(57)【要約】  本発明は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に特異的に結合する抗体に関するもので、より具体的には配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部として認識する、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又は抗体の断片、これを含むがん診断用組成物、さらに、前記抗体をコードするポリヌクレオチドと組換え発現ベクター、これを利用して形質転換された細胞及び前記抗体又は抗体の断片を製造する方法に関するものである。  本発明による抗体は、野生型ＡＩＭＰ２タンパク質には反応せずに、ｅｘｏｎ２が欠損されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２突然変異タンパク質に特異的に結合するので、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の存在と発現程度の確認に有用に利用することができる。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、がんと炎症性疾患などの病理に関連していて、特に肺がん、乳がん、大腸がんなどのがん疾患から過発現されているので、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２をがん発生と進行のバイオマーカーとして感知するがん診断用組成物の開発に利用することができる。
2019514350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部（epitope）として認識する、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又は抗体の断片。
【請求項２】
前記抗体又は抗体の断片は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位（ＣＤＲ）１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号９で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１記載の抗体又は抗体の断片。
【請求項３】
前記抗体又は抗体の断片は、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１７で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１記載の抗体又は抗体の断片。
【請求項４】
前記抗体は、配列番号１９で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖；及び配列番号２１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことを特徴とする請求項１記載の抗体又は抗体の断片。
【請求項５】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤからなる群から選ばれたことを特徴とする請求項１記載の抗体又は抗体の断片。
【請求項６】
前記抗体の断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖからなる群から選ばれたことを特徴とする請求項１記載の抗体又は抗体の断片。
【請求項７】
請求項１乃至６のうちいずれか一項に記載の抗体又は抗体の断片を含むがん診断用組成物。
【請求項８】
前記がんは結腸がん、大腸がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、子宮頸部がん、子宮内膜がん、絨毛がん、卵巣がん、乳がん、甲状腺がん、脳がん、頭頸部がん、悪性黒色腫、リンパ腫、再生不良性貧血及び血液がんからなる群から選ばれたことを特徴とする請求項７記載のがん診断用組成物。
【請求項９】
請求項１乃至６のうちいずれか一項に記載の抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１６又は配列番号１８で表示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１３】
（ａ）請求項１２に記載の組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；
（ｂ）形質転換された宿主細胞を培養して抗体又は抗体の断片を生産する段階；及び
（ｃ）宿主細胞から生産された抗体又は抗体の断片を収得する段階を含むＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法。
【請求項１４】
がん診断用製剤を製造するための請求項１乃至６のうちいずれか一項に記載の抗体又は抗体の断片の使用。
【請求項１５】
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）請求項１乃至６のうちいずれか一項に記載の抗体又は抗体の断片を利用して、前記生物学的試料内のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を、正常個体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準と比較する段階を含む個体のがん診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月１０日に出願された韓国特許出願第１０−２０１６−００２８８０９号の優先権を主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に特異的に結合する抗体に関するもので、より具体的には、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部（epitope）として認識する、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又は抗体の断片、これを含むがん診断用組成物、前記抗体をコードするポリヌクレオチドと組換え発現ベクター、これを利用して形質転換された細胞及び前記抗体又は抗体の断片を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ＡＩＭＰ２（aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein 2）は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase、ＡＲＳ）複合体の形成に関連したタンパク質の一つである。ＡＩＭＰ２は、タンパク質合成での本源的な機能の他にも、新規ながん抑制剤（tumor suppressor）として、Ｓｍａｄ２／３との直接的な相互作用を通じてＴＧＦ−βの信号伝達を強化する機能があることが知られている。
【０００４】
本発明者による韓国登録特許第１０−０７６２９９５号公報により公知にされた通り、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がん、骨肉腫などの多様ながん細胞株及び組織では、ＡＩＭＰ２のエキソン（exon）２が欠損された形態の変異体であるＡＩＭＰ２−ＤＸ２が過発現されることが観察された。一方、正常細胞を形質転換してＡＩＭＰ２−ＤＸ２を過発現するようにすれば、野生型（WT）ＡＩＭＰ２の水準が大幅に減少し、ＡＩＭＰ２が核に移動することを防ぐなど、ＡＩＭＰ２の活性が抑制され、ｃ−ｍｙｃの発現は増加し、細胞の成長は促進されるなど、ＴＧＦ−β信号の機能異常をもたらすことが分かった。これはＡＩＭＰ２−ＤＸ２とがんの発生と進行との間に密接な関連性があることを示している。
【０００５】
また、本発明者の他の韓国登録特許第１０−１０６７８１６号公報では、ＡＩＭＰ２が、ＴＲＡＦ２との相互作用を通じてＴＮＦ−αの細胞死滅活性（apoptotic activity）を媒介し、この活性はＡＩＭＰ２−ＤＸ２によって調節されることを初めて公開した。また、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２は、炎症マーカーであるＣＯＸ−２の発現にも影響を与える点を究明して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の活性を抑制することにより、炎症性疾患の治療効果を示すことを提示した。
【０００６】
このようにＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質が多様な疾患の誘発と進行に関連していることが究明されたことにより、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が新薬開発の新しい標的物質に擡頭してきている。従って、突然変異鎖ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を、野生型ＡＩＭＰ２と区別して正確に感知することができる試薬と診断方法に対する技術開発が必要な実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０７６２９９５号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１０６７８１６号公報
【発明の概要】
【０００８】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
そこで、本発明者らは、ヒトのＡＩＭＰ２−ＤＸ２からｅｘｏｎ２が欠損した部位のｅｘｏｎ１とｅｘｏｎ３の接合部分（junction）について、Ｆａｂファージライブラリ（phage library）をスクリーニングすることにより、野生型ＡＩＭＰ２には結合せず、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２にのみ特異的に結合する抗体を選別して、本発明を完成した。
【０００９】
従って、本発明の目的は、
配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部として認識する、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又は抗体の断片を提供するものである。
【００１０】
本発明の他の目的は、
前記抗体又は抗体の断片を含むがん診断用組成物を提供するものである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、
前記抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、
前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供するものである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、
前記組換え発現ベクターで形質転換された細胞を提供するものである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、
（ａ）前記抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；
（ｂ）形質転換された宿主細胞を培養して抗体又は抗体の断片を生産する段階；及び
