(57)【要約】本発明は、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＶＣ）などのポリオーマウイルスを宿主細胞から除去し、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）などのポリオーマウイルス関連疾患を治療するための方法及び組成物を含む。該組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む単離核酸配列を含み、ガイドＲＮＡはポリオーマウイルス中の標的配列に相補的である。【選択図】図１Ａ
2019512458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）をＪＣＶに感染した宿主細胞から除去するのに使用するための組成物であって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及び
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、組成物。
【請求項２】
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとして更に定義される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＪＣＶ  ＤＮＡの前記Ｔ−Ａｇコード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、又は前記ｇＲＮＡの任意の組合せを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９、ヒト最適化Ｃａｓ９、ニッカーゼ変異Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／ｒ１０６０Ａ）又はＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ１であり、前記ＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ２であり、前記ＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ３である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｇＲＮＡ  Ｍ１の前記スペーサー配列が配列番号１、２、３又は４を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ２の前記スペーサー配列が配列番号５、６、７又は８を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ３の前記スペーサー配列が配列番号９、１０、１１又は１２を含めた標的配列に相補的である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣｐｆ１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）をＪＣＶに感染した宿主細胞から除去する方法であって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼとＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的であるスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む組成物で前記宿主細胞を処理するステップ、及び
前記ＪＣＶを前記宿主細胞から除去するステップ
を含む、方法。
【請求項９】
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとして更に定義され、前記方法が、さらに、前記処理するステップ後に、Ｔ−Ａｇのコード領域に位置する前記ＪＣＶ  ＤＮＡの少なくとも１個のセグメントを欠失させるステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＪＣＶ  ＤＮＡの前記Ｔ−Ａｇコード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、又は前記ｇＲＮＡの任意の組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９；ヒト最適化Ｃａｓ９；ニッカーゼ変異Ｃａｓ９；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｍ４９５Ａ；又はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ１であり、前記ＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ２であり、前記ＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｇＲＮＡ  ｍ１の前記スペーサー配列が配列番号１、２、３又は４を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ２の前記スペーサー配列が配列番号５、６、７又は８を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ３の前記スペーサー配列が配列番号９、１０、１１又は１２を含めた標的配列に相補的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼがＣｐｆ１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）をＪＣＶに感染した宿主細胞から除去するのに使用するためのベクター組成物であって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及び
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含み、
前記単離核酸配列が少なくとも１個の発現ベクターに含まれ、
前記少なくとも１個の発現ベクターが、宿主細胞中の前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び前記少なくとも１個のｇＲＮＡの発現を誘導する、
ベクター組成物。
【請求項１６】
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとして更に定義される、請求項１５に記載のベクター組成物。
【請求項１７】
前記ＪＣＶ  ＤＮＡの前記Ｔ−Ａｇコード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、又は前記ｇＲＮＡの任意の組合せを含む、請求項１６に記載のベクター組成物。
【請求項１８】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９；ヒト最適化Ｃａｓ９；ニッカーゼ変異Ｃａｓ９；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｍ４９５Ａ；又はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａから選択される、請求項１７に記載のベクター組成物。
【請求項１９】
前記ＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ１であり、前記ＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ２であり、前記ＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ３である、請求項１８に記載のベクター組成物。
【請求項２０】
前記ｇＲＮＡ  ｍ１の前記スペーサー配列が配列番号１、２、３又は４を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ２の前記スペーサー配列が配列番号５、６、７又は８を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ３の前記スペーサー配列が配列番号９、１０、１１又は１２を含めた標的配列に相補的である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９がＣｐｆ１である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記発現ベクターが、レンチウイルス発現ベクター、薬剤誘発性レンチウイルス発現ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター及びプラスミドベクターからなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び前記少なくとも１個のｇＲＮＡが単一の発現ベクターに組み込まれる、請求項１５に記載の発現ベクター組成物。
【請求項２４】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと前記少なくとも１個のｇＲＮＡが別々のレンチウイルス発現ベクターに組み込まれる、請求項１５に記載の発現ベクター組成物。
【請求項２５】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）感染のリスクがある患者の細胞のＪＣＶ感染を予防する方法であって、
患者がＪＣＶ感染のリスクがあることを判定するステップ、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１個の単離核酸とを含む、有効量の発現ベクター組成物に、ＪＣＶ感染のリスクがある前記患者の細胞を曝露するステップ、
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び前記少なくとも１個のｇＲＮＡを前記患者の前記細胞中で安定に発現させるステップ、及び
前記患者の前記細胞のＪＣＶ感染を予防するステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１個のｇＲＮＡとして更に定義される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及び
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）ゲノム中の標的配列に相補的であるスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１個の単離核酸配列
を含み、
前記単離核酸配列が少なくとも１個の発現ベクターに含まれる、医薬組成物。
【請求項２８】
ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとして更に定義される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記ＪＣＶ  ＤＮＡの前記Ｔ−Ａｇコード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、前記Ｔ−Ａｇコード領域のＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有するｇＲＮＡ、又は前記ｇＲＮＡの任意の組合せを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、野生型Ｃａｓ９；ヒト最適化Ｃａｓ９；ニッカーゼ変異Ｃａｓ９；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｍ４９５Ａ；又はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａから選択される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記ＴＭ１領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ１であり、前記ＴＭ２領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ２であり、前記ＴＭ３領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記ｇＲＮＡがｇＲＮＡ  ｍ３である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ｇＲＮＡ  Ｍ１の前記スペーサー配列が配列番号１、２、３又は４を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ２の前記スペーサー配列が配列番号５、６、７又は８を含めた標的配列に相補的であり、前記ｇＲＮＡ  ｍ３の前記スペーサー配列が配列番号９、１０、１１又は１２を含めた標的配列に相補的である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９がＣｐｆ１である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記発現ベクターが、レンチウイルス発現ベクター、薬剤誘発性レンチウイルス発現ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター及びプラスミドベクターからなる群から選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）関連障害を有する対象を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
前記ＪＣＶ関連障害が進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）感染の治療又は予防用キットであって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列と１個以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１個の核酸配列とを含む測定量の組成物であって、前記１個以上のｇＲＮＡの各々がＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む組成物、及び
包装材料、使用説明書を含む添付文書、無菌流体、シリンジ及び無菌容器からなる群から選択される１個以上の物品
を含む、キット。
【請求項３８】
前記発現ベクターがレンチウイルス発現ベクターである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ポリオーマウイルスに感染した宿主細胞からポリオーマウイルスを除去する方法であって、
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼとポリオーマウイルスＤＮＡ中の標的配列に相補的であるスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含む組成物で前記宿主細胞を処理するステップ、及び
前記ポリオーマウイルスを前記宿主細胞から除去するステップ
を含む、方法。
【請求項４０】
ポリオーマウイルスＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する前記少なくとも１個のｇＲＮＡが、前記ポリオーマウイルスＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとして更に定義される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＭＨ０９３２７１、Ｒ０１ＮＳ０８７９７１及びＰ３０ＭＨ０９２１７７の米国政府支援によって成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００２】
技術分野
本発明は、ポリオーマウイルス、例えば、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルスなどのヒト向神経性ポリオーマウイルス中の標的配列を特異的に切断する組成物に関する。こうした組成物は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）関連エンドヌクレアーゼ及び１種以上の特定のガイドＲＮＡ配列を含むことができ、向神経性ポリオーマウイルス感染対象に投与することができる。
【背景技術】
【０００３】
ヒト向神経性ポリオーマウイルス、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）は、致死的な脱髄疾患、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）の病原体である。中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）のグリア細胞におけるＪＣＶの溶解感染は、脳において髄鞘の産生を担う細胞である乏突起膠細胞の死を招く。これは、広範な中度から重度の神経障害をもたらし、最終的に死に至る（Ｂｅｒｇｅｒ、２０１１）。ＰＭＬには幾つかの病因があるが、すべてがあるレベルの免疫系の障害を含む。
【０００４】
該疾患は、最初、主にリンパ球増殖性及び骨髄増殖性疾患患者に見られるまれな障害と認識されたが（Ａｓｔｒｏｅｍ他、１９５８）、ＡＩＤＳの大流行の発生によってＰＭＬの発生率が大きく増加した。ＨＩＶ−１感染症及びＡＩＤＳは、依然としてＪＣＶの再活性化に対して最も多い免疫不全状況であり、ＰＭＬ症例の約８０％を占める（Ｔａｖａｚｚｉ他、２０１２）。免疫抑制療法は、活性なＪＣＶ感染症のもう一つの引き金になっている。ナタリズマブ（Ｃｈａｋｌｅｙ及びＢｅｒｇｅｒ、２０１３）、エファリツマブ（Ｓｃｈｗａｂ他、２１０２）及びリツキシマブ（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ他、２０１１）を含めて、新しい治療用免疫調節モノクローナル抗体を用いた多発性硬化症、関節リウマチなどの自己免疫異常の治療は、ＰＭＬの病因と認識されている（Ｎａｇａｙａｍａ他、２０１３）。
【０００５】
ＪＣＶは、ウイルスのポリオーマウイルス科の一つであり、そのゲノムは、サイズ５．１ｋｂの二本鎖環状ＤＮＡで構成され、該ウイルスは、ウイルス感染の初期、すなわちＤＮＡ複製前、及び感染サイクルの後期に、２クラスのタンパク質を産生する（ＤｅＣａｐｒｉｏ他、２０１３）。初期遺伝子と後期遺伝子の間に位置する双方向コード配列は、ウイルス遺伝子発現を担い、ウイルスＤＮＡ複製の起点を含む。ウイルス初期タンパク質、ラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）、及びより小型のＴ−Ａｇタンパク質ファミリーは、選択的スプライシングによって産生され、その複製サイクル中にウイルスを組織化する調節的役割を果たす。特に、ラージＴ抗原は、ウイルスＤＮＡ複製の開始、及びウイルス後期遺伝子転写の刺激を担い、したがって、ウイルス生活環のすべての側面に重要である。さらに、ＪＣＶ  Ｔ−Ａｇは、細胞培養において形質転換能力を示し、動物モデルにおけるその発現は、他のウイルスタンパク質の非存在下で、神経起源の腫瘍を誘発する（総説については、Ｗｈｉｔｅ及びＫｈａｌｉｌｉ、２００４を参照されたい）。Ｔａｇは、ｐ５３、ｐＲｂなどの幾つかの細胞タンパク質に結合し、細胞増殖を調節不全にし、したがって幾つかの動物モデルにおいて潜在的に細胞の形質転換及び腫瘍の形成をもたらす。後期タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３並びにアグノプロテインとして知られる小型調節タンパク質である（Ｋｈａｌｉｌｉ他、２００５）。血清疫学的研究によれば、ＪＣＶ感染症は、世界中の個体群で極めて一般的であり、初感染は、通常、小児期に起こる（Ｗｈｉｔｅ及びＫｈａｌｉｌｉ、２０１１）。ＪＣＶ感染症の血清有病率が高く、ＰＭＬが珍しいことは、免疫系が、ウイルスを持続的な無症候状態で維持できることを示唆している。というのは、免疫機能の変化は、ＰＭＬの素因になるすべての状況の根底にあると思われるからである。
【０００６】
