(57)【要約】  本発明は、自己二重特異性リンパ球、製造方法、および腫瘍の治療のための使用に関する。詳しくは、本発明は少なくとも１つの腫瘍関連抗原に対する内因性受容体、および強い抗原に対する外因性受容体を含む自己二重特異性リンパ球を製造する方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の抗原に対して特異性を有する自己二重特異性リンパ球の精製集団であって、リンパ球の集団が患者から単離され、各リンパ球が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する内因性受容体を発現し、強い抗原に対するさらなる受容体を発現するように遺伝子操作され、前記二重特異性リンパ球の集団が、複数のＴＡＡおよび前記強い抗原を標的にする、自己二重特異性リンパ球の精製集団。
【請求項２】
前記リンパ球が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の自己リンパ球の精製集団。
【請求項３】
前記自己リンパ球が腫瘍浸潤性リンパ球である、請求項１または２に記載の精製集団。
【請求項４】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精製集団。
【請求項５】
前記強い抗原が、病原体、病原性抗原、またはアロ抗原である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の精製集団。
【請求項６】
前記強い抗原が、病原体由来の抗原であり、前記病原体が、リステリア・モノサイトゲネス（ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、破傷風、ジフテリア、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、粘液腫ウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔａｍａｔｉｓ）ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスからなる群から選択される、請求項５に記載の精製集団。
【請求項７】
前記強い抗原が、リステリア・モノサイトゲネス由来の抗原である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製集団。
【請求項８】
前記リンパ球が、前記患者の前記腫瘍から単離される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精製集団。
【請求項９】
前記リンパ球が、末梢血から単離され、所望によりＰＤ−１陽性である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精製集団。
【請求項１０】
前記遺伝子操作されたさらなる外因性受容体がキメラ受容体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製集団。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性リンパ球の精製集団および製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１２】
複数の腫瘍関連抗原と少なくとも１つの強い抗原を標的にすることのできる、二重特異性リンパ球の自己集団を生成する方法であって、前記方法が、
（ａ）患者からリンパ球を単離するステップと；
（ｂ）前記単離されたリンパ球から前記腫瘍特異的リンパ球を精製するステップと；
（ｃ）前記精製したリンパ球を強い抗原に特異的な第２の受容体を発現するように遺伝子操作するステップとを含み、
前記得られる集団が、二重特異性リンパ球を含む、方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）が、前記単離された腫瘍特異的リンパ球を培養で増殖させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）が、前記患者の腫瘍、末梢血または骨髄から前記リンパ球を単離することをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記強い抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、およびアロ抗原からなる群から選択される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記強い抗原が、病原体由来の抗原であり、前記病原体が、リステリア・モノサイトゲネス、カルメット・ゲラン桿菌、破傷風、ジフテリア、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、粘液腫ウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスの群からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子操作された受容体が、キメラ受容体である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リンパ球が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンパ球が、増殖を刺激するためにインターロイキンの存在下、培養中で刺激される、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記インターロイキンが、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リンパ球が、増殖するために培養中で前記強い抗原またはＴＡＡによって刺激される、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子操作が、前記リンパ球に強い抗原に対する前記受容体をコードする遺伝子を形質導入することを含む、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍を有する患者を治療する方法であって：
（ａ）前記患者に有効量の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の自己二重特異性リンパ球または請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の方法によって製造した二重特異性リンパ球の自己集団を投与するステップと
（ｂ）前記患者に強い抗原を注射するステップとを含む、方法。
【請求項２５】
前記自己二重特異性リンパ球が前記患者の静脈内に注射され、前記強い抗原が腫瘍内に注射される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記強い抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、およびアロ抗原からなる群から選択される、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記強い抗原が、病原体由来の抗原であり、前記病原体が、リステリア・モノサイトゲネス、カルメット・ゲラン桿菌、破傷風、ジフテリア、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、粘液腫ウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、およびニューカッスル病ウイルスの群からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子操作された受容体が、キメラ受容体である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記リンパ球が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
腫瘍に特異的な複数の腫瘍関連抗原と反応性であり、強い抗原と反応性の受容体を発現するように遺伝子操作された自己二重特異性リンパ球の集団；および製薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
患者における腫瘍の治療のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二重特異性リンパ球の使用。
【請求項３３】
患者において腫瘍を治療するためのキットであって、前記キットが、複数の自己腫瘍関連抗原と強い抗原を認識する、前記患者に対して自己である二重特異性リンパ球；および前記患者に注射することのできる強い抗原を含む、キット。
【請求項３４】
前記キットが、使用説明書をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
患者に対して自己である二重特異性リンパ球の集団を生成するためのキットであって、
（ａ）細胞で発現させることのできる強い抗原に特異的な受容体をコードするベクター
を含む、キット。
【請求項３６】
（ｂ）前記ベクターをリンパ球に形質導入するための系；および
（ｃ）患者の腫瘍または腫瘍の部分から腫瘍浸潤リンパ球を単離し、それらに前記強い抗原受容体を形質導入するための使用説明書
をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１１月１９日出願の米国特許仮出願第６２／２５７，４２９号、標題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｄｕａｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」の利益を主張し、その内容は参照によりその全文が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金援助を受けた研究開発の記載
該当しない
【背景技術】
【０００３】
本発明は、癌免疫療法に関する。詳しくは、本発明は癌の治療のための養子細胞移入に関する。
【０００４】
様々な種類の癌は、多くの場合、化学療法または放射線照射などの標準的な治療に対して難治性である。遺伝子操作されたＴ細胞の養子細胞移入（ＡＣＴ）は、血液悪性腫瘍の有望な癌免疫療法となっている（１−４）。この手法は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識することができる腫瘍浸潤性リンパ球を操作して増殖させた後、それらを患者に注入して腫瘍特異的免疫応答を誘導することを伴う。近年の造血性悪性腫瘍の治療での成功にも関わらず（Ｍａｕｓ，ｅｔ  ａｌ．）、固形腫瘍を治療する場合にはそのような手法の有効性は抑えられる（２、５、６）。固形腫瘍に対して効果的になるためにＡＣＴが克服しなければならない主な障害には、以下の：特に広範囲の腫瘍関連抗原を有する異種癌細胞を扱う際の、養子移入されたＴ細胞の不十分な応答（２、６）；養子移入されたＴ細胞の腫瘍への遊走の減少（７）；および、多くの場合Ｔ細胞エフェクター機能の急速な低下を誘導する腫瘍内の免疫抑制性の微小環境（８）が挙げられる。
【０００５】
患者の免疫系を刺激し、腫瘍微小環境において免疫抑制を解除する感染性病原体の使用は、１００年前からある戦略であるが、現在、癌免疫療法を促進するために再び活用されている（９）。カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）は、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）の弱毒生株であり、数十年もの間、膀胱癌および黒色腫の治療に広く用いられてきた（１０、１１）。有効ではあるが、ＢＣＧは、一過性で非特異的な抗腫瘍免疫応答しか誘導しない。この理由の１つは、ＢＣＧに誘導される炎症反応が、腫瘍を標的化せず、腫瘍に対して免疫応答が引き起こされないことである。腫瘍特異的Ｔ細胞応答を生じるために、改変されたＴＡＡを発現する組換えリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＬＭ）が近年開発され、乳癌および膵癌をはじめとする複数の癌の治療において有望な結果が示された（９）。腫瘍細胞の不均一性のために、標的ＴＡＡを発現しない癌細胞は免役監視を逃れることができるので、１個のＴＡＡを標的にする組換えＬＭに基づく免疫療法が、癌の永続的かつ完全な退縮をもたらすことは依然として困難である（２、６、７、９）。したがって、病原体に基づく癌ワクチンを改善するために、腫瘍抗原を幅広く網羅して、強いＴ細胞応答を生じる新しい戦略が非常に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、免疫抑制に打ち勝つだけでなく、強いポリクローナル抗腫瘍Ｔ細胞応答をまさに腫瘍の部位に補充する革新的な手法を提供することによって、ＡＣＴの上記の欠点を克服する。最初に、患者から採取した、複数の腫瘍関連抗原に特異的な自己リンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）をインビトロで腫瘍関連抗原と、非腫瘍性である強い抗原の両方を識別するように遺伝子操作する。これらの改変された自己リンパ球は、その後、強い抗原を直接腫瘍の中または腫瘍に注射または滴下注入することを併用して患者に注入し戻される。二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞は、しっかりと増殖し、腫瘍床に遊走して、そこで感染病原体を認識する。同時に、これらのエフェクターＣＤ８Ｔ細胞の第２のＴＣＲは、腫瘍抗原を認識し、エフェクター機能を果たし、部位特異的な腫瘍退縮および持続性の抗腫瘍免疫を引き起こす。完全かつ永続する腫瘍退縮がいくつかの処置動物で見られた。全体として、本発明は、多様な種類の固形腫瘍の標的化に使用できる、大変応用価値のある免疫系の複数のアームの力（the power of multiple arms of the immune system）を利用する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、２以上の抗原に対して特異性を有する二重特異性リンパ球の精製集団が提供される。この際、リンパ球の集団は、患者から単離されたものであり、各リンパ球は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の内因性受容体を発現し、強い抗原に対するさらなる外因性受容体を発現するように遺伝子操作されている。この二重特異性リンパ球の集団は、複数のＴＡＡおよび強い抗原を標的化し、それによって活性化されることができる。好ましい態様では、このリンパ球はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０００８】
一部の態様では、本発明は、二重特異性リンパ球の精製集団と製薬上許容される担体を含むかまたはそれらから本質的になる組成物である。
【０００９】
さらなる態様では、複数の腫瘍関連抗原と少なくとも１つの強い抗原に対して特異的な二重特異性リンパ球の自己集団を生成する方法が提供される。この方法は、次の：
（ａ）リンパ球を患者から単離するステップ；
（ｂ）単離したリンパ球から腫瘍特異的リンパ球を精製するステップ；および
（ｃ）精製したリンパ球を、少なくとも１つの強い抗原に特異的な第２の受容体を発現するように遺伝子操作するステップを含み、
結果として得られる集団は二重特異性リンパ球を含む。
【００１０】
