(57)【要約】  本発明は、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤との相乗的組合せを含む眼科用組成物、その調製方法、および、ドライアイ症候群の治療のためのその使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤との相乗的組み合わせを含む眼科用組成物であって、前記組成物が１％〜６％ｗ／ｗの範囲の前記グルコーゲンの量および、０．０５％〜０．３％ｗ／ｗの範囲の前記ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の量を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物が、２％〜５％ｗ／ｗ、好適には、３％〜４％ｗ／ｗの範囲の前記グルコーゲンの量を含む、請求項１に記載した、眼科用組成物。
【請求項３】
前記組成物が、約３％ｗ／ｗの前記グルコーゲンの量を含む、請求項２に記載した、眼科用組成物。
【請求項４】
前記組成物が、０．１％〜０．２５％ｗ／ｗ、好適には、０．１５％〜０．２％ｗ／ｗの範囲の前記ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の量を含む、請求項１に記載した、眼科用組成物。
【請求項５】
前記組成物が、約０．１５％ｗ／ｗの前記ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の量を含む、請求項４に記載した、眼科用組成物。
【請求項６】
前記組成物が、約５：１〜約４０：１、好ましくは約１０：１〜約３０：１、より好ましくは、約１５：１〜約２５：１である範囲の重量比で、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項７】
前記眼科用組成物が、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を、約２０：１の重量比で含む、請求項６に記載の眼科用組成物。
【請求項８】
前記眼科用組成物が、５〜１００の間のｃＰ、好ましくは、１０〜４０の間のｃＰ、およびより好ましくは１５〜３０の間のｃＰの粘度を有する、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項９】
前記眼科用組成物が、５ｍｍＨｇ未満、好ましくは、３ｍｍＨｇ未満の膠質浸透圧を有する、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項１０】
前記眼科用組成物が、１５０〜１５００ミリオスモル／ｋｇの範囲、好ましくは１５０〜５００ミリオスモル／ｋｇの範囲、そして最も好ましくは１８０〜２５０ミリオスモル／ｋｇの範囲の浸透圧を有する、請求項１に記載の眼科用組成物。
【請求項１１】
グリコーゲンとヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤の相乗的組み合わせを含む、ドライアイ症候群の治療に用いるための眼科用組成物。
【請求項１２】
グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤の相乗的な組み合わせを含む眼科用組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することからなる、ドライアイ症候群の治療方法。
【請求項１３】
前記グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を水性媒体に溶解するステップと、
前記少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤を添加するステップと、
前記グリコーゲンの濃度を、１％〜６％ｗ／ｗの範囲に、そして、
前記ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩の濃度を、０．０５％〜０．３％ｗ／ｗの範囲に、調整するステップと、
前記眼科用組成物のｐＨを６〜８の範囲の値に調整するステップと、
前記眼科用組成物の浸透圧を、１５０〜１，５００ミリオスモル／ｋｇの範囲の値に調整するステップと、そして
前記眼科用組成物を滅菌するステップ、
を含む、請求項１に規定した眼科用組成物の調製のためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、グリコーゲンとヒアルロン酸またはその塩との相乗的組み合わせを含む眼科用組成物、その調製方法、および、ドライアイ症候群の治療のためのその使用に関する。
特に、本発明は、グリコーゲンおよびヒアルロン酸（ＨＡ）またはその薬学的に許容される塩が、治療効果の相乗的な増加をもたらす量で存在する、眼科用組成物に関する。
本発明の眼科用組成物は、潜在的表面上皮損傷を有する眼の十分な潤滑及び水分の慢性的不足のために、眼の不快感の結果としての症状を緩和するのに有用である。
【０００２】
技術水準
涙液膜は、表面脂質層と、角膜（ｃｏｒｎｅａｌ）および結膜（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ）表面上皮に部分的に付着している粘液ゲル層と混合した、表面脂質層と水層とからなる比較的安定な薄膜である。
