(57)【要約】本開示は、CGRPに結合し、かつ、医薬用途、例えば片頭痛を含む種々の用途に使用することができる、hNGALムテインを提供する。本開示はまた、本明細書に記載の1つまたは複数のムテインを製造する方法、ならびにこのようなムテインの1つまたは複数を含む組成物および組み合わせにも関する。本開示はさらに、このようなムテインをコードする核酸分子に関し、また、このようなムテインおよび核酸分子の作製のための方法にも関する。加えて、本出願は、これらのムテインならびにこのようなムテインの1つまたは複数を含む組成物および組み合わせの治療的および/または診断的使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に実施例4に記載される競合ELISAアッセイで測定したときに、検出可能な親和性でCGRPに結合することができる、ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（hNGAL）ムテイン。
【請求項２】
本質的に実施例5に記載される表面プラズモン共鳴ベースのアッセイによって測定したときに、約5nM以下のKDでCGRPに結合することができる、請求項1に記載のhNGALムテイン。
【請求項３】
本質的に実施例6に記載されるSK-N-MC細胞ベースの機能アッセイにおいて、CGRP誘発cAMP生産を約5nM以下のIC50値で阻害または低減することができる、請求項1に記載のhNGALムテイン。
【請求項４】
ヒトCGRPおよびラットCGRPの両方と交差反応性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項５】
本質的に実施例4に記載される競合ELISAアッセイで測定したときに、検出可能な親和性でラットCGRPに結合することができる、請求項4に記載のhNGALムテイン。
【請求項６】
本質的に実施例5に記載される表面プラズモン共鳴ベースのアッセイによって測定したときに、約5nM以下のKDでラットCGRPに結合することができる、請求項4に記載のhNGALムテイン。
【請求項７】
本質的に実施例6に記載されるL6細胞ベースの機能アッセイにおいて、ラットCGRP誘発cAMP生産を約5nM以下のIC50値で阻害または低減することができる、請求項4に記載のhNGALムテイン。
【請求項８】
ヒトα-CGRP、ヒトβ-CGRP、ラットα-CGRPおよびラットβ-CGRPと交差反応性である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項９】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置8、9、28、36、38、40、41、42、44、46、47、49、52、54、62、65、66、68、70〜73、75、76、77、79、80、81、83、87、96、97、98、100、103、105、106、108、111、112、114、123、125、126、127、129、132、134、135、136、145、146、175、176、177および178に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１０】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列の配列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する1つまたは複数の位置に、変異アミノ酸残基をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１１】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の変異アミノ酸残基
2019506140.tif 000025
の少なくとも1つを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１２】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の置換：Gln 28→His；およびCys 87→Serを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１３】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000026
の1つを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１４】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の置換
2019506140.tif 000027
を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１５】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000028
2019506140.tif 000029
の1つを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１６】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の置換：Cys 76→Leu、Met、Val、Ile、Phe、Arg、LysまたはAsnおよびCys 175→Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、AspまたはGluをさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１７】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000030
2019506140.tif 000031
の1つを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１８】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の置換
2019506140.tif 000032
をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項１９】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000033
2019506140.tif 000034
2019506140.tif 000035
の1つを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２０】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の置換：Cys 76→LeuまたはTyr；Cys 175→Ile；Ile 176→AspおよびAsp 177→Glyをさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２１】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000036
の1つを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２２】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、hNGALムテインのアミノ酸配列が、以下の置換および付加
2019506140.tif 000037
をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２３】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換および付加のセット
2019506140.tif 000038
2019506140.tif 000039
の1つを含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２４】
成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置8、9、28、36、38、40、41、42、44、46、47、49、52、54、62、65、66、68、70、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、87、96、97、98、100、103、105、106、108、111、112、114、123、125、126、127、129、132、134、135、136、145、146、175、176、177および178に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21個の変異アミノ酸残基を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２５】
SEQ ID NO：2〜40、87〜93からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその機能的断片またはバリアントを含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２６】
野生型hNGALの1つまたは複数のアミノ酸を置換する1つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２７】
ネイティブシステイン残基の、別のアミノ酸によるアミノ酸置換を少なくとも1つ含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項２８】
別のアミノ酸がセリン残基である、請求項27に記載のhNGALムテイン。
【請求項２９】
有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、細胞分裂阻害剤、毒素、金属錯体、金属、およびコロイド金からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされている、請求項1〜28のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項３０】
そのN末端および/またはそのC末端で、タンパク質またはタンパク質ドメインもしくはペプチドである融合パートナーと融合している、請求項1〜28のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項３１】
ポリペプチドの血清半減期を延長する化合物にコンジュゲートされている、請求項1〜28のいずれか一項に記載のhNGALムテイン。
【請求項３２】
血清半減期を延長する化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される、請求項31に記載のhNGALムテイン。
【請求項３３】
ポリアルキレングリコールが、ポリエチレン（PEG）またはその活性化誘導体である、請求項32に記載のhNGALムテイン。
【請求項３４】
請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項３５】
核酸分子を発現させるために調節配列に機能的に連結されている、請求項34に記載の核酸分子。
【請求項３６】
ベクター内またはファージミドベクター内に含まれている、請求項34または35に記載の核酸分子。
【請求項３７】
請求項34〜36のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する、宿主細胞。
【請求項３８】
請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインを生産する方法であって、ポリペプチドが、ポリペプチドをコードする核酸から開始して遺伝子改変法によって生産される、方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが、細菌宿主生物または真核宿主生物において生産され、かつ、この宿主生物またはその培養物から単離される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインを含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
少なくとも1つの薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体をさらに含む、請求項40に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインを含む、診断または分析キット。
【請求項４３】
試料中のCGRPの検出および/または測定のための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインの使用。
【請求項４４】
遊離CGRPレベルの調節不全と関連する疾患または障害の治療、予防および/または改善に適した薬学的組成物の製造のための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインの使用。
【請求項４５】
請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインまたは請求項38〜39に記載の組成物を対象に投与する工程を含む、対象におけるCGRPに結合する方法。
【請求項４６】
請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインまたは請求項40〜41に記載の組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象における片頭痛または血漿タンパク質溢出を阻害または低減するための方法。
【請求項４７】
請求項1〜31のいずれか一項に記載のhNGALムテインまたは請求項40〜41に記載の組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象におけるタンパク質血漿溢出の調節不全と関連する疾患または障害を治療、予防または改善する方法。
【請求項４８】
疾患または障害が、片頭痛、顎関節症、心不全、高血圧および敗血症からなる群より選択される、請求項47に記載の方法または請求項44に記載の使用。
【請求項４９】
対象におけるCGRPの結合のための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインまたは請求項41に記載の組成物の使用。
【請求項５０】
対象における片頭痛または血漿タンパク質溢出を阻害または低減するための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインまたは請求項40〜41に記載の組成物の使用。
【請求項５１】
遊離CGRPレベルの調節不全と関連する疾患または障害の治療、予防および/または改善のための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のhNGALムテインまたは請求項40〜41に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
疾患または障害が、片頭痛、顎関節症、心不全、高血圧および敗血症からなる群より選択される、請求項51に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
I. 背景
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）は、中枢および末梢神経系（CGRP含有ニューロンが血管と密接に関連している）の神経によって分泌される血管作動性神経ペプチドである。CGRP介在性の血管拡張はまた、血漿の溢出および微小血管系の血管拡張をもたらす一連の事象の一部として神経性炎症に関連し、片頭痛において認められる。
【０００２】
CGRPは、ヒトおよびラットの両方において、相同性の高いαアイソフォームおよびβアイソフォームとして存在するが、各々は、別個の遺伝子によってコードされる。CGRPペプチドのαアイソフォームおよびβアイソフォームは、ヒトでは3アミノ酸、ラットでは1アミノ酸だけ異なる。CGRPペプチドのアミノ酸配列は、種間でよく保存されており、アミリン、カルシトニン、およびアドレノメデュリンを含むペプチドファミリーのメンバーと見なされる。
【０００３】
したがって、CGRPは、α-CGRPまたはCGRP1およびβ-CGRPまたはCGRP2と称される少なくとも2つのサブタイプに分けられる（Pharmacol. Rev 54:233-246, 2002）。少なくとも2つのCGRPサブタイプが存在することは、様々なインビボおよびインビトロバイオアッセイにおけるアンタゴニスト親和性およびアゴニスト効力の差から提唱されている（Dennis et al., hCGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptide in peripheral and brain tissues. Evidence for receptor multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251 :718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP agonist, [Cys(Et)2,7] hCGRP alpha: comparison in prototypical CGRP1 and CGRP2 in vitro bioassays, Can. J. Physiol. Pharmacol, 75:671-676 (1997)）。
【０００４】
CGRP1サブタイプは、アンタゴニスト断片CGRP（8-37）に感受性であることが見いだされた（Chiba et al., calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol, 256: E331-E335 (1989); Dennis et al (1990); Mimeault et al, Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)）。対照的に、CGRPは、位置2および7のシステイン残基が誘導体化された（例えば、アセトアミノメチル［Cys（ACM）2'7］またはエチルアミド［Cys（Et）2'7］を有する）直鎖ヒトCGRP（hCGRP）類似体に感受性であったが、CGRP受容体は、断片CGRP（8-37）に非感受性であった（Dennis et al (1989); Dennis et al (1990); Dumont et al (1997)）。また、3種のカルシトニン受容体刺激ペプチド（CRSP）が複数の哺乳動物種において同定されている；CRSPは、CGRPファミリーにおいて新たなサブファミリーを形成し得る（Katafuchi, T and Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family、Peptides, 25(11):2039-2045 (2004)）。
【０００５】
