(57)【要約】  常温で液状で存在するバイオポリマー、その用途およびその製造方法が提供される。
2019500437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
常温で液状で存在するポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）バイオポリマー。
【請求項２】
生分解性または疎水性を有するか、生分解性および疎水性を同時に有する、請求項１に記載のバイオポリマー。
【請求項３】
４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートがそれぞれ３０％以上のモル比率で含まれている、請求項１に記載のバイオポリマー。
【請求項４】
４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートがそれぞれ４０％以上のモル比率で含まれている、請求項１に記載の常温で液状で存在するバイオポリマー。
【請求項５】
４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートが１：１のモル比率で含まれている、請求項１に記載の常温で液状で存在するバイオポリマー。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオポリマーを含む、生分解性と疎水性を同時に有するバイオポリマー組成物。
【請求項７】
前記バイオポリマー組成物は、ガラス、金属、高分子物質、ヒドロゲル、木材、セラミックス、細胞、組織、器官および生体分子からなる群より選択される基質に接着されるものである、請求項６に記載のバイオポリマー組成物。
【請求項８】
前記バイオポリマー組成物は、組織接着剤、組織縫合剤、癒着防止剤、止血剤、組織工学用支持体、創傷被覆剤、薬物伝達担体、組織充填剤、環境にやさしい塗料、環境にやさしい油性染料、黒彩添加剤または化粧品添加剤として使用されるものである、請求項６に記載のバイオポリマー組成物。
【請求項９】
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が弱化または欠損し、２−ヒドロキシアルカノエート（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）を２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡ（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｙｌ−ＣｏＡ）に転換し、４−ヒドロキシアルカノエート（４−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）を４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡ（４−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏｙｌ−ＣｏＡ）に転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素をコーディングする遺伝子を含む微生物を培養する段階を含む、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞は、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を形質転換して得られたものである、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１１】
前記２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１２】
前記２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子は、
（ａ）配列番号１の塩基配列；
（ｂ）配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｃ）配列番号１の塩基配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｄ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＧｌｙ３３５Ａｓｐが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｅ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｌａ２４３Ｔｈｒが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｆ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ｇｌｙが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｇ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ２５７Ａｓｎが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｈ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ａｓｎが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｉ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＴｈｒ１９９Ｉｌｅが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；および
（ｊ）配列番号１の塩基配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異し、配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＶａｌ１９３Ａｌａが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列からなるものである、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１３】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６−１９由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１４】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号４のアミノ酸配列；または
配列番号４のアミノ酸配列においてＬ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１ＲおよびＡ５２７Ｓから構成される群より選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１５】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号４のアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｓ３２５ＴおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５ＴおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｉｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７ＲおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７ＦおよびＱ４８１Ｋ；および
（ｖ）Ｌ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１ＫおよびＡ５２７Ｓからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１６】
前記培養は、２−ヒドロキシブチレートおよび４−ヒドロキシブチレートを含む培地で行われるものである、請求項９に記載の共重合体の製造方法。
【請求項１７】
ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が弱化または欠損し、
２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子が導入された、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を生産する微生物。
【請求項１８】
前記２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼである、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
前記２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子は、
（ａ）配列番号１の塩基配列；
（ｂ）配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｃ）配列番号１の塩基配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｄ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＧｌｙ３３５Ａｓｐが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｅ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｌａ２４３Ｔｈｒが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｆ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ｇｌｙが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｇ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ２５７Ａｓｎが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｈ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ａｓｎが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｉ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＴｈｒ１９９Ｉｌｅが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；および
