(57)【要約】  本発明は肝性脳症を治療するための、１日の用量として少なくとも１００ｍｇのビオチンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に投与される１日当たりのビオチンの量が少なくとも１００ｍｇである、肝性脳症の治療または予防に使用するためのビオチン。
【請求項２】
前記肝性脳症がＣ型肝性脳症である、請求項１に記載のビオチン。
【請求項３】
前記肝性脳症が持続性Ｃ型肝性脳症である、請求項２に記載のビオチン。
【請求項４】
前記肝性脳症が一過性Ｃ型肝性脳症である、請求項２に記載のビオチン。
【請求項５】
前記肝性脳症が潜在性Ｃ型肝性脳症である、請求項２に記載のビオチン。
【請求項６】
肝硬変を有する患者における肝性脳症の予防に使用するためのビオチンであって、患者に投与される１日当たりのビオチンの量が少なくとも１００ｍｇである、前記ビオチン。
【請求項７】
前記患者に投与される１日当たりのビオチンが１００〜７００ｍｇの間の量で含まれてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項８】
前記患者に投与される１日当たりのビオチンが少なくとも３００ｍｇの量である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項９】
前記患者に投与される１日当たりのビオチンが１００ｍｇ〜３００ｍｇの間の量で含まれてなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１０】
経口投与に好適な形態である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１１】
ゲルカプセル剤、錠剤（任意にフィルムコーティングされたもの）、ロゼンジ剤またはピル剤の形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１２】
ビオチンおよび賦形剤を含んでなり、かつ他の任意の有効成分を含まない組成物の形態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１３】
前記賦形剤が、タルク、微結晶性セルロース、ラクトースおよびマンノースからなる群から選択される、請求項１０に記載のビオチン。
【請求項１４】
注射投与に好適な形態である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１５】
持続放出組成物の形態である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１６】
前記ビオチンによる治療が少なくとも３か月の期間を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１７】
前記ビオチンによる治療が少なくとも６か月の期間を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１８】
前記ビオチンによる治療が少なくとも１年の期間を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のビオチン。
【請求項１９】
肝性脳症の治療において同時に、別々に、または連続的に（長期間にわたって）使用するための、ビオチンと、肝性脳症に対する少なくとも１種の別の薬物との組成物。
【請求項２０】
前記別の薬物が、ラクツロース、ラクチトール、ネオマイシン、メトロニダゾール、リファキシミン、およびＬ−オルニチンとＬ−アスパルテートとの組み合わせ（ＬＯＬＡ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝性脳症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
門脈体循環性脳障害としても知られている肝性脳症（Hepatic encephalopathy：ＨＥ）は、急性または慢性の肝不全の重篤な合併症である。
【０００３】
患者は、様々な神経学上および神経精神病学上の異常に苦しむ（固定姿勢保持困難（asterixis）、錯乱、意識水準の変化、肝不全の結果としての昏睡）。
【０００４】
肝硬変の間に、肝性脳症は患者の生存に悪影響を与える。末期の肝臓病で死亡する患者の約３０％は重症の脳障害および迫り来る昏睡を経験する。
【０００５】
結果的に、肝性脳症の経済的負担が実質的であり、その理由としては米国では肝硬変の患者の入院の理由の２番目に一般的な理由であるためである。
【０００６】
肝性脳症は根本的な原因によってＡ型、Ｂ型およびＣ型に細分化することができる。
【０００７】
Ａ型（＝急性）は急性肝不全に関連する、典型的には脳浮腫に関連する肝性脳症を表す。急性肝不全は、先在する肝臓病を有していなかった人における肝機能の急速な低下（数日および数週間以内）である。急性肝不全は、一般的にパラセタモール（アセトアミノフェン）過量摂取、投薬（例えば、テトラサイクリン、トログリタゾン）への特異体質反応、自己免疫要因、ウイルス性肝炎（ＡまたはＢ型肝炎）、妊娠時の急性脂肪肝から引き起こされ、または特発性になり得る。
【０００８】
Ｂ型（＝バイパス）は関連する内因性肝臓病がなく門脈体循環短絡によって引き起こされる。よって血液が肝臓をバイパスし、したがってアンモニウムのように有毒になり得る血液物質を代謝させて取り除くことができない。通常Ｂ型は先天異常の結果としておよび／または浸潤的方法または外傷の結果として生じる。
Ｃ型（＝肝硬変）は肝硬変を有する患者に生じる。肝硬変は瘢痕化（繊維症）が成長した場合の慢性肝炎の末期である。肝硬変の主な原因は次のとおりである：
−慢性アルコール中毒症
−慢性ウイルス性肝炎（Ｂ型、Ｃ型およびＤ型）によって引き起こされるウイルス性感染
−ＮＡＳＨ（Non Alcoholic Steato Hepatitis）（非アルコール性脂肪肝炎）などの代謝障害
−アルファ−１−アンチトリプシン欠損症、ガラクトース血症および糖原病
−ウィルソン病およびヘモクロマトーシスなどの遺伝性疾患
−原発性胆汁胆管炎（primary biliary cholangitis：ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis：ＰＳＣ）などの疾患に起因する胆汁性肝硬変
