(57)【要約】  本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（「ＴＮＦ」または「ＴＮＦ−アルファ」）に結合するアミノ酸配列、化合物、およびポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、腫瘍壊死因子アルファに結合する改善された重鎖免疫グロブリン単一可変ドメイン（本願においては「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」ともまた言われる）に、ならびにかかるＩＳＶＤを含む蛋白質、ポリペプチド、および他の構築物、化合物、分子、または化学的実体、まとめてＴＮＦ結合因子に関する。本発明の他の側面、態様、特徴、使用、および利点は本願の開示に基づいて当業者には明瞭であろう。
2019506839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基は好ましくはＬまたはＶから選ばれ；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｖ、またはＬから選ばれ；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれ；
その結果、（ｉ）位置８９がＴであるか；または（ｉｉ）位置８９がＬでありかつ位置１１がＶであるか；または（ｉｉｉ）位置８９がＬでありかつ位置１１０がＫもしくはＱであるか；または（ｉｖ）位置８９がＬでありかつ位置１１２がＫもしくはＱであるか；または（ｖ）位置８９がＬでありかつ位置１１がＶでありかつ位置１１０がＫもしくはＱであるか；または（ｖｉ）位置８９がＬでありかつ位置１１がＶでありかつ位置１１２がＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１がＶでありかつ位置１１０がＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１がＶでありかつ位置１１２がＫもしくはＱである、
免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）。
【請求項２】
位置４９のアミノ酸残基がアラニンである、請求項１に記載のＩＳＶＤ。
【請求項３】
位置７４のアミノ酸残基がセリンである、請求項１または２に記載のＩＳＶＤ。
【請求項４】
位置７３のアミノ酸残基がＮであり、位置７５のアミノ酸残基がＫである、請求項３に記載のＩＳＶＤ。
【請求項５】
ＩＳＶＤが、配列番号４０、３９、３６、３７、３８、４１、および６１〜６８からなる群、特に配列番号４０、３９、および３６、最も具体的には配列番号４０から選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＩＳＶＤ。
【請求項６】
本質的に一価の形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項７】
位置１のＤと、好ましくはＣ末端アラニン残基であるＣ末端延長Ｘ（ｎ）とを有する、請求項５に記載の免疫グロブリン単一可変ドメイン。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＩＳＶＤを含む、化合物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
少なくとも２つのＩＳＶＤ同士が同じかまたは異なり得る、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
少なくとも２つのＩＳＶＤが、独立して、配列番号８〜４１、６１〜６６、および６９からなる群から選ばれる、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
化合物がさらに血清蛋白質結合性部分を含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
血清蛋白質結合性部分が血清アルブミンに結合する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
血清蛋白質結合性部分が血清アルブミン結合性ＩＳＶＤである、請求項１２または１３に記載の化合物。
【請求項１５】
血清アルブミン結合性ＩＳＶＤが、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、その中のＣＤＲ１がＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２がＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３がＧＧＳＬＳＲである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
血清アルブミン結合性ＩＳＶＤが、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２、およびＡｌｂ２２３を含む、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
血清蛋白質結合性部分が、抗体に基づかないポリペプチドである、請求項１２または１３に記載の化合物。
【請求項１８】
さらにＰＥＧを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
ＩＳＶＤが互いに直接的に連結されるかまたはリンカーによって連結される、請求項８〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
第１のＩＳＶＤおよび／または第２のＩＳＶＤおよび／または可能性として第３のＩＳＶＤおよび／または可能性として血清アルブミン結合性ＩＳＶＤが、リンカーによって連結される、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
リンカーが、５ＧＳ、７ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳ、および３５ＧＳのリンカーからなる群から選ばれる、請求項１９〜２０に記載の化合物。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物を含むか、または、本質的にそれからなり、さらに、任意に１つ以上のペプチド性リンカーによって連結された１つ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットを含む、構築物。
【請求項２３】
１つ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットが、ポリエチレングリコール分子、血清蛋白質またはその断片、血清蛋白質に結合し得る結合ユニット、Ｆｃ部分、および血清蛋白質に結合し得る小型の蛋白質またはペプチドからなる群から選ばれる、請求項２２に記載の構築物。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤ、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物、および／または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項２５】
医薬組成物である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
さらに、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／またはアジュバントを含み、任意に、１つ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
医薬としての使用のための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の構築物、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤ、または請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
消化管の疾患および／または障害の処置への使用のための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の構築物、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤ、または請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、セリアック病、消化管の外傷、および／または消化管の癌の処置への使用のための、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の構築物、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤ、または請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤが消化管に局所投与される、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３１】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤが、胃腸管（ＧＩ）への経口投与にとって好適な剤形で経口投与される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３２】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤがＧＩ管への経口投与のための剤形で投与され、剤形が、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、エマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤から選択される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３３】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤが、消化管の疾患または障害の処置のために経直腸投与される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３４】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤが、好ましくは座薬および浣腸剤から選択される経直腸投与のための剤形で経直腸投与される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３５】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤが、皮下注射、皮内注射、静脈注射、筋肉内注射、病巣内注射、または輸液技術によって非経口投与される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３６】
組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤが患者の全身循環に到達する、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載の組成物、化合物、構築物、またはＩＳＶＤ。
【請求項３７】
ａ）１つ以上のプロテアーゼによってＩＳＶＤを断片に分解するステップと；
ｂ）ステップａ）の断片を例えばＬＣ−ＭＳなどの好適な手段によって分析するステップと；
を含み、
それによって、胃内分解に対するＩＳＶＤの安定性を付与するアミノ酸残基（単数または複数）を同定する、
胃内分解に対するＩＳＶＤの安定性を付与するアミノ酸残基を同定する方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載のステップａ）およびｂ）、次に：
ｃ）胃内分解に対するＩＳＶＤの安定性を付与するアミノ酸残基（単数または複数）を変異させることと；
ｄ）請求項３７に記載のステップａ）およびｂ）を繰り返すことと；
を含み、
それによって、１つ以上の断片の不在が、胃内分解に対するＩＳＶＤの向上した安定性を指示する、
胃内分解に対するＩＳＶＤの安定性を向上させる方法。
【請求項３９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤ、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の構築物をコードする、核酸。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４１】
請求項３８に記載の核酸または請求項４０に記載の発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞。
【請求項４２】
方法が、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物によってまたは別の好適な発現系によって、請求項３９に記載の核酸配列を発現するステップと；任意に、次に：
ｂ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物を単離および／または精製するステップと、
を含む、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＩＳＶＤまたは請求項８〜２１のいずれか一項に記載の化合物を産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（「ＴＮＦ」または「ＴＮＦ−アルファ」）に結合するアミノ酸配列、化合物、およびポリペプチドに関する。具体的には、本発明は、腫瘍壊死因子アルファに結合する改善された重鎖免疫グロブリン単一可変ドメイン（本願においては「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」ともまた言われる）に、ならびにかかるＩＳＶＤを含む蛋白質、ポリペプチド、および他の構築物、化合物、分子、または化学的実体、まとめてＴＮＦ結合因子に関する。本発明の他の側面、態様、特徴、使用、および利点は、本願の開示に基づいて当業者には明瞭であろう。
【背景技術】
【０００２】
本願において、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン内のアミノ酸残基／位置はKabatに従う付番によって指示される。利便性の理由で、図１は、本願において具体的に参照されるアミノ酸位置のいくつかと、いくつかの代替的な付番システム（例えば、AhoおよびIMGT。注：明白に別様に指示されない限り、本明細書および請求項では、Kabat付番が最終的なものである；他の付番システムは参照のためのみに与えられている）に従うそれらの付番とを一覧化している表を与えている。
【０００３】
当分野において周知である通り、ＣＤＲに関しては、ＶＨまたはＶＨＨ断片のＣＤＲを定義および記載するための複数の規則、例えばKabatの定義（これは配列可変性に基づき、最も共通に用いられる）およびChothiaの定義（これは構造的なループ領域の配置に基づく）がある。例えば、ウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/の参照がされる。本明細書および請求項の目的のためには、Kabatに従うＣＤＲもまた言及され得るが、最も好ましくは、ＣＤＲはAbmの定義に基づいて定義される（これは、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアに基づく）。なぜなら、これはKabatおよびChothiaの定義の間の最適な折衷物であると見なされているからである。再びウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/の参照がされる。
【０００４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は慢性の活動障害性の進行性疾患である。大部分の非生物学的薬治療、例えばアミノサリチル酸製剤、ステロイド、および免疫調節薬は、症状改善を提供するが、底にある炎症プロセスを止めることはできず、疾患の経過を変えない。抗腫瘍壊死因子−α（抗ＴＮＦ−α）薬剤（インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル）の出現は、疾患の経過（ＣＤおよびＵＣ両方において、より少数の手術、より少ない入院、より良いクオリティ・オブ・ライフ、ステロイド節約、より高い臨床的寛解および粘膜治癒率）ならびに患者のクオリティ・オブ・ライフおよび労働生産性の両方を変えることによって、ＩＢＤが処置されるやり方を劇的に変えた（ｃｆ．Amiot and Peyrin-Biroulet 2015 Ther Adv Gastroenterol 8:66-82）。これらの治療薬蛋白質の最も共通の投与経路は注射である。これらの蛋白質の大部分は短い血清中半減期を有するので、それらは、有効であるためには高頻度でまたは高いドーズで投与されることを必要とする。さらにその上、全身投与は、感染の増大したリスクに関連する。一緒になって、これは患者コンプライアンスの損失をもたらす（ｃｆ．Singh et al. 2008 J Pharm Sci 97:2497-2523）。
【０００５】
しかしながら、結核および非ホジキンリンパ腫を包含する望ましくない長期的副作用および日和見感染が、全般的な免疫抑制によって引き起こされ、現行で用いられているモノクローナル抗体処置の繰り返しの全身注射からもたらされる（Ali et al., 2013; Galloway et al., 2011; Ford & Peyrin-Biroulet, 2013; Kozuch & Hanauer, 2008; Schreiber et al., 2007; Syed et al., 2013）。
【０００６】
抗ＴＮＦ−α抗体の経口投与はこれらの副作用のいくつかを回避するはずである。
【０００７】
しかしながら、これらの抗ＴＮＦ−α薬剤は複雑な蛋白質である。経口送達は、胃腸（ＧＩ）管の酸性のプロテアーゼリッチな環境による分解をもたらす。
【０００８】
治療薬抗体を保護するためにデコイ蛋白質を用いる上では、ヒトＴＮＦアルファに対するポリクローナルウシ初乳抗体（ＡＶＸ−４７０）が経口経路によって投与されることを含む患者に基づく研究が、Avaxia Biologies Inc.によって潰瘍性大腸炎患者に対して最近行われた。しかしながら、研究は打ち切られた。
【０００９】
ゆえに、新たなＩＢＤ薬の必要がある。
【００１０】
ＴＮＦに結合し得るＩＳＶＤ（特にナノボディ）およびそれらの使用は、当分野においては例えばＷＯ２００４／０４１８６２およびＷＯ２００６／１２２７８６から周知であり、これらは、ＴＮＦに対するナノボディ、ならびにＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αシグナル伝達に関連するおよび／またはそれによって媒介される疾患および障害、例えば炎症、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、１型糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、男性不妊、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節炎、甲状腺炎、および血管炎の防止および／または処置へのそれらの使用を記載している。
【００１１】
ＷＯ２００６／１２２７８６は、ＮＣ５５ＴＮＦ＿ＮＣ７（ＰＭＰ６Ｃ１１）と言われる特異的な抗ＴＮＦ−αナノボディを配列番号１２５として開示している。この従来技術のナノボディの配列は下の表Ａに配列番号５８として与えられている。表Ａは、（配列番号１として）この従来技術のＴＮＦ結合因子の配列最適化版（本願においては「参照Ａ」ともまた言われる）の配列をもまたそのＣＤＲと一緒に与えている（KabatおよびAbmの規則に従う）。図２のアラインメントから分かるように、この配列最適化版は、配列番号５８の従来技術の配列と比較して次の変異を含有する：Ｑ１Ｅ、Ａ１４Ｐ、Ｑ２７Ｆ、Ｓ２９Ｆ、Ｐ４０Ａ、Ａ４９Ｓ、Ｋ７３Ｎ、Ｑ７５Ｋ、Ｖ７８Ｌ、Ｄ８２ａＮ、Ｋ８３Ｒ、およびＱ１０８Ｌ（Kabat付番に従う）。
【００１２】
ＷＯ２０１５／１７３３２５６は、いわゆる既存抗体（「ＰＥＡ」）の結合を防止するＣ末端延長を含む、改善された免疫グロブリンドメインに関する。ＷＯ２０１５／１７３３２５６は、特異的な抗ＴＮＦ−αナノボディとして配列番号３４５を開示しており、これは本願においてはＴＮＦ３４５（配列番号５９）ともまた言われる。図２のアラインメントから分かるように、配列最適化版の参照Ａは、配列番号５９の従来技術の配列と比較して次の変異を含有する：Ｖ１１ＬおよびＬ８９Ｖ（Kabat付番に従う）。
【００１３】
毒素中和性のラマモノクローナルＶＨＨ抗体断片のカクテルが、潜在的な経口治療のために最近提案された（Hussack et al., 2011 J Biol Chem 286, 8961-76.）。しかしながら、Dumoulin et al.（2002 Protein Sci, 11, 500-15)、Harmsen et al. (2006 Appl Microbiol Biotechnol, 72, 544-51）およびHussack et al.（2012 Methods Mol Biol, 911, 417-29）は、単一ドメインラマ抗体断片がヒト胃腸系における蛋白質分解的な破壊を非常に受けやすいように見えると主張している。
【００１４】
ＷＯ２００７／０２５９７７は慢性腸炎の処置を記載しており、経口投与されたL. lactis細菌による抗ｍＴＮＦナノボディのインサイチュ分泌を包含する。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、改善されたＴＮＦ結合因子、具体的には、改善された抗ＴＮＦ化合物およびポリペプチド、より具体的には抗ＴＮＦのＩＳＶＤ、さらにはより具体的には改善された抗ＴＮＦナノボディを提供することを目指す。本発明によって提供される改善されたＴＮＦ結合因子は、本願においては「本発明のＴＮＦ結合因子」または「ＴＮＦ結合因子」ともまた言われる。
【００１６】
より具体的には、本発明は、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、セリアック病、消化管の外傷、および消化管の癌などの消化管の疾患を処置することに有用であろう改善されたＴＮＦ結合因子を提供することを目指す。それらのＴＮＦ結合因子は、好ましくは安定であり、経口投与が可能であるべきである。
【００１７】
経口投与されたＴＮＦ結合因子は、消化管の内腔においてＴＮＦを中和するのみならず、粘膜固有層および粘膜下層へのアクセスを獲得するということが予想される。なぜなら、消化管の腸バリアは、歯周病、アフタ性口内炎、消化管の細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫感染、消化性潰瘍、ストレスまたはH. pylori感染に関連する潰瘍、食道逆流症によって引き起こされるダメージ、炎症性腸疾患、消化管の癌によって引き起こされるダメージ、セリアック病を包含する食物不耐性、あるいはＮＳＡＩＤまたは他の摂取もしくは全身送達された薬によって誘導される潰瘍を包含するがこれに限定されない全般的炎症および／あるいは潰瘍化によって破られるかあるいは損なわれ得るからである。
【００１８】
ゆえに、本発明は、参照Ａのバリアントであり、かついくつかの健康なヒト対象および患者の血清中に存在し得る干渉因子（一般的に「既存抗体」または「ＰＥＡ」と言われる）による低減された結合を有する、改善されたＴＮＦ結合因子を提供することを目指す。ＷＯ２０１２／１７５７４１、ＷＯ２０１３／０２４０５９、およびまた例えばHolland et al. (J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203）、ならびに「Improved immunoglobulin variable domains」と題する２０１５年５月１３日出願のAblynx N.V.による同時係属中の公開ＰＣＴ出願ＷＯ２０１５／１７３３２５（Ａｐｐｌ．ｎｏ．ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６０６４３）の参照がされる。
【００１９】
本願にさらに記載されるように、本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくは、参照Ａに存在するものとＣＤＲの同じ組み合わせ（すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する。
【００２０】
本発明のいくつかの好ましい限定しないＴＮＦ結合因子が、図３に配列番号８から４１、６２、６３、６４、６５、６６、および６９として一覧化されている。図４は、配列番号１（参照Ａ）および配列番号５８（ＰＭＰ６Ｃ１１）との配列番号８〜４１の配列のアラインメントを示している。配列番号２２から４１、６２〜６６、および６９の結合因子は、本発明のＴＮＦ結合因子の例であり、通常のＣ末端配列ＶＴＶＳＳ（参照Ａに存在する配列番号５５）と比較してＣ末端アラニン延長、すなわちＩＳＶＤ配列のＣ末端のアラニン残基（場合によっては「位置１１４」ともまた言われる）を有する。ＷＯ２０１２／１７５７４１に（しかし、例えばＷＯ２０１３／０２４０５９およびＷＯ２０１５／１７３３２５にもまた）記載されているように、このＣ末端アラニン延長は、ＩＳＶＤのＣ末端領域に所在する推定されるエピトープに対するいわゆる「既存抗体」（ＩｇＧであると推測される）の結合を防止し得る。このエピトープは、他の残基のなかでも、Ｃ末端配列ＶＴＶＳＳの表面に露出されたアミノ酸残基ならびに位置１４のアミノ酸残基（およびアミノ酸配列中のそれの次の／それに近いアミノ酸残基、例えば位置１１、１３、および１５）を包含すると推測され、位置８３のアミノ酸残基（およびアミノ酸配列中のそれの次の／それに近いアミノ酸残基、例えば位置８２、８２ａ、８２ｂ、および８４）ならびに／または位置１０８のアミノ酸残基（およびアミノ酸配列中のそれの次の／それに近いアミノ酸残基、例えば位置１０７）をもまた含み得る。
