(57)【要約】  安定な凍結乾燥された治療用タンパク質組成物およびそれらの製造方法が提供される。具体的には、固形ケーキ可塑剤およびタンパク質安定剤としての水の使用が記載される。また、より大きい分子実体とより小さい分子実体とを含む多成分安定剤の包含も記載される。また、ある特定の条件下での乾燥後アニーリングの包含は、タンパク質安定性を改善する。タンパク質は、２５℃で２４ヶ月にわたって安定なままであることが予測される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）タンパク質であって、前記タンパク質の０．５％未満が、室温で２ヶ月後に凝集している、タンパク質と、
（ｂ）安定剤と、
（ｃ）緩衝剤と、
（ｄ）２重量％以上の水および１０重量％以下の水と、
を含む、凍結乾燥ケーキであって、崩壊せず、変色せず、およびバイアル内に含まれている、凍結乾燥ケーキ。
【請求項２】
前記凍結乾燥ケーキが、黄色、茶色、黒色、および赤色を含まない、請求項１に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３】
前記凍結乾燥ケーキが、融解せず、収縮せず、および密度変化を含まない、請求項１または２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４】
前記凍結乾燥ケーキが、２５℃を超えるガラス転移温度を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５】
約３重量％〜約７重量％の水または約５重量％〜約８重量％の水を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項６】
約３重量％、約３．５重量％、約４重量％、約４．５重量％、約５重量％、約５．５重量％、約６重量％、または約６．５重量％の水を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項７】
室温で約１８ヶ月貯蔵された前記凍結乾燥ケーキ中の凝集タンパク質の量の増加が、２％未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項８】
室温で約２４ヶ月貯蔵された前記凍結乾燥ケーキ中の凝集タンパク質の量の増加が、２％未満である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項９】
前記凝集タンパク質が、サイズ排除クロマトグラフィまたは電気泳動によって検出される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１０】
前記緩衝剤が、ヒスチジンを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１１】
前記ヒスチジンが、０．３４重量％〜約２．０４重量％で存在する、請求項１０に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１２】
前記安定剤が、ポリオール、糖、アミノ酸、塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１３】
（ｉ）前記ポリオールが、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、（ｉｉ）前記糖が、トレハロース、スクロース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、（ｉｉｉ）前記アミノ酸が、アルギニン、アラニン、プロリン、グリシン、塩化ナトリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、（ｉｖ）前記塩が、塩化ナトリウムである、請求項１２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１４】
前記安定剤が、約１９重量％〜約８３重量％で存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１５】
前記安定剤が、スクロースを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１６】
前記スクロースが、約１５重量％〜約７１重量％で存在する、請求項１４に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１７】
前記安定剤が、アルギニンをさらに含む、請求項１５または１６に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１８】
前記アルギニンが、約４重量％〜約２０重量％で存在する、請求項１７に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項１９】
前記安定剤が、マンニトールをさらに含む、請求項１４または１５に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２０】
前記マンニトールが、８重量％〜約２３重量％で存在する、請求項１９に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２１】
前記安定剤が、トレハロースを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２２】
前記トレハロースが、約１５重量％〜約７０重量％で存在する、請求項２１に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２３】
前記安定剤が、アルギニンをさらに含む、請求項２１または２２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２４】
前記アルギニンが、約０．８重量％〜約１５重量％のアルギニンで存在する、請求項２３に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２５】
前記安定剤が、ソルビトールをさらに含む、請求項２１または２２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２６】
前記ソルビトールが、約１．３重量％〜約２３重量％のソルビトールで存在する、請求項２５に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２７】
界面活性剤をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２８】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ３３５０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項２９】
前記界面活性剤が、約０．０２重量％〜約１重量％で存在する、請求項２７または２８に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３０】
前記タンパク質が、約６重量％〜約６４重量％で存在する、請求項１〜２９のいずれか
１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３１】
約６重量％〜約１９重量％のタンパク質を含む、請求項３０に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３２】
約３３重量％〜約６４重量％のタンパク質を含む、請求項３１に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３３】
前記タンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３４】
前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、および受容体−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項３３に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３５】
前記バイアルが、タイプＩホウケイ酸ガラスを含み、ポリテトラフルオロエチレン被覆ブチルゴム栓で閉鎖されている、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３６】
（ａ）タンパク質であって、前記タンパク質の１％未満が、室温で１ヶ月後に分解されている、タンパク質と、
（ｂ）１重量部のタンパク質に対して約０．２重量部の安定剤（０．２：１）〜１重量部のタンパク質に対して約１．５重量部の安定剤（１．５：１）の比の安定剤と、
（ｃ）３重量％以上および１０重量％以下の濃度の水と、
を含む、凍結乾燥ケーキであって、容器の壁に均一に付着し、変色を含まない、凍結乾燥ケーキ。
【請求項３７】
安定剤のタンパク質に対する前記重量比が、約０．２２：１、０．４４：１、０．６５：１、０．８７：１、１．１：１、１．３：１からなる群から選択される、請求項３６に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３８】
前記安定剤が、非還元糖、糖アルコール、アミノ酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６または３７に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項３９】
前記非還元糖が、スクロースまたはトレハロースを含み、前記糖アルコールが、ソルビトール、マンニトール、およびグリセロールからなる群から選択され、前記アミノ酸が、アルギニン、アラニン、プロリン、およびグリシンからなる群から選択される、請求項３７に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４０】
前記安定剤が、スクロースを含む、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４１】
アルギニンをさらに含む、請求項３９に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４２】
スクロースのアルギニンに対する重量比が、約３．２：１〜約３．４：１である、請求項４０に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４３】
マンニトールをさらに含む、請求項３９に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４４】
スクロースのマンニトールに対する重量比が、約１．８：１〜約２：１である、請求項４２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４５】
前記安定剤が、トレハロースを含む、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４６】
アルギニンをさらに含む、請求項４４に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４７】
トレハロースのアルギニンに対する重量比が、約３．２：１〜約３．４：１である、請求項４０に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４８】
ソルビトールをさらに含む、請求項４４に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項４９】
トレハロースのソルビトールに対する重量比が、約１：１〜約２：１である、請求項４２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５０】
分解タンパク質が、前記タンパク質の二量体、前記タンパク質の三量体、前記タンパク質の四量体、前記タンパク質の高次多量体、化学修飾タンパク質、およびそれらの組み合わせを含む、請求項３５〜４８のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５１】
前記タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、および受容体−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項３５〜４９のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５２】
緩衝剤をさらに含む、請求項３５〜５０のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５３】
前記緩衝剤が、クエン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、炭酸塩、酢酸塩、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５１に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５４】
前記緩衝剤が、ヒスチジンを含む、請求項５１または５２に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５５】
前記変色が、赤色、黄色、茶色、黒色、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５〜５３のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５６】
前記容器が、バイアルまたは注射器である、請求項３５〜５３のいずれか１項に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５７】
前記バイアルが、タイプＩホウケイ酸ガラスと、ポリテトラフルオロエチレン被覆ブチルゴム栓とを含む、請求項５５に記載の凍結乾燥ケーキ。
【請求項５８】
薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの作製方法であって、
（ａ）２重量％〜１０重量％の水分含量を含む薬学的に許容される凍結乾燥ケーキを得るために、タンパク質、安定剤、および水を含む試料から水を除去する乾燥ステップと、
（ｂ）前記凍結乾燥ケーキを、前記薬学的に許容される凍結乾燥ケーキのガラス転移温度未満の温度で加熱することと、
（ｃ）前記薬学的に許容される凍結乾燥ケーキを室温で貯蔵することであって、前記タンパク質が、２ヶ月後に０．５％未満の分解を有する、貯蔵することと、を含む、方法。
【請求項５９】
前記ガラス転移温度未満の前記温度が、ステップ（ａ）の後およびステップ（ｂ）の前に、前記試料を示差走査熱量測定にかけることによって決定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ガラス転移温度未満の前記温度が、約２５℃〜約９０℃である、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記ガラス転移温度未満の前記温度が、約７２時間維持される、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、および受容体−Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記タンパク質が、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で前記試料中に存在する、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記試料が、緩衝剤をさらに含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記緩衝剤が、ヒスチジンを含む、請求項６３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記安定剤が、トレハロース、ソルビトール、グリセロール、アルギニン、アラニン、マンニトール、スクロース、プロリン、ＮａＣｌ、グリシン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５７〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記安定剤が、スクロースを含む、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記スクロースが、約１０％重量／体積（ｗ／ｖ）未満の濃度で前記試料中に存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記試料が、３％±０．１％のアルギニンをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記スクロースが、約５％（ｗ／ｖ）の濃度で前記試料中に存在する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料が、（ｉ）約１．３％±０．１％（ｗ／ｖ）のアラニン、（ｉｉ）約１．５％±０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニン、（ｉｉｉ）約１．３４％±０．１％（ｗ／ｖ）のグリセロール、（ｉｖ）約２．６６％±０．１％（ｗ／ｖ）のマンニトール、または（ｖ）約２．６６％±０．１％（ｗ／ｖ）のソルビトールをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記安定剤が、（ｉ）約７．５％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび２．３％±０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニン、（ｉｉ）約１２．