一部の態様では、この方法は、（ｄ）二重特異性リンパ球の数を増加させるために二重特異性リンパ球を培養によって増殖させるステップをさらに含む。
【００１１】
もう１つの態様では、腫瘍をもつ患者を治療する方法が提供される。この方法は、（ａ）患者に有効量の自己二重特異性リンパ球を投与するステップ、および（ｂ）患者に強い抗原を注射するステップを含む。好ましい態様では、強い抗原は、腫瘍内に注射される。
【００１２】
さらにもう１つの態様では、医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、腫瘍に特異的な複数の腫瘍関連抗原と反応性であり、強い抗原と反応性の受容体を発現するように遺伝子操作されている自己二重特異性リンパ球の集団；および製薬上許容される担体を含むかまたはそれから本質的になる。
【００１３】
もう１つの態様では、患者において腫瘍を治療するためのキットが提供される。このキットは、複数の腫瘍関連抗原と強い抗原を認識する、患者に対して自己である二重特異性リンパ球、および患者に注射することのできる十分な量の強い抗原を含む。
【００１４】
もう１つの態様では、患者に対して自己である二重特異性リンパ球の集団を生成するためのキットが提供される。キットには、（ａ）細胞で発現させることのできる、強い抗原に特異的な受容体をコードするベクターが含まれる。
【００１５】
本発明の前述およびその他の態様および利点は、以下の説明から明らかになろう。説明では、本発明の一部をなし、本発明の好ましい実施形態が例として示される添付の図面が参照される。しかし、そのような実施形態は、必ずしも本発明の全範囲を表すわけではない。したがって、本発明の範囲を解釈するために特許請求の範囲および本明細書が参照される。
【００１６】
本特許または出願書類は、少なくとも１枚の着色された図面を含む。この１枚または複数枚のカラー図面を含む特許または出願公開のコピーは、特許局に依頼して必要な料金を支払うと得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ＲｅＡＣＴが著しく増加した抗腫瘍効力を示すことを示す図である。ＲｅＡＣＴ（再活性化された養子細胞移入（Ｒｅｅｎｅｒｇｉｚｅｄ  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ））の実験スキーム。Ｐｍｅｌ−１  ＣＤ８Ｔ細胞をインビトロで形質導入して第２のＴＣＲ（ＯＴ−Ｉ）を発現させて、ＴＡＡ  ｇｐ１００と代替細菌抗原ＯＶＡ２５７−２６４の両方を認識でき得るＴ細胞を生成する。これらの二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞をインビトロで増殖させ、腫瘍を有するマウスに移入した後、腫瘍内ＬＭ−ＯＶＡ感染させた。
【図１Ｂ】ドットプロットは、それぞれ、ｇｐ１００またはＯＶＡペプチドによる刺激の６時間後のＰｍｅｌ−１＋またはＯＴ−Ｉ＋Ｐｍｅｌ−１＋ＣＤ８Ｔ細胞の細胞内ＩＦＮγ染色を示す。
【図１Ｃ】Ｂ１６−Ｆ１０担腫瘍マウスに、次の処置の組合せ：単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入、ＬＭ−ＯＶＡの腫瘍内注射を伴う単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入またはＬＭ−ＯＶＡの腫瘍内注射を伴う二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入を行った。各群において、５×１０５ＣＤ８Ｔ細胞を各マウスに移入した。（Ｃ）で述べた各処置の後の個々の腫瘍増殖曲線を、ダンの多重比較試験を用いるＫｒｕｓｋａｉ−Ｗａｌｌｉｓによって分析した。右上の数字は、応答マウス／全マウス比を表す。
【図１Ｄ】全体的な腫瘍増殖は、平均容積±標準偏差として示される。
【図２Ａ−Ｂ】リステリア属のアジュバント効果およびＬＭ−ＯＶＡの癌ワクチンとしての抗腫瘍効果を示す図である。図２Ａは、確立されたＢ１６−Ｆ１０腫瘍をもつＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＯＴ−Ｉ細胞（５×１０５／マウス）単独の、または混合Ｐｍｅｌ−１（２．５×１０５／マウス）とＯＴ−Ｉ細胞（２．５×１０５／マウス）のＡＣＴで処置した後、ＬＭ−ＯＶＡ腫瘍内注射を行った。個々の腫瘍増殖曲線を示す。図２Ｂは、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞による皮下接種の１週間後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＬＭ−ＯＶＡかまたはＬＭ−ＧＰ３３を腫瘍内注射した。各群の腫瘍増殖を経時的にモニターし、個々の腫瘍増殖曲線を示す。全ての実験において、腫瘍を根絶したマウスを応答マウスと定義し（実線で示す）、残りのマウスを非応答マウス（破線で示す）と定義した。右上の数字は、応答マウス／全マウス比を表す。示されるデータは、２から３の独立した実験からプールされた。
【図３Ａ】ポリクローナルＲｅＡＣＴが、効率的な腫瘍制御を与え、長期の保護を生み出すことを示す図である。固形腫瘍に対するＲｅＡＣＴ治療のためのポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を生成するための概略図。
【図３Ｂ】ポリクローナルＲｅＡＣＴが、効率的な腫瘍制御を与え、長期の保護を生み出すことを示す図である。４群の担腫瘍マウスに、ＬＭ−ＯＶＡ感染を伴うまたは伴わないポリクローナル単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入（５×１０５／マウス）、およびＬＭ−ＯＶＡ感染を伴うまたは伴わないポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入（５×１０５／マウス）を含む、異なる処置計画を行った。各々の応答マウス（実線で示す）および非応答マウス（破線で示す）は、図１に記載される通り定義した。ダンの多重比較試験を用いるＫｒｕｓｋａｉ−Ｗａｌｌｉｓによってデータを分析した。
【図３Ｃ】（Ｂ）で述べた４つの異なる処置を受けた後の乳癌Ｅ０７７１腫瘍の個々の増殖曲線を示す。
【図３Ｄ】その原発性Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を根絶したマウスに、１×１０４Ｂ１６−Ｆ１０細胞（左に示す）、およびこれまでに遭遇したことのない乳癌細胞（Ｅ０７７１、右に示す）を再び接種した。比較として、未処理マウスでのＢ１６−Ｆ１０腫瘍増殖も示す。腫瘍のないマウスの数が示され、ログランク検定によって分析された。データは、２つの独立した実験からプールされた。
【図４Ａ】ＲｅＡＣＴが、腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞増殖、機能および腫瘍を標的化した遊走を著しく増加させることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、図１に記載される処置の様々な組合せを行った。１０日後、マウスを安楽死させて、フローサイトメトリー分析のために腫瘍浸潤免疫細胞を収集した。図４Ａ。代表的なプロットは、ＣＤ８Ｔ細胞でゲートされ、数字は移入された（ＧＦＰ＋）細胞の百分率を示す。
【図４Ｂ】移入されたＣＤ８Ｔ細胞の百分率および絶対数（腫瘍容積に対して正規化）を計算し、プロットに示した。
【図４Ｃ】相関プロットは、各処置群における腫瘍内のＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍サイズと発生頻度の関係を示す。各データポイントは、個々のマウスを表す。
【図４Ｄ】ＣＤ４４、ＫＬＲＧ−１、ＣＸＣＲ３およびグランザイムＢの発現を、二重特異性および単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞においてフローサイトメトリーによって比較した。未処理ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ４４−）は、対照としての役割を果たした。
【図４Ｅ】代表的なプロットは、インビトロで６時間ｇｐ１００ペプチドで刺激した後のＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生を示す。
【図４Ｆ】ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を計算し、プロットに示した。示されるデータは、３つの独立した実験からプールされた。
【図５Ａ】ＲｅＡＣＴが、腫瘍の免疫抑制性微小環境および腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞表現型を変えることを示す図である。図１に記載される各処置を受けたマウスの腫瘍内部のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの発生頻度をドットプロットに示す。
【図５Ｂ】腫瘍容積を用いて正規化したＴｒｅｇの百分率および絶対数を計算し、グラフに表した。
【図５Ｃ】相関プロットは、腫瘍内部のＴｒｅｇの腫瘍サイズと発生頻度の関係を示す。
【図５Ｄ−Ｅ】エフェクター／Ｔ−ｒｅｇ比を計算して表したグラフである。
【図５Ｆ】腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣの発生頻度をドットプロットに示す。
【図５Ｇ】腫瘍容積を用いて正規化したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋ＭＤＳＣの百分率および絶対数を算出し、グラフに表した。
【図５Ｈ】ｉＮＯＳの発現を、非感染および感染担腫瘍マウス由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋細胞において比較し、ヒストグラムに示した。
【図５Ｉ】ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＬＭ−ＯＶＡかまたはＰＢＳの腫瘍内注射で処置したＢ１６−Ｆ１０腫瘍から選別した。これらの細胞を、活性化ＣＤ８Ｔ細胞とともに共培養し、Ｔ細胞増殖を３Ｈ−チミジン取り込みによって評価し、棒グラフに示した。
【図５Ｊ】阻害受容体（ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｔｉｍ３およびＰＤ−１）の発現を、腫瘍内部の二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞と単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞で比較し、ヒストグラムに示した。データは、３つの独立した実験からプールされた。
【図６Ａ】骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）およびポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞の表現型を示す図である。ＢＭＤＣの表面マーカー発現をフローサイトメトリーにより分析し、ドットプロットおよびヒストグラムに示した。
【図６Ｂ】腫瘍細胞溶解物でパルスしたＢＭＤＣを用いてポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を生成した。ヒストグラムは、活性化二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞での表面表現型マーカーの発現を示す。
【図７Ａ】ポリクローナルＲｅＡＣＴが腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖および機能を増加させることを示す図である。４群のＢ１６−Ｆ１０担腫瘍マウスに、ＬＭ−ＯＶＡ感染を伴うまたは伴わないポリクローナル単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入（５×１０５／マウス）、およびＬＭ−ＯＶＡ感染を伴うまたは伴わないポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入（５×１０５／マウス）を含む、異なる処置計画を行った。ドットプロットは、処置の１０日後の末梢血における、各群の養子移入されたＣＤ８Ｔ細胞の発生頻度を示す。
【図７Ｂ】腫瘍における養子移入されたＣＤ８Ｔ細胞の発生頻度および数を算出し、散布図に示した。
【図７Ｃ】関連プロットは、腫瘍におけるＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍サイズと発生頻度の関連性を示す。
【図７Ｄ】ＰＤ−１、ＫＬＲＧ−１およびグランザイムＢの発現を、二重特異性、単一特異性および未処理のＣＤ８Ｔ細胞で比較し、ヒストグラムに示した。結果は２つの独立した実験の代表であり、ｎ＞３／群である。＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【図８Ａ】ポリクローナルＲｅＡＣＴがＴｒｅｇ細胞を減少させ、腫瘍におけるエフェクター／Ｔｒｅｇ比を増加させることを示す図である。担腫瘍マウスに、補足図２に記載される治療法の様々な組合せを行った。腫瘍内ＴｒｅｇをＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋として特定し、ＣＤ４＋細胞でゲートした代表的なＦＡＣＳプロット（ｐｏｔｓ）に示した。
【図８Ｂ】Ｔｒｅｇの発生頻度および数を算出し、散布図に示した。
【図８Ｃ】相関プロットは、腫瘍内のＴｒｅｇの発生頻度と腫瘍サイズの関係を示す。
【図８Ｄ−Ｅ】ＣＤ８  エフェクター／Ｔ−ｒｅｇ比およびその腫瘍サイズとの関連を計算し、グラフに示した。結果は２つの独立した実験の代表であり、ｎ＞３／群である。＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図９Ａ】ポリクローナルＲｅＡＣＴが腫瘍においてＣＤ１１ｂ＋細胞を減少させ、それらの表現型を変えることを示す図である。担腫瘍マウスに、補足図２に記載される治療法の様々な組合せを行った。腫瘍由来のＣＤ１１ｂ＋骨髄系細胞の発生頻度および絶対数を算出し、散布図に示した。
【図９Ｂ】腫瘍内ＬＭ−ＯＶＡ感染を伴うまたは伴わない担腫瘍マウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋細胞におけるｉＮＯＳ発現を、注入後（ｐ．ｉ．）３日目にフローサイトメトリーによって分析し、ヒストグラムに示した。結果は３つの独立した実験の代表であり、ｎ＞３／群である。＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示し、＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は１以上の好ましい実施形態に関して説明されているが、明示的に述べられているものは別として、多くの等価物、代替物、変形形態、および修正形態が可能であり、本発明の範囲内にあることは当然理解される。
【００１９】
本開示は、自己二重特異性リンパ球の精製集団、これらの二重特異性リンパ球を製造する方法、および患者において腫瘍を治療するためにこれらの二重特異性リンパ球を使用する方法を提供する。
【００２０】
癌と戦う際の養子細胞移入（ＡＣＴ）に基づく免疫療法には、近年、大きな関心が寄せられている。この手法は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識することができる腫瘍浸潤性リンパ球を操作して増殖させた後、それらを患者に注入して腫瘍特異的免疫応答を誘導することを伴う。近年の造血性悪性腫瘍の治療での成功にも関わらず（Ｍａｕｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１４）、その他の固形腫瘍を治療する際に実現される有効性は限られていた（Ｒｅｓｔｉｆｏ，ｅｔ  ａｌ  ２０１２）。
