(57)【要約】  本発明は、メチオニナーゼをアスパラギナーゼの前に投与する、ヒトをはじめとする哺乳動物における液性及び固形癌を処置するための新しい方法に関する。本発明はまた、ことによるとアスパラギナーゼ処置に先立ってメチオニナーゼ投与を組み合わせた、メチオニン欠乏食の利用を包含する。メチオニナーゼ及びアスパラギナーゼは、特に遊離形態で、ペグ化形態で用いられても、又は赤血球に封入されていてもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギナーゼの前にメチオニナーゼが投与される少なくとも１回の連続投与のためにアスパラギナーゼ及びメチオニナーゼを含む、哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物又はキット。
【請求項２】
メチオニナーゼ及びアスパラギナーゼが、遊離形態、ペグ化形態又は赤血球の内部に封入されている、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
メチオニナーゼが、遊離形態であるか、又はペグ化されており、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、約１時間〜約７日の間、特に約３時間〜約６日の間、好ましくは約１日〜約５日の間である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
メチオニナーゼが、赤血球に封入されており、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、約１時間〜約３０日の間、特に約１日〜約２０日の間、好ましくは約１日〜約１０日の間である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
メチオニナーゼが、約１００〜約１０００００ＩＵの間、特に約５００〜約５００００ＩＵの間、好ましくは約５００〜約５０００ＩＵの間の量で１回又は複数回投与される、請求項１から４の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
アスパラギナーゼが、約５００〜約１０００００ＩＵの間、特に約１０００〜約５００００ＩＵの間、好ましくは約５０００〜約３００００ＩＵの間の量で１回又は複数回投与される、請求項１から５の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
メチオニナーゼを投与された哺乳動物において癌を処置する際の使用のためのアスパラギナーゼを含む医薬組成物。
【請求項８】
メチオニナーゼが、遊離形態又はペグ化形態であり、メチオニナーゼ投与とアスパラギナーゼ投与の間の遅延時間が、約１時間〜約７日の間、特に約３時間〜約６日の間、好ましくは約１日〜約５日の間である、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
メチオニナーゼが、赤血球の内部に封入されており、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、約１時間〜約３０日の間、特に約１日〜約２０日の間、好ましくは約１日〜約１０日の間である、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
メチオニナーゼが、約１００〜約１０００００ＩＵの間、特に約５００〜約５００００ＩＵの間、好ましくは約５００〜約５０００ＩＵの間の量で１回又は複数回投与される、請求項７から９の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
アスパラギナーゼが、約５００〜約１０００００ＩＵの間、特に約１０００〜約５００００ＩＵの間、好ましくは約５０００〜約３００００ＩＵの間の量で１回又は複数回投与される、請求項７から１０の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
メチオニナーゼと同時の、別個の、又は連続した投与のために、ＰＬＰ又はＰＬＰ前駆体をさらに含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
別個の又は連続した投与のために、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼと、ＰＬＰの非リン酸エステル前駆体と、を含む、請求項１２に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼが投与される前に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼが少なくとも１回又は２回投与され、各メチオニナーゼ投与の後、アスパラギナーゼが投与される前にＰＬＰの非リン酸エステル前駆体の溶液の投与がある、請求項１から１１の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
液性又は固形腫瘍を処置するための、請求項１から１４の何れか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
白血病又は胃癌を処置するための、請求項１５に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
必要とする哺乳動物における癌を処置するための方法であって、前記必要とする哺乳動物に、メチオニナーゼを含む組成物を投与し、そしてその後、アスパラギナーゼを含有する組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
必要とする哺乳動物における癌を処置するための方法であって、前記必要とする哺乳動物に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼを含む組成物を投与し、そしてその後、赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼを含有する組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１９】
メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間が、１時間〜３０日の間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
メチオニナーゼが、１００〜１０００００ＩＵの間の量で１回又は複数回投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
アスパラギナーゼが、５００〜１０００００ＩＵの間の量で１回又は複数回投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼが投与される前に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼが少なくとも１回又は２回投与され、アスパラギナーゼが投与される前に、各メチオニナーゼ投与がＰＬＰ又はＰＬＰ前駆体の投与を伴う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＬＰの非リン酸エステル前駆体の溶液が、封入されたメチオニナーゼの各投与後に１回又は複数回投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＬＰの非リン酸エステル前駆体の溶液が、メチオニナーゼ処置の期間に１日１回、又は１日に２回以上投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、白血病又は胃癌である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトをはじめとする哺乳動物を癌に対して処置する新しい方法、詳細には酵素法に関し、そして癌の該処置におけるアスパラギナーゼ及びメチオニナーゼの新規な使用に関する。酵素療法は、腫瘍を飢餓させて、詳細には癌の管理を助けることを意図する。
【背景技術】
【０００２】
アスパラギナーゼは、細胞生存に必要なタンパク質産生に必須のアミノ酸であるアスパラギンを加水分解して、枯渇させる。ところで、特定の癌性リンパ芽球細胞は、正常細胞とは対照的に、アスパラギンそのものを産生する能力を有さず、それらのタンパク質を合成するための細胞外供給源に依存する。このように該酵素は、白血病（液性又は血液癌）を処置するのに用いられ得る。このようにＬ−アスパラギナーゼは、ここ３０年は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のために併用化学療法で用いられている。ＥＲＹ−ＡＳＰは、赤血球細胞に封入されたＬ−アスパラギナーゼからなる。封入により、Ｌ−アスパラギナーゼが赤血球細胞内部のアスパラギンを破壊して、アレルギー反応を予防し、他の有害事象を低減することができる（参照により本明細書に援用される国際公開第２００６／０１６２４７号パンフレット）。
【０００３】
メチオニナーゼとも称されるメチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ；ＥＣ番号４．４．１．１１；ＣＡＳ番号４２６１６−２５−１）は、必須の硫黄含有タンパク質新生アミノ酸であるＬ−メチオニン（Ｍｅｔ）の代謝に関与するピリドキサール依存性酵素である。１９７０年代に、癌におけるＭｅｔ要求性が企画され、培地中の前駆体ホモシステインによるＭｅｔの置換が線維芽細胞などの正常細胞に影響を有さずに、複数の形質転換細胞又は悪性細胞の成長速度を緩徐にすることが、試験で明らかになった。ＰＣ−３前立腺癌細胞において、Ｍｅｔ飢餓の抗腫瘍効果は、インビトロ及びインビボの両方の癌細胞増殖を劇的に緩徐化して細胞を強制的にアポトーシスに進めるＭｅｔ類似体を利用することによっても強化された。補助的試験から、Ｍｅｔ依存性癌細胞における外因性Ｍｅ制限が細胞周期の後期Ｓ又はＧ２期において細胞分裂を遮断することが明らかとなった。Ｍｅｔ制限は、癌処置に効果的であると思われるため、複数の供給源からのＭＧＬ酵素を用いた治療的アプローチが、腫瘍微小環境におけるＭｅｔの枯渇のために調査された。この目標は、Ｍｅｔ依存性癌を有する患者の全身Ｍｅｔの枯渇のための、赤血球に封入されたＭＧＬを基にした新たな治療的解決法を開発することであった（参照により本明細書に援用される国際公開第２０１５／１２１３４８号パンフレット）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
癌処置における新しい、又は追加的な治療的解決法が、依然として必要とされている。
【０００５】
薬物併用の効果は本来、予測不能である。多くの場合、一方の薬物が他方の薬物の効果を部分的又は完全に阻害する傾向がある。選択されたヒト白血病細胞株（ＨＬ−６０）に及ぼす、ＥＲＹ−ＡＳＰ及びＥＲＹ−ＭＥＴを構成する酵素であるＬ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの単独又は併用での細胞障害効果を評定するために、インビトロ試験を実施した。各薬物を別個で、細胞生存率の５０％阻害を与える濃度（ＩＣ５０）を、予め計測した。その後、併用の順序に関わらず、若干の遅延、例えば７２時間が、Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬ（各酵素のＩＣ５０用量）の添加の間に加えられた場合の併用処理の利益を評価するために、アッセイを実施した。
【０００６】
本発明は、ＩＣ５０用量のＭＧＬ添加と、その３日後のＩＣ５０用量のＬ−アスパラギナーゼの添加により細胞死亡率が上昇し得るという驚くべき観察に基づいている。逆の酵素添加設計では、白血病モデルという液性腫瘍モデルにおけるインビトロの細胞死亡率のそのような上昇が得られなかった。胃の腫瘍という固形腫瘍において、インビトロでの細胞死亡率上昇及びインビボでの腫瘍体積減少が観察されており、この顕著な効果は確認された。理論に束縛されるのを望むものではないが、ＭＧＬ活性により誘導されたメチオニン欠乏が細胞をＬ−アスパラギナーゼにより大きく応答させることができ、おそらく細胞周期調節に関与する各酵素の役割と関連性があると推察することができる。この知見が、連続でのメチオニン欠乏又はメチオニナーゼ処理とアスパラギン欠乏又はアスパラギナーゼ処置を含む処置レジメンへの道を開拓した。以下の開示から明白な通り、本発明は、癌への有益効果を誘導する食事及び／又は薬物投与を包含することができる。したがって本発明は、メチオニン欠乏又はメチオニナーゼ処置をアスパラギン欠乏又はアスパラギナーゼ処置に先立って行う任意の組み合わせで、食事と薬物投与を組み合わせてもよい。メチオニナーゼがシステイナーゼ活性を有すること、及びアスパラギナーゼがグルタミナーゼ活性を有することも公知であるため、システイナーゼ活性又はグルタミナーゼ活性がメチオニナーゼ又はアスパラギナーゼの作用機序に関与する可能性を排除することはできない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、必要とする哺乳動物における癌を処置する方法であって、該哺乳動物をメチオニンについて欠乏させ、その後、該哺乳動物をアスパラギンについて欠乏させることを含む、方法である。探求されることは、癌細胞に利用可能なメチオニン及びアスパラギンの量を減少させることである。前述のことから明らかな通り、メチオニン欠乏は、食事のメチオニン欠乏及び／又はメチオニナーゼ投与を通して実施してもよいが、アスパラギン欠乏は、好ましくはアスパラギナーゼ投与を利用して実施してもよい。
【０００８】
欠乏とは、癌細胞を充分量のアミノ酸について欠乏させるという、癌を処置する上での有益効果を生じるのに充分なメチオニン又はアスパラギンの減少を意味する。
【０００９】
酵素処置とは、酵素が関係するアミノ酸を分解し、ことによるとタンパク質若しくはアミノ酸合成の阻害、又は癌細胞に充分な量のアミノ酸の欠損を導く任意のメカニズムなどの他の有益効果を誘導することを意味する。
【００１０】
本発明の目的は、アスパラギナーゼの前にメチオニナーゼを投与する少なくとも１回の連続投与のためのアスパラギナーゼ及びメチオニナーゼを含む、哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物である。アスパラギナーゼ及びメチオニナーゼは、別個に、かつ連続して投与されることになるため、該組成物は、本発明の順序及び頻度に従って用いられる別個の配合剤を含むセット若しくはキット、又は組成物が適正になり得る。
