(57)【要約】本出願は、配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ（fructose-6-phosphate-3-epimerase）、前記フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼをコードする核酸、及び前記核酸を含む形質転換体に関する。また、本出願は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを含むアルロース（allulose）生産用組成物、及び本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを用いたアルロース製造方法に関する。【選択図】なし
2019522477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ（fructose-6-phosphate-3-epimerase）。
【請求項２】
請求項１に記載のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼをコードする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む形質転換体。
【請求項４】
請求項１に記載のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むアルロース（allulose）生産用組成物。
【請求項５】
前記組成物は、アルロース−６−リン酸ホスファターゼ（allulose-6-phosphate phosphatase）、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物をさらに含む、請求項４に記載のアルロース生産用組成物。
【請求項６】
前記アルロース生産用組成物は、
（ａ）（ｉ）デンプン、マルトデキストリン、スクロースもしくはその組み合わせ、（ｉｉ）ホスフェート（phosphate）、（ｉｉｉ）アルロース−６−リン酸ホスファターゼ、（ｉｖ）グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、（ｖ）ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及び（ｖｉ）α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は
（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物をさらに含む、請求項４に記載のアルロース生産用組成物。
【請求項７】
フルクトース−６−リン酸（fructose-6-phosphate）に配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、フルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸（allulose-6-phosphate）に変換するステップを含むアルロース製造方法。
【請求項８】
前記方法は、前記フルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸に変換するステップの後に、アルロース−６−リン酸にアルロース−６−リン酸ホスファターゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記アルロース−６−リン酸をアルロースに変換するステップをさらに含む、請求項７に記載のアルロース製造方法。
【請求項９】
前記方法は、前記フルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−６−リン酸（glucose-6-phosphate）にグルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項７に記載のアルロース製造方法。
【請求項１０】
前記方法は、前記グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−１−リン酸（glucose-1-phosphate）にホスホグルコムターゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項９に記載のアルロース製造方法。
【請求項１１】
前記方法は、前記グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース（glucose）にグルコキナーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項９に記載のアルロース製造方法。
【請求項１２】
前記方法は、前記グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコース−１−リン酸に変換するステップをさらに含む、請求項１０に記載のアルロース製造方法。
【請求項１３】
前記方法は、前記グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼもしくはイソアミラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコースに変換するステップをさらに含む、請求項１１に記載のアルロース製造方法。
【請求項１４】
前記接触は、ｐＨ５．０〜１０．０で、温度５０℃〜９０℃で、及び／又は１分〜２４時間行う、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のアルロース製造方法。
【請求項１５】
デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせ、及びホスフェートに、（ａ）アルロース−６−リン酸ホスファターゼ、配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及びα−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物を接触させるステップを含むアルロース製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ及びそれを用いたアルロース製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プシコース−３−エピメラーゼ（D-psicose-3-epimerase, EC 5.1.3.30）及びタガトース−３−エピメラーゼ（D-tagatose-3-epimerase, EC 5.1.3.31）は、フルクトース（D-fructose）を３−エピマー化（3-epimerization, ３位の炭素のエピマー化）することによりアルロースを生産する酵素として知られている。前記酵素を用いて単一酵素反応によりフルクトースからアルロースを生産する場合、基質であるフルクトースと産物であるアルロース間に一定レベルの反応平衡（reaction equilibrium）が存在する（産物／基質＝約２０％〜３５％）。よって、前記単一酵素反応を用いて高純度のアルロースを製造する場合、反応結果物から高濃度のフルクトースを分離して除去する追加精製工程が必要である。
【０００３】
