメインを以下に記載する（全ての番号付けは、Ｇαｓの長いアイソフォームを参照する）。この構築物は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグ、Ｎ末端欠失（残基１〜２０）、ヘリカルドメイン欠失（残基７１〜１９３）、近接する天然スイッチＩをインタクトのまま残すこと、及び末端のＧｌｙ２リンカーへの連結、ならびにヘリカルドメインの除去によって曝露された好ましくない表面残基を除去するためのスイッチＩ領域における２つの変異（Ｌ１９７Ａ及びＣ２００Ｓ）からなった。
【０３３６】
ヘテロ三量体Ｇｓの発現及び精製。本研究に使用した非脂質化ヘテロ三量体Ｇｓは、全ての潜在的なパルミトイル化部位を除去するためにＮ末端の４つのアミノ酸欠失を含んだ１０１ヒトＧαｓ（長い形態：リンカー１における可変的にスプライスされた領域を含む）、ヒトＧβ１（Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグを含む）、及びプレニル化部位を除去する１０２ためのＣ６８Ｓ変異を含むヒトＧγ２から成った。各個別のサブユニットをコードするバキュロウイルス構築物を、ｆｌａｓｈＢＡＣ  ＵＬＴＲＡシステム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して構築した。Ｇｓヘテロ三量体を、１０％仔ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％脂質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｓｉｇｍａ）中で成長したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）細胞で発現させた。細胞を、１：１：１の比率でサブユニット毎に２％の濃度でＰ３ウイルスを使用して感染させた。細胞を２７℃で４８時間インキュベートした。細胞を４０００ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、ＰＢＳ（培養物体積の１５％）で洗浄した。細胞ペレットを液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【０３３７】
３リットルの培養物由来の細胞ペレットを、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤を含有する１５０ｍＬの溶解緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのＧＤＰ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、２．５μＭのペプスタチン−Ａ、１０μＭのロイペプチン、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ、５０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡ（ｐＨ８．０））中に再懸濁させ、ＤＴＴを添加して、最終濃度０．１ｍＭにした。細胞を超音波処理によって分解し、不溶性材料を３８０００ｇで４０分間の遠心分離によって除去した。上清を濾過し（０．４５μＭ）、５ｍＬのＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に５ｍＬ／分で装填した。カラムを、１０カラム体積の溶解緩衝液で、その後、１０カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ（ｐＨ８．０））で、５ｍＬ／分で洗浄した。カラムを、２５ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ（ｐＨ８．３））で、２ｍＬ／分で溶出した。溶出液を、２２５ｍＬのＱ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ８．３））で希釈した。混合物を５ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に５ｍＬ／分で直接装填した。カラムを、１０カラム体積のＱ緩衝液で、５ｍＬ／分で洗浄した。Ｇｓを、２ｍＬ／分で４０カラム体積にわたって５０ｍＭから２５０ｍＭの線形ＮａＣｌ勾配（２５０ｍＭのＮａＣｌを含有するＱ緩衝液）で溶出した。Ｇｓを含有する画分をプールし、１０ＫＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５〜１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮したＧｓを、ＧＦ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．２ｍＭのＭｇＣｌ２、２μＭのＧＤＰ、０．１ｍＭのＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００（１６／６０）ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に１ｍＬ／分で装填した。純粋なＧｓを含有する画分をプールし、１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なＧｓ１〜２ｍｇであった。
【０３３８】
Ｎｂ３５の発現及び精製。Ｎｂ３５１０遺伝子を合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＥＴ２６ｂベクター（Ｍｅｒｃｋ）にクローニングした。Ｎｂ３５を、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（Ｍｅｒｃｋ）で発現させた。培養物を、グルコース（０．１％）及びＭｇＳＯ４（２ｍＭ）を補充したテリフィックブロス培地中で、３７℃で０．８のＯＤ６００ｎｍに成長させた。発現を２８℃でおよそ１８時間にわたってＩＰＴＧ（５０μＭ）で誘導した。細胞を４０００ｇでの遠心分離によって収集し、−８０℃で保管した。
【０３３９】
６リットルの培養物由来の細胞ペレットを、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤を含有する２００ｍＬの溶解緩衝液（４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＰＭＳＦ、１００μｇ／ｍＬのリゾチーム、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＡ（ｐＨ７．５））中に再懸濁させた。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、その後、超音波処理によって分解し、不溶性材料を３８０００ｇでの遠心分離によって除去した。上清を濾過し（０．４５μＭ）、５ｍＬのＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に５ｍＬ／分で装填した。カラムを、１５カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．５））で、５ｍＬ／分で洗浄した。カラムを、２５ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．０））で、２ｍＬ／分で溶出した。溶出液を２２５ｍＬのＳＰ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０））で希釈し、５ｍＬのＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に５ｍＬ／分で直接装填した。カラムを、１０カラム体積のＳＰ緩衝液で、５ｍＬ／分で洗浄した。Ｎｂ３５を、２ｍＬ／分で４０カラム体積にわたって０ｍＭから２５０ｍＭの線形ＮａＣｌ勾配（２５０ｍＭのＮａＣｌを含有するＳＰ緩衝液）で溶出した。Ｎｂ３５を含有する画分をプールし、５００ｍＬのＧＦ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール（ｐＨ７．５））に対して一晩透析し、外部緩衝液を２回交換した。Ｎｂ３５を、３ＫＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮したＮｂ３５を、ＧＦ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００（１６／６０）ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に１ｍＬ／分で装填した。純粋なＮｂ３５を含有する画分をプールし、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なＮｂ３５  ５ｍｇであった。
【０３４０】
アゴニストシフトアッセイに使用するためのＧαｓ  ＧＴＰａｓｅドメインの部分精製。ＧＴＰａｓｅドメインをＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞で発現させた。培養物を、グルコース（０．１％）を補充した２ＴＹ培地中で、２５℃で０．５〜０．８のＯＤ６００ｎｍに成長させた。発現を１５℃でおよそ１６時間にわたってＩＰＴＧ（１００μＭ）で誘導した。細胞を４０００ｇでの遠心分離によって収集し、−８０℃で保管した。
【０３４１】
２リットルの培養物由来の細胞ペレットを、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤を含有する２２ｍＬの溶解緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、２０％グリセロール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＡＴＰ、１００μＭのＧＤＰ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、２．５μＭのペプタスタチン−Ａ、１０μＭのロイペプチン、５０μｇ／ｍＬのリゾチーム、２０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ｐＨ７．５））中に再懸濁させた。ＤＴＴ（０．１ｍＭ）を添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞を超音波処理によって分解し、不溶性材料を５００００ｇで４０分間の遠心分離によって除去した。上清を濾過し（０．４５μＭ）、１ｍＬのＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加し、懸濁液を４℃で１．５時間混合した。混合物を空のＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に注ぎ、２０ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、２０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ（ｐＨ７．５））で洗浄した。カラムを２．５ｍＬの溶出緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール、２０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ（ｐＨ７．５））で溶出した。部分的に精製されたタンパク質を、ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＧＦ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ、０．１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７．５））に脱塩した。脱塩したタンパク質を、１０ＫＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、最終体積４００μＬに濃縮した。濃縮したタンパク質を液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【０３４２】
アゴニストシフトアッセイ。β８４受容体構築物を発現するおよそ２ｍＬのＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ培養物由来の細胞ペレットを、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する１ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのアスコルビン酸（ｐＨ７．５））中に再懸濁させた。細胞を、曲げ２６Ｇ針を１０回通過させることによって溶解し、不溶性材料を遠心分離（３０００ｇで５分間）によって除去した。粗膜画分を含有する上清を、溶解緩衝液中で８ｍＬに希釈した（１競合曲線当たり０．８ｍＬが必要であった）。Ｇタンパク質、ＭＥＧＡドメイン、Ｎｂ８０、または緩衝液（２００μＬ）を粗膜（０．８ｍＬ）に添加し、曲げ２６Ｇ針を３回通過させることによって均質化した。アッセイで使用したＧタンパク質またはＮｂ８０の最終濃度は、およそ１ｍｇ／ｍＬであり、使用したＭＥＧＡドメインの最終濃度は、それらの発現レベルに依存する。９つのアリコート（各々８８μＬ）を９６ウェルＰＣＲプレート（氷上）に移した。イソプレナリン（１１μＬ）を７つの試料に添加して、１×１０−３〜１〜１０−９Ｍの最終競合リガンド濃度曲線を得て、イソプレナリン希釈液を１Ｕ／ｍＬのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解緩衝液中で調製した。緩衝液（１１μＬ）を残りの試料のうちの１つに添加して、全シグナルを決定し、アルプレノロール（１１μＬ）を最後の試料に添加して、バックグラウンドシグナルを決定した（最終濃度１００μＭ）。試料を４℃で２時間（または２０℃で１時間）インキュベートした。３Ｈ−ジヒドロアルプレノロール（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を各ウェル（１１μＬ）に添加して、最終濃度１０ｎＭ（β８４のＫｄ以下）を得た。試料を４℃で２時間（または２０℃で１時間）インキュベートした。試料を９６ウェルＧＦ／Ｂ濾過プレオート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で濾過し、０．１％ＰＥＩを含有する溶解緩衝液中に予め浸漬した。プレートを氷冷洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５））で３回（２００μＬ）洗浄した。プレートを乾燥させ、フィルターを穿孔してシンチレーションバイアル内に入れた。シンチラント（４ｍＬ）を添加し、試料を一晩インキュベートし、その後、トリチウムを液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計数した。データを、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の「１サイト−ｌｏｇＩＣ５０フィット」機能を使用して分析した。
【０３４３】
実施例３：用途
ＭＥＧＡドメインは、ＧＰＣＲ及びＧタンパク質活性を調節するための治療薬の設計において幅広い用途を有する。
【０３４４】
精製中のＧＰＣＲの安定化
ＧＰＣＲは、立体構造的に動的であり、洗剤におけるそれらの不良な熱安定性に寄与する６９。ＭＥＧＡドメインは、ＧＰＣＲを立体構造的かつ熱的に安定化する可能性があり、それ故に、精製手順の効率性を改善する。
【０３４５】
ＧＰＣＲのそれらの完全活性立体構造での熱安定化
ＭＥＧＡドメインは、それらが結合したＧＰＣＲの熱安定性を著しく改善する可能性がある。しかしながら、安定性のさらなる劇的な改善は、ＭＥＧＡドメインと複合している間に受容体の変異誘発熱安定化によって達成され得る８８。結果として生じるＭＥＧＡ−ＳｔａＲ複合体は、高度に安定しており、さらに最も要求の厳しい用途にさえも好適である。さらに、この様式で熱安定化されたＧＰＣＲは、ＭＥＧＡドメインまたはリガンドの不在下でさえも完全活性立体構造を採用し、薬物設計に特有の機会を提供する。
【０３４６】
ＧＰＣＲのそれらの完全活性立体構造における構造決定
ＭＥＧＡドメインの安定化特性は、Ｘ線結晶学及びＮＭＲの両方を使用して、ＧＰＣＲの高親和性アゴニスト結合状態の高分解能構造決定を可能にする。
【０３４７】
適活性化ＧＰＣＲに対する断片ライブラリスクリーニング
ＭＥＧＡドメインは、構造的方法及び非構造的方法の両方を使用する断片ライブラリスクリーニングのための有益なツールでもあり得る。三元Ｇタンパク質−ＧＰＣＲ複合体が形成されると、リガンドが複合体の解離を引き起こすことなく結合ポケットから除去され得ることを示唆する有力な証拠が存在し、ヌクレオチド不含ロドプシン−トランスデューシン複合体のヒドロキシルアミン処理がロドプシンとレチナールとの間のシッフ塩基結合の加水分解を引き起こし、レチナールオキシムの放出をもたらす１４。しかしながら、これは、複合体の解離もＭｅｔａ−ＩＩ光化学状態の不活性オプシンへの減衰も引き起こさず、さらに、発色団部位は、その開放立体構造のまま留まるように見える１４。したがって、空リガンド結合ポケットが高親和性アゴニスト結合立体構造を維持するリガンド不含ＭＥＧＡ−ＧＰＣＲ複合体を産生することが可能であり得る。リガンド不含複合体は、生物物理学的方法または結晶浸漬技法を使用する断片ライブラリスクリーニングに理想的な基質を表す。これらの複合体は、オーファン受容体を標的とするためのアゴニストの設計にも極めて重要である。
【０３４８】
特定のＧタンパク質−ＧＰＣＲ界面を遮断する化合物のスクリーニング
ＧＰＣＲのリガンド結合ポケット及び細胞外表面は、薬物設計で利用されている主な標的であるが、下流シグナル伝達タンパク質も著しい治療可能性を有する。Ｇタンパク質αサブユニットを調節するいくつかのペプチド及び小分子が報告されている７０〜７２。これらの分子が一般にＧタンパク質の単一クラスを標的とするが、Ｇタンパク質シグナル伝達の不規則な特性は、治療用途に好適ではないことを意味する。ＭＥＧＡ−ＧＰＣＲ複合体の構造は、特定のＧタンパク質−受容体界面を標的とする小分子の設計を可能にする。したがって、特定のＧタンパク質−受容体対を通るシグナル伝達は、他のシグナル伝達カスケードにおける受容体及びＧタンパク質の両方の活性を保持すると同時に阻害され得る。
【０３４９】
細胞ベースのアッセイの開発
それらの単量体性質のため、ＭＥＧＡドメインは、インビボでの受容体／Ｇタンパク質共役を試験するための蛍光アッセイの開発に有用である。
【０３５０】
受容体特異性の分子機構の理解
ＭＥＧＡドメインは、我々がＧα−ＧＰＣＲ界面を超える受容体特異性の分子機構を決定することも可能にし得る。ＭＥＧＡドメインをβγサブユニットの異なる組み合わせで再構成することができ、これらのＧＰＣＲ−ＭＥＧＡ−βγ複合体は、完全Ｇタンパク質−ＧＰＣＲ複合体よりも結晶化に従順であり得る。したがって、受容体のＣ末端とβγサブユニットとの間の相互作用を研究することができる。これにより、Ｇタンパク質ヘテロ三量体のβγ構成成分に基づいて、特異的ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体を標的とすることができるアロステリックモジュレーターの設計が可能になり得る。
【０３５１】
治療剤としてのＭＥＧＡドメイン
ＭＥＧＡドメインを、ＧＰＣＲ、βγサブユニット、または下流エフェクターを隔離するように操作することができる。これらの優性陰性変異体は、例えば、癌療法において、それら自体が有益な治療薬であり得る。
【０３５２】
実施例４：操作Ｇタンパク質に結合したアデノシンＡ２Ａ受容体の構造
序文
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、全身の化学的細胞内シグナル伝達ネットワークの必須の構成成分である。シグナル伝達の分子機構を理解するために、不活性立体構造及びヘテロ三量体Ｇタンパク質に共役した活性立体構造の両方における受容体の構造が必要である。ここで、我々は、高度に操作されたＧタンパク質であるｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したアデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）の３．４Åの分解能での第１の構造を報告する。ｍｉｎｉ−Ｇｓは、β２−アドレナリン受容体とＧｓとの間の界面と同様であるが、同一ではない広範な界面（１０４８Å１０５）を介してＡ２ＡＲに結合する。ｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したＡ２ＡＲの構造は、アゴニスト結合活性中間体状態から完全活性Ｇタンパク質結合状態への受容体の移行に関与する主要なアミノ酸残基を特定する。この構造は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質共役における多様性及び類似性の両方を強調し、Ｇタンパク質特異性の分子基盤の潜在的な複雑性を示唆する。
【０３５３】
アデノシンは、ヒトにおいて４つの異なるアデノシン受容体Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、及びＡ３を活性化するシグナル伝達分子であり、血管新生、免疫機能、及び睡眠調節を含む広範囲の生理学的プロセスに関与している（１０４、１０５に概説されている）。加えて、高濃度の細胞外アデノシンが細胞の健康に有害であり、神経変性疾患、炎症性障害、癌、及び虚血再灌流損傷で観察される病理学的効果に寄与するという強力な証拠が存在する（１０６に概説されている）。したがって、アデノシン受容体に対するサブタイプ特異的アゴニスト及びアンタゴニストの開発にかなりの関心が示されている。過去４０年間にわたって、広範囲の化合物が従来の医薬品化学によって開発されており１０５、１０７、より最近では、パーキンソン病の潜在的治療のためのアデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）の新規のアンタゴニストを開発するための構造に基づく薬物設計が実施されている１０８。Ａ２ＡＲを標的とするアゴニスト（レガデノソン）は、ＦＤＡによって心筋灌流画像化に承認されており１０７、Ａ３Ｒに特異的なアゴニストは、それらの抗癌特性及び抗炎症特性について開発中である１０９。
【０３５４】
