(57)【要約】【課題】ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達を効果的に抑制し、同時に抗血管新生療法に対する耐性を軽減する。【解決手段】融合タンパク質であって、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）について、（ｉ）第１のアイソフォームと、（ｉｉ）第２のアイソフォームと、（ｉｉｉ）第１のアイソフォームと第２のアイソフォームとの間の二量化ドメインとを含む。第１のアイソフォーム及び第２のアイソフォームはＶＥＧＦ121及びＶＥＧＦ165から選択される。【選択図】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
血管内皮増殖因子（以下「ＶＥＧＦ」）のアイソフォームについて、
（ｉ）第１のアイソフォームと、
（ｉｉ）第２のアイソフォームと、
（ｉｉｉ）前記第１のアイソフォームと前記第２のアイソフォームとの間の二量化ドメインと、
を含み、
前記第１のアイソフォーム及び前記第２のアイソフォームはＶＥＧＦ121及びＶＥＧＦ165から選択される、融合タンパク質。
【請求項２】
前記二量化ドメインは２つのＦｃ領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記２つのＦｃ領域の間のリンカーを更に含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、
ＶＥＧＦ121、前記２つのＦｃ領域の一方、前記リンカー、前記２つのＦｃ領域の他方、及びＶＥＧＦ165を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、
ＶＥＧＦ165、前記２つのＦｃ領域の一方、前記リンカー、前記２つのＦｃ領域の他方、及びＶＥＧＦ121を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーは１５から３０のアミノ酸からなるフレキシブルリンカーである、請求項３から５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）nであり、ｎは３である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記Ｆｃ領域のそれぞれはヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ペプチドタグを更に含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチドタグはＣ末端６Ｘ−Ｈｉｓタグである、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は配列識別番号１１の配列と少なくとも９０％同じアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合タンパク質は配列識別番号１１の配列を有する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を備える宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１から１３の何れか一項に記載の融合タンパク質、及び、薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
被験体（ヒトを除く）のがんを治療する方法であって、請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む医薬組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２０１５年１２月３日出願の米国特許仮出願第６２／２６２，６３０号に基づく優先権を主張し、その内容の全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、ヘテロ二量体性の血管内皮増殖因子、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、血管増殖を推進する血管新生促進因子に関するバランス崩壊により誘発される腫瘍進行の間の限界率を制限するプロセスである。微環境におけるがん細胞は、酸素及び栄養素を供給する血管新生を利用する。よって、血管新生経路を標的に定めた物質は将来の抗がん剤として調べられてきた。最初の取り組みは主に、内皮及び腫瘍から派生する血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）／ＶＥＧＦＲ（血管内皮増殖因子受容体）のシグナル伝達を標的に定めることに集中した。ＶＥＧＦＲのシグナル伝達の小分子の阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａモノクローン抗体であるベバシズマブ（アバスチン）、２００４年にアメリカ食品医薬局に承認された最初のＶＥＧＦ−Ａを標的とする抗体等の様々な方法が、このシグナル伝達を単剤療法又は術後補助療法として抑制するよう設計されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、かなりの数の被験体が抗血管新生剤に反応しないか、又は迅速にそれらに対する耐性を生じる。腫瘍は、例えば別の血管新生促進のシグナル伝達の上方制御、通常の腫瘍周囲の血管の吸収、免疫細胞及び骨髄由来の血管新生促進細胞の形成による免疫学的監視の抑制、及び表現型の浸潤性の活性化等の適応反応を経由して、抗血管新生剤に対する耐性を生じ得る。これらの適用反応は、腫瘍血管の剪定及び血管新生の大規模な抑制から生じる腫瘍内の低酸素症により誘発される。
【０００５】
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達を効果的に抑制し、同時に抗血管新生療法に対する耐性を軽減することに対して大きな課題が残される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの態様において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）について、（ｉ）第１のアイソフォームと、（ｉｉ）第２のアイソフォームと、（ｉｉｉ）第１のアイソフォームと第２のアイソフォームとの間の二量化ドメインとを含む、融合タンパク質が提供される。