一方、Ｃｈａｎら（非特許文献１）は、フルクトース−６−リン酸（D-fructose-6-phosphate）及びアルロース−６−リン酸（D-allulose-6-phosphate）に対して３−エピマー化反応を行うことができるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のリブロース−５−リン酸−３−エピメラーゼ（D-ribulose-5-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.1）及びＥ．ｃｏｌｉ由来のアルロース−６−リン酸−３−エピメラーゼ（D-allulose 6-phosphate-3-epimerase, EC 5.1.3.-）を報告しているが、前記酵素は耐熱性を有さないので産業的に用いることができないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chan, 2008. Biochemistry. 47: 9608-9617
【非特許文献２】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献３】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献４】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51
【非特許文献５】Sambrook et al., supra, 11.7-11.8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、経済的かつ産業的にアルロースへの変換率を高める方法を開発すべく鋭意努力した。その結果、経済的原料であるスクロース、デンプン又はマルトデキストリンからグルコース（glucose）又はグルコース−１−リン酸（glucose-1-phosphate）、グルコース−６−リン酸（glucose-6-phosphate）及びフルクトース−６−リン酸への変換を経てアルロース−６−リン酸を生産すると、その後、不可逆反応経路を行うアルロース−６−リン酸ホスファターゼ（allulose-6-phosphate phosphatase）を用いてアルロースを生産することができ、アルロース生産経路に関与する複数の酵素を同時に使用する同時酵素反応（one-pot enzymatic conversions）によりアルロースを生産することができ、アルロースへの変換率を著しく向上させられることに着目し、前記フルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸に変換する経路に適用できる新規な耐熱性酵素を見出し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ（fructose-6-phosphate-3-epimerase）を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本出願は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼをコードする核酸を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本出願は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼをコードする核酸を含む形質転換体を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本出願は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むアルロース（allulose）生産用組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本出願は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを用いたアルロース製造方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１１】
本出願の耐熱性フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼは、耐熱性があるので、フルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸に変換する経路を産業的に行うことができ、経済的な原料を用いてアルロース合成経路を行うことができ、不可逆反応経路であるアルロース−６−リン酸の脱リン酸化反応によりアルロース生産を可能にし、アルロースへの変換率を著しく向上させることができる。
【００１２】
また、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを用いたアルロース製造方法は、アルロースへの変換率の上昇により反応結果物が高濃度のアルロースを含み、分離精製工程を単純化又は省略することができるので、製造方法が簡単かつ経済的であるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】デンプン（例えば、マルトデキストリン）、スクロース又はグルコースからアルロースを製造する反応経路を示す図である。
【図２】本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ（Ｅ：ＦＰ３Ｅ）の分子量をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した結果を示す図である。Ｍはタンパク質のサイズマーカー（size marker）である。
【図３】本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼのフルクトース−６−リン酸からアルロース−６−リン酸への変換活性を示す図である。
【図４】本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼの緩衝液及びｐＨによる活性の変化を示す図である。
【図５】本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼの温度による活性の変化を示す図である。
【図６】本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼの金属イオン添加による活性の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本出願について具体的に説明する。一方、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【００１５】
本出願の目的を達成するために、本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ（fructose-6-phosphate-3-epimerase）を提供する。
【００１６】
また、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼには、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有するポリペプチドが含まれてもよい。例えば、このような相同性を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
【００１７】
さらに、本出願の配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼに対応する活性を有するタンパク質であれば、配列番号１のアミノ酸配列の前後の無意味な配列追加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質も本出願に含まれる。
【００１８】
