(57)【要約】  ＨＥＲ２を標的とする細胞外ドメイン、膜貫通領域、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体（ＣＡＲ）が記載される。
2019500894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体をコードする核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体は、ＨＥＲ２標的配列、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン、並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記ＨＥＲ２標的ドメインはＨＥＲ２  ｓｃＦｖである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＨＥＲ２  ｓｃＦｖは、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳのアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体は、ＨＥＲ２標的配列、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン、並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ＨＥＲ２標的ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記スペーサー領域は、５〜３００のアミノ酸を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記スペーサー領域は、配列番号２〜１２を含む群から選択されるアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記スペーサーは、１０〜５０のアミノ酸を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記共刺激ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む４−１ＢＢ共刺激ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
３乃至１５のアミノ酸のリンカーが、前記共刺激ドメイン又はその変異体と前記ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含むポリペプチドを発現する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記キメラ抗原受容体は、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び、配列番号２〜１２のうちいずれかのアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含むスペーサー領域を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記１〜５のアミノ酸修飾は、１又は２のアミノ酸修飾である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記１〜５のアミノ酸修飾は、１〜５のアミノ酸置換である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団であって、キメラ抗原受容体は、ＨＥＲ２標的配列、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン、並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、ヒトＴ細胞の集団。
【請求項１９】
キメラ抗原受容体を発現するベクターを含むヒトＴ細胞の集団であって、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、ヒトＴ細胞の集団。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞の集団で構成される、請求項１９に記載のヒトＴ細胞の集団。
【請求項２１】
患者におけるＨＥＲ２発現脳癌を治療する方法であって、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己ヒトＴ細胞又は同種ヒトＴ細胞の集団を投与するステップを含み、キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、方法。
【請求項２２】
前記ヒトＴ細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋メモリーＴ細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌は、乳房から脳への転移である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記形質導入されたヒトＴ細胞は、前記患者からＴ細胞を取得するステップ、セントラルメモリーＴ細胞を単離するために前記Ｔ細胞を処理するステップ、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて前記セントラルメモリー細胞の少なくとも一部に形質導入を行うステップを含む方法によって調製され、キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞は、腫瘍内に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞は、脳室内に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞は、腫瘍に隣接して脳室内に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２９】
配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現するＴ細胞。
【請求項３０】
前記核酸分子は、配列番号２６〜４１のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記キメラ抗原受容体は、前記ＨＥＲ２標的ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を損なう、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記スペーサー領域は、配列番号９、７、３及び２のいずれかのアミノ酸配列、又は、配列番号３に続いて配列番号２のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列から成る、請求項３１に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子に関し、特に、ＨＥＲ２標的配列、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン、並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜５のアミノ酸修飾を有するその変異体を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
操作されたＴ細胞を利用する療法を含む、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について調査されてきた。場合によっては、そのような療法において使用されるＴ細胞は、十分長い間ｉｎ  ｖｉｖｏで活性のままではない。場合によっては、Ｔ細胞の腫瘍特異性は、一つには固形腫瘍の異種性及び自己抗原を標的とする場合の非癌性細胞に対するオフターゲット効果の可能性の理由で比較的低い。従って、改善された抗腫瘍特異性及び機能を用いる腫瘍特異的癌療法が当技術分野において必要とされる。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）は、細胞外腫瘍認識／標的ドメイン、細胞外リンカー／スペーサー、膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞活性化及び共刺激シグナル伝達ドメインで構成される。認識／標的ドメインの設計が、有害なオフターゲット作用を回避することに不可欠である。ＣＡＲ腫瘍標的ドメインの大部分は、特定の抗原に結合する抗体の特異性を活用する抗体配列から得られる単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）である。ＩＬ−１３受容体であるＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を標的とするＩＬ−１３サイトカインＣＡＲ等、通常の受容体リガンドから得られるＣＡＲ腫瘍標的ドメインの例もある。
【０００４】
ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者において、頑強で耐久性のある臨床的有効性を実証してきた（非特許文献１；非特許文献２）。血液学的疾患における初期の成功により、固形腫瘍に対するこのアプローチのより広範な適用が、現在、精力的に研究されている。