（ｊ）配列番号１の塩基配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異し、配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＶａｌ１９３Ａｌａが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列からなるものである、請求項１７に記載の微生物。
【請求項２０】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）６−１９由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項２１】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号４のアミノ酸配列；または
配列番号４のアミノ酸配列においてＬ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１ＲおよびＡ５２７Ｓから構成される群より選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、請求項１７に記載の微生物。
【請求項２２】
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子は、
配列番号４のアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｓ３２５ＴおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５ＴおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｉｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７ＲおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７ＦおよびＱ４８１Ｋ；および
（ｖ）Ｌ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１ＫおよびＡ５２７Ｓからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものである、請求項１７に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願との相互参照］
本出願は、２０１６年３月２８日付の韓国特許出願第１０−２０１６−００３７２１８号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
【０００２】
常温で液状で存在するポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）バイオポリマー、その用途およびその製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
バイオポリマーとは、バイオマスを原料として用いて製造した高分子プラスチックで、バイオマスベースの成分だけからなるものはもちろん、石油化学ベースのプラスチックが混合されたものまでを総称する。
【０００４】
バイオポリマーは、植物や微生物から作られたプラスチックが主成分で、簡単に分解されて生物体が吸収可能な形態に変化できる環境にやさしい物質である。
【０００５】
代表的なバイオポリマーの一種であるポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）は、微生物が窒素、酸素、リン、マグネシウムなどの成長に必要な元素が不足した状態で炭素源が豊富に存在する時、エネルギーおよび還元能の貯蔵のために微生物の内部に蓄積する天然ポリエステル物質である。
【０００６】
ＰＨＡは、従来石油に由来する合成高分子と似た物性を有して生分解性および生体適合性を示すため、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。
【０００７】
ＰＨＡのモノマーとして知られたものは約１５０種以上で、このうち大部分のモノマーが３−、４−、５−または６−ヒドロキシアルカノエート（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＨＡ）であり、活発に研究されている代表的なＰＨＡモノマーとしては、３−ヒドロキシブチレート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ：３ＨＢ）、４−ヒドロキシブチレート（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ：４ＨＢ）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ：３ＨＰ）、および炭素数が６〜１２個の中間鎖長（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ：ＭＣＬ）の３−ヒドロキシアルカノエート（ＭＣＬ３−ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ）などのように、３番と４番目の炭素位置にヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）があるモノマーが挙げられる。
【０００８】
微生物においてＰＨＡを合成するのに核心的な役割を果たす酵素はＰＨＡ合成酵素で、これは、多様なヒドロキシアシル−ＣｏＡ（ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）を基質として当該モノマーを含有するポリエステルを合成する。
【０００９】
また、ＰＨＡ合成酵素は、多様なヒドロキシアシル−ＣｏＡの中で基質特異性を有するため、高分子のモノマー組成はＰＨＡ合成酵素によって調節される。
【００１０】
したがって、ＰＨＡを合成するためには、ＰＨＡ合成酵素の基質として使用できる多様なヒドロキシアシル−ＣｏＡを合成し提供する代謝経路と、前記基質とＰＨＡ合成酵素を用いた高分子合成代謝経路が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従来のＰＨＡバイオポリマーは、常温で固体状態で存在する。
【００１２】
本願では、常温で液体状態で存在するバイオポリマーを提供し、さらに、常温で液状だけでなく、生分解性および粘着特性を示すことで、多様な分野で活用可能なバイオポリマーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一例は、常温で液状で存在するポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）バイオポリマーを提供する。
【００１４】
他の例は、前記バイオポリマーを含む、生分解性または疎水性を有するか、生分解特性と疎水性特性を同時に有するＰＨＡバイオポリマー組成物を提供する。
【００１５】
他の例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が弱化または欠損し、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子を含む微生物を培養する段階を含む、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体の製造方法を提供する。
【００１６】
他の例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が弱化または欠損し、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を含み、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を生産する微生物を提供する。
【００１７】
他の例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする遺伝子を欠失させ、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を細胞に導入する段階を含む、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を生産する微生物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、常温で液状であるＰＨＡバイオポリマーを提供し、これは、生分解性、生体適合性および疎水性のバイオプラスチックの原料であって、電子、自動車、食品、農業および医療分野などに幅広く活用できる。
【００１９】
特に、本願で提供する液状のＰＨＡ高分子は、優れた粘着特性を示すので、ペイント（塗料）、染料、コーティング、高分子、繊維および接着剤など化学産業全般に適用可能であり、湿潤状態でも水に溶けずに粘着特性を維持して医学用バイオ接着剤として応用可能である。
【００２０】
例えば、組織接着剤、止血剤、組織工学用支持体、薬物伝達用担体、組織充填剤、傷治療、または組織間癒着防止などの多様な医学的応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣｐＰＣＴ５４０ベクターの作製過程および開裂地図を示すものである。
【図２】ｐＰｓ６１９Ｃ１２４９．１８Ｈ−ＣＰＰＣＴ５４０ベクターの開裂地図を示すものである。
【図３】組換え細胞から生産された４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体をガスクロマトグラフィーで分析した結果を示す。
【図４】４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを多様なモル比で含む高分子の写真を示す。
【図５】４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを多様なモル比で含む高分子の示差走査熱量計（ＤＳＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）の分析結果を示す。ｅｎｄｏは吸熱（ｅｎｄｏｔｈｅｒｍｉｃ）反応を、ｅｘｏは発熱（ｅｘｏｔｈｅｒｍｉｃ）反応を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
一態様として、本発明は、常温で液状で存在するポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）バイオポリマーに関する。
【００２３】
具体的な一例は、常温で液状で存在し、生分解性または疎水性を有するか、生分解性および疎水性を同時に有するＰＨＡバイオポリマーに関する。
【００２４】
具体的な他の例は、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む、常温で液状で存在するＰＨＡ高分子に関する。
【００２５】
