(57)【要約】  本発明は、転写因子ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む新規融合蛋白質およびその用途に関する。本発明によれば、本発明の融合蛋白質は、競合阻害によってＮＦ−κＢおよびＩＬ−２の転写を抑制し、ＬＰＳによる炎症性サイトカインの分泌を抑制し、脾臓細胞におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の生成を抑制する効果があることから、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防または治療組成物として有用に利用可能である。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦ−κＢの転写調節ドメインおよび蛋白質運搬ドメインを含む融合蛋白質であって、前記融合蛋白質は、競合阻害によってＮＦ−κＢの転写を抑制する、融合蛋白質。
【請求項２】
前記ＮＦ−κＢは、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ｂ、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０）およびＮＦ−κＢ２（ｐ５２）から構成された群より選択されたＮＦ−κＢであることを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
前記ＮＦ−κＢは、ＲｅｌＡ（ｐ６５）であることを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
前記ＮＦ−κＢの転写調節ドメインは、配列リスト第１配列のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
前記ＮＦ−κＢの転写調節ドメインは、配列リスト第３配列のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項４に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
前記蛋白質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１、Ｓｉｍ−２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、Ｐｅｐ−１（ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＰＴＤ−５（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ−５）、７Ｒ、９Ｒ、１１ＲおよびＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）から構成された群より選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
前記蛋白質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１であることを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
前記蛋白質運搬ドメインは、配列リスト第２配列のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
前記蛋白質運搬ドメインは、配列リスト第４配列のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項８に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
前記融合蛋白質は、配列リスト第５配列のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
前記融合蛋白質は、配列リスト第６配列のヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
請求項１に記載の融合蛋白質を含む、ＮＦ−κＢの転写または活性抑制剤。
【請求項１３】
請求項１に記載の融合蛋白質を有効成分として含む、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項１４】
前記ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患は、炎症疾患または自己免疫疾患であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患は、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ関節炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイマー疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、痛風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再潅流障害および心臓肥大症から構成される群より選択される疾患であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の融合蛋白質を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む、ＮＦ−κＢの転写または活性抑制方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の融合蛋白質を有効成分として含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防、改善または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大韓民国未来創造科学部支援下の課題番号ＮＲＦ−２０１４Ｒ１Ａ２Ａ１Ａ１００５２４６６、２００９−００８３５２２（ＥＲＣ）、１００４４４９４、および延世大学支援下の２０１５−２２−００６５によって行われたもので、前記課題番号ＮＲＦ−２０１４Ｒ１Ａ２Ａ１Ａ１００５２４６６の研究管理専門機関は「韓国研究財団」、研究事業名は「中堅研究者支援事業」、研究課題名は「免疫活性化制御細胞のＴｒｅｇ合わせ型免疫疾患新素材開発」、主管機関は「延世大学産学協力団」、研究期間は２０１４年１１月１日〜２０１７年１０月３１日であり、前記課題番号２００９−００８３５２２（ＥＲＣ）の研究管理専門機関は「韓国研究財団」、研究事業名は「韓国研究財団−理工学分野（ＳＲＣ／ＥＲＣ）」、研究課題名は「ＥＲＣ／蛋白質機能制御履行研究センター（３／３、２段階）」、主管機関は「延世大学産学協力団」、研究期間は２００９年９月１日〜２０１６年２月２９日であり、前記課題番号１００４４４９４の研究管理専門機関は「情報通信技術研究振興センター」、研究事業名は「ＳＷコンピューティング産業源泉技術開発事業」、研究課題名は「ＷｉｓｅＫＢ：ビッグデータ理解基盤自己学習型知識ベースおよび推論技術開発」、主管機関は「（株）ソルトルックス」、研究期間は２０１３年７月１日〜２０１６年２月２８日であり、前記課題番号２０１５−２２−００６５の研究管理専門機関は「延世大学」、研究事業名は「校内研究支援」、研究課題名は「［未来先導−国際］自己免疫疾患の病因性Ｔ細胞ｓｕｂｓｅｔ遺伝子発現を制御できる転写因子機能制御用の個人合わせ型蛋白質新薬開発」、主管機関は「延世大学産学協力団」、研究期間は２０１５年９月１日〜２０１６年８月３１日である。
