(57)【要約】  本発明は、ＨＳＶに対する処置又はワクチン接種のためのワクチン組成物であって、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドのマルチマー複合体を含むワクチン組成物に関する。本発明はまた、ＨＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、ワクチン組成物を生産するための方法をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１、
（ｉｉ）ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８及びＵＬ４９；又は
（ｉｉｉ）ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１及びＵＬ３４
のマルチマー複合体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１が、配列番号：１のアミノ酸配列と７５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ１６が、配列番号：２のアミノ酸配列と７２％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ１６が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ２１が、配列番号：３のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ２１が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８が、配列番号：６のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ４９が、配列番号：７のアミノ酸配列と６２％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ４９が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１が、配列番号：８のアミノ酸配列と８５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ３４が、配列番号：９のアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ３４が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１又はＨＳＶポリペプチドＵＬ４８及びＵＬ４９を含むマルチマー複合体が、ＨＳＶポリペプチドｇＥを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ＨＳＶポリペプチドｇＥが、配列番号：４のアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドｇＥが、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
ＨＳＶポリペプチドｇＥが、前記ＨＳＶポリペプチドｇＥの細胞質ドメインである、請求項９又は１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
ＨＳＶポリペプチドｇＥの細胞質ドメインが、配列番号：５のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ｇＥの細胞質ドメインが、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドがＨＳＶ−１ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ポリペプチドがＨＳＶ−２ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
核酸によってコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容し得る担体又はアジュバントをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
被験体においてＨＳＶに対する免疫応答を誘導する方法において使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
ＨＳＶ感染症の治療、予防若しくは改善又はＨＳＶの再活性化の予防のための、請求項１７に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１９】
ＨＳＶがＨＳＶ−１である、請求項１７又は１８に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項２０】
ＨＳＶがＨＳＶ−２である、請求項１７又は１８に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項２１】
（ｉ）ＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１並びに場合によりｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＵＬ４８、ＵＬ４９及び場合によりｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｉｉｉ）ＵＬ３１及びＵＬ３４をコードするポリヌクレオチド
を含む、ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のワクチン組成物を生産するための方法であって、
（ｉ）請求項２２に記載の宿主細胞を培養すること；
（ｉｉ）マルチマー複合体を得ること；
（ｉｉｉ）及び、前記マルチマー複合体と薬学的に許容し得る担体又はアジュバントとを混合すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＳＶに対する処置又はワクチン接種のためのワクチン組成物であって、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドのマルチマー複合体を含むワクチン組成物に関する。本発明はまた、ＨＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、ワクチン組成物を生産するための方法をさらに含む。
【背景技術】
【０００２】
背景
単純ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスとして公知のウイルス科のウイルス属である。ヒトに感染する種は、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）及び単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）として一般的に公知であり、それらの正式名称は、それぞれヒトヘルペスウイルス１（ＨＨＶ−１）及びヒトヘルペスウイルス２（ＨＨＶ−２）である。ＨＳＶ−１の初期感染は、典型的には、小児期又は青年期に起こり、終生持続する。ＨＳＶ−１の感染率は世界中で４０％〜８０％であり、社会経済的地位が低い人ほど高い。多くの場合、ＨＳＶ−１に曝露された人は、無症候性のセロコンバージョンを示す。しかしながら、初期感染も重度であり得、脱水症になるほど飲食を妨げる重度の不快感を伴う１〜２mmの広範な水疱を引き起こし、１０〜１４日間継続し得、接種の１〜２６日後に起こり得る。再発性口唇ヘルペスは、米国人口の約３分の１が罹患しており、これらの患者は、典型的には、１年当たり１〜６回のエピソードを経験する。紅斑性基部上の丘疹は数時間以内に小胞になり、続いて、７２〜９６時間以内に潰瘍期、痂皮期及び治癒期へと進行する(Cernik et al., 2008, Arch Intern Med., vol. 168, pp. 1137-1144)。２００３年の全体的推定では、人口の１６．２％が、性器ヘルペスの主要原因であるＨＳＶ−２に感染していると推測されている。潜伏期として公知の非複製状態に入ることによって免疫系によるクリアランスを上手く回避するウイルスの能力は、終生感染につながる。潜伏期からの周期的再活性化が可能であり、初期感染部位からのウイルス排出につながる。ヘルペスによる生殖器病変は非常に痛みを伴うことが多く、重大な心理的病的状態につながり得る。このウイルスはまた、出生時に母親から子供に受け継がれ得る。処置しなければ、播種性疾患を有する乳児の８０％が死亡し、生存者は脳に損傷を受けることが多い。加えて、性器ヘルペスは、ＨＩＶ罹患リスクの２〜３倍の増加に関連し（性行為当たりのＨＩＶ伝播は最大５倍）、高ＨＳＶ−２有病率集団内の新たなＨＩＶ感染の４０〜６０％を占め得る(Looker et al., 2008, Bulletin of the World Health Organization, vol. 86, pp. 805-812)。
【０００３】
現在のところ、合成非環状プリンヌクレオシド類似体であるアシクロビルは、ＨＳＶ感染の標準治療であり、症候のコントロールに非常に役立っている。前駆薬物である（アシクロビルに変換される）バラシクロビル及び（ペンシクロビルに変換される）ファムシクロビルは認可されており、それぞれアシクロビル及びペンシクロビルよりも良好な経口バイオアベイラビリティを有する。利用可能な薬物は、ウイルス感染細胞内のみにおいてウイルス性チミジンキナーゼによって活性薬物に変換されるので、優れた安全性を有する。しかしながら、ＨＳＶは、チミジンキナーゼ欠損突然変異体の生成によって、又はアシクロビルをリン酸化することができないチミジンキナーゼ有する突然変異体の選択によって、チミジンキナーゼをコードするウイルス遺伝子における突然変異を介して、アシクロビルに対する耐性を生じ得る。アシクロビルに対して耐性のほとんどの臨床ＨＳＶ分離株はチミジンキナーゼ欠損性であるが、一部では、ＤＮＡポリメラーゼの変化が検出されている。ＨＳＶは、活性化前数カ月間又は数年間にわたってニューロンに潜伏し得るので、このような治療は、ＨＳＶによって引き起こされる症候を処置するために使用され得るが、ウイルスの周期的再活性化を回避し得ない。
【０００４】
したがって、ＨＳＶと闘う最も有効かつ経済的な方法は、ウイルスの初期感染及び／又は周期的再活性化を予防するワクチンであろう。過去数十年間、多くの努力がこのようなワクチンの開発に注がれてきた。しかしながら、強力なＨＳＶワクチンを開発しようとする試みは、臨床試験において低い成績を示した限られた数の抗原に焦点を当てている。したがって、ＨＳＶに対するワクチンが至急必要である。
【発明の概要】
【０００５】
詳細な説明
ワクチン組成物
本発明はこの必要性に対処し、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１のマルチマー複合体、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドＵＬ４８、ＵＬ４９及びｇＥのマルチマー複合体、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドＵＬ３１及びＵＬ３４のマルチマー複合体を含む新規ワクチン組成物を提供する。
【０００６】
「マルチマー複合体」又は「複合体」という用語は本明細書では互換的に使用され、任意の共有結合分子（例えば、脂質アンカー又はオリゴ糖）又は非タンパク質補欠分子族（例えば、ヌクレオチド又は金属イオン）と一緒に少なくとも２つのポリペプチドサブユニットから構成される安定なポリペプチド複合体を指す。この文脈における補欠分子族は、堅く結合した補因子を指す。したがって、マルチマー複合体は、２つのポリペプチド（すなわち、ダイマー）、３つのポリペプチド（すなわち、トリマー）又は４つのポリペプチド（すなわち、テトラマー）を含み得る。本発明のマルチマー複合体は、in vivoで機能的単位として存在することが示されている相互作用タンパク質のセットに関し、本発明のマルチマー複合体のポリペプチドは、ストリンジェントなタンパク質精製方法を使用して共精製され得る。このようなストリンジェントなタンパク質精製方法は、非特異的及び／又は人工的なタンパク質相互作用を強制しないバッファー及び溶液を使用するので、ストリンジェントな洗浄条件に供された場合にインタクトな状態を保持する複合体の精製のみをもたらす（すなわち、複合体のポリペプチドは放出されない）。したがって、ポリペプチドの相互作用を示すに過ぎない方法、例えば細胞抽出物からの免疫沈降又はプルダウン実験は、本発明の複合体を精製するための適切な方法とは考えられない。同様に、ポリペプチドの共局在化又はポリペプチドの相互作用を示すに過ぎない方法は、特にこのような方法が例えば酵母ツーハイブリッド系などの人工改変ポリペプチドを用いる場合、本発明の複合体を示すものではない。したがって、精製後、本発明の複合体は、適切な方法（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）を使用して検出され得る。その結果として、組成物中に単に存在する２つ以上のポリペプチド（これらは、in vivoで複合体として存在することが示されたものであり得る）は、このような複合体が、特定の精製方法及び条件を使用した場合にのみ形成する可能性があり、精製後に特定の保存条件下でのみ安定である可能性があるので、本発明の複合体とは考えられない。したがって、特定のポリペプチドがin vivoで複合体を形成することが示された場合であっても、前記ポリペプチドは、溶液中でモノマーとして存在し得る。一実施態様では、マルチマー複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１及びＵＬ１６を含むダイマーである。さらなる実施態様では、複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１６及びＵＬ２１を含むダイマーである。好ましい実施態様では、複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１を含むトリマーである。さらに好ましい実施態様では、マルチマー複合体はトリマーであり、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１を含むか又はそれらからなる。一実施態様では、マルチマー複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８及びＵＬ４９を含むダイマーである。さらなる実施態様では、複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ４９及びｇＥを含むダイマーである。好ましい実施態様では、複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８、ＵＬ４９及びｇＥを含むトリマーである。さらに好ましい実施態様では、マルチマー複合体はトリマーであり、ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８、ＵＬ４９及びｇＥを含むか又はそれらからなる。さらに好ましい実施態様では、複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１及びＵＬ３４を含むか又はそれらからなるダイマーである。本発明のマルチマー複合体では、タンパク質の１つ以上は、さらなるＢ細胞エピトープ及び／又はＴ細胞エピトープを含み得る。前記Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープ又はＣＤ８  Ｔ細胞エピトープであり得る。好ましくは、本発明の複合体は、相乗効果を提供する。したがって、本発明の複合体は、好ましくは、患者ＰＢＭＣを用いたELISPOTアッセイにおいて、単一タンパク質と比較して強い免疫応答を誘発することができる。