【０００３】
自然涙液膜は、眼の表面の潤滑および維持にとって重要である。ドライアイ症候群（ＤＥＳ）は、目を適切に潤滑するのに十分な涙液層を維持できないことを特徴とする多因子性疾患である。ＤＥＳは、涙液膜の１つ以上の成分の機能障害によって特徴付けられ、涙液膜の安定性の喪失、涙液膜の浸透圧（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）の増加、および眼球表面の炎症をもたらす。
この状態は、かゆみ、刺激、異物感（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｂｏｄｙ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）、発赤、羞明および痛みなどの眼の不快感の症状に関連する。
これらの症状は、１日の終わりに向かって、または、読書、運転、コンピュータ作業などの視力の注意を必要とする長期間の後にしばしば悪化する。
【０００４】
ＤＥＳは、涙液の生成の減少、過剰な涙の蒸発、涙液層に通常見出される粘液または脂質の生成の異常、のいずれかの原因に起因し得る。
【０００５】
涙腺による涙の貧弱な産生は、年齢、ホルモンの変化、または原発性シェーグレン症候群、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスなどの様々な自己免疫疾患の結果であり得る。
【０００６】
水分の涙層の蒸発による損失は、通常、不十分な上層脂質層の結果である。
【０００７】
抗ヒスタミン薬、抗うつ薬、ベータ遮断薬、経口避妊薬などの一部の薬剤は、涙の生成を減少させる。
【０００８】
ＬＡＳＩＫやその他の視力矯正手段は、眼の表面に貫通して、角膜神経感受性を低下させた後、ドライアイを引き起こす可能性がある。その後、眼は、潤滑の必要性および不適切な涙液生成の結果を感知しない。
【０００９】
ＤＥＳは、未治療および未補正の場合、露出した眼組織の劣化または極端な場合には、角膜移植を必要とする角膜組織の崩壊により、眼に永久的な損傷をもたらす可能性がある。
【００１０】
眼の十分な潤滑および湿気の慢性的な欠如に起因する、眼の不快感に対する最も一般的な治療は、目の前面（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ）に、ある量の液体を加える涙代用物の局所投与による症状の緩和を含む。
【００１１】
人工涙は、水中の高い含量およびそれらの生理化学的性質（浸透圧、ｐＨ、粘度、濡れ性）を模倣した自然の涙の代用をしようとする。典型的な涙代用組成物は、水溶性の水性ポリマー組成物を含む。
多くのポリマーが、局所的に投与可能な眼科用組成物において使用されている。これらの中には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよびエチルヒドロキシエチルセルロースのようなセルロース系ポリマーが含まれる。カルボキシビニルポリマーおよびポリビニルアルコールなどの合成ポリマーも含まれる。
【００１２】
さらに他のものには、キサンタンガム、グアーガム、デキストランおよびヒアルロン酸などの多糖類が含まれる。
【００１３】
ポリマーの組み合わせも、眼科用組成物に使用されている。ある種のポリマーの組み合わせは、粘度と、場合によっては、液体からゲルへの相転移さえも相乗効果をもたらすことが知られている。
【００１４】
人工涙液は、滴として眼に送達され、そして、それらは鼻涙管（ｎａｓｏｌａｃｒｉｍａｌ  ｄｕｃｔ）を通って迅速に排液される。
この問題を克服するために、人工涙は、眼球表面との接触時間を増加させる成分からなる。これらの成分は、粘膜粘着性を有するように設計されている。
１つの問題は、成分の高い粘度である。多くの場合、組成物が十分に高い濃度の有効成分を含有する場合、それは粘性であり、適用は患者にとって不快であり、そして、高粘度は刺激およびぼやけた視界（ｂｌｕｒｒｅｄ  ｖｉｓｉｏｎ）のような問題をもたらす。
【００１５】
高粘性材料の使用の欠点を克服する試みにおいて、様々な配合戦略が実施されている。１つの戦略は、目の表面に留まる粘膜付着特性に依存する、粘性の低い処方の使用である。
【００１６】
ヒアルロン酸ナトリウムは、粘膜粘着性を有し、粘弾性ポリマーであり、そして、抗炎症特性を有し、ＤＥＳによく見られる（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）表面炎症の治療に有用であり得る。それは高分子量ポリマーであり、その溶液は高度に粘性である。ＨＡを単独で使用しようとする試みは、ＤＥＳを治療するのに十分高い濃度で使用すると、この成分が眼に刺激を与える傾向があるという問題に遭遇している。
【００１７】
ＷＯ２００９／０４４４２３は、０．４％のヒアルロン酸とＴＳＰ（タマリンダス（Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ  ｉｎｄｉｃａ種ポリサッカライド）として知られている、多糖類０．２％との組み合わせを含有する、涙代替剤として使用することが示された点眼剤を開示している。これは、組み合わせて一緒に投与された場合に、ドライアイ症候群の影響を受け、結膜粘膜の正常状態への復帰する刺激に、相乗的に作用することが可能である。
