(57)【要約】本発明は一般に、合成キメラポックスウイルス、かかるウイルスを含む組成物、ならびにかかる合成キメラポックスウイルスを産生するためのシステムおよび方法の開発および使用に関する。合成キメラポックスウイルスは、生ウイルスワクチンおよび医薬製剤に十分適している。化学的ゲノム合成は、天然の鋳型に依存しないので、ウイルスゲノムの大量の構造的および機能的改変が可能である。天然の鋳型が、従来の分子生物学の方法による遺伝的複製または改変に利用可能でない場合、化学的ゲノム合成は特に有用である。
2019535311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化される合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）であって、前記ウイルスのウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なり、前記改変は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群に由来する、ｓｃＰＶ。
【請求項２】
前記合成ＤＮＡが、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、およびヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドのうち１つまたは複数から選択される、請求項１に記載のｓｃＰＶ。
【請求項３】
前記合成ＤＮＡが、化学的に合成されたＤＮＡである、請求項１に記載のｓｃＰＶ。
【請求項４】
前記１つまたは複数の改変が、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のｓｃＰＶ。
【請求項５】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の独自の制限部位を導入する１つまたは複数の改変を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のｓｃＰＶ。
【請求項６】
前記ウイルスゲノムが、異種末端ヘアピンループを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のｓｃＰＶ。
【請求項７】
前記ウイルスゲノムが、ワクシニアウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のｓｃＰＶ。
【請求項８】
左および右末端ヘアピンループが、
ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ループを含む、請求項７に記載のｓｃＰＶ。
【請求項９】
前記ウイルスが、前記ｓｃＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製および再活性化される、請求項１から８のいずれか一項に記載のｓｃＰＶ。
【請求項１０】
前記ウイルスが、１〜１４個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項９に記載のｓｃＰＶ。
【請求項１１】
前記ウイルスが、８〜１２個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項９に記載のｓｃＰＶ。
【請求項１２】
前記ウイルスが、１０個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項９に記載のｓｃＰＶ。
【請求項１３】
前記ウイルスが、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のｓｃＰＶ。
【請求項１４】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載のｓｃＰＶ。
【請求項１５】
合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化される合成キメラオルソポックスウイルス（ｓｃＯＰＶ）であって、前記ウイルスのウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ウイルスの野生型ゲノムとは異なり、前記改変は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群に由来する、ｓｃＯＰＶ。
【請求項１６】
前記合成ＤＮＡが、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、およびヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドのうち１つまたは複数から選択される、請求項１５に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項１７】
前記合成ＤＮＡが、化学的に合成されたＤＮＡである、請求項１５に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項１８】
前記ｓｃＯＰＶのウイルスゲノムが、ラクダ痘（ＣＭＬＶ）ウイルス、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ）、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスおよびハタネズミ痘ウイルスからなる群から選択されるＯＰＶに基づく、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項１９】
前記ｓｃＯＰＶのウイルスゲノムが、ＶＡＣＶに基づく、請求項１５から１８のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２０】
前記ｓｃＯＰＶのウイルスゲノムが、ＶＡＣＶ株ＡＣＡＭ２０００のゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ＡＣＡＭ２０００ゲノムとは異なる、請求項１９に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２１】
前記ｓｃＯＰＶのウイルスゲノムが、ＶＡＣＶ株ＩＯＣのゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ＩＯＣゲノムとは異なる、請求項１９に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２２】
前記ｓｃＯＰＶのウイルスゲノムが、ＶＡＣＶ株ＭＶＡのゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ＭＶＡゲノムとは異なる、請求項１９に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２３】
前記ｓｃＯＰＶのウイルスゲノムが、ＶＡＣＶ株ＭＶＡ−ＢＮのゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ＭＶＡ−ＢＮゲノムとは異なる、請求項１９に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２４】
前記野生型ＶＡＣＶゲノムが、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｃｌｏｎｅ  ３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＴ９、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、ＬＩＶＰ、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１および漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される株のゲノムである、請求項１９に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の改変が、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む、請求項１５から２４のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の独自の制限部位を導入する１つまたは複数の改変を含む、請求項１５から２５のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２８】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数のＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項２７に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の改変が、全てのＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項２８に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３０】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数のＢｓａＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項１５から２９のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３１】
前記ウイルスゲノムが、異種末端ヘアピンループを含む、請求項１５から３０のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３２】
前記ウイルスゲノムが、ワクシニアウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む、請求項１５から３０のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３３】
左および右末端ヘアピンループが、ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ループを含む、請求項３２に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３４】
前記スロー形態が、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３５】
前記スロー形態が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３６】
前記スロー形態が、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３７】
前記スロー形態が、配列番号１１のヌクレオチド配列からなり、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる、請求項３３に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３８】
前記ウイルスが、前記ＯＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製および再活性化される、請求項１５から３７のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項３９】
前記ウイルスが、１〜１４個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項３８に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項４０】
前記ウイルスが、８〜１２個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項３８に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項４１】
前記ウイルスが、１０個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項３８に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項４２】
前記ウイルスが、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される、請求項１５から４１のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項４３】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される、請求項４２に記載のｓｃＯＰＶ。
【請求項４４】
合成ＤＮＡから複製および再活性化される合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）であって、ウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＨＰＸＶの野生型ゲノムとは異なり、前記改変は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群に由来する、ｓｃＨＰＸＶ。
【請求項４５】
前記合成ＤＮＡが、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、およびヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドのうち１つまたは複数から選択される、請求項４４に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項４６】
前記合成ＤＮＡが、化学的に合成されたＤＮＡである、請求項４４に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項４７】
前記ウイルスゲノムが、ＨＰＸＶ株ＭＮＲ−７６のゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点で前記ＭＮＲ−７６ゲノムとは異なる、請求項４４から４６のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項４８】
前記１つまたは複数の改変が、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む、請求項４４から４７のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項４９】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の独自の制限部位を導入する１つまたは複数の改変を含む、請求項４４から４８のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５０】
前記１つまたは複数の改変が、ＨＰＸＶ０４４またはＨＰＸＶ０９５中に存在する、請求項４９に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５１】
前記１つまたは複数の改変が、表３に列挙される１つもしくは複数の変異を含む、請求項４４から５０のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５２】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数の制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項４４から５１のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５３】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数のＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項５２に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５４】
前記１つまたは複数の改変が、全てのＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項５３に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５５】
前記１つまたは複数の改変が、１つまたは複数のＢｓａＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む、請求項４４から５４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の改変が、表２に列挙される１つまたは複数の変異を含む、請求項４４から５５のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５７】
前記ウイルスゲノムが、異種末端ヘアピンループを含む、請求項４４から５６のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５８】
前記ウイルスゲノムが、ワクシニアウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む、請求項５７に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項５９】
左および右末端ヘアピンループが、ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態の前記ワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態の前記ワクシニアウイルス末端ループを含む、請求項５８に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６０】
前記スロー形態が、配列番号１１の配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６１】
前記スロー形態が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６２】
前記スロー形態が、配列番号１１の配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項５９に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６３】
前記スロー形態が、配列番号１１のヌクレオチド配列からなり、前記ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる、請求項５９に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６４】
前記ウイルスゲノムが、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、奇肢症ウイルス、サル痘ウイルス、痘瘡ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスまたはハタネズミ痘ウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む、請求項５７に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６５】
前記ウイルスが、前記ＨＰＸＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製およびアセンブルされる、請求項４４から６４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６６】
前記ウイルスが、１〜１４個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項６５に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６７】
前記ウイルスが、８〜１２個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項６５に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６８】
前記ウイルスが、１０個の重複する断片から複製および再活性化される、請求項６５に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項６９】
前記ウイルスが、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される、請求項４４から６８のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項７０】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される、請求項６９に記載のｓｃＨＰＸＶ。
【請求項７１】
合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を産生する方法であって、
（ｉ）ポックスウイルスのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；
（ｉｉ）前記重複するＤＮＡ断片を、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）前記細胞を培養して、前記細胞においてヘルパーウイルスおよび合成キメラポックスウイルス粒子の混合物を産生するステップ；ならびに
（ｉｖ）前記混合物を、ｓｃＰＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、前記ｓｃＰＶを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項７２】
前記ヘルパーウイルスがレポリポックスウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記レポリポックスウイルスがＳＦＶである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ヘルパーウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記ヘルパーウイルスが、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記ヘルパーウイルス感染細胞がＢＧＭＫ細胞である、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ｉ）が、ポックスウイルス由来の末端ヘアピンループを化学的に合成するステップ、およびそれらを、前記ウイルスゲノムの左および右末端を含む断片にライゲートさせるステップ、をさらに含む、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
合成キメラオルソポックスウイルス（ｓｃＯＰＶ）を産生する方法であって、
（ｉ）ＯＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；
（ｉｉ）前記重複するＤＮＡ断片を、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）前記細胞を培養して、前記細胞においてヘルパーウイルスおよびｓｃＯＰＶ粒子の混合物を産生するステップ；ならびに
（ｉｖ）前記混合物を、ＯＰＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、前記ｓｃＯＰＶを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項８０】
前記ヘルパーウイルスがレポリポックスウイルスである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記レポリポックスウイルスがＳＦＶである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ヘルパーウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記ヘルパーウイルスが、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記ヘルパーウイルス感染細胞がＢＧＭＫ細胞である、請求項７９から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＯＰＶに特異的な宿主細胞がＢＳＣ−４０細胞である、請求項７９から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＯＰＶが、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、奇肢症ウイルス、馬痘ウイルス、サル痘ウイルス、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ハタネズミ痘ウイルスからなる群から選択される、請求項７９から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
ステップ（ｉ）が、ＯＰＶ由来の末端ヘアピンループを化学的に合成するステップ、およびそれらを、前記ウイルスゲノムの左および右末端を含む断片にライゲートさせるステップ、をさらに含む、請求項７９から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生する方法であって、
（ｉ）ＨＰＸＶゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；
（ｉｉ）前記重複するＤＮＡ断片を、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）前記細胞を培養して、前記細胞においてヘルパーウイルスおよびｓｃＨＰＸＶ粒子の混合物を産生するステップ；ならびに
（ｉｖ）前記混合物を、ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、前記ｓｃＨＰＸＶを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項９０】
前記ヘルパーウイルスがレポリポックスウイルスである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記レポリポックスウイルスが、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記レポリポックスウイルスがＳＦＶである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ヘルパーウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
前記ヘルパーウイルスが、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記ヘルパーウイルス感染細胞がＢＧＭＫ細胞である、請求項８９から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞がＢＳＣ−４０細胞である、請求項８９から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
ステップ（ｉ）が、ＯＰＶ由来の末端ヘアピンループを化学的に合成するステップ、およびそれらを、前記ＨＰＸＶゲノムの左および右末端を含む断片にライゲートさせるステップ、をさらに含む、請求項８９から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記重複するＤＮＡ断片が、
ｉ）配列番号１〜１０の配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列；
ｉｉ）配列番号１〜１０の配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号１〜１０の配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列；または
（ｉｖ）配列番号１〜１０の配列からなるヌクレオチド配列
を含む、請求項８９から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生する方法であって、
（ｉ）ＨＰＸＶゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；
（ｉｉ）前記重複するＤＮＡ断片を、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）感染細胞中にトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）前記細胞を培養して、前記細胞においてＳＦＶおよびｓｃＨＰＸＶ粒子の混合物を産生するステップ；ならびに
（ｉｖ）前記混合物を、ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、前記ｓｃＨＰＸＶを回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１００】
前記ＳＦＶ感染細胞がＢＧＭＫ細胞である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞がＢＳＣ−４０細胞である、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項７１から７８のいずれか一項に記載の方法によって生成された、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）。
【請求項１０３】
請求項７９から８８のいずれか一項に記載の方法によって生成された、合成キメラオルソポックスウイルス（ｓｃＯＰＶ）。
【請求項１０４】
請求項８９から１０１のいずれか一項に記載の方法によって生成された、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）。
【請求項１０５】
薬学的に許容される担体ならびに請求項１から１４および１０２のいずれか一項に記載のｓｃＰＶを含む組成物。
【請求項１０６】
薬学的に許容される担体ならびに請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶを含む組成物。
【請求項１０７】
痘瘡ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１０８】
ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１０９】
サル痘ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１０】
ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から前記対象を保護する方法であって、前記対象に、請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から前記対象を保護する方法。
【請求項１１１】
痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１２】
薬学的に許容される担体ならびに請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物。
【請求項１１３】
痘瘡ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１４】
ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１５】
サル痘ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１６】
ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から前記対象を保護する方法であって、前記対象に、請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から前記対象を保護する方法。
【請求項１１７】
痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１８】
請求項１から１３および１０２のいずれか一項に記載のｓｃＰＶを含む組成物を含むキット。
【請求項１１９】
請求項１５から４３および１０３のいずれか一項に記載のＯＰＶを含む組成物、ならびにその使用指示を含むキット。
【請求項１２０】
請求項４４から７０および１０４のいずれか一項に記載のｓｃＨＰＸＶを含む組成物、ならびにその使用指示を含むキット。
【請求項１２１】
前記組成物が、ポックスウイルス処置施設において投与される、請求項１０７から１１１または１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記組成物が、天然痘有害事象の専門家によって投与される、請求項１０７から１１１、１１３から１１７または１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記天然痘有害事象が、種痘性湿疹、進行性ワクシニア、ワクチン後脳炎、心筋炎および拡張型心筋症から選択される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項１から７０および１０２から１０６のいずれか一項に記載のウイルスを含む組成物または請求項１０５、１０６もしくは１１２のいずれか一項に記載の組成物による免疫化または処置を必要とする対象が、免疫化または処置されることを意図しない他の対象から隔離されるような環境において免疫化または処置することができる、ポックスウイルス処置施設。
【請求項１２５】
天然痘有害事象の専門家が前記免疫化または処置を施すことを特徴とする、請求項１２４に記載のポックスウイルス処置施設。
【請求項１２６】
前記天然痘有害事象が、種痘性湿疹、進行性ワクシニア、ワクチン後脳炎、心筋炎および拡張型心筋症から選択される、請求項１２４または１２５に記載のポックスウイルス処置施設。
【請求項１２７】
免疫化または処置を必要とする前記対象が、請求項１０７から１１１または１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法に従って免疫化または処置される、請求項１２４から１２６のいずれか一項に記載のポックスウイルス処置施設。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のメンバー）は、ヒトおよび動物の両方に感染できる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ポックスウイルスは、宿主範囲に基づいて２つの亜科に分割される。脊椎動物宿主に感染するＣｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ亜科は、８つの属からなり、そのうち４つの属（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＭｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓおよびＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ）は、ヒトに感染することが公知である。天然痘は、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＯＰＶ）属のメンバーである痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）による感染によって引き起こされる。ＯＰＶ属は、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病（Uasin  Gishu  disease）ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）を含む、いくつかの遺伝的に関連し形態学的に同一なウイルスを含む。ＶＡＲＶ以外では、ＶＡＣＶ、ＭＰＸＶおよびＣＰＸＶを含む少なくとも３種の他のＯＰＶが、ヒトに感染することが公知である。これまでのところ、「生」ＶＡＣＶによるワクチン接種は、天然痘に対する唯一の証明された保護である。ワクチン接種の積極的なプログラムは、１９８０年に天然痘の根絶をもたらし、公共の慣用的な天然痘ワクチン接種は停止された。しかし、ＶＡＲＶおよび他のＯＰＶに対して個体をワクチン接種する、新たな安全かつ有効な手段を見出す必要が依然としてある。
ＶＡＣＶの種々の調製物が、天然痘ワクチンとして使用されてきた。これらのほとんどは、いくつかの関連するウイルスから構成され（例えば、Ｄｒｙｖａｘ）、１つは、単一の分子クローンＡＣＡＭ２０００を含む。しかし、Ｄｒｙｖａｘおよび他のＶＡＣＶワクチンと同様に、ＡＣＡＭ２０００でさえも、心筋症および心膜炎を含む重篤な副作用と関連する。リスクを低減させるために、ＡＣＡＭ２０００ワクチンは、他の生ワクチンと同様、がん、免疫不全を有する個体、臓器移植レシピエント、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、心臓状態を有する患者、および免疫抑制薬使用中の患者を排除する多数の禁忌を有する。米国人口の１５〜５０％がこれらのカテゴリーの１つに入ると推定されており、従って、より安全なワクチンまたはワクチン接種プロトコールの開発の必要性が確認される（Kennedyら、２００７年  Kennedy  R、Poland  GA.  ２００７年.  T-Cell  epitope  discovery  for  variola  and  vaccinia  viruses.  Rev  Med  Viroll  ７巻：９３〜１１３頁）。従って、有効性においてＤｒｙｖａｘまたはＡＣＡＭ２０００（商標）と等価であるがより安全なワクチンの開発が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Kennedyら、２００７年  Kennedy  R、Poland  GA.  ２００７年.  T-Cell  epitope  discovery  for  variola  and  vaccinia  viruses.  Rev  Med  Viroll  ７巻：９３〜１１３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、化学的に合成されたＤＮＡからアセンブルおよび複製されるキメラポックスウイルスを提供する。化学的ゲノム合成は、天然の鋳型に依存しないので、ウイルスゲノムの大量の構造的および機能的改変が可能である。天然の鋳型が、従来の分子生物学の方法による遺伝的複製または改変に利用可能でない場合、化学的ゲノム合成は特に有用である。
【０００４】
発明の要旨
本発明は、合成キメラポックスウイルス（例えば、合成キメラＯＰＶ即ちｓｃＯＰＶ）、かかるウイルスを産生するための方法、およびかかるウイルスの、例えば、免疫原としての、免疫原性製剤における、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、異種遺伝子発現のためのビヒクルとしての、または腫瘍溶解剤としての使用を提供する。本発明の合成キメラポックスウイルスは、野生型ポックスウイルスと比較した１つまたは複数の改変を特徴とする。
【０００５】
一部、本発明は、合成キメラポックスウイルス（例えば、ｓｃＯＰＶ）を、ポックスウイルスゲノムの化学的に合成された重複する断片から産生することができるという発見に関する。従って、本発明は一部、化学的に合成された核酸から複製およびアセンブルされる合成キメラポックスウイルス（例えば、ｓｃＯＰＶ）を提供する。本開示は、かかるウイルスを含む組成物もまた提供する。本開示は、本開示の方法に従って産生されたポックスウイルスを使用する方法をさらに提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、本発明の合成キメラポックスウイルスを使用して、天然痘、シュードタイプの天然痘ウイルスおよび他のＯＰＶによる感染の結果に対して個々のヒトおよびヒトの集団を保護するための方法を提供する。別の態様では、本発明は、本発明の合成キメラポックスウイルスを使用することによって、入手可能なＶＡＣＶベースのワクチンよりも少ない毒性、罹患率および死亡率で、天然痘（ＶＡＲＶ）およびシュードタイプの天然痘ウイルスによる感染の結果に対して個々のヒトおよびヒトの集団を保護するための方法である。ある特定の態様では、本発明は、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化される合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）であって、ウイルスのウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でウイルスの野生型ゲノムとは異なり、改変は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群に由来する、ｓｃＰＶを提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、合成ＤＮＡは、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、およびヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドのうち１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、合成ＤＮＡは、化学的に合成されたＤＮＡである。
【０００８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数の独自の制限部位を導入する１つまたは複数の改変を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、異種末端ヘアピンループを含む。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ワクシニアウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む。一部の実施形態では、左および右末端ヘアピンループは、ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態のワクシニアウイルス末端ループを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ウイルスは、ｓｃＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製および再活性化される。
【００１１】
一部の実施形態では、ウイルスは、１〜１４個の重複する断片から複製および再活性化される。一部の実施形態では、ウイルスは、８〜１２個の重複する断片から複製および再活性化される。一部の実施形態では、ウイルスは、１０個の重複する断片から複製および再活性化される。
【００１２】
一部の実施形態では、ウイルスは、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスは、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される。  
【００１３】
ある特定の態様では、本発明は、合成ＤＮＡに由来するＤＮＡから複製および再活性化される合成キメラオルソポックスウイルス（ｓｃＯＰＶ）であって、ウイルスのウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でウイルスの野生型ゲノムとは異なり、改変は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群に由来する、ｓｃＯＰＶを提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、合成ＤＮＡは、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、およびヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドのうち１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、合成ＤＮＡは、化学的に合成されたＤＮＡである。
【００１５】
一部の実施形態では、ＯＰＶは、ラクダ痘（ＣＭＬＶ）ウイルス、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ）、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスおよびハタネズミ痘ウイルスからなる群から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、ＯＰＶは、ＶＡＣＶである。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ＶＡＣＶ株ＡＣＡＭ２０００のゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＡＣＡＭ２０００ゲノムとは異なる。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ＶＡＣＶ株ＩＯＣのゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＩＯＣゲノムとは異なる。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ＶＡＣＶ株ＭＶＡのゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＭＶＡゲノムとは異なる。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ＶＡＣＶ株ＭＶＡ−ＢＮのゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＭＶＡ−ＢＮゲノムとは異なる。一部の実施形態では、野生型ＶＡＣＶゲノムは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｃｌｏｎｅ  ３、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＴ９、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＰ３、ＮＹＣＢＨ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ、ＩＨＤ−Ｗ、ＬＣ１６ｍ１８、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ４、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、ＬＩＶＰ、Ｉｋｅｄａ、ＥＭ−６３、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ、３７３７、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｒｒｏ  ２、ＣＭ−０１、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１３、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２０、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１７、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ２１および漿尿膜ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａからなる群から選択される株のゲノムである。
【００１７】
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数の独自の制限部位を導入する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数の制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数のＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、全てのＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数のＢｓａＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、異種末端ヘアピンループを含む。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ワクシニアウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む。一部の実施形態では、左および右末端ヘアピンループが、ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態のワクシニアウイルス末端ループを含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含み、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１のヌクレオチド配列からなり、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる。
【００２０】
一部の実施形態では、ウイルスは、ＯＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製および再活性化される。
【００２１】
一部の実施形態では、ウイルスは、１〜１４個の重複する断片から複製および再活性化される。一部の実施形態では、ウイルスは、８〜１２個の重複する断片から複製および再活性化される。一部の実施形態では、ウイルスは、１０個の重複する断片から複製および再活性化される。
【００２２】
一部の実施形態では、ウイルスは、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスは、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される。  
【００２３】
ある特定の態様では、本発明は、合成ＤＮＡから複製および再活性化される合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）であって、ウイルスゲノムは、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＨＰＸＶの野生型ゲノムとは異なり、改変は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む群に由来する、ｓｃＨＰＸＶを提供する。
【００２４】
一部の実施形態では、合成ＤＮＡは、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、およびヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドのうち１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、合成ＤＮＡは、化学的に合成されたＤＮＡである。
【００２５】
一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ＨＰＸＶ株ＭＮＲ−７６のゲノムに基づき、１つまたは複数の改変を特徴とするという点でＭＮＲ−７６ゲノムとは異なる。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数の独自の制限部位を導入する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、ＨＰＸＶ０４４またはＨＰＸＶ０９５中に存在する。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、表３に列挙される１つもしくは複数の変異を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数の制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数のＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、全てのＡａｒＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、１つまたは複数のＢｓａＩ制限部位を排除する１つまたは複数の改変を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、表２に列挙される１つまたは複数の変異を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、異種末端ヘアピンループを含む。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ワクシニアウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む。一部の実施形態では、左および右末端ヘアピンループが、ａ）それぞれ、スロー形態およびファスト形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｂ）それぞれ、ファスト形態およびスロー形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、ｃ）共にスロー形態のワクシニアウイルス末端ヘアピンループを含み、またはｄ）共にファスト形態のワクシニアウイルス末端ループを含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１の配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含み、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１の配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１の配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み、ファスト形態が、配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、スロー形態は、配列番号１１のヌクレオチド配列からなり、ファスト形態は、配列番号１２のヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、奇肢症ウイルス、サル痘ウイルス、痘瘡ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスまたはハタネズミ痘ウイルスに由来する末端ヘアピンループを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、ウイルスは、ＨＰＸＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複する化学的に合成されたＤＮＡ断片から複製およびアセンブルされる。
【００２９】
一部の実施形態では、ウイルスは、１〜１４個の重複する断片から複製および再活性化される。一部の実施形態では、ウイルスは、８〜１２個の重複する断片から複製および再活性化される。一部の実施形態では、ウイルスは、１０個の重複する断片から複製および再活性化される。
【００３０】
一部の実施形態では、ウイルスは、レポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化を使用して再活性化される。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスは、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される。
【００３１】
ある特定の態様では、本発明は、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を産生する方法であって、（ｉ）ポックスウイルスのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；（ｉｉ）重複するＤＮＡ断片を、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトするステップ；（ｉｉｉ）細胞を培養して、細胞においてヘルパーウイルスおよび合成キメラポックスウイルス粒子の混合物を産生するステップ；ならびに（ｉｖ）混合物を、ｓｃＰＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、ｓｃＰＶを回収するステップを含む、方法を提供する。
【００３２】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはレポリポックスウイルスである。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスは、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスはＳＦＶである。
【００３３】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは鶏痘ウイルスである。
【００３４】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである。
【００３５】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルス感染細胞はＢＧＭＫ細胞である。
【００３６】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ポックスウイルス由来の末端ヘアピンループを化学的に合成するステップ、およびそれらを、ウイルスゲノムの左および右末端を含む断片にライゲートさせるステップ、をさらに含む。
【００３７】
ある特定の態様では、本発明は、合成キメラオルソポックスウイルス（ｓｃＯＰＶ）を産生する方法であって、（ｉ）ＯＰＶのウイルスゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；（ｉｉ）重複するＤＮＡ断片を、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトするステップ；（ｉｉｉ）細胞を培養して、細胞においてヘルパーウイルスおよびｓｃＯＰＶ粒子の混合物を産生するステップ；ならびに（ｉｖ）混合物を、ＯＰＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、ｓｃＯＰＶを回収するステップを含む、方法を提供する。
【００３８】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはレポリポックスウイルスである。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスは、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスはＳＦＶである。  
【００３９】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは鶏痘ウイルスである。
【００４０】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである。
【００４１】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルス感染細胞はＢＧＭＫ細胞である。  
【００４２】
一部の実施形態では、ＯＰＶに特異的な宿主細胞はＢＳＣ−４０細胞である。
【００４３】
一部の実施形態では、ＯＰＶは、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、奇肢症ウイルス、馬痘ウイルス、サル痘ウイルス、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス、ウサギ痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ハタネズミ痘ウイルスからなる群から選択される。
【００４４】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ＯＰＶ由来の末端ヘアピンループを化学的に合成するステップ、およびそれらを、ウイルスゲノムの左および右末端を含む断片にライゲートさせるステップ、をさらに含む。
【００４５】
ある特定の態様では、本発明は、（ｉ）ＨＰＸＶゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；（ｉｉ）重複するＤＮＡ断片を、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトするステップ；（ｉｉｉ）前記細胞を培養して、前記細胞においてヘルパーウイルスおよびｓｃＨＰＸＶ粒子の混合物を産生するステップ；ならびに（ｉｖ）混合物を、ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、ｓｃＨＰＸＶを回収するステップ、を含む、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生する方法を提供する。
【００４６】
ある特定の態様では、本発明は、（ｉ）ＨＰＸＶゲノムの実質的に全てに対応する重複するＤＮＡ断片を化学的に合成するステップ；（ｉｉ）重複するＤＮＡ断片を、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）感染細胞中にトランスフェクトするステップ；（ｉｉｉ）前記細胞を培養して、前記細胞においてＳＦＶおよびｓｃＨＰＸＶ粒子の混合物を産生するステップ；ならびに（ｉｖ）混合物を、ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞上にプレーティングして、ｓｃＨＰＸＶを回収するステップ、を含む、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生する方法を提供する。
【００４７】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはレポリポックスウイルスである。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスは、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から選択される。一部の実施形態では、レポリポックスウイルスはＳＦＶである。
【００４８】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは鶏痘ウイルスである。
【００４９】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである。.