【００１１】
異なる態様又は目的の下での本目発明の文脈において、少なくとも１回の連続投与は、同じ哺乳動物が処置療法又は処置相の間に１回よりも多く連続で処置され得ることを意味する。しかし、１回又は複数回のメチオニナーゼ投与（複数可）が、１回又は複数回のアスパラギナーゼ投与（複数可）の前に実施されてもよい。
【００１２】
本発明の別の目的は、医薬組成物若しくは複数の医薬組成物、又は複数の医薬組成物（一方はメチオニナーゼを含み、他方はアスパラギナーゼを含む）のキット若しくはセットの調製のためのアスパラギナーゼ及びメチオニナーゼの使用であり、該組成物（複数可）又は該キットは、アスパラギンの前にメチオニナーゼが投与される少なくとも１回の連続投与で哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのものである。
【００１３】
本発明の別の目的は、
−  メチオニナーゼを投与されていた哺乳動物に投与される、哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのアスパラギナーゼを含む医薬組成物、
−  治療食品であるか否かにかかわらずメチオニン欠乏食を施されていた、即ちメチオニン欠乏食品を投与されていた哺乳動物に投与される、哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのアスパラギナーゼを含む医薬組成物（本発明の意味における治療食品とは、医療環境で投与される食品及び／又は規制当局による市場許可を受けた食品、特に注入によって投与可能であってもなくてもよい液状の食品を意味する）、
−  アスパラギナーゼをさらに投与される予定の哺乳動物に投与される哺乳動物における癌を処置する際の使用のためのメチオニナーゼを含む医薬組成物、
−  アスパラギナーゼで哺乳動物を処置する前に該哺乳動物をメチオニンについて欠乏させる際の使用のための、治療食品であるか否かにかかわらずメチオニンを含まない又はメチオニンを実質的に含まない食品組成物若しくは食事、
である。
【００１４】
本発明の別の目的は、
−  メチオニナーゼを投与されていた哺乳動物に投与される、哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物の調製のためのアスパラギナーゼの使用、
−  治療食品であるか否かにかかわらずメチオニン欠乏食を施されていた、即ちメチオニン欠乏食品を投与されていた哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物の調製のためのアスパラギナーゼの使用、
−  アスパラギナーゼをさらに投与される予定の哺乳動物に投与される哺乳動物における癌を処置する際の使用のための医薬組成物の調製のためのメチオニナーゼの使用、
である。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、メチオニナーゼを含む医薬組成物、又はメチオニン欠乏のための治療食品若しくは食事と、アスパラギナーゼを含む医薬組成物と、を含み、該組成物が別個に包装されたキットである。該組成物は、アスパラギナーゼの前にメチオニナーゼ、又は食品／食事が投与される、連続投与のためのものである。該キットは、該組成物がアスパラギナーゼの前にメチオニナーゼ、又は食品／食事が投与される、連続投与のためのものであることを示したリーフレットをさらに含んでいてもよい。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、まず効率的な量のメチオニナーゼを投与し、その後効率的な量のアスパラギナーゼを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌の処置の方法である。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、治療食品であるか否かにかかわらず、まずメチオニンを欠乏させるための食品若しくは食事を施し、その後効率的な量のアスパラギナーゼを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を処置する方法である。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、低いメチオニン生物学的利用性レベルを有する哺乳動物、或いは治療食品であるか否かにかかわらずメチオニンを欠乏させた食品若しくは食事を施されていた哺乳動物における癌の処置の方法であって、効率的な量のアスパラギナーゼを該哺乳動物に投与することを含む、方法である。
【００１９】
これらの異なる目的において、メチオニナーゼ投与とメチオニン食欠乏とを、組み合わせてもよい。
【００２０】
本発明は、液性、即ち血液の癌、及び固形癌をはじめとする任意の癌に対して有益になり得る。
【００２１】
本発明の特別な目的は、アスパラギン及び／又はメチオニンに対して栄養要求性の癌の処置への本発明の適用である。
【００２２】
本発明の特別な目的は、アスパラギン及び／又はメチオニンに対して栄養要求性でない癌の処置への本発明の適用である。
【００２３】
本発明は、任意の哺乳動物、特にヒト、犬及び猫などのコンパニオン動物、並びにウマなどの競技動物に適用することができる。
【００２４】
詳細な説明
食事又は１種の薬物での処置期間、及びメチオニン欠乏とアスパラギナーゼ処置の間の遅延時間が、処置、患者の応答、そして重要なこととして薬物又は食事の効果の半減期に応じて変動し得ることを、当業者は本開示から理解するであろう。例えば遊離酵素、ペグ化酵素、及び該酵素を封入した赤血球、或いはその他にマイクロカプセル（例えば、ＰＬＡ又はＰＬＧＡ製）若しくはリポソームに結合された、又はこれらの構造の中に封入された酵素など、本発明で用いられる剤形には差が存在し得る。
【００２５】
これらの異なる目的の好ましい実施形態において、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間は、約１時間〜約７日の間、特に約３時間〜約６日の間、好ましくは約１日〜約５日の間である。好ましくはこの実施形態において、メチオニナーゼは、遊離形態又はペグ化形態であり、アスパラギナーゼは、本明細書に記載された形態の何れであってもよい。
【００２６】
別の実施形態において、メチオニナーゼ投与の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間は、約１時間〜約３０日の間、特に約１日〜約２０日の間、好ましくは約１日〜約１０日の間である。好ましくはこの実施形態において、メチオニナーゼは、好ましくは赤血球の中に、封入されており、アスパラギナーゼは、本明細書に記載された形態の何れであってもよい。
【００２７】
さらに別の実施形態において、メチオニン制限の終了とアスパラギナーゼ投与の開始の間の遅延時間は、約１時間〜約７日の間、特に約１時間〜３日の間、好ましくは約１時間〜約１日の間である。アスパラギナーゼは、本明細書に記載された形態の何れであってもよい。
【００２８】
遊離形態又はペグ化形態、及び同種の形態の酵素を含む組成物：
これらの組成物は、標準技術を利用して哺乳動物に投与され得る。技術及び配合剤は一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０（参照により本明細書に援用される）に見出され得る。
【００２９】
医薬的に許容し得る担体及び／又は賦形剤は、本発明による医薬組成物に組み込まれて、特定のメチオニナーゼ又はアスパラギナーゼの投与を促進することもできる。本発明の実践における使用に適した担体の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、例えばラクトース、グルコース若しくはスクロース、又はデンプンのタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び生理学的に適合し得る溶媒が挙げられる。生理学的に適合し得る溶媒の例としては、注射用水（ＷＦＩ）の滅菌溶液、生理食塩溶液及びデキストロースが挙げられる。
【００３０】
本発明による医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、局所（経皮）、又は経粘膜投与をはじめとする異なる経路により投与され得る。全身投与の場合、経口投与が好ましい。経口投与の場合、例えば該化合物は、カプセル、錠剤、並びに液状調製物、例えばシロップ、エリキシル及び濃縮点滴薬などの従来の経口剤形に配合され得る。
【００３１】
或いは、注射（非経口投与）、例えば筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下注射が用いられてもよい。注射の場合、医薬組成物は、液体溶解物（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液又は溶液、例えば生理食塩水溶液、ハンクス液又はリンゲル液などに配合される。加えて該化合物は、固体形態に配合されて、使用の直前に再溶解又は懸濁されてもよい。例えばメチオニナーゼ又はアスパラギナーゼの凍結乾燥形態を、用いることができる。
【００３２】
全身投与は、経粘膜又は経皮手段によっても成就することができる。経粘膜又は経皮投与の場合、透過されるバリアに適した浸透剤が、配合剤中で用いられる。そのような浸透剤は、当該技術分野で周知であり、例えば経粘膜投与では胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体などがある。加えて洗浄剤を用いて、浸透を促進してもよい。例えば経粘膜投与は、点鼻薬、吸入器（肺送達の場合）、直腸坐剤、又は膣坐剤を通したものであり得る。局所投与では、当該技術分野で周知の通り、化合物が軟膏、膏薬、ゲル、又はクリームに配合され得る。
【００３３】
本発明は、移植器具、又は例えば注入又は他の経路を通して、該酵素を送達するための哺乳動物で適用される器具の使用も包含する。特別な実施形態において、該器具は、２つのチャンバー又はバイアルを含み、一方はメチオニナーゼを含み、他方はアスパラギナーゼを含む。該器具は、各チャンバー又はバイアルに、酵素を血液循環に送達するためのチューブ及び同種のもの、電子回路及び適切なソフトウエアにより制御される、電子若しくは電気弁若しくはポンプ、又は作動ピストンを有する。その電子回路及びそのソフトウエアは最初、所定の期間の、好ましくは特定のデビット率（ｄｅｂｉｔ  ｒａｔｅ）での、メチオニナーゼ送達と、遅延期間と、その後の所定の期間の、好ましくは特定のデビット率での、アスパラギナーゼ送達と、を制御する。
【００３４】
酵素を封入した赤血球（赤血球細胞又はＲＢＣ）を含む組成物：
一実施形態において、アスパラギナーゼは、赤血球の内部に封入され、該組成物は、医薬的に許容し得る担体又はビヒクル中のこれらの赤血球の懸濁液を含む。
【００３５】
一実施形態において、メチオニナーゼは、赤血球の内部に封入され、該組成物は、医薬的に許容し得る担体又はビヒクル中のこれらの赤血球の懸濁液を含む。
【００３６】
一実施形態において、アスパラギナーゼは、医薬的に許容し得る担体又はビヒクル中の遊離形態又はペグ化形態（ＰＥＧ−アスパラギナーゼ）である。
【００３７】
一実施形態において、メチオニナーゼは、医薬的に許容し得る担体又はビヒクル中の遊離形態又はペグ化形態（ＰＥＧ−メチオニナーゼ）である。
【００３８】
一実施形態において、メチオニナーゼは、約１００〜約１０００００ＩＵの間、特に約５００〜約５００００ＩＵの間、好ましくは約５００〜約５０００ＩＵの間の量で投与される。
【００３９】
一実施形態において、アスパラギナーゼは、約５００〜約１０００００ＩＵの間、特に約１０００〜約５００００ＩＵの間、好ましくは約５０００〜約３００００ＩＵの間の量で１回投与される。
【００４０】
一実施形態において、該組成物は、２回以上、特に２又は３回の連続する投与に使用するためのものである。
【００４１】
一実施形態において、アスパラギナーゼ及びメチオニナーゼは、本発明により連続して用いられ、これらの酵素は両者とも赤血球に封入されている。
【００４２】
一実施形態において、アスパラギナーゼ及びメチオニナーゼは、本発明により連続して用いられ、アスパラギナーゼは、赤血球に封入されており、メチオニナーゼは、遊離形態又はペグ化形態である。
【００４３】
一実施形態において、アスパラギナーゼ及びメチオニナーゼは、本発明により連続して用いられ、メチオニナーゼは、赤血球に封入されており、アスパラギナーゼは、遊離形態又はペグ化形態である。
【００４４】
「封入された」は、該酵素が赤血球の内部に含まれていることを意味する。しかし、酵素の一部の微量が赤血球の壁に保持されることは、可能である。
【００４５】
食事中メチオニン制限：
食事中メチオニン制限は、メラノーマ及びグリオーマにおけるシステムスチン療法（Ｅ．Ｔｈｉｖａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，２９：５２３５−５２４０）、又は転移大腸癌の第一選択治療としてのＦＯＬＦＯＸ（Ｘ．Ｄｕｒａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１０，７８：２０５−２０９）の何れかに関連して提案された。メチオニン制限又は欠乏食は、哺乳動物における遊離メチオニンの完全又は実質的な減少又は排除を誘導するのに充分な時間の、食養生又は該哺乳動物への食品組成物の供給である。
【００４６】
該食品は、好ましくは非経口経路、特に注入によって投与される液状の食品であってもよい。
【００４７】
同じく、メチオニナーゼを用いたメチオニン欠乏は、哺乳動物において遊離メチオニンの完全又は実質的な減少又は排除を誘導することを目標とする。典型的にはこの食事は、メチオニンレベルを哺乳動物における平均レベルに関して３０〜１００％、典型的には３０〜６０％減少させるために実施される。Ｔｈｉｖａｔ  ２００９及びＤｕｒａｎｄｏ  ２０１０による研究を参照してもよい。
【００４８】
食品の投与は、１日又はより長期間、例えば１日〜数日の間、実施されてもよい。
【００４９】
一実施形態において、該食品は、メチオニナーゼ処置に組み合わせられ、例えば該食品はメチオニナーゼでの処置の全期間又は一部の期間に投与される。
【００５０】
メチオニナーゼ