逆アゴニスト１１０〜１１２またはアゴニスト１、４、１１３のいずれかに結合したＡ２ＡＲの構造の比較により、サブタイプ特異性及び有効性の分子決定因子が解明された。しかしながら、Ｇタンパク質への共役を可能にする受容体の活性化の機構及びＧタンパク質選択性の基準は、完全に理解されていない。不活性状態のＡ２ＡＲの構造は、アンタゴニストＺＭ２４１３８５１１０〜１１２、ＸＡＣ１１０、カフェイン１１０、または１，２，４−トリアジン１０８のいずれかに結合すると決定されており、全ての構造が非常に類似している。アロステリックアンタゴニストとして作用することができる膜内Ｎａ＋イオンを最も高い分解能構造（１．８Å）で特定し１１５、その後に、相同Ｎａ＋イオンをＧＰＣＲの他の高分解能構造で特定した９６、１１６、１１７。Ａ２ＡＲの４つのアゴニスト結合構造も、アデノシン１、ＮＥＣＡ１、ＣＧＳ２１６８０１１３、またはＵＫ４３２０９７４のいずれかとの共結晶化後に決定された。全ての構造は非常に類似しており、Ｇタンパク質に結合する完全活性受容体ではなく、受容体の活性中間体立体構造を表すと考えられる１。この結論を支持する観察は、他のＧＰＣＲの活性化に関連する保存アミノ酸残基の主要な回転異性体変化の存在を含むが、受容体コアから離れた膜貫通リックス６（Ｈ６）の細胞質末端の著しい移動の不在を含まない。Ａ２ＡＲのＧタンパク質共役状態は、非共役状態と比較してアゴニストのより高い親和性結合を呈する１１８が、現在までに決定されているアゴニスト結合構造が結合ポケットを高親和性または低親和性立体構造で描写するかは不明である。Ａ２ＡＲとは対照的に、アゴニストに結合するβ１ＡＲまたはβ２ＡＲのいずれかの結晶化により、アンタゴニストに結合した構造とはほんのわずかに異なる不活性立体構造の構造がもたらされた２、３。よって、β２ＡＲが、アンタゴニストに結合しているか、アゴニストに結合しているか、またはリガンドに全く結合していないかにかかわらず、立体構造のアンサンブルで存在し、アゴニストの存在が活性状態の形成の可能性を増加させることが明らかである。次いで、活性化状態は、Ｇタンパク質の結合１０またはＧタンパク質模倣物（ナノボディ）３８によって安定化される。したがって、Ａ２ＡＲの活性化状態の構造を解明するために、我々は、操作されたＧタンパク質に結合したその構造を決定した。
【０３５５】
結果
Ｇタンパク質結合Ａ２ＡＲの構造
ヘテロ三量体Ｇタンパク質に結合したＧＰＣＲ、すなわち、Ｇｓ結合β２ＡＲの唯一の報告された構造が存在する。結晶化は、ＧαとＧβとの間の界面で結合することによってＧαβγ三量体を安定化するために特定のナノボディＮｂ３５の開発、Ｔ４−リゾチームのβ２ＡＲのＮ末端への融合、メソにおける結晶化のための新規のモノオレイン誘導体ＭＡＧ７：７の使用、ならびに精製及び結晶化の複雑な手順を必要とする真の解決手段であった。β２ＡＲ−Ｇｓ構造１０は、受容体とＧタンパク質との間の事実上全ての接触がＧαサブユニットに行われ、それ故に、Ｇβγが複雑な形成には不要であったことを示した。したがって、我々は、Ｇαｓサブユニットを操作してそれを十分に規則的な結晶の形成により従順にする代替のアプローチを採用し、これにより、原則として、活性化状態でのいずれのＧｓ共役受容体の結晶化が可能になるはずである１２０。我々は、Ｇβγの不在下及び洗剤の存在下でタンパク質を安定化するための８つの点変異を含む、ＧαｓのＧＴＰａｓｅドメインの切断形態を含む最小Ｇタンパク質、ｍｉｎｉ−Ｇｓを開発した１２０。切断は、スイッチＩＩＩ領域、Ｎ末端から２３個のアミノ酸、及びα−ヘリカルドメインを含み、これらは全て、複合体の構造不均一性を低減することによって結晶形成に有益になるであろう。ｍｉｎｉ−Ｇｓは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の存在下での受容体のインキュベーション時に生じたアゴニスト親和性の増加を再度もたらし、これは、アロステリックアンタゴニストＮａ＋の存在に対する同一の感受性も示した（図１５及び図１６）。加えて、ｍｉｎｉ−Ｇｓは、アゴニストＮＥＣＡの存在下でＡ２ＡＲとの複合体を容易に形成し、この複合体は、特に短鎖洗剤においてＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲよりも著しく熱安定性であった（図１７）。この複合体は、蒸気拡散によって洗剤オクチルチオグルコシド中で結晶化し、データセットを２つの結晶から収集した（さらなる方法を参照のこと）。Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造を、ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲの構造（ＰＤＢ  ＩＤ：  ２ＹＤＶ）１及びβ２ＡＲ−Ｇｓ複合体由来のＧαｓ  ＧＴＰａｓｅドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：  ３ＳＮ６）１０を探索モデルとして使用して分子置換によって決定し、その構造を３．４Åに精密化した（表６）。
【０３５６】
鎖Ａ及びＣ（複合体ＡＣ）または鎖Ｂ及びＤ（複合体ＢＤ）のいずれかから成る、１結晶学的非対称単位当たり２つのｍｉｎｉ−Ｇｓ−Ａ２ＡＲ複合体が存在する。複合体ＡＣ（鎖Ａ：Ａ２ＡＲ、鎖Ｃ：ｍｉｎｉ−Ｇｓ）の最良電子密度が観察され、Ａ２ＡＲに結合したアゴニストＮＥＣＡの密度及びｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したＧＤＰの分子の密度を含んだ（図１８）。複合体ＢＤ中の鎖Ｂ（Ａ２ＡＲ）もＮＥＣＡの密度を含んだが、鎖Ｄ（ｍｉｎｉ−Ｇｓ）は、ＧＤＰに対応する密度を含まなかった。ｍｉｎｉ−Ｇｓの２つの分子がＧＤＰ占有の点で異なる理由はこの構造からは不明であり、それは、構造が実質的に同一である（１１２７個の原子にわたってｒｍｓｄ０．１２Å）ためであり、鎖Ｄ内のＧＤＰ部位が対称関連受容体（鎖Ａ）の細胞外ループ２の近くにあるが、このループは不規則であり、ヌクレオチド結合を防止することを示唆しない。ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造におけるＧＤＰの存在は、操作されたＧタンパク質の特性の反映であり、これは、複合体の形成後に、ＧＴＰγＳ媒介解離に非感受性になる１２０。したがって、この構造は、ＧＤＰが解離される前のＧＰＣＲとＧＤＰ結合Ｇタンパク質との間の複合体と見なされ得る。対称単位内の２つのＡ２ＡＲ分子も実質的に同一である（１６６５個の原子にわたってｒｍｓｄ０．０５Å）が、膜貫通ヘリックス６（Ｈ６、以下で論じられる）の細胞質末端の外方移動のため、先に決定したＡ２ＡＲ構造とは著しく異なる。複合体ＡＣと複合体ＢＤとの構造的アライメントは、ｍｉｎｉ−Ｇｓが受容体に対する３°のＧＴＰａｓｅドメインの回転で、受容体間でわずかに異なって配向したことを示し、ｍｉｎｉ−ＧｓとＡ２ＡＲとの間にわずかに異なる充填をもたらす（図１９）。これが一方の複合体中ではなく他方の複合体中のＧＤＰの存在によるものである可能性があるが、それが格子接触の差異から生じる可能性が高いように見える。そうであったとしても、これは、活性化Ｇタンパク質及び受容体の柔軟な性質によるｍｉｎｉ−ＧｓとＡ２ＡＲとの間の界面の自然変動を表し得る。全てのその後の分析は、複合体ＡＣの電子密度が特にｍｉｎｉ−ＧｓとＡ２ＡＲとの間の相互作用に関与する残基のうちのいくつかについてより良く定義されたため、複合体ＡＣとの関連で論じられる。
【０３５７】
複合体ＡＣ中のＡ２ＡＲとｍｉｎｉ−Ｇｓとの間の界面は、受容体の２０個のアミノ酸残基とｍｉｎｉ−Ｇｓの１７個の残基との間に形成され（図１９、図２０、及び図２１）、受容体に１０４８Å１０５の総埋没表面積を含む。ｍｉｎｉ−Ｇｓと接触している２０個のアミノ酸残基のうち、６個のＡｒｇ残基、１０個の疎水性残基、及び２個のＧｌｎ残基が存在することが印象的である。ｍｉｎｉ−Ｇｓと接触する受容体内の主領域は、Ｈ３の細胞質末端、細胞質ループ２（ＣＬ２）、Ｈ５の細胞質末端、Ｈ６中の３個の残基、及びＨ７とＨ８との間のターンにおける正電荷領域にみられる（図２０）。ｍｉｎｉ−Ｇｓにおいて、接触は、Ａ２ＡＲのＨ３、ＣＬ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、及びＨ８中の残基に対して充填する１４個のアミノ酸残基を含むα５ヘリックスによって主に行われる。追加の相互作用は、Ａ２ＡＲにおけるＣＬ２中の残基と接触する、βシートＳ１中のＨｉｓ４１Ｓ１．２、Ｓ３中のＶａｌ２１７Ｓ３．１、及びＳ２とＳ３との間のループ内のＡｓｐ２１５Ｓ２Ｓ３．１を含む（図２２、上付き文字はＧタンパク質のＣＧＮシステムを指す１０３）。Ａ２ＡＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｓ中のアミノ酸残基は、界面にわたって６つの極性相互作用と主にファンデルワールス相互作用により一緒に充填する相補的表面を形成する（約９０％の接触）。この相補性は、Ｌｅｕ１１０が、Ｈｉｓ４１Ｓ１．２、Ｖａｌ２１７Ｓ３．１、Ｐｈｅ３７６Ｈ５．８、Ｃｙｓ３７９Ｈ５．１１、及びＡｒｇ３８０Ｈ５．１２から形成されたポケット内に位置する、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ２−Ｓ３ループ、及びα５中の残基に対するＡ２ＡＲのＣＬ２内の配列ＰＬＲＹの充填において特に明らかである。ヘリックスα５は、Ｈ６の細胞質末端の外方移動により作製されたＡ２ＡＲの細胞質表面内の中裂に突出し、α５ヘリックスの先端であるＴｙｒ３９１Ｈ５．２３が、中裂の全上面を形成するＡｒｇ１０２３．５０と広範囲に及ぶファンデルワールス相互作用を生み出す（上付き文字はＧＰＣＲのＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ番号付けシステムを指す１２１）（図２２）。α５ヘリックスの全体配向は、ほぼ隣接した屈折ヘリックスを形成する受容体のＨ８とα５との間の好ましいヘリックス双極子によっても容易になり得る。
【０３５８】
ＡＲ−Ｇｓ構造とＡ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造とのβ２における受容体−Ｇタンパク質界面の比較
Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の受容体とβ２ＡＲ−Ｇｓ複合体の受容体との重ね合わせ１０は、それらの受容体が非常に類似した構造（１２３９個の原子にわたってｒｍｓｄ１．７Å）を有することを示し、差異の大部分は、アミノ酸配列が最も相違する細胞外領域に生じた（図２２）。対照的に、これらの受容体の細胞内表面は、非常に良好にアラインし、Ｈ６の細胞質末端の大きい外方シフトを含む。しかしながら、ｍｉｎｉ−Ｇｓは、β２ＡＲに結合したヘテロ三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニットに正確には重なり合わず（図２２）、約１５°の配向差を有するが、α５ヘリックスの場合、この差はより小さい（約１０°）。これは、β２ＡＲと比較したＡ２ＡＲにおける異なるアミノ酸残基の結果であり（図１８及び図２２）、これにより、Ｇタンパク質の受容体へのわずかに異なる充填がもたらされる。しかしながら、ｍｉｎｉ−Ｇｓとβ２ＡＲに結合したＧαｓとのアライメントは、それらが本質的に同一である（１１５８個の原子にわたってｒｍｓｄ０．９２Å）ことを示し、最も有意な差は、それぞれのα５ヘリックス間の８°の傾きであり、Ｇタンパク質のコアから離れたｍｉｎｉ−ＧｓにおけるＴｙｒ３９１のＣαの３．７Åの変位をもたらす（図２３）。印象的には、Ｇｓ−β２ＡＲ界面と比較したｍｉｎｉ−Ｇｓ−Ａ２ＡＲ界面の最も有意な差は、Ｈ７−Ｈ８境界での異なるアミノ酸配列の結果として、この領域でも生じる。Ａ２ＡＲにおいて、Ｈ７は、これらの残基のいずれもＧαｓと接触しないβ２ＡＲの同等の位置における配列Ｓ７．５６ＰＤＦＲＩと比較して、Ａｒｇ２９１７．５６で終端し、配列Ｒ７．５６ＩＲＥＦＲを形成する（イタリック体のアミノ酸残基はｍｉｎｉ−Ｇｓと接触しない）、Ａ２ＡＲにおいて、Ａｒｇ２９１７．５６は、カルボニル基Ｔｙｒ３９１Ｈ５．２３と水素結合を形成し、ファンデルワールス接触もＡｒｇ２９１７．５６、Ｉｌｅ２９２、及びＡｒｇ２９３によってｍｉｎｉ−Ｇｓにおけるヘリックスα５に行われる。それらのそれぞれのＧタンパク質への接触の存在／不在の点で異なる受容体の別の領域は、Ｈ５の最後にある。β２ＡＲにおいて、Ｈ５は、この領域が構造内で不規則であるＡ２ＡＲと比較して追加のターンを伸長し、恐らくＡ２ＡＲ内のＣｌ３ループがβ２ＡＲよりも１８アミノ酸残基短いためである。したがって、β２ＡＲにおいて、Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造には存在しない追加の接触が、受容体（Ｉｌｅ２３３５．７２、Ｌｙｓ２３５５．７４、Ｓｅｒ２３６５．７５、及びＡｒｇ２３９５．７８）とＧαｓ（Ａｓｐ３２３Ｈ４．３、Ａｓｐ３４３Ｈ４．２３、Ｌｅｕ３４６Ｈ４．２６、Ａｒｇ３４７Ｈ４．２７、Ｔ３５０Ｈ４Ｓ６．３、及びＹ３５８Ｈ４Ｓ６．１１）との間で行われる（図１７及び図１８）。
【０３５９】
受容体−Ｇタンパク質接触に有意差があるが、多くの類似点も存在する（図３）。例えば、Ｈ３の細胞質末端で、Ａ２ＡＲ及びβ２ＡＲの両方におけるカルボニル基ｌｌｅ３．５４及びＡｒｇ３．５５（β２ＡＲ中のＴｈｒ３．５５）が水素結合Ｉｌｅ３．５４−ＧｌｎＨ５．１６及びＡｒｇ３．５５−ＡｒｇＨ５．１２を形成するが、β２ＡＲ−Ｇｓ複合体では、ＧｌｎＨ５．１６は、Ａ２ＡＲではＡｌａであるＧｌｕ５．６４の側鎖に追加の水素結合を作製する。両方の受容体において、Ｇｌｎ５．６８がＧタンパク質に２つの水素結合を作製するが、β２ＡＲでは、２つの水素結合はＧｌｎＨ５．１６及びＡｒｇＨ５．１７に対してであり、Ａ２ＡＲでは、ＧｌｎＨ５．１６との相互作用は同一であるが、第２の水素結合は、骨格カルボニル基ＡｓｐＨ５．１３に対してである。別の例では、ＡｓｐＨ５．１３は、両方の受容体に水素結合を形成するが、これは、Ａ２ＡＲにおけるＧｌｎ５．７１への単一の水素結合と比較して、β２ＡＲにおけるＬｙｓ５．７１への塩架橋からなる。これらの実施例から、非常に少ない接触しか同一ではないが、大部分が類似しており、関与するアミノ酸側鎖の仕様、界面でのそれらの立体構造、及び相互作用の性質の点で異なることが明らかである。
【０３６０】
ｍｉｎｉ−Ｇｓ結合時のＡ２ＡＲの立体構造的変化
アゴニストに結合したＡ２ＡＲの以前に報告された構造は、活性中間体立体構造である。この帰属は、ナノボディ３８及びロドプシンに活性状態で結合したβ２ＡＲの活性状態の構造でも観察される受容体コアにおける回転異性体の変化及び膜貫通ヘリックスの移動の類似点に基づく３６、１２２。しかしながら、アゴニスト結合Ａ２ＡＲにおけるＨ６移動の程度が他の受容体で観察される程度の半分未満であるため、Ｇタンパク質のＣ末端ペプチドを収容するには不十分な空間しか細胞質中裂に存在しないであろう１。ＵＫ４３２０９７に結合したＡ２ＡＲ１２の活性中間体状態とｍｉｎｉ−Ｇｓに結合したＡ２ＡＲの構造との比較は、Ｇタンパク質結合を収容するための受容体コアの細胞質半分における主要な再配置を特定し（図２４）、活性中間体状態からＧタンパク質結合立体構造への移行に必要な再配置の観点で説明される。最初に、Ｈ６の細胞質末端は、受容体コアから１４Å（Ｔｈｒ２２４６．２６のＣα原子間で測定される）離れて移動する。この移動は、Ｈ６の外方への屈曲によって達成され、ヘリックス軸を中心とした認識できる回転はほとんどない。Ｈ６移動の程度は、Ａ２ＡＲにおけるＬｙｓ２２７６．２９、Ａｌａ２３１６．３３、及びＬｅｕ２３５６．３７と、ｍｉｎｉ−ＧｓにおけるＬｅｕ３９３Ｈ５．２５及びカルボキシ末端との間のファンデルワールス相互作用によって決定される。Ｈ６の移動は、ヘリックスＨ５及びＨ７とのＨ６の細胞質末端の充填の著しい変化を必要とする。具体的には、高度に保存されたＴｙｒ１９７５．５８及びＴｙｒ２８８７．５３の側鎖はいずれも、それぞれ、Ｌｅｕ２３５６．３７（Ｃαが３．７Å移動する）及びＩｌｅ２３８６．４０（Ｃαが２．２Å移動する）の側鎖によって以前に占有された空間を満たすために新たな回転異性体を採用する。Ｔｙｒ２８８７．５３のシフトにより、ｍｉｎｉ−Ｇｓのα５ヘリックス内のＴｙｒ３９１Ｈ５．２３の側鎖に対して充填する保存されたＤＲＹモチーフのＡｒｇ１０２３．５０が完全に伸長した立体構造を採用することが可能になる。
【０３６１】
ｍｉｎｉ−Ｇｓ結合を可能にする受容体の細胞質半分の著しい再配置とは対照的に、ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ構造をＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲと比較したときに受容体の細胞質半分の著しい変化は存在しない（図２４）。したがって、活性中間体状態で説明されるリガンド結合ポケットの配置は、実際に、ＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲの高親和性状態を説明する。しかしながら、明らかに、この構造は、リガンド親和性の変化にも寄与し得る受容体内の動力学のいずれの潜在的な変化の情報を提供するものではない。
【０３６２】
結論
Ａ２ＡＲは、活性中間体立体構造及び完全活性立体構造の両方が構造的に定義されている第１のＧＰＣＲである。しかしながら、アゴニストペプチドニューロテンシンに結合したニューロテンシン受容体の構造は、アデノシン結合Ａ２ＡＲと非常に類似の特性を示し１、４、１１０〜１１４、それ故に、恐らく活性中間体状態も表す１２３，１２４。近年、広範囲に及ぶＥＰＲデータに基づいて、β２ＡＲが活性立体構造における２つの別個の状態でも存在することが提案されているが、第２の状態の構造はまだ解明されていない１１９。しかしながら、この研究から、アゴニスト結合受容体の活性化経路に位置するＧタンパク質結合を有するか有しない別個の立体構造が存在し得ることが明らかである。ＧＰＣＲ活性化の機構の高度に保存された性質を考慮して、Ａ２ＡＲの活性中間体が多くのクラスＡのＧＰＣＲの共通中間体を表し得るが、受容体のエネルギー景観のみに応じて過渡的に存在し得る可能性が高い。
【０３６３】
β２ＡＲ及びＡ２ＡＲのＧタンパク質界面間の類似点及び差異は、受容体の異なるアミノ酸配列の結果であり、受容体に対してＧタンパク質のわずかに異なる位置及び配向をもたらす。したがって、Ｇｓが他のＧｓ結合受容体ともわずかに異なって相互作用し、Ｇｉ及びＧｑ等の他のＧタンパク質が受容体とのそれらの相互作用の詳細の差異も示すことが予想され、これらはいずれも、異なるアミノ酸配列受容体及びＧタンパク質の両方の柔軟な性質のためである。したがって、Ｇタンパク質結合界面の比較的「緩い」性質により、Ｇタンパク質配向の著しい変動が可能になり得る。しかしながら、ヘリックスα５がヌクレオチド結合ポケットから離れて変位されるというＧＰＣＲによるＧタンパク質活性化の保存された機構の利点のうちの１つ１０３が提供され、α１の規則的移行から不規則移行及びヌクレオチド遊離を引き起こし、受容体との相互作用の正確な様式が大いに余分である。
【０３６４】
方法及び材料
発現及び精製。ｍｉｎｉ−Ｇｓ（構築物４１４）をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した（さらなる方法を参照のこと）。潜在的なＮ結合グリコシル化部位を除去するためのＮ１５４Ａ変異を含む野生型ヒトＡ２ＡＲ（残基１〜３０８）を、バキュロウイルス発現系を利用して昆虫細胞で発現させた。Ａ２ＡＲを、ＩＭＡＣ及びゲル濾過クロマトグラフィーによってｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）洗剤中のアゴニストＮＥＣＡの存在下で精製した（さらなる方法を参照のこと）。
【０３６５】
複合体化及び結晶化。アゴニスト結合精製Ａ２ＡＲ（ＤＭ中）を１．２倍モル過剰のｍｉｎｉ−Ｇｓと混合し、アピラーゼを添加し、試料を氷上で一晩インキュベートした。複合体をｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド（ＯＴＧ）洗剤に交換し、ゲル濾過によって精製し、蒸気拡散によって結晶化した（さらなる方法を参照のこと）。
【０３６６】
データ収集、構造解、及び構造精密化。回折データを、標準収集モードまたはヘリカル収集モードのいずれかを使用してビームラインＩＤ２３−２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で２つの低温冷却結晶（１００Ｋ）から収集した。構造を、熱安定化Ａ２ＡＲ（ＰＤＢコード２ＹＤＶ）及びβ２ＡＲ−Ｇｓ複合体由来のＧαｓ  ＧＴＰａｓｅドメイン（３ＳＮ６）を探索モデルとして使用して、分子置換によって解いた（さらなる方法を参照のこと）。
【０３６７】
さらなる方法
ｍｉｎｉ−Ｇｓの発現及び精製。Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ１０）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を組み込んだｍｉｎｉ−Ｇｓ４１４をＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬで発現させた。２５℃で２０時間にわたるＩＰＴＧ（５０μＭ）での発現を含めた。細胞を遠心分離によって収集し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充した溶解緩衝液（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２．５μＭのペプタスタチン−Ａ、１０μＭのロイペプチン、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ  Ｉ、１００μｇ／ｍＬのリゾチーム、１００μＭのＤＴＴ）中で超音波処理によって溶解した。溶解物を遠心分離によって浄化し、１０ｍＬのＮｉ２＋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム上に装填した。カラムを洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）で洗浄し、溶出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μＭのＧＤＰ）で溶出した。ＴＥＶプロテアーゼを添加し、試料を透析緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのＧＤＰ）に対して一晩透析した。ＴＥＶプロテアーゼを、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上でネガティブ精製によって除去した。試料を１．５ｍＬに濃縮し、ゲル濾過緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＧＤＰ、０．１ｍＭのＴＣＥＰ）で平衡化Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ２６／６００ゲル濾過カラム上に装填した。ピーク画分をプールし、１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。純粋なタンパク質をアリコートし、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保管した。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なｍｉｎｉ−Ｇｓｓ４１４  １００ｍｇであった。
【０３６８】
アデノシンＡ２ＡＲの発現及び精製。野生型ヒトアデノシンＡ２ＡＲ（残基１〜３０８）を、Ｃ末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ１０）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含むように修飾した。Ｎ１５４Ａ変異を導入して、潜在的なＮ結合グリコシル化部位を除去した。バキュロウイルスを、ｆｌａｓｈＢＡＣ  ＵＬＴＲＡシステム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製した。Ｔｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ細胞を、ＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で成長させて３×１０６細胞／ｍＬの密度にし、Ａ２ＡＲバキュロウイルスに感染させ、７２時間インキュベートした。細胞を収集し、膜を、膜緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）中で２つの超遠心分離ステップによって調製した。