【００２１】
しかしながら、かかるＣ末端アラニン（または、一般的にＣ末端延長）の存在は、広範囲の対象（健康な対象および患者両方）の血清中に見出され得る「既存抗体」の結合を著しく低減し得る（さらに、沢山のケースにおいては、本質的に完全に防止し得る）が、ＩＳＶＤがかかるＣ末端アラニン（または、より一般的には、かかるＣ末端延長）を含有するときでさえも、いくつかの対象の血清（例えば、ＳＬＥなどのいくつかの免疫疾患の患者の血清）は、ＩＳＶＤのＣ末端領域に（かかる領域が露出されているときに）結合し得る既存抗体を含有し得るということが見出されている。再び、「Improved immunoglobulin variable domains」と題する２０１５年５月１３日出願の譲受人による同時係属中の公開ＰＣＴ出願ＷＯ２０１５／１７３３２５の参照がされる。
【００２２】
従って、本発明の１つの特定の目的は、本願において「参照Ａ」と言われる抗ＴＮＦナノボディの改善されたバリアントであり、かつ具体的にはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載されている種類のいわゆる「既存抗体」（すなわち、Ｃ末端延長の存在下でさえもＩＳＶＤの露出されたＣ末端領域に結合し得る既存抗体）による低減された結合を有する、ＴＮＦ結合因子を提供することである。
【００２３】
一般的に、本発明は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を含む配列番号１の配列のバリアントであるアミノ酸配列を提供することによって、この目的を達成する：
−  ８９Ｔ；または
−  １１Ｖとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ。
【００２４】
具体的には、本発明によって提供されるＴＮＦ結合因子において：
−  位置１１のアミノ酸残基は好ましくはＬまたはＶから選ばれ；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｖ、またはＬから選ばれ；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれ；
その結果、（ｉ）位置８９はＴであるか；または（ｉｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶであるか；または（ｉｉｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｉｖ）位置８９はＬでありかつ位置１１２はＫもしくはＱであるか；または（ｖ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶでありかつ位置１１２はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１はＶでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１はＶでありかつ位置１１２はＫもしくはＱである。
【００２５】
本発明によって提供されるアミノ酸配列のうち、（任意に、１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせで、特に１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異との組み合わせで）位置８９がＴであるか、または位置１１がＶでありかつ位置８９がＬであるアミノ酸配列が、特に好ましい。位置１１がＶでありかつ位置８９がＬであり、任意に１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有するアミノ酸配列がさらにより好ましい。
【００２６】
特に好ましい態様においては、本発明によって提供されるＴＮＦ結合因子において、位置１１のアミノ酸残基はＶであり、位置８９のアミノ酸残基はＬであり、位置１１０のアミノ酸残基はＴであり、位置１１２のアミノ酸残基はＳである。
【００２７】
特に好ましい態様において、本発明はＴＮＦ結合因子、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）に関し：
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、もしくは１つのみの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
−  位置１１のアミノ酸残基はＶであり；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基はＬであり；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基はＴであり；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基はＳであり；かつ
−  位置４９のアミノ酸残基はＡであり；かつ
−  位置７４のアミノ酸残基はＳである。
【００２８】
言及した通り、本願に記載される本発明によって提供されるアミノ酸配列はＴＮＦに結合し得る（具体的には、特異的に結合し得る）。
【００２９】
本発明によって提供されるアミノ酸配列は、好ましくは、ＷＯ０４／０４１８６２の例１において３）に記載されているＫＹＭ細胞を用いる細胞に基づくアッセイにおいて、５０ｎＭよりも良い、より好ましくは２５ｎＭよりも良い、例えば１０ｎＭ未満であるＥＣ５０値を有する。
【００３０】
表Ｂは、本発明のＴＮＦ結合因子の位置１１、８９、１１０、および１１２に存在し得るアミノ酸残基のいくつかの限定しない可能な組み合わせを一覧化している。特に好ましい組み合わせは太字によって指示されており、最も好ましい組み合わせは太字／下線によって指示されている。
【００３１】
しかしながら、一方では既存抗体の結合部位を最小化または削除することに関してＴＮＦ結合因子の配列を最適化すること（「配列最適化」）と、他方ではヒト化することとによって、安定性を包含するＴＮＦ結合因子の種々の特性は（顕著に）負に影響された。具体的には、物理的安定性の尺度としての融点が減少し、真核生物宿主P. pastorisおよび原核生物宿主E. coli両方による産生が減ぜられ、ＧＩ液中での安定性が低減された。
【００３２】
ＰＥＡの結合部位およびヒト化変異を「復帰変異」させ、それによって配列最適化を損なう代わりに、驚くべきことに、本発明者は、アミノ酸残基４９および／または７４が、両方の一見相互排他的な要件が満たされるように変改され得るということを見出した。表Ｂ−１およびＢ−２は、本発明のＴＮＦ結合因子の位置１１、８９、１１０、１１２、４９、および／または７４に存在し得るアミノ酸残基のいくつかの限定しない可能な組み合わせを一覧化している。
【００３３】
本発明によって提供されるＴＮＦ結合因子は、さらに、本願の明細書、例、および図に記載されている通りである。すなわち、それらは本願に記載される通りであるＣＤＲを有し、本願において開示される配列番号１の配列との配列同一性のある総体的度合（本願において定義される通り）を有し、および／またはそれらの参照配列（の１つ）との「アミノ酸の違い」（本願に記載される通り）の限定された数を有し得る。
【００３４】
好ましくは、本発明のＴＮＦ結合因子は次のＣＤＲを含む（Kabatの規則に従う）：
−  アミノ酸配列ＴＡＤＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹＹＤＥＰＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Kabatに従う）。
【００３５】
代替的には、ＣＤＲがAbmの規則によって与えられるときには、本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくは次のＣＤＲを含む：
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）。
【００３６】
本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくは：
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
をもまた有する。
【００３７】
本発明によって提供される本発明のＴＮＦ結合因子の種々の側面および好ましい側面に関して、配列番号１に関しての配列同一性の度合ならびに／または本発明のかかる結合因子に存在し得る（すなわち、配列番号１の配列と比較しての）「アミノ酸の違い」の数および種類に関しては、（ｉ）本発明のアミノ酸配列が、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列番号１の配列との配列同一性の度合を有すると言われるとき（その中のＣＤＲ、存在し得るいずれかのＣ末端延長、ならびに当該の特定の側面によって要求される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異は、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；および／または（ｉｉ）本発明のアミノ酸配列が、配列番号１の配列との７つ以下の、好ましくは５つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」を有すると言われるとき（再び、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮せず、当該の特定の側面によって要求される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異を考慮しない）、これは、当該の特定の側面によって要求される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異）ならびに存在し得るいずれかのＣ末端延長以外には、配列番号１の配列とのアミノ酸の違いを有さない配列をもまた包含するということに注意すべきである。
【００３８】
それゆえに、本発明の１つの特定の側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、配列番号１との１００％の配列同一性を有し得（ＣＤＲを包含するが、本願において開示される位置１１、４９、７４、８９、１１０、および／もしくは１１２の変異（単数もしくは複数）または変異の組み合わせ、ならびに／あるいは存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）、および／または配列番号１とのアミノ酸の違いを有さずにあり得る（すなわち、本願において開示される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異（単数もしくは複数）または変異の組み合わせ、ならびに存在し得るいずれかのＣ末端延長以外には）。
【００３９】
いずれかのアミノ酸の違いが（すなわち、いずれかのＣ末端延長、ならびに当該の本発明の特定の側面によって要求される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異以外に）存在するときに、それらのアミノ酸の違いはＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域内に存在し得るが、それらは好ましくはフレームワーク領域内にのみ存在し（Abmの規則によって定義される通り。すなわち、Abmの規則に従って定義されるＣＤＲ内ではない）、すなわち、その結果、本発明のＴＮＦ結合因子は配列番号１に存在するものと同じＣＤＲ（Abmの規則に従って定義される）を有する。
【００４０】
また、本発明のいずれかの側面に従う本発明のＴＮＦ結合因子が配列番号１の配列との１つ以上のアミノ酸の違いを（当該の特定の側面によって要求される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異以外に）有するときに、存在し得るかかる変異／アミノ酸の違い（すなわち、配列番号１の配列と比較して）のいくつかの特定の限定しない例は、例えばＥ１Ｄ、Ｐ４０Ａ、Ｐ４０Ｌ、Ｐ４０Ｓ（特にＰ４０Ａ）、Ｓ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、Ｌ７８Ｖ、Ｔ８７Ａ、またはそのいずれかの好適な組み合わせである。また、本発明のＴＮＦ結合因子は、好適には、Ｄ６０Ａ、Ｅ６１Ｄ、および／またはＰ６２Ｓ変異（の好適な組み合わせ）を、特に位置６０〜６２のＡＤＳモチーフとして含み得る（限定しない例は配列番号３９を見よ）。変異の他の例は、１つ以上の好適な「ヒト化」置換（の好適な組み合わせ）である；例えば、ＷＯ２００９／１３８５１９（またはＷＯ２００９／１３８５１９に引用されている従来技術）およびＷＯ２００８／０２００７９（またはＷＯ２００８／０２００７９に引用されている従来技術）、ならびにＷＯ２００８／０２００７９の表Ａ−３からＡ−８（これらは、可能なヒト化置換を示す一覧である）の参照がされる。
【００４１】
前述の変異のうち、Ｓ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、および／またはＬ７８Ｖ変異（またはそのいずれか２つのいずれかの好適な組み合わせ。その３つ全てを包含する）の存在が好ましい（配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３を見よ）。図５は、配列番号１、配列番号３１、および配列番号３６から４１のアラインメントを示している。
【００４２】
また、本発明のＴＮＦ結合因子が、その中にそれらが存在するポリペプチドまたは化合物のＮ末端部に存在および／またはそれを形成するときに、それらは好ましくは位置１のＤを含有する（すなわち、参照Ａと比較してのＥ１Ｄ変異）。従って、さらなる側面において、本発明は本発明のポリペプチド（これは本願にさらに記載される通りである）に関し、これがそのＮ末端に本発明のＴＮＦ結合因子（これは本願にさらに記載される通りである）を有し、本発明の前記ＴＮＦ結合因子が位置１のＤを有する。
【００４３】
類似に、本発明のＴＮＦ結合因子が一価の形態で用いられるときに、これは、好ましくは、本願に記載されるＣ末端延長Ｘ（ｎ）および位置１のＤ両方を有する。
【００４４】
位置１のＤおよびＣ末端延長を有する一価ＴＮＦ結合因子のいくつかの好ましい限定しない例は、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３、好ましくは配列番号３６、３９、および４０、最も好ましくは配列番号４０として与えられる。これに関して、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３のＴＮＦ結合因子は、一価の形態ではない本発明の化合物またはポリペプチドにもまた用いられ得るということに注意すべきである。そのケースにおいては、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３のＴＮＦ結合因子は、それらが本発明の前記ポリペプチドまたは化合物のＮ末端に存在しないときに、好ましくはそれらのＮ末端のＤの代わりにＥ（すなわち、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３の配列と比較してのＤ１Ｅ変異）を有するであろう（代わりに、好ましくは、本発明の前記ポリペプチドまたは化合物のＮ末端ＩＳＶＤは位置１のＤを有し得る；また、それらは、それらが化合物またはポリペプチドのＣ末端に存在しないときに、好ましくはＣ末端延長（例えば、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３に存在するＣ末端アラニン）を含有しないであろう（代わりに、好ましくは、本発明の前記ポリペプチドまたは化合物のＣ末端ＩＳＶＤはＣ末端延長を有するであろう）。
【００４５】
好ましい限定しない例によって、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、および６２〜６３は、配列番号１とのさらなるアミノ酸の違い、すなわちＳ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、および／またはＬ７８Ｖを有する本発明のＴＮＦ結合因子の例でもまたある。それゆえに、特定の側面において、本発明は、少なくともＳ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、および／またはＬ７８Ｖ変異の好適な組み合わせ、好ましくはこれらの変異のいずれか２つの好適な組み合わせ、例えばこれらの変異の３つ全てを有する（すなわち、本願に記載される位置１１、８９、１１０、および／または１１２の変異を有し、また、さらに本願に記載される通りである）本発明のＴＮＦ結合因子に関する。
【００４６】
本発明のＴＮＦ結合因子は、それらが一価の形態で用いられるときに、ならびに／あるいはその中にそれらが存在する蛋白質、ポリペプチド、または化合物もしくは構築物のＣ末端に存在および／もしくはそれを形成するときに（あるいはそれらが別様にかかる蛋白質、ポリペプチド、または他の化合物もしくは構築物の「露出された」Ｃ末端を有するとき。これによって、一般的には、ＩＳＶのＣ末端が定常ドメイン（例えばＣＨ１ドメイン）と会合または連結されていないということが意味される；再びＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５６の参照がされる）、好ましくは、式（Ｘ）ｎのＣ末端延長をもまた有し、式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、これは独立して天然に存在するアミノ酸残基から選ばれ（しかし、好ましい１つの側面に従うと、これはいずれかのシステイン残基を含まない）、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれる。
【００４７】
かかるＣ末端延長Ｘ（ｎ）のいくつかの好ましい限定しない例に従うと、Ｘおよびｎは次の通りであり得る：
（ａ）ｎ＝１かつＸ＝Ａｌａ；
（ｂ）ｎ＝２かつ各Ｘ＝Ａｌａ；
（ｃ）ｎ＝３かつ各Ｘ＝Ａｌａ；
（ｄ）ｎ＝２かつ少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
（ｅ）ｎ＝３かつ少なくとも１つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
（ｆ）ｎ＝３かつ少なくとも２つのＸ＝Ａｌａ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
（ｇ）ｎ＝１かつＸ＝Ｇｌｙ；
（ｈ）ｎ＝２かつ各Ｘ＝Ｇｌｙ；
（ｉ）ｎ＝３かつ各Ｘ＝Ｇｌｙ；
（ｊ）ｎ＝２かつ少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
（ｋ）ｎ＝３かつ少なくとも１つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
（ｌ）ｎ＝３かつ少なくとも２つのＸ＝Ｇｌｙ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
（ｍ）ｎ＝２かつ各Ｘ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；
（ｎ）ｎ＝３かつ各Ｘ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ；
（ｏ）ｎ＝３かつ少なくとも１つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；または
（ｐ）ｎ＝３かつ少なくとも２つのＸ＝ＡｌａもしくはＧｌｙ（残りのアミノ酸残基（単数または複数）Ｘは、独立していずれかの天然に存在するアミノ酸から選ばれるが、好ましくは独立してＶａｌ、Ｌｅｕ、および／またはＩｌｅから選ばれる）；
側面（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｍ）、および（ｎ）が特に好ましく、ｎ＝１または２の側面が好ましく、ｎ＝１の側面が特に好ましい。
【００４８】
好ましくは、本発明のＴＮＦ結合因子に存在するいずれかのＣ末端延長は、（自由な）システイン残基を含有しないということにもまた注意すべきである（前記システイン残基が、さらなる官能化、例えばＰＥＧ化のために用いられるかまたはそれを意図されない限り）。
【００４９】
有用なＣ末端延長のいくつかの特定の限定しない例は、次のアミノ酸配列である：Ａ、ＡＡ、ＡＡＡ、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＧ、ＧＡ、ＡＡＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＧＡＡ、またはＧＡＧ。
【００５０】
本発明のＴＮＦ結合因子が位置１１０または１１２の変異を（任意に、本願に記載される位置１１および／または８９の変異との組み合わせで）含有するときに、（位置１０９から始まる）フレームワーク４のＣ末端アミノ酸残基は次の通りであり得る：（ｉ）Ｃ末端延長が存在しない場合：ＶＴＶＫＳ（配列番号４３）、ＶＴＶＱＳ（配列番号４４）、ＶＫＶＳＳ（配列番号４５）、もしくはＶＱＶＳＳ（配列番号４６）；または（ｉｉ）Ｃ末端延長が存在する場合：ＶＴＶＫＳＸ（ｎ）（配列番号４７）、ＶＴＶＱＳＸ（ｎ）（配列番号４８）、ＶＫＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号４９）、もしくはＶＱＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号５０）、例えばＶＴＶＫＳＡ（配列番号５１）、ＶＴＶＱＳＡ（配列番号５２）、ＶＫＶＳＳＡ（配列番号５３）、またはＶＱＶＳＳＡ（配列番号５４）。本発明のＴＮＦ結合因子が位置１１０または１１２の変異を含有しない（本願に記載される位置１１および／または８９の変異のみを含有する）ときに、（位置１０９から始まる）フレームワーク４のＣ末端アミノ酸残基は、通常は：（ｉ）Ｃ末端延長が存在しないときに：ＶＴＶＳＳ（配列番号５５）（配列番号１の配列の通り）；または（ｉｉ）Ｃ末端延長が存在するときに：ＶＴＶＳＳＸ（ｎ）（配列番号５６）、例えばＶＴＶＳＳＡ（配列番号５７）どちらかであろう。これらのＣ末端配列において、Ｘおよびｎは本願においてＣ末端延長について定義されている通りである。
【００５１】
図４のアラインメントおよび図３から分かるように、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３のＴＮＦ結合因子はＥ１Ｄ変異およびＣ末端アラニン延長両方を有する。言及した通り、位置１のＤおよびＣ末端延長両方の存在は、これらのＴＮＦ結合因子（ならびに位置１のＤおよびＣ末端延長を有する本発明の他のＴＮＦ結合因子）を、一価の形態での使用にとって（すなわち、本願に記載される目的にとって）特に好適にする。
【００５２】
従って、さらなる側面において、本発明は、位置１のＤおよびＣ末端延長Ｘ（ｎ）（これは好ましくは単一のＡｌａ残基である）を有する本発明のＴＮＦ結合因子（これは本願にさらに記載される通りである）に関する。前記ＴＮＦ結合因子は、好ましくは一価の形態である（それで用いられ、および／またはそれでの使用を意図される）。１つの特定の側面において、前記一価ＴＮＦ結合因子は配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、６２、６３、および４１から選ばれる。
【００５３】
本発明のＴＮＦ結合因子のいくつかの好ましい限定しない例は配列番号８から４１および６２〜６９によって与えられ、それらの配列のそれぞれは本発明のさらなる側面を形成する（それらの配列の１つを含む蛋白質、ポリペプチド、または他の化合物もしくは構築物もそうである）。
【００５４】
本発明のいくつかの特に好ましいＴＮＦ結合因子は、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、および６２〜６３の配列である（または本願に記載されるように、位置１のＥを有するおよび／またはＣ末端延長なしのそのバリアント。本発明のポリペプチドまたは化合物によるそれらの意図される使用に依存する）。
【００５５】
それゆえに、第１の側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＴＡＤＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹＹＤＥＰＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Kabatに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基は好ましくはＬまたはＶから選ばれ；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｖ、またはＬから選ばれ；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれ；
その結果、（ｉ）位置８９はＴであるか；または（ｉｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶであるか；または（ｉｉｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｉｖ）位置８９はＬでありかつ位置１１２はＫもしくはＱであるか；または（ｖ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶでありかつ位置１１２はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１はＶでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１はＶでありかつ位置１１２はＫもしくはＱである。
