(57)【要約】対象において骨壊死を処置する方法が提供される。いくつかの態様では、該方法は、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、骨壊死を有するかまたは骨壊死を有することが疑われる対象に投与する工程を含む。いくつかの態様では、該薬学的組成物は、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(LLP2A-Ale)を含む。いくつかの態様では、該方法は、外因性間葉系幹細胞を投与する工程をさらに含む。2019506386.tif 000011
2019506386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む、該対象において骨壊死を処置する方法。
【請求項２】
前記薬学的組成物が、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)を含み、該コンジュゲートが、式：
2019506386.tif 000008
を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記投与する工程の前に、少なくとも1つの骨に少なくとも1つの骨壊死性病変(osteonecrotic lesion)を有する対象を特定する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも1つの骨が、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、または顎の骨である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記特定する工程が、前記少なくとも1つの骨の磁気共鳴画像化を含む、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記特定する工程が、少なくとも3.5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む、請求項3から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記特定する工程が、少なくとも5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記投与する工程の後に、前記少なくとも1つの骨壊死性病変の大きさを測定する工程、および、該投与する工程の前の該骨壊死性病変の大きさと比べた該骨壊死性病変の大きさの減少を検出する工程をさらに含む、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記骨壊死が外傷性骨壊死である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨壊死が、グルココルチコイド誘導性骨壊死またはアルコール誘導性骨壊死である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
外因性間葉系幹細胞を投与する工程をさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬学的組成物および前記外因性間葉系幹細胞が同時に投与される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬学的組成物および前記外因性間葉系幹細胞が連続的に投与される、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬学的組成物が全身的に投与される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬学的組成物が局所的に投与される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬学的組成物が、前記少なくとも1つの骨壊死性病変の部位に局所的に投与される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬学的組成物が静脈内に投与される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬学的組成物が注射によって投与される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む、骨壊死組織において血管密度を増大させる方法。
【請求項２０】
前記薬学的組成物が、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)
を含み、該コンジュゲートが、式：
2019506386.tif 000009
を有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与する工程の前に、少なくとも1つの骨に少なくとも1つの骨壊死性病変を有する対象を特定する工程をさらに含む、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも1つの骨が、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、または顎の骨である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記特定する工程が、前記少なくとも1つの骨の磁気共鳴画像化を含む、請求項21または22に記載の方法。
【請求項２４】
前記特定する工程が、少なくとも3.5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む、請求項21から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記特定する工程が、少なくとも5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記骨壊死が外傷性骨壊死である、請求項19から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨壊死が、グルココルチコイド誘導性骨壊死またはアルコール誘導性骨壊死である、請求項19から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
外因性間葉系幹細胞を投与する工程をさらに含む、請求項19から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬学的組成物および前記外因性間葉系幹細胞が同時に投与される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬学的組成物および前記外因性間葉系幹細胞が連続的に投与される、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬学的組成物が全身的に投与される、請求項19から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬学的組成物が局所的に投与される、請求項19から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬学的組成物が、前記少なくとも1つの骨壊死性病変の部位に局所的に投与される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬学的組成物が静脈内に投与される、請求項19から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬学的組成物が注射によって投与される、請求項19から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む、骨壊死組織において細胞死を予防するかまたは低減させる方法。
【請求項３７】
前記薬学的組成物が、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)
を含み、該コンジュゲートが、式：
2019506386.tif 000010
を有する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与する工程の前に、少なくとも1つの骨に少なくとも1つの骨壊死性病変を有する対象を特定する工程をさらに含む、請求項36または37に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも1つの骨が、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、または顎の骨である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記特定する工程が、前記少なくとも1つの骨の磁気共鳴画像化を含む、請求項38または39に記載の方法。
【請求項４１】
前記特定する工程が、少なくとも3.5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記特定する工程が、少なくとも5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記骨壊死が外傷性骨壊死である、請求項36から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記骨壊死が、グルココルチコイド誘導性骨壊死またはアルコール誘導性骨壊死である、請求項36から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
外因性間葉系幹細胞を投与する工程をさらに含む、請求項36から44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記薬学的組成物および前記外因性間葉系幹細胞が同時に投与される、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記薬学的組成物および前記外因性間葉系幹細胞が連続的に投与される、請求項45に記載の方法。
【請求項４８】
前記薬学的組成物が全身的に投与される、請求項36から51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記薬学的組成物が局所的に投与される、請求項36から47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬学的組成物が、前記少なくとも1つの骨壊死性病変の部位に局所的に投与される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記薬学的組成物が静脈内に投与される、請求項36から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記薬学的組成物が注射によって投与される、請求項36から50のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み入れられる、2016年1月14日に出願された米国特許仮出願第62/278,921号に対する優先権を請求する。
【０００２】
連邦政府支援の研究および開発の下で行われた発明に対する権利に関する記載
本発明は、National Institutes of Healthにより認可された、助成金番号AR0631366の下での政府支援により行われた。米国政府は本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
骨壊死は、無血管性壊死としても知られ、骨の領域における血液供給の障害によってその領域における骨が死んでしまう障害である。2種類の骨壊死の外傷性骨壊死および非外傷性骨壊死が存在する。外傷性骨壊死では、骨折または脱臼などの骨への損傷が該骨において血管を傷つける。非外傷性骨壊死では、血液供給の障害および骨壊死は、直接的な外傷または損傷なしに起こる。いくつかの場合では、患者における骨の死滅の原因は不明である(特発性骨壊死)。
【０００４】
骨壊死は、股関節、肩、膝、足首、手首、および顎を含むがこれらに限定されない、体内の任意の複数の骨および関節に発症する可能性がある。処置せずに放置した場合、または初期治療が成功しない場合、骨壊死は、骨の圧潰および骨の周囲の関節の破壊をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【０００５】
1つの局面では、対象において骨壊死を処置する方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む。
【０００６】
いくつかの態様では、対象は、少なくとも1つの骨、例えば、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、または顎の骨に骨壊死を有するか、または骨壊死を有することが疑われる。いくつかの態様では、投与する工程の前に、方法は、少なくとも1つの骨に少なくとも1つの骨壊死性病変(osteonecrotic lesion)有する対象を特定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、薬学的組成物を投与する工程の前に、少なくとも1つの骨壊死性病変の大きさを測定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、薬学的組成物を投与する工程の後に、少なくとも1つの骨壊死性病変の大きさを測定する工程、および、投与する工程の前の骨壊死性病変の大きさと比べた骨壊死性病変の大きさの減少を検出する工程をさらに含む。いくつかの態様では、薬学的組成物を投与する工程の前の骨壊死性病変の大きさと比べた、骨壊死性病変の大きさの減少は、骨壊死が対象において処置されていることを示す。
【０００７】
別の局面では、(例えば、対象における、例えば、骨壊死組織を有するかまたは有することが疑われる対象における)骨壊死組織において血管密度を増大させる方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む。
【０００８】
