(57)【要約】  本願発明は、医薬の分野に関する。それは、さらに特に、ペプチド、かかるペプチドを含む微小胞、それを含む組成物、特にワクチン、および対象において免疫応答を刺激するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成される少なくとも第１のパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）、微小胞および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項２】
微小胞が、７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成される少なくとも１つの第２のＰＴＰを含み、該第２のＰＴＰが、好ましくは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み、微小胞が、所望により、第１のＰＴＰを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
組成物が、第１のＰＴＰに対応する全長タンパク質をさらに含む、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
微小胞が、第１のＰＴＰおよび少なくとも第２のＰＴＰの両方を、所望により少なくとも１つの第３の別個のＰＴＰと共に発現する、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項５】
微小胞が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化微小胞、典型的にはエキソソームまたは腫瘍由来微小胞、例えばメラノソームである、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
組成物が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するＰＴＰを含む、請求項１から５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ワクチンが癌ワクチンである、請求項１から６のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８】
組成物が、ワクチン接種される対象の癌性腫瘍に両方とも由来するＰＴＰおよび微小胞を、好ましくは、少なくとも１つの別個のＰＴＰと共に、および／または同じＰＴＰおよび／または少なくとも１つの別個のＰＴＰを発現するエキソソームと共に、含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
対象が哺乳動物、好ましくはヒトであり、組成物が、体重ｋｇあたり０．１から１０ｍｇのＰＴＰを、所望により体重ｋｇあたり０．１から５ｍｇの微小胞と共に含む、請求項１から８のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
癌が肉腫または黒色腫である、請求項７から９のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
対象におけるワクチンとして使用するための、イントロン、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＬｎｃＲＮＡ（ロング非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、遺伝子間配列およびそれらの組合せから選択される配列から発現される７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成されるパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）。
【請求項１２】
ワクチンとしての使用のための、ＰＴＰをコードする核酸配列。
【請求項１３】
ＰＴＰが、好ましくは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１１に記載のペプチドで構成されるパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）を含む微小胞。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸および薬学的に許容される担体または賦形剤を含むワクチン組成物。
【請求項１５】
ヒトにおける使用のための、請求項１から１０または１４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願発明は、医薬の分野に関し、治療および予防領域において典型的に使用される。本願発明は、さらに特に、好ましくは腫瘍抗原に対する、７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成されるパイオニア翻訳産物（「ＰＴＰ」）、かかるＰＴＰを含む微小胞、それを含む組成物、特にワクチン組成物、および対象において免疫応答を刺激するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチン接種の主な目的は、ヒトにおいてウイルス感染症および癌を制御することができる有効な免疫応答を誘導することである。免疫系は、一方では先天性免疫系および他方では適応免疫系の２つのカテゴリーに分類される。感染または形質転換細胞に対する細胞性免疫反応は、適応免疫系の活性化を必要とする。この活性化は、抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球、例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＴヘルパーＴ細胞、例えばＣＤ４＋  Ｔ細胞を刺激することによってのみなし遂げることができる。事実、細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子に結合される細胞表面抗原上に存在するウイルス感染細胞または癌性細胞を検出することができる。この認識は、結果として、感染細胞または腫瘍細胞に対するＴ細胞の直接的な細胞毒性作用をもたらす。それにもかかわらず、これらの異なる状態に対する適切な免疫反応は、交差提示と呼ばれるプロセスを介してＭＨＣクラスＩ分子上に存在する外部ペプチド物質を取り込む、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、例えば樹状細胞およびマクロファージによるＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を必要とする。直接および交差提示の経路は、宿主に脅威を与える細胞の検出および除去のための基本的プロセスである。このプロセスは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合される外因性タンパク質に由来する１３−２０個のアミノ酸の短いペプチドの形態において抗原を認識したＴヘルパーＴ細胞にさらに依存する。
【０００３】
数年前、ＭＨＣクラスＩ制限経路への直接提示のためのペプチド源は、全長タンパク質の分解に由来するのではなく、いわゆる欠陥リボソーム産物、またはＤＲｉＰに由来すると仮定された。クラスＩ経路についてのペプチドの実際の供給源は知られていなかったけれども、さらなる試験はこの考えを支持してきた。発明者らは、エプスタイン・バーウイルスの潜在性タンパク質ＥＢＮＡ１が、抗原提示を抑制するためにｍＲＮＡ翻訳に影響を及ぼし、そういう意味で、その検出を回避することを示した。さらに、発明者らは、ｍＲＮＡ翻訳の速度が抗原提示と密接に関連していることを観察した。加えて、いくつかのＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、非従来的な翻訳メカニズムから細胞において合成されるポリペプチドを指す潜在的翻訳から生成されるものとして記載されている。これらは、イントロン、イントロン／エキソン接合部、５’および３’非翻訳領域または別の翻訳リーディングフレームによってコードされるペプチドのいずれかであってよい。これらの観察はすべて、抗原産生のために重要なプロセスであるタンパク質分解からｍＲＮＡ翻訳への焦点のシフトにつながった。最近、発明者らは、ペプチドがイントロン的に  対  エキソン的に発現されるか、全長タンパク質を生じさせる規範的な(canonical)事象と異なる翻訳事象によって生産されるいわゆるパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）を引き起こすかどうかにかかわらず、抗原提示が同等であることを示した。以前の結果は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸出が遮断された場合、抗原提示はエキソンおよびイントロンでコードされたペプチドから著しく増強されたという事実によって支持された。全体として、発明者らは、ＭＨＣクラスＩ経路の抗原性ペプチドが、大部分において、全長タンパク質を生産するものとは異なり独立しており、核区画において新たに合成されたｍＲＮＡの初期スキャン中に起こるｍＲＮＡ翻訳事象に由来することを証明している（Apcher, Millot et al. 2013, Apcher, Daskalogianni et al. 2015）。これらのＰＴＰは、捉えどころのないＤＲｉＰを構成する可能性が高い。それらは、ｍＲＮＡスプライシングが起こる前に産生することができ、これは、例えば、免疫系が組織依存性の選択的スプライシング産物を「許容する」ことができるかについての説明を提供する。
【０００４】
今日では、宿主免疫介在腫瘍認識および破壊を改善することを目的とした癌免疫療法における治療ワクチン接種は、新たな熱烈な興味を見せ始めている。しかし、１９９６年に、ＭＡＧＥ−１タンパク質に由来するクラスＩ結合合成エピトープは、臨床試験においてペプチドベースのワクチンとして既に試験されていた。それにもかかわらず、ワクチンとして合成エピトープを使用する同じグループおよび他のものは、黒色腫患者において有益な臨床反応を見出すことができなかった。次に、異なる癌に対する他の短いペプチドが、患者において有益なＴ細胞応答を再び証明することなく使用されている。次に、複数のペプチドワクチンが、とりわけ黒色腫に対して現状打破なしで使用されている。最近、合成の長いペプチド（２０アミノ酸を超える）を用いた免疫化は、より免疫原性であり、短いペプチドで観察された免疫化よりも良い抗腫瘍増殖効果を有することが示されている。最小限の短い抗原性エピトープを含む２種類のペプチド間のこれらの相違は、より長いペプチドがそれらの三次構造に起因する細胞外分解に対して保護することができるという事実、およびそれらがあらゆる細胞系のＭＨＣクラスＩ分子に直接結合するには長すぎるという事実において見られ得る。加えて、ワクチンとしてより長いペプチドを使用する利点は、細胞表面に提示され、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化する前に、それらが内在化され、ｐＡＰＣ中のプロテアソームによる適切なプロセシングを必要とすることである。さらに、より長いペプチドは、異なるＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を誘発し、したがって複数の免疫応答を誘導し得るいくつかのエピトープを含むより良い機会を有する。
【０００５】
免疫細胞または腫瘍細胞によって分泌されるエキソソームは、腫瘍免疫療法におけるそれらの可能性について研究されている。エキソソームは、多小体（ＭＶＢ）における管腔内小胞として生じ、特異的タンパク質の取り込みは選択的である。エキソソームは直径３０〜１００ｎｍの小胞である。腫瘍由来のエキソソームは腫瘍抗原を含み、したがって癌ワクチンのための腫瘍抗原の供給源として使用することができると仮定されている。また、樹状細胞（ＤＣ）由来のエキソソームは、特異的な抗腫瘍免疫を誘導するための有用かつ有効な薬剤であり得ることを多くのグループが報告している。また、樹状細胞（ＤＣ）由来のエキソソームは、特異的な抗腫瘍免疫を誘導するために有用かつ有効な薬剤となることができることを多くのグループが報告している。それにもかかわらず、腫瘍由来エキソソームは、例えば、ＤＣの分化を阻害することによって、またはＮＫ細胞を負に調節することによって、異なる経路において異なる役割で腫瘍免疫回避を誘導することができるため、腫瘍由来エキソソームが不完全であることを示唆する証拠が増加している(Valenti, Huber et al. 2006, Clayton, Mitchell et al. 2008, Whiteside, Mandapathil et al. 2011)。