【０００７】
本発明の複合体は、当技術分野で公知の適切な手段及び方法を使用して作製され得る。本発明の複合体は、宿主細胞において複合体が形成するように、宿主細胞において複合体の単一ポリペプチドを共発現させることによって作製され得る。本発明の複合体はまた、別個の宿主細胞において複合体の単一ポリペプチドを発現させ、宿主細胞から単一ポリペプチドを精製し、複合体の形成を可能にする条件下で単一ポリペプチドをin vitroで混合することによって作製され得る。しかしながら、本発明の複合体はまた、別個の宿主細胞において複合体の単一ポリペプチドを発現させ、宿主細胞から単一ポリペプチドを精製し、複合体がin vivoで形成するように単一ポリペプチドを被験体に投与することによって作製され得る。複合体の単一ポリペプチドを被験体に投与した後に複合体がin vivoで形成するかは、in vivo条件（すなわち、３７℃、血液、血清及び生理学的塩濃度）に似たモデル系において決定され得る。
【０００８】
ワクチン組成物のポリペプチドは、タグを含み得る。本明細書で使用される場合、ポリペプチドタグは、ポリペプチドの精製及び／又は検出をもたらすリコンビナントポリペプチドと遺伝的に融合されたアミノ酸配列である。ワクチン組成物のポリペプチドは、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐＩＩタグ、Ｓｏｆタグ、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、Ｅタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＴＣタグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｔｙタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｎｕｓタグ、チオレドキシンタグ、Ｆｃタグ、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合され得る。好ましい実施態様では、ワクチン組成物のポリペプチドは、６個又は１２個のＨｉｓ残基から構成され得るポリヒスチジンタグに融合され、８個のＨｉｓ残基が好ましい。ポリペプチドタグは、好ましくは、ポリペプチドリンカーを介してワクチン組成物のポリペプチドに融合される。ポリペプチドリンカー及び８Ｈｉｓタグの好ましい組み合わせは、配列番号：１０に示されている。
【０００９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸のポリマーを含む分子を指す。前記用語は、本明細書では、特定の長さの分子を指すことを意味するものではないので、本明細書では「タンパク質」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語はまた、発現カセット若しくはベクターによって発現されるか、又は本発明の宿主細胞から単離され得る「目的のポリペプチド」又は「目的のタンパク質」を含む。ポリペプチドはアミノ酸配列を含むので、アミノ酸配列を含むポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」と称されることもある。したがって、本明細書では、「ポリペプチド配列」という用語は、「アミノ酸配列」という用語と互換的に使用される。
【００１０】
「アミノ酸」又は「ａａ」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、並びにその後に改変されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合した炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学物質を指す。
【００１１】
「エピトープ」は、免疫系、例えばＢ細胞又はＴ細胞によって認識される抗原の一部である。この用語は、コンフォメーショナルエピトープ及び線状（又は連続）エピトープの両方を包含する。コンフォメーショナルエピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続セクションを含むのに対して、線状エピトープは、抗原のアミノ酸配列の連続的セクションから構成される。コンフォメーショナルエピトープはまた、２つ以上の抗原のアミノ酸配列のセクションを含み得る。この用語は、クリプトトープ及びネオトープをさらに含む。「クリプトトープ」は、天然に存在する抗原、例えばウイルス中に隠れているが、抗原がその天然コンフォメーションで存在していない場合にアクセス可能になり得るエピトープである。「ネオトープ」は、タンパク質の四次構造においてのみ見られ、タンパク質モノマーに見られないエピトープである。
【００１２】
Ｂ細胞エピトープは、特定の膜結合型Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）又は抗体のいずれかによって認識される抗原（例えば、天然タンパク質）の領域である。Ｂ細胞エピトープを同定又は選択するための多くの方法が容易に利用可能であり、Ｘ線結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的突然変異誘発、突然変異誘発マッピング及びファージディスプレイ、並びにSun et al. Comput Math Methods Med. 2013; 2013: 943636に概説されている計算方法が挙げられる。例えば、適切な方法としては、幾何学的属性及び特定の物理化学的特性を含む抗原及びエピトープ関連傾向スケールの３Ｄ構造に依拠する構造ベースの予測モデルが挙げられる。構造ベースのアルゴリズム及びウェブサーバー（プログラム）としては、例えば、ＥＰＳＶＲ及びＥＰＭｅｔａ(http://sysbio.unl.edu/services/)、ＥＰＣＥＳ(http://sysbio.unl.edu/services/EPCES/)及びＥｐｉｔｏｐｉａ(http://epitopia.tau.ac.il/)が挙げられる。ミモトープベースの予測方法は、インプットとして抗体親和性選択ペプチド及び抗原の３Ｄ構造の両方を必要とするコンビナトリアル方法である。ミモトープベースの予測モデルに基づく例示的なアルゴリズム及びプログラムとしては、例えば、ＭｉｍｏＰｒｏ(http://informatics.nenu.edu.cn/MimoPro)、ＰｅｐＳｕｒｆ(http://pepitope.tau.ac.il)及びＥｐｉＳｅａｒｃｈ(http://curie.utmb.edu/episearch.html)が挙げられる。さらに、抗原の一次配列のみに依拠する配列ベースの予測モデル、例えばSun et al. Comput Math Methods Med. 2013; 2013: 943636に概説されているBEST及びZhangの方法が利用可能である。加えて、抗原及び抗体の相互作用であるタンパク質間相互作用の結合部位予測に注目する方法を推論する結合部位予測モデル、例えばＰｒｏＭａｔｅ、ＣｏｎＳｕｒｆ、ＰＩＮＵＰ、及びＰＩＥＲが使用され得る。
【００１３】
Ｔ細胞エピトープは、典型的には、プロセシングタンパク質抗原に由来する。Ｔ細胞エピトープは、ＣＤ４−Ｔ細胞エピトープ又はＣＤ８Ｔ細胞エピトープであり得る。細胞傷害性（ＣＤ８）Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子によってディスプレイされた細胞内ペプチド（ＣＤ８Ｔ細胞エピトープ）を認識するが、Ｔヘルパー細胞は、細胞外空間から取り込まれてＭＨＣクラスＩＩ分子によってディスプレイされたペプチド（ＣＤ４Ｔ細胞エピトープ）を認識する。ペプチド：ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）はＴ細胞レセプターと相互作用し、その活性化とそれに続く細胞性免疫応答の誘導をもたらす。Ｔ細胞エピトープ予測及び／又は選択のための多くのin silico方法が利用可能である。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ予測の場合、Larsen et al. BMC Bioinformatics 2007, 8:424に概説されているように、ＮｅｔＣＴＬ−１．２(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、ＥｐｉＪｅｎ(http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm)又はＭＡＰＰＰ(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/)が使用され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合、エピトープ予測のためのコンピューターモデルは、Oyarzun P et al. BMC Bioinformatics 2013, 14:52に概説されており、ペプチド配列比較に依拠して結合モチーフを同定するデータ駆動型の方法、例えばＲａｎｋｐｅｐ(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、ＴＥＰＩＴＯＰＥ及びＮＮ−ａｌｉｇｎ(http://www.cbs.dtu.dk/services/NNAlign/)、並びに結合エネルギーを推測するために分子モデリング計算を実施することによって実験的結合データとの非依存性を提供する構造ベースの方法、例えばＮｅｔＭＨＣＩＩＰａｎ−２．０(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-2.0/)、ＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎ(http://www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/TEPITOPEpan/)及びＰｒｅｄｉｖａｃ(http://predivac.biosci.uq.edu.au/)が挙げられる。
【００１４】
「単純ヘルペスウイルス」及び「ＨＳＶ」という用語は本明細書では互換的に使用され、一般に、ヘルペスウイルス属単純ヘルペスウイルスのウイルス、すなわちクモザル亜科ヘルペスウイルス１、ウシヘルペスウイルス２、オナガザル亜科ヘルペスウイルス１、オナガザル亜科ヘルペスウイルス２、オナガザル亜科ヘルペスウイルス１６、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、カンガルー科ヘルペスウイルス１、カンガルー科ヘルペスウイルス２、リスザル亜科ヘルペスウイルス１を指す。単純ウイルス属の好ましいウイルス種は、ヒトに感染するウイルスである。さらにより好ましいウイルス種は、それぞれヒトヘルペスウイルス１及び２（ＨＨＶ−１及びＨＨＶ−２）としても公知の単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）及び単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）である。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」という用語は、被験体におけるＨＳＶに関連する病理学的症状を予防又は治療するために使用され得る本発明のマルチマー複合体を含む組成物に関する。「ワクチン組成物」は、活性成分の免疫学的活性を増強する１つ以上のさらなる成分又は例えば緩衝剤、還元剤、安定剤、キレート化剤、増量剤、浸透圧平衡化剤（等張化剤）；界面活性剤、ポリオール、抗酸化剤；凍結保護剤；消泡剤；保存剤；及び着色料、洗浄剤、ナトリウム塩及び／若しくは抗菌剤などを含んでいてもよいし、又は含まなくてもよい。ワクチン組成物は、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。本発明のワクチンは、好ましくは、ヒト及び／又は家畜への使用のためのものである。ワクチン組成物は、滅菌及び／又はパイロジェンフリーのものであり得る。ワクチン組成物は、ヒトに対して等張性のものであり得る。
【００１６】
ワクチン組成物は、好ましくは、治療有効量の本発明のマルチマー複合体又は本発明の方法によって取得可能なマルチマー複合体を含む。