いくつかの態様では、投与する工程の前に、方法は、骨壊死組織(例えば、少なくとも1つ骨に少なくとも1つ骨壊死性病変)を有する対象を特定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、薬学的組成物を投与する工程の前に、少なくとも1つの骨壊死性病変を有する少なくとも1つの骨における血管密度の量を測定する工程(例えば、骨壊死性病変の部位における血管密度またはその周囲の血管密度の量を測定する工程)をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、薬学的組成物を投与する工程の後に、少なくとも1つの骨壊死性病変を有する少なくとも1つの骨における血管密度の量を測定する工程(例えば、骨壊死性病変の部位における血管密度またはその周囲の血管密度の量を測定する工程)をさらに含む。いくつかの態様では、薬学的組成物を投与する工程の前の血管密度の量と比べてより高い血管密度の量(例えば、骨壊死性病変の部位におけるまたはその周りの)は、血管密度が骨壊死組織において増大していることを示す。
【０００９】
さらに別の局面では、(例えば、骨壊死組織を有するかまたはそれを有することが疑われる、対象において)骨壊死組織において細胞死を予防するかまたは低減させる方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む。
【００１０】
いくつかの態様では、投与する工程の前に、方法は、骨壊死組織(例えば、少なくとも1つの骨に少なくとも1つの骨壊死性病変)を有する対象を特定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、薬学的組成物を投与する工程の前に、(例えば、少なくとも1つの骨壊死性病変の部位におけるまたはその周りの)少なくとも1つの骨壊死組織におけるアポトーシス細胞および/または壊死細胞の量を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、薬学的組成物を投与する工程の後に、(例えば、少なくとも1つの骨壊死性病変の部位におけるまたはその周りの)少なくとも1つの骨壊死組織におけるアポトーシス細胞および/または壊死細胞の量を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様では、薬学的組成物を投与する工程の前のアポトーシス細胞および/または壊死細胞の量と比べた、(例えば、少なくとも1つの骨壊死性病変の部位におけるまたはその周りの)少なくとも1つの骨壊死組織におけるアポトーシス細胞および/または壊死細胞の量の減少が、細胞死が骨壊死組織において予防されているかまたは低減されることを示す。
【００１１】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)を含み、該コンジュゲートは、式：
2019506386.tif 000003
を有する。
【００１２】
いくつかの態様では、骨壊死は外傷性骨壊死である。いくつかの態様では、骨壊死は、グルココルチコイド誘導性骨壊死またはアルコール誘導性骨壊死である。いくつかの態様では、少なくとも1つ骨は、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、または顎の骨である。
【００１３】
いくつかの態様では、少なくとも1つの骨に少なくとも1つの骨壊死性病変を有する対象を特定する工程は、少なくとも1つの骨の磁気共鳴画像化を含む。いくつかの態様では、特定する工程は、少なくとも3.5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む。いくつかの態様では、特定する工程は、少なくとも5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を検出することを含む。
【００１４】
いくつかの態様では、方法は、外因性間葉系幹細胞を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様では、薬学的組成物および外因性間葉系幹細胞は同時に投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物および外因性間葉系幹細胞は連続的に投与される。
【００１５】
いくつかの態様では、薬学的組成物および外因性間葉系幹細胞の一方または両方は全身的に投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物および間葉系幹細胞の一方または両方は局所的に(例えば、少なくとも1つの骨壊死性病変の部位に局所的に)投与される。いくつかの態様では、少なくとも1つの骨壊死性病変の部位は、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、または顎の骨にある。
【００１６】
いくつかの態様では、薬学的組成物および間葉系幹細胞の一方または両方は静脈内に投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物および間葉系幹細胞の一方または両方は注射によって投与される。いくつかの態様では、薬学的組成物および間葉系幹細胞の一方または両方は、数日または数週間の間隔で隔てられた一連の用量で投与される。
【００１７】
いくつかの態様では、対象はヒトである。いくつかの態様では、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様では、対象は成体である。いくつかの態様では、対象は幼若体である。
【００１８】
別の局面では、骨壊死の処置のための、骨壊死組織における血管密度の増大のための、および/または骨壊死組織における細胞死の予防もしくは低減のための、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物の使用が提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)を含み、該コンジュゲートは、式：
2019506386.tif 000004
を有する。
【００１９】
いくつかの態様では、薬学的組成物は外因性間葉系幹細胞をさらに含む。
【００２０】
さらに別の局面では、骨壊死の治療のための、骨壊死組織における血管密度の増大のための、および/または骨壊死組織における細胞死の予防もしくは低減のための医薬の製造用の、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)を含み、該コンジュゲートは、式：
2019506386.tif 000005
を有する。
【００２１】
いくつかの態様では、薬学的組成物は外因性間葉系幹細胞をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】骨壊死の病期。上腕骨頭の骨壊死について、骨壊死の病期を示す。最初に血液供給の低下、続いて骨細胞の死があり、次いで、死んだ骨の部位は関節の使用を支持できないことから、上腕骨が圧潰する。
【図２】グルココルチコイド処置マウス由来の大腿骨の血管密度。4ヶ月齢の雄のマウスをグルココルチコイド(「GC」)またはプラセボで56日間処置した。28日目に、グルココルチコイド処置マウスの群をLLP2A-AleまたはPTHでさらに28日間処置した。大腿骨の血管密度を、発表された方法にしたがいマイクロCTによって屠殺後に測定した。* GCとPLとの間でp＜0.05、GC＋LLP2A-Aleは他の全ての群と有意に異なり、GC＋PTHは他の全ての群と有意に異なった。
【図３】グルココルチコイド処置マウス由来の大腿骨の血管密度。4ヶ月齢の雄マウスをグルココルチコイドまたはプラセボで56日間処置した。28日目に、グルココルチコイド処置マウスの群をLLP2A-AleまたはPTHでさらに28日間処置した。56日目に、動物に造影剤を与え、次いで屠殺し、次に、動物の大腿骨を脱灰し、次いでマイクロCTによってスキャンした。プラセボ群と比較して、GC処置は血管密度を低減させた。GC＋LLP2A-Aleは、GC単独と比較して血管密度を増大させ、GC＋PTHは血管密度を有意に変化させなかった。
【図４】グルココルチコイド処置マウスにおける血清VEGF-Aレベル。プラセボ(PL)、グルココルチコイド(GC)、グルココルチコイドおよび250 μg/kg LLP2A-Ale(GC＋LLP2A-Ale)、グルココルチコイドおよびPTH(GC＋PTH)、またはグルココルチコイドおよびPTHおよび250 μg/kg LLP2A-Ale(GC＋PTH＋LLP2A-Ale)で処置したマウスを、VEGFの血清レベルについて測定した。GC処置はVEGFの血清レベルを低下させた一方で、GC＋LLP2A-Aleはプラセボ処置動物のレベルに戻した。
【図５】皮質骨骨細胞アポトーシス。マウスをPLで56日間、GC単独で56日間、またはGC単独で28日間、次いで28日目にGCに加えて1用量のLLP2A-Aleで処置した。動物を56日目に屠殺し、アポトーシス性であった骨細胞の割合を測定した。GC処置単独は56日目に、アポトーシス性である骨細胞の数を増大させ、GC＋LLP2A-Aleは骨細胞アポトーシスを防止した。* 試験28日目で他の全ての群からp＜0.05。
【図６】グルココルチコイド処置マウスにおける海綿骨体積。マウスを28日間グルココルチコイド(GC)で処置し、次いで、LLP2A-Ale、PTH、またはLLP2A-Ale＋PTHのいずれかで処置した。評価基準は、遠位大腿骨にてインビボで測定された28から56日までの海綿骨量の変化(左パネル)、および椎骨海綿骨体積の海綿骨量変化(右パネル)であった。GC処置だけを受けるマウスは、28から56日までの遠位大腿骨でおおよそ40％の海綿骨量を失い、GCとLLP2A-AleまたはPTHのいずれかによる処置は、ベースライン/シャムレベルまで海綿骨体積を増大させた。GC＋LLP2A-Ale＋PTHの組み合わせは、プラセボ(PL)群を上回って遠位大腿骨で海綿骨量を増大させた。椎骨では、GC＋LLP2A-Ale＋PTHの組み合わせは、プラセボ(PL)群のレベルまで海綿骨量を回復させた。* 56日目の他の全ての群からp＜0.05、# GCに対してp＜0.05。
【図７】デキサメタゾン処置マウスにおける骨壊死の有症率。マウスを、デキサメタゾン(Dex)、飲用水中に4 mg/l、またはプラセボ(PL)(新鮮水)で90日間処置した。30日目に、Dex処置マウスを、Dex単独、Dex＋250 μg/kg LLP2A-Ale、Dex＋500 μg/kg LLP2A-Ale、およびDex＋750 μg/kg LLP2A-Aleに再無作為化した。LLP2A-Ale処置を30、45、60、および75日目に与えた。90日目に全マウスを安楽死させた。右および左の遠位大腿骨を、10％中性緩衝ホルマリン中に固定し、脱灰した。検体を脱水し、パラフィン中に包埋し、5マイクロメートルの切片に切断し、H&E染色した。5つの以下の特徴：(1)空胞化した骨小腔 (empty lacunae)、(2)空胞化した骨小腔および隣接する骨髄の壊死の部位における濃縮した骨細胞の核、(3)骨髄における過剰な脂肪細胞の存在、(4) 軟骨分解、および(5)血管中のフィブリン血栓の存在、の存在によって骨壊死を定義する、Yang et al., J. Orthop. Res., 27: 169-75(2009)によって報告された改変基準を用いて、明視野光学顕微鏡(bright light microscopy)によって骨壊死について切片を評価した。GC処置群およびプラセボ群各々を、5つの骨壊死の特徴全て、または上述の5つの骨壊死の特徴のうち少なくとも3つの存在について評価した。Dex単独で処置したマウスと比較して、3つまたはそれ以上の骨壊死の特徴を呈したLLP2A-Ale処置を受けたマウスはより少なかった(Dex のみの群：14/16(88％)；Dex＋LLP2A-Ale 250 μg/kg：12/16(75％)；Dex＋LLP2A-Ale 500 μg/kg：9/16(56％)；およびLLP2A-Ale 750 μg/kg：11/16(69％))。処置群当たりの5つの骨壊死の特徴を全て示すマウスの数もまた、Dex単独での処置と比較して、LLP2A-Ale処置を受けるマウスで低下した。
【図８】図8A〜B. デキサメタゾン処置マウスの大腿骨の空胞化した骨小腔の密度。図7で上述したようにプラセボ(PL)、デキサメタゾン単独(Dex)、Dex＋250 μg/kg LLP2A-Ale、Dex＋500 μg/kg LLP2A-Ale、またはDex＋750 μg/kg LLP2A-Aleで処置したマウスを、遠位大腿骨骨端領域内での空胞化した骨小腔の密度について評価した。各検体について同じ領域内の骨細胞の合計数で割った遠位大腿骨骨端領域全体における空胞化した骨小腔の数を決定することによって、空胞化した骨小腔の密度を算出した。Dexのみの群では、LLP2A-Ale処置群での試料の44〜62％と比較して、試料の75％が10％またはそれ以上の空胞化した骨小腔を有した。Dexのみの処置と比較して、10％未満の空胞化した骨小腔を有するLLP2A-Ale 250 μg/kg、LLP2A-Ale 500 μg/kg、およびLLP2A-Ale 750 μg/kgで処置した試料の数はより多かった。
【図９】図9A〜F. プラセボまたはデキサメタゾンで処置したマウス由来の大腿骨の組織学的評価。図7で上述したように、マウスをプラセボ(PL)またはデキサメタゾン単独(Dex)で処置した。全てのマウスを90日目に安楽死させた。右および左の遠位大腿骨を10％中性緩衝ホルマリン中に固定し、脱灰した。検体を脱水し、パラフィン中に包埋し、5マイクロメートルの切片に切断し、H&E染色した。切片を2人の経験のある組織学者がスコア化し、次いで、さらなる2人の組織学者がコンセンサスリーディングを行った。図9A〜9B：プラセボで処置したマウスにおける4×(A)および20×(B)拡大率の代表的な近位大腿骨骨端。(C) デキサメタゾン(Dex)単独で処置したマウスにおける4×拡大率の代表的な近位大腿骨骨端。図9D、9E、および9F：デキサメタゾン(Dex)単独で処置したマウスにおける20×拡大率の代表的な近位大腿骨骨端。デキサメタゾン処置マウスでは、骨髄腔の大部分は、脂肪((D〜F)の青矢印)、壊死骨髄の発生((E)の緑矢印)、および骨梁によって占められ、空胞化した骨小腔(黒矢印)、骨細胞の濃縮核((D)の黄色矢印)によって特徴付けられ、壊死性脂肪デブリによって囲まれる。