【０００６】
発明者らは、今回、腫瘍増殖の完全阻害、好ましくは腫瘍破壊を可能にする腫瘍に対する適当なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる、イントロンまたはエキソン配列から生産されるＰＴＰを、好ましくはＰＴＰを含む微小胞、一般的に（典型的に）エキソソームと組み合わせて含むワクチン組成物を本願に記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本願発明は、抗原特異的免疫応答、特に癌治療および予防の分野において、抗原特異的免疫応答を改善するための産物および方法に関する。
【０００８】
本願発明は、７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成され、典型的には少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープを含み、好ましくは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むパイオニア翻訳産物（「ＰＴＰ」）が、癌に罹患している対象において、かかるペプチドを発現する腫瘍に対して効率的な、好ましくは持続的な免疫応答を誘導することができるという予期し得ない知見に基づく。
【０００９】
したがって、本願発明の第１の目的は、対象において、ワクチンとして、好ましくは癌ワクチンとしての使用のための、７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成され、典型的には５ｋＤａ以下の、パイオニア翻訳産物（「ＰＴＰ」）に関する。ＰＴＰは、典型的には、イントロン、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＬｎｃＲＮＡ（ロング非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、遺伝子間配列およびそれらの組合せから選択される配列から発現される。ＰＴＰは、好ましくは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。
【００１０】
本願発明の第２の目的は、少なくとも１つのＰＴＰ（好ましくはいくつかのＰＴＰ）、典型的には本願明細書に記載のＰＴＰ、好ましくは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む該ＰＴＰを含む、微小胞、典型的にはエキソソームまたは同等の腫瘍由来微小胞、例えばメラノソームに関する。
【００１１】
本願発明の第３の目的は、少なくとも１つのＰＴＰ（好ましくはいくつかのＰＴＰ）および／または微小胞、典型的には本願明細書に記載のエキソソームまたは腫瘍由来微小胞、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物、特にワクチン組成物に関する。
【００１２】
好ましいワクチン組成物は、少なくとも本願明細書に記載の第１のＰＴＰ、微小胞および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。好ましくは、微小胞は、７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成される少なくとも１つの第２のＰＴＰを含み、該第２のＰＴＰは、好ましくは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み、微小胞は、所望により第１のＰＴＰを含む。
【００１３】
本願発明は、また、本願発明によるワクチンとして使用するためのＰＴＰをコードする核酸配列、および、かかる核酸配列および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物、特にワクチン組成物に関する。
【００１４】
好ましい局面において、本願明細書に記載のワクチン組成物は、ヒトにおける使用のためのものである。
【００１５】
本願発明は、また、対象において癌を予防または処置するための、かかるＰＴＰ、微小胞、核酸または組成物の使用に関する。
【００１６】
本願発明の別の目的は、特定の抗原、好ましくは腫瘍抗原に対して、対象において免疫応答を生産する、または対象をワクチン接種する方法であって、該対象に該抗原に由来する本願発明によるＰＴＰ、該ＰＴＰを含む微小胞または該ＰＴＰを含むワクチン組成物を注射することを含む方法に関する。
【００１７】
本願発明のさらなる目的は、対象において癌を予防または処置する方法であって、該対象に本願発明によるＰＴＰ、好ましくは対象の癌性腫瘍によって発現されるポリペプチドに由来するＰＴＰ、該ＰＴＰを含む微小胞または該ＰＴＰを含むワクチン組成物を注射することを含む方法に関する。
【００１８】
発明の詳細な説明
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原提示経路は、免疫系が自己と非自己を区別することを可能にする。抗原性ペプチドの処理に関する広範な研究にもかかわらず、その起源についてはほとんど知られていない。発明者らは、パイオニア翻訳産物（「ＰＴＰ」）と呼ばれるユニークなクラスのペプチドが、ｍＲＮＡ翻訳の先駆的なラウンド中に生産され、ＭＨＣクラスＩ経路に対する直接提示のための抗原性ペプチド基質の主要な供給源を提供することを明らかにした。発明者らは、ＭＨＣクラスＩ経路のための基質の大部分が、核内で非規範的な(noncanonical)翻訳メカニズムを介して、イントロンがスプライシングされる前に、ｍＲＮＡ成熟の初期段階中に合成されることを証明した（Apcher et al., 2013）。このメカニズムは、全長タンパク質を生産するものとは無関係である。発明者らは、また、ＰＴＰが全長タンパク質よりもＭＨＣクラスＩ交差提示経路のためのより良いペプチド供給源であることを証明しており、本願において、今回、これらのＰＴＰが、特に微小胞と混合されるとき、特に癌を効率的に予防または処置するために、ワクチンとして使用することができることを明らかにしている。
【００１９】
したがって、本願発明の第１の目的は、対象において、ワクチンとして、好ましくは癌ワクチンとして、使用するための、７から５０個のアミノ酸残基または８から５０個のアミノ酸残基を有するペプチドで構成されるパイオニア翻訳産物（「ＰＴＰ」）に関する。
【００２０】
パイオニア翻訳産物（「ＰＴＰ」）は、本願において、イントロン、エキソン、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＬｎｃＲＮＡ（ロング非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）および／または遺伝子間配列から発現される非スプライシングｍＲＮＡに由来するペプチドとして定義される。好ましくは、ＰＴＰは、ｉ）イントロン、３’または５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＬｎｃＲＮＡ（ロング非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、遺伝子間配列およびそれらの組合せ、ｉｉ）イントロン、ＬｎｃＲＮＡ（ロング非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、遺伝子間配列およびそれらの組合せ、またはｉｉｉ）イントロン、ＬｎｃＲＮＡ（ロング非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）および遺伝子間配列、から選択される配列から発現される７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成される。ＰＴＰは、核区画において新たに合成されたｍＲＮＡの初期スキャン中に起こる、全長タンパク質を生じさせる規範的な事象と異なる翻訳事象によって生産される（Apcher, Millot et al. 2013, Apcher, Daskalogianni et al. 2015）。これらのＰＴＰは、好ましくは、ウイルスまたは細菌起源ではない。それらは、典型的には、７から５０個のアミノ酸残基の配列で構成され、５ｋＤａ以下、典型的には３ｋＤａ以下の原子質量を有する。ＰＴＰは、好ましくは、７から３０個のアミノ酸残基、例えば７から２７個のアミノ酸残基の配列で構成される。ＰＴＰは、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のアミノ酸残基を含むことができる。ＰＴＰは、典型的には、ＭＨＣクラスＩエピトープを含む。腫瘍細胞の核区画から精製されたＰＴＰ［本願において「腫瘍関連ＰＴＰ」（ＴＡ−ＰＴＰ）としても同定される］は、典型的には、腫瘍細胞が由来する腫瘍に対する特異的な抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発する。本願発明による好ましいＰＴＰは、少なくともＭＨＣクラスＩエピトープおよび／またはＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を延長する免疫系から長期ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘発する。
【００２１】
本願発明のＰＴＰは、特異的免疫応答が標準生化学的アプローチを使用して処置／ワクチン接種される対象において誘発されるあらゆるタンパク質、ポリペプチドまたは抗原から得られる、または生成される（および「に由来する」と言及される）ことができる。腫瘍の文脈において、ＰＴＰ抽出は、界面活性剤または塩での腫瘍細胞の溶解、次に５ｋＤａ以下、好ましくは３ｋＤａ以下のペプチドの抽出、およびカラム上での陰イオン性または疎水性クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーを含む標準クロマトグラフィーアプローチによる精製を含む。
【００２２】
本願発明の別の態様において、ＰＴＰに由来する抗原エピトープは、クエン酸リン酸バッファー（ｐＨ３．３）によって腫瘍細胞表面から溶出することができる。抗原エピトープは、質量分析によって分析することができ、ペプチドデノボ配列決定を行うことができる。分析プロセスは、実際に、配列データベースを使用することなく、タンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）からペプチドのアミノ酸配列の減算を可能にする。イントロン、エキソン、３’および５’ＵＴＲ、ＬｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは遺伝子間領域からのエピトープの同定後、様々なＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む新規なＰＴＰを合成することができる。
【００２３】
本願発明の特定の態様において、本願発明のＰＴＰは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。好ましくは、本願発明のＰＴＰは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。
【００２４】
好ましい態様において、ＰＴＰは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するＰＴＰである。
【００２５】
本願に記載の特定のＰＴＰは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３（表１および２および配列表参照）のいずれかから選択されるＰＴＰである。
【００２６】
好ましい態様において、対象において癌ワクチンとして使用するためのＰＴＰは、対象の癌性腫瘍に由来するＰＴＰ（「腫瘍関連ＰＴＰ」または「ＴＡ−ＰＴＰ」）である。かかるＴＡ−ＰＴＰは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するＰＴＰとして発明者らによって同定されている。
【００２７】
別の好ましい態様において、このＰＴＰは、対応する全長タンパク質またはポリペプチド、すなわち同じｍＲＮＡによって規範的に翻訳されるタンパク質またはポリペプチド、またはその抗原と組み合わせて、癌ワクチンとして使用される。
【００２８】
本願発明の別の目的は、対象においてワクチンとして使用するための本願に定義のＰＴＰをコードする核酸配列（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）である。