さらにメチオニナーゼは、中でもＬ−メチオニナーゼ、メチオニンγリアーゼＭＧＬと称され、この化合物は、受付番号ＥＣ４．４．１．１１及びＣＡＳ番号４２６１６−２５−１である。本発明により用いられ得るメチオニナーゼ供給源を知るために、とりわけＥｌ  Ｓａｙｅｄ  Ａ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）８６：４４５−４６７という発行物を挙げることができる。
【００５１】
組換えメチオニナーゼは、例えばシュードモナス・プチダ菌から、該酵素についてコードする遺伝子から大腸菌において産生してもよい。それにより得られたｒＭＥＴａｓｅと呼ばれる酵素は、遊離形態又は修飾形態、例えばペグ化形態（ＰＥＧ−ｒＭＥＴａｓｅ）で用いてもよい。Ｘ．Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３，６３：８３７７−８３８３を参照されたい。ｒＭＥＴａｓｅもまた、赤血球に封入してもよく、該組成物またな懸濁液は、有利には決定されたアスパラギナーゼの用量を該患者に送達するのに充分となる赤血球量及び封入されたメチオニナーゼ量を含有する。
【００５２】
当業者は、組成物及び使用方法について、国際公開第２０１５／１２１３４８号パンフレットを参照してもよい。
【００５３】
メチオニナーゼの組成物は、該酵素の補因子、即ちＰＬＰ、及び／又はその前駆体をさらに含んでいてもよく、該前駆体は、ビタミンＢ６の非リン酸エステル形態などの非リン酸エステル前駆体、及び／又はピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）などのリン酸エステル前駆体であってもよい。
【００５４】
ビタミンＢ６は、リン酸エステル又は非リン酸エステルの何れかの異なる形態で存在する。ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）及びピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）は、ビタミンＢ６のリン酸エステル形態である。対応する非リン酸エステル形態は、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、及びピリドキサミン（ＰＭ）である。ビタミンＢ６の非リン酸エステル形態は、赤血球膜を通過する場合があり、該リン酸エステル形態は、通過することができるが困難である。主な経路によれば、ピリドキシン（ＰＮ）は、ＰＮキナーゼの影響の下、赤血球の内部でＰＮＰに変換され、その後、ＰＮＰは、ＰＮＰオキシダーゼの影響の下、ＰＬＰに変換される。その後、ＰＬＰは、ＰＬＰホスファターゼの影響の下、ピリドキサール（ＰＬ）に変換され得、ＰＬは、赤血球を離れ得る。提供された前駆体が、調製方法の間、又は該組成物の貯蔵の間に赤血球内で変換を受け得ることは、容易に理解される。
【００５５】
ビタミンＢ６の非リン酸エステル形態とは、本明細書において、ビタミンＢ６の３つの「ビタマー」：ＰＬ、ＰＮ及びＰＭのうちの１つ、又は２つ若しくは３つのビタマーの混合物を意味する。ＰＮ形態が、好ましい。それらのビタマーは、塩の形態でもあってもよい。
【００５６】
該組成物は、赤血球に封入されたＰＬＰを含んでいてもよい。ＰＬＰは、封入手順の際に提供してもよく、又は全体若しくは一部を赤血球の前駆体から赤血球中に得てもよい。提示又は形成の何れかによるＰＬＰは、該酵素と会合されてもよい。したがって該組成物は、対応するホロ酵素、例えばメチオニナーゼＰＬＰを含んでいてもよい。これらの条件下で、例えば血漿の基質の枯渇の持続が観察される、活性酵素の半減期は、かなり増加する。本発明による組成物は、投与後２４時間を超えて、とりわけ１、５、１０又は１５日を超えて、酵素活性を保持する能力を与える。
【００５７】
一実施形態において、メチオニナーゼの組成物は、したがってピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）及び／又はビタミンＢ６の非リン酸エステル形態及び／又はリン酸エステル前駆体、ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）及び／又はピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含む。
【００５８】
１つの特徴によれば、ＰＮＰ及び／又はＰＭＰは、組成物中の赤血球の内部に封入されている。この前駆体は、該酵素と同時封入されてもよく、又は全体若しくは一部が赤血球の前駆体から赤血球中に得てもよい。
【００５９】
該組成物は、とりわけ赤血球細胞（赤血球）１リットル（Ｌ）に約０．０５〜約６００、とりわけ約０．５〜約１００、好ましくは約５〜約５０μｍｏｌｅの封入されたＰＬＰ及び／又はＰＮＰ及び／又はＰＭＰを含む。
【００６０】
１つの特徴によれば、該組成物は、ＰＬＰ酵素を封入した赤血球と、赤血球に封入された、赤血球の内部に存在する、又は赤血球の内部及び外部に存在する、ＰＬＰ及びさらに非リン酸ＰＬＰ前駆体と、を含む。この非リン酸エステル前駆体は、ＰＮ、ＰＬ若しくはＰＭ、好ましくはＰＮ、又はこれらの化合物の２種若しくは３種の混合物であってもよい。非リン酸エステル前駆体は、赤血球の内部及び／又は外部に存在し得る。この非リン酸エステル前駆体の存在は、この非リン酸エステル前駆体の非存在下よりも著しく高い赤血球内ＰＬＰレベルに達する可能性を与える。
【００６１】
一実施形態において、該組成物は、メチオニナーゼと、加えてＰＬＰ及びそのリン酸エステル前駆体の一種、ＰＮＰ、ＰＬＰ及び／又はＰＭＰをと、を封入した赤血球を含む。この同じ組成物は、直前に記載された通り、有利には非リン酸エステル前駆体、とりわけＰＮをさらに含んでいてもよい。
【００６２】
該組成物又は懸濁液は、有利には決定されたメチオニナーゼ用量を患者に送達するのに充分となる赤血球量及び封入されたメチオニナーゼ量を含有する。
【００６３】
したがって該組成物は、メチオニナーゼと同時の、別個の、又は連続した投与のためのＰＬＰ又はＰＬＰ前駆体をさらに含んでいてもよい。一実施形態において、該組成物は、別個の又は連続した投与のために、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼと、ＰＬＰの非リン酸エステル前駆体と、を含む。
【００６４】
一実施形態によれば、該組成物は、（ｉ）メチオニナーゼを封入した赤血球、及び医薬的に許容し得るビヒクルの配合剤と、（２ｉ）非リン酸エステル形態のビタミンＢ６、好ましくはＰＮ、及び医薬的に許容し得るビヒクルの配合剤と、を含む。これらの配合剤は、同時の、別個の、又は連続した投与のためのものであり、本発明によるメチオニンの枯渇に特化される。この後に提示される使用方法は、最良の投与様式を詳述している。該組成物は、とりわけこれらの配合剤を別個に含むセット又はキットの形態であってもよい。一実施形態によれば、赤血球の配合剤における医薬的に許容し得るビヒクルは、赤血球のための≪保持溶液≫、即ち、有効成分が封入された赤血球を注射の待機中の貯蔵に適した形態で懸濁させる溶液である。保持溶液は、好ましくは、とりわけグルコース、デキストロース、アデニン及びマンニトールから選択される、赤血球の保持を促進する少なくとも１種の薬剤を含む。ことによると該保持溶液は、赤血球内ＰＬＰホスファターゼ酵素の阻害を可能にする無機リン酸エステルを含有する。
【００６５】
一実施形態において、赤血球の内部に封入されたアスパラギナーゼが投与される前に、赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼが少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回投与され、各メチオニナーゼ投与の後、アスパラギナーゼが投与される前にＰＬＰの非リン酸エステル前駆体の溶液の投与がある。
【００６６】
ＭＧＬ活性は、以下の条件下で１分あたり１マイクロモルのアンモニアを遊離するのに必要となるＭＧＬ量に対応するＩＵで表される。
補因子ＰＬＰの存在下では、ＭＧＬは、Ｌ−メチオニンをαケト酪酸に加水分解して、Ｌ−メチオニン１分子あたり１分子のアンモニアを形成する：
Ｌ−メチオニン＋Ｈ2Ｏ  →  メタンチオール＋ＮＨ4+＋α−ケト酪酸
【００６７】
ＭＧＬ活性の投与は、０．２６μｇ／ｍＬ  ＭＧＬ、２０ｎＭ  ＰＬＰ及び２５ｍＭ  Ｌ−メチオニンの存在下、３７℃、ｐＨ８．６で実施されるが、市販のテストを用いてもよい（例えば、ＮＨ3キット、Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【００６８】
該方法は、ＭＧＬの最大活性（Ｖｍａｘ）に達したら、５分〜１０分の間の反応でのアンモニウム生成の反応速度を測定することからなる。アンモニウム生成の測定は、以下の通り、アンモニウム及びα−ケトグルタル酸の存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）によりＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ+に酸化することで、３４０ｎｍで光学密度の変動を測定することにより得られる。
α−ケトグルタル酸＋ＮＨ4+＋ＮＡＤＰＨ  →  Ｌ−グルタミン酸＋ＮＡＤＰ+＋Ｈ2Ｏ
【００６９】
アスパラギナーゼ
アスパラギナーゼそのものは、ＣＡＳ番号：９０１５−６８−３が割り当てられている。通常の名称は、アスパラギナーゼであり、これの他の一般的名称は、コラスパーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ及びＬ−アスパラギンアミノヒドロラーゼである。
【００７０】
本発明の意味におけるアスパラギナーゼという用語は、任意の起源のアスパラギナーゼも網羅し、特に天然若しくは組換え体起源のもの、及び、例えばペグ化若しくはＰＥＧ形態（ＰＥＧ−アスパラギナーゼ）などのアスパラギナーゼを組み込んだ任意の誘導体、又はＬ−アスパラギナーゼの活性を保持する断片であり得る。同じく、何れの細菌起源のアスパラギナーゼも網羅する。したがって、該アスパラギナーゼは、大腸菌型のもの、特に大腸菌ＨＡＰ−Ａ−１−３、エルウィニア・クリサンテミ型のもの、又はウォリネラ・スクシノゲネス型のものであってよい。「型」は、該当する細菌の培養物から得ることができること、又は組換え体、換言すると遺伝子工学によって得られた該細菌のアスパラギナーゼの形態であり得ることを意味すると理解する。好ましい実施様式において、アスパラギナーゼは、大腸菌ＨＡＰ−Ａ−１−３型のものである。
【００７１】
商業的製品を入手することができ、本明細書で使用可能である：５０００Ｕ  Ｍｅｄａｃ、１００００Ｕ  Ｍｅｄａｃ（登録商標）、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）。該製品は、粉末形態であり、使用前に注射液又は水で溶解される。リン酸二水素ナトリウム・１Ｈ2Ｏ、リン酸一水素ナトリウム・７Ｈ2Ｏ及び／又は塩化ナトリウムなどの賦形剤が、存在してもよい。
【００７２】
アスパラギナーゼという用語は、本発明の意味においては、Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有する細菌酵素であるアスパラギナーゼ様物質も網羅する。例として、アシネトバクター・グルタミナーゼ・アスパラギナーゼ（ＡＧＡ）を挙げることができる。
【００７３】
本発明の一実施形態によれば、アスパラギナーゼは、赤血球に封入されており、該組成物又は懸濁液は、有利には一定量の赤血球と、決定されたアスパラギナーゼ用量を該患者に送達するのに充分となる一定量の封入アスパラギナーゼと、を含有する。
【００７４】
アスパラギナーゼ  １ＩＵは、通常通り、Ｌ−アスパラギナーゼ量を過剰とし、ｐＨ７．３及び３７℃で１分あたり１μｍｏｌのアンモニアをＬ−アスパラギンから遊離するために必要となる酵素の量と定義される。
【００７５】
赤血球への封入
一実施形態によれば、メチオニナーゼの組成物及び／又はアスパラギナーゼの組成物は、該酵素を封入した赤血球と、医薬的に許容し得るビヒクルと、を含む。好ましくは該赤血球は、処置対象と同じ種の哺乳動物から生成される。該哺乳動物が、ヒトである場合、該赤血球は、好ましくはヒト起源のものである。一実施形態において、該赤血球は、患者自身から得られる。
【００７６】
一実施形態によれば、該医薬的に許容し得るビヒクルは、赤血球のための≪保持溶液≫、即ち、該酵素が封入された赤血球を注射の待機中の貯蔵に適した形態で懸濁させる溶液である。該保持溶液は、好ましくは、とりわけグルコース、デキストロース、アデニン及びマンニトールから選択される、赤血球の保持を促進する少なくとも１種の薬剤を含む。
【００７７】
該保持溶液は、ＮａＣｌと、アデニンと、グルコース、デキストロース及びマンニトールのうちの少なくとも１種の化合物と、を含む水性溶液であってもよい。
【００７８】
該保持溶液は、ＮａＣｌ、アデニン及びデキストロース、好ましくはＡＳ３培地を含んでいてもよい。
【００７９】
該保持溶液は、ＮａＣｌ、アデニン、グルコース及びマンニトール、好ましくはＳＡＧ−マンニトール又はＡＤｓｏｌ培地を含んでいてもよい。
【００８０】
特に保持溶液中の該組成物又は懸濁液は、７２時間目に０．５ｇ／ｄｌ以下、特に０．３ｇ／ｄｌ、とりわけ０．２ｇ／ｄｌ、好ましくは０．１５ｇ／ｄｌ、より良好には０．１ｇ／ｄｌのレベルで保持される細胞外ヘモグロビンレベルと、２〜８℃の間に含まれる温度での保持と、を特徴とする。
【００８１】
特に保持溶液中の該組成物又は懸濁液は、２４時間〜２０日の間、とりわけ２４〜７２時間の間に含まれる期間に０．５ｇ／ｄｌ以下、特に０．３ｇ／ｄｌ以下、とりわけ０．２ｇ／ｄｌ以下、好ましくは０．１５ｇ／ｄｌ以下、より良好には０．１ｇ／ｄｌ以下のレベルで保持される細胞外ヘモグロビンレベルと、２〜８℃の間に含まれる温度での保持と、を特徴とする。
【００８２】
細胞外ヘモグロビンレベルは、有利にはＧ．Ｂ．Ｂｌａｋｎｅｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｄｉｎｗｏｏｄｉｅ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８，９６−１０２，１９７５に記載された手作業での参照方法により測定される。器具に特有の感度でこの測定を測定することが可能な自動器具も、存在する。
【００８３】
特に保持溶液中の該組成物又は懸濁液は、７２時間目に２％以下、とりわけ１．５％以下、好ましくは１％以下で維持される溶血率と、２〜８℃の間に含まれる温度での保持と、を特徴とする。