【００５６】
さらなる側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＴＡＤＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹＹＤＥＰＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Kabatに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
この免疫グロブリン単一可変ドメインは、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列と比較しての変異）を言及されている位置に含む（付番はKabatに従う）：
−  ８９Ｔ；または
−  １１Ｖとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ。
【００５７】
具体的には、本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）を有する（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）。
【００５８】
特に、本発明によって提供されるＴＮＦ結合因子において、位置１１のアミノ酸残基はＶであり、位置８９のアミノ酸残基はＬであり、位置１１０のアミノ酸残基はＴであり、位置１１２のアミノ酸残基はＳである。
【００５９】
本願に記載されるように、存在し得る（すなわち、好適な組み合わせの）かかる変異／アミノ酸の違いのいくつかの特定の限定しない例は、例えば、Ｅ１Ｄ、Ｐ４０Ａ、Ｐ４０Ｌ、Ｐ４０Ｓ（特にＰ４０Ａ）、Ｓ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、Ｌ７８Ｖ、Ｔ８７Ａ、またはそのいずれかの好適な組み合わせ、ならびに例えばＤ６０Ａ、Ｅ６１Ｄ、および／またはＰ６２Ｓ変異（の好適な組み合わせ）（特に、位置６０〜６２のＡＤＳモチーフとして）および１つ以上の好適な「ヒト化」置換（の好適な組み合わせ。例えば配列番号３９を見よ）である。また、言及した通り、Ｓ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、および／またはＬ７８Ｖ変異（またはそのいずれか２つのいずれかの好適な組み合わせ。その３つ全てを包含する）の存在（ならびに、ＴＮＦ結合因子が本発明の化合物もしくはポリペプチドのＮ末端に存在および／もしくはそれを形成するか、または一価の形態であるときの位置１のＤの存在）が好ましい。
【００６０】
好ましい側面において、本発明のＴＮＦ結合因子、例えばＩＳＶＤは、位置４９のアラニン（Ａ４９）を含む。
【００６１】
さらなる好ましい側面において、本発明のＴＮＦ結合因子、例えばＩＳＶＤは、位置７４のセリン（Ｓ７４）を含む。
【００６２】
さらなる好ましい側面において、本発明のＴＮＦ結合因子、例えばＩＳＶＤは、位置７３のアスパラギン（Ｎ７３）および／または位置７５のリジン（Ｋ７５）を含む。
【００６３】
言及した通り、本発明においては、位置８９がＴであるか、または位置１１がＶでありかつ位置８９がＬである（任意に、１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせで、特に１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせで）アミノ酸配列が特に好ましい。位置１１がＶでありかつ位置８９がＬであり、任意に１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有するアミノ酸配列がさらにより好ましい。
【００６４】
それゆえに、１つの好ましい側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＴＡＤＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹＹＤＥＰＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Kabatに従う）と、
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基は好ましくはＬまたはＶから選ばれ；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基Ｔであり；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ（好ましくはＴである）；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれる（好ましくはＳである）。
【００６５】
別の好ましい側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＴＡＤＭＧ（配列番号２）であるＣＤＲ１（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹＹＤＥＰＶＫＧ（配列番号３）であるＣＤＲ２（Kabatに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Kabatに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基はＶであり；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基はＬであり；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれる。
１つの特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  ８９Ｌとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；
−  ８９Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  ８９Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；
かつＣＤＲ（Kabatに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００６６】
別の特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  １１Ｖとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；
かつＣＤＲ（Kabatに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００６７】
別の特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  １１Ｖとの組み合わせでの１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；または
−  ８９Ｌとの組み合わせでの１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；または
−  １１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせでの１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；
かつＣＤＲ（Kabatに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００６８】
別の特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  １１Ｖとの組み合わせでの１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；または
−  ８９Ｌとの組み合わせでの１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；または
−  １１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせでの１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；
かつＣＤＲ（Kabatに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００６９】
別の側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は位置８９のＴを含み、かつＣＤＲ（Kabatに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００７０】
別の側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は位置１１のＶおよび位置８９のＬを含み、かつＣＤＲ（Kabatに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００７１】
言及した通り、上の側面に従う本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくはさらにそれらがＳ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、および／またはＬ７８Ｖ変異の好適な組み合わせ、好ましくはこれらの変異のいずれか２つの好適な組み合わせ、例えばこれらの変異の３つ全てを（再び、ＴＮＦ結合因子が一価であるか、または本発明の化合物もしくはポリペプチドのＮ末端に存在するときには、好ましくはＥ１Ｄ変異をもまた）含有するようになっている。
【００７２】
別の側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基は好ましくはＬまたはＶから選ばれ；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｖ、またはＬから選ばれ；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれ；
その結果、（ｉ）位置８９はＴであるか；または（ｉｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶであるか；または（ｉｉｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｉｖ）位置８９はＬでありかつ位置１１２はＫもしくはＱであるか；または（ｖ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉ）位置８９はＬでありかつ位置１１はＶでありかつ位置１１２はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１はＶでありかつ位置１１０はＫもしくはＱであるか；または（ｖｉｉ）位置１１はＶでありかつ位置１１２はＫもしくはＱである。
【００７３】
さらなる側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
この免疫グロブリン単一可変ドメインは、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列と比較しての変異）を言及されている位置に含む（付番はKabatに従う）：
−  ８９Ｔ；または
−  １１Ｖとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ。
【００７４】
言及した通り、本発明のＴＮＦ結合因子が一価の形態で用いられ、および／または本発明の化合物のＣ末端（本願において定義される通り）に存在するときに、ＴＮＦ結合因子（および帰結として本発明のもたらされる化合物）は、好ましくはＣ末端延長Ｘ（ｎ）を有し、このＣ末端延長は、本発明のＴＮＦ結合因子について本願に記載される通り、および／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載される通りであり得る。
【００７５】
言及した通り、本発明において、位置８９がＴであるか、または位置１１がＶでありかつ位置８９がＬである（任意に、１１０Ｋもしくは１１０Ｑ変異および／または１１２Ｋもしくは１１２Ｑ変異との好適な組み合わせで、特に１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異との組み合わせで）アミノ酸配列が特に好ましい。位置１１がＶでありかつ位置８９がＬであり、任意に１１０Ｋまたは１１０Ｑ変異を有するアミノ酸配列がさらにより好ましい。
【００７６】
それゆえに、１つの好ましい側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基は好ましくはＬまたはＶから選ばれ；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基はＴであり；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ（好ましくはＴである）；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれる（好ましくはＳである）。
【００７７】
別の好ましい側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し：
−  アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＴＡＤＭＧ（配列番号５）であるＣＤＲ１（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＲＩＳＧＩＤＧＴＴＹ（配列番号６）であるＣＤＲ２（Abmに従う）と；
−  アミノ酸配列ＰＲＹＡＤＱＷＳＡＹＤＹ（配列番号４）であるＣＤＲ３（Abmに従う）と；
を有し、
−  少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％という、配列番号１のアミノ配列との配列同一性の度合（その中の存在し得るいずれかのＣ末端延長およびＣＤＲは、配列同一性の度合を決定するために考慮しない）；
および／または
−  配列番号１のアミノ酸配列との、７つ以下の、例えば５つ以下の、好ましくは３つ以下の、例えば３つ、２つ、または１つの「アミノ酸の違い」（本願において定義される通り。存在し得る位置（単数または複数）１１、８９、１１０、または１１２の上で一覧化されている変異のいずれかを考慮せず、存在し得るいずれかのＣ末端延長を考慮しない）（その中の前記アミノ酸の違いは、存在する場合には、フレームワークおよび／またはＣＤＲ内に存在し得るが、好ましくはＣＤＲではなくフレームワーク内のみに存在する）；
を有し、
任意に：
−  Ｃ末端延長（Ｘ）ｎ
を有し、
式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４、または５であり（好ましくは１または２、例えば１）；各Ｘは独立して選ばれる（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくは独立してアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から選ばれ；
その中の：
−  位置１１のアミノ酸残基はＶであり；かつ
−  位置８９のアミノ酸残基はＬであり；かつ
−  位置１１０のアミノ酸残基は好ましくは好適にＴ、Ｋ、またはＱから選ばれ；かつ
−  位置１１２のアミノ酸残基は好ましくは好適にＳ、Ｋ、またはＱから選ばれる。
【００７８】
１つの特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  ８９Ｌとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；
−  ８９Ｌおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；または
−  ８９Ｌおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの１１Ｖ；
かつＣＤＲ（Abmに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００７９】
別の特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  １１Ｖとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１０Ｋもしくは１１０Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；または
−  １１Ｖおよび１１２Ｋもしくは１１２Ｑとの組み合わせでの８９Ｌ；
かつＣＤＲ（Abmに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００８０】
別の特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  １１Ｖとの組み合わせでの１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；または
−  ８９Ｌとの組み合わせでの１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；または
−  １１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせでの１１０Ｋもしくは１１０Ｑ；
かつＣＤＲ（Abmに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００８１】
別の特定の限定しない側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は、次のアミノ酸残基（すなわち、配列番号１の配列と比較しての変異）を言及されている位置に含み（付番はKabatに従う）：
−  １１Ｖとの組み合わせでの１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；または
−  ８９Ｌとの組み合わせでの１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；または
−  １１Ｖおよび８９Ｌとの組み合わせでの１１２Ｋもしくは１１２Ｑ；
かつＣＤＲ（Abmに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００８２】
別の側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は位置８９のＴを含み、かつＣＤＲ（Abmに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００８３】
別の側面において、本発明のＴＮＦ結合因子は位置１１のＶおよび位置８９のＬを含み、かつＣＤＲ（Abmに従う）を有し、本願に記載される通りである配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性のある総体的度合を有する。
【００８４】
言及した通り、上の側面に従う本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくはさらに、それらがＳ４９Ａ、Ａ７４Ｓ、および／またはＬ７８Ｖ変異の好適な組み合わせ、好ましくはこれらの変異のいずれか２つの好適な組み合わせ、例えばこれらの変異の３つ全てを（再び、ＴＮＦ結合因子が一価であるかまたは本発明の化合物もしくはポリペプチドのＮ末端に存在するときには、好ましくはＥ１Ｄ変異をもまた）含有するようになっている。
【００８５】
別の特定の限定しない側面において、本発明は、一価の形態である本願に記載されるＴＮＦ結合因子に、特に、一価の形態でありかつ本願に記載される位置１のＤ（および／またはＥ１Ｄ変異）およびＣ末端延長Ｘ（ｎ）（例えばＣ末端アラニン残基）を有する本願に記載されるＴＮＦ結合因子に関する。
【００８６】
別の特定の限定しない側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し、これは、次のアミノ酸配列の１つから選ばれるアミノ酸配列であるか、または本質的にそれからなる：配列番号４０、配列番号３９、配列番号３６、配列番号６４、配列番号６９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、および配列番号６８。
【００８７】
別の特定の限定しない側面において、本発明は免疫グロブリン単一可変ドメインに関し、これは、次のアミノ酸配列の１つから選ばれるアミノ酸配列であるか、または本質的にそれからなる：配列番号４０、配列番号３９、配列番号３６、配列番号６４、配列番号６９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４１、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、および配列番号６８。
【００８８】
本発明の目的のためには、消化管は、口、咽頭、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結腸、直腸）、および肛門からなる。
【００８９】
本発明の目的のためには、「胃腸管」または「ＧＩ管」は、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（盲腸、結腸、直腸）、および肛門を包含すると理解される。本願において用いられる用語「胃内消化」は、胃、小腸、および／または大腸における消化を言い表していると理解される。
【００９０】
抗体の用語「胃内分解」は、本願においては、胃、小腸、および大腸に存在するエンド型もしくはエキソ型酵素による、または胃内消化の間の酸性条件への暴露による胃、小腸、大腸における本発明のＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの分解を言うために用いられる。
【００９１】
本願において用いられる用語「安定化されたＩＳＶＤ」、「安定化された化合物」、および「安定化されたポリペプチド」は、それぞれ、局所投与されたときの消化管における分解に対してそれをより安定にするように工作されたＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドを言い表していると理解される。本発明に従って処理または工作されていないＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドと比較して、本発明に従って工作された安定化されたＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドは、胃内消化、例えば胃、小腸、および大腸に存在するエンド型もしくはエキソ型酵素による消化によって、および／または胃に存在する酸性条件によって、よりゆっくりまたはより少ない程度に分解される。「安定化されたＩＳＶＤ」、「安定化された化合物」、および「安定化されたポリペプチド」は、それぞれ「ＧＩ管における分解に対する向上した安定性を有するＩＳＶＤ」、「ＧＩ管における分解に対する向上した安定性を有する化合物」、および「ＧＩ管における分解に対する向上した安定性を有するポリペプチド」ともまた言われる。
【００９２】
消化管へのＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの局所投与は難しい。なぜなら、消化管は局所適用されたＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドを分解および消化するからである。胃においては、低いｐＨおよびプロテアーゼペプシンが、摂取されたＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドを分解する。小腸においては、とりわけ酵素トリプシンおよびキモトリプシンが、摂取されたＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドを分解する。大腸においては、細菌由来のプロテアーゼが、摂取されたＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドを分解する。胃内消化に対する改善された安定性を有するＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドはＧＩ管への局所適用にとって好ましいであろう。
【００９３】
安定化されたＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドは、胃内分解を受けやすい１つ以上のアミノ酸残基から胃内分解に対して耐性であるアミノ酸残基への変異によって生じ得る。安定化されたＩＳＶＤ、化合物、およびポリペプチドは、胃内分解に対する安定性を増大させる複数のアミノ酸残基部分の変異によって生じ得る。
【００９４】
ゆえに、本発明は、本発明のＴＮＦ結合因子の安定性を付与し、ＴＮＦ結合因子の安定性を向上させるアミノ酸残基を同定することに関する。好ましくは、ＴＮＦ結合因子は、低ｐＨ条件の１つ以上、またはペプシン、トリプシン、キモトリプシン、および／もしくは細菌由来プロテアーゼなどのプロテアーゼの１つ以上の活性による胃内分解に対してより耐性にされる。
【００９５】