【００２１】
ＡＣＴの使用の主な障害の１つは、治療応答を達成するために必要な移入された改変Ｔ細胞の数が、ひとたび患者に注射されるとあまりに少ないことであり、悪性病変から単離されたＴＩＬは、高用量のＩＬ−２とともに生体外増殖させた後にその増殖能を容易に失う（Ｋａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０；  Ｐｉｐｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。
【００２２】
この問題を克服するため、自己Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍において顕著な応答をもたらした腫瘍反応性を備えるように遺伝子操作された、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である（Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。しかし、腫瘍細胞の不均一性により、このモノクローナルＴ細胞手法は、大部分の腫瘍の永続的かつ完全な退縮を確立するにはあまり効率的とならない。さらに、完全に活性化した腫瘍特異的細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞が多数あっても、腫瘍組織へのそれらの補充が不十分なために腫瘍退縮を誘導することができないことがある（Ｇａｎｓｓ  ａｎｄ  Ｈａｎａｈａｎ  １９９８、Ｇａｎｓｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００２およびＧａｒｂｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００４）。固形腫瘍の大部分は、無秩序な脈管構造に富む間質性であり、それは治療用Ｔ細胞の腫瘍床への効率的な輸送に対する物理的障壁を作り出す（Ｂａｒｎａｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｂｅｌｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）。
【００２３】
最後に、もう１つの等しく重要な大きな障害は、腫瘍微小環境内部での免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の蓄積（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００７  ａｎｄ  Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１）であり、これは通常、Ｔ細胞エフェクター機能の進行性の喪失を招く。最近の研究により、シクロホスファミド（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）かまたはＣＤ２５Ａｂ（Ｐｏｅｈｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）のいずれかを使用することによるＴｒｅｇの枯渇、あるいはスニチニブによるＭＤＳＣの除去（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）が、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を回復させることが示された。これらの制限がありながら、黒色腫などの固形腫瘍を免疫療法によって治療することは、まだ困難なままである。
【００２４】
本開示は、固形腫瘍を標的として治療するために、腫瘍内での強い抗原に対する免疫化と組み合わせた、腫瘍関連抗原に対するポリクローナル特異性と、強い抗原に対する特異性も有する二重特異性リンパ球の集団を使用する新しい戦略を提供する。この方法に本発明者らは再活性化されたＡＣＴ（ＲｅＡＣＴ）と名付けた。この方法は、免疫抑制を解除するだけでなく、腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させ、まさに腫瘍の部位に遊走させるために、強い抗原（例えば、病原体）を使用する。この組み合わせの手法を用いて、本発明者らは、ＲｅＡＣＴが、原発腫瘍の根絶においてＡＣＴかまたは病原体に基づく癌ワクチン単独と比較して抗腫瘍効力を強化させ、前臨床癌モデルでの再発に対して長期の保護をもたらすことを実証した。実施例で実証されるように、現在の方法は、腫瘍量を減らすだけでなく、治療後の腫瘍の完全な退縮ももたらした。
【００２５】
一部の実施形態では、本開示は、２以上の抗原に対して特異性を有する二重特異性リンパ球の精製集団を提供する。用語「二重特異性リンパ球」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対して特異性を有するリンパ球をさす。そのため、二重特異性リンパ球は、２つの異なる抗原と結合する少なくとも２つの受容体を有する。一部の実施形態では、二重特異性リンパ球は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原および少なくとも１つの強い抗原に対して特異性を有する。一部の実施形態では、二重特異性リンパ球は、第２の腫瘍抗原および／または第２の強い抗原に対する第２の受容体を有するように改変されてよい。例えば、二重特異性リンパ球は、１つのＴＡＡと１つの強い抗原に対して特異性を有してよく、あるいは、少なくとも２つのＴＡＡ（例えば、１つの内因性ＴＡＡおよび細胞の中に遺伝子操作された１つの外因性ＴＡＡ）と、少なくとも１つの強い抗原に対して特異性を有してよく、あるいは、少なくとも１つのＴＡＡと少なくとも２つの強い抗原などに対して特異性を有してよい。少なくとも１つのＴＡＡと少なくとも１つの強い抗原のその他の組合せも企図される。
【００２６】
本開示は、複数の腫瘍関連抗原および少なくとも１つの強い抗原を標的化することのできる二重特異性リンパ球の自己集団を生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）リンパ球を患者から単離するステップ；（ｂ）腫瘍特異的リンパ球を単離されたリンパ球から精製するステップ；（ｃ）精製したリンパ球を、強い抗原に特異的な第２の受容体を発現するように遺伝子操作するステップを含み、結果として得られる集団は二重特異性リンパ球を含む。
【００２７】
本方法によって生成される自己二重特異性リンパ球は、各々、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の受容体を発現し、強い抗原に対するさらなる受容体を発現するように遺伝子操作されており、該二重特異性リンパ球の集団は、複数のＴＡＡおよび強い抗原を標的にする。
【００２８】
用語「自己」とは、本明細書において、治療を受ける患者から取得されるリンパ球をさす。用語「リンパ球」とは、本明細書において、細胞性免疫応答を誘発する白血球をさす。使用してよい適したリンパ球としては、限定されるものではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびそれらの組合せが挙げられる。好ましい実施形態では、リンパ球はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００２９】
一部の実施形態では、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。ＴＩＬは、血流を離れて患者の体内の腫瘍に遊走する白血球である。ＴＩＬは、異なる種類の細胞（すなわちＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ）の様々な比率での混合であり得るが、Ｔ細胞が通常最も多く見られる。
【００３０】
患者からリンパ球を単離する方法は、当技術分野で公知である。最も好ましくは、リンパ球は、患者から切除した腫瘍組織から単離される。遺伝子操作に使用するための細胞集団を製造するために、リンパ球またはＴＩＬの供給源として患者から腫瘍または腫瘍の部分が収集される。例えば、腫瘍の断片をサイトカインとともに細胞培養に播種してリンパ球の成長および増殖を刺激することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、照射したフィーダーリンパ球の層を用いてＴＩＬの培養を支持するが、馴化培地または支持カクテルの添加などのその他の方法を用いることもあり得る。リンパ球の増殖を刺激するために使用されるサイトカイン条件のそのような例の１つは、１００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン−２の添加であるが、その他のサイトカイン、増殖因子および濃度を、経験的に決定することができ、インターロイキン−７またはインターロイキン−１５の使用などが当業者に公知である。強い増殖を伴う培養液は腫瘍細胞を死滅させて、リンパ球に富む培養液となる。次に、リンパ球のクローンを増殖させ、共培養系で原発腫瘍を死滅させるクローンの能力について具体的に試験する。腫瘍を死滅させることのできるクローンを、二重特異性リンパ球を製造するための遺伝子編集に選択する。これらの二重特異性リンパ球は、腫瘍だけでなく、強い抗原も標的にすることができる。
【００３２】
切除された腫瘍または腫瘍断片から、リンパ球の異種集団が患者から単離される。異種とは、リンパ球集団に、２以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な２以上のリンパ球が含まれることをいう。言い換えれば、該集団が２以上の異なるＴＡＡを認識することのできるＴＣＲを発現している２以上のリンパ球を含む、リンパ球の集団（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）が単離される。一部の実施形態では、二重特異性リンパ球は、少なくとも２から数万のＴＡＡを認識する。いかなる理論にも束縛されないが、活性化しているＴ細胞はポリクローナルであるので、それらは、リンパ球が単離された腫瘍に特異的な、多くの異なる腫瘍関連抗原と反応することができる。この方法の数ある中でも１つの利点は、リンパ球が、患者の腫瘍から単離されているので、その特定の患者の腫瘍において特異的に発現される異なるＴＡＡを認識する多くの内因性リンパ球を含むことである。そのため、これらのリンパ球は、１個のＴＡＡしか発現しないように操作された細胞に優る利点をもたらす、腫瘍特異的、患者特異的な異種集団である。これらのリンパ球は、強い抗原に対する第２の受容体を発現するように遺伝子操作されている。
【００３３】
強い抗原を認識する第２の受容体は、第２のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。リンパ球において第２の受容体を発現させる方法は、当分野で公知の標準法（例えば、トランスフェクションまたは形質導入）によって行うことができる。例えば、受容体遺伝子は、当分野で公知の方法、例えば、ネズミ形質導入のレトロウイルスベクターまたはヒト形質導入のレンチウイルスベクターを用いてリンパ球に形質導入されてよい。ＴＣＲまたはＣＡＲは、ベクター内にＴ細胞受容体核酸配列の全部または一部を含む組換えＤＮＡ分子として提供される。
【００３４】
ＣＡＲは、強い抗原に対する認識または結合部位を含有する細胞外部分と、リンパ球（例えばＴ細胞）を活性化するためのシグナル伝達の可能な膜貫通細胞内ドメインとを含有する膜貫通タンパク質である。ＣＡＲは、当技術分野で公知であり、標準的な技法を用いて製造することができる。一例では、キメラ受容体は、強い抗原を認識し、ひとたび強い抗原と結合されるとリンパ球を活性化するＴ細胞受容体またはそのフラグメントである。例えば、適したキメラ受容体は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を媒介することのできるＦｃ受容体部に連結されたモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域を含有するキメラ受容体である。別のキメラ受容体は、Ｔ細胞由来のＣＤ２８の細胞質領域、または、Ｔ細胞を活性化させるために必要な共刺激シグナルをＴ細胞に与えることのできる４１ＢＢなどの同様の領域に連結された、抗体可変領域を含む。当業者に公知のように、ＣＡＲの強い抗原受容体を、ＣＤ２８または４１ＢＢなどの内部シグナル増幅器と連結させることができる。遺伝子操作された抗原受容体、およびキメラ抗原受容体を製造する適した方法は、当技術分野で公知であり、それには例えば、Ｍｏｎｊｅｚｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＡＲ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１６  Ａｕｇ  ５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１６．１８０；Ｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ｐｒｏｄｉｇｙ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１６  Ａｕｇ；１８（８）：１００２−１１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｙｔ．２０１６．０５．００９；Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１６  Ｊｕｌ  １；８（７）：７０２−１１．ｄｏｉ：１０．１５２５２／ｅｍｍｍ．２０１５０５８６９；Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｍａｒ  １；７（９）：１０６３８−４９．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．７０７９；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＡＲｓ）ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍ��ｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１５  Ｄｅｃ；６４（１２）：１５１７−２９．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２−０１５−１７５７−６；  Ｏｌｄｈａｍ  ＲＡ，Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ  ＥＭ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｎ  ＪＡ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；７（３）：２７１−８４．ｄｏｉ：１０．２２１７／ｉｍｔ．１４．１０８；Ｒｅｖｉｅｗ；Ｕｒｂａｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｄｅｃ  １３；１２：３４７．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２９６７−０１４−０３４７−２に詳述されるものが含まれ、それらの内容は参照により全文が本明細書に組み込まれる。キメラ抗原受容体は、キメラ受容体遺伝子を発現することのできるベクターに入れられ得るキメラ受容体遺伝子によって発現される。キメラＴ細胞受容体の産生、および産生から得られるそれらの対応する遺伝子の適した例は、例えば、米国特許第５，８３０，７５５号および米国特許出願第０８／５４７，２６３号に見出すことができ、その両方は参照により全文が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
