(57)【要約】マグネシウム亜鉛酸化物（MZO）ナノ構造改変水晶マイクロバランス（MZOnano-QCM）は、MZOベースのナノ構造の独自の検出能力と生体適合性を利用し、それにQCMを含むバルク音響波（BAW）デバイスの動的インピーダンススペクトル特性を組み合わせて、特に種々の抗生物質および抗真菌薬および抗癌剤に対する細菌および真菌株および癌細胞の感受性および耐性をそれぞれ検出する、リアルタイムで非侵襲的で無標識の細胞モニタリングバイオセンサを形成する。
2019500005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤に対する細胞集団の応答をモニタリングする方法であって、
上部電極と下部電極との間に挟まれた圧電層と、上部電極の上面に堆積されパターン化されたMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造とを備え、MZO中のMg組成xが0<x<0.2の範囲にある、マグネシウムがドープされた酸化亜鉛（MZO）ナノ構造（MZOnano）改変バルク音響波（BAW）センサデバイス（MZOnano-BAW）を提供することと、
前記ナノ構造と接触している細胞集団を培養することと、
センサデバイスにおいて時間−周波数信号を生成することと、
MZOnano-BAWセンサデバイスの周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信することと、
細胞集団を薬剤と接触させることと、
細胞集団の培養を継続して時間−周波数信号を生成し周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信することと、
周波数応答スペクトルを測定することによって出力信号の変化を動的かつ連続的にモニタリングすることと、
出力信号からデータを抽出しデータを分析して薬剤に対する前記細胞集団の応答を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
MZO中のMg組成xが0.01<x<0.05の範囲にある請求項１記載の方法。
【請求項３】
MZO中のMg組成xが0.04から0.05の範囲にある請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記抽出されたデータがスペクトル形状進化データ、ピーク周波数シフトデータ、運動抵抗データ、および運動誘導データのうちの１つ以上を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤に対する前記細胞集団の応答を決定することがバターワース・バン・ダイク（BVD）集中定数モデルに基づくデータシミュレーションおよびモデリング技術を使用することを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤に対する前記細胞集団の前記応答がナノ構造上の細胞集団の粘弾性特性および／または質量負荷の変化に対応する請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記デバイスが前記薬剤に対する前記細胞集団の応答の動的かつ連続的なモニタリングを行うように構成されている請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が抗菌剤または抗生物質であり、前記抽出されたデータを参照と比較して前記薬剤の抗菌効果および／または前記薬剤に対する前記細胞集団の抗生物質耐性を決定することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が抗癌剤であり、前記抽出されたデータを参照と比較して前記薬剤の抗癌効果を決定することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞集団を培養することが前記MZOベースのナノ構造の表面で前記細胞集団を培養することを含む請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞集団が細菌細胞、真菌細胞、寄生虫細胞、または癌細胞を含む請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞集団が急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）またはリンパ腫を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞集団がマイコバクテリウム・ツベルクローシス（TB）およびメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（MRSA）からなる群から選択される薬剤耐性病原性細菌細胞を含み、前記薬剤が抗MRSA剤および抗TB剤からなる群から選択される抗病原性細菌剤である請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞集団がカンジダ・アルビカンスおよびクリプトコッカス・ネオフォルマンスからなる群から選択される真菌細胞であり、前記薬剤がポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノカンジン系抗真菌剤、アンホテリシン、ミコナゾール、5-フルオロシトシン、 グリセオフルビン、トルナフテート、およびシクロピロックスから選択される抗真菌剤である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞集団が新たに単離された癌細胞を含み、前記薬剤が抗癌剤である請求項１記載の方法。
【請求項１６】
データを抽出しデータを分析して前記薬剤に対する前記細胞集団の応答を決定することが
リアルタイム信号分析システムによって出力信号を受信することと、
リアルタイム信号分析システムによってデータを分析すること
を含む請求項１記載の方法。
【請求項１７】
データを抽出しデータを分析して前記薬剤に対する前記細胞集団の応答を決定することが
リアルタイム信号分析システムによって出力信号を受信することと、
リアルタイム信号分析システムと無線通信しているデータ分析装置によってデータを分析すること
を含む請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記MZOnano-BAWセンサデバイスの感度および選択性を最適化するために表面形態、濡れ性、pH安定性範囲、および毒性制御からなる群から選択される前記MZOナノ構造の１つ以上の所定の特性を提供するようにxの値が選択される請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記MZOナノ構造が前記MZOナノ構造表面への前記細胞集団の付着を高めるための実質的に平坦な表面、粗い表面、鋭い先端を有するナノチップまたはロッドアレイ、および丸みを帯びた頂部を有するナノチップまたはロッドアレイからなる群から選択される表面形態を含む請求項１記載の方法。
【請求項２０】
細胞集団の増殖をモニタリングする方法であって、
上部電極と下部電極との間に挟まれた圧電層と、上部電極の上面に堆積されパターン化されたMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造とを備え、MZO中のMg組成xが0<x<0.2の範囲にある、マグネシウムがドープされた酸化亜鉛（MZO）ナノ構造（MZOnano）改変バルク音響波（BAW）センサデバイス（MZOnano-BAW）を提供することと、
前記ナノ構造と接触している細胞集団を培養することと、
MZOnano-BAWセンサデバイスの周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信することと、
細胞集団の細胞の粘弾性特性および／または質量負荷の変化を示す出力信号からデータを抽出し、シミュレーションおよびモデリングを用いてデータを分析すること
を含む方法。
【請求項２１】
前記細胞集団が細菌性病原体の保因が疑われる対象から採取される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞集団が食物、農産物、水源、および環境汚染からなる群から選択される供給源から採取される請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記MZOベースのナノ構造が実質的に平坦な表面、粗い表面、鋭い先端を有するナノチップまたはロッドアレイ、およびナノチップまたはロッドアレイの丸みを帯びた頂部からなる群から選択される表面形態を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記MZOnano-BAWセンサデバイスがMZOnano-QCMであり、前記MZOナノ構造が通常のQCM（水晶マイクロバランス）の上部電極の表面に堆積されている請求項１又は２０記載の方法。
【請求項２５】
前記MZOnano-BAWセンサデバイスがMZOnano-TFBARであり、前記MZOナノ構造が通常のTFBAR（薄膜バルク音響波共振器）の上部電極の表面に堆積されている請求項１又は２０記載の方法。