【００１７】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ１１は、好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列と７５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ１１」という用語は、ＨＳＶのテグメントタンパク質に関する。配列番号：１は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４６７４．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ１１のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ１１」という用語はまた、配列番号：１に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ１１ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：１に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ１１」という用語は、配列番号：１のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％若しくは好ましくは７５％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：１のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個若しくは好ましくは２４個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ１１タンパク質は、ＵＬ１６、ＵＬ２１及び／又はｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいＵＬ１１タンパク質は、ＵＬ１６若しくはｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とダイマーを形成し得、ＵＬ１６及びＵＬ２１と、若しくはＵＬ１６及びｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とトリマーを形成し得、並びに／又はＵＬ１６、ＵＬ２１及びｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とテトラマーを形成し得る。
【００１９】
「配列同一性」又は「％同一性」は、正規化アルゴリズムを使用してアライメントした少なくとも２つのポリペプチド配列間の残基マッチの割合を指す。このようなアルゴリズムは、２つの配列間のアライメントを最適化するために、再現可能な正規化方法で、比較される配列にギャップを挿入し得るので、２つの配列のより有意義な比較を達成し得る。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．３．０(Jan-13-2016) (Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402)を使用して決定される。２つのアミノ酸配列の配列同一性は、以下のパラメータ：Matrix: BLOSUM62、Word Size: 3; Expect value: 10; Gap cost: Existence = 11、Extension = 1; Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustmentに設定されたｂｌａｓｔｐを使用して決定され得る。
【００２０】
「免疫応答」という用語は、好ましくはin vivoで、しかしin vivoのみではなく、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導する能力を指す。体液性免疫応答は、Ｂ細胞性抗体応答を含む。細胞性免疫は、限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞性免疫応答を含む。免疫応答を誘発する抗原の能力は免疫原性と称され、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答であり得る。本発明の免疫応答は、好ましくは、ＨＳＶに対する免疫応答、さらにより好ましくは被験体におけるＨＳＶ感染症に対する免疫応答である。
【００２１】
in vivoで体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導する能力は、性器ＨＳＶ−２感染症のモルモットモデル（これは、ヒトにおける疾患を正確に反映し、病因と、候補抗ウイルス化合物及びワクチンの治療有効性とを調べる系に相当する）を使用して決定され得る。それはまた、性器常在性及び神経組織常在性免疫記憶の両方の性質に対応する理想的な系としても機能する。モルモットの性器感染症は、ヒト疾患に見られるものを反映する神経学的兆候を伴う自己限定性外陰膣炎をもたらす。雌性モルモットにおける原発疾患は、一般には８日間に限定される性器上皮細胞におけるウイルス複製を伴う。この間、ウイルスは感覚神経終末に到達し、逆行性輸送によって、脊髄における感覚神経節及び自律神経ニューロンの細胞体に輸送される。この部位における短期間の急性複製の後、免疫系は、通常、接種後１５日目までに急性ウイルス複製を解消し、ウイルスは、感覚ニューロンの終生潜伏感染として維持される。原発ＨＳＶ−２性器感染症から回復した後、モルモットは、一時的な自発性再発性感染症及び疾患を経験する。ＨＳＶ−２再発は、会陰上に紅斑病変及び／若しくは水疱性病変を伴う臨床的に明らかな疾患として、又は生殖管からのウイルスの排出を特徴とする無症候性再発として現れ得る。ワクチン有効性は、例えば、モルモット性器感染症モデルを使用して評価され得る。ＨＳＶ−２（例えば、ＭＳ株） ５×１０１ＰＦＵ、５×１０２ＰＦＵ、５×１０３ＰＦＵ、５×１０４ＰＦＵ、５×１０６ＰＦＵ、５×１０７ＰＦＵ、５×１０８ＰＦＵ又は５×１０９ＰＦＵ、好ましくは５×１０５ＰＦＵを動物に膣内感染させ得る。感染前又は感染後に、動物を１回、２回、３回、４回、５回以上免疫化し得る。好ましくは、感染後１５日目に、動物を１５日間隔で２回免疫化した。一般に、任意の適切な投与経路が免疫化に使用され得る。しかしながら、好ましくは、動物を筋肉内的に免疫化する。アジュバントのみ（例えば、ＣｐＧ １００μg／ミョウバン １５０μg）又はＰＢＳ（両ネガティブコントロール）又はＨＳＶ−２  ｄＩ５−２９突然変異体ウイルス株（ポジティブコントロール）のいずれかで、可能なコントロール群を偽免疫化し得る。各免疫化ラウンドでは、各抗原 ０．１μg、０．５μg、１μg、２μg、３μg、４μg、５μg、１０μg、１５μg、２５μg、３０μg、３５μg、４０μg、５０μg、６０μg、７０μg、８０μg、９０μg、１００μg、１５０μg、２００μg、好ましくは２０μg用量を、アジュバントと組み合わせたワクチン候補で免疫化される群に投与し得る。再発性ウイルス排出の頻度及び規模の評価のために、例えば、感染後０日目〜２００日目、感染後１日目〜１８０日目、感染後３日目〜１６０日目、感染後５日目〜１４０日目、感染後７日目〜１２０日目、感染後１０日目〜１００日目、感染後１２日目〜９０日目に、リードアウトとして膣スワブを回収し得る。１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日又は１０日ごとに、膣スワブを回収し得る。好ましくは、感染後１５日目〜８５日目に、膣スワブを毎日回収する。同じ時間間隔で、再発性性器ヘルペス病変の重症度（スコア０〜４）及び持続期間を毎日スコア化する。好ましくは、研究終了時に、抗体応答並びにＣＤ４＋及��ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を決定する。
【００２２】
限定されないが、経口、局所、経皮、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内又は眼内を含む様々な経路が、本発明のワクチン組成物の投与に適用可能である。しかしながら、所望により、当業者であれば、任意の他の経路を容易に選択し得る。
【００２３】
被験体に投与される本発明のワクチン組成物の正確な用量は、処置の目的（例えば、急性疾患の処置対予防的ワクチン接種）、投与経路、年齢、体重、一般的健康、性別、食事、投与時間、薬物相互作用及び症状の重症度に依存し得、当業者によるルーチンな実験によって確認可能であろう。投与用量は、好ましくは有効用量である（すなわち、免疫応答を誘発するために有効である）。
【００２４】
本発明のワクチン組成物は、被験体に１回以上、例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回以上投与され得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、動物、好ましくは例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ又は霊長類であり得る哺乳動物に関する。好ましくは、被験体は、ヒトである。しかしながら、「被験体」という用語はまた、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞を含む。このような細胞は、免疫細胞、好ましくはリンパ球であり得る。
【００２６】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ１６は、好ましくは、配列番号：２のアミノ酸配列と７５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ１６は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ１６」という用語は、ＨＳＶのテグメントタンパク質に関する。配列番号：２は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４６７９．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ１６のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ１６」という用語はまた、配列番号：２に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ１６ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：２に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ１６」という用語は、配列番号：２のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％若しくは好ましくは７２％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：２のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個若しくは好ましくは１０４個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ１６タンパク質は、ＵＬ１１、ＵＬ２１及び／又はｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいＵＬ１６タンパク質は、ＵＬ２１若しくはＵＬ１１とダイマーを形成（for）し得、ＵＬ１１及びＵＬ２１とトリマーを形成し得、並びに／又はＵＬ１１、ＵＬ２１及びｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とテトラマーを形成し得る。
【００２８】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ２１は、好ましくは、配列番号：３のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ２１は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ２１」という用語は、ＨＳＶのテグメントタンパク質に関する。配列番号：３は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４６８４．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ２１のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ２１」という用語はまた、配列番号：３に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ２１ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：３に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ２１」という用語は、配列番号：３のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％若しくは好ましくは８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：３のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個若しくは好ましくは１３４個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ２１タンパク質は、ＵＬ１１、ＵＬ１６及び／又はｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいＵＬ２１タンパク質は、ＵＬ１６とダイマーを形成（for）し得、ＵＬ１１及びＵＬ１６とトリマーを形成し得、並びに／又はＵＬ１１、ＵＬ１６及びｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とテトラマーを形成し得る。
【００３０】
本明細書で言及されるように、本発明のワクチン組成物に含まれるマルチマー複合体はまた、４つのポリペプチドを含むポリペプチド複合体（すなわち、テトラマー）であり得る。したがって、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６、ＵＬ２１を含む本発明のマルチマー複合体は、ＨＳＶポリペプチドｇＥをさらに含み得る。この場合、本発明のマルチマー複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６、ＵＬ２１及びｇＥを含む。
