(57)【要約】  本発明は、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位とを有する、二重特異性分子（例えば、ダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合性分子等）（即ち、「ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子」）を対象とする。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、特に上記分子がヒト細胞表面上に配列されている場合に、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる。本発明は、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患又は状態の治療における上述の二重特異性分子の使用を伴う方法を対象とする。本発明はまた、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いて免疫応答を刺激する方法に関する。【選択図】図１８
2019506444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ‐１の１つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ又は複数のエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４の１つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ又は複数のエピトープ結合部位との両方を有する、二重特異性分子であって、
前記分子は：
（Ａ）ＰＤ‐１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン；並びに
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を備え、
ここで前記分子は：
（ｉ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；又は
（ｉｉ）３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子
である、二重特異性分子。
【請求項２】
前記分子は、一方がＰＤ‐１に結合する前記抗体の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインを有し、もう一方がＣＴＬＡ‐４に結合する前記抗体の前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインを有する、２つの単一特異性分子によって呈される活性に対して、増強された活性を呈する、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項３】
前記分子は、前記分子の投与を必要とする被検体に投与した場合に、ＣＴＬＡ‐４に結合する単一特異性抗体の投与によって誘発される免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）よりも少ないｉｒＡＥを誘発する、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
【請求項４】
前記分子はＦｃ領域を備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項５】
前記Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域であって：
（Ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾；及び／又は
（Ｂ）前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を備える、変異型Ｆｃ領域である、請求項４に記載の二重特異性分子。
【請求項６】
ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する前記修飾は、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（前記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である）の置換を含む、請求項５に記載の二重特異性分子。
【請求項７】
前記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる前記修飾は、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ（前記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である）の置換を含む、請求項５又は６に記載の二重特異性分子。
【請求項８】
前記分子は前記ダイアボディであり、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項９】
前記分子は前記３価結合性分子であり、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の二重特異性分子の実施形態に関する。
【請求項１０】
前記分子は、前記細胞表面上に存在するＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に結合できる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１１】
前記分子は、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に同時に結合できる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１２】
前記分子は、免疫細胞の刺激を促進する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１３】
前記免疫細胞の刺激は：
（Ａ）免疫細胞増殖；並びに／又は
（Ｂ）免疫細胞産生及び／若しくは少なくとも１つのサイトカインの放出；並びに／又は
（Ｃ）免疫細胞産生及び／若しくは少なくとも１つの溶解性分子の放出；並びに／又は
（Ｄ）少なくとも１つの活性化マーカの、免疫細胞発現
をもたらす、請求項１２に記載の二重特異性分子。
【請求項１４】
前記免疫細胞はＴリンパ球又はＮＫ細胞である、請求項１２又は１３に記載の二重特異性分子。
【請求項１５】
ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる前記エピトープ結合部位は：
（Ａ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号４７）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号４８）；又は
（Ｂ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン（配列番号４９）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン（配列番号５０）；又は
（Ｃ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号５１）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号５２）；又は
（Ｄ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメイン（配列番号５３）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメイン（配列番号５４）；又は
（Ｅ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメイン（配列番号５５）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメイン（配列番号５６）；又は
（Ｆ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン（配列番号５８）；又は
（Ｇ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨのＶＨドメイン（配列番号８６）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬのＶＬドメイン（配列番号８７）；又は
（Ｈ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメイン（配列番号５９）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメイン（配列番号６０）；又は
（Ｉ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメイン（配列番号６１）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメイン（配列番号６２）
を備える、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１６】
ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ以上の前記エピトープ結合部位は：
（Ａ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号７６）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号７７）；又は
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン（配列番号７８）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン（配列番号７９）；又は
（Ｃ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）
を備える、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１７】
（Ａ）ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる前記エピトープ結合部位が、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨのＶＨドメイン（配列番号８６）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱのＶＬドメイン（配列番号８７）を備え；
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ以上の前記エピトープ結合部位が、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）を備える、請求項１６に記載の二重特異性分子。
【請求項１８】
前記分子は：
（Ａ）配列番号９５を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号９６を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｂ）配列番号９７を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号９８を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｃ）配列番号９９を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１００を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｄ）配列番号１０２を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０３を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｅ）配列番号１０１を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１００を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｆ）配列番号１０４を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０５を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０６を有する１つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０７を有する１つのポリペプチド鎖；又は
（Ｇ）配列番号１０８を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０５を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０９を有する１つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０７を有する１つのポリペプチド鎖
を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項１９】
有効量の、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性分子のうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
前記分子は、免疫仲介性応答の刺激を必要とする被検体の免疫仲介性応答の刺激を促進するために使用される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項２１】
前記分子は、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態の治療に使用される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の二重特異性分子。
【請求項２２】
前記疾患又は状態は、癌又は感染症である、請求項２１に記載の二重特異性分子。
【請求項２３】
前記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌；白血病；脂肪腫／良性リポソーム腫瘍；脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍；肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項２２に記載の二重特異性分子。
【請求項２４】
前記感染症は、バクテリア性、菌類性、ウイルス性及び寄生虫性病原体の存在を特徴とする、請求項２２に記載の二重特異性分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／２６６，９４４号（２０１５年１２月１４日出願；係属中）の一部継続出願であり、また上記特許出願に対する優先権を主張するものであり、上記出願はその全体が本出願に援用される。
【０００２】
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１３４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１６年１２月４日作成、サイズ：１８６，０４０バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位とを有する、二重特異性分子（例えば、ダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合性分子等）（即ち、「ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子」）を対象とする。本発明は、ＰＤ‐１の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位とを有する、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関する。本発明はまた、イムノグロブリンＦｃ領域を更に備える、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を対象とする。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、特に上記分子がヒト細胞表面上に配列されている場合に、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる。本発明は、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患又は状態の治療における上述の二重特異性分子の使用を伴う方法を対象とする。本発明はまた、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いて免疫応答を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｉ．癌に対する免疫系応答
哺乳類の免疫系は、癌細胞を認識して排除する体制を自然に取っている（非特許文献１）。健康な個体では、免疫系は静止状態であり、多様な阻害性受容体及びリガンドによって阻害される。このような免疫「チェックポイント（checkpoint）」経路は、自己寛容性を維持する（即ち被検体が自身の細胞に対する免疫系の攻撃を発生させること（「自己免疫（autoimmune）応答」）を防止する）にあたって、及び抗菌又は抗アレルギ性免疫応答中の付帯的な組織損傷を制限するにあたって、重要である。癌抗原の認識、微生物病原体の検出又はアレルゲンの存在が発生すると、活性化受容体及びリガンドのアレイは、免疫系の活性化を誘発する。このような活性化は、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化につながり、様々なサイトカインの放出を促進し、これらのサイトカインは全て、被検体の健康に対する知覚された脅威に対抗するよう作用する（非特許文献２、３、４）。免疫系は、相殺阻害性免疫シグナルが活性化免疫シグナルよりも大きい場合に、その正常な静止状態に戻ることができる。
【０００５】
よって、癌の疾患状態（及び実際には感染性疾患の疾患状態）は、被検体の免疫系の十分な活性化の失敗を反映したものであると考えることができる。このような失敗は、活性化免疫シグナルの不十分な提示を反映したものであってよく、又は被検体における阻害性免疫シグナルを軽減する能力が不十分であることを反映したものであってよい。いくつかの例では、研究者により、癌細胞が免疫系を組み込むことによって、上記免疫系に検出されるのを避けることができることが判明した（非特許文献１）。
【０００６】
特に重要なのは、抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドとＣＤ４+Ｔリンパ球のＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４受容体との間の結合である（非特許文献５、２、６）。ＣＤ２８に対するＢ７．１及びＢ７．２の結合は、Ｔ細胞活性化を刺激し、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７．１及びＢ７．２の結合は上記活性化を阻害する（非特許文献２、６、７）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上で恒常的に発現され（非特許文献８）、一方ＣＴＬＡ‐４発現は、Ｔ細胞活性化に続いて迅速に上方制御される（非特許文献９）。ＣＴＬＡ‐４は高親和性受容体である（非特許文献５、１）ため、結合はまず（ＣＤ２８によって）Ｔ細胞増殖を開始させ、その後これを（ＣＴＬＡ‐４の初期発現によって）阻害することにより、増殖がこれ以上必要でない場合にその効果を減衰させる。
【０００７】
ＩＩ．ＣＴＬＡ‐４
細胞傷害性Ｔ‐リンパ球関連タンパク質‐４（ＣＴＬＡ‐４；ＣＤ１５２）は、ジスルフィド結合ホモ二量体を形成するシングルパスＩ型膜タンパク質である（非特許文献１０）。異なるアイソフォームをエンコードする複数の選択スプライス変異体が特性決定されており、これはモノマーとして機能する可溶性アイソフォームを含む（非特許文献１１、１２）。
【０００８】
ＣＴＬＡ‐４は主に、細胞表面への輸送の制限及び迅速な内在化によって表面発現が厳密に調節される、細胞内抗原であり（非特許文献１３、９）、Ｔ調節細胞上で恒常的に発現される（非特許文献１４）。
【０００９】
ＣＴＬＡ‐４の細胞外領域は、単一の細胞外Ｉｇ（Ｖ）ドメインと、これに続く膜貫通（ＴＭ）領域及び小さな細胞内細胞尾部（３７アミノ酸）とを含む。細胞内尾部は、２つのチロシン系モチーフを内包し、これらは、脂質キナーゼポリホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスファターゼＳＨＰ‐２及びＰＰＡ、並びにクラスリンアダプタタンパク質ＡＰ‐１及びＡＰ‐２を含む複数の細胞内タンパク質と相互作用する（非特許文献１５）。ＣＴＬＡ‐４はＣＤ２８に関連し、これら２つのタンパク質は、アミノ酸レベルにおいておよそ２９％の同一性を有する（非特許文献１６）。
【００１０】
ナイーブＴエフェクタ細胞をそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって活性化する際、ＣＴＬＡ‐４は細胞表面へと動員される（非特許文献９）。ＣＴＬＡ‐４がＴ細胞表面で発現されると、これはＣＤ８０／ＣＤ８６に関して（Ｔ細胞上で恒常的に発現される）ＣＤ２８と競合することにより、ＴＣＲによる更なるシグナリングを切断して、ＴＣＲシグナリングによるいずれの更なるＴ細胞応答を下方制御する（非特許文献１７、１８）。よってＣＴＬＡ‐４は、エフェクタ機能を低下させて、Ｔ細胞応答の効力及び持続時間を規定する、Ｔエフェクタ細胞活性化の負の調節因子として作用する（非特許文献９）。
【００１１】
更に、ＣＴＬＡ‐４は、癌に対する免疫応答に対する、調節Ｔ細胞の負の影響を増強する役割を果たすことができる（非特許文献１９）。ＣＴＬＡ‐４は、ＣＤ２８に対してよりもＢ７ファミリーのメンバーに対してはるかに高い親和性を有するため、Ｔ細胞上での発現により、Ｔ細胞の、優勢である負の調節を規定する（非特許文献２０）。ＣＴＬＡ‐４がＴ調節細胞の抑制因子としての機能に寄与する機序は、完全には理解されていないが、Ｔ調節細胞上でのＣＴＬＡ‐４の発現は、これらの細胞の抑制機能を増強する（非特許文献１９）。
【００１２】
ＣＴＬＡ‐４のブロックは、インビトロ（非特許文献２１）及びインビボ（非特許文献２２）でのＴ細胞応答を増強すること、及び抗腫瘍免疫を増大させること（非特許文献２３）が報告されている。よって、癌及び感染性疾患の治療のため等に免疫刺激が有益であり得る疾患、特にヒト疾患のための、新規の治療を提供するために、抗ＣＴＬＡ‐４抗体を用いたＣＴＬＡ‐４のブロックが提案されている（非特許文献２３及び特許文献１、２を参照）。ＣＴＬＡ‐４機能のブロッカーの開発は、イピリムマブ（例えば非特許文献２４を参照）及びトレメリムマブ（非特許文献２５）といったモノクローナル抗体の使用に焦点を当ててきた。
【００１３】
ＩＩＩ．プログラム死‐１（「ＰＤ‐１」）
プログラム死‐１（「ＰＤ‐１」、「ＣＤ２７９」としても公知）は、免疫応答を幅広く下方制御するＴ細胞制御因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ‐４ファミリーの、およそ３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（非特許文献２６、特許文献３〜１１）。
【００１４】
ＰＤ‐１系の受容体‐リガンド相互作用は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ‐４系のものよりもはるかに複雑なものと思われる。ＰＤ‐１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び単球上で（非特許文献２７、２８）、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞中において低レベルで（非特許文献２９、３０）、発現する。
【００１５】
ＰＤ‐１の細胞外領域は、ＣＴＬＡ‐４の同等のドメインに対して２３％の同一性を有する単一免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｖドメインで構成される（非特許文献３０）。細胞外ＩｇＶドメインには、膜透過性領域及び細胞内テールが続く。細胞内テールは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ内に位置する２つのリン酸化部位を含有し、これは、ＰＤ‐１がＴＣＲシグナルを下方制御することを示唆している（非特許文献２６、３１）。
【００１６】
ＰＤ‐１は、Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣ（ＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２として公知、非特許文献３２、特許文献１２〜１９）への結合によって、免疫系の阻害を仲介する。
【００１７】
Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣは、心臓、胎盤、筋肉、胎児の肝臓、脾臓、リンパ節及び胸腺、並びにマウスの肝臓、肺、腎臓、膵臓の島細胞及び小腸といった、多くのタイプのヒト及びマウス組織の表面上で広く発現する（非特許文献３０）。ヒトでは、Ｂ７‐Ｈ１タンパク質発現は、ヒト内皮細胞（非特許文献３３、３４、３５）、心筋（非特許文献３６）、合胞体栄養細胞（非特許文献３７）において見られた。上記分子はまた、いくつかの組織の常在性マクロファージによって、インターフェロン（ＩＦＮ）‐γ又は腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：ＴＮＦ）‐αによって活性化されたマクロファージによって（非特許文献３８）、及び腫瘍内において（非特許文献３９）も発現される。
【００１８】
Ｂ７‐Ｈ１とＰＤ‐１との間の相互作用は、Ｔ及びＢ細胞に対する重大な下方共刺激シグナル（非特許文献３０）、並びに細胞死誘導因子としての機能（非特許文献３７、４０）を提供することが分かっている。より具体的には、低濃度のＰＤ‐１受容体とＢ７‐Ｈ１リガンドとの間の相互作用は、抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を強く阻害する阻害シグナルの伝達をもたらすことが分かっており；高濃度では、ＰＤ‐１との相互作用はＴ細胞増殖を阻害しないものの、複数のサイトカインの産生を明らかに低減させる（非特許文献）。休止ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞並びに既に活性化されたＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方、更には臍帯血由来のナイーブＴ細胞による、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生は、可溶性Ｂ７‐Ｈ１‐Ｆｃ融合タンパク質によって阻害されることが分かっている（非特許文献、６）。
【００１９】
Ｔ細胞活性化及び増殖におけるＢ７‐Ｈ１及びＰＤ‐１の役割は、これらの生体分子が、炎症及び癌の治療のための治療標的として機能し得ることを示唆している。従って、感染及び腫瘍の治療並びに適応免疫応答の上方調節のための抗ＰＤ‐１抗体の使用が提案されている（特許文献２０、２１、２２、４、２３〜２８を参照）。ＰＤ‐１に特異的に結合できる抗体は、非特許文献２０及び３５によって報告されている（特許文献２９〜３７、２９、３８、２７、３９、４０、４１、２８、４２〜４６も参照）。
【００２０】
しかしながら、上述のようなこれまでのあらゆる進歩にもかかわらず、癌細胞又は病原体感染細胞を、特に比較的低い治療濃度で、及び／又は副作用が低減された状態で攻撃するよう、身体の免疫系により強力に指示できる、改良された組成物に対する需要が存在し続けている。適応免疫系は、癌及び疾患に対する強力な防護機構であり得るものの、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４の発現等の、腫瘍の微環境中の免疫抑制／回避機構によって妨げられる場合があるためである。更に、腫瘍環境において腫瘍細胞、免疫細胞及び間質細胞が発現する共阻害性分子は、癌細胞に対するＴ細胞応答を支配的に弱化させる場合がある。更に、抗ＣＴＬＡ‐４抗体の使用は、「免疫関連有害事象（immune‐related adverse event（ｉｒＡＥ））」と呼ばれる、十分に同定された副作用を誘発する。ｉｒＡＥは、大腸炎／下痢、皮膚炎、肝炎、内分泌障害及び炎症性ミオパチーが含まれる。これらの独特な副作用は、ＣＴＬＡ‐４ブロック時に免疫寛容が破壊されることによって発生することが報告されている（非特許文献４１）。従って、これらの制約を克服する療法は、非常に有益である。
【００２１】
以下で説明するように、本発明は、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を提供することにより、この需要に対処する。このような二重特異性分子は、消耗性及び寛容性腫瘍浸潤リンパ球並びに他の細胞タイプの表面上に存在する、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に結合でき、これにより、上記細胞表面分子がそのそれぞれのリガンドに応答する能力を阻害できる。従って、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ＰＤ‐１‐及びＣＴＬＡ‐４‐仲介型免疫系阻害をブロックするよう作用し、これにより、免疫系の活性化又は連続した活性化を促進する。これらの属性により、上述の二重特異性分子を、免疫系の刺激、並びに特に癌及び病原体関連疾患及び状態の治療に利用できる。本発明はこれらの目標及び他の目標を対象とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第０１／１４４２４号
【特許文献２】国際公開第００／３７５０４号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２０２１００号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０３１１１１７号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／００１１０６６７号
【特許文献６】米国特許第６，８０８，７１０号
【特許文献７】米国特許第７，１０１，５５０号
【特許文献８】米国特許第７，４８８，８０２号
【特許文献９】米国特許第７，６３５，７５７号
【特許文献１０】米国特許第７，７２２，８６８号
【特許文献１１】国際公開第０１／１４５５７号
【特許文献１２】米国特許第６，８０３，１９２号
【特許文献１３】米国特許第７，７９４，７１０号
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００５／００５９０５１号
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００９／００５５９４４号
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００９／０２７４６６６号
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００９／０３１３６８７号
【特許文献１８】国際公開第０１／３９７２２号
【特許文献１９】国際公開第０２／０８６０８３号
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【特許文献２１】米国特許公開第２０１０／００２８３３０号
【特許文献２２】米国特許公開第２００４／０２４１７４５号
【特許文献２３】米国特許公開第２００９／０２１７４０１号
【特許文献２４】米国特許第７，５２１，０５１号
【特許文献２５】米国特許第７，５６３，８６９号
【特許文献２６】米国特許第７，５９５，０４８号
【特許文献２７】国際公開第２００４／０５６８７５号
【特許文献２８】国際公開第２００８／０８３１７４号
【特許文献２９】米国特許第８，００８，４４９号
【特許文献３０】米国特許第８，５５２，１５４号
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００７／０１６６２８１
【特許文献３２】米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４８号
【特許文献３３】米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４９号
【特許文献３４】米国特許出願公開第２０１３／００１７１９９号
【特許文献３５】米国特許出願公開第２０１３／０２３０５１４号
【特許文献３６】米国特許出願公開第２０１４／００４４７３８号
【特許文献３７】国際公開第２００３／０９９１９６号
【特許文献３８】国際公開第２００４／００４７７１号
【特許文献３９】国際公開第２００４／０７２２８６号
【特許文献４０】国際公開第２００６／１２１１６８号
【特許文献４１】国際公開第２００７／００５８７４号
【特許文献４２】国際公開第２００９／０１４７０８号
【特許文献４３】国際公開第２００９／０７３５３３号
【特許文献４４】国際公開第２０１２／１３５４０８号
【特許文献４５】国際公開第２０１２／１４５５４９号
【特許文献４６】国際公開第２０１３／０１４６６８号
【非特許文献】
【００２３】
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【発明の概要】
【００２４】
本発明は、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位とを有する、二重特異性分子（例えば、ダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合性分子等）（即ち、「ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子」）を対象とする。本発明は、ＰＤ‐１の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位とを有する、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関する。本発明はまた、イムノグロブリンＦｃ領域を更に備える、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を対象とする。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、特に上記分子がヒト細胞表面上に配列されている場合に、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる。本発明は、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患又は状態の治療における上述の二重特異性分子の使用を伴う方法を対象とする。本発明はまた、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いて免疫応答を刺激する方法に関する。
【００２５】
詳細には、本発明は、ＰＤ‐１の１つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ又は複数のエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４の１つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ又は複数のエピトープ結合部位との両方を有する、二重特異性分子を提供し、
上記分子は：
（Ａ）ＰＤ‐１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン；並びに
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を備え、
ここで上記二重特異性結合分子は：
（ｉ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；又は
（ｉｉ）３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子
である。
【００２６】
本発明は、上記二重特異性結合分子が、一方がＰＤ‐１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有し、もう一方がＣＴＬＡ‐４に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する、２つの単一特異性分子によって呈される活性に対して、増強された活性を呈する、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
【００２７】
本発明は、上記分子が、それを必要とする被検体に投与した場合に、イピリムマブ等のＣＴＬＡ‐４に結合する単一特異性抗体の投与によって誘発される免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）よりも少ないｉｒＡＥを誘発する、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００２８】
本発明は更に、上記分子がＦｃ領域を備える、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｆｃ領域が、変異型Ｆｃ領域であって：
（Ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾；及び／又は
（Ｂ）上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を備える、変異型Ｆｃ領域である、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
【００２９】
本発明は更に、ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する上記修飾が、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（この番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である）の置換を含む、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３０】
本発明は更に、上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる上記修飾が、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ（この番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である）の置換を含む、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３１】
本発明は更に、上記分子が上記ダイアボディであり、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３２】
本発明は更に、上記分子が上記３価結合性分子であり、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３３】
本発明は更に、上記分子が、上記細胞表面上に存在するＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に結合できる、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３４】
本発明は更に、上記分子が、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に同時に結合できる、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３５】
本発明は更に、上記分子が免疫細胞の刺激を促進し、特に上記免疫細胞の刺激が：
（Ａ）免疫細胞増殖；並びに／又は
（Ｂ）免疫細胞産生及び／若しくは少なくとも１つのサイトカインの放出；並びに／又は
（Ｃ）免疫細胞産生及び／若しくは少なくとも１つの溶解性分子の放出；並びに／又は
（Ｄ）少なくとも１つの活性化マーカの、免疫細胞発現
をもたらす、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３６】
本発明は更に、上記免疫細胞がＴリンパ球又はＮＫ細胞である、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３７】
本発明は更に、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位が：
（Ａ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号４７）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号４８）；又は
（Ｂ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン（配列番号４９）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン（配列番号５０）；又は
（Ｃ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号５１）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号５２）；又は
（Ｄ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメイン（配列番号５３）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメイン（配列番号５４）；又は
（Ｅ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメイン（配列番号５５）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメイン（配列番号５６）；又は
（Ｆ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン（配列番号５８）；又は
（Ｇ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨのＶＨドメイン（配列番号８６）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬのＶＬドメイン（配列番号８７）；又は
（Ｈ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメイン（配列番号５９）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメイン（配列番号６０）；又は
（Ｉ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメイン（配列番号６１）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメイン（配列番号６２）
を備える、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３８】
本発明は更に、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ以上の上記エピトープ結合部位が：
（Ａ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号７６）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号７７）；又は
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン（配列番号７８）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン（配列番号７９）；又は
（Ｃ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）
を備える、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００３９】
本発明は更に：
（Ａ）ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位が、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨのＶＨドメイン（配列番号８６）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱのＶＬドメイン（配列番号８７）を備え；
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ以上の上記エピトープ結合部位が、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）を備える、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
【００４０】
本発明は更に、前記分子が：
（Ａ）配列番号９５を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号９６を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｂ）配列番号９７を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号９８を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｃ）配列番号９９を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１００を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｄ）配列番号１０２を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０３を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｅ）配列番号１０１を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１００を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｆ）配列番号１０４を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０５を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０６を有する１つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０７を有する１つのポリペプチド鎖；又は
（Ｇ）配列番号１０８を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０５を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０９を有する１つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０７を有する１つのポリペプチド鎖
を含む、上述の全ての二重特異性分子の実施形態に関する。
【００４１】
本発明は更に、上記分子がアルブミン結合ドメイン、特に脱免疫化アルブミン結合ドメインを備える、上述の二重特異性分子の実施形態に関する。
【００４２】