【０００５】
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｅｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＥＥＲ）のデータによると、２０１４年の乳癌、主に転移性疾患による死亡は４万件と推定されている。乳癌患者の約２５〜３０％がＨＥＲ２遺伝子の増幅を伴い、これは、特に不良な予後を与える。標的療法を含むより新しい薬剤の出現があっても、ステージＩＶの疾患における全体的な死亡率の改善はささやかなものでしかなかった。例えば、ＨＥＲ２陽性乳癌患者を対象としたランダム化試験では、２つのＨＥＲ２標的抗体であるトラスツズマブ及びペルツズマブとドセタキセルの最も有望な治療の組み合わせが、５６．５ヶ月の全生存期間中央値、及び、トラスツズマブ及びドセタキセルだけと比較して６．３ヶ月のみの進行無しの生存期間の延長をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｒｉｃｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１５  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ
【非特許文献２】Ｍａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｂｌｏｏｄ  １２３：２６２５−２６３５
【非特許文献３】Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
【非特許文献４】Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９６９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、改善された抗腫瘍特異性及び機能を用いる腫瘍特異的癌療法が当技術分野において必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において記載されているのは、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原受容体又は「ＣＡＲｓ」）である。細胞外ドメインは、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ、及び任意的に、例えば、ヒトＦｅドメインの一部を含むスペーサーを含む。膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインには、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖（ＣＤ３ξ）由来のシグナル伝達ドメインが含まれ、１つ又は複数の共刺激ドメインには、例えば、４−ＩＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメインが含まれる。細胞外ドメインは、ＣＡＲが、Ｔ細胞の表面に発現されたときに、ＨＥＲ２を発現する細胞にＴ細胞活性を向けることを可能にする。そのような細胞には、特定の乳癌細胞及び特定の脳癌細胞が含まれる。細胞内領域においてＣＤ３ξと直列に４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン等の共刺激ドメインを含めることにより、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受け取ることが可能になる。Ｔ細胞、例えば、患者特異的自己Ｔ細胞を操作して、本明細書において記載されるＣＡＲを発現させることができ、操作された細胞を、ＡＣＴにおいて増やす且つ使用することができる。アルファベータＴ細胞もガンマデルタＴ細胞も含む種々のＴ細胞サブセットを使用することができる。加えて、ＣＡＲを、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞において発現させることができる。本明細書に記載されるＣＡＲを発現する免疫細胞を用いて患者が治療される場合、その細胞は、自己Ｔ細胞又は同種Ｔ細胞であり得る。場合によっては、使用される細胞は、ＣＤ６２＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ４５ＲＡ−であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）両方を含む細胞集団であるか、又は、使用される細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴＣＭ細胞、ステムセルセントラルメモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含む細胞集団（すなわち、ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞の集団）である。ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋の細胞両方、並びに、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞両方を含む。そのような細胞の使用は、他のタイプの患者特異的Ｔ細胞の使用と比較して、養子移植後の細胞の長期間持続を改善することができる。
【０００９】
本明細書において記載されているのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であり、ＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ（例えば、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号１）又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体；を含む。
【００１０】
種々の実施形態において、共刺激ドメインは：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される。特定の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体が存在する。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体等、２つの共刺激ドメインが存在する。種々の実施形態では、１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾は置換である。
【００１１】
場合によっては、共刺激ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメインとの間、及び／又は、２つの共刺激ドメイン間に１〜６のアミノ酸の短い配列（例えばＧＧＧ）が存在する。
【００１２】
さらなる実施形態において、ＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；及び、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ又はその変異体と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、スペーサー領域は、配列番号２〜１２及び４２を含む群から選択されるアミノ酸配列（表３）又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む）；を含み、スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含み；スペーサー領域は、１〜１５０のアミノ酸を含み；スペーサーはなく；４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み；ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインは、配列番号２１アミノ酸配列を含み；３乃至１５のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する。特定の実施形態において、２つの共刺激ドメインがある場合、１つは４−１ＢＢ共刺激ドメインであり、もう一方は、ＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。種々の実施形態では、１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾は、例えば保存的置換等の置換である。