【００５０】
一部の実施形態では、ヘルパーウイルス感染細胞はＢＧＭＫ細胞である。
【００５１】
一部の実施形態では、ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞はＢＳＣ−４０細胞である。
【００５２】
一部の実施形態では、ステップ（ｉ）は、ＯＰＶ由来の末端ヘアピンループを化学的に合成するステップ、およびそれらを、ＨＰＸＶゲノムの左および右末端を含む断片にライゲートさせるステップ、をさらに含む。
【００５３】
一部の実施形態では、重複するＤＮＡ断片は、ｉ）配列番号１〜１０の配列に対して少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列；ｉｉ）配列番号１〜１０の配列に対して少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）配列番号１〜１０の配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列；または（ｉｖ）配列番号１〜１０の配列からなるヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
一部の実施形態では、ＳＦＶ感染細胞はＢＧＭＫ細胞である。
【００５５】
一部の実施形態では、ＨＰＸＶに特異的な宿主細胞はＢＳＣ−４０細胞である。
【００５６】
ある特定の態様では、本発明は、本開示の方法によって生成された、合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を提供する。
【００５７】
ある特定の態様では、本発明は、本開示の方法によって生成された、合成キメラオルソポックスウイルス（ｓｃＯＰＶ）を提供する。
【００５８】
ある特定の態様では、本発明は、本開示の方法によって生成された、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を提供する。
【００５９】
ある特定の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体ならびに本開示のｓｃＰＶを含む組成物を提供する。
【００６０】
ある特定の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体ならびに本開示のｓｃＯＰＶを含む組成物を提供する。  
【００６１】
ある特定の態様では、本発明は、痘瘡ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６２】
ある特定の態様では、本発明は、ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６３】
ある特定の態様では、本発明は、サル痘ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６４】
ある特定の態様では、本発明は、ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から対象を保護する方法であって、対象に、本開示のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から対象を保護する方法を提供する。
【００６５】
ある特定の態様では、本発明は、痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＯＰＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６６】
ある特定の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体ならびに本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を提供する。
【００６７】
ある特定の態様では、本発明は、痘瘡ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６８】
ある特定の態様では、本発明は、ワクシニアウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００６９】
ある特定の態様では、本発明は、サル痘ウイルスに対する免疫応答を誘発またはブーストする方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００７０】
ある特定の態様では、本発明は、ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から対象を保護する方法であって、対象に、本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、ヒト対象を免疫化して、痘瘡ウイルス感染から対象を保護する方法を提供する。
【００７１】
ある特定の態様では、本発明は、痘瘡ウイルス感染を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００７２】
ある特定の態様では、本発明は、本開示のｓｃＰＶを含む組成物を含むキットを提供する。
【００７３】
ある特定の態様では、本発明は、本開示のＯＰＶを含む組成物を含むキットを提供する。
【００７４】
ある特定の態様では、本発明は、本開示のｓｃＨＰＸＶを含む組成物を含むキットを提供する。
【００７５】
ある特定の態様では、本発明の組成物は、ポックスウイルス処置施設において投与される。ある特定の態様では、ポックスウイルス処置施設は、本発明の組成物または方法による免疫化または処置を必要とする対象が、免疫化もしくは処置されることを意図しない他の対象、または処置された対象によって潜在的に感染され得る他の対象（例えば、介護者および家族）から隔離されるような環境において免疫化または処置することができる施設である。一部の実施形態では、免疫化されることを意図しない対象または処置された対象によって潜在的に感染される対象は、ＨＩＶ患者、化学療法を受けている患者、がん、リウマチ学的障害または自己免疫性障害に対する処置を受けている患者、臓器または組織移植を受けているまたは受けた患者、免疫不全を有する患者、小児、妊娠女性、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、心臓状態を有する患者、および免疫抑制薬使用中の患者などが含まれる。一部の実施形態では、ポックスウイルス処置施設は、オルソポックスウイルス処置施設である。一部の実施形態では、ポックスウイルス処置施設は、天然痘処置施設である。
【００７６】
ある特定の態様では、本発明の組成物は、天然痘有害事象の専門家によって投与される。一部の実施形態では、天然痘有害事象には、種痘性湿疹、進行性ワクシニア、ワクチン後脳炎、心筋炎および拡張型心筋症が含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
上述の概要ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解される。本発明を例示することを目的として、本発明で好ましい実施形態が図面に示される。しかし、本発明は、示された正確な配置および手段に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂ。直鎖ｄｓＤＮＡ  ＨＰＸＶゲノム（株ＭＮＲ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４）の模式図。Ａ．図１Ａは、個々のＨＰＸＶ遺伝子（紫色）ならびに天然に存在するＡａｒＩおよびＢｓａＩ部位が示された、ＨＰＸＶゲノムの未改変のゲノム配列を示す。Ｂ．図１Ｂは、重複するゲノムＤＮＡ断片（赤色で示される）を使用して化学的に合成された、改変された合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）ゲノムを示す。ＶＡＣＶ末端ヘアピンループをＩＴＲにライゲートさせるために使用した操作されたＳａｐＩ制限部位もまた、左および右ＩＴＲ断片中の未改変のＢｓａＩ部位と共に示される。ＳａｐＩ部位は、プラスミドベクター部位中の、それぞれ左末端逆位配列（ＬＩＴＲ）および右末端逆位配列（ＲＩＴＲ）のすぐ左側終端および右側終端に位置した。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂ。直鎖ｄｓＤＮＡ  ＨＰＸＶゲノム（株ＭＮＲ；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４）の模式図。Ａ．図１Ａは、個々のＨＰＸＶ遺伝子（紫色）ならびに天然に存在するＡａｒＩおよびＢｓａＩ部位が示された、ＨＰＸＶゲノムの未改変のゲノム配列を示す。Ｂ．図１Ｂは、重複するゲノムＤＮＡ断片（赤色で示される）を使用して化学的に合成された、改変された合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）ゲノムを示す。ＶＡＣＶ末端ヘアピンループをＩＴＲにライゲートさせるために使用した操作されたＳａｐＩ制限部位もまた、左および右ＩＴＲ断片中の未改変のＢｓａＩ部位と共に示される。ＳａｐＩ部位は、プラスミドベクター部位中の、それぞれ左末端逆位配列（ＬＩＴＲ）および右末端逆位配列（ＲＩＴＲ）のすぐ左側終端および右側終端に位置した。
【００７９】
【図２】図２Ａ〜２Ｃ。改変されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムおよびＶＡＣＶ（ＷＲ株）末端ヘアピンループの詳細な模式図。Ａ．図２Ａは、改変されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムを示す。未改変のＢｓａＩ部位は、ゲノム上に青色の線として示される。ＨＰＸＶ０４４（ＶＡＣＶ  Ｆ４Ｌホモログ）中に創出された新規ＡｖａＩおよびＳｔｕＩ制限部位もマークされる（緑色の線）。断片＿３のＨＰＸＶ０９５遺伝子座（ＶＡＣＶ  Ｊ２Ｒホモログ）中の選択可能なマーカー黄色蛍光タンパク質／グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｙｆｐ／ｇｐｔ）の位置もまた示される（黄色）。Ｂ．図２Ｂは、Ｓ（配列番号１１）形態およびＦ（配列番号１２）形態の末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を示し、色コード化は、（Ｃ）で説明される。Ｃ．図２Ｃは、ＶＡＣＶの直鎖ｄｓＤＮＡゲノムの末端終端に共有結合されるＦ形態およびＳ形態の末端ヘアピンループの二次構造予測を示す。末端ループ配列は、緑色で強調される。コンカテマー分割（concatamer  resolution）配列は、赤色で囲まれる。
【００８０】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂ。約７０ｂｐのＶＡＣＶ末端ヘアピンが、左および右ＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片にライゲートされ得る。Ａ．図３Ａは、ＳａｐＩおよびＰｖｕＩＩ認識部位の位置をマークする、左および右ＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片の模式図を示す。ＳａｐＩおよびＰｖｕＩＩによる消化後のＤＮＡの予測された断片サイズが示される。Ｂ．図３Ｂは、ＳａｐＩによって切断された１４７２ｂｐのＩＴＲ断片への約７０ｂｐの末端ヘアピンのライゲーション後の、左および右ＩＴＲ断片のアガロースゲル電気泳動を示す。ライゲートされたＤＮＡを、ＰｖｕＩＩによって引き続いて切断して、ヘアピンの付加によって引き起こされた、サイズにおける小さい変化の検出を促進した。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂ。約７０ｂｐのＶＡＣＶ末端ヘアピンが、左および右ＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片にライゲートされ得る。Ａ．図３Ａは、ＳａｐＩおよびＰｖｕＩＩ認識部位の位置をマークする、左および右ＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片の模式図を示す。ＳａｐＩおよびＰｖｕＩＩによる消化後のＤＮＡの予測された断片サイズが示される。Ｂ．図３Ｂは、ＳａｐＩによって切断された１４７２ｂｐのＩＴＲ断片への約７０ｂｐの末端ヘアピンのライゲーション後の、左および右ＩＴＲ断片のアガロースゲル電気泳動を示す。ライゲートされたＤＮＡを、ＰｖｕＩＩによって引き続いて切断して、ヘアピンの付加によって引き起こされた、サイズにおける小さい変化の検出を促進した。
【００８１】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのＰＣＲ分析および制限消化は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の首尾よい再活性化を確認する。Ａ．図４Ａは、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンのＰＣＲ分析の結果を示す。ＶＡＣＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の両方における保存されたＢｓａＩ制限部位に隣接するプライマーを使用して、一連の約１ｋｂｐの産物を増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢｓａＩによって引き続いて消化し、得られたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＶＡＣＶは切断されるが、全てのＢｓａＩ部位が、２つの異なるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンから欠失されていた。Ｂ．図４Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示す。ウイルスＤＮＡを、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、または未処理のままにし、次いで、１〜１０秒の切り替え時間で、５．７Ｖ／ｃｍで１４℃で１４時間、１％Ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロースゲル上で分離した。インタクトなＶＡＣＶゲノムとｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムとの間で、サイズにおける僅かな差異が観察された。アスタリスク（＊）でマークされたかすかなバンドは、不完全なＤＮＡ消化産物であるか、またはＶＡＣＶビリオン調製物にしばしば混入する切断されたミトコンドリアＤＮＡ断片であり得る。Ｃ．図４Ｃは、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩによって消化したＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡの従来のアガロースゲル電気泳動を示す。ＤＮＡ断片を、ＳｙｂｒＧｏｌｄ  ＤＮＡ染色でゲルを染色することによって可視化した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのＰＣＲ分析および制限消化は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の首尾よい再活性化を確認する。Ａ．図４Ａは、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンのＰＣＲ分析の結果を示す。ＶＡＣＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の両方における保存されたＢｓａＩ制限部位に隣接するプライマーを使用して、一連の約１ｋｂｐの産物を増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢｓａＩによって引き続いて消化し、得られたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＶＡＣＶは切断されるが、全てのＢｓａＩ部位が、２つの異なるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンから欠失されていた。Ｂ．図４Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示す。ウイルスＤＮＡを、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、または未処理のままにし、次いで、１〜１０秒の切り替え時間で、５．７Ｖ／ｃｍで１４℃で１４時間、１％Ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロースゲル上で分離した。インタクトなＶＡＣＶゲノムとｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムとの間で、サイズにおける僅かな差異が観察された。アスタリスク（＊）でマークされたかすかなバンドは、不完全なＤＮＡ消化産物であるか、またはＶＡＣＶビリオン調製物にしばしば混入する切断されたミトコンドリアＤＮＡ断片であり得る。Ｃ．図４Ｃは、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩによって消化したＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡの従来のアガロースゲル電気泳動を示す。ＤＮＡ断片を、ＳｙｂｒＧｏｌｄ  ＤＮＡ染色でゲルを染色することによって可視化した。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのＰＣＲ分析および制限消化は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の首尾よい再活性化を確認する。Ａ．図４Ａは、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンのＰＣＲ分析の結果を示す。ＶＡＣＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の両方における保存されたＢｓａＩ制限部位に隣接するプライマーを使用して、一連の約１ｋｂｐの産物を増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢｓａＩによって引き続いて消化し、得られたＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＶＡＣＶは切断されるが、全てのＢｓａＩ部位が、２つの異なるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンから欠失されていた。Ｂ．図４Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡのパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示す。ウイルスＤＮＡを、ＢｓａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、または未処理のままにし、次いで、１〜１０秒の切り替え時間で、５．７Ｖ／ｃｍで１４℃で１４時間、１％Ｓｅａｋｅｍ  ｇｏｌｄアガロースゲル上で分離した。インタクトなＶＡＣＶゲノムとｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムとの間で、サイズにおける僅かな差異が観察された。アスタリスク（＊）でマークされたかすかなバンドは、不完全なＤＮＡ消化産物であるか、またはＶＡＣＶビリオン調製物にしばしば混入する切断されたミトコンドリアＤＮＡ断片であり得る。Ｃ．図４Ｃは、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩによって消化したＶＡＣＶ−ＷＲおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡの従来のアガロースゲル電気泳動を示す。ＤＮＡ断片を、ＳｙｂｒＧｏｌｄ  ＤＮＡ染色でゲルを染色することによって可視化した。
【００８２】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂ。ＶＡＣＶ末端ヘアピンを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＩＴＲ断片に首尾よくライゲートさせた。Ａ．Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照配列にマッピングした。ＳａｐＩ部位（ベクター中、上の鎖の配列）を切断して、左および右ＩＴＲ断片へのテロメアヘアピンのライゲーションのための点を創出した。ＶＡＣＶ由来末端ヘアピンの末端ループの位置が、コンカテマー分割部位と共に示される。コンカテマー分割部位中の最初のＡは、ＨＢＸＶ（ＮＣＢＩ  ＤＱ７９２５０４）の報告された最初のヌクレオチドでもあり、その「Ａ」の左側の配列の残部は、参照としてＶＡＣＶを使用して設計した。「Ｃ」は、アセンブリプログラムによる読み取りの短縮を回避するための足場として単に付加したことに留意されたい。Ｂ．公知のＨＰＸＶ配列を超えて伸びる最も長いＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りを含むサブセットが、ポリｄＣ鋳型に対してアラインされて示される。これらの読み取りは、合成オリゴヌクレオチドを使用して元々提供されたアンフォールディングされたヘアピンの全長に及ぶ。ポックスウイルス中の末端逆位重複に起因して、左および右終端からの読み取りの全てが一緒に「集積」し、元の配向も分布も失われている。Ｆ形態およびＳ形態の両方のＶＡＣＶヘアピンが検出され、この領域中のＦ読み取りのＳ読み取りに対する比は、８つの異なるウイルス配列決定反応において１．０３±０．０１（ＳＥＭ）であったことが明らかである。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂ。ＶＡＣＶ末端ヘアピンを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＩＴＲ断片に首尾よくライゲートさせた。Ａ．Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照配列にマッピングした。ＳａｐＩ部位（ベクター中、上の鎖の配列）を切断して、左および右ＩＴＲ断片へのテロメアヘアピンのライゲーションのための点を創出した。ＶＡＣＶ由来末端ヘアピンの末端ループの位置が、コンカテマー分割部位と共に示される。コンカテマー分割部位中の最初のＡは、ＨＢＸＶ（ＮＣＢＩ  ＤＱ７９２５０４）の報告された最初のヌクレオチドでもあり、その「Ａ」の左側の配列の残部は、参照としてＶＡＣＶを使用して設計した。「Ｃ」は、アセンブリプログラムによる読み取りの短縮を回避するための足場として単に付加したことに留意されたい。Ｂ．公知のＨＰＸＶ配列を超えて伸びる最も長いＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りを含むサブセットが、ポリｄＣ鋳型に対してアラインされて示される。これらの読み取りは、合成オリゴヌクレオチドを使用して元々提供されたアンフォールディングされたヘアピンの全長に及ぶ。ポックスウイルス中の末端逆位重複に起因して、左および右終端からの読み取りの全てが一緒に「集積」し、元の配向も分布も失われている。Ｆ形態およびＳ形態の両方のＶＡＣＶヘアピンが検出され、この領域中のＦ読み取りのＳ読み取りに対する比は、８つの異なるウイルス配列決定反応において１．０３±０．０１（ＳＥＭ）であったことが明らかである。
【００８３】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５領域９６，０５０〜９６，５００中のＢｓａＩ部位を、集合的に変異させた。Ａ．図６Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノムの１つの領域にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。９６，２３９位および９６４３７位における配列決定読み取りの矛盾は、それぞれ青色および黄色で強調される。Ｂ．図６Ｂは、９６２３９位近傍の、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ｔ９６２３９Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。Ｃ．図６Ｃは、９６４３７位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ａ９６４３７Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。これらの変異を、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５をアセンブルするのに使用するクローン中に導入して、望ましくないＢｓａＩ認識部位（ＧＧＴＣＴＣ）を欠失させた。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５領域９６，０５０〜９６，５００中のＢｓａＩ部位を、集合的に変異させた。Ａ．図６Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノムの１つの領域にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。９６，２３９位および９６４３７位における配列決定読み取りの矛盾は、それぞれ青色および黄色で強調される。Ｂ．図６Ｂは、９６２３９位近傍の、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ｔ９６２３９Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。Ｃ．図６Ｃは、９６４３７位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ａ９６４３７Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。これらの変異を、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５をアセンブルするのに使用するクローン中に導入して、望ましくないＢｓａＩ認識部位（ＧＧＴＣＴＣ）を欠失させた。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５領域９６，０５０〜９６，５００中のＢｓａＩ部位を、集合的に変異させた。Ａ．図６Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノムの１つの領域にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。９６，２３９位および９６４３７位における配列決定読み取りの矛盾は、それぞれ青色および黄色で強調される。Ｂ．図６Ｂは、９６２３９位近傍の、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ｔ９６２３９Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。Ｃ．図６Ｃは、９６４３７位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ヌクレオチド置換（Ａ９６４３７Ｃ）が検出された（表２を参照のこと）。これらの変異を、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５をアセンブルするのに使用するクローン中に導入して、望ましくないＢｓａＩ認識部位（ＧＧＴＣＴＣ）を欠失させた。
【００８４】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃ。独自の制限部位ＡｖａＩおよびＳｔｕＩを創出するために使用したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のＨＰＸＶ０４４遺伝子中のヌクレオチド変化。Ａ．図７Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノム中のＨＰＸＶ０４４遺伝子にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。ＨＰＸＶ０４４は、ＶＡＣＶ  Ｆ４ＬのＨＰＸＶホモログをコードする。配列読み取りが元のＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）配列と一致しない部位は、黄色の垂直線で強調される。Ｂ．図７Ｂは、４４，５１２位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ＡｖａＩ部位（ＣＹＣＧＲＧ；表２を参照のこと）を創出するヌクレオチド置換（Ｔ４４５１２Ｇ）が同定された。Ｃ．図７Ｃは、４５，０６１位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ；表２を参照のこと）を創出するヌクレオチド置換（Ｔ４５０６１Ｇ）が検出された。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃ。独自の制限部位ＡｖａＩおよびＳｔｕＩを創出するために使用したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のＨＰＸＶ０４４遺伝子中のヌクレオチド変化。Ａ．図７Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノム中のＨＰＸＶ０４４遺伝子にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。ＨＰＸＶ０４４は、ＶＡＣＶ  Ｆ４ＬのＨＰＸＶホモログをコードする。配列読み取りが元のＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）配列と一致しない部位は、黄色の垂直線で強調される。Ｂ．図７Ｂは、４４，５１２位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ＡｖａＩ部位（ＣＹＣＧＲＧ；表２を参照のこと）を創出するヌクレオチド置換（Ｔ４４５１２Ｇ）が同定された。Ｃ．図７Ｃは、４５，０６１位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ；表２を参照のこと）を創出するヌクレオチド置換（Ｔ４５０６１Ｇ）が検出された。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃ。独自の制限部位ＡｖａＩおよびＳｔｕＩを創出するために使用したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のＨＰＸＶ０４４遺伝子中のヌクレオチド変化。Ａ．図７Ａは、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）ゲノム中のＨＰＸＶ０４４遺伝子にマッピングされたＩｌｌｕｍｉｎａ配列読み取りを示す。読み取りのごく一部のみが示される。ＨＰＸＶ０４４は、ＶＡＣＶ  Ｆ４ＬのＨＰＸＶホモログをコードする。配列読み取りが元のＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）配列と一致しない部位は、黄色の垂直線で強調される。Ｂ．図７Ｂは、４４，５１２位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ＡｖａＩ部位（ＣＹＣＧＲＧ；表２を参照のこと）を創出するヌクレオチド置換（Ｔ４４５１２Ｇ）が同定された。Ｃ．図７Ｃは、４５，０６１位における、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）にマッピングされたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５からのＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りの拡大図を示す。ＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ；表２を参照のこと）を創出するヌクレオチド置換（Ｔ４５０６１Ｇ）が検出された。