第１のアイソフォーム及び第２のアイソフォームはＶＥＧＦ121及びＶＥＧＦ165から選択される。ＶＥＧＦ121は、配列識別番号２の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％又は８５％）同じアミノ酸配列を有し得る。ＶＥＧＦ165は、配列識別番号４の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％又は８５％）同じアミノ酸配列を有し得る。
【０００７】
一実施形態において、二量化ドメインは、２つのＦｃ領域及び２つのＦｃ領域の間のリンカーを含む。リンカーは１５から３０のアミノ酸からなる柔軟なリンカーである。例えば、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）nであり、ｎは３、４、５又は６であり得る。
【０００８】
一実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＶＥＧＦ121、２つのＦｃ領域の一方、リンカー、２つのＦｃ領域の他方及びＶＥＧＦ165を含む。
他の実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＶＥＧＦ165、２つのＦｃ領域の一方、リンカー、２つのＦｃ領域の他方及びＶＥＧＦ121を含む。
【０００９】
融合タンパク質は配列識別番号１１の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％又は８５％）同じアミノ酸配列を有し得る。
【００１０】
他の態様において、本開示に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
一実施形態において、核酸配列は、配列識別番号１１の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％又は８５％）同じアミノ酸配列をコードする。
【００１１】
更に他の態様において、融合タンパク質及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、がんの治療、又は必要とする被験体の血管新生の抑制に使用され得る。
【００１２】
１つ又は複数の実施形態の詳細が添付の図面及び以下の説明に述べられる。実施形態の他の特徴、目的及び利点は説明及び図面、更に請求項から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＶＥＧＦアイソフォームの概略図である。
【図２】ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質の概略図である。
【図３】細胞増殖のＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の効果を示す一組のグラフである。合計で１×１０4の３Ｂ−１１セル（Ａ）及びＨＣＴ−１５セル（Ｂ）が、ＶＥＧＦ165（２２２ｐＭ）の存在下で融合タンパク質（４２、８３、１２５ｐＭ）を使用して処理された。細胞増殖がＣＣＫ−８キットにより測定された（ｔ検定、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。１：対照群、２：ＶＥＧＦ165、３：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２ｐＭ）、４：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（８３ｐＭ）、５：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（１２５ｐＭ）。
【図４】管形成に関するＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の効果を示す一組のグラフである。（Ａ）３Ｂ−１１（８×１０5）セルがマトリゲルに植菌され、ＶＥＧＦ165の存在下（２２２ｐＭ）でＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２、８３、１２５ｐＭ）を使用して処理された。管形成は、１００倍の倍率でランダムに選択された領域の、連結されたセルを数えることにより定量化された。１：対照群、２：ＶＥＧＦ165、３：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２ｐＭ）４：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（８３ｐＭ）、５：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（１２５ｐＭ）。（Ｂ）ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165プラスミドが３Ｂ−１１セルにトランスフェクトされた。管形成の分析は、３Ｂ−１１セルを使用して実行された。データは３つの独立した実験に基づき標準誤差として示される。１：対照群、２：ＶＥＧＦ165（２２２ｐＭ）、３：ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165プラスミド。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図５】３Ｂ−１１セル移動に関するＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の効果を示すグラフである。ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165プラスミドが３Ｂ−１１セルにトランスフェクトされた。セル移動はトランスフェクトされた３Ｂ−１１セルを使用して決定された。３Ｂ−１１セルのセル移動能力はＶＥＧＦ165（２２２ｐＭ）の存在下で高められたが、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165プラスミドの存在により抑制された。