５％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび３．９％±０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニン、（ｉｉｉ）または約１５％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび４．６％±０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニンを含む、請求項５７〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記安定剤が、トレハロースを含む、請求項５７〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記トレハロースが、約１０％（ｗ／ｖ）未満の濃度で前記試料中に存在する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記トレハロースが、約９．０９％（ｗ／ｖ）のトレハロースの濃度で前記試料中に存在し、前記試料が、０．４８％（ｗ／ｖ）のソルビトール、０．２４％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．２８％（ｗ／ｖ）のアルギニン、または０．２４％（ｗ／ｖ）のアラニンをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記トレハロースが、約８．３３％（ｗ／ｖ）のトレハロースの濃度で前記試料中に存在し、前記試料が、０．８９％（ｗ／ｖ）のソルビトール、０．４５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．５１％（ｗ／ｖ）のアルギニン、または０．４３％（ｗ／ｖ）のアラニンをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記トレハロースが、約６．６６％（ｗ／ｖ）のトレハロースの濃度で前記試料中に存在し、前記試料が、０．１．７７％（ｗ／ｖ）のソルビトール、０．９％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１．０３％（ｗ／ｖ）のアルギニン、または０．８７％（ｗ／ｖ）のアラニンをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記トレハロースが、約５％（ｗ／ｖ）のトレハロースの濃度で前記試料中に存在し、前記試料が、２．６６％（ｗ／ｖ）のソルビトール、１．３４％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１．５４％％（ｗ／ｖ）のアルギニン、または１．３％（ｗ／ｖ）のアラニンをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記水分含量が、３重量％以上および８重量％以下である、請求項５７〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記水分含量が、約３重量％、約３．５重量％、約４重量％、約４．５重量％、約５重量％、約５．５重量％、または約６重量％である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記薬学的に許容される凍結乾燥ケーキが、室温で少なくとも１８ヶ月貯蔵される、請求項５７〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記薬学的に許容される凍結乾燥ケーキが、室温で少なくとも２４ヶ月貯蔵される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記タンパク質の約２％以下が、前記少なくとも１８ヶ月の間に分解する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記タンパク質の前記分解が、サイズ排除クロマトグラフィによって高分子量種のパーセントの変化を測定することによって決定される、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、生物学的分子の医薬製剤の分野に関する。具体的には、本発明は、安定な凍結乾燥された治療用タンパク質製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体および受容体Ｆｃ融合タンパク質などの治療用巨大分子は、分子を患者への投与に適したものにするだけではなく、長期貯蔵中にそれらの安定性を維持するように製剤化されなければならない。例えば、溶液中の治療用タンパク質（例えば、抗体）は、溶液が適切に製剤化されていない限り、凝集、化学修飾、または他の形態の分解を起こしやすい。液体製剤中の治療用タンパク質の安定性は、製剤中で使用される賦形剤の種類、ならびにそれらの賦形剤の互いに対する量および割合だけではなく、可溶性タンパク質の濃度および製造方法にも依存する。治療用タンパク質製剤を調製するときには、安定性以外の考慮事項も考慮されなければならない。これらの考慮事項には、溶液の粘度および所与の製剤によって受け入れられ得る抗体の濃度が含まれる。したがって、治療用タンパク質を製剤化するときには、貯蔵温度で経時的に安定なままであり、適切な濃度の抗体または他の治療用タンパク質を含有し、製剤が患者に便利に投与されることを可能にする他の特性を有する製剤に到達するために、細心の注意が払われなければならない。
【０００３】
治療用タンパク質の液体製剤は、一般に、冷凍または冷蔵時にタンパク質に長期安定性を提供するように設計されているが、多くの場合、室温で長期安定性を提供することができない。タンパク質の安定性を維持し、かつタンパク質の治療活性を保持するための当該技術分野において既知の１つの解決法は、分子を凍結乾燥することである。凍結乾燥（制御条件下でのフリーズドライ）は、タンパク質の長期貯蔵のために一般的に使用されている。凍結乾燥タンパク質は、フリーズドライ状態にある間に凝集、酸化、および他の変性過程などの分解に対して実質的に耐性がある（例えば、特許文献１を参照されたい）。凍結乾燥は、比較的長期間にわたって室温で比較的安定なままである乾燥「ケーキ」を提供する。室温安定性は、世界中で、特に電気および冷蔵が頼りにならない場所で、治療用タンパク質を貯蔵および分配する際に特に重要である。
【０００４】
スクロースおよびトレハロースなどの凍結乾燥保護剤（別名、安定剤）は、フリーズドライプロセス中の変性からタンパク質を保護するために凍結乾燥前製剤中に含まれることが多い。可塑剤もまた、全体的な緩和時間を短縮するために含まれてもよく、場合によっては、タンパク質の天然構造を維持するのを補助し得る。可塑剤には、ソルビトールおよびグリセロールのような糖アルコール、他のポリオール、ならびに少量の水が含まれる。
【０００５】
凍結乾燥タンパク質の５℃での貯蔵を最適化するように設計された研究において、Ｃｈａｎｇらは、タンパク質製剤の安定性に対する可塑剤の効果を調査した。１：１のスクロース対タンパク質の重量比（４０ｍｇ／ｍＬの凍結乾燥前のタンパク質）を含み、追加の可塑剤を含有しない凍結乾燥ケーキにおいて、５０℃で１ヶ月間の凝集速度定数は、報告によると２．４％の含水量で１．５％を超え、３．３％の含水量で約２％であった（同文献、１４５１、図４）。（非特許文献１）。実験は、４０℃および２５℃でも実行され、データは、３つの応力条件のうち最も過酷な条件についてのみ提示された。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、中間水分含量での最適貯蔵安定性の文書化された事例のまれな例に留意し、残留水分含量が、単に最小化されなければならないものよりもむしろ、製剤の開発中に最適化されるべきであることを示唆した。（同文献、１４５１。非特許文献２も参照されたい）。高い水分レベルが、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．によって挙げられた研究の全てにおいて、製剤の化学的安定性を低下させることが示された。非特許文献３。）
【０００６】
それらの研究のいずれも、試験した製剤について、２５℃はもちろんのこと、５℃を超える温度での長期安定性（１年、２年、または３年以上）を示唆していない。
【０００７】
生物治療薬の凍結乾燥製剤は、ある特定の条件下で長期安定性を示した。Ｋａｌｌｍｅｙｅｒらの特許文献２は、他の賦形剤の中でも、糖（再構成後最大２００ｍｇ／ｍＬ［例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、トレハロース］）、アミノ酸（凍結乾燥前１〜１００ｍｇ／ｍＬ［例えば、アルギニン、リジン、オルニチン］）、界面活性剤（再構成後０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ［例えば、ポリソルベートおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー］）、ならびに任意に緩衝剤（再構成後１０〜２０ｍＭ［例えば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩］）、および／または等張化剤（例えば、ＮａＣｌ、再構成後３０ｍＭ以下）を含有する、低濃度（例えば、最大８ｍｇ／ｍＬの凍結乾燥前溶液）の安定な凍結乾燥抗体製剤を記載している。Ｋａｌｌｍｅｙｅｒは、凍結乾燥物が安定した状態のまま最大２年間室温（すなわち、１８〜２３℃）で貯蔵され得ることを開示している。ここで、安定性は、再構成凍結乾燥物中の粒子形成が非常に少ないか、または全くないこと、すなわち、サイズが１０ミクロンを超える６０００未満の粒子、またはサイズが２５ミクロンを超える６００未満の粒子によって示される。
【０００８】
Ｄｉｘらの特許文献３は、少なくとも３ヶ月、生物学的活性を維持する安定な凍結乾燥ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（別名、ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）製剤を記載している。その出願は、５〜７５ｍｇ／ｍＬのトラップ分子と、５〜５０ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、０．１〜３％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、安定剤）と、０．２５〜３％のグリシン（充填剤として）と、０．５〜６％スクロース（安定剤として）とを含有する凍結乾燥前溶液を開示している。任意に、凍結乾燥前溶液は、クエン酸緩衝剤（０．０５ｍＭ）および／または０．００３％〜０．００５％ポリソルベートを含有する。
【０００９】
凍結乾燥タンパク質製剤に加えて、噴霧乾燥もまた乾燥タンパク質製剤を作製するために用いられてきた。Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｓｈ（特許文献４）は、２〜３０ミクロンの直径の範囲、および約１０〜１２ミクロン、場合によっては約６〜約７ミクロンの中位径を有する乾燥微粉化タンパク質粒子を開示している。続いて、これらの粒子は、ポリマーで被覆されて、タンパク質をさらに安定化し、水性環境中での長期間にわたるタンパク質の持続放出を可能にし得る。微粉化粒子が形成された前処理されたタンパク質溶液は、（１）２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質および０．１％ポリソルベート、（２）２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、または（３）５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１０ｍＭのリン酸、および２％スクロースのいずれかを含有した。ポリマーコーティングされた微粉化タンパク質粒子内に含有されるタンパク質は、少なくとも１４日間安定なままであることが実証された。
【００１０】
タンパク質凍結乾燥物の乾燥後アニーリングは、５０℃で４％を超える初期抗体凝集をもたらすことが示され、凝集速度定数は、１ヶ月当たり約２％の凝集であった。（非特許文献４を参照されたい。）ＵＳ  ＦＤＡは、初期凝集が４％の製剤の販売を許可しているかもしれないが、経時的な凝集速度は、販売されている医薬製剤にとっては許容できないであろう。その貯蔵寿命中に医薬製剤に目に見える変化があってはならない。
【００１１】
室温で長期間にわたって安定なままである汎用乾燥タンパク質製剤の必要性が依然としてある。汎用乾燥タンパク質製剤は、とりわけ、液体製剤としての使用のため、ポリマーと組み合わせて持続放出製剤またはデバイスを製造するため、および無数の他の経路を介して移植または送達するための再構成に適している。ここで、出願人らは、改善された安定タンパク質凍結乾燥物およびその作成方法を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，４３６，８９７号
【特許文献２】Ｗ０１９９８／０２２１３６Ａ２
【特許文献３】Ｗ０２００６／１０４８５２Ａ２
【特許文献４】Ｗ０２０１３／０７５０６Ａ１
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．９４（７）：１４４５−１４５４，（２００５）
【非特許文献２】Ｂｒｅｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，”Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１８（９）：１３４５−１３５３（２００１）
【非特許文献３】Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｏｐｔｉｍｕｍ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，”Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ７４：２５５−２７１（１９９１）
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｉｅｄ  Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ＩＩ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，”９９（２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．６８３−７００（２０１０）
【発明の概要】
【００１４】
比較的高い含有量の残留水分は、凍結乾燥された治療用タンパク質（別名、「固体状態」での治療用タンパク質）のための有効な可塑剤として役立ち得、これは、室温で貯蔵されながら少なくとも２４ヶ月、タンパク質に驚くべき安定性を与える。一態様では、０．５〜１０パーセントの水分を有する低移動度固体状態の、室温で安定な凍結乾燥された治療用タンパク質製剤が提供される。別の態様では、その室温で安定な凍結乾燥された治療用タンパク質製剤を作製する方法が提供される。具体的には、凍結乾燥ケーキ中２％超、３％超、４％超、５％超、または６％超であるが、１０％未満、８％未満、７％未満、または６％未満の残留水分レベルは、室温における長期間にわたった比較的高温でのアニーリングを可能にする。いかなる作用機序によっても限定されないが、凍結乾燥プロセス中の残留含水量は、比較的高濃度、好ましくは５０〜２００ｍｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは１００〜１５０ｍｇ／ｍＬの医薬製剤における、初期タンパク質凝集体の形成を防止しながら、アルファ緩和が生じることを可能にするように思われる。
【００１５】
第１の態様では、安定なタンパク質、賦形剤、および約０．５％〜約１０％の水、約３％〜約６％の水、約４％〜約７％の水、約５重量％〜約８重量％の水、約３重量％、約４重量％、約４．５重量％、または約６重量％の水を含む、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキが提供される。薬学的に許容される凍結乾燥ケーキのタンパク質は、１７〜２５℃、２０〜２５℃、または約２５℃であり得る室温で、少なくとも１ヶ月安定なままである。「安定な」が意味するものは、一般に、タンパク質の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満が、室温での貯蔵の１８ヶ月以内に分解するか、またはほとんどもしくは全く分解されていない。タンパク質に対する一般的な分解経路は、凝集体および他の高分子量（ＨＭＷ）種の形成である。ＨＭＷ種は、サイズ排除クロマトグラフィおよび天然または変性電気泳動ゲル移動度などの多くの既知の方法、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィによって検出され得る。分解はまた、脱アミド化残基、還元ジスルフィド結合、加水分解、およびペプチド断片化などの化学生成物の形成も含み、それらもまた当該技術分野で既知の方法によって測定され得る。
【００１６】
一実施形態では、約２％以下のタンパク質が、約２５℃で２４ヶ月の貯蔵後に分解されている。分解は、サイズ排除クロマトグラフィによって測定されるような高分子量種のパーセント変化によって決定される。この方法による検出可能な分解の下限は、約０．５％の分解であり、アッセイの変動性として約０．２〜０．３％を伴う。
【００１７】
薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、タンパク質および水分に加えて１つ以上の賦形剤を含み得る。一実施形態では、賦形剤は、緩衝剤を含む。その緩衝剤は、タンパク質安定性のための最適ｐＨを維持する任意の緩衝剤であり得る。ヒスチジンは、そのような緩衝剤であり、これは約６．０のｐＫａを有し、ｐＨ４．８と７．２の間で効果的に緩衝することが可能である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒスチジンである。好ましい実施形態では、ヒスチジンは、約０．３４重量％〜約２．０４重量％で薬学的に許容される凍結乾燥ケーキ中に存在する。
【００１８】
一実施形態では、賦形剤は、安定剤を含む。安定剤には、ポリオール、糖、アミノ酸、塩、またはそれらの任意の組み合わせなどの様々な分子が含まれる。有用な安定剤の例には、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、トレハロース、スクロース、アルギニン、アラニン、プロリン、グリシン、塩化ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。一実施形態では、安定剤は、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約１９．９％〜約８２．２％を構成する。
【００１９】
「安定剤」という用語は、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキ中の緩衝剤またはタンパク質ではない、少なくとも１つの化学物質を意味する。いくつかの実施形態では、安定剤という用語は、タンパク質または他の巨大分子を安定化する働きを一緒にする化学物質の組み合わせ（すなわち、２つ以上の化学物質）を意味する。例えば、安定剤は、スクロースであり得るか、または安定剤は、スクロースおよびアルギニンの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、例えば、スクロースまたはトレハロースなどのより大きい分子量の化学物質は、例えば、アルギニン、プロリン、アラニン、グリシン、マンニトール、ソルビトール、および／またはグリセロールなどのより小さい分子量の化学物質と対にされる。理論によって束縛されることは望まないが、より小さい化学物質は、移動度を高め、タンパク質がより低いエネルギー状態に緩和することを可能にする。
【００２０】
一実施形態では、安定剤は、スクロースのみであり、安定剤は、他の安定剤成分の存在、ならびにタンパク質、水、および他の賦形剤の量に応じて、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約３％〜約１５％、好ましくは約５〜１１％、４〜７．５％、または５〜７．５％を構成する。一実施形態では、タンパク質対安定剤の重量比は、１：１〜３：１、好ましくは１．２：１〜２：１、より好ましくは約１．５：１である。
【００２１】
一実施形態では、安定剤は、別の安定剤と組み合わせたスクロースを含む。スクロースと組み合わされるそれらの他の安定剤は、アルギニン、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、およびアラニンのうちの任意の１つ以上を含む。一実施形態では、追加の安定剤は、アルギニンを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約４．８３％〜約１９．３％を構成し得る。いくつかの実施形態では、スクロース対アルギニンの重量対重量比は、約３．２：１〜約３．４：１の範囲である。別の実施形態では、追加の安定剤は、ソルビトールを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約８．０７％〜約２２．４％を構成し得る。別の実施形態では、追加の安定剤は、マンニトールを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約８．０７％〜約２２．４％を構成し得る。別の実施形態では、追加の安定剤は、グリセロールを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約４．２３％〜約１２．７％を構成し得る。さらに別の実施形態では、追加の安定剤は、アラニンを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約４．１１％〜約１２．４％を構成し得る。
【００２２】
別の実施形態では、安定剤は、トレハロースを含み、これは他の安定剤の存在、ならびにタンパク質、水、および他の賦形剤の量に応じて、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約１５．８％〜約７０．２％を構成する。
【００２３】
一実施形態では、安定剤は、別の安定剤と組み合わせたトレハロースを含む。トレハロースと組み合わされるそれらの他の安定剤は、アルギニン、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、およびアラニンのうちの任意の１つ以上を含む。一実施形態では、追加の安定剤は、アルギニンを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約０．８１％〜約１４．３％を構成し得る。別の実施形態では、追加の安定剤は、ソルビトールを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約１．３５％〜約２２．４％を構成し得る。別の実施形態では、追加の安定剤は、グリセロールを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約０．６９％〜約１２．７％を構成し得る。さらに別の実施形態では、追加の安定剤は、アラニンを含み、これは薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約０．６９％〜約１２．４％を構成し得る。
【００２４】
別の実施形態では、賦形剤は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、脂肪アシル化ポリエトキシル化ソルビタンなどの非イオン性洗剤を含み得る。一実施形態では、界面活性剤は、一般にポリソルベート、または具体的にはポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、約０．２１重量％〜約０．９６重量％のポリソルベート８０などの界面活性剤を含む。
【００２５】
一実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施形態では、治療用タンパク質は、抗原結合タンパク質である。抗原結合タンパク質は、抗体、抗体フラグメント、受容体、リガンド、相補性決定領域を含む組換え分子、リガンド、および受容体ドメインを含む多様な分子の群を包含する。抗原結合タンパク質は、トラップ分子を含む受容体−Ｆｃ融合タンパク質などの様々な他の融合（組換えまたはキメラ）タンパク質を含む。特定の実施形態では、タンパク質は、組換えヒト様またはヒト化モノクローナル抗体などの治療用抗体である。抗体には、ハイブリッド抗体ならびに二重特異性抗体が含まれる。
【００２６】
一実施形態では、タンパク質は、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの重量の約６．２７％〜約６３．７％を示す。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、約６．２７重量％〜約１８．９重量％のタンパク質を含む。他の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、約３３．４重量％〜約６３．７重量％のタンパク質を含む。
【００２７】
安定剤は、タンパク質の安定性を維持するのを助けるために薬学的に許容される凍結乾燥ケーキ中に含まれる。したがって、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、タンパク質に対する特定の比の安定剤を含む。いくつかの実施形態では、安定剤対タンパク質の比は、重量で約０．２２：１〜約６．６：１である。様々な実施形態は、全て重量で、０．４４：１、０．６５：１、０．８７：１、１．１：１、および１．３：１から選択される安定剤対タンパク質の比を含む。
【００２８】
薬学的に許容される凍結乾燥ケーキが含有される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、閉鎖バイアルに含まれる。閉鎖するものは、栓であってもよい。他の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、注射器バレルに含まれる。さらに他の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、デュアルチャンバ自動注入器の一方のチャンバに含まれる。
【００２９】
一実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキは、タンパク質、緩衝剤、非イオン性界面活性剤、および１つ以上の安定剤を水中で組み合わせて、凍結乾燥前水溶液を作製することによって製造される。次いで、溶液をフリーズドライして、１０％以下および０．５％以上の水分を含有するケーキを作製する。フリーズドライ（凍結乾燥）タンパク質は、「固体状態」にある。特定の実施形態では、タンパク質は、治療用組換えヒト様またはヒト化モノクローナル抗体である。
【００３０】
別の態様によると、治療用タンパク質と、１０％以下の水および０．５％以上の水とを含む組成物を製造するためのプロセスが提供される。
【００３１】
一実施形態では、プロセスは、容器内にタンパク質および賦形剤を含有する水性試料を得るステップを含む。容器は、とりわけ、バイアル、注射器バレル、またはデュアルチャンバ自動注入器のチャンバであり得る。容器は、水蒸気のガス放出を可能にするのに十分に開放している。水性試料を含む容器がチャンバ内に配置され、試料から熱が除去されて第１の温度を達成し、ここで氷結晶が試料中に形成される。チャンバから空気が除去されて、第１の圧力を達成する。次いで、熱エネルギーが試料に加えられて、第２の温度を達成して、昇華による試料からの水の除去を可能にする。昇華後、残留水が試料内に閉じ込められたままになる可能性があり、それにより追加の第２の乾燥ステップが必要となる。その第２の乾燥ステップは、チャンバ内の第１の圧力を維持しながら試料に熱エネルギーを加えることによって達成され、それにより第３の温度を達成する。その温度で、試料から水が脱着して、１０％以下および０．５％以上の水分レベルを達成する。
【００３２】
一実施形態では、初期の冷蔵および一次乾燥ステップ中に、毎分約０．５℃の速度で水性試料から熱が除去される。一実施形態では、第１の温度は、約−４５℃である。別の実施形態では、第１の温度は、約６０分間保持される。さらに別の実施形態では、水性試料は、第１の温度に到達する前に約３０分間５℃に保持される。
【００３３】
一実施形態では、一次乾燥ステップは、約−２５℃の第２の温度で行われる。一実施形態では、第２の温度は、棚温度を毎分約０．５℃の速度で上昇させることによって達成される。一実施形態では、第２の温度は、約５０時間保持される。一実施形態では、一次乾燥中のチャンバ圧力は、約１００ｍＴｏｒｒである。
【００３４】
一実施形態では、二次乾燥ステップは、約３５℃の第３の温度で行われる。一実施形態では、加熱のための昇温速度は、毎分約０．３℃である。一実施形態では、試料は、第３の温度に約６時間保持される。
【００３５】
二次乾燥後、一実施形態では、バイアルは、約６０８，０００ｍＴｏｒｒのチャンバ圧力で栓をされる。一実施形態では、チャンバは、栓をする前にＮ２ガスで再充填される。一実施形態では、バイアルは、Ｆｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）被覆４４３２／５０ブチルゴム凍結乾燥栓で栓をされる。
【００３６】
一実施形態では、乾燥試料は、アニーリングされて、タンパク質をより低いエネルギー状態に緩和させ、その全体的な安定性を改善する。試料をアニーリングするために、熱エネルギーが試料に加えられて、第４の温度を達成する。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、または少なくとも約６０時間、第４の温度に保持されて、タンパク質の最適な有効緩和（アルファ緩和およびベータ緩和）を達成する。いったんタンパク質がその最適な緩和状態に到達すると、容器は、閉鎖される。
【００３７】
一実施形態では、第４の温度、すなわち、アニーリング温度は、水脱着ステップ後の試料のガラス転移温度未満である。特定の実施形態では、アニーリング温度は、約７０℃である。別の特定の実施形態では、アニーリング温度は、約４５℃である。一実施形態では、試料は、アニーリング温度に約７２時間維持される。異なるタンパク質が異なる生物物理学的特徴を有するため、いくつかの実施形態では、第４の温度は、変調示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）を介して決定される。ここで、熱量計は、二次乾燥ステップを経た凍結乾燥タンパク質製剤試料で充填される。次いで、熱流が監視されている間に、試料は、ガラス転移を通した段階加熱に供される。Ｔｇが決定される。次いで、凍結乾燥ケーキ中の分子のエンタルピー緩和を誘導するために、試料は、様々なサブＴｇ温度に様々な時間保持される。次いで、「弛緩した」試料は、ＤＳＣまたはＭＤＳＣに供され、エンタルピー回復によるピーク面積（温度の関数としての熱容量）が決定される（Ｌｕｔｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｏｎ  ｅｎｔｈａｌｐｙ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＤＳＣ  ｃｕｒｖｅｓ，”９７（８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．３０８４−９９，  ２００８、およびＬ．Ｔｈｏｍａｓ，“Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ＤＳＣ（登録商標）  Ｐａｐｅｒ  ＃５：  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｌａｓｓ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｔｈａｌｐｙ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，”ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＴＰ  ０１０，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ  ＤＥ（ｔａｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｃｏｍ（２０１６年５月１３日アクセス）からワールドワイドウェブ上でダウンロード可能）を参照されたい）。最適なエンタルピー緩和を提供するそれらのサブＴｇ温度および時間は、第４の（別名、アニーリング）温度および時間に対して選択される。Ｗ．Ｑ．，“Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，”１２５７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６３−７９（２０１５）も参照されたい。
【００３８】
一実施形態では、凍結乾燥前水溶液（すなわち、水性試料、別名、水溶液）は、１つ以上の安定剤、１つ以上の緩衝剤、および任意に１つ以上の界面活性剤などの複数の賦形剤を含む。
【００３９】
一実施形態では、凍結乾燥前水溶液ならびに再構成された凍結乾燥液体製剤は、タンパク質の構造および機能の維持を補助するｐＨを有する。特定の実施形態では、液体の凍結乾燥前および再構成後の液体製剤は、約６．０±２のｐＨを有する。ｐＨ６付近で緩衝する分子は、この実施形態において有用であると考えられる。したがって、一実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジンを含む。特定の実施形態では、水溶液は、約１０ｍＭのヒスチジンを含有する。
【００４０】
一実施形態では、凍結乾燥前水溶液は、少なくとも１つの安定剤を含有する。いくつかの実施形態では、安定剤または安定剤の組み合わせは、トレハロース、ソルビトール、グリセロール、アルギニン、アラニン、マンニトール、スクロース、プロリン、ＮａＣｌ、およびグリシンのうちの１つ以上を含む。
【００４１】
一実施形態では、安定剤または安定剤の組み合わせは、スクロースを含む。特定の実施形態では、安定剤は、水溶液中に約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロースを含む。ある場合には、スクロースが唯一の安定剤である。別の場合では、水溶液は、安定剤として１０％のスクロース（ｗ／ｖ）に加えて、約３％±０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニンを含む。
【００４２】