幾つかの治療選択肢がＰＭＬに適用されたが、ほとんど成功しなかった（Ｔａｖａｚｚｉ他、２０１２）。種々の手法が、ウイルス生活環における侵入、複製などの様々なポイントを標的にしている。ＪＣＶとセロトニン２Ａ受容体（５−ＨＴ２ＡＲ）の相互作用がウイルス侵入に必要であることが報告されたので（Ｅｌｐｈｉｃｋ他、２００４）、５ＨＴ２ＡＲに結合するリスペリドンが研究されたが、効果のないことが判明した（Ｃｈａｐａｇａｉｎ他、２００８）。シドフォビルなどのウイルス複製の小分子阻害剤が生体外及び生体内で試験されたが、相反する結果が得られた（Ａｎｄｒｅｉ他、１９９７、Ｈｏｕ及びＭａｊｏｒ、１９９８）。代わりの戦略の選択肢がこの致死的脱髄疾患の治療に至急必要であることは明らかである。
【０００７】
根絶のためにＪＣＶウイルスゲノムを標的にする新しい戦略は、特に魅力的である。この戦略は、活発に複製するウイルスと、ウイルスが休眠状態か、又はウイルスタンパク質が発現されず、若しくは極めて低レベルで産生される、持続性ウイルスの両方を効果的に標的にすることができる。加工ヌクレアーゼ技術の最近の進歩によって、この治療戦略が臨床ですぐに可能になるという見通しが立った。例としては、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ：ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）、及びより最近では、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）関連９（Ｃａｓ９）が挙げられる（Ｇａｊ他、２０１３）。
【０００８】
特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＤＮＡ編集系に基づくツール及び技術によって、ゲノム編集をこれまでになく制御することができる（Ｍａｌｉ他、２０１３、Ｈｓｕ他、２０１４）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、細菌及び古細菌の適応免疫系から開発され、短いガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる特定の核酸の切断を誘導する（Ｂｈａｙａ他、２０１１）。切断、通常、平滑末端二本鎖切断は、通常、不完全なＤＮＡ修復に起因する、ひと続きのＤＮＡの欠失、挿入及び切除を引き起こす。
【０００９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＤＮＡ編集系は、頚癌細胞における発癌性ヒト乳頭腫遺伝子Ｅ６及びＥ７を不活性化するのに使用され（Ｋｅｎｎｅｄｙ他、２０１４）、肝内Ｂ型肝炎ゲノムテンプレートの排出を生体内で促進するのに使用された（Ｌｉｎ他、２０１４）。より最近では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ＨＩＶ−１プロウイルスを潜伏感染細胞から除去し、新しいＨＩＶ−１感染を予防できることが報告された（Ｈｕ他、２０１４）。残念ながら、ｇＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ攻撃によるＪＣＶを標的にした系はまだ開発されていない。ＪＣＶ遺伝子中の特定の標的を切断し、ＪＣＶゲノムの完全性を破壊し、したがってＪＣＶを宿主細胞から除去するＣＲＩＳＰＲ／エンドヌクレアーゼ組成物及び方法が大いに必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＪＣＶに感染した宿主細胞からＪＣＶを除去するのに使用するための組成物を提供する。該組成物は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及びＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ｇＲＮＡの好ましい標的配列は、ＪＣＶ  ＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）遺伝子、特にＴ−ＡｇのＴＭ１、ＴＭ２及びＴＭ３領域にある。
【００１１】
本発明は、ＪＣＶに感染した宿主細胞からＪＣＶを除去する方法も提供する。該方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとを含む組成物で宿主細胞を処理するステップ、及びＪＣＶを宿主細胞から除去するステップを含む。
【００１２】
本発明は、さらに、ＪＣＶに感染した宿主細胞からＪＣＶを除去するのに使用するためのベクター組成物も提供する。ベクター組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及びＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡを含む。単離核酸配列は、宿主細胞中のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び少なくとも１個のｇＲＮＡの発現を誘導する少なくとも１個の発現ベクターに含まれる。
【００１３】
本発明は、さらに、ＪＣＶ感染のリスクがある患者の細胞のＪＣＶ感染を予防する方法も提供する。該方法は、患者がＪＣＶ感染のリスクがあることを判定するステップ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１個のｇＲＮＡをコードする少なくとも１個の単離核酸とを含む有効量の発現ベクター組成物に患者細胞を曝露するステップ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを患者の細胞中で安定に発現させるステップ、並びに患者の細胞のＪＣＶ感染を予防するステップを含む。
【００１４】
本発明は、ＪＣＶを哺乳動物対象の細胞から除去するための医薬組成物も提供する。医薬組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及びＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡをコードする少なくとも１個の単離核酸配列を含む。好ましい一実施形態においては、単離核酸配列は、少なくとも１個の発現ベクターに含まれる。
【００１５】
本発明は、さらに、対象に有効量の上記医薬組成物を投与するステップを含む、進行性多巣性白質脳症などのＬＣＶ関連障害を有する対象を治療する方法も提供する。
【００１６】
本発明は、さらに、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なｇＲＮＡとを含む測定量の１種以上の上記組成物を含む、ＪＣＶ感染症の治療又は予防用キットも提供する。キットは、使用説明書、無菌容器、シリンジなどの１個以上の物品も含む。
【００１７】
本発明は、ＪＣＶ以外のポリオーマウイルスをウイルスの宿主細胞から除去する方法も提供する。該方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとポリオーマウイルスＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとを含む組成物で宿主細胞を処理するステップ、及びポリオーマウイルスを宿主細胞から除去するステップを含む。好ましくは、標的配列は、特定のポリオーマウイルスのラージＴ抗原をコードする領域に位置する。
【００１８】
好ましい実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓ９；ヒト最適化Ｃａｓ９；ニッカーゼ変異Ｃａｓ９；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）；ＣＰＦ１；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ４９５Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｍ６９４Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｈ６９８Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｌ１６９Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｙ４５０Ａ；ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ  Ｄ１１３５Ｅ  Ｍ４９５Ａ；又はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａから選択される。
【００１９】
本特許又は出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面（単数又は複数）を含むこの特許又は特許出願の複製は、請求次第、かつ必要な手数料の支払い次第、米国特許商標庁によって提供される。
【００２０】
本発明の他の効果は、容易に認識され、添付図面に関連して考察すると、以下の詳細な説明を参照してより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＪＣＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティング用ガイドＲＮＡの設計を示す図である。図１Ａは、示したＪＣＶ  Ｔ−Ａｇ（Ｔ）のコード領域内の異なる位置で設計された３種のｇＲＮＡ（ＴＭ１、ＴＭ２及びＴＭ３）を示す。Ｔ−Ａｇコード領域は、５１３０ｎｔ環状Ｍａｄ−１  ＪＣＶゲノム（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００１６９９．１；Ｆｒｉｓｑｕｅら、１９８４）のヌクレオチド（ｎｔ）５０１３から始まり、反時計回りにｎｔ２６０３に進む。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＪＣＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティング用ガイドＲＮＡの設計を示す図である。図１Ｂは、３個の標的部位（太字及び赤で強調）の各々におけるＪＣＶゲノムの配列が与えられたことを示す。最上部の鎖の配列は、時計回りであり、Ｔ−Ａｇのコード領域に対してアンチセンスであることに留意されたい。というのは、Ｔ−Ａｇが反時計回りに転記され、最下部に示されている（センス鎖）からである。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）配列の位置を青色イタリックで示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ｇＲＮＡ  ｍ１及びｍ２の発現が、Ｔ−Ａｇ及びＣａｓ９を導入したＴＣ６２０細胞において、Ｔ−Ａｇ発現及びＴ−Ａｇ誘導ＪＣＶ後期遺伝子発現を減少させたことを示す図である。図２Ａ：ＴＣ６２０細胞にＪＣＶＬ−ＬＵＣレポータープラスミド及びＣａｓ９用発現プラスミドを、Ｔ−Ａｇ及び示したように単独又は組み合わせの図１に示したｇＲＮＡの各々の発現プラスミドと一緒に、又は発現プラスミドなしで、導入した。細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性を実施例１に記載のように分析した。レポータープラスミドのみを導入した細胞（レーン１）に対して活性を規準化した。図２Ｂ：図２Ａで言及した細胞抽出物をウエスタンブロットによってＴ−Ａｇ、Ｃａｓ９及びα−チューブリン（添加対照）の発現について分析した。図２Ｃ：図２Ｂに示したウエスタンブロットをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアによって定量化し、Ｔ−Ａｇ単体（レーン２）に対して規準化されたヒストグラムとして示した。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ  ｍ１を発現するＳＶＧＡのクローン誘導体は、ＪＣＶ感染を支援する能力が低下していることを示す図である。図３Ａ：ＳＶＧＡ細胞にＣａｓ９又はＣａｓ９＋ｇＲＮＡ  ｍ１を導入し、安定なクローン細胞系を選択した。３種のクローンを選択し、ＪＣＶ感染について分析した（ｍｏｉ＝１、７日間）：親ＳＶＧＡ細胞に対してＣａｓ９単体を有する１種のクローン及びＣａｓ９＋ｇＲＮＡ  ｍ１を有する２種のクローン（クローン８及び１０）。ウイルス感染をウエスタンブロットによってＶＰ１及びアグノプロテインについてα−チューブリンを添加対照として評価した。図３Ｂ：図３Ａにおける実験からの培養上清中のウイルスをＱＰＣＲによって定量化した。図３Ｃ：ＳＶＧＡＣａｓ９及びＳＶＧＡＣａｓ９ｍ１ｃ８のＣａｓ９発現をウエスタンブロットによってβ−チューブリンを添加対照として分析した。図３Ｄ：ＴＣ６２０細胞にＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９用発現プラスミドを導入し、免疫細胞化学を「材料及び方法」に記載のように抗ＦＬＡＧ抗体を用いて実施した。核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で標識した。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、Ｃａｓ９及びＪＣＶ特異的ｇＲＮＡの一過性導入後のＴ−Ａｇ遺伝子切断の直接証明を示す図である。組み込まれたＴＡｇ遺伝子を共に含むマウスＢｓＢ８とハムスターＨＪＣ−２細胞に、Ｃａｓ９及び示した様々な組合せのｇＲＮＡ用の発現プラスミドを導入した。ゲノムＤＮＡをＪＣＶ特異的プライマーを用いて増幅した。図４Ａは、Ｔ−Ａｇ遺伝子の図であり、ＰＣＲプライマーの位置、予想切断ポイント、及びＴ−Ａｇ遺伝子の生成領域の予想長さを示す。図４Ｂ：導入ＢｓＢ８細胞からのＴ−Ａｇ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで標識した。画像を見やすいように反転した。図４Ｃ：導入ＨＪＣ−２細胞からのＴ−Ａｇ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで標識した。画像を見やすいように反転した。
【図５】Ｔ抗原の３個の異なるモチーフを標的にするためのプライマーを示す図である。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞の安定誘導体が、ＪＣＶ特異的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスの導入及びドキシサイクリン誘導によってＴ−Ａｇ遺伝子のインデル変異を生じることを示す図である。図６Ａ：実施例１に記載のように、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞に、ＪＣＶ特異的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを導入し、ドキシサイクリンで、又はドキシサイクリンなしで、処理した。ゲノムＤＮＡ全体を抽出し、Ｔ−Ａｇの領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯＴＡベクター中にクローン化し、配列を決定した。図６Ｂ：Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して、Ｃａｓ９を発現しｇＲＮＡ（ｍ１、ｍ２及びｍ３）の各々のレンチウイルスベクターによって導入されたＨＪＣ−２細胞に由来するＰＣＲ産物における変異の存在を検出した。実施例１に記載のように、ＰＣＲ産物を変性し、徐冷してハイブリッド形成した。ハイブリッド形成ＤＮＡをＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼで消化して、ヘテロ二重鎖ＤＮＡを切断し、試料を等量の対照試料と一緒に２％アガロースゲル上で分離した。対照試料は並行して処理され、Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞から誘導されたが、ｇＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターによって導入されなかった（ｍ１  Ｃｏｎ、ｍ２  Ｃｏｎ、ｍ３  Ｃｏｎ）。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞の安定誘導体は、ＪＣＶ特異的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスの導入及びドキシサイクリン誘導によってＴ−Ａｇ発現が消失することを示す図である。図７Ａ：Ｃａｓ９及びＴ−Ａｇの発現を示すウエスタンブロット。実施例１に記載のように、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を発現するＪＣ−２安定細胞クローンに、３種のｇＲＮＡの各々のレンチウイルスベクターを導入した。２４時間後、導入細胞を２μｇ／ｍｌドキシサイクリンで、又はドキシサイクリンなしで処理し、更に４８時間後に収集し、Ｔ−Ａｇ及びＣａｓ９の発現をウエスタンブロットによってα−チューブリンを添加対照として分析した。図７Ｂは、ウエスタンブロットの定量化を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｅは、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞の安定誘導体は、ＪＣＶ特異的ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスの導入及びドキシサイクリン誘導によってコロニー形成が減少することを示す図である。ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞に、示した様々な組合せでｍ１、ｍ２及びｍ３  ｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを導入し、培養し、ドキシサイクリンで、又はドキシサイクリンなしで処理し、コロニー形成を評価した。結果を、得られたコロニーの総数のヒストグラムとして示す。エラーバーは、複製コロニー数から計算された１標準偏差である。図８Ａは組合せｍ１＋ｍ２の結果であり、図８Ｂは組合せｍ１＋ｍ３の結果であり、図８Ｃは組合せｍ２＋ｍ３の結果であり、図８Ｄは組合せｍ１＋ｍ２＋ｍ３の結果である。図８Ｅは、代表的実験の写真であり、図８Ａに要約した実験からの２個のメチレンブルー染色皿を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを発現するＳＶＧ−Ａ細胞の安定誘導体がオフターゲット遺伝子においてインデル変異を示さないことを示す図である。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイを使用して、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ  ｍ１（配列番号１に相補的、図９Ａ）、ｍ２（配列番号５に相補的、図９Ｂ）及びｍ３（配列番号９に相補的、図９Ｃ）を発現するＳＶＧ−Ａ細胞に由来するＰＣＲ産物における変異の存在を検出した。各モチーフとの相同性が最も高いヒト細胞遺伝子を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）におけるＢＬＡＳＴ検索によって特定した。各モチーフについて、実施例１に記載のように、ＰＣＲ産物を相同性が最も高い上位３つの遺伝子から増幅し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってインデル変異を調べた。Ｔ−Ａｇの増幅が各図における正の対照であった。図９Ａ：モチーフｍ１の場合、増幅は、Ｍ１２（ＮＭ＿０１７８２１、ヒトＲＨＢＤＬ２ロンボイド、小翅脈様２（ｒｈｏｍｂｏｉｄ，  ｖｅｉｎｌｅｔ−ｌｉｋｅ  ２）（ショウジョウバエ）、遺伝子ＩＤ：５４９３３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００１．