【０３６９】
ＮＥＣＡ（１００μＭ）、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、及びＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を膜に添加し、試料を室温で３０分間混合した。膜を氷上で１時間にわたって２％ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド（ＤＭ）で可溶化した。試料を超遠心分離によって浄化し、５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上に装填した。カラムを洗浄緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、８０ｍＭのイミダゾール、１００μＭのＮＥＣＡ、０．１５％ＤＭ）で洗浄し、溶出緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、３００ｍＭのイミダゾール、１００μＭのＮＥＣＡ、０．１５％ＤＭ）で溶出した。溶出物を、５０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して脱塩緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１００μＭのＮＥＣＡ、０．１５％ＤＭ）に交換した。ＴＥＶプロテアーゼを添加し、試料を氷上で一晩インキュベートした。試料を０．２ｍＬに濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填した。ピーク画分をプールし、およそ２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。典型的な収率は、培養物１リットル当たり純粋なＡ２ＡＲ  ２ｍｇであった。
【０３７０】
複合体化及び結晶化。精製したＡ２ＡＲを１．２倍モル過剰のｍｉｎｉ−Ｇｓ４１４と混合した。ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）及びアピラーゼ（０．１Ｕ）を添加し、混合物を氷上で一晩インキュベートした。試料をゲル濾過緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００μＭのＮＥＣＡ、０．３５％ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドＯＴＧ）中で１０倍希釈し、０．２ｍＬに濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（同じ緩衝液中で予め平衡化したもの）上に装填した。Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体を含有するピーク画分をプールし、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体を、ヘミコハク酸コレステロール（ＣＨＳ）の存在下または不在下のいずれかでＯＴＧ中で蒸気拡散によって結晶化した。結晶化プレートを、１２０ｎＬのシッティングドロップを使用して４℃で設置した。構造解に使用した結晶を、２つの条件下：  ０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）、１０％ＰＥＧ  ２０００（ＣＨＳの存在下）、または０．１ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．７）、９．５％ＰＥＧ  ２０００  ＭＭＥ（ＣＨＳの不在下）のいずれかで成長させた。結晶を、３０％ＰＥＧ  ４００を補充した母液中で低温保護し、液体窒素中で急速凍結した。
【０３７１】
データ収集、処理、及び精密化。回折データを、１０μｍの微小焦点ビーム（波長０．８７２９Å）を使用してＰｉｌａｔｕｓ  ２Ｍ検出器を備えたビームラインＩＤ２３−２で  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて収集した。データを、標準収集モードまたはヘリカル収集モードを使用して収集した。２つの結晶からのデータを構造解のために使用した。データを、ＭＯＳＦＬＭ１０４及びＡＩＭＬＥＳＳ１０５を使用して処理した。構造を、熱安定化Ａ２ＡＲの構造（ＰＤＢコード２ＹＤＶ）１０７及びβ２ＡＲ−Ｇｓ複合体由来のＧαｓ  ＧＴＰａｓｅドメイン（残基４０〜５９及び２０５〜３９４）の構造（ＰＤＢコード３ＳＮ６）１０８を探索モデルとして使用して、ＰＨＡＳＥＲ１０６での分子置換によって解いた。モデル精密化及び再構築を、ＲＥＦＭＡＣ１０９及びＣＯＯＴ１１０を使用して行った。
【０３７２】
競合結合アッセイ。野生型Ａ２ＡＲを過渡的に発現するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、アッセイ緩衝液Ａ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）、アッセイ緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）、またはアッセイ緩衝液Ｃ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再懸濁させ、２６Ｇ針を１０回通過させることによって溶解した。精製された結合パートナーをそれぞれの緩衝液に緩衝液交換した後に、膜に２５μＭの最終濃度で添加した。混合物をアリコートし、ＮＥＣＡを添加した（最終濃度０〜１ｍＭ、１ｕ／ｍＬのアピラーゼを含有するアッセイ緩衝液中で調製）。試料を２２℃で９０分間インキュベートし、３Ｈ−ＺＭ２４１３８５をその見かけのＫｄ（２．５ｎＭ）で添加し、試料を２２℃でさらに９０分間インキュベートした。非特異的結合を１００μＭのＺＭ２４１３８５の存在下で決定した。受容体結合放射性リガンド及び遊離放射性リガンドを、９６ウェルＧＦ／Ｂ濾過プレート（０．１％ポリエチレンイミンを予め浸漬したもの）による濾過によって分離し、適切な緩衝液で３回洗浄した。プレートを乾燥させ、放射活性を、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ２９１０  ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して液体シンチレーション計数によって定量化した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰によって分析した。ＮＥＣＡ結合のＫｉを、１サイト−Ｋｉフィット分析から導出した。各々二連で行った少なくとも３つの独立した実験からのデータを、対応のない両側ｔ検定を使用して統計的有意性について分析した。
【０３７３】
熱安定性アッセイ。野生型ヒトＡ２ＡＲを発現するＴｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ細胞由来の膜を、Ｔｍ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再懸濁させ、２６ゲージ針を１０回通過させることによって均質化した。結合パートナーを２５μＭの最終濃度で添加した。３Ｈ−ＮＥＣＡ及び非標識ＮＥＣＡを１：５の比率で混合し、膜に添加して、１μＭの最終濃度を得た（見かけのＫｄをおよそ１０倍上回る）。試料を室温で１時間インキュベートし、その後、氷上で３０分間冷却した。ＤＤＭ、ＤＭ、またはＯＧを添加して、それぞれ、０．１％、０．１３％、または０．８％の最終濃度にし、試料を氷上で１時間インキュベートした。細胞残屑を２０，０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去し、上清をＰＣＲストリップにアリコートした。試料を、所望の温度になるまで正確に３０分間加熱し、その後、氷上で３０分間クエンチした。試料（５０μＬ）を、９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に充填したゲル濾過樹脂上に装填し、これを遠心分離して、受容体結合放射性リガンドを遊離放射性リガンドから分離した。非特異的結合を２００μＭの非標識ＮＥＣＡの存在下で決定した。放射活性を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーション計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して液体シンチレーションによって定量化した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰によって分析した。見かけのＴｍ値を、シグモイド用量応答分析から導出した。結果は、二連で行った２つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【０３７４】
【表１】
2019507590.tif 000003
【０３７５】
表１：この研究中に使用したシチメンチョウβ１ＡＲ構築物β１ＡＲ−ＷＴ構築物は、Ｎ末端切断及びＣ末端切断、ならびにＣ１１６Ｌ変異を含んだ。これらの修飾を、グリコシル化を防止するか、または発現を改善するように設計した１５。β１ＡＲ−８４構築物は、細胞質ループ３のさらなる欠失を含んだ。熱安定化変異（Ｍ９０Ｖ、Ｄ３２２Ｋ、Ｆ３２７Ａ、及びＦ３８８Ｍ）２、３。Ｍ４０Ｃ変異及びＬ１０３Ｃ変異によって促進される膜貫通性ヘリックス１と２との間のジスルフィド結合。パルミトイル化を防止するように設計されたＣ３５８Ａ変異。結晶化を促進するように設計されたＮ末端ＭＢＰ融合。
【０３７６】
【表２−１】
2019507590.tif 000004
【０３７７】
【表２−２】
2019507590.tif 000005
【０３７８】
【表２−３】
2019507590.tif 000006
【０３７９】
表２：この研究中に使用した親ｍｉｎｉ−Ｇｓ構築物
【０３８０】
【表３−１】
2019507590.tif 000007
【０３８１】
【表３−２】
2019507590.tif 000008
【０３８２】
表３：異なる結合パートナーに応答してβ１ＡＲ−８４のイソプレナリンＫｉを示す競合結合アッセイデータデータは、表に別途述べられていない限り、二連に行った単一の実験からのものであり、これらの場合、データは、示される独立した実験の数（ｎ）の平均±標準誤差を表す。ｍｉｎｉ−Ｇｓの発現レベルへの変異の影響をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから推定した。親構築物と比較して２倍を超える発現変化を引き起こした変異体を、単に増加（＋）または減少（−）として示す。ａ：一般的なＧα番号付け（ＣＧＮ）システム。ｂ：該当せず。ｃ：決定されず。ｄ：２つのグリシン残基でのスイッチＩＩ残基２２７〜２３０の置換。ｅ：スイッチＩＩＩ残基２５４〜２６３の欠失。
【０３８３】
【表４−１】
2019507590.tif 000009
【０３８４】
【表４−２】
2019507590.tif 000010
【０３８５】
表４：基礎ＧＤＰ結合状態のβ１ＡＲ−ＷＴ複合体またはｍｉｎｉ−Ｇｓ変異体のいずれかの熱安定性（Ｔｍ）測定Ｔｍ値は、表に示される独立した実験の数（ｎ）の平均±標準誤差を表す。いくつかのＴｍ値を二連で行った単一の実験から決定し、±０．５℃の推定誤差であった。ＧＤＰ結合状態のｍｉｎｉ−Ｇｓの値を示差走査蛍光定量法によって決定した。ａ：一般的なＧα番号付け（ＣＧＮ）システム。ｂ：該当せず。ｃ：決定されず。ｄ：スイッチＩＩＩ残基２５４〜２６３の欠失をＳＩＩＩと称する。ｅ：ｍｉｎｉ−Ｇｓ１９９は、ｍｉｎｉ−Ｇｓ１８３と同じ変異を含むが、再設計されたリンカー領域を有し（表２を参照のこと）、洗剤安定化変異をスクリーニングするための親構築物として使用した。
【０３８６】
【表５−１】
2019507590.tif 000011
【０３８７】
【表５−２】
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【０３８８】
表５：ＧＴＰａｓｅドメイン変異体のアゴニストシフトアッセイデータアッセイを、部分的に精製されたＧＴＰａｓｅドメイン変異体で再構築したβ１ＡＲを含有する膜を使用して行った（Ｅ．ｃｏｌｉ培養物１リットルから精製された総量）。アッセイを変異体毎に４℃及び２０℃で行った。表は、各条件下での受容体の最終イソプレナリン親和性を示す。受容体の出発イソプレナリン親和性は、３．０３±０．８１μＭ（ｎ＝１６）であり、１．５〜４．４μＭの範囲の値を有する。したがって、３倍未満のアゴニスト親和性シフトが有意であると見なすことができない。発現レベルの定量化は、部分的に精製された材料の使用により不可能であった。したがって、簡易化スケールを使用して、親構築物と比較した相対的発現レベルを示した。注記：４℃でアゴニスト親和性のシフトを誘導しなかったいくつかの変異体を２０℃で試験しなかった（表中でｎ．ｄ．で示される）。
【０３８９】
【表６−１】
2019507590.tif 000013
【０３９０】
【表６−２】
2019507590.tif 000014
【０３９１】
表６：データ収集及び精密化統計学
【０３９２】
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５２．Ｃｌｅａｔｏｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｔｈｅ  Ｎ５４  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｇａｌｐｈａｓ  ｈａｓ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｗｈｉｃｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂａｓａｌ  ｃＡＭＰ  ｌｅｖｅｌｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４４３（２）：  ２０５−２０８。
５３．Ｃｌｅａｔｏｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｇａｌｐｈａｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＡＭＰ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ：ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７９（３５）：  ３６６０１−３６６０７。
５４．Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．Ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｍｇ（２＋）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｇｓ  ａｌｐｈａ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１（１０）：  ４８３０−４８３８。
５５．Ｎａｔｏｃｈｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ−ａｌｐｈａ  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；４５（２０）：  ６４８８−６４９４。
５６．Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｇａｌｐｈａ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｈａｔ  ｔｒａｐｓ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−Ｇａｌｐｈａ−ＧＴＰ−ｂｅｔａｇａｍｍａ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２８６（１４）：  １２７０２−１２７１１。
５７．Ｓｌｅｐａｋ，Ｖ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｇ  ａｌｐｈａ  ｉ２．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７０（８）：  ４０３７−４０４１。
５８．Ｗｕ，Ｙ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７９（３４）：  ３５２８７−３５２９７。
５９．Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ３  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ  ｙｉｅｌｄｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２８０（４２）：  ３５６９６−３５７０３。
６０．Ｂａｒｒｅｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒ２３８Ｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ−ａｌｐｈａ  ｙｉｅｌｄｓ  ａ  ＧＴＰａｓｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ，Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  １２：  ４９２−４９８。
６１．Ｚｕｒｉｔａ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｓａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ  ａｌｐｈａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅｓｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５（７）：  ２３６３−２３６８。
６２．Ｙｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ｅｍｐｔｙ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｇ（ｏ）：  Ｇ（１１）：ａｎｄ  Ｇ（１６）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７５（１）：  ７１−７６。
６３．Ｙｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｇｏａｌｐｈａ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７３（４６）：  ３０１８３−３０１８８。
６４．Ｙｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｇｏａｌｐｈａ  ｍｕｔａｎｔ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７２（２９）：  １８０１５−１８０１９。
６５．Ｉｉｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｇｓａｌｐｈａ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｇｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ；９６（２）：  ４９９−５０４。
６６．Ｉｉｒｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ｒａｐｉｄ  ＧＤＰ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｇｓ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｉｎ  ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ；３７１（６４９３）：  １６４−１６８。
６７．Ｗａｒｎｅｒ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ３  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｓａｌｐｈａ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ａｌｂｒｉｇｈｔ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｉｍｐａｉｒｓ  ＧＤＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７３（３７）：  ２３９７６−２３９８３。
６８．Ｂｅｒｌｏｔ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｌｐｈａ  ｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｓ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７７（２３）：  ２１０８０−２１０８５。
６９．Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ１−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ａ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｆｏｒｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５（３）：  ８７７−８８２。
７０．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｇａｌｐｈａ（ｉ１）ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ａ  ＧＤＰ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３（７）：  １０６９−１０８０。
７１．Ｋｉｍｐｌｅ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  ＧｏＬｏｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  Ｇａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ；４１６（６８８３）：  ８７８−８８１。
７２．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇｑ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７（３１）：  １３６６６−１３６７１。
