(57)【要約】本開示は、一本鎖標的ＲＮＡを検出するための方法を提供する。本開示は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡへの切断方法を提供する。本開示は、試料中の標的ＲＮＡを検出するためのキットを提供する。
2019522472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＲＮＡを含む試料における一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、
（ｉ）前記一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｉ）前記試料中に存在するＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、
ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
複数のＲＮＡを含む試料における一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、
（ｉ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、及び
（ｉｉ）前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断し、前記試料のＲＮＡをも切断する、Ｃ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、
ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定すること、
を含む、方法。
【請求項３】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１時間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の４０分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の５分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１分間内に、前記試料中に存在する５０％から９０％を超えるＲＮＡを切断する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記一本鎖標的ＲＮＡを検出することができる最小濃度は、５００ｆＭ〜１ｎＭの範囲である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記一本鎖標的ＲＮＡを、８００ｆＭの低い濃度で検出することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも少なくとも１．２倍効率的に非標的ＲＮＡを切断する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているアミノ酸配列を含むＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも少なくとも１．５倍効率的に非標的ＲＮＡを切断する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１、２、または４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１に記述されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜２及び４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の１つ以上の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を２時間以下接触させる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を６０分以下接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を３０分以下接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を１０分以下接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を１分以下接触させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的ＲＮＡの量を決定することは、
前記検出可能なシグナルを測定して、試験測定を生成すること、
基準試料によって生じる検出可能なシグナルを測定して、基準測定を生成すること、及び
前記試験測定を前記基準測定と比較して、前記試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定すること、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出可能なシグナルを測定して、試験測定を生成すること、
各々異なる量の陽性対照ＲＮＡを含む２つ以上の基準試料の各々によって生じる検出可能なシグナルを測定して２つ以上の基準測定を生成すること、及び
前記試験測定を前記２つ以上の基準測定と比較して、前記試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定すること、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は、配列において互いに異なる５〜１０7 のＲＮＡを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料は、配列において互いに異なる１０〜１０6 のＲＮＡを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料は、細胞溶解物由来のＲＮＡを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能なシグナルを測定することは、金ナノ粒子に基づく検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、及び半導体に基づく感知の１つ以上を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
（ｉ）前記試料を、蛍光−発光染料対を含む標識された検出ＲＮＡと接触させることを含み、（ｉｉ）前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、前記標識された検出ＲＮＡを切断し、（ｉｉｉ）前記検出可能なシグナルは、前記蛍光−発光染料対によって生じる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識された検出ＲＮＡは、切断される前にある量の検出可能なシグナルを生じ、前記検出可能なシグナルの量は、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに低減する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標識された検出ＲＮＡは、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生じ、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに第２の検出可能なシグナルを生じる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記標識された検出ＲＮＡは、蛍光−発光染料対を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記標識された検出ＲＮＡは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
検出可能なシグナルは、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに生じる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
検出可能なシグナルの量は、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに増加する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記標識された検出ＲＮＡは、消光剤／蛍光体対を含む、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標識された検出ＲＮＡは、修飾された核酸塩基、修飾された糖部分、及び／または修飾された核酸結合を含む、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記接触させることを、無細胞試料において実施する、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触させることを、インビトロ、エクスビボ、またはインビトロで細胞内において実施する、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断する方法であって、
各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを、Ｃ２ｃ２タンパク質と接触させることとし、前記Ｃ２ｃ２タンパク質は前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断することを含む、方法。
【請求項４５】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠くか、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、同一の標的ＲＮＡ分子内の異なる標的配列を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的ＲＮＡ分子を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
接触させることが、細胞内で起こらない、請求項４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの少なくとも１つが、検出可能に標識されている、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
複数のＲＮＡを含む試料における標的ＲＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸であって、前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、各々が異なるガイド配列及び／または選択されたガイド配列のための挿入部位を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、ならびに
（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質を含む、キット。
【請求項５１】
前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠くか、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、同一の標的ＲＮＡ分子内の異なる標的配列を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、請求項５０または請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的ＲＮＡ分子を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの少なくとも１つが、検出可能に標識されている、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５５】
蛍光−発光染料対を含む標識された検出ＲＮＡをさらに含む、請求項５０〜５４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５６】
複数のＲＮＡを含む試料における標的ＲＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）蛍光−発光染料対を含む標識された検出ＲＮＡ、及び
（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質を含む、キット。
【請求項５７】
陽性対照標的ＲＮＡを含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記陽性対照標的ＲＮＡは、２つ以上の容器各々に異なる量で存在する、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
（ｃ）Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、
（ｄ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び
（ｅ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸であって、前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、各々が異なるガイド配列及び／または選択されたガイド配列のための挿入部位を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、
の少なくとも１つを含む、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６０】
ガイド配列を含むか、または含まず、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む、請求項５６〜５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６１】
前記ＤＮＡは、ガイド配列の挿入のための挿入配列を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記ＤＮＡは発現ベクターであり、前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡが作動可能にプロモーターに連結されている、請求項６０または請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記プロモーターはＴ７プロモーターである、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
ヌクレアーゼ活性を欠くＣ２ｃ２エンドリボヌクレアーゼバリアントを含む、請求項５６〜６３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６５】
前記標識された検出ＲＮＡはＦＲＥＴ対を含む、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
前記標識された検出ＲＮＡは消光剤／蛍光体対を含む、請求項５６〜６５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６７】
前記標識された検出ＲＮＡは、第１の検出可能なシグナルを生じるＦＲＥＴ対、及び第２の検出可能なシグナルを生じる消光剤／蛍光体対を含む、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６８】
ａ）配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列、
ｂ）配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４４５及びＨ４５０、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０１６及びＨ１０２１、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列、
ｃ）配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４６４及びＨ４６９、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０５２及びＨ１０５７、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列、
ｄ）配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４６７及びＨ４７２、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０６９及びＨ１０７４、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列、または
ｅ）配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０４４及びＨ１０４９、ｉｉｉ）もしくはアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列、
を含む、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチド。
【請求項６９】
前記バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、ｓｓＲＮＡの低減したかまたは検出不能の切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する、請求項６８に記載のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチド。
【請求項７０】
請求項６８または６９に記載のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項７１】
前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターまたは調整可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項７０に記載の核酸。
【請求項７２】
請求項７０または７１に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項７３】
請求項７０もしくは７１に記載の核酸または請求項７２に記載の組換え発現ベクターによって遺伝的に改変された宿主細胞。
【請求項７４】
前記宿主細胞は真核生物細胞である、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記宿主細胞は原核生物細胞である、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
前記宿主細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボである、請求項７３〜７５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
複数のＲＮＡを含む試料における少なくとも２つの異なる一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、
（ｉ）少なくとも１つのＡを含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を切断する第１のＣ２ｃ２タンパク質、
（ｉｉ）少なくとも１つのＵを含むｓｓＲＮＡを切断する第２のＣ２ｃ２タンパク質、
（ｉｉｉ）第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｖ）第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ
と接触させることであって、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、少なくとも１つのＡを含むｓｓＲＮＡを切断し、
前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、少なくとも１つのＵを含むｓｓＲＮＡを切断すること、ならびに
ｂ）前記第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質によって媒介されるＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することであって、第１の検出可能なシグナルは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質の活性化の際に生じ、第２の検出可能なシグナルは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質の活性化の際に生じ、前記第１の検出可能なシグナルの検出は、第１の標的ｓｓＲＮＡの前記試料中の存在を示し、前記第２の検出可能なシグナルの検出は、第２の標的ｓｓＲＮＡの前記試料中の存在を示すこと、
を含む、方法。
【請求項７８】
ａ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｂ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｃ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｄ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｅ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｆ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｇ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｈ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｉ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｊ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｋ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｌ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｍ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｎ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｏ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｐ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｑ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｒ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｓ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｔ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｕ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｖ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または
ｗ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記試料を、
ｉ）第１の蛍光−発光染料対を含む第１の標識された検出ＲＮＡであって、前記第１の標識された検出ＲＮＡは少なくとも１つのＡを含み、Ｕを含まない、前記第１の標識された検出ＲＮＡ、及び
ｉｉ）第２の蛍光−発光染料対を含む第２の標識された検出ＲＮＡであって、前記第２の標識された検出ＲＮＡは少なくとも１つのＵを含み、Ａを含まない、前記第２の標識された検出ＲＮＡ、
と接触させることを含み、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１の標識された検出ＲＮＡを切断し、前記第１の検出可能なシグナルは前記第１の蛍光−発光染料対によって生じ、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２の標識された検出ＲＮＡを切断し、前記第２の検出可能なシグナルは前記第２の蛍光−発光染料対によって生じる、請求項７７または請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の標識された検出ＲＮＡは、２〜１５の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、２〜１５の連続的なＵの区間を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の標識された検出ＲＮＡは、４〜１５の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、４〜１５の連続的なＵの区間を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも３の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも３の連続的なＵの区間を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも４の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも４の連続的なＵの区間を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
（ａ）Ｕを欠き、少なくとも１つのＡを含み、第１の蛍光−発光染料対を含む、第１の標識された検出ＲＮＡ、
（ｂ）Ａを欠き、少なくとも１つのＵを含み、第２の蛍光−発光染料対を含む、第２の標識された検出ＲＮＡ、
（ｃ）第１のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸であって、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１の標識された検出ＲＮＡを切断することができるが、前記第２の標識された検出ＲＮＡを切断することができない、第１のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸、ならびに
（ｄ）第２のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第２のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸であって、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２の標識された検出ＲＮＡを切断することができるが、前記第１の標識された検出ＲＮＡを切断することができない、第２のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第２のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸
を含む、キット。
【請求項８５】
（ｅ）第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、
（ｆ）第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、
（ｇ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸、ならびに
（ｈ）前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸
の少なくとも１つを含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８７】
第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８８】
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸を含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項８９】
前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸を含む、請求項８４に記載のキット。
【請求項９０】
前記核酸は発現ベクターであり、前記ヌクレオチド配列が作動可能にプロモーターに連結されている、請求項８６〜８９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細菌の適応免疫系は、ＲＮＡに誘導される核酸の切断のために、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いる。概してＤＮＡ基質を標的とするが、ＩＩＩ型及びＶＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）基質に対して干渉複合体を誘導する。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、単一のサブユニットであるＣ２ｃ２タンパク質は、ＲＮＡに誘導されるＲＮＡエンドヌクレアーゼとして作用する。
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＲＮＡに誘導される核酸干渉を介して、細菌と古細菌に適応免疫を与える。多様なＣＲＩＳＰＲの型の中で、比較的稀なＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのみが、排他的に標的一本鎖ＲＮＡ基質を標的とし、活性は、大きなエフェクタータンパク質であるＣ２ｃ２によって与えられると考えられている。ＶＩ型オペロンは、短いウイルスＤＮＡセグメントの保存場所としての役割を果たすＣＲＩＳＰＲ配列アレイを含む、他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓのゲノム座位と共通の特徴を共有する。抗ウイルス免疫を提供するために、加工されたＣＲＩＳＰＲアレイ転写物（ｃｒＲＮＡ）は、スペーサーとして知られるウイルスに由来するｃｒＲＮＡのセグメントに相補的な配列を有する核酸を認識する、Ｃａｓタンパク質含有サーベイランス複合体と共に組み立てられる。
【０００３】
免疫サーベイランスの第１のステップは、ウイルスのスペーサー配列に隣接するリピート配列からなる前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）の、各々が単一のウイルス由来の配列セグメントを含む個別の機能的なｃｒＲＮＡへの加工を必要とする。ＣＲＩＳＰＲシステムは、成熟ｃｒＲＮＡを産生するために、特化したエンドヌクレアーゼの使用（例えば、Ｉ型及びＩＩＩ型システムにおけるＣａｓ６またはＣａｓ５ｄ）、宿主エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ）のトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ＩＩ型システム）とのカップリング、または、エフェクター酵素それ自体に内在的なリボヌクレアーゼ活性（例えば、Ｖ型システムからのＣｐｆ１）を含む、様々なメカニズムを用いる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、一本鎖標的ＲＮＡを検出するための方法を提供する。本開示は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡへの切断方法を提供する。本開示は、試料中の標的ＲＮＡを検出するためのキットを提供する。
【０００５】
一本鎖標的ＲＮＡを検出するための組成物及び方法であって、（ｉ）複数のＲＮＡを有する試料を、（ａ）一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）試料のＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに（ｉｉ）切断によって生じる検出可能なシグナルを測定すること、を含む方法が提供される。ガイドＲＮＡがハイブリダイズする一本鎖標的ＲＮＡを試料が含む（すなわち、試料が標的とされた一本鎖標的ＲＮＡを含む）ときに起こるように、対象のＣ２ｃ２タンパク質がＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されると、Ｃ２ｃ２タンパク質は、試料のＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼになる。したがって、標的とされた一本鎖標的ＲＮＡが試料中に存在するとき（例えば、いくつかの場合において、閾値量を超えて）、結果は、試料中のＲＮＡの切断であり、これは、任意の都合が良い検出方法（例えば、標識された検出ＲＮＡを用いて）によって検出することができる。
【０００６】
いくつかの場合において、２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを、Ｃ２ｃ２タンパク質によって個別のガイドＲＮＡに切断することができる前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを用いることによって提供することができ、これは、Ｃ２ｃ２タンパク質が無傷のＨＥＰＮ１及び／またはＨＥＰＮ２ドメインを有するか否かとは独立している。したがって、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡへの切断方法もまた提供される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】内在性Ｃ２ｃ２座位、ならびに、組換えＣ２ｃ２タンパク質の異種性発現及び精製を示す実験に関連する概略図を提示する。
【図１−２】内在性Ｃ２ｃ２座位、ならびに、組換えＣ２ｃ２タンパク質の異種性発現及び精製を示す実験に関連する概略図を提示する。
【図２】Ｃ２ｃ２タンパク質を用いて実施された切断アッセイの結果を描写する。
【図３】Ｃ２ｃ２が、一本鎖ＲＮＡを確実に切断することを示す結果を描写する。
【図４】Ｃ２ｃ２タンパク質を用いる様々な切断アッセイからの略図及び結果を提示する。
【図５】Ｃ２ｃ２タンパク質によるＲＮＡ切断を検出するための、標的化された検出ＲＮＡ（消光剤／蛍光体の対を用いる）を用いて実施される実験からの結果を描写する。
【図６】Ｃ２ｃ２タンパク質によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの加工を実証する実験からの結果を描写する。
【図７】Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの概略図及び配列を描写する。
【図８Ａ】Ｃ２ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）を提示する。
【図８Ｂ】Ｃ２ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を提示する。
【図８Ｃ】Ｃ２ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３）を提示する。
【図８Ｄ】Ｃ２ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）を提示する。
【図８Ｅ】Ｃ２ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）を提示する。
【図８Ｆ】Ｃ２ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号６）を提示する。
【図９】成熟ｃｒＲＮＡを産生するための、前駆体ｃｒＲＮＡ転写物のＣ２ｃ２ファミリーによる加工を描写する。
【図１０】ＬｂｕＣ２ｃ２に媒介されるｃｒＲＮＡの生合成に対する、ＣＲＩＳＰＲリピートの構造及び配列の影響を描写する。
【図１１】ＬｂｕＣ２ｃ２による、シス及びトランスの標的のガイド依存性ｓｓＲＮＡ分解を描写する。
【図１２】ＬｂｕＣ２ｃ２の２つの異なるリボヌクレアーゼ活性を描写する。
【図１３】複雑な混合物中の転写物のＣ２ｃ２媒介性の高感度の視覚的検出を描写する。
【図１４】実施例８〜１２に記載され、及び図１２Ａ〜１２Ｄにおいて示される、試験において使用される様々なＤＮＡ基質を提示する表２である。
【図１５】実施例８〜１２に記載される試験において使用される様々なＲＮＡ基質を提示する表３である。
【図１６】Ｃ２ｃ２によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工が、スペーサー配列とは独立し、タンデムｃｒＲＮＡアレイにおいて起こり得、ｐｒｅ−ｃＲＮＡの５’及び／または３’隣接領域における変異によって影響を受け、そして金属とは独立していることを示すデータを描写する。
【図１７】ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性に対する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの二重変異の影響の要約を提示する。
【図１８】ＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的の切断部位のマッピングを描写する。
【図１９】標的ＲＮＡ切断効率に対する、ｃｒＲＮＡスペーサーの長さ、反応温度、及びｃｒＲＮＡの５’末端配列の依存性を描写する。
【図２０】成熟ｃｒＲＮＡ及び標的ｓｓＲＮＡに対するＬｂｕＣ２ｃ２の結合データを描写する。
【図２１】ＲＮａｓｅ検出アッセイのλ２−ｓｓＲＮＡの経時変化を描写する。
【図２２】Ｃ２ｃ２ファミリーの系統樹及びＣ２ｃ２アラインメントを描写する。
【図２３】Ｃ２ｃ２の精製及び産生を描写する。
【図２４】Ｃ２ｃ２タンパク質が前駆体ｃｒＲＮＡ転写物を加工して、成熟ｃｒＲＮＡを生じることを示すデータを描写する。Ａは、Ｃ２ｃ２タンパク質の最尤系統樹であり、この試験において使用される相同体は、黄色で強調される。Ｂは、この試験において使用される３つのＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位の略図であって、黒い長方形はリピート要素を表し、黄色い菱形はスペーサー配列を表し、Ｃａｓ１とＣａｓ２のみが、ＬｓｈＣ２ｃ２のゲノム近辺において見出される。Ｃは、ＬｂｕＣ２ｃ２、ＬｓｅＣ２ｃ２、及びＬｓｈＣ２ｃ２  ＣＲＩＳＰＲのリピート座位に由来する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのＣ２ｃ２媒介性切断を示す。ＯＨ：アルカリ加水分解ラダー、Ｔ１：ＲＮａｓｅ  Ｔ１加水分解ラダーであり、切断反応の加工は、１００ｎＭＣ２ｃ２及び１ｎＭ未満のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡで実施された。切断の概略図は右側に描写され、予測されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの二次構造は下方に示され、矢印は、マッピングされたＣ２ｃ２切断部位を示す。
【図２５】ＬｂｕＣ２ｃ２媒介性ｃｒＲＮＡ生合成が、ＣＲＩＳＰＲリピートの構造と配列の両方に依存することを示すデータを描写する。Ａは、ヘアピンのステム及びループ領域内の構造的変異を含むｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに対する、ＬｂｕＣ２ｃ２による代表的な切断アッセイを示す。下方に列挙される加工されたパーセンテージは、６０分で定量される（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。Ｂは、ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の依存性を示す棒グラフである。野生型リピート配列は、下方に示され、個別の棒は、赤で示されるようなタンデムヌクレオチド変異を表す。切断部位はイラストのハサミによって示される。加工されたパーセンテージは、６０分後に測定された（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。試験された変異の図示されるヘアピンは、拡張データの図３−４に見出すことができる。Ｃは、ｃｒＲＮＡ加工反応の二価の金属イオン依存性が、標準的な反応条件への１０〜５０ｍＭのＥＤＴＡ及びＥＧＴＡの添加によって試験されたことを示す。
【図２６】ＬｂｕＣ２ｃ２が２つの異なるリボヌクレアーゼ活性を含むことを示すデータを描写する。Ａは、３７°Ｃにおける、シスｓｓＲＮＡ標的（黒色）及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（ティール色）のＬｂｕＣ２ｃ２による切断の定量化された経時変化のデータを示す。指数関数の適合を、実線として示し（ｎ＝３）、計算された擬一次速度定数（ｋobs ）（平均±ｓ．ｄ．）は、シスｓｓＲＮＡ標的とｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの切断について、それぞれ、９．７４±１．１５分-1と０．１２±０．０２分-1である。Ｂは、ＨＥＰＮモチーフと加工欠損点変異の場所を描写するＬｂｕＣ２ｃ２の構造を示す。Ｃ及びＤは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のためのｓｓＲＮＡ標的及びＬｂｕＣ２ｃ２変異体のリボヌクレアーゼ活性を示す。
【図２７】Ｃ２ｃ２が複雑な混合物中で転写物の高感度の検出を提供することを示す。Ａは、消光された蛍光ＲＮＡレポーターを用いるＬｂｕＣ２ｃ２のＲＮＡの検出アプローチのイラスト図である。Ｂは、ヒト全ＲＮＡの存在下で様々な濃度の標的ＲＮＡに対して、ＬｂｕＣ２ｃ２によって３０分後に産生される蛍光シグナルの定量を示し、ＲＮａｓｅ  Ａは、陽性ＲＮＡ分解対照として示される（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。Ｃは、様々な量のヒト全ＲＮＡまたは細菌全ＲＮＡ（βアクチンがゼロである陰性対照として）に対して、βアクチン標的化ｃｒＲＮＡと共にロードされたＬｂｕＣ２ｃ２によって３時間後に産生される蛍光シグナルの定量を示す（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。Ｄは、タンデムｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工がまたＲＮＡ検出を可能にすることを示す（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。Ｅは、Ｃ２ｃ２のリボヌクレアーゼ活性の両方を強調する、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ経路のモデルを示す。
【図２８】Ｃ２ｃ２ファミリーの完全な系統樹及びＣ２ｃ２アラインメントを描写する。Ａは、Ｃ２ｃ２タンパク質の最尤の系統学的な再構成を示す。葉は起源のＧＩタンパク質ナンバーと起源の生物を含み、１００のリサンプリングのうちのブートストラップサポート値は、内部分岐に提示される。スケールは位置ごとに置き換えられる。Ｂは、３つの分析されたＣ２ｃ２相同体の多重配列アラインメントを示し、整合はＬｂｕＣ２ｃ２に基づく。
【図２９】Ｃ２ｃ２の精製及び産生に関連するデータを描写する。全てのＣ２ｃ２相同体は、Ｈｉｓ−ＭＢＰ融合としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現され、アフィニティ、イオン交換、及びサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって精製された。Ｎｉ+ アフィニティタグは、ＴＥＶプロテアーゼとのインキュベーションによって除去された。Ａ及びＢは、クロマトグラフィー画分の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｃは、Ｃ２ｃ２が単一ピークとして溶離し、核酸を含んでいないことを実証するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１６／６０）カラムのクロマトグラムを示す。Ｄは、この原稿において使用される精製されたタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を示す。
【図３０】インビトロ及びインビボでＣ２ｃ２によって加工されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのマッピングを描写する。Ａは、単一の同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイのＬｓｅＣ２ｃ２及びＬｓｈＣｃ２ｃ２による切断の切断部位マッピングを示す。ＯＨ：アルカリ加水分解ラダー、Ｔ１：Ｔ１  ＲＮａｓｅ加水分解ラダーである。切断反応は、１００ｎＭのＣ２ｃ２及び１ｎＭ未満のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡで実施された。Ｂ〜Ｉは、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．による、ＬｓｈＣ２ｃ２（Ｂ〜Ｆ）及びＬｓｅＣ２ｃ２（Ｇ〜Ｉ）のＣＲＩＳＰＲアレイＲＮＡシークエンシング実験の再解析（それぞれ図Ｓ７及び図５）を示す。全てのデータ読み取り（Ｂ、Ｇ）及びフィルタリングされたデータ読み取り（５５ｎｔ未満、オリジナルのＳｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．の分析と同様で、Ｃ、Ｈは、Ｂｏｗｔｉｅ２（方法を参照）を用いて各々のＣＲＩＳＰＲアレイとストリンジェントにアラインメントされた。各々のＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーの詳細図は、Ｌｓｈ（Ｄ〜Ｆ）及びＬｓｅ（Ｉ）について示される。５’末端のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の差異は、各々の配列の下方に矢印で示されている。解析のＢＡＭアラインメントファイルは入手可能である。このマッピングは、Ｌｓｈｐｒｅ−ｃｒＲＮＡによって生成される小型ＲＮＡの５’末端のシークエンシング読み取りが、予測されたヘアピンの付け根から２ｎｔの位置にマッピングされ、インビトロ加工データ（Ａ）と一致することを、明らかに示す。Ｌ．  ｓｈａｈｉｉにおける天然の発現とＥ．ｃｏｌｉにおける異種性の発現との両方から検出される全ての成熟ｃｒＲＮＡについて、このパターンは保持される。不幸なことに、ＬｓｅＣ２ｃ２  ｃｒＲＮＡのシークエンシングデータ（Ｇ〜Ｉにおいて使用される）は、低い読み取り深度のために低い情報価値であり、各々のアラインメントされたｃｒＲＮＡは、明らかな均一性をほとんど有さず、わずかに異なる５’末端を示す。加工されたリピートの１つのマッピング（リピート−スペーサー２（Ｉ））は、データと一致するが、不十分な読み取り深度のため、低い信頼度のみを有する。
【図３１】Ｃ２ｃ２によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工が、スペーサー配列とは独立し、タンデムｃｒＲＮＡアレイにおいて起こり得、ｐｒｅ−ｃＲＮＡの５’隣接領域における変異によって影響を受け、そして３’ホスフェート産物をもたらすことを描写する。Ａは、タンデムｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイのＬｂｕＣｃ２ｃ２による切断の切断部位マッピングを示す。ＯＨ：アルカリ加水分解ラダー、Ｔ１：Ｔ１  ＲＮａｓｅ加水分解ラダーである。切断反応は、１００ｎＭのＬｂｕＣ２ｃ２及び１ｎＭ未満のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡで実施された。切断産物の概略図を右側に描写し、矢印はマッピングされたＣ２ｃ２切断産物を示す。Ｂは、効率的なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に対する５’一本鎖隣接領域の重要性を実証する、ＬｂｕＣ２ｃ２の４−ｍｅｒ変異ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの加工データを示す。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のパーセンテージは、６０分後に測定された（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。Ｃは、同様の速度のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工がｃｒＲＮＡのスペーサー配列と独立して起こることを実証する代表的なＬｂｕＣ２ｃ２のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断の経時変化を示し、スペーサーＡ及びスペーサーλ２に対する擬一次速度定数（ｋ0bs ）（平均±ｓ．ｄ．）は、それぞれ０．０７±０．０４分-1及び０．０８±０．０４分-1である。Ｄは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）処理によって切断されたＲＮＡの末端基解析を示す。標準的な加工アッセイ条件が切断産物を生成するために使用され、続いて、任意の２’、３’環状ホスフェート／３’モノホスフェートを除去するためにＰＮＫと共に１時間インキュベートされた。バンドの遅延した移動は、放射性標識された５’産物の３’末端からの荷電したモノホスフェートの除去を示す。
【図３２】ＬｂｕＣ２ｃ２がシス及びトランス標的におけるガイド依存性ｓｓＲＮＡ分解を触媒することを示す。Ａは、Ｃ２ｃ２のガイド依存性ｓｓＲＮＡ分解の２つのモードの概略図である。Ｂは、２つの異なる放射性標識されたｓｓＲＮＡ基質、Ａ及びＢのＬｂｕＣ２ｃ２による切断を示す。１００ｎＭのＣ２ｃ２及び５０ｎＭのｃｒＲＮＡの複合体は３７℃で予め形成され、反応は２５℃で１ｎＭ未満の５’標識された標的ＲＮＡを添加することによって開始された。トランスの切断反応は、等モル（１ｎＭ未満）の濃度の放射性標識された非誘導相補的基質と標識されていないオンターゲットｓｓＲＮＡとを含んだ。複数のｓｓＲＮＡ基質に対し、ＬｂｕＣ２ｃ２は、相補的ｃｒＲＮＡに結合したときにのみ効率的な切断を触媒し、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡがＲＮＡ誘導の様式でｓｓＲＮＡを切断することが観察された。この活性は、これ以降、オンターゲットまたはシスターゲットの切断と称される。ＬｂｕＣ２ｃ２媒介性シス切断は、ＬｓｈＣ２ｃ２9 と類似し、ウラシル残基前で優先的に起こる切断を伴う、複数の産物のラダー化を生じる。非標的切断反応は、非標識のオンターゲット（ｃｒＲＮＡ相補的）ｓｓＲＮＡの存在下で繰り返された。シスで実施された非標的切断実験と対照的に、トランスにおける非標的ＲＮＡの急速な分解が観察された。シスオンターゲット切断とトランス非標的切断との両方で観察された同様のＲＮＡ切断速度及びほぼ同一の切断産物は、両方の活性における同一のヌクレアーゼ中心を暗示する。Ｃは、スペーサーＡを標的とするｃｒＲＮＡと共にロードされるＬｂｕＣ２ｃ２が、２５ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、シス（標的Ａ標識化）及びトランス（非標識標的Ａの存在下での標的Ｂ標識化）の切断条件の両方における切断活性について試験されたことを示す。
【図３３】ＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的の切断部位マッピングを示す。Ａは、同一のスペーサー相補的配列を有するが、可変の長さ及びヌクレオチド組成の異なる５’隣接配列のいくつかの放射性標識されたｓｓＲＮＡ基質のＬｂｕＣ２ｃ２媒介性「シス」切断を実証する、方法に従って実施されるｓｓＲＮＡ標的切断アッセイを示す。ｓｓＲＮＡ基質の配列は、黄色で強調されたｃｒＲＮＡ−Ａのスペーサー相補的配列と共に右側に示される。矢印は、検出された切断部位を示す。ゲルは、明確性のために短く切断された。異なる基質（例えば、Ａ．１対Ａ．２対Ａ．３）においてもたらされる切断産物のパターンが、切断部位の選択がウラシル選好性によって主に誘導され、ｃｒＲＮＡ−相補的標的配列内の排他的切断メカニズムの明らかな欠如を示し、これは、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１等の他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ単一エフェクター複合体において観察されたもの１１、２１とは対照的であることを示すことは注目すべきである。興味深いことに、基質Ａ．０に対して観察される切断パターンは、ポリＧ配列に対する第２の選好性を暗示する。Ｂは、ｓｓＲＮＡ標的の長さをタイル表示するｃｒＲＮＡの範囲を用いる、方法に従うＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断アッセイを示す。この実験において使用されるｓｓＲＮＡ基質の配列は、黄色で強調される各々のｃｒＲＮＡに対するスペーサー相補的配列と共にゲルの下に示される。矢印は、予測された切断部位を示す。各々のレーンのセットの上で、小さな略図は、標的（黄色い箱）に沿うスペーサー配列の位置、及び観察された（赤い矢印）または存在しない（黒い矢印）切断産物を示す。同様に、全てのｃｒＲＮＡに対し、切断産物の長さの分布が非常に類似し、同様に、ｃｒＲＮＡ結合配列内における排他的切断の明らかな欠如を示すことは、注目すべきである。反応のサブセットにおけるいくつかの切断産物の非存在は、ｓｓＲＮＡ標的上の結合した、任意のシス（分子内）またはトランス（分子間）のＬｂｕＣ２ｃ２活性部位によるウラシルへの接近を立体的にふさぐことができるＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡの存在によって説明できる可能性がある。プロトスペーサー隣接配列（ＰＦＳ）のＬｂｕＣ２ｃ２に対する選好性について正確な分析は本研究の範囲を超えるが、３’隣接ヌクレオチドの最小限の影響が観察された。予測されるＰＦＳ塩基は、略図中で試験された各々のガイドの次に赤で注記されている。
【図３４】ＲＮＡ標的化の、ｃｒＲＮＡバリアント、温度、及び点変異に対する依存性を描写する。Ａは、１６ｎｔ、２０ｎｔ、または２４ｎｔのスペーサーを有するｃｒＲＮＡと共に方法に従って実施されるＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断アッセイを示す。Ｂは、方法に従って、２５℃及び３７℃のいずれかで実施されるＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断の経時変化を示す。Ｃは、異なる５’隣接ヌクレオチド変異を有するｃｒＲＮＡと共に方法に従って実施される、ＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断の経時変化を示す。変異は赤で強調される。１〜２ヌクレオチドの５’伸長は切断効率に対し無視できる影響のみを及ぼした。対照的に、隣接領域を３ｎｔまで短くすることは、切断速度を遅延した。Ｄは、ＨＥＰＮモチーフ内の保存された残基の変異における点変異の、ｓｓＲＮＡを標的化するＣ２ｃ２のリボヌクレアーゼ活性に対する影響を示す。
【図３５】成熟ｃｒＲＮＡ及び標的ｓｓＲＮＡに対するＬｂｕＣ２ｃ２の結合データを描写する。Ａは、成熟ｃｒＲＮＡ−Ａ＿ＧＧのＬｂｕＣ２ｃ２−ＷＴ、ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１、ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ２、またはＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２に対する結合親和性を決定するために、フィルター結合アッセイが方法に記載されるように実施された結果を示す。定量されたデータは、標準的な結合等温線に適合された。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。３つの独立した実験からの測定された解離定数（平均±ｓｄ）は、２７．１±７．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ＷＴ）、１５．２±３．２ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１）、１１．５±２．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ２）、及び４３．３±１１．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２）であった。Ｂは、ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２：ｃｒＲＮＡ−Ａ＿ＧＧと、「オンターゲット」Ａ  ｓｓＲＮＡまたは「オフターゲット」Ｂ  ｓｓＲＮＡのいずれかとの間の結合反応についての、代表的な電気泳動移動度シフトアッセイを示す。３つの独立した実験は、方法に記載されるように実施された。ゲルは、明確性のために短く切断された。Ｃは、Ｂからの定量された結合データが、標準的な結合等温線に適合された結果を示す。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。３つの独立した実験からの測定された解離定数（平均±ｓｄ）は、ｓｓＲＮＡ  Ａについて１．６２±０．４３ｎＭ、ｓｓＲＮＡ  Ｂについて、Ｎ．Ｄ（＞＞１０ｎＭ）であった。Ｄは、成熟ｃｒＲＮＡ−Ａ＿ＧＡのＬｂｕＣ２ｃ２−ＷＴ及びＬｂｕＣ２ｃ２−Ｒ１０７９Ａに対する結合親和性を決定するために、フィルター結合アッセイが方法に記載されるように実施された結果を示す。定量されたデータは、標準的な結合等温線に適合された。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。３つの独立した実験からの測定された解離定数（平均±ｓｄ）は、４．６５±０．６ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ＷＴ）及び２．５２±０．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−Ｒ１０７９Ａ）であった。これらの結合親和性がパネルａと異なることは注目すべきである。この相違は、パネルａのガイドが５’−ＧＧＣＣＡ．．．で始まり、パネルｄが５’−ＧＡＣＣＡで始まるような、ガイドの５’配列におけるわずかな相違が原因であった。天然の配列ガイド（５’−ＧＡＣＣＡ）がＬｂｕＣ２ｃ２に固く結合するが、これらのガイドバリアントのＲＮＡ標的化効率における相違は全くみられなかった（拡張データ図６ｃ）。
【図３６】ＲＮａｓｅ検出アッセイのλ２−ｓｓＲＮＡの経時変化を描写する。Ａは、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ−λ２が、増加する量のλ２ｓｓＲＮＡ（０〜１ｎＭ）の存在下で、ＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質（（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）及び１００ｎｇのＨｅＬａ全ＲＮＡと共に、３７℃で１２０分間、インキュベートされた結果を示す。蛍光測定は、５分ごとになされた。１ｎＭのλ２ｓｓＲＮＡ反応は、第１の時点が測定され得る前に、飽和に到達した。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。Ｂは、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ−λ４またはａｐｏ  ＬｂｕＣ２ｃ２は、オンターゲットの活性化λ４ｓｓＲＮＡの存在下または非存在下で、ＨｅＬａ全ＲＮＡ中で２時間インキュベートされた結果を示す。バックグランドの小型ＲＮＡの分解は、方法に従って、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００中の小型ＲＮＡチップ上で決定された。ａｐｏ  ＬｂｕＣ２ｃ２とＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ−λ４の間のフラグメントのプロファイル中に小さな相違がみられた。対照的に、オンターゲットｓｓＲＮＡの反応への添加に際し、ｔＲＮＡピークの劇的な拡大とシフトが、ＬｂｕＣ２ｃ２のトランス活性の活性化の際に反応に存在する他の構造の、及び構造化されていないＲＮＡの広範囲の分解を明らかにする。
【図３７】タンパク質が、Ｒ１０７９（例えば、Ｒ１０７９Ａ）、Ｒ１０７２（例えば、Ｒ１０７２Ａ）、及びＫ１０８２（例えば、Ｋ１０８２Ａ）から選択される任意のアミノ酸位置に変異を含むときの、ＬｂｕＣ２ｃ２による前駆体ガイドＲＮＡの切断（ガイドＲＮＡ加工）の大幅な減少を実証する切断実験を描写する。
【図３８】Ｃａｓ１３ａファミリー内のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の保存を描写する。
【図３９】Ｃａｓ１３ａ相同体について、ＣＲＩＳＰＲ座位とｃｒＲＮＡリピートの構造とを描写する。
【図４０】ＬｂｕＣａｓ１３ａによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断に重要な残基を描写する。
【図４１】Ｃａｓ１３ａファミリーメンバーのらせん１及びＨＥＰＮのドメインのアラインメントを描写する。
【図４２】Ｃａｓ１３ａファミリーのメンバーによるｓｓＲＮＡの効率を描写する。
【図４３】Ｃａｓ１３ａ相同体によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断を描写する。
【図４４】Ｃａｓ１３ａファミリー内のｃｒＲＮＡの交換可能性を描写する。
【図４５】ＲＮＡ検出についての直交性Ｃａｓ１３ａサブファミリーの機能的検証を描写する。
【図４６】野生型（ＷＴ）ＬｂｕＣａｓ１３ａ、及び、ＬｂｕＣａｓ１３ａのＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ二重変異による、ｃｒＲＮＡアレイ加工を描写する。
【図４７】ＬｂｕＣａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与する領域における点変異による、トランス−切断を描写する。
【図４８】野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａと比較したＬｂｕＣａｓ１３ａのＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ二重変異の特徴を描写する。
【図４９】表４を提示する。
【図５０】表５を提示する。
【図５１】表６を提示する。
【図５２】表７を提示する。
【図５３】表８を提示する。
【図５４】表９を提示する。
【図５５】ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの機能についてのモデルを提示する。
【図５６Ａ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｂ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｃ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｄ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｅ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｆ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｇ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｈ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｉ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｊ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５６Ｋ】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列を提示する。
【図５７−１】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−２】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−３】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−４】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−５】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−６】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−７】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図５７−８】Ｃａｓ１３ａポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、マルチストランドＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、マルチストランドＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、及びプリン及びピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
【０００９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾された核酸）における３〜１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さの上限は存在しない。オリゴヌクレオチドはまた、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離、転写（インビトロ及び／もしくはインビボ）、または化学合成することができる。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、記載される実施形態に適用可能なものとして、一本鎖（センスまたはアンチセンス等）、及び二本鎖のポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００１０】
