(57)【要約】  本開示は、試料において、ｐ５３に対する抗体（抗ｐ５３抗体）を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：分析しようとする試料をｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原とインキュベートし、それによって、ｐ５３捕捉抗原、抗ｐ５３抗体およびｐ５３検出抗原を含む複合体を形成し、形成された複合体を、未結合検出抗原から分離し、そして得られた複合体を該複合体に含まれる検出抗原を通じて測定し、それによって試料中に含まれる抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む、前記方法に関する。
2019512688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料において、ｐ５３に対する抗体（抗ｐ５３抗体）を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：
ａ）分析しようとする試料をｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原とインキュベートし、それによって、該ｐ５３捕捉抗原、該抗ｐ５３抗体および該ｐ５３検出抗原を含む複合体を形成し、
ｂ）（ａ）で形成された複合体を、未結合検出抗原から分離し、
ｃ）工程（ｂ）で得られた複合体を、該複合体に含まれる検出抗原を通じて測定し、それによって試料中に含まれる抗ｐ５３抗体を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ｐ５３捕捉抗原が固相に結合可能である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｐ５３捕捉抗原が結合対の第一のパートナーに共有結合し、そして該結合対の第二のパートナーが固相に結合している、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
結合対の第一のパートナーが、ハプテン、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、ＤｓＦおよび受容体のリガンドより選択され、そして該結合対の第二のパートナーが、抗ハプテン抗体、アビジンまたはストレプトアビジン、ＦｍＧ  ＤｓＦ、およびリガンド受容体より選択される、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
前記ｐ５３捕捉抗原がビオチン化され、そして固相がアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされる、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
前記ｐ５３捕捉抗原が固相に結合されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
前記ｐ５３検出抗原が直接検出可能な標識を含む、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
直接検出可能な標識が、発光標識、蛍光標識、化学発光標識または電気化学発光標識からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
直接検出可能な標識が化学発光または電気化学発光標識である、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐ５３捕捉抗原および前記ｐ５３検出抗原の両方が、配列番号１のペプチドを含む、請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐ５３捕捉抗原および前記ｐ５３検出抗原の両方が、配列番号２のペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１および配列番号２のペプチドが、各々、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原の両方に含まれる、請求項１〜１１のいずれか記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐ５３検出抗原が、配列番号１および配列番号２のペプチドの両方を少なくとも２回含む、請求項１〜１２のいずれか記載の方法。
【請求項１４】
前記検出抗原が、少なくとも１つの多量体化ドメイン、少なくとも１つの配列番号１のポリペプチドおよび少なくとも１つの配列番号２のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含み、該多量体化ドメインが、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｅｃＢ、Ｈｓｐ２５、ＭＩＰ、ＧｒｏＥＬ、ＣｌｐＢおよびＣｌｐＸからなる群より選択される原核または真核シャペロンである、請求項１〜１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記ｐ５３検出抗原が間接的に検出可能な標識を含む、請求項１〜１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの多量体化ドメイン、少なくとも１つの配列番号１のポリペプチドおよび少なくとも１つの配列番号２のポリペプチドを含み、該多量体化ドメインが、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｅｃＢ、Ｈｓｐ２５、ＭＩＰ、ＧｒｏＥＬ、ＣｌｐＢおよびＣｌｐＸからなる群より選択される原核または真核シャペロンである、融合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ｐ５３に対する抗体（抗ｐ５３抗体）の検出のための方法に関する。開示する方法は、最新技術の方法と比較した際に、より高い特異性を持つ抗ｐ５３抗体の検出を可能にする。本開示記載の方法は、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原を必要とする。該方法は、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原を、抗ｐ５３抗体を含むことが知られるかまたは含むと推測される試料とインキュベートし、それによって、ｐ５３捕捉抗原および抗ｐ５３抗体およびｐ５３検出抗原を含む複合体を形成し、形成された複合体を未結合検出抗原から分離し、得られた複合体を該複合体に含まれる検出抗原を通じて測定し、そしてそれによって試料中に含まれる抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む。