【００１８】
ＥＰ１０６９８８５は、グリコーゲン多糖に基づく眼科用保湿剤および潤滑剤溶液を開示しており、そのような溶液は、低粘性および低い膠質浸透圧（ｏｎｃｏｔｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を示し、そして、角膜（ｃｏｒｎｅａ）に、心地よい（ｐｌｅａｓｉｎｇ）爽やかで（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇ）滑らかな（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）保湿効果（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）を発揮する。
【００１９】
発明の概略
本出願人は、ＤＥＳの治療および／または予防のための眼科用組成物を得るという問題に直面した。
特に、本出願人は、ＤＥＳの治療のため、低粘度の粘膜付着性と共に、非刺激性の眼科用組成物を得るという問題に直面した。
広範な調査の後、本出願人は、驚くべきことに、ヒアルロン酸ナトリウムおよびグリコーゲンを含有する組成物が、各成分のみを等量含む組成物から予想されるよりも、または、２つの成分の特性の組み合わせから予想されるよりも、表面上皮損傷に起因する角膜の再上皮化を促進する点で、十分な眼の潤いおよび水分の、慢性的欠如による眼の不快感の症状に関連する炎症パラメータの低減において、そして、過剰なマトリックス分解から眼を保護することにおいて、改善された有効性を示すことを見出した。
これらの２つの成分の間に観察される相乗効果により、それらが低濃度、典型的には、ヒアルロン酸（通常はヒアルロン酸ナトリウムとして）０．１５％およびグリコーゲンに対して３％のオーダーで存在する組成物の製剤化が可能になる。
ヒアルロン酸ナトリウムとグリコーゲンとの併用を含む組成物は、粘膜粘着性、偽可塑性および低粘性であるというさらなる利点を有する。
したがって、第１の態様では、本発明は、グリコーゲンとヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩と、そして、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤との相乗的組み合わせを含む眼科用組成物に関し、前記組成物は、１％〜６％ｗ／ｗの範囲の量のグリコーゲンおよび前記ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩０．０５％〜０．３％ｗ／ｗの範囲の量を含む。
別段の指定がない限り、すべての％ｗ／ｗは、眼科用組成物の全重量に対する重量で表される。
【００２０】
第２の態様において、本発明は、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤との相乗的組み合わせを含む、ドライアイ症候群の治療に用いる眼科用組成物に関する。
【００２１】
さらなる態様によれば、本発明はまた、ドライアイ症候群の治療方法であって、この方法は、グリコーゲンとヒアルロン酸または薬学的に許容される塩および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤の相乗的組合せを含む眼科用組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例３．１ｂにしたがって、処置後、２，０００倍、１０，０００倍および２０，０００倍の倍率の、ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）表面のＳＥＭ写真を示す。
【図２】図２は、実施例３．２ｂにしたがって、治療後の、２０倍の倍率のＨＣＥスライスの光学顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、実施例３．２ｃにしたがって、処理した後のＨＣＥ表面の倍率２，０００倍でのＳＥＭ写真を示す。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の眼科用組成物は、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の相乗的組み合わせを含む。
【００２４】
本発明の眼科用組成物に使用されるグリコーゲンは、動物または野菜から抽出され得るか、または化学的および酵素的に合成され得る天然のグリコーゲンから得られる。
【００２５】
軟体動物、特にイガイ（ｍｕｓｓｅｌｓ）（ムラサキイガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ）およびミチルスガルスプロビンシアリス（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ  ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ））は、グリコーゲンの特に有用な供給源である。なぜなら、それらは低コストで大量に入手可能であり、そして、適量のグリコーゲン（平均２．５〜３．９重量％）を含むからである。
