(57)【要約】肝細胞癌を検出するための方法、アッセイ、およびキット、ならびに肝細胞癌を有する高いまたは低いリスクカテゴリー内で被験体を層別化するための方法、ならびに肝細胞癌を有する疑いがあるまたはそのリスクがある被験体を処置および処置を管理する方法を提供する。以前の研究は、１つまたは複数の生物学的因子のアセスメントによる肝細胞癌の高感度で早期の予測因子の必要性に対処しようと試みられてきたが、被験体、特に無症候性の被験体がその状態を有するかどうかの臨床的に関連する決定に必要とされる感度の程度に近づいてはいなかった。本発明者らは、ある特定の因子の組合せが以前には達成されなかった高いレベルの精度を付与することによりこの必要性を満たすことを発見した。
2019512091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の肝細胞癌を検出するための方法であって、
該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；
該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；
該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに
該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
被験体の肝細胞癌を検出するためのアッセイであって、
生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップであって、該アッセイが、該測定するステップの前に該被験体の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するための試薬を利用する、ステップ：
該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに
該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するステップ
を含むアッセイ。
【請求項３】
被験体の肝細胞癌を決定するためのキットであって、
該被験体由来の生体液からＩｇＧを除去するための試薬；
該被験体由来の生体液からＩｇＭを除去するための試薬；
該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーをそれぞれ測定するための試薬；ならびに
該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するための指示
を含むキット。
【請求項４】
肝細胞癌の確率が高いまたは低い群に被験体を割り当てるための方法であって、
該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；
該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；
該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに
該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力に基づいて、肝細胞癌の確率が高いまたは低い群に該被験体を割り当てるステップ
を含む方法。
【請求項５】
肝細胞癌を有する疑いがある被験体の処置を管理するための方法であって、
該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；
該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；
該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに
該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力に基づいて該被験体を処置するステップであって、該被験体が該関数の該出力に基づいて疾患を有すると決定される場合、該被験体が肝細胞癌を処置される、ステップ
を含む方法。
【請求項６】
前記関数が、前記決定した年齢および性別、ならびに前記１つまたは複数のバイオマーカーの前記測定した量の、それぞれ最適化した重み付け係数を含む、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、フコシル化ヘモペキシン、フコシル化キニノーゲン、フコシル化アルファ−１−アンチトリプシン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）のうちの１つまたは複数である、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーが、
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化フェチュイン−Ａ；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシン；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化フェチュイン−Ａ；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化ヘモペキシン；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化キニノーゲン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化ヘモペキシン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、およびフコシル化キニノーゲン；または
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン
である、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシンである、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化フェチュイン−Ａである、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩｇＧが、前記生体液をプロテインＡ／Ｇとインキュベートすることによって除去され、ＩｇＭが、前記生体液を分子量ベースのフィルターに通すことによって除去される、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩｇＧおよび前記ＩｇＭが、前記生体液をポリエチレングリコールとインキュベートすることによって除去される、請求項１、４、および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記関数が、前記決定した年齢および性別、ならびに前記１つまたは複数のバイオマーカーの前記測定した量の、それぞれ最適化した重み付け係数を含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、フコシル化ヘモペキシン、フコシル化キニノーゲン、フコシル化アルファ−１−アンチトリプシン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）のうちの１つまたは複数である、請求項２または請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
前記バイオマーカーが、
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化フェチュイン−Ａ；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシン；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化フェチュイン−Ａ；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化ヘモペキシン；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化キニノーゲン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化ヘモペキシン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、およびフコシル化キニノーゲン；または
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン
である、請求項２、１４または１５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである、請求項２または請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシンである、請求項２または請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１９】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化フェチュイン−Ａである、請求項２または請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記ＩｇＧを除去するための前記試薬がプロテインＡ／Ｇであり、ＩｇＭを除去するための前記試薬が分子量ベースのフィルターである、請求項２または１４〜１９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２１】
前記ＩｇＧおよび前記ＩｇＭが、前記生体液をポリエチレングリコールとインキュベートすることによって除去される、請求項２または１４〜１９のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記関数が、前記決定した年齢および性別、ならびに前記１つまたは複数のバイオマーカーの前記測定した量の、それぞれ最適化した重み付け係数を含む、請求項３に記載のキット。
【請求項２３】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、フコシル化ヘモペキシン、フコシル化キニノーゲン、フコシル化アルファ−１−アンチトリプシン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）のうちの１つまたは複数である、請求項３または請求項１５に記載のキット。
【請求項２４】
前記バイオマーカーが、
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化フェチュイン−Ａ；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシン；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化フェチュイン−Ａ；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化ヘモペキシン；
アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化キニノーゲン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化ヘモペキシン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン；
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、およびフコシル化キニノーゲン；または
アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン
である、請求項３、２２または２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼである、請求項３または請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化アルファ−１−アンチトリプシンである、請求項３または請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