【００８５】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＢＳＣ−４０細胞において、他のオルソポックスウイルスのように増殖するが、小さいプラークの表現型を示す。Ａ．図８Ａは、ＢＳＣ−４０（左上パネル）、ＨｅＬａ（中央上パネル）、初代ＨＥＬ（右上パネル）およびＶｅｒｏ（左下パネル）細胞株におけるＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の多段階増殖を示す。Ｂ．図８Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５間でのプラークサイズ比較を示す。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、感染の４８時間後に、細胞を固定および染色した。３回の独立した実験を通じた２４個のプラークの面積（任意単位［Ａ．Ｕ．］）を、各ウイルスについて測定した。データは、平均プラーク直径として表される。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ｃ．図８Ｃは、示されたウイルスを７２時間感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラーク形態学を示す。細胞を固定し、染色し、可視化のためにスキャンした。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＢＳＣ−４０細胞において、他のオルソポックスウイルスのように増殖するが、小さいプラークの表現型を示す。Ａ．図８Ａは、ＢＳＣ−４０（左上パネル）、ＨｅＬａ（中央上パネル）、初代ＨＥＬ（右上パネル）およびＶｅｒｏ（左下パネル）細胞株におけるＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の多段階増殖を示す。Ｂ．図８Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５間でのプラークサイズ比較を示す。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、感染の４８時間後に、細胞を固定および染色した。３回の独立した実験を通じた２４個のプラークの面積（任意単位［Ａ．Ｕ．］）を、各ウイルスについて測定した。データは、平均プラーク直径として表される。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ｃ．図８Ｃは、示されたウイルスを７２時間感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラーク形態学を示す。細胞を固定し、染色し、可視化のためにスキャンした。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＢＳＣ−４０細胞において、他のオルソポックスウイルスのように増殖するが、小さいプラークの表現型を示す。Ａ．図８Ａは、ＢＳＣ−４０（左上パネル）、ＨｅＬａ（中央上パネル）、初代ＨＥＬ（右上パネル）およびＶｅｒｏ（左下パネル）細胞株におけるＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の多段階増殖を示す。Ｂ．図８Ｂは、ＶＡＣＶ−ＷＲ、ＤＰＰ１５、ＣＰＸＶおよびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５間でのプラークサイズ比較を示す。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、感染の４８時間後に、細胞を固定および染色した。３回の独立した実験を通じた２４個のプラークの面積（任意単位［Ａ．Ｕ．］）を、各ウイルスについて測定した。データは、平均プラーク直径として表される。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。Ｃ．図８Ｃは、示されたウイルスを７２時間感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラーク形態学を示す。細胞を固定し、染色し、可視化のためにスキャンした。
【００８６】
【図９】図９。ＶＡＣＶ（株ＡＣＡＭ２０００；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７）の直鎖ｄｓＤＮＡゲノムの模式図。ＶＡＣＶ  ＡＣＡＭ２０００の未改変のゲノム配列が、天然に存在するＡａｒＩおよびＢｓａＩ認識部位をマークして示される。重複するＤＮＡ断片は、青色で示される。左（ＬＩＴＲ＿ＡＣＡＭ２０００）および右（ＲＩＴＲ＿ＡＣＡＭ２０００）断片は、橙色で示される。
【００８７】
【図１０】図１０。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％体重減少のグラフ表示。示されたデータは、１０μｌのＰＢＳ中の、示された用量のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５（ｓｃＨＰＸＶ（ΔＨＰＸＶ＿０９５／Ｊ２Ｒ）またはｓｃＨＰＸＶ（ｙｆｐ／ｇｐｔ）とも称する）、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）、Ｄｒｙｖａｘ  ＤＰＰ１５またはＶＡＣＶ  ＷＲが接種された５匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群から生成される。マウスを、２８日間にわたって毎日体重測定し、初期体重の＞２５％を失ったいずれのマウスも安楽死させる。データポイントは平均スコアを示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【００８８】
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂ。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％体重減少のグラフ表示。示されたデータは、先にワクチン接種され（図１０）、次いで、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスから生成される。図１１Ａは、１３日間にわたって毎日記録した、マウスにおける体重変化を示し、図１１Ｂは、臨床スコアを示す。初期体重の＞２５％を失ったいずれのマウスも安楽死させる。マウスに、被毛の乱れ（ruffled  fur）、猫背の姿勢、呼吸困難および減少した運動性の出現に基づいて臨床スコアを割り当てた。データポイントは、体重またはスコアにおける平均差異を示し、エラーバーは標準偏差を示す。†は、所与の日にＶＡＣＶ感染で死亡するマウスの数を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂ。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％体重減少のグラフ表示。示されたデータは、先にワクチン接種され（図１０）、次いで、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスから生成される。図１１Ａは、１３日間にわたって毎日記録した、マウスにおける体重変化を示し、図１１Ｂは、臨床スコアを示す。初期体重の＞２５％を失ったいずれのマウスも安楽死させる。マウスに、被毛の乱れ（ruffled  fur）、猫背の姿勢、呼吸困難および減少した運動性の出現に基づいて臨床スコアを割り当てた。データポイントは、体重またはスコアにおける平均差異を示し、エラーバーは標準偏差を示す。†は、所与の日にＶＡＣＶ感染で死亡するマウスの数を示す。
【００８９】
【図１２】図１２。マウスへの種々の組成物および用量の投与後の経時的な％生存のグラフ表示。示されたデータは、先にワクチン接種され（図１０）、次いで、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスから生成される。図１２は、致死用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で鼻腔内抗原投与されるマウスの生存曲線を示す。†は、示された日にＶＡＣＶ感染で死亡するマウスの数を示す。
【００９０】
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂ。ＶＡＣＶ−ＨＰＸＶハイブリッドウイルスの特徴付け。Ａ．ＶＡＣＶ株ＷＲ中のＨＰＸＶ挿入物。ウイルスゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定し、アセンブルし、ＬＡＧＡＮ３２および「Ｂａｓｅ−ｂｙ−Ｂａｓｅ」３３ソフトウェアを使用してアラインさせ、示されたマップを生成した。ＶＡＣＶ配列（白色）がＨＰＸＶ配列によって置き換えられた場所は、差異に従って色コード化する。最初のハイブリッドウイルス（「ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶ＋断片３」）は、ＶＡＣＶ  ＤＮＡをＨＰＸＶ断片＿３と共にＳＦＶ感染細胞中に共トランスフェクトすることによって得た。緑色でタグ付けした挿入物は、ＹＦＰ−ｇｐｔ選択マーカーをコードする。クローン１〜３を、この最初のハイブリッドゲノムからＤＮＡを精製し、それをＨＰＸＶ断片２、４、５および７と共にＳＦＶ感染細胞中に再度トランスフェクトすることによって得た。Ｂ．ハイブリッドおよび再活性化されたウイルスを同定するための、ＰＣＲベースのスクリーニングアプローチ。ＨＰＸＶおよびＶＡＣＶの両方を標的化するように設計され、合成ＨＰＸＶクローン中の変異されたＢｓａＩ部位にまたがるＤＮＡセグメントを増幅するために使用されたＰＣＲプライマー。ＰＣＲ増幅後、産物をＢｓａＩによって消化して、ＨＰＸＶ（切断しない）からＶＡＣＶ配列（切断する）を区別する。ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶハイブリッドは、ＢｓａＩ感受性部位および抵抗性部位のミックスを示すが、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、完全にＢｓａＩ抵抗性である。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂ。ＶＡＣＶ−ＨＰＸＶハイブリッドウイルスの特徴付け。Ａ．ＶＡＣＶ株ＷＲ中のＨＰＸＶ挿入物。ウイルスゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを使用して配列決定し、アセンブルし、ＬＡＧＡＮ３２および「Ｂａｓｅ−ｂｙ−Ｂａｓｅ」３３ソフトウェアを使用してアラインさせ、示されたマップを生成した。ＶＡＣＶ配列（白色）がＨＰＸＶ配列によって置き換えられた場所は、差異に従って色コード化する。最初のハイブリッドウイルス（「ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶ＋断片３」）は、ＶＡＣＶ  ＤＮＡをＨＰＸＶ断片＿３と共にＳＦＶ感染細胞中に共トランスフェクトすることによって得た。緑色でタグ付けした挿入物は、ＹＦＰ−ｇｐｔ選択マーカーをコードする。クローン１〜３を、この最初のハイブリッドゲノムからＤＮＡを精製し、それをＨＰＸＶ断片２、４、５および７と共にＳＦＶ感染細胞中に再度トランスフェクトすることによって得た。Ｂ．ハイブリッドおよび再活性化されたウイルスを同定するための、ＰＣＲベースのスクリーニングアプローチ。ＨＰＸＶおよびＶＡＣＶの両方を標的化するように設計され、合成ＨＰＸＶクローン中の変異されたＢｓａＩ部位にまたがるＤＮＡセグメントを増幅するために使用されたＰＣＲプライマー。ＰＣＲ増幅後、産物をＢｓａＩによって消化して、ＨＰＸＶ（切断しない）からＶＡＣＶ配列（切断する）を区別する。ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶハイブリッドは、ＢｓａＩ感受性部位および抵抗性部位のミックスを示すが、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、完全にＢｓａＩ抵抗性である。
【００９１】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性。Ａ．プラークサイズ測定。相同組換えを使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＹＦＰ−ｇｐｔ遺伝子座を、チミジンキナーゼ遺伝子配列で置き換えた。これは、ＨＰＸＶ遺伝子の完全に野生型の相補体を有するウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生した。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、３日間培養した。培養皿を染色し、プラーク面積を、スキャンされたデジタル画像を使用して測定した。統計的有意差が注記される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。Ｂ．プラーク画像。Ｃ．培養物における多段階ウイルス増殖。示された細胞株に、０．０１の感染多重度でｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ＢＳＣ−４０細胞に対して三連で力価決定した。これらのウイルスの増殖には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは有意差は検出されなかった。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性。Ａ．プラークサイズ測定。相同組換えを使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＹＦＰ−ｇｐｔ遺伝子座を、チミジンキナーゼ遺伝子配列で置き換えた。これは、ＨＰＸＶ遺伝子の完全に野生型の相補体を有するウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生した。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、３日間培養した。培養皿を染色し、プラーク面積を、スキャンされたデジタル画像を使用して測定した。統計的有意差が注記される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。Ｂ．プラーク画像。Ｃ．培養物における多段階ウイルス増殖。示された細胞株に、０．０１の感染多重度でｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ＢＳＣ−４０細胞に対して三連で力価決定した。これらのウイルスの増殖には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは有意差は検出されなかった。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃ。ｓｃＨＰＸＶ対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性。Ａ．プラークサイズ測定。相同組換えを使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＹＦＰ−ｇｐｔ遺伝子座を、チミジンキナーゼ遺伝子配列で置き換えた。これは、ＨＰＸＶ遺伝子の完全に野生型の相補体を有するウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生した。ＢＳＣ−４０細胞に、示されたウイルスを感染させ、３日間培養した。培養皿を染色し、プラーク面積を、スキャンされたデジタル画像を使用して測定した。統計的有意差が注記される（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。Ｂ．プラーク画像。Ｃ．培養物における多段階ウイルス増殖。示された細胞株に、０．０１の感染多重度でｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、示された時点でウイルスを収集し、ＢＳＣ−４０細胞に対して三連で力価決定した。これらのウイルスの増殖には、これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは有意差は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
発明の詳細な説明
一般技術
本明細書で特に定義しない限り、本出願で使用する科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。一般に、本明細書に記載される薬理学、細胞および組織培養、分子生物学、細胞およびがん生物学、神経生物学、神経化学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学と併せて使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００９３】
本発明の実施は、特記しない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。かかる技術は、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版（Sambrookら、１９８９年）Cold  Spring  Harbor  Press；Oligonucleotide  Synthesis（M.J.  Gait編、１９８４年）；Methods  in  Molecular  Biology、Humana  Press；Cell  Biology:  A  Laboratory  Notebook（J.E.  Cellis編、１９９８年）Academic  Press；Animal  Cell  Culture（R.I.  Freshney編、１９８７年）；Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture（J.P.  MatherおよびP.E.  Roberts、１９９８年）Plenum  Press；Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures（A.  Doyle、J.B.  GriffithsおよびD.G.  Newell編、１９９３〜１９９８年）J.  Wiley  and  Sons；Methods  in  Enzymology（Academic  Press,  Inc.）；Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells（J.M.  MillerおよびM.P.  Calos編、１９８７年）；Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７年）；PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction（Mullisら編、１９９４年）；SambrookおよびRussell、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY（２００１年）；Ausubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、NY（２００２年）；HarlowおよびLane、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、NY（１９９８年）；Coliganら、Short  Protocols  in  Protein  Science、John  Wiley  &  Sons、NY（２００３年）；Short  Protocols  in  Molecular  Biology（Wiley  and  Sons、１９９９年）などの文献中で完全に説明されている。
【００９４】
酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、合成有機化学ならびに医薬品化学および製薬化学と併せて使用される命名法、ならびにそれらの実験室手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学的合成および化学的分析のために使用される。
【００９５】
本明細書および実施形態を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または変化形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数の群を排除することを意味しないと理解される。
【００９６】
実施形態が言語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて本明細書に記載される場合、「〜からなる」および／または「〜から本質的になる」で記載される、他の点では類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【００９７】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「〜が含まれるがこれらに限定されない」を意味するために使用される。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「〜が含まれるがこれらに限定されない」は、相互交換可能に使用される。
【００９８】
用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」の後の任意の例は、徹底的でも限定的でもないことを意味する。
【００９９】
文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【０１００】
冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つよりも多く（即ち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つよりも多い要素を意味する。本明細書の「約」値またはパラメーターに対する言及は、その値またはパラメーター自体に対する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数的範囲は、その範囲を規定する数を含む。
【０１０１】
本発明の広い範囲を示す数的範囲およびパラメーターが近似であるものの、具体例で示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、そのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を固有に含む。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に含まれる任意のおよび全ての下位範囲を包含することを理解すべきである。例えば、「１〜１０」の述べられた範囲は、１の最小値と１０の最大値との間（それらを含む）の任意のおよび全ての下位範囲；即ち、１またはそれよりも大きい最小値、例えば、１〜６．１で始まり、１０またはそれ未満の最大値、例えば、５．５〜１０で終わる全ての下位範囲、を含むとみなすべきである。
【０１０２】
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または選択肢の他の群分けで記載される場合、本発明は、列挙された群全体を全体として包含するだけでなく、群の各メンバーを個々に、および主要群の全ての可能な下位群を包含し、群メンバーのうち１つまたは複数が存在しない主要群もまた包含する。本発明は、具現化された本発明における、群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明確な排除もまた想定する。
【０１０３】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
【０１０４】
定義
以下の用語は、特記しない限り、以下の意味を有すると理解するものとする：
本明細書で使用する場合、用語「野生型ウイルス」、「野生型ゲノム」、「野生型タンパク質」または「野生型核酸」は、ある特定の集団（例えば、特定のウイルス種など）内に天然に存在するアミノ酸または核酸の配列を指す。
【０１０５】
用語「キメラ」もしくは「操作された」もしくは「改変された」（例えば、キメラポックスウイルス、操作されたポリペプチド、改変されたポリペプチド、操作された核酸、改変された核酸）またはそれらの文法上の変化形は、ネイティブ配列と比較して１つまたは複数の変化を有するように操作された非ネイティブ配列を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「合成ウイルス」は、合成ＤＮＡ（例えば、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドなど、またはそれらの組合せ）に当初由来するウイルスを指し、その子孫を含み、この子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異に起因して、元の親合成ウイルスと必ずしも完全に同一（形態学において、またはゲノムＤＮＡ相補体において）でない場合がある。一部の実施形態では、合成ウイルスは、ウイルスゲノムの実質的に全てが化学的に合成されたＤＮＡに当初由来するウイルスを指す。
【０１０７】
本明細書の他の場所で概説したように、ウイルスゲノムのある特定の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、変更され得る。「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用する場合、ゲノム配列中の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を意味する。対応する位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、一般に、他の親配列とのアラインメントによって決定される。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「残基」は、タンパク質中の位置およびそれに関連するアミノ酸同一性に言及するのに用いられる。
【０１０９】
当技術分野で公知のように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で相互交換可能に使用する場合、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらのアナログ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に取り込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、鎖のアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド成分が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって、さらに改変され得る。他の型の改変には、例えば、「キャップ」、アナログによる１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート（phosphoamidate）、カルバメートなど）によるもの、および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるものなど、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）によるもの、キレーター（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化的金属など）を含むもの、アルキル化薬を含むもの、改変された連結によるもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、ならびに未改変形態のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置き換えられ得、標準的な保護基によって保護され得、またはさらなるヌクレオチドへのさらなる連結を調製するために活性化され得、あるいは固体支持体にコンジュゲートされ得る。５’および３’末端のＯＨは、リン酸化され得、またはアミン、もしくは１〜２０炭素原子の有機キャップ基部分で置換され得る。他のヒドロキシルは、標準的な保護基へと誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、アルファ−またはベータ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよび脱塩基ヌクレオシドアナログ、例えばメチルリボシドを含む、当技術分野で一般に公知の類似の形態のリボースまたはデオキシリボース糖を含み得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替的な連結基によって置き換えられ得る。これらの代替的な連結基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられる実施形態が含まれるがこれらに限定されず、式中、各ＲまたはＲ’は、独立して���であるか、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（araldyl）を任意選択で含む置換もしくは未置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【０１１０】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。鎖は、直鎖でも分枝鎖でもよく、改変されたアミノ酸を含み得、および／または非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然に改変された、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸鎖もまた包含する。アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ならびに当技術分野で公知の他の改変を含むポリペプチドなどもまた、この定義内に含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在できることが理解される。
【０１１１】
「相同な」は、その全ての文法的形態およびつづりの変化形で、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、このタンパク質には、同じ種の生物中のスーパーファミリー由来のタンパク質、ならびに異なる種の生物由来の相同なタンパク質が含まれる。かかるタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性であれ、特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によってであれ、それらの配列類似性に反映される配列相同性を有する。
【０１１２】
しかし、一般的な用法および本出願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞で修飾される場合、配列類似性を指し得、共通の進化的起源に関連していてもいなくてもよい。
【０１１３】
用語「配列類似性」は、その全ての文法的形態で、共通の進化的起源を共有していてもいなくてもよい核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を指す。
【０１１４】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に関する「パーセント（％）配列同一性」は、配列をアラインし、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、いずれの保存的置換も配列同一性の一部とはみなさない、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列中のアミノ酸残基（または核酸）と同一である、候補配列中のアミノ酸残基（または核酸）の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定できる。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の取り込みのためのベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、この子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学において、またはゲノムＤＮＡ相補体において）でない場合がある。宿主細胞には、本発明の核酸でｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトおよび／または形質転換された細胞が含まれる。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、「ベクター」は、目的の１つまたは複数の遺伝子または配列を、宿主細胞に送達することが可能な、好ましくは、それらを宿主細胞において発現させることが可能な構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびある特定の真核生物細胞、例えば産生細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば、構成的もしくは誘導性プロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結している。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、「単離された分子」（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの断片である場合）は、その起源または派生の供給源のおかげで、（１）そのネイティブ状態でそれに付随する１つもしくは複数の天然に関連する成分と関連しない、（２）同じ種由来の１つもしくは複数の他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）天然に存在しない、分子である。従って、化学的に合成される、またはそれが天然に起源する細胞とは異なる細胞系において発現される分子は、その天然に関連する成分から「単離される」。分子はまた、当技術分野で周知の精製技術を使用する単離によって、天然に関連する成分を実質的に含まないようにされ得る。分子の純度または均一性は、当技術分野で周知のいくつかの手段によってアッセイされ得る。例えば、ポリペプチド試料の純度は、当技術分野で周知の技術を使用する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイされ得る。ある特定の目的のために、より高い解像度が、ＨＰＬＣ、または精製のための当技術分野で周知の他の手段を使用することによって提供され得る。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、ウイルスに関して、単一の親ウイルスに由来するウイルスを指す。ウイルスは、プラーク精製および限界希釈に基づく方法が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の慣用的な方法を使用して単離され得る。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、語句「感染多重度」または「ＭＯＩ」は、感染細胞当たりのウイルスの平均数である。ＭＯＩは、添加されたウイルスの数（添加したｍｌ×プラーク形成単位（ＰＦＵ））を、添加した細胞の数（添加したｍｌ×細胞／ｍｌ）によって除算することによって決定される。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「精製する」およびその文法上の変化形は、完全にであれ部分的にであれ、それによって組成物中のポリペプチドの純度のレベルを改善する（即ち、組成物中の不純物の量（ｐｐｍ）を減少させることによって）、ポリペプチドおよび１つまたは複数の不純物を含む混合物からの、少なくとも１つの不純物の除去を指す。本明細書で使用する場合、「精製された」は、ウイルスに関して、そのウイルスが由来する細胞または組織供給源由来の細胞性材料および培養培地を実質的に含まないウイルスを指す。言語「細胞性材料を実質的に含まない」は、ウイルスが、それが単離されるまたは組換え産生される細胞の細胞性成分から分離されている、ウイルスの調製物を含む。従って、細胞性材料を実質的に含まないウイルスは、約３０％、２０％、１０％または５％未満（乾燥重量）の細胞性タンパク質（本明細書で「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物を含む。ウイルスはまた、培養培地を実質的に含まない、即ち、培養培地は、ウイルス調製物の体積の約２０％、１０％または５％未満を占める。ウイルスは、クロマトグラフィーおよび遠心分離が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の慣用的な方法を使用して精製され得る。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（即ち、混入物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは、少なくとも９８％純粋、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【０１２３】