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【０３９３】
実施例５：さらなるｍｉｎｉ−Ｇタンパク質
概要
最初に開発されたｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は、ｍｉｎｉ−Ｇｓであった。ここで、我々は、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、ならびにキメラｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉを含むようにｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のファミリーを拡張した。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は、関連ＧＰＣＲに共役し、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る精製された受容体と安定した複合体を形成することを示した。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質に共役したアゴニスト結合ＧＰＣＲは、アゴニスト結合受容体のみと比較してより高い熱安定性を示した。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のＮ末端でのＧＦＰの融合により、受容体共役が蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）によって監視されることが可能になり、別個のアッセイでは、洗剤可溶化受容体へのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質結合の親和性を決定した。この研究は、任意のｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の開発のための基盤、最終的には、完全活性状態での任意のＧＰＣＲの構造決定のための基盤を提供した。
【０３９４】
序文
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の概念は、活性状態でのＧＰＣＲの構造決定の速度の加速にかなり有望であることを示す。しかしながら、Ｇαサブユニットには様々なＧＰＣＲに対する異なる特異性を示す４つのファミリー（図２８：Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、及びＧα１２）が存在する［２４］。したがって、構造生物学におけるツールとして真に有用であるために、各ファミリーの少なくとも１つのメンバーがｍｉｎｉ−Ｇタンパク質に変換されなければならない。ここで、我々は、全ての主要なＧαファミリーのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の開発を報告する。我々は、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの結合を特徴付けるために使用され得る５つの異なるアッセイも説明し、複合体がサイズ排除クロマトグラフィーによって精製され得る３つの事例を示す。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を生成するための２つの異なる方法を任意の他のＧαサブユニットに容易に適用することができ、潜在的に任意の種由来の任意のＧＰＣＲに関する研究への道を開くことができる。
【０３９５】
材料及び方法
リガンド
β１−アドレナリン受容体（β１ＡＲ）アゴニストイソプロテレノール塩酸塩及び逆アゴニストＩＣＩ１１８５５１塩酸塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のものであった。アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）アゴニストＮＥＣＡ及びアンタゴニストＺＭ２４１３８５もＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製のものであった。セロトニン５ＨＴ１Ｂ受容体（５ＨＴ１ＢＲ）アゴニストドニトリプタン塩酸塩及び選択的アンタゴニストＳＢ２２４２８９塩酸塩は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のものであり、アゴニストスマトリプタンは、Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ製のものであった。アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）アゴニストアンジオテンシンＩＩは、Ｔｏｃｒｉｓ製のものであった。全ての放射性リガンドは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製のものであった。
【０３９６】
ＧＰＣＲ構築物、発現、及び精製
ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ａＲ）
２つの異なるＡ２ＡＲ構築物をこの研究中に使用した。精製された受容体を使用したＳＥＣ実験の場合、Ｎ末端チオレドキシン融合タンパク質を含有するＡ２ＡＲ構築物を使用して、受容体の分子量を増加させた。この融合タンパク質なしでは、Ａ２ＡＲ及びｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で同一の移動性を有し、それ故に、複合体を分析する際に別個の成分を視覚化することが困難である。チオレドキシン−Ａ２ＡＲ融合タンパク質は、Ｎ末端切断可能リーダー配列（ｇｐ６７）、Ｈｉｓ１０タグ、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位、続いて、ＥＡＡＡＫＡリンカーを介して野生型ヒトＡ２ＡＲ（残基６〜３１６）に接続されたチオレドキシンからなった。Ａ２ＡＲは、潜在的なＮ結合グリコシル化部位を除去するためのＮ１５４Ａ変異を含んだ。全ての他の実験の場合、Ｃ末端切断ヒトＡ２ＡＲ構築物を使用し（残基１〜３１７）、この構築物は、Ｃ末端Ｈｉｓ１０タグ及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに潜在的なＮ結合グリコシル化部位を除去するためのＮ１５４Ａ変異を含んだ。両バキュロウイルスを、以前に説明された［１９］バキュロウイルス発現系を使用して発現させた（実施例４を参照のこと）。細胞を感染後７２時間の遠心分離によって収集し、低張緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保管した。受容体の精製を、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィー、その後、本質的に以前に説明された［１９］ＳＥＣを使用してＤＤＭ中で行った。
【０３９７】
シチメンチョウβ１−アドレナリン受容体（β１ＡＲ）
野生型シチメンチョウβ１ＡＲ（構築物βＡＲ６、［２５］）の切断バージョンは、Ｎ末端及びＣ末端での切断、ならびに精製のためのＣ末端Ｈｉｓ６タグを含み［２５］、以前に説明された［２６］通りに２７℃でバキュロウイルス発現系を使用して発現させた。細胞を感染後４８時間の遠心分離によって収集し、低張緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０３９８】
ヒトアンジオテンシンＩＩ型受容体１（ＡＴ１Ｒ）
野生型ＡＴ１Ｒ（残基１〜３５９）は、Ｃ末端第Ｘ因子切断部位、続いて、ＧＦＰ及び精製のためのＨｉｓ１０タグを有し、それを、テトラサイクリン誘導性哺乳類発現系をＨＥＫ２９３細胞における安定細胞株として使用して発現させた［２７］。細胞を、それらが８０％コンフルエントになるまで５％テトラサイクリン不含ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で成長させ、その後、テトラサイクリンを添加して、１μｇ／ｍＬの最終濃度にした。細胞を２４時間成長させ、その後、収集し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０３９９】
ラットニューロテンシン受容体（ＮＴＳＲ１）
ＮＴＳＲ１を以前に説明された［１３］ように発現させた。バキュロウイルス構築物ＮＴＳＲ１は、ヘマグルチニンシグナルペプチド及びＦｌａｇタグ、続いて、野生型ラットＮＴＳＲ１（残基４３〜３９６）及びＣ末端Ｈｉｓ１０タグからなった。組換えバキュロウイルスを、修飾された導入プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生成した。Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞を組換えウイルスに感染させ、温度を２７℃から２１℃に低下させた。細胞を感染後４８時間の遠心分離によって収集し、低張緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ）中に再懸濁させ、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０４００】
ヒトセロトニン５ＨＴ１Ｂ受容体（５ＨＴ１ＢＲ）
野生型５ＨＴ１ＢＲ（残基３４〜３９０）を、Ｃ末端ＴＥＶ切断部位及びＨｉｓ１０タグを含有するように修飾し、プラスミドｐＢａｃＰＡＫ８にクローニングし、組換えバキュロウイルスを、ＦｌａｓｈＢＡＣ  ＵＬＴＲＡシステム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して調製した。Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞をＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で成長させて、３×１０６細胞／ｍＬの密度にし、５ＨＴ１ＢＲバキュロウイルスに感染させ、発現のために２７℃で４８時間インキュベートした。受容体の精製を、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィー、その後、ＳＥＣを使用してＤＤＭまたはＬＭＮＧ中のいずれかで行った。
【０４０１】
Ｇタンパク質サブユニットの発現、精製、及び安定性
構築物については、図２９及び図３５〜３７を参照されたい。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質、ならびに非脂質化Ｇβ１γ２二量体の示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）による発現、精製、及び安定性測定を、実施例１に記載のプロトコルに従って行った。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の安定性も、天然ＤＳＦ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ）を使用して洗剤中で決定した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（ＫＯＨ）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１μＭのＧＤＰ中のｍｉｎｉ−Ｇタンパク質（２ｍｇ／ｍＬ）を、洗剤なし（対照）、０．１％ＬＭＮＧ、または０．１％ＤＤＭのいずれかと混合した。試料を氷上でインキュベート（最低３０分間）した後に、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（２０％励起、１５℃〜８５℃、速度２．０℃／分）上で加熱し、散乱の開始を決定した。
【０４０２】
Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体のＳＥＣ
Ａ２ＡＲのチオレドキシン融合構築物をＤＤＭ中で精製し、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を１：１．２のモル比で過剰に添加し、氷上で一晩インキュベートし、その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００サイズ排除カラム（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μＭのＮＥＣＡ、０．０２％ＤＤＭ、４℃、０．５ｍＬ／分）上に装填した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０４０３】
ＦＳＥＣアッセイ
（１）Ａ２ＡＲ
合計２０μｇ（５６０ｐｍｏｌ）の野生型Ａ２ａＲを含有する昆虫細胞膜（２０×１０６細胞）を、２ｍＬの最終体積中４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．５ｖ／ｖ％ＤＤＭ中で、氷上で３０分間可溶化した。不溶性材料を超遠心分離（３０分間、４℃、１３５，０００×ｇ）によって除去した。上清を、その後のアッセイのためにアリコートに分けた。５００μＬの上清に、アゴニストＮＥＣＡまたは逆アゴニストＺＭ２４１３８５（陰性対照）のいずれかを、いずれも６０μＭの最終濃度で添加した。その後、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（６μｇ、１１０ｐｍｏｌ）を添加し、氷上で９０分間結合させた後に、２００μＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００サイズ排除カラム（緩衝液：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのＮＥＣＡまたはＺＭ２４１３８５、０．０３％ＤＤＭ、４℃、流量０．４５ｍＬ／分）上に装填した。対照試料は、５００μＬのアッセイ緩衝液中に６μｇのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓのみを含有した。ＧＦＰ蛍光を、励起４８８ｎｍ及び発光５２５ｎｍに設定したＨｉｔａｃｈｉ蛍光光度計（ｍＶ）で検出した。
【０４０４】
（２）β１ＡＲ
合計８μｇ（１７８ｐｍｏｌ）の野生型β１ＡＲを含有する昆虫細胞膜（３０×１０６細胞）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２Ｕ／ｍＬのアピラーゼ、及び０．５ｖ／ｖ％ＤＤＭ中で、氷上で３０分間可溶化した。不溶性材料を超遠心分離（３０分間、４℃、１３５，０００×ｇ）によって除去した。上清を、その後のアッセイのためにアリコートに分けた。イソプレナリン（最終濃度１００μＭ）またはＩＣＩ１１８５５１（最終濃度１０μＭ）を５００μＬの上清に添加した。その後、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（６μｇ）を添加し、氷上で９０分間結合させた後に、２００μＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００サイズ排除カラム（緩衝液：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭのイソプレナリンまたはＩＣＩ１１８５５１、０．０３％ＤＤＭ、４℃、流量０．４５ｍＬ／分）上に装填した。対照試料は、５００μＬのアッセイ緩衝液中に６μｇのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓのみを含有した。
【０４０５】
（３）５ＨＴ１ＢＲ
洗剤可溶化未精製受容体を使用した場合、６１０ｐｍｏｌの５ＨＴ１ＢＲを発現する昆虫細胞（４０×１０６細胞）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２中に再懸濁させて、２０×１０６細胞／ｍＬの最終細胞密度にし、０．５％ＤＤＭで可溶化した（４５分間、４℃）。不溶性材料を超遠心分離（３０分間、４℃、１３５，０００×ｇ）によって除去した。上清を、その後のアッセイのために９００μＬのアリコートに分けた。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１（５μｇ）をドニトリプタンまたはＳＢ２２４２８９と添加して各々１００μＭの最終濃度にし、氷上で９０分間結合させた後に、５００μＬをＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００サイズ排除カラム上に装填した。対照試料は、５００μＬのアッセイ緩衝液中に５μｇのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１を含有した。
【０４０６】
いくつかのＦＳＥＣ実験では、精製５ＨＴ１ＢＲを使用した。ＬＭＮＧ中またはＤＤＭ中のいずれかのドニトリプタン結合精製受容体（１２０μｇ、３ｎｍｏｌ）を、４μｇ（６０〜８０ｐｍｏｌ）のＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、またはＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（陰性対照）のいずれかと氷上で９０分間インキュベートして、４５０μＬの最終濃度にした。その後、試料（２００μＬ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  １０／３００サイズ排除カラム（緩衝液：２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＭの０．０３％ＤＤＭまたは０．００１％ＬＭＮＧ緩衝液、４℃、流量０．４５ｍＬ／分）上に装填した。
【０４０７】
蛍光飽和結合アッセイ（ＦＳＢＡ）
（１）β１ＡＲ
β１ＡＲを発現する昆虫細胞（５０×１０６細胞）から調製した膜を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのイミダゾール、０．５％ＤＤＭ中で可溶化した（１時間、４℃、最終体積８ｍＬ）。不溶性材料を超遠心分離（３０分間、４℃、１３５，０００×ｇ）によって除去し、上清を２つのアリコートに分けた。アゴニストイソプレナリンを一方の試料に添加し（最終濃度１０μＭ）、逆アゴニストＩＣＩ１１８５５１を他方の試料に添加した（最終濃度１μＭ）。その後、試料を、１ウェル毎に２００μＬで黒色Ｎｉ２＋被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）にアリコートした。受容体をそのＨｉｓタグを介して氷上で１時間結合させた。その後、上清を吸引し、様々な濃度（０〜２．８μＭ）の２００μのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓを添加し、氷上でさらに９０分間インキュベートした。その後、上清を吸引によって除去し、各ウェルを緩衝液Ａ（１０μＭイソプレナリン（アゴニスト）、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、３０ｍＭのイミダゾール、０．０３％ＤＤＭ，）または緩衝液Ｂ（１μＭのＩＣＩ１１８５５１（逆アゴニスト）、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、３０ｍＭのイミダゾール、０．０３％ＤＤＭ）で４回洗浄した。均質溶液を作製するためのウェルの側面からの受容体−ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の溶出を、３００ｍＭのイミダゾールを含有した２００μＬのそれぞれの洗浄緩衝液で行った。その後、蛍光を、励起４８５ｎｍ及び発光５２０ｎｍのＰｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。特定結合に対応するΔＦデータ（蛍光アゴニスト条件−蛍光アンタゴニスト条件）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した非線形回帰及び一部位特異的結合分析から導出された見かけのＫＤ値によって分析した。
【０４０８】
（２）Ａ２ａＲ
本アッセイを、本質的にβ１ＡＲについて上で説明されるように行ったが、緩衝液条件は異なった。昆虫細胞膜（４０×１０６細胞）の可溶化を、１０ｍＬの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、及び０．５％ＤＤＭ中で行った。超遠心分離後、アゴニストＮＥＣＡ（最終濃度１０μＭ）を一方の上清試料に添加し、逆アゴニストＺＭ２４１３８５（最終濃度１０μＭ）を他方の上清試料に添加した。Ａ２ａＲの洗浄緩衝液は、緩衝液Ｃ（１０ｕＭのＮＥＣＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのイミダゾール、０．０３％ＤＤＭ）または緩衝液Ｄ（１０μＭのＺＭ２４１３８５、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのイミダゾール、０．０３％ＤＤＭ）であった。
【０４０９】
（３）５ＨＴ１ＢＲ
５ＨＴ１ＢＲを発現する昆虫細胞（５０×１０６細胞）を、１０μＭのドニトリプタン、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、０．５％ＤＤＭを含有する緩衝液で可溶化した（１時間、４℃、最終体積６ｍＬ）。不溶性材料を超遠心分離（３０分間、４℃、１３５，０００×ｇ）によって除去し、その後、上清を、１ウェル毎に２００μＬで黒色Ｎｉ２＋被覆９６ウェルプレートにアリコートした。受容体をそのＨｉｓタグを介して氷上で１時間結合させた。その後、上清を吸引し、様々な濃度（０〜５μＭ）の２００μＬのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１、またはＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ（陰性対照）のいずれかを添加し、氷上でさらに９０分間インキュベートした。その後、上清を吸引によって除去し、各ウェルを緩衝液Ｅ（１μＭのドニトリプタン、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのイミダゾール、０．０３％ＤＤＭ）で４回洗浄した。溶出を、３００ｍＭのイミダゾールを含有する２００μＬの緩衝液Ｅで行った。ΔＦデータ（蛍光Ｇｏ１条件−蛍光Ｇｓ条件）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した非線形回帰及び一部位特異的結合アッセイから導出された見かけのＫＤ値によって分析した。
【０４１０】
競合結合アッセイ