CGRPは、カルシトニン受容体様受容体（CALCRL）と呼ばれるGタンパク質共役受容体と受容体活性調節タンパク質（RAMP1）とから構成されるヘテロマーの受容体を通して、その作用を媒介する。CGRP受容体は、脳、心血管、内皮および平滑筋を含む数種の組織および細胞において、同定および薬理学的評価がなされている。別個の薬理学的特性に基づいて複数のCGRP受容体が特徴付けられている。カルシトニンスーパーファミリーペプチドは、7回膜貫通型ドメインGタンパク質共役受容体（GPCR）を通して作用する。カルシトニン受容体（「CT」、「CTR」または「CT受容体」）およびCGRP受容体は、II型（「ファミリーB」）GPCRであり、このファミリーは、セクレチン、グルカゴンおよび血管作動性腸ポリペプチド（VIP）などの調節ペプチドを認識する他のGPCRを含む。ヒトカルシトニン受容体のスプライスバリアントで最も特徴付けられているものは、1番目の細胞内ループ中の16個のアミノ酸が存在するか（以前はCTRn+またはCTRl、現在はCT^として公知）しないか（主要なスプライスバリアント、以前はCTRπ_またはCTR2、現在はCT（a）として公知）に依存して異なる（Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002）。
【０００６】
CGRPは、末梢および中枢神経系の両方の感覚神経に広範に分布しており、多数の異なる生物学的活性を示す。CGRPは、三叉神経および他の神経線維から放出されると、特異的な細胞表面受容体に結合することによってその生物学的応答を媒介すると考えられている。CGRPの生物学的活性は、神経筋接合部、免疫系内の抗原提示、血管緊張および感覚神経伝達の調節を含む（Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene-related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995)）。
【発明の概要】
【０００７】
それ故、CGRPを特異的に認識して結合する新たな化合物を同定することが強く求められている。このような化合物は、CGRP活性と関連する疾患状態における診断スクリーニングおよび治療的介入に有用であろう。したがって、本開示の目的は、CGRP活性をモジュレートするための、CGRPの特異的結合化合物を提供することである。本明細書に開示のこのような化合物は、ヒトリポカリン2（好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン「hNGAL」としても公知）に由来するムテインの形態をとる。
【０００８】
II. 定義
以下のリストは、本明細書全体を通して使用される用語、語句、および略語を定義する。本明細書に列挙および定義される全ての用語は、全ての文法上の形態を包含することを意図する。
【０００９】
本明細書において使用される場合、「CGRP」は、ヒト以外の種に由来すると特定されていない限り（例えば、「ラットCGRP」、「サルCGRP」など）、ヒトα-CGRPおよび/またはヒトβ-CGRPを意味する。
【００１０】
本明細書において使用される場合、「α-CGRP」または「アルファCGRP」は、ヒト以外の種に由来すると特定されていない限り（例えば、「ラットα-CGRP」、「サルα-CGRP」など）、ヒトCGRP1、すなわちSwiss Prot P06881によって定義される完全長タンパク質、またはその生物学的に活性な断片（例えば、インビトロまたはインビボで血漿タンパク質溢出を誘発することができるCGRP1タンパク質の断片）を意味する。
【００１１】
本明細書において使用される場合、「β-CGRP」または「ベータCGRP」は、ヒト以外の種に由来すると特定されていない限り（例えば、「ラットβ-CGRP」、「サルβ-CGRP」など）、ヒトCGRP2、すなわちSwiss Prot P10092によって定義される完全長タンパク質、またはその生物学的に活性な断片（例えば、インビトロまたはインビボで血漿タンパク質溢出を誘発することができるCGRP2タンパク質の断片）を意味する。
【００１２】
本明細書において使用される場合、「ラットCGRP」は、ラットα-CGRPおよび/またはラットβ-CGRPを意味する。ラットα-CGRP（アルファCGRP）またはラットCGRP1は、Swiss Prot P01256によって定義される完全長タンパク質またはその生物学的に活性な断片である。ラットβ-CGRP（ベータCGRP）またはラットCGRP2は、Swiss Prot P10093によって定義される完全長タンパク質またはその生物学的に活性な断片である。
【００１３】
本明細書において使用される場合、「検出可能な親和性」は、選択された標的に、一般に少なくとも約10-5M以下の親和性定数で結合する能力を意味する。より低い親和性は、一般に、ELISAなどの一般的な方法でもはや測定可能ではなく、それ故、重要性は低い。
【００１４】
本明細書において使用される場合、選択された標的（本件の場合CGRP）への、本開示のタンパク質（例えば、ヒトリポカリン2のムテイン）の「結合親和性」は、当業者に公知の数多くの方法によって測定することができる（それによって、ムテイン-リガンド複合体のKD値を決定することができる）。このような方法は、限定されないが、蛍光滴定、直接ELISA、競合ELISA、熱量測定法、例えば等温滴定型熱量測定法（ITC）、および表面プラズモン共鳴（SPR）を含む。このような方法は、当技術分野において十分に確立されており、また、その例を以下に詳述する。
【００１５】
また、それぞれの結合物質とそのリガンドとの間の複合体形成は、それぞれの結合パートナーの濃度、競合物質の存在、使用される緩衝系のpHおよびイオン強度、ならびに解離定数KDの決定に使用される実験法（例えば、いくつかの例を挙げると、蛍光滴定、直接ELISA、競合ELISAまたはSPR）などの多くの異なる因子、またはさらには実験データの評価に使用される数学アルゴリズムによって影響されることも留意される。
【００１６】
それ故、KD値（それぞれの結合物質とその標的/リガンドとの間で形成された複合体の解離定数）は、特定のムテインの所与のリガンドに対する親和性を決定するために使用される方法および実験の設定に依存して、ある特定の実験範囲内で変動し得ることもまた、当業者に明らかである。これは、例えば、KD値がSPRによって決定されたか、競合ELISAによって決定されたか、または直接ELISAによって決定されたかに依存して、測定されるKD値にわずかな偏差または許容差範囲があり得ることを意味する。
【００１７】
本明細書において使用される場合、本開示のムテインなどの化合物は、標的と1つまたは複数の参照標的とを区別することができる場合、その標的（例えば、CGRP）に「特異的に結合する」か、またはその標的に対して「結合特異性」を有する（結合特異性とは、絶対的でなく相対的な特性であるため）。「特異的結合」を、例えば、ウエスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、IHCおよびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００１８】
用語「ヒトリポカリン2」または「ヒトLcn 2」または「ヒトNGAL」または「hNGAL」は、本明細書において使用される場合、SWISS-PROT/UniProt Data Bank Accession Number P80188の成熟ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）を指す。本開示のヒトリポカリン2ムテインは、本明細書において「hNGALムテイン」と称される場合がある。SWISS-PROT/UniProt Data Bank Accession Number P80188に示されるアミノ酸配列が、好ましい「参照配列」として使用される場合があり、より好ましくは、SEQ ID NO：1に示されるアミノ酸配列が参照配列として使用される。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「ムテイン」、「変異した」実体（タンパク質であるか核酸であるかにかかわらず）、または「変異体」は、天然に存在する（野生型）核酸またはタンパク質「参照」骨格と比較した、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入を指す。用語「ムテイン」はまた、本明細書において使用される場合、その機能的断片またはバリアントも含む。本開示に記載の特定のムテインの断片またはバリアントは、好ましくは、CGRPに結合（例えば、検出可能な親和性、またはさらに高い親和性で）する機能を保持し、このような断片またはバリアントは、本明細書に開示の参照ムテインの「機能的断片またはバリアント」である。
【００２０】
用語「断片」は、本明細書において、本開示のムテインに関連して使用される場合、N末端および/またはC末端が短縮された、すなわちN末端および/またはC末端アミノ酸の少なくとも1つを欠く、完全長の成熟ヒトリポカリン2に由来するタンパク質またはペプチドに関する。このような断片は、成熟ヒトリポカリン2の一次配列の少なくとも10個、さらには例えば20個または30個以上の連続したアミノ酸を含んでよく、通常、成熟ヒトリポカリン2の免疫測定において検出可能である。
【００２１】
一般に、用語「断片」は、本明細書において、本開示のムテインまたは本開示に係る組み合わせの対応するタンパク質リガンドに関して使用される場合、本開示に係るムテインによって認識および/または結合される完全長リガンドの能力を保持する、N末端および/またはC末端が短縮されたタンパク質またはペプチドリガンドに関する。
【００２２】
用語「変異誘発」は、本明細書において使用される場合、実験条件を選択して、成熟ヒトリポカリン2の所与の配列位置に天然に存在するアミノ酸を、それぞれの天然ポリペプチド配列ではこの特定の位置に存在しない、少なくとも1つのアミノ酸によって置換できるようにすることを意味する。用語「変異誘発」はまた、1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入による配列セグメントの長さの（追加の）修飾も含む。したがって、例えば、選択された配列位置の1つのアミノ酸が、連続した3つのランダムな変異によって置換されて、野生型タンパク質のそれぞれのセグメントの長さと比較して2つのアミノ酸残基の挿入を導くことは、本開示の範囲内である。このような挿入または欠失は、本開示の変異誘発に供することができるいずれのペプチドセグメントにも、互いに独立して導入され得る。
【００２３】
用語「ランダム変異誘発」は、ある特定の配列位置に所定の単一アミノ酸（変異）が存在するのではなく、変異誘発の間に、ある一定の確率で、規定の配列位置に少なくとも2つのアミノ酸を組み込むことができることを意味する。
【００２４】
「同一性」は、配列の類似性または関係の尺度となる属性である。用語「配列同一性」または「同一性」は、本開示において使用される場合、本開示のポリペプチドの配列と問題の配列との(相同)アライメント後の、これらの2つの配列の長い方の残基数に対する、ペアをなす同一残基のパーセンテージを意味する。配列同一性は、同一アミノ酸残基の数を残基の総数で割り、その結果に100を掛けることによって測定される。
【００２５】
用語「相同性」は、本明細書においてその通常の意味で使用され、同一アミノ酸、ならびに本開示のポリペプチド（例えば、本開示の任意のムテイン）の直鎖アミノ酸配列内の等価な位置における保存的置換（例えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基で交換）であると見なされるアミノ酸を含む。
【００２６】
配列相同性または配列同一性のパーセンテージは、本明細書においては、例えばプログラムBLASTPバージョンblastp 2.2.5を使用して決定することができる（November 16, 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402）。この態様において、相同性のパーセンテージは、好ましくは、ペアワイズ比較において参照として野生型タンパク質骨格を使用した、プロペプチド配列を含むポリペプチド配列全体のアライメントに基づく（マトリックス：BLOSUM 62；ギャップコスト：11.1；カットオフ値10-3に設定）。それは、BLASTPプログラム出力で結果として示される「陽性」（相同アミノ酸）の数を、アライメントのためにプログラムによって選択されたアミノ酸の総数で割ったパーセンテージとして算出される。
【００２７】
具体的には、ムテインのアミノ酸配列のあるアミノ酸残基（野生型ヒトリポカリン2とは異なる）が、野生型ヒトリポカリン2のアミノ酸配列内のある特定の位置に対応するかどうかを決定するために、当業者は、当技術分野において周知の手段および方法、例えば、手作業によるか、または、コンピュータープログラム、例えばBLAST2.0（Basic Local Alignment Search Toolを意味する）もしくはClustalW、または配列アライメントを作成するのに適している任意の他の好適なプログラムを使用することによる、アライメントを使用することができる。したがって、野生型ヒトリポカリン2は、「対象配列」または「参照配列」となり得、本明細書に記載の野生型ヒトリポカリン2と異なるムテインのアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」となる。用語「参照配列」および「野生型配列」は、本明細書において互換的に使用される。
【００２８】
「ギャップ」は、アミノ酸の付加または欠失の結果である、アライメント中の隙間である。したがって、厳密に同じ配列の2つのコピーは、100％の同一性を有するが、それほど高度に保存されておらず、欠失、付加、または置換を有する配列は、より低い程度の配列同一性を有し得る。当業者は、標準的なパラメーターを使用して配列同一性を決定するために幾つかのコンピュータープログラム、例えばBlast（Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402）、Blast2（Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410）、およびSmith-Waterman（Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197）が利用可能であることを認識するであろう。
【００２９】
用語「バリアント」は、本開示において使用される場合、例えば置換、欠失、挿入または化学修飾によるアミノ酸配列の修飾を含む、タンパク質またはペプチドの誘導体に関する。このような修飾は、幾つかの態様において、タンパク質またはペプチドの機能性を低減することはない。このようなバリアントは、1つまたは複数のアミノ酸がそれらのそれぞれのD-立体異性体によってまたは天然に存在する20種のアミノ酸以外のアミノ酸、例えば、オルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンなどによって置換されている、タンパク質を含む。しかしながら、このような置換もまた保存的であってよく、すなわち、あるアミノ酸残基が、化学的に類似するアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間の置換である：1）アラニン、セリン、およびトレオニン；2）アスパラギン酸およびグルタミン酸；3）アスパラギンおよびグルタミン；4）アルギニンおよびリジン；5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。
【００３０】
「ネイティブ配列」ヒトリポカリン2とは、天然に由来する対応するポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するヒトリポカリン2を意味する。したがって、ネイティブ配列ヒトリポカリン2は、それぞれの天然に存在するヒトリポカリン2のアミノ酸配列を有することができる。このようなネイティブ配列ポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換え手段もしくは合成手段によって生産することができる。用語「ネイティブ配列」ポリペプチドは、具体的には、天然に存在する短縮型または分泌型のヒトリポカリン2、別の形でスプライシングされた形態などの天然に存在するバリアント形態、およびヒトリポカリン2の天然に存在する対立遺伝子バリアントを包含する。ポリペプチド「バリアント」は、ネイティブ配列ポリペプチドと少なくとも約50%、60%、70%、80%または少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このようなバリアントは、例として、ポリペプチドのN末端またはC末端で1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されているかまたは欠失している、ポリペプチドを含む。一般に、バリアントは、ネイティブ配列ポリペプチドと少なくとも約70%（少なくとも約80%、例えば少なくとも約85%を含む）のアミノ酸配列同一性（少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性または少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を含む）を有する。
【００３１】
用語「位置」は、開示に従って使用されるとき、本明細書において描写されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置または本明細書において描写される核酸配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。1つまたは複数のムテインのアミノ酸配列位置との関連で本明細書において使用される場合の用語「対応する」または「対応」を理解するために、対応する位置は、先行のヌクレオチド/アミノ酸の数によってのみ決定されるわけではない。したがって、本開示に従う所与のアミノ酸（置換され得る）の位置は、（変異体または野生型）ヒトリポカリン2内の別の場所でのアミノ酸の欠失または付加に起因して変動し得る。同様に、本開示に従う所与のヌクレオチド（置換され得る）の位置は、ムテインまたは野生型ヒトリポカリン2の5'非翻訳領域（UTR）（プロモーターおよび/または任意の他の調節配列を含む）または遺伝子（エキソンおよびイントロンを含む）内の別の場所での欠失または付加的ヌクレオチドに起因して変動し得る。
【００３２】
したがって、本開示に従う対応する位置について、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、類似する隣接ヌクレオチド/アミノ酸と表示の数が異なり得るが、前記隣接ヌクレオチド/アミノ酸（交換、欠失、または付加され得る）もまた、1つまたは複数の対応する位置に含まれることを、好ましくは理解すべきである。
【００３３】
加えて、本開示に従う参照骨格に基づくムテイン内の対応する位置について、ヌクレオチド/アミノ酸の位置は、表示の数が異なり得る場合であっても、ムテインまたは野生型ヒトリポカリン2内の別の場所の位置に構造的に対応することを、好ましくは理解すべきである。
【００３４】
用語「有機分子」または「有機低分子」は、非天然標的について本明細書において使用される場合、少なくとも2つの炭素原子を含むが好ましくは7または12以下の回転可能な炭素結合を含み、100〜2000ダルトンの間、好ましくは100〜1000ダルトンの間の範囲の分子量を有し、場合により1または2つの金属原子を含む、有機分子を示す。
【００３５】
「検出する」、「検出」、「検出可能な」または「検出すること」なる語は、本明細書において使用される場合、定量レベルおよび定性レベルの両方、ならびにそれらの組み合わせに基づいて理解される。したがって、それは、関心対象の分子の定量的測定、半定量的測定および定性的測定を含む。
【００３６】
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。用語「哺乳動物」は、実例をいくつか挙げると、ヒト、家畜および農場動物、ならびに動物園、競技用、またはペット用の動物、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、カニクイザルなどの類人猿などを非限定的に含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指すものとして本明細書において使用される。好ましくは、本明細書における哺乳動物は、ヒトである。