本発明は更に、有効量の上述の二重特異性分子のうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明は更に、それを必要とする被検体の免疫仲介性応答の刺激を促進するための、上述の医薬組成物の使用、又は上述の二重特異性分子のうちのいずれの使用に関し、特に上述の分子は、免疫細胞の刺激、特にＮＫ細胞及び／又はＴリンパ球の刺激を促進する。本発明は特に、上述の刺激が、免疫細胞増殖、免疫細胞産生及び／若しくはサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ‐２、ＴＮＦα等）の放出、免疫細胞産生及び／若しくは溶解性分子（例えばグランザイム、パーフォリン等）の放出、並びに／又は活性化マーカ（例えばＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ１０７ａ等）の免疫細胞発現をもたらす、実施形態に関する。本発明は更に、免疫仲介性応答を刺激するための上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の使用又は投与を伴う、癌又は他の疾患を治療する方法に関する。本発明は特に、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のうちのいずれの免疫刺激活性が、別個の抗ＰＤ‐１抗体及び別個の抗ＣＴＬＡ‐４抗体（特にこれらの抗体は上述の分子に対して単一特異性である）の共同又は併用投与よりも強力である、実施形態に関する。本発明はまた、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子によって刺激された免疫細胞、特にＮＫ細胞及び／又はＴリンパ球が、別個の抗ＰＤ‐１抗体及び別個の抗ＣＴＬＡ‐４抗体の共同又は併用投与によって刺激された上述の細胞が呈するものに対して、増殖の増強、サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ‐２、ＴＮＦα等）の産生及び／若しくは放出の変化、溶解性分子の産生及び／若しくは放出の変化、並びに／又は活性化マーカの発現の変化を呈する、実施形態に関する。本発明はまた、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子がｉｒＡＥの発生を減少させる、実施形態に関する。本発明は更に、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のうちのいずれが、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態、特に癌又は感染症の治療に使用される、実施形態に関する。
【００４４】
本発明は更に、抑制された免疫系に関連する疾患若しくは状態を治療するための、又は上述のような疾患若しくは状態の治療における、上述のような使用に関する。本発明は特に、上記疾患又は状態が、癌又は感染症（特にバクテリア、菌類、ウイルス若しくは原虫病原体の存在を特徴とする感染症）である、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態の治療における上述のような使用に関する。
【００４５】
本発明は特に：
（Ａ）上記使用が癌の治療におけるものであり、上記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする；又は
（Ｂ）上記使用が感染症の治療におけるものであり、上記感染症は：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアの存在を特徴とする、慢性ウイルス性、バクテリア性、菌類性及び寄生虫性感染症である、実施形態に関する。
【００４６】
本発明は特に、癌の治療における上述のような使用に関し、上記癌は：結腸直腸癌；肝細胞癌；神経膠腫；腎臓癌；乳癌；多発性骨髄腫；膀胱癌；神経芽細胞腫；肉腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；卵巣癌：膵臓癌；直腸癌；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；急性Ｂリンパ芽球性白血病（Ｂ‐ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病（ＨＣＬ）；芽球性形質細胞様樹状細胞新生物（ＢＰＤＣＮ）；マントル細胞白血病（ＭＣＬ）及び小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）を含む非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；ホジキンリンパ腫；全身性肥満細胞症；又はバーキットリンパ腫である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。図３Ｂに示すように、システイン残基がリンカー中及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図２】図２は、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合した４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｂに示すように）２ペアのポリペプチド鎖が同一であり、かつＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃにおいて様々な陰影及びパターンで示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。図３ＢはＦｃ領域含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを備えるポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図５】図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃ領域の全体又は一部を含むＦｃ領域を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを備えるポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合部位を有する、代表的なＦｃ領域含有３価結合分子の概略図である。図６Ａ及び６Ｂはそれぞれ、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを備える３価結合分子のドメインを示す。図６Ａ及び６Ｂの分子は４つの鎖を備える。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、Ｆｃ領域のＮ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを備える、３価結合分子のドメインを示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、Ｆｃ領域のＣ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを備える、３価結合分子のドメインを、概略的に示す。図６Ｃ〜６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を備える。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図７】図７は、例示的な二重特異性分子（ＤＡＲＴ  Ａと呼ばれるＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子）がサイトカイン産生を、親抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体の共同又は併用投与時に観察されるものより高いレベルまで刺激できることを示すことによって、本発明の原理を示している。ＳＥＢ（０．５ｎｇ／ｍＬ）で刺激され、かつ例示的な二重特異性分子（ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ａ）を用いて、又は抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体を単独で若しくは組み合わせて用いて処置された代表的なドナーからの、ＰＢＭＣのＩＦＮγ分泌プロファイルが示されている。
【図８Ａ−８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、連続希釈された結合分子の、ヒトＣＴＬＡ‐４及びヒトＰＤ‐１に対する結合を測定する、ＥＬＩＳＡ研究の結果を示す。図８Ａ〜８Ｂは、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、又はＤＡＲＴ  Ｂの、支持プレート上にコーティングされた可溶性ｈＣＴＬＡ‐４‐Ａｖｉ‐Ｈｉｓ（１μｇ／ｍＬ）（図８Ａ）又はｈＰＤ‐１‐Ｈｉｓ（１μｇ／ｍＬ）（図８Ｂ）に対する結合曲線を示す。ヤギ抗ヒト‐Ｆｃ‐ＨＲＰ（１：１０，０００）を、結合を検出するための二次検出分子として採用した。図８Ｃ〜８Ｄは、配向及び結合ドメインの変更の、結合に対する影響に関する研究の結果を示す。ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １（例えば、ＤＡＲＴ  Ｂ）並びにＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３（例えばＤＡＲＴ  Ｃ及びＤＡＲＴ  Ｄ）のＣＴＬＡ‐４結合ドメインを備えるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を、支持プレート上にコーティングされた可溶性ヒトＰＤ‐１（図８Ｃ）又は可溶性ヒトＣＴＬＡ‐４‐Ａｖｉ‐Ｈｉｓ（図８Ｄ）の存在下でインキュベートした。ヤギ抗ヒト‐Ｆｃγ‐ＨＲＰを、ＰＩＣＯ化学発光基質を用いて結合を検出するための二次検出分子として採用した。
【図９Ａ−９Ｅ】図９Ａ‐９Ｅは、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ並びに（ＲＳＶに対する２つの結合部位及びＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位を有する）対照ＴＲＩＤＥＮＴの、単独の又は組み合わせられたＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐１に対する結合リガンドの結合をブロックする能力の評価の結果を示す。ＰＤ‐１に対するＰＤ‐Ｌ１の結合のブロックは、等量の無関係な抗原の存在下（図９Ａ）及び等量のＣＴＬＡ‐４の存在下（図９Ｂ）で評価され、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７‐１の結合のブロックは、等量の無関係な抗原の存在下（図９Ｃ）、及び等量のＰＤ‐１の存在下（図９Ｄ）、及び４倍多いＰＤ‐１の存在下（図９Ｅ）で、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価された。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、抗ＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ、及びｈＩｇＧ対照抗体の、カニクイザルＣＴＬＡ‐４（図１０Ａ）又はヒトＣＴＬＡ‐４（図１０Ｂ）を発現するＣＨＯ細胞に結合する能力の評価の結果を示す。結合は、抗ヒトＦｃ二次抗体を用いて検出した。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、抗ＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及び抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの、（表面上にｈｕＣＴＬＡ‐４を発現するもののＰＤ‐１を発現しない）Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合する能力の評価の結果を示す。ＤＡＲＴ及びＴＲＩＤＥＮＴ分子の、ヒトＣＴＬＡ‐４に対する結合は、抗ヒトＦＣ二次Ａｂ（ＦＡＣＳ）を用いて検出した。図１１Ａは、ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐに関する結果を示す。図１１Ｂは、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ａに関する結果を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡの、ＣＴＬＡ‐４リガンドＢ７‐１及びＢ７‐２をブロックする能力の、細胞ベースのアッセイでの評価の結果を示す。Ｂ７‐１及びＢ７‐２のＨｉｓタグ付与誘導体を、Ｊｕｒｋａｔ細胞及び人工抗原提示細胞（Promega）の存在下でインキュベートした。Ｈｉｓ‐Ｂ７‐１及びＨｉｓ‐Ｂ７‐２の結合を、抗Ｈｉｓ抗体を用いて決定した。この評価の結果を図１２Ａ（Ｈｉｓ‐Ｂ７‐１）及び図１２Ｂ（Ｈｉｓ‐Ｂ７‐２）に示す。
【図１３】図１３は、ＩＬ‐２／Ｌｕｃ‐Ｊｕｒｋａｔ‐ＣＴＬＡ‐４レポータアッセイにおいてルシフェラーゼ発現の増大によって実証されるような、ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの、ＣＴＬＡ‐４免疫チェックポイント阻害シグナルを反転させる能力の評価の結果を示す。ＩＬ‐２／Ｌｕｃ‐Ｊｕｒｋａｔ‐ＣＴＬＡ‐４細胞を、列挙されている結合分子の存在下（Ｒ：Ｓ＝１：０．３）で、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、Ｒａｊｉ細胞を提示する人工抗原を添加し、インキュベーションを６時間継続した。ＣＴＬＡ‐４免疫チェックポイント阻害シグナルの反転は、ルシフェラーゼアッセイで決定した。
【図１４】図１４は、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡの、ＰＤ‐１を発現するもののＣＴＬＡ‐４を発現しないＮＳＯ細胞に結合する能力の評価の結果を示す。結合分子を細胞の存在下でインキュベートし、細胞の平均蛍光指数を測定した。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂは、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡの、ＰＤ‐１とそのリガンドＰＤ‐Ｌ１とＰＤ‐Ｌ２の間の結合をブロックする能力の、細胞ベースのアッセイでの評価の結果を示す。ＰＤ‐Ｌ１‐ＰＥ又はＰＤ‐Ｌ２‐ＰＥを、上述の結合分子の存在下でインキュベートし、これらがＮＳＯ‐ＰＤ‐１細胞に結合する能力を、ＦＡＣＳを用いて評価した。図１５Ａ（ＰＤ‐Ｌ１）；図１５Ｂ（ＰＤ‐Ｌ２）。
【図１６】図１６は、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用に起因する免疫阻害をブロックする能力の評価の結果を示す。結合分子を、ＰＤ‐Ｌ１+ＣＨＯ及びＪｕｒｋａｔエフェクタ細胞の存在下でインキュベートし、結合分子が免疫阻害を、（（ＮＦＡＴ‐ｌｕｃ／ＰＤ‐１  Ｊｕｒｋａｔアッセイ（Promega）におけるルシフェラーゼ発現の増大によって実証される）ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックすることによって）ブロックする能力を、ＣＤ３仲介型活性化の程度を追跡することによって評価した。
【図１７】図１７は、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、及び陰性対照抗体の、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４を共連結する能力の、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸによる酵素断片相補性アッセイにおける評価の結果を示す。３８４ウェルプレート上のＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＣＰ５プレーティング培地中に、Ｕ２ＯＳ  ＣＴＬＡ−４（１−１９５）−ＰＫ  ＰＤ−１（１−１９９）−ＥＡ細胞株＃９のアリコートを、５０００細胞／ウェルで４重に播種した。細胞を、３７℃／５％ＣＯ2において４時間付着させた。次に、各結合分子の１１点１：３連続希釈物をＰＤ‐１-ＣＴＬＡ‐４細胞に添加し、ＤＡＲＴ  Ｄ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ試料を、ＰＤ‐１-ＬＡＧ‐３細胞に添加した。プレートを、３７℃／５％ＣＯ2において一晩（１６時間）インキュベートした。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬をウェルに添加し、続いてこれを暗所において室温で１時間インキュベートした後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎルミノメータで読み取った。
【図１８】図１８は、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）の、混合リンパ球反応の応答を増強する能力の評価の結果を示す。ＣＤ１４＋単球をＧＭ‐ＣＳＦ（インキュベーション期間の１日目に供給）及びＩＬ‐４（インキュベーション期間の７日目に供給）で処置することによって、単球由来樹状細胞を生成した。インキュベーション期間の８日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単球由来樹状細胞（インキュベーション期間の８日目に供給）並びに抗ＣＴＬＡ‐４及び抗ＰＤ‐１結合分子（インキュベーション期間の８日目に供給）でインキュベートすることによって、ＭＬＲをセットアップした。ＩＦＮ‐γの放出が図１８にプロットされている。二重特異性ＤＡＲＴ  Ｄ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ分子の両方が、個々の親抗体の組み合わせに対して同程度に又はわずかに良好にＭＬＲ応答を増強することが分かった。提示されたデータは、７つのシリーズ（それぞれ異なる結合分子：ｈＩｇＧ４対照；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ；ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ；ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）；ＤＡＲＴ  Ｄ；ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ；及びｈＩｇＧ１対照（左から右）に関連する）を含み、各シリーズは、６つのカラム（それぞれ、提供される分子の異なる濃度：０．０１６、０．０８、０．４、２、１０又は５０ｎＭ（左から右）に関する）で構成される。
【図１９Ａ−１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｄは、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型（ＳＥＢ）再刺激アッセイを用いて、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）の投与の、Ｔ細胞応答に対する影響を示す。図１９Ａ〜１９Ｂは、ＳＥＢ刺激の不在下（図１９Ａ）又は存在下（１９Ｂ）における上記ＰＢＭＣによるＰＤ‐１とＣＴＬＡ‐１との発現の、蛍光活性化細胞分類（fluorescence‐activated cell sorting：ＦＡＣＳ）ドットプロットを示す。図１９Ｃは、ＩＦＮ‐γ分泌に対するＳＥＢ刺激の影響を示す。ＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型（ＳＥＢ）で４８時間刺激した。次に細胞を採取し、洗浄して、追加の４８時間にわたって様々な濃度の抗体と共に９６ウェルプレートに再播種した。次に上清を採取し、ＩＦＮ‐γ産生に関してフローサイトメトリーＥＬＩＳＡで分析した。二重特異性ＤＡＲＴ及びＴＲＩＤＥＮＴタンパク質の両方が、ＩＦＮ‐γ応答の増大を示し、これは個々の親ｍＡｂの組み合わせによって観察された応答を再現するものであった。ＰＢＭＣを高濃度（５００ｎｇ／ｍＬ）のＳＥＢで７２時間培養したＳＥＢ刺激アッセイにおいて、同様の結果が見られた。提示されているのは６つのシリーズであり、これらはそれぞれ異なる結合分子に関連する。各シリーズは８つのカラムで構成され、これらはそれぞれ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．３９ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０２ｎＭ又は０．００６ｎＭの結合分子（左から右）によって得られた結果に関連する。図１９Ｄは、代表的なドナーに関するＩＬ‐２の放出を示す。ＰＢＭＣを０．５ｎｇ／ｍｌＳＥＢで４８時間刺激し、採取して洗浄し、追加の４８時間にわたって新鮮なＳＥＢ及びＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、又はＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ  ／  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）と共に９６ウェルプレートに再播種し、放出されたＩＬ‐２を測定した。提示されているのは７つのシリーズであり、これらはそれぞれ異なる結合分子又は組み合わせに関連する。各シリーズは３つのカラムで構成され、これらはそれぞれ、０．５ｎＭ、５ｎＭ又は５０ｎＭの結合分子（左から右）によって得られた結果に関連する。抗体を組み合わせて用いた場合、各抗体が、指示されている濃度で添加されたため、添加された抗体の合計濃度は２倍になっている。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａ〜２０Ｂは、移植片対宿主病（Graft Versus Host Disease：ＧＶＨＤ）のＰＢＭＣ埋入ＮＯＧマウスモデルにおけるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の活性を示す。５０ｍｇ／ｋｇ又は５００ｍｇ／ｋｇの用量（図２０Ａ）のＤＡＲＴ  Ｄを投与されたマウスに対して、ＣＤ３＋Ｔ細胞の計数を、研究日においてＦＡＣＳで実施した（図２０Ａ）。研究の経過にわたって生存を監視し、図２０Ｂに生存％をプロットした。
【図２１Ａ−２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｃは、研究１日目、８日目及び１５日目に５０ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄ（図２１Ａ）、研究の１日目、８日目及び１５日目に７５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄ（図２１Ｂ）、又は１日目に５ｍｇ／ｋｇのＴｒｉｄｅｎｔ  Ａを投与された（６文字の英数字コードが付与された）カニクイザルに関する血清濃度‐時間プロファイルを示す。
【図２２Ａ−２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｂは、処置されたカニクイザルにおける、ＤＡＲＴ  Ｄの投与の絶対リンパ球数（absolute lymphocyte count：ＡＬＣ）に対する影響を示す。図２２Ａは、数千個（thousands）の細胞／μｌ（ｔｈ／μｌ）のＡＬＣを示す。図２２Ｂは、１日目（Ｄ１）に対して正規化された、ＡＬＣの変化％を示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｂは、５０ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄ（図２３Ａ）又は７５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄ（図２３Ｂ）を投与されたカニクイザルのＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞におけるＰＤ‐１の占有率を示す。
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａ〜２４Ｂは、５０ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄ（図２４Ａ）又は７５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄ（図２４Ｂ）を投与されたカニクイザルにおける、ＤＡＲＴ  Ｄ投与の、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに対して免疫特異的な少なくとも１つのエピトープ結合部位とを有する、二重特異性分子（例えば、ダイアボディ、二重特異性抗体、３価結合性分子等）（即ち、「ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子」）を対象とする。本発明は、ＰＤ‐１の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位とを有する、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関する。本発明はまた、イムノグロブリンＦｃ領域を更に備える、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を対象とする。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、特に上記分子がヒト細胞表面上に配列されている場合に、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる。本発明は、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患又は状態の治療における上述の二重特異性分子の使用を伴う方法を対象とする。本発明はまた、上述のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いて免疫応答を刺激する方法に関する。
【００４９】
Ｔ細胞活性化は、２つの別個のシグナルを必要とする（非特許文献３、４）。第１のシグナルは、Ｔ細胞の表面上で発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子によって提供され、これは抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と関連しているペプチド抗原を認識している。第２のシグナルは、ＡＰＣ上で発現される同族のペアの共刺激リガンド：Ｂ７‐１及びＢ７‐２と、Ｔ細胞上で発現されるこれらに対応する受容体：ＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４との相互作用によって提供される。
【００５０】
ＣＤ２８に対するＢ７‐１及びＢ７‐２分子の結合は、Ｔ細胞増殖を刺激し、更にＣＴＬＡ‐４の発現の増大を誘発する。ＣＴＬＡ‐４は、ＣＤ２８への結合に関してＢ７‐１及びＢ７‐２と競合する、負の調節因子である。従ってプロセスは、疾患に対して２段階で応答し：第１の段階は、Ｔ細胞増殖を刺激するステップを伴い；後続の段階は、上記免疫応答を「緩め（wind down）」、被検体を静止免疫状態に戻す。ＣＤ２８に結合する抗体はＢ７‐１又はＢ７‐２の結合を模倣でき、これにより、Ｔ細胞エフェクタ機能及び腫瘍根絶性免疫を誘発又は増強でき、このような抗体は共刺激性である。対照的に、ＣＴＬＡ‐４がＢ７‐１及びＢ７‐２に結合するのをブロックする抗体は、Ｔ細胞が静止状態に戻るのを防止でき、これにより上記Ｔ細胞は持続的な増殖を維持し、これは自己免疫及び免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の進展につながり得る（Wang, L. et al. (March 7, 2011) “VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T‐Cell Responses,” J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1‐16; Lepenies, B. et al. (2008) “The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections,” Endocrine, Metabolic & Immune Disorders ‐ Drug Targets 8:279‐288）。特に重要なのは、抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドと、ＣＤ４+Ｔリンパ球のＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４受容体との間の結合である（非特許文献５、２、６）。Ｂ７．１又はＢ７．２のＣＤ２８に対する結合は、Ｔ細胞活性化を刺激し；Ｂ７．１又はＢ７．２のＣＴＬＡ‐４に対する結合は、このような活性化を阻害する（非特許文献２、６、７）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上で恒常的に発現され（非特許文献８）、一方ＣＴＬＡ‐４発現は、Ｔ細胞活性化後に迅速に上方制御される（非特許文献９）。ＣＴＬＡ‐４は、比較的高親和性の受容体（非特許文献５）でありまず（ＣＤ２８によって）Ｔ細胞増殖を開始させた後、（ＣＴＬＡ‐４の初期発現によって）これを阻害することによって、増殖がそれ以上必要でない場合に上記効果を減衰させる。
【００５１】
上述の相互作用と並行して、受容体及び結合リガンドの第２のセットは、免疫系を阻害するよう機能し、これにより、免疫応答のＣＤ２８／Ｂ７‐１／Ｂ７‐２仲介型増強を遅延させるブレーキとして作用する。この補助的応答は、Ｔ細胞の表面上で発現されるプログラム細胞死‐１タンパク質（ＰＤ‐１）受容体の、対応するリガンド：抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現されるＰＤ‐Ｌ１、及び上皮細胞上で発現されるＰＤ‐Ｌ２に対する結合に関与する（Chen L. et al. (2013) “Molecular Mechanisms Of T‐Cell Co‐Stimulation And Co‐Inhibition,” Nature Reviews Immunology 13(4):227‐242）。ＣＤ２８に結合してＴ細胞応答を直接刺激するアゴニスト抗体とは対照的に、ＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１に結合する抗体は、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１会合に拮抗するか又はこれをブロックし、これにより、Ｔ細胞への負のシグナルの送達を防止することによって、Ｔ細胞活性化を維持する。従って、ＰＤ‐１又はＰＤ‐Ｌ１に結合する抗体は、Ｔ細胞増殖、細胞傷害、及び／又はサイトカイン分泌を増進させるか又は維持する。以上を考え合わせると、抗ＣＤ２８等のアゴニスト抗体は、正のシグナルの経路を標的とするため、共刺激因子であるが、抗ＣＴＬＡ‐４及び抗ＰＤ‐１のアンタゴニスト性抗体は、負のシグナルの経路を標的とし、チェックポイント阻害剤と呼ばれる。
【００５２】
以上のように、ＣＴＬＡ‐４及びＰＤ‐１はＴ細胞活性化に対して別個の阻害効果を及ぼす、標準的なチェックポイント阻害剤を表す。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分は、リンパ球の表面上に存在するＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４細胞表面分子に結合でき、これにより、上述の細胞表面分子の、それぞれの受容体に応答する能力を阻害できる。いずれの理論又は機序に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＰＤ‐１結合が（例えば腫瘍部位における及び／又は感染の結果としての）Ｔ細胞阻害を和らげることができ、またＣＴＬＡ‐１結合がポリクローナル活性化及び刺激を刺激できると考えている。従って本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４仲介型免疫系阻害を弱めて、連続的な免疫系の活性化を促進できる。本明細書では、２つの免疫調節経路を標的とする二重特異性分子が、別個の抗体の組み合わせよりも強力であることが実証されている。本発明はまた、ＰＤ‐１：ＣＴＬＡ‐４結合比が１：１、１：２、２：２及び２：１であるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子も提供し、これは、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４の両方の完全なブロック、並びにＰＤ‐１と共発現された場合の、ＣＴＬＡ‐４へとバイアスがかけられたブロックを可能とする。従って本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、別個の抗ＰＤ‐１及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体の組み合わせと比べて、予想外の優位性を提供する。更に本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ｉｒＡＥのリスクが低減された免疫刺激を提供し得る。
【００５３】
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明の抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody及びantibodies）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものとすることができる。本明細書において使用される場合、「Ｆｃ領域（Fc region）は、そのアミノ酸配列が他のＩｇＧアイソタイプよりもある特定のＩｇＧアイソタイプに対して最も高い相同性を有する場合、当該特定のＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものを指す。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に免疫特異的に結合できる。というのは、このような分子上に特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（epitope）」）が存在するためである。エピトープ含有分子は、免疫学的活性を有することができ、これにより、動物における抗体産生応答を誘発する。このような分子を「抗原（antigen）」と呼ぶ。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【００５４】
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並びに親和��最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。
【００５５】
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置するヒンジ領域を含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジ領域を有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでＨはヒンジ領域であり、ｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ結合断片（epitope-binding fragment）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる抗体の断片を意味し、用語「エピトープ結合部位（epitope-binding site）」は、エピトープ結合断片を含む分子の一部分を指す。エピトープ結合断片は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの１、２、３、４、５個又は６個全てを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。しかしながら好ましく���、エピトープ結合断片は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。ある抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’2断片等）を含んでよい。明記されていない場合、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、Ｎ末端からＣ末端への方向である。
【００５６】
本発明は特に、抗ＰＤ‐１抗体の１つ、２つ又は３つ以上の単鎖可変ドメイン断片（「ｓｃＦｖ」）と、抗ＣＴＬＡ‐４抗体の１つ、２つ又は３つ以上の単鎖可変ドメイン断片とを含む、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性結合分子を包含する。単鎖可変ドメイン断片は短い連結ペプチドを用いて軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを連結することによって作製される。リンカーは、薬剤又はアタッチメントを固体支持体に取り付けを可能とする等の更なる機能を提供するために修飾できる。単鎖変異型は、組み換え又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成器を使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生のためには、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞といった、好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションといった慣用の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技法を用いて単離できる。
【００５７】
本発明は特に、本発明の抗ＰＤ‐１抗体のヒト化変異型、及びこれを含む多重特異性結合分子も包含する。用語「ヒト化（humanized）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンの抗原結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。本発明の抗ヒトＰＤ‐１抗体は、抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の、ヒト化、キメラ又はイヌ化変異体を含む。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００５８】
抗原結合部位は、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを備えてよい。抗原結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除されるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220‐4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6‐Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851‐856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323‐327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534‐1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR‐Grafting: The Importance Of Framework ResiduesOn Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773‐3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV‐Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124‐134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181‐4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266‐271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869‐2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti‐p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285‐4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149‐1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
【００５９】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を備える多数の「ヒト化（humanized）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A マウスMonoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
【００６０】
ＩＩ．Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）
２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは相互作用してＦｃ領域を形成し、このＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに限定されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ領域（Fc region）」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
290          300           310         320         330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350           360         370          380
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400         410           420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
440        447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００６１】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
231      240         250          260          270          280
APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
290         300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA 
340         350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE
390         400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE 
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００６２】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
231    240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
290         300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340         350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390         400          410          420          430
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE
440       447
ALHNRFTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００６３】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
231    240          250          260          270          280
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
290          300         310           320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
340          350          360          370          380
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
440       447
ALHNHYTQKS   LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００６４】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス（EU index as in Kabat）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内のアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てており、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているように識別される（Chothia, C. & Lesk, A. M.（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobrins,”. J. Mol. Biol. 196:901‐917）によって定義されるＣＤＲH１は、５残基前から始まることを理解されたい）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
【００６５】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる番号付与で、１９２位、１９３位及び２１４位を含むがこれらに限定されないＣＨ１位置；並びに２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43‐78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199‐211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明のＰＤ‐１結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けたＰＤ‐１結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