５ＨＴ１ＢＲを発現する昆虫細胞を、１ｍＬのアッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのアスコルビン酸塩、２０μＭのパルギリン）中に２×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁させた。細胞を、曲げ２６Ｇ針を１０回通過させることによって剪断した。上清をアッセイ緩衝液中に１０倍希釈し、試料毎にアリコート（９００μＬ）に分けた。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質（１００μＬ、最終濃度２５μＭ）または緩衝液（陰性対照）を添加した。混合物を９６μＬ／ウェルで０．２ｍＬのＰＣＲプレートにアリコートした。２Ｕ／ｍＬのアピラーゼも含有するアッセイ緩衝液中で調製したスマトリプタン（１２μＬ）を、各ウェルに添加した（１００ｐＭ〜１ｍＭの範囲の最終濃度）。非特異的結合を１００μＭのドニトリプタンの存在下で決定した。試料を混合し、４℃で２時間インキュベートした。［３Ｈ］−ＧＲ１２５７４３（１２μＬ）をその見かけのＫＤ（１０ｎＭ）濃度で添加した。試料を混合し、４℃で２時間インキュベートした後に、９６ウェルガラス繊維ＧＦ／Ｂ濾過プレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、氷冷アッセイ緩衝液で洗浄した。フィルターを乾燥させ、シンチレーションバイアル内に穿孔し、４ｍＬのＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄシンチラント（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加した。放射活性を、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してシンチレーション計数（１試料当たり１分間）によって定量化し、Ｋｉ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して決定した。
【０４１１】
熱安定性アッセイ
（１）Ａ２ＡＲ
野生型ヒトＡ２ＡＲを発現するＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞由来の膜を、Ｔｍ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中に再懸濁させ、２６ゲージ針を１０回通過させることによって均質化した。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を２５μＭの最終濃度で添加した。３Ｈ−ＮＥＣＡ及び非標識ＮＥＣＡを１：５のモル比で混合し、膜に添加して、１μＭの最終濃度を得た（見かけのＫＤをおよそ１０倍上回る）。試料を室温で１時間インキュベートし、その後、氷上で３０分間冷却した。デシルマルトシド（ＤＭ）を添加して、０．１３％の最終濃度にし、試料を氷上で１時間インキュベートした。細胞残屑及び不溶性材料を遠心分離（５分間、２０，０００×ｇ、４℃）によって除去し、上清をＰＣＲストリップにアリコートした（１２０μＬ）。試料を所望の温度になるまで正確に３０分間加熱し、その後、氷上で３０分間クエンチした。試料（５０μＬ）を、９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に充填したゲル濾過樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｆ）上に装填し、これを遠心分離して、受容体結合放射性リガンドを遊離放射性リガンドから分離した［２８］。特異的な結合を２００μＭの非標識ＮＥＣＡの存在下で決定した。放射活性を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーション計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して液体シンチレーションによって定量化した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰によって分析した。見かけのＴｍ値を、非線形回帰によって行われたシグモイド用量応答分析から導出した。結果は、二連で行った２つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【０４１２】
（２）ＮＴＳＲ１
１０ｍＬの昆虫細胞培養物由来の細胞ペレットを、ＤＤＭを含有する１．８ｍＬの緩衝液中に再懸濁させて、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｗ／ｖ％ＤＤＭの最終緩衝液組成物を得た。試料を４℃で１時間回転ミキサー上に置いた。細胞残屑及び非可溶化材料を超遠心分離（１５２，８００×ｇ、４℃、３０分間）によって除去し、洗剤可溶化ＮＴＳＲ１を含有する上清を使用して、ＮＴＳ及びｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の存在下での熱安定性を試験した。熱変性曲線について、上清を、２２．５μＭのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質及び１０ｎＭの３Ｈ−ＮＴＳを含有するアッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中に６．６７倍希釈し、氷上で１時間インキュベートした。アピラーゼ（０．２５単位／ｍＬ、ＮＥＢ）の添加後、試料を氷上にさらに３０分間置いた。試料（１２０μＬのアリコート）を０℃〜６０℃の異なる温度に曝露し、氷上に置いた。遊離３Ｈ−ＮＴＳ（１００μＬ）からの受容体−リガンド−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体の分離を、本質的に以前に説明された［２９］通りに、ＲＤＢ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｗ／ｖ％ＤＤＭ、０．２ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳ、０．０４ｗ／ｖ％ＣＨＳ］で平衡したＢｉｏ−Ｓｐｉｎ  ３０  Ｔｒｉｓカラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用した遠心分離支援ゲル濾過（スピンアッセイ）によって達成した。氷上の対照反応を各変性実験の開始及び終了時に記録した。熱曝露後に活性のままであった割合を、加熱していない対照に対して決定した。データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）におけるボルツマンシグモイド方程式を使用して非線形回帰によって分析した。
【０４１３】
（３）ＡＴ１Ｒ
野生型ＡＴ１Ｒを発現するＨＥＫ２９３細胞を、放射性リガンド結合アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、４０μｇ／ｍＬのバシトラシン）中に再懸濁させ、超音波処理（４秒パルス）によって均質化した。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質及びアピラーゼを、それぞれ、２５μＭ及び０．１単位／ｍＬの最終濃度で添加した。１２５Ｉ−Ａｎｇ  ＩＩ及び非標識Ａｎｇ  ＩＩを、それぞれ、０．５ｎＭ及び２５ｎＭの濃度で添加した（見かけのＫＤ値のおよそ５０倍）。試料を室温（２０℃）で１時間インキュベートし、氷上で１０分間冷却し、その後、ジギトニンを添加して１％の最終濃度にし、氷上で１時間インキュベートした。不溶性材料を遠心分離（２分間、２０，０００×ｇ、４℃）によって除去した。反応混合物をいくつかの１１５μＬアリコートに分け、各々を正確に３０分間インキュベートした。その後、反応物を氷上で５分間クエンチした。ＡＴ１Ｒに結合した１２５Ｉ−Ａｎｇ  ＩＩを、本質的に以前に説明された［２７］通りに、遠心分離支援ゲル濾過カラムを使用して非結合１２５Ｉ−Ａｎｇ  ＩＩから分離した。非特異的結合を、５００倍過剰の冷リガンドを使用して決定した。放射活性を、液体シンチレーション計数を使用して測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非直線回帰によって分析し、見かけのＴｍ値を、シグモイド用量応答曲線の非直線回帰によって導出した。
【０４１４】
結果及び考察
新たなｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の初期開発
近年設計された最小Ｇタンパク質、ｍｉｎｉ−Ｇｓ［２３］は、Ｇｓ由来のＧαＧＴＰａｓｅドメインのみ、ならびにそれを熱安定化するための３つの欠失及び７つの変異を含む（図２９）。ｍｉｎｉ−Ｇｓは、β１−アドレナリン受容体（β１ＡＲ）及びアデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）に共役し、ヘテロ三量体Ｇｓ共役で観察される増加と同じアゴニスト親和性の増加をもたらした［１９、２３、ならびに実施例１及び４］。しかしながら、Ｇαサブユニットには４つのファミリーが存在し（図２８）、ＧＰＣＲは、それらの生理学的機能に応じて異なるＧタンパク質に共役する［２４］。したがって、任意のＧＰＣＲのその完全活性状態での構造決定のためのツールを提供するために、他のファミリーの各々からの少なくとも１つのメンバーのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のバージョンの開発が必要であった。ｍｉｎｉ−Ｇｓを作製するために使用される変異及び欠失は全て、Ｇαサブユニットの保存領域内に位置する（図２９）。したがって、理論的には、これらの変異は、他のＧαファミリーに潜在的に移行可能であり、任意のＧＰＣＲに共役することができるｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のパネルの産生を可能にした。
【０４１５】
各Ｇαファミリーからの原型メンバーを選択し、ＧｓファミリーからのＧｏｌｆ、ＧｉファミリーからのＧｉ１、Ｇｏ１、Ｇｚ、及びＧｔ、Ｇｑ／１１ファミリーからのＧｑ及びＧ１６、ならびにＧ１２／１３ファミリーからのＧ１２を含む。Ｇαｓをｍｉｎｉ−Ｇｓに変換するために必要な変異を選択されたＧαタンパク質に一括で移行して、各々のｍｉｎｉ−Ｇタンパク質バージョンを産生した（図２９）。これらの変異は、以下のものであった：（Ｉ）Ｉｌｅ／ＬｅｕＨＮ４３のＮ末端の全てのアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）残基ＨＨ１Ｓ２．１２とＴｈｒ（ＩｌｅＳ２．１のＮ末端の３個の残基）との間のα−ヘリカルドメインの欠失、及び８個のアミノ酸残基リンカーでの置換、（ｉｉｉ）ＴｙｒＳ４Ｈ３．４とＡｓｎ／ＳｅｒＳ４Ｈ３．１５との間のスイッチＩＩＩの１０個のアミノ酸残基の欠失、（ｉｖ）７個の残基のＤ４９Ｓ１Ｈ１．３、Ｎ５０Ｓ１Ｈ１．４、Ｄ２４９Ｓ４．７、Ｄ２５２Ｓ４Ｈ３．３、Ｄ２７２Ｈ３．８、Ａ３７２Ｈ５．４、Ｉ３７５Ｈ５．７への変異。残基番号は、Ｇαｓのためのものあり、上付き文字は、Ｇタンパク質の残基を比較するためのＣＧＮシステムを指す［６］。各ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の初期特徴付けを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでの発現ならびにＮｉ２＋−親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製を評価することによって行った。８つの操作されたｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のうちの４つ（ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、及びｍｉｎｉ−Ｇ１２）が、これらの初期基準を満たし、すなわち、それらは全て、それらの基礎立体構造において、高収率発現及び精製を可能にするのに十分に安定していた。培養物１リットル当たりの精製ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の収率及び示差走査蛍光測定によって測定されるそれらの安定性（括弧内）は、以下の通りである：ｍｉｎｉ−Ｇｓ：１００ｍｇ／Ｌ（６５℃）、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ：８０ｍｇ／Ｌ（６５℃）、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１：１００ｍｇ／Ｌ（６４℃）、ｍｉｎｉ−Ｇ１２：２５ｍｇ／Ｌ（７３℃）。４つの新たなｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の最も不良な発現は、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１であり、よって、追加の変異Ｇ２１７Ｄを組み込み、Ｎ末端での切断を短縮し、これにより、純粋なタンパク質を１２ｍｇ／Ｌの収率に増加させたが、安定性は４８℃のみであった。したがって、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、及びｍｉｎｉ−Ｇ１２は全て、関連ＧＰＣＲに共役するそれらの能力を試験するために使用するのに十分な安定性であった。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列を図３５に示す。
【０４１６】
４つのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質すなわち、ｍｉｎｉ−Ｇｚ、ｍｉｎｉ−Ｇｔ、ｍｉｎｉ−Ｇ１６、及びｍｉｎｉ−Ｇｑは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現しなかった。（アミノ酸配列を図３６に示す）。Ｇタンパク質構造の高度保存にもかかわらず、ｍｉｎｉ−Ｇｓからの欠失及び変異の一括での移行の失敗は、我々のこれらのタンパク質の折り畳みの理解の欠如を強調する。実際には、補助因子Ｒｉｃ８は、哺乳類細胞におけるＧｑの効率的な折り畳みに必要であることが十分に知られており［３０］、他の未知の因子も必要とされ得る。したがって、この研究の目的のために、我々は、Ｇｉファミリーの２つの他のメンバー、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１及びｍｉｎｉ−Ｇｏ１が既に安定したｍｉｎｉ−Ｇタンパク質をもたらしたことを考慮して、ｍｉｎｉ−Ｇｔ１及びｍｉｎｉ−Ｇｚのさらなるいずれの開発も行わなかった。対照的に、試験したＧｑファミリーのいずれのメンバーも安定したｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を産生しなかったため、我々は、ｍｉｎｉ−Ｇｑの使用可能なバージョンを作製するための代替の戦略を開発することを決定し、ｍｉｎｉ−Ｇ１６に関するさらなる研究を終了した。ｍｉｎｉ−Ｇｑのキメラバージョンの操作の成功について後で論じる。
【０４１７】
ｍｉｎｉ−Ｇｓ系を使用したアッセイ開発及び検証
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を開発する最終目的は、アゴニスト及びｍｉｎｉ−Ｇタンパク質に結合した完全活性状態にあるＧＰＣＲの構造決定である。最も単純な形式では、これは、洗剤中のＧＰＣＲの精製及びインビトロで精製された成分からＧタンパク質−ＧＰＣＲ複合体を形成することを必要とする。したがって、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質が洗剤溶液中のＧＰＣＲに共役したかを評価することができるいくつかの単純なアッセイを考案することが不可欠であった。これは、不活性立体構造及び／または活性立体構造のいずれかにおけるＧＰＣＲ及び／またはｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のいずれかの潜在的な不安定性のため、当初予想されたものほど単純ではないことが分かった。これらの問題は、ｍｉｎｉ−Ｇｓが開発された最も安定したｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のうちの１つであり、かつ熱安定化β１−アドレナリン受容体（β１ＡＲ）及び野生型アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）の両方が他のＧＰＣＲよりもはるかにより安定していたため、ｍｉｎｉ−Ｇｓの開発における最初の研究を行ったときには明らかではなかった。したがって、我々は、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質がＧＰＣＲに共役し、かつ／または洗剤中に安定した複合体を形成したかを評価するための５つの別個のアッセイを開発した。これらを全て、β１ＡＲ及びＡ２ＡＲに共役したｍｉｎｉ−Ｇｓを使用して最初に試験した。各アッセイは各々制限があり、それらは、多くの場合、それらをより不安定な受容体及び新しく開発されたｍｉｎｉ−Ｇタンパク質で使用したその後の節で明らかであり、これらについて以下で論じる。使用した５つの異なるアッセイは、以下のものである：  （ｉ）アゴニスト親和性シフトアッセイ、（ｉｉ）熱安定性アッセイ（ＴＳＡ）、（ｉｉｉ）ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質結合の蛍光ベースの飽和結合分析（ＦＳＢＡ）、（ｉｖ）蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）、（ｖ）精製された複合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。利点及び不利点を有する各アッセイを使用するための簡単な論理的根拠を以下に示す。
【０４１８】
（ｉ）アゴニスト親和性シフトアッセイ
ｍｉｎｉ−Ｇｓの開発は、β１ＡＲに共役した変異体を特定するためのアゴニスト親和性シフトアッセイに依存した［２３］。Ｇタンパク質共役の決定的な特徴は、一般に、ＧＰＣＲのみと比較してＧタンパク質−ＧＰＣＲ複合体に対するアゴニストの親和性の増加であると考えられている。例えば、野生型β２ＡＲは、Ｇタンパク質に共役したときに受容体のみよりも１００倍密にアゴニストに結合する［３１］。しかしながら、他の受容体におけるアゴニスト親和性のシフトは、多くの場合、β２ＡＲで観察されたシフトよりもかなり小さく、例えば、β１ＡＲで観察されたアゴニスト親和性の１０倍のシフトであり［３１］、例えば、ＮＴＳＲ１では完全に不在であり得る。しかしながら、このアッセイの利点は、膜調製物中の受容体または洗剤中で可溶化した受容体のいずれかを使用して、ハイスループットでの標準の薬理学的手順を使用して本アッセイを行うことができることである。アッセイは、飽和結合実験における放射標識アゴニスト、またはより一般的には放射標識アンタゴニストのいずれかを使用することができる［１９、２３、ならびに実施例１及び４］（以下のセロトニン５ＨＴ１Ｂ受容体実験を参照のこと）。このアッセイの利点は、非常に感受性であり、かつ膜結合受容体で、すなわち、受容体が全ての立体構造で最も安定である形式で行うことができることである。このアッセイの不利点は、いくつかの受容体がＧタンパク質に結合したときにアゴニスト親和性のシフトを示さない場合があることである。
【０４１９】
（ｉｉ）熱安定性アッセイ
洗剤可溶化ＧＰＣＲの熱安定性は、使用する洗剤の種類、及び受容体がリガンド不含、アゴニスト結合、またはアンタゴニスト結合のいずれかであるかに依存する［３２、３３］。加えて、受容体安定性は、リガンドの親和性の増加及び／またはオフ速度の減少によって増加する傾向がある［３４］。多くの場合、アゴニスト結合状態は、恐らくアゴニストが完全活性状態への移行の確率を増加させるため、受容体の最も不安定な立体構造のうちの１つである。不活性状態では、膜貫通α−ヘリックスの細胞内表面の密接充填が存在する。活性化時、ヘリックス５及びヘリックス６の外方移動により、この密接充填構造が破壊され、Ｇタンパク質のＣ末端が結合する隙間が作り出され、Ｇタンパク質共役が可能になる［３５］。完全活性状態の非ロドプシンＧＰＣＲの構造は、それらがヘテロ三量体Ｇタンパク質［２］、立体構造特異的ナノボディ［１４、１７、１８］、またはｍｉｎｉ−Ｇタンパク質［１９］の結合によって安定化されたときにのみ決定されている。ＧＰＣＲとＧタンパク質との間の界面は、１０００Å２を超え［２、１９］、それ故に、アゴニスト結合ＧＰＣＲと比較してアゴニスト結合ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体の熱安定性を増加させることが予測される。これは、ｍｉｎｉ−Ｇｓが不在していたときと比較して様々な異なる洗剤中のｍｉｎｉ−Ｇｓに結合しているときにアゴニスト結合状態で一貫してより安定していたβ１ＡＲ及びＡ２ＡＲの両方で観察された［１９、２３、ならびに実施例１及び４］。
【０４２０】
典型的な熱安定性アッセイは、異なる温度で３０分間加熱した後にどのくらいの放射標識アゴニストが洗剤可溶化受容体に結合したままであるかを測定する［３３］。このアッセイの利点は、高速かつハイスループットであり、任意の最適な洗剤中で行うことができることである。別の利点は、アゴニスト−ＧＰＣＲ−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体が膜中に予め形成され得ることであり、これにより、洗剤可溶化時に受容体が安定化されて、本アッセイを行うことが可能になり得る。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の存在下で熱安定性のシフトが存在する場合、これは、結合または共役を強く示唆する。
【０４２１】
（ｉｉｉ）蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）
ＦＳＥＣは、ＳＥＣを未精製洗剤可溶化物質に行い、かつ溶出物におけるＧＦＰ蛍光を監視することによってＧＦＰに融合した膜タンパク質が洗剤中で安定しているかを評価するための迅速な方法である［３６］。洗剤中で安定した膜タンパク質は、膜タンパク質の分子量ならびに特異的に結合した洗剤及び脂質の質量と一致するサイズで対称ピークを提供する。ＧＦＰをｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のＮ末端に融合すること（図３７）によって、安定した複合体がｍｉｎｉ−Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間に形成されたかを監視ためにＦＳＥＣを使用することが可能であった。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ融合タンパク質は、５４ｋＤａの分子量を有し、ＦＳＥＣにおいて１５．１ｍＬの保持体積で移動した。これをアゴニストの不在下でＤＤＭ可溶化β１ＡＲまたはＡ２ＡＲのいずれかと混合したとき、追加のピークが１２．１〜１２．５ｍＬで観察され（図３０ａ、ｃ）、これはＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓに結合した洗剤可溶化受容体の分子量（約１８０ｋＤａ）と一致した。この追加のピークは、受容体が逆アゴニストに結合した場合は観察されなかった。追加のピークは、時折、ＳＥＣカラムの空隙体積に対応し、かつ恐らくＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓの凝集体に起因した８ｍＬの保持体積で観察された。
【０４２２】