１１、＞ｇｉ｜５６８８１５５９７：ｃ３８９４１８３０〜３８８８５８０６）、Ｍ１７（ＮＭ＿００１２４３５４０、ヒトＫＩＡＡ１７３１ＮＬ，遺伝子ＩＤ：１００６５３５１５、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１７．１１、＞ｇｉ｜５６８８１５５８１：７８８８７７２１〜７８９０３２１７）、及びＭ１９（ＮＭ＿０１６２５２、ヒトＢＩＲＣ６バキュロウイルスＩＡＰリピート含有６（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ＩＡＰ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ６）、遺伝子ＩＤ：５７４４８、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００２．１２）のものであった。図９Ｂ：モチーフｍ２の場合、増幅は、Ｍ２１（ＮＭ＿０１２０９０、ヒトＭＡＣＦ１微小管−アクチン架橋因子１（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｃｔｉｎ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）、遺伝子ＩＤ：２３４９９、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００１．１１、＞ｇｉ｜５６８８１５５９７：３９０８４１６７〜３９４８７１３８）、Ｍ２３（ＮＭ＿００５８９８、ヒトＣＡＰＲＩＮ１細胞周期関連タンパク質１（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、遺伝子ＩＤ：４０７６、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１１．１０、＞ｇｉ｜５６８８１５５８７：３４０５１６８３〜３４１０２６１０）、Ｍ２４（ＮＭ＿０２４５６２、ヒトＴＡＮＧＯ６輸送及びゴルジ機構６ホモログ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｇｏｌｇｉ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ６  ｈｏｍｏｌｏｇ）（ショウジョウバエ）、遺伝子ＩＤ：７９６１３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１６．１０、＞ｇｉ｜５６８８１５５８２：６８８４３５５３〜６９０８５４８２）のものであった。図９Ｃ：モチーフｍ３の場合、増幅は、Ｍ３１（ＮＭ＿００１０４８１９４、ヒトＲＣＣ１染色体凝縮制御因子１（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ  １）、遺伝子ＩＤ：１１０４、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００１．１１、＞ｇｉ｜５６８８１５５９７：２８５０５９４３〜２８５３９��９６）、Ｍ３２（ＮＭ＿００４６７３、ヒトＡＮＧＰＴＬ１アンジオポエチン様１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  １）、遺伝子ＩＤ：９０６８、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００１．１１、＞ｇｉ｜５６８８１５５９７：ｃ１７８８７１３５３〜１７８８４９５３５）、Ｍ３３（ＮＭ＿１７４９４４、ヒトＴＳＳＫ４精巣特異的セリンキナーゼ４（ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ４）、遺伝子ＩＤ：２８３６２９、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００００１４．９、＞ｇｉ｜５６８８１５５８４：２４２０５５３０〜２４２０８２４８）のものであった。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ技術をＪＣＶによる活動性、潜伏、潜在的感染の問題に適用した最初のものである。ＣＲＩＳＰＲ技術は、先行技術の別のＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ技術とは異なり、特定の標的に容易に合わせられ、多重化可能である。本発明のＣＲＩＳＰＲ組成物及び方法は、ＪＣＶ感染を宿主細胞から除去し、宿主細胞を将来の感染から保護するのに有効である。
【００２３】
ポリオーマウイルス除去及び感染予防のための組成物及び方法。
ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲバイオテクノロジーは、細菌のゲノム防御機構を採用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座が、可動遺伝因子（ウイルス、転移因子及び接合性プラスミド）に対するＲＮＡ誘導型適応免疫系をコードする。
【００２４】
ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、ウイルス核酸中の標的配列（「プロトスペーサー」）に相補的な配列、又は標的にされる別の核酸をコードする。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写され、処理されて、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質もコードする。ｃｒＲＮＡは標的ＤＮＡ配列に結合し、その結果、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、標的配列における、又は標的配列に隣接する、標的ＤＮＡを切断する。
【００２５】
１つの有用なＣＲＩＳＰＲ系としては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９が挙げられる。Ｃａｓ９は、スペーサーの約２０〜３０塩基対（ｂｐ：ｂａｓｅ  ｐａｉｒ）を含む成熟ｃｒＲＮＡ、及びプレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ支援プロセシング用ガイドとして働く転写活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）によってガイドされる。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の標的配列との相補的塩基対合によって、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに誘導する。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）フォトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ：ｐｈｏｔｏｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）を認識して、切断部位（ＰＡＭから３番目のヌクレオチド）を決定する。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現することができ、又は天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣するように合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工キメラ低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）中に操作することができる。こうしたｓｇＲＮＡは、直接ＲＮＡ導入のために合成することができ、若しくは生体外で転写することができ、又は、例えばＵ６若しくはＨ１促進ＲＮＡ発現ベクターから、その場で発現することができる。「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）という用語は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖又はｓｇＲＮＡを表すのに使用される。標的配列「に相補的なｇＲＮＡ」という用語は、そのスペーサー配列が標的配列に相補的であるｇＲＮＡを示すことを理解されたい。
【００２６】
本発明の組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９及びポリオーマウイルス、例えばＪＣＶ中の標的配列に相補的な少なくとも１個のｇＲＮＡをコードする核酸を含む。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る。一部の実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、別の種、例えば、サーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの別のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、緑膿菌（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、又は別の配列決定された細菌ゲノム及び古細菌、又は別の原核微生物由来の配列とすることができる。あるいは、野生型化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列を改変することができる。好ましくは、核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的発現に対して最適化された、すなわち「ヒト化」コドンである。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７、ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１、又はＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５に記載された発現ベクターのいずれかによってコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列とすることができる。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（ケンブリッジ、ＭＡ）製ＰＸ３３０、ＰＸ２６０などの市販ベクターに含まれる配列とすることができる。一部の実施形態においては、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＩ：６６９１９３７５７、ＫＭ０９９２３２．１  ＧＩ：６６９１９３７６１、若しくはＫＭ０９９２３３．１  ＧＩ：６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列、又はＰＸ３３０若しくはＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ、ケンブリッジ、ＭＡ）のＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかの変異体又は断片であるアミノ酸配列を有することができる。
【００２８】
Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物活性変異体をコードするように修飾することができ、これらの変異体は、例えば、１つ以上の変異（例えば、付加、欠失若しくは置換変異又はこうした変異の組合せ）を含むことによって、野生型Ｃａｓ９とは異なるアミノ酸配列を有する、又は含むことができる。１つ以上の置換変異は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）とすることができる。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物活性変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも又は約５０％の配列相同性（例えば、少なくとも又は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％配列相同性）を有するアミノ酸配列を有することができる。保存的アミノ酸置換としては、一般に、以下の群内の置換が挙げられる：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン；リジン、ヒスチジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。
【００２９】
Ｃａｓ９アミノ酸配列中のアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基とすることができる。天然アミノ酸残基としては、遺伝コードによって天然にコードされるもの、及び非標準アミノ酸（例えば、Ｌ配置の代わりにＤ配置を有するアミノ酸）が挙げられる。本発明のペプチドは、標準残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基を含むこともできる（例えば、ピロールリジンをリジンの代わりに使用することができ、セレノシステインをシステインの代わりに使用することができる）。非天然アミノ酸残基は、天然に見られないが、アミノ酸の基本式に適合し、ペプチドに組み込むことができるものである。これらとしては、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２アミノ−３−メチルペンタン酸及びＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸が挙げられる。他の例については、教科書やワールドワイドウェブを調べることができる（あるサイトは、現在、カリフォルニア工科大学によって維持され、機能タンパク質に組み込むことに成功した非天然アミノ酸の構造を掲載している）。
【００３０】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、変異配列とすることができる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、鎖特異的切断に関与する保存ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインにおいて変異させることができる。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異によって、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）は、ＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡに切れ目を入れて、一本鎖切断することができ、ＨＤＲ２２による後続の優先的な修復によって、オフターゲット二本鎖切断からの不要なインデル変異の頻度を潜在的に減少させることができる。
【００３１】
一部の実施形態においては、本発明の組成物は、上記核酸配列のいずれかによってコードされるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドを含むことができる。ポリペプチドは、例えば、組換え技術又は化学合成を含めて、種々の方法によって生成することができる。生成後、ポリペプチドを当該技術分野で周知の手段によって、単離し、任意の所望の程度に精製することができる。例えば、逆相（好ましくは）若しくは順相ＨＰＬＣ、又はセファデックスＧ−２５などの多糖ゲル媒体上のサイズ排除若しくは分配クロマトグラフィ後に、例えば、凍結乾燥を使用することができる。最終ポリペプチドの組成は、標準手段によるペプチドの分解後のアミノ酸分析によって、アミノ酸配列決定によって、又はＦＡＢ−ＭＳ技術によって、確認することができる。
【００３２】
例示的実施形態においては、本発明は、Ｃａｓ９とＪＣＶ  Ｔ抗原配列に相補的な１種以上のｇＲＮＡとを含む加工ＣＲＩＳＰＲ系を含む。例示的なＪＣＶゲノム配列は、Ｍａｄ−１系統、ＮＣＢＩ参照配列、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＣ＿００１６９９．１、ｐｕｂｌｉｃ  ＧＩ（Ｆｒｉｓｑｕｅら、１９８４）である。Ｍａｄ１系統においては、Ｔ−Ａｇコード領域は、５１３０ｎｔ環状Ｍａｄ−１  ＪＣＶゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）５０１３から始まる。例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、ＴＭ１、ＴＭ２又はＴＭ３領域ＪＣＶ  Ｔ抗原配列に相補的である。Ｍａｄ−１  ＪＣＶの構造構成を図１Ａに示す。ＴＭ１、ＴＭ２及びＴＭ３に対応するヌクレオチド配列を図１Ｂに示す。ｇＲＮＡの標的配列を太字の大文字で示す。標的配列は、約２０〜４０以上のｎｔ長に及び得る。ＪＣＶの異なる系統においては、又は変異体においては、ＴＭ１、ＴＭ２及びＴＭ３と相同である配列を、周知の配列決定及びゲノム科学技術によって容易に特定できることを理解されたい。
【００３３】
ＴＭ１における例示的標的配列としては、配列番号１、又は逆平行鎖上のその補体、配列番号２が挙げられる。各鎖中のＰＡＭ配列（図１Ｂ及び以下で小文字の太字で示す）は、標的配列に含まれる可能性があり、そのため、標的配列は、配列番号３又は逆平行鎖上のその補体、配列番号４を含む可能性がある。したがって、ｇＲＮＡ  ｍ１と命名されるＴＭ１に相補的なｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に相補的なスペーサー配列を含むことができる。
【００３４】
ヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
ＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧ（配列番号１）
ＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧｇｇｇ（配列番号２）
ＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＴＴ（配列番号３）
ｃｃｃＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴＴＴ（配列番号４）
【００３５】
ＴＭ２における例示的標的配列としては、配列番号５、又は逆平行鎖上のその補体、配列番号６が挙げられる。各鎖中のＰＡＭ配列は、標的配列に含まれる可能性があり、そのため、標的配列は、配列番号７又は逆平行鎖上のその補体、配列番号８を含む可能性がある。したがって、ｇＲＮＡ  ｍ２と命名されるＴＭ２に相補的なｇＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号７又は配列番号８に相補的なスペーサー配列を含むことができる。
【００３６】
ヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
ＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴ（配列番号５）
ＧＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴｇｇｇ（配列番号６）
ＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣ（配列番号７）
ｃｃｃＡＣＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＴＣ（配列番号８）
【００３７】
ＴＭ３における例示的標的配列としては、配列番号９、又は逆平行鎖上のその補体、配列番号１０が挙げられる。各鎖中のＰＡＭ配列は、標的配列に含まれる可能性があり、そのため、標的配列は、配列番号１１又はその補体配列番号１２を含む可能性がある。したがって、ｍ３と命名されるＴＭ３に相補的なｇＲＮＡは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に相補的なスペーサー配列を含むことができる。
【００３８】
ヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
ＡＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＡＧ（配列番号９）
ＡＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＡＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＧＡＣＡＧｔｇｇ（配列番号１０）
ＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴ（配列番号１１）
ｃｃａＣＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＴ（配列番号１２）
【００３９】
ＴＭ１、ＴＭ２及びＴＭ３の標的部位を含むひと続きのＤＮＡを図１Ａに示し、それらのヌクレオチド配列を図１Ｂに配列番号１３〜１８として示す。本発明のｇＲＮＡは、標的配列に相補的でも、相補的でなくともよい、追加の５’及び／又は３’配列を含むこともできることを理解されたい。各ｇＲＮＡのスペーサーは、その標的配列に対する相補性１００％未満、例えば相補性９５％とすることができる。
【００４０】
実施例２、４及び５においては、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２及び／又はｍ３を含むＣＲＩＳＰＲ系が、宿主細胞におけるＪＣＶ複製及びＴ−Ａｇ発現を阻害し、ＪＣＶゲノムの完全性を損なうことが判明した。これらの作用によって、遊離エピソームウイルスと宿主ゲノムに組み込まれたウイルスの両方が除去される。健常な遺伝子に対する有害なオフターゲット作用は生じなかった。したがって、本発明は、ＪＣＶに感染した宿主細胞からＪＣＶを除去するのに使用するための組成物を包含する。該組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及びＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡを含む。本発明は、ＪＣＶに感染した宿主細胞からＪＣＶを除去する方法も包含する。該方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡとを含む組成物で宿主細胞を処理するステップ、及びＪＣＶを宿主細胞から除去するステップを含む。
【００４１】
実施例３の実験においては、本発明のＣＲＩＳＰＲ系の安定発現によって、ＪＣＶによる新たな感染に対して宿主細胞を抵抗性にすることができることが判明した。したがって、本発明は、ＪＣＶ感染のリスクがある患者の細胞のＪＣＶ感染を予防する方法も包含する。該方法は、患者がＪＣＶ感染のリスクがあることを判定するステップ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくとも１個のガイドｇＲＮＡをコードする少なくとも１個の単離核酸とを含む有効量の発現ベクター組成物にＪＣＶ感染のリスクがある患者の細胞を曝露するステップ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び少なくとも１個のｇＲＮＡを患者の細胞中で安定に発現させるステップ、並びに患者の細胞のＪＣＶ感染を予防するステップを含む。
【００４２】
本発明のｇＲＮＡは、単一配列として構成することができ、又は１個以上の異なる配列の組合せ、例えば、多重構成として構成することができる。多重構成は、２個、３個又はそれ以上の異なるｇＲＮＡの組合せを含むことができる。組成物を発現ベクター中で投与するときには、ガイドＲＮＡを単一のベクターによってコードすることができる。あるいは、複数のベクターを操作して、各々が２個以上の異なるガイドＲＮＡを含むようにすることができる。ＪＣＶゲノム又はＪＣＶタンパク質発現の消失をもたらす、切断部位間のウイルス配列を切り出すｇＲＮＡの組合せが特に有用である。切り出し領域は、サイズが単一ヌクレオチドから数百ヌクレオチドまで変わり得る。
【００４３】
ＲＮＡ分子（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、１個以上の修飾核酸塩基を含むように操作することができる。例えば、ＲＮＡ分子の公知の修飾は、例えば、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩ、９章（「Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」）、Ｌｅｗｉｎ編（１９９７、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）、並びに「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ＲＮＡ」、Ｇｒｏｓｊｅａｎ及びＢｅｎｎｅ編（１９９８、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントン特別区）に見ることができる。修飾ＲＮＡ成分としては以下が挙げられる：２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４−２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；５−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−ホルミルシチジン；２’−Ｏ−メチル−５−ホルミルシチジン（ｆｏｒｍａｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）；３−メチルシチジン；２−チオシチジン；ライシジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２チオウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−（３−アミノ−カルボキシプロピル）ウリジン；４−チオウリジン；リボシルチミン；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５−メチル−２チオウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メトキシウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；５−カルボキシメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−チオウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５メチルアミノメチルウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２セレノウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏメチル−ウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２’−メチルアデノシン；２−メチルアデノシン；Ｎ６−メチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６Ｎ−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６スレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスファート）；イノシン；２’Ｏ−メチルイノシン；１−メチルイノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルグアノ��ン；１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスファート）；７−メチルグアノシン；Ｎ２；７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；ウイオシン；メチルウイオシン；不完全修飾（ｕｎｄｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；３０ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；キューオシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル−キューオシン；マンノシル−キューオシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アルカエオシン［７−ホルムアミド−７−デアザグアノシンとも称する］；及び７−アミノメチル−７−デアザグアノシン。本発明の方法又は当該技術分野における他の方法を使用して、更なる修飾ＲＮＡ分子を特定することができる。
【００４４】
本発明のｇＲＮＡは、ＪＣＶ  Ｔ抗原のＴＭ１、ＴＭ２又はＴＭ３領域内に見られる配列に相補的なものに限定されない。ＪＣＶの別の領域、及び別のポリオーマウイルスも、適切に設計されたｇＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ系によって標的にすることができる。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９を使用するＣＲＩＳＰＲ系の場合、ＰＡＭ配列をＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ又はＧＧＧとすることができる。候補標的配列は、ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ、ＧＧＧなどの５’ＰＡＭへの近さによって特定することができる。別のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ特異性を有し得る。例えば、Ｓ．サーモフィラス由来のＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１に５’−ＮＮＡＧＡＡ及びＣＲＩＳＰＲ３に５’−ＮＧＧＮＧ）を必要とし、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｇｉｄｉｔｉｓ）は５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴ）を必要とする。ｇＲＮＡの特定の配列は変わり得るが、有用なｇＲＮＡ配列は、オフターゲット作用を最小限に抑えながら、ＪＣＶを高効率で完全に除去するものである。候補ｇＲＮＡの効率及びオフターゲット作用は、実施例１〜５に開示されたアッセイによって求めることができる。
【００４５】
前述の野生型及び変異Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに加えて、本発明は、オフターゲット切断を劇的に減少させる新規開発「高特異性」化膿レンサ球菌Ｃａｓ９変異体（ｅＳｐＣａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲ系も包含する。これらの変異体は、アラニン置換によって操作されて、ＤＮＡの非標的鎖と相互作用する溝における正電荷部位を中和する。この修飾のこの目的は、Ｃａｓ９と非標的鎖の相互作用を弱め、それによって標的鎖と非標的鎖の再ハイブリダイゼーションを促進することである。この修飾の効果は、オフターゲット切断を制限する、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖のより厳密なワトソン−クリック対形成の一要件である（Ｓｌａｙｍａｋｅｒら、２０１５）。
【００４６】
特に好ましいのは、最高の切断効率及び最少のオフターゲット作用を有することが判明した３種の変異体である：ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（別名ｅＳｐＣａｓ９  １．０）及びＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）（別名ｅＳＰＣａｓ９  １．１）。これらの高特異性変異体をクローン化し、その細胞発現を誘導する技術は、その全体を本明細書に援用するＳｌａｙｍａｋｅｒら（２０１５）に見つけることができる。本発明は、これらの変異体に決して限定されず、Ｓｌａｙｍａｋｅｒら（２０１５）によって開示されたすべてのＣａｓ９変異体も包含する。
【００４７】
本発明は、別のタイプの高特異性Ｃａｓ９変異体である、Ｊｏｕｎｇ及び同僚によって開示された原理に従って設計された「高忠実度」ｓｐＣａｓ９変異体（ＨＦ−Ｃａｓ９）も含む（その全体を本明細書に援用するＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら、２０１６）。ＨＦ−Ｃａｓ９変異体の幾つかは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（２００９）によって開示された。本発明は、ウイルスＤＮＡを不活性化し、ウイルス感染をなくす目的で、これらの変異体を初めて利用するものである。本発明は、これまで開示されなかったＨＦ−Ｃａｓ９変異体も含む。
【００４８】
Ｃａｓ９と標的ＤＮＡのｇＲＮＡ媒介性複合体は、水素結合及び疎水性塩基スタッキングを含めて、Ｃａｓ９と標的ＤＮＡの多数の接触を含む。本発明のＨＦ−Ｃａｓ９変異体は、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断のために複合体を安定化するのに必要なエネルギーよりも高いエネルギーをこれらの接触が有するという概念から生まれる。これによって、ミスマッチがｇＲＮＡとその標的配列の結合を部分的に妨げるときでも、安定な複合体を形成することができる。ＨＦ−Ｃａｓ９変異体は、Ｃａｓ９と標的ＤＮＡの接触の一部を撹乱するアミノ酸置換を含む。撹乱は、安定な複合体がｇＲＮＡとその標的配列の完全又はほぼ完全な一致からのみ得られるという点まで、接触エネルギーを減少させる。
【００４９】
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらによって開示されたＨＦ−Ｃａｓ９変異体の１種は、４つのアラニン置換、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａを含む。これらの置換はすべて残基と塩基の水素結合を弱め、Ｎ４９７Ａは、ペプチド骨格を介した水素結合にも影響を及ぼす。この変異体は、培養ヒト骨肉腫細胞を用いた実験において、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット切断活性を有することが判明したが、計画的ミスマッチ部位におけるオフターゲット切断を著しく減少させた。この変異体は、本発明においては、変異体１（表１のＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａとして含まれる。３種の追加の変異体を試験した。それらはすべて、ｓｐＣａｓ９−ＨＦ−１の上記４つの置換Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａを含み、さらに、第５の置換Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ又はＹ４５０Ａを含んだ。追加の置換は、塩基対スタッキングに関与するアミノ酸のすべてであった。これらの変異体は、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット活性を示し、オフターゲット切断は、変異体１で認められたレベルよりもさらに低いレベルに減少した。本発明は、抗ウイルスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関連してこれらの変異体を含む。表１においては、これらを変異体２（ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ）、変異体３（ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ）及び変異体４（ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ）と称する。
【００５０】
Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらは、変異体１の置換の３つ、すなわちＲ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ及びＱ９２６Ａのみを含む変異体も開示した。この変異体は、野生型Ｃａｓ９に見られるものに匹敵するオンターゲット切断を生じたが、オフターゲット作用については試験されなかった。オフターゲット作用を抑制することが予測されるので、この３置換変異体は、表１の変異体１３（ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ）として本発明に含まれる。
【００５１】
本発明は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらによって開示されていないＣａｓ９変異体も含む。これらの変異体はすべて、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット活性を有し、野生型Ｃａｓ９に比べてオフターゲット活性が低下すると予測される。
【００５２】
これまで開示されていない変異体の３種１４、１５及び１６は、第４の置換を変異体１３に追加したものである。変異体１４は、Ｄ１１３Ｅ置換を含み、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅと命名される。変異体１５は、Ｌ１６９Ａ置換を含み、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａと命名される。Ｌ１６９Ａ変異は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。変異体１６は、Ｙ４５０Ａ置換を含み、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａと命名される。Ｙ５４０Ａ置換は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。
【００５３】
２種の変異体５及び１７は、置換Ｍ４９５Ａをそれぞれ変異体１及び１３に追加したものである。したがって、変異体５はＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ４９５Ａと命名され、変異体１７はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ４９５Ａと命名される。Ｍ４９５Ａ置換は、残基−塩基水素結合、及びペプチド骨格を介した水素結合に影響を及ぼす。
【００５４】
２種の変異体６及び１８は、置換Ｍ６９５Ａをそれぞれ変異体１及び１３に追加したものである。したがって、変異体６はＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ６９５Ａと命名され、変異体１８はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｍ６９４Ａと命名される。Ｍ６９４Ａ置換は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。
【００５５】
２種の変異体７及び１９は、置換Ｈ６９８Ａをそれぞれ変異体１及び１３に追加したものである。したがって、変異体７はＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａと命名され、変異体１９はＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａと命名される。Ｈ６９８Ａ置換は、疎水性塩基対スタッキングに影響を及ぼす。
【００５６】