【００６６】
上述のように、天然ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、細胞Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合できる。このような結合は、免疫系に対する活性化又は阻害シグナルの伝達をもたらす。このような結合の、正反対の機能をもたらす能力は、異なるＦｃγＲ間の構造的差異を反映しており、特に、結合されたＦｃγＲが、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）又は免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）のいずれを有しているかを反映する。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、Ｆｃ領域に結合した場合に免疫系を活性化させる。ＦｃγＲＩＩＢは、現在知られている唯一の、天然ＩＴＩＭ含有ＦｃγＲであり、これはＦｃ領域に結合した場合に、免疫系を減衰させる又は阻害する役割を果たす。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症促進性メディエータの放出につながる。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。最近、この阻害の分子的基礎が確率された。活性化ＦｃγＲと共同結紮すると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ポリリン酸イノシトール５’‐ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を防止する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ結紮に対する活性化応答を弱め、細胞応答性を阻害する。このようにして、Ｂ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌が中断される。
【００６７】
ＩＩＩ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにアミノ酸配列に依存する。抗体軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエプトープ結合部位のうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種にのみ結合できる（即ちこれらは単一特異性である）が、これらは上記種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
【００６８】
本発明の抗体及びＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の結合ドメインは、エピトープに、「免疫特異的な」様式で結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（immunospecific binding）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「免疫特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子それぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（physiospecific）」様式で互いに結合できると言い表される。
【００６９】
本発明の一態様は、抗体の機能性が、ＰＤ‐１の１つ以上のエピトープ及びＣＴＬＡ‐４の１つ以上のエピトープに同時に結合できる多重特異性抗体ベースの分子を生成することにより、増強できるという認識を反映したものである。ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的な２つ以上のエピトープ結合部位を有する分子に関して、このようなエピトープは、互いに同一であっても、重複していても、又は互いに別個であってもよく、一方のこのようなエピトープへの結合は、他方のこのようなエピトープへの結合と競合してもしなくてもよい。同様に、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに対して免疫特異的な２つ以上のエピトープ結合部位を有する分子に関して、このようなエピトープは、互いに同一であっても、重複していても、又は互いに別個であってもよく、１つのこのようなエピトープへの結合は、第２のこのようなエピトープへの結合と競合してもしなくてもよい。このような特徴を独立して変化させることにより、例えば：
（１）ＰＤ‐１の２つの同一のエピトープと：
（ａ）ＣＴＬＡ‐４の２つの同一のエピトープ；又は
（ｂ）ＣＴＬＡ‐４の２つの重複するエピトープ；又は
（ｃ）ＣＴＬＡ‐４の２つの別個のエピトープ
とに結合する能力；あるいは
（２）ＰＤ‐１の２つの重複するエピトープと：
（ａ）ＣＴＬＡ‐４の２つの同一のエピトープ；又は
（ｂ）ＣＴＬＡ‐４の２つの重複するエピトープ；又は
（ｃ）ＣＴＬＡ‐４の２つの別個のエピトープ
とに結合する能力；あるいは
（３）ＰＤ‐１の２つの別個のエピトープと：
（ａ）ＣＴＬＡ‐４の２つの同一のエピトープ；又は
（ｂ）ＣＴＬＡ‐４の２つの重複するエピトープ；又は
（ｃ）ＣＴＬＡ‐４の２つの別個のエピトープ
とに結合する能力
を有するＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子が得られると明らかに考えられる。
【００７０】
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号；国際公開第２００９／１３２８７６号；国際公開第２００８／００３１０３号；国際公開第２００７／１４６９６８号；国際公開第２００９／０１８３８６号；国際公開第２０１２／００９５４４号；国際公開第２０１３／０７０５６５参照）、その殆どは、更なるエピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数のエピトープ結合断片（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、エピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号；国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号；国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号；国際公開第２００７／０４６８９３号）。国際公開第２０１３／１７４８７３号；国際公開第２０１１／１３３８８６号；及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を開示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。国際公開第２０１３／１６３４２７号、及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。国際公開第２０１０／０２８７９７号；国際公開第２０１００２８７９６号；及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。国際公開第２０１４／０２２５４０号；国際公開第２０１３／００３６５２号；国際公開第２０１２／１６２５８３号；国際公開第２０１２／１５６４３０号；国際公開第２０１１／０８６０９１号；国際公開第２００８／０２４１８８号；国際公開第２００７／０２４７１５号；国際公開第２００７／０７５２７０号；国際公開第１９９８／００２４６３号；国際公開第１９９２／０２２５８３号；及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。
【００７１】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448;米国特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.);米国特許第２００４／０２２０３８８号；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）； Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１  号（Mertens et al.）； Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al.(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
【００７２】
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）として公知の抗体誘導体に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００７３】
二重特異性結合分子（例えば非単一特異性ダイアボディ）の提供は、異なるエピトープを発現する異なる複数の細胞を共連結及び／若しくは共存させるために十分な「トランス（trans）」結合能力、並びに／又は同一の細胞が発現する異なる複数の分子を共連結及び／又は共存させるために十分な「シス（cis）」結合能力を含むがこれに限定されない、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性結合分子（例えば非単一特異性ダイアボディ）は、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。
【００７４】
二重特異性ダイアボディを産生する能力により、異なる細胞上に存在する受容体の共連結（例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋）によって、２つの細胞を共連結するために、上記ダイアボディを（「トランス」として）使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。あるいは又は更に、二重特異性ダイアボディを（「シス」として）用いて、同一の細胞の表面上に存在する受容体等の分子を共連結できる。異なる細胞及び／又は受容体の共連結は、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止する（即ちホモ二量体化を防止する）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００７５】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。
【００７６】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）（Dual Affinity Re‐Targeting Reagents）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号、並びにSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによってこのようなポリペプチド鎖の１つ又は複数のペアを互いに共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、ダイアボディの結合特性に干渉することなく、得られるダイアボディを安定化させる。
【００７７】
このような分子の多数の変異型が記載されており（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；欧州公開特許第１８６８６５０号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号;国際公開第２００６／１１３６６５号参照）、また本明細書中で提供される。
【００７８】
４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば米国公開特許第２００５-００７９１７０号；米国公開特許第２００７-００３１４３６号；米国公開特許第２０１０-００９９８５３号；米国公開特許第２０１１-０２０６６７号；米国公開特許第２０１３-０１８９２６３号；欧州公開特許第１０７８００４号；欧州公開特許第２３７１８６６号；欧州公開特許第２３６１９３６号；及び欧州公開特許第１２９３５１４号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号参照）。
【００７９】
ＩＶ．好ましいＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子
本発明の一実施形態は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合できるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関し、これらのエピトープは互いに同一ではない。このような二重特異性分子は、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、及び第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインを備える。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第１の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第２の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。ある特定のエピトープが第１のエピトープ又は第２のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在又は配向のみに関連する。一実施形態では、このようなエピトープのうちの１つは、ヒトＰＤ‐１のエピトープであり、このようなエピトープのうちのもう１つは、ＣＴＬＡ‐４のエピトープである。特定の実施形態では、二重特異性分子は、３つ以上のエピトープ結合部位を備える。このような二重特異性分子は、少なくとも１つのＰＤ‐１のエピトープ及び少なくとも１つのＣＴＬＡ‐４のエピトープに結合することになり、更にＰＤ‐１の追加のエピトープ及び／又はＣＴＬＡ‐４の追加のエピトープに結合してよい。
【００８０】
本発明は特に、それ自体を少なくとも１つのＰＤ‐１のエピトープ及び少なくとも１つのＣＴＬＡ‐４のエピトープに配位結合させることができる抗体のエピトープ結合断片を有する、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価結合性分子等）に関する。このような分子のポリペプチドドメインのＶＬ及びＶＨドメインの選択は、同一のポリペプチド鎖のＶＬドメイン及びＶＨドメインが、ＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４に結合できるエピトープ結合部位を形成できないように、調整される。このような選択は更に、このようなＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を構成する複数のポリペプチド鎖が会合して、少なくとも１つのＰＤ‐１のエピトープに対して特異的な少なくとも１つの機能性抗原結合部位と、少なくとも１つのＣＴＬＡ‐４のエピトープに対して特異的な少なくとも１つの機能性抗原結合部位とを形成するように、調整される。
【００８１】
本発明は特に、一方がＰＤ‐１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有し、もう一方がＣＴＬＡ‐４に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する、２つの単一特異性分子の活性に対して、増強された活性を呈する、上述のようなＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関する。このような活性の例としては、ＰＤ‐１の活性の減衰、ＣＴＬＡ‐４の活性の減衰、免疫系活性化の増強、エフェクタ機能の増強、抗腫瘍活性の増強が挙げられる。本明細書において使用される場合、このような活性の減衰は、ＰＤ‐１及び／若しくはＣＴＬＡ‐４阻害活性の１０％以上の低下、２０％以上の低下、５０％以上の低下、８０％以上の低下若しくは９０％以上の低下、又は上記ＰＤ‐１及び／若しくはＣＴＬＡ‐４阻害活性の完全な排除を指す。本明細書において使用される場合、上記活性の増強は、一方がＰＤ‐１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有し、もう一方がＣＴＬＡ‐４に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する、２つの単一特異性分子が呈する活性に対して、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４の発現又は存在によって仲介される又は実現される免疫系活性化活性の、１０％以上の増強、２０％以上の増強、５０％以上の増強、８０％以上の増強又は９０％以上の増強を指す。免疫系活性化活性の例としては、限定するものではないが、免疫細胞（例えば、Ｔ‐リンパ球、ＮＫ細胞）増殖、免疫細胞産生及び／若しくはサイトカインの放出、免疫細胞産生及び／若しくは溶解性分子（例えばグランザイム、パーフォリン等）の放出、並びに／又は活性化マーカの免疫細胞発現が挙げられる。免疫系の活性化時に放出されるサイトカインは、当該技術分野において公知であり、限定するものではないが：ＩＦＮγ、ＩＬ‐２及びＴＮＦαが挙げられる（例えばJaneway, C.A. et al. (2011) Immunobiology 8th ed. Garland Science Publishing, NY; Banyer, J.L. (2000) “Cytokines in innate and adaptive immunity,” Rev Immunogenet. 2:359‐373を参照)。免疫細胞が発現する活性化マーカは、当該技術分野において公知であり、限定するものではないが、CD69、CD25及びCD107aが挙げられる（例えJaneway, C.A. et al. (2011) Immunobiology 8th ed. Garland Science Publishing, NY; Shipkova, M. and Wieland, E. (2012) “Surface markers of lymphocyte activation and markers of cell proliferation,” Clin Chim Acta 413:1338‐1349を参照)。
【００８２】
Ａ．ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性抗体
本発明は、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる二重特異性抗体を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる上記二重特異性抗体は、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第２００６／１０７６１７号、国際公開第２００７／０４６８９３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１０／０２８７９７、国際公開第２０１００２８７９６号、国際公開第２０１０／０２８７９５号、国際公開第２０１０／１０８１２７号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１３／０７０５６５号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１３／１７４８７３号、及び国際公開第２０１４／０２２５４０号に記載の方法のうちのいずれを用いて産生され、上記文献はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【００８３】
Ｂ．Ｆｃ領域を有しないＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは上記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖から構成される、二重特異性ダイアボディに関し、その配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに対して共有結合して、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成することを可能とする。
【００８４】
二重特異性ダイアボディのこのような実施形態の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬPD-1又はＶＬCTLA-4）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬPD-1を含有する場合は）ＣＴＬＡ‐４又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬCTLA-4を含有する場合は）ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【００８５】
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬPD-1又はＶＬCTLA-4；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬPD-1を含有する場合は）ＣＴＬＡ‐４又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬCTLA-4を含有する場合は）ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【００８６】
第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４）に対して特異的な第１の機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原（即ちＣＴＬＡ‐４又はＰＤ‐１）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。よって、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、ダイアボディのこれら２つのポリペプチド鎖が合わせて、ＰＤ‐１のエピトープ及びＣＴＬＡ‐４のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを備える（即ちこれらが合わせて、ＶＬPD-1／ＶＨPD-1及びＶＬCTLA-4／ＶＨCTLA-4を備える）ように、調整される。
【００８７】
最も好ましくは、上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる介在リンカーペプチド（リンカー１）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号５）：GGGSGGGGを有する。
【００８８】
上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、上述のような二量体化を促進する１つ又は複数のポリペプチドドメイン（即ち「ヘテロ二量体促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特に、採用した１つ以上のヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列番号６：GGCGGGの配列を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号７）、LGGGSG（配列番号８）、GGGSGGGSGGG（配列番号９）、ASTKG（配列番号１０）、LEPKSS（配列番号１１）、APSSS（配列番号１２）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【００８９】
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号１３）又はVEPKSC（配列番号１４）又はAEPKSC（配列番号１５）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号１６）又はFNRGEC（配列番号１７）を含む（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【００９０】
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインは、対向する電荷のタンデム反復コイルドメイン、例えば、グルタミン酸残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号１８：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）と、リシン残基がｐＨ７において正の電荷形成する「Ｋコイル」ドメイン（配列番号１９：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）とを備える。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の関連付けが促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。上述のＥコイル及びＫコイルの配列の、１つ又は複数のシステイン残基を含むような修飾を含む、ヘテロ二量体促進ドメインを利用してよい。このようなシステイン残基の存在により、一方のポリペプチド鎖に存在するコイルが、他方のポリペプチド鎖に存在する相補的なコイルと共有結合し、これにより上記ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上できる。特に好ましい例は、アミノ酸配列EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０）を有する修飾されたＥコイルと、アミノ酸配列 KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１）を有する修飾されたＫコイルとを含む、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【００９１】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114‐8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号２２）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【００９２】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号２２の「脱免疫化（deimmunized）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP（配列番号２３）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号２４）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号２５）
を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号７：GGGSである。
【００９３】
Ｃ．Ｆｃ領域を含有するＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４  二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｆｃ領域を備える、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できる二重特異性ダイアボディに関する。上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃ領域が形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
【００９４】
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジ領域由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号１３）、VEPKSC（配列番号１４）又はAEPKSC（配列番号１５）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号１６）又はFNRGEC（配列番号１７）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号１８：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK又は配列番号１９：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号２０：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE又は配列番号２１：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備えるペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
【００９５】
本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子は、更なる介在スペーサペプチド（リンカー）を含んでよく、このようなリンカーは一般に、ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含む。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGGS（配列番号７）、LGGGSG（配列番号８）、GGGSGGGSGGG（配列番号９）、ASTKG（配列番号１０）、DKTHTCPPCP（配列番号２６）、EPKSCDKTHTCPPCP（配列番号２７）、LEPKSS（配列番号１１）、APSSS（配列番号２８）、及びAPSSSPME（配列番号２９）、LEPKSADKTHTCPPC（配列番号３０）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりに配列番号１１を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又は配列番号１１の直後に配列番号２６を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号３１）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号３２）を形成してよい。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジ領域を組み込んでよい。例示的なヒンジ領域としては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号３３）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号３４）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号３５）；及び鎖交換を低減するための安定化置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号３６）が挙げられる（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従って番号付与）。
【００９６】
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは４つの異なる鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、４つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表１に提示する。
【００９７】
【表１】
2019506444.tif 000003
【００９８】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ〜３Ｃ）。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ又はＰＤ‐１の異なるエピトープに結合できる）、及びＣＴＬＡ‐４に対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＣＴＬＡ‐４の同一のエピトープ又はＣＴＬＡ‐４の異なるエピトープに結合できる）を備える。
【００９９】
更なる実施形態では、上記二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１のエピトープ（即ちＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４）に結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び上記第２のエピトープ（即ちＣＴＬＡ‐４又はＰＤ‐１）に結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃ領域を形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃ領域含有二重特異性ダイアボディは、２つの配向（表２）のうちのいずれを有してよい。
【０１００】
【表２】
2019506444.tif 000004
【０１０１】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ〜４Ｂ）。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及びＣＴＬＡ‐４に特異的な１つのエピトープ結合部位を備える。
【０１０２】
更なる実施形態では、上記二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
【０１０３】
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１結合部位を形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃ領域を形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら、本明細書において提示されるように、これらのドメインは好ましくは、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に結合するように選択される。
【０１０４】
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、二重特異性ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を備えるように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
2019506444.tif 000005
【０１０６】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ又はＰＤ‐１の異なるエピトープに結合してよい）、及び第ＣＴＬＡ‐４に特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＣＴＬＡ‐４の同一のエピトープ又はＣＴＬＡ‐４の異なるエピトープに結合してよい）を有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な３つのエピトープ結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ又はＰＤ‐１の２つ若しくは３つの異なるエピトープに結合してよい）、及びＣＴＬＡ‐４に特異的な１つのエピトープ結合部位を備える。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、ＰＤ‐１に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及びＣＴＬＡ‐４に特異的な３つのエピトープ結合部位（これらはＣＴＬＡ‐４の同一のエピトープ又はＣＴＬＡ‐４の２つ若しくは３つの異なるエピトープに結合してよい）を備える。
【０１０７】
Ｄ．Ｆｃ領域を含有する、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性３価結合性分子
本発明の更なる実施形態は、ＰＤ‐１のエピトープ及びＣＴＬＡ‐４上に存在するエピトープに同時に結合できるＦｃ領域を備える、二重特異性３価結合性分子に関する。このような二重特異性３価結合性分子は３つのエピトープ結合部位を備え、そのうちの２つは、結合部位Ａ及び結合部位Ｂを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合部位Ｃを提供するＦａｂ型結合ドメイン（又はｓｃＦｖ型結合ドメイン）である（例えば図６Ａ〜６Ｆ、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号を参照）。このような二重特異性３価分子は従って、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、並びに第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、並びに上記３価分子の「第３の」エピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを備える。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、ダイアボディ、特に上述のようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ中に存在するエピトープ結合のタイプである。「Ｆａｂ型結合ドメイン」及び「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」はそれぞれ、イムノグロブリン軽鎖のＶＬドメインと、相補的なイムノグロブリン重鎖のＶＨドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合部位である。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合部位しか備えないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を備えるという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合部位しか備えないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Ｆａｂ型及びｓｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
【０１０８】
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂ参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｃ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃ領域に対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表４（図６Ａ及び６Ｂも参照）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
【０１１０】
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、介在スペーサペプチドによって、このようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号９）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ又は複数の介在スペーサペプチド（リンカー）によって隔てられていてよい。特に上述のように、このようなリンカーは典型的には可変ドメイン（即ちＶＨ又はＶＬ）とペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）との間、及び上記ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは上で提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。
【０１１１】
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、（例えば介在スペーサペプチド（リンカー４）を用いて）第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合部位を形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。この目的に関して好ましい１つの介在スペーサペプチドは、配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号３７）を有する。
【０１１２】
このような３価結合性分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは異なっていてよく、それによって二重特異性又は三重特異性の結合が可能となることが理解されるだろう。しかしながら本明細書において、これらのドメインは、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に結合できる３価結合性分子を提供するよう選択される。
【０１１３】
特に、ＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合性分子が：ＰＤ‐１に対する２つの結合部位（これらはＰＤ‐１の同一のエピトープ若しくはＰＤ‐１の異なるエピトープに結合できるものであってよい）及びＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位；又はＰＤ‐１に対する１つの結合部位及びＣＴＬＡ‐４に対する２つの結合部位（これらはＣＴＬＡ‐４の同一のエピトープ若しくはＣＴＬＡ‐４の異なるエピトープに結合できるものであってよい）；又はＰＤ‐１に対する１つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位、及びＰＤ‐１若しくはＣＴＬＡ‐４ではない第３の抗原に対する１つの結合部位を備えるよう、選択してよい。本発明の代表的な３価結合性分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｆ及び表４で提供する。
【０１１４】
【表４】
2019506444.tif 000006
【０１１５】
本発明の一実施形態は、ＰＤ‐１に関する２つのエピトープ結合部位、及びＣＴＬＡ‐４に関する１つのエピトープ結合部位を備える、二重特異性３価結合分子に関する。
【０１１６】
ＰＤ‐１に関する２つのエピトープ結合部位は、同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合してよい。本発明の別の実施形態は、ＰＤ‐１に関する１つのエピトープ結合部位、及びＣＴＬＡ‐４に関する２つのエピトープ結合部位を備える、二重特異性３価結合分子に関する。ＣＴＬＡ‐４に関する２つのエピトープ結合部位は、ＣＴＬＡ‐４の同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合してよい。上述のように、このような二重特異性３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。
【０１１７】
Ｖ．定常ドメイン及びＦｃ領域
ここで提示されるのは、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子（例えば、抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）の生成に有用な抗体定常ドメインである。
【０１１８】
好ましいＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインである。例示的なヒトＩｇＧ  ＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３８）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
である。
【０１１９】
あるいは、例示的なＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。例示的なヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３９）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
である。
【０１２０】
本明細書において提示されるように、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性結合分子は、Ｆｃ領域を備えてよい。本発明のこのような分子のＦｃ領域は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のものであってよい。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性結合分子は更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域を備えてよい。上記ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域が存在する場合、上記ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のものであってよく、好ましくは所望のＦｃ領域と同一のアイソタイプのものである。
【０１２１】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４０）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【０１２２】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４１）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
【０１２３】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４２）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV 
である。
【０１２４】
ある例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号３３）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
【０１２５】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号３４）：ERKCCVECPPCPである。
【０１２６】
別の例示的なヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域である。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号３５）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書に記載されているように、ＩｇＧ４ヒンジ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化突然変異を含んでよい。例示的な安定化されたＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列は、（配列番号３６）：ESKYGPPCPPCPである。