具体的な他の例は、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートがそれぞれ３０％以上のモル比率で含まれている、常温で液状で存在するバイオポリマーに関する。
【００２６】
具体的な他の例は、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートがそれぞれ４０％以上のモル比率で含まれている、常温で液状で存在するバイオポリマーに関する。
【００２７】
具体的な他の例は、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含み、ポリマー内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートが１：１のモル比率で含まれている、常温で液状で存在するバイオポリマーに関する。
【００２８】
他の例は、前記バイオポリマーを含む、生分解特性と疎水性特性を同時に有するバイオポリマー組成物に関する。
【００２９】
具体的な一例は、ガラス、金属、高分子物質、ヒドロゲル、木材、セラミックス、細胞、組織、器官および生体分子からなる群より選択される基質に接着できるバイオポリマー組成物に関する。
【００３０】
具体的な他の例は、組織接着剤、組織縫合剤、癒着防止剤、止血剤、組織工学用支持体、創傷被覆剤、薬物伝達担体、組織充填剤、環境にやさしい塗料、環境にやさしい油性染料、黒彩添加剤または化粧品添加剤として使用できるバイオポリマー組成物に関する。
【００３１】
他の例は、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体の製造方法に関する。
【００３２】
他の例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が弱化または欠損し、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコーディングする遺伝子を含む細胞を培養する段階を含む、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体の製造方法に関する。
【００３３】
他の様態として、本発明は、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を生産する微生物およびその製造方法に関する。
【００３４】
具体的な一例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の活性が弱化または欠損し、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を含み、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を生産する微生物に関する。
【００３５】
他の例は、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする遺伝子を欠失させ、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を細胞に導入する段階を含む、４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体を生産する微生物の製造方法に関する。
【００３６】
以下、本発明の構成をより詳細に説明する。
【００３７】
本願において、常温で液状で存在するＰＨＡバイオポリマーを提供する。
【００３８】
好ましくは、常温および常圧で液状で存在するＰＨＡバイオポリマーを提供する。
【００３９】
常温とは、特別に熱を加えたり調節しない平常の温度をいい、一般に１５℃〜３０℃、または２０℃〜２５℃の温度範囲であってよい。
【００４０】
常圧とは、特別に圧力を加えたり調節しない通常の大気圧をいい、一般に９００〜１，１００ｈＰａ程度の圧力範囲であってよい。
【００４１】
一具体例として、前記バイオポリマーは、生分解特性を有するものである。
【００４２】
生分解特性とは、生体内で分解可能な性質をいう。
【００４３】
他の具体例として、前記バイオポリマーは、疎水性特性を有するものである。
【００４４】
疎水性とは、水分子と結合しにくい性質をいう。
【００４５】
他の具体例として、前記バイオポリマーは、生分解性および疎水性を同時に有するものである。
【００４６】
ＰＨＡ高分子としては、常温および常圧で液体状態で存在する限り、特別な制限なく多様なヒドロキシアルカノエートモノマーから構成された高分子を含む。
【００４７】
例えば、前記ヒドロキシアルカノエートモノマーは、２−、３−、４−、５−または６−ヒドロアルカノエートであってもよい。
【００４８】
一具体例として、「４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体」とは、モノマーとして４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートがエステル結合で重合された繰り返し単位を含む線状のポリエステルであるＰＨＡ高分子をいう。
【００４９】
この時、各モノマーの重合順序には特別な制限がなく、ランダムに繰り返される。
【００５０】
例えば、４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体、または２−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレート共重合体が挙げられる。
【００５１】
本願の一実施例では、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを多様なモル比率で含むポリアルカノエート共重合体高分子を製造した後、物性を分析した。
【００５２】
示差走査熱量計（ＤＳＣ）分析において、４−ヒドロキシブチレートまたは２−ヒドロキシブチレートのホモポリマー（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）の場合、結晶化（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）が観察されたが、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートの共重合体の場合には、結晶化および溶融温度（Ｔｍ）が観察されない無定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）形態の高分子であることを確認することができた。
【００５３】
また、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートの共重合体が粘着特性を示すことを初めて確認し、特に、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートモノマーのモル比率がそれぞれ３０％以上の時、接着剤として適切な液状の特性、疎水性および粘着特性を示すことを確認することができた。
【００５４】
さらに、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートモノマーのモル比率がそれぞれ４０％以上の時、接着剤として適切な液状の特性、疎水性および粘着特性を示すことができる。
【００５５】
また、４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートモノマーのモル比率が１：１の時、接着剤として適切な液状の特性、疎水性および粘着特性を示すことができる。
【００５６】
したがって、共重合体内の４−ヒドロキシブチレートに対する２−ヒドロキシブチレートのモル比は３０：７０〜７０：３０、または４０：６０〜６０：４０、または５０：５０で提供され、常温および常圧で液状で存在し得る。
【００５７】
また、前記範囲内で本願の共重合体は粘着特性を示すことができる。
【００５８】
さらに、前記範囲内で本願の共重合体は液状で存在するだけでなく、生体適合性、疎水性および粘着性を示すので、ガラス、金属、高分子物質、ヒドロゲル、木材、セラミックスまたは生物試料を接着させたり固定するための接着剤用途に使用することができる。
【００５９】
また、本発明の高分子は、湿潤状態でも水に溶けずに粘着特性を維持するので、医学用バイオ接着剤として使用可能である。
【００６０】
したがって、本発明はさらに、常温で液状で存在するバイオポリマーを含む、生分解性と疎水性を同時に有するバイオポリマー組成物を提供する。
【００６１】
一例として、前記バイオポリマー組成物は、溶剤型、水溶性、無溶剤型でもよいし、基質に対して０．０１〜１００μｇ／ｃｍ２で使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
また、使用方法は、通常のバイオポリマーの使用方法に準じ、代表的な方法は、塗布法を例示することができる。
【００６３】
本願のバイオポリマー組成物は、無生物の表面または生体試料など多様な基質に接着することができる。
【００６４】
例えば、ガラス、金属、高分子物質、ヒドロゲル、木材、セラミックス、細胞、組織、器官および生体分子からなる群より選択される基質に接着することができるが、これに制限されるわけではない。
【００６５】
生体分子は、核酸、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、炭水化物、酵素、ホルモン、成長因子またはリガンドを例示することができるが、これに制限されるわけではない。
【００６６】
したがって、本願のバイオポリマー組成物は、環境にやさしい素材であって、ペイント（塗料）、染料、コーティング、高分子、フィルム、接着シート、繊維など化学産業全般に応用できるだけでなく、自動車産業、電気および電子産業、化粧品、医学および薬学など多様な領域に適用可能である。
【００６７】
例えば、前記バイオポリマー組成物は、組織接着剤、組織縫合剤、癒着防止剤、止血剤、組織工学用支持体、創傷被覆剤、薬物伝達担体、組織充填剤、環境にやさしい塗料、環境にやさしい油性染料、黒彩添加剤、または化粧品添加剤などに使用できる。
【００６８】
具体例として、前記バイオポリマー組成物は、現在市中で主に用いられているシアノアクリル系接着剤またはフィブリン系接着剤などを代替して、皮膚、血管、消化器、脳神経、成形外科、整形外科などの様々な領域で使用可能である。
【００６９】
例えば、前記バイオポリマー組成物は、外科手術用縫合糸を代替することができ、不必要な血管を閉塞するのに用いられ、顔面組織、軟骨などの軟組織と、骨、歯などの硬組織の止血および縫合に用いられ、家庭常備薬として適用することが可能である。
【００７０】
より詳細には、前記バイオポリマー組成物はバイオ接着剤であって、人体の内部および外部表面に適用可能であり、例えば、皮膚のような人体の外部表面または外科手術過程で露出する内部器官の表面などに局所的に適用可能である。
【００７１】
また、本発明のバイオポリマー組成物は、組織の損傷した部分を接着させるか組織から空気／流体が漏出することを縫合したり、医療器具を組織に接着させたるかまたは組織の欠陥部分を満たすのに用いられる。
【００７２】