【００３１】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドｇＥは、好ましくは、配列番号：４のアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドｇＥは、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「ｇＥ」という用語は、「糖タンパク質Ｅ」と称されることもあり得る。配列番号：４は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４７３２．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ｇＥのアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ｇＥ」という用語はまた、配列番号：４に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するｇＥポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：４に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ｇＥ」という用語は、配列番号：４のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％若しくは好ましくは７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：４のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個若しくは好ましくは１６５個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいｇＥタンパク質は、ＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１と複合体を形成し得る。したがって、好ましいｇＥタンパク質は、��Ｌ１１とダイマー、ＵＬ１１及びＵＬ１６とトリマー、並びにＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１とテトラマーを形成し得る。
【００３３】
本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物に含まれるＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６、ＵＬ２１を含むマルチマー複合体はまた、ＨＳＶポリペプチドｇＥの細胞質ドメインを含むテトラマーであり得る。この場合、本発明のマルチマー複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６、ＵＬ２１及びｇＥの細胞質ドメインを含む。
【００３４】
本発明のワクチン組成物のｇＥの細胞質ドメインは、好ましくは、配列番号：５に記載されているアミノ酸配列を含む。しかしながら、ｇＥの細胞質ドメインは、配列番号：５のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％若しくは好ましくは８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号：５のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２４個、２５個、２６個、２７個若しくは好ましくは２３個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを含むことも本明細書で想定される。ｇＥの好ましい細胞質ドメインは、ＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１と複合体を形成し得る。したがって、ｇＥの好ましい細胞質ドメインは、ＵＬ１１とダイマー、ＵＬ１１及びＵＬ１６とトリマー、並びにＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１とテトラマーを形成し得る。
【００３５】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ４８は、好ましくは、配列番号：６のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ４８」という用語は、ＨＳＶのテグメントタンパク質ＶＰ１６に関する。配列番号：６は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４７１２．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ４８のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ４８」という用語はまた、配列番号：６に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ４８ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：６に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ４８」という用語は、配列番号：６のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％若しくは好ましくは８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：６のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個若しくは好ましくは９８個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ４８タンパク質は、ＵＬ４９とダイマーを形成し得、又はＵＬ４９及びｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とトリマーを形成し得る。
【００３７】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ４９は、好ましくは、配列番号：７のアミノ酸配列と６２％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ４９は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ４９」という用語は、ＨＳＶのテグメントタンパク質ＶＰ２２に関する。配列番号：７は、アクセッションナンバーＡＫＣ４２８１３．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ４９のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ４９」という用語はまた、配列番号：７に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ４９ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：７に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ４９」という用語は、配列番号：２のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７４％、７３％、７２％、７１％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％若しくは好ましくは６２％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：７のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個若しくは好ましくは１１５個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ４９タンパク質は、ＵＬ４８及び／又はｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいＵＬ４９タンパク質は、ＵＬ４８若しくはｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とダイマーを形成し得、又はＵＬ４８及びｇＥ若しくはｇＥの細胞質尾部とトリマーを形成し得る。
【００３９】
本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物に含まれるＨＳＶポリペプチドＵＬ４８、ＵＬ４９を含むマルチマー複合体はまた、ＨＳＶポリペプチドｇＥの細胞質ドメインを含むトリマーであり得る。この場合、本発明のマルチマー複合体は、ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８、ＵＬ４９及びｇＥの細胞質ドメインを含む。
【００４０】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ３１は、好ましくは、配列番号：８のアミノ酸配列と８５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ３１」という用語は、ＨＳＶのビリオン放出タンパク質に関する。配列番号：８は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４６９５．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ３１のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ３１」という用語はまた、配列番号：８に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ３１ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：８に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ３１」という用語は、配列番号：１のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％若しくは好ましくは８５％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：８のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個若しくは好ましくは４６個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ３１タンパク質は、ＵＬ３４とダイマーを形成し得る。
【００４２】
本発明のワクチン組成物のＨＳＶポリペプチドＵＬ３４は、好ましくは、配列番号：９のアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ３４は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ＵＬ３４」という用語は、ＨＳＶのビリオン放出タンパク質に関する。配列番号：９は、アクセッションナンバーＡＨＧ５４６９８．１でＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋにも寄託されているＨＳＶ−２  ＵＬ３４のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「ＵＬ３４」という用語はまた、配列番号：９に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するＵＬ３４ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号：９に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「ＵＬ３４」という用語は、配列番号：２のアミノ酸配列と比較して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％若しくは好ましくは７０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号：９のアミノ酸配列と比較して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個若しくは好ましくは７５個のアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいＵＬ３４タンパク質は、ＵＬ３１とダイマーを形成（for）し得る。
【００４４】
前述のように、突然変異が、本発明のワクチン組成物における抗原としてのタンパク質の使用に有害ではない限り、本発明の各タンパク質は、配列番号：１（ＵＬ１１）、配列番号：２（ＵＬ１６）、配列番号：３（ＵＬ２１）、配列番号：４（ｇＥ）、配列番号：５（ｇＥの細胞質ドメイン）、配列番号：６（ＵＬ４８）、配列番号：７（ＵＬ４９）、配列番号：８（ＵＬ３１）及び配列番号：９（ＵＬ３４）に示されている参照配列と比べて、挿入、欠失及び置換などの突然変異を含有し得る。加えて、このような突然変異は、本発明のマルチマー複合体を形成するタンパク質の能力を妨げてはならない。本発明のマルチマー複合体の形成は、タンパク質精製を実施し、例えば非還元ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析することによって試験され得る。特に、各タンパク質は、例えば、検出、精製を容易にし得、及び／又は溶解性を増強し得るタグを含み得る。
【００４５】
本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物のマルチマー複合体のポリペプチドは、ＨＳＶ−１ポリペプチドである。
【００４６】
本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物のマルチマー複合体のポリペプチドは、ＨＳＶ−２ポリペプチドである。
【００４７】
本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容し得る担体又はアジュバントをさらに含み得る。
【００４８】