【０１２７】
本発明のＦｃ領域含有分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価分子等）のＦｃ領域は、完全なＦｃ領域（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃ領域）であっても、又はＦｃ領域の断片のみであってもよい。任意に、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、Ｃ末端リシンアミノ酸残基を含まない。
【０１２８】
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性シグナルにまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃ領域の、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１）、ＩｇＧ２（配列番号２）、ＩｇＧ３（配列番号３）及びＩｇＧ４（配列番号４）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
【０１２９】
Ｆｃ領域の修飾は、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はエフェクタ機能の変化につながり得る。従って、本発明のＦｃ領域含有ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明のこのような分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１３０】
従って特定の実施形態では、本発明のＦｃ領域含有分子のＦｃ領域は、操作された可変Ｆｃ領域であってよい。本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃ領域は、（野生型Ｆｃ領域が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しており、例えばある活性化受容体への結合が増強されており、及び／又は１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃ領域含有分子のＦｃ領域は、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。このようなＦｃ領域は、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０１３１】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low‐Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882‐8890を参照）。表５は、活性化受容体への結合を増大させる、及び／又は阻害性受容体への結合を低下させる例示的な修飾の、（配列番号１のアミノ酸配列に対する）単一、二重、三重、四重及び五重置換のリストを示す。
【０１３２】
【表５】
2019506444.tif 000007
【０１３３】
ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域内に存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のＦｃ領域に関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。ある具体的実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ＡＤＣＣエフェクタ機能が低下したＩｇＧ  Ｆｃ領域を備える。ある好ましい実施形態では、このようなＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。別の実施形態では、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合及びエフェクタ機能に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低い、天然のＦｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域（配列番号２）又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域（配列番号４）を備える。ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を利用する場合、本発明は、上述のヒンジ領域Ｓ２２８Ｐ置換（例えば配列番号３６参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
【０１３５】
エフェクタ機能が低下したか又は消失した、本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの置換を含む（配列番号４３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１３６】
Ｆｃ領域を備えるタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃ領域の結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（half-life）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被検体の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性は、変異型Ｆｃ領域を備え、上記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って上記分子は、（野生型Ｆｃ領域を含む分子に対して）増大した半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を備え、上記変異型Ｆｃ領域は、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ又は複数の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む。Ｆｃ領域含有分子の半減期を増大させることができる多数の突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。半減期が増強されたＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子としては、Ｆｃドメイン残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含む変異型Ｆｃ領域有するものも挙げられる。
【０１３８】
ある具体的実施形態では、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する。
【０１３９】
ある好ましい実施形態では、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる、１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ又は複数の突然変異
を含む可変Ｆｃ領域を有するＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を包含する。
【０１４０】
血清半減期が増大した本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、好ましいＩｇＧ１配列は、置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを含む（配列番号８０）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１４１】
上述のように、配列番号８０のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、２３４位及び２３５位におけるアラニンでの置換を含み、これにより、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１）が呈する結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）に対する結合が低下した（又はこれらに結合しない）Ｆｃ領域を形成する。本発明はまた、Ｆｃ領域のエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修飾する代替的な及び／又は追加の残基を含む、上述のようなＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。
【０１４２】
血清半減期が増大した本発明のＦｃ領域含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ４配列は、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（配列番号８１）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGX
を含み、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１４３】
Ｆｃ領域含有第１及び第３のポリペプチド鎖が同一ではない特定の抗体、ダイアボディ及び３価結合分子に関して、２つの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３のドメイン間、又は２つの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の突然変異は、Ｆｃ領域を形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。
【０１４４】
好ましいノブは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃ領域含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性ヘテロ二量体は、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持第３のポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
【０１４５】
本発明のＦｃ領域含有分子の第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号４４）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１４６】
２つのポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖）を有する、本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号４５）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１４７】
上述のように、配列番号４４及び配列番号４５のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位及び２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃ領域を形成する。本発明はまた、野生型アラニン残基、Ｆｃ領域のエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替的な及び／又は更なる置換を含む、このようなＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ又は複数の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に上述のように本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０１４８】
本発明のＦｃ領域含有分子の第１のポリペプチド鎖の、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含むＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号８２）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１４９】
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖）の、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含むＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、好ましいＩｇＧ１アミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号８３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１５０】
本発明のＦｃ領域含有分子の第１のポリペプチド鎖の、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含むＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、好ましいＩｇＧ４アミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号８４）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSLGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１５１】
２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖）の、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含むＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する、好ましいＩｇＧ４アミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号８５）：
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSLGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１５２】
後に記載されるように、配列番号８４及び配列番号８５のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ置換を含み、従って血清半減期の増大を呈するＩｇＧ４  Ｆｃ領域を形成する。本発明はまた、野生型Ｍ２５２／Ｓ２５４／Ｔ２５６残基を含むＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０１５３】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号４４のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４５）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４４）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃ領域含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃ領域含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
【０１５４】
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを備える、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性結合分子を包含する。
【０１５５】
ＶＩ．抗ＰＤ‐１結合能力
ＰＤ‐１に対して免疫特異的な抗体は公知である（例えば米国特許出願第６２／１９８，８６７号；米国特許出願第６２／２３９，５５９号：米国特許出願第６２／２５５，１４０号；米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第８，５５２，１５４号；国際公開第２０１２／１３５４０８号；国際公開第２０１２／１４５５４９；及び国際公開第２０１３／０１４６６８号を参照）。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の生成において有用な好ましいＰＤ‐１結合能力は、ヒトＰＤ‐１（ＣＤ２７９）の連続した又は不連続の（例えば立体配置の）部分に結合でき、好ましくは１つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種（及び特にカニクイザル等の霊長類種）のＰＤ‐１分子への結合能力も呈する。更に望ましい抗体は、ＰＤ‐１又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌ハイブリドーマの単離によって作製してよい。代表的なヒトＰＤ‐１ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５００９．２；２０アミノ酸残基のシグナル配列（下線を付して示す）及び２６８アミノ酸残基の成熟タンパク質を含む）は、アミノ酸配列（配列番号４６）：
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWRPGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA 
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL 
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE 
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI 
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT 
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL 
を含む。
【０１５６】
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の生成において有用な好ましい抗ＰＤ‐１結合分子（例えば抗体）は、抗ヒトＰＤ‐１モノクローナル抗体「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １」（ニボルマブ、ＣＡＳ登録番号：９４６４１４‐９４‐４、５Ｃ４、ＢＭＳ‐９３６５５８、ＯＮＯ‐４５３８、ＭＤＸ‐１１０６としても公知、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂによってＯＰＤＩＶＯ（登録商標）として市販）；「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２」（ペンブロリズマブ（旧名ランブロリズマブ）ＣＡＳ登録番号：１３７４８５３‐９１‐４、ＭＫ‐３４７５、ＳＣＨ‐９００４７５としても公知、ＭｅｒｃｋによってＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）として市販）；「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３」（ＥＨ１２．２Ｈ７；Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ）、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４」（ピジリズマブ、ＣＡＳ登録番号：１０３６７３０‐４２‐３、ＣＴ‐０１１としても公知、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）又は表６の抗ＰＤ‐１抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し；より好ましくは、このような抗ＰＤ‐１モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。本発明の方法及び組成物において有用な固有の結合特性を有する追加の抗ＰＤ‐１抗体が、最近同定された（米国特許出願第６２／１９８，８６７号；６２／２３９，５５９号；米国特許出願第６２／２５５，１４０号を参照）。特に好ましいのは、抗ＰＤ‐１抗体「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５」（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６」（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７」（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；又は「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８」（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）のヒト化ＶＨ及び／又はＶＬドメインを有し；より好ましくは、このような抗ＰＤ‐１モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する、ＰＤ‐１結合分子である。
【０１５７】
Ａ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV 
IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND 
DYWGQGTLVT VSS
【０１５８】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ 
GTKVEIK
【０１５９】
Ｂ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号４９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG 
INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD 
YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
【０１６０】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL 
LIYLASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL 
TFGGGTKVEIK
【０１６１】
Ｃ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIHWVKQR PGQGLEWIGY 
IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR 
DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS
【０１６２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL 
LIKFGSNLES GIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQHSWEIPY 
TFGGGTKLEI K
【０１６３】
Ｄ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW 
INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG 
YDALDYWGQG TLVTVSS
【０１６４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT 
SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG 
TKLEIK
【０１６５】
Ｅ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY 
ISSGSMSISY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCASLS 
DYFDYWGQGT TVTVSS
【０１６６】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPQ 
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQTTHVP 
WTFGQGTKLE IK
【０１６７】
Ｆ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWXGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS 
ここでＸ1はＩ又はＡである。
【０１６８】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号５８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRAX1ESVDNYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNX2GS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI K
ここで；Ｘ1はＮ若しくはＳであり、Ｘ2はＱ若しくはＲであり；又はＸ1はＮであり、Ｘ2はＱであり；又はＸ1はＳでありＸ2はＱであり；又はＸ1はＳであり、Ｘ2はＲである。
【０１６９】
特定の実施形態では、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のアミノ酸配列は：
（ａ）配列番号５７、ただしＸ1はＩである；及び配列番号５８、ただしＸ1はＮであり、Ｘ2はＱである；又は
（ｂ）配列番号５７、ただしＸ1はＩである；及び配列番号５８、ただしＸ1はであり、Ｘ2はＱである
を含む。
【０１７０】
「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ」と呼ばれる例示的な抗ＰＤ‐１  ＶＨドメインは、配列番号５７（ただしＸ1はＩである）を含み、アミノ酸配列（配列番号８６）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
を有する。
【０１７１】
「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ」と呼ばれる例示的な抗ＰＤ‐１  ＶＬドメインは、配列番号５８（ただしＸ1はＳであり、Ｘ2はＱである）を含み、アミノ酸配列（配列番号８７）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI K
を有する。
【０１７２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨドメイン及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬドメインを有する例示的な抗ＰＤ‐１抗体は、「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＩＳＱ」と呼ばれる。
【０１７３】
Ｇ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号５９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LX1RPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVX2WVRQA PGKGLEWX3AT 
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSX4RAED TATYYCARYG 
FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
ここでＸ1はＶ若しくはＡであり、Ｘ2はＳ若しくはＧであり、Ｘ3はＶ若しくはＴであり、Ｘ4はＬ若しくはＡであるか；又はＸ1はＶであり、Ｘ2はＳであり、Ｘ3はＶであり、Ｘ4はＬであるか；又はＸ1はＡであり、Ｘ2はＧであり、Ｘ3はＴであり、Ｘ4はＡである。
【０１７４】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY X1YLAWYQQKP GKAPKLLIYX2 
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ 
GTKLEIK
ここで：Ｘ1はＳ若しくはＮであり、Ｘ2はＮ若しくはＤであるか；又はＸ1はＳであり、Ｘ2はＮであるか；又はＸ1はＮであり、Ｘ2はＤである。
【０１７５】
好ましい実施形態では、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７は：
（ａ）配列番号５９、ただしＸ1はＶであり、Ｘ2はＳであり、Ｘ3はＶであり、Ｘ4はＬである；及び配列番号６０、ただしＸ1はＳであり、Ｘ2はＮである；又は
（ｂ）配列番号５９、ただしＸ1はＡであり、Ｘ2はＧであり、Ｘ3はＴであり、Ｘ4はＡである；及び配列番号６０、ただしＸ1はＮであり、Ｘ2はＤである
を含む。
【０１７６】
Ｈ．ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLISWVRQA PGKGLEWVAA 
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARRG 
TYAMDYWGQG TLVTVSS
【０１７７】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD 
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ 
GTKLEIK
【０１７８】
Ｉ．更なる抗ＰＤ‐１抗体
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の生成に利用できる更なる抗ＰＤ‐１抗体を、表６に提供する。
【０１７９】
【表６】
2019506444.tif 000008
【０１８０】
Ｊ．例示的な抗ＰＤ‐１抗体
「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ」と呼ばれる例示的な抗ＰＤ‐１抗体は：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６ＩのＶＨドメイン（配列番号８６）と、ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号４２）と、安定化ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号３６）と、Ｃ末端リシンを有しないＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）とを有する重鎖；及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６ＳＱのＶＬドメイン（配列番号８７）とκＣＬ（配列番号３８）とを有する軽鎖を含む。
【０１８１】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６Ｇ４Ｐの完全な重鎖のアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTKTY 
TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL 
MISRTPEVTC VVVDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR 
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL 
PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD 
GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
【０１８２】
ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの完全な軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８９）を以下に示す：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 
THQGLSSPVT KSFNRGEC
【０１８３】
ＶＩＩ．抗ＣＴＬＡ‐４結合能力
ＣＴＬＡ‐４に対して免疫特異的な抗体は公知である（例えば米国特許第６，９８４，７２０号；米国特許第６，６８２，７３６号；米国特許第７，０３４，１２１号；米国特許第７，１０９，００３号；米国特許第７，１３２，２８１号；米国特許第７，４１１，０５７号；米国特許第７，６０５，２３８号；米国特許第７，８０７，７９７号；米国特許第７，８２４，６７９号；米国特許第８，０１７，１１４号；米国特許第８，１４３，３７９号；米国特許第８，３１８，９１６号；米国特許第８，４９１，８９５号；米国特許第８，７８４，８１５号；及び米国特許第８，８８３，９８４号；米国公開特許第２００９／０１２３４７７号；米国公開特許第２００９／０２５２７４１号；及び米国公開特許第２０１４／０１０５９１４号；国際公開第００／３７５０４号；国際公開第０１／１４４２４号；国際公開第０１／５４７３２号；国際公開第２００６／０２９２１９号；国際公開第２００６／０６６５６８号；及び国際公開第２０１２／１２０１２５号；並びに表７）。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の生成において有用な好ましいＣＴＬＡ‐４結合能力は、ヒトＣＴＬＡ‐４の連続した又は不連続の（例えば立体配置の）部分に結合でき、好ましくは１つ又は複数の非ヒト種、特に霊長類種（及び特にカニクイザル等の霊長類種）のＣＴＬＡ‐４分子への結合能力も呈する。更に望ましい抗体は、ＣＴＬＡ‐４又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌ハイブリドーマの単離によって作製してよい。代表的なヒトＣＴＬＡ‐４ポリペプチド（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５２０５．２；３５アミノ酸残基のシグナル配列（下線を付して示す）及び１８８アミノ酸残基の成熟タンパク質を含む）は、アミノ酸配列（配列番号７５）：
MACLGFQRHK AQLNLATRTW PCTLLFFLLF IPVFCKAMHV AQPAVVLASS 
RGIASFVCEY ASPGKATEVR VTVLRQADSQ VTEVCAATYM MGNELTFLDD 
SICTGTSSGN QVNLTIQGLR AMDTGLYICK VELMYPPPYY LGIGNGTQIY 
VIDPEPCPDS DFLLWILAAV SSGLFFYSFL LTAVSLSKML KKRSPLTTGV 
YVKMPPTEPE CEKQFQPYFI PIN
を含む。
【０１８４】
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の生成において有用な好ましい抗ＣＴＬＡ‐４結合分子（例えば抗体）は、抗ヒトＣＴＬＡ‐４モノクローナル抗体「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １」（イピリムマブ、ＣＡＳ登録番号：４７７２０２‐００‐９、ＭＤＸ０１０としても公知、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂによってＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として市販）；「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２」（トレメリムマブ、ＣＡＳ登録番号：７４５０１３‐５９‐６、CP‐６７５２０６としても公知）；「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３」（表７で提供される４Ｂ６）又は表７の他の抗ＣＴＬＡ‐４抗体のうちのいずれの、ＶＬ及び／又はＶＨドメインを有し；より好ましくは、このような抗ＣＴＬＡ‐４モノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又はＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有する。
【０１８５】
Ａ．ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF 
ISYDGNNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG 
WLGPFDYWGQ GTLVTVSS
【０１８６】
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIK
【０１８７】
Ｂ．ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAV 
IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP 
RGATLYYYYY GMDVWGQGTT VTVSS
【０１８８】
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIN SYLDWYQQKP GKAPKLLIYA 
ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYSTPFTFGP 
GTKVEIK
【０１８９】
Ｃ．ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF 
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG 
WLGPFDYWGQ GTLVTVSS
【０１９０】
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９１）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示す）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIK
【０１９１】
Ｄ．更なる抗ＰＤ‐１抗体
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の生成に利用できる更なる抗ＣＴＬＡ‐４抗体を、表７に提供する。
【０１９２】
【表７】
2019506444.tif 000009
【０１９３】
Ｅ．例示的な抗ＣＴＬＡ‐４抗体
「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ」と呼ばれる例示的な抗ＣＴＬＡ‐４抗体は、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）と、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号４０）と、ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３３）と、置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含むＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４３）とを有する重鎖を含む。
【０１９４】
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡの完全な重鎖のアミノ酸配列（配列番号９２）を以下に示す。
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF 
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG 
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD 
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 
TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 
SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
【０１９５】
「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ」と呼ばれる例示的な抗ＣＴＬＡ‐４抗体の代替例は、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）と、ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号４２）と、安定化ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号３６）と、Ｃ末端リシンを有しないＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号４）とを有する重鎖を含む。ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐの完全な重鎖のアミノ酸配列（配列番号９３）を以下に示す。
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF 
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG 
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY 
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT 
CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM 
ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV 
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP 
PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG 
SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLG
【０１９６】
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐの完全な軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９４）を以下に示す。
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK 
VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ 
GLSSPVTKSF NRGEC
【０１９７】
例示的な抗ＣＴＬＡ‐４抗体であるＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐはいずれも、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）及びκＣＬ（配列番号３８）を有する軽鎖を含む。
【０１９８】
ＶＩＩＩ．例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子
Ａ．Ｅ／Ｋコイルを有する例示的な４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディ
Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える、３つの例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディを生成した（「ＤＡＲＴ  Ｂ」、「ＤＡＲＴ  Ｃ」及び「ＤＡＲＴ  Ｄ」と呼ぶ）。これらのＦｃ領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。これらの例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４ダイアボディは本発明の範囲の例示を目的としており、本発明の範囲の限定は全く意図していない。
【０１９９】
１．ＤＡＲＴ  Ｂ
ＤＡＲＴ  Ｂは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な２つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｂの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １  ＶＬ）（配列番号７７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号８１）；及びＣ末端を備える。
【０２００】
ＤＡＲＴ  Ｂの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号９５）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVG SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM 
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS 
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV 
AALEKEVAAL EKEVAALEKE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD 
TLYITREPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST 
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY 
TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 
SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
である。
【０２０１】
ＤＡＲＴ  Ｂの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １  ＶＨ）（配列番号７６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１）；及びＣ末端を備える。
【０２０２】
ＤＡＲＴ  Ｂの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号９６）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGNNKYYA DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL 
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGKVAACKE 
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