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」によって、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、温度及び溶液イオン強度の適切なインビトロ及び／またはインビボの条件下で、配列特異的な逆平行の様式で（すなわち、核酸が相補的な核酸に特異的に結合する）別の核酸と非共有結合する、すなわちワトソン−クリック塩基対及び／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、「アニール」もしくは「ハイブリダイズ」するヌクレオチドの配列を含むことを意味する。標準的なワトソン−クリック塩基対は、チミジン／チミジン（Ｔ）と対形成するアデニン／アデノシン）（Ａ）、ウラシル／ウリジン（Ｕ）と対形成するＡ、及びシトシン／シチジン（Ｃ）と対形成するグアニン／グアノシン）（Ｇ）を含む。さらに、２つのＲＮＡ分子間のハイブリダイゼーション（例えば、ｄｓＲＮＡ）のために、及びＤＮＡ分子とＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡ標的核酸のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ等との塩基対）のために、Ｇはまた、Ｕと塩基対となり得る。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対形成は、ｔＲＮＡアンチコドンのｍＲＮＡ中のコドンとの塩基対形成に関連した遺伝子コードの縮重（すなわち、冗長性）について、部分的に関与する。したがって、本開示に関連して、Ｇ（例えば、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のもの、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡと塩基対形成する標的核酸のもの）は、ＵとＣとの両方に対して相補的であると考えられる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対が、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置においてなされ得るとき、位置は、非相補的であるとは考えられないが、代わりに相補的であると考えられる。
【００１１】
ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、よく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の１１章及び表１１．１；ならびに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示される。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００１２】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを要求するが、塩基間のミスマッチも可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の度合いに依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の度合いがより大きいと、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値がより大きくなる。短い区間の相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置は、重要になり得る（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．の１１．７〜１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは８以上のヌクレオチド（例えば、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上、または３０ヌクレオチド以上）である。温度及び洗浄溶液の塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の度合い等の要素に従って、必要に応じて調整され得る。
【００１３】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズするべき、またはハイブリダイズ可能なその標的核酸の配列と１００％相補性である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし、介在するセグメント、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、またはヘアピン構造）ようになってもよい。ポリヌクレオチドは、ハイブリダイズする標的核酸配列内の標的領域に対し、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、アンチセンス化合物の２０のうちの１８のヌクレオチドが標的領域に対して相補性であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補性ヌクレオチドは、相補性ヌクレオチドとクラスターを形成するか、散在していてもよく、互いに、または相補性ヌクレオチドと連続的である必要はない。核酸内の核酸配列の特定の区間のパーセント相補性は、任意の都合が良い方法によって決定することができる。例示的な方法は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本局所的アラインメント検索ツール）、及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）、またはデフォルトの設定を用いる、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）のアルゴリズムを用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を含む。
【００１４】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、コードされた、及びコードされていないアミノ酸、化学的、もしくは生化学的に修飾された、または誘導体化アミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
【００１５】
本明細書において使用されるとき、「結合」（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメイン、標的核酸に対する結合等を参照して）は、巨大分子間の非共有相互作用（例えば、タンパク質と核酸間、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ複合体と標的核酸間など）を指す。非共有相互作用の状態において、巨大分子は、「会合している」、「相互作用している」、または「結合している」と言われる（例えば、分子Ｘが、分子Ｙと相互作用していると言われるとき、それは、分子Ｘが非共有の様式で分子Ｙに結合することを意味する）。全ての結合相互作用の構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格内のホスフェート残基と接触する）が、結合相互作用のいくつかの部分は配列特異的であり得る。結合相互作用は、一般的に、１０-6Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、１０-10 Ｍ未満、１０-11 Ｍ未満、１０-12 Ｍ未満、１０-13 Ｍ未満、１０-14 Ｍ未満、または１０-15 Ｍ未満の解離定数（Ｋd ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強さを指し、増加する結合親和性は、低下するＫd と相関する。
【００１６】
「結合ドメイン」によって、別の分子に非共有結合することができるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合ドメイン）、及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合ドメイン）に結合することができる。タンパク質結合ドメインを有するタンパク質の場合、ある場合にはそれ自身に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマー等を形成するために）、及び／または、それは、異なるタンパク質または異なる複数のタンパク質の１つ以上の領域に結合することができる。
【００１７】
用語「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質における、類似する側鎖を有するアミノ酸残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン−グリシン、及びアスパラギン酸−グルタミン酸である。
【００１８】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定のパーセントの「配列同一性」を有し、アラインメントされたとき、塩基またはアミノ酸のパーセンテージは同一であり、２つの配列を比較するとき、同一の相対位置にあることを意味する。配列同一性は、数多くの異なる方法によって決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ／、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／、ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／〜ｐｈｙｒｅ２／を含むサイトのワールドワイドウェブにわたって利用可能な様々な方法及びコンピュータープログラムを用いてアラインメントすることができる（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｐｈｙｒｅ２等）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．２１５：４０３−１０を参照されたい。
【００１９】
特定のＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく、または、ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、「非コード」ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ等）をコードしてもよい。
【００２０】
用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」は、本明細書において交換可能に使用され、非コード配列（例えば、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ）、またはコード配列（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の転写を提供する及び／または調節する、及び／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等の転写及び翻訳の制御配列を指す。
【００２１】
本明細書において使用されるとき、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’の方向）のコードまたは非コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本開示の目的のために、プロモーター配列は、その３’末端において転写開始部位によって境界とされ、上流（５’の方向）に伸長し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内で、転写開始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、しばしば、しかし常にではなく、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。誘導可能なプロモーターを含む様々なプロモーターは、本開示の様々なベクターを駆動するために使用してもよい。
【００２２】
本明細書において使用されるとき、用語「天然に存在する」または「非修飾」または「野生型」は、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用され、自然に見出される、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、天然の源から単離でき、実験室内でヒトによって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は野生型（かつ天然に存在する）である。
【００２３】
本明細書において使用されるとき、「組換え」は、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然系に見出される内在性核酸と区別できる構造的コードまたは非コード配列を有するコンストラクトを生じるクローニング、制限酵素処理、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び／または連結のステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡフラグメントまたは一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てて細胞または細胞フリー転写及び翻訳システムに含まれる組換え転写ユニットから発現することができる合成核酸をもたらすことができる。関連する配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子または転写ユニットの形成に利用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在し得、そのような配列は、操作またはコード領域の発現とは干渉せず、実際に、様々なメカニズムによって所望の産物の産生を調節するように作用し得る（以下の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。代替的に、翻訳されないＲＮＡ（例えば、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列もまた、組換えと考えられ得る。したがって、例えば用語「組換え」核酸は、天然に存在しないもの、例えば、ヒトの介入を通じて、そうでないと分かれている２つの配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、化学合成手段によって、または単離した核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技術によってしばしば達成できる。コドンを同一のアミノ酸、保存的アミノ酸、または非保存的アミノ酸をコードするコドンと置き換えて実施されることは通常行われる。代替的に、所望の機能の組み合わせを生じるために、所望の機能の核酸セグメントをまとめて合わせることが実施される。この人工的な組み合わせは、化学合成手段によって、または単離した核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技術によってしばしば達成できる。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードするとき、コードされたポリペプチドの配列は、天然に存在するもの（「野生型」）であり得、または天然に存在する配列のバリアント（例えば変異体）であり得る。したがって、用語「組換え」ポリペプチドは、必ずしも、天然に存在しない配列のポリペプチドを指す必要はない。代わりに、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ配列によってコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然に存在するもの（「野生型」）、または天然に存在しないもの（例えば、バリアント、変異体等）であり得る。したがって、「組換え」ポリペプチドは、ヒトの介入の結果であるが、天然に存在するアミノ酸配列であり得る。
【００２４】
「ベクター」または「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」が結合し、細胞内の結合したセグメントの複製をもたらす、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミド等のレプリコンである。
【００２５】
「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素がそれらの意図された様式によってそれらが機能することを許容する関係にある近位を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。
【００２６】
用語「組換え発現ベクター」または「ＤＮＡコンストラクト」は、本明細書において交換可能に使用され、ベクター及び１つのインサートを含むＤＮＡ分子を指す。組換え発現ベクターは、通常、インサート（複数可）の発現及び／または増殖の目的で、または他の組換えヌクレオチド配列の構築のために、作製される。インサート（複数可）は、プロモーター配列に作動可能に連結されていても、されていなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されていても、されていなくてもよい。
【００２７】
任意の所与の構成要素または構成要素の組み合わせは、非標識であり得、または標識部分によって検出可能に標識され得る。いくつかの場合において、２つ以上の構成要素が標識されているとき、それらは、互いに区別できる標識部分によって標識され得る。
【００２８】
分子及び細胞の生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ  ＆  Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）のような標準的な教科書において見出すことができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２９】
本発明をさらに説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、よって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。
【００３０】
一定の範囲の値が提供されるとき、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間、及び、その述べられた範囲内の他の任意の述べられた値または中間の値における、各々の中間の値は、その下限の単位の１０分の１まで本発明に包含されることが理解されるべきである。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定を有することを条件として、独立して、より小さな範囲に含まれ得、本発明に包含される。述べられる範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界のいずれかまたは両方を除外する範囲は、本発明に含まれる。
【００３１】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の任意の方法及び物質はまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び物質はここに記載される。本明細書において述べられた全ての刊行物は、共に刊行物が引用されている方法及び／または物質を開示及び記載するための参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含することは注目されるべきである。したがって、例えば「タンパク質」に対する言及は、複数のそのようなタンパク質を含み、「ガイドＲＮＡ」に対する言及は、１つ以上のそのようなガイドＲＮＡ及び当業者に公知のそれらの同等物等を含む。特許請求の範囲は、任意選択の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲における要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して「単独で」、「のみ」等のような排他的用語の使用の先行詞として役立つことを意図する。
【００３３】
明確さのために別個の実施形態と関連して記載される本発明のある特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態と関連して記載される本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の好適な部分的な組み合わせとして提供され得る。本発明に関する実施形態の全ての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、各々及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されるかのように、本明細書において開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素の全ての部分的な組み合わせは、本発明に具体的に包含され、各々及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されるかのように、本明細書において開示される。
【００３４】
本明細書において論じられている刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみが提供されている。本明細書中のいかなるものも、先行発明のために、本発明がそのような刊行物に先行する権利がないということの承認として解釈されるべきではない。さらに、提示される公開日が、実際の公開日と異なることがあり得、それは、独立して確認する必要がある場合がある。
【００３５】
本開示は、一本鎖標的ＲＮＡを検出するための方法を提供する。本開示は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡへの切断方法を提供する。本開示は、試料中の標的ＲＮＡを検出するためのキットを提供する。用語「Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ」は、本明細書において、「Ｃａｓ１３ａガイドＲＮＡ」と交換可能に使用され、いくつかの場合において、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（例えば、「Ｃａｓ１３ａ  ｃｒＲＮＡ」）として呼ばれ、用語「Ｃ２ｃ２タンパク質」（または「Ｃ２ｃ２ポリペプチド」）は、本明細書において、「Ｃａｓ１３ａタンパク質」（または「Ｃａｓ１３ａポリペプチド」）と交換可能に使用される。
【００３６】
一本鎖ＲＮＡを検出する方法
一本鎖標的ＲＮＡを検出するための組成物及び方法であって、（ｉ）複数のＲＮＡを有する試料を、（ａ）一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）試料中に存在するＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、（ｉｉ）切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含む方法が提供される。試料が、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする一本鎖標的ＲＮＡを含む（すなわち、試料が標的とされた一本鎖標的ＲＮＡを含む）ときに起こるように、対象のＣ２ｃ２タンパク質がＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されると、Ｃ２ｃ２タンパク質は活性化されて、試料中に存在するＲＮＡ（非標的ＲＮＡを含む）を非特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼとして機能する。したがって、標的とされた一本鎖標的ＲＮＡが試料中に存在するとき（例えば、いくつかの場合において、閾値量を超えて）、結果は、試料中のＲＮＡ（非標的ＲＮＡを含む）の切断であり、これは、任意の都合が良い検出方法（例えば、標識された検出ＲＮＡを用いて）によって検出することができる。接触ステップは、一般的に二価の金属イオンを含む組成物中で実施される。接触ステップは、無細胞環境、例えば細胞の外部で実施され得る。接触ステップは、細胞の内部で実施され得る。接触ステップは、インビトロの細胞内で実施され得る。接触ステップは、エクスビボの細胞内で実施され得る。接触ステップは、インビボの細胞内で実施され得る。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡはＲＮＡとして提供され、Ｃ２ｃ２タンパク質はタンパク質それ自体として提供される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとして提供され、Ｃ２ｃ２タンパク質はタンパク質それ自体として提供される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡはＲＮＡとして提供され、Ｃ２ｃ２タンパク質はＣ２ｃ２タンパク質をコードするＲＮＡとして提供される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとして提供され、Ｃ２ｃ２タンパク質はＣ２ｃ２タンパク質をコードするＲＮＡとして提供される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡはＲＮＡとして提供され、Ｃ２ｃ２タンパク質はＣ２ｃ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡとして提供される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとして提供され、Ｃ２ｃ２タンパク質はＣ２ｃ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡとして提供される。いくつかの場合において、本開示の方法は、試料中の２つの異なる標的ＲＮＡ（第１の一本鎖標的ＲＮＡ及び第２の一本鎖標的ＲＮＡ）の実質的に同時の検出を提供する。
【００３７】
いくつかの場合において、２つ以上（例えば３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを、Ｃ２ｃ２タンパク質によって個別の（「成熟」）ガイドＲＮＡに切断することができる前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを用いることによって提供することができ、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの切断は、Ｃ２ｃ２タンパク質が無傷のＨＥＰＮ１及び／またはＨＥＰＮ２ドメインを有するか否かとは独立している。したがって、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡへの切断方法もまた提供される。したがって、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、１つ超のガイド配列を含み得る。いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前駆体ｃｒＲＮＡ由来のハンドルを含み得るが、必ずしも複数のガイド配列を含む必要はない。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。接触ステップは、無細胞環境、例えば細胞の外部で実施され得る。接触ステップは、細胞内部で実施され得る。接触ステップは、インビトロの細胞内で実施され得る。接触ステップは、エクスビボの細胞内で実施され得る。接触ステップは、インビボの細胞内で実施され得る。
【００３８】
いくつかの場合において（例えば、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びＣ２ｃ２タンパク質と接触させるとき、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及びＣ２ｃ２タンパク質と接触させるとき、等）、試料を、測定ステップの前に、２時間以下（例えば、１．５時間以下、１時間以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１０分以下、または５分以下、または１分以下）接触させる。例えば、ある場合において、試料を、測定ステップの前に、４０分以下接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、２０分以下接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、１０分以下接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、５分以下接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、１分以下接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、５０秒間〜６０秒間接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、４０秒間〜５０秒間接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、３０秒間〜４０秒間接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、２０秒間〜３０秒間接触させる。ある場合において、試料を、測定ステップの前に、１０秒間〜２０秒間接触させる。
【００３９】
本開示は、複数のＲＮＡ（例えば、標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中の一本鎖ＲＮＡを検出する方法を提供する。いくつかの場合において、方法は、ａ）試料を、（ｉ）一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉ）試料中に存在するＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含む。いくつかの場合において、方法は、ａ）試料を、ｉ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、及び（ｉｉ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断し、試料のＲＮＡをも切断する、Ｃ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含む。いくつかの場合において、本開示の方法は、試料中の２つの異なる標的ＲＮＡ（第１の一本鎖標的ＲＮＡ及び第２の一本鎖標的ＲＮＡ）の実質的に同時の検出を提供する。
【００４０】
複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中の一本鎖ＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ）を検出するための本開示の方法は、高感度で一本鎖標的ＲＮＡを検出することができる。いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出するために使用することができ、ここで標的一本鎖ＲＮＡは、１０7 の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー（例えば、１０6 の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、１０5 の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、１０4 の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、１０3 の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、１０2 の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、５０の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、２０の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、１０の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー、または５の非標的ＲＮＡ当たり１以上のコピー）で存在する。
【００４１】
いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出することができ、ここで、標的一本鎖ＲＮＡは、１０7 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０の非標的ＲＮＡ当たり１コピー（例えば、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０2 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０2 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０2 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、または１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー））で存在する。
【００４２】
いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出することができ、ここで、標的一本鎖ＲＮＡは、１０7 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１００の非標的ＲＮＡ当たり１コピー（例えば、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０2 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１００非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０2 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１００非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０2 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、または１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー））で存在する。
【００４３】
いくつかの場合において、試料中の一本鎖標的ＲＮＡを検出する対象の方法に関して、検出の閾値は、１０ｎＭ以下である。用語「検出の閾値」は、検出が生じるために、試料中に存在するべき標的ＲＮＡの最少量を記載するために本明細書において使用される。したがって、実例として、検出の閾値が１０ｎＭであるとき、シグナルは、標的ＲＮＡが、１０ｎＭ以上の濃度で試料中に存在するときに検出できる。いくつかの場合において、本開示の方法は、５ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．５ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．１ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０５ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０１ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００５ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００１ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０００５ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０００１ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００００５ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００００１ｎＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１０ｐＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｐＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、５００ｆＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、２５０ｆＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１００ｆＭ以下の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、５０ｆＭ以下の検出の閾値を有する。
【００４４】
いくつかの場合において、検出の閾値（対象の方法における一本鎖標的ＲＮＡの検出について）は、５００ｆＭ〜１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、または１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である（ここで、濃度は、標的ＲＮＡを検出することができる、標的ＲＮＡの閾値濃度を指す）。いくつかの場合において、本開示の方法は、８００ｆＭ〜１００ｐＭの範囲の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｐＭ〜１０ｐＭの範囲の検出の閾値を有する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１０ｆＭ〜５００ｆＭ、例えば、１０ｆＭ〜５０ｆＭ、５０ｆＭ〜１００ｆＭ、１００ｆＭ〜２５０ｆＭ、または２５０ｆＭ〜５００ｆＭの範囲の検出の閾値を有する。
【００４５】
いくつかの場合において、試料中で検出することができる一本鎖標的ＲＮＡの最小濃度は、５００ｆＭ〜１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、または１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である。いくつかの場合において、試料中で検出することができる一本鎖標的ＲＮＡの最小濃度は、８００ｆＭ〜１００ｐＭの範囲である。いくつかの場合において、試料中で検出することができる一本鎖標的ＲＮＡの最小濃度は、１ｐＭ〜１０ｐＭの範囲である。
【００４６】
いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出することができ、ここで、標的一本鎖ＲＮＡは、５００ｆＭという低い濃度（例えば、８００ｆＭという低い濃度、１ｐＭという低い濃度、１０ｐＭという低い濃度、または１００ｐＭという低い濃度）で存在する。いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出することができ、ここで、標的一本鎖ＲＮＡは、１ｐＭという低い濃度で存在する。
【００４７】
いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出することができ、ここで、標的一本鎖ＲＮＡは、５００ｆＭという低い濃度（例えば、８００ｆＭという低い濃度、１ｐＭという低い濃度、１０ｐＭという低い濃度、または１００ｐＭという低い濃度）で存在し、ここで試料は、測定ステップの前に、６０分以下接触させる（例えば、いくつかの場合４０分以下）。いくつかの場合において、本開示の方法は、複数のＲＮＡ（一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的一本鎖ＲＮＡを検出することができ、ここで、標的一本鎖ＲＮＡは、１ｐＭという低い濃度で存在し、ここで試料は、測定ステップの前に、６０分以下接触させる（例えば、ある場合において４０分以下）。
【００４８】
例えば、いくつかの場合において、本開示の方法は、５００ｆＭ以上（例えば、８００ｆＭ以上、１ｐＭ以上、５ｐＭ以上、１０ｐＭ以上）の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｐＭ以上（例えば、２ｐＭ以上、５ｐＭ以上、または８ｐＭ以上）の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、５００ｆＭ以上（例えば、１ｐＭ以上、５ｐＭ以上、１０ｐＭ以上）の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供し、ここで、試料は、測定ステップの前に、６０分以下接触させる（例えば、いくつかの場合、４０分以下）。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｐＭ以上（例えば、２ｐＭ以上、５ｐＭ以上、または８ｐＭ以上）の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供し、ここで、試料は、測定ステップの前に、６０分以下接触させる（例えば、いくつかの場合、４０分以下）。
【００４９】
いくつかの場合において、本開示の方法は、１０ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、５ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．５ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．１ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０５ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０１ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００５ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００１ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０００５ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０００１ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００００５ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００００１ｎＭ以下の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。
【００５０】
いくつかの場合において、本開示の方法は、１０-6ｎＭ〜１ｎＭ、例えば、１０-6ｎＭ〜５×１０-6ｎＭ、５×１０-6ｎＭ〜１０-5ｎＭ、１０-5ｎＭ〜５×１０-5ｎＭ、５×１０-5ｎＭ〜１０-4ｎＭ、１０-4ｎＭ〜５×１０-4ｎＭ、５×１０-4ｎＭ〜１０-3ｎＭ、１０-3ｎＭ〜５×１０-3ｎＭ、５×１０-3ｎＭ〜１０-2ｎＭ、１０-2ｎＭ〜５×１０-2ｎＭ、５×１０-2ｎＭ〜０．１ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．５ｎＭ、０．５ｎＭ〜１ｎＭ、１ｎＭ〜５ｎＭ、または５ｎＭ〜１０ｎＭの濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。
【００５１】
いくつかの場合において、本開示の方法は、１０ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、５ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、１ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．５ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．１ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０５ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０１ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００５ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００１ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０００５ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．０００１ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００００５ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。いくつかの場合において、本開示の方法は、０．００００１ｎＭ未満の濃度で試料中に存在する標的ＲＮＡの検出を提供する。
【００５２】
いくつかの場合において、本開示の方法は、試料（例えば、標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む試料）中の標的ＲＮＡの量を決定するために使用することができる。試料中の標的ＲＮＡの量を決定することは、試験試料から生じる検出可能なシグナルの量を、基準試料から生じる検出可能なシグナルの量と比較することを含むことができる。試料中の標的ＲＮＡの量を決定することは、検出可能なシグナルを測定して試験測定を生成すること、基準試料によって生じる検出可能なシグナルを測定して、基準測定を生成すること、及び、試験測定を基準測定と比較して、試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含むことができる。
【００５３】
例えば、いくつかの場合において、試料中の標的ＲＮＡの量を決定するための本開示の方法は、試料（例えば、標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む試料）を、（ｉ）一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉ）試料中に存在するＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定して、試験測定を生成すること、ｃ）基準試料によって生じる検出可能なシグナルを測定して、基準測定を生成すること、ならびに、ｄ）試験測定を基準測定と比較して、試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含む。
【００５４】
別の例として、いくつかの場合において、試料中の標的ＲＮＡの量を決定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む試料）を、ｉ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、及び（ｉｉ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断し、試料のＲＮＡをも切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定して、試験測定を生成すること、ｃ）２つ以上の基準試料の各々によって生じる検出可能なシグナルを測定して、２つ以上の基準測定を生成すること、ならびに、ｄ）試験測定を基準測定と比較して、試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含む。
【００５５】
試料
対象の試料は、複数の標的ＲＮＡを含む。用語「複数」は、２つ以上を意味するために本明細書において使用される。したがって、いくつかの場合において、試料は２つ以上（例えば、３以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１，０００以上、または５，０００以上）のＲＮＡを含む。対象の方法は、ＲＮＡの複雑な混合物中に存在する一本鎖標的ＲＮＡを検出するための非常に高感度の方法として使用することができる。したがって、いくつかの場合において、配列において互いに異なる試料は５つ以上のＲＮＡ（例えば、１０以上、２０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１，０００以上、または５，０００以上のＲＮＡ）を含む。いくつかの場合において、試料は、配列において互いに異なる、１０以上、２０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１０3 以上、５×１０3 以上、１０4 以上、５×１０4 以上、１０5 以上、５×１０5以上、１０6 以上、５×１０6 以上、または１０7 以上のＲＮＡを含む。いくつかの場合において、試料は、配列において互いに異なる、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜５００、５００〜１０3 、１０3 〜５×１０3 、５×１０3 〜１０4 、１０4 〜５×１０4 、５×１０4 〜１０5 、１０5 〜５×１０5 、５×１０5 〜１０6 、１０6 〜５×１０6 、もしくは５×１０6 〜１０7 、または１０7 を超える、ＲＮＡを含む。いくつかの場合において、試料は、配列において互いに異なる５〜１０7 のＲＮＡ（例えば、配列において互いに異なる５〜１０6 、５〜１０5 、５〜５０，０００、５〜３０，０００、１０〜１０6 、１０〜１０5 、１０〜５０，０００、１０〜３０，０００、２０〜１０6 、２０〜１０5 、２０〜５０，０００、または２０〜３０，０００のＲＮＡ）を含む。いくつかの場合において、試料は、配列において互いに異なる、５〜５０，０００のＲＮＡ（例えば、配列において互いに異なる、５〜３０，０００、１０〜５０，０００、または１０〜３０，０００のＲＮＡ）を含む。いくつかの場合において、試料は、配列において互いに異なる２０以上のＲＮＡを含む。いくつかの場合において、試料は、細胞溶解物（例えば、真核生物細胞溶解物、哺乳動物細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、原核生物細胞溶解物、植物細胞溶解物等）由来のＲＮＡを含む。例えば、いくつかの場合において、試料は、真核生物細胞、例えばヒト細胞等の哺乳動物細胞等の細胞から発現されたＲＮＡを含む。
【００５６】
用語「試料」は、一本鎖ＲＮＡを含む任意の試料を意味するために本明細書において使用される。試料は、任意の源に由来し得、例えば、試料は精製ＲＮＡの合成の組み合わせであり得、試料は、細胞溶解物、ＲＮＡ濃縮細胞溶解物、または細胞溶解物から単離及び／または精製されたＲＮＡであり得る。試料は患者由来であり得る（例えば、診断の目的のため）。試料は透過処理された細胞由来であり得る。試料は架橋された細胞由来であり得る。試料は組織切片中であり得る。試料は、架橋、ならびに後に続く、脱脂及び均一な屈折率をもたらすための調整によって調製される組織由来であり得る。架橋、ならびに後に続く、脱脂及び均一な屈折率をもたらすための調整によって調製される組織の例は、例えば、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）１４３，２８６２−２８６７ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１３８５６０に記載されている。
【００５７】
「試料」は、一本鎖標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、標的一本鎖ＲＮＡは、１０の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、２０の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、２５の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５０の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１００の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５００の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０3 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５×１０3 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０4 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５×１０4 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５×１０5 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０6 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー、または、１０6 の非標的ＲＮＡ当たり１コピー未満で試料中に存在する。いくつかの場合において、標的一本鎖ＲＮＡは、１０の非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜２０非標的ＲＮＡ当たり１コピー、２０非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜５０非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５０非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１００非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１００非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜５００非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５００非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜５×１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、５×１０3 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０4 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、１０5 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー、または１０6 非標的ＲＮＡ当たり１コピー〜１０7 非標的ＲＮＡ当たり１コピーで試料中に存在する。
【００５８】
好適な試料は、血液、血清、血漿、尿、吸引物、及び生検試料を含むが、これらに限定されない。したがって、患者に関して、用語「試料」は、血液、ならびに生物学的起源の他の液体試料、生検試料または組織培養もしくはそれら由来の細胞及びそれらの子孫等の固体組織試料を包含する。定義はまた、それらの入手の後に、試薬による処理、洗浄、または癌細胞等の特定の細胞集団の濃縮等による任意の方法によって操作されている試料をも含む。定義はまた、特定の型の分子、例えばＲＮＡが濃縮されている試料を含む。用語「試料」は、臨床試料、例えば血液、血漿、血清、吸引物、脳脊髄液（ＣＳＦ）等の生体試料を包含し、外科的切除によって取得された組織、生検によって取得された組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、器官、骨髄等をも含む。「生体試料」は、それら（例えば、癌細胞、感染細胞等）に由来する生物流体、例えば、そのような細胞から取得されたＲＮＡを含む試料（例えば、細胞溶解物または他のＲＮＡを含む細胞抽出物）を含む。
【００５９】
試料は、任意の様々な細胞、組織、器官、または無細胞液を含み得るか、またはそれらから取得され得る。好適な試料の源は、真核生物細胞、細菌細胞、及び古細菌細胞を含む。好適な試料の源は、単細胞生物及び多細胞生物を含む。好適な試料源は、単細胞真核生物、植物もしくは植物細胞、藻類細胞、例えばＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．  ａｇａｒｄｈ等、真菌細胞（例えば酵母細胞）、動物細胞、組織、もしくは器官、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫、昆虫、クモ）由来の細胞、組織、もしくは器官、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、組織、液体、もしくは器官、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄類、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等）由来の細胞、組織、流体、もしくは器官を含む。好適な試料の源は、線虫、原虫等を含む。好適な試料の源は、寄生生物、例えば、蠕虫類、マラリア原虫等を含む。
【００６０】
好適な試料源は、６界、例えば、細菌界（例えば、真正細菌界）、古細菌界、原生生物界、菌界、植物界、及び動物界の任意のものの細胞、組織、または生物を含む。好適な試料源は、藻類（例えば、緑藻類、紅藻類、緑藻類、シアノバクテリア）を含むがこれらに限定されない原生生物界の植物様メンバー、原生生物界の真菌様メンバー、例えば、粘菌、卵菌等、原生生物界の動物様メンバー、例えば、鞭毛藻類（例えば、ユーグレナ）、アメーバ（例えば、アメーバ）、スポロゾーン（例えば、アピコンプレックス門、ミクソゾア門、微胞子虫門）、及び繊毛虫（例えば、ゾウリムシ類）を含む。好適な試料源は、門：担子菌門（棍棒状菌、例えば、ハラタケ属、テングタケ属、ヤマドリタケ属、アンズタケ属等のメンバー）、子嚢菌門（例えば、サッカロミセス属を含む子嚢菌）、ミコフィコフィタ（Ｍｙｃｏｐｈｙｃｏｐｈｙｔａ）（地衣類）、接合菌門（接合菌）、及び不完全菌門の任意のメンバーを含むがこれらに限定されない菌界のメンバーを含む。好適な試料源は、以下の分類：コケ植物門（例えば、コケ）、ツノゴケ植物門（例えば、ツノゴケ類）、苔植物門（例えば、ゼニゴケ類）、ヒカゲノカズラ植物門（例えば、ヒカゲノカズラ類）、トクサ類（例えば、トクサ類）、マツバラン植物門（例えば、松葉蘭）、ハナヤスリ目、シダ類（例えば、シダ）、ソテツ門、イチョウ植物門、裸子植物門、マオウ門、及び被子植物（例えば、顕花植物）の任意のメンバーを含むがこれらに限定されない植物界のメンバーを含む。好適な試料源は、以下の門：海綿動物門（カイメン）、平板動物門、直泳動物門（海洋無脊椎動物の寄生虫）、ひし形類、刺胞動物門（サンゴ、アネモネ、クラゲ、ウミエラ、ウミシイタケ、オーストラリアウンバチクラゲ）、有櫛動物門（クシクラゲ）、扁形動物門（扁形動物）、紐形動物門（ひも形動物）、顎口動物門（ジョードワーム（ｊａｗｅｄ  ｗｏｒｍｓ））腹毛虫類、輪虫類、鰓曳虫類、動吻動物門、胴甲動物門、鉤頭動物門、内肛動物門、線形動物門、類線形動物門、有輪動物門、軟体動物門（軟体動物）、星口動物門（星口動物）、環形動物門（条虫類）、緩歩動物門（緩歩類）、有爪動物門（有爪動物）、節足動物門（亜門：きょう角亜門、多足類、六脚類、及び甲殻類を含み、ここで、きょう角亜門は、例えば、クモ類、腿口類、及びウミグモ類を含み、多足類は、例えば、唇脚類（ムカデ）、倍脚類（ヤスデ）、少脚類、及び結合類を含み、六脚類は、昆虫を含み、甲殻類は、小エビ、オキアミ、フジツボ等を含む、箒虫動物門、外肛動物門（コケムシ類）、椀足動物門、棘皮動物門（例えば、ヒトデ、シャリンヒトデ、ウミシダ目、ウニ、ナマコ、クモヒトデ類、テズルモズル類等を含む）、毛顎動物門（毛顎動物）、半索動物門（腸鰓綱）、及び、脊索動物門の任意のメンバーを含むがこれらに限定されない動物界のメンバーを含む。脊索動物門の好適なメンバーは、以下の亜門：尾索動物亜門（ホヤ類、単ぼや類、サルパ類、及び幼形類を含む）、頭索動物亜門（ナメクジウオ）、ヌタウナギ網（メクラウナギ）、及び脊椎動物亜門の任意のメンバーを含み、ここで、脊椎動物亜門のメンバーは、例えば、ヤツメウナギ科（ヤツメウナギ）、軟骨魚類（軟骨魚類���、条鰭綱（条鰭類）、シーラカンス（コエラカントゥス）、肺魚類（肺魚）、爬虫類（爬虫類、例えばヘビ、アリゲーター、クロコダイル、トカゲ等）鳥類（トリ）、及び哺乳類（哺乳動物）のメンバーを含む。好適な植物は、任意の単子葉植物及び任意の双子葉植物を含む。
【００６１】
試料の好適な源は、生物より得られる細胞、流体、組織、または器官、生物より単離される特定の細胞、細胞の群等を含む。例えば、生物が植物である場合、好適な源は、木質部、師部、形成層、葉、根等を含む。生物が動物である場合、好適な源は、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織等）、または特定の細胞型（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星細胞、マクロファージ、神経膠細胞、島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等）を含む。
【００６２】
いくつかの場合において、試料の源は、病的な細胞、液体、組織、または器官である。いくつかの場合において、試料の源は、正常な（非病的）細胞、液体、組織、または器官である。いくつかの場合において、試料の源は、病原体感染の細胞、組織、または器官である。病原体は、ウイルス、真菌、蠕虫類、原虫、マラリア原虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ等を含む。「蠕虫類」は、カイチュウ、糸状虫、及び植物食性線虫（線形動物門）、吸虫（吸虫綱）、鉤頭動物門、及び条虫（条虫綱）を含む。原虫感染症は、ジアルジア属、トリコモナス属、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム赤痢、シャーガス病、コクシジウム症、マラリア、及びトキソプラズマ症からの感染症を含む。寄生虫／原虫病原体等の病原体の例は、以下を含むが、これらには限定されない：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ。真菌病原体は、以下を含むが、これらには限定されない：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ。病原性ウイルスは、例えば免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱、西ナイルウイルス、ヘルペスウイルス、黄熱病ウイルス、肝炎ウイルスＣ、肝炎ウイルスＡ、肝炎ウイルスＢ、パピローマウイルス等を含む。病原体は、例えば、ＨＩＶウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、肺炎球菌、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎Ｂウイルス、肝炎Ｃウイルス、はしかウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ｍｕｍｐｓウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイ��ス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ，Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む。
【００６３】
標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡは、任意の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）であり得る。例は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むが、これらには限定されない。いくつかの場合において、標的ｓｓＲＮＡはｍＲＮＡである。いくつかの場合において、一本鎖標的核酸は、ウイルス（例えば、ジカウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス等）由来のｓｓＲＮＡである。いくつかの場合において、一本鎖標的核酸は、寄生生物のｓｓＲＮＡである。いくつかの場合において、一本鎖標的核酸は、細菌、例えば病原性細菌のｓｓＲＮＡである。標的ＲＮＡの源は、上述のような、ＲＮＡ試料の源と同一であり得る。
【００６４】
検出可能なシグナルの測定
いくつかの場合において、対象の方法は、測定（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定すること）のステップを含む。Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡがＣ２ｃ２タンパク質の存在下で標的ＲＮＡとハイブリダイズすることで活性化されると非標的ＲＮＡを切断するので、検出可能なシグナルは、ＲＮＡが切断されるときに生じる任意のシグナルであり得る。例えば、いくつかの場合において、測定のステップは、金ナノ粒子に基づく検出（例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００７；４６（１９）：３４６８−７０；及びＸｉａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０Ｊｕｎ１５；１０７（２４）：１０８３７−４１を参照）、蛍光偏光、コロイド相転移／分散（例えば、Ｂａｋｓｈ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００４Ｊａｎ８；４２７（６９７０）：１３９−４１を参照）、電気化学的検出、半導体に基づく感知（例えば、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊｕｌ  ２０；４７５（７３５６）：３４８−５２、例えば、ＲＮＡ切断反応の後に、２’−３’環状リン酸を開裂し、溶液中に無機リン酸を放出することによって、ｐＨ変化を生じるためのホスファターゼを使用することができる）、及び、標識された検出ＲＮＡ（より詳細には以下を参照）の検出の１つ以上を含む。そのような検出方法の読み取りは、任意の都合が良い読み取りであり得る。考え得る読み取りの例は、検出可能な蛍光シグナルの測定量、ゲル上のバンドの視覚分析（例えば、切断された産物を表すバンド対切断されていない基質を表すバンド）、色の存在または非存在の視覚またはセンサーに基づく検出（すなわち、色検出法）、及び、電気シグナルの存在または非存在（またはその特定の量）を含むが、これらには限定されない。
【００６５】
測定することは、いくつかの場合において、例えば、検出されたシグナルの量を、試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定するために使用することができるという意味において定量的であり得る。測定することは、いくつかの場合において、例えば、検出可能なシグナルの存在または非存在が、標的とされたＲＮＡの存在または非存在を示し得るという意味において定性的であり得る。いくつかの場合において、検出可能なシグナルは、標的とするＲＮＡ（複数可）が、特定の閾値濃度を超えて存在しない限り、存在しない（例えば、所与の閾値レベルを超えて）（例えば図５を参照）。いくつかの場合において、検出の閾値は、Ｃ２ｃ２タンパク質、ガイドＲＮＡ、試料容量、及び／または検出ＲＮＡ（使用される場合）の量を修正することによって量を決定され得る。そのように、例えば、当業者によって理解されるように、所望とされる場合、１つ以上の反応を設定するために、数多くの対照を使用でき、各々が標的ＲＮＡの異なる閾値レベルの検出を設定し、したがって、そのような一連の反応は、試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定するために使用することができる（例えば、そのような一連の反応を、標的ＲＮＡが試料中に『少なくともＸの濃度で』存在することを決定するために使用することができる）。