「担体」及び「賦形剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。薬学的に許容し得る担体としては、限定されないが、希釈剤（充填剤、増量剤、例えばラクトース、微結晶性セルロース）、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム）、結合剤（例えば、ＰＶＰ、ＨＰＭＣ）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、流動促進剤（例えば、コロイダルＳｉＯ２）、溶媒／共溶媒（例えば、水性ビヒクル、プロピレングリコール、グリセロール）、緩衝剤（例えば、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）、保存剤（例えば、安息香酸Ｎａ、パラベン（Ｍｅ、Ｐｒ及びＢｕ）、ＢＫＣ）、抗酸化剤（例えば、ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸）、湿潤剤（例えば、ポリソルベート、ソルビタンエステル）、消泡剤（例えば、シメチコン）、増粘剤（例えば、メチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース）、甘味剤（例えば、ソルビトール、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファム）、香味剤（例えば、ペパーミント、レモン油、バタースコッチなど）、保湿剤（例えば、プロピレン、グリコール、グリセロール、ソルビトール）が挙げられる。さらなる薬学的に許容し得る担体は、（生分解性）リポソーム；生分解性ポリマーポリ（Ｄ，Ｌ）−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）から作製されたマイクロスフェア、アルブミンマイクロスフェア；合成ポリマー（可溶性）；ナノ繊維、タンパク質−ＤＮＡ複合体；タンパク質コンジュゲート；赤血球；又はビロソームである。様々な担体ベースの剤形は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ポリマーナノ粒子、セラミックナノ粒子、ヒドロゲルナノ粒子、共重合ペプチドナノ粒子、ナノ結晶及びナノ懸濁液、ナノ結晶、ナノチューブ及びナノワイヤー、官能化ナノ担体、ナノスフェア、ナノカプセル、リポソーム、脂質エマルジョン、脂質マイクロチューブ／マイクロシリンダー、脂質マイクロバブル、リポスフェア、リポポリプレックス、逆脂質ミセル、デンドリマー、エトソーム、多成分超薄カプセル、アクアソーム、ファーマコソーム、コロイドソーム、ニオゾーム、ディスコーム、プロニオソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン及びポリマーミセルである。他の適切な薬学的に許容し得る賦形剤は、とりわけRemington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991)及びBauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5th Ed., Govi-Verlag Frankfurt (1997)に記載されている。当業者であれば、例えば、医薬組成物の製剤化及び投与経路に応じて、適切な薬学的に許容し得る担体を容易に選択することができるであろう。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原又はそのフラグメントに対する宿主の免疫応答（抗体及び／又は細胞性）を増強、増大又は強化する物質を指す。本発明にしたがって使用するための例示的なアジュバントとしては、無機化合物、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン灰石、ＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＴＬＲ４アゴニストであるモノホスホリル脂質（ＭＰＬ）、ＴＬＲ４アゴニストであるグルコピラノシル脂質（ＧＬＡ）、油中水型エマルジョンであるＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１及び７２０鉱油、例えばパラフィン油、ビロソーム、細菌産物、例えば死菌Bordetella pertussis、Mycobacterium bovis、トキソイド、非細菌有機物質、例えばスクアレン、チメロサール、洗浄剤（Ｑｕｉｌ  Ａ）、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２、並びに複合組成物、例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバントが挙げられる。一般に、本発明にしたがって使用されるアジュバントは、好ましくは、本発明のマルチマー複合体に対する免疫応答を強化し、及び／又はそれを所望の免疫応答に対してモジュレーションする。
【００５０】
「薬学的に許容し得る」という用語は、本発明のマルチマー複合体の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性材料を意味する。
【００５１】
精製
全てのその文法的形態の「精製」は、望ましくない化合物、例えば細胞、細胞残屑、培養培地、バキュロウイルス、インタクト又は非インタクトなバキュロウイルスなどを除去することを意味する。発現系、収量などに応じた適切な精製方法は、先行技術において容易に利用可能である。例えば、精製としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び／又は混合モードクロマトグラフィー（これらは全て、これまでに詳細に記載されている）が挙げられ得る。前記のように、精製工程は、とりわけ、バキュロウイルスを除去することを包含する。このようなバキュロウイルスは、バキュロウイルスベクター又はＢａｃＭａｍベクターを感染させた宿主細胞から取得可能な培養培地及び／又は上清に含まれ得る。本発明のマルチマー複合体を精製する場合、このようなバキュロウイルスが除去されることが好ましい。
【００５２】
本明細書で使用される場合、精製はまた、ＨＳＶタンパク質を共発現する宿主細胞が培養培地から除去され得ることを含む。前記宿主細胞は前記マルチマー複合体を分泌し得るので、前記培養培地は、好ましくは本発明のマルチマー複合体を含む。培養培地からの宿主細胞の除去は、機械力によって、例えば遠心分離又はろ過によって行われ得る。ろ過は、好ましくは、ろ過媒体、例えば精密ろ過フィルタ又はデプスフィルタを使用することによって行われる。精密ろ過フィルタは、ポリエーテルスルホン又は再生セルロースから構成され得る。デプスフィルタは、ポリプロピレン又はガラス繊維から構成され得る。
【００５３】
しかしながら、前記宿主細胞は、前記マルチマー複合体を必ずしも分泌しなくてもよいことも想定される。そのような場合、前記宿主細胞を回収し得る。回収後、マルチマー複合体を放出させるために、前記宿主細胞を例えば酵素的又は機械的に破壊し得、次いで、本明細書に記載されるようにこれを精製し得る。
【００５４】
精製後、キレート化剤をマルチマー複合体に追加することが想定される。
【００５５】
保存
全てのその文法的形態の「保存」は、好ましくは本発明のマルチマー複合体をそのインタクト又は機能的な形態で維持する条件下で（将来的な使用のために）貯蔵することを意味する（すなわち、マルチマー複合体は、好ましくは、その天然に存在する形態に似ている）。したがって、保存条件は、本発明のマルチマー複合体の崩壊を促進しない（又は防止さえする）ことが想定される。「崩壊」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で理解されるべきであり、「分解」及び／又は「変性」を意味し得る。本発明のマルチマー複合体の保存は、キレート化剤及び／又は安定剤を含むバッファー溶液中であることが想定される。
【００５６】
一般に、本発明のマルチマー複合体の保存を可能にし、その崩壊を促進しない限り、任意のキレート化剤及び／又は安定剤が適切である。
【００５７】
本発明のバッファー溶液は、トリスバッファー、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファーを含み得る。
【００５８】
ワクチン組成物の使用
本発明はまた、被験体においてＨＳＶに対する免疫応答を誘導する方法におけるワクチン組成物の使用に関する。
【００５９】
本発明の好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、ＨＳＶ感染症の治療、予防若しくは改善又はＨＳＶ再活性化の予防に使用される。
【００６０】
したがって、ワクチン組成物は、ＨＳＶによって引き起こされる疾患及び／又は関連症候との闘いにおいて使用され得る。本発明のワクチン組成物は、被験体におけるウイルスを除去するために使用され得ることも想定される（すなわち、処置後、被験体から得られた適切なサンプルにおいて、ＨＳＶは、当業者に公知の適切な方法、例えばＰＣＲ、ＥＬＩＳＡなどを使用して検出され得ない）。したがって、本発明のワクチン組成物は、原発感染症を阻止し、原発疾患を停止し、ウイルスの再活性化及び再感染を阻止し、潜伏を阻止するために使用され得る。
【００６１】
性器ヘルペスの機会を減少させるために、母親の一次ＨＳＶ感染を予防するための予防的ワクチンが望ましいが、母親が活動性ＨＳＶ感染症と診断された場合には、有効な治療が必要である。本発明のマルチマー複合体は、例えば、妊婦若しくは子供のための予防ワクチンとして、又は血清陽性女性において送達時に無症候性再活性化を予防するための治療的ワクチンとして適用され得る。
【００６２】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、被験体においてＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２に対する免疫応答を誘導するための方法において使用される。
【００６３】
ベクター
本発明はさらに、ＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１並びに場合によりｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、ＵＬ１１及びＵＬ１６をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、ＵＬ１６及びＵＬ２１をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明はさらに、ＵＬ４８、ＵＬ４９及びｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、ＵＬ４８及びＵＬ４９をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、ＵＬ４９及びｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明はさらに、ＵＬ３１及びＵＬ３４をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一般に、本発明の複合体のＨＳＶタンパク質をコードする遺伝子はまた、１つを超えるベクター、例えば２つのベクター上に存在し得る。したがって、遺伝子の１つ、２つ又は３つは第１のベクター上にあり、残りの遺伝子は第２のベクター上にある。しかしながら、各遺伝子はまた、別個のベクター上に存在し得る。しかしながら、好ましくは、前記遺伝子は、単一ベクター上に存在する。遺伝子はまた、ポリジェニック形態で存在し得る（欧州特許出願公開第１９４５７７３号）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットが挿入又はクローニングされ得る核酸配列を指す。さらに、ベクターは、宿主細胞の選択をもたらす抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。
【００６５】
ベクターは、細菌（例えば、E. coli）、酵母（例えば、S. cerevisiae）、昆虫細胞及び／又は哺乳動物細胞における増殖のためのエレメントを含有し得る。好ましくは、前記ベクターは、バキュロウイルスベクター又はバキュロウイルスＢａｃＭａｍベクターである。ベクターは、線状、環状又はスーパーコイル状の形態を有し得、特定の目的のために他のベクター又は他の材料と複合体形成し得る。ベクターはまた、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。
【００６６】
ＢａｃＭａｍ系では、バキュロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞に送達するために使用される。ＢａｃＭａｍ系は、宿主細胞として広範囲の細胞株及び初代細胞への遺伝子送達のために使用され得、これらの例示的なリストは、本明細書の他の箇所に含まれる。非改変バキュロウイルスは哺乳動物細胞に侵入することができるが、しかしながら、哺乳動物認識可能プロモーターが目的の遺伝子の上流に組み込まれない限り、その遺伝子は発現されない。したがって、本発明のＢａｃＭａｍベクターは、本発明のマルチマー複合体のタンパク質をコードする遺伝子の上流に哺乳動物プロモーターを含むことが想定される。ベクターは、本明細書の他の箇所に記載されるさらなるエレメント、例えば抗生物質耐性遺伝子、E. coli、S. cerevisiaeなどにおける増殖のためのエレメントを含み得る。
【００６７】
ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、クローニング部位、遺伝子マーカー、抗生物質耐性遺伝子、エピトープ、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグを含む１つ以上のさらなるエレメントを含有し得る。当業者であれば、特定の発現系に適切なエレメントを容易に把握するであろう。
【００６８】
特に、本発明のベクターは、細菌（E. coli）、酵母（S. cerevisiae）、昆虫細胞及び／又は哺乳動物細胞における増殖のためのエレメント、例えば複製起点、選択マーカーなどをさらに含有し得る。
【００６９】