（ｃ）宿主細胞から生産された抗体又は抗体の断片を収得する段階を含むＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法を提供するものである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、
がん診断用製剤を製造するための前記抗体又は抗体の断片の使用を提供するものである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）前記抗体又は抗体の断片を利用して前記生物学的試料内のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を正常個体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準と比較する段階を含む個体のがんの診断方法を提供するものである。
【００１７】
［技術的解決方法］
前記のような目的を達成するために本発明は、
配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部として認識する、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又は抗体の断片を提供する。
【００１８】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、
前記抗体又は抗体の断片を含むがん診断用組成物を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
前記抗体または抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００２１】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
前記組換え発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００２２】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）前記抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；
（ｂ）形質転換された宿主細胞を培養して抗体又は抗体の断片を生産する段階；及び
（ｃ）宿主細胞から生産された抗体又は抗体の断片を収得する段階を含むＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
がん診断用製剤を製造するための前記抗体又は抗体の断片の使用を提供する。
【００２４】
本発明のさらに他の目的を達成するために本発明は、
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）前記抗体又は抗体の断片を利用して前記生物学的試料内のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を正常個体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準と比較する段階を含む個体のがん診断方法を提供する。
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明は、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部として認識する、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又は抗体の断片を提供する。
【００２７】
本発明で“ＡＩＭＰ２−ＤＸ２”とは、野生型（wild type、ＷＴ）ＡＩＭＰ２タンパク質からエキソン（exon）２の領域が欠失された変異体を意味する。前記ＡＩＭＰ２タンパク質は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む複合体の形成に関与するタンパク質の一つで、ｐ３８、ＪＴＶ−１、ＪＴＶ１又はｐ３８／ＪＴＶ−１などと呼ばれることもあり、ヒトでは７番染色体上（７ｐ２２）のＡＩＭＰ２遺伝子にコードされている。ＡＩＭＰ２タンパク質は３１２又は３２０個のアミノ酸からなるタンパク質で発見され、３１２ａａタンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ５０３９１．１又はＧＩ：１２１５６６９、３２０ａａタンパク質のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＨ１３６３０．１又はＧＩ：１５４８９０２３などで公知にされており、文献にも記載されている（312aa version:Nicolaides、NC、Kinzler、KW and Vogelstein、B. Analysis of the 5’region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene、Genomics29(2)、329-334(1995);320aa version:Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.99(26)、16899-16903(2002)）。
【００２８】
従って、本発明でＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、前記３１２ａａ又は３２０ａａのＡＩＭＰ２タンパク質からｅｘｏｎ２に該当するアミノ酸配列が欠損した変異体タンパク質を意味する。前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、全体配列のＡＩＭＰ２においてｅｘｏｎ２の領域が欠失されたタンパク質、さらに、ＡＩＭＰ２タンパク質の等価物（アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、またはこれらの組み合わせによる変形体としてＡＩＭＰ２と実質的に同等の活性を有する機能的同等物、または物理化学的性質を増加または減少させる変形を持つがＡＩＭＰ２と実質的に同等の活性を有する機能的誘導体）においてｅｘｏｎ２の領域が欠失されたタンパク質を含む。また、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、ＡＩＭＰ２タンパク質のｅｘｏｎ２のアミノ酸配列が全て欠失したり、又はｅｘｏｎ２のアミノ酸配列の一部が欠失されてＡＩＭＰ２でｅｘｏｎ１とｅｘｏｎ３に該当するアミノ酸配列が、本発明に係る抗体によって認識される程度に近くに位置するタンパク質を意味し、さらにｅｘｏｎ１、ｅｘｏｎ３、及び／又はｅｘｏｎ４領域の一部が欠失したタンパク質も含まれる。好ましくは、本発明のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、ＡＩＭＰ２タンパク質のｅｘｏｎ２領域が全て欠失したタンパク質、すなわちｅｘｏｎ２によってコードされている６９個のアミノ酸が全て欠失されてＡＩＭＰ２のｅｘｏｎ１の最後のアミノ酸とｅｘｏｎ３の最初のアミノ酸が連結されているタンパク質である。
【００２９】
本発明で“抗体（antibody）”とは、免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）とも呼ばれ、抗原に選択的に作用して、生体免疫に関与するタンパク質の総称である。自然の中で発見される全体抗体（whole antibody）は、一般的に複数のドメインから成るポリペプチドである軽鎖（light chain、ＬＣ）及び重鎖（heavy chain、ＨＣ）の２つの対からなり、これらのＨＣ／ＬＣの２つの対からなる構造を基本単位として構成されている。哺乳類の抗体を構成する重鎖の種類は、ギリシャ文字のα、δ、ε、γ及びμで表示されている５つのタイプがあり、重鎖の種類によってそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭなどの他の種類の抗体を構成することになる。哺乳類の抗体を構成する軽鎖の種類はλ及びκで表示される２つの種類が存在する。
【００３０】
抗体の重鎖と軽鎖は、構造的にアミノ酸配列の可変性により可変領域と不変領域とに区分される。重鎖の不変領域は、抗体の種類によってＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ抗体）及びＣＨ４（ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体）など、３又は４つの重鎖不変領域で構成されており、軽鎖は１つの不変領域であるＣＬで構成されている。重鎖と軽鎖の可変領域は、それぞれ重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかのドメインで構成されている。軽鎖と重鎖はそれぞれの可変領域と不変領域が並んで配置され、１つの共有二硫化結合（ジスルフィド結合；disulfide bond）により連結され、軽鎖と結合した二分子の重鎖は、２つの共有二硫化結合を通じて連結され、全体抗体の形態を形成する。全体抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域を通じて抗原に特異的に結合し、全体の抗体は、２つの重鎖及び軽鎖の対（ＨＣ／ＬＣ）で構成されているので、一つの分子の全体の抗体は、二つの可変領域を通じて同じ２つの抗原に結合する２価の単一特異性を有するようになる。抗原に結合する抗体可変領域を、抗体の抗原結合部位（antigen-binding site）と称し、抗原の表面で抗体により認識される部分を抗原決定部（epitope）と称する。
【００３１】
抗原結合部位が含まれている抗体の可変領域は、配列の可変性が少ない骨組み部位（フレームワーク領域；framework region、ＦＲ）と、配列可変性が高い超可変性部位（高頻度可変領域；hypervariable region）の相補性決定部位（相補性決定領域；complementary determining region、ＣＤＲ）とに細分される。ＶＨとＶＬは、それぞれ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲが、Ｎ−末端からＣ−末端の方向に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順に配列されている。抗体の可変領域の中でも、配列可変性が最も高いＣＤＲが抗原と直接結合する部位であり、抗体の抗原特異性に最も重要である。
【００３２】
本発明に係る抗体は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体の断片であって、配列番号１で表示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原決定部として認識することを特徴とする。前記配列番号１で表示されるアミノ酸配列（以下、本明細書では、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドと呼ぶ）は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質からｅｘｏｎ２が全て欠失されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質において、ｅｘｏｎ１とｅｘｏｎ３が接合された部位の１１個のアミノ酸の配列であって、アミノ酸配列ではＧＨＶＱＤＹＧＡＬＫＤである。Ｎ−末端の配列ＧＨＶＱは、ｅｘｏｎ１に該当し、Ｃ−末端の配列ＤＹＧＡＬＫＤはｅｘｏｎ３に該当する（図１のＢ参照）。配列番号１のアミノ酸配列はｅｘｏｎ２が欠損していない野生型のＡＩＭＰ２タンパク質には存在しないので、配列番号１を抗原決定部として認識する抗体又は抗体の断片は、野生型ＡＩＭＰ２タンパク質には結合せず、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質にのみ特異的に結合する抗体又はその断片であることが分る。