−処方薬に対する重篤な反応または環境的毒素への長期的な被曝によって引き起こされた中素性肝炎
−肝臓うっ血を伴う心不全の繰り返し起こる発作。
【０００９】
Ｃ型ＨＥは一過性（症状の発現の間、神経の正常状態に戻る）、持続性（神経の正常状態へ戻らない）および潜在性脳障害に細分することができる（Bajaj, Aliment Pharmacol Ther. 2010 Mar;31(5):537-47）。
【００１０】
潜在性脳障害は、臨床的に顕著な認知機能障害に結びつかないが、神経心理学的検査を使用して証明できる脳障害であり、生活の質を損ない、かつ交通事故に巻き込まれる危険性を増加させることが実証されてきた。
【００１１】
潜在性ＨＥは、肝硬変（cirrrhosis）を有する患者の３０〜７０％に影響を与えるかもしれず、顕著なＨＥ（一過性または持続性のいずれか）は肝硬変を有する患者の３０〜４５％で生存している間に観察される。
【００１２】
ＨＥは潜在性であったとしても、死亡率の独立した（independant）リスクであることが着目される。
【００１３】
肝性脳症の生理病理学は依然として議論されているが、多くの仮説が研究されている。アンモニアは、全身性炎症および血液脳関門上の特定の担体の変化と一緒に、中心的な重要な役割を有しているかもしれない。肝性脳症は通常肝臓によって取り除かれる血流中の有害物質、特にアンモニアの蓄積の結果であり得る。アンモニア血症はＨＥを引き起こすのには十分ではない。ＨＥが生じるには、特に血液脳関門の変化による、増加した血液アンモニアおよび炎症の両方の組み合わせが必要であって、これが有害物質の大脳内の蓄積および神経伝達の変調につながるという仮説が立てられている。
【００１４】
肝性脳症の治療
現在の最も特効的な治療は、腸のアンモニア発生および結果として生じる高アンモニア血症を減少させることを目指している。
【００１５】
急性肝性脳症中に、ラクツロース（ベータ−ガラクトシドフルクトース）またはラクチトール（ベータ−ガラクトシドソルビトール）を患者に与えて通過を促進させかつ腸のアンモニア発生を阻害する。これらは、腸内細菌によって乳酸および他の有機酸に分解される、非吸収性二糖類である。ラクツロースは、経口的に１日１回または２回で、３０ｍＬの用量で患者に投与され、用量は患者において観察される耐性または副作用によって増加または減少させてもよい。
【００１６】
高用量のラクツロース（８時間ごとに６０ｍＬ）は重篤な肝性脳症の患者に投与してもよい。ラクツロースは再発を防止するために肝性脳症の初回の発現の後に与えられる。
【００１７】
またアンモニア産生細菌量を減少させるために様々な抗生物質が使用される。通常、ラクツロースでの治療が十分に効果的でない場合や、二次的予防において抗生物質（Antiobiotics）を使用する。
【００１８】
ネオマイシン、メトロニダゾール、リファキシミン、経口バンコマイシン、パロモマイシン、および経口キノロンを使用することができる。リファキシミンは広範囲の抗菌活性を有するリファンピンの非吸収性誘導体である。それは、細菌の腸内転移を低減させることによって、高アンモニア血症を含む内毒素血症を軽減することができる。多くの試みにおいて使用され、リファキシミンの効果は良好な耐性を有しながら対比薬品と同等またはそれ以上であった。推奨された薬量学は１日２回５５０ｍｇである。
【００１９】
最近、尿素代謝の先天異常の治療に使用された療法が肝性脳症（hepathic encephalopathy）の患者においても使用され始めたが、いまだに正式には推奨されていない。これらには以下のことが含まれる。
・２つの構成アミノ酸である、Ｌ−オルニチンおよびＬ−アスパルテート（ＬＯＬＡ）の安定した塩を使用して、アンモニア排除を増加させることができる。それはラクツロースおよび／またはリファキシミンと組み合わせてもよい。
・安息香酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、およびフェニル酪酸グリセロールを、肝性脳症の治療に使用してもよい。安息香酸ナトリウムの経口量は１日２回約５ｇであるが、より少ない用量（１週間に３回２．５ｇ）でも肝性脳症の症状から患者を回復させる助けとなり得る。フェニル酪酸グリセロールは１日２回６ｍｌの経口量で使用してもよい。
【００２０】
栄養障害または不十分な食事摂取の場合には栄養上の介在が必要である。赤身肉に由来したタンパク質ではなく野菜タンパク質を食し、鶏肉および魚肉のタンパク質を食することが好ましいかもしれない。また治療食を分枝状鎖のアミノ酸で補うことも推奨される。高アンモニア血症を改善する可能性として亜鉛の投与を採用してもよく、硫酸亜鉛および酢酸亜鉛は、毎日経口で６００ｍｇの用量で投与することができる。また肝性脳症の症状を改善するため、特に硬変の患者にＬ−カルニチンを使用してもよい。
【００２１】
ＷＯ２０１１／１２４５７１には、視力障害、具体的には視神経萎縮と関係する障害の治療のために高用量（１００〜６００ｍｇ／日の範囲）でビオチンを使用することが記載されている。この出願で実際に記載されている視力障害が特定の白質脳症（つまり脳白質の関与）と関係する症状であることに着目するべきである。この文章ではビオチンをＨＥの治療に使用することができることを記載してもいないし示唆もしていない。
【００２２】
ＷＯ２０１４／０１６００３には、多発性硬化症（multiple sclerosis：ＭＳ）、脳卒中およびＸ連鎖副腎脳白質ジストロフィー（X-linked adrenoleukodystrophy：Ｘ−ＡＬＤ）、具体的には副腎脊髄神経障害（adrenomyeloneuropathy：ＡＭＮ）の治療のための高用量（約１００〜６００ｍｇ／日）でのビオチンの使用が記載されている。
ＷＯ２０１４／１７７２８６には、ビオチンがＡＭＮの治療に有用であるというエビデンスが提供されている。
【００２３】
ＷＯ２０１６１５１１３２には、ビオチンが筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis：ＡＬＳ）の治療に有用であるというエビデンスが提供されている。