【０００２】
本発明は、転写因子ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメイン（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＴＭＤ）と蛋白質運搬ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）とを含む新規融合蛋白質およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
転写因子ＮＦ−κＢによって調節されるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）は、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１、ＩＬ−１）、インターロイキン−６および顆粒球大食細胞コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＧＭ−ＣＳＦ）などがあり、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）は、インターロイキン−８、大食細胞炎症蛋白質−１α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α、ＭＩＰ−１α）、走化性調節蛋白質−１（ｍｅｔｈｙｌ  ａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＭＣＰ−１）およびエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）などがある。また、ＮＦ−κＢによって調節される付着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は、Ｅ−セレクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、血管細胞付着分子−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＶＣＡＭ−１）、内皮白血球付着分子−１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＥＬＡＭ−１）および細胞内付着分子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１、ＩＣＡＭ−１）があり、誘導酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ）は、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２、ＣＯＸ−２）などがあり、ＮＦ−κＢは、体内のほぼすべての生理反応に関与している。
【０００４】
転写因子ＮＦ−κＢは、同種またはヘテロ二量体で構成された、互いに異なるサブユニットから構成されている。ＮＦ−κＢ蛋白質は、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ｂ、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０）およびＮＦ−κＢ２（ｐ５２）が含まれ、前記ｐ５０およびｐ５２は、それらの前駆体であるＮＦ−κＢ１（ｐ１０５）およびＮＦ−κＢ２（ｐ１００）からそれぞれ生成される。ＮＦ−κＢ蛋白質は、すべてＮ末端のＲＨＤ（Ｒｅｌ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｏｍａｉｎ）と呼ばれる３００個のアミノ酸を共通して有しているが、これらは、二量体形成、特定ＤＮＡとの結合およびＩκＢ蛋白質との反応に関与する。また、核内に移動して転写因子として作用するための核位置信号（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）も含んでいる。そして、ＮＦ−κＢの構成蛋白質は、Ｃ末端のトランスアクチベーションドメイン（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＴＡＤ）の存在の有無によってｃｌａｓｓＩ（ＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ２）とｃｌａｓｓＩＩ（ＲｅｌＡ／ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ）に区分することができる。ｃｌａｓｓＩＩは、他のＮＦ−κＢ構成蛋白質なくても転写因子として作用できるトランスアクチベーションドメインを有しており、ｃｌａｓｓＩにはトランスアクチベーションドメインがない。この２種類のＮＦ−κＢの間で二量体が形成されてＤＮＡ転写因子として作用し、二量体の中でｐ５０／ｐ６５の形態が最もありふれて存在する。ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢおよびｃ−Ｒｅｌは、Ｃ末端にトランスアクチベーションドメインを有していて、標的遺伝子の発現を活性化することができる。逆に、ＮＦ−κＢ１とＮＦ−κＢ２であるｐ５０とｐ５２は、Ｃ末端にトランスアクチベーションドメインを有しておらず、ｐ５０とｐ５２の同種二量体は、トランスアクチベーションドメインを有している補助因子（ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）のような蛋白質の結合なしには転写をすることができない。
【０００５】
蛋白質運搬ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）は、疎水性の強い短いペプチドで、共に融合した蛋白質やＤＮＡおよびＲＮＡなどの生理活性分子を細胞内に効果的に伝達することが知られている。本発明者らは、現在まで２種のＰＴＤを開発し、前記ＰＴＤは、ＷＯ２００３０５９９４０およびＷＯ２００３０５９９４１に詳しく開示されている。蛋白質運搬ドメインは、細胞質のみならず、核内にも生理活性分子を運搬できるため、本発明の核心物質である変形した転写因子を核内に伝達するのに適した特性を有している。
【０００６】
したがって、本発明者らは、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む融合蛋白質を用いて、競合阻害によってＮＦ−κＢの転写および活性を抑制することにより、ＮＦ−κＢの過度の活性によって引き起こされる疾患を効果的に治療しようとした。
【０００７】