一部の実施形態では、リンパ球の遺伝子操作は、強い抗原に対する受容体をコードする遺伝子をリンパ球に形質導入することを含む。「遺伝子操作」とは、本発明者らは、当分野で公知の方法による外因性または外来性のＤＮＡの設計およびリンパ球への導入を意味する。用語「形質導入」とは、外因性または外来性のＤＮＡのリンパ球への導入を意味する。リンパ球を形質導入するのに適した方法は、当技術分野で公知であり、それには、限定されるものではないが、レトロウイルス形質導入、アデノウイルスまたはその他のウイルスの形質導入法、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを用いるトランスフェクション、遺伝子導入、または、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに考察されるような当業者に公知のその他の手順が含まれる。第２の受容体を発現するために適したベクターおよびキットが市販されており、当業者に公知である。さらに、遺伝子操作には、受容体および／またはベクターで遺伝子編集を行うために使用することができ得る任意の数の酵素系を用いるどんな方法も含まれ、それには、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ））、ＣＲＩＳＰＲ関連ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。これらは、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結されるプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールからなるキメラヌクレアーゼである。細胞を遺伝子操作して第２の受容体を発現させる方法は、当技術分野で公知である。
【００３６】
適したベクターは、当技術分野で公知であり、それには、核酸配列に動作可能に連結された少なくとも１つの発現制御エレメントを含む発現ベクターが挙げられる。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入され、当技術分野で公知である（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー）。適したベクターとしては、限定されるものではないが、アデノウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＭＭＬＶ、ＳＶ４０などが挙げられる。さらに好ましい使用可能なエレメントとしては、限定されるものではないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、および核酸の適切な転写および発現に必要な任意のその他の配列が挙げられる。適した発現系および発現ベクターは、当技術分野で公知であり、当業者は選択された細胞に適した発現ベクターを選択することができる。ベクターが適切なタンパク質発現に有益なさらなるエレメントを含んでよいこと、そしてそれらが当技術分野で周知であることは当然理解される。一部の実施形態では、ベクターには、選択マーカー、例えば、形質導入され、かつ／または形質転換された細胞の選択を可能にするアンピシリン抵抗性および／または蛍光タンパク質発現（例えば、ＧＦＰ／ＲＦＰ）、が含まれる。
【００３７】
限定されない例では、強い抗原に対する受容体を発現するためのトランスフェクションに使用されるベクターは、次のように製造され得る：健康なドナーのＰＢＭＣから単離されたペプチド特異的Ｔ細胞を、インビトロで病原性ペプチドとともにそれらをインキュベートすることによって増殖させる。例えば、ＢＣＧに関して、Ｇｅｌｕｋらは、Ａｇ８５Ｂ（ＢＣＧ由来抗原）の２つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを特定し、これらの２つのペプチドは、ａａ１４５−１５２  ＦＩＹＡＧＳＬＳ（配列番号１）およびａａ１９９−２０７  ＫＬＶＡＮＮＴＲＬ（配列番号２）に及んだ。この例では、インビトロでＴ細胞を増殖させるために２つのペプチドのうち１つを選択する。次に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってペプチド特異的Ｔ細胞を単離し、活性化マーカーＣＤ４５ＲＯ（エフェクターおよびメモリーＴ細胞のマーカー）を有するＣＤ８Ｔ細胞を選択する。これらのＴ細胞から単離されたＤＮＡを次世代シーケンシングに付して、クローンＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のαおよびβ鎖の最も豊富な可変領域を特定することができる。このシーケンシング結果により、支配的なＴＣＲが示される。特定された支配的なＴＣＲ配列は、ＴＣＲのα鎖とβ鎖の両方を共発現するベクターを構築するために使用され、次にそれをリンパ球においてＴＣＲを発現させるために使用することができる。
【００３８】
好ましい実施形態では、リンパ球は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター系を用いてトランスフェクトされ、リンパ球は、約１×１０２〜約１×１０１０ウイルス粒子／ｍｌの濃度でレトロウイルスまたはレンチウイルス上清とともにインキュベートされる。好ましくは、レンチウイルスベクターは、ヒト対象で使用される。
【００３９】
一部の実施形態では、ベクターは、形質導入細胞を選択するために使用することのできる選択マーカーをさらに含む。
【００４０】
用語「強い抗原」とは、リンパ球（Ｔ細胞を含む）の増殖を誘導することのできる抗原をさす。強い抗原は、インビトロかまたはインビボのいずれかでリンパ球に曝されると増殖を誘導することができる。強い抗原という用語は、１個の抗原または１組の抗原をさすことがある。適した強い抗原としては、限定されるものではないが、病原体（例えば、ウイルス抗原または細菌抗原）およびアロ抗原が挙げられる。一部の実施形態では、病原体は、微生物の弱毒化された形態、つまりヒトにおけるワクチン接種および臨床使用に適した病原体であってよい。適した強い抗原としては、限定されるものではないが、生または弱毒化された細菌、ウイルス、ヒト白血球抗原、主要組織適合抗原複合体、病原性タンパク質あるいは上述のいずれかのタンパク質またはペプチド断片が挙げられる。
【００４１】
アロ抗原は、同じ種の遺伝的に同一でないメンバーに由来する抗原である。アロ抗原は、組織、細胞、タンパク質、またはペプチド、例えばＨＬＡであってよい。
【００４２】
一部の実施形態では、強い抗原は、病原体由来の抗原であり、該病原体は、リステリア・モノサイトゲネス、カルメット・ゲラン桿菌、破傷風、ジフテリア、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、粘液腫ウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔａｍａｔｉｓ）ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよびそれらの組合せからなる群から選択される。ヒト臨床試験で、本技術の実践に使用されてよいその他の適した病原体としては以下が挙げられる：
（ａ）アデノウイルス５（ｄｌ１５２０誘導体）頭頚部の扁平上皮癌（中国での認可薬；腫瘍内）；
（ｂ）アデノウイルス５（ＰＳＥ−Ｅ１ＡおよびＥ３欠失）前立腺（Ｉ；前立腺）；
（ｃ）単純ヘルペスウイルス１（ＩＣＰ３４．５欠損）多形神経膠芽腫（ＩＩ；腫瘍内）；
（ｄ）ワクシニアウイルス（チミジンキナーゼノックアウトおよび顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を発現）進行肝腫瘍（Ｉ−ＩＩ；腫瘍内）；
（ｅ）レトロウイルス（レオライシン）表在性腫瘍（Ｉ；病巣内）；
（ｆ）ニューカッスル病ウイルス（ＰＶ７０１）膀胱、頭頚部および卵巣の扁平上皮癌（Ｉ−ＩＩ；静脈内）；
（ｇ）麻疹ウイルス（Ｖタンパク質ノックアウトおよびレポーター癌胎児性抗原またはエフェクターヨウ化ナトリウム共輸送体を発現）卵巣（Ｉ；腫瘍内）、神経膠腫。
【００４３】
一部の例では、病原体に対する応答性を追跡、発見または強化するために病原体マーカーが使用され得る。示される例では、オボアルブミンタンパク質の一部が、病原体に続く抗原として発現した。具体的には、ＯＶＡ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（配列番号３）（組換えリステリア・モノサイトゲネス−ＯＶＡ、ＬＭ−ＯＶＡに応答）。
【００４４】
本技術の二重特異性リンパ球を生成する方法には、インビトロでリンパ球を培養するステップが含まれる。この培養ステップの間、当分野で公知の方法によって、１以上の腫瘍関連抗原に特異的なリンパ球が、選択され／活性化され、精製された。例えば、患者の腫瘍細胞に特異的なリンパ球を培養および精製する一方法は、リンパ球を患者から単離された腫瘍細胞または１以上の腫瘍関連抗原の存在下で培養することである。好ましい実施形態では、リンパ球は、患者の腫瘍由来の組織、細胞、または組織の部分とともに培養される。別の方法では、細胞とともに培養するために適した腫瘍関連抗原は、当技術分野で公知であり、治療される腫瘍の特定の種類に特異的であることがある。例えば、培養に使用することのできる腫瘍抗原のリストは、オンラインで、ペプチドデータベースで見出すことができ、例えば、限定されるものではないが、ＴＡＡ、例えばＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＡＬＫ遺伝子再構成、Ｂ細胞免疫グロブリン遺伝子再構成、Ｂ２Ｍ（β−２ミクログロブリン）、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＣＡ  １５−３（癌抗原１５−３）、ＣＡ  １９−９（癌抗原１９−９）、ＣＡ−１２５（癌抗原１２５）、カルシトニン、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、ＤＣＰ（Ｄｅｓ−γ−カルボキシプロトロンビン）、ＥＧＦＲ変異、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体、フィブリン／フィブリノゲン、ガストリン、ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、β−ｈＣＧとも呼ばれる）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＪＡＫ２変異、ＫＲＡＳ変異、ＬＤ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、モノクローナル免疫グロブリン、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＳＭＲＰ（可溶性メソテリン関連ペプチド）、Ｔ細胞受容体遺伝子再構成、サイログロブリン、２１−遺伝子シグネチャー（Ｏｎｃｏｔｙｐｅ  ＤＸ（登録商標））および７０−遺伝子シグネチャー（ＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（登録商標））、および当技術分野で公知のその他のものなどである。リンパ球を培養するために適した方法は、参照によりその全文が本明細書に援用される、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  Ｐ，Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ  Ｖ，Ｖｉｇｎｅｒｏｎ  Ｎ，Ｖａｎｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  Ｂ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ：Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．２０１３に見出すことができる。
【００４５】
培養ステップには、患者に移入し戻すことのできる腫瘍特異的リンパ球の数を増加させるために、腫瘍細胞を培養によって増殖させるステップも含まれてよい。インビトロで培養したリンパ球を増殖させるために適した方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、特定の増殖ステップは、その内因性Ｔ細胞が患者の腫瘍由来の複数の腫瘍関連抗原に向けられる、Ｔ細胞の亜集団を増大させる。このことが、患者に特異的な複数の腫瘍関連抗原を認識することのできる、自己リンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の異種集団を生成する。これらの増殖されたリンパ球の異種集団は、次に、第２の受容体（例えば、外因性ＴＣＲまたはキメラ抗原受容体）でさらに形質導入されて、二重特異性リンパ球を生成する。
【００４６】
本方法の一部の実施形態では、遺伝子操作された二重特異性リンパ球は、ＴＡＡと強い抗原の両方と反応性の細胞の数を増大させるために、腫瘍関連抗原（または患者の腫瘍由来の組織または細胞）と強い抗原の両方の存在下で培養される。言い換えれば、二重特異性リンパ球は、増殖させるための培養液中で強い抗原および／または複数のＴＡＡによって刺激される。一部の実施形態では、リンパ球、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞は、培養液中の二重特異性リンパ球の数を増加させるために、ＩＬ−２とともに培養される。
【００４７】
一部の実施形態では、リンパ球は、二重特異性リンパ球の増殖をもたらすために、強い抗原によって活性化する。一部の実施形態では、リンパ球は、１時間よりも長い間、一部の実施形態では少なくとも２４時間強い抗原に曝される。リンパ球は、好ましくは、この期間連続的に強い抗原に曝される。好適には、病原性抗原は、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１６時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間を含む、少なくとも１時間リンパ球に曝される（その間のどんな時間も含む）。好適には、アロ抗原は、少なくとも２４時間、あるいは少なくとも３０時間、あるいは少なくとも４８時間、リンパ球に曝される。二重特異性リンパ球に曝される強い抗原の適量は、強い抗原に依存し、当業者が決定することができる。例えば、強い抗原は、タンパク質、ペプチドまたは細胞成分に対して約０．１〜約１ｍＭの濃度で提供されてよい。感染性または不活化ウイルス粒子について、それらは培養液に１〜１０００ウイルス粒子／細胞の比で提供され得る。同様に、使用してよい同種異系細胞の数は、培養液中１〜１００／リンパ球であり得る。一部の実施形態では、強い抗原は１以上のＴＡＡと組み合わされ、それには、一部の実施形態では、患者から抽出された腫瘍由来の組織または細胞の包含が含まれる。
【００４８】
本明細書において、複数という用語は、２以上をさす。