他の実施形態では、安定剤は、スクロースと、少なくとも１つの他の分子実体とを含む。いくつかの実施形態では、水溶液は、約５％のスクロースと、１つの他の安定剤とを含む。１つの特定の実施形態では、水溶液は、５％スクロースと、（ａ）約１．３％±０．１％（ｗ／ｖ）のアラニン、（ｂ）約１．５％±０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニン、（ｃ）約１．３４％±０．１％（ｗ／ｖ）のグリセロール、（ｄ）約２．６６％±０．１％（ｗ／ｖ）のマンニトール、および（ｅ）約２．６６％±０．１％（ｗ／ｖ）のソルビトールのうちのいずれか１つとを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、安定剤は、様々な濃度および割合で、スクロースとアルギニンとを含む。特定の実施形態では、水溶液は、約７．５％のスクロースと、２．３％±０．１％のアルギニンとを含む。別の特定の実施形態では、水溶液は、約１２．５％のスクロースと、３．９％±０．１％のアルギニンとを含む。さらに別の特定の実施形態では、水溶液は、約１５％のスクロースと、４．６％±０．１％のアルギニンとを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、安定剤は、唯一の安定剤として、または別の安定剤と組み合わせてのいずれかで、トレハロースを含む。一実施形態では、安定剤は、水溶液中に約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のトレハロースを含む。別の実施形態では、水溶液は、約９．０９％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、０．４８％（ｗ／ｖ）のソルビトール、０．２４％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．２８％（ｗ／ｖ）のアルギニン、および０．２４％のアラニン％（ｗ／ｖ）のうちのいずれか１つとを含む。別の実施形態では、水溶液は、８．３３％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、０．８９％（ｗ／ｖ）のソルビトール、０．４５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、０．５１％（ｗ／ｖ）のアルギニン、および０．４３％（ｗ／ｖ）のアラニンのうちのいずれか１つとを含む。別の実施形態では、水性試料は、６．６６％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、１．７７％（ｗ／ｖ）のソルビトール、０．９％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１．０３％（ｗ／ｖ）のアルギニン、および０．８７％（ｗ／ｖ）のアラニンのうちのいずれか１つとを含む。別の実施形態では、水性試料は、５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、２．６６％（ｗ／ｖ）のソルビトール、１．３４％（ｗ／ｖ）のグリセロール、１．５４％（ｗ／ｖ）のアルギニン、および１．３％（ｗ／ｖ）のアラニンのうちのいずれか１つとを含む。
【００４５】
このプロセスの治療用タンパク質は、より小さいペプチドならびにより大きいタンパク質を含む任意の治療用タンパク質であり得る。一実施態様では、本発明の治療用タンパク質は、１００キロダルトン超、または約１５０キロダルトン以上である。本発明に含まれる治療用タンパク質は、単離された内因性タンパク質、異種発現タンパク質、および／またはキメラ融合タンパク質もしくは内因性ポリペプチドの変異体などの組換えタンパク質であり得る。一実施形態では、治療用タンパク質は、抗原結合タンパク質である。抗原結合タンパク質は、別の分子実体に結合する任意のタンパク質を包含する。例えば、抗原結合タンパク質としては、抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、ＳｃＦｖ融合タンパク質、相補性決定領域（ＣＤＲ）含有タンパク質、リガンド、受容体、リガンドフラグメント、受容体フラグメント、リガンドおよび／または受容体ドメインを含む融合タンパク質、ならびにトラップ分子を含む受容体−Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。
【００４６】
一実施形態では、治療用タンパク質は、抗体である。特定の実施形態では、治療用抗体は、モノクローナル抗体である。より具体的な実施形態では、治療用タンパク質は、異種細胞株で産生される組換えヒト様またはヒト化抗体である。別の実施形態では、治療用タンパク質は、受容体−Ｆｃ融合タンパク質である。別のより具体的な実施形態では、治療用タンパク質は、ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ分子（ＶＥＧＦトラップ）またはｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ分子（ＩＬ−１トラップ）などのトラップ分子である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、水溶液中の抗体濃度は低く、これはゼロを超え（すなわち、１μｇ／ｍＬと同じくらい低いか、またはそれよりも低い）、２５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度範囲を含む。低濃度の一実施形態では、抗体濃度は、約２ｍｇ／ｍＬである。
【００４８】
他の実施形態では、水溶液中の抗体濃度は中程度であり、これは２５ｍｇ／ｍＬを超え、１００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度範囲を含む。中程度の濃度における一実施態様では、抗体濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬである。
【００４９】
他の実施形態では、水溶液中の抗体濃度は高く、これは１００ｍｇ／ｍＬを超え、２００ｍｇ／ｍＬ以下の濃度範囲を含む。高濃度の一実施形態では、抗体濃度は、約１５０ｍｇ／ｍＬである。
【００５０】
さらに他の実施形態では、水溶液中の抗体濃度は超高濃度であり、これは２００ｍｇ／ｍＬを超える濃度範囲の抗体を含む。超高濃度の一実施形態では、抗体濃度は、約２０５ｍｇ／ｍＬである。
【００５１】
上述のように、しかしいかなる作用機序によっても限定されないが、水は、凍結乾燥生成物のための可塑剤として役立ち得、これは驚くべきことにタンパク質の安定性を改善する。したがって、一実施形態では、製造された組成物（すなわち、安定な凍結乾燥製剤）の水分含量は、２重量％以上および１０重量％以下である。別の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの水分含量は、３重量％以上および６重量％以下である。別の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの水分含量は、４重量％以上および６重量％以下である。特定の一実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの水分含量は、約６％である。別の特定の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの水分含量は、約４．５％である。さらに別の特定の実施形態では、薬学的に許容される凍結乾燥ケーキの水分含量は、約３％である。
【００５２】
一実施形態では、凍結乾燥タンパク質は、室温で少なくとも２４ヶ月安定である。特定の実施形態では、約２％以下の薬学的に許容される凍結乾燥ケーキが、２５℃で２４ヶ月の貯蔵後に分解する。いかなる機序によっても限定されないが、分解は、タンパク質分解、化学修飾、凝集などを伴い得る。凝集は、抗体分解の一般的な形態であり、高分子量（ＨＭＷ）種の形成によって注目される。分解は、当該技術分野で既知の、またはまだ発明されていない任意のタンパク質分析を使用して決定され得る。特定の実施形態では、抗体の分解は、サイズ排除（ＳＥ）クロマトグラフィによって高分子量（ＨＭＷ）種のパーセントの変化を測定することによって決定される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】経時的なタンパク質安定性に対する温度および水分の効果を示す棒グラフである。Ｘ軸は、月単位の時間および温度を表す。Ｙ軸は、タンパク質の高分子量種の量のパーセント変化を表す。各温度について、個々のヒストグラムは、Ｘ軸に沿って左から右に増加する含水量パーセント（ｗ／ｗ）、０％の水（白抜きの棒）、０．５％の水（薄い灰色の棒）、１．５％の水（下向きクロスハッチの棒）、３．０％の水（縦線の棒）、４．５％の水（水平線の棒）、６％の水（白抜きのダイヤモンドの棒）、８％の水（チェックの様）、および１０％の水（濃い灰色の棒）を表す。
【図２】経時的なタンパク質安定性に対する温度および水分の効果を示す棒グラフである。Ｘ軸は、月単位の時間および温度を表す。Ｙ軸は、タンパク質の高分子量種の量のパーセント変化を表す。各温度について、個々のヒストグラムは、Ｘ軸に沿って左から右に増加する含水量パーセント（ｗ／ｗ）、０％の水（白抜きの棒）、０．５％の水（薄い灰色の棒）、１．５％の水（下向きクロスハッチの棒）、３．０％の水（縦線の棒）、４．５％の水（水平線の棒）、６％の水（白抜きのダイヤモンドの棒）、８％の水（チェックの様）、および１０％の水（濃い灰色の棒）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明が説明される前に、説明される特定の方法および実験条件が変動し得るため、本発明が、そのような方法および条件に制限されないことが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限することを企図するものではないことも理解されることになっている。
【００５５】
賦形剤、成分、および他の材料の絶対量および相対量は、質量またはモル数によって表され得る。質量単位は、グラム、ミリグラム、マイクログラムなどとして表され得る）。「重量／体積」または「ｗ／ｖ」における「重量」という用語は、「質量」を意味する。相対量は、重量パーセント（すなわち、質量パーセント）として表され得、１パーセントの重量／体積（ｗ／ｖ）は、１００ミリリットルの体積当たり１グラムの材料を意味する。また例えば、重量で１部の成分「Ｂ」当たり１部の成分「Ａ」は、例えば、１グラムの成分「Ａ」毎に１グラムの成分「Ｂ」が存在することを意味する。また、例えば、成分「Ａ」の１重量パーセント（１％）は、例えば、粒子の全質量１００グラム毎に１グラムの成分「Ａ」が存在することを意味する。成分の相対量はまた、所与の体積当たりのモル数または分子数、例えば１リットル当たりのミリモル（ミリモル（ｍＭ））、または他の成分当たりを単位として表されてもよく、例えば、モルによるＹ部分成分「Ｂ」当たりのＸ部成分「Ａ」は、「Ａ」のＸモル毎に「Ｂ」のＹモルが存在することを意味する。
【００５６】
本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験で使用され得るが、例となる方法および材料がここで説明される。本明細書で言及される全ての出版物は、それらの全体を記載するために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
賦形剤
賦形剤は、医薬製剤中に活性原薬と一緒に添加される成分である。賦形剤は、原薬を安定化する、および／または製剤に嵩を加えるのを助ける。成分という用語は、賦形剤と互換的に使用される。
【００５８】
賦形剤は、原薬の緩衝、増量、可溶化、安定化、可塑化、および保護のような様々な目的のための様々な物質を含む。保護剤は、熱応力および／または撹拌のような物理的応力から保護する。緩衝剤は、当該技術分野において周知である。
【００５９】
一般に、凍結乾燥前および再構成後にタンパク質を安定化するために、緩衝剤が凍結乾燥前タンパク質水溶液中に含まれる。緩衝剤は、１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で凍結乾燥前溶液中に含まれてもよい。いくつかの特定の実施形態では、緩衝剤は、約１０ｍＭで凍結乾燥前溶液中に含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、５ｍＭ±０．７５ｍＭ〜１５ｍＭ±２．２５ｍＭ、６ｍＭ±０．９ｍＭ〜１４ｍＭ±２．１ｍＭ、７ｍＭ±１．０５ｍＭ〜１３ｍＭ±１．９５ｍＭ、８ｍＭ±１．２ｍＭ〜１２ｍＭ±１．８ｍＭ、９ｍＭ±１．３５ｍＭ〜１１ｍＭ±１．６５ｍＭ、１０ｍＭ±１．５ｍＭ、または約１０ｍＭの濃度で、凍結乾燥前溶液中に存在する。ある特定の実施形態では、凍結乾燥前溶液の緩衝剤系は、１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、リン酸塩、および／または酢酸塩を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約３〜約９のｐＨ範囲内、または約３．７〜約８．０のｐＨ範囲内のどこかで緩衝することが可能な化学物質から選択される。例えば、凍結乾燥前溶液は、約３．４、約３．６、約３．８、約４．０、約４．２、約４．６、約４．８、約５．０、約５．２、約５．４、約５．６、約５．８、約６．０、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、または約８．０のｐＨを有し得る。
【００６１】
緩衝剤は、例えば、ヒスチジンおよび酢酸塩の組み合わせ（ヒス−酢酸塩緩衝剤）などの個々の緩衝剤の組み合わせであってもよい。一実施形態では、緩衝剤は、酢酸塩によって緩衝された範囲など、約３．５〜約６、または約３．７〜約５．６の緩衝範囲を有する。一実施形態では、緩衝剤は、リン酸によって緩衝された範囲など、約５．５〜約８．５、または約５．８〜約８．０の緩衝範囲を有する。一実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジンによって緩衝された範囲など、約５．０〜約８．０、または約５．５〜約７．４の緩衝範囲を有する。
【００６２】
賦形剤は、安定剤を含む。本明細書で使用される場合、安定剤は、凍結乾燥前溶液に添加されて、凝集または他の分解に対してタンパク質を安定化する。凍結乾燥プロセス中にガラス動力学を制御することによって、または安定剤とタンパク質との特異的相互作用を通してタンパク質の本来の構造を保存するのを助けることによって、安定化が生じ得る。凍結乾燥中の安定剤の生物物理学的考察については、Ｃｈａｎｇら，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｇａｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ：ｎａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ／ｏｒ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｇｌａｓｓｙ  ｍａｔｒｉｘ？”９４（７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１４２７−４４（２００５）を参照されたい。
【００６３】
凍結乾燥前溶液中に含むための安定剤には、ポリオール、糖、塩（例えば、塩化ナトリウム）、アミノ酸などが含まれる。最適な安定化効果のために、様々な個々の安定剤が単独で、または１つ以上の他の安定剤と組み合わせて使用され得る。例えば、糖とポリオール、アミノ酸と糖、アミノ酸とポリオール、糖と塩、アミノ酸と塩、ポリオールと塩などが組み合わされ得る。
【００６４】
ポリオールは、２つ以上のヒドロキシル基（−ＯＨ）を有する有機分子である。ポリオールには、ポリマーならびにモノマーが含まれる。糖アルコールは、ポリオールのサブグループである。有用な安定剤として役立ち得る糖アルコールには、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、イソマルト、エリトリトール、マルチトール、およびグリセロールが含まれる。他のモノマーポリオールには、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびペンタエリスリトールが含まれる。ポリマーポリオールは、ポリオールサブユニットのポリエステルまたはポリエーテルであってもよい。有用な例となるポリマーポリオールには、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびポリ（テトラメチレンエーテル）グリコールが含まれる。
【００６５】
糖は、安定剤（ならびに充填剤）として使用される。糖は、還元糖または非還元糖のいずれかに分類され得る。非還元糖には、ジサッカライドスクロースおよびトレハロースが含まれる。還元糖には、グルコース、マルトース、およびラクトースが含まれる。一般に、還元糖は、メイラード反応を介してタンパク質を還元することがあるため、非還元糖がタンパク質の凍結乾燥に好ましい。一般に、Ｌａｖａｋｕｍａｒら，“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ／Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｉｎｇ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”３（４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２２７７−２７８２（２０１３）を参照されたい。ジサッカライドトレハロースおよびスクロースは、比較的不活性であり、凍結乾燥中に非晶質ガラスを形成する傾向がある。トレハロースまたはスクロースは、単独でまたはアミノ酸もしくはポリオールと組み合わせてのいずれかで、本発明の実施において安定剤として使用される。
【００６６】
一実施形態では、トレハロースが唯一の安定剤として使用される。他の実施形態では、トレハロースは、ポリオールと組み合わされる。いくつかの実施形態では、安定剤は、トレハロースおよびソルビトール、またはトレハロースおよびグリセロールの組み合わせである。他の実施形態では、トレハロースは、アミノ酸と組み合わされる。具体的には、トレハロースは、アラニンと組み合わされるか、またはトレハロースは、アルギニンと組み合わされる。