【００２９】
本願発明のさらなる目的は、本願明細書に記載の少なくとも１つのＰＴＰを含む／発現する微小胞、典型的にはエキソソームまたは同等の腫瘍由来微小胞に関する。
【００３０】
エキソソームは、後期エンドソーム多小胞体と細胞膜との融合後、細胞外環境において分泌されるエンドソーム起源の小胞である（Garin et al., 2001; Thery et al., 2002）。種々の組織型由来の細胞、例えば、樹状細胞、Ｂリンパ球、腫瘍細胞および肥満細胞は、エキソソームを分泌することが示されている。例えば、腫瘍細胞に由来するエキソソームは、本願において、腫瘍由来微小胞として同定される。黒色腫細胞から得られるエキソソームまたは腫瘍由来微小胞は、本願において、「メラノソーム」として同定される。異なる起源由来のエキソソームは、タンパク質および脂質部分の別々のセットを示す（Thery et al., 1999, Thery et al., 2001）。それらは、特に、抗原提示および免疫調節に関与するタンパク質を含み、エキソソームが免疫応答の調節をもたらす細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすことを示す。実際に、腫瘍抗原に由来するペプチドでパルスされた樹状細胞（ＤＣ）由来のエキソソームは、マッチングする腫瘍を使用する動物モデルにおいて抗腫瘍応答を誘発する（Wolfers et al., 2001, Zitvogel et al., 1998）。
【００３１】
治療目的のために、または研究手段としてエキソソームを生産、精製または使用する方法は、例えば出典明示により本願に包含されるＷＯ９９／０３４９９、ＷＯ００／４４３８９およびＷＯ９７／０５９００において記載されている。組換えタンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞に由来する組換えエキソソームが、当分野で記載されている。かかる組換えエキソソームは、プラスミドにコードされた組換えタンパク質を含む（ＷＯ００／２８００１）。エキソソームのタンパク質含有量を操作する、治療目的のために、または研究手段として抗原、アジュバントおよびマーカーを提示する方法は、ＷＯ０３／０１６５２２に記載されている。
【００３２】
したがって、発明者らは、本願において、対象において、ワクチンとして、好ましくは癌ワクチンとして使用するための、本願に定義のＰＴＰを含む／発現する、微小胞、典型的には腫瘍細胞に由来する微小胞を記載する。特定の態様において、この微小胞は、いくつかのＰＴＰ、特に種々の長さおよび所望により異なる起源の、すなわち別個の（非スプライシング）ｍＲＮＡに由来する、いくつかのＰＴＰを含む。
【００３３】
腫瘍細胞によって生産される腫瘍由来微小胞は、当分野で知られている技術、例えば遠心分離、クロマトグラフィーなどによって回収および／または精製されてもよい。好ましい技術は、出典明示により本願明細書に包含させるＷＯ００／４４３８９およびＵＳ０９／７８０，７４８に記載されている。
【００３４】
発明者らはまた、本願において、本願明細書に記載のＰＴＰを含む／発現する機能化微小胞／エキソソーム／メラノソームを調製する方法を記載しており、方法は、
−ＰＴＰをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
−該ＰＴＰを含む／発現する、典型的には表面に該ＰＴＰを提示する機能化微小胞／エキソソーム／メラノソームを産生するために、該構築物を微小胞／エキソソーム／メラノソームを生産する細胞に導入すること、および
−該機能化微小胞／エキソソーム／メラノソームを回収および／または精製すること
を含む。
【００３５】
このような細胞によって生産される微小胞は、当分野で知られている技術、例えば遠心分離、クロマトグラフィーなどによって回収および／または精製されてもよい。好ましい技術は、出典明示により本願明細書に包含させるＷＯ００／４４３８９およびＵＳ０９／７８０，７４８に記載されている。
【００３６】
発明者らはさらに、本願において、本願明細書に記載のＰＴＰを生産する方法を記載しており、方法は、
−ＰＴＰをコードするキメラ遺伝子構築物を提供すること；
−該ＰＴＰを含む／発現する、典型的には表面に該ＰＴＰを提示する機能化微小胞／エキソソーム／メラノソームを産生するために、該構築物を微小胞／エキソソーム／メラノソームを生産する細胞に導入すること、
−該機能化微小胞／エキソソーム／メラノソームを回収および／または精製すること、および
−該ポリペプチドまたはそのフラグメントを該機能化微小胞／エキソソーム／メラノソームから回収および／または精製すること
を含む。
【００３７】
本願発明の文脈において、ＰＴＰに由来する抗原エピトープまたはＰＴＰを「含む／発現する」微小胞（エキソソームまたはメラノソーム）なる用語は、膜に結合したＰＴＰに由来するかかる抗原エピトープまたはＰＴＰを含む微小胞を指す。ＰＴＰに由来する抗原エピトープは、微小胞の外部に露出していてもよく、ＰＴＰは、典型的には、微小胞内に含まれている（すなわち、膜の内側に結合されている、または微小胞の内部に浮遊状態である）。典型的には、微小胞は、樹状細胞へのＰＴＰ（複数も含む）の効率的な輸送を可能にする、および樹状細胞表面でＰＴＰ（複数も含む）およびそれに由来する抗原エピトープ（複数も含む）の効率的な交差提示を可能にする。
【００３８】
本願発明はさらに、上記のキメラ遺伝子構築物を含むベクター、ならびに上記のキメラ遺伝子構築物またはベクターを含む組換え細胞を含む。
【００３９】
ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体などであり得る。典型的な例は、プラスミド、例えば市販されているプラスミドに由来するもの、特にｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどを含む。他の好ましいベクターは、ウイルス、例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルスまたはワクシニアウイルスに由来する。ベクターの選択は、該ベクターが使用される組換え宿主細胞に依存して、当業者によって調整され得る。この点において、哺乳動物細胞にトランスフェクトまたは感染することができるベクターを使用することが好ましい。実際、好ましい組換え宿主細胞は哺乳動物細胞である。これらは、初代細胞または確立された細胞系であってよい。説明的な例は、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、免疫細胞など、ならびにそれらの創始または前駆細胞を含む。最も好ましい哺乳動物細胞は、エキソソームを生産する哺乳動物細胞である。これらは、例えば、腫瘍細胞、樹状細胞、ＢおよびＴリンパ球または肥満細胞を含む。
【００４０】
本願発明の微小胞は、ワクチンとして単独で使用することができる。好ましい態様において、この微小胞は、標的細胞または組織（例えば腫瘍）によって発現される全長タンパク質またはポリペプチドと、および／または該全長タンパク質またはポリペプチドに対応する非スプライシングｍＲＮＡに由来する少なくとも１つのＰＴＰ、典型的にはいくつかのＰＴＰと組み合わせて使用される。
【００４１】
本願発明のさらなる目的は、本願明細書に記載の産物、典型的には少なくとも１つのＰＴＰ、ＰＴＰ全長対応タンパク質またはポリペプチド、および／または本願明細書に記載の微小胞（エキソソームまたはメラノソーム）、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物、特にワクチン組成物、好ましくは癌ワクチンに関する。
【００４２】
本願発明の好ましい組成物は、種々の長さのいくつかのＰＴＰを含む。
【００４３】
本願発明の別の好ましい組成物は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するＰＴＰを含む。
【００４４】
存在する場合、微小胞は、典型的には、ＰＴＰ（複数も含む）、例えば組成物に存在するものと同一のＰＴＰを、所望により（少なくとも１つの）別個のＰＴＰ（複数も含む）と共に、含有する（含むまたは発現する）。
【００４５】
好ましいワクチン組成物は、本願明細書に記載の少なくとも第１のＰＴＰ、微小胞および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。好ましくは、微小胞は、７から５０個のアミノ酸を有するペプチドで構成される少なくとも１つの第２のＰＴＰを含み、該第２のＰＴＰは、好ましくは少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み、微小胞は、所望により第１のＰＴＰを含む。
【００４６】
微小胞は、所望のＰＴＰ（複数も含む）を発現する組換え微小胞および処置される対象に由来する天然微小胞、例えば処置される対象の腫瘍に由来する微小胞（腫瘍由来微小胞）を含む、微小胞の組成物であってよい。
【００４７】
好ましい態様において、微小胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化微小胞、典型的にはエキソソームまたは腫瘍由来微小胞、例えば腫瘍を有する対象のＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化するＰＴＰを天然に発現するメラノソームである。
【００４８】
本願発明の別の別個の態様において、組成物は、本願に定義のＰＴＰをコードする核酸配列（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）または遺伝的構築物を含むワクチン組成物である。
【００４９】
遺伝学的ワクチン接種は、種々のウイルスベクター、例えばワクシニア、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなど、非ウイルスベクター、例えば種々の脂質またはペプチド組成物と関連する核酸配列を使用して、または純粋な（例えば、裸の、または言い換えればトランスフェクション促進剤を含まない）核酸を使用して行うことができる。ワクチン接種は、筋肉内、静脈内、皮下または皮膚内を含む種々の注射経路によって実施することができる。種々のベクター送達デバイスまたは技術が、遺伝子銃またはエレクトロポレーションを含む遺伝学的ワクチン接種のために、使用することができる。対象はまた、インビトロでベクターでトランスフェクトされた細胞系を使用して免疫化することができる。多数のエキソソームの放出のために選択された細胞系が特に有利であろう。
【００５０】
好ましい癌ワクチンは、腫瘍関連ＰＴＰ（複数も含む）を、エキソソーム、好ましくは腫瘍由来微小胞、および／またはＰＴＰ全長対応タンパク質またはポリペプチド、および薬学的に許容される担体または賦形剤と共に含む。
【００５１】
別の好ましい癌ワクチンは、ワクチン接種される対象の腫瘍に両方とも由来するＰＴＰおよび微小胞を、好ましくは、少なくとも１つの別個のＰＴＰと共に、および／または同じＰＴＰおよび／または少なくとも１つの別個のＰＴＰを発現するエキソソームと共に、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。さらに好ましい癌ワクチンはさらに、ＰＴＰ全長対応タンパク質またはポリペプチドを含む。
【００５２】
本願発明の文脈において使用可能である、薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体は、所望により安定化剤、例えば同系のアルブミンまたは任意の他の安定化タンパク質、グリセロールなどと組み合わせられた、例えば生理食塩水、希釈剤、等張液または緩衝溶液、例えばマンニトール２０％である。
【００５３】
適切なアジュバントの例は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、トール様受容体（ＴＬＲ）、例えばＴＬＲ３アゴニスト（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）、およびサイトカインおよびケモカイン、例えばＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。
【００５４】
本願発明はまた、対象において、疾患、特に癌を予防または処置するための組成物、特にワクチン組成物を調製するための、本願明細書に記載の本願発明の産物（ＰＴＰ、微小胞、核酸）の使用に関する。典型的なワクチン組成物はヒトにおける使用のためのものである。
【００５５】
