(57)【要約】本発明は、リプログラミング因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）を用いて白血病を治療する方法を提供する。
2019514381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを促進する用途。
【請求項２】
前記誘導因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃは白血病細胞にリプログラミング過程の開始を促すことを特徴とする請求項１に記載の用途。
【請求項３】
前記白血病細胞は哺乳動物（ヒトを含む）の白血病細胞であり、
好ましくはヒト白血病細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の用途。
【請求項４】
前記誘導因子はｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質の形態であることを特徴とする請求項１又は２に記載の用途。
【請求項５】
リプログラミング効果を用いて、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法であって、
前記方法は、リプログラミング因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）を白血病細胞に導入するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記の導入方法は、ウイルス感染、組換えタンパク質トランスフェクション又はベクターのエレクトロポレーションを用いることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リプログラミング効果を用いて白血病を治療する方法であって、
前記方法は、リプログラミング因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）を白血病細胞に導入するステップを含み、
好ましくは、前記の導入方法は、ウイルス感染、組換えタンパク質トランスフェクション又はベクターのエレクトロポレーションを用いることを特徴とする方法。
【請求項８】
リプログラミング効果を用いて、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法であって、
前記方法は、リプログラミング小分子を用いてインビトロ培養するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）のうちの１種又は２種以上の組成物であり、
好ましくは、前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）の６種類の組み合わせであることを特徴とする請求項８に記載のリプログラミング効果を用いて、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法。
【請求項１０】
リプログラミング効果を用いて白血病を治療する方法であって、
前記方法は、リプログラミング小分子を用いてインビトロ培養するステップを含み、
好ましくは、前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）のうちの１種又は２種以上の組成物であり、
より好ましくは、前記リプログラミング小分子はｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）の６種類の組み合わせである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リプログラミング効果を用いて白血病を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞リプログラミング（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）とは、分化した体細胞を、特定の方法を用いて多能性又は全能性状態に戻すプロセスをいう。２００６年に日本の科学者である山中伸弥（ＳｈｉｎｙａＹａｍａｎａｋａ）は、４つの転写因子ＯＳＫＭ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ）の過剰発現が、分化細胞に再び多能性を回復させて、胚性幹細胞と非常に類似した生物学的特性を有する細胞を形成できることを確認し、このような細胞を誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ｉＰＳＣｓ）と命名し、それによって、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した。ｉＰＳ技術は、開発されて以来、基礎研究、発症メカニズム、薬物スクリーニング及び臨床治療などの分野において非常に幅広い応用性が期待されている。
【０００３】