ある態様において、本発明は、胃内分解に対するＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの安定性を付与するアミノ酸残基を同定する方法に関し、（ａ）ＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドを１つ以上のプロテアーゼによって断片に分解するステップと；（ｂ）ステップ（ａ）の断片を例えばＬＣ−ＭＳなどの好適な手段によって分析するステップとを含み；それによって、胃内分解に対するＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの安定性を付与するアミノ酸残基（単数または複数）を同定する。
【００９６】
ある態様において、本発明は、胃内分解に対するＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの安定性を向上させる方法に関し、上のステップ（ａ）および（ｂ）、次に：（ｃ）胃内分解に対するＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの安定性を付与するアミノ酸残基（単数または複数）を変異させることと；（ｄ）上のステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すこととを含み；それによって、１つ以上の断片の不在は、胃内分解に対するＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの向上した安定性を指示する。
【００９７】
本明細書において：
−  用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」ともまた言われる）は、一般的に、別の可変ドメインとの相互作用なしに（例えば、従来の４鎖モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬドメインの間に要求されるＶＨ／ＶＬ相互作用なしに）機能的な抗原結合部位を形成し得る免疫グロブリン可変ドメイン（これは、ＶＨ、ＶＨＨ、またはＶＬドメインを包含する重鎖または軽鎖ドメインであり得る）を言うために用いられる。ＩＳＶＤの例は当業者には明瞭であろう。例えば、ナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、および／またはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨを包含する）、ＩｇＮＡＲドメイン、ＶＨドメインであるかまたはＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂ（商標））、ならびにＶＬドメインであるかまたはＶＬドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂ（商標））を包含する。本願において明白に別様に言及されない限り、重鎖可変ドメイン（例えばＶＨまたはＶＨＨドメイン）に基づくおよび／または由来するＩＳＶＤが一般的に好ましい。最も好ましくは、本願において明白に別様に指示されない限り、ＩＳＶＤはナノボディである。
−  用語「ナノボディ」は、一般的には、ＷＯ２００８／０２００７９またはＷＯ２００９／１３８５１９において定義されている通りであり、それゆえに特定の側面において、一般的には、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、もしくはラクダ化ＶＨ（例えばラクダ化ヒトＶＨ）、または一般的には（例えば、化学的安定性および／または可溶性、公知のヒトフレームワーク領域との最大のオーバーラップ、ならびに最大の発現のために最適化されたなどの）配列最適化されたＶＨＨを意味する。用語ナノボディ（単数または複数）はAblynx N.V.の登録商標であり、それゆえにナノボディ（登録商標）（単数および／または複数）ともまた言われ得るということが注意される）；
−  一般的に、本願において別様に指示されない限り、本願において参照されるＩＳＶＤ、ナノボディ、ポリペプチド、蛋白質、ならびに他の化合物および構築物は、人において（および／または任意に温血動物、特に哺乳動物においてもまた）疾患または障害の予防または処置への使用を意図される。それゆえに、一般的に、本願に記載されるＩＳＶＤ、ナノボディ、ポリペプチド、蛋白質、ならびに他の化合物および構築物は、好ましくは、それらが、（生物学的）薬または他の医薬的にもしくは治療上活性な化合物、および／あるいは医薬製品または組成物として用いられ得、および／または好適にその一部であり得るようになっている。かかる薬、化合物、または製品は、好ましくは、人間への投与にとって、例えばかかる予防または処置の必要がある対象の予防または処置にとって、または例えば治験の一部として好適であるようになっている。本願にさらに記載されるように、この目的のためには、かかる薬または化合物は、本発明によって提供されるＩＳＶＤ以外に他の部分、実体、または結合ユニットを含有し得る（これは、また本願に記載されるように、例えば１つ以上の他のさらなる治療薬部分、および／またはＩＳＶＤに基づくもしくはナノボディに基づく生物学的薬の薬物動態もしくは薬力学特性、例えばその半減期に影響する１つ以上の他の部分であり得る）。かかるさらなる治療薬または他の部分の好適な例は、当業者には明瞭であろう。例えば、一般的に、いずれかの治療活性蛋白質、ポリペプチド、または他の結合ドメインもしくは結合ユニット、および例えば修飾、例えばＷＯ２００９／１３８１５９の１４９から１５２頁に記載されているものを包含し得る。ＩＳＶＤに基づく生物学的薬またはナノボディに基づく生物学的薬は、好ましくは治療薬であるか、または治療薬としての使用を意図され（これは、予防薬および診断薬を包含する）、この目的のためには、好ましくは、治療上意味のある標的（例えば、ＲＡＮＫ−Ｌ、ｖＷＦ、ＩｇＥ、ＲＳＶ、ＣＸＣＲ４、ＩＬ−２３、または他のインターロイキンなど）に対する少なくとも１つのＩＳＶＤを含有する。かかるＩＳＶＤに基づくまたはナノボディに基づく生物学的薬のいくつかの特定の限定しない例については、例８から１８、また、例えば（例えば、限定なしにＷＯ２００４／０６２５５１、ＷＯ２００６／１２２８２５、ＷＯ２００８／０２００７９、およびＷＯ２００９／０６８６２７などの）Ablynx N.V.による種々の出願、ならびに例えば（限定なしに）ＷＯ２００６／０３８０２７、ＷＯ２００６／０５９１０８、ＷＯ２００７／０６３３０８、ＷＯ２００７／０６３３１１、ＷＯ２００７／０６６０１６、およびＷＯ２００７／０８５８１４などの出願の参照がされる。また、本願にさらに記載されるように、さらなる部分は、（ヒト）血清アルブミンなどの（ヒト）血清蛋白質を目標とする本願に記載されるＩＳＶＤまたはナノボディであり得、かかるＩＳＶＤまたはナノボディもまた、特に本願に記載されるＴＮＦ結合因子の半減期を延長する際のおよび／またはそのための治療使用を見出し得る。例えばＷＯ２００４／０４１８６５、ＷＯ２００６／１２２７８７、およびＷＯ２０１２／１７５４００の参照がされ��これらは、半減期延長のための血清アルブミン結合性ナノボディの使用を一般的に記載している。また、本明細書においては、本願において明白に別様に言及されない限り、本願において言及される全ての用語は、ＷＯ２００９／１３８５１９（もしくはＷＯ２００９／１３８５１９に引用されている従来技術）またはＷＯ２００８／０２００７９（もしくはＷＯ２００８／０２００７９に引用されている従来技術）において与えられている意味を有する。また、方法または技術が具体的に本願に記載されていないところでは、それはＷＯ２００９／１３８５１９（もしくはＷＯ２００９／１３８５１９に引用されている従来技術）またはＷＯ２００８／０２００７９（もしくはＷＯ２００８／０２００７９に引用されている従来技術）に記載されているように実施され得る。また、本願に記載される通り、本発明のいずれかのＩＳＶＤまたは化合物を含むいずれかの医薬製品または組成物は、医薬製品もしくは組成物への使用のための自体公知の１つ以上のさらなる組成物（すなわち、意図される医薬形態に依存する）および／または例えば治療使用を意図される１つ以上の他の化合物もしくは活性成分（すなわち、組み合わせの製品を提供する）をもまた含み得る。
【００９８】
また、本明細書または請求項に用いられるときに、次の用語は、ＷＯ２００９／１３８５１９の６２〜７５頁において与えられているものと同じ意味を有し、および／または当てはまるところではそれに記載されている様式で決定され得る：「アゴニスト」、「アンタゴニスト」、「インバースアゴニスト」、「非極性非荷電アミノ酸残基」、「極性非荷電アミノ酸残基」、「極性荷電アミノ酸残基」、「配列同一性」、「厳密に同じ」、および「アミノ酸の違い」（２つのアミノ酸配列の配列比較を言うとき）、「本質的に単離された（形態）（で）」、「ドメイン」、「結合ドメイン」、「抗原決定基」、「エピトープ」、（抗原）「に対する」または「を目標とする」、「特異性」、および「半減期」。加えて、用語「調節すること」および「調節する」、「相互作用部位」、「に特異的」「交差ブロッキングする」、「交差ブロッキングされる」、および「交差ブロッキング」、ならびに「本質的にｐＨに非依存的」は、Ablynx N.V.のＷＯ２０１０／１３０８３２の７４〜７９頁において定義されている通りである（および／またはそれに記載されているように決定され得る）。また、本発明の構築物、化合物、蛋白質、またはポリペプチドを言うときに、「一価」、「二価」（または「多価」）、「二重特異性」（または「多重特異性」）、および「二重パラトープ型」（または「多重パラトープ型」）のような用語は、ＷＯ２００９／１３８５１９、ＷＯ２０１０／１３０８３２、またはＷＯ２００８／０２００７９において与えられている意味を有し得る。
【００９９】
本願において言及されるＩＳＶＤ、ナノボディ、ＩＳＶＤに基づく生物学的薬、ナノボディに基づく生物学的薬、またはいずれかの他のアミノ酸配列、化合物、もしくはポリペプチドとの関係においてここで用いられる用語「半減期」は、一般的には、ＷＯ２００８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に記載されているように定義され得、そこにおいて言及されている通り、例えば天然のメカニズムによる配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離を原因として、アミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドの血清中濃度がインビボにおいて５０％低減されるために取られる時間を言う。本発明のアミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドのインビボ半減期は、自体公知のいずれかの様式で、例えば薬物動態分析によって決定され得る。好適な技術は当業者には明瞭であろう。例えば、一般的には、ＷＯ２００８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に記載されている通りであり得る。また、ＷＯ２００８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）において言及されている通り、半減期はｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、および曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを用いて表現され得る。これに関して、本願において用いられる用語「半減期」は、具体的にはｔ１／２ベータまたは消失半減期を言うということに注意すべきである（その中で、ｔ１／２アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方は考慮に入れずにおき得る）。例えば、下の実験の部、ならびに標準的なハンドブック、例えばKenneth, A et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPeters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)の参照がされる。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)の参照もまたされる。類似に、用語「半減期の増大」または「増大した半減期」もまたＷＯ２００８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）において定義されている通りであり、具体的にはｔ１／２ベータの増大を言い、ｔ１／２アルファおよび／もしくはＡＵＣまたは両方の増大ありまたはなしどちらかである。
【０１００】
従って、ある側面において、本発明は本願に記載される化合物に関し、前記化合物がさらに血清蛋白質結合性部分を含む。
【０１０１】
さらなる側面において、本発明は本願に記載される化合物に関し、前記血清蛋白質結合性部分が血清アルブミンに結合する。
【０１０２】
用語が本願において具体的に定義されていないときには、それは当分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者には明瞭であろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd. Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)；Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985)；Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)；Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)；Roitt et al., Roitt' s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)；およびJaneway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)、ならびに本願において引用される一般的な背景技術の参照がされる。
【０１０３】
また、すでに本願において指示されている通り、ナノボディのアミノ酸残基は、Kabat et al.（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）によって与えられているＶＨの一般的な付番に従って付番され、Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195の記事においてラクダからのＶＨＨドメインに適用；または本願において参照される通りである。この付番に従って、ナノボディのＦＲ１は位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は位置３６〜４９のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。［これに関しては、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当分野において周知である通り、ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸残基の総数は様々であり得、Kabat付番によって指示されるアミノ酸残基の総数に対応せずにあり得るということに注意すべきである（すなわち、Kabat付番に従う１つ以上の位置は、実際の配列中では占有されずにあり得、または実際の配列は、Kabat付番によって許される数よりも多くのアミノ酸残基を含有し得る）。これは、一般的に、Kabatに従う付番が、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の付番に対応し得、または対応せずにあり得るということを意味している。しかしながら、一般的には、Kabatの付番に従って、ＣＤＲ中のアミノ酸残基の数にかかわらず、Kabat付番に従う位置１はＦＲ１の始めに対応し、逆もまた同様であり、Kabat付番に従う位置３６はＦＲ２の始めに対応し、逆もまた同様であり、Kabat付番に従う位置６６はＦＲ３の始めに対応し、逆もまた同様であり、Kabat付番に従う位置１０３はＦＲ４の始めに対応し、逆もまた同様であると言い得る。］。
【０１０４】
ＶＨドメインのアミノ酸残基に付番するための代替的な方法は、Chothia et al.（Nature 342, 877-883 (1989)）によって記載されている方法、いわゆる「AbM定義」、およびいわゆる「コンタクト定義」であり、これらの方法は、似た様式でラクダからのＶＨＨドメインおよびナノボディにもまた適用され得る。しかしながら、本明細書、側面、および図においては、別様に指示されない限り、Riechmann and MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されているKabatに従う付番が遵行される。
【０１０５】
図、いずれかの配列一覧、および実験の部／例は本発明をさらに例解するためにのみ与えられており、本願において明白に別様に指示されない限り、本発明および／または添付の請求項の範囲をいずれかのやり方で限定すると解釈または理解されるべきではないということにもまた注意すべきである。
【０１０６】
本発明は、本願に記載される本発明のＴＮＦ結合因子を含むかまたは本質的にそれからなる（すなわち、かかるＴＮＦ結合因子の１つ以上、例えば１つ、２つ、または３つのかかるＴＮＦ結合因子を含むかまたは本質的にそれからなる）蛋白質、ポリペプチド、および他の構築物、分子、または化学的実体と；本発明のＴＮＦ結合因子を発現／産生するためのならびに／またはそれを含む蛋白質、ポリペプチド、および他の構築物、分子、もしくは化学的実体を発現／産生するための方法と；本発明のＴＮＦ結合因子ならびに／またはそれを含む蛋白質、ポリペプチド、および他の構築物、分子、もしくは化学的実体を含む組成物および製品（例えば、医薬組成物および製品）と；本発明のＴＮＦ結合因子をコードおよび／またはそれを含む蛋白質もしくはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および核酸と；本発明のＴＮＦ結合因子、ならびにそれを含む蛋白質、ポリペプチド、および他の構築物、分子、または化学的実体の使用（特に治療、予防、ならびに診断使用）とにもまた関する。
【０１０７】
本発明のこれらおよび他の側面、態様、利点、適用、および使用は、本願におけるさらなる記載から明瞭になるであろう。
【０１０８】
従って、さらなる側面において、本発明は、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、または３つの）本発明のＴＮＦ結合因子を含むかまたは本質的にそれからなる蛋白質（例えば、融合蛋白質）、ポリペプチド、構築物、化合物、または他の化学的実体に関する（まとめて、本願においては「本発明の化合物」、「本発明のポリペプチド」、「本発明の構築物」、または「本発明の融合蛋白質」ともまた言われる）。ゆえに、本発明の化合物はポリペプチドであり得る。
【０１０９】
本発明のかかる化合物は、本発明の１つ以上のＴＮＦ結合因子以外に、さらに１つ以上の他のアミノ酸配列、化学的実体、または部分を含有し得る。それらの他のアミノ酸配列、化学的実体、または部分は、１つ以上の所望の特性を本発明の（もたらされる）化合物に授け得、および／または本発明の（もたらされる）化合物の特性を所望の様式で変改し得て、例えば、本発明の（もたらされる）化合物に所望の生物学的および／または治療活性を提供し（例えば、本発明のもたらされる化合物に、別の治療上意味のある標的に対する親和性および好ましくは力価を提供し、その結果、もたらされる化合物がＴＮＦおよびその他の治療上意味のある標的に関して「二重特異性」になる）、所望の半減期を提供し、ならびに／または薬物動態および／もしくは薬力学特性を（別様に）改変もしくは改善して、本発明の化合物を特定の細胞、組織、もしくは臓器（癌細胞および癌組織を包含する）にターゲティングし、細胞傷害効果を提供し、および／または検出可能なタグもしくは標識として働く。かかる他のアミノ酸配列、化学的実体、または部分のいくつかの限定しない例は：
−  １つ以上の好適なリンカー（例えば、９ＧＳ、１５ＧＳ、もしくは３５ＧＳリンカー）；ならびに／または
−  ＴＮＦ以外の治療上意味のある標的を目標とする１つ以上の結合ドメインもしくは結合ユニット（すなわち、ＴＮＦおよび別の治療上意味のある標的両方について二重特異性である本発明の化合物を提供するため）；ならびに／または
−  半減期の増大を提供する１つ以上の結合ドメインもしくは結合ユニット（例えば、血清アルブミンなどの血清蛋白質に対して結合し得る結合ドメインもしくは結合ユニット）；ならびに／または
−  本発明の化合物を所望の細胞、組織、もしくは臓器（例えば癌細胞）にターゲティングする１つ以上の結合ドメインもしくは結合ユニット；ならびに／または
−  ＴＮＦに対する増大した特異性を提供する１つ以上の結合ドメインもしくは結合ユニット（通常は、それらはＴＮＦに結合する能力があるであろうが、一般的には、それら自体では本質的にＴＮＦに対して機能的ではないであろう）；ならびに／または
−  本発明の化合物が（所望の）細胞内に内在化されることを許す結合ドメイン、結合ユニット、もしくは他の化学的実体（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５８に記載されている内在化抗ＥＧＦＲナノボディ）；ならびに／または
−  半減期を改善する部分、例えば好適なポリエチレングリコール基（すなわちＰＥＧ化）、もしくは増大した半減期を提供するアミノ酸配列、例えばヒト血清アルブミンもしくはその好適な断片（すなわちアルブミン融合体）、もしくは例えばＷＯ２００８／０６８２８０に記載されている血清アルブミン結合性ペプチド；ならびに／または
−  細胞傷害性ペイロードなどのペイロード；ならびに／または
−  検出可能な標識もしくはタグ、例えば放射性標識もしくは蛍光標識；ならびに／または
−  本発明の化合物の固定化、検出、および／もしくは精製を助け得るタグ、例えばＨＩＳもしくはＦＬＡＧ３タグ；ならびに／または
−  官能化され得るタグ、例えばＣ末端ＧＧＣもしくはＧＧＧＣタグ；ならびに／または
−  本発明のＴＮＦ結合因子についてさらに本願に記載される通りおよび／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載される通りであり得る、Ｃ末端延長Ｘ（ｎ）、
である。
【０１１０】
通常はより好ましくないが、本発明の化合物が（好ましくはヒトの）従来の抗体の１つ以上の一部もしくは断片（例えば、Ｆｃ部もしくはその機能的な断片、または１つ以上の定常ドメイン）および／またはラクダ重鎖のみの抗体の１つ以上の一部もしくは断片（例えば、１つ以上の定常ドメイン）をもまた含有し得るということもまた本発明の範囲から除外されない。
【０１１１】
ある具体的な側面において、本発明は構築物に関し、これが、本願において定義されるＩＳＶＤまたは本願において定義される化合物を含むかまたは本質的にそれからなり、かつ任意に１つ以上のペプチド性リンカーによって連結される１つ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットをさらに含む。
【０１１２】
さらなる具体的な側面において、本発明は本願において定義される構築物に関し、その中の前記１つ以上の他の基、残基、部分、または結合ユニットは、ポリエチレングリコール分子、血清蛋白質またはその断片、血清蛋白質に結合し得る結合ユニット、Ｆｃ部分、および血清蛋白質に結合し得る小型の蛋白質またはペプチドからなる群から選ばれる。
【０１１３】
本発明の化合物が、１つ以上のさらなる結合ドメインまたは結合ユニット（例えば、ＴＮＦに対する増大した特異性を提供するＴＮＦに対するさらなる本質的に非機能的な結合ドメインまたは結合ユニット、ＴＮＦ以外の治療標的に対する結合ドメインまたは結合ユニット、増大した半減期を提供するヒト血清アルブミンなどの標的に対する結合ドメインまたは結合ユニット、ならびに／あるいは本発明の化合物を特定の細胞、組織、もしくは臓器にターゲティングするおよび／または本発明の化合物が細胞内に内在化されることを許す結合ドメインまたは結合ユニット）を含有するときに、これらの他の結合ドメインまたは結合ユニットは、好ましくは１つ以上のＩＳＶＤを含み、より好ましくは全てＩＳＶＤである。例えば、限定なしに、これらの１つ以上のさらなる結合ドメインまたは結合ユニットは、１つ以上のナノボディ（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、および／またはラクダ化ＶＨ、例えばラクダ化ヒトＶＨを包含する）、ＶＨドメインであるかまたはＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体、ＶＨドメインであるかもしくは本質的にそれからなるかまたはＶＨドメインに由来するｄＡｂ、あるいはさらにはＶＬドメインであるかまたは本質的にそれからなる（単一）ドメイン抗体またはｄＡｂであり得る。特に、これらの１つ以上の結合ドメインまたは結合ユニットは、存在するときには、１つ以上のナノボディを含み得、より具体的には全てナノボディである。
【０１１４】
本発明の化合物がそのＣ末端にＩＳＶＤを有するときに（このＣ末端ＩＳＶＤは本発明のＴＮＦ結合因子であり得るか、あるいは例えば本発明の化合物に存在する場合には、ＴＮＦに対する増大した特異性を提供するＴＮＦに対するさらなる本質的に非機能的なＩＳＶＤ、ＴＮＦ以外の治療標的に対するＩＳＶＤ、増大した半減期を提供するヒト血清アルブミンなどの標的に対するＩＳＶＤ、あるいは本発明の化合物を特定の細胞、組織、もしくは臓器にターゲティングするおよび／または本発明の化合物が細胞内に内在化されることを許すＩＳＶＤであり得る）、本発明の化合物（すなわち、前記Ｃ末端ＩＳＶＤ）は、好ましくはＣ末端延長Ｘ（ｎ）を有し、このＣ末端延長は、本発明のＴＮＦ結合因子について本願に記載される通りおよび／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載される通りであり得る。
【０１１５】