【００６７】
他の実施形態では、スクロースが唯一の安定剤として使用される。他の実施形態では、スクロースは、ポリオールと組み合わされる。特定の実施形態では、安定剤は、スクロースおよびマンニトール、スクロースおよびソルビトール、またはスクロースおよびグリセロールの組み合わせである。他の実施形態では、スクロースは、アミノ酸と組み合わされる。具体的には、スクロースは、アルギニンと組み合わされるか、またはスクロースは、アラニンと組み合わされる。
【００６８】
アミノ酸が安定剤として使用される。グリシンは、一般的に使用される充填剤および安定剤である。他の有用なアミノ酸には、アルギニン、アラニン、およびプロリンが含まれる。いくつかの実施形態では、アルギニンが安定剤として使用される。いくつかの特定の実施形態では、アルギニンは、スクロースと組み合わされるか、またはアルギニンは、トレハロースと組み合わされる。他の実施形態では、アラニンが安定剤として使用される。いくつかの特定の実施形態では、アラニンは、スクロースと組み合わされるか、またはアラニンは、トレハロースと組み合わされる。
【００６９】
場合によっては、１つ以上の界面活性剤が賦形剤として使用され得る。界面活性剤は、タンパク質−タンパク質の疎水性相互作用およびその結果として生じる高分子量種（すなわち、凝集体）の形成を減少させることによって、さらなる安定性を提供すると考えられている。いくつかの実施形態では、１つ以上の界面活性剤（複数可）が、凍結乾燥前タンパク質含有水溶液中に含まれてもよい。他の実施形態では、１つ以上の界面活性剤（複数可）が、再構成希釈剤溶液中に含まれてもよい。界面活性剤は、それが溶解している流体の表面張力を低下させ、かつ／または油と水との間の界面張力を低下させる物質を含む。界面活性剤は、イオン性または非イオン性であってもよい。凍結乾燥前溶液または再構成後溶液中に含まれ得る例示的な非イオン性界面活性剤には、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルポリグルコシド（例えば、オクチルグルコシドおよびデシルマルトシド）、セチルアルコールおよびオレイルアルコールなどの脂肪アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ならびにコカミドＴＥＡが含まれる。凍結乾燥前水溶液（または再構成後溶液）中にふくまれ得る特定の非イオン性界面活性剤には、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート２８、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、およびポリソルベート８５などのポリオキシエチレンソルビタンエステル（別名、ポリソルベート）、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７などのポロキサマー、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ポリソルベート２０は、ＴＷＥＥＮ２０、ソルビタンモノラウレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしても知られている。ポリソルベート８０は、ＴＷＥＥＮ８０、ソルビタンモノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られている。
【００７０】
凍結乾燥前溶液または再構成溶液内に含有される界面活性剤の量は、凍結乾燥製剤に望まれる特定の性質および目的に応じて変化し得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥前溶液または再構成溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）を含有し得る。例えば、凍結乾燥前は、約０．００１％、約０．００１５％、約０．００２％、約０．００２５％、約０．００３％、約０．００３５％、約０．００４％、約０．００４５％、約０．００５％、約０．００５５％、約０．００６％、約０．００６５％、約０．００７％、約０．００７５％、約０．００８％、約０．００８５％、約０．００９％、約０．００９５％、約０．０１％、約０．０１５％、約０．０１６％、約０．０１７％、約０．０１８％、約０．０１９％、約０．０２％、約０．０２１％、約０．０２２％、約０．０２３％、約０．０２４％、約０．０２５％、約０．０２６％、約０．０２７％、約０．０２８％、約０．０２９％、約０．０３％、約０．０３１％、約０．０３２％、約０．０３３％、約０．０３４％、約０．０３５％、約０．０３６％、約０．０３７％、約０．０３８％、約０．０３９％、約０．０４％、約０．０４１％、約０．０４２％、約０．０４３％、約０．０４４％、約０．０４５％、約０．０４６％、約０．０４７％、約０．０４８％、約０．０４９％、約０．０５％、約０．０５１％、約０．０５２％、約０．０５３％、約０．０５４％、約０．０５５％、約０．０５６％、約０．０５７％、約０．０５８％、約０．０５９％、約０．０６％、約０．０６１％、約０．０６２％、約０．０６３％、約０．０６４％、約０．０６５％、約０．０６６％、約０．０６７％、約０．０６８％、約０．０６９％、約０．０７％、約０．０７１％、約０．０７２％、約０．０７３％、約０．０７４％、約０．０７５％、約０．０７６％、約０．０７７％、約０．０７８％、約０．０７９％、約０．０８％、約０．０８１％、約０．０８２％、約０．０８３％、約０．０８４％、約０．０８５％、約０．０８６％、約０．０８７％、約０．０８８％、約０．０８９％、約０．０９％、約０．０９１％、約０．０９２％、約０．０９３％、約０．０９４％、約０．０９５％、約０．０９６％、約０．０９７％、約０．０９８％、約０．０９９％、約０．１０％、約０．１５％、約０．２０％、約０．２５％、約０．３０％、約０．３５％、約０．４０％、約０．４５％、または約０．５０％の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）を含有し得る。
【００７１】
１つ以上の可塑剤が凍結乾燥タンパク質組成物中に含まれる。可塑剤は、系の流動性または柔軟性を高めるために一般に使用される。流動性の増加は、可塑剤が系の自由体積を増加させ、ガラス転移温度を低下させることの結果であると考えられている。可塑剤の添加は、凍結乾燥ケーキ内のアルファ緩和およびベータ緩和の両方を修正する。アルファ緩和は、一次緩和またはガラス緩和としても知られており、全体的な緩和プロセスである。ベータ緩和は、より小さい分子（すなわち、可塑剤）によってより良好に修飾され得るタンパク質ポリマー骨格運動に関連するより局所的なプロセスである。両方の緩和プロセスが、系の全体的なエネルギーを減少させ、特にベータ緩和の場合には、タンパク質安定性に影響を及ぼすと考えられている。可塑剤がベータ緩和時間を短縮し、同時にタンパク質安定性を低下させる可能性があることは、タンパク質生物物理学の分野では一般的に知られている（例えば、Ｃｉｃｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ，“β−Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｓｕｇａｒ−ｇｌａｓｓ  ｍａｔｒｉｃｅｓ，”Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ８：２９８３−２９９１，２０１２を参照されたい）。
【００７２】
本発明はまた、一態様において、タンパク質安定性を維持または増強しながら、ケーキに十分な柔軟性およびアルファ緩和をもたらす「安定剤」を作り出すために、特定の比で１つ以上の可塑剤と組み合わせた１つ以上の糖を含有する、凍結乾燥タンパク質製剤の実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、安定剤は、約１９：１〜約１：１の糖対可塑剤の重量対重量（すなわち、質量対質量）比を含む。いくつかの実施形態では、安定剤は、約１９：１、約１８：１、約１７：１、約１６：１、約１５：１、約１４：１、約１３：１、約１２：１、約１１：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の糖対可塑剤の重量対重量比を含む。
【００７３】
有用な可塑剤には、ソルビトール、グリセロール（グリセリン）、マンニトール、およびキシリトールなどのポリオール、グリシン、アルギニン、プロリン、およびアラニンなどのアミノ酸、ならびにＮａＣｌなどの塩が含まれる。興味深いことに、水も可塑剤として機能することができる。しかしながら、水は、移動度の増加およびＴｇの低下をもたらす化学反応物および可塑剤の両方であるため、一般的には好まれない。移動度の増加は、系内の反応性および加水分解の増加と相関している。反応性および加水分解の増加は、タンパク質の安定性を損なう。Ｔｅｒａｋｉｔａら，“Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ  ａｓ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，”５７（５）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４５９−４６３（２００９）を参照されたい。
【００７４】
上記のように、水と組み合わせたマンニトール、グリセロール、ソルビトール、およびグリシンは、いくつかの実施形態では可塑剤として使用される。理論によって束縛されないが、特定の製剤実施形態におけるこれらの分子は、タンパク質安定性も高めながらベータ緩和時間を短縮すると考えられている。
【００７５】
いくつかの特定の実施形態では、糖スクロースまたはトレハロースは、約４：１、約３．９：１、約３．８：１、約３．７：１、約３．６：１、約３．５：１、約３．４：１、約３．３：１、約３．２：１、約３．１：１、約３：１、約２．９：１、約２．８：１、約２．７：１、約２．６：１、約２．５：１、約２．４：１、約２．３：１、約２．２：１、約２．１：１、約２：１、約２：１、約１．９：１、約１．８：１、約１．７：１、約１．６：１、約１．５：１、約１．４：１、約１．３：１、約１．２：１、約１．１：１、または約１：１の重量対重量比で、可塑剤ソルビトールと組み合わされる。他の特定の実施形態では、糖スクロースまたはトレハロースは、約３３：１、約３２：１、約３１：１、約３０：１、約２９：１、約２８：１、約２７：１、約２６：１、約２５：１、約２４：１、約２３：１、約２２：１、約２１：１、約２０：１、約１９：１、約１８：１、約１７：１、約１６：１、約１５：１、約１４：１、約１３：１、約１２：１、約１１：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、または約３：１の重量対重量比で、可塑剤アルギニンと組み合わされる。
【００７６】
本発明はまた、一態様において、水が凍結乾燥組成物中で安定化可塑剤として役立ち、室温で貯蔵された凍結乾燥組成物中のタンパク質凝集速度を低下させるのを助けるということを示す。凍結乾燥ケーキ中のタンパク質を室温で効果的に安定化するのに必要な水分の量は、タンパク質含有量の増加と共に増加し、タンパク質含有量の減少と共に減少する。したがって、５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する凍結乾燥前溶液から得られた凍結乾燥組成物は、１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有する凍結乾燥前溶液から得られた凍結乾燥組成物よりも低い水分含量を必要とし得る。また、凍結乾燥ケーキ中のタンパク質を効果的に安定化するのに必要とされる水分の最適量は、貯蔵温度と共に変化する。例えば、中間量の水分は、室温でのタンパク質凍結乾燥物の長期貯蔵に有益である。より高い貯蔵温度（例えば、３７℃）では、より少ない水分が必要とされる。
【００７７】
例えば、図１は、２５℃、３７℃、または５０℃で貯蔵した例示的な抗体凍結乾燥製剤の安定性に対する水分の影響を示す。ここで、凍結乾燥前製剤は、１５０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ、５％スクロース、および１．５４％アルギニンを含有していた。最終凍結乾燥ケーキは、０％、０．５％、１．５％、３．０％、４．５％、６％、８％、または１０％の水分（ｗ／ｗ）を含有していた。図１に示されるように、より高い貯蔵温度は、２〜３ヶ月にわたってより低いタンパク質安定性をもたらした。興味深いことに、最大の安定性をもたらす水分の最適量は、３７℃または５０℃よりも室温の方が高かった。この特定の例では、室温でのタンパク質安定性のための最適水分含量は、約４．５％（ｗ／ｗ）であり、５０℃で２ヶ月の貯蔵に対しては約１．５％〜約３％であった。より長期の安定性データが図２に示され、図２は、２５℃および３７℃でそれぞれ１２ヶ月および６ヶ月貯蔵した例示的な抗体凍結乾燥製剤を示す。図２に示されるように、３．０％〜４．５％（ｗ／ｗ）の水分含量が試験した両方の温度下で最良の安定性をもたらし、４．５％の水分含量は、室温（２５℃）条件下で１２ヶ月において最大の安定性をもたらした。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、室温（２５℃）で少なくとも１２ヶ月安定なままである１．５％〜８％の水（ｗ／ｗ）を含む、安定な凍結乾燥タンパク質（例えば、抗体）製剤を提供し、安定性とは、１２ヶ月の貯蔵期間にわたる高分子量種の２％未満の増加を指す。別の実施形態では、本発明は、室温（２５℃）で少なくとも１２ヶ月安定なままである３．０％〜４．５％の水（ｗ／ｗ）を含む、安定な凍結乾燥タンパク質（例えば、抗体）製剤を提供し、安定性とは、１２ヶ月の貯蔵期間にわたる高分子量種の１．５％未満の増加を指す。
【００７９】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥組成物は、０．５重量％以上の水、０．６重量％以上の水、０．７重量％以上の水、０．８重量％以上の水、０．９重量％以上の水、１重量％以上の水を、１．５重量％以上の水、２重量％以上の水、２．５重量％以上の水、３重量％以上の水、３．５重量％以上の水、４重量％以上の水、４．５重量％以上の水、５重量％以上の水、５．５重量％以上の水、６重量％以上の水、６．５重量％以上の水、７重量％以上の水、７．５重量％以上の水、８重量％以上の水、８．５重量％以上の水、９重量％以上の水、または９．５重量％以上の水であるが、１０重量％以下の水を含有する。しかしながら、最適量を超えた水は、タンパク質の不安定性を増大させる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、凍結乾燥組成物は、１０重量％以下の水、９．５重量％以下の水、９重量％以下の水、８．５重量％以下の水、８重量％以下の水、７．５重量％以下、７重量％以下の水、６．５重量％以下の水、６重量％以下の水、５．５重量％以下の水、５重量％以下の水、４．５重量％以下の水、４重量％以下の水、３．５重量％以下の水、３重量％以下の水、２．５重量％以下の水、２重量％以下の水、１．５重量％以下の水、１重量％以下の水、０．９重量％以下の水、０．８重量％以下の水、０．７重量％以下の水、０．６重量％以下の水であるが、０．５重量％以上の水を含有する。
【００８０】
「水分含量」という語句は、「含水量」と互換的に使用され得る。しかしながら、「水分含量」は、凍結乾燥ケーキの含水量を説明するのに使用され、一方、「含水量」は、水溶液、ゲル、他の液体、ガス、氷、または凍結乾燥ケーキ、噴霧乾燥粒子などの固体形態の製剤中の水の量を説明するために使用される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥組成物の水分含量は、０．５重量％〜１０重量％、１重量％〜１０重量％、２重量％〜１０重量％、３重量％〜１０重量％、４重量％〜１０重量％、５重量％〜１０重量％、６重量％〜１０重量％、７重量％〜１０重量％、８重量％〜１０重量％、９重量％〜１０重量％、０．５重量％〜９重量％、０．５重量％〜８重量％、０．５重量％〜７重量％、０．５重量％〜６重量％、０．５重量％〜５重量％、０．５重量％〜４重量％、０．５重量％〜３重量％、０．５重量％〜２重量％、０．５重量％〜１重量％、１重量％〜２重量％、１．５重量％〜２．５重量％例えば、２重量％〜３重量％、２．５重量％〜３．５重量％、３重量％〜４重量％、３．５重量％〜４．５重量％、４重量％〜５重量％、４．５重量％〜５．５重量％、５重量％〜６重量％、５．５重量％〜６．５重量％、６重量％〜７重量％、６．５重量％〜７．５重量％、７重量％〜８重量％、７．５重量％〜８．５重量％、８重量％〜９重量％、８．５重量％〜９．５重量％、９重量％〜１０重量％、９．５重量％〜１０重量％、または約１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％もしくは８重量％である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥組成物の水分含量は、３重量％〜６重量％、３．１重量％〜５．９重量％、３．２重量％〜５．８重量％、３．３重量％〜５．７重量％、３．４重量％〜５．６重量％、３．５重量％〜５．５重量％、３．６重量％〜５．４重量％、３．７重量％〜５．３重量％、３．８重量％〜５．２重量％、３．９重量％〜５．１重量％、４重量％〜５重量％、４．１重量％〜４．９重量％、４．２重量％〜４．８重量％、４．３重量％〜４．７重量％、４．４重量％〜４．６重量％、または約４．５重量％である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥組成物の水分含量は、２重量％〜４重量％、２．１重量％〜３．９重量％、２．２重量％〜３．８重量％、２．３重量％〜３．７重量％、２．４重量％〜３．６重量％、２．５重量％〜３．５重量％、２．６重量％〜３．４重量％重量％、２．７重量％〜３．３重量％、２．８重量％〜３．２重量％、２．９重量％〜３．１重量％、または約３重量％である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥ケーキ中の重量パーセント含水量は、約３％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４％、約４．１％、約４．２％、約４．３％、約４．４％、約４．５％、約４．６％、約４．７％、約４．８％、約４．９％、約５％、約５．１％、約５．２％、約５．３％、約５．４％、約５．５％、約５．６％、約５．７％、約５．８％、約５．９％、約６％、約６．１％、約６．２％、約６．３％、約６．４％、約６．５％、約６．６％、約６．７％、約６．８％、約６．９％、約７％、約７．１％、約７．２％、約７．３％、約７．４％、約７．５％、約７．６％、約７．７％、約７．８％、約７．９％、または約８％である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥ケーキの含水量は、３重量％超および１０重量％未満である。