【発明の概要】
【０００２】
発明の背景
抗ｐ５３抗体（抗ｐ５３  Ａｂ）は、腫瘍関連抗原スクリーニングの過程で、３０年以上前に発見された。Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｌ．Ｖ．ら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ３０：  ４０３−４０８，  １９８２。しかし、この研究、ならびに１９８０年代初めに行われたいくつかの類似のものは、その期間中にはｐ５３には関心が持たれていなかったために、１０年以上実質的に無視されてきた。
【０００３】
１９９０年代初め、ｐ５３遺伝子が、ヒト癌のほぼすべてのタイプにおいて、分子改変の最も一般的なターゲットであることが発見された。これにより、正常および形質転換細胞における、ｐ５３タンパク質およびその機能の研究に、かなりの関心が誘発された。これはまた、癌患者においてすでにそれより以前に見出されていた、体液性反応の再発見にもつながった。
【０００４】
腫瘍抑制因子ｐ５３は、正常細胞の核において辛うじて検出可能なリンタンパク質である（Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌ，  Ｓ．ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １  （１９８２）  １０５５−１０６２）。細胞性ストレス、特にＤＮＡ損傷によって誘導されたストレスに際して、ｐ５３は、細胞周期進行を抑止し、それによってＤＮＡが修復されることを可能にする、またはこれはアポトーシスを導きうる。突然変異体ｐ５３を所持する癌細胞において、このタンパク質はもはや細胞増殖を制御することは不可能であり、この結果、ＤＮＡ修復が不十分となる（Ｌｅｖｉｎｅ，  Ａ．  Ｃｅｌｌ  ８８  （１９９７）  ３２３−３３１）。ヒト癌におけるｐ５３の最も一般的な変化は、点ミスセンス突然変異であり、これは、結腸、胃、乳房、肺、脳および食道の癌に見出される（Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ，  Ｍ．ら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４  （１９９４）  ４８５５−４８７８）。ｐ５３突然変異は、ヒト癌において最も頻繁な遺伝子事象であり、そして症例の５０％以上と概算される。ｐ５３抗体の頻度およびｐ５３突然変異の頻度の間には、非常に強い相関があり、ｐ５３突然変異がこれらの抗体の出現に関与することを示している（Ｓｏｕｓｓｉ，  Ｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０  （２０００）  １７７７−１７８８）。抗ｐ５３抗体は、ヒト癌患者において、約９６％の特異性で見出されるが、こうした検出の感度はわずか約３０％である。
【０００５】
抗ｐ５３抗体とｐ５３突然変異の関連は、抗ｐ５３体液性免疫反応が、ｐ５３タンパク質の強い免疫原性に関連した自己免疫プロセスのためであることを示唆する。
発癌におけるｐ５３突然変異の役割は徹底的に研究されてきており、そして抗ｐ５３抗体は、とりわけ、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、食道癌および乳癌などの多くの癌タイプに関連することが見出されてきている。これらの３つの癌タイプは、かなりの医療負荷に相当する。
【０００６】
男性において、７４６，０００症例／年の発症があるＣＲＣは、世界中の男性において３番目に一般的な癌であり、そして男性患者の癌全体の１０．０％に相当する。ＣＲＣはまた、世界中の女性において２番目に多く、毎年６１４，０００の新規症例があり、女性患者が罹患する癌の９．２％に相当する。食道癌は、癌による死因で６番目目に多く、そして男性および女性の４５６，０００の新規症例の発症があると概算され、毎年の新規癌総数の３．２％に相当する。乳癌は、女性の間で圧倒的に最も頻繁な癌であり、２０１２年には、世界中で概算１６７万の新規癌症例があり、これは女性患者のすべての癌の２５％に相当する。全体で、乳癌は世界中で２番目に最も一般的な癌である。抗ｐ５３（自己）抗体と関連する癌タイプの発症率が高いことから明らかであるように、抗ｐ５３（自己）抗体の検出のために、高感度でそして信頼性がある診断法に関する必要性がある。
【０００７】
Ｓｏｕｓｓｉ，  Ｔ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０  （２０００）  １７７７−１７８８）によって要約されるように、抗ｐ５３に関する多くの論文が発表されてきている。用いられる検出法は非常に多様であり、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法およびウェスタンブロッティングが最も顕著なものである。抗ｐ５３抗体検出のための多くの異なる方法の使用が、抗ｐ５３抗体の診断有用性に関して、いくつかの矛盾した結果およびある程度の不確実性を生じていることも十分にありうる。
【０００８】
抗ｐ５３抗体の測定のために最初の商業的アッセイが利用可能になったことは、抗ｐ５３抗体に対するデータ／論文の比較可能性を改善する際に大きな価値を有している。抗ｐ５３抗体の測定のために最も頻繁に用いられるアッセイの１つは、株式会社医学生物学研究所、ＫＤＸ、日本・名古屋によって販売されている「ＭＥＳＡＣＵＰ抗ｐ５３試験」である。ヒト血清における抗ｐ５３  ＩｇＧの検出のためのこの酵素イムノアッセイは、面倒であり、そして例えば、それぞれ特異的（非特異的を含む）および非特異的結合両方の平行測定を必要とする。次いで、特異的結合の割合は、特異的および非特異的結合の合計から、非特異的結合に関して決定された値を引くことによって、計算されなければならない。
