(57)【要約】  各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターを含む新規治療的免疫療法組成物であって、それによりベクターの組合せが２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている新規治療的免疫療法組成物、ならびにがんならびに他の疾患および状態を処置するために使用され得る患者特異的免疫療法におけるその使用の方法が、本明細書で提供される。
2019534246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物であって、前記ベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく、それによりベクターの組合せが２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている、免疫療法組成物。
【請求項２】
（ａ）細胞中で機能的である核酸配列をそれぞれが含む少なくとも２つのベクターを含む免疫療法組成物であって、
（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；
（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフから構成され；
（ｄ）前記ベクターの内の１つにおける前記少なくとも１つの結合ドメインが同一でなく；ならびに
（ｅ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合で連結されており、ベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、
免疫療法組成物。
【請求項３】
（ａ）細胞中で機能的である核酸配列をそれぞれが含む少なくとも２つのベクターを含む免疫療法組成物であって、
（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；
（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；
（ｄ）各ベクター中の前記少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく；
（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せが前記各ベクターの間で同一でなく；
（ｆ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合で連結されており、２つ以上のベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、
免疫療法組成物。
【請求項４】
各ベクターが１つよりも多い機能的ＣＡＲをコードする、請求項１から３に記載の免疫療法組成物。
【請求項５】
前記リンパ球集団（複数可）が自家Ｔ細胞または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項６】
ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項７】
ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項８】
ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続されている、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項９】
ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインにリーダーペプチドが先行する、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１０】
ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１１】
ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ−２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳｏ−１  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１２】
ＣＡＲのリンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結されている、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１３】
ＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１４】
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置されている、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２または３に記載の免疫療法組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１６に記載の免疫療法組成物。
【請求項１８】
単一ウイルスベクターが、組込みのためのＣＲＩＳＰＲシステムとの組合せで、全てのキメラ抗原受容体（例えばアデノ、ＳＶ４０、ヘルペスベクター、ＰＯＸベクターまたはコスミドベクター）をコードするために使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫療法組成物。
【請求項１９】
各ベクターがＲＮＡまたはＤＮＡベクターである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫療法組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つのベクターが前記細胞における核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫療法組成物。
【請求項２１】
前記核酸分子が内因性遺伝子の発現を阻害するまたは欠失させる、請求項２０に記載の免疫療法組成物。
【請求項２２】
ヒトリンパ球細胞の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が、各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、前記ベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく、それによりベクターの組合せが２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されている、医薬組成物。
【請求項２３】
ヒトリンパ球細胞の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフから構成され；（ｄ）前記ベクターの内の１つにおける前記少なくとも１つの結合ドメインが同一でなく；ならびに（ｅ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
【請求項２４】
ヒトリンパ球細胞の集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、前記集団の前記細胞が（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクター中の前記少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せが前記各ベクター間で同一でなく；ならびに（ｆ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、２つ以上のベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物。
【請求項２５】
リンパ球細胞が、血液学的がんを有するヒトのＴ細胞である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
血液学的がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
白血病が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
血液学的がんが多発性骨髄腫である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ヒトがんが、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、前記ベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく、それによりベクターの組合せが２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合的に連結されており、ベクターの前記組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法。
【請求項３２】
腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフから構成され；（ｄ）前記ベクターの内の１つの前記少なくとも１つの結合ドメインが同一でなく；ならびに（ｅ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクター中の前記少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せが前記各ベクター間で同一でなく；ならびに（ｆ）前記少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、２つ以上のベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３４】
遺伝子改変されるリンパ球が自家リンパ球であり、前記自家または同種リンパ球が、悪性疾患の再発を予防するように患者に直接、注入により戻される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子改変されるリンパ球が自家Ｔ細胞であり、前記自家Ｔ細胞が、腫瘍の安定化、低減、排除、緩解またはがんもしくはがんの再発の排除を生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するために患者に直接、注入により戻される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞が、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーを発現することによって事前選択されている、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
Ｔ細胞および樹状細胞が造血幹細胞ドナーに由来し、この手順が造血幹細胞移植の状況で実施される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年９月２日出願の米国仮特許出願第６２／３８２，７９１号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
開示の分野
本出願は、がんの分野、特に、機能的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも２つのベクターを含む組成物および患者特異的免疫療法におけるその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
がんは、ヒトの健康に対する重大な脅威の１つである。米国だけで、がんは毎年ほぼ１３０万人の新たな患者が罹患し、心血管疾患に次いで２番目に多い死因であり、死亡数の約４分の１を占めている。固形腫瘍が、これらの死亡のほとんどの原因である。ある特定のがんの医学的処置においては顕著な進歩があったものの、全てのがんについての５年全生存率は過去２０年間で約１０％しか改善しなかった。がんまたは悪性腫瘍は、制御されずに迅速に転移および成長し、処置を非常に困難にする。現代のがん処置における困難の１つは、患者の生検およびがんの診断ならびに有効な処置の間に経過する時間である。この時間の間に、患者の腫瘍は妨げなしに成長する可能性があり、その結果、疾患は、処置が適用される前にさらに進行してしまう。これは、がんの予後および転帰に負の影響を与える。
【０００４】
キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）は、３つの本質的な単位を含むハイブリッド分子である：（１）細胞外抗原結合性モチーフ、（２）連結／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達モチーフ（Ｌｏｎｇ  ＡＨ、Ｈａｓｏ  ＷＭ，Ｏｒｅｎｔａｓ  ＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ−ａｃｔｉｖｅ  ＣＤ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３年；２巻（４号）：ｅ２３６２１頁）。ＣＡＲの抗原結合性モチーフは一般に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最小の結合性ドメインである単鎖断片可変（ｓｃＦｖ）を基にして作られる。代替の抗原結合性モチーフとして、例えば、受容体リガンド（即ち、ＩＬ−１３は、腫瘍が発現するＩＬ−１３受容体に結合するように操作されている）、インタクトな免疫受容体、ライブラリー由来ペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）も操作されている。ＣＡＲ発現のための代替の細胞標的（例えば、ＮＫまたはガンマ−デルタＴ細胞）も開発中である（Ｂｒｏｗｎ  ＣＥら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２年；１８巻（８号）：２１９９〜２０９頁；Ｌｅｈｎｅｒ  Ｍら  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２年；７巻（２号）：ｅ３１２１０頁）。ＣＡＲベクターを形質導入するための最も活性なＴ細胞集団を定義すること、最適な培養および増殖の技術を決定すること、ならびにＣＡＲタンパク質構造自体の分子的詳細を定義することに関して、いまだにかなりの労力を要している。
【０００５】
ＣＡＲの連結モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインとするか、または伸長された可撓性リンカーとなるように設計することができる。ＩｇＧの定常ドメインに由来するものなどの構造モチーフを使用して、ｓｃＦｖ結合性ドメインをＴ細胞原形質膜表面から離れて延在させることができる。これは、結合性ドメインが腫瘍細胞表面膜に特に近い一部の腫瘍標的にとって重要であり得る（例えば、ジシアロガングリオシドＧＤ２にとって；Ｏｒｅｎｔａｓら、未公開の観察）。今日まで、ＣＡＲにおいて使用されるシグナル伝達モチーフは常にＣＤ３−ζ鎖を含んでいるが、それは、このコアモチーフが、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルであるからである。最初に報告された第２世代ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴としていた。このモチーフは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達モチーフを含有する第３世代ＣＡＲでも同様に使用された（Ｚｈａｏ  Ｙら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９年；１８３巻（９号）：５５６３〜７４頁）。新たなテクノロジーの進歩に伴い、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体に連結されたビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８由来のカノニカルな「シグナル２」の存在がＣＡＲ自体によってコードされる必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を使用して、第３世代ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターよりも優れているわけではないことが見出され、また、白血病のマウスモデルにおいては第２世代ベクターを超える明らかな利益は得られなかった（Ｈａｓｏ  Ｗ，Ｌｅｅ  ＤＷ，Ｓｈａｈ  ＮＮ，Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｍ，Ｙｕａｎ  ＣＭ，Ｐａｓｔａｎ  ＩＨ，Ｄｉｍｉｔｒｏｖ  ＤＳ，Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ＤＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＤＭ，Ｗａｙｎｅ  ＡＳ，Ｍａｃｋａｌｌ  ＣＬ，Ｏｒｅｎｔａｓ  ＲＪ．Ａｎｔｉ−ＣＤ２２−ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３年；１２１巻（７号）：１１６５〜７４頁；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮら  Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻（１２号）：２７０９〜２０頁）。これは、第２世代ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ（Ｌｅｅ  ＤＷら  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ；１２月７〜１０日、２０１３年）およびＣＤ１３７／ＣＤ３−ζシグナル伝達形式（Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（８号）：７２５〜３３頁）のＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床的成功によって裏付けられている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの他の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続シグナルを提供することができる（Ｙｖｏｎ  Ｅら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９年；１５巻（１８号）：５８５２〜６０頁）。ＣＡＲ  Ｔ細胞集団が培養された培養条件も等しく重要である。
【０００６】
がんに対するＣＡＲ療法のより広範で有効な適応における現在の課題は、説得力のある標的の不足に関する。細胞表面抗原への結合因子を創出することは、現在容易に達成可能であるが、正常組織を見逃しながら腫瘍に対して特異的な細胞表面抗原を発見することは、依然として厄介な課題である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞により高い標的細胞特異性を与えるための１つの潜在的な方法は、コンビナトリアルＣＡＲアプローチを使用することである。１つのシステムでは、ＣＤ３−ζとＣＤ２８シグナル単位が、同じ細胞において発現される２つの異なるＣＡＲ構築物間で分割される；別のシステムでは、２つのＤｕｏＣＡＲが、同じＴ細胞において発現されるが、一方はより低い親和性を有し、したがって第２のＣＡＲの完全な活性のために代替的ＣＡＲが最初に結合されることを必要とする（Ｌａｎｉｔｉｓ  Ｅら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１３年；１巻（１号）：４３〜５３頁；Ｋｌｏｓｓ  ＣＣら  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１巻（１号）：７１〜５頁）。免疫療法剤としての単一のｓｃＦｖベースのＣＡＲの生成のための第２の課題は、腫瘍細胞の不均一性である。少なくとも１つのグループは、標的抗原陰性集団の成長を回避することを期待して、エフェクター細胞集団が複数の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を同時に標的化する、神経膠芽腫のためのＣＡＲ戦略を開発している（Ｈｅｇｄｅ  Ｍら  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３年；２１巻（１１号）：２０８７〜１０１頁）。
【０００７】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、合成生物学における新たな領域になっている；複数のプロモーターおよび遺伝子産物は、これらの高度に強力な細胞を腫瘍微小環境に導くことが想定され、ここで、Ｔ細胞は、負の調節シグナルを免れることができ、かつ有効な腫瘍死滅を媒介できる。誘導性カスパーゼ９構築物のＡＰ１９０３との薬物誘導性二量体化を介した望ましくないＴ細胞の排除は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチが薬理学的に開始され得る１つの方法を実証している（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  Ａら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１年；３６５巻（１８号）：１６７３〜８３頁）。デコイ受容体の発現によるトランスフォーミング成長因子−βの負の調節効果に対して免疫性であるエフェクターＴ細胞集団の創出は、エフェクターＴ細胞が最適な抗腫瘍活性のために操作され得る程度をさらに実証している（Ｆｏｓｔｅｒ  ＡＥら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８年；３１巻（５号）：５００〜５頁）。
【０００８】
したがって、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体と類似した様式でＴ細胞活性化を誘発できるようであるが、今日までのこのＣＡＲベースのテクノロジーの臨床適用に対する主要な障害は、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の限定的なｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、注入後の細胞の迅速な消失、期待外れの臨床活性、基礎疾患または状態の再発、および診断とかかるＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用するがんの時宜を得た処置との間に経過する過度の長さの時間である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、上述の欠点なしにがん特異的な意図した治療的特質を示し得るＣＡＲベース療法を使用するがんの処置のための組成物および方法を発見する、当該分野における緊急かつ長年にわたる要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、機能的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも２つのベクターを含む組成物、ならびにがんならびに他の疾患および／または状態を処置するために使用され得る患者特異的免疫療法におけるその使用の方法を提供することによってこれらの必要性に対処する。
【００１１】
具体的には、開示され、本明細書に記載される本発明は、各ベクターが機能的ＤｕｏＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む免疫療法組成物であって、それによりベクターの組合せが２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されており、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するために患者に直接、注入により戻すことができる活性患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する自家リンパ球への形質導入のために使用され得る免疫療法組成物を提供する。
【００１２】
発明の概要
２つ以上のベクターが形質導入されたリンパ球を含む新規養子免疫療法組成物、ならびにがんならびに他の疾患および状態を処置するために使用され得る患者特異的併用免疫療法におけるその使用の方法が、本明細書で提供される。
【００１３】
したがって、一態様では、Ｄｕｏキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクターおよびＤｕｏＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターをコードする核酸分子が本明細書で提供される。ＤｕｏＣＡＲを発現する、開示されるレンチウイルスベクター、宿主細胞および核酸分子の使用方法も、例えば対象におけるがんを処置するために提供される。
【００１４】
一態様では、免疫療法組成物は、少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む形で提供され（ＤｕｏＣＡＲ）、各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし、ここでベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）は同一でなく、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている。
【００１５】
一実施形態では、免疫療法組成物は、少なくとも３つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む形で提供され（ＴｒｉｏＣＡＲ）、各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている。
【００１６】
一実施形態では、免疫療法組成物は、少なくとも４つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む形で提供され（ＱｕａｔｒｏＣＡＲ）、各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている。
【００１７】
さらに別の実施形態では、免疫療法組成物は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０個のベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む形で提供され（例えば「ｎＣＡＲ」）、各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されており、ｎＣＡＲセットのそれぞれの独自のメンバーは、ＣＡＲ産物に組み入れられた場合に、本明細書で「ｎ−ＳＥＴ」（例えば、Ｄｕｏ−ＳＥＴ、Ｔｒｉｏ−ＳＥＴ、Ｑｕａｔｒｏ−ＳＥＴ、Ｐｅｎｔａ−ＳＥＴ、Ｈｅｘａ−ＳＥＴ、Ｈｅｐｔａ−ＳＥＴ、Ｏｃｔａ−ＳＥＴ、Ｎｏｎａ−ＳＥＴおよびＤｅｃａ−ＳＥＴなど）と称される独自のＣＡＲ組成物を構成する。
【００１８】
一実施形態では、免疫療法組成物は：（ａ）細胞中で機能的である核酸配列をそれぞれが含む少なくとも２つのベクターを含む形で提供され；（ｂ）各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲは少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフから構成され；（ｄ）ベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメインは同一でなく；ならびに（ｅ）少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフは前記各ベクターにおいて共有結合で連結されており、ベクターの組合せは１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００１９】
別の実施形態では、免疫療法組成物は：（ａ）細胞中で機能的である核酸配列をそれぞれが含む少なくとも２つのベクターを含む形で提供され；（ｂ）各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲは少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクター中の少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）は同一でなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せが各ベクター間で同一でなく；ならびに（ｆ）少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合で連結されており、２つ以上のベクターの組合せは１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される。
【００２０】
一実施形態では、各ベクターが１個よりも多い機能的ＣＡＲをコードする、免疫療法組成物が提供される。
【００２１】
別の実施形態では、１または複数のシグナル伝達モチーフ組合せが１または複数のベクター上で同一である、免疫療法組成物が提供される。
【００２２】
別の実施形態では、１または複数の多重結合ドメインが１または複数のベクター上で同一である、免疫療法組成物が提供される。
【００２３】
別の実施形態では、リンパ球集団（複数可）が自家Ｔ細胞または末梢血由来リンパ球の混合物を含む、免疫療法組成物が提供される。
【００２４】
別の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、免疫療法組成物が提供される。
【００２５】
別の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、免疫療法組成物が提供される。
【００２６】
別の実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、ＣＡＲの少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカーまたはスペーサードメインによって膜貫通ドメインに接続される、免疫療法組成物が提供される。
【００２７】
別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインにリーダーペプチドが先行する、免疫療法組成物が提供される。
【００２８】
別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＴＳＬＰＲ、メソセリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＨＣと組み合わせたＰＲＡＭＥペプチド、またはそれらの任意の組合せを含む抗原を標的化する、免疫療法組成物が提供される。
【００２９】
別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ−２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ（１本鎖ＴＣＲ構築物を含む）抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ−Ａ３  ＴＣＲ、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
【００３０】
別の実施形態では、ＣＡＲのリンカーまたはスペーサードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、免疫療法組成物が提供される。
【００３１】
別の実施形態では、ＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦｃイプシロンＲ、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、免疫療法組成物が提供される。
【００３２】
別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、免疫療法組成物が提供される。
【００３３】
別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、免疫療法組成物が提供される。
【００３４】
別の実施形態では、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
【００３５】
別の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ−１、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含む、免疫療法組成物が提供される。
【００３６】
別の実施形態では、単一のベクターが、組込みのためのＣＲＩＳＰＲシステムとの組合せで、全てのキメラ抗原受容体（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ヘルペスベクター、ＰＯＸベクター、ＲＮＡ、プラスミド、コスミドまたは任意のウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）をコードするために使用される、免疫療法組成物が提供される。
【００３７】
別の実施形態では、各ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡベクターであり、単独で、あるいはトランスフェクション試薬または非限定的例が電気穿孔法であるＲＮＡもしくはＤＮＡを細胞に送達する方法との組合せで、免疫療法組成物が提供される。
【００３８】
別の実施形態では、少なくとも１つのベクターが細胞における核酸の発現を調節する核酸分子を発現する、免疫療法組成物が提供される。
【００３９】
別の実施形態では、核酸分子が内因性遺伝子の発現を阻害するまたは欠失させる、免疫療法組成物が提供される。
【００４０】
ある特定の実施形態では、活性患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が、リンパ球回収または腫瘍生検の１日、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１２日、１４日、２１日または１カ月以内に生成され、がんに罹患している患者に直接、注入により戻すことができる活性患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団が、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能である、免疫療法組成物が提供される。
【００４１】
一態様では、上述のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子が、本明細書で提供される。
【００４２】
本発明の免疫療法組成物の患者特異的自家リンパ球集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一態様では、ＤｕｏＣＡＲは、診断、がん患者の無増悪生存期間などの処置転帰のモニタリングおよび／もしくは予測における使用のため、またはかかる処置の進行をモニタリングするために、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、開示されたＤｕｏＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスまたは非ウイルスベクターなどのベクター中に含有され得る。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、もしくはレトロウイルスベクターまたはそれらの組合せである。
【００４３】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのある特定の実施形態では、２つ以上のレンチウイルスベクターは、例えば、限定としてではなく、両種指向性マウス白血病ウイルス［ＭＬＶ−Ａ］、ヒヒ内因性ウイルス（ＢａＥＶ）、ＧＰ１６４、テナガザル白血病ウイルス［ＧＡＬＶ］、ＲＤ１１４、ネコ内因性ウイルスレトロウイルス由来ＧＰ、および水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ］、麻疹ウイルス、家禽ペストウイルス［ＦＰＶ］、エボラウイルス［ＥｂｏＶ］、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス［ＬＣＭＶ］非レトロウイルス由来ＧＰを含む異なるウイルス糖タンパク質（ＧＰ）、ならびに例えば、限定としてではなく、ＭＬＶ−Ａ  ＧＰの細胞質テイル（ＴＲと称する）に融合されたＧＡＬＶまたはＲＤ１１４  ＧＰの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするキメラＧＰを含むそれらのキメラバリアントでシュードタイプ化される。
【００４４】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのある特定の実施形態では、ベクターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーターまたはそれらの任意の組合せであるプロモーターをさらに含む。