【００２４】
Ｎａｇａｍｉｎｅら（J Gastroenterol. 1995 Jun;30(3):351-5; and Nihon Shokakibyo Gakkai Zasshi. 1989 Jul;86(7):1519-24）およびＪＰＨ０１２２６８１４Ａは、ウレアーゼまたは酢酸アンモニウムを投与することによってラット中の急性高アンモニア血症を引き起こした。別のモデルでは、ＣＣｌ４を単独で高用量注入することにより急性肝不全が引き起こされた。著者らは、この動物急性肝不全モデルにおいてビオチンの血清アンモニウムレベルを減少させる能力に気づいた。経口投与された場合に、ビオチンの量は調整されず、腹腔内注射された場合の単回用量は０．５ｍｇ／ｋｇ  ＢＷ（体重）であった（Ｎａｇａｍｉｎｅ、１９８９年）。Ｎａｇａｍｉｎｅ（１９９５）でも、ビオチンの用量（単一の腹腔内注射として提供）は非常に低かった。
【００２５】
ＪＰＨ０１２２６８１４Ａでは、ビオチンは単独（signle）腹腔内注射として１ｍｇのビオチンが提供されている。報告された結果は、ヒトについて１日当たり数ミリグラム（約５〜１０ｍｇ）の範囲における使用用量である。しかしながら、患者について報告された結果は決定的ではない。確かに、ＨＥを有する患者の血清におけるアンモニアレベルおよび全身状態には高い自然変動がある。表７および８には、患者が受けた他の治療に対しての調整および情報なしに１０日間で得られたデータのみが報告されている。患者２から、最初の５日の間では、この間に患者は一切のビオチンを受け取らなかったもののアンモニアレベルが高く変動（増加および減少）したことが見られる。また患者３でも、４８〜９６日目の間に、この間にビオチンを患者に投与しなかったものの、アンモニアレベルが十分に減少したことも事実である。したがってこれらの患者においてアンモニアレベルおよびＨＥの制御のためのビオチンの実際の役割に関する結論に達する可能性はない。
【００２６】
さらに、そこで２０年以上前に報告された結果にもかかわらず、Ｃ型肝性脳症を治療または予防するためのビオチンに基づく薬が開発されることも、市場で提案されることもなかったことに着目すべきである。
【００２７】
特に、Ｂａｊａｊによる検証（2010, Aliment Pharmacol Ther 31, 537-547）では、ビオチンをＣ型肝性脳症の治療に使用することができる製品として言及していない。
【発明の概要】
【００２８】
本発明の文脈では、肝性脳症に苦しむ患者の病態を改善するために、はるかに高い用量でビオチンを使用することが提案されている。
高用量(先行技術で示されたものより高用量)のビオチンが、肝性脳症治療に有用であり得ること、病気の進行を終局的に制限することができること、さらにそのいくつかの症状を正常化させることさえもできることは特に新しく驚くべきことである。
【発明の具体的説明】
【００２９】
したがって、本発明は、肝性脳症の治療または予防でのビオチンの使用であって、非常に好ましくはビオチンが高用量（つまり１日当たり少なくとも１００ｍｇ）で使用される、使用に関する。それは、１００ｍｇを超える１日用量で好ましくは使用される。
【００３０】
本発明のさらなる主題は、その肝性脳症の治療でのビオチンを含有している組成物の使用、同様に肝性脳症の治療のための薬の生産または製造のためのビオチンの使用である。特に、薬は特に経口投与によって使用された場合にビオチンを２０ｍｇ以上、より好ましくは４０ｍｇ以上、より好ましくは５０ｍｇ以上、より好ましくは７０ｍｇ以上、より好ましくは約またはちょうど１００ｍｇ含有するものとする。
【００３１】
したがって本発明の教示では、肝性脳症に苦しむ患者へビオチン投与することを含む治療方法を実現することが可能になる。したがって本発明はまた、肝性脳症に苦しむ患者の、ビオチンを当該患者へ投与する工程を含む治療方法に関する。ビオチンの用量の例および治療計画は下記で開示する。
【００３２】
ビオチンは、単独で使用しても肝性脳症（またはその症状）を治療するために使用される別の化合物と組み合わせて使用することもできる。
【００３３】
したがって本発明は、肝性脳症の治療におい同時に、別々に、または連続的に（数時間にわたって広がる）に使用するための、ビオチンおよび別の肝性脳症に対する薬物を含有している組成物も含む。
【００３４】
また本発明は、肝性脳症に苦しむ患者の治療方法であって、当該患者にビオチンを提供する工程、および場合により（しかし好ましくは）当該患者に肝性脳症の症状に対して緩和をもたらすのに有用な別の薬を提供する工程を含む方法を記載しかつそれに関する。
【００３５】
ビオチンは特に認識上および精神上の処理速度、記憶、ならびに運動制御および連携を改善するために使用することができる。
【００３６】
またビオチンでの治療は、患者の体重の増加につながる場合もある。
【００３７】
持続性、一過性または潜在性であるかにかかわらず、ビオチンはＣ型肝性脳症の治療に好ましくは使用される。しかしながら、Ａ型またはＢ型肝性脳症の患者において、病態が正常に戻る前に症状を軽減するためにビオチンを使用してもよい。Ａ型患者へのビオチンの投与することで、これら患者が肝臓移植を受けるまで、より長時間待機することが可能になり、および／またはそれを受ける際により良好な状態になることが可能になるだろう。
【００３８】
またビオチンは肝性脳症の発現を予防するために使用することもできる。特に、そのような予防は肝硬変の診断を受けた患者に有用であり、それは彼らがＨＥの発現を既に示している（つまり、彼らが一過性のＨＥまたは持続性のＨＥを有する）か、または彼らがＨＥの診断を受けていない（ＨＥ症状の発現を一切示していないか、ＨＥの臨床的兆候を示していない）ので潜在性ＨＥを有しているかまったくＨＥを有していないかに関係はない。
【００３９】
高用量のビオチンは、既にＨＥの発現を提示した患者においてＨＥの二次発現を防止するために特に興味深い。
【００４０】
上記の疾患の治療のため、または上記の疾患の治療のための薬の調製のために、ビオチンは以下のように使用してもよい。
【００４１】