用語「患者」、「対象」または「個体」は、本明細書で相互交換可能に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタ、ラクダなどを含む）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコなど）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」は、治療（例えば、予防剤または治療剤）の投与の結果としての、対象における、疾患（例えば、ポックスウイルス感染）の再発もしくは発症の予防、またはその１つもしくは複数の症状における低減を指す。例えば、感染について、対象への治療の投与に関して、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」は、治療（例えば、予防剤または治療剤）の投与、または治療の組合せ（例えば、予防剤または治療剤の組合せ）の投与から生じる、対象における、感染（例えば、ポックスウイルス感染またはそれと関連する状態）の発達もしくは発症における阻害もしくは低減、または感染（例えば、ポックスウイルス感染またはそれと関連する状態）の１つもしくは複数の症状の再発、発症もしくは発達の予防を指す。
【０１２５】
状態または患者を「処置する」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのステップをとることを指す。感染（例えば、ポックスウイルス感染）に関して、処置は、感染性因子（例えば、ポックスウイルス）の複製の根絶もしくは制御、感染性因子の数における低減（例えば、ポックスウイルスの力価における低減）、感染（例えば、ポックスウイルス感染またはそれと関連する状態もしくは症状）の進行、重症度および／もしくは持続時間の低減もしくは寛解、または１つもしくは複数の治療の投与（１つもしくは複数の予防剤または治療剤の投与が含まれるがこれに限定されない）から生じる１つもしくは複数の症状の寛解を指す。がんに関して、処置は、本発明の１つまたは複数の治療剤の投与から生じる、原発性、限局性または転移性がん組織の根絶、除去、改変または制御を指す。ある特定の実施形態では、かかる用語は、かかる疾患を有する対象への本発明の１つまたは複数の治療剤の投与から生じる、がんの広がりの最小化または遅延を指す。他の実施形態では、かかる用語は、疾患を引き起こす細胞の排除を指す。
【０１２６】
対象に物質、化合物もしくは薬剤を「投与する」または対象への物質、化合物もしくは薬剤「の投与」は、当業者に公知の種々の方法の１つを使用して実施され得る。例えば、化合物または薬剤は、舌下もしくは鼻腔内で、肺中への吸入によって、または直腸で投与され得る。投与することはまた、例えば、１回、複数回、および／または１つもしくは複数の延長された期間にわたって、実施され得る。一部の態様では、投与は、自己投与を含む直接的投与、および薬物を処方する行動を含む間接的投与の両方を含む。例えば、本明細書で使用する場合、薬物を自己投与するようにもしくは他者に薬物を投与してもらうように患者に指導する医師、および／または薬物の処方箋を患者に提供する医師は、患者に薬物を投与している。
【０１２７】
本明細書に記載される各実施形態は、個々に、または本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わせて使用され得る。
概要
【０１２８】
ポックスウイルスは、感染細胞の原形質中で複製する大きい（約２００ｋｂｐ）ＤＮＡウイルスである。Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＯＰＶ）属は、異なる宿主に感染する能力が大きく異なる、いくつかのポックスウイルスを含む。例えば、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）は、広い群の宿主に感染できるが、天然痘の原因因子である痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）は、ヒトにのみ感染する。全てではないが多くのポックスウイルスに共通する特色は、宿主内で非遺伝的に「再活性化する」能力である。非遺伝的再活性化は、１つのポックスウイルスが感染した細胞が、それ自体では非感染性である第２の「死」ウイルス（例えば、熱によって不活性化されたもの）の回復を促進できるプロセスを指す。
【０１２９】
ウイルスのライフサイクルは、ビリオン中にパッケージングされるウイルスにコードされたＲＮＡポリメラーゼを介した初期遺伝子の転写を必要とするので、精製されたポックスウイルスＤＮＡは、感染性ではない。しかし、この欠陥は、ヘルパーポックスウイルスが先に感染した細胞中にウイルスＤＮＡがトランスフェクトされる場合には克服され得、トランスフェクトされたゲノムをｉｎ  ｔｒａｎｓに転写、複製およびパッケージングするために必要な因子を提供する（Sam  CK、Dumbell  KR.  Expression  of  poxvirus  DNA  in  coinfected  cells  and  marker  rescue  of  thermosensitive  mutants  by  subgenomic  fragments  of  DNA.  Ann  Virol  (Inst  Past).  １９８１年；１３２巻：１３５〜５０頁）。これは、混合ウイルス子孫を産生するが、この問題は、両方のウイルスの繁殖を支持する細胞株において再活性化反応を実施し、次いで、ウイルスの混合物を、ヘルパーウイルスの増殖を支持しない細胞上にプレーティングすることによって、ヘルパーウイルスを排除することによって克服できる（Scheiflinger  F、Dorner  F、Falkner  FG.  Construction  of  chimeric  vaccinia  viruses  by  molecular  cloning  and  packaging.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  １９９２年；８９巻（２１号）：９９７７〜８１頁）。
【０１３０】
以前から、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓであるショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）によって高頻度組換え反応が触媒される方法が、ウイルスＤＮＡの複数の重複する断片を使用して組換えＶＡＣＶ株を迅速にアセンブルするために、ＳＦＶ触媒される再活性化反応とカップリングされ得る（Yao  XD、Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  virology.  ２００３年；７７巻（１３号）：７２８１〜９０頁）。初めて、化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片を使用した、機能的ポックスウイルス（合成キメラ馬痘ウイルス［ｓｃＨＰＸＶ］）の再活性化および特徴付けが記載される。これらの原理は、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、馬痘（ＨＰＸＶ）、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）が含まれるがこれらに限定されない他のポックスウイルスに同様に適用および外挿され得る。
【０１３１】
本発明の合成キメラポックスウイルス（例えば、合成キメラ馬痘ウイルス）の一実施形態は、マウスに感染でき、致死ＶＡＣＶ抗原投与に対してマウスを免疫化でき、初回免疫化ステップの間にいずれの疾患も引き起こすことなくそれを行うことができることが、本明細書でさらに示される。
本発明の合成キメラポックスウイルス
【０１３２】
本発明は、化学的に合成されたＤＮＡから当初複製およびアセンブルされる機能的合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を提供する。本発明の方法に従って産生され得るウイルスは、そのゲノムが大部分配列決定された、またはそれについての天然の単離体が入手可能な、任意のポックスウイルスであり得る。本発明のｓｃＰＶは、天然に存在する株、バリアントもしくは変異体、変異誘発されたウイルスまたは遺伝的に操作されたウイルスのゲノム配列に基づき得る。本発明のｓｃＰＶのウイルスゲノムは、前記ウイルスの野生型ゲノムまたは基本的ゲノム配列と比較して、１つまたは複数の改変を含む。改変は、１つもしくは複数の欠失、挿入、置換、またはそれらの組合せを含み得る。改変は、当技術分野で一般に公知のいくつもの方法で導入され得ることが理解される。ゲノムの改変された部分は、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。
【０１３３】
化学的ゲノム合成は、天然の鋳型が、従来の分子生物学の方法による遺伝的改変、増幅または複製に利用可能でない場合に、特に有用である。例えば、馬痘ウイルス（ＨＰＸＶ）の天然の単離体は、鋳型ＤＮＡを得るために容易に利用可能ではないが、ＨＰＸＶ（株ＭＮＲ−７６）のゲノム配列は記載されている。しかし、ＨＰＸＶゲノム配列は不完全である。末端ヘアピンループの配列は決定されなかった。驚くべき結果として、機能的合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）が、ＨＰＸＶ末端ヘアピンループ配列の代わりに、ＶＡＣＶテロメアに基づく末端ヘアピンループを使用することによって生成された。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ亜科に属する。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓから選択されるＣｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ亜科の属に属する。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＯｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓは、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）から選択される。好ましい実施形態では、ポックスウイルスはＨＰＸＶである。別の好ましい実施形態では、ポックスウイルスはＶＡＣＶである。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＰａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓは、オルフウイルス（ＯＲＦＶ）、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）、牛丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）、リスパラポックスウイルス（ＳＰＰＶ）、アカシカパラポックスウイルス、Ａｕｓｄｙｋウイルス、シャモア伝染性膿瘡（Chamois  contagious  ecythema）ウイルス、トナカイパラポックスウイルスまたはアザラシ痘ウイルス（sealpox  virus）から選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＭｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓは伝染性軟属腫（molluscum  contagiousum）ウイルス（ＭＣＶ）である。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓは、タナポックスウイルス（Tanapox  virus）またはヤバサル腫瘍ウイルス（ＹＭＴＶ）から選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＣａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、羊痘（sheepox）、山羊痘またはランピースキン病ウイルスから選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓはブタポックスウイルスである。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、粘液腫ウイルス、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、リス線維腫ウイルスまたは野兎線維腫ウイルスから選択される。新たなポックスウイルス（例えば、オルソポックスウイルス）が、なおも絶えず発見されている。本発明のｓｃＰＶは、かかる新たに発見されたポックスウイルスに基づき得ることが理解される。
【０１３４】
化学的ウイルスゲノム合成は、得られたゲノムに、またはその特定の一部に、多数の有用な改変を導入する可能性も切り開く。改変は、ウイルスを生成するためのクローニングの容易さを改善し得、組換え遺伝子産物の導入のための部位を提供し得、再活性化されたウイルスクローンの同定の容易さを改善し得、および／または大量の他の有用な特色（例えば、所望の抗原を導入する、腫瘍溶解性ウイルスを産生するなど）を付与し得る。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数のビルレンス因子の弱毒化または欠失を含み得る。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数のビルレンス調節遺伝子、または遺伝子がコードする調節因子の付加または挿入を含み得る。
【０１３５】
これまで、ポックスウイルスの末端ヘアピンは、クローニングおよび配列することが困難であり、従って、公開されたゲノム配列（例えば、ＶＡＣＶ、ＡＣＡＭ  ２０００およびＨＰＸＶ  ＭＮＲ−７６）の一部が不完全であることは意外ではない。ＨＰＸＶゲノムの公開された配列もまた、おそらくは末端終端から約６０ｂｐを欠いて、不完全である。従って、ＨＰＸＶヘアピンは、本発明の前には正確に複製できず、ＨＰＸＶが、ＨＰＸＶゲノムの公知の部分のみに基づいてポリヌクレオチドから複製およびアセンブルできるかどうかは知られていなかった。１つのウイルス由来のヘアピンが別のウイルスにおいて作動可能であることも知られていなかった。例示的な実施形態では、１２９ｎｔのｓｓＤＮＡ断片を、ＶＡＣＶテロメアの公開された配列をガイドとして使用して化学的に合成し、ＨＰＸＶゲノムの左および右終端を含むｄｓＤＮＡ断片にライゲートさせた。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶの末端ヘアピンは、ＶＡＣＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、ＣＭＬＶ、ＣＰＸＶ、ＥＣＴＶ、ＨＰＸＶ、ＭＰＸＶ、ＲＰＸＶ、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスまたはＶＰＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、そのゲノムが完全に配列決定された任意のポックスウイルス、またはゲノム配列決定のために利用可能な天然の単離体の末端ヘアピンに基づく。
【０１３６】
一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の制限部位の欠失を含み得る。一部の実施形態では、改変は、１つまたは複数の制限部位の導入を含み得る。一部の実施形態では、ゲノムから欠失されるまたはゲノムに付加される制限部位は、例えば、ＡａｎＩ、ＡａｒＩ、ＡａｓＩ、ＡａｔＩ、ＡａｔＩＩ、ＡｂａＳＩ、ＡｂｓＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＧＩ、ＢａｅＩ、ＢａｍＨＩ  ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦαＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＳαＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓαＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＥＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＣＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｐＪＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｃｉＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｌｅＩ、ＰｌｕＴＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、Ｓ���ｆＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｒｆＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａｑαＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＸｂａＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｍａＩ、ＸｍｎＩまたはＺｒａＩであるがこれらに限定されない１つまたは複数の制限部位から選択され得る。任意の所望の制限部位または制限部位の組合せが、ゲノム中に挿入され得るもしくは変異され得る、および／またはゲノムから排除され得ることが理解される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡａｒＩ部位が、ウイルスゲノムから欠失される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＢｓａＩ部位が、ウイルスゲノムから欠失される。一部の実施形態では、１つまたは複数の制限部位が、ゲノムから完全に排除される（例えば、ウイルスゲノム中の全てのＡａｒＩ部位が排除され得る）。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡｖａＩ制限部位が、ウイルスゲノム中に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＳｔｕＩ部位が、ウイルスゲノム中に導入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の改変は、ｌｏｘＰまたはＦＲＴ部位が含まれるがこれらに限定されないリコンビニアリング（recombineering）標的の取り込みを含み得る。
【０１３７】
一部の実施形態では、改変は、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン／青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、またはそれらのバリアントなどであるがこれらに限定されない；選択可能なマーカー、例えば、薬物耐性マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ遺伝子（ｎｐｔＩ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子ＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）、ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子などであるがこれらに限定されない；タンパク質またはペプチドタグ、例えば、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ＣＢＤ（セルロース結合ドメイン）、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ポリ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ＮＥ−タグ、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）、ルシフェラーゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、Ｔ７、チオレドキシン、酵母ツーハイブリッドタグ、例えば、Ｂ４２、ＧＡＬ４、ＬｅｘＡまたはＶＰ１６であるがこれらに限定されない；局在化タグ、例えば、ＮＬＳ−タグ、ＳＮＡＰ−タグ、Ｍｙｒ−タグなど、の導入を含み得る。当技術分野で公知の他の選択可能なマーカーおよび／またはタグが使用され得ることが理解される。一部の実施形態では、改変は、再活性化されたウイルスクローンの選択を補助するための、再活性化されたクローンの選択を補助するための１つまたは複数の選択可能なマーカー（例えば、ＹＦＰなどの蛍光マーカー、ｇｐｔなどの薬物選択マーカーなど）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の選択可能なマーカーは、選択ステップ後に、再活性化されたクローンから欠失される。
【０１３８】
本発明のｓｃＰＶは、病原性ポックスウイルス感染（例えば、ＶＡＲＶ、ＭＰＸＶ、ＭＣＶ、ＯＲＦＶ、Ａｕｓｄｙｋウイルス、ＢＰＳＶ、アザラシ痘ウイルスなど）に対して保護するためのワクチンとして、病原性ポックスウイルス感染（例えば、ＶＡＲＶ、ＭＰＸＶ、ＭＣＶ、ＯＲＦＶ、Ａｕｓｄｙｋウイルス、ＢＰＳＶ、アザラシ痘ウイルスなど）を処置もしくは予防するための治療剤として、異種遺伝子発現のためのビヒクルとして、または腫瘍溶解剤として、使用され得る。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、ＶＡＲＶ感染に対して保護するためのワクチンとして使用され得る。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、ＶＡＲＶ感染を処置または予防するために使用され得る。
【０１３９】
合成キメラポックスウイルスを産生する方法
本発明は、ウイルスゲノムの化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から、機能的合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を合成、再活性化および単離するためのシステムおよび方法を提供する。ウイルスゲノムの重複するＤＮＡ断片の組換えおよび機能的ｓｃＰＶの再活性化は、ヘルパーウイルスに先に感染した細胞において実施される。簡潔に述べると、ｓｃＰＶのウイルスゲノムの全てまたは実質的に全てを包含する重複するＤＮＡ断片は、化学的に合成され、ヘルパーウイルス感染細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヘルパーウイルスおよび再活性化されたｓｃＰＶを含む混合ウイルス子孫を産生するために培養される。次に、混合ウイルス子孫は、ヘルパーウイルスを排除し、合成キメラポックスウイルスを回収するために、ヘルパーウイルスの増殖を支持しないが合成キメラポックスウイルスを増殖させる宿主細胞上にプレーティングされる。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、宿主細胞に感染しない。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、宿主細胞に感染できるが、宿主細胞中ではあまり増殖しない。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ｓｃＰＶと比較して、宿主細胞においてより緩徐に増殖する。
【０１４０】
一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムの実質的に全てが、化学的に合成されたＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムの約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、９９％超または１００％が、化学的に合成されたＤＮＡに由来する。一部の実施形態では、ポックスウイルスゲノムは、化学的に合成されたＤＮＡおよび天然に存在するＤＮＡの組合せに由来する。
【０１４１】
本発明の方法において使用される重複するＤＮＡ断片の数は、ポックスウイルスゲノムのサイズに依存する。実務上の考慮事項、例えば、一方では断片の数が増加するにつれた、組換え効率における低減、および他方では断片の数が減少するにつれた、非常に大きいＤＮＡ断片を合成する際の困難もまた、本発明の方法において使用される重複する断片の数についての情報を与える。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、単一の断片として合成され得る。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、２〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、４〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、６〜１０個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、８〜１２個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、８〜１０、１０〜１２または１０〜１４個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。一部の実施形態では、合成キメラポックスウイルスゲノムは、１０個の重複するＤＮＡ断片からアセンブルされる。本開示の例示的な実施形態では、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）は、１０個の化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、別々に合成され、ポックスウイルスゲノムの左および右終端を含む断片にライゲートされる。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、天然に存在する鋳型に由来し得る。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶの末端ヘアピンは、ＶＡＣＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、ＣＭＬＶ、ＣＰＸＶ、ＥＣＴＶ、ＨＰＸＶ、ＭＰＸＶ、ＲＰＸＶ、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルスまたはＶＰＶに由来する。一部の実施形態では、末端ヘアピンは、そのゲノムが完全に配列決定された任意のポックスウイルス、またはゲノム配列決定のために利用可能な天然の単離体の末端ヘアピンに基づく。一部の実施形態では、ポックスウイルスゲノムを包含する断片の全てが、化学的に合成される。一部の実施形態では、１つまたは複数の断片が化学的に合成され、１つまたは複数の断片が、天然に存在するＤＮＡに由来する（例えば、ＰＣＲ増幅によって、または十分確立された組換えＤＮＡ技術によって）。
【０１４２】
本発明の方法において使用される重複する断片のサイズは、ポックスウイルスゲノムのサイズに依存する。断片サイズには広いバリエーションが存在し得、種々の実務上の考慮事項、例えば、非常に大きいＤＮＡ断片を化学的に合成する能力が、断片サイズの選択についての情報を与えることが理解される。一部の実施形態では、断片は、約２，０００ｂｐ〜約５０，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、断片は、約３，０００ｂｐ〜約４５，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、断片は、約４，０００ｂｐ〜４０，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、断片は、約５，０００ｂｐ〜３５，０００ｂｐのサイズ範囲である。一部の実施形態では、最も大きい断片は、約２０，０００ｂｐ、２１，０００ｂｐ、２２，０００ｂｐ、２３，０００ｂｐ、２４、０００ｂｐ、２５，０００ｂｐ、２６，０００ｂｐ、２７，０００ｂｐ、２８，０００ｂｐ、２９，０００ｂｐ、３０，０００ｂｐ、３１，０００ｂｐ、３２，０００ｂｐ、３３，０００ｂｐ、３４，０００ｂｐ、３５，０００ｂｐ、３６，０００ｂｐ、３７，０００ｂｐ、３８，０００ｂｐ、３９，０００ｂｐ、４０，０００ｂｐ、４１，０００ｂｐ、４２，０００ｂｐ、４３，０００ｂｐ、４４、０００ｂｐ、４５，０００ｂｐ、４６，０００ｂｐ、４７，０００ｂｐ、４８，０００ｂｐ、４９，０００ｂｐまたは５０，０００ｂｐである。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＨＰＸＶは、約８，５００ｂｐ〜約３２，０００ｂｐのサイズ範囲の、１０個の化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から再活性化される（表１）。
【０１４３】
ヘルパーウイルスは、トランスフェクトされたＤＮＡからポックスウイルスを再活性化するために必要なトランス作用性の酵素機構を提供できる任意のポックスウイルスであり得る。ヘルパーウイルスは、産生されるｓｃＰＶとは異なるまたはそれよりも狭い宿主細胞範囲を有し得る（例えば、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）は、オルソポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）またはＨＰＸＶと比較して、非常に狭い宿主範囲を有する）。ヘルパーウイルスは、産生されるｓｃＰＶと比較して、異なるプラーク表現型を有し得る。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、ＳＦＶ、野兎線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルスまたは粘液腫ウイルスである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＳＦＶである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＯｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓは、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ＶＡＣＶおよびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）である。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは鶏痘ウイルスである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、Ａｌｐｈａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＢｅｔａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＧａｍｍａｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ソラレンで不活性化されたヘルパーウイルスである。本開示の例示的な実施形態では、ｓｃＨＰＸＶは、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中にトランスフェクトされた重複するＤＮＡ断片から再活性化される。次いで、ＳＦＶは、ＢＳＣ−４０細胞上に混合ウイルス子孫をプレーティングすることによって排除される。
