(57)【要約】  本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、摂取された食事を感知し、生物学的システム内の血糖数値とインスリン分泌を調節できる新たな経口遺伝子伝達システムで経口投与用遺伝子伝達のためのナノ粒子に関し、より詳細には、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む遺伝子伝達用ナノ粒子およびこれを含む薬学組成物に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子；および
遺伝子；を含み、
前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項２】
前記イオン性高分子は、陽イオン性高分子である、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項３】
前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）およびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）からなる群より選択されるものである、請求項２に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項４】
前記イオン性高分子は、陰イオン性高分子である、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項５】
前記陰イオン性高分子は、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびコンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）から選択されるものである、請求項４に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項６】
陽イオン性高分子をさらに含むものである、請求項４に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項７】
前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）およびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項８】
前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子は、二硫化結合により共有結合したものである、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項９】
前記胆汁酸またはその誘導体は、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロコール酸（ＴＣＡ：ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリココール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびグリコケノデオキシコール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１０】
前記胆汁酸またはその誘導体は、タウロコール酸（ＴＣＡ：ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である、請求項９に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１１】
前記遺伝子は、単鎖または二重鎖ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、単鎖または二重鎖ＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、プラスミド形ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、リボザイム、触媒的ＲＮＡおよびヌクレオチドの中から選択された１つ以上である、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１２】
前記遺伝子は、ＧＬＰ−１遺伝子（ＧＬＰ−１  ｇｅｎｅ）、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）およびエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）からなる群より選択される１つ以上である、請求項１１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１３】
前記胆汁酸またはその誘導体とイオン性高分子は、１：１〜１：３００のモル比で共有結合するものである、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１４】
前記ナノ粒子のサイズは、５００ｎｍ以下である、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１５】
前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子は、１：１〜１：２００のモル比で結合するものである、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１６】
前記ナノ粒子のＮ／Ｐ比（胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子の窒素原子の個数／遺伝子のリン酸塩原子の個数）は、１〜２００である、請求項１に記載の遺伝子伝達用ナノ粒子。
【請求項１７】
胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１、Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物。
【請求項１８】
前記薬学組成物は、経口投与用である、請求項１７に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率的な経口投与用遺伝子伝達のための標的型ナノ粒子に関し、より詳細には、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む遺伝子伝達用ナノ粒子およびこれを含む薬学組成物に関する。また、本発明は、標的にしようとする小腸細胞に遺伝子や治療タンパク質を伝達して副作用を最小化し、現在の治療技術の効率性を提供するための遺伝子伝達用ナノ粒子およびこれを含む薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療遺伝子を体内の所望する臓器に伝達して細胞内で新しいタンパク質を発現させることで疾病を治療する遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、疾病の症状を治療するのではなく、疾病の原因を除去して治療する方式である。遺伝子治療は、一般的な薬物による治療に比べて優れた選択的治療効果を有し、他の治療法では調節しにくい疾病の治療率および治療速度を改善して長期間適用することができる。
【０００３】
遺伝子治療は、多様な疾病治療のために記載されている次世代治療技術であるが、巨大分子であるＤＮＡ、ＲＮＡなどを水溶液状態で細胞内に伝達する場合、生体内の特定酵素によって急速に分解され細胞伝達率が低くて、遺伝子治療を効果的にするためには、治療遺伝子を所望する標的細胞に安全に伝達して高い発現効率が得られるようにする遺伝子伝達体（ｇｅｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）を開発することが必須である。
【０００４】
遺伝子伝達体は、毒性が低かったりなければならず、遺伝子を選択的で効果的に所望する細胞に伝達できなければならない。このような遺伝子伝達体は、大きく、ウイルス性と非ウイルス性とに分けられる。
【０００５】
ウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）は、レトロウイルス（ＲＶ；Ｒｅｔｒｏ  Ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ＡＶ；Ａｄｅｎｏ  Ｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；Ａｄｅｎｏ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）などを遺伝子伝達体として用いたものであって、非ウイルス性ベクター（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）に比べて遺伝子伝達効率が高いのに対し、体内適用時、ベクター自体が誘発する免疫反応や癌誘発などが問題となり、ベクターに挿入可能な遺伝子の大きさにも制限がある。
【０００６】
高分子やナノ粒子などの非ウイルス性ベクターは、ウイルス性ベクターによる生物学的危険性が低く、非免疫原性であり、変形および大量生産が可能であり、伝達可能な遺伝子の大きさにも比較的制限がないという利点のため、最近多くの研究が行われている。特に、陽イオン性高分子などの非ウイルス性ベクターを用いる方法が、製造方法の簡便性や相対的に低い危険性のため、多く研究されている。具体的なメカニズムは、負電荷を帯びている遺伝子と静電的相互作用によって複合体を形成して遺伝子を安定化させ、複合体表面の正電荷と細胞表面の負電荷が電気的相互作用によって複合体が細胞表面に結合した後、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から細胞質に遺伝子が放出される過程を経る。
【０００７】
このような陽イオン性高分子の具体例としては、プロタミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリアミノエステル、ポリプロピレンイミンのような陽イオン性単一重合体、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ブロック−ポリＬ−リシンおよびＰＥＧ−ＰＥＩのような陽イオン性ブロック共重合体などが挙げられ、これらは、ＤＮＡなどの遺伝子を圧縮してナノ粒子を形成することにより酵素分解から遺伝子を保護し、速やかに細胞内に侵入してエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から抜けられるように助ける。
【０００８】
大部分の非ウイルス性ベクターは、ウイルス性ベクターに比べて生分解性、低い毒性、非免疫原性、使用上の簡便さなどの利点を有するが、ウイルス性ベクターに比べて相対的に低い形質導入効率、制限的な粒子サイズなどの問題点がある。
【０００９】
現在、非ウイルス性ベクターとして最も広範囲に研究されているポリエチレンイミン（ＰＥＩ）も、生体内の形質導入効率が著しく低下し、高い細胞毒性および低い血液適合性による遺伝子の低い発現効果などの問題点がある。
【００１０】
一方、韓国公開特許第１０−２０１０−０１２２４０５号は、親水性高分子と疎水性高分子が結合した複合体である両親性高分子ナノ粒子にｓｉＲＮＡを結合させたｓｉＲＮＡ伝達体で、親水性高分子としてキトサンとポリエチレンイミドそれぞれを、胆汁酸の５−β−コール酸（５−β−ｃｈｏｌａｎｉｃ  ａｃｉｄ）と結合させて複合体を生成した後、それぞれの複合体を混合して製造されたナノ粒子形態の両親性高分子ナノ粒子を開示している。特に、前記文献は、胆汁酸の疎水性基とキトサン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の親水性基による両親性によって水系で球形の自己集合体を形成し、これによって、キトサン−胆汁酸／ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）−胆汁酸の複合体ナノ粒子は、表面には強い両親性を帯びるポリエチレンイミンとキトサンが、内部（ｃｏｒｅ）には疎水性の胆汁酸が位置していることを開示している。しかし、ＰＥＩの毒性の深刻性のため、臨床実験にはたどり着けずにいる。
【００１１】
したがって、安全で効率的な遺伝子伝達のために、既存の非ウイルス性ベクターの利点はそのまま維持しつつ、形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）効率を増強させた遺伝子伝達体の開発が切実に求められている。
【００１２】
一方、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は、インスリンの分泌量が不足したり正常な機能が行われず、血中ブドウ糖の濃度が高くなる代謝疾患で、インスリンがうまく分泌しなかったり、分泌したインスリンが体内でうまく作用せず体内の血糖が調節できずに上昇する場合を、第２型糖尿病といい、膵臓でインスリンを分泌せずに血糖が上昇する場合を第１型糖尿病という。第１型糖尿病の場合には、必ずインスリン投与治療が必要である。第２型糖尿病の場合には、生活習慣の見直しを基本とし、追加的に経口用血糖降下剤の投与が必要になりうる。飲み薬の場合、１日１〜３回服用し、薬の作用時間に応じて、飲む時間や副作用などが少しずつ異なる。
【００１３】
現在、糖尿病の治療法としては、食事療法、運動療法、スルホニルウレア剤、ビグアナイド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅ）系薬物、α−グルコシダーゼ抑制剤、インスリンなどが用いられており、新たな薬物の開発に対する多くの研究を通して多様なインスリンなどが開発されて臨床に適用されている。
【００１４】
一方、インスリン分泌ペプチドの一種であるグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ１、ＧＬＰ−１）は、回腸と大腸のＬ−細胞から分泌するインクレチン（ｉｎｃｒｅｔｉｎ）ホルモンである。グルカゴン様ペプチド−１の主な作用は、インスリン分泌を増加させ、ブドウ糖の濃度に応じたインスリン分泌（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）が行われて低血糖が発生しない。この特徴から第２型糖尿病の治療方法に適用されるが、血中半減期が２分前後と非常に短いため、薬剤としての開発に大きな制約がある。これによって、開発されて市販されるグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）作用剤（アゴニスト）としては、アメリカドクトカゲ（ｇｌｉａ  ｍｏｎｓｔｅｒ）の唾液腺から精製されたグルカゴン様ペプチド−１類似体であるエキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４がある。これは、ＤＰＰ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４）に対する抵抗性とともに、グルカゴン様ペプチド−１より高い生理活性を有し、よって、体内半減期が２〜４時間とグルカゴン様ペプチド−１に比べて長くなった体内半減期を有する（ＵＳ５，４２４，２８６）。しかし、ＤＰＰ−ＩＶの抵抗性を増加させる方法だけでは十分な生理活性の持続期間を期待することができないが、例えば、現在市販のエキセンディン−４（エキセナチド、ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）の場合、患者に１日２回注射により投与されなければならず、投与による嘔吐誘発およびムカムカ現象が患者に大きな負担として作用するというデメリットが依然として残っている。
【００１５】
しかし、これらの治療剤は、薬効が低かったり、肝機能障害、低血糖、乳酸血症などといった多くの副作用を起こす問題点がある。したがって、既存の糖尿病治療剤の副作用を低減し、代謝異常症状などを改善させ、長期服用時にも安全性に優れた糖尿病治療剤へのニーズがある。
【００１６】
そして、このような問題を解決するために、ウイルス伝達体を用いた技術が浮上したが、この技術は非特異的免疫反応などの危険性にさらされており、生産工程が複雑で商用化に多くの問題点がある。したがって、最近の研究方向は、非ウイルス性伝達体、すなわち、陽イオン性脂質や高分子を用いた伝達体を用いる方向へ進んでいる。このような非ウイルス性伝達体の効率はウイルス性伝達体に及ばないものの、生体内の安定性と生産工程が容易で価格が安いという利点がある。しかし、高分子と遺伝子を用いて混合物を作ろうとする際に、遺伝子特有の硬い性質と弱陰イオン性によって混合物の形成に大きな困難を覚える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
そこで、本発明者らは、上記の問題点を解決するために研究努力した結果、胆汁酸または胆汁酸誘導体が表面修飾されたイオン性高分子および遺伝子を含みかつ、遺伝子伝達用ナノ粒子のコアにイオン性高分子と遺伝子のイオン複合体を含み、ナノ粒子の表面に親水性のイオン性基を有する胆汁酸または胆汁酸誘導体が位置することにより、体内での安定性を向上させることができ、生体内での毒性を最小化して上記の副作用を減少させることができ、経口投与に関連する障害を克服できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、細胞内で目的の位置に治療遺伝子を効果的に伝達可能な遺伝子伝達用ナノ粒子であって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子；および遺伝子を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を提供することである。
【００１９】
また、本発明の他の目的は、前記遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記の目的を達成するために、本発明は、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子および遺伝子を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を提供する。
【００２１】
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陽イオン性高分子であってもよい。
【００２２】
本発明の一実施形態において、前記陽イオン性高分子は、キトサン、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）およびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）からなる群より選択される。
【００２３】
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陰イオン性高分子であってもよいし、この場合、陽イオン性高分子をさらに含む。
【００２４】
本発明の一実施形態において、前記陰イオン性高分子は、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびコンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）から選択され、前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）およびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）からなる群より選択される。