５種の変異体８〜１２は、第６の置換を５置換変異体２に追加したものである。追加された置換は、それぞれ、Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｍ４９５Ａ、Ｍ６９４Ａ及びＭ６９８Ａである。したがって、変異体８は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａと命名され、変異体９は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａと命名され、変異体１０は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４９５Ａと命名され、変異体１１は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａと命名され、変異体１２は、ＳｐＣａｓ９  Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９８Ａと命名される。
【００５７】
４種の変異体２０〜２３は、第５の置換を４置換変異体１３に追加したものである。追加された置換は、それぞれ、Ｌ１６９Ａ、Ｙ４５０Ａ、Ｍ４９５Ａ及びＭ６９４Ａである。したがって、変異体２０は、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａと命名され、変異体２１は、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａと命名され、変異体２２は、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ４９５Ａと命名され、変異体２３は、ＳｐＣａｓ９  Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｄ１１３５Ｅ、Ｍ６９４Ａと命名される。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
表１に示した変異体は、それ自体、更なるアミノ酸置換、及びそれらの機能を更に変更する別の変異を含み得ることを理解されたい。例えば、Ｃａｓ９配列は、ＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡに切れ目を入れて、一本鎖切断する「ニッカーゼ」として挙動するように変異させることができる。Ｃａｓ９においては、ニッカーゼ活性は、鎖特異的切断に関与する保存ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインにおける変異によって得られる。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異によって、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）は、ＤＮＡを切断するのではなく、ＤＮＡに切れ目を入れて、一本鎖切断することができる（Ｓａｎｄｅｒ及びＪｏｕｎｇ、２０１４）。ＨＦ−Ｃａｓ９のいずれか又はすべての核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的発現に対して最適化された、すなわち「ヒト化」コドンとすることができる。
【００６０】
本発明は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに限定されない。それは、ｇＲＮＡによるＰＡＭ部位への誘導後にウイルスゲノムを切断することができる任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの使用を必要とする組成物及び方法も包含する。例としては、Ｃｐｆ１ファミリーのエンドヌクレアーゼ（プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１由来のＣＲＩＳＰＲ）が挙げられる（Ｚｅｔｓｃｈｅら、２０１５）。２種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種ＢＶ３Ｌ６  Ｃｐｆ１及びラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１が、培養ヒト腎細胞系における遺伝子編集に有効であることがこれまでに示された。
【００６１】
Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９によって認識されるシトシンリッチＰＡＭとは異なるＰＡＭを認識するので、ＪＣＶ及び他のポリオーマウイルスにおける可能な標的の範囲を拡大する。Ｃｐｆ１は、コンセンサス配列ＴＴＮを有するチミンリッチＰＡＭを認識し、そのＰＡＭは、標的配列の５’末端に位置する。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９系よりも小さく単純なｇＲＮＡによって誘導される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む２ユニットｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの改変キメラハイブリッドの代わりに、Ｃｐｆ１は、ｇＲＮＡと呼ばれる単一ガイドＲＮＡによって誘導される。Ｃｐｆ１分子もＣａｓ９分子より小さい。この単純性の増加及びサイズの減少によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の設計及び使用と、宿主細胞の核へのエンドヌクレアーゼ成分の送達の両方が促進される。
【００６２】
ｇＲＮＡの配列は、編集に選択された特定の標的部位の配列に依存する。好ましい標的部位は、ＪＣＶ又は別のポリオーマウイルスのＴ−Ａｇ領域に位置する。一般に、ｇＲＮＡは、配列５’ＴＴＮのチミンリッチＰＡＭのすぐ３’側にある標的ＤＮＡ配列に相補的であると予測される。ｇＲＮＡ配列は、センス又はアンチセンス配列に相補的とすることができる。ｇＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列の相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含んでも、含まなくてもよい。ｇＲＮＡ配列は、標的配列に相補的でなくてもよい追加の５’及び／又は３’配列を含むことができる。ｇＲＮＡ配列は、標的配列に対する相補性１００％未満、例えば相補性９５％とすることができる。ｇＲＮＡは、コード又は非コード標的配列に相補的な配列を有する。ｇＲＮＡ配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なるｇＲＮＡの組合せを含めて、多重構成で使用することができる。
【００６３】
本発明の組成物及び方法は、Ｔ−Ａｇ遺伝子に対するｇＲＮＡ誘導攻撃によってＪＣＶを除去するのに有効であることが証明された。したがって、本発明は、ＳＶ４０などの他のポリオーマウイルスに対する有効な処置として役立つように容易に改変可能である可能性がある。改変は、主に、特定のポリオーマウイルスのＴ−Ａｇ遺伝子又は他の重要な遺伝子中のＣａｓ９又は別の適切なエンドヌクレアーゼに対するＰＡＭ配列を特定することに関わる問題である。そこで、ＰＡＭ配列に隣接する配列に相補的なｇＲＮＡが生成され、実施例１〜５に開示された方法によって試験される。
【００６４】
したがって、本発明は、ポリオーマウイルスに感染した宿主細胞からポリオーマウイルスを除去する方法を包含する。該方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとポリオーマウイルスＤＮＡ中の標的配列に相補的であるスペーサー配列を有する少なくとも１個のガイドｇＲＮＡで宿主細胞を処理するステップ、及びポリオーマウイルスを宿主細胞から除去するステップを含む。好ましい実施形態においては、ｇＲＮＡスペーサー配列は、ポリオーマウイルスＤＮＡのラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）コード領域中の標的配列に相補的である。
【００６５】
ベクター。本発明は、１個以上のｇＲＮＡ、Ｃａｓ９などのＣａｓエンドヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲ成分の発現用の１個以上のカセットを含むベクターを含む。ベクターは、当該技術分野で公知であり所望の発現カセットを発現するのに適切である任意のベクターとすることができる。当該技術分野で知られているとおり、また、本明細書に記載のとおり、幾つかのベクターは、遺伝子産物を哺乳動物細胞に移すのを媒介する能力のあることが知られている。「ベクター」（遺伝子送達又は遺伝子移入「ビヒクル」と時折称される）とは、生体外又は生体内で宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子又は分子複合体を指す。送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子療法における目的コード配列を含むことができる。
【００６６】
好ましいベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、増殖細胞と休止細胞の両方の効率的導入の提供、宿主クロマチンへの組み込みによる送達遺伝子の安定発現、及び既存ウイルス免疫からの干渉がないという利点を有する。実施例５に開示された実験においては、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ成分の薬剤誘発性レンチウイルス発現ベクターは、感染細胞におけるＪＣＶ  Ｔ−Ａｇ発現の消失に有効であることが示された。一例示的構成においては、宿主細胞に、ドキシサイクリン誘導性レンチウイルスベクター中のＣａｓ９又は別の適切なＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが安定に導入された。ＪＣＶの除去が望まれるときには、宿主細胞に１個以上のｇＲＮＡを導入し、宿主細胞をドキシサイクリンで処理して、Ｃａｓ９の発現を活性化し、ＪＣＶゲノムの誘導切断及びウイルスの不活性化を引き起こした。あるいは、１個以上のｇＲＮＡを薬剤誘発様式で安定に導入することができ、又はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとｇＲＮＡの両方をそのように導入することができる。臨床状況においては、この処置をＪＣＶ感染のリスクがある患者に使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ成分が感染によって活性化される。
【００６７】
したがって、本発明は、ＪＣＶを宿主細胞から除去するのに使用するためのベクター組成物を包含する。ベクター組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１個の単離核酸配列、及びＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を有する少なくとも１個のｇＲＮＡを含む。単離核酸配列は、宿主細胞中のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び少なくとも１個のｇＲＮＡの発現を誘導する少なくとも１個の発現ベクターに含まれる。
【００６８】
本発明は、実施例１〜５に記載のプラスミド及びレンチウイルスベクターに決して限定されない。別の好ましいベクターとしては、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。これらは、宿主細胞ＤＮＡに組み込まれないという利点がある。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ベクター、ポックスウイルスベクター及びレトロウイルスベクターを含めて、ただしそれらに限定されない多数の他の組換えウイルスベクターも適切である。
【００６９】
「組換えウイルスベクター」とは、１種以上の異種遺伝子産物又は配列を含むウイルスベクターを指す。多くのウイルスベクターは、パッケージングに関連したサイズの制約があるので、異種遺伝子産物又は配列は、一般に、ウイルスゲノムの１個以上の部分を置換することによって導入される。こうしたウイルスは、複製欠損になることがあり、（例えば、複製及び／又はカプシド形成に必要な遺伝子産物を保有するヘルパーウイルス又はパッケージング細胞系を使用することによって）失われた機能（単数又は複数）をウイルス複製及びカプシド形成中に途中で付与する必要がある。送達されるポリヌクレオチドをウイルス粒子の外側に保有する改変ウイルスベクターも記述された。
【００７０】
レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルス及びＨＩＶ系ウイルスが挙げられる。１種の好ましいＨＩＶ系ウイルスベクターは、少なくとも２種のベクターを含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子がＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子が別のウイルスに由来する。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターとしては、オルソポックス、トリポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｉ  ｖｉｒｕｓ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【００７１】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、核酸の短期発現しかもたらさない。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）ベクターは、幾つかの発明実施形態のための指標になり得る。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期の発現（例えば、約１か月未満）をもたらし、一部の実施形態においては、はるかに長い発現を示す場合もある。選択される特定のベクターは、標的細胞及び処置される症状に依存する。適切なプロモーターの選択は、容易に行うことができる。一部の実施形態においては、高発現プロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの一例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）及びＭＭＴプロモーターを使用することもできる。ある種のタンパク質は、それらの天然プロモーターを用いて発現され得る。ｔａｔ遺伝子、ｔａｒエレメントなどの高レベルの発現をもたらすエンハンサー又は系などの発現を高めることができる別のエレメントを含むこともできる。次いで、このカセットをベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２などのプラスミドベクター、又は例えば大腸菌複製開始点を含む、別の公知のプラスミドベクターに挿入することができる。プラスミドベクターは、マーカーポリペプチドが処置する生物の代謝に悪影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択マーカーを含むこともできる。カセットは、国際公開第９５／２２６１８号に開示された系などの合成送達系における核酸結合部分に結合することもできる。
【００７２】
別の送達方法は、発現産物を細胞内で産生することができる一本鎖ＤＮＡ生成ベクターを使用することである。例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する、Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４：１６７〜１７１（２００３）を参照されたい。
【００７３】
発現は、発現のために選択された宿主中で機能し得る当該技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御することができる。実施例の項に記載のプロモーターに加えて、遺伝子発現に使用することができる他のプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の制御配列；ベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター、又はｔａｃプロモーター；Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母又は別の真菌由来のプロモーターエレメント、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＣ）プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；及び組織特異性を示し、トランスジェニック動物に利用される動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ球様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ球及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞において活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７４】
多種多様な宿主／発現ベクターの組合せを、本発明の核酸配列の発現に使用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージ１の多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び別のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ；２μプラスミド又はその誘導体などの酵母プラスミド、昆虫又は哺乳動物細胞に有用なベクターなどの真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は別の発現制御配列を使用するように修飾されたプラスミドなどのプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクターなどが挙げられる。
【００７５】
酵母発現系を使用することもできる。例えば、ほんの２種を挙げれば、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製され、エンテロキナーゼを用いて切断されたＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を本発明に従って採用することができる。酵母二重ハイブリッド発現系を本発明に従って調製することができる。
【００７６】
追加の適切なベクターとしては、ｖ融合タンパク質及び化学複合物が挙げられる。必要に応じて、本発明のポリヌクレオチドは、カチオン性リポソームなどの微小送達ビヒクル、及び別の脂質含有複合体、及び宿主細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介する能力のある別の巨大分子複合体と一緒に使用することもできる。
【００７７】
ベクターは、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現を更に調節する、又は有益な性質を標的細胞に付与する、別の成分又は官能基を含むこともできる。こうした別の成分としては、例えば、細胞への結合又はターゲティングに影響する成分（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響する成分、取り込み後に細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響する成分（核局在化を媒介する剤など）、及びポリヌクレオチドの発現に影響する成分が挙げられる。こうした成分は、ベクターによって送達される核酸を取り込み、発現している細胞を検出又は選択するのに使用することができる検出可能及び／又は選択可能なマーカーなどのマーカーを含むこともできる。こうした成分は、ベクターの自然な特徴（結合及び取り込みを媒介する成分又は官能基を有するある種のウイルスベクターの使用など）として付与することができ、又はベクターを修飾して、こうした官能基を付与することができる。別のベクターとしては、Ｃｈｅｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５３４：１６７〜１７１（２００３）に記載のものが挙げられる。多様なこうしたベクターが当該技術分野で公知であり、一般に利用可能である。