【００８４】
特に保持溶液中の該組成物又は懸濁液は、２４時間〜２０日の間、とりわけ２４〜７２時間の間に含まれる期間、及び２〜８℃の間に含まれる温度で２％以下、とりわけ１．５％以下、好ましくは１％以下で維持される溶血率を特徴とする。
【００８５】
封入方法
赤血球への酵素の封入は、低張液体培地と接触して赤血球膜内の細孔を開く赤血球懸濁液を利用して実施されてもよい。溶解−再封技術には、低張透析、低張予備膨潤及び低張希釈という３つの選択肢があり、全てが赤血球の内側と外側の浸透圧差に基づいている。低張透析が、好ましい。
【００８６】
酵素を封入した赤血球の懸濁液は、とりわけ以下の方法で得ることができる：
１  −  ６５％以上のヘマトクリットレベルで、等張溶液中に赤血球ペレットを懸濁させ、＋１〜＋８℃の間で冷却すること、
２  −  ＋１〜＋８℃の間に維持された温度で、コイル又は透析カートリッジなどの透析器具（該カートリッジが好ましい）に、６５％以上のヘマトクリットレベルの赤血球と、＋１〜＋８℃の間の冷却された低張溶解溶液と、の懸濁液を通過させることを含む、溶解手順、
３  −  溶解の前又は溶解の間に、＋１〜＋８℃の間で維持された温度で、封入される酵素（とりわけ、前述のとおり構成された溶液中の）を該懸濁液に、好ましくは徐々に、添加することによる封入手順、及び
４  −  等張又は高張、有利には高張の溶液の存在下、とりわけ＋３０〜＋４２℃の間に含まれる、高温で実施される再封手順。
【００８７】
好ましい代替法において、使用は、国際公開第２００６／０１６２４７（Ａ）号パンフレット（欧州特許第１７７３４５２号明細書；参照により本明細書に援用される）に記載された方法で実施されてもよい：
１  −  ６５％以上のヘマトクリットレベルで、等張溶液に赤血球ペレットを懸濁させ、＋１〜＋８℃の間で冷却すること、
２  −  この同じペレットからの赤血球試料で浸透圧脆弱性を測定すること。
３  −  ＋１〜＋８℃の間に維持された温度で、コイル又は透析カートリッジなどの透析器具（該カートリッジが好ましい）に、６５％以上のヘマトクリットレベルの赤血球と＋１〜＋８℃の間で冷却された低張溶解溶液との懸濁液を通過させることを含む、溶解手順であって、該溶解パラメータがより早期に測定された浸透圧脆弱性に従って調整され、とりわけ測定された浸透圧脆弱性に応じて、透析器具を通過する赤血球懸濁液の流れを調整するか、又は溶解溶液の浸透圧を調整する、溶解手順、
４  −  溶解の前又は溶解の間に、＋１〜＋８℃の間で維持された温度で、封入される酵素（とりわけ、前述のとおり構成された溶液中の）を該懸濁液に、好ましくは徐々に、添加することによる封入のための手順、及び
５  −  等張又は高張、有利には高張の溶液の存在下、とりわけ＋３０〜＋４２℃の間に含まれる、高温で実施される再封手順。
【００８８】
とりわけ透析では、赤血球のペレットを６５％以上、好ましくは７０％以上の高いヘマトクリットレベルで等張溶液に懸濁させ、この懸濁液を＋１〜＋８℃の間、好ましくは＋２〜＋６℃の間、典型的にはほぼ＋４℃で冷却する。特定の方法によれば、該ヘマトクリットレベルは、６５〜８０％の間、好ましくは７０〜８０％の間に含まれる。
【００８９】
該浸透圧脆弱性は、測定される際、有利には、封入される酵素の存在下又は非存在下で、好ましくは存在下で溶解ステップの直前に赤血球で測定される。赤血球又はそれを含有する懸濁液は、有利には溶解に選択された温度に近い、又はその温度と同一の温度である。本発明の別の有利な特徴によれば、実施された浸透圧脆弱性の測定は、迅速に利用され、即ち該溶解手順は、試料採取後、短時間のうちに実施される。好ましくは試料採取と溶解開始の間の時間経過は、３０分以下、より良好には２５分以下、さらに良好には２０分以下である。
【００９０】
測定を含む溶解−再封手順を実施する方法に関し、そして浸透圧脆弱性を考慮して、当業者は、より詳細について国際公開第２００６／０１６２４７号パンフレットを参照してもよい。該文書は、参照により本明細書に援用される。
【００９１】
この封入技術の重要性は、当業者が参照することができ、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１４／１８０８９７号パンフレットに記載された。したがって一実施形態によれば、該酵素を封入した赤血球は、溶解−再封により赤血球の内部に有効成分を封入すること、該酵素を封入した赤血球と、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液と、を含む懸濁液又はペレットを得ること、該ペレット又は懸濁液をそのままの状態で、又はインキュベーション溶液を添加した後に２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧でインキュベートすること、を含む方法により得られる。インキュベーションは、とりわけ３０分以上、特に１時間以上の期間に実施される。その後、インキュベーションされた溶液の液体培地の除去に進められ、患者への懸濁液の注射を可能にする溶液、好ましくは患者への懸濁液の注射を可能にする保持溶液に、得られた赤血球を懸濁させる。示された浸透圧は、赤血球を懸濁させる溶液、又は関連の時点でのペレットの浸透圧である。
【００９２】
≪安定した赤血球懸濁液≫とは、とりわけヒトにおいて使用されるまで０．２ｇ／ｄｌ以下のままの細胞外ヘモグロビン量を有する懸濁液を意味し、該ヘモグロビン量は、とりわけ有効成分を組み込んだ赤血球バッチを生成した後１〜７２時間の間であってもよい。
【００９３】
≪即時使用可能な安定した赤血球懸濁液≫とは、患者への注射を可能にする溶液、とりわけ保持溶液中の、安定した懸濁液を意味する。そのヘマトクリットは一般に、３５％以上、４０％以上、又は４５％以上である。
【００９４】
≪赤血球ペレット≫とは、過去に赤血球が懸濁された液体培地の赤血球を分離した後に回収された赤血球の濃縮物又は集結物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を意味する。該分離は、濾過により、又は遠心分離により確実になり得る。遠心分離は、そのような分離に一般に用いられる手段である。ペレットは、特定割合の液体培地を含む。一般にペレットは、７０〜８５％の間で含まれるヘマトクリットを有する。
【００９５】
≪インキュベーション溶液≫とは、有効成分を封入した赤血球がインキュベーションステップの間に存在する溶液を意味する。該インキュベーションは、大きな範囲のヘマトクリット、とりわけ１０〜８５％の間のヘマトクリットで成就され得る。
【００９６】
≪脆弱な赤血球≫とは、保持溶液に懸濁されたら、該懸濁液が２〜８℃の間で、とりわけ１〜７２時間後に、保持されると溶解され得る組み込み手順から生じる赤血球を意味する。
【００９７】
≪初期ヘマトクリット≫とは、インキュベーションの間の脆弱赤血球の溶解による細胞損失の前のヘマトクリットを意味する。
【００９８】
該方法は、とりわけ以下のステップを含んでいてもよい：
（ａ）赤血球を低等張培地と接触させること（赤血球の膜の細孔を開かせること）、有効成分と接触させること（赤血球に進入させるため）、とりわけ等張又は高張、有利には高張の培地を用いて、赤血球を再封すること、を含む赤血球の内部に該酵素を封入するステップ、
（ｂ）酵素を取り込んだ赤血球と、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液と、を含む懸濁液又はペレットを獲得又は調製するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のペレット又は懸濁液をそのままの状態で、又はインキュベーション溶液を添加した後に、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧で３０分以上、とりわけ１時間以上の期間、インキュベートするステップ、
（ｄ）該インキュベートされたステップ（ｃ）の懸濁液の液体培地を除去するステップ、
（ｅ）（ｄ）で得られた赤血球を、患者への該懸濁液の注射を可能にする溶液、好ましくは患者への該懸濁液の注射を可能にする保持溶液に懸濁させるステップ。
【００９９】
第一の方法によれば、溶解−再封による封入に続くステップ、とりわけステップ（ｂ）は、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧での、溶液への、溶解−再封ステップ又はステップ（ａ）で得られた懸濁液又はペレットの希釈による少なくとも１回の洗浄サイクル、好ましくは２又は３回の洗浄サイクルと、その後に赤血球のペレット又は懸濁液を得ること、を含む。このペレット又はこの懸濁液は、該酵素を組み込んだ赤血球と、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液と、を含む。以後のステップ、例えば（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）がその後、適用される。
【０１００】
第二の方法によれば、該溶解−再封ステップ又はステップ（ａ）において、等張又は高張培地を用いた赤血球の再封は、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧の溶液中で、その後にインキュベーションを受け得る赤血球の懸濁液、例えばステップ（ｂ）の懸濁液を生成する。換言すると、該溶解−再封ステップ又はステップ（ａ）は、酵素を封入している懸濁された赤血球を等張又は高張、有利には高張の再封溶液と混合して、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間の浸透圧を有する赤血球の懸濁液を生成させる、赤血球を再封するためのステップを含む。この方法において、該インキュベーションステップ又はステップ（ｃ）は、再封から生じた懸濁液のインキュベーションを含む。該インキュベーションは、３０分以上、とりわけ１時間以上の期間、実施される。以後のステップ、例えば（ｄ）及び（ｅ）がその後、適用される。
【０１０１】
該溶解−再封の後のステップ、例えば（ｂ）〜（ｅ）は、脆弱赤血球、又はそれらの大部分、とりわけ５０、６０，７０、８０又は９０％、又はより大部分の溶解をもたらす条件下で実施される。これを行うために、赤血球が懸濁される際のインキュベーション期間、インキュベーション温度、及び溶液浸透圧で作用することが可能である。浸透圧が高いほど、インキュベーション時間が長くなり得る。したがって浸透圧が低いほど、同じ効果を得るのにより短いインキュベーションになり得る。同じく温度が高いほど、インキュベーション時間が短くなり得、その逆もあてはまる。その後、１回又は複数回の洗浄サイクルにより、細胞残屑及び細胞外ヘモグロビンに加え、細胞外酵素も除去することができよう。
【０１０２】
本発明によれば、洗浄サイクルは、赤血球の懸濁液又はペレットの希釈、及びその後の赤血球と洗浄溶液との分離を含む。好ましくは洗浄ステップは、好ましくは２又は３回の希釈−分離サイクルを含む。該分離は、濾過及び遠心分離などの任意の適切な手段により実行され得る。遠心分離が、好ましい。
【０１０３】
インキュベーションは、該懸濁液のヘマトクリットにより限定されない。このようにして、概ね１０〜８５％の間、とりわけ４０〜８０％の間に含まれる初期ヘマトクリットを有する懸濁液が、インキュベートされ得る。これは、７０％からはむしろペレットと称され、この値未満は懸濁液と称される。
【０１０４】
該除去ステップ又はステップ（ｄ）は、とりわけ細胞残屑及び細胞外ヘモグロビンに加え、結果として細胞外酵素を除去するために、懸濁液又はインキュベートされたペレットの液体部分を除去することを目的とする。
【０１０５】
該除去ステップ又はステップ（ｄ）のための第一の方法によれば、分離、とりわけ遠心分離が実施され、これはとりわけ懸濁液に提供可能である。この分離に続いて、１回又は複数回、例えば２又は３回の洗浄サイクル、等張溶液での希釈、そしてその後、とりわけ遠心分離による、分離が行われてもよい。
【０１０６】
該除去ステップ又はステップ（ｄ）のための第二の方法によれば、分離、とりわけ遠心分離の前に希釈が実施され、これは懸濁液又はペレットに適用可能である。該希釈は、とりわけ等張洗浄溶液又は保持溶液で実施されてもよい。
【０１０７】
最終ステップ又はステップ（ｅ）は、任意の他の処置を行わずに患者に投与され得るように、最終懸濁液を調製することからなる。
【０１０８】
このステップのための第一の方法によれば、該除去ステップ又はステップ（ｄ）から得られた赤血球ペレットの希釈が、注射溶液、とりわけ保持溶液で実施される。
【０１０９】
このステップのための第二の方法によれば、該除去ステップ又はステップ（ｄ）から生じた赤血球ペレットを洗浄するための１回又は複数回のサイクルは、注射溶液、とりわけ保持溶液で実施され、その後、希釈と、続いて分離が実施される。洗浄の後、赤血球を注射溶液、とりわけ保持溶液で再懸濁する。
本発明の方法は、以下の特徴の１つ、複数又は全てをさらに含んでいてもよい：
−  該インキュベーションステップ又はステップ（ｃ）が、約２〜約３９℃の間に含まれる温度で、脆弱赤血球の溶解を確実にするのに充分な時間、実施される、
−  該インキュベーションステップ又はステップ（ｃ）が、とりわけ約２〜約１０℃の間、特に約２〜約８℃の間に含まれる低温で実施され、約１時間〜約７２時間、とりわけ約６時間〜約４８時間、好ましくは約１９時間〜約３０時間持続する、
−  該インキュベーションステップ又はステップ（ｃ）が、約２０〜約３９℃の間に含まれる高温で、とりわけ室温（２５℃±５℃）で実施され、約３０分〜約１０時間、とりわけ約１時間〜約６時間、好ましくは約２時間〜約４時間持続し、室温よりも高い温度でも操作することが可能であるが、これは、細胞収率、Ｐ５０及び／又は２，３−ＤＰＧ量に及ぼす負の影響を有する場合がある、
−  該インキュベーションステップ又はステップ（ｃ）において、該懸濁液が、１０〜８５％の間、とりわけ４０〜８０％の間に含まれる初期ヘマトクリットであり、分離からのペレットは、例えば７０〜約８５％の間のヘマトクリットを有し、又は約４０〜７０％の間に含まれるヘマトクリットを有する希釈されたペレットが、インキュベートされてもよい、
−  該インキュベーションステップは、該懸濁液の撹拌を含む、
−  該インキュベーションステップは、任意の撹拌を含まない、