【００２５】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子は、二硫化結合により共有結合したものであってもよい。
【００２６】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロコール酸（ＴＣＡ：ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリココール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびグリコケノデオキシコール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択され、より好ましくは、タウロコール酸（ＴＣＡ：ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）である。
【００２７】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子は、単鎖または二重鎖ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、単鎖または二重鎖ＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、プラスミド形ＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ；ｐＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、リボザイム、触媒的ＲＮＡおよびヌクレオチドの中から選択された１つ以上であってもよい。好ましくは、前記遺伝子は、プラスミド形ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から選択された１つ以上であってもよい。さらに好ましくは、前記遺伝子は、グルカゴン様ペプチド−１遺伝子（ＧＬＰ−１、Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｇｅｎｅ）、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）であってもよい。
【００２８】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、イオン性高分子の官能基数に応じて共有結合する程度が異なるが、好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体とイオン性高分子は、１：１〜１：３００のモル比で共有結合してもよい。
【００２９】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、粒子サイズに関係なく吸収可能であるが、好ましくは、５００ｎｍ以下の粒子サイズを有することができる。
【００３０】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子は、１：１〜１：２００のモル比で結合してもよい。
【００３１】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子のＮ／Ｐ比（胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子の窒素原子の個数／遺伝子のリン酸塩原子の個数）は、１〜２００であってもよい。
【００３２】
また、本発明は、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１、Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物を提供する。
【００３３】
本発明の一実施形態において、前記組成物は、経口投与用であってもよい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、摂取された食事を感知し、生物学的システム内の血糖数値とインスリン分泌を調節できる新たな経口遺伝子伝達システムであって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む。
【００３５】
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記陽イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性の陰イオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
【００３６】
また、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記イオン複合体の陽イオン性高分子と、親水性の陰イオン性基を有する胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子が静電的相互作用で結合して前記陰イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
【００３７】
したがって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、陽イオン性高分子と遺伝子を直接的な物理的な結合により胃酸から防御をし、安全に小腸細胞に伝達することができ、また、小腸細胞内にＧＬＰ−１遺伝子を発現するＬ−Ｃｅｌｌでのみ発現させる標的型ナノ粒子として用いることができる。
【００３８】
治療遺伝子を標的細胞に伝達するために、本発明の胆汁酸またはその誘導体が表面修飾されたナノ粒子を用いる場合、腸粘膜を通して遺伝子をよく伝達すると同時に、ナノ粒子のコアに存在するイオン複合体によって胃腸管で非常に安定している。これから、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、経口投与用に非常に好適であることが分かる。
【００３９】
本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸によってナノ粒子のＧＩ分解を抑制し、小腸の回腸部分で腸細胞膜の胆汁酸受容体であるＡＳＢＴ（ａｐｉｃａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）受容体を吸収して細胞内に治療遺伝子を伝達可能で、向上した遺伝子発現を示すことができる。
【００４０】
特に、治療遺伝子として、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を用いた場合、腸細胞内の酵素であるグルタチオンおよびｐＨによって、本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸と陽イオン性高分子が分離されてｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎに入り、分離された治療遺伝子は腸細胞の核にのみ伝達されて、多量のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）が発現して糖尿病治療効能を効率的に示す。したがって、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、糖尿病マウスモデルへの経口投与時、成功したＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を発現させると同時に、インスリンを分泌させて血糖降下効果を示し、糖尿病、特に第２型糖尿病を効果的に予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】回腸部分におけるＡＳＢＴを通した本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子の吸収過程を示す模式図。
【図２】実施例１のＰｒｏｔ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図３】実施例１で製造されたＰｒｏｔ−ＴＣＡの１Ｈ  ＮＭＲ。
【図４】実施例２のＣＳ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図５】実施例２で製造されたＣＳ−ＴＣＡの１Ｈ  ＮＭＲ。
【図６】実施例３のＰＡＭＡＭ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図７】実施例４のＰＬＬ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図８】実施例７のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図９】実施例１１のＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＮＨ２の製造過程を示す反応式。
【図１０】実施例１１のＴＣＡ−ＮＰＣの製造過程を示す反応式。
【図１１】実施例１１のＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図１２】実施例１１で製造されたＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＮＨ２およびＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの１Ｈ  ＮＭＲ。
【図１３】実施例１３で製造されたＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図１４】実施例１３で製造されたＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの１Ｈ  ＮＭＲ。
【図１５】実施例１５のＰｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図１６】実施例１６のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造過程を示す反応式。
【図１７】実施例１７で製造されたＴＣＡ−ＮＰＣおよびＴＣＡ−ＮＨ２の１Ｈ  ＮＭＲ。
【図１８】実施例１７で製造されたＨＡ−ＴＣＡの１Ｈ  ＮＭＲ。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明についてより具体的に説明する。この時、使われる技術用語および科学用語において別の定義がなければ、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が通常理解している意味を有し、下記の説明において本発明の要旨を不必要にあいまいにしうる公知の機能および構成に関する説明は省略する。
【００４３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００４４】
本発明は、新たな経口遺伝子伝達システムであって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子；および遺伝子；を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を提供する。
【００４５】
遺伝子は、陰イオンに帯電した巨大な高分子鎖形態で、遺伝子単独で存在する場合、比較的体積の大きいランダムコイルの形態を帯びていて遺伝子を細胞内に伝達しにくいことから、このような遺伝子との静電的相互作用によってナノサイズのイオン複合体を形成できる陽イオン性高分子を使用する。
【００４６】
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、遺伝子とイオン性高分子のイオン複合体を含み、陰イオン性の遺伝子とイオン複合体を形成するイオン性高分子は、必ず陽イオン性高分子であり、前記陽イオン性高分子は、胆汁酸と共有結合した形態であってもよい。
【００４７】
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成されたり、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子、陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成されたもので、より安全に遺伝子の細胞内在化を誘導することができる。
【００４８】
すなわち、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、陽イオン性高分子と遺伝子のイオン複合体がナノ粒子のコアに存在し、親水性のイオン性基を有する胆汁酸がナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸が表面修飾された形態のナノ粒子である。
【００４９】
治療遺伝子を標的細胞に伝達するために、本発明の胆汁酸が表面修飾されたナノ粒子を用いる場合、腸粘膜を通して遺伝子をよく伝達すると同時に、ナノ粒子のコアに存在するイオン複合体によって胃腸管で非常に安定している。これから、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、経口投与用に非常に好適であることが分かる。
【００５０】
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陽イオン性高分子であってもよい。前記イオン性高分子が陽イオン性高分子の場合、負電荷の遺伝子は、陽イオン性高分子と静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に封入されたイオン複合体を形成し、形成されたイオン複合体は、ナノ粒子のコア部分に位置し、陽イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する。
【００５１】
本発明の一実施形態において、前記陽イオン性高分子は、毒性がない重量平均分子量１００〜１００，０００の高分子で、例えば、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ；ＣＳ）、グリコールキトサン、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ；Ｐｒｏｔ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）およびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）からなる群より選択され、好ましくは、キトサン（ＣＳ）、プロタミン（Ｐｒｏｔ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）またはポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）であってもよい。
【００５２】
キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）は、（１−＞４）２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎの構造を有する天然に存在する非常に安全な陽イオン性多糖類である。キトサンは、天然の甲殻類などから得られるキチン（ｃｈｉｔｉｎ）をＮ−脱アセチル化して製造される塩基性多糖類であって、生分解性、生体適合性および低い細胞毒性を示すことが知られている。本発明では、好ましくは、生分解性、生体適合性に優れた天然高分子である水溶性キトサンまたはグリコール基が導入されて水溶性がさらに増大したグリコールキトサンを使用することができる。
【００５３】
プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）は、アルギニンが豊富な天然の陽イオン性タンパク質であって、動物の精巣のうち、特にサケを含んだ魚類の精子核に多く存在し、ヒストンのようにＤＮＡと会合または解離により遺伝情報の発現に関与するタンパク質として知られている。通常、魚類の精子核から抽出されるプロタミンの分子量は約４，０００〜１０，０００であり、構成アミノ酸の７０％以上がアルギニンで存在するが、発明がこれに制限されるものではない。本発明のプロタミンは、プロタミン自体およびその薬剤学的に許容可能な塩をすべて含む。具体的には、本発明のプロタミンの塩は、塩酸塩または硫酸塩を含む酸性物質による塩形態を包括する。プロタミンは、塩形成なくても水に溶解可能であり、塩形態も水に溶解可能なため、いかなる形態でも使用可能である。
【００５４】
ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）は、生分解性のペプチド結合で連結されていて遺伝子とイオン複合体を形成して細胞内に伝達できるが、やや毒性を示すので、単独で高い伝達効率を示すには限界があり、エンドソーム破壊物質やエンドソーム融合ペプチドなどを付着させて使用することができる。
【００５５】
本発明の一実施形態において、前記イオン性高分子は、陰イオン性高分子であってもよいし、この場合、遺伝子とのイオン複合体を形成するために、必ず陽イオン性高分子をさらに含む。すなわち、負電荷の遺伝子は、陽イオン性高分子と静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に封入されたイオン複合体を形成し、形成されたイオン複合体は、ナノ粒子のコア部分に位置する。前記陰イオン性高分子は、イオン複合体の陽イオン性高分子と静電的相互作用で結合しており、前記陰イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する。
【００５６】
本発明の一実施形態において、前記陰イオン性高分子は、ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびコンドロイチン硫酸（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）から選択され、前記陽イオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ：ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）およびポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ：ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）からなる群より選択される。
【００５７】
ヘパリンは、ヒドロキシ基、カルボキシル基およびアミノ基を含む構造で、非分画ヘパリン、高分子量ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリン断片、組換えヘパリン、ヘパリン類似体、ヘパランスルフェート、ヘパリン活性を有するスルホン化された多糖類などを使用することができる。