【００４５】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、自殺スイッチによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現を制御するため、またはＣＡＲ−Ｔ細胞を排除するために、１または複数の作動可能なエレメントを含むようにさらに改変され得る。自殺スイッチには、例えば、アポトーシス誘導性シグナル伝達カスケード、または細胞死を誘導する薬物が含まれ得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようにさらに改変され得る。
【００４６】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の態様では、ＤｕｏＣＡＲをコードする核酸分子（複数可）を含む宿主細胞もまた提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞、例えば、対象から得られた初代Ｔ細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態では宿主細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施形態では宿主細胞は、患者産物から比を考慮せずに直接精製された、選択されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球である。別の実施形態では、産物中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、特異的である。別の実施形態では、Ｔ細胞の特定のサブセットは、Ｔナイーブ細胞（Ｔｎ）、Ｔエフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）、Ｔセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）、Ｔ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）、誘導性Ｔ調節性細胞（ｉＴｒｅｇ）、Ｔサプレッサー細胞（Ｔｓ）、Ｔ幹細胞メモリー細胞（Ｔｓｃｍ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞が挙げられる表現型マーカーによって同定されるとおり利用される。
【００４７】
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の集団を含む免疫療法組成物の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、集団の細胞が、各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている、医薬組成物が提供される。
【００４８】
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の集団を含む免疫療法組成物の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、集団の細胞が（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフから構成され；（ｄ）ベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメインが同一でなく；ならびに（ｅ）少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物が提供される。
【００４９】
さらに別の実施形態では、がんを有するヒトの患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の集団を含む免疫療法組成物の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物であって、集団の細胞が（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む細胞を含み；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクター中の少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せが各ベクター間で同一でなく；ならびに（ｆ）少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、少なくとも１つのリンカードメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、２つ以上のベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物が提供される。
【００５０】
一実施形態では、がんが、１または複数の化学療法剤に対して非応答性の難治性がんである。がんは、造血がん、骨髄異形成症候群、膵がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、肺がん、乳房がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫もしくは他の血液学的がんおよび固形腫瘍、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、がんが、血液学的がん、例えば、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）もしくは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫またはホジキンリンパ腫）または多発性骨髄腫、あるいはそれらの任意の組合せを含む。
【００５１】
さらに別の実施形態では、がんが、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器系がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管、胆嚢、膵臓）、呼吸器系がん（喉頭、肺および気管支）、骨および関節のがん、軟組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳腫瘍、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫）、ならびに乳房、生殖系（子宮頸部、子宮体、卵巣、外陰部、腟、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）ならびに脳および他の神経系のがん、またはそれらの任意の組合せを含む成人癌を含む。
【００５２】
別の態様では、単一または多重キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターを用いて形質導入された自家リンパ球細胞集団を含み、それにより腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能である患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する医薬組成物が提供される。
【００５３】
別の態様では、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能である患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する、単一または多重キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターを用いて形質導入された自家リンパ球細胞集団を含む医薬組成物が提供される。
【００５４】
別の態様では、活性患者特異的自家抗腫瘍Ｄｕｏ  ＣＡＲ含有リンパ球細胞を作製する方法が提供される。この方法は、抗原に特異的に結合する２つ以上のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のベクターまたは核酸分子をリンパ球細胞に形質導入し、それによって、活性患者特異的自家抗腫瘍ＤｕｏＣＡＲ含有リンパ球細胞を作製することを含む。
【００５５】
さらに別の態様では、ＲＮＡ操作されたリンパ球細胞の集団を生成する方法であって、２つ以上のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを対象の細胞集団中に導入し、それによって、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成することを含む方法が提供される。
【００５６】
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置するための方法であって、方法が、単一または複数のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする１または複数のレンチウイルスベクターが形質導入された自家リンパ球細胞集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、それによって、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進することが可能な患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する、方法が提供される。
【００５７】
別の態様では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、腫瘍の安定化、低減、排除またはがんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するために患者に直接、注入により戻され得る患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成する、単一または多重キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターを用いて形質導入された自家リンパ球細胞集団の抗腫瘍有効量を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００５８】
一実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターおよび医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、それによりベクターの組合せが２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）が膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されており、ベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、方法が提供される。
【００５９】
別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフから構成され；（ｄ）ベクターの内の少なくとも１つの結合ドメインが同一でなく；ならびに（ｅ）少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合的に連結されており、ベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６０】
さらに別の実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する疾患、障害または状態を有する哺乳動物を処置する方法であって、（ａ）２つ以上のベクターをコードする核酸分子を含み、；（ｂ）各ベクターが機能的ＣＡＲをコードし；（ｃ）各ＣＡＲが少なくとも１つの結合ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフを含み；（ｄ）各ベクター中の少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）が同一でなく；（ｅ）少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せが各ベクター間で同一でなく；ならびに（ｆ）少なくとも１つの結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達モチーフが前記各ベクターにおいて共有結合で連結されており、２つ以上のベクターの組合せが１または複数のリンパ球集団を遺伝子改変するために使用される、医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、遺伝子改変されるリンパ球は、自家Ｔ細胞リンパ球であり、ここで自家または同種Ｔ細胞リンパ球は、悪性疾患の再発を予防または寛解するために患者に直接、注入により戻される。
【００６２】
ある特定の他の実施形態では、遺伝子改変されるリンパ球は、自家Ｔ細胞リンパ球であり、自家リンパ球は、腫瘍の安定化、低減、排除またはがんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの任意の組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するように患者に直接、注入により戻される。
【００６３】
さらに別の実施形態では、Ｔ細胞が、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーを発現するということによって事前選択されている。
【００６４】
さらに別の実施形態では、Ｔ細胞が、造血幹細胞ドナーに由来し、この手順が、造血幹細胞移植の状況で実施される。
【００６５】
ある特定の実施形態では、リンパ球細胞が、特異的活性化またはメモリー関連表面マーカーを発現するということによって事前選択されている、方法が本明細書で提供される。
【００６６】
ある特定の実施形態では、リンパ球細胞がＴ細胞であり、造血幹細胞ドナーに由来し、この手順が造血幹細胞移植の状況で実施される方法が本明細書において提供される。
【００６７】
さらに別の態様では、がんと診断されたヒトにおいて、遺伝子操作された患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の持続性の集団を生成するための方法が提供される。一実施形態では、方法は、本明細書に記載される１または複数の患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）を、それを必要とするヒト患者に投与するステップであって、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の持続性の集団、またはリンパ球細胞の子孫の集団は、投与の後少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、２年または３年にわたって、ヒトにおいて持続するステップを含む。
【００６８】
一実施形態では、ヒト中の子孫リンパ球細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。
【００６９】
本明細書に記載される方法の全ての態様および実施形態では、腫瘍抗原の上昇した発現と関連する上述のがん、疾患、障害または状態のいずれも本明細書に開示される１または複数のＤｕｏ  Ｃａｒ免疫療法組成物を含む患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）を使用して処置または予防または緩和され得る。
【００７０】
さらに別の態様では、上記患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）を含むＤｕｏＣａｒ免疫療法組成物を作製するためのキット、または上記対象において、腫瘍抗原の上昇した発現と関連するがん、疾患、障害もしくは状態のいずれかを予防、処置もしくは寛解するためのキットであって、上に開示された核酸分子、ベクター、宿主細胞もしくは組成物のいずれか１つまたはそれらの任意の組合せを含むコンテナ、およびキットを使用するための指示書を含むキットが提供される。
【００７１】
本発明の組成物および方法がＤｕｏＣＡＲの生成および利用を参照して例示されているが、組成物および方法がＴｒｉｏＣＡＲおよびＱｕａｔｒｏＣＡＲの生成および利用を具体的に意図して含むことが本明細書で企図される。
【００７２】
さらに別の態様では、免疫療法組成物は、少なくとも１つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸を含み、前記ベクターは、ＤｕｏＣＡＲをコードする少なくとも１つのメッセンジャーＲＮＡを生じる核酸配列（即ち、多重シストロン核酸または１つよりも多い転写物をもたらす核酸）を含有し、２つ以上の同一でない抗原標的に結合する能力を生じ、それにより前記ベクターを発現する単一細胞中に多重抗原特異性の存在をもたらす。
【００７３】
さらに別の態様では、上記のような、免疫療法組成物は、少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸を含み、ここで各ベクターは、可溶性バインダー（タグ化ｓｃＦｖ、または抗タグバインダーに連結されたｓｃＦｖなど）を共にインキュベーションまたは共に投与した際、機能的キメラ抗原受容体を再構成する機能的タグまたは抗タグ結合成分（ＡＴ−ＣＡＲ）をさらにコードし、それにより２つのベクターの組合せは、２つ以上の同一でない抗原結合ドメインに結合する能力を生じ、これら２つのベクターを発現する細胞中に多重抗原特異性の存在をもたらす。
【００７４】
さらに別の態様では、上記のような、免疫療法組成物は、少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸を含み、ここで各ベクターは、可溶性バインダー（タグ化ｓｃＦｖ、または抗タグバインダーに連結されたｓｃＦｖなど）を共にインキュベーションまたは共に投与した際、機能的キメラ抗原受容体を再構成する機能的タグまたは抗タグ結合成分（ＡＴ−ＣＡＲ）をコードし、ここで各ベクターは可溶性タンパク質またはタンパク質改変構造（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に結合して多重抗原特異性をもたらすことができる独自のタグ（もしくは抗タグ）を発現する、または各ベクターは、可溶性結合ドメインの内の１つだけに結合する独自のタグ（もしくは抗タグ）を発現し、ＡＴ−ＣＡＲによりコードされる細胞内シグナル伝達モチーフの、タグ化（もしくは抗タグ化）バインダーの抗原結合ドメインへの特異的連結を生じる。
【００７５】
上記に参照される実施形態および態様において開示されるＤｕｏＣＡＲベクターの製造、それぞれの組成物および方法についての非限定的実施形態では、２つのベクターは、別々に作製され、次いでＴ細胞に連続的にまたは同時に添加されてよい。別の非限定的実施形態では、２つ以上のベクターのプラスミドＤＮＡは、多重ＤｕｏＣＡＲベクター粒子を含有するウイルスベクターの混合物を産生するために、産生細胞のトランスフェクション前もしくはその際に組み合わされてよく、または産生細胞ゲノムに組み入れられてよく、続いて患者Ｔ細胞の遺伝子導入および遺伝子改変のために使用される。
【００７６】
上記のような、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）、キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現する２つ以上のレンチウイルスベクター、宿主細胞および方法は、本明細書に詳細に記載される具体的な態様および実施形態を超えて有用であることが理解される。本開示の前述の特色および利点は、添付の図面を参照して進む以下の詳細な説明からより明らかになる。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読むとさらによく理解される。本発明を例証する目的のため、本発明において好ましい図面の実施形態を示す。しかしながら本発明が、図面中に示した実施形態の正確な配置と手段に限られないことは理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】別々の商業的実体として生産され得る４個（４つ）の産物（例１から４）を示す図である。これらのＤｕｏＣＡＲセットは、３個の白血病関連抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２を発現するヒトＢ細胞悪性疾患を標的化するように創出されてよい。産物１では２つの遺伝子ベクターは、活性化Ｔ細胞集団を共形質導入するために使用される。第１のベクターは、ＣＤ８膜貫通領域（８）によって繋がれた単一細胞内ドメイン（ｚ、ＣＤ３ゼータ鎖）に連結された２つの抗原結合ドメイン（ＣＤ１９、ＣＤ２０）をコードしている。第２のベクターは、ＣＤ２２結合ドメインおよび２つのシグナル伝達ドメイン（ＢＢ、ＣＤ１３７／４−１ＢＢに由来；およびｚ）をコードしている。第２の産物、例２は、ＣＤ２８およびｚシグナル伝達ドメインに連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０結合ドメインを含む第１のベクターを特色とする。第２のベクターは、ＣＤ２２結合ドメインならびにＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインをコードし、第３世代ＣＡＲベクター（３個の異なるシグナル伝達ドメイン）のシグナル伝達パッケージを本質的に再現する。第３の産物、例３では、第１のベクターはＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインに連結されたＣＤ２０−およびＣＤ２２−結合ドメインをコードし、第２のベクターはＣＤ２８およびｚシグナル伝達ドメインに連結されたＣＤ１９−結合ドメインをコードしている。第４の産物、例４では、第１のベクターはＣＤ２０−およびＣＤ２２−結合ドメインならびにＢＢおよびｚシグナル伝達ドメインをコードしている。第２のベクターは、ＣＤ１９結合ドメインおよびｚシグナル伝達ドメインをコードしている。
【図２】Ｂ細胞悪性疾患を標的化する治療製品のためにＤｕｏＣＡＲセットに組み合わされ得る全ての可能な単一構成成分を示している。命名法は、図１のものと同一である。
【図３】炎症性または自己免疫疾患および感染性疾患が挙げられる複数の治療必要性に適用され得るＤｕｏＣＡＲセットについての一般的スキーマを示す図である。図においてａ−ＣＤＸ、ａ−ＣＤＹ、ａ−ＣＤＺは、３つの異なる標的抗原、ＣＤＸ、ＣＤＹおよびＣＤＺにそれぞれ特異的な抗原結合ドメインを指す。ＣＡＲの細胞内態様は、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８または４−１ＢＢシグナル伝達ドメインのいずれかに連結されたＣＤ８リンカーおよび膜貫通ドメインを全て含む（図１のとおり）。単一ベクターへのこれら２つのベクターのいずれかの具体的な組合せ（例えばＡプラスＦ、ここで抗原Ｘ、ＹおよびＺは、ＣＤ３−ゼータおよび４−１ＢＢを通じた細胞内シグナル伝達が提供される間に標的化される）は、具体的な治療的必要性により規定される。
【図４】２つの抗原が各ベクターによって標的化されるＤｕｏＣＡＲセットについての一般的スキーマを示す図である。図３におけるものと同一であるベクターは、それらの特定の文字指定を保持している（図３および図４中のＡは同じである）。新たな第４の抗原結合ドメインは、ａ−ＣＤＷによって示されている。４個の抗原を標的化する一産物は、Ａ＋Ｔ  Ｄｕｏ  ＣＡＲセットである。この場合細胞外抗原ＣＤＸ、ＣＤＹ、ＣＤＺおよびＣＤＷは、ＣＤ３−ゼータおよびＣＤ２８細胞内シグナルの両方が提供されている間、標的化される。
【図５】文献における現在のＣＡＲ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を本発明のＤｕｏＣＡＲ（Ｅ、Ｆ、Ｇ）と比較して示す図である。リンカーおよび膜貫通ドメイン（単一の空四角）に繋がれた単一結合ドメイン（対になった黒、空のまたは縞の球、それぞれ別々の特異性を有する）の発現を誘導するＣＡＲ発現ベクターを創出することができる。図では、太い灰色線は形質細胞膜を表す。この図では、対になった黒球は抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを表し、対になった空の球は抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖを表し、対になった縞の球は抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖを表し、全て、アミノ酸配列、例えばＧＧＧＧＳの多量体（１、２、３、４、５または６回リピート）を繋ぐことによって連結される。細胞内では、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ鎖に由来するリンパ球シグナル伝達ドメインは、示されるとおりに組み合わされてよい。（Ａ）単一ＣＡＲでは、単一結合ドメインが、膜貫通および２つのシグナル伝達ドメインと組み合わされ、第２世代ＣＡＲが創出される。（Ｂ）スプリットＣＡＲでは、２つの異なるバインダーが、２つの別々の抗原の認識でＴ細胞シグナル伝達を有効にするためには組み合わされなければならない単一シグナル伝達ドメインを有する形で発現される。（Ｃ）タンデムＣＡＲでは、２つの結合ドメインが、単一シグナル伝達ドメインに連結される。この場合、いずれかのドメインの結合は、完全なＴ細胞活性化を誘導する。（Ｄ）１つのベクターからの多重ＣＡＲでは、２つの完全に機能的なＣＡＲは単一ベクターから発現され、それぞれ１つだけの抗原に結合できる。（Ｅ）対照的に、ＤｕｏＣＡＲは２つのベクターから構成され、シグナル伝達ドメインの可能な複数の組合せを含む少なくとも３つの結合ドメインを発現する。ＤｕｏＣＡＲを他と異なったものにする本質的な特色は、２つ以上の転写物の発現、結合ドメイン（少なくとも１つが多重標的化されている）の多重性、２つの発現された細胞表面タンパク質の少なくとも１つの完全に機能的なシグナル伝達特徴である。（Ｆ）ＤｕｏＣＡＲ単一特異性可溶性バインダーフォーマットでは、ベクターによってコードされるＣＡＲ部分は、膜貫通および細胞内シグナル伝達モチーフもコードするタグまたは抗タグモチーフを発現する（ＣＡＲベースベクター。これらは細胞内モチーフに関して同一でない）。ベースベクターは、抗原と相互作用するｓｃＦｖドメインを含有し、またＣＡＲベースタンパク質それ自体への結合を媒介するようにタグまたは抗タグモチーフも含有する可溶性タンパク質に結合する。可溶性タンパク質がＣＡＲベースタンパク質に結合すると、ＤｕｏＣＡＲによって媒介される抗腫瘍活性を媒介する同じ構造的特徴が再構築される［（Ｅ）のとおり］。（Ｇ）ＤｕｏＣＡＲでは、二重特異性可溶性バインダーフォーマット、二重特異性「タグ」−「抗タグ」相互作用は、独自であり、可溶性バインダーの１つだけがベースベクターの１つだけに結合できる。この場合、ベースベクター上の黒ひし形および可溶性二重ｓｃＦｖタンパク質上の角型バインダーは、「ビオチン」−「抗ビオチン」相互作用を表し、第２のＣＡＲベースベクター上の黒三日月形は、単一特異性ｓｃＦｖ構造上の黒楕円と相互作用し、「ＦＩＴＣ」−「抗ＦＩＴＣ」相互作用を表すことができる。
【図６】第２世代（２つの共刺激ドメイン）と第３世代（３つの共刺激ドメイン）フォーマットとの間で異なるＣＡＲ発現ベクターを用いて形質導入された初代ヒトＴ細胞上のＣＡＲ構築物の細胞表面発現レベルを示す図である。Ｔ細胞は、次のＣＡＲ：ＣＡＲなし（偽）、第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ｚ）、第３世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ＢＢｚ）および代替第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−ＢＢｚ）を、発現するように形質導入された。ＣＡＲの表面発現レベルは、フローサイトメトリーによって検出され、平均蛍光強度（ＭＦ）ｙ軸として報告されている。全ての構築物がまさに同じＣＡＲ結合ドメインを発現したにも関わらず、両方の第２世代ＣＡＲのＭＦＩが、より明るかった。
【図７】ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ細胞表面発現を示す図である。ヒトＴ細胞は、ＩＬ−２の存在下でＣＤ３−ＣＤ２８ｎａｎｏｍａｔｒｉｘ（ＴｒａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化され、２つのベクター（１つはタンデムＣＤ２０−ＣＤ１９  ＣＡＲをコードし、１つは単一ＣＤ２２  ＣＡＲをコードする、それにより２＋１  Ｄｕｏ−Ｓｅｔフォーマット）を用いて形質導入され、次いで、染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２を用いてフローサイトメトリーによってＣＤ１９−、ＣＤ２０−またはＣＤ２２−ｓｃＦｖドメインの発現について分析された。対になった列は、左列、ＣＤ２０およびＣＤ１９  ｓｃＦｖｓならびに右列、ＣＤ２２およびＣＤ１９  ｓｃＦｖｓについての二重染色を示している。列１は、形質導入されておらず（ＵＴＤ）、それにより結合を示さないＴ細胞を示している。列２は、ＣＤ８膜貫通ならびに細胞内ＣＤ２８およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン（２０−１９−２８ｚ）を含むＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲベクターをコードするＬＶを用いて形質導入されたＴ細胞を示している。二重染色がＣＤ２０およびＣＤ１９結合（左パネル）について見られる一方で、ＣＤ１９結合だけが右パネルにおいては見られる。列３は、ＣＤ８膜貫通ならびに細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン（２２−ＢＢｚ）を含むＣＤ２２ＣＡＲベクターを用いて形質導入されたＴ細胞を示している。ＣＤ１９またはＣＤ２０（左パネル）では二重染色は見られず、細胞の単一の集団だけがＣＤ２２に結合できることが見られる（右パネル）。列４では、Ｔ細胞は、列２および列３における両方のベクターから構成されるＤｕｏＳｅｔを用いて形質導入されている。ＤｕｏＳｅｔだけが３つ全ての、ＣＡＲによりコードされる結合ドメインを発現している（４２％の細胞はＣＤ２０＿１９を発現し（左パネル）、３８％はＣＤ２２およびＣＤ１９結合ドメインを発現する（右パネル）。ＣＤ２２およびＣＤ１９  ｓｃＦｖが、ＤｕｏＳｅｔを含む２つの別々の膜貫通タンパク質上にそれぞれあることから、３８％がこの例における真のＤｕｏＳｅｔ発現集団を表している。
【図８】ＤｕｏＣＡＲ発現Ｔ細胞の抗腫瘍細胞溶解活性を示す図である。図７に記載のとおり、単一ＣＡＲ構成成分（２０＿１９−２８ｚもしくは２２−ＢＢｚ）またはＤｕｏＳｅｔ（２０＿１９−２８ｚ＋２２−ＢＢｚ）を用いて形質導入されたヒトＴ細胞は、４つの異なるエフェクター標的比（表示のとおり２０：１、１０：１、５：１、２．５：１）で細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて使用された。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用された白血病細胞株は：Ｒａｊｉ（３つ全ての標的抗原を発現する）、ＲＥＨ（３つ全ての標的抗原を発現する）、Ｋ５６２（対照、標的を発現しない）、Ｋ５６２−ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ５６２−ＣＤ２０（ＣＤ２０を発現する）およびＫ５６２−ＣＤ２２（ＣＤ２２を発現する）であった。ＤｕｏＣＡＲ形質導入細胞（２０−１９−２８ｚ＋２２−ＢＢｚ、２＋１  ＤｕｏＳｅｔ）だけが両方の白血病細胞株（ＲａｊｉおよびＲＥＨ）および３つ全ての単一発現Ｋ５６２標的細胞株（Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２０、Ｋ５６２−ＣＤ２２）に対して高い細胞溶解活性を示した。
【図９】ＬＶ調製の２つの異なる方法によって達成された初代ヒトＴ細胞におけるＤｕｏＣＡＲ細胞表面発現を示す図である。同じ方法およびデータ分析が図７においてのとおり使用され、それにより、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２に対して特異的なＤｕｏＣＡＲ（２＋１  ＤｕｏＳｅｔ、１つのＣＡＲがタンデムＣＤ２０およびＣＤ１９バインダーであり、第２のＣＡＲがＣＤ２２バインダーから構成される）を用いて形質導入された細胞が、創出された。データの第１の列は、ＣＤ１９およびＣＤ２０バインダーの発現についてのフローサイトメトリー分析を示しており、一方第２の列は、それぞれ下左、上左、上右および下右の象限で、非形質導入、単一ＣＤ２２−ＣＡＲ形質導入、ＣＤ２２およびＣＤ２０＿１９  ＣＡＲを用いた二重形質導入ならびにタンデムＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲを用いた単一形質導入に対応する４つの異なる集団に関して、ＤｕｏＣＡＲ発現細胞においてＣＡＲとして存在するＣＤ２２およびＣＤ１９バインダーについてのフローサイトメトリー分析を示している。２つのＬＶ形質導入法（共形質導入）および単一ＬＶ形質導入法（共トランスフェクション）の両方は、両方のＣＡ細胞表面タンパク質を発現していることから、Ｔ細胞集団の３０％超が、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２に対して特異的であり、同様のＤｕｏＣＡＲ染色パターンを示した。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
詳細な説明
定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方を指す。例えば、用語「１つの抗原」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と等価とみなされ得る。本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「１つの抗原を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の要素を排除することなく、「１つの抗原を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。語句「および／または」とは、「および」または「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた任意のおよび全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびに全ての分子量または分子質量値は、特記しない限り、おおよそであり、便宜的に提供されていることをさらに理解すべきである。本明細書に記載されるものと類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特に適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図しない。種々の実施形態の再検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
【００８０】
用語「約」とは、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定された値から±２０％、±１０％、またはより好ましくは±５％、もしくは±１％、またはなおより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は、開示された方法を実施するために適切である。
【００８１】
特記しない限り、本明細書の技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、１９９９年；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．によって刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５年；および他の類似の参考文献中に見出すことができる。
【００８２】
本発明は、疾患および／または状態、ならびにこれだけに限らないが、血液悪性疾患および固形腫瘍が挙げられるがんを処置するための組成物および方法に関する。本発明は、１または複数のＤｕｏＣＡＲを発現する２つ以上のベクターを用いて形質導入されたＴ細胞の養子細胞移入の患者特異的、腫瘍特異的戦略に関する。
【００８３】
本発明は、より具体的には、キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター、およびＣＡＲＳを発現するレンチウイルスベクターを用いて形質導入された宿主細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞）、レンチウイルスベクターおよびキメラ抗原受容体をコードする核酸分子に関し、ならびに例えば対象におけるがんを処置するために、それを使用する方法も提供される。
【００８４】
驚くべきことにかつ予想外に、患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を含む免疫療法組成物が、自家リンパ球細胞集団が単一または多重キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のレンチウイルスベクターを用いて形質導入された場合に、抗腫瘍免疫治療としてさらに有効であることが本発明者らによって発見された。単一または多重ＣＡＲＳを発現する少なくとも２つ以上のレンチウイルスベクターの使用は、腫瘍の安定化、低減、排除、またはがんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するようである。