ビオチンは、治療上有効な量（それは一般に高用量、即ち１日当たり約１００ｍｇまたはちょうど１００ｍｇである）で投与されることが好ましい。最大の用量が実際に想定されていなくても、後者は一般に１日当たり、５００ｍｇ、６００ｍｇまたは７００ｍｇを超過するべきでない。これによって、患者の病態の改善および／または患者の病態の悪化の阻止もしくは軽減を観察することが可能になる。
【００４２】
そのようにして、医師は患者の体重によって用量を決定してもよい。特に少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日に等しい用量、好ましくは３ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは５ｍｇ／ｋｇ／日、または少なくとも７．５ｍｇ／ｋｇ／日に等しい用量、または約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量さえも患者に投与される。
【００４３】
したがって患者に投与するビオチンは好ましくは１日当たり１００〜７００ｍｇの間、通常１日当たり１００〜５００ｍｇの間、または１日当たり１００〜６００ｍｇの間、より好ましくは１日当たり１００〜３００ｍｇの間、通常１日当たり約３００ｍｇまたは３００ｍｇちょうどである。したがって１日当たり少なくとももしくは約もしくはちょうど１００ｍｇ、または１日当たり少なくとももしくは約もしくはちょうど１５０ｍｇ、または一層１日当たり少なくとももしくは約もしくはちょうど２００ｍｇ、または１日当たり少なくとももしくは約もしくはちょうど２５０ｍｇ、または１日当たり少なくとももしくは約もしくはちょうど３００ｍｇを投与されることが可能である。
【００４４】
好まれる１つの特定の実施態様では（特に患者による使用の容易さの問題のためには）、ビオチンは経口投与に適した形態である。したがって、これは経口投与のための組成物を含み、これには少なくとももしくは約もしくはちょうど２０ｍｇ、好ましくは少なくとももしくは約もしくはちょうど４０ｍｇのビオチン、またはさらに少なくとももしくは約もしくはちょうど５０ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど７５ｍｇ少なくとももしくは約もしくはちょうど１００ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど１５０ｍｇ、または少なくとももしくは約もしくはちょうど２５０ｍｇのビオチン、または少なくとももしくは約もしくはちょうど３００ｍｇのビオチンが含まれる。この組成物は好ましくは製薬学的用途であるので薬剤である。この組成物の各用量単位が、有効成分として少なくとももしくは約もしくはちょうど２０ｍｇ、好ましくは少なくとももしくは約もしくはちょうど４０ｍｇ、またはさらに少なくとももしくは約もしくはちょうど５０ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど１００ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど１５０ｍｇ、または少なくとももしくは約もしくはちょうど２５０ｍｇのビオチン、または約もしくはちょうど３００ｍｇのビオチンを含有している。
【００４５】
ビオチンの合計用量は１日に１回、または複数回の摂取によって投与してもよい。特にビオチンは１日当たり２回または３回の摂取を通じて取られてもよい。ビオチンが食事時間ごろに摂取される場合、およびビオチンの量が各摂取につき実質的に同一である場合が好ましい。
【００４６】
本明細書に記載される疾患は時間とともに悪化する慢性疾患であることに着目すべきである。したがって最も効果的にするにはビオチンでの治療は長期間行われることが好ましく、これによって新しいHE発現の発生を防止し、それがもたらすあらゆる改善を安定させる。従って、ビオチンでの当該治療の存続時間は少なくとも３か月である場合が好まれしい。ビオチンでの当該治療の存続時間が少なくとも６か月である場合がさらに好ましい。示されるように、そのような治療は新しいHE発現の発生を防止し、ビオチンをもたらし、かつ治療効果を安定させ得る改善を増強させるために可能な限り延長させてもよい。特に、ビオチンでの治療の持続期間は少なくとも１年である。治療について想定される終了はなく、患者は必要な限り、および患者の病態を安定または改善させる限りビオチンを摂取することが期待されている。
【００４７】
1つの特定の実施態様では、経口投与用のための組成物は、他の有効成分がなく単独の有効成分としてのビオチン、ならびに賦形剤を含有している。
【００４８】
賦形剤は単純な担体としての役割を果たすことが意図された（即ち、生物活性を有することが意図されていない）製剤の一部である任意の化合物を意味すると理解されるべきである。
【００４９】
この組成物は当技術分野において知られた任意の形態であってよい。特に、それはゲルカプセル剤、錠剤（場合によりフィルムコーティングされたもの）、ピルまたはロゼンジ剤の形態をしている。別の実施態様では、それはシロップの形態をしている。当該シロップは、単位用量当たりに少なくとももしくは約もしくはちょうど２０ｍｇ、好ましくは少なくとももしくは約もしくはちょうど４０ｍｇ、または一層少なくとももしくは約もしくはちょうど５０ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど７５ｍｇ、または少なくとももしくは約もしくはちょうど１００ｍｇのビオチンを含有している。このシロップ中のビオチンの濃度は、患者に投与されることが望まれている単位用量に依存する。 
【００５０】
当業者によって使用することができる賦形剤は当技術分野において公知である。タルク（Ｅ５５３ｂ）、微結晶性セルロース、ラクトース、マンノース、デンプン（特にコーンスターチ）、ステアリン酸マグネシウム（Ｅ５７２）、およびステアリン酸（Ｅ５７０）を選択することができる。このリストは包括的ではない。
【００５１】
この組成物がゲルカプセル剤の形態で調整されている場合、好ましい賦形剤は微結晶性セルロースである。
【００５２】
組成物がフィルムコーティング錠の形態である場合、当該フィルムコーティング錠はヒプロメロース（Ｅ４６４）、エチルセルロース、マクロゴール、タルク（Ｅ５５３ｂ）二酸化チタン（Ｅ１７１）、または酸化鉄（Ｅ１７２）などの当技術分野において知られた任意の物質から形成されてもよい。