【００７８】
ベクターの送達は、エキソソームによって媒介することもできる。エキソソームは、多数の細胞型によって放出される脂質ナノベシクルである。それらは、核酸及びタンパク質を細胞間で輸送することによって、細胞間情報伝達を媒介する。エキソソームは、エンドサイトーシス経路に由来するＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びタンパク質を含む。それらは、エンドサイトーシス、融合又は両方によって標的細胞に取り込むことができる。一般に、エンドソーム内容物を受け取ると、受け取り細胞の機能が変わる（Ｌｅｅら、２０１２）。
【００７９】
エキソソームを利用して、核酸を標的細胞に送達することができる。好ましい一方法においては、エキソソームは、産生細胞によってインビトロで産生され、精製され、電気穿孔法によって、又は脂質導入剤によって、核酸カーゴを搭載する（Ｍａｒｃｕｓ及びＬｅｏｎａｒｄ、２０１３、Ｓｈｔａｍら、２０１３）。カーゴは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び１個以上のｇＲＮＡのための発現構築物を含むことができる。適切な技術は、Ｋｏｏｉｊｍａｎｓら（２０１２）、Ｌｅｅら（２０１２）、Ｍａｒｃｕｓ及びＬｅｏｎａｒｄ（２０１３）、Ｓｈｔａｍら（２０１３）、又はその中の参考文献に見つけることができる。エキソソームを生成し、エキソソームに搭載するための例示的なキットは、ＥｘｏＦｅｃｔ（商標）キット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、マウンテンビュー、ＣＡ）である。
【００８０】
エキソソームは、特定の細胞型による優先的な取り込みの標的にすることもできる。本発明に特に有用なターゲティング戦略は、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｔｉら（２０１１）によって開示されている。その中に開示された技術を使用して、エキソソームに狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ：ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒａｌ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ペプチドを搭載することができる。ＲＶＧを保有するエキソソームは、脳、特にニューロン、乏突起膠細胞及び小膠細胞に特異的に戻り、他の組織に非特異的に蓄積することがほとんどない。
【００８１】
本発明の発現構築物は、ナノクリュー（ｎａｎｏｃｌｅｗｓ）によって送達することもできる。ナノクリューは、繭状のＤＮＡナノコンポジットである（Ｓｕｎら、２０１４）。それらは、標的細胞による取り込み及び標的細胞の細胞質における放出のために核酸を搭載することができる。ナノクリューを構築し、それに搭載し、放出分子を設計する方法は、Ｓｕｎら（２０１４）及びＳｕｎら（２０１５）に見つけることができる。
【００８２】
本発明の遺伝子編集構築物は、宿主細胞による誘導発現ではなく、直接送達、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓヌクレアーゼタンパク質＋１個以上のｇＲＮＡの送達によって送達することもできる。エキソソームは、タンパク質とＲＮＡの両方を搭載することができるので、直接送達に好ましいビヒクルである（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｔｉら、２０１１；Ｍａｒｃｕｓ及びＬｅｏｎａｒｄ、２０１３）。エキソソームにタンパク質を搭載する例示的な方法は、エキソソーム産生細胞における、ラクトアドヘリンなどのエンドソームタンパク質との融合物としてのタンパク質の発現による。エキソソームの別の好都合な特徴は、前述のように、脳などの特定の部位をそれらの標的にし得ることである。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼタンパク質として、好ましくは、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体の形で、同じエキソソームに搭載することができる。あるいは、ＣａｓエンドヌクレアーゼとｇＲＮＡは、同時又は段階的送達のために、別々のエキソソームに搭載することができる。
【００８３】
遺伝子編集複合体の直接送達は、ナノクリューによって行うこともできる。Ｓｕｎら（２０１５）は、受け取り細胞への取り込み及び放出のためにＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体をナノクリューに搭載する技術を開示している。
【００８４】
直接送達ビヒクルは、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ、直腸、髄腔内、頭蓋内、吸入、及び錠剤を含めた経口を含めて、ただしそれらに限定されない、任意の適切な経路によって投与することができる。
【００８５】
医薬組成物
培養細胞からのＪＣＶの除去に有効であることが証明された組成物及び方法（実施例１〜５）は、１個以上の適切な発現ベクターによって送達された場合、生体内で有効である可能性が極めて高い。したがって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列とＪＣＶゲノム中の標的配列に相補的である少なくとも１個のｇＲＮＡをコードする少なくとも１個の単離核酸配列とを含む、哺乳動物対象の細胞からＪＣＶを除去するための医薬組成物を包含する。好ましいｇＲＮＡは、ＪＣＶ  Ｔ−ＡｇのＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３又は別の領域に相補的であるスペーサー配列を含む。例えば、ｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２及びｍ３を個々に又は任意の組合せで含むことができる。医薬組成物は、単離核酸配列がコードされた少なくとも１個の発現ベクターも含むことも好ましい。
【００８６】
本発明に係る医薬組成物は、当業者に既知の種々の方法で調製することができる。例えば、上記核酸及びベクターは、組織培養において細胞に適用するために、又は患者若しくは対象に投与するために、組成物内で処方することができる。これらの組成物は、医薬品技術分野で周知の様式で調製することができ、局所療法と全身療法のどちらが所望か、及び処置すべき領域に応じて、種々の経路で投与することができる。投与は、局所（眼、並びに鼻腔内、膣及び直腸送達を含めた粘膜）、肺（例えば、噴霧器によるものを含めて、粉体又はエアロゾルの吸入又は吹送、気管内、鼻腔内、表皮及び経皮）、眼球、経口又は非経口とすることができる。眼球送達方法としては、局所投与（点眼剤）、結膜下、眼周囲若しくは硝子体内注射、又はバルーンカテーテルによる導入、又は結膜嚢に手術によって置かれた眼挿入物が挙げられる。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射若しくは注入、又は頭蓋内、例えば、髄腔内若しくは脳室内投与が挙げられる。非経口投与は、単一大量瞬時投与の形とすることができ、又は例えば、連続潅流ポンプによることができる。局所投与用医薬組成物及び製剤としては、皮膚貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤などが挙げられる。従来の薬剤担体、水性、粉体又は油性基剤、増粘剤などが必要な場合もあり、又は望ましい場合もある。
【００８７】
本発明は、活性成分として本明細書に記載の核酸、ベクター、エキソソーム及びナノクリューを１種以上の薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も含む。本発明者らは、「薬学的に許容される」（又は「薬理学的に許容される」）という用語を、動物又はヒトに適宜投与したときに、副作用も、アレルギー反応も、他の有害反応も生じない分子的実体及び組成物を指すのに使用する。本明細書では「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される物質の媒体として使用することができる、任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル剤、界面活性剤などを含む。本発明の組成物を製造する際には、活性成分は、一般に、賦形剤と混合され、賦形剤によって希釈され、又は、例えば、カプセル、錠剤、サシェ、紙若しくは別の容器の形でこうした担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として働くときには、それは、活性成分のビヒクル、担体又は媒体として作用する、固体、半固体又は液体材料（例えば、生理食塩水）とすることができる。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液剤、乳濁液剤、溶液剤、シロップ剤、エアロゾル剤（固体として、又は液体媒体中の）、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、軟及び硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌注射液剤、並びに無菌包装散剤の形とすることができる。当該技術分野で知られているように、希釈剤のタイプは、意図された投与経路に応じて変わり得る。得られる組成物は、防腐剤などの追加の薬剤を含むことができる。一部の実施形態においては、担体は、脂質ベース若しくはポリマーベースのコロイドとすることができ、又は該コロイドを含むことができる。一部の実施形態においては、担体材料は、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、又はブロックコポリマーミセルとして処方されるコロイドとすることができる。上述したように、担体材料はカプセル剤を形成することができ、該材料は、ポリマーベースのコロイドとすることができる。例示的な薬学的に許容される担体及び希釈剤、並びに医薬製剤の更なる記述は、この分野における標準の教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＵＳＰ／ＮＦに見つけることができる。別の物質を組成物に添加して、組成物を安定化及び／又は保存することができる。
【００８８】
本発明の核酸配列は、対象の適切な細胞に送達することができる。これは、例えば、マクロファージなどの食細胞による食作用を最適化するサイズのポリマー生分解性微粒子又はマイクロカプセル送達ビヒクルの使用によって行うことができる。例えば、直径約１〜１０μｍのポリ−ラクト−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ：ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｏ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）微粒子を使用することができる。ポリヌクレオチドは、これらの微粒子に封入され、微粒子は、マクロファージによって取り込まれ、細胞内で徐々に生物分解され、それによってポリヌクレオチドを放出する。放出後、ＤＮＡが細胞内で発現される。第２のタイプの微粒子は、細胞によって直接取り込まれることを意図せず、生分解による微粒子からの放出によってのみ細胞に取り込まれる核酸の徐放貯蔵器として主に働くことを意図している。これらのポリマー粒子は、したがって、食作用を予防するのに十分な大きさであるべきである（すなわち、５μｍを超え、好ましくは２０μｍを超える）。核酸を取り込む別の方法は、標準の方法によって調製されたリポソームを使用することである。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で取り込むことができ、又は組織特異抗体、例えば、ＨＩＶ感染の一般的潜伏感染貯蔵器である細胞型、例えば、脳マクロファージ、小膠細胞、星状細胞及び消化管関連リンパ球様細胞を標的にする抗体と一緒に取り込むことができる。あるいは、静電気力若しくは共有結合力によってポリＬ−リジンに付着したプラスミド又は別のベクターで構成される分子複合体を調製することができる。ポリＬ−リジンは、標的細胞の受容体に結合することができるリガンドに結合する。「裸ＤＮＡ」（すなわち、送達ビヒクルなし）の筋肉内、皮内又は皮下部位への送達は、生体内発現を実現する別の手段である。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）においては、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする配列とガイドＲＮＡとを含む単離核酸配列をコードする核酸配列は、プロモーター又はエンハンサー−プロモーターの組合せに作用可能に結合する。プロモーター及びエンハンサーについては上述した。
【００８９】
一部の実施形態においては、本発明の組成物は、ナノ粒子、例えば、ＤＮＡと複合化され、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）低分子量ＬＰＥＩのシェルで包囲された高分子量線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）のコアを含むナノ粒子として処方することができる。
【００９０】
核酸及びベクターは、装置（例えば、カテーテル）の表面に適用することもでき、又はポンプ、パッチ若しくは他の薬物送達装置に含むこともできる。本発明の核酸及びベクターは、薬学的に許容される賦形剤若しくは担体（例えば、生理食塩水）の存在下で、単独で、又は混合物で投与することができる。賦形剤又は担体は、投与の方法及び経路に基づいて選択される。適切な薬剤担体、及び医薬製剤に使用される医薬必需品は、この分野で周知の参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）、並びに米国薬局方及び国民医薬品集（ＵＳＰ／ＮＦ）に記載されている。
【００９１】
一部の実施形態においては、組成物は、Ｃａｓ９又は変異Ｃａｓ９をコードする核酸及び標的ＨＩＶに相補的な少なくとも１個のｇＲＮＡ配列を封入するナノ粒子として処方することができ、又はこれらの成分をコードするベクターを含むことができる。あるいは、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを封入するナノ粒子として、本発明の核酸組成物の１つ以上によってコードされるポリペプチドを処方することができる。
【００９２】
治療方法
実施例１〜４に開示された結果によれば、本発明のＣＲＩＳＰＲ系は、ＪＣＶを宿主細胞から除去するのに有効であり、新たな感染に対して宿主細胞を抵抗性にするのに有効である。これらの知見は、ＣＲＩＳＰＲ系の成分をＪＣＶに感染した患者及びＪＣＶのリスクがある患者に、治療及び予防処置として送達できることを示している。好ましい送達方法は、前述の医薬組成物を含む。
【００９３】
したがって、本発明は、対象に有効量の上記医薬組成物を投与するステップを含む、進行性多巣性白質脳症などのＬＣＶ関連障害を有する対象を治療する方法を包含する。本発明は、ＪＣＶ感染のリスクがある患者の細胞のＪＣＶ感染を予防する方法であって、患者がＪＣＶ感染のリスクがあることを判定するステップ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸と、ＪＣＶ  ＤＮＡ中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含む少なくともｇＲＮＡをコードする少なくとも１個の単離核酸とを含む有効量の発現ベクター組成物に患者の細胞を曝露するステップ、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ及び少なくとも１個のｇＲＮＡを患者の細胞中で安定に発現させるステップ、並びに患者の細胞のＪＣＶ感染を予防するステップを含む方法も包含する。
【００９４】
本発明の組成物及び方法は、ポリオーマウイルス媒介性感染症、例えばＪＣＶ感染症の対象の治療に一般的に多様に有用である。対象は、臨床的に有益な結果が得られる時はいつでも有効に治療される。これは、例えば、疾患の症状の完全な消散、疾患の症状の重症度の減少、又は疾患の進行の減速を意味し得る。したがって、本発明の方法は、副腎神経芽細胞腫、神経外胚葉性腫瘍、小脳から発生する腫瘍、下垂体腫瘍、末梢神経鞘腫瘍、及び乏突起星細胞腫、黄色星細胞腫、髄芽腫、乏突起膠腫、多形性膠芽腫、膠細胞起源の脳腫瘍、ＣＮＳリンパ腫などの脳腫瘍を含めた癌；並びに結腸及び食道の癌；又は二次感染症などのＪＣＶ感染症に関連する疾患及び障害の治療に有用であり得る。該方法は、更に、ａ）ＪＣＶ感染症の対象（例えば、患者、より具体的にはヒト患者）を特定するステップ、及びｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼをコードする核酸とＪＣＶ標的配列、例えばＴ抗原配列に相補的なガイドＲＮＡとを含む組成物を対象に供給するステップも含むことができる。感染症の症状の完全な消散、感染症の症状の重症度の減少、又は感染症の進行の減速をもたらす、対象に供給されたこうした組成物の量は、治療有効量と考えられる。本発明の方法は、投与及び計画の最適化を助け、成果を予測するモニタリングステップを含むこともできる。
【００９５】
本発明の幾つかの方法においては、患者がＪＣＶ感染症を有するかどうかをまず判定し、次いで本明細書に記載の組成物の１種以上で患者を治療するかどうかを決定することができる。モニタリングは、薬剤耐性の発生を検出し、反応性患者を非反応性患者から迅速に区別するのに使用することもできる。一部の実施形態においては、該方法は、更に、患者が内部に有する特定のＪＣＶの核酸配列を決定するステップと、次いで、これら特定の配列に相補的であるガイドＲＮＡを設計するステップも含むことができる。例えば、対象のＴＭ１、ＴＭ２及び／又はＴＭ３領域の核酸配列を決定し、次いで１個以上のｇＲＮＡを患者の配列に正確に相補的であるように設計することができる。
【００９６】
一部の実施形態においては、組成物を生体外で投与して、一個体から取り出された細胞又は器官を処置し、別の個体に移植することができる。移植用の細胞又は器官に、本発明のＣａｓ９組成物を含むベクターを導入することができる。標的ＪＣＶ配列の除去又は減弱を確認することができ、処置された細胞を患者に注入することができる。
【００９７】
本明細書で具体的に例示された方法で特定された組成物又は薬剤は、動物及びヒトを含めた対象に任意の適切な処方で投与することができる。例えば、組成物を生理食塩水、緩衝塩溶液などの薬学的に許容される担体又は希釈剤中で処方することができる。適切な担体及び希釈剤は、投与方法及び投与経路並びに標準薬務に基づいて選択することができる。
【００９８】
本発明の組成物は、任意の従来技術によって対象に投与することができる。組成物は、例えば、内部若しくは外部の標的部位への外科的送達によって、又は血管によって到達可能な部位にカテーテルによって、標的部位に直接投与することができる。別の送達方法、例えば、リポソーム送達、又は組成物を含浸させた装置からの拡散が当該技術分野で公知である。組成物は、単一大量瞬時投与、複数回注射又は持続注入（例えば、静脈内）で投与することができる。非経口投与の場合、有用な組成物は、滅菌され発熱物質を含まない形で処方される。
【００９９】