グリコーゲンの他の天然源には、ハマグリ、カキ、腹足類（ｇａｓｔｒｏｐｏｄ）または巻貝（ｓｅａ  ｓｎａｉｌｓ）のいくつかの種、またはスリッパリンペッツ（ｓｌｉｐｐｅｒ  ｌｉｍｐｅｔｓ）（ネコゼフネガイ（Ｃｒｅｐｉｄｕｌａ  ｆｏｒｎｉｃａｔａ））のような海のカタツムリのような他の二枚貝（ｂｉｖａｌｖｅ  ｍｏｌｌｕｓｃｓ）の軟体動物が含まれる）、ならびに肝臓および筋肉のようなグリコーゲンが豊富な脊椎動物（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｎｉｍａｌｓ）の器官が含まれる。
【００２６】
グリコーゲンの別のソースは、（ＥＰ１８１３６７８に開示されているように）特定の酵素を用いてグリコーゲンに変換することができる、デンプンである。
【００２７】
本発明の眼科用組成物に使用されるグリコーゲンは、上述の抽出プロセスおよび化学的または酵素的合成から得られたものをそのまま使用することができ、またはその後の精製工程で処理されてもよい。
【００２８】
市販のグリコーゲンの品質は、タンパク質残渣（窒素の量をｐｐｍとして測定）および還元糖の多量または少量の存在に依存する。
【００２９】
本発明の目的のためには、低い、還元糖および窒素含量を有するグリコーゲンの使用が好ましい。
【００３０】
本発明において好ましく使用される市販品の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって製造され、そして、流通されているグリコーゲンである。
好ましくは、本発明で使用されているグリコーゲンは、Ｆ．Ｄ．ＳｎｅｌｌおよびＳｎｅｌｌ（「分析の比色法」“Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”、ニューヨーク、１９５４年、ＩＩＩ巻、２０４頁）の方法によって測定して、１重量％未満、そして、より好ましくは０．２５重量％未満の還元糖を含む。
【００３１】
好ましくは、本発明に使用されるグリコーゲンは、ケルダール法（Ｋｊｅｌｄａｈｌ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、窒素を測定して、１０００ｐｐｍ未満、そして、より好ましくは１００ｐｐｍ未満の窒素を含む。
【００３２】
好ましくは、本発明で使用されるグリコーゲンは、Ａ．Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｆ．  ＳｐＡ、ローマ、イタリア）によって製造され、流通されている、脱蛋白グリコーゲンの、商品名Ｐｏｌｇｌｕｍｙｔ（商標）グリコーゲンであり、ＥＰ６５４０４８Ｂ１特許に記載の精製手順に従って得られる。
【００３３】
本発明の眼科用組成物は、１％〜６％ｗ／ｗ、好ましくは、２％〜５％ｗ／ｗ、そして、より好ましくは３％〜４％ｗ／ｗの範囲のグリコーゲンの量を含む。
好ましくは、本発明の眼科用組成物は、約３％ｗ／ｗの量のグリコーゲンを含む。
【００３４】
ヒアルロン酸は、化学的には、非分枝のグリコサミノグリカンとして定義可能であり、Ｄ−グルクロン酸（ＧＩｃＵＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の交互単位からなる、交互のβ−１，４グリコシド結合およびβ−１，３グリコシド結合を介して連結され、その構造は、以下の式で表すことができる：
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二糖ユニットを示しており、そして、単位の繰り返し結合の数ｎは、多糖の分子量が５０，０００および数百万ダルトン（ＤＡ）の間に含まれるような数である。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、ヒアルロン酸の平均分子量（対応するナトリウム塩の形態で）は、１００，０００ＤＡおよび１０，０００，０００ＤＡの間、そして、より好ましくは１，０００，０００ＤＡおよび５，０００，０００ＤＡの間である。最も好ましい実施形態では、ヒアルロン酸（対応するナトリウム塩の形態で）の平均分子量は、２００万Ｄａと３００万Ｄａの間である。
【００３６】
ヒアルロン酸は、たとえば、ヒト臍帯、ケイトウ（ｃｏｃｋ’ｓ  ｃｏｍｂ）、または脊椎動物（ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ）の結合組織のような、様々な供給源から単離することができる。
ヒアルロン酸はまた、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）のような細菌中にも存在し、そして、したがって、発酵プロセスによっても得られる。
【００３７】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸の塩は、本発明に従って使用することができる。好ましくは、塩は薬学的に許容される塩である。薬学的に許容される塩の例は、たとえば、ナトリウムまたはカリウム塩のようなアルカリ金属塩、または、たとえば、マグネシウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、である。最も好ましい実施形態では、ヒアルロン酸ナトリウムが使用される。