【図１０】図10A〜B. 処置マウス由来の大腿骨の脂肪体積および洞様毛細血管体積。図7で上述したように、マウスをプラセボ(PL)、デキサメタゾン単独(Dex)、Dex＋250 μg/kg LLP2A-Ale、Dex＋500 μg/kg LLP2A-Ale、またはDex＋750 μg/kg LLP2A-Aleで処置した。(A)マウスを遠位大腿骨骨端領域内の脂肪体積について評価した。LLP2A-Ale処置を受けたマウスは、Dex単独で処置したマウスと比較して脂肪体積が低下していた。(B)マウスを骨髄中の洞様毛細血管について評価した。LLP2A-Ale処置を受けたマウスは、Dex単独またはプラセボで処置したマウスと比較して洞様毛細血管体積が増加していた。*試験90日目でDex＋LLP2A-Ale処置からp＜0.05。
【図１１】図11A〜F. LLP2A-Ale処置マウス由来の大腿骨の組織学的評価。図7で上述したように、マウスをDex＋250 μg/kg LLP2A-Aleで処置した。全マウスを90日目に安楽死させた。右および左の遠位大腿骨を10％中性緩衝ホルマリン中に固定し、脱灰した。検体を脱水し、パラフィン中に包埋し、5マイクロメートルの切片に切断し、H&E染色した。切片を2名の経験のある組織学者がスコア化し、次いで、さらなる2人の組織学者がコンセンサスリーディングを行った。(A、D)：Dex＋LLP2A-Ale で処置したマウスにおける4×拡大率の代表的な近位大腿骨骨端。(B、C、E、F)：Dex＋LLP2A-Aleで処置したマウスにおける20×拡大率の代表的な近位大腿骨骨端。LLP2A-Ale処置マウスでは、壊死性骨髄内に突き出る(B)、または骨髄壊死が確認されない骨髄中を占める(E〜F)、洞様毛細血管形成の増加が観察された。いくつかの骨芽細胞が、骨梁表面および洞様毛細血管近くに観察された((E)の黄色矢印)。
【図１２】組換えLLP2A-Aleで処置したマウスにおけるグルココルチコイド誘導性骨壊死の発生率の低下。マウスを、30日処置期間または45日処置期間に対してプラセボ(PL)(新鮮水)、飲用水中にデキサメタゾン(Dex) 4 mg/l、Dex＋250 μg/kg LLP2A-Ale、Dex＋500 μg/kg LLP2A-Ale、またはDex＋40 μg/kg hPTH(1-34)の群に無作為化した。Dex誘導性骨壊死の発生率は、30日で57％および45日で73％であった。LLP2A-Ale(両用量)処置およびhPTH(1-34)処置のどちらも、グルココルチコイド誘導性骨壊死性病変を防止した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
I. 序論
骨壊死は、骨への血液供給の一時的なまたは永続的な喪失に起因する骨疾患である。適切な血液供給がないと、骨組織は死に、最終的には骨および周囲の関節の圧潰につながる可能性がある。
【００２４】
本明細書に記載されるように、LLP2A-Aleコンジュゲートが、骨への血液供給の喪失を予防でき、グルココルチコイド誘導性骨壊死の動物モデルにおいて骨の血管分布を増大できることが見出された。LLP2A-Aleコンジュゲートはまた、骨細胞の死も予防でき、さらに、グルココルチコイド誘導性骨壊死の動物モデルにおける新たな骨の形成も増大できる。
【００２５】
したがって、1つの局面では、ビスホスホネート薬(例えば、アレンドロネート)にコンジュゲートさせたペプチド模倣リガンド(例えば、LLP2A)の薬学的組成物の投与を含む、骨壊死を予防および/または処置する方法が提供される。別の局面では、ビスホスホネート薬(例えば、アレンドロネート)にコンジュゲートさせたペプチド模倣リガンド(例えば、LLP2A)の薬学的組成物の投与を含む、骨粗鬆症組織において血管密度を増大させる方法が提供される。さらに別の局面では、ビスホスホネート薬(例えば、アレンドロネート)にコンジュゲートさせたペプチド模倣リガンド(例えば、LLP2A)の薬学的組成物の投与を含む、骨壊死組織において細胞死を低下させるかまたは予防する方法の方法が提供される。いくつかの態様では、ペプチド模倣リガンド-ビスホスホネート薬コンジュゲートは、間葉系幹細胞および/またはPTHなどのタンパク質同化剤との組み合わせで投与される。
【００２６】
II. 定義
別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は概して、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。概して、本明細書において用いられる命名法、および以下に記載の細胞培養、分子生物学、および化学における実験手法は、当技術分野において周知かつ通常利用されるものである。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「1つの(a)」または「1つの(an)」は、本明細書において置換成分の基または「置換基」に関連して用いられる場合、少なくとも1つを意味する。例えば、化合物が「1つの(an)」アルキルまたはアリールで置換される場合、化合物は、少なくとも1つのアルキルおよび/または少なくとも1つのアリールで置換されてもよく、ここで、アルキルおよび/またはアリールはそれぞれ異なってもよい。別の例では、化合物が「1つの(a)」置換基で置換される場合、化合物は少なくとも1つの置換基で置換され、ここで各置換基は異なってもよい。
【００２８】
本発明の化合物の記述は、当業者に公知の化学結合の原則によって制限される。したがって、基がいくつかの置換成分の1つまたは複数によって置換される可能性がある場合、そのような置換は、化学結合の原則にしたがい、かつ本質的に不安定ではない化合物および/または環境条件、例えば水性、中性、または生理的条件などの下では不安定であるおそれがあるとして当業者に知られている化合物を生じるように選択される。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「Ale」または「Alen」はアレンドロネートを指す。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、ペプチド結合で連結されたDもしくはLアミノ酸の単鎖またはDおよびLアミノ酸の混合物で構成された化合物を指す。概して、ペプチドは約2から約50アミノ酸長である。好ましくは、ペプチドは、約2から約25アミノ酸長、約3から20アミノ酸長、または約3から10アミノ酸長である。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、天然の、非天然のおよび合成のアミノ酸、ならびに天然に生じるアミノ酸と類似の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は本明細書において、一般に知られている3文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される1文字記号のいずれかによって記載されうる。ヌクレオチドも同様に、それらの一般に認められた1文字コードによって記載されうる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「塩」は、本発明の方法で用いられる化合物の酸性塩およびまたは塩基性塩を指す。薬学的に許容される塩の実例は、鉱酸(塩酸、臭化水素酸、およびリン酸など)塩、有機カルボン酸(酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、およびクエン酸など)、有機スルホン酸(メタンスルホン酸)、塩、四級アンモニウム(ヨウ化メチル、およびヨウ化エチルなど)塩である。薬学的に許容される塩には、塩基、すなわち、カチオン性塩、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリおよびアルカリ土類性金属塩、ならびにアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)メチルアンモニウム塩などのアンモニウム塩によって形成される塩が含まれる。薬学的に許容される塩は非毒性であることが理解される。適した薬学的に許容される塩についての追加の情報は、参照によって本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985において見出すことができる。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される賦形剤」および「薬学的に許容される担体」は、活性を有する剤の対象への投与および対象による吸収を助ける物質を指す。「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書に記載される組成物中に含むことができ、かつ対象に対して重大な有害毒性作用を引き起こさない賦形剤を指す。薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例には、水、NaCl、正常食塩溶液、乳酸リンゲル液、通常のスクロース(normal sucrose)、通常のグルコース(normal glucose)、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、甘味剤、香料、および着色剤などが含まれる。当業者は、他の薬学的賦形剤もまた用いることができることを認識するであろう。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「水和物」は、少なくとも1つの水分子と複合体を形成する化合物を指す。いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなLLP2A-ビスホスホネート化合物は、1から10個の水分子と複合体を形成することができる。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「異性体」は、同じ化学式を有するが、構造的に識別できる化合物を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「間葉系幹細胞」は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞を含む、さまざまな細胞型に分化することができる多能性幹細胞(すなわち、細胞型のサブセットに分化する能力を有する細胞)を指す。間葉系幹細胞は、これらに限定されないが、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、分娩組織(birth tissue)(例えば、羊膜、羊水、または臍帯組織)、皮膚組織、骨組織、および歯の組織を含む、さまざまな組織から得ることができる。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「対象」は、本明細書で提供されるような薬学的組成物の投与によって処置することができる状態を有するかまたはその傾向がある生体(例えば、骨壊死性病変と診断されている、骨壊死性病変を有すると疑われる、または骨壊死性病変を有するリスクがある生体)を指す。非限定的な例には、ヒト、他の哺乳動物、および他の非哺乳類動物が含まれる。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「治療的有効量」は、特定された疾患もしくは状態を処置するかもしくは回復させるのに、または検出可能な治療効果もしくは阻害効果を呈するのに有用な、薬学的組成物(例えば、本明細書に記載されるような、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とを含むコンジュゲート、および/または幹細胞)の量を指す。効果は当技術分野において公知の任意のアッセイ法によって検出できる。
【００３９】
本明細書において用いられる用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、任意の客観的なまたは主観的なパラメーター、例えば、軽減；寛解；症状を減退させること、または損傷、病態もしくは状態を患者にとってより耐えられるものにすること；変性または衰弱の速度を遅らせること；変性の終点をより衰弱の少ないものにすること；および/または患者の身体的または精神的な幸福を向上させることなどを含む、損傷、病態または状態の処置または回復における成功の任意の徴候を指す。症状の処置または回復は、これらに限定されないが、対象由来の試料に対して実施される理学的検査および/または生物学的アッセイの結果を含む、客観的または主観的なパラメーター基づく可能性がある。
【００４０】
III. 骨壊死の処置のための組成物
1つの局面では、本発明は、骨壊死を予防および/もしくは処置するための、骨壊死組織において血管密度を増大させるための、または骨壊死組織において細胞死を予防するもしくは低減させるための、単独でまたは間葉系幹細胞および/もしくはタンパク質同化剤との組み合わせで用いることができる、アレンドロネートなどのビスホスホネートとコンジュゲートされたペプチド模倣リガンドに、例えばLLP2Aに関する。
【００４１】
LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート
いくつかの態様では、ペプチド模倣リガンドは、以下の構造：
2019506386.tif 000006
を有するLLP2A化合物である。
【００４２】
LLP2Aは、α4β1インテグリンに結合する、高親和性高特異性ペプチド模倣リガンドである。Liu et al., Biopolymers, 84:595-604(2006); Peng et al., Nature Chemical Biology 2:381-389(2006); DeNardo et al., J. Nucl. Med. 50:625-634(2009)を参照されたい。
【００４３】
