(57)【要約】  本発明は、糖と化学結合している、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)及びビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸により特徴づけられる化合物に関する。本発明は更に、ポリマー又はファインケミカルの合成の成分として用いられる、対応する化合物に関する。
2019512521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む化合物。
【請求項２】
MHET又はBHET及び糖がグリコシド結合を介して互いに化学結合している、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
糖と化学結合した、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸を含む化合物。
【請求項４】
MHET又はBHET及び糖がグリコシド結合を介して互いに化学結合している、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
糖が単糖又は二糖である、請求項2から4の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
単糖又は二糖が、六炭糖及び五炭糖からなる群から選択される、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
単糖又は二糖が、α-グルコース、β-グルコース、α-フルクトース、β-フルクトース、α-ガラクトース及びβ-ガラクトース、α-マンノース及びβ-マンノース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、グルコサミン、並びにグルクロン酸から選択される、請求項5に記載の化合物。
【請求項８】
MHET又はBHETの酵素的グリコシル化により得られる、請求項1から7の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
MHET又はBHETの酵素的グリコシル化により形成される、請求項1から8の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
酵素的グリコシル化が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はフルクトシダーゼにより触媒される、請求項8又は9に記載の化合物。
【請求項１１】
酵素的グリコシル化がグルコシダーゼにより触媒される、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
グルコシダーゼがα-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼである、請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
MHET又はBHETがポリエチレンテレフタレート(PET)から細菌分解又は酵素分解により得られる、請求項8から12の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
MHET又はBHETがポリエチレンテレフタレート(PET)から細菌分解又は酵素分解により形成される、請求項8から13の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
PETの酵素分解がヒドロラーゼにより触媒される、請求項13又は14に記載の化合物。
【請求項１６】
ヒドロラーゼのPETエースがイデオネラ・サカイエンシス由来である、請求項15に記載の化合物。
【請求項１７】
ヒドロラーゼが、配列番号1に示されたアミノ酸配列を含む、請求項15又は16に記載の化合物。
【請求項１８】
MHET又はBHETの酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素が一緒に用いられる、請求項13から17の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素を含有する微生物が用いられる、請求項18に記載の化合物。
【請求項２０】
グリコシド結合を介して糖と化学結合したMHET又はBHETからなる、請求項1から19の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
以下の構造(a)又は(b)の1つを有する、請求項1から20の少なくともいずれか一項に記載の化合物:
【化１】
2019512521.tif 000037
(式中、R1はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、R2はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、又はHである)。
【請求項２２】
少なくとも1つのメタクリル残基を更に含む、請求項1から19の少なくともいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
以下の構造を有する、請求項22に記載の化合物:
【化２】
2019512521.tif 000038
(式中、R1はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、R2はメタクリル残基を含む)。
【請求項２４】
以下の構造を有する、請求項23に記載の化合物:
【化３】
2019512521.tif 000039
【請求項２５】
以下の構造を有する、請求項23に記載の化合物:
【化４】
2019512521.tif 000040
【請求項２６】
以下の構造を有する、請求項23に記載の化合物:
【化５】
2019512521.tif 000041
【請求項２７】
親油性側鎖を更に含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
以下の構造を有する、請求項27に記載の化合物:
【化６】
2019512521.tif 000042
(式中、R1はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、R2は、親油性側鎖、好ましくは、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素側鎖、又はリンカーを含む)。
【請求項２９】
R2が、飽和又は不飽和脂肪族C5〜C20炭化水素側鎖、好ましくは飽和又は不飽和脂肪族C5〜C15炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和脂肪族C8〜C12炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和脂肪族C10炭化水素側鎖、及び最も好ましくは飽和脂肪族C10炭化水素側鎖である、請求項28に記載の化合物。
【請求項３０】
以下の構造(a)〜(j)を有する化合物から選択される、請求項28に記載の化合物:
【化７Ａ】
2019512521.tif 000043
【化７Ｂ】
2019512521.tif 000044
(式中、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20である)。
【請求項３１】
グリコシド結合を介してMHET又はBHETと化学結合した糖がメタクリル化されている、請求項2から24、26から29、又は30(b)から(j)のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
請求項1から31の少なくともいずれか一項に記載の化合物のポリマー。
【請求項３３】
バイオハイブリッドポリマーである、請求項32に記載のポリマー。
【請求項３４】
モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)の酵素的グリコシル化の工程を含む、グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む化合物を調製するための方法。
【請求項３５】
酵素的グリコシル化の工程において、MHET又はBHET及び糖がグリコシド結合を介して一緒に化学結合する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
糖が単糖又は二糖である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
単糖又は二糖が、六炭糖及び五炭糖を含有する群から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
単糖又は二糖が、α-グルコース、β-グルコース、α-フルクトース、β-フルクトース、α-ガラクトース及びβ-ガラクトース、α-マンノース及びβ-マンノース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、グルコサミン、並びにグルクロン酸から選択される、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
酵素的グリコシル化が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はフルクトシダーゼにより触媒される、請求項34から38の少なくともいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
酵素的グリコシル化がグルコシダーゼにより触媒される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
グルコシダーゼがα-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼである、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
MHET又はBHETがポリエチレンテレフタレート(PET)から細菌分解又は酵素分解により得られる、請求項34から41の少なくともいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
好ましくは、酵素的グリコシル化の工程の前に、ポリエチレンテレフタレート(PET)のMHET又はBHETへの細菌分解又は酵素分解の工程を含む、請求項34から42の少なくともいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
PETの酵素分解がヒドロラーゼにより触媒される、請求項42又は43に記載の方法。
【請求項４５】
