(57)【要約】本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を単離する方法であって、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞上で発現される１つまたは複数の第１のマーカーについて５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を陰性選択し、それによってＨＶＰを単離する方法を提供する。本方法は、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される第２のマーカーの発現のための陽性選択をさらに含むことができる。第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性である単離されたＨＶＰの、クローン集団を含む大きな集団も提供される。心臓修復のためのまたは心機能を向上させるためのＨＶＰのインビボ使用の方法も提供される。試験化合物の心臓毒性スクリーニングのためのＨＶＰの使用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法であって、
心臓の心室前駆細胞を含む５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を、ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーと反応性の１つまたは複数の第１の作用物質と接触させること；および
第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つの前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシン、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培養物が、心筋前駆細胞の６日目の培養物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養物を、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーに反応性の１つまたは複数の第２の作用物質とさらに接触させ；
第２のマーカー反応性の陽性細胞を、非反応性細胞から分離する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触の前に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触の後に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触と同時に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の作用物質が、前記第１のマーカーに結合する抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の作用物質が、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９に結合する抗体である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＬＩＦＲである、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＪＡＧ１である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＦＺＤ４である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＦＧＦＲ３である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＴＮＦＳＦ９である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のマーカー非反応性の陰性細胞が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のマーカー非反応性の陰性細胞が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のマーカー反応性の陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のマーカー反応性の陽性細胞が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒト心臓の心室前駆細胞を、それらがＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養し、分化させる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、心筋前駆細胞を生成する条件下で培養して、５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を得ること；
５〜７日目の心筋前駆細胞の前記培養物を、ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーと反応性の１つまたは複数の第１の作用物質と接触させること；および
第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞を単離すること
を含む方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシン、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養物が、心筋前駆細胞の６日目の培養物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養物を、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーに反応性の１つまたは複数の第２の作用物質とさらに接触させ；
第２のマーカー反応性の陽性細胞を、非反応性細胞から分離する、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触の前に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触の後に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触と同時に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の作用物質が、前記第１のマーカーに結合する抗体である、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の作用物質が、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９に結合する抗体である、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＬＩＦＲである、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカー、ＪＡＧ１である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＦＺＤ４である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＦＧＦＲ３である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０であり、前記第２のマーカーが、ＴＮＦＳＦ９である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のマーカー非反応性の陰性細胞が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のマーカー非反応性の陰性細胞が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される、請求項２１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２のマーカー反応性の陽性細胞が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２のマーカー反応性の陽性細胞が、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒト心臓の心室前駆細胞を、それらがＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養し、分化させる、請求項２１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団を得る方法であって、
単一のヒト心臓の心室前駆細胞を単離することであって、単一の前記ヒト心臓の心室前駆細胞が、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、単離すること；ならびに
前記第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞を、前記細胞が少なくとも１×１０９細胞に拡大し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団が得られるような条件下で培養すること
を含む方法。
【請求項４２】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記単一の前記ヒト心臓の心室前駆細胞が、心臓前駆体培養（ＣＰＣ）培地で培養される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記単一の前記ヒト心臓の心室前駆細胞が、心室分化に偏るような条件下で培養される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記単一の前記ヒト心臓の心室前駆細胞が、少なくとも１０×１０９細胞に拡大される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法によって得られる少なくとも１×１０９個のヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）のクローン集団。
【請求項４８】
少なくとも１×１０６個の精製されたヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）の単離された集団であって、ＨＰＶの前記集団は：（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、集団。
【請求項４９】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０である、請求項４８に記載の単離された集団。
【請求項５０】
前記第１のマーカーが、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される、請求項４８に記載の単離された集団。
【請求項５１】
対象において心機能を増強する方法であって、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のＨＶＰの集団を含む医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項５２】
ＨＶＰの前記集団が、前記対象の心臓に直接的に投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
クローン集団が、前記対象の前記心臓の心室領域に直接的に投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記医薬組成物が、２次元または３次元のマトリックス上に製剤化されたＨＶＰの前記集団を含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、心筋梗塞を患っている、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、先天性の心臓障害を有する、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ヒト心室組織を生成するための方法であって、
非ヒト動物の器官にヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を移植することであって、前記ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、移植すること；ならびに
ヒト心室組織が生成されるように前記ＨＶＰをインビボで成長させること
を含む方法。
【請求項５８】
前記非ヒト動物が、免疫不全マウスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記器官が、腎臓または心臓である、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
以下の細胞マーカーパターン：（ｉ）心臓中胚葉形成のピークの後；（ｉｉ）ピークのＩｓｌｅｔ−１発現のとき；（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピークの前；（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１のピーク発現の前；および（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現の前のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つが存在するときに、前記ＨＶＰが移植される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の５日目と７日目の間（両端を含む）に移植される、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の６日目に移植される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
試験化合物の心臓毒性についてスクリーニングする方法であって、
ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を提供することであって、前記ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、提供すること；
前記ＨＶＰを前記試験化合物と接触させること；ならびに
前記ＨＶＰへの前記試験化合物の毒性を測定すること
を含み、
前記ＨＶＰへの前記試験化合物の毒性は、前記試験化合物の心臓毒性を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１１月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／４２７，５６９号に基づく優先権を主張しており、前述の出願の内容は、参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
主に心筋梗塞により引き起こされる心不全は、世界中で成人と小児の両方における主要な死因であり、世界中で急激に増加している（Ｂｕｉ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８：３０−４１）。疾患は、心筋損傷中に生じる心室筋の喪失により主にもたらされ（Ｌｉｎ，Ｚ．ａｎｄ  Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．（２０１４）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２３９ｒｖ１）、成人の心臓が再生反応を開始するごくわずかな能力により悪化する（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：９８−１０２；Ｓｅｎｙｏ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９３：４３３−４３６）。心臓移植は、治療的であり得るが、ヒト心臓器官ドナーの入手の可能性は著しく制限されており、純粋な、成熟かつ機能的ヒト心室筋組織の再生可能な供給源は、広範な臨床上の充足されていないニーズとなっている（Ｓｅｇｅｒｓ，Ｖ．Ｆ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：９３７−９４２；Ｓｐａｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１：４４１８−４４３１）。
【０００３】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、損傷したまたは病変した心臓における機能の潜在的な臨床的回復のため、多数の機能的心筋細胞を生成する可能性を提供する。心機能を改善し、および／または損傷された心筋を富化し、再生するための幹細胞の心臓への移植が、提案されている（例えば、米国特許公開第２００４０１８００４３号を参照）。成体の幹細胞が成長因子タンパク質での治療と併用して投与される併用療法もまた、提案されている（例えば、米国特許公開第２００５０２１４２６０号を参照）。
【０００４】
心臓への細胞移植は心機能を向上させ、心臓組織を再生するための有望なアプローチを提供するが、どの細胞型を移植するかという問題は多くの調査の課題であった。心臓組織の再生で使用するために調査された細胞型には、骨髄細胞（例えば、Ｏｒｌｉｃ，  Ｄ．ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ４１０巻：７０１〜７０５頁；Ｓｔａｍｍ，  Ｃ．ら（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ３６１巻：４５〜４６頁；Ｐｅｒｉｎ，  Ｅ．Ｃ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０７巻：２２９４〜２３０２頁を参照）、成体幹細胞（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｋ．Ａ．ら（２００１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０７巻：１３９５〜１４０２頁を参照）、骨髄由来の間葉性幹細胞（例えば、Ｂａｒｂａｓｈ，  Ｉ．Ｍ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０８巻：８６３頁；Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．およびＭａｒｔｉｎ，  Ｂ．Ｊ．（２００３年）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．９５巻：９〜２０頁を参照）、骨髄間質細胞（Ｂｉｔｔｉｒａ，  Ｂ．ら（２００３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．２４巻：３９３〜３９８頁）、間葉性幹細胞および胎児心筋細胞の組合せ（例えば、Ｍｉｎ，  Ｊ．Ｙ．ら（２００２年）Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．７４巻：１５６８〜１５７５頁を参照）ならびに、骨髄由来の単核細胞および骨髄由来の間葉性幹細胞の組合せ（例えば、米国特許出願公開第２００８００３８２２９号を参照）が含まれる。移植のために心臓幹細胞を生成するためのインビトロでの成体哺乳動物心筋細胞の脱分化も、提案されている（例えば、米国特許出願公開第２０１０００９３０８９号を参照）。
【０００５】
心機能を改善し、心臓組織を再生するための細胞移植のアプローチにおける大きな進歩は、心筋細胞、心平滑筋および心内皮細胞を生じる能力がある多能性心筋前駆細胞のファミリーの同定ならびに単離であった（Ｃａｉ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．５：８７７−８８９；Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７：１１５１−１１６５；Ｂｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：１１３−１１７；米国特許公開第２００６０２４６４４６号）。これらの心筋前駆細胞は、ＬＩＭホメオドメイン転写因子Ｉｓｌｅｔ１（Ｉｓｌ１）の発現により特徴付けられ、したがって、Ｉｓｌ１＋心筋前駆細胞として言及される（前掲）。対照的に、Ｉｓｌ１は、分化した心臓細胞において発現しない。Ｉｓｌ１より、分化において後で生じるＩｓｌ１＋心臓前駆細胞のさらなるマーカーが、記載されており、それは、Ｎｋｘ２．５およびｆｌｋ１を含む（例えば、米国特許公開第２０１００１６６７１４号を参照）。
【０００６】
Ｉｓｌ１＋心臓前駆細胞の再生および分化は、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路により制御されることが示された（例えば、Ｑｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．１：１６５−１７９；Ｋｗｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：１０８９４−１０８９９を参照）。これは、多能性幹細胞を誘導してＩｓｌ１＋系統に入り、Ｗｎｔシグナル伝達の調節を介してＩｓｌ１＋集団の拡大のための方法の開発に至った（例えば、Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：Ｅ１８４８−５７；Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：１６２−１７５；米国特許公開第２０１１００３３４３０号；米国特許公開第２０１３０１８９７８５号を参照）。
【０００７】
一方、ヒト多能性幹細胞は、多いに有望であり、大きな課題は、多様な心臓細胞の単純な分化からインビボでの巨大スケールの純粋な３Ｄ心室筋組織の形成に展開させる能力であり、最終的に、血管新生、細胞外基質の構築およびアライメント、ならびに成熟を必要とする。その目的に向い、心臓細胞（心房性、心室性、ペースメーカ）の多様な集団が、人工的かつ脱細胞化基質と結び付けられ（Ｍａｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：５７１６；Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：２１３−２２１；Ｓｃｈａａｆ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２６３９７）、血管細胞および導管（Ｔｕｌｌｏｃｈ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０９：４７−５９）ならびにｍｉｃｒｏＲＮＡのカクテル（Ｇａｍａ−Ｇａｒｖａｌｈｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌｓ  ３：９９６−１０２６）が、研究されてきたが、目標は、つかみどころがないままである。
【０００８】
心筋前駆細胞のマーカーとしてのＩｓｌ１の同定は大きな進歩であったが、Ｉｓｌ１は細胞内タンパク質であるので、それは大量の生存可能な細胞の単離で使用するのに適するマーカーでない。むしろ、細胞表面マーカーが、なお必要である。さらに、マーカーとしてのＩｓｌ１は、心臓系統の中で複数の細胞型に分化することができる集団を同定し、したがって、心臓系統の中の特定の細胞型に偏った心筋前駆細胞、特に心室細胞に分化する前駆体細胞を同定するマーカーへの必要性がなおある。したがって、心筋細胞を主に生成する、ならびに心筋芽前駆細胞の迅速な単離および大規模増殖を可能にするだろう心筋前駆細胞のさらなるマーカー、特に心筋前駆細胞の細胞表面マーカーへの大きな必要性が当該技術分野においてなおある。さらに、インビボで心室筋細胞に分化する心臓心室前駆体を単離し、それによって、心機能を増強するためにインビボでの心室前駆体または心室筋細胞の移植を可能にするための方法および組成物への大きな必要性が当該技術分野においてなおある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／０１８００４３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２１４２６０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／００３８２２９号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／００９３０８９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／０２４６４４６号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１０／０１６６７１４号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１１／００３３４３０号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１３／０１８９７８５号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｕｉ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８：３０−４１
【非特許文献２】Ｌｉｎ，Ｚ．ａｎｄ  Ｐｕ，Ｗ．Ｔ．（２０１４）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６：２３９ｒｖ１
【非特許文献３】Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：９８−１０２
【非特許文献４】Ｓｅｎｙｏ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９３：４３３−４３６
【非特許文献５】Ｓｅｇｅｒｓ，Ｖ．Ｆ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：９３７−９４２
【非特許文献６】Ｓｐａｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１：４４１８−４４３１
【非特許文献７】Ｏｒｌｉｃ，  Ｄ．ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ４１０巻：７０１〜７０５頁
【非特許文献８】Ｓｔａｍｍ，  Ｃ．ら（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ３６１巻：４５〜４６頁
【非特許文献９】Ｐｅｒｉｎ，  Ｅ．Ｃ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０７巻：２２９４〜２３０２頁