いくつかの態様では、LLP2Aペプチド模倣リガンドはビスホスホネートにコンジュゲートされる。ビスホスホネートは、2つのホスホネート基(phosphonate group)を有する薬物のクラスであり、骨粗鬆症の処置のためおよび骨喪失の予防のために用いられている。ビスホスホネートは、炭素に共有結合的に連結される2つのホスホネート基を含む。ビスホスホネートは、窒素含有(例えば、エチドロネート)でもよく、窒素非含有(例えば、アレンドロネート)でもよい。ペプチド模倣リガンドへのコンジュゲートに使用するのに適したビスホスホネート薬には、これらに限定されないが、エチドロネート(Didronel(登録商標))、クロドロネート(Bonefos(登録商標)、Loron(登録商標))、チルドロネート(Skelid(登録商標))、パミドロネート(Aredia(登録商標))、ネリドロネート(Neridronate)、オルパドロネート(Olpadronate)、アレンドロネート(Fosamax(登録商標))、イバンドロネート(Boniva(登録商標))、リセドロネート(Actonel(登録商標))、およびゾレドロネート(Zometa(登録商標)、Reclast(登録商標))が含まれる。当業者は、他のビスホスホネートが本発明において有用であることを理解するであろう。いくつかの態様では、ビスホスホネートはアレンドロネートである。
【００４４】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、式I：
2019506386.tif 000007
の化合物(例えば、LLP2A-Ale)を含む。
【００４５】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、ビスホスホネート薬にコンジュゲートされたLLP2A化合物(例えば、式Iの化合物)の塩、水和物、溶媒和化合物、プロドラッグ形態、異性体、または代謝物を含む。
【００４６】
塩には、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、ホスホン酸、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩(すなわち、1,1'-メチレン-ビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸))が含まれる。他の塩には、これらに限定されないが、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；ならびにアンモニウム、トリメチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム、およびトリス-(ヒドロキシメチル)-メチルアンモニウム塩などのアンモニウム塩を含む、無機塩基による塩が含まれる。有機塩基との他の塩には、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メグルミン、およびN,N'-ジベンジルエチレンジアミンによる塩が含まれる。
【００４７】
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、通常の方法で親化合物から単離することによって、再生させることができる。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解性など特定の物性が種々の塩形態と異なるが、他の点では、塩は、本発明の目的について化合物の親形態と等価である。
【００４８】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような化合物は、非溶媒和形態ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在できる。概して、溶媒和形態は非溶媒和形態と等価であり、本発明の範囲の範囲内に包含される。ある特定の化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在しうる。概して、全ての物理的形態が、本発明によって企図される使用について等価であり、本発明の範囲の範囲内であることが意図される。
【００４９】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような化合物は、不斉炭素原子(光学中心)または二重結合を有し；絶対立体化学の観点から(R)-もしくは(S)- または、アミノ酸では(D)-もしくは(L)-として定義されうる、エナンチオマー、ラセミ化合物、ジアステレオマー、互変異性体、幾何異性体、立体異性体、ならびに個々の異性体が、本発明の範囲の範囲内に包含される。本発明の化合物には、合成および/または単離するには不安定すぎることが当技術分野において公知である化合物は含まれない。本発明は、ラセミ体のまたは光学的に純粋な形態での化合物を含むことを意味する。光学的に活性な(R)-および(S)-、または(D)-および(L)-異性体は、キラルシントンまたはキラル試薬を用いて調製されるか、または通常の技術を用いて分離されうる。
【００５０】
いくつかの態様では、化合物はプロドラッグ形態である。本明細書に記載される化合物のプロドラッグは、生理的条件下で容易に化学変化を受け、本発明の化合物を提供する化合物である。加えて、プロドラッグは、エクスビボ環境における化学的または生化学的な方法によって本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適した酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバー内に配置される場合、本発明の化合物へとゆっくり変換されうる。
【００５１】
本明細書に記載されるような化合物は、当業者に公知のさまざまな方法(Comprehensive Organic Transformations by Richard C. Larock, 1989を参照)によって、または一般に周知の合成方法の適切な組み合わせによって合成することができる。本発明の化合物を合成するのに有用な技術は、関連技術分野における当業者に容易に分かりかつ利用可能である。非限定的な例としては、LLP2A-アレンドロネート(LLP2A-Ale)は、LLP2A-Lys(D-Cys)のスルフヒドリル基のアレンドロネートマレイミド(Ale-Mal)への共役付加によって作製することができる。後者は、アレンドロネートおよびスルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸(sulfo-SMCC)からインサイチューで調製することができる。LLP2A-Lys(D-Cys)は、複数の市販の出発材料および1つの特徴付けられた中間体、4-[(N’-2-メチルフェニル)ウレイド]フェニル酢酸(UPA)から固相合成によって調製することができ、これもまた市販の出発物質から調製できる。LLP2A-Aleの合成の詳細な説明を含む、ビスホスホネート薬にコンジュゲートされたLLP2A化合物を作製する方法は、例えば、国際出願公開番号WO 2012/031228号および同WO 2013/032527号に認められ、これらの開示は全ての目的でそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【００５２】
間葉系幹細胞
いくつかの態様では、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)を含む薬学的組成物は、骨壊死を処置するため、骨壊死組織において血管密度を増大させるため、または骨壊死組織において細胞死を予防するかもしくは低減させるために、間葉系幹細胞(MSC)と一緒に共投与される。
【００５３】
投与される間葉系幹細胞は、均一な組成物であってもよく、またはMSCを含むまたはMSCについて濃縮された混合細胞集団であってもよい。適したMSCは、例えば、骨髄の吸引液から収集された骨髄単核細胞から入手されうる、またはそれに由来しうる。いくつかの態様では、均一な間葉系幹細胞組成物は、適切な培養培地中で骨髄付着細胞または骨膜細胞を培養することによって得られ、該間葉系幹細胞組成物は、骨髄付着細胞または骨膜細胞を培養し、拡大MSC集団を得ることによって得られうる。MSCは、特有のモノクローナル抗体によって特定される特異的細胞表面マーカーによって特定されうる。間葉系幹細胞において濃縮された細胞集団を得るための方法は、例えば、本明細書に参照によって組み入れられる、米国特許第5,486,359号に記載される。間葉系幹細胞の供給源には、これらに限定されないが、骨髄、筋肉、脂肪、胎盤組織、臍帯組織、歯髄、皮膚組織、末梢血、および滑膜が含まれる。間葉系幹細胞(MSC)は当技術分野において公知の方法(例えば、Wakitani et al., 1995; Fukuda and Yuasa, 2006; Woodbury et al., 2000; Deng et al., 2001; Kim et al., 2006; Mareschi et al., 2006; Krampera et al., 2007を参照)を用いて精製されうる。
【００５４】
MSCについて濃縮される組成物(例えば、約95％を上回る、通常約98％を上回る間葉系幹細胞を有する)は、当技術分野において公知である間葉系幹細胞の単離、精製、および培養拡大についての技術を用いて達成することができる。非限定的な例として、単離され培養された間葉系幹細胞は、発現した表面抗原のフローサイトメトリー分析によって単一の表現型集団 (例えば、少なくとも約95％または約98％均一)を含みうる。そのような組成物中の所望の細胞は、該細胞型の1つまたは複数の細胞表面マーカー(例えば、CD73またはCD105)を発現するとして特定される。
【００５５】
間葉系幹細胞は、自己、同種異系、または異種を含む、広範な供給源に由来しうる。
【００５６】
いくつかの態様では、間葉系幹細胞は、細胞約1×104個/kg体重から細胞約1×108個/kg体重(例えば、細胞約1×104個/kg、細胞約1×105個/kg、細胞約1×106個/kg、細胞約1×107個/kg、または細胞約1×108個/kg)の量で投与される。投与されるべき間葉系幹細胞の量は、患者の年齢、体重、および性別を含む、さまざまな要因によって左右される。
【００５７】
間葉系幹細胞は、許容可能な薬学的担体と併せて投与されうる。例えば、間葉系幹細胞は、注射または局所適用のための薬学的に許容される液体媒体またはゲル中の細胞懸濁物として投与されうる。1つの態様では、薬学的に許容される液体媒体は食塩溶液である。食塩溶液は、ジメチルスルホキシド(DMSO)およびヒト血清アルブミンなどの追加の物質を含有してもよい。
【００５８】
タンパク質同化剤
いくつかの態様では、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)を含む薬学的組成物は、骨壊死を処置するため、骨壊死組織において血管密度を増大させるため、または骨壊死組織において細胞死を予防するかもしくは低減させるために、タンパク質同化剤と共に共投与される。
【００５９】
本明細書において用いられるタンパク質同化剤は、新しい骨の形成を刺激するかまたは促進する剤である。LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲートとの組み合わせでの使用に適したタンパク質同化剤には、これらに限定されないが、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン(GH)、インスリン様成長因子-I(IGF-I)、副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHrp)、または抗スクレロスチン抗体が含まれる。いくつかの態様では、タンパク質同化剤はPTHまたはその類似体である。いくつかの態様では、タンパク質同化剤はPTHの組換え体(例えば、PTH 1-34(テリパラチド))である。
【００６０】
タンパク質同化剤は、本明細書に記載されるような許容される薬学的担体と併せて投与されうる。例えば、いくつかの態様では、タンパク質同化剤は、注射による、または経口、非経口、もしくは経鼻投与による投与用に製剤化されうる。
【００６１】
製剤および投与
いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物(例えば、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)、間葉系幹細胞、および/またはタンパク質同化剤を含む組成物)は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物として提供される。製剤および投与のための技術の詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されており、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co, Easton PAの最新版を参照されたい。
【００６２】
本明細書に記載されるような薬学的組成物を調製するための、薬学的に許容される担体は、固体または液体のいずれかでありうる。固形調製物には、粉末剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒剤が含まれる。固体担体は1種類または複数種類の物質であてもよく、希釈剤、着香剤、結合剤、保存料、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても機能する可能性がある。
【００６３】
概して、担体の種類は投与の様式に基づき選択される。例えば、いくつかの態様では、経口調製物には、患者による摂取に適した錠剤、丸剤、粉末剤、糖衣錠、カプセル剤、液体剤、トローチ剤、カシェ剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などが含まれる。いくつかの態様では、経口投与または注入による送達のための薬学的組成物は、液体の形態(例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤または懸濁剤)をとりうる。液体薬学的組成物には、例えば、以下の1種類または複数種類が含まれうる：注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として機能しうる固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたは他の溶媒などの滅菌希釈剤；抗菌剤；抗酸化剤；キレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖など張度の調整のための剤。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入することができる。生理食塩水の使用が好適であり、注射可能な薬学的組成物は好ましくは滅菌状態である。