【００１３】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し；キメラ抗原受容体は、配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団も開示され、キメラ抗原受容体は：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；及び、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；を含む。種々の実施形態において、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号２６〜４１のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含み；ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）を含み、例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり、又は、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセルセントラルメモリー細胞の組み合わせ（ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞）を含み、例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合においても、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞もＣＤ８＋細胞も含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０又は９０％が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり；ＣＤ３＋細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）。
【００１５】
患者における癌を治療する方法も記載され、当該方法は、自己ヒトＴ細胞又は同種ヒトＴ細胞の集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）又はセントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセルセントラルメモリー細胞の組み合わせ（すなわち、Ｔ細胞はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である）を含む自己又は同種Ｔ細胞）を投与するステップを含み、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合においても、Ｔ細胞の集団は、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたＣＤ４＋細胞もＣＤ８＋細胞も含み（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０又は９０％が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり；ＣＤ３＋細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）、キメラ抗原受容体は、配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含む。種々の実施形態では、癌は、脳癌、例えば、乳癌からの転移であるＨＥＲ２発現脳癌であり；形質導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を取得するステップ、セントラルメモリーＴ細胞を単離するためにＴ細胞を処理するステップ、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いてセントラルメモリー細胞の少なくとも一部に形質導入を行うステップを含む方法によって調製され、キメラ抗原受容体は、配列番号２６又は２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含む。場合によっては、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、脳腫瘍に直接は投与されず、代わりに、患者の脳内の脳室内空間に投与される。
【００１６】
配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；５以下のアミノ酸の置換、欠失、存在又は挿入の存在を除いて、配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；５以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び、２以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号２６〜４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；も記載される。
【００１７】
本開示は、本明細書において記載されるＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲのうちの１つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書において記載されるＣＡＲのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球も含む。
【００１８】
本明細書において記載されるＣＡＲは、ＨＥＲ２結合ドメイン（例えばＨＥＲ２  ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含み得る。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらの一部は、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又は、ＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書において記載されるＣＡＲにおいて使用することができる種々のスペーサーを提供している。
【００１９】
【表１】
2019500894.tif 000003
一部のスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のヒンジ領域のうち全て又は一部、すなわち、例えばＩｇＧ４  Ｆｅヒンジ又はＣＤ８ヒンジ等、免疫グロブリンのＣＨＩドメインからＣＨ２ドメインの間に入る配列を含む。一部のスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。免疫グロブリン由来の配列は、１つ又は複数のアミノ酸修飾、例えば１、２、３、４又は５の置換、例えばオフターゲット結合を減少させる置換を含み得る。
【００２０】
「アミノ酸修飾」は、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を指す。「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ペプチド又はタンパク質の配列における特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸と交換することを指す。置換を行って、結果として生じるタンパク質におけるアミノ酸を、非保存の様式で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸までコドンを変えることによって）、又は、保存的様式で（すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸までコドンを変えることによって）変えることができる。そのような保存的変化は、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能における変化をより少なくする。以下は、アミノ酸の種々のグループの例である：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）（ｐＨ６．０で負に荷電した）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）（ｐＨ６．０で正に荷電した）塩基性アミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０）。別のグループは、フェニル基を有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。
【００２１】
特定の実施形態では、スペーサーは、未修飾のスペーサーにおいて存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ又は複数のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。１つ又は複数の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ又は複数のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下により詳細に記載されるこのナンバリングスキームにおいて、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列における最初のアミノ酸のように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９である。
【００２２】
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ又は複数の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。
【００２３】