【非特許文献１０】Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｋ．Ａ．ら（２００１年）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０７巻：１３９５〜１４０２頁
【非特許文献１１】Ｂａｒｂａｓｈ，  Ｉ．Ｍ．ら（２００３年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１０８巻：８６３頁
【非特許文献１２】Ｐｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．およびＭａｒｔｉｎ，  Ｂ．Ｊ．（２００３年）Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．９５巻：９〜２０頁
【非特許文献１３】Ｂｉｔｔｉｒａ，  Ｂ．ら（２００３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．２４巻：３９３〜３９８頁
【非特許文献１４】Ｍｉｎ，  Ｊ．Ｙ．ら（２００２年）Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．７４巻：１５６８〜１５７５頁
【非特許文献１５】Ｃａｉ，Ｃ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．５：８７７−８８９
【非特許文献１６】Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７：１１５１−１１６５
【非特許文献１７】Ｂｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：１１３−１１７
【非特許文献１８】Ｑｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．１：１６５−１７９
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【非特許文献２０】Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０９：Ｅ１８４８−５７
【非特許文献２１】Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：１６２−１７５
【非特許文献２２】Ｍａｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：５７１６
【非特許文献２２】Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：２１３−２２１
【非特許文献２３】Ｓｃｈａａｆ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ２６３９７
【非特許文献２４】Ｔｕｌｌｏｃｈ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０９：４７−５９
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
この発明は、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つのマーカーについての５〜７日目の心筋前駆細胞（好ましくは６日目の前駆体）の陰性選択の使用が、それによって、ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を培養物から単離するのに十分であることを実証する。単離したＨＶＰは、対象に導入したとき、それらの心室プログラミングに従って機能する心室筋細胞にほとんど排他的に分化し、それによってインビボ組織操作を可能にする。本明細書の方法によって提供される陰性選択の使用は、ＨＶＰ集団の厳しい規定を確実にするだけでなく、バッチ変動および潜在的なテラトーマを引き起こす細胞を排除する。
【００１２】
本発明の方法では、ＴＲＡ−１−６０などのヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つのマーカーの発現の欠如について心筋前駆細胞の５〜７日目の培養物が選択され（陰性選択）、それによってＨＶＰの高度精製集団が単離される。本発明の方法は、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現についての選択（陽性選択）をさらに含むことができる。これらのＨＶＰは、本明細書に記載されるように、インビトロまたはインビボのいずれかにおける様々な目的のために次に使用することができる。
【００１３】
従って、一つの態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法であって、
心臓の心室前駆細胞を含む５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を、ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーと反応性の１つまたは複数の第１の作用物質と接触させること；および
第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞を単離すること
を含む方法に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、心筋前駆細胞を生成する条件下で培養して、５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を得ること；
５〜７日目の心筋前駆細胞の前記培養物を、ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーと反応性の１つまたは複数の第１の作用物質と接触させること；および
第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞を単離すること
を含む方法に関する。
【００１５】
一つの実施形態では、前記第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。他の実施形態では、前記第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシン、およびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ならびにその組合せからなる群から選択される。一つの実施形態では、前記培養物は、心筋前駆細胞の６日目の培養物である。
【００１６】
ＨＶＰを単離するための方法の一つの実施形態では、前記培養物を、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーに反応性の１つまたは複数の第２の作用物質とさらに接触させ；
第２のマーカー反応性の陽性細胞を、非反応性細胞から分離する。
【００１７】
一つの実施形態では、１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触の前に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる。別の実施形態では、１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触の後に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる。別の実施形態では、１つまたは複数の前記第１の作用物質との接触と同時に、前記培養物を、１つまたは複数の前記第２の作用物質と接触させる。
【００１８】
ヒト心臓の心室前駆細胞を単離するための方法では、第１のマーカーまたは第２のマーカーに結合する各種の作用物質を第１のマーカーまたは第２のマーカーと反応性の作用物質として使用することができる。例えば、一実施形態では、少なくとも１つの第１の作用物質は、第１のマーカー（例えば、ＴＲＡ−１−６０）に結合するモノクローナル抗体などの抗体である。一実施形態では、少なくとも１つの第２の作用物質は、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９に結合するモノクローナル抗体などの抗体である。さらに他の実施形態では、第１の作用物質および／または第２の作用物質は、第１のマーカーまたは第２のマーカーの可溶性リガンド、例えば可溶性リガンド融合タンパク質（例えば、可溶性リガンドＩｇ融合タンパク質）であってよい。
【００１９】
一実施形態では、第２のマーカーは、ＬＩＦＲである。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＦＺＤ４である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＬＩＦＲである。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＪＡＧ１である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＦＺＤ４である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９である。
【００２０】
ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法では、第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離するために、および／または第２のマーカー反応性の陽性細胞を非反応性細胞から分離するために、各種の分離法を使用することができる。例えば、一実施形態では、第１のマーカー非反応性の陰性細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される。一実施形態では、第２のマーカー反応性の陽性細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される。一実施形態では、第１のマーカー非反応性の陰性細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される。一実施形態では、第２のマーカー反応性の陽性細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される。
【００２１】
一実施形態では、ヒト心臓の心室前駆細胞を、それらがＭＬＣ２ｖ陽性になるように、さらに培養し、分化させる。
【００２２】
なお別の態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団を得る方法であって、
単一のヒト心臓の心室前駆細胞を単離することであって、単一の前記ヒト心臓の心室前駆細胞が、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、単離すること；ならびに
前記第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞を、前記細胞が少なくとも１×１０９細胞に拡大し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団が得られるような条件下で培養すること
を含む方法に関する。
【００２３】
一つの実施形態では、前記第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、前記第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。
【００２４】
一実施形態では、第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性であることに加えて、単一のヒト心臓の心室前駆細胞は、最初の培養時にＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である。単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、上記の方法（例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ）などの方法によって単離することができる。単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、上記のもの（例えば、モノクローナル抗体、可溶性リガンド融合タンパク質）などの第１のマーカーまたは第２のマーカーと反応性の作用物質を使用して単離することができる。さらなる培養および分化の後に、ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団は、心室マーカーＭＬＣＶ２を発現することができる。
【００２５】
一実施形態では、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、細胞が、心室分化に偏るような条件下でインビトロにおいて培養される。例えば、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、ＭＬＣ２ｖ心室マーカーを発現する心室細胞への細胞の分化を可能にする心臓前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２０％ノックアウト血清代用物、２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘおよび１００μｇ／ｍｌビタミンＣを補填した８０％先進ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で培養することができる。様々な実施形態では、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、例えば少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞のクローン集団に拡大される。
【００２６】
したがって、別の態様では、本発明は、単離されたヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）のクローン集団に関係し、ここで、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である。一実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。様々な実施形態では、このクローン集団は、例えば少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞を含む。好ましい実施形態では、このクローン集団は、少なくとも１×１０９個のＴＲＡ−１−６０陰性／ＬＩＦＲ陽性のヒト心臓の心室前駆細胞を含む。
【００２７】
なお別の態様では、本発明は、少なくとも１×１０６個の精製されたヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）の単離された集団であって、ＨＰＶの前記集団は：（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、集団を提供する。一つの実施形態では、前記第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、前記第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。様々な実施形態では、この単離された集団は、例えば少なくとも１×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞を含む。好ましい実施形態では、この単離された集団は、少なくとも１×１０９個のＴＲＡ−１−６０陰性／ＬＩＦＲ陽性のヒト心臓の心室前駆細胞を含む。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載される第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞を使用して対象における心機能を増強する方法に関係する。例えば、一実施形態では、本発明は、対象における心機能を増強する方法を提供し、この方法は、第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞の単離された集団（例えば、クローン集団）、例えば、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞のクローン集団を含む医薬組成物を投与することを含む。一実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。様々な実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９である。一実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーはＬＩＦＲである。一実施形態では、細胞集団は、対象の心臓に直接的に投与される。例えば、細胞集団は、対象の心臓の心室領域に直接的に投与することができる。一実施形態では、対象に投与される医薬組成物は、心室筋細胞を含む心筋パッチなどの３次元マトリックス上に製剤化された細胞集団を含む。対象は、心機能の増強を必要とする者、例えば心筋梗塞を患った者または先天性心臓障害を有する者である。
【００２９】
なお別の態様では、本発明は、ヒト心室組織を生成するための方法であって、
非ヒト動物の器官にヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を移植することであって、前記ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、移植すること；ならびに
ヒト心室組織が生成されるように前記ＨＶＰをインビボで成長させること
を含む方法に関する。
【００３０】
非ヒト動物は、例えば、免疫不全マウスであってよい。器官は、例えば、腎臓（例えば、細胞は腎臓嚢の下に移植される）または心臓であってよい。一つの実施形態では、以下の細胞マーカーパターン：（ｉ）心臓中胚葉形成のピークの後；（ｉｉ）ピークのＩｓｌｅｔ−１発現のとき；（ｉｉｉ）ＮＫＸ２．５発現のピークの前；（ｉｖ）下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１のピーク発現の前；および（ｖ）分化した収縮タンパク質遺伝子の発現の前のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つが存在するときに、前記細胞が移植される。一つの実施形態では、前記細胞は、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の５日目と７日目の間（両端を含む）に移植される。別の実施形態では、前記細胞は、ヒト心室前駆細胞を生成する条件下でのヒト多能性幹細胞のインビトロ培養の６日目に移植される。本方法は、非ヒト動物において生成されるヒト心室組織を収集することをさらに含むことができる。
【００３１】
本発明のさらに別の態様では、本明細書に記載されるヒト心臓の心室前駆細胞は、試験化合物の心臓毒性を評価するスクリーニングアッセイで使用することができる。従って、本発明は、試験化合物の心臓毒性についてスクリーニングする方法であって、
ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を提供することであって、前記ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、提供すること；
前記ＨＶＰを前記試験化合物と接触させること；ならびに
前記ＨＶＰへの前記試験化合物の毒性を測定すること
を含み、
前記ＨＶＰへの前記試験化合物の毒性は、前記試験化合物の心臓毒性を示す、方法を提供する。
【００３２】
細胞への試験化合物の毒性は、例えば、細胞生存度または細胞の他の生理的パラメータを評価することによって測定することができる。
【００３３】
本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からヒトＩｓｌ１＋心筋芽前駆細胞を生成するための例示的な培養プロトコールの模式図である。
【００３５】
【図２】図２は、Ｉｓｌ１、Ｎｋｘ２．５およびｃＴｎ１の発現を示す、ｈＰＳＣの心臓分化の間のタンパク質発現のウエスタンブロット解析の結果を示す。ＧＡＰＤＨを、対照として使用した。
【００３６】
【図３】図３は、分化の６日目の細胞上でのＩｓｌ１の発現を示す、心筋芽前駆細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【００３７】
【図４】図４は、分化の６日目の細胞上でのＩｓｌ１およびＪａｇ１の共発現を示す、心筋芽前駆細胞の二重染色フローサイトメトリー解析の結果を示す。
【００３８】
【図５】図５は、ＦＺＤ４の発現を示す、ｈＰＳＣの心臓分化の間のタンパク質発現のウエスタンブロット解析の結果を示す。ＧＡＰＤＨを、対照として使用した。
【００３９】
【図６】図６は、分化の５日目の細胞上でのＩｓｌ１およびＦＺＤ４の共発現を示す、心筋芽前駆細胞の二重染色フローサイトメトリー解析の結果を示す。
【００４０】
【図７】図７は、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）細胞の生成、心室筋細胞へのそれらの最終的な分化、それらの抗体精製および移植におけるそれらの使用の模式図である。
【００４１】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、器官に対する器官の組織操作のための腎臓嚢内（図８Ａ）または心筋内（図８Ｂ）へのＨＰＶの移植の模式図である。
【００４２】
【図９】図９は、細胞上でのＩｓｌ１およびＬＩＦＲの共発現を示す、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）細胞の二重染色フローサイトメトリー解析の結果を示す。
【００４３】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｂは、未分化胚性幹（ＥＳ）細胞（図１０Ａ）と比較した、ヒト心室前駆細胞（図１０Ｂ）上でのＬＩＦＲおよびＦＧＦＲ３の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｂは、未分化胚性幹（ＥＳ）細胞（図１０Ａ）と比較した、ヒト心室前駆細胞（図１０Ｂ）上でのＬＩＦＲおよびＦＧＦＲ３の発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【００４４】
【図１１】図１１は、ＨＶＰ分化プロセスの間の選択された発生遺伝子発現のＲＮＡ−ｓｅｑ解析を示す一連の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
本発明は、心筋前駆細胞の５〜７日目（好ましくは６日目）の培養物で実行される陰性選択工程がＨＶＰを効果的に精製し、そのため、それらは機能的心室パッチを形成することを含めて、機能的心筋細胞をインビトロおよびインビボで形成するとの発見に基づいて、心室系統に偏ったヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を単離する方法、ならびにかかる前駆体細胞の単離された集団（例えば、クローン集団）およびインビトロまたはインビボのいずれかでのその使用方法を提供する。本明細書に記載される少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーの発現に対する陰性選択の使用は、ＨＶＰ集団の厳しい規定を確実にするだけでなく、バッチ変動および潜在的なテラトーマを引き起こす細胞を排除する。さらに、本明細書に記載されるように、多能性幹細胞マーカー発現への陰性選択とＬＩＦＲ、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＦＧＦＲ３および／またはＴＮＦＳＦ９の発現への陽性選択との組合せは、ＨＶＰ集団のさらに厳しい規定を可能にする。
【００４６】
本発明がより容易に理解され得る目的で、ある種の用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して説明される。
【００４７】
本明細書において使用される、用語「Ｊａｇｇｅｄ１」、「Ｊａｇ１」および「ＪＡＧ１」を互換的に使用して、例えば、Ｏｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４３：３７６−３７９；Ｏｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２３５−２４２；Ｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８：４３−５５；Ｂａｓｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：２８０３−２８１１；およびＪｏｎｅｓ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３７：６５８−６６２において記載されている当該技術分野において公知のタンパク質を指す。Ｊａｇｇｅｄ１タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ７８５０４．３において説明されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００４８】
本明細書において使用される、用語「Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４」、「Ｆｚｄ４」および「ＦＺＤ４」を互換的に使用して、例えば、Ｋｉｎｋｏｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６４：９５５−９６１；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０１６４−１０１６９；およびＲｏｂｉｔａｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３２：３２６−３３０において記載されている当該技術分野において公知のタンパク質を指す。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９ＵＬＶ１において説明されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００４９】
本明細書において使用される、用語「白血病抑制因子受容体」、「ＬＩＦ受容体」および「ＬＩＦＲ」を互換的に使用して、例えば、Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８３９−２８４８；Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｄ．ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ，Ａ．Ｇ．（１９９２）Ｎｅｗ．Ｂｉｏｌ．４：６１−６５；およびＳｃｈｉｅｍａｎｎ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：５３６１−５３６５において記載されている当該技術分野において公知のタンパク質を指す。ＬＩＦＲはまた、当該技術分野において、白血病抑制因子受容体アルファ、ＣＤ１１８、ＣＤ１１８抗原、ＳＪＳ２、ＳＴＷＳおよびＳＷＳとして言及される。ＬＩＬＦＲタンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２１１４３．１において説明されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００５０】