本発明の化合物が本発明の１つ以上のＴＮＦ結合因子に加えていずれかのさらなるＩＳＶＤを含有するときに（この１つ以上のさらなるＩＳＶＤは、言及した通り、ＴＮＦに対する増大した特異性を提供するＴＮＦに対するさらなる本質的に非機能的なＩＳＶＤ、ＴＮＦ以外の治療標的に対するＩＳＶＤ、増大した半減期を提供するヒト血清アルブミンなどの標的に対するＩＳＶＤ、ならびに／あるいは本発明の化合物を特定の細胞、組織、もしくは臓器にターゲティングするおよび／または本発明の化合物が細胞内に内在化されることを許すＩＳＶＤであり得る）、かかるさらなるＩＳＶＤがナノボディであるか、またはＶＨ配列である、本質的にそれからなる、および／もしくはそれに由来するＩＳＶＤであるところでは、本発明の好ましい側面に従って、本発明の化合物に存在する前記１つ以上の（好ましくは全ての）さらなるＩＳＶＤは、それらの配列中に、既存抗体による結合を低減する１つ以上のフレームワーク変異を含有するであろう。特に、本発明のこの側面に従うと、かかるさらなるＩＳＶＤは位置１１、８９、１１０、および／または１１２のアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）を含有し得、それらはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載される通りであり、および／またはそれらは本質的に本発明のＴＮＦ結合因子について本願に記載される通りである。１つの特定の側面において、本発明の化合物がそのＣ末端にかかるＩＳＶＤを有する（すなわち、そのＣ末端に本発明のＴＮＦ結合因子を有さない）ときに、Ｃ末端に存在および／またはそれを形成する少なくとも前記ＩＳＶＤは、既存抗体による結合を低減するかかるフレームワーク変異を有する（前記Ｃ末端ＩＳＶＤは、好ましくは本願に記載されるＣ末端延長Ｘ（ｎ）をもまた有するであろう）。
【０１１６】
言及した通り、本発明の化合物が増大した半減期（すなわち、本発明の一価ＴＮＦ結合因子と比較して）を有すべきときには、本発明の化合物は、好ましくは、かかる増大した半減期を提供する少なくとも１つの（例えば１つの）ＩＳＶＤ（特にナノボディ）を含有する。かかるＩＳＶＤは、通常は、好適な血清蛋白質、例えばトランスフェリン、特に（ヒト）血清アルブミンを目標とするであろう。具体的には、かかるＩＳＶＤまたはナノボディは、例えばＥＰ２１３９９１８、ＷＯ２０１１／００６９１５、ＷＯ２０１２／１７５４００、ＷＯ２０１４／１１１５５０に記載されているヒト血清アルブミンに対する（単一）ドメイン抗体またはｄＡｂであり得、特に、ＷＯ２００４／０４１８６５、ＷＯ２００６／１２２７８７、ＷＯ２０１２／１７５４００、またはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載されている血清アルブミン結合性ナノボディであり得る。特に好ましい血清アルブミン結合性ＩＳＶＤは、ナノボディＡｌｂ−１（ＷＯ２００６／１２２７８７を見よ）またはそのヒト化バリアント、例えばＡｌｂ−８（ＷＯ２００６／１２２７８７、配列番号６２）、Ａｌｂ−２３（ＷＯ２０１２／１７５４００、配列番号１）、およびＡｌｂ−１の他のヒト化（また、好ましくは配列最適化）バリアント、および／またはＡｌｂ−８もしくはＡｌｂ−２３のバリアント（または、より一般的には、Ａｌｂ−１、Ａｌｂ−８、およびＡｌｂ−２３と本質的に同じＣＤＲを有するＩＳＶＤ）である。
【０１１７】
再び、言及した通り、かかる血清アルブミン結合性ＩＳＶＤは、存在するときには、その配列中に、既存抗体による結合を低減する１つ以上のフレームワーク変異を含有し得る。特に、かかる血清アルブミン結合性ＩＳＶＤが、本質的にＶＨドメインからなるおよび／またはそれに由来するナノボディまたは（単一）ドメイン抗体であるときに、血清アルブミン結合性ＩＳＶＤは位置１１、８９、１１０、および／または１１２のアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）を含有し得、それらはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載されている通りであり、および／またはそれらは本質的に本発明のＴＮＦ結合因子について本願に記載される通りである。例えば、ＷＯ２０１５／１７３３２５は、既存抗体による結合を低減する位置１１、８９、１１０、および／または１１２のアミノ酸残基／変異を含有するＡｌｂ−１、Ａｌｂ−８、およびＡｌｂ−２３のいくつものバリアントを記載しており、それらは本発明の化合物に用いられ得る。
【０１１８】
本発明のある具体的な限定しない側面において、本発明は、ＴＮＦに結合する１つ以上のビルディングブロック、例えばＩＳＶＤ以外に、本願に記載されるように好ましくはヒト血清アルブミンに結合する血清アルブミン結合性ＩＳＶＤなどの血清アルブミンに結合する少なくとも１つのビルディングブロックを含む本発明の化合物、例えば本発明のポリペプチドを提供し、前記血清アルブミン結合性ＩＳＶＤは、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１からＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１からＣＤＲ３）からなり、その中のＣＤＲ１はＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２はＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、ＣＤＲ３はＧＧＳＬＳＲである。好ましくは、ヒト血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２、またはＡｌｂ２２３からなる群から選ばれる（ｃｆ．表Ｄ）。
【０１１９】
再び、かかる血清アルブミン結合性ＩＳＶＤが本発明の化合物のＣ末端に存在するときに、血清アルブミン結合性ＩＳＶＤ（および結果として本発明の化合物）は好ましくはＣ末端延長Ｘ（ｎ）を有し、このＣ末端延長は、本願において本発明のＴＮＦ結合因子について記載されている通りおよび／またはＷＯ２０１２／１７５７４１もしくはＷＯ２０１５／１７３３２５に記載されている通りであり得る。これは、好ましくは、ＷＯ２０１５／１７３３２５に記載されている位置１１、８９、１１０、および／または１１２のアミノ酸残基／変異（の好適な組み合わせ）のような、既存抗体による結合を低減する変異をもまた有する。
【０１２０】
しかしながら、言及した通り、本発明の化合物の半減期を増大させる他の手段（例えばＰＥＧ化、ヒトアルブミンもしくはその好適な断片との融合、または好適な血清アルブミン結合性ペプチドの使用）もまた、より好ましくはないが、本発明の範囲に包含される。
【０１２１】
従って、ある態様において、本発明は本願に記載される化合物に関し、前記血清蛋白質結合性部分が抗体に基づかないポリペプチドである。
【０１２２】
さらなる態様において、本発明は、さらにＰＥＧを含む本願に記載される化合物に関する。
【０１２３】
一般的には、本発明の化合物が増大した半減期を有するときに（例えば、半減期増大性のＩＳＶＤの存在、または半減期を増大させるいずれかの他の好適なやり方による）、本発明のもたらされる化合物は、好ましくは、本発明の一価ＴＮＦ結合因子の半減期よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、または２０倍超長い半減期（本願において定義される通り）を有する（ヒトおよび／または好適な動物モデルどちらか、例えばマウスもしくはカニクイザルにおいて測定される）。具体的には、本発明の化合物は、好ましくは、少なくとも１日、好ましくは少なくとも３日、より好ましくは少なくとも７日、例えば少なくとも１０日というヒト対象における半減期（本願において定義される通り）を有する。
【０１２４】
１つ以上のＩＳＶＤに基づく本発明の化合物が異なる「フォーマット」を有し得、例えば本質的に一価、二価、または三価であり得、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであり得、二重パラトープ型であり得るということは本願の開示から明瞭であろう（本願および例えばＷＯ２００９／０６８６２５において定義される通り）。例えば、本発明の化合物は：
−  （本質的に）一価であり得、すなわち（本質的に）本発明の単一のＴＮＦ結合因子を含む。言及した通り、一価の形態で用いられるときに、本発明のＴＮＦ結合因子は、好ましくは本願にさらに記載されるＣ末端延長Ｘ（ｎ）を有する。本発明のかかる化合物もまた半減期延長され得る；
−  （本質的に）二価または三価で単一特異性であり得る。本発明のかかる化合物は、ＴＮＦに対する２つ以上のＩＳＶＤを含むであろう。それらは同じかまたは異なり得、異なるときには、ＴＮＦ上の同じエピトープまたはＴＮＦ上の異なるエピトープを目標とし得る（後者のケースにおいては、本発明の二重パラトープ型または多重パラトープ型化合物を提供するため）。本発明のかかる化合物もまた半減期延長され得る；
−  （本質的に）二価、三価（または多価）で二重特異性または三重特異性（または多重特異性）であり得る。本発明のかかる化合物は、ＴＮＦおよび少なくとも１つの他の標的を目標とするであろう。本願に記載されるように、前記他の標的は、例えば、ＴＮＦおよび前記他の治療標的に関して二重特異性である本発明の化合物を提供するために、別の治療上意味のある標的（すなわち、ＴＮＦ以外）であり得る。前記他の標的は、増大した半減期を有する本発明の化合物を提供するために、増大した半減期を提供する標的（例えばヒト血清アルブミン）でもまたあり得る。また本願において言及されるように、かかる他の標的は、本発明の化合物が特定の細胞、組織、もしくは臓器にターゲティングされることをもまた許し得、または本発明の化合物が細胞内に内在化されることを許し得る。これらのアプローチ／ＩＳＶＤを組み合わせて、例えば、ＴＮＦおよび少なくとも１つの他の治療上意味のある標的について二重特異性でありかつ半減期延長された本発明の化合物を提供することもまた可能である。
【０１２５】
再び、好ましくは、本発明のこれらの化合物が、本発明の少なくとも１つのＴＮＦ結合因子以外の１つ以上のＩＳＶＤを含有するときに、それらの他のＩＳＶＤの少なくとも１つ、好ましくは全ては、その配列中に、既存抗体による結合を低減する１つ以上のフレームワーク変異を含有するであろう（例えば、具体的には、本発明のＴＮＦ結合因子について本願に記載されている通りおよび／または一般的にＷＯ２０１５／１７３３２５に記載されている通りである位置１１、８９、１１０、および／または１１２のアミノ酸残基／変異の組み合わせ）。また、本発明のかかる化合物がそれらのＣ末端に本発明のＴＮＦ結合因子を有するときに、前記Ｃ末端ＴＮＦ結合因子（および結果として本発明の化合物）は、好ましくは本願に記載されるＣ末端延長Ｘ（ｎ）を有するであろう。類似に、本発明のかかる化合物がそれらのＣ末端に別のＩＳＶＤ（すなわち、本発明のＴＮＦ結合因子ではなく、例えば半減期延長性のＩＳＶＤ）を有するときに、前記Ｃ末端ＩＳＶＤ（および結果として本発明の化合物）は、好ましくは本願に記載されるＣ末端延長Ｘ（ｎ）を有し、および／またはその配列中に、既存抗体による結合を低減する１つ以上のフレームワーク変異を含有するであろう（再び、さらに本願およびＷＯ２０１５／１７３３２５に記載される通り）。
【０１２６】
当業者には明瞭であろう通り、本発明の化合物が（例えば皮膚もしくは目への）局所使用を意図されるか、または例えば、例えばＧＩ管のどこかで（胃腸；例えば、経口投与、または座薬による投与後）もしくは肺において（例えば、吸入による投与後）（局部的な）治療作用を有することを意味されるか、またはその意図される作用箇所に（例えば直接注射によって）直接的に適用されることを別様に意味されるときには、本発明の化合物は通常は半減期延長を要求しないであろう。また、ある種の急性状態または適応症の処置のためには、長くなった半減期を有さないことが好ましくあり得る。これらのケースにおいて、半減期延長なしの本発明の一価化合物または本発明の化合物（ＴＮＦ結合因子を含む）（例えば、ＴＮＦに関して二価または二重パラトープ型である本発明の化合物）の使用が好ましい。
【０１２７】
本発明のかかる化合物のいくつかの好ましい限定しない例が下の表Ｃ−１に概略的に表されており、それらのそれぞれは本発明のさらなる側面を形成する。半減期延長なしの本発明の好適な化合物の他の例は、本願の開示に基づいて当業者には明瞭であろう。
【０１２８】
当業者には明瞭であろう通り、本発明の化合物が全身投与をならびに／または慢性疾患もしくは障害の防止および／もしくは処置を意図されるときには、本発明の前記化合物は、すなわち本発明のかかる化合物に存在するＴＮＦ結合因子（単数または複数）と比較して、増大した半減期（本願において定義される通り）を有することが通常は好ましいであろう。より好ましくは、本発明のかかる化合物は、半減期延長性のＩＳＶＤ、例えば好ましくはヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶＤ、特にナノボディを含有するであろう（本願において定義される通り）。
【０１２９】
本発明のかかる化合物のいくつかの好ましい限定しない例が下の表Ｃ−２に概略的に表されており、これらのそれぞれは本発明のさらなる側面を形成する。半減期延長を有する本発明の好適な化合物の他の例は、本願の開示に基づいて当業者には明瞭であろう。一般的に、半減期延長を有する本発明の化合物では、Ｃ末端延長の存在が大いに好ましい。
【０１３０】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のポリペプチドなどの化合物の調製のための「ビルディングブロック」として用いられ得、これは、ＴＮＦ上の同じもしくは別のエピトープに対するおよび／またはＴＮＦ以外の１つ以上の抗原、蛋白質、もしくは標的に対する１つ以上のさらなる「ビルディングブロック」、例えばＩＳＶＤ、例えば治療作用機序を有するビルディングブロックを任意に含有し得る。
【０１３１】
一般的に、単一のビルディングブロック、単一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、または単一のナノボディを含むかまたは本質的にそれからなる化合物、ポリペプチド、または構築物は、本願においてはそれぞれ「一価」化合物または「一価」ポリペプチドまたは「一価構築物」と言われる。（例えばＩＳＶＤなどの）２つ以上のビルディングブロックまたは結合ユニットを含む化合物、ポリペプチド、または構築物は、本願においては「多価」化合物、ポリペプチド、構築物ともまた言われ、かかる化合物、ポリペプチド、または構築物に存在するビルディングブロック／ＩＳＶＤは、本願においては「多価フォーマット」であるともまた言われる。例えば、「二価」化合物またはポリペプチドは、任意にリンカー配列によって連結される２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得、その一方で、「三価」化合物またはポリペプチドは、任意に２つのリンカー配列によって連結される３つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る；その一方で、「四価」化合物またはポリペプチドは、任意に３つのリンカー配列によって連結される４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る、などである。
【０１３２】
多価化合物、ポリペプチド、または構築物において、２つ以上のＩＳＶＤ、例えばナノボディ同士は同じかまたは異なり得、同じ抗原または抗原決定基（例えば、同じ一部（単数もしくは複数）もしくはエピトープ（単数もしくは複数）、または異なる一部もしくはエピトープ）を目標とし得、あるいは代替的には異なる抗原または抗原決定基を目標とし得；あるいはそのいずれかの好適な組み合わせである。少なくとも１つのビルディングブロックが第１の抗原（すなわちＴＮＦ）を目標としかつ少なくとも１つのビルディングブロックが第２の抗原（すなわちＴＮＦとは異なる）を目標とする、（例えばＩＳＶＤなどの）少なくとも２つのビルディングブロックを含有する化合物、ポリペプチド、または構築物は、それぞれ「多重特異性」化合物、ポリペプチド、または構築物ともまた言われ、かかる化合物、ポリペプチド、または構築物に存在する（例えばＩＳＶＤなどの）ビルディングブロックは、本願においては「多重特異性フォーマット」であるともまた言われる。それゆえに、例えば、本発明の「二重特異性」化合物またはポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＴＮＦ）を目標とする少なくとも１つのＩＳＶＤと第２の抗原（すなわち、ＴＮＦとは異なる）を目標とする少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤとを含む化合物またはポリペプチドであり、その一方で、本発明の「三重特異性」化合物またはポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＴＮＦ）を目標とする少なくとも１つのＩＳＶＤと第２の抗原（すなわちＴＮＦとは異なる）を目標とする少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤと第３の抗原（すなわち、ＴＮＦおよび第２の抗原両方とは異なる）を目標とする少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤとを含む化合物またはポリペプチドである；などである。
【０１３３】
例えば「二重パラトープ型」化合物、ポリペプチド、もしくは構築物、または「三重パラトープ型」化合物、ポリペプチド、もしくは構築物などの、「多重パラトープ型」化合物、「多重パラトープ型」ポリペプチド、および「多重パラトープ型」構築物は、それぞれが異なるパラトープを有する２つ以上のビルディングブロックを含むかまたは本質的にそれからなる。
【０１３４】
従って、ＴＮＦに結合する本発明のＩＳＶＤは本質的に単離された形態（本願において定義される通り）であり得、またはそれらは化合物、ポリペプチド、もしくは構築物の一部を形成し得、これはＴＮＦに結合する１つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなり得、これは任意にさらに１つ以上のさらなるアミノ酸配列を含み得る（全て、任意に１つ以上の好適なリンカーによって連結される）。本発明は、本発明に従う少なくとも１つのＩＳＶＤ、例えば本願において定義されるＴＮＦに結合する本発明の１つ以上のＩＳＶＤ（またはその好適な断片）を含むかまたは本質的にそれからなる化合物、ポリペプチド、または構築物に関する。
【０１３５】
本発明の１つ以上のＩＳＶＤは、全て本願において定義されるそれぞれ本発明の一価、多価、または多重パラトープ型化合物、ポリペプチド、または構築物を提供するための結合ユニットまたはビルディングブロックとして、かかる化合物、ポリペプチド、または構築物に用いられ得る。それゆえに、本発明は、本発明の１つの一価ポリペプチドまたはＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる一価である化合物またはポリペプチドに関する。それゆえに、本発明は、本発明の２つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなる例えば二価または三価化合物、ポリペプチド、または構築物などの、それぞれ多価化合物、多価ポリペプチド、または多価構築物である化合物、ポリペプチド、または構築物にもまた関する（１つ以上のＶＨＨドメインを含有する多価の多重特異性化合物またはポリペプチド、およびそれらの調製については、Conrath et al.（J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001）、ならびに例えばＷＯ９６／３４１０３、ＷＯ９９／２３２２１、およびＷＯ２０１０／１１５９９８の参照もまたされる）。
【０１３６】
本発明は、さらに、多価化合物またはポリペプチド（本願においては、それぞれ「本発明の多価化合物（単数または複数）」および「本発明の多価ポリペプチド（単数または複数）」ともまた言われる）に関し、これが、ＴＮＦ、好ましくはヒトＴＮＦを目標とする少なくとも１つのＩＳＶＤ（またはその好適な断片）と１つの追加のＩＳＶＤとを含むかまたは（本質的に）それからなる。
【０１３７】
ある側面において、その最も単純な形態において、本発明の多価化合物、ポリペプチド、または構築物は本発明の二価化合物、ポリペプチド、または構築物であり、ＴＮＦを目標とする第１のＩＳＶＤ、例えばナノボディとＴＮＦを目標とする同一の第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディとを含み、前記第１および前記第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディは、任意にリンカー配列（本願において定義される通り）によって連結され得る。その最も単純な形態において、本発明の多価化合物、ポリペプチド、または構築物は、本発明の三価化合物、ポリペプチド、または構築物であり得、ＴＮＦを目標とする第１のＩＳＶＤ、例えばナノボディと、ＴＮＦを目標とする同一の第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディと、ＴＮＦを目標とする同一の第３のＩＳＶＤ、例えばナノボディとを含み、その中の前記第１、第２、および第３の免疫グロブリンＩＳＶＤ、例えばナノボディは任意に１つ以上の、特に２つのリンカー配列によって連結され得る。
【０１３８】
別の側面において、本発明の多価化合物、ポリペプチド、または構築物は、本発明の二重特異性化合物、ポリペプチド、または構築物であり得、ＴＮＦを目標とする第１のＩＳＶＤ、例えばナノボディと、第２の抗原を目標とする第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディとを含み、その中の前記第１および第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディは、任意にリンカー配列（本願において定義される通り）によって連結され得る；その一方で、本発明の多価化合物、ポリペプチド、または構築物は、本発明の三重特異性化合物、ポリペプチド、または構築物であり得、ＴＮＦを目標とする第１のＩＳＶＤ、例えばナノボディと、第２の抗原を目標とする第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディと、第３の抗原を目標とする第３のＩＳＶＤ、例えばナノボディとを含み、その中の前記第１、第２、および第３のＩＳＶＤ、例えばナノボディは任意に１つ以上の、特に２つのリンカー配列によって連結され得る。
【０１３９】
ある具体的な側面において、本発明の化合物、ポリペプチド、または構築物は、それぞれ三価の二重特異性化合物、ポリペプチド、または構築物である。本発明の三価の二重特異性化合物、ポリペプチド、または構築物は、その最も単純な形態においては、ＴＮＦに対する２つの同一のＩＳＶＤ、例えばナノボディと別の抗原を目標とする第３のＩＳＶＤ、例えばナノボディとを含む本発明の三価化合物、ポリペプチド、または構築物（本願において定義される通り）であり得、その中の前記第１、第２、および第３のＩＳＶＤ、例えばナノボディは任意に１つ以上の、特に２つのリンカー配列によって連結され得る。
【０１４０】
別の側面において、本発明の化合物またはポリペプチドは二重特異性化合物またはポリペプチドである。本発明の二重特異性化合物、ポリペプチド、または構築物は、その最も単純な形態において、ＴＮＦに対するＩＳＶＤ、例えばナノボディと別の抗原を目標とする第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディとを含む本発明の二価化合物、ポリペプチド、または構築物（本願において定義される通り）であり得、その中の前記第１および第２のＩＳＶＤ、例えばナノボディは任意にリンカー配列によって連結され得る。
【０１４１】
好ましい側面において、本発明の多価化合物、ポリペプチド、または構築物は、ＴＮＦを目標とする２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むかまたは本質的にそれからなる。ある側面において、本発明は、ＴＮＦに結合する本発明に従う少なくとも２つのＩＳＶＤ、例えば２つ、３つ、または４つのＩＳＶＤ（またはその好適な断片）を含むかまたは本質的にそれからなる化合物、ポリペプチド、または構築物に関する。２つ以上のＩＳＶＤは、任意に１つ以上のペプチド性リンカーによって連結され得る。
【０１４２】
好ましい側面において、本発明の化合物、ポリペプチド、または構築物は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなり、前記少なくとも２つのＩＳＶＤは同じかまたは異なり得るが、その少なくとも１つのＩＳＶＤはＴＮＦを目標とし、例えばＴＮＦに結合する。
【０１４３】
特定の側面において、本発明の化合物、ポリペプチド、または構築物は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれからなり、少なくとも２つのＩＳＶＤは独立して配列番号８〜４１および６１〜６６および６９からなる群から選ばれる。
【０１４４】
相対的親和性は、本発明のもたらされる化合物、ポリペプチド、または構築物中におけるＩＳＶＤの配置に依存し得る。本発明の化合物またはポリペプチドにおけるＩＳＶＤの順序（配置）が、当業者の必要に従って選ばれ得るということは理解されるであろう。個々のＩＳＶＤの順序、および化合物またはポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計の選択肢の問題である。リンカーありまたはなしのいくつかの配置は、他の配置と比較して好ましい結合性質を提供し得る。例えば、本発明の化合物、ポリペプチド、または構築物における第１のＩＳＶＤ（例えばＩＳＶＤ１）および第２のＩＳＶＤ（例えばＩＳＶＤ２）の順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）：（ｉ）ＩＳＶＤ１（例えばナノボディ１）−［リンカー］−ＩＳＶＤ２（例えばナノボディ２）；または（ｉｉ）ＩＳＶＤ２（例えばナノボディ２）−［リンカー］−ＩＳＶＤ１（例えばナノボディ１）であり得る；（リンカーは任意である）。全ての配置が本発明によって包摂される。所望の結合性質を提供するＩＳＶＤの配置を含有する化合物、ポリペプチド、および構築物は、慣例のスクリーニングによって容易に同定され得る。