【図６】ＨＣＴ−１５セル移動に関するＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165の効果を示す一組のグラフである。（Ａ）ＨＣＴ−１５セルが、トランズウェル（商標）パーミアブルインサートに植菌され、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質（４２、８３、１２５ｐＭ）を使用して、又はＶＥＧＦ165（２２２ｐＭ）の存在下で処理された。間隔の長さはトランズウェル（商標）パーミアブルインサートで分析された。未処理のＨＣＴ−１５セルが対照群として使用された。１：対照群、２：ＶＥＧＦ165、３：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２ｐＭ）、４：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（８３ｐＭ）、５：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（１２５ｐＭ）。（Ｂ）ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165プラスミドがＨＣＴ−１５セルにトランスフェクトされた。セル移動はトランスフェクトされたＨＣＴ−１５セルを使用して決定された。ＨＣＴ−１５セルのセル移動能力はＶＥＧＦ165（２２２ｐＭ）の存在下で高められたが、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165プラスミドの存在により抑制された。ｔ検定、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、ｎ＝３。
【図７】セル浸潤に関するＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の効果を示すグラフである。ＨＣＴ−１５セルはＶＥＧＦ165（２２２ｐＭ）の存在下で異なる濃度のＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２、８３、１２５ｐＭ）を使用して処理された。セル浸潤はトランズウェルチャンバアッセイにより決定された。４８時間の移動の後、フィルタを通過したセルの数が、クリスタルバイオレットに染色した後に計数された（元の倍率４００倍）。１：対照群、２：ＶＥＧＦ165、３：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２ｐＭ）、４：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（８３ｐＭ）、５：ＶＥＧＦ165＋ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（１２５ｐＭ）。ｔ検定、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図８】異種移植腫瘍形成分析におけるＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の効果を示す一組のグラフである。ＨＣＴ−１５セルがヌードマウスの背面の脇腹に皮下注射された（マウスに付き１箇所）。注射されたマウスは腫瘍形成のため２日おきに調べられた。異なる濃度のＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質（１０、５０、又は２５０ｎｇ／ｍｌ）又はリン酸緩衝生理食塩水の対照群がマウスの腫瘍に直接注射された。（Ａ）注射されたマウスの体重が監視された。（Ｂ）腫瘍の体積が、腫瘍体積＝１×ｗ2×０．５２の公式を使用して、６インチダイアルのキャリパーにより測定された長さと幅から推定された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
驚くべきことに、２つの異なるＶＥＧＦアイソフォームからなるヘテロ二量体性の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が、ＶＥＧＦ165ホモ二量体と傍分泌及び自己分泌の方法で競合することを通して、内皮及びがん細胞の増殖、移動、浸潤及び管形成を減少させたことが発見された。
【００１５】
よって、本明細書に記載されるのは二量化ドメインによりリンクされたアイソフォームＶＥＧＦ121及びアイソフォームＶＥＧＦ165を含む融合ＶＥＧＦタンパク質である。
【００１６】
ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は８つのエクソンを含み、それらは選択的スプライスによる異形、即ち、ＶＥＧＦ121、ＶＥＧＦ145、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ183、ＶＥＧＦ189、ＶＥＧＦ206を生じ得る。図１を参照。
【００１７】
ＶＥＧＦ121は、ヘパリン結合領域の無い、自由に溶解できる弱酸性のポリペプチドである。ＶＥＧＦ121の核酸配列（配列識別番号：１）及びそれがコードするアミノ酸配列（配列識別番号：２）がここに提供される。配列識別番号２の配列は、ＶＥＧＦ121の成熟形態に存在しないＮ末端シグナルペプチドを含む。
【００１８】
ＶＥＧＦ165は、塩基性アミノ酸、及びＶＥＧＦ受容体を結合してシグナル伝達を誘発し内皮の細胞増殖を促すヘパリン結合領域を含む。ＶＥＧＦ165核酸配列（配列識別番号：３）及びそれがコードするアミノ酸配列（配列識別番号：４）がここに提供される。配列識別番号４の配列は、ＶＥＧＦ165の成熟形態に存在しないＮ末端シグナルペプチドを含む。
【００１９】
融合ＶＥＧＦは更に、融合ＶＥＧＦがヘテロ二量体を形成するような２つのＶＥＧＦアイソフォーム間に配置された二量化ドメインを含む。一実施形態において、二量化ドメインはリンカーにより結び付けられた２つのＦｃ領域からなる。Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域であり得る。例えば、Ｆｃ領域は、配列識別番号５の核酸配列によりコードされる配列識別番号６のアミノ酸配列を有し得る。
【００２０】
２つのＦｃ領域間のリンカーは業界に知られた任意の柔軟なリンカーであっても良い。リンカーは１５及び３０のアミノ酸を有し得る。柔軟なリンカーはグリシン及びセリンに富むリンカーであり得る。例えば、リンカーは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）n（配列識別番号７）、ｎは整数（例えば１、２、３、４，５、６、７又は８）であっても良い。