【００３８】
本発明の眼科用組成物は、０．０５％〜０．３％ｗ／ｗ、好ましくは０．１％〜０．２５％ｗ／ｗ、そしてより好ましくは０．１５％〜０．２％ｗ／ｗの範囲の、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の量を含む。
【００３９】
好ましくは、本発明の眼科用組成物は、約０．１５％ｗ／ｗの量のヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４０】
本発明の眼科用組成物は、約５：１〜約４０：１、好ましくは約１０：１〜約３０：１、より好ましくは約１５：１〜約２５：１の範囲の重量比で、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を含む。
好ましくは、本発明の眼科用組成物は、グリコーゲンおよびヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を、約２０：１の重量比で含む。
典型的には、本発明に係る眼科用組成物は、５〜１００センチポアズ、好ましくは１０〜４０センチポアズ、そして、さらにより好ましくは、１５〜３０センチポアズの間の粘度を有する。
【００４１】
典型的には、本発明に係る眼科用組成物は、５ｍｍＨｇ未満の膠質浸透圧を有する。好ましくは、それは、３ｍｍＨｇ未満の膠質浸透圧を有する。
【００４２】
本発明に係る眼科用組成物は、１またはそれ以上の薬学的に許容される、緩衝剤、防腐剤、張度調整剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤、安定化剤、着色剤、抗酸化剤、キレート剤、皮膚軟化剤、湿潤剤および／または潤滑剤のような他の慣用成分も含んでよい。
【００４３】
緩衝剤は、望ましいｐＨ範囲を維持するのに適した弱い共役酸−塩基対を含むことができる。有用な例には、重炭酸塩緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはトロメタミン（ＴＲＩＳ、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）緩衝液、およびそれらの組み合わせが含まれる。たとえば、一塩基性リン酸塩、二塩基性リン酸塩のような組み合わせ、またはトロメタミンおよび塩酸トロメタミンを用いることができ、そして、本発明に係る眼科用組成物のｐＨを、５〜９、好ましくは６〜８に調節するようにそれらの量を選択する。好ましくは、緩衝液は、リン酸緩衝液またはトロメタミン緩衝液である。好ましくは、本発明に係る眼科用組成物のｐＨは、６．５と７．５の間に調整される。
【００４４】
防腐剤は、様々であってよく、そして、眼科用製剤中の微生物汚染を防ぐのに適した任意の化合物または物質を含み得る。防腐剤は、過ホウ酸塩、過炭酸塩などの過酸塩；ベンジルアルコール、クロロブタノール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム、ベンザルコニウムブロマイド、ポリクオタニウム（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ）等の第四級アンモニウム塩を含有する防腐剤；ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、クロルヘキシジンなどを含むグアニジン系防腐剤；チメロサール、フェニル水銀酢酸塩、フェニル水銀硝酸塩のような水銀系防腐剤；アルカリ金属およびアルカリ土類金属の亜塩素酸塩などの金属亜塩素酸塩；そのようなカリウムソルベートおよび混合物のような、ソルビン酸および眼科的に許容される塩；安定化されたオキシクロロ錯体（たとえば、Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標））のような酸化防止剤を含む群から選択される。
Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）は、Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．の登録商標である。
【００４５】
防腐剤の量は、使用される特定の防腐剤に依存して、比較的広い範囲にわたって変化する。防腐剤が点眼液に添加されない場合、点眼液は一回投与でしか点眼剤を使用しない単回投与型点眼剤として使用することができる。そうでなければ、点眼液は、点眼剤を投与するために、たとえば、容器のノズルに取り付けられたフィルターを備えた容器に含まれて、またはエアレス適用システム装置に含まれて、多用量の点眼剤として、使用することができる。
【００４６】
張性は張性増強剤によって調節される。そのような薬剤は、たとえば、イオン性および／または非イオン性のタイプであり得る。
【００４７】
イオン性等張増強剤の例は、たとえば、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウムおよび硫酸カリウム、重炭酸ナトリウムおよびカリウム、およびホウ酸の１又はそれ以上のような、アルカリ金属またはアルカリ土類金属ハライドである。
【００４８】