本明細書において使用される、用語「線維芽細胞成長因子受容体３」、「ＦＧＦ受容体３」および「ＦＧＦＲ３」を互換的に使用して、例えば、Ｋｅｅｇａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０９５−１０９９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：１１３３−１１４２；およびＳｈｉａｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７８：３３５−３４３において記載されている当該技術分野において公知のタンパク質を指す。ＦＧＦＲ３はまた、当該技術分野において、ＣＤ３３３、ＣＤ３３３抗原、ＥＣ２．７．１０．１、ＪＴＫ４、ＡＣＨ、ＣＥＫ２およびＨＳＦＧＦＲ３ＥＸとして言及される。ＦＧＦＲ３タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１３３．１において説明されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００５１】
本明細書において使用される、用語「腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー９」、「ＴＮＦＳＦ９」、「４−１ＢＢ−Ｌ」および「ＣＤ１３７Ｌ」は、例えば、Alderson,  M.R.ら（１９９４年）Eur.  J.  Immunol.、２４巻：２２１９〜２２２７頁；Tan,  J.T.ら（１９９９年）J.  Immunol.１６３巻：４８５９〜４８６８頁；およびXia,  R.ら（２０１０年）Cytokine５０巻：３１１〜３１６頁に記載されている、当該技術分野において公知のタンパク質を指すために互換的に使用される。ＴＮＦＳＦ９タンパク質の非限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３８０２．１に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質である。
【００５２】
本明細書において使用される、用語「ＴＲＡ−１−６０抗原」および「ＴＲＡ−１−６０」は、ＴＲＡ−１−６０モノクローナル抗体によって認識される、当該技術分野において公知の抗原決定基を指すために互換的に使用され、この抗原決定基は、例えば、Marrink,  J.ら（１９９１年）Int.  J.  Cancer、４９巻：３６８〜３７２頁；Badcock,  G.ら（１９９９年）Cancer  Res.５９巻：４７１５〜４７１９頁；Schopperle,  W.M.ら（２００７年）Stem  Cells２５巻：７２３〜７３０頁；およびFong,  C.  Y.ら（２００９年）Stem  Cell  Rev.５巻：７２〜８０頁に記載されるように、ヒト多能性幹細胞上で発現されるムチン様のシアル化硫酸ケラチンプロテオグリカンである。
【００５３】
本明細書において使用される、用語「幹細胞」は、広義で使用され、伝統的な幹細胞、前駆細胞、プレ前駆細胞、貯蔵細胞などを含む。用語「幹細胞」または「前駆体」を本明細書において互換的に使用し、分化した、または分化可能な娘細胞を順に生じることができる多くの母細胞を生成する能力を有する、より前駆の細胞を増殖および生じる能力がある未分化の細胞を指す。娘細胞自体を誘導して、親の発生の可能性を有する１つまたは複数の細胞も保持しながら、１つまたは複数の成熟細胞タイプに連続して分化する子孫を増殖し、生み出すことができる。次に、用語「幹細胞」は、ある種の状況下で、実質的に分化することなく、増殖する能力を保持した、特定の状況下で、より特殊化もしくは分化した表現型に分化する能力または可能性を有する細胞を指す。１つの実施形態において、用語、前駆体または幹細胞は、その卑属（子孫）が、胚細胞および組織の向上する多様性において生じる、分化により、例えば、個々の特徴を完全に獲得することにより、しばしば異なる方向に特殊化する一般化母細胞を指す。細胞の分化は、多くの細胞分裂を介して典型的に生じる複雑なプロセスである。分化した細胞は、それ自体が、多能性細胞などからもたらされる多能性細胞から派生し得る。これらの多能性細胞のそれぞれが、幹細胞であるとみなされ得る一方、それぞれが生じることのできる細胞タイプの範囲はかなり変動し得る。幾つかの分化した細胞はまた、より大きな発生の可能性の細胞を生じる能力を有する。かかる能力は、天然であってもよく、または様々な因子での処理の際に人工的に誘導されてもよい。多くの生物学的場合において、幹細胞は、それらが、１つより多くの別々の細胞タイプの子孫を生み出すことができるが、これは、「幹細胞性」を必要としないので、「多能性」でもある。自己再生は、幹細胞定義の他の古典的な部分であり、本書類において使用される通り、必須である。理論において、自己再生は、２つの主要な機序のいずれかにより生じることができる。幹細胞は、一方の娘が、幹状態を保持し、他の娘が、幾つかの別々の他の特定の機能および表現型を発現しながら、非対称的に分割し得る。あるいは、集団内の幹細胞の幾つかは、２つの幹に対称的に分化することができ、したがって、全体としての集団内の幾つかの幹細胞を維持し、一方、集団内の他の細胞は、分化した子孫のみを生じる。公式には、幹細胞として始まる細胞は、分化した表現型に向けて前進し得るが、次に、「脱分化」としてしばしば言及される用語である、「逆転し」、幹細胞表現型を再度発現することが可能である。
【００５４】
用語「前駆体細胞」を本明細書において使用して、それが分化により生じ得る細胞と比べて、より原始的である（例えば、完全に分化した細胞であるより、発生経路または向上に沿って初期工程にある）細胞表現型を有する細胞を指す。しばしば、前駆細胞はまた、有意または非常に高い増殖ポテンシャルを有する。前駆細胞は、発生経路、および細胞が発生し、分化する環境に依存し、複数の別々の分化した細胞タイプまたは単一の分化した細胞タイプを生じることができる。
【００５５】
本明細書において使用される用語「多能性の」は、異なる条件下で、全３種の生殖細胞層（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞タイプ特徴に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウスおよびテラトーマ形成アッセイを使用して、全３種の胚葉に分化するそれらの能力により、主に特徴付けられる。多能性についての好ましい試験は、３種の胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力の証明であるが、多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現により、証明される。幾つかの実施形態において、多能性細胞は、未分化の細胞である。
【００５６】
本明細書において使用される用語「多能性」または「多能性状態」は、全３種の胚の胚葉：内胚葉（腸組織）、中胚葉（血液、筋肉、および血管を含む）、ならびに外胚葉（例えば、皮膚および神経）に分化する能力を有し、典型的には、インビトロで長期間、例えば、１年より長く、または３０回より多くの継代、分裂する可能性を有する細胞を指す。
【００５７】
用語「多能性」は、「多能性細胞」に関して使用されるとき、全３種の胚葉からもたらされる細胞の全てではないが、幾つかの細胞に分化することができる細胞を指す。したがって、多能性細胞は、部分的に分化した細胞である。多能性細胞は、当該技術分野において周知であり、多能性細胞の例は、例えば、造血幹細胞および神経幹細胞のような、成体の幹細胞を含む。多能性は、幹細胞が、所定の系統にある多くのタイプの細胞を形成し得るが、他の系統の細胞を形成し得ないことを意味する。例えば、多能性血液幹細胞は、多くの異なるタイプの血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成することができるが、それは、ニューロンを形成することができない。
【００５８】
用語「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」または「ＥＳＣ」は、本明細書において互換的に使用され、胚の胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指す（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号を参照、それらは、参照により本明細書に取り込まれる）。かかる細胞は、体細胞核移植からもたらされる胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、第５，９９４，６１９号、第６，２３５，９７０号を参照、それらは、参照により本明細書に取り込まれる）。胚性幹細胞の際立った特徴は、胚性幹細胞表現型を定義する。したがって、細胞が、他の細胞と区別することができるように、細胞は、それが胚性幹細胞の固有の特徴の１つまたは複数を有するなら、胚性幹細胞の表現型を有する。典型的な際立った胚性幹細胞特徴は、遺伝子発現特性、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性などを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ＥＳ細胞は、胚を破壊することなく、例えば、ヒト胚を破壊することなく、得ることができる。
【００５９】
用語「成体の幹細胞」または「ＡＳＣ」を使用して、胎児の、若齢の、および成体の組織を含む、非胚性組織からもたらされる任意の多能性幹細胞を指す。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、および心筋を含む多種多様な成体の組織から単離されている。これらの幹細胞のそれぞれが、遺伝子発現、因子応答性、および培養中の形態に基づき特徴付けることができる。典型的な成体の幹細胞は、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、および膵幹細胞を含む。上で示された通り、幹細胞は、事実上、全組織において常在することが見出されている。したがって、本発明は、幹細胞集団が、事実上あらゆる動物の組織から単離することができることを十分理解する。
【００６０】
本明細書において使用される用語「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣと略される）は、幹細胞および多能性に関して上で考察された様々な異なる細胞タイプに分化する能力を有するヒト細胞である。ヒト多能性ヒト幹細胞は、例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびＥＳ細胞株のようなヒト胚性幹細胞を含む。
【００６１】
本明細書において使用される用語「ヒト心筋前駆細胞」は、心臓系統に関与し、全３種の心臓系統細胞（心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞）に分化する能力を有するヒト前駆体細胞を指す。
【００６２】
本明細書において使用される用語「ヒト心筋芽前駆細胞」は、心臓系統に関与し、心筋細胞に主に分化する（すなわち、前駆細胞に由来する、分化した細胞の５０％より多く、好ましくは、分化した細胞の６０％、７０％、８０％または９０％が心筋細胞である）ヒト前駆体細胞を指す。
【００６３】
本明細書において使用される用語「心臓の心室前駆細胞」は、心臓系統に関与し、心臓の心室筋細胞に主に分化する（すなわち、前駆細胞に由来する、分化した細胞の５０％より多く、好ましくは、分化した細胞の６０％、７０％、８０％または９０％より多くが心臓の心室筋細胞である）前駆体細胞を指す。このタイプの細胞はまた、本明細書において、ヒト心室前駆体、またはＨＶＰ、細胞としても言及される。
【００６４】
用語「心筋細胞」は、心臓の筋細胞（例えば、心筋細胞）を指す。心筋細胞は、一般に、その細胞表面および／または細胞質において１つまたは複数の心臓特異的マーカーを発現するだろう。適切な心筋細胞特異的マーカーは、心トロポニンＩ、心トロポニン−Ｃ、トロポミオシン、カベオリン−３、ＧＡＴＡ−４、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖−２ａ、ミオシン軽鎖−２ｖ、リアノジン受容体、および心房性ナトリウム利尿因子を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
別の細胞に由来する細胞の文脈で使用される用語「に由来する」は、細胞が、異なる細胞タイプである細胞から生じた（例えば、それか変化したか、またはそれにより生み出された）ことを意味する。用語「に由来する」はまた、前駆体細胞から分化した細胞を指す。
【００６６】
本明細書において使用される用語「Ｉｓｌ１＋心筋前駆細胞」は、心臓系統に関与し、Ｉｓｌｅｔ１を発現するヒト前駆体細胞を指す。
【００６７】
本明細書において使用される、用語「Ｉｓｌ１＋ＪＡＧ１＋心筋前駆細胞」、「Ｉｓｌ１＋ＦＺＤ４＋心筋前駆細胞」、「Ｉｓｌ１＋ＬＩＦＲ＋心筋前駆細胞」、「Ｉｓｌ１＋ＦＧＦＲ３＋心筋前駆細胞」および「Ｉｓｌ１＋ＴＮＦＳＦ９＋心筋前駆細胞」は、心臓系統に関与し、Ｉｓｌｅｔ１およびＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９のいずれかの両方を発現するヒト前駆体細胞をそれぞれ指す。
【００６８】
細胞培養物中または細胞集団における細胞に関して、用語「実質的に含まない」は、その細胞培養物または細胞集団が、ないか、細胞培養物もしくは細胞集団に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の量で存在する特定の細胞タイプを意味する。
【００６９】
細胞個体発生の文脈において、隣接の「分化した」、または「分化している」は、比較用語である。「分化した細胞」は、それが比較される細胞よりさらに下の発生経路に進んでいる細胞である。したがって、幹細胞は、系統が制限された前駆細胞（例えば、中胚葉系幹細胞）に分化することができ、それが、順に、さらに下の経路の他のタイプの前駆細胞（例えば、心筋細胞前駆体）に、次に、ある種の組織タイプにおいて特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持し得るか、またはし得ない最終ステージの分化した細胞に分化することができる。
【００７０】
本文脈における用語「分化」は、より特殊化し、さらなる分化の能力がない最終分化した細胞になることにさらに近づいた細胞と関連することが公知のマーカーを発現する細胞の形成を意味する。細胞が、より少なく関与した細胞から、特定の細胞タイプにますます関与する細胞に、最終的には、最終分化した細胞まで進む経路は、漸進的分化または漸進的関与としても言及される。より特殊化した（例えば、漸進的分化の進路に沿って進み始めた）が、まだ最終分化していない細胞は、部分的に分化したとして言及される。分化は、発生のプロセスであり、これにより、細胞は、特殊化表現型を想定し、例えば、他の細胞タイプと異なる１つもしくは複数の特徴または機能を想定する。幾つかの場合において、分化した表現型は、幾つかの発生経路における成熟エンドポイントにある細胞表現型（いわゆる最終分化した細胞）を指す。多くだが、全てではない組織において、分化のプロセスは、細胞サイクルからの出口と結び付けられる。これらの場合において、最終分化した細胞は、それらの増殖する能力を失うか、または大いに制限する。しかしながら、本発明者らは、この明細書の文脈において、用語「分化」または「分化した」は、それらの発生の前のポイントよりそれらの運命または機能においてより特殊化した細胞を指し、最終分化した細胞と、最終分化していないが、それらの発生における前のポイントより特殊化した細胞の両方を含むことに注意する。未関与の細胞（例えば、幹細胞）から、特定の分化した細胞タイプへの増大する程度の関与を有する細胞まで、および、最終的に、最終分化した細胞までの細胞の発生は、漸進的な分化または漸進的な関与として知られている。前駆体細胞と比べて、「分化した」細胞は、その前駆体細胞と比べて１つまたは複数の表現型の差を有する。表現型の差は、限定するものではないが、形態学的な差ならびに、発現したマーカーの存在または非存在ばかりでなく、マーカーの量の差および一連のマーカーの共発現パターンにおける差を含む、遺伝子発現および生物学的活性における差を含む。
【００７１】
本明細書において使用される用語「分化」は、原始的ステージからより成熟（すなわち、あまり原始的でない）細胞に向けた細胞の細胞発生を指す。
【００７２】
本明細書において使用される、「増殖すること」および「増殖」は、細胞分裂による集団における細胞の数における増大（成長）を指す。細胞増殖は、一般に、成長因子および他のマイトジェンを含む、環境に応答した複数のシグナル伝達経路の協調した活性化の結果と理解される。細胞増殖はまた、細胞増殖を阻害するか、もしくは負に影響する細胞内または細胞外シグナルおよび機序の作用からの放出により促進され得る。
【００７３】
用語「再生」または「自己再生」または「増殖」は、互換的に使用され、細胞のそれ自体のより多くのコピー（例えば、複製）を作る細胞のプロセスを指す。幾つかの実施形態において、細胞は、長期間、および／または多くの月から年に渡り、同じ未分化の細胞（例えば、前駆体細胞タイプ）に分裂することにより、それ自体の再生の能力がある。幾つかの場合において、増殖は、単一細胞から２つの同一の娘細胞への繰り返される分裂による、細胞の拡大を指す。
【００７４】
本明細書において使用される用語「系統」は、共通の先祖を有する細胞、または共通の発生運命を有する細胞、例えば、心室の心筋細胞に発生する発生運命を有する細胞を記載する用語を指す。
【００７５】
本明細書において使用される用語「クローン集団」は、単一細胞の派生物に由来する細胞の集団を指す。すなわち、クローン集団内の細胞は、クローン集団を播種するために使用された単一細胞の全ての子孫である。
【００７６】
本明細書において使用される、用語「ＨＶＰの単離された集団」および「ＨＶＰの精製された集団」は、ＨＶＰ以外の細胞から精製され、そのため、集団がＨＶＰ以外の細胞の３％未満、より好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満、より好ましくは０．５％未満を含有する、ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）の集団を指すために互換的に使用される。
【００７７】
本明細書において言及される用語「培地」は、細胞生存能を維持し、増殖を支持する栄養素を含有する、組織もしくは細胞集団を維持するための培地、または、細胞集団を培養するための培地（例えば、「培養培地」）である。細胞培養培地は、適切な組み合わせで以下のいずれかを含有してもよい：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、およびペプチド成長因子のような他の成分など。特定の細胞タイプのため通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【００７８】
用語「表現型」は、実際の遺伝子型にもかかわらず、特定の一連の環境条件および因子下で、細胞または生物を定義するトータルの生物学的特徴の１つまたは多数を指す。
【００７９】
本明細書において使用される「マーカー」は、細胞の特徴および／または表現型を記載する。マーカーは、対象となる特徴を含む細胞のセレクションのため使用することができる。マーカーは、特定の細胞で変動するだろう。マーカーは、特徴、細胞タイプに特定の形態学的、機能的もしくは生化学的（酵素的）特徴か、それとも細胞タイプにより発現される分子である。好ましくは、かかるマーカーはタンパク質であり、より好ましくは抗体のエピトープ、または当該技術分野において入手可能な他の結合分子、例えば細胞の表面に発現されるタンパク質を有する（「細胞表面マーカー」）。しかし、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸ならびにステロイドを含むが、これらに限定されない、細胞において見られる任意の分子からなり得る。形態学的特徴または形質の例は、形、サイズ、および細胞質に対する核の比を含むが、これらに限定されない。機能的特徴または形質の例は、特定の基質に接着する能力、特定の色素を取り込むかまたは排除する能力、特定の条件下で遊走する能力、および特定の系統に沿って分化する能力を含むが、これらに限定されない。マーカーは、当業者が入手可能な任意の方法により、検出され得る。本明細書において使用される、「マーカー陽性」である細胞はそのマーカーを発現する細胞を指し、一方、「マーカー陰性」である細胞はそのマーカーを発現しない細胞を指す。集団レベルでは、「マーカー陽性」である細胞集団は、その集団内の細胞の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％がそのマーカーを発現する集団を指す。集団レベルでは、「マーカー陰性」である細胞集団は、その集団内の細胞の３％未満、より好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満、より好ましくは０．５％未満がそのマーカーを発現する集団を指す。
【００８０】
本明細書において使用される用語「単離された細胞」は、それが本来見られたか、またはかかる細胞の卑属であった生物から取り出された細胞を指す。場合により、細胞は、インビトロで、例えば、他の細胞の存在下で培養されている。場合により、細胞は、第２の生物に後で導入されるか、または当該細胞（または当該細胞が子孫である細胞）が単離された生物に再度導入される。
【００８１】
本明細書において使用される、細胞の単離された集団に関して用語「単離された集団」は、細胞の混合されたまたは不均一な集団から取り出された、分離された細胞の集団を指す。幾つかの実施形態において、単離された集団は、当該細胞がそこから単離されるか、または富化された不均一な集団と比較して、細胞の実質的に純粋な集団である。
【００８２】
特定の細胞集団に関する用語「実質的に純粋」は、トータルの細胞集団を作り上げる細胞に関して、少なくとも約７５％、好ましくは、少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。
【００８３】
用語「対象」および「個体」は、互換的に使用され、本明細書において開示される心臓の心室前駆細胞が、例えば、幾つかの実施形態において、予防的処置を包含する処置のため、または本明細書に記載される方法および組成物が提供されるか、または複数提供される、疾患モデルのため、移植され得る、動物、例えば、ヒトを指す。ヒト対象のような特定の動物にとって特異的である疾患状態の処置について、用語「対象」は、その特定の動物を指す。用語「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳類」は、本明細書において互換的に使用され、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類のような哺乳類を含む。用語「対象」はまた、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類を含むが、これらに限定されない任意の脊椎動物を包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒトのような哺乳類であるか、または家畜化動物のような他の哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウマなど、もしくは生産哺乳類、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなどもまた、用語対象において包含される。
【００８４】
本明細書において使用される、用語「レシピエント」は、移植された器官、組織または細胞を受け取るであろう対象を指す。
【００８５】
本明細書において使用される用語「３次元基質」または「スキャフォールド」または「基質」は、生体適合可能な基質、スキャフォールドなどを含む組成物と広義で指す。３次元基質は、２５℃で液体、ゲル、半固体、または固体であってもよい。３次元基質は、生分解性または非生分解性であってもよい。幾つかの実施形態において、３次元基質は、生体適合可能であるか、または生体吸収可能か、もしくは生体置換可能である。典型的な３次元基質は、ポリマーおよびコラーゲンを含むヒドロゲル、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ポリエチレングリコール、化学的に架橋結合可能なデキストランまたは光架橋結合可能なデキストランを含むデキストラン、粘膜下組織のような処理された組織基質などを含む。ある種の実施形態において、３次元基質は、同種成分、自家成分、または同種成分と自家成分の両方を含む。ある種の実施形態において、３次元基質は、合成または半合成物質を含む。ある種の実施形態において、３次元基質は、フィブリン由来のスキャフォールドのような、フレームワークまたはサポートを含む。
【００８６】
本明細書において使用される、用語「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」は、互換的に使用され、所望される部位での細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、心筋芽前駆細胞および／または本明細書において記載される分化した心筋細胞の対象への留置を指す。細胞は、細胞の少なくとも一部が生存可能なままである対象において、所望される位置へのデリバリーをもたらす任意の適切な経路により投与することができる。対象への投与後の細胞の生存能の期間は、数時間と同等の短さ、例えば、２４時間から、数日まで、数年と同等の長さまでであることができる。
【００８７】
用語「統計学的に有意な」または「有意に」は、統計学的な有意を指し、一般に、マーカーの正常、またはより低い濃度未満の２標準偏差（２ＳＤ）を意味する。用語は、差が存在するという統計学的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真実であるとき帰無仮説を拒否する決断をする可能性として定義される。決断は、しばしば、ｐ−値を使用してなされる。本明細書において使用される用語「実質的に」または「主に」は、少なくとも約６０％、または好ましくは、少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％または少なくとも約９９％以上、あるいは７０％〜１００％の任意の整数の割合を意味する。
【００８８】
用語「疾患」または「障害」は、本明細書において互換的に使用され、機能の性能を中断するかもしくは妨害する、および／または不快、機能不全、苦痛のような症状、または苦しめられた人もしくは人と接触したものに死さえを引き起こす、身体の、あるいは器官の幾つかの状態における任意の変化を指す。疾患または障害はまた、ジステンパー、病的な状態、病気、病弊、障害、病的状態、病、愁訴、軽い病気または情動に関連し得る。