【００３７】
「有効量」は、有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量を、1回または複数回の投与で投与することができる。
【００３８】
「試料」は、任意の対象から採取された生物学的試料と定義される。生物学的試料は、限定されないが、血液、血清、尿、糞便、精液、または組織を含む。
【００３９】
本開示に係る用語「転移」は、原発腫瘍から患者の他の1つまたは複数の部位へがん性細胞が伝播して、そこで二次腫瘍が発生することを指す。がんが転移したかを決定するための手段は当技術分野において公知であり、骨スキャン、胸部X線、CATスキャン、MRIスキャン、および腫瘍マーカー試験を含む。用語「転移の予防」は、原発性の腫瘍またはがんの転移が予防、遅延、または低減され、ひいては、二次腫瘍の発生が予防、遅延、または低減されることを意味する。好ましくは、肺の転移、すなわち二次腫瘍が予防または低減されるが、これは、原発腫瘍から肺へのがん性細胞の転移性の伝播が予防または低減されることを意味する。
【００４０】
用語「がん」は、本明細書において使用される場合、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨がん、膵癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（CNS）の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫（上記がんのいずれかの難治型、または上記がんの1以上の組み合わせを含む）を指す。
【００４１】
用語「血管疾患」は、がん、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、外傷、敗血症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、糖尿病、加齢黄斑変性症（AMD）、網膜症、卒中、脂肪過多症、急性肺傷害、出血、血管漏出（例えば、サイトカイン誘発性）、アレルギー、グレーブス病、橋本自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎（特に固形腫瘍に対する）、眼内新血管新生症候群（増殖網膜症またはAMDなど）、関節リウマチ、および乾癬を含む（Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; and Garner, A., VASCULAR DISEASES, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp 1625-1710）。
【００４２】
用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、4本のポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合によって相互に連結した2本の重（H）鎖および2本の軽（L）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、IgM）を指すものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてHCVRまたはVHと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、すなわちCH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてLCVRまたはVLと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン（CL1）を含む。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と称されるより保存された領域が介在している、相補性決定領域（CDR）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各VHおよびV1は、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で並んだ3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本開示の異なる態様において、抗CGRP抗体（またはその抗原結合部分）のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であっても、天然にまたは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、2以上のCDRの並行解析に基づいて定義され得る。
【００４３】
用語「抗体」はまた、本明細書において使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在するか、酵素的に得ることができるか、合成であるか、または遺伝子改変された、任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、任意の好適な標準技術、例えば、タンパク質消化、または抗体の可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を伴う組換え遺伝子改変技術を使用して、例えば、完全な抗体分子から誘導され得る。このようなDNAは、公知であり、かつ/または、例えば商業的供給源であるDNAライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成することもできる。DNAを、化学的にまたは分子生物学的技術を使用することによって配列決定および操作して、例えば、1つまたは複数の可変ドメインおよび/もしくは定常ドメインを好適な構成に並べて、あるいはコドンを導入、システイン残基を生成、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させるなどしてもよい。抗原結合断片の非限定例は、以下を含む：（i）Fab断片；（ii）F（ab'）2断片；（iii）Fd断片；（iv）Fv断片；（v）単鎖Fv（scFv）分子；（vi）dAb断片；および（vii）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（CDR））。他の改変分子、例えばダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびミニボディも、本明細書において使用される表現「抗原結合断片」の範囲内に包含される。抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも1つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、一般に、1つまたは複数のフレームワーク配列に隣接しているまたはそれと共にフレームに含まれる、少なくとも1つのCDRを含む。VLドメインと関連するVHドメインを含む抗原結合断片では、VHドメインおよびVLドメインは、任意の好適な配置で互いに相対的に位置し得る。例えば、可変領域は、二量体であってよく、かつ、VH-VH、VH-VLまたはVL-VL二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のVHドメインまたはVLドメインを含有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
III. 図面の説明
【図１】溶液結合競合ELISAで測定した場合の、選択されたCGRP特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO：2〜6）のヒトおよびラットのCGRPアルファおよびベータへの結合を示す。ムテインは、それぞれラットアルファおよびヒトベータCGRPに対してより低い親和性を有するSEQ ID NO：3およびSEQ ID NO：6は除いて、4つのCGRP種全てに、低いナノモル濃度〜2桁のナノモル濃度のEC50値で結合する。得られたEC50値を実施例4の表1にまとめる。
【図２】リポカリンムテインSEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7〜17、およびSEQ ID NO：19〜28についてのSPRによるオンレート（on-rate）およびオフレート（off-rate）の典型的な測定値を提供する。それぞれヒトおよびラットCGRP種（アルファおよびベータ）に対する会合速度（ka）、解離速度（kd）および得られた解離定数（KD）を実施例5の表2にまとめる。
【図３】選択されたCGRP特異的リポカリンムテインの機能的活性のグラフ表示である。リポカリンムテインのCGRPへの結合は、それぞれヒトおよびラットCGRP種（アルファおよびベータ）についてのSK-N-MC細胞（ヒト脳神経上皮腫）またはL6細胞（ラット骨格筋芽細胞）によるCGRP誘発cAMP生産の低減を導く。4つのCGRP種全てのIC50値は、ナノモル濃度未満〜低ナノモル濃度の範囲であり、これを実施例6の表3にまとめる。
【図４】タンパク質改変によって天然に存在するシステイン架橋が除去されているCGRP特異的ムテインの結合を介した、SK-N-MC細胞（ヒト脳神経上皮腫）によるヒトアルファおよびベータCGRP誘発cAMP生産の阻害を示す。システイン不含ムテイン（SEQ ID NO：29〜40）のIC50値は、システイン架橋を有するそれらのそれぞれの親ムテイン（SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：27）のものと比較して影響を受けないままであり、これを実施例7の表4にまとめる。
【図５】リポカリンムテイン（SEQ ID NO：87〜93）についてのSPRによるオンレートおよびオフレートの典型的な測定値を提供する。ヒトアルファCGRPに対する得られた解離定数（KD）を実施例9の表5にまとめる。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
IV. 本開示の詳細な説明
本開示は、CGRPに対して結合特異性を有するポリペプチドであって、CGRPに検出可能な親和性で結合するhNGALムテインを含むポリペプチドを提供する。
【００４６】
幾つかの態様において、CGRPに検出可能な親和性で結合するhNGALムテインは、少なくとも1つの、ネイティブシステイン残基の別のアミノ酸、例えばセリン残基によるアミノ酸置換を含み得る。幾つかの他の態様において、CGRPに検出可能な親和性で結合するムテインは、野生型hNGALの1以上のアミノ酸を置換する1以上の非ネイティブシステイン残基を含み得る。さらなる特定の態様において、本開示に係るhNGALムテインは、少なくとも2つの、ネイティブアミノ酸のシステイン残基によるアミノ酸置換（それによって1以上のシステイン架橋を形成する）を含む。幾つかの態様において、前記システイン架橋は、少なくとも2つのループ領域を連結し得る。これらの領域の定義は、Flower （Flower, 1996、上記、Flower, et al., 2000、上記）およびBreustedt et al. （2005、上記）に従って本明細書において使用される。
【００４７】
本明細書に開示の通りのCGRPに対して特異性を有するムテインまたはその組成物は、CGRPの少なくとも1つの生物学的活性に関して、アンタゴニスト活性、または中和もしくは遮断活性を有し得る。
【００４８】
一局面において、本開示は、CGRPに少なくとも検出可能な親和性で結合する種々のhNGALムテインを含む。この意味で、CGRPは、参照野生型hNGALの非天然リガンドと見なされ、ここで、「非天然リガンド」は、生理学的条件下では野生型ヒトリポカリン2に結合しない化合物を指す。ある特定の配列位置において1つまたは複数の変異で野生型hNGALを改変することによって、本発明者らは、非天然リガンドであるCGRPに対して高い親和性および高い特異性が実現可能であることを実証した。幾つかの態様において、野生型Iヒトリポカリン2上のある特定の配列位置をコードする1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはさらに多くのヌクレオチドトリプレットにおいて、ヌクレオチドトリプレットのサブセットによるこれらの位置での置換を介してランダム変異誘発が実施され得る。
【００４９】
さらに、本開示のムテインは、hNGALの直鎖ポリペプチド配列のある特定の配列位置に対応する配列位置の任意の1つまたは複数（少なくとも任意の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12を含む）に、例えばヒトNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置8、9、28、36、38、40、41、42、44、46、47、49、52、54、62、65、66、68、70、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、87、96、97、98、100、103、105、106、108、111、112、114、123、125、126、127、129、132、134、135、136、145、146、175、176、177および178に、変異アミノ酸残基を有し得る。
【００５０】
本開示のムテインは、変異アミノ酸配列位置の外部に、「親」タンパク質骨格（hNGALなど）の野生型（天然）アミノ酸配列を含み得る。幾つかの態様において、本開示に係るhNGALムテインはまた、このような変異がムテインの結合活性およびフォールディングを少なくとも本質的に妨害または干渉しない限り、1つまたは複数の配列位置に1つまたは複数のアミノ酸変異を保有し得る。このような変異を、確立された標準的な方法を使用してDNAレベルで非常に容易に成し遂げることができる（Sambrook, J. et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。アミノ酸配列の変更の例示的な例は、挿入または欠失、ならびにアミノ酸置換である。このような置換は保存的であってよく、すなわち、あるアミノ酸残基が、特に極性ならびにサイズに関して、化学的に類似した特性のアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間の置換である：1）アラニン、セリン、およびトレオニン；2）アスパラギン酸およびグルタミン酸；3）アスパラギンおよびグルタミン；4）アルギニンおよびリジン；5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；および6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。その一方で、アミノ酸配列に非保存的変更を導入することも可能である。加えて、単一のアミノ酸残基を置換する代わりに、ヒトリポカリン2の一次構造の1以上の連続したアミノ酸を挿入するかまたは欠失させることも、これらの欠失または挿入が、安定なフォールディングされた/機能的なムテイン（例えば、N末端およびC末端が短縮されたhNGALムテイン）をもたらす限り可能である。このようなムテインでは、例として、ポリペプチドのN末端またはC末端に1以上のアミノ酸残基が付加されているかまたは欠失している。一般に、このようなムテインは、成熟hNGALのアミノ酸配列と約少なくとも70%（少なくとも約80%、例えば少なくとも約85%を含む）のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【００５１】
本明細書に開示のhNGALムテインのアミノ酸配列は、他のリポカリンとの配列同一性と比較したとき、成熟hNGAL（SEQ ID NO：1）に対して高い配列同一性を有する。この一般的な文脈において、本開示のムテインのアミノ酸配列は、天然野生型hNGALのアミノ酸配列と少なくとも実質的に類似しているが、但し、アミノ酸の付加または欠失の結果であるギャップ（以下に定義する通り）がアライメント内にある可能性があるものとする。成熟hNGALの配列と実質的に類似している本開示のムテインのそれぞれの配列は、幾つかの態様において、成熟hNGALの配列に対して少なくとも70%の同一性もしくは配列相同性、少なくとも75%の同一性もしくは配列相同性、少なくとも80%の同一性もしくは配列相同性、少なくとも82%の同一性もしくは配列相同性、少なくとも85%の同一性もしくは配列相同性、少なくとも87%の同一性もしくは配列相同性、または少なくとも90%の同一性もしくは配列相同性（少なくとも95%の同一性もしくは配列相同性を含む）を有するが、但し、変更された位置または配列が保持されていること、および1以上のギャップが可能であるものとする。
【００５２】
本明細書において使用される場合、本開示のムテインは、ある標的と1つまたは複数の参照標的との区別ができる場合、その標的（例えば、CGRP）と「特異的に結合する」。これは、結合特異性が絶対的ではなく相対的な特性であることによる。「特異的結合」は、例えば、ウエスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、FACS、IHCおよびペプチドスキャンに従って決定することができる。
【００５３】
一態様において、本開示のムテインは、そのN末端および/またはそのC末端で、融合パートナー（幾つかの特定の態様において、タンパク質、またはタンパク質ドメインもしくはペプチドである）に融合される。幾つかの態様において、タンパク質ドメインは、ムテインの血清半減期を延長し得る。さらなる特定の態様において、タンパク質ドメインは、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質である。
【００５４】
別の態様において、本開示のムテインは、ムテインの血清半減期を延長する化合物にコンジュゲートされる。より好ましくは、ムテインは、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロエチルデンプン、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される化合物にコンジュゲートされる。
【００５５】
なお別の態様において、本開示は、本明細書に開示のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
【００５６】
別の態様において、本開示は、前記核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００５７】
別の態様において、本開示は、前記核酸分子を含む宿主細胞または形質転換細胞を包含する。
【００５８】
別の態様において、本開示は、前記核酸分子を含む宿主細胞または形質転換細胞を使用した本明細書に開示のムテインを生産する方法を包含する。
【００５９】
別の態様において、本開示は、活性成分として本明細書に開示のムテインを含む薬学的組成物を包含する。
【００６０】
A. CGRPに特異的な例示的ムテイン
一局面において、本開示は、CGRPに特異的な新規の特異的結合ヒトリポカリン2（ヒトLcn2またはhNGAL）ムテインに関する。
【００６１】
本開示の一態様は、ヒトα-CGRP（SEQ ID NO：80）およびヒトβ-CGRP（SEQ ID NO：81）の少なくとも1つに、検出可能な親和性で、例えば、本質的に実施例4に記載される競合ELISAアッセイで測定したときに、例えば、約200nM以下、例えば約150nM以下のKDを尺度とした親和性で結合することができる、hNGALムテインに関する。
【００６２】