【００６６】
標識された検出ＲＮＡ
いくつかの場合において、対象の方法は、試料（例えば、標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む試料）を、ｉ）標識された検出ＲＮＡ、ｉｉ）Ｃ２ｃ２タンパク質、及びｉｉｉ）Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ）と接触させることを含む。例えば、いくつかの場合において、対象の方法は、試料を、蛍光−発光染料対を含む標識された検出ＲＮＡと接触させること、Ｃ２ｃ２タンパク質が、活性化された後標識された検出ＲＮＡを切断すること（標的ＲＮＡとハイブリダイズするガイドＲＮＡの状況においてＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに結合することによって）、及び、測定される検出可能なシグナルが、蛍光−発光染料対によって生じることを含む。例えば、いくつかの場合において、対象の方法は、試料を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対もしくは消光剤／蛍光体対またはその両方を含む標識された検出ＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合において、対象の方法は、試料を、ＦＲＥＴ対を含む標識された検出ＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合において、対象の方法は、試料を、蛍光体／消光剤対を含む標識された検出ＲＮＡと接触させることを含む。蛍光−発光染料対は、ＦＲＥＴ対または消光剤／蛍光体対を含む。ＦＲＥＴ対と消光剤／蛍光体対の両方の場合において、染料の一方の発光スペクトルは、対の他方の染料の吸収スペクトルの領域と重なる。本明細書において使用されるとき、用語「蛍光−発光染料対」は、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対」と「消光剤／蛍光体対」との両方を包含するために使用される一般的な用語であり、両方の用語は、以下により詳細に論じられる。用語「蛍光−発光対」は、語句「ＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対」と交換可能に使用される。
【００６７】
いくつかの場合において（例えば、検出ＲＮＡがＦＲＥＴ対を含むとき）、標識された検出ＲＮＡは、切断される前にある量の検出可能なシグナルを生じ、測定された検出可能なシグナルの量は、標識された検出ＲＮＡが切断されるときに低減する。いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生じ（例えば、ＦＲＥＴ対から）、標識された検出ＲＮＡが切断されるときに第２の検出可能なシグナルを生じる（例えば、消光剤／蛍光体対から）。したがって、いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、ＦＲＥＴ対及び消光剤／蛍光体対を含む。
【００６８】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む。ＦＲＥＴは、それによって、励起状態のフルオロフォアからごく近接した第２の発色団へと、無放射のエネルギーの移動が起こるプロセスである。エネルギー移動が起こり得る範囲は、約１０ナノメートル（１００オングストローム）に限定され、移動の効率は、フルオロフォア間の分離距離に極めて高感度である。このように、本明細書において使用されるとき、用語「ＦＲＥＴ」（「蛍光共鳴エネルギー移動」、「Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」としても知られる）は、ドナーの発光スペクトルが、アクセプターの励起スペクトルと重なるように選択され、さらに、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動のいくらかが量子カップリング効果を介するため、ドナーとアクセプターとが互いにごく近接するとき（通常１０ｎｍ以下）、ドナーの励起がアクセプターの励起及び発光を引き起こすように選択される、ドナーフルオロフォアと適合するアクセプターフルオロフォアを含む物理的現象を指す。このように、ＦＲＥＴシグナルは、ドナーとアクセプターとの近接さの基準としての役割を果たし、それらが互いに近接したときにのみシグナルが生じる。ＦＲＥＴドナー部分（例えば、ドナーフルオロフォア）及びＦＲＥＴアクセプター部分（例えば、アクセプターフルオロフォア）は、本明細書において、まとめて「ＦＲＥＴ対」と呼ばれる。
【００６９】
ドナー−アクセプター対（ＦＲＥＴドナー部分とＦＲＥＴアクセプター部分）は、本明細書において「ＦＲＥＴ対」または「シグナルＦＲＥＴ対」と呼ばれる。このように、いくつかの場合において、一方のシグナルパートナーがＦＲＥＴドナー部分であり、かつ他方のシグナルパートナーがＦＲＥＴアクセプター部分である場合、対象の標識された検出ＲＮＡは、２つのシグナルパートナー（シグナル対）を含む。したがって、そのようなＦＲＥＴ対（ＦＲＥＴドナー部分とＦＲＥＴアクセプター部分）を含む対象の標識された検出ＲＮＡは、シグナルパートナーがごく近接する（例えば、同一のＲＮＡ分子内で）とき、検出可能なシグナル（ＦＲＥＴシグナル）を示すが、シグナルは、パートナーが分離するとき（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質によるＲＮＡ分子の切断の後）、低減する（または非存在となる）。
【００７０】
ＦＲＥＴのドナーとアクセプターとの部分（ＦＲＥＴ対）は、当業者に公知であり、任意の都合が良いＦＲＥＴ対（例えば、任意の都合が良いドナー部分とアクセプター部分との対）が使用できる。好適なＦＲＥＴ対の例は、表１に提示されるものを含むが、これらに限定されない。Ｂａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１６  Ｓｅｐ１４；１６（９）；及びＡｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５  Ａｕｇ３；１０（８）：ｅ０１３４４３６もまた参照できる。
【００７１】
【表１】
2019522472.tif 000003
【００７２】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡが切断されるとき（例えば、いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡが消光剤／蛍光体対を含む）、検出可能なシグナルが生じる。シグナル消光対の一方のシグナルパートナーは、検出可能なシグナルを生じ、他方のシグナルパートナーは、第１のシグナルパートナーの検出可能なシグナルを消光する消光部分である（すなわち、消光部分は、シグナル部分のシグナルを消光し、シグナルパートナーが互いに近接するとき、例えば、シグナル対のシグナルパートナーがごく接近するとき、シグナル部分からのシグナルが低減（消光）されるようにする）。
【００７３】
例えば、いくつかの場合において、検出可能なシグナルの量が、標識された検出ＲＮＡが切断されるときに増加する。例えば、いくつかの場合において、一方のシグナルパートナー（シグナル部分）によって示されるシグナルは、例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質による切断前に、両方が同一のＲＮＡ分子上に存在するとき、他方のシグナルパートナー（消光剤シグナル部分）によって消光される。そのようなシグナル対は、本明細書において、「消光剤／蛍光体対」、「消光対」、または「シグナル消光対」と呼ばれる。例えば、いくつかの場合において、１つのシグナルパートナー（例えば、第１のシグナルパートナー）は、第２のシグナルパートナー（例えば、消光剤部分）によって消光されている、検出可能なシグナルを生じるシグナル部分である。このように、そのような消光剤／蛍光体対のシグナルパートナーは、パートナーが分離したとき（例えばＣ２ｃ２タンパク質による検出ＲＮＡの切断後）、検出可能なシグナルを生じるが、シグナルは、パートナーがごく接近するとき（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質による検出ＲＮＡの切断前）、消光される。
【００７４】
消光剤部分は、シグナル部分からのシグナルを、（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質による検出ＲＮＡの切断前に）様々な度合いで消光することができる。いくつかの場合において、消光剤部分はシグナル部分からのシグナルを消光し、ここで、消光剤部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接するとき）で検出されるシグナルは、消光剤部分の非存在下（シグナルパートナーが分離しているとき）で検出されるシグナルの９５％以下である。例えば、いくつかの場合において、消光剤部分の存在下で検出されるシグナルは、消光剤部分の非存在下で検出されるシグナルの、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下であり得る。いくつかの場合において、消光剤部分の存在下で、全くシグナルが検出されない（例えば、バックグラウンドを超えて）。
【００７５】
いくつかの場合において、消光剤部分の非存在下（シグナルパートナーが分離しているとき）で検出されるシグナルは、消光剤部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接しているとき）で検出されるシグナルよりも、少なくとも１．２倍大きい（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍大きい）。
【００７６】
いくつかの場合において、シグナル部分は、蛍光標識である。いくつかのそのような場合、消光剤部分は、蛍光標識からのシグナル（光シグナル）を消光する（例えば、標識の発光スペクトルにおけるエネルギーを吸収することによって）。したがって、消光剤部分がシグナル部分と近接していないとき、蛍光標識からの発光（シグナル）は、シグナルが消光剤部分によって吸収されないので検出可能である。任意の都合が良いドナーアクセプター対（シグナル部分／消光剤部分対）を使用することができ、多くの好適な対は、当該技術分野において公知である。
【００７７】
いくつかの場合において、消光剤部分は、シグナル部分（本明細書において「検出可能な標識」とも呼ばれる）からのエネルギーを吸収して、シグナル（例えば、異なる波長での光）を放出する。このように、いくつかの場合において、消光剤部分は、それ自体がシグナル部分（例えば、シグナル部分は６−カルボキシフルオレセインであり得、一方で消光剤部分は、６−カルボキシ−テトラメチルローダミンであり得る）であり、いくつかのそのような場合において、対はまた、ＦＲＥＴ対であり得る。いくつかの場合において、消光部分はダーククエンチャーである。ダーククエンチャーは、励起エネルギーを吸収し、そしてエネルギーを異なる方法で（例えば、熱として）消散させることができる。このように、ダーククエンチャーは、最小限から全くないものまで、それ自体の蛍光を有する（蛍光を放出しない）。ダーククエンチャーの例は、米国特許第８，８２２，６７３号、及び米国特許第８，５８６，７１８号、米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、米国特許出願公開第２０１４０３４９２９５号、及び米国特許出願公開第２０１４０１９４６１１号、ならびに国際特許出願：ＷＯ２００１４２５０５及びＷＯ２００１８６００１においてさらに記載され、これら全てが参照により、その全体として本明細書に組み込まれる。
【００７８】
蛍光標識の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、パシフィックオレンジ、量子ドット、及び係留蛍光タンパク質を含むが、これらには限定されない。
【００７９】
いくつかの場合において、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、及びパシフィックオレンジから選択される蛍光標識である。
【００８０】
いくつかの場合において、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、パシフィックオレンジ、量子ドット、及び係留蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である。
【００８１】
ＡＴＴＯ染料の例は、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、及びＡＴＴＯ  ７４０を含むが、これらには限定されない。
【００８２】
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ染料の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０下を含むが、これらには限定されない。
【００８３】
消光剤部分の例は、ダーククエンチャー、ブラックホール消光剤（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌ消光剤、ＡＴＴＯ消光剤（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、アイオワブラックＲＱ、アイオワブラックＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ染料（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金ナノ粒子等の金属クラスター等を含むが、これらには限定されない。
【００８４】
いくつかの場合において、消光剤部分は、ダーククエンチャー、ブラックホール消光剤（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌ消光剤、ＡＴＴＯ消光剤（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、アイオワブラックＲＱ、アイオワブラックＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ染料（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金属クラスターから選択される。
【００８５】
ＡＴＴＯ消光剤の例は、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑを含むが、これらには限定されない。ブラックホール消光剤（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））の例は、ＢＨＱ−０（４９３ｎｍ）、ＢＨＱ−１（５３４ｎｍ）、ＢＨＱ−２（５７９ｎｍ）、及びＢＨＱ−３（６７２ｎｍ）を含むが、これらには限定されない。
【００８６】
いくつかの検出可能な標識（例えば蛍光染料）及び／または消光剤部分の例として、Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２００９；１１：２５−４７、ならびに、米国特許第８，８２２，６７３号及び米国特許第８，５８６，７１８号；米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、米国特許出願公開第２０１４０３４９２９５号、米国特許出願公開第２０１４０１９４６１１号、米国特許出願公開第２０１３０３２３８５１号、米国特許出願公開第２０１３０２２４８７１号、米国特許出願公開第２０１１０２２３６７７号、米国特許出願公開第２０１１０１９０４８６号、米国特許出願公開第２０１１０１７２４２０号、米国特許出願公開第２００６０１７９５８５号、及び米国特許出願公開第２００３０００３４８６号、ならびに国際特許出願ＷＯ２００１４２５０５及びＷＯ２００１８６００１を参照でき、これらの全ては参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡの切断は、比色定量の読み取りを測定することによって検出できる。例えば、フルオロフォアの解放（例えば、ＦＲＥＴ対からの解放、消光剤／蛍光体対からの解放等）は、検出可能なシグナルの波長のシフトをもたらす（そしてしたがって、色のシフト）。このように、いくつかの場合において、対象の標識された検出ＲＮＡの切断は、色のシフトによって検出することができる。そのようなシフトは、１つの色（波長）のシグナルの量の消失、別の色の量の増加、１つの色の他の色に対する比率の変化等として表される。
【００８８】
核酸修飾
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、核酸に新規または増強された特徴（例えば改善された安定性）をもたらすために、１つ以上の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾等を含む。当該技術分野において公知なように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、ヘテロ環の塩基である。そのようなヘテロ環の塩基の２つの最も共通のクラスは、プリンとピリミジンとである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分へと連結することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、直鎖状のポリマー化合物を形成する。同様に、この直鎖状ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに結合して環状化合物を形成することができるが、直鎖状化合物が一般的に好適である。さらに直鎖状化合物は、内部のヌクレオチド塩基の相補性を有し得、したがって、完全に、または部分的に二本鎖化合物を生じるような様式で折りたたみ得る。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の骨格を形成するものとして一般に言及される。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合または骨組みは、３’から５’のホスホジエステル結合である。
【００８９】
修飾された骨組み及び修飾されたヌクレオシド間結合
好適な修飾の例は、修飾された核酸骨格及び非天然ヌクレオシド間結合を含む。修飾された骨格を有する核酸は、骨格にリン原子を保持するもの、及び骨格にリン原子を有さないものを含む。
【００９０】
内部にリン原子を含む好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートを含むメチル及び他のアルキルのホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミド酸及びアミノアルキルホスホロアミド酸を含むホスホロアミド酸、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノリン酸及びボラノリン酸、２’−５’結合するそれらの類似体、ならびに、１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’〜３’、５’〜５’、または２’〜２’の結合である、反転した極性を有するものを含む。反転した極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’〜３’結合を有し、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を有する（核酸塩基は、それらの位置において、ヒドロキシル基を喪失するか、または有する）。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウム等）、混合した塩、及び遊離酸の形態もまた含まれる。
【００９１】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に−ＣＨ2 −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−Ｏ−ＣＨ2 −（メチレン（メチルイミノ）として知られる）またはＭＭＩ骨格）、−ＣＨ2 −Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −ＣＨ2 −を含む（ここで、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ2 −として表される）。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合は、上で参照される米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。好適なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
【００９２】
例えば米国特許第５，０３４，５０６号に記載されているようなモルホリノ骨格構造を有する核酸もまた同様に好適である。例えば、いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。いくつかの場合において、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合を置き換える。
【００９３】
内部にリン原子を含まない好適な修飾されたポリヌクレオチドの骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ2 構成要素部分を有する他のものを有するものを含む。
【００９４】
模倣物
標識された検出ＲＮＡは核酸模倣物であり得る。ポリヌクレオチドに適用されるとき、用語「模倣物」は、フラノース環のみ、またはフラノース環とヌクレオチド間結合が、非フラノース基によって置き換えられているポリヌクレオチドを含むことを意図し、フラノース環のみの置き換えは、当該技術分野において、糖代替物と呼ばれる。ヘテロ環塩基部分、または修飾されたヘテロ環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、１つのそのような核酸、すなわちポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格によって置き換えられる。ヌクレオチドが保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。
【００９５】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている、１つのポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、２つ以上結合したアミノエチルグリシン単位であり、それはＰＮＡにアミド含有骨格をもたらす。ヘテロ環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を記載する代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、米国特許第５，７１４，３３１号、及び米国特許第５，７１９，２６２号を含むが、これらには限定されない。
【００９６】
研究されている別のクラスのポリヌクレオチド模倣物は、モルホリノ環に結合するヘテロ環塩基を有する結合したモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を結合する多くの結合基が報告されている。結合基の１つのクラスは、非イオン性オリゴマー化合物をもたらすために選択されている。非イオン性のモルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望まれない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望まれない相互作用を形成する可能性が低い、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。モルホリノのクラスのポリヌクレオチド内で、モノマーサブユニットを連結する様々な異なる結合基を有する様々な化合物が調製されている。
【００９７】
ポリヌクレオチド模倣物のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。通常ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に存在するフラノース環は、シクロヘキシル環によって置き換えられる。古典的なホスホラミダイト化学に従って、ＣｅＮＡ  ＤＭＴに保護されるホスホラミダイトモノマーが調製され、オリゴマー化合物合成に使用されている。特異的な位置をＣｅＮＡによって修飾されている完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物、及びオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照）。一般的に、ＣｅＮＡモノマーのＤＮＡ鎖への組込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加する。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体と同様の安定性で、ＲＮＡ及びＤＮＡの相補体と複合体を形成する。天然の核酸構造へのＣｅＮＡ構造の組込みの研究は、簡単な立体配置の適用と共に進むことが、ＮＭＲ及び円偏光二色性によって示されている。
【００９８】
さらなる修飾は、２’−ヒドロキシル基が、糖環の４’炭素原子に結合し、それによって２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、それによって二環糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ2 −）基であり得、ここでｎは１または２である（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡと共に非常に高い二重鎖の熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼの分解に対する安定性、及び良好な溶解度特性を示す。ＬＮＡを含む強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
【００９９】
ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミジン、及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー形成、及び核酸認識特性と共に、記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＬＮＡ及びそれらの調製はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【０１００】
修飾された糖部分
標識された検出ＲＮＡはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル、またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換されていても置換されていなくてもよい、Ｃ．ｓｕｂ．１〜Ｃ10アルキル、またはＣ2 〜Ｃ10アルケニル及びアルキニルから選択される糖置換基を含む。Ｏ（（ＣＨ2 ）n Ｏ）m ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＮＨ2 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＮＨ2 、及びＯ（ＣＨ2 ）n ＯＮ（（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 ）2 が特に好適であり、ここでｎ及びｍは１〜約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ1 〜Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3 、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3 、ＯＣＦ3 、ＳＯＣＨ3 、ＳＯ2 ＣＨ3 、ＯＮＯ2 、ＮＯ2 、Ｎ3 、ＮＨ2 、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を向上させるための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＣＨ3 （２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる））（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾は、例として、本明細書において以下の例に記載されるような、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ2 ）2 ＯＮ（ＣＨ3 ）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ2 −Ｏ−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）2 を含む。
【０１０１】
他の好適な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ3 ）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ2 ）、アリル（−ＣＨ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、及びフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位においてであり得る。好適な２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物の他の位置、特に３’末端ヌクレオシドの糖の３’位、または、２’−５’結合オリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位においてなされ得る。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにおけるシクロブチル部分等の糖模倣物を有し得る。
【０１０２】
塩基の修飾及び置換
標識された検出ＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野においてしばしば簡単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用されるとき、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及び他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン等の他の合成及び天然の核酸塩基を含む。さらなる修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピラミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）等のＧ−クランプを含む。
【０１０３】
ヘテロ環塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンによって置換されているものも含み得る。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは、オリゴマー化合物の結合親和性を向上するために有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃向上することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるとき、安定な塩基置換である。
【０１０４】
２つの異なる標的ＲＮＡの検出
上述のように、いくつかの場合において、本開示の方法は、試料中の２つの異なる標的ＲＮＡ（第１の一本鎖標的ＲＮＡ及び第２の一本鎖標的ＲＮＡ）の実質的に同時の検出を提供する。いくつかの場合において、方法は、ａ）試料（例えば、２つの異なる標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む試料）を、（ｉ）試料中に存在するアデニン＋ＲＮＡ（すなわち、Ａを含むＲＮＡであるが、ポリＵ  ＲＮＡ等のＡを欠くＲＮＡではない）を切断する第１のＣ２ｃ２タンパク質、（ｉｉ）ウラシル＋ＲＮＡ（すなわち、Ｕを含むＲＮＡであるが、ポリＡ  ＲＮＡ等のＵを欠くＲＮＡではない）を切断する第２のＣ２ｃ２タンパク質、（ｉｉｉ）第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、ならびに（ｉｖ）第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡと接触させること、ならびに、ｂ）第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質によって媒介されるＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含み、ここで第１の検出可能なシグナルは第１のＣ２ｃ２タンパク質によって生じ、第２の検出可能なシグナルは第２のＣ２ｃ２タンパク質によって生じ、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルとは互いに区別できる。いくつかの場合において、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、第１のＣ２ｃ２タンパク質はＡを含むｓｓＲＮＡを切断し（例えば、Ａを欠くｓｓＲＮＡを切断しない）、かつ第２のＣ２ｃ２タンパク質は、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、第２のＣ２ｃ２タンパク質はＵを含むｓｓＲＮＡを切断する（例えば、Ｕを欠くｓｓＲＮＡを切断しない）。いくつかの場合において、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、第１のＣ２ｃ２タンパク質はＵを含むｓｓＲＮＡを切断し（例えば、Ｕを欠くｓｓＲＮＡを切断しない）、かつ第２のＣ２ｃ２タンパク質は、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、第２のＣ２ｃ２タンパク質はＡを含むｓｓＲＮＡを切断する（例えば、Ａを欠くｓｓＲＮＡを切断しない）。
【０１０５】
いくつかの場合において、方法はまた、試料を、ｉ）第１のＦＲＥＴ対及び／または第１の消光剤／蛍光体対（例であるＦＲＥＴ対及び消光剤／蛍光体対は上述される）を含む第１の標識された検出ＲＮＡ、ならびにｉｉ）第２のＦＲＥＴ対及び／または第２の消光剤／蛍光体対（例であるＦＲＥＴ対及び消光剤／蛍光体対は上述される）を含む第２の標識された検出ＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＡを含み、Ｕを含まず、一方で第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＵを含み、Ａを含まない。いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＵを含み、Ａを含まず、一方で第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＡを含み、Ｕを含まない。第１のＣ２ｃ２タンパク質は第１の標識された検出ＲＮＡを切断し、第１の検出可能なシグナルは、第１のＦＲＥＴ対及び／または第１の消光剤／蛍光体対によって生じ、第２のＣ２ｃ２タンパク質は第２の標識された検出ＲＮＡを切断し、第２の検出可能なシグナルは、第２のＦＲＥＴ対及び／または第２の消光剤／蛍光体対によって生じる。第１の検出可能なシグナルの検出は、第１の標的ＲＮＡの試料における存在を示し、第２の検出可能なシグナルの検出は、第２の標的ＲＮＡの試料における存在を示す。いくつかの場合において、検出された第１及び第２のシグナルの相対量は、試料における第１の標的ＲＮＡの第２の標的ＲＮＡに対する比を示す。
【０１０６】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、第２の標識された検出ＲＮＡの標識と区別できる標識を含む。例えば、第１の標識された検出ＲＮＡは、第１のＦＲＥＴ対及び／または第１の消光剤／蛍光体対を含み得、第２の標識された検出ＲＮＡは、第２のＦＲＥＴ対及び／または第２の消光剤／蛍光体対を含み得る。１つの非限定的な例として、第１の標識された検出ＲＮＡは、トリプトファンを含むドナーとダンシルを含むアクセプターとを含み得、第２の標識された検出ＲＮＡは、ＩＡＥＤＡＮＳを含むドナーとＤＤＰＭを含むアクセプターとを含み得る。別の非限定的な例として、第１の標識された検出ＲＮＡは、ダンシルを含むドナーとＦＩＴＣを含むアクセプターとを含み、第２の標識された検出ＲＮＡは、Ｃｙ３を含むドナーとＣｙ５を含むアクセプターとを含む。いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、５’ＦＡＭ（フルオレセイン）−３’ＩＢＦＱ（アイオワブラック（登録商標）ＦＱ）の消光剤／蛍光体対を含み、いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、５’ＦＡＭ（フルオレセイン）−３’ＩＢＦＱ（アイオワブラック（登録商標）ＦＱ）の消光剤／蛍光体対を含む。
【０１０７】
いくつかの場合において、第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、同時に試料に添加される（実質的に同時の接触）。いくつかのそのような場合において、第１及び第２の標識された検出ＲＮＡによって生じるシグナルは、同時（実質的に同時の接触）に検出され、これは、例えば、そのような場合において、第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、区別できるように標識され得るためである。
【０１０８】
「実質的に同時」は、約５分以内、約３分以内、約２分以内、約１分以内、約３０秒以内、約１５秒以内、約１０秒以内、約５秒以内、または約１秒以内を指す。
【０１０９】
しかしながら、いくつかの場合において、第１及び第２の標識された検出ＲＮＡによって生じるシグナルは、同時に検出されず、代わりに、連続的に検出される（一方が他方の前に）。例えば、いくつかの場合において、第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、同時に試料に添加されず、代わりに連続的に添加され（例えば、第２の標識された検出ＲＮＡは、第１の標識された検出ＲＮＡを添加した後に添加できる）、いくつかのそのような場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、第１の標識された検出ＲＮＡによって生じるシグナルが検出される後まで添加されない。このように、いくつかの場合において、第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、区別できるように標識されている必要はなく（例えば、いくつかの場合において、それらは、同一の検出可能なシグナルを生じ、例えば、同一の波長の蛍光を発する）、これはシグナルが連続的に検出されるためである。
【０１１０】
例示的な例として、ある場合において、（ｉ）第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、区別できるように標識されず、（ｉｉ）試料を一方の標識された検出ＲＮＡと接触させ、その標識された検出ＲＮＡによって生じるシグナルが検出され（例えば、測定され）、（ｉｉｉ）次いで、試料を他方の標識された検出ＲＮＡと接触させ、第２の添加された標識された検出ＲＮＡによって生じるシグナルが検出され、したがって、両方の標的ｓｓＲＮＡが試料中に存在するとき、第２の標識された検出ＲＮＡの添加がシグナルの増強をもたらし得（例えば、シグナルが、増加した切断と共に向上する場合、例えば蛍光体／消光剤対）、または第２の標識された検出ＲＮＡの添加に続き、シグナルの検出可能な低下をもたらし得る（例えば、シグナルが、増加した切断と共に低下する場合、例えばＦＲＥＴ対）。
【０１１１】
第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ結合に関して、互いに直交性であり得る。そのような場合、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに結合せず、第２のＣ２ｃ２タンパク質は第１のガイドＲＮＡに結合しない。第１のＣ２ｃ２タンパク質及び第２のＣ２ｃ２タンパク質はまた、それらのｓｓＲＮＡ切断の選好性において互いに異なることもあり得、Ｃ２ｃ２タンパク質の一方がＡでｓｓＲＮＡを切断し、他方のＣ２ｃ２タンパク質がＵでｓｓＲＮＡを切断するようになし得る。
【０１１２】
Ｃ２ｃ２タンパク質の直交性対の説明は、図４４Ｅに見出され得る。
【０１１３】
本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質の直交性対の非限定的な例は、以下の表１０に描写されるものを含む。切断選好性は、Ｃａｓ１３ａタンパク質の名称に続く括弧で表される。例えば、「Ｌｂａ（Ａ）」は、ＡでｓｓＲＮＡを切断するＬｂａ  Ｃａｓ１３ａタンパク質を指し、「Ｌｂｕ（Ｕ）」は、ＵでｓｓＲＮＡを切断するＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａタンパク質を指す。
【０１１４】
【表２】
2019522472.tif 000004
【０１１５】
第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、各々独立して、２〜１００リボヌクレオチドの長さ（例えば、２〜８０、２〜６０、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、または２〜１０リボヌクレオチド）を有し得る。第１及び第２の標識された検出ＲＮＡは、各々独立して２リボヌクレオチド〜１００リボヌクレオチド、例えば、２リボヌクレオチド〜５リボヌクレオチド、５リボヌクレオチド〜７リボヌクレオチド、７リボヌクレオチド〜１０リボヌクレオチド、１０リボヌクレオチド〜１５リボヌクレオチド、１５リボヌクレオチド〜２０リボヌクレオチド、２０リボヌクレオチド〜２５リボヌクレオチド、２５リボヌクレオチド〜３０リボヌクレオチド、３０リボヌクレオチド〜３５リボヌクレオチド、３５リボヌクレオチド〜４０リボヌクレオチド、４０リボヌクレオチド〜４５リボヌクレオチド、または４５リボヌクレオチド〜５０リボヌクレオチドの長さを有し得る。
【０１１６】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは少なくとも１つのＡ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のＡ）を含み、Ｕを欠き、第２の標識された検出ＲＮＡは少なくとも１つのＵ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４のＵ）を含み、Ａを欠く。
【０１１７】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡはＵを欠き、２〜１５の連続的なＡ（例えば、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、または４〜６の連続的なＡ）の区間を含む。いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、Ｕを欠き、少なくとも２の連続的なＡ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の連続的なＡ）の区間を含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡはＡを欠き、２〜１５の連続的なＵ（例えば、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、または４〜６の連続的なＵ）の区間を含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、Ａを欠き、少なくとも２の連続的なＵ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の連続的なＵ）の区間を含む。
【０１１８】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡはＡを欠き、２〜１５の連続的なＵ（例えば、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、または４〜６の連続的なＵ）の区間を含む。いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、Ａを欠き、少なくとも２の連続的なＵ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の連続的なＵ）の区間を含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡはＵを欠き、２〜１５の連続的なＡ（例えば、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、または４〜６の連続的なＡ）の区間を含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、Ｕを欠き、少なくとも２の連続的なＡ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の連続的なＡ）の区間を含む。
【０１１９】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＵを含み、Ａを欠き、第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＡを含み、Ｕを欠く。
【０１２０】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＡを含み、Ｕを欠く。例えば、いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、ホモアデノシンポリマー（ポリＡ  ＲＮＡ）である。別の例として、第１の標識された検出ＲＮＡは、ｉ）少なくとも１つのＡを含み、ｉｉ）Ｕを欠き、かつｉｉｉ）１つ以上のＣ及び／またはＧを含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＵを含み、Ａを欠く。例えば、いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、ホモウリジンポリマー（ポリＵ  ＲＮＡ）である。別の例として、第２の標識された検出ＲＮＡは、ｉ）少なくとも１つのＵを含み、ｉｉ）Ａを欠き、かつｉｉｉ）１つ以上のＣ及び／またはＧを含む。
【０１２１】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＵを含み、Ａを欠く。例えば、いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、ホモウリジンポリマー（ポリＵ  ＲＮＡ）である。別の例として、第２の標識された検出ＲＮＡは、ｉ）少なくとも１つのＵを含み、ｉｉ）Ａを欠き、かつｉｉｉ）１つ以上のＣ及び／またはＧを含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも１つのＡを含み、Ｕを欠く。例えば、いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、ホモアデノシンポリマー（ポリＡ  ＲＮＡ）である。別の例として、第２の標識された検出ＲＮＡは、ｉ）少なくとも１つのＡを含み、ｉｉ）Ｕを欠き、かつｉｉｉ）１つ以上のＣ及び／またはＧを含む。
【０１２２】
上述のように、本開示の方法は、試料を、第１のＣ２ｃ２タンパク質、第２のＣ２ｃ２タンパク質、第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列、及び、本明細書において「定常領域」または「ハンドル」と呼ばれる、第１のＣ２ｃ２タンパク質と結合する第２のヌクレオチド配列を含む第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、ならびに、第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列、及び第２のＣ２ｃ２タンパク質と結合する第２のヌクレオチド配列（ハンドル）を含む第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに接触させることを含み得る。
【０１２３】
例えば、いくつかの場合において、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１３ａポリペプチドであり、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＧＡＵＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＵＡＡＣ（配列番号１６）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む定常領域（「ハンドル」−Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでｃｒＲＮＡは、約２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、または３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ｃｒＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＧＡＵＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＵＡＡＣ（配列番号１６）を有し、２７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＡＡＣＡＡＵＣＣＣＣＧＵＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＡＣＵＧＣＡＡＣ（配列番号１７）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含む。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＵＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＡＡＣＣ（配列番号１８）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含む。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＵＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＡＣＵＡＣＡＡＣ（配列番号１９）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含���ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＵＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＡＣＵＡＣＡＡＣ（配列番号１９）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）を含むハンドルを含み、ハンドルは３１ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、���なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）を含むハンドルを含み、ハンドルは３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、または２９ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）を含むハンドルを含み、ハンドルは２７ｎｔの長さを有する。
【０１２４】
別の例として、いくつかの場合において、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１３ａポリペプチドであり、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＧＵＡＧＣＣＣＧＡＵＡＵＡＧＡＧＧＧＣＡＡＵＡＡＣ（配列番号２３）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、または３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ハンドルは、ヌクレオチド配列ＡＡＧＵＡＧＣＣＣＧＡＵＡＵＡＧＡＧＧＧＣＡＡＵＡＡＣ（配列番号２３）を有し、２７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１３ａポリペプチドであり、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＵＡＣＡＧＣＵＣＧＡＵＡＵＡＧＵＧＡＧＣＡＡＵＡＡＧ（配列番号２４）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、または３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ハンドルは、ヌクレオチド配列ＡＵＡＣＡＧＣＵＣＧＡＵＡＵＡＧＵＧＡＧＣＡＡＵＡＡＧ（配列番号２４）を有し、２７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＡＡＣＡＡＵＣＣＣＣＧＵＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＡＣＵＧＣＡＡＣ（配列番号１７）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、または３５ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＡＡＣＡＡＵＣＣＣＣＧＵＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＡＣＵＧＣＡＡＣ（配列番号１７）を含むハンドルを含み、ハンドルは３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＵＣＡＣＡＵＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＡＡＣＣ（配列番号２５）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、３５ｎｔ、３６ｎｔ、または３７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＵＣＡＣＡＵＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＡＡＣＣ（配列番号２５）を含むハンドルを含み、ハンドルは３４ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＵＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＡＣＵＡＣＡＡＣ（配列番号１９）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＵＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＡＣＵＡＣＡＡＣ（配列番号１９）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）を含むハンドルを含み、ハンドルは３１ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）を含むハンドルを含み、ハンドルは３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、または２９ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）を含むハンドルを含み、ハンドルは２７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＵＡＣＣＵＣＵＡＵＡＵＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号７）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＵＡＣＣＵＣＵＡＵＡＵＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号７）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。
【０１２５】
別の例として、いくつかの場合において、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１３ａポリペプチドであり、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＡＵＡＵＡＧＡＧＧＧＣＡＡＵＡＧＡＣ（配列番号２６）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、２９ｎｔ、または３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、ハンドルは、ヌクレオチド配列ＧＡＡＣＡＧＣＣＣＧＡＵＡＵＡＧＡＧＧＧＣＡＡＵＡＧＡＣ（配列番号２６）を有し、２８ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＡＡＣＡＡＵＣＣＣＣＧＵＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＡＣＵＧＣＡＡＣ（配列番号１７）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約３０ｎｔ、３１ｎｔ、３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、または３５ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＵＡＡＣＡＡＵＣＣＣＣＧＵＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＡＣＵＧＣＡＡＣ（配列番号１７）を含むハンドルを含み、ハンドルは３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＵＣＡＣＡＵＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＡＡＣＣ（配列番号２５）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約３２ｎｔ、３３ｎｔ、３４ｎｔ、３５ｎｔ、３６ｎｔ、または３７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＵＣＡＣＡＵＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＧＡＣＵＧＡＡＣＣ（配列番号２５）を含むハンドルを含み、ハンドルは３４ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＵＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＡＣＵＡＣＡＡＣ（配列番号１９）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＡＡＵＵＡＵＣＣＣＡＡＡＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＡＣＵＡＣＡＡＣ（配列番号１９）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＧＵＡＣＣＵＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２０）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）を含むハンドルを含み、ハンドルは３１ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＵＵ（配列番号２１）を含むハンドルを含み、ハンドルは３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含む（例えば、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）から１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、または５ｎｔのみの違いを有するヌクレオチド配列を含む）ハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２５ｎｔ、２６ｎｔ、２７ｎｔ、２８ｎｔ、または２９ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号２２）を含むハンドルを含み、ハンドルは２７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＵＡＣＣＵＣＵＡＵＡＵＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号７）からわずか１ヌクレオチド（ｎｔ）、わずか２ｎｔ、わずか３ｎｔ、わずか４ｎｔ、またはわずか５ｎｔの違いを有するヌクレオチド配列を含むハンドル（Ｃａｓ１３ａポリペプチドに結合するヌクレオチドの区間）を含み、ここでハンドルは、約２８ｎｔ、２９ｎｔ、３０ｎｔ、３１ｎｔ、または３２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合において、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、ヌクレオチド配列ＧＡＣＵＡＣＣＵＣＵＡＵＡＵＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号７）を含むハンドルを含み、ハンドルは３０ｎｔの長さを有する。
【０１２６】
多重化
上述のように、いくつかの場合において、本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＲＮＡ及び複数の非標的ＲＮＡを含む試料）を、ｉ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、及び（ｉｉ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断し、試料のＲＮＡをも切断する、Ｃ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含む。
【０１２７】
いくつかの場合において、２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、アレイ（前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ）上に存在し得る。Ｃ２ｃ２タンパク質は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断することができる（例えば、図４及び図６を参照）。
【０１２８】
いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、または７以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ）を含む。所与のアレイのＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、同一の標的ＲＮＡの異なる標的部位を標的となし得（すなわちそれにハイブリダイズするガイド配列を含み得）（例えば、検出感度を向上することができる）、及び／または異なる標的ＲＮＡ分子を標的となし得る（例えば、転写物のファミリー（例えば、一塩基多型、一塩基多型（ＳＮＰ）等の多様性に基づく）、それらは、例えば、インフルエンザウイルスバリアント、ジカウイルスバリアント、ＨＩＶバリアント等の複数の系統のウイルスを検出するために使用することができる）。
【０１２９】
Ｃ２ｃ２タンパク質
Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡに結合し、（標的ＲＮＡにハイブリダイズする）ガイドＲＮＡによって一本鎖標的ＲＮＡに誘導され、それによって「活性化」される。Ｃ２ｃ２タンパク質のＨＥＰＮ１及びＨＥＰＮ２ドメインが無傷である場合、活性化されると、Ｃ２ｃ２タンパク質は、標的ＲＮＡを切断するが、非標的ＲＮＡもまた切断する。
【０１３０】
天然に存在するＣ２ｃ２タンパク質の例は図８に描写され、配列番号１〜６に記述されている。いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜６の任意の１つに記述されているアミノ酸配列と、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、好適なＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、好適なＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、好適なＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、好適なＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているＣａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、好適なＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているＨｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２タンパク質（例えば、配列番号２を参照）である。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜２、及び４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列を含む。
【０１３１】
いくつかの場合において、本開示の方法において使用されるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合において、本開示の方法において使用されるＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているＬｓｈ  Ｃ２ｃ２ポリペプチドに対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するＣ２ｃ２ポリペプチドではない。
【０１３２】
いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、方法のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって標的化されていないＲＮＡの切断において、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも１．２倍以上の倍率でより効率的である。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、方法のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって標的化されていないＲＮＡの切断において、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも１．５倍以上の倍率でより効率的である。いくつかの場合において、本開示の方法において使用されるＣ２ｃ２ポリペプチドは、活性化されるとき、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２よりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または３０倍を超えて、効率的に非標的ＲＮＡを切断する。
【０１３３】
いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１時間以内に、少なくとも５０％のＲＮＡ切断効率（例えば５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上の切断効率）を示す。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の４０分以内に、少なくとも５０％のＲＮＡ切断効率（例えば５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上の切断効率）を示す。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の３０分以内に、少なくとも５０％のＲＮＡ切断効率（例えば５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上の切断効率）を示す。
【０１３４】
いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３０秒〜６０分、例えば、１分〜６０分、３０秒〜５分、１分〜５分、１分〜１０分、５分〜１０分、１０分〜１５分、１５分〜２０分、２０分〜２５分、２５分〜３０分、３０分〜３５分、３５分〜４０分、４０分〜４５分、４５分〜５０分、５０分〜５５分、または５５分〜６０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３０秒〜５分の期間内（例えば、１分〜５分、例えば１分、２分、３分、４分、または５分の期間内）に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、５分〜１０分の期間内（例えば５分、６分、７分、８分、９分、または１０分の期間内）に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、１０分〜１５分の期間内（例えば１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、または１５分の期間内）に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、１５分〜２０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、２０分〜２５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、２５分〜３０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３０分〜３５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３５分〜４０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、４０分〜４５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、４５分〜５０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、５０分〜５５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、５５分〜６０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、１分未満の期間内、例えば５０秒〜５９秒、４０秒〜４９秒、３０秒〜３９秒、または２０秒〜２９秒の期間内に切断する。いくつかの場合において、切断は生理的条件下で起こる。いくつかの場合において、切断は、１５℃〜２０℃、２０℃〜２５℃、２５℃〜３０℃、３０℃〜３５℃、または３５℃〜４０℃の温度で起こる。いくつかの場合において、切断は、約３７℃で起こる。いくつかの場合において、切断は、約３７℃で起き、反応条件は、二価の金属イオンを含む。いくつかの場合において、二価の金属イオンはＭｇ2+である。いくつかの場合において、二価の金属イオンはＭｎ2+である。いくつかの場合において、反応条件のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ６である。いくつかの場合において、反応条件のｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ７である。いくつかの場合において、反応条件のｐＨは、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５である。いくつかの場合において、反応条件のｐＨは、ｐＨ７．５超である。
【０１３５】
用語「切断効率」は、Ｃ２ｃ２タンパク質が、適切なＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ／標的ＲＮＡハイブリダイゼーションによって活性化されていると、試料中のＲＮＡを迅速に切断するＣ２ｃ２タンパク質の能力を指すために方明細書において使用される。「切断効率」は、所与の期間内にタンパク質が切断し得るＲＮＡの量を指す。例えば、５０％切断効率は、５０％の所与のＲＮＡが、特定の期間内に切断されることを示す。例えば、ＲＮＡが試料中に１００μＭの開始濃度で存在する場合、５０％の切断は、５０μＭのＲＮＡが切断されているときに達成されている。別の例において、複数のＲＮＡ分子が試料中に存在する場合、５０％切断は、５０％のＲＮＡ分子が切断されているときに達成されており、効率は、ある特定のパーセントの全ＲＮＡが切断されるために必要とされる時間量の表現である。これは、任意の都合が良い方法によって測定することができ、多くのそのような方法は、当業者に公知である。例えば、標識された検出ＲＮＡが使用され得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ種（切断されたもの対切断されていないもの）は、ゲル上で分離することができ、切断されたＲＮＡの量は、切断されていないＲＮＡの量と比較することができ、例えば図３を参照できる。
【０１３６】
語句「Ｃ２ｃ２タンパク質が試料中に存在するＲＮＡの少なくともＸ％を切断する」（例えば、特定の期間内に）が使用されるとき、試料中に存在する『シグナル産生』ＲＮＡのＸ％が特定の期間内に切断されることを意味する。どのＲＮＡが『シグナル産生』ＲＮＡであるかは、使用される検出方法に依存し得る。例えば、標識された検出ＲＮＡが使用されるとき、標識された検出ＲＮＡは、唯一の『シグナル産生ＲＮＡ』となり得る。しかしながら、標識された検出ＲＮＡが試料のＲＮＡを表すために使用され、したがって、標識された検出ＲＮＡについて観察するものが、試料の非標的ＲＮＡに起きるものを代表すると仮定される。したがって、５０％の標識された検出ＲＮＡが切断されるとき、これは一般的に、５０％の『試料中に存在するＲＮＡ』が切断されているときを表すと仮定される。いくつかの場合において、一般的なＲＮＡ切断が測定され、したがって、全ての切断可能な試料のＲＮＡは『シグナル産生』ＲＮＡである。したがって、試料中に存在するＲＮＡの％が切断されることを指すとき、この値は任意の都合が良い方法を用いて測定でき、いずれの方法が使用されても、本明細書において、値は一般的に、酵素が試料中の切断可能な標的の半分を切断しているときを意味する。
【０１３７】
いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも（例えば非標的ＲＮＡの切断において）、１．２倍以上（例えば１．５倍以上、１．７倍以上、または２倍以上）の倍率でより効率的である。したがって、いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２タンパク質は、方法のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって標的化されていないＲＮＡの切断において、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも１．２倍以上（例えば、１．５倍以上、１．７倍以上、または２倍以上）の倍率でより効率的である。いくつかの場合において、本開示の方法において使用されるＣ２ｃ２ポリペプチドは、活性化されるとき、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２よりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または３０倍を超えて、効率的に非標的ＲＮＡを切断する。
【０１３８】
バリアントＣ２ｃ２ポリペプチド
バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１、２、及び４〜６のいずれか１つのバリアントを含み、ここでバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した（または検出できない）ヌクレアーゼ活性を示す。例えば、いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠く。別の例として、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、かつ触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。
【０１３９】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸の１、２、３、または４のアミノ酸置換を含む。配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における対応するアミノ酸は、容易に同定でき、例えば図２２Ｂを参照できる。例えば、配列番号２のＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３に対応する配列番号１（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１である。別の例として、配列番号２のＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３に対応する配列番号４（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２、及びＨ１０５７である。別の例として、配列番号２のＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３に対応する配列番号５（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９、及びＨ１０７４である。別の例として、配列番号２のＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３に対応する配列番号６（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４、及びＨ１０４９である。
【０１４０】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
【０１４１】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４８Ａ及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１４２】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５及びＨ４５０の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ及びＨ４５０Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０１６及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０２１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０１６Ａ及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位及び１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位及び１０１６位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ、Ｈ４５０Ａ、Ｒ１０１６Ａ、及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１４３】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４及びＨ４６９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ及びＨ４６９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０５２及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０５２Ａ及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２、及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位及び１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位及び１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ、Ｈ４６９Ａ、Ｒ１０５２Ａ、及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１４４】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７及びＨ４７２の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ及びＨ４７２Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０６９及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０６９Ａ及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９、及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位及び１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位及び１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ、Ｈ４７２Ａ、Ｒ１０６９Ａ、及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１４５】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４４及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４４Ａ及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４、及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４４Ａ、及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１４６】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の１、２、３、または４の置換を含み、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドが、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持するようにされている。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。例えば、いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満の、配列番号２に記述されているアミノ酸配列を有するＣ２ｃ２ポリペプチドによって示される非標的ＲＮＡのＲＮＡ誘導切断を示す。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１４７】
任意の上述したＣ２ｃ２ポリペプチドはまた、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する低減した能力（例えば、活性の喪失）をもたらす変異（例えば、以下にさらに詳述されるような、位置Ｒ１０７９、Ｒ１０７２、及びＫ１０８２のいずれか１つにおいて）を含み得る。
【０１４８】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する低減した能力を有する（例えば、以下の実施例ならびに関連する図２６Ｃ〜２６Ｄ、３５Ｄ、及び３７を参照）。例えば、いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０７９、Ｒ１０７２、及びＫ１０８２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１、２、または３のアミノ酸置換を含む。配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における対応するアミノ酸は、容易に同定できる。例えば、配列番号２のＲ１０７９、Ｒ１０７２、及びＫ１０８２に対応する配列番号１（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ１０４８、Ｒ１０４１、及びＫ１０５１である。別の例として、配列番号２のＲ１０７９、Ｒ１０７２、及びＫ１０８２に対応する配列番号４（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ１０８５、Ｒ１０７８、及びＫ１０８８である。別の例として、配列番号２のＲ１０７９、Ｒ１０７２、及びＫ１０８２に対応する配列番号５（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ１０９９、Ｒ１０９２、及びＫ１１０２である。別の例として、配列番号２のＲ１０７９及びＲ１０７２に対応する配列番号６（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ１１７２及びＲ１１６５である。
【０１４９】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０７９、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０７９Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０７２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０７２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｋ１０８２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｋ１０８２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のＲ１０７９（例えば、Ｒ１０７９Ａ）、Ｒ１０７２（例えばＲ１０７２Ａ）、及びＫ１０８２（例えば、Ｋ１０８２Ａ）から選択される位置において、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１つ以上（例えば、２つ以上、または３つ全て）のアミノ酸置換を含む。
【０１５０】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０７９、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０７９Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０７２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０７２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｋ１０８２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｋ１０８２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のＲ１０７９（例えば、Ｒ１０７９Ａ）、Ｒ１０７２（例えばＲ１０７２Ａ）、及びＫ１０８２（例えば、Ｋ１０８２Ａ）から選択される位置において、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１つ以上（例えば、２つ以上、または３つ全て）のアミノ酸置換を含む。
【０１５１】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０４１、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０４１Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０４８、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０４８Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｋ１０５１、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｋ１０５１Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１に記述されているアミノ酸配列のＲ１０４８（例えば、Ｒ１０４８Ａ）、Ｒ１０４１（例えばＲ１０４１Ａ）、及びＫ１０５１（例えば、Ｋ１０５１Ａ）から選択される位置において、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１つ以上（例えば、２つ以上、または３つ全て）のアミノ酸置換を含む。
【０１５２】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０８５、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０８５Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０７８、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０７８Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｋ１０８８、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｋ１０８８Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４に記述されているアミノ酸配列のＲ１０８５（例えば、Ｒ１０８５Ａ）、Ｒ１０７８（例えばＲ１０７８Ａ）、及びＫ１０８８（例えば、Ｋ１０８８Ａ）から選択される位置において、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１つ以上（例えば、２つ以上、または３つ全て）のアミノ酸置換を含む。
【０１５３】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０９９、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号２、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０９９Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０９２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号２、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１０９２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｋ１１０２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号２、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｋ１１０２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号５に記述されているアミノ酸配列のＲ１０９９（例えば、Ｒ１０９９Ａ）、Ｒ１０９２（例えばＲ１０９２Ａ）、及びＫ１１０２（例えば、Ｋ１１０２Ａ）から選択される位置において、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号２、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１つ以上（例えば、２つ以上、または３つ全て）のアミノ酸置換を含む。
【０１５４】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１１７２、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号２に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１１７２Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１１６５、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号２に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸のアミノ酸置換（例えば、Ｒ１１６５Ａ）を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６に記述されているアミノ酸配列のＲ１１７２（例えば、Ｒ１１７２Ａ）及びＲ１１６５（例えば、Ｒ１１６５Ａ）から選択される位置において、または任意のＣ２ｃ２アミノ酸配列（例えば、配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号２に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列）の対応するアミノ酸の１つ以上（例えば、両方）のアミノ酸置換を含む。
【０１５５】
Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ
対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（例えばＣ２ｃ２  ｃｒＲＮＡ）は、ガイド配列及び定常領域（例えば、ガイド配列の５’の領域）を含む。ガイド配列の５’の領域は、Ｃ２ｃ２タンパク質に結合し（タンパク質結合領域と考えられる）、一方で、ガイド配列は、標的ＲＮＡの標的配列にハイブリダイズする。
【０１５６】
ガイド配列
ガイド配列は、一本鎖標的ＲＮＡの標的配列と相補性を有する（それにハイブリダイズする）。いくつかの場合において、標的配列（プロトスペーサー）の直ぐ３’の標的ＲＮＡの塩基は、Ｇではない。ある場合において、ガイド配列は、１６〜２８ヌクレオチド（ｎｔ）の長さ（例えば、１６〜２６、１６〜２４、１６〜２２、１６〜２０、１６〜１８、１７〜２６、１７〜２４、１７〜２２、１７〜２０、１７〜１８、１８〜２６、１８〜２４、または１８〜２２ｎｔの長さ）である。いくつかの場合において、ガイド配列は１８〜２４ヌクレオチド（ｎｔ）の長さである。いくつかの場合において、ガイド配列は、少なくとも１６ｎｔの長さ（例えば、少なくとも１８、２０、または２２ｎｔの長さ）である。いくつかの場合において、ガイド配列は少なくとも１７ｎｔの長さである。いくつかの場合において、ガイド配列は少なくとも１８ｎｔの長さである。いくつかの場合において、ガイド配列は少なくとも２０ｎｔの長さである。
【０１５７】
いくつかの場合において、ガイド配列は、一本鎖標的ＲＮＡの標的配列と、８０％以上の相補性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％の相補性）を有する。いくつかの場合において、ガイド配列は、一本鎖標的ＲＮＡの標的配列と１００％相補性である。
【０１５８】
定常領域
以下の３つの配列は、各々が、天然に存在するＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの定常領域（例えば、ガイド配列の５’の領域）の例である。
ＧＡＣＵＡＣＣＵＣＵＡＵＡＵＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣ（配列番号７）
（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（「Ｌｓｅ」）
ＣＣＡＣＣＣＣＡＡＵＡＵＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号８）
（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ）（「Ｌｓｈ」）
ＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＵＧＡＡＧＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＣＡ（配列番号９）
（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ）（「Ｌｂｕ」）
【０１５９】
いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号７〜９のいずれか１つに記述されている配列と、７０％以上の同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号７〜９のいずれか１つに記述されている配列と、９０％以上の同一性（例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号７〜９のいずれか１つに記述されているヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号９に記述されている配列と、７０％以上の同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号９に記述されている配列と、９０％以上の同一性（例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号９に記述されているヌクレオチド配列を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（ＬｓＨ）のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡのヌクレオチド配列を含まない。例えば、いくつかの場合において、使用されるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ由来のＣ２ｃ２ではなく（例えば、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２タンパク質ではない）、いくつかのそのような場合において、使用されるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡはまた、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ由来ではない（例えば、使用されるガイドＲＮＡは、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの定常領域を含まない）。したがって、いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、配列番号８に記述されている配列を含まない。
【０１６２】
いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を含む。例えば、Ｌｂｕ由来のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡが一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズし、そこで、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡが４塩基対（ｂｐ）の長さのｄｓＲＮＡ二重鎖を含むことを、図７Ａは例示する。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは２〜１２ｂｐ（例えば、２〜１０ｂｐ、２〜８ｂｐ、２〜６ｂｐ、２〜５ｂｐ、２〜４ｂｐ、３〜１２ｂｐ、３〜１０ｂｐ、３〜８ｂｐ、３〜６ｂｐ、３〜５ｂｐ、３〜４ｂｐ、４〜１２ｂｐ、４〜１０ｂｐ、４〜８ｂｐ、４〜６ｂｐ、または４〜５ｂｐ）の長さのｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、２ｂｐ以上の長さ（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、または７以上のｂｐの長さ）のｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖よりも長いｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。例えば、Ｌｂｕ由来のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡが一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズし、そこで、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡが４塩基対（ｂｐ）の長さのｄｓＲＮＡ二重鎖を含むことを、図７Ａは例示する。したがって、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、いくつかの場合、５ｂｐ以上の長さ（例えば６以上、７以上、または８以上のｂｐの長さ）であるｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖よりも短いｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。したがって、いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、４ｂｐ未満の長さであるｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、２または３ｂｐの長さを有するｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。
【０１６３】
いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は、１５以上のヌクレオチド（ｎｔ）の長さ（例えば、１８以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上のｎｔ、３２以上、３３以上、３４以上、または３５以上のｎｔの長さ）である。いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は２９以上のｎｔの長さである。
【０１６４】
いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は１２〜１００ｎｔ（例えば、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２５〜１００、２５〜９０、２５〜８０、２５〜７０、２５〜６０、２５〜５０、２５〜４０、２８〜１００、２８〜９０、２８〜８０、２８〜７０、２８〜６０、２８〜５０、２８〜４０、２９〜１００、２９〜９０、２９〜８０、２９〜７０、２９〜６０、２９〜５０、または２９〜４０のｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は、２８〜１００ｎｔの範囲の長さを有する。いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は、２８〜４０ｎｔの範囲の長さを有する。
【０１６５】
いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの対応する領域（よりも短い）に対して短縮されている。例えば、成熟Ｌｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのガイド配列の５’領域を含み、したがって、対象の短縮されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（Ｌｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡと比べて）は、３０ｎｔ未満の長さ（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２２、または２０ｎｔ未満の長さ）であるガイド配列の５’領域を有し得る。いくつかの場合において、短縮されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、１２〜２９ｎｔ（例えば、１２〜２８、１２〜２７、１２〜２６、１２〜２５、１２〜２２、１２〜２０、１２〜１８のｎｔ）の範囲の長さを有するガイド配列の５’領域を含む。いくつかの場合において、短縮されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、例えば、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドと比べて１以上のｎｔ（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、または１０以上のｎｔ）短縮されている。
【０１６６】
いくつかの場合において、ガイド配列の５’であるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの領域は、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの対応する領域（よりも長い）に対して伸長されている。例えば、成熟Ｌｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのガイド配列の５’領域を含み、したがって、伸長されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（Ｌｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡと比べて）は、３０ｎｔより長い（例えば、３１より長い、３２より長い、３３より長い、３４より長い、または３５ｎｔより長い）ガイド配列の５’領域を有し得る。いくつかの場合において、伸長されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３０〜１００ｎｔ（例えば、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、または３０〜４０のｎｔ）の範囲の長さを有するガイド配列の５’領域を含む。いくつかの場合において、伸長されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、（例えば、対応する野生型のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの対応する領域と比べて）１以上のｎｔ（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、または１０以上のｎｔ）伸長されたガイド配列の５’領域を含む。
【０１６７】
いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３０以上のヌクレオチド（ｎｔ）の長さ（例えば、３４以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、または８０以上のｎｔの長さ）である。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは３５以上のｎｔの長さである。
【０１６８】
いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３０〜１２０ｎｔの範囲の長さ（例えば、３０〜１１０、３０〜１００、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３５〜１２０、３５〜１１０、３５〜１００、３５〜９０、３５〜８０、３５〜７０、３５〜６０、４０〜１２０、４０〜１１０、４０〜１００、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０、５０〜１２０、５０〜１１０、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、または５０〜７０のｎｔ）を有する。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３３〜８０ｎｔの範囲の長さを有する。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３５〜６０ｎｔの範囲の長さを有する。
【０１６９】
いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（より短い）と比べて短縮されている。例えば、成熟したＬｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは５０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり得、（Ｌｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡと比べて）短縮されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、したがって、いくつかの場合において、５０未満のｎｔの長さ（例えば、４９、４８、４７、４６、４５、４２、または４０未満のｎｔの長さ）であり得る。いくつかの場合において、短縮されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、３０〜４９ｎｔの範囲の長さを有する（例えば、３０〜４８、３０〜４７、３０〜４６、３０〜４５、３０〜４２、３０〜４０、３５〜４９、３５〜４８、３５〜４７、３５〜４６、３５〜４５、３５〜４２、または３５〜４０のｎｔ）。いくつかの場合において、短縮されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、例えば、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドと比べて１以上のｎｔ（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、または１０以上のｎｔ）短縮されている。
【０１７０】
いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、対応する野生型Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（より長い）と比べて伸長されている。例えば、成熟したＬｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡは５０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり得、（Ｌｓｅ  Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡと比べて）伸長されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、したがって、いくつかの場合において、５０ｎｔより長く（例えば、５１より長く、５２より長く、５３より長く、５４より長く、または５５より長いｎｔ）あり得る。いくつかの場合において、伸長されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、５１〜１００ｎｔ（例えば、５１〜９０、５１〜８０、５１〜７０、５１〜６０、５３〜１００、５３〜９０、５３〜８０、５３〜７０、５３〜６０、５５〜１００、５５〜９０、５５〜８０、５５〜７０、または５５〜６０のｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合において、伸長されたＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、（例えば、対応する野生型のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡと比べて）１以上のｎｔ（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、または１０以上のｎｔ）伸長されている。
【０１７１】
前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを切断する方法
本開示は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡへの切断方法を提供する。方法は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをＣ２ｃ２タンパク質と接触させることを含む。前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、２つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含み、その各々は、異なるガイド配列を有し得る。Ｃ２ｃ２タンパク質は、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断する。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの接触領域（「ハンドル」とも呼ばれる）は、前駆体ガイドＲＮＡからのヌクレオチド配列（例えば、ガイドＲＮＡアレイの切断前に通常存在する配列）を含む。換言すると、いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの定常領域は、前駆体ｃｒＲＮＡハンドルを含む。
【０１７２】
いくつかの場合において、接触ステップは、細胞内部、例えば生細胞内部で起こらない。いくつかの場合において、接触ステップは細胞内部（例えば、インビトロ（培養内）の細胞、エクスビボの細胞、インビボの細胞）で起こる。任意の細胞は好適である。中で接触が起こり得る細胞の例は、真核生物細胞、原核生物細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞）、単細胞真核生物、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．  ａｇａｒｄｈ等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物細胞（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫、昆虫、クモ形類動物等）、脊椎動物細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、猫科の動物、ウシ亜科の動物、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、げっ歯類、ブタ、ヒツジ、ウシ等）、寄生細胞（例えば、蠕虫、マラリア原虫等）を含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
Ｃ２ｃ２タンパク質
Ｃ２ｃ２タンパク質が無傷のＨＥＰＮドメインを有するとき、それは、「活性化」された後にＲＮＡ（標的ＲＮＡ及び非標的ＲＮＡ）を切断することができる。しかしながら、Ｃ２ｃ２タンパク質はまた、ＨＥＰＮ非依存性の様式で、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを成熟Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断することができる。例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質が、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインもまた欠くとき、それは、前駆体ガイドＲＮＡを成熟ガイドＲＮＡに切断することができる。したがって、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを含む方法において使用されるとき、Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメイン及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠くことができる（いくつかの場合において欠くであろう）。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、及び触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。
【０１７４】
触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、かつ触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠くＣ２ｃ２タンパク質は、いくつかの場合において、結合方法（例えば、画像化方法）において使用することができる。例えば、いくつかの場合において、結合方法（及び／または画像化）は、試料を、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、かつ触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠くＣ２ｃ２タンパク質と接触させることを含む。そのような場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、検出可能に標識することができる（例えば、エピトープタグを融合する、フルオロフォアに融合する、緑色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質に融合する等）。
【０１７５】
本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、無傷のＨＥＰＮ１及びＨＥＰＮ２ドメインを有し得る。しかしながら、いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。
【０１７６】
いくつかの場合において、本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜６の任意の１つに記述されているアミノ酸配列と、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１に記述されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号４に記述されているＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号５に記述されているＣａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の方法における使用のために好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号６に記述されているＨｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２タンパク質（例えば、配列番号２を参照）である。いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜２、及び４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列を含む。
【０１７７】
いくつかの場合において、本開示の方法において使用される、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合において、本開示の方法において使用される、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているＬｓｈ  Ｃ２ｃ２ポリペプチドに対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するＣ２ｃ２ポリペプチドではない。
【０１７８】
いくつかの場合において、本開示の方法における使用に好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのＣ２ｃ２ポリペプチドは、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドである。本開示の方法における使用に好適な、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの切断のためのバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１、２、及び４〜６のいずれか１つのバリアントを含み、ここでバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した（または検出できない）ヌクレアーゼ活性を示す。例えば、いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠く。別の例として、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、かつ触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。
【０１７９】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸の１、２、３、または４のアミノ酸置換を含む。配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における対応するアミノ酸は、容易に同定でき、例えば図２２Ｂを参照できる。例えば、配列番号２のＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３に対応する配列番号１（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１である。
【０１８０】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
【０１８１】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４８Ａ及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１８２】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５及びＨ４５０の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ及びＨ４５０Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０１６及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０２１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０１６Ａ及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位及び１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位及び１０１６位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ、Ｈ４５０Ａ、Ｒ１０１６Ａ、及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１８３】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４及びＨ４６９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ及びＨ４６９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０５２及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０５２Ａ及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２、及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位及び１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位及び１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ、Ｈ４６９Ａ、Ｒ１０５２Ａ、及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１８４】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７及びＨ４７２の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ及びＨ４７２Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０６９及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０６９Ａ及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９、及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位及び１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位及び１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ、Ｈ４７２Ａ、Ｒ１０６９Ａ、及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１８５】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４４及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４４Ａ及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４、及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４４Ａ、及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１８６】
前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ
以下の実施例において実証されるように、Ｃ２ｃ２タンパク質は、例えば、前駆体のエンドリボヌクレアーゼ切断によって、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを成熟ガイドＲＮＡに切断することができる。以下の実施例において実証されるように、Ｃ２ｃ２タンパク質は、（タンデムに配置された１つを超えるＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを２つ以上の個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断することができる。このように、いくつかの場合において、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、２以上（例えば３以上、４以上、５以上、２、３、４、または５）のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（例えば、前駆体分子としてタンデムに配置されて）を含む。いくつかの場合において、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの各々のガイドＲＮＡは、異なるガイド配列を有する。いくつかの場合において、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のガイドＲＮＡは、同一のガイド配列を有する。
【０１８７】
いくつかの場合において、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、同一の標的ＲＮＡ分子内の異なる標的部位を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む。例えば、そのようなシナリオは、いくつかの場合において、いずれか１つが標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズするときに、Ｃ２ｃ２タンパク質を活性化することによって、検出感度を向上することができる。
【０１８８】
いくつかの場合において、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的ＲＮＡ分子を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む。例えば、そのようなシナリオは、可能性がある標的ＲＮＡのファミリーの任意の１つが存在するときに、陽性シグナルをもたらすことができる。そのようなアレイが、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等の多様性に基づく、転写物のファミリーを標的とするために使用することができる（例えば、診断目的のために）。それはまた、ウイルスの多くの異なる系統の任意の１つが存在するか否か（例えば、インフルエンザウイルスバリアント、ジカウイルスバリアント、ＨＩＶバリアント等）を検出するために有用であり得る。それはまた、細菌の多くの異なる種、系統、分離株、バリアント（例えば、マイコバクテリウム属の異なる種、系統、分離株、またはバリアント、ナイセリア属の異なる種、系統、分離株、またはバリアント、ブドウ球菌属の異なる種、系統、分離株、またはバリアント、Ｅ．ｃｏｌｉの異なる種、系統、分離株、またはバリアント等）の任意の１つが存在するか否かを検出するために有用であり得る。
【０１８９】
バリアントＣ２ｃ２ポリペプチド
本開示は、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチド及びバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組換え発現ベクター）を提供する。
【０１９０】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４８Ａ及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１９１】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５及びＨ４５０の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ及びＨ４５０Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０１６及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０２１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０１６Ａ及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位及び１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位及び１０１６位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ、Ｈ４５０Ａ、Ｒ１０１６Ａ、及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１９２】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４及びＨ４６９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ及びＨ４６９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０５２及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０５２Ａ及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２、及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位及び１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位及び１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ、Ｈ４６９Ａ、Ｒ１０５２Ａ、及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１９３】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７及びＨ４７２の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ及びＨ４７２Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０６９及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０６９Ａ及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９、及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位及び１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位及び１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ、Ｈ４７２Ａ、Ｒ１０６９Ａ、及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１９４】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４４及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４４Ａ及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４、及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４４Ａ、及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１９５】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の１、２、３、または４の置換を含み、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドが、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持するようにされている。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。例えば、いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．１％未満の、配列番号２に記述されているアミノ酸配列を有するＣ２ｃ２ポリペプチドによって示される非標的ＲＮＡのＲＮＡ誘導切断を示す。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０１９６】