−  洗浄及び／又はインキュベーションのための溶液として、計量された水性ＮａＣｌ溶液を、所望の浸透圧を得るために用い、例として溶液は、つまり０．９％のＮａＣｌを含んでいてもよく、この溶液はまた、とりわけＮａＣｌに加えて、グルコース、とりわけグルコース一水和物、リン酸一ナトリウム二水和物、リン酸二ナトリウム十二水和物を含んでいてもよく、例として組成物は、０．９％のＮａＣｌ、０．２％のグルコース一水和物、０．０３４％のリン酸一ナトリウム二水和物、０．２％のリン酸二ナトリウム十二水和物を含む、
−  最終ステップ又はステップ（ｅ）における洗浄は、保持溶液で実施される、
−  即時使用可能な懸濁液、又は患者に注射され得る懸濁液の該溶液（液体部分）の浸透圧は、約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間、好ましくは約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間に含まれる、
−  即時使用可能な懸濁液、又は患者に注射され得る懸濁液のヘマトクリットは、３５％以上、４０％以上又は４５％以上である、
−  洗浄、インキュベーションのためのステップ全てが、保持溶液で実施される、
−  ステップ（ｂ）の洗浄溶液及び／又はステップ（ｅ）の洗浄溶液及び保持溶液は、同じ組成のものであり、赤血球の保持を促進する化合物（複数可）を含む、
−  該保持溶液（そして必要に応じて、該洗浄溶液（複数可）又は該インキュベーション溶液）は、ＮａＣｌと、アデニンと、グルコース、デキストロース及びマンニトールのうちの少なくとも１種の化合物と、を含む水性溶液である、
−  該保持溶液（そして必要に応じて、該洗浄又は該インキュベーション溶液（複数可））は、ＮａＣｌ、アデニン及びデキストロース、好ましくはＡＳ３培地を含む、
−  該保持溶液（そして必要に応じて、該洗浄又は該インキュベーション溶液（複数可））は、ＮａＣｌ、アデニン、グルコース及びマンニトール、好ましくはＳＡＧ−マンニトール又はＡＤｓｏｌ培地を含む。
【０１１０】
本発明による方法は、とりわけ以下のステップを含む：
（ａ）低等張培地と接触させて、赤血球の膜の細孔を開かせること、該酵素を赤血球に進入させるために該酵素と接触させること、等張又は高張の培地を用いて赤血球を再封すること、を含む赤血球の内部に該酵素を封入するステップ。該酵素が赤血球の溶解前に赤血球の懸濁液中に存在してもよく、又は溶解の際若しくは溶解後にさらに添加されてもよいが、必ず再封の前に添加され得ることが留意されなければならない。このステップ（ａ）の一実施形態において、該方法は、以下のサブステップを含む：
（ａ１）６０又は６５％以上のヘマトクリットの赤血球の懸濁液を有するサブステップ、
（ａ２）この懸濁液中の赤血球の浸透圧脆弱性を測定するサブステップ、
（ａ３）該赤血球懸濁液を溶解溶液に対する透析器具、とりわけ透析カートリッジに通すこと、（ａ２）の下で測定された浸透圧脆弱性に応じて、赤血球懸濁液の流れを調整する、又は溶解溶液の流速を調整する、又は溶解溶液の浸透圧を調整すること、を含む有効成分（複数可）の溶解及びインタナリゼーションのための手順のサブステップ、
（ａ４）赤血球を再封するための手順のサブステップ。
【０１１１】
使用方法
第一の態様において、本発明は、必要とする哺乳動物における癌を処置する方法であって、該哺乳動物をメチオニンについて欠乏させ、その後、特に充分量のアスパラギナーゼを投与することを通して、該哺乳動物をアスパラギンについて欠乏させることを含む、方法である。探求されることは、癌細胞に利用可能なメチオニン及びアスパラギンの量を減少させることである。メチオニン欠乏は、上述の通り、食事のメチオニン欠乏及び／又はメチオニナーゼ投与を通して実施してもよい。
【０１１２】
第二の態様において、本発明は、必要とする哺乳動物における癌を処置するための方法であって、該必要とする哺乳動物に、メチオニナーゼを含む組成物を、そしてその後、アスパラギナーゼを含有する組成物を投与すること、特に注射することを含む、方法である。
【０１１３】
連続投与、メチオニン欠乏及び／又はメチオニナーゼ投与とアスパラギナーゼ投与の間の遅延時間、投与量、反復投与、並びに医薬組成物の形態（酵素を封入した赤血球（ＲＢＣ）の遊離形態、ペグ化形態及び／又は懸濁液）は、先に詳述されており、使用方法に適用される。
【０１１４】
一実施形態において、メチオニナーゼ（例えば、遊離形態、ペグ化形態又は封入された）を、１回又は複数回投与する。
【０１１５】
別の実施形態において、遊離又はペグ化メチオニナーゼは、アスパラギナーゼ投与前に１回よりも多く投与され、例えばメチオニナーゼの２用量以上（例えば、２、４、５用量）が、典型的には異なる日数に、例えば１日１回、哺乳動物に投与される。
【０１１６】
一実施形態において、メチオニナーゼの補因子の有効量が、患者に投与される。該補因子は、メチオニナーゼ投与の前、メチオニナーゼ投与と同時、又はメチオニナーゼ投与の後に投与され得る。一実施形態において、該補因子は、メチオニナーゼと同じ組成物中に存在する。別の実施形態において、該補因子は、別の組成物中で投与される。
【０１１７】
一実施形態において、赤血球に封入されたメチオニナーゼの投与が実施され、補因子もまた、封入されていてもよく、又は該補因子は、溶液中に遊離形態であってもよい。好ましい実施形態において、該補因子は、医薬的に許容し得るビヒクルの溶液中に存在し、非リン酸エステル形態のビタミンＢ６、好ましくはＰＮである。非リン酸エステル形態のビタミンＢ６のこの溶液は、注射若しくは経口経路により、又は任意の他の経路を介して投与され得る。一実施形態において、該溶液は、封入されたメチオニナーゼの各注射後、例えば１時間後〜１０時間後の間に１回又は複数回投与される。好ましくは該溶液は、メチオニナーゼ処置の期間又は血液循環におけるメチオニナーゼ活性の存続期間（半減期に応じて）に、有利には１日１回、又はその他では１日２回以上、投与される。赤血球の内部に封入されたメチオニナーゼにより、溶液中の補酵素は、１０〜３０日の間、少なくとも１日１回投与されてもよい。
【０１１８】
一実施形態において、遊離形態、ペグ化形態又は封入されたアスパラギナーゼは、１回又は複数回投与される。
【０１１９】
別の実施形態において、遊離又はペグ化アスパラギナーゼは、１回よりも多く投与され、例えばアスパラギナーゼの２用量以上（例えば、３、４、５用量）が、典型的には異なる日数で、例えば１日１回、哺乳動物に投与される。
【０１２０】
一実施形態において、該メチオニナーゼ及び／又はアスパラギナーゼは、粉末形態であり、使用方法は、哺乳動物に投与する前に医薬的に許容し得る溶液又は液体に該粉末を可溶化することを含む。
【０１２１】
一実施形態において、使用は、上記の器具で行われる。このように癌処置の方法は、記載された器具を哺乳動物、特にヒトへ移植又は留置することを含む。該移植又は留置は、既に適所にある血管への、又はカテーテル及び同種のものへのチューブの接続を含み得る。該方法はその後、本発明の方法に従ってソフトウエアのプログラミングにより連続送達するための器具を始動させることを含んでいてもよい。
【０１２２】
有利には保持溶液中のメチオニナーゼ又はアスパラギナーゼを封入した赤血球の懸濁液は、即時使用可能であり、好ましくは、特にＦＤＡ推奨に適合する低い細胞外ヘモグロビンレベルを有していてもよい。
【０１２３】
第一の実施形態において、注射前１〜７２時間の間、特に１０〜７２時間の間に調製された有効成分を封入したＲＢＣの懸濁液の注射を、哺乳動物、特にヒト患者に与える。この懸濁液のヘマトクリットは、４０％以上である。該懸濁液は、保持溶液に含有される。細胞外ヘモグロビンは、０．５ｇ／ｄｌ以下、特に０．３ｇ／ｄｌ以下、より特に０．２ｇ／ｄｌ以下、好ましくは０．１５ｇ／ｄｌ以下、さらに好ましくは０．１ｇ／ｄｌ以下であり、そして／又は溶血率は、２％以下、特に１．５％以下、好ましくは１％以下である。該懸濁液は、注射前に洗浄又は類似のことを受けない。
【０１２４】
別の実施形態において、この方法は、包装された赤血球細胞を提供するステップと、該赤血球細胞を６０又は６５％又はそれを超えるヘマトクリットで生理学的緩衝液中の懸濁液に入れるステップと、溶解及び再封手順を利用してこれらのＲＢＣに有効成分を封入するステップと、得られたＲＢＣをインキュベートするステップと、該ＲＢＣを洗浄して、ＲＢＣの最終懸濁液を回収するステップと、を含む。懸濁液のヘマトクリットは、４０％以上である。該懸濁液は、保持溶液に含まれる。この懸濁液は、２〜８℃の間の温度で貯蔵される。この最終懸濁液を哺乳動物、特にヒト患者に、懸濁液の調製後１〜７２時間の間、好ましくは２４〜７２時間の間に注射する。この懸濁液の細胞外ヘモグロビンレベルは、０．５ｇ／ｄｌ以下、特に０．３ｇ／ｄｌ以下、より特に０．２ｇ／ｄｌ以下、好ましくは０．１５ｇ／ｄｌ以下、さらに好ましくは０．１ｇ／ｄｌ以下であり、そして／又は溶血率は、２％以下、特に１．５％以下、好ましくは１％以下である。該懸濁液は、注射前に洗浄又は類似のことを受けない。
【０１２５】
組成物、キット及び方法は、アスパラギン及び／又はメチオニナーゼに栄養要求性の液性（血液（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｖａｌ））及び固形腫瘍を処置することを目標とする。例として、白血病（急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病）及び胃癌（癌ステージＩＶ、腺癌）を挙げることができる。
【０１２６】
ここに本発明を、以下の非限定的実施形態を利用してさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】異なる処置条件下で細胞生存率％を示したグラフである。
【図２】異なる処置条件下で細胞生存率％を示したグラフである。
【図３】異なる処置条件下で細胞生存率％を示したグラフである。
【図４】個々の腫瘍体積と中央値を時間の関数で示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
【実施例】
【０１２９】
実施例１
Ｉ．略語
ＣＣＫ−８：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８
ＤＰＢＳ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＩＭＤＭ：イスコフ改変ダルベッコ培地
ＭＧＬ：メチオニン−γ−リアーゼ
ｖ／ｖ：容量対容量
【０１３０】
ＩＩ．操作条件
ＩＩ．１．  テスト項目
ＩＩ．１．１．  Ｌ−アスパラギナーゼ
種類：Ｍｅｄａｃ（登録商標）（ドイツ）、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ  １００００ＩＵ
１種の濃度のＬ−アスパラギナーゼ（２．５３ＩＵ／ｍＬ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１Ｘでの系列希釈により調製した。Ｌ−アスパラギナーゼの濃度を１１倍希釈して、最終濃度０．２３ＩＵ／ｍＬ（ＩＣ５０）を得た。
ＩＩ．１．２．  メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）
種類：大腸菌内で産生されたＰ．プチダメチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）
【０１３１】
１種の濃度のＭＧＬ（２．０９ＩＵ／ｍＬ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１Ｘでの系列希釈により調製した。ＭＧＬの濃度を１１倍希釈して、最終濃度０．１９ＩＵ／ｍＬ（ＩＣ５０）を得た。
【０１３２】
ＩＩ．２  細胞株
ＩＩ．２．１．  種類
名称：ＨＬ−６０細胞株
種類：ヒト前骨髄球性白血病細胞株（懸濁液）
供給業者及び参照番号：ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４０
ＩＩ．２．２．培養条件
Ｌ−グルタミン培地を含み、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充されたＩＭＤＭで、細胞を培養した。ＰＯ−ＣＥＬＬ−００２及びＰＯ−ＣＥＬＬ−００５により、継代培養を実施した。
ＩＩ．２．３．  比色キット
名称：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）
供給業者及び参照番号：Ｆｌｕｋａ  ９６９９２
【０１３３】
原理：ＣＣＫ−８試薬は、高水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を含有する。ＷＳＴ−８は、細胞内のデヒドロゲナーゼにより還元されて、該組織培地に可溶性の黄色生成物（ホルマザン）を与える。細胞内のデヒドロゲナーゼの活性により発生したホルマザン色素の量は、生存する細胞数に正比例する。
【０１３４】
比色テストを、ＰＯ−ＣＥＬＬ−００４により実施した。
【０１３５】
ＩＩＩ．  細胞障害性アッセイ
ＩＩＩ．１  方法
１００μＬ／ウェル中の細胞１５０００個を、９６ウェル平底プレート５枚に分配した。加えて、各プレートのブランク対照として、２つのウェルに培地を充填した。蒸発及び濃縮を最小限にするために、空のウェルの全てに培地を充填した。０日目（Ｄ０）に、ＩＣ５０濃度のＬ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬ  １０μＬを、対応するウェルに添加した。対照（ブランクウェル及び対照プレート）は、ＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬを受けた。３日目（Ｄ３）に、培地をウェルから除去して、対応するウェルに添加された新しい培地及びＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬ又はＩＣ５０濃度のＬ−アスパラギナーゼ（それまでにＭＧＬとインキュベートされた細胞の場合）若しくはＭＧＬ（それまでにＬ−アスパラギナーゼとインキュベートされた細胞の場合）１０μＬと交換した。対照（ブランク及び陽性対照）は、ＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬを受けた。その後、プレートをインキュベータでさらに３日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時（Ｄ６）に、ＣＣＫ−８溶液１０μＬを、ＰＯ−ＣＥＬＬ−００４により各ウェルに添加し、プレートをインキュベータで２時間インキュベートした。その後、光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダーを利用して４５０ｎｍで計測した。