【００８５】
本明細書に記載されるかかる活性患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞集団は、腫瘍の安定化、低減、排除、がんの緩解またはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの組合せを生じる患者特異的抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進するように患者に直接、注入により戻されてよい。これは、治療的細胞集団の有効な増殖および迅速な縮小も含む。
【００８６】
したがって、その最も広い態様では、この養子免疫療法の新規性は、ＣＡＲ−発現ベクターの組合せの使用にある。鑑別特色は、１または複数のキメラ抗原受容体を発現する単一ベクターの従来の使用とは対照的に、Ｄｕｏ  ＣＡＲ手法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍Ｔ細胞活性に対して多重抗原特異性および最適なシグナル伝達の両方を付与する。それにより３つ以上の抗原が効率的に標的化されるシステムを創出することは、腫瘍がん細胞が腫瘍転移および／または腫瘍再発を生じるエスケープバリアントを生成できるようにする単一またはタンデム手法よりも優れている。少なくとも１つのシグナル伝達モチーフ組合せ（複数可）が各ベクター間で同一でないという条件と合わせた、各ベクター中の少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）の具体的な組合せが同一でない単一または多重のキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする２つ以上のベクターの使用は、かかる二重レンチウイルスベクター由来ＣＡＲを用いて形質導入された遺伝子改変された１または複数のリンパ球集団が腫瘍もしくはがんの安定化、低減、排除もしくは緩解および／または腫瘍もしくはがんの再発の予防もしくは寛解またはそれらの任意の組合せを生じる患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、持続を患者特異的に促進できる患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団を生成することを確実にするために働く。
【００８７】
一態様では、免疫療法組成物は、少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む形で提供され（ＤｕｏＣＡＲ）、各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし、ここでベクターの内の１つにおける少なくとも１つの結合ドメイン（複数可）は同一でなく、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている。
【００８８】
別の態様では、免疫療法組成物が図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）にそれぞれ示される単一ＣＡＲ、スプリットＣＡＲ、タンデムＣＡＲまたは多重ＣＡＲを特異的に排除するという条件で、少なくとも２つのベクターをコードする１または複数の単離された核酸分子を含む形で提供され（ＤｕｏＣＡＲ）、各ベクターは機能的ＣＡＲをコードし、それによりベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、ここで各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結されている。
【００８９】
本発明のＤｕｏＣＡＲレンチウイルスベクター改変Ｔ細胞を用いて達成される免疫療法の有効性および腫瘍またはがんの再発の予防または寛解は、１つだけの従来のＣＡＲ設計を用いて達成されるものより顕著に大きく相乗的に多い。これは、従来のＣＡＲベースＴ細胞免疫療法と比較して腫瘍もしくはがんの安定化、低減、排除もしくは緩解生じる患者特異的抗腫瘍リンパ球細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖、維持の増加と関連する生物学的治療利益の独自の組合せである。
【００９０】
リンカーおよび膜貫通ドメイン（単一の空四角）に繋がれた単一結合ドメイン（黒、空または縞の球、それぞれ別々の特異性を有する、図５）の発現を誘導するＣＡＲ発現ベクターを創出することができる。下記図５は、従来のＣＡＲに対する本発明のＤｕｏＣＡＲの比較を示している。図５では、太い灰色線は形質細胞膜を表す。細胞内では、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ鎖に由来するリンパ球シグナル伝達ドメインは、示されるとおりに組み合わされてよい。本文書におけるＣＤ３シグナル伝達ドメインの全ての例および使用において含まれるのは、そのチロシン残基の選択的変異導入、またはもはやＩＴＡＭモチーフをリン酸化のための標的にしないようにする他の変異による免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）の１つ、２つまたは３つのいずれかの変更による、ＣＤ３ゼータ鎖の改変である。単一ＣＡＲでは（図５Ａ）、単一結合ドメインが、膜貫通および２つのシグナル伝達ドメインと組み合わされる。スプリットＣＡＲでは（図５Ｂ）、２つの異なるバインダーが、シグナル伝達を有効にするためには組み合わされなければならない単一シグナル伝達ドメインを有する形で発現される。タンデムＣＡＲでは（図５Ｃ）、２つの結合ドメインが、単一シグナル伝達ドメインに連結される。１つのベクターからの多重ＣＡＲでは（図５Ｄ）、２つの完全に機能的なＣＡＲは単一ベクターから発現される。本発明のＤｕｏＣＡＲは（例えば、図５Ｅ）、各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターをコードし、それにより、ベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフに共有結合で連結される。本発明のＤｕｏＣＡＲを他と異なったものにする本質的特色は、２つ以上のベクターの使用、結合ドメインの多重性および発現される２つの細胞表面タンパク質の少なくとも１つの完全に機能的なシグナル伝達特徴（ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖に関して）である。
【００９１】
別の態様では、ＤｕｏＣＡＲは、治療的Ｔ細胞集団によって媒介される、腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用される。免疫応答は、少なくとも３つの方法で増強される。
【００９２】
第１に、身体中で増殖および生存するためにＴ細胞にさらなるシグナルを提供することによって、本発明のＤｕｏＣＡＲは、その喪失が患者によって忍容され得、腫瘍組織自体の中には存在しない治療的細胞集団に刺激シグナルを提供するようになおも機能する自己抗原（例えば、ＣＤ１９）に遭遇したときにＴ細胞集団を刺激することによって、治療的Ｔ細胞集団の持続を可能にする。第３世代ＤｕｏＣＡＲ（単一細胞外Ｉｇ様バインダーに連結された３つの共刺激ドメインを細胞内で発現する）が、２つの細胞内共刺激ドメインを発現するこれらのＤｕｏＣＡＲと比較して治療的Ｔ細胞では同様には発現されていないことは周知／定着している。例えば下記図６では、初代ヒトＴ細胞上でのＣＡＲ構築物の発現レベルは、第２世代（２つの共刺激ドメイン）と第３世代（３つの共刺激ドメイン）構築物との間で異なっている。Ｔ細胞は、次のＣＡＲ：ＣＡＲを含まない（偽）、第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ｚ）、第３世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−２８ＢＢｚ）および変更された第２世代ＣＡＲ（ＣＡＲ−Ａ−ＢＢｚ）を発現するように形質導入された。ＣＡＲの表面発現レベルはフローサイトメトリーによって検出され、平均蛍光強度（ＭＦ）ｙ軸として報告されている。全ての構築物がまさに同じＣＡＲ結合ドメインを発現したにも関わらず、両方の第２世代ＣＡＲのＭＦＩは、さらに明るかった。
【００９３】
別々のベクターＣＡＲ構築物上に第３のＴ細胞活性化配列を提供することによって、本発明者らは、Ｔ細胞表面でのＣＡＲの発現を減少させる不利益に陥ることなく、３つの共刺激ドメインを発現する利益を回復することができる。
【００９４】
第二の態様では本発明のＤｕｏＣＡＲは、免疫抑制性効果を媒介する腫瘍以外の細胞型を標的化してもよい。例えば、ＣＤ１９発現Ｂ細胞が腫瘍病変に存在し、ＩＬ−４または他の媒介物の産生によって、抗腫瘍免疫も阻害する場合、ＤｕｏＣＡＲ発現腫瘍特異的Ｔ細胞集団を使用する第２の利益は、免疫抑制性細胞集団も除去されることである。
【００９５】
例えば、免疫抑制性Ｂ細胞が固形腫瘍病変内に存在する場合、これらはＢ細胞特異的ＤｕｏＣＡＲ（ＣＤ１９特異的ＤｕｏＣＡＲなど）の使用によって排除され得る。免疫抑制性線維芽細胞様細胞が存在する場合、これらは間質性特異的ＤｕｏＣＡＲによって（例えば、線維芽細胞活性化タンパク質−アルファ（ＦＡＰ）を標的化することによって）除去され得る。奇形脈管構造が有効な免疫応答の欠如の原因である場合、これらの種類の血管またはリンパ管特異的標的（抗ＶＥＧＦＲなど）に特異的なＤｕｏＣＡＲも治療転帰を改善できる。
【００９６】
第３の態様では、本発明のＤｕｏＣＡＲは、腫瘍に対して遠位の、即ち、身体中の別の区画中に存在する免疫抑制的集団を標的化する。例えば、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を標的化し、腫瘍病変自体中または所属リンパ節もしくは骨髄中のいずれかに存在し得るＤｕｏＣＡＲを使用する。腫瘍流入領域リンパ節が免疫活性化または免疫抑制の遺伝子座のいずれかである場合があることは充分定着している。これは、リンパ節の全体的な炎症性トーンおよびリンパ節への移動前の遠位樹状細胞分化に依存する。腫瘍流入領域リンパ節に、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）または樹状細胞などの誤分化した抗原提示細胞がある場合、これらの細胞型を標的化するＤｕｏＣＡＲは、腫瘍自体からは遠位でも、同様に治療転帰を改善できる。がん特異的ＤｕｏＣＡＲ免疫療法適用を超える、ＤｕｏＣＡＲの第２の適用は、自己免疫性および／または炎症性疾患の予防または処置である。腫瘍学に基づく適用との差異は、Ｔ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）、または誘導性Ｔ調節性細胞（ｉＴｒｅｇ）、またはＴｈ−２様免疫応答を促進する条件下で培養された他の細胞が細胞質基質であることである。腫瘍学的適用について、Ｔｈ−１様細胞は細胞質基質である。治療的適用では、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、アレルギー性気道、腸管もしくは他の粘膜炎症または皮膚アレルギーと同様に多様に、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＦＧ−ベータ）などの免疫阻害性サイトカインを産生するＣＡＲ改変リンパ球の存在は、自己免疫性または炎症誘発疾患を回復させる広い免疫寛容原性シグナルを発するように働く。この手法は、アルツハイマー病、多発性硬化症、外傷性脳損傷、パーキンソン病およびＣＴＥ（頻回の脳振盪またはマイクロ振盪による慢性外傷性脳障害）などの末梢または中枢神経系（ＣＮＳ）の神経の炎症状態を含む。この手法は、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）などの進行性瘢痕性疾患も含む。
【００９７】
炎症性疾患の処置では、組織抗原に特異的なリンパ球、炎症性細胞の表面上のディストレスマーカーまたはミスフォールドタンパク質（タウタンパク質またはベータアミロイドなど）は、これらの標的に特異的であるＤｕｏＣＡＲ発現ベクターを生成することによって創出される。アルツハイマー病に対する単一抗体ベースの治療は、既に臨床開発中である（即ち、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  ＣｏｍｐａｎｙによるソラネズマブおよびＢｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．によるアデュカヌマブ）。アルツハイマー病では、モノマー性または凝集性ベータアミロイドに対する抗体は、細胞表面タンパク質へのバインダーの代わりにＣＡＲフォーマットにおいて使用できる。ＭＨＣ分子が結合したタウタンパク質またはタウペプチドへのバインダーは、ＣＡＲに対する結合モチーフとしても使用できる。特異的抹消組織へのリンパ球のホーミングを媒介する受容体も、ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇ集団に領域特異性を与えるために、ＣＡＲフォーマットに含まれてよい。特定の組織へのリンパ球浸潤を駆動することが周知である接着受容体ドメインおよびサイトカイン配列、またはサイトカインもしくはケモカイン受容体もしくはバインダーは、ＣＡＲドメインの一部として使用できる。ＣＤ４４およびインテグリンアルファ−４などの接着分子は、リンパ球をＣＮＳに標的化することが周知であり、それによりリンパ球集団のＣＮＳ遊走性挙動を媒介することが周知である接着分子由来ドメインを含むことは、ＣＡＲ発現リンパ球を疾患の領域に標的するためにも使用できる。同じことが、腸管（即ち、ＭＡｄＣＡｍ−１へのバインダー、ＣＣＲ９または抗ＣＣＬ２５の発現、など）、肺（即ち、Ｐ−セレクチンもしくはメソテリン）、皮膚（即ち、Ｅ−セレクチンへのバインダー）または他の粘膜表面にも当てはまる。
【００９８】
この手法を使用するために、炎症状態を有するまたはアルツハイマー病など、その疾患が炎症性病態の軽減によって処置できる患者は、診療所に入院させ、末梢血液を採取する。Ｔｒｅｇは、免疫磁気ビーズ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって直接選択できる、または適切なサイトカイン環境下での培養によって誘導できる。次いでこれらのＴｒｅｇまたはｉＴｒｅｇをＤｕｏＣＡＲベクターを用いて形質導入し、必要に応じてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる（Ｔｒｅｇ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。ＤｕｏＣＡＲ結合ドメインは、抗体、または組織特異的ホーミングを媒介する受容体、および抗ベータアミロイドなどの疾患関連バインダーに由来する。したがって、生成された、操作された免疫エフェクター細胞は、適切な部位に標的化され、それらのＴｈ２またはＴｒｅｇ分化パターンと一致するサイトカインを産生する。ＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＡＲ受容体の活性化により、特異的な遺伝子ペイロードを分泌するように操作されてよいことも周知である。ベクターから発現されるＤｕｏＣＡＲペイロードに加えて、さらなる治療用タンパク質またはペプチドは：ａ）Ａ−ベータＤＰ（アミロイドベータ分解プロテアーゼ）、ｂ）マトリックスプロテアーゼ（ＣＯＰＤにおけるＭＭＰ−９およびＭＭＰ９阻害剤など）、ｃ）プラーク形成を妨げるペプチドまたは可溶性抗体様バインダー、およびｄ）サイトカイン（ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０など）などの操作されたＴ細胞集団によって発現または分泌されてよい。
【００９９】
ＭｉＲＮＡは、Ｔ細胞機能を調節するために細胞内でも発現されてよい。ｍｉＲＮＡの例は、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−３１６２、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−１２４６およびｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１７−９２である。ｓｈＲＮＡからｍｉＲＮＡも開発されてよい。例はｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−１０７に標的化されたｓｈＲＮＡであり、通常ＰＤ１に結合し、その発現を増加させる。
【０１００】
腫瘍学に基づくならびに炎症性および自己免疫性疾患に基づく適用を超える、Ｄｕｏ  ＣＡＲテクノロジーの第３の適用は、ウイルス、細菌または真菌抗原に対して特異的な治療的リンパ球集団の生成である。それにより、Ｂ細胞悪性疾患について記載された腫瘍学適用に関しては、感染性疾患の標的化は、感染体または微生物抗原の認識に基づいて存在する疾患組織に対する免疫防御または免疫治療活性をＤｕｏＣＡＲ産物が媒介できるようにする。Ｔ細胞受容体それ自体が、病原体によりコードされるペプチドの認識を媒介するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの手法とは異なり、Ｄｕｏ  ＣＡＲ手法は、形質導入されたＴ細胞集団に抗体様認識を与える（即ち、抗原プロセシングを必要としない）、ＣＡＲベクターフォーマットにおいて発現される結合タンパク質を利用する。治療的Ｔ細胞集団の活性化は、感染細胞を除去できる、および微生物抗原が細胞結合型ではない場合、感染体に対して開始される有効な免疫応答を可能にするインターフェロン−ガンマなどの可溶性媒介物を放出できる免疫活性化遺伝子座を生じる。
【０１０１】
例えばＨＩＶは、高度に可変性であることが周知であるが、特異的クレードまたは科を分類でき、クレード特異的ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ、ｇｐ１２０）に対する抗体を創出できる。ＤｕｏＣＡＲ手法を使用して、３つ以上のクレード特異的抗体様バインダーがＣＡＲ構築物に含まれ、幅広い抗ＨＩＶ免疫活性をもたらしている。ウイルスタンパク質に加えて、細菌タンパク質も標的化できる。現在の医学の課題は、医療の現場で頻繁に生じる抗生物質耐性細菌株の処置である。これらとして、ＶＲＥ（バンコマイシン耐性腸球菌）、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ＫＰＣ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネマーゼ産生グラム陰性細菌、同様にＣＲＫＰ）などが挙げられる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ細胞表面抗原として、Ｏ抗原（バリアント９個）およびＫ抗原（バリアントおよそ８０個）が挙げられる。Ｏ抗原スペクトラムは、小さなＤｕｏＣＡＲライブラリーを用いて容易に網羅され、多数のＫ抗原も同様である。使用にあたっては、異なるＫまたはＯ血清型に結合する抗体を特徴とするＣＡＲ構築物が創出され、腫瘍学的適用の場合のように、これらのＣＡＲベクターはＴｈ１−様エフェクター細菌集団への形質導入のために使用され、単離され、活性化される。真菌疾患では、Ｌ．Ｃｏｏｐｅｒらの業績（Ｋｕｍａｓｅｓａｎ、Ｐ．Ｒ．、２０１４年、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１１１巻：１０６６０頁）は、通常ヒト細胞上に発現される真菌結合タンパク質、デクチン１を、ＣＡＲとして再構成することができ、真菌のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を制御するために使用できることを実証した。ヒト疾患アスペルギルス症は、重度に免疫抑制された個体において生じ、真菌Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓによって引き起こされる。複数の群が、アスペルギルス細胞表面の抗原性構成成分に対して特異的なモノクローナル抗体を産生し、それにより真菌表面上の３つ以上のアスペルギルス抗原を標的化するＤｕｏＣＡＲを用いた養子免疫療法を可能にする。したがって、これらの感染性疾患適用の全てにおいて、微生物抗原に対する免疫グロブリン様バインダーを創出する能力は、複数の抗原がＣＡＲ発現エフェクターリンパ球集団によって標的化されるようにする。
【０１０２】
ＤｕｏＣＡＲ、抗体およびその抗原結合性断片、コンジュゲート、ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞、開示されたＤｕｏＣＡＲを使用する処置の方法、組成物およびキットのさらなる記載と共に、それらの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの記載を含む、本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用され得るＤｕｏＣＡＲの詳細な記載は以下である。本発明の組成物および方法は、ＤｕｏＣＡＲの生成および利用を参照して例示されているが、組成物および方法がＴｒｉｏＣＡＲおよびＱｕａｔｒｏＣＡＲの生成および利用を含むことが具体的に意図されることが、本明細書において企図される。
【０１０３】
Ａ．キメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲに存在する）
本明細書で開示されるＤｕｏＣＡＲは、各ベクターが機能的ＣＡＲをコードする少なくとも２つのベクターを含み、それにより、ベクターの組合せは２つ以上の同一でない結合ドメインの発現を生じ、各ベクターによりコードされた結合ドメイン（複数可）は膜貫通ドメインおよび１または複数の同一でない細胞内シグナル伝達モチーフ、抗原に結合できる少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインに共有結合で連結される。
【０１０４】
ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＤｕｏＣＡＲの特徴には、非ＭＨＣ拘束様式で、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させるそれらの能力が含まれる。非ＭＨＣ拘束的な抗原認識は、ＤｕｏＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与え、そうして、腫瘍エスケープの主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＤｕｏＣＡＲは、有利なことに、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖およびベータ鎖と二量体化しない。
【０１０５】
本明細書に開示するように、ＤｕｏＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、限定としてではなく、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。一部の場合では活性化ドメインは、リン酸化の特定の部位、即ちＣＤ３ゼータ鎖中のＩＴＡＭモチーフの変異によって減弱される場合がある、即ちそのドメインによって媒介されるシグナル伝達の程度を慎重に調節する。
【０１０６】
１．細胞外ドメイン
一実施形態では、本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲは、さもなければ抗原結合性ドメインまたは部分と呼ばれる標的特異的結合エレメントを含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの型および数に依存する。例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
【０１０７】
一実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合性ドメインを操作することによって、目的の腫瘍抗原を標的化するように操作され得る。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。抗原結合性ドメインの選択は、処置される特定の型のがんに依存する。腫瘍抗原は、当該分野で周知であり、これには、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）−Ｉ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体ならびにメソセリンが含まれる。本明細書に開示される腫瘍抗原は、例として含まれるにすぎない。このリストは、排他的である意図はなく、さらなる例が、当業者に容易に明らかである。
【０１０８】
一実施形態では、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１または複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。これらの分子には、組織特異的抗原、例えば、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびＧＰ  １００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）が含まれるがこれらに限定されない。他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性抗原である。Ｂ細胞リンパ腫では、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンが、個々の腫瘍に独自の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ３７は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、イディオタイプ）は、限定的な成功で、モノクローナル抗体による受動免疫療法の標的として使用されている。
【０１０９】
腫瘍抗原の型は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）でもあり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に独自であり、身体中の他の細胞上には存在しない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に独自ではなく、その代り、抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導できない条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できるようにする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟であり応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であり得、または正常細胞上では非常に低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上ではかなり高いレベルで発現される抗原であり得る。
【０１１０】
ＴＳＡまたはＴＡＡの非限定的な例には、以下が含まれる：分化抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および腫瘍特異的多系列抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５；過剰発現された胚抗原、例えば、ＣＥＡ；過剰発現された癌遺伝子および変異した腫瘍サプレッサー遺伝子、例えば、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えば、エプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他の大きいタンパク質ベースの抗原には、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３／ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０／Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが含まれる。
【０１１１】
好ましい実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する。さらに別の実施形態では、ＤｕｏＣＡＲは、タグまたは抗Ｔａｇ結合ドメインを含む形で本明細書で提供される。
【０１１２】
標的化される望ましい抗原に応じて、ＣＡＲは、望ましい抗原標的に特異的である適切な抗原結合ドメインを含むように操作されてよい。例えば、ＣＤ１９が標的化される望ましい抗原である場合、ＣＤ１９に特異的な抗体またはそのｓｃＦｖ細断片は、ＣＡＲに組み込まれた抗原結合ドメインとして使用され得る。
【０１１３】
例示的な一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、ＣＤ１９を標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合性ドメインは、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶであり、ここで、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶの核酸配列は、配列番号２７に示される配列を含む。一実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶは、配列番号２８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ部分は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。第２の例示的実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ２０を標的化する。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖであり、抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖの核酸配列は、配列番号１に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ部分は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。第３の例示的実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインはＣＤ２２を標的化する。好ましくはＣＡＲ中の抗原結合ドメインは抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖであり、抗ＣＤ２２  ｓｃＦｖの核酸配列は、配列番号７に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＣＡＲの抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ部分は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
本発明の一態様では、例えば、限定としてではなく、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−ＬＰ）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスおよびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科［例えば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ならびにヘルペスウイルス］、ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルスおよびポックスウイルス）もしくはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原、またはそれらの任意の組合せを含む非ＴＳＡまたは非ＴＡＡに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
【０１１５】
本発明の別の態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細菌株に由来する抗原に結合することが可能なＣＡＲが提供される。特に、感染性細菌、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ．の細菌株（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉまたはＭ．ｇｏｒｄｏｎｅａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅもしくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉに由来する抗原、またはそれらの組合せに結合することが可能なＣＡＲが提供される。
【０１１６】
２．膜貫通ドメイン
本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲでは、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された１または複数の膜貫通ドメインを含む。
【０１１７】
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、単離された核酸分子が提供される。
【０１１８】
一実施形態では、コードされるリンカードメインが、膜貫通ドメインの細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、単離された核酸分子が提供される。
【０１１９】
一部の場合には、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するために、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するために、選択され得るまたはアミノ酸置換により得る。
【０１２０】
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＦｃイプシロンＲ、またはそれらの任意の組合せに由来し得る（即ち、それらの膜貫通領域（複数可）を少なくとも含み得る）。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を優勢に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端において見出される。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間での連結を形成し得る。グリシン−セリン二重または三重アラニンモチーフは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明のＣＡＲ中の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１１の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
一部の場合には、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１３の核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
任意の特定の作用機構に限定する意図はないが、本発明の本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用される例示的なＤｕｏＣＡＲと関連する増強された治療機能の可能な理由には、例えば、限定としてではなく、ａ）より効率的なシグナル伝達を可能にする、原形質膜内での改善された側方の動き、ｂ）脂質ラフトなどの原形質膜マイクロドメイン内の優れた位置、およびＴ細胞活性化と関連する膜貫通シグナル伝達カスケードと相互作用するより高い能力、ｃ）抑制的もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きによる、原形質膜内の優れた位置、例えば、ＣＤ４５などのホスファターゼとあまり近接していないこと、もしくはそれとのより少ない相互作用、ならびにｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（即ち、免疫シナプス）への優れたアセンブリ、またはそれらの任意の組合せが含まれると考えられる。
【０１２４】
本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）の一実施形態では、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲにおいて使用される非限定的な例示的な膜貫通ドメインには、ＴＮＦＲＳＦ１６が含まれ、ＴＮＦＲＳＦ１９膜貫通ドメインは、出願人の同時係属中の仮特許出願第６２／２３９，５０９号、表題ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＮＴＩＧＥＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ、２０１５年１０月９日出願、および譲渡されたＬｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．の案件番号ＬＥＮ＿０１５ＰＲＯに開示されたような、特に、その中の表Ｉに列挙された腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー内に列挙された他のＴＮＦＲＳＦメンバーを含む、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインおよび／またはリンカーもしくはスペーサードメインを誘導するために使用され得る。