【０００９】
抗体のＩｇＭクラスの抗体は、一般に、より粘着性が高く、そしてさらなる複雑な事態、例えばさらなる交差反応性および非特異的結合を導く。このため、抗ｐ５３検出法は、大部分の場合、抗ヒトＩｇＧ検出試薬、すなわち免疫グロブリンＧクラスのヒト（自己）抗体のみの検出に頼り、そして免疫グロブリンＭクラスの検出には頼らない。Ｍｅｓａｃｕｐアッセイを実行すべき方法によってさらに明らかであるように、非特異的結合は、抗ｐ５３抗体の検出において用いられる方法いずれに関しても重要な問題である可能性が最も高い。
【００１０】
抗ｐ５３（自己）抗体に関連する癌タイプの高い発症率から明らかであるように、そしてこれらの抗体を検出するために用いられている最新技術の方法の欠点からさらに明らかであるように、抗ｐ５３（自己）抗体の検出のための高感度でそして信頼性があるイムノアッセイ法に関する非常に大きな必要性がある。
【００１１】
驚くべきことに、本明細書に開示するような抗ｐ５３（自己）抗体を検出するための方法は、迅速で、信頼性があり、特異的、高感度であり、そして抗ｐ５３（自己）抗体の検出において新規の基準となる可能性を有することが見出されてきている。
【００１２】
発明の要約
本明細書において、試料において、ｐ５３に対する抗体（抗ｐ５３抗体）を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：ａ）分析しようとする試料をｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原とインキュベートし、それによって、ｐ５３捕捉抗原、抗ｐ５３抗体およびｐ５３検出抗原を含む複合体を形成し、ｂ）（ａ）で形成された複合体を、未結合検出抗原から分離し、ｃ）工程（ｂ）で得られた複合体を該複合体に含まれる検出抗原を通じて測定し、それによって試料中に含まれる抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む、前記方法を報告する。さらなるそしてより詳細な態様は、例えば、本開示に記載する方法で使用するための、ｐ５３の特異的部分的配列に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｅｌｅｃｓｙｓ抗ｐ５３アッセイのアッセイ原理。二重抗原サンドイッチアッセイ（ＤＡＧＳ）形式を模式的に示す。→ビオチン化捕捉抗原（常磁性ビーズにコーティングされたストレプトアビジンに結合する）およびルテニウム化ｐ５３検出抗原を通じて、試料中に存在する抗ｐ５３自己抗体の検出を達成する。
【図２】ＲＯＣブロット。分析した両方のアッセイに関する受信者動作曲線（ＲＯＣ）を提供する。ＭｅｓａＣｕｐアッセイに関するＲＯＣを破線として示す一方、本出願に開示するアッセイに関するＲＯＣを実線／全線として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、試料において、ｐ５３に対する抗体（抗ｐ５３抗体）を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：ａ）分析しようとする試料をｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原とインキュベートし、それによって、ｐ５３捕捉抗原、抗ｐ５３抗体およびｐ５３検出抗原を含む複合体を形成し、ｂ）（ａ）で形成された複合体を、未結合検出抗原から分離し、ｃ）工程（ｂ）で得られた複合体を該複合体に含まれる検出抗原を通じて測定し、それによって試料中に含まれる抗ｐ５３抗体を検出する工程を含む、前記方法に関する。
【００１５】
以下において、用語「抗ｐ５３（自己）抗体」、「抗ｐ５３抗体」または「ｐ５３抗体」は、交換可能に用いられる。抗ｐ５３抗体は、配列番号３のｐ５３ポリペプチドまたはその部分配列に結合する抗体である。
【００１６】
上述のように、本発明記載の方法は、それぞれ、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原の両方の使用を必要とする。調べようとする試料中に存在するｐ５３に対する抗体は、これらの抗原の両方に結合し、それによって、ｐ５３捕捉抗原、抗ｐ５３抗体およびｐ５３検出抗原を含む複合体を形成する。
【００１７】
用語「捕捉抗原」は、当業者によく知られる。
二重抗原サンドイッチイムノアッセイを実行するため、エピトープを少なくとも２つ提供することが必要であり、少なくとも１つは固相への結合を仲介するために捕捉抗原に対し、そして少なくとも１つは、形成されたサンドイッチ複合体（抗原−抗体−抗原）の検出を可能にするために検出抗原に対する。
【００１８】
１つの態様において、ｐ５３捕捉抗原は、固相への結合が可能である。
固相（固体支持体）を製造するための材料は、当該技術分野に周知であり、そしてこれにはとりわけ、商業的に入手可能なカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、デュラサイト（ｄｕｒａｃｙｔｅ）、反応トレイのウェルおよび壁、反応容器のウェルおよび壁、プラスチックチューブ等が含まれる。
【００１９】
１つの態様において、固相は、マイクロタイタープレートのウェルおよび壁によって代表される。
１つの態様において、固相は、粒子の形である。粒子は、磁性または強磁性金属、合金または組成物であるかまたはこれらを含む、微粒子であることも可能である。さらなる態様において、固相材料は、特定の特性を有することも可能であり、そして例えば疎水性または親水性であることも可能である。本発明の１つの態様において、微粒子は常磁性微粒子であり、そして本開示記載の測定法におけるこうした粒子の分離は、磁力によって促進される。磁力を適用して常磁性または磁性粒子を溶液／懸濁物から引き出し、そしてこれらを望ましいように保持しながら、溶液／懸濁物の液体を除去することも可能であり、そして粒子を、例えば洗浄することも可能である。
【００２０】
上に示すように、１つの態様において、ｐ５３捕捉抗原は固相に結合可能である。捕捉抗原が固相に結合することを可能にするため、特異的結合対を使用することが好ましい。こうした結合対の一方のパートナーを捕捉抗原に結合させ、そしてこうした結合対のもう一方のパートナーを固相に結合させる。