【０１４４】
当業者は、ｓｃＰＶの再活性化ならびにｓｃＰＶの選択および／または単離に使用される適切な宿主細胞が、ヘルパーウイルスおよび本発明の方法によって産生されるキメラポックスウイルスの特定の組合せに依存することが理解される。ヘルパーウイルスおよびｓｃＰＶの両方の増殖を支持する任意の宿主細胞が、再活性化ステップに使用され得、ヘルパーウイルスの増殖を支持しない任意の宿主細胞が、ヘルパーウイルスを排除するため、ならびにｓｃＰＶを選択および／または単離するために使用され得る。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓであり、再活性化ステップに使用される宿主細胞は、ウサギ腎臓細胞（例えば、ＬＬＣ−ＲＫ１、ＲＫ１３など）、ウサギ肺細胞（例えば、Ｒ９ａｂ）、ウサギ皮膚細胞（例えば、ＳＦ１Ｅｐ、ＤＲＳ、ＲＡＢ−９）、ウサギ角膜細胞（例えば、ＳＩＲＣ）、ウサギ癌腫細胞（例えば、Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ）、ウサギ皮膚／癌腫細胞（例えば、ＣＴＰＳ）、サル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ、ＢＧＭＫなど）またはハムスター細胞（例えば、ＢＨＫ−２１など）から選択され得る。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはＳＦＶである。
【０１４５】
本発明のｓｃＰＶは、本明細書に記載されるｓｃＰＶの使用を可能にする力価までウイルスを増殖させる任意の基質中で繁殖され得る。一実施形態では、基質は、対応する野生型ウイルスについて決定された力価と匹敵する力価まで、ｓｃＰＶを増殖させる。本発明のｓｃＰＶは、ポックスウイルスによる感染に対して感受性である細胞（例えば、トリ細胞、コウモリ細胞、ウシ細胞、ラクダ細胞、カナリア細胞、ネコ細胞、シカ細胞、ウマ細胞、野禽細胞、スナネズミ細胞、ヤギ細胞、ヒト細胞、サル細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、アライグマ細胞、アザラシ細胞、ヒツジ細胞、スカンク細胞、ハタネズミ細胞など）において増殖され得る。かかる方法は、当業者に周知である。代表的な哺乳動物細胞には、ＢＨＫ、ＢＧＭＫ、ＢＲＬ３Ａ、ＢＳＣ−４０、ＣＥＦ、ＣＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＣＶＩ、ＨａＣａＴ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｖｅｒｏ細胞などが含まれるがこれらに限定されない。ウイルス単離のために、ｓｃＰＶは、典型的には周知の清澄化手順、例えば、勾配遠心分離およびカラムクロマトグラフィーなどによって細胞培養物から除去され、細胞性成分から分離され、当業者に周知の手順、例えばプラークアッセイを使用して、必要に応じてさらに精製され得る。
【０１４６】
本発明のポリヌクレオチド
本発明は、機能的合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）を産生するためのポリヌクレオチド（例えば、二本鎖ＤＮＡ断片）を提供する。本発明は、合成ＤＮＡ（例えば、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ、操作されたＤＮＡ、ヌクレオシドアナログを含むポリヌクレオチドなど）から機能的ｓｃＰＶを産生するための方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ウイルスゲノムの化学的に合成された重複する二本鎖ＤＮＡ断片から機能的ｓｃＰＶを産生するための方法を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、公に利用可能なゲノム配列に基づいて設計され得る。ポックスウイルスの天然の単離体が容易に入手可能である場合、ウイルスゲノムが、本発明のポリヌクレオチドを選択および設計する前に配列決定され得る。あるいは、ポックスウイルスの部分的ＤＮＡ配列が、例えば、臨床的単離体から、法医学的試料から、または感染した人と関連する材料からＰＣＲ増幅されたＤＮＡから入手可能である場合、部分的ウイルスゲノムが、本発明のポリヌクレオチドを選択および設計する前に配列決定され得る。本発明のｓｃＰＶ、および従って、本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在する株、バリアントもしくは変異体、変異誘発されたウイルスまたは遺伝的に操作されたウイルスのゲノム配列に基づき得る。
【０１４７】
本発明は、参照ポックスウイルスゲノム配列またはその相補体の全てまたは一部分に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一）、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一）または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド分子（例えば、参照ポックスウイルスゲノムまたはその断片）の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００ｂｐまたはそれよりも大きい連続するまたは非連続のヌクレオチドを含み得る。当業者は、これらの核酸に対して相補的な核酸配列、およびこれらの核酸のバリアントもまた本発明の範囲内であることを理解する。さらなる実施形態では、本発明の核酸配列は、単離された、組換えの、および／もしくは異種ヌクレオチド配列と融合された、またはＤＮＡライブラリー中であり得る。
【０１４８】
一部の態様では、本発明は、ポックスウイルスが、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｅｒｖｉｄｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｃｏｄｙｌｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓまたはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ属から選択される、ｓｃＰＶを産生するためのポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＯｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓは、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ＶＡＣＶ、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ）から選択される。好ましい実施形態では、ポックスウイルスはＨＰＸＶである。別の好ましい実施形態では、ポックスウイルスはＶＡＣＶである。別の好ましい実施形態では、ポックスウイルスは、ＶＡＣＶのＡＣＡＭ２０００クローンである。別の好ましい実施形態では、ポックスウイルスは、ＶＡＣＶ株ＩＯＣ（ＶＡＣＶ−ＩＯＣ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）である。別の好ましい実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）に基づく。さらに別の好ましい実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）に基づく。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＰａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓは、オルフウイルス（ＯＲＦＶ）、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）、牛丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）、リスパラポックスウイルス（ＳＰＰＶ）、アカシカパラポックスウイルス、Ａｕｓｄｙｋウイルス、シャモア伝染性膿瘡ウイルス、トナカイパラポックスウイルスまたはアザラシ痘ウイルスから選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＭｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓは伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）である。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＹａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓは、タナポックスウイルスまたはヤバサル腫瘍ウイルス（ＹＭＴＶ）から選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＣａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、羊痘、山羊痘またはランピースキン病ウイルスから選択される。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＳｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓはブタポックスウイルスである。一部の実施形態では、ポックスウイルスはＬｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓである。一部の実施形態では、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓは、粘液腫ウイルス、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、リス線維腫ウイルスまたは野兎線維腫ウイルスから選択される。新たなポックスウイルス（例えば、オルソポックスウイルス）が、なおも絶えず発見されている。本発明のｓｃＰＶは、かかる新たに発見されたポックスウイルスに基づき得ることが理解される。
【０１４９】
一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株ＣＭＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ００９０８９．１））に基づくＣＭＬＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｒｅｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４８２７５８）、株ＧＲＩ−９０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ９４３５５））に基づくＣＰＸＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｍｏｓｃｏｗ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４１０５））に基づくＥＣＴＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｚａｉｒｅ−９６−１−１６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３８０１３８））に基づくＭＰＸＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｕｔｒｅｃｈｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ４８４６６９））に基づくＲＰＸＶである。一部の態様では、ｓｃＰＶは、そのゲノムが公開されたゲノム配列（例えば、株Ｄａｈｏｍｅｙ  １９６８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００８２９１））に基づくアレチネズミ痘ウイルスである。
【０１５０】
一態様では、本発明は、合成キメラ馬痘ウイルス（ｓｃＨＰＸＶ）を産生するためのポリヌクレオチドを提供する。具体的な実施形態では、ｓｃＨＰＸＶゲノムは、ＨＰＸＶ株ＭＮＲ−７６について記載されたゲノム配列（配列番号４９）に基づき得る（Tulman  ER、Delhon  G、Afonso  CL、Lu  Z、Zsak  L、Sandybaev  NTら、Genome  of  horsepox  virus.  Journal  of  virology.  ２００６年；８０巻（１８号）：９２４４〜５８頁）。このゲノム配列は、不完全であり、末端ヘアピンループの配列を含まないようである。ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）由来の末端ヘアピンループは、本発明の方法を使用して機能的ｓｃＨＰＸＶ粒子を産生するために、ＨＰＸＶゲノムの終端にライゲートされ得ることが、本明細書で示される。ＨＰＸＶゲノムは、本開示の実施例に記載され、表１に示されるように、１０個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノム全体が、１つの断片として提供され得る。例示的な重複する断片のゲノム位置および断片サイズは、表１に示される。表２は、基礎的配列と比較してこれらの断片においてなされ得る改変の一部を示す。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１０に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、これらの配列のバリアントを含み、かかるバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含み得る。配列番号１１および配列番号１２は、ＶＡＣＶ（ＷＲ株）末端ヘアピンループのヌクレオチド配列を示す。一部の実施形態では、末端ヘアピンループは、配列番号１１または配列番号１２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。
【０１５１】
本発明は、参照ＨＰＸＶゲノム配列（例えば、配列番号４９）の全てまたは一部分に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一）、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一）または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、参照配列のバリアントを含み、かかるバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含み得る。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド分子（例えば、配列番号４９またはその一部分が含まれるがこれらに限定されない参照ＨＰＸＶゲノム）の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００ｂｐまたはそれよりも大きい連続するまたは非連続のヌクレオチドを含み得る。
【０１５２】
別の態様では、本発明は、合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）を産生するためのポリヌクレオチドを提供する。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、公開されたＶＡＣＶゲノムに基づく。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、株ＡＣＡＭ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７）に基づく。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、ＶＡＣＶ−ＩＯＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）に基づく。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）に基づく。具体的な実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）に基づく。ＶＡＣＶゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノム全体が、１つの断片として提供され得る。具体的な実施形態では、ＶＡＣＶゲノムは、表７に示される９個の重複する断片へと分割される。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５０〜５８に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、これらの配列のバリアントを含み、かかるバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含み得る。他の実施形態では、ｓｃＶＡＣＶゲノムは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００６９９８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２４３３１２）、ＣＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４８）、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０９５６８９．１）、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＴ９（ＪＸ４８９１３６）、ＴＰ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＣ２０７８１０）およびＴＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＣ２０７８１１）、ＮＹＣＢＨ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ１２１３９４）、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６７８２７６）、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０４４３０９）およびＴＫＴ４（ＫＭ０４４３１０）、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、ＬＩＶＰ、Ｉｋｅｄａ、ＩＨＤ−Ｗ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＪ１２５４３９）、ＬＣ１６ｍ８（ＡＹ６７８２７５）、ＥＭ−６３、ＩＣ、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ４３９８１５）、３７３７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ３７７９４５）、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２）、Ｓｅｒｒｏ  ２ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＦ１７９３８５）、Ｃａｎｔａｇｌｏウイルス単離体ＣＭ−０１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ０１３２１０）、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８１）、ＤＰＰ２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８５）、ＤＰＰ１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８０）、ＤＰＰ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８３）、ＤＰＰ２１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８６）から選択されるＶＡＣＶ株に基づく。ＶＡＣＶゲノムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の重複する断片へと分割され得る。一部の実施形態では、ゲノム全体が、１つの断片として提供され得る。
【０１５３】
一実施形態では、本発明は、参照ゲノム配列またはその相補体（例えば、ＶＡＣＶ）の全てまたは一部分に対して少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％または９４％同一）、少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一）または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、参照配列のバリアントを含み、かかるバリアントは、ミスセンス変異、ナンセンス変異、重複、欠失および／または付加を含み得る。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、参照ゲノムまたはその部分の、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、４５０００ｂｐまたはそれよりも大きい連続するまたは非連続のヌクレオチドを含み得る。
【０１５４】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノムまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、ｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコードまたは非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、しなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結され得るが、されなくてもよい。
【０１５５】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大の対応を求めてアラインした場合に同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定し比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって実施される。本明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適にアラインされた後に、配列が、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る、少なくとも約２０連続する位置、通常は３０〜約７５または４０〜約５０連続する位置のセグメントを指す。ポリヌクレオチドまたはバリアントもまた、またはあるいは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドに対して実質的に相同であり得る。かかるポリヌクレオチドバリアントは、本発明のポリヌクレオチド（またはその相補体）に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能である。
【０１５６】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で事前洗浄すること；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩ハイブリダイズさせること；その後、０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々で、６５℃で２０分間２回洗浄することを含む。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシーの条件」は、（１）洗浄のために、低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用するもの；（２）ハイブリダイゼーションの間に、４２℃で、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液と共に、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを使用するもの；または（３）４２℃の０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃の５０％ホルムアミド中での洗浄と、その後の、５５℃での、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄と共に、４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸を使用するものである。当業者は、例えばプローブ長さなどの因子を適応させるために、必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を認識する。
【０１５８】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的合成、組換え法またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を産生するために、本明細書で提供される配列、および市販のＤＮＡ合成機を使用できる。
【０１５９】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書でさらに議論されるように、適切なベクター中に挿入され得、このベクターが次に、複製および増幅に適切な宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接的取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。いったん導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持され得、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。そうして増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法によって、宿主細胞から単離され得る。例えば、Sambrookら、１９８９年を参照のこと。
【０１６０】
あるいは、ＰＣＲが、ＤＮＡ配列の再生産を可能にする。ＰＣＲテクノロジーは、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにPCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction、Mullisら編、Birkauswer  Press、Boston、１９９４年に記載されている。
【０１６１】
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを適切な宿主細胞中に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写される場合、ＲＮＡは、例えば、Sambrookら、１９８９年、上記に示されるように、当業者に周知の方法を使用して単離され得る。
【０１６２】
他の実施形態では、本発明の核酸は、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１〜１０もしくは５０〜５８に示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して相補的な配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた含む。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーの条件が変動し得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを実施し、その後、５０℃で２．０×ＳＳＣでの洗浄を実施することができる。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから、５０℃で約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでで選択され得る。さらに、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃での低いストリンジェンシーの条件から、約６５℃での高いストリンジェンシーの条件まで増加し得る。温度および塩は共に変動し得、または温度もしくは塩濃度は、他の変数を変化させながら、一定に維持され得る。一実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣの低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、その後室温で２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。
【０１６３】
遺伝コードにおける縮重に起因して異なる単離された核酸もまた、本発明の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸は、１つよりも多い三つ組によって指定される。同じアミノ酸または同義語を特定するコドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンについて同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない「サイレント」変異を生じ得る。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの最大で約３〜５％）におけるこれらのバリエーションが、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、所与の種のメンバー間に存在し得ることを理解する。任意のおよび全てのかかるヌクレオチドのバリエーションおよび生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
【０１６４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングする際に有用な組換えクローニングベクターおよび発現ベクターをさらに提供する。本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子もしくは組換えベクターを含む形質転換された宿主細胞、およびそれらに由来する新規株または細胞株をさらに提供する。
【０１６５】
宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、糸状菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。とりわけ、ファージ、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミドおよびシャトルベクターが含まれる種々の異なるベクターが、これらの宿主細胞の各々における特異的な使用のために開発されており、これらのいずれかが、本発明を実施するために使用され得る。
【０１６６】
適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得、または当技術分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に従って変動し得るが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を保有し得、および／またはベクターを含むクローンを選択する際に使用され得るマーカーの遺伝子を保有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＢＡＤ１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらのおよび多くの他のクローニングベクターが、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの販売業者から入手可能である。
【０１６７】
本発明のクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を補助するために、ベクターは、レポーター遺伝子産物または他の選択可能なマーカーのコード配列をさらに含むように操作され得る。かかるコード配列は、好ましくは、上記のように、調節エレメントコード配列と、動作可能な関連状態にある。本発明において有用なレポーター遺伝子は、当技術分野で周知であり、とりわけ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙｌＥおよびチロシナーゼをコードするものが含まれる。選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知であり、抗生物質もしくは代謝拮抗薬に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードするもの、または栄養要求性の要件を満たすものが含まれる。かかる配列の例には、とりわけ、アンピシリン、エリスロマイシン、チオストレプトンまたはカナマイシンに対する耐性をコードするものが含まれる。