本願発明の目的はまた、特定の標的、好ましくは腫瘍抗原または癌／腫瘍細胞に対して、対象において免疫応答を生産する、典型的には対象にワクチン接種する方法であって、該標的に由来する本願発明によるＰＴＰ、該ＰＴＰを含む本願発明による微小胞、または本願発明によるワクチン組成物を該対象に注射することを含む方法に関する。
【００５６】
本願発明の別の目的は、対象において癌を予防または処置する方法であって、本願発明によるＰＴＰ、好ましくは対象の癌性腫瘍によって発現されるタンパク質またはポリペプチドに由来するＰＴＰ、該ＰＴＰを含む本願発明による微小胞、または本願発明によるワクチン組成物を該対象に注射することを含む方法である。
【００５７】
本願明細書において使用される「処置」または「処置する」は、処置される対象の自然経過を変える試みにおける治療的介入を示し、予防（防止）または治癒目的のために行うことができる。処置の望ましい効果は、限定はしないが、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、および疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的帰結の減少、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または改善された予後を含む。好ましい態様において、本願発明の組成物および方法は、癌の発生を遅延させるため、または癌、典型的には腫瘍増殖の進行を遅らせるために使用される。
【００５８】
典型的には、処置は、対象の免疫系の治療応答、典型的にはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞反応を誘導する。Ｔ細胞応答を誘導するとは、本願において、特定の抗原に対するＴ細胞応答が誘発されることを意味する。該誘導の前に、該Ｔ細胞応答は存在しなかったか、または検出レベル未満であったか、または機能的でなかった。Ｔ細胞応答を増強するとは、本願において、特定の抗原に対するＴ細胞の全体的作用が、該増強の前のＴ細胞の全体的作用と比較して、より高くおよび／またはより効率的にさせることを意味する。例えば、該増強の後に、該抗原に対する多くのＴ細胞が産生され得る。結果として、追加的に産生されたＴ細胞の作用は、該抗原に対する全体的作用を増加させる。あるいは、該増強は、該抗原に対するＴ細胞の作用の増加を含み得る。該Ｔ細胞は、例えば、該抗原とより強く及び／又はより迅速に反応することができる。もちろん、該増強の結果は、該Ｔ細胞の作用の増加と共に、追加的なＴ細胞の産生であってよい。あるいは、該増強は、追加的なＴ細胞の産生またはＴ細胞の作用の増加のみであってもよい。
【００５９】
処置、典型的にはワクチンは、対象に対して意図される。「対象」または「個体」なる用語は、動物、典型的には哺乳動物を示す。哺乳動物の例は、ヒトおよび非ヒト動物、例えば限定はしないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、非ヒト霊長類（例えばサル）、ウサギ、および齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）を含む。処置は、好ましくは、年齢または性別に関係なく、それを必要とするヒトに対して意図される。特に、そのように考えられるものは、癌に罹患している対象、または予防されなければならない癌「を発症する危険性がある」と考えられるものである。患者は、典型的には腫瘍を有する。本願に特記されない限り、腫瘍は癌性または悪性腫瘍である。
【００６０】
癌または腫瘍は、任意の種類の癌または新生組織形成であってよい。腫瘍は、典型的には、特に上皮性、神経外胚葉または間葉性起源の固形腫瘍である。それは、黒色腫、肉腫、癌腫、リンパ腫、および小児腫瘍（神経膠腫）、例えば黒色腫または肉腫から選択することができる。本願発明は、治療の文脈において、原発性腫瘍、または二次的侵入、局所領域または遠隔転移に、および予防の文脈において、黒色腫、肺癌、腎臓癌、乳癌、および大腸癌からの観察される侵入（転移）のような二次悪性中枢神経系の関与を回避するために、適用することができる。
【００６１】
本願発明のワクチン組成物において、ＰＴＰは、所望の標的（病原体、標的細胞）に対する所定の対象の免疫系の治療応答、例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞反応、典型的にはＣＤ４＋  Ｔ細胞反応、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞治療応答を誘発する、および疾患、好ましくは癌を予防または処置する、典型的にはコントロールするために十分な量で存在する。
【００６２】
対象が哺乳動物、好ましくはヒトであるとき、ワクチン組成物は、典型的には、体重ｋｇあたり０．１から１０ｍｇのＰＴＰを、所望により体重ｋｇあたり０．１から５ｍｇの微小胞と共に含む。
【００６３】
治療的免疫応答を誘導することができる本願に記載の産物は、それを必要とする任意の哺乳動物対象、特にヒト対象にインビボで投与することができる。投与は、種々の経路によって、例えば全身注射、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、皮下などによって、行うことができる。
【００６４】
治療的免疫応答の検出は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、遅延型過敏症応答、細胞内サイトカイン染色および／または細胞外サイトカイン染色のような技術のおかげで、当業者によって容易に決定することができる。
【００６５】
本願発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの実施例および図は、決して本願発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１：腫瘍拒絶におけるパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）の役割。Ａ）マウスを、ＭＣＡ２０５  ＷＴ腫瘍細胞、または、ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８をコードするプラスミド、ｇｌｏｂ−エキソン−ＳＬ８をコードするプラスミドもしくはオボアルブミンによりトランスフェクトされたＭＣＡ２０５のいずれかで皮下に注射した。各グループからの半分のマウスは、６日目または４日目に静脈内にＯＴ１細胞を受けた。腫瘍サイズを、２０日目まで時間とともに評価した。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５（対応がないスチューデントｔ検定）。Ｂ）マウスを、Ｂ１６Ｆ１０  ＷＴ腫瘍細胞、または、ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８をコードするプラスミド、ｇｌｏｂ−エキソン−ＳＬ８をコードするプラスミドもしくはオボアルブミンによりトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０で皮下に注射した。３日目に、各グループからの半分のマウスは、静脈内にＯＴ１細胞を受けた。腫瘍サイズを、１９日目まで時間とともに評価した。データは平均±ＳＥＭとして示される。＊ｐ＜０．０５（対応がないスチューデントｔ検定）。Ｃ）マウスにＣＦＳＥでマークされた２．１０６個のＯＴ１細胞を静脈内注射した。３時間後、５．１０６個のＨｅｋ細胞  ＷＴ  またはプラスミドｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８またはｇｌｏｂ−エキソン−ＳＬ８またはＯｖａによりトランスフェクトされたものを腹腔内に注射した。３日後、リンパ節および脾臓由来の細胞を回収し、ＣＤ８細胞においてＣＦＳＥ発現を分析した。ドットプロットは、異なるマウスにおいて得られた典型的な結果である。
【００６７】
【図２】図２：全てのＰＴＰ：癌ワクチンのためのペプチドの供給源。グループの６匹のマウスを、１２５μｇ（ＰＴＰ  Ｘ１）、６４μｇ（ＰＴＰ  Ｘ１／２）、３２μｇ（ＰＴＰ  Ｘ１／４）のＰＴＰで、または８μｇ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ  １／２５）のＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープ（ＭＣＡ−２０５−ＯｖａについてポジティブコントロールおよびＭＣＡ−２０５  ＷＴ細胞についてネガティブコントロール）（ＣｐＧ＋ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化された（ネガティブコントロール））でワクチン接種した。１５日後、マウスに、右脇腹にオボアルブミンを発現する５０．１０３個のＭＣＡ−２０５生存細胞（Ａ）および左脇腹に５０．１０３個のＭＣＡ−２０５  ＷＴ生存細胞（Ｂ）を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について７日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【００６８】
【図３】図３：肉腫細胞系からの特異的ＰＴＰ：癌ワクチンのためのペプチドの供給源。グループの６匹のマウスを、１２５μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１）、６４μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／２）、３２μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／４）のＰＴＰで、または  ｗｉｔｈ  ８μｇ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ  １／２５）のＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープ（ポジティブコントロール）、ＣｐＧ＋ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化されたもの（ネガティブコントロール）でワクチン接種した。１５日後、マウスに、右脇腹にオボアルブミンを発現する５０．１０３個のＭＣＡ−２０５生存細胞（Ａ）および左脇腹に５０．１０３個のＭＣＡ−２０５  ＷＴ生存細胞（Ｂ）を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について７日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【００６９】
【図４】図４：ＰＴＰ  プラス  エキソソーム：新規の癌ワクチン。Ａ）ＦＡＣＳによるＭＣＡ２０５−ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８細胞から精製されたエキソソームにおけるＣＤ９およびＣＤ８１の発現の分析。薄い灰色において染色されていないエキソソーム、濃い灰色においてＷＴエキソソームおよび黒色においてｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８−エキソソーム。Ｂ）左パネル：ＢＭＤＣ（骨髄樹状細胞）を、ＭＣＡ２０５  ＷＴまたはＭＣＡ２０５−ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８から精製されたエキソソームによってパルスした。それらを回収し、ＯＴ１細胞と共に培養した。ＩＬ−２ｍを検出するためにＥＬＩＳＡを行った。データは平均±ＳＥＭとして示される。右パネル：ＢＭＤＣが存在しない場合、エキソソームをＯＴ１細胞に加えた。少なくとも１８時間後に上清に生産されたｍＩＬ−２の量をＥＬＩＳＡによって評価した。データを平均±ＳＥＭとして表す。Ｃ）ＭＣＡ２０５細胞およびエキソソーム上の２５Ｄ１抗体を使用するＳＩＩＮＦＥＫＬの発現のＦＡＣＳ分析。左パネル、破線において染色されていないＭＣＡ２０５細胞、薄い灰色においてＷＴ  ＭＣＡ２０５および白色においてＧｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８構築物を発現するＭＣＡ２０５細胞。右パネル、薄い灰色において染色されていないエキソソーム、暗い灰色においてＭＣＡ２０５細胞から精製されたエキソソームおよび黒色においてＧｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８構築物を発現するＭＣＡ２０５細胞から精製されたエキソソーム。Ｄ）グループの６匹のマウスを、６４μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／２）、３２μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／４）の腫瘍由来ＰＴＰで、または６４μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／２）、３２μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／４）の腫瘍由来ＰＴＰ  プラス  １５μｇのＰＴＰを含む腫瘍由来エキソソームで、またはポジティブコントロールとして８μｇ（ＳＩＩＮ  １／２５）のＣｐＧ＋ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化されたＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープでワクチン接種した。１５日後、マウスに、右脇腹にオボアルブミンを発現する５０．１０３個のＭＣＡ−２０５生存細胞を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について７日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【００７０】