特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、未修飾の領域において存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ又は複数のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域から得られる。１つ又は複数の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ又は複数のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
【００２４】
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ又は複数の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ４領域から得られ、未修飾のスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置にて上記の同定されたアミノ酸で置換される。
【００２５】
本明細書において論じられる免疫グロブリンにおけるアミノ酸の位置に対して、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームによる（参照により全内容が本願に援用される非特許文献３）。ＥＵインデックス又は非特許文献３に記載のＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（非特許文献４）。
【００２６】
様々な膜貫通ドメインを使用することができる。表２は、適した膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対するカルボキシ末端に位置する。
【００２７】
【表２】
2019500894.tif 000004
本明細書において記載されるＣＡＲのうち多くは、１つ又は複数の（例えば２つの）共刺激ドメインを含む。１つ又は複数の共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインの配列と共に適した共刺激ドメインの例を含む。
【００２８】
【表３】
2019500894.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列を描いた図である。種々のドメインが、配列の下に順番に列挙されており、交互の下線及び非下線によって示されている。成熟ＣＡＲ配列（配列番号２６）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又はトランケート型ＣＤ１９を含まない。
【図２】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列を描いた図である。種々のドメインが、配列の下に順番に列挙されており、交互の下線及び非下線によって示されている。成熟ＣＡＲ配列（配列番号２７）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又はトランケート型ＣＤ１９を含まない。
【図３】ＨＥＲ２特異的ＣＡＲのコンストラクト及びＣＡＲ  Ｔ細胞増殖データを描いた図である。
【図４】乳癌細胞株に対するＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏの特徴づけを描いた図である。
【図５】ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏの腫瘍活性に対する研究の結果を描いた図である。
【図６】局所腫瘍内送達されたＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの抗腫瘍有効性に対する研究の結果を描いた図である。
【図７】ヒト同所性ＢＢＭ異種移植モデルにおけるＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所送達に対する研究の結果を描いた図である。
【図８】ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の脳室内送達に対する研究の結果を描いた図である。
【図９】ＨＥＲ２を標的にするさらなるＣＡＲを描いた図である。
【図１０】ＨＥＲ２を標的にするさらなるＣＡＲを描いた図である。
【図１１】ＨＥＲ２を標的にするさらなるＣＡＲを描いた図である。
【図１２】ＨＥＲ２を標的にするさらなるＣＡＲを描いた図である。
【図１３】ＨＥＲ２を標的にするさらなるＣＡＲを描いた図である。
【図１４】ＨＥＲ２を標的にするさらなるＣＡＲを描いた図である。
【図１５】種々のスペーサーを有する特定のさらなるＣＡＲを特徴づける研究の結果を描いた図である。ＩｇＧ３（ＥＱ）は図２にあり；ＤｅｌｔａＣｈ２は図１１にあり；ＣＤ８ｈは図９にあり；ＨＬは図１０にあり；Ｌは図１４にある。
【図１６】種々のＣＡＡＲを発現するＴＣＭが、ＨＥＲ２の発現がない細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲ）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＬＯ）又はＨＥＲ２の発現が多い細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＨＩ）に曝露される場合に産生されるＣＤ１０７ａ及びＩＮＦガンマを検査する研究の結果を示した図である。
【図１７】図２のＣＡＲ（ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζ）又は図１４のＣＡＲ（ＨＥＲ２（Ｌ）ＢＢζ）を用いた種々の細胞株におけるＰＤ−１の生成及び腫瘍細胞の死滅を検査する研究の結果を示した図である。
【図１８】種々のＣＡＡＲを発現するＴＣＭが、ＨＥＲ２の発現がない細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲ）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＬＯ）又はＨＥＲ２の発現が多い細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＨＩ）に曝露される場合に産生されるＣＤ１０７ａ及びＩＮＦガンマを検査する研究の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に記載されるのは、ＨＥＲ２を標的とし、ＨＥＲ２発現乳癌並びに乳房から脳への転移を治療することに有用な種々のキメラ抗原受容体の構造、構築及び特徴づけである。重要なことに、本明細書において記載されるＣＡＲをＡＣＴにおいて使用して、脳室内又は腫瘍内送達によって、脳におけるＨＥＲ２発現腫瘍を治療することができる。
【００３１】
キメラ抗原（ＣＡＲ）は、最低でも細胞外認識ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。従って、「抗原」という用語は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子に限定される。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含み得る。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単に細胞外認識ドメインが含有する認識要素とも呼ばれる）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、任意選択で、１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣの制限とは無関係に、抗原に結合することも、Ｔ細胞活性化を伝達することもできる。従って、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型に無関係に、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療することができる「普遍的な」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を使用した養子免疫療法は、癌の治療のための強力な治療戦略となり得る。
【００３２】
場合によっては、本明細書において記載されるＣＡＲはベクターを使用して作製することができ、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及びトランケート型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続き、細胞質シグナル伝達テールを欠いている（アミノ酸３２３でトランケートされている）。この構成では、ＣＤ１９ｔの同時発現が、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にし、さらに、遺伝子改変細胞のポジティブ選択を可能にする不活性で非免疫原性の表面マーカーを提供するだけでなく、効率的な細胞トラッキング及び／又は養子移植に続くｉｎ  ｖｉｖｏでの治療用Ｔ細胞のイメージングも提供する。ＣＤ１９ｔの同時発現は、治療用細胞を選択的に除去し、その結果、自殺スイッチとして機能する免疫毒素試薬及び／又は臨床的に利用可能な抗体を使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏでの形質導入された細胞の免疫学的標的化のためのマーカーを提供する。