【００２１】
融合タンパク質は更に、Ｎ末端のシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドはＶＥＧＦアイソフォームに対し内因性のシグナルペプチドであっても良い。例えば、シグナルペプチドは配列識別番号９の配列（配列識別番号８の核酸配列によりコードされる）を有していても良い。融合タンパク質内のＣ末端ＶＥＧＦアイソフォームはシグナルペプチドを有しても、有さなくても良い。
【００２２】
更に、融合タンパク質は、融合タンパク質の分離又は識別を容易にするＣ末端タグを含み得る。そのようなタグはポリヒスチジンタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５又はＦＬＡＧタグを含み得る。
【００２３】
融合タンパク質はＮ末端からＣ末端の方向へ、ＶＥＧＦ165、Ｆｃ領域、リンカー、Ｆｃ領域及びＶＥＧＦ121を含み得る。或いは、融合タンパク質はＮ末端からＣ末端の方向へ、ＶＥＧＦ121、Ｆｃ領域、リンカー、Ｆｃ領域及びＶＥＧＦ165を含み得る。各アイソフォームは、２つのＦｃ領域間のリンカーと異なる又は同一であり得るリンカーを介して直接又は間接的にＦｃ領域に結合され得る。一実施形態において、融合タンパク質は、配列識別番号１０の配列によりコードされる配列識別番号１１の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％又は８５％）同じアミノ酸配列を有する。
【００２４】
例えば組み換え技術のような従来の方法が融合タンパク質を作製するのに使用され得る。例えば、タンパク質をコードする発現構築物が生成され、適切な宿主細胞（例えば哺乳類細胞）に導入され得る。宿主細胞で発現された融合タンパク質はその後、分離され得る。
【００２５】
融合タンパク質は薬学的に許容可能なキャリアと混合され、医薬組成物を形成し得る。組成物はがんの治療又は血管新生の抑制を必要とする被験体に投与され得る。融合タンパク質は他のがん治療を使用する併用療法にも使用され得る。
【００２６】
融合タンパク質は、融合タンパク質を腫瘍及び／又はそれらの関連する血管系へ向けるよう設計された部分構造（例えば脂質、炭水化物、ポリマー又はナノ粒子）に共役されるか、又はカプセル化されても良い。
【００２７】
組成物は、リン酸緩衝食塩水、重炭酸塩溶液、及び／又は補助剤等の薬学的に許容可能なキャリアと共に形成され得る。適切な薬学キャリア及び希釈剤、並びにそれらの使用への薬学的必需品が業界に知られている。この組成物は注射可能な溶液、乳液、又は他の適切な剤形として調合されても良い。
【００２８】
補助剤の例は、これらに限らないが、ミョウバン沈降物、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリルリピドＡ／トレハロースジコリノミコラートアジュバント、コリネバクテリウム−パルヴム及び転移ＲＮＡを含む油中水型乳剤、及びリポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原用分子ケージ、菌細胞壁の要素、及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ等の細胞内に取り込まれた核酸を含む特定の組の進化的に保存された分子を模倣することにより免疫反応を増加するというタスクを達成する他の物質を含む。他の例はコレラ毒素、大腸菌易熱性エンテロトキシン、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、免疫活性化配列オリゴデオキシヌクレオチド及び水酸化アルミニウムを含む。組成物は又、生体内の移動を容易にするポリマーを含み得る。
【００２９】
上記に記載した組成物の有効量は、例えば皮下注射、静脈注射又は筋肉注射等の非経口で投与されても良い。他の投与の方法が使用されても良い。熟練の医師は適切な分量及び投与方法を決定出来るであろう。
【００３０】
融合タンパク質を使用して治療され得るがんは、グリア芽腫、大腸がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、腎臓がん、神経内分泌腫瘍、乳がん、食道がん、消化管間質腫瘍、黒色腫、卵巣がん、子宮頸がん、すい臓がん、前立腺がん、胃がん及び頭頸部がん等の固形腫瘍を含む。
【００３１】
以下の特定の実施例は単に例示として理解されるが、如何なる方法でも残りの開示を制限するものではない。更なる詳細な説明なしに、当業者は、本明細書の記載に基づき、本開示を最大限に利用可能であると考えられる。本明細書で引用された全ての文献の全体が、本明細書に参照として援用される。
【００３２】
［実施例］
私どもは、強力な抗血管新生モジュレータとしてヒトＩｇＧ１の２つのＦｃ領域と融合されるＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165の新規なキメラ二量体を生成した。キメラＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165組み換えタンパク質は３Ｂ−１１の内皮細胞の管形成を減少させ、ＨＣＴ−１５がん細胞の浸潤を抑制することが分かった。更に私どもは、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質が、がん細胞のＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を介したＶＥＧＦＲ２−ＨＩＦ−１αシグナル伝達を減衰させることが分かった。データが示すには、キメラＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質は血管新生及びＨＩＦ−１αシグナル伝達に拮抗し、抗血管新生治療に対する薬物耐性に効果があると示唆した。
【００３３】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質の構築及び特性評価＞