本開示は、本開示のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、単離された核酸）を提供する。いくつかの場合において、ヌクレオチド配列は、転写制御エレメント、例えばプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの場合において、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの場合において、プロモーターは調節可能なプロモーターである。いくつかの場合において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの場合において、プロモーターは真核生物細胞において機能的である。いくつかの場合において、プロモーターは原核生物細胞において機能的である。
【０１９７】
本開示は、本開示の核酸、例えば、本開示のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、組換え発現ベクターを提供する。
【０１９８】
本開示は、本開示の核酸、例えば、本開示のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸によって遺伝的に改変された宿主細胞を提供する。本開示は、本開示の核酸、例えば、本開示のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、組換え発現ベクターによって遺伝的に改変された宿主細胞を提供する。いくつかの場合において、宿主細胞は原核生物細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞はインビトロである。いくつかの場合において、宿主細胞はエクスビボである。いくつかの場合において、宿主細胞はインビボである。いくつかの場合において、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は植物細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞はヒト細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は昆虫細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は節足動物細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は真菌細胞である。いくつかの場合において、宿主細胞は藻類細胞である。
【０１９９】
キット
本開示は、複数のＲＮＡを含む試料中の標的ＲＮＡを検出するためのキットを提供する。いくつかの場合において、キットは、（ａ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、ならびに、（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質、及び／または上記Ｃ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの場合において、そのようなキットは、標識された検出ＲＮＡ（例えば、蛍光−発光染料対、すなわちＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対を含む、標識された検出ＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの場合において、所与の前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（例えば、いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの各々）は、同一のガイド配列を含む。
【０２００】
いくつかの場合において、対象のキットは、（ａ）蛍光−発光染料対、すなわち、ＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対を含む標識された検出ＲＮＡ、ならびに、（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質、及び／または上記Ｃ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの場合において、そのようなキットは、（ｃ）Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／またはＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、及び／または、（ｄ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、及び／または、（ｅ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ（及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、例えば、使用者によるガイド配列の挿入のための配列挿入部位を含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸）をさらに含む。
【０２０１】
１）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及びＣ２ｃ２タンパク質を含むキット
いくつかの場合において、キットは、（ａ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、ならびに、（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質、及び／または上記Ｃ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を含む。上述のように、いくつかの場合において、そのようなキットは、標識された検出ＲＮＡ（例えば、蛍光−発光染料対、すなわちＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対を含む、標識された検出ＲＮＡ）をさらに含む。
【０２０２】
Ｃ２ｃ２タンパク質
本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡに結合し、（標的ＲＮＡにハイブリダイズする）ガイドＲＮＡによって一本鎖標的ＲＮＡに誘導され、それによって「活性化」される。Ｃ２ｃ２タンパク質のＨＥＰＮ１及びＨＥＰＮ２ドメインが無傷である場合、活性化されると、Ｃ２ｃ２タンパク質は、標的ＲＮＡを切断するが、非標的ＲＮＡもまた切断する。
【０２０３】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜６の任意の１つに記述されているアミノ酸配列と、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１に記述されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号４に記述されているＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号５に記述されているＣａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号６に記述されているＨｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２タンパク質（例えば、配列番号２を参照）である。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜２、及び４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列を含む。
【０２０４】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているＬｓｈ  Ｃ２ｃ２ポリペプチドに対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するＣ２ｃ２ポリペプチドではない。
【０２０５】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるＣ２ｃ２ポリペプチドは、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドである。本開示のキットに含まれるために好適なバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１、２、及び４〜６のいずれか１つのバリアントを含み、ここでバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した（または検出できない）ヌクレアーゼ活性を示す。例えば、いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠く。別の例として、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠き、かつ触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く。
【０２０６】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸の１、２、３、または４のアミノ酸置換を含む。配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６における対応するアミノ酸は、容易に同定でき、例えば図２２Ｂを参照できる。例えば、配列番号２のＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３に対応する配列番号１（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２）におけるアミノ酸位置は、それぞれ、Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１である。
【０２０７】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３、または配列番号１、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に描写されるＣ２ｃ２アミノ酸配列の対応するアミノ酸のアミノ酸置換を含む。
【０２０８】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４８Ａ及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４８位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０５３位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、及びＨ１０５３Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０２０９】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５及びＨ４５０の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ及びＨ４５０Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０１６及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０２１位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０１６Ａ及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６、及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４４５位及び１０１６位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４５０位及び１０１６位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４４５Ａ、Ｈ４５０Ａ、Ｒ１０１６Ａ、及びＨ１０２１Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０２１０】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４及びＨ４６９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ及びＨ４６９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０５２及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０５２Ａ及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２、及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６４位及び１０５２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４６９位及び１０５７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６４Ａ、Ｈ４６９Ａ、Ｒ１０５２Ａ、及びＨ１０５７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０２１１】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７及びＨ４７２の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ及びＨ４７２Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０６９及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０６９Ａ及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９、及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４６７位及び１０６９位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７２位及び１０７４位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４６９Ａ、Ｈ４７２Ａ、Ｒ１０６９Ａ、及びＨ１０７４Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０２１２】
いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６（Ｈｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２）に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ及びＨ４７７Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ１０４４及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ１０４４Ａ及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４、及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、４７２位及び１０４４位のアミノ酸は、Ａｒｇ以外の任意のアミノ酸であり、４７７位及び１０４９位のアミノ酸は、Ｈｉｓ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの場合において、置換はＲ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４４Ａ、及びＨ１０４９Ａである。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減した、または検出できないｓｓＲＮＡの切断（例えばＲＮＡ誘導切断活性）を有し、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。いくつかの場合において、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したか、または検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する。
【０２１３】
２）標識された検出ＲＮＡとＣ２ｃ２タンパク質を含むキット
いくつかの場合において、キットは、（ａ）蛍光−発光染料対、すなわち、ＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対を含む標識された検出ＲＮＡ、ならびに、（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質、及び／または上記Ｃ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの場合において、キットは、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、及び／またはＣ２ｃ２ガイドＲＮＡの定常領域をコードする核酸をさらに含む。上述のように、いくつかの場合において、そのようなキットは、（ｃ）Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／またはＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、及び／または、（ｄ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、及び／または、（ｅ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ（及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、例えば、使用者によるガイド配列の挿入のための配列挿入部位を含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸）をさらに含む。
【０２１４】
標識された検出ＲＮＡ
いくつかの場合において、本開示のキットは、蛍光−発光染料対、すなわち、ＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対を含む標識された検出ＲＮＡを含む。標識された検出ＲＮＡは、切断される前にある量の検出可能なシグナルを生じ、測定される検出可能なシグナルの量は、標識された検出ＲＮＡが切断されるときに低減する。いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生じ（例えば、ＦＲＥＴ対から）、標識された検出ＲＮＡが切断されるときに第２の検出可能なシグナルを生じる（例えば、消光剤／蛍光体対から）。したがって、いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、ＦＲＥＴ対及び消光剤／蛍光体対を含む。
【０２１５】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む。ＦＲＥＴは、それによって、励起状態のフルオロフォアからごく近接した第２の発色団へと、無放射のエネルギーの移動が起こるプロセスである。エネルギー移動が起こり得る範囲は、約１０ナノメートル（１００オングストローム）に限定され、移動の効率は、フルオロフォア間の分離距離に極めて高感度である。ドナー−アクセプター対（ＦＲＥＴドナー部分とＦＲＥＴアクセプター部分）は、本明細書において「ＦＲＥＴ対」または「シグナルＦＲＥＴ対」と呼ばれる。このように、いくつかの場合において、一方のシグナルパートナーがＦＲＥＴドナー部分であり、かつ他方のシグナルパートナーがＦＲＥＴアクセプター部分である場合、対象の標識された検出ＲＮＡは、２つのシグナルパートナー（シグナル対）を含む。したがって、そのようなＦＲＥＴ対（ＦＲＥＴドナー部分とＦＲＥＴアクセプター部分）を含む対象の標識された検出ＲＮＡは、シグナルパートナーがごく近接する（例えば、同一のＲＮＡ分子内で）とき、検出可能なシグナル（ＦＲＥＴシグナル）を示すが、シグナルは、パートナーが分離するとき（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質によるＲＮＡ分子の切断の後）、低減する（または非存在となる）。
【０２１６】
ＦＲＥＴのドナー及びアクセプターの部分（ＦＲＥＴ対）は、当業者に公知であり、任意の都合が良いＦＲＥＴ対（例えば、任意の都合が良いドナー部分とアクセプター部分との対）が使用できる。好適なＦＲＥＴ対の例は、上述の表１に提示されるものを含むが、これらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡが切断されるとき（例えば、いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡが消光剤／蛍光体対を含む）、検出可能なシグナルが生じる。シグナル消光対の一方のシグナルパートナーは、検出可能なシグナルを生じ、他方のシグナルパートナーは、第１のシグナルパートナーの検出可能なシグナルを消光する消光部分である（すなわち、消光部分は、シグナル部分のシグナルを消光し、シグナルパートナーが互いに近接するとき、例えば、シグナル対のシグナルパートナーがごく接近するとき、シグナル部分からのシグナルが低減（消光）されるようにする）。
【０２１８】
例えば、いくつかの場合において、検出可能なシグナルの量は、標識された検出ＲＮＡが切断されるときに増加する。例えば、いくつかの場合において、一方のシグナルパートナー（シグナル部分）によって示されるシグナルは、例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質による切断前に、両方が同一のＲＮＡ分子上に存在するとき、他方のシグナルパートナー（消光剤シグナル部分）によって消光される。そのようなシグナル対は、本明細書において、「消光剤／蛍光体対」、「消光対」、または「シグナル消光対」と呼ばれる。例えば、いくつかの場合において、１つのシグナルパートナー（例えば、第１のシグナルパートナー）は、第２のシグナルパートナー（例えば、消光剤部分）によって消光されている、検出可能なシグナルを生じるシグナル部分である。このように、そのような消光剤／蛍光体対のシグナルパートナーは、パートナーが分離したとき（例えばＣ２ｃ２タンパク質による検出ＲＮＡの切断後）、検出可能なシグナルを生じるが、シグナルは、パートナーがごく接近するとき（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質による検出ＲＮＡの切断前）、消光される。
【０２１９】
消光剤部分は、シグナル部分からのシグナルを、（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質による検出ＲＮＡの切断前に）様々な度合いで消光することができる。いくつかの場合において、消光剤部分はシグナル部分からのシグナルを消光し、ここで、消光剤部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接するとき）で検出されるシグナルは、消光剤部分の非存在下（シグナルパートナーが分離しているとき）で検出されるシグナルの９５％以下である。例えば、いくつかの場合において、消光剤部分の存在下で検出されるシグナルは、消光剤部分の非存在下で検出されるシグナルの、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下であり得る。いくつかの場合において、消光剤部分の存在下で、全くシグナルが検出されない（例えば、バックグラウンドを超えて）。
【０２２０】
いくつかの場合において、消光剤部分の非存在下（シグナルパートナーが分離しているとき）で検出されるシグナルは、消光剤部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接しているとき）で検出されるシグナルよりも、少なくとも１．２倍大きい（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍大きい）。
【０２２１】
いくつかの場合において、シグナル部分は、蛍光標識である。いくつかのそのような場合、消光剤部分は、蛍光標識からのシグナル（光シグナル）を消光する（例えば、標識の発光スペクトルにおけるエネルギーを吸収することによって）。したがって、消光剤部分がシグナル部分と近接していないとき、蛍光標識からの発光（シグナル）は、シグナルが消光剤部分によって吸収されないので検出可能である。任意の都合が良いドナーアクセプター対（シグナル部分／消光剤部分対）を使用することができ、多くの好適な対は、当該技術分野において公知である。
【０２２２】
いくつかの場合において、消光剤部分は、シグナル部分（本明細書において「検出可能な標識」とも呼ばれる）からのエネルギーを吸収して、シグナル（例えば、異なる波長での光）を放出する。このように、いくつかの場合において、消光剤部分は、それ自体がシグナル部分（例えば、シグナル部分は６−カルボキシフルオレセインであり得、一方で消光剤部分は、６−カルボキシ−テトラメチルローダミンであり得る）であり、いくつかのそのような場合において、対はまた、ＦＲＥＴ対であり得る。いくつかの場合において、消光部分はダーククエンチャーである。ダーククエンチャーは、励起エネルギーを吸収し、そしてエネルギーを異なる方法で（例えば、熱として）消散させることができる。このように、ダーククエンチャーは、最小限から全くないものまで、それ自体の蛍光を有する（蛍光を放出しない）。ダーククエンチャーの例は、米国特許第８，８２２，６７３号、及び米国特許第８，５８６，７１８号、米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、米国特許出願公開第２０１４０３４９２９５号、及び米国特許出願公開第２０１４０１９４６１１号、ならびに国際特許出願：ＷＯ２００１４２５０５及びＷＯ２００１８６００１においてさらに記載され、これら全てが参照により、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
蛍光標識の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、パシフィックオレンジ、量子ドット、及び係留蛍光タンパク質を含むが、これらには限定されない。
【０２２４】
いくつかの場合において、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、及びパシフィックオレンジから選択される蛍光標識である。
【０２２５】
いくつかの場合において、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料、ＡＴＴＯ染料（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ染料、シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ染料、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ染料、Ｓｅｔａ染料、ＩＲＩＳ染料、ＳｅＴａｕ染料、ＳＲｆｌｕｏｒ染料、Ｓｑｕａｒｅ染料、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、パシフィックオレンジ、量子ドット、及び係留蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である。
【０２２６】
ＡＴＴＯ染料の例は、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、及びＡＴＴＯ  ７４０を含むが、これらには限定されない。
【０２２７】
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ染料の例は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０等を含むが、これらには限定されない。
【０２２８】
消光剤部分の例は、ダーククエンチャー、ブラックホール消光剤（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌ消光剤、ＡＴＴＯ消光剤（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、アイオワブラックＲＱ、アイオワブラックＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ染料（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金ナノ粒子等の金属クラスター等を含むが、これらには限定されない。
【０２２９】
いくつかの場合において、消光剤部分は、ダーククエンチャー、ブラックホール消光剤（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌ消光剤、ＡＴＴＯ消光剤（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、アイオワブラックＲＱ、アイオワブラックＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ染料（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金属クラスターから選択される。
【０２３０】
ＡＴＴＯ消光剤の例は、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑを含むが、これらには限定されない。ブラックホール消光剤（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））の例は、ＢＨＱ−０（４９３ｎｍ）、ＢＨＱ−１（５３４ｎｍ）、ＢＨＱ−２（５７９ｎｍ）、及びＢＨＱ−３（６７２ｎｍ）を含むが、これらには限定されない。
【０２３１】
いくつかの検出可能な標識（例えば蛍光染料）及び／または消光剤部分の例として、Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２００９；１１：２５−４７、ならびに、米国特許第８，８２２，６７３号及び米国特許第８，５８６，７１８号；米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、米国特許出願公開第２０１４０３４９２９５号、米国特許出願公開第２０１４０１９４６１１号、米国特許出願公開第２０１３０３２３８５１号、米国特許出願公開第２０１３０２２４８７１号、米国特許出願公開第２０１１０２２３６７７号、米国特許出願公開第２０１１０１９０４８６号、米国特許出願公開第２０１１０１７２４２０号、米国特許出願公開第２００６０１７９５８５号、及び米国特許出願公開第２００３０００３４８６号、ならびに国際特許出願ＷＯ２００１４２５０５及びＷＯ２００１８６００１を参照でき、これらの全ては参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
核酸修飾
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、核酸に新規または増強された特徴（例えば改善された安定性）をもたらすために、１つ以上の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾等を含む。当該技術分野において公知なように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、ヘテロ環の塩基である。そのようなヘテロ環の塩基の２つの最も共通のクラスは、プリンとピリミジンとである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分へと連結することができる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、直鎖状のポリマー化合物を形成する。同様に、この直鎖状ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに結合して環状化合物を形成することができるが、直鎖状化合物が一般的に好適である。さらに直鎖状化合物は、内部のヌクレオチド塩基の相補性を有し得、したがって、完全に、または部分的に二本鎖化合物を生じるような様式で折りたたみ得る。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の骨格を形成するものとして一般に言及される。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合または骨組みは、３’から５’のホスホジエステル結合である。
【０２３３】
修飾された骨組み及び修飾されたヌクレオシド間結合
好適な修飾の例は、修飾された核酸骨格及び非天然ヌクレオシド間結合を含む。修飾された骨格を有する核酸は、骨格にリン原子を保持するもの、及び骨格にリン原子を有さないものを含む。
【０２３４】
内部にリン原子を含む好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートを含むメチル及び他のアルキルのホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミド酸及びアミノアルキルホスホロアミド酸を含むホスホロアミド酸、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノリン酸及びボラノリン酸、２’−５’結合するそれらの類似体、ならびに、１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’〜３’、５’〜５’、または２’〜２’の結合である、反転した極性を有するものを含む。反転した極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合において単一の３’〜３’結合を有し、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を有する（核酸塩基は、それらの位置において、ヒドロキシル基を喪失するか、または有する）。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウム等）、混合した塩、及び遊離酸の形態もまた含まれる。
【０２３５】
いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に−ＣＨ2 −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−Ｏ−ＣＨ2 −（メチレン（メチルイミノ）として知られる）またはＭＭＩ骨格）、−ＣＨ2 −Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3 ）−ＣＨ2 −ＣＨ2 −を含む（ここで、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ2 −として表される）。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合は、参照される米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。好適なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
【０２３６】
例えば米国特許第５，０３４，５０６号に記載されているようなモルホリノ骨格構造を有する核酸もまた同様に好適である。例えば、いくつかの場合において、標識された検出ＲＮＡは、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。いくつかの場合において、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合を置き換える。
【０２３７】
内部にリン原子を含まない好適な修飾されたポリヌクレオチドの骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ2 構成要素部分を有する他のものを有するものを含む。
【０２３８】
模倣物
標識された検出ＲＮＡは核酸模倣物であり得る。ポリヌクレオチドに適用されるとき、用語「模倣物」は、フラノース環のみ、またはフラノース環及びヌクレオチド間結合が、非フラノース基によって置き換えられているポリヌクレオチドを含むことを意図し、フラノース環のみの置き換えは、当該技術分野において、糖代替物と呼ばれる。ヘテロ環塩基部分、または修飾されたヘテロ環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、１つのそのような核酸、すなわちポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格によって置き換えられる。ヌクレオチドが保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。
【０２３９】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている、１つのポリヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、２つ以上結合したアミノエチルグリシン単位であり、それはＰＮＡにアミド含有骨格をもたらす。ヘテロ環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について記載している代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号、米国特許第５，７１４，３３１号、及び米国特許第５，７１９，２６２号を含むが、これらには限定されない。
【０２４０】
研究されている別のクラスのポリヌクレオチド模倣物は、モルホリノ環に結合するヘテロ環塩基を有する結合したモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を結合する多くの結合基が報告されている。結合基の１つのクラスは、非イオン性オリゴマー化合物をもたらすために選択されている。非イオン性のモルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望まれない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望まれない相互作用を形成する可能性が低い、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣物である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノに基づくポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。モルホリノのクラスのポリヌクレオチド内で、モノマーサブユニットを連結する様々な異なる結合基を有する様々な化合物が調製されている。
【０２４１】
ポリヌクレオチド模倣物のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。通常ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に存在するフラノース環は、シクロヘキシル環によって置き換えられる。古典的なホスホラミダイト化学に従って、ＣｅＮＡ  ＤＭＴに保護されるホスホラミダイトモノマーが調製され、オリゴマー化合物合成に使用されている。特異的な位置をＣｅＮＡによって修飾されている完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物、及びオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照）。一般的に、ＣｅＮＡモノマーのＤＮＡ鎖への組込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加する。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体と同様の安定性で、ＲＮＲ及びＤＮＡの相補体と複合体を形成する。天然の核酸構造へのＣｅＮＡ構造の組込みの研究は、簡単な立体配置の適用と共に進むことが、ＮＭＲ及び円偏光二色性によって示されている。
【０２４２】
さらなる修飾は、２’−ヒドロキシル基が、糖環の４’炭素原子に結合し、それによって２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、それによって二環糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ2 −）基であり得、ここでｎは１または２である（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡと共に非常に高い二重鎖の熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼの分解に対する安定性、及び良好な溶解度特性を示す。ＬＮＡを含む強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
【０２４３】
ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミジン、及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー形成、及び核酸認識特性と共に、記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＬＮＡ及びそれらの調製はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
【０２４４】
修飾された糖部分
標識された検出ＲＮＡはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル、またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換されていても置換されていなくてもよい、Ｃ．ｓｕｂ．１〜Ｃ10アルキル、またはＣ2 〜Ｃ10アルケニル及びアルキニルから選択される糖置換基を含む。Ｏ（（ＣＨ2 ）n Ｏ）m ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＮＨ2 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 、Ｏ（ＣＨ2 ）n ＯＮＨ2 、及びＯ（ＣＨ2 ）n ＯＮ（（ＣＨ2 ）n ＣＨ3 ）2 が特に好適であり、ここでｎ及びｍは１〜約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ1 〜Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3 、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3 、ＯＣＦ3 、ＳＯＣＨ3 、ＳＯ2 ＣＨ3 、ＯＮＯ2 、ＮＯ2 、Ｎ3 、ＮＨ2 、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させるための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を向上させるための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＣＨ3 （２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる））（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾は、例として、本明細書において以下の例に記載されるような、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ2 ）2 ＯＮ（ＣＨ3 ）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ2 −Ｏ−ＣＨ2 −Ｎ（ＣＨ3 ）2 を含む。
【０２４５】
他の好適な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ3 ）、アミノプロポキシ（−−ＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ2 ）、アリル（−ＣＨ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ2 −ＣＨ＝ＣＨ2 ）、及びフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位においてであり得る。好適な２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴマー化合物の他の位置、特に３’末端ヌクレオシドの糖の３’位、または、２’−５’結合オリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位においてなされ得る。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにおけるシクロブチル部分等の糖模倣物を有し得る。
【０２４６】
塩基の修飾及び置換
標識された検出ＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野においてしばしば簡単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用されるとき、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及び他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン、及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル、及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン等の他の合成及び天然の核酸塩基を含む。さらなる修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピラミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）等の三環ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）等のＧ−クランプを含む。
【０２４７】
ヘテロ環塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンによって置換されているものも含み得る。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは、オリゴマー化合物の結合親和性を向上するために有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃向上することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるとき、安定な塩基置換である。
【０２４８】
３）２つの異なるＣ２ｃ２タンパク質、及び２つの異なる標識された検出ＲＮＡを含むキット
いくつかの場合において、対象のキットは、（ａ）Ｕを欠くが、少なくとも１つのＡ（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＡ）を含み、かつ第１のＦＲＥＴ対及び／または第１の消光剤／蛍光体対を含む、第１の標識された検出ＲＮＡ、（ｂ）Ａを欠くが、少なくとも１つのＵ（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＵ）を含み、かつ第２のＦＲＥＴ対及び／または第２の消光剤／蛍光体対を含む、第２の標識された検出ＲＮＡ、（ｃ）第１のＣ２ｃ２タンパク質、及び／または上記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸であって、第１のＣ２ｃ２タンパク質が、活性化されたときにアデニン+ ＲＮＡ（Ａを含むＲＮＡ）を切断するが、Ａを欠くＲＮＡ（例えば、ポリＵ  ＲＮＡ）を切断しない［例えば、第１のＣ２ｃ２タンパク質は第１の標識された検出ＲＮＡを切断することができるが、第２の標識された検出ＲＮＡを切断することができない］、第１のＣ２ｃ２タンパク質、及び／または上記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸、ならびに、（ｄ）第２のＣ２ｃ２タンパク質、及び／または上記第２のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸であって、第２のＣ２ｃ２タンパク質が、活性化されたときにウラシル+ ＲＮＡ（Ｕを含むＲＮＡ）を切断するが、Ｕを欠くＲＮＡ（例えば、ポリＡ  ＲＮＡ）を切断しない（例えば、第２のＣ２ｃ２タンパク質は第２の標識された検出ＲＮＡを切断することができるが、第１の標識された検出ＲＮＡを切断することができない）、第２のＣ２ｃ２タンパク質、及び／または上記第２のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を含む。
【０２４９】
いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡはＵを欠き、２〜１５の連続的なＡ（例えば、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、または４〜６の連続的なＡ）の区間を含む。いくつかの場合において、第１の標識された検出ＲＮＡは、Ｕを欠き、少なくとも２の連続的なＡ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の連続的なＡ）の区間を含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡはＡを欠き、２〜１５の連続的なＵ（例えば、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１５、３〜１２、３〜１０、３〜８、３〜６、３〜５、４〜１５、４〜１２、４〜１０、４〜８、または４〜６の連続的なＵ）の区間を含む。いくつかの場合において、第２の標識された検出ＲＮＡは、Ａを欠き、少なくとも２の連続的なＵ（例えば、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５の連続的なＵ）の区間を含む。
【０２５０】
いくつかの場合において、そのようなキットは、（ｅ）第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／または第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、例えば、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、核酸が使用者によるガイド配列（例えば、標的ＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列）の挿入のための配列挿入部位を含む、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／または第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、ならびに、（ｆ）第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／または第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）、例えば、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、核酸が使用者によるガイド配列（例えば、標的ＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列）の挿入のための配列挿入部位を含む、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（及び／または第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸）をさらに含む。第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む。第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む。第１のＣ２ｃ２タンパク質は、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、第１のＣ２ｃ２タンパク質は、少なくとも１つのＡを含むｓｓＲＮＡを切断する（例えばＡを欠くｓｓＲＮＡを切断しない）。第２のＣ２ｃ２タンパク質は、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、少なくとも１つのＵを含むｓｓＲＮＡを切断する（例えば、Ｕを欠くｓｓＲＮＡを切断しない）。
【０２５１】
以下は、本開示のキットに含まれるために好適な第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質の非限定的例である（以下にａ）〜ｗ）として列挙する）。
【０２５２】
ａ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５３】
ｂ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５４】
ｃ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５５】
ｄ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５６】
ｅ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５７】
ｆ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５８】
ｇ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２５９】
ｈ）第１のＣ２ｃ２タンパク質が、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質が、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６０】
ｉ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６１】
ｊ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６２】
ｋ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６３】
ｌ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６４】
ｍ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６５】
ｎ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６６】
ｏ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６７】
ｐ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６８】
ｑ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２６９】
ｒ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７０】
ｓ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７１】
ｔ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７２】
ｕ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７３】
ｖ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質が、図５６Ｆに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７４】
ｗ）第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０２７５】
Ｃ２ｃ２タンパク質
本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡに結合し、（標的ＲＮＡにハイブリダイズする）ガイドＲＮＡによって一本鎖標的ＲＮＡに誘導され、それによって「活性化」される。Ｃ２ｃ２タンパク質のＨＥＰＮ１及びＨＥＰＮ２ドメインが無傷である場合、活性化されると、Ｃ２ｃ２タンパク質は、標的ＲＮＡを切断するが、非標的ＲＮＡもまた切断する。
【０２７６】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜６の任意の１つに記述されているアミノ酸配列と、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１に記述されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号４に記述されているＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号５に記述されているＣａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号６に記述されているＨｅｒｂｉｎｉｘ  ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａのＣ２ｃ２アミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２タンパク質（例えば、配列番号２を参照）である。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜２、及び４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列を含む。
【０２７７】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるＣ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているＬｓｈ  Ｃ２ｃ２ポリペプチドに対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するＣ２ｃ２ポリペプチドではない。
【０２７８】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、方法のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって標的化されていないＲＮＡの切断において、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも１．２倍以上の倍率でより効率的である。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、方法のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって標的化されていないＲＮＡの切断において、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも１．５倍以上の倍率でより効率的である。いくつかの場合において、本開示の方法において使用されるＣ２ｃ２ポリペプチドは、活性化されるとき、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２よりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または３０倍を超えて、効率的に非標的ＲＮＡを切断する。
【０２７９】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、接触の１時間以内に、少なくとも５０％のＲＮＡ切断効率（例えば５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上の切断効率）を示す。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、接触の４０分以内に、少なくとも５０％のＲＮＡ切断効率（例えば５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上の切断効率）を示す。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、接触の３０分以内に、少なくとも５０％のＲＮＡ切断効率（例えば５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、または７５％以上の切断効率）を示す。
【０２８０】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３０秒〜６０分、例えば、１分〜６０分、３０秒〜５分、１分〜５分、１分〜１０分、５分〜１０分、１０分〜１５分、１５分〜２０分、２０分〜２５分、２５分〜３０分、３０分〜３５分、３５分〜４０分、４０分〜４５分、４５分〜５０分、５０分〜５５分、または５５分〜６０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３０秒〜５分の期間内（例えば、１分〜５分、例えば１分、２分、３分、４分、または５分の期間内）に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、５分〜１０分の期間内（例えば５分、６分、７分、８分、９分、または１０分の期間内）に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、１０分〜１５分の期間内（例えば１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、または１５分の期間内）に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、１５分〜２０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、２０分〜２５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、２５分〜３０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３０分〜３５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、３５分〜４０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、４０分〜４５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、４５分〜５０分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、５０分〜５５分の期間内に切断する。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％を超えて、５５分〜６０分の期間内に切断する。
【０２８１】
いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるＣ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも（例えば非標的ＲＮＡの切断において）、１．２倍以上（例えば１．５倍以上、１．７倍以上、または２倍以上）の倍率でより効率的である。したがって、いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、方法のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって標的化されていないＲＮＡの切断において、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも１．２倍以上（例えば、１．５倍以上、１．７倍以上、または２倍以上）の倍率でより効率的である。いくつかの場合において、本開示のキットに含まれるために好適なＣ２ｃ２タンパク質は、活性化されるとき、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２よりも、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、または３０倍を超えて、効率的に非標的ＲＮＡを切断する。
【０２８２】
陽性対照
標識された検出ＲＮＡ及びＣ２ｃ２ポリペプチドを含む本開示のキットは、また、陽性対照標的ＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、キットは、また、対照標的ＲＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む陽性対照ガイドＲＮＡを含む。いくつかの場合において、陽性対照標的ＲＮＡは、様々な量で、別個の容器中で提供される。いくつかの場合において、陽性対照標的ＲＮＡは、様々な既知の濃度で、別個の容器中で、対照非標的ＲＮＡと共に提供される。