【００３３】
本発明者らは、前記配列番号１のアミノ酸配列を抗原決定部として認識して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質に特異的に結合する抗体を開発するために、ファージ提示（ファージディスプレイ；phage-displayed）Ｆａｂライブラリをスクリーニングした。配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに、担体タンパク質を簡単に接合するためのシステイン（Cys）アミノ酸をＣ−末端に追加し、担体タンパク質のキーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）を接合して、ウサギに注入して、免疫反応を誘導した。免疫反応を起こしたウサギの脾臓から抽出したｍＲＮＡから、ウサギ抗体の可変領域に該当するｃＤＮＡを合成し、ヒトのＦａｂの抗体不変領域をコードするＤＮＡを連結して、ファージディスプレイに使用されるｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクターに挿入した。前記ウサギ／ヒトのキメラＦａｂをコードするベクターで大腸菌（ＥＲ２５３７）を形質転換して、ヘルパーファージ（helper phage）を用いて感染させて製作したＦａｂライブラリをＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に対してパニングして、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に結合するクローンを選別した。
【００３４】
本発明者らは、抗原吸着（antigen preadsoption）、ｓｉＲＮＡを利用した抗原の発現抑制などの実験を通じて、前記Ｆａｂライブラリスクリーニングで選別されたＨ５抗体と抗体の断片（Ｆａｂ）が、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質に特異的に結合することを確認した。Ｈ５抗体とＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体間の結合は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質の溶解性に影響を及ぼすＮ−末端アミノ酸欠損形態にも影響を受けない。特に、本発明に係る抗体は、野生型のＡＩＭＰ２タンパク質には全く結合せず、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質にのみ結合して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質を選択的に感知するのに極めて効果的である。
【００３５】
本発明に係る抗体又は抗体の断片は、好ましくは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位（ＣＤＲ）１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号９で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とするものでもある。
【００３６】
また、本発明に係る抗体又は抗体の断片は、好ましくは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位（ＣＤＲ）１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２及び配列番号７で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号９で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域からなることを特徴とするものでもある。
【００３７】
また、本発明に係る抗体又は抗体の断片は、本質的に、好ましくは配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位（ＣＤＲ）１、配列番号５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２及び配列番号７で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号９で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域からなることを特徴とするものでもある。
【００３８】
また、本発明に係る抗体又は抗体の断片は、前記の重鎖と軽鎖のＣＤＲの構成を含み、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号１７で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことを特徴とするものでもある。
【００３９】
また、本発明に係る抗体又は抗体の断片は、前記の重鎖と軽鎖のＣＤＲの構成を含み、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１７で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなることを特徴とするものでもある。
【００４０】
また、本発明に係る抗体又は抗体の断片は、本質的に、前記の重鎖と軽鎖のＣＤＲの構成を含み、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び配列番号１７で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）からなることを特徴とするものでもある。
【００４１】
前記本発明に係る抗体は、配列番号１９で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖；及び配列番号２１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことを特徴とする抗体でもある。
【００４２】
また、本発明に係る抗体は、配列番号１９で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖；及び配列番号２１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなることを特徴とする抗体でもある。
【００４３】
また、本発明に係る抗体は、本質的に、配列番号１９で表示されるアミノ酸配列を含む重鎖；及び配列番号２１で表示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなることを特徴とする抗体でもある。
【００４４】
本発明に係る抗体又は抗体の断片は、前記のＣＤＲ、ＶＨとＶＬ、又は軽鎖と重鎖の構成を有するものであれば、その種類に制限はなく、抗体はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ形態の抗体でもある。好ましくは、ＩｇＧ形態の抗体でもある。
【００４５】
また、本発明において、抗体の断片は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に特異的な結合力を維持している抗体の断片を意味し、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ（二重特異性抗体；diabody）、ｓｃＦｖなどの形態でもある。Ｆａｂ（抗原結合性フラグメント；fragment antigen-binding）は、抗体の抗原結合断片であって、重鎖と軽鎖それぞれの一つの可変領域と不変領域で構成されている。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体をペプシンで加水分解させて生成される断片であって、二つのＦａｂが重鎖ヒンジ（hinge）で二硫化結合（disulfide bond）で連結された形態をなしている。Ｆ（ａｂ’）は、Ｆ（ａｂ’）２断片の二硫化結合を還元して分離させた、Ｆａｂに重鎖ヒンジが付加された形態の単量体抗体断片である。Ｆｖ（variable fragment）は、重鎖と軽鎖それぞれの可変領域でのみ構成される抗体断片である。ｓｃＦｖ（single chain variable fragment）は、ＶＨとＶＬが柔軟なペプチドリンカーで連結されている組換え抗体断片である。ダイアボディは、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬが極めて短いリンカーで連結されて互いに結合できず、同じ形態の他のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとそれぞれ結合して二量体を形成している形態の断片を意味する。
【００４６】
また、本発明に係る抗体は、単一のＢ細胞から由来する単一クローン（モノクローナル；monoclonal）抗体でもあって、複数のＢ細胞から由来する多クローン（ポリクローナル；polyclonal）抗体でもあって、抗体の重鎖と軽鎖のアミノ酸配列が実質的に同一な抗体の集団である単一クローン抗体であることが望ましい。本発明に係る抗体又は抗体の断片は、ヒトを含む哺乳動物、鳥類などを含む任意の動物から由来したものでもあって、異種の抗体配列を一緒に有しているキメラ（chimera）抗体又は抗体の断片でもある。本発明の抗体又はその断片は、酵素、蛍光物質、放射性物質及びタンパク質などと接合されたものでもあるが、これに限定はされない。
【００４７】
また、本発明は、本発明に係る抗体又は抗体の断片を含むがん診断用組成物を提供する。
【００４８】
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体タンパク質は、多様な種類のがんから過剰発現されており、がんの発生と進行に密接に関連していることが知られている。本発明者らが明らかにしたところによると（韓国登録特許第１０−０７６２９９５号）、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がん、骨肉腫など多様な種類のがん細胞株及びがん組織では、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が特異的に過剰発現される。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が過剰発現されると、がん抑制因子の機能を有する野生型ＡＩＭＰ２の水準が劇的に減少し、核への移動が抑制されるなど、活性が低下する。また、過剰発現されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２は、ｃ−ｍｙｃの発現を増加させ、ＡＩＭＰ２が核に移動することを防止して、ＴＧＦ−β信号の機能異常をきたすなど、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現水準とがんの発生と進行の間に密接な関連性がある。従って、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の異常発現又は異常過剰発現を感知することにより、がんを診断できることが分る。