一局面において、本開示は、CGRPに、例えば、本質的に実施例5に記載されるSPRベースのアッセイでBiacore T200装置によって測定したときに、約5nM以下、例えば約2nM以下のKDでさらに結合することができる、hNGALムテインを提供する。
【００６３】
幾つかの他の態様において、本開示のhNGALムテインはさらに、CGRP誘発cAMP生産を、本質的に実施例6に記載されるSK-N-MC細胞ベースの機能アッセイにおいて約5nM以下、例えば約1.7nM以下のIC50値で阻害または低減することができる。
【００６４】
幾つかの特定の態様において、本開示のhNGALムテインはさらに、ラットα-CGRP（SEQ ID NO：82）およびラットβ-CGRP （SEQ ID NO：83）の少なくとも1つに、検出可能な親和性で、例えば、本質的に実施例4に記載される競合ELISAアッセイで測定したときに、例えば、約200nM以下、例えば約150nM以下のKDを尺度とした親和性で結合することができる。
【００６５】
別の局面において、本開示は、ラットCGRPに、例えば、本質的に実施例5に記載されるSPRベースのアッセイによって測定したときに約5nM以下のKDでさらに結合することができる、hNGALムテインを提供する。
【００６６】
いくつかのなおさらなる態様において、本開示のhNGALムテインはさらに、ラットCGRP誘発cAMP生産を、本質的に実施例6に記載されるL6細胞ベースの機能アッセイにおいて約5nM以下、例えば約0.2nM以下のIC50値で阻害または低減することができる。
【００６７】
幾つかの態様において、本開示のhNGALムテインはさらに、ヒトCGRPおよびラットCGRPの両方と交差反応性であり得る。
【００６８】
幾つかの他の態様において、本開示のhNGALムテインはさらに、ヒトα-CGRPおよびヒトβ-CGRPの両方と交差反応性であり得る。
【００６９】
幾つかの他の態様において、本開示のhNGALムテインはさらに、ラットα-CGRPおよびラットβ-CGRPの両方と交差反応性であり得る。
【００７０】
これに関して、本開示は、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置8、9、28、36、38、40、41、42、44、46、47、49、52、54、62、65、66、68、70、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、87、96、97、98、100、103、105、106、108、111、112、114、123、125、126、127、129、132、134、135、136、145、146、175、176、177および178に対応する1つまたは複数の位置に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21またはさらに多くの変異アミノ酸残基をさらに含み得、かつ、CGRPに検出可能な親和性で結合する、1つまたは複数のhNGALムテインに関する。
【００７１】
幾つかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132および134に対応する任意の1つまたは複数の位置に変異アミノ酸残基をさらに含み得る。
【００７２】
幾つかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の変異アミノ酸残基
2019506140.tif 000002
の少なくとも1つをさらに含み得る。
【００７３】
幾つかの態様において、本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALのこれらの配列位置に、2以上、例えば3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、もしくはさらに多くのまたは全ての変異アミノ酸残基をさらに含み得る。
【００７４】
追加的に、本開示に係るhNGALムテインはまた、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換を含み得る：Gln 28→HisおよびCys 87→Ser。
【００７５】
いくつかの追加の態様において、CGRPに結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000003
の1つをさらに含み得る。
【００７６】
さらに、本開示に係るhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換
2019506140.tif 000004
をさらに含み得る。
【００７７】
幾つかの特定の態様において、CGRPに結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000005
2019506140.tif 000006
2019506140.tif 000007
の1つをさらに含み得る。
【００７８】
追加的に、本開示に係るhNGALムテインはまた、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換を含み得る：Cys 76→Leu、Met、Val、Ile、Phe、Arg、LysまたはAsnおよびCys 175→Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、AspまたはGlu。
【００７９】
幾つかの特定の態様において、CGRPに結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000008
2019506140.tif 000009
の1つをさらに含み得る。
【００８０】
加えて、本開示に係るhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換
2019506140.tif 000010
をさらに含み得る。
【００８１】
幾つかの特定の態様において、CGRPに結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000011
2019506140.tif 000012
の1つをさらに含み得る。
【００８２】
追加的に、本開示に係るhNGALムテインはまた、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換を含み得る：Cys 76→LeuまたはTyr; Cys 175→Ile; Ile 176→AspおよびAsp 177→Gly。
【００８３】
幾つかの特定の態様において、CGRPに結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換のセット
2019506140.tif 000013
の1つをさらに含み得る。
【００８４】
加えて、本開示に係るhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下の置換および付加
2019506140.tif 000014
をさらに含み得る。
【００８５】
幾つかの特定の態様において、CGRPに結合する本開示のhNGALムテインは、成熟hNGALの直鎖ポリペプチド配列と比較して、以下のアミノ酸置換および付加のセット
2019506140.tif 000015
2019506140.tif 000016
の1つをさらに含み得る。
【００８６】
残存領域、すなわち、配列位置8、9、28、36、38、40、41、42、44、46、47、49、52、54、62、65、66、68、70、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、87、96、97、98、100、103、105、106、108、111、112、114、123、125、126、127、129、132、134、135、136、145、146、175、176、177および178と異なる領域において、本開示のhNGALムテインは、変異アミノ酸配列位置の外部に、野生型（天然）アミノ酸配列を含み得る。
【００８７】
さらなる特定の態様において、本開示に係るムテインは、SEQ ID NO：2〜40、87〜93からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその機能的断片もしくはバリアントを含む。幾つかの態様において、このような断片またはバリアントは、SEQ ID NO：2〜40、87〜93のいずれか1つに定義されるムテインの構造的相同体である。
【００８８】
本開示のhNGALムテインのアミノ酸配列は、SEQ ID NO：2〜40、87〜93からなる群より選択される配列に対して高い配列同一性、例えば少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%の同一性（少なくとも95%の同一性を含む）を有し得る。
【００８９】
幾つかのさらなる態様において、本開示に係るヒトCGRPおよび/またはラットCGRPと交差反応性であるかまたはそれに結合するhNGALムテインは、SEQ ID NO：2〜40、87〜93からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその機能的断片またはバリアントを含む。
【００９０】
本開示はまた、SEQ ID NO：2〜40、87〜93からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むhNGALムテインの構造的相同体も含み、その構造的相同体は、前記hNGALムテインに対して約60%超、好ましくは65%超、70%超、75%超、80%超、85%超、90%超、92%超、最も好ましくは95%超のアミノ酸配列相同性または配列同一性を有し、かつ、CGRPに結合する。
【００９１】
本開示に係るhNGALムテインは、天然に存在する形態のヒトリポカリン2の変異誘発によって得ることができる。変異誘発の幾つかの態様において、置換（または置き換え）は、保存的置換である。それでもなお、ムテインが、CGRPへのその結合能を保持し、かつ/または、ムテインが、その後に置換された配列に対して同一性（成熟ヒトリポカリン2のアミノ酸配列（SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188、SEQ ID NO：1）に対して少なくとも60%、例えば少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%またはより高い同一性である）を有する限り、あらゆる置換（非保存的置換または以下の例示的な置換からの1つまたは複数を含む）が想定される。
【００９２】
本開示はまた、本明細書に開示の少なくとも1つのhNGALムテイン、または本明細書に記載の通りのそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物に関する。
【００９３】
したがって、本開示のhNGALムテインは、薬学的に許容される成分ならびに確立された調製方法を使用して組成物へと製剤化することができる（Gennaro and Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機の賦形剤を使用することができる。
【００９４】
B. CGRPに特異的なムテインの用途
最近、Arulmozhiおよび同僚は、片頭痛に関する種々の理論を報告した（Vascular Pharmacology 43; 176-187, 2005）。理論の1つは、現在のところ未知の片頭痛のトリガーが、頭部組織を神経支配する三叉神経および神経節を刺激して、血管系上の軸索からの神経ペプチドメッセンジャー分子の放出を引き起こすと提唱している。これらの神経ペプチドの放出は、次いで、片頭痛に至る一連の事象を活性化する。加えて、これらの神経ペプチドの放出は、血管透過性を変化させ、刺激された三叉神経繊維によって神経支配された組織におけるその後の血漿タンパク質の漏出をもたらす。この漏出は、片頭痛へ至る神経性炎症をもたらす。
【００９５】
これらの神経ペプチドの中で、CGRPは、感覚神経の刺激時に放出され、強力な血管拡張活性を有することから、片頭痛において役割を果たすと報告されている（Vascular Pharmacology 43; 176-187, 2005）。さらに、CGRPの放出は、血管透過性およびその後の血漿タンパク質漏出（血漿タンパク質溢出）を、三叉神経線維によって神経支配された組織においてこれらの繊維の刺激時に、増加させる（Vascular Pharmacology 43; 176-187, 2005）。加えて、片頭痛を患う患者へのCGRPの注入が片頭痛様症状をもたらしたことを研究は報告している（Cephalagia 22(1): 54-61, 2002）。
【００９６】
歴史的に、セロトニン5-HT1B受容体および5-HT1D受容体の低分子アゴニストが片頭痛の処置として使用されている。これらのいわゆるトリプタンは、強力な血管収縮物質であり、かつ、実験動物片頭痛モデルにおいて三叉神経線維の刺激に起因する血漿タンパク質溢出を阻害することが示されている。加えて、血漿タンパク質溢出を減少させたトリプタンの用量は、同じ実験動物モデルにおいてCGRPレベルも減弱させた（Br. J. Pharmacology 99; 202-206, 1990; Neuropharmacology 30(11): 1193-1200, 1991）。
【００９７】
トリプタンは有効性が見いだされているが、トリプタン処置に応答する多くの患者は、処置後数時間以内に再び起こる頭痛に苦しむ。さらに、トリプタンは強力な血管収縮物質であるため、高血圧を患うまたは虚血性心疾患を患う患者集団などのある特定の患者集団には禁忌である。それ故、心血管関連作用などの不要な副作用なしに片頭痛を予防および/または治療するための治療用化合物が求められている。
【００９８】
それ故、本開示のCGRPに対して結合親和性を有するムテインの多数の可能性のある用途が、医学において、例えば、片頭痛、顎関節症、ならびに様々な他の疾患、例えば心不全、高血圧、および敗血症において存在する。1つのさらなる局面において、本開示は、試料中のCGRPを検出するためのならびにそれぞれの診断法のための、本明細書に開示のこのようなムテインの使用に関する。
【００９９】
本開示はまた、CGRPとの複合体形成のための、記載の通りのCGRPに対して結合親和性を有する1つまたは複数のムテインの使用を包含する。
【０１００】
それ故、本開示の別の局面において、開示のムテインは、CGRPの検出に使用される。このような使用は、1つまたは複数の前記ムテインを、好適な条件下で、CGRPを含有する疑いのある試料と接触させて、それによってムテインとCGRPとの間で複合体を形成させる工程、および好適なシグナルによって複合体を検出する工程を含み得る。
【０１０１】
検出可能なシグナルは、上に説明した通り標識によって、または結合に起因する物理的特性の変化、すなわち複合体形成それ自体によって生じうる。一例は、SPRであり、その値は、結合パートナー同士（その一方は、金箔などの表面に固定化されている）の結合の間に変化する。
【０１０２】
本明細書に開示のムテインはまた、CGRPの分離にも使用され得る。このような使用は、1つまたは複数の前記ムテインを、好適な条件下で、CGRPを含有しているはずの試料と接触させて、それによってムテインとCGRPとの間で複合体を形成させる工程、および試料から複合体を分離する工程を含み得る。
【０１０３】
CGRPの検出ならびにCGRPの分離のための開示のムテインの使用において、ムテインおよび/もしくはCGRP、またはそのドメインもしくは断片は、好適な固相に固定化され得る。
【０１０４】
したがって、CGRPなどの分子の存在または非存在（例えば試料中の）、ならびにその濃度またはレベルが決定され得る。
【０１０５】
本開示のムテインは、それ故、試料中のCGRPを、例えば、診断目的で、検出および/または測定するために使用され得る。例えば、ムテインは、CGRPの異常発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現欠如など）によって特徴付けられる病態または疾患を診断するために使用され得る。CGRPの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されているムテインと接触させる工程を含み得る。あるいは、未標識ムテインを、それ自体検出可能に標識されている二次分子と組み合わせて、診断用途で使用することもできる。検出可能な標識またはレポーター分子は、3H、14C、32P、35S、もしくは125Iなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアナート、もしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であることができる。試料中のCGRPを検出または測定するために使用することができる特定の例示的なアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、放射免疫測定（RIA）、および蛍光活性化細胞選別（FACS）を含む。
【０１０６】
なお別の局面において、本開示は、本開示に係るCGRPに対して結合親和性を有するムテインを含む診断または分析キットを特徴とする。
【０１０７】
さらなる局面において、本開示はまた、薬学的組成物の製造のための、開示のhNGALムテインまたは本明細書に記載のこのようなムテインを含む組み合わせの使用を包含する。このようにして得られる薬学的組成物は、対象、好ましくはヒトにおける片頭痛の治療または予防に有用である遊離CGRPの循環レベルを減少させるのに好適であり得る。薬学的組成物は、単独療法としてまたは併用療法として使用され得る。したがって、本開示はまた、タンパク質血漿溢出の調節不全に関連する疾患または障害の処置のためのhNGALムテインを提供する。
【０１０８】
診断法におけるそれらの使用に加えて、なお別の局面において、本開示は、対象におけるCGRPの結合のためのおよび/または対象におけるタンパク質溢出の量を低減するための、本開示のこのようなムテインまたはこのようなムテインを含む組成物もしくは組み合わせの使用を包含する。幾つかの態様において、このような対象は、血管透過性を変化させ、刺激された三叉神経繊維によって神経支配された組織におけるその後の血漿タンパク質の漏出をもたらす神経ペプチドの放出によって引き起こされる疾患または障害を患う場合がある。
【０１０９】
なお別の局面において、本開示は、対象におけるCGRPに結合する方法であって、前記対象に、有効量の、本開示のCGRPに対して結合親和性を有する1つまたは複数のムテインまたはこのようなムテインを含む1つまたは複数の組成物もしくは組み合わせを投与する工程を含む方法を特徴とする。
【０１１０】
なお別の局面において、本開示は、対象における片頭痛を阻害または低減するための方法であって、対象に、有効量の、CGRPもしくはCGRPの断片に対して結合親和性を有する1つまたは複数の本開示のムテインまたはこのようなムテインを含む1つまたは複数の組成物もしくは組み合わせを投与する工程を含む方法を包含する。幾つかの態様において、このような対象は、遊離CGRPレベルの調節不全に関連する疾患または障害を患う場合がある。
【０１１１】
本開示のムテインまたはこのようなムテインを含む組成物もしくは組み合わせは、とりわけ、CGRP活性と関連する任意の疾患または障害（遊離CGRPレベルの調節不全に関連する疾患または障害を含む）の治療、予防および/または改善に有用である。
【０１１２】
なお別の局面において、本開示は、対象における血漿タンパク質溢出を阻害または低減するための方法であって、対象に、有効量の、CGRPもしくはCGRPの断片に対して結合親和性を有する1つまたは複数の本開示のムテインまたはこのようなムテインを含む1つまたは複数の組成物もしくは組み合わせを投与する工程を含む方法を包含する。