【０２８３】
Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／またはＣ２ｃ２タンパク質
本開示のＲＮＡ（例えばＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ）は、任意の都合が良い方法（例えば、化学合成、ＲＮＡポリメラーゼ酵素、例えばＴ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等を用いてインビトロで）を用いて合成することができ、２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸もまた企図されている。さらに、本開示のＣ２ｃ２タンパク質がタンパク質形態で（例えば、キットの一部として）提供され得るが、一方でＣ２ｃ２タンパク質（複数可）をコードする核酸（ｍＲＮＡ及び／またはＤＮＡ等）もまた提供され得る。
【０２８４】
例えば、いくつかの実施形態において、本開示のキットは、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクター）を含む。いくつかの場合において、ヌクレオチド配列は、ガイド配列を含まないＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする。例えば、いくつかの場合において、核酸は、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡの定常領域（ガイド配列を有さないＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含み、かつガイド配列をコードする核酸のための挿入部位を含む。いくつかの実施形態において、本開示のキットは、Ｃ２ｃ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクター）を含む。
【０２８５】
いくつかの実施形態において、本開示のキットは、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ（例えば、いくつかの場合において、アレイの各々のガイドＲＮＡが異なるガイド配列を有する場合）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクター）を含む。いくつかの場合において、アレイの１つ以上のコードされたガイドＲＮＡは、ガイド配列を有さず、例えば、核酸は、アレイの１つ以上のガイドＲＮＡのガイド配列（複数可）のための、挿入部位（複数可）を含み得る。いくつかの場合において、対象のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前駆体ｃｒＲＮＡ由来のハンドルを含み得るが、必ずしも複数のガイド配列を含む必要はない。
【０２８６】
いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（及び／または前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードするヌクレオチド配列）は、作動可能にプロモーター、例えば、原核生物細胞において機能的なプロモーター、真核生物細胞において機能的なプロモーター、哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、ヒト細胞において機能的なプロモーター等に連結される。いくつかの場合において、Ｃ２ｃ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、例えば、原核生物細胞において機能的なプロモーター、真核生物細胞において機能的なプロモーター、哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、ヒト細胞において機能的なプロモーター、細胞型特異的プロモーター、調節可能なプロモーター、組織特異的プロモーター等に作動可能に連結される。
【０２８７】
本開示の非限定的な態様の例
上述した本発明の主題の実施形態を含む態様は、単独でも、１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせても有益であり得る。上述の記載を限定することなく、１〜９０の番号が付された、本開示のある特定の非限定的態様が以下に提示される。当業者に明らかであるように、本開示を読む際に、各々の個別に番号が付された態様が、任意の先行するまたは後に続く個別の番号の付された態様と共に使用され得るか、または組み合わせ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせのサポートを提供することを意図し、以下に明示的に記載されている態様の組み合わせに限定することを意図しない。
【０２８８】
１．複数のＲＮＡを含む試料における一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、（ｉ）前記一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズするＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉ）前記試料中に存在するＲＮＡを切断するＣ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含む、方法。
２．複数のＲＮＡを含む試料における一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、（ｉ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ、及び（ｉｉ）前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断し、前記試料のＲＮＡをも切断する、Ｃ２ｃ２タンパク質と接触させること、ならびに、ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質介在性ＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することを含む、方法。
３．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１時間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、態様１または態様２に記載の方法。
４．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の４０分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、態様３に記載の方法。
５．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の５分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、態様４に記載の方法。
【０２８９】
６．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１分間内に、前記試料中に存在するＲＮＡの少なくとも５０％を切断する、態様５に記載の方法。
７．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、接触の１分間内に、前記試料中に存在する５０％から９０％を超えるＲＮＡを切断する、態様１に記載の方法。
８．前記一本鎖標的ＲＮＡを検出することができる最小濃度は、５００ｆＭ〜１ｎＭの範囲である、態様１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記一本鎖標的ＲＮＡは、８００ｆＭの低い濃度で検出することができる、態様１〜７のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質ではない、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０２９０】
１１．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも少なくとも１．２倍効率的に非標的ＲＮＡを切断する、態様１０に記載の方法。
１２．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号３に記述されているアミノ酸配列を含むＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）のＣ２ｃ２タンパク質よりも少なくとも１．５倍効率的に非標的ＲＮＡを切断する、態様１１に記載の方法。
１３．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１、２、または４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）のＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１に記述されているＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのＣ２ｃ２アミノ酸配列と８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０２９１】
１６．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号１〜２及び４〜６のいずれか１つに記述されているアミノ酸配列を含む、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＲ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の１つ以上の置換を含む、態様１に記載の方法。
１８．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７の置換を含む、態様１に記載の方法。
１９．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、態様１に記載の方法。
２０．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、配列番号２に記述されているＣ２ｃ２アミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８、及びＨ１０５３の置換を含む、態様１に記載の方法。
【０２９２】
２１．前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を２時間以下接触させる、態様１〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を６０分以下接触させる、態様２１に記載の方法。
２３．前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を３０分以下接触させる、態様２２に記載の方法。
２４．前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を１０分以下接触させる、態様２３に記載の方法。
２５．前記検出可能なシグナルを測定することの前に、前記試料を１分以下接触させる、態様２４に記載の方法。
【０２９３】
２６．前記試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含む、態様１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．標的ＲＮＡの量を決定することは、前記検出可能なシグナルを測定して、試験測定を生成すること、基準試料によって生じる検出可能なシグナルを測定して、基準測定を生成すること、及び前記試験測定を前記基準測定と比較して、前記試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含む、態様２６に記載の方法。
２８．前記検出可能なシグナルを測定して、試験測定を生成すること、各々異なる量の陽性対照ＲＮＡを含む２つ以上の基準試料の各々によって生じる検出可能なシグナルを測定して２つ以上の基準測定を生成すること、及び前記試験測定を前記２つ以上の基準測定と比較して、前記試料中に存在する標的ＲＮＡの量を決定することを含む、態様２６に記載の方法。
２９．前記試料は、配列において互いに異なる５〜１０7 のＲＮＡを含む、態様１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記試料は、配列において互いに異なる１０〜１０6 のＲＮＡを含む、態様１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２９４】
３１．前記試料は、細胞溶解物由来のＲＮＡを含む、態様１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．検出可能なシグナルを測定することは、金ナノ粒子に基づく検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、及び半導体に基づく感知の１つ以上を含む、態様１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．（ｉ）前記試料を、蛍光−発光染料対（すなわち、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及び／または消光剤／蛍光体対）を含む標識された検出ＲＮＡと接触させることを含み、（ｉｉ）前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、前記標識された検出ＲＮＡを切断し、（ｉｉｉ）前記検出可能なシグナルは、前記ＦＲＥＴ対及び／または前記消光剤／蛍光体対によって生じる、態様１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記標識された検出ＲＮＡは、切断される前にある量の検出可能なシグナルを生じ、前記検出可能なシグナルの量は、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに低減する、態様３３に記載の方法。
３５．前記標識された検出ＲＮＡは、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生じ、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに第２の検出可能なシグナルを生じる、態様３３に記載の方法。
【０２９５】
３６．前記標識された検出ＲＮＡは、ＦＲＥＴ対及び消光剤／蛍光体対を含む、態様３５に記載の方法。
３７．前記標識された検出ＲＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む、態様３３〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．検出可能なシグナルは、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに生じる、態様３３に記載の方法。
３９．検出可能なシグナルの量は、前記標識された検出ＲＮＡが切断されるときに増加する、態様３３に記載の方法。
４０．前記標識された検出ＲＮＡは、消光剤／蛍光体対を含む、態様３８または態様３９に記載の方法。
【０２９６】
４１．前記標識された検出ＲＮＡは、修飾された核酸塩基、修飾された糖部分、及び／または修飾された核酸結合を含む、態様３３〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．接触させることを、無細胞試料において実施する、態様１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．接触させることを、インビトロ、エクスビボ、またはインビトロで細胞内において実施する、態様１〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４４．前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断する方法であって、
各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを、Ｃ２ｃ２タンパク質と接触させることとし、前記Ｃ２ｃ２タンパク質は前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイを個別のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡに切断する、前記接触させることを含む、方法。
４５．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠くか、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く、態様４４に記載の方法。
【０２９７】
４６．前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、同一の標的ＲＮＡ分子内の異なる標的配列を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、態様４４または態様４５に記載の方法。
４７．前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的ＲＮＡ分子を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、態様４４〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．接触させることが、細胞内で起こらない、態様４４〜４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの少なくとも１つが、検出可能に標識されている、態様４４〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．複数のＲＮＡを含む試料における標的ＲＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸であって、前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、各々が異なるガイド配列及び／または選択されたガイド配列のための挿入部位を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、ならびに、
（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質を含む、キット。
【０２９８】
５１．前記Ｃ２ｃ２タンパク質は、触媒的に活性なＨＥＰＮ１ドメインを欠くか、及び／または触媒的に活性なＨＥＰＮ２ドメインを欠く、態様５０に記載のキット。
５２．前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、同一の標的ＲＮＡ分子内の異なる標的配列を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、態様５０または態様５１に記載のキット。
５３．前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的ＲＮＡ分子を標的とする２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、態様５０〜５２のいずれか１つに記載のキット。
５４．前記ガイドＲＮＡ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイの少なくとも１つが、検出可能に標識されている、態様５０〜５３のいずれか１つに記載のキット。
５５．蛍光−発光染料対（すなわち、ＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対）を含む標識された検出ＲＮＡをさらに含む、態様５０〜５４のいずれか１つに記載のキット。
【０２９９】
５６．複数のＲＮＡを含む試料における標的ＲＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）蛍光−発光染料対（すなわち、ＦＲＥＴ対及び／または消光剤／蛍光体対）を含む標識された検出ＲＮＡ、及び、（ｂ）Ｃ２ｃ２タンパク質を含む、キット。
５７．陽性対照標的ＲＮＡを含む、態様５６に記載のキット。
５８．前記陽性対照標的ＲＮＡは、２つ以上の容器各々に異なる量で存在する、態様５７に記載のキット。
５９．（ｃ）Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、（ｄ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び、（ｅ）前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸であって、前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイは、各々が異なるガイド配列及び／または選択されたガイド配列のための挿入部位を有する２つ以上のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡを含む、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイ及び／または前記前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸の少なくとも１つを含む、態様５６〜５８のいずれか１つに記載のキット。
６０．ガイド配列を含むか、または含まず、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを含む、態様５６〜５９のいずれか１つに記載のキット。
【０３００】
６１．前記ＤＮＡは、ガイド配列の挿入のための挿入配列を含む、態様６０に記載のキット。
６２．前記ＤＮＡは発現ベクターであり、前記Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡが作動可能にプロモーターに連結されている、態様６０または態様６１に記載のキット。
６３．前記プロモーターはＴ７プロモーターである、態様６２に記載のキット。
６４．ヌクレアーゼ活性を欠くＣ２ｃ２エンドリボヌクレアーゼバリアントを含む、態様５６〜６３のいずれか１つに記載のキット。
６５．前記標識された検出ＲＮＡはＦＲＥＴ対を含む、態様５６〜６４のいずれか１つに記載のキット。
【０３０１】
６６．前記標識された検出ＲＮＡは消光剤／蛍光体対を含む、態様５６〜６５のいずれか１つに記載のキット。
６７．前記標識された検出ＲＮＡは、第１の検出可能なシグナルを生じるＦＲＥＴ対、及び第２の検出可能なシグナルを生じる消光剤／蛍光体対を含む、態様５６〜６６のいずれか１つに記載のキット。
６８．ａ）配列番号２に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０４８及びＨ１０５３、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４８及びＨ１０５３の置換を含む、アミノ酸配列、
ｂ）配列番号１に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４４５及びＨ４５０、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０１６及びＨ１０２１、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４４５、Ｈ４５０、Ｒ１０１６及びＨ１０２１の置換を含む、アミノ酸配列、
ｃ）配列番号４に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４６４及びＨ４６９、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０５２及びＨ１０５７、もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４６４、Ｈ４６９、Ｒ１０５２及びＨ１０５７の置換を含む、アミノ酸配列、
ｄ）配列番号５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４６７及びＨ４７２、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０６９及びＨ１０７４。もしくはｉｉｉ）アミノ酸Ｒ４６７、Ｈ４７２、Ｒ１０６９及びＨ１０７４の置換を含む、アミノ酸配列、または
ｅ）配列番号６に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、ｉ）アミノ酸Ｒ４７２及びＨ４７７、ｉｉ）アミノ酸Ｒ１０４４及びＨ１０４９、ｉｉｉ）もしくはアミノ酸Ｒ４７２、Ｈ４７７、Ｒ１０４４及びＨ１０４９の置換を含む、アミノ酸配列を含む、バリアントＣ２ｃ２ポリペプチド。
６９．前記バリアントＣ２ｃ２ポリペプチドは、低減したかまたは検出不能のｓｓＲＮＡの切断（例えば、ＲＮＡ誘導切断活性）を有するが、Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ及びｓｓＲＮＡに結合する能力を保持し、前駆体Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡを切断する能力を保持する、６８に記載のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチド。
７０．態様６８または態様６９に記載のバリアントＣ２ｃ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【０３０２】
７１．前記ヌクレオチド配列が、構成的プロモーターまたは調整可能なプロモーターに作動可能に連結されている、態様７０に記載の核酸。
７２．態様７０または態様７１に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
７３．態様７０もしくは態様７１に記載の核酸または態様７２に記載の組換え発現ベクターによって遺伝的に改変された宿主細胞。
７４．前記宿主細胞は真核生物細胞である、態様７３に記載の宿主細胞。
７５．前記宿主細胞は原核生物細胞である、態様７３に記載の宿主細胞。
【０３０３】
７６．前記宿主細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボである、態様７３〜７５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
７７．複数のＲＮＡを含む試料における少なくとも２つの異なる一本鎖標的ＲＮＡを検出する方法であって、
ａ）前記試料を、（ｉ）少なくとも１つのＡを含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を切断する第１のＣ２ｃ２タンパク質、（ｉｉ）少なくとも１つのＵを含むｓｓＲＮＡを切断する第２のＣ２ｃ２タンパク質、（ｉｉｉ）第１の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ、及び、（ｉｖ）第２の一本鎖標的ＲＮＡとハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列及び前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する第２のヌクレオチド配列を含む第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡと接触させることであって、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質が、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質が、少なくとも１つのＡを含むｓｓＲＮＡを切断し、
前記第２のＣ２ｃ２タンパク質が、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡによって活性化されず、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質が、少なくとも１つのＵを含むｓｓＲＮＡを切断すること、ならびに
ｂ）前記第１及び第２のＣ２ｃ２タンパク質によって媒介されるＲＮＡ切断によって生じる検出可能なシグナルを測定することであって、第１の検出可能なシグナルは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質の活性化の際に生じ、第２の検出可能なシグナルは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質の活性化の際に生じ、前記第１のシグナルの検出は、前記第１の標的ｓｓＲＮＡの前記試料中の存在を示し、前記第２のシグナルの検出は、前記第２の標的ｓｓＲＮＡの前記試料中の存在を示すこと
を含む、方法。
【０３０４】
７８．ａ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｂ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｃ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｄ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｅ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｆ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｇ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｂａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｈ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｉ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｊ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｋ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｌ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｍ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｎ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｄに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｏ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｊに描写されるＥｒｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｐ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｋに描写されるＨｈｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｑ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｇに描写されるＲｃａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｒ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｂに描写されるＰｐｒ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｓ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｉに描写されるＬｎｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｔ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｃに描写されるＬｂｕ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｕ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｅに描写されるＬｗａ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、
ｖ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｆに描写されるＬｓｈ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または
ｗ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ｈに描写されるＣａｍ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、図５６Ａに描写されるＬｓｅ  Ｃａｓ１３ａアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様７７に記載の方法。
【０３０５】
７９．前記試料を、ｉ）第１の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及び／または第１の消光剤／蛍光体対を含む第１の標識された検出ＲＮＡであって、前記第１の標識された検出ＲＮＡはが少なくとも１つのＡを含み、Ｕを含まない、第１の標識された検出ＲＮＡ、及び、ｉｉ）第２のＦＲＥＴ対及び／または第２の消光剤／蛍光体対を含む第２の標識された検出ＲＮＡであって、前記第２の標識された検出ＲＮＡは少なくとも１つのＵを含み、Ａを含まない、第２の標識された検出ＲＮＡと接触させることを含み、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１の標識された検出ＲＮＡを切断し、前記第１の検出可能なシグナルは前記第１のＦＲＥＴ対及び／または前記第１の消光剤／蛍光体対によって生じ、
前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２の標識された検出ＲＮＡを切断し、前記第２の検出可能なシグナルは前記第２のＦＲＥＴ対及び／または前記第２の消光剤／蛍光体対によって生じる、態様７７または態様７８に記載の方法。
８０．前記第１の標識された検出ＲＮＡは、２〜１５の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、２〜１５の連続的なＵの区間を含む、態様７９に記載の方法。
【０３０６】
８１．前記第１の標識された検出ＲＮＡは、４〜１５の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、４〜１５の連続的なＵの区間を含む、態様７９に記載の方法。
８２．前記第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも３の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも３の連続的なＵの区間を含む、態様７９に記載の方法。
８３．前記第１の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも４の連続的なＡの区間を含み、及び／または前記第２の標識された検出ＲＮＡは、少なくとも４の連続的なＵの区間を含む、態様７９に記載の方法。
８４．（ａ）Ｕを欠き、少なくとも１つのＡを含み、第１の蛍光−発光染料対を含む、第１の標識された検出ＲＮＡ、（ｂ）Ａを欠き、少なくとも１つのＵを含み、第２の蛍光−発光染料対を含む、第２の標識された検出ＲＮＡ、（ｃ）第１のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸であって、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第１の標識された検出ＲＮＡを切断することができるが、前記第２の標識された検出ＲＮＡを切断することができない（例えば、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質が、活性化されるときにアデニン＋ＲＮＡを切断し、Ａを欠くＲＮＡを切断しない）、第１のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸、ならびに、（ｄ）第２のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第２のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸であって、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質は、前記第２の標識された検出ＲＮＡを切断することができるが、前記第１の標識された検出ＲＮＡを切断することができない（例えば、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質が、活性化されるときにウラシル＋ＲＮＡを切断し、Ｕを欠くＲＮＡを切断しない）、第１のＣ２ｃ２タンパク質及び／または前記第１のＣ２ｃ２タンパク質をコードする核酸を含む、キット。
８５．（ｅ）第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、（ｆ）第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸であって、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ及び／または前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードする核酸、（ｇ）前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸、ならびに、（ｈ）前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸の少なくとも１つを含む、態様８４に記載のキット。
【０３０７】
８６．第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記第１のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、態様８４に記載のキット。
８７．第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記第２のＣ２ｃ２ガイドＲＮＡは、前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列を含む、態様８４に記載のキット。
８８．前記第１のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸を含む、態様８４に記載のキット。
８９．前記第２のＣ２ｃ２タンパク質に結合する定常領域配列をコードするヌクレオチド配列と、選択されたガイド配列のための挿入部位とを含む、核酸を含む、態様８４に記載のキット。
９０．前記核酸は発現ベクターであり、前記ヌクレオチド配列が作動可能にプロモーターに連結されている、態様８６〜８９のいずれか１つに記載のキット。
【実施例】
【０３０８】
以下の実施例は、当業者に本発明をいかに作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するために進められ、発明者が自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された全部または唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内（筋肉内に）、ｉ．ｐ．は腹腔内（腹腔内に）、ｓ．ｃ．は皮下（皮下に）等の標準的な略語が使用され得る。
【０３０９】
本明細書に記載のデータは、Ｃ２ｃ２がＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ加工及びｓｓＲＮＡ分解に関与する２つの異なるリボヌクレアーゼ活性を有することを示す。前駆体ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）の成熟は、比較的遅く、非常に特異的な触媒の事象である。対照的に、ｃｒＲＮＡのガイドセグメントに相補的な配列を持つ標的ＲＮＡへの結合の際、Ｃ２ｃ２は、ウラシルヌクレオチドにおける鎖切断を開始することによって、シス及びトランスにおいてＲＮＡを切断する確実な一般的なＲＮａｓｅとして活性化される。データは、このトランス切断活性を、複雑な混合物内で超高感度ＲＮＡ検出に利用できることを示す。
【０３１０】
実施例１：Ｃ２ｃ２組換えタンパク質の精製
図１Ａ〜１Ｅは、内在性Ｃ２ｃ２座位、ならびに組換えＣ２ｃ２タンパク質の異種発現及び精製の要約を示す。図１Ａは、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓのＣ２ｃ２座位の概略図であり、黄色で示された予測されたＨＥＰＮ活性部位、活性部位残基を示す。図１Ｂは、このＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからの成熟ｃｒＲＮＡの概略図である。図１Ｃは、陽イオン交換クロマトグラフィー画分のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析を示す。Ｈｉｓ−結合タンパク質（ＭＢＰ）−Ｃ２ｃ２を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を採取し、超音波処理により溶解した。溶解物は、遠心により清浄化され、次いで、Ｈｉｓ−ＭＢＰ−Ｃ２ｃ２を金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上で単離した。タンパク質溶離液を、ＴＥＶプロテアーゼと共にインキュベートして、Ｈｉｓ−ＭＢＰタグを切断した。切断されたタンパク質はＨｉＴｒａｐヘパリンカラムにロードされ、直線状ＫＣｌ勾配で溶離した。溶離画分は、解析のために１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。図１Ｄは、陽イオン交換クロマトグラフィー画分をプールして、濃縮し、次いで、Ｓ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードした結果を示す。サイズ交換クロマトグラフィーからの画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。図１Ｅは、Ｃ２ｃ２酵素活性のためのワーキングモデルを示す。
【０３１１】
実施例２：Ｃ２ｃ２は、プログラム制御可能なエンドリボヌクレアーゼである。
精製されたＣ２ｃ２は、触媒的に活性なＨＥＰＮドメインの存在に依存したｃｒＲＮＡ−誘導様式で一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を切断した（図２）。
【０３１２】
図２にあって、切断アッセイは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、５％のグリセロール中で実施された。１００ｎＭのＣ２ｃ２タンパク質は、複合体の集合を促進するために、３７℃で１０分間、２：１の比率でｃｒＲＮＡと共に予めインキュベートされた。約１ｎＭの５’32Ｐ標識されたｓｓＲＮＡの添加が反応を開始し、時点は、ホルムアミドローディングバッファによるクエンチングによって取られた。切断産物形成は、１５％変性尿素−ＰＡＧＥによって分離され、ホスフォイメージャーを用いて可視化された。不活化タンパク質（ｄＣ２ｃ２の注記によって示される）は、両方の予測された活性部位のＲ−Ｘ４−６−Ｈ  ＨＥＰＮモチーフからアルギニンとヒスチジンとの両方を取り除く、四重の点変異体（Ｒ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、Ｈ１０５３Ａ）である。このゲルにおいて、対象のレーンは、赤い箱によって強調されている。オフターゲットｓｓＲＮＡによって、または、ＨＥＰＮドメインが不活化されているとき、切断活性は全く検出されない。
【０３１３】
実施例３：Ｃ２ｃ２切断活性は一本鎖ＲＮＡに特異的である。
Ｃ２ｃ２は、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの切断を全く示さず、ｓｓＲＮＡと比べて非常に減少した割合の、一本鎖ＤＮＡの限定された切断を示す（図３）。
【０３１４】
図３にあって、Ｃ２ｃ２は、一本鎖ＲＮＡを確実に切断し、二本鎖の基質を切断しない。切断アッセイの条件は図２と同様である。切断産物は、１５％変性尿素−ＰＡＧＥゲルで分離した。試料は、５、１０、３０、７５分で取られ、全ての対照のレーンは、並行して７５分間インキュベートされた。予測されたサイズ範囲の切断産物が、ｓｓＲＮＡ反応物においてのみ検出することができ、より少ない程度で一本鎖ＤＮＡ条件において検出された。一本鎖ＲＮＡ標的の３’末端標識は、切断が、標的−スペーサーハイブリダイゼーション領域の外側で起こっていることを実証する。図の頂部の標識は、タンパク質（「Ｌｂｕ  Ｃ２ｃ２」）またはＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ（「ｃｒＧＡＰＤＨ１」のいずれかが添加されたかを示す。対照は、（ｉ）タンパク質、しかしガイドＲＮＡなし、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ、しかしタンパク質なし、及び、（ｉｉｉ）タンパク質なしかつガイドＲＮＡなし、を含んだ。
【０３１５】
実施例４：Ｃ２ｃ２は、前駆体ｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡに加工する。
Ｃ２ｃ２は、ＨＥＰＮ−ドメイン非依存的な様式で前駆体ｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡに加工し（図４Ａ〜４Ｂ）、さらなるエンドヌクレアーゼドメインの存在を示す。
【０３１６】
図４Ａは、Ｃ２ｃ２によって触媒されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工反応の略図である。図４Ｂにあって、１００ｎＭのＬｂｕ  Ｃ２ｃ２を、ホルムアミドローディングバッファーのクエンチングの前に、６０分間、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、５％のグリセロール中で、約５ｎＭの５’３２Ｐ標識ｓｓＲＮＡと共にインキュベートした。反応産物は、１５％変性尿素−ＰＡＧＥゲルで分離され、ホスフォイメージャーによって可視化された。不活化タンパク質（ｄＣ２ｃ２の注記によって示される）は、両方の予測された活性部位のＲ−Ｘ４−６−Ｈ  ＨＥＰＮモチーフからアルギニンとヒスチジンとの両方を取り除く、四重の点変異体（Ｒ４７２Ａ、Ｈ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、Ｈ１０５３Ａ）である。様々なスペーサー配列を有する３つの異なるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、Ｃ２ｃ２加工能力について試験された。
【０３１７】
実施例５：複雑な混合物中の転写物の高感度の検出
Ｃ２ｃ２は、複雑な混合物中の標的転写物を検出するために使用された（図５）。
【０３１８】
図５にあって、５０ｎＭのＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ標的化λ２ｓｓＲＮＡは、増加する量のλ２ｓｓＲＮＡ（０〜１０ｎＭ）の存在下で、３７℃で３０分間、１８５ｎＭのＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質（小さな蛍光−消光剤ＲＮＡオリゴヌクレオチド−消光剤／蛍光体対で標識された、標識された検出ＲＮＡ）、及び１００ｎｇのＨＥＫ２９３Ｔの全ＲＮＡとインキュベートされた。蛍光における増加は、「活性化」Ｃ２ｃ２（Ｃ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ：λ２ｓｓＲＮＡ）がＲＮＡｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質を切断して、消光剤部分から蛍光体を放出するときに、観察された。
【０３１９】
実施例６：Ｃ２ｃ２タンパク質による前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）加工
Ｃ２ｃ２は、前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）を切断（加工）し、この切断は、ＨＥＰＮ−ドメインとは独立していた（図６）。
【０３２０】
図６にあって、３００ｎＭのＣ２ｃ２を、１ｎＭの５’−32Ｐ−標識ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと共に、３７℃で０〜６０分間インキュベートした。ＲＮＡ産物は、１５％尿素−ＰＡＧＥで分離し、ホスフォイメージャーを用いて画像化した。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの加工の成功は、より小さい「切断されたＲＮＡ」産物の存在によって判定される。
【０３２１】
実施例７：物質及び方法
以下の物質及び方法が使用され、実施例８〜１２に適用可能である。
【０３２２】
Ｃ２ｃ２の系統及び候補選択に関して、Ｃ２ｃ２の最尤の系統は、ＲＡｘＭＬを用いてＰＲＯＴＧＡＭＭＡＬＧ進化モデル及び１００ブートストラップサンプリングによって計算された。配列はＭＡＦＦＴによって、『ｅｉｎｓｉ』法でアラインメントされた。Ｎｉｅｗｏｅｈｎｅｒ，Ｏ．  ＆  Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ−Ａ  ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｓｍ６．ＲＮＡ２２，３１８−３２９（２０１６）。候補の相同体は、タンパク質ファミリーの主枝をサンプリングするために選択された。
【０３２３】
Ｃ２ｃ２タンパク質の産生及び精製に関して、タンパク質精製のための発現ベクターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから注文された、合成ｇＢｌｏｃｋｓを用いて組み立てられた。コドン最適化Ｃ２ｃ２ゲノム配列は、Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−ＴＥＶ切断部位によってＮ−末端タグ化され、発現はＴ７プロモーターによって駆動された（マップは要求に応じて入手可能である）。変異体タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ２コンストラクトのラウンドザホーン部位特異的変異を介してクローニングされた。発現ベクターは、３７℃において２ｘＹＴブロスで増殖するＲｏｓｅｔｔａ２  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換された。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、対数増殖期に、０．５Ｍのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラトピラノシド（ＩＴＰＧ）によって誘導され、Ｈｉｓ−ＭＢＰ−Ｃ２ｃ２の終夜発現のために、温度を１６℃に低下させた。その後細胞を回収し、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、０．５ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、及びエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−フリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））で再懸濁し、超音波処理によって溶解し、溶解物を遠心によって清浄化した。可溶性Ｈｉｓ−ＭＢＰ−Ｃ２ｃ２を、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上で単離し、タンパク質含有溶離液を、Ｈｉｓ６−ＭＢＰタグの切断のために、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼと共に、４℃で一晩インキュベートしつつ、イオン交換バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中に透析した。切断されたタンパク質はＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラムにロードされ、直線状ＫＣｌ（０．２５〜１．５Ｍ）勾配で溶離した。陽イオン交換クロマトグラフィー画分はプールされ、３０ｋＤカットオフ濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で濃縮した。Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｓ２００カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製され、続く酵素アッセイのために、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２００ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中で保存された。
【０３２４】
ｓｓＲＮＡの生成に関して、この研究において使用される全てのＲＮＡは、合成を注文された（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｃｒＲＮＡ  ＡＥＳ４６１を除いて、インビトロで転写された［図１５及び図１９を参照］。インビトロ転写反応は、以下の修正を伴ってこれまでに記載されたように実施された。Ｔ７ポリメラーゼ濃度は、１０μｇ／ｍＬに減ぜられ、ＵＴＰ濃度は、２．５ｍＭに減ぜられた。転写は３７℃で１〜２時間インキュベートされ、ヌクレオチドの非テンプレート付加を減じた。全ての転写反応物は、１５％変性ＰＡＧＥゲルを用いて精製された。全てのＲＮＡは、切断バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）に再懸濁された。以前に記載されたように（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａｕｒｗｉｔｚ，Ｒ．Ｅ．  ＆  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ．ＲＮＡ１８，６６１−６７２（２０１２）．）、放射性実験のために、５’トリホスフェートは、放射性標識の前に子ウシ腸管内ホスフェート（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって除去され、続いてｓｓＲＮＡ基質は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、５’末端標識された。
【０３２５】
この研究において使用されるＤＮＡ基質は表２、図１４に提示される。
【０３２６】
この研究において使用されるＲＮＡ基質は表３、図１５に提示される。
【０３２７】
Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工アッセイに関して、Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断アッセイは、３７℃において、５’−標識ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに対して１００倍モル過剰のＣ２ｃ２を含む（それぞれ、１００ｎＭ及び＞１ｎＭの最終濃度）、加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．０５％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％グリセロール）中で実施された。別途示されない限り、反応は、６０分後に、１．５×ＲＮＡローディングダイ（１００％のホルムアミド、０．０２５ｗ／ｖ％のブロモフェノールブルー、及び２００μｇ  ｍＬ−１のヘパリン）によってクエンチされた。クエンチングの後、１２％または１５％の変性ＰＡＧＥ（０．５×ＴＢＥバッファー）によって分離する前に、反応物は９５℃で５分間変性された。反応の金属依存性は、１０〜１００ｍＭで変動する濃度での反応バッファーへのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの添加によって試験された。バンドは、ホスフォイメージングによって可視化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量された。切断パーセントは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、産物と切断されていないｐｒｅ−ｃｒＲＮＡバンドの両方の全強度に対する産物のバンド強度の比として決定され、各々の測定された基質内のバックグラウンドで標準化され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて一相指数的結合に適合させた。
【０３２８】
産物サイズマッピングに関して、切断産物の長さは、産物バンドのゲル移動を、ＡｍｂｉｏｎのＲＮａｓｅ  Ｔ１キットを用いる、アルカリ加水分解及びＲＮａｓｅ  Ｔ１消化ラダーと比較することによって、生化学的に決定された。加水分解ラダーについて、１５ｎＭの全長ＲＮＡ基質は、１×アルカリ加水分解バッファー（Ａｍｂｉｏｎ）中で、９５℃で５分間インキュベートされた。反応は１．５×ＲＮＡローディングバッファーによってクエンチされ、加水分解をすぐに停止させるために−２０℃に冷却された。ＲＮａｓｅ  Ｔ１ラダーについて、１５ｎＭの全長ＲＮＡ基質は、６５℃で１×ＲＮＡシーケンシングバッファー（Ａｍｂｉｏｎ）中で広げられた。反応は常温に冷却され、次いで、１μｌのＲＮａｓｅ  Ｔ１が反応に添加された。１５分後、反応を、フェノール−クロロホルム抽出によって停止させ、保存のために１．５×ＲＮＡローディングバッファーを添加した。加水分解バンドは、切断試料と並行して１５％変性ＰＡＧＥ上で分離され、ホスフォイメージングによって可視化された。
【０３２９】
標的切断アッセイに関して、標的切断アッセイは、切断バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）中で２５℃及び３７℃で実施された。ｃｒＲＮＡガイドは、切断バッファー中で、６５℃で５分間加熱して、次いで、ゆっくりと常温に冷却することによって予め折りたたまれた。ＲＮＰ複合体形成は、５’末端標識された標的及び／または他の非放射性標識のＲＮＡ標的基質の添加前に、一般的に２：１のモル比のタンパク質対ｃｒＲＮＡで、３７℃で１０分間、切断バッファー中で実施された。別途示されない限り、全ての反応について、タンパク質、ガイド、及び標的の最終濃度は、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び＞１ｎＭであった。反応は１．５×ＲＮＡローディングダイによってクエンチされ、１５％変性ＰＡＧＥ（０．５×ＴＢＥバッファ）によって分離された。バンドは、ホスフォイメージングによって可視化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量された。切断パーセントは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、切断されていないバンドに対する全ての短い産物の全バンド強度の比として決定され、各々の測定された基質内のバックグラウンドで標準化され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて一相指数的結合に適合させた。
【０３３０】
ｃｒＲＮＡフィルター結合アッセイに関して、フィルター結合アッセイはＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中で実施された。ＬｂｕＣ２ｃ２は、放射性標識されたｃｒＲＮＡ（＜０．１ｎＭ）と共に、３７℃で１時間インキュベートされた。Ｔｕｆｒｙｎ、Ｐｒｏｔｒａｎ、及びＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、上記の列挙された順番で、ドットブロット装置上で組み立てられた。膜は、試料を膜に適用する前に、５０μＬの平衡バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）によって２回洗浄した。膜は再び５０μＬの平衡バッファーによって洗浄され、乾燥され、ホスフォイメージングによって可視化された。データは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、結合等温線に適合された。全ての実験は、三重で実施された。解離定数及び関連誤差は、図の説明で報告される。
【０３３１】
電気泳動移動度シフトアッセイに関して、ｓｓＲＮＡ結合実験中に、低濃度におけるＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２：ｃｒＲＮＡ複合体の解離を避けるために、結合反応は、常に過剰なＬｂｕＣ２２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２（２００ｎＭ）、ならびに増加する濃度のｃｒＲＮＡ−Ａ及び＜０．１ｎＭの標的ｓｓＲＮＡを含んだ。アッセイはＣ２ｃ２電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中で実施された。ＬｂｕＣ２ｃ２−ｃｒＲＮＡ−Ａ複合体は、５’放射性標識されたｓｓＲＮＡ基質の添加及び、３７℃で４５分間のさらなるインキュベーションの前に、上述のように、３７℃において１０分間で予め形成された。次いで、試料は、４℃で８％ネイティブＰＡＧＥによって分離された（０．５×ＴＢＥバッファー）。ゲルは、ホスフォイメージングによって画像化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、結合等温線に適合された。全ての実験は、三重で実施された。解離定数及び関連誤差は、図の説明で報告される。
【０３３２】
蛍光ＲＮＡ検出アッセイに関して、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体は、３７℃で１０分間、１μＭのＬｂｕ−Ｃ２ｃ２：Ｃ２ｃ２を、５００ｎＭのｃｒＲＮＡと共にインキュベートすることによって予め組み立てられた。次いで、これらの複合体は、１８５ｎＭのＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、１００ｎｇのＨｅＬａ全ＲＮＡ及び増加する量のｓｓＲＮＡ（０〜１ｎＭ）の存在下で、ＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中で、１００ｎＭのＬｂｕＣ２ｃ２：５０ｎＭのｃｒＲＮＡ−λ２に希釈された。これらの反応物は、３７℃で１２０分まで、蛍光プレートリーダー中でインキュベートされ、５分ごとに蛍光測定（λex：４８５ｎｍ、λem：５３５ｎｍ）がなされた。バックグラウンド補正蛍光値は、標的ｓｓＲＮＡの非存在下で実施された反応から得られた蛍光値を引くことによって得られた。最大蛍光は、５０ｎＭのＲＮａｓｅＡを１８５ｎＭのＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質と共にインキュベートすることによって測定された。結合したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ検出アッセイについて、ＬｂｕＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体は、３７℃で２０分間、１μＭのＬｂｕ−Ｃ２ｃ２：Ｃ２ｃ２を５００ｎＭのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−Ａ−λ２と共にインキュベートすることによって予め組み立てられ、反応は上述のように、増加する量のｓｓＲＮＡ  Ａ及びｓｓＲＮＡλ２（それぞれ０〜１ｎＭ）の存在下で実施された。各々の場合において、エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。
【０３３３】
実施例８：Ｃ２ｃ２ファミリーは、成熟ｃｒＲＮＡを産生するために前駆体ｃｒＲＮＡ転写物を加工する。
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位は、明確なＣａｓ６またはＣａｓ５ｄ様エンドヌクレアーゼまたはｔｒａｃｒＲＮＡを欠く。Ｃ２ｃ２それ自体が、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を有し得るか否かという問いがなされた。これを試験するために、図９Ａ及び９Ｂに示すように、Ｃ２ｃ２タンパク質ファミリーの３つの異なる枝を起源とする、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ（Ｌｂｕ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ）、及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ（Ｌｓｅ）からの組換えＣ２ｃ２相同体が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて発現され、精製された。
【０３３４】
図９Ｃに示すように、全ての３つのタンパク質は、６０分以内に、全長のコンセンサスリピート配列と２０ヌクレオチド（ｎｔ）スペーサー配列とからなる５’末端放射性標識されたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ基質を切断した。図９Ｃに示すように、全てのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ相同体のための切断部位は、Ｔ１  ＲＮａｓｅ及び水酸化物加水分解ラダーを用いてマッピングされ、相同体に応じて予測されたヘアピン構造の２または５ｎｔ上流の位置で加工が起きることが示された。
【０３３５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＬｓｅＣ２ｃ２及びＬｓｈＣ２ｃ２オペロンの異種性発現からのシーケンシングデータが、類似するが同一でない加工事象を見出だすので、細胞要素がさらにｃｒＲＮＡを加工し得る可能性がある。ＬｂｕＣ２ｃ２及びタンデムヘアピンリピートアレイを含むｐｒｅ−ｃｒＲＮＡによる切断アッセイは、２つの連続する切断事象に対応する２つの産物をもたらし（図１６Ａ〜１６Ｆ）、一次ｃｒＲＮＡ転写物の加工におけるＣ２ｃ２の役割と一致する。これらの結果は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム内でＣ２ｃ２相同体が、それらの関連するｃｒＲＮＡの成熟を触媒することを実証する。
【０３３６】