前記バイオマーカーが、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびフコシル化フェチュイン−Ａである、請求項３または請求項２２に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＩｇＧが、前記生体液をプロテインＡ／Ｇとインキュベートすることによって除去され、ＩｇＭが、前記生体液を分子量ベースのフィルターに通すことによって除去される、請求項３または２２〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記肝細胞癌が、早期の肝細胞癌、アルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌、またはアルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌でもある早期の肝細胞癌である、請求項１、４、または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記肝細胞癌が、早期の肝細胞癌、アルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌、またはアルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌でもある早期の肝細胞癌である、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項３１】
前記肝細胞癌が、早期の肝細胞癌、アルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌、またはアルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌でもある早期の肝細胞癌である、請求項３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１６年２月２６日に出願された米国仮出願第６２／３００，１４２号に対する優先権の利益を主張する。この出願の内容全体は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の米国国立がん研究所（ＮＣＩ）により授与された助成金番号第Ｒ０１  ＣＡ１２０２０６号およびＵ０１  ＣＡ１６８８５６号の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、肝疾患の検出、患者の層別化、および治療的介入のためのアッセイ、キット、および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染は、肝細胞がん（ＨＣＣ）の主な病因である。ＨＢＶとＨＣＶは共に、急性および慢性肝臓感染を引き起こし、ほとんどの慢性的に感染した個体は、臨床疾患（ＨＣＣおよび肝硬変）は通常発症に数十年を要するため、何年も無症候性のままである。全ての慢性ＨＢＶ保有者の１０から４０パーセントは最終的に肝臓がんを発症し、ＨＢＶ／ＨＣＶに関連する肝臓がんのために、世界中で１００万人を超える人が亡くなると見積もられている。実際に、ＨＢＶおよびＨＣＶ感染は、世界中の全てのＨＣＣ症例の８０％より多くと関連し、ＨＢＶが風土病である地域では９６％にも達する場合がある。
【０００５】
肝疾患の肝臓がんへの進行は、癌胎児性糖タンパク質、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、またはＡＦＰのコアフコシル化糖型（ＡＦＰ−Ｌ３）の血清中レベルの使用によって主にモニターされる。しかしながら、ＡＦＰは、ヒトヘパトーマ、肝芽腫、およびＢ型肝炎感染などの他の肝疾患を含む多くの環境下で産生され得、ＨＣＣを有するもの全てにおいて存在するわけでもない。したがって、ＨＣＣの一次スクリーニングとしてのＡＦＰの使用は疑問視されており、ＨＣＣのより高感度な血清バイオマーカーの必要性がある。
【０００６】
タンパク質のグルコシル化は、細胞特異的であり得、タンパク質が担持するＮ結合型グリカンは、それが由来する細胞で起こる修飾である。悪性または病変組織から分泌されるタンパク質上の糖（グリカン）構造は、正常細胞からの同じタンパク質上に存在するグリカンとは異なる場合があり、多くの場合そうである。実際に、多くの研究が、肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症に伴うＮ結合型グルコシル化における変化を観察している（例えば、Naitoh,  A.ら、Highly  enhanced  fucosylation  of  serum  glycoproteins  in  patients  with  hepatocellular  carcinoma.  J  Gastroenterol  Hepatol、１４巻：４３６〜４４５頁、１９９９年；Block,  T.  M.ら、Use  of  targeted  glycoproteomics  to  identify  serum  glycoproteins  that  correlate  with  liver  cancer  in  woodchucks  and  humans.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、１０２巻：７７９〜７８４頁、２００５年参照）。例えば、ＨＣＶに慢性的に感染した個体およびＨＣＣの診断を受けた個体では、血清から単離した総タンパク質調製物由来のフコシル化Ｎ結合型グリカンの量は、健康な被験体またはＨＣＶおよび「非活動性の」疾患を有する被験体より一貫して多かった（Comunale,  M.  A.ら、Proteomic  analysis  of  serum  associated  fucosylated  glycoproteins  in  the  development  of  primary  hepatocellular  carcinoma.  Journal  of  Proteome  Research.、６巻：３０８〜３１５頁、２００６年）。
しかしながら、単一の糖タンパク質、グルコシル化パターン、バイオマーカー組（suite）、または高度な感度および早期検出の能力を付与するＨＣＣの他の指標を同定することは未だできていない。ＨＣＣの早期検出器（early  detectors）に対する要求が未解決なままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Naitoh,  A.ら、Highly  enhanced  fucosylation  of  serum  glycoproteins  in  patients  with  hepatocellular  carcinoma.  J  Gastroenterol  Hepatol、１４巻：４３６〜４４５頁、１９９９年
【非特許文献２】Block,  T.  M.ら、Use  of  targeted  glycoproteomics  to  identify  serum  glycoproteins  that  correlate  with  liver  cancer  in  woodchucks  and  humans.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A、１０２巻：７７９〜７８４頁、２００５年
【非特許文献３】Comunale,  M.  A.ら、Proteomic  analysis  of  serum  associated  fucosylated  glycoproteins  in  the  development  of  primary  hepatocellular  carcinoma.  Journal  of  Proteome  Research.、６巻：３０８〜３１５頁、２００６年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
本明細書においては、被験体の肝細胞癌を検出するための方法であって、該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するステップを含む方法が提供される。
【０００９】
本開示に従って測定する個々のバイオマーカーの独自性（identity）は、肝細胞癌の検出の精度に特異的でもあり必要不可欠でもあるが、簡略にするため、本発明のバイオマーカーの組合せは本概要から省略する。
【００１０】
また、被験体の肝細胞癌を検出するためのアッセイであって、生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップであって、該アッセイが、該測定するステップの前に該被験体の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するための試薬を利用する、ステップ：該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するステップを含むアッセイが開示される。
【００１１】
本開示はまた、被験体の肝細胞癌を決定するためのキットであって、生体液からＩｇＧタンパク質を除去するための試薬；および該被験体由来の生体液からＩｇＭタンパク質を除去するための試薬；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーをそれぞれ測定するための試薬；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するための指示を含むキットに関する。
【００１２】
また、本明細書において、肝細胞癌の確率が高いまたは低い群に被験体を割り当てるための方法であって、該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力に基づいて、肝細胞癌の確率が高いまたは低い群に該被験体を割り当てるステップを含む方法が提供される。
【００１３】
本開示はまた、肝細胞癌を有する疑いがある被験体の処置を管理するための方法であって、該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力に基づいて該被験体を処置するステップであって、該被験体が該関数の該出力に基づいて疾患を有すると決定される場合、該被験体が肝細胞癌を処置される、ステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、フコシル化低分子量キニノーゲン、アルファ−フェトプロテイン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）、年齢、および性別からなるパネルの評価の結果を示す。図１Ａは、肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝９３）からＨＣＣを有する全ての患者（Ｎ＝１１５）；肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝９３）から早期ＨＣＣを有する全ての患者（Ｎ＝６９）；ＡＦＰ陰性肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝８４）からＡＦＰ陰性（ＡＦＰ−、正常な被験体間、例えばＨＣＣではない、で観察される範囲内のＡＦＰレベルを有する）ＨＣＣを有する全ての患者（Ｎ＝３９）；ならびにＡＦＰ陰性肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝８４）から早期ＨＣＣおよびＡＦＰ陰性ＨＣＣの両方を有する全ての患者（Ｎ＝２９）を識別する、ＡＵＲＯＣデータを要約する。図１Ｂは、同じ試験における同じそれぞれの患者群の識別のための９０％特異性カットオフでの感度値を要約し、図１Ｃは、同じ試験における同じそれぞれの患者群の識別のための９５％特異性カットオフでの感度値を要約する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、フコシル化低分子量キニノーゲン、アルファ−フェトプロテイン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）、年齢、および性別からなるパネルの評価の結果を示す。図１Ａは、肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝９３）からＨＣＣを有する全ての患者（Ｎ＝１１５）；肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝９３）から早期ＨＣＣを有する全ての患者（Ｎ＝６９）；ＡＦＰ陰性肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝８４）からＡＦＰ陰性（ＡＦＰ−、正常な被験体間、例えばＨＣＣではない、で観察される範囲内のＡＦＰレベルを有する）ＨＣＣを有する全ての患者（Ｎ＝３９）；ならびにＡＦＰ陰性肝硬変を有する全ての患者（Ｎ＝８４）から早期ＨＣＣおよびＡＦＰ陰性ＨＣＣの両方を有する全ての患者（Ｎ＝２９）を識別する、ＡＵＲＯＣデータを要約する。図１Ｂは、同じ試験における同じそれぞれの患者群の識別のための９０％特異性カットオフでの感度値を要約し、図１Ｃは、同じ試験における同じそれぞれの患者群の識別のための９５％特異性カットオフでの感度値を要約する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