【００４９】
本明細書において、患者および対象という用語は、同義的に使用され得る。患者は好適には哺乳動物、より好ましくはヒトである。一部の実施形態では、組成物および方法は、哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはその他の家畜を治療するために使用されてよい。最も好ましい実施形態では、本方法はヒトを治療するために使用される。
【００５０】
本開示は、腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載される自己二重特異性リンパ球または本明細書に記載される方法によって製造した二重特異性リンパ球の自己集団の有効量を患者に投与すること、および患者に強い抗原を注射すること、好ましくは強い抗原を腫瘍内に注射することを含む。病原体は、身体の特定の領域での感染および複製に天然の偏向（ｐｒｅｄｉｌｉｃｔｉｏｎｓ）または指向性を有する。インフルエンザは、主に気道を感染および損傷させるが、中枢神経系は二次的に、または稀な例でしか感染および損傷させない。ポリオウイルスは主に中枢神経系を感染および損傷させるが呼吸器系は二次的にしか感染および損傷させない。病原体の天然の指向性の知識を用いて、当業者は、治療される腫瘍の位置に指向性をもつ病原体から強い抗原を選択し得る。例えば、肺腫瘍を治療したい場合には、選択される強い抗原としてインフルエンザ由来の強い抗原を使用した後、インフルエンザワクチンを注射するかまたは鼻腔内送達する戦略を使用してもよい。局所送達の好ましい方法は多くの例で注射であろうが、強い抗原を腫瘍の部位に送達するその他の機構、例えば鼻腔内送達、胃管栄養法、洗浄、または局所送達などを使用することもあり得る。
【００５１】
「治療する」または「治療」とは、腫瘍と戦い、それを縮小させることを目的とする、対象の管理およびケアを意味する。治療する、には、症状または合併症の発症を減らし、阻害し、寛解させ、かつ／または改善するための、腫瘍の症状または合併症を軽減し、または腫瘍を除去するための、本発明の二重特異性リンパ球の投与が含まれる。具体的には、治療は、患者において腫瘍量または容積の減少をもたらし、一部の例では、腫瘍または腫瘍細胞の退縮および消失を導く。本明細書において、用語「治療」は、必ずしも腫瘍の治癒または完全消滅を意味するものではない。治療は、腫瘍の進行を阻害または遅延させること、腫瘍の発生率を低下させること、腫瘍の転移を減少させること、またはさらなる腫瘍増殖を防ぐことをさすことがある。一部の実施形態では、治療は、腫瘍の完全な退縮をもたらす。
【００５２】
「寛解させる」、「寛解」、「改善」などは、本発明者らは検出可能な改善または改善に一致する検出可能な変化が、対象において、または対象の少なくとも少数で、例えば、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％またはこれらの値の任意の２つの間の範囲内で発生することを意味する。そのような改善または変化は、本発明の二重特異性リンパ球および強い抗原による免疫化で治療していない対象と比較して、治療した対象において観察されることがあり、この際、非治療対象は、同じまたは同様の腫瘍を有するか、または同じまたは同様の腫瘍を発症しやすい。
【００５３】
一部の実施形態では、強い抗原を腫瘍内に注射するステップ（言い換えれば、インビボ免疫化ステップ）は、養子移入した二重特異性リンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を活性化させ、さらに、移入したリンパ球を腫瘍に向けるかまたは標的化するのに役立つ。いかなる理論にも束縛されないが、腫瘍細胞への強い抗原の注射が腫瘍環境の免疫抑制に打ち勝ち、腫瘍に補充されるより多くの量の移入された二重特異性リンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）をもたらし、それが腫瘍の死滅および腫瘍細胞死の増加を導くと思われる。
【００５４】
一部の実施形態では、この方法は、自己二重特異性リンパ球の集団と製薬上許容される担体を含む、本明細書に記載される組成物の有効量を投与すること、および強い抗原を用いて患者に注射し／免疫化することを含む。
【００５５】
好ましい実施形態では、組成物または二重特異性リンパ球は、患者の静脈内に投与される。一部の実施形態では、その他の投与方法、例えば、動脈内、腫瘍内、非経口的などが企図される。
【００５６】
強い抗原の注射は、二重特異性リンパ球の投与（養子移入）と同時に投与されてもよいし、順次行われることもできる。一部の実施形態では、強い抗原の２回目の注射は腫瘍内に実施される。その他の実施形態では、数カ月または数年にわたる、強い抗原の複数の注射または遺伝子改変された患者の免疫細胞の複数の送達は、有益であり得る。医師は、リスクプロフィールおよび腫瘍量をモニターして所与患者の治療スケジュールを経験的に決定することになる。
【００５７】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原と反応性であり、強い抗原と反応性の遺伝子操作された受容体を含有する自己二重特異性リンパ球の集団、製薬上許容される担体を含む医薬組成物。二重特異性リンパ球は、腫瘍に特異的な複数の腫瘍関連抗原と反応性であるように選択される。
【００５８】
「製薬上許容される担体」とは、本発明者らは、生理学的に適合性であり、準備、貯蔵または投与の間に二重特異性リンパ球に害をもたらさない、ありとあらゆる溶媒、分散媒、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤、溶液または媒体などを意味する。医薬組成物には、所望により１以上のさらなる成分が、投与様式、ならびに貯蔵、準備および投与の間の二重特異性リンパ球または強い抗原の活性を維持するために投与される二重特異性リンパ球または強い抗原に応じて含まれてよい。好適には、一部の実施形態では、医薬組成物は、ｐＨ調整添加剤、抗菌性保存剤、安定剤などの添加剤を含んでよい。好ましくは、担体は、静脈内、非経口、腹腔内、または筋肉投与に適している。製薬上許容される担体としては、滅菌水溶液または分散液が挙げられ、それには例えば生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤がリンパ球と適合しない場合を除いて、その本発明の医薬組成物中での使用が企図される。さらなる薬剤または治療法を組成物に組み込むこともできる。
【００５９】
本明細書に記載される医薬組成物は、公知の技法に従って製薬担体中にリンパ球とともに処方されてよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ９ｔｈ  Ｅｄ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）を参照されたい。また、強い抗原は、注射用の公知の技法に従って製薬担体とともに処方されてよい。
【００６０】
本発明者は、驚くべきことに、実施例に記載されるような腫瘍抗原のポリクローナル認識に加えて、第２の強い抗原に応答するようにＴ細胞を人工的に操作することによって、腫瘍に対するＴ細胞応答を促進する方法を見出した。以下の例では、Ｐｍｅｌ−１  ＣＤ８トランスジェニックマウス由来のＣＤ８  Ｔ細胞では、ＣＤ８Ｔ細胞の９５％がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、つまりＶα１およびＶβ１３を発現する。これらのＴ細胞は黒色腫腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ｇｐ１００のエピトープを認識する。レトロウイルスベクターを用いて、オボアルブミン（ＯＶＡ）残基２５７−２６４を認識し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を生成するＯＴ−Ｉ  ＴＣＲ（Ｖα２およびＶβ５）をＰｍｅｌ−１  ＣＤ８Ｔ細胞に形質導入し、その結果、ｇｐ１００腫瘍関連抗原の受容体；さらにＴ細胞を腫瘍環境に標的化し、その応答性を促進するために腫瘍に接種することのできるＯＶＡの受容体；および人工的に操作した細胞の単離、精製およびその後の追跡に有用な分子ＧＦＰ、を含む３つの重要な物質を発現する細胞を生じた。
【００６１】
その他の種類の免疫細胞、腫瘍抗原、病原体および病原体マーカーを用いてもよい。
【００６２】
本開示の二重特異性リンパ球の集団、組成物および方法は、腫瘍に罹患している患者を治療するために使用することができる。より好ましくは、腫瘍は固形腫瘍である。本明細書に記載される方法によって治療することのできる、適した腫瘍としては、限定されるものではないが、肉腫、癌腫および黒色腫からなる群から選択される腫瘍が挙げられる。本明細書に記載される方法によって治療することのできる、適した固形腫瘍としては、限定されるものではないが、脳およびその他の中枢神経系腫瘍；頭部および／または頚部癌；乳腺腫瘍；循環器系腫瘍（例えば、心臓、縦隔および胸膜、およびその他の胸腔内器官、血管内腫瘍および腫瘍関連血管組織）；排泄系腫瘍（例えば、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、その他の不特定の泌尿器官）；胃腸管腫瘍（例えば、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ字結腸移行部、直腸、肛門および肛門管、肝臓および肝内胆管、胆嚢、胆道系のその他の不特定部位、膵臓、その他の消化薬器官を巻き込む腫瘍）；口腔；子宮癌、卵巣癌、陰茎癌、前立腺癌、精巣癌；気道腫瘍（例えば、鼻腔および中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺癌または非小細胞肺癌）；骨格系腫瘍（例えば、手足の骨および関節軟骨、骨関節軟骨およびその他の部位）；皮膚腫瘍（例えば、皮膚の悪性黒色腫、非黒色腫性皮膚癌、皮膚の基底細胞癌、皮膚の扁平上皮癌、中皮腫、カポジ肉腫）；ならびにその他の組織を巻き込む腫瘍が挙げられる。一部の好ましい実施形態では、商業的に関連してよいものとしては、限定されるものではないが、ＢＣＧを強い抗原として用いる膀胱癌、リステリアを強い抗原として用いる膵臓癌、ワクシニアを強い抗原として用いる黒色腫およびインフルエンザを強い抗原として用いる肺癌が挙げられる。
【００６３】
本開示はまた、キットを提供する。キットは、本明細書に記載される方法での使用に適し得る。適したキットとしては、上記の遺伝子操作された自己二重特異性リンパ球と、強い抗原を含む注射可能な組成物とを含む、腫瘍を治療するためのキットが挙げられる。
【００６４】
一部の実施形態では、二重特異性リンパ球を生成するためのキットが企図される。一実施形態では、キットは、細胞で発現させることのできる強い抗原に特異的な受容体をコードするベクターを含む。
【００６５】
もう１つの実施形態では、（ａ）細胞で発現させることのできる強い抗原に特異的な受容体をコードするベクター；（ｂ）ベクターをリンパ球に形質導入するための系；および（ｃ）患者の腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球を単離し、それらに強い抗原受容体を形質導入するための使用説明書、を含むキットが提供される。細胞は、好ましくはリンパ球、より好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００６６】
一部の実施形態では、本開示の方法を実行するためのキットが提供される。例えば、二重特異性リンパ球、より具体的にはＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生成するためのキットが提供される。キットは、強い抗原に特異的な受容体をコードするベクターおよび強い抗原を提供する。腫瘍特異的リンパ球を患者から単離し、患者から単離したリンパ球を培養し、リンパ球を形質導入して強い抗原に対する受容体を発現させる方法を説明する使用説明書が提供され、腫瘍の治療のための二重特異性リンパ球を使用する方法が提供される。一部の実施形態では、使用説明書は、リンパ球を培養によって増殖させる、および／または活性化させるための方法をさらに提供する。
【００６７】
当業者に理解され、容易に実行され得るように、以下の限定されない例は、説明のためだけに含められ、本発明の組成物および方法が有用性を見出し得る技法およびプロトコールの幅の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６８】
実施例１：対象に特異的な複数の腫瘍関連抗原および細菌抗原を認識する二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞の集団、および固形腫瘍を治療するための使用
【００６９】
免疫抑制性の腫瘍微小環境、不十分な遊走および腫瘍特異的Ｔ細胞のエフェクター機能の低下は固形腫瘍を治療する際の免疫療法の効力を妨害する主な障害である。この例では、本発明者らは、固形腫瘍を治療するために、養子細胞移入（ＡＣＴ）と病原体に基づく癌ワクチンの力を組み合わせ、革新的な戦略である、再活性化されたＡＣＴ（ＲｅＡＣＴ）を開発した。ＲｅＡＣＴは、免疫抑制を解除するだけでなく、腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させ、まさに腫瘍の部位に遊走させるために、病原体を使用する。この組み合わせの手法を用いて、本発明者らは、ＲｅＡＣＴが、原発腫瘍の根絶においてＡＣＴかまたは病原体に基づく癌ワクチン単独と比較して抗腫瘍効力を強化させ；前臨床癌モデルでの再発に対して長期の保護をもたらすことを実証した。
【００７０】
免疫抑制の障害に打ち勝ち、活発な抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するために、本発明者らは、再活性化されたＡＣＴ（ＲｅＡＣＴ）という名称の新しい戦略を用いてＡＣＴと病原体に基づく癌ワクチンの力を組み合わせた。ＡＣＴと病原体の橋渡しをするために、本発明者らは、細菌抗原に特異的な第２のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて腫瘍反応性ＣＤ８Ｔ細胞の集団を遺伝子操作して、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞（すなわち、２つの抗原を認識することのできる１個のＴ細胞）を製造した。この技術は、Ｋｅｒｓｈａｗと同僚らによって開発された系に基づく（１２、１３）。しかし、本発明者らの二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞は有利であり、本発明者らが強い抗原に特異的な遺伝子操作されたＴＣＲ、この実施例ではリステリア属の細菌に特異的なＴＣＲをさらに発現する、異なる腫瘍抗原に特異的な複数の異なるＴＣＲを発現するＣＤ８Ｔ細胞の集団を有するという点でＫｅｒｓｈａｗとは異なる。次に、本発明者らは病原体に基づくワクチンを使用して、養子移入された細菌と腫瘍に（二重に）特異的なＴ細胞の強い増殖を推進し、それらを腫瘍部位に補充し、同時に腫瘍微小環境で免疫抑制を逆転させる。この組み合わされた手法は、前臨床癌モデルで原発腫瘍の根絶および再発に対する長期保護において強い効力を示した。いかなる理論にも束縛されないが、全ての腫瘍細胞と反応しない可能性のある特異的腫瘍抗原を発現するように遺伝子操作された二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を使用するＡＣＴとは対照的に、本発明者らの操作された二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞が、腫瘍に対して優れた免疫応答をもたらし、標的化された腫瘍細胞を増殖させ、置き換えるために、その特異的腫瘍抗原を発現しないかまたは低レベルの特異的腫瘍抗原を発現する一部の腫瘍細胞を残すと本発明者らは考える。