【００２１】
「結合対」は、本明細書において、高アフィニティで、すなわち１ナノモルのアフィニティまたはそれより優れたアフィニティで互いに結合する２つのパートナーからなる。結合対に関する態様は、例えば、受容体およびリガンド、抗原および抗体、ハプテンおよび抗ハプテン抗体からなる結合対、ならびに天然に存在する高アフィニティ結合対に基づく結合対である。
【００２２】
受容体−リガンド結合対の１つの例は、ステロイドホルモン受容体および対応するステロイドホルモンからなる対である。
本発明記載の方法に適した、結合対の１つのさらなるタイプは、ハプテンおよび抗ハプテン抗体結合対である。ハプテンは、１００〜２０００ダルトン、好ましくは１５０〜１０００ダルトンの分子量を持つ有機分子である。こうしたものとして用いる場合、こうした小分子は非免疫原性であるが、キャリアー分子にカップリングすることによって免疫原性を与えられることも可能であり、そして標準法にしたがって、抗ハプテン抗体を生成することも可能である。ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド−グリコシド、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド−グリコシドを含む群より選択されることも可能である。これらの物質クラスの代表は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ジトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、ストロファンチンである。別の適切なハプテンは、例えば、フルオレセインである。
【００２３】
天然に存在する高アフィニティ結合対に基づく結合対の例は、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ならびにＦｉｍＧおよびＤｓＦ結合対である。ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対は、当該技術分野に周知である。ＦｉｍＧ−ＤｓＦ結合対の基本原理は、例えば、ＷＯ２０１２／０２８６９７に記載される。
【００２４】
１つの態様において、ｐ５３捕捉抗原は、結合対の第一のパートナーに共有結合し、そして前記結合対の第二のパートナーは固相に結合する。
１つの態様において、結合対の第一のパートナーは、ハプテン、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、ＤｓＦおよび受容体のリガンドより選択され、そして前記結合対の第二のパートナーは、抗ハプテン抗体、アビジンまたはストレプトアビジン、ＦｍＧおよびリガンド受容体より選択される。
【００２５】
１つの態様において、結合対の第一のパートナーは、ハプテン、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびＤｓＦより選択され、そして前記結合対の第二のパートナーは、抗ハプテン抗体、アビジンまたはストレプトアビジンおよびＦｍＧより選択される。
【００２６】
１つの態様において、結合対の第一のパートナーは、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン、およびＤｓＦより選択され、そして前記結合対の第二のパートナーは、アビジンまたはストレプトアビジンおよびＦｍＧより選択される。
【００２７】
１つの態様において、結合対の第一のパートナーは、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンであり、そして前記結合対の第二のパートナーは、アビジンまたはストレプトアビジンより選択される。
【００２８】
１つの態様において、結合対の第一のパートナーはビオチンであり、そして前記結合対の第二のパートナーはストレプトアビジンである。
１つの態様において、本発明記載の方法は、ビオチン化されたｐ５３捕捉抗原およびアビジンまたはストレプトアビジンでコーティングされた固相を用いて実施される。
【００２９】
しかし、固相に捕捉抗原を直接結合させることもまた可能である。１つの態様において、本発明記載の方法は、固相に結合したｐ５３捕捉抗原を用いて実施される。
抗体は少なくとも二価であり、すなわち１つの「アーム」で捕捉抗原に結合し、そしてもう一方のアーム（または多価抗体に関しては他のアームいずれか）で検出抗原に結合する能力を有する。
【００３０】
調べようとする試料中に存在するｐ５３に対する抗体は、これらの抗原の両方に結合し、それによって、捕捉抗原、抗ｐ５３抗体および検出抗原を含む複合体が形成される。
当業者は、用語「検出抗原」をよく知っている。
【００３１】
用語、検出抗原は、この抗原が検出可能であることを意味する。こうした検出は、直接的または間接的のいずれかで検出可能な、多様なタイプの標識によって達成可能である。
１つの態様において、本開示記載の方法は、ｐ５３検出抗原が直接検出可能な標識を含む方法である。
【００３２】
用語、検出可能に標識される、は、直接または間接的に検出可能な標識を含む。
直接検出可能な標識は、検出可能シグナルを提供するか、または第二の標識と相互作用して、第一または第二の標識により提供される検出可能なシグナルを修飾し、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を生じる。標識、例えば蛍光色素および発光（化学発光および電気化学発光を含む）色素などの標識（Ｂｒｉｇｇｓら「官能化蛍光色素の合成、ならびにアミンおよびアミノ酸へのそのカップリング」Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．  １（１９９７）１０５１−１０５８）は、検出可能なシグナルを提供し、そして一般的に標識に適用可能である。１つの態様において、検出可能に標識される、は、それぞれ、検出可能なシグナルを提供するかまたは提供するよう誘導可能である標識、すなわち、発光標識、蛍光標識、化学発光標識または電気化学発光標識を指す。
【００３３】
本開示にしたがった１つの態様において、微粒子に基づく分析物特異的結合アッセイは、化学発光または電気化学発光標識および対応する光検出系を利用する。標識によって産生される光を測定し、そしてこの光は、直接または間接的に、分析物の存在または量を示す。