【００６４】
前記組成物には典型的には、一般的な薬学的担体または賦形剤が含まれ、追加的に他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織浸透促進剤、および可溶化剤などが含まれうる。いくつかの態様では、組成物は、重量で約0.01％から約90％、例えば、約0.1％から約75％、約0.1％から50％、または約0.1％から10％のコンジュゲート、間葉系幹細胞、および/またはタンパク質同化剤を含有し、残りは、適した薬学的担体および/または賦形剤からなる。適切な賦形剤は、当技術分野において周知の方法、例えば、上述のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESによって、特定の組成物および投与の経路に合わせて調整されうる。
【００６５】
適した固体賦形剤には、これらに限定されないが、炭酸マグネシウム；ステアリン酸マグネシウム；リン酸カルシウム；ケイ酸カルシウム；タルク；ペクチン；デキストラン、デキストリン、およびシクロデキストリン包接錯体；低融点ワックス；ココアバター；炭水化物；これらに限定されないが、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；これらに限定されないが、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプンを含むデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；およびアラビア、トラガント、およびアカシアを含むガム；ならびに、これらに限定されないが、ゼラチン、コラーゲンを含むタンパク質；微結晶性セルロール、水、食塩水、シロップ、エチルセルロース、およびポリアクリル酸、例えば、Carbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981などのCarbopol；潤滑剤；鉱物油；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；メチル-、エチル-、およびプロピル-ヒドロキシ安息香酸(すなわち、パラベン)などの保存剤；無機および有機の酸および塩基などのpH調整剤；甘味剤；および着香剤；生分解性ポリマービーズが含まれる。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、アルギネートン、またはその塩、アルギン酸ナトリウムなどが添加されてもよい。
【００６６】
薬学的に許容される担体には、例えば、本発明の化合物を安定化するようにまたはそれらの吸収を調節するように機能する、生理学的に許容される化合物、または所望の他の賦形剤が含まれうる。生理学的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば、化合物の投与の経路、および化合物の特定の生理化学的特徴に左右されることを理解している。
【００６７】
概して、そのような担体は、利用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であるべきである。任意で、そのような組成物の調製は、1種類または複数種類の化合物を緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、マルトース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、EDTAなどのキレート剤、グルタチオン、ならびに他の安定化剤および賦形剤と組み合わせることを伴う。中性緩衝化食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した食塩水は、例示的な適切な希釈剤である。
【００６８】
糖衣錠コアは、濃縮糖溶液などの適したコーティングと共に提供され、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、carbopolゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタン、ラッカー液、ならびに適した有機溶媒または溶媒混合物も含みうる。染料または色素が、製品特定のためにまたは活性化合物の量(すなわち、投与量)を特徴付けるために錠剤または糖衣錠コーティングに添加されうる。薬学的調製物はまた、例えば、ゼラチンで作製された押し嵌め型(push-fit)カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作製された密封型カプセルを用いて、経口的に用いることもできる。押し嵌め型カプセルは、充填剤または結合剤、例えばラクトースまたはデンプン、潤滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および任意で安定化剤と混合された化合物を含むことができる。ソフトカプセルでは、化合物は、安定化剤と共にまたは安定化剤なしで、適した液体、例えば、脂肪油、液状パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁されうる。
【００６９】
液体形態調製物には、溶液、懸濁剤、および乳剤、例えば、水または水/プロピレングリコール溶液が含まれる。液体組成物は、例えば、コンジュゲートおよび任意で1種類または複数種類の薬学的に許容されるアジュバントを、例えば、水性食塩水(例えば、0.9％w/v塩化ナトリウム)、水性デキストロース、グリセロール、およびエタノールなどの担体中に溶解しまたは分散させ、例えば、経口、局所、または静脈内投与向けの、溶液または懸濁剤を形成することによって、調製できる。非経口注射剤のために、液体調製物は、ポリエチレングリコール水溶液での溶液で製剤化することができる。
【００７０】
経口使用に適した水溶液は、活性成分を水に溶解し、所望の適した着色剤、香料、安定化剤、および増粘剤を添加することによって調製できる。経口使用に適した水性懸濁剤は、微粉化した活性成分を、粘性材料、例えば、天然ゴムもしくは合成ゴム、レジン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアカシアガム、および分散剤または湿潤剤、例えば天然のホスファチド(例えば、レシチン)、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物(例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン)、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物(例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール)、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合生成物(例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸)、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合生成物(例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸)と共に水中に分散させることによって作製できる。水性懸濁剤はまた、1種類または複数種類の保存料、例えばp-ヒドロキシ安息香酸エチルまたはp-ヒドロキシ安息香酸n-プロピルなど、1種類または複数種類の着色剤、1種類または複数種類の着香剤、および1種類または複数種類の甘味剤、例えばスクロース、アスパルテームまたはサッカリンなどを含有できる。製剤は、モル浸透圧濃度について調製されてもよい。
【００７１】
油性懸濁剤は、本明細書に記載される化合物を、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油などの植物油、もしくは液状パラフィンなどの鉱物油；またはこれらの混合物に懸濁させることにより製剤化することができる。油性懸濁剤は、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。グリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤が、口当たりがいい経口調製物を提供するために添加されうる。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存することができる。注射可能な油性媒体の例としては、Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102, 1997を参照されたい。薬学的製剤はまた、水中油型乳剤の形態であってもよい。油層は、上述の植物油もしくは鉱物油、またはこれらの混合物でありうる。適した乳化剤には、アカシアガムおよびトラガントガムなどの天然ゴム、ダイズレシチンなどの天然ホスファチド、ソルビタンモノオレイン酸などの脂肪酸とヘキシトール無水物から得られるエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸などのこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物が含まれる。乳剤はまた、シロップ剤およびエリキシル剤の製剤のように、甘味剤および着香剤も含有することができるそのような製剤はまた、粘滑剤、保存料、または着色剤も含有することができる。
【００７２】
使用直前に経口投与用の液体形態調製物に変換されることが意図される、固形調製物も含まれる。そのような液体形態には、溶液、懸濁剤、および乳剤が含まれる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工および天然の甘味料、分散剤、増粘剤、ならびに可溶化剤なども含有してもよい。
【００７３】
経口投与のために、組成物は、錠剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、溶液、シロップ剤、スプレー剤、トローチ剤、粉末剤、および徐放性製剤の形態でありうる。経口投与に適した賦形剤には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、および炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【００７４】
局所投与のために、本発明の組成物は、乳剤、ローション剤、ゲル剤、クリーム剤、ゼリー剤、溶液、懸濁剤、軟膏、および経皮パッチの形態でありうる。吸入による送達のために、組成物は、乾燥粉末剤として、またはネブライザーを介して液体形態で送達することができる。非経口投与のために、組成物は、滅菌注射用溶液および滅菌パッケージ化粉末の形態でありうる。好ましくは、注射用溶液は、約4.5から約7.5のpHで製剤化される。
【００７５】
本発明の組成物は、凍結乾燥した形態でも提供されうる。そのような組成物は、投与前の再構成のための緩衝剤、例えば、炭酸水素を含みうるか、または緩衝剤が、水などによる再構成のために凍結乾燥組成物中に含まれうる。凍結乾燥した組成物は、適した血管収縮剤、例えば、エピネフリンをさらに含みうる。凍結乾燥した組成物は、再構成した組成物が患者に直ちに投与できるように、任意で再構成のための緩衝剤との組み合わせでパッケージ化された、シリンジで提供することができる。
【００７６】
いくつかの態様では、薬学的組成物は緩効性製剤である。緩効性態様には、生分解性であるおよび/またはゆっくり溶解する重合物質が含まれる。そのような重合物質には、ポリビニルピロリドン、低および中分子量ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カリウムメタクリラートジビニルベンゼンコポリマー(potassium methacrylatedivinylbenzene copolymer)、ポリビニルアルコール、デンプン、デンプン誘導体、微結晶性セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、およびセルロース誘導体、βシクロデキストリン、ポリ(メチルビニルエーテル/無水マレイン酸)、グルカン、スクレログルカン(scierozlucan)、マンナン、キサンタン、アルギン酸(alzinic acid)およびその誘導体、デキストリン誘導体、モノステアリン酸グリセリル、半合成グリセリド、パルミトステアリン酸グリセリル、ベヘン酸グリセリル、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、タルク、安息香酸ナトリウム、ホウ酸、およびコロイド状シリカが含まれる。
【００７７】
本発明の緩効性剤には、デンプン、プレゲル化(pregelled)デンプン、リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、サッカロース、グルコース、ソルビトール、微結晶性セルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、デンプン溶液、エチルセルロース、アラビアガム、トラガントガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、コロイド状シリカ、モノステアリン酸グリセリル、水素化ヒマシ油、ワックス、ならびに一置換、二置換、および三置換グリセリドなどのアジュバントも含まれうる。緩効性剤はまた、WO94/06416に概して記載されるように調製してもよい。
【００７８】