【００３３】
本明細書において記載されるＣＡＲは、当技術分野において既知のいかなる手段によっても作製することができるが、好ましくは、組換えＤＮＡ技術を使用して作製される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、簡便な当技術分野において既知の標準的な分子クローニングの技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー支援によるライゲーション、部位特異的変異誘発等）によって完全なコード配列に調製及び構築することができる。結果として生じるコード領域は、好ましくは、発現ベクター内に挿入され、適した発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
【００３４】
選択されていないＰＢＭＣ若しくは濃縮されたＣＤ３のＴ細胞、又は、濃縮されたＣＤ３若しくはメモリーＴ細胞のサブセット又はＴＣＭ若しくはＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎを含む、患者から単離された種々のＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現のためのベクターを用いて形質導入することができる。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞のサブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を濃縮することによって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞のために濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて活性化させ、例えばＳＩＮレンチウイルスベクターを用いて形質導入することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出に対してもあり得るｅｘ  ｖｉｖｏでの選択に対しても非免疫原性の表面マーカーであるトランケート型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）並びにＣＡＲの発現を導く。活性化／遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やすことができ、次に、凍結保存することができる。
【実施例１】
【００３５】
２つのＨＥＲ２−ＣＡＲの構造
本明細書において記載されるＨＥＲ２  ｓｃＦｖを含む１つのＣＡＲは、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔと呼ばれる。このＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；Ｆｅ受容体（ＦｃＲｓ）による結合を減らす様式でＣＨ２領域内の２つの部位（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）にて突然変異されたＩｇＧ４  Ｆｅ領域；ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ξ活性化ドメインを含む様々な重要な特徴を含む。図１は、このＣＡＲのアミノ酸配列を示しており、ＣＡＲ発現をモニターするために使用されるトランケート型ＣＤＩ９配列の配列、及び、トランケート型ＣＤＩ９配列の融合なしでＣＡＲが作製されるのを可能にするＴ２Ａリボソームスキップ配列を含む。図２において示されているように、未成熟ＣＡＲは：ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ、スペーサーとして作用するＩｇＧ４、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＬＬからＧＧへの配列変化を含む４−ＩＢＢ共刺激ドメイン、Ｇｌｙ３つの配列、ＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。転写物も、ＣＡＲタンパク質配列の一部ではないＴ２Ａリボソーム配列及びトランケート型ＣＤＩ９配列をコードする。成熟ＣＡＲは、未成熟ＣＡＲと同一であるが、ＧＭＣＳＦシグナルペプチドを欠いている。
【実施例２】
【００３６】
ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現に使用されるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｅｐＨＩＶ７ベクターは、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲの発現に使用することができるベクターであり、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦＩプロモーターを使用してＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５´配列も３´配列も、ＨＸＢｃ２プロウイルスから以前に得たｐｖ６５３ＲＳＮから得た。ポリプリン区域ＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）を、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ由来のＨＩＶ−Ｉ株ｐＮＬ４−３から得た。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載されている。
【００３７】
ｐＨＩＶ７の構築を以下のように行った。手短に言えば、介在性ＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を有するｇａｇ−ｐｏｌ＋５´及び３´の末端反復配列（ＬＴＲｓ）由来の６５３ｂｐを含有するｐｖ６５３ＲＳＮを、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。ステップ１では、５´ＬＴＲからＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）の配列が、ｐ５´ＨＩＶ−Ｉ  ５Ｉを作製し、次に、５´ＬＴＲを、ＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変し、第一にＣＭＶエンハンサーに連結させ、次に、複製のＳＶ４０開始点に連結させた（ｐ５´ＨＩＶ−２）。ステップ２では、３´ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３´ＨＩＶ−１を作製した後、３´ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行って、ＨＩＶ  Ｕ３におけるシス制御要素を除去し、ｐ３´ＨＩＶ−２を形成した。ステップ３では、ｐ５´ＨＩＶ−３及びｐ３´ＨＩＶ−２から単離したフラグメントを連結させて、ｐＨＩＶ−３を作製した。ステップ４では、ｐ３´ＨＩＶ−３を生成するために余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによりｐ３´ＨＩＶ−２をさらに改変し、ＷＰＲＥを含有する６００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐ３´ＨＩＶ−３に添加して、ｐ３´ＨＩＶ−４を作製した。ステップ５では、ｐＨＩＶ−３  ＲＲＥのサイズをＰＣＲによって減らし、ｐＨＩＶ−３由来の５´フラグメント（図示せず）及びｐ３´ＨＩＶ−４に連結させて、ｐＨＩＶ−６を作製した。ステップ６では、ＨＩＶ−Ｉ  ｐＮＬ４−３（５５）由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＮＬ４−３から増幅させ、ｐＨＩＶ６におけるＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置してｐＨＩＶ−７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７−ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を使用して、４−プラスミド系を使用して親ベクターをパッケージングした。
【００３８】
パッケージングシグナルｐｓｉ（ψ）は、ベクター内へのウイルスゲノムの効率的なパッケージングに要求される。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の運搬及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入の効率を高めると実証されてきた。
【００３９】
ウイルスベクターの作製に要求されるヘルパー機能は、３つの別々のプラスミドに分けられ、組換えを介した複製可能なレンチウイルスの生成の可能性を減少させる：ｌ）ｐＣｇｐは、ウイルスベクター構築に要求されるｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの運搬に寄与するＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする；及び、３）ｐＣＭＶ−Ｇは、ウイルスベクターの感染力に要求される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。