【００３４】
電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイは、関心対象の分析物の存在および濃度の高感度でそして正確な測定を提供する。こうした技術は、適切な化学的環境において、電気化学的に酸化されるかまたは還元された際、発光するように誘導することが可能な標識または他の反応体を用いる。こうした電気化学発光は、特定の時間にそして特定の方式で、作用電極に課された電圧によって誘発される。標識によって産生された光を測定し、そしてこの光は分析物の存在または量を示す。こうしたＥＣＬ技術のより詳細な説明に関しては、米国特許第５，２２１，６０５号、米国特許第５，５９１，５８１号、米国特許第５，５９７，９１０号、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９０／０５２９６、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９２／１４１３９、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９０／０５３０１、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／２４６９０、ＰＣＴ公開出願ＵＳ９５／０３１９０、ＰＣＴ出願ＵＳ９７／１６９４２、ＰＣＴ公開出願ＵＳ９６／０６７６３、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９５／０８６４４、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／０６９４６、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／３３４１１、ＰＣＴ公開出願ＷＯ８７／０６７０６、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／３９５３４、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／４１１７５、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／４０９７８、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３６５３および米国特許出願０８／４３７，３４８（米国特許第５，６７９，５１９号）を参照されたい。また、Ｋｎｉｇｈｔら（Ａｎａｌｙｓｔ，  １９９４，  １１９：８７９−８９０）によるＥＣＬの分析適用の１９９４年の概説および該文献に引用される参考文献もまた参照されたい。１つの態様において、電気化学発光標識を用いた、本明細書記載の方法を実施する。
【００３５】
１つの態様において、直接検出可能な標識（本開示の方法において、検出抗原を標識するために用いられる）は、発光標識、蛍光標識、化学発光標識または電気化学発光標識からなる群より選択される。
【００３６】
１つの態様において、直接検出可能な標識は化学発光または電気化学発光標識である。
１つの態様において、本開示記載の二重抗原サンドイッチアッセイは、捕捉ならびに検出抗原の両方として、配列番号３の全長ｐ５３ポリペプチドを用いる。
【００３７】
ｐ５３ポリペプチドのｐ５３の少なくとも１つの重要なエピトープに相当する合成ペプチドは、本開示記載の方法において非常に有用である。理論に束縛されることは望ましくないが、こうした合成ペプチド配列が、全長ｐ５３ポリペプチドにもまた結合する、試料中のこれらの抗体のかなりの割合によって結合されるエピトープを含む可能性も十分にある。同時に、まれにしかまたはまったく抗ｐ５３抗体（例えば体液試料中に含まれるようなもの）に結合されないｐ５３ポリペプチドのストレッチが、抗体、特に粘着性が高いＩｇＭクラス抗体の非特異的結合に有意に寄与する配列ストレッチである可能性も十分にある。
【００３８】
１つの態様において、本発明記載の抗ｐ５３抗体の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原の両方が配列番号１のペプチドを含む、二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法である。
【００３９】
１つの態様において、本発明記載の抗ｐ５３抗体の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原の両方が配列番号２のペプチドを含む、二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法である。
【００４０】
１つの態様において、本発明記載の抗ｐ５３抗体の検出のための方法は、配列番号１および配列番号２のペプチドが、各々、ｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原の両方に含まれる、二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法である。
【００４１】
１つの態様において、本発明記載の抗ｐ５３抗体の検出のための方法で用いられるｐ５３ポリペプチドの適切な部分配列に相当するペプチドは、それぞれ、配列番号１および配列番号２からなるペプチドである。
【００４２】
１つの態様において、本発明記載の抗ｐ５３抗体の検出のための方法は、ｐ５３検出抗原が、配列番号１および配列番号２のペプチドの両方を少なくとも２回含む単一ポリペプチドである、二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法である。
【００４３】
１つの態様において、本発明記載の抗ｐ５３抗体の検出のための方法は、ｐ５３検出抗原が、少なくとも１つの多量体化ドメイン、少なくとも１つの配列番号１のポリペプチドおよび少なくとも１つの配列番号２のポリペプチドを含む、融合ポリペプチドを含む、二重抗原サンドイッチイムノアッセイ法であって、該多量体化ドメインが、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｅｃＢ、Ｈｓｐ２５、ＭＩＰ、ＧｒｏＥＬ、ＣｌｐＢおよびＣｌｐＸからなる群より選択される原核または真核シャペロンである、前記方法である。