【０１３６】
ＩＩＩ．２．  内部対照
対照は、二重測定で実施した。
ＩＩＩ．２．１．  ブランクウェル
４６０ｎｍ前後のわずかな天然の吸収が、ＣＣＫ−８を含む培地で生じる。このバックグランド吸収は、培地、ｐＨ、インキュベーション時間及び露光の長さに依存する。したがってブランクウェルを、培地１００μＬ及びＬ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬ希釈剤、ＤＰＢＳ  １×  １０μＬを含有して実施した。これらの対照ウェルの平均吸収を、細胞を含む他のウェルから差し引いた。
ＩＩＩ．２．２．  生存率対照（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）（陽性対照）
ＨＬ−６０細胞株の陽性対照（細胞生存率１００％）として、Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬを含まず希釈剤（ＤＰＢＳ  １Ｘ）１０μＬを含む培地（１００μＬ）で細胞を培養した。
【０１３７】
ＩＩＩ．３．  細胞生存率の計測
細胞を含まない培地を、ブランク対照（ＯＤブランク）とした。Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬを伴わない細胞を、陽性対照（生存率対照）とした。
生存する細胞の割合％を、以下に示す通り計算した。
【０１３８】
【数１】
2019500386.tif 000003
【０１３９】
計算は、マイクロプレートリーダーを誘導するＧｅｎ５ソフトウエアを介して自動的に実施した。２つのブランクウェルの平均光学密度（ＯＤ）を、全ての光学密度から自動的に差し引いた。細胞生存率の計算を、連続処置について実施した。
【０１４０】
ＩＶ．  結果
ＩＶ．１．  内部対照
内部対照は、生データで特定されなければ、容認できるものとした。
ＩＶ．２．  Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬ単独でのＩＣ５０の計算
薬物単独（ＭＧＬ又はＬ−アスパラギナーゼ）での細胞生存率の割合％を、薬物併用の各実験で照査した。
ＩＶ．２．１．  Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの連続添加
【０１４１】
Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの連続処置を含む実験を、二重測定データで１回実施した。全ての品質対照（ブランク及び陽性対照）を、実験で受けた。
【０１４２】
細胞生存率％の計算及びグラフ表示の詳細を、以下の表１及び図１に表す。
【０１４３】
【表１】
2019500386.tif 000004
【０１４４】
結果から、ＩＣ５０用量でのＬ−アスパラギナーゼの添加の前にＭＧＬをＩＣ５０用量で添加した酵素連携（図１の赤色）が、細胞生存率を
−  ＩＣ５０  Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼのＩＣ５０対照）に比較して７６％、
−  ＭＧＬ（ＭＧＬのＩＣ５０対照）に比較して７０％、
−  最初にＬ−アスパラギナーゼをＩＣ５０用量で添加した酵素連携に比較して７５％、
低下させることが示された。
【０１４５】
しかし、逆順での酵素連携は、そのような結果を与えず、酵素単独（対照）に比較して細胞生存率に与える連携の利益を有さなかった。
【０１４６】
Ｖ．  結論
連続の酵素連携から、ＩＣ５０用量のＭＧＬ添加と、その３日後のＩＣ５０用量のＬ−アスパラギナーゼの添加により、細胞死亡率が上昇することが実証された。しかし逆設計の酵素添加では、そのような結果を得ることができなかった。
【０１４７】
本発明者らは、ＭＧＬ酵素活性により誘導されたＭｅｔ欠乏によりＨＬ−６０白血病細胞がＬ−アスパラギナーゼ活性に対してより感受性になると推察することができる。さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの役割を議論して、既知の各影響を検討しなければならない。実際にＬ−アスパラギナーゼは、白血病細胞においてアポトーシスを惹起することが公知であり（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）したがって、おそらく細胞障害剤の役割を担う可能性がある。細胞周期のＳ又はＧ２期において細胞分裂を遮断することが公知のＭＧＬは、おそらくさらに細胞増殖抑制剤として作用するであろう。
【０１４８】
実施例２：ネズミ赤血球におけるＬ−アスパラギナーゼの封入のための方法
Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｍｅｄａｃ（登録商標）大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ）は、透析バッグにおける低張透析の方法によりネズミ赤血球（ＯＦ１マウス）に封入される。血液を事前に遠心分離して血漿を除去し、その後、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄する。ヘマトクリットをアスパラギナーゼの存在下で７０％に調整し、透析を開始する前に最終濃度４００ＩＵ／ｍＬの赤血球又は赤血球細胞（ＲＢＣ）に添加する。透析は、低浸透圧の溶解緩衝液に対して４℃で５０分間継続する。ネズミ赤血球をその後、高浸透圧溶液の添加及び３７℃で３０分間のインキュベーションにより再封する。０．９％ＮａＣｌでの２回の洗浄及びウシ血清アルブミンＢＳＡ（６％）補充Ｓａｇ−マンニトールでの１回の洗浄の後、赤血球をヘマトクリット５０％に調整する。Ｌ−アスパラギナーゼを封入した赤血球は、Ｌ−アスパＲＢＣと呼称する。封入により、５０％ヘマトクリットでアスパラギナーゼ４０ＩＵ／ＲＣ  ｍｌの濃度のＬ−アスパＲＢＣが生成する。
【０１４９】
封入手順の間、全血、洗浄されたＲＢＣ、Ｌ−アスパラギナーゼを混合されたＲＢＣ（透析前）、及びＬ−アスパラギナーゼを負荷されたＲＢＣ（透析後）を、
−  ヘマトクリット（Ｈｔ）
−  平均血球容積（ＡＣＶ）
−  総ヘモグロビン濃度（ＡＣＨＣ）、及び
−  細胞計数
についてテストする。
【０１５０】
細胞懸濁液のアリコットを、Ｌ−アスパラギナーゼ酵素活性の測定について低張透析の前及び後に取り出す。Ｌ−アスパラギナーゼの推定を、Ｏｒｓｏｎｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｂｉｏｌ  Ｃｌｉｎ，６２：５６８−５７２で発表されたプロトコルに従って実施した。
【０１５１】
実施例３：ヒト赤血球におけるＬ−アスパラギナーゼの封入
国際公開第２００６／０１６２４７（Ａ）号パンフレットに記載された方法を利用して、Ｌ−アスパラギナーゼを封入した赤血球のバッチを生成する。国際公開第２００６／０１６２４７（Ａ）号パンフレットの教示に従い、浸透圧脆弱性を検討し、それに応じて溶解パラメータを調整する（透析カートリッジ中の赤血球懸濁液の流速を調整する）。該方法をさらに、患者の体重及び投与されるＬ−アスパラギナーゼの用量を考慮する医師の処方に従って実施する。最終生成物の詳細は、以下の通りである：
−  平均血球容積（ＭＣＶ）：７０〜９５ｆＬ
−  平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）：２３〜３５ｇ／ｄＬ
−  細胞外ヘモグロビン≦０．２ｇ／ｄＬ懸濁液
−  浸透圧脆弱性≦６ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ
−  平均血球Ｌ−アスパラギナーゼ濃度：７８〜１４６ＩＵ／ｍＬ
−  細胞外Ｌ−アスパラギナーゼ≦総酵素活性の２％
【０１５２】
そのようにして得られた赤血球の懸濁液は、ＧＲＡＳＰＡ（登録商標）と呼称され、該特許文献で言及されている。
【０１５３】
実施例４：メチオニンγリアーゼ（ＭＧＬ）を獲得して特徴づけるための方法
菌株の生成及び高生産性クローンの単離：シュードモナス・プチダのＭＧＬの天然配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ８８５５４．１）を、レアコドンを修飾することにより最適化した（Ｐ．プチダから生じた配列を生成株の大腸菌に適合させるため）。翻訳開始の状況を改善するために、他の変更を行った。そして非表現突然変異を実施して、コード配列内の推定細菌プロモーターの一部である３つのエレメント（ボックス−３５、ボックス−１０及び位置５６の転写因子結合部位）を除去した。生成株の大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、最適化配列を含む発現ベクターｐＧＴＰｃ５０２＿ＭＧＬ（プロモーターＴ７）で形質転換して、生成クローンを選択した。生成クローンを、ＧＹ培地＋０．５％グルコース＋カナマイシン中、３７℃で６〜８時間（予備培養１）及び１６時間（予備培養２）、予備培養する。
【０１５４】
発酵：その後、ＧＹ培地を含む発酵槽にて、制御された圧力及び予備培養物２のｐＨで、光学密度０．０２で撹拌しながら生成を実施する。光学密度１０が得られるまで生育相（３７℃）を行い、１ｍＭ  ＩＰＴＧを培地に添加することにより、２８℃で発現誘導を実行する。細胞堆積物を、二期への誘導の２０時間後に回収し、細胞ブロスを５００ｋＤａ中空繊維に通過させた後に５〜１０倍濃縮し、その後、細胞ペレットを１５９００×ｇでの遠心分離により採取し、その後、−２０℃で貯蔵する。
【０１５５】
精製：細胞ペレットを解凍して、溶解緩衝液に懸濁させる（７ｖ／ｗ）。溶解は、１０℃で高圧均質化により３つのステップで実施する（１ステップは１０００バール（１０8Ｐａ）、その後、２ステップは６００バール（６×１０7Ｐａ））。その後、０．２％ＰＥＩを添加して１５９００×ｇで遠心分離することにより、１０℃で細胞溶解物を清澄化する。その後、可溶性画分を０．２μｍで滅菌した後、６℃の硫酸アンモニウム（６０％飽和）で２０時間にわたり沈降させる。第一の結晶化ステップが１０％（最終濃度）のＰＥＧ−６０００及び１０％飽和の硫酸アンモニウムの添加により実行され、第二の結晶化が３０℃での１２％最終濃度のＰＥＧ−６０００及び０．２Ｍ  ＮａＣｌ（最終濃度）の添加により実施される、２つの結晶化ステップを、可溶化緩衝液を用いた再可溶化堆積物で実施する。ＭＧＬタンパク質を含むペレットを、１５９００×ｇでの遠心分離後の各段階で回収する。ＭＧＬタンパク質を含むペレットを、可溶化緩衝液に再懸濁させて、０．４５μｍフィルターに通した後、２つの陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥセファロースＦＦ）に供する。その後、精製されたタンパク質をポリッシングステップに供し、異なる汚染物（内毒素、ＨＣＰ宿主細胞タンパク質、残留ＤＮＡ）を除去するためにＱメンブレンクロマトグラフィーカプセルに通す。そして精製されたＭＧＬタンパク質を４０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１０ｋＤａカットオフ・タンジェンシャルフローフィルトレーションカセットを用いて、配合緩衝液中で透析濾過する。その後、バイアルあたりタンパク質約５０ｍｇで物質を分取し、そして制御された圧力及び温度の下でフリーズドライして、−８０℃で貯蔵する。
【０１５６】
特徴づけ：酵素の特異的活性は、国際公開第２０１５／１２１３４８号パンフレットに記載された通り生成されたＮＨ3を測定することにより決定される。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される。水に取り込まれた後のＰＬＰレベルは、国際公開第２０１５／１２１３４８号パンフレットに記載された方法により評価した。浸透圧は、浸透圧計で測定される（Ｍｉｃｒｏ−Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ  Ｌｏｓｅｒ  Ｔｙｐｅ１５）。
以下の表２は、ＭＧＬの１つの生成バッチの主な特徴づけを要約している：
【０１５７】
【表２】
2019500386.tif 000005
【０１５８】
生成方法の考察。国際公開第２０１５／１２１３４８号パンフレットに記載されたＭＧＬを精製するための方法は、欧州特許第０９７８５６０（Ｂ１）号明細書及び関連の発行物（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００６）に基づいて確定される。この選択は、該著作物により特に実用的で大規模生産に容易に適合可能であることが記載されている結晶化ステップの簡便性及びロバストネスにより説明される。このステップは、ＰＥＧ６０００／硫酸アンモニウムステップを加えることにより、溶解／清澄化及び不純物除去の後に得られたＭＧＬ溶液を加熱した後にＰＥＧ６０００及び硫酸アンモニウムを使用することに基づく。このステップの他の注目に値するポイントは、ＰＥＧ６０００によるＭＧＬ溶液の処置の後に遠心分離を実行することにより、不純物を除去するためのステップの間に高い純度レベルを迅速に得る可能性である。該不純物は再度、遠心分離ペレット中に見出され、ＭＧＬは大部分が上清の溶液に見出される。この純度により、セファクリルＳ２００ＨＲカラムでのゲル濾過による精製ステップに関連して陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ）の単一クロマトグラフィーステップでＭＧＬ溶液を通すことで、精製されたタンパク質を得る可能性が与えられる。
【０１５９】
特許取得する方法を小規模テスト用に定着させる際に、得られた結果が再現できないと思われた。欧州特許第０９７８５６０（Ｂ１）号明細書によれば、不純物を除去するためのステップ（ＰＥＧ６０００／硫酸アンモニウムでの処置及び遠心分離）の終了時に、ＭＧＬ酵素は、大部分が可溶性画分に見出され、遠心分離によりペレット中の不純物が除去される。欧州特許第０９７８５６０（Ｂ１）号明細書に記載された方法により実行された小規模テストの際に、ＭＧＬタンパク質は再度、大部分（約８０％）が遠心分離ペレット中に見出される。以下の表３に、可溶性画分中のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリーにより評価されたＭＧＬの割合％を列挙する。