ベクターは、遺伝子発現のためのプロモーターを含むことが想定される。本明細書に記載される本発明のタンパク質をコードする各遺伝子は、プロモーターによって駆動される。プロモーターは、好ましくは、ｐｏｌｈ、ｐ１０及びｐＸＩＶ超後期バキュロウイルスプロモーター、ｖｐ３９バキュロウイルス後期プロモーター、ｖｐ３９ｐｏｌｈバキュロウイルス後期／超後期ハイブリッドプロモーター、ｐｃａ／ｐｏｌｈ、ｐｃｎａ、ｅｔｌ、ｐ３５、ｅｇｔ、ｄａ２６バキュロウイルス初期プロモーター；ＣＭＶ−ＩＥ１、ＵＢｃ．ＥＦ−１、ＲＳＶＬＴＲ、ＭＴ、シミアンウイルス４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサーを含むベータ−アクチンプロモーター）、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター／エンハンサー、ヒトユビキチンＣプロモーター、ハイブリッドニューロンプロモーター、ｐＤＳ４７、Ａｃ５及びＰＧＡＬ及びＰＡＤＨからなる群より選択される。各遺伝子の後に、ターミネーター配列、例えばＨＳＶｔｋターミネーター、ＳＶ４０ターミネーター又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネーターが続く。
【００７０】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」又は「核酸分子」という用語は本明細書では互換的に使用され、通常、あるデオキシリボース又はリボースから別のものに連結されたポリマー形態のヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、好ましくは、一本鎖形態及び二本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。本発明の核酸分子は、（リボヌクレオチドを含有する）ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーを含み得る。当業者によって容易に認識されるように、それらは、化学的若しくは生化学的に改変され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上を類似体で置換すること、ヌクレオチド間改変、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤及び改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力の点でポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。このような分子は当技術分野で公知であり、例えば、分子の骨格においてペプチド結合がリン酸結合と置き換わった分子を含む。
【００７１】
これに関して、発現産物である核酸は、好ましくはＲＮＡであるのに対して、細胞に導入される核酸は、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば合成ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡである。
【００７２】
本明細書に開示されるマルチマー複合体をコードする核酸又はベクターを含むワクチン組成物も想定される。前記核酸又はベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベースのものであり得る。ワクチン組成物にしたがって使用するための適切なベクターとしては、ＤＮＡベースのベクター、例えばバキュロウイルスベクター、ＢａｃＭａｍベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクターが挙げられる。例えば、プラスミドの形態でかつ場合により複合体化及び／又は安定化形態（例えば、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ビロソーム及び無機ナノ粒子との複合体）の、ネイキッドなＤＮＡの使用も想定される。適切なＲＮＡベースのベクターとしては、レトロウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）ベクターが挙げられる。
【００７３】
マルチマー複合体を含むワクチン組成物と、マルチマー複合体をコードする核酸又はベクターを含むワクチン組成物とは、プライムブーストレジメンにおいて使用され得る。プライムブーストレジメンでは、一次免疫化（プライム又はプライミング）において使用されるワクチン及びブースター免疫化（ブースト又はブースティング）において使用されるワクチンを含む２種類以上のワクチンから構成されるプライム／ブーストワクチンが使用される。一次免疫化において使用されるワクチン及びブースター免疫化において使用されるワクチンは、互いに異なり得る。一次免疫化及びブースティング免疫化は逐次的に実施され得るが、しかしながら、これは必須ではない。プライム／ブーストレジメンとしては、限定されないが例えば、ＤＮＡプライム／タンパク質ブーストが挙げられる。しかしながら、ブースティング組成物はプライミング組成物としても使用され得、前記プライミング組成物はブースティング組成物として使用される。
【００７４】
宿主細胞
本発明はさらに、ＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１並びに場合によりｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞に関する。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、ＵＬ１１及びＵＬ１６をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、ＵＬ１６及びＵＬ２１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。
【００７５】
本発明はさらに、ＵＬ４８、ＵＬ４９及びｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞に関する。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、ＵＬ４８及びＵＬ４９をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、ＵＬ４９及びｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。
【００７６】
本発明はさらに、ＵＬ３１及びＵＬ３４をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞に関する。
【００７７】
宿主細胞は、昆虫細胞又は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はまた、細菌（例えば、E. coli）又は酵母（例えば、S. cerevisiae）であり得る。一般に、核酸分子を発現して本発明のマルチマー複合体を産生するために適切な任意の宿主細胞が使用され得る。しかしながら、昆虫宿主細胞及び哺乳動物宿主細胞が好ましい。昆虫宿主細胞がさらにより好ましい。本発明にしたがって使用される宿主細胞は、昆虫細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−１（ＶＥ−１）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−２（ＶＥ−２）、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｆ９−３（ＶＥ−３）、Ｈｉ−５、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｆ＋及びＳ２シュナイダー細胞であり得、Ｈｉ−５が好ましい[Oxford Expression Technologies, Cat. No. 600103, Oxford, UK; Fath-Goodin et al. (2006), Adv. Virus Res. 68, 75-90; Kroemer et al. (2006), J. Virol. 80(24), 12291-12228及び米国特許出願公開第２００６０１３４７４３号]。使用され得る例示的な哺乳動物宿主細胞は当技術分野で公知であり、American Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な不死化細胞株、限定されないが、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＵＶＥＣ、ＨＵＡＥＣ、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、ＭＴ−２、Ｃｏｓ−７、Ｃｏｓ−１、Ｃ１２７、３Ｔ３、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、骨髄線維芽細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ、初代神経細胞又は上皮細胞が挙げられる。ＢａｃＭａｍ系では、バキュロウイルス発現ベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞に送達するために使用される。
【００７８】
生産方法
本発明はさらに、マルチマー複合体を含むワクチン組成物を生産するための方法であって、
（ｉ）本発明の宿主細胞を培養すること；
（ｉｉ）マルチマー複合体を得ること；
（ｉｉｉ）及び、前記マルチマー複合体と薬学的に許容し得る担体又はアジュバントとを混合すること
を含む方法を提供する。
【００７９】
本発明のマルチマー複合体との関連で記載されている実施態様は、必要な変更を加えて、本発明の方法にも適用されることに留意する。
【００８０】
マルチマー複合体は、バキュロウイルス、例えばバキュロウイルス発現系又はＢａｃＭａｍ発現系を使用することによって、宿主細胞、好ましくは昆虫細胞又は哺乳動物細胞において発現され得る。「発現ベクター」は、本明細書では、遺伝物質を発現させ得るターゲット宿主細胞に遺伝物質を移入するために使用されるビヒクルとして定義される。「発現系」は、発現ベクターと、該ベクターのための宿主細胞であって、該宿主細胞における外来遺伝子発現を可能にするための状況を提供する宿主細胞との組み合わせである。本発明の複合体は、一過的又は安定的に発現され得る。したがって、本発明の宿主細胞は、発現ベクターで一過的にトランスフェクションされ得るか、又は例えば安定な細胞株をもたらす宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みを介して、発現ベクターで安定的にトランスフェクションされ得る。
【００８１】
バキュロウイルス発現系は、典型的には、例えばターゲット遺伝子を含有するトランスファーベクターとの相同組換えを介した、非必須ウイルスゲノム領域への外来遺伝子の導入に基づく。得られたリコンビナントバキュロウイルスは、適切な宿主細胞において発現され得る異種タンパク質をコードする外来遺伝子で置き換えられた非必須遺伝子（例えば、ｐｏｌｈ、ｖ−ｃａｔｈ、ＣｈｉＡ）の１つを欠き得る。一般に、これらの技術は当業者に公知であり、例えばKosta et al. Nat Biotechnol. 2005; 23(5):567-75に概説されている。リコンビナントバキュロウイルスベクターを調製するための特定のアプローチは、Bac-to-Bac（登録商標）バキュロウイルス系(Invitrogen)である。
【００８２】
リコンビナントバキュロウイルス発現ベクターは、宿主細胞において、及び場合によりE. coliなどの原核細胞において複製可能なものであり得る。本発明によれば、タンパク質のリコンビナント発現に一般に使用されるバキュロウイルスに由来する任意のバキュロウイルス発現ベクターが使用され得る。例えば、バキュロウイルスベクターは、例えば、ＡｃＭＮＰＶ、Bombyx mori（Ｂｍ）ＮＰＶ、Helicoverpa armigera（Ｈｅａｒ）ＮＰＶ又はSpodoptera exigua（Ｓｅ）ＭＮＰＶに由来し得る。バキュロウイルスベクターは、バクミドであり得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形は、特に文脈上明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「発現カセット」への言及は、本明細書に開示される発現カセットの１つ以上を含み、「方法」への言及は、改変され得るか又は本明細書に記載される方法と置き換えられ得る当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。
【００８４】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、特に文脈上必要がない限り、「含む（comprise）」という単語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変化形は、記述されている整数若しくは工程又は一群の整数若しくは工程を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は一群の整数若しくは工程を排除しないことを暗示すると理解されよう。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「含有する」という用語と置き換えられ得るか、又は本明細書で使用される場合には「有する」という用語と置き換えられることもあり得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「からなる」は、請求項のエレメントにおいて特定されていないいかなるエレメント、工程又は成分も排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的な新規特徴に実質的に影響を与えない材料又は工程を排除しない。本明細書における各事例では、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられ得る。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、所定の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。それはまた、名数を含む（例えば、約２０は２０を含む）。