【００４４】
１つの態様において、本開示は、少なくとも１つの多量体化ドメイン、少なくとも１つの配列番号１のポリペプチドおよび少なくとも１つの配列番号２のポリペプチドを含む、融合ポリペプチドであって、該多量体化ドメインが、ＦｋｐＡ、Ｓｋｐ、ＳｅｃＢ、Ｈｓｐ２５、ＭＩＰ、ＧｒｏＥＬ、ＣｌｐＢおよびＣｌｐＸからなる群より選択される原核または真核シャペロンである、前記融合ポリペプチドに関する。
【００４５】
多量体化ドメインは、好ましくは、融合ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端、より好ましくはＮ末端に位置する。多量体化ドメインは、個々の融合ポリペプチド分子の多量体化を支持するポリペプチド配列であって、これにより、非共有相互作用によって会合する、複数の単量体サブユニットで構成される多量体が形成される。複合体の単量体サブユニットは遺伝子融合タンパク質であり、個々のアミノ酸残基はペプチド結合によって連結される。多量体の単量体サブユニットは、好ましくは同一である。
【００４６】
例えば、多量体化ドメインは、二量体化ドメイン、すなわち２つのサブユニットの非共有会合を支持するドメイン、３つのサブユニットの非共有会合を支持する三量体化ドメイン、四量体化ドメインまたはさらにより高次の多量体化ドメインであってもよい。好ましくは、多量体化ドメインは、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインである。
【００４７】
多量体化ドメインは、原核または真核シャペロンから、好ましくはＡＴＰ非依存性シャペロンから選択されることも可能である。多量体化ドメインの特定の例は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）由来のタンパク質ＦｋｐＡ、ＳｋｐおよびＳｅｃＢ、または他の原核生物由来のそのオルソログである。ＦｋｐＡは、大腸菌由来のＡＴＰ非依存性周辺質二量体化シャペロンである。Ｓｋｐは、大腸菌由来のＡＴＰ非依存性周辺質三量体化シャペロンである。ＳｅｃＢは、大腸菌由来のＡＴＰ非依存性細胞質ゾル四量体化シャペロンである。さらに適切な多量体化ドメインは、真核または原核生物由来の熱ショックタンパク質、例えばＡＴＰ非依存性真核細胞質ゾル／核オリゴマー化シャペロンであるＨｓｐ２５である。さらに適切な多量体化ドメインは、ＦｋｐＡに構造的に関連する、ＡＴＰ非依存性二量体化シャペロンであるＭＩＰ（マクロファージ感染性増強因子）である。大腸菌由来のＡＴＰ依存性細胞質七量体化シャペロンであるＧｒｏＥＬ、または大腸菌由来のＡＴＰ依存性六量体化シャペロンであるＣｌｐＢまたはＣｌｐＸのようなＡＴＰ非依存性シャペロンもまた適切である。さらに、多量体化ドメインは、多量体形成能力を保持する、上記ポリペプチドの断片または変異体より選択されることも可能である。
【００４８】
融合ポリペプチド中の配列番号１および配列番号２の個々のポリペプチド配列は、それぞれ、スペーサー配列によって分離されていることも可能である。スペーサー配列は、好ましくは、ｐ５３に対して異種性の配列である。現実的な目的のため、スペーサー配列は、抗ｐ５３抗体を決定するための抗原としての融合ポリペプチドの使用と、まったくではなくてもほとんど干渉しない配列から選択される。これは、スペーサー配列が試験しようとしている抗体に対して免疫学的に反応性でないことを意味する。例えば、スペーサー配列は、グリシンおよび／またはセリン残基を含む。１つの態様において、スペーサーはポリグリシンスペーサーである。スペーサー配列の長さは、好ましくは、１〜１０アミノ酸である。
【００４９】
さらに、スペーサー配列は、多量体化ドメインならびに配列番号１のポリペプチドおよび／または配列番号２のポリペプチドの間に存在することも可能である。
このスペーサー配列は、例えば１〜１００アミノ酸の長さを有することも可能である。好ましくは、このスペーサー配列は上記の通りである。
【００５０】
１つの態様において、本開示記載の方法は、間接的に検出可能な標識を含む、ｐ５３検出抗原を用いて実施される。
間接的に検出可能に標識された、は、例えば、ハプテンを含む検出抗原、および直接検出可能な標識を所持する抗ハプテン抗体によるこうしたハプテン化化合物の検出、または酵素を含む検出抗原、および適切な色素基質の変換を生じる対応する酵素活性によるこうした酵素の検出を指す。多様な酵素−基質標識が利用可能であるかまたは開示されている（例えばＵＳ  ４，２７５，１４９を参照されたい）。酵素は、一般的に、多様な技術を用いて測定可能である発色基質の化学的改変を触媒する。例えば、酵素は、基質における色の変化を触媒することも可能であり、これを分光光度的に測定することも可能である。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変することも可能である。化学発光基質は、化学反応によって電気的に励起されるようになり、そして次いで、測定可能（例えば化学発光測定装置を用いて）な光を放出することも可能であるし、またはエネルギーを蛍光アクセプターに供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えばホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；ＵＳ  ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素をポリペプチドにコンジュゲート化するための技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら「酵素イムノアッセイにおいて使用するための酵素−抗体コンジュゲートの調製法」，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  ＩＴ  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ監修）中，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ７３（１９８１）１４７−１６６に記載される。
【００５１】