【図５】図５：ＰＴＰ癌ワクチンを改善するためのＣＤ４エピトープの追加。グループの６匹のマウスを、６４μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／２）の腫瘍由来ＰＴＰで、または６４μｇ（ＰＴＰ−ｈｉｓ  Ｘ１／２）の腫瘍由来ＰＴＰ  プラス  １ｍｇの精製されたオボアルブミンで、またはポジティブコントロールとして８μｇ（ＳＩＩＮ  １／２５）のＣｐＧ＋ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化されたＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープでワクチン接種した。１５日後、マウスに、右脇腹にオボアルブミンを発現する５０．１０３個のＭＣＡ−２０５生存細胞および左脇腹に５０．１０３個のＭＣＡ−２０５  ＷＴ生存細胞を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について７日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【００７１】
【図６】図６：オボアルブミンｃＤＮＡおよびβ−グロビン遺伝子のイントロン配列におけるＳＬ８抗原エピトープの異なる位置を示す図。
【００７２】
【図７】図７：黒色腫細胞系からの特異的ＰＴＰ：癌ワクチンのためのペプチドの供給源。グループの６匹のマウスを、３２μｇまたは１６μｇのＰＴＰ−Ｈｉｓで、または８μｇのＳＩＩＮＦＥＫｌエピトープ（ポジティブコントロール）、ＣｐＧ＋Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化されたもの（ネガティブコントロール）でワクチン接種した。１５日後、マウスに、マトリゲルと共に右脇腹にオボアルブミンを発現する３０．１０３個のＢ１６Ｆ１０生存細胞（Ａ）および左脇腹に３０．１０３個のＢ１６Ｆ１０  ＷＴ生存細胞（Ｂ）を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について３−４日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【００７３】
【図８】図８：黒色腫細胞系からのＰＴＰ  プラス  エキソソーム。グループの６匹のマウスを、１６μｇのＰＴＰ−Ｈｉｓで、１５μｇのＢ１６Ｆ１０細胞に由来するエキソソームで、またはＣｐＧ＋Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化された１５μｇ  エキソソームと共にＰＴＰ−Ｈｉｓ１６μｇ（ネガティブコントロール）でワクチン接種した。１５日後、マウスに、マトリゲルと共に右脇腹にオボアルブミンを発現する３０．１０３個のＢ１６Ｆ１０生存細胞（Ａ）および左脇腹に３０．１０３個のＢ１６Ｆ１０  ＷＴ生存細胞（Ｂ）を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について３−４日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【００７４】
【図９】図９：黒色腫細胞系からのＰＴＰ  プラス  メラノソーム。Ａ）ＢＭＤＣを、Ｂ１６Ｆ１０−ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８細胞から精製されたメラノソームによってパルスした。次に、ＢＭＤＣを、１６時間、ＳＬ８−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞ハイブリドーマ（Ｂ３Ｚ）と共培養し、Ｔ細胞活性化をβ−ガラクトシダーゼを測定することにより評価した。ＢおよびＣ）グループの６匹のマウスを、３２μｇのＰＴＰ−Ｈｉｓで、または３０μｇのＣｐＧ＋Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃに乳化されたＢ１６Ｆ１０細胞に由来するメラノソーム（ネガティブコントロール）でワクチン接種した。１５日後、マウスに、マトリゲルと共に右脇腹にオボアルブミンを発現する３０．１０３個のＢ１６Ｆ１０生存細胞（Ｂ）および左脇腹に３０．１０３個のＢ１６Ｆ１０  ＷＴ生存細胞（Ｃ）を皮下接種した。腫瘍増殖は、各腫瘍細胞系について３−４日ごとに測定した。各線は、各グループの６匹のマウスの腫瘍面積（ｍｍ２）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
この出願を通して、種々の文献は、本願発明が関係する最先端を記載している。これらの文献の開示は、出典明示により本願明細書に包含させる。
【００７６】
本願発明の他の特性および利点は、説明のためと見なされ、本願の範囲を限定しない以下の実験セクション（図１から６を基準にして）に挙げられている。
【実施例】
【００７７】
実験部
実施例１−エキソソームと組み合わせてのパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）：新規の癌ワクチン
材料および方法
細胞培養
ＭＣＡ２０５マウス肉腫細胞系を、標準条件下で１％  グルタミン、１％  ピルビン酸、１％  非必須アミノ酸および１０％  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下でＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で５％  ＣＯ２下で３７℃で培養した。Ｂ１６Ｆ１０（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  マウス由来の同系）を、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で５％  ＣＯ２下で３７℃で培養した。
【００７８】
ＭＣＡ２０５およびＢ１６Ｆ１０細胞に、ＰＴＰの精製のために製造業者のプロトコール（Ｏｚｙｍｅ）にしたがってＪｅｔＰｒｉｍｅを使用してＹＦＰ−グロビン−イントロン−ＳＬ８−ｈｉｓプラスミドをトランスフェクトした。腫瘍拒絶実験のために、安定なＭＣＡ２０５−Ｏｖａおよび安定なＢ１６Ｆ１０−Ｏｖａ細胞を調製した。安定なＭＣＡ２０５−Ｏｖａを標準条件下でＲＰＭＩ  １６４０中で培養する。オボアルブミンタンパク質を安定に発現する安定なＢ１６Ｆ１０−Ｏｖａ細胞をＤＭＥＭ標準条件下で培養する。
【００７９】
動物試験
Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスをＨａｒｌａｎから得た。ＯＴ１  Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、ＣＥＲＦＥ（Ｃ．Ｄａｖｉａｕｄ）によって寛大に提供され、Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ動物施設で飼育された。７週Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、右脇腹に皮下に０．１ｘ１０６個のＭＣＡ２０５またはＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を植菌した。ＭＣＡ２０５について、腫瘍が約２０ｍｍ２のサイズに達したとき、マウスに、静脈内に０．１ｘ１０６個のＯＴ１細胞を注入した。Ｂ１６Ｆ１０モデルにおいて、０．２ｘ１０６個のＯＴ１細胞を、腫瘍接種の３日後に静脈内に接種させた。全ての動物実験を、フランスおよびヨーロッパの法律および規制に準拠して実施した。
【００８０】
ＰＴＰ−ｈｉｓ精製
トランスフェクトされたＭＣＡ２０５またはＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を、１０ｍＬの、６Ｍ  グアニジウム−ＨＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５ｍＭ  イミダゾールおよび１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール中で超音波処理した。次に、溶解物をインキュベートし、室温で４時間、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ−アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と共に回転させた。ビーズを、８ｍｌの以下の各バッファーで室温で５分間連続的に洗浄した：６Ｍ  グアニジウム−ＨＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０および１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール；６Ｍ  ウレア、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０および１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール；６Ｍ  ウレア、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；６Ｍ  ウレア、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８および１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール；６Ｍ  ウレア、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。次に、４００ｍＭ  イミダゾール、０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８、３０％  グリセロール、０．７２Ｍ  β−メルカプトエタノールおよび５％  ＳＤＳで室温で２０分間ビーズをインキュベートすることによって、ＰＴＰを溶出した。溶出液を、室温で一晩透析チューブ  ＭＷＣＯ  ０．５ｋＤ（ＶＷＲ）を使用してＰＢＳで透析した。最後に、溶出液を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量した。
【００８１】
全てのＰＴＰ精製
ＭＣＡ２０５腫瘍細胞を溶解し、次に１０ｍＬの、６Ｍ  グアニジウム−ＨＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、５ｍＭ  イミダゾールおよび１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール中で超音波処理した。溶解物を精製し、ポリペプチドを３ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。このカラムを、ＰＴＰの定義である小さなポリペプチドを精製することを可能にする３０００ｇで９０分間遠心分離した。下部を、室温で一晩透析チューブＭＷＣＯ  ０．５ｋＤａ（ＶＷＲ）を使用してＰＢＳで透析した。最後に、溶出液を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量した。