ヒドロラーゼのPETエースがイデオネラ・サカイエンシス由来である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
ヒドロラーゼが、配列番号1に示されたアミノ酸配列を含む、請求項44又は45に記載の方法。
【請求項４７】
MHET又はBHETの酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素が一緒に用いられる、請求項42から46の少なくともいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素を含有する微生物が用いられる、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
更なる工程において、メタクリル残基が、グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと化学結合し、メタクリル残基が、好ましくは、グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと酵素的エステル化により化学結合し、酵素的エステル化が好ましくはリパーゼにより触媒される、請求項34から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
メタクリル残基が、メタクリル酸ビニルメチルの添加によりグリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと化学結合する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
更なる工程において、親油性側鎖、好ましくは飽和又は不飽和脂肪族炭化水素側鎖が、グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと化学結合する、請求項34から48の少なくともいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
親油性側鎖が、飽和又は不飽和C5〜C20炭化水素側鎖、好ましくは飽和又は不飽和C5〜C15炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和C8〜C12炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和C10炭化水素側鎖、及び特に好ましくは飽和C10炭化水素側鎖である、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
親油性側鎖が飽和C10炭化水素側鎖である、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
親油性側鎖がデカノールの添加により結合する、請求項51から53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
酵素的グリコシル化の後に重合工程が続く、請求項34から54の少なくともいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
請求項34から55のいずれか一項に記載の方法により得られるポリマー。
【請求項５７】
バイオハイブリッドポリマーである、請求項56に記載のポリマー。
【請求項５８】
MHET及び/又はBHETの酵素的グリコシル化のための少なくとも1つの酵素、並びにPETの酵素分解のための少なくとも1つの酵素を含有する微生物。
【請求項５９】
微生物が組換え微生物であり、MHET及び/若しくはBHETの酵素的グリコシル化のための酵素並びに/又はPETの酵素分解のための酵素が組換え酵素である、請求項58に記載の微生物。
【請求項６０】
酵素的グリコシル化のための酵素が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はフルクトシダーゼである、請求項58又は59に記載の微生物。
【請求項６１】
酵素的グリコシル化のための酵素がグルコシダーゼである、請求項60に記載の微生物。
【請求項６２】
グルコシダーゼがα-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼである、請求項61に記載の微生物。
【請求項６３】
PETの酵素分解のための酵素がヒドロラーゼである、請求項58から62の少なくともいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６４】
ヒドロラーゼのPETエースがイデオネラ・サカイエンシス由来である、請求項63に記載の微生物。
【請求項６５】
ヒドロラーゼが配列番号1に示されたアミノ酸配列を含む、請求項63又は64に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸を含有する化合物に関し、その化合物は、ファインケミカル、活性成分、又はバイオハイブリッドポリマーについての出発材料として用いられる。
【背景技術】
【０００２】
S. Yoshidaらは、細菌種I.サカイエンシス(I. sakaiensis)に関して報告した。それは、ポリエチレンテレフタレート(略語PET)(重縮合により生成されるポリエステルファミリー由来の熱可塑性材料)に付着して、分解することができる。酵素PETエースは、その細菌種から放出され、それは、PETを加水分解し、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)を生成する(図1) (文献S. Yoshidaら、Science 351、1196 (2016); U. Bornscheuer、Science 351、1154 (2016))。更なる工程において、MHETは、モノマーのエチレングリコール及びテレフタル酸に加水分解される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】S. Yoshidaら、Science 351、1196 (2016)
【非特許文献２】U. Bornscheuer、Science 351、1154 (2016)
【非特許文献３】Fujiwaraら、Infect Immun.、2000; 68(5):2475〜83頁、2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
PETは、プラスチックボトル(PETボトル)、フィルム、織物繊維等の製造に用いられる。世界中での製造は、1年あたり4千万トンである。今まで、PETを使用可能な物質へ分解すること、又はそれを合成に用いることは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、本発明に従って、物質モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)のグリコシル化及び物質ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)のグリコシル化により達成される。
【０００６】
この発明の利点は、PET製造物由来の廃棄物及び分解生成物から新しい化学化合物を製造することを可能にすることである。これらの化学化合物は、グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む。これらの化学化合物は、様々に、例えば、ファインケミカル、活性成分、又はバイオポリマーとして、有利に用いることができる。したがって、本発明は、PET廃棄物及び分解生成物から新しい化学物質を製造することを可能にする。
【０００７】
本発明の別の有利な態様は、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)のグリコシル化、及び本発明の他の任意の方法工程が、ほぼ完全に酵素的に実行され得ることである。
【０００８】
加えて、本発明によるグリコシル化化合物は、有利な表面性質を有する。これらの性質により、その化合物は、本発明に従って多様に、例えば、細胞培養基質として、用いることができる。
【０００９】
加えて、本発明により、本発明の化合物のグリコシル化は、それらの生分解性及び生体適合性を促進する。この理由により、本発明による化合物は、医学的適用、特に、生物医学的適用に有利に用いることができる。
【００１０】
したがって、本発明は、以下の好ましい実施形態を提供する:
【００１１】
好ましい実施形態:
1.  グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む化合物。
2.  MHET又はBHET及び糖がグリコシド結合を介して互いに化学結合している、実施形態1に記載の化合物。
3.  糖と化学結合した、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸を含む化合物。
4.  MHET又はBHET及び糖がグリコシド結合を介して互いに化学結合している、実施形態3に記載の化合物。
5.  糖が単糖又は二糖である、実施形態2〜4の少なくとも1つに記載の化合物。
6.  単糖又は二糖が、六炭糖及び五炭糖からなる群から選択される、実施形態5に記載の化合物。
7.  単糖又は二糖が、α-グルコース、β-グルコース、α-フルクトース、β-フルクトース、α-ガラクトース及びβ-ガラクトース、α-マンノース及びβ-マンノース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、グルコサミン、並びにグルクロン酸から選択される、実施形態5に記載の化合物。
8.  化合物がMHET又はBHETの酵素的グリコシル化により得られる、実施形態1〜7の少なくとも1つに記載の化合物。
9.  化合物がMHET又はBHETの酵素的グリコシル化により形成される、実施形態1〜8の少なくとも1つに記載の化合物。
10.  酵素的グリコシル化が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はフルクトシダーゼにより触媒される、実施形態8又は9に記載の化合物。
11.  酵素的グリコシル化がグルコシダーゼにより触媒される、実施形態10に記載の化合物。
12.  グルコシダーゼがα-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼである、実施形態11に記載の化合物。
13.  MHET又はBHETがポリエチレンテレフタレート(PET)から細菌分解又は酵素分解により得られる、実施形態8〜12の少なくとも1つに記載の化合物。
14.  MHET又はBHETがポリエチレンテレフタレート(PET)から細菌分解又は酵素分解により形成される、実施形態8〜13の少なくとも1つに記載の化合物。