【０１２５】
３．スペーサードメイン
本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲでは、スペーサードメインは、細胞外ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインとＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインとの間に配置され得る。スペーサードメインは、ＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞外ドメインと連結させるように、および／またはＴＮＦＲＳＦ膜貫通ドメインを細胞内ドメインと連結させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有する。結合を促進すると予測されるアミノ酸の例には、システイン、荷電アミノ酸、ならびに潜在的グリコシル化部位中のセリンおよびスレオニンが含まれ、これらのアミノ酸は、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用され得る。
【０１２８】
スペーサードメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域を含むアミノ酸番号１３７〜２０６（配列番号１５）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５〜１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５〜３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７〜１５２の全体または一部が使用され得る。また、スペーサードメインとして、抗体Ｈ鎖またはＬ鎖の定常領域の一部（ＣＨ１領域またはＣＬ領域、例えば、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するペプチド）が使用され得る。さらに、スペーサードメインは、人工的に合成された配列であり得る。
【０１２９】
さらに、ＣＡＲでは、シグナルペプチド配列が、Ｎ末端に連結され得る。シグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５〜３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして上で言及されるタンパク質分子の多くは、シグナルペプチド配列を有するので、これらのシグナルペプチドがＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用され得る。一実施形態ではシグナルペプチドは、配列番号５に示されるリーダー（シグナルペプチド）配列のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが中に置かれた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行するように細胞を指示する、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が使用され得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される限りにおいて、かかる短縮された部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、用語、細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
【０１３１】
ＣＡＲでの使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させるように協力して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体もしくはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列が含まれる。
【０１３２】
ＴＣＲ単独を通じて生成されるシグナルが、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であること、および二次または共刺激シグナルもまた必要とされることは公知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言われ得る：ＴＣＲを介した抗原依存的な一次活性化を開始させるもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）。
【０１３３】
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０１３４】
本明細書に開示されるＣＡＲにおいて特に使用される一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例には、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。ＩＴＡＭの具体的な非限定的な例には、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１〜１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５〜８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１〜２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９〜１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８〜１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３〜２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、００２２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７〜８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６〜２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２〜２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７〜２５２の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。本明細書に記載されるＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされる。一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ３ゼータ中の１つ、２つまたは３つのＩＴＡＭモチーフは、別のアミノ酸によるチロシン残基の変異または置換によって減弱される。
【０１３５】
好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体で、またはＣＡＲの状況で有用な任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。かかる共刺激分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。かかる共刺激分子の具体的な非限定的な例には、ＣＤ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６〜３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１〜４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７〜２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６〜２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１〜２２０、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４〜２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１〜２７７およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６〜１９９の配列を有するペプチド、ならびにこれらのペプチドが有するのと同じ機能を有するそれらのバリアントが含まれる。したがって、本明細書の開示は、４−１ＢＢを共刺激シグナル伝達エレメントとして主に例示するが、他の共刺激エレメントが本開示の範囲内である。
【０１３６】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムにまたは特定された順序で、互いに連結され得る。任意選択で、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２アミノ酸長と１０アミノ酸長との間が、連結を形成し得る。グリシン−セリン二つ組は、特に適切なリンカーを提供する。
【０１３７】
一実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
【０１３８】
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１７に示される核酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１９に示される核酸配列を含む。
【０１３９】
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０１４０】
一実施形態では、ＣＡＲ中の細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
５．ＤｕｏＣＡＲのさらなる記載
本明細書で開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明示的に含まれる。用語「機能的部分」とは、ＣＡＲに関して使用する場合、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲの１または複数の任意の一部または断片を指し、この一部または断片は、それがその一部であるＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力、または疾患を検出、処置もしくは予防する能力を保持する、ＣＲＡの一部を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、例えば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％以上を含み得る。
【０１４２】
機能的部分は、その部分のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、または両方の末端において、さらなるアミノ酸を含み得、このさらなるアミノ酸は、親ＣＡＲのアミノ酸配列中には見出されない。望ましくは、さらなるアミノ酸は、例えば、標的細胞を認識し、がんを検出し、がんを処置または予防するなどの、機能的部分の生物学的機能を妨害しない。より望ましくは、さらなるアミノ酸は、親ＣＡＲの生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
【０１４３】
本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用する場合、親ＣＡＲに対する実質的なまたは著しい配列同一性または類似性を有するＣＡＲ、ポリペプチドまたはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、それがそのバリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲと類似の程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持する、本明細書に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、例えば、親ＣＡＲに対して、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％以上、アミノ酸配列が同一であり得る。
【０１４４】
機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。あるいは、またはさらに、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＣＡＲのアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得、その結果、機能的バリアントの生物学的活性は、親ＣＡＲと比較して増加される。
【０１４５】
ＤｕｏＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、当該分野で公知であり、これには、ある特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換が含まれる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を置換する酸性／負に荷電した極性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を置換する非極性側鎖を有するアミノ酸、塩基性／正に荷電した別の極性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を置換する塩基性／正に荷電した極性アミノ酸、極性側鎖を有する別の非荷電アミノ酸（例えば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を置換する極性側鎖を有する非荷電アミノ酸、ベータ分岐側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｅ、ＴｈｒおよびＶａｌ）を置換するベータ分岐側鎖を有するアミノ酸、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）を置換する芳香族側鎖を有するアミノ酸などであり得る。
【０１４６】
ＣＡＲは、本明細書に記載される特定されたアミノ酸配列（単数または複数）から本質的になり得、その結果、他の構成要素、例えば、他のアミノ酸は、機能的バリアントの生物学的活性を著しくは変化させない。
【０１４７】
ＤｕｏＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、任意の長さであり得る、即ち、任意の数のアミノ酸を含み、但し、ＤｕｏＣＡＲ（またはその機能的部分もしくは機能的バリアント）は、それらの生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持する。例えば、ＣＡＲは、約５０〜約５０００アミノ酸長、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上アミノ酸長であり得る。
【０１４８】
ＤｕｏＣＡＲ（本発明の機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１または複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含み得る。かかる合成アミノ酸は、当該分野で公知であり、これには、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、−アミノ  ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−ヒドロキシプロリンおよびトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ν’，Ν’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、−アミノシクロペンタンカルボン酸、ａ−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ−アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、γ−ジアミノ酪酸、β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニンおよびａ−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが含まれる。
【０１４９】
ＤｕｏＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、例えばジスルフィド架橋を介した環化、もしくは酸付加塩へ変換および／または任意選択で二量体化もしくは重合、あるいはコンジュゲートされ得る。
【０１５０】
ＤｕｏＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、当該分野で公知の方法によって得られ得る。ＤｕｏＣＡＲは、ポリペプチドまたはタンパク質を作製する任意の適切な方法によって作製され得る。ポリペプチドおよびタンパク質をデノボ合成する適切な方法は、Ｃｈａｎら、Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、２０００年；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｉｄ，Ｒ．編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、２０００年；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄら編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ、２００１年；および米国特許第５，４４９，７５２号などの参考文献に記載されている。キメラ抗原受容体を生成する方法、かかる受容体を含むＴ細胞、およびそれらの使用（例えば、がんの処置のため）は、当該分野で公知であり、本明細書にさらに記載されている（例えば、その各々が、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１８巻：４号、６６６〜６６８頁；Ｍｏｒｇａｎら、２０１０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、オンライン公開２月２３日、２０１０年、１〜９頁；Ｔｉｌｌら、２００８年、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻：２２６１〜２２７１頁；Ｐａｒｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２９巻：５５０〜５５７頁、２０１１年；Ｇｒｕｐｐら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、３６８巻：１５０９〜１５１８頁、２０１３年；Ｈａｎら、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．、６巻：４７頁、２０１３年；Ｔｕｍａｉｎｉら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、１５巻、１４０６〜１４１７頁、２０１３年；Ｈａｓｏら、（２０１３年）Ｂｌｏｏｄ、１２１巻、１１６５〜１１７４頁；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１３／１２６７２６；および米国特許出願公開第２０１２／０２１３７８３号を参照のこと）。例えば、開示されたキメラ抗原結合性受容体をコードする核酸分子は、開示されたＣＡＲを作製するために、Ｔ細胞などの宿主細胞に形質導入するために使用される発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）中に含まれ得る。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体を使用する方法は、対象からＴ細胞を単離するステップ、キメラ抗原受容体をコードする発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）をＴ細胞に形質導入するステップ、および対象における処置、例えば腫瘍の処置のために、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を対象に投与するステップを含む。
【０１５１】
Ｂ．抗体および抗原結合性断片
一実施形態は、本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書で開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性ドメインもしくは部分をさらに提供する。本明細書で使用する場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲ  Ｔ細胞」とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＡＲの抗体由来の標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、「抗原結合性ドメイン」は、抗体およびその抗原結合性断片を含み得る。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、およびそれらの抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を包含する。抗体の非限定的な例には、例えば、当該分野で公知のインタクトな免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合親和性を保持するそのバリアントおよび断片が含まれる。
【０１５３】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示すのであって、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。一部の例では、モノクローナル抗体は、単一クローンのＢリンパ球によって産生された抗体、または単一の抗体（またはその抗原結合性断片）の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクトされた細胞、もしくはその子孫によって産生された抗体である。一部の例では、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対する影響を実質的に有さない保存的アミノ酸置換を有し得る。モノクローナル抗体の産生の例示的な方法は公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１３年）を参照のこと。
【０１５４】
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。
【０１５５】
各重鎖および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメインを含有する；例えば、Ｋｉｎｄｔら  Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７年）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。さらなる実施形態では、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物（camelid）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６〜４４８頁、１９９３年；Ｓｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３巻：７３３〜７３６頁、１９９６年を参照のこと）。「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗原結合性断片、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
【０１５６】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成成分である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを位置付けアラインさせるように機能する。
【０１５７】
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、（ＪＭＢ  ２７３巻、９２７〜９４８頁、１９９７年；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、およびＬｅｆｒａｎｃら（「  ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻：５５〜７７頁、２００３年；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）に記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定され得る。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へ）と呼ばれ、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ３であるが、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。重鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる場合もある。
【０１５８】
「抗原結合性断片」は、同族抗原を特異的に認識する能力を保持する全長抗体の部分、ならびにかかる部分の種々の組合せである。抗原結合性断片の非限定的な例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多特異的抗体が含まれる。抗体断片には、抗体全体の改変によって産生された抗原結合性断片、または組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで合成された抗原結合性断片が含まれる（例えば、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１〜２巻、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、２０１０年を参照のこと）。
【０１５９】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、適切なポリペプチドリンカーによって連結された１または複数の抗体（複数可）のＶＨおよびＶＬドメインを遺伝学的に融合された単鎖分子として含有する遺伝子操作された分子である（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５巻：５８７９〜５８８３頁、１９８８年；Ａｈｍａｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ、ＩＤｒｕｇｓ、１３巻：５４３〜５４９頁、２０１０年を参照のこと）。ｓｃＦｖ中のＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ｓｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（ＶＨドメイン−リンカードメイン−ＶＬドメイン；ＶＬドメイン−リンカードメイン−ＶＨドメイン）を有するｓｃＦｖが使用され得る。
【０１６０】
ｄｓＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変鎖は、鎖の会合を安定化させるために、ジスルフィド結合を導入するように変異されている。ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異的抗体であるディアボディもまた含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０巻：６４４４〜６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１〜１１２３頁、１９９４年を参照のこと）。
【０１６１】
抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異的抗体）などの、遺伝子操作された形態もまた含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年もまた参照のこと。
【０１６２】
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築され得、組換え産生され得、または、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻：１２７５〜１２８１頁（１９８９年）に記載されるように、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、単鎖および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４巻：２４３〜２４６頁（１９９３年）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、１９８８年；Ｈｉｌｙａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２年）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５年）；その各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６３】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいてその抗原への参照抗体の結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を５０％以上遮断する。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが本明細書で提供される。
【０１６４】
「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）抗体または抗原結合性断片由来の１または複数のＣＤＲを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば、少なくとも約８５〜９０％、例えば、約９５％以上同一であり得る。したがって、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分は、おそらくはＣＤＲを除いて、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。
【０１６５】
「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである２つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、１つのヒト抗体由来の１または複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。
【０１６６】
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）配列を含むが、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部の実施形態では、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはヒトゲノムに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて配列を創出するためのテクノロジーを使用して、またはトランスジェニック動物を使用して、同定および単離され得る（例えば、Ｂａｒｂａｓら  Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ．第１版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年  Ｐｒｉｎｔ．；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２３巻：１１１７〜１１２５頁、２００５年；Ｌｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０〜４５９頁、２００８年を参照のこと）。
【０１６７】
抗体は、１または複数の結合部位を有し得る。１よりも多い結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２つの同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１つの結合部位を有するが、二重特異的または二機能性抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【０１６８】
ＣＡＲの任意の機能的部分に結合する能力について抗体を試験する方法は、当該分野で公知であり、これには、任意の抗体−抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降および競合阻害アッセイなどが含まれる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、以下、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号Ａｌ、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照のこと）。
【０１６９】
また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などを含み得る。
【０１７０】
Ｃ．コンジュゲート
本明細書に開示される患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、または本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に対して特異的なモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片は、当業者に公知のいくつもの手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの薬剤にコンジュゲートされ得る。共有結合および非共有結合の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片へのエフェクター分子または検出可能なマーカーの共有結合的連結が存在する分子を含むがこれらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射活性剤、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓ、ならびに他の標識、標的部分およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）種々のエフェクター分子および検出可能なマーカーが使用され得ることを理解する。
【０１７１】
特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。
【０１７２】