本明細書全体にわたって多数の論文および特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野における水準および本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ＮＦ−κＢの過度の活性によって引き起こされる疾患を効果的に予防、改善または治療できる物質を開発すべく、鋭意研究努力した。その結果、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む融合蛋白質を用いる場合、競合阻害によってＮＦ−κＢの転写および活性を抑制できることを確認することによって、本発明を完成した。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む融合蛋白質を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明の融合蛋白質を含むＮＦ−κＢの転写または活性抑制剤を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、本発明の融合蛋白質を有効成分として含むＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、ＮＦ−κＢの転写または活性抑制方法およびＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防、改善または治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的および利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲および図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様によれば、本発明は、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む融合蛋白質を提供する。本発明の融合蛋白質は、競合阻害によってＮＦ−κＢの転写を抑制する。
【００１５】
本発明者らは、ＮＦ−κＢの過度の活性によって引き起こされる疾患を効果的に予防、改善または治療できる物質を開発すべく、鋭意研究努力した。その結果、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む融合蛋白質を用いる場合、競合阻害によってＮＦ−κＢの転写および活性を抑制できることを確認した。
【００１６】
本明細書で使われる用語「転写調節ドメイン」は、転写因子を構成するドメインで、トランスアクチベーションドメインなしにＤＮＡ結合部位だけで構成されたドメインを意味する。下記の実施例で立証したように、本発明の融合蛋白質は、トランスアクチベーションドメインはないが、ＤＮＡ結合部位を有しているため、目的のプロモーターに結合することはできるが、転写を促進することができない。したがって、本発明の融合蛋白質は、ＮＦ−κＢ遺伝子に対する優性ネガティブ変異体（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ）であるため、細胞内の野生型ＮＦ−κＢに対する競合阻害剤として作用して、ＮＦ−κＢの転写および活性を抑制することができる。
【００１７】
本発明の一実施形態によれば、本発明のＮＦ−κＢは、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ｂ、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０）およびＮＦ−κＢ２（ｐ５２）から構成された群より選択されたＮＦ−κＢである。本発明の特定の実施形態によれば、本発明のＮＦ−κＢは、ＲｅｌＡ（ｐ６５）である。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、本発明のＮＦ−κＢの転写調節ドメインは、配列リスト第１配列のアミノ酸配列からなる。本発明の他の実施形態によれば、本発明の配列リスト第１配列のアミノ酸配列からなるＮＦ−κＢの転写調節ドメインは、配列リスト第３配列のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１９】
本明細書で使われる用語「蛋白質運搬ドメイン」は、７−５０個のアミノ酸からなる、疎水性の強い短いペプチドで、１２０ｋＤａ以上の分子量を、蛋白質のみならず、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞内に伝達できるドメインを意味する。下記の実施例で立証したように、本発明の蛋白質運搬ドメインが付着しない蛋白質（つまり、転写調節ドメインだけで構成されたｐ６５−ＴＭＤ）の場合、本発明の融合蛋白質とは異なり、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−２の転写抑制、ＬＰＳによる炎症性サイトカインの分泌抑制、脾臓細胞におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の生成抑制効果がないことを確認することができた。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、本発明の蛋白質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１、Ｓｉｍ−２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、Ｐｅｐ−１（ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＰＴＤ−５（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ−５）、７Ｒ、９Ｒ、１１ＲおよびＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）から構成された群より選択される。本明細書の用語「７Ｒ」、「９Ｒ」および「１１Ｒ」は、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）がそれぞれ７個、９個および１１個から構成されたペプチドを意味する。本発明の特定の実施形態によれば、本発明の蛋白質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１である。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、本発明の蛋白質運搬ドメインは、配列リスト第２配列のアミノ酸配列からなる。本発明の他の実施形態によれば、本発明の配列リスト第２配列のアミノ酸配列からなる蛋白質運搬ドメインは、配列リスト第４配列のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の融合蛋白質は、配列リスト第５配列のアミノ酸配列を含む。本発明の特定の実施形態によれば、本発明の配列リスト第５配列のアミノ酸配列を含む融合蛋白質は、配列リスト第６配列のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、本発明は、本発明の融合蛋白質を含むＮＦ−κＢの転写または活性抑制剤を提供する。下記の実施例で立証したように、本発明の融合蛋白質は、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−２の転写および活性を抑制し（図６）、ＬＰＳによる炎症性サイトカインの分泌抑制し（図７）、脾臓細胞における抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞の活性化によって発現するＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の生成を抑制して（図９）、ＮＦ−κＢによるＴ細胞の増殖、分化および炎症性サイトカインの分泌誘導活性を抑制できることを確認し、したがって、ＮＦ−κＢの過度の活性によって引き起こされる疾患を効果的に予防、改善または治療できることを確認することができた。