【０１１３】
例えば、本開示のムテインまたはこのようなムテインを含む組成物もしくは組み合わせは、遊離CGRPの循環レベルを減少させるために使用され得る。
【０１１４】
幾つかの他の態様において、本開示のムテインまたはこのようなムテインを含む組成物もしくは組み合わせはまた、片頭痛の治療、予防および/または改善にも有用であり得る。
【０１１５】
本開示に係るhNGALムテインまたはこのようなムテインを含む組成物もしくは組み合わせを、治療的に有効である任意の非経口経路または非経口ではない（例えば、腸内）経路を介して投与することができる。治療的に有効な経路は、所望の区画、システム、または位置への作用物質の送達を提供する。例えば、治療的に有効な経路は、それを介して、有益または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量の作用物質を所望の作用部位で提供するように作用物質を投与することができる経路である。
【０１１６】
C. 本開示のムテイン
CGRPに結合する本開示のムテインの文脈において本明細書で使用されるとき、用語「に特異的な」は、ムテインが、CGRPに対して方向づけられる、結合する、または反応することを含む。したがって、方向づけられる、結合する、または反応することは、ムテインがCGRPに特異的に結合することを含む。この文脈における用語「特異的に」は、ムテインが、本明細書に記載の通りにCGRPと反応するが別の標的と本質的に反応しないことを意味する。ムテインが本明細書で先に定義の通り特異的に反応するか否かは、とりわけ、本開示のhNGALムテインとCGRPとの反応およびこのムテインと他の1つまたは複数の標的との反応を比較することによって、容易に試験することができる。「特異的結合」はまた、例えば、ウエスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、FACS、IHCおよびペプチドスキャンに従って決定することもできる。
【０１１７】
本開示に係るムテインのアミノ酸配列は、別のリポカリンとの配列同一性と比較したとき、ヒトリポカリン2に対して高い配列同一性を有する（上記も参照のこと）。この一般的な文脈において、本開示に係る組み合わせのムテインのアミノ酸配列は、対応するリポカリン（野生型hNGAL）のアミノ酸配列と少なくとも実質的に類似する。本開示に係る組み合わせのムテインのそれぞれの配列は、成熟hNGALの配列と実質的に類似し、例えば、成熟hNGALの配列に対して少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%の同一性（少なくとも95%の同一性を含む）である。これに関して、本開示のムテインは、当然ながら、比較して、ムテインをCGRPへ結合できるようにする本明細書に記載の通りの置換を含有し得る。典型的には、hNGALのムテインは、hNGALのネイティブ配列と比較して、hNGALのリガンド結合部位の開放端にある4つのループ内のアミノ酸の1つまたは複数の変異を含む。上に説明した通り、これらの領域は、CGRPに対するムテインの結合特異性を決定する際に必要不可欠である。ムテイン由来hNGALまたはその相同体は、そのN末端領域内、ならびに/または天然の結合ポケットと対向して位置しているβバレル構造の末端に配置された3つのペプチドループBC、DE、およびFG内の、任意の配列位置に、1、2、3、4またはそれ以上の変異アミノ酸残基を有し得る。幾つかの特定の態様において、本開示に係るhNGALムテインは、CGRPの結合ポケットを一緒に規定するSEQ ID NO：2〜40、87〜93のうちの1つにおける4つのループを含む。
【０１１８】
本開示に係るムテインは、対応するネイティブhNGALと比較して、1または複数の、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19またはさらには20個の置換を含むが、但し、このようなムテインは、CGRPに結合できるものとする。例えば、ムテインは、hNGALの別個の位置に対応する位置（すなわち、対応する位置）に置換を有することができる。幾つかの態様において、本開示に係る組み合わせのムテインは、アルギニン残基によるネイティブアミノ酸の少なくとも2つのアミノ酸置換（2、3、4、5またはさらに多くのアミノ酸置換を含む）を含む。したがって、本明細書に記載の通りのタンパク質「参照」骨格の核酸は、CGRPに結合することができるムテインを作製する目的で変異誘発に供される。
【０１１９】
また、本開示のムテインは、ムテインの生物学的活性（その標的、例えばCGRPに結合する）に影響を及ぼすことなしに、そのN末端またはC末端、好ましくはC末端に、異種アミノ酸配列、例えばStrep-tag、例えば、Strep IIタグを含むことができる。
【０１２０】
具体的には、野生型hNGALと異なるムテインのアミノ酸配列のアミノ酸残基が野生型hNGALのアミノ酸配列内のある特定の位置に対応するか否かを決定するために、当業者は、当技術分野において周知の手段および方法、例えば、手作業によるか、または、コンピュータープログラム、例えばBLAST2.0（Basic Local Alignment Search Toolを意味する）もしくはClustalW、または配列アライメントを作成するのに適している任意の他の好適なプログラムを使用することによる、アライメントを使用することができる。したがって、野生型hNGALは、「対象配列」または「参照配列」となり得、本明細書に記載の野生型hNGALと異なるムテインのアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」となる。用語「参照配列」および「野生型配列」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１２１】
幾つかの態様において、置換（または置き換え）は、保存的置換である。それでもなお、ムテインが、CGRPへのその結合能を保持し、かつ/または、ムテインが、その後に置換された配列に対して同一性（「オリジナル」配列に対して少なくとも60%、例えば少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%またはより高い同一性である）を有する限り、あらゆる置換（非保存的置換または以下に列挙される例示的な置換からの1つまたは複数を含む）が想定される。
【０１２２】
保存的置換は、一般に以下の置換
2019506140.tif 000017
である（変異されるアミノ酸に従って列挙し、各々、保存的になるように選ぶことができる1つまたは複数の置換を続ける）。また、他の置換も許容され、経験的に、または他の公知の保存的置換もしくは非保存的置換に従って、これを決定することができる。さらなる方針として、以下の8つの群は各々、互いにとっての保存的置換を規定するように典型的に選ぶことができるアミノ酸を含有する：
a. アラニン（Ala）、グリシン（Gly）；
b. アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）；
c. アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）；
d. アルギニン（Arg）、リジン（Lys）；
e. イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、バリン（Val）；
f. フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）；
g. セリン（Ser）、トレオニン（Thr）；および
h. システイン（Cys）、メチオニン（Met）。
【０１２３】
このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、より実質的な変化、例えば、アミノ酸クラスに関する以下の、またはさらに後述する通りの変化を導入し、その産物を所望の特徴についてスクリーニングしてもよい。このようなより実質的な変化の例は、以下である：Ala→Leu、Ile; Arg→Gln; Asn→Asp、Lys、Arg、His; Asp→Asn; Cys→Ala; Gln→Glu; Glu→Gln; His→Lys; Ile→Met、Ala、Phe; Leu→Ala、Met、ノルロイシン; Lys→Asn; Met→Phe; Phe→Val、Ile、Ala; Trp→Phe; Tyr→Thr、Ser; Val→Met、Phe、Ala。
【０１２４】
hNGALの生物学的特性の実質的な修飾は、（a）例えば、シート状もしくは螺旋状の立体配置としての、置換領域のポリペプチド骨格の構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖の嵩高さ、を維持することに対する効果が顕著に異なる置換を選択することによって、成し遂げられる。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群に分けられる：（1）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；（2） 中性で親水性：システイン、セリン、トレオニン；（3）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（4）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン；（5）鎖の配向に影響する残基：グリシン、プロリン；および（6）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０１２５】
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。また、hNGALの適切な立体配置の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンで置換して、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防止してもよい。逆に、システイン結合を追加して安定性を向上させてもよい。
【０１２６】
任意の変異（上で考察した通りの挿入を含む）を、確立された標準的な方法を使用して、核酸、例えばDNAレベルで、非常に容易に成し遂げることができる。アミノ酸配列の変更の例示的な例は、挿入または欠失、ならびにアミノ酸置換である。このような置換は保存的であってよく、すなわち、あるアミノ酸残基が、特に極性ならびにサイズに関して、化学的に類似した特性のアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、以下の群のメンバー間の置換である：1）アラニン、セリン、およびトレオニン；2）アスパラギン酸およびグルタミン酸；3）アスパラギンおよびグルタミン；4）アルギニンおよびリジン；5）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；ならびに6）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。その一方で、アミノ酸配列に非保存的変更を導入することも可能である。加えて、単一のアミノ酸残基を置換する代わりに、hNGALの一次構造の1以上の連続したアミノ酸を挿入するかまたは欠失させることも、これらの欠失または挿入が、安定なフォールディングされた/機能的なムテインをもたらす限り可能である。
【０１２７】
アミノ酸配列の修飾は、ある特定の制限酵素のための切断部位を組み込むことによって、変異したhNGAL遺伝子またはその一部分のサブクローニングを簡素化するための単一アミノ酸位置の特異的変異誘発を含む。加えて、これらの変異をまた、所与の標的、例えばCGRPに対するムテインの親和性をさらに向上させるために組み込むこともできる。さらに、ムテインのある特定の特徴をモジュレートするために、例えば、必要に応じて、フォールディング安定性、血清安定性、タンパク質耐性もしくは水溶性を向上させるために、または凝集傾向を低減するために、変異を導入することができる。例えば、天然に存在するシステイン残基を他のアミノ酸に変異させて、ジスルフィド架橋の形成を防止してよい。また、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）、ビオチン、ペプチド、もしくはタンパク質などの他の化合物へのコンジュゲーションのためまたは天然に存在しないジスルフィド結合の形成のため、新しい反応性基を導入するために、他のアミノ酸配列位置をシステインに故意に変異させることも可能である。生成されたチオール部分は、例えば、それぞれのムテインの血清半減期を長くするために、ムテインをPEG化またはHES化するのに使用され得る。
【０１２８】
また、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）、ビオチン、ペプチド、もしくはタンパク質などの他の化合物へのコンジュゲーションのためまたは天然に存在しないジスルフィド結合の形成のため、新しい反応性基を導入するために、他のアミノ酸配列位置をシステインに変異させることも可能である。
【０１２９】
幾つかの態様において、上記の部分の1つが本開示のムテインにコンジュゲートされる場合、アミノ酸側鎖へのコンジュゲーションが有利な場合がある。好適なアミノ酸側鎖は、hNGALのアミノ酸配列内に天然に存在しても、変異誘発によって導入されてもよい。好適な結合部位が変異誘発を介して導入される場合、1つの可能性は、適切な位置のアミノ酸をシステイン残基によって置換することである。
【０１３０】
ヒトリポカリン2のムテインに関して、システイン残基をリポカリン（ヒトリポカリン2ムテインを含む）のアミノ酸配列に導入するこのような変異の例示的な可能性は、ヒトNGALの野生型配列の配列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146または158に対応する配列位置の少なくとも1つへのシステイン（Cys）残基の導入を含む。SWISS-PROT/UniProt Data Bank Accession Number P80188の配列と比較して、システインが別のアミノ酸残基によって置換された配列を本開示のヒトリポカリン2ムテインが有する幾つかの態様において、対応するシステインがその配列に再導入され得る。例示的な例として、そのような場合、SWISS-PROT accession No. P80188の配列（SEQ ID NO：1）内に元々存在していたようにシステインに戻すことによって、アミノ酸位置87のシステイン残基を導入してもよい。アミノ酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146および/または158のいずれかの側の生成されたチオール部分は、例えば、それぞれのヒトリポカリン2ムテインの血清半減期を長くするために、ムテインをPEG化またはHES化するのに使用され得る。
【０１３１】
別の態様において、上記化合物の1つを本開示に係るムテインにコンジュゲートするための好適なアミノ酸側鎖を提供するために、変異誘発によって人工アミノ酸が導入され得る。一般に、このような人工アミノ酸は、より反応性となるように、ひいては、所望の化合物へのコンジュゲーションを容易にするように、設計されている。人工tRNAを介して導入され得るこのような人工アミノ酸の1つの例は、パラ-アセチル-フェニルアラニンである。
【０１３２】
幾つかの態様において、本開示のムテインは、そのN末端またはそのC末端で、タンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチド、例として、シグナル配列および/または親和性タグに融合され得る。
【０１３３】
親和性タグ、例えばStrep-tag（登録商標）もしくはStrep-tag（登録商標）II（Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766）、mycタグ、FLAGタグ、His6タグもしくはHAタグ、またはタンパク質、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼもまた、組換えタンパク質の容易な検出および/もしくは精製を可能にし、好適な融合パートナーのさらなる例である。最後に、発色または蛍光特性を有するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）または黄色蛍光タンパク質（YFP）も同様に、本開示のムテインの好適な融合パートナーである。
【０１３４】
一般に、化学反応、物理反応、光学反応、または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的にまたは間接的に生じる任意の適切な化学物質または酵素で、本開示のムテインを標識することが可能である。物理反応および同時に光学反応/マーカーの例は、照射による蛍光の放射、または放射性標識を使用したときのX線の放射である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびβ-ガラクトシダーゼは、発色性反応生成物の形成を触媒する酵素標識（同時に光学標識）の例である。一般に、抗体に対して通常使用される標識もまた、全て本開示のムテインへのコンジュゲートに使用することができる（免疫グロブリンのFc部分の糖部分と共に排他的に使用されるものを除く）。本開示のムテインはまた、任意の好適な治療的に活性な作用物質と、例えば、所与の細胞、組織もしくは器官へこのような作用物質を標的送達するために、または周囲の正常細胞に影響を及ぼさずに細胞、例えば腫瘍細胞を選択的に標的化するために、コンジュゲートされ得る。このような治療的に活性な作用物質の例は、放射性核種、毒素、有機低分子、および治療用ペプチド（例えば、細胞表面受容体のアゴニスト/アンタゴニストとして作用するペプチドまたは所与の細胞標的上のタンパク質結合部位に競合するペプチド）を含む。しかしながら、本開示のムテインはまた、アンチセンス核酸分子、低分子干渉RNA、マイクロRNAまたはリボザイムなどの治療的に活性な核酸とコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲートを当技術分野において周知の方法によって生産することができる。
【０１３５】
先に示したように、本開示のムテインは、幾つかの態様において、ムテインの血清半減期を延長する部分にコンジュゲートされ得る（これに関しては、CTLA-4に対して結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンのムテインに関してこのようなコンジュゲーション戦略が記載されているPCT公報WO 2006/56464も参照のこと）。血清半減期を延長する部分は、数例を挙げると、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、脂肪酸分子、例えばパルミチン酸（Vajo & Duckworth 2000, Pharmacol. Rev. 52, 1-9）、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、またはアルブミン結合タンパク質、トランスフェリンであり得る。アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体断片（例えば、米国特許第6,696,245号を参照のこと）、またはアルブミンに対して結合活性を有するムテインであり得る。したがって、本開示のムテインの半減期を延長するための好適なコンジュゲーションパートナーは、アルブミン結合タンパク質、例えば、細菌アルブミン結合ドメイン、例えば連鎖球菌プロテインGの1つを含む（Konig, T., & Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83）。コンジュゲーションパートナーとして使用することができるアルブミン結合ペプチドの他の例は、例として、米国特許出願第2003/0069395号（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）またはDennis等（Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002) J Biol Chem 277, 35035-35043）に記載されている通りの、Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cysコンセンサス配列［式中、Xaa1は、Asp、Asn、Ser、Thr、またはTrpであり；Xaa2は、Asn、Gln、His、Ile、Leu、またはLysであり；Xaa3は、Ala、Asp、Phe、Trp、またはTyrであり；そしてXaa4は、Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、またはThrである］を含むものである。