図９Ａ−９Ｃに関して、Ｃ２ｃ２ファミリーは、成熟ｃｒＲＮＡを産生するために前駆体ｃｒＲＮＡ転写物を加工する。図９Ａは、Ｃ２ｃ２タンパク質の最尤系統樹を示す。受入番号、生物名称、及びブートストラップ値を含む完全な詳細は図２２Ａに提示される。この試験において使用される相同体は、黄色で強調される。図９Ｂは、３つの異なるＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位の略図である。黒い長方形はリピート要素を表し、一方で黄色い菱形はスペーサー配列を表す。Ｃａｓ１及びＣａｓ２のみが、Ｌｓｈ  Ｃ２ｃ２のゲノム近辺において見出される。図９Ｃは、ＬｂｕＣ２ｃ２、ＬｓｅＣ２ｃ２、及びＬｓｈＣ２ｃ２に由来する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのＣＣ２ｃ２媒介性切断を示す。ＯＨ：アルカリ加水分解ラダー、Ｔ１：Ｔ１  ＲＮａｓｅ加水分解ラダーであり、切断反応の処理は、１００ｎＭのＣ２ｃ２及び＞１ｎＭのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡで実施された。切断の概略図は右側に描写され、予測されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの二次構造は、下方に図示され、矢印は、マッピングされたＣ２ｃ２切断部位を示す。
【０３３７】
図２２Ａ−２２Ｂは．Ｃ２ｃ２ファミリーの完全な系統樹及びＣ２ｃ２アラインメントを示す。図２２Ａは、Ｃ２ｃ２タンパク質の最尤の系統学的な再構成を示す。葉は起源のＧＩタンパク質ナンバーと起源の生物とを含み、１００のリサンプリングのうちのブートストラップサポート値は、内部分岐に提示される。スケールは位置ごとに置き換えられる。図２２Ｂは、３つの分析されたＣ２ｃ２相同体の多重配列アラインメントを示し、整合はＬｂｕＣ２ｃ２に基づく。
【０３３８】
図２３Ａ−２３Ｄは、Ｃ２ｃ２の精製及び産生を示す。全てのＣ２ｃ２相同体は、Ｈｉｓ−ＭＢＰ融合としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現され、アフィニティ、イオン交換、及びサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって精製された。Ｎｉ+ アフィニティタグは、ＴＥＶプロテアーゼとのインキュベーションによって除去された。クロマトグラフィー画分の代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、上述されている（図２３Ａ〜２３Ｂ）。図２３Ｃは、Ｃ２ｃ２が単一ピークとして溶離し、核酸を含んでいないことを実証するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（１６／６０）カラムのクロマトグラフである。図２３Ｄは、この原稿において使用される全ての精製されたタンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を示す。
【０３３９】
図１６Ａ〜１６Ｆに関して．Ｃ２ｃ２によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工は、スペーサー配列とは独立し、タンデムｃｒＲＮＡアレイにおいて起こり得、ｐｒｅ−ｃＲＮＡの５’隣接領域における変異によって影響を受け、そして金属とは独立している。図１６Ａは、ＬｂｕＣ２ｃ２、ＬｓｈＣ２ｃ２、及びＬｓｅＣ２ｃ２のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の同様の速度を実証する代表的な経時変化のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断アッセイを示す。図１６Ｂは、単一の同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイのＬｓｅＣ２ｃ２及びＬｓｈＣＣ２ｃ２の切断の切断部位のマッピングを示し、ＯＨ：アルカリ加水分解ラダー、Ｔ１：Ｔ１  ＲＮａｓｅ加水分解ラダーである。切断反応は、１００ｎＭのＬｂｕ  Ｃ２ｃ２及び＜１ｎＭのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡで実施された。切断産物の概略図を描写し、矢印はマッピングされたＣ２ｃ２切断産物を示す。図１６Ｃは、タンデムｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイのＬｂｕＣｃ２ｃ２による切断の切断部位マッピングを示し、ＯＨ：アルカリ加水分解ラダー、Ｔ１：Ｔ１  ＲＮａｓｅ加水分解ラダーである。切断反応は、１００ｎＭのＬｂｕ  Ｃ２ｃ２及び＜１ｎＭのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡで実施された。切断産物の概略図を右側に描写し、矢印はマッピングされたＣ２ｃ２切断産物を示す。図１６Ｄは、同様の速度のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工がｃｒＲＮＡスペーサー配列と独立して起こることを実証する代表的なＬｂｕＣ２ｃ２のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断の経時変化を示す。図１６Ｅは、効率的なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のための５’一本鎖隣接領域の重要性を実証するＬｂｕＣ２ｃ２の４−ｍｅｒの変異体のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のデータを示す。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のパーセンテージは、６０分後に測定された（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。図１６Ｆは、種々のＥＤＴＡ及びＥＧＴＡの濃度範囲における加工活性を例示する変性ゲルを示す。高濃度のキレーターは、産物の予測された移動パターンを変化させる。
【０３４０】
実施例９：ＬｂｕＣ２ｃ２媒介性ｃｒＲＮＡ生合成は、ＣＲＩＳＰＲリピートの構造と配列との両方に依存する。
Ｃａｓ６及びＣａｓ５ｄ等の他のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工酵素は、非常に特異的な様式で、それらのそれぞれのＣＲＩＳＰＲリピート配列のヘアピンを認識する。ＬｂｕＣ２ｃ２ガイドＲＮＡ加工のための配列及び構造の要件が決定された。切断アッセイは、ステムループまたはコンセンサスリピート配列の一本鎖隣接領域のいずれかに変異を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡによって実施された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断活性は、リピート領域におけるステムの長さを変動させる際に大幅に低減され、リピートコンセンサス４塩基対（ｂｐ）のステムは、６０分後に、８５±０．７％の切断をもたらし、−１ｂｐ及び＋１ｂｐのステムは、それぞれ５４±１．３％及び６±３．８％の切断のみをもたらす（図１０Ａ）。同様に、ステムループの反転またはループの長さの低減は、加工活性を減じた。切断可能な結合を含むか、またはその近傍の連続的な４−ｎｔ変異を含む最初の研究は、ＬｂｕＣ２ｃ２のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを加工する能力を完全に無効にした（図１６Ｄ）。全ｃｒＲＮＡリピート配列のより広範な変異解析は、ヘアピンの両側における塩基変化に著しく感受性である２つの異なる領域を明らかにした（図１０Ｂ、図１７）。加工活性は、二価の金属イオンキレーターＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの存在によって全く影響を受けなかった（図１０Ｃ、図１６Ｅ）。まとめると、これらのデータは、Ｃ２ｃ２のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断が、前駆体ＣＲＩＳＰＲ転写物内のリピート由来へアピンの構造及び配列特異的認識の組み合わせに支配される二価の金属イオンに非依存性なプロセスであることを示す。
【０３４１】
図１０Ａ〜１０Ｃに関して、ＬｂｕＣ２ｃ２媒介性ｃｒＲＮＡ生合成は、ＣＲＩＳＰＲリピートの構造と配列との両方に依存する。図１０Ａは、ヘアピンのステム及びループ領域内の構造的変異を含むｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのＬｂｕＣ２ｃ２による加工の代表的なゲルを示す。以下に列挙される加工されたパーセンテージは、各々の条件に対して６０分で定量される（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。図１０Ｂは、ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の依存性を示すグラフィックマップを示す。野生型リピート配列は、下方に示され、個別の棒は、上方に赤で示されるような２ヌクレオチド変異を表す。切断部位はイラストのハサミによって示される。加工されたパーセンテージは、６０分後に測定された（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。試験された変異の描写されたヘアピンは、図１６Ａ〜１６Ｆ、及び図１７に見出される。図１０Ｃは、加工反応の二価の金属依存性が、１０〜１００ｍＭのＥＤＴＡを標準的な加工反応条件に添加することによって試験された結果を示す。６０分における反応の終了点が示される。
【０３４２】
図１７は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性に対する、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの二重変異の影響の詳細な要約を示す。方法に従って、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のパーセンテージは、６０分後に測定された（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。変異したヌクレオチドは黄色で強調される。グラフ表示のために図１０Ｂを参照されたい。
【０３４３】
実施例１０：ＬｂｕＣ２ｃ２がシス及びトランス標的におけるガイド依存性ｓｓＲＮＡ分解を触媒する。
成熟に続いて、ｃｒＲＮＡは、典型的に高親和性でＣａｓエフェクタータンパク質（複数可）に結合し、配列特異的核酸認識をすることができるＲＮＡ誘導のサーベイランス複合体を生成する。Ｃ２ｃ２加工されたｃｒＲＮＡの機能性を試験するために、最初の切断実験において最も確実な活性を実証したＬｂｕＣ２ｃ２タンパク質を使用した。複数のｓｓＲＮＡ基質に対し、ＬｂｕＣ２ｃ２は、相補的ｃｒＲＮＡに結合したときにのみ効率的に切断することが観察され、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡがＲＮＡ誘導の様式でｓｓＲＮＡを切断することが示された（図１１Ｂ）。この活性は、これ以降、オンターゲットまたはシスターゲットの切断と称される（図１１Ａ）。ＬｂｕＣ２ｃ２媒介性シス切断は、ＬｓｈＣ２ｃ２と類似し、ウラシル残基前で優先的に起こる切断を伴う、複数の産物のラダー化を生じる（図１８Ａ〜１８Ｂ）。この活性は、ｃｒＲＮＡへの塩基対形成によって特定される規定された領域内においてのみ標的核酸切断を触媒する他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエフェクター（Ｃａｓ９及びＣｐｆ１等）とは異なる。トランスでｃｒＲＮＡ活性化非特異的ＲＮＡエンドヌクレアーゼとして作用するＬｂｕＣ２ｃ２の能力（すなわち、ｃｒＲＮＡによって標的とされていないＲＮＡ分子のＣ２ｃ２触媒切断）が試験された（図１１Ａ）。この能力は、標識されていないオンターゲット（ｃｒＲＮＡ−相補的）のｓｓＲＮＡの存在下での繰り返される非標的切断反応によって調査された。これらのトランス切断条件下での５′標識された非標的ＲＮＡの急速な分解が観察された（図１１Ｂ）。この結果は、ｃｒＲＮＡのスペーサーセグメントに相補的な標的ｓｓＲＮＡの認識は、トランスでのＲＮＡの急速かつ非特異的な分解について、Ｃ２ｃ２を活性化することを示唆する。シスオンターゲット切断とトランス非標的切断との両方で観察された同様のＲＮＡ切断速度及びほぼ同一の切断産物は、両方の活性における同一のヌクレアーゼ中心を暗示する。さらに、これらの結果は、「シス」活性として観察されたものが、１つの基質のみが利用可能であるときに起こる単なるトランス活性であることを示唆する（図１８Ａ〜１８Ｂ）。
【０３４４】
図１１Ａ〜１１Ｃに関して、ＬｂｕＣ２ｃ２がシス及びトランス標的におけるガイド依存性ｓｓＲＮＡ分解を触媒する。図１１Ａは、Ｃ２ｃ２のガイド依存性ｓｓＲＮＡ分解の２つのモードの概略図である。図１１Ｂは、２つの異なる放射性標識されたｓｓＲＮＡ基質、Ａ及びＢのＬｂｕＣ２ｃ２による切断を示す。１００ｎＭのＣ２ｃ２及び５０ｎＭのｃｒＲＮＡの複合体は３７℃で予め形成され、反応は２５℃で＞１ｎＭの５’標識された標的ＲＮＡを添加することによって開始された。トランスの切断反応は、等モル（＞１ｎＭ）の濃度の放射性標識された非誘導相補的基質と標識されていないオンターゲットｓｓＲＮＡとを含んだ。図１１Ｃは、スペーサーＡを有するｃｒＲＮＡと共にロードされるＬｂｕＣ２ｃ２は、ＥＤＴＡの存在下で、シス（標的Ａ標識化）及びトランス（非標識標的Ａの存在下での標的Ｂ標識化）の切断条件の両方における切断活性について試験された結果を示す。
【０３４５】
図１８Ａ〜１８Ｂは、ＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的の切断部位マッピングを示す。図１８Ａは、同一のスペーサー相補的配列を有するが、可変の長さ及びヌクレオチド組成が異なる５’隣接配列のいくつかの放射性標識されたｓｓＲＮＡ基質のＬｂｕＣ２ｃ２媒介性「シス」切断を実証する、方法に従って実施されるｓｓＲＮＡ標的切断アッセイを示す。ｓｓＲＮＡ基質の配列は、ゲルの右側及び下側に示され、ｃｒＲＮＡ−Ａ及びｃｒＲＮＡ−Ｂに対するスペーサー相補的配列は、それぞれ黄色及び赤色で強調されている。矢印は、予測された切断部位を示す。ゲルは、明確性のために短く切断された。異なる基質（例えば、Ａ．１対Ａ．２対Ａ．３）においてもたらされる切断産物のパターンが、切断部位の選択がウラシル選好性によって主に誘導され、『ｃｒＲＮＡ−ルーラーに基づく』切断メカニズムの明らかな欠如を示し、これは、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１等の他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ単一エフェクター複合体において観察されたものとは対照的であることを示すことは注目すべきである＜ｒｅｆ？＞。興味深いことに、基質Ａ．０に対して観察される切断パターンは、ポリＧ配列に対する第２の選好性を暗示し、それはおそらくＧ−四重鎖または類似の二次構造を形成するかもしれない。図１８Ｂは、ｓｓＲＮＡ標的の長さをタイル表示するｃｒＲＮＡの範囲を用いる、方法に従うＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断アッセイを示す。この実験において使用されるｓｓＲＮＡ基質の配列は、黄色で強調される各々のｃｒＲＮＡに対するスペーサー相補的配列と共にゲルの下方に示される。矢印は、予測された切断部位を示す。同様に、全てのｃｒＲＮＡに対し、切断産物の長さの分布が非常に類似し、同様に、『ｃｒＲＮＡルーラーに基づく』切断メカニズムの明らかな欠如を示すことは、注目すべきである。反応のサブセットにおけるいくつかの切断産物の非存在は、任意のシス（分子内）またはトランス（分子間）のＬｂｕＣ２ｃ２活性部位によるウラシルへの接近を立体的にふさぐｓｓＲＮＡ標的上の結合したＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡの存在によって説明できる可能性がある。ＰＦＳのＬｂｕＣ２ｃ２に対する選好性について正確な分析は本研究の範囲を超えるが、３’隣接配列の最小限の影響が観察された。予測されるＰＦＳ塩基は、略図中で試験された各々のガイドの次に赤で示されている。
【０３４６】
実施例１１：ＬｂｕＣ２ｃ２は、２つの異なるリボヌクレアーゼ活性を含む。
Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性は、標的ＲＮＡまたは非相補的トランス−ｓｓＲＮＡのいずれかのｃｒＲＮＡ−媒介性切断よりも８０倍遅い見かけ上の速度で起きた（図１２Ａ）。飽和酵素条件下において、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工は、１時間後に約８５％に到達するにすぎず、一方で、トランス基質のＲＮＡ誘導切断の速度は、３７℃において１分以内に反応が完了するのでほとんど測定不能であった（図１９Ａ〜１９Ｃ）。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工と対照的に、ＲＮＡ誘導切断はＥＤＴＡの存在下で完全に無効となり、この活性が二価の金属イオン依存性であることを示す（図１１Ｃ）ということもまた見出された。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工とＲＮＡ−誘導切断との間の動態及び金属イオン依存性における明確な相違を考慮すると、Ｃ２ｃ２が、一方がｃｒＲＮＡ成熟のためであり、他方がｃｒＲＮＡ誘導の非特異的ＲＮＡ分解のためである、２つの直交性ＲＮＡ切断活性を有する新規のクラスのＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質を表す可能性があることが推論された。この仮説を試験するために、ＲＮＡ切断活性部位を含むと予測されている、ＬｂｕＣ２ｃ２の保存されたＨＥＰＮドメイン内のいくつかの残基が体系的に変異導入され、変異体のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ−誘導ＲＮａｓｅ活性が評価された（図１２Ｂ）。保存されたＨＥＰＮ残基の二重及び四重変異（Ｒ４７２Ａ、Ｒ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、及びＲ１０５３）は、確実なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断活性を保持した（図１２Ｃ）。対照的に、全てのＨＥＰＮの変異体は、ＲＮＡ−誘導切断活性を無効にし、一方で、ｃｒＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ結合活性に影響を及ぼさなかった（図２０Ａ〜２０Ｃ）。切断速度ならびに点変異及びＥＤＴＡに対する異なる感受性の不一致は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ−誘導ＲＮＡ切断がＣ２ｃ２タンパク質内の異なる触媒中心によって媒介され、前者が金属非依存性であり、後者が二価の金属依存性ＨＥＰＮドメインを必要とすることを示す。
【０３４７】
図１２Ａ〜１２Ｄに関して、ＬｂｕＣ２ｃ２は、２つの異なるリボヌクレアーゼ活性を含む。図１２Ａは、３７℃における、シスｓｓＲＮＡ標的（黒色）及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（ティール色）のＬｂｕＣ２ｃ２による切断の定量化された経時変化のデータを示す。指数関数の適合を、実線として示し（ｎ＝３）、計算された一次速度定数（ｋobs ）は、シス標的とｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの切断について、それぞれ、９．７４±１．１５と０．１２±０．０２である。図１２Ｂは、ＨＥＰＮ変異の位置を描写するＬｂｕＣ２ｃ２のドメイン構造を示す。図１２Ｃは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のリボヌクレアーゼ活性を示し、図１２Ｄは、ｓｓＲＮＡを標的とする二重及び四重のＨＥＰＮドメイン変異体のリボヌクレアーゼ活性を示す。シス及びトランス切断反応は、両方の活性についてスペーサーＡを標的とするｃｒＲＮＡを用いて、図１１Ｃにおけるように実施した。
【０３４８】
図１９Ａ〜１９Ｃは、標的ＲＮＡ切断効率に対する、ｃｒＲＮＡスペーサーの長さ、反応温度、ｃｒＲＮＡの５’末端配列の依存性を示す。図１９Ａは、１６ｎｔ、２０ｎｔ、または２４ｎｔのスペーサーを有するｃｒＲＮＡと共に方法に従って実施されるＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断アッセイを示す。図１９Ｂは、方法に従って、２５℃または３７℃のいずれかで実施されるＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断の経時変化を示す。図１９Ｃは、異なる５’隣接ヌクレオチド変異を有するｃｒＲＮＡと共に方法に従って実施される、ＬｂｕＣ２ｃ２のｓｓＲＮＡ標的切断の経時変化を示す。変異は赤で強調される。１〜２ヌクレオチドの５’伸長は切断効率に対し無視できる影響のみを及ぼした。対照的に、隣接領域を３ｎｔまで短くすることは、切断効率を遅延した。それぞれの反復について、指数関数の適合は、実線で示される。
【０３４９】
図２０Ａ〜２０Ｃは、成熟ｃｒＲＮＡ及び標的ｓｓＲＮＡに対するＬｂｕＣ２ｃ２の結合データを示す。図２０Ａは、成熟ｃｒＲＮＡ−ＡのＬｂｕＣ２ｃ２−ＷＴ、ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１、ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ２、またはＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２に対する結合親和性を決定するために、フィルター結合アッセイが方法に記載されるように実施された結果を示す。定量されたデータは、標準的な結合等温線に適合された。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。３つの独立した実験からの測定された解離定数（平均±ｓｄ）は、２７．１±７．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ＷＴ）、１５．２±３．２ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１）、１１．５±２．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ２）、及び４３．３±１１．５ｎＭ（ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２）であった。図２０Ｂは、ＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２：ｃｒＲＮＡ−Ａと『オンターゲット』Ａ  ｓｓＲＮＡまたは『オフターゲット』Ｂ  ｓｓＲＮＡのいずれかとの間の結合反応に関する代表的な電気泳動移動度シフトアッセイを示す。３つの独立した実験は、方法に記載されるように実施された。ゲルは、明確性のために短く切断された。図２０Ｃは、図２０Ｂからの定量された結合データが、標準的な結合等温線に適合された結果を示す。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。３つの独立した実験からの測定された解離定数（平均±ｓｄ）は、ｓｓＲＮＡ  Ａについて１．６２±０．４３ｎＭ、ｓｓＲＮＡ  Ｂについて、Ｎ．Ｄ（＞＞１０  ｎＭ）であった。
【０３５０】
実施例１２：Ｃ２ｃ２は、複雑な混合物中の転写物の高感度の視覚的検出を提供する。
トランス基質のＣ２ｃ２の確実なＲＮＡ刺激切断は、転写物のプール内の特異的ＲＮＡを検出する手段として利用できる。今日まで、最も高感度なＲＮＡ検出戦略は、複数のラウンドのポリメラーゼ及び／または逆転写に基づく増幅を必要とする。代替的に、Ｃ２ｃ２のＲＮＡ誘導トランスエンドヌクレアーゼ活性を、フルオロフォア−消光剤標識されたレポーターＲＮＡ基質を切断することに利用し、それによって、標的ＲＮＡ誘発ＲＮａｓｅ活性化の際の蛍光の増加をもたらすことができるか否かを試験した（図１３Ａ）。手短に、ＬｂｕＣ２ｃ２にバクテリオファージλを標的とするｃｒＲＮＡをロードし、ＨｅＬａ細胞全ＲＮＡ中にスパイクした対応するλのｓｓＲＮＡ標的を検出する能力について試験した。ＬｂｕＣ２ｃ２が相補的標的を成功裏に検出した場合、トランス切断活性が活性化されて、レポーターを切断し、消光剤から蛍光体を解放する。１〜１０ｐＭという少ない相補的λ標的ＲＮＡの添加の際、蛍光の基質ｃｒＲＮＡ特異的増加が３０分後に観察された（図１３Ｂ及び図２１）。Ｃ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体単独での、またはｃｒＲＮＡと非相補的標的ＲＮＡの存在下のいずれかの対照実験は、ＲＮａｓｅ  Ａ陽性対照と比較して、蛍光における無視できる増加をもたらした（図１３Ｂ及び図２１）。λ標的ＲＮＡの１０ｐＭの濃度において、約０．０２％のみのＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体が活性状態にあると予測され、それにもかかわらず、観察された蛍光シグナルは、ＲＮＡ標的に依存するレポーターＲＮＡ基質の約２５〜５０％の切断を反映し、ＬｂｕＣ２ｃ２による確実な複数回のターンオーバーの酵素活性を示唆した。このように、ｃｒＲＮＡ−誘導トランス切断は、非常に低いレベルの活性タンパク質においてさえ、強力であり、検出可能である。
【０３５１】
Ｃ２ｃ２がそれ自体のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを有していることを考慮し、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ検出が単一の反応において組み合わせることができるか否かが試験された。この考えを試験するために、標的ＲＮＡ  Ａ及びλ２に相補的なスペーサーを含むタンデムｃｒＲＮＡリピートが設計され、ＨｅＬａ全ＲＮＡにスパイクされた低下した量のＡ及びλ２のＲＮＡを検出するそれらの能力について試験した。成熟ｃｒＲＮＡを用いる実験と同様の程度及び感度での蛍光における大幅な増加が観察され（図１３Ｂ、１３Ｃ）、タンデムｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが成功裏に加工され得、ＲＮＡ標的化のためにＣ２ｃ２によって利用され得ることを示唆した。これらのデータは、単一のタンデムｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ転写物を用いる、１アッセイにおける単一及び／または複数のＲＮＡ分子の多重ＲＮＡ検出の可能性を強調する。
【０３５２】
理論に拘束されず、ｃｒＲＮＡとの塩基対形成を介して宿主細胞内において浸潤的転写物が検出されるとき、Ｃ２ｃ２がトランスでのＲＮＡの無差別の切断のために活性化されることが提案された（図１３Ｄ）。
【０３５３】
図１３Ａ〜１３Ｄに関して、Ｃ２ｃ２は、複雑な混合物中の転写物の高感度の視覚的検出を提供する。図１３Ａは、消光された蛍光ＲＮＡレポーターを用いるＣ２ｃ２によるＲＮＡの検出アプローチのイラスト図である。相補的標的ＲＮＡ結合の際、Ｃ２ｃ２は、レポーターＲＮＡの分解を触媒し、蛍光シグナルの蓄積をもたらす。図１３Ｂは、１００ｎｇの全ＲＮＡの存在下での、様々な濃度の標的ＲＮＡに対する、Ｃ２ｃ２による３０分後の蛍光シグナルの定量を示す。ＲＮａｓｅＡは、陽性ＲＮＡ分解対照として示される。データは、ｎ＝３の独立した実験について、平均±ｓ．ｄ．として示される。図１３Ｃは、タンデムｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工はまた、ＲＮＡ検出を可能にすることを示す。データは、ｎ＝３の独立した実験について、平均±ｓ．ｄ．として示される。図１３Ｄは、Ｃ２ｃ２のリボヌクレアーゼ活性の両方を強調する、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ経路のモデルを示す。
【０３５４】
図２１は、ＲＮａｓｅ検出アッセイのλ２−ｓｓＲＮＡの経時変化を示す。ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ−λ２は、増加する量のλ２ｓｓＲＮＡ（０〜１ｎＭ）の存在下で、ＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質（（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）及び１００ｎｇのＨｅＬａ全ＲＮＡと共に、３７℃で１２０分間、インキュベートされた。蛍光測定は、５分ごとになされた。１ｎＭのλ２ｓｓＲＮＡ反応は、第１の時点が測定され得る前に、飽和に到達した。エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。
【０３５５】
実施例１３：物質及び方法
ＭＥＣ２ｃ２の系統及び候補選択にあって、Ｃ２ｃ２の最尤の系統は、ＲＡｘＭＬを用いてＰＲＯＴＧＡＭＭＡＬＧ進化モデル及び１００ブートストラップサンプリングによって計算された。配列はＭＡＦＦＴによって、『ｅｉｎｓｉ』法でアラインメントされた。
【０３５６】
Ｃ２ｃ２タンパク質の産生及び精製に関して、タンパク質精製のための発現ベクターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから注文された、合成ｇＢｌｏｃｋｓを用いて組み立てられた。コドン最適化Ｃ２ｃ２ゲノム配列は、Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−ＴＥＶ切断部位によってＮ−末端タグ化され、発現はＴ７プロモーターによって駆動された。変異体タンパク質は、野生型Ｃ２ｃ２コンストラクトの部位特異的変異を介してクローニングされた。発現ベクターは、３７℃において２ｘＹＴブロスで増殖するＲｏｓｅｔｔａ２  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換された。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、対数増殖期に、０．５ＭのＩＴＰＧによって誘導され、Ｈｉｓ−ＭＢＰ−Ｃ２ｃ２の終夜発現のために、温度を１６℃に低下させた。その後細胞を回収し、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、及びＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））で再懸濁し、超音波処理によって溶解し、溶解物を遠心によって清浄化した。可溶性Ｈｉｓ−ＭＢＰ−Ｃ２ｃ２を、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上で単離し、タンパク質含有溶離液を、Ｈｉｓ６−ＭＢＰタグの切断のために、ＴＥＶプロテアーゼと共に、４℃で一晩インキュベートしつつ、イオン交換バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中に透析した。切断されたタンパク質はＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラムにロードされ、直線状ＫＣｌ（０．２５〜１．５Ｍ）勾配で溶離した。陽イオン交換クロマトグラフィー画分はプールされ、３０ｋＤカットオフ濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で濃縮した。Ｃ２ｃ２タンパク質は、Ｓ２００カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製され、続く酵素アッセイのために、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２００ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中で保存された。発現プラスミドをＡｄｄｇｅｎｅに寄託する。
【０３５７】
ＲＮＡの産生にあって、この研究において使用される全てのＲＮＡは、合成を注文された（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｃｒＲＮＡ  ＡＥＳ４６１を除いて、インビトロで転写された［図３３を参照］。インビトロ転写反応は、以下の修正を伴ってこれまでに記載されたように実施された。Ｔ７ポリメラーゼ濃度は、１０μｇ／ｍＬに減ぜられ、ＵＴＰ濃度は、２．５ｍＭに減ぜられた。転写物が３７℃で１〜２時間インキュベートされて、ヌクレオチドの非テンプレートの追加を低減し、３７℃で０．５〜１時間のＤＮａｓｅ  Ｉによる処理によってクエンチされた。転写反応は１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製され、全てのＲＮＡは、切断バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）に再懸濁された。以前に記載されたように、放射性実験のために、５’トリホスフェートは、放射性標識の前に子ウシ腸管内ホスフェート（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって除去され、続いてｓｓＲＮＡ基質は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）及び［γ−32Ｐ］−ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、５’末端標識された。
【０３５８】
Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工アッセイにあって。Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断アッセイは、３７℃において、５’−標識ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに対して１００倍モル過剰のＣ２ｃ２を含む（それぞれ、１００ｎＭ及び＜１ｎＭの最終濃度）、ＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．０５％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％グリセロール）中で実施された。別途示されない限り、反応は、６０分後に、１．５×ＲＮＡローディングダイ（１００％のホルムアミド、０．０２５ｗ／ｖ％のブロモフェノールブルー、及び２００μｇ  ｍＬ-1のヘパリン）によってクエンチされた。クエンチングの後、１２％または１５％の変性ＰＡＧＥ（０．５×ＴＢＥバッファー）によって分離する前に、反応物は９５℃で５分間変性された。反応の金属依存性は、１０〜１００ｍＭで変動する濃度での反応バッファーへのＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの添加によって試験された。バンドは、ホスフォイメージングによって可視化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量された。切断パーセントは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、産物と切断されていないｐｒｅ−ｃｒＲＮＡバンドとの両方の全強度に対する産物のバンド強度の比として決定され、各々の測定された基質内のバックグラウンドで標準化され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて一相指数的結合に適合させた。
【０３５９】
産物サイズマッピング及び３’末端部分の同定にあって、切断産物の長さは、産物バンドのゲル移動を、ＡｍｂｉｏｎのＲＮａｓｅ  Ｔ１キットを用いる、アルカリ加水分解及びＲＮａｓｅ  Ｔ１消化ラダーと比較することによって、生化学的に決定された。加水分解ラダーについて、１５ｎＭの全長ＲＮＡ基質は、１×アルカリ加水分解バッファー（Ａｍｂｉｏｎ）中で、９５℃で５分間インキュベートされた。反応は１．５×ＲＮＡローディングバッファーによってクエンチされ、加水分解をすぐに停止させるために−２０℃に冷却された。ＲＮａｓｅ  Ｔ１ラダーについて、１５ｎＭの全長ＲＮＡ基質は、６５℃で１×ＲＮＡシーケンシングバッファー（Ａｍｂｉｏｎ）中で広げられた。反応は常温に冷却され、次いで、１ＵのＲＮａｓｅ  Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ）が反応に添加された。１５分後、反応を、フェノール−クロロホルム抽出によって停止させ、保存のために１．５×ＲＮＡローディングバッファーを添加した。加水分解バンドは、切断試料と並行して１５％変性ＰＡＧＥ上で分離され、ホスフォイメージングによって可視化された。３’末端部分同定のために、加工反応からの産物を、３７℃で１時間、加工バッファー中で１０ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共にインキュベートした。反応は、１．５×ＲＮＡローディングバッファーによってクエンチされ、２０％変性ＰＡＧＥ上で分離され、ホスフォイメージングによって可視化された。
【０３６０】
小型ＲＮＡシーケンシング解析にあって、Ｓｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．からのＲＮＡ読み取りは、ＳＲＡから、実行ＳＲＲ３７１３６９７、ＳＲＲ３７１３９４８、及びＳＲＲ３７１３９５０でダウンロードされた。対形成した末端読み取りは、以下のオプションでＢｏｗｔｉｅ２を用いて基準配列に対して局所マッピングされた。「−−リオーダー−−非常に−速い−局所−−局所」次いで、「−ｍ  ０  −ｐ  ｂｏｔｈ」のオプションによってｍａｐｐｅｄ．ｐｙを用いてミスマッチを含まないアラインメントのみが残るようにマッピングをフィルタリングした。生じたマッピングのＢＡＭファイルは入手可能である。読み取りのカバレッジは、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを用いて可視化され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてプロットされた。
【０３６１】
標的切断アッセイにあって、標的切断アッセイは、切断バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）中で２５℃または３７℃で実施された。ｃｒＲＮＡガイドは、切断バッファー中で、６５℃で５分間加熱して、次いで、ゆっくりと常温に冷却することによって予め折りたたまれた。Ｃ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体形成は、５’末端標識された標的及び／または他の非放射性標識のＲＮＡ標的基質の添加前に、一般的に２：１のモル比のタンパク質対ｃｒＲＮＡで、３７℃で１０分間、切断バッファー中で実施された。別途示されない限り、全ての反応について、タンパク質、ガイド、及び標的の最終濃度は、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び＜１ｎＭであった。反応は１．５×ＲＮＡローディングダイによってクエンチされ、１５％変性ＰＡＧＥ（０．５×ＴＢＥバッファ）によって分離された。バンドは、ホスフォイメージングによって可視化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量された。切断パーセントは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、切断されていないバンドに対する全ての短い産物の全バンド強度の比として決定され、各々の測定された基質内のバックグラウンドで標準化され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて一相指数的結合に適合させた。
【０３６２】
ｃｒＲＮＡフィルター結合アッセイにあって、フィルター結合アッセイはＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中で実施された。ＬｂｕＣ２ｃ２は、放射性標識されたｃｒＲＮＡ（＜０．１ｎＭ）と共に、３７℃で１時間インキュベートされた。Ｔｕｆｒｙｎ、Ｐｒｏｔｒａｎ、及びＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、上記の列挙された順番で、ドットブロット装置上で組み立てられた。膜は、試料を膜に適用する前に、５０μＬの平衡バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）によって２回洗浄した。膜は再び５０μＬの平衡バッファーによって洗浄され、乾燥され、ホスフォイメージングによって可視化された。データは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、結合等温線に適合された。全ての実験は、三重で実施された。解離定数及び関連誤差は、図の説明で報告される。
【０３６３】
電気泳動移動度シフトアッセイにあって、ｓｓＲＮＡ結合実験中に、低濃度におけるＬｂｕＣ２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２：ｃｒＲＮＡ複合体の解離を避けるために、結合反応は、常に過剰なＬｂｕＣ２２ｃ２−ｄＨＥＰＮ１／ｄＨＥＰＮ２（２００ｎＭ）、ならびに増加する濃度のｃｒＲＮＡ−Ａ及び＜０．１ｎＭの標的ｓｓＲＮＡを含んだ。アッセイはＣ２ｃ２  ＥＭＳＡバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中で実施された。ＬｂｕＣ２ｃ２−ｃｒＲＮＡ−Ａ複合体は、５’放射性標識されたｓｓＲＮＡ基質の添加及び、３７℃で４５分間のさらなるインキュベーションの前に、上述のように、３７℃において１０分間で予め形成された。次いで、試料は、４℃で８％ネイティブＰＡＧＥによって分離された（０．５×ＴＢＥバッファー）。ゲルは、ホスフォイメージングによって画像化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて定量され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、結合等温線に適合された。全ての実験は、三重で実施された。解離定数及び関連誤差は、図の説明で報告される。
【０３６４】
蛍光ＲＮＡ検出アッセイにあって、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体は、３７℃で１０分間、１μＭのＬｂｕ−Ｃ２ｃ２：Ｃ２ｃ２を、５００ｎＭのｃｒＲＮＡと共にインキュベートすることによって予め組み立てられた。次いで、これらの複合体は、１８５ｎＭのＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）、１００ｎｇのＨｅＬａ全ＲＮＡ及び増加する量の標的の６０ｎｔのｓｓＲＮＡ（０〜１ｎＭ）の存在下で、ＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬ酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中で、１００ｎＭのＬｂｕＣ２ｃ２：５０ｎＭのｃｒＲＮＡ−λ２に希釈された。これらの反応物は、３７℃で１２０分まで、蛍光プレートリーダー中でインキュベートされ、５分ごとに蛍光測定（λex：４８５ｎｍ、λem：５３５ｎｍ）がなされた。バックグラウンド補正蛍光値は、標的ｓｓＲＮＡの非存在下で実施された反応から得られた蛍光値を引くことによって得られた。最大蛍光は、５０ｎＭのＲＮａｓｅＡを１８５ｎＭのＲＮＡａｓｅ−Ａｌｅｒｔ基質と共にインキュベートすることによって測定された。ヒト全ＲＮＡ中のβアクチンｍＲＮＡによるｃｒＲＮＡ−ＡＣＴＢ媒介性ＬｂｕＣ２ｃ２活性化の測定のために、ＬｂｕＣａｓ９：ｃｒＲＮＡ複合体を、３７℃で１０分間、１μＭのＬｂｕＣ２ｃ２を５００ｎＭのｃｒＲＮＡ−ＡＣＴＢと共にインキュベートすることによって、予め組み立て、増加する量（０〜１μｇ）のＨｅＬａ細胞全ＲＮＡまたはＥ．Ｃｏｌｉ全ＲＮＡ（陰性対照として）のいずれかの存在下で、上述の条件において反応を実施した。これらの反応物は、３７℃で１８０分まで、蛍光プレートリーダー中でインキュベートされ、５分ごとに蛍光測定（λex：４８５ｎｍ、λem：５３５ｎｍ）がなされた。バックグラウンド補正蛍光値は、標的ｓｓＲＮＡの非存在下で実施された反応から得られた蛍光値を引くことによって得られた。結合したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ検出アッセイについて、ＬｂｕＣａｓ９−ｃｒＲＮＡ複合体は、３７℃で２０分間、１μＭのＬｂｕＣ２ｃ２を５００ｎＭのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ−Ａ−λ２と共にインキュベートすることによって予め組み立てられ、反応は上述のように、増加する量のｓｓＲＮＡ  Ａ及びｓｓＲＮＡλ２（それぞれ０〜１ｎＭ）の存在下で実施された。各々の場合において、エラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を表す。
【０３６５】
全ＲＮＡにおけるバックグラウンド切断にあって、ＬｂｕＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡλ４複合体は、蛍光ＲＮＡ検出アッセイに関して上述されるように組み立てられた。複合体は、３ｕｇの全ＲＮＡの存在下で、１０ｎＭのλ４ｓｓＲＮＡ標的と共に、及び伴わずにＲＮＡ加工バッファー中でインキュベートされた。２時間後、ＲＮＡをトリゾール抽出及びエタノール沈殿によって単離した。再懸濁した試料のＲＮＡフラグメントサイズ分布は、製造者のプロトコールを用いてＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）上でＳｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて決定した。蛍光強度曲線を、カーブオーバーレイについてＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）中で標準化された。
【０３６６】
結果
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位は、明確なＣａｓ６またはＣａｓ５ｄ様エンドヌクレアーゼまたはｔｒａｃｒＲＮＡを欠く。Ｃ２ｃ２タンパク質ファミリー（図２４Ａ〜２４Ｂ及び図２８及び図２９）の３つの異なる枝由来の、精製された組換えＣ２ｃ２タンパク質相同体を用いて、本明細書において提示されるデータは、３つのＣ２ｃ２酵素が全て、全長コンセンサスリピート配列及び２０ヌクレオチド（ｎｔ）スペーサー配列からなる５’末端放射性標識されたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ基質を切断することを示す（図２４Ｃ）。各々のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ：Ｃ２ｃ２相同体対について、切断部位がマッピングされ、Ｃ２ｃ２相同体に応じて、予測されたリピート配列ヘアピン構造の２または５のいずれかのヌクレオチド上流の位置で加工が起こることを明らかにした（図２４Ｃ、図３０Ａ）。驚くべきことに、生化学的マッピングされた５’切断部位は、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｓｈａｈｉｉ（ＬｓｈＣ２ｃ２）またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ（ＬｓｅＣ２ｃ２）のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡについて以前に報告された切断部位と一致しなかった。Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．のＲＮＡシーケンシングデータセットの再解析は、本明細書に報告されるインビボ切断部位とインビトロ部位の一致を示した（図３０Ｂ〜３０Ｉ）。さらに、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓからのＣ２ｃ２（ＬｂｕＣ２ｃ２）、及びタンデムヘアピン−リピートアレイを含む大きなｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを用いる切断アッセイは、２つの別個の切断事象に起因する２つの産物をもたらし（図３１ａ）、これはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位から生じる前駆体ｃｒＲＮＡ転写物の加工におけるＣ２ｃ２の役割と一致した。
【０３６７】
Ｃ２ｃ２ガイドＲＮＡ加工の基質の要件及びメカニズムを理解するために、コンセンサスリピート配列のステムループまたは一本鎖隣接領域に変異を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを生成し、それらのＬｂｕＣ２ｃ２によって加工される能力について試験した（図２５）。データは、Ｃ２ｃ２触媒切断が、リピート領域内のステムの長さを改変する際に減ぜられたことを示した（図２５Ａ）。ステムループの反転またはループの長さの低減はまた、Ｃ２ｃ２の加工活性を低減し、切断可能な結合を含むか、またはその近傍の連続的な４−ｎｔの変異は、それを完全に無効にした（図３１Ｂ）。全ｃｒＲＮＡリピート配列のより広範な変異解析は、ヘアピンの両側における塩基変化に著しく感受性である２つの異なる領域を明らかにした（図２５Ｂ）。対照的に、加工の動力学に関してスペーサー配列の依存性は存在しなかった（図３１Ｃ）。ヘアピンの両方の隣接領域に対するこの感受性は、多くのＣａｓ６及びＣａｓ５ｄ酵素に要求される配列及び構造モチーフの暗示である。対照的に、Ｃｐｆ１は、様々なスペーサー領域がヘアピンステムに隣接するので、３’ヘアピン隣接領域に対する依存性を全く有さない。
【０３６８】
ＬｂｕＣ２ｃ２のメカニズム研究は、加工活性が二価の金属イオンのキレーターＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの存在によって影響を受けなかったことを明らかにし（図２５Ｃ）、金属イオン非依存性のＲＮＡ加水分解メカニズムを示した。金属イオン非依存性ＲＮＡ加水分解は、ｃｒＲＮＡ切断産物の５’及び３’半分における、それぞれ２’，３’−環状ホスフェート及び５’ヒドロキシドの形成という特徴を有する。Ｃ２ｃ２加工基質の、末端基の化学的同一性を決定するために、５’隣接産物を２’３’−環状ホスフェートを除去して３’ヒドロキシルを残す、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと共にさらにインキュベートした。５’隣接産物の変性ゲル移動度の変化が、キナーゼ処理後に観察され、３’リン酸基の除去と一致した（図３１Ｄ）。Ｃ２ｃ２のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性の二価の金属イオン非依存性は、ガイド加工を実施することが示された唯一の他の単一タンパク質ＣＲＩＳＰＲエフェクターである、Ｃｐｆ１の二価の金属イオン依存性と全く対照的である。まとめると、これらのデータは、Ｃ２ｃ２触媒ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断が、一般的な酸−塩基触媒メカニズムを用いる可能性がある、二価の金属イオンに非依存性のプロセスであることを示す。
【０３６９】
成熟に続いて、ｃｒＲＮＡは、典型的に高親和性でＣａｓエフェクタータンパク質（複数可）に結合し、配列特異的核酸認識をすることができるＲＮＡ誘導のサーベイランス複合体を生成する。ＬｓｈＣ２ｃ２を用いる以前の研究と一致して、ＬｂｕＣ２ｃ２は、このような基質がｃｒＲＮＡの相補的配列と塩基対形成をなし得るときにのみ、標的ＲＮＡ切断を効率的に触媒した（図３２〜３４）。Ｃ２ｃ２において観察された無差別の切断パターン（図３３）を考慮して、ＬｂｕＣ２ｃ２の、トランスにおけるｃｒＲＮＡ活性化非特異的ＲＮＡエンドヌクレアーゼとして作用する能力を試験した（図３２Ｂ）。シスで実施された非標的切断実験と非常に対照的に、かつＬｓｈＣ２ｃ２に関する以前の観察と一致して、トランスにおける非標的ＲＮＡの急速な分解が観察された（図３２Ｂ）。この結果は、標的認識が一般的な非特異的なＲＮＡの分解についてＣ２ｃ２を活性化することを示す。重要なことに、同一のＲＮＡ基質の、シスオンターゲット切断とトランス非標的切断の両方で観察された同様のＲＮＡ切断速度及びほぼ同一の切断産物は、両方の活性における同一のヌクレアーゼ中心を暗示する（図３２Ｂ）。
【０３７０】
注目すべきことに、標的ｓｓＲＮＡのｃｒＲＮＡ媒介性切断は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工よりも約８０倍速い速度で起き（図２６Ａ）、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工と対照的に、ＲＮＡ誘導標的切断はＥＤＴＡの存在において、大幅に低減し、この活性が二価の金属イオン依存性であることを示す（図２６Ａ、図３２Ｃ、図３４）。これらの明確な相違を考慮して、Ｃ２ｃ２が、一方がｃｒＲＮＡ成熟のための、他方がｃｒＲＮＡ誘導非特異的ＲＮＡ分解のための、２つの直交性ＲＮＡ切断活性を有する可能性があることが推論された。この仮説を試験するために、ＬｂｕＣ２ｃ２の保存されたＨＥＰＮモチーフ内のいくつかの残基を体系的に変異導入し、変異体のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ−誘導ＲＮａｓｅ活性を評価した（図２６、図３４Ｄ）。保存されたＨＥＰＮ残基の二重及び四重変異（Ｒ４７２Ａ、Ｒ４７７Ａ、Ｒ１０４８Ａ、及びＲ１０５３）は、確実なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断活性を保持した（図２６Ｃ）。対照的に、全てのＨＥＰＮの変異体は、ＲＮＡ−誘導切断活性を無効にし、一方で、ｃｒＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ結合活性に影響を及ぼさなかった（図３４Ｄ、図３５）。
【０３７１】
続いて、標的ＲＮＡ切断を破壊することなく、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を無効にする変異が求められた。ＨＥＰＮモチーフを超える、任意の他の起こり得るＲＮａｓｅモチーフが予測できないこと、及びＣ２ｃ２タンパク質がＣｐｆ１に対して相同性を有さないことを考慮して、ＬｂｕＣ２ｃ２全体にわたって荷電した残基を体系的に変異導入した。変異の際に大幅に減ぜられたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性をもたらすアルギニン残基（Ｒ１０７９Ａ）が同定された（図２６Ｃ）。このＣ２ｃ２変異体酵素は、ｃｒＲＮＡ−結合能及びＲＮＡ標的切断活性を保持した（図３５Ｄ、図２６Ｄ）。まとめると、結果は、Ｃ２ｃ２タンパク質内の異なる活性部位が、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工とＲＮＡ−誘導ＲＮＡ切断を触媒することを示す。
【０３７２】
次に、トランス基質のＣ２ｃ２の確実なＲＮＡ刺激切断が、転写物のプール内の特異的ＲＮＡを検出する手段として利用できるか否かを試験した。多くのポリメラーゼに基づく方法が、ＲＮＡ増幅及び続く検出のために開発されているが、数少ないアプローチのみが、各々の新しいＲＮＡ標的に対する、重要な操作または厳しい設計の制約なしで標的ＲＮＡを直接検出することができる。容易にプログラム制御可能な代替として、Ｃ２ｃ２のＲＮＡ誘導トランスエンドヌクレアーゼ活性を、フルオロフォア−消光剤標識されたレポーターＲＮＡ基質を切断することに利用し、それによって、標的ＲＮＡ誘発ＲＮａｓｅ活性化の際の増加した蛍光をもたらすことができるか否かを試験した（図２７ａ）。ＬｂｕＣ２ｃ２にバクテリオファージλを標的とするｃｒＲＮＡをロードし、ＨｅＬａ細胞全ＲＮＡ中にスパイクした対応するλのｓｓＲＮＡ標的を検出する能力について試験した。１〜１０ｐＭという少ない相補的λ標的ＲＮＡの添加の際、蛍光の基質ｃｒＲＮＡ特異的増加が３０分以内に起きた（図２７Ｂ及び図３６Ａ）。Ｃ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体単独での、またはｃｒＲＮＡと非相補的標的ＲＮＡの存在下のいずれかの対照実験は、ＲＮａｓｅ  Ａ陽性対照と比較して、蛍光における無視できる増加をもたらした（図２７Ｂ及び図３６Ａ）。λ標的ＲＮＡの１０ｐＭの濃度において、約０．０２％のみのＣ２ｃ２：ｃｒＲＮＡ複合体が活性状態にあると予測され、それにもかかわらず、観察された蛍光シグナルは、ＲＮＡ標的に依存するレポーターＲＮＡ基質の約２５〜５０％の切断を反映したことは注目すべきであった。これらの反応におけるバックグラウンドＲＮＡのフラグメントサイズ分離は、高度に構造化したｔＲＮＡにおいてさえ、大幅な分解を明らかにした（図３６Ｂ）。レポーターＲＮＡ切断が、大過剰の標識されていないＲＮＡの存在下で起きるので、ＬｂｕＣ２ｃ２が、認識された標的ＲＮＡ当たり、少なくとも１０4 のターンオーバーが可能である、確実な複数回のターンオーバーの酵素であると結論付けられた。このように、以前の観察と対照的に、ｃｒＲＮＡ−誘導トランス切断は、非常に低いレベルの活性化タンパク質においてさえ、強力であり、検出可能である。
【０３７３】
このＬｂｕＣ２ｃ２のＲＮＡ検出システムを拡張するために、内在性のβアクチンｍＲＮＡを標的とするようなｃｒＲＮＡを設計した。蛍光における測定可能な増加は、Ｅ．ｃｏｌｉ全ＲＮＡと比べて、ヒト全ＲＮＡの存在下で観察され、この方法の特異性を実証した（図２７Ｃ）。さらに、Ｃ２ｃ２がそれ自体のガイドを加工することを考慮して、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及びＲＮＡ検出が、標的ＲＮＡ  Ａ及びλ２に相補的なスペーサーを含むタンデムｃｒＲＮＡ−リピートを設計することによって、単一の反応中で組み合わされた。検出アッセイにおいて、これらの加工されていないタンデムガイドＲＮＡと共にインキュベートされたＬｂｕＣ２ｃ２は、成熟ｃｒＲＮＡを用いる実験と同様の程度及び感度で、蛍光における大幅な増加をもたらした（図２７Ｂ、図２７Ｄ）。まとめると、これらのデータは、Ｃ２ｃ２の２つの異なるＲＮａｓｅ活性のさまざまなバイオテクノロジー用途への応用の利点を得る刺激的な機会を強調する（図２７Ｅ）。
【０３７４】
細菌において、Ｃ２ｃ２は、ウイルスＲＮＡに対する見張りとして機能する可能性がある。理論によって拘束されず、ｃｒＲＮＡとの塩基対形成を介して宿主細胞内において浸潤的転写物が検出されるとき、Ｃ２ｃ２がトランスでのＲＮＡの無差別の切断のために活性化されることが提案される（図２７Ｅ）。防御メカニズムとして、それは、細胞シグナルが、宿主内における無差別なリボヌクレアーゼ、またはプロテアーゼによる分解を誘発し、それぞれがアポトーシスを導く真核生物におけるＲＮａｓｅ  Ｌ及びカスパーゼシステムと驚くべき類似性を有する。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ標的化メカニズムが、プロトスペーサー−誘導二重鎖内でのＲＮＡ切断を一般的にもたらす一方で、会合したヌクレアーゼＣｓｘ１及びＣｓｍ６の最近の例は、ＶＩ型システムと複数の構成要素のＩＩＩ型干渉複合体の間の説得力がある類似性を提示する。
【０３７５】
本明細書において記載されるデータは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃ２ｃ２タンパク質が、２つの別個のＲＮＡ認識と切断活性をなすことができる新規のクラスの酵素を表すことを示す。効率的なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工は、非内在性のｃｒＲＮＡのロードを防ぎ、このＲＮａｓｅの強力な毒性を低減することを助ける、ＣＲＩＳＰＲリピート内の配列及び構造モチーフを必要とする。Ｃ２ｃ２とＶ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質Ｃｐｆ１の完全に異なるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工メカニズムは、各々のタンパク質ファミリーが、それらのそれぞれのＣＲＩＳＰＲ経路の加工及び干渉の両方の機能を包含する独立した活性の上に収束していることを示す。さらに、Ｃ２ｃ２の２つの異なる触媒能力は、何千ものトランスＲＮＡを切断するＣ２ｃ２の活性化が、検出された全ての標的ＲＮＡに関して強力なシグナル増幅を可能にするので、ＲＮＡ検出について協調して利用できる。アレイからのガイドＲＮＡを加工するＣ２ｃ２それ自体の能力は、幅広い範囲の用途のための標的多重化に加えて、ガイド発現のための組織特異的Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの使用を可能にする。Ｃ２ｃ２酵素は、その二重のＲＮａｓｅ活性のために、細菌の適応免疫内において独特であり、細胞内及び細胞フリーシステムにおける正確な核酸操作のためにＣＲＩＳＰＲタンパク質を利用する有用性を強調する。
【０３７６】
実施例１４
変異されたとき大幅に低減したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を生じる、さらなるアミノ酸位置がＬｂｕＣ２ｃ２において同定された（図３７）。アミノ酸位置はＲ１０７９（例えば、Ｒ１０７９Ａ）、Ｒ１０７２（例えば、Ｒ１０７２Ａ）及びＫ１０８２（例えば、Ｋ１０８２Ａ）を含んだ。
【０３７７】
実施例１５
Ｃａｓ１３ａ酵素は、直交性のｃｒＲＮＡのセットを認識し、異なるｓｓＲＮＡ切断特異性を有する２つの異なる機能的な群を含む。Ｃａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工は、ｓｓＲＮＡ切断にとって重要ではないが、それはＣＲＩＳＰＲアレイ内部にコードされるｃｒＲＮＡのｓｓＲＮＡ標的化を増強する。２つのＣａｓ１３ａタンパク質のサブファミリーが定義され、サブファミリーは、細菌内と診断用との両方のＲＮＡ検出及び破壊について並行して機能し得る。
【０３７８】
物質及び方法
Ｃａｓ１３ａの系統学的及びリピート保存解析にあって、Ｃａｓ１３ａの最尤の系統は、ＲＡｘＭＬ（Ｓｔａｍａｔｋｉｓ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４  Ｍａｙ  １；３０（９）：１３１２−３）を用いてＰＲＯＴＧＡＭＭＡＬＧ進化モデル及び１００ブートストラップによって計算された。タンパク質クレードα及びβは、共通の祖先を有することに高い信頼性を示唆する、９０より大きいブートストラップ値を有する分岐点として定義された。残余のタンパク質は、９０未満のブートストラップ値に反映される、それらの系統学的関係が低い信頼性のために、不明瞭な祖先としてラベルされた。配列はＭＡＦＦＴによって、『ｅｉｎｓｉ』法（Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．２０１３  Ａｐｒ；３０（４）：７７２−８０）でアラインメントされた。候補は、Ｃａｓ１３ａタンパク質の系統樹の主な枝の各々を表すように選択された。アラインメントは、全ての非重複の相同体（図４１）及び候補タンパク質について実施された。ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）リピートの比較は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（ＭｃＷｉｌｌｉａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｊｕｌ；４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７−６００）のＮｅｅｄｌｅツールを通じてＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いてペアワイズ類似性スコアを計算することによって実施された。ＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡの階層的クラスタリングは、類似性スコアマトリックスを用いてＲにおいて実施された。
【０３７９】
Ｃａｓ１３ａタンパク質の発現及び精製にあって、タンパク質精製のための発現ベクターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文された、合成ｇＢｌｏｃｋｓを用いて組み立てられた。コドン最適化Ｃａｓ１３ａゲノム配列は、Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−ＴＥＶ切断部位配列によってＮ−末端タグ化され、発現はＴ７プロモーターによって駆動された。変異体タンパク質は、野生型Ｃａｓ１３ａコンストラクトの部位特異的変異を介してクローニングされた。全ての相同体の精製は、上述の実施例７及び１３に記載されるように実施された。手短に、発現ベクターは、３７℃において２ｘＹＴブロス中で増殖するＲｏｓｅｔｔａ２  ＤＥ３またはＢＬ２１のＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換され、対数期中期において、０．５ｍＭのＩＰＴＧによって誘導され、次いで、終夜発現のための１６℃に移された。細胞ペレットを、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、及びＥＤＴＡ−フリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））で再懸濁し、超音波処理によって溶解し、１５，０００ｇにおける遠心によって清浄化した。可溶性Ｈｉｓ６−ＭＢＰ−ＴＥＶ−Ｃａｓ１３ａを、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上で単離し、Ｈｉｓ６−ＭＢＰタグの切断のために、タンパク質含有溶離液を、ＴＥＶプロテアーゼと共に、４℃で一晩インキュベートしつつ、イオン交換バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．０、２５０ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中に透析した。切断されたタンパク質はＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードされ、直線状ＫＣｌ（０．２５〜１．５Ｍ）勾配で溶離した。Ｃａｓ１３ａ含有画分がプールされ、濃縮され、Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除クロマトグラフィーによってゲルろ過バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．０、２００ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ）中でさらに精製され、続いて−８０℃で保存された。全ての相同体は、ＳＰカラムの代わりにＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎカラムに結合し、イオン交換の後の試料の十分な純度のためにサイズ排除クロマトグラフィーステップを省略したＬｗａＣａｓ１３ａを除いて、このプロトコールを用いて精製された。全ての発現プラスミドをＡｄｄｇｅｎｅに寄託する。
【０３８０】