15.  PETの酵素分解がヒドロラーゼにより触媒される、実施形態13又は14に記載の化合物。
16.  ヒドロラーゼのPETエースがイデオネラ・サカイエンシス(Idionella sakaiensis)由来である、実施形態15に記載の化合物。
17.  ヒドロラーゼが、配列番号1に示されたアミノ酸配列を含む、実施形態15又は16に記載の化合物。
18.  MHET又はBHETの酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素が一緒に用いられる、実施形態13〜17の少なくとも1つに記載の化合物。
19.  酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素を含有する微生物が用いられる、実施形態18に記載の化合物。
20.  グリコシド結合を介して糖と化学結合したMHET又はBHETからなる、実施形態1〜19の少なくとも1つに記載の化合物。
21.  化合物が以下の構造(a)又は(b)の1つを有する、実施形態1〜20の少なくとも1つに記載の化合物:
【００１２】
【化１】
2019512521.tif 000003
【００１３】
式中、R1はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、R2はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、又はHである。
22.  化合物が、少なくとも1つのメタクリル残基を更に含む、実施形態1〜19の少なくとも1つに記載の化合物。
23.  化合物が以下の構造を有する、実施形態22に記載の化合物:
【００１４】
【化２】
2019512521.tif 000004
【００１５】
式中、R1はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、R2はメタクリル残基を含む。
24.  化合物が以下の構造を有する、実施形態23に記載の化合物:
【００１６】
【化３】
2019512521.tif 000005
【００１７】
25.  化合物が以下の構造を有する、実施形態23に記載の化合物:
【００１８】
【化４】
2019512521.tif 000006
【００１９】
26.  前記化合物が以下の構造を有する、実施形態23に記載の化合物:
【００２０】
【化５】
2019512521.tif 000007
【００２１】
27.  化合物が親油性側鎖を含む、実施形態1〜19の少なくとも1つに記載の化合物。
28.  化合物が以下の構造を有する、実施形態27に記載の化合物:
【００２２】
【化６】
2019512521.tif 000008
【００２３】
式中、R1はグリコシド結合を介して結合した糖を含み、R2は、親油性側鎖、好ましくは、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素側鎖、又はリンカーを含む。
29.  R2が、飽和又は不飽和脂肪族C5〜C20炭化水素側鎖、好ましくは飽和又は不飽和脂肪族C5〜C15炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和脂肪族C8〜C12炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和脂肪族C10炭化水素側鎖、及びより特に好ましくは飽和脂肪族C10炭化水素側鎖である、実施形態28に記載の化合物。
30.  以下の構造(a)〜(j)を有する化合物から選択される、実施形態28に記載の化合物:
【００２４】
【化７Ａ】
2019512521.tif 000009
【００２５】
【化７Ｂ】
2019512521.tif 000010
【００２６】
式中、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20である。
31.  グリコシド結合を介してMHET又はBHETと化学結合した糖がメタクリル化されている、実施形態2〜24、26〜29、又は30(b)〜(j)に記載の化合物。
32.  実施形態1〜31の少なくとも1つに記載の化合物のポリマー。
33.  ポリマーがバイオハイブリッドポリマーである、実施形態32に記載のポリマー。
34.  モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)の酵素的グリコシル化の工程を含む、グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む化合物を調製するための方法。
35.  酵素的グリコシル化の工程において、MHET又はBHET及び糖がグリコシド結合を介して一緒に化学結合する、実施形態34に記載の方法。
36.  糖が単糖又は二糖である、実施形態35に記載の方法。
37.  単糖又は二糖が、六炭糖及び五炭糖を含有する群から選択される、実施形態36に記載の方法。
38.  単糖又は二糖が、α-グルコース、β-グルコース、α-フルクトース、β-フルクトース、α-ガラクトース及びβ-ガラクトース、α-マンノース及びβ-マンノース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、グルコサミン、並びにグルクロン酸から選択される、実施形態37に記載の方法。
39.  酵素的グリコシル化が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はフルクトシダーゼにより触媒される、実施形態34〜38の少なくとも1つに記載の方法。
40.  酵素的グリコシル化がグルコシダーゼにより触媒される、実施形態39に記載の方法。
41.  グルコシダーゼがα-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼである、実施形態40に記載の方法。
42.  MHET又はBHETがポリエチレンテレフタレート(PET)から細菌分解又は酵素分解により得られる、実施形態34〜41の少なくとも1つに記載の方法。
43.  好ましくは、酵素的グリコシル化の工程の前に、ポリエチレンテレフタレート(PET)のMHET又はBHETへの細菌分解又は酵素分解の工程を含む、実施形態34〜42の少なくとも1つに記載の方法。
44.  PETの酵素分解がヒドロラーゼにより触媒される、実施形態42又は43に記載の方法。
45.  ヒドロラーゼのPETエースがイデオネラ・サカイエンシス由来である、実施形態44に記載の方法。
46.  ヒドロラーゼが、配列番号1に示されたアミノ酸配列を含む、実施形態44又は45に記載の方法。
47.  MHET又はBHETの酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素が一緒に用いられる、実施形態42〜46の少なくとも1つに記載の方法。
48.  酵素的グリコシル化のための酵素及びPETの酵素分解のための酵素を含有する微生物が用いられる、実施形態47に記載の方法。
49.  更なる工程において、メタクリル残基が、グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと化学結合し、メタクリル残基が、好ましくは、グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと酵素的エステル化により化学結合し、酵素的エステル化が好ましくはリパーゼにより触媒される、実施形態34〜48の1つに記載の方法。
50.  メタクリル残基が、メタクリル酸ビニルメチルの添加によりグリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと化学結合する、実施形態49に記載の方法。
51.  更なる工程において、親油性側鎖、好ましくは飽和又は不飽和脂肪族炭化水素側鎖が、グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETと化学結合する、実施形態34〜48の少なくとも1つに記載の方法。
52.  親油性側鎖が、飽和又は不飽和C5〜C20炭化水素側鎖、好ましくは飽和又は不飽和C5〜C15炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和C8〜C12炭化水素側鎖、より好ましくは飽和又は不飽和C10炭化水素側鎖、及び特に好ましくは飽和C10炭化水素側鎖である、実施形態51に記載の方法。
53.  親油性側鎖が飽和C10炭化水素側鎖である、実施形態52に記載の方法。
54.  親油性側鎖がデカノールの添加により結合する、実施形態51〜53の1つに記載の方法。
55.  酵素的グリコシル化の工程の後に重合の工程が続く、実施形態34〜54の少なくとも1つに記載の方法。
56.  実施形態34〜55の1つに記載の方法により得られるポリマー。
57.  ポリマーがバイオハイブリッドポリマーである、実施形態56に記載のポリマー。
58.  MHET及び/又はBHETの酵素的グリコシル化のための少なくとも1つの酵素、並びにPETの酵素分解のための少なくとも1つの酵素を含有する微生物。
59.  微生物が組換え微生物であり、MHET及び/若しくはBHETの酵素的グリコシル化のための酵素並びに/又はPETの酵素分解のための酵素が組換え酵素である、実施形態58に記載の微生物。
60.  酵素的グリコシル化のための酵素が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、又はフルクトシダーゼである、実施形態58又は59に記載の微生物。
61.  酵素的グリコシル化のための酵素がグルコシダーゼである、実施形態60に記載の微生物。
62.  グルコシダーゼがα-グルコシダーゼ又はβ-グルコシダーゼである、実施形態61に記載の微生物。
63.  PETの酵素分解のための酵素がヒドロラーゼである、実施形態58〜62の少なくとも1つに記載の微生物。
64.  ヒドロラーゼのPETエースがイデオネラ・サカイエンシス由来である、実施形態63に記載の微生物。
65.  ヒドロラーゼが配列番号1に示されたアミノ酸配列を含む、実施形態63又は64に記載の微生物。
66.  モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の酵素的グリコシル化により生成される化合物であって、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸が、PETから細菌又は酵素による分解により生成される、化合物。
67.  糖と化学結合した、モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸により特徴づけられる化合物。