初期のｉＰＳ技術は主に、逆転写又はレンチウイルスを用いて外因性リプログラミング因子ＯＳＫＭの発現の開始に用いられていた。直接レトロウイルス感染が体細胞突然変異を増加させ、且つ、ｉＰＳＣｓでは直接ゲノムに組み込まれたウイルスベクターが細胞分化につれて発現されて、最終的にｉＰＳＣｓの応用と研究に悪影響を及ぼすと考えられるため、リプログラミング因子の誘導方法に関して、科学者は、さまざまな非組込みｉＰＳＣｓ誘導法を開発している。ＤＮＡレベルでは、科学者は、エピソーム、センダイウイルス、トランスポゾンなどの技術を用いてＯＳＫＭの誘導発現を達成しているが、これらの方法は、リプログラミング効率が異なる上、ベクターを担持していないｉＰＳＣｓを得るには、複数回の継代が必要である。ＲＮＡレベルでは、Ｗａｒｒｅｎらがインビトロで転写されたＯＳＫＭのｍＲＮＡを線維芽細胞に直接導入してｉＰＳＣｓを取得しているが、この方法は、所定の技術難度があり且つ複数回のトランスフェクションを必要とするが、ベクターを担持していないｉＰＳＣｓ細胞を効果的に取得できる。タンパク質レベルでは、Ｋｉｍらは細胞透過性ペプチドを介してＯＳＫＭを細胞に導入して、ヒト腎臓繊維芽細胞由来のｉＰＳＣｓの取得を成功しており、このような方法は遺伝物質を全く必要としないが、誘導効率が比較的低い。他方、リプログラミング系に小分子化合物を加えて、あるシグナル伝達経路を抑制又は活性化させることでリプログラミング効率を著しく向上させることができ、ひいては複数種の小分子が一般的なリプログラミング因子に代ってリプログラミングを実現させることができる。上記ゲノム非組込み方法は、ｉＰＳＣｓの臨床レベルの応用を大幅に促進している。
【０００４】
正常な細胞はインビボで効果的にリプログラミングされてｉＰＳ細胞になることができるが、腫瘍細胞がインビボでリプログラミングされてｉＰＳ細胞になり得るか否かについて、現時点では研究が未だ報告されていない。悪性腫瘍と同様に、ｉＰＳ細胞の発生は腫瘍抑制遺伝子、たとえばＰ５３やＲｂの経路により抑制され、リプログラミング因子のうち、Ｃ−ＭＹＣとＫＬＦ４はいずれもよく知られた癌促進因子である。そして、既存の研究から分かるように、正常な細胞がマウスのインビボでリプログラミングされると、腫瘍を形成することができる。したがって、腫瘍の発生と体細胞リプログラミングの間に所定の類似性がある。正常な体細胞に比べて、腫瘍細胞のリプログラミングは実施しにくく、効率が極めて低いものの、そのメカニズムについて未だ不明である。
【０００５】
白血病は血液系の悪性腫瘍であり、統計によると、中国では、白血病の発症率は、さまざまな腫瘍の中で第６位、小児腫瘍の中で第１位である。発症の重篤度及び細胞の類型に応じて、白血病はいくつかの類型に分けることができる。従来、体内における白血病細胞の除去は、主に標的薬物化学療法又は免疫療法により行われる。しかし、複数の白血病を治療するための薬効範囲が広い治療法は未だない。ｉＰＳ細胞への白血病細胞の成功したリプログラミングのケースがほとんどないことから、白血病細胞は効果的にリプログラムするのが難しいと分かるものの、そのメカニズムは未だ報告されていない。リプログラミングの誘導過程において、遺伝的及びエピジェネティックな改変の劇的な変化により、一部の細胞は死亡しやすい。我々は研究中に、白血病細胞のリプログラミング過程に、大部分の細胞がアポトーシスを発生し、そして、それは白血病細胞がｉＰＳ細胞を形成しにくいことに直接関係があることを見出した。白血病細胞のこの特性を利用して、リプログラミング技術と組み合わせることにより、白血病の治療のための新しい考え方及び方法が提供され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする技術課題は、リプログラミング効果を用いて、インビトロ及びインビボで白血病細胞を選択的に除去することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の技術方案は次の通りである。
【０００８】
本発明は、誘導因子（即ち、リプログラミング因子）Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）の、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを促進する用途を提供する。
【０００９】
該用途では、前記誘導因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃは白血病細胞にリプログラミング過程の開始を促す。
【００１０】
前記白血病細胞は哺乳動物（ヒトを含む）の白血病細胞であり、好ましくはヒト白血病細胞である。
【００１１】
前記誘導因子はｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質の形態である。
【００１２】
本発明は、リプログラミング効果を用いて、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法をさらに提供し、該方法は、リプログラミング因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）を白血病細胞に導入するステップを含む。これにより、白血病細胞のリプログラミング過程を開始させる。