【００２４】
発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の融合蛋白質を有効成分として含む、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００２５】
本明細書で使われた用語、「治療」は、（ａ）疾患、疾病または症状の進行の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、代謝疾患の症状の進行を抑制するか、これを除去または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体でＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の治療用組成物になってもよく、あるいは他のＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の治療用組成物と共に投与され、これら疾患に対する治療補助剤として適用されてもよい。そこで、本明細書において、用語「治療」または「治療剤」は、「治療補助」または「治療補助剤」の意味を含む。
【００２６】
下記の実施例で立証したように、本発明の融合蛋白質は、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−２の転写を抑制し、ＬＰＳによる炎症性サイトカインの分泌を抑制し、脾臓細胞におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の生成を抑制する。したがって、本発明の融合蛋白質は、多様なＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の効率的な予防または治療組成物として有用に利用可能である。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、本発明のＮＦ−κＢの過活性−関連疾患は、炎症疾患または自己免疫疾患である。本発明の他の実施形態によれば、本発明のＮＦ−κＢの過活性−関連疾患は、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ関節炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイマー疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、蕁麻疹、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、痛風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再潅流障害および心臓肥大症から構成される群より選択される疾患である。本発明の特定の実施形態によれば、本発明のＮＦ−κＢの過活性−関連疾患は、敗血症性ショックである。微生物に感染して全身に深刻な炎症反応が現れる敗血症性ショックは、血管を循環する内毒素と炎症媒介物質によって心脈管系と血管運動因子の異常症状が現れる。これによって脱水と血管内液体の流出による低血量症が発生し、毛細管上に血管の収縮と弛緩が起こって血液の供給に異常が生じ、血管炎と血栓は組織への還流をさらに困難にして、最終的に、組織に低酸素症と代謝性酸症を誘発させる。特に、内毒素は、兔疫細胞（大食細胞、顆粒細胞、樹枝状細胞、リンパ球）でＮＦ−κＢを活性化させて、腫瘍壊死因子、インターロイキン１と６のようなサイトカインを分泌させ、このようなサイトカインは、好中球、内皮細胞、血小板、または炎症媒介因子を放出する細胞を刺激して全身的な反応が現れる。下記の実施例で立証したように、本発明の融合蛋白質は、ＬＰＳによって誘導した敗血症ショック動物モデルにおいて炎症性サイトカインの分泌を抑制し、生存率を増加させることを確認した（図１０）。
【００２８】
したがって、本発明によれば、本発明の融合蛋白質は、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患を予防または治療する効果がある。
【００２９】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含んでもよい。好適な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００３０】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の一実施形態によれば、本発明の薬剤学的組成物は、腹腔注入によって投与される。
【００３１】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方可能である。本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、例えば、０．０００１−１０００ｍｇ／ｋｇである。
【００３２】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量の形態で製造されるか、または多用量容器内に入れられて製造される。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【００３３】
本発明のＮＦ−κＢの転写または活性抑制剤、そしてＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防または治療用薬剤学的組成物は、上述した融合蛋白質と共通するため、前記融合蛋白質との関係において共通する内容は、本発明の過度の複雑性を回避するためにその記載を省略する。
【００３４】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の融合蛋白質を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む、ＮＦ−κＢの転写または活性抑制方法を提供する。
【００３５】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の融合蛋白質を有効成分として含む組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防、改善または治療方法を提供する。
【００３６】
本明細書で使われた用語、「投与」または「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を、前記組成物を必要とする個体（つまり、対象体）に直接的に投与することにより、対象の体内で同量が形成されるようにすることをいう。したがって、用語「投与」は、本発明の有効成分（本発明の融合蛋白質）を病変部位に注入することを含むので、用語「投与する」は、「注入する」と同じ意味で使われる。
【００３７】