【０１６８】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターおよび／またはポリヌクレオチド自体は、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）を含む、いくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入され得る。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択肢は、宿主細胞の特色にしばしば依存する。
【０１６９】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子もしくは組換えベクターを含む形質転換された宿主細胞、およびそれらに由来する新規株または細胞株をさらに提供する。一部の実施形態では、本発明の実施において有用な宿主細胞は、E.coli細胞である。典型的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０、ＵＳＡおよび市販の供給源から入手可能な、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０またはＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５αなどのＥ．ｃｏｌｉの株が、使用され得る。一部の実施形態では、他の原核生物細胞または真核生物細胞が使用され得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、ＰｉｃｈｉａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓから選択される属のメンバーである。かかる形質転換された宿主細胞には、典型的には、微生物、例えば、とりわけ、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡベクターで形質転換された細菌、または組換えベクターで形質転換された酵母が含まれるがこれらに限定されない。好ましい真核生物宿主細胞には酵母細胞が含まれるが、哺乳動物細胞または昆虫細胞もまた、効率的に利用され得る。適切な宿主細胞には、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。
【０１７０】
一態様では、本発明は、ｓｃＰＶ、その組換え体のゲノム、またはそれらの機能的一部もまた含む。ウイルスゲノムの機能的一部は、タンパク質またはその部分（例えば、ドメイン、エピトープなど）をコードするゲノムの一部分、プロモーター、エンハンサー、シスもしくはトランス作用性エレメントなどの調節エレメント、または調節エレメントの成分を含む一部分などであり得る。かかるウイルス配列は、例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションテクノロジーを使用することによって、またはＥＬＩＳＡアッセイを確立することによって、ウイルスまたはその組換え体を同定または単離するために使用され得る。
【０１７１】
例示的な使用
病原性ポックスウイルス感染の予防または処置
本発明の合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）は、病原性ポックスウイルス感染に対する対象の免疫化において使用され得る。本発明のｓｃＰＶは、対象において１つまたは複数の病原性ポックスウイルス感染を予防、管理または処置するために使用され得る。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスは、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、ラクダ痘ウイルス（ＣＭＬＶ）、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）、奇肢症ウイルス（ＥＣＴＶ、「マウス痘因子」）、ＨＰＸＶ、サル痘ウイルス（ＭＰＸＶ）、ウサギ痘ウイルス（ＲＰＸＶ）、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス、ウアシンギシュー病ウイルス、ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）、痘瘡ウイルス（ＶＡＲＶ）およびハタネズミ痘ウイルス（ＶＰＶ））である。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスは、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、オルフウイルス（ＯＲＦＶ）、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）、牛丘疹性口炎ウイルス（ＢＰＳＶ）、リスパラポックスウイルス（ＳＰＰＶ）、アカシカパラポックスウイルス、Ａｕｓｄｙｋウイルス、シャモア伝染性膿瘡ウイルス、トナカイパラポックスウイルスまたはアザラシ痘ウイルス）である。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスは、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））である。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスは、Ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、タナポックスウイルスまたはヤバサル腫瘍ウイルス（ＹＭＴＶ））である。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスは、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、羊痘、山羊痘またはランピースキン病ウイルス）である。一部の実施形態では、ポックスウイルスは、Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、ブタポックスウイルス）である。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスは、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ（例えば、粘液腫ウイルス、ショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）、リス線維腫ウイルスまたは野兎線維腫ウイルス）である。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスはＶＡＲＶである。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスはＭＰＸＶである。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスはＭＣＶである。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスはＯＲＦＶである。一部の実施形態では、病原性ポックスウイルスはＣＰＸＶである。病原性ポックスウイルスは、ポックスウイルスのシュードタイプまたはキメラであり得る。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。一部の実施形態では、対象は動物対象である。新たなポックスウイルス（例えば、オルソポックスウイルス）が、なおも絶えず発見されている。本発明のｓｃＰＶは、新たに発見された病原性ポックスウイルスに対する対象の免疫化において、または新たに発見された病原性ポックスウイルスによる感染の予防、管理もしくは処置において使用され得ることが理解される。
【０１７２】
本発明のｓｃＰＶは、免疫原性製剤、例えば、ワクチン製剤において使用され得る。製剤は、病原性ポックスウイルス感染を予防、管理、中和、処置および／または寛解するために使用され得る。免疫原性製剤は、本発明の生または不活性化ｓｃＰＶのいずれかを含み得る。ｓｃＰＶは、当業者に周知の方法によって不活性化され得る。一般的な方法は、不活性化のためにホルマリンおよび熱を使用する。一部の実施形態では、免疫原性製剤は、生ワクチンを含む。かかる生免疫原性製剤の産生は、細胞培養物におけるｓｃＰＶの繁殖とその後の精製を含む従来の方法を使用して達成され得る。例えば、ｓｃＰＶは、当業者によって決定されるように、ＢＨＫ、ＢＧＭＫ、ＢＲＬ３Ａ、ＢＳＣ−４０、ＣＥＦ、ＣＥＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＣＶＩ、ＨａＣａＴ、ＨＥＬ、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｖｅｒｏ細胞などにおいて培養され得る。
【０１７３】
一態様では、本発明のｓｃＰＶは、天然痘を予防、管理または処置するために使用され得る。本発明のｓｃＰＶ（例えば、合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）または合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ））は、天然痘に曝露された、潜在的に曝露される、または曝露のリスクがある個体または集団における天然痘の予防のためのワクチンとして使用され得る。本発明のｓｃＰＶ（例えば、本発明のｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＶＡＣＶ）は、天然痘ワクチンの新たな国家備蓄品を創出するために使用され得る。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、ファースト・レスポンダーなどの防衛職員に、予防的に投与され得る。
【０１７４】
一実施形態では、本発明のｓｃＨＰＸＶを含む組成物は、天然痘ワクチンとして使用される。本発明の方法に従って産生されたｓｃＨＰＸＶは、小さいプラークの表現型を有することが本明細書で示される。一般に、小さいプラークの表現型は、弱毒化を反映するとみなされる。従って、本発明の方法に従って産生されたｓｃＨＰＸＶは、既存の天然痘ワクチンに対する安全な代替法を提供する。一部の実施形態では、ワクチンは、既存の天然痘ワクチンからの重症合併症に罹患し得、従って、既存の天然痘ワクチンが禁忌である、免疫抑制対象（例えば、ＨＩＶ患者、化学療法を受けている患者、がん、リウマチ学的障害または自己免疫性障害に対する処置を受けている患者、臓器または組織移植を受けているまたは受けた患者、免疫不全を有する患者、小児、妊娠女性、アトピー性皮膚炎、湿疹、乾癬、心臓状態を有する患者、および免疫抑制薬使用中の患者など）への投与にとって安全であり得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、１つまたは複数の抗ウイルス処置と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、ブリンシドホビル処置と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、テコビリマット（tecovirimat）／ＳＩＧＡ−２４６処置と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、非環式ヌクレオシドホスホネート（シドホビル）、非環式ヌクレオシドホスホネート（acyclic  nucleoside  or  phosphonates）の経口アルコキシアルキルプロドラッグ（ブリンシドホビルまたはＣＭＸ００１）と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ＶＡＣＶ、ＶＡＲＶまたはＨＰＸＶに由来するペプチドまたはタンパク質抗原で先に免疫化された対象において使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、死滅または不活性化されたＶＡＣＶで先に免疫化された対象において使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、複製欠損（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ／ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ＶＡＣＶウイルス株であるＭＶＡ（改変ウイルスＡｎｋａｒａ）で先に免疫化された対象において使用され得る。本発明のｓｃＨＰＸＶを含むワクチン製剤は、生または不活性化ｓｃＨＰＸＶのいずれかを含み得る。
【０１７５】
一実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶを含む組成物は、天然痘ワクチンとして使用される。ｓｃＶＡＣＶは、ＡＣＡＭ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ００６９９８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２４３３１２）、ＣＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４８）、Ｔｉａｎ  Ｔｉａｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０９５６８９．１）、Ｔｉａｎ  ＴｉａｎクローンＴＴ９（ＪＸ４８９１３６）、ＴＰ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＣ２０７８１０）およびＴＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＣ２０７８１１）、ＮＹＣＢＨ、Ｗｙｅｔｈ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３５０２７）、Ｌｉｓｔｅｒ  １０７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ１２１３９４）、Ｌｉｓｔｅｒ−ＬＯ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６７８２７６）、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）、ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）、Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＴａｓｈｋｅｎｔクローンＴＫＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＭ０４４３０９）およびＴＫＴ４（ＫＭ０４４３１０）、ＵＳＳＲ、Ｅｖａｎｓ、Ｐｒａｈａ、ＬＩＶＰ、Ｉｋｅｄａ、ＩＨＤ−Ｗ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＪ１２５４３９）、ＬＣ１６ｍ８（ＡＹ６７８２７５）、ＥＭ−６３、ＩＣ、Ｍａｌｂｒａｎ、Ｄｕｋｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ４３９８１５）、３７３７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ３７７９４５）、ＣＶ−１、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＭ５０１４８２）、Ｓｅｒｒｏ  ２ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＦ１７９３８５）、Ｃａｎｔａｇｌｏウイルス単離体ＣＭ−０１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ０１３２１０）、ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８１）、ＤＰＰ２０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８５）、ＤＰＰ１３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８０）、ＤＰＰ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８３）、ＤＰＰ２１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＮ６５４９８６）ならびにＩＯＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）から選択されるＶＡＣＶ株であり得る。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、株ＡＣＡＭ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７）に基づく。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、株ＶＡＣＶ−ＩＯＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＴ１８４６９０およびＫＴ１８４６９１）に基づく。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＶＣは、株ＭＶＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９４８４８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ６０３３５５）に基づく。一実施形態では、天然痘ワクチンとして使用されるｓｃＶＡＣＶは、株ＭＶＡ−ＢＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ９８３２３８）に基づく。本発明のｓｃＰＶを含むワクチン製剤は、生または不活性化ｓｃＶＡＣＶのいずれかを含み得る。
【０１７６】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶ（例えば、ｓｃＨＰＸＶまたはｓｃＶＡＣＶ）を含む組成物は、ＶＡＣＶ感染、ＭＰＸＶ感染またはＣＰＸＶ感染に対するワクチンとして使用される。
【０１７７】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、異種抗原またはエピトープを発現するように設計され得、かかる抗原および／またはエピトープの供給源生物に対するワクチンとして使用され得る。
【０１７８】
本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、有効量の本発明のｓｃＰＶ、および薬学的に許容される担体を含む。用語「薬学的に許容される」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物（例えば、免疫原性またはワクチン製剤）がそれを用いて投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液のために使用され得る。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。適切な医薬担体の例は、E.  W.  Martinによる「Remington’s  Pharmaceutical  Sciences」に記載されている。製剤は、投与の様式に適していなければならない。特定の製剤は、ｓｃＰＶが生であるか不活性化されているかにも依存し得る。精製された本発明のｓｃＰＶは、後の使用のために凍結乾燥され得る、または医薬溶液中で即座に調製され得る。ｓｃＰＶはまた、アジュバントまたは担体ありまたはなしで、無菌食塩水などの生理学的に許容される溶液中に希釈され得る。
【０１７９】
本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、乱切によって患者に投与され得る。ワクチンは、任意の他の標準的な投与経路によっても投与され得る。多くの方法が、免疫原性製剤（例えば、ワクチン）を導入するために使用され得、これらには、鼻腔内、気管内、経口、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、結膜および皮下経路が含まれるがこれらに限定されない。鳥類では、これらの方法は、後鼻孔接種をさらに含み得る。非経口投与の代替法として、本発明は、飲用水を介してまたはスプレー中などの、農業目的のための大量投与の経路もまた包含する。あるいは、本発明のｓｃＰＶを、その天然の感染経路を介して導入することが好ましい場合がある。一部の実施形態では、本発明の免疫原性製剤は、注射用液体、ワクチンを発現する吸収可能なトランスジェニック植物、徐放性ゲル、またはインプラント可能な封入された組成物、固体インプラントもしくは核酸として投与される。免疫原性製剤は、クリーム、ローション、軟膏、皮膚パッチ、ロゼンジまたは経口液体、例えば、懸濁液、溶液および乳濁液（水中油または油中水）中でも投与され得る。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、感染からの完全な保護を生じないが、未処置の対象と比較して、より低い力価または低減された数の病原体（例えば、病原性ポックスウイルス）を生じる。ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性製剤の投与は、未処置の対象と比較して、病原体の力価における、０．５倍、１倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、１７５倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７５０倍もしくは１，０００倍またはそれよりも大きい低減を生じる。病原体の力価、数または総負荷における低減の利益には、感染の症状の重症度の低下、および感染と関連する疾患または状態の長さにおける低減が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）は、感染からの完全な保護を生じないが、未処置の対象と比較して、より低い数の症状もしくは症状の減少した強度、または減少した罹患率もしくは減少した死亡率を生じる。
【０１８２】
種々の実施形態では、本発明の免疫原性製剤（例えば、ワクチン）または本発明のｓｃＰＶによって生成される抗体は、感染（例えば、病原性ポックスウイルス感染）の予防のために、１つまたは複数の他の治療（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節治療）と組み合わせて対象に投与される。他の実施形態では、本発明の免疫原性製剤または本発明のｓｃＰＶによって生成される抗体は、感染（例えば、病原性ポックスウイルス感染）の処置のために、１つまたは複数の他の治療（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節治療）と組み合わせて対象に投与される。さらに他の実施形態では、本発明の免疫原性製剤または本発明のｓｃＰＶによって生成される抗体は、感染（例えば、病原性ポックスウイルス感染）の管理および／または寛解のために、１つまたは複数の他の治療（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節治療）と組み合わせて対象に投与される。具体的な実施形態では、本発明の免疫原性製剤または本発明のｓｃＰＶによって生成される抗体は、天然痘の予防のために、１つまたは複数の他の治療（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節治療）と組み合わせて対象に投与される。別の具体的な実施形態では、本発明の免疫原性製剤または本発明のｓｃＰＶによって生成される抗体は、天然痘の処置のために、１つまたは複数の他の治療（例えば、抗ウイルスまたは免疫調節治療）と組み合わせて対象に投与される。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、１つまたは複数の抗ウイルス処置と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、ブリンシドホビル処置と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ウイルス複製を抑制するために、テコビリマット／ＳＩＧＡ−２４６処置と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、非環式ヌクレオシドホスホネート（シドホビル）、非環式ヌクレオシドホスホネートの経口アルコキシアルキルプロドラッグ（ブリンシドホビルまたはＣＭＸ００１）と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、ＶＡＣＶ、ＶＡＲＶまたはＨＰＸＶに由来するペプチドまたはタンパク質抗原で先に免疫化された対象において使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、死滅または不活性化されたＶＡＣＶで先に免疫化された対象において使用され得る。一部の実施形態では、ワクチンは、複製欠損（deficient/defective）ＶＡＣＶウイルス株であるＭＶＡ（改変ウイルスＡｎｋａｒａ）で先に免疫化された対象において使用され得る。
【０１８３】
当業者に周知の任意の抗ウイルス剤は、本発明の製剤（例えば、ワクチン製剤）および方法において使用され得る。抗ウイルス剤の非限定的な例には、その受容体へのウイルスの付着、細胞中へのウイルスの内在化、ウイルスの複製、または細胞からのウイルスの放出を阻害および／または低減する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子および小分子が含まれる。特に、抗ウイルス剤には、細胞外ウイルス成熟化を遮断する抗ウイルス薬（テコビリマット／ＳＩＧＡ−２４６）、非環式ヌクレオシドホスホネート（シドホビル）、非環式ヌクレオシドホスホネートの経口アルコキシアルキルプロドラッグ（ブリンシドホビルまたはＣＭＸ００１）またはワクシニア免疫グロブリン（ＶＩＧ）が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ウイルス剤には、ヌクレオシドアナログ（例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル（gangcyclovir）、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン）、ホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、アルファ−インターフェロンおよび他のインターフェロン、ならびにＡＺＴが含まれるがこれらに限定されない。
【０１８４】
用量および投薬レジメンは、処置される対象の要求に従って、当業者によって決定され得る。当業者は、考慮因子、例えば、対象の年齢または体重、処置されている疾患または状態の重症度、および処置に対する対象の応答を考慮し得る。本発明の組成物は、例えば、必要に応じて、または毎日、投与され得る。投薬は、変動する期間にわたって行われ得る。例えば、投薬レジメンは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間またはそれよりも長く持続し得る。一部の実施形態では、投薬レジメンは、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間またはそれよりも長く持続する。
【０１８５】
本発明のｓｃＰＶは、受動免疫療法、診断または予後判定イムノアッセイなどに有用な抗体を産生するためにも使用され得る。抗体を産生する方法は、当技術分野で周知である。抗体は、免疫療法における使用前に、さらに改変（例えば、キメラ化、ヒト化など）され得る。
腫瘍溶解剤
【０１８６】
本発明の合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）は、がん細胞において選択的に複製しそれを死滅させる腫瘍溶解剤として使用され得る。迅速に分裂している細胞、例えばがん細胞は一般に、非分裂細胞よりも、ポックスウイルス感染に対して許容的である。ポックスウイルスの多くの特色、例えば、ヒトにおける安全性、高力価ストックの産生の容易さ、ウイルス調製物の安定性、および腫瘍細胞における複製後に抗腫瘍免疫を誘導する能力は、ポックスウイルスを望ましい腫瘍溶解剤にする。本発明の方法に従って産生されたｓｃＰＶは、それらをがんの処置にとって適切なものにする１つまたは複数の改変を含み得る。従って、一態様では、本開示は、がん細胞において死を誘導する方法であって、細胞を、単離されたｓｃＰＶ、または本発明のｓｃＰＶを含む医薬組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。一態様では、本開示は、がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本発明のｓｃＰＶを投与するステップを含む方法を提供する。別の態様は、がん細胞などの新生物障害細胞において死を誘導するため、またはがんなどの新生物障害を処置するための、本明細書に記載されるｓｃＰＶまたは組成物の使用を含む。一部の実施形態では、ポックスウイルス腫瘍溶解治療は、１つまたは複数の従来のがん治療（例えば、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法および生物学的／免疫学的治療）と組み合わせて投与される。具体的な実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラＶＡＣＶ（ｓｃＶＡＣＶ）である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラ粘液腫ウイルスである。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）である。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラアライグマ痘ウイルスである。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本発明の合成キメラヤバ様疾患ウイルスである。
【０１８７】
本発明の方法を使用して、１つまたは複数の望ましい遺伝子が容易に導入され得、１つまたは複数の望ましくない遺伝子が、合成キメラポックスウイルスゲノムから容易に欠失され得る。一部の実施形態では、腫瘍溶解剤としての使用のための本発明のｓｃＰＶは、それらの免疫反応性、抗腫瘍標的化および／もしくは効力、細胞から細胞への広がりならびに／またはがん特異性を増強する導入遺伝子を発現するように設計される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、免疫調節遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＴＮＦ機能を遮断するウイルス遺伝子）を発現するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、ビルレンスを弱毒化する因子を発現する遺伝子を含むように設計される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、治療剤（例えば、ｈＥＰＯ、ＢＭＰ−４、特異的腫瘍抗原に対する抗体またはその部分など）を発現するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、弱毒化のために改変されている。一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、ウイルスＴＫ遺伝子を欠如するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ワクシニア増殖因子遺伝子を欠如するように設計または操作される。一部の実施形態では、本発明のｓｃＶＡＣＶは、ヘマグルチニン遺伝子を欠如するように設計または操作される。
【０１８８】
本発明のｓｃＰＶは、種々の新生物障害および／またはがんを処置するために有用である。一部の実施形態では、がんの型には、骨がん、乳がん、膀胱がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、神経膠腫、胃がん、胃腸がん、頭頸部がん、肝がん、例えば肝細胞癌、白血病、肺がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、皮膚がん、例えば黒色腫、精巣がんなど、または処置され得る任意の他の腫瘍もしくはプレ新生物病変が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８９】
別の実施形態では、方法は、本明細書に記載される単離されたもしくは組換えウイルスまたは組成物が投与された対象由来の新生物障害もしくはがん細胞中および／または試料中の、投与されたｓｃＰＶの存在を検出するステップをさらに含む。例えば、対象は、例えば感染の進行を評価するために、本明細書に記載されるｓｃＰＶまたは組成物の投与前および／または投与後に試験され得る。一部の実施形態では、本開示のｓｃＰＶは、検出カセットを含み、投与されたキメラポックスウイルスの存在を検出するステップは、検出カセットにコードされたタンパク質を検出することを含む。例えば、検出カセットが蛍光タンパク質をコードする場合、対象または試料は、蛍光を可視化するための方法を使用して画像化される。
【０１９０】