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合性断片に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含有し、これらは、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合を生じるための、抗体上の適切な官能基との反応のために利用可能である。あるいは、抗体または抗原結合性断片は、さらなる反応性官能基を曝露または結合するために誘導体化される。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能なものなどの、いくつかの公知のリンカー分子のいずれかの結合を含み得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーに結合させるために使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方への共有結合を形成することが可能である。適切なリンカーは、当業者に周知であり、これには、直鎖もしくは分岐鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合性断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側基を介して（例えば、システインへのジスルフィド連結を介して）構成成分アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に結合され得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、存在する場合には、リンカーのサイズを増加させ、その結果、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合性断片との間の距離が増加される、スペーサーエレメントを含み得る。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、これには、米国特許第７，９６４，５６６号、米国特許第７，４９８，２９８号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４，０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号および米国特許第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許出願公開第２０１１０２１２０８８号および米国特許出願公開第２０１１００７０２４８号中に列挙されるものが含まれ、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内条件下で切断可能であり、その結果、リンカーの切断は、細胞内環境中で、抗体または抗原結合性断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーを放出させる。さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、例えば、抗体分解によって放出される。一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境中（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。しかし、リンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長、例えば、１〜２、１〜３、２〜５、３〜１０、３〜１５、１〜５、１〜１０、１〜１５アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得、その全ては、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞の内側での活性薬物の放出を生じることが公知である（例えば、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁を参照のこと）。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンＢによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る（例えば、フェニルアラニン−ロイシンまたはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシンリンカー）。かかるリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。具体的な実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン−シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン−リシンリンカーである（例えば、バリン−シトルリンリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。
【０１７５】
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、即ち、ある特定のｐＨ値において加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド（cis-aconitic amide）、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；米国特許第５，８２４，８０５号；米国特許第５，６２２，９２９号；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９年、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻：６７〜１２３頁；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：１４６５３〜１４６６１頁を参照のこと）。かかるリンカーは、血液中などの中性のｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０を下回るｐＨでは不安定である。ある特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
【０１７６】
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当該分野で公知であり、これには、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成され得るものが含まれる（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７巻：５９２４〜５９３１頁；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、 Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９８７年）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８巻：９２８０〜９２９０頁、２００８年を参照のこと）。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照のこと。
【０１７７】
さらに他の具体的な実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５巻：１３８７〜９３頁）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１２９９〜１３０４頁）または３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５年、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３巻（１０号）：１３０５〜１２頁）である。
【０１７８】
さらに他の実施形態では、リンカーは切断不能であり、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、抗体分解によって放出される（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞外環境中での切断に対して抵抗性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境中（例えば、血漿中）に存在する場合、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が切断される。リンカーが細胞外環境中での切断に対して抵抗性であるか否かは、例えば、目的のリンカーを含有するコンジュゲートを、所定の期間（例えば、２、４、８、１６または２４時間）にわたって血漿と共にインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって決定され得る。コンジュゲート中で使用され得る種々の例示的なリンカーは、ＷＯ２００４−０１０９５７、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号に記載されており、その各々は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲのコンジュゲート、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分、および１または複数の小分子毒素、例えば、カリチアマイシン、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドラスタチン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、トリコテシンおよびＣＣ１０６５ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体が提供される。
【０１８１】
マイタンシノイド毒素部分としての使用に適切なマイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）化合物は、当該分野で周知であり、公知の方法に従って天然供給源から単離され得、遺伝子操作技術（Ｙｕら（２００２年）ＰＮＡＳ  ９９巻：７９６８〜７９７３頁を参照のこと）、または公知の方法に従って合成により調製されたマイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）およびマイタンシノールアナログを使用して産生され得る。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある特定の微生物もまた、マイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；および米国特許第４，３７１，５３３号に開示されており，その各々は、参照により本明細書に組み込まれる。マイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許第５，４１６，０６４号；米国特許第６，４４１，１６３号および欧州特許ＥＰ０  ４２５  ２３５  Ｂ１に開示されており、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１８２】
さらなる毒素が、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分と共に使用され得る。例示的な毒素には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ヒマ毒、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリチアマイシン、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが含まれる。これらの毒素は、当該分野で周知であり、多くは、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手可能である。企図される毒素には、これらの毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと）。
【０１８３】
サポリンは、リボソーム複合体の６０Ｓ部分を不活性化することによってタンパク質合成を破壊する、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素である（Ｓｔｉｒｐｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：４０５〜４１２頁、１９９２年）。しかし、この毒素は、細胞中への特異的進入のための機構を有さず、したがって、細胞によって効率的に取り込まれるために、内在化される細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合性断片へのコンジュゲートを必要とする。
【０１８４】
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素における使用のためのジフテリア毒素は、非特異的毒性を低減または排除するために変異される。完全な酵素活性を有するが非特異的毒性が顕著に低減された、ＣＲＭ１０７として公知の変異体は、１９７０年代以降公知であり（ＬａｉｒｄおよびＧｒｏｍａｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９巻：２２０頁、１９７６年）、ヒト臨床試験において使用されてきた。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照のこと。
【０１８５】
ヒマ毒は、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）由来のレクチンＲＣＡ６０である。ヒマ毒の例については、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照のこと。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニン（ＲＣＡ）は、それぞれ、およそ６５ｋＤおよび１２０ｋＤの分子量に従って、ＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される２つの形態で存在する（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＢｌａｕｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２６６巻：５４３頁、１９７２年）。Ａ鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の死滅を担う。Ｂ鎖は、ヒマ毒を細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２４９巻：６２７〜６３１頁、１９７４年および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【０１８６】
リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素としての使用のために標的化分子にコンジュゲートされてきた（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：２６５〜７０頁、１９９９年を参照のこと）。例示的なリボトキシン、例えば、α−サルシン（α−ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）は、例えば、Ｒａｔｈｏｒｅら、Ｇｅｎｅ  １９０巻：３１〜５頁、１９９７年；ならびにＧｏｙａｌおよびＢａｔｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５巻２部：２４７〜５４頁、２０００年で議論されている。カリチアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ中にアポトーシスをもたらす二本鎖切断を生じさせて、エンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２巻：１０７０〜８７頁、１９８９年を参照のこと）。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である（例えば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１巻：７３５〜４１頁、２０００年を参照のこと）。
【０１８７】
アブリンは、Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ由来の毒性レクチンを含む。毒性素であるアブリンａ、ｂ、ｃおよびｄは、約６３ｋＤおよび６７ｋＤの分子量を有し、２つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖ＡおよびＢから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害する；Ｂ鎖（アブリン−ｂ）は、Ｄ−ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２巻：１０９５頁、１９８８年；およびＯｌｓｎｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０巻：３３０〜３３５頁、１９７８年を参照のこと）。
【０１８８】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、本明細書に開示された抗原のうち１または複数に対して特異的なモノクローナル抗体、その抗原結合性断片はまた、検出可能なマーカー；例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法または画像診断技術（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、コンピュータ体軸断層撮影（ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ａｘｉａｌ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡下試験）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能なマーカーの具体的な非限定的な例には、フルオロフォア、化学発光剤、酵素的連結、放射活性同位体および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能なマーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）塩化物、フィコエリトリン、ランタニドリン蛍光体などを含む蛍光化合物が含まれる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた使用される。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、検出のために有用な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどにもコンジュゲートされ得る。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分が、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別できる反応産物を産生するために酵素が使用するさらなる試薬を添加することによって検出され得る。例えば、薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、視覚的に検出可能な着色反応産物をもたらす。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、ビオチンとコンジュゲートされ得、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的な測定を介して検出され得る。アビジン自体が酵素または蛍光標識とコンジュゲートされ得ることに留意すべきである。
【０１８９】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分は、ガドリニウムなどの常磁性薬剤とコンジュゲートされ得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性薬剤もまた、標識として使用される。抗体は、ランタニド（例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンともコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合性断片はまた、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体への結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識され得る。
【０１９０】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体またはその抗原結合性部分はまた、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射標識は、診断目的および治療目的の両方のために使用され得る。例えば、放射標識は、ｘ線、発光スペクトルまたは他の診断技術によって本明細書に開示された抗原および抗原発現細胞のうち１または複数を検出するために使用され得る。さらに、放射標識は、対象における腫瘍の処置のため、例えば、神経芽細胞腫の処置のために、毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチドのための標識の例には、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が含まれるがこれらに限定されない：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ。
【０１９１】
かかる検出可能なマーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得、蛍光マーカーは、発せられた照明を検出するために光検出器を使用して検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、発色標識は、着色標識を単純に可視化することによって検出される。
【０１９２】
Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクターおよび宿主細胞
本明細書に記載されるＤｕｏＣＡＲ、抗体またはその抗原結合性部分（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が、本発明の一実施形態によってさらに提供される。本発明の核酸は、本明細書に記載されるリーダー配列、抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１９３】
一実施形態では、Ｎ末端からＣ末端へ、少なくとも１つの細胞外抗原結合性ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＤｕｏＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子が提供される。
【０１９４】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの単鎖可変断片を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０１９５】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０１９６】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされるＣＡＲ細胞外抗原結合性ドメインが、抗原に結合する少なくとも１つのリポカリンベースの抗原結合性抗原（アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ））を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０１９７】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続される、単離された核酸分子が提供される。
【０１９８】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインに、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列が先行する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０１９９】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、またはそれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない抗原を標的化する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２００】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのある特定の実施形態では、コードされる細胞外抗原結合性ドメインが、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２０  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ２２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＲＯＲ１  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗メソセリンｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ３８  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＣＤ１３８  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＰＣ３  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＧＤ−２  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳｏ−１  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、抗ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ  ｓｃＦＶ抗原結合性ドメイン、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列、あるいはそれらの任意の組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０１】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一態様では、本明細書で提供されるＤｕｏＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。
【０２０２】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、細胞外抗原結合性ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方が、リンカードメインによって膜貫通ドメインに接続される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０３】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、コードされるリンカードメインが、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ドメインに連結される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０４】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、膜貫通ドメインをコードする核酸配列が、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するそのヌクレオチド配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０５】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、コードされる膜貫通ドメインが、少なくとも１つであるが１０以下の改変を含むアミノ酸配列、または８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するその配列を含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０６】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の実施形態では、コードされるＣＡＲが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータもしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０７】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらに別の実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０８】
本明細書に開示されるＣＡＲの一実施形態では、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに対してＣ末端側に配置される、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２０９】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの別の実施形態では、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２１０】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲのさらなる実施形態では、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらの組合せを含む、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２１１】
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲの一実施形態では、リーダー配列またはシグナルペプチド配列をさらに含有する、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供される。
【０２１２】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン改変され得る。特定の理論に束縛されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換し、そうして翻訳効率を増加させることを含み得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害する二次ｍＲＮＡ構造を低減させ得、そうして翻訳効率を増加させる。
【０２１３】
本発明の実施形態では、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合性ドメインをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるＤｕｏＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいずれかをコードするコドン改変されたヌクレオチド配列を含み得る。
【０２１４】
「核酸」は、本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸分子」を含み、一般に、一本鎖または二本鎖の、合成のまたは天然供給源から得られた（例えば、単離および／または精製された）ものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得、未改変のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見出されるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）連結またはホスホロチオエート連結を含有し得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。一部の実施形態では、核酸は、いずれの挿入、欠失、逆位および／または置換も含まない。しかし、一部の場合には、本明細書で議論されるように、核酸は、１または複数の挿入、欠失、逆位および／または置換を含むことが適切であり得る。
【０２１５】
組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列の２つのさもなければ分離されたセグメントの人工的な組合せによって作製される配列を有するものであり得る。この人工的な組合せは、化学的合成によって、またはより一般的には、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載されるものなどの遺伝子操作技術による、核酸の単離されたセグメントの人工的操作によって達成される場合が多い。核酸は、当該分野で公知の手順を使用する化学的合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変型ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換されたアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６−ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうち１または複数は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）などの会社から購入できる。
【０２１６】
核酸は、ＤｕｏＣＡＲまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のいずれかと縮重するヌクレオチド配列、または縮重配列の組合せを含み得る。
【０２１７】
一実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列、または本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸もまた提供する。
【０２１８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る。「高いストリンジェンシーの条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーの条件には、ヌクレオチド配列と一致したいくつかの小領域（例えば、３〜１０塩基）を偶然に有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、またはいくつかの散在するミスマッチしか含有しないポリヌクレオチドを識別する条件が含まれる。相補性のかかる小領域は、１４〜１７またはそれを超える塩基の全長相補体よりも容易に融解され、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーの条件には、例えば、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によって、約５０〜７０℃の温度で提供されるような、低塩および／または高温条件が含まれる。かかる高いストリンジェンシーの条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチをほとんど忍容せず、本発明のＤｕｏＣＡＲのいずれかの発現を検出するのに特に適切である。一般に、条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントにされ得ることが理解される。
【０２１９】
本明細書に記載される核酸のいずれかに対して、少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供される。
【０２２０】
一実施形態では、核酸は、組換え発現ベクター中に取り込まれ得る。これに関して、一実施形態は、核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」とは、構築物が、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、およびベクターが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが細胞内で発現されるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現を可能にする、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。ベクターは、全体としては天然に存在しない。
【０２２１】
しかし、ベクターの一部は、天然に存在し得る。組換え発現ベクターは、一本鎖または二本鎖の、合成または一部天然供給源から得られたものであり得、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有し得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意の型のヌクレオチドを含み得る。組換え発現ベクターは、天然に存在するもしくは天然に存在しないヌクレオチド間連結、またはその両方の型の連結を含み得る。好ましくは、天然に存在しないまたは変更されたヌクレオチドまたはヌクレオチド間連結は、ベクターの転写も複製も邪魔しない。
【０２２２】
一実施形態では、組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用され得る。適切なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、繁殖および増殖のためもしくは発現のため、またはその両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択され得る。
【０２２３】