さらに、これらに限定されるものではないが、前記フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼは、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよく、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％又は９９％の相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであってもよい。コドンの縮退（codon degeneracy）により配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれと相同性を有するタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドも本出願に含まれることは言うまでもない。
【００１９】
前記「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列に一致する程度を意味し、百分率で表すことができる。本出願において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％相同性」で表される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献２、３）で決定される。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。例えば、このような条件は非特許文献２に具体的に記載されている。
【００２０】
本出願における前記ストリンジェントな条件は、相同性を確認するために調節されてもよい。ポリヌクレオチド間の相同性を確認するために、５５℃のＴｍ値に対応する、低ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件が用いられてもよい。例えば、５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク及び無ホルムアミド、又は３０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳの条件が用いられてもよい。温和なストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は高いＴｍ値に対応し、例えば５Ｘ又は６ＸＳＳＣを有する４０％ホルムアミドが用いられてもよい。高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は最も高いＴｍ値に対応し、例えば５０％ホルムアミド、５Ｘ又は６ＸＳＳＣ条件が用いられてもよい。しかし、前記例に限定されるものではない。
【００２１】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられる。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似した核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【００２２】
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。
【００２３】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きいほど、その配列を有するポリヌクレオチドのハイブリッドに対するＴｍ値はさらに大きくなる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍ値に対応する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に減少する。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドにおいて、Ｔｍ値の計算式は公知である（非特許文献４参照）。より短いポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて、ミスマッチ位置はより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定することがある（非特許文献５参照）。
【００２４】
具体的には、ポリヌクレオチドは、５００ｍＭ塩より低く、少なくとも３７℃のハイブリダイゼーションステップ、及び少なくとも６３℃の２ＸＳＳＰＥにおける洗浄ステップを含むハイブリダイゼーション条件を用いて検知することができる。前記ハイブリダイゼーション条件は、２００ｍＭ塩より低く、少なくとも３７℃のハイブリダイゼーションステップを含んでもよい。あるいは、前記ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄ステップの両方において、６３℃及び２ＸＳＳＰＥを含んでもよい。
【００２５】
ハイブリダイゼーション核酸の長さは、例えば少なくとも約１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチドであってもよい。また、当業者であれば、温度及び洗浄溶液の塩濃度をプローブの長さなどの要素により必要に応じて調節することができる。
【００２６】
本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼは、サーモトガ（Thermotoga）属由来の酵素であってもよく、具体的にはサーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）由来の酵素であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本出願の他の態様は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼをコードする核酸を提供する。
【００２８】
本出願のさらに他の態様は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼをコードする核酸を含む形質転換体を提供する。
【００２９】
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記核酸がコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換された核酸は、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、それら全てを含んでもよい。また、前記核酸は、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記核酸は、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記核酸は、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。通常、前記発現カセットは、前記核酸に作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記核酸は、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３０】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的タンパク質をコードする核酸の転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【００３１】