組成物の「治療的有効量」は、組成物を投与しようとする個体に治療的または予防的効果を提供するのに十分な抽出物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。本明細書で使われた用語、「個体」は、制限なく、ヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザルを含む。具体的には、本発明の個体は、ヒトである。
【００３８】
本発明のＮＦ−κＢの転写または活性抑制方法、そしてＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防、改善または治療方法は、上述した融合蛋白質およびその用途を共通するため、前記融合蛋白質、ＮＦ−κＢの転写または活性抑制およびＮＦ−κＢの過活性−関連疾患と共通する内容は、本発明の過度の複雑性を回避するためにその記載を省略する。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の特徴および利点をまとめると、次の通りである：
（ａ）本発明は、ＮＦ−κＢのサブユニットであるｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む融合蛋白質およびその用途を提供する。
（ｂ）本発明の融合蛋白質は、競合阻害によってＮＦ−κＢおよびＩＬ−２の転写を抑制し、ＬＰＳによる炎症性サイトカインの分泌を抑制し、脾臓細胞におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の生成を抑制する効果があることから、ＮＦ−κＢの過活性−関連疾患の予防または治療組成物として有用に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明の融合蛋白質の一実施形態であるｐ６５転写調節ドメイン（ｐ６５−ＴＭＤ）とＨｐｈ−１（ＰＴＤ）との組換え融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）の構造を示す。ＤＢＤ：ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ、ＩＢＤ：ＩκＢ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ、ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＴＡＤ：ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ。
【図２】図２は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）のクマシーブルー染色の結果を示す。
【図３】図３は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）のＢＶ２とＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞内伝達の結果を示す。
【図４】図４は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）のＢＶ２とＨｅＬａ細胞核内伝達の結果を示す。
【図５】図５は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）のＢＶ２と脾臓細胞における細胞毒性の結果を示す。
【図６】図６は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）の競合的な転写抑制効果を示す。
【図７】図７は、ＬＰＳによって発現するＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６に対する、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）の発現抑制効果を示す。
【図８】図８Ａは、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）が抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞の活性化によるＮＦ−κＢの転写を特異的に抑制することを示す。図８Ｂは、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）が抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞の活性化による信号伝達経路には影響を及ぼさない結果を示す。
【図９】図９は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）が抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞の活性化によって発現するＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の発現抑制結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の融合蛋白質（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）が敗血症性ショック動物モデルにおいて炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の分泌を抑制することにより、生存率を増加させることを確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【００４２】
［実施例１：ｐ６５の転写調節ドメインと蛋白質運搬ドメインとを含む組換え融合蛋白質の製造］
蛋白質運搬ドメイン（ＰＴＤ）のＨｐｈ−１（配列リスト第４配列）を、ｐ６５の転写調節ドメインのｐ６５−ＴＭＤ（配列リスト第２配列）とｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングして、組換え融合ＤＮＡ（ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ）（配列リスト第６配列）を製作した。前記組換え融合ＤＮＡをＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ大腸菌菌株（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に形質転換させた。前記形質転換菌株を培養した後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｄｕｃｈｅｆａ）を入れて、３７℃で５時間蛋白質を発現するように誘導した。その後、細胞のみを集めて分解用緩衝液（１０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよびｐＨ８．０）に溶解させた後、粉砕機で細胞を分解させた。融合蛋白質は、蛋白質の前部分に人為的に結合させておいた６個のヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を用いてＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と結合させた。カラム（ＨｉｓＴｒａｐ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に蛋白質を入れて洗浄用緩衝液（３０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよびｐＨ８．