【請求項２６】
MZOnano-TFBARデバイスが適切な厚さの薄い圧電層を適切に設計して堆積することによってGHzまたは数GHz範囲の周波数で動作する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
高スループットの測定および診断のために複数のMZOnano-TFBARデバイスがチップ上に配列されている請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
センサデバイスが抗菌剤耐性をモニタリングするためのBAW信号および蛍光の光信号の同時または別々の測定を含む二重モード動作用に構成されている請求項１又は２０記載の方法。
【請求項２９】
前記センサデバイスが複数の細胞増殖ウェルの内部に配置される請求項１又は２０記載の方法。
【請求項３０】
前記センサデバイスがデータ処理装置および表示装置と無線通信する請求項２０記載の方法。
【請求項３１】
前記MZOナノ構造のMg組成値xおよび適切な形態が所定の濡れ性を提供するように選択され、前記MZOナノ構造の表面の超親水性状態が前記MZOnano-BAWセンサデバイスへの細胞の結合を増加させる請求項１または２０記載の方法。
【請求項３２】
前記MZOナノ構造のMg組成値xが細胞測定プロセス中のMZOnano-BAWセンサデバイスの前記MZOナノ構造のpH範囲を拡大するように選択される請求項１又は２０記載の方法。
【請求項３３】
前記MZOナノ構造中のMg組成値xが細胞に対する前記ナノ構造中の亜鉛イオンの毒性を減少させると同時に前記MZOnano-BAWセンサデバイスの感度を高めるように選択される請求項１又は２０記載の方法。
【請求項３４】
細胞集団の成長をモニタリングするためのバルク音響波（BAW）センサデバイスであって、
上部電極および下部電極の間に挟まれた圧電層を含み、上部電極及び下部電極のそれぞれが圧電層に堆積されパターン化された金属、合金および／又は透明導電性酸化物膜であり、
BAWデバイスの上部電極の上面に堆積されパターン化されたMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造を含み、MZO中のMg組成xが0<x<0.2の範囲にある
センサデバイス。
【請求項３５】
前記MZOベースのナノ構造が実質的に平坦な表面、粗い表面、鋭い先端を有するナノチップまたはロッドアレイ、およびナノチップまたはロッドアレイの丸みを帯びた頂部からなる群から選択される表面形態を含む請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項３６】
センサデバイスがMZOnano-QCMセンサであり、圧電層が水晶マイクロバランス（QCM）を含み、前記MZOナノ構造が上部電極の上面に堆積されている請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項３７】
センサデバイスがMZOnano-TFBARセンサであり、圧電層が薄膜バルク音響波共振器（TFBAR）を含み、前記MZOナノ構造が上部電極の上面に堆積されている請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項３８】
センサデバイスが適切な厚さの薄い圧電層を適切に設計して堆積することによってGHzまたは数GHz範囲の周波数で動作すように構成された請求項３７記載のセンサデバイス。
【請求項３９】
センサデバイスが高スループットの測定および診断のために追加のMZOnano-TFBARセンサデバイスを有するアレイに配置されるように構成された請求項３７記載のセンサデバイス。
【請求項４０】
センサデバイスが抗菌剤耐性をモニタリングするためのBAW信号および蛍光の光信号の同時または別々の測定を含む二重モード動作で動作するように構成されている請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４１】
センサデバイスが複数の細胞増殖ウェルの内部に配置されるように構成された請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４２】
センサデバイスがリアルタイム信号分析システムに接続されるように構成された請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４３】
センサデバイスがデータ処理装置および表示装置と無線通信するように構成された請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４４】
前記MZOナノ構造のMg組成値xおよび適切な形態が所定の濡れ性を提供するように選択され、前記MZOナノ構造の表面の超親水性状態が前記MZOnano-BAWセンサデバイスへの細胞の結合を増加させる請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４５】
前記MZOナノ構造のMg組成値xが細胞測定プロセス中の前記MZOナノ構造のpH範囲を拡大するように選択される請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４６】
前記MZOナノ構造中のMg組成値xが細胞に対する前記ナノ構造中の亜鉛イオンの毒性を減少させると同時に前記センサデバイスの感度を高めるように選択される請求項３４記載のセンサデバイス。
【請求項４７】
薬剤に対する細胞集団の応答のモニタリングに使用するためのMZOナノ構造改変バルク音響波（MZOnano-BAW）センサデバイスを製造する方法であって、
圧電層の表面に上部電極を堆積することと、
圧電層の対向する表面に下部電極を堆積することと、
堆積された上部電極にMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造を堆積させ、MZO中のMgの組成百分率（x）が0<x<0.2の範囲にあること
を含む方法。
【請求項４８】
圧電層がバルク音響波（BAW）を含む請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
BAWが水晶マイクロバランス（QCM）または薄膜バルク音響波共振器（TFBAR）である請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
適切な表面形態が達成されて選択された生物種との結合を強化するようにMZO中のMgの組成百分率（x）を選択することを含む請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
適切な濡れ性が達成されてバイオセンシングのための生体試料への付着および非毒性を高めるようにMZO中のMg組成百分率（x）を選択することを含み、濡れ性は超疎水性から超親水性までの範囲である請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
MZOナノ構造の成長中または成長後にMZO表面の酸素欠損密度を調整することを含み、MZO中のMgの組成百分率（x）が0.01<x<0.05の範囲にある請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
毒性を低減するためにMZO中のMgの組成百分率（x）を選択することを含む請求項４７記載の方法。
【請求項５４】
ナノ構造がセンシングプロセス中に維持され得るpH範囲を拡大するようにMZO中のMgの組成百分率（x）を選択することを含む請求項４７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、国立科学財団（NSF）の化学、生命工学、環境および輸送システム（CBET）部門によって授与された助成金番号NSF-1264508の下での政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、バイオセンサーに関し、特に、マグネシウム亜鉛酸化物（MZO）ナノ構造改変バイオセンサーおよび薬剤に対する細胞集団の応答のモニタリングを含むバイオセンサーの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機関（WHO）によると、抗菌剤耐性（AMR）は、次の「パンデミック」となることを脅かす主要な世界的な健康懸念となっている。感度の高い診断監視ツールが緊急に必要とされている。例えば、新規の約3.5％の、および以前に治療された20.5％の結核（TB）患者が、多剤耐性（MDR）のTBを有する。効果的な薬物感受性試験（DST）の欠如のために、MDR-TB症例の20％のみが適切な治療を受け、MDR-TBの先送りや不必要な苦痛と死亡に寄与する。M.ツベルクローシス細菌の増殖が遅いため、標準的な寒天／液体法は、典型的には、結果を得るのに4〜8週間を要する。より新しいDST技術は、試験の信頼性と速度を向上させたが、依然として幅広い用途を制限する明白な欠点を抱えている。表現型試験法は平均4週間かかり、高度な訓練を受けた技術者が行う必要がある。薬剤耐性突然変異のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）検出などの分子的方法は、検出時間を短縮することができるが、それらは病原体特異的であり、既存のすべての突然変異または新しい機構を確実に検出することができない。また、それらはDSTには適していない。迅速かつ経済的にAMRを検出し、治療に適切な抗生物質を同定する新しい技術が緊急に必要とされている。