本発明の腫瘍溶解製剤は、有効量の本発明のｓｃＰＶ、および薬学的に許容される担体を含む。用語「薬学的に許容される」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、医薬組成物（例えば、腫瘍溶解製剤）がそれを用いて投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液のために使用され得る。適切な賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。適切な医薬担体の例は、E.  W.  Martinによる「Remington’s  Pharmaceutical  Sciences」に記載されている。製剤は、投与の様式に適していなければならない。
組換え遺伝子発現のためのウイルスベクター
【０１９１】
本発明の合成キメラポックスウイルス（ｓｃＰＶ）は、異種配列を保有するように操作され得る。異種配列は、異なるポックスウイルス種由来または任意の非ポックスウイルス供給源由来であり得る。一態様では、異種配列は、任意の非ポックスウイルス供給源から選択される抗原性エピトープである。一部の実施形態では、組換えウイルスは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、マイコバクテリア、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、ＭＲＳＡ、ラブドウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス科のウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスが含まれるがこれらに限定されない非ポックスウイルス供給源由来の、あるいは出血熱を引き起こすウイルス、例えば、ハンタウイルスまたはフィロウイルス、即ち、エボラもしくはマールブルグウイルス由来の、１つまたは複数の抗原性エピトープを発現し得る。別の態様では、異種配列は、異なるポックスウイルス種由来の抗原性エピトープである。これらのウイルス配列は、ｓｃＰＶの宿主スペクトルまたは免疫原性を改変するために使用され得る。
【０１９２】
一部の実施形態では、本発明のｓｃＰＶは、治療的核酸（例えば、アンチセンス核酸）または治療的ペプチド（例えば、所望の生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質）を発現する異種遺伝子／核酸をコードし得る。
【０１９３】
一部の実施形態では、異種核酸配列の発現は、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下にあるが、排他的にではない。一部の実施形態では、異種核酸配列は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域中に挿入される。異種配列をポックスウイルスゲノム中に挿入するための方法は、当業者に公知である。一部の実施形態では、異種核酸は、化学的合成によって導入される。例示的な実施形態では、異種核酸は、本発明のｓｃＨＰＸＶのＨＰＸＶ０９５／Ｊ２ＲまたはＨＰＸＶ０４４遺伝子座中にクローニングされ得る。
【０１９４】
本発明のｓｃＰＶは、標的細胞中への異種核酸配列の導入のために使用され得、この配列は、標的細胞に対して相同または異種のいずれかである。標的細胞中への異種核酸配列の導入は、その配列によってコードされる異種ペプチドもしくはポリペプチドおよび／または完全なウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生するために使用され得る。この方法は、ｓｃＰＶによる宿主細胞の感染；適切な条件下での感染宿主細胞のカルチベーション；ならびに宿主細胞によって産生されるペプチド、タンパク質および／またはウイルスの単離および／または富化を含む。
【０１９５】
記載されてきた本発明の実施形態は、本発明の原理の適用の一部の単なる例示であることを理解すべきである。多数の改変が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に示された教示に基づいて、当業者によってなされ得る。
【０１９６】
以下の実施例は、本発明の代表として示される。これらおよび他の等価な実施形態が、本開示、図面および添付の実施形態を考慮して明らかになるので、これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【０１９７】
（実施例１）
ウイルスゲノムの重複する断片の選択および設計
材料および方法
合成キメラＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ）ゲノム設計
ｓｃＨＰＸＶゲノムの設計は、ＨＰＸＶについて先に記載されたゲノム配列に基づく（株ＭＮＲ−７６；図１Ａ）［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４］（Tulman  ER、Delhon  G、Afonso  CL、Lu  Z、Zsak  L、Sandybaev  NTら、Genome  of  horsepox  virus.  Journal  of  virology.  ２００６年；８０巻（１８号）：９２４４〜５８頁）。２１２，６３３ｂｐのゲノムを、１０個の重複する断片へと分割する（図１Ｂ）。相同組換えが全長ゲノムのアセンブリを駆動する部位を提供するために、これらの断片が各隣接断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列（即ち、相同性）を共有するように、それらを設計した（表１）。これらの重複する配列は、共トランスフェクトされた断片間での組換えを正確に実施するのに十分な相同性を提供する（Yao  XD、Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  virology.  ２００３年；７７巻（１３号）：７２８１〜９０頁）。より短いまたはより長い重複が同様の目的を果たすことが可能である。ＨＰＸＶゲノム配列由来の末端４０ｂｐ（５’−ＴＴＴＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＡ−３’）（配列番号５９）は、合成された末端逆位配列（ＩＴＲ）断片中には含まれない。その代わり、ＳａｐＩ制限部位が、ＩＴＲ断片の５’末端（ＧＡ＿ＬＩＴＲ）および３’末端（ＧＡ＿ＲＩＴＲ）において付加され、ＴＧＴ配列が後に続く。これらのＳａｐＩ制限部位を使用して、ＶＡＣＶ末端ヘアピンをＩＴＲ断片にライゲートさせる（以下に記載される）。
【０１９８】
各断片を化学的に合成し、各断片上の末端ＳｆｉＩ制限部位を使用してプラスミド中にサブクローニングする。これらの断片のサブクローニングを補助するために、ＡａｒＩおよびＢｓａＩ制限部位を、２つのＩＴＲコード断片を除く全ての断片においてサイレントに変異させる（表２）。これらの領域が、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分割にとって重要なヌクレオチド配列特異的認識部位を含む場合、２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させない。
【０１９９】
ポックスウイルス初期後期プロモーターの制御下にあるｙｆｐ／ｇｐｔカセットを、ＧＡ＿断片＿３内のＨＰＸＶ０９５／Ｊ２Ｒ遺伝子座中に導入すると、ＨＰＸＶ（ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５）の再活性化を蛍光顕微鏡下で可視化することが容易になる。ｇｐｔ遺伝子座は、薬物選択を使用して再活性化されたウイルスを選択するための有望なツールも提供する。ＨＰＸＶ０９５は、非必須ＶＡＣＶ  Ｊ２Ｒ遺伝子のＨＰＸＶホモログをコードし、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中に、断片＿３および他のＨＰＸＶクローンをＶＡＣＶ  ＤＮＡと共に共トランスフェクトすることによって、種々のハイブリッドウイルスを回収して、選択戦略を検証する（図１３Ａおよび１３Ｂ）。サイレント変異をＨＰＸＶ０４４（ＶＡＣＶＷＲＦ４Ｌ）配列（ＧＡ＿断片＿２）中にも導入して、ＧＡ＿断片＿２内に２つの独自の制限部位を創出する（表３）。一部の実施形態では、これらの独自の制限部位は、ＨＰＸＶの再活性化の前に、組換え遺伝子産物（例えば、選択可能なマーカー、蛍光タンパク質、抗原などであるがこれらに限定されない）をＧＡ＿断片＿２中に迅速に導入するために使用され得る。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【０２００】
ＶＡＣＶ（株ＷＲ）由来のスロー（Ｓ）形態およびファスト（Ｆ）形態の末端ヘアピンループの合成
ＶＡＣＶ（株ＷＲ）由来のスロー（Ｓ）形態およびファスト（Ｆ）形態の末端ヘアピンループを、１５７ｎｔのｓｓＤＮＡ断片として合成する（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；図２Ｂ）。ＤＮＡ合成を介して、３ヌクレオチドから構成される５’オーバーハングが、各ヘアピンの終端に残される（５’−ＡＣＡ；図２Ｃ）。ＨＰＸＶ配列［ＤＱ７９２５０４］由来のコンカテマー分割部位（ｃｏｎｔａｔｅｍｅｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）もまた、末端ヘアピンループ中に合成する（図２Ｂ）。
【０２０１】
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片の消化および精製
合成ＨＰＸＶ断片を、５０℃でＳｆｉＩで一晩消化する。ｓｃＨＰＸＶ  ＩＴＲ断片を、ＳａｐＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間個々に消化し、６５℃で１０分間不活性化し、その後、５０℃でＳｆｉＩで一晩消化する。およそ１ＵのＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＩＴＲ消化物に添加し、３７℃でもう１時間インキュベートする。全てのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片を、ＱｉａｅｘＩＩ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して引き続いて精製する。全てのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中でＱｉａｅｘＩＩ懸濁液から溶出させる。ＤＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して推定する。
【０２０２】
結果
ポックスウイルスは、ウイルス複製のプロセスに密接に関連する非常に高頻度の相同組換え反応を触媒する。本明細書では、化学的に合成されたＨＰＸＶ二重鎖ＤＮＡの大きい断片を、機能的ｓｃＨＰＸＶゲノムを形成するために、ウイルスにより触媒される組換えおよび複製反応を使用して接合することができることが実証される。
【０２０３】
ＨＰＸＶゲノム（株ＷＮＲ−７６）の公開された配列を使用して、２１２，６３３ｂｐのゲノムを、１０個の重複する断片へと分割する（図２）。この領域内の配列特異的部位が効率的なゲノム複製およびコンカテマー分割に知らずに必要とされる場合、ＩＴＲを除く全ての断片中の全てのＢｓａＩおよびＡａｒＩ部位を変異させる。上記のように、ＶＡＣＶ由来の末端ヘアピンループ構造の、ＩＴＲの終端への付加を促進するために、ＳａｐＩ認識部位を、それぞれＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片の両方の左側末端終端および右側末端終端の隣に含める（図２Ａ）。これらのＳａｐＩ部位は、隣接するベクター配列内に包埋され、ＳａｐＩ酵素は、認識配列の外側かつＨＰＸＶ  ＤＮＡ中で、この部位の下流を切断する。従って、ＤＮＡをＳａｐＩで切断すると、ＨＰＸＶ配列からコピーされたＤＮＡ内に粘着終端が残り、従って、無関係な制限部位を含まない、正確な配列コピーの（引き続くライゲーションを介した）アセンブリが可能になる。ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片の他方の終端（ゲノムマップに関して内部終端）は各々、残りのＨＰＸＶ断片の両終端と同様、ＳｆｉＩ認識部位によって境界される。これらのＤＮＡは全て、容易な繁殖のためにプラスミド形態で供給される。ＳＦＶ感染細胞中へのトランスフェクションのための内部断片を調製するために、これらのプラスミドをＳｆｉＩで消化して、各ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片からプラスミドを放出させる（ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片をどのようにプロセシングするかについては、以下を参照のこと）。消化後、各反応は、いずれの混入酵素をも除去するために精製されるが、プラスミドは、消化物から除去されず、各ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５断片と一緒に共トランスフェクトされる。これは、反応を妨害せず、ＤＮＡ操作の量、およびこれらの大きいＤＮＡ断片の可能な断片化を最小化するために実施される。
【０２０４】
反応効率は、トランスフェクトされた断片の数によって影響され得るが、１０個よりも多いまたは少ない重複する断片が、本発明の方法において使用され得る。理論に束縛されないが、約１５個の断片が、再活性化反応のさらなる最適化なしの実務的上限を示し得る。理想的な下限は単一のゲノム断片であるが、実務上、テロメアは、より控えめなサイズの断片（例えば、約１０ｋｂ）として最も容易に操作される。
【０２０５】
（実施例２）
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５左および右ＩＴＲ断片へのＶＡＣＶ  Ｆ末端およびＳ末端ヘアピンループのライゲーション
材料および方法
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＩＴＲ断片へのＳ形態およびＦ形態の末端ヘアピンループのライゲーション
およそ１マイクログラムの末端ＶＡＣＶヘアピンループの各々を、９５℃で５分間インキュベートし、その後、氷上での「即座の」冷却によってヘアピン構造を形成させる。ヘアピンループを、それらの５’終端において引き続いてリン酸化し、その後ライゲートさせる。簡潔に述べると、１μｇのＶＡＣＶ  Ｆ−ヘアピンまたはＶＡＣＶ  Ｓ−ヘアピンのいずれか、２μｌの１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭ  ＡＴＰ、および１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む別々の２０μｌ反応を、３７℃で１時間インキュベートする。反応を、７５℃での熱不活性化によって終結させる。
【０２０６】
およそ１マイクログラムの左ＩＴＲまたは右ＩＴＲのいずれかを、５％ＰＥＧ−４０００および５単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、２０倍モル過剰の各末端ヘアピンと共に、１６℃で一晩別々にインキュベートする。各ライゲーション反応を、６５℃で１０分間熱不活性化し、その後、細胞中にトランスフェクトする準備ができるまで、氷上でインキュベートする。
【０２０７】
結果
オルソポックスウイルスは、ゲノムの各終端において変動する長さの末端逆位配列（ＩＴＲ）を保有する直鎖ｄｓＤＮＡゲノムをコードする。二重鎖ゲノムの２つの鎖をヘアピンループによって接続して、共有結合的に連続的なポリヌクレオチド鎖を形成させる。ループは、Ａ＋Ｔリッチであり、完全に塩基対合した構造を形成できず、配列が反転した形態および相補的な形態の２つの形態で存在する（Baroudy  BM、Venkatesan  S、Moss  B.  Incompletely  base-paired  flip-flop  terminal  loops  link  the  two  DNA  strands  of  the  vaccinia  virus  genome  into  one  uninterrupted  polynucleotide  chain.  Cell.  １９８２年；２８巻（２号）：３１５〜２４頁）（図２Ｂ）。これらは、それらの電気泳動特性に基づいてスロー［Ｓ］形態およびファスト［Ｆ］形態と呼ばれ、おそらくは、直鎖ｄｓＤＮＡゲノムの終端をキャップする、部分的に二重鎖のヘアピン構造へとフォールディングする（図２Ｃ）。ＨＰＸＶゲノムの公開された配列は不完全であり、おそらくは末端終端から約６０ｂｐを欠くために、ＨＰＸＶヘアピンを正確に複製することが不可能になっている。その代わり、１５７ｎｔのｓｓＤＮＡ断片を、ＶＡＣＶテロメアの公開された配列をガイドとして使用して化学的に合成し、各ヘアピンの終端に、３ヌクレオチドから構成される５’オーバーハングを残した（５’−ＡＣＡ；図２Ｃ）（Baroudy  BM、Venkatesan  S、Moss  B.  Incompletely  base-paired  flip-flop  terminal  loops  link  the  two  DNA  strands  of  the  vaccinia  virus  genome  into  one  uninterrupted  polynucleotide  chain.  Cell.  １９８２年；２８巻（２号）：３１５〜２４頁）。このオーバーハングは、クローニングされたＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ断片をＳａｐＩで切断することによって生成された終端に対して相補的である。
【０２０８】
ＶＡＣＶに由来する配列を、ＨＰＸＶとＶＡＣＶとの間の近い共通の祖先を示唆するデータに基づいて使用する。異なるコードポックスウイルスのヘアピン終端間で共通して保存された配列特色が存在するので、他のポックスウイルス由来の他の末端ヘアピンを使用することが可能であり得る。例えば、ヘアピン終端中の分割部位は、配列および機能性の両方が高度に保存されている（これらは後期プロモーターと似ている）。
【０２０９】
これらの一本鎖オリゴヌクレオチドを９５℃に加熱し、次いで、氷上で迅速に冷却して、不完全に塩基対合した末端ヘアピンを形成させる（図２Ｃ）。次に、各オリゴヌクレオチドをリン酸化し、ＳａｐＩおよびＳｆｉＩの両方で先に消化した左または右ＩＴＲ断片のいずれかと、２０倍モル過剰で別々にライゲートさせる。これらの酵素によるＩＴＲの消化は、各ＩＴＲの５’末端に５’−ＴＧＴオーバーハングを生じ、これは、末端ヘアピンループ構造中の５’−ＡＣＡオーバーハングに対して相補的であった。これは、各ＩＴＲのヘアピン終結したコピーを生成する。
【０２１０】
ヘアピン終結した構造が両方のＩＴＲ断片に付加されたことを確認するために、ＩＴＲ断片のＰｖｕＩＩによる制限消化を実施する。約１０ｋｂのＩＴＲの末端への約７０ｂｐの末端ヘアピンの付加をゲル電気泳動によって可視化することは不可能なので、少量の各ライゲーションを、ＰｖｕＩＩで消化する。ＩＴＲに末端ヘアピンがライゲートされていない場合、ＰｖｕＩＩによる消化は、１４７２ｂｐの産物を生じる（図３Ａおよび３Ｂ、レーン２および５）。しかし、末端ヘアピンループがＨＰＸＶ  ＩＴＲに首尾よく付加された場合、ＩＴＲ断片のサイズにおける増加がアガロースゲル上で見られる（図３Ｂ、レーン２を３および４と比較する；レーン５を６および７と比較する）。これらのデータは、これらの条件下で、ＨＰＸＶ  ＩＴＲのほぼ全てが、断片の一方の終端において末端ヘアピンループを含むことを示唆している。
【０２１１】
（実施例３）
化学的に合成されたｄｓＤＮＡ断片からのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化
材料および方法
ウイルスおよび細胞培養
ＳＦＶ株ＫａｓｚａおよびＢＳＣ−４０は、元々Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞は、Ｇ．ＭｃＦａｄｄｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ）から得た。ＢＳＣ−４０およびＢＧＭＫ細胞を、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および抗真菌薬、ならびに５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させる。
【０２１２】
ショープ線維腫ウイルス感染細胞におけるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化
バッファローミドリザル腎臓（ＢＧＭＫ）細胞を、およそ８０％の培養密度に達するまで、ＭＥＭ含有６０ｍｍ組織培養皿中で増殖させる。細胞に、０．５のＭＯＩで、３７℃で１時間、無血清ＭＥＭ中でショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）を感染させる。接種材料を、５％ＦＣＳを含む温ＭＥＭ  ３ｍｌで置き換え、もう１時間インキュベーターに戻す。一方で、トランスフェクション反応を以下のように設定する。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を、１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中およそ５μｇの総合成ＨＰＸＶ  ＤＮＡ断片を、３：１の比（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の総ＤＮＡに対する比）で、１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と混合することによって調製する。各ＨＰＸＶ断片の相対的な量を決定するための計算例は、表４に示される。複合体を室温で１０分間インキュベートし、次いで、先にＳＦＶを感染させたＢＧＭＫ細胞に滴下した。感染のおよそ１６時間後、培地を、５％ＦＣＳを含む新鮮なＭＥＭで置き換える。細胞を、３７℃でさらに４日間（合計で５日間）培養する。感染細胞を細胞培養培地中に掻き取り、３サイクルの凍結および解凍を実施することによって、ウイルス粒子を回収した。粗製抽出物を、無血清ＭＥＭ中に１０−２希釈し、４ｍｌの接種材料を、ＢＳＣ−４０細胞の９〜１６枚の１５０ｍｍ組織培養プレート上にプレーティングして、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を回収する。感染の１時間後、接種材料を、５％ＦＣＳおよび０．９％Ｎｏｂｌｅ  Ａｇａｒを含むＭＥＭで置き換える。黄色蛍光プラークを、倒立顕微鏡下で可視化し、個々のプラークを、さらなる分析のためにピックする。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５プラークを、黄色蛍光選択を用いて３回プラーク精製する。
【表４】
2019535311.tif 000006
【０２１３】
結果
組換えワクシニアウイルスをアセンブルするための、オルソポックスウイルスＤＮＡのＳＦＶにより触媒される組換えおよび再活性化は、先に記載されている（Yao  XD、Evans  DH.  High-frequency  genetic  recombination  and  reactivation  of  orthopoxviruses  from  DNA  fragments  transfected  into  leporipoxvirus-infected  cells.  Journal  of  virology.  ２００３年；７７巻（１３号）：７２８１〜９０頁；およびYao  XD、Evans  DH.  Construction  of  recombinant  vaccinia  viruses  using  leporipoxvirus-catalyzed  recombination  and  reactivation  of  orthopoxvirus  DNA.  Methods  Mol  Biol.  ２００４年；２６９巻：５１〜６４頁）。いくつかの生物学的特色が、これを魅力的なモデル系にしている。第１に、ＳＦＶは、狭い宿主範囲を有し、ウサギ細胞およびある特定のサル細胞株、例えばＢＧＭＫに生産的に感染する。これは、ＢＳＣ−４０などの細胞に感染できるが、そこでの増殖は非常に悪い。第２に、ＳＦＶは、オルソポックスウイルスと比較してより緩徐に増殖し、細胞の単層中に形質転換された「病巣」を形成するのにおよそ４〜５日間かかり、これは、培養物中で１〜２日以内にプラークを生じるオルソポックスウイルスとは非常に異なる特徴である。レポリポックスウイルスとオルソポックスウイルスとの間の増殖におけるこの差異により、ＢＧＭＫ細胞において再活性化アッセイを実施し、ＢＳＣ−４０細胞上に子孫をプレーティングすることによって、これらのウイルスを区別することが可能になる。一部の実施形態では、他のヘルパーウイルス（例えば鶏痘ウイルスであるがこれに限定されない）が使用され得る。一部の実施形態では、異なる細胞組合せが使用され得る。
【０２１４】
ＢＧＭＫ細胞に、０．５のＭＯＩでＳＦＶを感染させ、次いで、２時間後に５μｇの消化したＧＡ＿ＨＰＸＶ断片（表４）をトランスフェクトする。トランスフェクションの５日後、全ての感染性粒子を細胞溶解によって回収し、ＨＰＸＶ（または他のオルソポックスウイルス）の増殖のみを効率的に支持するＢＳＣ−４０細胞上に再プレーティングする。得られた再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５プラークを、蛍光顕微鏡下で可視化する。可視化は、断片＿３内のＨＰＸＶ０９５／Ｊ２Ｒ遺伝子座中のｙｆｐ／ｇｐｔ選択可能なマーカーによって可能になる（図２Ａ）。ウイルスプラークが、トランスフェクションの４８時間以内にＢＳＣ−４０単層において検出される。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を回収する効率は、ＤＮＡトランスフェクション効率を含むいくつかの因子に依存するが、最大で数ＰＦＵ／μｇのトランスフェクトされたＤＮＡまでの範囲である。
【０２１５】
（実施例４）
ＰＣＲおよび制限断片分析によるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム配列の確認
材料および方法
ｓｃＨＰＸＶのＰＣＲおよび制限消化分析
再活性化されたプラークピック中のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の存在を迅速に確認するために、ＰＣＲプライマーを、ｓｃＨＰＸＶ中の変異された個々のＢｓａＩ部位に隣接するように設計する（表５）。ゲノムｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＤＮＡを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５に感染したＢＳＣ−４０細胞から単離し、鋳型として使用する。ＶＡＣＶ感染ＢＳＣ−４０細胞由来のゲノムＤＮＡを、各ＰＣＲ産物内のＢｓａＩ部位の存在を確認するための対照として使用する。ＰＣＲ増幅後、反応を、３７℃で１時間、ＢｓａＩで引き続いて消化する。ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲ（登録商標）ｓａｆｅ染色を含む１％アガロースゲル上で分離して、ＤＮＡバンドを可視化する。
【０２１６】
制限消化とその後のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのさらなる分析を、スクロース勾配精製を使用して単離されたゲノムＤＮＡに対して実施する（Yao  XD、Evans  DH.  Construction  of  recombinant  vaccinia  viruses  using  leporipoxvirus-catalyzed  recombination  and  reactivation  of  orthopoxvirus  DNA.  Methods  Mol  Biol.  ２００４年；２６９巻：５１〜６４頁）。簡潔に述べると、１００ｎｇの精製されたウイルスゲノムＤＮＡを、３７℃で２時間、５ＵのＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化する。消化されたＤＮＡを、１％  Ｓｅａｋｅｍ  Ｇｏｌｄアガロースゲルキャスト上で、０．５×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ電気泳動（ＴＢＥ）緩衝液［１１０ｍＭトリス；９０ｍＭホウ酸；２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ］中で泳動する。ＤＮＡを、１〜１０秒の切り替え時間勾配、直線的傾斜因数および１２０°角度を使用して、１４℃で９．５時間、５．７Ｖ／ｃｍでＣＨＥＦ  ＤＲ−ＩＩＩ装置（ＢｉｏＲａｄ）で分離する。このプログラムは、１ｋｂｐ〜＞２００ｋｂｐのＤＮＡ種の分離を可能にする。７５ｂｐ〜５ｋｂｐの断片を分離するために、１．５％アガロースゲルキャスト上での、１．０×ＴＢＥ中で１１５Ｖで室温で２時間泳動する電気泳動を実施する。ＤＮＡを、ＳＹＢＲ（登録商標）ｇｏｌｄ染色で可視化する。消化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＤＮＡ断片のサイズを、対照ＶＡＣＶゲノムＤＮＡと比較する。
【表５−１】
2019535311.tif 000007
【表５−２】
2019535311.tif 000008
【０２１７】
結果
再活性化アッセイから増殖したプラークから単離されたウイルスのゲノム配列を、ＰＣＲ、制限消化および全ゲノム配列決定によって確認する。ＰＣＲ分析は、ＩＴＲ  ＨＰＸＶ断片を除いた全ての内部の変異されたＢｓａＩ部位に基づく。プライマーセットを、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中の各ＢｓａＩ部位に隣接するように設計する（表５）。これらのプライマーセットは、ＶＡＣＶ  ＷＲ内の類似の領域もまた増幅することが確認される。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５内のこれらの変異されたＢｓａＩ部位を囲むおおよそ１ｋｂの領域のＰＣＲ増幅の後、各反応をＢｓａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、ゲル電気泳動によって分析する。ＶＡＣＶ（野生型）中には変異されたＢｓａＩ部位が存在しないので、酵素消化は、各ＰＣＲ産物を首尾よく消化し、より小さいＤＮＡ断片を生じる（図４Ａ、ＶＡＣＶ）。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムＤＮＡから生成されたＰＣＲ産物は、ＢｓａＩ消化に対して抵抗性であり、これは、ＢｓａＩ認識部位が、これらのゲノムにおいて首尾よく変異されたことを示唆している（図４Ａ、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５（ＰＰ１）およびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５（ＰＰ３））。プライマーセット７Ｃのプライマー産物は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５  ＰＰ１およびＰＰ３試料において、ＤＮＡのいずれの増幅も生じなかった。このプライマーセットが非機能的であったかどうか、または断片７のこの領域が、得られたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムへとアセンブルしなかったかどうかを確認するために、ＰＣＲを元のＧＡ＿断片＿７プラスミドＤＮＡに対して実施したが、この反応もまた、産物の増幅において不首尾であった。
【０２１８】
次に、ゲノムＤＮＡを、スクロース勾配精製されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムから単離し、ＢｓａＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＢｓａＩ部位の大部分が首尾よく変異されたことを確認する。興味深いことに、３つの異なるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローン由来の未消化のゲノムＤＮＡは、ＶＡＣＶと比較してゲル上で著しく緩徐に泳動し、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のゲノム（２１３，３０５ｂｐ）がＶＡＣＶ−ＷＲ（１９４，７１１ｂｐ）よりも大きいことが確認される（図４Ｂ、レーン２〜４をレーン５と比較する）。これらのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、ＢｓａＩ消化に対して抵抗性であり、ＰＦＧＥによる分離後に、１つの大きいＤＮＡ断片（約１９８０００ｂｐ）およびおよそ４０００ｂｐのより小さいＤＮＡ断片を生じる（図４Ａ、レーン７〜９）。これは、ＢｓａＩで消化した場合にゲル上で分離されるいくつかのＤＮＡ断片をもたらすＶＡＣＶ−ＷＲゲノムとは対照的である（図４Ｂ、レーン１０）。ＢｓａＩによるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムの消化後の予想されるＤＮＡサイズは比較的小さいので（表６）、これらの消化産物を従来のアガロースゲル電気泳動によって分離すると、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５が適切なサイズの断片を生成することが確認される（図４Ｃ、レーン２〜４）。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５が、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に正確なサイズのＤＮＡ断片を生じることも確認され、これは、これらの認識が、大きいＤＮＡ断片の合成の間維持されることを示唆している（表６；図４Ｂ、レーン１２〜１４；図４Ｃ、レーン６〜８）。全体として、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析は、化学的に合成されたＤＮＡ断片からのＨＰＸＶの再活性化が首尾よいことを示唆している。