【００８２】
固形腫瘍からのペプチド抽出
固形腫瘍崩壊を、０．２２μｍ  細胞ろ過器で材料を破砕することによって氷上で行った。可溶化を、組織重量の１０倍の１ｘ  ＳＤＳバッファー（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、２％  ドデシル硫酸ナトリウム、１０％  グリセロール、５％  ２−メルカプトエタノール）の添加によって行った。崩壊した組織を７０℃でインキュベートし、１０分間１  ４００ｒｐｍでシャックした(shacked)。次に、固形腫瘍を沈降除去するために、室温で５分間１３  ２００ｇで遠心分離した。Ｄ−ＴｕｂｅＴＭ  Ｄｉａｌｙｚｅｒｓ（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５ｋＤａの分子量カットオフでペプチドを精製および濃縮した。遠心分離を１時間３０分間３  ０００ｇで行った。最後に、ペプチド濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。
【００８３】
ワクチン接種
ＭＣＡ２０５細胞に対するワクチンを、以下のグループにしたがって調製した：ＰＴＰ−Ｈｉｓ  ｘ１（１２８μｇ）、ＰＴＰ−Ｈｉｓ  ｘ１／２（６４μｇ）、ＰＴＰ−Ｈｉｓ  ｘ１／４（３２μｇ）−／＋エキソソーム、エキソソーム（から精製された  ＭＣＡトランスフェクト細胞（１５μｇ））、ＰＴＰ−Ｈｉｓ  ｘ１／２（６４μｇ）−／＋（１ｍｇ／５０μＬ／マウス）オボアルブミンタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、全てのＰＴＰ  ｘ１（１２８μｇ）、全てのＰＴＰ  ｘ１／２（６４μｇ）、全てのＰＴＰ  ｘ１／４（３２μｇ）、ＣｐＧ（２０μｇ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、ＰＢＳ（最大３００μＬ）。ワクチンを注射の２時間前に調製し、氷上に保った。ワクチン接種の前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３％イソフルランで麻酔した。ワクチンを、脚部（１５０μＬ／脚）および足蹠（５０μＬ／足）に皮下に注射した。２週間後、５０＊１０３個のＭＣＡ２０５腫瘍細胞（右脇腹）およびＭＣＡ２０５  ＯＶＡ腫瘍細胞（左脇腹）の皮下注射を与えた。１週間に１回、腫瘍サイズが３００ｍｍ２に達するまで測定した。
【００８４】
Ｂ１６Ｆ１０細胞に対するワクチンを、以下のグループにしたがって調製した：３２μｇまたは１６μｇのＰＴＰ−Ｈｉｓ、エキソソーム（Ｂ１６Ｆ１０トランスフェクト細胞から精製された、１５ｕｇ）、メラノソーム（Ｂ１６Ｆ１０細胞から精製された、３０μｇ）または８μｇのＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープ（ポジティブコントロール）、ＣｐＧ（２０μｇ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。ワクチンを注射の２時間前に調製し、氷上に保った。ワクチン接種の前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３％イソフルランで麻酔した。ワクチンを、脚部（１５０μＬ／脚）および足蹠（５０μＬ／足）に皮下に注射した。２週間後、３０ｘ１０３個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（右脇腹）およびＢ１６Ｆ１０  ＯＶＡ腫瘍細胞（左脇腹）の皮下注射を与えた。１週間に１回、腫瘍サイズが３００ｍｍ２に達するまで測定した。
【００８５】
結果
腫瘍拒絶におけるパイオニア翻訳産物（ＰＴＰ）の役割
過去１０年間で、ＰＴＰおよびＤＲｉＰは、内因性ＭＨＣクラスＩ経路のためのペプチドの主要な供給源であると提案されている。特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞抗腫瘍免疫応答を媒介するＰＴＰの役割を正確に定義するために、発明者らは、個々のＣ５７ＢＬ／６マウスに、異なる構築物を安定に発現するＭＣＡ肉腫モデルおよびＢ１６Ｆ１０黒色腫モデルの２つの異なる腫瘍モデルを接種した（図６参照）。ＭＣＡモデルについて、１０５個の腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下に注射した。次に、腫瘍を約２０ｍｍ２まで増殖させた。この時点で、１０５個のナイーブ卵巣特異的ＴＣＲ−トランスジェニックＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞をマウスに適合移植した。次に、腫瘍増殖をモニターし、２日ごとに記録した。１４日後、発明者らは、ＯＴ−１  Ｔ細胞の適合移植が、Ｇｌｏｂ−イントロンまたはＧｌｏｂ−エキソンの設定においてＳＩＩＮＦＥＫＬ／ＳＬ８エピトープを独立して安定に発現するＭＣＡ腫瘍の発生を妨げることを観察した（図１Ａ、下方および上方パネル）。そして、予期されるとおり、ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の適合移植は、ＳＬ８陰性ＭＣＡ腫瘍の増殖を妨げず（図１Ａ、下方および上方パネル）、腫瘍細胞系によって発現される抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的認識を確認し、抗腫瘍応答を誘導することにおけるＰＴＰの特異的役割を確認した。Ｂ１６Ｆ１０モデルについて、１０５個の腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下に注射した。次に、３日後、１０５個のナイーブ卵巣特異的ＴＣＲ−トランスジェニックＯＴ−１細胞をマウスに適合移植した。ＭＣＡモデルと同様に、ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の適合移植が、一方では、イントロンまたはエキソン配列においてＳＩＩＮＦＥＫＬ／ＳＬ８エピトープを安定に発現するＢ１６Ｆ１０腫瘍の発生を妨げるが（図１Ｂ、下方および上方パネル）、もう一方では、ＳＬ８陰性Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の増殖を妨げず（図１Ｂ、下方および上方パネル）、ＰＴＰが特異的抗腫瘍応答を誘導するという考えを再び支持する。
【００８６】
さらに、ＰＴＰがインビボモデルにおいてクロスプライミングに寄与することができることを最終的に結論付けるために、ＨＥＫ−２９３細胞に種々の構築物をトランスフェクトし、３時間前に、ＣＦＳＥで染色されたナイーブＯＴ−Ｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を受けたＣＤ４５．１コンジェニック(congenic)Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに皮下に注射した。エキソンおよび／またはイントロン配列から発現されたＰＴＰがクロスプライミングに寄与するとき、それらはＣＦＳＥ蛍光の時間とともに減少を見ることが予期され、ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞の増殖を証明した。図１Ｃにおいて見られるとおり、接種の３日後、ＰＴＰは、ＨＥＫ−２９３細胞が空のベクターのみでトランスフェクトされた、および接種と同期間にＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞が急増しなかったネガティブコントロールと比較して、ＣＤ８＋  ＯＴ−Ｉ  Ｔ細胞分裂を誘導した。ＨＥＫ−２９３細胞がヒト起源であるため、それらは、マウスＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞へＰＴＰから直接的に来る、抗原を直接提示することはできない。したがって、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖は、ＰＴＰのクロスプライミングを介してのみ起こることができ、腫瘍拒絶結果を支持する。
【００８７】
これらの結果は、ＰＴＰが、特異的抗原腫瘍拒絶を促進することによってインビボで特異的免疫応答を誘導することができることを証明する。さらに、これらの結果は、ＰＴＰが、内因性経路のための抗原性ペプチドの主要な供給源として使用されることに加えて、ＭＨＣクラスＩ外因性経路のための外因性ペプチドの供給源でもあり得ることを示す。
【００８８】
腫瘍ポリペプチド：癌ワクチンのためのペプチド供給源
並行して、癌ワクチンのための主要な供給源であるとしてＭＨＣクラスＩエピトープを運ぶ（carrying）ポリペプチドの特定の役割を確認するために、発明者らはＷＴ腫瘍細胞系からＰＴＰを精製した。その目的のために、ＭＣＡ２０５  ＷＴ腫瘍細胞系を溶解し、５ｋＤａまたは５ｋＤａより小さい全てのポリペプチド（ＰＴＰの定義）を精製し、発明者らの興味ある構築物に由来するＰＴＰで以前に記載されているように、マウスにおいてワクチンとして使用した。種々のグループの６匹のマウスを、異なる濃度のＰＴＰ、またはアジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）でワクチン接種した。２週間後、５０．１０４個のオボアルブミン構築物を発現する、または発現しないＭＣＡ２０５腫瘍細胞系を、マウスの右脇腹（ＭＣＡ−２０５  Ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８）および左脇腹（ＭＣＡ−２０５  ＷＴ）に皮下に注射した。発明者らのデータは、腫瘍細胞系の核区画から精製された５ｋＤａまたは５ｋＤａより小さいポリペプチドが、腫瘍が発明者らの特異的モデルエピトープを発現するか否かとは無関係に同じ腫瘍の欠損を誘導することができることを示す（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００８９】
並行して、数週間マウスで増殖した固形腫瘍からのポリペプチドを精製した。固形腫瘍を崩壊させ、次に、ＰＴＰを含むポリペプチドを５ｋＤａのカットオフで精製した。精製されたポリペプチドを、これらのポリペプチドが精製されたのと同じ腫瘍細胞系で２週間後に抗原投与されるマウスにおいてワクチンとして使用した。発明者らのデータは、固形腫瘍から精製されたポリペプチドが、腫瘍が発明者らの特異的モデルエピトープを発現するか否かとは無関係に同じ腫瘍の欠損を誘導することができることを示す。
【００９０】
これらの実験は、腫瘍の増殖に対して、種々の長さの腫瘍由来ポリペプチドから構成されるワクチンとして特異的効果を明らかにし、ＰＴＰが特異的抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するためにワクチンとして使用することができるという考えを支持する。
【００９１】
ＰＴＰ：癌ワクチンのためのペプチドの供給源
この試験において、ワクチンとして使用される前に、肉腫ＭＣＡ２０５および黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞系から精製されたＰＴＰを、質量分析により分析し、ワクチンを構成する種々のポリペプチドの性質をより詳細に調べた。表１に示されるとおり、ワクチンは、異なる長さの種々のポリペプチドからなる。
【００９２】
【表１】
2019507171.tif 000002
表１：ＭＣＡ２０５細胞によって生産されるエキソソームに由来するペプチドの質量分析。イントロン配列に由来するＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対応するペプチドが強調されている。
【００９３】
ＳＬ８エピトープは、ナイーブＯｖａ特異的ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞によって細胞表面で認識されるエピトープであり、特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖および腫瘍拒絶を誘導するという影響を与える。
【００９４】
試験の以前の部において、発明者らは、特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の助けでＰＴＰを発現している腫瘍細胞系の腫瘍拒絶を調べていたが、試験のこの部において、発明者らは、それらの腫瘍由来ＰＴＰでワクチン接種されたマウスが、予防様式において、ワクチン接種されなかったマウスと比較したとき、腫瘍増殖において欠損を示すということを証明することを目的とし、ＰＴＰがワクチンとして腫瘍増殖欠損および特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫抗腫瘍応答を誘導することができるという仮説を支持した。