用語「生体組織」は特に制限はなく、例えば、皮膚、骨、神経、エクソン、軟骨、血管、角膜、筋肉、筋膜、脳、前立腺、乳房、子宮内膜、肺、脾臓、小腸、肝、精巣、卵巣、頸部、直腸、胃、リンパ節、骨髄および腎臓などを含む。
【００７３】
また、前記バイオポリマー組成物は、傷治癒（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）に用いられる。
【００７４】
例えば、傷に適用されるドレッシングに用いられる。
【００７５】
さらに、前記バイオポリマー組成物は、皮膚縫合に用いられる。
【００７６】
つまり、局所的に適用されて傷を縫合するのに用いられ、縫合糸を代替することができる。
【００７７】
また、本発明のバイオポリマー組成物は、脱腸の復元にも適用可能であり、例えば、脱腸の復元に用いられるメッシュの表面コーティングに用いられる。
【００７８】
また、前記バイオポリマー組成物は、血管のような管構造の縫合および漏出を防止するのにも用いられる。
【００７９】
さらに、本発明のバイオポリマー組成物は、止血にも用いられる。
【００８０】
また、前記バイオポリマー組成物は、癒着防止剤として用いられる。
【００８１】
癒着とは、すべての手術部位で発生するもので、手術部位の周辺で他の組織が傷周囲にくっつく現象である。
【００８２】
癒着は、手術後９７％程度発生し、特になかでも５−７％が深刻な問題を引き起こす。
【００８３】
このような癒着を防止するために、手術時に傷を最小化したり、消炎剤を使用したりする。
【００８４】
さらに、繊維素の形成を防止するために、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を活性化するか、結晶性溶液、高分子溶液、固体膜などの物理的障壁を使用しているが、これらの方法は生体内で毒性を示すことがあり、他の副作用を示すことがある。
【００８５】
本発明のバイオポリマー組成物は、例えば、手術後に露出した組織に適用され、その組織と周囲の組織との間に発生する癒着を防止するのに用いられる。
【００８６】
例えば、臓器癒着防止剤、特に腸癒着防止剤として使用できる。
【００８７】
さらに、前記バイオポリマー組成物は、組織工学用支持体として使用できる。
【００８８】
組織工学技術とは、患者の組織から分離された細胞を支持体に培養して、細胞−支持体複合体を製造した後、体内移植する技術をいい、組織工学技術は、人工皮膚、人工骨、人工軟骨、人工角膜、人工血管、人工筋肉など人体のほぼすべての臓器の再生に適用されている。
【００８９】
本発明のバイオポリマー組成物は、多様な生体分子に接着可能なため、組織工学用支持体として使用され、さらに、化粧品、傷被覆材、歯科用マトリックスなどの医療用素材としても活用可能である。
【００９０】
その他にも、穿孔、裂傷、切開などの治療、角膜移植、人工角膜挿入のような眼科的接合；補正装置、加工義歯、歯冠装着、揺歯固定、破折歯治療、および充填剤固定のような歯科的接合；血管接合、細胞組織接合、人工材料移植、傷縫合のような外科的治療；骨、靭帯、腱、半月（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）および筋肉治療および人工材料移植のような整形外科的治療；または薬物伝達用担体などに用いられる。
【００９１】
用語「２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素」は、ＣｏＡ供与体からＣｏＡを切り離して２−ヒドロキシアルカノエートおよび４−ヒドロキシアルカノエートにそれぞれ伝達することによって、２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを生成することができる酵素をいう。
【００９２】
前記ＣｏＡ供与体としては、アセチル−ＣｏＡまたはアシル−ＣｏＡ（例えば、プロピオニル−ＣｏＡなど）を例示することができる。
【００９３】
一実現例として、前記酵素は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼであってもよい。
【００９４】
また、前記酵素の遺伝子は、クロストリジウムプロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）に由来するものであってもよい。
【００９５】
例えば、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子は、
（ａ）配列番号１の塩基配列；
（ｂ）配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｃ）配列番号１の塩基配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｄ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＧｌｙ３３５Ａｓｐが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｅ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｌａ２４３Ｔｈｒが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｆ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ｇｌｙが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｇ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ２５７Ａｓｎが変異し、配列番号１の塩基配列においてＡ１２００Ｇが変異した塩基配列；
（ｈ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＡｓｐ６５Ａｓｎが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；
（ｉ）配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＴｈｒ１９９Ｉｌｅが変異し、配列番号１の塩基配列においてＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異した塩基配列；および
（ｊ）配列番号１の塩基配列においてＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃが変異し、配列番号１に対応するアミノ酸配列においてＶａｌ１９３Ａｌａが変異した塩基配列からなる群より選択された塩基配列を有するものであってもよい。
【００９６】
用語「２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素」は、２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートを繰り返し単位として含む共重合体を合成できる酵素をいう。
【００９７】
例えば、前記酵素は、シュードモナス属６−１９（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９）に由来するＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ）であってもよい。
【００９８】
例えば、前記ＰＨＡ合成酵素は、
配列番号４のアミノ酸配列；または
配列番号４のアミノ酸配列においてＬ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ、Ｑ４８１ＲおよびＡ５２７Ｓから構成される群より選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものであってもよい。
【００９９】
他の具体例において、前記ＰＨＡ合成酵素は、
配列番号４のアミノ酸配列において、
（ｉ）Ｓ３２５ＴおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５ＴおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｉｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７ＲおよびＱ４８１Ｍ；
（ｉｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７ＦおよびＱ４８１Ｋ；および
（ｖ）Ｌ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１ＫおよびＡ５２７Ｓからなる群より選択される変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列からなるものであってもよい。
【０１００】
前記酵素は、分子の活性を全体的に変更させない範囲内で追加的な変異を含むことができる。
【０１０１】
例えば、分子の活性を全体的に変更させない蛋白質およびペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野で公知である。
【０１０２】
例えば、通常起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの間の交換が挙げられるが、これに制限されるわけではない。
【０１０３】
場合によって、前記蛋白質は、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。
【０１０４】
また、アミノ酸配列上の変異または修飾により蛋白質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加するか、蛋白質の活性が増加した酵素蛋白質を含むことができる。
【０１０５】
また、前記酵素をコーディングする遺伝子は、機能的に均等なコドンまたは（コドンの縮退性によって）同一のアミノ酸をコーディングするコドン、または生物学的に均等なアミノ酸をコーディングするコドンを含む核酸分子を含むことができる。
【０１０６】
前記核酸分子は、標準分子生物学技術、例えば、化学的合成方法または組換え方法を利用して分離または製造するか、市販のものを使用することができる。
【０１０７】
用語「ラクテートデヒドロゲナーゼ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）」は、ピルビン酸とラクテートとの間の可逆的変換を触媒する酵素をいい、ラクテート合成経路において必須の役割を果たす。
【０１０８】
一具体例として、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ｌｄｈＡであってもよい。
【０１０９】
本願では、ラクテートが含まれない共重合体を生産するために、宿主細胞の代謝過程中、ラクテートの生産に関与するラクテートデヒドロゲナーゼの活性が内在的調節活性に比べて弱化または欠損することを特徴とする。
【０１１０】
内在的調節活性とは、宿主細胞が天然の状態で有している酵素の活性状態を意味するもので、例えば、大腸菌が天然的に有しているラクテート合成に関する活性を意味することができる。