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165の融合は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ核酸配列をＶＥＧＦ121配列の３’末端及びＶＥＧＦ165配列の５’末端にそれぞれ融合することにより生成され、２つのＦｃ配列がリンカー配列により連結された。ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合核酸配列はｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングされ、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165の発現ベクターを産出する。最終構築物の完全性はＤＮＡ配列により確認された。推定されたタンパク質は推定上の２６−ａａシグナルペプチドを含む。図２を参照。
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合を含むプラスミド遺伝子は２９８Ｔ細胞株にトランスフェクトされた。ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質の発現及び分泌はウエスタンブロットにより確認された。
【００３４】
私どもはトランスフェクトされた２９３Ｔセルの培地及び細胞溶解液からのサンプルにおけるＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質のための１２０ｋＤａまでの単一バンドを発見した（データは示されない）。組み換えタンパク質ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165は、２９３ＴセルのＨｉｓタグ融合タンパク質として発現され、ニッケル親和クロマトグラフィーを使用して精製された。精製された融合タンパク質の純度及び分子量はウエスタンブロットにより決定された（データは示されない）。これらの結果は、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165がＩｇＧ１  Ｆｃフラグメント及びポリペプチドリンカーにより共有結合された二量体を形成したことを示した。
【００３５】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質はＶＥＧＦ165により誘発された細胞増殖を抑制した＞
内皮細胞増殖は初期の血管新生反応に必要であるため、私どもは、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質が、菅形成分析のための便利な内皮細胞モデルであるＶＥＧＦ165刺激性の３Ｂ−１１セルの増殖に影響したかどうかを調べた。ジョーら、メソッド、２００８年、第４４巻第２号、１９０から１９５頁を参照。
【００３６】
３Ｂ−１１のＶＥＧＦ165誘導性細胞増殖はＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165により濃度依存性の方法で阻止された。図３のパネルＡを参照。
３Ｂ−１１セル増殖に関する濃度２２２ｐＭのＶＥＧＦ165の効果は４２ｐＭの組み換えＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165により容易に抑制され、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質がＶＥＧＦ165誘導性増殖の活動を効果的に阻止出来たことを示唆する。更に、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質は、ＨＣＴ−１５がん細胞のＶＥＧＦ165誘導性増殖の抑制において同様の効力を示した。図３のパネルＢを参照。
【００３７】
私どもは又、抑制は統計的に有意ではなかったが（データは示されない）、融合遺伝子のプラスミドがこれらの細胞にトランスフェクトされた時、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165が、３Ｂ−１１及びＨＣＴ−１５セルの細胞増殖の自己分泌による抑制において同様の活性を示したことも分かった。この結果は、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165が細胞毒性ではなく、増殖の抑制により細胞数の増加を抑制することを示唆する。更に、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165はＨＣＴ−１５の細胞形質転換を自己分泌により抑制した（データは示されない）。私どもの結果は、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165組み換えタンパク質が、３Ｂ−１１の細胞増殖及び結腸がん細胞ＨＣＴ−１５の形質転換を自己分泌及び傍分泌で阻止できることを示す。
【００３８】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質はＶＥＧＦ165により誘発される管形成を抑制した＞
血管新生の後の段階は内皮細胞の形態学的変化を必要とし、それは管腔形成となる。私どもはＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の存在下で生体外の（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）管形成を調べた。生体外の管形成分析は、毛細管状の管のネットワークを形成した場合に３次元のコラーゲンゲルに浸潤するよう誘導された３Ｂ−１１内皮細胞を使用することにより採用された。ジョーら、メソッド、２００８年、第４４巻第２号、１９０から１９５頁を参照。
【００３９】
結果は、３Ｂ−１１セルが通常の条件下で管ネットワークを形成出来、ＶＥＧＦ165は管形成の数を増加することを示した。図４のパネルＡを参照。
しかし、３Ｂ−１１セルの管状構造形成の数は、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質を濃度依存性の方法で加えることにより抑制された。図４のパネルＡを参照。
更に、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質は、傍分泌（図４、Ａ）及び自己分泌（図４、Ｂ）でＶＥＧＦ165誘導性管形成を有意に抑制した。これらの結果は、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質はＶＥＧＦ165誘導性血管新生を生体外で抑制できることを示した。