【０２０３】
２．ＤＡＲＴ  Ｃ
ＤＡＲＴ  Ｃは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な２つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｃの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号８１）；及びＣ末端を備える。
【０２０４】
ＤＡＲＴ  Ｃの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号９７）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM 
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS 
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV 
AALEKEVAAL EKEVAALEKE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD 
TLYITREPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST 
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY 
TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 
SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
である。
【０２０５】
ＤＡＲＴ  Ｃの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１）；及びＣ末端を備える。
【０２０６】
ＤＡＲＴ  Ｃの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号９８）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL 
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGKVAACKE 
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
【０２０７】
３．ＤＡＲＴ  Ｄ
ＤＡＲＴ  Ｄは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な２つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｄの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号８１）；及びＣ末端を備える。
【０２０８】
ＤＡＲＴ  Ｄの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号９９）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL 
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGEVAACEK 
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP 
KDTLYITREP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN 
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ 
VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 
LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG
である。
【０２０９】
ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１）；及びＣ末端を備える。
【０２１０】
ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１００）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM 
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS 
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV 
AALKEKVAAL KEKVAALKE
である。
【０２１１】
４．ＤＡＲＴ  Ｆ
ＤＡＲＴ  Ｆは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な２つの結合部位、エフェクタ機能を低減／消去するため及び半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、並びにＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｆの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５））；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０））；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３３）；置換Ｌ２３５Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号８０）；及びＣ末端を備える。
【０２１２】
ＤＡＲＴ  Ｆの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０１）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL 
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSGGC GGGEVAACEK 
EVAALEKEVA ALEKEVAALE KLEPKSADKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF 
PPKPKDTLYI TREPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP 
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT 
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL 
SPG
である。
【０２１３】
ＤＡＲＴ  Ｆの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１）；及びＣ末端を備える。
【０２１４】
ＤＡＲＴ  Ｆの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１００）と同一である。
【０２１５】
Ｂ．ＣＬ／ＣＨ１ドメインを有する例示的な４鎖Ｆｃ領域含有ダイアボディ：ＤＡＲＴ  Ｅ
「ＤＡＲＴ  Ｅ」と呼ばれる、ＣＬ／ＣＨ１ドメインを備える、例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディを生成した。このＦｃ領域含有ダイアボディの構造を以下に詳述する。この例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４ダイアボディは本発明の範囲の例示を目的としており、本発明の範囲の限定は全く意図していない。
【０２１６】
ＤＡＲＴ  Ｅは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な２つの結合部位、及び半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域を有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディである。ＤＡＲＴ  Ｅの第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；介在リンカーペプチド（リンカー２：LGGGSG（配列番号８））；ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号４２）；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型（配列番号８１）；及びＣ末端を備える。
【０２１７】
ＤＡＲＴ  Ｅの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０２）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYSFTSYWM 
NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK STSTAYMELS 
SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSLGGGS GASTKGPSVF 
PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS 
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC 
PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV 
DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 
SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH 
EALHNHYTQK SLSLSLG
である。
【０２１８】
ＤＡＲＴ  Ｅの第２及び第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；介在リンカーペプチド（リンカー２： LGGGSG（配列番号8））；κＣＬドメイン（配列番号３８）；及びＣ末端を備える。
【０２１９】
ＤＡＲＴ  Ｅの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０３）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CAASGFTFSS 
YTMHWVRQAP GKGLEWVTFI SYDGSNKHYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL 
QMNSLRAEDT AIYYCARTGW LGPFDYWGQG TLVTVSSLGG GSGRTVAAPS 
VFIFPPSDEQ LKSGTASVVC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT 
EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 
である。
【０２２０】
Ｃ．Ｆｃ領域を含有する例示的な３価結合性分子
２つの例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有３価結合性分子を生成した（「ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ」及び「ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂ」と呼ばれる）。これらのＦｃ領域含有３価結合性分子の構造を以下に詳述する。以下では、「ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃ」と呼ばれる、生成され得る３鎖変異型も提示される。これらの例示的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４  ３価結合性分子は本発明の範囲の例示を目的としており、本発明の範囲の限定は全く意図していない。
【０２２１】
１．ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な１つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ノブ／ホール担持ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン、及びＣＬ／ＣＨ１ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有３価結合性分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０））；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ノブ担持ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号８４）；及びＣ末端を備える。
【０２２２】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０４）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS 
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM 
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE 
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKESKYGPPC PPCPAPEFLG GPSVFLFPPK 
PKDTLYITRE PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF 
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPSSIEKTI SKAKGQPREP 
QVYTLPPSQE EMTKNQVSLW CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 
VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSLG
である。
【０２２３】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端、ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１））；及びＣ末端を備える。
【０２２４】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０５）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS 
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM 
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAACK 
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
【０２２５】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；ＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン（配列番号４２）；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ホール担持ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号８１）；及びＣ末端を備える。
【０２２６】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０６）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF 
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG 
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY 
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT 
CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLY 
ITREPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV 
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP 
PSQEEMTKNQ VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG 
SFFLVSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNRYTQKSLS LSLG
である。
【０２２７】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；κＣＬドメイン（配列番号３８）；及びＣ末端を備える。
【０２２８】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０７）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK 
VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ 
GLSSPVTKSF NRGEC
である。
【０２２９】
２．ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂ
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な１つの結合部位、エフェクタ機能を低減／消去するため及び半減期を延長するために操作された変異型ノブ／ホール担持ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン、並びにＣＬ／ＣＨ１ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有３価結合性分子である。ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号２０））；リンカー（配列番号３１）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ノブ担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号８２）；及びＣ末端を備える。
【０２３０】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０８）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS 
YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM 
ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE 
KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGGDKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP 
KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
GK
である。
【０２３１】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端、ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬ）（配列番号８７）；介在リンカーペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨPD-1  ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨ）（配列番号８６）；システイン含有介在リンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１））；及びＣ末端を備える。
【０２３２】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１０５）と同一である。
【０２３３】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号４０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３３）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ホール担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号８３）；及びＣ末端を備える。
【０２３４】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１０９）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYTMHWVRQA PGKGLEWVTF 
ISYDGSNKHY ADSVKGRFTV SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAIYYCARTG 
WLGPFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY 
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI 
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD 
TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST 
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY 
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
である。
【０２３５】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；κＣＬドメイン（配列番号３８）；及びＣ末端を備える。
【０２３６】
ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１０７）と同一である。
【０２３７】
３．ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃ
本明細書において提示されるように、３つのポリペプチド鎖を含む３価結合性分子は、２つの別個のポリペプチド鎖の結合ドメインを１つの鎖へと組み合わせる（例えばエンコードヌクレオチドを融合する等）によって生成してよい。生成され得るある二重特異性、３鎖、Ｆｃ領域含有３価結合性分子は、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な１つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ノブ／ホール担持ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する（「ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃ」）。ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃの第１及び第２のポリペプチド鎖は、上述のＴＲＩＤＥＮＴ  Ａのものと同一であってよい。
【０２３８】
第１及び第２の鎖が上述のＴＲＩＤＥＮＴ  Ａのものと同一である場合、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶLCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＬ）（配列番号９１）；介在スペーサペプチド（GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号３７））；ＣＴＬＡ‐４に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨCTLA-4  ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  ＶＨ）（配列番号９０）；安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）；置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しない、ホール担持ＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号８５）；及びＣ末端を備えてよい。
【０２３９】
よって、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃの第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号１１０）：
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSFLAWYQQK PGQAPRLLIY 
GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 
QGTKVEIKGG GGSGGGGSGG GGSQVQLVES GGGVVQPGRS LRLSCAASGF 
TFSSYTMHWV RQAPGKGLEW VTFISYDGSN KHYADSVKGR FTVSRDNSKN 
TLYLQMNSLR AEDTAIYYCA RTGWLGPFDY WGQGTLVTVS SESKYGPPCP 
PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW 
YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG 
LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI 
AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV 
MHEALHNRYT QKSLSLSLG
である。
【０２４０】
ＩＸ．産生方法
最も好ましくは、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
【０２４１】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341‐347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid‐Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen‐Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131‐5135; Ganesan, A. (2006) “Solid‐Phase Synthesis In The Twenty‐First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3‐10）。
【０２４２】
ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知であり、また上述されている。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０２４３】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０２４４】
ポリペプチド、又はタンパク質を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
本発明は、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。
【０２４６】
本発明は、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等のポリペプチド、及び活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リジン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０２４７】
本発明は、本発明のポリペプチド又は抗体のうちの１つ又は複数を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４、並びにネイティブ分子内では上記抗体融合タンパク質が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列又は同種配列に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【０２４８】
Ｘ．本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性結合分子の使用
本発明は、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価結合性分子等）、このような分子由来のポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用剤を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
【０２４９】
既に議論したように、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４はいずれも、免疫応答（例えば免疫細胞増殖、機能及びホメオスタシス）の下方調節において重要な役割を果たす。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ＰＤ‐１機能を阻害する能力、従ってＰＤ‐１仲介型免疫系阻害を反転させる能力を有する。更に本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、ＣＴＬＡ‐４機能を阻害する能力、従ってＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４が仲介する免疫系阻害をブロックすることによって免疫系を増強能力を有する。また、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子により、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４の両方の完全なブロック、並びにＰＤ‐１と共発現した場合にはＣＴＬＡ‐４に対してバイアスがかけられるブロックが可能となる。よって、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、Ｔ細胞の枯渇の緩和、並びに／又は被検体の免疫応答（例えばＴ細胞及び／若しくはＮＫ細胞仲介型免疫応答）の増強に有用である。特に本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いて、病原体の存在に関連する癌及び疾患（例えば細菌、真菌、ウイルス又は原虫感染）を含む、望ましくない様式で抑制された免疫系に関連するいずれの疾患又は状態を治療できる。
【０２５０】
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子で治療できる癌としては、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌が挙げられる。本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０２５１】
特に本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、本発明の三重特異性結合分子は、結腸直腸癌、肝細胞癌、神経膠腫、腎臓癌、乳癌、多発性骨髄腫、膀胱癌、神経芽細胞腫；肉腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌及び直腸癌の治療に使用できる。
【０２５２】
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子で治療できる感染症としては、慢性ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫感染が挙げられる。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子で治療できる慢性感染としては：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（アスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアが挙げられる。
【０２５３】
ＸＩ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
【０２５４】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（pharmaceutically acceptable）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（carrier）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０２５５】
本発明はまた、単独の又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０２５６】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤及び／又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含むことができる
【０２５７】
ＸＩＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０２５８】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０２５９】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【０２６０】
本発明はまた、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の調製物を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０２６１】
凍結乾燥された本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の調製物は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このようなＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
【０２６２】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な調製物の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０２６３】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（effective amount）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。
【０２６４】
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な：癌細胞の殺滅及び／又は増殖の低減；癌の原発部位からの転移の進展の低減及び／又は遅延；感染病原体の存在（又はその影響）の増殖の低減；並びに病原体仲介型疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０２６５】
本発明に包含されるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被検体の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含されるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被検体の体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ以上である。
【０２６６】
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
【０２６７】
患者に投与される本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０２６８】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０２６９】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327参照）。
【０２７０】
本発明の組成物が、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子をエンコードする核酸である場合、この核酸は、この核酸がエンコードするＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Biolistic、Dupont）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０２７１】
治療的又は予防的有効量の本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。あるいはこの医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【０２７２】
ＸＩＩＩ．例示的実施形態
本発明は、実施形態Ｅ１〜Ｅ４を特に対象とする：
Ｅ１．ＰＤ‐１の１つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ又は複数のエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４の１つ以上のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ又は複数のエピトープ結合部位との両方を有する、二重特異性分子であって、
上記分子は：
（Ａ）ＰＤ‐１に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン；並びに
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４に結合する抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を備え、
ここで上記分子は：
（ｉ）２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；又は
（ｉｉ）３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合性分子
である、二重特異性分子。
Ｅ２．上記分子は、一方がＰＤ‐１に結合する上記抗体の上記重鎖可変ドメイン及び上記軽鎖可変ドメインを有し、もう一方がＣＴＬＡ‐４に結合する上記抗体の上記重鎖可変ドメイン及び上記軽鎖可変ドメインを有する、２つの単一特異性分子によって呈される活性に対して、増強された活性を呈する、実施形態Ｅ１の二重特異性分子。
Ｅ３．上記分子は、それを必要とする被検体に投与した場合に、ＣＴＬＡ‐４に結合する単一特異性抗体の投与によって誘発される免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）よりも少ないｉｒＡＥを誘発する、実施形態Ｅ１又はＥ２の二重特異性分子。
Ｅ４．ＣＴＬＡ‐４に結合する上記単一特異性抗体は、イピリムマブである、実施形態３の二重特異性分子。
Ｅ５．上記分子はＦｃ領域を備える、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ６．上記Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域であって：
（Ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾；及び／又は
（Ｂ）上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を備える変異型Ｆｃ領域である、実施形態５の二重特異性分子。
Ｅ７．ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃ領域の親和性を低減する上記修飾は、Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（上記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である）の置換を含む、実施形態Ｅ６の二重特異性分子。
Ｅ８．上記変異型Ｆｃ領域の血清半減期を向上させる上記修飾は、Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ（上記番号付与はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスの番号付与である）の置換を含む、実施形態Ｅ６又はＥ７の二重特異性分子。
Ｅ９．上記分子は上記ダイアボディであり、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ１０．上記分子は上記３価結合性分子であり、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか１つの二重特異性分子の実施形態に関する。
Ｅ１１．上記分子は、上記細胞表面上に存在するＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に結合できる、実施形態Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ１２．上記分子は、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に同時に結合できる、実施形態Ｅ１〜Ｅ１１のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ１３．上記分子は、免疫細胞の刺激を促進する、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ１４．上記免疫細胞の刺激は：
（Ａ）免疫細胞増殖；並びに／又は
（Ｂ）免疫細胞産生及び／若しくは少なくとも１つのサイトカインの放出；並びに／又は
（Ｃ）免疫細胞産生及び／若しくは少なくとも１つの溶解性分子の放出；並びに／又は
（Ｄ）少なくとも１つの活性化マーカの、免疫細胞発現
をもたらす、実施形態Ｅ１３の二重特異性分子。
Ｅ１５．上記免疫細胞はＴリンパ球又はＮＫ細胞である、実施形態Ｅ１３又はＥ１４の二重特異性分子。
Ｅ１６．ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位は：
（Ａ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号４７）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号４８）；又は
（Ｂ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン（配列番号４９）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン（配列番号５０）；又は
（Ｃ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号５１）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号５２）；又は
（Ｄ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＨドメイン（配列番号５３）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４のＶＬドメイン（配列番号５４）；又は
（Ｅ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＨドメイン（配列番号５５）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５のＶＬドメイン（配列番号５６）；又は
（Ｆ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン（配列番号５８）；又は
（Ｇ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨのＶＨドメイン（配列番号８６）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱ  ＶＬのＶＬドメイン（配列番号８７）；又は
（Ｈ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＨドメイン（配列番号５９）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７のＶＬドメイン（配列番号６０）；又は
（Ｉ）ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＨドメイン（配列番号６１）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８のＶＬドメイン（配列番号６２）
を備える、実施形態Ｅ１〜Ｅ１５のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ１７．ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ以上の上記エピトープ結合部位は：
（Ａ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＨドメイン（配列番号７６）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １のＶＬドメイン（配列番号７７）；又は
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＨドメイン（配列番号７８）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２のＶＬドメイン（配列番号７９）；又は
（Ｃ）ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）
を備える、実施形態Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ１８．（Ａ）ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合できる上記エピトープ結合部位が、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐Ｉ  ＶＨのＶＨドメイン（配列番号８６）及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６‐ＳＱのＶＬドメイン（配列番号８７）を備え；
（Ｂ）ＣＴＬＡ‐４のエピトープに免疫特異的に結合できる１つ以上の上記エピトープ結合部位が、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン（配列番号９０）及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン（配列番号９１）を備える、実施形態Ｅ１７の二重特異性分子。