非イオン性張性増強剤は、たとえば、尿素、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、プロピレングリコール、デキストロースまたはそれらの組み合わせである。
【００４９】
グリセリン、塩化ナトリウムおよびマンニトールは、最も好ましい張度増強剤である。張性剤の量は、等張性液体、高張性液体、または低張性液体が所望されるかどうかによって変わり得る。
【００５０】
本発明の組成物は、一般に、１５０〜５００ミリオスモル／ｋｇの範囲内、好ましくは１５０から１５００ミリオスモル／ｋｇの範囲内、そして、最も好ましくは１８０から２５０ミリオスモル／ｋｇの範囲での浸透圧を有する。
【００５１】
本発明による眼科用組成物は、成分を水性媒体に溶解することによって調製することができる。脱イオン水が好ましい水性媒体であり、これは少量の他の親水性溶媒、たとえば、グリコールおよび／またはポリオールを含むことができる。組成物は、１種以上の成分の溶液を調製し、次いで残りの１種以上の成分を添加することによって、またはそれぞれ１種以上の成分を含む２種以上の別個の溶液を調製し、次いで、そのような溶液を全部一緒に混合することによって、調製することができる。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明の眼科用組成物は、予め調製されたヒアルロン酸またはその塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウムの水溶液に、グリコーゲンを添加し、次いで他の慣用の成分を添加することによって調製される。
【００５３】
しかし、慣用の成分の正確な添加順序は特に重要ではない。非限定的な例として、緩衝液は、それらのうちの１つのみを含む溶液の調製後ではなく、全ての活性成分が混合された後に添加され得る。通常、浸透圧およびｐＨの調整は、製造の最終段階であるが、本発明の他の工程の間に起こる、塩、酸および塩基の途中での追加は、本発明の範囲内であると発明者によって考えられている。
この溶液を、高温、好ましくは５０℃〜８０℃、より好ましくは６０℃〜８０℃で、３０分〜数時間の期間で、加熱するなどの従来の方法によって最終的に滅菌した。
好ましくは、滅菌組成物は、７０℃で１時間加熱し、次いで、溶液を、０．２２mｍ  ＰＥＳ滅菌フィルターを通過させ、ろ過することによって得た（ＵＳ２０１１０１９５９２５Ａ１に開示されている。参照により本明細書に組み込まれる）。
より好ましくは、滅菌組成物は、溶液を０．２２mｍの滅菌フィルターに通過させてろ過することによって得た。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【００５５】
実施例１
点眼液の調製
６つの点眼液１〜６のセットは、下記表１に示す成分を、所定量の水に、室温で溶解して調製した。すべての成分を完全に可溶化した後、溶液を７０℃で１時間加熱した。熱処理工程の後、水溶液を０．２２mｍのＰＥＳ滅菌フィルターを使用して濾過して、滅菌溶液を提供した。
【００５６】
2019514887.tif 000004
【００５７】
上記のように調製した、６つの点眼液１〜６は、以下の表２に要約された特性を有していた。
【００５８】
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【００５９】
浸透圧は、Ｋｎａｕｅｒ自動式オスモメーター装置を用いて測定した。粘度は、Ｂｏｈｌｉｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  １５０レオメーターを用いて、０．５Ｐａの応力および２５℃で測定した。
【００６０】
実施例２
粘膜付着特性の測定
粘膜付着は、少なくとも１つがムチンのような生物学的基質である２つの物質が、界面力の手段によって長時間、一緒に維持される状態と定義することができる。
【００６１】
鼻、眼、舌下、膣および直腸を含む人体の粘膜は、その表面が粘液で覆われている上皮層によって特徴付けられる。粘液は糖タンパク質を含み、その中で最も重要なものはムチンである。ムチンは、粘膜付着製剤に含まれる巨大分子との相互作用を確立することによって、粘着のメカニズムに関与する。粘性の測定に基づくレオロジー試験は、製剤−ムチン相互作用を測定するために使用される、単純なインビトロの方法である。
そのような試験から、試験に係る製剤とムチンの混合物によって構成される系の粘性測定的変化を、それぞれ、製剤およびムチンのみで構成された系の合計と比較して、モニターすることによって、粘膜粘着力を得ることが可能である（Ｈａｓｓａｎ、ＥＥ、Ｇａｌｌｏ、ＪＭ、“ムチンポリマー生体粘着結合力の強さのインビトロ評価のための単純なレオロジー的方法”、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７巻、５号、４９１−４９５頁、１９９０年）。
【００６２】
６．８グラム／ＬのＮａＣｌ、２．２グラム／ＬのＮａＨＣＯ３、０．０８４グラム／ＬのＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、１．４グラム／ＬのＫＣｌを含み、そして、１ＮのＨＣｌでｐＨ７．４に調整した、シミュレートされた涙液中に、胃のブタムチン（タイプＩＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミラノ、イタリア）を、４％ｗ／ｗおよび８％ｗ／ｗで懸濁させた。