【０１３６】
他の態様において、アルブミンそれ自体（Osborn, B.L. et al., 2002, J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548）、またはアルブミンの生物学的に活性な断片を、本開示のムテインのコンジュゲーションパートナーとして使用することができる。用語「アルブミン」は、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンまたはラットアルブミンなどの全ての哺乳動物アルブミンを含む。アルブミンまたはその断片を、米国特許第5,728,553号または欧州特許出願EP 0 330 451およびEP 0 361 991（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる）に記載の通り組換え産生することができる。ムテインの半減期を延長するために、組換えヒトアルブミン（Recombumin（登録商標）） Novozymes Delta Ltd. （Nottingham, UK）を本開示のムテインにコンジュゲートまたは融合させることができる。
【０１３７】
アルブミン結合タンパク質が抗体断片である場合、それはドメイン抗体であり得る。ドメイン抗体（dAb）は、生物物理学的特性およびインビボ半減期の正確な制御を可能にし、最適な安全性および有効性の生成物プロファイルを作り出すよう改変されている。ドメイン抗体は、例えば、Domantis Ltd. （Cambridge, UK and MA, USA）から市販されている。
【０１３８】
本開示のムテインの血清半減期を延長する部分としてトランスフェリンを使用して、非グリコシル化トランスフェリンのN末端もしくはC末端または両方にムテインを遺伝学的に融合させることができる。非グリコシル化トランスフェリンは、14〜17日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質は、延長された半減期を同様に有する。トランスフェリン担体はまた、高度な生物学的利用能、体内分布および循環血中安定性も提供する。この技術は、BioRexis（BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, USA）から市販されている。タンパク質安定化物質/半減期延長パートナーとして使用するための組換えヒトトランスフェリン（DeltaFerrin(商標)）もまた、Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK）から市販されている。
【０１３９】
免疫グロブリンのFc部分が、本開示のムテインの血清半減期を延長する目的で使用される場合、Syntonix Pharmaceuticals, Inc（MA, USA）から市販されているSynFusion（商標）技術が使用され得る。このFc融合技術の使用は、より長い時間作用する生物薬剤の作製を可能にし、例えば、薬物動態、溶解度、および生産効率を向上させるために抗体のFc領域に結合したムテインの2つのコピーからなり得る。
【０１４０】
本開示のムテインの半減期を延長するためのさらに別の代替法は、ムテインのN末端またはC末端に、長くて構造化されていない柔軟なグリシンリッチ配列（例えば、約20〜80個の連続したグリシン残基を有するポリグリシン）を融合させることである。WO2007/038619において開示されているこのアプローチは、例えば、「rPEG」（組換えPEG）とも呼ばれている。
【０１４１】
ポリアルキレングリコールがコンジュゲーションパートナーとして使用される場合、ポリアルキレングリコールは、置換型、非置換型、直鎖状、または分枝状であることができる。また、これは、活性化ポリアルキレン誘導体であることもできる。好適な化合物の例は、インターフェロンに関してWO 99/64016、米国特許第6,177,074号または米国特許第6,403,564号に記載されているか、またはPEG修飾アスパラギナーゼ、PEG-アデノシンデアミナーゼ（PEG-ADA）、もしくはPEG-スーパーオキシドジスムターゼなどの他のタンパク質に関して記載されている、ポリエチレングリコール（PEG）分子である（例えば、Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148を参照のこと）。ポリエチレングリコールなどのこのようなポリマーの分子量は、約300〜約70,000ダルトンの範囲であってよく、例えば、分子量が約10,000ダルトン、約20,000ダルトン、約30,000ダルトンまたは約40,000ダルトンのポリエチレングリコールが含まれる。さらに、例えば米国特許第6,500,930号または第6,620,413号に記載されている通り、デンプンまたはヒドロキシエチルデンプン（HES）などの炭水化物オリゴマーおよび炭水化物ポリマーを、血清半減期を延長する目的で本開示のムテインにコンジュゲートさせることができる。
【０１４２】
加えて、本明細書に開示のムテインは、酵素活性または他の分子に対する結合親和性などの新しい特徴を本開示のムテインに付与し得る部分に融合され得る。好適な融合パートナーの例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、プロテインGのアルブミン結合ドメイン、プロテインA、抗体断片、オリゴマー形成ドメインまたは毒素である。
【０１４３】
特に、得られる融合タンパク質の両方の「構成要素」が、所与の治療標的に対して一緒に作用するように、本明細書に開示のムテインを別々の酵素活性部位と融合させることが可能でありうる。ムテインの結合ドメインは疾患の原因となる標的に結合して、酵素ドメインが標的の生物学的機能を無効にすることを可能にする。
【０１４４】
本開示はまた、本開示のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（DNAおよびRNA）に関する。遺伝コードの縮重は、ある特定のコドンの、同じアミノ酸を指定する他のコドンによる置換を許容するので、本開示は、本明細書に記載の通りのムテインをコードする特定の核酸分子に限定されず、機能的ムテインをコードするヌクレオチド配列を含む全ての核酸分子を包含する。これに関して、本開示は、本開示の一部のムテインをコードするSEQ ID NO：41〜79、94〜100に示される通りのヌクレオチド配列を提供する。
【０１４５】
本開示の一態様において、本方法は、ヒトNGALの直鎖ポリペプチド配列（SEQ ID NO：1）の配列位置8、9、28、36、38、40、41、42、44、46、47、49、52、54、62、65、66、68、70、71、72、73、75、76、77、79、80、81、83、87、96、97、98、100、103、105、106、108、111、112、114、123、125、126、127、129、132、134、135、136、145、146、175、176、177および178に対応する配列位置の少なくとも1つ、またはさらに多くのアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットにおける変異誘発に、核酸分子を供する工程を含む。
【０１４６】
本開示はまた、実験的変異誘発の指定の配列位置以外の追加の変異を含む本開示のムテインをコードする核酸分子も含む。このような変異は、許容されることが多く、またはさらには有利であると証明される場合があり、例えば、これらがムテインのフォールディング効率、血清安定性、熱安定性またはリガンド結合親和性の向上に寄与する場合がある。
【０１４７】
本出願に開示される核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするために1つまたは複数の調節配列に「機能的に連結され」得る。
【０１４８】
核酸分子、例えばDNAは、転写調節および/または翻訳調節に関する情報を含有する配列エレメントを含み、そのような配列が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結され」ている場合、「核酸分子を発現することができる」または「ヌクレオチド配列の発現を可能にする」ことができると称される。機能的な連結は、調節配列エレメントおよび発現されるべき配列が、遺伝子発現を可能にするように接続される連結である。遺伝子発現に必要な調節領域の厳密な性質は、種間で変動し得るが、一般に、これらの領域はプロモーターを含み、プロモーターは、原核生物では、プロモーター自体、すなわち転写開始を指令するDNAエレメント、ならびにRNAに転写されて翻訳開始の合図を送るDNAエレメントの両方を含む。このようなプロモーター領域は、通常、転写および翻訳の開始に関与する5'非コード配列、例えば、原核生物の-35/-10ボックスおよびシャイン・ダルガノエレメント、または真核生物のTATAボックス、CAAT配列、および5'キャッピングエレメントを含む。これらの領域はまた、エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメント、ならびに宿主細胞の特定の区画をネイティブポリペプチドの標的とするための翻訳されるシグナル配列およびリーダー配列も含むことができる。
【０１４９】
加えて、3'非コード配列は、転写終結またはポリアデニル化などに関与する調節エレメントを含有し得る。しかしながら、これらの終結配列が、特定の宿主細胞において充分に機能的ではない場合、これらは、その細胞において機能的なシグナルで置換され得る。
【０１５０】
それ故、本開示の核酸分子は、調節配列、例えばプロモーター配列を含むことができる。幾つかの態様において、本開示の核酸分子は、プロモーター配列および転写終結配列を含む。好適な原核生物プロモーターは、例えば、tetプロモーター、lacUV5プロモーターまたはT7プロモーターである。真核細胞における発現に有用なプロモーターの例は、SV40プロモーターまたはCMVプロモーターである。
【０１５１】
本開示の核酸分子はまた、ベクターまたは任意の他の種類のクローニング媒体、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、もしくは人工染色体の一部分であることもできる。
【０１５２】
一態様において、核酸分子は、ファージミド内に含まれる。ファージミドベクターとは、関心対象のcDNAに融合されたM13もしくはf1などの溶原性（temperent）ファージの遺伝子間領域、またはその機能的部分をコードするベクターを示す。細菌宿主細胞にこのようなファージミドベクターおよび適切なヘルパーファージ（例えば、M13K07、VCS-M13またはR408）を重感染させた後に、完全なファージ粒子が生産され、それによって、コードされた異種cDNAの、ファージ表面に提示されたその対応するポリペプチドへの物理的カップリングが可能になる（例えば、Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424、またはRodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93を参照のこと）。
【０１５３】
このようなクローニング媒体は、上記の調節配列および本明細書に記載の通りのムテインをコードする核酸配列とは別に、発現に使用される宿主細胞と適合性のある種に由来する複製配列および制御配列、ならびに形質転換された細胞または形質導入された細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含むことができる。多数の好適なクローニングベクターが当技術分野において公知であり、市販されている。
【０１５４】
本明細書に記載の通りのムテインをコードするDNA分子、特にこのようなムテインのコード配列を含有するクローニングベクターを、その遺伝子を発現することができる宿主細胞に形質転換させることができる。形質転換は、標準的な技術を使用して実施することができる。したがって、本開示はまた、本明細書に開示の通りの核酸分子を含有する宿主細胞にも関する。
【０１５５】
形質転換された宿主細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現に好適な条件下で培養される。好適な宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli（E. coli））もしくは枯草菌（Bacillus subtilis）などの原核性であるか、またはサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、SF9昆虫細胞もしくはHigh5昆虫細胞、不死化哺乳動物細胞株（例えば、HeLa細胞もしくはCHO細胞）、もしくは初代哺乳動物細胞などの真核性であることができる。
【０１５６】
本開示はまた、本明細書に記載の通りのムテインの生産のための方法であって、ムテインまたはポリペプチド、ムテインの断片またはムテインの融合タンパク質が、該ムテインまたはポリペプチドをコードする核酸から開始して遺伝子改変法によって生産される、方法にも関する。該方法を、インビボで実施することができ、ムテインまたはポリペプチドを、例えば、細菌宿主生物または真核宿主生物において生産して、次いで、この宿主生物またはその培養物から単離することができる。また、タンパク質をインビトロで、例えばインビトロ翻訳系の使用によって生産することも可能である。
【０１５７】
インビボでムテインを生産するとき、このようなムテインまたはポリペプチドをコードする核酸は、組換えDNA技術によって好適な細菌宿主生物または真核宿主生物中に導入される（上で既に概説した通り）。この目的のために、宿主細胞は最初に、確立された標準的な方法を使用して、本明細書に記載の通りのムテインをコードする核酸分子を含むクローニングベクターで形質転換される。次いで、宿主細胞は、異種DNAの発現、ひいては対応するポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養される。その後、該ポリペプチドが、細胞または培養培地のいずれかから回収される。
【０１５８】
幾つかの態様において、本出願に開示される核酸分子、例えばDNAは、本開示の融合タンパク質の発現を可能にするために本開示の別の核酸分子に「機能的に連結され」得る。これに関して、機能的な連結とは、第一の核酸分子の配列エレメントおよび第二の核酸分子の配列エレメントが、融合タンパク質の単一ポリペプチドとしての発現を可能にするように接続される連結である。
【０１５９】
加えて、幾つかの態様において、Cys 76とCys 175との間の天然に存在するジスルフィド結合が、本開示のhNGALムテインにおいて除去され得る。したがって、このようなムテインを、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において生産することができる。
【０１６０】
本開示のムテインが分子内ジスルフィド結合を含む場合、適切なシグナル配列を使用して、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に新生ポリペプチドを向かわせることが好ましい場合がある。このような酸化性環境は、E. coliなどのグラム陰性細菌の周辺質によって、グラム陽性細菌の細胞外環境において、または真核細胞の小胞体の内腔において提供され得、通常、構造的なジスルフィド結合の形成に好都合である。
【０１６１】
しかしながら、宿主細胞、好ましくはE. coliのサイトゾルにおいて本開示のムテインを生産することもまた可能である。この場合、ムテインまたはポリペプチドを、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に得ることも、封入体の形態で回収した後にインビトロで復元することもできる。さらなる選択肢は、酸化性の細胞内環境を有し、したがって、サイトゾルでのジスルフィド結合の形成を可能にし得る、特定の宿主株の使用である（Venturi et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-8）。
【０１６２】
しかしながら、本明細書に記載の通りのムテインまたはポリペプチドは、必ずしも、遺伝子改変の使用によってのみ生成または生産されるわけではない。むしろ、このようなムテインまたはポリペプチドは、メリフィールド固相ポリペプチド合成などの化学合成によって、またはインビトロの転写および翻訳によって得ることもできる。例えば、分子モデリングを使用して有望な変異を特定し、次いで、望まれる（設計された）ポリペプチドをインビトロで合成し、CGRPに対する結合活性を調査することが可能である。タンパク質を固相合成および/または溶液相合成するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43を参照のこと）。
【０１６３】
別の態様において、本開示のムテインまたはポリペプチドは、当業者に公知の十分に確立された方法を用いて、インビトロ転写/翻訳によって生産され得る。 
【０１６４】
熟練した研究者は、本開示によって企図されるがそのタンパク質配列または核酸配列が本明細書において明確に開示されないムテインまたはそのポリペプチドを調製するのに有用な方法を認識するであろう。概要として、アミノ酸配列のこのような修飾は、例えば、ある特定の制限酵素のための切断部位を組み込むことによって、変異したhNGAL遺伝子またはその一部分のサブクローニングを簡素化するための単一のアミノ酸位置の特異的変異誘発を含む。加えて、これらの変異を、その標的（例えば、CGRP）に対するムテインの親和性をさらに向上させるために組み込むこともできる。さらに、ムテインのある特定の特徴をモジュレートするために、例えば、必要に応じて、フォールディング安定性、血清安定性、タンパク質耐性もしくは水溶性を向上させるために、または凝集傾向を低減するために、変異を導入することができる。例えば、天然に存在するシステイン残基を他のアミノ酸に変異させて、ジスルフィド架橋の形成を防止してよい。
【０１６５】
本明細書に開示のムテインまたはそのポリペプチドおよびそれらの誘導体を、抗体またはその断片と同様に多くの分野で使用することができる。例えば、ムテインを、酵素、抗体、放射性物質または生化学的活性もしくは規定の結合特徴を有する任意の他の基で標識するために使用することができる。そうすることによって、それらのそれぞれの標的またはそのコンジュゲートもしくは融合タンパク質を検出することも、それらと接触させることもできる。加えて、本開示のムテインまたはそのポリペプチドは、確立された分析方法（例えば、ELISAもしくはウエスタンブロット）によって、または顕微鏡検査もしくは免疫検知法（immunosensorics）によって化学構造を検出するのに役立ちうる。これに関して、好適なムテインコンジュゲートもしくは融合タンパク質の使用によって直接的に、または結合したムテインの抗体を介した免疫化学的検出によって間接的に、検出シグナルを生成させることができる。