【０００４】
統計によると、発展途上国における全体的な高齢化および生活様式の変化に伴い、癌は世界的な流行となっている。世界保健機関（WHO）によると、2012年には世界中で1,410万人の新たな癌患者と820万人の癌関連死亡者があった。新たな癌患者の数は2035年までに2,400万人に増加すると予想されている。高い癌死亡率は、主に薬物治療に対する低い応答率に起因する。ヒト癌が同じタイプの腫瘍であっても遺伝的にもエピジェネティック的にも高度に変化して薬物治療の成功を制限することが、ますます認識されている。治療効果を制限する分子事象の例には、薬物輸送、薬物結合部位突然変異、生存機構の活性化、および治療標的に対する代替およびフィードバック経路の活性化が含まれる。これらの多様な機構のために、同じタイプの個々の腫瘍は、しばしば、特定の薬物治療に対して非常に異なる応答を有する。肺癌における小分子表皮成長因子受容体（EGFR）阻害剤などの標的抗癌剤であっても、代用バイオマーカーが治療成果を予測するのに利用可能である場合でも、他の可変因子が治療成果を制限する可能性がある。結果として、一般的な癌患者集団における所与の抗癌剤の典型的な応答率は、20％未満である。個別化された応答を予測するのに十分な新しいスクリーニング方法を開発することが緊急に必要とされている。
【０００５】
次世代シーケンシング技術の最近の進歩により、癌ゲノム情報を用いて治療計画を導き出す精密医学イニシアチブにつながり、これがいくつかの成功を収めた。しかしながら、腫瘍、特に後期癌は、しばしば大量の突然変異およびエピジェネティックな変質を蓄積して、主な癌の発症事象を特定し好結果の治療法を設計することを非常に困難にする。したがって、臨床医が個々の癌患者のための最も適切な治療計画を決定するために、新しい補完的技術が未だに緊急に必要とされている。抗癌剤応答のインビトロ試験を容易にするために、長年にわたって多くの技術が開発されている。よく知られている方法には、免疫不全マウスにおける癌細胞株、癌オルガノイド／スフェロイド、および患者由来異種移植片（PDX）腫瘍の樹立が含まれる。これらの新しいリソースは、薬物感受性および耐性の分子メカニズムを理解する能力を大幅に強化した。しかし、これらの腫瘍モデルは、治療反応の解析に適するまでに、典型的には数ヶ月および最長1年の、樹立するための長い時間がかかる。さらに、大きな腫瘍試料が必要とされる。現在、それらは主に医薬品の発見や研究目的に留まっている。したがって、原発腫瘍の小さな新鮮な生検で治療成果を直接決定するために使用することができる新しい技術が大いに必要とされている。我々のバイオセンサーは数分から数時間で抗癌薬の活性を分析すると約束しており、個々の癌患者の治療成果を予測するための実用的な解決策になる。
【０００６】
この書類は、上記の問題および／または他の問題の少なくとも一部に対処する可能性のある装置、システム、および方法について説明する。
【発明の概要】
【０００７】
マグネシウムがドープされた酸化亜鉛（MZO）ナノ構造（MZOnano）の利点を、水晶振動子マイクロバランス（QCM）のようなバルク音響波（BAW）デバイスの動的インピーダンススペクトル特性と組み合わせることにより、MZOnano-QCMは、抗菌抵抗（AMR）効果を含む、薬剤に対する細胞集団の応答の動的検出をモニタリングするのに十分に適した高感度バイオセンサーとなる。MZOナノ構造改変水晶マイクロバランス（MZOnano-QCM）は、MZOベースのナノ構造の独自の検出能力と生体適合性を利用し、それにQCMを含むバルク音響波（BAW）デバイスの動的インピーダンススペクトル特性を組み合わせて、種々の抗生物質および抗真菌薬および抗癌剤に対する細菌および真菌株および癌細胞の感受性および耐性をそれぞれ検出するために特に適した、リアルタイムで非侵襲的で無標識の細胞モニタリングバイオセンサを形成する。
【０００８】
MZOの膜およびナノ構造の多機能性は、細胞界面材料および感度向上材料の両方として働き、MZOnano-QCMの細菌、真菌および癌細胞モニタリングセンサを形成するために利用することができる。MZOナノ構造によってもたらされる効果的な検出表面の増加に加えて、バイオセンサーの感度は、（i）表面形態、（ii）MZOナノ構造の表面濡れ性、および（iii）MZOナノ構造の毒性プロファイルの制御および最適化によって大きく向上する。この増強された感度は、複数のパラメータを同時に単一の測定で出力することを可能にし、薬剤に応答した細胞集団の生物物理学的特性の変化の非侵襲的測定を可能にする。生物物理学的特性、主に、細胞活性（増殖および生存能力）に関連する粘弾性遷移および質量蓄積（質量負荷）は、特定の時間発展型センサーのスペクトルシグネチャー（すなわち、スペクトル形状、ナイキストマップ回転特性、および周波数ピークシフト）を介して、リアルタイムで連続的にモニタリングすることができる。BAWデバイスの上部電極の表面上に堆積されたMZOナノ構造は、BAWデバイスの全体的なサイズを変化させず、それによりポータブルで費用効果の高い設計をもたらす。
【０００９】
一実施形態では、細胞集団の成長をモニターするためのMZO-BAWセンサデバイスは、上部電極と下部電極との間に挟まれた圧電層を含み、上部電極および下部電極は金属、合金または透明導電性酸化物であり、圧電層に堆積されパターン化される。センサデバイスはまた、センサデバイスの上部電極に堆積されパターン化されたMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造を含む。MZO中のMg組成x（MZO中のMgの組成百分率）は、0<x<0.2の範囲にある。Mg組成xは0.01〜0.05（0.01<x<0.05）であってもよい。あるいは、および／またはさらに、MZO中のMg組成xは、0.04〜0.05（4〜5％）の範囲、または0.03（3％）である。
【００１０】
MZOベースのナノ構造は、実質的に平坦な表面、粗い表面、鋭い先端を有するナノチップまたはロッドアレイ、および丸みを帯びた先端のナノチップまたはロッドアレイから選択することができる表面形態を含む。
【００１１】
MZO-BAWセンサデバイスは、水晶振動子マイクロバランス（QCM）センサまたは薄膜バルク音響性波共鳴器（TFBAR）センサのいずれかであってもよい。一例では、MZO-BAWセンサは、QCMベース（MZOnano-QCM）であり、圧電層はQCMを含み、MZOナノ構造はセンサデバイスの上部電極の表面に堆積されている。別の例では、MZO-BAWセンサはTFBARベース（MZOnano-TFBAR）であり、圧電層はTFBARを含み、MZOナノ構造は上部電極の表面に堆積されている。TFBARセンサは、QCMセンサよりも高い周波数（マルチGHz）で動作可能であり、より高い感度を提供する。
【００１２】
一実施形態では、薬剤に対する細胞集団の応答をモニタリングする方法は、本明細書に開示されるMZO-BAWセンサデバイスを提供することを含む。MZO-BAWセンサデバイスの、上部電極に堆積されパターン化されたMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造では、MZO中のMg組成xは0<x<0.2の範囲にある。Mg組成xは0.01〜0.05（0.01<x<0.05）であってもよい。あるいは、および／または、さらに、MZO中のMg組成xは、0.04〜0.05の範囲、すなわち4〜5％、または0.03（3％）である。
【００１３】
この方法はまた、ナノ構造と接触している細胞集団を培養することと、センサデバイスにおいて時間−周波数信号を生成することと、MZOnano-BAWセンサデバイスの周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信することと、細胞集団を薬剤と接触させること、細胞集団の培養を継続して時間−周波数信号を生成し周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信することと、周波数応答スペクトルを測定することによって出力信号の変化を動的かつ連続的にモニタリングすることと、出力信号からデータを抽出しデータを分析して薬剤に対する細胞集団の応答を決定することを含む。
【００１４】
データを抽出する際、この方法は、スペクトル形状展開データ、ピーク周波数シフトデータ、運動抵抗データ、運動誘導データ、および／またはナイキストマップ回転データなどの、時間−周波数出力信号からデータを抽出することができる。応答および抽出されたデータは、細胞のナノ構造への粘弾性特性および／または質量負荷の変化を示す。データを抽出する方法は、バターワース・バン・ダイク（BVD）集中定数モデルおよび多層伝送線信号伝搬モデルに基づくデータシミュレーションおよびモデリング技術を使用することができる。
【００１５】