68.  MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸及び糖が、グリコシド結合を介して互いに化学結合している、実施形態66及び67に記載の化合物。
69.  モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸のグリコシル化後に重合され得る化合物。
70.  糖が単糖又は二糖である、実施形態66又は67に記載の化合物。
71.  前記単糖又は二糖が、六炭糖及び五炭糖からなる群(α-グルコース、β-グルコース、α-フルクトース、β-フルクトース、α-ガラクトース及びβ-ガラクトース、α-マンノース及びβ-マンノース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、グルコサミン、グルクロン酸)から選択される、実施形態70に記載の化合物。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】U. Bornscheuer、Science 351、1154 (2016)からの図;PETのI.サカイエンシスによる分解を示す図である。
【図２】微生物を用いてPETから得られたMHETの例示的な表現を示す図である。
【図３】グリコシル化MHETでできたバイオハイブリッドポリマーを示す図である。
【図４】グリコシル化MHETは活性成分、ファインケミカルとして、又はポリマーの合成のために用いられることを示す図である。
【図５】グルコシル化MHET又はグルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸のバイオハイブリッドポリマーの例示的な構造を示す図である。
【図６】グリコシル化MHET及びグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸はメタクリレートと組み合わせられ得ることを示す図である。この目的のために、メタクリレートを、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の1つ又は複数のアルコール官能基で酵素的にエステル化する。
【図７】グリコシル化MHET及びグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸はメタクリレートと組み合わせられ得ることを示す図である。この目的のために、メタクリレートを、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の1つ又は複数のアルコール官能基で酵素的にエステル化する。
【図８】合成された、グリコシル化BHETメタクリレート及びグリコシル化MHETメタクリレートは、ラジカル開始剤、例えば、ペルオキソ二硫酸カリウムを用いて重合され得ることを示す図である。
【図９】合成された、グリコシル化BHETメタクリレート及びグリコシル化MHETメタクリレートは、ラジカル開始剤、例えば、ペルオキソ二硫酸カリウムの助けを借りて重合され得ることを示す図である。
【図１０】合成された、グリコシル化BHETメタクリレート及びグリコシル化MHETメタクリレートは、ラジカル開始剤、例えば、ペルオキソ二硫酸カリウムの助けを借りて重合され得ることを示す図である。
【図１１】グリコシル化MHET及びグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸もまた、脂肪族アルコールに連結され得ることを示す図である。このことについて、例えば、BHET-α-Glcで酵素的にエステル化されたドデカノール。
【図１２】ドデカノールの代わりに、チオール、アミン、及び他のアルコールもまたグリコシル化BHETとコンジュゲートされ得ることを示す図である。
【図１３】α-グリコシル化MHETの構造の例示的な表現を示す図である。
【図１４】MHETの構造の例示的な表現を示す図である。
【図１５】β-グリコシル化MHETの構造の例示的な表現を示す図である。
【図１６】β-グリコシル化MHETの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図１７】β-グリコシル化MHETの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図１８】Di-1,3-β-グルコシル化MHETの構造の例示的な表現を示す図である。
【図１９】β-ガラクトシル化MHETの構造の例示的な表現を示す図である。
【図２０】β-ガラクトシル化MHETの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図２１】β-ガラクトシル化MHETの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図２２】α-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの構造の例を示す図である。
【図２３】α-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図２４】α-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図２５】di-α-1,6-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの構造の例示的な表現を示す図である。
【図２６】di-α-1,6-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図２７】di-α-1,6-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図２８】β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの構造の例を示す図である。
【図２９】β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図３０】β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図３１】β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの構造の例を示す図である。
【図３２】β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図３３】β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図３４】Di-β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの構造の例示的な表現を示す図である。
【図３５】Di-β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図３６】Di-β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図３７】グリコシル化MA-BHET-α-Glcの構造の例示的な表現を示す図である。
【図３８】グリコシル化MA-BHET-α-Glcの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図３９】グリコシル化MA-BHET-α-Glcの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図４０】グリコシル化MA2-BHET-α-Glcの構造の例示的な表現を示す図である。
【図４１】グリコシル化MA2-BHET-α-Glcの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図４２】グリコシル化MA2-BHET-α-Glcの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図４３】グリコシル化α-Glc-MHET-デカノールの構造の例示的な表現を示す図である。
【図４４】グリコシル化α-Glc-MHET-デカノールの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図４５】グリコシル化α-Glc-MHET-デカノールの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図４６】α-グルコシル化MHETの構造の例示的な表現を示す図である。
【図４７】α-グルコシル化MHETの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図４８】α-グルコシル化MHETの13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図４９】ポリマーの検出;ポリマーの1H-NMRスペクトルを示す図である。
【図５０】MHETの例示的な13C-NMRスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義及び一般的な技術
他に指示がない限り、この発明に用いられる用語は、当業者にとってのそれらの通常の意味で理解されるべきである。
【００２９】
「含む」又は「含むこと」等の用語は、これらの用語のいかなる存在も任意で、「からなる」又は「からなること」に置き換えることができるように、本明細書で用いられる。
【００３０】
「含有する」又は「含有すること」等の用語は、本明細書において、当業者にとってのそれらの通常の意味で用いられる。任意で、これらの用語の各存在は、「からなる」又は「からなること」に置き換えることができる。
【００３１】
用語「化合物」は、それが当業者により理解されているように、すなわち、特に、「化学化合物」を意味するように、本明細書で用いられる。
【００３２】
用語「グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む化合物」は、それぞれのモノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)と共に、任意で、それぞれのモノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)のエステル、アミド、チオエステル、及びエーテルもまた意味されると意図すると理解されるべきである。一実施形態において、それぞれのモノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)のエステル、アミド、チオエステル、及びエーテルは、用語「グリコシル化モノ(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(MHET)又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸(BHET)を含む化合物」の下で、含まれない。