【０１６６】
本開示の追加の目的、利点、および特徴は、限定することを意図しない以下の実施例およびその添付図面の考察によって、当業者に明らかになるであろう。したがって、本開示は、例示的な態様および任意の特徴によって具体的に開示されるが、本明細書において開示されその中で具体化される本開示の修正および変更を当業者が行ってよいこと、ならびにそのような修正および変更が本開示の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。
【実施例】
【０１６７】
V. 実施例
実施例1：カルシトニン遺伝子関連ペプチドのペプチド合成およびビオチン化
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）は、神経活性ペプチドである。それは、アルファCGRPおよびベータCGRPという2つの異なるアイソフォームで存在し、ヒトおよびラット由来の両アイソフォームをペプチド合成によって生成した（SEQ ID NO：80〜83）。ペプチド溶液を、シリコン処理をした1.5mLチューブ（ThermoFisher, No. 02-681-320）に分割し、シリコン処理をした1.5mLチューブ（Thermo Fisher, No. 02-681-320）中で高速真空濃縮システムによって凍結乾燥した。該ペプチドを再溶解するために、0.5% AcOHを加え、タッピングまたはピペッティングによって十分に混合した。
【０１６８】
関心対象のムテインの選択およびスクリーニングのために、CGRPペプチドをビオチン化しうる。これに関して、合成中に、ペプチドのN末端アミノ酸のNH2基にビオチン基を直接カップリングした。
【０１６９】
実施例2：ファージディスプレイおよびハイスループットELISAスクリーニングを使用した、CGRPに特異的に結合するムテインの選択および同定
成熟hNGALのランダム変異誘発によって生成されたhNGALに基づくライブラリーを、異なるCGRP標的に特異的に結合するムテインの選択に使用した。ビオチン化したヒトおよびラットCGRPαおよびβの4つの形態を、独立したファージディスプレイおよび選択プロセスにおいて、4ラウンドの選択全体にわたり単一の作用物質として使用、または交互に適用した。
【０１７０】
これらのライブラリー由来の2×1012個のファージミドを、200または500nMのビオチン化標的とインキュベートした。ニュートラアビジンまたはストレプトアビジンでコートした常磁性ビーズを使用して標的/ファージミド複合体を捕捉し、その後磁石で単離した。ビーズをPBSTまたはPBSで洗浄することによって未結合のファージミドを除去した。結合したファージミドをまず70mMトリエチルアミン300μlで10分間溶離させ、続いて、上清を1M Tris-Cl（pH 6.0）100μlで即時中和した。1回の中間洗浄サイクル後に、残留ファージミドを100mMグリシン（pH 2.2）で10分間溶離させ、続いて、0.5 M Tris塩基50μlで即時中和した。両方の溶離画分を集め、再増幅のためにE. coli XL1ブルー培養物（OD550 0.45〜0.6）4mlを感染させるのに使用した。撹拌下で30分間のインキュベーション後、5000×gで2分間の遠心分離によって細菌を収集し、2×YT培地1mLに再懸濁して、3つの大きなLB/Amp寒天プレート（10g/lバクトトリプトン（bacto tryptone）、5g/l酵母エキス、5g/l NaCl、pH 7.5、15g/l寒天、100μg/mLアンピシリン）上にプレーティングした。プレートを32℃で一晩インキュベートした。100μg/mLアンピシリンを補充した2×YT培地（2×YT/Amp）50mLを使用して寒天プレートから感染細胞を擦り取った。2×YT/Amp培地50mLに、適量の細菌懸濁液を0.08のOD550に達するまで接種した。培養物を、振盪器（160rpm）上37℃で0.5のOD550に達するまでインキュベートし、次いで、穏やかな撹拌で15分間および振盪器上で45分間、37℃にてインキュベーションすることによってヘルパーファージ（1.5×1011pfu）を感染させた。その後、カナマイシンを終濃度70μg/mLまで加え、ヘルパーファージに感染した細菌を選択した。最後に、25ng/mLアンヒドロテトラサイクリンの添加によってpIII-hNGALムテインの発現を誘発した。
【０１７１】
24℃で15時間のインキュベーション後、培養物の上清を遠心分離（5000×gで20分間）によって清浄にした。その後、上清20mLを、孔径0.22μmのポリエーテルスルホン膜に通した。濾液に、水中20%（w/v）PEG-8000および15%（w/v）NaClを含有する溶液5mLを加え、穏やかに混合した。溶液を氷上で30分間インキュベートした後、4℃&5000×gで20分間遠心分離した。ファージミドを含有するペレットを、200mMホウ酸、160mM NaClおよび1mM EDTAを含有する緩衝液1mLに溶解した。遠心分離（5000×gで5分間）によって不溶性粒子を除去した。上清を新たなチューブに移し、水中20%（w/v）PEG-8000および15%（w/v）NaClを含有する溶液200μlと混合した。溶液を氷上で30分間インキュベートし、その後、沈殿したファージミドを遠心分離（5000×gで5分間）によって収集した。50mMベンズアミジンを補充したPBSにファージミドを再懸濁し、これをファージミド選択の次のラウンドに使用した。4回の連続した選択ラウンドを実施した。
【０１７２】
第4の選択ラウンドのアウトプットを感染させたE. coli細胞からファージミドDNAを調製し、BstX1でのDNAの消化とその後の標準的な方法を使用したアガロースゲル電気泳動を介した精製によってhNGALムテインカセットを単離した（Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual）。hNGALムテインカセットを、テトラサイクリンプロモーターの制御下でhNGALムテインの細菌生産を可能にする同様にカットしたベクターに挿入した。CaCl2コンピテントTG1-F細胞を、ライゲーション混合物で形質転換し、LB/Ampプレート上にプレーティングした。
【０１７３】
CGRP特異的ムテインの最適化のため、ムテインSEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：5に基づき、選択された位置のバイアスをかけたランダム化またはエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースの方法のいずれかを使用してライブラリーを生成した。選択された位置の各々について、コードされたアミノ酸が、それぞれの母クローンにおいて見いだされるアミノ酸に50〜70%の確率で対応し、50〜30%の確率で異なるアミノ酸でありうるように、バイアスをかけた設計を行った。標的とされた位置の数をNとし、バイアスをBとして、1クローン当たりの交換の最確数は、N×（1-B）である。真核細胞における発現を容易にするために、hNGAL由来の天然N-グリコシル化部位N65を変異N65Dによって除去し、他の潜在的なN-グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr）についても、これらのライブラリー位置でバイアスを設定することによって発生の可能性を低減させた。
【０１７４】
ファージディスプレイを用いて、向上した熱安定性および結合親和性を有する最適化されたムテインを選択した。ファージミド選択を、初期のムテイン選択と比較して増加したストリンジェンシーで、高温および限界標的濃度でのプレインキュベーション工程を含めて実行した。
【０１７５】
CGRP特異的ムテインの結合親和性をさらに最適化するために、ムテインSEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：11に基づき、SEQ ID NO：14についてはエラープローンポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースの方法を、SEQ ID NO：11については選択された位置のバイアスをかけたランダム化を使用して追加のライブラリーを生成した。バイアスをかけた設計は正確に先に記載の通り行った。
【０１７６】
ファージディスプレイを用いて、向上した熱安定性および結合親和性を有する最適化されたムテインを選択した。ファージミド選択を、初期のムテイン選択と比較して増加したストリンジェンシーで、高温および限界標的濃度でのプレインキュベーション工程を含めて実行した。
【０１７７】
E. coliにおける発現を容易にするために、内因性のジスルフィド結合を除去した。ムテインSEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：27に基づき、TRIMオリゴヌクレオチドを用いることによるシステイン76およびシステイン175の位置のバイアスをかけたランダム化を使用してライブラリーを生成した。ムテインの選択を、記載の通りであるが増加したストリンジェンシーで実施した。
【０１７８】
上記の各選択プロセスを通して得られた個々のコロニーを使用して、2×YT/Amp培地に接種し、静止期まで一晩成長させた（14〜18時間）。その後、2×YT/Amp 50μlに静止期培養物から接種し、37℃で3時間、次いで、22℃に切り換えてOD595 0.6〜0.8に達するまでインキュベートした。1.2μg/mLアンヒドロテトラサイクリンを補充した2×YT/Amp 10μlの添加によってムテインの生産を誘発した。培養物を22℃で翌日までインキュベートした。PBS/T中5%（w/v）BSA 40μlの添加および25℃で1時間のインキュベーション後、培養物はスクリーニングアッセイで使用できる状態になった。培養物20μlをスクリーニングELISAプレートに直接適用し、残量を65℃で1時間インキュベートした。
【０１７９】
単離したムテインのCGRPへの結合を、ニュートラアビジンとストレプトアビジンとの1:1混合物（PBS中5μg/mL）をマイクロタイタープレート上に4℃で一晩コーティングすることによって試験した。PBST中2% BSAでプレートをブロッキングした後、ビオチン化したCGRPを、PBS/T中1μg/mLの濃度で、コーティングしたマイクロタイタープレート上に捕捉した。その後、BSAでブロッキングした培養物（事前の加熱インキュベーションありまたはなし）20μlをマイクロタイタープレートに加え、25℃で1時間インキュベートした。結合したムテインを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗Streptag抗体で検出した（1時間インキュベーション; IBA, Boettingen）。定量のため、QuantaBlu蛍光原性ペルオキシダーゼ基質20μlを加え、励起波長330nmおよび発光波長420nmで蛍光を測定した。
【０１８０】
加えて、リバーススクリーニングフォーマット（抗Streptag抗体でコートしたマイクロタイタープレート上にstrep-tagを介してムテインを捕捉し、異なる濃度のビオチン化標的を加えて、Extravidin-HRP（E2886; Sigma）を介して検出する）を適用した。
【０１８１】
親和性および安定性が増加したムテインを選択するために、i）減少した抗原濃度、および/またはii）非ビオチン化標的との競合、および/またはiii）標的プレートに添加する前の65℃または70℃でのスクリーニング上清のインキュベーション、および/またはiv）リバーススクリーニングフォーマット（抗Streptag抗体でコートしたマイクロタイタープレート上にStreptagを介してムテインを捕捉し、異なる濃度のビオチン化標的を加えて、Extravidin-HRP（Sigma Aldrich, St. Louis, MO）を介して検出する）を使用して、スクリーニングを実施した。
【０１８２】
次いで、上記のELISAスクリーニングにおいて陽性シグナルを示したクローンを配列決定し、さらなる特性決定のためにムテインを選択した。選択したムテインのアミノ酸配列をSEQ ID NO：2〜40に示す。
【０１８３】
実施例3：ムテインの発現および精製
実施例2から得られたムテイン（SEQ ID NO：2〜40）（コーディングヌクレオチド配列をSEQ ID NO：41〜79に示す）を、C末端タグSAWSHPQFEK（SEQ ID NO：84）（SAリンカーおよびStrep-tag（登録商標）II、WSHPQFEK（SEQ ID NO：85）を含む）と共に、2YT-Amp培地中、E. coliにおいて発現させて、Streptactin親和性クロマトグラフィーおよび分取サイズ排除クロマトグラフィーを使用して発現後のムテインを精製した。
【０１８４】
実施例4：ELISAに基づく設定において決定された、可溶性ヒトおよびラットCGRPへのムテインの親和性
ヒトおよびラット由来のアルファおよびベータCGRPへのリポカリンムテインの溶液中の結合を、競合ELISAアッセイフォーマットを使用してインビトロで試験した（図1）。この実験では、一定濃度のビオチン化されていないCGRP（0.5μM）を、可変濃度のリポカリンムテインSEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5、およびSEQ ID NO：6と1時間インキュベートした。溶液中でのこのプレインキュベーション後、リポカリンムテイン/CGRP混合物のアリコートを、ニュートラアビジン捕捉ヒトアルファCGRP-bioでコートしたELISAプレートに移して、ビオチン化されていないヒトアルファCGRP（SEQ ID NO：80）によってブロックされずに固定化ヒトアルファCGRP-bioが依然として結合できたリポカリンムテインの濃度を測定した（図1）。この手順を別の関連するCGRP種（ヒトベータCGRP（SEQ ID NO：81）、ラットアルファCGRP（SEQ ID NO：82）、ラットベータCGRP（SEQ ID NO：83））に実施した。全てのインキュベーション工程を300rpmで振盪しながら実施し、各インキュベーション工程後にBiotek ELx405 select CW洗浄機を使用してPBS-T緩衝液（PBS、0.05% Tween 20）80μLでプレートを5回洗浄した。最初の工程では、384ウェルELISAプレートを、PBS中5μg/mLの濃度のニュートラアビジン20μLで4℃にて一晩コートした。洗浄後、プレートを、PBS-T/BSA（0.05% Tween 20を含有するPBS中2% BSA）60μLで室温にて1時間ブロッキングした。
【０１８５】
プレートに結合したリポカリンムテインの検出および定量を可能にするために、残留上清を廃棄し、そして、HRPで標識された抗hNGAL抗体20μLをPBS-T/BSA中所定の最適濃度で加え、RTで1時間インキュベートした。ムテインの混合物でのウサギの免疫化によって抗hNGAL抗体を得て、これをその後、キット（EZ-link Plus Activated Peroxidase, Thermo Scientific）を製造業者の指示に従って使用してHRPにカップリングさせて、抗体-HRPコンジュゲートを得た。洗浄後、蛍光原性HRP基質（QuantaBlu, Thermo）20μlを各ウェルに加え、反応を15〜60分間進行させた。蛍光マイクロプレートリーダー（TecanまたはMolecular Devices）を使用して、プレート上の全てのウェルの蛍光強度を読み取った。データを評価するために、遊離ムテイン濃度であるc（ムテイン）freeを標準曲線結果に基づいて算出し、リガンド濃度であるc（リガンド）に対してプロットした。リガンド/ムテイン複合体の形成が50%遮断されるリガンド濃度（IC50）を得るために、曲線を、c（ムテイン）free=c（ムテイン）tot/（1+c（リガンド）/IC50））に従う単一部位結合モデルに、総トレーサー濃度c（ムテイン）tot及びIC50値を自由パラメーターとして、非線形回帰によってフィッティングさせた。曲線フィッティングは、GraphPad Prism 4ソフトウェアを使用して実施した。
【０１８６】
得られたIC50値を表1にまとめる。選択されたムテインは、図1に示される通りそれぞれのCGRP種の全てのサブタイプに結合する。
【０１８７】
（表１）競合ELISAアッセイにおけるIC50値
2019506140.tif 000018
【０１８８】
実施例5：SPRによって決定された、CGRPに結合する最適化されたムテインの親和性
SPRを使用して、本明細書に開示の最適化されたリポカリンムテインの結合動態および親和性を測定した。
【０１８９】
ヒトおよびラットのCGRPアルファおよびベータへのhNGALムテインの結合のSPR分析を、Biacore T200装置（GE Healthcare）にてHBS-EP+（1×; BR-1006-69; GE Healthcare）をランニング緩衝液として使用して37℃で実施した。
【０１９０】
Biotin CAPture Kit（GE Healthcare）を使用して、ビオチン化したリポカリンムテインをチップ表面に固定化した。標準的なNHS化学を使用してムテインをビオチン化した。未希釈のBiotin CAPture Reagent（ss-DNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、予め固定化された相補的ss-DNAオリゴを有するSensor Chip CAP上に捕捉した。その後、1μg/mLのビオチン化したムテインを流速5μL/分で300秒間アプライした。
【０１９１】
図2に示される通り、1サイクル当たり、30nM、3nMおよび0.3nMの3つの濃度で流速30μL/分にてまたは単一濃度25nMで、CGRP種をアプライした。希釈物を180秒の会合時間および5400秒の解離時間で注入して、kaおよびkd情報を得た。チップ表面の再生を、6Mグアニジニウム-HCl+0.25M NaOH（120秒）を流速10μL/分で注入することによって達成した。再生溶液の注入の後に、HBS-EP+（1×; BR-1006-69; GE Healthcare）ランニング緩衝液での追加の洗浄工程および120秒の安定化期間を続けた。
【０１９２】
結合応答からの、対照チャネル（Biotin CAPture reagentのみをロードした）について測定された対応するシグナルの減算および緩衝液注入の減算によって、データを二つの参照先を持つものとした。結合反応についての会合速度定数kaおよび解離速度定数kdを、データ処理および動力学フィッティングのためにBiacore T200 Evaluation Software V2.0を使用して決定した。データ全体を1:1結合モデルにフィッティングさせた。
【０１９３】
SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7〜17、およびSEQ ID NO：19〜28のka、kdおよび得られた平衡解離定数KDについて決定された値を、表2にまとめる。ヒトおよびラットのアルファおよびベータCGRPそれぞれについて、結果のグラフ表示を図2A〜2Dに示す。最適化されたCGRP特異的リポカリンムテインは、ヒトおよびラットCGRPの両方のアイソフォームにピコモル濃度〜低ナノモル濃度の親和性で結合し、親和性は最適化後に最大120倍まで向上するが、対照としてのhNGAL野生型（SEQ ID NO:1）の顕著な結合は検出されない。
【０１９４】
（表２）SPRによって決定された、ヒトおよびラットCGRP種に対する最適化されたムテインの親和性、会合速度定数kaおよび解離速度定数kd
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【０１９５】
実施例6：cAMPアッセイにおけるCGRPに結合するムテインの機能試験