【００６３】
粘度測定は、コーンプレートの組み合わせ（ｃｏｎｅ  ｐｌａｔｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＣＰ１／６０）を備えた回転レオメーターの手段（Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  ６００、Ｈａａｋｅ、Ｅｎｃｏ、イタリア）により行った。
【００６４】
試験は、本発明の点眼液１，２および４を用いて行った。各レオロジー試験のために、以下のサンプルを調製し、試験した：
−涙液をシミュレートした、４％ｗ／ｗのムチン分散液（サンプルＡ）、
−本発明の点眼液を、シミュレートされた涙液と、１：１の重量比で混合された溶液（サンプルＢ）、
−本発明の点眼液を、シミュレートされた涙液の８％ムチン分散液と、１：１の重量比で混合した溶液（サンプルＣ）。
【００６５】
各サンプルを、３２℃で粘度測定に供した。ムチンと、本発明の組成物との間の相互作用は、以下のように、剪断速度（１０〜１００／秒）の範囲における、生体粘着粘度成分Δηの手段によって定量した。希臘文字
Δη＝ηＣ−（ηＢ＋ηＡ）
ここで、ηＣは、サンプルＣの粘度（Ｐａ．ｓ）である。
ηＢは、サンプルＢの粘度（Ｐａ．ｓ）であり、
ηＡは、サンプルＡの粘度（Ｐａ．ｓ）であり、そして、
Δηは、生体粘着粘性成分である。
【００６６】
本発明の組成物（サンプルＢ）およびムチン（サンプルＡ）の単独溶液の組成物の粘度の合計と比較した、ムチンと本発明の組成物（サンプルＣ）との混合物の粘度の増加は、陽性の生体粘着粘度成分（Δη＞０）、そして、従って、組成物の粘膜粘着特性を示した。
【００６７】
陽性の生体粘着粘度成分は、本発明の組成物が、ムチン分散液と混合されるときに発生し、そして、高分子種の鎖間の相互作用に依存する、混合物粘度の増大を示す。
換言すれば、成分Δηの０より高い値 は、ムチンと本発明の組成物とを別々にして与えられた粘度の寄与の単純加算に基づく期待した値と比較して、ムチンと本発明の組成物との相互作用によって、粘度に対して、特別な寄与を示す。
【００６８】
異なる剪断速度での、本発明の点眼剤１，２および４を用いた各レオロジー試験の結果を以下の表３に要約する。
【００６９】
2019514887.tif 000006
【００７０】
実施例３
眼の不快感の症状を調査するためのインビトロモデル
ヒアルロン酸ナトリウムとグリコーゲンとの組み合わせによってもたらされる治療有効性に対する相乗効果は、２つの異なるインビトロモデル、すなわち、ドライアイの症状を研究するモデルおよび表面上皮損傷を研究するモデルによって記載される。
【００７１】
第１のモデルは、３Ｄのヒト角膜乾燥および超浸透圧モデルである。モニターされたパラメータは、炎症パラメータを低下、および、過剰なマトリックス分解から眼を保護することにおいて、ヒアルロン酸ナトリウムおよびグリコーゲンの相乗効果を示した。
【００７２】
表面上皮損傷を研究するためのモデルは、機械的損傷に対するヒト角膜上皮応答をモニターするために使用されるインビトロモデルである。このモデルを用いて、表面上皮損傷に起因する角膜再上皮化の促進における本発明の組合せの相乗効果を実証した。
【００７３】
両モデルとも、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニース、フランス）により供給された、３Ｄで再構築ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）を採用した。ＨＣＥは、ヒト角膜上皮のそれと同様の全体的形態を有する不死化ＨＣＥ細胞からなるモデルである。
【００７４】
実施例３．１
ドライアイの症状を調べるモデル
この実施例では、ＨＣＥは、ヒトの角膜乾燥および過浸透圧（ＨＹＰ−ＤＲＹＨＣＥ）のモデルを設定して使用された。
【００７５】
ＨＣＥ組織を、乾燥を模倣するように制御された環境条件下に（培地中にソルビトール０．６Ｍの存在下に、＜４０％の相対湿度で、Ｔ＞３７℃）、１６時間置いた。ストレス期間の終わりに、サンプルを、製品（３０μＬ）で、２４時間処理し、そして、組織を異なるパラメーター（ｍＲＮＡ発現、組織学的および超微細構造解析）について調べた。この試験は、本発明の点眼剤１および比較点眼剤５および６を用いて行った。
【００７６】
実施例３．１ａ−転写解析
ＨＣＥから抽出された総ｍＲＮＡを、マトリックスメタロペプチダーゼ−９（ＭＭＰ−９）およびインテグリン−β１（ＩＴＧ−β１）の発現を定量化するために、転写分析（リアルタイムＰＣＲ）によって分析した。
【００７７】
ＭＭＰ−９は、眼表面に存在する最も重要なゼラチナーゼである。この酵素は、角膜上皮基底膜の成分および角膜上皮バリア機能を維持する、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む、様々な異なる基質を溶解する。高レベルのＭＭＰ−９が、ドライアイ患者の涙液中に投与される。涙のＭＭＰ−９活性レベルは、角膜疾患の重篤度と正の相関を示した。ＭＭＰ−９の発現の増加は、眼表面炎症の増加と相関した。