【００８９】
本明細書において使用される、語句「心血管状態、疾患または障害」は、対象、特に、ヒト対象における不十分な、所望されないまたは異常な心機能、例えば、虚血性心疾患、高血圧性心疾患および肺高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、ならびに鬱血性心不全に至る任意の状態により特徴付けられるすべての障害を含むことが意図される。不十分なまたは異常な心機能は、疾患、損傷および／または加齢の結果であり得る。背景として、心筋障害に対する応答は、幾つかの細胞が死ぬ一方、他のものは依然死んでいないものの、機能不全である冬眠状態になる明確な経路をたどる。これに、炎症性細胞の浸潤、瘢痕の一部としてのコラーゲンの沈着、新たな血管の内殖および持続細胞死の度合と並行して起こったものの全てが続く。本明細書において使用される、用語「虚血」は、血液の流入の低減に起因した任意の局所性組織虚血を指す。用語「心筋虚血」は、冠動脈硬化および／または心筋への不十分な酸素供給により引き起こされる循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織に対する不可逆的な虚血発作を表す。この発作は、冠循環において閉塞性（例えば、血栓性または塞栓）現象をもたらし、心筋代謝需要が、心筋組織への酸素の供給を超える環境を生じる。
【００９０】
本明細書において使用される、用語「処置すること」または「処置」は、本明細書において互換的に使用され、心血管状態、疾患または障害、すなわち、不十分なもしくは所望されない心機能により特徴付けられる任意の障害の少なくとも１つの副作用または症状を低減すること、または低下すること、または緩和すること、または停止させることを指す。心異常の副作用または症状は、当該技術分野において周知であり、呼吸困難、胸痛、動悸、眩暈、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、疲労および死を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本明細書において使用される用語「処置」は、対象において心血管の状態の症状の発生を予防するための予防的処置または予防処置を指す。
【００９１】
１つまたは複数の症状または臨床マーカーが、その用語が本明細書において定義される通り、低減されるなら、処置は、一般に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減されるか、または停止されるなら、処置は、「有効」である。すなわち、「処置」は、症状の改善または疾患のマーカーの低下だけでなく、処置がないときに予測され得る症状の進行もしくは悪化の休止または遅延をも含む。有益なまたは所望される臨床結果は、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または遅くすること、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的またはトータルのいずれか）、検出可能かまたは検出可能でないかのいずれかを含むが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予測される生存と比較して、延長された生存を意味し得る。処置の必要なものは、心臓の状態をすでに診断されたもの、ならびに遺伝子感受性または体重、食餌および健康状態のような他の要因に起因して心臓の状態を恐らく発症するものを含む。幾つかの実施形態において、処置するとの用語はまた、予防対策および／または予防的処置を包含し、疾患または障害の開始を防ぐために本明細書において開示される医薬組成物を投与することを含む。
【００９２】
症状における治療上有意な低減は、対照または未処置の対象と比較して、測定されたパラメーターにおいて例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％以上である。測定されたまたは測定可能なパラメーターは、疾患の臨床上検出可能なマーカー、例えば、生物学的マーカーの上昇または抑制されたレベル、ならびに症状または疾患もしくは障害についてのマーカーの臨床上許容されるスケールと関連するパラメーターを含む。本明細書において開示される組成物および製剤の総一日使用が、正当な医療判断の範囲内で主治医により決定されるであろうことは理解されるだろう。要求される正確な量は、処置される疾患のタイプのような要因に依存して変動するだろう。
【００９３】
対象における心血管状態または疾患の処置に関して、用語「治療上有効量」は、安全であり、発生または心血管疾患もしくは障害を防ぐか、あるいは遅延させるのに十分な量を指す。したがって、量は、心血管疾患もしくは障害を治癒するかまたは寛解に持ち込むことができ、心血管疾患の進行を遅らせることができ、心血管疾患もしくは障害の症状を遅らせるか、または阻害することができ、心血管疾患もしくは障害の二次症状の確立を遅延するか、または阻害することができ、あるいは心血管疾患もしくは障害の二次症状の発症を阻害することができる。心血管疾患または障害の処置のための有効量は、処置されるべき心血管疾患のタイプ、症状の重症度、処置される対象、対象の年齢および一般的状態、投与の様式などに依存する。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能ではない。しかしながら、任意の所定の場合について、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者により決定され得る。処置の有効性は、当業者により判断され得、例えば、有効性は、本明細書において考察される心血管疾患または障害の動物モデルにおいて評価することができ、例えば、急性心筋梗塞または虚血−再灌流障害を有するげっ歯類の処置、および本明細書において開示される心血管疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状の低下に至る組成物または製剤の任意の処置または投与、例えば、増大した心臓駆出分画、心不全の低下した率、低下した梗塞サイズ、低下した関連する罹患率（肺浮腫、腎不全、不整脈）、改善された運動負荷試験または他のクオリティ・オブ・ライフの測定、ならびに低下した死亡率が、有効な処置を示す。組成物が、心血管疾患または障害の処置のため使用される実施形態において、組成物の有効性が、心血管疾患の実験的動物モデル、例えば、虚血−再灌流障害の動物モデル（Ｈｅａｄｒｉｃｋ  Ｊ  Ｐ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８５；  Ｈ１７９７；  ２００３）、および動物モデル急性心筋梗塞（Ｙａｎｇ  Ｚ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８２：Ｈ９４９：２００２；Ｇｕｏ  Ｙ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３；  ８２５−８３０，２００１）を使用して、判断することができる。実験動物モデルを使用するとき、処置の有効性は、無処置の動物に対して、処置された動物において、心血管疾患または障害の症状における低減、例えば、呼吸困難、胸痛、動悸、眩暈、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、疲労および高血圧の１つまたは複数の症状における低減がより早く生じるとき、証明される。「より早く」により、例えば、腫瘍のサイズにおける低下が、少なくとも５％より早くだが、好ましくは、さらに、例えば、１日早く、２日早く、３日早く、またはそれ以上で生じることが意味される。
【００９４】
本明細書において使用される、心血管疾患または障害の処置に関して使用されるときの用語「処置すること」を使用して、心血管疾患もしくは障害の症状および／または生化学的マーカーの低減を指し、例えば、少なくとも約１０％による、心血管疾患の少なくとも１つの生化学的マーカーにおける低減が、有効な処置とみなされるだろう。心血管疾患のかかる生化学的マーカーの例は、例えば、血中のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の低減、および／または心血管疾患の症状における低下、および／または、心電図（ＥＣＧもしくはＥＫＧ）、または心エコー図（心臓超音波）、ドプラ超音波および核医学イメージングにより測定される当業者のいずれかにより決定される血流ならびに／あるいは心機能の改善を含む。少なくとも約１０％による、心血管疾患の症状の低減はまた、本明細書において開示される方法による有効な処置であるとみなされるだろう。代わりの例として、心血管疾患の症状における低減、例えば、少なくとも約１０％による、以下の呼吸困難、胸痛、動悸、眩暈、失神、浮腫、チアノーゼなどの少なくとも１つの低減もしくはかかるシステムの休止、または少なくとも約１０％による、心血管疾患の１つのかかる症状のサイズにおける低減もまた、本明細書において開示される方法により、感情的処置とみなされるだろう。幾つかの実施形態において、治療剤は、心血管疾患または障害を実際に除去し、むしろ丁度、症状を管理可能な程度まで低減することが好ましいが、要求されない。
【００９５】
本明細書において開示される方法による処置に適している対象は、当業者に一般に公知の心筋梗塞（一般に、心臓発作として言及される）を診断する任意の方法により同定することができ、本明細書において開示される方法を使用した処置に適しており、かかる診断方法は、例えば、（ｉ）クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）および他の心筋梗塞中に放出される酵素のレベルを検出するための血液検査；（ｉｉ）紙またはコンピューターモニター上のいずれかでの心臓の活性の図表による記録である心電図（ＥＣＧまたはＥＫＧ）を含むが、これらに限定されない。ＥＣＧは、疾患および／または損傷を検出する際に有益であり得；（ｉｉｉ）心エコー図（心臓超音波）は、先天性心疾患を調べ、心臓壁、弁および血管の機能異常を含む、心臓壁の異常を評価するために使用され；（ｉｖ）ドプラ超音波を使用して、心臓弁を通る血流を測定することができ；（ｖ）核医学イメージング（当該技術分野において放射性核種スキャニングとしても言及される）は、器官の解剖学および機能の可視化を可能にし、これを使用して、冠動脈疾患、心筋梗塞、弁疾患、心移植拒絶を検出することができ、バイパス術の有効性をチェックできるか、または血管新生もしくは冠状動脈バイパス手術のための患者を選択することができる。
【００９６】
本明細書において互換的に使用され、心筋梗塞を指す用語「冠動脈疾患」および「急性冠症候群」は、心血管の状態、疾患または障害を指し、対象、特に、ヒト対象における不十分な、所望されないまたは異常な心機能、例えば、虚血性心疾患、高血圧性心臓疾患および肺高血圧性心臓疾患、弁膜症、先天性心疾患および鬱血性心不全に至る任意の状態により特徴付けられる全ての障害を含む。不十分なまたは異常な心機能は、疾患、損傷および／または加齢の結果であり得る。背景として、心筋障害に対する応答は、幾つかの細胞が死ぬ一方、他のものは依然死んでいないものの、機能不全である冬眠状態になる明確な経路をたどる。これに、炎症性細胞の浸潤、瘢痕の一部としてのコラーゲンの沈着、新たな血管の内殖および持続細胞死の度合と並行して起こったものの全てが続く。
【００９７】
本明細書において使用される、用語「虚血」は、血液の流入の低減に起因した任意の局所性組織虚血を指す。用語「心筋虚血」は、冠動脈硬化および／または心筋への不十分な酸素供給により引き起こされる循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織に対する不可逆的な虚血発作を表す。この発作は、冠循環において閉塞性（例えば、血栓性または塞栓）現象をもたらし、心筋代謝需要が、心筋組織への酸素の供給を超える環境を生じる。
【００９８】
本明細書において互換的に使用される用語「組成物」または「医薬組成物」は、当該技術分野においてありふれており、哺乳類、好ましくは、ヒトまたはヒト細胞への投与に適切である薬学的に許容可能な担体のような、賦形剤を通常含む組成物または製剤を指す。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、標的組織への、直接注射によりもしくはカテーテル注入を介して標的組織または器官への直接的デリバリーのため特に製剤化することができる。他の実施形態において、組成物は、経口、点眼、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、舌下、脊髄内、脳室内などを含むが、これらに限定されない、多数の経路の１つまたは複数を介した投与のため特に製剤化することができる。加えて、局所（例えば、口腔粘膜、呼吸粘膜）および／または経口投与のための組成物は、当該技術分野において公知であり、本明細書において記載される、液剤、懸濁剤、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、口腔リンス、または粉剤を形成することができる。組成物はまた、安定剤および保存剤を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例として、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  （２００５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ，２１ｓｔ  Ｅｄ。
【００９９】
本明細書において使用される、用語「投与すること」、「導入すること」および「移植すること」は、互換的に使用され、所望される部位もしくは組織位置にて、医薬組成物の少なくとも部分的な局在性をもたらす方法または経路による、心筋芽前駆細胞を含む医薬組成物、あるいは本明細書において記載される分化した心筋細胞（例えば、心室心筋細胞）の集団を含む組成物の対象への留置を指す。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路により投与することができ、すなわち、投与は、細胞の少なくとも一部が、所望される標的組織もしくは標的細胞位置に位置する対象における所望される位置または組織へのデリバリーをもたらす。
【０１００】
本明細書において使用される語句「非経口投与」および「非経口投与される」は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与の様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射ならびに注入を含むが、これらに限定されない。本明細書において使用される語句「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は、それらが、動物の全身に入り、したがって、代謝および他の同様のプロセス、例えば、皮下または静脈内投与の対象になるように、心臓組織への直接的以外の、心血管の幹細胞および／またはそれらの子孫および／または化合物および／または他の物質の投与を意味する。
【０１０１】
語句「薬学的に許容可能」を、本明細書において利用して、合理的な恩恵／リスクの比と釣り合った過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに、正当な医療判断の範囲内で適切である化合物、物質、組成物、ならびに／あるいは投薬形態を指す。
【０１０２】
本明細書において使用される語句「薬学的に許容可能な担体」は、対象作用物質を１つの器官、もしくは身体の一部から、別の器官、もしくは身体の一部に運ぶか、または輸送する際に関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入物質のような、薬学的に許容可能な物質、組成物あるいはビヒクルを意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合可能であるという意味で、「許容可能」であるべきである。
【０１０３】
本明細書において使用される用語「薬物」または「化合物」または「試験化合物」は、疾患もしくは状態を処置するか、または予防するか、または制御するために対象に投与される、化学成分もしくは生物学的製品、または化学成分または生物学的製品の組み合わせを指す。化学成分または生物学的製品は、好ましくは、だが必須ではなく、低分子量化合物であるが、より大きな化合物、例えば、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにその修飾物および組み合わせを含むが、これらに限定されない、核酸のオリゴマー、アミノ酸、または炭水化物であってもよい。
【０１０４】
本明細書において使用される用語「移植」は、新たな細胞（例えば、初期化された細胞）、組織（例えば、初期化された細胞から生じた分化した細胞）、または器官の宿主（すなわち移植レシピエントまたは移植対象）への導入を指す。
【０１０５】
本明細書において使用される、用語「マーカーと反応性の作用物質」は、マーカーに結合するかさもなければそれと相互作用する作用物質を指す。好ましくは、作用物質はマーカーに「特異的に」結合するかさもなければそれと相互作用し、そのためそれは他のマーカー以外のタンパク質に結合しないか、それと相互作用しない。
【０１０６】
本明細書において使用される用語「抗体」は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、１つの好ましい実施形態において、ジスルフィド結合により間で結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨとして略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。本明細書において使用される抗体（または単に「抗体部分」）の用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。
【０１０７】
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープについての単一結合特異性および親和性を提示する抗体を指す。
【０１０８】
本明細書において使用される用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を提示し、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および場合により定常領域を有する、抗体を指す。
【０１０９】
本明細書において使用される用語「ヒト化モノクローナル抗体」は、単一結合特異性を提示し、ヒトフレームワークおよび定常領域に合体させた、非ヒト抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）由来の重ならびに軽鎖ＣＤＲ１、２ならびに３を有する、抗体を指す。
【０１１０】
本明細書において使用される用語「キメラモノクローナル抗体」は、単一結合特異性を提示し、別の種由来の定常領域と結び付けられた１つの種由来の重および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
【０１１１】
本明細書において使用される用語「融合タンパク質」は、２つの異なるタンパク質、またはその部分が、互いに作動可能に結合されている、典型的には、組換えＤＮＡテクノロジーを使用して作られた複合タンパク質を指す。非限定的な例は、非免疫グロブリンタンパク質が、免疫グロブリンＦｃ領域に作動可能に結合されている、Ｆｃ融合タンパク質である。
【０１１２】
本発明の様々な態様が、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。
【０１１３】
ヒト心臓の心室前駆細胞
マーカーとしてＩｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）を使用して、ヒト心室前駆細胞（ＨＶＰ）を生成するためのスケーラブルな二段階培養プロトコールが開発されて、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの数十億の純粋なＨＶＰの生成および精製を可能にする細胞表面マーカーが同定された。この頑強な心臓分化プロトコールと組み合わせたＲＮＡ−ｓｅｑ技術を使用して、ｈＰＳＣ分化の異なる時点のゲノムスケールレベルの転写発現を実行した。これらの実験は、ｈＰＳＣに由来したＩｓｌ１＋心筋芽前駆細胞のための細胞表面マーカーとしての、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９の同定につながった。これらの実験は、米国特許出願公開第２０１６／００５３２２９号および米国特許出願公開第２０１６／０１０８３６３号に詳細に記載され、そのそれぞれの全体的内容は、本明細書で明確に、参照により取り込まれる。
【０１１４】
さらに、ＲＮＡ−ｓｅｑ実験は、さらなる潜在的表面マーカー、例えば、ブラキウリを発現する中胚葉細胞のための以下のマーカー：ＦＺＤ１０、ＣＤ４８、ＣＤＩＤ、ＣＤ８Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１３、ＩＣＯＳＬＧ、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＤＣ１およびＨＬＡ−Ａ；ならびに心臓の中胚葉ｍｅｓｐ１陽性細胞のための以下のマーカー：ＣＸＣＲ４、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＦＺＤ２、ＣＤＩＤ、ＣＤ１７７、ＡＣＶＲＬ１、ＩＣＡＭ１、ＬＩＣＡＭ、ＮＧＦＲ、ＡＢＣＧ２、ＦＺＤ７、ＴＮＦＲＳＦ１３ＣおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ならびに心筋前駆細胞のための以下のマーカー：ＰＤＧＦＲＡを同定した。分化の異なる段階の前駆体を単離するために、これらのさらなる心臓前駆体マーカーのいずれも、本発明の方法で使用することができる。
【０１１５】
これらのＨＶＰは、４週ヒト胎児の心室チャンバにおいて同定することができる。さらに、マウスの正常なまたは損傷を受けた心臓への精製ＨＶＰ細胞の移植の後、富化された前駆体細胞はｃＴｎＴ＋心筋細胞を生成し、前駆体細胞の心筋原的性質を実証した。これらのインビボ移植研究では、正常な心臓と比較して、心筋芽前駆細胞を移植した損傷心臓においてより大きな移植片が観察され、心筋細胞再生のための心筋芽前駆細胞の能力を実証した。
【０１１６】
本明細書で提供される心室前駆細胞の移植は、移植の５カ月後までに力を発生すること、カテコールアミンに応答すること、自動性を失うこと、Ｔ管を含有することおよび成体桿状細胞の肥大性成長を提示することができる、大きなサイズ（例えば、マウス心臓のサイズの２倍）の純粋で、機能的および成熟したヒト心室筋器官を生成する。したがって、ヒト心室生成は、本明細書で提供される精製ＨＶＰによって促進される細胞自律経路を通して達成することができる。本明細書で提供されるこれらのＨＰＶは、マウス−ヒトキメラにおけるヒト心疾患の新しいインビボモデル、および心疾患のための器官に対する器官の再生治療戦略の開発を可能にする。
【０１１７】
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を含有する培養物の生成
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を含む心筋前駆細胞を含有する培養物は、ＨＶＰの生成に適切な培養条件下でのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の培養によって得ることができる。培養条件および適する出発細胞の例示的なセットは、実施例１および実施例１０に詳細に記載され、本明細書ではヒト心室前駆体生成（ＨＶＰＧ）プロトコールとも呼ばれる。適するｈＰＳＣ出発細胞には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）およびＥＳ細胞系などのヒト胚性幹細胞が含まれる。プロトコールのために、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達はｈＰＳＣにおいて先ず活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ５５６８１３−３９−９；例えばＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから市販されている）とのインキュベーションによって達成される。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ１２４３２４３−８９−１；例えばＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＴｏｃｒｉｓから市販されている）とのインキュベーションによって達成される。Ｇｓｋ３阻害剤は心臓の中胚葉分化を促進するために使用されるが、一方、Ｐｏｒｃｎ阻害剤は中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強するために使用される。
【０１１８】
したがって、ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を含む培養物を生成する方法は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４を含む培地においてヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を少なくとも２４時間、より好ましくは２日間または３日間培養すること、その後、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９を含む（およびＧｓｋ３阻害剤を欠く）培地においてｈＰＳＣを少なくとも４８時間培養してＨＶＰを生成することを含む。実験は、ＣＨＩＲ−９８０１４による２４時間の処置の後、ｈＰＳＣの９９％より多くが中胚葉マーカーブラキュリを発現したこと、および、ＣＨＩＲ−９８０１４による処置の３日後に、分化した細胞の９５％より多くが心臓中胚葉の印であるＭｅｓｐ１を発現したことを示した。さらに、Ｗｎｔ−Ｃ５９による４８時間の処置は、中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強した。
【０１１９】
従って、Ｇｓｋ３およびＰｏｒｃｎ阻害剤の使用のタイミングに関して、典型的には、培養の０日目に、ｈＰＳＣは、Ｇｓｋ３阻害剤と共に培養され、培養の３日目に、培地を変更して、Ｇｓｋ３阻害剤を取り除き、次に、細胞は、培養の５日目の間中、Ｐｏｒｃｎ阻害剤を含有する培地と共に培養される。ＨＶＰ生成は、培養中の５〜７日の間（包括的）で最適であり、培養の６日目にピークがある。培養条件ならびにＧｓｋ３およびＰｏｒｃｎ阻害剤の使用のタイミングについての他の非限定的な、典型的な詳細は、実施例１および実施例１０において詳細に記載される。
【０１２０】
したがって、本明細書において使用される、「５〜７日目の心筋前駆細胞」または「６日目の心筋前駆細胞」の培養物は、ｈＰＳＣが０日目から３日目までのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化（例えば、Ｇｓｋ３阻害剤との培養による）と、その後の３日目から５日目までのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害（例えば、Ｐｏｒｃｎ阻害剤との培養による）に付され、そのため５、６および７日目に培養物がＨＶＰを含有する培養物を指す。