【００９５】
その目的のために、種々のグループの６匹のマウスを、異なる濃度のＰＴＰ、またはアジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）、または同じアジュバントに乳化されたＳＬ８エピトープでワクチン接種した。これらのＰＴＰを、以前にＧｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８−Ｈｉｓ構築物によってトランスフェクトされたマウス腫瘍細胞系から精製した。２週間後、５０．１０４個の精製されたＰＴＰと同一のＰＴＰを発現するトランスフェクトされたＭＣＡ２０５腫瘍細胞系の細胞を、マウスの右脇腹に皮下に注射した。マウスの左脇腹において、５０．１０４個の野生型ＭＣＡ２０５腫瘍細胞を同様に接種させた。発明者らのデータは、ＰＴＰが、ＰＴＰを発現する腫瘍細胞系からの腫瘍増殖の欠損を誘導することができるが、野生型（ＷＴ）腫瘍細胞系からは誘導することができないことを示し（図３Ａおよび３Ｂ）、ＰＴＰワクチンの特異的抗腫瘍効果を証明する。
【００９６】
全てのこれらの実験は、腫瘍増殖に対するＰＴＰの特異的効果を明らかにし、ＰＴＰが、予防および治療様式において、特異的抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するために、マウスにおいてワクチンとして使用することができるという概念を支持する。
【００９７】
ＰＴＰおよびエキソソーム：新規の癌ワクチン
発明者らは、最近、ＰＴＰが、全長タンパク質よりもＭＨＣクラスＩ交差提示経路のためのペプチドのより良い供給源であることを証明している。発明者らは、今回、ＰＴＰが、小胞に保存されたときより良い交差提示を可能にすることを報告している。実際に、ほとんどの細胞によって放出することができる亜細胞画分は、４００ｎｍ未満であるとき、微小胞またはエキソソーム（３０−１００ｎｍ）と呼ばれる。この考えを追跡するために、発明者らは、ＰＴＰ移動が、ドナー細胞から分泌されるエキソソームによって介在され、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）によって内在化されると仮定した。ＭＣＡ２０５細胞系からのエキソソームを以前の報告にしたがって精製した。精製された物質がエキソソームであることを確認するために、ＦＡＣＳ分析を行った。図４Ａは、エキソソームの通常のマーカーである種々の表面タンパク質ＣＤ９およびＣＤ８１の存在を示し、種々の細胞系からの精製された微小胞がエキソソームであったことを確認する。次に、これらのエキソソームをＢＭＤＣ上で直接パルスした。図４Ｂ（左パネル）は、ＭＣＡ２０５腫瘍由来エキソソームを取り込んだＢＭＤＣが、ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞を活性化することができることを示す。エキソソーム精製画分がＫｂ分子を内因的に発現する細胞系であるＭＣＡ腫瘍細胞系由来であったため、発明者らはこの細胞系からのエキソソームがＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞を直接的に活性化することができているかどうかは疑問であった。生成されたＭＣＡエキソソームをＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞上で直接パルスした。エキソソームの添加後にＴ細胞の活性化は見られなかった（図４Ｂ、右パネル）。実際に、発明者らが抗−Ｋｂ抗体を使用するＦＡＣ分析によるＭＨＣクラスＩ  Ｋｂ分子の発現を調べたとき、発明者らは、予期されるとおり、マウス細胞系の細胞表面上でＫｂ分子を検出することができ、同時に、エキソソームの細胞表面でＫｂ分子を検出することができず（図４Ｃ）、ＭＣＡエキソソームがそれ自体によってＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞を活性化することができないという事実を支持した。
【００９８】
よって、ワクチン設計における次の工程は、ＰＴＰベースの癌ワクチンにおいて、ＰＴＰが精製されている同じ腫瘍細胞系のエキソソームを含むことであった。この目的のために、発明者らは、ＭＣＡ−２０５−Ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８から精製されたＰＴＰを同じ腫瘍からのエキソソームと共にアジュバント中で数時間インキュベートした。次に、種々のグループの６匹のマウスを、異なる濃度のＰＴＰで、エキソソーム（１５μｇ）有りまたは無しで、またはアジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）で、または同じアジュバントに乳化されたＳＬ８エピトープ（ポジティブコントロール）でワクチン接種した。発明者らのデータは、腫瘍由来エキソソームと共に腫瘍由来ＰＴＰから構成されるワクチンが、腫瘍由来ＰＴＰのみによって構成されるワクチン（図４Ｄ、正方形の線）よりも、ＰＴＰとしてＳＬ８エピトープを発現する腫瘍細胞系（ＭＣＡ  Ｏｖａ腫瘍細胞）からの腫瘍増殖においてより良い欠損（図４Ｄ、十字の線）を誘導することを示す。
【００９９】
ＰＴＰ癌ワクチンを改善するためのＣＤ４エピトープの追加
上記の結果から、発明者らは、ＰＴＰに組み込まれ、エキソソームにおいて見られるＭＨＣクラスＩペプチドがマウスにおいて特異的な抗腫瘍応答を誘導することを示している。それにもかかわらず、ワクチン接種の、およびとりわけ癌処置において、主な目的は、その再発を回避することである。この再発を回避するためには、長期の免疫を誘導する必要がある。ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、特異的な抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞を開始し、その寿命を延長し、さらに腫瘍部位にプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）の蓄積を誘導することができることが十分に確立されている。この蓄積は、腫瘍によって生産されるＰＴＰが全長タンパク質よりもｐＡＰＣによって提示されるＭＨＣクラスＩ経路のより良い供給源であるため、有益であり得る。これらの理由のために、同じ遺伝子からの全長タンパク質と組み合わせたＰＴＰからなるから構成されるワクチンを使用した。種々のグループの６匹のマウスを、ＰＴＰ単独で、またはタンパク質オボアルブミンと組み合わせて、またはアジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）で、または同じアジュバントに乳化されたＳＬ８エピトープ（ポジティブコントロール）でそれぞれワクチン接種した。発明者らのデータは、全長タンパク質と組み合わせて腫瘍由来ＰＴＰから構成されるワクチンが、腫瘍由来ＰＴＰのみによって構成されるワクチン（図５、正方形の線）よりも、ＰＴＰとしてＳＬ８エピトープを発現する腫瘍細胞系（ＭＣＡ  Ｏｖａ  腫瘍細胞）からの腫瘍増殖のより良い欠損（図５、十字の線）を誘導し、ＷＴ腫瘍細胞系の増殖において効果を見ることができないことを示し、ＰＴＰ全長タンパク質ワクチンの特異的抗腫瘍効果を証明し、形質転換細胞に対するより良い免疫応答のために、ワクチンにおいてＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するペプチドを組み合わせて、より良く長期な抗腫瘍免疫応答を誘導することが好ましいという考えを支持する。
【０１００】
実施例２−黒色腫に対するワクチン
黒色腫に対するＰＴＰベースのワクチン：
発明者らは、実施例１において、ＭＣＡ２０５のような肉腫細胞系から精製されたＰＴＰが、予防様式において特異的抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するためにマウスにおいてワクチンとして使用することができることを示している。ＰＴＰが抗癌ワクチンとして適切であるという考えを拡張する(expend)ために、発明者らは他の型の癌を調べた。この目的のために、発明者らは、マウスＢ１６Ｆ１０細胞系のような黒色腫細胞系からＰＴＰを精製した。次に、種々のグループの６匹のマウスを、異なる濃度のＰＴＰで、アジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）で、または同じアジュバントに乳化されたＳＬ８エピトープ（ポジティブコントロール）でワクチン接種した。これらのＰＴＰを、発明者らのＧｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８−Ｈｉｓ構築物で以前にトランスフェクトされたマウスＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞系から精製した。２週間後、５０．１０４個の精製されたＰＴＰと同一のＰＴＰを発現するトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞系からの細胞を、マウスの右脇腹に皮下に注射した。マウスの左脇腹において、５０．１０４個の野生型Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を同様に接種させた。
【０１０１】
発明者らのデータは、ＰＴＰが、ＰＴＰを発現する黒色腫腫瘍細胞系からの腫瘍増殖の欠損を誘導することができるが、野生型（ＷＴ）黒色腫腫瘍細胞系からでは誘導しないことを示し、ＰＴＰワクチンの特異的抗腫瘍効果を証明する（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１０２】
全てのこれらの実験は、あらゆる腫瘍増殖サブタイプに対するＰＴＰの特異的効果を明らかにし、ＰＴＰが、予防および治療戦略において、特異的抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘発するために、マウスにおいてワクチンとして使用することができるという考えを支持する。
【０１０３】
黒色腫に対するＰＴＰ−エキソソームベースのワクチン：
発明者らは、以前に、腫瘍由来エキソソームがＰＴＰを含むこと、およびこれらのエキソソームが、腫瘍細胞系から精製されたＰＴＰそれら自体と関連しており、癌ワクチンとして使用することができることを報告している。Ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８構築物を発現するＢ１６Ｆ１０細胞系からのエキソソームを、以前の報告にしたがって精製した。本願発明者らは、アジュバント中で数時間、Ｂ１６Ｆ１０−Ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８からの精製されたＰＴＰを同じ腫瘍からのエキソソームとインキュベートした。種々のグループの６匹のマウスを、異なる濃度のＰＴＰで、またはエキソソーム（１５μｇ）有りまたは無しで、またはアジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）で、または同じアジュバントに乳化されたＳＬ８エピトープ（ポジティブコントロール）でワクチン接種した。発明者らのデータは、腫瘍由来エキソソームと共に腫瘍由来ＰＴＰから構成されるワクチンが、腫瘍由来エキソソームのみによって構成されるワクチン（図８Ａ、黒丸の線）よりも、ＰＴＰとしてＳＬ８エピトープを発現する腫瘍細胞系（Ｂ１６Ｆ１０  Ｏｖａ  腫瘍細胞）からの腫瘍増殖のより良い欠損（図８Ａ、正方形の線）を誘導することを示す。これらの結果から、ＰＴＰを含む黒色腫細胞系からの腫瘍由来エキソソームが、発明者らがＭＣＡ２０５由来のエキソソームで見られたものと比較して、弱い特異的免疫応答を刺激している。実際には、腫瘍由来ＰＴＰおよび腫瘍由来エキソソームの組合せが、この効果が完全な腫瘍拒絶を誘導するには不十分であっても、腫瘍増殖欠損を誘導することにおいてより強力である。発明者らのデータは、また、黒色腫細胞系から精製されたＰＴＰおよびエキソソームの組合せが、ＰＴＰを発現する腫瘍細胞系からの腫瘍増殖における弱い欠損を誘導することができるが、野生型（ＷＴ）腫瘍細胞系からの腫瘍増殖において誘導しないことを示し（図８Ａおよび８Ｂを比較する）、ＰＴＰ−エキソソームベースのワクチンの特異的抗腫瘍効果を証明する。
【０１０４】
黒色腫に対するＰＴＰ−メラノソームベースのワクチン：