例示的な実施形態の詳細な説明
本発明は、本開示の一部を構成する添付の図面および実施例と関連付けて、以下の詳細な記載を参照することによってより容易に理解され得る。これらの発明は、本明細書に記載および／または示した特定の方法、アッセイ、キット、条件、またはパラメーターに限定されず、本明細書で使用した専門用語は、例示のみのために特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、請求した発明を限定することを意図しないことを理解されたい。
【００１６】
本文書に引用または記載した各特許、特許出願、および刊行物の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
上記および開示の全体に用いられる場合、以下の用語および略語は、特に指示しない限り、以下の意味を有すると理解される。
【００１８】
本開示において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の参照を含み、特定の数値の参照は、文脈が明確に他を示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」という参照は、そのような試薬および当業者に公知のその等価物などの１つまたは複数への参照である。さらに、ある特定の要素が、Ｘ、Ｙ、またはＺで「あり得る（ｍａｙ  ｂｅ）」ことを示す場合、そのような使用により全ての例においてその要素に関する他の選択肢を除外することを意図しない。
【００１９】
値が、先行詞「約（ａｂｏｕｔ）」の使用により、およそとして表される場合、特定の値が別の実施形態を構成すると理解される。本明細書で使用する場合、「約Ｘ（ａｂｏｕｔ  Ｘ）」（ここでは、Ｘは数値）は好ましくは示した値の±１０％を包括的に指す。例えば、フレーズ「約８」は、７．２〜８．８の値を包括的に指すことができ；別の例としては、フレーズ「約８％」は、７．２％〜８．８％の値を包括的に指すことができる。範囲がある場合、全ての範囲は包括的および組合せ可能である。例えば、「１〜５」の範囲を示す場合、示した範囲は、任意選択で範囲「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２＆４〜５」、「１〜３＆５」などを含むと解釈すべきである。さらに、代替値（alternative）のリストが明確に提供される場合、そのような列挙は、代替値のいずれかが除外され得る実施形態も含み得る。例えば、「１〜５」の範囲が記載される場合、そのような記載は１、２、３、４、または５のいずれかが除外される状況を支持し得る。したがって、「１〜５」の言及は、「１および３〜５であるが、２ではない」または単に「２は含まれない」を支持し得る。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「処置」または「治療」（ならびにその異なる語形）は、予防的（preventative）（例えば予防的（prophylactic））、治癒的、緩和的、または抗増殖処置を含む。そのような予防、治癒的、緩和的、または抗増殖処置は、完全または部分的であり得る。例えば、望ましくない症状の完全な除去、または１つもしくは複数の望ましくない症状の部分的な除去は、本明細書で意図する場合「処置」を表す。
【００２１】
本開示は、とりわけ肝細胞癌を検出するための方法、アッセイ、およびキット、ならびに肝細胞癌を有する高いおよび低いリスクカテゴリー内で被験体を層別化するための方法、ならびに肝細胞癌を有する疑いがあるまたはそのリスクがある被験体を処置するおよび処置を管理する方法に関する。特に指定しない限り、本開示の一態様に関して（本方法、キット、およびアッセイのいずれかに関連するなど）開示されるステップ、試薬、および因子（バイオマーカーなど）は、本開示の任意の他の態様と関連して用いられ得る。
【００２２】
以前の研究は、１つまたは複数の生物学的因子のアセスメントによる肝細胞癌の、高感度の、早期予測因子の必要性に取り組むために試みられてきたが、被験体、特に無症候性の被験体がその状態を有するかどうかの臨床的に関連する決定に必要とされる感度の程度に達するものはなかった。本発明者らは、ある特定の因子の組合せが以前には達成されなかった高いレベルの精度を付与することによりこの必要性を満たすことを発見した。重要なことに、同定した組合せは、個体ベースで肝細胞癌の正確な検出器に相当しなかった因子を利用することができる、従来疾患の指標に相当すると考えられてきた因子を省略することができる、またはその両方である。本開示の主題のこれらのおよび他の特色を本明細書においてより完全に記載する。
【００２３】
本明細書では、被験体の肝細胞癌を検出するための方法、または被験体が肝細胞癌を有する尤度（likelihood）を決定するための方法であって、被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに決定した年齢および性別、ならびに生体液中の測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、被験体の肝細胞癌の非存在または存在を決定するステップを含む方法を提供する。
【００２４】
本開示の主題の発見の過程において、本発明者らは、被験体由来の生体液内のタンパク質の、フコース含有糖型を含むある特定の糖型を同定することは不可能であることを観察した。本発明者らは、糖型を同定するために使用したアッセイにおいて非特異的なシグナルを産生する被験体の試料中に存在するいくつかの物質を決定し、最終的に、主な交絡物質はＩｇＭであることを発見した。さらに、ＩｇＭとＩｇＧの両方の除去が、夾雑するシグナルを除去し、以前は不可能であった方法で特定のタンパク質糖型の正確な分析を可能にすることを発見した。ＩｇＭおよびＩｇＧもまた除去するステップ、ならびにこれらのステップを達成するための試薬は、驚くべきことに、本方法、アッセイ、およびキットによる肝細胞癌の早期検出のプロセスの臨床的に必須の態様を示すことが決定された。一部の実施形態では、ＩｇＧは、生体液をプロテインＡ／Ｇとインキュベートすることによって除去され、これは、他の試験した戦略よりも効果的であることが見出された。ＩｇＭは、生体液をフィルターに通すことによって除去される。フィルターは、例えば、１０００ｋＤフィルター、９００ｋＤフィルター、８００ｋＤフィルター、５００ｋＤフィルター、４５０ｋＤフィルター、４００ｋＤフィルター、３５０ｋＤフィルター、３００ｋＤフィルター、２５０ｋＤフィルター、２００ｋＤフィルター、１７５ｋＤフィルター、１５０ｋＤフィルター、１２５ｋＤフィルター、１００ｋＤフィルター、８０ｋＤフィルター、７５ｋＤフィルター、７０ｋＤフィルター、６０ｋＤフィルター、５０ｋＤフィルター、４０ｋＤフィルター、３０ｋＤフィルター、２５ｋＤフィルター、２０ｋＤフィルター、１５ｋＤフィルター、または１０ｋＤフィルターであり得る。濾過は、例えば重力または遠心分離によって達成され得る。代わりに、ＩｇＧおよびＩｇＭは両方ともポリエチレングリコールを使用する沈殿によって除去され得る。そのような実施形態に従って、血清はポリエチレングリコールとともにインキュベートされ、次いで遠心分離にかけられ得、生じた上清は、それぞれ量の目的のバイオマーカーが測定される物質を表す。
【００２５】
任意の生体液が、本発明に準じて使用され得る。例えば、生体液は、全血、血清、血漿、尿、唾液、涙、粘液、または２つもしくはそれよりも多いこれらの流体の組合せであってよい。
【００２６】
生体液からのＩｇＧおよびＩｇＭの除去後、生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量が測定される。生体液中のバイオマーカーの「量（ａｍｏｕｎｔ）」は、例えばｎｇ／ｍＬの単位で表されるように生体液中のその濃度を指し得、またはバイオマーカーがフコシル化糖タンパク質である場合には、フコシル化されていない試料中のバイオマーカーの数量（quantity）に対してフコシル化された生体試料中のバイオマーカーの数量を指し得る。一部の実施形態では、フコシル化バイオマーカーの量は、試料中のバイオマーカーの総量に対する百分率の単位で表され得る。
【００２７】
以前の研究では、肝細胞癌、肝硬変、または両方を有することが公知の被験体において、フコシル化の増加を示す５０より多くの糖タンパク質を同定している（Comunale,  M.  A.ら、J  Proteome  Res.２００６年２月；５巻（２号）：３０８〜１５頁）。様々な公開された研究が、フェチュインＡ（アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質とも呼ばれる）（Comunale,  MAら、J.  Proteome  Res.２００９年；８巻；５９５〜６０２頁）、キニノーゲン（Wang,  Mら、Cancer  Epidemiol  Biomarkers  Prev.２００９年；１８巻；１９１４〜１９２１頁）、アルファ−１抗トリプシン（同上）、ヘモペキシン（Comunale,  MAら、２００９年）、アルファ−１−抗キモトリプシン（Comunale,  MAら、Proteomics  Clin.  Appl.２０１３年；７巻；６９０〜７００頁）、ＧＰ７３（Drake,  RRら、Mol  Cell  Proteomics.２００６年；５巻；１９５７〜６７頁）、およびＬＲＡＧＧ（レクチン反応性抗α−ガラクトースＩｇＧ）（Mehta,  ASら、J  Virol.２００８年；８２巻；１２５９〜１２７０頁）を含む、個々のフコシル化糖タンパク質の肝細胞癌のマーカーとして機能する能力のアセスメントを行っている。これらの糖タンパク質の中で、成績優秀者は、例えば、ヘモペキシン（ＡＵＲＯＣ＝０．８７）およびフェチュイン−Ａ（ＡＵＲＯＣ＝０．９０）を含んでいた。本発明者らは、そのいくつかの因子がフコシル化糖タンパク質である、因子のある特定の組合せ（パネルと呼ばれ得る）が、任意の個々の糖タンパク質または他の個々の因子のアセスメントよりもかなりより正確に肝細胞癌の存在を同定するために使用され得ることを決定した。予想外に、個々にアセスメントを行った場合、肝細胞癌の最良の指標として機能したある特定の糖タンパク質は、とりわけ、そのようなタンパク質のアセスメントを含む因子のパネル（１つまたは複数の他のフコシル化糖タンパク質など）に中程度の寄与のみ、またはさらにマイナスの寄与を有した。したがって、肝細胞癌の個々の指標を同定する以前の研究は、肝細胞癌を有する被験体の同定のための因子のパネルへのそれらの指標の寄与を予想するために使用できないことが見出された。
【００２８】
本方法に従って、それぞれの量が測定されたバイオマーカーは、アルカリホスファターゼ、ＧＰ−７３、ヘモペキシン、ＨＢｓＡｇ、Ｂ型肝炎ウイルス粒子、アルファ−酸性糖タンパク質、アルファ−１−抗キモトリプシン、アルファ−１−抗キモトリプシンＨｉｓ−Ｐｒｏ欠損型、アルファ−１−抗トリプシン、セロトランスフェリン、セルロプラスミン、アルファ−２−マクログロブリン、フェチュイン−Ａ／アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質、アルファ−フェトプロテイン、ハプトグロビン、フィブリノーゲンガンマ鎖前駆体、免疫グロブリン（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥを含む）、ＡＰＯ−Ｄ、キニノーゲン、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、補体因子１前駆体、補体因子Ｉ重鎖、補体因子Ｉ軽鎖、補体Ｃ１ｓ、補体因子Ｂ前駆体、補体因子Ｂ  Ｂａ断片、補体因子Ｂ  Ｂｂ断片、補体Ｃ３前駆体、補体Ｃ３ベータ鎖、補体Ｃ３アルファ鎖、Ｃ３ａアナフィラトキシン、補体、Ｃ３ｂアルファ’鎖、補体Ｃ３ｃ断片、補体Ｃ３ｄｇ断片、補体Ｃ３ｇ断片、補体Ｃ３ｄ断片、補体Ｃ３ｆ断片、補体Ｃ５、補体Ｃ５ベータ鎖、補体Ｃ５アルファ鎖、Ｃ５ａアナフィラトキシン、補体Ｃ５アルファ’鎖、補体Ｃ７、Ｂ−２−糖タンパク質、ビタミンＤ−結合タンパク質、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質、アンジオテンシノーゲン前駆体、アンジオテンシン−１、アンジオテンシン−２、アンジオテンシン−３、ＧＡＲＰタンパク質、ベータ−２−糖タンパク質、クラスタリン（Ａｐｏ  Ｊ）、インテグリンアルファ−８前駆体糖タンパク質、インテグリンアルファ−８重鎖、インテグリンアルファ−８軽鎖、Ｃ型肝炎ウイルス粒子、ｅｌｆ−５、キニノーゲン、ＨＳＰ３３−ホモログ、リシルエンドペプチダーゼ、およびロイシンリッチリピート含有タンパク質３２前駆体の１つまたは複数であり得る。一部の実施形態では、これらの糖タンパク質の糖型は本方法に従って測定される。例えば、バイオマーカーのフコシル化Ｎ結合型糖型などこれらの糖タンパク質のＮ結合型グルコシル化形態が測定され得、特に、コアフコシル化Ｎ結合型糖型が測定され得る。さらなるバイオマーカーは、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ビリルビン、アルブミン、血小板数、または白血球数の１つまたは複数であり得る。さらに、いずれかの上記の因子の量における経時的な変化は、本開示による「バイオマーカー」を表し得る。