【０１４５】
本発明の化合物または構築物、例えば本発明のポリペプチドにおいて、例えばＩＳＶＤなどの２つ以上のビルディングブロックと任意に１つ以上の他の基、薬、薬剤、残基、部分、または結合ユニットとは、互いに直接的に連結され得（例えばＷＯ９９／２３２２１に記載されている通り）、および／または１つ以上の好適なスペーサーもしくはリンカーまたはそのいずれかの組み合わせによって互いに連結され得る。多価の多重特異性化合物またはポリペプチドへの使用のための好適なスペーサーまたはリンカーは、当業者には明瞭であろう。一般的には、アミノ酸配列同士を連結するために当分野において用いられるいずれかのリンカーまたはスペーサーであり得る。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサーは、医薬使用を意図される化合物、構築物、蛋白質、またはポリペプチドを構築することへの使用にとって好適である。
【０１４６】
ある態様において、本発明は本願において定義される化合物またはポリペプチドに関し、前記ＩＳＶＤは互いに直接的に連結またはリンカーによって連結される。別の態様において、本発明は本願において定義される化合物またはポリペプチドに関し、第１のＩＳＶＤおよび／または第２のＩＳＶＤおよび／または可能性として第３のＩＳＶＤおよび／または可能性として血清アルブミンに結合するＩＳＶＤがリンカーによって連結される。
【０１４７】
いくつかの特に好ましいリンカーおよびスペーサーは、抗体断片または抗体ドメインを連結するために当分野において用いられるスペーサーおよびリンカーを包含する。それらは、上で引用されている一般的な背景技術において言及されているリンカー、および例えばダイアボディまたはＳｃＦｖ断片を構築するために当分野において用いられるリンカーを包含する（しかしながら、これに関して、ダイアボディおよびＳｃＦｖ断片においては、用いられるリンカー配列は、当のＶＨおよびＶＬドメインが一緒にまとまって完全な抗原結合部位を形成することを許す長さ、柔軟性の度合、および他の特性を有するべきであり、その一方で、本発明のポリペプチドに用いられるリンカーの長さまたは柔軟性については特定の限定がないということに注意すべきである。なぜなら、各ＩＳＶＤ、例えばナノボディは、それ自体で完全な抗原結合部位を形成するからである）。
【０１４８】
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、特に１および５０、好ましくは１および３０、例えば１および１０アミノ酸残基の間のアミノ酸配列であり得る。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例は、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば（例えば、ＷＯ９９／４２０７７に記載されている（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、ならびに本願において言及されるAblynxによる出願に記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９、およびＧＳ７リンカー（例えばＷＯ０６／０４０１５３およびＷＯ０６／１２２８２５を見よ）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または類似の配列（例えばＷＯ９４／０４６７８に記載されている）を包含する。好ましいリンカーは表Ｅ、例えば配列番号８５〜１００に示されている。
【０１４９】
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（例えばＡＡＡ）、ならびにリンカーＧＳ３０（ＷＯ０６／１２２８２５の配列番号８５）およびＧＳ９（ＷＯ０６／１２２８２５の配列番号８４）である。
【０１５０】
ある態様において、本発明は本願において定義される化合物に関し、前記リンカーが５ＧＳ、７ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳ、３５ＧＳ、および４０ＧＳのリンカーからなる群から選ばれる。
【０１５１】
他の好適なリンカーは、一般的には、有機化合物またはポリマー、特に医薬使用のための蛋白質への使用にとって好適なものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が抗体ドメインを連結するために用いられている。例えばＷＯ０４／０８１０２６を見よ。
【０１５２】
用いられるリンカー（単数または複数）の長さ、柔軟性の度合、および／または他の特性が（ＳｃＦｖ断片に用いられるリンカーにおいては通常であるように重大ではないが）、ケモカインに対するまたは他の抗原の１つ以上に対する親和性、特異性、またはアビディティを包含するがこれに限定されない、本発明の最終化合物または構築物、例えば本発明のポリペプチドの特性にいくらかの影響を有し得るということは本発明の範囲に包摂される。本願の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の化合物または構築物、例えば本発明のポリペプチドへの使用のための最適なリンカー（単数または複数）を、任意にいくつかの限定された慣例の実験後に決定する能力があるであろう。
【０１５３】
例えば、ビルディングブロック、例えばＴＮＦおよび別の標的を目標とするＩＳＶＤまたはナノボディを含む本発明の多価化合物またはポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよび柔軟性は、好ましくは、それが、ポリペプチド中に存在する本発明の各ビルディングブロック、例えばＩＳＶＤがその正当な標的、例えば標的のそれぞれの上の抗原決定基に結合することを許すようになっている。再び、本願の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の化合物または構築物、例えば本発明のポリペプチドへの使用のための最適なリンカー（単数または複数）を、任意にいくつかの限定された慣例の実験後に決定する能力があるであろう。
【０１５４】
用いられるリンカー（単数または複数）が、１つ以上の他の好都合な特性もしくは官能性を本発明の化合物もしくは構築物、例えば本発明のポリペプチドに授け、ならびに／または誘導体の形成のためのおよび／もしくは官能基の取り付けのための１つ以上の部位を提供するということもまた本発明の範囲内である（例えば、本発明のＩＳＶＤの誘導体について本願において定義される通り）。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含有するリンカーは改善された親水性特性を提供し得、その一方で、小型のエピトープまたはタグを形成または含有するリンカーは検出、同定、および／または精製の目的のために用いられ得る。再び、本願の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の化合物、ポリペプチド、または構築物への使用のための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された慣例の実験後に決定する能力があるであろう。
【０１５５】
最後に、２つ以上のリンカーが本発明のポリペプチドなどの化合物または構築物に用いられるときに、それらのリンカーは同じかまたは異なり得る。再び、本願の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の化合物または構築物またはポリペプチドへの使用のための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された慣例の実験後に決定する能力があるであろう。
【０１５６】
１つ以上のナノボディを含有する多価および多重特異性化合物およびポリペプチド、ならびにそれらの調製の一般的な説明については、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001；Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302；および例えばＷＯ１９９６／３４１０３、ＷＯ１９９９／２３２２１、ＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４、またはＷＯ２００９／０６８６２７の参照もまたされる。
【０１５７】
本発明は、本願に記載されるアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、および構築物をコードするヌクレオチド配列または核酸にもまた関する。本発明は、さらに、上述のヌクレオチド配列または核酸と自体公知の遺伝子構築物のための１つ以上のエレメントとを包含する遺伝子構築物を包含する。遺伝子構築物はプラスミドまたはベクターの形態であり得る。再び、かかる構築物は、一般的には、例えばＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４、またはＷＯ２００９／０６８６２７などのAblynx N.V.の公開特許出願に記載されている通りであり得る。
【０１５８】
ある側面において、本発明は、本発明に従うＩＳＶＤ、ポリペプチド、化合物、または構築物をコードする核酸に関する。
【０１５９】
別の側面において、本発明は、本発明に従う核酸を含む発現ベクターに関する。
【０１６０】
本発明は、かかるヌクレオチド配列もしくは核酸を含有する、ならびに／または本願に記載されるアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、および構築物を発現する（もしくは、発現することができる）宿主または宿主細胞にもまた関する。再び、かかる宿主細胞は、一般的には、例えばＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４、またはＷＯ２００９／０６８６２７などのAblynx N.V.の公開特許出願に記載されている通りであり得る。
【０１６１】
ある側面において、本発明は、本発明に従う核酸または本発明に従う発現ベクターを含む宿主または宿主細胞に関する。
【０１６２】
本発明は、本願に記載されるアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物を調製するための方法にもまた関し、この方法は、本願に記載される宿主細胞を、前記宿主細胞が本願に記載されるアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物を産生または発現するような条件下において培養または維持することを含み、任意に、さらに、そのように産生されたアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物を単離することを含む。再び、かかる方法は、一般的に、例えばＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４、またはＷＯ２００９／０６８６２７などのAblynx N.V.の公開特許出願に記載されているように実施され得る。
【０１６３】
ある具体的な側面において、本発明は、本発明に従うＩＳＶＤまたは本発明に従う化合物または本発明に従うポリペプチドを産生するための方法に関し、前記方法は、少なくとも：
ａ）好適な宿主細胞もしくは宿主生物によってまたは別の好適な発現系によって、本願において定義される核酸配列を発現するステップ；任意に、次に：
ｂ）それぞれ本発明に従うＩＳＶＤ、本発明に従う化合物、または本発明に従うポリペプチドを単離および／または精製するステップ、
を含む。
【０１６４】
本発明は、本願に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物を含む組成物にもまた関する。
【０１６５】
本発明は、本願に記載される少なくとも１つのアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物と、任意に少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤、および／またはアジュバントとを含み、任意に１つ以上のさらなる医薬的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬組成物にもまた関する。
【０１６６】
かかる調製物、担体、賦形剤、および希釈剤は、一般的には、例えばＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４、またはＷＯ２００９／０６８６２７などのAblynx N.V.の公開特許出願に記載されている通りであり得る。
【０１６７】
本願に記載されるアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物が、増大した半減期を有するときには、それらは好ましくは循環に投与される。そして、それらは、アミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、もしくは構築物循環に入ることを許すいずれかの好適な様式で、例えば静脈から注射もしくは輸液によって、またはアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、もしくは構築物が循環に入ることを許すいずれかの他の好適な様式で（経口投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与などを包含する）、投与され得る。投与の好適な方法および経路は、再び例えば、例えばＷＯ２００４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４、またはＷＯ２００９／０６８６２７などのAblynx N.V.の公開特許出願の教示からもまた当業者には明瞭であろう。
【０１６８】
別の側面において、本発明は、本願に記載されるアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物の使用によって防止または処置され得る少なくとも１つの疾患または障害の防止および／または処置のための方法に関し、この方法は、その必要がある対象に、本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、もしくは構築物、および／またはそれを含む医薬組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。本願に記載されるポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物の使用によって防止または処置され得る疾患および障害は、一般的には、本発明のポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物に存在する治療薬部分の使用によって防止または処置され得る疾患および障害と同じであろう。特に、本発明は、医薬としての使用のための、本願に記載される化合物、組成物、構築物、ポリペプチド、ＴＮＦ結合因子、またはＩＳＶＤに関する。
【０１６９】
本発明の文脈において、用語「防止および／または処置」は、疾患を防止および／または処置することを含むのみならず、一般的には、疾患の始まりを防止することと、疾患の進行を低速化または後退させることと、疾患に関連する１つ以上の症状の始まりを防止することまたは低速化させることと、疾患に関連する１つ以上の症状を低減および／または緩和することと、疾患および／またはそれに関連するいずれかの症状の重症度および／または持続期間を低減することと、および／または疾患および／またはそれに関連するいずれかの症状の重症度のさらなる増大を防止することと、疾患によって引き起こされるいずれかの生理的ダメージを防止すること、低減すること、または後退させることと、一般的に、処置されようとする患者にとって有益であるいずれかの薬理学的作用とをもまた含む。本発明の組成物は、現実的な治療薬剤を構成するためには、完全な治癒を奏すること、または疾患のあらゆる症状もしくは病像を根絶することを必要としない。当分野において認識される通り、治療薬剤として使用される薬は所与の疾患状態の重症度を低減し得るが、有用な治療薬剤と見なされるためには、疾患のあらゆる病像を無くすことを必要としない。類似に、予防的に投与される処置は、現実的な予防薬剤を構成するためには、状態の始まりを防止することにおいて完全に有効であることを必要としない。疾患のインパクトを単純に低減すること（例えば、その症状の数もしくは重症度を低減することにより、または別の処置の有効性を増大させることにより、または別の有益な効果を産生することによる）、または疾患が対象に起こるかもしくは悪化するであろう蓋然性を低減することが十分である。
【０１７０】
１つの態様において、組成物の治療有効量が患者に投与されたという指示は、具体的な障害の重症度を反映する指標のベースラインからの持続的な改善である。本発明の医薬組成物は、１つ以上の医薬的に許容される担体または賦形剤と一緒に製剤化された本発明のＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの治療有効量を含む。本発明のＩＳＶＤ、化合物、またはポリペプチドの「治療有効量」によって、いずれかの医療処置に当てはまる妥当なベネフィット／リスク比で、処置される対象に対する治療効果を授ける組成物の量が意味される。用語が本願において用いられる治療効果は、患者を「処置する」ために十分である。
【０１７１】
ある態様において、本発明は、消化管の疾患および／または障害の処置への使用のための、本願に記載される組成物、構築物、化合物、ＴＮＦ結合因子、ＩＳＶＤ、またはポリペプチドに関する。
【０１７２】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、構築物、化合物、ＴＮＦ結合因子、ＩＳＶＤ、またはポリペプチドに関し、消化管の前記疾患および／または障害は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、セリアック病、消化管の外傷、および消化管の癌である。
【０１７３】
過敏性腸症候群の患者は、腸の検出可能な組織学的変化を有さないかまたは少ししか有さないにもかかわらず、変改された腸透過性を有する（Dunlop Am J Gastroenterol. 2006 Jun; 101(6): 1288-94）。セリアック病の患者は、変改された腸透過性と、ＩＢＤと見分けられない小腸の絨毛の特徴的なダメージとを有する。炎症性腸疾患は、微生物−宿主相互作用によって開始する制御異常になった免疫応答からもたらされると考えられている。免疫系は非病原性の共生細菌に応答し、慢性炎症を生ずる。類似に、壊死性腸炎では、ストレス負荷された未発達の免疫系が、正常な腸内細菌に対する不適切な応答を生じ、結腸炎の潜在的に致命的な形態を誘導する（Jilling et al, 2006, J Immunol, 177, 3273-82）。
【０１７４】
処置されるべき対象はいずれかの温血動物であり得るが、特に哺乳動物、より具体的には人間である。当業者には明瞭であろう通り、処置されるべき対象は、特に、本願において言及される疾患および障害を患うかまたはそのリスクがある者であろう。
【０１７５】
別の態様において、本発明は、免疫療法のための、特に受動的免疫療法のための方法に関し、この方法は、本願において言及される疾患および障害を患うかまたはそのリスクがある対象に、本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、もしくは構築物、および／またはそれを含む医薬組成物の医薬的に活性な量を投与することを含む。
【０１７６】
アミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、もしくは構築物、および／またはそれを含む組成物は、防止または処置されるべき疾患または障害を防止および／または処置することにとって好適である処置の方式に従って投与される。臨床医は、一般的に、好適な処置レジメンを決定する能力があるであろう。防止または処置されるべき疾患または障害、処置されるべき疾患の重症度および／またはその症状の重症度、用いられるべき本発明の特定のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物、用いられるべき特定の投与経路および医薬製剤または組成物、患者の年齢、性別、重さ、食事、一般的状態、ならびに臨床医に周知の類似の因子などの因子に依存する。
【０１７７】
一般的に、処置レジメンは、１つ以上の医薬的に有効な量またはドーズによる、本発明の１つ以上のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、もしくは構築物の、またはそれを含む１つ以上の組成物の投与を含むであろう。投与されるべき特定の量（単数もしくは複数）またはドーズは、再び上で引用されている因子に基づいて臨床医によって決定され得る。
【０１７８】
一般的には、本願において言及される疾患および障害の防止および／または処置のために、処置されるべき特定の疾患または障害、用いられるべき特定の融合蛋白質または構築物の力価および／または半減期、用いられる特定の投与経路および特定の医薬製剤または組成物に依存して、本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物は、一般的には、１日あたりｋｇ体重あたり１グラムおよび０．０１マイクログラムの間、好ましくは１日あたりｋｇ体重あたり０．１グラムおよび０．１マイクログラムの間、例えば１日あたりｋｇ体重あたり約１、１０、１００、または１０００マイクログラムの量で、連続的に（例えば輸液によって）、単一の１日ドーズとして、または複数の分割されたドーズとして日中にどちらかで投与されるであろう。臨床医は、一般的には、本願において言及される因子に依存して好適な１日ドーズを決定する能力があるであろう。特定のケースにおいて、臨床医は、例えば上で引用されている因子および本人の専門的判断に基づいて、これらの量から逸脱することを選び得るということもまた明瞭であろう。一般的に、投与されるべき量のいくらかの手引きは、本質的に同じ経路によって投与される同じ標的に対する同等の従来の抗体または抗体断片について通常投与される量から得られ得る。しかしながら、親和性／アビディティ、有効性、生体内分布、半減期、および当業者に周知の類似の因子の違いを考慮する。
【０１７９】
通常は、上の方法においては、本発明の単一のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物が用いられる。しかしながら、本発明の２つ以上のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物を組み合わせで用いることは本発明の範囲内である。
【０１８０】
本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物は、１つ以上のさらなる医薬的に活性な化合物または成分との組み合わせで、すなわち併用処置レジメンとしてもまた用いられ得、これは相乗効果に至り得るか、または至らずにあり得る。再び、臨床医は、上で引用されている因子および本人の専門的判断に基づいてかかるさらなる化合物または成分、および好適な併用処置レジメンを選択する能力があるであろう。
【０１８１】
具体的には、本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物は、本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物によって防止または処置され得る疾患および障害の防止および／または処置のために用いられるかまたは用いられ得る他の医薬的に活性な化合物または成分との組み合わせで用いられ得、その結果として、相乗効果が得られ得、または得られずにあり得る。
【０１８２】
臨床医には明瞭であろう通り、本発明に従って用いられる処置レジメンの有効性は、当該の疾患または障害について自体公知のいずれかの様式で決定および／または追跡され得る。臨床医は、所望の治療効果を達成するために、不要の副作用を回避、限定、もしくは低減するために、および／または一方では所望の治療効果を達成することと他方では望まれない副作用を回避、限定、もしくは低減することとの間の適切なバランスを達成するために、適切なところでは、またはケース毎に、特定の処置レジメンを変えるかまたは改変する能力があるであろう。
【０１８３】
一般的に、処置レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持されるべき限り、遵行されるであろう。再び、これは臨床医によって決定され得る。
【０１８４】
本発明のアミノ酸配列、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、融合蛋白質、化合物、または構築物はＴＮＦに結合することができるので、それらは、特に、ＴＮＦに結合および／またはＴＮＦを調節することができる他の生物学的薬（抗体、例えばアダリムマブ／ヒュミラ（商標）またはインフリキシマブ／レミケード（商標）のような）によって処置され得る疾患または障害の防止および／または処置のために用いられ得る。かかる疾患および障害は当業者には明瞭であろう。本発明のＴＮＦ結合因子は、特に、ＷＯ２００４／０４１８６２およびＷＯ２００６／１２２７８６において言及されている疾患および障害の防止および処置のために用いられ得る。
【０１８５】