【００３３】
グリコシド結合は、グリコン、すなわち糖の、アノマー炭素原子と、アグリコン、「非糖質」の、ヘテロ原子又はまれに炭素原子との間の化学結合である。グリコシド結合は、α-グリコシド結合及びβ-グリコシド結合のどちらでもあり得る。接頭辞のα及びβは、アノマー配置を定義する。
【００３４】
グリコシド結合は、酵素的グリコシル化により形成され得る。酵素的グリコシル化は、グリコシダーゼ(ヒドロラーゼの酵素クラスに属し、かつEC 3.2.1.に分類されているグリコシダーゼ)により触媒され得る。グリコシダーゼは、α-又はβ-グリコシド結合を可逆的に加水分解することができる。グリコシダーゼの例は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、シアリダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、キシロシダーゼ、グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、エキソ-β-グルコサミニダーゼ、ガラクツロナーゼ、グルコサミニダーゼ、N-アセチルグルコサミニダーゼ、及びフルクトシダーゼを含む。具体的には、グリコシダーゼは、α-又はβ-グルコシダーゼであり得る。更に、グリコシダーゼはβ-ガラクトシダーゼであり得る。
【００３５】
親油性は特に、疎水性を意味し得る。親油性側鎖は、例えば、炭化水素、及び特に、脂肪族炭化水素を含む。
【００３６】
炭化水素側鎖は、炭素及び水素からなる側鎖である。炭化水素側鎖は、飽和又は不飽和であり得る。不飽和炭化水素側鎖には、一不飽和炭化水素側鎖と多価不飽和炭化水素側鎖の両方が挙げられる。炭化水素側鎖は、2つの炭素原子の間に二重結合及び三重結合を含有し得る。更に、炭化水素側鎖における個々の炭素原子は任意で、ヘテロ原子に置換され得る。炭化水素側鎖は、非分岐型又は分岐型であり得る。炭化水素側鎖は、非環状又は環状であり得る。
【００３７】
複数のグリコシル化において、受容体が典型的には、まず、グリコシル化される。十分なモノグリコシル化受容体が反応混合物に存在する場合には、複数のグリコシル化が起こり得る。
【００３８】
酵素合成のためのグリコシダーゼとして、例えば、以下を用いることができる:
α-グルコシダーゼ(スクロースイソメラーゼ):微生物(プロタミノバクター・ルブルム(Protaminobacter rubrum) Z 12 (CBD 574.77))の懸濁液中。それは、好ましくは、モノグルコシル化に用いられ得る。酵素反応についての最適なpH値はpH=6である。
ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)由来のα-グルコシダーゼ、GTFRは、まず、グルコースを受容体へ転移させる。実施例(6)に実証されているように、より長い反応時間後、別のグルコース単位がグルコシル化受容体のグルコースへ転移される。酵素反応についての最適なpH値はpH=6である。GTFRは、Fujiwaraら(Fujiwaraら、Infect Immun.、2000; 68(5):2475〜83頁、2000)においてのようにS.  オラリスから精製することができる。
アーモンド由来のβ-グルコシダーゼEC.3.2.1.21、CAS 9001-22-3 (BioChemika 49290、WA10531)。酵素反応についての最適なpH値はpH=5.2である。
アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来のβ-ガラクトシダーゼ、CAS 9031-11-2 (Sigma G5160-25KU)。酵素反応についての最適なpH値はpH=5.2である。
酵母由来のβ-フルクトシダーゼ(Boehringer Mannheim GmbH、注文番号104914)。酵素反応についての最適なpH値はpH=5.2である。
リパーゼNovozymes 435は、酵素的エステル化又はエステル交換反応に用いることができる。酵素反応についての最適なpH値はpH=7.5である。
【００３９】
本発明による、反応混合物の分離及び反応生成物の単離の一般的な説明:
本発明の全ての化合物は単離することができる。したがって、本発明による全ての方法は、好ましくは、それぞれの化合物の単離を含む。
【００４０】
これは、好ましくは、以下の通り、行うことができる:
反応混合物を、溶媒から蒸留し、又は凍結乾燥する。グリコシル化MHET又はグリコシル化BHETを、カラムクロマトグラフィにより分離する。クロマトグラフィ材はシリカゲル60 (Macherey Nagel社、0.044〜0.063mm)である。分離されるべき反応混合物の1グラムに対して、100gシリカゲルが用いられる。分離容器はガラスカラムである。好ましくは、1:20の直径対長さを有するカラムが用いられる。シリカゲルに、酢酸エチル:イソプロパノール:水(体積比6:3:1)の溶媒混合物中で吸い取らせ、非極性物質について、酢酸エチル:メタノール(体積比12:1)の混合物を用い、カラムを充填する。その後、反応混合物を、できる限り少量の溶媒中に溶解し(好ましくは、1ml中1g)、カラムに置く。溶媒での溶出により分離が起こる。溶出液を容器(10ml)中に収集し、どの容器に生成物が含有されているかをHPLCによって決定する。生成物と容器を合わせ、溶媒を蒸発させる。固体が得られる。
【００４１】
実施形態
本発明において、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸が、酵素及びグリコース基質を用いて、グリコシル化される。二糖(例えば、スクロース、ラクトース、マルトース)、オリゴ糖(マルトオリゴ糖)、又は多糖(デキストラン、フルクトオリゴ糖、キチン、マンナン、セルロース)が糖基質として用いられる。グリコシル化MHET又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の調製は、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸から行うことができる。MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸は、ヒドロラーゼ、例えば、I.サカイエンシス由来のPETエース、例えば、配列番号1: MNFPRASRLMQAAVLGGLMAVSAAATAQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTARQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTRVSDFRTANCS (配列番号1)に示されたアミノ酸配列を有するPETエースを用いて、PETから製造することができる。両方の酵素を一緒に用いることができる。両方の酵素を含有する微生物もまた、製造のために用いることができる(図2参照)。
【００４２】
本発明の化合物は、糖と化学結合したMHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸によって特徴づけられる。グリコシル化MHET又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸は、活性成分として用いることができる。グリコシル化MHET又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸はまた、バイオハイブリッドポリマーへ重合することができる(図3参照)。
【００４３】
特に好ましくは、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸及び糖が、グリコシド結合を介して互いに化学結合している。グリコシド結合は、グリコン、すなわち糖の、アノマー炭素原子と、アグリコン、「非糖質」の、ヘテロ原子又はまれに炭素原子との間の化学結合である。グリコシド結合を含有する化合物は、一般的に、グリコシドと呼ばれる。グリコシドにおけるグリコシド結合の加水分解は、特にグルコシダーゼにより可逆的に触媒され、グリコン、すなわち存在する糖、及びアグリコン、ここではMHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸が、水分子を用いて遊離される。
【００４４】
好ましくは、糖は単糖である。単糖は、カルボニル基(-C=O)及び少なくとも1つのヒドロキシル基(-OH)を有する少なくとも3個の連結された炭素原子の基本的構造を有する単純な糖質である。
【００４５】
グリコシル化MHET又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸は、ファインケミカル、活性成分、又はバイオハイブリッドポリマーについての出発物質としての役割を果たす。(図4参照)グリコシル化MHET又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の重縮合により、ポリエステルファミリーの熱可塑性ポリマーが形成され得る。グリコシル化MHET又はグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の重縮合により、ポリエステルファミリーからの熱可塑性物質が形成される。
【００４６】
更に、ポリエステルは、ジグルコシル化及びモノグルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸のエタンジオールとのエステル交換反応により調製することができる。これは平衡反応であるため、分離されたエタンジオールは、アルブミン中で蒸留される。グリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸が濃縮される。同様に、モノグリコシル化及びジグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸は、テレフタル酸で直接的にポリエステルへエステル化される。例えば、酸化アンチモン(III)を触媒として用いることができる。
【００４７】
グルコシル化MHET又はグルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸のバイオハイブリッドポリマーは、図5からの構造をとることができる。
【００４８】
グリコシル化MHETメタクリレート及びグリコシル化BHETメタクリレート