【０１２１】
ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法
一態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を単離する方法に関係する。実施例１３に記載の通りに、心筋前駆細胞の５〜７日目の培養物からＨＶＰを単離するのに十分である、ヒト多能性幹細胞の１つまたは複数の細胞表面マーカー（陰性マーカー）を使用した、陰性選択アプローチを開発した。したがって、一実施形態では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法であって、
心臓の心室前駆細胞を含む５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を、ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーと反応性の１つまたは複数の第１の作用物質と接触させること；および
第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞を単離する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、心筋前駆細胞を生成する条件下で培養して、５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を得ること；
５〜７日目の心筋前駆細胞の培養物を、ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーと反応性の１つまたは複数の第１の作用物質と接触させること；および
第１のマーカー非反応性の陰性細胞を反応性細胞から分離し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞を単離すること
を含む方法に関係する。
【０１２３】
一実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。
【０１２４】
一実施形態では、培養物は、ＨＶＰを含む心筋前駆細胞の６日目の培養物である。ＨＶＰを含む心筋前駆細胞の５〜７日目の培養物または６日目の培養物を、上記の通り調製することができる。
【０１２５】
ＨＶＰを単離するための方法のある特定の実施形態では、陰性選択工程に加えて陽性選択工程を組み込み、それによってＨＶＰを単離することができる。したがって、ある特定の実施形態では、培養物を、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーに反応性の１つまたは複数の第２の作用物質とさらに接触させ；
第２のマーカー反応性の陽性細胞を、非反応性細胞から分離する。
【０１２６】
一実施形態では、１つまたは複数の第１の作用物質との接触の前に、培養物を、１つまたは複数の第２の作用物質と接触させる。別の実施形態では、１つまたは複数の第１の作用物質との接触の後に、培養物を、１つまたは複数の第２の作用物質と接触させる。別の実施形態では、１つまたは複数の第１の作用物質との接触と同時に、培養物を、１つまたは複数の第２の作用物質と接触させる。
【０１２７】
一実施形態では、第２のマーカーは、ＬＩＦＲである。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＦＺＤ４である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＬＩＦＲである。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＪＡＧ１である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＦＺＤ４である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９である。
【０１２８】
一実施形態では、少なくとも１つの第２のマーカーは、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される２つのマーカーである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＦＺＤ４およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１およびＦＺＤ４である。
【０１２９】
同じく実施例に記載の通り、Ｉｓｌｅｔ１は、心臓の心室前駆細胞によってＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３および／またはＴＮＦＳＦ９と共発現されるマーカーであり、したがって、両方のマーカー（Ｉｓｌｅｔ１ならびにＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３および／またはＴＮＦＳＦ９から選択される別のマーカー）は、これらの前駆体細胞の単離を促進するための陽性マーカーとして使用することができる。したがって、上記の方法の別の実施形態では、ヒト細胞の培養物を、Ｉｓｌｅｔ１に反応性の第３の作用物質とも接触させ；Ｉｓｌｅｔ１／第１のマーカー反応性の陽性細胞を、非反応性細胞から分離する。ヒト細胞の培養物は、第１のマーカーに反応性の第１の作用物質およびＩｓｌｅｔ１に反応性の第３の作用物質と同時に接触させることができる。あるいは、ヒト細胞の培養物は、第１のマーカーに反応性の第１の作用物質と接触させる前にＩｓｌｅｔ１に反応性の第３の作用物質と接触させることができる。あるいは、ヒト細胞の培養物は、Ｉｓｌｅｔ１に反応性の第３の作用物質と接触させる前に、第１のマーカーに反応性の第１の作用物質と接触させることができる。
【０１３０】
好ましい実施形態では、第１のマーカーに反応性の第１の作用物質は、モノクローナル抗体などの抗体である。非限定的な例には、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンまたはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）への結合特異性を有する、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化またはキメラのモノクローナル抗体が含まれる。第１のマーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体は、当該技術分野において市販されている（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｂｃａｍ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。さらに、第１のマーカーに特異的に結合する抗体は、第１のマーカーを抗原として使用して、当該技術分野において十分に確立されている標準の技術を使用して調製することができる。
【０１３１】
好ましい実施形態では、第２のマーカーに反応性の第２の作用物質は、モノクローナル抗体などの抗体である。非限定的な例には、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９への結合特異性を有する、マウス、ウサギ、ヒト、ヒト化またはキメラのモノクローナル抗体が含まれる。ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３またはＴＮＦＳＦ９に特異的に結合するモノクローナル抗体は、当該技術分野において市販されている（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｂｃａｍ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。さらに、第２のマーカーに特異的に結合する抗体は、第２のマーカーを抗原として使用して、当該技術分野において十分に確立されている標準の技術を使用して調製することができる。
【０１３２】
別の実施形態では、第１のマーカーに反応性の第１の作用物質または第２のマーカーに反応性の第２の作用物質は、マーカーのリガンド、例えば可溶性リガンドまたは可溶性リガンド融合タンパク質である。例えば、Ｊａｇｇｅｄ１リガンドの非限定的な例には、Ｎｏｔｃｈ−１およびＮｏｔｃｈ−２が含まれる。好ましくは、Ｊａｇｇｅｄ１リガンドは、Ｎｏｔｃｈ−１である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４リガンドの非限定的な例には、ネスチンタンパク質およびＷｎｔ受容体が含まれる。ＬＩＦＲリガンドの非限定的な例には、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）およびカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）が含まれる。好ましくは、ＬＩＦＲリガンドは、ＬＩＦである。ＦＧＦＲ３リガンドの非限定的な例には、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）および線維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ９）が含まれる。ＴＮＦＳＦ９リガンドの非限定的な例は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７；ＴＮＦＲＳＦ９）である。可溶性リガンドは、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば膜貫通および細胞質ドメインの欠失によって調製することができる。可溶性リガンドは、同じく標準的組換えＤＮＡ技術を使用して可溶性リガンド融合タンパク質に形質転換することができる。融合パートナーが融合タンパク質の分離を促進する結合性部分を含むことができる、融合タンパク質を調製することができる。
【０１３３】
同様に、Ｉｓｌｅｔ１に反応性の作用物質は、例えば、抗Ｉｓｌｅｔ１抗体（例えば、モノクローナル抗体）またはＩｓｌｅｔ１リガンド融合タンパク質などのＩｓｌｅｔ１リガンドであってよい。
【０１３４】
反応性細胞から第１のマーカー非反応性の陰性細胞を分離するために、当該技術分野において公知の様々な異なる細胞分離技術の１つを使用することができる。一実施形態では、第１のマーカー非反応性の陰性細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって反応性細胞から分離される。ＦＡＣＳ技術および細胞を分離するためにそれを実行する装置は、当該技術分野において十分に確立されている。細胞分離のためにＦＡＣＳが使用されるとき、好ましくは使用される第１のマーカーに反応性の第１の作用物質は、第１のマーカーに特異的に結合する蛍光標識モノクローナル抗体である。代わりに、細胞分離は、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって達成することができる。細胞分離のためにＭＡＣＳが使用されるとき、好ましくは使用される第１のマーカーに反応性の第１の作用物質は、第１のマーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ナノ粒子である。代わりに、本発明の心臓の心室前駆細胞を単離する方法に、ＩｓｏＲａｆｔアレイおよびＤＥＰＡｒｒａｙ技術を限定されずに含む、当該技術分野において公知である他の単一細胞ソーティング方法を適用することができる。
【０１３５】
非反応性細胞から第２のマーカー反応性の陽性細胞を分離するために、当該技術分野において公知の様々な異なる細胞分離技術の１つを使用することができる。一実施形態では、第２のマーカー反応性の陽性細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって非反応性細胞から分離される。細胞分離のためにＭＡＣＳが使用されるとき、好ましくは使用される第２のマーカーに反応性の第２の作用物質は、第２のマーカーに特異的に結合するモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ナノ粒子である。代わりに、細胞分離は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって達成することができる。ＦＡＣＳ技術および細胞を分離するためにそれを実行する装置は、当該技術分野において十分に確立されている。細胞分離のためにＦＡＣＳが使用されるとき、好ましくは使用される第２のマーカーに反応性の第２の作用物質は、第２のマーカーに特異的に結合する蛍光標識モノクローナル抗体である。代わりに、本発明の心臓の心室前駆細胞を単離する方法に、ＩｓｏＲａｆｔアレイおよびＤＥＰＡｒｒａｙ技術を限定されずに含む、当該技術分野において公知である他の単一細胞ソーティング方法を適用することができる。
【０１３６】
第１のマーカーに反応性の第１の作用物質および第２のマーカーに反応性の第２の作用物質と接触させる前に、心筋前駆細胞の生成に至る条件下でヒト多能性幹細胞を培養することができる。心筋前駆細胞を生成するための培養条件は、当該技術分野において記載され（例えば、Lian,  X.ら（２０１２年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA１０９巻：Ｅ１８４８〜１８５７頁；米国特許出願公開第２０１３０１８９７８５号を参照）、実施例１および図１に、ならびに実施例１０にも詳細に記載されている。一般的に、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達はｈＰＳＣにおいて先ず活性化され、その後インキュベーション期間が続き、その後Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ５５６８１３−３９−９）とのインキュベーションによって達成される。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤、好ましくはＷｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ１２４３２４３−８９−１）とのインキュベーションによって達成される。本発明の方法における使用のため適切なｈＰＳＣは、１９−１１−１、１９−９−７または６−９−９細胞のような、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：７９７−８０１）、およびＥＳ０３細胞（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはＨ９細胞のようなヒト胚性幹細胞株（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７）を含む。心筋芽前駆体を生成するための適切な培養培地は、Ｅ８培地、ｍＴｅＳＲ１培地およびインスリンを除いたＲＰＭＩ／Ｂ２７、それぞれが、実施例１および／または実施例１１においてさらに記載される。
【０１３７】
好ましくは、ヒト心筋芽前駆細胞は、心室前駆細胞である。心筋芽前駆細胞を心室系統に偏らせる、培養条件が、ここで、決定されている。これらの心室心筋芽前駆細胞は、ＲＰＭＩ／Ｂ２７培地において培養することができ、それらは、心室筋細胞にさらに分化することができる。それらが、インビトロで心室細胞に分化する（例えば、下で記載されるＭＬＣ２ｖマーカーを発現する）ように、インビトロでの心臓の心室前駆細胞を培養するための好ましい培地は、心臓の前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２０％ノックアウト血清代替物、２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸおよび１００μｇ／ｍｌビタミンＣを補填した高度ＤＭＥＭ／Ｆ１２）である。
【０１３８】
分化した心臓細胞の公知のマーカーを使用して、心筋前駆細胞の分化により生成される細胞のタイプを同定することができる。例えば、心臓のトロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を、心筋細胞分化のマーカーとして使用することができる。ＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）を、内皮細胞のマーカーとして使用することができる。平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を、平滑筋細胞のマーカーとして使用することができる。ＭＬＣ２ｖを、心室筋細胞のマーカーとして使用することができる。未成熟心室筋細胞と心房性筋細胞の両方において発現される、ＭＬＣ２ａを、それらの細胞タイプについてのマーカーとして使用することができる。加えて、心房性筋細胞において特異的に発現される、サルコリピンを、心房性筋細胞についてのマーカーとして使用することができる。心室において主に、心房において、比較的低い程度まで発現される、ホスホランバンをまた、マーカーとして使用することができる。心房性心筋細胞において発現される、Ｈｅｙ１とも呼ばれる、ヘアリー関連転写因子１（ＨＲＴ１）を、心房性心筋細胞についてのマーカーとして使用することができる。心室心筋細胞において発現される、ＨＲＴ２（Ｈｅｙ２）を、心室心筋細胞についてのマーカーとして使用することができる。加えて、ＩＲＸ４は、発生の全てのステージ中で心室の制限された発現パターンを有し、したがって、心室系統マーカーとして使用することができる。要約すると、心室において発現され、したがって、適切な心室マーカーである、遺伝子は、ＭＬＣ２ｖ、ＩＲＸ４およびＨＲＴ２であり、一方、心房において発現され、したがって、適切な心房性マーカーである遺伝子は、ＭＬＣ２ａ、ＨＲＴ１、サルコリピンおよびＡＮＦ（心房性ナトリウム利尿因子）である。心室分化の好ましいマーカーは、ＭＬＣ２ｖである。
【０１３９】
ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団
別の態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団ならびにかかる前駆体の単離されたクローン集団を得る方法を提供する。本発明は、１０億またはそれより多くの細胞のクローン集団を達成することができるように、心臓の心室前駆細胞の拡大および増殖を可能にする。かかる多数に心臓の心室前駆細胞をクローンで拡大させる能力は、心機能を増強するためのこれらの細胞のインビボでの首尾よい使用のために必要な特性であるが、その理由は、かかる使用が１０億またはそれより多くのオーダーで細胞を必要とするからである。
【０１４０】
したがって別の態様では、本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団を得る方法であって、
単一のヒト心臓の心室前駆細胞を単離することであって、単一のヒト心臓の心室前駆細胞は、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、単離すること；ならびに
第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞を、細胞が少なくとも１×１０９細胞に拡大し、それによってヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団が得られるような条件下で培養すること
を含む方法を提供する。
【０１４１】
一実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。
【０１４２】
一実施形態では、第２のマーカーは、ＬＩＦＲである。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＦＺＤ４である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３である。別の実施形態では、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＬＩＦＲである。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＪＡＧ１である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＦＺＤ４である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０であり、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９である。
【０１４３】
一実施形態では、少なくとも１つの第２のマーカーは、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される２つのマーカーである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＦＺＤ４およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＦＧＦＲ３およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＴＮＦＳＦ９およびＬＩＦＲである。一実施形態では、第２のマーカーは、ＪＡＧ１およびＦＺＤ４である。
【０１４４】
好ましい実施形態では、単一のヒト心臓の心室前駆細胞は、最初の培養時にＩｓｌｅｔ１陽性、Ｎｋｘ２．５陰性およびｆｌｋ１陰性である。実施例にさらに記載されるように、かかる単一の細胞は、心筋芽前駆体の生成を促進する条件下での培養の概ね６日目に得ることができる。細胞が心室マーカーＭＬＣ２ｖを発現するように、ヒト心臓の心室前駆体のクローン集団をさらに培養し、インビトロで分化させることができる。
【０１４５】
好ましくは、単一のヒト心臓の心室前駆細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、または両者の組合せによって単離される。一実施形態では、第１のマーカーについて陰性である細胞はＭＡＣＳ細胞によって単離され、ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される第２のマーカーについて陽性である細胞はＦＡＣＳによって単離される。クローン増大のために、生じた第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性の集団から、単一のＨＶＰを次に単離することができる。あるいは、当該技術分野において公知でありおよび／または本明細書に記載される他の細胞ソーティング方法によって、細胞を単離することができる。
【０１４６】
好ましくは、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、第１のマーカーに反応性の１つまたは複数の第１の作用物質、および第２のマーカーに反応性の１つまたは複数の第２の作用物質、例えば先に記載される第１のマーカーまたは第２のマーカーに反応性のモノクローナル抗体または他の作用物質を使用して単離される。
【０１４７】
好ましい実施形態では、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、先に記載される心臓前駆体培養（ＣＰＣ）培地において培養される。
【０１４８】
好ましい実施形態では、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、細胞が、心室分化に偏るような条件下で培養される。好ましい培養条件には、ＣＰＣ培地における培養が含まれる。
【０１４９】
様々な実施形態では、単一の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞は、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、少なくとも６×１０９細胞、少なくとも７×１０９細胞、少なくとも８×１０９細胞、少なくとも９×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞に拡大させることができる。
【０１５０】
したがって、本発明は、少なくとも１×１０９個のヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）のクローン集団も提供し、ここで、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である。一実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０である。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、第１のマーカーは、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、ＣＤ２４、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｅ−カドヘリン、ポドカリキシンおよびアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、およびその組合せからなる群から選択される。ＨＶＰのクローン集団は、ヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団を得るための本発明の方法によって入手できるかまたは得られる。様々な実施形態では、第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のヒト心臓の心室前駆細胞のクローン集団は、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞、少なくとも６×１０９細胞、少なくとも７×１０９細胞、少なくとも８×１０９細胞、少なくとも９×１０９細胞または少なくとも１０×１０９細胞を含む。インビトロでの心室系統への前駆体細胞の分化は、心室系統の方へ偏らせるための本明細書に記載される条件下での培養によって達成することができる。さらに、インビボでの心臓の心室前駆細胞の移植は、インビボでの心室分化に至る。
【０１５１】
本発明は、心臓の心室前駆細胞のクローン集団を含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、典型的には、無菌であり、医薬投与に適した緩衝液、培地、賦形剤などを含み得る。１つの実施形態において、クローン集団を含む医薬組成物は、３次元（３Ｄ）基質上に製剤される。３Ｄ基質上に製剤された組成物は、心筋修復のためインビボに移植することができる心筋細胞パッチの形成に特に好ましい。さらに、組成物は、Ｄｏｍｉａｎ，Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：４２６−４２９において記載される薄い筋フィルム（ＭＴＦ）のような、細胞の２次元（２Ｄ）シートに製剤することができる。細胞組織のかかる２Ｄシートはまた、心筋修復のためインビボに移植することができる心筋細胞パッチの形成において使用することができる。
【０１５２】
インビボ組織操作
ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）が、ヌードマウスにおいて腎被膜下に移植された、実施例６および実施例７において記載される、インビボ移植研究は、腎被膜の表面上の成熟、機能的、ヒト心室筋の巨大な壁に自発的にアセンブルするＨＶＰの能力を証明する。血管新生は、マウス脈管構造を心室筋壁と呼ぶことにより、パラクリン経路を介して生じ、一方、基質は、細胞の自律的経路を介して前駆体自体から生成される。ＨＶＰが、正常マウス心臓に移植される、実施例８において記載される、インビボ心筋内移植研究は、ＨＶＰが、それらが拡大し、続いて、分化し、心外膜の表面上のヒト心室筋の壁に成熟する、心外膜表面に自発的に遊走することを証明する。まとめると、これらの研究は、ヒト心室形成が、精製されたＨＶＰを介してインビボで完全な細胞の自律的経路を介して生じることができ、これにより、器官に対する器官のインビボ組織操作においてそれらを使用することが可能となることを示す。
【０１５３】
ヒト心室心筋は、再生について制限された能力を有し、その大部分が、年齢１０歳を超えると失われる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６１：１５６６−１５７５）。したがって、心筋修復再生を生成するための新規ストラテジー、および心臓損傷中の組織操作アプローチは、再生生物学および医薬において熱心な研究の対象であった（Ｓａｈａｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＥＭＢＯ  Ｊ．３４：７１０−７３８；Ｓｅｇｅｒｓ，Ｖ．Ｆ．Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｒ．Ｔ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５１：９３７−９４２）。任意の実質器官の組織操作中に組織的血管新生および基質形成を達成する必要が与えられると、仮説は、インビボでのインタクトな３−Ｄ実質器官の形成が、血管細胞および／または導管、ならびに収縮力のアライメントおよび生成を可能にするであろう生体材料および／または脱細胞化基質の添加を最終的に必要とするであろうということであった（Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｎ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２０：８５７−８６９；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｒｅｖ．２０：１−１６）。機能的実質器官の形成を達成するためのこれらの様々な成分の添加の複雑さは、臨床的実施に対してこれを減らすための試みを複雑にした（Ｗｅｂｂｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４３：６４１−６５６）。ｈＰＳＣは、今まで、多いに有望であったが、任意の哺乳類の系において、心臓の表面上で、インビボで純粋な、血管新生された、完全な機能的、かつ成熟３Ｄヒト心室筋器官を構築することは可能ではなかった（Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１３：２４５−２６７）。
【０１５４】
ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞株のいずれかの再生可能な供給源から数十億の精製されたＨＶＰを生成する能力は、進行した心不全の設定における機能的心室筋の生成への新規アプローチを表す。前駆体は、心筋内注射によりデリバリーされ、次に、それらが拡大し、分化し、前駆体マーカーを失う、心外膜表面に自己遊走することができる。数週間の経過を終え、細胞は、細胞サイクルを出て、Ｔ管の形成、カテコールアミン応答性、自動性の喪失、整列したサルコメア（sarcomenric）構造を有する成体の杆体形の立体構造、およびｈＰＳＣから分化した心筋細胞に由来する他の心筋パッチに匹敵する力を生成する能力を含む、成熟心室心筋の幾つかの独立したマーカーを提示する成体の杆体形の細胞を形成するよう進む（Ｔｕｌｌｏｃｈ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０９：４７−５９）。この細胞の自律的経路のスケーラビリティは、ヒト心室フリー壁に対応するレベルに近づく、厚さ１．５ｃｍを超える組み合わされた厚さを有するヒト心室筋の異所性生成が可能になった（Ｂａｓａｖａｒａｊａｉａｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．４１：７８４−７８８）。
【０１５５】
後のステージにある成体の心臓前駆体の大部分の部位である、心外膜の微小環境に遊走する能力は、ＨＶＰの固有の特性であり、心室形成中に心室のコンパクトなゾーンの拡大中にこれらの細胞の正常微小環境を模倣する。従前の研究は、血管透過性における急性虚血性損傷および崩壊の生成が、比較的少数のＥＳ細胞由来の心筋細胞の損傷された心筋への移植に必須であり（ｖａｎ  Ｌａａｋｅ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１：９−２４；Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１０１５−１０２４）、そのときでさえ、生存率は低い（＜５％）（Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｍｕｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７３：３２６−３３５；Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６７：６６３−６７１）ことを示した。急性虚血性損傷の非存在下で心外膜の表面上の広範な心室パッチを形成する心筋内ＨＶＰの能力は、さらなる生体材料、細胞、または外来遺伝子および／もしくはＲＮＡの導入を必要とすることなく、横に広がった心筋症についての新規治療ストラテジーを提供する。
【０１５６】
より後のステージの前駆体が、心臓または非心臓のいずれかの状況における３次元心室組織の形成についての能力を提示せず、これにより、関与する心室系統を生成することの重要性を強調し、ならびに心室形成の特定のステージにある特定の心室前駆体を精製するので、インビボ正常心臓の心外膜の表面上で３Ｄ心室筋壁を形成する能力は、ＩＳＬ１／ＦＺＤ４／ＪＡＧ１／ＬＩＦＲ／ＦＧＦＲ３／ＴＮＦＳＦ９陽性心室前駆体の固有の特性である。
【０１５７】
したがって、本発明は、本明細書に記載されるＨＶＰを使用してインビボでヒト心室組織を生成する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、非ヒト動物の器官に第１のマーカー陽性／第２のマーカー陰性のＨＶＰを移植すること、およびヒト心室組織が生成されるように前駆体をインビボで成長させることを含む。好ましくは、非ヒト動物は、それがヒト前駆体細胞に対して免疫応答を開始することができないように免疫不全である。一実施形態では、非ヒト動物は、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスまたは免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅから市販されている）などのマウスである。一実施形態では、器官は、腎臓である（例えば、細胞は腎臓嚢の下に移植される）。別の実施形態では、器官は、心臓である。様々な実施形態では、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞が移植される。
【０１５８】
移植のためのＨＶＰを得るために、本明細書に記載されるように、ＨＶＰの生成に至る条件下でヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）をインビトロで培養することができる（本明細書ではＨＶＰＧプロトコールと呼ばれる）。インビトロ培養後にＨＶＰを移植するタイミングに関して、最適な心室組織生成のため、細胞は、移植の時にＨＶＰにより発現される細胞マーカーに基づき定義され、ＨＶＰＧプロトコールの０日目として定義される、培養の開始後の日数にて決定され得る、ステージにて移植されるべきである。１つの実施形態において、細胞は、中胚葉マーカーＭＥＳＰ１のピーク発現として定義され得る、心臓中胚葉形成のピークの後に移植される。典型的には、ＭＥＳＰ１発現は、培養の２日目〜４日目（包括的）であり、３日目にピークがある。１つの実施形態において、細胞は、ピークＩｓｌｅｔ−１発現に対応する時に移植される。典型的には、Ｉｓｌｅｔ１は、培養の４日目〜８日目（包括的）であり、培養の６日目にピークがある。１つの実施形態において、細胞は、ＮＫＸ２．５発現のピークの前に移植される。典型的には、ＮＫＸ２．５発現は、培養の６日目に始まり、培養の１０日目にピークがあり、次に、以後維持される。１つの実施形態において、細胞は、下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１のピーク発現前に、移植される。典型的には、これらの下流遺伝子は、培養の５日目〜１５日目（包括的）に発現され、培養の８日目にピークがある。１つの実施形態において、細胞は、分化した収縮性タンパク質遺伝子の発現前に、移植される。典型的には、収縮性タンパク質遺伝子（ＴＮＮＴ２およびＭＹＨ６を含む）の発現は、培養の１０日目以降に始まる。ある種の実施形態において、細胞は、上述のマーカーパターンの２つ、３つまたは４つが存在するときの時点で、移植される。別の実施形態において、細胞は、上述のマーカーパターンの全５つが存在するときの時点で、移植される。１つの実施形態において、細胞は、培養の４日目〜８日目（包括的）に移植される。より好ましい実施形態において、細胞は、培養の５日目〜７日目（包括的）に移植される。最も好ましい実施形態において、細胞は、培養の６日目に移植される。
【０１５９】
移植された細胞は、所望されるサイズ、量または厚さの心室組織の生成を可能にするのに適切な期間、非ヒト動物において成長させることができる。様々な実施形態において、細胞は、１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月間成長させることができる。方法は、細胞成長および心室組織への分化の後、心室組織を非ヒト動物から回収することをさらに含み得る。
【０１６０】
心機能を増強する方法
本発明の心室前駆細胞を、インビボで使用して、細胞を心臓に直接移植することにより、心機能を増強することができる。ＨＶＰが、全３つのタイプの心臓系統細胞（心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞）に分化する能力を有することは、ここで示されている（実施例３を参照）。さらに、心室系統に向けてバイアスをかける条件下で培養されたとき、ＨＶＰは、インビボの天然の心室環境に移植されるとき、主に心室筋表現型に適合することが今や示され、これは、これらの前駆細胞が、心室環境を「認識し」、インビボで適切に応答し、分化することを示している。心室環境に対する損傷は、心臓の疾患および障害における障害された心機能の大きな原因となるので、本発明の心室前駆細胞を使用して心室筋細胞を回復させる能力は、当該技術分野における大きな進歩を表す。
【０１６１】
したがって別の態様では、本発明は、対象において心機能を増強する方法であって、本発明の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性の心臓の心室前駆細胞のクローン集団を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、クローン集団は、対象の心臓に直接的に投与される。より好ましくは、クローン集団は、対象の心臓の心室領域に直接的に投与される。一実施形態では、対象に投与される医薬組成物は、３次元マトリックス上に製剤化されたクローン集団を含む。
【０１６２】
対象において心機能を増強する本発明の方法は、心臓への損傷、または低減もしくは障害された心機能を含む様々な臨床的状況において使用することができる。かかる臨床的状況の非限定的な例は、心筋梗塞を患っている対象、および先天性心臓障害を患っている対象を含む。好ましい心血管状態、疾患または障害の例は、冠動脈疾患および急性冠症候群を含む。
【０１６３】
したがって別の態様では、本発明は、対象において心血管の状態、疾患または障害を処置する方法であって、本発明の第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性の心臓の心室前駆細胞のクローン集団を含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。心血管の状態、疾患または障害の処置のために、心臓の心室前駆細胞の治療的有効量を投与することができる。好ましい心血管の状態、疾患または障害の例には、冠状動脈疾患および急性の冠動脈症候群が含まれる。
【０１６４】
インビトロでの心臓心室前駆細胞の使用方法
本発明の心臓心室前駆細胞は、心臓の成熟および分化の様々な態様の研究において、特に、心臓の成熟および分化のプロセスに関与する細胞シグナル伝達経路ならびに生物学的メディエータの同定において、インビトロで使用することができる。
【０１６５】
さらに、本発明のＨＶＰは、心臓系統に関与し、さらに、心室分化に向けてバイアスをかけられるので、これらの前駆細胞はまた、試験化合物の心毒性を評価するのに有用である。全ての可能性のある新規薬物および治療剤は、それらが、ヒトにおける使用について安全であるとみなされる前に、心臓細胞に対するそれらの毒性について評価されなければならない。したがって、インビトロでの培養システムにおいて心毒性を評価する能力は、非常に有利である。
【０１６６】
したがって別の態様では、本発明は、試験化合物の心臓毒性についてスクリーニングする方法であって、
ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を提供することであって、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、提供すること；
ＨＶＰを試験化合物と接触させること；ならびに
ＨＶＰへの試験化合物の毒性を測定すること
を含み、
ＨＶＰへの試験化合物の毒性は、試験化合物の心臓毒性を示す、方法を提供する。
【０１６７】
好ましい実施形態では、ＨＶＰは、本明細書に記載される方法によって細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、第１のマーカーまたは第２のマーカーに特異的に結合する抗体を使用して、心筋前駆細胞を含む細胞培養物から第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のＨＶＰを分離することによって細胞は単離される。好ましくは、細胞は、本明細書に記載されるようにＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。さらに別の実施形態では、試験化合物と接触させる前にＨＶＰはさらに培養され、ＭＬＣ２ｖ＋心室細胞に分化させられる。
【０１６８】
細胞に対する試験化合物の毒性は、細胞生存能もしくは他の生理学的機能を評価する様々な異なる方法の１つまたは複数により評価することができる。好ましくは、細胞生存能に対する試験化合物の効果は、標準的細胞生存能アッセイを使用して測定され、ここで、試験化合物の存在下での低減された細胞生存能は、試験化合物の心毒性の指標である。加えてまたはあるいは、細胞成長を、測定することができる。加えてまたはあるいは、細胞接着、細胞シグナル伝達、表面マーカー発現、遺伝子発現などのような、生理学的機能の他の指標を、測定することができる。同様に、生理学的機能のこれらの指標のいずれかに対する試験化合物の負の効果は、試験化合物の心毒性の指標である。
【０１６９】
本発明は、ヒト心臓の心室前駆細胞の分化をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を提供することであって、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、提供すること；
試験化合物の存在下または不在下において細胞を培養すること；
試験化合物の存在下または不在下において細胞の分化を測定すること；ならびに
試験化合物の不在下における分化と比較してヒト心臓の心室前駆細胞の分化をモジュレートする試験化合物を選択し、それによって、ヒト心臓の心室前駆細胞の分化をモジュレートする化合物を同定すること
を含む方法をさらに提供する。
【０１７０】
１つの実施形態において、試験化合物は、ヒト心臓の心室前駆細胞分化を刺激する。別の実施形態において、試験化合物は、ヒト心臓の心室前駆細胞分化を刺激する。細胞の分化は、例えば、本明細書において記載される通り、培養された細胞上に出現する分化マーカーの発現の測定により、測定することができる。
【０１７１】
好ましい実施形態では、ＨＶＰは、本明細書に記載される方法によって細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、第１のマーカーまたは第２のマーカーに特異的に結合する抗体を使用して、心筋前駆細胞を含む細胞培養物から第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のＨＶＰを分離することによって細胞は単離される。好ましくは、細胞は、本明細書に記載されるようにＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。
【０１７２】
本発明は、ヒト心室心筋細胞機能をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
ヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を提供することであって、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、提供すること；
ヒト心室心筋細胞を生成する条件下で試験化合物の存在下または不在下において細胞を培養すること；
試験化合物の存在下または不在下においてヒト心室心筋細胞の機能を測定すること；ならびに
試験化合物の不在下における機能と比較してヒト心室心筋細胞機能をモジュレートする試験化合物を選択し、それによって、ヒト心室心筋細胞機能をモジュレートする化合物を同定すること
を含む方法をさらに提供する。
【０１７３】
１つの実施形態において、試験化合物は、ヒト心室心筋細胞機能を刺激する。別の実施形態において、試験化合物は、ヒト心室心筋細胞機能を阻害する。細胞の機能は、例えば、Ｔ管の形成、成体の杆体形の心室心筋細胞の獲得、および電気的刺激に応答して力を生成する能力を含むが、これらに限定されない、心室細胞機能の任意の適切な指標の測定により、測定することができる。心室細胞機能のかかる指標を測定する適切なアッセイは、当該技術分野において公知である。
【０１７４】
好ましい実施形態では、ＨＶＰは、本明細書に記載される方法によって細胞を単離することによって提供される。特に好ましい実施形態では、第１のマーカーまたは第２のマーカーに特異的に結合する抗体を使用して、心筋前駆細胞を含む細胞培養物から第１のマーカー陰性／第２のマーカー陽性のＨＶＰを分離することによって細胞は単離される。好ましくは、細胞は、本明細書に記載されるようにＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用して単離される。
【０１７５】
ヒト心室前駆細胞を使用したインビボ動物モデル
心臓の疾患のモデルに基づくヒトｉＰＳおよびＥＳ細胞の発生は、開発および発見中に心血管薬物における新たな限界を開放する。しかしながら、これまで、これらのシステムは、培養された細胞システムにおいて２Ｄ構造物に基づく制限を有していた。加えて、細胞の胎児性および未成熟特性は、成体の心臓のそれらの有用性および忠実度を制限する。ヒト心臓疾患、特に、心不全は、腎臓のような、治療標的についての公知の部位である環境、ホルモン、および他の鍵となる器官により影響される、複雑な、多機能の、多器官の疾患である。異所性、またはインタクトな正常マウス心臓の表面上のいずれかに成熟した機能的ヒト心室器官を構築する能力は、通常、心室性不整脈、収縮力の生成、線維症、および再生の可能性のような、成熟ヒト心室筋チャンバにおいてアッセイされるのみであり得る研究を可能にする新規インビボでモデルを始める。したがって、インビトロでの組織培養システムの外側、かつインビボでの心不全の状況において直接的に、ヒト心臓の疾患を研究するための開始は、ここで明確に可能である。
【０１７６】
したがって、ヒト心室前駆細胞をまた使用して、インビボで試験化合物の心毒性を決定するため、またはインビボでヒト心臓の組織分化もしくは機能を調節する化合物を同定するためのような、ヒト心臓の組織機能のインビボでの評価、および化合物のインビボでのスクリーニングを可能にする動物モデルを創出する。したがって、本発明は、本明細書において記載されるＨＶＰを使用して、インビボでのヒト心室組織に対する試験化合物の効果を試験する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、
非ヒト動物の器官にヒト心臓の心室前駆細胞（ＨＶＰ）を移植することであって、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、移植すること；
ヒト心室組織が生成されるように前駆体をインビボで成長させること；
非ヒト動物に試験化合物を投与すること；ならびに
非ヒト動物においてヒト心室組織に及ぼす試験化合物の効果を評価すること
を含む。
【０１７７】
別の実施形態では、本方法は、
非ヒト動物に試験化合物を投与することであって、非ヒト動物は非ヒト動物の器官に移植されるヒト心室前駆体（ＨＶＰ）を含み、ＨＶＰは、（ｉ）ヒト多能性幹細胞上で発現される少なくとも１つの第１のマーカーについて陰性であり、（ｉｉ）ＪＡＧ１、ＦＺＤ４、ＬＩＦＲ、ＦＧＦＲ３およびＴＮＦＳＦ９からなる群から選択される少なくとも１つの第２のマーカーについて陽性である、投与すること；ならびに
非ヒト動物においてＨＶＰに及ぼす試験化合物の効果を評価すること
を含む。
【０１７８】
１つの実施形態において、試験化合物の心毒性は、例えば、（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の生存能と比較した）非ヒト動物においてヒト心室組織またはＨＶＰの生存能に対する試験化合物の効果を測定することにより、評価される。細胞生存能は、当該技術分野において公知の標準的方法により評価することができる。
【０１７９】
別の実施形態において、心臓の分化を調節する試験化合物の能力は、例えば、（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の分化と比較した）非ヒト動物においてヒト心室組織またはＨＶＰの分化に対する試験化合物の効果を測定することにより、評価される。細胞の分化は、例えば、培養された細胞上に出現する分化マーカーの発現の測定により、測定することができる。
【０１８０】
別の実施形態において、心機能を調節する試験化合物の能力は、例えば、（試験化合物の非存在下での組織または前駆体の機能と比較した）非ヒト動物においてヒト心室組織またはＨＶＰの機能に対する試験化合物の効果を測定することにより、評価することができる。組織または前駆体の機能は、例えば、Ｔ管の形成、成体の杆体形の心室心筋細胞の獲得、および電気的刺激に応答して力を生成する能力を含むが、これらに限定されない、心室細胞機能の任意の適切な指標の測定により、測定することができる。心室細胞機能のかかる指標を測定する適切なアッセイは、当該技術分野において公知である。
【０１８１】
好ましくは、非ヒト動物は、それが、ヒト前駆細胞に対する免疫応答を開始することができないよう、免疫不全である。１つの実施形態において、非ヒト動物は、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスまたは免疫不全ＳＣＩＤ−ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅから市販されている）のような、マウスである。１つの実施形態において、器官は、腎臓である（例えば、細胞は、腎被膜下に移植される）。別の実施形態において、器官は、心臓である。様々な実施形態において、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞が、移植される。
【０１８２】
動物モデルを生成するために、移植のためのＨＶＰは、ＨＶＰの生成に至る条件下でインビトロでｈＰＳＣを培養することにより、上で記載された通り得ることができる。インビトロ培養後にＨＶＰを移植するタイミングに関して、最適な心室組織生成のため、細胞は、移植の時にＨＶＰにより発現される細胞マーカーに基づき定義され、ＨＶＰＧプロトコールの０日目として定義される、培養の開始後の日数にて決定され得る、ステージにて移植されるべきである。１つの実施形態において、細胞は、中胚葉マーカーＭＥＳＰ１のピーク発現として定義され得る、心臓中胚葉形成のピークの後に移植される。典型的には、ＭＥＳＰ１発現は、培養の２日目〜４日目（包括的）であり、３日目にピークがある。１つの実施形態において、細胞は、ピークＩｓｌｅｔ−１発現に対応する時に移植される。典型的には、Ｉｓｌｅｔ１は、培養の４日目〜８日目（包括的）であり、培養の６日目にピークがある。１つの実施形態において、細胞は、ＮＫＸ２．５発現のピークの前に移植される。典型的には、ＮＫＸ２．５発現は、培養の６日目に始まり、培養の１０日目にピークがあり、次に、以後維持される。１つの実施形態において、細胞は、下流遺伝子ＭＥＦ−２およびＴＢＸ−１のピーク発現前に、移植される。典型的には、これらの下流遺伝子は、培養の５日目〜１５日目（包括的）に発現され、培養の８日目にピークがある。１つの実施形態において、細胞は、分化した収縮性タンパク質遺伝子の発現前に、移植される。典型的には、収縮性タンパク質遺伝子（ＴＮＮＴ２およびＭＹＨ６を含む）の発現は、培養の１０日目以降に始まる。ある種の実施形態において、細胞は、上述のマーカーパターンの２つ、３つまたは４つが存在するときの時点で、移植される。別の実施形態において、細胞は、上述のマーカーパターンの全５つが存在するときの時点で、移植される。１つの実施形態において、細胞は、培養の４日目〜８日目（包括的）に移植される。より好ましい実施形態において、細胞は、培養の５日目〜７日目（包括的）に移植される。最も好ましい実施形態において、細胞は、培養の６日目に移植される。
【０１８３】
移植された細胞は、試験化合物の投与に先立ち、所望されるサイズ、量または厚さの心室組織の生成を可能にするのに適切な期間、非ヒト動物において成長させることができる。様々な実施形態において、細胞は、１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月間成長させることができる。
【０１８４】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明され、それは、さらなる制限と解釈されるべきではない。図、ならびに本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願は、明確に、参照により本明細書に取り込まれる。