組成物は、追加の治療薬、例えば、脱髄疾患治療用薬剤、例えば、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、フィンゴリモド（Ｇｉｌｅｎｙａ）；Ｂ細胞機能不全（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）及びＺｙｔｕｘ（登録商標））；免疫介在性障害及び移植（アダリムマブ／Ｈｕｍｉｒａ；ブレンツキシマブベドチン／Ａｄｃｅｔｒｉｓ；エファリツマブ／Ｒａｐｔｉｖａ；エタネルセプト／Ｅｎｂｒｅｌ、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）；ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）／Ｃｅｌｌ  Ｃｅｐｔ；又はレトロウイルス感染症、例えば、極めて有効な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ：Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）と一緒に投与することができる。２種以上の治療薬の同時投与は、薬剤がその治療効果を発揮する期間が重複する限り、薬剤が同時に又は同じ経路で投与される必要はない。同時又は逐次的な投与が企図され、異なる日又は週の投与も同様である。治療薬は、規則正しい投薬計画、例えば、連続低用量の治療薬で投与することができる。
【０１００】
こうした組成物の投与量、毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を求める、細胞培養物又は実験動物における標準の薬学手順によって決定することができる。毒作用と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示すＣａｓ９／ｇＲＮＡ組成物が好ましい。有毒な副作用を示すＣａｓ９／ｇＲＮＡ組成物を使用することもできるが、非感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を軽減するために、患部組織の部位を標的としてこうした組成物を送る送達系の設計には注意しなくてはならない。
【０１０１】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用されるある範囲の投与量を処方するのに使用することができる。こうした組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性がない、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、使用剤形及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意の組成物では、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿中濃度範囲が得られるように、動物モデルにおいて処方することができる。こうした情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【０１０２】
本明細書に定義したとおり、治療有効量の組成物（すなわち、有効投与量）とは、治療上（例えば、臨床的に）望ましい結果を生じるのに十分な量を意味する。組成物は、隔日１回を含めて、１日１回以上から週１回以上まで投与することができる。当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全般的健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含めて、ただしそれらに限定されない、ある種の要因が、対象を有効に治療するのに必要な投与量及びタイミングに影響し得ることを理解されたい。さらに、治療有効量の本発明の組成物を用いた対象の治療は、単一の治療又は一連の治療を含むことができる。
【０１０３】
本明細書に記載の組成物は、上記種々の薬物送達システムにおける使用に適している。さらに、投与化合物の生体内血清中半減期を延長するために、組成物を封入することができ、リポソームの管腔に導入することができ、コロイドとして調製することができ、又は組成物の血清中半減期を延長する他の従来技術を採用することができる。例えば、その各々を参照により本明細書に援用する、Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，２３５，８７１号、同４，５０１，７２８号及び同４，８３７，０２８号に記載のように、種々の方法をリポソームの調製に利用することができる。さらに、標的薬物送達システム中で、例えば、組織特異抗体で被覆されたリポソーム中で、薬物を投与することができる。リポソームは、器官を標的にし、器官によって選択的に取り込まれる。
【０１０４】
組成物の投与製剤としては、直腸、経鼻、経口、局所（頬及び舌下を含む）、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与に適切なものが挙げられる。製剤は、好都合には単位剤形、例えば錠剤及び徐放性カプセル剤として提供することができ、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製することができる。
【０１０５】
組成物は、１個以上のＣａｓ／ｇＲＮＡベクターを形質転換又は導入された細胞を含むことができる。細胞は、対象の細胞とすることができ、又はそれらは、ハプロタイプが一致したもの、又は細胞系とすることができる。細胞を照射して複製を防止することができる。一部の実施形態においては、細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ：ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）が一致した自己の細胞系、又はそれらの組合せである。別の実施形態においては、細胞は、幹細胞、例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ  ｃｅｌｌ：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ））とすることができる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含めた多数の動物種から樹立されている。これらのタイプの多能性幹細胞は、最も有用な再生医療用細胞源であろう。なぜなら、これらの細胞は、それらの分化の適切な誘導によってほぼすべての器官に分化可能であり、それらの多能性を維持しながら、活発に分裂する能力を保持するからである。ｉＰＳ細胞は、特に、自己由来の体細胞から樹立することができ、したがって胚の破壊によって生成されるＥＳ細胞に比べて、倫理的及び社会的問題を引き起こしそうにない。さらに、ｉＰＳ細胞は、自己由来の細胞であり、再生医療又は移植療法の最大の障壁である拒絶反応を回避することができる。
【０１０６】
ｇＲＮＡ発現カセットは、当該技術分野で公知の方法によって対象に送達することができる。一部の態様においては、Ｃａｓは、断片とすることができ、Ｃａｓ分子の活性なドメインが含まれ、それによって分子のサイズを削減することができる。したがって、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子は、現在の遺伝子療法による手法と同様に、臨床的に使用することができる。特に、細胞移植療法及びポリオーマウイルスワクチン接種用のＣａｓ９／多重ｇＲＮＡ安定発現幹細胞又はｉＰＳ細胞が、対象における使用のために開発されるであろう。
【０１０７】
導入細胞は、確立された方法に従って再注入用に調製される。約２〜４週間の培養後、細胞は、数が１×１０６〜１×１０１０になり得る。この点で、細胞の増殖特性は、患者ごとに、また、細胞型ごとに異なる。導入細胞の再注入の約７２時間前に、表現型、及び治療薬を発現する細胞の割合の分析のために一定分量を採取する。投与する場合、本発明の細胞は、患者の体重及び健康全般に適用して、細胞型のＬＤ５０及び種々の濃度における細胞型の副作用で決まる速度で投与することができる。投与は単一又は分割用量で実施することができる。成体幹細胞は、それらの生成を刺激する体外から投与された因子を用いて動員することもでき、骨髄又は脂肪組織を含めて、ただしそれらに限定されない、組織又は空間から出てくる場合もある。
【０１０８】
製品
本明細書に記載の組成物は、例えば、レトロウイルス感染症、例えばＪＣＶ感染症の対象、又はＪＣＶ感染症のリスクがある対象を治療する療法として使用するために、標識された適切な容器にパッケージすることができる。容器は、意図した用途に適宜、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ＪＣＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、又は該核酸をコードするベクター、及び適切な安定剤、担体分子、香味剤などの１種以上を含む組成物を含むことができる。したがって、少なくとも１種の本発明の組成物、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ＪＣＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、又は該核酸をコードするベクター、及び使用説明書を含む、パッケージ製品（例えば、本明細書に記載の組成物の１種以上を含み、濃縮又はすぐ使用できる濃度で貯蔵、出荷又は販売のためにパッケージされた、無菌容器）及びキットも本発明の範囲内である。製品は、１種以上の本発明の組成物を含む容器（例えば、バイアル、広口瓶、瓶、袋など）を含むことができる。さらに、製品は、例えば、パッケージング材料、使用説明書、シリンジ、送達装置、緩衝剤、又は予防若しくは治療が必要な症状を治療若しくは監視するための他の管理試薬を更に含むことができる。
【０１０９】
一部の実施形態においては、キットは、上述したように１種以上の追加の治療薬を含むことができる。追加の薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ＪＣウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、若しくは該核酸をコードするベクターと同じ容器に一緒にパッケージすることができ、又はそれらを別々にパッケージすることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ＪＣウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、又は該核酸をコードするベクター、及び追加の薬剤は、使用直前に組み合わせることができ、又は別々に投与することができる。
【０１１０】
製品は、説明文（例えば、印刷したラベル若しくは挿入物、又は製品の使用を述べる他の媒体（例えば、音声テープ又はビデオテープ）を含むこともできる。説明文は、容器に添える（例えば、容器に貼る）ことができ、その中の組成物を投与すべき方法（例えば、投与の回数及び経路）、そのための指示、及び他の用途を記載することができる。組成物は、すぐに投与することができ（例えば、用量の適切な単位で存在）、１種以上の追加の薬学的に許容されるアジュバント、担体若しくは他の希釈剤及び／又は追加の治療薬を含むことができる。あるいは、組成物は、希釈剤及び希釈説明書と一緒に、濃縮形態で提供することができる。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：材料及び方法
Ｔ抗原を標的にする際のＣａｓ９及びｇＲＮＡの効果並びにその機能をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて調べた。ＪＣＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティングのためのガイドＲＮＡの設計を図１Ａ及び１Ｂに示す。
【０１１２】
細胞培養。ヒト乏突起膠腫細胞系ＴＣ６２０（Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１１）、及びＳＶ４０  Ｔ−Ａｇを発現する開始点欠損ＳＶ４０によって形質転換された初代ヒト胎児グリア細胞に由来する細胞系であるＳＶＧ−Ａ（Ｍａｊｏｒら、１９８５）を、既報のとおり１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した（Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１１）。ＨＪＣ−２は、ＪＣＶ  Ｔ−Ａｇを発現するＪＣＶ誘導ハムスターグリア芽細胞腫細胞系である（Ｒａｊら、１９９５）。ＢｓＢ８は、ＪＣＶ初期タンパク質Ｔ−Ａｇを発現するトランスジェニックマウスにおいて生じる小脳神経外胚葉起源の腫瘍に由来するマウス細胞系である（Ｋｒｙｎｓｋａら、２０００）。ＳＶＧ−Ａ細胞にｐＸ２６０由来のプラスミド（後述）を導入し、ピューロマイシン含有培地中で選択し、単一クローンを希釈クローニングによって単離することによって、Ｃａｓ９及びＪＣＶ  Ｔ抗原ｇＲＮＡを発現するＳＶＧ−Ａ細胞の誘導体を発生させた。
【０１１３】
プラスミド調製。ヒトＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現カセットｐＸ２６０及びｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ）を含むベクターを使用して、種々の構築物を作製した。どちらのベクターも、ＣＡＧプロモーターによって駆動されるヒト化Ｃａｓ９コード配列、及びヒトＵ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ発現カセットを含む（Ｃｏｎｇら、２０１３）。ベクターをＢｂｓＩで消化し、アンタークティックホスファターゼで処理した。各ターゲティング部位に対する１対のオリゴヌクレオチドをアニールし、リン酸化し、線状化ベクターに連結した。オリゴヌクレオチドを図５に示す（配列番号１９〜３０）。ｇＲＮＡ発現カセットをＧＥＮＥＷＩＺにおいてＵ６配列決定プライマーを用いて配列決定した。ｐＸ３３０ベクターの場合、他のベクターへの直接導入又はサブクローニングのためにｇＲＮＡ発現カセット（Ｕ６−ｇＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ−ステム−ｔｒａｃｒＲＮＡ）を細片にすることができる、オーバーハング消化部位を有する１対のユニバーサルＰＣＲプライマーを設計した。
【０１１４】
レポーター構築物ＪＣＶＬ−ＬＵＣ（Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１１）及びｐｃＤＮＡ３．１−ラージＴ−Ａｇ発現プラスミドは、以前に記述されている（Ｃｈａｎｇら、１９９６）。レンチウイルス産生のために、以下のプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅから得た：ｐＣＷ−Ｃａｓ９（＃５０６６１）、ｐｓＰＡＸ２（＃１２２６０）、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（＃８４５４）、ｐＫＬＶ−Ｕ６ｇＲＮＡ（ＢｂｓＩ）−ＰＧＫｐｕｒｏ２ＡＢＦＰ（＃５０９４６）、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（＃１２２５１）、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（＃１２２５３）。３個の標的の各々に対してｇＲＮＡレンチウイルス発現プラスミドを構築するために、上記３種のｐＸ３３０ｇＲＮＡプラスミドの各々からのＵ６発現カセットを隣接プライマー（５’−ｔａｔｇｇｇｃｃｃａｃｇｃｇｔｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃ−３’（配列番号４２）及び５’−ｔｇｔｇｇａｔｃｃｔｃｇａｇｇｃｇｇｇｃｃａｔｔｔａｃｃｇｔａａｇｔｔａｔｇ−３’）（配列番号４３）を用いたＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物をＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩで切断されたｐＫＬＶ−Ｕ６ｇＲＮＡ（ＢｂｓＩ）−ＰＧＫｐｕｒｏ２ＡＢＦＰ中にクローン化した。ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ＴＡベクターは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カールズバッド、ＣＡ製であった。
【０１１５】
一過性導入及びレポーターアッセイ。ＪＣＶＬ−ＬＵＣレポータープラスミドとＴ−Ａｇ発現プラスミドの同時導入を既報のとおりに行った（Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１１、Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１２）。手短に述べると、ＴＣ６２０細胞にレポーター構築物を単独で（２００ｎｇ）又は種々の発現プラスミドと組み合わせて、収集前に４８時間導入した。導入ＤＮＡの総量を空のベクターＤＮＡを用いて規準化した。ルシフェラーゼアッセイを既報のとおりに行った（Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１１、Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１２）。
【０１１６】
Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを発現するＳＶＧ−Ａのクローン誘導体の製造。ＳＶＧ−Ａ細胞に、３種の前述のｇＲＮＡｓｅの各々を発現するｐＸ２６０又はｐＸ２６０由来のプラスミドを導入した。３μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択を行い、クローンを希釈クローニングによって単離した。
【０１１７】
ＪＣＶ感染症のアッセイ。上記Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを発現するＳＶＧ−Ａ細胞又はＳＶＧ−ＡのＳＶＧ−Ａクローン誘導体を用いて感染実験を行った。細胞を既報のとおりにＭＯＩ１でＭａｄ−１  ＪＣＶに感染させ（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら、２００３  Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら、２００４）、非感染対照培養物と一緒に７日後に収集し、分析した。細胞全体のタンパク質抽出物中のウイルスタンパク質ＶＰ１及びアグノプロテインの発現をウエスタンブロットによって測定した。並行して、細胞の増殖培地も収集して、ウイルス量をＱ−ＰＣＲによって測定した。
【０１１８】
免疫細胞化学。ＴＣ６２０細胞にＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９の発現プラスミドを導入し、免疫細胞化学を既報のとおりにマウス抗Ｆｌａｇ  Ｍ２一次抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ）を用いて行った（Ｈｕら、２０１４）。
【０１１９】
ＰＣＲによるＴ−Ａｇ遺伝子切断の分析。ＢｓＢ８又はＨＪＣ−２細胞に、上記ｇＲＮＡを発現するプラスミドｐＸ２６０又はｐＸ２６０由来のプラスミドを導入した。全ゲノムＤＮＡを４８時間後に抽出した。Ｔ−Ａｇ遺伝子をＪＣＶ  Ｔ−Ａｇコード領域（５’−ｇｃｔｔａｔｇｃｃａｔｇｃｃｃｔｇａａｇｇｔ−３’（配列番号４４）及び５’−ａｔｇｇａｃａａａｇｔｇｃｔｇａａｔａｇｇｇａ−３’（配列番号４５）に隣接するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した。
【０１２０】