言及した通り、本発明の１つの特定の側面は、一価の形態である本発明のＴＮＦ結合因子に関する。本発明のそれらの一価ＴＮＦ結合因子は、局所適用（皮膚、ＧＩ管、もしくは肺への適用を包含する）にとって、ならびに／または局所投与（例えば皮膚への）、経口投与（例えばＧＩ管への）、座薬による投与（再び、例えばＧＩ管への）、および／もしくは肺への投与（例えば、吸入による）にとって特に好適である。そして、それらは、それぞれ皮膚、肺、またはＧＩ管へのＴＮＦ阻害剤の適用によって防止または処置され得る皮膚、肺、またはＧＩ管の疾患および障害の防止および／または処置のために用いられ得る（例えば、それぞれ皮膚、肺、またはＧＩ管に影響を及ぼす炎症および／または自己免疫疾患）。
【０１８６】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤに関し、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤは、消化管に局所投与される。
【０１８７】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤに関し、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤは、胃腸管（ＧＩ）への経口投与にとって好適な剤形で経口投与される。
【０１８８】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤに関し、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤはＧＩ管への経口投与のための剤形で投与され、剤形は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、エマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤から選択される。
【０１８９】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤに関し、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤは、消化管の疾患または障害の処置のために経直腸投与される。
【０１９０】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤに関し、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤは、経直腸投与のための、好ましくは座薬および浣腸剤から選択される剤形で経直腸投与される。
【０１９１】
ある態様において、本発明は、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤに関し、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤは皮下注射、皮内注射、静脈注射、筋肉内注射、病巣内注射、または輸液技術によって非経口投与される。
【０１９２】
かかる疾患および障害のいくつかの特定の限定しない例は、ＧＩ管の疾患または障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、セリアック病、消化管の外傷、および／または消化管の癌である。言及した通り、これらの目的に用いられるときに、本発明の一価ＴＮＦ結合因子は、好ましくは位置１のＤ（またはＥ１Ｄ）変異およびＣ末端延長（例えばＣ末端アラニン）を有し、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、６２〜６３、および６５〜６６、特に配列番号４０、３９、３６、６４、および６９、最も具体的には配列番号４０のＴＮＦ結合因子は、特にこれらの目的に適した本発明のＴＮＦ結合因子の好ましい例である。
【０１９３】
それゆえに、さらなる側面において、本発明は、皮膚、肺、またはＧＩ管の疾患および障害の防止および処置への、特に皮膚、肺、またはＧＩ管に影響を及ぼす炎症および／または自己免疫疾患の防止および処置への使用のための、本質的に一価の形態である（かつ好ましくは位置１のＤまたはＥ１Ｄ変異およびＣ末端延長、例えばＣ末端アラニンを有する）本発明のＴＮＦ結合因子（本願に記載される通り）に関する。前記ＴＮＦ結合因子は、好ましくは、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、６２〜６３、および６５〜６６からなる群、特に配列番号４０、３９、３６、６４、および６９、最も具体的には配列番号４０から選ばれる。
【０１９４】
本発明は、ＧＩ管の疾患または障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、セリアック病、消化管の外傷、および／または消化管の癌、特にＩＢＤおよびクローン病の防止および処置への使用のための、本質的に一価の形態である（かつ好ましくは位置１のＤまたはＥ１Ｄ変異およびＣ末端延長、例えばＣ末端アラニンを有する）本発明のＴＮＦ結合因子（本願に記載される通り）にもまた関する。再び、前記ＴＮＦ結合因子は、好ましくは、配列番号４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、６２〜６３、および６５〜６８からなる群、特に配列番号４０、３９、３６、６４、および６９、最も具体的には配列番号４０から選ばれる。
【０１９５】
本発明は、皮膚への局所適用、吸入もしくは他の投与による肺への投与、および／または経口投与、経直腸投与、もしくはＧＩ管への他の投与を意図される（および／またはそれにとって好適である）医薬組成物にもまた関し、これは、本質的に一価の形態である（かつ好ましくは位置１のＤまたはＥ１Ｄ変異およびＣ末端延長、例えばＣ末端アラニンを有する）本発明のＴＮＦ結合因子を含む。再び、前記ＴＮＦ結合因子は、好ましくは、４０、３９、３６、６４、６９、３７、３８、４１、６２〜６３、および６５〜６８からなる群、特に配列番号４０、３９、３６、６４、および６９、最も具体的には配列番号４０から選ばれる。
【０１９６】
本発明は、皮膚の疾患または障害の防止または処置のための方法にもまた関し、この方法は、かかる処置の必要がある対象の皮膚に、本質的に一価の形態である（かつ好ましくは位置１のＤまたはＥ１Ｄ変異およびＣ末端延長、例えばＣ末端アラニンを有する）本発明のＴＮＦ結合因子、またはかかる一価ＴＮＦ結合因子を含む組成物を適用することを含む。
【０１９７】
本発明は、皮膚の疾患または障害の防止または処置のための方法にもまた関し、この方法は、かかる処置の必要がある対象の肺に、本質的に一価の形態である（かつ好ましくは位置１のＤまたはＥ１Ｄ変異およびＣ末端延長、例えばＣ末端アラニンを有する）本発明のＴＮＦ結合因子、またはかかる一価ＴＮＦ結合因子を含む組成物を（例えば吸入によって）投与することを含む。
【０１９８】
本発明は、ＧＩ管の疾患または障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、セリアック病、消化管の外傷、および／または消化管の癌、特にＩＢＤまたはクローン病の防止または処置のための方法にもまた関し、この方法は、かかる処置の必要がある対象のＧＩ管に、本質的に一価の形態である（かつ好ましくは位置１のＤまたはＥ１Ｄ変異およびＣ末端延長、例えばＣ末端アラニンを有する）本発明のＴＮＦ結合因子またはかかる一価ＴＮＦ結合因子を含む組成物を投与すること（例えば、経口または経直腸投与）を含む。
【０１９９】
前に言及した通り、炎症の部位において、消化管の粘膜バリアは多くの場合に損なわれており、それゆえに、経口投与された蛋白質は腸組織および全身循環に入り得る。それゆえに、ある態様において、本発明は、組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤが患者の腸組織および全身循環に到達する、本願に記載される組成物、化合物、構築物、ＴＮＦ結合因子、ポリペプチド、またはＩＳＶＤにもまた関する。
【０２００】
本発明の側面、態様、利点、および適用は、本願におけるさらなる記載から明瞭になるであろう。
【０２０１】
以下で、本発明は、次の限定しない好ましい側面、例、および図によってさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】本願において具体的に参照されるアミノ酸位置のいくつかと、いくつかの代替的な付番システム（例えば、AhoおよびIMGT）に従うそれらの付番とを一覧化する表である；
【図２】配列番号１、５９、および５８のアラインメントを示している；
【図３】本願において参照されるアミノ酸配列を一覧化している；
【図４】配列番号１、８から４１、および５８のアラインメントを示している；
【図５】配列番号１、３１、および３６から４１のアラインメントを示している；
【図６】９６個の血清サンプル（健康なヒト対象からの６６個およびＳＬＥ患者からの３０個）が次のアミノ酸配列に対する結合について試験されたときの、例１で得られたデータ点の２つの対応するプロットを示している：配列番号５８（Ｑ１０８Ｌ変異を有する）、参照Ａ、参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ｖ８９Ｌ）−Ａｌａ、参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ａ７４Ｓ，Ｖ８９Ｌ）−Ａｌａ、および参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ｓ４９Ａ，Ｖ８９Ｌ）−Ａｌａ。各ドットは、試験された９６サンプルの１つの結合レベルを表している。右手のパネルおよび左手のパネルに示されているデータ点は同じである；右手のパネルにおいて、各個々のサンプルの測定されたデータ点は、試験された化合物のそれぞれ（すなわち、配列番号５８（Ｑ１０８Ｌ）、参照Ａ、参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ｖ８９Ｌ）−Ａ、参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ａ７４Ｓ，Ｖ８９Ｌ）−Ａ、および参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ｓ４９Ａ，Ｖ８９Ｌ）−Ａ）について線によって繋がれている（結果として、線の傾きは、本発明の変異およびＣ末端アラニンが導入されたときに既存抗体による結合が低減される程度の指示を与える）；
【図７−１】結合データを一覧化する表である（５つの列は、正規化されたＰｒｅＡｂ結合レベル（１２５秒におけるＲＵ）を与え、４つの列は、図６にコンパイルされたデータ点の参照Ａと比較したＰｒｅＡｂ結合の低減のパーセンテージを与えている。
【図７−２】結合データを一覧化する表である（５つの列は、正規化されたＰｒｅＡｂ結合レベル（１２５秒におけるＲＵ）を与え、４つの列は、図６にコンパイルされたデータ点の参照Ａと比較したＰｒｅＡｂ結合の低減のパーセンテージを与えている。
【図７−３】結合データを一覧化する表である（５つの列は、正規化されたＰｒｅＡｂ結合レベル（１２５秒におけるＲＵ）を与え、４つの列は、図６にコンパイルされたデータ点の参照Ａと比較したＰｒｅＡｂ結合の低減のパーセンテージを与えている。
【図７−４】結合データを一覧化する表である（５つの列は、正規化されたＰｒｅＡｂ結合レベル（１２５秒におけるＲＵ）を与え、４つの列は、図６にコンパイルされたデータ点の参照Ａと比較したＰｒｅＡｂ結合の低減のパーセンテージを与えている。
【図７−５】結合データを一覧化する表である（５つの列は、正規化されたＰｒｅＡｂ結合レベル（１２５秒における  ＲＵ）を与え、４つの列は、図６にコンパイルされたデータ点の参照Ａと比較したＰｒｅＡｂ結合の低減のパーセンテージを与えている。
【図８】Ａ０１６６０００１５配列に基づいて（Ａ）予測（「Ｐ」）および実験的に（「Ｅ」）決定されたトリプシンおよびキモトリプシン切断部位。（Ｂ）クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるＡ０１６６０００１５分析。（Ｃ）Ａ０１６６０００１５配列のＲＰＣＬＣ−ＭＳによるトリプシン消化分析の例示的な結果。
【図９】ＳＨＩＭＥモデルの概略的な図示。
【図１０】エンブレル（ＥＣ３０＝０．０２ｎＭ；パネルＡ）およびエンブレル（ＥＣ９０＝０．２ｎＭ；パネルＢ）によって処理されたＨＥＫ２９３Ｈ−ｍＴＮＦ細胞の競合ＦＡＣＳ。ＩＲＲ００００２７＝無関係なナノボディ。
【図１１】非還元条件下における１２％のNuPageビストリスゲルによって、Ａ０１６６０００２１、Ａ０１６６０００３９、およびＡＯ１６６０００４０の発現結果を示している。５μｌサンプルを適用した。レーンは次の通りである：（１）Ａ０１６６０００２１；（２）Ａ０１６６０００３９；（３）Ａ０１６６０００４０；（４）無関係なコンパレータ；（５）無関係なコンパレータ；（６）Precision Plus蛋白質標準（BioRad）；（７）標準０．５μｇ；（８）標準１．０μｇ；（９）標準２．５μｇ。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２０３】
本発明者は、ＴＮＦ結合因子のアミノ酸配列を最適化することにした（「配列最適化」）。このケースにおいては、ＴＮＦ結合因子は経口投与を意図され、それゆえに、ＴＮＦ結合因子は好ましくはプロテアーゼ安定性であるべきである。その上、配列最適化のプロセスにおいては、（１）ＴＮＦ結合因子をヒト化し；（２）既存抗体の潜在的なエピトープをノックアウトし；（３）翻訳後修飾（ＰＴＭ）の部位をノックアウトすることもまた意図される。同時に、これらの性質は、ＴＮＦ結合因子の機能的性質、すなわちＴＮＦαを阻害することに合致させるべきであり、これは好ましくは約同じかまたはさらには改良されるべきである。
例１：Pichia pastorisによるナノボディ産生とプロテインＡ結合による精製
【０２０４】
抗ＴＮＦαナノボディ構築物を含有するPichia pastorisのＸ３３細胞を、２４ウェルプレート（２４ｍＬ）上でＢＧＣＭクエン酸緩衝液中において育てた（３０℃、２５０ｒｐｍ）。２日後に、培地をメタノール含有緩衝液（ＢＭＣＭクエン酸）に切り替えて発現を誘導した。新しいメタノールを定期的に追加してメタノール消費および蒸発を補い、２日後に培地を収穫した。ナノボディを、プロテインＡカラム（Poros）またはMEP Hypercel（Pall）による捕捉、次にグリシン緩衝液による溶出によって、製造者の説明書に従って精製した。爾後に、ナノボディを２ｍＬのZebaspinカラム（Pierce）を用いてＰＢＳに対して脱塩した。画分はVivaSpinカラム（ＭＷＣＯ５０００、PES）を用いて濃縮した。ナノボディ画分の濃度をTrinean Dropsenseを用いて測定した。濃度は、ＯＤ３４０値に対する正規化ありのＯＤ２８０測定に基づいた。ナノボディの純度およびインテグリティーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＳ分析によって、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計（Q-TOF Ultimate（Waters）にカップリングされた逆相ＨＰＬＣシステムを用いて検証した。
例２：ヒト化
【０２０５】
本発明のＴＮＦ結合因子の蛋白質配列は結局はラマから取得されており、ヒトに天然に存在する相同な抗体とは部分的に違っている。そのため、それらのＴＮＦ結合因子はヒト患者に投与されたときには潜在的に免疫原性である。
【０２０６】
一般的には、ヒト化目的のために、ナノボディ配列は、ヒト生殖細胞系列コンセンサス配列に対してより相同にされる。ナノボディ「ホールマーク」残基を例外として、ナノボディとヒト生殖細胞系列コンセンサス配列との間において異なるフレームワーク領域内の特定のアミノ酸は、蛋白質構造、活性、および安定性が好ましくは無傷に保たれるようなやり方でヒトカウンターパートに変改される。
【０２０７】
このケースにおいては、ヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子データベースとのアラインメント後に、ＤＰ５１が、配列番号５８との最も高い相同性を有するとして同定された。好ましくは他のナノボディ性質を無傷に保ち、またはさらにはそれらの性質を改良しながら、ヒトＤＰ５１生殖細胞系列コンセンサス配列により合致した親のナノボディ配列を変改する観点から、全ての可能な順列を作り上げた。
【０２０８】
結局は、合計で１２アミノ酸残基を配列番号５８に導入した：１Ｅ、１４Ｐ、２７Ｆ、２９Ｆ、４０Ａ、４９Ｓ、７３Ｎ、７５Ｋ、７８Ｌ、８２ａＮ、８３Ｒ、および１０８Ｌ。特に、Ｑ２７ＦおよびＳ２９ＦはＣＤＲ１の一部であるが、結合に影響を及ぼさなかった（ｃｆ．配列番号１；データは示さない）。
例３：既存抗体の結合を低減する
３．１．実験の部
【０２０９】
下の例３．２に用いたヒトサンプルは、商業的なソースまたはヒトボランティア（全ての要求される同意および承認が得られた後）どちらかから得られ、当てはまる法律および規制要件（医療上の秘密および患者プライバシーに関してのものを包含するが、これに限定されない）に従って用いた。
【０２１０】
下の例３．２においては、明白に別様に指示されない限り、用いられたサンプル（すなわち、健康なボランティア、関節リウマチ（ＲＡ）患者、およびＳＬＥ患者から）中に存在する既存抗体の試験されたナノボディに対する結合は、ProteOnを用いて次のように決定した：
【０２１１】
ナノボディを、血清アルブミン上に、またはモノクローナル抗ＦＬＡＧ−Ｍ２を用いてＦＬＡＧ３タグによってどちらかで捕捉した。
【０２１２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上に捕捉されたナノボディ上への既存抗体の結合のケースにおいては、ProteOn XPR36（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として用い、実験は２５℃で実施した。ProteOn GLCセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流量３０μｌ／ｍｉｎ）によって活性化し、ＨＳＡをProteOn酢酸緩衝液ｐＨ４．５中の１０μｌ／ｍｌで注入して（流量１００μｌ／ｍｉｎ）、固定化レベルをおよそ３２００ＲＵにした。固定化後に、表面をエタノールアミンＨＣｌによって不活性化した（流量３０μｌ／ｍｉｎ）。ナノボディをＨＳＡ表面に４５μｌ／ｍｉｎで２分間注入して、ナノボディ捕捉レベルをおよそ２００ＲＵにした。既存抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）によって１：１０希釈した後に、４５μｌ／ｍｉｎで２分間注入し、次に爾後の４００秒解離ステップであった。各サイクル後に（すなわち、新たなナノボディ捕捉および血液サンプル注入ステップの前に）、ＨＳＡ表面を４５μｌ／ｍｉｎのＨＣｌ（１００ｍＭ）の２分注入によって再生した。センサーグラム処理およびデータ分析はProteOn Manager 3.1.0（Bio-Rad Laboratories, Inc.）によって実施した。既存抗体の結合を示すセンサーグラムは、１）ナノボディ−ＨＳＡ解離および２）参照リガンドレーンに対する非特異的結合を差し引くことによる二重参照後に得られた。既存抗体の結合レベルは、報告時点を１２５秒に（会合の終わりの５秒後に）設定することによって決定した。既存抗体の結合のパーセンテージの低減は、参照ナノボディの１２５秒における結合レベルに対して相対的に計算した。
【０２１３】
モノクローナル抗ＦＬＡＧ−Ｍ２（Sigma）上に捕捉されたＦＬＡＧタグ付きナノボディ上への既存抗体の結合のケースにおいては、ProteOn XPR36（Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用いて評価した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）をランニング緩衝液として用い、実験は２５℃で実施した。ProteOn GLCセンサーチップのリガンドレーンをＥＤＣ／ＮＨＳ（流量３０μｌ／ｍｉｎ）によって活性化し、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２のｍＡｂをProteOn酢酸緩衝液ｐＨ４．５中の１０μｇ／ｍｌで注入して（流量１００μｌ／ｍｉｎ）、固定化レベルをおよそ４０００ＲＵにした。固定化後に、表面をエタノールアミンＨＣｌによって不活性化した（流量３０μｌ／ｍｉｎ）。ナノボディを抗ＦＬＡＧ−Ｍ２表面に４５μｌ／ｍｉｎで２分間注入して、ナノボディ捕捉レベルをおよそ１００ＲＵにした。抗ＦＬＡＧ−Ｍ２表面に対する血液サンプルの非特異的結合を低減するために、１００ｎＭの３×ＦＬＡＧペプチド（Sigma）を血液サンプルに追加した。既存抗体を含有するサンプルを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）によって１：１０希釈した後に、４５μｌ／ｍｉｎで２分間注入し、次に爾後の６００秒解離ステップであった。各サイクル後に（すなわち、新たなナノボディ捕捉および血液サンプル注入ステップの前に）、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２表面を、１５０μｌ／ｍｉｎのグリシンｐＨ１．５（１０ｍＭ）の１０秒注入によって再生した。センサーグラム処理およびデータ分析はProteOn Manager 3.1.0（Bio-Rad Laboratories, Inc.）によって実施した。既存抗体の結合を示すセンサーグラムは、１）ナノボディ−抗ＦＬＡＧ−Ｍ２解離および２）参照リガンドレーンに対する非特異的結合を差し引くことによる二重参照後に得られた。既存抗体の結合レベルは、報告時点を１２５秒に（会合の終わりの５秒後に）設定することによって決定した。既存抗体の結合のパーセンテージの低減は、参照ナノボディの１２５秒における結合レベルに対して相対的に計算した。
３．２：参照Ａ（配列番号１）に本発明の変異を導入することは、既存抗体による結合の低減に至る．
【０２１４】
次のアミノ酸配列を用いた：配列番号５８（Ｑ１０８Ｌ変異を有する）、参照Ａ、参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ｖ８９Ｌ）−Ａｌａ、参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ａ７４Ｓ，Ｖ８９Ｌ）−Ａｌａ、および参照Ａ（Ｌ１１Ｖ，Ｓ４９Ａ，Ｖ８９Ｌ）−Ａｌａ、全てＮ末端ＨＩＳ６−ＦＬＡＧ３タグを有する（配列番号４２）。これらのナノボディを、健康なヒトボランティアからの９６個の血清サンプルからのサンプル中に存在する既存抗体による結合について試験した。化合物をＦＬＡＧタグを用いて捕捉し、結合を、この実験の部の前段において与えられているプロトコールに従ってProteOnを用いて測定した。
【０２１５】
結果は図６に示されている。図７は、図６のデータ点の１つを形成するサンプルのそれぞれの結果を一覧化している。
【０２１６】
試験された９６サンプルの大部分について、本発明に従って変異を導入することは、既存抗体の結合の低減に至るということが分かり、低減の度合は、一般的には、各サンプル中の既存抗体が参照Ａに結合することができたレベルに依存する。
例４：化学的安定性評価
【０２１７】
種々のヒト化および／または最適化されたナノボディの化学的安定性を、強制酸化および温度ストレス試験によって評価した。
【０２１８】
新たな参照化合物、すなわちＡ０１６６０００１５（配列番号６１）を作った。この新たな参照化合物は推定上の臨床候補により合致しており、それゆえに変異のインパクトのより良い評価を可能にする。Ａ０１６６０００１５は、Ｃ末端アラニンおよびアミノ酸残基１のアスパラギン酸を除いて、参照Ａ（配列番号１）と同一である。Ｃ末端Ａｌａは、ＰＥＡを低減する観点からＷＯ２０１２／１７５７４１に従って導入した（ｃｆ．例３）。ピログルタミン酸形成の評価後に、Ｎ末端グルタミン酸をアミノ酸残基１のアスパラギン酸に置換した。新たな参照Ａ０１６６０００１５の活性は実質的に参照Ａと同一であった（データは示さない）。この新たな化合物Ａ０１６６０００１５は、別様に指示されない限り、例において参照化合物としてさらに用いる。
【０２１９】
例３の結果に基づいて、抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌを（とりわけ）新たな参照化合物Ａ０１６６０００１５と比較して導入し、Ａ０１６６０００１８（配列番号３７）およびＡ０１６６０００１９（配列番号３８）をもたらした。配列は図３に示されている。
４．１．強制酸化安定性
【０２２０】
参照化合物Ａ０１６６０００１５のナノボディサンプル（１ｍｇ／ｍｌ）を、Ｈ２Ｏ２なしのコントロールサンプルと平行して、ＰＢＳ中の１０ｍＭのＨ２Ｏ２に暗所においてＲＴで４時間付し、次にZeba脱塩スピンカラム（０．５ｍｌ）（Thermo Scientific）を用いるＰＢＳへの緩衝液切り替えであった。それから、ストレス負荷およびコントロールサンプルを、Series 1200または1290機（Agilent Technologies）によるＲＰＣによって、Zorbax 300SB-C3カラム（Agilent Technologies）によって７０℃で分析した。ナノボディの酸化を、蛋白質のメインピークと比較して、酸化ストレスの結果として起こるプレピークの％ピーク面積の決定によって定量した。
【０２２１】
参照化合物Ａ０１６６０００１５の酸化ストレス負荷サンプルにおいて、バリアントは観察されなかった（データは示さない）。
４．２．温度ストレス安定性
【０２２２】
ナノボディサンプル（１〜２ｍｇ／ｍｌ）を、−２０℃（負のコントロール）、２５、および４０℃でＰＢＳ中に４週間保存した。このインキュベーション期間後に、ナノボディをトリプシンまたはＬｙｓＣによって消化した。それから、ストレス負荷およびコントロールサンプルのペプチドを、Series 1290機（Agilent Technologies）によるＲＰＣによって、Acquity UPLC BEH300-C18カラム（Agilent Technologies）によって６０℃で分析した。カラムはＱ−ＴＯＦ質量分析計（6530 Accurate Mass Q-TOF（Agilent））にカップリングされている。ペプチドマップＵＶ２１４ｎｍまたはＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラム）クロマトグラムの統合は、所与の修飾の確実な定量を許す。