薬剤に対する細胞の応答は、細胞のナノ構造への粘弾性特性および／または質量負荷の変化を示す。そして、この方法は、抽出されたデータを参照と比較して薬剤の抗菌効果および／または薬剤に対する細胞の抗生物質耐性を決定することをさらに含むことができる。この方法は、あるいは、および／または、さらに、データを参照と比較して細胞に対する薬剤の抗癌効果を決定することを含むことができる。
【００１６】
MZOベースのナノ構造の表面で培養されるべき細胞は、細菌細胞、真菌細胞、寄生虫細胞、またはMZOベースのナノ構造の表面で直接培養された新たに単離された癌細胞であってもよい。例えば、細胞は病原性細菌細胞であり、薬剤は抗病原性細菌剤である。別の例では、細胞は真菌細胞であり、薬剤は抗真菌剤である。真菌細胞の例としては、カンジダ・アルビカンスおよびクリプトコッカス・ネオフォルマンスが挙げられる。 別の例では、細胞は寄生虫細胞であり、薬剤は抗寄生虫剤である。別の例では、細胞は癌細胞であり、薬剤は抗癌剤である。この方法は、培養すべき細胞をMZOセンシング表面と間接的に接触させるように配置することができる。
【００１７】
MZOベースのナノ構造は、BAWデバイスの上部電極と直接的または間接的に接触していてもよい。間接接触の場合、上部電極に薄い非導電層（例えばSiO2）または薄い導電層（GaをドープしたZnO-GZOなど）を堆積させることができ、MZOナノ構造は、SiO2またはGZOの薄い層の上部に堆積される。
【００１８】
BAWデバイスの上部電極および下部電極は、金属（Au、Cuなど）、合金、GaをドープしたZnO（GZO）、AlをドープしたZnO（AZO）、またはそれらの組み合わせなどの透明導電性酸化物（TCO）であってもよい。TCO電極を使用すると、デバイス全体が透明なBAWセンサデバイスになる。ナノ構造体の表面形態は制御され、実質的に平坦な表面、粗い表面、あるいは鋭い先端を有するナノチップアレイまたは丸みを帯びた端部を有するナノロッドアレイをもつナノ構造表面から選択される。
【００１９】
一実施形態では、細胞集団の成長をモニタリングする方法は、本明細書の様々な実施形態で開示されているMZO-BAWセンサデバイスを提供することを含み、MgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造が、BAWデバイスの上部電極に堆積されパターン化され、0<x<0.2である。この方法はさらに、前記ナノ構造と接触している細胞集団を培養することと、MZOnano-BAWセンサデバイスの周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信することと、細胞集団の細胞の粘弾性特性および／または質量負荷の変化を示す出力信号からデータを抽出し、シミュレーションおよびモデリングを使用してデータを分析することを含む。
【００２０】
この方法はさらに、細菌性病原体の保因が疑われる被験体から試料を採取することを含む。例えば、試料は、食品、農産物、水源、環境汚染物質から採取される。
【００２１】
一実施形態では、MZOナノ構造改変バルク音響波（MZOnano-BAW）センサデバイスを製造する方法は、バルク音響波（BAW）デバイスを提供することを含む。BAWはQCMまたはTFBARである。この方法はさらに、MgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造をBAWデバイスの上部電極の表面に堆積させ、MZO中のMgの組成百分率（x）は0<x<0.2の範囲である。
【００２２】
この方法はまた、ある特性が満足されるように、MZO中のMg組成百分率（x）を適切な範囲で選択することを含む。例えば、組成百分率（x）は、選択された生物種との結合を増強するための適切な表面形態を提供するように選択される。別の例では、MZO中のMgの組成百分率（x）は、選択された生物種との結合を増強し、検出に必要な生物種の量を減少させるための適切な濡れ性を提供するように選択される。別の例では、MZO中のMgの組成百分率（x）は、毒性を低減するように選択される。別の例では、MZO中のMgの組成百分率（x）は、ナノ構造がセンシングプロセス中に維持され得るpH範囲を拡大するように選択される。
【００２３】
濡れ性は、超疎水性から超親水性までの範囲である。濡れ性の状態は、MZOの表面濡れ性を制御するために、成長中または成長後にMZO表面の酸素欠損密度を調整することによって、両方向に制御することができる。Mg組成xは、0.01<x<0.05の範囲内とすることができる。
【００２４】
MgxZn1-xO（MZO）中のMgの組成百分率（x）は、バイオセンシングのための生体試料への付着および非毒性を高めるための適切な濡れ性、およびセンシングプロセス中のMZOナノ構造の安定性のための広いpH範囲を提供するように選択される。
【００２５】
センサデバイスは、二重モード動作で動作するように構成することもでき、バイオセンシングのために同時にまたは別々に、音響アドミタンスで音響信号を生成し、蛍光で光信号を生成する。バイオセンシングは、抗菌剤耐性（AMR）のモニタリングにも使用できる。
【００２６】
MZOnano-BAWセンサは、複数の細胞増殖ウェルの内部に配置することもできる。センサはさらに、データ転送、記憶、処理および／または表示のためにセンサをモバイル機器および無線機器に接続することができるインタフェースを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
図１Ａは、一実施形態によるマグネシウム亜鉛酸化物（MZO）ナノ構造改変水晶マイクロバランス（MZOnano-QCM）バイオセンサを示す。
【００２８】
図１Ｂは、一実施形態によるAu電極表面の上部に堆積されたMZOナノ構造を示す。
【００２９】
図２Ａおよび２Ｂは、ZnOと比較して実施形態（x=0.03）によるMZO上の大腸菌の細胞死が減少したことを示し、それによってMZOベースのバイオセンサーの感度および生体適合性が増加していることを示す。
【００３０】
図２Ｃは、細菌培養物に対して毒性を引き起こす主要なイオン種である細胞培養培地中のZn2+イオンが5倍低い濃度であることを実証することにより、細菌培養に対するMZOの生体適合性が増加したことを検証したことを示す。
【００３１】
図３は、一実施形態による薬剤に対する細胞集団の応答のモニタリング方法のダイアグラムを示す。
【００３２】
図４Ａ〜４Ｄは、様々な実施形態による標準的なQCM、ZnOnano-QCMおよびMZOnano-QCMを用いた、大腸菌に対する抗生物質効果のセンサ応答を示す。図４Ａおよび４Ｃは、大腸菌に対するアンピシリンおよびテトラサイクリンの抗生物質効力を示し、一方、図４Ｂおよび４Ｄは、アンピシリンおよびテトラサイクリンに対する大腸菌の耐性株の抗菌剤耐性（AMR）の検出を示す。
【００３３】
図５Ａ〜５Ｄは、現在使用されているAMR検出技術である分光光度法（OD600）によって検証された大腸菌に対する抗生物質効果の検出を示す。
【００３４】
図６Ａ〜６Ｄは、様々な実施形態によるZnOnano-QCMおよびMZOnano-QCMを用いた、サッカロマイセス・セレビシエ（酵母）に対する抗真菌薬効果の検出を示す。図６Ａおよび６Ｂは、いくつかの実施形態によるアンホテリシンに対する殺菌剤応答およびミコナゾールに対する真菌静的応答の検出を示す。図６Ｃは、いくつかの実施形態による酵母の正常（無薬物）増殖状態の検出を示す。図６Ｄは、分光光度法（OD600）を用いたサッカロマイセス・セレビシエ（酵母）に対する抗真菌薬効果の検出を示す。
【００３５】
図７は、一実施形態による薬剤（VP16）処理の有無の両方についての、薬剤感受性急性リンパ芽球性白血病（ALL）（CEM）細胞の48時間のモニタリング期間全体にわたるセンサの時間依存性周波数シフトを示す。
【００３６】
図８は、一実施例における薬剤処理のない薬剤感受性ALL（CEM）細胞の総細胞数および細胞生存率を示す。
【００３７】
図９は、一実施例における薬剤処理を伴う薬剤感受性ALL（CEM）細胞の総細胞数および細胞生存率を示す。
【００３８】
図１０は、一実施例における薬剤（VP16）処理の存在下および非存在下における、薬物耐性ALL（CEM-V1）細胞の48時間のモニタリング期間全体にわたるバイオセンサの時間依存性周波数シフトを示す。
【００３９】
図１１は、一実施例における薬剤処理のない薬剤耐性ALL（CEM-V1）細胞の総細胞数および細胞生存率を示す。
【００４０】
図１２は、一実施例における薬剤処理を伴う薬剤耐性ALL（CEM-V1）細胞の総細胞数および細胞生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の様々な実施形態は、マグネシウム亜鉛酸化物（MZO）ナノ構造改変バイオセンサーの設計、製造、およびMZOナノ構造改変バイオセンサーを用いた細胞の検出およびモニタリングに関する。特に、MZOnano-QCMからの音響周波数応答を測定し分析することにより、MZOナノセンシング表面上に培養された細菌および真菌細胞の粘弾性特性および質量の変化をモニタリングすることによって、AMR効果を自動的および連続的に検出するシステムおよび検出方法が提供される。これらの生物物理学的測定は、増殖状態および生存率などの細菌および真菌細胞の生理学の変化の検出を介して、薬剤効果による微生物および抗菌効力および耐性に関する情報を提供する。