０）で十分に洗浄し、溶出用緩衝液（２５０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよびｐＨ８．０）で蛋白質を分離した。ＰＤ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて緩衝液を１０％グリセロールＰＢＳに切り替えながらイミダゾールとＮａＣｌを除去した。得られた蛋白質にはＬＰＳのようなエンドトキシンが存在するので、これを除去するために、ＳＰビーズ（ＳＰ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりもう一度精製をした。これを再び結合用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で結合させた後、これをカラムに入れて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で蛋白質を分離した。最後に、ＰＤ−１０Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５によりＮａＣｌを除去し、緩衝液を１０％グリセロールＰＢＳに切り替えた後、最終的に得られた蛋白質（配列リスト第５配列、組換え融合蛋白質）は実験前まで８０℃で保管した（図１および２参照）。
【００４３】
［実施例２：ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質の細胞内伝達の確認］
（２−１．ウェスタンブロットを利用した細胞内伝達の確認）
ＢＶ２ミクログリア細胞とジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞を用いて、実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤを濃度別（０、０．１、０．５、１、２および５μＭ）または時間別（０、１、２、４、６、１２、２４および４８ｈ）に組換え融合蛋白質と共に培養し、ウェスタンブロットで蛋白質伝達の有無を確認した。
その結果、濃度に比例してよく伝達されることを確認し、４８時間後にも細胞培養液内で蛋白質が構造をよく維持しつつ持続的に伝達されることを確認した（図３参照）。
【００４４】
（２−２．抗体を用いて細胞の核まで伝達されるか否かの確認）
実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質５μＭを、１時間、ＢＶ２ミクログリア細胞およびＨｅＬａ細胞と共に培養をし、ＰＢＳで洗った後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞に隙間を設けた後、その間に蛍光標識抗体を前記組換え融合蛋白質に結合させた。次に、ＤＡＰＩ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞の核を染色した後、蛍光顕微鏡により蛍光の位置を確認して、組換え融合蛋白質が伝達された位置を確認した。
【００４５】
その結果、融合蛋白質はＰＴＤの性質によって細胞の核までよく伝達されたことを確認した（図４参照）。
【００４６】
［実施例３：ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質の細胞毒性の確認］
大腸菌菌株から発現して得た蛋白質からＬＰＳが完全に除去されて細胞や動物で毒性を示さないことを確認するために、細胞毒性テストを行った。ＢＶ２ミクログリア細胞および脾臓細胞に多様な濃度の蛋白質を伝達した後に、生きている細胞に存在するジヒドロゲナーゼによって色を示す基質のＷＳＴ−８を入れて共に培養した。
【００４７】
その結果、処理した融合蛋白質の濃度に関係なく、蛋白質を処理しない細胞と比較して全く毒性を示さないことを確認することができた（図５参照）。
【００４８】
［実施例４：ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質の転写因子の特異的抑制効果の確認］
（４−１．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢおよびＩＬ−２の転写抑制効果の確認）
実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質がＮＦ−κＢおよびＩＬ−２サイトカイン遺伝子のプロモーターに野生型ｐ６５の代わりに結合して発現を抑制するかを直接的に確認するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ）を用いた。まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、下位にルシフェラーゼを有するＮＦ−κＢおよびＩＬ−２プロモーターと野生型ｐ６５遺伝子を核内注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質で処理した。
【００４９】
その結果、組換え融合蛋白質で処理した場合に、ルシフェラーゼの発現が効果的に抑制されたことを確認することができた。これは、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤが野生型ｐ６５の競合阻害剤として作用してＮＦ−κＢおよびＩＬ−２プロモーターのｐ６５の結合サイトを塞いだことを意味する（図６参照）。
【００５０】
（４−２．ＢＶ２ミクログリア細胞における炎症性サイトカインの分泌抑制効果の確認）
ＢＶ２ミクログリア細胞に、実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質を処理した後、１時間後にＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｏ５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理して２４時間培養した。
【００５１】
その結果、ＬＰＳによって活性化されて発現するＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６がｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質によって発現が抑制されたことを確認することができた（図７参照）。
【００５２】
（４−３．ジャーカットＴ細胞におけるＮＦ−κＢの転写因子の特異的抑制効果の確認）