【００５３】
また有効成分は着色（コチニールなどの任意の許容可能な着色剤によって）させてもよく、それによってビオチンが賦形剤中によく分散されていることを確認することが可能になる。
【００５４】
ビオチンの血漿半減期が短い（約２時間）という事実を前提として、徐放（または持続放出（slow sustained））の形態を想定してもよい。
【００５５】
当該持続放出組成物は当技術分野において知られていて、特にＷＯ２０１１／０７７２３９に記載されている。特に、当該持続放出組成物はビオチンを単独でまたは１種以上の有効成分と一緒に含む持続放出マトリックスを含んでいてもよい。
【００５６】
特定の実施態様において、持続放出組成物は、即時放出を可能にするマトリックスを含み、当該マトリックスは、ビオチンを単独でまたは１種以上の他の有効成分と一緒に含み、持続放出は放出修飾マトリックスまたはコーティングによって達成される。
【００５７】
したがって、持続放出組成物は、ビオチンの即時放出および異なった（持続）放出を提供し得る。
【００５８】
特定の実施態様において、持続放出は浸透圧により動く（osmotically driven）放出システムによって達成してもよい。
【００５９】
別の実施態様では、持続放出組成物は、ビオチン、場合により１種以上の有効成分、および場合により医薬賦形剤を含むコア、ならびに１つ以上の外側層を含み、外側層は、1種以上の持続放出剤を含む。
【００６０】
別の実施態様では、ビオチンは、注射による投与を可能にする形態であってもよく：これには単位用量当たりに少なくとももしくは約もしくはちょうど２０ｍｇ、好ましくは少なくとももしくは約もしくはちょうど４０ｍｇ、または一層少なくとももしくは約もしくはちょうど５０ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど７５ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど１００ｍｇ、少なくとももしくは約もしくはちょうど１５０ｍｇ、または少なくとももしくは約もしくはちょうど２５０ｍｇのビオチンを含有している注射可能な組成物を含んでいる。
【００６１】
この注射可能な組成物は、ビオチン、ならびに許容可能な賦形剤を含有しているバイアルの形態でもよい。ビオチンの濃度は想定されているバイアルの容量によって調節される。ビオチン溶解度を改善するための特定の添加剤を使用することができる。
【００６２】
注射可能な組成物の製造に使用することができる賦形剤は当技術分野において公知である。具体的にはリン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム（Ｅ５５０ｉ）、ｐａｒａ−ヒドロキシ安息香酸メチル（Ｅ２１８）およびｐａｒａ‐ヒドロキシ安息香酸プロピル（Ｅ２１６）を言及してもよく、これらは当業者が決定できる割合で一緒に使用することができる。使用される水は注射用水である。注射は好ましくは筋肉内に実施される。また静脈内で実施することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、対照（偽手術（sham））ラットまたは胆管結紮された(bile duct ligated：ＢＤＬ）ラットの血清中のＡＳＡＴ（Ａ）、ＡＬＡＴ（Ｂ）、ビリルビン（Ｃ）およびアルブミン（Ｄ）のレベルを示す図である。
【図２】図２は、ＮＨ３が富化された水がない、またはある、対照またはＢＤＬラットの６分間のコンパートメント（comportmental）解析を示す図である。Ａ．総距離；Ｂ．平均速度；Ｃ．活性期間（動物が受動的ではなく活動的である間の時間）；Ｄ．ゾーン変更の数；Ｅ．飼育の番号；Ｆ．飼育の合計期間。
【図３】図３は、対照（偽手術）ラットもしくはＢＤＬラット（Ａ）中、または油（対照）もしくはＣＣｌ４を注入されたラット（Ｂ）での血液アンモニア血症を示す図である。
【図４】図４は、対照（油）またはＣＣｌ４を注入されたラットの血清中のＡＳＡＴ（Ａ）、ＡＬＡＴ（Ｂ）、ビリルビン（Ｃ）、およびアルブミン（Ｄ）のレベルを示す図である。
【図５】図５は対照（油）およびＣＣｌ４を注入されたラットの６分間のコンパートメント（comportmental）解析を示す図である。Ａ．総距離；Ｂ．平均速度；Ｃ．活性期間（動物が受動的ではなく活動的である間の時間）；Ｄ．ゾーン変更の数；Ｅ．飼育の番号；Ｆ．飼育の合計期間。
【図６】図６は偽薬またはビオチン（食事中３００ｍｇ／ｋｇ、これはラットで３０ｍｇ／ｋｇ  体重／日またはヒトで３００ｍｇ／日の１日用量に相当）が給餌された対照またはＢＤＬラットの血液アンモニア血症を示す図である。
【図７】図７は、ビオチン抜きの食事またはビオチンでの食事（ヒトにおいて３００ｍｇに相当する用量）が給餌された対照（偽手術）またはＢＤＬラットの６分間のコンパートメント（comportmental）解析を示す図である。Ａ．総距離；Ｂ．平均速度；Ｃ．活性期間（動物が受動的ではなく活動的である間の時間）；Ｄ．ゾーン変更の数；Ｅ．飼育の番号。
【図８】図８は、ビオチンが富化された食事でないか、またはビオチンが富化された食事（２用量はヒトにおける５０ｍｇまたは３００ｍｇの１日用量に相当）の対照およびＢＤＬラットの６分間のコンパートメント（comportmental）解析を示す図である。Ａ．総距離；Ｂ．平均速度；Ｃ．活性期間（動物が受動的ではなく活動的である間の時間）；Ｄ．ゾーン変更の数；Ｅ．飼育の番号。
【図９】図９は、デキストランに結合させたＴｅｘａｓ  ＲｅｄのＣＮＳ内への浸透から観察された血液脳関門透過性を示す図である。Ａ．ＮＨ３が富化した水でないかＮＨ３が富化した水での対照およびＢＤＬラット。Ｂ．ＮＨ３が富化した食事でないかＮＨ３が富化した食事での対照（油）およびＣＣｌ４が注入されたラット。
【図１０】図１０は、デキストランに結合させたＴｅｘａｓ  ＲｅｄのＣＮＳ内への浸透から観察された血液脳関門透過性を示す図である。Ａ．ビオチンが富化された食事でないかまたはビオチンが富化された食事（３００ｍｇ／ｋｇの食物）での対照およびＢＤＬラット。Ｂ．ビオチンが富化された食事でないかまたはビオチンが富化された食事（５０ｍｇ／ｋｇの食物）での対照（油）およびＣＣｌ４が注入されたラット。