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
前記宿主細胞としては、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主を用いることが好ましく、例えば大腸菌を用いてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本出願のさらに他の態様は、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを発現する微生物、又は本出願のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを発現する微生物の培養物を含むアルロース生産用組成物を提供する。
【００３４】
本出願のアルロース生産用組成物は、本出願のアルロース製造経路（図１参照）に関与する酵素、本出願のアルロース製造経路に関与する酵素を発現する微生物、又は本出願のアルロース製造経路に関与する酵素を発現する微生物の培養物をさらに含んでもよい。しかし、これらは例示的なものであり、本出願のフルクトース−６−リン酸−エピメラーゼを用いてアルロースを生産できるものであれば、本出願のアルロース生産用組成物に含まれる酵素やアルロース生産に用いられる基質は限定されない。
【００３５】
本出願のアルロース生産用組成物は、アルロース−６−リン酸ホスファターゼ（allulose-6-phosphate phosphatase）、前記アルロース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物、又は前記アルロース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物の培養物をさらに含んでもよい。
【００３６】
また、本出願のアルロース生産用組成物は、（ａ）（ｉ）デンプン、マルトデキストリン、スクロースもしくはその組み合わせ、グルコース、グルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸又はフルクトース−６−リン酸、（ｉｉ）ホスフェート（phosphate）、（ｉｉｉ）アルロース−６−リン酸ホスファターゼ、（ｉｖ）グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、（ｖ）ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及び／又は（ｖｉ）α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物、もしくは前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物の培養物をさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
具体的には、本出願のデンプン／マルトデキストリンホスホリラーゼ（starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1）及びα−グルカンホスホリラーゼは、ホスフェート（phosphate）をグルコースにリン酸化転移させてデンプン又はマルトデキストリンからグルコース−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のスクロースホスホリラーゼ（sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7）は、ホスフェートをグルコースにリン酸化転移させてスクロースからグルコース−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のデンプン液化酵素であるα−アミラーゼ（α-amylase, EC 3.2.1.1）、プルラナーゼ（pullulanase, EC 3.2.1.41）、グルコアミラーゼ（glucoamylase, EC 3.2.1.3）及びイソアミラーゼ（isoamylase）は、デンプン又はマルトデキストリンをグルコースに変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のスクラーゼ（sucrase, EC 3.2.1.26）は、スクロースをグルコースに変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のホスホグルコムターゼ（phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2）は、グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。グルコキナーゼ（glucokinase）は、グルコースにリン酸を転移させてグルコース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。具体的には、前記グルコキナーゼは、ポリリン酸依存性グルコキナーゼであってもよく、より具体的には、アミノ酸配列番号５及び塩基配列番号７のＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼ、又はアミノ酸配列番号６及び塩基配列番号８のＡｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ由来のポリリン酸依存性グルコキナーゼであってもよい。本出願のグルコース−６−リン酸−イソメラーゼは、グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。本出願のアルロース−６−リン酸ホスファターゼは、アルロース−６−リン酸をアルロースに変換する活性を有するタンパク質であれば、いかなるタンパク質であってもよい。より具体的には、前記アルロース−６−リン酸ホスファターゼは、不可逆的にアルロース−６−リン酸をアルロースに変換する活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３８】
本出願のさらに他の態様は、フルクトース−６−リン酸（fructose-6-phosphate）に配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、前記フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを発現する微生物、又は前記フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、フルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸（allulose-6-phosphate）に変換するステップを含むアルロース製造方法を提供する。
【００３９】
本出願の製造方法は、本出願のフルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸に変換するステップの後に、アルロース−６−リン酸（allulose-6-phosphate）にアルロース−６−リン酸ホスファターゼ、前記アルロース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物、又は前記アルロース−６−リン酸ホスファターゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記アルロース−６−リン酸をアルロースに変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４０】