【０１１１】
ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の欠損は、前記酵素をコーディングする遺伝子の一部または全部を欠失または置換したり、前記遺伝子の塩基配列内に特定の変異配列を挿入するなどの遺伝子操作によって行われる。
【０１１２】
また、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の弱化は、前記遺伝子のプロモーター部位または５'−ＵＴＲ部位など遺伝子の発現調節配列の塩基配列を変形させることによって酵素の発現を弱化させたり、当該遺伝子のオープンリーディングフレーム部位に変異を導入することによって酵素の活性を弱化させることができる。
【０１１３】
このような変異の導入は、当業界で知られた任意の方法、例えば、相同組換え、またはラムダレッド組換えシステム（ｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）によって行われる。
【０１１４】
本願で提供する微生物は、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を含んでおり、前記遺伝子が遺伝子組換え的方法で細胞内に導入されているものであってもよい。
【０１１５】
例えば、前記微生物は、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を組換えベクターで形質転換するか、前記遺伝子が染色体上に挿入されるように遺伝子操作されたものであってもよい。
【０１１６】
また、前記細胞は、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子のうちの１種をすでに含んでいてもよいし、残りの１種は組換えベクターで形質転換されるか、前記遺伝子が染色体上に挿入されるように遺伝子操作されたものであってもよい。
【０１１７】
例えば、前記微生物は、２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を含む細胞に、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子を形質転換して得られたものであってもよい。
【０１１８】
他の例として、前記微生物は、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子を含む細胞に、２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を形質転換して得られたものであってもよい。
【０１１９】
遺伝子組換え方法で前記４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体を生産する微生物を製造するか、前記微生物を用いて４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体を生産する過程は、次の段階を含むことができる。
【０１２０】
まず、２−ヒドロキシアルカノエートを２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換し、４−ヒドロキシアルカノエートを４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素をコーディングする遺伝子、および２−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡおよび４−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡを基質として用いるＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子のうちの１種以上をベクターに挿入して組換えベクターを製造する段階である。
【０１２１】
前記２種の遺伝子は、それぞれ別途のベクターに挿入されてもよく、１つのベクターに挿入されてもよい。
【０１２２】
用語「ベクター」は、個体の細胞内で目的蛋白質をコーディングする遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいい、目的蛋白質をコーディングする核酸配列を宿主細胞として導入するための手段となる。
【０１２３】
前記ベクターとしては、プラスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターなど多様な形態のベクターを使用することができる。
【０１２４】
組換えベクターは、クローニングベクターおよび発現ベクターを含む。
【０１２５】
クローニングベクターは、複製起点、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドの複製起点を含み、他のＤＮＡ切片が付着し、付着した切片が複製できるレプリコンである。
【０１２６】
発現ベクターは、蛋白質を合成するのに使用されるように開発された。
【０１２７】
本願において、ベクターは、原核細胞または真核細胞など各種宿主細胞で目的の酵素遺伝子を発現し、これを生産する機能をすれば特に限定はないが、ベクター内に挿入されて伝達された遺伝子が宿主細胞のゲノム内に不可逆的に融合して細胞内で遺伝子の発現を長期間安定的に持続させるベクターが好ましい。
【０１２８】
このようなベクターは、当該遺伝子が選択された宿主内で発現できるようにする転写および解読発現調節配列を含む。
【０１２９】
発現調節配列としては、転写を実施するためのプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列および／または転写および解読の終結を調節する配列を含むことができる。
【０１３０】
例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列および／またはリボソーム結合部位を含むことができる。
【０１３１】
真核細胞に適した調節配列は、プロモーター、ターミネーターおよび／またはポリアデニル化シグナルを含むことができる。
【０１３２】
開始コドンおよび終結コドンは、一般に目的蛋白質をコーディングする核酸配列の一部と見なされ、遺伝子作製物が投与された時、個体で作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）になければならない。
【０１３３】
ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性でもよい。
【０１３４】
また、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含むことができる。
【０１３５】
その他、エンハンサー、目的の遺伝子の５'末端および３'末端の非解読領域、選別マーカー（例えば、抗生剤耐性マーカー）、または複製可能単位などを適切に含んでもよい。
【０１３６】
ベクターは、自己複製するか、宿主ゲノムＤＮＡに統合される。
【０１３７】
有用な発現調節配列の例としては、アデノウイルスの初期および後期プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ロースサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコード蛋白質の調節領域、ホスホグリセレートキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＰＧＫ）または他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、ホスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモーターおよび原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られた構成と誘導のその他の配列およびこれらの様々な組み合わせを含むことができる。
【０１３８】
細胞において形質転換遺伝子の発現水準を高めるためには、目的の遺伝子と転写および解読発現調節配列が互いに作動可能に連結されなければならない。
【０１３９】
一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。
【０１４０】
例えば、前配列（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡが蛋白質の分泌に参加する前蛋白質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。
【０１４１】
これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われ、その部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いて行われる。
【０１４２】
当業者は、宿主細胞の性質、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力および当該ベクターによってコーディングされる他の蛋白質、例えば、抗生剤マーカーの発現などを考慮して、本発明に適した各種ベクター、発現調節配列、宿主などを選定することができる。
【０１４３】
次に、前記組換えベクターを用いて微生物を形質転換させる段階である。
【０１４４】
用語「形質転換」は、ＤＮＡを宿主に導入して、ＤＮＡが染色体外因子として、または染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する。
【０１４５】
本発明による組換えベクターで形質転換できる微生物は、原核細胞と真核細胞ともを含み、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常使用できる。
【０１４６】
具体例として、大腸菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を含むエスケリキア属、シュードモナス属、バシラス属、ストレプトミセス属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属、サルモネラ属、ブレビバクテリア属、ハイポモナス属、クロモバクテリウム属、ノカルディア属、真菌または酵母のような周知の真核および原核宿主などを例示することができるが、これらに制限されるわけではない。
【０１４７】
適当な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムと関係なく複製し機能できるか、または一部の場合にゲノム自体に統合される。
【０１４８】
また、本発明の目的上、前記宿主細胞は、炭素源からヒドロキシアシル−ＣｏＡを生合成する経路を有する微生物であってもよい。
【０１４９】