【図１１】図１１は、ＮＨ３富化水での、またはＮＨ３富化水でない、対照動物、ＢＤＬ動物およびＣＣｌ４動物における血清ＩＦＮガンマ（Ａ）またはＴＮＦアルファ（Ｂ）の測定（Mesure）を示す図である。ＨＥ＋：肝性脳症のコンパートメント（comportmental）な兆候を示す動物；ＨＥ−：肝性脳症の兆候を示さない動物。
【図１２】図１２は、ＮＨ３富化水および／またはビオチン（３００ｍｇ／ｋｇの食物）での、あるいはＮＨ３富化水および／またはビオチンでない、対照動物、ＢＤＬ動物における血清ＩＦＮガンマ（Ａ）またはＴＮＦアルファ（Ｂ）またはＩＬ６（Ｃ）の測定（Mesure）を示す図である。
【実施例】
【００６４】
実施例１−ラット胆管結紮モデルと高アンモニア血症性（ＮＨ３富化）水の研究
−胆管結紮（ＢＤＬ）を有するラットは、関連する酸化ストレスおよび繊維成長を伴う胆汁うっ滞性肝疾患のモデルである。
−これらのラットは、２週間以内の繊維症の発症および４〜６週間以内の胆汁性肝硬変の進行を伴う進行性の肝損傷を発現する。
−高アンモニア血症性のサプリメントを与えると、より多くの胆管結紮ラットが脳障害を発現する。
【００６５】
ビオチンの効果は、臨床効果に関して高アンモニア血症性水で処理した胆管結紮ラットにおいてオープンフィールドでの配向性および体重増加量の点から評価した。
【００６６】
「臨床」評価：
−５個体ずつのラット４グループ：１）対照食、対照水のいずれか；２）対照食、高アンモニア血症性（ＮＨ３富化）水のいずれか；３）ビオチン補給食、対照水のいずれか；および４）ビオチン補給食、高アンモニア血症性水のいずれかで処理した偽手術ラット。
−１０個体のラット４グループ：１）対照食、水のいずれか；２）対照食、高アンモニア血症性水のいずれか；３）ビオチン補給食、対照水のいずれか；および４）ビオチン補給食、高アンモニア血症性水のいずれかで処理した胆管結紮ラット。
−使用されるビオチンの用量は、ヒトの用量の３００ｍｇ／日と同等である体重１ｋｇ／１日当たりに３０ｍｇである。
−ビオチンはドライフード中に混合させて送達する。
−「臨床」検証：
○体重
○オープンフィールド（配向）
−治療開始：手術から３日目
−ラットが肝硬変である場合、治療を６週間継続する。
−血液脳関門透過性は研究の終了時に評価する。
【００６７】
この実験は、慢性ＨＥのモデルにおいて、臨床的改善、血液脳関門の弱体化および代謝正常化の点から高用量のビオチン治療の効果を評価することを可能にする。
【００６８】
実施例２−ラットの肝性脳症の別のモデルは肝臓繊維症により引き起こされたＣＣｌ４と高アンモニア血症性水のモデルである
−ＣＣｌ４を投与されたラットは、遊離基産生により媒介される肝毒性を有する。
−これらのラットは、８週間以内に肝硬変の進行を伴う進行性の肝損傷を発現する。
−高アンモニア血症サプリメントが与えられると、より多くのＣＣｌ４で処理されたラットが脳障害になる。
【００６９】
実施例１に記載されているようなものと同一の臨床試験計画がこれらの動物にも適用された。
【００７０】
実施例３−詳細な資料および方法
動物
成体雄ウィスターラット（外科手術の開始時には体重１７５〜２００ｇ）をＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ（ル・ジュネスト＝サン＝ティスル）から得て全ての実験に使用した。
【００７１】
胆管結紮
胆管結紮（ＢＤＬ）を胆汁性肝硬変モデルとして使用した。このグループのラットは全て手術を受けた。それらは、ランダムに２つのグループに分離させた：ＢＤＬまたは単純な開腹術（偽手術、対照群）。以前に記載したように(Kountouras J, Prolonged bile duct obstruction : a new experimental model for cirrhosis in the rat ; Br J Exp Pathol 1984）ＢＤＬ手順を行い、我々の研究室で管理した。
【００７２】
外科手術は、空気と３％混合させた吸入イソフラン(Aerrane、Baxter Maurepas)での完全麻酔下で行った。無痛覚症は、手術直前および直後に２％ブプレノルフィン（buprenorphin）の皮下注射（Ｂｕｐｒｅｃａｒｅ  ０．３ｍｇ／ｍｌ、Ａｘｉｅｎｃｅ）によって行われた。
【００７３】
動物は週に二回検査し、体重を毎週計測した。動物はすべて６週間維持して外科手術が続いた。
【００７４】
ＣＣｌ４
結果の対照を得るために、四塩化炭素（ＣＣｌ４）による慢性中毒からなる別の肝硬変モデルを使用したによるにあって使用された；ウィスターラットは、鉱油において８週間の間ＣＣｌ４を１ｍｌ／ｋｇ体重、週に２度受け取った。対照は、ＣＣｌ４のない鉱油を受け取った。処理は、鎮静剤の使用をすることなく、ポリエチレン・カテーテルを使用して、強制的に胃内に投与した。
【００７５】
この実験で使用したＣＣｌ４の用量は、より急性の肝損傷（Ａ型ＨＥ）のモデルであるＮａｇａｍｉｎｅで使用された用量を下回る。
【００７６】
現在のモデルでは、より長い時間でより低用量を使用することによって擬態の進行性（pregressive）肝臓損傷をより改善させ、したがってＣ型ＨＥを改善させることを可能にする。
【００７７】
肝性脳症
肝性脳症罹患率を増加させることを目標に、高タンパク/アンモニア生成（ammoniagenic）食品サプリメント（ＮＨ３富化サプリメント）を６〜８週間（肝硬変モデルに従い）添加する診療を行った(Wright et al, Hepatology 2007, Jun;45(6):1517-26)。ＮＨ３治療は外科手術またはＣＣｌ４手順の３日後に開始した。それは、水と混合させたヘモグロビン分子（４ｇ／ｋｇ／ｇ；ＥＦラット高アンモニア血症ＡＡ混合物粗製タンパク質、８８．９％、ＳＳＮＩＦＦ）のアミノ酸組成物を模倣する、個々に適した混合物からなるものであった。ラットには２つのボトルが与えられ、１つは水のみが入っていて、もう１つには治療薬（treatment）が入っていた。
【００７８】
この投薬計画の目的は慢性高アンモニア血症を生産することであった。
【００７９】
ラットのグループ４つが、ＢＤＬ、偽手術、ＣＣｌ４および油のうち、このＮＨ３富化治療を受けた。