また、本出願の製造方法は、本出願のフルクトース−６−リン酸をアルロース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−６−リン酸（Glucose-6-phosphate）にグルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、前記グルコース−６−リン酸−イソメラーゼを発現する微生物、又は前記グルコース−６−リン酸−イソメラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４１】
さらに、本出願の製造方法は、本出願のグルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース−１−リン酸（Glucose-1-phosphate）にホスホグルコムターゼ、前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物、又は前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４２】
さらに、本出願の製造方法は、本出願のグルコース−６−リン酸をフルクトース−６−リン酸に変換するステップの前に、グルコース（Glucose）にグルコキナーゼ、前記グルコキナーゼを発現する微生物、又は前記グルコキナーゼを発現する微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記グルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４３】
さらに、本出願の製造方法は、本出願のグルコース−１−リン酸をグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼもしくはスクロースホスホリラーゼ、前記ホスホリラーゼを発現する微生物、又は前記ホスホリラーゼを発現する微生物の培養物、及びホスフェートを接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコース−１−リン酸に変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４４】
さらに、本出願の製造方法は、本出願のグルコースをグルコース−６−リン酸に変換するステップの前に、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼもしくはイソアミラーゼ、前記アミラーゼ、プルラナーゼもしくはスクラーゼを発現する微生物、又は前記アミラーゼ、プルラナーゼもしくはスクラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせをグルコースに変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４５】
本出願の製造方法は、グルコースに４−α−グルカノトランスフェラーゼ、前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを発現する微生物、又は前記４−α−グルカノトランスフェラーゼを発現する微生物の培養物を接触させることにより、前記グルコースをデンプン、マルトデキストリン又はスクロースに変換するステップをさらに含んでもよい。
【００４６】
本出願の製造方法において、本出願の「接触」は、ｐＨ５．０〜１０．０で、５０℃〜９０℃で、及び／又は１分〜２４時間行うことができる。具体的には、本出願の接触は、ｐＨ５．０〜９．０、ｐＨ５．０〜８．０、ｐＨ５．０〜７．０、ｐＨ５．０〜６．０、ｐＨ６．０〜１０．０、ｐＨ６．０〜９．０、ｐＨ６．０〜８．０、ｐＨ６．０〜７．０、ｐＨ７．０〜１０．０、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．０、ｐＨ８．０〜１０．０、ｐＨ８．０〜９．０、又はｐＨ９．０〜１０．０で行うことができる。また、本出願の接触は、５５℃〜９０℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜７５℃、６５℃〜７５℃、又は６０℃〜７０℃で行うことができる。さらに、本出願の接触は、１分〜１２時間、１分〜６時間、１分〜３時間、１分〜１時間、５分〜２４時間、５分〜１２時間、５分〜６時間、５分〜３時間、５分〜１時間、１０分〜２４時間、１０分〜１２時間、１０分〜６時間、１０分〜３時間、又は１０分〜１時間行うことができる。
【００４７】
本出願のさらに他の態様は、デンプン、マルトデキストリン、スクロース又はその組み合わせ、及びホスフェートに、（ａ）アルロース−６−リン酸ホスファターゼ、配列番号１のアミノ酸配列からなるフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼ、グルコース−６−リン酸−イソメラーゼ、ホスホグルコムターゼもしくはグルコキナーゼ、及びα−グルカンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼもしくはスクラーゼ、又は（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物、もしくは前記微生物の培養物を接触させるステップを含むアルロース製造方法を提供する。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
[実施例１]
フルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼの遺伝子を含む組換え発現ベクター及び形質転換微生物の作製
新規な耐熱性のフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼを見出すために、好熱性微生物であるサーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）から遺伝子を分離し、組換え発現ベクター及び形質転換微生物を作製した。
【００５０】
具体的には、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているサーモトガ・ネアポリタナ遺伝子配列を対象にフルクトース−６−リン酸−３−エピメラーゼと予想される遺伝子ｆｐ３ｅを選択し、そのアミノ酸配列（配列番号１）及び塩基配列（配列番号２）情報に基づいて正方向プライマー（配列番号３）及び逆方向プライマー（配列番号４）を設計して合成した。前記合成したプライマーを用いて、サーモトガ・ネアポリタナ染色体ＤＮＡ（genomic DNA）を鋳型とし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び６８℃で２分間の重合で行い、前記反応を２５回繰り返した。制限酵素Ｎｄｅ及びＸｈｏを用いて、大腸菌発現用プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（Novagen社）に挿入し、ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅと命名した組換え発現ベクターを作製した。ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅを通常の形質転換方法（参照：Sambrook et al. 1989）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換し、配列番号２の塩基配列を含む組換えベクターで形質転換された微生物を作製し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅと命名した。