バクテリオファージベクター、例えば、λυΤΙ  Ο、λυΤΙ  １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４およびλΝΜΙ  １４９もまた使用され得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭおよびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。レンチウイルスベクターは、特に、Ｍｉｌｏｎｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７巻（８号）：１４５３〜１４６４頁（２００９年）に提供されるような自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。クリニックにおいて使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、限定としてではなく、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  ｐｌｃのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達テクノロジー、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが含まれる。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
【０２２４】
いくつかのトランスフェクション技術が、当該分野で一般に公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４６７頁（１９７３年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６年）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３巻：９７頁（１９８１年）を参照のこと）。
【０２２５】
トランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈（例えば、Ｇｒａｈａｍら、上記を参照のこと）、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２巻：４７９〜４８８頁（１９８０年）を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：７４２〜７５１頁（１９８８年）を参照のこと）、リポソーム媒介性遺伝子移入（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２〜６９０頁（１９８８年）を参照のこと）、脂質媒介性形質導入（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：７４１３〜７４１７頁（１９８７年）を参照のこと）および高速微小推進剤（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸送達（例えば、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２７巻：７０〜７３頁（１９８７年）を参照のこと）が含まれる。
【０２２６】
一実施形態では、組換え発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または直鎖状である発現ベクターの構築物は、原核生物または真核生物宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
【０２２７】
組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮に入れて、必要に応じて、ベクターが導入される宿主細胞の型（例えば、細菌、真菌、植物または動物）に特異的な調節配列、例えば、転写および翻訳開始および終結コドンを含み得る。組換え発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限部位を含み得る。
【０２２８】
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする、１または複数のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における補完などが含まれる。本発明の発現ベクターに適切なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
【０２２９】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列に、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なもしくはかかるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結したネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的および発生特異的は、当業者の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることもまた、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列において見出されるプロモーターであり得る。
【０２３０】
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導性発現のために作製され得る。
【０２３１】
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現する細胞を死なせる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、この遺伝子が発現される細胞に薬物などの薬剤に対する感受性を付与する遺伝子、または細胞が薬剤と接触した場合もしくは薬剤に曝露された場合にその細胞を死なせる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該分野で公知であり（例えば、Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｕｔｔｏｎ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと）、これには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびニトロレダクターゼが含まれる。
【０２３２】
一実施形態は、本明細書に記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、本発明の組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得る、または原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生生物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であり得る、即ち、ヒトなどの生物から直接単離され得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、即ち、懸濁物中で成長する細胞であり得る。適切な宿主細胞は、当該分野で公知であり、これには、例えば、ＤＨ５ａ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが含まれる。組換え発現ベクターを増幅または複製することを目的とすると、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、ＤＨ５ａ細胞であり得る。組換えＣＡＲを産生することを目的とすると、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に起源し得、任意の発生段階のものであり得るが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。宿主細胞は、Ｔ細胞であり得る。
【０２３３】
本明細書の目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴｈｉおよびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【０２３４】
一実施形態では、本明細書に記載されるＤｕｏＣＡＲは、適切な非Ｔ細胞において使用され得る。かかる細胞は、免疫エフェクター機能を有する細胞、例えば、多能性幹細胞から生成されたＮＫ細胞およびＴ様細胞などである。
【０２３５】
本明細書に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、一実施形態によって提供される。細胞の集団は、いずれの組換え発現ベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載される組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、ここで、集団は主に、組換え発現ベクターを含む（例えば、それらから本質的になる）宿主細胞を含む。集団はまた、細胞のクローン性集団であり得、ここで、集団の全ての細胞は、組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、その結果、集団の全ての細胞は、その組換え発現ベクターを含む。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン性集団である。
【０２３６】
ＤｕｏＣＡＲ（その機能的部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）および抗体（その抗原結合性部分を含む）は、単離および／または精製され得る。例えば、精製（または単離）された宿主細胞の調製物は、宿主細胞が身体内のその天然環境中の細胞よりも純粋である調製物である。かかる宿主細胞は、例えば、標準的な精製技術によって産生され得る。一部の実施形態では、宿主細胞の調製物は精製され、その結果、宿主細胞は、調製物の総細胞含量の少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％を示す。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％もしくは約８０％よりも上であり得、または約１００％であり得る。
【０２３７】
Ｅ．処置の方法
患者特異的自家抗腫瘍リンパ球細胞集団（複数可）において使用されるＤｕｏＣＡＲは、哺乳動物において疾患を処置または予防する方法において使用され得ることが企図される。これに関して、一実施形態は、ＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、ならびに／または医薬組成物を、哺乳動物においてがんを処置または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物においてがんを処置または予防する方法を提供する。上述のＤｕｏＣＡＲのさらなる使用方法は、上に開示されている。
【０２３８】
一実施形態は、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲを投与するステップの前に、哺乳動物をリンパ枯渇させる（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。リンパ枯渇の例には、非骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、骨髄破壊的リンパ枯渇性化学療法、全身照射などが含まれ得るがこれらに限定されない。
【０２３９】
宿主細胞、または細胞の集団が投与される方法を目的として、細胞は、哺乳動物にとって同種または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物にとって自家である。本明細書で使用する場合、同種とは、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を意味する。１または複数の遺伝子座において遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種材料は、抗原性に相互作用するのに十分に遺伝的に異なり得る。本明細書で使用する場合、「自家」とは、個体に後に再導入される、同じ個体に由来する任意の材料を意味する。
【０２４０】
本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用する場合、用語「哺乳動物」とは、齧歯目の哺乳動物、例えば、マウスおよびハムスター、ならびにウサギ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物、例えば、ウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（Ｆｅｌｉｎｅ）（ネコ（ｃａｔ））およびイヌ（Ｃａｎｉｎｅ）（イヌ（ｄｏｇ））を含む食肉目由来であり得る。哺乳動物は、ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ）（ウシ（ｃｏｗ））およびブタ（Ｓｗｉｎｅ）（ブタ（ｐｉｇ））を含む偶蹄目由来、またはウマ（Ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであり得る。哺乳動物は、霊長目、新世界ザル（Ｃｅｂｏｉｄ）目もしくはサル（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル（ｍｏｎｋｅｙ））または類人猿（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄ）目（ヒトおよび類人猿（ａｐｅ））のものであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２４１】
これらの方法に関して、がんは、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱がん（例えば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（例えば、髄芽腫）、乳房がん、肛門、肛門管もしくは肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢もしくは胸膜のがん、鼻、鼻腔もしくは中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ−慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）およびバーキットリンパ腫、卵巣がん、膵がん、腹膜、網および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がんならびに尿管がんのいずれかを含む任意のがんであり得る。
【０２４２】
用語「処置する」および「予防する」ならびにそれらから派生した単語は、本明細書で使用する場合、１００％または完全な処置または予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益な効果または治療効果を有すると認識する、種々の程度の処置または予防が存在する。これに関して、この方法は、任意の量または任意のレベルの、哺乳動物におけるがんの処置または予防を提供し得る。
【０２４３】
さらに、この方法によって提供される処置または予防には、処置または予防されているがんなどの疾患の１または複数の状態または症状の処置または予防が含まれ得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、またはその症状もしくは状態の発病を遅延させることを包含し得る。
【０２４４】
別の実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、（ａ）哺乳動物由来の１または複数の細胞を含む試料を、ＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／もしくはその抗原結合性部分、または医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成するステップ、ならびに（ｂ）複合体を検出するステップであって、複合体の検出が、哺乳動物におけるがんの存在を示す、ステップを含む方法を提供する。
【０２４５】
試料は、任意の適切な方法、例えば、生検または剖検によって得られ得る。生検は、個体からの組織および／または細胞の取り出しである。かかる取り出しは、取り出された組織および／または細胞に対する実験を実施するために、個体から組織および／または細胞を収集することであり得る。この実験には、個体がある特定の状態もしくは疾患状態を有するかどうか、および／またはある特定の状態もしくは疾患状態に罹患しているかどうかを決定するための実験が含まれ得る。状態または疾患は、例えば、がんであり得る。
【０２４６】
哺乳動物における増殖障害、例えばがんの存在を検出する方法の実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、細胞全体、その溶解物、または細胞全体溶解物の画分、例えば、核もしくは細胞質画分、タンパク質全体画分、または核酸画分を含む試料であり得る。試料が細胞全体を含む場合、これらの細胞は、哺乳動物の任意の細胞、例えば、血液細胞または内皮細胞を含む任意の臓器または組織の細胞であり得る。
【０２４７】
接触させるステップは、哺乳動物に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。好ましくは、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【０２４８】
また、複合体の検出は、当該分野で公知の多くの方法によって行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体もしくはその抗原結合性部分は、検出可能な標識、例えば、上に開示される放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および元素粒子（例えば、金粒子）などで標識され得る。
【０２４９】
標的細胞を認識する能力および抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｌａｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６３巻：５０７〜５１３頁（１９９９年）は、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）またはインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出を測定する方法を教示している。さらに、ＣＡＲ機能は、Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４巻：４４１５〜４４２３頁（２００５年）に記載されるように、細胞傷害性の測定によって評価され得る。
【０２５０】
別の実施形態は、本発明のＤｕｏＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体もしくはその抗原結合性部分、および／または医薬組成物の使用、哺乳動物におけるがんなどの増殖障害の処置または予防を提供する。がんは、本明細書に記載されるがんのいずれかであり得る。
【０２５１】
局所および全身投与を含む任意の投与方法が、開示された治療剤のために使用され得る。例えば、外用、経口、静脈内などの血管内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内および皮下投与が使用され得る。特定の投与様式および投薬レジメンは、症例の特徴（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、および処置が予防的かどうか）を考慮して、担当の臨床医によって選択される。１よりも多い薬剤または組成物が投与されている場合、１または複数の投与経路が使用され得る；例えば、化学療法剤は、経口投与され得、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートまたは組成物は、静脈内投与され得る。投与方法には、ＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞、コンジュゲート、抗体、抗原結合性断片または組成物が、非毒性の医薬的に許容される担体、例えば、水、食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、固形油、オレイン酸エチルまたはリポソーム中に提供される注射が含まれる。一部の実施形態では、開示された化合物の局所投与は、例えば、腫瘍が除去された組織の領域、または腫瘍発達の傾向があると疑われる領域に、抗体または抗原結合性断片を適用することによって使用され得る。一部の実施形態では、治療有効量の抗体または抗原結合性断片を含む医薬調製物の持続性の腫瘍内（または腫瘍近傍）放出が有益であり得る。他の例では、コンジュゲートが、角膜に点眼薬として外用で、または目に硝子体内で適用される。
【０２５２】
開示された治療剤は、正確な投薬量の個々の投与に適切な単位剤形で製剤化され得る。さらに、開示された治療剤は、単一の用量でまたは複数用量のスケジュールで投与され得る。複数用量のスケジュールは、処置の主要な過程が、１よりも多い別々の用量、例えば１〜１０用量と、その後の、組成物の作用を維持または強化するために必要に応じて引き続く時間間隔で与えられる他の用量とによるものであり得るスケジュールである。処置は、数日〜数カ月またはさらには数年の期間にわたる、１日用量または複数の１日用量の化合物（複数可）を含み得る。したがって、投薬レジームはまた、処置される対象の特定の要求に基づいて少なくとも一部決定され、投与する実務者の判断に依存する。
【０２５３】
抗体またはコンジュゲートの典型的な投薬量は、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２５４】
特定の例では、対象には、複数の１日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも２連続日、１０連続日など、例えば、数週間、数カ月または数年の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物、ＤｕｏＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはさらなる薬剤のうち１または複数を含む治療組成物が投与される。一例では、対象には、少なくとも３０日、例えば、少なくとも２カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月の期間にわたって、コンジュゲート、抗体、組成物またはさらなる薬剤が投与される。
【０２５５】
一部の実施形態では、開示された方法は、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて、手術、放射線療法および／または化学療法薬を（例えば、連続的に、実質的に同時にまたは同時に）対象に提供することを含む。かかる薬剤および処置の方法および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。さらなる薬剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って使用され得る、または当業者によって実験的に決定されるとおりであり得る。かかる化学療法についての調製および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、（１９９２年）Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄにも記載されている。
【０２５６】
一部の実施形態では、併用治療は、治療有効量のさらなるがん阻害剤の、対象への投与を含み得る。併用治療で使用され得るさらなる治療剤の非限定的な例には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節因子ならびに血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤（治療有効量で投与される）および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。例えば、任意の適切な抗がん剤または抗血管新生剤は、本明細書に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗体、抗原結合性断片またはコンジュゲートと組み合わせて投与され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
【０２５７】
併用免疫療法用のさらなる化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパおよびウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；代謝拮抗薬、例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビン；植物アルカロイド、例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、例えば、アントラサイクリンファミリーのメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレアおよびマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、トポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ；腫瘍親和性感光色素、例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウムおよびベルテポルフィン；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブおよびトレチノインが含まれるがこれらに限定されない。かかる薬剤の選択および治療的投薬量は、当業者に公知であり、熟練の臨床医によって決定され得る。
【０２５８】
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法、またはＴ細胞が治療レベルまで増殖される当該分野で公知の他の方法を使用して活性化および増殖された細胞は、ＭＳ患者のための、薬剤による処置、例えば、抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても公知）もしくはナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはＰＭＬ患者のための他の処置を含むがこれらに限定されない、いくつもの適切な処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）薬剤、例えば、ＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、細胞毒（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存的ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子誘導性シグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ  ６６巻：８０７〜８１５頁、１９９１年；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎ  ７３巻：３１６〜３２１頁、１９９１年；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ  ５巻：７６３〜７７３頁、１９９３年）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学療法薬剤、例えばフルダラビン、外部照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたは抗体、例えば、ＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのいずれかを使用するＴ細胞除去療法と併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法とその後の末梢血幹細胞移植とによる標準的な処置を受け得る。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の増殖された免疫細胞の注入を受ける。さらなる一実施形態では、増殖された細胞は、手術の前または後に投与される。
【０２５９】
患者に投与される上記処置の投薬量は、処置されている状態および処置のレシピエントの正確な性質によって変動する。ヒト投与のための投薬量の調整は、当該分野で受容された実務に従って実施され得る。例えば、ＣＡＭＰＡＴＨの用量は一般に、成人患者について１〜約１００ｍｇの範囲内であり、通常は１日と３０日との間の期間にわたって毎日投与される。好ましい１日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、一部の場合には、１日当たり最大で４０ｍｇのより大きい用量が使用され得る。
【０２６０】
併用療法は、相乗作用を提供し得、相乗的であることが証明され得る、即ち、活性成分が一緒に使用される場合に達成される効果は、それらの化合物を別々に使用することから生じ得る効果の合計よりも大きい。相乗効果は、活性成分が、（１）共製剤化され、併用される単位投薬製剤と同時に投与もしくは送達される場合；（２）別々の製剤として交互にもしくは並行して送達される場合；または（３）一部の他のレジメンによる場合に、達成され得る。交互に送達される場合、相乗効果は、それらの化合物が、例えば、別々のシリンジ中の異なる注射によって連続的に投与または送達される場合に達成され得る。一般に、交代の間、有効投薬量の各活性成分が、連続的に、即ち、順次に投与されるが、併用療法では、有効投薬量の２以上の活性成分が一緒に投与される。
【０２６１】
一実施形態では、本明細書に開示された抗原のうち１もしくは複数に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合性断片またはそのコンジュゲートの有効量が、抗がん処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートがそれぞれのがん細胞上で発現された抗原と免疫複合体を形成するのに十分な量の時間が経過した後で、免疫複合体が検出される。免疫複合体の存在（または非存在）は、処置の有効性を示す。例えば、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の増加は、その処置が有効でないことを示し、処置の前に採取された対照と比較した免疫複合体の減少は、その処置が有効であることを示す。
【０２６２】
Ｆ．バイオ医薬組成物
担体（例えば、医薬的に許容される担体）中に、開示されたＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、ＤｕｏＣＡＲ、または本明細書に開示された１もしくは複数の抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む、遺伝子治療、免疫療法、養子免疫療法および／または細胞療法における使用のためのバイオ医薬組成物または生物製剤組成物（本明細書で以下「組成物」）が、本明細書で提供される。これらの組成物は、対象への投与のために単位投薬形態で調製され得る。所望の転帰を達成するための投与の量およびタイミングは、処置を行う臨床医の裁量である。これらの組成物は、全身（例えば、静脈内）または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。一例では、開示されたＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、コンジュゲートは、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、腫瘍、例えば、限定としてではなく、神経芽細胞腫の、例えば、処置および検出などのために使用される。一部の例では、これらの組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片を含む組成物は、例えば、病理学的血管新生の検出にも使用される。
【０２６３】
投与のための組成物には、水性担体などの医薬的に許容される担体中に溶解されたＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、コンジュゲート、抗体もしくは抗原結合性断片の溶液が含まれ得る。例えば緩衝食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。組成物は、従来の周知の無菌化技術によって無菌化され得る。組成物は、生理学的条件に近づくのに必要な医薬的に許容される補助的物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、アジュバント薬剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有し得る。これらの製剤中のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの濃度は、広く変動し得、選択された特定の投与様式および対象の要求に従って、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。遺伝子治療、免疫療法および／または細胞療法における使用のためのかかる投薬形態を調製する実際の方法は、当業者に公知であり、または明らかとなる。
【０２６４】
静脈内投与のための典型的な組成物は、１日当たり対象１人当たり約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇの抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート（あるいは対応する用量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）を含む。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５年）などの刊行物中により詳細に記載されている。
【０２６５】
ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され得、投与前に無菌水で再水和され得るが、これらは、既知の濃度の無菌溶液中でも提供される。次いで、ＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲートの溶液が、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され、一部の場合には、０．５〜１５ｍｇ／体重ｋｇの投薬量で投与される。抗体または抗原結合性断片およびコンジュゲート薬物の投与では、当該分野でかなりの経験が利用可能である；例えば、抗体薬物は、１９９７年のＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）の承認以降、米国で市販されている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合性断片およびそれらのコンジュゲートは、静注または静脈内ボーラスでではなく、緩徐な注入によって投与され得る。一例では、より高い負荷用量が、より低いレベルで投与される引き続く維持用量と共に投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量の抗体または抗原結合性断片（または対応する用量の、抗体もしくは抗原結合性断片を含むコンジュゲート）が、およそ９０分の期間にわたって注入され得、その後、以前の用量が十分に忍容された場合に３０分の期間にわたって注入される４〜８週間にわたる２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が注入され得る。
【０２６６】
制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射として、または粒状の系として作製され得る。タンパク質送達系の広い概説については、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９５年）を参照のこと。粒状の系には、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物などの治療的タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子の至る所に分散される。約１μｍよりも小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと呼ばれる。毛細管は、ナノ粒子だけが静脈内投与されるように、およそ５μｍの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋内投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２１９〜３４２頁（１９９４年）；ならびにＴｉｃｅおよびＴａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、３１５〜３３９頁（１９９２年）を参照のこと。
【０２６７】