同様に、グリコシル化MHET及びグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸は、メタクリレートと組み合わせることができる。この目的のために、メタクリレートは、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の1つ又は複数のアルコール官能基で酵素的にエステル化される。tert-ブチルアルコールが溶媒として用いられる場合、BHET-α-Glcを、50℃でアクリル酸ビニルメチル及びリパーゼNovozymes 435と反応させる時、二重エステル化生成物MA2-BHET-α-Glc及び単一グリコシル化MA-BHET-α-Glc(図6)が形成される。
【００４９】
グリコシル化BHETメタクリレート及びグリコシル化MHETメタクリレートの重合
合成されたグリコシル化BHETメタクリレート及びグリコシル化MHETメタクリレートは、ラジカル開始剤、例えば、ペルオキソ二硫酸カリウムを用いて重合することができる(図8、図9、図10)。
【００５０】
様々なメタクリレートを異なる比率で混合し、その混合物を重合することも可能である。このようにして、ブロックポリマーもまた製造することができる。
【００５１】
グリコシル化MHET脂質及びグリコシル化BHET脂質
グリコシル化MHET及びグリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸はまた、脂肪族アルコールと連結することができる。この目的のために、例えば、デカノールが、BHET-α-Glcで酵素的にエステル化される(図11)。溶媒tert-ブタノールを用いる場合、BHET-α-Glcを、50℃でデカノール及びリパーゼNovozymes 435と反応させた時、好ましくは、α-Glc-MHET-デカノールが生成される(図11)。デカノールの代わりに、チオール、アミン、及び他のアルコールもまた、グリコシル化BHETとコンジュゲートすることができる。これは、ビオチンを含有し、又は細胞培養スキャフォールドを構築するための生物学的直交クリック反応に用いることができる、異なるリンカーの導入を可能にする(図12)。
【００５２】
単糖は、五炭糖及び六炭糖を含有する群から選択されることが特に好ましい。六炭糖(C6H12O6)は、6個の炭素原子を有する炭素骨格をもち、基本的にカルボニル官能基の型が異なる。非末端カルボニル官能基(R1-C(O)-R2)、ケト基に関して、ケトヘキソースを意味する。末端カルボニル官能基、アルデヒド基に関しては、アルドヘキソースである。
【００５３】
五炭糖(C5H10O5)は、5個の炭素原子を有する炭素骨格をもつ。
【００５４】
六炭糖は、好ましくは、α-グルコース、β-グルコース、α-フルクトース、β-フルクトース、α-マンノース、β-マンノース、α-ガラクトース及びβ-ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、グルコサミン、グルクロン酸を含有する群から選択される。どの糖が、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸と化学結合しているかに依存して、化合物の命名もまた異なる。MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸と化学結合したα-又はβ-グルコースにおいて、その化合物は、α-又はβ-グルコシル化MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸である。化学結合した糖としてのα-又はβ-ガラクトースは、α-又はβ-ガラクトシル化MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸と呼ばれる。α-又はβ-フルクトースが糖としてMHETと結合している場合には、それは、α-又はβ-フルクトシル化MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸である。
【００５５】
有利には、五炭糖は、キシロース、アラビノース、又はキシロースを含有する群から選択される。
【００５６】
本発明の特に有利な実施形態において、α-グルコースが、MHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸とグリコシド結合を介して連結される。α-グリコシル化MHET又はα-グリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸の合成は、α-グルコース及びMHET又はビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸からの水分離で実行される。これは、α-グリコシル化MHET又はα-グリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタル酸を生成する。
【００５７】
化合物、α-グリコシル化MHETは、好ましくは、図13に示された構造式により特徴づけられる。
【００５８】
α-グリコシル化MHETの合成において、グリコシド結合は、α-グルコースとMHETの間に形成される。選択的に、1'炭素原子と結合するMHETのヒドロキシル基を介しての結合が、特に有利である。α-グルコースをMHETと架橋する酸素原子は、MHETに由来する。原理的には、この結合は、用いられる糖とは無関係に、好ましくは、選択的に、1'炭素原子と結合するMHETのヒドロキシル基を介して起こる。用いられる酵素は、1' C原子における結合の選択性に関与する。
【００５９】
以下において、本発明の例示的な実施形態が、化合物の製造方法を参照して、より詳細に説明される。
【実施例】
【００６０】
全ての以下の例示的な実施形態は、実験的に行われた。
【００６１】
(1)MHETの製造
MHETは、図14において例として示されている。
【００６２】
NaHCO3 (3.05g、36mmol)を、DMF(15ml)中テレフタル酸(2.00g、12.04mmol)の溶液に加えた。その混合物を、85℃で50分間、撹拌した。その後、2-ブロモ-1-エタノール(0.75g、426μl、6mmol)を加え、85℃で更に4時間、撹拌した。反応の経過を、薄層クロマトグラフィ(MeOH/CH2Cl2、1:4)によりモニターする。その後、その反応混合物を、シリカに対して濾過し、シリカにおける濃縮後、分離する(MeOH/CH2Cl2、1:4)。
【００６３】
MHETの分光学的検出について、1H-NMRスペクトル及び13C-NMRスペクトルを記録した。
【００６４】
1H-NMRスペクトル1は、重水素化ジメチルスルホキシド中、400MHzで記録され、シグナルの帰属はTable 1(表1)に示されている。
【００６５】
【表１】
2019512521.tif 000011
【００６６】
図50は、例、MHETの13C-NMRスペクトルを示す。13C-NMRスペクトル11もまた、重水素化ジメチルスルホキシド中、100MHzで記録された。シグナルの帰属はTable 2(表2)に列挙されている。
【００６７】
【表２】
2019512521.tif 000012
【００６８】
MHETは、H原子又はC原子のシグナルの化学シフト及び積分値(H原子の場合)により、明らかに決定されており、そのことは表から解釈することができる。質量スペクトルもまた測定した。これもまたMHETを確認している。
MS (ESI、ネガティブ): C10H9O5 (M-H)-について計算209.045;  gem. 209.045
【００６９】
(2)α-グルコシル化MHETの製造
MHET(0.05mol/l)及びスクロース(0.4mol/l)を、0.05Mリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=6)中に溶解し、微生物(プロタミノバクター・ルブルムZ 12 (CBS 574.77))の懸濁液を加える。代替の実施形態において、α-グルコシダーゼ溶液(リン酸バッファー中100U)を加える。
【００７０】
スクロースは、α,β-1,2-グリコシド結合を介して連結されている、α-D-グルコースとβ-D-フルクトースからなる。微生物プロタミノバクター・ルブルムZ 12は、酵素、α-グルコシダーゼを含有する。それは、用いられるスクロースのα-D-グルコースとβ-D-フルクトースへの切断を触媒する。α-D-グルコースは、その反応中、MHETと化学結合する。
【００７１】
この目的のために、反応混合物を、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。生成物α-グリコシル化MHETが得られる。最適な生成物形成を、連続的サンプリング及び薄層クロマトグラフィにより決定する。α-グルコシル化MHETは図13において例として示されている。
【００７２】
微生物(プロタミノバクター・ルブルムZ 12 (CBS 574.77))の懸濁液を用いた実施形態の試験結果は、以下の通りである。
【００７３】
生成物は質量分析により確認される(MT203)。
MS (ESI、ネガティブ):C16H19O10 (M-H)-について計算371.0978;  according to. 371.09727
【００７４】
(3)β-グルコシル化MHETの製造
MHET(0.05mol/l)及びセロビオース(0.4mol/l)を、酢酸ナトリウムバッファー(0.05mol/l、pH=5.2)又はリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=7)中に溶解し、β-グルコシダーゼ溶液(酢酸ナトリウムバッファー又はリン酸バッファー中100U)を加える。セロビオースは、β-1,4-グルコシドにより一緒に連結された2個のグルコース分子からなる二糖である。酵素β-グルコシダーゼは、セロビオースのグルコースへの分解を可能にする。グルコースは、その反応中、MHETと化学結合する。
【００７５】
反応混合物をまた、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。カラムクロマトグラフィ後、β-グルコシル化MHETが得られる。β-グルコシル化MHETは図15において例として示されている。
【００７６】
酢酸ナトリウムバッファーを用いた実施形態の試験結果は以下の通りである。
【００７７】
生成物は質量分析により確認される(MT204)。
MS (ESI、ネガティブ):C16H19O10 (M-H)-について計算371.0978;  according to. 371.09727
更なる試験結果は、図16、図17、及び以下の表に示されている。
【００７８】
【表３】
2019512521.tif 000013
【００７９】
【表４】
2019512521.tif 000014
【００８０】
Di-1,3-β-グルコシル化MHET
MS(ESI、ポジティブ): C22H30NaO15 (M-H)-について計算557.1482;  according to. 557.1477.