ヒトおよびラットCGRPの生物学的活性を中和するSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17〜20、およびSEQ ID NO：23〜27のリポカリンムテインの能力を、HitHunter（登録商標）c-AMP XS+Kit（DiscoverX）を使用したCGPR処置に応じたヒトSK-N-MC（ヒト脳神経上皮腫）およびラットL6（ラット骨格筋芽細胞）それぞれにおけるcAMP（セカンドメッセンジャー）生産を測定することによって評価した。
【０１９６】
この実験では、一定濃度のヒトまたはラットCGRPを可変濃度のリポカリンムテインと90分間インキュベートした。溶液中でのこのプレインキュベーション後、リポカリンムテイン/CGRP混合物のアリコートをそれぞれSK-N-MC細胞またはL6細胞とインキュベートして、残留CGRP誘発cAMP生産を測定した。
【０１９７】
SK-N-MC細胞を、10%ウシ胎仔血清を補充したEMEM中で維持し、製造業者の指示に従って細胞培養フラスコ中標準条件下にて培養した（ATCC、37℃、5% CO2雰囲気）。
【０１９８】
L6細胞を、10%ウシ胎仔血清を補充したDMEM中で維持し、製造業者の指示に従って細胞培養フラスコ中標準条件下にて培養した（ATCC、37℃、5% CO2雰囲気）。
【０１９９】
アッセイを設定する詳細な手順を以下に記載する。
【０２００】
固定濃度のヒトまたはラットCGRPを、様々な濃度のSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17〜20およびSEQ ID NO：23〜27を含む溶液（好適な開始濃度を使用し、これを0.5mM IBMXおよび0.1% BSAを含有する無血清培養培地（Working Buffer）でピコモル濃度範囲まで1:3の比で段階希釈）中でインキュベートした。室温で90分間のインキュベーション後、反応混合物5μlを白色384ウェルプレートに移し、これをその後、37℃、5% CO2で10分間予熱した直後、細胞を添加した。
【０２０１】
接着細胞のヒトSK-N-MC細胞またはラットL6細胞を、アクターゼ（accutase）で基材から剥離させ、PBSに再懸濁した。その後、300gで5分間の遠心分離で細胞を沈降させ、製造業者の指示に従ってAntibody Working Solution（2/3 Working Buffer、1/3 HitHunter（登録商標）Antibody Solution）中3×106細胞/mLに細胞数を調整した。
【０２０２】
30,000細胞/ウェル（10μl）をプレートに加え、ガス透過性接着シールで被覆した。
【０２０３】
次いで、37℃、5% CO2で30分間、cAMPを生産させた。
【０２０４】
その後、ED/Lysis/CL Working Solution（Lysis Buffer 19部、Galacton Star 1部、Emerald 5部、cAMP XS+ED Reagent 25部）20μlを加え、光から保護して室温で1時間プレートをインキュベートした。
【０２０５】
EA試薬20μlを各ウェルの細胞に加え、1〜18時間後にPheraStarを使用して発光を測定した。
【０２０６】
評価および曲線フィッティングは、GraphPad Prism 4ソフトウェアを使用して実施した。ヒトおよびラットのアルファおよびベータCGRPそれぞれについて、結果のグラフ表示を図3A〜3Dに示す。得られたIC50値を以下の表3にまとめる。
【０２０７】
（表３）ヒトおよびラットCGRP種を使用した機能的cAMPアッセイからのムテインのIC50値
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【０２０８】
実施例7：CGRPに特異的なシステイン不含リポカリンムテインの特性決定
ヒトアルファおよびベータCGRPに対するCGRP特異的ムテイン（SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、およびシステイン不含ムテインSEQ ID NO：29〜40）のBiacore親和性を、実施例5に同様に記載された通りのSPR法を使用して決定した。得られたKD値を表4に列挙する。
【０２０９】
cAMPアッセイを実施例6に記載のものと同じ手法で用いて、CGRP特異的ムテインSEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、およびシステイン不含ムテインSEQ ID NO：29〜40の機能的効力を決定した（図4Aおよび4Bを参照のこと）。ヒトアルファおよびベータCGRP種について得られたIC50値を表4にまとめる。
【０２１０】
蛍光に基づく熱変性アッセイ（一般的に、示差走査蛍光定量法の熱シフトアッセイと称される）を用いて、CGRP特異的ムテイン（SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27、およびシステイン不含ムテインSEQ ID NO：29〜40）の熱安定性をMx3005P qPCR System （Agilent Technologies）を使用して測定した。
【０２１１】
そのため、リポカリンムテイン溶液をリン酸緩衝生理食塩水（PBS; pH 7.4; 10010; Life Technologies）中10μMの濃度に希釈し、蛍光色素SYPRO Orange（DMSO中5000×濃度; S-6650; Life technologies）のPBS中15倍ストック溶液を調製した。タンパク質希釈物20μlをSYPRO Orangeストック5μlとqPCRプレート（FrameStar 96 non skirted; Cat No 4ti-0711; 4titude）内で混合し、プレートをキャップ（Flat Optically Clear Caps; Cat No 4Ti-0751; 4titude）で密閉した。Mx3005P qPCR Systemを使用して、プレートを25℃から100℃まで徐々に加熱し（45秒/工程）、その間、励起波長492nmおよび発光波長610nmで蛍光シグナルを記録した。
【０２１２】
SYPRO Orangeは疎水性表面に非特異的に結合し、水がSypro Orangeの蛍光を強くクエンチするので、蛍光の増加は、タンパク質アンフォールディングを示す（James K. Kranz. Celine Schalk-Hihi (2011); "Protein thermal shifts to identify low molecular weight fragments"; Methods Enzymol. 493: 277-298; doi:10.1016/B978-0-12-381274-2.00011-X; PMID 21371595）。
【０２１３】
Savitzky-golayスムージング（5×savitzky golayフィルタ）を生データ（温度に対する蛍光シグナル）に適用し、一次導関数を計算した。融解温度Tmの決定のために、一次導関数の最大値（蛍光対温度曲線の変曲点に対応する）を読み取り、対応する温度（=Tm）と一致させた。Microsoft Excelで完全な評価を実施した。
【０２１４】
上記の熱シフトアッセイで決定されたリポカリンムテインの融解温度（Tm）を表4にまとめる。
【０２１５】
（表４）システイン不含ムテインのSPR親和性（KD）、機能的効力（IC50）および融解温度（Tm）を以下の表にまとめる。
2019506140.tif 000021
【０２１６】
実施例8：タグ不含リポカリンムテインの調製
リポカリンムテイン（SEQ ID NO：34および17）のアミノ酸配列に関して、タグ不含リポカリンムテインをそれぞれSEQ ID NO：87および88に示される通りに設計した。成熟hNGAL（SEQ ID NO：1）の元々のN末端アミノ酸であるGlnからのピログルタミン酸の形成を回避するために、N末端Glyを結合させた。これらを生産するために、タグ不含リポカリンムテイン（SEQ ID NO：87および88）のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列（SEQ ID NO：94および95）を、E.coli発現ベクターにサブクローニングした。さらに、ヌクレオチド配列（SEQ ID NO：95）に基づいて、PCRに基づく部位特異的変異誘発によって2以上の塩基を置換した。また、リポカリンムテイン（SEQ ID NO：89〜93）をコードする得られたヌクレオチド配列（SEQ ID NO：96〜100）もE.coli発現ベクターにサブクローニングした。
【０２１７】
上記のベクターを使用して、E. coli発現を培地（MagicMedia（商標）（Life Technologies））を使用して実施した。精製を容易にするため、各発現産物をTEVプロテアーゼによって切断することができるように、N末端アミノ酸がGlyであるリポカリンムテイン（SEQ ID NO：87〜93）を、N末端タグ
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（His6タグと、TEVプロテアーゼ認識モチーフの一部（SEQ ID NO：86のE（Glu）13〜Q（Gln）18からなるアミノ酸配列）とを含む）と共に発現させた。TEVプロテアーゼのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列をそれぞれSEQ ID NO：101および102に示す。TALON CellThru Resin（Clontech）を使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィーによって発現産物を精製し、続いて、TEVプロテアーゼを使用してタグを除去した。TEVプロテアーゼはQ（Gln）とG（Gly）との間で切断し、結果として、精製されたタグ不含リポカリンムテインはN末端Glyを有した（SEQ ID NO：87〜93）。HiTrap Q FFカラム（GE Healthcare）を使用した陰イオン交換クロマトグラフィーおよびHiLoad 16/600 Superdex 75pgカラム（GE Healthcare）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによってさらなる精製を実施した。
【０２１８】
実施例9：タグ不含リポカリンムテインの特性決定
ヒトアルファCGRPへのタグ不含ムテインの結合のSPR分析を、Biacore T200装置（GE Healthcare）にてHBS-EP+をランニング緩衝液として使用して37℃で実施した。
【０２１９】
Biotin CAPture Kit （GE Healthcare）を使用して、ビオチン化リポカリンムテインをチップ表面に固定化した。標準的なNHS化学を使用してムテインをビオチン化した。50倍希釈したBiotin CAPture Reagent（ss-DNAオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン）を、予め固定化された相補的ss-DNAオリゴを有するSensor Chip CAP上に捕捉した。その後、200nMのビオチン化したムテインを流速10μL/分で60秒間アプライした。
【０２２０】
ヒトアルファCGRPを、0.0256nM〜5nMの範囲の濃度で流速30μL/分にてアプライした。希釈物を600秒の会合時間および1800秒の解離時間で注入した。チップ表面の再生を、6Mグアニジニウム-HCl+0.25M NaOH（120秒）を流速10μL/分で注入し、続いて、30%アセトニトリル+0.25M NaOH（120秒）を流速10μL/分で注入することによって達成した。再生溶液の注入の後に、HBS-EP+ランニング緩衝液での追加の洗浄工程および60秒の安定化期間を続けた。
【０２２１】
結合応答からの、対照チャネル（Biotin CAPture reagentのみをロードした）について測定された対応するシグナルの減算および緩衝液注入の減算によってデータを二つの参照先を持つものとした。結合反応についての会合速度定数kaおよび解離速度定数kdを、データ処理および動力学フィッティングのためにBiacore T200 Evaluation Software version 1.0を使用して決定した。データ全体を1:1結合モデルにフィッティングさせた。
【０２２２】
タグ不含ムテイン（SEQ ID NO：87〜93）について得られたKD値を表5に示す。結果のグラフ表示を図5に示す。
【０２２３】
タグ不含ムテインSEQ ID NO：87〜93の機能的効力を決定するために、cAMPアッセイを実施例6に記載のものと同じ手法で以下の通り少しの修正を加えて用いた。（1）5,000細胞/ウェルをプレートに加えた。（2）EnSpire（Perkin Elmer）を使用して発光を測定した。
【０２２４】
ヒトアルファCGRPについて得られたIC50値を表5にまとめる。
【０２２５】
（表５）タグ不含ムテインのSPR親和性（KD）および機能的効力（IC50）
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【０２２６】
実施例10：伏在神経の電気刺激によって誘発されるラットの皮膚血管拡張に対するリポカリンムテインの効果
CGRP特異的リポカリンムテイン（SEQ ID NO：11、17、18、23、25、27、87および89）のアンタゴニスト活性を試験するために、ラット伏在神経の刺激による皮膚血管拡張に対するムテインの効果を、ラットモデル（Br J Pharmacol., 1993, 110（2）:772-6）を使用して以下の修正を加えて試験した。実験の前日にSprague Dawleyラットを硫酸グアネチジン（20mg/kg、sc）で前処理して交感神経活性を遮断した。チオブタバルビタール（100mg/kg、ip）でラットに麻酔をかけ、0.5〜1%イソフルランで維持した。後肢の伏在神経を、外科的に露出させ、近位切断し、刺激用の白金双極電極上に置いた。実験中、流動パラフィン中に浸漬させた脱脂綿で神経を覆って乾燥を防いだ。レーザードップラー血流計に接続された皮膚プローブを使用して、後足の背内側部で皮膚の血流を測定した。安定なベースライン流動（5%未満の変動）が確立された後、伏在神経の遠位端を30パルス（2Hz、10V、1ms、15秒間）で投与の125分後に電気刺激した。全てのムテインおよび媒体は皮下に投与した。
【０２２７】
全てのデータは、チャートソフトウェア（LabChart 7, ADInstruments Pty. Ltd.）を使用して記録した。電気パルス刺激に対する各流動応答についての流動-時間曲線下面積（AUC）によって、皮膚の血流の累積変化を推定した。電気刺激による血流増加に対するムテインの阻害効果（AUC）を、媒体処置群と比較して血流阻害として計算した（表6に示す）。
【０２２８】
（表６）ラット皮膚の血流アッセイ
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【０２２９】
本明細書において例示的に記載される態様は、本明細書において具体的には開示しない任意の1つまたは複数の要素、1つまたは複数の制限の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」などは、包括的かつ非限定的であると解釈されるものとする。追加的に、本明細書において用いられる用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示されかつ記載される特徴またはその一部の任意の等価物を除外する意図はないが、請求される本発明の範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。したがって、本態様は好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示されるが、その修正および変更を当業者が行ってよいこと、ならびにそのような修正および変更が本開示の範囲内であるとみなされることを理解すべきである。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、教科書および同業者による審査を受けた刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。さらに、参照によって本明細書に組み入れられる参考文献におけるある用語の定義または使用が、本明細書において提供されるその用語の定義と一致しないかまたは相いれない場合、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、その参考文献におけるその用語の定義は適用されない。また、一般的開示の範囲内にあるより狭義の種および下位概念のグループの各々もまた、本発明の一部分をなす。これは、削除される題材が本明細書において具体的に列挙されているか否かに関わらず、属から任意の主題を除く条件または否定的限定付きの本発明の一般的記載を含む。加えて、特徴がマーカッシュ群によって記載される場合、それによって当業者は、本開示がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位集団の観点からも記載されることを認識するだろう。さらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかとなろう。
【０２３０】
等価物：当業者は、本明細書に記載の発明の具体的な態様に対する多くの等価物を認識するだろうし、または、日常的なものにすぎない実験を用いてこれを確かめることができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されると意図される。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、参照によって本明細書に組み入れられると、各々具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ａ−４】
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【図２Ａ−５】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図２Ｂ−３】
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【図２Ｂ−４】
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【図２Ｂ−５】
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【図２Ｃ−１】
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【図２Ｃ−２】
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【図２Ｃ−３】
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【図２Ｃ−４】
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【図２Ｃ−５】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｄ−３】
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【図２Ｄ−４】
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【図２Ｄ−５】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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