【表６】
2019535311.tif 000009
【０２１９】
ＨＰＸＶ０９５は、非必須ＶＡＣＶ  Ｊ２Ｒ遺伝子のＨＰＸＶホモログをコードするので、ＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中に、断片＿３および他のＨＰＸＶクローンをＶＡＣＶ  ＤＮＡと共に共トランスフェクトすることによって、種々のハイブリッドウイルスを回収し、選択戦略を検証する（図１３Ａおよび１３Ｂ）。最初のハイブリッドウイルス（「ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶ＋断片３」）を、ＶＡＣＶ  ＤＮＡをＨＰＸＶ断片＿３（図１）と共にＳＦＶ感染細胞中に共トランスフェクトすることによって得る。緑色でタグ付けした挿入物は、ＹＰＦ−ｇｐｔ選択マーカーをコードする。クローン１〜３を、この最初のハイブリッドゲノムからＤＮＡを精製し、それをＨＰＸＶ断片２、４、５および７と共にＳＦＶ感染細胞中に再度トランスフェクトすることによって得る。ＨＰＸＶおよびＶＡＣＶの両方を標的化するように設計されたＰＣＲプライマー（表５）を使用して、ｓｃＨＰＸＶクローン中の変異されたＢｓａＩ部位にまたがるＤＮＡセグメントを増幅する。ＰＣＲ増幅後、産物をＢｓａＩで消化して、ＨＰＸＶ（切断しない）からＶＡＣＶ配列（切断する）を区別する。ＶＡＣＶ／ＨＰＸＶハイブリッドは、ＢｓａＩ感受性部位および抵抗性部位のミックスを示すが、再活性化されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローンは、完全にＢｓａＩ抵抗性である。
【０２２０】
（実施例５）
全ゲノム配列分析によるｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム配列の確認
材料および方法
ウイルスＤＮＡの単離および配列決定
ＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５クローン（プラークピック［ＰＰ］１．１、ＰＰ２．１およびＰＰ３．１］）のストックを、スクロース勾配上で調製および精製する。ウイルスＤＮＡを、プロテイナーゼＫ消化とその後のフェノール−クロロホルム抽出を使用して、各精製されたウイルス調製物から抽出する。ｄｓＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定する。各ウイルスゲノムを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＡｌｂｅｒｔａのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＢＳＵ）で配列決定する。配列決定ライブラリーを、Ｎｅｘｔｅｒａ  Ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して生成する。およそ５０ｎｇの各試料を剪断し、ゲノムにわたって３，１００読み取り／ｎｔならびにＦ−ヘアピンおよびＳ−ヘアピンにおいて約１９０読み取り／ｎｔの平均読み取り深度でＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを使用するペアードエンド配列決定（２×３００ｂｐ）のためにライブラリーを調製する。
【０２２１】
配列アセンブリ、分析およびアノテーション
ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ８．５ソフトウェアを使用して、生配列決定読み取りから低品質の配列スコアをトリミングし、ＨＰＸＶ参照配列［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ７９２５０４］に最初にマッピングする。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５配列内の全てのヌクレオチド挿入、欠失および置換を、ＨＰＸＶ参照配列に対して検証する。Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｕｔｉｌｉｔｙ（ＧＡＴＵ）（Tcherepanov  V、Ehlers  A、Upton  C.  Genome  Annotation  Transfer  Utility  (GATU):  rapid  annotation  of  viral  genomes  using  a  closely  related  reference  genome.  BMC  Genomics.  ２００６年；７巻：１５０頁、電子出版２００６年６月１５日）を使用して、参照アノテーションをｓｃＨＰＸＶゲノム配列に移行させる。
【０２２２】
結果
精製されたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノムを、多重アプローチおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑシーケンサーを使用して配列決定する。配列読み取りを、野生型ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）およびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照配列上にマッピングして、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中の具体的な改変の存在を確認する。ＶＡＣＶ末端反復配列が左ＩＴＲの末端終端に正確にライゲートされたことを確認するために、ゲノムのこの領域中の配列決定読み取りを分析する。ＣのストリングをｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム参照配列の先頭に付加して、この領域中のマッピングされた全ての配列読み取りを捕捉する（図５Ａおよび５Ｂ）。配列読み取りをアセンブルするために使用されるプログラムは、そうしなければ、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム参照配列が終わるポイントにおいて配列の表示を短縮するので、これを実施する。
【０２２３】
ＳａｐＩ認識部位は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照ゲノム中に存在するが、全ての配列決定読み取りがこの配列を欠くことが、マッピングされた読み取りから明らかである。これにより、本明細書に記載されるアプローチが、合成ヘアピンがＩＴＲの終端にライゲートされた部位において、信頼できるＨＰＸＶ配列を生じることが確認される。ＩＴＲ終端にライゲートされた合成ｓｓＤＮＡの配列に対して同一であることが判明した、ＶＡＣＶ  ＷＲ末端ヘアピンループの完全な配列もまた首尾よく得られる。全体として、これらのデータは、ＶＡＣＶ−ＷＲ末端ヘアピンループが、ＨＰＸＶ  ＩＴＲ配列に首尾よくライゲートされ、感染性ウイルスにおいて回復されることを示唆している。さらに、５つのウイルスの各々におけるＦ−読み取りおよびＳ−読み取りの１：１分布は、両方の終端がウイルスを産生するために必要であることを示唆した（図５Ｂ）。
【０２２４】
次に、ＢｓａＩ部位をサイレントに変異させる各ヌクレオチド置換が、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中に正確に取り込まれたことを検証する（図６）。配列決定読み取りを、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）参照配列にマッピングする。領域９６，０５０〜９６，５００のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５中のＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定読み取りカバー度全体が、図６Ａに示される。この領域中に参照ＨＰＸＶと正確にアラインしない２つの矛盾が存在することが、本明細書から明らかである（図６Ａ、青色および黄色の垂直線）。これらの領域の拡大図から、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中の９６，２３９位にＴからＣへの置換が存在し（図６Ｂ）、９６，４３７位にＡからＧへの置換が存在する（図６Ｃ）ことが明らかである。選択されたＢｓａＩおよびＡａｒＩ認識部位を変異させるために導入されるヌクレオチド置換が全て、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中に創出されていることが検証された（表２）。
【０２２５】
最後に、ＧＡ＿断片＿２中に独自の制限部位を創出するために設計されたＨＰＸＶ０４４中のヌクレオチド置換もまたｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５ゲノム中に取り込まれることが決定される。ＨＰＸＶ０４４（領域４４，４００〜４５，１００）にマッピングされる配列決定読み取りが図７Ａに示される。この領域内には、配列決定読み取りがＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５参照配列中の配列の配列決定読み取りと矛盾する２つの領域が存在する（図７Ａ、黄色の垂直線）。これらの領域の拡大図から、ＴからＧへの置換２つが、４４，５１２位および４５，０６１位においてＨＰＸＶ０４４の非コード鎖中に導入され、そうして、断片＿２中にＡｖａＩおよびＳｔｕＩ制限部位を創出することが明らかである（図７Ｂおよび７Ｃ）。全体として、配列決定データは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏゲノム分析データを裏付け、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５がＳＦＶ感染細胞において首尾よく再活性化されることを確認する。
【０２２６】
（実施例６）
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、ＨｅＬａ細胞において、他のポックスウイルスと比較して緩徐に複製する
材料および方法
ＢＳＣ−４０、ＨｅＬａおよびＨＥＬ線維芽細胞は、元々Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ＢＳＣ−４０細胞を、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質および抗真菌薬、ならびに５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させる。ＨｅＬａおよびＨＥＬ細胞を、Ｌ−グルタミン、抗生物質および抗真菌薬、ならびに１０％ＦＣＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、５％ＣＯ２中で３７℃で繁殖させる。
【０２２７】
結果
多段階増殖曲線およびプラークサイズ測定値を使用して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５が、他のオルソポックスウイルスと同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製し広がるかどうかを評価する。天然のＨＰＸＶ単離体は入手不能であるので、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖を、プロトタイプポックスウイルスであるＶＡＣＶ（株ＷＲ）、ＨＰＸＶと密接に関連するポックスウイルスである牛痘ウイルス（ＣＰＸ）、およびＤｒｙｖａｘウイルスのクローンであるＤＰＰ１５と比較する。サル腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−４０）、Ｖｅｒｏ細胞、ヒト癌腫細胞株（ＨｅＬａ）および初代ヒト線維芽細胞（ＨＥＬ）に、低ＭＯＩでＶＡＣＶ  ＷＲ、ＣＰＸ、ＤＰＰ１５またはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、感染細胞を、７２時間の時間経過にわたって収集する。ＢＳＣ−４０細胞では、ウイルスの複製および広がりの速度は、試験した全てのウイルス間で同等である（図８Ａ）。重要なことに、試験した他のポックスウイルスのいずれかだけでなく、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５も複製する。ウイルスは、ＨＥＬ細胞およびＶｅｒｏ細胞上でいくらかより低い力価まで増殖し、ＨｅＬａ細胞上では最も増殖が低かった。ＨｅＬａ細胞では、ウイルス産生における最大で１．５ｌｏｇの減少が、他のオルソポックスウイルスと比較して見られる。
【０２２８】
次に、ＢＳＣ−４０細胞において増殖したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のプラークサイズを測定する。ＶＡＣＶ  ＷＲおよびさらには牛痘ウイルスと比較して、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のプラークサイズにおける統計的に有意な減少（図８Ｂ）が観察される。興味深いことに、ＢＳＣ−４０細胞では、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５は、試験した全ての他のオルソポックスウイルスと比較した場合、最も小さいプラークを生じる（図８Ｃ）。また、異なるＶＡＣＶ株は、より小さい二次プラークを形成する細胞外ウイルスを生じるが、これらは、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５によっては生成されない（図８Ｃ）。全体として、これらのデータは、本明細書に記載される系を使用したｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化が、他のオルソポックスウイルスと比較した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルスの複製および広がりにおいて、いずれの明らかな欠陥も導入しないことを示唆している。さらに、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のプラークサイズは牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）のものと類似しており、これは、合成ウイルスの再活性化が、他のＨＰＸＶ様クローンで先に観察された小さいプラークの表現型に対して、いずれの有害な影響も有さないことを示唆している（Medaglia  ML、Moussatche  N、Nitsche  A、Dabrowski  PW、Li  Y、Damon  IKら、Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.    Journal  of  virology.  ２０１５年；８９巻（２３号）：１１９０９〜２５頁）。
【０２２９】
（実施例７）
ｙｆｐ／ｇｐｔ選択マーカーの除去
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の再活性化後、ＨＰＸＶ０９５遺伝子座中のｙｆｐ／ｇｐｔ選択マーカーを除去する。これを行うために、ＨＰＸＶ（ＤＱ７９２５０４）中のヌクレオチド位置９１５７３〜９２９２１に対応する配列の１３４９ｂｐ領域を合成する（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（配列番号６０）。この断片は、野生型ＨＰＸＶ０９５／Ｊ２Ｒ遺伝子のいずれかの側に隣接する、およそ４００ｂｐの相同性を含んだ。ＤＮＡのこの配列を、ＧｅｎｅＡｒｔによって提供される市販のベクター中にクローニングする。ＨＰＸＶ０９５遺伝子配列でｙｆｐ／ｇｐｔカセットを置き換えるために、ＢＳＣ−４０細胞に、０．５のＭＯＩでｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５を感染させ、次いで、２時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、野生型ＨＰＸＶ０９５配列を含む直鎖化されたプラスミド２μｇをトランスフェクトする。ウイルス組換え体を、感染の４８時間後に収集し、組換えウイルス（ｓｃＨＰＸＶ（野生型））を、寒天下での３ラウンドの非蛍光プラーク精製を使用して単離する。ＨＰＸＶ０９５遺伝子遺伝子座に隣接するプライマーを使用するＰＣＲを使用して、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）の同一性を確認する。ＨＰＸＶ０９５遺伝子の正確な置き換えを確認するために使用されるプライマーは、ＨＰＸＶ０９５＿ｃｈｅｃｋ−ＦＷＤ  ５’−ＣＣＴＡＴＴＡＧＡＴＡＣＡＴＡＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧ−３’（配列番号６１）およびＨＰＸＶ０９５＿ｃｈｅｃｋ−ＲＥＶ  ５’−ＣＧＧＴＴＴＡＴＣＴＡＡＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号６２）である。
【０２３０】
（実施例８）
ｓｃＨＰＸＶ（野生型）対ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖特性
実施例６に上記したように実施した実験では、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５と顕著には異ならない増殖特性を示す（図１４Ａ〜Ｃ）。ＶＡＣＶ  ＷＲと比較して、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）のプラークサイズにおける統計的に有意な減少が観察される（図１４Ａ）。ｓｃＨＰＸＶ（野生型）は、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５と同様、細胞外ウイルスを産生せず（図１４Ｂ）、ＢＳＣ−４０細胞、ＨＥＬ細胞、ＨｅＬＡ細胞およびＶｅｒｏ細胞上でのｓｃＨＰＸＶ（野生型）およびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の増殖には、有意差は存在しない（図１４Ｃ）。ｓｃＨＰＸＶ（野生型）が細胞外ウイルスを産生しないという知見は、この特性がビルレンスに影響を与えることを考慮すると適切である。
【０２３１】
（実施例９）
マウス鼻腔内モデルにおけるｓｃＨＰＸＶ（野生型）のビルレンスの決定
ｓｃＨＰＸＶ（野生型）の毒性効果をこの研究で決定する。この実験のために、６群のＢａｌｂ／ｃマウスに、実施例１〜７に記載したｓｃＨＰＸＶ（ΔＨＰＸＶ＿０９５／Ｊ２Ｒ）またはｓｃＨＰＸＶ（野生型）の３つの異なる用量を投与し、ＰＢＳ対照群ならびにＶＡＣＶ（ＷＲ）対照群およびＶＡＣＶ（Ｄｒｙｖａｘ株ＤＰＰ１５）対照群と比較する（合計で９つの処置群）。研究の持続時間にわたっていずれの処置も受けない３匹のさらなるマウスを、この実験に含める。全てのマウスから、実験を通じた所定の時点において血液を試料採取し、さらなるマウスが、血清分析のためのベースラインとして機能する。
【０２３２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの接種の前に、全てのウイルス株を、ＢＳＣ−４０細胞（アフリカミドリザル腎臓）中で増殖させ、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、ダウンス型のホモジナイゼーションによって細胞から抽出し、３６％スクロースクッションを介した遠心分離によって精製し、ＰＢＳ中に再懸濁し、最終濃度が以下になるように力価決定する：１）ＶＡＣＶ（ＷＲ）−５×１０５ＰＦＵ／ｍｌ；２）ＶＡＣＶ（ＤＰＰ１５）−１０９ＰＦＵ／ｍｌ；３）ｓｃＨＰＸＶ（ΔＨＰＸＶ＿０９５／Ｊ２Ｒ）−１０７ＰＦＵ／ｍｌ、１０８ＰＦＵ／ｍｌおよび１０９ＰＦＵ／ｍｌ、ならびに４）ｓｃＨＰＸＶ（野生型）−１０７ＰＦＵ／ｍｌ、１０８ＰＦＵ／ｍｌおよび１０９ＰＦＵ／ｍｌ。
【０２３３】
この研究のために選択されたｓｃＨＰＸＶ用量（１０５ＰＦＵ／用量、１０６ＰＦＵ／用量および１０７ＰＦＵ／用量）は、ＤｒｙｖａｘおよびＩＯＣを含む、ＶＡＣＶの公知のワクチン株を使用した以前の研究に基づく（Medaglia  ML、Moussatche  N、Nitsche  A、Dabrowski  PW、Li  Y、Damon  IKら、Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.    Journal  of  virology.  ２０１５年；８９巻（２３号）：１１９０９〜２５頁；Qin  L、Favis  N、Famulski  J、Evans  DH.  Evolution  of  and  evolutionary  relationships  between  extant  vaccinia  virus  strains.  Journal  of  virology.  ２０１５年；８９巻（３号）：１８０９〜２４頁）。
【０２３４】
体重減少は、マウスにおけるビルレンスの測定値として使用されるので、ＶＡＣＶ（株ＷＲ）を、およそ２０〜３０％の体重減少をもたらす５×１０３ＰＦＵの用量で鼻腔内投与する。ＶＡＣＶ  ＤｒｙｖａｘクローンＤＰＰ１５もまた、この周知の天然痘ワクチンのビルレンスをｓｃＨＰＸＶ（野生型）と直接比較できるように、１０７ＰＦＵ／用量で鼻腔内投与する。マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、受取り後、ウイルス投与の前に少なくとも１週間にわたって環境に順化させる。
【０２３５】
各マウスは、麻酔下での鼻腔内注射を介して投与される単一用量のウイルス（約１０ｕｌ）を受ける。マウスを、感染の徴候、例えば、腫脹、分泌（discharge）または他の異常について、３０日間の期間にわたって毎日モニタリングする。各マウスを、ウイルス投与後毎日、体重減少について具体的にモニタリングする。他の罹患率因子に加えて、体重の２５％よりも多くを失うマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａにおいて動物ヘルスケア施設プロトコールに従って安楽死に供する。
【０２３６】
試験した最も高い用量のｓｃＨＰＸＶでさえ、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける病気の明白な徴候が存在しない場合がある。ｓｃＨＰＸＶと最も密接に関連するＶＡＣＶ株である旧南アメリカウイルス（old  South  American  virus）は、一部の場合には、１０７ＰＦＵで疾患を生じなかった（Medaglia  ML、Moussatche  N、Nitsche  A、Dabrowski  PW、Li  Y、Damon  IKら、Genomic  Analysis,  Phenotype,  and  Virulence  of  the  Historical  Brazilian  Smallpox  Vaccine  Strain  IOC:  Implications  for  the  Origins  and  Evolutionary  Relationships  of  Vaccinia  Virus.    Journal  of  virology.  ２０１５年；８９巻（２３号）：１１９０９〜２５頁）。１０９ＰＦＵ／ｍＬを超える力価を有する精製されたストックを作製することは困難であるので、これよりもかなり高い用量を試験することは実用的ではない。
【０２３７】
（実施例１０）
ｓｃＨＰＸＶが致死ＶＡＣＶ−ＷＲ抗原投与に対する免疫保護を付与するかどうかを決定する
実施例９に記載される初回ウイルス投与によって影響されなかったように見えるマウスは、実験を通じて正常に体重が増加し続けた。ウイルス接種の３０日後、マウスを、鼻腔内接種を介して致死用量のＶＡＣＶ−ＷＲ（１０６ＰＦＵ／用量）で引き続いて抗原投与する。マウスを、上記のように、感染の徴候について入念にモニタリングする。マウスを毎日体重測定し、他の罹患率因子に加えて、体重の２５％よりも多くを失うマウスは安楽死に供する。本発明者らは、致死用量のＶＡＣＶ−ＷＲの投与の前にＰＢＳを接種したマウスは、接種後７〜１０日以内に、顕著な体重減少および他の罹患率因子の徴候を示すと予想している。ＶＡＣＶ−ＷＲによる致死抗原投与のおよそ１４日後、全てのマウスを安楽死させ、血液を収集して、標準的なプラーク減少アッセイによって血清中のＶＡＣＶに特異的な中和抗体の存在を確認する。
【０２３８】
（実施例１１）
ＳＦＶにより触媒される組換えおよび再活性化反応を使用した、合成キメラＶＡＣＶ（株ＡＣＡＭ２０００）（ｓｃＡＣＡＭ２０００）の構築
ＶＡＣＶ（ＡＣＡＭ２０００）ゲノムの重複する断片の設計
ＶＡＣＶゲノムの公開された配列（株ＡＣＡＭ２０００；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３１３８４７）を使用して、ゲノムを、１５，９７９ｂｐ〜２８，７９５ｂｐ長のサイズ範囲の９個の重複する断片（図９）へと分割する（表７）。これらの断片を、相同組換えが全長ゲノムのアセンブリを駆動できる部位を提供するために、各隣接断片と少なくとも１．０ｋｂｐの重複する配列相同性を共有するように設計する（表７）。これらの重複は、共トランスフェクトされた断片間での正確かつ効率的な組換えを支持するのに十分でなければならない。
【０２３９】
これらの大きい断片を首尾よく合成およびサブクローニングするために、ＶＡＣＶ＿ＡＣＡＭ２０００断片１〜７中の各ＢｓａＩおよびＡａｒＩ部位をサイレントに変異させる。ｓｃＨＰＸＶの創出と同様、効率的なＤＮＡ複製およびコンカテマー分割にとって重要であったＤＮＡ配列特色が存在する場合、２つのＩＴＲコード断片中のＢｓａＩ制限部位は変異させない。
【０２４０】
初回再活性化のために、ＶＡＣＶ（ＡＣＡＭ２０００）中のチミジンキナーゼをｙｆｐ／ｇｐｔカセットで置き換えて、新たに再活性化されたＶＡＣＶ粒子の回収を助ける。
【表７】
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【０２４１】
ＶＡＣＶ  ＩＴＲの左および右終端へのＳ形態およびＦ形態の末端ループ（ＶＡＣＶ株ＡＣＡＭ２０００由来）のライゲーション
ＳＦＶ感染細胞中にトランスフェクトされるＶＡＣＶ  ＩＴＲ断片を調製するために、末端ヘアピンループを、ＶＡＣＶヘアピンをＨＰＸＶテロメアに結合させるのに使用した、記載された同じ方法を使用して、左および右ＩＴＲ断片にライゲートさせる。簡潔に述べると、ＤＮＡ合成を介して、３ヌクレオチドから構成される５’オーバーハングが、各ヘアピンの終端に残される（５’−ＡＣＡ；実施例１および２に記載されるとおり）。一方、左および右ＶＡＣＶ  ＩＴＲ断片をコードするプラスミドクローンを、ＶＡＣＶゲノムの開始をコードする最初のヌクレオチドにすぐ隣接する位置にあるＳａｐＩ認識部位をコードするように設計する。ＩＴＲクローンをＳａｐＩで消化することで、末端ヘアピンループ構造中の５’−ＡＣＡオーバーハングに対して相補的な３塩基オーバーハング（５’−ＴＧＴ）を創出する。左または右ＩＴＲ断片を、約２０倍モル過剰の末端ループと混合し、ライゲートさせる。これは、各ＩＴＲのヘアピン終結したコピーを生成する。
【０２４２】
ｓｃＡＣＡＭ２０００のレポリポックスウイルスにより触媒される組換えおよび再活性化
ＶＡＣＶゲノムＤＮＡ断片の消化およびＤＮＡ浄化後、これらをＳＦＶ感染ＢＧＭＫ細胞中にトランスフェクトする。先に記載したように、ＳＦＶヘルパーウイルスは、隣接する相同な配列を共有する断片間での組換えを触媒して、パッケージングされ細胞から放出され得る全長ＶＡＣＶゲノムの創出を生じる。ハイブリッドウイルスがこのアッセイで産生される可能性は低い。４日後、ＢＧＭＫ細胞を収集し、再活性化されたＶＡＣＶウイルス粒子を、凍結−解凍によって放出させ、その後感受性ＢＳＣ−４０細胞上にプレーティングする。再活性化されたＶＡＣＶ（ＡＣＡＭ２０００）プラークは、ＢＳＣ−４０細胞上でプラークを形成する唯一のウイルスである。プラークをピックしてクローン性ウイルスストックを産生し、その後、ｎｅｘｔＧｅｎ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定によって配列決定されるゲノムＤＮＡを単離して、回収されたウイルスの完全性を確認し、ｓｃＡＣＡＭ２０００が首尾よく再活性化されたかどうかを同定する。
【０２４３】
（実施例１２）
小動物モデルにおけるｓｃＨＰＸＶの安全性および免疫原性
材料および方法
ｓｃＨＰＸＶ感染のマウス鼻腔内モデル。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入する。５匹のマウスの群に、１０μｌのＰＢＳ中５×１０３ＰＦＵのＶＡＣＶ（株ＷＲ）、１×１０７のＶＡＣＶ（Ｄｒｙｖａｘ  ＤＰＰ１５）、または１×１０５ＰＦＵ、１×１０６ＰＦＵもしくは１×１０７ＰＦＵのｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５（実施例１〜６に記載される）もしくはｓｃＨＰＸＶ（野生型）（実施例７および８に記載される）を、鼻腔内感染させる（またはモック感染させる）。マウスを、２８日間にわたって毎日体重測定し、以下の臨床的徴候をスコアする：被毛の乱れ、呼吸困難、低減された運動性およびポックス病変。初期体重の２５％を失うマウスは安楽死させる。これらのワクチン接種マウスを、１×１０６ＰＦＵのＶＡＣＶ（株ＷＲ）で引き続いて鼻腔内抗原投与し、上記のように１３日間にわたって毎日、体重測定し、疾患の臨床的徴候についてモニタリングする。初期体重の２５％を失うマウスは、現地の動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って安楽死させる。
【０２４４】
結果
ｓｃＨＰＸＶ株は、ポックスウイルス感染の鼻腔内マウスモデルにおいて体重減少を引き起こさない
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５またはｓｃＨＰＸＶ（野生型）の毒性効果を、ポックスウイルス感染の鼻腔内マウスモデルにおいて試験する。マウスに、示された用量のｓｃＨＰＸＶ（野生型）を鼻腔内接種し、その体重を２８日間の期間にわたってモニタリングする。２８日間の期間にわたって、ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５またはｓｃＨＰＸＶ（野生型）の用量のいずれを接種したマウスにおいても体重減少は見られない（図１０）。これは、それぞれ初期体重の平均で１５％および１０％を失う、Ｄｒｙｖａｘ  ＤＰＰ１５（１０７ＰＦＵ）またはＶＡＣＶ  ＷＲ（５×１０３ＰＦＵ）のいずれかを接種した動物とは対照的である。これらのデータは、試験したｓｃＨＰＸＶ（野生型）およびｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の最も高い用量（１０７ＰＦＵ）であっても、有害効果が観察されないことを示唆している。しかし、公知の天然痘ワクチン株ＤＰＰ１５を用いると、一過的な体重減少が、接種の約７日後までにマウスにおいて検出されるが、これらのマウスは、接種の約１０日後までに初期体重に戻る。
【０２４５】
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５（１０６および１０７ＰＦＵ）およびｓｃＨＰＸＶ（野生型）（１０５、１０６、１０７ＰＦＵ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて致死ＶＡＣＶ  ＷＲ抗原投与に対する免疫保護を付与する
ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５、ｓｃＨＰＸＶ（野生型）、ＤＰＰ１５およびＶＡＣＶ  ＷＲの示された株によるＢＡＬＢ／ｃマウスの２８日間の免疫化（図１０）後、マウスを、致死鼻腔内用量のＶＡＣＶ  ＷＲ（１０６ＰＦＵ）で引き続いて抗原投与して、マウスにおけるｓｃＨＰＸＶ（野生型）またはｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５の保護有効性を評価する。ＰＢＳで最初に処置したマウスは全て、感染で死亡するが、１０７ＰＦＵのＤｒｙｖａｘ（ＤＰＰ１５）または５×１０３ＰＦＵのＶＡＣＶ  ＷＲに最初に曝露させた動物は、体重減少を示さず（図１１Ａ）、病気の徴候を示さない（図１１Ｂ）。２つのより低い用量のｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５でワクチン接種した動物は、体重減少（図１１Ａ）および臨床スコアに基づく重症の病気の徴候（図１１Ｂ）を示し、最も低いｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５用量の２匹の動物も感染で死亡することが観察される（図１２）。ｓｃＨＰＸＶ  ＹＦＰ−ｇｐｔ：：０９５のこれらの低用量群中の残りの動物は、感染から回復することが最終的に観察されるが、その体重は、群の残りにおける平均体重よりも低いままである。１０５〜１０７ＰＦＵのｓｃＨＰＸＶ（野生型）に先に曝露させた動物は、ポックスウイルス抗原投与後の最初の数日間に軽微な一過的な体重減少のみを示し（図１１Ａ）、病気の臨床的徴候は示さない（図１１Ｂ）。これらのデータは、ｓｃＨＰＸＶがマウスに感染でき、致死ＶＡＣＶ抗原投与に対してマウスを免疫化でき、初回免疫化ステップの間に疾患を引き起こすことなくそれを行うことができることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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