Di-1,3-β-グルコシル化MHETは、図18において例として示されている、更なる試験結果は以下の表に示されている。
【００８１】
【表５】
2019512521.tif 000015
【００８２】
【表６】
2019512521.tif 000016
【００８３】
(4)β-ガラクトシル化MHETの製造
MHET(0.05mol/l)及びラクトース(0.4mol/l)を、酢酸ナトリウムバッファー(0.05mol/l、pH=5.2)又はリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=7)中に溶解し、β-ガラクトシダーゼ溶液(酢酸ナトリウムバッファー又はリン酸バッファー中100U)を加える。ラクトースは、β-1,4-グリコシド結合により連結されている、D-ガラクトースとD-グルコースからなる。β-ガラクトシダーゼは、この結合の加水分解を酵素的に触媒し、ガラクトースを生成し、そのガラクトースは、その反応中にMHETと化学結合する。
【００８４】
この目的のために、反応混合物を、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。生成物β-ガラクトシル化MHETをカラムクロマトグラフィにより単離する。
【００８５】
β-ガラクトシル化MHETは図19において例として示されている。酢酸ナトリウムバッファーを用いた実施形態の試験結果は以下の通りである。
【００８６】
生成物は質量分析により確認される(MT206)。
MS (ESI、ネガティブ): C16H19O10 (M-H)-について計算371.0978;  according to. 371.0975
更なる試験結果は、図20、図21、及び以下の表に示されている。
【００８７】
【表７】
2019512521.tif 000017
【００８８】
【表８】
2019512521.tif 000018
【００８９】
(5)フルクトシル化MHETの製造
MHET(0.05mol/l)及びスクロース  (0.4mol/l)を、酢酸ナトリウムバッファー(0.05mol/l、pH=5.2)中に溶解し、フルクトシダーゼ溶液(酢酸ナトリウムバッファー中100U)を加えた。フルクトシダーゼ溶液は、スクロースのα-D-グルコースとβ-D-フルクトースへの切断を酵素的に触媒する。β-D-フルクトースは、その反応中、MHETと化学結合する。この目的のために、反応混合物をまた、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。
【００９０】
(6)α-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの製造
ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(0.05mol/l)及びスクロース(0.4mol/l)を、0.05Mリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=7)中に溶解し、又は0.05Mリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=6)中に溶解し、微生物(プロタミノバクター・ルブルムZ 12 (CBD 574.77))の懸濁液を加える。代替の実施形態において、α-グルコシダーゼ溶液(リン酸バッファー中100U)を加える。
【００９１】
スクロースは、α,β-1,2-グリコシド結合を介して連結されている、α-D-グルコースとβ-D-フルクトースからなる。微生物プロタミノバクター・ルブルムZ 12は、酵素、α-グルコシダーゼを含有する。それは、用いられるスクロースのα-D-グルコースとβ-D-フルクトースへの切断を触媒する。α-D-グルコースは、その反応中、ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートと化学結合する。
【００９２】
この目的のために、反応混合物を、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。生成物α-グリコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートが得られる。最適な生成物形成を、連続的サンプリング及び薄層クロマトグラフィにより決定する。
α-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートは図22において例として示されている。0.05Mリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=6)及び微生物(プロタミノバクター・ルブルムZ 12 (CBD 574.77))の懸濁液を用いた実施形態の試験結果は、図23、図24、及び以下の表に示されている。
【００９３】
【表９】
2019512521.tif 000019
【００９４】
【表１０】
2019512521.tif 000020
【００９５】
Di-α-1,6-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート
Di-α-1,6-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートは、図25において例として示されている。更なる試験結果は、図26、図27、及び以下の表に示されている。
【００９６】
【表１１】
2019512521.tif 000021
【００９７】
【表１２】
2019512521.tif 000022
【００９８】
(7)β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの製造
ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(0.05mol/l)及びセロビオース(0.4mol/l)を、酢酸ナトリウムバッファー(0.05mol/l、pH=5.2)中に溶解し、β-グルコシダーゼ溶液(酢酸ナトリウムバッファー中100U)を加える。セロビオースは、β-1,4-グルコシドにより一緒に連結された2個のグルコース分子からなる二糖である。酵素β-グルコシダーゼは、セロビオースのグルコースへの分解を可能にする。グルコースは、その反応中、ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートと化学結合する。
【００９９】
反応混合物をまた、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。カラムクロマトグラフィ後、β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートが得られる(図28参照)。更なる試験結果は、図29、図30、及び以下の表に示されている。
【０１００】
【表１３】
2019512521.tif 000023
【０１０１】
【表１４】
2019512521.tif 000024
【０１０２】
(8)β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートの製造
ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート(0.05mol/l)及びラクトース(0.4mol/l)を、酢酸ナトリウムバッファー(0.05mol/l、pH=5.2)又はリン酸バッファー(0.05mol/l、pH=7)中に溶解し、β-ガラクトシダーゼ溶液(酢酸ナトリウムバッファー又はリン酸バッファー中100U)を加える。ラクトースは、β-1,4-グリコシド結合により連結されている、D-ガラクトースとD-グルコースからなる。β-ガラクトシダーゼは、この結合の加水分解を酵素的に触媒し、ガラクトースを生成し、そのガラクトースは、その反応中にビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートと化学結合する。
【０１０３】
この目的のために、反応混合物をまた、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。生成物β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートをカラムクロマトグラフィにより単離する。
【０１０４】
β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートは図31において例として示されている。酢酸ナトリウムバッファーを用いた実施形態の試験結果は、図32、図33、及び以下の表に示されている。
【０１０５】
【表１５】
2019512521.tif 000025
【０１０６】
【表１６】
2019512521.tif 000026
【０１０７】
Di-β-ガラクトシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート
MS(ESI、ポジティブ): C24H34NaO16  (M-H)-について計算601.1745;  according to. 601.1739
【０１０８】
Di-β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレート
Di-β-グルコシル化ビス(2-ヒドロキシエチル)テレフタレートは、図34において例として示されている。
【０１０９】
その生成物は質量分析により確認される。
MS(ESI、ポジティブ): C24H34O16Na (M-H)+について計算601.1745;  according to. 601.1739
更なる試験結果は、図35、図36、及び以下の表に示されている。
【０１１０】
【表１７】
2019512521.tif 000027
【０１１１】
【表１８】
2019512521.tif 000028
【０１１２】
(9)フルクトシル化BHETの製造