【００５８】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、前記イオン性高分子と共有結合可能な官能基のほか、親水性の陰イオン性基を有するもので、デオキシコール酸（ＤＣＡ：ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、タウロコール酸（ＴＣＡ：ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリココール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびグリコケノデオキシコール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択され、より好ましくは、親水性の陰イオン性基が４つ以上存在するタウロコール酸（ＴＣＡ）であってもよい。
【００５９】
前記胆汁酸は、小腸の回腸部分を通して９５％以上の高い効率で吸収されて肝に吸収されるが、これを「腸肝循環（ｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｉｃ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」といい、このような腸肝循環で脂質移動に重要な役割を果たす生物学的界面活性剤で、末端の腸部分に存在するＡＳＢＴ（ａｐｉｃａｌ  ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）によって特異的に認識されるため、経口伝達において標的リガンドとして作用できる。
【００６０】
すなわち、回腸部分を通して吸収が行われる胆汁酸は、前記遺伝子伝達用ナノ粒子の表面に位置することにより、ＡＳＢＴを通して既存の経口投与方式の最大の問題点である腸内壁を通した前記遺伝子伝達用ナノ粒子のターゲット細胞内の吸収を増大させる役割を果たす［図１］。これによって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、胆汁酸を吸収する回腸部分を通して吸収が容易であるので、経口用に使用可能であり、これによって、薬物の生体内利用率を増大させることができる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子は、二硫化結合により共有結合したものであってもよい。
【００６２】
二硫化結合（Ｓ−Ｓ）は、腸細胞から多く分泌するグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）に敏感に反応し分離されやすい傾向をもっていて、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子が腸細胞に接近した時、大部分が分離され細胞内に遺伝子のみがＬ−ＣＥＬＬの核内に入る。このように入った遺伝子は発現してＧＬＰ−１ペプチドを発現して損傷した機能を回復させる機能を行い、他の臓器や細胞への無分別な伝達を最小化するための役割を果たしたりする。
【００６３】
本発明の一実施形態において、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子に結合可能な遺伝子の種類は特に限定されず、本発明の目的に応じて所望する標的に伝達されて所望する治療効果を発揮できるいかなる遺伝子も本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の遺伝子としては、疾病に関連する治療遺伝子の正常遺伝子、標的タンパク質の発現抑制遺伝子、アンチセンスポリヌクレオシドを含む大小のポリヌクレオシド、リボザイムやｓｉＲＮＡを含む任意のＲＮＡ形態の遺伝子が含まれる。具体的には、単鎖または二重鎖ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、単鎖または二重鎖ＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、プラスミド形ＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ；ｐＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、リボザイム、触媒的ＲＮＡおよびヌクレオチドの中から選択された１つ以上であってもよい。好ましくは、前記遺伝子は、プラスミド形ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から選択された１つ以上であってもよい。前記遺伝子は、遺伝子薬物であってもよいし、ここで、遺伝子薬物は、１つ以上の疾病治療または予防を薬効として示す遺伝子を意味する。
【００６４】
前記遺伝子は、インスリン分泌性ペプチドで、ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子であってもよいし、好ましくは、グルカゴン様ペプチド−１遺伝子（ＧＬＰ−１、Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１  ｇｅｎｅ）、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）であってもよい。
【００６５】
本発明において、「ＧＬＰ−１遺伝子」、「ＧＬＰ−１変異体」の用語は、当該遺伝子をコーディングする前記核酸（ＤＮＡ）分子を称するものとして使われる。その他、ＧＬＰ−作用剤、リラグルチドまたはエキセンディン−４なども遺伝子の並びを意味する場合には、当該ペプチドまたはタンパク質をコーディングする核酸（ＤＮＡ）分子を称するものとして使われる。
【００６６】
前記ＧＬＰ−１遺伝子、ＧＬＰ−１変異体またはＧＬＰ−１誘導体は、環状（ｃｉｒｃｕｌａｒ）または線状（ｌｉｎｅａｒ）プラスミドにすべて含まれて発現できる。前記ＧＬＰ−１変異体は、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｇｌｎ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｔｈｒ１８−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｈｉｓ７−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｓｅｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）またはＴｙｒ８−ＧＬＰ−１（７−３７）として例示され、これらの配列リストは、ＵＳ２０１３−０２１０７１７Ａ１に公知である。前記ＧＬＰ−１遺伝子、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を用いて遺伝子伝達用ナノ粒子として複合化して生体内投与時に優れた血糖低下効果を得ることができ、これによって、糖尿病、特に第２型糖尿病を効果的に治療または予防することができる。
【００６７】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸またはその誘導体は、イオン性高分子の官能基数に応じて共有結合する程度が異なる。好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体およびイオン性高分子は、１：１〜１：３００のモル比で共有結合してもよい。
【００６８】
好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体および陽イオン性高分子の場合、１：１〜１：１００のモル比で共有結合してもよい。
【００６９】
好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体およびヘパリンの場合、１：１〜１：３０のモル比で共有結合してもよい。
【００７０】
好ましくは、前記胆汁酸またはその誘導体およびヒアルロン酸の場合には、１：１〜１：２００のモル比で共有結合してもよい。
【００７１】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、粒子サイズに関係なく吸収可能であるが、好ましくは、５００ｎｍ以下であってもよいし、さらに好ましくは、１００〜３００ｎｍである。
【００７２】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子のゼータ電位は、ナノ粒子の表面に用いられたイオン性高分子の種類に応じて異なり、具体的には、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成された遺伝子伝達用ナノ粒子は、１０〜３０ｍＶの範囲のゼータ電位を示すことができる。また、胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子、陽イオン性高分子および遺伝子の間の静電的相互作用で形成された遺伝子伝達用ナノ粒子は、−１０〜−３０ｍＶの範囲のゼータ電位を示すことができる。
【００７３】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子は、１：１〜１：２００のモル比、好ましくは、１：１〜１：１００のモル比で結合してもよい。前記結合比率は、遺伝子の発現率および細胞内に伝達される遺伝子伝達用ナノ粒子による細胞毒性による細胞成長に対する副作用がない範囲である。
【００７４】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子は、１：１〜１：２００の重量比／モル比、好ましくは、１：３〜１：３０の重量比／モル比で混合できる。陽イオン性高分子が結合しうる限界があり、最適な強い結合能力を有しうる範囲でのみ伝達可能なため、前記範囲内で陽イオン性高分子と遺伝子の静電的相互作用によるイオン複合体の形成がよくなる。
【００７５】
本発明の一実施形態において、前記胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した陰イオン性高分子、陽イオン性高分子および遺伝子は、３：１：１〜１０：１：２００の重量比／モル比、好ましくは、３：１：１〜１０：１：３０の重量比／モル比で混合できる。前記範囲は、電荷対電荷（ｃｈａｒｇｅ  ｔｏ  ｃｈａｒｇｅ）を利用して結合力を維持できる最適な範囲で、その範囲を超えると、剤形が設けられず安定性を失ってしまう。
【００７６】
本発明の一実施形態において、前記遺伝子伝達用ナノ粒子のＮ／Ｐ比（胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子、特に陽イオン性高分子の窒素原子の個数／遺伝子のリン酸塩原子の個数）は、１〜２００である。前記Ｎ／Ｐ比が前記範囲内に含まれると、陽イオン性高分子による遺伝子の安定化がよくなって、細胞吸収率が高くなり安定した遺伝子伝達用ナノ粒子を形成することができる。
【００７７】
また、本発明は、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合した１種以上のイオン性高分子およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１、Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を含み、前記共有結合した胆汁酸または胆汁酸誘導体は、イオン性基を有する遺伝子伝達用ナノ粒子を有効成分として含む糖尿病治療用薬学組成物を提供する。
【００７８】
前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、インスリン分泌ペプチドの一種であるグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ１、ＧＬＰ−１）遺伝子、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を治療遺伝子として含んでいて、ターゲット細胞に吸収されてインスリン分泌を増加させ、血中ブドウ糖の濃度に応じたインスリン分泌（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を起こして低血糖が発生しないようにする。したがって、糖尿病、特に第２型糖尿病の治療に有用に使用可能である。
【００７９】
本発明において、用語「有効成分」とは、前記組成物が個体に投与される場合、そうでない場合に比べて糖尿病の予防または治療する活性を有するものを含む。前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタおよびヤギからなる群より選択された１つ以上であってもよい。用語「予防」とは、前記組成物が投与されないものに比べて、血中ブドウ糖の濃度が高くなるのを防止することを含む。用語「治療」とは、前記組成物が投与されないものに比べて、血中ブドウ糖の濃度を低下させることを含む。
【００８０】
また、本発明の薬学組成物は、前記遺伝子伝達用ナノ粒子を単独で含んだり、１つ以上の薬学的に許容される担体、補強剤または賦形剤などをさらに含んでもよい。
【００８１】
さらに、本発明の薬学組成物は、薬学分野における通常の製剤、例えば、錠剤、丸剤、硬質・軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）などの経口投与用製剤、または静脈内、皮下、舌下、筋肉内投与用滅菌性水性またはオイル状溶剤の非経口投与用製剤に製剤化することができる。
【００８２】
本発明の薬学組成物に使用できる薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
本発明の薬学組成物に使用できる賦形剤としては、甘味剤、結合剤、溶解剤、溶解補助剤、湿潤剤、乳化剤、等張化剤、吸着剤、崩壊剤、酸化防止剤、防腐剤、滑沢剤、充填剤、芳香剤などがあり、このような賦形剤の比率および性質は、選択された錠剤の溶解度および化学的特性、選択された投与経路および標準薬剤実務によって決定可能である。賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシン、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステリン、マグネシウムステアリン酸塩、マグネシウムアルミニウムケイ酸塩、デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、アルギニン酸、ソジウムアルギン酸塩、メチルセルロース、ソジウムカルボキシルメチルセルロース、アガー、水、エタノール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、オレンジエッセンス、イチゴエッセンス、バニラフレーバーなどが挙げられる。
【００８４】
また、本発明の薬学組成物は、非経口投与形態に剤形化されてもよいが、この場合、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与などを利用することができるが、これらに制限されない。この時、前記非経口投与用剤形に製剤化するために、前記薬学組成物は、有効成分、すなわち、前記遺伝子伝達用ナノ粒子が安定剤または緩衝剤とともに水で混合されて溶液または懸濁液に製造され、このような溶液または懸濁液がアンプルまたはバイアルの単位投与型で製造される。
【００８５】
本発明に係る薬学組成物は、より好ましくは、経口投与剤形であってもよい。
【００８６】
また、本発明の薬学組成物は、滅菌されたり、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、滲透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤をさらに含んでもよく、その他治療的に有用な物質をさらに含んでもよいし、混合、顆粒化またはコーティングの通常の方法によって製剤化される。
【００８７】
また、本発明に係る薬学組成物において、有効成分である前記遺伝子伝達用ナノ粒子は、ヒトを含む哺乳類に対する投与用量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾病の程度に応じて異なり、１日１回または２回以上分割されて経口または非経口的経路を通して投与される。
【００８８】
以下、具体的な実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００８９】
この時、使われる技術用語および科学用語において別の定義がなければ、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が一般的に理解する意味を有する。また、従来と同一の技術的構成および作用に関する繰り返しの説明は省略する。
【００９０】
物質：
低−分子量のヘパリン（Ｈｅｐ、ａｖｅｒａｇｅ  ＭＷ５０００Ｄａ）はメディプレックス（Ｍｅｄｉｐｌｅｘ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ、韓国）から購入し、ヒアルロン酸ナトリウム（ＭＷ：８３ｋＤａ）はバイオランド（Ｂｉｏｌａｎｄ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、韓国）から購入し、ＴＣＡ（ＰｌｕｒｏｎｉｃＴａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、プロタミン（Ｐｒｏｔ）、キトサン（ＣＳ）、アセトン、４−ＮＰＣ（４−ｍｅｔｈｙｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ、４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）、ＴＥＡ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＥＤＣ（Ｎ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＤＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｄｉａｍｉｎｅ）およびシスタミン二塩酸塩はｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ．ｃｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＣａＣｏ２細胞、ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴおよびＭＤＣＫ細胞株は韓国細胞株銀行から購入した。ｐＤＮＡ遺伝子はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＲＲ１に由来するＰｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅｓ  Ｄ４１５４  ａｎｄ  Ｄ３４０４）を使用した。
【００９１】
胆汁酸が共有結合した陽イオン性高分子の製造
実施例１：タウロコール酸が共有結合したプロタミン（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ−Ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、以下、「Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ」という）の製造