このアッセイの利点は、受容体が精製される必要がなく、ＳＥＣ実験に１時間もかからないため、ＧＰＣＲがｍｉｎｉ−Ｇタンパク質と複合体を形成するかの迅速な評価であることである。しかしながら、主な制限は、検出器の飽和及びＧＰＣＲとＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質との間の複合体の存在を不明瞭にする非常に広範なピークの産生を回避するために少量のＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓのみしか実験毎に使用することができないことである。したがって、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の濃度は、受容体との会合に対してそのＫＤ未満であり、それ故に、本アッセイは定量的ではない。加えて、受容体−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体は、ピークが観察されるために洗剤安定性でなければならない。ＤＤＭで観察されるには不安定すぎるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質複合体が多く存在するため、ＬＭＮＧ等のより低刺激性の洗剤を評価することが不可欠である（セロトニン５ＨＴ１Ｂの項を参照のこと）。
【０４２３】
（ｉｖ）ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質結合の蛍光ベースの飽和結合分析
受容体に結合するｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の親和性を決定するために、蛍光ベースの飽和結合アッセイ（ＦＳＢＡ）を開発した。このアッセイでは、固定化された受容体に特異的に結合したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の量を、蛍光プレートリーダーを使用して決定した。原理の証明として、ＤＤＭ可溶化β１ＡＲまたはＡ２ＡＲを、アゴニストまたは逆アゴニストのいずれかの存在下でそれらのＣ末端ポリ−ヒスチジンタグにより９６ウェルプレートのＮｉ２＋被覆ウェル上に固定化した。その後、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓを増加濃度で添加した。洗浄していずれの非特異的に結合したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓを除去した後、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ蛍光の量を測定した（図３０ｂ、ｄ）。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓは、それぞれ、β１ＡＲ及びＡ２ＡＲへのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ結合の２０１±１ｎＭ（ｎ＝２）及び４２８±２４ｎＭ（ｎ＝２）の見かけのＫＤ値での受容体への特異的飽和結合を示した。
【０４２４】
ＦＳＢＡは、インビトロでの受容体へのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質結合の親和性を決定するための単純なアッセイである。しかしながら、決定される見かけの親和性が本アッセイの条件のみに対して特異的であり得ることを理解されたい。具体的には、使用する洗剤の種類は、特にそれが受容体の活性状態をわずかに不安定化する場合に、親和性に著しい影響を及ぼし得る。アゴニストは、アゴニストが受容体の活性状態の安定化にどの程度有効であるかに応じて、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の見かけの親和性にも影響を及ぼし得る。しかしながら、ＦＳＢＡは、依然として受容体へのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質結合の生物物理学的分析のための有用なツールである。
【０４２５】
（ｖ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の受容体への共役を観察するための最終的な生化学的アッセイは、精製された成分をインビトロで組み合わせ、その後、ＳＥＣで関連タンパク質の共溶出を観察することである［２３及び実施例１］。精製Ａ２ＡＲ及び精製ｍｉｎｉ−ＧｓをアゴニストＮＥＣＡの存在下で１：１．２のモル比で混合し、複合体を形成させ、その後、ＳＥＣによって分離した。Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体は、受容体のみの場合の１３３ｋＤａ及びｍｉｎｉ−Ｇｓのみの場合の２２ｋＤａと比較して１５３ｋＤａの見かけの分子量を有する優性ピークとして分解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１５３ｋＤａの複合体由来の画分中にＡ２ＡＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｓの両方の存在を確認した（図３０ｅ）。
【０４２６】
複合体形成を分析するために精製された成分及びＳＥＣを使用する利点は、複合体形成が明確に観察されないことである。複合体形成のための条件を精密化することができ、複合体の安定性は、ＳＥＣを繰り返すことによって数日後に容易に評価することができるる。これらのデータは、ＧＰＣＲ−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体の構造の決定を成功させるために不可欠である。このアッセイの欠点は、十分な量の精製受容体が必要であり、これにより、プロジェクトの初期段階が制限され得ることである。
【０４２７】
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の特徴付け
ｍｉｎｉ−ＧｏｌｆがＡ２ＡＲに結合し、それを安定化する
Ｇｏｌｆ及びＧｓのＧＴＰａｓｅドメインは、８７％の配列同一性を共有し（全長αサブユニットの場合、８０％）、両Ｇタンパク質がＡ２ＡＲに共役する［３７］。Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ複合体の結晶構造でのＡ２ＡＲにおける残基と直接接触するｍｉｎｉ−Ｇｓにおける１７個のアミノ酸残基［１９及び実施例４］のうち、Ｇｓにおける２つのＡｒｇ残基がＧｏｌｆにおける２つのＬｙｓ残基で置換されることを除いて、これらの残基は全て同一である。これらの２つのアイソフォーム間の高度の配列相同性にもかかわらず、Ｇαｏｌｆは、Ｇαよりも過剰発現することがはるかに困難であり、実際には、官能性Ｇαｏｌｆを産生するための報告されている唯一の方法は、昆虫細胞における分子シャペロンＲＩＣ８Ｂとの共発現である［３８］。したがって、我々は、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質バージョンが天然αサブユニットよりも良好に発現さするかを調査するためにｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆを構築した。ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆを、ｍｉｎｉ−Ｇｓから７つの点変異及び３つの欠失を移行することによって構築し（図２９）、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆは、Ｅ．ｃｏｌｉで高度に発現し、ｍｉｎｉ−Ｇｓと同程度に安定していた。ｍｉｎｉ−ＧｏｌｆのＡ２ＡＲへの共役を、精製されたタンパク質からインビトロでアセンブリした複合体のＳＥＣ及び熱安定性アッセイによって評価した［１９、２３、ならびに実施例１及び４］。精製されたＮＥＣＡ結合Ａ２ＡＲをｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆと混合し、ＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３１ａ）。ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆの見かけの分子量は２３ｋＤａ（１７．１ｍＬ、理論的分子量２６ｋＤａ）であり、ＤＭ中の精製されたＡ２ＡＲの見かけの分子量は１３３ｋＤａ（１３．３ｍＬ）であった。複合体Ａ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆは、１５３ｋＤａ（１３ｍＬ）の見かけの分子量を有する優性ピークとして分解し、Ａ２ＡＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆの両方を含んだ。ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆは、アゴニスト結合ＤＭ可溶化Ａ２ＡＲを安定化し、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ共役Ａ２ＡＲは、受容体のみの場合の２６．９±０．３℃と比較して３２．５±１℃の見かけのＴｍを示した（図３１ｂ）。この安定性は、同じ条件下でｍｉｎｉ−Ｇｓで得られた安定性（３２．９℃）と同様であった［１９及び実施例４］。
【０４２８】
ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆの結果は、変異の移行可能性、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆの発現及び安定性、ならびにＡ２ＡＲ−ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ複合体の安定性の両方の観点で非常に有望なものであった。したがって、Ｇタンパク質間に高度の相同性が存在する場合、ＧＰＣＲ間の熱安定化変異の移行について先に観察されたように変異の良好な移行性が存在する［３９］。これらのデータは、天然αサブユニットが不十分にしか発現しない場合でさえも、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質バージョンが高度に発現しており、非常に安定している場合があることも示唆した。
【０４２９】
Ｇｑ共役受容体を研究するためのキメラｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑの開発
Ｅ．ｃｏｌｉでのｍｉｎｉ−Ｇｑの発現は失敗に終わった。これを説明するための１つの可能性は、インビボでのＧｑの効率的な折り畳みが分子シャペロンＲｉｃ８に依存し［３０］、かつｍｉｎｉ−Ｇｑが類似の要件を有したことである。実際には、バキュロウイルス発現系におけるＲｉｃ８とｍｉｎｉ−Ｇｑとの共発現が、ｍｉｎｉ−Ｇｑの過剰産生をもたらした。しかしながら、ｍｉｎｉ−Ｇｑの精製時に、Ｒｉｃ８を解離することは不可能であり（結果示さず）、ｍｉｎｉ−Ｇｑが恐らく正しく折り畳まれておらず、かつ／または非常に不安定であったことを示唆する。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質変異のＧｓからＧｑへの移行の失敗を考慮して、別の戦略を開発した。
【０４３０】
ｍｉｎｉ−Ｇｑの試行及び開発に使用した第２の戦略は、Ｇｑの特異性決定基をｍｉｎｉ−Ｇｓに移送することであった。ＧαサブユニットのＣ末端領域が主な受容体結合部位を形成し［４０］、共役特異性の主な決定基のうちの１つである［４１、４２］ことが十分に確立されている。ＧアルファサブユニットのＣ末端におけるわずか３〜５個のアミノ酸の変異がいくつかのＧＰＣＲへの共役の特異性をスイッチすることが示されている［４１、４２］。しかしながら、現在に至るまでに公開された２つのＧＰＣＲ−Ｇタンパク質構造［２、１９］は、受容体とＧαとの間の広範な界面を明らかにし、Ｇタンパク質の他の領域も特異性に関与し得ることを示唆している。近年のインビボＦＲＥＴ研究は、α５ヘリックス内にあるが、５つのＣ末端残基の遠位にある残基が特異性に強く影響を与えることを示唆している［４３］。
【０４３１】
ｍｉｎｉ−Ｇｓは、試験したＧｑ共役受容体のいずれにも共役しなかった（結果示さず）。次いで、我々は、主に熱安定性アッセイ（図３２ｃ）及びＳＥＣ（図３９）を使用して、いくつかのＧｓ／ｑキメラ（図３８）をＧｑ共役受容体への結合の利得（図３２ａ、ｂ）及び同族Ｇｓ共役受容体Ａ２ＡＲへの結合の喪失の両方について評価した。最初に、ｍｉｎｉ−Ｇｓの５つのＣ末端アミノ酸（ＱＨ５．２２ＹＥＬＬＨ５．２６）をＧαｑに見られるものに変化させたキメラｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５７を構築し、これは、３つの変異（Ｑ３９０ＥＨ５．２２、Ｅ３９２ＮＨ５．２４、及びＬ３９４ＶＨ５．２６）を必要とした。我々は、この構築物と試験したＧｑ受容体のうちのいずれかとの間にいずれの検出可能な相互作用も観察しなかった（図３２ａ、ｂ）。さらに、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５７とＡ２ＡＲとの間の複合体は依然として観察された（図３２ｃ及び図３９）、これらの変異がＧｓのＧｑへの特異性の変化に不十分であったことを示唆した。次に、ｍｉｎｉ−Ｇｓのα５ヘリックス内の最後の１９個のアミノ酸残基（Ｐｈｅ３７６Ｈ５．８〜Ｌｅｕ３９４Ｈ５．２６）をＧαｑ内の最後の１９個のアミノ酸残基に変化させたキメラｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８を構築し、これは、１３の変異（Ｎ３７７ＡＨ５．９、Ｄ３７８ＡＨ５．１０、Ｃ３７９ＶＨ５．１１、Ｒ３８０ＫＨ５．１２、Ｉ３８２ＴＨ５．１４、Ｑ３８４ＬＨ５．１６、Ｒ３８５ＱＨ５．１７、Ｍ３８６ＬＨ５．１８、Ｈ３８７ＮＨ５．１９、Ｒ３８９ＫＨ５．２１、Ｑ３９０ＥＨ５．２２、Ｅ３９２ＮＨ５．２４、及びＬ３９４ＶＨ５．２６）を必要とした。ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８は、Ａ２ＡＲに共役せず（図３２ｃ及び図３９）、Ｃ末端５アミノ酸を越えるα５ヘリックスにおける残基がＧタンパク質特異性に重要であることを実証した。しかしながら、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８の存在下でＧｑ共役受容体ＮＴＳＲ１の熱安定性に著しいシフトは存在しなかった（図３２ｂ）。我々は、これがｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ５８の安定性が損なわれ、ｍｉｎｉ−Ｇｓ内の最後の１９個のアミノ酸残基の変異がＧタンパク質のコアに埋没された残基も変化させ、それ故に、ｍｉｎｉ−Ｇｓ骨格の安定性に影響を及ぼしたためであり得ると推論した。したがって、形成された側鎖がＧタンパク質結合構造におけるβ２ＡＲ［２］またはＡ２ＡＲ［１９］のいずれかと直接接触（３．９Åカットオフ）するα５ヘリックス内の残基がＧαｑ内の残基（Ｒ３８０ＫＨ５．１２、Ｑ３８４ＬＨ５．１６、Ｒ３８５ＱＨ５．１７、Ｈ３８７ＮＨ５．１９、Ｅ３９２ＮＨ５．２４、及びＬ３９４ＶＨ５．２６；図３８）と一致するように変異した、このキメラの精密化バージョンであるｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０を構築した。加えて、変異Ｑ３９０ＥＨ５．２２が受容体−Ｇタンパク質界面に埋没され、かつＧｑ共役受容体への結合に重要であり得るため、骨格を介してＡ２ＡＲとしか接触しないにもかかわらず、変異Ｑ３９０ＥＨ５．２２を含めた。ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０は、試験したＧｑ共役受容体ＮＴＳＲ１及びＡＴ１Ｒの両方により良好に結合し、Ａ２ＡＲには結合しなかった（図３２及び図３９）。
【０４３２】
ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０を試行及び改良するために２つの他のキメラも構築した。ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７２は、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０と比較して追加の変異Ｃ３７９ＶＨ５．１１を含み、Ｃ３７９Ｈ５．１１側鎖がＡ２ＡＲまたはβ２ＡＲのいずれかと直接接触しないが、そのＶａｌへの変異がＡ２ＡＲ由来のＶａｌ  γ２炭素とＬｅｕ１１０との間の直接相互作用を導入すると予測される。しかしながら、ＡＴ１Ｒ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７２複合体は、ＡＴ１Ｒ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０よりも高い熱安定性を有しなかった（結果示さず）。最後に、β２ＡＲ［２］またはＡ２ＡＲ［１９］のいずれかのβと直接接触するＧαの他の領域由来の残基がＧαｑ内の残基と一致するように変異したキメラｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７１を構築した。これは、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０内の７つの変異（Ｒ３８０ＫＨ５．１２、Ｑ３８４ＬＨ５．１６、Ｒ３８５ＱＨ５．１７、Ｈ３８７ＮＨ５．１９、Ｑ３９０ＥＨ５．２２、Ｅ３９２ＮＨ５．２４、及びＬ３９４ＶＨ５．２６）、ならびに６つの追加の変異（Ａ３９ＲＨＮＳ１．３、Ｈ４１ＬＳ１．２、Ｄ３４３ＫＨ４．２３、Ｌ３４６ＶＨ４．２６、Ｒ３４７ＤＨ４．２７、及びＹ３５８ＩＨ４Ｓ６．１１）を含んだ。Ｄ３４３Ｈ４．２３は、側鎖がＡ２ＡＲまたはβ２ＡＲのいずれかと相互作用しなかった唯一のアミノ酸残基であったが、より長い側鎖が受容体と潜在的に相互作用し得るため、Ｌｙｓへの変異を含み、電荷反転が特異性のために重要であり得る。逆に、Ｔｈｒ３５０Ｈ４Ｓ６．３は、その側鎖がβ２ＡＲと直接接触するが、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７１内のＰｒｏに変異しなかった。Ｇαｑの２つの独立して解かれた構造とのＧαｓのアライメント［４４、４５］は、Ｇタンパク質のこの領域が著しく異なり、それ故に、Ｇαｑで、この残基が受容体と相互作用する可能性が低いことを示した。しかしながら、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０の改良バージョンを作製するためにこれらを全て考慮した結果、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７１は、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑ７０と比較してアゴニスト結合Ｇｑ共役受容体の熱安定性を改善しなかった（図３２ａ、ｂ）。
【０４３３】
ｍｉｎｉ−Ｇｉ１：安定性問題の対処
結果として生じたタンパク質が非常に不十分にしか発現せず、低い安定性しか有しなかったため、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１を作製するためのｍｉｎｉ−ＧｓからＧαｉ１への７つの点変異及び３つ欠失の移行は失敗に終わった（結果示さず）。ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑのキメラを開発する研究が進行中である間に、我々は、何故ｍｉｎｉ−Ｇｉ１がそれほど不安定に見えたのかの理由を最初に調査することを決定した。したがって、発現及び安定性を改善し、かつｍｉｎｉ−Ｇｉ１のβγサブユニットへの結合を可能にするために、Ｇｉ１（不十分な発現）とＧｓ／Ｇｏ（高度な発現）との間の配列比較に基づいて、Ｎ末端（残基４〜１８）を再挿入し、Ａｓｐ２４９Ｈ３．８をＬｅｕに戻し変異し、Ｇ２１７ＤＨ２Ｓ４．３変異を導入した（図２９及び図３５）。結果として生じたｍｉｎｉ−Ｇｉ１（構築物４６）は、培養物１リットル当たり１２ｍｇの精製されたタンパク質しか産出せず、ｍｉｎｉ−Ｇｓよりも１７℃不安定であったが、ＧＰＣＲ共役における初期研究に好適であった。
【０４３４】
セロトニン５−ＨＴ１Ｂ受容体（５ＨＴ１ＢＲ）がバキュロウイルス発現系を使用してＤＤＭで発現及び精製され得るため、セロトニン５−ＨＴ１Ｂ受容体（５ＨＴ１ＢＲ）を、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１を開発するためのモデルＧｉ共役受容体として使用し、その構造を不活性状態で決定した［１０］。最初に、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１を、ＦＳＥＣを使用して精製された５ＨＴ１ＢＲ（ＤＤＭ中）への結合について試験し、アゴニストドニトリプタンに結合させた。しかしながら、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１（図３７）は、受容体の不在下またはドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲの存在下で、１３．５ｍＬで移動し、共役が生じなかったことを示す（図３３ｃ）。しかしながら、ＬＭＮＧ精製５ＨＴ１ＢＲを使用した場合、ＦＳＥＣは２つのピークを示し、一方は、１４．３ｍＬの保持体積を有する遊離ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１に対応し、他方は、１２．２ｍＬの保持量を有するドニトリプタン活性化５ＨＴ１ＢＲに結合したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１に対応した（図３３ｄ）。ドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲが結晶化されているため、これは、受容体が洗剤中で適度に安定していることを示唆し、これは、次いで、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１−５ＨＴ１ＢＲ−ドニトリプタン複合体の不安定性が恐らく受容体ではなくｍｉｎｉ−Ｇタンパク質に起因したことを示唆した。これを、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１４６（図３７）とβ１γ２との間にヘテロ三量体を形成し、ＬＭＮＧ中のドニトリプタン結合５ＨＴ１ＢＲとのｍｉｎｉ−三量体複合体を作製し、かつＦＳＥＣを実行することによって試験した。ＬＭＮＧ精製５ＨＴ１ＢＲと複合したＧＦＰ−ｍｉｎｉ−三量体は、遊離ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｉ１β１γ２三量体の場合の１４．３ｍＬと比較して１１．８ｍＬの保持体積を有する単一ピークとして分解した（図３３ｆ）。したがって、β１γ２サブユニットは、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１の安定性を回復した。
【０４３５】