【００１３】
本発明は、リプログラミング効果を用いて白血病を治療する方法をさらに提供し、該方法は、リプログラミング因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）を白血病細胞に導入するステップを含む。白血病細胞ＯＳＫＭ遺伝子の高発現により、白血病細胞のリプログラミング過程を開始させ、これにより、白血病細胞アポトーシスを発生させ、インビボ又はインビトロで白血病細胞を除去する目的を達成させる。
【００１４】
好ましくは、前記の導入方法は、ウイルス感染、組換えタンパク質トランスフェクション又はベクターのエレクトロポレーションを用いる。
【００１５】
本発明に係るウイルス感染、組換えタンパク質トランスフェクション、ベクターのエレクトロポレーションの方法はいずれも本技術分野の常法に従って行う。
【００１６】
たとえば、前記のウイルス感染のステップは、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを含有するウイルスベクターを対応するパッケージングベクターとパッケージング細胞系（たとえば２９３Ｔ、２９３Ａ等）にトランスフェクションし、ウイルスが発生した後、対応するウイルスを収集して、白血病細胞培地に対応するウイルスを加えて感染させることを含み、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びセンダイウイルスベクターから選ばれる。
【００１７】
たとえば、前記の組換えタンパク質トランスフェクションのステップは、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの組換えタンパク質を透過性ペプチドと融合させた後、白血病細胞培養系に加えて、リプログラミング誘導を行うことを含む。
【００１８】
たとえば、前記のベクターのエレクトロポレーションのステップは、エレクトロポレーションの方法により、リプログラミング因子を有するｅｐｉｓｏｍａｌプラスミドを白血病細胞に形質導入して、白血病細胞にリプログラミング因子（ＯＳＫＭ）を一過性発現させることを含む。具体的には、該ステップは、Ａｍａｘａ細胞核細胞核トランスフェクション装置を用いて（取扱説明書に従って）行われる細胞核トランスフェクションであり、その過程は、過程全体で１５ｍｉｎを超えないものであり、５ｘ１０５個の白血病細胞を含む１５ｍｌ遠心管に調製したエレクトロポレーションバッファーを１００μｌ加え、用意したプラスミドをさらに加え、該プラスミドは１０μｇのｐＥＶ  ＳＦＦＶ／ＥＦ１／ＣＡＧ−ＯＳと５μｇのｐＥＶ  ＳＦＦＶ／ＥＦ１／ＣＡＧ−ＭＫを含み、そして、均一に混合した後、エレクトロポレーションカップに移して、エレクトロポレーション槽内に入れてエレクトロポレーションを行う。
【００１９】
本発明は、リプログラミング効果を用いて、インビボ又はインビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法をさらに提供し、該方法は、リプログラミング小分子（ｓｍａｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を用いてインビトロ培養するステップを含む。白血病細胞にリプログラミング過程の開始を促す。
【００２０】
本発明は、リプログラミング効果を用いて白血病を治療する方法をさらに提供し、該方法は、リプログラミング小分子を用いてインビトロ培養するステップを含む。白血病細胞にリプログラミング過程の開始を促し、これにより、白血病細胞アポトーシスを発生させて、インビトロで白血病細胞を除去する目的を達成させる。
【００２１】
前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）のうちの１種又は２種以上の組成物である。
【００２２】
好ましくは、前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）の６種類の組み合わせである。
【００２３】
本発明の前記白血病細胞は、哺乳動物（ヒトを含む）白血病細胞であり、好ましくはヒト白血病細胞である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は次の有益な効果を有する。
【００２５】
本発明は、リプログラミング効果を利用して、インビトロ及びインビボで白血病細胞を効果的且つ選択的に除去し、今後の白血病臨床治療のための新しい考え方と方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】白血病マウスの飲料水にＤｏｘを加えた後の、マウスの脾臓と骨髄における白血病細胞の比率の分析である。
【図２】異なる類型の白血病マウスの飲料水にＤｏｘを加えた後の、白血病マウスの生存分析である。
【図３】白血病マウスの飲料水にＤｏｘを加えた後の、マウスの脾臓と骨髄における白血病幹細胞の比率及び数量の分析である。
【図４】白血病マウスの飲料水にＤｏｘを加えた後の、マウスの脾臓と骨髄における白血病細胞アポトーシスの分析である。