【００４９】
本発明に係るがん診断用組成物は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を異常発現又は過剰発現するがんであれば制限なく診断対象になれる。例えば、結腸がん、大腸がん、肺がん、肝臓がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、胆嚢がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、精巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、絨毛がん、卵巣がん、乳がん、甲状腺がん、脳腫瘍、頭頸部がん、悪性黒色腫、リンパ腫、再生不良性貧血や血液がんなどを診断対象とすることができ、好ましくは乳がん、大腸がん、結腸がん、肺がん、肝臓がん、皮膚がん、腎臓がん、骨肉腫などを診断するために使用することができる。また、本発明に係るがん診断用組成物は、本発明に係る抗体又は抗体の断片のほかに、二次抗体、二次抗体の発色反応のための基質、補助因子などの抗体でタンパク質を感知するために通常使用される要素をさらに含むことができる。
【００５０】
また、本発明は、本発明に係る抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
具体的には、前記ポリヌクレオチドは、本発明に係る抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号１６又は軽鎖可変領域をコードする配列番号１８で表示される塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドでもある。
【００５２】
また、本発明は、本発明に係る抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００５３】
本発明で“組換え（recombinant）”は“遺伝子操作（manipulation）”と互換して使用することができ、遺伝子に変形を加えて切る、連結するなど分子的クローニング（molecular cloning）実験技法を利用して、自然の状態では存在しない形態の遺伝子を製造することを意味する。本発明で“発現（expression）”とは、細胞からタンパク質又は核酸が生成されることを意味する。
【００５４】
本発明で“組換え発現ベクター”とは、適切な宿主細胞（host cell）から、目的とするタンパク質又は核酸を発現することができるベクターとして、ポリヌクレオチド（遺伝子）挿入物が発現されるように動作可能に連結された必須的な調整要素を含む遺伝子作製物を意味する。“動作可能に接続された（operably linked）”とは、一般的な機能を遂行するように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質又はＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（functional linkage）されているもので、発現調節配列によって遺伝子が発現されるように連結されたことを意味する。前記“発現調節配列（expression control sequence）”とは、特定の宿主細胞において動作可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどを含む。
【００５５】
本発明の組換え発現ベクターは、クローニングと抗体の製造分野で通常的に使用されるベクターであれば、その種類は特に制限されず、その例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどを含むがこれらに限定されない。前記プラスミドは、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣｌ１８及びｐＵＣｌ１９、ｐＥＴ−２２ｂ（＋））、バチルスサブチリス由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０及びｐＴＰ５）及び酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４及びＹＣｐ５０）などがあり、前記ウイルスはレトロウイルス、アデノウイルス、又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスなどが使用できる。ファージ表示などに通常的に使用されるｐＣｏｍｂ３系列のベクターを使用することもでき、抗体を哺乳類細胞で発現するために、哺乳類細胞でタンパク質を発現するために通常的に使用されるベクターは、例えば、ｐｃＤＮＡやｐＶＩＴＲＯなどのベクターを使用することができる。
【００５６】
また、本発明は、本発明に係る抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００５７】
本発明の細胞は、本発明の組換え発現ベクターに含まれた抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現するために使用することができる細胞であれば、その種類は特に制限されない。本発明に係る組換え発現ベクターで形質転換された細胞（宿主細胞）は、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母または他の菌類）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物の細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞（hamster cell）、ラット（rat cell）細胞、マウス（mouse）細胞）、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、昆虫細胞、又はこれらに由来するハイブリドーマでもある。好ましくは、ヒトを含む哺乳類から由来した細胞でもある。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、２９３Ｆ細胞などを利用することができる。
【００５８】
本発明に係る抗体又は抗体の断片のポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターは、当業界に公知された方法、例えば、これに限定はされないが、一時的形質感染（transient transfection）、微細注射、形質導入（transduction）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介された形質感染（liposome-mediated transfection）、ＤＥＡＥデキストラン媒介された形質感染（DEAE Dextran-mediated transfection）、ポリブレン媒介された形質感染（polybrene-mediated transfection）、電気穿孔法（electroporation）、遺伝子銃（gene gun）及び細胞内に核酸を流入させるための公知の方法により抗体又はその断片を生産するための細胞内部に導入して形質転換することができる。前記本発明に係る組換え発現ベクターで形質転換された細胞は、本発明に係る抗体の重鎖、軽鎖、又は抗体の断片を生産することになる。
【００５９】
また、本発明は、
（ａ）本発明による抗体又は抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで、宿主細胞を形質転換する段階；
（ｂ）形質転換された宿主細胞を培養して、抗体又は抗体の断片を生産する段階；及び
（ｃ）宿主細胞から生産された抗体又は抗体の断片を収得する段階を含むＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法を提供する。
【００６０】
（ａ）段階は、本発明による抗体又はその断片を生産するための宿主細胞を、前記の抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドが動作可能に連結された組換え発現ベクターで形質転換する段階である。
【００６１】
通常の技術者は、選択された宿主細胞と組換え発現ベクターの種類により、前述した通り、適切な形質転換方法を選択して本段階を実施することができる。重鎖と軽鎖の塩基配列を含む組換え発現ベクターは、同じ宿主細胞に共同形質転換して重鎖と軽鎖が一つの細胞から発現するようにすることもでき、重鎖と軽鎖の塩基配列を含む組換え発現ベクターをそれぞれ個別の宿主細胞に形質転換して重鎖と軽鎖が別に発現するようにすることもできる。
【００６２】
（ｂ）段階は前記形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞に導入された組換え発現ベクターから、本発明に係る抗体の重鎖と軽鎖又は抗体の断片のポリペプチドが生産できるようにする段階である。
【００６３】
通常の技術者は、選ばれた宿主細胞を培養するための培地組成と培養条件、培養時間などを適切に選ぶことができる。宿主細胞から生産される抗体分子は、細胞の細胞質内に蓄積されるか、適切な信号伝達配列により細胞外部若しくは培養培地に分泌されるか、又はペリプラズムなどで標的化（targeted）されるようにすることができる。また、本発明による抗体がＡＩＭＰ２−ＤＸ２に対する結合特異性を維持するように、当業界で公知の方法を利用してタンパク質をリフォールディング（再折りたたみ；refolding）させて、機能性構造（コンフォメーション；conformation）を有するようにすることが好ましい。またＩｇＧ形態の抗体を生産する場合、重鎖と軽鎖は別の細胞から発現させて、別の段階で重鎖と軽鎖を接触させて完全な抗体を構成するように製造することもできて、重鎖と軽鎖を同じ細胞から発現するようにして細胞内部で完全な抗体を形成することもできる。
【００６４】
（ｃ）段階は宿主細胞から生産された抗体又はその断片を収得する段階である。
【００６５】
宿主細胞から生産された抗体又はその断片ポリペプチドの特性、宿主細胞の特性、発現方式又はポリペプチドの標的化可否などを考慮して、通常の技術者は、収得方法を適切に選択及び調節することができる。例えば、培養培地に分泌された抗体又はその断片は、宿主細胞を培養した培地を収得し、遠心分離して不純物を除去するなどの方法で抗体を回収することができる。必要により細胞内特定小器官や、細胞質に存在する抗体を細胞外部に放出して回収するために、抗体又はその断片の機能的構造に影響を及ぼさない範囲で細胞を溶解させることもできる。また、収得した抗体は、クロマトグラフィー、フィルターなどによる濾過、透析などの方法を通じて不純物を除去して濃縮する過程を追加して経ることができる。
【００６６】
本発明はがん診断用製剤を製造するための前記抗体又は抗体の断片の使用を提供する。
【００６７】
本発明は
（ａ）個体から生物学的試料を収得する段階；
（ｂ）前記抗体又は抗体の断片を利用して前記生物学的試料内のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を正常個体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準と比較する個体のがん診断方法を提供する。