酵素−基質の組み合わせの例（ＵＳ  ４，２７５，１４９；  ＵＳ  ４，３１８，９８０）には、例えば：セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と、基質としての過酸化水素、ここで過酸化水素が色素前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸（ＴＭＢ））を酸化する；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と、発色基質としてのリン酸パラ−ニトロフェニル；およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と、発色基質（例えばｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼが含まれる。
【００５２】
上述のように、そして実施例セクションに示すように、抗ｐ５３抗体は、最も頻繁には、ＣＲＣにおいて見出される。１つの態様において、本発明は、試料において、ｐ５３に対する抗体（抗ｐ５３抗体）を検出することによって、ＣＲＣを診断するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって：ａ）分析しようとする試料をｐ５３捕捉抗原およびｐ５３検出抗原とインキュベートし、それによって、ｐ５３捕捉抗原、抗ｐ５３抗体およびｐ５３検出抗原を含む複合体を形成し、ｂ）（ａ）で形成された複合体を、未結合検出抗原から分離し、ｃ）工程（ｂ）で得られた複合体を該複合体に含まれる検出抗原を通じて測定し、そしてｄ）抗ｐ５３抗体が試料中で測定される場合、ＣＲＣと診断する工程を含む、前記方法に関する。
【００５３】
本開示記載の方法において、抗ｐ５３抗体の特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための方法において、液体試料を用いることも可能である。試料は、抗ｐ５３抗体を含むことが知られていてもよいし、または抗ｐ５３抗体を含むと推測されることも可能である。１つの態様において、本開示記載の方法で用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための試料は、全血、血清、血漿、髄液、尿または唾液より選択される体液である。１つの態様において、抗ｐ５３抗体を含むと推測されるかまたは含む試料は、血清、血漿または髄液である。１つの態様において、抗ｐ５３抗体を含むと推測されるかまたは含む試料は、血清または血漿である。
【００５４】
以下の実施例および図は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、付随する請求項に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示す方法に修飾を行うことも可能であることが理解される。
【実施例】
【００５５】
実施例１：
抗ｐ５３自己抗体の検出のために用いられる捕捉および検出抗原
多様なタイプの二重抗原サンドイッチアッセイ（ＤＡＧＳ）が用いられてきている。
【００５６】
マイクロタイタープレート中の酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）として、試料中に存在する抗ｐ５３自己抗体の検出のためのＤＡＧＳアッセイを実行することが可能である。
【００５７】
配列番号１および配列番号２の合成ペプチドは、それぞれ、好適であることが立証された。これらは容易に、そして再現可能に合成可能であり、そして抗ｐ５３抗体の特異的結合によって適切であるようであった。
【００５８】
より高いスループットおよびより高い再現可能性のため、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ・マンハイムから、自動化電気化学発光に基づく分析装置上で作動する抗ｐ５３アッセイが開発された。
【００５９】
１つのアッセイ形式において、一方は配列番号１のペプチドを含み、そして他方は配列番号２のペプチドを含む２つのビオチン化ペプチドを捕捉抗体として用い、そして両方のこれらのペプチドのルテニウム化型を検出抗原として用いる。
【００６０】
１．１  捕捉抗原として用いられるビオチン化ペプチド
上述のように、配列番号１および配列番号２の配列はどちらも、それぞれ、抗ｐ５３（自己）抗体によって好ましく結合されるエピトープを含むようである。これらの配列に加えて、３組の二ペプチド、グルタミン酸（Ｅ）−β−アラニン（Ｕ）からなるリンカー（＝ＥＵ３）をＮ末端に含む合成ペプチドを、活性化ビオチンにＮ末端でカップリングさせて、以下により詳細に記載するＥｌｅｃｓｙｓ法で一緒に用いられる２つの捕捉抗原を生じた。これらのビオチン化捕捉抗原は、それぞれ、ｐ５３（１１−３５）［Ｂｉ（ＥＵ）３−１１］ａｍｉｄおよびｐ５３（４１−６０）［Ｂｉ（ＥＵ）３−４１］ａｍｉｄと命名された。
【００６１】
１．２  検出抗原として用いられるルテニウム化組換え融合タンパク質
多量体検出抗原を用いることによって、アッセイ感度を改善することが可能であることが見いだされた。多量体抗原の使用によって、低アフィニティＩｇＧ自己抗体の結合が可能になり、そして／またはＩｇＭ型の自己抗体の結合が可能になる。この目的に向けて、配列番号１（ｐ５３のアミノ酸１１〜３５）および配列番号２（ｐ５３のアミノ酸４１〜６０）のｐ５３ペプチドを、Ｓｋｐ、２組の配列番号１および配列番号２、ならびにオクタＨｉｓタグを含む組換えポリペプチドの一部として、大腸菌中で発現させた。
【００６２】
組換えｐ５３構築物（配列番号４）の配列は以下の通りであった：
【００６３】
【化１】
2019512688.tif 000003
【００６４】
配列の下線部分は、それぞれ、配列番号１および配列番号２に相当する。筆記体（ｃｕｒｓｏｒｙ  ｗｒｉｔｉｎｇ）で示す配列部分は、シャペロンＳｋｐ由来の配列に対応する。オクタＨｉｓタグは、ｐ５３検出抗原で用いられるようにこの組換えポリペプチドのＣ末端にある。
【００６５】
当該技術分野に周知であり、そして例えばＥＰ  １  ９８２  ９９３  Ｂ１に詳述される方法にしたがって、配列番号３の組換えポリペプチドを産生した。