【００７１】
結果
【００７２】
ＲｅＡＣＴによる抗腫瘍効力の向上
【００７３】
最初に、本発明者らは確立されたマウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫モデル（１４）を使用してＲｅＡＣＴの抗腫瘍効力を試験した。二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を生成するために、本発明者らは、ネズミ黒色腫のｇｐ１００エピトープを認識するＴＣＲ（Ｖα１およびＶβ１３）を発現するＰｍｅｌ−１  ＣＤ８Ｔ細胞から始めた（１４）。次に、これらの細胞をインビトロでのレトロウイルス形質導入によって遺伝子操作して、ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲ（Ｖα２およびＶβ５）を発現させた（図１Ａ）。ＯＴ−Ｉは、オボアルブミン（ＯＶＡ）残基２５７−２６４を認識する。これは組換えＬＭ−ＯＶＡで発現する代替細菌抗原として役立つ。本発明者らは、臨床使用に適するリステリアをモデル生物として選択した。そして、弱毒化されたリステリアは、多くのその他の病原体に基づく癌ワクチンのように、有望な抗腫瘍効果をヒト（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒａｉｌｓ．ｇｏｖ）およびマウスの複数の癌モデルにおいて示した（９）。二重特異性を検証するために、対照（形質導入された空のベクター；以後、単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞と呼ぶ）およびＯＴ−Ｉ−ＴＣＲを形質導入された（以後、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞と呼ぶ）Ｐｍｅｌ−１細胞を、抗原ペプチドで刺激した。単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞は、ｇｐ１００による刺激の後にＩＦＮγを生成したが、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドでは生成しなかった（図１Ｂ）。対照的に、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞は、ｇｐ１００とＯＶＡ２５７−２６４ペプチドの両方に応答した（図１Ｂ）。
【００７４】
形質導入された単一特異性または二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞が治療環境で黒色腫を制御する能力を試験するために、少数の細胞（５×１０５／マウス）を確立された皮下Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍をもつＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。これまでに公開されたデータ（１４）と一致して、両方のＡＣＴ治療計画は、腫瘍増殖を防ぐことができなかった（図１Ｃ）。しかし、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を低用量のＬＭ−ＯＶＡと併用して投与した場合（ＲｅＡＣＴ）、全てのマウスで腫瘍が大幅に退縮し、大部分のマウス（１０匹のうち７匹）で完全に根絶された（図１Ｃ−１Ｄ）。特に、単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞およびＬＭ−ＯＶＡを受けたマウスでは腫瘍増殖がわずかに、かつ一時的に抑制されただけであったので、抗腫瘍効果には、二重特異性Ｔ細胞とＬＭ−ＯＶＡの両方で処置されることが必要とされた（図１Ｃ−１Ｄ）。総合して、これらの結果は、本発明者らの手法の実現可能性を検証し、ＲｅＡＣＴが抗腫瘍効力を著しく強化することを明白に示す。
【００７５】
リステリアのアジュバント効果
【００７６】
ＲｅＡＣＴに媒介される腫瘍根絶は、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞からのバイスタンダー抗菌効果によるものであった可能性がある。この可能性を試験するため、本発明者らは最初にＯＴ−Ｉ（ＯＶＡ／細菌特異的、形質導入されていない）ＣＤ８Ｔ細胞を、単独でまたはＰｍｅｌ−１（腫瘍特異的）ＣＤ８Ｔ細胞とともに、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍を有するマウスに移入した後、ＬＭ−ＯＶＡを腫瘍内投与した。ＬＭ−ＯＶＡ感染に応じたＯＴ−Ｉ細胞の強い増殖およびそれらの腫瘍への遊走にも関わらず、図１Ｄと比較してＯＴ−Ｉ＋ＬＭ−ＯＶＡ群で明白な治療上の利益は見られなかった（図２Ａおよびデータは示さず））。同じ静脈で、ＬＭ−ＯＶＡへのバイスタンダーＯＴ−Ｉの反応は、一時的なアジュバント効果を与えたにすぎず、Ｐｍｅｌ−１細胞の存在下でさえ腫瘍を根絶することができなかった（図２Ａ、データは示さず）。これらの結果は、図１に示されるデータとともに、単一特異性Ｔ細胞のみ（Ｐｍｅｌ−１またはＯＴ−Ｉ）かまたは混合単一特異性Ｔ細胞（Ｐｍｅｌ−１およびＯＴ−Ｉ）のいずれかによるＬＭ−ＯＶＡ感染が、腫瘍を根絶するには不十分であったことを示す。養子移入された腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させなければ、ＬＭ−ＯＶＡの示す腫瘍制御におけるアジュバント効果は限られる。
【００７７】
癌ワクチンとしてのＬＭ−ＯＶＡの抗腫瘍効果
【００７８】
ＴＡＡを発現する組換えリステリアは、固形腫瘍を治療するための癌ワクチンとしての役割を果たし得る（９）。ＬＭに基づくワクチンがＲｅＡＣＴによって見出されるのと同様の腫瘍制御を与えることがあり得るかを試験するため、本発明者らはリステリアの２つの組換え株、ＬＭ−ＯＶＡ（ＬＣＭＶ糖タンパク質を発現、３３−４１残基）およびＬＭ−ＧＰ３３（無関係な対照ＧＰ３３ペプチド）をＢ１６−ＯＶＡ黒色腫腫瘍モデルで比較した。原理の証明を試験するために、そして簡潔にするために、本発明者らは、前に報告したように代替腫瘍抗原としてＯＶＡ２５７−２６４を使用した（１５）。本発明者らは、確立されたＢ１６−ＯＶＡ黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスにＬＭ−ＯＶＡおよびＬＭ−ＧＰ３３を腫瘍内投与し、腫瘍増殖を経時的に追跡した。これまでに公開された研究（１６）と一致して、ＬＭ−ＯＶＡは、ＬＭ−ＧＰ３３処置マウスと比較して、より大きい腫瘍制御および２５％の根絶をもたらした（図２Ｂ）。それにもかかわらず、この手法は、ＲｅＡＣＴ処置マウスに見られるような強い腫瘍根絶を与えなかった（図１Ｄ）。総合すると、本発明者らのデータは、ＡＣＴと病原体に基づく癌ワクチンによる組み合わせ治療が、いずれかの治療だけよりもはるかに大きい腫瘍制御をもたらすことを示唆する。
【００７９】
ポリクローナルＲｅＡＣＴによる腫瘍根絶および長期保護
【００８０】
大部分のヒト腫瘍に関してはっきり定義されたＴＡＡがないこと、および癌患者を処置する複数のＴＡＡを認識する天然に存在する腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）を使用する利点（２）を考慮して、本発明者らは、１つの細菌抗原と複数の腫瘍抗原を標的にするポリクローナルＣＤ８Ｔ細胞を製造することによって原理の証明をさらに試験した（図３Ａ）。簡潔にするために、本発明者らは、Ｂ１６−Ｆ１０細胞溶解物をパルスしたＤＣを使用して、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞を刺激して、それらを以前に示されたような様々なＢ１６−Ｆ１０由来腫瘍抗原を認識するエフェクター細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分化させた（１７）。次に、これらの細胞をＯＴ−Ｉ  ＴＣＲを発現するように遺伝子操作し、ポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞と呼ぶ（図３Ａおよび図６Ａ−６Ｂ）。
【００８１】
前述の知見に一致して、単一特異性ポリクローナルＣＤ８Ｔ細胞の移入も二重特異性ポリクローナルＣＤ８Ｔ細胞のどちらの移入も、単独ではＬＭ−ＯＶＡ感染のない場合に腫瘍増殖に対する治療応答を生じなかった（図３Ｂ）。ポリクローナル単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞とＬＭ−ＯＶＡ感染の組合せだけが、１１匹のマウスうち１匹で腫瘍の除去をもたらした（図３Ｂ）。際だったことに、組み合わせたポリクローナル二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞とＬＭ−ＯＶＡ感染（ＲｅＡＣＴ）は、大部分のマウス（１６匹のうち１１匹）において完全な腫瘍根絶をもたらした（図３Ｂ）。Ｅ０７７１乳癌モデル（図３Ｃ）においても同様の結果が得られ、この治療法が様々な種類の固形腫瘍に適用される可能性があることを示す。
【００８２】
この組み合わせた治療法が腫瘍再発から宿主を守る免疫記憶を生じることができたかどうかを試験するために、本発明者らは原発性黒色腫（Ｂ１６−Ｆ１０）腫瘍を根絶させたマウスの左脇腹に低用量のＢ１６−Ｆ１０細胞を負荷し、右脇腹にこれまでに遭遇したことのない癌株（Ｅ０７７１乳癌細胞）を負荷した。これらのマウスの大部分（１０匹のうち７匹）がＢ１６−Ｆ１０に抵抗性であったが、どれもＥ０７７１を拒絶しなかった（図３Ｄ）。予測したように、ナイーブマウスは、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍もＥ０７７１腫瘍も拒絶しなかった（図３Ｄ）。これらのデータは、ポリクローナルＲｅＡＣＴ手法が、原発腫瘍を根絶させる免疫応答の強化を提供するだけでなく、腫瘍再発を防ぐ長期の感染防御免疫も確立することを示す。
【００８３】
ＲｅＡＣＴによるＣＤ８Ｔ細胞の増殖、機能および腫瘍を標的化した遊走の増加
【００８４】
この組み合わせた戦略の注目すべき抗腫瘍効果により、本発明者らは腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を調査した。プレコンディショニングまたはさらなるアジュバントを用いずに、以前に報告されたように（１４）、非常に低い頻度および数の移入されたＣＤ８Ｔ細胞が、単一または二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞移入だけしか受けていないマウスの腫瘍で検出された（図４Ａ−４Ｂおよび図７Ａ−７Ｂ）。移入された細胞の数が少なく、ＡＣＴに続くインビボ増殖がほとんどないことを考えれば、これは驚くことではない。興味深いことに、腫瘍内ＬＭ−ＯＶＡ感染は、腫瘍浸潤単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞をわずかに増加させた、これは走化性炎症に応答している可能性が高い。より顕著なことに、かなりの量の移入されたＣＤ８Ｔ細胞が、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞養子移入と組み合わせて細菌感染されたマウスの腫瘍で検出された（図４Ａ−４Ｂおよび図７Ａ−７Ｂ）。重要なことに、腫瘍に補充されたＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、全ての処置群において腫瘍サイズと逆相関した（図４Ｃおよび図７Ｃ）。さらに、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞は、腫瘍へのＴ細胞遊走の改善に寄与していることが示されたケモカイン受容体ＣＸＣＲ３の高い発現（１８）を伴って、活性化された表現型（ＣＤ４４ｈｉ、ＫＬＲＧ−１ｈｉおよびグランザイムＢｈｉ）を提示した（図４Ｄおよび図７Ｄ）。より顕著なことに、本発明者らは、組み合わせた処置を受けたマウスにおいてのみ、ＩＦＮγとＴＮＦαの両方を産生する、かなりの数の多能性ＣＤ８Ｔ細胞を観察した（図３Ｅ−３Ｆ）。総合して、これらの結果は、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞が、細菌感染に応答してしっかりと増殖し、エフェクター機能を獲得し、腫瘍部位に遊走し、そのことが次に腫瘍制御の強化をもたらすことを示唆する。
【００８５】
ＲｅＡＣＴによる免疫抑制性ＴＭＥの逆転およびＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍への補充
【００８６】
本発明者らの手法がＴＭＥを変えて腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を相乗的に改善することができたかどうかを評価するために、本発明者らは腫瘍内部の２つの主な免疫抑制性細胞、Ｔｒｅｇおよび骨髄系由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ）を調べた。腫瘍内ＬＭ−ＯＶＡ感染は、移入されたＣＤ８Ｔ細胞の種類（単一または二重特異性）にかかわらず、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度を著しく低下させた（図５Ａ−５Ｂおよび図８Ａ−８Ｂ）。特に、Ｔｒｅｇの発生頻度は、全ての処置マウスで腫瘍サイズと正に相関した（図５Ｃおよび図８Ｃ）。興味深いことに、図５Ａ−５Ｂおよび図７Ａ−７Ｂに示されるようなエフェクター細胞の強い増殖のために、エフェクター／Ｔｒｅｇ比は、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を受けたマウスでのみ増加した（図５Ｄおよび図８Ｄ）。さらに、エフェクター／Ｔｒｅｇ比は、腫瘍サイズと逆相関した（図５Ｅおよび図８Ｅ）。総合して、このことは、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞とＴｒｅｇの比が、異なる処置の最終結果を決定する重要な要素であることを示す。
【００８７】
もう１つの重要な種類の抑制性細胞、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＭＤＳＣも、ＬＭ−ＯＶＡ感染によって著しく低下した（図５Ｆ−５Ｇおよび図９Ａ）。これは、リステリアがＭＤＳＣを直接感染させることができるという以前の知見（１９）に一致し、そのことがＭＤＳＣを細胞傷害性Ｔ細胞によって死滅しやすくする可能性がある。さらに、リステリア感染は、ＭＤＳＣを免疫刺激細胞に変換することができる（１９、２０）。同様に、本発明者らは、腫瘍内リステリア感染がＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞でｉＮＯＳ発現を増加させたことを見出した（図５Ｆおよび図９Ｂ）。この表現型の変化が免疫抑制の低下と相関するのかどうかをさらに試験するために、本発明者らはＣＤ１１ｂ＋細胞をＬＭ−ＯＶＡ感染腫瘍から単離し、それらをインビトロで活性化したＣＤ８Ｔ細胞とともに共培養した。実際に、ＬＭ−ＯＶＡ感染腫瘍由来のＣＤ１１ｂ＋細胞は、非感染腫瘍由来のＣＤ１１ｂ＋細胞よりもＴ細胞増殖に対して抑制性が低く（図５Ｉ）、リステリア感染が骨髄系細胞の免疫抑制機能を低下させ、ＣＤ８Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター機能を改善することが示唆された。