【００８２】
凍結乾燥ケーキの含水量は、当該技術分野において既知の任意の１つ以上の方法によって決定され得る。それらの方法には、熱重量分析、ガスクロマトグラフィ、近赤外分光法、クーロメトリ、およびカールフィッシャー法または相対湿度センサ法を含む重量法が含まれる。これらの方法のいくつかは、Ｊ．Ｋ．Ｔｏｗｎｅｓ，“Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，”７０５Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １１５−１２７，１９９５、およびＭａｌｉｋら，“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｄｕａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，”Ａｍ．Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｖ．Ａｕｇｕｓｔ  ０１，２０１０、ならびにそこに引用されている参考文献で概説されている。例えば、凍結乾燥ケーキが秤量され、追加の加熱に供されて、全ての水および他の揮発物を完全に除去し、次いで再び秤量される、乾燥減量（ＬＯＤ）法（重量）が使用され得る。質量損失は、出発原料内に含有される水（および他の揮発物）に起因する。含水量を決定するための別の方法は、Ｉ２によるＳＯ２の酸化を測定することによってＨ２Ｏの量を決定するカールフィッシャー法（体積または電量）であり、１モルのＩ２は、１モルのＨ２Ｏ当たりの消費である。近赤外分光法は、タンパク質を含むガラスバイアル（ガラス表面）を通して１１００ｎｍ〜２５００ｎｍの反射率を測定して、試料を破壊することなく水分含量を決定する。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，ＸＸＩＩＩ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ，ＵＳＰ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  １９９５，ｐｐ．１８０１−１８０２、およびＳａｖａｇｅら，“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｑｕａｔｅ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｄｒｙ−Ｈｅａｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｂｙ  Ｌｏｓｓ  ｏｎ  Ｄｒｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｙ  Ｎｅａｒ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”２６  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  １１９−１２４，１９９８を参照されたい。
【００８３】
凍結乾燥ケーキ
タンパク質と安定剤とを含有する凍結乾燥組成物は、「ケーキ」または「凍結乾燥ケーキ」としても知られている固体マトリックスを形成する。「薬学的に許容されるケーキ」（「薬学的に許容される凍結乾燥ケーキ」と互換的に使用される）は、非晶質（ガラス質、結晶質ではない）であり、審美的に優雅な外観を有する。薬学的に許容されるケーキは、収縮、クラッキング、部分的または全体的崩壊、メルトバック、または変色を示すべきではない。赤色、黒色、茶色、黄色、または他の薄く色のついたケーキは、変色して、許容されない。理想的なケーキは、機械的に強く、取扱い中の破壊に抵抗性があり、多孔質かつスポンジ状であり、均一な手触りがあり、かつ単一の実体を形成し、均一に白色である。ケーキは、バイアルの壁に均一に付着しているべきであり、剥離または他の収縮の兆候を示してはいけない。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら，“Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｓｏｍｅ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｄｖｉｃｅ，”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４（８）：９６９−９７５，１９９７を参照されたい。
【００８４】
ケーキは、煙突状の構造、上面領域上の乾燥発泡体、ケーキ表面上のクラスティングまたはグレージング、および水平方向の層化または環形成を含む、凍結問題による視覚的欠陥がないべきである。ケーキは、ケーキ体積が凍結マトリクスよりも小さく、壁剥離の兆候が明らかである収縮、ケーキが乾燥マトリクスの亀裂を示し、ケーキが単一の実体を形成しないクラッキング、ケーキの全体的または部分的な崩壊などの異なる程度のケーキ構造の損失、ケーキが下部領域に溶解した材料の環を含有するメルトバック、ケーキの基部の小さい領域のみが溶解した材料を含有する部分的メルトバック、およびメイラード反応を受けた還元糖を含むことによるケーキの黄色または茶色の変色である茶色化を含む、乾燥問題による視覚的欠陥がないべきである。メルトバックは、遅い溶解時間、タンパク質凝集、分解、および効力の低下を招く可能性があるため、特に問題である。ＦＤＡ，“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｓ（７／９３）．Ｆｉｎｉｓｈｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｓｔ  ｕｐｄａｔｅ  ２００９，”２００９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＩＣＥＣＩ／Ｉｎｓｐｅｃ−ｔｉｏｎｓ／ＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＧｕｉｄｅｓ／ｕｃｍ０７４９０９．ｈｔｍから最終アクセス２０１６年７月８日）を参照されたい。
【００８５】
タンパク質原薬
「タンパク質」という用語は、アミド結合を介して共有結合している約５０を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを意味する。タンパク質は、当該技術分野において「ポリペプチド」として一般に知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含有する。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つ以上のポリペプチドを含有し得る。「ポリペプチド」は一般に、５０を超えるアミノ酸を含有し、一方で、「ペプチド」は一般に、５０以下のアミノ酸を含有する。タンパク質は、１つ以上の共有結合および非共有結合修飾を含み得る。ジスルフィド架橋（すなわち、システイン残基間でシスチンを形成する）が、いくつかのタンパク質中に存在し得る。これらの共有結合は、単一のポリペプチド鎖内にあってもよく、または２つの個々のポリペプチド鎖間にあってもよい。例えば、ジスルフィド架橋は、インスリン、免疫グロブリン、プロタミンなどの適切な構造および機能にとって不可欠である。ジスルフィド結合形成の最近の概説については、Ｏｋａ  ａｎｄ  Ｂｕｌｌｅｉｄ，“Ｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，”１８３３（１１）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２４２５−９（２０１３）を参照されたい。
【００８６】
ジスルフィド結合形成に加えて、タンパク質は、他の翻訳後修飾に供され得る。それらの修飾には、脂質化（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｏｙｌａｔｉｏｎ）、ゲラニルゲラニル化、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えば、メチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えば、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、トレオニン、チロシン、および／またはトリプトファンへのグリコシル基の付加）、ならびにリン酸化（すなわち、セリン、トレオニン、チロシン、および／またはヒスチジンへのリン酸基の付加）が含まれる。真核生物において産生されたタンパク質の翻訳後修飾に関する最近の概説については、Ｍｏｗｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ，“Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”１５（６）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５１２−２０（２０１４）、およびＢｌｉｘｔ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ，“Ａｒｒａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ（ＰＴＧ），”１８  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．６２−９（２０１４）を参照されたい。
【００８７】
免疫グロブリン（別名、「抗体」）は、複数のポリペプチド鎖および広範な翻訳後修飾を有するタンパク質の例である。標準免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＧ）は、４つのポリペプチド鎖、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む。各軽鎖は、シスチンジスルフィド結合を介して１つの重鎖に結合し、２つの重鎖は、２つのシスチンジスルフィド結合を介して互いに結合している。哺乳動物系において産生された免疫グロブリンはまた、様々なポリサッカライドで様々な残基（例えば、アスパラギン残基）においてグリコシル化され、種によって異なり得、これは治療用抗体の抗原性に影響を与える可能性がある（Ｂｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｅａｒｍａｎ，“Ｔｈｅ  ｃｈｏｉｃｅ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，３０  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １０７−１１２（２０１４）を参照されたい。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、治療用タンパク質、研究または治療で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他の受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含む。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。治療用タンパク質およびそれらの産生を考察する最近の概説については、Ｇｈａｄｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”２８  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ  Ｒｅｖ．１４７−７５（２０１２）を参照されたい。
【００８９】
いくつかの組換えＦｃ含有タンパク質は、生物学的系において同族の結合パートナーを有する受容体または受容体フラグメント、リガンドまたはリガンドフラグメントを含有する。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合した可溶性受容体を含有する組換え分子を指す。いくつかの受容体Ｆｃ融合タンパク質は、複数の異なる受容体のリガンド結合ドメインを含有し得る。これらの受容体Ｆｃ融合タンパク質は、「トラップ」または「トラップ分子」として知られている。ｒｉｌｏｎｏｃｅｐｔおよびａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔはそれぞれ、ＩＬ１Ｒ（米国特許第７，９２７，５８３号を参照されたい）およびＶＥＧＦ（米国特許第７，０８７，４１１号を参照されたい）に拮抗する市販のトラップの例である。他の組換えＦｃ含有タンパク質は、Ｆｃドメインに融合したペプチドを含有する組換えタンパク質、例えば、ＣｅｎｔｏｃｏｒのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）技術を含む。組換えＦｃ含有タンパク質は、Ｃ．Ｈｕａｎｇ，“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｔｒａｐｓ，ａｎｄ  ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”２０（６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９２−９（２００９）に記載されている。
【００９０】
「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部または全部を含み（そのうちの１つは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分である）、それらの天然の状態で融合していない。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ−１トラップ（例えば、ｈＩｇＧｌのＦｃに融合したＩＬ−１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するＲｉｌｏｎａｃｅｐｔ。米国特許第６，９２７，００４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧｌのＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体ＦｌｋｌのＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２、例えば、配列番号１を含有するＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ。米国特許第７，０８７，４１１号および同第７，２７９，１５９号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）などのトラップである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、４０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で凍結乾燥前水溶液中に含まれる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥前水溶液は、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ〜約１７５ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥前水溶液は、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１０５ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１１５ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１３５ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１４５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１５５ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１６５ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１８５ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約１９５ｍｇ／ｍＬ、または約２００ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を含む。
【００９２】
容器