Ｅ１９．前記分子は：
（Ａ）配列番号９５を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号９６を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｂ）配列番号９７を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号９８を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｃ）配列番号９９を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１００を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｄ）配列番号１０２を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０３を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｅ）配列番号１０１を有する２つのポリペプチド鎖、及び配列番号１００を有する２つのポリペプチド鎖；又は
（Ｆ）配列番号１０４を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０５を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０６を有する１つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０７を有する１つのポリペプチド鎖；又は
（Ｇ）配列番号１０８を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０５を有する１つのポリペプチド鎖、配列番号１０９を有する１つのポリペプチド鎖、及び配列番号１０７を有する１つのポリペプチド鎖
を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ２０．有効量の、実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つの二重特異性分子のうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
Ｅ２１．上記分子は、それを必要とする被検体の免疫仲介性応答の刺激を促進するために使用される、実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ２２．上記分子は、抑制された免疫系に関連する疾患又は状態の治療に使用される、実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つの二重特異性分子。
Ｅ２３．上記疾患又は状態は、癌又は感染症である、実施形態Ｅ２２の二重特異性分子。
Ｅ２４．上記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌の細胞からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、実施形態Ｅ２３の二重特異性分子。
Ｅ２５．上記感染症は、バクテリア性、菌類性、ウイルス性及び寄生虫性病原体の存在を特徴とする、実施形態Ｅ２４の二重特異性分子。
Ｅ２６．上記感染症は：エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；ヘルペスウイルス（例えばＨＳＶ‐１、ＨＳＶ‐２、ＨＨＶ‐６、ＣＭＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）；桿菌；シトロバクター；コレラ；ジフテリア；エンテロバクター；淋菌；ヘリコバクター・ピロリ；クレブシエラ；レジオネラ；髄膜炎菌；マイコバクテリア；シュードモナス；肺炎球菌；リケッチア細菌；サルモネラ；セラチア；ブドウ球菌；連鎖球菌；破傷風；アスペルギルス（フミガーツス、クロコウジカビ等）；ブラストミセス・デルマチチジス；カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス；ムコラエ属（ケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）；スポロスリックス・シェンキー；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；コクシジオイデス・イムチス；ヒストプラスマ・カプスラツム；レプトスピラ症；ボレリア・ブルグドルフェリ；蠕虫性寄生虫（鉤虫、条虫、吸虫、扁虫（例えば住血吸虫））；ランブル鞭毛虫；トリキネラ属；二核アメーバ；トリパノソーマ・ブルセイ；トリパノソーマ・クルージ；及びドノバン・リーシュマニアの存在を特徴とする、実施形態Ｅ２５の二重特異性分子。
【実施例】
【０２７３】
ここまで本発明について概説したが、以下の例を参照することによって本発明を更に容易に理解できるだろう。以下の実施例は、本発明の診断又は治療方法における組成物に関する様々な方法を例示したものである。これらの実施例は、本発明の範囲を例示することを意図しており、限定を意図したものではない。
【０２７４】
実施例１  二重特異性分子は、免疫応答の刺激の増強を提供する
２つの免疫調節経路を調節する別個の細胞表面タンパク質、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に対する特異性を有する二重特異性分子を生成し、「ＤＡＲＴ  Ａ」と命名した。
【０２７５】
ＤＡＲＴ  Ａは、ＰＤ‐１に対して特異的な２つの結合部位、ＬＡＧ‐３に対して特異的な２つの結合部位、半減期を延長するために操作された変異型ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、及びシステイン含有Ｅ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを有する、二重特異性、４鎖、Ｆｃ領域含有ダイアボディである。以下で更に詳細に提示するように、ＤＡＲＴ  Ａは、ヒト化抗ＰＤ‐１抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６）及びヒト化抗ＬＡＧ‐３抗体（ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １）の結合特異性（即ちＶＨ及びＶＬドメイン）を備える。ＤＡＲＴ  Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６３）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SVVAWYQQKP GKAPKLLIYS 
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG 
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN 
WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS 
LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA 
ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT 
LYITREPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY 
RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT 
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 
DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
である。
【０２７６】
配列番号６３において、アミノ酸残基１〜１０７は、ＬＡＧ‐３に結合できるヒト化モノクローナル抗体（ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １）のＶＬドメインのアミノ酸配列に対応し；残基１０８〜１１５は、介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））に対応し；残基１１６‐２３４は、ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６）のＶＨドメイン（配列番号５７、ただしＸ1はＩ）に対応し；残基２３５〜２４０介在スペーサペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））に対応し；残基２４１〜２６８は、システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（ＥＶＡＡＣＥＫ‐ＥＶＡＡＬＥＫ‐ＥＶＡＡＬＥＫ‐ＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号２０））に対応し；残基２６９〜２８０は、安定化ＩｇＧ４ヒンジ領域（配列番号３６）に対応し；残基２８１〜４９６は、置換Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを含みかつＣ末端残基を有しないＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの変異型に対応する。
【０２７７】
ＤＡＲＴ  Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６４）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 
YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM 
ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC GGGKVAACKE 
KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
である。
【０２７８】
配列番号６４において、アミノ酸残基１〜１１１は、ＰＤ‐１に結合できるモノクローナル抗体（ｈＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６）のＶＬドメイン（配列番号５８、ただしＸ１はＳであり、Ｘ2はＱである）に対応し；残基１１２〜１１９は、介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号５））に対応し；残基１２０〜２３７は、ＬＡＧ‐３に結合できるヒト化モノクローナル抗体（ｈＬＡＧ‐３  ｍＡｂ  １）のＶＨドメインに対応し；残基２３８〜２４３は、システイン含有スペーサリンカーペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号６））に対応し；残基２４４〜２７１は、システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号２１））に対応する。
【０２７９】
ＤＡＲＴ  Ａの、Ｔ細胞を刺激する能力を、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型（「ＳＥＢ」）アッセイで検査した。ＳＥＢは、ＳＥＢ応答ドナーにおいて、高い割合のＴ細胞（５〜３０％）を活性化できる、微生物超抗原である。ＳＥＢは、ペプチド結合溝（grove）の外側でＭＨＣ  ＩＩに結合するため、ＭＨＣ  ＩＩ依存性であるが、制限されておらず、またＴＣＲ仲介性でもない。Ｔ細胞のＳＥＢ刺激により、オリゴクローナルＴ細胞増殖及びサイトカイン産生がもたらされる（ただしドナーによる変動は観察され得る）。ＳＥＢ刺激の４８時間以内に、ＰＢＭＣはＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３を上方制御し、ＳＥＢ刺激を用いた９６ウェルプレート内での２次培養の５日目には更なる増強が観察される。ＰＢＭＣのＳＥＢ刺激に続く免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３の上方制御は、ＳＥＢ再刺激時のサイトカイン放出を制限する。ＤＡＲＴ  Ａの、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力を検査し、親抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体の単独での及び組み合わせた場合の活性と比較した。
【０２８０】
簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、製造元の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（GE Healthcare）密度勾配遠心法を用いて、健康なドナーからインフォームドコンセントのもとで得た全血から精製し、続いて製造元の指示に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）非接触ヒトＴ細胞キット（Life Technologies）を用いて、Ｔ細胞を精製した。精製したＰＢＭＣを、Ｔ‐２５バルクフラスコ中のＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、単独で、又は０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Sigma‐Aldrich）と共に（一次刺激）、２〜３日間培養した。ＳＥＢ刺激の第１ラウンドの終了時、ＰＢＳを用いてＰＢＭＣを２回洗浄して、培地単独、対照抗体を含む培地、０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢを含み抗体を含まない培地（二次刺激）、又はＳＥＢ及びＤＡＲＴ  Ａ、対照ＩｇＧ又は抗ＰＤ‐１抗体±抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂを含む培地中に、１〜５×１０5細胞／ウェルの濃度で９６ウェル組織培養プレートに播種し、更に２〜３日間培養した。二次刺激の終了時、上清を採取し、製造元の指示に従って、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐４（R&D Systems）用のヒトＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキットを用いてサイトカイン分泌を測定した。
【０２８１】
これらのアッセイにおいて、ＤＡＲＴ  Ａ（ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子）、並びに抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体は、０．００６１、０．０２４、０．０９、０．３９、１．５６、６．２５又は２５ｎＭの濃度で使用された。これらの研究に関して、抗体の組み合わせを用いる場合、各抗体を指示されている濃度で提供するため、抗体の合計濃度は、各抗体に関して使用される濃度の２倍（即ち、０．０１２２、０．０４８、０．１８、０．７８、３．１２、１２．５又は５０ｎＭ）となる。図７は、代表的なドナー（Ｄ：５６０４１）由来のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからの、ＩＦＮγ分泌プロファイルを示す。代替的なＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３抗体からのＶＨ／ＶＬドメインを備えるＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子、並びに代替的な構造を有するＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子（例えば図３Ｃ参照）、並びに多数のドナーに関して、同様の結果が観察された。
【０２８２】
これらの研究の結果は、ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３二重特異性分子が、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ産生を、再刺激時に劇的に増強したことを実証する。これらの結果は、２つの免疫調節経路を標的とする二重特異性分子が、同一の経路を標的とする別個の抗体の組み合わせよりも強力であったことを示す。
【０２８３】
実施例２  ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子
本明細書で提供され、かつ当該技術分野において公知の方法を用いて、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に対する特異性を有する二重特異性分子を生成した。いくつかのＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のポリペプチド鎖の一般構造を表８に提示する。特に、ＰＤ‐１に対する１つの結合部位及びＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位を有する２つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性２価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型Ｉの一般構造を有する（例えば図１も参照）。ＰＤ‐１に対する１つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位及びＦｃ領域を有する３つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性２価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型ＩＩの一般構造を有する（例えば図４Ａも参照）。ＰＤ‐１に対する２つの同一の結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対する２つの同一の結合部位及びＦｃ領域を有する４つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性３価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型ＩＩＩ又はＩＶの一般構造を有する（例えば図３Ａ〜３Ｃも参照）。更に、ＰＤ‐１に対する２つの結合部位及びＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位（又はＣＴＬＡ‐４に対する２つの結合部位及びＰＤ‐１に対する１つの結合部位）並びにＦｃ領域を有する４つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性３価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型Ｖの一般構造を有する（例えば図６Ａも参照）。更に、ＰＤ‐１に対する１つの結合部位、ＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位及びＦｃ領域を有する４つのポリペプチド鎖を含む、二重特異性２価ダイアボディ分子を生成でき、ここでは上記ポリペプチド鎖は、変異型ＶＩの一般構造を有する（例えば米国特許第７，６９５，９３６号、及び国際公開第２０１１／１４３５４５号も参照）。
【０２８４】
【表８】
2019506444.tif 000010
【０２８５】
表８に提示された二重特異性分子の各変異型に関して：
（ａ）ＶＬ１及びＶＨ１は、抗ＰＤ‐１抗体の可変ドメインであり、ＶＬ２及びＶＨ２は、抗ＣＴＬＡ‐４抗体の可変ドメインである；又は
（ｂ）ＶＬ１及びＶＨ１は、抗ＣＴＬＡ‐４抗体の可変ドメインであり、ＶＬ２及びＶＨ２は、抗ＰＤ‐１抗体の可変ドメインである。
変異型Ｖ及びＶＩに関しては：ＶＬ３及びＶＨ３は抗ＰＤ‐１抗体の可変ドメインであるか、又は抗ＣＴＬＡ‐４抗体の可変ドメインである。
【０２８６】
このような二重特異性分子の生成に有用なリンカー、ヘテロ二量体促進ドメイン及び定常領域（例えばＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）が上で提示されている。特に、ここで詳述されるように、第１及び第３のポリペプチド鎖が同一ではない分子に関して、例えばＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの一方の鎖を「ホール」を含むように修飾し、かつ上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのもう一方の鎖を「ノブ」を含むように修飾することによって、ヘテロ二量体化を促進してホモ二量体化を低減又は防止するように、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを修飾する。上で詳述したように、ヒンジ及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、二重特異性分子を安定化させる、及び／又はエフェクタ機能を変更する、及び／又は血清半減期を増進させる、アミノ酸置換を含んでよい。
【０２８７】
実施例３  汎用二重特異性アダプタ（Universal Bispecific Adaptor：ＵＢＡ）分子
あるいは、ＰＤ‐１（又はＣＴＬＡ‐４）に特異的に結合する１つのエピトープ結合部位、及びヘプタン、例えばフルオレセインイソチオシアネート（フルオロイソチオシアネート又はＦＩＴＣとしても公知）に特異的に結合する第２のエピトープ結合部位を備える、二重特異性分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価結合性分子等）を構成してよい。このような二重特異性分子は、ＰＤ‐１（又はＣＴＬＡ‐４）に対して特異的な結合ドメインを、ＣＴＬＡ‐４（又はＰＤ‐１）に対して特異的なフルオレセイン連結結合分子（例えば、抗体、ｓｃＦｖ等）と共連結させることができる、汎用二重特異性アダプタ（「ＵＢＡ」）分子として作用する。例えばこのような汎用二重特異性アダプタ分子のＦＩＴＣ反応性アームを用いて、ＣＴＬＡ‐４（又はＰＤ‐１）に結合するＦＩＴＣ標識抗体に結合することにより、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に適合された汎用二重特異性アダプタ分子を生成できる。このような汎用二重特異性アダプタ分子は、二重特異性分子の迅速な評価に有用である。
【０２８８】
抗フルオレセイン抗体、４‐４‐２０（「ｍＡｂ  ４‐４‐２０」）を、ＦＩＴＣ特異的結合ドメインのソースとして採用してよい（Gruber、M. et al.（1994）“Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli,” J. Immunol. 152(11): 5368‐5374）。
【０２８９】
ｍＡｂ  ４‐４‐２０の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号６５）は、以下の通りである（ＣＤＲH残基には下線が付されている）：
EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ 
IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG 
SYYGMDYWGQ GTSVTVSS
【０２９０】
ｍＡｂ  ４‐４‐２０の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）は、以下の通りである（ＣＤＲL残基には下線が付されている）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IK
【０２９１】
本明細書において提示される二重特異性フォーマットのいずれを利用してよい（例えば表１、２、３及び４を参照）。好ましい二重特異性分子は、ヘプタン（例えばフルオレセイン）結合部位を１つだけ備え、単一のヘプタン標識抗体に結合することになり、これにより、結果として得られる複合体において、汎用二重特異性アダプタ分子とヘプタン標識抗体との非が１：１となる。このような汎用二重特異性アダプタ分子は、例えば抗ＰＤ‐１抗体及び抗フルオレセイン抗体のＶＬ及びＶＨドメインを用いて、構成してよい。好ましくは、このような汎用二重特異性アダプタ分子は、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合ダイアボディ又は３価結合性分子である。構成され得る代表的な汎用二重特異性アダプタ分子を以下で提示する。
【０２９２】
Ａ．ＵＢＡ１
生成され得る１つの汎用二重特異性アダプタ分子は、１つのＰＤ‐１エピトープ結合部位及び１つのフルオレセイン結合部位を備える２つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合ダイアボディ（「ＵＢＡ１」）である。
【０２９３】
ＵＢＡ１の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；４‐４‐２０のＶＬドメイン（配列番号６６）；介在スペーサペプチド（リンカー１、GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７、ただしＸ1はＩである）；介在スペーサペプチド（リンカー２、GGCGGG（配列番号６））；Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１８）；及びＣ末端を備える。
【０２９４】
よって、ＵＢＡ１の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６７）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
である。
【０２９５】
ＵＢＡ１の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン（配列番号５８、ただしＸ1はＳであり、Ｘ2はＱである）；介在スペーサペプチド（リンカー１、GGGSGGGG（配列番号５））；ｍＡｂ  ４‐４‐２０のＶＨドメイン（配列番号６５））；介在スペーサペプチド（リンカー２、GGCGGG（配列番号６））；Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号１９）；及びＣ末端を備える。
【０２９６】
よって、ＵＢＡ１の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６８）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGGSGGGG EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS 
DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS 
VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDYWGQ GTSVTVSSGG CGGGKVAALK 
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
である。
【０２９７】
Ｂ．ＵＢＡ２
上で提示したように、ＵＢＡ１等のダイアボディの１つのポリペプチド鎖にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むことにより、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディを形成できる。よって、生成され得る第２の汎用二重特異性アダプタ分子は、２つのＰＤ‐１エピトープ結合部位、２つのフルオレセイン結合部位及びＦｃ領域を備える４つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合ダイアボディ（「ＵＢＡ２」）である。ＵＢＡ２は、上記２つのフルオレセイン結合部位を介して、２つのフルオレセイン標識分子に結合できることに留意されたい。
【０２９８】
ＵＢＡ２の第１及び第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ｍＡｂ  ４‐４‐２０のＶＬドメイン（配列番号６６）；介在スペーサペプチド（リンカー１、GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７、ただしＸ1はＩである）；介在スペーサペプチド（リンカー２、ＧＧＣＧＧＧ（配列番号７））；Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１８））；介在スペーサペプチド（リンカー３、GGGDKTHTCPPCP（配列番号３１））；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含むＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号４３、ただしＸはＫである）；及びＣ末端を備える。
【０２９９】
よって、ＵＢＡ２の第１及び第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号６９）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS 
PGK
である。
【０３００】
ＵＢＡ２の第２及び第４のポリペプチド鎖は、ＵＢＡ１の第２のポリペプチド鎖と同一である。よって、ＵＢＡ２の第２及び第４のポリペプチド鎖はそれぞれ、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
【０３０１】
Ｃ．ＵＢＡ  ３
生成され得る第３の汎用二重特異性アダプタ分子は、１つのＰＤ‐１エピトープ結合部位、１つのフルオレセイン結合部位及びＦｃ領域を備える３つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合ダイアボディ（「ＵＢＡ３」）である。
【０３０２】
ＵＢＡ３の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ｍＡｂ  ４‐４‐２０のＶＬドメイン（配列番号６６）；介在スペーサペプチド（リンカー１、GGGSGGGG（配列番号５））；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７、ただしＸ1はＩである）；介在スペーサペプチド（リンカー２、GGCGGG（配列番号６））；Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号１８））；介在スペーサペプチド（リンカー３、GGGDKTHTCPPCP（配列番号３１））；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む「ノブ担持」ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号４４、ただしＸはＫである）；及びＣ末端を備える。
【０３０３】
よって、ＵＢＡ３の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号７０）：
DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK 
VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP 
WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT 
SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY 
MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS 
PGK
である。
【０３０４】
ＵＢＡ３の第２のポリペプチド鎖は、ＵＢＡ１の第２のポリペプチド鎖と同一であってよい。よって、ＵＢＡ３の第２のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
【０３０５】
ＵＢＡ３の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；スペーサペプチド（リンカー３、DKTHTCPPCP（配列番号２６））；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む「ホール担持」ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号４５、ただしＸはＫである）；及びＣ末端を備える。
【０３０６】
よって、ＵＢＡ３の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号７１）：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
である。
【０３０７】
Ｄ．ＵＢＡ４
生成され得る第４の汎用二重特異性アダプタ分子は、２つのＰＤ‐１エピトープ結合部位、１つのフルオレセイン結合部位及びＦｃ領域を備える４つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合３価結合性分子（「ＵＢＡ４」）である。
【０３０８】
ＵＢＡ４の第１のポリペプチド鎖は、ＵＢＡ３の第１のポリペプチド鎖と同一である。よって、ＵＢＡ４の第１のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を有する。
【０３０９】
ＵＢＡ４の第２のポリペプチド鎖は、ＵＢＡ１の第２のポリペプチド鎖と同一である。よって、ＵＢＡ４の第２のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
【０３１０】
ＵＢＡ４の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７、ただしＸ1はＩである）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号４０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３３）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む「ホール担持」ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号４５、ただしＸはＫである）；及びＣ末端を備える。
【０３１１】
よって、ＵＢＡ４の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号７２）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV 
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH 
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 
YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY 
ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK 
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS 
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV 
YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL 
DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
である。
【０３１２】
ＵＢＡ４の第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン（配列番号５８、ただしＸ1はＳであり、Ｘ2はＱである）；ＣＬドメイン（例えばＩｇＧκドメイン（配列番号３８））；及びＣ末端を備える。
【０３１３】
よって、ＵＢＡ４の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号７３）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 
THQGLSSPVT KSFNRGEC
である。
【０３１４】
Ｅ．ＵＢＡ５
生成され得る第５の汎用二重特異性アダプタ分子は、２つのＰＤ‐１エピトープ結合部位、１つのフルオレセイン結合部位及びＦｃ領域を備える３つのポリペプチド鎖で構成される、共有結合３価結合性分子（「ＵＢＡ５」）である（例えば図６Ｃ〜６Ｄを参照）。
【０３１５】
ＵＢＡ５の第１のポリペプチド鎖は、ＵＢＡ３の第１のポリペプチド鎖と同一である。よって、ＵＢＡ５の第１のポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列を有する。
【０３１６】
ＵＢＡ５の第２のポリペプチド鎖は、ＵＢＡ１の第２のポリペプチド鎖と同一である。よって、ＵＢＡ５の第２のポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。
【０３１７】
ＵＢＡ５の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＬドメイン（配列番号５８、ただしＸ1はＳであり、Ｘ2はＱである）；介在スペーサペプチド（リンカー４、GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号37))；ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６のＶＨドメイン（配列番号５７、ただしＸ1はＩである）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン（配列番号４０）；ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号３３）；置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む「ホール担持」ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号４５、ただしＸはＫである）；及びＣ末端を備える。
【０３１８】
よって、ＵＢＡ５の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、（配列番号７４）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL 
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY 
TFGGGTKVEI KGGGGSGGGG SGGGGSQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA 
SGYSFTSYWM NWVRQAPGQG LEWIGVIHPS DSETWLDQKF KDRVTITVDK 
STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCAREHYGTS PFAYWGQGTL VTVSSASTKG 
PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA 
VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KRVEPKSCDK 
THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE 
VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK 
VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF 
YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV 
FSCSVMHEAL HNRYTQKSLS LSPGK
である。
【０３１９】
従来の方法を用いて、抗ＣＴＬＡ‐４抗体をフルオレセインで標識してよい。このような標識分子を、ＰＤ‐１に結合するエピトープ結合部位及びフルオレセインに結合するエピトープ結合部位を有する、上で提示した汎用二重特異性アダプタ分子の存在下でインキュベートすると、これら標識分子はＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を形成し、これは以下で説明するようにアッセイできる。
【０３２０】
本明細書において提供されている教示に鑑みて、異なるＶＨドメイン、ＶＬドメイン、リンカー、ヘテロ二量体促進ドメイン、及び／又はＩｇＧ定常ドメインを利用して、代替的な汎用二重特異性アダプタ分子を生成できることが理解されるだろう。例えば、抗ＣＴＬＡ‐４抗体及び／又は異なる抗ＰＤ‐１抗体のＶＨ及びＶＬドメインを、上で採用した抗ＰＤ‐１抗体のＶＨ及びＶＬドメインの代わりに用いて、代替的な又は同等の汎用二重特異性アダプタ分子を生成できる。あるいは、抗ＣＴＬＡ‐４抗体のＶＨ及びＶＬドメインを、抗フルオレセイン抗体のＶＨ及びＶＬドメインの代わりに用いて、上で提示した変異型Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ及びＶＩの一般構造を有するＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を生成してよい。このようなＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、以下に記載のアッセイで直接使用してよい。
【０３２１】
実施例４  アッセイ
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子は、多様な方法のいずれにおいて特性決定してよい。特に本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を、（例えば細胞表面上に存在するもの等の）ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４分子に免疫特異的に結合する能力に関してアッセイしてよく、並びに／又は抗原との相互作用の結合動態を決定してよい。二重特異性分子がＦｃ領域（又はその一部分）を備える場合、上記分子が、Ｆｃ‐ＦｃγＲ相互作用、例えばＦｃγＲに対するＦｃ領域（又はその一部分）の特異的結合、エフェクタ機能の仲介、シグナル伝達等を行う能力をアッセイしてよい。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の免疫調節活性及び／又はインビボ抗腫瘍活性を、当該技術分野において公知のインビトロ及びインビボアッセイを用いてアッセイしてよい。
【０３２２】
Ａ．ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４を発現する免疫細胞及び細胞の調製
１．ヒト全血からのＰＢＭＣ及び免疫細胞部分集団の単離
健康なヒトドナーからのＰＢＭＣを、例えばＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を用いて、全血から単離する。簡潔に述べると、全血を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈する。希釈された血液（３５ｍＬ）を、５０ｍＬ試験管中の１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ上に重ね、上記試験管を、４００×ｇ（１３２０ｒｐｍ）で３０分間、ブレーキをオフにして遠心分離する。２相の間の緩衝コート層を５０ｍＬ試験管に回収し、６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを（例えば試験管を６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間遠心分離することにより）ＰＢＳで３回洗浄する。生存細胞数を、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染料を用いて決定する。ＰＢＭＣを完全培養培地（例えばＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に再懸濁し、５％ＣＯ2を用いて３７℃で一晩インキュベートするか、又は以下で説明するように、Ｔ細胞（例えばＴ  ｒｅｇ、ＣＤ８、ＣＤ４）、ＮＫ細胞、樹状細胞及び単球といった所望の免疫細胞部分集団を単離するために更に処理する。
【０３２３】
市販の調製キット（例えば、Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、単球、樹状細胞の単離のためのＵｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＴ細胞単離キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｔ調節細胞の単離のためのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）調節ＣＤ４＋／ＣＤ３５＋Ｔ細胞キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）等）を、製造元の説明書に従って使用すると、特定の免疫細胞部分集団がＰＢＭＣから容易に単離される。単離後、免疫細胞部分集団（例えばＴ細胞）を、適切な完全培養培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（これにはサイトカイン（例えば、ＩＬ‐２、ＧＭ‐ＣＦ、ＩＬ‐４、ＴＮＦ‐α等）を添加してよい）中に再懸濁し、５％ＣＯ2を用いて３７℃で一晩インキュベートする。本明細書において提示されるように、このような精製済みの部分集団は、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４の細胞表面発現の評価、並びに本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の免疫刺激活性の評価に有用である。
【０３２４】
２．カニクイザル又はアカゲザル全血からのＰＢＭＣの単離
カニクイザル又はアカゲザルからのＰＢＭＣを、例えばＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を用いて、全血から単離する。簡潔に述べると、全血を、滅菌ＰＢＳで１：３に希釈する。希釈された血液（３５ｍＬ）を、５０ｍＬポリプロピレン遠心分離管中の１５ｍＬの９０％Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（９０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ＋１０ｍＬのＰＢＳ）上に重ね、上記試験管を、室温において９３１×ｇ（２０００ｒｐｍ）で３０分間、ブレーキをオフにして遠心分離する。２相の間の緩衝コート層を回収して清浄な５０ｍＬ試験管に移し、試験管を６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間遠心分離することにより、４５ｍＬのＰＢＳで洗浄する。上清を廃棄し、ペレットをＰＢＳで３回すすぐ。カニクイザル又はアカゲザルＰＢＭＣを３０ｍＬの完全培養培地に再懸濁して、生存細胞数を、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染料による除外によって決定する。
【０３２５】
市販の調製キット（例えば、Ｐａｎ  Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ単離キット（Miltenyl Biotech））を、製造元の説明書に従って使用すると、非ヒト霊長類ＰＢＭＣから、特定の免疫細胞部分集団が容易に単離される。あるいは、非ヒト霊長類特異的又は交差反応性ｍＡｂを用いたフローサイトメトリー分類を、分類のために使用できる。