透明な溶液になるまで、０℃でＴＣＡ（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（５ｍＬ）に溶解させた。その後、ＴＥＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（３ｍｍｏｌ）および４−ＮＰＣ（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）（２．５ｍｍｏｌ）を順に加えて、０℃で３０分、常温で３０分間反応させた。Ｐｒｏｔ（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）（０．１ｍｍｏｌ）を２次蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）（１０ｍＬ）に溶解させた後、前記反応溶液に加えて、常温で２４時間反応させた。反応液を透析膜（ＭＷＣＯ：１０００Ｄａ）を用いて毎６時間ごとに媒質を変えながら、３日間２次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してＰｒｏｔ−ＴＣＡを得た（収得率７８±２％、図２）。
【００９２】
１Ｈ  ＮＭＲおよびＴＮＢＳＡ分析により、プロタミンにタウロコール酸が共有結合したことを確認した（図３）。
【００９３】
実施例２：タウロコール酸が共有結合したキトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、以下、「ＣＳ−ＴＣＡ」という）の製造
透明な溶液になるまで、０℃でＴＣＡ（１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた。その後、ＴＥＡ（３ｍｍｏｌ）および４−ＮＰＣ（２．５ｍｍｏｌ）を順に加えて、０℃で３０分、常温で３０分間反応させた。ＣＳ（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）（０．０１ｍｍｏｌ）を２次蒸留水（２０ｍＬ）に溶解させた後、前記反応溶液に加えて、常温で２４時間反応させた。反応液を透析膜（ＭＷＣＯ：１０００Ｄａ）を用いて毎６時間ごとに媒質を変えながら、３日間２次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してＣＳ−ＴＣＡを得た（収得率９２±２％、図４）。
【００９４】
１Ｈ  ＮＭＲおよびＴＮＢＳＡ分析により、キトサンにタウロコール酸が共有結合したことを確認した（図５）。
【００９５】
（構造の確認）
前記Ｐｒｏｔ−ＴＣＡおよびＣＳ−ＴＣＡはそれぞれＰｒｏｔおよびＣＳのアミン基がＴＣＡのヒドロキシル基に共有結合して製造された。これを確認するために、Ｄ２ＯにＰｒｏｔ−ＴＣＡおよびＣＳ−ＴＣＡをそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬに溶解させた後、１Ｈ  ＮＭＲ分析を実施した。その結果を図３および図５に示し、これから、ＴＣＡとＰｒｏｔとの間のアミド結合コンジュゲーションおよびＴＣＡとＣＳとの間のアミド結合コンジュゲーションに対するピークがδ８ｐｐｍで検出された。
【００９６】
また、前記Ｐｒｏｔ−ＴＣＡおよびＣＳ−ＴＣＡのアミン基の含有量を調べるために、ＴＮＢＳＡ（ｔｒｉｎｉｔｒｏ  ｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）分析により、ＰｒｏｔとＣＳそれぞれにＴＣＡが共有結合した後、アミノ化の程度を定量化した。その結果、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡはＰｒｏｔへのＴＣＡ共有結合前に比べて５３％と、ＴＣＡの共有結合後にアミン基の含有量が減少したことを確認した。
【００９７】
実施例３：タウロコール酸が共有結合したポリアミドアミン（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ−Ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、以下、「ＰＡＭＡＭ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｐｒｏｔ（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）の代わりにポリアミドアミンを用いることを除けば、前記実施例１と同様の方法でＰＡＭＡＭ−ＴＣＡを製造し、ＦＴ−ＩＲとＦＴ−ＮＭＲにより構造を確認した（収得率５０％、図６）。
【００９８】
実施例４：タウロコール酸が共有結合したポリ−Ｌ−リシン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−Ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、以下、「ＰＬＬ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｐｒｏｔ（Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）の代わりにポリ−Ｌ−リシンを用いることを除けば、前記実施例１と同様の方法でＰＬＬ−ＴＣＡを製造し、ＦＴ−ＩＲとＦＴ−ＮＭＲにより構造を確認した（収得率５５％、図７）。
【００９９】
胆汁酸が共有結合した陽イオン性高分子および遺伝子を含むナノ粒子の製造
実施例５：タウロコール酸が共有結合したプロタミンおよびＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子を含むナノ粒子（以下、「Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１」という）の製造
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解したＰｒｏｔ−ＴＣＡ（１ｍｇ／ｍＬ）をストック溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）として使用した。ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）をコーディングする遺伝子（７．７８０ｍｇ）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）（１．９２２ｍＬ）に溶解させてＧＬＰ−１遺伝子溶液を製造した。ｇｅｎｔｌｅ  ｖｏｒｔｅｘ下、ＧＬＰ−１遺伝子溶液（１０ｍＬ）をストックＰｒｏｔ−ＴＣＡ溶液（１０ｍＬ）に滴加した。その後、反応物を常温で１時間放置し、２日間凍結乾燥してＰｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１を得た［図８］。
【０１００】
実施例６：タウロコール酸が共有結合したキトサンおよびＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子を含むナノ粒子（以下、「ＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１」という）の製造
前記実施例５のＰｒｏｔ−ＴＣＡの代わりにＣＳ−ＴＣＡを用いたことを除けば、前記実施例５と同様の方法でＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１を得た。
【０１０１】
粒子サイズおよびゼータ電位を分析するために、Ｄ２ＯにＰｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例６）をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬに溶解させた。
【０１０２】
（ナノ粒子の形態学的分析）
ＴＥＭ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および光散乱粒子分析器（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いてＰｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）の形態および粒子サイズ分布を観察した。
【０１０３】
前記ナノ粒子のサイズは平均１５０ｎｍ程度であり、相対的に均一なサイズ分布を示した。
【０１０４】
（ナノ粒子の表面電荷）
ゼータ電位分析器（Ｚｅｔａ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて前記実施例５で製造されたナノ粒子のゼータ電位を測定した結果、正のゼータ電位を示した。このように表面電荷が正電荷を帯びるというのは、負電荷を帯びるＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子が遺伝子伝達複合体の内部に完全に取り囲まれていることを意味し、正の表面電荷は遺伝子伝達ナノ粒子の細胞内への流入を容易にする。また、粒子の間に静電的反発力を起こして粒子同士の凝集現象を減少させる。
【０１０５】
（ナノ粒子の安定性）
前記実施例５および６で製造されたナノ粒子の安定性を確認するために、ゲルリタデーション（Ｇｅｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）分析を実施した。
【０１０６】
ゲルリタデーション実験は１％ａｇａｒｏｓゲルと１×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ溶液を用いて行われた。本発明のナノ粒子に封入された遺伝子ＧＬＰ−１は０．５μｇ／ｍＬ  ＥｔＢｒ（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色されてゲル上に現れた。前記実験は１００Ｖで３０分間進行した。
【０１０７】
その結果、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡにＧＬＰ−１の複合化およびＣＳ−ＴＣＡに対するＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の複合化は１：１０以上のモル比で行われることを確認した。特に、実施例５のＰｒｏｔ−ＴＣＡとＧＬＰ−１の複合化が１：１５０のモル比、実施例６のＣＳ−ＴＣＡとＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の複合化が１：１０のモル比で行われた場合、ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の凝縮による遅延現象がもたらされてＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の移動性が完全に遅延された。これから、前記Ｐｒｏｔ−ＴＣＡおよびＣＳ−ＴＣＡそれぞれはＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子を効果的に凝縮させて遺伝子伝達複合体Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１が形成されたことが分かった。したがって、本発明に係るナノ粒子は、遺伝子と複合体を形成することにより、遺伝子を伝達する遺伝子伝達体として有用に使用可能である。
【０１０８】
（血清内安定性）
前記実施例５および６で製造されたナノ粒子の血清内安定性を確認するために、下記のような実験を実施した。
【０１０９】
Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例６）をそれぞれ、２０％血清下、３７℃の条件で４８時間保管した後、０．５ＭのＥＤＴＡを処理した。その後、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例６）それぞれからＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子を分離するために１％ＳＤＳを添加した。
【０１１０】
その結果、ｆｒｅｅ遺伝子ＧＬＰ−１と比較して、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例６）それぞれに封入されたＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子は４８時間血清から分解されず、血清内で非常に安定していることを確認した。
【０１１１】
（ｐＨ条件に対する粒子の安定性）
多様なｐＨ条件で本発明のナノ粒子の安定性を確認した。
【０１１２】
すなわち、胃腸管（ＧＩ  ｔｒａｃｔ）の胃、十二指腸および回腸（ｉｌｅｕｍ）断片でのｐＨ条件と類似のｐＨ３、ｐＨ５およびｐＨ７．４の３つのｐＨ溶液にＰｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例６）それぞれを入れて、粒子サイズを観察した。その結果、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例５）およびＣＳ−ＴＣＡ／ＧＬＰ−１（実施例６）ともｐＨ３で２４時間まで安定していることを確認した。
【０１１３】
実験例１：試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の遺伝子発現およびトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）研究
ＡＳＢＴ（Ａｐｉｃａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂｉｌｅ  Ｓａｌｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）−過発現ＭＤＣＫ細胞およびＣａｃｏ−２細胞株を用いて緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）の発現を観察した。
【０１１４】
実施例５および６の遺伝子伝達用ナノ粒子にｅＧＦＰ遺伝子４μｇをそれぞれローディングした後、前記細胞株から成功した発現および緑色蛍光を観察した。
【０１１５】
次に、二重層細胞培養技術で遺伝子複合体の伝達を研究するために、トランスウェルプレートの頂端部位でＣａｃｏ−２単層を培養し、基底部位でＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞株を培養した。その結果、前記ナノ粒子の成功した伝達が観察され、これから、ＴＣＡ分子はこれら遺伝子複合体の吸収と伝達を助ける役割を果たすことが分かった。
【０１１６】
培地で糖数値に反応して試験管内のＧＬＰ−１の発現を数値化するＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡキットを用いており、その結果、ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の向上した発現が現れた。
【０１１７】
実験例２：複合体の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）生体分布（ｂｉｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）
ｅＧＦＰローディングされた実施例５および６の遺伝子伝達用ナノ粒子の生体内生体分布を調べるために、下記の実験を行った。
【０１１８】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の１２時間、前記動物を絶食させた。絶食１２時間後、ｅＧＦＰ遺伝子１００μｇを含有する実施例５および６の遺伝子伝達用ナノ粒子それぞれを経口胃管栄養法（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ）で投与した。投与２４時間後に動物を犠牲にし、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で生体内遺伝子発現および試料の生体内分布を定量化した。
【０１１９】
その結果、本発明の遺伝子伝達ナノ粒子によって回腸と肝断片での向上したｅＧＦＰ遺伝子の発現を確認した。また、プロタミンとキトサンそれぞれに共有結合したＴＣＡは、ＧＩ（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）分解を防止し、ｅＧＦＰの吸収と発現を助けることが分かった。
【０１２０】
実験例３：生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の発現および血糖数値の調節
５週齢のＺＤＦＲ（Ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔｓ）を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。実施例５および６の遺伝子伝達用ナノ粒子の経口投与前の１２時間、前記動物を絶食させた。絶食１２時間後、実施例５および６の遺伝子伝達用ナノ粒子１００μｇをそれぞれ経口投与させた。投与２４時間後に所定の時間間隔で尾静脈から血液を採取して血糖数値を測定した。驚くべきことに、血糖数値が正常血糖数値に調節されたことを確認した。５日後、実験動物を犠牲にし、ＥＬＩＳＡキットで回腸と肝断片でのＧＬＰ−１およびインスリンの発現を分析した。その結果、対照群と比較して、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子の経口投与後、ＧＬＰ−１ペプチドとインスリンタンパク質の向上した発現が現れた。
【０１２１】
実験例４：ＧＬＰ−１遺伝子伝達用複合体の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）毒性
４週齢のＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄｏｗｌｅｙ  ｒａｔｓ）を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。実施例５および６の遺伝子伝達用ナノ粒子１００μｇをそれぞれ経口および静脈投与した。所定の時間間隔で２４時間実験動物の血液を採取して一般の血液内容物（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を分析し、肝および腎臓の活性を決定する生物学的マーカーの発現を評価した。その結果、本発明の遺伝子伝達複合体を非常に高い濃度で投与したとしても毒性がほとんど現れなかった。
【０１２２】
投与７日後に動物を犠牲にし、回腸と肝断片の免疫組織検査を実施した。その結果、組織内でいかなる炎症も観察されておらず、毒性もほとんど現れなかった。
【０１２３】
したがって、本発明の遺伝子伝達複合体は、安全で、無毒性であり、糖尿病の治療に使用可能であることが分かった。
【０１２４】
実施例７：タウロコール酸が共有結合したプロタミンおよびｐＤＮＡを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ」という）の製造
タウロコール酸とプロタミンの共有結合は、タウロコール酸のヒドロキシルグループとプロタミンのアミングループをＴｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（以下、ＴＥＡ）と４−ｎｉｔｒｏｐｈｙｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（以下、４−ＮＰＣ）を用いて製造した。