【図５】ＯＳＫＭマウスの正常な骨髄細胞と白血病細胞を共移植し、マウスが白血病を発症した後に、白血病マウスの飲料水にＤｏｘを加えた後の、マウス骨髄における正常な造血幹細胞／前駆細胞の比率とアポトーシスの分析、及び白血病マウスの生存分析である。
【図６】リプログラミング小分子によりインビトロで正常な造血幹細胞／前駆細胞と白血病細胞を処理したときの、アポトーシスと増殖の分析、及び処理した白血病細胞の病原性能力の分析である。
【図７】リプログラミング小分子によりインビトロでヒト白血病細胞系を処理したときの、アポトーシスと増殖の分析である。
【図８】リプログラミング小分子によりインビトロでヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞とＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞を処理したときの、アポトーシス及びコロニー形成能力の分析である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を理解する観点から、次に、実施例にて本発明を更に説明するものの、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【００２８】
実施例１：リプログラミング因子によるインビトロ及びインビボでのマウス白血病細胞の除去
【００２９】
１．白血病レトロウイルスの製造
レトロウイルスの製造には、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の方法を用いた。２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ培養皿に培養して、細胞が９０％細胞コンフルエンスになったとき、プラスミドとｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合液を加えた。プラスミドは、パッケージングプラスミド（ｐＫａｔとｐＶＳＶＧ）とレトロウイルスのターゲットプラスミド（ＭＳＣＶ−ＭＬＬ／ＡＦ９−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を含む。それぞれ４８時間及び７２時間目にウイルスの上澄み液を収集した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ（１００Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いて濃縮させた。
【００３０】
２．マウス急性骨髄性白血病細胞の製造
ＯＳＫＭマウス（「ａｌｌ−ｉＰＳ」マウスともいう、マウスは高紹榮教授の実験室で作成されたものであり、文献の出処はＫａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９；５：１３５−１３８である。）から骨髄細胞を得て、磁気ビーズ方法でＬｉｎｅａｇｅ陰性（Ｌｉｎ−）の骨髄細胞を富化した。ＭＬＬ−ＡＦ９白血病遺伝子を有するレトロウイルスをＬｉｎ−細胞培養液に加えて、４８時間感染させた後、感染させた細胞を収集して、致死照射量で照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈に移植した。マウスが発症した後、マウスの脾臓と骨髄における白血病細胞を収集した。白血病細胞がＯＳＫＭマウスに由来するため、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘ）は白血病細胞におけるＯＳＫＭの発現を活性化できる。
【００３１】
３．インビボでの白血病細胞の除去
白血病細胞を半致死用量で照射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈に移植し、白血病が発症した後期（骨髄における白血病細胞が７０％以上に達する）に、マウスを２群に分けて、対照群では、マウスの飲料水にいずれの成分も添加しておらず、実験群では、マウスの飲料水にＤｏｘ（濃度１ｍｇ／ｍｌ）を加えて、且つ７日間持続させた。結果を図１に示す。図１Ａにおいて、フローサイトメトリーの結果が示すように、実験群では、マウスの脾臓と骨髄における白血病細胞の数量が徐々に減少している。図１Ｂ及び図１Ｃはそれぞれ骨髄及び脾臓における白血病細胞の比率を示し、対照群では、マウスの脾臓及び骨髄における白血病細胞の比率が徐々に上昇し、実験群では、マウスの脾臓及び骨髄における白血病細胞の比率が徐々に低下して、完全に消失したことが分かる。図１から分かるように、Ｄｏｘを加えた後で、マウスの脾臓と骨髄における白血病細胞は急速に消失した。このことは、ＯＳＫＭの白血病細胞での高発現が、白血病細胞のインビボでの除去に直接繋がることを示している。
【００３２】
４．インビボでの複数種の白血病細胞の除去