【００４０】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質はセル移動を抑制した＞
セル移動は血管新生及び腫瘍転移における重要なプロセスである。私どもはセル移動がＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質により影響されたかどうかを調べた。セル移動はギャップクロージャー移行アッセイにより調べられた。一貫して、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質は３Ｂ−１１セルの移動を自己分泌で有意に抑制した。図５を参照。
【００４１】
それに加え、結果は、ＶＥＧＦ165により誘発されるＨＣＴ−１５のセル移動がＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質を濃度依存性の方法で加えることにより抑制されたことを示した。図６のパネルＡを参照。
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質は、傍分泌（図６、Ａ）及び自己分泌（図６、Ｂ）でセル移動を有意に抑制した。これらのデータは、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質が内皮細胞及び腫瘍細胞の移動を抑制できることを示唆した。
【００４２】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質は腫瘍浸潤を減じた＞
腫瘍細胞の転移のＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質の効果を有効にするため、私どもはトランズウェルアッセイを使用することにより細胞浸潤に関するタンパク質の効果を調べた。ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165が無いと、ＶＥＧＦ165は集中的な浸透により示されるように浸潤能力を誘発した。図７を参照。
しかし、ＶＥＧＦ165誘導性細胞浸潤は、ＨＣＴ−１５がん細胞の濃度依存性の方法でＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165を加えることにより抑制された。浸透された細胞の数は、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の濃度を高めて処理すると、ＶＥＧＦ165のみの場合と比べて有意に減少した。図７を参照。
これらの結果は、がん細胞の浸潤がＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の追加により著しく抑制され、がん転移を抑制するタンパク質の役割を示唆することを示した。
【００４３】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質はＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を介して自己分泌のＶＥＧＦＲ２−ＨＩＦ−１α−ＶＥＧＦ165／Ｌｏｎシグナル伝達を減衰させた＞
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165が抗血管新生治療に対する耐性を減ずるためのＨＩＦ−１αシグナル伝達を減衰させるかどうかをチェックするため、私どもは最初に腫瘍細胞におけるＶＥＧＦＲ２−ＨＩＦ−１α−ＶＥＧＦ165軸に関するＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165の効果を調べた。Ｌｏｎは低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）により上方制御され、がん細胞を低酸素環境に適応させる低酸素利用性に反応して含まれる。
【００４４】
私どもは融合タンパク質がＬｏｎプロテアーゼの発現に影響するかどうかを調べた。ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ165、及びＬｏｎの発現はウエスタンブロット分析により決定された。結果は、ＨＣＴ−１５がん細胞内のＶＥＧＦＲ２−ＨＩＦ−１α−ＶＥＧＦ165／Ｌｏｎシグナル伝達が、ＶＥＧＦ165処理及び塩化コバルト（ＣｏＣｌ2）により刺激された低酸素により活性化されたことを示した（データは示されない）。しかし、シグナル伝達の活性化は酸素正常状態及び低酸素状態下の濃度依存性の方法でＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165を加えることにより抑制された。
【００４５】
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165の組み換えタンパク質は、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ165、Ｌｏｎ及びＶＥＧＦ165及び／又は低酸素により誘発されたホスホＶＥＧＦＲ２の液位を下げた（データは示されない）。機械的に、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質は、抑制するＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を介してＶＥＧＦＲ２−ＨＩＦ−１α−ＶＥＧＦ165／Ｌｏｎシグナル伝達の活性化を抑制し（データは示されない）、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質が、低酸素下のＶＥＧＥＲ２−ＨＩＦ−１α−ＶＥＧＦ165／Ｌｏｎ軸へのＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲにより引き起こされる生き残り機構を克服したことを示唆した。これらのデータは、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165が、がん細胞のＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路を介して自己分泌のＶＥＦＧＲ２−ＨＩＦ−１α−ＶＥＧＦ165／Ｌｏｎシグナル伝達を抑制したことを示唆する。
【００４６】