【００８０】
肝性脳症に対する治療
リファキシミンは、ラクツロースと関連したＨＥの再発を予防するためのヒトに妥当であることが確認された経口の非吸収性抗生物質である。正確な作用機序はよく知られていないが、その腸の微生物群に対しる役割を理由に、高アンモニア血症および細菌転座を減少させることが推定されている。
【００８１】
それによって、ＨＥの２つの主要な要因、高アンモニア血症および全身性炎症に対する役割を果たすことができる。
【００８２】
リファキシミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）は５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で水と混合し、手術の３日後に開始した。
【００８３】
ラットの４グループはリファキシミン（ＲＦＸ）を受け取った：ＢＤＬ、偽手術、ＢＤＬ＋ＲＦＸ、偽手術＋ＲＦＸ。
【００８４】
また、尿素回路の遺伝性障害において妥当であることが確認された安息香酸ナトリウムを２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で水と混合して手術の３日後に開始した。
【００８５】
ビオチンは、５０ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇのフードを用量として、アニマルフード中に混合して与えられ、これは動物１個体／１日当たりに５ｍｇ／ｋｇまたは動物１個体／１日当たりに３０ｍｇ／ｋｇ、およびヒトにおける５０ｍｇまたは３００ｍｇの１日用量に相当する。
【００８６】
動物はＨＥを１回しか発現せずにＨＥが進行すると胆管結紮が続いた後にすぐに死亡するために、ビオチンは、ＨＥの誘発に先立って動物に提供されたことに注意すべきである。したがって、この動物モデルでは、第二のＨＥ発現を予防するためのビオチンの性能を研究するために手術後にビオチンを提供することができない。血液脳関門透過性を研究するために動物を殺処分（sacrified）したために動物の生存率は研究されなかった。 
【００８７】
挙動試験
肝性脳症を評価するために、ＢＤＬラットにおいて有効である挙動試験であるオープンフィールド試験（ＢｉｏＳｅｂ）を使用して神経学的欠陥を調査した（Leke, Plos One 2012;7(5)）。試験は、標準実験条件（時間、場所、明度、騒音）下で、殺処分の日に行われた。ラットをそれぞれ正方形１ｍ２の箱に入れて、６分間の間領域（arena）を自由に歩き回らせた（explore）。２つの領域、中央および周辺、四角の中に定めた。運動性パラメーターを三次元カメラによって登録した。６分間の実験後に分析されたデータは：移動した総距離（ｃｍ）、運動の時間（ｓ）、速度（ｃｍ／ｓ）、ゾーン変更の数、中心および周囲ゾーンにおいて移動した距離、中心および周囲ゾーンにおいて費やした時間、飼育数、飼育の合計期間である。
【００８８】
デキストランＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを使用したＢＢＢ透過性の決定
ＢＢＢの整合性は、接合したデキストランＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の血管内区画からの管外遊出を測定することによって検証した。
【００８９】
手術から６週間後に、すべてのラットに３％の吸入（inhaleted）イソフラン（isofluran）の麻酔をかけた。大腿静脈に０．７５ｍｌの螢光色素（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  １０ｋＤａ  １０ｍｇ／ｍｌ）を注射し、６分間循環させた。その後、我々は中央開腹術によって下大静脈内の血液サンプル（２ｍｌ）を採取した。血管内の局所的染料を除去するために、我々は、大規模な開胸術を行い、３００ｍｌの冷ＰＢＳ（蠕動ポンプで４０ｍｌ／分）を、左心室を通してかん流させた。
【００９０】
断頭術後、脳を素早く摘出し、小脳から嗅球および脳幹を除去した。
【００９１】
右脳半球を激しく撹拌させて遠心分離することによって粉砕した後に、上澄み中の蛍光性デキストラン（μｇ／ｇ）の量を、蛍光分析（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）によって５８８ｎｍの励起で６２０ｎｍにて測定した。染料の含有量は標準曲線における補間によって評価した。
【００９２】
生化学的分析および組織学的分析
殺処分中に採取した血液サンプルを遠心分離機にかけ、血漿を使用して肝性トランスアミナーゼのレベル、ならびに合計した接合したビリルビンおよびアンモニアのレベルを決定した。血漿サイトカイン（ＩＬ６、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ）は市販の多重キットによって決定した。
【００９３】
殺処分後、肝臓を抽出して計量した；その後、我々は器官の生検を行い、繊維症状態を決定し、１０％のホルマリンに固定した後にＳｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色によって肝硬変を確認した。
【００９４】
ＢＤＬラットについてＭＥＴＡＶＩＲスコアがＦ４でなかった場合、これらの動物は分析から除外した。
【００９５】
統計分析
データはすべて中間＋／−標準偏差として提示され、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、ｖ５．０ｃ）で分析を行った。グループ間の差異は一元配置分散分析（分散分析（ＡＮＯＶＡ））を使用して比較した。ＡＮＯＶＡが有意なグループ間差異を同定した場合、グループ間（integroup）比較にＤｕｎｎｅｔｔの試験を使用した。
【００９６】
差異は、ｐが０．０５より劣っていた場合に統計的に有意であると考えられた。
【００９７】
実施例４−結果
−ＢＤＬおよびＣＣｌ４ラットモデルの両方ともが肝硬変を有していた。ＭＥＴＡＶＩＲスコアで分類されたＦ４には広範な繊維化および破壊された肝実質の構造が観察された。一貫して、２つのモデルにおいて血漿肝性マーカーが変更され、２つのモデル間の差異は、肝臓疾患の原因を反映していた。ＢＤＬでは、優勢な変質作用は高ビリルビン血症であった一方で、ＣＣｌ４では、トランスアミナーゼ（ＡＳＡＴとＡＬＡＴ）上昇（図１および４）であった。ＢＤＬおよびＣＣｌ４ラットモデルの両方が高アンモニア血症（図３）を発現していた。