【０１６０】
【表３】
2019500386.tif 000006
【０１６１】
したがってこの予想外の結果が、１）ＭＧＬを含有する遠心分離ペレットから操作すること、２）ＤＥＡＥカラムにロードした後の不純物の除去を改善するための２つの連続結晶化ステップを実施すること、３）ＤＥＡＥカラムでのクロマトグラフィーを最適化すること、による特許取得する方法の最適化に導いた。
【０１６２】
この最後のステップで、ＤＥＡＥセファロースＦＦ樹脂が最終的に、テストされた緩衝液及びｐＨ条件では充分に強い交換物質にならないことが見出される。異なる追加的最適化テストの後、該選択は、最終的に１）該方法のロバストネスを改善するために、最初の方法で用いられたリン酸緩衝液をトリス緩衝液ｐＨ７．６と交換すること、並びに２）任意のＭＧＬ損失をせずに（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６による０．８ＥＵ／ｍｇに対して該改変法では０．５７ＥＵ／ｍｇ）内毒素レベル及びタンパク質純度を実質的に改善するために、ＤＥＡＥへの第二の透過を実施することに向けられた。
【０１６３】
そして大規模ＧＭＰ生成の要件に適合する方法を得るために、残留する内毒素及びＨＣＰレベルを減少させるためにメンブレンＱでのポリッシングステップを追加した。この最後のポリッシングステップにより、工業的規模の生産工程で用いられる困難なステップである（クロマトグラフィーの経費及び持続時間）Ｓ２００ゲル濾過クロマトグラフィーの実行が回避される。
２つの方法を用いて得られた生成物を、以下の表４に要約する。
【０１６４】
【表４】
2019500386.tif 000007
【０１６５】
実施例５．ネズミ赤血球中のＭＧＬ及びＰＬＰの同時封入
血漿及びバフィコートを除去するために、ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の全血を１０００×ｇ及び４℃で１０分間遠心分離する。ＲＣを、０．９％ＮａＣｌ（ｖ：ｖ）で３回洗浄する。異なる濃度のＭＧＬ及びＰＬＰを含む、ヘマトクリット７０％の最終懸濁液を得るために、フリーズドライＭＧＬを水で７８．７ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁させて、赤血球懸濁液に添加する。その後、該懸濁液を１２０ｍｌ／時の流速で血液透析器に負荷し、逆流での流速１５ｍｌ／分の低張溶液に対して透析した。該懸濁液をその後、高張溶液で再封し、その後、３７℃で３０分間インキュベートした。０．９％ＮａＣｌ、０．２％グルコースで３回洗浄した後、該懸濁液を、６％ＢＳＡが補充された保持溶液ＳＡＧ−マンニトールに取り込んだ。得られた生成物を、Ｄ０（調製後２時間以内）及びＤ１（即ち、２〜８℃での保持の１８〜２４時間後）で特徴づける。血液学的特徴を、獣医学検査用自動装置（Ｓｙｓｍｅｘ、ＰｏｃＨ−１００ｉＶ）で得る。
【０１６６】
結果：
後に列挙される異なる試験において、完成された生成物のＭＧＬ活性を、実施例５に記載された方法で水性溶液中のＭＧＬの外部較正範囲に対してアッセイする。これらの結果を解説した試験と合わせると、完成された生成物のＭＧｌ活性が該方法に導入された酵素の量に応じて上昇すること、そして良好な安定性を維持しながら、完成された生成物ｍｌあたりに３２ＩＵまでのＭＧＬを封入することが容易に可能であること、が示される。
別の試験において、ネズミの完成された生成物３種ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ１、ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２及びＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３を、以下の方法により調製した。
【０１６７】
−  ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ１：３ｍｇ／ｍｌ  ＭＧＬ及び約３０μＭ  ＰＬＰを含有する懸濁液からのＭＧＬ及びＰＬＰの同時封入。最終生成物を、最終濃度１０μＭのＰＬＰを補充されたＳＡＧ−マンニトール  ６％ＢＳＡに取り込んだ。
−  ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ２：３ｍｇ／ｍｌ  ＭＧＬ及び約３０μＭ  ＰＬＰを含有する懸濁液からのＭＧＬ及びＰＬＰの同時封入。完成された生成物を、ＳＡＧ−マンニトール  ６％ＢＳＡに取り込んだ。
−  ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ３：この生成物は、３ｍｇ／ｍｌ  ＭＧＬ及び約１２４μＭ  ＰＬＰを含有する懸濁液からのＭＧＬ及びＰＬＰの同時封入から生じる。最終生成物を、ＳＡＧ−マンニトール  ６％ＢＳＡに取り込んだ。
【０１６８】
第三の試験において、ネズミの完成された生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４を、以下の方法によりＭＧＬの新しいバッチから調製した：
−  ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ４：５ｍｇ／ｍｌ  ＭＧＬ及び約３５μＭ  ＰＬＰを含有する懸濁液からのＭＧＬ及びＰＬＰの同時封入。最終生成物を、ＳＡＧ−マンニトール  ６％ＢＳＡに取り込んだ。
【０１６９】
そして第四の試験において、ネズミ生成物ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５を、以下の方法によりＭＧＬの第三のバッチから調製した：
−  ＲＣ−ＭＧＬ−ＰＬＰ５：６ｍｇ／ｍｌ  ＭＧＬ及び約１００μＭ  ＰＬＰを含有する懸濁液からのＭＧＬ及びＰＬＰの同時封入。完成された生成物を、ＳＡＧ−マンニトール  ６％ＢＳＡに取り込んだ。
【０１７０】
Ｄ０（調製後）の３種の完成された生成物の血液学的及び生化学的特徴を、以下の表５に詳述する。封入収率は充分であり、１８．６％〜３０．５％で変動する。
【０１７１】
【表５】
2019500386.tif 000008
【０１７２】
実施例６．工業的方法によりメチオニンγリアーゼ及びＰＬＰを封入した人ＲＣの生成
白血球枯渇ヒト赤血球細胞ＲＣ（「Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ」により提供）のパウチを、０．９％ＮａＣｌで３回洗浄の１サイクルに供する（洗浄機Ｃｏｂｅ  ２９９１）。３ｍｇ／ｍｌ  ＭＧＬ及び約３０μＭ  ＰＬＰを含有するヘマトクリット７０％の最終懸濁液（ＭＧＬの配合物から生成する）を得るために、フリーズドライＭＧＬを０．７％ＮａＣｌで再懸濁させて、赤血球懸濁液に添加する。該懸濁液を均質化して、欧州特許第１７７３４５２号明細書に記載された方法により封入して進める。再封からの懸濁液をその後、最も脆弱なＲＣを除去するために、室温で３時間インキュベートする。該懸濁液を０．９％ＮａＣｌ、０．２％グルコース溶液で３回洗浄し（洗浄機Ｃｏｂｅ  ２９９１）、保持溶液（ＡＳ−３）８０ｍｌで再懸濁する。封入されたＭＧＬレベルを、実施例６と同様にアッセイする。以下の表６を参照されたい。
【０１７３】
【表６】
2019500386.tif 000009
【０１７４】
実施例７
追加の略語
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所培地
【０１７５】
Ｉ．  操作条件
Ｉ．１．  テスト項目
Ｉ．１．１．  Ｌ−アスパラギナーゼ
種類：Ｍｅｄａｃ（登録商標）（ドイツ）、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ  １００００ＩＵ
【０１７６】
１種の濃度のＬ−アスパラギナーゼ（２．２ＩＵ／ｍＬ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１Ｘでの系列希釈により調製した。Ｌ−アスパラギナーゼの濃度を１１倍希釈して、最終濃度０．２０ＩＵ／ｍＬ（ＩＣ５０）を得た。
Ｉ．１．２．  メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）
種類：大腸菌内で産生されたＰ．プチダメチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）
【０１７７】
１種の濃度のＭＧＬ（３．８５ＩＵ／ｍＬ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１Ｘでの系列希釈により調製した。ＭＧＬの濃度を１１倍希釈して、最終濃度０．３５ＩＵ／ｍＬ（ＩＣ５０）を得た。
Ｉ．２．  細胞株
Ｉ．２．１．  種類
名称：ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株
種類：ヒト胃癌細胞株（接着）
供給業者及び参照番号：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−５８２２
Ｉ．２．２．  培養条件
【０１７８】
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ培地で、細胞を培養した。ＰＯ−ＣＥＬＬ−００２及びＰＯ−ＣＥＬＬ−００５により継代培養を実施した。
Ｉ．２．３．  比色キット
名称：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）
供給業者及び参照番号：Ｆｌｕｋａ  ９６９９２
【０１７９】
原理：ＣＣＫ−８試薬は、高水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を含有する。ＷＳＴ−８は、細胞内のデヒドロゲナーゼにより還元されて、該組織培地に可溶性の黄色生成物（ホルマザン）を与える。細胞内のデヒドロゲナーゼの活性により発生したホルマザン色素の量は、生存する細胞数に正比例する。比色テストは、ＰＯ−ＣＥＬＬ−００４で実施した。
【０１８０】
ＩＩ．  細胞障害性アッセイ
ＩＩ．１．  方法
１００μＬ／ウェル中の細胞２５００個を、９６ウェル平底プレートに分配した（生データのプレート数を参照）。加えて、各プレートのブランク対照として、２つのウェルに培地を充填した。蒸発及び濃縮を最小限にするために、空のウェルの全てに培地を充填した。０日目（Ｄ０）に、ＩＣ５０濃度のＬ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬ１０μＬを、対応するウェルに添加した。対照（ブランクウェル及び対照プレート）は、ＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬを受けた。４日目（Ｄ４）に、培地をウェルから除去して、対応するウェルに添加された新しい培地及びＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬ又はＩＣ５０濃度のＬ−アスパラギナーゼ（それまでにＭＧＬとインキュベートされた細胞の場合）若しくはＭＧＬ（それまでにＬ−アスパラギナーゼとインキュベートされた細胞の場合）１０μＬと交換した。対照（ブランク及び陽性対照）は、ＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬを受けた。その後、プレートをインキュベータでさらに４日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時（Ｄ８）に、ＣＣＫ−８溶液１０μＬを、ＰＯ−ＣＥＬＬ−００４により各ウェルに添加し、プレートを４時間インキュベートした。その後、光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダーを利用して４５０ｎｍで計測した。
【０１８１】
ＩＩ．２．  内部対照
対照は、二重測定で実施した。
ＩＩ．２．１．  ブランクウェル
先の実施例１の通り。
ＩＩ．２．２．  生存率対照（陽性対照）
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞株の陽性対照（細胞生存率１００％）として、Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬを含まず希釈剤（ＤＰＢＳ  １Ｘ）１０μＬを含む培地（１００μＬ）で、細胞を培養した。
【０１８２】
ＩＩ．３  細胞生存率の計測
先の実施例１の通り。
【０１８３】
ＩＩＩ．  結果
ＩＩＩ．１．  内部対照
内部対照は、生データで特定されなければ、容認できるものとした。
ＩＩＩ．２．  Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬ単独でのＩＣ５０の計算
薬物単独（ＭＧＬ又はＬ−アスパラギナーゼ）での細胞生存率の割合％を、薬物併用の各実験で照査した。酵素で用いられた本明細書のＩＣ５０値が、過去にＤ４での単回処置で確証されているため、５０％の細胞生存率は、テストの半分の時点（Ｄ４）で予測される。
ＩＩＩ．２．１．  Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの連続添加
【０１８４】
Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの連続処置を含む実験を、二重測定データで２回実施した。全ての品質対照（ブランク及び陽性対照）を、実験で受けた。
【０１８５】
細胞生存率％の計算及びグラフ表示の詳細を、以下の表７及び図２に表す。
【０１８６】
【表７】
2019500386.tif 000010
【０１８７】
結果から、ＩＣ５０用量でのＬ−アスパラギナーゼの添加の前にＭＧＬをＩＣ５０用量で添加した酵素連携（図２参照）が、細胞生存率を
−  ＩＣ５０  Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼのＩＣ５０対照）に比較して５５％、
−  ＭＧＬ（ＭＧＬのＩＣ５０対照）に比較して４４％、
−  最初にＬ−アスパラギナーゼをＩＣ５０用量で添加した酵素連携に比較して４３％、
低下させることが示された。
【０１８８】
ＩＶ．  結論
連続の酵素連携から、ＩＣ５０用量のＭＧＬ添加と、その４日後のＩＣ５０用量のＬ−アスパラギナーゼの添加により、細胞死亡率が上昇し得ることが実証された。
【０１８９】