【００８８】
より興味深いことに、ＲｅＡＣＴで使用した二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞は、単一特異性ＣＤ８Ｔ細胞と比較して低いレベルの数個の阻害受容体（ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ３およびＰＤ−１）を発現し（図５Ｊ）、これらの再活性化されたＣＤ８Ｔ細胞が、抗腫瘍機能の強化およびより低い消耗表現型を与える可能性があることを示唆した。これらの結果は、集合的に、腫瘍内細菌感染が、ＴＭＥにおける免疫抑制を大きく逆転し（９、１９）、抗腫瘍特性のより大きい二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を腫瘍部位に補充することができることを示す。
【００８９】
考察
【００９０】
遺伝子操作されたＴ細胞の養子細胞移入も、病原体に基づく癌ワクチンも、癌を治療する有望な戦略である。しかし、養子移入されたＴ細胞は非効率的に腫瘍に遊走し、免疫抑制性ＴＭＥにおいて容易にエフェクター機能を失う。病原体に基づくワクチンは、腫瘍において免疫抑制を逆転することができるが、腫瘍根絶を与えるのに十分な規模およびクローンの種類で腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞を誘導する効率が低い。この研究で、本発明者らは両方の手法の力を組み合わせ、前臨床モデルで固形腫瘍を治療するための革新的な戦略である、ＲｅＡＣＴを開発した。ＲｅＡＣＴは、免疫抑制性ＴＭＥを解除するだけでなく、腫瘍特異的Ｔ細胞を増殖させ、腫瘍部位に遊走させるために、病原体を使用する。本発明者らは、原発腫瘍根絶において、いずれかの処置単独と比較して、この組み合わせの手法の強化された抗腫瘍効力を実証した。より重要なことには、ＲｅＡＣＴから治癒したマウスは、その後の同じ腫瘍の再負荷からマウスを保護する免疫記憶も獲得する。
【００９１】
ＡＣＴと病原体に基づく癌ワクチンをともに橋渡しするために、本発明者は、二重特異性Ｔ細胞を製造するために病原性抗原を認識する第２のＴＣＲを用いて腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞を遺伝子操作した。いくつかの研究により、二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞の増殖の増強および耐久性が、担腫瘍マウスの抗腫瘍活性および全体的な生存を明らかに上昇させたことが示された。それにもかかわらず、腫瘍はこれらの適用で根絶されなかった（１２、２１−２３）。病原体が全身投与された（２３）かまたは使用されなかった（１２、２１、２２）かのいずれかであったことを考慮すると、これはおそらく二重特異性Ｔ細胞の腫瘍への非効率的な遊走および変わらない免疫抑制性腫瘍微小環境に起因する。その上、ＲｅＡＣＴにおける二重特異性Ｔ細胞生成の１つの重要な特徴は、病原体特異的ＴＣＲを腫瘍反応性Ｔ細胞に与えることである。これは、病原体（ＥＢＶ、ＣＭＶおよびインフルエンザウイルス）反応性Ｔ細胞に１つの腫瘍特異的ＴＣＲを与える以前の研究とは正反対である（２１−２３）。本発明者らの手法は、腫瘍制御の能力を増加させるために、複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的にするポリクローナル二重特異性Ｔ細胞を本発明者らが製造することを可能にする。
【００９２】
Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｃｏｌｅｙは、１世紀前におそらく最初に癌免疫療法を実践した。数十年もの間、膀胱癌および黒色腫を治療するために、患者の免疫系を刺激するために生きている病原体がアジュバント（例えばＢＣＧなど）として使用された（１０、１１）。病原体に基づく免疫療法は、ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇを標的化することによって、抑制性の腫瘍微小環境を解除する強力な自然免疫応答を少なくとも一部分誘導する（９、１９）。しかし、腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖は量とクローンの種類の両方で限られているので、この手法の抗腫瘍効果は一時的であり、長期にわたる抗腫瘍効果を実現できることは稀である（９）。多様な癌を治療するために腫瘍抗原を発現するリステリアなどの組換え細菌を使用する新しい戦略は、臨床試験において有望な効力を示した（９）。この研究において、本発明者らは、病原体に基づく癌ワクチンと二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞のＡＣＴを組み合わせた場合の抗腫瘍効果が、腫瘍抗原を発現する組換えリステリアよりも大きいことを示す。このことは、養子移入された腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞のクローン増殖の規模が内因性Ｔ細胞から得られるよりも大きいことによって説明することができ、そのことは、初期Ｔ細胞によって媒介される死滅が、根絶の成功のために十分に高い用量のＴ細胞が腫瘍内にあることに決定的に依存するという考えを裏付ける（２４）。
【００９３】
要約すると、本発明者らは、固形腫瘍を治療するための新規な免疫療法である、ＲｅＡＣＴを開発し、原理証明の動物実験においてその効力を検証した。ＡＣＴと病原体に基づくワクチンの両方が癌治療において広く使用されていることを考えると、この組み合わせ戦略はヒトの様々な悪性腫瘍の治療において大きなトランスレーショナルバリューを有する。
方法
【００９４】
腫瘍細胞株、細菌およびマウス
【００９５】
Ｂ１６−Ｆ１０、Ｂ１６−ＯＶＡおよびＥ０７７１は、ＡＴＣＣより入手し、１０％ＦＢＳを添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で培養した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）助成（ｇｒａｎｔｅｅｓ）プログラム（メリーランド州フレデリック）によって入手した。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫の表面に提示されるｇｐ１００のＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｄｂ）制限エピトープを認識するＰｍｅｌ−１  ＴＣＲトランスジェニックマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）から購入した。ＯＶＡ（ＬＭ−ＯＶＡ）およびＧＰ３３（ＬＭ−ＧＰ３３）を発現する組換えリステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＬＭ）は、Ｈａｏ  Ｓｈｅｎ博士（ペンシルベニア大学医学大学院、ペンシルベニア州フィラデルフィア）によって開発され、Ｓｕｓａｎ  Ｋａｅｃｈ博士（イェール大学、コネチカット州ニューヘブン）のご厚意によって提供された。
【００９６】
腫瘍の誘導および再負荷
【００９７】
黒色腫腫瘍は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの片方の側腹部に２×１０５Ｂ１６−Ｆ１０細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって確立され、一方、乳腺腫瘍は、下腹部の第４乳腺の脂肪パッドの近くに３×１０５細胞で注射することによって確立された。その原発Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍が根絶したマウスに、１×１０５  Ｂ１６−Ｆ１０細胞を片方の側腹部に再負荷し、１×１０５  Ｅ０７７１細胞を反対側の側腹部から第４乳腺の脂肪パッドに再負荷した。原発腫瘍の根絶は、最初の処置の後の腫瘍のクリアランスから少なくとも６〜８週後に、目に見えて触知できる腫瘍塊がないことによって評価した。年齢と性別の一致したナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを対照として使用した。腫瘍増殖は、一日おきにカリパスで測定することによってモニターし、長さ×（幅）２／２として腫瘍容積を計算した。
【００９８】
二重特異性腫瘍反応性Ｔ細胞の生成のためのレトロウイルス形質導入および養子Ｔ細胞移入
【００９９】
Ｔ細胞でＯＴ−Ｉオボアルブミン特異的ＴＣＲを発現させるためのレトロウイルス上清を生成するために、２９３Ｔ細胞に、ＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ＭＩＧ）プラスミドか、ＭＩＧ−ＯＴ−ＩベクターのいずれかをｐｃＬＥｃｏエコトロピックパッケージングプラスミドとともにトランスフェクトした。同時に、脾細胞をＰｍｅｌ−１マウスから回収し、２４ウェルプレートに５×１０６細胞／ウェルで播種し、１０ｎＭ  ｇｐ１００（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに２４時間培養した後、調製したレトロウイルス上清を用いてスピン形質導入した。形質導入の後、これらの細胞を最初の培地でさらに２日間培養し、ＰＢＳで洗浄した。１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７および１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５を含有するＴ細胞培地でさらに３日培養した後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現によって規定される陽性に形質導入された細胞を移入用に選別した。
【０１００】
ＡＣＴを伴う実験に関して、マウスに、最初の腫瘍接種の少なくとも７日後に５×１０５の選別されたＰｍｅｌ−１＋単一特異性またはＯＴ−Ｉ＋Ｐｍｅｌ−１＋二重特異性ＣＤ８Ｔ細胞を投与した。同時に、これらのマウスに１×１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬＭ−ＯＶＡかまたはＰＢＳを腫瘍内注射した。
【０１０１】
ポリクローナル腫瘍反応性ＣＤ８Ｔ細胞の生成
【０１０２】
骨髄細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、２００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ３Ｌを含む１０％  ＦＣＳ  ＲＰＭＩ培地中で１週間培養した。７日目に、ＤＣを回収し、以前に記載されるように（１７）、１の腫瘍細胞等価物に対して１のＤＣの比（すなわち１：１）で凍結融解した腫瘍溶解物とともにインキュベートした。インキュベーションの１８時間後に、ＤＣを回収し、ＬＰＳとともに４時間成熟させた。成熟したＤＣと精製したＣＤ８Ｔ細胞を１：２の比で混合し、低用量のＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）とともに２４時間培養した。その後、活性化したＣＤ８Ｔ細胞を形質導入し、上記のように継代培養した。
【０１０３】
固形腫瘍からの免疫細胞の単離
【０１０４】
切開した腫瘍組織を小片に切断し、０．７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＸＩ（シグマ−アルドリッチ）および３０ｍｇ／ｍｌのＩＶ型ウシ膵ＤＮアーゼ（シグマ−アルドリッチ）で４５分間３７℃で消化させた。免疫細胞を、リンパ球細胞分離培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｓ）による遠心分離によって単離した。
【０１０５】
ＭＤＳＣ抑制アッセイ
【０１０６】
前に記載されたように（２５）、脾臓ＣＤ８Ｔ細胞を、マウスＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて単離し、９６ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルで播種し、抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体で刺激した。同時に、ＣＤ１１ｂ＋骨髄系細胞を蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって腫瘍から選別し、これらのウェルに様々な比（１：１６、１：８、１：４および１：２）で添加した。４８時間のインキュベーションの後、３Ｈ−チミジン（１μＣｒ／ウェル）を添加し、１６時間インキュベートした。Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６を用いて細胞を収集し、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター（パーキンエルマー、英国ビーコンズフィールド）によって計数した。
【０１０７】
統計分析
【０１０８】
グラフを作成し、統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。図１Ｃの全体的な腫瘍増殖を一元配置分散分析によって分析し、腫瘍のないマウスの二次負荷の後の比較をログランク（Ｌｏｇ−ｒａｎｄ）検定によって求めた。ダンの多重比較試験を用いるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓを用いて、異なる処置群から得た個々の腫瘍増殖曲線を比較した。スピアマンの順位相関係数試験を用いて、異なる処置を受けたマウスの腫瘍サイズと細胞組成の間の関連を求めた。その他の全ての比較に関して、ｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【０１０９】
参考文献
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２０．Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩ，Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ，Ｂｒｏｎｔｅ  Ｖ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１２；１２（４）：２５３−６８．
２１．Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ＭＨ，Ｈｏｏｇｅｂｏｏｍ  Ｍ，Ｈａｇｅｄｏｏｒｎ  Ｒ，Ｋｅｓｔｅｒ  ＭＧ，Ｗｉｌｌｅｍｚｅ  Ｒ，Ｆａｌｋｅｎｂｕｒｇ  ＪＨ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４；１９９（７）：８８５−９４．
２２．Ｌｏｕｉｓ  ＣＵ，Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ，Ｄｏｔｔｉ  Ｇ，Ｐｕｌｅ  Ｍ，Ｙｖｏｎ  Ｅ，Ｍｙｅｒｓ  ＧＤ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１８（２３）：６０５０−６．
２３．Ｍｕｒｐｈｙ  Ａ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ  ＪＡ，Ｂｒｏｗｎ  ＬＥ，Ｔｅｎｇ  ＭＷ，Ｍｏｅｌｌｅｒ  Ｍ，Ｘｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００７；１４（５）：４９９−５０８．