【００６８】
本発明の前記“生物学的試料”には、血液及び生物学的起源のその他の液状試料、生検標本、組織培養のような固形組織試料又はこれらから由来した細胞が含まれる。より具体的には、例えば、これらに限定はされないが、組織、抽出物、細胞溶解物、全血、血漿、血清、唾液、眼球液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水液、滑液、腹膜液などでもある。前記試料は、動物、好ましくは哺乳動物から収得することもでき、最も好ましくは、ヒトから得ることができる。前記試料は検出に使用する前に前処理することができる。例えば、濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などを含むことができる。また、前記試料から核酸及びタンパク質を分離して検出に使用することができる。
【００６９】
本発明の前記“個体”とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物から由来した細胞、組織、器官等でもある。前記個体は前記効果が必要な患者（ｐａｔｉｅｎｔ）でもある。
【００７０】
本発明の診断方法は、正常個体の生物学的試料内ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を、がんが疑われる個体の生物学的試料内のタンパク質水準と比較することにより、実際の疾患発症可否を診断することができる。つまり、がんと推定される個体の生物学的試料から、本発明の前記抗体又はその断片を利用してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を測定し、正常個体の生物学的試料から、本発明の抗体又はその断片を利用してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を測定して、両者を比較した後、疾患が疑われる個体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準が正常個体のものより異常発現又は異常過発現の場合、これを該当疾患に診断することができる。従って、前記診断方法は、“（ｄ）正常個体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準より異常発現又は異常過発現の場合、がんが発症したと判定する段階”をさらに含むことができる。これに関連して前述した通り体液内ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の水準は、特に肺がん、肝臓がん、皮膚がん、乳がん、腎臓がん、骨肉腫などの多様ながん細胞株及び組織で増加していることが報告されていることに基づく。がんについては前述した通りである。
【００７１】
前記診断方法は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質と本発明の抗体又はその断片との特異的抗原−抗体反応を通じて達成されるものであって、前記反応によって生成される抗原−抗体複合体の生成量は、検出ラベル（detection label）のシグナルの大きさを通じて定量的に測定可能である。本発明において、用語“抗原−抗体複合体”とは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質とこれに特異的な本発明の抗体及びその断片との結合物を意味する。
【００７２】
前記検出ラベル（標識）は、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（microparticle）、レドックス分子及び放射性同位元素からなるグループの中から選択することができ、必ずしもこれに制限されるものではない。検出ラベルとして酵素が使用される場合、利用可能な酵素には、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノルフィールベイトカルボキシラーゼ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスフェノールフィールベイトデカボキシラーゼ（ホスホフェノールピルビン酸デカルボキシラーゼ）、β−ラクタマーゼなどがあり、これに限定されない。蛍光物には、フルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミンなどがあり、これに限定されない。リガンドには、ビオチン誘導体などがあり、これに限定されない。発光物には、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに限定されない。微小粒子には、コロイド金、着色されたラテックスなどがあり、これに限定されない。レドックス分子にはフェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオローゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ハイドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＭＯ（ＣＮ）８］４−などが含まれ、これに限定されない。放射線同位元素には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅなどが含まれ、これに制限されない。
【００７３】
タンパク質の水準を測定するための分析方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オークタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色（immunohistochemistry）、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがあるが、これに制限されるものではない。前記分析方法を通じて、正常対照群での抗原抗体複合体の形成量とがんが疑われる患者での抗原抗体複合体の形成量を比較することができ、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２生成量の増加の可否などの異常発現又は異常過発現を判断して、疾病が疑われる患者の実際のがん発症の可否を診断することができる。
【００７４】
本発明の用語“〜を含む”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同意で使用され、組成物又は方法において、記載されていない追加的な成分要素又は方法段階などを排除しない。用語“〜からなる（consisting of）”とは、別に記載されていない追加的な要素、段階又は成分などを除外することを意味する。用語“本質的に〜からなる（essentially consisting of）”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された成分の要素又は段階と共に、この基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素又は段階などを含むことを意味する。
【００７５】
［有利な効果］
従って、本発明は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体の断片、これを含むがん診断用組成物、さらに、前記抗体をコードするポリヌクレオチドと組換え発現ベクター、これを利用して形質転換された細胞及び前記抗体又は抗体の断片を製造する方法を提供する。本発明で提供する抗体と抗体の断片は、野生型ＡＩＭＰ２には反応せず、ｅｘｏｎ２が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２突然変異タンパク質に特異的に結合するため、がん、炎症性疾患など多様な病理に関連しているＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の存在と発現程度を確認するのに効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】図１は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに対する結合特異性を確認するための実験を示す。図１のＡは、肺がん細胞株であるＨ４６０細胞溶解物を、抗原ペプチド（epitope peptide、１００μｇ／ｍｌ）存在下で、Ｈ５  Ｆａｂ（“＋”で表示）、又は抗原ペプチドを添加していない状態で、Ｈ５  Ｆａｂ（“−”で表示）で感知したウェスタンブロットの結果である。
【図１Ｂ】図１は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに対する結合特異性を確認するための実験を示す。図１のＢは、野生型ＡＩＭＰ２においてｅｘｏｎ２が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２のアミノ酸配列について、Ｈ５抗体の選別に使用した抗原ペプチドに該当する部分を示す（下線の部分、アミノ酸配列ＧＨＶＱＤＹＧＡＬＫＤ）。ｅｘｏｎ１、ｅｘｏｎ３、ｅｘｏｎ４はそれぞれ灰色、緑色、黒色で表示されている。
【図２Ａ】図２は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に対する結合特異性を確認するための実験を示す。図２のＡは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＸ２、“ＤＸ２”；ｓｉ  ｅｘｏｎ４  ＃１、“＃１”、ｓｉ  ｅｘｏｎ４  ＃２、“＃２”）で形質転換されて、７２時間培養したＨ４６０細胞の溶解物とＨ５  Ｆａｂを利用したウェスタンブロットの結果である。
【図２Ｂ】図２は、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に対する結合特異性を確認するための実験を示す。図２のＢは、実験に使用したｓｉＲＮＡの標的部位を示す。ｓｉＤＸ２は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｅｘｏｎ１−ｅｘｏｎ３接合部分、ｓｉ  ｅｘｏｎ４＃１と＃２は、それぞれｅｘｏｎ４の異なる部分を標的とする。“Ｃ”は対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）を意味する。
【図３Ａ】図３は、Ｈ５  ＦａｂとＮ−末端が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の結合を確認するための実験を示す。図３のＡは、多様な形態のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物を、抗原ペプチド（epitope peptide、１００μｇ／ｍｌ）存在下で、Ｈ５  Ｆａｂ（“Ｈ５＋ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ”）、又は抗原ペプチドがない状態でＨ５  Ｆａｂ（“Ｈ５”）を利用して感知したウェスタンブロットの結果である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、ｓｔｒｅｐ  ｔａｇに接合されており、全体の長さのタンパク質（Ｆ−ＤＸ２、“Ｆ”）であるか又は、Ｎ−末端アミノ酸が欠損した形態のタンパク質（“△２”、アミノ酸２個欠損、△２−ＤＸ２；“△２３”、アミノ酸２３個欠損、△２３−ＤＸ２；“△３３”、アミノ酸３３個欠損、△３３−ＤＸ２）である。この結果は、Ｈ５  Ｆａｂがｅｐｉｔｏｐｅを含む多様な形態のＭＰ２−ＤＸ２を認識することを示している。“ＥＶ”は空のベクター（empty vector）を意味する。