【０２２３】
４０℃においてのみ、いくらかの異性化およびピログルタミン酸バリアントが観察された。特に、環境に露出されたＣＤＲ２内に配置され、潜在的に異性化が可能であるアミノ酸残基５４Ｄは、実質的に異性化を実証しなかった。ナノボディが２５℃またはそれよりも下に延長された期間保たれた場合には、アミノ酸残基１の異性化ははっきりしなかった。
４．３．サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）による融点
【０２２４】
ナノボディの融点はその生物物理学的安定性の尺度である。
【０２２５】
種々のナノボディの融点を、サーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）によって、本質的にEricsson et al. 2006（Anals of Biochemistry, 357: 289-298）に従って評価した。手短には、精製された一価ナノボディの５μｌ（８００μｇ／ｍｌ）を、緩衝液（１００ｍＭリン酸、１００ｍＭホウ酸、１００ｍＭクエン酸、１１５ｍＭのＮａＣｌ、３．５から９の範囲の異なるｐＨに緩衝した）の１０μＬ中において蛍光プローブSypro Orange（Invitrogen、S6551）（最終濃度１０×）の５μＬとインキュベーションした。サンプルを、LightCycler 480II機（Roche）によって３７から９９℃に４．４℃／ｓの速度で加熱し、その後に、それらを３７℃まで０．０３℃／ｓの速度で冷却した。熱によって誘導されるアンフォールディングによって、蛋白質の疎水性パッチが露出され、これにSypro Orangeが結合し、蛍光強度の増大をもたらす（Ｅｘ／Ｅｍ＝４６５／５８０ｎｍ）。蛍光強度曲線の一次導関数の変曲点が融点（Ｔｍ）の尺度として働く。
【０２２６】
参照化合物Ａ０１６６０００１５（配列番号６１）をＡ０１６６０００１８（配列番号３７）およびＡ０１６６０００１９（配列番号３８）と比較した。Ａ０１６６０００１５とは対照的に、Ａ０１６６０００１８およびＡ０１６６０００１９両方は例３に従って抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌを含む。
【０２２７】
結果は表４．３に示されている。
【表１】
2019506839.tif 000003
【０２２８】
表４．３から分かるように、抗ＰＥＡ変異は、Ｔｍに対する効果を有さないか（Ａ０１６６０００１８）またはＴｍに対する負の効果を有するか（Ａ０１６６０００１９）どちらかに見えた。特に、Ａ０１６６０００１８（「０００１８」）およびＡ０１６６０００１９（「０００１９」）の間の違いはそれぞれ７８Ｌおよび７８Ｖである。総体的に、アミノ酸残基７８のこの違いのいずれかの効果は、抗ＰＥＡ変異の導入と比較して非有意であることが示された（下もまた見よ）。
【０２２９】
産生するときに、抗ＰＥＡ変異を含むこれらのバリアントの発現が最適ではないということもまた分かった。これを例１の方法を用いてさらに定量した。
【０２３０】
結果は表４．３に示されている。
【０２３１】
実に、抗ＰＥＡ変異を含む両方のバリアントから取得可能な量は、参照ナノボディよりも約２倍低いか（Ａ０１６６０００１８）、またはさらには４倍低かった（Ａ０１６６０００１９）。これは本発明者の完全な驚きであった。なぜなら、これらの抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌの導入は、それまでは、いずれかの他のクローンについて決定されたナノボディを回収する能力のかかる深刻な低下をもたらさなかったからである。
４．４．プロテアーゼ安定性
【０２３２】
ＴＮＦ阻害剤は結局は経口投与され得るということが意図される。しかしながら、胃および腸は天然に不利な環境を構成する。なぜなら、それらは部分的に固体の食物の酵素的分解および吸収のために設計されているからである。一般的に、蛋白質基質の蛋白質分解は、ポリペプチド鎖内の８〜１０アミノ酸残基がプロテアーゼの活性部位の特異的な立体化学に結合および適合し得る場合にのみ起こり得る（Fontana et al. 2004 Acta Biochim Pol, 51, 299-321）。ゆえに、酵素的切断の受けやすさは基質の物理的特性に大きく依存する。
【０２３３】
潜在的なプロテアーゼ分解部位を同定し、より安定なバリアントを設計するために、本発明者は、標準的な方法に従ってトリプシンおよびキモトリプシン切断部位を同定することにした。
【０２３４】
配列番号５８および新たな参照化合物Ａ０１６６０００１５（「０００１５」）の予測されたプロテアーゼ部位（「Ｐ」）は、トリプシンおよびキモトリプシン両方について図８Ａにおいては（「Ｘ」）として示されている。
【０２３５】
この図から、すでに：
−  ＣＤＲ３は９つの潜在的なプロテアーゼ切断部位を含む。
−  ヒト化変異Ｑ７５Ｋ（ＶＨ３−ＤＰ５１）は潜在的なトリプシン切断部位を導入した。
−  ヒト化変異Ｋ７３Ｎ（ＶＨ３−ＤＰ５１）は潜在的なトリプシン切断部位を削除した。
−  抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌはこれに関して中立的であり、すなわちこれらの変異は、予想されたように、潜在的なプロテアーゼ切断部位を導入または削除しなかった。
ということが結論づけられ得る。
【０２３６】
予測されたプロテアーゼ切断部位をよりインビボの条件において評価するために、ナノボディをトリプシンおよびキモトリプシンによって消化した。具体的には、抗ＴＮＦαナノボディを１０％トリプシンまたはα−キモトリプシン溶液中でインキュベーションした。２μｇのナノボディを、３７℃における２ｈ、４ｈ、および一晩のトリプシン消化または２５℃における２ｈ、４ｈ、もしくは一晩のキモトリプシン消化にかけた。蛋白質分解反応をＴＦＡ（０．１％最終）の追加によって止めた。反応混合物を、ＲＰＣＬＣ−ＭＳによって分析するか、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、クマシーブルーによって染色するかどちらかをした。ImageQuant（GE）を用いて、無傷の材料の量を計算し、参照タイムポイントとして０ｈに対して正規化した。
【０２３７】
クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるトリプシン消化の例示的な結果が図８Ｂに提供されている。ＲＰＣＬＣ−ＭＳによるトリプシン消化分析の例示的な結果が図８Ｃに提供されている。実験的に（「Ｅ」）確認された切断部位が図８Ａにトリプシン（「Ｅ」）およびキモトリプシン（「Ｅ」）として示されている。
【０２３８】
図８Ａから、実際の切断部位の数が低減されているということが明瞭である。それにもかかわらず、種々のトリプシンおよびキモトリプシン認識部位は残る。
【０２３９】
トリプシン耐性を最適化するために、１つの最適化バリアントを工作するために５つの位置：Ｒ３８、Ｋ６４、Ｓ９４、Ｐ９５、およびＲ９６を選択し、バリアントＡ０１６６０００１３；配列番号６５をもたらした。
【０２４０】
しかしながら、これらの部位を変異させることは、バリアントの低減された発現レベルおよび細胞内蓄積をもたらした（Ａ０１６６０００１３；配列番号６５）。事実、アミノ酸残基３８を復帰変異させたときには、これは発現を改善し、もたらされたバリアント（Ａ０１６６０００１４；配列番号６６）は完全に予想に反して参照化合物Ａ０１６６０００１５よりもプロテアーゼ感受性であった（データは示さない）。ゆえに、研究中の参照化合物およびナノボディ、すなわちＡ０１６６０００１８およびＡ０１６６０００１９のこれらの位置は変異させないことに決めた。
【０２４１】
結果の概要が表４．４に示されている。
【表２】
2019506839.tif 000004
例５：ＳＨＩＭＥモデルに由来する腸液中での安定性
【０２４２】
ヒトＧＩ管における抗ＴＮＦαナノボディの安定性を検討するために、ナノボディを、ヒト胃腸管（ＧＩ）を表すＳＨＩＭＥ（ヒト腸内微生物生態系のシミュレータ）に由来する５つの異なる液中でインキュベーションした。ＳＨＩＭＥモデルは、完全な胃腸管の科学的に認められた動的モデルであり、これは胃腸管の物理化学的、酵素的、および微生物的パラメータをコントロールされたインビトロ条件において研究するために用いられる。
【０２４３】
ＳＨＩＭＥモデルは５つの反応器からなり、これらは胃（酸条件およびペプシン消化）、小腸（消化プロセス）、ならびに大腸の３つの領域、すなわち上行（「Ａ」）、横行（「Ｔ」）、および下行結腸（「Ｄ」）（微生物プロセス）を連続的にシミュレーションする。これらの反応器の環境パラメータの綿密なコントロールは、構造および機能両方がヒト結腸の異なる領域の微生物コミュニティーに高度に類似した複雑で安定な微生物コミュニティーを許した（図９を見よ）。全てのＧＩ液はProDigest（テクノロジーパーク４、９０５２ズウェイナールデ、ベルギー）によって提供された。抗ＴＮＦナノボディをＧＩ液中で３９時間という最大の期間試験した。ＧＩ液中でのインキュベーション後に、ナノボディの安定性を競合ＥＬＩＳＡによる機能性試験によって決定した。ナノボディを、ＳＨＩＭＥモデルの５つの異なるＧＩ液中で３７℃において１００μｇ／ｍｌという固定された濃度で試験した。表５．１のスケジュールに従って、異なるタイムポイントにおいてサンプルを取り、プロテアーゼ阻害剤の追加ありまたはなしで−２０℃で保存した。サンプルをコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに移し、爾後に競合ＥＬＩＳＡによって試験した。簡潔には、Ａ０１６６０００１５をＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。ブロッキング後に、異なるＧＩ液中の、０．３ｎＭのｂｉｏｔ−ｈＴＮＦαの固定された濃度をバリアントのタイトレーションシリーズと一緒に追加した。検出をエクストラアビジン−ＨＲＰによって実施した
。
【表３】
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【０２４４】
結腸「Ｔ」の例示的な結果が表５．２に提供されている。
【表４】
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【０２４５】
異なるＳＨＩＭＥコンパートメントに由来する液の結果に基づいて、安定性評価は、全てのＧＩコンパートメントにおける安定性を表すナノボディのランクづけを許す：０００１５＞０００１９＞０００１８。
【０２４６】
まとめて、プロテアーゼ切断部位を削除することは、ナノボディのこのファミリーの例えば安定性およびプロテアーゼ感受性に対して正の効果を有さないように見える。Ａ１６６０００１５における抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌの導入は、この特定のナノボディの安定性に対して負の効果を有するように見える。
例６：安定化されたバリアント
【０２４７】
プロテアーゼ切断部位を削除することは期待された結果をもたらさなかったので、本発明者は、さらに、固有により安定であろうが、ヒト化および抗ＰＥＡ変異が好ましくは損なわれていない手の込んだ抗ＴＮＦ−αバリアントを述べる。これは、ヒト化対プロテアーゼ安定性対親和性などの相互排他的な性質を見せる種々のアミノ酸残基の観点から、非従来的なアプローチを要求した。
６．１．内部システイン結合とＣＤＲ３キモトリプシン切断部位の削除
【０２４８】
ＣＤＲ３内に配置され、結合特性に潜在的に影響を及ぼすが、それにもかかわらず、キモトリプシン切断部位であるアミノ酸残基Ｙ１００ｄがＹ１００ｄＬ置換によって削除されたバリアントを構築することに決めた（Ａ０１６６０００４６の１００ｄＬ；配列番号６２）。バリアントＡ０１６６０００４５（配列番号６９）を工作して、ＣＤＲ３の位置１００ｄのチロシンのインパクトをさらに評価した。
【０２４９】
加えて、本発明者は、ドメイン内ジスルフィド結合の導入によって固有に安定であるバリアントを工作し得るという仮説を立てた（ｃｆ．Wozniak-Knopp et al. 2012 PLoS One. 2012; 7(1): e30083）。これは２つのシステイン残基の導入を要求するであろう。それから、それらは対になってシスチンを形成するべきである。アミノ酸残基Ｓ４９はＣＤＲ２に隣接しており、ヒト化目的の観点から導入されたが（ヒト生殖細胞系列ＤＰ５１に対応する。例２を見よ）、ナノボディの蛋白質構造および標的ＴＮＦ−αとのその相互作用を結晶化研究によって解明した後に（データは示さない）、本発明者は、ドメイン内ジスルフィド結合を導入するためにアミノ酸Ｓ４９ＣおよびＩ６９Ｃ変異を変異させることに決めた。Ｓ４９Ｃ、Ｉ６９Ｃ、およびＹ１００ｄＬを含む新たなバリアントはＡ０１６６０００５２（配列番号６３）とアノテーションする。
【０２５０】
アミノ酸位置４９の影響を詳しく評価するために、このアミノ酸残基をアラニンに変異させた。特に、位置４９のこの変異は、異なりはするがヒト生殖細胞系列ＩｇＨＶ３−ＩｇＨＪに対応するであろう。新たなバリアントＡ０１６６０００４６（配列番号６２）、Ａ０１６６０００１６（配列番号３６）、Ａ０１６６０００２０（配列番号３９）、およびＡ０１６６０００２１（配列番号４０）の全てはＡ４９を含む。
【０２５１】
加えて、バリアントＡ０１６６０００２０（配列番号３９）において、位置Ｄ６０Ａ、Ｅ６１Ｄ、およびＰ６２Ｓを物理的安定性の観点から評価した。アミノ酸残基Ａ６０、Ｄ６１、およびＳ６２は、実験的に確認されたキモトリプシン切断部位Ｙ５８に隣接して、Kabatに従うＣＤＲ２内に配置されており、これは力価損失の高いリスクを示唆する。
【０２５２】
さらにその上、プロテアーゼ切断部位がヒト化変異Ｑ７５Ｋによって偶然に導入された。いずれかの理論によって拘束されないが、本発明者は、隣接して配置されたアミノ酸残基Ａ７４Ｓを変えることが、ヒト化およびプロテアーゼ感受性両方にある度合までのみだが潜在的に影響を及ぼすであろうという仮説を立てた。すなわち、ヒト化およびプロテアーゼ感受性両方が許容される度合まで減ぜられるということが期待された。Ｓ７４を含むバリアントは、Ａ０１６６０００１６（「０００１６」）、Ａ０１６６０００２０（「０００２０」）、Ａ０１６６０００２１（「０００２１」）、Ａ０１６６０００４６（「０００４６」）、およびＡ０１６６０００５２（「０００５２」）である（それぞれ配列番号３６、３９、４０、６２、および６３）。コンパレータバリアントはＡ０１６６０００３８であった（「０００３８」；配列番号６４）。これはＡ０１６６０００２１（配列番号４０）と同一であるが、７４Ａの代わりに７４Ｓである。
【０２５３】
もたらされた配列が図３に提供されている。
６．２．安定化されたバリアントのキャラクタリゼーション
【０２５４】
次に、これらのバリアントを、本質的に例３および４に述べられているように種々の性質について評価した。
【０２５５】
先ず、バリアント０００１６、０００２０、および０００２１の産生をP. pastorisにおいて例１に従って決定した。
【０２５６】
得られた結果の概要が表６．２Ａに提供されている。
【表５】
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【０２５７】
これらの結果から、これらの変異が、８７μｇを産生した参照化合物の産生の４〜５倍よりも多い（ｃｆ．例４．３）、またはさらには近縁のバリアント０００１８および０００１９よりも２０〜３０多い産生の増大をもたらしたということが分かる。
【０２５８】
次に、これらのバリアントの熱安定性を例４．３に従って決定した。得られた結果の概要もまた表６．２Ａに提供されている。
【０２５９】
産生が劇的に増大したのみならず、意外なことに熱安定性もまた参照化合物と比較して５〜１６℃、さらにはより近縁のバリアント０００１８および０００１９と比較して最高で１６〜１９℃増大した。
【０２６０】
意外なことに、アミノ酸残基Ａ４９は、産生および安定性に対する抗ＰＥＡアミノ酸残基Ｖ１１およびＬ８９の影響を取り除く。
【０２６１】
例６．１の種々のバリアントを、例５に従ってＳＨＩＭＥモデルに由来するＧＩ液中において一緒に評価した。
【０２６２】
Ａ０１６６０００２１、Ａ０１６６０００３８、Ａ０１６６０００４６、およびＡ０１６６０００５２の種々の条件下におけるインキュベーション期間の終わりにもたらされた活性の概要が、表６．２Ｂに提供されている。ＰＢＳ中でのインキュベーションは、ナノボディの固有の安定性を確認した（データは示さない）。
【表６】
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【０２６３】
プロテアーゼ切断部位が除去されたバリアントＡ０１６６０００４６のＹ１００ｄＬ（配列番号６２）およびドメイン内システイン結合によってさらに安定化されたバリアントＡ０１６６０００５２（配列番号６３）は、これに関していずれかの改善を提供しなかった。特に、バリアント０００４６および０００５２のＩＣ５０は、ＣＤ３の変異ゆえに、０００２１と比較して２〜５倍増大した（０．６７ｎＭと比較してそれぞれ１．１３ｎＭおよび３．５６ｎＭ）。
【０２６４】
ＳＨＩＭＥの結果は、本質的に、Ｔｍおよび産生の結果を確認および延長した。加えて、ＳＨＩＭＥモデルは、バリアント０００２１（配列番号４０）が一貫してバリアントＡ０１６６０００４０（「０００４０」；配列番号６７）およびバリアント０００３８（配列番号６４）よりも安定であるということを明らかにした。これは位置７４のセリンの正の寄与を指示するものである。
【０２６５】
特に、Ａ７４Ｓ以外はバリアント０００４０（配列番号６７）と同一であるバリアントＡ０１６６０００３９（配列番号６８）は、Ｓ７４がＳＨＩＭＥモデルにおいては一貫してＡ７４よりも安定でないということを示した。
【０２６６】
異なるＳＨＩＭＥコンパートメントに由来する液の結果を包含する全ての結果に基づいて、総体的な安定性評価は、全てのＧＩコンパートメントにおける安定性を表すナノボディのランクづけを許す：０００２１＞０００１６＞０００２０＞０００４０＞０００１５＞０００１９＞０００１８。
【０２６７】
ゆえに、Ａ１６６０００１５における抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌは、この具体的なナノボディの安定性に対して負の効果を有するように見え、これは４９Ｃ〜６９Ｃではなく４９Ａによって緩和され得た。その上、抗ＰＥＡ変異Ｌ１１ＶおよびＶ８９Ｌを含むナノボディにおいて、アミノ酸残基７４ＳはＳＨＩＭＥモデルにおいて安定性にとって有益であった。
６．３．Ａ０１６６０００２１は（Ａ０１６６０００３９およびＡ０１６６０００４０よりも）好都合な性質を有する
【０２６８】
経口投与については、高用量が安定性の次に要求され得ると信じられる。許容されるコストを有するためには、候補は、好ましくは高い量で産生され、相当な損失なしに精製され、高濃度で製剤化される。ゆえに、本発明者は、これらのパラメータを試験するための実験を述べる。
【０２６９】
第１に、本発明者は、Ａ０１６６０００３９およびＡ０１６６０００４０の発現レベルをＡ０１６６０００２１と比較することにした。
【０２７０】
図１１Ａから分かるように、Ａ０１６６０００３９（配列番号６８）の発現はＡ０１６６００２１（配列番号４０）およびＡ０１６６０００４０（配列番号６７）の発現レベルよりも相当に低かった。これらの結果はAKTAmicroによってもまた定量した。その結果は表６．３に示されている。
【表７】
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【０２７１】
Ａ０１６６０００２１対Ａ０１６６０００４０の製造性に関して、両方を発酵ブロスの濃縮の間の最大可溶性について試験した。清澄化された発酵ブロスにおける最大可溶性は、（Ａ０１６６０００２１の＞７５ｇ／Ｌに対して）Ａ０１６６０００４０では３０ｇ／Ｌのみである。加えて、Ａ０１６６０００４０のさらなる精製の間には大きな損失に遭遇した。
【０２７２】
ゆえに、安定性に加えて、意外なことにＡ０１６６０００２１はＡ０１６６０００３９およびＡ０１６６０００４０と比べて好都合な産生および精製性質をもまた有する。
【０２７３】
有利な安定性、発現、および精製性質に基づいて、本発明者はＡ０１６６０００２１に注目し、その可溶性を決定した。本発明者の完全な驚きとして、Ａ０１６６０００２１は前代未聞の２００ｍｇ／ｍｌまでＨ２Ｏ中に可溶であった。
例７：安定化されたバリアントはベンチマークよりも高性能である
【０２７４】
バリアントＡ０１６６０００２１（配列番号４０）、Ａ０１６６０００３８（配列番号６４）、およびＡ０１６６０００４５（配列番号６９）を、膜結合したヒトＴＮＦ（ｍＴＮＦ）に対する結合について、ＴＮＦ−Ｒ２に基づく抗ＴＮＦ治療薬剤のエンブレル（エタネルセプト）との競合アッセイによって評価した。そのために、ヒトＴＮＦの切断不能形態を安定に発現する細胞株を、ヒトＴＮＦのＲ７７Ｔ／Ｓ７８Ｔバリアントをコードする真核生物発現ベクターによるＨＥＫ２９３Ｈ細胞のトランスフェクションによって（ＨＥＫ２９３Ｈ−ｍＴＮＦと名付ける）、以前に記載されているように生じた（Harashima et al., 2001 J Immunol 166:130-136）。ピューロマイシン耐性遺伝子の共発現による選択後に、個々のｍＴＮＦ発現細胞のソーティングを、レミケード（インフリキシマブ）および二次ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧマウスａｄｓ−ＰＥによる細胞の染色によるＦＡＣＳ（BD FACS Aria）によって実施した。選択された個々のクローン上の膜結合したＴＮＦの恒常的発現は、フローサイトメトリー（BD FACS Array）によって確認された。
【０２７５】
先ず、これらの細胞上のｍＴＮＦに対するエンブレルの結合を評価した。これには、ＨＥＫ２９３Ｈ−ｍＴＮＦシングルクローンの５．１０５細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、ＦＡＣＳ緩衝液（１０％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを足したＰＢＳ）によって希釈されたエンブレルの異なる濃度と、４℃において９０分間直接的にインキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液によって洗浄し、二次ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧマウスａｄｓ−ＰＥ抗体によって４℃において３０分間染色した。細胞の洗浄および死細胞染色試薬TO-PRO-3ヨウ素塩の存在下におけるＦＡＣＳ緩衝液中でのインキュベーション後に、生存可能なＨＥＫ２９３Ｈ−ｍＴＮＦ細胞上のｍＴＮＦに対するエンブレルの結合を、BD FACS Arrayの読み出しによって測定した。得られた用量反応曲線から、ｍＴＮＦに対する結合についてのエンブレルのＥＣ３０およびＥＣ９０値は、それぞれ０．０２ｎＭおよび０．２ｎＭであると定義された。両方の濃度は、後でＴＮＦをターゲティングするナノボディとの競合アッセイに適用した。
【０２７６】
Ａ０１６６０００２１、Ａ０１６６０００３８、およびＡ０１６６０００４５のｍＴＮＦ結合を評価するために、固定されたＥＣ３０およびＥＣ９０濃度のエンブレルによる競合実験をセットアップした。抗ＴＮＦナノボディの力価をベンチマーク化合物シムジア（セルトリズマブペゴル）と比較した。加えて、無関係なナノボディ（ＩＲＲ０００２７）を負のコントロールとして包含した。この実験においては３００ｎＭから１２．５ｐＭの範囲の抗ＴＮＦナノボディまたはシムジアの異なる濃度との組み合わせでのエンブレルの固定された濃度（ＥＣ３０またはＥＣ９０）による細胞の共処置を使う第１のインキュベーションステップを除けば、このアッセイにおいては、エンブレル結合について上で記載されている同一の条件を適用した。BD FACS Arrayの読み出しは、ナノボディの増大していく濃度およびシムジアによる共処置によって明瞭に低減されたＨＥＫ２９３Ｈ−ｍＴＮＦ細胞上へのエンブレルの結合を決定しており、ｍＴＮＦに対する結合についてエンブレルとの抗ＴＮＦ薬剤の競合を指示した。抗ＴＮＦ薬剤のＩＣ５０値を表７に指示されているように決定した。
【表８】
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【０２７７】
得られた結果は、Ａ０１６６０００２１、Ａ０１６６０００３８、およびＡ０１６６０００４５が、ＥＣ９０ではシムジアよりも６〜７倍良い力価、ＥＣ３０ではシムジアよりも１５〜１８倍良い驚異的な力価を有するということを実証している。安定化されたバリアントは、ｍＴＮＦ結合についてエンブレルと競合するだけの同等の力価を有する。
【０２７８】
競合ＦＡＣＳにおいては、ナノボディが、ｍＴＮＦに対するエンブレルの結合を完全にもまた阻害し得るということが実証された。これは、経口適用のための医薬としての優れた好適性を指示するものであろう。対照的に、シムジアの高濃度はエンブレル結合の部分的なブロッキングのみをもたらした（図１０）。
【０２７９】
本願において引用される参照の全て（文献参照、発行済特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を包含する）の内容全体は、特に本願において上で参照されている教示について、参照によってここに明示的に組み込まれる。
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
2019506839.tif 000013
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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