黒色腫細胞系からのエキソソームが腫瘍増殖において弱い欠損を誘導するため、本願発明者らは、黒色腫細胞系によって放出された別の小胞が、腫瘍増殖に対して肉腫エキソソームと同じ効果を有することができると仮説を立てる。黒色腫細胞系は、エキソソームだけでなくメラノソームもまた分泌する能力を有する。実際に、メラニン細胞は、メラノソームと呼ばれるオルガネラにおいて貯蔵されるメラニン色素の生産に特化している（Raposo and Marks, 2007）。メラノソームは、組織特異的リソソーム関連オルガネラであり（Raposo and Marks, 2007）、形態および色素沈着レベルに基づく２つの主要な成熟段階に分類される（Watabe, Kushimoto et al., 2005）。未成熟（段階ＩおよびＩＩ）メラノソームは色素を欠き、中心の細胞質に位置する。これらは「成熟前メラノソーム」と呼ばれる。成熟した、重度に着色したメラノソーム（段階ＩＩＩおよびＩＶ）または「成熟メラノソーム」は、分泌の主な部位である遠位樹状突起で優勢である。
【０１０５】
発明者らが肉腫エキソソームから報告しているとおり、ＰＴＰ移動が、黒色腫ドナー細胞から分泌されるメラノソームによって介在され、骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）によって内在化されることができるという考えを追跡するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞系から分泌されたメラノソームを以前のレポートにしたがって精製した。次に、これらのメラノソームをＢＭＤＣ上で直接パルスした。図９Ａは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍由来メラノソームを取り込んでいるＢＭＤＣが、細胞表面でＭＨＣクラスＩ  Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体を認識することが特異的であるＢ３Ｚハイブリドーマ細胞系を活性化することができることを示す。発明者らは、次に、発明者らこれらの分泌されたメラノソーム内の対応するＰＴＰを検出することができるかどうかを試験した。この目的のために、発明者らは、６ｘＨｉｓ−ｔａｇがイントロンにおいてＳＬ８エピトープの隣に挿入されたＢ１６Ｆ１０細胞において構築物を発現させた。次に、発明者らは、ニッケルアガロースビーズを使用して精製および超音波処理された分泌型ステージＩＶメラノソームからのＰＴＰを富化し、これらの画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析に付した。表２は、ＳＬ８エピトープを運ぶ（carrying）、または運ばない種々のペプチドフラグメントを示す。ＭＳ分析によって検出されるのに十分な濃度のイントロン由来ＰＴＰを得るためには、濃縮ステップが必要であることを指摘する価値がある。これは、内因性経路のための優れた基質であるにもかかわらず、ＰＴＰはまれな生成物であることを示す以前の観察と一致する。
【０１０６】
【表２】
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表２：Ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８構築物によりトランスフェクトされるＢ１６Ｆ１０細胞によって生産されるメラノソームに由来するペプチドの質量分析。イントロン配列に由来するＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対応するペプチドが強調されている。
【０１０７】
さらに、本願発明者らは、本願明細書に上記のＰＴＰに基づく癌ワクチンにおいて、Ｂ１６Ｆ１０メラニン細胞からの精製された分泌された段階ＩＶメラノソームを含んだ。その目的のために、種々のグループの６匹のマウスを、３０μｇの分泌された段階ＩＶメラノソームで、１６μｇのＢ１６Ｆ１０−Ｇｌｏｂ−イントロン−ＳＬ８から精製されたＰＴＰで、およびアジュバントそれ自体（ネガティブコントロール）で、それぞれワクチン接種した。
【０１０８】
発明者らのデータは、段階ＩＶの腫瘍由来メラノソームから構成されるワクチンが、腫瘍由来ＰＴＰのみによって構成されるワクチンよりも、ＰＴＰとしてＳＬ８エピトープを発現する腫瘍細胞系（Ｂ１６Ｆ１０  Ｏｖａ  腫瘍細胞）からの腫瘍増殖のより良い欠損を誘導することを示す（図９Ｂ）。発明者らのデータは、また、メラノソームが、ＰＴＰを発現する腫瘍細胞系からの腫瘍増殖における欠損を誘導することができるが、野生型（ＷＴ）腫瘍細胞系からの腫瘍増殖において誘導しないことを示し（図９Ｂおよび９Ｃを比較する）、ＰＴＰを含むメラノソームベースのワクチンの特異的抗腫瘍効果を証明する。
【０１０９】
議論
ワクチンの主な目的が、形質転換細胞が宿主免疫系を逃れる機会を低減することであるとき、発明者らは、この試験において、ｉ）全長タンパク質を生じさせる規範的な事象と異なる翻訳事象によって早期に生産されるポリペプチド（ＰＴＰ）を、特異的なおよび強力な癌ワクチンとして、使用することができること、ｉｉ）このようなポリペプチドおよび同様のポリペプチドを運ぶ（carrying）エキソソームの組合せが、形質転換細胞に対する広範なＴ細胞レパートリーを引き起こすために、癌ワクチンとして、さらに強力な組合せであることができること、およびｉｉｉ）長期免疫応答のために、ＣＤ８およびＣＤ４  ＰＴＰの組合せが必要とされることを証明している。
【０１１０】
ＭＡＧＥ−１タンパク質に由来するクラスＩ結合合成エピトープは、臨床試験において単一ペプチドベースのワクチンとして既に試験されている。次に、異なる癌に対する他の短いペプチドがその後使用されている。それにもかかわらず、全てのこれらの試験において、ワクチンとして単一の合成エピトープを使用して、黒色腫患者において有益な臨床反応を見ることができなかったため、期待された結果は期待されたほど良好ではなかった。これらの結果は、特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化することができるｐＡＰＣだけでなく多数のタイプの細胞に短いペプチドが直接結合することができるという事実によって説明することができる。短いペプチドが非プロフェッショナル細胞へのＭＨＣクラスＩ分子に結合するときはさらに悪化し、寛容性の免疫応答を誘導する可能性がある。また、これらのペプチドが短鎖であるため、それらは何らかの三次構造を有するかもしれないが、迅速な分解に付される。全てのこれらの理由のために、発明者らのＰＴＰに基づく癌ワクチンは、短いペプチドを使用することよりも、より良い戦略であると思われる。種々の理由は、ｉ）発明者らのＰＴＰが、種々の長さのペプチド、６アミノ酸より長い、好ましくは少なくとも７または８のアミノ酸から構成されることが示されている、ｉｉ）それらが、外因性ＭＨＣクラスＩ経路だけでなく内因性についてもペプチドの主要な供給源であることが示されている、ｉｉｉ）それらが、ｐＡＰＣによって取り込まれ、適切に処理されＭＨＣクラスＩ経路に到達し、細胞表面に提示されることを必要とする、ｉｖ）それらが、ＭＨＣクラスＩＩエピトープだけでなくＭＨＣクラスＩエピトープから構成することができる、ことである。この最後の理由は、ワクチンの主な目的が癌に対する長期免疫応答を誘導することであるとき、非常に重要である。実際には、発明者らは、あらゆる型の癌の再発を回避するために癌ワクチンを設計している。それらのワクチンは、ＰＴＰおよびエキソソームが既に癌を発症している患者から精製されることを必要とする治療用ワクチンである。発明者のワクチンの目標は、完全な腫瘍拒絶を有し、再発はしないことである。これらの目的のために、それらのワクチンは、細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化に基づく迅速な免疫応答を誘導する必要があるが、長期応答について、ワクチンはまたメモリー応答を誘導することも必要とする。その特定の場合、メモリー応答はＣＤ４＋  Ｔ細胞の役割に基づくであろう。事実、発明者らがＷＴ腫瘍細胞系からＰＴＰを精製したとき（図２Ａ）、発明者らは、ただ１つのＭＨＣクラスＩエピトープが使用される操作されたモデル構築物から特異的に来るＰＴＰのみを使用したときよりも、腫瘍増殖のより良い阻害を観察する（図３Ａ）。説明は、ＷＴ腫瘍細胞系から精製されたＰＴＰにおいて、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むポリペプチドだけでなくＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むポリペプチドも精製されると考えていることである。この観察は、操作された構築物から精製されたＰＴＰと全長オボアルブミンを混合したとき、この混合されたワクチンの効果は、ＰＴＰそれ自体のみが使用されたときよりもはるかに強力である（図５）という事実によって支持される。ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびｐＡＰＣ間のＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞の維持のために重要であることが示されており、これは再びワクチン接種の成功におけるｐＡＰＣの重要かつ特異的な役割を実証する。
【０１１１】
一連の報告によると、腫瘍由来エキソソームは、種々の経路に作用することによって、例えばＤＣの分化を阻害することによって、またはＮＫ細胞を負に調節することによって、腫瘍免疫回避を誘導する免疫抑制因子であることが見いだされたが、特異的腫瘍免疫応答を誘導することによって免疫刺激効果を有することも報告された。それらは、通常、腫瘍抗原を含むことが示されており、したがって癌ワクチンのための腫瘍抗原の新規な供給源として使用されている。発明者らの結果から、ＰＴＰを含む腫瘍エキソソームは、特異的免疫応答を刺激している。事実、腫瘍由来ＰＴＰおよび腫瘍由来エキソソームの組合せは、腫瘍由来ＰＴＰそれ自体よりも、拒絶の誘導においてより強力である（図４）。この結果は、発明者らがエキソソーム内で操作された構築物から生産されたＰＴＰを精製することに成功したこと、およびエキソソームがまた腫瘍それ自体に由来するＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むことができるという事実によって説明することができる。
【０１１２】
一連の報告によると、メラノソームは、メラニン細胞からケラチン生成細胞に移動することができる。事実、一連の研究は、例えば、メラノソームがメラニン細胞から隣接するケラチン生成細胞へのメラニンの移動に関与する小胞であると報告している。しかし、発明者らにとってより重要なことには、黒色腫細胞は、分泌されたメラノソームの助けを借りて細胞間移動によってＭＨＣクラスＩＩ抗原を獲得することができることも最近示されている。ここで、発明者らは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープだけでなく、ＭＨＣクラスＩエピトープも移動することができることを報告している。事実、発明者らは、分泌されたメラノソームが特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化の結果のために黒色腫細胞系からＢＭＤＣに移動することができることを見いだした。さらに、発明者らはまた、メラノソームが黒色腫癌ワクチンの基礎であることができることも報告している。発明者らは、黒色腫細胞系で植菌されているマウスにおいて注射されたメラノソームが、重要な腫瘍増殖欠損を誘導することができることを示し、メラノソームと組み合わせてのＰＴＰが適切な黒色腫癌ワクチンとして使用することができるという考えを支持した。適切な腫瘍免疫応答が特異的ＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞の補充および活性化に依存すること、およびＣＤ４＋  Ｔ細胞がこれらのプロセスに必要であるという事実、および適切な抗ＣＤ８腫瘍免疫応答が抗腫瘍ＣＤ４＋  Ｔ細胞の非存在下で確立された長期Ｔ細胞メモリーをしないという事実を考慮すると、これらの結果は、分泌されたメラノソームがＭＨＣクラスＩＩを含むがＭＨＣクラスＩエピトープも含む、ＰＴＰベースの黒色腫癌ワクチンにおけるメラノソームの使用の重要性を示す。
【０１１３】
文献
【表３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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