インビトロＲＮＡ転写にあって、全てのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、成熟ｃｒＲＮＡｓ、及び標的は、以前に記載された方法（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．２０１２  Ａｐｒ；１８（４）：６６１−７２）、及び上述の実施例に記載されるように、インビトロで転写された。手短に、全ての基質は、非−ＧＲ５’末端を必要とする成熟ｃｒＲＮＡを除いて、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレート（ＩＤＴ）から転写された。これらの成熟ｃｒＲＮＡｓのために、成熟ｃｒＲＮＡ配列のすぐ上流にハンマーヘッドリボザイム配列を含むＴ７ポリメラーゼテンプレートがオーバーラップＰＣＲを用いて生成され、次いで、Ｔ７転写のためのテンプレートとしての使用のために精製された（配列について図５０（表５）を参照）。Ｌｂｕ６−ｍｅｒのＣＲＩＳＰＲアレイのインビトロ転写のテンプレートは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によってプラスミドとして合成された。Ｔ７プロモーター−ＣＲＩＳＰＲアレイ領域はＰＣＲ増幅され、Ｔ７転写のためのテンプレートとしての使用の前に精製された。６％尿素−ＰＡＧＥを用いて精製されたアレイを除いて、全ての転写されたＲＮＡは１５％尿素−ＰＡＧＥを用いて精製された。続いて、全てのＲＮＡは、５’ホスフェートを除去するために、子ウシアルカリホスファターゼによって処理された。放射性標識は以前に記載されるよう（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．２０１２  Ａｐｒ；１８（４）：６６１−７２）に、及び上述の実施例に記載されるように実施された。Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵのホモポリマー、ならびにトランス−ｓｓＲＮＡ切断のための蛍光標識されたＲＮＡレポーターは、ＩＤＴによって合成された。ホモポリマーは、基質の不均一性を減ずるために、放射性標識の後に、２５％尿素−ＰＡＧＥを用いて精製された。
【０３８１】
放射性標識されたｓｓＲＮＡヌクレアーゼアッセイにあって、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工アッセイは、３７℃において、５’−標識ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに対して１００倍モル過剰のＣａｓ１３ａを含む（それぞれ、１００ｎＭ及び＜１ｎＭの最終濃度）、ＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．０５％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％グリセロール）中で実施された。別途示されない限り、反応は、６０分後に、１．５×ＲＮＡローディングダイ（１００％のホルムアミド、０．０２５％のブロモフェノールブルー、及び２００μｇ  ｍＬ-1のヘパリン）によってクエンチされた。クエンチングの後、１５％の変性ＰＡＧＥ（０．５×ＴＢＥバッファー）によって分離する前に、反応物は９５℃で５分間変性された。標的切断アッセイは、切断バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）中において３７℃で実施された。一般的にＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体形成は、５’標識された標的及び／または他の非放射性標識のＲＮＡ標的基質の添加前に、２：１のモル比のタンパク質対ｃｒＲＮＡで、３７℃で６０分間、切断バッファー中で実施された。別途示されない限り、最終濃度は、１００ｎＭのＣａｓ１３ａ、５０ｎＭのｃｒＲＮＡまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ、５０ｎＭのｃｒＲＮＡ−相補的標的ｓｓＲＮＡ（これ以降『活性化因子』と呼ぶ）及び＜１ｎＭのトランス−ｓｓＲＮＡ標的であった。全てのバンドは、ホスフォイメージング（Ｔｙｐｈｏｏｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって可視化され、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量された。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工のために、切断パーセントが、産物と切断されていないｐｒｅ−ｃｒＲＮＡバンドとの両方の全強度に対する産物バンド強度の比として決定され、各々の測定された基質内のバックグラウンドに対して標準化された。トランス−ｓｓＲＮＡ切断反応のために、切断パーセントが、レーン内の全強度に対する標的よりも小さい全てのフラグメントの比として決定され、各々の基質内のバックグラウンドに対して標準化された。続いてこれらのデータは、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて単一指数的関数減衰に適合され、切断速度を図の説明に報告する。
【０３８２】
蛍光ｓｓＲＮＡヌクレアーゼアッセイにあって、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体は、上述のように、切断バッファー中で組み立てられた。１５０ｎＭのＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔレポーター（ＩＤＴ）、及び様々な最終濃度（０〜１μＭ）のｓｓＲＮＡ−活性化因子は、反応を開始するために添加された。注目すべきことに、これらの反応は、より正確なトランス切断活性の測定のために、競合のｔＲＮＡまたは全ＲＮＡの非存在下である。これらの反応物は、３７℃で１２０分まで、蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｒｏ  Ｆ２０００）中でインキュベートされ、５分ごとに蛍光測定（λex：４８５ｎｍ、λem：５３５ｎｍ）がなされた。バックグラウンド補正蛍光値は、標的ｓｓＲＮＡ活性因子の非存在下で実施された反応から得られた蛍光値を引くことによって得られた。相同体の感度及びアレイ加工効果を決定するために、バックグラウンド補正値は、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて単一指数関数的減衰に適合され、計算された速度は、それらの関連するｎ＝３の標準偏差と共にプロットされた。非同一源のｃｒＲＮＡ誘導トランス−ｓｓＲＮＡ切断を比較するために、データセット間の蛍光プラトー値の不一致のために、初期反応速度が代わりに計算された。次いで、速度は、同一源ｃｒＲＮＡに対してスケールされ、相同体間で速度を標準化した。標準化された値のために、それぞれ表７、８、及び９を提示する、図５２、図５３、及び図５４を参照されたい。蛍光ホモポリマーのｓｓＲＮＡレポーター研究のために、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体は、標準的な条件を用いて３７℃で６０分間予めインキュベートされた。活性化因子ｓｓＲＮＡ及び２００ｎＭの蛍光ｓｓＲＮＡレポーターは、反応をプレートリーダーに配置する直前に反応を開始するために添加された。蛍光ホモポリマーｓｓＲＮＡレポーターと共にＬｂｕ−及びＬｂａ−のＣａｓ１３ａを含む試料のために、１０ｐＭ及び１ｎＭの活性化因子がそれぞれ使用された。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ実験のために、３００ｎＭのＣａｓ１３ａが、切断バッファー中で５０ｎＭのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイと共に最初に１時間インキュベートされ、アレイの結合及び加工を可能にした。１００ｐＭの各々のｓｓＲＮＡ活性化因子が１５０ｎＭのＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔレポーター（ＩＤＴ）と共に添加され、各々のスペーサー配列に対し、生物学的に三重の反応を開始した。見かけ上の速度は、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて１つの単一指数関数的減衰を用いて計算され、計算された速度は、それらの関連する標準偏差と共にプロットされた。
【０３８３】
ｃｒＲＮＡフィルター結合アッセイにあって、フィルター結合アッセイは上述の実施例に記載されるように実施された。手短に、Ｃａｓ１３ａ及び放射性標識されたｃｒＲＮＡは、３７℃で１時間、ＲＮＡ加工バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ、０．０１％のＩｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、及び５％のグリセロール）中でインキュベートされた。Ｔｕｆｒｙｎ、Ｐｒｏｔｒａｎ、及びＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、上に列挙された順番で、ドットブロット装置上で組み立てられた。膜は、試料を膜に適用する前に、５０μＬの平衡バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ、ｐＨ６．８、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、及び５％のグリセロール）によって２回洗浄した。膜は再び５０μＬの平衡バッファーによって洗浄され、乾燥され、ホスフォイメージングによって可視化された。データは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって定量され、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、結合等温線に適合された。全ての実験は、三重で実施された。解離定数及び関連誤差は、図の説明で報告される。
【０３８４】
結果
多くのＣａｓ１３ａ相同体は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を有する。Ｃａｓ１３ａタンパク質の機能的多様性を調査するために、タンパク質ファミリー系統樹からの１０の相同体のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性が、それらの同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡから成熟ｃｒＲＮＡを産生する能力について比較された（図３８Ａ及び図３９）。上に論じられる３つの相同体と類似して、７つのさらなるＣａｓ１３ａ酵素は、ｃｒＲＮＡ成熟活性を有する（図３８Ｂ及び３８Ｃ）。今日まで、試験された１１のＣａｓ１３ａタンパク質のうちの１つのみが幅広いアッセイ条件にわたって、その同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの検出可能な切断を全く示さない（ＨｈｅＣａｓ１３ａ）（図３８及び図３９Ａ）。それらの天然のｃｒＲＮＡを加工した相同体のうち、ＬｓｈＣａｓ１３ａを除いて全てが、保存されたｃｒＲＮＡリピートヘアピンの４ヌクレオチド上流に結合するホスホジエステルを切断した（図３８Ｂ及び３８Ｃ）。これらの結果は、ＶＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲシステム内のＣａｓ１３ａ媒介性ｃｒＲＮＡ生合成活性の強固な保存を示す。
【０３８５】
多くのＣａｓ１３ａ酵素内の保存されたｃｒＲＮＡ成熟中心
以前の研究は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工を担うＣａｓ１３ａの２つの異なる領域を暗示している。ＬｓｈＣａｓ１３ａの結晶構造によって確立された一般的なＣａｓ１３ａタンパク質の構造は、２つのらせんドメインによって分離されるＮ−末端ドメインと２つのＨＥＰＮ（高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合）ドメインからなる（図４０Ａ）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２）。ＬｂｕＣａｓ１３ａについて、ＨＥＰＮ２ドメイン内の単一残基（Ｒ１０７９）の変異は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を実質的に低減するために十分であった。対照的に、らせん１ドメイン内に位置する２つの位置、Ｒ４３８及びＫ４４１における変異は、ＬｓｈＣａｓ１３ａによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断を減ずることが示された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４ｅ．１２）。これらの領域の両方は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与し得るが、ＬｂｕＣａｓ１３ａによる加工がらせん１ドメイン変異によって阻害されるか否か、及び、いずれのドメインがＣａｓ１３ａタンパク質ファミリー全体にわたってｃｒＲＮＡ成熟を主として担っているのかが不明である。
【０３８６】
１９のＣａｓ１３ａ相同体にわたって、らせん１とＨＥＰＮ２ドメインとの両方の保存が確かめられた。以前に報告されたアラインメント（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ５；６０（３）：３８５−９７）は、らせん１ドメイン領域において不一致であり、このドメインにおける相同体間の関係性が非常に不明瞭であることを示唆する。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与するらせん１ドメインのアラインメント内の最小限の保存が観察され、対照的に、ＨＥＰＮ２ドメイン内の一貫的な保存が存在した（図４０Ｂ〜４０Ｃ及び図４１）。唯一のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工欠失相同体、ＨｈｅＣａｓ１３ａは、両方のドメインにわたって、保存された荷電残基の大部分を維持し、タンパク質の他の部分またはリピート配列が、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断を防いでいる可能性を示唆する。この研究に使用された相同体の中で、ＬｓｈＣａｓ１３ａは、ＨＥＰＮ２ドメインにわたって、最も不一致であり、この相同体による代替的な触媒ドメイン及び非典型的な切断部位選択を明らかにする可能性がある。
【０３８７】
ＬｓｈＣａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に極めて重要ならせん１ドメイン残基の、ＬｂｕＣａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性に対する効果が試験された。４つの残基（Ｅ２９９、Ｋ３１０、Ｒ３１１、及びＮ３１４）が、それらのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断における役割について試験された（図４０Ｂ及び４０Ｃ）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２；Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ５；６０（３）：３８５−９７）。これらの残基のアラニンへの変異は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の効率に対する影響の範囲を明らかにした：Ｎ３１４Ａは切断速度を大幅に低減し、Ｒ３１１Ａは、活性を最小限に損ない、Ｅ２９９Ａ及びＫ３１０は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に全く影響を与えなかった（図４０Ｄ）。並行して、ＬｂｕＣａｓ１３ａのＨＥＰＮ２ドメイン内の変異導入が実施された。Ｒ１０７２及びＫ１０８２におけるアラニンの置換は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断を大幅に低減し、一方で、同一の領域における他の変異（Ｄ１０７８Ａ、Ｋ１０８０Ａ、及びＫ１０８７Ａ）は、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に対して最低限の影響を与えた（図４０Ｅ）。これらの結果は、ＬｂｕＣａｓ１３ａに関して、ＨＥＰＮ２、及び、より少ない度合いでらせん１ドメインが、ｃｒＲＮＡの生合成において重大な役割を果たすが、加水分解を触媒することを直接的に担う残基は未知のままであることを示唆する。ＬｂｕＣａｓ１３ａとＬｓｈＣａｓ１３ａとにわたるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与する領域間の相違（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２）は、ｃｒＲＮＡの５’末端は、ＬｓｈＣａｓ１３ａ構造において、ＨＥＰＮ２とらせん１ドメインとの間で保持されるので、必ずしも互いに矛盾しない（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４ｅ．１２）。両方のドメインからの残基は、基質結合を安定化させるか、適切な基質の方向を促進するか、及び／または加水分解を触媒することによって、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工において重要な役割を果たす可能性がある。
【０３８８】
ＬｓｈＣａｓ１３ａのＨＥＰＮ２ドメイン内の保存の欠失、その推定上のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性部位、及びこの酵素の非典型的なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断部位は、ＬｓｈＣａｓ１３ａが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工を触媒するために、らせん１ドメイン内の異なる領域を利用する可能性があるという仮説を導いた。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ結合Ｃａｓ１３ａ相同体の三次元構造の非存在の状況において、この仮説は、非同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ上のＬｓｈＣａｓ１３ａ切断部位をマッピングすることによって試験された（図４０Ｆ）。ＬｓｈＣａｓ１３ａは、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＬｂｕＣａｓ１３ａからのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを加工することが可能であり、予測されたヘパリンの付け根から１ヌクレオチドシフトした切断部位を生じた。この観察と一致して、ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＬｂｕＣａｓ１３ａによるＬｓｈ  ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの加工は、同一源のＬｓｈＣａｓ１３ａ部位とは異なり、リピートステムから標準的な４ヌクレオチドの間隔で起こる。これは、異なるＬｓｈＣａｓ１３ａ加工部位がタンパク質の構造に依存し、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配列に依存しないという観察、及びＬｓｈＣａｓ１３ａが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関して、Ｃａｓ１３ａ系統樹内で外れ値であるという観察を裏付ける。
【０３８９】
Ｃａｓ１３ａ酵素はウリジンまたはアデノシンのいずれかでｓｓＲＮＡ切断を開始する。以前の研究は、Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体が、本明細書によってｓｓＲＮＡ活性化因子と呼ばれる相補的ｓｓＲＮＡ標的を認識して結合し、露出したウリジン残基において一般的なＲＮａｓｅ活性を誘発するということを確立した（図４２Ａ）。相同体のパネルが、ＬｂｕＣａｓ１３ａ及びＬｓｈＣａｓ１３ａによって実証された非特異的分解活性を保持するか否かについて試験した。ＨＥＰＮ活性部位内のウリジン選好性がファミリーに普遍的であるか否かについても試験した。一般的なＲＮａｓｅ活性を体系的に試験するために、結合したｓｓＲＮＡ活性化因子と共にＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡを含む三重複合体のトランス−ｓｓＲＮＡ標的を分解する能力を観察した（図４２Ａ）。トランス−ｓｓＲＮＡ切断活性は、１時間にわたって、１０の相同体中８において検出された（図４２Ｂ及び図４３Ａ）。トランス−ｓｓＲＮＡ切断について活性である最も注目すべきＣａｓ１３ａ相同体はＨｈｅＣａｓ１３ａであり、それは、検出可能なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を全く有さないにもかかわらず、その同一源の全長ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡによって誘導される基質の完全な分解を触媒した。以前に分析された相同体ＬｓｈＣａｓ１３ａ（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６  Ａｕｇ  ５；３５３（６２９９）：ａａｆ５５７３）とＬｂｕＣａｓ１３ａとの両方は、切断可能な結合に対して５’のウリジンに対する選好性を示すが、一方で、他の相同体によって生成される異なる長さの産物は、異なる活性部位のヌクレオチド選好性がこのタンパク質ファミリー内に存在する可能性があることを示唆する（図４３Ｂ）。
【０３９０】
Ｃａｓ１３ａ相同体のトランス−ｓｓＲＮＡ切断のヌクレオチド選好性をさらに調べるために、これらの酵素のトランス−切断能力を、基質としてＡ、Ｃ、Ｇ、及びＵの５−ｍｅｒホモポリマーを用いて測定した。６つの相同体はこれらの短い基質を切断することができた（図４２Ｃ、図４３Ｃ、図５０（表５））。相同体のうちの４つ、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、及びＰｐｒＣａｓ１３ａは、ホモウリジン基質の優先的な切断を示したが、二次選好性は、最大の活性を有する相同体について観察された（図４２Ｃ及び図４３Ｄ）。対照的に、ＬｂａＣａｓ１３ａ及びＥｒｅＣａｓ１３ａは、ホモアデニンを選好し、より長い標的上の生化学的マッピングされた切断部位と一致した（図４３Ｂ）。ＣａｍＣａｓ１３ａによるこれらの長い基質からの同一産物生成は、Ｃａｓ１３ａファミリーの系統樹のこのクレードによるアデノシン選好性と一致する（図４２、図３９、図４３）。
【０３９１】
これらの酵素間の１つの注目すべき相違は、等モルのｓｓＲＮＡ活性化因子とＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ干渉複合体との試験された条件下における、トランス−ｓｓＲＮＡ切断が飽和に到達する速度であった。これらの酵素的な相違は、Ｃａｓ１３ａの生物学的役割に対し、劇的な効果を与え得る。Ｃａｓ１３ａ相同体ファミリー内のトランス−ｓｓＲＮＡ切断における相違が定量された。全体的な酵素のアウトプットに寄与するＣａｓ１３ａ酵素の２つの中心の特性であるｓｓＲＮＡ活性化因子の結合とトランス−ｓｓＲＮＡ切断との両方を把握するために、ＲＮＡ切断に対する短い蛍光ｓｓＲＮＡレポーターを用いるハイスル―プットスクリーニングが開発された。各々のＣａｓ１３ａ相同体の感度を調べるために、減少する量の相補的ｓｓＲＮＡ活性化因子を、反応を開始するために添加し、蛍光ｓｓＲＮＡレポーター切断の見かけ上の速度を、生じた経時変化の各々から計算した。計算された速度は、ｓｓＲＮＡ活性化因子の結合親和性と各々の酵素の触媒ターンオーバー速度とのコンボリューションである一方で、それらは、相同体間で比較可能である切断活性の相対基準をもたらす。
【０３９２】
５つの相同体（ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、及びＰｐｒＣａｓ１３ａ）は、再現可能な分析のために、このアッセイにおいて、十分に検出可能な切断活性を実証した。これら５つの相同体のうち、ＬｂｕＣａｓ１３ａは、最も高感度であることを示し、１０ｆＭのみの相補的活性化因子の存在下で検出可能なレポーター切断を有した（図４２Ｄ）。２つの相同体ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＰｐｒＣａｓ１３ａのみが、ピコモル範囲で活性化因子を検出する十分な活性を示し、それぞれ１０ｐＭ及び１００ｐＭの感度を有した。ＬｂａＣａｓ１３ａ及びＨｈｅＣａｓ１３ａは、かなり低く感受性であり、レポーターのナノモルレベルでのみ活性であり、これはＣａｓ１３ａ複合体と比べ等モルに近い。このアッセイは、検出可能な蛍光を生じるトランス−切断事象の実質的な数に依存するため、同様の切断部位選好性（ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、及びＬｓｈＣａｓ１３ａ）が、さらに低い感度の相補的標的の感度を有しているにも関わらず、３つの相同体が、バックグラウンドを超える検出可能なシグナルを生じることができないという仮説が立てられ得る。感度における顕著に広い範囲（約１０7 倍）は、外来ＲＮＡから宿主生物を保護するＣａｓ１３ａ酵素の多様な能力を示唆する。
【０３９３】
ＣＲＩＳＰＲリポート配列は、非同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工を決定する。Ｃａｓ１３ａの二重の活性は、異なるＶＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲオペロン間のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工及び標的化の相互依存を研究する機会を提供する。両方の活性に対する基質の要件を決定するために、ガイド加工及び標的化のために、異なる相同体が非同一源のｃｒＲＮＡを認識できる度合いを試験した。最初に、Ｃａｓ１３ａファミリーの系統学的解析及びｃｒＲＮＡ類似性を通じて、バイオインフォマティクスによって、ｃｒＲＮＡの交換可能性の可能性について予測することを試みた。この解析は、明確さのためにα及びβと名付けられる、相同体の２つの異なるクレードが存在することを示唆した（Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１４  Ｍａｙ  １；３０（９）：１３１２−３）（図４４Ａ）。精製された相同体のうちの５つは、不明瞭な祖先の関係を有してこれらのクレードの外側に存在し、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲリピート）の配列が、機能的な直交性を決定づける可能性があるか否かが問われた。ＣＲＩＳＰＲリピートの短くかつ構造化された内容物のために、ペアワイズ配列アラインメントスコアマトリクスが、ファミリー間の多様性をスコア付けするために、ＣＲＩＳＰＲリピート間の階層クラスタリング関係を構築するために使用された（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｆｅｂ  ３；７：１０６１３）。驚くべきことに、この解析は、アミノ酸配列によって決定されたタンパク質クレードと重なり合うが異なる、２つのｃｒＲＮＡクラスターの存在を指摘した（図４４Ｂ及び４４Ｃ）。クラスター１のｃｒＲＮＡは、αクレードタンパク質のサブセットとよく相関するが、一方で、全てのβクレードと相関するｃｒＲＮＡは、クラスター２内にあり、不明瞭な祖先の系統学的関係を有する相同体は、２つのクラスターにわたって分離される（図４４Ｃ）。
【０３９４】
バイオインフォマティクス解析のみでＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡの直交性を容易に予測することが不可能であり、Ｃａｓ１３ａ相同体の各々による、加工とトランス−ｓｓＲＮＡ標的切断との両方について非同一源のｃｒＲＮＡ間の機能的交換可能性の度合いを試験した（図４４Ｄ及び４４Ｆ）。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工について、ペアワイズ配列比較によって定義されるｃｒＲＮＡクラスターが、それらの関連するＣａｓ１３ａタンパク質によって加工されるそれらの能力を予測したことを見出だした（図４４Ｄ）。例えば、クラスター１からのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、クレードαのタンパク質によってのみ加工され、逆にクラスター２とクレードβとについても成り立つ。対照的に、タンパク質分類はあまり予測的ではないが、これは、多くの不明瞭に分類されたタンパク質が、それらのリピート配列がクラスターされる場所と独立して、リピートクラスター２からの配列を有し得るためである。
【０３９５】
３つの相同体（ＰｐｒＣａｓ１３ａ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、及びＲｃａ１３ａ）は、それらのｃｒＲＮＡクラスター内の位置に関連して、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の外れ値であった。ＨｈｅＣａｓ１３ａは、非同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを全く切断することができず、逆にＨｈｅＣａｓ１３ａを含む相同体は、いずれもＨｈｅ  ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを加工できなかった。これは、ＨｈｅＣａｓ１３ａがその同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを加工することができないことは、多様なリピート配列（図３８及び図３９）を反映するのみでなく、タンパク質内のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性の欠失をまた反映することを示唆する。対照的に、ＰｐｒＣａｓ１３ａ及びＲｃａＣａｓ１３ａの逸脱した活性は、ｃｒＲＮＡリピート配列の多様性によって説明される。ＰｐｒＣａｓ１３ａ及びＲｃａＣａｓ１３ａは、それら自体のｃｒＲＮＡを有するが、それにもかかわらず両方がまた、ｃｒＲＮＡリピートクラスター２の非同一源配列を有する。ＰｐｒＣａｓ１３ａ  ｃｒＲＮＡリピート配列は、５’隣接領域の切断部位にわたる他のクラスター２のｃｒＲＮＡリピートと異なり、ＰｐｒＣａｓ１３ａによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に対するより大きな基質の柔軟性を示唆する。同様に、特徴的なＲｃａＣａｓ１３ａ  ｃｒＲＮＡの配列の特徴は、ファミリーの残りのもののｃｒＲＮＡに存在する標準的な５塩基対のステムループに対して伸長した６塩基対のステムループである。Ｃａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関して、各々のｃｒＲＮＡリピート内の位置的な置換の許容性が、上述したＬｂｕＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体の変異研究、及びＬｓｈＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体で得られた最近の構造的知見（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２）と一致することは注目に価する。全体として、これらの結果は、ＶＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲリピートの配列が、Ｃａｓ１３ａファミリーによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工についてのその能力を決定づけることを示唆する。しかしながら、多様なリピートの存在下で進化した相同体（ＰｐｒＣａｓ１３ａ及びＲｃａＣａｓ１３ａ）は、他のクラスター２の配列を加工する能力を保持する。
【０３９６】
機能的に直交性のＣａｓ１３ａ酵素の２つのサブファミリー
図４４Ｄにおいて定義されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の交換可能性のクラスターが、非同一源Ｃａｓ１３ａ相同体によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断を誘導する能力を有するか否かを調査した。非同一源のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及び成熟ｃｒＲＮＡによって誘導されるＣａｓ１３ａ−媒介性トランス−ｓｓＲＮＡ切断を試験するために、上述の実施例において記載された蛍光アッセイが修正され、解析はｓｓＲＮＡ−切断実験において顕著な切断活性を示した５つの相同体に限定された（図４２Ｃを参照）。大まかに、これらの結果はｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の結果に酷似し、ｃｒＲＮＡリピートクラスター同一性が機能的な群を決定するが、加工と標的化とが独立した酵素的活性であることと一致するいくつかの顕著な対照があった（図４４Ｅ及び４４Ｆ）。例えば、Ｐｐｒのｐｒｅ−及び成熟ｃｒＲＮＡは、非同一源タンパク質ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＬｂｕＣａｓ１３ａがこれらのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを加工することができないにもかかわらず、非同一源タンパク質ＬｗａＣａｓ１３ａ及びＬｂｕＣａｓ１３ａによるｓｓＲＮＡ切断を誘導できる。別の驚きは、ＨｈｅＣａｓ１３ａの無差別性であり、トランス−ｓｓＲＮＡ切断について、任意のそれらのガイドによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を欠いているにもかかわらず全てのクラスター２のｐｒｅ−及び成熟ｃｒＲＮＡによって誘導される。これは、ｃｒＲＮＡ成熟が、トランス−ｓｓＲＮＡ切断に必要とされないことを示唆し、ＬｂｕＣａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工欠失変異体が、影響を受けないトランス−ｓｓＲＮＡ切断能力を有するという発見と一致する観察である。
【０３９７】
ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工とトランス−ｓｓＲＮＡ切断との両方についてのｃｒＲＮＡの交換可能性の比較は、Ｃａｓ１３ａタンパク質ファミリー内の２つの機能的な直交性サブファミリーを規定する。第１の群（例えば、ＬｂｕＣａｓ１３ａ）は、タンパク質ファミリーにわたるｃｒＲＮＡによって誘導される、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工とトランス−ｓｓＲＮＡ切断との両方について広範囲の無差別性を有する。この系統学的群はまた、トランス−ｓｓＲＮＡ切断活性部位内のウリジンに対する選好性を示す。ｃｒＲＮＡとタンパク質配列との両方によって定義される第２の群（例えば、ＬｂａＣａｓ１３ａ）は、異なるｃｒＲＮＡ交換可能性プロファイルを有し、トランス−ｓｓＲＮＡ標的切断の間に優先的にアデノシンを切断する。これらのＣａｓ１３ａサブファミリーの直交性の反応性を試験するために、ＬｂｕＣａｓ１３ａ及びＬｂａＣａｓ１３ａが、それぞれホモ−ＡまたはホモＵのｓｓＲＮＡレポーターを切断することが検証された（図４５Ａ及び４５Ｂ）。異なるプローブが同様の量の蛍光シグナルを生じたが、一方で、相同体の異なる感度（ＬｂｕＣａｓ１３ａ及びＬｂａＣａｓ１３ａに対して、それぞれ１０ｐＭ対１ｎＭ）のために、実質的に異なる量のｓｓＲＮＡ活性化因子が添加されたことは注目されるべきである。直交性を検証するために、ｃｒＲＮＡ、活性化因子及びレポーターの間の全ての起こり得る非同一源の組み合わせの対照反応のパネルが試験され、同一源の組み合わせを除いて、実質的なシグナルが全く検出されなかった（図４５Ｃ）。まとめると、これらの結果は、同一のシステム内で並行して機能し得る異なるＣａｓ１３ａ相同体を規定する。
【０３９８】
Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工は、ＣＲＩＳＰＲアレイの環境において標的化効率を増強する。この研究の１つの不可解な発見は、後続するＣａｓ１３ａによるトランス−ｓｓＲＮＡ標的切断反応を誘発するための成熟ｃｒＲＮＡに対する厳格な要件の欠如である。さらに、ＬｂｕＣａｓ１３ａの加工欠失変異体は、成熟ｃｒＲＮＡの代わりにｐｒｅ−ｃｒＲＮＡによって誘導されるときでさえ、トランス−ｓｓＲＮＡ切断の同様の効率を維持する（図４６及び図４７）。これは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ座位内のｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工の役割は、効率的なｓｓＲＮＡ標的化に必須ではないが、代わりに長いＣＲＩＳＰＲアレイ転写物の領域からの各々のｃｒＲＮＡを開放するように機能するという仮説を導いた。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工が、ｃｒＲＮＡロード及び／またはｓｓＲＮＡ標的化の間に、ＲＮＡフォールディングの制約及び起こり得る隣接するＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡスペーサー種の立体障害を緩和する可能性があるか否かについて問われた。これを試験するために、野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａまたはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工不活化変異体のいずれかを用いて、ＣＲＩＳＰＲアレイによって誘導されるトランス−ｓｓＲＮＡ切断の効率が比較された。
【０３９９】
ＬｂｕＣａｓ１３ａ全ての加工欠失の単一点変異（図４０）が、低レベルのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工活性を保持したので、検出可能な加工活性を有さないが、なおも野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａに匹敵するかまたはそれより大きいトランス−ｓｓＲＮＡ切断効率を保持する二重変異体（Ｒ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ）が作製された（図４６Ａ及び４６Ｂ）。この二重変異体及び野生型のＬｂｕＣａｓ１３ａ酵素は、標的ＲＮＡ及び６つの異なるリピート−スペーサー単位からなる小型ＣＲＩＳＰＲアレイ転写物の存在下で、ｓｓＲＮＡ切断について試験された（図４６Ｃ及び４６Ｄ）。ｃｒＲＮＡ−加工不活化変異体によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断の速度は、アレイ内の全てのスペーサー配列について、大幅に低減した（全ての対についての片側ｔ−検定：ｐ＜０．００１）。野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａと比べて低減した活性は、アレイ内の各々の連続的なスペーサーによってより顕著であり、野生型酵素によって触媒されるものの１５％にすぎない速度で最後のスペーサーが切断を誘導した。この発見はｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工が標的化に必須ではないが、一方でそれは、ＣＲＩＳＰＲアレイからｃｒＲＮＡを開放することによって活性を向上することを示唆し、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの改訂されたモデルを導く（図５５）。
【０４００】
図３８Ａ〜３８Ｃに関して、Ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工は、Ｃａｓ１３ａタンパク質ファミリー内で広範囲に保存されている。図３８Ａは、Ｃａｓ１３ａによって触媒されるｃｒＲＮＡ生合成経路の概略図である。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ転写物はＣａｓ１３ａによって切断されて成熟ｃｒＲＮＡを生成する。以下の、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの概略図は、重要な機能的特徴を強調する。図３８Ｂは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断部位を強調する、研究されたＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムからのＣＲＩＳＰＲリピート配列の５’部分のアラインメントを示す。マッピングされた切断部位は赤い棒として示される。Ｌｂｕ  ｃｒＲＮＡ−リピート配列からの偏差は、黒字で注記される。小文字のｇは、転写の目的に必要とされ、天然のｃｒＲＮＡリピート配列の一部ではない。全ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、図３９Ｂに図示される。図３８Ｃは、５’−放射性標識されたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ基質との６０分間のインキュベーションの後の、９のＣａｓ１３ａ相同体によるＣａｓ１３ａ媒介性ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断の代表的なゲルを示す。
【０４０１】
図３９Ａ〜３９Ｃに関して、図３９Ａは．この研究に使用されたＣａｓ１３ａ相同体のためのＣＲＩＳＰＲ座位及びｃｒＲＮＡリピート構造（Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１５  Ｎｏｖ  ５；６０（３）：３８５−９７）から翻案されたＶＩ−Ａ型座位の図を含むＣａｓ１３ａタンパク質の最尤系統樹を示す。Ｃａｓ１３ａのＯＲＦは、ティールで示される。黒い箱（リピート）、黄色いひし形（スペーサー）として描写されるＣＲＩＳＰＲアレイ、大きなアレイに対するスペーサーアレイのサイズは上方に注記される。座位を囲む対象のＯＲＦは、以下の略語によって注記される。Ｔ−毒素、ＡＴ−抗毒素、及びＴＰ−トランスポゼースである。図３９Ｂは、使用された相同体からのＣＲＩＳＰＲリピート配列の手動のアラインメントを示す。赤い線で注記される部位はｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工切断部位である。Ｌｂｕ  ｃｒＲＮＡ−リピート配列からの偏差は、黒字で注記される。小文字のｇは、転写の目的に必要とされ、天然のｃｒＲＮＡリピート配列の一部ではない。第１が天然の配列を含み、第２が、非典型的に短い天然のリピートを伸長するための４ヌクレオチドの伸長を有する、２つの別個のＨｈｅ  ｃｒＲＮＡの配列が試験された。いずれのｃｒＲＮＡリピートも、いずれの試験された条件下においても、ＨｈｅＣａｓ１３ａによって切断されなかった。図３９Ｃは、様々な塩及びｐＨ条件にわたる、天然のｃｒＲＮＡリピート配列に対する、ＨｈｅＣａｓ１３ａによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工アッセイを示す。切断産物は全く観察されなかった。
【０４０２】
図４０Ａ〜４０Ｆは、ＬｂｕＣａｓ１３ａによるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ切断に重要な残基の同定を表し、図４０Ａは、ＬｓｈＣａｓ１３ａ結晶構造（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２）に基づいて注釈されたドメインを含むＬｂｕＣａｓ１３ａドメイン構成の概略図である。図４０Ｂは、ＬｓｈＣａｓ１３ａに対する研究によってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与するＣａｓ１３ａのらせん１ドメイン内の局所領域を示し、図４０Ｃは、ＬｂｕＣａｓ１３ａに対する研究によってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与するＣａｓ１３ａのＨＥＰＮ２ドメイン内の領域の複数の配列のアミノ酸アラインメントを示す。これらの領域の完全なファミリーの系統樹のアラインメントについては図４１を参照、完全なタンパク質のアラインメントについては図５７を参照のこと。変異が大幅にｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に影響を及ぼす残基は黄色のひし形でマークされ、変異がｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に最小限の影響を及ぼす残基はティールのひし形でマークされる。ＬｂｕＣａｓ１３ａ配列の上部のシンボルは、ＬｂｕＣａｓ１３ａになされた変異に対応し、ＬｓｈＣａｓ１３ａ配列の下部のシンボルは、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２によってＬｓｈＣａｓ１３ａになされた変異に対応する。マトリクスアラインメントの着色は、ＣｌｕｓｔａｌＸスキームを用いる残基の保存を意味し、より暗い色相が保存の強固さを示す。図４０Ｄは、らせん１ドメインを示し、図４０Ｅは、ＨＥＰＮ２ドメインにおける変異について測定された、単一のターンオーバー条件下におけるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工を示す。定量されたデータは単一指数関数的減衰に対して適合され、計算された擬一次速度定数（ｋｏｂｓ）（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）は、Ｌｂｕ  ＷＴ  ０．０７４±０．００３分-1、Ｅ２９９Ａ  ０．０７１±０．００５分-1、Ｋ３１０Ａ  ０．０７１±０．００３分-1、Ｒ３１１Ａ  ０．０５４±０．００７分-1、Ｎ３１４Ａ  ０．０２９±０．００８分-1、Ｒ１０７９Ａ  ０．００９±０．００７分-1、Ｄ１０７８Ａ  ０．０２３±０．００２分-1、Ｋ１０８０Ａ  ０．０１６±０．００４分-1、及びＫ１０８７Ａ  ０．０７６±０．００７分-1であって、一方でＲ１０７２Ａ及びＫ１０８２Ａは適合できなかった。図４０Ｆは、標準的な条件下での、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｓｈＣａｓ１３ａ、及びＬｗａＣａｓ１３ａタンパク質によるＬｓｈＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、及びＬｂｕＣａｓ１３ａのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの加工の代表的なゲルを示す。最も右側のレーンの加水分解ラダーは、相対サイズ比較を可能にするが、３つのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ間の微妙な配列の相違は、これらの小さいフラグメントの移動を改変する。
【０４０３】
図４１Ａ〜４１Ｂは、らせん１及びＨＥＰＮドメインの完全なアラインメントを示しており、図４１Ａは、らせん１ドメインにわたる１９のＣａｓ１３ａファミリーメンバーの多重配列アラインメントを示し、図４１Ｂは、ＨＥＰＮ２ドメインにわたる１９のＣａｓ１３ａファミリーメンバーの多重配列アラインメントを示す。ＧＩ受入番号は各々の種の名称の前に列挙される。ＬｂｕＣａｓ１３ａの配列に基づく整合を上方に列挙し、ＬｓｈＣａｓ１３ａの配列に基づく整合を下方に列挙する。この研究において試験された変異は、それぞれｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工反応に負の影響を及ぼすアラニン置換またはｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に最小限の影響を及ぼすものに対応する、黄色及びティールのひし形によってアラインメントの上部に注記される。（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２０１７  Ｊａｎ  １２；１６８（１−２）：１２１−１３４．ｅ１２）によって試験される変異は、ＬｓｈＣａｓ１３ａ配列の下部に描写される。保存スコアは、ＡＭＡＳ法を用いてＪａｌｖｉｅｗによって計算された。
【０４０４】
図４２Ａ〜４２Ｄに関して、Ｃａｓ１３ａタンパク質ファミリーのメンバーは、ある範囲の効率でｓｓＲＮＡを切断する。図４２Ａは、Ｃａｓ１３ａによるｓｓＲＮＡ−標的化の概略図である。単純化のために、トランス−ｓｓＲＮＡ切断が研究の焦点とされた。図４２Ｂは、全ての１０の相同体による６０分間のインキュベーションの後のＣａｓ１３ａ媒介性トランス−ｓｓＲＮＡ切断の代表的なゲルを示す。Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体は、５０ｎＭの最終的なＲＮＰ複合体濃度で、成熟ｃｒＲＮＡ産物を用いて、方法に記載されるように形成された。５０ｎＭの標識されていないｃｒＲＮＡ相補的ｓｓＲＮＡ活性化因子の存在及び非存在において、反応を開始するために、＜１ｎＭの放射性標識されたトランス−ｓｓＲＮＡ標的を添加した。ＬｓｈＣａｓ１３ａによる弱いトランス−ｓｓＲＮＡ切断活性が、右側の二重の矢印によって注記される産物のバンドと共に観察された。図４２Ｃは、６つの異なるＣａｓ１３ａについて、各々の５−ｍｅｒホモポリマー、ｓｓＲＮＡ基質に対するＣａｓ１３ａに触媒されたトランス−ｓｓＲＮＡ切断パーセンテージを報告するヒートマップを示す。アッセイ条件は、６０分間の代わりに５分間インキュベートされたＬｂｕＣａｓ１３ａ及びＬｗａＣａｓ１３ａを除いて、図４２Ｂと同一であった（ｎ＝３、関連誤差を有する値は図５１（表６）に提示される）。図４２Ｄは、ｓｓＲＮＡ活性化因子の濃度の範囲にわたる５つの相同体による蛍光ｓｓＲＮＡレポーターの見かけ上の切断速度を示す。Ｃａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡ複合体は、５０ｎＭの最終的な活性複合体濃度で、各々２：１の比で予めインキュベートされた。相補的ｓｓＲＮＡ活性化因子及び蛍光ｓｓＲＮＡ切断レポーターは、反応を開始するために添加された。標準化されたレポーターシグナル曲線の経時変化は、単一指数関数的減衰に適合され、見かけ上の速度がプロットされた（ｎ＝３）。いくつかの条件は第１の測定時点より前にプラトーに達し、それゆえ、それらの速度は、最小限に０．５分−１と仮定され、チャート中にａ＊とラベルされた。
【０４０５】
図４３Ａ〜４３Ｄは、Ｃａｓ１３ａ相同体によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断を示す。図４３Ａは、ｓｓＲＮＡ活性化因子の存在及び非存在での１０の異なるＣａｓ１３ａ相同体によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断の経時変化解析を示す。時点は１分、１０分、及び６０分で取られた。ｓｓＲＮＡ−活性因子特異的切断産物は、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＰｐｒＣａｓ１３ａ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、及びＬｓｈＣａｓ１３ａについて注記された。点線は分離ＰＡＧＥゲル間の境界を示す。図４３Ｂは、４つのＣａｓ１３ａ相同体について、複数の切断反応にわたってマッピングされたトランス−ｓｓＲＮＡ切断部位を示す。異なる切断パターンは赤い矢印によって注記される。ＬｂａＣａｓ１３ａ及びＥｒｅＣａｓ１３ａがアデノシン選好性を有し得ると考えられ、一方でＬｗａＣａｓ１３ａは、ヌクレオチド選好性に関してより無差別であると考えられる。図４３Ｃ及び４３Ｄは、５つのＣａｓ１３ａ相同体によるホモポリマーｓｓＲＮＡ基質の代表的なトランス−ｓｓＲＮＡ切断のゲルを示す。
【０４０６】
図４４Ａ〜４４Ｆは．Ｃａｓ１３ａファミリー内のｃｒＲＮＡ交換可能性を示す。図４４Ａは、Ｃａｓ１３ａタンパク質の最尤系統樹を示す。この研究において使用された相同体は、太字で記され、クレードが強調されている。ブートストラップされた値は図３９に配置される。図４４Ｂは、この研究において使用される相同体からのＣＲＩＳＰＲリピートについての対称類似性スコアマトリクスを示す。行と列とは、ＣＲＩＳＰＲリピートクラスター形成によって順序付けられる。図４４Ｃは、この研究において使用される相同体からのＣＲＩＳＰＲリピートについての非対称類似性スコアマトリクスを示す。行がＣａｓ１３ａ系統樹に対応して再度順位付けされていることを除いて図４４Ｂにおけるような、同一のペアワイズスコアがここに提示される。図４４Ｄ、図４４Ｅ、図４４Ｆはそれぞれ、非同一源タンパク質によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡに誘導されるトランス−ｓｓＲＮＡ切断、成熟ｃｒＲＮＡによって誘導されるトランス−ｓｓＲＮＡ切断についての機能的活性マトリクスを示す。加工アッセイは標準的な条件を用いて実施され、６０分の反応の終点が解析された。トランス−ｓｓＲＮＡ切断アッセイは、蛍光ｓｓＲＮＡレポーターアッセイを用いて、適合された初期速度と共に実施された。ｓｓＲＮＡ活性化因子の濃度は、ＬｂｕＣａｓ１３ａ：１００ｐＭ、ＬｗａＣａｓ１３ａ：１００ｐＭ、ＰｐｒＣａｓ１３ａ：１００ｎＭ、ＬｂａＣａｓ１３ａ：１０ｎＭ、及びＨｈｅＣａｓ１３ａ：１００ｎＭであった。蛍光プラトー値における相違を把握するために、初期速度は三重にわたって適合され、各々のＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡの同一源の対に対して標準化された。数値及び関連誤差（ｎ＝３）に関しては、図５２、５３、及び５４（それぞれ表７、８、及び９）を参照されたい。
【０４０７】
図４５Ａ〜４５Ｃは、ＲＮＡ検出に関する直交性Ｃａｓ１３ａサブファミリーの機能的検証を示す。図４５Ａは、ＬｂｕＣａｓ１３ａまたはＬｂａＣａｓ１３ａのいずれかによるトランス−ｓｓＲＮＡ切断活性をアッセイするために、蛍光ホモポリマーｓｓＲＮＡレポーター基質を使用するために修正されたＲＮＡ検出アッセイの概略図である。図４５Ｂは、ＬｂｕＣａｓ１３ａ：Ｌｂｕ−ｃｒＲＮＡ：１０ｐＭのｓｓＲＮＡ活性化因子またはＬｂａＣａｓ１３ａ：Ｌｂａ−ｃｒＲＮＡ：１ｎＭのｓｓＲＮＡ活性化因子のいずれかと共にインキュベートされたホモポリマーレポーターによって生じる生の蛍光測定の経時変化（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）を示す。図４５Ｃは、ｃｒＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ活性化因子、及びＣａｓ１３ａタンパク質の組み合わせのパネルにわたって、蛍光ホモポリマーｓｓＲＮＡレポーターによって生じる生の蛍光測定（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）を示す。
【０４０８】
図４６Ａ〜４６Ｄに関して、ＬｂｕＣａｓ１３ａについて、ｃｒＲＮＡアレイ加工の役割を解読する。図４６Ａは、野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａと比較したＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ変異体に対するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工アッセイの定量された経時変化データを示す。定量されたデータは単一指数関数的減衰及び擬一次速度定数（ｋｏｂｓ）に適合され（平均±ｓ．ｄ．，ｎ＝３）、ＬｂｕＣａｓ１３ａ  ＷＴについて０．０７４±０．００３分-1であり、一方でＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ変異体は、速度定数を得るために十分な信頼性で適合することができなかった。図４６Ｂは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及び成熟ｃｒＲＮＡによって誘導される、ＬｂｕＣａｓ１３ａの野生型及びＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ加工不活化変異体による蛍光レポーターの見かけ上の速度を示す。Ｃａｓ１３ａ：ＲＮＡ複合体は、１：１の比で、６０分間予めインキュベートされ、次いで、１０ｐＭの活性化因子及び１５０ｎＭのレポーターが反応を開始するために添加された（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）。図４６Ｃは、６のｃｒＲＮＡリピート−スペーサーを含む５０ｎＭのＣＲＩＳＰＲアレイによって誘導される、３００ｎＭの野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａまたはＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ  ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工不活化変異体による蛍光ｓｓＲＮＡレポーター切断の見かけ上の速度を示す。各々の棒の群は、各々の棒の群の下部に示されるＣＲＩＳＰＲアレイ内の概略された位置に相補的な異なるｓｓＲＮＡ活性化因子配列の１００ｐＭの添加を表す。各々の速度は、３つの生物学的な反復からのデータから適合され、速度の標準偏差が描写される。変異タンパク質の速度は、全てのスペーサー位置に関して、野生型ＬｂｕＣａｓ１３ａとは統計学的に異なる（片側ｔ検定：ｐ＜０．００１）。図４６Ｄは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工不活化変異体による減少したトランス−ｓｓＲＮＡ標的化効率の位置効果を実証する、野生型ＬｂｕＣＡｓ１３ａ活性のパーセンテージとして描写された図４６Ｃからのデータを示す。
【０４０９】
図４７Ａ〜４７Ｃは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工に関与する領域におけるＬｂｕＣａｓ１３ａの点変異による、トランス−切断を示しており、ＬｂｕＣａｓ１３ａの点変異に「関与する」様々なｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ加工によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断を示す。切断反応は、注記されるように、２５℃または３７℃のいずれかで、０．２ｎＭまたは１ｎＭのｓｓＲＮＡ活性化因子を伴って５０ｎＭのＣａｓ１３ａ：ｃｒＲＮＡによって実施された。より正確な測定のために、より低い温度及び活性化因子濃度が、反応動力学を遅延させるために使用された。適合曲線は、計算された擬一次速度定数を有する単一指数関数的減衰であり（平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝３）、：２５℃条件：Ｌｂｕ  ＷＴ  １．７６±０．２４分-1、Ｋ２９９Ａ  １．７２±０．６５分-1、Ｋ３１０Ａ  ３．１９±０．２７分-1、Ｒ１０７２Ａ  ２．９５±０．５３分-1、Ｒ１０７９Ａ  ０．９３±０．２８分-1、及びＫ１０８２Ａ  ２．６４±０．６３分-1、ならびに３７℃条件：Ｒ３１１Ａ  ０．３９±０．０９分-1、及びＮ３１４Ａ  ０．５４±０．１１分-1である。一方で野生型及び加工不活化変異体（Ｒ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ）は、正確な速度測定についてあまりに急速にプラトーに達し、ＷＴ  ２．９５±１．９７分-1、及びＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ  ４．８６±４．９９分-1である。
【０４１０】
図４８Ａ〜４８Ｂに関して、ｃｒＲＮＡ加工不活化変異Ｒ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａは、同様のｃｒＲＮＡ結合親和性を保持し、ｐｒｅ−ｃＲＮＡアレイを加工しない。図４８Ａは、成熟ｃｒＲＮＡの、ＬｂｕＣａｓ１３ａ  ＷＴ及びＬｂｕＣａｓ１３ａ  Ｒ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａに対する結合親和性を決定するために、フィルター結合アッセイが方法に記載されるように実施された結果を示す。定量されたデータは、標準的な結合等温線に適合された。３つの独立した実験からの測定された解離定数（平均±ｓｄ）は、１．２１±０．５７ｎＭ（ＬｂｕＣａｓ１３ａ  ＷＴ）、及び３．１１±０．８９ｎＭ（ＬｂｕＣａｓ１３ａ  Ｒ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ）であった。図４８Ｂは、様々なサイズマーカーと共に、ＬｂｕＣａｓ１３ａ及びＬｂｕＣａｓ１３ａのＲ１０７９Ａ／Ｋ１０８０Ａ変異体と共に基質として６−ｍｅｒのＣＲＩＳＰＲアレイを用いるｐｒｅ−ｃＲＮＡ加工アレイを示す。産物の同定は、ゲルの右側に描写される。時折加工されなかったさらなるリーダー領域のために、注記されるようにさらなるサイズの産物が時折生じる。
【０４１１】
図４９（表４）には、ＣＲＩＳＰＲリピートコンセンサス配列：Ｃａｓ１３ａ含有オペロンの１０ｋｂ内の複数のＣＲＩＳＰＲ座位を有する相同体（ＲｃａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣａｓ１３ａ、及びＥｒｅＣａｓ１３ａ）、またはリピート多様性を有する長いアレイ（ＰｐｒＣａｓ１３ａ）について、複数のｃｒＲＮＡリピート配列が、赤い文字で変異を強調して列挙される。ＰｐｒＣａｓ１３ａについて、アレイのリーダー側の第１のｃｒＲＮＡリピートが、この研究のために選択された。ＲｃａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣａｓ１３ａ、及びＥｒｅＣａｓ１３ａについて、ｃｒＲＮＡリピート配列がこの研究のための代表的なｃｒＲＮＡを選択するために、（１）アレイの長さ、及び、（２）同一源のＣａｓ１３ａタンパク質によるトランス−ｓｓＲＮＡ切断を誘導する能力の２つの要素について解析された。本文において使用される配列は最後のカラムに注記される。
【０４１２】
図５０（表５）にあって、＊オリゴＩＤは、この研究において使用されるＲＮＡ基質について一貫性を維持するためのインデックスナンバーであり、＊＊略語の出典：ＳＳは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートがインビトロ転写のために使用された、ＨＨ  ＰＣＲ−インビトロ転写テンプレートは、ハンマーヘッドリボザイムテンプレート配列を含む重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲ産物である、ＩＤＴ−ＩＤＴによって合成された、ＰＣＲ−プラスミドから増幅されたインビトロ転写テンプレートである。
【０４１３】
図５１は表６を提示する。図５２は表７を提示する。図５３は表８を提示する。図５４は表９を提示する。
【０４１４】
図５５は、ＶＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲシステムの機能の改訂されたモデルを示す。図５５Ａは、この研究における重要な発見のグラフによる要約である。この研究において使用される相同体は、太字の略語によって示され、トランス−ｓｓＲＮＡ切断不活性相同体はグレイで示される。着色された円は一般化されたｃｒＲＮＡ交換可能性及びトランス−ｓｓＲＮＡ切断基質のヌクレオチド選好性によって定義される、２つの直交性Ｃａｓ１３ａ酵素群を強調する。図５５Ｂは、ＶＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲシステムの機能の改訂されたモデルを描写する概略図である。
【０４１５】
本発明をその具体的な実施形態を参照して説明したが、本発明の真の趣旨と範囲とを逸脱することなく様々な変更がなされたり、均等物と置き換えたりすることができることは当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセスステップまたはステップを本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために多くの修正がなされ得る。全てのそのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。 
【０４１６】
相互参照
本出願は、２０１６年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，１７２号、２０１６年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７８，１５６号、及び２０１７年３月２３日に出願された米国仮特許出願第１５／４６７，９２２号の権益を主張し、その出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１７】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって与えられた１２４４５５７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０４１８】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組込み
２０１７年３月２１日作成の、６７ＫＢのサイズを有するテキストファイル「ＢＥＲＫ−３３７ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として、配列表が本明細書において提供される。テキストファイルの内容は、参照により本明細書にその全てが組み込まれる。 
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【図５６Ｄ】
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【図５６Ｅ】
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【図５６Ｆ】
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【図５６Ｇ】
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【図５６Ｈ】
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【図５６Ｉ】
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【図５６Ｊ】
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【図５６Ｋ】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５７−３】
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【図５７−４】
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【図５７−５】
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【図５７−６】
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【図５７−７】
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【図５７−８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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