−オープンフィールド試験では、ＢＤＬラットが神経学的障害を発現したことが示された：偽手術ラットと比較して、移動した総距離が顕著により短く、活動の期間がより短く、速度がより遅く、飼育がより少なく、かつ短かったことが観察された。これらの異常はＣＣｌ４ラットには見出されなかった。これは、ＢＤＬラットがオープンフィールド試験でＨＥを呈示したがＣＣｌ４ラットは呈示しなかったことを示唆する（図２および５）。
−ビオチン治療（３００ｍｇ／ｋｇの食物）でＢＤＬラット中の高アンモニア血症を軽減することができた（図６；ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０１）。
−ビオチンが高用量（３００ｍｇ／ｋｇの食物）でＢＤＬラットに与えられた場合、オープンフィールド試験で観察された神経学的障害はビオチンがないＢＤＬラットと比較して軽減された。分析したパラメーターのうちのいくつか（移動総距離、活動の平均速度および期間）は、偽手術ラットと比較して、ビオチンで処理したＢＤＬラットにおいてほぼ標準化された。したがって、ビオチンを高用量（図７および８は、５０ｍｇ／ｋｇの食物用量は効果を有するほどには高くないことを示す）でＢＤＬラットに与えれば、ＨＥ発生を予防するだろう。結果はリファキシミンまたは安息香酸ナトリウム（図示せず）で観察されたものに類似している。
−ＢＤＬラットは、ＮＨ３富化水が与えられなかった場合でさえも、偽手術と比較して大脳内のデキストラン−ＴｅｘａｓＲｅｄの量が著しく増加していた；この結果は、単に鉱油を受けたものと比較して、ＣＣｌ４ラットにおいては確認されなかった（図９および１０）。これは、ＢＤＬラットが溶質に対しても増加した血液脳関門透過性を有するであろうということを示唆する。
−ビオチン（３００ｍｇ／ｋｇの食物）での治療は、対照食（図１１）で処理したＢＤＬラットと比較して、大脳内のデキストランの量を正常化することができたが、５０ｍｇ／ｋｇの食物の用量では正常に達しなかった。これは、高用量のビオチンが肝硬変におけるＨＥの間のＢＢＢ透過性の変質作用を予防することができることを示唆する。
−我々の結果では、ＢＤＬおよびＣＣｌ４ラットの両方が肝硬変を発現し、両方が高アンモニア血症を発現したことが示された。しかしながら、ＢＤＬラットはＨＥを呈示し、溶質に対する増加したＢＢＢの透過性を有していたが、ＣＣｌ４ラットは有していなかった。ＢＤＬグループとＣＣｌ４グループとの間で観察された差異は炎症性サイトカイン（図１２および１３）による可能性があった。ＨＥを有するＢＤＬラットでは、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの割合は、他のすべてのラットのグループ（ＨＥを有さないＢＤＬ、偽手術、ＣＣｌ４および油）と比較してより高く観察された。ビオチンで処理したＢＤＬラットでは、血漿中のＩＦＮγレベルが減少した。これらの結果は、高アンモニア血症単独では肝硬変中のＨＥを発現させるのには十分でなく、ＨＥを誘発させるには高アンモニア血症と共に炎症が必要とされるであろうことを裏付けるように思われる。ビオチンは、高アンモニア血症を軽減させること、および直接または間接的に炎症性サイトカイン生成を縮小させることの両方によって、ＨＥを予防するであろう。
【００９８】
要約すると、ＢＤＬラットにおいて、トランスアミナーゼ（ＡＬＡＴとＡＳＡＴ）の僅かな増加、ビリルビンの大幅な増加およびアルブミンの僅かな減少を観察することができる（図１）。
【００９９】
本明細書で開示されたＣＣｌ４モデルは、単一の高用量ショットでの急性高アンモニア血症のモデルである、ＮａｇａｍｉｎｅらまたはＪＰＨ０１２２６８１４Ａで開示されたＣＣｌ４モデルとは異なる。本モデルでは、より綿密に慢性疾患を模倣するために数日にわたり少ない用量のＣＣｌ４を動物に投与した。トランスアミナーゼの非常に大幅な増加、ビリルビンの僅かな増加、アルブミンの無変異を観察することができる（図４）。
【０１００】
モデルにおける両方の動物はアンモニア血症を増加させたが、コンパートメント（comportmental）変質作用を考慮すると、ＢＤＬ動物のみがＨＥを表示し、一方で、そのような変質作用はＣＣｌ４動物において観察されなかった。
【０１０１】
ＢＤＬラットは増加したＢＢＢ透過性を有するがＣＣｌ４ラットは有さないこともさらに観察することができる。
【０１０２】
動物１個体／１日当たりに３０ｍｇ／ｋｇ（ヒトにおける３００ｍｇの１日用量に相当）で提供されたビオチンは、コンパートメント（comportmental）な改善およびＢＢＢ透過性の正常化の点から動物の病態を改善し、したがってＨＥの発現を予防するが、動物１個体／１日当たり５ｍｇ／ｋｇ（ヒトにおける５０ｍｇの１日用量に相当）で提供されたビオチンでは改善しない。
【０１０３】
本明細書および図で報告した日付から、ビオチンがアンモニア血症を軽減させることおよび炎症性プロファイルを調節することによって作用することが仮定される。
【図１】
2019522030.tif 000002
【図２】
2019522030.tif 000003
【図３】
2019522030.tif 000004
【図４】
2019522030.tif 000005
【図５】
2019522030.tif 000006
【図６】
2019522030.tif 000007
【図７Ａ−Ｃ】
2019522030.tif 000008
【図７Ｄ−Ｅ】
2019522030.tif 000009
【図８Ａ−Ｃ】
2019522030.tif 000010
【図８Ｄ−Ｅ】
2019522030.tif 000011
【図９】
2019522030.tif 000012
【図１０】
2019522030.tif 000013
【図１１】
2019522030.tif 000014
【図１２】
2019522030.tif 000015
【国際調査報告】
2019522030.tif 000016
2019522030.tif 000017