【００４０】
ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性の領域には約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域が含まれ、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列内；３種全てのヘルパープラスミドのＣＭＶプロモーター配列内；及び、ヘルパープラスミドｐＣｇｐのＲＲＥ配列内；に位置する。これらの領域における相同性のために複製可能な組換えウイルスを生成することができる見込みは、多数の組換え事象を要求するため、極めて低い。加えて、いかなる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製に要求されるｔａｔ配列及び機能的ＬＴＲを欠いているであろう。
【００４１】
ＣＭＶプロモーターをＥＦｌα−ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦＩｐ）に置き換え、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦｌｐは５６３ｂｐを有し、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを使用してｅｐＨＩＶ７内に導入した。
【００４２】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、且つ、標的細胞の増殖性感染に要求されるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれてきた。加えて、ベクター構築物は、インタクトな３´ＬＴＲプロモーターを含有しないため、結果として生じる標的とされた細胞における発現され且つ逆転写されたＤＮＡプロウイルスゲノムは、不活性ＬＴＲを有することになる。この設計の結果として、ＨＩＶ−Ｉ由来配列はプロウイルスから転写されることはなく、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されることになる。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図していない活性化の可能性を有意に減らすと予想される。
【実施例３】
【００４３】
患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターの作製
患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターは、以下のように調製することができる。ＣＡＲ、及び、任意選択でトランケート型ＣＤ１９；２）ｐＣｇｐ；３）ｐＣＭＶ−Ｇ；及び４）ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２等のマーカーを発現する各プラスミドに対して、種子バンクが生成され、種子バンクは、発酵槽を播種して十分な量のプラスミドＤＮＡを生じるために使用される。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの作製におけるその使用に先立ち、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
【００４４】
手短に言えば、細胞は、無菌性及びウイルス汚染の欠如を確認するために試験された２９３Ｔワーキングセル（ＷＣＢ）から増やされる。２９３Ｔ  ＷＣＢ由来の２９３Ｔ細胞のバイアルが解凍させられる。十分な数の細胞が存在して、ベクター作製及び細胞トレイン維持のために適切な数の１０層のセルファクトリー（ＣＦｓ）を蒔くまで、細胞は成長させられ、増やされる。単一の細胞トレインを、作製のために使用することができる。
【００４５】
レンチウイルスベクターは、１０ＣＦまでのサブバッチで作製される。２つのサブバッチを同じ週に作製することができ、１週あたり約２０Ｌのレンチウイルス上清を作製することができる。全てのサブバッチから作製された材料は、製品のロットを作製するために、下流の処理段階の間にプールされる。２９３Ｔ細胞は、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ）内のＣＦ中に蒔かれる。ファクトリーは、３７℃のインキュベーター内に置かれ、ＣＦの層全てに細胞を均一に分布させるため水平にされる。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｈ、２Ｘ  ＨＢＳ及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＱ４法を使用して、細胞に上記の４つのレンチウイルスプラスミドが遺伝子導入される。遺伝子導入の３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清が回収、精製及び濃縮される。上清がＣＦから除去された後、エンド・オブ・プロダクション細胞が各ＣＦから回収される。細胞は、各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離によって回収される。細胞は、凍結培地に再懸濁され、凍結保存される。これらの細胞は、後に、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）の試験に使用される。
【００４６】
ベクターを精製し且つ製剤化するために、未精製の上清が、膜ろ過法によって浄化されて細胞片が除去される。宿主細胞のＤＮＡ及び残存プラスミドのＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによる消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））によって分解される。ウイルス上清は、０．４５μｍのフィルターを使用して細胞片が除去され浄化される。浄化された上清は、予め重さが量られた容器内に回収され、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）が添加される（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残存プラスミドのＤＮＡ及び宿主ゲノムのＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼによる消化が、３７℃で６時間行われる。エンドヌクレアーゼ処理された上清の最初のタンジェンシャルフローウルトラフィルトレーション（ＴＦＦ）濃縮が、ウイルスを２０倍まで濃縮しながら、未精製の上清から残存の低分子量成分を除去するために使用される。浄化されたエンドヌクレアーゼ処理されたウイルス上清は、流動速度を最大にしながら、剪断速度を４，０００秒−１以下に維持するように設計された流速で５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有するホローファイバーカートリッジを循環させられる。ヌクレアーゼで処理された上清のダイアフィルトレーションが、カートリッジの性能を持続させるために濃縮プロセスの間に開始される。８０％の透過置換速度（ｐｅｒｍｅａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｒａｔｅ）が、ダイアフィルトレーションバッファーとしてＰＢＳ中４％ラクトースを使用して確立される。ウイルス上清は、未精製の上清の２０倍の濃度を表す目標量までもたらされ、さらに、ダイアフィルトレーションは、１００％の透過置換速度で、４つの追加の交換量に対して続けられる。
【００４７】
ウイルス産物のさらなる濃縮が、高速遠心分離技術を使用することによって達成される。レンチウイルスの各サブバッチは、６℃で１６〜２０時間、６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）でＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６ｐｌｕｓ遠心機を使用してペレット状にされる。次に、各サブバッチからのウイルスペレットは、ＰＢＳ中４％ラクトースを有する５０ｍＬの量で再構成される。このバッファー中の再構成されたペレットは、ウイルス調製に対する最終製剤を表す。ベクター濃縮プロセス全体によって、約２００分の１まで体積が減少する。サブバッチ全ての完了に続いて、材料が−８０℃に置かれ、各サブバッチからの試料は、無菌性について試験される。試料の無菌性の確認に続いて、サブバッチは、頻繁に攪拌されながら３７℃で急速に解凍される。次に、この材料はプールされ、クラスＩＩタイプＡ／Ｂ３バイオセイフティーキャビネットに手動で分注される。無菌のＵＳＰクラス６、雄ネジが切られた０リングクライオバイアルにおいて１ｍＬの濃縮されたレンチウイルスの充填構成が使用される。
【００４８】
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残存宿主のＤＮＡ混入物及び残存宿主及びプラスミドのＤＮＡの導入が試験される。いくつかある試験の中で特に、正しいベクターが存在していることを確実にするために、ベクター同一性がＲＴ−ＰＣＲによって評価される。