【実施例】
【０１８５】
実施例１：ヒト多能性幹細胞におけるＷｎｔのシグナル伝達の調節によるヒトＩｓｌ１＋心筋芽前駆体細胞の生成
古典的なＷｎｔシグナル伝達の一時的調節は、多数のｈＰＳＣ株から高収量かつ純度で機能的心筋細胞を生成するのに十分であることが示されている（Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９：Ｅ１８４８−１８５７；Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：１６２−１７５）。このアプローチにおいて、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、ｈＰＳＣにおいてまず活性化され、インキュベーション期間が続き、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の阻害が続く。元々公開されたプロトコールにおいて、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性化は、Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３α、ＩＣ５０＝１０ｎＭ；ＧＳＫ−３、βＩＣ５０＝６．７ｎＭ）とのインキュベーションにより達成され、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達阻害は、Ｐｏｒｃｎ阻害剤ＩＷＰ２（ＩＣ５０＝２７ｎＭ）とのインキュベーションにより達成された。本発明者らは、心臓の分化のためＧｓｋ３阻害剤およびＷｎｔ産生産性阻害剤を使用したので、このプロトコールを、ＧｉＷｉプロトコールと呼んだ。元々のプロトコールの効率を改善し、元々のプロトコールにおいて使用された小分子の可能性のある副作用を低減するために、より高い阻害効力を有する小分子の別のセットを使用する第２の生成プロトコールを開発した。この第２の生成ＧｉＷｉプロトコールにおいて、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達活性化を、Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ５５６８１３−３９−９；例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから市販されている）（ＧＳＫ−３α、ＩＣ５０＝０．６５ｎＭ；ＧＳＫ−３，βＩＣ５０＝０．５８ｎＭ）とのインキュベーションにより達成し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達阻害を、Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９（ＣＡＳ１２４３２４３−８９−１；例えば、ＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍまたはＴｏｃｒｉｓから市販されている）（ＩＣ５０＝７４ｐＭ）とのインキュベーションにより達成した。Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４を使用して、心臓の中胚葉分化を促進し、一方、Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９を使用して、中胚葉細胞からの心室前駆体分化を増強した。
【０１８６】
これらの小分子の使用を介した心筋細胞分化のため、ｈＰＳＣを、マトリゲル（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）コートプレート（コーニング）上、Ｅ８培地（Ｃｈｅｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：４２４−４２９において記載される；市販；ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはｍＴｅＳＲ１培地（市販；ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において維持した。適切なｈＰＳＣは、１９−１１−１、１９−９−７または６−９−９細胞のような誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：７９７−８０１）およびＥＳ０３（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）またはＨ９細胞のようなヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７）を含む。
【０１８７】
マトリゲルコート表面上、ｍＴｅＳＲ１培地中で維持したｈＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ライフテクノロジーズ）で、３７℃にて５分間、単一細胞に分離し、次に、マトリゲルコート細胞培養皿に、５μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補填したｍＴｅＳＲ１培地中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２にて（−２日目）２４時間播種した。次に、細胞をｍＴｅＳＲ１中で培養し、ｍＴｅＳＲ１を毎日交換した。０日目に、次に、細胞を、１μＭ  Ｇｓｋ３阻害剤ＣＨＩＲ９８０１４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で２４時間（０日目〜１日目）、ＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ（インスリンを含まないＢ２７添加物１０ｍｌを含むＲＰＭＩ５００ｍｌ）において処理した。次に、培地を、２μＭ  Ｐｏｒｃｎ阻害剤Ｗｎｔ−Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有する対応する培地に３日目にて交換し、次に、５日目に培地交換中に取り除いた。７日目から開始し、３日毎に培地を交換しながら、細胞をＲＰＭＩ／Ｂ２７（ストック溶液：ＲＭＰＩ培地５００ｍｌ＋Ｂ２７添加物１０ｍｌ）において維持した。心筋芽前駆細胞を生成するためのこの典型的な培養プロトコールを、図１において模式的に説明する。
【０１８８】
フローサイトメトリーおよび免疫染色を行い、特定の系統のマーカーの発現を調べた。ＣＨＩＲ−９８０１４での処理の２４時間後、９９％より多くのｈＰＳＣが、中胚葉マーカーブラキュリを発現した。ＣＨＩＲ−９８０１４での処理の３日後、９５％より多くの分化した細胞が、心臓の中胚葉を特徴付けるＭｅｓｐ１を発現した。培養プロトコールは、細胞が、心臓の中胚葉系統に同調的に分化することを可能にするばかりでなく、ｃＴｎＴフローサイトメトリーおよび電気生理学解析により決定した通り、分化の１４日後に９０％より多くの心室筋細胞を再現性よく生成した。
【０１８９】
経時的なｈＰＳＣの心臓の分化をさらに評価するために、ウエスタンブロット解析を、０〜７日目および１１日目に行い、Ｉｓｌ１およびＮｋｘ２．５（心筋芽前駆体マーカー）ならびにｃＴｎＩ（心筋細胞マーカー）の発現を調べた。細胞を、Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）においてＨａｌｔタンパク質分解酵素およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で溶解した。タンパク質を、１０％トリス−グリシンＳＤＳ／ＰＡＧＥ（インビトロジェン）により、変性条件下で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＴＢＳＴ中の５％乾燥ミルクでブロッキング後、膜を、１次抗体と一晩４℃にてインキュベーションした。次に、膜を洗浄し、抗マウス／ウサギペルオキシダーゼ抱合２次抗体と室温にて１時間インキュベーションし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）により現像した。結果を図２に示す。ｈＰＳＣの心臓の分化中、Ｉｓｌ１発現は、４日目に始まり、６日目にその最大発現まで増大し、一方、ＮＫｘ２．５は、６日目についに発現を開始し、１０日後、その最大発現に達した。分化の１１日目まで、心筋細胞（ｃＴｎＩ＋細胞）を誘導しなかった。
【０１９０】
加えて、６日目の細胞の免疫染色を、Ｉｓｌ１発現について行った。細胞を、４％ホルムアルデヒドで１５分間室温にて固定し、次に、ＰＢＳプラス０．４％トリトンＸ−１００および５％無脂肪乾燥ミルク（バイオ・ラッド）中の１次抗体（抗Ｉｓｌ１）ならびに２次抗体で染色した。核を、ＤＡＰＩを含むＧｏｌｄアンチフェード試薬（インビトロジェン）で染色した。ＱＩｍａｇｉｎｇ（登録商標）Ｒｅｔｉｇａ  ４０００Ｒカメラを備えた落射蛍光顕微鏡（ライカＤＭ  ＩＲＢ）を、画像解析のため使用した。結果は、相当な数のＩｓｌ１＋細胞を示した。
【０１９１】
Ｉｓｌ１発現について６日目の細胞のフローサイトメトリー解析も行った。細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで１０分間、単一細胞に分離し、次に、１％パラホルムアルデヒドで２０分間室温にて固定し、０．１％トリトンＸ−１００および０．５％ＢＳＡのＰＢＳにおいて１次抗体および２次抗体で染色した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）において収集し、ＦｌｏＪｏを使用して解析した。図３に示される結果は、９５％より多くの細胞が、このステージにてＩｓｌ１を発現したことを示した。
【０１９２】
要約すると、この実施例は、６日以内に数十億ものＩｓｌ１＋ヒトＨＰＶの大規模の産生を効率的に可能にするヒト心室前駆体生成のためのプロトコール（ＨＶＰＧプロトコール）を提供する。
【０１９３】
実施例２：心臓前駆細胞の細胞表面マーカーとしてのＪａｇｇｅｄ１の同定
心臓の分化プロセス中にゲノムスケールレベルで生じる転写変化の特性を明らかにするために、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を、心臓の発生の転写景色を構築するための分化後の異なる時点にて行った。本発明者らは、０日目〜７日目の試料、ならびに１９日目および３５日目の試料（時点当たりの２つの独立した生物学的複製物）においてＲＮＡ−ｓｅｑ実験を行った。ｉｌｌｕｍｉｎｅ  Ｈｉｓｅｑ  ２０００プラットフォームを使用して、２つのバッチのＲＮＡ−ｓｅｑ（読み取り長１００ｂｐおよび５０ｂｐ）を行った。合計で、２０の試料を調べた。ＢｏｗｔｉｅおよびＴｏｐｈａｔを使用して、本発明者らの読み取り値を参照ヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングし、本発明者らは、ＲＰＫＭ方法（百万の読み取り値当たりの１キロベースの転写物当たりの読み取り値）を使用して、それぞれの遺伝子発現（Ｒｅｆｓｅｑによる遺伝子のアノテーション）を計算する。心筋細胞へのｈＰＳＣの分化は、５つの主要な細胞タイプ：多能性幹細胞（０日目）、中胚葉前駆体（１日目〜２日目）、心臓の中胚葉細胞（３日目〜４日目）、心臓フィールドの前駆体（５日目、６日目および７日目）、ならびに心筋細胞（１０日以降）を含む。
【０１９４】
ＨＶＰＧプロトコールを使用したｈＰＳＣからの心臓の分化の分子ｍＲＮＡ解析は、分化中に多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２の下方制御を伴った、遺伝子発現におけるダイナミックな変化を明らかにした。原条様遺伝子ＴおよびＭＩＸＬ１の誘導は、ＣＨＩＲ−９８０１４添加後最初の２４時間以内に生じ、続いて、２日目および３日目に心臓の中胚葉マーカーＭＥＳＰ１が上方制御された。心筋マーカーＴＮＮＴ２、ＴＮＮＣ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＩＲＸ４の発現を、分化のより後のステージ（１０日目以降）にて検出した。
【０１９５】
この解析により、中胚葉細胞、心臓の前駆体および心筋細胞を含む、それぞれの分化ステージにて富化された遺伝子を同定した。１日目の分化した細胞に関連する中胚葉細胞は、ブラキュリを発現する。本発明者らは、ＦＺＤ１０、ＣＤ４８、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ８Ｂ、ＩＬ１５ＲＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１３、ＩＣＯＳＬＧ、ＳＥＭＡ７Ａ、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＤＣ１、ＨＬＡ−Ａを含む、中胚葉細胞についての可能性のある表面マーカーを同定した。同様の解析を通じて、本発明者らはまた、ＣＸＣＲ４、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ５、ＴＮＦＲＳＦ９、ＦＺＤ２、ＣＤ１Ｄ、ＣＤ１７７、ＡＣＶＲＬ１、ＩＣＡＭ１、Ｌ１ＣＡＭ、ＮＧＦＲ、ＡＢＣＧ２、ＦＺＤ７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂを含む、心臓の中胚葉ｍｅｓｐ１陽性細胞についての表面マーカーを同定した。
【０１９６】
ウエスタンブロット解析と一致し、ＩＳＬ１  ｍＲＮＡは、４日目と同等の早さで発現し、そのタンパク質発現がそのピークに達する１日前の、５日目にピークがあった。分化の５日目（心臓の前駆体ステージ、５日目にｉｓｌ１  ｍＲＮＡ発現最大、６日目にｉｓｌ１タンパク質発現最大）に、５日目の富化された遺伝子を、抗ＣＤ抗体アレイ（３５０種の公知のＣＤ抗体のパネル）と比較し、多数の可能性のある細胞表面タンパク質マーカーを同定した。本発明者らは、ＦＺＤ４、ＪＡＧ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＬＩＦＲ（ＣＤ１１８）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦＲ３を含む、このステージで発現した多くの細胞表面タンパク質を同定した。
【０１９７】
細胞表面タンパク質Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）を、さらなる解析のため選択した。Ｊａｇｇｅｄ１発現を、以下および実施例３および実施例４において記載する通り、さらに研究した。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ４発現を、実施例５において記載する通り、さらに研究した。
【０１９８】
まず、Ｉｓｌ１およびＪａｇ１の発現を、二重染色フローサイトメトリー技術を使用して、特性を明らかにした。フローサイトメトリー解析を、二重染色のため抗Ｉｓｌ１および抗Ｊａｇ１抗体を使用して、実施例１において記載した通り、本質的に行った。結果を図４に示す。Ｊａｇｇｅｄ１発現は、Ｉｓｌｅｔ１の発現を追跡することが見いだされ、分化の６日目に、Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞の全てがまたＪａｇｇｅｄ１を発現し、そして逆もまた同様である。これらの２つのマーカーの共発現パターンのため、Ｊａｇｇｅｄ１抗体を使用して、９４．１％Ｉｓｌｅｔ１＋細胞の分化した集団を、９９．８％の純度のＩｓｌｅｔ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋細胞に富化した。
【０１９９】
Ｉｓｌｅｔ１が、ＨＶＰにおけるＩＳＬ１およびＮＫＸ２．５発現の二重免疫染色を使用して、Ｎｋｘ２．５遺伝子より早い発生の遺伝子であることも確認した。精製したＨＶＰは、ＩＳＬ１遺伝子を均一に発現するが、このステージで、ごく少数の細胞が、Ｎｋｘ２．５を発現し始める。
【０２００】
さらに、４週目のヒト胎児心臓組織、新生児心臓組織、および８歳の心臓組織にて、抗Ｉｓｌ１と抗Ｊａｇ１の両方での免疫染色を、実施例１において記載した通り、本質的に行った。結果は、インビボ胎児心臓において、Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞の全てがまた、Ｊａｇｇｅｄ１を発現したことを明らかにした。しかしながら、新生児心臓および８歳の心臓は、Ｉｓｌｅｔ１もＪａｇｇｅｄ１も発現しなかった。４週目のヒト胎児心臓の心室において、心臓のトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）染色は、目に見えるサルコメア構造を明らかにした。加えて、４週目の胎児心臓において、５０％を超える心室細胞が、Ｉｓｌｅｔ１とＪａｇｇｅｄ１の両方を発現し、それは、ヒト新生児心臓の心室筋細胞におけるＩｓｌｅｔ１とＪａｇｇｅｄ１の両方の発現の喪失を伴い、続く成熟中に著しく低下した。
【０２０１】
上記の実験は、Ｊａｇｇｅｄ１が、Ｉｓｌｅｔ１陽性心筋芽前駆細胞の細胞表面マーカーであることを示している。
【０２０２】
実施例３：Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋前駆細胞のクローン分化
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞のクローン分化の可能性を特徴付けるために、心筋芽前駆細胞を、実施例１において記載した培養プロトコールにより生成し、１つの単一Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞を、マトリゲルコート４８ウェルプレートの１つのウェルに播種した。細胞を、Ｊａｇ１の抗体で精製し、次に、１つの単一細胞を、１つのウェルに播種した。次に、単一細胞を、３週間、心臓前駆体培養（ＣＰＣ）培地（２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１００μｇ／ｍｌビタミンＣ、２０％ノックアウト血清代替物を補填した高度ＤＭＥＭ／Ｆ１２）において培養した。
【０２０３】
次に、３週間分化の細胞集団の免疫染色を、３種の抗体：心筋細胞についての心臓のトロポニンＩ（ｃＴｎ１）、内皮細胞についてＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）および平滑筋細胞について平滑筋アクチン（ＳＭＡ）で行った。結果は、単一細胞で培養したＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞が、ｃＴｎＩ陽性細胞およびＳＭＡ陽性細胞を生じるが、ＶＥ−カドヘリン陽性細胞を生じないことを示し、これは、これらの生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞が、内皮系統に対する制限された分化可能性を有する心筋前駆体であることを示している。ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ１９−９−１１株）からＨＶＰＧプロトコールで分化させた精製したＩｓｌｅｔ１＋Ｊａｇｇｅｄ１＋細胞はまた、同様のインビトロ分化可能性および主にｃＴｎＩ＋ＳＭＡ＋細胞への分化を示したが、ＶＥ−カドヘリン＋細胞への分化を示さなかった。数週間の間に、細胞は、心室特異的マーカーＭＬＣ２ｖを発現し、これは、最初のＩＳＬ１＋サブセットが、心室細胞運命に既に関与したことを示している。ＨＶＰＧプロトコールを使用して生成させたＩｓｌｅｔ１＋細胞の制限された血管性分化の可能性のため、これらの生成されたＩｓｌｅｔ１＋細胞は、既に報告されたＫＤＲ＋集団と異なる前駆体集団（Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ  ４５３：５２４−５２８）、または全３種の系統の心血管細胞を生じることができる、多能性ＩＳＬ１＋細胞と異なる前駆体集団（Ｂｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：１１３−１１７；Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７：１１５１−１１６５）を表し得る。
【０２０４】
これらの結果は、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞を、単一細胞から、心筋細胞優位で、全３タイプの心臓系統細胞を含有する有意に拡大した細胞集団（１×１０９細胞以上）までインビトロで首尾よく培養できることを示した。さらに、これらの細胞を、拡大した期間、少なくとも２〜３週間、数カ月間（例えば、６カ月以上）でさえインビトロで培養することができる。心筋芽前駆細胞は、心筋細胞に徐々に分化し、増殖しないので、およそ２〜３週間の培養期間が好ましい。
【０２０５】
実施例４：Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋前駆細胞のインビボ発生の可能性
ＥＳ０３ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た）は、心臓特異的ｃＴｎＴプロモーターによりもたらされた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。ＥＳ０３細胞を使用して、実施例１において記載した培養プロトコールを使用して、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞を生成した。Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）であるベージュマウスの心臓に移植して、インビボでのそれらの発生の可能性を立証した。
【０２０６】
簡単に言うと、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞を、胸部開放法でＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ガンママウスの左心室壁に直接注射した（レシピエント当たり１，０００，０００個の細胞）。心臓を、手術の２〜３週間後に回収し、１％ＰＦＡにおいて固定し、１０μｍで薄片を作った（ｎ＝１２）。移植したマウスの心臓の組織学的解析は、落射蛍光により、および抗ＧＦＰ抗体での染色により検出した、ＧＦＰ＋ドナー細胞の存在を明らかにし、これは、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞が、インビボに移植されたとき、心筋細胞に分化する能力があったことを示している。
【０２０７】
Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞をまた、ＳＣＩＤであるベージュマウス（「損傷マウス」）の梗塞心臓に直接移植し、同様に移植した正常マウスと比較した。２週間後解析したとき、Ｉｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞を移植した損傷マウスが、同様に移植した正常マウスより大きな移植片を有し、これが、インビボでのＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋心筋芽前駆細胞の心筋細胞再生能力を示している。
【０２０８】
（実施例５）
心筋前駆細胞の細胞表面マーカーとしてのＦｒｉｚｚｌｅｄ４の同定
実施例２に記載の通りに、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析によってＦｒｉｚｚｌｅｄ４（ＦＺＤ４）は心筋前駆細胞において発現されると同定された。したがって、ＦＺＤ４を心筋前駆細胞の細胞表面マーカーとして確認するために、ウエスタンブロット解析によって心臓分化の間のＦＺＤ４発現を評価した。図５に示すように、結果は、多能性幹細胞および最初の３日間の分化細胞においてＦＺＤ４が発現しないことを実証した。しかし、ＦＺＤ４は４日目に発現し始め、発現の５日目にその発現を最大にする。
【０２０９】
ＦＺＤ４およびＩｓｌ１の共発現パターンを単一細胞レベルで数量化するために、ＦＡＣＳ解析を実行した。図６に示すように、分化の５日目に、８３％より多くの細胞がｉｓｌ１およびＦＺＤ４の両方を発現し、ＧｉＷｉプロトコールを使用して、ＦＺＤ４が心臓前駆体分化の間のｉｓｌ１陽性細胞のための細胞表面マーカーであることを実証する。
【０２１０】
ＪＡＧ１およびＦＺＤ４の両方がヒト心室前駆細胞上で実際にＩＳＬ１と共発現されたことを確認するために、ｈＰＳＣに由来する６日目の分化細胞の三重免疫蛍光解析を、Ｉｓｌｅｔ１、Ｊａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４に対する抗体で実行した。三重染色実験は、Ｉｓｌ１＋細胞がＪａｇｇｅｄ１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ４の両方を発現したことを実証した。
【０２１１】
実施例６：ヒト心室前駆体（ＨＰＶ）はインビボで３Ｄ心室心筋器官を生成する
心室心筋チャンバの構築は、ヒト器官形成中の最も重大かつ初期工程の１つであり、遊走、増殖、血管新生、構築、および基質アライメントを含む、一連の協調した工程を必要とする。インビボで心室形成をもたらすＨＶＰの能力を試験するために、本発明者らは、精製したＨＶＰまたは未精製のＨＶＰ（９２．０±１．９％ＩＳＬ１＋）を免疫不全状態のマウスの腎被膜下に移植した。移植の２か月後、未精製のＨＶＰを移植した動物は腫瘍を形成し、これは、腫瘍形成効率１００％（１００％、４／４）をもたらし、一方、精製したＨＶＰを移植した動物は、腫瘍を全く形成しなかった（０％、０／１０）。
【０２１２】
精製したＨＶＰが生着した腎臓を、組織学的解析のためさらにアッセイした。ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色が、マウス腎臓の表面上で１ｍｍより厚い厚さを伴い長さ０．５ｃｍを超え、心室特異的マーカーＭＬＣ２ｖを均一に発現した器官を明らかにした（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５１５７−５１６１）。得られたヒト筋肉器官は、完全に血管新生し、赤血球細胞を、血管において検出することができた。ｃＴｎＴ、ＭＬＣ２ｖ、およびＭＬＣ２ａ免疫染色の解析は、移植したＨＶＰが、心筋細胞（ｃＴｎＴ＋細胞）に分化したばかりでなく、さらに成熟して、ＭＬＣ２ａ発現について陰性であるＭＬＣ２ｖ＋心室筋細胞になることを明らかにした。得られた心室筋器官は、マウス由来血管細胞により完全に血管新生し、これは、その血管新生が、ＨＶＰに由来するパラクライン合図を介して生じたという考えと一致する。
【０２１３】
構造化した血管を、ＶＥ−カドヘリンおよび平滑筋アクチン発現に対する抗体の免疫染色解析により明らかにした。加えて、ラミニンγ−１鎖を標的にするヒト特異的モノクローナルラミニン抗体を使用して、ＨＶＰは、それらの細胞外基質としてそれら独自のヒトラミニンを分泌した（マウス腎臓領域は、ヒトラミニン免疫染色について陰性である）。加えて、本発明者らは、ヒトフィブロネクチン発現が、モノクローナルヒトフィブロネクチン抗体を使用して、血管近くの範囲に限定されることを見出した。
【０２１４】