【０１２５】
Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの製造
タウロコール酸５０ｍｍｏｌを溶かした１０ｍｌの蒸留水に４−ＮＰＣ７０ｍｍｏｌをＤＭＦ溶液３ｍｌに完全に溶かして追加し、ＴＥＡ溶液をタウロコール酸溶液が完全に黄色に変わるまで追加（１００μｌ）した。この後、５ｍｍｏｌのプロタミンを追加した後、２４時間撹拌して常温で反応を進行させた。反応が終わった後、透析により未反応物を除去するが、１ｋＤａサイズのメンブレンフィルタ容器を用い、２４時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により収得物Ｐｒｏｔ−ＴＣＡを得た。
【０１２６】
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの製造
前記実験方法で製造されたＰｒｏｔ−ＴＣＡ（１５０ｎｍｏｌ〜５０ｎｍｏｌ）とｐＤＮＡ（１ｎｍｏｌ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備する。この後、製造されたＰｒｏｔ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加する。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、１０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡを得た（図８）。
【０１２７】
（ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡのｐＨに対する安定性試験）
前記製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの安定性を確認するために、蒸留水、ｐＨ５．２、１．８、７．４のＨＥＰＥＳバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡとｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、６、１２、２４時間にｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ溶液を取って分析する。
【０１２８】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でｐＨに対する安定性が増加したと説明することができる。対照群としては、タウロコール酸が結合しないｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔを用い、ｐＨ５．２、７．４、そして蒸留水の条件では時間に応じて大きさが増加する傾向を、ｐＨ１．８では時間に応じて大きさが減少する傾向を示すことを確認した。特に、ｐＨ１．８で大きさが減少する傾向を示すのは、プロタミンが酸性の条件に弱くて分解が起こり、ｐＤＮＡとの物理的結合が壊れる現象のためである。
【０１２９】
（ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡのＳＥＭイメージを用いた合成の確認）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡをｓｉｌｉｃｏｎ  ｗａｆｅｒに載せた後、自然乾燥をして分析するサンプルを準備する。分析はＳｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用い、１０．０ｋＶ、×２，０００倍率の条件で撮影された。
【０１３０】
結果的に、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡは、粒子の１００ｎｍのサイズを有する粒子形状を有することを確認することができ、観察されたすべての粒子も同一のサイズを有する傾向を確認した。
【０１３１】
（ＨＣＴ１１６細胞を用いたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの毒性試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの毒性を確認するためにＨＣＴ１１６細胞を用い、毒性の検証方法としてはＭＴＴ実験方法を利用した。
【０１３２】
理論的に知られているように、プロタミンは８５％以上の生存率を示し、タウロコール酸が共有結合したプロタミンも８０％以上の高い生存率を示すことを確認することができた。
【０１３３】
（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いた細胞吸収能確認試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの細胞吸収能を確認するためにＨＣＴ１１６細胞を用いた。実験方法はＨＣＴ１１６細胞を１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分譲させて準備した後、サンプルＲｈｄａｍｉｎｅ−Ｂが結合したｐＤＮＡ／ＰｒｏｔとｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡを注入する。２時間の培養後、ＰＢＳを用いて３回の洗浄過程を経てｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて観察する。
【０１３４】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔより優れた細胞吸収能を有することを確認することができ、その数値は約４倍以上であると確認した。
【０１３５】
（Ｃａｃｏ−２単層を用いたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの細胞透過能検査）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの細胞透過能を検証するためにＣａｃｏ−２細胞を単層培養して試験をした。試験は計６時間進行し、１０分、３０分、１、２、４、６時間にサンプルを採取して検査した。
【０１３６】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔより優れた細胞透過能を有することを確認することができ、これは、後の動物実験において小腸を通したｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの吸収が可能であることを示唆する。
【０１３７】
（経口投与によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験）
経口投与によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験のためにＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂが結合したプロタミンを用い、マウスはＢａｌｂ／ｃ７週齢を用い、６時間の絶食後に薬物を経口投与し、０．２、０．５、２、６、１２、２４時間での生体内分布を蛍光イメージと蛍光数値を通して確認した。
【０１３８】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡは小腸を通して吸収され、３０分内の短い時間内に小腸で吸収が進み、２〜６時間にかけて肝に吸収された後、徐々に除去される現象を確認した。これは、既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡもタウロコール酸の生体内吸収効果を妨げたり阻害せず、本来の循環経路を維持することを検証した。
【０１３９】
実施例８：タウロコール酸が共有結合したキトサンおよびｐＤＮＡを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡ」という）の製造
ＴＣＡ−ＮＰＣの製造
キトサンにＴＣＡをコンジュゲーションさせるために、ＴＣＡ（５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた後、４−ＮＰＣ（２００ｍｇ）およびＴＥＡ（１００μｇ）を加えて、常温で１時間反応させてＴＣＡ−ＮＰＣを製造した。
【０１４０】
ＣＳ−ＴＣＡの製造
キトサン（１００ｍｇ）を蒸留水に溶解させ、製造されたＴＣＡ−ＮＰＣ（２０ｍｇ）を追加して２４時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は１ｋＤａのメンブレンフィルタ容器を用い、２４時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物ＣＳ−ＴＣＡを得た。
【０１４１】
ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの製造
前記実験方法で製造されたＣＳ−ＴＣＡ（１５０ｎｍｏｌ〜５０ｎｍｏｌ）とｐＤＮＡ（１ｎｍｏｌ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたＣＳ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、１０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡを得た。
【０１４２】
（電気泳動方法と大きさの分析によるｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの安定性確認）
ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの安定性を確認するために電気泳動方法とその大きさを測定して確認し、背景条件は蒸留水を用いた。
【０１４３】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは非常に安定した状態を最小２４時間維持することを確認した。
【０１４４】
（表面電荷の測定によるｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの製造検証）
ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの製造検証のためにＺｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ分析機器を用い、表面電荷（ｍＶ）を測定して製造の有無を確認した。
【０１４５】
既存のｐＤＮＡは−２．９６ｍＶを有し、キトサンは３６．１２ｍＶを有する。この後、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡを製造すると、１９．５５〜２５．６８ｍＶを有するが、これは、陽イオンのキトサンが陰イオンのｐＤＮＡの表面を完全に包んで製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡが陽イオンの表面電荷を有するのである。これによりｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの完全な製造を確認した。
【０１４６】
（ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡのｐＨに対する安定性試験）
前記製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの安定性を確認するために、ｐＨ５．２、１．８、７．４のＰＢＳバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、６、１２、１８、２４時間にｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡ溶液を取って分析した。
【０１４７】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でｐＨに対する安定性が増加することが分かった。
【０１４８】
（ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの毒性試験）
製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの毒性を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用い、毒性の検証方法としてはＭＴＴ実験方法を利用した。
【０１４９】
結果的に、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは８０％以上の高い生存率を示すことを確認した。
【０１５０】
（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いた細胞吸収能の確認試験）
製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの細胞吸収能を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いた。実験方法は、ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分譲させて準備した後、サンプルＲｈｄａｍｉｎｅ−Ｂが結合したｐＤＮＡ／ＣｈｉｔｏｓａｎとｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡを注入した。２時間の培養後、ＰＢＳを用いて３回の洗浄過程を経てｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて観察した。
【０１５１】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎより優れた細胞吸収能を有することを確認することができ、その数値は約２倍以上であると確認した。
【０１５２】
（Ｃａｃｏ−２単層を用いたｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの細胞透過能検査）
ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの細胞透過能を検証するためにＣａｃｏ−２細胞を単層培養して試験をした。試験は計６時間進行し、１０分、３０分、１、２、４、６時間にサンプルを採取して検査した。
【０１５３】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎより優れた細胞透過能を有することを確認することができ、これは、後の動物実験において小腸を通したｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの吸収が可能であることが分かった。
【０１５４】
（ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの遺伝子発現による遺伝子伝達能検証）
ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの遺伝子発現効果検証のためにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ方法を利用した。対照群としては、ｐＤＮＡ、ｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎ、そしてｂＰＥＩを用いた。
【０１５５】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは、陰性対照群であるｐＤＮＡ、ｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎより最小２倍最大５０倍以上の効果を有することを確認し、陽性対照群であるｂＰＥＩよりも優れた遺伝子伝達効果を有することを確認した。
【０１５６】
（経口投与によるｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験）
経口投与によるｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験のためにＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂが結合したキトサンを用い、マウスはＢａｌｂ／ｃ７週齢を用い、６時間の絶食後に薬物を経口投与し、１２時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
【０１５７】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡは小腸、特に回腸を通して吸収され、肝にも吸収が進むことを確認した。これは、既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、製造されたｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ＴＣＡもタウロコール酸の生体内吸収効果を妨げたり阻害せず、本来の循環経路を維持することを検証した。
【０１５８】
実施例９：タウロコール酸が共有結合したポリアミドアミンおよびｐＤＮＡを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／ＰＡＭＡＭ−ＴＣＡ」という）の製造
ＴＣＡ−ＮＰＣの製造
キトサンにＴＣＡをコンジュゲーションさせるために、ＴＣＡ（５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた後、４−ＮＰＣ（２００ｍｇ）およびＴＥＡ（１００μｇ）を加えて、常温で１時間反応させてＴＣＡ−ＮＰＣを製造した。
【０１５９】
ＰＡＭＡＭ−ＴＣＡの製造
ポリアミドアミン（１００ｍｇ）をＨＥＰＥＳバッファー溶液に溶解させ、製造されたＴＣＡ−ＮＰＣ（２０ｍｇ）を追加して２４時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は１ｋＤａのメンブレンフィルタ容器を用い、２４時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物ＰＡＭＡＭ−ＴＣＡを得た。
【０１６０】
ｐＤＮＡ／ＰＡＭＡＭ−ＴＣＡの製造
前記実験方法で製造されたＰＡＭＡＭ−ＴＣＡ（１５０ｎｍｏｌ〜５０ｎｍｏｌ）とｐＤＮＡ（１ｎｍｏｌ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたＭＡＭ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、１０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／ＰＡＭＡＭ−ＴＣＡを得た。
【０１６１】
実施例１０：タウロコール酸が共有結合したポリ−Ｌ−リシンおよびｐＤＮＡを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／ＰＬＬ−ＴＣＡ」という）の製造
ＴＣＡ−ＮＰＣの製造
キトサンにＴＣＡをコンジュゲーションさせるために、ＴＣＡ（５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた後、４−ＮＰＣ（２００ｍｇ）およびＴＥＡ（１００μｇ）を加えて、常温で１時間反応させてＴＣＡ−ＮＰＣを製造した。