【００２９】
ある特定の実施形態では、それぞれの量が測定されたバイオマーカーは、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、フコシル化ヘモペキシン、フコシル化キニノーゲン、フコシル化アルファ−１−アンチトリプシン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）のうちの１つまたは複数である。一態様では、本方法は、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、ＡＬＫ、およびＡＳＴを測定するステップを含む。別の態様では、本方法は、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、ＡＬＫ、ＡＳＴ、およびフコシル化アルファ−１−抗トリプシンを測定するステップを含む。さらなる態様では、本方法は、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、ＡＬＫ、ＡＳＴ、およびフコシル化フェチュイン−Ａを測定するステップを含む。本方法は、アルファ−フェトプロテイン、フコシル化キニノーゲン、ＡＬＫ、ＡＳＴ、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化アルファ−１−抗トリプシンを測定するステップを選択的に含み得る。本方法に従って測定されるバイオマーカーの他の組合せは、アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化フェチュイン−Ａ；アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化ヘモペキシン；アルファ−フェトプロテインおよびフコシル化キニノーゲン；アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化（fuoxylated）ヘモペキシン；アルファ−フェトプロテイン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲン；アルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、およびフコシル化キニノーゲン；ならびにアルファ−フェトプロテイン、フコシル化アルファ−１アンチトリプシン、フコシル化フェチュイン−Ａ、およびフコシル化キニノーゲンを含む。
【００３０】
バイオマーカーのそれぞれの量を決定するための任意の許容可能なプロセスは本方法に従って使用され得る。総アルファ−フェトプロテインなど、総タンパク質バイオマーカーは、イムノアッセイなどの従来の技法を使用して検出され得る。バイオマーカーがグルコシル化される場合、例えば、炭水化物特異的化学物質もしくは色素により、または標識レクチン、標識炭水化物結合タンパク質、もしくは標識抗体により、検出試薬はグリコシル部分を直接標識できる。検出試薬は、例えば、まず標的被検体を捕捉し、次いで捕捉試薬−標的複合体を標識二次試薬と接触することによる、二次試薬であってもよい。一部の実施形態では、検出および定量は、グルコシル化の定量可能な検出の前にタンパク質からグリコシル部分を分離することによって進めることができる。他の実施形態では、糖タンパク質はグルコシル化の定量可能な検出の前に生体液から分離され得る。これらの手法およびその他は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年４月１０日に出願された米国特許公開第２０１２／０１９６２７７号に記載される。レクチンがグルコシル化タンパク質を検出するために使用される場合、レクチンは野生型であってよく、または目的の特定のグリカンに対する結合親和性が増強した組換えレクチンであってよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月３日に出願された米国特許公開第２０１５／０１９８６１０号は、疾患を有さない被験体の糖タンパク質と比較して、肝細胞癌を有する被験体の糖タンパク質上により多く存在することが公知のコアフコシル部分への増強した結合によって特徴付けられる様々な組換えＡｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａレクチンを開示する。
【００３１】
ＡＬＴおよびＡＳＴのそれぞれの量は、検出のための比色、分光光度、化学発光、クロマトグラフィー、蛍光またはＵＶ吸光度、放射化学、および電気化学技法を使用して、ＡＳＴおよびＡＬＴのそれぞれの酵素活性に基づいて動力学アッセイを使用して決定され得る。当業者はかかるアッセイおよび技法に精通している。
【００３２】
本方法に準じて、被験体の年齢および性別は決定される。被験体の年齢は、所望により年、月、または日の単位で表され得る。年齢および性別は、肝細胞癌を有する被験体間で関連因子であることが以前に示されている（Wang,  M.ら、Proceedings.  IEEE  International  Conference  on  Bioinformatics  and  Biomedicine  ２０１２年；Wang,  M.ら、BMC  Medical  Genomics、２０１３年、６巻補遺３：Ｓ９参照）。
【００３３】
特定のバイオマーカーのそれぞれの量の測定ならびに被験体の年齢および性別の決定後、決定した年齢および性別、ならびにバイオマーカーのそれぞれの測定した量の関数の最適化した出力を使用して、肝細胞癌の非存在または存在が決定される。例えば、関数は、決定した年齢および性別、ならびにバイオマーカーの測定した量の、それぞれ最適化した重み付け係数を含み得る。適切な統計学的方法論が、年齢、性別、およびバイオマーカー量の最適化した関数を同定するために使用され得る。例えば、ロジスティック回帰アルゴリズムを作成するため、因子の各所望のパネル（すなわち、バイオマーカー、年齢、および性別）に関するロジスティック回帰を使用できる。各回帰の適合性を判定するため、ＡＩＣ、Ｒ２、Ｄｘｙ、尤度比検定、ピアソンの適合度、対数尤度、偏差統計（Deviation  statistic）、Ｔａｕ−ａ、ＮＲＩ、およびＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）の明らかな検証（apparent  validation）１つまたは複数を導き出すことができる（Steyerberg,  E.（２００９年）、「Clinical  Prediction  Models」、Springer-Verlag  New  York参照）。これらの基準および検定から、さらなる評価に最高の適合性を有するロジスティック回帰モデルを選択し得る。任意選択で、過剰適合を避けるため、一個抜き交差検証、ブートストラップ検証、および３分割交差検証の１つまたは複数を、候補モデルを検証するために適用し得る。
【００３４】
年齢、性別、およびバイオマーカー量の最適化した関数は、被験体が肝細胞癌を有する確率を表す値をもたらす。本方法に従って、値は、確実性の臨床的に妥当なレベルで被験体が肝細胞癌を有することを明らかにし得る。例えば、確実性のレベルは約５０％もしくはそれよりも高くてよい、６０％もしくはそれよりも高くてよい、７０％もしくはそれよりも高くてよい、７５％もしくはそれよりも高くてよい、８０％もしくはそれよりも高くてよい、８５％もしくはそれよりも高くてよい、９０％もしくはそれよりも高くてよい、約９１％もしくはそれよりも高くてよい、約９２％もしくはそれよりも高くてよい、約９３％もしくはそれよりも高くてよい、約９４％もしくはそれよりも高くてよい、約９５％もしくはそれよりも高くてよい、約９６％もしくはそれよりも高くてよい、約９７％もしくはそれよりも高くてよい、または約９８％もしくはそれよりも高くてよい。したがって、本方法を使用して、非常に高い程度の確実性で、被験体が肝細胞癌を有するかどうかを決定することができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「肝細胞癌を検出する」または「肝細胞癌の非存在または存在を決定する」は、本開示の時点で既存の方法によって通常検出可能ではない型またはステージの被験体における肝細胞癌の検出を包含し得る。例えば、本開示の方法、アッセイ、およびキットは、被験体が、早期の肝細胞癌；アルファフェトプロテイン陰性（ＡＦＰ−）肝細胞癌；または早期の肝細胞癌とアルファフェトプロテイン陰性（ＡＦＰ−）肝細胞癌（すなわち、早期およびＡＦＰ−の両方であるＨＣＣ）を有するかどうか決定するために使用され得る。
【００３６】
「アルファフェトプロテイン陰性（ＡＦＰ−）肝細胞癌」は、肝疾患のない被験体において見出されるＡＦＰレベルと著しく異なるＡＦＰのレベルによって特徴付けられない疾患を指す。例えば、被験体由来の生体液中のＡＦＰの量が約２０ｎｇ／ｍＬよりも少ない場合、被験体はＡＦＰ−と言うことができる。
【００３７】
重要なことに、本開示、例えば表３Ａおよび３Ｂで提供されるデータは、本開示の方法、アッセイ、およびキットの、それにより被験体において早期および／またはアルファフェトプロテイン陰性肝細胞細胞癌（hepatocellular  cellular  carcinoma）が検出され得るシステムを提供する能力を実証する。適切な処置が続いて行われ得る。本発明の主題のこの態様の高度の臨床的な重要性は、特に早期の肝細胞癌は治療可能であること（一方、後期の疾患は通常緩和ケアのみが適格である）を考慮すると、当業者には明らかである。本開示の主題とは違って、肝細胞癌を検出するための以前のシステムは、早期の肝細胞癌、アルファフェトプロテイン陰性（ＡＦＰ−）肝細胞癌、または早期の肝細胞癌とアルファフェトプロテイン陰性（ＡＦＰ−）肝細胞癌を検出できなかった。
【００３８】
したがって、本開示は、早期の肝細胞癌、アルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌、またはアルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌でもある早期の肝細胞癌について特別に被験体を処置するか、または被験体の処置を推奨することを含む方法も提供する。そのような方法は、肝細胞癌を検出するための本開示の方法に付加的なものであってもよく、または本開示のアッセイおよびキットの使用の結果であってもよい。早期の肝細胞癌、アルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌、またはアルファフェトプロテイン陰性肝細胞癌でもある早期の肝細胞癌に特別に合わせた適切な処置は、医師によって同定され得る。
【００３９】
例示的な方法は、早期の肝細胞癌、ＡＦＰ陰性肝細胞癌、またはその両方を有する疑いがある被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；被験体の年齢および性別を決定するステップ；決定した年齢および性別、ならびに生体液中の測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、被験体の早期の肝細胞癌、ＡＦＰ陰性肝細胞癌、またはその両方の非存在または存在を決定するステップ；ならびに早期の肝細胞癌、ＡＦＰ陰性肝細胞癌、またはその両方が被験体に存在することが決定される場合には、被験体を処置するステップ、または被験体の処置の推奨を提供するステップを含み得、ここで、処置は、早期の肝細胞癌、ＡＦＰ陰性肝細胞癌、またはその両方の処置のために特別に選択される。生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ、生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ、被験体の年齢および性別を決定するステップ、ならびに決定した年齢および性別、ならびに生体液中の測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、疾患の非存在または存在を決定するステップに関するそのような方法の態様は、肝細胞癌の非存在または存在を検出するための以前に開示された方法の相当する態様に従って実施され得る。