【００５１】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅ菌株をブダペスト条約に基づいて２０１６年６月２３日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託番号ＫＣＣＭ１１８４８Ｐとして寄託した。
【００５２】
[実施例２]
組換え酵素の作製
組換え酵素（以下、ＦＰ３Ｅ）を作製するために、ＬＢ液体培地５ｍｌを含む培養チューブにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅを接種し、６００ｎｍでの吸光度が２．０になるまで３７℃の振盪培養器で種菌培養を行った。その後、ＬＢ液体培地を含む培養フラスコに種菌培養を行った培養液を接種して本培養を行った。その後、６００ｎｍでの吸光度が２．０になったら、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加してＦＰ３Ｅの発現産生を誘導した。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度２００ｒｐｍ、温度３７℃で行った。培養終了後、培養液を８，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液で２回洗浄し、同じ緩衝液に懸濁して超音波細胞破砕機で細胞を破砕した。細胞破砕物を１３，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して上清のみ回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを用いて前記上清からＦＰ３Ｅを精製した。精製した組換え酵素液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液で透析して酵素の特性分析に用いた。
【００５３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分子量を確認した結果、前記精製したＦＰ３Ｅの分子量は約２５ｋＤａであった（図２にＥで示す）。
【００５４】
[実施例３]
ＦＰ３Ｅの活性確認
ＦＰ３Ｅのフルクトース−６−リン酸からアルロース−６−リン酸への変換活性の分析のために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に５０ｍＭフルクトース−６−リン酸を懸濁し、それに０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製したＦＰ３Ｅを添加して７０℃で１時間反応させた。
【００５５】
この時点ではアルロース−６−リン酸標準物質が存在しないのでアルロース−６−リン酸を生成するか否かを測定できないため、アルロース−６−リン酸ホスファターゼ（alullose-6-phosphate phosphatase）であるフィターゼ（phytase）を用いてアルロース−６−リン酸をアルロースに変換し、その後アルロースを生成するか否かにより前記変換活性を測定した。具体的には、前記反応の終了後に、１０ｕｎｉｔ／ｍｌのフィターゼを添加して３７℃で１時間反応させ、基質であるフルクトース−６−リン酸と産物であるアルロース−６−リン酸を全て脱リン酸化した。その後、フルクトース及びアルロースをＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃ（Bio-rad社）カラムを用いて、８０℃で移動相として０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流して行い、フルクトース及びアルロースをＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで検出した。
【００５６】
その結果、ＦＰ３Ｅの反応結果物からフルクトース及びアルロースが検出されたので（図３）、ＦＰ３Ｅはフルクトース−６−リン酸を３−エピマー化してアルロース−６−リン酸を生成する活性を有することが確認された（図３）。
【００５７】
[実施例４]
ｐＨ、温度、金属イオン添加によるＦＰ３Ｅの活性確認
４−１．ｐＨによる活性確認
ＦＰ３Ｅに対するｐＨの影響を調査するために、様々なｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０のクエン酸ナトリウム，ｐＨ６．０〜８．０のリン酸カリウム，ｐＨ７．０〜９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ）に懸濁された５０ｍＭフルクトース−６−リン酸に０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製されたＦＰ３Ｅを添加して７０℃で１０分間反応させた。その後、実施例３と同じ条件でフィターゼと反応させ、次いでＨＰＬＣを用いてアルロースを定量分析した。
【００５８】
その結果、ＦＰ３Ｅは、ｐＨ７．０〜８．０で最大活性を示し、ｐＨ５．０〜１０．０にわたる非常に広範囲で最大活性の７０％以上の活性が保持されることが確認された（図４）。
【００５９】
[実施例４]
ｐＨ、温度、金属イオン添加によるＦＰ３Ｅの活性確認
４−１．ｐＨによる活性確認
ＦＰ３Ｅに対するｐＨの影響を調査するために、様々なｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０のクエン酸ナトリウム，ｐＨ６．０〜８．０のリン酸カリウム，ｐＨ７．０〜９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ）に懸濁された５０ｍＭフルクトース−６−リン酸に０．１ｕｎｉｔ／ｍｌの精製されたＦＰ３Ｅを添加して７０℃で１０分間反応させた。その後、実施例３と同じ条件でフィターゼと反応させ、次いでＨＰＬＣを用いてアルロースを定量分析した。
【００６０】
その結果、ＦＰ３Ｅは、ｐＨ７．０〜８．０で最大活性を示し、ｐＨ５．０〜１０．０にわたる非常に広範囲で最大活性の７０％以上の活性が保持されることが確認された（図４）。
【００６１】
４−３．金属イオン添加による活性確認
金属イオン添加がＦＰ３Ｅの活性に及ぼす影響を調査するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に懸濁された５０ｍＭフルクトース−６−リン酸に各金属イオン（ＮｉＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＦｅＳＯ４、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ及びＫＣｌ）を最終濃度０．５ｍＭで添加した。次に、金属イオンの除去のために、１０ｍＭ ＥＤＴＡで処理して透析したＦＰ３Ｅを０．１ｕｎｉｔ／ｍｌで添加して７０℃で１０分間反応させた。その後、実施例３と同じ条件でフィターゼと反応させ、次いでＨＰＬＣを用いてアルロースを定量分析した。
【００６２】
その結果、ＦＰ３Ｅは、ＣａイオンやＣｕイオンを添加すると活性が若干増加したが、他の金属イオンの添加による酵素活性の変化はほとんどなかった。よって、金属要求性酵素でないことが確認された（図６）。
【００６３】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【００６４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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