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質を含有する凍結乾燥前水溶液は、容器に含まれる。フリーズドライプロセスは、半密閉式容器内の溶液に適用され、続いてこれは、閉鎖されてフリーズドライ組成物を含む。容器という用語は、本明細書では非常に広く適用される。容器は、例えば、２ｍＬ〜最大４リットル以上を含むことが可能なボトル、ジャー、またはキャニスタなどのバルク容器、アンプル、バイアル（ガラスもしくはプラスチック）、注射器（ガラスもしくはプラスチック）、カートリッジ、または自動注入器であってもよい。バイアルは、０．２ｍＬ以下ほど小さくても、または１００ｍＬほど大きくてもよい。例示的なバイアルは、透明ガラスまたはアンバーガラス、タイプＩホウケイ酸ガラス、タイプＩＩケイ酸ソーダガラス、またはタイプＩＩＩケイ酸ソーダガラスで作られてもよい。バイアルは、栓、キャップ、フリップキャップ、またはスクリューキャップで閉鎖され得る。ＳＣＨＯＴＴ（登録商標）スタイルの管状ガラスは、凍結乾燥用途において特に有用である。
【００９３】
生物学的薬剤の出現および注入可能な薬剤の患者の自己投与により、自動注入器は、薬物製品のためのより重要な容器となってきた。凍結乾燥薬物製品の自己投与は、患者が凍結乾燥ケーキを注入用滅菌水または他の滅菌溶媒で再構成することを必要とする。滅菌再構成、体積制御、取扱いの容易さ、および全体的な単純化を確実にするのを助けるために、デュアルまたはマルチチャンバ充填済み注射器が使用され得る。デュアルチャンバ自動注入器または他の充填済み注射器は、一方のチャンバに凍結乾燥薬物製品を含み、もう一方のチャンバに予め測定した量の希釈剤または液体医薬組成物を含む。例となるデュアルチャンバ注入器は、２００６年１１月２１日に登録された米国第６，１４９，６２６Ａ号、および２０１１年６月１４日に登録された米国第７，９５９，６００Ｂ２号に記載されている。
【００９４】
タンパク質安定性
凍結乾燥形態のタンパク質は、いくつかの利点を提供し、そのうちの１つは、長期間、特に室温で少なくとも１８ヶ月、タンパク質の安定性を維持することである。「室温」は、通常の作業環境の温度を指す。室温には、１０〜４０℃、１７〜２７℃、２０〜２４℃、２５℃±３℃、２５℃±２℃、２５℃±１℃の範囲内、または約２５℃の温度が含まれる。「室温」という語句は、「周囲温度」という語句と互換的に使用され得る。室温は、「制御された室温」を包含し、これは薬局、病院、および倉庫で経験され得る１５°〜３０°の過渡偏差（逸脱）を伴う２０℃〜２５℃の通常の作業環境の温度を示す。「制御された室温」は、２５℃以下の計算された平均動態温度を含む（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｔｈｉｒｔｙ−Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｔｗｅｎｔｙ−Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳＰ  ３３−ＮＦ  ２８  Ｒｅｉｓｓｕｅ，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｎｏｔｉｃｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ，“Ａｐｐｌｙｉｎｇ  ｔｏ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｔｅｓｔｓ，Ａｓｓａｙｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ”，§１０．３０  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍｉｄｉｔｙ（２０１０年５月１日）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ｕｓｐ＿ｐｄｆ／ＥＮ／ＵＳＰＮＦ／ＵＳＰ３３−ＮＦ２８−ＲｅｉｓｓｕｅＧｅｎｅｒａｌＮｏｔｉｃｅｓ．ｐｄｆで入手可能（最終アクセス２０１６年７月８日）を参照されたい）。
【００９５】
「安定性」という用語は、関連する環境中またはある特定の条件下での貯蔵後のタンパク質の許容可能な程度の物理構造（熱力学的およびコロイド安定性）、化学構造（速度論的安定性）、または生物学的機能（機能安定性）の保持を指す。タンパク質は、たとえそれが一定期間の貯蔵後にその物理構造、化学構造、または生物学的機能の１００％を維持しなくても安定であり得る。ここで、例えば、凍結乾燥タンパク質は、室温で最大２４ヶ月の貯蔵後にタンパク質集団の２％以下が高分子量形態で存在するときに、安定と見なされる。いくつかの実施形態では、タンパク質の約３％、約２．９％、約２．８％、約２．７％、約２．６％、約２．５％、約２．４％、約２．３％、約２．２％、約２．１％、約２％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、約１．０％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、または約０．１％以下が、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約３６ヶ月、または１８ヶ月以上の室温での貯蔵後に高分子量形態である場合に、凍結乾燥または他の固体形態のタンパク質は、安定と見なされる。
【００９６】
ここで、高分子量種のパーセント変化が、室温での貯蔵の最初の月の間に約０．５％超、約０．６％超、約０．７％超、約０．８％超、または約０．９％超である場合に、凍結乾燥または他の固体形態のタンパク質は、室温で「不安定」と見なされる。したがって、室温での貯蔵の最初の月の間に０．５％以下の高分子量種のパーセント増加を有する凍結乾燥または他の固体形態のタンパク質は、安定と見なされ得る。
【００９７】
安定性は、とりわけ、規定の温度で規定の時間貯蔵した後、または患者に送達した後に製剤中に残存する天然分子の割合を決定することによって測定され得る。その天然型を保持するタンパク質の割合（例えば、高分子量種および低分子量種を含む、全タンパク質に対する天然種の割合）は、とりわけ、サイズ排除クロマトグラフィ（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィ［ＳＥ−ＨＰＬＣ］）によって決定され得る。凍結乾燥タンパク質の場合、ケーキが最初に可溶化され、次いでタンパク質が試験に供される。天然タンパク質には、凝集していないか、または別様に分解されていないタンパク質が含まれる。ある特定の実施形態では、天然型のタンパク質の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、規定の温度で規定の期間貯蔵した後に凍結乾燥ケーキ中で検出され得る。凍結乾燥ケーキ中のタンパク質の８０％超、好ましくは９０％超がその天然型であるべきである。安定性が測定される既定の期間は、少なくとも１４日、少なくとも２８日、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１３ヶ月、少なくとも１４ヶ月、少なくとも１５ヶ月、少なくとも１６ヶ月月、少なくとも１７ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも１９ヶ月、少なくとも２０ヶ月、少なくとも２１ヶ月、少なくとも２２ヶ月、少なくとも２３ヶ月、少なくとも２４ヶ月、またはそれ以上であり得る。安定性を評価するときに試料が保持され得る温度は、約−８０℃〜約５０℃、例えば、約−８０℃、約−３０℃、約−２０℃、約０℃、約４°〜８℃、約５℃、約２５℃、または他の室温、約３５℃、約３７℃、または他の生理学的温度、約４５℃、または約５０℃の任意の温度であり得る。
【００９８】
安定性は、とりわけ、規定の温度で規定の期間後に凍結乾燥ケーキ内で凝集体（すなわち、高分子量種、別名、ＨＭＷ種）を形成するタンパク質の割合を決定することによって測定され得、安定性は、形成される高分子量（ＨＭＷ）種のパーセントに反比例する。タンパク質のＨＭＷ種の割合は、上記のように、とりわけ、可溶化後のサイズ排除クロマトグラフィによって決定され得る。凍結乾燥タンパク質組成物はまた、室温で３ヶ月後にタンパク質の約１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満がＨＭＷ形態で検出される場合に安定とみなされ得る。
【００９９】
安定性は、規定の温度で規定の期間後に凍結乾燥ケーキ内で分解されるか、または別様に低分子量（ＬＭＷ）種として発見されるタンパク質の割合を決定することによって測定され得、安定性は、可溶化された凍結乾燥ケーキで検出されるＬＭＷ種のパーセントに反比例する。タンパク質のＬＭＷ種の割合は、上記のように、サイズ排除クロマトグラフィによって決定され得る。タンパク質の凍結乾燥ケーキはまた、室温で３ヶ月後に第１の分子の約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満がＬＭＷ形態で検出される場合に安定とみなされ得る。
【０１００】
例えば、熱安定性を決定するための示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、機械的安定性を決定するための制御された撹拌、および溶液濁度を決定するための約３５０ｎｍまたは約４０５ｎｍにおける吸光度などの他の方法が、凍結乾燥タンパク質の安定性を評価するために使用され得る。例えば、本発明の製剤は、約５℃〜約２５℃で６ヶ月以上貯蔵した後、製剤のＯＤ４０５の変化が、時間０における製剤のＯＤ４０５から約０．０５未満（例えば、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、またはそれ以下）である場合に安定と見なされ得る。
【０１０１】
安定性はまた、抗体または他のタンパク質のその標的に対する生物学的活性、生理学的活性、または結合親和性を測定することによって評価され得る。例えば、凍結乾燥抗体は、既定の期間（例えば、最大１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月など）、例えば、５℃、２５℃、３７℃、４５℃、５０℃などで貯蔵した後に、凍結乾燥製剤内に含まれる抗体が、前述の凍結乾燥および貯蔵前の抗体の結合親和性の少なくとも５０％、９５％、またはそれ以上である親和性で、その同族エピトープ含有抗原に結合する場合に、安定と見なされ得る。結合親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはプラズモン共鳴によって決定され得る。生物学的活性は、抗体、可溶性受容体、またはリガンド活性アッセイ、例えば、同族結合パートナーを発現する細胞を抗体、可溶性受容体、またはリガンドを含む再構成製剤と接触させることによって決定され得る。そのような細胞への抗体、可溶性受容体、またはリガンドの結合は、例えば、ＦＡＣＳ分析などを介して直接測定され得る。タンパク質は、タンパク質の生物学的または生理学的な比活性度（すなわち、効力）が、室温で少なくとも１８ヶ月貯蔵した後のその初期（Ｔ０）効力の少なくとも５０％である場合に「安定」と見なされ得る。安定なタンパク質は、室温で最大１２ヶ月、最大１３ヶ月、最大１４ヶ月、最大１５ヶ月、最大１６ヶ月、最大１７ヶ月、最大１８ヶ月、最大１９ヶ月、最大２０ヶ月、最大２１ヶ月、最大２２ヶ月、最大２３ヶ月、または最大２４ヶ月貯蔵した後に、少なくとも５１％の効力、少なくとも５２％の効力、少なくとも５３％の効力、少なくとも５４％の効力、少なくとも５５％の効力、少なくとも５６％の効力、少なくとも５７％の効力、少なくとも５８％の効力、少なくとも５９％の効力、少なくとも６０％の効力、少なくとも６１％の効力、少なくとも６２％の効力、少なくとも６３％の効力、少なくとも６４％の効力、少なくとも６５％の効力、少なくとも６６％の効力、少なくとも６７％の効力、少なくとも６８％の効力、少なくとも６９％の効力、少なくとも７０％の効力、少なくとも７１％の効力、少なくとも７２％の効力、少なくとも７３％の効力、少なくとも７４％の効力、少なくとも７５％の効力、少なくとも７６％の効力、少なくとも７７％の効力、少なくとも７８％の効力、少なくとも７９％の効力、少なくとも８０％の効力、少なくとも８１％の効力、少なくとも８２％の効力、少なくとも８３％の効力効力、少なくとも８４％の効力、少なくとも８５％の効力、少なくとも８６％の効力、少なくとも８７％の効力、少なくとも８８％の効力、少なくとも８９％の効力、少なくとも９０％の効力、少なくとも９１％の効力、少なくとも９２％の効力、少なくとも９３％の効力、少なくとも９４％の効力、少なくとも９５％の効力、少なくとも９６％の効力、少なくとも９７％の効力、少なくとも９８％の効力、または少なくとも９９％の効力を保持する。
【０１０２】
「安定な」タンパク質は、最大１８ヶ月などの長期間にわたる室温での貯蔵後に構造または比活性度の変化をほとんどまたは全く受けない。構造の変化には、凝集体または他の高分子量形態のタンパク質の形成、ペプチド結合の加水分解などのタンパク質の分解、および脱アミド、アシアリル化などの化学分解が含まれる。例えば、抗体分解の一般的な形態は、可逆的二量体および三量体、ならびにより安定で、かつあまり可逆性ではない四量体および高次多量体を含む凝集体の形成である。「不可逆的凝集体」は、凍結乾燥ケーキの再構成時に容易に可溶化または解離しない凝集体のサブセットである。「安定な」タンパク質は、室温で最大７ヶ月、最大８ヶ月、最大９ヶ月、最大１０ヶ月、最大１１ヶ月、最大１２ヶ月、最大１３ヶ月、最大１４ヶ月、最大１５ヶ月、最大１６ヶ月、最大１７ヶ月、最大１８ヶ月、最大１９ヶ月、最大２０ヶ月、最大２１ヶ月、最大２２ヶ月、最大２３ヶ月、または最大２４ヶ月貯蔵した後に、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満である、高分子量種の形成の増加を受ける。高分子量種を検出する方法は、０．２〜０．３％の検出変動性を有し得る。
【０１０３】
タンパク質凝集または他の高分子量種の形成の温度依存性の速度は、アレニウスまたは修正アレニウス速度論（わずかに湾曲したアレニウスプロット）に従う（例えば、Ｃｈａｋｒｏｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ，”Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１３：３０７−３１９（２０１６）を参照されたい）。したがって、所与の製剤についての所与の温度での経時的な凝集速度および高分子量種のパーセント変化は、時間平方根関係およびアレニウスまたは修正アレニウス速度論に基づき予測され得る。例えば、凍結乾燥試料は、密封ガラスバイアル中で所与の温度（例えば、５℃、２５℃、３７℃、５０℃）においてインキュベートされる。アリコートは、一定間隔で採取され、不溶性凝集体が除去され、次いでＳＥ−ＨＰＬＣに供される。観察された凝集速度は、時間依存性のメインピーク対ＨＭＷピーク面積データの線形適合から直接決定される。高分子量種のパーセント変化の予測は、時間平方根速度則およびアレニウス速度論をデータに適用することによって行われる。例えば、様々な温度で観測された速度定数は、アレニウスの式、ｌｎ  ｋ＝ｌｎ  Ａ−（Ｅ／ＲＴ）に当てはめられ、式中、Ｅは、活性化エネルギー（ｃａｌ／ｍｏｌ）であり、Ｒは、一般ガス定数（１．９８７ｃａｌ／ｍｏｌ／Ｋ）であり、Ｔは、絶対温度（ケルビン単位）であり、ｌｎ  Ａは、衝突頻度などの因子を含む温度定数である。ｋの値は、アレニウスフィットから外挿されて、所与の温度（例えば、２５℃）における高分子量種の経時的な変化（例えば、２４ヶ月）を予測する。
【０１０４】
凍結乾燥
一般的にタンパク質を凍結乾燥する方法、および特に治療用抗体または他の抗原結合タンパク質を凍結乾燥する方法は、当該技術分野において周知である。簡潔に、一実施形態では、凍結乾燥は、上記のように、原薬と賦形剤とを含有する凍結乾燥前水溶液から始まる。凍結乾燥前水溶液は、開放容器（例えば、バイアル）内に配置され、開放容器は、棚上の凍結乾燥チャンバ内に配置される。凍結乾燥プロセスは、３つの基本的なステップ：（１）任意のアニーリングサイクルを伴う凍結、（２）一次乾燥、および（３）任意の乾燥後アニーリングステップを伴う二次乾燥を含む。第１のステップは、凍結である。ここで、棚温度は低下させられて、バイアル内の製剤を冷却する。氷晶が製剤内に形成され、製剤の残部は、より濃縮され粘性になる。濃縮された残部は凝固して、非晶質、結晶質、または結晶質／非晶質の組み合わされた状態を形成する。一実施形態では、残部は、非晶質ガラス状態で凝固する。
【０１０５】
いくつかの凍結乾燥プロトコルでは、凍結組成物は、結晶化を促進するためにアニーリングに供される。固体残部は、マンニトールおよびグリシンのような増量剤などのいくつかの成分を結晶化するためにある期間にわたって最終凍結温度より高い温度に保持される。
【０１０６】
次いで、氷は、昇華によって除去される。凍結乾燥チャンバの圧力（例えば、４０〜４００トル）および棚温度（−３０℃〜＋１０℃）は、水の三重点未満に調整される。温度は、非晶質残部がケーキ構造の崩壊を防止するために、ガラス転移温度（Ｔｇ）未満に維持される。
【０１０７】
一次乾燥ステップ後、一部の水は、マトリクス内に閉じ込められたままである場合がある。残りの水は、二次乾燥ステップ中の脱着プロセスを通して除去される。ここで、棚温度は、脱着を促進し、かつ凍結乾燥生成物中の最適な水分含量を達成するために高められる。一実施形態では、最終水分含量は、約０．５％以上および約１０％以下である。別の実施形態では、最終水分含量は、約３％以上および約６％以下である。特定の実施形態では、水分含量は、３％超であるが４％未満である。別の特定の実施形態では、水分含量は、約３％である。別の特定の実施形態では、水分含量は、約３．５％である。別の特定の実施形態では、水分含量は、約４％である。別の特定の実施形態では、水分含量は、約４．５％である。さらに別の特定の実施形態では、水分含量は、約６％である。