【００４０】
また、被験体の肝細胞癌を検出するためのアッセイであって、生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップであって、該アッセイが、該測定するステップの前に該被験体の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するための試薬を利用する、ステップ：該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するステップを含むアッセイが開示される。
【００４１】
生体液からＩｇＧを除去するための試薬はプロテインＡ／Ｇであり得る。他の実施形態では、試薬はプロテインＬであり得る。本開示のアッセイ、方法、およびキットに関して本明細書で使用する場合、ＩｇＭを除去するための「試薬」は、実験器材（laboratory  equipment）または機械系の品目であり得る。例えば、ＩｇＭを除去するための試薬は分子量ベースのフィルターまたは濾過システムであり得る。濾過は、例えば重力または遠心分離ベースの濾過によって実施され得る。他の実施形態では、ＩｇＧおよびＩｇＭの両方を除去するための試薬は、ポリエチレングリコールであってよく、非限定的な例としては、ＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−３３５０、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００、およびＰＥＧ−８０００が挙げられる。
【００４２】
１つまたは複数のバイオマーカーを定量的に検出するために、任意の様々な異なるアッセイフォーマットが、本発明のアッセイに準じて使用され得る。イムノアッセイは、１つの好ましいアッセイであり、限定はされないが、ＥＬＩＳＡ、放射イムノアッセイ、競合アッセイ、ウェスタンブロッティング、ビーズ凝集アッセイ、側方流動イムノアッセイ、イムノクロマトグラフィー試験紙法、ディップスティック、移動フォーマットイムノアッセイ（migratory  format  immunoassay）などが挙げられる。他の好適なイムノアッセイが当業者に公知である。顕微鏡検査も使用され得る。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは選択されたアッセイフォーマットを示す。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が特に好ましい。一部の実施形態では、質量分析が好ましいアッセイである。一部の実施形態では、デンシトメトリーを伴うゲル電気泳動が、アッセイフォーマットとして使用される。
【００４３】
アッセイの一般的なフォーマットは、適切な試薬を試料中に見出される他の成分と区別され得る目的の被検体、すなわちバイオマーカーを含有する試験試料と接触させるステップを含み得る。試料は被験体由来の生体液、または生体液由来の別の試料であり得る。被検体と試薬との相互作用後、システムは洗浄され、次いで直接検出され得るか、または二次試薬によって検出され得る。
【００４４】
一部の実施形態では、バイオマーカーを検出するための試薬は、固体支持体上に固定される。他の好ましい実施形態では、試験試料、または試験試料から分離もしくは精製された分子、例えば翻訳後修飾ポリペプチドが、固体支持体上に固定される。細胞、組織、または生体液などの試料からの生体分子の精製技法は、当技術分野で周知である。選択される技法は、調べられる組織または試料によって変わり得るが、適切な精製手順を試験試料源と適合させるのは、十分に当技術分野の範囲内である。
【００４５】
好適な固体支持体の例としては、限定はされないが、ガラス、プラスチック、金属、ラテックス、ゴム、セラミック、ポリプロピレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリエチレン、ポリスチレン、およびポリアクリルアミドなどのポリマー、デキストラン、セルロース、ニトロセルロース、ｐｖｄｆ、ナイロン、アミラーゼなどが挙げられる。固体支持体は、平面、凹面、または凸面、球面、円筒状などであってよく、粒子、ビーズ、膜、糸、沈殿物、ゲル、シート、容器、ウェル、キャピラリー、フィルム、プレート、スライドなどであってよい。固体支持体は磁性であってもよく、またはカラムであってもよい。
【００４６】
生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ、被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに決定した年齢および性別、ならびに生体液中の測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、被験体の肝細胞癌の非存在または存在を決定するステップを含む本アッセイの他の態様は、被験体の肝細胞癌を検出するための本発明の方法に関する上記のいずれかの態様に従い得る。
【００４７】
本開示はまた、被験体の肝細胞癌を決定するためのキットであって、該被験体の生体液からＩｇＧタンパク質を除去するための試薬；および該生体液からＩｇＭタンパク質を除去するための試薬；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーをそれぞれ測定するための試薬；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力を使用して、該被験体の肝細胞癌の存在または非存在を決定するための指示を含むキットに関する。
【００４８】
生体液からＩｇＧを除去するための試薬は、プロテインＡ／Ｇであり得る。他の実施形態では、試薬はプロテインＬであり得る。生体液からＩｇＭを除去するための試薬は、１０００ｋＤフィルター、９００ｋＤフィルター、８００ｋＤフィルター、５００ｋＤフィルター、４５０ｋＤフィルター、４００ｋＤフィルター、３５０ｋＤフィルター、３００ｋＤフィルター、２５０ｋＤフィルター、２００ｋＤフィルター、１７５ｋＤフィルター、１５０ｋＤフィルター、１２５ｋＤフィルター、１００ｋＤフィルター、８０ｋＤフィルター、７５ｋＤフィルター、７０ｋＤフィルター、６０ｋＤフィルター、５０ｋＤフィルター、４０ｋＤフィルター、３０ｋＤフィルター、２５ｋＤフィルター、２０ｋＤフィルター、１５ｋＤフィルター、または１０ｋＤフィルターなど、分子量ベースのフィルターであり得る。濾過は、例えば重力または遠心分離によって達成され得る。
【００４９】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧを除去するための試薬およびＩｇＭを除去するための試薬は同じであってよい。この種の例示的な実施形態は、ポリエチレングリコールである。
【００５０】
バイオマーカーが、ポリペプチド、例えば糖タンパク質である場合、生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーを測定するための試薬は、ポリペプチドが１つまたは複数の翻訳後修飾（グルコシル化など）を含有するという事実を利用し得る。翻訳後修飾の検出は、ある特定のポリペプチド部分複合体を検出することによって達成され得る。別の好ましい実施形態では、翻訳後修飾の検出は、ポリペプチドと部分とを分離し、部分を検出することによって行われ得る。ポリペプチド−部分複合体の検出は、部分、特定のクラスの部分、またはポリペプチドとの複合体としての部分を特異的に認識する試薬を使用して行われ得る。好適な検出試薬は、当業者には明らかであり、その非限定的な例は以下に記載する。試薬は、異なる標的部分に特異性をそれぞれ有し、それにより複数の試薬−標的相互作用をもたらす複数の分子を含み得る。
【００５１】
バイオマーカーを検出するために使用される試薬は、抗体であり得る。例えば、目的の標的部分に特異的に結合する任意の抗体が、本キットに従って使用され得る。モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体が、一本鎖抗体およびファージディスプレイ抗体、ならびにキメラ抗体およびヒト化抗体などの組換え抗体と同様に、産生源の如何を問わず使用され得る。ＦａｂまたはＦｖなどの抗体の抗原結合断片も使用され得る。
【００５２】
一部の実施形態では、バイオマーカーを検出するための試薬は糖タンパク質を特異的に認識する抗体である。好ましくは、抗体は、単糖および多糖を含む炭水化物部分を特異的に認識する。一部の例では、抗体はフコース部分、例えばコアフコシル化部分を特異的に認識する。フコースを特異的に認識することができる抗体が記載されている。例えば、Roy  SSら（２００２年）Ann.  Bot.８９巻：２９３〜９頁；および、Srikrishna  Gら（１９９８年）Glycobiology  ８巻：７９９〜８１１頁参照。代わりに、抗体は、またフコースを含む様々な部分に対して産生され、本発明に使用され得る。抗体を産生および精製するための方法は、当技術分野で周知である。さらに、モノクローナル抗体は、Kohler  and  Milstein（１９７５年）Nature  ２５６巻：４９５〜４９７頁によって最初に開発された技法を含む、当技術分野で公知のいくつかの技法によって調製され得る。
【００５３】
炭水化物認識ドメインを保持する他のタンパク質も、バイオマーカーを検出するために使用される試薬として使用され得る。炭水化物認識ドメインを有するタンパク質が記載されており、例えば、Bouyain  Sら（２００２年）J.  Biol.  Chem.２７７巻：２２５６６〜７２頁（フコースを認識するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒタンパク質ＣＧ２９５８）参照。
【００５４】
特に好ましい実施形態では、バイオマーカーを検出するために使用される試薬としてレクチンが使用される。レクチンは、植物、動物、酵母、細菌、原生動物などを含む任意の生物から得ることができる。精製したレクチンが市販されており、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）参照。レクチンは、当業者に周知の手段により、その天然に存在する供給源からも単離され、または組換えにより発現および精製され得る。レクチンは、特定の炭水化物部分に特異的であってよいが、特異的である必要はない。フコース特異的レクチンが記載されている。例えば、Mansour  MHら（２００５年）Immunobiology.２１０巻：３３５〜４８頁；Amano  Kら（２００３年）Biosci.  Biotechnol.  Biochem.６７巻：２２７７〜９頁；Loris  Rら（２００３年）J.  Mol.  Biol.３３１巻：８６１〜７０頁；および、Ishida  Hら（２００２年）Biosci.  Biotechnol.  Biochem.６６巻：１００２〜８頁参照。参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月３日に出願された米国特許公開第２０１５／０１９８６１０号は、コアフコシル部分への増強した結合によって特徴付けられる様々な組換えＡｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａレクチンを開示する。将来同定または開発されるレクチンが、本開示による１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための試薬としての使用に好適であることが意図される。
【００５５】
レクチン様ドメインを有するタンパク質も、１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための試薬としての使用に好適である。レクチン様ドメインを有するタンパク質は、当技術分野で公知である。例えば、Drickamer  K（１９９９年）Curr.  Opin.  Struct.  Biol.９巻：５８５〜９０頁参照。
【００５６】