薬学的調製物は好ましくは単位剤形である。用語「単位剤形」は、ヒト対象および他の哺乳動物(例えば、イヌ)に単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、適した薬学的賦形剤と関連して、所望の発現、認容性、および/または治療効果を生じるように算出された所定の量の活性物質を含有する(例えば、アンプル)。加えて、より濃縮された組成物が調製されてもよく、次いで、それからより希釈した単位投与量組成物が作製されてもよい。したがって、より濃縮された組成物は、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍、またはそれらを上回る量のLLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、および/またはタンパク質同化剤を実質的に含むであろう。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に再分割される。単位剤形はパッケージ化調製物であってもよく、該パッケージは、個別量の調製物、例えば、バイアルまたはアンプル中に小分けにされた錠剤、カプセル剤、および粉末剤などを含有する。また、単位剤形は、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはトローチ剤自体であってもよく、またはパッケージ化された形態での適切な数のこれらいずれかであってもよい。組成物は、所望であれば、他の適合する治療剤も含むことができる。好ましい薬学的調節物は、徐放性製剤中の化合物を送達することができる。
【００７９】
そのような剤形を調製するための方法は当業者に公知である(例えば、上記のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照されたい)。投与されるべき組成物は、本発明の教示にしたがって投与される場合に処置される状態の軽減のための薬学的有効量でLLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、および/またはタンパク質同化剤の量を含有する。加えて、本明細書に記載されるコンジュゲートの薬学的に許容される塩(例えば、酸付加塩)は、有機化学合成の分野における当業者に公知であり、かつ例えば、J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed.(New York: Wiley-Interscience, 1992)によって記載される標準的な手法を用いて調製され、組成物中に含まれる。
【００８０】
いくつかの態様では、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、および/またはタンパク質同化剤は、治療的有効量または用量で投与される。約0.01 mg/kgから約500 mg/kg、または約0.1 mg/kgから約200 mg/kg、または約1 mg/kgから約100 mg/kg、または約10 mg/kgから約50 mg/kgの1日用量範囲を用いることができる。一方で、投与量は、選択した投与経路、組成物の剤形、患者反応、状態の重症度、対象の体重、および処方医師の判断を含む、複数の要因によって変化しうる。投与量は、個々の患者による必要に応じて、時間と共に増大または低減させることができる。ある特定の例では、患者は最初に低用量を与えられ、次に、患者に容認可能な効果的な投与量に増大される。有効量の決定は当業者能力の十分範囲内である。
【００８１】
いくつかの態様では、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲートと間葉系幹細胞および/またはタンパク質同化剤との共投与は、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、またはタンパク質同化剤の1つまたは複数の投与が、単独で投与した場合に治療効果を誘導するのに必要とされる量および/または頻度と比べて低下した量または低下した頻度で投与できるように、治療効果を増強する。例えば、いくつかの態様では、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、およびタンパク質同化剤の1つまたは複数は、単独で投与した場合より10％、20％、30％、40％、50％、60％、または70％低い頻度で投与することができる。いくつかの態様では、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、およびタンパク質同化剤の1つまたは複数は、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲートまたは間葉系幹細胞を単独で投与した場合に治療効果を誘導するのに必要とされる量より約10％、20％、30％、40％、50％、60％、または70％少ない量で投与することができる。
【００８２】
本明細書に記載される方法を実施する際に、薬学的組成物は、単独で、または他の治療剤もしくは診断用剤との組み合わせで用いることができる。複数の組成物が治療プロトコールで用いられる場合、組成物は別個に投与されてもよく、または組成物は混合物中などで一緒に投与されてもよい。1つまたは複数の組成物が別々に投与される場合、各組成物の投与のタイミングおよびスケジュールは異なる可能性がある。他の治療剤または診断用剤は、本発明の化合物と同時に、別個にまたは異なる時点で投与されうる。
【００８３】
いくつかの態様では、組成物の共投与（例えば、本明細書に記載されるようなLLP2A-ビスホスホネートコンジュゲートを間葉系幹細胞およびタンパク質同化剤の1つまたは複数と共に）には、第2の組成物の0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20、または24時間以内の一方の組成物の投与が含まれる。いくつかの態様では、2種類の組成物が、同時に、ほぼ同時に（例えば、互いに約1、5、10、15、20、または30分以内に）、または任意の順番で連続的に投与される。いくつかの態様では、共投与は、共製剤(co-formulation)、例えば、LLP2A-Aleコンジュゲートと間葉系幹細胞および/またはタンパク質同化剤との両方を含む単一の薬学的組成物を調製することによって達成することができる。他の態様では、組成物は別々に製剤化することができる。
【００８４】
必要に応じて適した薬学的賦形剤を伴う本発明の化合物の投与は、投与の許容される様式のいずれかを介して実施することができる。したがって、投与は、例えば、静脈内、局所、皮下、経皮性(transcutaneous)、経皮(transdermal)、筋肉内、経口、関節内、非経口、細動脈内、皮内、脳室内(intraventricular)、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、膣内、または吸入によるものでありうる。いくつかの態様では、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、およびタンパク質同化剤の1つまたは複数は、局所に、例えば、骨(例えば、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、顎の骨)、または骨(例えば、大腿、股関節、膝、肩、足首、手首、顎の骨)内の骨壊死性病変部位に投与される。いくつかの態様では、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート、間葉系幹細胞、およびタンパク質同化剤の1つまたは複数は全身的に投与される。いくつかの態様では、組成物は異なる経路によって投与される。例えば、いくつかの態様では、1つの組成物(例えば、LLP2A-ビスホスホネートコンジュゲート)は局所に投与され、別の組成物(例えば、間葉系幹細胞またはタンパク質同化剤)は全身的に投与される。
【００８５】
IV. 骨壊死を予防または処置し、骨壊死組織において血管密度を増大させ、かつ骨壊死組織において細胞死を低減させる方法
1つの局面では、本明細書に記載される組成物(例えば、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)を含む組成物)は、骨壊死を予防および/もしくは処置するため、血管密度を増大させるため、または骨壊死組織において細胞死を低減させるために用いられる。いくつかの態様では、方法は、
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む。
【００８６】
いくつかの態様では、方法は、
少なくとも1つの骨に骨壊死を有するかまたは骨壊死を有することが疑われる対象を特定する工程；および
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程
を含む。
【００８７】
いくつかの態様では、方法は、上述の式Iに示すような、LLP2Aとアレンドロネートとのコンジュゲート(「LLP2A-Ale」)を含む、薬学的組成物を投与する工程を含む。いくつかの態様では、方法は、例えば、コンジュゲートと同時にまたは連続的に、間葉系幹細胞を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様では、方法は、例えば、コンジュゲートと同時にまたは連続的に、1種類または複数種類のタンパク質同化剤(例えば、テリパラチド)を投与する工程をさらに含む。
【００８８】
いくつかの態様では、対象は骨壊死を有するとして特定されている成体または幼若体の対象である。いくつかの態様では、対象は骨壊死を有することが疑われる成体または幼若体の対象である。いくつかの態様では、対象は成体である。いくつかの態様では、対象は幼若体である。
【００８９】
骨壊死は、無血管性壊死または無菌性壊死とも呼ばれ、血流低下を原因とする骨における骨細胞の死である。未処置の場合、骨における骨細胞の死は、次には骨近くの関節の変性性関節炎につながる可能性がある、骨部位の圧潰につながるおそれがある。骨壊死は最も一般的には股関節および関節に発症するが、肩、手首、手、足首、足、および顎にも発症しうる。
【００９０】
骨壊死は、外傷性の原因および非外傷性の原因を含む、さまざまな原因を有しうる。典型的には、外傷性骨壊死では、骨に対する重篤な外傷が骨の血液供給を妨害する。非外傷性骨壊死は、特に、高用量の医薬が長期間にわたって投与される場合の、ある特定の薬物療法、例えば、コルチコステロイド薬物療法(例えば、プレドニゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、またはメチルプレドニゾロン)；過剰なアルコール消費；もしくは放射線療法に起因しうるか；または疾患または状態の結果として生じうる。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるXie et al., 2015, Journal of Orthopaedic Translation, 3:58-70を参照されたい。いくつかの態様では、対象は、外傷後骨壊死(例えば、骨折または骨の脱臼後に生じる骨壊死)を有する。いくつかの態様では、対象は非外傷性骨壊死を有する。いくつかの態様では、対象はステロイド誘導性骨壊死(例えば、高用量ステロイド処置誘導性骨壊死またはグルココルチコイド誘導性骨壊死)、アルコール誘導性骨壊死、または喫煙誘導性骨壊死を有する。いくつかの態様では、対象は、これらに限定されないが、レッグ-カルヴェ-ペルテス病、ケイソン病、鎌状赤血球症、照射後、化学療法、動脈疾患、ゴーシェ病、脂質障害、結合組織疾患、膵炎、腎臓疾患、肝臓疾患、または狼瘡を含む、別の疾患または状態の二次的原因として誘導される骨壊死を有する。いくつかの態様では、骨壊死は特発性骨壊死である。
【００９１】
骨壊死は、疾患進行の程度に言及する病期に分類される。いくつかの態様では、Ficat分類体系を用いて疾患の病期を決定することができる。他の分類体系、例えば、University of Pennsylvaniaの体系、Association Research Circulation Osseous(ARCO)の体系、および日本整形外科学会の体系なども用いることができる。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるJawad et al., Clin Orthop Related Res, 2012, 470:2636-2639を参照されたい。Ficat体系では、骨の壊死の5つの病期(0期から4期)が存在する。0期から2期は概して骨壊死の「早」期として説明され、3期および4期は概して「後」期として説明される。0期では、骨壊死は症状発現前かつX線撮影所見前(すなわち、X線撮影によって検出できない)だが、骨における欠損の証拠が骨髄圧試験またはコア生検によって検出される可能性がある。1期では、骨壊死性病変の証拠はMRIによって見ることができ、軽度の骨減少症がX線によって見ることができる可能性があり、骨スキャンが骨部位への放射性物質の取り込みの増大を示す可能性があり、これは骨への損傷(例えば、腫瘍、骨折、または感染)を示す。関節における疼痛の臨床症状もまた1期で呈されうる。2期では、骨組織における病変および異常の証拠をMRIによって検出することができ、混合型骨減少症、硬化症、および/または軟骨下嚢胞をX線によって検出することができ、放射性物質の取り込みの増大を骨スキャンによって検出することができ；臨床症状には関節における疼痛およびこわばりが含まれる。3期では、骨の輪郭の変化を検出することができ(例えば、大腿骨における「三日月(crescent)」形として)、最終的な皮質骨圧潰をX線またはMRIによって検出することができる。4期、疾患の最終期では、骨の圧潰および関節腔の減少が検出可能となる。
【００９２】