【００８７】
特に本明細書で他の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、特に文脈上必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本発明の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法にしたがって実施される。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションの技術に関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。
【００８８】
特に他の指示がない限り、本発明の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知でありかつ本明細書を通して引用及び議論されている様々な一般的な参考文献及びより専門的な参考文献に記載されている通りの従来の方法にしたがって実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Pressを参照のこと。本明細書に記載される分子細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学及び医薬品化学に関連して使用される命名法並びにそれらの実験手順及び技術は、当技術分野で周知でかつ一般に使用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１−１】本発明のＨＳＶタンパク質のアミノ酸配列
【図１−２】本発明のＨＳＶタンパク質のアミノ酸配列
【図２】ＵＬ２１／ＵＬ１６／ＵＬ１１−Ｈｉｓトリマーを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの例
【図３−１】ＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓダイマーを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの例
【図３−２】ＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓダイマーを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの例
【図４−１】ＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓダイマーを示すサイズ排除クロマトグラフィーの例
【図４−２】ＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓダイマーを示すサイズ排除クロマトグラフィーの例
【図５】ＵＬ３１−Ｈｉｓ／ＵＬ３４ダイマーを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの例
【図６】ＵＬ３１／ＵＬ３４−Ｈｉｓダイマーを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの例
【図７】ＵＬ３１／ＵＬ３４−Ｈｉｓダイマーを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの例
【図８】感染モルモットを用いたＵＬ３１／ＵＬ３４ダイマーのELISPOT
【図９】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ３１／ＵＬ３４ダイマーのELISPOT
【図１０】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ４８／ＵＬ４９ダイマーのELISPOT
【図１１】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ４８／ＵＬ４９ダイマーのELISPOT
【図１２】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１トリマーのELISPOT
【図１３】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１トリマーのELISPOT
【図１４】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ３１／ＵＬ３４ダイマーのLuminexアッセイ
【図１５】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ４８／ＵＬ４９ダイマーのLuminexアッセイ
【図１６】患者ＰＢＭＣを用いたＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１トリマーのLuminexアッセイ実施例  以下の実施例は本発明を例証するが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００９０】
実施例１
Ｈｉ−５昆虫細胞においてＵＬ２１／ＵＬ１６／ＵＬ１１−Ｈｉｓトリマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、ＩＭＡＣ及び０〜５００mM イミダゾールバッファー系（５０mM Ｈｅｐｅｓ、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１mM ＴＣＥＰ、１０％グリセロール）を使用して、トリマーを精製した。２５mM イミダゾールをカラムに適用することによって、不純物を洗い流した。次いで、２５０mM イミダゾールでトリマーを溶出させ、続いて、イミダゾールを含まないＨｅｐｅｓバッファー（５０mM Ｈｅｐｅｓ、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０．５mM ＴＣＥＰ、１０％グリセロール）で透析した。図２（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの例が示されている。このブロットでは、ＵＬ１１−Ｈｉｓは、薄いバンドによって表されているが、これは、抗Ｈｉｓ抗体を使用して明らかにされたものである。図２（Ｂ）ＵＬ１１−Ｈｉｓを検出するために抗Ｈｉｓ抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示：１．標準、２．ろ過上清、３．細胞ペレット、４．フロースルー、５〜１０．画分Ａ５、Ｂ９、Ｂ１１、Ｃ３、Ｃ６、Ｅ６、１１．画分Ｂ９〜Ｃ３のプール、１２．透析後のペレット、１３．透析後の上清、１４．ろ過タンパク質。
【００９１】
実施例２：
Ｈｉ−５昆虫細胞においてＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、ＩＭＡＣ及び０〜５００mM イミダゾールバッファー系（ＴＢＳバッファー、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を使用して、ダイマーを精製した。５０mM イミダゾールをカラムに適用することによって、不純物を洗い流した。次いで、３５０mM イミダゾールでダイマーを溶出させ、続いて、イミダゾールを含まないＴＢＳバッファー（ＴＢＳバッファー、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール）で透析した。生成物をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にさらに供して、ダイマーの存在を証明した。ＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓダイマーの予想サイズに対応するピークが存在した。図３（Ａ）は、ＳＥＣが示される前のＳＤＳ−ＰＡＧＥの例を示す。表示：１．標準−ａ、２．上清、３．残屑ペレット、４．ろ過上清、５．未結合画分の洗浄、６〜１４．画分２Ａ９、２Ａ１２、２Ｃ４、２Ｃ１０、２Ｃ１２、ろ過２Ｃ１２、２Ｄ２、２Ｄ６、２Ｄ７。図３（Ｂ）及び（Ｃ）は、サンプルのＳＥＣ及びアセトン沈殿後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの例を示す。パネル（Ｃ）では、（Ｂ）と同じゲルが示されているが、低強度のバンドをより可視化するために露出過度にされている。表示：１．標準−ｂ、２〜９．画分ＳＥＣアセトン沈殿Ａ８、Ａ１２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６．１０．標準−ａ、１１．画分２Ｃ１１、２Ｄ１及び２Ｄ２のプールＩＭＡＣ、１２．プールＩＭＡＣ透析液、１３．透析液のプールＩＭＡＣ上清、１４．プールＩＭＡＣペレット、１５．プールＩＭＡＣろ過タンパク質。
【００９２】
実施例３：
ＵＬ４８−Ｈｉｓ／ＵＬ４９−Ｈｉｓ生成物の分析のために、ＴＢＳバッファー、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。Superdex 200 Increase 10/300 GL SECカラム及び流速 ０．５mL/分を使用して、ランを実施した。標準として３mg/mL ＢＳＡを使用して、カラムを較正した。図４（Ａ）では、保持容量 １２．３６及び１４．２１mLのピークは、それぞれＢＳＡ較正標準のダイマー及びモノマー（６６kDa）に対応する。図４（Ｂ）では、１２．９３mLの主ピークはＵＬ４８／ＵＬ４９ダイマーを表すのに対して、１２．１６mLのピークは、ＵＬ４８及びＵＬ４９サブユニットのテトラマー形成に対応する可能性が高い。図４（Ｃ）は、（Ａ）及び（Ｂ）に示されている２回の独立したランのオーバーレイを示す。挿入図は、保持容量 ８．５〜１８mLの領域の拡大を示す。
【００９３】
実施例４：
Ｈｉ−５昆虫細胞においてＵＬ３１−Ｈｉｓ／ＵＬ３４ダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、ＩＭＡＣ及び０〜５００mM イミダゾール連続勾配バッファー系（５０mM Ｈｅｐｅｓ、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１mM ＴＣＥＰ）を使用して、ダイマーを精製した。図５（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの例が示されている。２つの最濃縮画分の一方が、アスタリスクでマーキングされている。図５（Ｂ）ＵＬ３１−Ｈｉｓを検出するために抗Ｈｉｓ抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示：１．標準、２．上清、３．ろ過上清、４．細胞ペレット、５．フロースルー、６．未結合タンパク質の洗浄、７〜１３．画分Ａ８、Ａ１０、Ｂ４、Ｂ８、Ｂ１１、Ｃ２、Ｃ７。
【００９４】
実施例５：
Ｈｉ−５昆虫細胞においてＵＬ３１／ＵＬ３４−Ｈｉｓダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、ＩＭＡＣ及び２５〜５００mM イミダゾール連続勾配バッファー系（５０mM Ｈｅｐｅｓ、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１mM ＴＣＥＰ）を使用して、ダイマーを精製した。図６（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの例が示されている。２つの最濃縮画分の一方が、アスタリスクでマーキングされている。図６（Ｂ）ＵＬ３４−Ｈｉｓを検出するために抗Ｈｉｓ抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示：１．標準、２．上清、３．ろ過上清、４．細胞ペレット、５．フロースルー、６．未結合タンパク質の洗浄、７〜１３．画分Ａ８、Ａ１０、Ｂ４、Ｂ８、Ｂ１１、Ｃ２、Ｃ７。
【００９５】
実施例６：
Ｈｉ−５昆虫細胞においてＵＬ３１／ＵＬ３４−Ｈｉｓダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、ＩＭＡＣ及び０〜５００mM イミダゾールバッファー系（５０mM Ｈｅｐｅｓ、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１mM ＴＣＥＰ、１０％グリセロール）を使用して、ダイマーを精製した。５０mM及び７５mM イミダゾールをカラムに適用することによって、不純物を２段階で洗い流した。次いで、３５０mM イミダゾールでダイマーを溶出させ、続いて、イミダゾールを含まないＨｅｐｅｓバッファー（５０mM Ｈｅｐｅｓ、５００mM ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、０．５mM ＴＣＥＰ、１０％グリセロール）で透析した。図７（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの例が示されている。図７（Ｂ）ＵＬ３４−Ｈｉｓを検出するために抗Ｈｉｓ抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示：１．標準、２．培養細胞ペレット、３．溶解物、４．上清、５．粗ペレット、６．ろ過上清、７．フロースルー、８〜１６．画分Ｂ１２、Ｃ２、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ１１及びＦ１、１７．画分Ｃ３〜Ｃ７のプール、１８．透析材料の合計、１９．透析後の上清、２０．透析後のペレット、２１．ろ過タンパク質。
【００９６】
実施例７：
ＨＳＶ−２感染モルモット及びコントロールモルモット由来の脾細胞（細胞 １×１０５個）と、２０μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ３１／ＵＬ３４複合体とを混合した。次いで、細胞をELISPOT抗インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体コーティングプレート(Multiscreen HTS Plates; Millipore)に移し、２０時間インキュベーションした。その後、標準的なELISPOTプロトコールにしたがってプレートを現像し、自動リーダーを使用してスポットとしてＩＦＮ−γ分泌細胞を定量した。非刺激細胞及び２０μg/mL ＰＨＡをそれぞれネガティブコントロール及びポジティブコントロールとして使用した。結果は、図８に示されている。