【図３Ｂ】図３は、Ｈ５  ＦａｂとＮ−末端が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の結合を確認するための実験を示す。図３のＢは、前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の模式図（ｅｘｏｎ１、ｅｘｏｎ３、ｅｘｏｎ４はそれぞれグレー、緑、黒で表示；ｓｔｒｅｐ  ｔａｇはオレンジ色で表示、リンカーを含む３０個のアミノ酸で構成される）と、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２アミノ酸配列での該当する部分を示す（黒い矢印と赤で表示されたアミノ酸）。
【図４Ａ】図４は、Ｈ５  ＩｇＧ抗体とＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドの結合力を確認するための表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）実験を示す。Ｈ５抗体とＩｇＧタンパク質をＣＭ５チップにコーティングして、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドを多様な濃度で流して、抗原ペプチドと抗体との間の結合反応の程度をセンサーグラム（sensorgram）で示した。センサーグラムのｘ軸は時間（秒、ｓ）、ｙ軸は反応単位（response unit、ＲＵ）を表示する。ボックスの中は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドの濃度を示し（単位はすべてｎＭ）、図４のＡとＢで全て同じである。
【図４Ｂ】図４は、Ｈ５  ＩｇＧ抗体とＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドとの結合力を確認するための表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）実験を示す。Ｈ５抗体とＩｇＧタンパク質をＣＭ５チップにコーティングして、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドを多様な濃度で流して、抗原ペプチドと抗体との間の結合反応の程度をセンサーグラム（sensorgram）で示した。センサーグラムのｘ軸は時間（秒、ｓ）、ｙ軸は反応単位（response unit、ＲＵ）を表示する。ボックスの中は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドの濃度を示し（単位はすべてｎＭ）、図４のＡとＢで全て同じである。
【図５Ａ】図５は、Ｈ５  Ｆａｂの結合特異性を確認するためのウェスタンブロット実験を示す。Ｈ４６０細胞溶解物を電気泳動したブロットを、野生型ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２−ＤＸ２に全て結合する＃３２４抗体と反応させた結果を示す。ブロットにおいて、野生型ＡＩＭＰ２（“ＡＩＭＰ２”）とＡＩＭＰ２−ＤＸ２（“ＤＸ２”）のタンパク質バンドの位置は、それぞれ赤い矢印で示されている。
【図５Ｂ】図５は、Ｈ５  Ｆａｂの結合特異性を確認するためのウェスタンブロット実験を示す。Ｈ４６０細胞溶解物を電気泳動したブロットを、野生型ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２−ＤＸ２に全て結合するＨ５  Ｆａｂと反応させた結果を示す。ブロットにおいて、野生型ＡＩＭＰ２（“ＡＩＭＰ２”）とＡＩＭＰ２−ＤＸ２（“ＤＸ２”）のタンパク質バンドの位置は、それぞれ赤い矢印で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００７８】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するものであって本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００７９】
＜実施例１＞
キメラＦａｂライブラリ製作
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合する抗原結合部位（antigen-binding site）をスクリーニングするためのウサギ／ヒトキメラ（chimeric）Ｆａｂライブラリーを構築した。ウサギの免疫化（immunization）、ウサギ脾臓細胞（splenocyte）からのｍＲＮＡの分離とｃＤＮＡ合成、さらに、ウサギ／ヒトキメラＦａｂ抗体ライブラリの構築は、基本的に“Phage Display:A Laboratory Manual”（Barbas, C.F. 3rd. et al. Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press）によって公知にされた方法に基づいて行った。
【００８０】
具体的には、野生型ＡＩＭＰ２タンパク質とＡＩＭＰ２−ＤＸ２突然変異タンパク質とを区別することができる抗原決定部として、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２でｅｘｏｎ１とｅｘｏｎ３が接合した部分のポリペプチドを利用した（図１Ｂ参照、アミノ酸配列GHVQDYGALKD）。前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドのＣ−末端に、運搬体（キャリア）タンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、ＫＬＨ）タンパク質を接合するために、システイン（Ｃ）アミノ酸を追加した。ＫＬＨに接合されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドをウサギに接種して免疫反応を誘導して、ウサギの脾臓を得て、ｍＲＮＡを分離し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して、キメラＦａｂライブラリの構築に必要なウサギ抗体の可変領域の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を製作した。ｃＤＮＡの製作に使用されたプライマーは、表１に記載された通りである。製作されたｃＤＮＡから、表２に記載されたプライマーの組み合わせと表３に記載されたＰＣＲ条件を利用して、ウサギ抗体の重鎖と軽鎖可変領域のＤＮＡを増幅した。増幅されたＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルで電気泳動して分離した後、ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ゲル抽出キット）を利用して精製した。
【００８１】
【表１】
2019514350.tif 000003
【００８２】
【表２】
2019514350.tif 000004
【００８３】
【表３】
2019514350.tif 000005
【００８４】
ヒトのＦａｂを含むｐＣｏｍｂ３ＸＴＴから、キメラＦａｂライブラリの構築に必要なヒトの抗体（Ｆａｂ）の不変領域のＤＮＡを、ＰＣＲ反応で得た。軽鎖と重鎖不変領域は、ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ（２６４０．２ｎｇ／ｍｌ）プラスミドを鋳型にして、それぞれＨＫＣ−Ｆ（正方向、配列番号５３）、Ｌｅａｄ−ｂ（逆方向、配列番号５４）のプライマー対と、ＨＩｇＣＨ１−Ｆ（正方向、配列番号５１）、ｄｐｓｅｑ（逆方向、配列番号５２）のプライマー対を利用して、表４に記載されたＰＣＲ条件により増幅した。増幅されたＰＣＲ産物は、ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを利用して精製した。精製された重鎖と軽鎖不変領域のＤＮＡの大きさは、それぞれ４００ｂｐと３５０ｂｐであった。
【００８５】
【表４】
2019514350.tif 000006
【００８６】
予め準備したウサギの抗体の可変領域のＤＮＡと、ヒトの抗体（Ｆａｂ）の不変領域のＤＮＡは、重複拡張ＰＣＲ（overlap extension PCR）に連結された。重鎖は、重鎖可変領域ＤＮＡと不変領域ＤＮＡを混合して鋳型とし、ＬｅａｄＶＨ（配列番号５５）、ｄｐｓｅｑ（配列番号５２）のプライマー対を利用してＰＣＲ反応を実施し、軽鎖は、軽鎖可変領域ＤＮＡと不変領域ＤＮＡを混合して鋳型とし、ＲＳＣ−ＳＦ（配列番号５６）、Ｌｅａｄ−ｂ（配列番号５４）のプライマー対を利用してＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ条件は、表５に記載された通りである。
【００８７】
【表５】
2019514350.tif 000007
【００８８】
前記のように製作されたＦｄ重鎖断片（重鎖不変領域＋重鎖可変領域）とキメラ軽鎖（軽鎖不変領域＋軽鎖可変領域）のＤＮＡは、ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを利用して分離精製した。重鎖と軽鎖のＰＣＲ産物は、それぞれ７５０ｂｐ、８００ｂｐであった。最後に、Ｆｄ鎖断片とキメラ軽鎖をＦａｂ形態で結合させるために、Ｆｄ重鎖断片とキメラ軽鎖の混合物を鋳型にして、ＲＳＣ−ＳＦ（配列番号５６）、ｄｐｓｅｑ（配列番号５２）のプライマー対を利用して表６に記載された条件に基づいて、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物で得られたＦａｂ（Ｆｄ重鎖＋キメラ軽鎖）は、１．５％ゲルに電気泳動し、ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔで分離精製した。最終的な結果物は、１５００ｂｐの大きさであった。
【００８９】
【表６】
2019514350.tif 000008
【００９０】
前記のように製作されたＦａｂ  ＤＮＡはファージ（ｐｈａｇｅ）で発現され、ファージ提示（ファージディスプレイ；phage-displayed）Ｆａｂライブラリを構築することができるように、ｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクターに挿入した。具体的には、ＦａｂのＰＣＲ産物とｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクターを、ＳｆｉＩ制限酵素でそれぞれ切断した後、１％ゲルに電気泳動して分離精製した。制限酵素反応は、５μｇのＦａｂ  ＤＮＡと３０μｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクターをそれぞれ２．５μｌのＳｆｉＩ制限酵素で切断して実施した。切断されたＦａｂ  ＤＮＡとベクターの大きさは、それぞれ１５００ｂｐ、３４００ｂｐである。制限酵素で切断したＩｎｓｅｒｔ（インサート）  ＤＮＡとベクターを３：１のモル比で混合して、Ｔ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）と反応させた後、エタノールで沈殿させた。
【００９１】