診断ツール、例えば、X線、MRI、骨スキャン(骨シンチグラフィー)、骨生検、臨床的特徴、および「骨の機能の診査」などの組み合わせを用いて、症状を骨壊死の病期と相関させることができる。例えば、骨髄圧を骨領域において測定することができ、骨髄圧の変化は骨に対するストレス試験を実施することによって(例えば、骨内に等張食塩水を注入し、所定の時間待ち、次いで、注入後のある時点で圧を測定することによって)測定することができる。骨スキャンは、テクネチウムなどの放射性物質を静脈内に注入し、骨を画像化することによって実施することができる。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるLiehn et al., European Journal of Orthopaedic Surgery & traumatology, 1997, 4:263-265を参照されたい。MRI(磁気共鳴画像法)は骨壊死を検出するための高感度の方法であり、骨壊死に典型的な低シグナル強度の区域を示すことができる。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるSaini et al., Clinical Radiology, 2004, 59:1079-1093を参照されたい。コンピュータ断層撮影法(CT)スキャンもまた骨壊死を検出するために用いることができる。
【００９３】
いくつかの態様では、対象は、対象における少なくとも1つの骨または関節を検査し、本明細書に記載される分類体系の1つ(例えば、FicatまたはARCO)にしたがって対象を分類することによって、骨壊死を有するかまたは骨壊死を有することが疑われるとして特定される。いくつかの態様では、対象は、骨壊死を有することが疑われるとして特定され、ここで、対象は検出可能な骨壊死性病変を有さないが、骨の異常が検出されうる(例えば、骨圧の変化)。いくつかの態様では、対象は、Ficat分類体系によって0期疾患を有するとして分類された対象である。
【００９４】
いくつかの態様では、対象は、少なくとも1つの骨または関節において血流、血液プール、および/または骨芽細胞活性の異常の場合、骨壊死を有するとして特定される。いくつかの態様では、異常は骨シンチグラフィーによって検出される。
【００９５】
いくつかの態様では、対象は、少なくとも1つの骨壊死性病変が少なくとも1つの骨で検出される場合、骨壊死を有するとして特定される。いくつかの態様では、骨壊死性病変はMRIによって検出される。いくつかの態様では、対象は、少なくとも3.5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を有するとして特定される。いくつかの態様では、対象は、少なくとも5 cm2の大きさを有する少なくとも1つの骨壊死性病変を有するとして特定される。いくつかの態様では、対象は、MRIまたは骨スキャンによって検出されるような骨における少なくとも1つの骨壊死性病変または異常を有するが、X線によって測定されるような骨密度の減少は呈さない。
【００９６】
いくつかの態様では、対象は、Ficat分類体系によって1期の疾患を有するとして分類される対象である。いくつかの態様では、対象は、MRIまたは骨スキャンによって検出されるような骨における少なくとも1つの骨壊死性病変または異常を有し、さらに、X線によって測定されるような骨密度の減少、骨減少症、硬化症、および/または骨のう腫を呈する。いくつかの態様では、対象は、Ficat分類体系によって2期の疾患を有するとして分類された対象である。
【００９７】
いくつかの態様では、対象は、骨の平坦化、切迫した骨圧潰、または骨圧潰を呈する。いくつかの態様では、対象は後期骨壊死(例えば、Ficat分類体系による3期または4期)を有する対象である。
【００９８】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなLLP2Aペプチド模倣リガンド-ビスホスホネート薬コンジュゲートは骨壊死を処置するために用いられる。いくつかの態様では、骨壊死の処置は、骨壊死性の骨または関節が骨壊死の1つまたは複数の症状の低下、例えば、骨壊死性病変の数または大きさの減少、硬化性病変の数または大きさの減少、骨における細胞死の量の減少、骨における血管新生の量(例えば、血管密度)の増加、または骨髄脂肪細胞体積の減少などを呈するかどうかを評価することによって測定される。いくつかの態様では、本明細書に記載のような薬学的組成物(例えばLLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)を含む組成物)の投与後に、方法は、対象の骨壊死性の骨または関節を検査して、骨壊死の1つまたは複数の症状の変化を特定する工程をさらに含む。したがって、いくつかの態様では、骨壊死を処置する方法は、
少なくとも1つの骨に骨壊死の1つまたは複数の症状を有する対象を特定する工程：
LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲートを含む薬学的組成物を、対象に投与する工程：および
少なくとも1つの骨を検査して、投与する工程の前と比べた骨壊死の1つまたは複数の症状の変化を特定する工程
を含む。
【００９９】
いくつかの態様では、方法は、骨壊死の2つ以上の症状(例えば、骨壊死の2つ、3つ、4つ、またはそれを上回る症状)の変化を特定する工程を含む。
【０１００】
非限定的な例として、いくつかの態様では、方法は、本明細書に記載されているような薬学的組成物の投与前に、骨または関節における骨壊死性病変の量を決定する工程および/または骨または関節における1つまたは複数の骨壊死性病変の大きさを測定する工程を含み；その上、薬学的組成物の投与の後に、方法は、骨壊死性病変の数を決定する工程、および/または骨もしくは関節における1つもしくは複数の骨壊死性病変の大きさを測定し、かつ薬学的組成物の投与の前後での病変の大きさを比較する工程をさらに含む。いくつかの態様では、投与する工程の前と比べた、投与する工程の後の骨壊死性病変の量および/または骨壊死性病変の大きさの減少は、骨壊死が対象において処置されていることを示す。いくつかの態様では、投与する工程の前の骨壊死性病変の大きさと比べた、投与する工程の後の骨壊死性病変の大きさの少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれを上回る減少は、骨壊死が処置されていることを示す。いくつかの態様では、投与する工程の前の骨壊死性病変の数と比べた、投与する工程の後の骨または組織における骨壊死性病変の数の少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれを上回る減少は、骨壊死が処置されていることを示す。
【０１０１】
いくつかの態様では、本明細書に記載されているようなLLP2Aペプチド模倣リガンド-ビスホスホネート薬コンジュゲートは、骨壊死組織における血管密度を増大させるために用いられる。いくつかの態様では、血管密度の増大は骨における血管新生の量の増大を含む。いくつかの態様では、血管密度の増大は、骨における洞様毛細血管形成または洞様毛細血管赤血球体積の増大を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載されるような薬学的組成物(例えば、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)を含む組成物)の投与後に、方法は、対象の骨壊死性の骨または関節を検査して、血管新生の量の変化を特定する工程をさらに含む。
【０１０２】
いくつかの態様では、骨壊死組織の血管新生は、超選択的血管造影(SSA)、デジタルサブトラクション動脈造影(DSA)、ドップラー-レーザー血行動態計測、骨シンチグラフィー、磁気共鳴画像法(MRI、例えば、造影剤注入によるダイナミックMRI)によって測定され、骨壊死組織において血管新生を測定する方法は当技術分野において記載される。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるEhlinger et al., Orthopedics & traumatology: Surgery & Research, 2001, 97:79-88を参照されたい。いくつかの態様では、骨壊死組織の血管新生は、放射性核種骨シンチグラフィーによって測定される。いくつかの態様では、骨壊死組織の血管新生は、MRI、例えば、ダイナミックMRIによって測定される。いくつかの態様では、投与する工程の前の血管新生の程度と比べた、骨壊死組織(例えば、骨壊死性の骨)における血管新生の程度の少なくとも約0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれを上回る増加は、血管密度が骨壊死組織において増大することを示す。いくつかの態様では、投与する工程の前の洞様毛細血管形成または洞様毛細血管赤血球体積の程度と比べた、骨壊死組織(例えば、骨壊死性の骨)における洞様毛細血管形成または洞様毛細血管赤血球体積の少なくとも約0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれを上回る増加は、血管密度が骨壊死組織において増大することを示す。
【０１０３】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなLLP2Aペプチド模倣リガンド-ビスホスホネート薬コンジュゲートは、骨壊死組織における細胞死を低下させるかまたは予防するために用いられる。いくつかの態様では、骨壊死組織における細胞死は、骨における空胞化した骨細胞小腔の存在を検出することによって測定される。したがって、いくつかの態様では、本明細書において記載されるような薬学的組成物(例えば、LLP2Aペプチド模倣リガンドとビスホスホネート薬とのコンジュゲート(例えば、LLP2A-Ale)を含む組成物)の投与を原因とする骨壊死組織(例えば、骨)における細胞死の予防または細胞死の割合の低下は、薬学的組成物の投与前と投与後の骨壊死組織における空胞化した骨細胞小腔の量を比較することによって測定することができる。いくつかの態様では、空胞化した骨小腔は画像化(例えば、MRIまたはX線撮影)によって検出される。いくつかの態様では、空胞化した骨小腔は、例えば、対象由来の骨生検試料の、病理組織検査によって検出される。いくつかの態様では、薬学的組成物の投与前および後の骨壊死組織における空胞化した骨小腔の量の安定化(例えば、薬学的組成物の投与後の骨壊死組織における空胞化した骨小腔の数が、薬学的組成物の投与前の骨壊死組織における空胞化した骨小腔の数と実質的に同じである)は、骨壊死組織における細胞死の予防または低下を示す。
【０１０４】
いくつかの態様では、本明細書に記載されるような骨壊死を処置する方法は、骨の再構築を増加させる工程(例えば、血管密度を増加させるおよび/または骨壊死性の骨または関節における細胞死を低下させる工程と併せて)をさらに含む。いくつかの態様では、骨壊死を処置する方法は、骨壊死が観察される部位での骨表面上に存在する骨芽細胞の数を増加させる工程を含む。骨成長は、当業者に公知のさまざまな方法で測定することができる。骨成長を測定する方法には、これらに限定されないが、マイクロCT、二重X線吸収、超音波、QCT、SPA、DPA、DXR、SEXA、QUS、X線、またはマーカー分析、例えば、アリザリンレッドS、血清オステオカルシン、血清アルカリホスファターゼ、血清骨γカルボキシグルタミン酸含有タンパク質(BGP)、骨塩量、血清カルシウム、血清リン、タンタルマーカー、および血清IGF-1などが含まれる。いくつかの態様では、投与する工程の前の骨密度と比べた、骨壊死組織(例えば、骨壊死性の骨)における骨密度の少なくとも約0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、またはそれを上回る増加は、骨再構成が骨壊死組織において増加することを示す。
【実施例】
【０１０５】
V. 実施例
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載の発明を例示するために提供され、該発明を限定するために提供されない。
【０１０６】
実施例1
グルココルチコイド誘導性骨壊死の56日マウスモデルにおけるLLP2A-Aleの使用
骨壊死は、骨、特に関節における骨への血流の低下によって特徴付けられる疾患である。血液供給の低下は骨の死と崩壊をもたらす。図1は、グルココルチコイド誘導性骨壊死の病期を図示する。骨壊死は、疾患がどの程度まで進行しているかを指す病期(IからV)に分類される。外傷性骨壊死では、最初に血液供給が低下し、骨細胞の死がもたらされ、次いで、死んだ骨の部位が骨の使用を支持できないために、骨の圧潰がもたらされる(図1、上腕骨)。
【０１０７】
LLP2A-Aleの有効性を、グルココルチコイド誘導性骨壊死のマウスモデルを用いて評価した。4ヶ月齢の雄マウスをグルココルチコイドで56日間処置した。28日目に、マウスの群をLLP2A-AleまたはPTHのいずれかでさらに28日間処置した。大腿骨の血管密度を、公開された方法によるマイクロCTによって屠殺後に測定した。図2に示すように、グルココルチコイドおよびLLP2A-Aleで処置したマウスの大腿骨の血管密度は、負の対照(グルココルチコイドでのみ処置された)マウスまたはグルココルチコイドおよびPTHで処置されたマウスより有意に高かった。続いてLLP2A-AleまたはPTHで処置したグルココルチコイド処置マウス大腿骨の血管密度を、マウスに造影剤を与え、次いで、マウスを屠殺し、大腿骨を脱灰し、マイクロCTによって大腿骨をスキャンすることによっても評価した。図3に示すように、グルココルチコイド処置は血管密度を低下させた。LLP2A-Aleによるグルココルチコイド処置マウスの処置は、グルココルチコイド単独と比較して血管密度を増加させ、PTHでさらに処置したグルココルチコイド処置マウスは、グルココルチコイド処置単独と比べた血管密度の有意な変化を十分に呈さなかった。これらのデータは、グルココルチコイド誘導性骨壊死の一部が血管分布を低減させ、LLP2A-Aleが骨壊死組織において血管密度を増加させることを示す。特定の理論に拘束されるものではないが、LLP2A-Aleは、骨壊死によって代謝回転している骨へMSCを運ぶことによって血管分布の増大を促進し、新たな血管形成を刺激し、さらにはこの血管形成は骨壊死性骨における新たな骨形成を刺激するのに必要とされると考えられる。
【０１０８】