【００４２】
この特許文献における様々な実施形態の利点のいくつかとしては、（1）高感度（例えば、MZOnano-QCMは〜0.3μg/kHz、一方、MZOnano-TFBARについては5ng/kHz）、（2）AMR効果をモニターするための高速検出速度（例えば、従来技術の使用と比較して、大腸菌で30分対1.5日（70倍）、酵母では60分対2.5日（60倍）、しか要さない）、（3）ラベルフリー、および通常の生理学的条件下でのAMR効果の連続モニタリング、（4）リアルタイムの自動および定量的データ収集、（5）少ない試料量（ナノからマイクロリットルのスケール）、（6）バルク音響波（BAW）の特定のスペクトルシグネチャにおける細胞の生物物理学的特性の特徴付けによるAMR効果の動的および連続的な検出、（7）同一周波数領域の携帯電話などのモバイル機器を介した無線データ収集、（8）多重化を用いた高スループット、およびデバイスが薄膜バルク音響共振器（TFBAR）構成を使用するときの高コンテンツ配列、（9）特にTFBAR構成を使用する装置の場合に小型であり、ポータブルおよびモバイル用途に特に有用、（10）低コスト、が挙げられる。
【００４３】
これらの特徴は、この特許文献に開示されたシステムおよび方法を、AMR、抗生物質耐性をモニタリングするためと耐性株に作用する薬剤をスクリーニングするための診断ツールの提供、および新しい抗菌薬発見のための研究ツールの提供、およびパーソナライズされた癌治療と癌の創薬のための抗癌薬応答を検出するための診断ツールの提供、のような幅広い用途に適したものにする。これらの用途は、医師のオフィスで、患者のベッドサイドで、モバイルアプリケーションで、またはリサーチセンターで使用できる。
【００４４】
この特許文献全体を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示全体は、開示された事項が関係する技術水準をより完全に説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。以下の文章は、デバイスの特定の構成要素またはデバイスを利用する方法を参照または例示することができるが、本発明の範囲をそのような特定の参照または例に限定することを意図するものではない。ナノ構造の組成および形態ならびに培地の状態のような実用的および経済的考慮の観点から、当業者は様々な改変を行うことができる。
【００４５】
ここで使用される冠詞「a」および「an」は、他に示されない限り、「１つ以上」または「少なくとも１つ」を指す。すなわち、不定冠詞「a」または「an」による本発明の任意の要素または成分への言及は、複数の要素または成分が存在する可能性を排除するものではない。
【００４６】
ここで使用される「約」という用語は、その参照された数値表示のプラスまたはマイナス10％の参照された数値表示を指す。
【００４７】
ここで使用される「細胞」という用語は、適切な条件下で増殖し得る任意のタイプの生物を指す。非限定的な例には、哺乳動物細胞、細菌、真菌、酵母、および他の寄生虫病原体が含まれる。関心のある細胞の他の例には、分化細胞、老化細胞などの、細胞分裂によって増殖する細胞および非分裂様式で増殖する細胞が含まれる。
【００４８】
ここで使用される「薬剤」という用語は、細胞の増殖に影響を及ぼし得る任意の物質を指す。例としては、化合物、タンパク質または天然物抽出物、薬物の化合物が挙げられる。
【００４９】
ここで使用される「応答」という用語は、細胞増殖または溶解の結果としての、質量、粘度、弾性などの、細胞または細胞集団の１つ以上の生物物理学的特性の変化を指す。
【００５０】
ここで使用される用語「バイオセンサ」または「バイオセンサデバイス」は、他に指示がない限り、MZOナノ構造改変バルク音響波デバイス（MZOnano-BAW）装置を指す。 MZOnano-BAWは、MZOナノ構造改変QCM（MZOnano-QCM）であり、MZOnano-BAWは、MZOナノ構造改変薄膜バルク音響波共振器（MZOnano-TFBAR）である。
【００５１】
図示された実施形態では、図１Ａに示すように、MZOナノ構造改変バルク音響波（BAW）センサデバイス（MZOnano-BAW）は、上部電極110と下部電極111と、上部電極と下部電極との間に挟まれた圧電層121とを含むことができる。センサデバイスはまた、上部電極上に堆積されパターン化されたMgxZn1-xO（MZO）ベースのナノ構造のようなナノ構造122（概略図が示されている）を含む。組成百分率（x）は、0<x<0.2の範囲であり、xは、MZOナノ構造の濡れ性、非毒性およびpH安定性から選択される少なくとも１つの所定の特性を提供するように選択される。非限定的な例において、図１Ｂを参照すると、Au電極表面の上部にMZOナノ構造130（走査型電子顕微鏡（SEM）写真が示されている）が堆積される。
【００５２】
図１Ａに戻ると、下部電極111は、圧電層121の下に堆積されパターン化された導電性膜を含むことができ、上部電極110は、圧電層121に堆積されパターン化された金属電極を含むことができ、MgxZn1-xOベースのナノ構造122は、上部電極の上面に堆積されパターン化され、ここで0<x<0.20である。
【００５３】
MZOナノ構造122の濡れ性状態（超疎水性から超親水性、またはその逆）は、成長中または成長後のMZO表面の酸素欠損密度を調節することによって制御することができる。例えば、親水性から超親水性、特に先端タイプの鋭い表面形態を有するMZOナノ構造の場合に、濡れ性を強化することができる。MZOベースのナノ構造の親水性は、センサの液体試料消費を低減し、感度を著しく高めることができる。濡れ性の最適化は、特定の生物種または細胞との結合を強化する。
【００５４】
図示された実施形態では、MZO中のMgの組成百分率（すなわち、MgxZn1-xO中のx）は、0〜20％（0<x<0.2）の範囲である。しかしながら、そのような範囲は、所望の性能を達成するための単なる例示であることに留意すべきである。正確なx値は、MZOナノ構造の堆積中のMg組成の制御によりMZOnano-BAWセンサの高感度および選択性を得るために重要である。
【００５５】
純粋なZnO（x=0）と比較して、MgxZn1-xOベースのナノ構造中に少量のMg（例えば5％）を添加することにより、ナノ構造が耐えうる試料のpH値の範囲を広げることが可能になり、したがって、測定および製造プロセス中のMZOnano-BAWセンサの安定性および耐久性が向上する。
【００５６】
MZO中のMgの量は、様々なpH条件下でのMZOナノ構造体の、濡れ性、表面形態、および安定性と生体適合性を含む、ナノ構造の重要な特性に直接影響を及ぼす。さらに、適切な範囲のMgはまた、MZOナノ構造の低レベルの毒性または非毒性を導き、MZOnano-BAWセンサの生体適合性を高める。一例では、xの範囲は、0より大きく0.2未満の任意の値のグループであってもよいが、いくつかの好ましい範囲は、約0.01から約0.05、さらには0.02から約0.04、または約0.03または約0.04から0.05である。したがって、MgxZn1-xO（MZO）のMg組成は、性質、特性、試料の大きさ、細胞培養のpH値、温度、安定性、および所望の毒性（または非毒性）レベル、などの要因に応じて調整して最適化する必要がある。
【００５７】
図１Ａに開示され示されているMZOベースのナノ構造は、有機金属気相成長（MOCVD）および他の化学的または物理的堆積技術によって基板上に成長させ、フォトリソグラフィおよびエッチングプロセスによってパターン化することができる。ドープされていないZnOおよびそのナノ構造は、n型半導体の挙動を示す。マグネシウム（Mg）は、ZnOの成長中に原位置に導入され、三元化合物MgxZn1-xO（0<x<0.2）すなわちMZOを形成し、ZnOベースのナノ構造の物理的および化学的特性を改変することができる。
【００５８】
純粋な二元ZnOのように、様々なセンシング用途に適したドーピングによって、MZOを多機能化することができる。 例えば、AlおよびGaのようなIII族供与体のドーパントは、電気伝導度を著しく高め、FeおよびMnのような遷移金属（TM）ドーパントはそれを強磁性にし、CuおよびNiのような補償ドーパントはそれを圧電性にする。
【００５９】
MZOは、ガラス、石英およびAl2O3などの絶縁体、Si、GaAs、GaNおよびSiCなどの半導体、金属および透明導電性酸化物（TCO）などの電極、などの多数の基材に、ならびに、ポリマーなどの可撓性基材にも、薄膜およびナノチップやナノロッドなどの様々な形態で成長させることができる。一例では、適切な表面形態を有するMZOが、QCMおよびTFBARのAu上部電極に直接堆積される。
【００６０】
ここで使用されるナノ構造化MZOの表面形態に関して、「実質的に平坦」という語句は、〜1.5nmの表面粗さ（rms）を有するMZO膜として定義される。「粗い」は、〜7.5nmの表面粗さ（rms）を有するMZO膜と定義され、凹凸、突起、および／または隆起によって特徴付けられる。「鋭く不均一」は、密集したナノチップ／ナノロッドアレイを有するMZO膜として定義され、チップトップの直径は5〜100nmである。