同様の方法により、ＭＬＬ−ＮＲＩＰ３による急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）とＮＯＴＣＨ１による急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の２種類の白血病のモデルを作成した。生存曲線は図２に示されており、図２ＡはＭＬＬ−ＡＦ９で誘導されたＡＭＬモデルであり、生存曲線の結果が示すように、対照群では、マウスはすべて白血病を発症して死亡したが、実験群では、マウスはすべて生存した。図２ＢはＭＬＬ−ＮＲＩＰ３で誘導されたＡＭＬモデルであり、生存曲線の結果が示すように、対照群では、マウスはすべて白血病を発症して死亡したが、実験群では、少量のマウスだけが死亡した。図２ＣはＮＯＴＣＨ１で誘導されたＡＬＬモデルであり、生存曲線の結果が示すように、対照群では、マウスはすべて白血病を発症して死亡したが、実験群では、マウスはすべて生存した。図２から分かるように、ＭＬＬ−ＡＦ９で誘導された白血病モデルに類似しており、実験群では、マウスの飲料水にＤｏｘを加えた後（７日間持続）に、ほかの２種類の白血病細胞も除去されて、その結果マウス白血病は治療された。このことは、ＯＳＫＭリプログラミング因子により、インビボで複数種の白血病を除去できることを示している。
【００３３】
５．白血病幹細胞の効果的な除去
飲料水にＤｏｘを加えて１〜４日間後、フローサイトメトリーにより白血病幹細胞の比率を検出した。結果が図３に示されており（図３Ａは脾臓における白血病幹細胞の比率及び数量であり、図３Ｂは骨髄における白血病幹細胞の比率及び数量である）、図３から分かるように、成熟白血病細胞に比べて、白血病幹細胞の方はより急速に除去された。
【００３４】
６．リプログラミング因子による白血病細胞アポトーシス
実験群では、飲料水にＤｏｘを加えて１〜４日間後、フローサイトメトリーにより白血病細胞のアポトーシスの状況を分析した。結果が図４に示されており、図４ＡはＤｏｘ処理後の、脾臓における白血病細胞の早期と末期アポトーシスの比率であり、図４ＢはＤｏｘ処理後の、骨髄における白血病細胞の早期と末期アポトーシスの比率である。図４から分かるように、ＯＳＫＭはインビボで白血病細胞のアポトーシスを効果的に誘導することができる。
【００３５】
７．リプログラミング因子による正常な造血幹細胞／前駆細胞への影響が小さい。
ＯＳＫＭマウスの骨髄細胞と白血病細胞を致死用量で照射したマウスの体内に共移植して、マウスが白血病を発症した後で、実験群では、マウスの飲料水にＤｏｘを７日間添加した。結果が図５に示されており、図５Ａは骨髄における正常な造血幹細胞及び前駆細胞の比率であり、図５Ａから分かるように、実験群では、Ｄｏｘで処理した後に、骨髄における正常な造血幹細胞と前駆細胞の比率はほぼ影響を受けなかった。図５Ｂは骨髄における正常な造血幹細胞及び前駆細胞のアポトーシスの比率であり、図５Ｂから分かるように、Ｄｏｘで処理した後に、正常な造血幹細胞と前駆細胞のアポトーシスは影響を受けなかった。図５Ｃはマウスの生存曲線であり、実験群では、１匹を除き、残りの白血病マウスはすべて治癒された。図５から分かるように、正常な造血幹細胞／前駆細胞の数量とアポトーシスはほぼ影響を受けず、実験群では、マウス白血病は治癒できた。
【００３６】
８．リプログラミング誘導小分子によるマウス白血病細胞の除去
リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）を含む。異なる組み合わせを用いてインビトロで白血病細胞と正常な造血幹細胞／前駆細胞を処理した。
【００３７】
処理条件：マウス白血病細胞の開始数量：１ｘ１０５。培地：ＩＭＤＭ＋１５％ウシ胎仔血清＋１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−６＋１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３＋５０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ。
【００３８】
ｃ−Ｋｉｔ＋造血幹細胞／前駆細胞の開始数量：８ｘ１０４。培地：ＩＭＤＭ＋１５％ウシ胎仔血清＋１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−６＋１０ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ−３＋５０ｎｇ／ｍｌマウスＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌマウスＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌマウスＦｌｔ３−Ｌ。
【００３９】
小分子濃度：ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（１０μＭ）、ＶＰＡ（５００μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（１０μＭ）、ＲｅｐＳｏｘ（５μＭ）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（５μＭ）及びＴＴＮＰＢ（１μＭ）
【００４０】