【００９７】
実施例８：
ＨＳＶ−２感染個体 １４人及び非感染個体 ６人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ２×１０５個／ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ３１／ＵＬ３４複合体で細胞を４８時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてＩＦＮ−γ分泌細胞をカウントした。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、ＰＢＭＣ ２×１０５個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）として結果を表した。結果は、図９に示されている。ＨＳＶ−２タンパク質ＵＬ３１及びＵＬ３４は、モノマーとして発現することができず、ダイマーとしてのみ発現することができる（個人的意見、データは示さず）。したがって、ＵＬ４８／ＵＬ４９及びＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１複合体について示されているように、ＵＬ３１／ＵＬ３４複合体及び各モノマーの応答を比較することができなかった（図１０及び１２を参照のこと）。
【００９８】
実施例９：
ＨＳＶ−２感染個体 ４人及び非感染個体 ２人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ２×１０５個／ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ４８／ＵＬ４９複合体、又は複合体中の単一タンパク質の量に対して正規化した各モノマーで細胞を４８時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてＩＦＮ−γ分泌細胞をカウントした。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、ＰＢＭＣ ２×１０５個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）として結果を表した。結果は、図１０に示されている。ここでは、非感染個体の応答は、平均値として示されている。
【００９９】
実施例１０：
ＨＳＶ−２感染個体 １４人及び非感染個体 ６人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ２×１０５個／ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ４８／ＵＬ４９複合体で細胞を４８時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてＩＦＮ−γ分泌細胞をカウントした。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、ＰＢＭＣ ２×１０５個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）として結果を表した。結果は、図１１に示されている。
【０１００】
実施例１１：
ＨＳＶ−２感染個体 ４人及び非感染個体 ２人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ２×１０５個／ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１複合体、又は複合体中の単一タンパク質の量に対して正規化した各モノマーで細胞を４８時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてＩＦＮ−γ分泌細胞をカウントした。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、ＰＢＭＣ ２×１０５個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）として結果を表した。結果は、図１２に示されている。ここでは、非感染個体の応答は、平均値として示されている。
【０１０１】
実施例１２：
ＨＳＶ−２感染個体 １４人及び非感染個体 ６人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ２×１０５個／ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１複合体で細胞を４８時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてＩＦＮ−γ分泌細胞をカウントした。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、ＰＢＭＣ ２×１０５個当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）として結果を表した。結果は、図１３に示されている。
【０１０２】
実施例１３：
ＨＳＶ−２感染個体 ４人及び非感染個体 ２人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ５×１０５個／ウェルでプレート上に播種し、続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ３１／ＵＬ３４複合体で４８時間刺激した。その後、上清を収集し、Luminex機器を用いてＩＦＮ−γの分泌について分析した。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、pg/mlとして結果を表した。結果は、図１４に示されている。
【０１０３】
実施例１４：
ＨＳＶ−２感染個体 ４人及び非感染個体 ２人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ５×１０５個／ウェルでプレート上に播種し、続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ４８／ＵＬ４９複合体で４８時間刺激した。その後、上清を収集し、Luminex機器を用いてＩＦＮ−γの分泌について分析した。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、pg/mlとして結果を表した。結果は、図１５に示されている。
【０１０４】
実施例１５：
ＨＳＶ−２感染個体 ４人及び非感染個体 ２人由来のＰＢＭＣを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 ５×１０５個／ウェルでプレート上に播種し、続いて、５μg/mL ＨＳＶ−２  ＵＬ１１／ＵＬ１６／ＵＬ２１複合体で４８時間刺激した。その後、上清を収集し、Luminex機器を用いてＩＦＮ−γの分泌について分析した。（バッファー刺激細胞から生成された）バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、pg/mlとして結果を表した。結果は、図１６に示されている。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月16日(2018.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２感染症の治療、予防又は改善又はＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２の再活性化の予防における使用のための
（ｉ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１、
（ｉｉ）ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８及びＵＬ４９；又は
（ｉｉｉ）ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１及びＵＬ３４
のマルチマー複合体を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１が、配列番号：１のアミノ酸配列と７５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項３】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ１６が、配列番号：２のアミノ酸配列と７２％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ１６が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項４】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ２１が、配列番号：３のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ２１が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項５】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８が、配列番号：６のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ４８が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項６】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ４９が、配列番号：７のアミノ酸配列と６２％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ４９が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項７】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１が、配列番号：８のアミノ酸配列と８５％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ３１が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項８】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ３４が、配列番号：９のアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドＵＬ３４が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項９】
ＨＳＶポリペプチドＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１又はＨＳＶポリペプチドＵＬ４８及びＵＬ４９を含むマルチマー複合体が、ＨＳＶポリペプチドｇＥを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１０】
ＨＳＶポリペプチドｇＥが、配列番号：４のアミノ酸配列と７０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ＨＳＶポリペプチドｇＥが、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項９に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１１】
ＨＳＶポリペプチドｇＥが、前記ＨＳＶポリペプチドｇＥの細胞質ドメインである、請求項９又は１０のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１２】
ＨＳＶポリペプチドｇＥの細胞質ドメインが、配列番号：５のアミノ酸配列と８０％以上同一のアミノ酸配列を含み、前記ｇＥの細胞質ドメインが、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項１１に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドがＨＳＶ−１ポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１４】
ポリペプチドがＨＳＶ−２ポリペプチドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１５】
核酸によってコードされる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容し得る担体又はアジュバントをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
ＨＳＶがＨＳＶ−１である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１８】
ＨＳＶがＨＳＶ−２である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン組成物。
【請求項１９】
（ｉ）ＵＬ１１、ＵＬ１６及びＵＬ２１並びに場合によりｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＵＬ４８、ＵＬ４９及び場合によりｇＥ又はｇＥの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチド；又は
（ｉｉｉ）ＵＬ３１及びＵＬ３４をコードするポリヌクレオチド
を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のワクチン組成物を生産するための方法であって、
（ｉ）請求項２０に記載の宿主細胞を培養すること；
（ｉｉ）マルチマー複合体を得ること；
（ｉｉｉ）及び、前記マルチマー複合体と薬学的に許容し得る担体又はアジュバントとを混合すること
を含む、方法。
【国際調査報告】
2019512501.tif 000021
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