【００６１】
MZOベースのナノ構造表面の形態（例えば、薄膜または実質的に平坦な、粗い表面、および鋭い先端）を制御することにより、ナノ構造と特定の生物学的細胞（例えば、AMR試験のための細菌および真菌細胞）との結合を高めることができ、種々の抗生物質および抗真菌薬に対する細菌および真菌の株の感受性および耐性をモニターすることができる。例えば、モニタリングされている細胞が哺乳動物である場合、実質的に平坦なナノチップ構造を有するBAWセンサデバイスを使用することができる。モニタリングされている細胞が真菌である場合、粗いナノチップ構造を有するBAWセンサデバイスが適している。モニタリングされている細胞が細菌性またはウイルス性である場合、粗いナノチップ構造を有するBAWセンサデバイスは、記述可能な感度を提供する。ナノ構造化されたMZOはまた、免疫センシングの用途のための酵素および抗体との反応のための細菌およびウイルス培養物との結合に使用することができる。MZOナノ粒子の形態の操作はまた、特定の細胞および分析物に対する感度を最大にするように働く。
【００６２】
ZnO（x=0）ナノ構造改変BAWデバイス（ZnOnano-BAW）およびMZO（0<x<0.2）ナノ構造修飾BAWデバイス（MZOnano-BAW）の両方とも、集積されたナノ構造をもたない通常のBAWデバイスよりも利点を有する。例えば、QCMデバイスのいくつかの利点として、（i）ナノ構造改変QCMデバイスはより大きな有効センシング表面積を有し、（ii）濡れ性および表面形態を制御して適切な細胞との結合を強化することができ、（iii）導電性などの他の化学的および物理的特性をドーピングによって制御することができる。これらの利点は、ZnOnano-QCMおよびMZOnano-QCMの両方が、通常のQCMデバイスよりも、はるかに高い感度を有し、液体バイオサンプル量をはるかに少なくすることを可能にする。
【００６３】
MZOnano-QCMをZnOnano-QCMを比較すると、MZOnano-QCMは、ZnOnano-QCMよりもはるかに高い感度を示す（例えば、大腸菌では5倍高い）。MZOnano-QCMはまた、大幅に低い検出限界を示す。例えば、0.1〜0.9ng（100〜900個の大腸菌細胞）の検出限界は、ZnOnano-QCMの検出限界の1〜9ngよりも10倍低い（大腸菌は〜1pgの平均質量を有する）。MZOナノ構造ベースのバイオセンサーデバイスのZnOナノ構造ベースの対応物に対する利点のいくつかの理由は、（i）広いpH値範囲および異なる温度で純粋なZnOよりMZOがより安定であり、したがって、MZOデバイスは、様々な動作条件下で、より長い保管寿命とより良い機能を提供し、（ii）MZOナノ構造の毒性レベルは、図２Ｃに示されるように、MZOからのZnイオン放出の有意な減少によりZnOベースの対応物よりもはるかに低い。
【００６４】
別の例示された実施形態では、MZO-BAWセンサデバイスを製造する方法は、米国特許第8,377,683号に開示された手順を使用することができ、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、製造時には、上述のように、バイオ検出の特定の必要性（生体分子のサイズなど）およびセンシングの条件（pHおよび温度など）に応じて、MZO中のMgの組成百分率（すなわち、MgxZn1-xOのx）を変化させてもよい（0<x<0.2）。
【００６５】
BAWに用いられる圧電材料は、石英、LiNbO3、LiTaO3、ZnOなどが挙げられるが、これらに限定されない。金属電極は、標準的なマイクロエレクトロニクス処理技術を用いて堆積されパターン化される。MZOベースのナノ構造改変BAW（MZOnano-BAW）センサは、BAW共振器デバイスと同様に動作する。BAW共振器は、圧電材料の特性および厚さによって決定される特定の周波数で共振する。標的の結合がMZOベースのナノ構造上に生じると、質量負荷は、MZOベースのナノ構造に結合された標的材料の量に正比例する、BAWデバイスの共振周波数のシフトをもたらす。
【００６６】
MZOナノ構造は、通常のQCMを含むBAWデバイスに組み込まれて、MZOnano-QCMを形成することができる。MZOベースのナノ構造は、薄膜バルク音響共振器に組み込まれて、MZOnano-TFBARを形成することもできる。TFBARは、上部電極と下部電極の間に挟まれた圧電膜からなる。TFBARははるかに高い周波数で動作することができる。それは、小型、低挿入損失および低消費電力など多くの利点を有する。さらに、TFBARセンサは、アレイに容易に組み込むことができる。TFBARセンサは、同じ基板上の他のSiベースの電子部品と一体化することができ、小型マイクロ波アンテナと互換性があり、したがって、無線の距離プロービングに使用することができる。
【００６７】
別の例示的な実施形態では、モニタリングシステムは、図１Ａに開示されるセンサデバイスを含むことができる。システムはまた、従来の手段を使用してBAWセンサデバイスの圧電層に振動を誘起することによって時間−周波数信号を生成するための源と、センサデバイスと通信可能に結合されたリアルタイム信号アナライザシステムとを含むことができる。リアルタイム信号アナライザシステムは、時間−周波数信号のスペクトル応答（例えば、振幅、位相、およびスペクトルの形状など）を測定するように構成される。モニタリングシステムはまた、CO2流を有するインキュベータ、温度コントローラ、およびインキュベーター内に配置された１つの細胞増殖ウェルを含むことができる。
【００６８】
モニタリングシステムでは、MZOnano-BAWセンサは、MZOnano-QCMおよびMZOnano-TFBARであってもよい。モニタリングシステムは、インキュベータと、インキュベータの内部に配置された複数の細胞増殖ウェルをさらに含んでいてもよい。２つ以上の細胞増殖ウェルはそれぞれ、そこに配置されたMZOnano-BAWセンサーを有してもよい。この構成は、検出の範囲をさらに拡大する。例えば、複数の化合物を同じ細胞または標的に対して並行して研究することができる。あるいは、同じ化合物を複数の標的に対して同時にスクリーニングすることができる。さらに、複数のMZOnano-TFBARセンサモジュールを同一チップ上に配列して集積することができ、異なる抗菌薬の並行検出が可能になる。
【００６９】
MZOnano-BAWセンサからの出力信号は周波数領域にあるので、モニタリングシステムは、信号を受信して処理し、病院および保健センターなどの処理または保管施設にデータを遠隔送信する無線モバイル機器（例えば、iPhone、iPad）にセンサを通信可能に接続するためのインターフェースをさらに含むことができる。
【００７０】
モニタリングシステムは、デュアルモード動作で動作するように構成することもでき、抗菌剤耐性（AMR）をモニタリングするために、音響アドミタンスの音響信号および蛍光の光信号を同時または別々に生成する。
【００７１】
MZOnano-BAWセンサは、生体機能化されて、直接的および間接的に、患者の試料、水道、食品、および農産物、汚染物質、および環境源の細菌または真菌の病原体の存在および／または増殖を検出することができる。したがって、センサ、方法およびモニタリングシステムは、食品および農産物の安全性および環境モニタリングを含む様々な分野で用途を見出す。生体機能化されたMZOnano-BAWバイオセンサはまた、化学療法中の、臨床応用および個人の健康のために、患者の試料において癌細胞および抗癌剤応答を直接的かつ選択的に検出するために使用することができる。
【００７２】
別の例示的な実施形態では、図３に示すように、音響周波数応答を測定し分析することにより、MZOナノセンシング表面で培養された細胞の粘弾性および質量の変化を動的にモニタリングするために、MZOnano-BAWセンサを用いる方法と、モニタリングシステムが提供される。この方法は、図１Ａの実施形態で開示されたマグネシウムがドープされた酸化亜鉛（MZO）ナノ構造（MZOnano）改変バルク音響波（BAW）センサデバイス（MZOnano-BAW）を提供すること301を含んでいてもよく、ここでMZO中のMg組成xは0<x<0.2の範囲にある。この方法はさらに、MZOナノ構造と接触している細胞集団を培養すること302、センサデバイスにおいて時間−周波数信号を生成すること303、MZOnano-BAWセンサデバイスの周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信すること304、細胞集団を薬剤と接触させること305、細胞集団を培養し続け、時間−周波数信号を生成し、周波数応答スペクトルに対応する出力信号を受信すること306、周波数応答スペクトルを測定することによって、出力信号の変化を動的かつ連続的にモニタリングすること307、出力信号からデータを抽出し、データを分析して前記細胞集団の前記薬剤に対する応答を決定すること308、を含む。
【００７３】