ｍｉｎｉ−Ｇｉ１β１γ２三量体がＬＭＮＧ可溶化５ＨＴ１ＢＲにうまく共役したが、これは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のサイズが大きいため、ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質結合受容体として結晶学に望ましいものではない。したがって、ｍｉｎｉ−Ｇｓの共役をＧｑの共役に変化させる成功した戦略に従って、同じ戦略を適用して、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１キメラを操作した（図３５及び図４０）。したがって、９つの変異（Ｃ３７９ＶＨ５．１１、Ｒ３８０ＴＨ５．１２、Ｑ３８４ＩＨ５．１６、Ｒ３８５ＫＨ５．１７、Ｈ３８７ＮＨ５．１９、Ｑ３９０ＤＨ５．２２、Ｙ３９１ＣＨ５．２３、Ｅ３９２ＧＨ５．２４、及びＬ３９４ＦＨ５．２６）をｍｉｎｉ−Ｇｓのα５ヘリックスに導入して、その共役特異性をＧｉ１の共役特異性に変化させた。ドニトリプタン結合ＤＤＭ精製５ＨＴ１ＢＲとのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１４３間の複合体（図３７）は、遊離ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１の場合の１５．１ｍＬと比較して１３．２ｍＬの保持体積を有する単一ピークとして分解した（図３３ｅ）。したがって、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１は、実際には、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１よりも安定していた。ドニトリプタン結合ＤＤＭ可溶化５ＨＴ１ＢＲに対するｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１と比較したｍｉｎｉ−Ｇｓの特異性を、ＦＳＢＡを使用して確認した（図３３ｂ）。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓの５ＨＴ１ＢＲへの特異的共役は観察されなかったが、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１への特異的共役（見かけのＫＤ：３８６ｎＭ、図３３ｂ）が確認された。
【０４３６】
全てのｍｉｎｉ−Ｇｉ１構築物及びβ１γ２の役割を比較するために、アゴニスト親和性シフトアッセイを５ＨＴ１ＢＲに行った。非共役受容体は、このアッセイでアゴニストスマトリプタンの場合に２７６±１０ｎＭのＫｉを示し、これは、それぞれ、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１４６及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１４３によって、８０±１３ｎＭ及び３６±２ｎＭにシフトされた（図３３ａ）。しかしながら、β１γ２のｍｉｎｉ−Ｇタンパク質への添加により、それぞれ、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１４６−β１γ２及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１４３−β１γ２に対する１５±１ｎＭ及び７．２±０．８ｎＭへのアゴニスト親和性のさらなる増加がもたらされた。したがって、ｍｉｎｉ−Ｇｉ１及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１の両方の生成の成功にもかかわらず、それらの安定性は、β１γ２の結合がｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を安定化し、ｍｉｎｉ−三量体の共役時にアゴニスト親和性のさらなる増加を誘発するため、依然として完璧ではない。
【０４３７】
ｍｉｎｉ−Ｇｏ１の５ＨＴ１ＢＲへの共役
Ｇｏ１及びＧｉ１のＧＴＰａｓｅドメインは高度に保存されている（８０％の同一性）が、それらに由来するｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は非常に異なって挙動した。不安定なｍｉｎｉ−Ｇｉ１とは異なり、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１は、良好に発現し（１００ｍｇ／Ｌ）、ｍｉｎｉ−Ｇｓと同程度の高い安定性を有し、それは、低刺激性の洗剤の存在に対して大幅に非感受性であった。５ＨＴ１ＢＲがＧｏ及びＧｉファミリーメンバーに結合する［４６］ため、我々は、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１の５ＨＴ１ＢＲへの共役を試験し、結果をｍｉｎｉ−Ｇｉ１との共役と比較した（上記を参照のこと）。ＦＳＥＣで、ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１１２（図３７）は、ドニトリプタン結合ＤＤＭ可溶化５ＨＴ１ＢＲ（未精製）に部分的に共役し、受容体がアンタゴニストに結合したときにより高い分子量種（保持体積１３ｍＬ）が減少した（図３４ｃ）。これは、結合が観察されなかった同じ条件下でのｍｉｎｉ−Ｇｉ１の結果とは対照的であった（図３３ｃ）。部分的共役は、精製５ＨＴ１ＢＲ及びＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１を使用してこの実験を繰り返したときに、全てのＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１が受容体に結合したため、恐らく本アッセイで使用した低濃度の５ＨＴ１ＢＲ及びＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１に起因した（図３４ｅ）。加えて、複合体をＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製し、１：１．２のモル比での５ＨＴ１ＢＲ及びｍｉｎｉ−Ｇｏ１の共溶出を示した（図３４ｄ）。ＧＦＰ−ｍｉｎｉ−Ｇｏ１は、ドニトリプタンの存在下で１８４±２４ｎＭの見かけのＫＤでＤＤＭ可溶化５ＨＴ１ＢＲに結合した（図３４ｂ）。膜内で、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１１２は、５ＨＴ１ＢＲに対するアゴニスト親和性を２７６±１０ｎＭから３２±３ｎＭにシフトした（図３４ａ）。
【０４３８】
ｍｉｎｉ−Ｇｏ１がより高度に発現し、かつ洗剤への耐性がより高いため、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１の特性は、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉを使用するのではなく、これをＧｏ／Ｇｉ共役受容体の構造研究に理想的な選択にする。
【０４３９】
結論
本明細書に提示される研究の目的は、完全活性状態のＧＰＣＲの構造決定の基準として使用することができる一連のｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を生成することであった。ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を開発する最初の研究をＧｓで行い［２３］、これが、最も良好に発現し、かつ最も安定したｍｉｎｉ−Ｇタンパク質のうちの１つであることが分かった。関連変異の他のＧタンパク質への移行により、ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆ、ｍｉｎｉ−Ｇｏ１、及びｍｉｎｉ−Ｇ１２の誘導に成功した。ｍｉｎｉ−Ｇｏｌｆもｍｉｎｉ−Ｇｏ１もいずれもアゴニストの存在下でのみ関連受容体に共役し、ＳＥＣによって精製され得る安定した複合体を形成した。現在、我々は、ｍｉｎｉ−Ｇ１２がＥ．ｃｏｌｉで高度に発現し、高い熱安定性を有し、タンパク質が折り畳まれた状態であることを示唆するにもかかわらず、ｍｉｎｉ−Ｇ１２の任意の受容体への結合を実証することができていない（結果示さず）。対照的に、ｍｉｎｉ−Ｇｔ１、ｍｉｎｉ−Ｇｚ、ｍｉｎｉ−Ｇｑ、及びｍｉｎｉ−Ｇ１６を生成する最初の試行は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現しなかったため、失敗に終わった。ｍｉｎｉ−Ｇｉ１が極めて不十分にしか発現せず、さらなる変異誘発時に改善されたが、依然としてｍｉｎｉ−Ｇｓと同程度には安定しておらず、５ＨＴ１ＢＲの完全アゴニスト親和性シフトを達成するためにβγサブユニットの結合を必要とした。
【０４４０】
最初に機能しなかったもののｍｉｎｉ−Ｇタンパク質を生成するための第２のアプローチは、ｍｉｎｉ−Ｇｓの特異性を所望のＧタンパク質の特異性に変換することによってキメラを作製することであった。第２のアプローチを、側鎖が関連複合体の結晶構造におけるβ２ＡＲまたはＡ２ＡＲのいずれかと接触するα５ヘリックスに存在する残基のみをｍｉｎｉ−Ｇｓで変異させて［２，１９］、Ｇｑ内の同等の残基と一致させることによって最初に開発した。最終ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｑキメラは、安定しており、Ｅ．ｃｏｌｉで過剰発現し、Ｇｑ共役受容体に結合したが、Ｇｓ共役受容体には結合しなかった。このプロセスは、ｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｉ１及びｍｉｎｉ−Ｇｓ／ｏキメラの生成でも成功した。α５ヘリックスは、現在に至るまでに結晶化された２つのＧタンパク質−ＧＰＣＲ複合体におけるＧＴＰａｓｅドメインと受容体との間の埋没表面積の約７０％を提供した。この研究は、これらの接触を変化が共役の特異性を変化させるのに十分であることを示す。しかしながら、界面の残りの３０％が重要ではないわけではなく、単に一連のアミノ酸残基をこの界面内に収容することができ、それ故に、Ｇタンパク質結合の特異性及び親和性の両方を定義するのにさほど重要な役割を果たさないだけである。
【０４４１】
ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質及びそれらの特性を表７に示す。全体的に見て、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現レベルは満足できるものであり、洗剤の不在下でのｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の安定性も良好である。しかしながら、それらの安定性は、洗剤中で、特に高い濃度で減少し、安定性の最大減少は、高い洗剤濃度（０．５ｗ／ｖ％超）及び膜タンパク質精製に過酷なものと見なされる洗剤で観察された［４７］。したがって、受容体−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体を形成するための洗剤の初期選択に注意を払わなければならない。
【０４４２】
結論として、本明細書で開発した一連のｍｉｎｉ−Ｇタンパク質は、受容体−ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質複合体の結晶化によって受容体の活性構造についてのさらなる知識をもたらすであろう。これは、ＧＰＣＲのシグナル伝達の我々の理解を深め、創薬にも有用に適用される。
【０４４３】
【表７−１】
2019507590.tif 000015
【０４４４】
【表７−２】
2019507590.tif 000016
【０４４５】
表７：  ｍｉｎｉ−Ｇタンパク質の変異及びそれらの特性
【０４４６】
実施例５の参考文献
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８．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ＤＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｃ，Ｌｙｏｎｓ  ＪＡ，Ｈｏｌｌ  Ｒ，Ａｒａｇａｏ  Ｄ，Ａｒｌｏｗ  ＤＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｅｔａ（２）ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４６９（７３２９）：２３６−４０．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０１／１４．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６６５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１２２８８７６；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０７４３３５。
９．Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｇａｏ  ＺＧ，Ｐａｏｌｅｔｔａ  Ｓ，Ｚｈａｎｇ  Ｄ，Ｈａｎ  ＧＷ，ｅｔ  ａｌ．Ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｐ２Ｙ１２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５０９（７４９８）：１１９−２２．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３２８８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４７８４２２０；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４１２８９１７。
１０．Ｗａｎｇ  Ｃ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｍａ  Ｊ，Ｗｕ  Ｈ，Ｗａｃｋｅｒ  Ｄ，Ｋａｔｒｉｔｃｈ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｔ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３４０（６１３２）：６１０−４．ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３２８０７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３５１９２１０；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ３６４４３７３。
１１．Ｌｅｂｏｎ  Ｇ，Ｗａｒｎｅ  Ｔ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＣ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｋ，Ｌａｎｇｍｅａｄ  ＣＪ，Ｌｅｓｌｉｅ  ＡＧ，ｅｔ  ａｌ．Ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＧＰＣＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７４（７３５２）：５２１−５．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０５／２０．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０１３６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１５９３７６３；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３１４６０９６。
１２．Ｘｕ  Ｆ，Ｗｕ  Ｈ，Ｋａｔｒｉｔｃｈ  Ｖ，Ｈａｎ  ＧＷ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＫＡ，Ｇａｏ  ＺＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ｈｕｍａｎ  Ａ２Ａ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１；３３２（６０２７）：３２２−７．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０３／１２．ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２０２７９３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１３９３５０８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０８６８１１。
１３．Ｗｈｉｔｅ  ＪＦ，Ｎｏｉｎａｊ  Ｎ，Ｓｈｉｂａｔａ  Ｙ，Ｌｏｖｅ  Ｊ，Ｋｌｏｓｓ  Ｂ，Ｘｕ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４９０（７４２１）：５０８−１３．Ｅｐｕｂ  ２０１２／１０／１２．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１５５８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３０５１７４８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３４８２３００。
１４．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＳＧ，Ｃｈｏｉ  ＨＪ，Ｆｕｎｇ  ＪＪ，Ｐａｒｄｏｎ  Ｅ，Ｃａｓａｒｏｓａ  Ｐ，Ｃｈａｅ  ＰＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｎａｎｏｂｏｄｙ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ（２）ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４６９（７３２９）：１７５−８０．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０１／１４．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９６４８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１２２８８６９；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０５８３０８。
１５．Ｃｈｏｅ  ＨＷ，Ｋｉｍ  ＹＪ，Ｐａｒｋ  ＪＨ，Ｍｏｒｉｚｕｍｉ  Ｔ，Ｐａｉ  ＥＦ，Ｋｒａｕｓｓ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ＩＩ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７１（７３４０）：６５１−５．ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０９７８９［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９７８９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１３８９９８８。
１６．Ｓｔａｎｄｆｕｓｓ  Ｊ，Ｅｄｗａｒｅ  ＰＣ，Ｄ’  Ａｎｔｏｎａ  Ａ，Ｆｒａｎｓｅｎ  Ｍ，Ｘｉｅ  Ｇ，Ｏｐｒｉａｎ  ＤＤ，ｅｔ  ａｌ  ａｌ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７１（７３４０）：６５６−６０．ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０９７９５［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９７９５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１３８９９８３。
１７．Ｋｒｕｓｅ  ＡＣ，Ｒｉｎｇ  ＡＭ，Ｍａｎｇｌｉｋ  Ａ，Ｈｕ  Ｊ，Ｈｕ  Ｋ，Ｅｉｔｅｌ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０４（７４７８）：１０１−６．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２７３５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４２５６７３３；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４０２０７８９。
１８．Ｓｏｕｎｉｅｒ  Ｒ，Ｍａｓ  Ｃ，Ｓｔｅｙａｅｒｔ  Ｊ，Ｌａｅｒｅｍａｎｓ  Ｔ，Ｍａｎｇｌｉｋ  Ａ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕ−ｏｐｉｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５２４（７５６５）：３７５−８．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４６８０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６２４５３７７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４８２０００６。
１９．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｂ，Ｎｅｈｍｅ  Ｒ，Ｗａｒｎｅ  Ｔ，Ｌｅｓｌｉｅ  ＡＧ，Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ（２Ａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６；５３６（７６１４）：１０４−７．Ｅｐｕｂ  ２０１６／０７／２８．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１８９６６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７４６２８１２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ４９７９９９７。
２０．Ｐａｒｋ  ＪＨ，Ｓｃｈｅｅｒｅｒ  Ｐ，Ｈｏｆｍａｎｎ  ＫＰ，Ｃｈｏｅ  ＨＷ，Ｅｒｎｓｔ  ＯＰ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｆｒｅｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｐｓｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５４（７２０１）：１８３−７．Ｅｐｕｂ  ２００８／０６／２０．ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０７０６３［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７０６３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８５６３０８５。