核酸ベースのレクチンの代替物も使用され得る。アプタマーと呼ばれるそのような試薬は、一本鎖核酸の非常に大きなコンフォーメーションの柔軟性を利用する。無作為化した短核酸の大きなプールから、多くの非核酸リガンドに対する高い親和性を有する個々の分子が繰り返し選択により単離された。グリカン結合「レクタマー」試薬の利点は、浸出したＤＮＡが下流での分析を混乱または干渉する可能性が低いことである。レクタマーは均一な結合条件（ｐＨ、イオン強度）下で機能できる。合成核酸は、様々な誘導体型で調製され得る（例えば、末端ビオチン化）。標的グリカンは、存在するレクチンの特異性、存在する分画の実質的な拡張、および分析的能力により限定されない。
【００５７】
バイオマーカーを検出するための試薬は、検出可能部分で直接標識され得る。代わりに、一次試薬を特異的に認識する、検出可能部分で標識した二次試薬が使用される。二次試薬は任意の分子であってよく、抗体などである。二次試薬は検出可能部分で標識される。本発明での使用を意図した検出可能部分としては、限定はされないが、放射性同位体、フルオレセイン、フィコエリトリン（phyocoerythrin）、Ｃｙ−３、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、ＤＡＰＩ、テキサスレッド、ローダミン、オレゴングリーン、ルシファーイエローなどの蛍光色素、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓオレンジ蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ｌａｃＺ（α−ガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、胎盤アルカリホスファターゼ、分泌胚性アルカリホスファターゼ、またはホタルもしくは細菌性ルシフェラーゼが挙げられる。酵素タグは、それらの同種基質と共に使用される。本発明の実施に関連する他の標準的手順と同様に、当業者は使用され得るさらなる標識を知っている。一部の実施形態では、試薬または二次試薬はビオチンに連結され、検出可能部分のタグを有するアビジンまたはストレプトアビジンと接触させられる。
【００５８】
一部の実施形態では、翻訳後修飾によりポリペプチドバイオマーカーに結合した部分は、直接標識および検出され得、これにより特定部分を特異的に認識する標識試薬の必要性、ならびに標識二次試薬のいかなる必要性も取り除くことができる。本開示の目的のため、バイオマーカーの検出は、翻訳後修飾によってバイオマーカーに結合される部分の検出を包含する。一部の実施形態では、翻訳後修飾によってバイオマーカーに結合した部分は、バイオマーカーから分離され、直接標識および検出され得る。例えば、限定はされないが、炭水化物および炭水化物部分は、当技術分野で公知の様々な方法を使用して直接標識され得る。炭水化物および炭水化物部分の標識キットは市販されている。炭水化物および炭水化物部分はまた、ビオチン化され（biotinlyated）、本明細書に記載したものなどのアビジンがコンジュゲートした検出可能部分またはストレプトアビジンがコンジュゲートした検出可能部分で標識され得る。オリゴ糖を直接標識できる試薬の非限定的な例としては、２−アミノベンズアミドおよび２−アミノ安息香酸が挙げられる。
【００５９】
翻訳後に結合した部分は、例えば、ヒドラジンまたはフッ化水素酸もしくはトリフルオロメタンスルホン酸などの酸による処理による化学的なもの、例えば、ＰＮＧアーゼＦ、Ｏ−グリコシダーゼ、エンドグリコシダーゼ、またはエキソグリコシダーゼなどのＮ−グリコシダーゼによる処理による酵素的なもの、あるいは物理的手段によるものを含む、当技術分野で好適な任意の手段によってポリペプチドバイオマーカーから分離され得る。脱グリコシル化を含む、翻訳後修飾を除去するための市販のキットがある。ヒドラジンなどの化学塩基、またはベータ脱離反応（beta-elination  reaction）をもたらす化学試薬もまた、脱グリコシル化反応に使用され得る。他の技法および試薬が当業者には理解されており、本開示の範囲内であることを意図する。
【００６０】
一部の実施形態では、分離され、事前に翻訳後に結合した部分は、標識または検出の前に精製される。当技術分野で公知の固相または液相抽出技法が、さらなる分析用に分離部分を精製するために使用され得る。
【００６１】
上記のように、全アルファ−フェトプロテインなどの全タンパク質バイオマーカーは、イムノアッセイなど従来の技法を使用して検出され得、そのような技法を実施するために必要な試薬は本キットに含まれ得る。これは、検出のための比色、分光光度、化学発光、クロマトグラフィー、蛍光またはＵＶ吸光度、放射化学、および電気化学技法を使用する、ＡＳＴおよびＡＬＴのそれぞれの酵素活性に基づく動力学アッセイと同様である。
【００６２】
本キットは、決定した年齢および性別、ならびに生体液中のバイオマーカーの測定した量の関数の最適化した出力を使用して、被験体の肝細胞癌の非存在または存在を決定するための指示を含む。関数は、被験体の肝細胞癌を検出するための現方法に関する上記に提供される記載に従って提供され得る。本開示は、決定した年齢および性別、ならびにバイオマーカーの測定した量の適切な関数を作成し得る方法の具体例も提供する。
【００６３】
また本明細書において、肝細胞癌の確率が高いまたは低い群に被験体を割り当てるための方法であって、該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力に基づいて、肝細胞癌の確率が高いまたは低い群に該被験体を割り当てるステップを含む方法が提供される。
【００６４】
被験体の肝細胞癌を検出するための本開示の方法に従って上で提供したように、年齢、性別、およびバイオマーカー量の最適化した関数は、被験体が肝細胞癌を有する確率を表す値をもたらす。値は、約９０％もしくはそれよりも高い、約９１％もしくはそれよりも高い、約９２％もしくはそれよりも高い、約９３％もしくはそれよりも高い、約９４％もしくはそれよりも高い、約９５％もしくはそれよりも高い、約９６％もしくはそれよりも高い、約９７％もしくはそれよりも高い、または約９８％もしくはそれよりも高い確実性のレベルで、被験体が肝細胞癌を有することを明らかにし得る。肝細胞癌である確率が高いまたは低い群に被験体を割り当てるための本方法に準じて、最適化した関数がもたらす値が、肝細胞癌である確率が高いまたは低い群への被験体の割り当てを保証するかどうかに関して、臨床的に適切な決定がなされ得る。例えば、年齢、性別、およびバイオマーカー量の最適化した関数によってもたらされた値が、被験体が肝細胞癌を有することを示し、関数と関連する確実性のレベルが臨床的に有意である場合、被験体は「高い確率」群に割り当てられ得る。例えば、確実性のレベルは、少なくとも５０％高くてよい、少なくとも６０％高くてよい、少なくとも６５％高くてよい、少なくとも７０％高くてよい、少なくとも７５％高くてよい、少なくとも８０％もしくはそれよりも高くてよい、少なくとも８２％もしくはそれよりも高くてよい、少なくとも８４％もしくはそれよりも高くてよい、少なくとも８５％もしくはそれよりも高くてよい、少なくとも８６％もしくはそれよりも高くてよい、少なくとも８８％もしくはそれよりも高くてよい、または少なくとも９０％もしくはそれよりも高くてよい。熟練の病理学者は、バイオ統計学者、バイオインフォマティシャンなどとチームを組み、適切な統計的方法論を適用して、年齢、性別、およびバイオマーカー量の特定の最適化した関数によってもたらされる値が、肝細胞癌である確率が高いまたは低い群への被験体の割り当てを保証するかどうか決定することができる。
【００６５】
本開示はまた、肝細胞癌を有する疑いがある被験体の処置を管理するための方法であって、該被験体由来の生体液からＩｇＧおよびＩｇＭタンパク質を除去するステップ；該生体液中の１つまたは複数のバイオマーカーの量を測定するステップ；該被験体の年齢および性別を決定するステップ；ならびに該決定した年齢および性別、ならびに該生体液中の該測定したバイオマーカーの関数の最適化した出力に基づいて該被験体を処置するステップであって、該被験体が該関数の該出力に基づいて疾患を有すると決定される場合、該被験体が肝細胞癌を処置される、ステップを含む方法を提供する。
【００６６】
適切な統計的アセスメントの適用後、決定した年齢および性別、ならびに被験体の生体液中の測定したバイオマーカーの最適化した関数の出力が、被験体の肝細胞癌の存在を示す場合、被験体は、本方法に従って処置を受け得る。被験体が無症候性である場合、本方法は、被験体の早期の肝細胞癌を考慮に入れた処置レジメンの開始を有利に許可する。早期の肝細胞癌の処置は、容認された医療行為に従い得る。本方法に準じて、被験体が肝細胞癌を有していないことが決定される場合、被験体は、適用され得る任意の代わりの状態または前駆状態を処置され得る。例えば、被験体が肝細胞癌を有する疑いがある場合、被験体はすでに、アルコール症、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、アフラトキシン、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、２型糖尿病、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）または血友病など、共通の危険因子のいずれかを示していることがすでに分かっているか、または後に有することが見出される（例えば、肝細胞癌の陰性診断によって動機付けられる検査の結果として）場合がある。肝細胞癌の危険因子を示す１つまたは複数の状態のいずれかに対する処置は、当業者によって決定される適切な尺度に従って進められ得る。さらに、被験体が肝細胞癌を有していないことが決定される場合、被験体は、将来１回または複数回、肝細胞癌について被験体を検査することを含み得る定期的なモニタリングを受けることを求められ得る。本方法の目的のため、「処置」は、被験体が肝細胞癌を有していない最初の決定後に、被験体が肝細胞癌を発症するか否かを確かめるために被験体を定期的なモニタリングにかけることを包含し得る。例えば、本方法に準じて、被験体は、決定した年齢および性別、ならびに生体液中の測定したバイオマーカーの最適化した関数の出力に基づいて肝細胞癌を有していないと決定され、被験体は、検査の１つまたは複数の追加のエピソードにかけられ、被験体が後に肝細胞癌を発症するかどうか決定され得る。追加の検査は、例えば、肝細胞癌の最初の陰性診断後２カ月、３カ月、６カ月、８カ月、１年、１８カ月、２年、３０カ月、または３年、および例えば、被験体が肝細胞癌を有すると見出されるまで３カ月毎、６カ月毎、１年毎、１８カ月毎、２年毎、３０カ月毎、３年毎、４年毎、または５年毎に行い得る。追加の検査は、被験体における肝細胞癌を検出するための本方法に従い得る。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は、当業者に、本明細書に請求した方法、キット、およびアッセイがどのように開発および評価され得るかについての完全な開示および説明を提供するために記載され、単に本発明の例示を意図し、本発明者らが、彼らの発明であるとみなす範囲を限定することを意図しない。数（例えば、量）に関して精度を確実にするための努力がなされるが、いくつかのエラーおよび偏差は考慮すべきである。
【００６８】
（実施例１）
臨床データの分析およびＨＣＣの予測因子の同定
本発明の予測因子の開発は、２つの臨床コホートからのデータを使用して行った。１つは、ＨＣＣの１１５人の患者および肝硬変の９３人の患者からなり（このコホートの肝機能検査のデータは入手可能である）、もう１つはＨＣＣの６６人の患者、肝硬変の３８人の患者からなった（このコホートの肝機能検査のデータは入手可能ではない）。
【００６９】