キメラＦａｂ  ＤＮＡが挿入されたベクターは、電気穿孔法（electroporation）でＥＲ２５３７大腸菌を形質転換させた。電気穿孔にはＳＯＣ培地（Super Optima1 Broth with Catabolite Repression-glucose added）を使用した。冷たい状態に維持したキュベット（cuvette）に、２００μｌのＥＲ２５３７大腸菌形質転換受容性細胞（competent cell）とベクターを混合して電気衝撃を加えた後、すぐにＳＯＣを３ｍＬ添加した。その後、５０ｍｌチューブに移して常温で１時間培養し、１μｌ、１／１０μｌ、１／１００μｌの容量で、予め暖めておいたアンピシリンを含む１００ｍｍアガー（ａｇａｒ）プレートに塗布した。別途、汚染の有無を確認するために、カナマイシンとアンピシリンが含有された半分に分けられたプレートにも塗布した。塗布した残りの電気衝撃を受けた大腸菌を４０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、５００μｌのＳＯＣで再分散して１５０ｍｍアンピシリンプレートに塗布して、先に大腸菌を塗布した１００ｍｍプレートと共に３７℃で約１８時間培養した。結果として翌日約１０７個の形質転換されたコロニーを得た。
【００９２】
＜実施例２＞
ファージ提示Ｆａｂライブラリパニングとスクリーニング
＜２−１＞ファージ提示Ｆａｂライブラリパニング
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに特異的に結合する抗原結合部位を有するＦａｂを選別するために、前述した実施例で製作した抗体（Ｆａｂ）ライブラリパニング（panning）実験を、公知の方法（Bai, X. et al. PLoS ONE 2015 doi:10.1371/journal.pone.0141045）により実施した。
【００９３】
パニングの一番目の段階として、ヘルパーファージ（helper phage）を大腸菌に導入するライブラリレスキュー（library rescue）を実施した。実験一日前に１５０ｍｍプレートに塗布して育ったコロニーを、５ｍｌ  ＬＢ（Luria-Bertani Broth）に接種して集めた後、このうち１００μｌをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２０ｍｌ  ＳＢ（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）に接種し、３時間かけて３７℃で２２０ｒｐｍで振盪培養した。培養液の６００ｎｍ吸光度（ＯＤ６００）が０．５に達したとき、５００μｌのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（１０１２ｐｆｕ）を入れた後、再び３７℃で１２０ｒｐｍで１時間振盪培養した。その後、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を添加して、３０℃でさらに２２０ｒｐｍで１８時間振盪培養した。培養物は、１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を集めて、５ｍｌの５×ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）沈殿溶液（１６％  ＰＥＧ−８０００、１２％  ＮａＣｌ）に添加して３０分間氷の上に置いた。そして再び１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得た沈殿物（pellet）を、１ｍｌの３％ＢＳＡを含むＰＢＳに再分散して、ファージ溶液（phage solution）を準備して、室温に１時間静置した。別途、１０ｍｌのＬＢに１６０μｌのＥＲ２５３７大腸菌を接種して、抗生剤なしで２２０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養した。
【００９４】
パニングのための免疫試験管（immunotube、Ｎｕｎｃ  ｃａｔ．  Ｎｏ  ４７０３１９）は、１０μｇのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチド（ウサギ免疫反応に使用した抗原ペプチドをＢＳＡに接合した形）を含む１ｍｌ  ＰＢＳを添加して３７℃で１時間反応させ、試験管内部表面に抗原ペプチドを吸着させた。その後、１時間の間、３％脱脂乳（skim milk）が添加されたＰＢＳＴ（ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でブロッキング（blocking）して、抗原が吸着されていない部分が埋まるようにした。ファージライブラリ（１０１２ｐｆｕ）は、３％脱脂乳と３００μｇ  ＢＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳＴで１時間ブロッキングした。
【００９５】
ブロッキングされた免疫試験管にファージライブラリを添加し、３７℃で２時間振盪培養して、ファージに発現されたＦａｂと抗原ペプチドとが結合するようにして、５ｍｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。免疫試験管に結合したファージは、１ｍｌのトリエチルアミン（脱イオン水中に１００ｍＭ）で、室温で１０分間溶出して、直ちに０．５ｍｌのＴｒｉｓ（１Ｍ、ｐＨ  ７．０）で中和した後、８．５ｍｌの指数成長中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｇｅ）のＥＲ２５３７大腸菌と混合した。大腸菌とファージ培養物は、１２０ｒｐｍ、３７℃で１時間の振盪培養し、２％ブドウ糖とアンピシリンを含むＬＢアガープレートに塗布して、３７℃で一晩培養した。プレートで育った大腸菌は、約１０８細胞をアンピシリンを含む２０ｍｌのＳＢ培地（super broth：  ３％  トリプトン、２％  酵母エキス、１％  ＭＯＰＳ、ｐＨ  ７．０）に接種して培養し、ＯＤ６００が０．７に達したとき、１０１２ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを添加した。３７℃で１時間、８０ｒｐｍで攪拌して、カナマイシン（７０μｇ／ｍｌ）を追加して、２００ｒｐｍ、３０℃で一晩培養した。培養液を遠心分離し、ファージを５ｍｌの５×ＰＥＧ沈殿溶液（２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で沈殿させて、氷に３０分間置いた。沈殿されたファージは、遠心分離して０．３ｍｌのＰＢＳに再分散して、次の段階のパニングに使用した。パニングは、前記の方法で４回繰り返し、パニングで選別された大腸菌コロニーを結果物として得た。
【００９６】
＜２−２＞クローンスクリーニング
実施例＜２−１＞のパニングで選別されたコロニーのファージが発現する抗体（Ｆａｂ）が、実際にＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに特異的に結合するか否かを確認した。
【００９７】
先ず、２回乃至４回目のパニングから選別されたコロニーのうち、ＢＳＡに接続されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドに結合するコロニーを、Bai, X. et al.（２０１５）の方法によりＥＬＩＳＡ実験で選別した。ＥＬＩＳＡ実験のための９６ｗｅｌｌ免疫プレートは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチド（１０μｌ／ｍｌ）でコーティングし、１８０μｌの３％ＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロッキングした。抗体を発現する大腸菌の培養液は、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して沈殿させ、４０μｌの１×ＴＥＳ（２０％  スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、ｐＨ  ８．０）と６０μｌの０．２×ＴＥＳを順番に入れて分散させ、細胞外膜を除去して細胞質抽出物（periplasmic extract）を製造した。これを遠心分離して得られた上澄み液２５μｌを、抗原ペプチドでコーティングした免疫プレートに添加して、１時間反応させた。反応が終わったプレートは、ＰＢＳＴで３〜４回洗浄して、２次抗体として３％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈したａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ（抗ヒト）  ＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ＨＲＰ（１：１０００）を２５μｌずつ添加して、１時間常温で反応させた。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を２５μｌ添加して１０分間発色反応を進行した後、硫酸（Ｈ２ＳＯ４、１ｍＭ）を２５μｌずつ添加して反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ実験の陰性対照群は、抗原ペプチドの代わりにＢＳＡを使用した実験であり、背景（background）と比べて３倍以上強い信号を示すコロニーを選別した。
【００９８】
ＥＬＩＳＡで選別されたコロニーの抗体クローンは、ウェスタンブロットを利用して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の結合特異性を確認した。先に選別された大腸菌コロニーを、アンピシリンを含む２０ｍＬ  ＳＢ培地で培養し、ＯＤ６００が０．７に達したときＩＰＴＧ（１ｍＭ  ｆｉｎａｌ）を添加して、一晩３０℃で振盪培養した。遠心分離して沈殿させた大腸菌に、１ｍｌの冷たい１×ＴＥＳを添加して再分散して、１．５ｍｌの冷たい０．２×ＴＥＳを入れて氷の中で３０分間培養し、細胞質抽出物を製造した。遠心分離して得た上澄み液を３％脱脂乳−ＰＢＳＴと１：１で混合して、ウェスタンブロットの１次抗体（primary antibody）に使用した。２次抗体（secondary antibody）には、ａｎｔｉ−ＨＡ  ｔａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＨＲＰ（抗ＨＡ標識抗体−ＨＲＰ）又はａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＨＲＰ（抗ヒトＦａｂ抗体−ＨＲＰ）を使用した。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する結腸がん細胞株のＳＷ４６０細胞溶解物を利用して、ウェスタンブロットを行った結果、クローンＨ５の抗体（Ｆａｂ）が、２５ｋＤａの大きさのＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合することが分かった（データ図示せず）。
【００９９】