結果が図６に示されており、図６Ａから分かるように、リプログラミング小分子の異なる組み合わせで処理したところ、白血病細胞のアポトーシスは著しく増加するが、正常な造血幹細胞／前駆細胞への影響は小さかった。図６Ｂから分かるように、白血病細胞は、リプログラミング小分子で処理したところ、増殖が著しく抑制され、処理前（０日目）に比べて、細胞の数量は著しく低下した。図６Ｃから分かるように、正常な幹／前駆細胞も、リプログラミング小分子で処理したところ、増殖が抑制されるが、処理前（０日目）に比べて、細胞の数量はわずかに上昇した。図６Ｄから分かるように、ＶＣ６ＴとＦＶＣ６ＴＮの２種の組み合わせで処理したところ、同じ数量の白血病細胞は、病原性能力が著しく弱まり、大部分のマウスには、白血病が発症しなかった。図６Ｅから分かるように、リプログラミング小分子で細胞を処理したところ、細胞内の多能性遺伝子の発現は高まった。このことは、リプログラミング過程が開始されたことを示している。図６から分かるように、リプログラミング小分子は、インビボ及びインビボで、マウス白血病細胞を特異に除去するとともに、正常な造血幹細胞／前駆細胞への影響が小さく、マウス白血病を効果的に治療できた。
【００４１】
実施例２：リプログラミング誘導小分子によるインビトロでのヒト白血病細胞の除去
【００４２】
１．ヒト白血病細胞系
複数種の白血病細胞系を用いて、リプログラミング小分子でインビトロ処理を行い、アポトーシスレベル及び成長状態を測定した。
【００４３】
処理条件：開始数量１ｘ１０５。
【００４４】
ＨＬ−６０、Ｋ５６２、ＮＢ４、Ｋａｓｕｍｉ−１及びＪｕｒｋａｔ細胞：ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ウシ胎仔血清
【００４５】
ＴＨＰ−１細胞：ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ウシ胎仔血清＋０．０５ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
【００４６】
ＫＧ−１及びＫＧ−１ａ細胞：ＩＭＤＭ＋２０％ウシ胎仔血清
【００４７】
小分子濃度：ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（１０μＭ）、ＶＰＡ（５００μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（１０μＭ）、ＲｅｐＳｏｘ（５μＭ）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（５μＭ）及びＴＴＮＰＢ（１μＭ）
【００４８】
結果が図７に示されており、ＦＶＣ６ＴＮ小分子の組み合わせで処理したところ、すべての白血病細胞系のアポトーシスは著しく増加し、成長の抑制は深刻だった。
【００４９】
２．白血病患者モデル
本実験では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者細胞２２例、正常なヒト臍帯血幹細胞（ＣＤ３４＋）５例を集め、インビトロ培養条件においてリプログラミング小分子薬物を用いて処理した。
【００５０】
処理条件：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞とＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞の開始数量：１ｘ１０５。培地：ＩＭＤＭ＋１５％ウシ胎仔血清＋１％二重抗体＋１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ＋１００ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ３−Ｌ＋５０ｎｇ／ｍｌヒトＴＰＯ＋１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３＋１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６。
【００５１】
小分子濃度：ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（１０μＭ）、ＶＰＡ（５００μＭ）、ＣＨＩＲ９９０２１（１０μＭ）、ＲｅｐＳｏｘ（５μＭ）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（５μＭ）及びＴＴＮＰＢ（１μＭ）
【００５２】