２４の特徴選択アルゴリズムを用い、各潜在的なパネルの構成要素（血清バイオマーカー；患者の人口統計学的要因）および組合せを探索した。適用された特徴選択アルゴリズムは、相関特徴選択フィルター（correlation  feature  selection  filter）（ｃｆｓフィルター）、カイ二乗フィルター、一貫性ベースのフィルター（consistency-based  filter）、線形相関フィルター、順位相関フィルター、情報ゲインフィルター、情報比フィルター、システムの不確実性、全数探索アルゴリズム、貪欲検索フォワード（greed  search  forward）、貪欲検索バックワード（greed  search  backward）、山登り探索、oneRアルゴリズム、ランダムフォレストフィルター、３つの隣接値によるレリーフフィルター（relief  filter  with  3  neighbors）、５つの隣接値によるレリーフフィルター、ステップロジスティック回帰、ステップペナルティ付加ロジスティック回帰（step  penalized  logistic  regression）、ペナルティ付加ｓｖｍ、ｂｅｓｔｇｌｍ（ｂｉｃ）、ｂｅｓｔｇｌｍ（ａｉｃ）、ロバストロジスティック回帰、ＧＬＭのベイズ分数多項式（Bayesian  fractional  polynomial）（ｇｌｍＢｆｐ）、およびベイズモデル平均化（ＢＭＡ）を含んでいた。続いて、ロジスティック回帰が、２４の特徴選択アルゴリズムによって提供された予測因子のサブセットに適用された。特徴選択アルゴリズムおよびマーケットバスケット分析から選択された２１のサブセットの特徴があった。このため、全予測因子およびＡＦＰがカンファレンスサブセットに加えられ、これから、２３のロジスティック回帰アルゴリズムが構築された。各回帰の適合性を判定するため、本発明者らは、ＡＩＣ、Ｒ２、Ｄｘｙ、尤度比検定、ピアソンの適合度、対数尤度、偏差統計、ｔａｕ−ａ、ＮＲＩ、およびＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）の明らかな検証を導き出した。これらの基準および検定から、さらなる評価のために最高の適合度を有する４つのロジスティック回帰モデルが選択された。過剰適合を避けるため、４つの候補モデルを検証するために一個抜き交差検証、ブートストラップ検証、および３分割交差検証が適用された。
【００７０】
１４のバイオマーカー、臨床的および人口統計学的変数のアセスメントを行った：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン（ＢＩＬ）、アルブミン（ＡＬＢ）、血小板（ＰＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）、白血球（ＷＢＣ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、フコシル化Ａ１ＡＴ、フコシル化低分子量（ＬＭＷ）キニノーゲン、フコシル化フェチュインＡ、フコシル化ヘモペキシン、年齢および性別。ＡＦＰ値は、広範囲に分布し（１〜３４７，０００ｎｇ／ｍｌ）、さらなる分析のためにｌｏｇ変換した。残りの因子のデータ分布は、統計分析およびアルゴリズム探索に影響しないため、オリジナルデータのフォーマットを使用した。
【００７１】
予備分析は、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＡＳＴ、年齢および男性の性別が、ＨＣＣである確率と正の関連があることを示した。ＨＣＣ群では、オッズ比１．７５、χ２＝５．３６、ｄｆ＝１、ｐ＝０．０２０５６の高い男性比があった。ＡＦＰを含めると、ＨＣＣの識別のための最高に高いＡＵＲＯＣ値を得たことを見出した。フコシル化バイオマーカーの非存在下でＡＦＰを使用した場合、ＡＵＲＯＣ値は、ＡＦＰ単独の０．８０１６から４つの追加の因子（年齢、性別、ＡＬＫ、ＡＬＴ）を含めた０．９０６６まで変わった。変数の数の増加は、この値を超えてＡＵＲＯＣを変更せず、検出をもたらす新しいバイオマーカーを含む必要性を示した。
【００７２】
この目的のために、様々なバイオマーカーを含有するパネルの評価を行った。ＡＦＰ、フコシル化低分子量（ＬＭＷ）キニノーゲン、フコシル化Ａ１ＡＴ、年齢、および性別の組合せは、０．９４０５のＡＵＲＯＣをもたらした。ＡＳＴおよびＡＬＫの追加はＡＵＲＯＣを０．９８３５に増加させた。フコシル化Ａ１ＡＴの除外は、ＡＵＲＯＣを０．９８２６へとやや減少させた。フコシル化ＬＭＷキニノーゲン、ＡＦＰ、ＡＳＴ、ＡＬＫ、年齢および性別からなるこの後者の最小のパネルは、下記のアルゴリズムＡをもたらし、図１Ａ〜１Ｃに示した患者サブセットデータ（早期およびＡＦＰ陰性疾患による）の生成に用いた。
【数１】
2019512091.tif 000003
【００７３】
図１Ａ〜１Ｃは、フコシル化低分子量キニノーゲン、アルファ−フェトプロテイン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＫ）、年齢、および性別からなるパネルの評価の結果を示す。パネルは、ＨＣＣおよび肝硬変患者の３つの異なるコホートの１つの中で評価した。３つの患者のコホートはそれぞれ以下の表１に記載した特徴を有した。
【表１】
2019512091.tif 000004
図１のデータを生成するために使用した集団において、ＨＣＣの病因は、６１％ＨＣＶ、６％ＨＢＶ、および３３％その他であり、肝硬変の病因は、４８％ＨＣＶ、１０％ＨＢＶ、および４２％その他であった。図１Ａは、肝硬変の全ての患者（Ｎ＝９３）からＨＣＣの全ての患者（Ｎ＝１１５）；肝硬変（Ｎ＝９３）から早期のＨＣＣ（Ｎ＝６９）；ＡＦＰ陰性肝硬変（Ｎ＝８４）からＡＦＰ陰性ＨＣＣ（Ｎ＝３９）；ならびにＡＦＰ陰性肝硬変（Ｎ＝８４）から早期およびＡＦＰ陰性ＨＣＣ（Ｎ＝２９）の両方を識別する受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）のデータを要約する。９５％信頼区間（ＣＩ）は全ての場合においてオーバーラップしなかった。図１Ｂは、同じ試験における同じそれぞれの患者群の識別のための９０％特異性カットオフでの感度値を要約し、図１Ｃは、同じ試験における同じそれぞれの患者群の識別のための９５％特異性カットオフでの感度値を要約する。
【００７４】
上記のように、開発したモデルへのＡＳＴおよびＡＬＫの組み入れは、ＡＵＣを０．９４０５から０．９８３５に増加させた。これら２つの臨床的変数の組み入れは、フコシル化バイオマーカーの１つ、この場合フコシル化Ａ１ＡＴを含める必要性を予想外に相殺し、ＡＳＴおよびＡＬＫを方程式に加え、フコシル化Ａ１ＡＴをアルゴリズムから外した場合、ＡＵＣは０．９８２６のままであり、高い予測性の基本モデルは、年齢、性別、キニノーゲン、ＡＬＫ、およびＡＳＴを組み入れることを示唆した。
【００７５】
以前の研究は、肝細胞癌の非常に良い個々の指標としてフコシル化フェチュイン−Ａおよびフコシル化ヘモペキシンを同定した（Comunale,  MAら、J.  Proteome  Res.２００９年；８巻；５９５〜６０２頁）。これらの個々のフコシル化バイオマーカーの、年齢、性別、およびＡＦＰ（ｌｏｇ）も含むパネルへの寄与に関してアセスメントを実施した。下記に示すアルゴリズムＢは、フコシル化フェチュイン−Ａおよびフコシル化ヘモペキシンを含むパネルを試験するために用いた：
【数２】
2019512091.tif 000005
【００７６】
さらなるアルゴリズムを使用して、同じパネルメンバー（パネル４、下記の表２に示す）の分離試験を実施し、０．８４６１のＡＵＣを算出した。ヘモペキシンをキニノーゲン（表２中パネル５ｂ）により置き換えた場合、ＡＵＣは０．８６６１に増加した。
【００７７】
年齢、アルファフェトプロテイン、および他の指定されたバイオマーカーを含むパネルのアセスメントの結果の要約を下記の表２に提供する。
【表２】
2019512091.tif 000006
【００７８】
下記の表３Ａおよび３Ｂは、以下の患者のパネルＮｏ．１による識別（上記表２に示したように）のため、示した固定特異性および陽性（ＬＲ＋）と陰性（ＬＲ−）の尤度比でのＡＵＲＯＣ（９５％信頼区間）、感度（９５％信頼区間）を提供する：（１）肝硬変（Ｎ＝９３）からＨＣＣ（Ｎ＝１１５）；（２）肝硬変（Ｎ＝９３）から早期のＨＣＣ（ＵＮＯＳ  Ｔ１／２；Ｎ＝６９）；（３）ＡＦＰ陰性肝硬変（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝８４）からＡＦＰ陰性ＨＣＣ（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝３９）；および（４）ＡＦＰ陰性肝硬変（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝８４）から早期（ＵＮＯＳ  Ｔ１／２）とＡＦＰ陰性ＨＣＣ（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝２９）。［ＨＣＣ病因（％）＝ＨＣＶ（６１）；ＨＢＶ（６）；その他（３３）；ＨＣＣ性別（Ｍ／Ｆ％）＝７３／２７；肝硬変病因（％）＝ＨＣＶ（４８）；ＨＢＶ（１０）；その他（４２）；肝硬変性別（Ｍ／Ｆ％）＝５１／４９］。これらのデータは、直接アルゴリズムＡから得られたＨＣＣパネルスコア（Ｐ値）を使用して得た。
【表３Ａ】
2019512091.tif 000007
【表３Ｂ】
2019512091.tif 000008
【００７９】
下記の表４Ａおよび４Ｂは、以下の患者のパネルＮｏ．１１による識別（上記表２に示したように）のため、示した固定特異性でＡＵＲＯＣ（９５％信頼区間）および感度（９５％信頼区間）を提供する：（１）肝硬変（Ｎ＝９３）からＨＣＣ（Ｎ＝１１５）；（２）肝硬変（Ｎ＝９３）から早期のＨＣＣ（ＵＮＯＳ  Ｔ１／２；Ｎ＝６９）；（３）ＡＦＰ陰性肝硬変（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝８４）からＡＦＰ陰性ＨＣＣ（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝３９）；および（４）ＡＦＰ陰性肝硬変（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝８４）から早期（ＵＮＯＳ  Ｔ１／２）とＡＦＰ陰性ＨＣＣ（＜２０ｎｇ／ｍＬ；Ｎ＝２９）。［ＨＣＣ病因（％）＝ＨＣＶ（６１）；ＨＢＶ（６）；その他（３３）；ＨＣＣ性別（Ｍ／Ｆ％）＝７３／２７；肝硬変病因（％）＝ＨＣＶ（４８）；ＨＢＶ（１０）；その他（４２）；肝硬変性別（Ｍ／Ｆ％）＝５１／４９］。これらのデータは、アルゴリズムＡ（ＡＳＴ値はＡＬＴ値によって置き換えたこと以外）および３分割交差検証を使用して得た。
【表４Ａ】
2019512091.tif 000009
【表４Ｂ】
2019512091.tif 000010
【００８０】
全体としてデータをよく調べると、最も高い性能を示すパネルに寄与する変数が、個体ベースでの肝細胞癌の指標としては最も小さい効果を示すものである傾向があることは、予想外であった。例えば、ヘモペキシンは単独で使用した場合最も高いＡＵＣ値を得（患者セットｂで０．８６９５）、Ａ１ＡＴ（患者セットａ）、ＡＦＰ（患者セットａ）、およびキニノーゲン（患者セットａ）は単独で使用した場合最も低いＡＵＣ値を得たが（それぞれ０．７３９５、０．８３４６および０．８１９２）、後者はヘモペキシンを含有するパネルよりも高い性能のパネルに寄与した。肝細胞癌の存在を決定するためのバイオマーカーの個々の能力に基づくパネルへの特定のバイオマーカーの寄与を予測することはできないことが、これらのデータから分かった。
【００８１】
データはまた、早期の肝細胞細胞癌、ＡＦＰ陰性肝細胞細胞癌、およびＡＦＰ陰性肝細胞細胞癌でもある早期の肝細胞細胞癌の検出を可能にする試験したパネルの能力も明らかにする。
【００８２】
（実施例２）
アッセイ夾雑物としてのＩｇＧおよびＩｇＭの同定
肝細胞癌の検出のためのプレートベースアッセイは、従来、異好抗体および潜在的に他のレクチン結合夾雑物の存在によって妨害されてきた。そのような夾雑物は、偽陽性の結果をもたらすことが公知である。肝硬変および肝臓がんを有する被験体の血清に存在する夾雑するレクチン反応性因子を同定するために、研究が着手された。下に記載したように、本発明者らは夾雑するレクチン反応性因子としてＩｇＭを同定し、レクチン−ＥＬＩＳＡの前に血清からＩｇＭを除去した場合、特定のタンパク質に関連する、レクチン反応性シグナルが検出できた。この方法は、２つの独立した試料セットで使用し、方法を検証し、肝細胞癌のバイオマーカーとしてのフコシル化糖型の性能も検証した。
【００８３】
方法
血清試料は、患者集団の人口統計学および臨床情報のため、各試験被験体の血液から得た。ＨＣＣの継続患者、ならびにＨＣＣ患者と年齢、性別、および人種／民族性が一致する肝硬変の患者が研究に登録された。ＨＣＣの診断は、全てのＴ１病変を含む病理組織によってなされ、病理組織が入手できない場合、＞２ｃｍに拡大した血管塊（vascular  enhancing  mass）を示す２つの画像モダリティ（超音波、磁気共鳴画像法、またはコンピュータ断層撮影）によってなされた。肝硬変の診断は、肝臓の組織学または、肝臓の代償不全もしくは門脈圧亢進症の臨床的、検査室のおよび画像証拠に基づいていた。肝硬変を有する各患者は、正常な超音波を有し、血清のＡＦＰが上昇した場合、登録前３カ月以内の肝臓のＭＲＩ、および登録後６カ月の別のＭＲＩによって、肝臓の塊は示されなかった。肝硬変対照は、登録後中央値で１２カ月間（範囲：７〜１８カ月）追跡調査され、ＨＣＣを発症した対照はいなかった。腫瘍ステージは、ＨＣＣの全米臓器配分ネットワーク−修正ＴＮＭ病期分類システムを使用して決定した。早期のＨＣＣはＴ１（直径が＜２ｃｍの単一病変）およびＴ２（直径２ｃｍと５ｃｍの間の単一病変；または各直径＜３ｃｍの＜３の病変）病変と定義され、それらは米国の肝臓移植の判定基準に適合した。各被験体から２０ｍｌの血液試料を採血し、スピンし、分割し、得られた血清を試験まで−８０℃で保存した。血液試料は、ＨＣＣ処置の開始前に採血した。ＡＦＰは、増強した化学発光を利用する市販のイムノアッセイを使用して試験した。