血管形成の増大は、マーカー分析によっても評価することができる。例えば、VEGFは血管新生促進因子であり、新たな血管形成を刺激する。図4に示すように、VEGF血清レベルを、1〜28日にグルココルチコイド処置単独、次いでグルココルチコイドもしくはプラセボ単独、またはグルココルチコイド＋LLP2A-Ale、またはグルココルチコイド＋PTH、またはグルココルチコイド＋PTH＋LLP2A-Aleのいずれかを行った処置試験における動物から56日目に測定した。PTHを週に20 μg/kg 5×与え、LLP2A-Aleを28日目のみに500 μg/kgで与えた。グルココルチコイド処置は、二度繰り返してELISAによって測定されたようにVEGFの血清レベルを低下させ、グルココルチコイド＋LLP2A-Aleは、血清VEGFのレベルをプラセボ処置動物のレベルへ戻した。
【０１０９】
骨細胞は血液供給の喪失で死滅し、グルココルチコイド処置でも死滅する。図5に示すように、本発明者らは、上述のグルココルチコイド処置試験からの皮質骨薄片のアポトーシス性骨細胞を計数した、該試験では、動物は、56日間PLで、56日間GC単独で、または28日間GC単独、次いで28日目にGC＋1用量のLLP2A-Aleで処置された。動物を56日目に屠殺し、骨を脱灰し、次いでTUNELアッセイを実施しアポトーシス性骨細胞の数を決定した。グルココルチコイド処置単独は、56日目にアポトーシス性である骨細胞の数を増加させた。グルココルチコイド＋LLP2A-Ale処置は骨細胞アポトーシスを防止した。骨壊死はアポトーシス性骨細胞を有することから、このデータは、LLP2A-Aleが骨の骨壊死を処置できることを示唆する。
【０１１０】
LLP2A-Aleによる処置はまた、グルココルチコイド誘導性骨壊死のマウスモデルにおいて骨を再構築する。図6に示すように、マウスをグルココルチコイドで28日間処置し、次いで、LLP2A-Ale、PTH、またはLLP2A-Ale＋PTHのいずれかで処置した。遠位大腿骨および椎骨の海綿骨体積について処置期間の海綿骨量の変化を測定した。遠位大腿骨および椎骨の両方で、LLP2A-Aleによる処置は、グルココルチコイド処置マウスと比べて骨体積を増加させた。遠位大腿骨海綿骨体積では、LLP2A-Aleによる処置は、ベースライン/シャムレベルに対して遠位大腿骨海綿骨体積を増加させた。
【０１１１】
実施例2
グルココルチコイド誘導性骨壊死の90日マウスモデルにおけるLLP2A-Aleの使用
この試験は、LLP2A-Aleがマウスにおいて確立された外傷性骨壊死を元に戻すまたは処置することができるかどうかを決定するために行われた。
【０１１２】
材料および方法：
動物および実験方法
LLP2A-Aleの有効性を、グルココルチコイド誘導性骨壊死のマウスモデルを用いる90日試験を通じて評価した。7週齢の雄マウス(BALB/c(n=80, Jackson laboratories, USA)を、12時間明暗周期で20℃に維持した清潔な換気された動物室に収容した。全動物を、UC Davis Committee on Animal Researchの承認を受けたUSDA動物取扱いガイドラインにしたがって取り扱った。マウスに水および標準的な市販の齧歯類用固形飼料(22/5 Rodent Diet; Teklad, Madison, WI)を自由に与えた。動物を、プラセボ群(新鮮水)またはグルココルチコイドのみ(飲用水中に4 mg/Lデキサメタゾン(Dex))のいずれかに体重無作為化し、90日間処置した。次に、30日目に、Dex処置マウスをDex単独、Dex＋250 μg/kg LLP2A-Ale、Dex＋500 μg/kg LLP2A-AleおよびDex＋750 μg/kg LLP2A-Aleに再無作為化した。LLP2A-Ale処置を30、45、60および75日目に与えた。加えて、0.1 mg/kgメトトレキサートを、グルココルチコイドを受ける全ての群において1〜42日目に皮下注射によって週に2回投与した。
【０１１３】
全マウスを90日目に安楽死させた。全ての試験動物の体重を週毎に評価した。試験動物が、前週と比較して10％の体重減少を有する場合、体重増加が観察されるまで、デキサメタゾンの用量を2 mg/Lに減じた。安楽死の7日および2日前に、全ての動物にカルセイン(30 mg/kg)およびアリザリンレッド(20 mg/kg)を注射した。
【０１１４】
組織学的分析
右および左の遠位大腿骨の両方を、10％中性緩衝化ホルマリン中に固定し、3日間振とうさせ、次いで、骨が十分に脱灰されるまで5％EDTA中で脱灰した。次に検体を漸増濃度のエタノールで処理し、パラフィン中に包埋した。組織切片を5マイクロメートルの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、20×拡大率での明視野光学顕微鏡によって骨壊死の存在について評価した。実験法は、全ての目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Mohan et al., Calif Tissue Int(2016) doi:10.1007/s00223-016-0195-6にも記載される。骨壊死を以下の変化：(1)空胞化した骨小腔、(2)空胞化した骨小腔および隣接する骨髄の壊死の部位における濃縮した骨細胞の核、(3)骨髄における過剰な脂肪細胞の存在、(4) 軟骨分解、および(5)血管中のフィブリン血栓の存在の全てを要件とするとして骨壊死を定義する、Yang el al.,(a mouse model for glucocorticoid-induced osteonecrosis: Effect of a steroid holiday. J Orthop Res. 2009; 27: 169-75)によって報告された改変基準を用いて、骨壊死を検出した。加えて、遠位大腿骨骨端における海綿骨体積、脂肪体積、洞様毛細血管体積、および骨芽細胞表面を測定した。空胞化した骨小腔密度を、各試料について遠位大腿骨骨端領域全体内での空胞化した骨小腔/総骨細胞によって算出した。各切片を2名の経験のある組織学者がスコア化し、次いで、さらなる2人の経験のある組織学者がコンセンサスリーディングを行った。
【０１１５】
結果：
体重
プラセボ群でのBALB/cマウスの体重は、90日の実験期間にわたって、ベースライン体重とは有意に異なる(p＜0.05)体重の増加を有したが、これは他の群では観察されなかった。全てのデキサメタゾン(Dex)処置動物の体重は、7日目から90日目までプラセボと比較して有意に低かった(p＜0.05)。
【０１１６】
骨壊死の有症率
骨壊死の証拠は、Dex処置マウスにおいて遠位大腿骨の骨端の全体にわたって存在した。図7に示すように、Dex単独処置群は少なくとも3つ、または5つ全ての骨壊死の特徴(Yang el alによって報告された改変基準を用いて決定される)を示し、Dex＋LLP2A-Ale処置群のいずれかにおける対象の数より有意に高かった。骨壊死の3つまたはそれ以上の特徴を有する試料：PL(0％)；Dexのみの群14/16(88％)；Dex＋LLP2A-Ale 250 μg/kg 12/16(75％)；Dex＋LLP2A-Ale 500 μg/kg 9/16(56％)およびLLP2A-Ale 750 μg/kg 11/16(69％)。Dexのみの群では、LLP2A-Ale処置群での試料の44〜62％と比較して、試料の75％が10％またはそれ以上の空胞化した骨小腔を有した(図8A〜B)。また、図8A〜Bに示されるように、LLP2A-Ale処置群では、Dex処置群と比較して、より多くの試料が10％未満の空胞化した骨小腔を呈した。
【０１１７】
デキサメタゾン処置マウスの組織学的評価
図9Aおよび９Bに示すように、プラセボ処置マウス由来の骨端の組織切片は、骨壊死の証拠を何ら示さず、数個の骨髄脂肪細胞および洞様毛細血管が骨髄中に観察された。Dex処置マウス由来の骨端の組織切片(図9C〜9F)は、大きな空胞化した骨小腔(図9Dおよび9F、黒矢印)、および骨細胞の核濃縮によって特徴付けられる壊死性の骨梁を示した。一部のデキサメタゾン処置マウスは、壊死性骨髄(図9E、緑矢印)および脂肪組織(図9D、9E、および9F、青矢印)によって囲まれた、関節軟骨(図9D、黄色矢印)の減少を呈した。これらのデータは、グルココルチコイド誘導性骨壊死が90日試験の間このマウスモデルにおいて観察されることを示す。
【０１１８】
LLP2A-Ale処置マウスにおける骨壊死性病変の修復
図10Aに示すように、3種類の投与量のLLP2A-Ale処置は全て、Dex処置マウスの脂肪体積と比較して脂肪体積を低減させ、骨壊死病変の修復の証拠を示した。図10Bに示すように、3種類の投与量のLLP2A-Ale処置は全て、プラセボまたはDex単独処置と比較して洞様毛細血管体積を増加させた。250 μg/kgを上回ってLLP2A-Ale処置を増加させることは、洞様毛細血管体積のわずかな減少をもたらした。これらのデータは、LLP2A-Ale処置が、血管新生を増大させることによって骨壊死性病変を修復できることを示唆する。
【０１１９】
LLP2A-Ale処置マウスの組織学的評価
図11Aから11Fに示すように、LLP2A-Ale処置マウス由来の骨端の組織切片は、洞様毛細血管形成の増大を示し、該洞様毛細血管は、壊死性骨髄内に突き出る(図11B)または骨髄壊死が観察されない骨髄中を占有した(図11E＆11F)。図11Eでは、いくつかの骨芽細胞が、骨梁表面および洞様毛細血管の近くで観察された(黄色矢印)。これらのデータは、骨壊死後のLLP2A-Ale処置が、デキサメタゾン単独と比較して、空胞化した骨小腔/濃縮核の数、骨髄における脂肪細胞密度を減少させるよう見え、洞様毛細血管赤血球体積を増大させ、および骨髄の細胞充実性を維持するよう観察されたことを示唆する。加えて、LLP2A-Ale処置は、骨髄内のフィブリンの量を低減させると考えられ、かつ骨壊死が存在する骨端部位において骨表面上に存在する骨芽細胞の数を増大させ、新たな骨形成を刺激する能力を示唆した。
【０１２０】
実施例3
マウスモデルにおいてグルココルチコイド誘導性骨壊死および血管分布の減少を予防するためのLLP2A-AleおよびhPTH(1-34)の使用
この試験は、LLP2A-AleまたはhPTH(1-34)の30日間または45日間にわたる投与がグルココルチコイド誘導性骨壊死を予防し、マウスにおける遠位大腿骨内の血管分布を維持できるかどうか決定するために行われた。
【０１２１】
材料および方法：
動物および実験方法
LLP2A-AleおよびhPTH(1-34)の有効性を、グルココルチコイド誘導性骨壊死のマウスモデルを用いて30および45日の試験を通じて評価した。7週齢の雄BALB/cマウスを、30または45日間のプラセボ群(新鮮水)、グルココルチコイドのみ(飲用水中に4 mg/Lデキサメタゾン(Dex))、Dex＋250 μg/kg LLP2A-Ale、Dex＋500 μg/kg LLP2A-Ale、またはDex＋40 μg/kg hPTH(週に5回投与)に無作為化した。30または45日目にマウスを屠殺した。試験のエンドポイントには、遠位大腿骨における骨壊死の組織学的証拠、骨量、および血管の広がり(CD31およびエンドムチンの発現)が挙げられ、実施例2に記載のように実施された。ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリス検定を用いて、群間の差を判定した。
【０１２２】
結果：
骨壊死の有症率
骨壊死の証拠は、Dex処置マウスでは遠位大腿骨の骨端全体にわたって存在した。図12に示すように、Dex単独処置群は、LLP2A-AleまたはhPTH処置群におけるマウスより有意に高いパーセンテージの骨壊死有症率を有した。グルココルチコイド誘導性骨壊死の発生率は、Dex単独では30日目に57％および45日目に73％であり、LLP2A-AleおよびhPTH(1-34)処置はどちらも、付随的なGC誘導性骨壊死病変を予防した。
【０１２３】
組織学的評価
Dex処置マウス由来の骨端の組織切片は、30日および45日目でプラセボと比較して海綿骨体積および骨梁幅の有意な低下を示した(p＜0.05)。骨梁数は45日目に有意に低下した(p＜0.05)。これに対して、LLP2A-AleおよびhPTH(1-34)処置動物はどちらも、30日および45日目にDex群と比較して高い骨体積と低い骨梁間隔を有した(p＜0.05)。加えて、LLP2A-Ale、hPTH(1-34)、またはプラセボ処置と比較して、Dex処置は、30および45日目にCD31およびエンドムチン発現の両方の染色強度を低下させた(データは示さず)。これらのデータは、グルココルチコイド誘導性骨壊死が30および45日試験を通じてこのマウスモデルにおいて観察されることを示す。
【０１２４】
結論
Dex処置は海綿骨減少および骨壊死病変を誘導した。LLP2A-AleおよびhPTH処置はどちらも、骨壊死の発生率および重症度を低下させ、遠位大腿骨の血管完全性を維持した。
【０１２５】
前述の発明は、明確な理解を目的として説明および例としていくぶん詳細に記載されているが、当業者は、ある特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実行されうることを理解するであろう。加えて、本明細書で提供される各参考文献は、各参考文献が参照によって個別に組み入れられる場合と同じ程度でその全体が参照によって組み入れられる。
【図１】
2019506386.tif 000012
【図２】
2019506386.tif 000013
【図３】
2019506386.tif 000014
【図４】
2019506386.tif 000015
【図５】
2019506386.tif 000016
【図６】
2019506386.tif 000017
【図７】
2019506386.tif 000018
【図８Ａ】
2019506386.tif 000019
【図８Ｂ】
2019506386.tif 000020
【図９−１】
2019506386.tif 000021
【図９−２】
2019506386.tif 000022
【図９−３】
2019506386.tif 000023
【図１０Ａ】
2019506386.tif 000024
【図１０Ｂ】
2019506386.tif 000025
【図１１−１】
2019506386.tif 000026
【図１１−２】
2019506386.tif 000027
【図１２】
2019506386.tif 000028
【国際調査報告】
2019506386.tif 000029
2019506386.tif 000030