２４．ＭｃＧｒａｙ  ＡＪ，Ｈａｌｌｅｔｔ  Ｒ，Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｄ，Ｓｗｉｆｔ  ＳＬ，Ｚｈｕ  Ｚ，Ｔｅｏｄｅｒａｓｃｕ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｓｔｉｇａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１４；２２（１）：２０６−１８．
２５．Ｈａｖｅｒｋａｍｐ  ＪＭ，Ｃｒｉｓｔ  ＳＡ，Ｅｌｚｅｙ  ＢＤ，Ｃｉｍｅｎ  Ｃ，Ｒａｔｌｉｆｆ  ＴＬ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｔｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；４１（３）：７４９−５９．
２６．Ｍａｒｃｅｌａ  Ｖ．Ｍａｕｓ，Ｓｔｅｐｈａｎ  Ａ．Ｇｒｕｐｐ，Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｐｏｒｔｅｒ，Ｃａｒｌ  Ｈ．Ｊｕｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ＣＡＲｓ  ｔａｋｅ  ｔｈｅ  ｆｒｏｎｔ  ｓｅａｔ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ａｐｒ  ２０１４，１２３（１７）２６２５−２６３５；
２７．Ｖａｎｄａｎａ  Ｋａｌｉａ，Ｓｕｒｏｊｉｔ  Ｓａｒｋａｒ，Ｓｈｒｕｔｉ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｗ．Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｈａｉｎｉｎｇ，Ｋｅｎｄａｌｌ  Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｒａｆｉ  Ａｈｍｅｄ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２Ｒα  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｖｉｒｕｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆａｖｏｒｓ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３２，Ｉｓｓｕｅ  １，２９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０，Ｐａｇｅｓ  ９１−１０３
２８．Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｅ．Ｐｉｐｋｉｎ１，Ｊｉｌｉａｎ  Ａ．Ｓａｃｋｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｃｒｕｚ−Ｇｕｉｌｌｏｔｙ１，Ｍａｔｈｉａｓ  Ｇ．Ｌｉｃｈｔｅｎｈｅｌｄ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ａｎｊａｎａ  Ｒａｏ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３２，Ｉｓｓｕｅ  １，２９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０，Ｐａｇｅｓ  ７９−９０．
２９．Ｍａｕｄｅ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７１，１５０７−１５１７（２０１４）．
３０．Ｒｕｔｈ  Ｇａｎｓｓ  ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｈａｎａｈａｎ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃａｎ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５  １９９８（５８）（２０）４６７３−４６８１．
３１．Ｒｕｔｈ  Ｇａｎｓｓ，Ｅｄｕａｒｄ  Ｒｙｓｃｈｉｃｈ，Ｅｒｎｓｔ  Ｋｌａｒ，Ｂｅｒｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｕｎｔｅｒ  Ｊ．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｔｒｉｇｇｅｒ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｍａｒｃｈ  １  ２００２（６２）（５）１４６２−１４７０．
３２．Ｎａｔａｌｉｏ  Ｇａｒｂｉ，Ｂｅｒｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｓｉａｍｏｎ  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｇｕｎｔｅｒ  Ｊ．Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ａｎｄ  Ｒｕｔｈ  Ｇａｎｓｓ．ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ：  ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ａｓ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ｒｅｎｄｅｒ  Ａｕｔｏｃｈｔｈｏｎｏｕｓ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４  １７２：５８６１−５８６９．
３３．Ｂａｒｎａｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｒ．Ｊ．＆  Ｂａｎｋｅｒｔ，Ｒ．Ｂ．Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎ  ３，２９−４７（２０１０）．
３４．Ｂｅｌｌｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ａ．Ｗａｙｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｏ  Ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｉｔｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ３，２３１（２０１３）．
３５．Ｃｕｒｉｅｌ，Ｔ．Ｊ．Ｔｒｅｇｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｈｉｎｋｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，１１６７−１１７４（２００７）．
３６．Ｔａｎｇｙｉｎｇ  Ｌｕ，Ｒｕｐａｌ  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓｏｎｅｒ  Ａｌｔｉｏｋ，Ｊｅ−Ｉｎ  Ｙｏｕｎ，Ｐｉｎｇｙａｎ  Ｃｈｅｎｇ，Ｅｓｔｅｂａｎ  Ｃｅｌｉｓ，Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｐｉｓａｒｅｖ，Ｓｉｍｏｎ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．Ｓｐｏｒｎ，ａｎｄ  Ｄｍｉｔｒｙ  Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ．Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１（１０）：４０１５−４０２９．
３７．Ｄｕｎｇ  Ｔ．Ｌｅ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｍ．Ｊａｆｆｅｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ：Ａ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｊｕｌｙ  １５  ２０１２（７２）（１４）３４３９−３４４４；
３８．Ｐｏｅｈｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９，Ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ａｕｇｕｓｔ  ２００９，ｐｐ．６７３−６８２（１０）．
３９．Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｓ．Ｋｏ，Ａｒｎｏｌｄ  Ｈ．Ｚｅａ，Ｂｒｉａｎ  Ｉ．Ｒｉｎｉ，Ｊｏａｎｎａ  Ｌ．Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｐａｕｌ  Ｅｌｓｏｎ，Ｐｅｔｅｒ  Ｃｏｈｅｎ，Ａｌｉ  Ｇｏｌｓｈａｙａｎ，Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ａ．Ｒａｙｍａｎ，Ｌａｕｒａ  Ｗｏｏｄ，Ｊｏｒｇｅ  Ｇａｒｃｉａ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｄｒｅｉｃｅｒ，Ｒｏｎａｌｄ  Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｈ．Ｆｉｎｋｅ．Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  Ｍｙｅｌｏｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｍａｒｃｈ  １５  ２００９（１５）（６）２１４８−２１５７
４０．Ｍｏｃｋ，Ｕｌｒｉｋｅ，ｅｔ  ａｌ．「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ｐｒｏｄｉｇｙ．」Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １８．８（２０１６）：１００２−１０１１．
４１．Ｊｉｎ，Ｃｈｕａｎ，ｅｔ  ａｌ．「Ｓａｆｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｎｇ‐ｔｅｒｍ  ｅｐｉｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．」ＥＭＢＯ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１６）：ｅ２０１５０５８６９．
４２．Ａｎ，Ｎａ，ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．」Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７．９（２０１６）：１０６３８−１０６４９．
４３．Ｒｅｎ，Ｘｕｅｑｕｎ，ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＣＡＲｓ）ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．」Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ６４．１２（２０１５）：  １５１７−１５２９．
４４．Ｏｌｄｈａｍ，Ｒｏｂｙｎ  ＡＡ，Ｅｌｌｉｏｔ  Ｍ．Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ａ．Ｍｅｄｉｎ．「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．」Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ７．３（２０１５）：２７１−２８４．
４５．Ｕｒｂａｎｓｋａ，Ｋａｔａｒｚｙｎａ，ｅｔ  ａｌ．「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２．１（２０１４）：１．
４６．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｐｒｉｃｅ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｅｄｓ．Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｂｅｒｉｎｇｅｒ．Ｖｏｌ．１．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６．
【０１１０】
配列表についての陳述
本出願は、コンピュータ可読形態で同時に提出される配列表を含む。この配列表は参照により本明細書に援用される。
【図１Ａ】
2019500028.tif 000003
【図１Ｂ】
2019500028.tif 000004
【図１Ｃ】
2019500028.tif 000005
【図１Ｄ】
2019500028.tif 000006
【図２Ａ−Ｂ】
2019500028.tif 000007
【図３Ａ】
2019500028.tif 000008
【図３Ｂ】
2019500028.tif 000009
【図３Ｃ】
2019500028.tif 000010
【図３Ｄ】
2019500028.tif 000011
【図４Ａ】
2019500028.tif 000012
【図４Ｂ】
2019500028.tif 000013
【図４Ｃ】
2019500028.tif 000014
【図４Ｄ】
2019500028.tif 000015
【図４Ｅ】
2019500028.tif 000016
【図４Ｆ】
2019500028.tif 000017
【図５Ａ】
2019500028.tif 000018
【図５Ｂ】
2019500028.tif 000019
【図５Ｃ】
2019500028.tif 000020
【図５Ｄ−Ｅ】
2019500028.tif 000021
【図５Ｆ】
2019500028.tif 000022
【図５Ｇ】
2019500028.tif 000023
【図５Ｈ】
2019500028.tif 000024
【図５Ｉ】
2019500028.tif 000025
【図５Ｊ】
2019500028.tif 000026
【図６Ａ】
2019500028.tif 000027
【図６Ｂ】
2019500028.tif 000028
【図７Ａ】
2019500028.tif 000029
【図７Ｂ】
2019500028.tif 000030
【図７Ｃ】
2019500028.tif 000031
【図７Ｄ】
2019500028.tif 000032
【図８Ａ】
2019500028.tif 000033
【図８Ｂ】
2019500028.tif 000034
【図８Ｃ】
2019500028.tif 000035
【図８Ｄ−Ｅ】
2019500028.tif 000036
【図９Ａ】
2019500028.tif 000037
【図９Ｂ】
2019500028.tif 000038
【配列表】
2019500028000001.app
【国際調査報告】
2019500028.tif 000039
2019500028.tif 000040
2019500028.tif 000041