【０１０８】
一実施形態では、凍結乾燥生成物（「凍結乾燥ケーキ」）は、二次乾燥ステップ後にアニーリングステップに供される。乾燥後アニーリングはまた、物理エージングまたは構造緩和とも称される。この乾燥後アニーリングステップは、非晶質マトリクスの平衡ガラス状態への緩和（アルファ緩和）を促進し、貯蔵温度での構造緩和時間を増加させ、ガラス状態での移動度を減少させ、かつタンパク質をより安定なエネルギー状態に低下させ、それによりタンパク質安定性を最適化する可能性が高い。ここで、アニーリングステップは、分子移動度を短時間促進して、ガラス状態のエントロピーおよびタンパク質の回転形態の全体的な低減を可能にする。
【０１０９】
アニーリングステップ後、ガラスのランダムな熱力学的分子状態の数は、最小化され、ガラス平衡は、最大化される。いくつかの実施形態では、アニーリング温度は、生成物のＴｇ未満である。いくつかの実施形態では、アニーリング温度は、２５℃〜約９０℃、２５℃〜約８０℃、２５℃〜約７５℃、約約２５℃〜約７０℃、３５℃〜約７０℃、４０℃〜約７０℃、３０℃〜約５５℃、５０℃〜約６０℃、５５℃〜約６５℃、６０℃〜約７０℃、６５℃〜約７５℃、７０℃〜約８０℃、または７５℃〜約８５℃である。いくつかの実施形態では、アニーリング温度は、約９０℃、約８０℃、約７９℃、約７８℃、約７７℃、約７６℃、約７５℃、約７４℃、約７３℃、約７２℃、約７１℃、約７０℃、約６９℃、約６８℃、約６７℃、約６６℃、約６５℃、約６４℃、約６３℃、約６２℃、約６１℃、約６０℃、約５９℃、約５８℃、約５７℃、約５６℃、約５７℃、約５６℃、約５５℃、約５４℃、約５３℃、約５２℃、約５１℃、約５０℃、約４９℃、約４８℃、約４７℃、約４６℃、約４５℃、約４４℃、約４３℃、約４２℃、約４１℃、約４０℃、約３９℃、約３８℃、約３７℃、約３６℃、約３５℃、約３４℃、約３３℃、約３２℃、約３１℃、約３０℃、約２９℃、約２８℃、約２７℃、約２６℃、または２５℃である。特定の実施形態では、アニーリング温度は、２５℃を超える。別の特定の実施形態では、アニーリング温度は、５０℃を超える。
【０１１０】
凍結乾燥ケーキは、ＤＳＣからのエントロピー回復または等温熱量測定によって定義されるケーキ構造の緩和を可能にするのに十分な期間、アニーリング温度に保持される。いくつかの実施形態では、アニーリング温度は、約１２時間〜約２週間、約１２時間〜１週間、約１２時間〜約数日間、約１８時間〜約７２時間、約２４時間〜約３６時間、約３０時間〜約４２時間、約３６時間〜約４８時間、約４２時間〜約５４時間、約４８時間〜約６０時間、約５４時間〜約６６時間、約６０時間〜約７２時間、約６６時間〜約７８時間、または約７２時間〜約８４時間保持される。いくつかの実施形態では、アニーリング温度は、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約４９時間、約５０時間、約５１時間、約５２時間、約５３時間、約５４時間、約５５時間、約５６時間、約５７時間、約５８時間、約５９時間、約６０時間、約６１時間、約６２時間、約６３時間、約６４時間、約６５時間、約６６時間、約６７時間、約６８時間、約６９時間、約７０時間、約７１時間、約７２時間、約７３時間、約７４時間、約７５時間、約７６時間、約７７時間、約７８時間、約７９時間、約８０時間、約８１時間、約８２時間、約８３時間、または約８４時間保持される。
【０１１１】
特定の実施形態では、アニーリング温度は、５０℃を超え、これは約７２時間保持される。別の特定の実施形態では、アニーリング温度は、約２５℃であり、これは約７２時間保持される。
【０１１２】
一実施形態では、アニーリング条件は、示差走査熱量計で乾燥後アニーリングステップを実施することによって実験的に決定される。温度曲線の吸熱領域は、一般に、アニーリング効果の直後に発生し、実践者がアニーリング温度を選択することを可能にする。Ｓａｒｔｏｒら，“Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｕｎｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈｙｄｒａｔｅｄ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ａｎｄ  Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，”６６  ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪ．２４９−２５８（１９９４）を参照されたい。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する説明を当業者に提供するために提示され、本発明の範囲を制限するよう意図されていない。使用される数（例えば、量、サイズなど）に関する精度を確実にするための努力が払われてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が説明されるべきである。
【０１１４】
実施例１：凍結乾燥手順
（本明細書に記載される）抗体と賦形剤とを含有する凍結乾燥前水溶液をタイプＩホウケイ酸ガラスバイアルに装填した。充填バイアルをＬＹＯＳＴＡＲ３凍結乾燥機（ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｒｍｉｎｓｔｅｒ，ＰＡ）内に配置した。チャンバを閉鎖し、棚温度を５℃に低下させた。試料を凍結前に３０分間５℃に保持した。凍結のための昇温速度は、０．５℃／分であった。棚温度を６０分間−４５℃に保持した。
【０１１５】
一次乾燥を、約１００ｍＴｏｒｒの真空設定点および約−２５℃の棚温度で実施し、これを約５０時間、約０．５℃／分の加熱のための昇温速度で達成した。
【０１１６】
二次乾燥を３５℃で実施し、これを約０．３℃／分の加熱のための昇温速度で達成した。二次乾燥は、約６時間継続した。
【０１１７】
二次乾燥後、チャンバを窒素ガスで約０．８気圧（約６０８，０００ｍＴｏｒｒ）の圧力に再充填し、バイアルにＦｌｕｒｏｔｅｃ（登録商標）被覆４４３２／５０ブチルゴム凍結乾燥栓で栓をした。
【０１１８】
実施例２：水分含量対タンパク質安定性
水分子は、凍結乾燥生成物中で可塑剤および安定剤として役に立ち得る。水は、その小さいサイズ、ならびに他の水分子および他の分子（タンパク質分子など）と水素結合を形成する能力により、可塑剤として役立つ。安定剤／可塑剤として水を使用することの利点は、再構成製剤の張度に影響を与えることなく、安定剤（水）対タンパク質の比が増加し得ることである。水分含量は、凍結乾燥プロセスの設計を通して調整され得る。凍結乾燥ケーキの水分含量を、Ｃｏｍｐｕｔｒａｃ（登録商標）Ｖａｐｏｒ  Ｐｒｏ（登録商標）水分計（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＬＬＣ，Ｃｈａｎｄｌｅｒ，ＡＺ）によって決定した。
【０１１９】
組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３）をＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞中で産生し（２０１０年８月１０日に発行された米国特許第７，７７１，９９７Ｂ２号を参照されたい）、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、０．１％ポリソルベート８０、５％スクロース、および１．５４％アルギニン（凍結乾燥前液体製剤中、全て％ｗ／ｖ）中１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤化した。液体製剤を特定のレベルの水分含量（％ｗ／ｗ）まで上記のように凍結乾燥し、５０℃、３７℃、または２５℃で特定の時間貯蔵した。貯蔵後、凍結乾燥製剤を水で再構成し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）に供した。高分子量（ＨＭＷ）種を検出し、統合し、Ｔ＝０の対照と比較した。全タンパク質の一部分としてのＨＭＷ種のパーセント変化を計算し、表１に報告した。凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１は、２５℃で貯蔵されたときに約４．５％の水分含量を有し、最も安定であった。
【０１２０】
３〜１０％の水分含量を有するｍＡｂ１の凍結乾燥製剤は、２４ヶ月の２５℃での貯蔵後に約２．０％以下分解すると予測された。アレニウス速度論アルゴリズムを測定された分解速度に適用し、時間平方根速度則に基づく予測を少なくとも２４ヶ月まで行った。各水分含量点についてのＨＭＷ種のパーセント変化は、表２に報告される。凍結乾燥前水性製剤は、１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、０．１％ポリソルベート８０、５％スクロース、１．５４％アルギニンであった。
【０１２１】
実施例３：乾燥後アニーリングの効果
凍結乾燥薬物製品をアニーリングすることによって、タンパク質安定性が改善された。凍結乾燥製剤をガラス転移温度未満でアニーリングすることは、非晶質分子をより低いエネルギー状態に緩和し、より安定な生成物をもたらすと仮定される。凍結乾燥製剤を７０℃で７２時間アニーリングすると、１０％スクロースおよび３．０８％アルギニンで凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１について、％ＨＭＷの観察された増加が低くなった（凍結乾燥前製剤：１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、０．１％ポリソルベート８０、１０％スクロース、３．０８％アルギニン）。抗体のＨＭＷ種のパーセント変化は、２５℃、３７℃、および５０℃で６ヶ月貯蔵したアニーリング製剤および非アニーリング製剤について表３に報告される。
【０１２２】
【表１】
2019534263.tif 000002
【０１２３】
【表２】
2019534263.tif 000003
【０１２４】
アレニウス速度論アルゴリズムを測定された分解速度に適用し、アニーリングされた試料対３７℃で貯蔵されたアニーリングされていない試料について、時間平方根速度則に基づく予測を少なくとも２４ヶ月まで行った。アニーリングは、２４ヶ月においてアニーリングされていない試料よりも約２０％少ないＨＭＷ種をもたらすと予測された（すなわち、５．７６％対６．０５％の△％ＨＭＷ）。
【０１２５】
【表３】
2019534263.tif 000004
【０１２６】
実施例４：安定性に対する個々の賦形剤の効果
糖、ポリオール、塩、およびアミノ酸を含む特定の安定剤を、凍結乾燥抗体を安定化するそれらの個々の能力について評価した。凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１は、スクロースと製剤化された場合に最も安定であった（表４を参照されたい）。スクロース製剤のＴｇは、室温での貯蔵に対して十分高く（約１１０℃）、必要な場合、可塑剤を添加するのに十分な許容度を提供する。
【０１２７】
実施例５：安定性に対するトレハロースの組み合わせ効果
トレハロースまたはスクロースをソルビトールまたはマンニトールなどの可塑剤と組み合わせると、驚くべきことに、より安定な室温製剤をもたらした。ソルビトールおよびトレハロースの組み合わせは、トレハロース単独よりも凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を安定化した。ベースの凍結乾燥前製剤は、凍結乾燥前にトレハロースおよびソルビトールの様々な組み合わせを添加した１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、０．１％ポリソルベート８０であった。トレハロースおよび／またはソルビトールと組み合わせた凍結乾燥タンパク質の安定性を表５にΔ％ＨＭＷとして示した。
【０１２８】
【表４】
2019534263.tif 000005
【０１２９】
【表５】
2019534263.tif 000006
【０１３０】
実施例６：安定性に対するスクロースの組み合わせ効果
マンニトールおよびスクロースの組み合わせは、スクロース単独よりも凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を安定化した。ベースの凍結乾燥前製剤は、凍結乾燥前にスクロースおよびマンニトールの様々な組み合わせを添加した１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０、０．１％ポリソルベート８０であった。スクロースおよび／またはマンニトールと組み合わせた凍結乾燥タンパク質の安定性を表６にΔ％ＨＭＷとして示した。マンニトールおよびスクロースの組み合わせは、スクロース単独よりも凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を安定化した。
【０１３１】
【表６】
2019534263.tif 000007
【０１３２】
凍結乾燥抗体を安定化する能力を評価するために、スクロースをポリオールおよびアミノ酸と組み合わせた。１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を、スクロース（Ｓｕｃ）、ならびにソルビトール（Ｓｏｒ）、グリセロール（Ｇｌｙ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびアラニン（Ａｌａ）のうちのいずれか１つと異なる割合で組み合わせた。ＨＭＷ種の変化を、様々な貯蔵時間で２５℃および５℃において評価した。結果（Δ％ＨＭＷ）は、表７に示される。２５℃で貯蔵した場合、試験した賦形剤の組み合わせのいずれも、スクロース単独よりも凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を安定化しなかった。驚くべきことに、ソルビトールおよびスクロースの組み合わせは、５℃で１２０ヶ月貯蔵した場合にスクロース単独よりも安定性を改善すると予測され、スクロース単独よりも安定である。
【０１３３】
実施例７：原薬の安定性に対するスクロースおよびアルギニンの組み合わせ効果
凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１および凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ２は、１０％スクロースおよび３．０８％アルギニンを用いて製剤化した場合に同等の安定性を有する。ＨＭＷ種の％変化を、２５℃、３７℃、および５０℃における１ヶ月の貯蔵で計算した。凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１および凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ２は、１０％スクロースおよび３．０８％アルギニンを用いて製剤化した場合に、２５℃で２４ヶ月以上まで同等の安定性を有すると予測された。Δ％ＨＭＷ分析の結果は、表８に示される。
【０１３４】
【表７】
2019534263.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2019534263.tif 000009
【０１３６】
実施例８：薬物製品安定性に対する安定剤対薬物製品の比の効果
スクロースおよびアルギニンの組み合わせを抗体と様々な重量比で製剤化し、Δ％ＨＭＷを５０℃および２５℃において様々な時点で決定した。安定剤対タンパク質が０．８７：１以上である凍結乾燥された１５０ｍｇ／ｍＬの抗体製剤は、２４ヶ月、２５℃での貯蔵後に１％以下分解すると予測される（時間平方根速度則およびアレニウス速度論に基づく）。結果は、表９に列挙される。
【０１３７】
【表９】
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【０１３８】
【表１０】
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【０１３９】
実施例９：凍結乾燥前液体製剤中の低タンパク質濃度での凍結乾燥タンパク質に対する賦形剤の安定化効果
糖、ポリオール、塩、およびアミノ酸を含む特定の安定剤を、凍結乾燥抗体を安定化するそれらの個々の能力について評価した。凍結乾燥された２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ３は、スクロース、トレハロースまたはアルギニンが安定剤として含まれた場合に、目立った分解を示さなかった。結果は、表１０に示される。グリセロールも試験したが、凍結乾燥後に著しい分解が観察された。
【０１４０】
凍結乾燥抗体を安定化する能力を評価するために、トレハロースをポリオールおよびアミノ酸と組み合わせた。２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ３を、トレハロース（Ｔｒｅ）、ならびにソルビトール（Ｓｏｒ）、グリセロール（Ｇｌｙ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびアラニン（Ａｌａ）のうちのいずれか１つと異なる割合で組み合わせた。ＨＭＷ種の変化を、様々な貯蔵時間で２５℃において評価した。結果（Δ％ＨＭＷ）は、表１１に示される。３ヶ月、２５℃での貯蔵後に試験した２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ３凍結乾燥製剤のいずれにおいても、目立った分解は観察されなかった。
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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