形質転換方法としては、当分野で公知のように好適な標準技術、例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム共沈法（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ）、陽イオンリポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、ポリエチレングリコール沈澱法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｕｐｔａｋｅ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）などを用いることができるが、これらに制限されるわけではない。
【０１５０】
この時、円形のベクターを適切な制限酵素で切断して線状のベクター形態で導入することができる。
【０１５１】
次に、前記形質転換された微生物を培養して、４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体を生産する段階である。
【０１５２】
前記組換えベクターが発現する形質転換体を培地で培養して、４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体を大量に製造、分離可能である。
【０１５３】
培地と培養条件は、形質転換細胞の種類によって慣用のものを適当に選択して用いることができる。
【０１５４】
培養時、細胞の生育と共重合体の大量生産に適合するように、温度、培地のｐＨおよび培養時間などの条件を適切に調節することができる。
【０１５５】
前記培養方法の例には、回分式、連続式および半回分式培養が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１５６】
一実現例として、前記培養は、２−ヒドロキシブチレートおよび／または４−ヒドロキシブチレートを含む培地で行われるものであってもよい。
【０１５７】
また、グルコースなどの炭素源から２−ヒドロキシブチレートおよび４−ヒドロキシブチレートを生合成できる微生物であれば、２−ヒドロキシブチレートおよび／または４−ヒドロキシブチレートを別途に添加しなくても前記共重合体を製造することができる。
【０１５８】
この他、培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。
【０１５９】
前記培地は、多様な炭素源、窒素源、リン源および微量元素成分を含むことができる。
【０１６０】
培地内の炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸を例示することができるが、これに制限されるわけではない。
【０１６１】
これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用可能である。
【０１６２】
培地内の窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを例示することができるが、これに制限されるわけではない。
【０１６３】
窒素源も、個別的にまたは混合物として使用可能である。
【０１６４】
培地内のリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム−含有塩を例示することができるが、これに制限されるわけではない。
【０１６５】
また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むか、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質を含むことができるが、これに制限されるわけではない。
【０１６６】
前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式によって回分式または連続式で添加されてもよい。
【０１６７】
また、必要に応じて、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で用いて培養物のｐＨを調節することができる。
【０１６８】
さらに、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。
【０１６９】
好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素−含有気体（例、空気）を注入することができ、培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であってもよい。
【０１７０】
培養は、所望する共重合体の生産量が最大に得られるまで続けられるとよい。
【０１７１】
次に、前記生産された４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体を回収する段階である。
【０１７２】
組換え微生物から生産された４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体は、当業界で広く知られている方法で細胞または培養培地から分離することができる。
【０１７３】
４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体の回収方法の例として、遠心分離、超音波破砕、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＧＣ）などの方法があるが、これらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１７４】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【０１７５】
ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【０１７６】
実施例１．４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体の製造用組換えベクターの製造
１−１．ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５４０組換えベクターの製造
プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）は、クロストリジウムプロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）の変異体を使用し、ＰＨＡ合成酵素遺伝子は、シュードモナス属ＭＢＥＬ６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来のＰＨＡ合成酵素の変異体を使用した。
【０１７７】
この時使用されたベクターはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）である。
【０１７８】
まず、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、シュードモナス属ＭＢＥＬ６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（配列番号３）に基づいて、プライマー［５'−ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＧ−３'（配列番号５）、５'−ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＴＡＣ−３'（配列番号６）］を作製し、前記抽出した全体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。
【０１７９】
得られたＰＣＲ産物を電気泳動して、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子に相当する１．７ｋｂの大きさの遺伝子切片を確認し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。
【０１８０】
ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素を発現させるために、ｐＳＹＬ１０５ベクター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９４，４４：１３３７−１３４７）でＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組換えベクターを製造した。
【０１８１】
ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥおよびｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモーターによって常時的に発現する。
【０１８２】
ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位がそれぞれ両端に１つずつのみ含まれているｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子切片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法でアミノ酸の変換なく除去し、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を添加するために、プライマー［５'−ａｔｇ  ｃｃｃ  ｇｇａ  ｇｃｃ  ｇｇｔ  ｔｃｇ  ａａ−３'（配列番号７）、５'−ＣＧＴ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＴＣ−３'（配列番号８）、５'−ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＧ−３'（配列番号９）、５−ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＴＡＣ３'（配列番号１０）、５'−ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＧＴＧ３'（配列番号１１）、５'−ａａｃ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｇａａ  ｃｃｔ  ｇｃａ  ｇｇ−３'（配列番号１２）］を用いてオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【０１８３】
ｐＲｅＣＡＢベクターをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで切断してＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６  ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）を除去した後、前記得られたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１−ＲｅＡＢ組換えベクターを製造した。
【０１８４】