出力信号からデータを抽出するとき308に、この方法は、スペクトル形状進化データ、ピーク周波数シフトデータ、ナイキストマップ回転データ、運動抵抗データ、および／または運動誘導データなどの、データを抽出してもよい。バターワース・バン・ダイク（BVD）集中定数モデルと多層音響波伝送ラインシミュレーションに基づくデータ解析は、細胞の粘弾性特性および／または質量の変化などの細胞応答に、BAW周波数応答をリンクさせる。したがって、データ分析は、抗菌の効力および耐性（AMR）の情報を提供することができる。動的かつ継続的なモニタリングおよび分析も達成することができる。
【００７４】
この方法は、抽出されたデータを参照と比較して、例えば、薬剤の抗癌効果または抗菌効果および／または薬剤に対する細胞の抗生物質耐性、を決定することをさらに含んでいてもよい。参照は、薬剤で処理されていない細胞からの対照データまたは任意の関連した統計値であってもよい。高スループットのモニタリングと診断のため、複数のセンサを１つのプラットフォームに組み込むことができる。したがって、この特許文献の種々の例示された実施形態に開示されている方法およびモニタリングシステムは、抗癌または抗病原性真菌／細菌剤に対する耐性の効率的な検出を可能にし、創薬および開発において迅速かつ高スループットの方法または試験法として役立つことができる。
【００７５】
モニタリングされるべき細胞の非限定的な例には、細菌、真菌および寄生虫病原体が含まれる。さらなる例には、癌患者から単離された原発性癌細胞などの哺乳動物細胞が含まれる。細胞は、患者の試料、水道、食品、農産物、環境源から採取することができる。
【００７６】
検出プロセスの感度および効率を最大にするために、上述の種々の表面形態を種々の標的に用いることができる。例えば、粗いフィルムが細菌に使用され、実質的により平坦なナノ構造が哺乳動物細胞に使用される。
【００７７】
細胞集団は、MZOベースのナノ構造の表面において直接的または間接的に培養することができる。例えば、細胞は、MZOベースのナノ構造の表面においてMZOセンシング表面と直接接触して培養される。別の例では、細胞は、抗体などの適切な培地を介してMZOセンシング表面と間接的に接触する。
【００７８】
TBのAMRは主要な世界的な健康問題であり、これらの有機体のAMR検出は、その成長が非常に遅いため特に困難である。本明細書に開示される様々な実施形態に記載されたモニタリングシステムを用いる方法は、化合物または薬物（例えば、メチシリン、アンホテリシンなど）に対するAMRを検出するために使用することができる。これらの方法は、H37RvおよびMDR誘導体などのTB株の迅速かつ正確なモニタリングおよびAMR検出を可能にする。一例では、細菌および真菌の細胞培養物の抗生物質および抗真菌薬の有効性または耐性（AMR）をモニタリングする方法は、ここに記載されたモニタリングシステム内の細菌および真菌の細胞培養物の存在下で音響波インピーダンスおよび透過スペクトル信号をリアルタイムで生成することを含んでいてもよく、抗生物質または抗真菌薬が培養物に導入される時点を含む。
【００７９】
この方法はまた、バターワース・バン・ダイク（BVD）集中定数モデルと多層音響波伝送路シミュレーション法に基づくデータシミュレーションとモデリングの技術を使用して、時間−周波数信号からスペクトル形状進化データ、ピーク周波数シフトデータ、運動抵抗データ、および／または運動誘導データを抽出することを含んでいてもよい。
【００８０】
この方法はまた、抽出されたデータ（ここではまとめて「バイオセンサスペクトルシグネチャ」と呼ばれる）を対照培養株に対応するバイオセンサスペクトルシグネチャの対照セットと比較してもよい。比較は、データ分析ソフトウェアパッケージを用いて行うことができる。
【００８１】
この特許文献に開示されている種々の例示された実施形態に記載された方法およびモニタリングシステムは、薬物効力および薬物耐性を研究するために使用することができる。例えば、モニタリングされる細胞は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（TB）および／または多剤耐性スタフィロコッカス・アウレウス（MRSA）のような薬剤感受性および薬剤耐性の病原性細菌株であり、細胞培養物に導入される薬物は、抗TB薬またはメチシリンなどの抗病原性細菌薬である。
【００８２】
別の例では、モニタリングシステムは、薬剤耐性TBの病原性の広がりを緩和することを目的とした創薬と開発のための迅速かつ高スループットの方法または試験法のために、抗TBおよび抗病原性薬物に対する耐性を検出するための診断ツールを提供することができる。別の例では、細菌培養物は大腸菌を含み、この特許文献に開示されている例示された実施形態の方法を用いて、種々の薬剤（例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン）の静菌効果および殺菌効果を容易に決定することができる。
【００８３】
この特許文献に開示されている様々な例示された実施形態に記載された方法およびモニタリングシステムは、種々の真菌株、および抗真菌剤（例えば、ミコナゾールおよびアンホテリシン）の静真菌効果および／又は殺真菌効果に対する応答を研究するために使用することができる。例えば、モニタリングされる細胞は、カンジダ・アルビカンスなどの病原性真菌の薬剤感受性株および薬剤耐性株であってもよく、細胞培養物に導入される薬物は、アンホテリシンなどの抗真菌である。同様に、モニタリングされる細胞は、新たに単離された癌細胞であってもよく、細胞培養物に導入される薬剤は、抗癌剤または薬剤である。様々な実施形態に記載された方法は、他の細菌および真菌の株、特に病原性株にも適用することができ、他の薬剤化合物を含む。
【００８４】
細胞または病原体のAMRを検出するために、化合物または薬物は、細胞または病原体の培養の前または間に、細胞増殖ウェルに添加される。抵抗性株は増殖し続け、感受性株は参照と比較して質量の蓄積が減少する。参照は、化合物の干渉がない細胞増殖の並行試験であってもよい。参照はまた、データベースに記録された既知のデータおよび統計値であってもよい。この特許文献に開示された様々な例示された実施形態に記載された方法およびモニタリングシステムは、薬剤を導入した後のAMR効果の迅速かつ連続的な検出を可能にする。例えば、AMRの正確な検出は、薬剤（例えば、特定の薬物）が細胞培養ウェルに導入された後、大腸菌については30分で、酵母については60分で達成可能である。
【００８５】
AMRの検出に加えて、ここに記載の方法は、哺乳動物細胞の増殖の検出にも使用することができる。例えば、新たに単離された癌細胞および確立された癌細胞株由来の細胞の増殖は、MZOnano-QCMベースのデバイスでモニターすることができる。さらに、広範囲の細胞培養をすることなく、癌細胞の増殖を阻害する化合物の有効性を検出することができる。
【００８６】
上述のMZOnano-BAWセンサおよび関連するシステムは、細菌性病原体の保因が疑われる対象から採取された試料を動的にモニタリングするために使用することができる。対象は、ヒトまたは動物であってもよい。試料は、食品、農産物、水道、および環境汚染を含む供給源から採取することもできる。
【００８７】
例示された実施形態では、薬物化合物（非限定的な例として抗生物質、抗真菌剤または化学療法剤）の高スループットスクリーニング法が提供され、様々な疾患の治療におけるそれらの有効性を決定する。例えば、複数の試料ウェルに複数のMZOnano-BAWセンサ（この場合、MZOnano-QCM）を設置することにより、複数の化合物をスクリーニングしてもよい。別の例では、チップ上にユニットセンサ（この場合、MZOnano-TFBAR）を配列し、それを試料ウェルに入れることにより、多数の化合物をスクリーニングしてもよい。細胞標的の例としては、細菌、真菌、寄生虫、および癌細胞が挙げられる。例えば、細胞集団は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）またはリンパ腫を含んでいてもよい。
【００８８】
ここに記載される方法は、個人化された疾患診断、モニタリング、および治療の設計および開発においても使用することができる。例えば、様々な化合物または薬剤を、新しく単離された癌細胞に対してスクリーニングして、最も有効な薬剤を同定することができる。さらに、様々な化合物または薬物の組み合わせを試験して、新しい治療法を開発することができる。
【実施例】
【００８９】
マグネシウムをドープした酸化亜鉛（MZO）ナノ構造（MZOnano）改変バルク音響波（BAW）センサデバイス（MZOnano-BAW）、ここでMZO中のMg組成xが0.04≦x≦0.05の範囲、を使用する最初の２つの例、および薬剤に対する細胞集団の応答をモニタリングする方法、がさらに提供される。
【００９０】
第１の例は、図１Ａおよび１Ｂを参照して、感受性および耐性の大腸菌細胞の抗生物質効果を動的にモニタリングするための、本明細書に開示されているマグネシウム亜鉛酸化物（MZO）ナノ構造改変水晶マイクロバランス（MZOnano-QCM）バイオセンサの適用を示す。有機金属化学蒸着を用いて、標準的なQCM上部電極上にMZOナノ構造を成長させた。ZnOおよびMZOナノ構造化フィルムは、それらの多官能性および生体適合性に応じて選択される。それらの表面濡れ性および形態は制御可能であって、様々な生物学的／生化学的な種に対して高感度を提供する。MZOは、ZnOよりも広いpH範囲に耐えることができる。MZOナノ構造の利点とQCMの動的インピーダンススペクトル機能を組み合わせることで、MZOnano-QCMはAMR検出に好適な高感度動的バイオセンサになる。ZnOおよびMZOナノ構造上の大腸菌の増殖は、90分間のインキュベーションによって決定された。結果は、ZnO（図２Ａ）と比較して、MZO（図２Ｂ）上で有意により良好な細菌増殖を示している。