心室形成をもたらす後のステージの心臓細胞の能力を評価するために、ＮＫＸ２．５＋細胞（分化の１０日後）を、免疫不全状態のＮＳＧマウスの腎被膜下に移植した。移植の３週間後に、ＮＫＸ２．５＋細胞を移植した動物は、目に見えるヒト筋肉移植片を全く形成せず、これは、ＨＶＰが、ピークＩｓｌｅｔ−１発現後にインビボでの心室形成についてのそれらの能力を失ったことを示している。
【０２１５】
まとめると、これらの研究は、ＨＶＰが、それら独自の心臓ラミニン由来基質、および新生心室器官への脈管構造を安定化させるのに働くフィブロネクチンを合成し、放出することができることを示す。
【０２１６】
実施例７：ＨＶＰは細胞自律的経路を介してインビボで成熟機能性心室筋器官を生成する
ヒト心臓生物学および疾患の研究のためのｈＰＳＣの有用性についての重大な制限の１つは、胎児アイソフォームの発現の成熟度および持続をそれらが欠くことである。ＨＶＰ由来器官が、機能的成熟心室筋になることができたかを決定するために、長期移植研究を行い、その後、Ｔ管の形成（Ｂｒｅｔｔｅ，Ｆ．ａｎｄ  Ｏｒｃｈａｒｄ，Ｃ．（２００３）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９２：１１８２−１１９２；Ｍａｒｋｓ，Ａ．Ｒ．（２０１３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３：４６−５２）、操作した心室組織の他の研究に匹敵する力を生成する能力、自動性の喪失、および成体の杆体形の心室心筋細胞の獲得を含む成体の心室心筋の十分に許容される特性のパネルの詳細な解析を行った。
【０２１７】
精製したＨＶＰの移植の５カ月後に、本発明者らの動物の全てにおいて、腫瘍を形成しなかった。動物を屠殺し、生着した腎臓を、さらなる解析のため取り出した。５カ月間のヒト移植片は、半径０．４ｃｍ（直径０．８ｃｍ）を有する半球構造であった。５カ月間の体積は、１つの腎臓についておよそ０．１３ｃｍ３であり、体積は、インビボのヒト成体の心臓に匹敵する厚さを達成する、ヒト心室筋を生着させる実現可能性を示唆する。杆体形の成熟ヒト心室筋細胞を、ヒト筋肉器官において観察した。加えて、本発明者らの成熟ヒト筋肉器官から採取した筋肉トリップは、電気的刺激に応答して力（０．３６±０．０４ｍＮ）を生成し、β−アドレナリン作動薬イソプレナリンでの処理後、それらの力の生成を増大した（０．５１±０．０２ｍＮ、対照と比較してｐ＜０．０５）。まとめると、これらの研究は、ＨＶＰが、細胞の自律的経路を介して、すなわち、他の細胞、遺伝子、基質タンパク質、または生体材料を添加することなく、インビボで完全に機能的な成熟ヒト心室筋器官を生成する能力があることを示す。
【０２１８】
実施例８：ＨＶＰは心外膜微小環境に遊走し、インビボで正常なマウス心臓の表面上にヒト心室筋パッチを自発的に形成する
心外膜は、緻密な領域拡大中に心室チャンバの成長をもたらし、ならびに心筋障害後に拡大することができ、ＶＥＧＦのような、公知の血管細胞運命スイッチに応答して血管新生をもたらすことができる成体の心外膜前駆体として働く、心臓前駆体のための公知の微小環境である（Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５７８０−５７８５；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒｉｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．（２０１４）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１３：６８３−６９２；Ｚａｎｇｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８９８−９０７）。ＨＶＰが、正常な心臓の心外膜表面に自発的に遊走し得るかを決定するために、精製緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−標識ＨＶＰを、免疫不全状態のマウスの心臓に心筋内注射した。移植の１週間後または１か月後、動物を屠殺し、生着した心臓を組織診断のため取り出した。移植の１週間後、ＧＦＰ＋細胞の大部分が、心筋において保持された。しかしながら、ほぼ全てのＧＦＰ＋細胞が、移植の１か月後に心外膜に遊走した。加えて、ＧＦＰ＋細胞は、移植の１週間後にＩＳＬ１＋およびＫｉ６７＋であった。
【０２１９】
Ｉｓｌｅｔ１＋細胞の分化の可能性を追跡するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ｈＥＳＣ株（Ｈ９−ｃＴｎＴ−ＧＦＰ）に由来するｃＴｎＴプロモーターから生成した、精製ＩＳＬ１＋ＪＡＧ１＋細胞を、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）であるベージュマウスの心臓に移植して、インビボでのそれらの発生の可能性を証明した。ＳＣＩＤであるベージュマウスの心臓の心室への直接的なＩｓｌ１＋Ｊａｇ１＋細胞の移植の１か月後、ヘマトキシリンおよびエオジン染色により、マウス心臓の心外膜に存在するヒト筋肉ストリップ移植片が明らかになった。加えて、免疫組織学的解析により、落射蛍光により、および抗ＧＦＰ抗体での染色により検出したＧＦＰ＋ドナー細胞の存在が明らかになった。より重要なことに、ＭＬＣ２ｖおよびＭＬＣ２ａの抗体で解析したとき、生着したヒト筋肉ストリップが、ＭＬＣ２ｖ陽性であり（１００％の細胞＋）、心房マーカーＭＬＣ２ａ陰性であり、これは、移植したＩＳＬ１＋細胞が、心筋細胞にさらに分化したばかりでなく、心室筋細胞になったことを示している。
【０２２０】
まとめると、これらの研究は、ＨＶＰが、心外膜微小環境に遊走することができ、そこで、再度外来細胞、遺伝子、基質、または生体材料を添加することなく、それらが拡大し、続いて、均一な心室筋パッチに分化することを示す。
【０２２１】
実施例９：追加実験の材料および方法
この実施例において、実施例１〜８において使用した実験材料および方法についてのさらなる詳細を提供する。
【０２２２】
ｈＰＳＣの維持
ｈＥＳＣ（ＥＳ０３、Ｈ９）およびヒトｉＰＳＣ（１９−９−１１）を、既に公開された方法（Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｃ．８：１６２−１７５；Ｌｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１：４４７−４５７）に従い、マトリゲル（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）コートプレート上、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において維持した。
【０２２３】
ヒト心室前駆体生成（ＨＶＰＧ）プロトコール
マトリゲルコート表面上、ｍＴｅＳＲ１中で維持したｈＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅで、３７℃にて１０分間、単一細胞に分離し、次に、マトリゲルコート細胞培養皿に、５μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を補填したｍＴｅＳＲ１中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２にて（−２日目）２４時間播種した。−１日目に、細胞をｍＴｅＳＲ１において培養した。０日目に、細胞を、インスリンを含まないＢ２７を補填したＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ）中１μＭ  ＣＨＩＲ−９８０１４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で２４時間（０日目〜１日目）処理し、次に、それを、１日目の培地交換中に取り出した。３日目に、培地の半分を、２μＭ  Ｗｎｔ−Ｃ５９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含有するＲＰＭＩ／Ｂ２７−ｉｎｓ培地に交換し、次に、それを、５日目の培地交換中に取り出した。６日目に、細胞を、単一細胞に分離させ、抗ＪＡＧ１または抗ＦＺＤ４抗体で精製した。
【０２２４】
ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー構築
ＲＮＡを、単離し（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ、キアゲン）、定量し（Ｑｕｂｉｔ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、ライフテクノロジーズ）、品質を管理した（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ２１００、アジレント）。各試料由来のＲＮＡ（８００ｎｇ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ｍＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（イルミナ）用のインプットとして使用し、製造元の指示に従い、配列決定ライブラリーを創出した。簡単に言うと、ポリＡ含有ｍＲＮＡ分子を、ポリＴオリゴ結合磁気ビーズを使用して精製した。精製後、ｍＲＮＡを断片化し、ランダムプライマーおよび逆転写酵素を使用して、第１の鎖相補性ＤＮＡにコピーした。次に、第２の鎖ｃＤＮＡ合成を、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮａｓｅＨを使用して行った。ｃＤＮＡをアダプターにライゲーションし、ＰＣＲで富化して、最終的なｃＤＮＡライブラリーを創出した。ライブラリーをプールし、製造元の指示によって、ＨｉＳｅｑ  ２０００（イルミナ）装置上で配列決定した。
【０２２５】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータ処理
ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取り値を編集し、Ｔｏｐｈａｔ２を使用して、ｈｇ１９参照にマッピングした。平均して、１つの試料当たりおよそ２３００万の読み取り値を生成し、これらの読み取り値の７６％を独自にマッピングした。各遺伝子についての発現レベルを、パイソンスクリプトｒｐｋｍｆｏｒｇｅｎｅを使用して定量し、ＲｅｆＳｅｑを使用して注釈を付けた。少なくとも１０の読み取り値を含む少なくとも１つの試料を含まない遺伝子を、解析から除いた。主成分分析およびヒートマップを、それぞれ、Ｒおよび遺伝子Ｅを使用して行った。
【０２２６】
移植
精製ＨＶＰ２００万個のアリコートを、エッペンドルフチューブに集めた。細胞をスピンダウンし、上清を捨てた。各チューブの細胞を、既に記載されたプロトコール（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６４７７−６４８９）に従い、それぞれ、免疫不全マウス、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪまたはＳＣＩＤ−ベージュ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）の腎被膜下に移植するか、または心臓に心筋内注射した。組織学的および生理学的解析のため、様々な時間間隔で、生着した腎臓または心臓を回収した。
【０２２７】
フローサイトメトリー
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅで１０分間、単一細胞に分離し、次に、１％パラホルムアルデヒドで２０分間室温にて固定し、ＰＢＳプラス０．１％トリトンＸ−１００および０．５％ＢＳＡにおいて１次抗体および２次抗体で染色した。データを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）において収集し、ＦｌｏｗＪｏを使用して解析した。
【０２２８】
免疫染色
細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１５分間室温にて固定し、次に、ＰＢＳプラス０．４％トリトンＸ−１００および５％無脂肪乾燥ミルク（バイオ・ラッド）中の１次抗体ならびに２次抗体で染色した。核を、ＤＡＰＩを含むＧｏｌｄアンチフェード試薬（インビトロジェン）で染色した。画像解析のため、落射蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡（ＺＥＩＳＳ、ＬＳＭ７００）を使用した。
【０２２９】
ウエスタンブロット解析
細胞を、Ｍ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）においてＨａｌｔタンパク質分解酵素およびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で溶解した。タンパク質を、１０％トリス−グリシンＳＤＳ／ＰＡＧＥ（インビトロジェン）により、変性条件下で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＴＢＳＴ中の５％乾燥ミルクでブロッキング後、膜を、１次抗体と一晩４℃にてインキュベーションした。次に、膜を洗浄し、抗マウス／ウサギペルオキシダーゼ抱合２次抗体と室温にて１時間インキュベーションし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）により現像した。
【０２３０】
電気生理学（パッチクランプ）
拍動する心室筋細胞クラスターを、顕微解剖し、記録前にガラスカバーガラスに再播種した。１２０ｍＭ  Ｋ  Ｄ−グルコン酸、２５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、２ｍＭ  ＮａＧＴＰ、４ｍＭ  Ｎａ２−ホスホ−クレアチン、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、２５℃にてＨＣｌで調節）からなる細胞内溶液を充填したホウケイ酸ガラスピペット（抵抗４〜５Ｍ  Ｏｈｍ）を使用して、活動電位活性を評価した。カバーガラス皿上に播種した培養した心筋細胞を、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭグルコース、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、２５℃にてＮａＯＨで調節）を含有する細胞外溶液（タイロード液）に浸した。自発活動電位を、１ｋＨｚで低減フィルターをかけたＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（モレキュラーデバイス、カリフォルニア州、米国）ソフトウエアを使用して行ったパッチクランプ技術（細胞全体、現在のクランプ配置）を使用して、３７℃にて記録し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２ＡおよびＣｌａｍｐｅｘ  ９．６ソフトウエア（モレキュラーデバイス、カリフォルニア州、米国）を使用して、デジタル化し、保存した。
【０２３１】
統計学
データを、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。統計学的有意差を、２群間のスチューデントｔ検定（両側）により決定した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であるとみなした。
【０２３２】
実施例１０：異種成分不含有のヒト心室前駆体分化プロトコール
この実施例において、定義した異種成分不含有の培養培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８を利用する、ヒト心室前駆体の分化についての代わりの分化プロトコールを提供する。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の成長および拡大のため、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地が開発され、Ｃｈｅｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：４２４−４２９（そこで「Ｅ８」培地として言及される）においてさらに記載される。
【０２３３】
ビトロネクチン（またはラミニン５２１）コート表面上、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地中で維持したｈＰＳＣを、バーゼン溶液で、３７℃にて１０分間、単一細胞に分離し、次に、ビトロネクチン（またはラミニン５２１）コート細胞培養皿に、５μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を補填したＥｓｓｅｎｔｉａｌ８中１００，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ２にて（−２日目）２４時間播種した。−１日目に、細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地において培養した。０日目に、細胞を、ＲＰＭＩ中０．５μＭ  ＣＨＩＲ−９８０１４で２４時間（０日目〜１日目）処理し、次に、それを、１日目の培地交換中に取り出した。３日目に、培地の半分を、０．５μＭ  Ｗｎｔ−Ｃ５９を含有するＲＰＭＩ培地に交換し、次に、それを、５日目の培地交換中に取り出した。６日目に、細胞（ヒト心室前駆体）を、単一細胞に分離させ、抗ＪＡＧ１または抗ＦＺＤ４抗体で精製した。あるいは、細胞を、抗ＬＩＦＲ抗体または抗ＦＧＦＲ３抗体で精製した。
【０２３４】
（実施例１１）
白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）および線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）の心筋前駆細胞の細胞表面マーカーとしての同定
この実施例では、実施例１〜８に記載される心筋前駆細胞（すなわち、ヒト心室前駆細胞）のためのさらなる細胞表面マーカーの発現は、フローサイトメトリー解析によって確認した。ヒト心室前駆体（ＨＶＰ）細胞を実施例１または１０に記載の通りに生成し、６日目の細胞を標準のフローサイトメトリーによって解析した。
【０２３５】
図９は、抗Ｉｓｌｅｔ１および抗白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）抗体を使用した二重染色フローサイトメトリー実験の結果を示す。結果は、ＨＶＰ細胞がＩｓｌｅｔ１およびＬＩＦＲを共発現することを実証し、それによって、ＬＩＦＲがＨＶＰ細胞のための細胞表面マーカーであることを確認する。
【０２３６】
図１０Ａ〜Ｂは、６日目のＨＶＰ細胞上でのＬＩＦＲおよび線維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）の発現を未分化胚性幹（ＥＳ）細胞と比較した、フローサイトメトリー実験の結果を示す。結果は、ＬＩＦＲおよびＦＧＦＲ３の両方がＨＶＰ細胞上での発現のために高度に富化されることを実証し、それによって、ＬＩＦＲおよびＦＧＦＲ３の両方がＨＶＰ細胞のための細胞表面マーカーであることを確認する。
【０２３７】
（実施例１２）
精製されたヒト心臓心室前駆細胞の電気生理学
精製されたＨＶＰの成熟ポテンシャルを、インビトロで電気生理学を実行することによってさらに特徴付けた。成熟したＨＶＰの電気的性質は、活動電位（ＡＰ）およびカルシウム移行（ＣａＴ）、特に電気的結合を提示する細胞の能力の光学式マッピングで調査した。６日目のＨＶＰのインビトロ光学式マッピングは、ＡＰまたはＣａＴの自発的なまたは誘導された伝搬はなかったことを明らかにした。１８＋日目までに、自発的なおよび点刺激の後のＡＰおよびＣａＴの両方の伝搬は容易に明らかになり、ネットワーク活性および電気的結合を示唆した。６〜７日目に、ＮＫＸ２．５−ＧＦＰ  ＨＶＰはＧＦＰ−であって、パッチクランピングは、細胞の全てが脱分極した静止膜電位を示すことを明らかにし、刺激の後にそれらはＡＰを発生することができなかった。後の時点と比較して、１９〜２３日目および３９〜４０日目の細胞は９０％超がＧＦＰ＋であり、ＧＦＰ＋細胞だけをパッチクランピングのために選択した。パッチされた細胞の全ては、自発的な心室様（ＳＶ）ＡＰを示した。しかし、１９〜２３日目と３９〜４０日目の細胞の間で、ＳＶ  ＡＰの有意差はなかった。注目すべきことに、ＮＫＸ２．５  ＧＦＰ細胞系に由来するこれらのＨＶＰは調整することができ、約２５０ｍｓ（１０００ｍｓの基礎的サイクル長で）のＡＰＤ５０を有することができ、これは、生来の成体ヒト心室細胞のそれを再現する（図２Ｍｖ；１７、１８）。まとめると、電気生理学的データは、インビトロで１９日目までにＨＶＰがそれらの成熟に到達することを示した。さらに、ＡＰおよびＣａＴの両方のインビトロでの伝導は連続的および均一であって、インビトロでの心室筋パッチにおける同期した電気的結合を示した。
【０２３８】
（実施例１３）
ヒト心臓の心室前駆細胞の単離のための陰性選択の使用
この実施例では、陰性選択を使用して、腎臓嚢の下の移植を通してインビボで心室壁を生成するＨＶＰの能力の直接的に解析するためにＨＶＰを単離した。心筋前駆細胞の６日目の培養物を、本明細書に記載の通りに調製した。ＴＲＡ−１−６０陰性ＨＶＰ集団を精製するために、多能性幹細胞表面マーカーＴＲＡ−１−６０（＜３％のＴＲＡ−１−６０＋）に磁気活性化細胞選別（ＭＡＣｓ）を使用して、数百万の６日目の前駆体細胞を次に陰性選択した。
【０２３９】
３００万のＴＲＡ−１−６０陰性ＨＶＰを、免疫不全ＮＳＧマウスの腎臓嚢の下に移植した。移植の２カ月後に、腎臓パッチは、マウス腎臓の表面の長さが０．６ｃｍを超え、厚さが０．２ｃｍを超える純粋なヒト心室筋壁を明らかにし、心筋細胞の超構造的構成要素および心室マーカーＭＬＣ２ｖの均一な発現を伴った。αＳＭＡおよびＶＥ−カドヘリンの発現によって評価したとき、心室壁は完全に血管化されていた。移植されたＨＶＰは心臓筋細胞（ｃＴｎＴ＋細胞）に分化しただけでなく、さらに成熟してＭＬＣ２ｖ＋心室筋細胞にもなった。移植片中のヒトフィブロネクチンの存在によって実証されるように、ＨＶＰはそれ自身のＥＣＭを分泌することもできた；移植片パッチの中には、ラミニンも検出された。さらに、大多数の細胞がＫｉ６７陰性であるので、心室筋パッチには非常に少ない増殖しかなかった。注目すべきことに、静脈内注入の後の腎臓ＨＶＰ移植片上での赤色レクチン染色によって示されるように、ヒト心室筋壁はマウスの宿主循環に接続されていた。
【０２４０】
本発明者らは、インビボ腎臓ＨＶＰパッチの機能を次に調査した。６〜７週齢の腎臓ＨＶＰパッチの生体外光学式マッピングは、刺激したとき、それらが電気的に応答性であったことを明らかにした。様々な基礎的サイクル長（５００〜２０００ｍｓ）で電気的に調整したとき、全ての６＋週齢の腎臓ＨＶＰパッチ（ｎ＝５）はＡＰを発生した。さらに、それらは、インビトロで成熟したＨＶＰと同等のＡＰアップストローク、減衰時間および伝導速度を提示し、インビボで機能的心筋細胞に分化する６日目のＨＶＰ細胞の注目に値する能力を鮮明にした。さらに、インビボの６＋週齢の腎臓ＨＶＰパッチの超音波画像診断は、パッチの収縮する能力を明らかに示した。パッチの拍動は、１分につき概ね７０拍動の頻度で起こった。移植片の断面表面積は、各収縮サイクルの間に１９±４％（ｎ＝３）で収縮し、弛緩の間はベースラインに戻った。
【０２４１】
未熟なＨＶＰが無傷の心臓に移植することができるかどうか判定するために、２００万の精製されたＮＫＸ２．５  ＧＦＰ標識ＨＶＰ（ＬＩＦＲに関して陽性に分類され、ＴＲＡ−１−６０に関して陰性に分類された）を、ＮＳＧマウスの心臓に対して心筋内に注射した。移植から８週後に動物を屠殺し、移植された心臓を組織学のために取り出した。心筋内注射の後、ＧＦＰ＋細胞のほぼ全ては、心外膜に移動した。ＨＶＰ心臓パッチはＮＫＸ２．５を均一に発現し、心臓の心室マーカーｃＴｎＴおよびＭＬＣ２ｖについて陽性でもあったが、ペースメーカーマーカーＨＣＮ４には陰性であった。αＳＭＡおよびＶＥ−カドヘリンの発現によって評価するとき、心室パッチは血管化されている。さらに、ＨＶＰ心臓パッチは、それがヒトフィブロネクチンについて陽性染色されたのでそれ自身のＥＣＭを分泌しており、ラミニンが移植片を囲んでいるのを検出することもできる。まとめると、これらの研究は、心臓においてＨＶＰは移植することができ、心外膜ニッチに移動することができ、そこでそれらは拡大し、その後インビボで均一な心室筋パッチに分化することを実証する。
【０２４２】
これらの実験は、陰性選択されたＨＶＰ集団のインビボ機能を実証する。これらの実験は陰性選択マーカーとしてＴＲＡ−１−６０を使用して実行されたが、他の適する陰性選択マーカーが当業者に明らかになる。例えば、図１１は、ＨＶＰ分化プロセスの間の選択された発生遺伝子発現のＲＮＡ−ｓｅｑ解析の結果を示す。０日目から７日目まで毎日、および１９日目にＲＮＡを採取した。３５日目は、後期心筋細胞のための対照の役目をした。２つのバッチの細胞が、同時に分化を経た；このことは、各日の２つの生物学的反復を確実にした。図１１に示す結果は、多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２が０日目に存在したが、分化の間に迅速に下方制御されて、６日目までに事実上不在であったことを実証する。多能性マーカーの下方制御の後、２４時間目までに原条様遺伝子ＴおよびＭＩＸＬ１の誘導が続き、２日目および３日目のＭＥＳＰ１の上方制御が続いた。心筋マーカーＴＮＮＴ２、ＴＮＮＣ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬ７、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７およびＩＲＸ４の発現は、分化の後期に検出された。ＩＳＬ１  ｍＲＮＡは、４日目という早期に発現され、５日目、そのタンパク質発現がそのピークに到達した前日にピークに達した。したがって、この発現データは、ＴＲＡ−１−６０以外の多能性マーカー、例えばＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよび／またはＳＯＸ２も、ＨＶＰのための陰性選択マーカーとしての使用に適することを実証する。
【０２４３】
均等物
当業者は、たかだか日常的な実験を使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確定することができるだろう。かかる均等物は、以下の請求項により包含されることが意図される。
【図１】
2019535299.tif 000002
【図２】
2019535299.tif 000003
【図３】
2019535299.tif 000004
【図４】
2019535299.tif 000005
【図５】
2019535299.tif 000006
【図６】
2019535299.tif 000007
【図７】
2019535299.tif 000008
【図８】
2019535299.tif 000009
【図９】
2019535299.tif 000010
【図１０Ａ】
2019535299.tif 000011
【図１０Ｂ】
2019535299.tif 000012
【図１１】
2019535299.tif 000013
【国際調査報告】
2019535299.tif 000014
2019535299.tif 000015
2019535299.tif 000016