実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質が抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で刺激されたジャーカットＴ細胞の活性化によって活性化されたＮＦ−κＢの転写を特異的に抑制するか否かを確認した。Ｔ細胞が活性化されると、ＮＦ−κＢのみならず、ＮＦＡＴの転写も活性化されるため、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ融合蛋白質がＮＦＡＴの転写には影響を及ぼさずにＮＦ−κＢだけを抑制する場合、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質がＮＦ−κＢに特異的な競合阻害剤として作用することを確認することができる。したがって、これを確認するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた。まず、ジャーカットＴ細胞に、下位にルシフェラーゼを有するＮＦ−κＢおよびＮＦＡＴレポーター遺伝子を、電気穿孔法（ｅｌｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して核内注入した後、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激されたジャーカットＴ細胞をｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質で処理した。
【００５３】
その結果、組換え融合蛋白質を処理したＮＦ−κＢの場合に、ルシフェラーゼの発現が効果的に抑制されたが、ＮＦＡＴには影響を及ぼさないことを確認することができた（図８Ａ参照）。
【００５４】
（４−４．細胞内信号伝達蛋白質のリン酸化）
実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質が細胞内の多様な信号伝達体系に関連する蛋白質のチロシンリン酸化に関与するかを確認するために、ウェスタンブロットを利用した。ジャーカットＴ細胞にｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ  ２μＭを１時間処理した後、抗ＣＤ３（２．５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（２．５μｇ／ｍｌ）で刺激を与えて、ＺＡＰ−７０、ｐ３８、ＪＮＫおよびＥＲＫのチロシンリン酸化の有無を観察した。
【００５５】
その結果、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤはこれらのリン酸化には影響を及ぼさないことを確認することができた（図８Ｂ参照）。
【００５６】
（４−５．脾臓細胞におけるサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の生成抑制）
６−８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から脾臓細胞を分離し、実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤを１時間処理して、組換え融合蛋白質を細胞内に伝達した。この細胞を抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で刺激した後、７２時間培養した。その後、培養液に存在するサイトカインの量を、ＥＬＩＳＡを利用して測定した。
【００５７】
その結果、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤを処理した場合、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１０の発現量が大きく抑制されることを確認することができた。また、Ｔ細胞活性化の指標になるＣＤ６９の発現量をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて確認した結果、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤはＴ細胞におけるＣＤ６９の発現には影響を及ぼさないことを確認することができた（図９参照）。
【００５８】
［実施例５：敗血症ショック動物モデルにおけるｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤの治療効果の確認］
６−８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスにＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注入して、敗血症ショック動物モデルにした。その後、２時間、１４時間経過時、それぞれ実施例１のｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤ組換え融合蛋白質を腹腔内注入し、６日間観察した。
【００５９】
その結果、ｎｔ−ｐ６５−ＴＭＤを処理した場合、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の分泌を抑制して、それによる生存率が大きく増加したことを確認することができた（図１０参照）。
【００６０】
［実施例６：組換え融合蛋白質の急性毒性実験］
大韓実験供給センターから供給された６週齢の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを用いて、急性毒性実験を下記のように行った：各グループあたり２匹ずつの動物に、本発明の実施例１の組換え融合蛋白質を１ｇ／ｋｇの用量で１回経口投与後、動物のへい死の有無、臨床症状および体重変化を観察し、血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、解剖して、肉眼で腔臓器と胸腔臓器の異常の有無を観察した。
【００６１】
その結果、実験物質を投与したすべての動物で特異的な臨床症状やへい死した動物はおらず、体重変化、血液検査、血液生化学検査および解剖と所見などからも毒性変化は観察されなかった。したがって、本発明の実施例１の組換え融合蛋白質はラットでそれぞれ１ｇ／ｋｇまでも毒性を示しておらず、経口投与の最小致死量（ＬＤ５０）が１ｇ／ｋｇ以上である安全な物質と判断されることを確認することができた。
【００６２】
（参考文献）
Park et al., Intranuclear interactomic inhibition of NF-kB suppresses LPS-induced severe sepsis, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015;464:711-717.
【００６３】
以上、本発明の特定部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義されるべきであろう。
【図１】
2019507117.tif 000003
【図２】
2019507117.tif 000004
【図３Ａ】
2019507117.tif 000005
【図３Ｂ】
2019507117.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019507117.tif 000010
【図８Ａ】
2019507117.tif 000011
【図８Ｂ】
2019507117.tif 000012
【図９】
2019507117.tif 000013
【図１０】
2019507117.tif 000014
【配列表】
2019507117000001.app
【国際調査報告】
2019507117.tif 000015
2019507117.tif 000016
2019507117.tif 000017
2019507117.tif 000018
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