２１．Ｓｃｈｅｅｒｅｒ  Ｐ，Ｐａｒｋ  ＪＨ，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ  ＰＷ，Ｋｉｍ  ＹＪ，Ｋｒａｕｓｓ  Ｎ，Ｃｈｏｅ  ＨＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｏｐｓｉｎ  ｉｎ  ｉｔｓ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５５（７２１２）：４９７−５０２．Ｅｐｕｂ  ２００８／０９／２７．ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０７３３０［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７３３０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８８１８６５０。
２２．Ｐａｒｄｏｎ  Ｅ，Ｌａｅｒｅｍａｎｓ  Ｔ，Ｔｒｉｅｓｔ  Ｓ，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ＳＧ，Ｗｏｈｌｋｏｎｉｇ  Ａ，Ｒｕｆ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１４；９（３）：６７４−９３．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１４．０３９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４５７７３５９；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４２９７６３９。
２３．Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｂ，Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ  ＆  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：  ＰＥＤＳ．２０１６；２９（１２）：５８３−９４．Ｅｐｕｂ  ２０１６／０９／２８．ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｗ０４９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７６７２０４８。
２４．Ｓｙｒｏｖａｔｋｉｎａ  Ｖ，Ａｌｅｇｒｅ  ＫＯ，Ｄｅｙ  Ｒ，Ｈｕａｎｇ  ＸＹ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６；４２８（１９）：３８５０−６８．Ｅｐｕｂ  ２０１６／０８／１６．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１６．０８．００２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７５１５３９７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ５０２３５０７。
２５．Ｗａｒｎｅ  Ｔ，Ｃｈｉｒｎｓｉｄｅ  Ｊ，Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ  ＧＦ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ，ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｔｕｒｋｅｙ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００３；１６１０（１）：１３３−４０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １２５８６３８７。
２６．Ｗａｒｎｅ  Ｔ，Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ  ＭＪ，Ｂａｋｅｒ  ＪＧ，Ｍｏｕｋｈａｍｅｔｚｉａｎｏｖ  Ｒ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＣ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ１−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５４（７２０３）：４８６−９１．Ｅｐｕｂ  ２００８／０７／０３．ｄｏｉ：ｎａｔｕｒｅ０７１０１［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７１０１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８５９４５０７。
２７．Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ，Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１４；４２６（２４）：４１３９−５４．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１４．１０．０１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５４５４０２０；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４２７１７３７。
２８．Ｌｅｂｏｎ  Ｇ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｋ，Ｊａｚａｙｅｒｉ  Ａ，Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ（２Ａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；４０９（３）：２９８−３１０．ｄｏｉ：  Ｓ００２２−２８３６（１１）００３７８−０［ｐｉｉ］
１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１１．０３．０７５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１５０１６２２。
２９．Ｓｈｉｂａｔａ  Ｙ，Ｗｈｉｔｅ  ＪＦ，Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ  ＭＪ，Ｍａｇｎａｎｉ  Ｆ，Ａｌｏｉａ  ＡＬ，Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＴＳ１．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；３９０（２）：２６２−７７．Ｅｐｕｂ  ２００９／０５／０９．ｄｏｉ：  Ｓ００２２−２８３６（０９）００５３５−Ｘ［ｐｉｉ］
１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００９．０４．０６８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９４２２８３１。
３０．Ｃｈａｎ  Ｐ，Ｔｈｏｍａｓ  ＣＪ，Ｓｐｒａｎｇ  ＳＲ，Ｔａｌｌ  ＧＧ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｃ−８  ｉｓ  ｔｏ  ｆｏｌｄ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３；１１０（１０）：３７９４−９．ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１２２０９４３１１０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３４３１１９７；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ３５９３９２６。
３１．Ｇｒｅｅｎ  ＳＡ，Ｈｏｌｔ  ＢＤ，Ｌｉｇｇｅｔｔ  ＳＢ．Ｂｅｔａ  １−  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｕｂｔｙｐｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｇｓ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９２；４１（５）：８８９−９３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １３５０３２１。
３２．Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ａ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｃｌｅａｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１２；３７（９）：３４３−５２．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１２．０６．００３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２７８４９３５。
３３．Ｍａｇｎａｎｉ  Ｆ，Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ  ＭＪ，Ｓｈｉｂａｔａ  Ｙ，Ａｂｄｕｌ−Ｈｕｓｓｅｉｎ  Ｓ，Ｌｅｂｏｎ  Ｇ，Ｍｉｌｌｅｒ−Ｇａｌｌａｃｈｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｐｔｉｍａｌｌｙ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６；１１（８）：１５５４−７１．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０８８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７４６６７１３。
３４．Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＲＣ，Ｘｕ  Ｆ．Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１５；４０（２）：７９−８７．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１４．１２．００５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５６０１７６４。
３５．Ｌｅｂｏｎ  Ｇ，Ｗａｒｎｅ  Ｔ，Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ａｇｏｎｉｓｔ−ｂｏｕｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２０１２．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０４／０７．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｓｂｉ．２０１２．０３．００７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２４８０９３３。
３６．Ｋａｗａｔｅ  Ｔ，Ｇｏｕａｕｘ  Ｅ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６；１４（４）：６７３−８１．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２００６．０１．０１３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １６６１５９０９。
３７．Ｋｕｌｌ  Ｂ，Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎ  Ｐ，Ｆｒｅｄｈｏｌｍ  ＢＢ．Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ（２Ａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｒｅ  ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｇ（ｏｌｆ）ｉｎ  ｒａｔ  ｓｔｒｉａｔｕｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０００；５８（４）：７７１−７．Ｅｐｕｂ  ２０００／０９／２２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １０９９９９４７。
３８．Ｃｈａｎ  Ｐ，Ｇａｂａｙ  Ｍ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＦＡ，Ｋａｎ  Ｗ，Ｏｎｅｒ  ＳＳ，Ｌａｎｉｅｒ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｂｙ  ＧＳＴ−Ｒｉｃ−８  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇ  ａｌｐｈａ（ｏｌｆ）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（４）：２６２５−３５．ｄｏｉ：  １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１０．１７８８９７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１１１５４７９；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ３０２４７５８。
３９．Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｖｅｇａ  ＭＪ，Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．２００９；２６（８）：３８５−９６．Ｅｐｕｂ  ２００９／１１／０４．ｄｏｉ：  １０．３１０９／０９６８７６８０９０３２０８２３９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９８８３２９８。
４０．Ｈａｍｍ  ＨＥ，Ｄｅｒｅｔｉｃ  Ｄ，Ａｒｅｎｄｔ  Ａ，Ｈａｒｇｒａｖｅ  ＰＡ，Ｋｏｅｎｉｇ  Ｂ，Ｈｏｆｍａｎｎ  ＫＰ．Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８８；２４１（４８６７）：８３２−５．Ｅｐｕｂ  １９８８／０８／１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ３１３６５４７。
４１．Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＢＲ，Ｆａｒｆｅｌ  Ｚ，Ｌｕｓｔｉｇ  ＫＤ，Ｊｕｌｉｕｓ  Ｄ，Ｂｏｕｒｎｅ  ＨＲ．Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｑ  ａｌｐｈａ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｏｆ  Ｇｉ  ａｌｐｈａ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９３；３６３（６４２６）：２７４−６．Ｅｐｕｂ  １９９３／０５／２０．ｄｏｉ：  １０．１０３８／３６３２７４ａ０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ８３８７６４４。
４２．Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＢＲ，Ｈｅｒｚｍａｒｋ  Ｐ，Ｉｓｈｉｄａ  Ｓ，Ｖｏｙｎｏ−Ｙａｓｅｎｅｔｓｋａｙａ  ＴＡ，Ｓｕｎ  Ｙ，Ｆａｒｆｅｌ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇｑ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  Ｇｓ  ａｌｐｈａ  ｔｈａｔ  ａｌｔｅｒ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９６；５０（４）：８８５−９０．Ｅｐｕｂ  １９９６／１０／０１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ８８６３８３４。
４３．Ｓｅｍａｃｋ  Ａ，Ｓａｎｄｈｕ  Ｍ，Ｍａｌｉｋ  ＲＵ，Ｖａｉｄｅｈｉ  Ｎ，Ｓｉｖａｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇａｌｐｈａｓ  ａｎｄ  Ｇａｌｐｈａｑ  Ｃ  Ｔｅｒｍｉｎｉ  Ｔｈａｔ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１６；２９１（３４）：１７９２９−４０．ｄｏｉ：  １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７３５７２０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７３３００７８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ５０１６１８１。
４４．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ａ，Ｋｉｔａｎｏ  Ｋ，Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｊ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｎ，Ｔａｇｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇｑ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０；１０７（３１）：１３６６６−７１．ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．１００３５５３１０７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２０６３９４６６；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ２９２２２６６。
４５．Ｔｅｓｍｅｒ  ＶＭ，Ｋａｗａｎｏ  Ｔ，Ｓｈａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ  Ａ，Ｋｏｚａｓａ  Ｔ，Ｔｅｓｍｅｒ  ＪＪ．Ｓｎａｐｓｈｏｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ｔｈｅ  Ｇａｌｐｈａｑ−ＧＲＫ２−Ｇｂｅｔａｇａｍｍａ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００５；３１０（５７５４）：１６８６−９０．ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１１８８９０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １６３３９４４７。
４６．Ｃｌａｗｇｅｓ  ＨＭ，Ｄｅｐｒｅｅ  ＫＭ，Ｐａｒｋｅｒ  ＥＭ，Ｇｒａｂｅｒ  ＳＧ．Ｈｕｍａｎ  ５−ＨＴ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｆ９  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７；３６（４２）：１２９３０−８．Ｅｐｕｂ  １９９７／１０／２３．ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｂｉ９７０１１２ｂ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ９３３５５５２。
４７．Ｔａｔｅ  ＣＧ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；６０１：１８７−２０３．ｄｏｉ：  １０．１００７／９７８−１−６０７６１−３４４−２＿１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２００９９１４７。
【０４４７】
実施例６：ＧＬＰ１Ｒへのｍｉｎｉ−Ｇｓの影響
受容体安定性へのｍｉｎｉ−Ｇｓの影響を評価するために、我々は、洗剤可溶化後のＧＬＰ１Ｒ安定性を測定した。この目的を達成するために、可溶化前に、ヒトＧＬＰ１Ｒ受容体を発現する細胞をトリチウム化ペプチドアゴニスト及びｍｉｎｉ−Ｇｓとインキュベートした。混合物を室温で１時間にわたって平衡に到達させた後、４℃で１時間可溶化した。受容体／リガンド／ｍｉｎｉ−Ｇｓのアリコートを異なる温度で３０分間インキュベートした。過剰な非結合リガンドを受容体結合分子から分離した後、保持された放射活性のレベルを温度点に対してプロットされた温度毎に測定した。これらの結果を、同一であったが、ｍｉｎｉ−Ｇｓを欠いた実験の対照アームと比較した。ｍｉｎｉ−Ｇｓの存在は、アゴニスト結合立体構造の安定性を著しく増加させた（図４１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−４】
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【図２６−９】
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【図２６−１０】
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【図２６−１２】
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【図２６−１７】
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【図２６−１９】
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【図２６−２０】
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【図２６−２１】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2019507590.tif 000075
【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019507590.tif 000078
2019507590.tif 000079
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