ＳＣＬ（ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ）活性に影響を与えるアミノ酸位置３ケ所をアミノ酸配列の配列分析により探し、プライマー［５'−ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＡＣＣ−３'（配列番号１３）、５−ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  ＣＡＧ−３'（配列番号１４）、５'−ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＴＣ  Ａ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＣＧＣ−３'（配列番号１５）、５'−ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＧ−３'（配列番号１６）、５'−ａｔｃ  ａａｃ  ｃｔｃ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｇａｔ  ｇｃｇ  ａｔｇ  ｇｃｇ  ｃｃｇ  ａｃｃ−３'（配列番号１７）、５'−ｇｇｔ  ｃｇｇ  ｃｇｃ  ｃａｔ  ｃｇｃ  ａｔｃ  ｇｇｔ  ｃａｔ  ｇａｇ  ｇｔｔ  ｇａｔ−３'（配列番号１８）］を用いたＳＤＭ方法を利用して、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｑ４８１Ｍを含むｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体のｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９  ３００を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢを製造した。
【０１８５】
これにプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼが共に発現するオペロン形態の常時的発現するシステムを構築するために、クロストリジウムプロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）を使用した。
【０１８６】
ＣＰ−ＰＣＴは、クロストリジウムプロピオニカムの染色体ＤＮＡをプライマー［５'−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＴＧＡ−３'（配列番号１９）、５'−ｇｃ  ｔｃｔａｇａ  ｔｔａ  ｇｇａ  ｃｔｔ  ｃａｔ  ｔｔｃ  ｃｔｔ  ｃａｇ  ａｃｃ  ｃａｔ  ｔａａ  ｇｃｃ  ｔｔｃ  ｔｇ−３'（配列番号２０）］を用いてＰＣＲして得られた断片を使用した。
【０１８７】
この時、元々野生型ＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ  ｓｉｔｅをｃｌｏｎｉｎｇの容易性のためにＳＤＭ方法を利用して除去し、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、プライマー［５'−ａｇｇ  ｃｃｔ  ｇｃａ  ｇｇｃ  ｇｇａ  ｔａａ  ｃａａ  ｔｔｔ  ｃａｃ  ａｃａ  ｇｇ−３'（配列番号２１）、５'−ｇｃｃ  ｃａｔ  ａｔｇ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｔｔａ  ｇｇａ  ｃｔｔ  ｃａｔ  ｔｔｃ  ｃ−３'（配列番号２２）］を用いてオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【０１８８】
ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＲｅＡＢベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断してＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６由来の単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥおよびｐｈａＢＲＥ）を除去した後、前記ＰＣＲクローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを製造した。
【０１８９】
次に、ＣＰ−ＰＣＴ遺伝子にランダム突然変異（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を導入するために、前記作製されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴを鋳型とし、プライマー［５'−ＣＧＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧ−３'（配列番号２３）、５'−ＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣ−３'（配列番号２４）］を用いてＭｎ２＋が添加され、ｄＮＴＰｓの濃度差が存在する条件でＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを実施した。
【０１９０】
その後、ランダム突然変異が含まれているＰＣＲ断片を増幅するために、前記プライマーを用いて一般の条件でＰＣＲした。
【０１９１】
ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断して野生型ＣＰ−ＰＣＴを除去した後、前記増幅された突然変異ＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入させたｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを作り、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入して〜１０５程度の規模のＣＰ−ＰＣＴライブラリーを作製した。
【０１９２】
前記作製されたＣＰ−ＰＣＴライブラリーは、高分子検出培地（ＬＢ  ａｇａｒ、ｇｌｕｃｏｓｅ２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ１ｇ／Ｌ、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ０．５μｇ／ｍｌ）で３日間生育させた後、高分子生成の有無を確認するスクリーニング作業を行って、〜８０余りの個体の候補を１次選定した。
【０１９３】
これらの候補を高分子が生成される条件で４日間液体培養（ＬＢ  ａｇａｒ、ｇｌｕｃｏｓｅ２０ｇ／Ｌ、３ＨＢ１ｇ／Ｌ、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ１００ｍｇ／Ｌ、３７℃）し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）分析により２個体、つまり、ＣＰ−ＰＣＴ  Ｖａｒｉａｎｔ５１２（核酸置換Ａ１２００Ｇを含む）およびＣＰ−ＰＣＴ  Ｖａｒｉａｎｔ５２２（核酸置換Ｔ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ、Ｔ１１５８Ｃを含む）を選定した。
【０１９４】
前記１次選別された突然変異体（ＣＰ−ＰＣＴ  Ｖａｒｉａｎｔ５１２、ＣＰ−ＰＣＴ  Ｖａｒｉａｎｔ５２２）を基本として再び前記Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲの方法でランダム突然変異を行って多様なＣＰ−ＰＣＴ変異体を得ることができ、そのうち、ＣＰ−ＰＣＴ  Ｖａｒｉａｎｔ５４０（Ｖａｌ１９３Ａｌａおよび沈黙突然変異Ｔ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ、Ｔ１１５８Ｃを含む）を２次選別してｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ５４０ベクターを製造した。
【０１９５】
また、前記製造したｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９  ３００）に基づいてプライマー［５'−ｇａａ  ｔｔｃ  ｇｔｇ  ｃｔｇ  ｔｃｇ  ａｇｃ  ｃｇｃ  ｇｇｇ  ｃａｔ  ａｔｃ−３'（配列番号２５）、５'−ｇａｔ  ａｔｇ  ｃｃｃ  ｇｃｇ  ｇｃｔ  ｃｇａ  ｃａｇ  ｃａｃ  ｇａａ  ｔｔｃ−３'（配列番号２６）、５'−ｇｇｇ  ｃａｔ  ａｔｃ  ａａｇ  ａｇｃ  ａｔｃ  ｃｔｇ  ａａｃ  ｃｃｇ  ｃ−３'（配列番号２７）、５'−ｇ  ｃｇｇ  ｇｔｔ  ｃａｇ  ｇａｔ  ｇｃｔ  ｃｔｔ  ｇａｔ  ａｔｇ  ｃｃｃ−３'（配列番号２８）］を用いたＳＤＭ方法を利用して、Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７ＦおよびＱ４８１Ｋが変異したアミノ酸配列を有するシュードモナス属ＭＢＥＬ６−１９由来のＰＨＡ合成酵素変異体（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３１０）を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５４０ベクターを製造した（図１）。
【０１９６】
１−２．ｐＰｓ６１９Ｃ１２４９．１８Ｈ−ＣＰＰＣＴ５４０組換えベクターの製造
前記１−１で製造したｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５４０ベクターを鋳型とし、プライマー［５'−ＡＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＴＴＣＧＡＡ−３'（配列番号２９）および５'−ＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧ−３'（配列番号３０）］を用いてｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った。
【０１９７】
ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った後、突然変異が含まれているＰＣＲ断片を増幅するために、前記プライマーを用いて再びＰＣＲした後、増幅された突然変異をｐＰｓ６１９Ｃ１３１０−ＣＰＰＣＴ５４０ベクターのＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ位置に挿入して、変異体に対するライブラリーを作製した。
【０１９８】
作製された変異体ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１Ｂｌｕｅに形質転換させ、これをＰＨＢ検出培地（ＬＢ  ａｇａｒ、ｇｌｕｃｏｓｅ２０ｇ／Ｌ、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ０．５μｇ／ｍｌ）で３日間培養した。