BHET(0.05mol/l)及びスクロース  (0.4mol/l)を、酢酸ナトリウムバッファー(0.05mol/l、pH=5.2)中に溶解し、フルクトシダーゼ溶液(酢酸ナトリウムバッファー中100U)を加えた。フルクトシダーゼ溶液は、スクロースのα-D-グルコースとβ-D-フルクトースへの切断を酵素的に触媒する。β-D-フルクトースは、その反応中、BHETと化学結合する。この目的のために、反応混合物をまた、水浴中、37℃の温度で振盪する。最適な生成物形成後、反応を停止させる。
【０１１３】
MS(ESI、ポジティブ): C16H19NaO10  (M-H)-について計算439.1216;  according to. 439.1211
【０１１４】
(10)α-グルコシル化MHETからのポリエステルの製造
α-グルコシル化MHET(20mg)を、250℃で50秒間、加熱する。ガス発生がある。水に一部、懸濁及び溶解して、白褐色の固体が残る。薄層クロマトグラフィ(MeOH/CH2Cl2)により、高重合体物質がその基質から形成され、及びUV活性でもあることが示されている。
【０１１５】
(11)グリコシル化MA-BHET-α-Glcの製造
40mg  α-グルコシル化BHET及び72μl  アクリル酸ビニルメチルを、2ml tert-ブタノール中に溶解する。その後、25mg Novozymes 435(アクリル樹脂上に固定化されている)を加える。その懸濁液を、50℃で18時間、振盪する。その後、その懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、回転エバポレータで圧縮する。その残留物を、シリカゲル60 (Macherey Nagel社、0.044〜0.063mm)においてクロマトグラフ分析する(流体系: 1体積のメタノールに対して11体積の酢酸エチル)。白色の固体が得られた。
グリコシル化MA-BHET-α-Glcは、図37において例として示されている。更なる試験結果は、図38、図39、及び以下の表に示されている。
重水素化(CD3)2SOにおけるNMR
【０１１６】
【表１９】
2019512521.tif 000029
【０１１７】
【表２０】
2019512521.tif 000030
【０１１８】
(12)グリコシル化MA2-BHET-α-Glcの製造
40mg  α-グルコシル化BHET及び72μl  アクリル酸ビニルメチルを、2ml tert-ブタノール中に溶解する。その後、25mg Novozymes 435(アクリル樹脂上に固定化されている)を加える。その懸濁液を、50℃で30時間、振盪する。その後、その懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、回転エバポレータで圧縮する。その残留物を、シリカゲルにおいてクロマトグラフ分析する(流体系: 1体積のメタノールに対して11体積の酢酸エチル)。白色の固体が得られた。
グリコシル化MA2-BHET-α-Glcは、図40において例として示されている。更なる試験結果は、図41、図42、及び以下の表に示されている。
CD3ODにおけるNMR
【０１１９】
【表２１】
2019512521.tif 000031
【０１２０】
【表２２】
2019512521.tif 000032
【０１２１】
(13)グリコシル化α-Glc-MHET-デカノールの調製
40mg  α-グルコシル化BHET及び120μl 1-デカノールを、2ml tert-ブタノール中に加える。その後、25mg Novozymes 435(アクリル樹脂上に固定化されている)を加える。その懸濁液を、50℃で24時間、振盪する。その後、その懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、回転エバポレータで圧縮する。その残留物を、シリカゲルにおいてクロマトグラフ分析する(流体系: 1体積のメタノールに対して11体積の酢酸エチル)。白色の固体が得られた。グリコシル化α-Glc-MHET-デカノールは、図43において例として示されている。更なる試験結果は、図44、図45、及び以下の表に示されている。
CDCl3において測定されたNMR
【０１２２】
【表２３】
2019512521.tif 000033
【０１２３】
【表２４】
2019512521.tif 000034
【０１２４】
(14)α-グルコシル化MHETの代替の製造
40mg  α-グルコシル化BHETを、2ml 50mM HEPESバッファー、pH7.5に加える。その後、25mg Novozymes 435(アクリル樹脂上に固定化されている)を加える。その懸濁液を、50℃で24時間、振盪する。その溶液の7.5のpH値を、1N NaOH溶液を加えることにより一定に保つ。その後、その懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、回転エバポレータで圧縮する。その残留物を、シリカゲルにおいてクロマトグラフ分析する(流体系: 3体積のイソプロパノールと1体積の水に対して6体積の酢酸エチル)。白色の固体が得られた。
α-グルコシル化MHETは、図46において例として示されている。更なる試験結果は、図47、図48、及び以下の表に示されている。
【０１２５】
【表２５】
2019512521.tif 000035
【０１２６】
【表２６】
2019512521.tif 000036
【０１２７】
(15)MA-BHET-α-Glcの重合
1ml  水及び50mg MA-BHET-α-Glc及び1mg K2O8S2を2ml DMSOに加える。この溶液を、窒素で2時間、すすぐ。その後、その反応を終了し、50℃で12時間、振盪する。溶媒を、凍結乾燥により除去し、その後、残留物の一部を、重水素化メタノール中に50℃で一晩、溶解し、1H-NMR 400MHzを測定した。試験結果は図49に示されている。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
この発明は、商業的に多様に用いることができる。例えば、PETの加水分解からの分解生成物の、バイオハイブリッドポリマーの形での更なる使用が可能になる。本発明に従って、バイオハイブリッドポリマーは、生体適合性、堆肥化可能性が増加し、及び/又は培養細胞の表面への接着の向上を可能にする。
【図１】
2019512521.tif 000045
【図２】
2019512521.tif 000046
【図３】
2019512521.tif 000047
【図４】
2019512521.tif 000048
【図５】
2019512521.tif 000049
【図６】
2019512521.tif 000050
【図７】
2019512521.tif 000051
【図８】
2019512521.tif 000052
【図９】
2019512521.tif 000053
【図１０】
2019512521.tif 000054
【図１１】
2019512521.tif 000055
【図１２】
2019512521.tif 000056
【図１３】
2019512521.tif 000057
【図１４】
2019512521.tif 000058
【図１５】
2019512521.tif 000059
【図１６】
2019512521.tif 000060
【図１７】
2019512521.tif 000061
【図１８】
2019512521.tif 000062
【図１９】
2019512521.tif 000063
【図２０】
2019512521.tif 000064
【図２１】
2019512521.tif 000065
【図２２】
2019512521.tif 000066
【図２３】
2019512521.tif 000067
【図２４】
2019512521.tif 000068
【図２５】
2019512521.tif 000069
【図２６】
2019512521.tif 000070
【図２７】
2019512521.tif 000071
【図２８】
2019512521.tif 000072
【図２９】
2019512521.tif 000073
【図３０】
2019512521.tif 000074
【図３１】
2019512521.tif 000075
【図３２】
2019512521.tif 000076
【図３３】
2019512521.tif 000077
【図３４】
2019512521.tif 000078
【図３５】
2019512521.tif 000079
【図３６】
2019512521.tif 000080
【図３７】
2019512521.tif 000081
【図３８】
2019512521.tif 000082
【図３９】
2019512521.tif 000083
【図４０】
2019512521.tif 000084
【図４１】
2019512521.tif 000085
【図４２】
2019512521.tif 000086
【図４３】
2019512521.tif 000087
【図４４】
2019512521.tif 000088
【図４５】
2019512521.tif 000089
【図４６】
2019512521.tif 000090
【図４７】
2019512521.tif 000091
【図４８】
2019512521.tif 000092
【図４９】
2019512521.tif 000093
【図５０】
2019512521.tif 000094
【配列表】
2019512521000001.app
【国際調査報告】
2019512521.tif 000095
2019512521.tif 000096
2019512521.tif 000097
2019512521.tif 000098
2019512521.tif 000099
2019512521.tif 000100
2019512521.tif 000101
2019512521.tif 000102