Ｃａｓ９用レンチウイルスベクターの製造、及び誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞の生成。ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９発現の導入用レンチウイルスベクターを製造するために、２９３Ｔ細胞にプラスミドｐＣＷ−Ｃａｓ９、ｐｓＰＡＸ２及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇをリン酸カルシウム沈殿法によって導入した（Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３）。既述のとおりに、レンチウイルスを上清から４８時間後に収集し、遠心分離によって清澄にし、０．４５μｍフィルタに通した（Ｗｏｌｌｅｂｏら、２０１３）。Ｃａｓ９を誘導発現する安定に導入されたＨＪＣ−２クローン細胞誘導体を得るために、レンチウイルスをＨＪＣ−２細胞に６μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で添加し、続いて３μｇ／ｍｌピューロマイシンで選択し、クローンを希釈クローニングによって単離した。生成したクローンにおいてＣａｓ９発現を誘導するために、２μｇ／ｍｌドキシサイクリンを培地に添加した。
【０１２１】
ｇＲＮＡ用レンチウイルスベクターの製造、及び誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞の導入。３種のｇＲＮＡを導入するためのレンチウイルスベクターを製造するために、上述したようにｐＫＬＶ−Ｕ６ｇＲＮＡ（ＢｂｓＩ）−ＰＧＫｐｕｒｏ２ＡＢＦＰから構築された、３種のｇＲＮＡレンチウイルス発現プラスミド誘導体の各々を、２９３Ｔ細胞に塩化カルシウム沈殿によってパッケージングプラスミドｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ及びｐＲＳＶ−Ｒｅｖと一緒に導入した。レンチウイルスを上清から４８時間後に収集し、遠心分離によって清澄にし、０．４５μｍフィルタに通し、ＨＪＣ−２細胞に６μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で添加し、続いて選択した。２４時間後、導入細胞を２μｇ／ｍｌドキシサイクリンで処理して、Ｃａｓ９発現を誘導し、更に４８時間後に収集し、Ｔ−Ａｇ変異をＰＣＲ／配列決定によって分析し、Ｔ−Ａｇ発現をウエスタンブロットによって分析し、クローン原性をコロニー形成アッセイによって分析した。
【０１２２】
インデル変異の分析。ＤＮＡをＣａｓ９によって切断すると特徴的な短い挿入／欠失（インデル）変異が残るので、ｇＲＮＡが導入されたＨＪＣ−２細胞からのＴ−Ａｇ遺伝子の配列をインデルについて分析した。全ゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ精製キットを用いて製造者（５ｐｒｉｍｅ  Ｉｎｃ．、ゲイサーズバーグＭＤ）の指示に従って細胞から単離し、標的にされたＴ−Ａｇ遺伝子の領域を隣接プライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＴＭ１及びＴＭ２の場合、使用した以下のプライマーは、５’−ｃｔｃｔｇｇｔｃａｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｇｔ−３’（配列番号４６）及び５’−ａｔｇｇａｃａａａｇｔｇｃｔｇａａｔａｇｇｇａ−３’（配列番号４７）であった。プライマー５’−ｇｃｔｔａｔｇｃｃａｔｇｃｃｃｔｇａａｇｇｔ−３’（配列番号４８）及び５’−ａｃａｇｃａｔｃｃａｃａｔｇａｃｃａｇａｇ−３’（配列番号４９）をＴＭ３に使用した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローン化し、コロニーの配列を決定した。
【０１２３】
ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。Ｃａｓ９を発現し、ｇＲＮＡ用レンチウイルスベクターによって導入されたＨＪＣ−２細胞に由来するＰＣＲ産物中の変異の存在を、ＳＵＲＶＥＹＯＲ変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて製造者の手順に従って調べた。インデル変異分析について記述したものと同じプライマーを使用した。不均一ＰＣＲ産物を１０分間９５℃で変性し、次いでサーマルサイクラーを用いて徐々に冷却してハイブリッド形成した。３００ナノグラムのハイブリッド形成ＤＮＡ（９μｌ）を、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ中の変異を走査するのに使用されるミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ０．２５μｌ＋ＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ０．２５μｌ及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて４時間４２℃で消化した。停止液を添加し、試料を等量の対照試料と一緒に２％アガロースゲル上で分離した。対照試料は、並行して処理されたが、Ｃａｓ９を発現するがｇＲＮＡ用レンチウイルスベクターが導入されないＨＪＣ−２細胞に由来した。ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイも使用して、細胞遺伝子上のオフターゲット変異の存在を、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを発現するＳＶＧ−Ａ細胞系の安定誘導体を用いて検出した。
【０１２４】
コロニー形成アッセイ。誘導性Ｃａｓ９を発現するＨＪＣ−２細胞に、３個の標的の各々に対するｇＲＮＡ用レンチウイルス発現ベクターを単独で又は組み合わせて導入した。細胞をコロニー形成アッセイ用にドキシサイクリンの存在又は非存在下で培養した。細胞を１０〜１４日間増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、４０％メタノール及び０．４％メチレンブルーで固定し、染色した。５０個を超える細胞を含むコロニーを数えた。
【０１２５】
実施例２：Ｔ−Ａｇを標的にしたｇＲＮＡの発現は、Ｔ−Ａｇ及びＣａｓ９を導入したＴＣ６２０細胞において、Ｔ−Ａｇ発現とＴ−Ａｇ誘導ＪＣＶ後期遺伝子発現の両方を抑制する。
第１の実験セットにおいては、Ｃａｓ９が、ＴＭ１、ＴＭ２及びＴＭ３を標的にした種々のｇＲＮＡと組み合わせて、ヒト乏突起膠細胞の細胞系ＴＣ６２０におけるＴ抗原の発現を抑制できるかどうか判定した。これらの実験においては、ｇＲＮＡ  ｍ１は、ＴＭ１標的配列の配列番号１に相補的であり、ｇＲＮＡ  ｍ２は、ＴＭ２標的配列の配列番号５に相補的であり、ｇＲＮＡ  ｍ３は、ＴＭ３標的配列の配列番号９に相補的である。
【０１２６】
Ｔ抗原を発現するプラスミドを単独で又はＣａｓ９と組み合わせて、及び／又はＴ−Ａｇ標的ｇＲＮＡ発現プラスミドと組み合わせて導入したＴＣ６２０細胞のウエスタンブロット分析結果を図２Ａに示す。この図に見られるように、ｍ１又はｍ２  ｇＲＮＡと一緒にＣａｓ９が存在すると、導入細胞におけるＴ−Ａｇ産生レベルが著しく低下した。しかし、ｇＲＮＡ  ｍ３の発現は、Ｔ−Ａｇ発現レベルに有意な効果を示さなかった図２Ｂは、ハウスキーピング遺伝子β−チューブリンに対して規準化された、Ｔ抗原に対応するバンドの強度に基づくＴ抗原産生の定量化の結果を示す。
【０１２７】
次に、機能的研究を行って、ＪＣＶ後期プロモーター活性を刺激するＴ−Ａｇの能力を測定した（Ｌａｓｈｇａｒｉら、１９８９］。ＴＣ６２０細胞は、この研究に特に適している。というのは、それらの乏突起膠細胞起源のために、Ｔ−Ａｇ発現によって誘導することができるＪＣＶプロモーターの細胞型特異的転写が基底レベルで可能になるからである。レポータールシフェラーゼ遺伝子を駆動するＪＣＶ後期プロモーターＪＣＶＬを用いた転写研究の結果によれば、Ｔ−ＡｇによるＪＣＶＬプロモーター活性化のレベルは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ｍ１又はＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ｍ２を発現する細胞ではかなり低下するが、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ｍ３では低下しない（図２Ｃ）。総合すると、これらの観察は、ｇＲＮＡ  ｍ１とｍ２が、単独で又は組み合わせて、Ｃａｓ９と一緒に発現されると、Ｔ−Ａｇ発現を抑制し、ウイルス溶解感染に関連した後続のＴ−Ａｇ誘導事象を阻害することを示している。これらの効果の結果、ＪＣＶが宿主細胞から除去される。
【０１２８】
実施例３：Ｃａｓ９及びＴ−Ａｇを標的にしたｇＲＮＡを発現するＳＶＧＡのクローン誘導体は、ＪＣＶ感染を支援する能力を低下させた。
ＪＣＶ感染症に対するｇＲＮＡ誘導Ｃａｓ９の効果を調べるために、ＳＶＧ−Ａ細胞系を用いて実験を行った。この系はウイルス遺伝子発現を支援し、完全な増殖性ウイルス溶解感染も可能にする。まず、安定クローン細胞系を、Ｃａｓ９又はＣａｓ９＋ｇＲＮＡ  ｍ１を発現するＳＶＧ−Ａ細胞から樹立した。これらの実験においては、ｇＲＮＡ  ｍ１は、ＴＭ１標的配列の配列番号１に相補的であった。３種の別々のクローンを選択し、ＪＣＶ感染にＭＯＩ＝１．０で７日間使用した。ウイルス感染をウエスタンブロット分析によってウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１及び補助タンパク質、アグノプロテインの存在についてα−チューブリンを添加対照として評価した。並行して、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を行って、培地のウイルスＤＮＡレベルを、ＤＮＡ複製の、したがってウイルス産生のマーカーとして測定した。図３Ａに示すように、Ｃａｓ９のみを発現するクローン細胞系（レーン３）は、これらの細胞におけるウイルスカプシドタンパク質、ＶＰ１及び補助アグノプロテインの存在によって証明されるように（レーン２）、ＪＣＶ感染を支援した。それに対して、Ｃａｓ９とｇＲＮＡ  ｍ１の両方を発現するＳＶＧ−Ａクローンは、ウイルス複製を支援できなかった。この知見は、培養上清中のウイルスを測定するＱ−ＰＣＲ実験によって裏づけられた（図３Ｂ）。クローン細胞の幾つかは、Ｃａｓ９とｇＲＮＡ  ｍ１の両方が最初に導入され、ＪＣＶ複製を支援することができたことから、これらの細胞がＣａｓ９発現及び／又はｇＲＮＡ  ｍ１生成を維持できなくなったことが示唆される（データ示さず）。ＪＣＶ感染がＣａｓ９発現に影響するかどうかを明らかにするために、Ｃａｓ９発現をウエスタンブロットによってＳＶＧ−Ａ  Ｃａｓ９及びＳＶＧ−Ａ  Ｃａｓ９ｍ１ｃ８細胞において確認し（図３Ｃ）、ＦＬＡＧ標識Ｃａｓ９が免疫細胞化学によって核に局在することが分かった（図３Ｄ）。
【０１２９】
結果の示すところによれば、Ｃａｓ９、及びＪＣＶ  Ｔ−Ａｇ遺伝子を標的にした少なくとも１個のｇＲＮＡの安定発現は、ＪＣＶによる感染に対して細胞を抵抗性にする。
【０１３０】
実施例４  Ｃａｓ９及びＪＣＶ  Ｔ−Ａｇ標的ｇＲＮＡの一過性導入後のＴ−Ａｇ遺伝子切断の直接証明
次に、Ｔ−Ａｇ遺伝子に対応するＪＣＶ  ＤＮＡ配列を編集するＣａｓ９及びｇＲＮＡの能力を確認した。これらの実験では、ＢｓＢ８細胞を利用した。ＢｓＢ８は、取り込まれた導入遺伝子としてＪＣＶ初期領域を含みＴ−Ａｇを発現するマウス細胞系である（Ｋｒｙｎｓｋａら、２０００）。ＪＣＶの脳内注射によって誘導されるグリア芽細胞腫から限界希釈によって単離されたハムスター細胞系である別の細胞系ＨＪＣ−２も使用した（Ｒａｊら、１９９５）。これらの細胞は、宿主ゲノムに組み込まれたＪＣＶ初期遺伝子も保有し、Ｔ−Ａｇを発現する。これらの細胞系が実験に選択されたのは、それらの組み込まれたＪＣＶゲノムのコピーがＣａｓ９／ＪＣＶ配列を標的にしたｇＲＮＡの編集能力の正確な測定を可能にするからである。細胞にＣａｓ９及び種々の組合せのｇＲＮＡ用の発現プラスミドを導入し、ゲノムＤＮＡをＪＣＶ特異的プライマーを用いて増幅した。図４Ａに、切断ポイントの位置、及び編集後のＴ−Ａｇ遺伝子に対応する生成ＤＮＡ断片の予想長さを示す。
【０１３１】
図４Ｂに示すように、ＢｓＢ８細胞にＣａｓ９及びｇＲＮＡ  ｍ１及びｍ３（レーン１）；ｍ１、ｍ２及びｍ３（レーン２）；並びにｍ２及びｍ３（レーン３）用発現プラスミドを導入すると、予想された完全な１４６５塩基対配列に加えてより小さい断片が出現した（レーン４）。図４Ｃに示すように、ＨＪＣ−２細胞にＣａｓ９及びｇＲＮＡ  ｍ１及びｍ２又はｍ１、ｍ２及びｍ３用発現プラスミドを導入しても、分解産物が出現した。図４Ｂ及び４Ｃは、ｇＲＮＡ  ｍ１とｍ３の組合せを使用してＤＮＡの切断を誘導すると、予想された完全な１４６５ｂｐ配列の代わりに、３２７ｂｐのより小さい断片が出現することを示している。更なる分析の示唆するところによれば、３２７ｂｐ断片は、標的配列ｍ１とｍ３標的部位間のＤＮＡのセグメントが切断除去された後の残りのＤＮＡ配列（１０７＋２２０）の再結合に対応する。同様の事象は、多重のｍ２及びｍ３を組み合わせて使用したときに認められ、８２４ｂｐ  ＤＮＡ（６０４＋２２０）が生成する。これらの結果は、ウイルスゲノム内の２個のｇＲＮＡ標的領域の切断を示し、残りの遺伝子配列は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ：ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）によって再結合する。
【０１３２】
結果の示すところによれば、本発明に係るｇＲＮＡは、単独で、また、組み合わせて、Ｃａｓ９と組み合わせて発現されると、ＪＣＶ  ＤＮＡにおける切断及び大きな欠失を誘発する。このＤＮＡ損傷は、ＪＣＶ  Ｔ−Ａｇ遺伝子の完全性を破壊し、宿主細胞からウイルスを除去する結果になる。
【０１３３】
実施例５：Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ系の成分の安定な薬剤誘発性発現は、宿主細胞におけるＴ−Ａｇ発現の薬剤誘発性消失をもたらす。
ＪＣＶを宿主細胞において薬剤誘発的に不活性化できるかどうかを明らかにするために、ＨＪＣ−２細胞にＣａｓ  ９をコードするドキシサイクリン誘導性レンチウイルスベクターを導入した。安定誘導体が樹立された。次いで、誘導細胞にＪＣＶ  Ｔ−Ａｇのコード領域中の標的部位に特異的なｇＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターを導入した。ｇＲＮＡは、ｍ１、ｍ２及びｍ３を含んだ（それぞれ、配列番号１、５及び９に相補的なスペーサーを有する。ドキシサイクリン誘導後、全ゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔ−Ａｇの領域をＰＣＲによって増幅し、ＴＡベクター中にクローン化し、配列を決定した。
【０１３４】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して、ＰＣＲ産物中のインデル変異を検出した（図６Ｂ）。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ分解産物の存在によって示されるように、ｍ１、ｍ２及びｍ３  ｇＲＮＡはすべてインデル変異を生じた（図６Ｂ）。
【０１３５】
ＰＣＲ増幅産物由来のクローンの配列決定によって、４８時間後にこれらの培養物から抽出されたゲノムＤＮＡのＴ−Ａｇ遺伝子の対応する領域にインデル変異が検出された。欠失又は挿入を含む代表的配列を図６Ａに示す（配列番号３１〜３４、３５〜３６及び３９〜４１）。結果の示すところによれば、インデルの大部分は、ＰＡＭ領域に近く、１又は２個のヌクレオチドの挿入又は欠失からなった。これは、Ｔ−Ａｇ翻訳に影響するフレームシフト変異を起こすと予測される。予想どおりに、ドキシサイクリンによるＣａｓ９発現の誘導後、Ｔ−Ａｇ発現が３種のｇＲＮＡの各々を用いて消失したことがウエスタンブロットによって確認された（図７Ａ）。図７Ｂは、濃度測定定量分析ウエスタンブロット結果を示す。
【０１３６】
ＨＪＣ−２細胞のクローン形成能に対するＣａｓ９並びに種々の組合せのｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２及びｍ３の発現の効果も調べた。これらの細胞におけるクローン形成能は、Ｔ−Ａｇの発現に依拠する表現型である。ｇＲＮＡ  ｍ１、ｍ２及びｍ３（それぞれ配列番号１、５及び９に相補的）は、種々の組合せで発現された。図８に示すように、ｇＲＮＡと一緒のドキシサイクリンによるＣａｓ９発現の誘導は、これらの細胞によって形成されるコロニーの数を極度に減少させ（図８Ａ〜８Ｄ）、細胞中のＣａｓ９及びｇＲＮＡによるＴ−Ａｇ抑制を示している。ｇＲＮＡ  ｍ１＋ｍ２、ｍ１＋ｍ３、ｍ２＋ｍ３及びｍ１＋ｍ２＋ｍ３の組合せすべてがコロニー数を減少させた。図８Ｅに典型的なコロニー形成アッセイ結果を示す。
【０１３７】
細胞ゲノムにおいて起こり得るオフターゲット事象を評価するために、安定なＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現ＳＶＧ−Ａ細胞をＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってオフターゲット遺伝子中のインデル変異について分析した。３個のモチーフの各々との相同性が最も高いヒト細胞遺伝子を、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）におけるＢＬＡＳＴ検索によって特定した。各モチーフについて、実施例１に記載のように、ＰＣＲ産物を相同性が最も高い上位３つの遺伝子から増幅し、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってインデル変異を調べた。モチーフ１ｇＲＮＡの分析結果を図９Ａに示す。モチーフ２の分析結果を図９Ｂに示す。モチーフ３の分析結果を図９Ｃに示す。Ｔ−Ａｇの増幅を各実験における正の対照として使用した。ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼによる切断に起因する追加のバンドをアステリスクで示す。すべての場合において、オフターゲット遺伝子の切断が検出されず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の特異性を示した。
【０１３８】
この実施例に開示された結果によれば、本発明に係る誘導性ＣＲＩＳＰＲ系は、有害なオフターゲット作用を類似の正常遺伝子に起こさずに、ＪＣＶ  Ｔ−Ａｇの薬剤誘発性消失を引き起こし、ＪＣＶ感染症の作用を軽減することができる。総合すると、前述の実施例のすべての結果の示すところによれば、本発明に係るＣＲＩＳＰＲ系は、ＰＭＬ患者において活発に複製するＪＣＶを除去するのに有用であり、ＪＣＶの無症候性宿主から潜伏ＪＣＶを除去するのに有用であり、ＪＣＶのリスクがある非感染個体がウイルスを取得するのを予防するのに有用である。
【０１３９】
本発明を説明的に記述したが、使用した用語は、限定の用語ではなく、記述の用語の性質を帯びたものであるように意図されることを理解されたい。言うまでもなく、本発明の多数の改変及び変更が上記教示に照らして可能である。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲内で、具体的に記述したものとは異なる方法で実施できることを理解されたい。
【０１４０】
【表２−１】
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【０１４１】
【表２−２】
2019512458.tif 000005
【０１４２】
【表２−３】
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【０１４３】
【表２−４】
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【０１４４】
【表２−５】
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【０１４５】
【表２−６】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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