＜ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165融合タンパク質は生体内の（ｉｎ  ｖｉｖｏ）腫瘍増殖を減じた＞
私どものデータは、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質が内皮細胞の管形成を停止させ、腫瘍細胞の増殖、移動及び生体内での浸潤に干渉し得ると示した。ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質の生体内での腫瘍に対する抑制効果を示すために異種移植腫瘍形成分析が行われた。分析にはＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６から８週間）が使用された。０．２ｍｌのマトリゲルに懸濁された１×１０6のＨＣＴ−１５セルがヌードマウスの背面の脇腹に皮下注射された（マウスに付き１箇所）。
マウスは腫瘍形成のため２日おきに調べられた。異なる濃度のＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165タンパク質（１０、５０、又は２５０ｎｇ／ｍｌ）又はリン酸緩衝生理食塩水の対照群がマウスの腫瘍に直接注射された。図８のパネルＢを参照。
マウスの体重が監視された。図８のパネルＡを参照。
マウスはその後二酸化炭素安楽死により犠牲になった。
【００４７】
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質で処理されたマウスの体重は大きく変化せず、タンパク質が動物に有毒でなかったことを示す。図８のパネルＡを参照。
キメラタンパク質は用量依存性の方法でマウスの腫瘍増殖を減じた。図８のパネルＢを参照。よって、研究によりＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165キメラタンパク質が生体内で腫瘍増殖を抑制できると示された。
【００４８】
＜材料及び方法＞
細胞株及び細胞培養：３Ｂ−１１セルはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（＃ＣＲＬ−２１６０、マナサス、バージニア、米国）から購入した。３Ｂ−１１セルはダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に保持され、ＨＣＴ−１５セルは、３７℃、５％二酸化炭素の加湿培養器において、１０％の（ｖ／ｖ）加熱不活性化したＦＢＳ（正規のウシ胎仔血清、インビトロジェン）及び１％のＰＳＡ（ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液、バイオロジカルインダストリーズ、ニューヨーク、米国）を付加したＲＰＭＩ−１６４０補足培地に保持された。
【００４９】
ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165組み換えタンパク質の精製：プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターヘルパーフリーシステム（バイオミクス）の取扱説明書に記載されたバイオミクストランスフェクション試薬を使用して、２９３Ｔセルにトランスフェクトされた。３６時間の培養の後、２９３Ｔセル培養の上澄みが集められ、取扱説明書に従い２５０ｍｍｏｌ／Ｌのイミダゾールで溶離したＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製した。組み換えタンパク質はマイクロコン遠心式フィルタユニット（ミリポア、ベドフォード、マサチューセッツ、米国）により濃縮された。最後に、精製されたタンパク質は１０％のポリアクリルアミド電気泳動及びウエスタンブロッティングにより確認された。
【００５０】
細胞増殖分析：３Ｂ−１１セル及びＨＣＴ−１５セルの増殖はＣＣＫ−８色素還元アッセイ（エンゾ、米国）を使用して評価された。３Ｂ−１１又はＨＣＴ−１５セルは異なる濃度のＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165（４２、８３、１２５ｐＭ）で３０分間前処理され、市販のＶＥＧＦ165が加えられ（２２２ｐＭ、アブカム、ケンブリッジ、マサチューセッツ、米国）、その後セルは２４時間培養された。処理の最後に、１０μｌのＣＣＫ−８溶液がプレートの各ウェルに加えられ、プレートは培養器で２から４時間培養された。プレートを１０秒振った後、セルの生存率が、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍの吸光度で測定することにより評価された。全ての測定は３回行われた。Ｔ検定が群を比較するために使用された。データは標準誤差として表される。
【００５１】
コロニー形成分析：クローン形成法は単一のセルがコロニーに増殖する能力に基づく生体外の（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）形質転換試験である。これを調べるため、ＶＥＧＦ121−ＶＥＧＦ165のプラスミドは１０ｃｍのディッシュ内で一晩、ＨＣＴ−１５にトランスフェクトされ、陽性対照としてＶＥＧＦ165組み換えタンパク質２２２ｐＭで処理された。翌日、処理されたＨＣＴ−１５セル（ウェルに付き１×１０3まで）は６ウェルプレートに蒔かれ、３７℃の培養器で培養された。１０％のＦＢＳを含む新鮮なＲＰＭＩ培地が４８時間ごとに加えられた。１４日目の最後に、セルは氷のように冷たいリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄され、メタノールで１０分間凝固され、１％のクリスタルバイオレットを使用してメタノール内で１５分間染色され、その後脱イオン水で洗浄された。５０個以上のセルのコロニーが２００倍の顕微鏡で得られ、計数された。
【００５２】
セル移動分析：セル移動分析はギャップクロージャーアッセイにより決定された。３Ｂ−１１セル又はＨＣＴ−１５セルが、異なる濃度（４２、８３、１２５ｐＭ）の組み換えタンパク質を使用して１６時間（３７℃、５％二酸化炭素）で処理された。これらのセルはトリプシン処理され、無血清ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁された。７０μｌの無血清ＤＭＥＭ又はＰＲＭＩ−１６４０内の合計８×１０5のセルが、培地の各ウェルに蒔かれ（ウェル当たり８×１０5セル）、３７℃、５％二酸化炭素で培養された。翌日、イビディ  カルチャーインサート（アプライドバイオフィジックス、米国）が消毒したピンセットによりそっと除去され、各ウェルは２ｍｌの０．１％ＦＢＳ培地で充填された。セル移動は顕微鏡で４８時間監視された。