【実施例４】
【００４９】
ＡＣＴにおける使用に適したＴ細胞の調製
ＴＣＭがＣＡＲを発現するために使用されることになる場合、適した患者細胞を以下のように調製することができる。第一に、Ｔリンパ球が、白血球フェレーシスによって患者から得られ、さらに、適切な同種又は自己Ｔ細胞のサブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）が、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、次に、抗癌療法を達成するために、任意の臨床的に許容可能な手段によって患者に投与され戻される。
【００５０】
適したＴｃＭは以下のように生成することができる。同意した研究参加者から得られたアフェレーシス生成物が、フィコール処理され（ｆｉｃｏｌｌｅｄ）、洗浄され、一晩インキュベートされる。次に、ＧＭＰグレードの抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を使用して、細胞から単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞の集団が枯渇される。枯渇に続いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置上でＤＲＥＧ５６−ビオチン（ＣＯＨ臨床グレード）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、陰性画分細胞（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ）が、ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ細胞に対して濃縮される。
【００５１】
濃縮に続いて、ＴＣＭ細胞は、完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５＋５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５中に配合され、Ｔｅｆｌｏｎ細胞培養バッグに移され、そこで細胞は、Ｄｙｎａｌ  ＣｌｉｎＥｘ（商標）Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激される。刺激の５日後までに、細胞は、１．０から０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で所望のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで形質導入される。培養は、細胞増殖に要求される完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ−２及びＩＬ−１５サイトカインが添加されながら（３ｘ１０５から２ｘ１０６生細胞／ｍＬの細胞密度、及び、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日のサイトカイン補給を保ち）、４２日間まで維持される。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９の細胞まで増やされる。培養期間の終わりに、細胞は収集され、２回洗浄され、臨床グレードの凍結保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ  ＣＳ５、ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中に配合される。
【００５２】
Ｔ細胞注入の日（一日又は複数日）に、凍結保存され放出された生成物が解凍され、洗浄され、再注入のために製剤化される。放出される細胞生成物を含有する凍結保存されたバイアルは、液体窒素貯蔵から取り出され、解凍され、冷却され、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄される。遠心分離後、上清が除去され、細胞は、防腐剤無添加生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈剤に再懸濁される。試料が、品質管理試験のために取り除かれる。
【実施例５】
【００５３】
ＨＥＲ２を標的とするＣＡＲの発現
図３Ａは、図１及び図２において描かれている２つのＨＥＲ２特異的ＣＡＲ構築物の概略図である。ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξにおいて、ｓｃＦｖは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び細胞溶解性ＣＤ３ξドメインを含有する改変ＩｇＧ４Ｆｃリンカー（二重変異体、Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）によって膜に繋ぎ止められる。Ｔ２Ａスキップ配列は、細胞トラッキングのために利用されるトランケート型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξは、共刺激ドメインがＣＤ２８ではなく４−１ＢＢであること、及び、膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメインではなくＣＤ８膜貫通ドメインであることを除いて類似している。ヒトセントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで遺伝子導入した。図３Ｂは、ヒトＴＣＭ表面表現型の代表的なＦＡＣＳデータを描いている。図３Ｃは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで遺伝子導入されたＴＣＭにおけるＣＤ１９及びタンパク質Ｌの発現に対するアッセイの結果を描いている。これらの結果からわかるように、ＣＤ１９の発現によって評価された導入効率は、両方のＣＡＲに対して類似していた。しかし、タンパク質Ｌの発現は、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξよりもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξにおいて低く、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲは、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξよりも安定性が低いことを示唆している。細胞増殖の分析（図３Ｄ）が、いずれのＣＡＲもＴ細胞増殖に干渉しないことを示している。
【実施例６】
【００５４】
種々の乳癌細胞株に対するＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴づけ
ＨＥＲ２陰性細胞株（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、２３１ＢＲ）及び高ＨＥＲ２発現細胞株（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）を含む様々な乳癌細胞株を使用して、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξを特徴づけた。図４Ａは、これらの細胞株のそれぞれのＨＥＲ２発現レベルを描いている。フローサイトメトリー（ＣＡＲ＋Ｔ細胞にゲートのある）を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍細胞との（低ＨＥＲ２発現）、又は、ＢＢＭ１腫瘍細胞（高いＨＥＲ２発現）との５時間の共培養に続くＭｏｃｋ（形質導入されていない）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮｙの産生を特徴づけた。この分析の結果が、図４Ｂにおいて示されている。類似の研究を、他の乳癌細胞株を用いて行い、その結果が図４Ｃにおいて要約されている。組換えＨＥＲ２タンパク質又は腫瘍標的を用いた２４時間の培養に続くＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγの生成を、ＥＬＩＳＡによって測定し、この分析の結果が図４Ｄにおいて示されている。
【実施例７】
【００５５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性