ＥＬＩＳＡ実験を通じて結合が確認されたＨ５クローンのＦａｂをコードするＤＮＡの塩基配列を、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（塩基配列決定法）で確認した。確認されたＨ５  Ｆａｂの重鎖と軽鎖のＣＤＲの塩基配列とアミノ酸配列は、本明細書の配列表の配列番号３乃至配列番号１４に記載されている。また、Ｈ５  Ｆａｂの重鎖と軽鎖可変領域の塩基配列とアミノ酸配列は、本明細書の配列表の配列番号１５乃至配列番号１８に記載されている通りである。Ｈ５  Ｆａｂの重鎖部分（Ｆｄ、ウサギ抗体から由来した重鎖可変領域とヒト抗体の重鎖ＣＨ１ドメイン）の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４と配列番号２３に記載されており、Ｈ５  Ｆａｂの軽鎖部分（ウサギ抗体から由来した軽鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖Ｃκドメイン）の塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２と配列番号２１に記載されている。
【０１００】
前記のように、固有の配列が確認されたＨ５  Ｆａｂは、より一般的に使用される形態であるＩｇＧ形態の全体抗体に変換した。ＦａｂをＩｇＧ抗体に変換する通常の方法によって、Ｈ５  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域のＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ヒトのＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖不変領域の遺伝子がクローニングされているｐＶＩＴＲＯ１ベクターに適切な制限酵素を利用して挿入した。このように製作されたＨ５  ＩｇＧ抗体の重鎖（ウサギ抗体から由来した重鎖可変領域とヒト抗体の重鎖不変領域）とＨ５  ＩｇＧ抗体の軽鎖（ウサギ抗体から由来した軽鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖Ｃκドメイン）の塩基配列とアミノ酸配列は、本明細書の配列目録の配列番号１９乃至配列番号２２に記載されている通りである。Ｈ５  ＩｇＧ抗体の軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列は、Ｈ５  Ｆａｂの軽鎖の配列と同一である。Ｈ５  ＩｇＧのＤＮＡを含むベクターは２９３Ｆ細胞株で発現させてｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（タンパク質  Ｇ  アフィニティークロマトグラフィー）で分離精製した。
【０１０１】
＜実施例３＞
選別されたクローンのＡＩＭＰ２−ＤＸ２に対する結合特異性確認
Ｈ５抗体又は断片（Ｆａｂ）のＡＩＭＰ２−ＤＸ２に対する結合特異性をさらに詳しく確認した。
【０１０２】
まず、Ｈ５  ＦａｂがＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合するか否かを抗原吸着（antigen preadsorption）実験で調べた（図１）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する肺がん細胞株のＨ４６０細胞溶解物を電気泳動して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチド（１００μｇ／ｍｌ）存在下でＨ５  Ｆａｂ（図１のＡ、“＋”）で、又は抗原ペプチドを添加していない条件でＨ５  Ｆａｂ（図１のＡ、“−”）で、ウェスタンブロットを実施した。抗原ペプチドと反応していないＨ５  Ｆａｂは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質バンドを感知したが、抗原ペプチドが追加された条件でのＨ５  Ｆａｂは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のバンドとは全く反応しないので、Ｈ５  ＦａｂがＡＩＭＰ２−ＤＸ２に特異的に結合することを示した。
【０１０３】
さらにＨ４６０細胞において、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現を抑制する方法で、Ｈ５  ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２に対する結合特異性を確認した（図２）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｅｘｏｎ１−ｅｘｏｎ３接合部分又はｅｘｏｎ４を標的とするｓｉＲＮＡ（図２のＢ、それぞれ”ｓｉＤＸ２”（配列番号５７）、”ｓｉ  ｅｘｏｎ４＃１”（配列番号５８）、”ｓｉ  ｅｘｏｎ４＃２”（配列番号５９））でＨ４６０細胞を形質転換して、７２時間培養した。培養された細胞の溶解物についてＨ５  Ｆａｂでウェスタンブロットを実施した結果（図２のＡ）、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のｅｘｏｎ１−ｅｘｏｎ３接合部分だけではなく、ｅｘｏｎ４を標的とするｓｉＲＮＡで形質転換された細胞溶解物からも、Ｈ５  ＦａｂによってＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質バンドが感知されなかった。ｓｉＲＮＡによって、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２変異体のｍＲＮＡが全て分解されたからであると判断される。
【０１０４】
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のＮ−末端アミノ酸欠失がＨ５  ＦａｂとＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の結合に影響を与えるかを調べた（図３）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のＮ−末端のアミノ酸残基は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の溶解性に重要な影響を与えることが知られている（韓国特許出願第１０−２０１４−００５８６３４号）。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のＮ−末端から２個、２３個、又は３３個のアミノ酸が欠損した形態のＡＩＭＰ２−ＤＸ２（図３のＢ）にｓｔｒｅｐ  ｔａｇを接合して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からそれぞれ発現させて、Ｈ５  Ｆａｂでウェスタンブロット実験を実施した。図３のＡに示した通り、Ｈ５  Ｆａｂは、全体の長さのＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質だけではなく、Ｎ−末端が欠損した形態のＡＩＭＰ２−ＤＸ２にも全てよく結合することが分かった。一方、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドが存在する条件において、Ｈ５  Ｆａｂ（“Ｈ５＋ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ”）は、全体の長さ又はＮ−末端が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２のいずれにも結合していないので、Ｈ５  ＦａｂがＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質に特異的に結合することを再確認した。
【０１０５】
ＩｇＧ形態に変換したＨ５抗体のＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に対する結合力を、表面プラズモン共鳴実験で確認した（図４）。Ｈ５抗体（ＩｇＧ）とＩｇＧタンパク質をＣＭ５チップにコーティングして、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原ペプチドを、多様な濃度で流して、Ｈ５抗体と結合反応の程度を測定した。分析試料やバッファは、１５μｌ／ｍｉｎの流速で６分間注入して２０分間洗浄した。Ｈ５抗体及びＩｇＧがそれぞれ抗原ペプチドと反応した反応の結果から、タンパク質がコーティングされていないｂｌａｎｋの反応値を差引いたｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ（センサーグラム）で分析した。その結果、図４に示した通り、Ｈ５抗体では抗原ペプチドの濃度に比例して結合が増加したが、ＩｇＧではタンパク質と抗原ペプチドの有意な結合を観察することができなかった。ＩｇＧに変換された形態のＨ５抗体も、ＦａｂのＡＩＭＰ２−ＤＸ２抗原に対する結合力を維持していることが分かった。
【０１０６】
最後に、Ｈ５抗体が野生型（ＷＴ）ＡＩＭＰ２タンパク質とＡＩＭＰ２−ＤＸ２を区別することができるか否かを確認した（図５）。野生型ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２−ＤＸ２を区別せずに結合する＃３２４抗体と、Ｈ５  Ｆａｂを利用して、Ｈ４６０細胞溶解物でウェスタンブロットを実施して、結果を比較した。＃３２４抗体が野生型ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２−ＤＸ２に全て結合したものとは対照的に（図５のＡ）、Ｈ５  Ｆａｂは、野生型ＡＩＭＰ２には全く結合せずに、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２にのみ特異的に結合することが分かった（図５のＢ）。つまりＨ５抗体を利用して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のみを選択的に感知することを確認した。Ｈ５  ＩｇＧ抗体は、Ｈ５  Ｆａｂの可変領域をそのまま含めて、抗原に対する結合特性を維持しているので、Ｈ５  ＩｇＧ抗体でもＨ５  Ｆａｂと同じ結果を得られることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
以上述べた通り、本発明に係る抗体は野生型ＡＩＭＰ２には反応せず、ｅｘｏｎ２が欠損したＡＩＭＰ２−ＤＸ２突然変異パク質に特異的に結合するので、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の存在と発現程度確認に有用に利用することができる。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、がんと炎症性疾患などの病理に関連しており、特に肺がん、乳がん、大腸がんなどのがん疾患で過剰発現されているので、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２をがんの発生と進行のバイオマーカーとして感知するためのがん診断用組成物の開発に有用に利用することができる。
【図１Ａ】
2019514350.tif 000009
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2019514350.tif 000015
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019514350.tif 000018
【配列表】
2019514350000001.app
【国際調査報告】
2019514350.tif 000019
2019514350.tif 000020
2019514350.tif 000021
2019514350.tif 000022
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