【０１６２】
ＰＬＬ−ＴＣＡの製造
ポリ−Ｌ−リシン（５０ｍｇ）をＨＥＰＥＳバッファー溶液に溶解させ、製造されたＴＣＡ−ＮＰＣ（２０ｍｇ）を追加して２４時間撹拌させた。この後、透析により未反応物を除去し、透析は１ｋＤａのメンブレンフィルタ容器を用い、２４時間蒸留水で透析を進行させた。この後、凍結乾燥により最終収得物ＰＬＬ−ＴＣＡを得た。
【０１６３】
ｐＤＮＡ／ＰＬＬ−ＴＣＡの製造
前記実験方法で製造されたＰＬＬ−ＴＣＡ（１５０ｎｍｏｌ〜５０ｎｍｏｌ）とｐＤＮＡ（１ｎｍｏｌ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたＰＬＬ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、１０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／ＰＬＬ−ＴＣＡを得た。
【０１６４】
実施例１１：ＴＣＡが二硫化結合で共有結合したヘパリン（以下、「Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの合成はヘパリンとシスタミンのコンジュゲートから始まった。すなわち、ヘパリンのカルボキシル基は、ＥＤＣ（１−ｅｔｈｙｌ−３−（−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）／ＮＨＳ（Ｎ−ｂｒｏｍｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙによりシスタミンのアミン基と共有結合した。
【０１６５】
Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＮＨ２の製造
ヘパリン（１００ｍｇ）を１０ｍＬのＭＥＳバッファー（５０ｍｍｏｌ、ｐＨ６）に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させた。過剰のＥＤＣ（ヘパリンに対して２．４当量）を加えて１０分間撹拌させた後、常温で過剰のＮＨＳ（ＥＤＣに対して２．５倍当量）を加えて１０分間撹拌させた。ＥＤＣとＮＨＳによるカルボキシル基の活性後、シスタミン（１００μｇ）を加えて、ｐＨ７で２４時間反応させた。反応が終わると、２次蒸留水で２４時間透析し、凍結乾燥してＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＮＨ２を得た（図９）。
【０１６６】
ＴＣＡ−ＮＰＣの製造
活性化されたヘパリンにＴＣＡをコンジュゲーションさせるために、ＴＣＡ（５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた後、４−ＮＰＣ（２００ｍｇ）およびＴＥＡ（１００μｇ）を加えて、常温で１時間反応させてＴＣＡ−ＮＰＣを製造した（図１０）。
【０１６７】
Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造
その後、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解した活性化されたヘパリン（１００μｇ）を加えて、常温で２４時間反応させた。反応液を透析膜（ＭＷＣＯ：１０００Ｄａ）を用いて毎３時間ごとに媒質を変えながら、４８時間２次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを得た（収得率８０±５％、図１１、図１２）。
【０１６８】
Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは細胞内のグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）濃度に反応して治療遺伝子を局所的に放出するように合成され、図９〜図１１にＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを製造するための反応式を例示した。
【０１６９】
ヘパリンにシスタミンのコンジュゲーションは１Ｈ  ＮＭＲおよびＴＮＢＳ分析によりそれぞれ定性的および定量的に決定され［図１２］、これから、それぞれのヘパリン分子は５つの二硫化結合で結合したＴＣＡ分子が付着していることが分かった。
【０１７０】
実施例１２：ＴＣＡが二硫化（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合で共有結合したヘパリン、ｐＤＮＡおよびプロタミンを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造において前記実施例１１の方法を利用した。
【０１７１】
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの製造
プロタミン（１５０ｎｍｏｌ〜５０ｎｍｏｌ）とｐＤＮＡ（１ｎｍｏｌ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備する。この後、プロタミン溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、２０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔを得た。
【０１７２】
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造
Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ（２０ｍｇ）とｐＤＮＡ／ＰｒｏｔをそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備した。この後、Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１ｍｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔをすべて追加した後、３０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを得た。
【０１７３】
（電気泳動方法によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの製造確認）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの製造を確認するために電気泳動方法を利用して確認し、背景条件はＨＥＰＥＳバッファー溶液を用い、重量比を１：０．５、１、２、３、４、６の比を比較して最適な条件を確認した。
【０１７４】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔは非常に安定して製造され、最小１：２の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。
【０１７５】
（粒子のサイズおよび表面電荷の分析によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの製造確認）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔの製造を確認するために粒子のサイズおよび表面電荷の分析を利用して確認し、背景条件はＨＥＰＥＳバッファー溶液を用い、重量比を１：０．５、１、２、３、４、６の比を比較して最適な条件を確認した。
【０１７６】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔは非常に安定して製造され、結果的に、１：３の重量比を用いて製造した時、最適な条件で製造されることを確認した。
【０１７７】
（電気泳動方法と粒子サイズの分析によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造確認）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズの分析により確認し、背景条件はＨＥＰＥＳバッファー溶液を用い、重量比を１：３、４．５の比を比較して最適な条件を確認した。
【０１７８】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは非常に安定して製造され、最小１：３の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。
【０１７９】
（ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡのＴＥＭイメージを用いた合成確認）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡをｓｉｌｉｃｏｎ  ｗａｆｅｒに載せた後、自然乾燥をして分析するサンプルを準備した後、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて分析した。
【０１８０】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、粒子の１００ｎｍのサイズを有する粒子形状を有することを確認することができ、表面のＨｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡのコーティング層を観測することにより、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡが完全に製造されることを確認した。また、観察されたすべての粒子も同一のサイズを有する傾向を確認した。
【０１８１】
（ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの遺伝子封入率の測定）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの遺伝子封入率測定のために電気泳動の方法を利用し、電気泳動により分離されたＤＮＡの量を測定することにより、封入率を測定した。
【０１８２】
その結果、重量比１：６において７０％の封入率で最大の封入効果を有することを確認し、１：３では約１５％の封入効果を有することを確認した。１：６において最大の封入効果を有するが、前記電気泳動方法と粒子サイズの分析によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造確認実験で言及したように、遺伝子伝達のために最適化された重量比は１：３に固定した。
【０１８３】
（電気泳動方法によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの安定性確認）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの安定性を確認するために電気泳動方法を利用して確認し、背景条件はｐＤＮＡ分解要素のＤＮＡｓｅが含まれたＨＥＰＥＳバッファー溶液を用いた。
【０１８４】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、ｐＤＮＡ分解要素のＤＮＡｓｅからｐＤＮＡを効果的に保護し、非常に安定した状態を維持することを確認した。
【０１８５】
（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いた細胞吸収能確認試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞吸収能を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いた。実験方法は、ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分譲させて準備した後、サンプルＲｈｄａｍｉｎｅ−Ｂが結合したｐＤＮＡ／ＰｒｏｔとｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを注入した。２時間の培養後、ＰＢＳを用いて３回の洗浄過程を経てｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて観察した。
【０１８６】
その結果、対照群として用いられたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔも陽イオンの表面電荷をもっていて若干の吸収能は有することを示したが、結果的に、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡが対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔより優れた細胞吸収能を有することを確認した。
【０１８７】
（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いた細胞発現確認試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞発現効果を確認するためにＨｅｐＧ２細胞を用いた。実験方法は、ＨｅｐＧ２細胞を１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分譲させて準備した後、サンプルｅＧＦＰが追加されたｐＤＮＡ／ＰｒｏｔとｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを注入した。２４時間の培養後、ＰＢＳを用いて３回の洗浄過程を経てｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて観察した。
【０１８８】
その結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡがｅＧＦＰ遺伝子を伝達するのに成功して緑色蛍光を有することを確認し、その程度が対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔよりはるかに高いことを確認した。
【０１８９】
（ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの毒性試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの毒性を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用い、毒性の検証方法としてはＭＴＴ実験方法を利用した。
【０１９０】
結果的に、Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは９０％以上、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡも９０％以上の高い生存率を示すことを確認した。
【０１９１】
（Ｃａｃｏ−２単層を用いたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞透過能検査）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞透過能を検証するためにＣａｃｏ−２細胞を単層培養して試験をした。試験は計６時間進行し、１０分、３０分、１、２、４、６時間にサンプルを採取して検査した。
【０１９２】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／ＣＳＡ−ＴＣＡより低い細胞透過能を有することを確認することができ、その数値はｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔと類似すると確認した。これは、二硫化結合（−Ｓ−Ｓ−）によってタウロコール酸がＣａｃｏ−２細胞内で分離されてタウロコール酸のみが透過をし、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐは細胞内に蓄積されることを意味する。
【０１９３】
（経口投与によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験）
経口投与によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験のためにＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂが結合したプロタミンを用い、マウスはＢａｌｂ／ｃ７週齢を用い、６時間の絶食後に薬物を経口投与あるいは静脈投与し、６時間での生体内分布を組織、そして細胞単位の蛍光イメージを通して確認した。
【０１９４】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは小腸、特に回腸を通して吸収され、肝にも若干の吸収が進むことを確認した。これは、小腸までは既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、小腸で二硫化結合（−Ｓ−Ｓ−）が分離されて製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ／Ｈｅｐがタウロコール酸の循環経路を外れて小腸に蓄積されることを意味する。
【０１９５】
実施例１３：ＴＣＡが二硫化結合で共有結合したキトサン（以下、「ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｃｈｉｔｏｓａｎ−Ｓ−Ｓ−ＣＯＯＨの製造
キトサン（１００ｍｇ）を１０ｍＬのＭＥＳバッファー（５０ｍｍｏｌ、ｐＨ６）に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させる。過剰のＥＤＣ（キトサンに対して５当量）を加えて１０分間撹拌させた後、常温で過剰のＮＨＳ（ＥＤＣに対して２．５倍当量）を加えて１０分間撹拌させた。ＥＤＣとＮＨＳによるカルボキシル基の活性後、システイン（５００μｇ）を加えて、ｐＨ７で２４時間反応させた。反応が終わると、２次蒸留水で２４時間透析し、凍結乾燥してＣｈｉｔｏｓａｎ−Ｓ−Ｓ−ＣＯＯＨを得た。
【０１９６】
ＴＣＡ−ＮＨ２の製造
活性化されたキトサンＣｈｉｔｏｓａｎ−Ｓ−Ｓ−ＣＯＯＨにＴＣＡをコンジュゲーションさせるために、ＴＣＡ（５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた後、４−ＮＰＣ（２００ｍｇ）およびＴＥＡ（１００μｇ）を加えて、常温で１時間反応させてＴＣＡ−ＮＰＣを製造した。
【０１９７】
この後、製造されたＴＣＡ−ＮＰＣ（１００ｍｇ）をＤＭＦに完全に溶解し、４−ＭＭＰを３０μｌ追加して４時間反応する。この後、エチレンジアミンを１ｍｌ追加して１６時間反応させてＴＣＡ−ＮＨ２を製造した。
【０１９８】
ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造
その後、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解した活性化されたキトサンＣｈｉｔｏｓａｎ−Ｓ−Ｓ−ＣＯＯＨ（１００μｇ）を加えて、常温で２４時間反応させた。反応液を透析膜（ＭＷＣＯ：１０００Ｄａ）を用いて毎３時間ごとに媒質を変えながら、２４時間ｐＨ７の条件である２次蒸留水で透析した。透析後、反応物を凍結乾燥してＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを得た。（収得率５０％、図１３、図１４）。
【０１９９】