本発明者らは、ＭＧＬ酵素活性により誘導されたＭｅｔ欠乏によりＮＣＩ−Ｎ８７胃細胞がＬ−アスパラギナーゼ活性に対してより感受性になると推察することができる。さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの役割を議論して、既知の各影響を検討しなければならない。実際にＬ−アスパラギナーゼは、白血病細胞においてアポトーシスを惹起することが公知であり（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）したがって、おそらく細胞障害剤の役割を担う可能性がある。細胞周期のＳ又はＧ２期において細胞分裂を遮断することが公知のＭＧＬは、おそらくさらに細胞増殖抑制剤として作用するであろう。
【０１９０】
実施例８
Ｉ．  追加の略語
Ｆ１２Ｋ：ハムＦ−１２のカイン改変培地
ＩＩ．  操作条件
ＩＩ．１  テスト項目
ＩＩ．１．１．  Ｌ−アスパラギナーゼ
種類：Ｍｅｄａｃ（登録商標）（ドイツ）、大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ  １００００ＩＵ
【０１９１】
１種の濃度のＬ−アスパラギナーゼ（２．９７ＩＵ／ｍＬ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１Ｘでの系列希釈により調製した。Ｌ−アスパラギナーゼの濃度を１１倍希釈して、最終濃度０．２７ＩＵ／ｍＬ（ＩＣ５０）を得た。
ＩＩ．１．２．  メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）
種類：大腸菌内で産生されたＰ．プチダメチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）
【０１９２】
１種の濃度のＭＧＬ（１．４３ＩＵ／ｍＬ）を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）１Ｘでの系列希釈により調製した。ＭＧＬの濃度を１１倍希釈して、最終濃度０．１３ＩＵ／ｍＬ（ＩＣ５０）を得た。
ＩＩ．２．  細胞株
ＩＩ．２．１．  種類
名称：ＡＧＳ細胞株
種類：ヒト胃腺癌細胞株（接着）
供給業者及び参照番号：ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７３９
ＩＩ．２．２．  培養条件
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充されたＬ−グルタミンを含むＦ１２Ｋ培地で、細胞を培養した。ＰＯ−ＣＥＬＬ−００２及びＰＯ−ＣＥＬＬ−００５により継代培養を実施した。
ＩＩ．２．３．  比色キット
名称：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）
供給業者及び参照番号：Ｆｌｕｋａ  ９６９９２
【０１９３】
原理：ＣＣＫ−８試薬は、高水溶性テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を含有する。ＷＳＴ−８は、細胞内のデヒドロゲナーゼにより還元されて、該組織培地に可溶性の黄色生成物（ホルマザン）を与える。細胞内のデヒドロゲナーゼの活性により発生したホルマザン色素の量は、生存する細胞数に正比例する。比色テストを、ＰＯ−ＣＥＬＬ−００４により実施した。
【０１９４】
ＩＩＩ．  細胞障害性アッセイ
ＩＩＩ．１．  方法
１００μＬ／ウェル中の細胞１０００個を、９６ウェル平底プレートに分配した（生データのプレート数を参照）。加えて、各プレートのブランク対照として、２つのウェルに培地を充填した。蒸発及び濃縮を最小限にするために、空のウェルの全てに培地を充填した。０日目（Ｄ０）に、１０μＬのＩＣ５０濃度のＬ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬを、対応するウェルに添加した。対照（ブランクウェル及び対照プレート）は、ＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬを受けた。４日目（Ｄ４）に、培地をウェルから除去して、対応するウェルに添加された新しい培地及びＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬ又は１０μＬのＩＣ５０濃度のＬ−アスパラギナーゼ（それまでにＭＧＬとインキュベートされた細胞の場合）若しくはＭＧＬ（それまでにＬ−アスパラギナーゼとインキュベートされた細胞の場合）と交換した。対照（ブランク及び陽性対照）は、ＤＰＢＳ  １Ｘ  １０μＬを受けた。その後、プレートをインキュベータでさらに４日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時（Ｄ８）に、ＣＣＫ−８溶液１０μＬを、ＰＯ−ＣＥＬＬ−００４により各ウェルに添加し、プレートを４時間インキュベートした。その後、光学密度（ＯＤ）を、マイクロプレートリーダーを利用して４５０ｎｍで計測した。
ＩＩＩ．２．  内部対照
対照は、二重測定で実施した。
ＩＩＩ．２．１．  ブランクウェル
先の実施例１の通り。
ＩＩＩ．２．２．  生存率対照（陽性対照）
【０１９５】
ＡＧＳ細胞株の陽性対照（細胞生存率１００％）として、Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬを含まず希釈剤（ＤＰＢＳ  １Ｘ）１０μＬを含む培地（１００μＬ）で、細胞を培養した。
ＩＩＩ．３．  細胞生存率の計測
先の実施例１の通り。
【０１９６】
ＩＶ．  結果
ＩＶ．１．  内部対照
内部対照は、生データで特定されなければ、容認できるものとした。
ＩＶ．２．  Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬ単独でのＩＣ５０の計算
【０１９７】
薬物単独（ＭＧＬ又はＬ−アスパラギナーゼ）での細胞生存率の割合％を、薬物併用の各実験で照査した。酵素で用いられた本明細書のＩＣ５０値が、過去にＤ４での単回処置で確証されているため、５０％の細胞生存率は、テストの半分の時点（Ｄ４）で予測される。
ＩＶ．２．１．  Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの連続添加
Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの連続処置を含む実験を、二重測定データで２回実施した。全ての品質対照（ブランク及び陽性対照）を、実験で受けた。
【０１９８】
細胞生存率％の計算及びグラフ表示の詳細を、以下の表８及び図３に表す。
【０１９９】
【表８】
2019500386.tif 000011
【０２００】
結果から、ＩＣ５０用量でのＬ−アスパラギナーゼの添加の前にＭＧＬをＩＣ５０用量で添加した酵素連携（図３参照）が、細胞生存率を
−  ＩＣ５０  Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギナーゼのＩＣ５０対照）に比較して２２％、
−  ＭＧＬ（ＭＧＬのＩＣ５０対照）に比較して２６％、
−  最初にＩＣ５０用量で添加されたＬ−アスパラギナーゼでの酵素連携に比較して１０％、
低下させることが示された。
【０２０１】
さらに、ここでは精密さのために、Ｌ−アスパラギナーゼ又はＭＧＬのためのＩＣ５０対照は（Ｄ４で最初に用いられ確証された）、テストのＤ４／半減期で培地を再生した培養の８日後に、細胞生存率１００％に戻った。実際に、Ｄ４で残留する生存率細胞は、「新鮮な」栄養素を添加して再生することができた。ＩＣ５０対照（酵素のみ）がＤ４での細胞生存率５０％に達するように、結果を従わせた。
【０２０２】
Ｖ．  結論
連続の酵素連携から、ＩＣ５０用量のＭＧＬ添加と、その４日後のＩＣ５０用量のＬ−アスパラギナーゼの添加により、細胞死亡率が上昇し得ることが実証された。
【０２０３】
本発明者らは、ＭＧＬ酵素活性により誘導されたＭｅｔ欠乏によりＡＧＳ胃細胞がＬ−アスパラギナーゼ活性に対してより感受性になると推察することができる。さらに、Ｌ−アスパラギナーゼ及びＭＧＬの役割を議論して、既知の各影響を検討しなければならない。実際にＬ−アスパラギナーゼは、白血病細胞においてアポトーシスを惹起することが公知であり（Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、したがって、おそらく細胞障害剤の役割を担う可能性がある。細胞周期のＳ又はＧ２期において細胞分裂を遮断することが公知のＭＧＬは、おそらくさらに細胞増殖抑制剤として作用するであろう。
【０２０４】
実施例９
Ｉ．  追加の略語
Ａ．Ｍ．：午前
ＥＲＹ−ＡＳＰ：赤血球細胞に封入されたＬ−アスパラギナーゼ
ＥＲＹ−ＭＥＴ：赤血球細胞に封入されたメチオニンγリアーゼ
ＩＧ：胃内注射（強制経口投与）
ＩＵ：μｍｏｌ／分に対応する国際単位
ＩＶ：静脈内
ＮＤ：測定されず
ＰＮ：ピリドキシン
ＴＧＩ：腫瘍成長阻害
【０２０５】
ＩＩ．  インビボ試験の目的
この試験の目的は、メチオニナーゼ負荷赤血球（ＥＲＹ−ＭＥＴ）とＬ−アスパラギナーゼ負荷赤血球（ＥＲＹ−ＡＳＰ）との組み合わせが、ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍皮下異種移植片マウスモデルにおいてＥＲＹ−ＭＥＴ単独で観察された抗腫瘍活性を改善し得るか否かを決定することである。
【０２０６】
ＩＩＩ．  操作条件
ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、ＥＲＹＴＥＣＨ  Ｐｈａｒｍａで培養し、注射用のＤＰＢＳ  １×中の５×１０7細胞／ｍＬで調製した。雌ＮＭＲＩヌードマウス１０又は１２匹の４群（群１、２、３及び４）に、該細胞株を一定濃度５×１０6細胞／μＬで皮下注射した。ＥＲＹ−ＭＥＴ及びＥＲＹ−ＡＳＰ注射を、それぞれ１０８ＩＵ／ｋｇ（８ｍＬ／ｋｇ）及び２００ＩＵ／ｋｇ（４〜５．４ｍＬ／ｋｇ）で注射した（Ｉ．Ｖ．経路）。群２は、ＥＲＹ−ＭＥＴの注射を３回、７、１４及び２１日目に受けた。群３（ＥＲＹ−ＡＳＰ／ＥＲＹ−ＭＥＴ）は、ＥＲＹ−ＡＳＰの注射を７日目に１回、その後ＥＲＹ−ＭＥＴの注射を２１及び２８日目に２回受けた。群４（ＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰ）は、ＥＲＹ−ＭＥＴの注射を７及び１４日目に２回、その後ＥＲＹ−ＡＳＰの注射を２１日目に１回受けた。群１は、ＥＲＹ−ＭＥＴ（ＳＡＧ−マンニトール／血漿）の保持溶液を８ｍＬ／ｋｇで７、１４及び２１日目に投与された。
【０２０７】
ＰＮ補因子の経口投与（強制経口投与）を、各ＥＲＹ−ＭＥＴ注射の６時間後（群２ではＤ７の６時間後、Ｄ１５の６時間後、Ｄ２１の６時間後；群３ではＤ２１の６時間後、Ｄ２８の６時間後、群４ではＤ７の６時間後、Ｄ１５の６時間後）に、そしてそれ以外の日（ＥＲＹ−ＭＥＴ投与がない）はＤ２０（群４）、Ｄ２７（群２）又はＤ３４（群３）まで１日１回（Ａ．Ｍ．）実施した。
【０２０８】
ＩＶ．  結果
ＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰの組み合わせに関連する腫瘍体積減少は、ＥＲＹ−ＭＥＴ群で観察されたものと異なるようであり、実際にＤ３７では、ビヒクルを与えられたマウス（対照）は、平均腫瘍体積４４１．５±５６．６ｍｍ3を有したが、ＥＲＹ−ＭＥＴマウスは、平均腫瘍体積２９８．３±３６．２ｍｍ3を示し、ＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰマウスは、平均腫瘍体積１８９．７±２９．８ｍｍ3を示し、それぞれ平均腫瘍体積減少率３７％及び５７％に対応した。腫瘍成長阻害の割合％（ＴＧＩ*）は、以下の式に従って酵素連携ＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰ  対  対照（ビヒクル群）又はＥＲＹ−ＭＥＴ群について計算した：
【０２０９】
【数２】
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【０２１０】
結果を、以下の表９に表す。
【０２１１】
【表９】
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【０２１２】
群間の有意性及びＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍についてのＥＲＹ−ＭＥＴ単独に比較したＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰ処置の効率を評定するために、二元配置分散分析検定を、腫瘍成長測定についてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（バージョン５．０４）で実施した。ビヒクル（対照）、ＥＲＹ−ＭＥＴ及びＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰ処置を比較した解析は、Ｄ３７に群間の有意性を示し、Ｐ値が０．０００１よりも低く（図４参照）、胃腫瘍に対する処置のための最後の注射後１６日間のＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰの組み合わせの有効性が明らかとなった。ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍でのＥＲＹ−ＭＥＴ単独処置に比較した逆の投与スケジュールによるＥＲＹ−ＭＥＴ／ＥＲＹ−ＡＳＰ処置では、二元配置分散分析検定（図４参照）で、追跡調査の３つの時点（Ｄ７／Ｄ２０／Ｄ３７）では、Ｐ値＞０．０５で群間の有意性は明らかにならなかった。
【０２１３】
Ｖ．  結論
２つの投与スケジュール：１−ＥＲＹ−ＡＳＰ（Ｄ７）−ＥＲＹ−ＭＥＴ（Ｄ２１／Ｄ２８）及び２−ＥＲＹ−ＭＥＴ（Ｄ７／Ｄ１５）−ＥＲＹ−ＡＳＰ（Ｄ２１）で、ＥＲＹ−ＭＥＴをＥＲＹ−ＡＳＰと組み合わせた。ＥＲＹ−ＭＥＴをＥＲＹ−ＡＳＰの前に投与した場合（２回）、ＥＲＹ−ＭＥＴ単独に比較した陽性反応が現れるようである。結果のこの有意性は、個々の腫瘍体積測定についてＤ３７に０．０００１よりも低いＰ値を得ることにより裏づけられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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