【０３２６】
３．単離されたヒト単球からの、ヒト未成熟又は成熟骨髄由来樹状細胞（ｍＤＣ）の生成
市販の調製キット（例えばＵｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒト単球キット（Life Technologies/ThermoFisher Scientific））を、製造元の説明書に従って使用して、ドナー由来の精製済みＰＢＭＣからヒト単球を単離する。単離されたヒト単球を、組み換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（例えば、ｈＧＭ‐ＣＳＦ；Peprotech、１００ｎｇ／ｍｌ）及び組み換えヒトインターロイキン‐４（ｈＩＬ‐４；Peprotech、４０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、上記単球を、（例えばヌクレオシドを含むα最小必須培地（αＭＥＭ）＋２％ヒトＡＢ陰性血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で）５〜７日間培養することによって、ヒト未成熟ｍＤＣへと分化するよう誘導する。未成熟ｍＤＣを採取し、以下で詳述するもの等の同種異系混合リンパ球反応（allogeneic mixed lymphocyte reaction：ａｌｌｏ‐ＭＬＲ））アッセイにおいて刺激細胞として使用するために、試験管を６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間遠心分離することによって、ＰＢＳで洗浄する。
【０３２７】
特定のａｌｌｏ‐ＭＬＲ実験では、未成熟ｍＤＣを、ＴＮＦα、又は追加のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ‐１β）及びマイトジェン（ＬＰＳ）のカクテルを、追加の培養日数２日にわたって添加することによって、分化するよう誘導する（例えばHan、T.(2009)“Evaluation of 3 Clinical Dendritic Cell Maturation Protocols Containing LPS and IFN‐gamma,” J Immunother 32:399を参照）。ｍＤＣの純度、成熟及び活性化を、以下の抗体：抗ＣＤ１４、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ８６、抗ＨＬＡ‐ＤＲ；及び適切なアイソタイプ対照のうちの１つ又は複数を用いたフローサイトメトリーで評価してよい。このような評価からのフローサイトメトリーデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ／Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Becton Dickinson/BD Biosciences）で取得でき、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TreeStar）を用いて分析できる。
【０３２８】
４．ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４の発現
ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４を発現する細胞は、当該技術分野において公知の方法を用いて生成してよい。例えば、適切な遺伝子（例えばヒトＰＤ‐１遺伝子）を含有するレトロウイルスベクターを用いて、細胞（例えばＮＳＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＨＯ等）を、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４を発現するように操作してよい。あるいは、免疫細胞を、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４を誘発する又は増大させるように刺激してよい。簡潔に述べると、上述のようにして単離された精製済み免疫細胞（例えばＰＢＭＣ、Ｔ細胞、樹状細胞等）を、マイトジェンの存在又は不在下で２〜６日間培養し、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４の発現を、例えばフローサイトメトリーを用いて、未処置（ナイーブ）細胞及び刺激細胞上で検査する。マイトジェン刺激に応答しての、ナイーブ細胞上での発現パターンの予備評価のために、市販の抗ＰＤ‐１及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体を使用できる。更に、又は任意に、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を使用してよい。
【０３２９】
このような研究に利用できるマイトジェンは当該技術分野において公知であり、限定するものではないが：ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、リポ多糖類（ＬＰＳ）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ〜Ｅ型（例えばＳＥＢ）、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）等が挙げられる。ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４の発現を誘発／増強すると同定された１つ以上のマイトジェンを、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の刺激活性を評価するための機能アッセイにおいて用いてよい。例えば本明細書に記載の「ＳＥＢ」及び「ＭＬＲ」アッセイを参照。
【０３３０】
Ｂ．結合アッセイ
ＰＤ‐１若しくはＣＴＬＡ‐４分子への免疫特異的結合、結合の交差反応性、又はＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用を分析するために使用できるイムノアッセイとしては、限定するものではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、イムノクロマトグラフィアッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイ等といった、競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる（例えばAusubel et al.、2008、Current Protocols in Molecular Biologyを参照）。標的抗原に対する結合親和性は典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ競合アッセイ、飽和アッセイ、又はＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡといったイムノアッセイ等の、標準的な抗体‐抗原アッセイによって測定又は決定される。当業者に公知の技法のうちのいずれを用いた蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を、本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を特性決定するための免疫学的又は機能ベースアッセイのために使用してよい。
【０３３１】
例えば、ＰＢＭＣを上述のようにして調製してよく、所望の免疫細胞サブセット（例えばＴ調節細胞、Ｔヘルパー細胞、ＡＰＣ等）を精製済みＰＢＭＣから単離してよい。次に単離された細胞を、以下に記載されるような共染色及びＦＡＣＳ分析によって、様々な細胞サブセット（例えばＴ調節細胞、Ｔヘルパー細胞、ＡＰＣ等）上でのＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４発現に関して検査する。
【０３３２】
１．細胞表面結合（飽和アッセイ）
ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の、細胞表面上で発現されたＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４に結合する能力は、ＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４を発現する細胞（標的細胞）を用いた飽和／希釈ベースのアッセイで測定してよい。このような細胞は、ＰＤ‐１及び／若しくはＣＴＬＡ‐４を発現するよう刺激された免疫細胞、又はＰＤ‐１及び／若しくはＣＴＬＡ‐４分子を安定して過剰発現するよう操作された細胞株（例えばＮＳＯ細胞）であってよい。簡潔に述べると、培養された標的細胞（例えばＰＤ１+を発現するよう操作されたＮＳＯ細胞）を採取し、ブロッキングバッファ（例えばＦＡＣＳバッファ＋１０％ヒトＡＢ血清）中に（例えば約５×１０6細胞／ｍｌで）再懸濁する。等モル濃度（例えば合計２００μｌ中２０ｎＭ）で開始して、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４、又は抗ＰＤ‐１と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせを、別個のマイクロタイタープレートでの希釈用に調製し、その後５〜１２回連続希釈（例えば、１：４、１：５、１：１０等）して、５〜１２点の曲線を生成する。全ての実験における最高の開始濃度は、経験的に決定される。同一体積（例えば５０μｌ）の各希釈物を新しいマイクロタイタープレートに添加し、各ウェルに標的細胞を（例えば０．２５×１０6細胞／ウェルで）添加して、（例えば４〜２５℃で３０〜１２０分間）インキュベートする。細胞を１〜３回洗浄し（例えばマイクロタイタープレートを６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間スピンさせた後、ブロッキングバッファで洗浄し、再びスピンさせて）、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。二次染色のために、適切な二次試薬を選択し、例えばヤギ抗ヒトＦｃ‐ＡＰＣを用いてヒト一次抗体を検出してよく、またその一方ではヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を用いてマウス一次抗体を検出する。選択した二次試薬をブロッキングバッファ中で個々の二次試薬の濃度に基づいて希釈し、原液を作製し、同一体積／ウェルの二次混合物を個々のウェルにアリコートして、（例えば４〜２５℃で３０〜１２０分間）インキュベートする。細胞を上述のようにして洗浄し、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。染色された細胞をフローサイトメトリーで分析する。フローサイトメトリーデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ／Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Becton Dickinson/Fortessa）で取得でき、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TreeStar）を用いて平均蛍光強度として分析でき、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（Graphpad）のｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．反応‐可変傾斜（４パラメータ）関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
【０３３３】
２．受容体／リガンド結合及びシグナリングアッセイ
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の、リガンド結合及びシグナリングを変調する（例えばブロック、阻害、刺激する等）能力を分析するために使用できるアッセイを、以下で更に詳細に提供する。
【０３３４】
ａ．ＰＤ‐１受容体／リガンド結合
ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の、ＰＤ‐１がＰＤ‐Ｌ１及び／又はＰＤ‐Ｌ２に結合するのを阻害する能力は、ＰＤ‐１を発現する細胞（標的細胞）を用いて評価してよい。このような細胞は、ＰＤ‐１を発現するよう刺激された免疫細胞、又はＰＤ‐１分子を発現するよう操作された細胞株、例えばヒトＰＤ‐１遺伝子をレトロウィルスで形質移入されたＮＳＯ細胞であってよい。簡潔に述べると、ＰＤ‐１発現細胞（例えばＮＳＯ／ＰＤＣＤ１（ＮＳＯ‐ＰＤ１+））を採取し、ブロッキングバッファ（例えばＦＡＣＳバッファ＋１０％ヒトＡｂ血清）中に（例えば約１．５×１０6細胞／ｍｌで）再懸濁し、マイクロタイタープレートに（例えば０．２５×１０6細胞／ウェルで）播種する。等モル濃度（例えば合計２００μｌ中２０ｎＭ）で開始して、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４、又は抗ＰＤ‐１と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせを、別個のマイクロタイタープレートでの希釈用に調製し、５〜１２回連続希釈（例えば、１：４、１：５、１：１０等）して、５〜１２点の曲線を生成する。全ての実験における最高の開始濃度は、経験的に決定される。同一体積（例えば５０μｌ）の各希釈物を、標的細胞を内包するマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。ＰＤ‐Ｌ１結合を評価するために、可溶性ＰＤ‐Ｌ１融合タンパク質（例えばｈＰＤ‐Ｌ１（Ｂ７Ｈ１）ＴＥＶ‐ｈＩｇＧ１‐Ｆｃ‐ビオチン（Ancell））を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、（例えば４〜２５℃で３０〜１２０分間）インキュベートする。ＰＤ‐Ｌ２結合を評価するために、可溶性ＰＤ‐Ｌ２融合タンパク質（例えばＣＤ２７３（ＰＤ‐Ｌ２）ｍｕＩｇＧ／ビオチン（Ancell））を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、（例えば４〜２５℃で３０〜１２０分間）インキュベートする。細胞を１〜３回洗浄する（例えばマイクロタイタープレートを６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間スピンさせた後、ブロッキングバッファで洗浄し、再びスピンさせる）。上記細胞をブロッキングバッファ中に再懸濁する。未染色の陰性対照ウェルを除いて、ＰＤ‐Ｌ１又はＰＤ‐Ｌ２融合タンパク質を検出するための適切な二次試薬（例えばストレプトアビジン‐ＰＥ標識二次試薬（eBiosciences））を添加して、（例えば４〜２５℃で１５〜１２０分間）インキュベートする。細胞を上述のようにして洗浄し、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。染色された細胞をフローサイトメトリーで分析してよい。フローサイトメトリーデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ／Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Becton Dickinson/Fortessa）で取得でき、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TreeStar）を用いて、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４抗体、又は抗ＰＤ‐１抗体と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせの存在下での、ｓＰＤ‐Ｌ１又はｓＰＤ‐Ｌ２の平均蛍光強度の損失として分析でき、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（Graphpad）のｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．反応‐可変傾斜（４パラメータ）関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
【０３３５】
ｂ．ＣＴＬＡ‐４  受容体／リガンド結合
ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の、ＣＴＬＡ‐４がＣＤ８０及び／又はＣＤ８６に結合するのを阻害する能力は、ＣＴＬＡ‐４を発現する細胞（標的細胞）を用いて評価してよい。このような細胞は、ＣＴＬＡ‐４を発現するよう刺激された免疫細胞、又はＣＴＬＡ‐４分子を発現するよう操作された細胞株、例えばヒトＣＴＬＡ‐４遺伝子をレトロウィルスで形質移入されたＮＳＯ細胞であってよい。簡潔に述べると、ＣＴＬＡ‐４発現細胞を採取し、ブロッキングバッファ（例えばＦＡＣＳバッファ＋１０％ヒトＡｂ血清）中に再懸濁し、マイクロタイタープレートに（例えば０．２５×１０6〜１．０×１０6細胞／ウェルで）播種する。等モル濃度（例えば合計２００μｌ中２０ｎＭ）で開始して、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４、又は抗ＰＤ‐１と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせを、別個のマイクロタイタープレートでの希釈用に調製し、５〜１２回連続希釈（例えば、１：４、１：５、１：１０等）して、５〜１２点の曲線を生成する。全ての実験における最高の開始濃度は、経験的に決定される。同一体積（例えば５０μｌ）の各希釈物を、標的細胞を内包するマイクロタイタープレートの各ウェルに添加する。ＣＤ８０結合を評価するために、可溶性ＣＤ８０融合タンパク質（例えばｈＣＤ８０‐ｍｕＩｇ‐ビオチン（ＡＤＩＰＯＧＥＮ（登録商標）））を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、（例えば４〜２５℃で３０〜１２０分間）インキュベートする。ＣＤ８６結合を評価するために、可溶性ＣＤ８６融合タンパク質（例えばｈＣＤ８６‐ｍｕＩｇ‐ビオチン（ＡＤＩＰＯＧＥＮ（登録商標）））を、未染色の陰性対照ウェルを除いた各ウェルに添加して、（例えば４〜２５℃で３０〜１２０分間）インキュベートする。細胞を１〜３回洗浄する（例えばマイクロタイタープレートを６００×ｇ（１６２０ｒｐｍ）で５分間スピンさせた後、ブロッキングバッファで洗浄し、再びスピンさせる）。上記細胞をブロッキングバッファ中に再懸濁する。未染色の陰性対照ウェルを除いて、ＣＤ８０又はＣＤ８６融合タンパク質を検出するための適切な二次試薬（例えばストレプトアビジン‐ＰＥ標識二次試薬（eBiosciences））を添加して、（例えば４〜２５℃で１５〜１２０分間）インキュベートする。細胞を上述のようにして洗浄し、ブロッキングバッファ中に再懸濁する。染色された細胞をフローサイトメトリーで分析してよい。フローサイトメトリーデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ／Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Becton Dickinson/Fortessa）で取得でき、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TreeStar）を用いて、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４抗体、又は抗ＰＤ‐１抗体と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせの存在下での、ＣＤ８６又はＣＤ８０の平均蛍光強度の損失として分析でき、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（Graphpad）のｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．反応‐可変傾斜（４パラメータ）関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
【０３３６】
Ｃ．レポータアッセイ
ＰＤ‐１とＰＤ‐Ｌ１との相互作用のブロックにおける、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の機能活性を、Ｐｒｏｍｅｇａが開発した市販のレポータシステムを製造元の指示に従って用いて、評価してよい。簡潔に述べると、刺激因子株又はレポータ細胞株として機能するように操作された２つの細胞株を使用する。刺激因子株は、ＣＨＯ親株から、ＰＤ‐Ｌ１分子及びＴ細胞活性化因子を発現するよう操作されたものであり、膜結合抗ＣＤ３アゴニストｍＡｂ［ＣＨＯ／ＰＤＬ１細胞］である。レポータ細胞株は、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ親株から、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の転写制御下でルシフェラーゼレポータ構造を発現するよう操作されたもの（ＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１  Ｊｕｒｋａｔ細胞）である。共培養すると、ＣＨＯ‐ＰＤＬ１細胞株上で発現される抗ＣＤ３アゴニストは、Ｊｕｒｋａｔ‐ＮＦＡＴ‐ｌｕｃ／ＰＤ‐１細胞株上に存在するＴＣＲ／ＣＤ３シグナリング複合体の合体によって仲介されるＮＦＡＴシグナル伝達経路によって、ルシフェラーゼ発現を推進する。抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の不在下において、ルシフェラーゼは、ＴＣＲ／ＣＤ３シグナリングに対してあるレベルで発現するが、ブレーキとして機能するＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１阻害軸の存在によって下方制御又は阻害される。ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１シグナリングを阻害する分子（例えば、抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１抗体）の存在下では、この阻害軸又は「ブレーキ」は解放され、これによりルシフェラーゼ発現を増強でき、これを測定できる。従ってＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子のＰＤ‐１阻害活性は、ＣＨＯ／ＰＤＬ１をＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ１  Ｊｕｒｋａｔ（３Ｈ‐Ｄ５）と共に培養することによって評価してよい。簡潔に述べると、ＣＨＯ‐ＰＤＬ１をマイクロタイタープレートに（例えば４．０×１０４細胞／ウェルで）播種し、（例えば１０％ＦＢＳ＋１００ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ＋５００ｕｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含有するＲＰＭＩ培地中で）一晩培養する。翌日、アッセイバッファ（例えばＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ）を、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の５〜１２点連続希釈と共に調製するか、又は等しいモル当量（例えば１００〜２００ｎＭ）での最高希釈点及び５〜１２連続希釈（例えば、１：４、１：５、１：１０等）を用いて、アッセイバッファ中の抗ＰＤ‐１抗体を調製する。以下の順序で、細胞培地中の細胞の一部分を、接着ＣＨＯ／ＰＤＬ１細胞を含有するマイクロタイタープレートから取り除き、各希釈物のアリコートをＣＨＯ／ＰＤＬ１細胞に添加する。培養したＮＦＡＴ‐ｌｕｃ２／ＰＤ‐１  Ｊｕｒｋａｔ細胞を採取し、アッセイバッファ中に再懸濁して、ＣＨＯ／ＰＤＬ１細胞に（例えば４０μｌ／ウェルにおいて５．０×１０4細胞／ウェルで）添加する。共培養物を（例えば３７℃で６時間）インキュベートする。インキュベーションの終了時、Ｂｉｏ‐Ｇｌｏ基質（Promega）を再構成して、周囲温度平衡マイクロタイタープレートに添加する。インキュベーション後（例えば５〜１０分後）、各ウェルの光学密度を、読み出し単位としてルミネッセンス相対光単位（relative light unit：ＲＬＵ）を用いて、４５０ｎｍにおいて、ＶＩＣＴＯＲ（商���）Ｘ４マルチラベルプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＃２０３０‐００４０）上で読み取る。次にこのデータを、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（Graphpad）のｌｏｇ（アゴニスト）ｖｓ．反応‐可変傾斜（４パラメータ）関数を用いてプロット及びフィッティングできる。
【０３３７】
同様のレポータアッセイは、ＣＴＬＡ‐４シグナリングに関して利用可能であり（例えばＣＴＬＡ‐４ブロック生体アッセイキット（Promega））、及び／又はＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の、ＣＴＬＡ‐４とその１つ以上のリガンドそれぞれとの相互作用をブロックする機能活性を分析するために容易に生成できる。
【０３３８】
Ｄ．免疫調節アッセイ
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の免疫調節活性を分析するために使用できるアッセイとしては、上述の「ＳＥＢ」アッセイ等のマイトジェン刺激アッセイ、及び以下で更に詳細に提示されるもののような混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイが挙げられる。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４阻害経路両方を変調する能力は、抗ＰＤ１抗体及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体単独の場合又はこれらの抗体を組み合わせた場合に比べて、アッセイにおいて増強された刺激を提供すると予測される。
【０３３９】
ＰＢＭＣ又はＴ細胞を、上述のようなＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ（商標）勾配遠心分離によって、同一の（自己）又は無関係の（同種異系の）１人以上の患者及び一人以上の健康なドナーの血液から単離し、完全培養培地中に再懸濁する。ｍＤＣを使用するａｌｌｏ‐ＭＬＲアッセイのために、単球を上述のように精製して成熟させる。一方向（単方向）ａｌｌｏ‐ＭＬＲアッセイのために、レスポンダ細胞（例えばＰＢＭＣ）を刺激性細胞と共にマイクロタイタープレートで共培養する。状況に応じて、刺激性細胞は、ＤＣ、自己ＰＢＭＣ（ａｕｔｏ‐ＭＬＲ（即ち陰性対照）に関して）、又は同種異系ＰＢＭＣ（ａｌｌｏ‐ＭＬＲ（即ち陽性対照）に関して）である。レスポンダ細胞：刺激性細胞の比は典型的には１：１又は２：１であるが、変更してもよい。上記共培養は、等モル量の、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４、抗ＰＤ‐１抗体と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせ、又は対応するアイソタイプｍＡｂの連続（例えば１：４、１：５、１：１０等）希釈物の存在下で実施される。連続抗体希釈物は上述のようにして調製してよい。更に、抗ＣＤ３＋／‐抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激された又は刺激されていない、単一細胞集団対照を、このような実験において対照として使用してよい。刺激性細胞（刺激因子）を、（例えばＧａｍｍａｃｅｌｌ（登録商標）３０００  Ｅｌａｎ血液／細胞照射器（Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて４５グレイ（Ｇｙ）（４５００ｒａｄ）で）予備照射して、刺激因子細胞の増殖を防止し、応答細胞（レスポンダ）の増殖のみを測定できるようにする。５〜７日後（この時間は、アッセイ中のＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４の発現が確実になるように調整される）、［3Ｈ］‐チミジン（例えば、１μＣｉ／ウェル（Perkin Elmer））を、更に１８〜４８時間にわたって添加する。ＤＮＡに組み込まれた放射能を（例えば、ＴＯＰＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ  βシンチレーションカウンタ（Perkin Elmer）で）測定する。結果は、１分あたりの平均計数（ｃｐｍ）として表現されるか、又は異なるドナーからの結果の比較を可能とするために刺激指数（ＳＩ）として表現される。ＳＩは以下のようにして算出される：刺激細胞からの１分あたりの平均計数（ｃｐｍ）を、非刺激細胞からの平均ｃｐｍで除算する。ＭＬＲ反応は、ＰＢＭＣ誘発型刺激に関してＳＩが≧３であり、ＤＣ誘発型刺激に関してＳＩ≧６であった場合に陽性とみなされる。あるいは増殖を、ＣＥＦＳＥベースの増殖アッセイを用いて測定してよい（Boks, M.A., et al. (2010) “An optimized CFSE based T‐cell suppression assay to evaluate the suppressive capacity of regulatory T‐cells induced by human tolerogenic dendritic cells,” Scand J Immunol 72:158-168）。
【０３４０】
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の免疫刺激活性を評価するために使用してよい更なるＭＬＲアッセイが当該技術分野において公知である。例えば、Davies, J.K. et al. (2011) “Induction of alloantigen‐specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co‐stimulatory signal blockade,” Journal of Visualized Experiments：JoVE, (49), 2673; Kruisbeek, A.M., et al. (2004) “Proliferative Assays for T cell Function,” Current Protocols in Immunology, 60:III:3.12.1‐3.12.20; Wallgren, A.C. et al. (2006) “The Direct Pathway Of Human T‐Cell Allorecognition Is Not Tolerized By Stimulation With Allogeneic Peripheral Blood Mononuclear Cells Irradiates With High‐Dose Ultraviolet,” Ba. Scand J of Immunol 63:90‐96; Levitsky, J. et al. (2009) “The Human 'Treg MLR' Immune Monitoring for Foxp3+ T regulatory cell generation, Transplantation 88:1303‐11を参照。
【０３４１】
Ｅ．インビボ抗腫瘍アッセイ
本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の抗腫瘍活性は、当該技術分野において公知の様々な動物モデルで評価してよい。本発明のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を用いた処置は、抗ＰＤ１抗体及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体を単独で用いた、又はこのような抗体の組み合わせを用いた処置よりも、腫瘍確立及び／又は腫瘍成長を大幅に阻害すると予測される。
【０３４２】
マウスの異種移植腫瘍モデルは特に有用である。簡潔に述べると、マウスに関心対象の癌細胞株、又は腫瘍細胞株を移植し、（ｉ）ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、（ｉｉ）抗ＰＤ‐１抗体、（ｉｉｉ）抗ＣＴＬＡ‐４抗体、（ｉｖ）抗ＰＤ‐１抗体と抗ＣＴＬＡ‐４抗体との組み合わせ、並びに（ｖｉ）ビヒクル単独及び／又は無関係な抗体であってよい未処置対照を用いて処置する。処置は：移植前（例えば１日前（即ち‐１日目）；移植と同日（即ち０日目）；又は腫瘍確立後（例えば７日目）に開始してよい。動物は、１回の処置を受けてよく、又は（例えば移植後毎週）複数回の処置を受けてもよい。動物を経時的に監視して、腫瘍確立及び／又は成長に対するこれらの分子のインビボでの影響を決定する。腫瘍の成長は、腫瘍を測定し、腫瘍体積（高さ×幅×長さ）を決定することによって監視してよい。完全な腫瘍退縮を示す、処置された動物を用いて、同一の腫瘍細胞又は対照としての無関係な腫瘍細胞を用いた再誘発によって、腫瘍特異的免疫を検査できる。更にこれらのモデルを、化学療法、照射等といった標準的な治療処置との併用処置を含むように修正してよい。
【０３４３】
このような異種移植モデルにおいて利用してよい多数の移植可能な癌細胞株が当該技術分野において公知であり、限定するものではないが：ＭＤＳＴ８、ＳＷ４８０及びＳＷ６２０結腸直腸癌細胞；ＡＧＳ胃癌細胞；ＵＡＣＣ‐６２、Ａ２０５８及びＬＯＸ  ＩＭＶＩ黒色腫細胞；２２ｒｖ前立腺癌細胞；ＡｓＰＣ‐１及びＢｘＰｃ‐３膵臓癌細胞；Ｃａｋｉ‐１、Ａ４９８及び７８６‐０腎臓癌細胞；ＨＴ‐１１９７膀胱癌細胞；４Τ１、ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１乳癌細胞；Ａ５４９、ＷＸ３２２肺癌細胞；ＨＴ１０８０線維肉腫細胞；ＨＢＬ‐２ヒトマントル細胞リンパ腫細胞；Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞が挙げられる。特に好ましいのは、患者由来異種移植（Patient‐Derived Xenograft：ＰＤＸ）モデルである。このような癌細胞株又は患者由来腫瘍を、免疫無防備状態のマウス株（例えばヌードマウス、Ｓｃｉｄマウス、ＮＯＤマウス、Ｒａｇ１ヌルマウス等（例えばBelizario, J.E., (2009) “Immunodeficient Mouse Models: An Overview,” Bentham Open 1874-2262/09を参照）、又はトランスジェニックヒトＨＬＡ‐Ａ２マウス等のヒト化マウス（例えばShultz, L.D., et al. (2012) “Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges,” Nature Rev Immunol 12:786-798を参照）に、上述のように移植する。更に、免疫チェックポイントを変調する分子の評価のために、免疫不全マウスに、所望の腫瘍細胞の移植及び上で詳述した処置の前に又はこれと同時に、（例えばヒトＰＢＭＣ、幹細胞、免疫前駆細胞等を用いて再構成した）ヒト免疫系成分を移植してよい。
【０３４４】
実施例５  ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の結合の研究
Ｆｃ領域含有ダイアボディ、及び４つのポリペプチド鎖を含むＦｃ領域含有３化分子を含む、複数のＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を生成した。４つのポリペプチド鎖を有しかつＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメインを備える、３つのダイアボディを生成し、名称「ＤＡＲＴ  Ｂ」、「ＤＡＲＴ  Ｃ」及び「ＤＡＲＴ  Ｄ」を与えた。４つの鎖を有しかつＣＨ１／ＣＬドメインを備える１つのダイアボディを生成し、名称「ＤＡＲＴ  Ｅ」を与えた。４つの鎖を有し、かつＥ／Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン及びＣＨ１／ＣＬドメインを備える、２つの３価結合性分子を生成し、名称「ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ」及び「ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂ」を与えた。
【０３４５】
更にＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４に対する特異性を有する複数の抗体を生成した。ＰＤ‐１に対して特異的な１つの抗体を生成し、名称「ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ」を与えた。ＣＴＬＡ‐４に対して特異的な３つの抗体を生成し、名称「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １」、「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ」及び「ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ」を与えた。
【０３４６】
これらのＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＣＴＬＡ‐４抗体の構造及びアミノ酸配列は上で提示されており、以下の表９にまとめられている。
【０３４７】
【表９】
2019506444.tif 000011
【０３４８】
異なるＶＨ及びＶＬドメインを組み込むことによって、代替的なＰＤ‐１及び／又はＣＴＬＡ‐４エピトープ結合部位を備える更なるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を容易に生成できる。同様に、代替的なリンカー、Ｆｃ領域を備える、及び／又は代替的な構造を有する分子を、本明細書中で提示したように生成してよい（例えば表８参照）。
【０３４９】
Ａ．ＥＬＩＳＡ結合研究
連続希釈した結合分子（抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ又はＤＡＲＴ  Ｂ）の、支持プレート上にコーティングした可溶性ｈＣＴＬＡ‐４‐Ａｖｉ‐Ｈｉｓ（１μｇ／ｍＬ）又はｈＰＤ‐１‐Ｈｉｓ（１μｇ／ｍＬ）に対する結合を測定するために、ＥＬＩＳＡ研究を実施した。ヤギ抗ヒト‐Ｆｃ‐ＨＲＰ（１：１０，０００）を、結合を検出するための二次検出分子として採用した。このような研究の結果を、表１０及び図８Ａ〜８Ｂに示す。このデータは、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４のための２つの結合部位を有するＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子（例えばＤＡＲＴ  Ｄ及びＤＡＲＴ  Ｂ）が、その親抗ＰＤ‐１及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体と同等の、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４への結合を呈したことを示す。ＰＤ‐１に対する２つの結合部位、及びＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位を有する、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子（例えばＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ）は、親抗ＰＤ‐１抗体と同等の、ＰＤ‐１に対する結合を呈し、また上記３価分子（これはＣＴＬＡ‐４に対する結合部位を１つしか備えない）の結合活性の低下により、（親抗体に比べて）低下したＣＴＬＡ‐４への結合を呈した。ＩｇＧ１  ＣＨ１及び／又はＩｇＧ１（ＡＡ／ＹＴＥ）Ｆｃ領域を有するＤＡＲＴ  Ｆ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂに関しても、同様の結合結果が観察された。
【０３５０】
【表１０】
2019506444.tif 000012
【０３５１】
ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １（例えばＤＡＲＴ  Ｂ）並びにＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３（例えばＤＡＲＴ  Ｃ及びＤＡＲＴ  Ｄ）のＣＴＬＡ‐４結合ドメインを備えるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子を、支持プレート上にコーティングした可溶性ヒトＰＤ‐１（図８Ｃ）又は可溶性ヒトＣＴＬＡ‐４‐Ａｖｉ‐Ｈｉｓ（図８Ｄ）の存在下でインキュベートすることによって、配向及び結合ドメインの変更の、結合に対する影響を調査した。ヤギ抗ヒト‐Ｆｃγ‐ＨＲＰを、ＰＩＣＯ化学発光基質を用いて結合を検出するための二次検出分子として採用した。結果は、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １（例えばＤＡＲＴ  Ｂ）並びにＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３（例えばＤＡＲＴ  Ｃ及びＤＡＲＴ  Ｄ）のＣＴＬＡ‐４結合ドメインを備えるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子が、ＣＴＬＡ‐４に対する同等の結合を呈することを示す。結合ドメインの配向（即ち第１又は第２の鎖の位置）は、（ＤＡＲＴ  Ｃ及びＤＡＲＴ  Ｄの結合に比べて）ＰＤ‐１又はＣＴＬＡ‐４への結合を有意に変化させることは観察されなかった。
【０３５２】
Ｂ．ＥＬＩＳＡによるブロック研究
本発明の二重特異性分子の、リガンドがＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４（単独又は組み合わせ）に結合するのをブロックする能力を評価するために、一連のＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ＰＤ‐１に対するＰＤ‐Ｌ１の結合のブロックを、等量の無関係の抗原の存在下、及び等量のＣＴＬＡ‐４の存在下で評価した。プレートを、Ｈｉｓ‐タグ付与可溶性ヒトＰＤ‐１（ｓｈＰＤ‐１）とＨｉｓ‐タグを付与された無関係の抗原（ｉｒｒＡｇ）との１：１混合物（それぞれ２μｇ／ｍｌ）、又はｓｈＰＤ‐１とＨｉｓ‐タグ付与ヒトＣＴＬＡ‐４（ｓｈＣＴＬＡ‐４）との１：１混合物（それぞれ２μｇ／ｍｌ）でコーティングした。指示された濃度の、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、又は（ＲＳＶに対する２つの結合部位及びＣＴＬＡ‐４に対する１つの結合部位を有する）対照ＴＲＩＤＥＮＴを、６μｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＤ‐Ｌ１と５分間にわたって事前に混合して、プレートに添加した。ＰＤ‐Ｌ１結合を、ストレプトアビジンＨＲＰ（１：３０００）を用いて検出した。この評価の結果を図９Ａ〜９Ｂに提示する。試験されたＰＤ‐１結合分子は全て、ＰＤ‐１に対するＰＤ‐Ｌ１の結合を阻害できることが分かった。
【０３５３】
ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７‐１の結合を、等量の無関係の抗原の存在下、及び等量の又は４倍量のＰＤ‐１の存在下で評価した。プレートを、ｓｈＣＴＬＡ‐４とｉｒｒＡｇとの１：１混合物（それぞれ２μｇ／ｍｌ）、ｓｈＣＴＬＡ‐４とｓｈＰＤ‐１との１：１混合物（それぞれ２μｇ／ｍｌ）、又はｓｈＣＴＬＡ‐４（０．８μｇ／ｍｌ）とｓｈＰＤ‐１（３．２μｇ／ｍｌ）との１：４混合物でコーティングした。指示された濃度の、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ又は対照ＴＲＩＤＥＮＴを、０．２μｇ／ｍｌのビオチン標識Ｂ７‐１と５分間にわたって事前に混合して、プレートに添加した。Ｂ７‐１結合を、ストレプトアビジンＨＲＰ（１：３０００）を用いて検出した。この評価の結果を図９Ｃ〜９Ｅに提示する。試験されたＣＴＬＡ‐４結合分子は全て、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７‐１の結合を阻害できることが分かった。ＴＲＩＤＥＮＴ  ＡによるＢ７‐１結合のブロックは、そのＰＤ‐１結合アームと、不動化されたＰＤ‐１との相互作用によって（ＰＤ‐１に結合しない対照ＴＲＩＤＥＮＴに比べて）増強されることが分かった（図９Ｄ）。更に、刺激細胞において観察される相対発現レベル（図１９Ａを参照）を比較的良好に模倣した、ＣＴＬＡ‐４：ＰＤ‐１が１：４である条件下では、ＴＲＩＤＥＮＴ  ＡによるＢ７‐１結合のブロックは更に増強されることが分かった（即ちＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの曲線が、ＰＤ‐１に結合しない対照ＴＲＩＤＥＮＴの曲線に比べて更に変位した）（図９Ｅ）。
【０３５４】
これらのＥＬＩＳＡ研究の結果は、試験した全てのＰＤ‐１結合分子が、ＰＤ‐Ｌ１がＰＤ‐１に結合するのを阻害できたことを実証している（図９Ａ〜９Ｂ）。これらの分子は全て、ＰＤ‐１に対して２価であり、同等の阻害プロファイルを呈した。試験した全てのＣＴＬＡ‐４結合分子は、Ｂ７‐１が不動化されたＣＴＬＡ‐４に結合するのを阻害でき（図９Ｃ〜９Ｅ）、かつ２つのＰＤ‐１結合部位及び１つのＣＴＬＡ‐４結合部位を備える分子がＰＤ‐１の存在下で更に強力な阻害を示した（図９Ｄ〜９Ｅ）。よって、単一のＣＴＬＡ‐４結合部位を備える３価分子は、ＣＴＬＡ‐４リガンドの、ＰＤ‐１にバイアスがかけられたブロックを呈し、これは、価数を調整することによってＣＴＬＡ‐４の相互作用を調節できることを実証している。
【０３５５】
Ｃ．ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）研究
ＤＡＲＴ  Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １の、ヒトＣＴＬＡ‐４及びカニクイザルＣＴＬＡ‐４に対する結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を用いて調査した。簡潔に述べると、Ｈｉｓタグ付与可溶性ＣＴＬＡ‐４（ヒスチジン含有ペプチドに融合したヒト又はカニクイザルＣＴＬＡ‐４の細胞外部分）を、不動化された抗ＰｅｎｔａＨｉｓ上で捕捉し、異なる濃度（１２．５〜２００ｎＭ）のＣＴＬＡ‐４結合分子に、上記不動化ＣＴＬＡ‐４タンパク質上を通過させた。結合の動態を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析で決定した（１：１ラングミュア結合モデル（同時のｋａ／ｋｄ）による親和性；又は別個のｋａ／ｋｄの１：１でのフィットによる結合活性）。これらの研究から算出されたｋa、ｋd及びＫDを表１１に提示する。
【０３５６】
【表１１】
2019506444.tif 000013
【０３５７】
ＤＡＲＴ  ＤはＣＴＬＡ‐４に対して２価であり、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １の約２〜４倍以内の、ヒト及びカニクイザルＣＴＬＡ‐４に対する結合親和性を呈する。ＴＲＩＤＥＮＴ  ＡはＣＴＬＡ‐４に対して１価であり、ヒト及びカニクイザルＣＴＬＡ‐４の両方に対して、その結合活性の低下から予測されるような比較的低い親和性を呈する。
【０３５８】