【００８４】
レクチンＦＬＩＳＡ
簡単に言うと、捕捉抗体（マウス抗ヒトＡＡＴまたはウサギ抗フェチュイン、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）のフコシル化を除去するため、抗体を１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムと４℃で１時間インキュベートした。等容量のエチレングリコールを添加し、酸化抗体を炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５で１０μｇ／ｍＬの濃度にした。抗体（５μｇ／ウェル）をプレートに添加し、インキュベーション後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ  ７．４で洗浄し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで終夜ブロッキングした。分析のため、５μｌの血清を９５μｌのＨｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｔｕｂｅ（商標）（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔｅｅ、ＣＡ）中で希釈し、室温で１時間インキュベートした。続いて、試料を２時間プレートに添加し、フコシル化タンパク質がビオチンコンジュゲートＡｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ（ＡＡＬ）レクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によって検出される前に、レクチンインキュベーション緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄した。結合レクチンはＩＲＤｙｅ（商標）８００コンジュゲートストレプトアビジンを使用して検出し、シグナル強度はＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して測定した。全ての場合において、シグナル強度を市販のヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって検出されたシグナルと比較した。レクチン−ＦＬＩＳＡは、各患者試料からの等量の捕捉分子上に存在するフコシル化の量を検出し、任意の所与の患者のタンパク質の総量とは無関係に行われることに留意する。
【００８５】
夾雑因子のプロテオーム同定
レクチン−ウェスタン
血清は、プロテインＡ／Ｇコートしたアガロースビーズを使用してＩｇＧを枯渇させ、モノクローナル抗Ａ１ＡＴ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）によってコートした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してＡ１ＡＴを免疫沈降した。続いて、Ａ１ＡＴを溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。フコシル化Ａ１ＡＴを、ビオチンコンジュゲートＡｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａレクチン（ＡＡＬ）を使用して検出した。結合ＡＡＬは、ＩＲＤｙｅ（商標）８００コンジュゲートストレプトアビジンを使用して可視化し、シグナル強度はＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を使用して測定した。続いて、Ａ１ＡＴをポリクローナル抗Ａ１ＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して検出し、結合抗体はＩＲＤｙｅ（商標）７００コンジュゲート抗ウサギ抗体を使用して検出した。
【００８６】
肝硬変を有する２０人、肝硬変とＨＣＣを有する２０人の、４０人の患者の少ない試料セットの以前の分析では、レクチン−ＥＬＩＳＡの方法は、所与のタンパク質の変化したフコシル化を特異的に検出することはできなかった。例えば、レクチンＥＬＩＳＡを、フコシル化アルファ−１−抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）に行った。この方法では、その本来のフコシル化を除去するように改変されたＡ１ＡＴに対する抗体を９６ウェルプレートの底にコートする。プロテインＡ／Ｇを使用してＩｇＧを枯渇した血清を添加し、捕捉Ａ１ＡＴのフコシル化レベルを、組換えＡｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａレクチン（ＡＡＬ）を使用して検出する。ＨＣＣ血清を使用してそのようなアッセイを行った場合、レクチン反応性シグナルが観察される。しかしながら、非フコシル化Ａ１ＡＴが捕捉抗体に結合した場合でさえも、非フコシル化Ａ１ＡＴを使用してこのシグナルと競合することはできなかった。さらに、ＡＦＰ陰性患者でのＡＦＰなど、非特異的抗体の使用は、同じ非特異的シグナルをもたらした。分析前の試料のトリプシン消化により、シグナルがタンパク質ベースであることを確認した。
【００８７】
潜在的な夾雑物としてのＩｇＭの同定
血清中に見出される非特異的レクチン反応性物質を同定するため、Ａ１ＡＴについてのレクチンＥＬＩＳＡを９６ウェルプレート中で行った。通常のレクチンＥＬＩＳＡと同一の条件を使用して、プレートを、血清を含んでインキュベートしたが、レクチンを添加する前に、試料はＳＤＳ溶解緩衝液と共にインキュベートし、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコロイド状クマシーブリリアントブルー染色によるフコース結合レクチンでのレクチンブロッティング、またはヒトＡ１ＡＴの存在についてブロッティングによって調べた。強いレクチン染色は、約８０ｋＤのバンドで観察され、弱いバンドは５０ｋＤで観察された。５０ｋＤのバンドは、続くコロイド状クマシーブリリアントブルーによる染色およびＡ１ＡＴ抗体による染色でも観察されたが、約８０ｋＤのバンドはコロイド状クマシーブリリアントブルーまたはＡ１ＡＴレクチンブロッティングのいずれによる染色でも観察されなかった。このことは、これらの試料中の非特異的レクチン反応性物質が、高度にフコシル化された８０ｋＤの糖タンパク質であることを示唆した。続いて、同様に処置したウェルをＥＬＩＳＡ捕捉後に回収し、トリプシンによる消化後にプロテオミクスにより調べた。これらの試料で同定した糖タンパク質のリストを下記の表５に示し、レクチンブロッティングで観察されたものにサイズが似ている２つの主なタンパク質：補体ＢおよびＩｇＭ重鎖、が観察された。
【表５−１】
2019512091.tif 000011
【表５−２】
2019512091.tif 000012
【００８８】
続いて、上記と同じレクチンＥＬＩＳＡ実験を、抗補体Ｂ抗体および抗ＩｇＭ抗体で繰り返した。抗補体Ｂ抗体による捕捉物質の染色はなかったが、免疫ブロッティングは、これらの試料中で見出される８０ｋＤのレクチン反応性物質がＩｇＭ重鎖であることを示した。８０ｋＤのバンドは、ＩｇＭ分子全体を示すＩｇＭ重鎖を表す。合計で、１つのＩｇＭ分子につき１０個の重鎖がある。
【００８９】
血清試料から天然のＩｇＭを除去するために、レクチン−ＥＬＩＳＡ分析の前に血清からこの物質を除去する方法が開発された。まず、プロテインＬを使用したが、不十分な結果をもたらした。続いて、血清を２０μｌのＰｉｅｒｃｅ（商標）プロテインＡ／Ｇ  Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と１時間インキュベートするステップの後に、レクチンＥＬＩＳＡの前に血清からＩｇＧとＩｇＭの両方を除去するための１００ｋＤのスピンフィルター中での混合物の濾過を含む方法を使用した。この方法を使用した場合、免疫ブロッティングまたはレクチンブロッティングの両方によって決定されたように、ＩｇＧおよびＩｇＭが血清から効率的に除去された。続いて、この方法を使用するＩｇＭおよびＩｇＧの除去後、非フコシル化Ａ１ＡＴを使用してレクチン反応性Ａ１ＡＴシグナルをブロックすることができ、ＩｇＧおよびＩｇＭの存在がこれらの試料で観察される夾雑するシグナルの原因となるという発見を実証した。
【００９０】
Ａ１ＡＴのフコシル化糖型の分析に使用されるこの方法の能力を、レクチン−ＥＬＩＳＡ方法が以前に失敗している少ない試料セットを使用して調べた。このセットは、肝硬変を有する２０人の患者および肝硬変が背景にあるＨＣＣを有する２０人の患者からなった。重要なことに、このセットでは、レクチン反応性Ａ１ＡＴを示すレクチン−ウェスタンのデータが決定され、レクチン−ＥＬＩＳＡのゴールドスタンダードとして役割を果たし（Comunale,  MAら、Proteomics  Clin.  Appl.２０１３年；７巻；６９０〜７００頁）、濾過有りおよび濾過無しでのレクチン−ＥＬＩＳＡの性能の比較を可能にした。非濾過方法を使用して、肝硬変試料の平均値は３．２（±２．０）であり、ＨＣＣ試料は２．９（±１．８）であった。これらの試料中のレクチン反応性シグナル間に統計的な差はない（ｐ＝０．７４）。このアッセイのＡＵＲＯＣは、０．５７８であった。これに対して、本発明の濾過方法を使用すると、レクチンＥＬＩＳＡは、肝硬変試料では平均値１．４（±０．７５）およびＨＣＣ試料では２．４（±１．１）を生じる。この差は、統計的な差であった（ｐ＝０．００１６）。濾過前と濾過後で試料を比較した場合、濾過前と濾過後の肝硬変試料間では統計的な差があったが（ｐ＝０．０００５）、濾過前と濾過後のＨＣＣ試料間では統計的な差がなかった（ｐ＝０．５２４９）。
【００９１】
濾過後のＨＣＣと肝硬変試料間の比較のＡＵＲＯＣは０．７８８であり、これはレクチン−ウェスタンによって観察されたものとほぼ同一であった（Comunaleら、２０１３年）。重要なことに、濾過後のレクチン−ウェスタンとレクチン−ＥＬＩＳＡの間には高度な相関性があった。重要なことに、濾過後のレクチン−ＥＬＩＳＡに陽性な全ての試料は、レクチン−ウェスタンによって陽性を示し、濾過後のレクチン−ＥＬＩＳＡによって陰性を示した全ての試料は、レクチン−ウェスタンによって陰性を示した。
【００９２】
このアッセイを続いて使用して、８０個の独立した試料のフコシル化アルファ−１抗トリプシンおよびフコシル化キニノーゲンの存在についてアセスメントを行った。試料は、濾過レクチン−ＥＬＩＳＡおよび非濾過レクチン−ＥＬＩＳＡを使用して調べた。非濾過分析は、ＨＣＣと対照試料の間に差をもたらさなかったが、濾過分析は統計的に有意な差をもたらした。
【００９３】
ＩｇＧおよびＩｇＭ夾雑物の除去のための代替え手順
ＩｇＧおよびＩｇＭを除去するために代替えの方法が開発され、それにより血清をＰＥＧ−８０００とインキュベートし、遠心分離し、上清をレクチンＥＬＩＳＡでアッセイした。例えば、フコシル化Ａ１ＡＴまたはフコシル化フェチュインＡの分析のため、２μＬの血清を８μＬ  ＰＢＳに添加し、続いて６μＬの４０％ＰＥＧ−８０００水溶液を最終ＰＥＧ−８０００濃度が１５％になるように添加した。試料は、１０〜２０回ピペットに試料を吸い上げ、ピペットから試料を排出し、次いで短くボルテックスすることによって混合した。次に、試料は振盪機上で、３０分間１０００〜１５００ｒｐｍでインキュベートし、次いで緩やかに振盪しながら４℃で終夜、インキュベーションを続けた。翌朝、試料は４℃、１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、レクチンＥＬＩＳＡの前に上清を素早く新しいチューブに移した。ＩｇＧおよびＩｇＭの除去の効果は、例えば免疫ブロッティングによるまたはレクチンブロッティングによる、免疫グロブリンを除去する元来の手順に関して、同様の方法論を使用して確認した。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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