標準法にしたがって、ルテニウム化を行った。ルテニウム化のための典型的なプロトコルにおいて、融合タンパク質のリジンε−アミノ基を、約１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化ルテニウム標識で修飾する。標識：タンパク質モル比は、それぞれの融合タンパク質の標識密度に関する必要性に応じて、２：１〜７：１に変化させうる。反応緩衝剤は、通常、１５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡである。カップリングまたは標識反応は通常、室温で１０分間行われ、そして緩衝Ｌ−リジンを最終濃度１０ｍＭまで添加することによって停止される。活性化標識の加水分解的不活性化を回避するため、それぞれのストック溶液を、例えば、乾燥ＤＭＳＯ（ｓｅｃｃｏｓｏｌｖ品質、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）中で調製する。反応緩衝液中、最大２０％のＤＭＳＯ濃度は、本明細書に開示するような配列番号４の融合タンパク質によってよく許容される。カップリング反応後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨｉＬｏａｄ）上に未精製タンパク質コンジュゲートを通過させることによって、未反応の遊離標識および有機溶媒を除去した。
【００６６】
ｐ５３構築物のシャペロン部分（「Ｓｋｐ」）のため、タンパク質は、制御再フォールディングおよび精製プロセスにおいて、Ｎｉ−ＮＴＡカラムからの溶出中に自発的に三量体化する。生じる三量体は非常に安定であり、そしてルテニウム化およびさらなるプロセシング中、その立体配置を保持する。
【００６７】
実施例２：
抗ｐ５３自己抗体の測定のためのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイ
抗ｐ５３抗体の検出のためのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）アッセイのアッセイ原理を図１に示す。
【００６８】
簡潔には、ビオチン化捕捉抗原（実施例１．１のビオチン化ペプチド）、試料およびルテニウム化検出抗原（実施例１．２の標識融合タンパク質）をインキュベートして、捕捉抗原−抗ｐ５３抗体−検出抗原の複合体の形成を可能にする。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）イムノアッセイにおけるシグナル検出は、電気化学発光に基づく。ビオチン・コンジュゲート化捕捉抗原を、ストレプトアビジン・コーティング磁気ビーズ表面上に固定する一方、検出抗原は、発光部分として、錯体化ルテニウム陽イオンを所持する。抗ｐ５３抗体の存在下で、発色ルテニウム錯体は固相に架橋され、そして白金電極での励起後、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、恣意的な光単位である。
【００６９】
以下の免疫学的試薬を用いた：
【００７０】
【表１】
2019512688.tif 000004
【００７１】
両ペプチドを各々、上記の濃度で含む７５μｌの捕捉抗原、７５μｌの検出抗原および２０μｌの試料を９分間インキュベートした。磁気Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ビーズ３０μｌを添加し、そして９分間インキュベートして、捕捉抗原−抗ｐ５３抗体−検出抗原の複合体を吸着させた。
【００７２】
標準法によって、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）ｅ６０１分析装置上で、シグナル測定を行った。
捕捉抗原用に用いた緩衝剤は、以下の構成要素を含む：
【００７３】
【表２】
2019512688.tif 000005
【００７４】
ｐＨ７．２
検出抗原用に用いた緩衝剤は、以下の構成要素を含む：
【００７５】
【表３】
2019512688.tif 000006
【００７６】
ｐＨ５．４
実施例３：
臨床試料における抗ｐ５３自己抗体の検出
４６３人の患者由来の試料を、実施例２に記載するような抗ｐ５３アッセイ、および株式会社医学生物学研究所、ＫＤＸ、日本・名古屋によって販売される商業的に入手可能なアッセイ「ＭＥＳＡＣＵＰ抗ｐ５３試験」を用いて、抗ｐ５３抗体に関してサイドバイサイドで分析した。後者は、製造者に提供される指示にしたがって用いた。
【００７７】
【表４】
2019512688.tif 000007
【００７８】
上記表からわかるように、新規抗ｐ５３抗体アッセイは、競合剤アッセイに比較した際、結腸直腸癌患者において、匹敵する量またはわずかにより少ない抗ｐ５３陽性試料を検出する。
【００７９】
しかし、驚くべきことに、新規に開発されたアッセイは、ｐ５３に対する抗体と関連することが知られていない疾患実体において、「陽性」シグナルを生じる傾向がはるかにより低い。
【００８０】
図２に示すように、曲線下面積（ＡＵＣ）は、商業的に入手可能なキットに比較した際、ここで開発したアッセイに関してより優れている。
ＣＲＣスクリーニング由来の対照、ＩＢＤ（感染性腸疾患）、変形性関節症、関節リウマチ、肝硬変、腎不全または自己免疫疾患患者で見られる陽性測定は、偽陽性測定に相当する可能性が最も高い。新規アッセイでは、非常に少ない偽陽性しか見られず、一方、最新技術のアッセイは、非常にしばしば偽陽性結果を導く。明らかに、上に示すＣＲＣ症例において、競合剤アッセイで見られるさらなる陽性のいくつかは、抗ｐ５３競合剤アッセイに関する偽陽性である可能性が非常に高い。
【００８１】
本明細書に開示するような、抗ｐ５３抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出のための新規に開発されたアッセイは、非常に優れた特異性を有する。こうした優れた特異性は、例えば、抗ｐ５３抗体陽性として誤って見出された患者の臨床的精密検査を減らすことにつながる。
【図１】
2019512688.tif 000008
【図２】
2019512688.tif 000009
【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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