ＤＡＲＴ  Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡの、ヒトＰＤ‐１に対する結合親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析を用いて調査した。結合分子を、不動化されたＦ（ａｂ）2ヤギ抗ヒトＦｃ上で捕捉した後、異なる濃度（６．２５〜１００ｎＭ）のＨｉｓ‐タグ付与ヒトＰＤ‐１に、上記不動化された結合分子上を通過させ、結合の動態を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析で決定した（ラングミュア１：１結合フィット）。これらの研究から算出されたｋａ、ｋｄ及びｋＤを表１２に提示する（ｎ．ｄ．：検出不可）。
【０３５９】
【表１２】
2019506444.tif 000014
【０３６０】
ＤＡＲＴ  Ａ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐはそれぞれ、ＰＤ‐１に対して２価であり、相当な結合親和性を呈する。予測されたように、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡは、ヒトＰＤ‐１に対するいずれの検出可能な結合も呈さなかった。
【０３６１】
Ｄ．ＣＴＬＡ‐４細胞ベースアッセイ
ＤＡＲＴ  Ｂ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、抗ＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐ、及びｈＩｇＧ対照抗体を、カニクイザルＣＴＬＡ‐４（ｃｙｎｏＣＴＬＡ‐４）又はヒトＣＴＬＡ‐４（ｈｕＣＴＬＡ‐４）を発現するＣＨＯ細胞への結合に関して評価した。この評価の結果を図１０Ａ〜１０Ｂに示す。これらの結合分子を、カニクイザルＣＴＬＡ‐４（図１０Ａ）又はヒトＣＴＬＡ‐４（図１０Ｂを）を発現するＣＨＯ細胞の存在下でインキュベートした。これらの細胞への結合を、抗ヒトＦｃ二次抗体を用いて検出した。結果は、試験した全ての分子が、ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒト及びカニクイザルＣＴＬＡ‐４に結合できたことを示す。抗ＣＴＬＡ‐４抗体は、ｈｕＣＴＬＡ‐４に対して同等の結合プロファイルを呈し；２価二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ｂ及びＤＡＲＴ  Ｄは、わずかに低下した結合を呈する。ＣＴＬＡ‐４に対して１価である３価結合性分子ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａは、ＣＴＬＡ‐４に対してより高い価数を有する分子よりも低い結合を呈した。対照抗体は結合しなかった。同様の結果が、ｃｙｎｏＣＴＬＡ‐４への結合に関しても観察された。
【０３６２】
ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、抗ＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、及び抗ＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐを、表面上でｈｕＣＴＬＡ‐４を発現するがＰＤ‐１を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞に対する結合に関して評価した。ヒトＣＴＬＡ‐４に対するＤＡＲＴ及びＴＲＩＤＥＮＴ分子の結合を、抗ヒトＦＣ二次Ａｂ（ＦＡＣＳ）を用いて検出した。評価の結果を表１３並びに図１１Ａ（ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＤＡＲＴ  Ｅ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ）並びに図１１Ｂ（ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ）に示す。図１１Ａ〜１１Ｂに示すように、ＰＤ‐１抗体はＣＴＬＡ‐４に結合しなかったが、試験した全てのＣＴＬＡ‐４結合分子は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上に発現されたｈｕＣＴＬＡ‐４に結合できた。抗ＣＴＬＡ‐４抗体は同等の結合プロファイルを呈し；２価二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ及びＤＡＲＴ  Ｅは、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するわずかに低下した結合を呈した。ＣＴＬＡ‐４に対して１価である３価結合性分子ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａは、ＣＴＬＡ‐４に対してより高い価数を有する分子よりも低い結合を呈した。
【０３６３】
【表１３】
2019506444.tif 000015
【０３６４】
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、及び抗ＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡを、ＣＴＬＡ‐４リガンドＢ７‐１及びＢ７‐２をブロックする能力に関して評価した。Ｂ７‐１及びＢ７‐２のＨｉｓタグ付与誘導体を、ＣＴＬＡ‐４  Ｊｕｒｋａｔ細胞の存在下でインキュベートした。Ｈｉｓ‐Ｂ７‐１及びＨｉｓ‐Ｂ７‐２の結合を、抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。この評価の結果を、図１２Ａ（Ｈｉｓ‐Ｂ７‐１）及び図１２Ｂ（Ｈｉｓ‐Ｂ７‐２）に示す。試験した全ての分子は、Ｂ７‐１及びＢ７‐２が、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面上に発現されたＣＴＬＡ‐４に結合するのを阻害できることが分かった。抗ＣＴＬＡ‐４抗体は同等の結合プロファイルを呈し；２価二重特異性分子ＤＡＲＴ  Ｄは、わずかに弱い阻害因子である。ＣＴＬＡ‐４に対して１価である３価結合性分子ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａは、ＣＴＬＡ‐４に対してより高い価数を有する分子よりも弱かった。対照抗体は全く阻害しなかった。上述のＥＬＩＳＡ研究は、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、並びに２つのＰＤ‐１結合部位及び１つのＣＴＬＡ‐４結合部位を有する同様の分子が、ＰＤ‐１の存在下においてより強力な阻害因子となることを示唆する。
【０３６５】
ＩＬ‐２／Ｌｕｃ  Ｊｕｒｋａｔ細胞ＣＴＬＡ‐４レポータアッセイを用いて、ＤＡＲＴ  Ｃ、ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの、ルシフェラーゼ発現の増加によって実証されるように、ＣＴＬＡ‐４免疫チェックポイント阻害を反転させる能力を評価した。従って、ＩＬ‐２／Ｌｕｃ‐Ｊｕｒｋａｔ‐ＣＴＬＡ‐４細胞を、これらの分子の存在下（Ｒ：Ｓ＝１：０．３）で、３７℃で３０分間インキュベートした後、人工抗原提示Ｒａｊｉ細胞を添加し、インキュベーションを６時間続行した。人工抗原提示細胞は、Ｊｕｒｋａｔレポータ細胞上のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を活性化させる。評価の結果を図１３に示す。試験した全てのＣＴＬＡ‐４結合分子は、ルシフェラーゼアッセイによって決定されるように、ＣＴＬＡ‐４免疫チェックポイント阻害を反転させることができた。ＣＴＬＡ‐４に対して１価であるＴＲＩＤＥＮＴ  Ａは、このアッセイにおいて、ＣＴＬＡ‐４に対してより高い価数を有するいずれの分子よりも弱かった。対照抗体は全く阻害しなかった。上述のＥＬＩＳＡ研究は、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、並びに２つのＰＤ‐１結合部位及び１つのＣＴＬＡ‐４結合部位を有する同様の分子が、ＰＤ‐１の存在下においてより強力な阻害因子となることを示唆する。
【０３６６】
Ｅ．ＰＤ‐１細胞ベースアッセイ
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡを、ＰＤ‐１を発現するがＣＴＬＡ‐４を発現しないＮＳＯ細胞に結合する能力に関して評価した。結合分子を、上記細胞の存在下でインキュベートし、上記細胞の蛍光指数を測定した。この評価の結果を図１４に提示する。予測されたように、ＣＴＬＡ‐４抗体は結合せず、全ての二重特異性結合分子は、ＮＳＯ細胞の表面上に発現されるＰＤ‐１に結合できることが分かった。全ての二重特異性分子は、ＰＤ‐１に対して２価であり、ＮＳＯ細胞に対して同様の結合を呈した。
【０３６７】
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡを、細胞表面上に発現されるＰＤ‐１とそのリガンドＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２との間の結合をブロックする能力に関して評価した。ＰＤ‐Ｌ１‐ＰＥ又はＰＤ‐Ｌ２‐ＰＥを、上述のような結合分子の存在下でインキュベートし、ＮＳＯ‐ＰＤ‐１細胞に結合する能力を、ＦＡＣＳを用いて評価した。この評価の結果を図１５Ａ（ＰＤ‐Ｌ１）及び図１５Ｂを（ＰＤ‐Ｌ２）に提示する。予測されたように、ＣＴＬＡ‐４抗体は阻害せず、試験した全てのＰＤ‐１結合分子は、ＰＤ‐Ｌ１（図１５Ａ）及びＰＤ‐Ｌ２（図１５Ｂ）の両方が、ＮＳＯ細胞の表面上に発現されたＰＤ‐１に結合するのを阻害できた。全てのＰＤ‐１結合分子は、ＰＤ‐１に対して２価であり、同様の阻害プロファイルを呈した。
【０３６８】
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐも、ＰＤ‐１ブロックレポータアッセイで評価した。これらの結合分子を、ＰＤ‐Ｌ１+  ＣＨＯ及びＪｕｒｋａｔエフェクタ細胞の存在下でインキュベートし、上記結合分子の、（ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１相互作用をブロックすることによって）免疫阻害をブロックする能力を、（ＮＦＡＴ‐ｌｕｃ／ＰＤ‐１  Ｊｕｒｋａｔアッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａにおけるルシフェラーゼ発現の増加によって実証されるような）ＣＤ３仲介型活性化の程度を追跡することによって評価した。この評価の結果を図１６に提示する。試験した全てのＰＤ‐１結合分子は、ルシフェラーゼ発現の増加によって実証されるように、ＰＤ‐１免疫チェックポイント阻害シグナルを反転させることができた。全てのＰＤ‐１結合分子は、ＰＤ‐１に対して２価であり、Ｔ細胞シグナリングのＰＤ‐１によるブロックを阻害する能力を同等に呈した。ＣＴＬＡ‐４抗体は、この系では全く阻害しなかった。
【０３６９】
Ｆ．ＣＴＬＡ‐４／ＰＤ‐１細胞ベースアッセイ
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ及び陰性対照抗体を、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４を共連結する能力に関して、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸによる酵素断片相補性アッセイにおいて試験した。簡潔に述べると、Ｕ２ＯＳ  ＣＴＬＡ‐４（１‐１９５）‐ＰＫ  ＰＤ‐１（１‐１９９）‐ＥＡ細胞株＃９のアリコートを、３８４ウェルプレート上のＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＣＰ５播種培地に、５０００細胞／ウェルで４回播種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で４時間付着させた。各結合分子の１１点１：３連続希釈物を、ＰＤ‐１‐ＣＴＬＡ‐４細胞に添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩（１６時間）インキュベートした。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬をウェルに添加した後、これを暗所において、室温で１時間インキュベートし、続いてプレートをＥｎｖｉｓｉｏｎルミノメータで読み取った。この評価の結果を、表１４及び図１７（Ｕ２ＯＳ  ＣＴＬＡ‐４（１‐１９５）‐ＰＫ  ＰＤ‐１（１‐１９９）‐ＥＡ細胞株＃９）に提示する。二重特異性ＤＡＲＴ  Ｄ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ分子はいずれも、酵素断片相補性によって示されるように、両方の受容体を発現する細胞において相当なＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４の合体を示し、これは、本発明の二重特異性分子が、ＰＤ‐１及びＣＴＬＡ‐４に同時に結合できることを示し、更に、ＰＤ‐１による係留によって、両方の標的受容体が発現された場合のＴＲＩＤＥＮＴ分子のＣＴＬＡ‐４結合親和性の低下が補償されることを示す。この発見は、上述のＥＬＩＳＡ阻害研究と矛盾しない。陰性対照は、ＰＤ１‐ＣＴＬＡ４細胞株においてシグナルの有意な増大を誘発しなかった。より高濃度のＴＲＩＤＥＮＴ  Ａを用いたインキュベーションは、Ｕ２ＯＳ  ＰＤ１‐ＣＴＬＡ４二量体化細胞株（Ｓ：Ｂ＝１２．７）におけるロバストなシグナル増大を誘発した。ＰＤ‐１‐ＣＴＬＡ‐４細胞株における用量応答試験でのＤＡＲＴ  Ｄとの反応は、大きさが比較的小さかった（Ｓ：Ｂ＝９．２）が、ＥＣ５０値はこれらの分子両方に関して同様であった（ＥＣ５０＝２０ｐＭ）。
【０３７０】
【表１４】
2019506444.tif 000016
【０３７１】
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の応答を増強する能力を評価した。（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ陽性選択キットを用いてＰＢＭＣから単離した）ＣＤ１４＋単球を、ＧＭ‐ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ‐４（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置することによって、単球由来樹状細胞を生成した後、この細胞を７日間培養した。７日目、細胞を採取して９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。８日目、２０００００細胞／ウェルの（Ｍｙｌｔｅｎｙｉキットを用いた陰性選択によって単離した）ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び試験物を添加し、３日間培養した。次に、培養物上清中のＩＦＮ‐γレベルを、ＩＦＮ‐γ用のヒトＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を製造元の説明書に従って用いて、測定した。抗体を組み合わせて使用する場合、各抗体を指示されている濃度で添加するため、抗体の合計濃度は２倍となる。ＩＦＮ‐γの放出を図１８にプロットする。二重特異性ＤＡＲＴ  Ｄ及びＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ分子はいずれも、個々の親抗体の組み合わせと同程度に、又はそれよりもわずかに良好に、ＭＬＲ応答を増強することが分かった。
【０３７２】
ＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、及びＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １の組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）の、チェックポイント阻害によってサイトカイン放出を増強する能力も、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型（ＳＥＢ）再刺激アッセイで評価した。全体として、（例えばＦｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ密度勾配遠心法（GE Healthcare）を製造元の説明書に従って用いて）健康なドナーからの全血からＰＢＭＣを精製した。精製したＰＢＭＣを、Ｔ‐２５バルクフラスコ内において、ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、２〜３時間、単独で又は０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（例えばＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）と組み合わせて、培養した。ＳＥＢ刺激の第１ラウンドの終了時に、ＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄し、培地単独、対照若しくは試験物を含む培地、０．５ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（二次刺激）を含むが抗体を含まない培地、又はＳＥＢ及び対照ＩｇＧ若しくは試験物を含む培地中で１‐５×１０5細胞／ウェルの濃度で、９６ウェル細胞培養プレートに即座に播種し、更に２〜３日間培養した。第２の刺激の終了時に上清を採取して、（ＩＦＮγ、ＩＬ‐２、ＴＮＦα、ＩＬ‐１０及びＩＬ‐４用のヒトＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を製造元の説明書に従って用いて）サイトカイン分泌を測定した。
【０３７３】
図１９Ａ〜１９Ｂは、ＳＥＢ刺激の不在下（図１９Ａ）又は存在下（図１９Ｂ）での、上述のようなＰＢＭＣによる、ＰＤ‐１対ＣＴＬＡ‐４の発現の、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）ドットプロットを示す。図１９Ｃは、ＩＦＮ‐γ分泌に対するＳＥＢ刺激の影響を示す。ＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍｌの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ型で４８時間刺激した。続いて細胞を採取して洗浄し、更に４８時間にわたって、新鮮なＳＥＢを用いて、様々な濃度の抗体と共に９６ウェルプレートに再播種した。上清を採取し、ＩＦＮ‐γ産生に関して、フローサイトメトリーELISAによって分析した。二重特異性ＤＡＲＴ及びＴＲＩＤＥＮＴタンパク質はいずれも、個々の親ｍＡｂの組み合わせで観察された応答を再現したＩＦＮ‐γ応答の増大を示した。同様の結果が、ＰＢＭＣを高濃度（５００ｎｇ／ｍＬ）のＳＥＢを用いて７２時間にわたって培養したＳＥＢ刺激アッセイにおいて観察された。Ｔ細胞応答に対するＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の影響を更に調査するために、ＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍｌのＳＥＢで４８時間にわたって刺激し、採取して洗浄し、更に４８時間にわたって、新鮮なＳＥＢ、及びＤＡＲＴ  Ｄ、ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ、ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐ、又はＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ／ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの組み合わせ（Ａｂ  Ｃｏｍｂｏ  １）を用いて、９６ウェルプレートに再播種し、放出されたＩＬ‐２を測定した（図１９Ｄ）。図１９Ａ〜１９Ｄは、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の投与によってＴ細胞応答が有意に増強されたことを示す。抗体を組み合わせて使用する場合、各抗体を指示されている濃度で添加するため、抗体の合計濃度は２倍となる。
【０３７４】
実施例６  インビボ研究
Ａ．ＧＶＨＤマウスモデルにおけるＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の活性
代表的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性２価分子、ＤＡＲＴ  Ｄの活性を、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のＰＢＭＣ移植ＮＯＧマウスモデルで評価した。この研究の設計を表１５に提示する。
【０３７５】
【表１５】
2019506444.tif 000017
【０３７６】
ＣＤ３＋Ｔ細胞の計数を、研究１４日目にＦＡＣＳによって実施した。これは図２０Ａにプロットされている。研究の過程全体にわたって生存数を監視した。これは図２０Ｂに、％生存数としてプロットされている。５００μｇ／ｋｇのＤＡＲＴ  Ｄで処置した動物において、Ｔ細胞膨張の増大及びＧＶＨＤの加速が見られ、これはＴ細胞免疫応答の増強と矛盾しない。
【０３７７】
Ｂ．ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の毒物学及び薬物動態学的研究
代表的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性２価分子であるＤＡＲＴ  Ｄ、及び代表的なＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性３価分子であるＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの安全性プロファイルを、カニクイザルにおける非ＧＬＰ（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：優良試験所基準）投薬研究で評価した。更に、薬物動態学的活性の複数のマーカを検査した。
【０３７８】
この研究では、複数の静脈内注入によって投与した場合の、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の潜在的毒性を評価した。この研究の設計を表１６に提示する。
【０３７９】
【表１６】
2019506444.tif 000018
【０３８０】
このように、５０ｍｇ／ｋｇの用量と、７５ｍｇ／ｋｇへの増量との間に、２週間のインターバルを設けた。この研究において、以下のパラメータ及びエンドポイントを評価した：臨床的兆候、体重、食餌消費量、体温、臨床病理パラメータ（群１〜３に関しては投薬前及び投薬の２３時間後、群４に関しては２２日目までの、凝固、臨床化学及び血液学）、生体分析及び毒物動態パラメータ、フローサイトメトリー（投薬前及び投薬の２３時間後）、サイトカイン（投薬の２、６、２２時間後）。抗薬物抗体を、８日目、１５日目及び２２日目においてのみ、群４に関して評価した。群１〜３に関してのみ、３回目の投薬の４８時間後に剖検を実施した。ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子にインビボ結合及び活性も、以下のようにして評価した。
【０３８１】
全ての動物は、スケジュール設定された安楽死まで生存した。最高７５ｍｇ／ｋｇ／週の３回の用量を投与された動物において、有害な臨床的観察は存在しなかった。特に、下痢は観察されなかった。病理組織も顕著ではなかった。免疫系の刺激時に予測されたように、処置群においてグロブリンレベルの上昇が観察され、群２〜３では脾臓及び胸腺の臓器重量の増大が観察された（表１７を参照；群４は安楽死させられなかった）。各処置群に関する血清濃度‐時間プロファイルが図２１Ａ〜２１Ｃに示されており、これは、カニクイザルにおける、ヒトＦｃ領域を備える分子と矛盾しない。
【０３８２】
【表１７】
2019506444.tif 000019
【０３８３】
抗ＣＴＬＡ‐４抗体イピリムマブでの処置後の、絶対リンパ球数（ＡＬＣ）の増加は、臨床的便益及び全体的な生存に相関していると思われることが報告されており（例えば、Ku, G.Y., et al.  (2010) “Single‐Institution Experience With Ipilimumab In Advanced Melanoma Patients In The Compassionate Use Setting: Lymphocyte Count After 2 Doses Correlates With Survival” Cancer 116(7):1767‐1775を参照）これは、ＡＬＣが有用な薬力学（ＰＤ）的エンドポイントとなり得ることを示す。ＡＬＣは、処置前、並びに処置の２、８、９、１５及び１６日後に、上述の群それぞれにおいて検査された。ＰＤ‐１＋Ｔ細胞上でのＤＡＲＴ  Ｄ又はＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ結合部位の占有度を、サルの血液試料それぞれに関する２つの条件下で、ＣＤ４＋／ＰＤ‐１＋及びＣＤ８＋／ＰＤ‐１＋Ｔ細胞集団における、抗ヒトＩｇＧ４  Ａｌｅｘａ  ４８８＋イベントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって決定した。一方の条件下では、過剰量のＤＡＲＴ  Ｄ又はＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの存在下で得られるＭＦＩ値を用いて、各細胞集団内における、ＰＤ‐１＋細胞に対する細胞最高ＤＡＲＴ  Ｄ又はＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ結合強度を決定した。第２の条件下では、過剰量の陰性対照の存在下で得られるＭＦＩ値を用いて、試料回収時にＤＡＲＴ  Ｄ又はＴＲＩＤＥＮＴ  Ａで処置された動物が呈する、各細胞集団内におけるＰＤ‐１＋細胞の結合強度を決定した。これら２つの条件間の差異を用いて、ＤＡＲＴ  Ｄ又はＴＲＩＤＥＮＴ  Ａで処置された動物における、ＰＤ‐１＋Ｔ細胞サブセット上でのＤＡＲＴ  Ｄ又はＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ結合部位の％占有度を、以下のようにして算出した：
【０３８４】
【数１】
2019506444.tif 000020
【０３８５】
絶対数、及び１日目に対して正規化された％変化が、図２２Ａ（細胞１０００個／μｌ（ｔｈ／μｌ）及び図２２Ｂ（１日目（Ｄ１）に対して正規化されたＡＬＣの％変化）にプロットされている。各ＤＡＲＴ  Ｄ処置群は、処置直後にＡＬＣの初期降下を呈し、その後、ベースラインを十分に超えるレベルまでのＡＬＣの増加を呈する。同様の傾向が、１回の比較的低い用量のみを投与されたＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ処置群に関して観察された。
【０３８６】
更に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞上でのＰＤ‐１の占有率を、上述の群１〜３に関して検査した。簡潔に述べると、ＣＤ３＋／ＰＤ‐１＋Ｔ細胞をＦＡＣＳで分析して、ＤＡＲＴ  Ｄによって結合される細胞の％を評価した。４０μｌの陰性対照分子（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）×フルオレセインＩｇＧ４、κＦｃ  ＤＡＲＴ）又は３５μｇ／ｍＬの試験物（ＤＡＲＴ  Ｄ若しくはＴＲＩＤＥＮＴ  Ａ）を、９６深型ウェルプレートに添加した。次に、１００μｌの十分に混合した抗凝固全血を各ウェルに添加し、ピペットを用いて完全に混合して、周囲温度で４５〜７５分間、暗所でインキュベートした。続いて、１０００μｌの１×ＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液を各ウェルに添加し、ピペットを用いて混合した後、プレートを周囲温度で更に１０〜２０分間、暗所でインキュベートした。次にプレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄ステップとして、１０００μｌのＦＡＣＳバッファを各ウェルに添加して混合した。次にプレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、２０μｌのＰａｎｅｌ  １抗体混合物を用いて再懸濁し、周囲温度で３０〜６０分間インキュベートした。プレートを上述の洗浄ステップと同様にして洗浄した。インキュベーションの終了時、プレートを再洗浄し、最終的に細胞ペレットを３００μｌのＦＡＣＳバッファ中に再懸濁して、試料を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ細胞分析器で分析した。分析の結果を図２３Ａ〜２３Ｂに示す。
【０３８７】
図２３Ａ（５０ｍｇ／ｋｇで投与したＤＡＲＴ  Ｄに関する）及び図２３Ｂ（７５ｍｇ／ｋｇで投与したＤＡＲＴ  Ｄに関する）に示すように、ＰＤ‐１占有度（即ちＤＡＲＴ  Ｄによる結合）は、群２及び３に関して、処置の持続時間全体を通して最大であった。増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｋｉ‐６７（増殖の細胞マーカ）の共発現に関して、ＦＡＣＳで評価した。
【０３８８】
２０μｌの（細胞表面マーカ：ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８に結合する抗体を含有する）抗体混合物Ａを、９６深型ウェルプレートに添加した。次に、５０μｌの十分に混合した抗凝固全血を各ウェルに添加し、ピペットを用いて完全に混合して、周囲温度で１５〜４５分間、暗所でインキュベートした。続いて、５００μｌの１×ＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液を各ウェルに添加し、ピペットを用いて混合した後、プレートを周囲温度で更に１０〜２０分間、暗所でインキュベートした。プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に洗浄ステップとして、５００μｌのＦＡＣＳバッファを各ウェルに添加して混合した。次にプレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、（細胞内マーカＫｉ６７に結合する抗体を含有する）抗体混合物Ｂ中に再懸濁するか、又は（細胞内マーカのアイソタイプ対照を含有する）イソ抗体調製物中で再懸濁し、暗所で１５〜４５分間インキュベートした。洗浄後、細胞ペレットを３００μｌのＦＡＣＳバッファ中に再懸濁して、試料を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ細胞分析器で分析した。Ｔ細胞の細胞内染色パネルから、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の百分率を、全ＣＤ４５＋白血球ゲート細胞の分数として決定した。ゲートＣＤ４＋細胞中のＫｉ６７＋の細胞イベントを計数し、ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋Ｔ細胞（増殖性ＣＤ４Ｔ細胞）の百分率を、全ＣＤ４＋細胞の分数として決定した。同様にして、ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋Ｔ細胞（増殖性ＣＤ８  Ｔ細胞）の百分率を全ＣＤ８＋細胞の分数として決定した。この分析の結果を図２４Ａ〜２４Ｂに示す。
【０３８９】
図２４Ａ〜２４Ｂに示すに示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、処置の持続時間を通して、処置群２及び３において顕著に増強された。この研究の結果は、ＰＤ‐１×ＣＴＬＡ‐４二重特異性分子の投与が、カニクイザルにおいて、最高７５ｍｇ／ｋｇの濃度において十分に耐容性であることを示している。イピリムマブで処置したカニクイザルに関して、有害なイベントが報告されたのは投薬量５ｍｇ／ｋｇを大きく超えた場合であった。上記分子は良好な薬物動態プロファイルを呈し、リンパ球数の増加、グロブリンレベルの上昇、脾臓及び胸腺臓器重量の増加、Ｔ細胞増殖（Ｔ細胞数及びＫｉ‐６７の発現の両方）の増大、並びにＴ細胞上の最大ＰＤ-１占有率を含む、多数の薬力学活性のマーカが観察された。
【０３９０】
本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０３９１】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号２：例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号３：例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号４：例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号５：介在スペーサペプチド（リンカー１）
配列番号６：システイン含有スペーサペプチド（リンカー１）
配列番号７〜１２：代替的なスペーサペプチドリンカー２
配列番号１３：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１４、１５：ヒトＩｇＧヘテロ二量体促進ドメインのヒンジ領域
配列番号１６、１７：ヒトκ軽鎖ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１８：Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１９：Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２０：システイン含有Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２１：システイン含有Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号２２：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）
配列番号２３〜２５：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異型
配列番号２６〜３２：介在スペーサリンカー
配列番号３３：例示的なＩｇＧ１ヒンジ領域
配列番号３４：例示的なＩｇＧ２ヒンジ領域
配列番号３５：例示的なＩｇＧ４ヒンジ領域
配列番号３６：安定化Ｓ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型
配列番号３７：介在スペーサペプチド
配列番号３８：例示的なヒトＩｇＧ  ＣＬκドメイン
配列番号３９：例示的なヒトＩｇＧ  ＣＬλドメイン
配列番号４０：ヒトＩｇＧ  １  ＣＨ１ドメイン
配列番号４１：ヒトＩｇＧ  ２  ＣＨ１ドメイン
配列番号４２：ヒトＩｇＧ  ４  ＣＨ１ドメイン
配列番号４３：Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（Ｋａｂａｔ）を含むヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号４４：「ノブ担持」ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号４５：「ホール担持」ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号４６：シグナル配列（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５００９．２）を含むヒトＰＤ‐１
配列番号４７：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １（ニボルマブ）のＶＨドメイン
配列番号４８：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １（ニボルマブ）のＶＬドメイン
配列番号４９：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２（ペンブロリズマブ）のＶＨドメイン
配列番号５０：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２（ペンブロリズマブ）のＶＬドメイン
配列番号５１：マウス抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３（ＥＨ１２．２Ｈ７）のＶＨドメイン
配列番号５２：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３（ＥＨ１２．２Ｈ７）のＶＬドメイン
配列番号５３：ヒト化抗ヒト抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４（ピジリズマブ）のＶＨドメイン
配列番号５４：ヒト化抗ヒト抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４（ピジリズマブ）のＶＬドメイン
配列番号５５：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５）のＶＨドメイン
配列番号５６：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５）のＶＬドメイン
配列番号５７：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６）のＶＨドメイン、Ｘａａはイソロイシン（Ｉ）又はアラニン（Ａ）である
配列番号５８：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６）のＶＬドメイン、２６位のＸａａはアスパラギン（Ｎ）又はセリン（Ｓ）であり、５８位のＸａａはグルタミン（Ｑ）またはアルギニン（Ｒ）である
配列番号５９：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７）のＶＨドメイン、１２位のＸａａはバリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）であり、３５位のＸａａはセリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）であり、４８位のＸａａはバリン（Ｖ）またはトレオニン（Ｔ）であり、８６位のＸａａはロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）である。
配列番号６０：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７）のＶＬドメイン、３１位のＸａａはセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）であり、５０位のＸａａはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラテート（Ｄ）である
配列番号６１：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８）のＶＨドメイン
配列番号６２：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８）のＶＬドメイン
配列番号６３：ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３ＤＡＲＴ  Ａの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号６４ＰＤ‐１×ＬＡＧ‐３ＤＡＲＴ  Ａの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号６５：ｍＡｂ  ４‐４‐２０のＶＨドメイン
配列番号６６：ｍＡｂ  ４‐４‐２０のＶＬドメイン
配列番号６７：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−１の第１のポリペプチド鎖
配列番号６８：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−１の第２のポリペプチド鎖
配列番号６９：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−２の第１及び第３のポリペプチド
配列番号７０：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−３の第１のポリペプチド鎖
配列番号７１：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−３の第３のポリペプチド鎖
配列番号７２：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−４の第３のポリペプチド鎖
配列番号７３：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−４の第４のポリペプチド鎖
配列番号７４：汎用二重特異性アダプタ分子ＵＢＡ−５の第３のポリペプチド鎖
配列番号７５：シグナル配列（ＮＣＢＩ配列番号ＮＰ＿００５２０５．２）を含むヒトＣＴＬＡ−４
配列番号７６：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １（イピリムマブ）のＶＨドメイン
配列番号７７：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  １（イピリムマブ）のＶＬドメイン
配列番号７８：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２（トレメリムマブ）のＶＨドメイン
配列番号７９：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ‐４  ｍＡｂ  ２（トレメリムマブ）のＶＬドメイン
配列番号８０：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むＩｇＧ１のＦＣ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８１：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むＩｇＧ４のＦＣ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８２：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むＩｇＧ１のＦＣ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの「ノブ担持」変異型、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８３：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むＩｇＧ１のＦＣ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの「ホール担持」変異型、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８４：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むＩｇＧ４のＦＣ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの「ノブ担持」変異型、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８５：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ置換を含むＩｇＧ４のＦＣ領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの「ホール担持」変異型、Ｘａａはリジン（Ｋ）又は不在である
配列番号８６：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｉ  ＶＨ）のＶＨドメイン
配列番号８７：ヒト化抗ヒトＰＤ‐１抗体（ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  ＳＱ  ＶＬ）のＶＬドメイン
配列番号８８：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの重鎖
配列番号８９：抗ヒトＰＤ‐１抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６  Ｇ４Ｐの軽鎖
配列番号９０：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ  ３のＶＨドメイン
配列番号９１：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ  ３のＶＬドメイン
配列番号９２：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡの重鎖
配列番号９３：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐの重鎖
配列番号９４：抗ヒトＣＴＬＡ‐４抗体ｍＡｂ  ３  Ｇ１ＡＡ及びｍＡｂ  ３  Ｇ４Ｐの軽鎖
配列番号９５：ＤＡＲＴ  Ｂの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号９６：ＤＡＲＴ  Ｂの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号９７：ＤＡＲＴ  Ｃの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号９８：ＤＡＲＴ  Ｃの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号９９：ＤＡＲＴ  Ｄの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号１００：ＤＡＲＴ  Ｄの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号１０１：ＤＡＲＴ  Ｆの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号１０２：ＤＡＲＴ  Ｅの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号１０３：ＤＡＲＴ  Ｅの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号１０４：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第１のポリペプチド鎖
配列番号１０５：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第２のポリペプチド鎖
配列番号１０６：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第３のポリペプチド鎖
配列番号１０７：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ａの第４のポリペプチド鎖
配列番号１０８：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第１のポリペプチド鎖
配列番号１０９：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｂの第３のポリペプチド鎖
配列番号１１０：ＴＲＩＤＥＮＴ  Ｃの第３のポリペプチド鎖
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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