ポリマーは、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合性断片またはコンジュゲート組成物のイオン制御された放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６巻：５３７〜５４２頁，１９９３年）。例えば、ブロックコポリマーであるｐｏｌａｘａｍｅｒ  ４０７は、低温で粘性であるがなお可動性の液体として存在するが、体温では半流動性ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９巻：４２５〜４３４頁，１９９２年；およびＰｅｃら，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４巻（２号）：５８〜６５頁，１９９０年）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御された放出のための微小担体として使用されてきた（Ｉｊｎｔｅｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２巻：２１５〜２２４頁，１９９４年）。さらに別の態様では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御された放出および薬物標的化に使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ（１９９３年））。治療的タンパク質の制御された送達のための多数のさらなる系が公知である（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。
【０２６８】
Ｇ．キット
一態様では、本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲを使用するキットもまた提供される。例えば、対象における腫瘍を処置するためのキットまたは本明細書に開示されるＤｕｏＣＡＲのうち１もしくは複数を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を作製するためのキット。キットは、典型的には、本明細書に開示される、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞を含む。開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１よりも多くが、キット中に含まれ得る。
【０２６９】
キットは、コンテナ、およびコンテナ上のまたはコンテナと関連したラベルまたは添付文書を含み得る。適切なコンテナには、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。コンテナは、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。コンテナは、典型的には、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１または複数を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、コンテナは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。
【０２７０】
ラベルまたは添付文書は、典型的には、例えば、腫瘍を処置もしくは予防する方法、またはＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する方法における、開示された抗体、抗原結合性断片、コンジュゲート、核酸分子、ＤｕｏＣＡＲまたはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用のための指示書をさらに含む。添付文書は、典型的には、治療的製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌および／またはかかる警告についての情報を含む、治療的製品の市販の包装中に習慣的に含まれる指示書を含む。教材は、電子的形態（例えば、コンピューターディスケットまたはコンパクトディスク）で書かれ得、または視覚的（例えば、動画ファイル）であり得る。キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするためのさらなる構成要素もまた含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに含み得る。キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。かかるキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【実施例】
【０２７１】
本発明は、その例がその範囲に制限をかけるといかなる場合も解釈されることなく、以下の添付の図および１７〜２７頁、両端を含む、の開示内に示されるＤｕｏＣＡＲの例によってさらに例示される。反対に、その様々な他の実施形態、変更形態、および均等物に頼らなければならず、これらは本明細書の記載を読んだ後、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、当業者の念頭に浮かび得ることは容易に理解される。
【０２７２】
様々な詳細を前に略述した例示的施行と共に記載してきたが、様々な代替、変更形態、変形、改良、および／または実質的均等物が、公知であれまたは現在予想外もしくは予想外の可能性があれ、前述の開示を再検討することによって明らかとなり得る。
【０２７３】
本文中に引用したそれぞれの出願と特許、および（訴訟中のそれぞれの交付済特許、「出願引用文書」を含めた）それぞれの出願と特許中で引用されたそれぞれの文書または参照文献、およびこれらの出願と特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張するそれぞれのＰＣＴと外国出願または特許、およびそれぞれの出願引用文書中で引用もしくは参照されたそれぞれの文書は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施する際に利用することができる。より一般的には、文書または参照文献は本文中、特許請求の範囲の前の参照文献一覧中、または本文自体中のいずれかに引用され、それぞれのこれらの文書または参照文献（「本明細書中引用参照文献」）、および（任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた）それぞれの本明細書中引用参照文献中に引用されたそれぞれの文書または参照文献は、ここで明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７４】
一部の具体的実施形態の前述の記載によって、他者が、本発明の知識を適用することによって、一般的概念から逸脱せずに、具体的実施形態などの様々な適用例に関して容易に変更または適合させることができるのに充分な情報を与え、したがってこのような適合および変更形態は、開示した実施形態の均等物の意味および範囲内と理解すべきであり、理解することが意図されている。本明細書で利用する語句または述語は、限定の目的ではなく記載の目的であることは理解される。図面および記載中、例示的実施形態を開示しており、特異的用語が利用された可能性はあるが、他に言及しない限り、それらは限定の目的ではなく一般的および叙述的な意味でのみ使用され、したがって特許請求の範囲もそのように限定されない。さらに当業者は、本明細書で論じた方法の、ある特定ステップは別の順序で順に並べることができ、またはステップを組み合わせることができることを理解する。したがって、添付の特許請求の範囲は本明細書で開示した詳細な実施形態に限られないことが意図される。当業者は、ごく普通の実験を使用した、本明細書に記載した本発明の実施形態の多くの均等物を理解し、把握することができる。このような均等物は以下の特許請求の範囲によって包含される。
【０２７５】
２つの例が提供され、それによりＬＶ形質導入ヒトＴ細胞集団の表面上の３つの機能的結合ドメインの発現は、ＤｕｏＳｅｔテクノロジーの実現可能性を証明し（実施例１）、３つの異なる白血病抗原に対するこの集団の機能活性はその有効性を証明している（実施例２）。
【０２７６】
このテクノロジーが基づき、ＤｕｏＣＡＲ中にＤｕｏＳｅｔ構成成分として含まれる場合がある単一特異性ＣＡＲの例として、単一ＣＤ２０標的化ベクターＬＴＧ１４９５、ヌクレオチド配列の配列番号３およびアミノ酸配列の配列番号４が挙げられる。第２の例は、ＣＤ２２に対して特異的な単一特異性ＣＡＲ  ＬＴＧ２２００、ヌクレオチド配列の配列番号９およびアミノ酸配列の配列番号１０である。ＤｕｏＣＡＲを創出することにおける重要な分子態様は、非重複適合性配列の包含、および有害な組換えまたは細胞内会合が生じないように形質導入Ｔ細胞におけるこれらの配列を評価することである。これは、ベクターの産生細胞株または標的細胞集団の両方において生じる場合がある。この理由から本発明者らは、ＤｕｏＣＡＲ設定において適合性であることが周知であるバリアントＣＡＲ構造を含める。これらは、ヌクレオチド配列の配列番号２９およびアミノ酸配列の配列番号３０にそれぞれ記載されるＣＤ１９特異的  ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９４を含む。この配列は、ウィットロウリンカーと称されるｓｃＦｖの重鎖と軽鎖とをつなぐ、十分記載されたリンカー（アミノ酸配列ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ、Ｗｈｉｔｌｏｗ  Ｍ．ら，１９９３年，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．６巻：９８９〜９９５頁を参照されたい）を含む。一部の場合では、ウィットロウリンカーは、例えばＬＴＧ１５３８においてと同様に、ＣＤ１９  ＣＡＲフォーマットそれぞれヌクレオチド配列の配列番号３１およびアミノ酸配列の配列番号３２において、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーに置換されている。別の例ではＣＡＲは、代替膜貫通ドメインを有する形で創出した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６２、それぞれヌクレオチド配列の配列番号２１およびアミノ酸配列の配列番号２２は、ＣＤ４（ＣＤ８の反対として）膜貫通ドメインを利用する。同様に抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６３は、ＴＮＦＲＳＦ１９、それぞれヌクレオチド配列の配列番号４９およびアミノ酸配列の配列番号５０に由来する代替膜貫通を有する。ＤｕｏＣＡＲは、固形腫瘍、例えばメソテリン腫瘍抗原を発現しているものに標的化されてもよい。例えば、ｓｃＦＶバインダーは、本出願人の同時係属仮特許出願第６２／４４４，２０１号、表題Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１７年１月９日出願、およびＬｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．に譲渡された案件番号ＬＥＮ＿０１７、それぞれヌクレオチド配列の配列番号３７およびアミノ酸配列の配列番号３８に開示されたようにメソテリンに対して創出され、機能的ＣＡＲ、それぞれヌクレオチド配列の配列番号３９およびアミノ酸配列の配列番号４０に組み込まれてよく、それによりＤｕｏＣＡＲ療法に組み込まれてよい。ｓｃＦｖ配列に加えて、１本鎖抗原バインダー（ｓｃＦｖの反対として）は、ＤｕｏＣＡＲ適用に組み込まれてよい。例えば、ＣＤ３３特異的な重鎖のみのバインダーは、本出願人の同時係属仮特許出願第６２／４７６，４３８号、表題Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３３  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１７年３月２４日出願、およびＬｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．に譲渡された案件番号ＬＥＮ＿０１８、それぞれヌクレオチド配列の配列番号４１およびアミノ酸配列の配列番号４２に開示されたように、機能的ＣＡＲ、ＬＴＧ１９０６、それぞれヌクレオチド配列の配列番号４３およびアミノ酸配列の配列番号４４に組み入れられてよく、ＣＤ３３発現悪性疾患を標的化する。ＤｕｏＣＡＲ治療適用の一例は、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＴＳＬＰＲ抗原を発現する白血病の処置である。この場合、ＬＴＧ１４９６またはＬＴＧ  １４９７（それぞれ配列番号３５、２６）は、ＴＳＬＰＲ特異的ＣＡＲ（ＬＴＧ１７８９）、それぞれ配列番号４７およびアミノ酸配列の配列番号４８と組み合わされてよく、ＴＳＬＰＲ特異的ｓｃＦＶドメイン、ヌクレオチド配列の配列番号４５およびアミノ酸配列の配列番号４６から創出された。
【０２７７】
本テクノロジーが基づくタンデムＣＡＲ（ヌクレオチド配列の配列番号２３およびアミノ酸配列の配列番号２４として記載される２つのｓｃＦｖドメインを含有する）の例として、ＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９７、ヌクレオチド配列の配列番号２５およびアミノ酸配列の配列番号２６が挙げられる。一部の場合では、２つのバインダーの順序を逆にすることは、標的細胞におけるさらに良好なＤｕｏＣＡＲ発現を提供できる。したがって、ＣＤ１９  ｓｃＦＶがさらに近位であり、ヌクレオチド配列の配列番号２５およびアミノ酸配列の配列番号２６に示すＬＴＧ１４９７；およびＣＤ１９  ｓｃＦＶが膜にさらに遠位であるヌクレオチド配列の配列番号３３およびアミノ酸配列の配列番号３４に示すＬＴＧ１４９６は、両方とも、ＤｕｏＣＡＲを含むＤｕｏＳｅｔのメンバーの１つとして使用することができる。
【０２７８】
実施例１および２において利用される方法：
細胞株（ＰＢＭＣおよび標的）
特記しない限り、全ての細胞株および試薬は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、急性リンパ性白血病細胞株ＲＥＨ、および慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地において培養した。ヒト胎児由来腎臓細胞株２９３Ｔは、１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。
【０２７９】
ルシフェラーゼ発現細胞株の単一細胞クローンをホタルルシフェラーゼをコードしているレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて安定に形質導入した野生型腫瘍株によって生成し、クローニングおよびルシフェラーゼ陽性クローンの選択が続いた。マウス適応Ｒａｊｉ−ｌｕｃ株を、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＲａｊｉクローンをＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）に移植し、移植したＲａｊｉ−ｌｕｃ腫瘍細胞をマウス脾臓から陽性（ＣＤ１９  ｍｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ｈｕｍａｎ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）または陰性選択（ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって単離し、培養物中で増殖させ、ホタルルシフェラーゼの高発現を有するクローンの選択を促進するために再クローニングすることによって生成した。全血をＯｋｌａｈｏｍａ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＢＩ、Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ、ＯＫ）においてドナーの承諾書と共に健常者から収集した。処理済バフィーコートは、ＯＢＩから購入した。ＣＤ４陽性およびＣＤ８陽性ヒトＴ細胞は、ＣＤ４−  ａｎｄ  ＣＤ８−ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の１：１混合物を製造者のプロトコールに従って使用する陽性選択を介してバフィーコートから精製した。
【０２８０】
ＤｕｏＳｅｔを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの創出
ＣＡＲ抗原結合ドメイン、ｓｃＦｖ、配列は、ＣＤ１９についてのマウス融合細胞ＦＭＣ−６３（ＦＭＣ−６３：ＡＡ  １−２６７、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：ＨＭ８５２９５２．１）ならびにＣＤ２０についてのＬｅｕ−１６［１］、ＶＬおよびＶＨの全体配列に由来した。ＣＤ２２  ｓｃＦｖ結合は、公表されている配列から創出した。タンデムＣＡＲ１９＿２０またはＣＡＲ２０＿１９を、各抗体のｓｃＦｖをインフレームでＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン（ＡＡ  １２３−１９１、参照配列ＩＤ  ＮＰ＿００１７５９．３）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＡＡ  ２１４−２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列ＩＤ  Ｑ０７０１１）トランス活性化ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ＡＡ  ５２−１６３、参照配列ＩＤ：ＮＰ＿０００７２５．１．）に連結することによって生成した。１９Ａおよび２０ＡのｓｃＦｖ領域を可撓性鎖間リンカー（ＧＧＧＧＳ）５、に続いてＣＤ８、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータドメインによって配列中に連結した。ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニット由来リーダー配列は、［２］に記載のとおり、全ての構築物に含まれた。ＣＡＲ構築物配列をコドン最適化し（ＤＮＡ２．０、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、ヒトＥＦ−１αプロモーターの調節下で第３世代レンチウイルスプラスミド骨格（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にクローニングした。レンチウイルスベクター（ＬＶ）含有上清を、［３］に既に記載のとおり、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。回収した沈殿レンチウイルス上清を−８０℃で保存した。
【０２８１】
初代Ｔ細胞形質導入：
正常ドナーから選択されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞を４０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地（無血清）中で細胞０．３から２ｘ１０６個／ｍｌの密度で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８  ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化し、３日目にＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターを用いて１０ｕｇ／ｍｌ硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で一晩形質導入し、４日目に培地を交換した。５日目に培養物を、２００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地に移し、１０〜１３日目の回収まで増殖させた。
【０２８２】
免疫エフェクターアッセイ：
細胞媒介性細胞傷害を決定するために（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼを用いて安定に形質導入された５，０００個の標的細胞を様々なエフェクター対標的比でＣＡＲ  Ｔ細胞と組み合わせ、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を各ウエルに加え、生じた発光をＥｎＳｐｉｒｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）上で分析し、１秒当たりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウエル（最大ＣＰＳ）および１％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた標的のみのウエル（最少ＣＰＳ）をアッセイ範囲を決定するために使用した。特異的溶解のパーセントを：（１−（試料ＣＰＳ−最少ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ−最少ＣＰＳ））として算出した。
【０２８３】
フローサイトメトリー分析：
特記しない限り、フローサイトメトリーのための全ての細胞染色試薬は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃからのものであった。１００万個のＣＡＲ  Ｔ形質導入細胞を培養物から回収し、冷却染色緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンを含むＡｕｔｏＭＡＣＳ溶液）中で２回洗浄し、３５０ｘｇ、５分間、４℃で沈殿させた。形質導入されたＴ細胞上のＣＡＲ表面発現を、タンパク質Ｌ−ビオチンコンジュゲート（ストック１ｍｇ／ｍｌ、１：１０００希釈、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて３０分間、４℃で染色し、続く２回の洗浄およびストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートを用いる３０分間、４℃での染色（ストック：１．０ｍｌ、１：２００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）によって最初に検出した。非形質導入細胞およびストレプトアビジン−ＰＥのみを用いて染色した形質導入細胞を陰性対照として使用した。抗ＣＤ４抗体をＣＡＲ  Ｔ陽性集団のＣＤ４対ＣＤ８比を決定するために使用し、２回目のインキュベーションステップの際に加えた。死細胞を７ＡＡＤ染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって排除した。フローサイトメトリーによる定量的分析の前に細胞を２回洗浄し、２００ｕｌ染色緩衝液に再懸濁した。特異的ＤｕｏＳｅｔ  ＣＡＲ  Ｔ染色を、ＣＤ３−ＣＤ２８ナノマトリックス（ＴｒａｎｓＡｃｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化し、ＤｕｏＳｅｔベクターを用いてＩＬ−２の存在下で形質転換したヒトＴ細胞上で実行し、ＣＤ１９−、ＣＤ２０−またはＣＤ２２−ｓｃＦｖドメインの発現について、抗体に関する染色のために組換えＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２を使用するフローサイトメトリーによって分析した。
【０２８４】
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ活性を、１ｕｇ／試料で使用するＣＤ１９−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ヤギ抗ヒトＦｃ−ガンマ−Ｒ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を０．７５ｕｇ／試料で用いて染色して検出した。抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ活性をＣＤ２０−ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．１ｕｇ／試料を用いて検出し、ストレプトアビジンｐＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を０．２ｕｇ／試料で用いて検出した。抗ＣＤ２２  ｓｃＦｃ活性をＣＤ２２−Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を０．１ｕｇ／試料で用いて検出し、抗Ｈｉｓ  ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて検出した。フローサイトメトリー分析をＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で実施した。標的腫瘍株およびルシフェラーゼ陽性サブクローンの特徴付けをＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０  ＶｉｏＢｌｕｅおよびＣＤ２２−ＡＰＣ抗体を用いて実施した。死細胞を７ＡＡＤ染色（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって分析から排除した。
【０２８５】
実施例１
初代ヒトＴ細胞上のＤｕｏＣＡＲ（２＋１  ＤｕｏＳｅｔ）の発現
原理の証明として、２つのＣＡＲ−Ｔベクターから構成されるＤｕｏＳｅｔを創出した。セットのメンバーの１つは、ＣＤ８膜貫通ならびにＣＤ２８およびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン（ＬＴＧ２２２８）、配列番５１および配列番号５２に連結されたタンデムＣＤ２０＿ＣＤ１９結合ドメインを発現した。ＤｕｏＳｅｔの第２のメンバーは、ＣＤ８膜貫通ならびに４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＬＴＧ２２００）、配列番号９および配列番号１０に連結されたＣＤ２２バインダーを含むＣＡＲ構築物であった。図７では、対になった列は、ＣＤ２０およびＣＤ１９  ｓｃＦｖｓ、左列ならびにＣＤ２２およびＣＤ１９  ｓｃＦｖｓ、右列についての二重染色を示している。列１は、形質導入されておらず、それにより結合を示さないＴ細胞を示している（ＵＴＤ）。列２は、ＣＤ８膜貫通ならびに細胞内ＣＤ２８およびＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、ＣＤ２０＿ＣＤ１９  ＣＡＲベクターをコードするＬＶを用いて形質導入されたＴ細胞を示している（２０−１９−２８ｚ）。二重染色がＣＤ２０およびＣＤ１９結合（左パネル）について見られる一方で、ＣＤ１９結合だけが右パネルにおいては見られる。列３は、ＣＤ８膜貫通ならびに細胞内４−１ＢＢおよびＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＤ２２  ＣＡＲベクターを用いて形質導入されたＴ細胞を示している（２２−ＢＢｚ）。ＣＤ１９またはＣＤ２０（左パネル）では二重染色は見られず、細胞の単一の集団だけがＣＤ２２に結合できることが見られる（右パネル）。列４では、Ｔ細胞は、列２および列３における両方のベクターから構成されるＤｕｏＳｅｔを用いて形質導入される。ＤｕｏＳｅｔだけが３つ全ての、ＣＡＲによりコードされる結合ドメインを発現している（４２％の細胞はＣＤ２０＿１９を発現し（左パネル）、３８％はＣＤ２２およびＣＤ１９結合ドメインを発現する（右パネル）。ＣＤ２２およびＣＤ１９  ｓｃＦｖが、ＤｕｏＳｅｔを含む２つの別々の膜貫通タンパク質上にそれぞれあることから、３８％がこの実施例における真のＤｕｏＳｅｔ発現集団を表している。
【０２８６】
実施例２
ＤｕｏＣＡＲを発現しているヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性
ＤｕｏＣＡＲを発現しているヒトＴ細胞調製物の抗白血病活性は、３つの白血病抗原を同時に標的化する（ＤｕｏＣＡＲ発現特徴について図７を参照されたい）。ＣＤ２０＿１９タンデムＣＡＲおよびＣＤ２２特異的単一ＣＡＲ（実施例１において調製されたとおり）から構成されるＤｕｏＳｅｔは、白血病細胞株および標的としてのモデル細胞株を使用する細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて、エフェクターＴ細胞集団を使用した。単一ＣＡＲ構成成分（２０＿１９−２８ｚもしくは２２−ＢＢｚ）またはＤｕｏＳｅｔ（２０＿１９−２８ｚ＋２２−ＢＢｚ）を用いて形質導入したヒトＴ細胞を、４つの異なるエフェクター標的比（表示のとおり２０：１、１０：１、５：１、２．５：１）で細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて使用した（図８を参照されたい）。ＣＡＲ−Ｔ標的として使用された白血病細胞株は：Ｒａｊｉ（３つ全ての標的抗原を発現する）、ＲＥＨ（３つ全ての標的抗原を発現する）、Ｋ５６２（対照、標的を発現しない）、Ｋ５６２−ＣＤ１９（ＣＤ１９を発現する）、Ｋ５６２−ＣＤ２０（ＣＤ２０を発現する）およびＫ５６２−ＣＤ２２（ＣＤ２２を発現する）であった。ＤｕｏＣＡＲ形質導入細胞（２０−１９−２８ｚ＋２２−ＢＢｚ）だけが両方の白血病細胞株（ＲａｊｉおよびＲＥＨ）、および３つ全ての単一発現Ｋ５６２標的細胞株（Ｋ５６２−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＣＤ２０、Ｋ５６２−ＣＤ２２）に対して高い細胞溶解活性を示した。これは、ＤｕｏＣＡＲテクノロジーが同じエフェクターＴ細胞集団において、３つの白血病抗原を同時に独自に標的化できることを実証し、それにより１つまたは２つよりも多い標的抗原を同時に標的化できることによる優れた抗新生物活性を実証し、それにより悪性腫瘍がエスケープ変異体（１つまたは２つの抗原が喪失したまたは下方制御されている細胞クローン。これは免疫アブレーションからエスケープした）を生成する可能性を減少させた。最終結果は、結果的には再発である抗原喪失バリアントのエスケープおよび増殖に起因する、患者についてのさらに高い治癒率である。
【０２８７】
実施例３
ＤｕｏＣＡＲ産生方法
本出願に記載されるＤｕｏＣＡＲテクノロジーは、遺伝子ベクターによってコードされる１つよりも多い膜貫通タンパク質から２つよりも多い抗原特異性を発現する治療的リンパ球、本実施例ではヒトＴ細胞の集団を生成する。本実施例では、これは２つの別々の手段によって達成される。図９は、「未形質導入」「共形質導入」および「共トランスフェクション」と表示される３つのデータ列を含有している。図９は、図７においてと同様に生成されたデータの２つの列を含有し、ここで第１列はＣＤ２０−およびＣＤ１９−特異的な特異的結合の発現についてフローサイトメトリーによって分析され、第２列はＣＤ２２−およびＣＤ１９−結合活性の発現についてフローサイトメトリーによって分析している。データの第１の列は、未形質導入ヒトＴ細胞を示している。結合活性は、ＣＡＲ由来結合活性のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２組換えタンパク質指標については示されておらず、ＤｕｏＣＡＲ発現が無いことを実証している。第２の列では、「共形質導入」を、ＤｕｏＣＡＲを生成するために使用した。このデータセットでは、２つのＬＶを活性化Ｔ細胞を同時に形質導入するために使用した。図７においてと同様に、ＤｕｏＣＡＲを含むＤｕｏＳｅｔ中の１つのＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達およびＣＤ３ゼータシグナル伝達モチーフに連結されたタンデムＣＤ２０およびＣＤ１９バインダーであり；他のＣＡＲは、ＣＤ２２バインダーであり４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達モチーフに連結されていた。列１中の第２象限（Ｑ２）は、ＣＤ２０およびＣＤ１９−ｓｃＦｖ活性についてのユニタリ染色の非常に特異的なパターンを示している。これは、両方のバインダーが同じ表面糖タンパク質上にあるためであり、それによりそれらは同じ強度で共発現され、見られる非常に特異的な直線のパターンを生じている。共形質導入データの第２列では、２つの糖タンパク質が各細胞上で均一なパターンで発現されない場合に、さらに伝統的なパターンが見られる。それにより、４つの異なる集団のパターンが見られる。下左の象限では、いずれのバインダーも発現していない細胞が見られる。上左の象限では、ＣＤ２２  ＣＡＲだけを発現している細胞が見られる。下右の象限では、ＣＤ２０＿ＣＤ１９タンデムＣＡＲだけを発現している細胞が見られる。最後に、上右の象限では、ＤｕｏＣＡＲを含むＣＡＲ  ＤｕｏＳｅｔの両方のメンバーを発現している細胞が見られる。
【０２８８】
下の列では、ＤｕｏＣＡＲを発現する細胞集団が異なる様式で生成されている。無関係に創出された２つのＬＶ調製物をＴ細胞形質導入の時に使用する共形質導入法とは異なり、「共トランスフェクション」は、２つの骨格プラスミド（ＤｕｏＣＡＲを含む２つのＣＡＲをコードしている）が２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、同時にＬＶを生成する方法を指す。この第３世代ＬＶシステムを含む他のプラスミドは、両方の方法において同一である。共トランスフェクション法の有利点は、両方のＣＡＲをコードするベクターを含有するＬＶの単一の調製物が、創出されることである。データから見られるとおり、第２の列の共形質導入法と比較して、ＣＤ２０−ＣＤ１９  ＣＡＲおよびＣＤ２２  ＣＡＲ発現のほとんど同一のパターンが見られる。第２列中のデータの上右象限における、共トランスフェクション（ＣＤ２２−ＣＡＲについてＣＤ２２およびＣＤ２０＿１９  ＣＡＲについてＣＤ１９共染色）によって生成されたＬＶによって誘導された両方の糖タンパク質についての染色パターンは、両方法が効率的にＤｕｏＣＡＲを生成することを実証している。
【０２８９】
参考文献：
【０２９０】
【表１】
2019534246.tif 000003
【０２９１】
配列表に関する参照
本出願は、「配列表」という表題のＰＤＦファイルによって米国特許商標庁に電子出願された配列表を含有する。その配列表は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
本開示の配列
以下に列記した核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されたのと同様に、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略語およびアミノ酸に関する３文字コードを使用して示す。それぞれの核酸配列の一本鎖のみを示すが、示した鎖に関する何らかの参照によって相補鎖が含まれると理解される。添付の配列表中：
配列番号１は、ＣＤ２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメインＬＴＧ１４９５）のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAA
配列番号２は、ＣＤ２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９５）のアミノ酸配列である。
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK
配列番号３は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９５（ＬＰ−１４９５−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９５（ＬＰ−１４９５−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５は、リーダー／シグナルペプチド配列のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCG
配列番号６は、リーダー／シグナルペプチド配列のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
配列番号７は、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ結合ドメインＬＴＧ２２００）のヌクレオチド配列である。
CAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCA
配列番号８は、ＣＤ２２反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ２２００）のアミノ酸配列である。
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAA
配列番号９は、ＣＡＲ  ＬＴＧ２２００（ＬＰ−２２００−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTTTTGGTGACTTCCCTTTTGCTGTGCGAGTTGCCACACCCCGCCTTCCTGCTTATTCCCCAGGTACAGCTCCAGCAGAGTGGCCCAGGGCTCGTGAAGCCAAGCCAGACGCTGTCCCTGACTTGTGCAATTTCAGGGGATTCAGTTTCATCAAATAGCGCGGCGTGGAATTGGATTCGACAATCTCCTTCCCGAGGGTTGGAATGGCTTGGACGAACATATTACAGATCCAAATGGTATAACGACTATGCGGTATCAGTAAAGTCAAGAATAACCATTAACCCCGACACAAGCAAGAACCAATTCTCTTTGCAGCTTAACTCTGTCACGCCAGAAGACACGGCAGTCTATTATTGCGCTCGCGAGGTAACGGGTGACCTGGAAGACGCTTTTGACATTTGGGGGCAGGGTACGATGGTGACAGTCAGTTCAGGGGGCGGTGGGAGTGGGGGAGGGGGTAGCGGGGGGGGAGGGTCAGACATTCAGATGACCCAGTCCCCTTCATCCTTGTCTGCCTCCGTCGGTGACAGGGTGACAATAACATGCAGAGCAAGCCAAACAATCTGGAGCTATCTCAACTGGTACCAGCAGCGACCAGGAAAAGCGCCAAACCTGCTGATTTACGCTGCTTCCTCCCTCCAATCAGGCGTGCCTAGTAGATTTAGCGGTAGGGGCTCCGGCACCGATTTTACGCTCACTATAAGCTCTCTTCAAGCAGAAGATTTTGCGACTTATTACTGCCAGCAGTCCTATAGTATACCTCAGACTTTCGGACAGGGTACCAAGTTGGAGATTAAGGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号１０は、ＣＡＲ  ＬＴＧ２２００（ＬＰ−２２００−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号１１は、ＤＮＡ  ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列である。
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
配列番号１２は、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号１３は、ＤＮＡ  ＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列である。
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTAC
配列番号１４は、ＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列である。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
配列番号１５は、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ．ｓｕｂ．−−００１７５９．３）のヒンジおよび膜貫通領域のアミノ酸番号１３７から２０６のアミノ酸配列である。
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
配列番号１６は、ヒトＩｇＧ  ＣＬ配列のアミノ酸配列である。
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
配列番号１７は、４−１ＢＢのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である。
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAG AAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
配列番号１８は、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列である。
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号１９は、ＣＤ３−ゼータのＤＮＡシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列である。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
配列番号２０は、ＣＤ３ゼータのアミノ酸配列である。
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２１は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６２（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンカー−ＣＤ４ｔｍ−４−１ＢＢ−ＣＤ３−ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGATATTCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCGAGCCTGGGCGATCGCGTGACCATTAGCTGCCGCGCGAGCCAGGATATTAGCAAATATCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCGGATGGCACCGTGAAACTGCTGATTTATCATACCAGCCGCCTGCATAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAACCTGGAACAGGAAGATATTGCGACCTATTTTTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCGTATACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAAATTACCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGAAGTGAAACTGCAGGAAAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCGGATTATGGCGTGAGCTGGATTCGCCAGCCGCCGCGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCAGCGAAACCACCTATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGACCATTATTAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGACCGATGATACCGCGATTTATTATTGCGCGAAACATTATTATTATGGCGGCAGCTATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGCGGCGGCGCCGGCGCCGCGCCCGCCGACCCCGGCGCCGACCATTGCGAGCCAGCCGCTGAGCCTGCGCCCGGAAGCGTGCCGCCCGGCGGCGGGCGGCGCGGTGCATACCCGCGGCCTGGATTTTGTGCAGCCGATGGCGCTGATTGTGCTGGGCGGCGTGGCGGGCCTGCTGCTGTTTATTGGCCTGGGCATTTTTTTTTGCGTGCGCTGCCGCCCGCGCCGCAAAAAACTGCTGTATATTTTTAAACAGCCGTTTATGCGCCCGGTGCAGACCACCCAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCCGCTTTCCGGAAGAAGAAGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTTAGCCGCAGCGCGGATGCGCCGGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTATAACGAACTGAACCTGGGCCGCCGCGAAGAATATGATGTGCTGGATAAACGCCGCGGCCGCGATCCGGAAATGGGCGGCAAACCGCGCCGCAAAAACCCGCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGATAAAATGGCGGAAGCGTATAGCGAAATTGGCATGAAAGGCGAACGCCGCCGCGGCAAAGGCCATGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACCGCGACCAAAGATACCTATGATGCG CTGCATATGCAGGCGCTGCCGCCGCGC
配列番号２２は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６２（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンク−ＣＤ４ｔｍ−４−１ＢＢ−ＣＤ３−ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFVQPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRCRPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２３は、ＣＤ２０＿１９−反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９７二重特異性バインダー）のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCA
配列番号２４は、ＣＤ２０＿１９−反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９７二重特異性バインダー）のアミノ酸配列である。
EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAA
配列番号２５は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９７（ＬＰ−ＬＴＧ１４９７−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ−ＣＤ２０  ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ−（ＧＧＧＧＳ）５−ＣＤ１９ＶＬ−ウィットロウリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号２６は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９７（ＬＰ−ＬＴＧ１４９７−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ−ＣＤ２０  ＶＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ−（ＧＧＧＧＳ）５−ＣＤ１９ＶＬ−ウィットロウリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号２７は、ＣＤ１９のためのｓｃＦＶのヌクレオチド配列である。
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
配列番号２８は、ＣＤ１９のためのｓｃＦＶのアミノ酸配列である。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
配列番号２９は、ＣＡＲ  ＬＴＧ  １４９４（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンク−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACACTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCTCCACGAGCGGCTCCGGGAAGCCTGGTTCCGGGGAAGGCTCCACTAAGGGTGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACATCCGTGACAGTCAGCTCCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３０は、ＣＡＲ  ＬＴＧ  １４９４（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンク−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDTDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３１は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５３８（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンク−ＣＤ８ｔｍ−シグナル（ＬＴＩ再操作されたＣＤ１９  ＣＡＲ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTTCTCCTGGTCACCTCCCTGCTCCTCTGCGAACTGCCTCACCCTGCCTTCCTTCTGATTCCTGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCTTCCTTGTCCGCGTCACTGGGAGACAGAGTGACCATCTCGTGTCGCGCAAGCCAGGATATCTCCAAGTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGACGGGACTGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCACGCCTGCACAGCGGAGTGCCAAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCGGGAACCGATTACTCGCTTACCATTAGCAACCTCGAGCAGGAGGACATCGCTACCTACTTCTGCCAGCAAGGAAATACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGAACCAAATTGGAAATCACCGGCGGAGGAGGCTCCGGGGGAGGAGGTTCCGGGGGCGGGGGTTCCGAAGTGAAGCTCCAGGAGTCCGGCCCCGGCCTGGTGGCGCCGTCGCAATCACTCTCTGTGACCTGTACCGTGTCGGGAGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGAGCTGGATTCGGCAGCCGCCGCGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGTGTCATCTGGGGATCCGAGACTACCTACTACAACTCGGCCCTGAAGTCCCGCCTGACTATCATCAAAGACAACTCGAAGTCCCAGGTCTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAAACTGACGACACCGCCATCTATTACTGTGCTAAGCACTACTACTACGGTGGAAGCTATGCTATGGACTACTGGGGGCAAGGCACTTCGGTGACTGTGTCAAGCGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３２は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５３８（ＬＰ−ＣＤ１９バインダー−ＣＤ８リンク−ＣＤ８ｔｍ−シグナル（ＬＴＩ再操作されたＣＤ１９  ＣＡＲ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３３は、ＣＤ１９＿２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９６）のヌクレオチド配列である。
GACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCA
配列番号３４は、ＣＤ１９＿２０反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１４９６）のアミノ酸配列である。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAA
配列番号３５は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９６（ＬＰ−ＬＴＧ１４９６−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ−ＣＤ１９  ＶＬ−ウィットロウリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）５  ＣＤ２０  ＶＨ  （ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ  ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号３６は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１４９６（ＬＰ−ＬＴＧ１４９６−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）または（ＬＰ−ＣＤ１９  ＶＬ−ウィットロウリンカー−ＣＤ１９  ＶＨ（ＧＧＧＧＳ）５  ＣＤ２０  ＶＨ  （ＧＧＧＧＳ）３−ＣＤ２０  ＶＬ  ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号３７は、メソテリン反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１９０４）のヌクレオチド配列である。
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGT
配列番号３８は、メソテリン反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１９０４）のアミノ酸配列である。
EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLG
配列番号３９は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０４（ＬＰ−ＬＴＧ１９０４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATTTATCGTCAGTGGCTGGACCCTTTAACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGAGGTGGCGGGTCTGGTGGAGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCTGGTATTCGGCGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTCGGTGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４０は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０４（ＬＰ−ＬＴＧ１９０４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDLSSVAGPFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHLVFGGGTQLTVLGAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４１は、ＣＤ３３反応性１本鎖結合ドメインＶＨ−４（ＬＴＧ１９０６）のヌクレオチド配列である。
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号４２は、ＣＤ３３反応性１本鎖結合ドメインＶＨ−４（ＬＴＧ１９０６）のアミノ酸配列である。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSS
配列番号４３は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０６（ＬＰ−ＶＨ４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCGCATCCGGCGTTTCTGCTGATTCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGCGGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCACGTATTACTGTGCGAAAGAAAATGTGGACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAACTACCACCCCTGCCCCTCGGCCGCCGACTCCGGCCCCAACCATCGCAAGCCAACCCCTCTCCTTGCGCCCCGAAGCTTGCCGCCCGGCCGCGGGTGGAGCCGTGCATACCCGGGGGCTGGACTTTGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCGCTGGCCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４４は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９０６（ＬＰ−ＶＨ４−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPRQGLEWVANIKQDGSEKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAKENVDWGQGTLVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４５は、ＴＳＬＰＲ−反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１７８９）のヌクレオチド配列である。
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGATCTGGGTCCGGTACTGACTACAGCCTCACCATTAGAAACCTTGAACAGGAGGACATCGCAACTTATTTCTGCCAACAGGTCTATACTCTGCCGTGGACCTTCGGCGGAGGTACCAAACTGGAGATTAAGTCCGG
配列番号４６は、ＴＳＬＰＲ−反応性ｓｃＦｖ結合ドメイン（ＬＴＧ１７８９）のアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKS
配列番号４７は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１７８９（ＬＰ−３Ｇ１１−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGGCACTGCCCGTGACCGCCCTGCTTCTGCCGCTTGCACTTCTGCTGCACGCCGCTAGGCCCCAAGTCACCCTCAAAGAGTCAGGGCCAGGAATCCTCAAGCCCTCACAGACTCTGTCTCTTACTTGCTCATTCAGCGGATTCAGCCTTTCCACCTCTGGTATGGGCGTGGGGTGGATTAGGCAACCTAGCGGAAAGGGGCTTGAATGGCTGGCCCACATCTGGTGGGACGACGACAAGTACTACAACCCCTCACTGAAGTCCCAGCTCACTATTTCCAAAGATACTTCCCGGAATCAGGTGTTCCTCAAGATTACCTCTGTCGACACCGCTGATACCGCCACTTACTATTGTTCACGCAGACCGAGAGGTACCATGGACGCAATGGACTACTGGGGACAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCATCTGGCGGTGGAGGGTCAGGAGGTGGAGGTAGCGGAGGCGGTGGGTCCGACATTGTCATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGAGCGCTTCACTGGGCGACAGGGTGACCATCAGCTGTCGCGCATCACAAGATATCTCTAAGTATCTTAATTGGTACCAGCAAAAGCCGGATGGAACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTCACGGCTGCATTCTGGAGTGCCTAGCCGCTTTAGCGGCACTTGCGGCGTGCTCCTGCTGTCGCTGGTCATCACCCTTTACTGCAAGAGGGGCCGGAAGAAGCTGCTTTACATCTTCAAGCAGCCGTTCATGCGGCCCGTGCAGACGACTCAGGAAGAGGACGGATGCTCGTGCAGATTCCCTGAGGAGGAAGAGGGGGGATGCGAACTGCGCGTCAAGTTCTCACGGTCCGCCGACGCCCCCGCATATCAACAGGGCCAGAATCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGAAGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGACGCGGACGCGACCCGGAGATGGGGGGGAAACCACGGCGGAAAAACCCTCAGGAAGGACTGTACAACGAACTCCAGAAAGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCAGAAATCGGGATGAAGGGAGAGCGGAGGAGGGGAAAGGGTCACGACGGGCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACTAAGGATACCTACGATGCCTTGCATATGCAAGCACTCCCACCCCGG
配列番号４８は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１７８９（ＬＰ−３Ｇ１１−ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIKAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号４９は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６３（ＬＰ−ＣＤ１９−ＴＮＦＲＳＦ１９ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のヌクレオチド配列である。
ATGCTGCTGCTGGTCACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTCCCTCACCCCGCCTTTCTGCTTATCCCGGACATTCAGATGACACAGACCACCTCGAGCTTGTCCGCGTCGCTGGGCGATCGCGTGACCATCTCCTGCCGGGCCTCCCAAGACATTTCAAAGTATCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCGGACGGAACCGTGAAACTGCTGATCTACCATACCAGCCGCCTGCACTCCGGCGTGCCGTCCCGCTTCTCCGGATCGGGTTCCGGAACTGACTACTCACTGACTATCTCCAACTTGGAACAAGAGGACATCGCCACTTACTTCTGTCAACAAGGAAATACCCTTCCCTACACCTTCGGGGGGGGTACCAAGCTGGAGATCACTGGGGGCGGAGGCTCCGGTGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGGAGCGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCAGGACTCGTGGCGCCATCCCAGTCCCTGTCGGTGACCTGTACTGTCTCCGGAGTCAGCCTCCCCGATTACGGAGTGTCATGGATTAGGCAACCCCCAAGAAAAGGGCTGGAATGGCTCGGAGTGATCTGGGGCTCCGAAACCACCTACTACAACTCGGCGCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTGTTCTTGAAGATGAACAGCTTGCAGACCGACGATACCGCAATCTACTACTGTGCCAAGCACTATTACTACGGGGGGTCTTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACCTCCGTGACTGTGTCGTCCGCGGCCGCGCCCGCCCCTCGGCCCCCGACTCCTGCCCCGACGATCGCTTCCCAACCTCTCTCGCTGCGCCCGGAAGCATGCCGGCCCGCCGCCGGTGGCGCTGTCCACACTCGCGGACTGGACTTTGATACCGCACTGGCGGCCGTGATCTGTAGCGCCCTGGCCACCGTGCTGCTGGCGCTGCTCATCCTTTGCGTGATCTACTGCAAGCGGCAGCCTAGGCGAAAGAAGCTCCTCTACATTTTCAAGCAACCCTTCATGCGCCCCGTGCAAACCACCCAGGAGGAGGATGGATGCTCATGCCGGTTCCCTGAGGAAGAAGAGGGCGGTTGCGAGCTCAGAGTGAAATTCAGCCGGTCGGCTGACGCCCCGGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTCAACCTGGGGCGCCGCGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGAGGCAGAGATCCGGAAATGGGCGGAAAGCCAAGGCGGAAGAACCCGCAGGAAGGTCTTTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCCGAGATTGGGATGAAGGGAGAAAGACGGAGGGGAAAGGGACATGACGGACTTTACCAGGGCCTGAGCACTGCCACGAAGGACACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCGCTGCCGCCTCGG
配列番号５０は、ＣＡＲ  ＬＴＧ１５６３（ＬＰ−ＣＤ１９−ＴＮＦＲＳＦ１９ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFDTALAAVICSALATVLLALLILCVIYCKRQPRRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号５１は、ＣＡＲ  ＬＴＧ２２２８（ＬＰ−ＣＤ２０＿ＣＤ１９−ＣＤ８ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
ATGCTCCTTCTCGTGACCTCCCTGCTTCTCTGCGAACTGCCCCATCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGAGGTGCAGTTGCAACAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGCCAGGAGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGTTACACCTTCACCTCCTACAACATGCACTGGGTGAAACAGACCCCGGGACAAGGGCTCGAATGGATTGGCGCCATCTACCCCGGGAATGGCGATACTTCGTACAACCAGAAGTTCAAGGGAAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCTCCTCCACCGCGTATATGCAGTTGAGCTCCCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGACTACTACTGCGCACGGTCCAACTACTATGGAAGCTCGTACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGGGCCGGCACCACTGTGACCGTCAGCTCCGGGGGCGGAGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGGGGTGGAGGATCCGACATTGTGCTGACTCAGTCCCCGGCAATCCTGTCGGCCTCACCGGGCGAAAAGGTCACGATGACTTGTAGAGCGTCGTCCAGCGTGAACTACATGGATTGGTACCAAAAGAAGCCTGGATCGTCACCCAAGCCTTGGATCTACGCTACATCTAACCTGGCCTCCGGCGTGCCAGCGCGGTTCAGCGGGTCCGGCTCGGGCACCTCATACTCGCTGACCATCTCCCGCGTGGAGGCTGAGGACGCCGCGACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTTCAACCCGCCGACTTTTGGAGGCGGTACTAAGCTGGAGATCAAAGGAGGCGGCGGCAGCGGCGGGGGAGGGTCCGGAGGGGGTGGTTCTGGTGGAGGAGGATCGGGAGGCGGTGGCAGCGACATTCAGATGACTCAGACCACCTCCTCCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACCGCGTGACCATCTCATGCCGCGCCAGCCAGGACATCTCGAAGTACCTCAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACCGTGAAGCTCCTGATCTACCACACCTCCCGGCTGCACAGCGGAGTGCCGTCTAGATTCTCGGGTTCGGGGTCGGGAACTGACTACTCCCTTACTATTTCCAACCTGGAGCAGGAGGATATTGCCACCTACTTCTGCCAACAAGGAAACACCCTGCCGTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAGCTGGAAATCACTGGCAGCACATCCGGTTCCGGGAAGCCCGGCTCCGGAGAGGGCAGCACCAAGGGGGAAGTCAAGCTGCAGGAATCAGGACCTGGCCTGGTGGCCCCGAGCCAGTCACTGTCCGTGACTTGTACTGTGTCCGGAGTGTCGCTCCCGGATTACGGAGTGTCCTGGATCAGGCAGCCACCTCGGAAAGGATTGGAATGGCTCGGAGTCATCTGGGGTTCCGAAACCACCTATTACAACTCGGCACTGAAATCCAGGCTCACCATTATCAAGGATAACTCCAAGTCACAAGTGTTCCTGAAGATGAATAGCCTGCAGACTGACGACACGGCGATCTACTATTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGATCCTACGCTATGGACTACTGGGGCCAGGGGACCAGCGTGACCGTGTCATCCGCGGCCGCGACTACCACTCCTGCACCACGGCCACCTACCCCAGCCCCCACCATTGCAAGCCAGCCACTTTCACTGCGCCCCGAAGCGTGTAGACCAGCTGCTGGAGGAGCCGTGCATACCCGAGGGCTGGACTTCGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCATTGGCTGGAACTTGCGGCGTGCTGCTCTTGTCTCTGGTCATTACCCTGTACTGCCGGTCGAAGAGGTCCAGACTCTTGCACTCCGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGGCCCGGACCCACTAGAAAGCACTACCAGCCGTACGCCCCTCCTCGGGATTTCGCCGCATACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCCGCTCAGCCGATGCACCGGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTCTACAACGAGCTCAACCTGGGTCGGCGGGAAGAATATGACGTGCTGGACAAACGGCGCGGCAGAGATCCGGAGATGGGGGGAAAGCCGAGGAGGAAGAACCCTCAAGAGGGCCTGTACAACGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCGGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGAGAACGCCGGAGAGGGAAGGGTCATGACGGACTGTACCAGGGCCTGTCAACTGCCACTAAGGACACTTACGATGCGCTCCATATGCAAGCTTTGCCCCCGCGG
配列番号５２は、ＣＡＲ  ＬＴＧ２２２８（ＬＰ−ＣＤ２０＿ＣＤ１９−ＣＤ８ＴＭ−ＣＤ２８−ＣＤ３ゼータ）のアミノ酸配列である。
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019534246.tif 000012
【配列表】
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【国際調査報告】
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