【００９１】
図４Ａ〜４Ｄは、通常のQCM、ZnOnano-QCMおよびMZOnano-QCMを用いた大腸菌における抗生物質効果の検出を示す。通常のQCMは感度が低いため検出に失敗したが、ZnOnano-QCMおよびMZOnano-QCMの両方は、周波数シフト（Δf）を介して活性成長中の細菌数の正確な検出を可能にしている。MZOnano-QCMはZnOnano-QCMより４倍高い感度を提供している。抗生物質感受性および耐性の検出は、対にした抗生物質感受性および耐性大腸菌を殺菌性アンピシリン（256μg/mL）および静菌性テトラサイクリン（8μg/mL）で処理することによって行った。アンピシリン感受性細胞（図４Ａ）では、Δfはアンピシリン処理後の5分以内に増加を停止して10分以内に減少したが、アンピシリン耐性細胞ではΔfは増加し続けた（図４Ｂ）。テトラサイクリン感受性細胞において静菌効果が示され、抗生物質処理後に信号出力が平坦になったが、テトラサイクリン耐性細胞では平坦にならなかった（図４Ｃ〜４Ｄ）。これらの結果は、MZOnano-QCM（図４Ａ〜４Ｄ）と同じ傾向を示す、分光光度法（OD600）の結果（図５Ａ〜Ｄ）によって検証された。しかし、分光測光法では、装置内部に配置するためにバイアルに試料を分注する必要がある。これには、時間のかかる試料抽出と測定、およびはるかに大きな試料サイズが含まれる。図４Ａ〜４Ｄに例示された実施形態を用いたAMRおよび薬物効力の検出は、試料の分注や培養の妨害を要せず、迅速、高感度でリアルタイムのAMR検出を実証し、微生物病原菌の診断を約束する。
【００９２】
第２の例は、同じMZOnano-QCMバイオセンサーの適用が、酵母細胞におけるアンホテリシンおよびミコナゾールの効果をモニタリングすることを実証した。図６Ａ〜６Ｄを参照すると、この特許文献に開示された種々の実施形態を用いた検出結果と分光光度法とを比較すると、OD600法は細胞死滅効果を検出することができず、殺真菌剤ではなく静真菌剤としてアンホテリシンを誤って同定することが示されている。この特許文献の様々な実施形態を使用した結果は、両方の薬物効果を迅速に正確に検出する。
【００９３】
特に、図６Ａは、ZnOnano-QCMおよびMZOnano-QCMを用いた、酵母におけるアンホテリシンの細胞死滅効果およびミコナゾールの増殖阻害効果（図６Ｂ）の検出を示す。図６Ｃは、対照として薬物のない酵母増殖曲線を示す。最初の増殖播種の330分後にアンホテリシンとミコナゾールの両方を細胞培養物に導入し、MZOnano-QCMは薬物処理の1時間以内に細胞死滅効果と増殖阻害効果の両方を示している。MZOnano-QCMはまた、ZnOnano-QCMと比較して４倍高い信号感度を示している。これらの結果を、酵母細胞培養物のOD600分光モニタリングと比較した。図６Ｄは、アンホテリシンおよびミコナゾールの抗真菌効果ならびに無薬物状態についてのOD600プロットを示す。分光学的方法は、酵母に対するアンホテリシンの細胞死滅効果とミコナゾールの増殖阻害効果とを区別することができなかったことに留意されたい。これは、分光学的方法が懸濁細胞による光吸収に依存し、死滅した酵母細胞が懸濁状態にあり、吸収に寄与することによる。
【００９４】
薬物効果の検出のためのこの特許文献に開示されている様々な実施形態に記載された方法およびシステムの有効性を実証するための大腸菌および酵母の使用は、大腸菌および酵母の両方が抗生物質および抗真菌薬の開発のための一般的な細菌および真菌のモデルであることによる。さらに、両方の種は、ヒトの感染を引き起こす最も一般的な病原体の１つである。
【００９５】
第３の例は、MZO中のMg組成xが0.03である、MZOnano-QCMセンサデバイスを用いて癌細胞の増殖に対する抗癌剤の効果をモニタリングするためのモデルとして、薬物VP16（エトポシド、抗癌剤としても知られている）、VP16感受性ALL細胞株（CEM）およびそのVP16耐性誘導体細胞株（CEM-V1）を使用する。
【００９６】
この例のすべての実験では、2mLの培地中に4×105個の細胞の初期播種密度を使用し、MZOnano-QCMを用いた白血病細胞増殖を48時間動的にモニタリングする。最初の播種から4時間後に薬物（VP16）を細胞培養物に導入した。図７には、薬剤感受性CEM細胞の48時間のモニタリング期間全体にわたるセンサの時間依存性周波数シフトが示されている。薬物がない場合、周波数シフトは0〜40時間に指数関数的に増加し（センシング領域に指数関数的に細胞が蓄積していることを示している）、つぎに周波数シフト率は減少し、細胞増殖の飽和を示している。デバイス内の細胞培養物に薬物を導入した場合では、薬物を導入した後（初期播種後4時間）に細胞が増殖し続けることが観察されているが、薬物が導入されてから16時間後に薬物が作用していることがわかる。この時点で、20時間から48時間に周波数シフトの減少が起こることによって示されるように、細胞は死滅し始める（または増殖が停止する）。
【００９７】
センサの測定値は、標準的な細胞生存率分析器（Beckman Coulter、Vi-cell XR）を用いて確認し、48時間後の最終細胞数および細胞生存率を決定することができる。並行して、標準的な細胞ウェル中の同じ量の細胞を、デバイスと共に培養する。モニタリングサイクルの終了時（48時間）に、0.5mLの細胞培養物を細胞ウェルから、またデバイスからも抽出する。生存率分析器を用いて、対照およびデバイス内で増殖する細胞の細胞計数を行うことができる。図８（薬物なし）および図９（薬剤あり）は、総細胞数および細胞生存率が最終的な信号の傾向と一致することを示している。しかしながら、生存率分析器は、白血病細胞に対する薬物治療の効果をリアルタイムで示すことができなかった。
【００９８】
図８において、この例で用いられる様々な設定として、con1、con2およびcon3は三連で行われる標準ウェル中の対照細胞培養物であり、MSは底部のガラス試料（平滑な形態）上のMZOを有する標準ウェル中の対照細胞培養物であり、MRは底部のガラス試料（粗い形態）上のMZOを有する標準ウェル中の対照細胞培養物であり、MNは底部のガラス試料（ナノ形態）上のMZOを有する標準ウェル中の対照細胞培養物であり、センサは実際のMZOnano-QCMセンサ＋細胞ウェルからの細胞培養物である。
【００９９】
図９において、この例で用いられる様々な設定として、CEM DMSOはDMSO（DMSOを薬物溶媒として使用した）を用いた標準ウェル中の対照細胞培養物であり、CEM VP16は最初の播種の4時間後にVP16薬剤が導入された標準ウェル中の細胞培養物であり、CEMは標準ウェル中の対照細胞培養物であり、MSは底部のガラス試料（平滑な形態）上のMZOを有する標準ウェル中の対照細胞培養物であり、MRは底部のガラス試料（粗い形態）上のMZOを有する標準ウェル中の対照細胞培養物であり、MNは底部のガラス試料（ナノ形態）上のMZOを有する標準ウェル中の対照細胞培養物であり、センサは実際のMZOnano-QCMセンサ＋細胞ウェルからの細胞培養物である。
【０１００】
薬剤耐性CEM白血病細胞（CEM-V1）について、MZOnano-QCMセンサと生存率分析器の両方を用いて同じ実験を繰り返し、モニタリングを48時間行うことができる。図１０は、薬物（VP16）治療の存在下および非存在下におけるセンサの時間依存性周波数シフトを示している。4×105個の細胞の初期播種の4時間後に薬物を細胞培養物に添加した。薬物処理のない細胞培養物の場合、時間依存性周波数シフトは、感受性細胞の実験の薬物のない場合と同じ傾向を示すことが観察されている。最初の播種から19時間後（薬物の添加後の〜15時間）、時間依存性周波数シフトは薬物のない対照で観察されたものと比較して減少し始めたが、継続的な増加傾向は、薬物の存在下での継続的な細胞増殖を示している。この傾向はまた、図11および図12に示される細胞生存率分析器の結果によっても確認されている。図11の例で用いられる様々な設定は、図8に関して説明したものと同じであり、図12の例で用いられる様々な設定は、図9に関して説明したものと同じである。
【０１０１】
上記で開示したシステム、方法および特徴、ならびに代替物は、多くの他の種々のシステム、方法または用途と組み合わせてもよい。当業者であれば、現在予期しない種々の代替、改変、変形または改良を行うことができ、その各々は開示された実施形態に包含されることも意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２ＡＢ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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