実施例１４：ＴＣＡが二硫化（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合で共有結合したキトサンおよびｐＤＮＡを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ」という）の製造
ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ（２０ｎｍｏｌ）とｐＤＮＡ（１ｎｍｏｌ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、１０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを得た。
【０２００】
（電気泳動方法と粒子サイズの分析によるｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造確認）
ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズの分析により確認し、背景条件はＨＥＰＥＳバッファー溶液を用い、重量比を１：３、４．５の比を比較して最適な条件を確認した。
【０２０１】
電気泳動方法により確認した結果、製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは非常に安定して製造され、最小１：５の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。そして、粒子サイズの変化を適用して最適な重量比は１：５０に設定した。
【０２０２】
（ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡのｐＨに対する安定性試験）
前記製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの安定性を確認するために、ｐＨ５．２、１．８、７．４のＰＢＳバッファー溶液の条件で試験をする。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、６、１２、１８、２４時間にｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ溶液を取って分析する。
【０２０３】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でｐＨに対する安定性が増加したと説明することができる。
【０２０４】
（ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの毒性試験）
製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの毒性を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用い、毒性の検証方法としてはＭＴＴ実験方法を利用した。
【０２０５】
結果的に、ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは９０％以上の高い生存率を示すことを確認した。
【０２０６】
（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いた細胞吸収能確認試験）
製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞吸収能を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いた。実験方法は、ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分譲させて準備した後、サンプルＲｈｄａｍｉｎｅ−Ｂが結合したｐＤＮＡ／ＣｈｉｔｏｓａｎとｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを注入する。２時間の培養後、ＰＢＳを用いて３回の洗浄過程を経てｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて観察する。
【０２０７】
その結果、対照群として用いられたｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎも陽イオンの表面電荷をもっていて若干の吸収能は有することを示したが、結果的に、製造されたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡが対照群のｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎより優れた細胞吸収能を有することを確認した。
【０２０８】
（Ｃａｃｏ−２単層を用いたｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞透過能検査）
ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞透過能を検証するためにＣａｃｏ−２細胞を単層培養して試験をした。試験は計６時間進行し、１０分、３０分、１、２、４、６時間にサンプルを採取して検査した。
【０２０９】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／ＣＳ−ＴＣＡより低い細胞透過能を有することを確認することができ、その数値はｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎと類似すると確認した。これは、二硫化結合（−Ｓ−Ｓ−）によってタウロコール酸がＣａｃｏ−２細胞内で分離されてタウロコール酸のみが透過をし、ｐＤＮＡ／ＣＳはＣａｃｏ−２細胞内に蓄積されることを示す。
【０２１０】
（経口投与によるｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験）
経口投与によるｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験のためにＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂが結合したキトサンを用い、マウスはＢａｌｂ／ｃ７週齢を用い、６時間の絶食後に薬物を経口投与し、６時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
【０２１１】
その結果、ｐＤＮＡ／ＣＳ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは小腸、特に回腸を通して吸収され、肝にも若干の吸収が進むことを確認した。これは、小腸までは既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路にそのまま沿うものであり、小腸で二硫化結合（−Ｓ−Ｓ−）が分離されて製造されたｐＤＮＡ／Ｃｈｉｔｏｓａｎがタウロコール酸の循環経路を外れて小腸内に蓄積されることを示す。
【０２１２】
実施例１５：ＴＣＡが二硫化結合で共有結合したプロタミン（以下、「Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＮＨ２の製造
システイン（１０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＭＥＳバッファー（５０ｍｍｏｌ、ｐＨ６）に溶解させ、溶液が透明になるまで冷浴で撹拌させた。過剰のＥＤＣ（システインに対して２．４当量）を加えて１０分間撹拌させた後、常温で過剰のＮＨＳ（ＥＤＣに対して２．５倍当量）を加えて１０分間撹拌させた。ＥＤＣとＮＨＳによるカルボキシル基の活性後、プロタミン（１５０ｍｍｏｌ）を加えて、ｐＨ７で２４時間反応させた。反応が終わると、２次蒸留水で２４時間透析し、凍結乾燥してＰｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＮＨ２を得た。
【０２１３】
Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造
活性化されたプロタミンにＴＣＡをコンジュゲーションさせるために、ＴＣＡ（５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた後、４−ＮＰＣ（２００ｍｇ）およびＴＥＡ（１００μｇ）を加えて活性化されたプロタミン（１００ｎｍｏｌ）を追加する。この後、常温で１時間反応させてＰｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを製造した（図１５）。
【０２１４】
実施例１６：ＴＣＡが二硫化（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合で共有結合したプロタミンおよびｐＤＮＡを含むナノ粒子（以下、「ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ」という）の製造
Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ（２００μｇ）とｐＤＮＡ（１μｇ）をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー溶液に追加して準備した。この後、製造されたＰｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ溶液を撹拌し、同時にｐＤＮＡの入ったＨＥＰＥＳバッファー溶液を１０μｌずつ追加した。定められた量のｐＤＮＡをすべて追加した後、１０分間追加的に撹拌し、反応を仕上げて最終収得物ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを得た。（収得率：８０％、図１６）。
【０２１５】
（ＴＮＢＳＡ方法および表面電荷の測定を利用したＰｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの合成検証）
Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの合成を検証するためにＴＮＢＳＡ方法を利用し、より正確には、プロタミンのアミングループを数量化して消耗したアミングループ、すなわち、ＴＣＡが結合した比率を測定した。また、Ｚｅｔａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ分析機器を用いて表面電荷を測定した。
【０２１６】
その結果、プロタミンに対してタウロコール酸の供給比が増加すれば増加するほどプロタミンのアミングループが減少することを確認し、これによって表面電荷も減少することを確認した。このような変化は供給比１：１５まで行われ、供給比１：１５の後には大きな変化を見せなかった。これにより、タウロコール酸が効果的にプロタミンに結合し、最適な供給比は１：１５であることを確認した。
【０２１７】
（電気泳動方法と粒子サイズ、表面電荷の分析によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造確認）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの製造を確認するために電気泳動方法と粒子サイズ、表面電荷を測定して確認し、背景条件はＨＥＰＥＳバッファー溶液を用い、重量比を１：５、２５、５０、１００、１５０、２００の比を比較して最適な条件を確認した。
【０２１８】
電気泳動方法により確認した結果、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは非常に安定して製造され、最小１：５の重量比を用いて製造した時、完全に製造されることを確認した。そして、粒子サイズの変化および表面電荷値を適用して最適な重量比は１：２００に設定した。
【０２１９】
（ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡのｐＨに対する安定性試験）
前記製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの安定性を確認するために、ｐＨ５．２、１．８、７．４のＰＢＳバッファー溶液の条件で試験をした。試験される因子は、時間に応じた大きさを測定してｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの安定性を測定し、時間は、試験開始直後、６、１２、２４時間にｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡ溶液を取って分析した。
【０２２０】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、前記提示された条件で優れた安定性を示すことを確認し、これは、胆汁酸の一種であるタウロコール酸の結合でｐＨに対する安定性が増加したと説明することができる。
【０２２１】
（ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの毒性試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの毒性を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用い、毒性の検証方法としてはＭＴＴ実験方法を利用した。
【０２２２】
結果的に、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは９０％以上の高い生存率を示すことを確認した。
【０２２３】
（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いた細胞吸収能確認試験）
製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞吸収能を確認するためにＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を用いた。実験方法は、ＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞を１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分譲させて準備した後、サンプルＲｈｄａｍｉｎｅ−Ｂが結合したｐＤＮＡ／ＰｒｏｔとｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡを注入した。２時間の培養後、ＰＢＳを用いて３回の洗浄過程を経てｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙを用いて観察した。
【０２２４】
その結果、対照群として用いられたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔも陽イオンの表面電荷をもっていて若干の吸収能は有することを示したが、結果的に、製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡが対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔより優れた細胞吸収能を有することを確認した。
【０２２５】
（Ｃａｃｏ−２単層を用いたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞透過能検査）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの細胞透過能を検証するためにＣａｃｏ−２細胞を単層培養して試験をした。試験は計６時間進行し、試験直後、１０分、３０分、１、２、４、６時間にサンプルを採取して検査した。
【０２２６】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、対照群のｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＴＣＡより低い細胞透過能を有することを確認することができ、その数値はｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔと類似すると確認した。これは、二硫化結合（−Ｓ−Ｓ−）によってタウロコール酸がＣａｃｏ−２細胞内で分離されてタウロコール酸のみが透過をし、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ、より正確にはｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−ＳＨはＣａｃｏ−２細胞内に蓄積されることを意味する。
【０２２７】
（製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの遺伝子発現による遺伝子伝達能検証）
ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの遺伝子発現効果検証のためにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ方法を利用した。対照群としては、ｐＤＮＡ、Ｐｒｏｔ、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡ、そしてｂＰＥＩを用いた。
【０２２８】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは、陰性対照群であるｐＤＮＡ、Ｐｒｏｔ、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡより最小２倍最大１０倍以上の効果を有することを確認し、陽性対照群であるｂＰＥＩと類似の遺伝子伝達効果を有することを確認した。
【０２２９】
（経口投与によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験）
経口投与によるｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡの生体内分布度確認実験のためにＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂが結合したプロタミンを用い、マウスはＢａｌｂ／ｃ７週齢を用い、６時間の絶食後に薬物を経口投与し、６時間での生体内分布を蛍光イメージを通して確認した。
【０２３０】
その結果、ｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔ−Ｓ−Ｓ−ＴＣＡは回腸を通して吸収され、肝には全く吸収されないことを確認した。これは、小腸までは既存の知られたタウロコール酸の生体内循環経路をそのまま沿うものであり、小腸で二硫化結合（−Ｓ−Ｓ−）が分離されて製造されたｐＤＮＡ／Ｐｒｏｔがタウロコール酸の循環経路を外れて小腸内に蓄積されることを意味する。証拠資料として、Ｐｒｏｔ−ＴＣＡは、小腸を経て肝においても高い量の吸収率を示したことを確認することができる。
【０２３１】
実施例１７：ＴＣＡが共有結合したヒアルロン酸（ＨＡ−ＴＣＡ）の製造
ＴＣＡはＨＡとコンジュゲーションを誘導するために初期アミノ化された。アミノ化されたＴＣＡの合成は次の通りである。
【０２３２】
ＴＣＡ−ＮＨ２の製造