【０１９９】
培養後、スクリーニング過程により最終的に選別された変異体は、Ｌ１８Ｈ、Ｖ２４Ａ、Ｋ９１Ｒ、Ｍ１２８Ｖ、Ｅ１３０Ｄ、Ｎ２４６Ｓ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１ＫおよびＡ５２７Ｓが変異したアミノ酸配列を有するｐＰｓ６１９Ｃ１２４９．１８Ｈであった。
【０２００】
このようにして組換えベクターｐＰｓ６１９Ｃ１２４９．１８Ｈ−ＣＰＰＣＴ５４０ベクターを製造した（図２）。
【０２０１】
実施例２．ｌｄｈＡ遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されたＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ変異体の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に基づいてラクテートが含まれない重合体を生産するために、大腸菌の代謝過程中、ラクテートの生産に関与するＤ−ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬｄｈＡ）をｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡでｋｎｏｕｋ−ｏｕｔさせた。
【０２０２】
遺伝子の欠失は、業界でよく知られているｒｅｄ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ方法を利用した。
【０２０３】
ｌｄｈＡを欠失させるために使用されたオリゴマーは、配列番号３１（５'−ａｔｃａｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇａｔｇｃｔａａｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｇａｃｃｇｇｃｔｔｔａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇ−３'）および配列番号３２（５'−ａｔｃａｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇａｔｇｃｔａａｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｇａｃｃｇｇｃｔｔｔａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇ−３'）の塩基配列で合成した。
【０２０４】
実施例３．４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体の製造
実施例１で作製された組換えベクターを、実施例２で作製されたｌｄｈＡがｋｎｏｃｋ−ｏｕｔされたＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢｌｕｅΔｌｄｈＡに電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して形質転換させることによって、組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢｌｕｅΔｌｄｈＡを作製した。
【０２０５】
これを用いて前記三重合体を製造するために、フラスコ培養を行った。
【０２０６】
まず、前培養（ｓｅｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のために、前記組換え大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）と２０ｍｇ／Ｌカナマイシンが含有されている３ｍＬのＬＢ培地［ＢａｃｔｏＴＭ  Ｔｒｉｐｔｏｎｅ（ＢＤ）１０ｇ／Ｌ、ＢａｃｔｏＴＭ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ）５ｇ／Ｌ、ＮａＣＬ（ａｍｒｅｓｃｏ）１０ｇ／Ｌ］で１２時間培養した。
【０２０７】
本培養のために、前培養液１ｍｌを１ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）、１ｇ／Ｌの２−ヒドロキシブチレート（２−ＨＢ）、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、２０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、１０ｍｇ／Ｌのｔｈｉａｍｉｎｅが追加的に含有されている１００ｍｌのＭＲ培地（１ＬあたりＧｌｕｃｏｓｅ１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．８ｇ、ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ０．８ｇ、およびｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ５ｍＬ；ここで、Ｔｒａｃｅ  ｍｅｔａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎは、１Ｌあたり５Ｍ  ＨＣｌ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１０ｇ、ＣａＣｌ２  ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ１ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ０．１ｇ、およびＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ０．０２ｇ）に接種して、３０℃で３日間、２５０ｒｐｍで撹拌して培養した。
【０２０８】
前記培養液を４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で２回洗った後、８０℃で１２時間乾燥した。
【０２０９】
除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として用いて、硫酸触媒下でメタノールと反応させた。
【０２１０】
これを常温でクロロホルムの半分に相当する体積の蒸留水を添加して混合した後、２つの層に分離されるまで静置させた。
【０２１１】
２つの層のうちメチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取して、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で高分子の成分を分析した。
【０２１２】
内部標準物質としてはベンゾエート（ｂｅｎｚｏａｔｅ）を使用した。
【０２１３】
この時使用されたＧＣ分析条件は、下記表１の通りである。
【０２１４】
ＧＣ分析の結果は、表２と図３に示すように、組換え大腸菌によって４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体が生成されたことを確認することができた。
【０２１５】
【表１】
2019500437.tif 000003
【０２１６】
【表２】
2019500437.tif 000004
【０２１７】
実施例４．４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体における各モノマーのモル比率に応じた物性の分析
実施例３に記載した方法において、本培養培地内の４−ヒドロキシブチレートおよび２−ヒドロキシブチレートの濃度を０〜３ｇ／Ｌに変化させ、４−ヒドロキシブチレート−２−ヒドロキシブチレート共重合体の生産のための培養を行った。
【０２１８】
培養後、高分子精製のために遠心分離を利用して培養液から細胞のみを回収した後、蒸留水を用いて２回洗浄段階を経て凍結乾燥を行った。
【０２１９】
次に、凍結乾燥した細胞にクロロホルムを高分子濃度基準で約３０ｇ／Ｌとなるように添加した後、磁石撹拌機（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｒｒｅｒ）を用いて撹拌しながら、常温で２４時間高分子を抽出した。
【０２２０】
その後、クロロホルム、蒸留水、メタノールの比率が２：１：１となるように添加して混合し、常温で層分離を誘導した後、分別漏斗を用いて下層の高分子抽出液を分離させた。
【０２２１】
そして、ろ過紙を用いて細胞残留物から分離ろ過した。
【０２２２】
次に、蒸発（ｅｖａｐｏｔａｔｉｏｎ）によりろ過した高分子溶液からクロロホルムを微量だけ残してすべて除去した後、メタノールを添加して高分子を沈殿させた。
【０２２３】
沈殿した高分子を遠心分離して回収した後、最終的にドライオーブン（７５℃）で乾燥させた。
【０２２４】
高分子内のモノマーのモル比率は、実施例３に記載したＧＣ分析により確認した（表３）。下記表３で、高分子含有量（ｗｔ％）は、細胞乾燥重量（ｄｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ）対比のＰＨＡ高分子含有量を示すものである。
【０２２５】
【表３】
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【０２２６】
前記サンプルのうちいくつかだけを精製して物性をみると、２ＨＢと４ＨＢモノマーのモル比率がそれぞれ３０％以上の時、バイオ接着剤として使用できる程度の適切な粘着特性を示し、常温で液体として存在することを確認することができた（図４）。
【０２２７】
また、モノマーのモル比率に応じた高分子の熱的物性を知るために、示差走査熱量計（ＤＳＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）分析を実施した。
【０２２８】
ＤＳＣ測定時、昇温を２回行い、２回目の昇温区間でガラス転移温度（Ｔｇ）および溶融温度（Ｔｍ）を測定した。
【０２２９】
昇温時、初期温度は−６０℃であり、温度上昇速度は１０℃／ｍｉｎであり、最終温度は２００℃とした。
【０２３０】
ＤＳＣ分析のためのｃａｒｒｉｅｒ  ｇａｓとして窒素を使用した。
【０２３１】
ＤＳＣ分析の結果、２ＨＢと４ＨＢそれぞれのホモポリマー（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）の場合、結晶化（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）が観察されたが、２ＨＢと４ＨＢの共重合体の場合、結晶化が観察されず、無定形（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ）形態の高分子であることが分かった。
【０２３２】
さらに、２ＨＢと４ＨＢの共重合体では、溶融温度（Ｔｍ）も現れておらず、２ＨＢのモル比率が増加するに伴ってガラス転移温度（Ｔｇ）が増加することを確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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