【００５３】
菅形成分析：コーニングマトリゲル（登録商標）マトリックス（ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア、米国）溶液が一晩氷の上で解凍され、９６ウェルプレートの上で５０μｌの量の表面が覆われ、３７℃で１時間培養されて固化された。約８×１０5の３Ｂ−１１セルを含む１０％のＦＢＳ培地で補足された５０μｌのＤＭＥＭが、メッキされたマトリゲルマトリックスに蒔かれ、３７℃で培養された。これらのセルは前に記載された通りに処理された。分析は３回行われ、５%二酸化炭素、３７℃で培養された。毛細管状の構造の形成の画像が、２００倍の倍率のコンピュータを利用した顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を用いて２時間後に得られた。菅状構造は、２００倍の倍率でランダムに選択された領域の連結セルの数を手で数えることにより定量化された。ネットワーク形成の全部の菅の数が数えられた。
【００５４】
セル浸潤分析：セル浸潤は、マトリゲルで覆われたフィルタ膜（８μｍの細孔）を備えるトランズウェルチャンバ（コーニングコースター、ケンブリッジ、マサチューセッツ、米国）を使用して評価された。簡潔に言うと、フィルタは２００μｇ／ｍｌの基底膜タンパク質（マトリゲル、ＢＤバイオサイエンス、サンノゼ、カリフォルニア、米国）で予めコートされ、５％二酸化炭素、３７℃で一晩乾燥させた。ＦＢＳの無い培地のＨＣＴ−１５セル（８×１０5）は上部チャンバに蒔かれ、下部のウェルは１０％のＦＢＳ培地で充填された。３７℃で４８時間培養の後、インサートの上側の非移動性のセルは綿棒で取り除かれた。フィルタを通過したセルはメタノール内で凝固され、クリスタルバイオレットで染色された。顕微鏡検査下の写真の下方のランダムに選択された領域が計数された。
【００５５】
免疫ブロット法：ＨＣＴ−１５セルは、１０ｍｍのディッシュに、１０ｍｌの培地に１．５×１０6セルの密度で蒔かれ、酸素正常状態及び低酸素状態（塩化コバルト、塩化コバルト（ＩＩ）、１５０μＭ）で２４時間置かれ、前に記載したように処理された。合計のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイを使用して決定された。合計のタンパク質と同じ量が１０％のポリアクリルアミド電気泳動を使用して分解され、ポリフッ化ビニリデン膜にエレクトロブロッティングされた。膜は５％の無脂肪乳で閉鎖され、一次抗体を用いて４℃で一晩精査された。その後、膜は適切なＨＲＰ結合の二次抗体（ジーンテックス、新竹、台湾）で精査され、免疫活性バンドが、高められた化学発光法（バイオラッド、ハーキュリーズ、カリフォルニア、米国）を使用して可視化された。
【００５６】
この研究で使用した抗体は示されたように購入又は製造された。ヒトＬｏｎに対する抗体は前に記載したように製造された。ワンら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年、１０１巻１２号、２６１２から２６２０頁、及びチェンら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ＆Ｄｅｓｅａｓｅ、２０１３年、４号、ｅ６８１を参照。
【００５７】
ホスホ−ＰＩ３Ｋ（Ｔｙｒ４５８／Ｔｙｒ１９９、＃４２２８）、ホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、＃４０６０）及びホスホ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８、＃２９７１）抗体がセルシグナリングテクノロジー（ビバリー、マサチューセッツ、米国）から得られた。ＨＩＦ−１α（＃６１０９５８）抗体がＢＤバイオサイエンス（フランクリンレイクス、ニュージャージー）から得られた。ホスホ−ＶＥＧＦＲ２（Ｔｙｒ１０５４／Ｔｙｒ１０５９．ａｂ５４７３）、ＶＥＧＦ−１６５Ａ（ａｂ６９４７９）抗体がアブカム（ケンブリッジ、マサチューセッツ、米国）から得られた。ベータアクチン抗体がジーンテックス（ＧＴＸ１０９６３９、新竹、台湾）から得られた。
【００５８】
統計的手法：この研究において、パラメトリックであるスチューデントのｔ検定が、関連する状態の相違の重要性を判断するのに使用された。一般的に、＜０．０５のＰ値が統計学的に有意であると見なされる。（スチューデントのｔ検定、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。
【００５９】
（他の実施例）
本明細書に記載される特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされ得る。本明細書に開示された各特徴は同一、同等又は同様の目的に供する他の特徴に置き換えられても良い。よって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、単に一般的な、連続した同等の又は同様の特徴の例である。
【００６０】
上記の説明から、当業者は記載された実施形態の最も重要な特徴を容易に解明することが出来、それらの範囲及び精神から逸脱せずに、実施形態の様々な変更及び修正を行い、様々な用途及び状況に適応させることが出来る。よって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【図１】
2019500900.tif 000003
【図２】
2019500900.tif 000004
【図３】
2019500900.tif 000005
【図４】
2019500900.tif 000006
【図５】
2019500900.tif 000007
【図６】
2019500900.tif 000008
【図７】
2019500900.tif 000009
【図８】
2019500900.tif 000010
【配列表】
2019500900000001.app
【国際調査報告】
2019500900.tif 000011
2019500900.tif 000012
2019500900.tif 000013