０℃でＴＣＡ（１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（５ｍＬ）に溶解させ、溶液が透明になるまで撹拌した。ＴＥＡ（６ｍｍｏｌ）および４−ＮＰＣ（５ｍｍｏｌ）を順に加えて、０℃で１時間反応させた後、常温で６時間さらに撹拌した。その後、５０００ｒｐｍで遠心分離した後、ペレットをエチルアセテート（２０ｍＬ）に分散させ、分別漏斗に移し、同量の２次蒸留水を加えて抽出した。水層を集めて回転蒸発器で残っている有機溶媒を除去した後、４８時間凍結乾燥させてＴＣＡ−ＮＰＣを得た。
【０２３３】
形成されたＴＣＡ−ＮＰＣ（１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた後、４−ＭＭＰ（４−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎ−２−ｏｎｅ）（２ｍｍｏｌ）を加えて、５０℃で６０分間撹拌させた。その後、エチレンジアミン（１００ｍｍｏｌ）を滴加し、常温で１６時間反応させた。過剰のアセトンを加えて生成された沈殿物を濾過した後、４８時間凍結乾燥させてＴＣＡ−ＮＨ２を得た（図１７）。
【０２３４】
ＨＡ−ＴＣＡの製造
ＴＣＡとＨＡ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）のコンジュゲーションはＥＤＣ／ＮＨＳ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにより行われた。ＨＡのカルボキシル基は、初期ｐＨ４、４℃でＥＤＣ（２００ｍｇ）で１５分間処理された。その後、ＮＨＳ（１００μｇ）を加えて１０分間撹拌した。ＴＣＡ−ＮＨ２（１００μｇ）を加えて、ｐＨ７、常温で７時間反応させた。反応が終わると、２次蒸留水で２４時間透析膜（ＭＷＣＯ：１０００Ｄａ）を用いて透析した後、４８時間凍結乾燥してＨＡ−ＴＣＡを得た［収得率１０％、図１８］。
【０２３５】
実施例１８：ＴＣＡが共有結合したヘパリン（Ｈｅｐ−ＴＣＡ）の製造
ＨＡの代わりにＨｅｐを用いたことを除けば、実施例１７と同様の方法でＨｅｐ−ＴＣＡを得た。
【０２３６】
ＴＣＡのアミノ化はＴＣＡとＨＡまたはＨｅｐとの間の安定したアミド結合を形成するのに役立った。図１８に示された１Ｈ  ＮＭＲ分析の結果、δ８ｐｐｍでＴＣＡとＨＡとの間のアミド結合コンジュゲーションピークが検出された。
【０２３７】
ＴＮＢＳ分析により、ＴＣＡの成功したアミノ化を確認した。このような結果からそれぞれのＴＣＡ分子はそのバックボーン内に１つのアミン基を有することが分かった。ＴＣＡとしてＨｅｐまたはＨＡのコンジュゲーションは１Ｈ  ＮＭＲ分析により確認された［図１８］。１．０〜１．５ｐｐｍ付近のピークからＴＣＡモイエティの存在および３．５〜３．９ｐｐｍ付近のピークからＨＡモイエティの存在が確認され、８ｐｐｍの新しいピークからＴＣＡとＨＡとの間の安定したアミド結合が形成されたことが確認された。
【０２３８】
ＨｅｐまたはＨＡに結合したＴＣＡ分子の数を定量化するために硫酸分析を実施した。この後、実験はＨｅｐまたはＨＡとＴＣＡが１：５のコンジュゲーション比率を有するＨＡ−ＴＣＡまたはＨｅｐ−ＴＣＡで行った。しかも、これらのゼータ電位は負電荷を示した。
【０２３９】
実施例１９：Ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡの製造
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に溶解したＰｒｏｔ（１ｍｇ／ｍＬ）をストック溶液として用いた。ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子（７．７８０ｍｇ）を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）（１．９２２ｍＬ）に溶解させてＧＬＰ−１遺伝子溶液を製造した。ｇｅｎｔｌｅ  ｖｏｒｔｅｘ下、ＧＬＰ−１遺伝子溶液をストックＰｒｏｔ溶液に滴加してＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体溶液を製造した。Ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体のＰｒｏｔ：ＧＬＰ−１が１：２０のモル比の場合、正のゼータ電位および強い相互作用が現れた。
【０２４０】
ｇｅｎｔｌｅ  ｖｏｒｔｅｘ下、前記Ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体をＨＡ−ＴＣＡ水溶液に１：１（ｖ／ｖ）で加えて、常温で３０分間培養させた後、凍結乾燥してｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡを得た（収得率２０％）。
【０２４１】
実施例２０：ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡの製造
ＨＡの代わりにＨｅｐを用いたことを除けば、実施例１９と同様の方法でｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡを得た。
【０２４２】
ＧＬＰ−１およびＰｒｏｔの間の異なるモル比率を有するＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体を製造し、ゲルリタデーション実験により、Ｐｒｏｔに対してＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子が１：２０のモル比率で複合化されていることが確認された。
【０２４３】
ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体は血清内で安定しており、Ｈｅｐ−ＴＣＡまたはＨＡ−ＴＣＡでＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体をコーティングしてもＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体の構造的完全性を失うことなく依然として血清内安定していることを確認した。また、ＴＥＭ分析により、Ｈｅｐ−ＴＣＡまたはＨＡ−ＴＣＡでＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体をコーティングする場合、１８５ｎｍから２３５ｎｍに粒子サイズが増加することを確認し、また、Ｈｅｐ−ＴＣＡまたはＨＡ−ＴＣＡでＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１遺伝子複合体をコーティングした後、ＴＥＭ顕微鏡写真から透明なコーティングシェルが観察された。
【０２４４】
多様なｐＨ条件で粒子の安定性を確認した。すなわち、胃腸管（ＧＩ  ｔｒａｃｔ）の胃、十二指腸および回腸（ｉｌｅｕｍ）断片でのｐＨ条件と類似のｐＨ３、ｐＨ５およびｐＨ７．４の３つのｐＨ溶液に入れて、粒子サイズを観察した。その結果、ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１イオン複合体はｐＨ３で不安定であったが、Ｈｅｐ−ＴＣＡまたはＨＡ−ＴＣＡのような多糖類−ＴＣＡ高分子でコーティングされたｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１遺伝子複合体は、Ｈｅｐ−ＴＣＡまたはＨＡ−ＴＣＡのような多糖類−ＴＣＡ高分子のコーティングによって粒子の安定性が改善され、ｐＨ３で２４時間まで安定していることを確認した。したがって、多糖類−ＴＣＡ高分子でコーティングされた後、粒子は安定していることを確認した。
【０２４５】
実験例７：試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）遺伝子発現およびトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）研究
ＡＳＢＴ（Ａｐｉｃａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂｉｌｅ  Ｓａｌｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）−過発現ＭＤＣＫ細胞およびＣａｃｏ−２細胞株を用いて緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）の発現を観察した。
【０２４６】
実施例１９および２０の遺伝子伝達用ナノ粒子にｅＧＦＰ遺伝子４μｇをローディングした後、前記細胞株から成功した発現および緑色蛍光を観察した。
【０２４７】
次に、二重層細胞培養技術で遺伝子複合体の伝達を研究するために、トランスウェルプレートの頂端部位でＣａｃｏ−２単層を培養し、基底部位でＭＤＣＫ−ＡＳＢＴ細胞株を培養した。Ｈｅｐ−ＴＣＡおよびＨＡ−ＴＣＡそれぞれがコーティングされたＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡ（実施例１９）およびＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡ（実施例２０）の伝達を分析した。Ｃａｃｏ−２単層でＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡ（実施例１９）およびＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡ（実施例２０）からｅＧＦＰの最小限の発現が観察された。これから、シェルは標的遺伝子の放出において重要な役割を果たしていることが分かった。
【０２４８】
培地で糖数値に反応して試験管内のＧＬＰ−１の発現を数値化するＧＬＰ−１  ＥＬＩＳＡキットを用いた結果、ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の向上した発現が現れた。
【０２４９】
実験例８：Ｐｒｏｔ／ｅＧＦＰ／多糖類−ＴＣＡ遺伝子複合体の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）生体分布（ｂｉｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）
ｅＧＦＰローディングされたＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡ（実施例１９）およびＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡ（実施例２０）の生体内生体分布を調べるために、下記の実験を行った。
【０２５０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の１２時間、前記動物を絶食させた。絶食１２時間後、ｅＧＦＰ遺伝子１００μｇを含有する試料を経口胃管栄養法（ｏｒａｌ  ｇａｖａｇｅ）で投与した。投与２４時間後に動物を犠牲にし、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で生体内遺伝子発現および試料の生体内分布を定量化した。
【０２５１】
その結果、本発明の遺伝子伝達複合体は、ＨＡ−ＴＣＡまたはＨｅｐ−ＴＣＡによって回腸および肝断片での向上したｅＧＦＰ遺伝子の発現を確認した。
【０２５２】
実験例９：生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＧＬＰ−１をコーディングする遺伝子の発現および血糖数値の調節
５週齢のＺＤＦＲ（Ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔｓ）を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。治療遺伝子複合体の経口投与前の１２時間、前記動物を絶食させた。絶食１２時間後、Ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡ（実施例１９）およびＰｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡ（実施例２０）１００μｇをそれぞれ経口投与させた。投与２４時間後、所定の時間間隔で尾静脈から血液を採取して血糖数値を測定した。驚くべきことに、血糖数値が正常血糖数値に調節されたことを確認した。５日後、実験動物を犠牲にし、ＥＬＩＳＡキットで異なる組織でのＧＬＰ−１およびインスリンの発現を分析した。その結果、対照群と比較して、ＧＬＰ−１  ｌｏａｄｅｄ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ＴＣＡ  ｇｅｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓの経口投与後、ＧＬＰ−１ペプチドとインスリンタンパク質の向上した発現が現れた。
【０２５３】
実験例１０：ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）毒性
４週齢のＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄｏｗｌｅｙ  ｒａｔｓ）を木からなるケージに閉じ込めて、規則的に食べ物と水を提供した。本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子、すなわち、ｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／ＨＡ−ＴＣＡ（実施例１９）およびｐｒｏｔ／ＧＬＰ−１／Ｈｅｐ−ＴＣＡ（実施例２０）をそれぞれ異なる濃度で経口および静脈投与した。所定の時間間隔で実験動物の血液を採取して一般の血液内容物（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を分析し、肝および腎臓の活性を決定する生物学的マーカーの発現を評価した。その結果、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子を非常に高い濃度で投与したしても毒性がほとんど現れなかった。
【０２５４】
投与７日後に動物を犠牲にし、他の臓器の免疫組織検査を実施した。その結果、組織内でいかなる炎症も観察されておらず、毒性もほとんど現れなかった。
【０２５５】
したがって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、安全で、無毒性であり、糖尿病の治療に使用可能であることが分かった。
【０２５６】
以上、本発明の実施例について詳細に記述されたが、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、添付した請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明を多様に変形して実施できる。したがって、本発明のこれからの実施例の変更は、本発明の技術を逸脱することがない。
【産業上の利用可能性】
【０２５７】
本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、摂取された食事を感知し、生物学的システム内の血糖数値とインスリン分泌を調節できる新たな経口遺伝子伝達システムであって、胆汁酸または胆汁酸誘導体が共有結合したイオン性高分子および遺伝子を含む。
【０２５８】
本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記陽イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性の陰イオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
【０２５９】
また、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、負電荷の遺伝子と陽イオン性高分子の静電的相互作用によって陽イオン性高分子の内部に負電荷の遺伝子が封入されたイオン複合体がナノ粒子のコア部分に存在し、前記イオン複合体の陽イオン性高分子と、親水性の陰イオン性基を有する胆汁酸またはその誘導体が共有結合した陰イオン性高分子が静電的相互作用で結合して前記陰イオン性高分子に共有結合した胆汁酸またはその誘導体は、親水性のイオン性基を有する形態でナノ粒子の表面に位置する、胆汁酸またはその誘導体が表面修飾された形態のナノ粒子である。
【０２６０】
したがって、本発明の遺伝子伝達用ナノ粒子は、陽イオン性高分子と遺伝子を直接的な物理的な結合により胃酸から防御をし、安全に小腸細胞に伝達することができ、また、小腸細胞内にＧＬＰ−１遺伝子を発現するＬ−Ｃｅｌｌでのみ発現させる標的型ナノ粒子として用いることができる。
【０２６１】
治療遺伝子を標的細胞に伝達するために、本発明の胆汁酸またはその誘導体が表面修飾されたナノ粒子を用いる場合、腸粘膜を通して遺伝子をよく伝達すると同時に、ナノ粒子のコアに存在するイオン複合体によって胃腸管で非常に安定している。これから、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、経口投与用に非常に好適であることが分かる。
【０２６２】
本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸によってナノ粒子のＧＩ分解を抑制し、小腸の回腸部分で腸細胞膜の胆汁酸受容体であるＡＳＢＴ（ａｐｉｃａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）受容体を吸収して細胞内に治療遺伝子を伝達可能で、向上した遺伝子発現を示すことができる。
【０２６３】
特に、治療遺伝子として、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を用いた場合、腸細胞内の酵素であるグルタチオンおよびｐＨによって、本発明に係るナノ粒子の表面に修飾された胆汁酸と陽イオン性高分子が分離されてｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎに入り、分離された治療遺伝子は腸細胞の核にのみ伝達されて、多量のＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）が発現して糖尿病治療効能を効率的に示す。したがって、本発明に係る遺伝子伝達用ナノ粒子は、糖尿病マウスモデルへの経口投与時、成功したＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１ペプチド（ＧＬＰ−１  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＧＬＰ−１変異体、ＧＬＰ−１誘導体、ＧＬＰ−１作用剤（ＧＬＰ−１  ａｇｏｎｉｓｔ）、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）またはエキセンディン−４（ｅｘｅｎｄｉｎ−４）を発現させると同時に、インスリンを分泌させて血糖降下効果を示し、糖尿病、特に第２型糖尿病を効果的に予防または治療することができる。
【０２６４】
（配列リストＦｒｅｅ  Ｔｅｘｔ）
配列リスト１：ＧＬＰ−１コーディング配列（ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019514902.tif 000022
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