結果が図８に示されており、図８Ａはヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞とＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞の、異なるリプログラミング小分子の組み合わせで処理した後のアポトーシス比率であり、図８Ａから分かるように、リプログラミング小分子の組み合わせで処理したところ、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞に比べて、ＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞のアポトーシスはより顕著になった。図８Ｂ及び図８Ｃはそれぞれ、ＦＶＣ６ＴＮ小分子の組み合わせで処理した後の、ＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞とヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のコロニーの数量であり、図８Ｂから分かるように、ＦＶＣ６ＴＮ小分子の組み合わせで処理したところ、ＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞のコロニー形成能力は著しく低下した（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１７、Ｌ１９、Ｌ２１は患者番号である）。図８Ｃから分かるように、ＦＶＣ６ＴＮ小分子の組み合わせで処理したところ、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のコロニー形成能力は顕著な影響を受けなかった。図８Ｄから分かるように、リプログラミング誘導小分子で細胞を処理した後に、リプログラミング小分子で細胞を処理したところ、細胞内の多能性遺伝子の発現は高くなった。、このことは、リプログラミング過程が開始されたことを示している。図８から分かるように、正常な臍帯血ＣＤ３４＋細胞に比べて、ＡＭＬ患者ＣＤ３４＋細胞のアポトーシスレベルの上昇はより顕著であり、インビトロコロニー形成実験（ＣＦＣ）から、小分子で処理したＡＭＬ  ＣＤ３４＋細胞コロニー形成能力は大幅に抑制されたが、正常な臍帯血ＣＤ３４＋細胞コロニー形成能力は影響を受けなかった。
【００５３】
マウスモデルに類似しており、リプログラミング因子は、インビトロでヒト白血病細胞の死亡を特異的に誘導でき、且つ正常な造血幹細胞／前駆細胞への影響が小さく、これにより、インビトロで白血病を治療する効能を果たす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月29日(2018.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを含む、インビボ又はインビトロにおける白血病細胞アポトーシス促進剤。
【請求項２】
前記誘導因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃは白血病細胞にリプログラミング過程の開始を促すことを特徴とする請求項１に記載の促進剤。
【請求項３】
前記白血病細胞は哺乳動物（ヒトを含む）の白血病細胞であることを特徴とする請求項１又は２に記載の促進剤。
【請求項４】
前記白血病細胞はヒト白血病細胞であることを特徴とする請求項３に記載の促進剤。
【請求項５】
前記誘導因子はｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質の形態であることを特徴とする請求項１又は２に記載の促進剤。
【請求項６】
リプログラミング効果を用いて、インビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法であって、
前記方法は、リプログラミング因子Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭと略称する）を白血病細胞に導入するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記の導入方法は、ウイルス感染、組換えタンパク質トランスフェクション又はベクターのエレクトロポレーションを用いることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
リプログラミング効果を用いて、インビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法であって、
前記方法は、リプログラミング小分子を用いてインビトロ培養するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）のうちの１種又は２種以上の組成物であることを特徴とする請求項８に記載のリプログラミング効果を用いて、インビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法。
【請求項１０】
前記リプログラミング小分子は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（ＦＳＫ，Ｆ）、ＶＰＡ（Ｖ）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ，Ｃ）、ＲｅｐＳｏｘ（６１６４５２，６）、ｔｒａｎｙｌｃｙｐｒｏｍｉｎｅ（ＴＣＰ，Ｔ）及びＴＴＮＰＢ（Ｎ）の６種類の組み合わせであることを特徴とする請求項９に記載のリプログラミング効果を用いて、インビトロで白血病細胞アポトーシスを誘導する方法。
【国際調査報告】
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