フローサイトメトリーを使用して、Ｍｏｃｋ（形質導入されていない）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍標的との７２時間の共培養に続く腫瘍細胞死滅を評価した。この分析の結果は、図５Ａに示されている。ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＨＥＲ２陽性ＢＢＭ１細胞との７２時間の共培養後の全ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１及びＬＡＧ−３誘導を測定し、この分析の結果は、図５Ｂに示されている。ＨＥＲ２陰性（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、２３１ＢＲ）又は高ＨＥＲ２発現（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）である腫瘍標的との７２時間の共培養に続くＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１誘導を測定し、この分析の結果は、図５Ｃに示されている。これらの研究は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξが、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξよりも低いＰＤ−１誘導を引き起こすことを示唆している。０．２５：１から２：１に及ぶエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比を有する腫瘍細胞死滅を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξＣＡＲ  Ｔ細胞又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ  Ｔ細胞両方に対して測定した。この分析の結果は、図５Ｄに示されており、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞死滅において効果的であるということが示されている。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＢＢＭＩ細胞との７２時間の共培養に続くＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖を、フローサイトメトリーによって測定した。この分析の結果は、図５Ｅに示されており、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ  Ｔ細胞はＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξＣＡＲ  Ｔ細胞よりも増殖するということが示されている。
【実施例８】
【００５６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性
腫瘍内に送達されたＨＥＲ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を、患者由来の乳房から脳への転移モデルにおいて評価した。図６Ａ〜６Ｃは、腫瘍のＨ＆Ｅ染色である。マウスを、Ｍｏｃｋ（形質導入されていない）又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ  Ｔ細胞で腫瘍内への直接の注入により処置した。図６Ｄ〜６Ｆは、腫瘍の光学イメージングの結果を描いており、図６Ｇ〜６Ｉは、腫瘍注入後３日、８日又は１４日に局所的に処置したマウスに対するカプラン・マイヤー生存曲線である。これらの研究は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍に直接注入された場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍効力を有することを示している。
【００５７】
乳房から脳への転移のヒト異種移植モデルにおける抗腫瘍効力を評価するために、ＢＢＭ１細胞（０．２Ｍ）又はＢＴ４７４（０．１５Ｍ）をＮＳＧマウスにおいて頭蓋内に注入した。腫瘍注射後８日に、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ又はＭｏｃｋ（形質導入されていない）のＴ細胞（ＩＭ）を、腫瘍内に注入した。ＢＢＭＩ（図７Ａ）及びＢＴ４７４（図７Ｂ）の腫瘍を、ルシフェラーゼに基づく光学イメージングによってモニターした。カプラン・マイヤー曲線が、図７Ｃ及び図７Ｄに示されている。
【００５８】
乳癌から脳への転移のヒト患者由来の同所性異種移植モデルも使用して、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのＣＡＲ  Ｔ細胞を評価した。図８Ａは、ＢＢＭ  １細胞（０．２Ｍ）の定位的注入による腫瘍注入の領域、及び、脳心室内Ｔ細胞送達を例示している。腫瘍の染色が、図８Ｂにおいて描かれている。腫瘍注入後１４日に、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ又はＭｏｃｋ（形質導入されていない）のＴ細胞（０．５Ｍ）を、腫瘍内注入した。腫瘍成長を、ルシフェラーゼに基づく光学イメージングによってモニターした。図８Ｃは、各処置群に対する流束の平均（ｆｌｕｘ  ａｖｅｒａｇｅｓ）を示し、図８Ｄは、各処置群に対するカプラン・マイヤー生存曲線を示している。
【実施例９】
【００５９】
ＨＥＲ２を標的としたさらなるＣＡＲ
図９〜１４は、異なるリンカーを有する種々のＣＡＲのアミノ酸配列を描いている。具体的には、ＣＡＲは、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間の部分の配列及び長さが異なる。膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８又はＣＤ２８ｇｇである。共刺激ドメインは、４−１ＢＢ又はＣＤ２８である。全てがＣＤ３ζ刺激ドメインを有する。いずれの場合にも、Ｔ２Ａスキップ配列が、細胞トラッキングのために利用されるトランケート型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。
【００６０】
図１５Ａは、ＨＥＲ２  ｓｃＦｖとＣＤ８膜貫通ドメインとの間の部分の配列及び長さを除いて同一である種々のＨＥＲ２  ＣＡＲを概略的に描いている。全てが、４−１ＢＢ共刺激ドメインとそれに続くＣＤ３ζ刺激ドメインを含む。図１５Ｂは、示されたＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで遺伝子導入されたＴＣＭにおけるＣＤ１９及びタンパク質Ｌの発現に対するアッセイの結果を描いている。これらの結果からわかるように、ＣＤ１９の発現によって評価した導入効率は、両方のＣＡＲに対して類似していた。しかし、タンパク質Ｌの発現は、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζよりもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζにおいて低く、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲは、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζよりも安定性が低いことを示唆している。細胞増殖の分析（図１５Ｃ）が、ＣＡＲのいずれもＴ細胞増殖に干渉しないことを示している。図１６〜１８は、さらなる研究の結果を示しており、非常に短いスペーサーを有するＣＡＲ（図１４）高レベルのＨＥＲ２を発現するＣＡＲに対して比較的選択的であることを示している。そのようなＣＡＲは、癌性細胞よりも低いレベルのＨＥＲ２を発現する細胞を残すことが望ましいＨＥＲ２発現癌の治療において有用であり得る。
【図１】
2019500894.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
2019500894000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月5日(2018.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2019500894.tif 000024
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2019500894.tif 000025
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2019500894.tif 000026
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2019500894.tif 000027
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2019500894.tif 000028
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2019500894.tif 000029
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１５】
2019500894.tif 000030
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１６】
2019500894.tif 000031
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
2019500894.tif 000032
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2019500894.tif 000033
【国際調査報告】
2019500894.tif 000034
2019500894.tif 000035
2019500894.tif 000036
2019500894.tif 000037
2019500894.tif 000038