【００７８】
ＩＴＧ−β１は、インテグリンの大きなファミリーのメンバーである。インテグリンは、ドライアイ患者の眼球表面への免疫細胞の移動および活性化のための重要な成分である。ＩＴＧ−β１が、炎症性障害の治療の標的となり得ることが実証されている。α４β１インテグリンアンタゴニストの局所適用は、疾患寛解につながる；α４β１の遮断は、ドライアイ症状および炎症を減少させた。ＩＴＧ−β１の増加は、眼球表面への免疫細胞の活性化を示すドライアイ症状および炎症のシグナルである。
【００７９】
以下の表４に示されている結果は、相対的定量化（ＲＱ）として表され、キャリブレーター（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）（非処置ＨＣＥ組織）と比較した発現の倍数変化を示した。
【００８０】
2019514887.tif 000007
【００８１】
結果は明らかに、比較点眼液５は、ＨＹＰ−ＤＲＹＨＣＥ（２．７１対２．８２）に関して、ＭＭＰ−９のレベルを変化させず、そして、比較点眼液６は、ＨＹＰ−ＤＲＹＨＣＥ（２．４対２．８２）に関して、ＭＭＰ−９のレベルをわずかに減少させることができただけである、ことを示した。
【００８２】
一方、本発明の点眼液１は、ＭＭＰ−９発現の最大の低下を誘導し、過剰なマトリックス分解（２．０８対２．８２）からの保護を示した。
【００８３】
結果は、さらに、明らかに、比較点眼液５及び６は、ＩＴＧ−β１の過剰発現を誘導したが、一方、本発明の点眼液１は、陽性対照（ＨＹＰ−ＤＲＹＨＣＥ）と比較して、最も低い発現を生じた、ことを示した。ＩＴＧ−β１の減少は、ドライアイの症状および炎症を減少させる陽性のシグナルである。
【００８４】
実施例３．１ｂ−超微細構造解析
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて超微細構造解析を行った。ＳＥＭ  Ｚｅｉｓｓ  Ｓｉｇｍａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅでサンプルを観察した。２０００倍の倍率が実行された。
【００８５】
角膜上皮に起因するスコアは、０（標準：最も滑らかな表面）、１（わずか）、２（強）および３（重度：表面ラフリング）の角膜平滑性の品質評価に基づく。
【００８６】
結果を以下の表５および図１に要約する。
【００８７】
2019514887.tif 000008
【００８８】
実施例３．２
表面上皮の損傷を研究するためのモデル
この実施例においては、ＨＣＥは、ヒト角膜創傷治癒のモデルを設定して使用した。上皮表面で４つの対称的損傷を伴い、そして、損傷後１時間で、損傷組織を２４時間および７２時間、製品（３０μＬ）で処置した。治療の最後に、組織を異なったパラメータ（ｍＲＮＡ発現、免疫蛍光、組織学的および超微細構造解析）について調べた。この試験は、本発明の点眼剤１および比較点眼剤５および６を用いて行った。
【００８９】
実施例３．２ａ−転写解析
ＨＣＥから抽出された全ｍＲＮＡを転写分析（リアルタイムＰＣＲ）によって分析して、マトリックスメタロペプチダーゼ−１（ＭＭＰ−１）の発現を定量化した。
【００９０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、その基質が細胞外マトリックスおよび基底膜のほとんどの成分を含む、亜鉛依存性プロテイナーゼの一群である。
【００９１】
損傷後、およびサイトカインの放出に応答して、角膜内のいくつかのＭＭＰは、転写または活性化によってアップレギュレートされる。ＭＭＰ−１は、上皮移行の重要なメディエーターである。Ｅｘ  ｖｉｖｏで傷ついたヒト角膜組織の研究は、間質（ｓｔｒｏｍａ）上での再上皮化の間に、主要な角膜上皮細胞におけるＭＭＰ−１の存在を確認した。
【００９２】
下記表６に示す結果は、キャリブレータ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）（非処理ＨＣＥ組織）と比較して、発現の倍数変化を示す相対的定量化（ＲＱ）として表した。
【００９３】
2019514887.tif 000009
【００９４】
損傷した組織において、ＭＭＰ−１は、２４時間で、アップレギュレートされ、再上皮化およびマトリックスリモデリングに対する細胞の最初の陽性反応を実証した。
【００９５】
点眼液５及び６は、２４時間でＭＭＰ−１のレベルを強く減少し、そして、再上皮化プロセスおよびマトリックスリモデリングの減少を示した。
【００９６】
本発明の点眼液１によって促進された、ＭＭＰ−１のより高いレベルは、再上皮化およびマトリックスリモデリングのための、陽性の符号である。
【００９７】
実施例３．２ｂ−組織学的分析
曝露の終わりに、組織を緩衝化１０％ホルマリン中で固定し、そして、５μｍの切片を得るために、パラフィンブロックに入れた。スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして、光学顕微鏡下で分析した（２０倍）。
【００９８】
治癒の進行は、対照組織における治癒状態を比較して評価した。
【００９９】
治癒率に基づく分類（良い＞公正（ｆａｉｒ）＞悪い（ｐｏｏｒ））が用いられた。
【０１００】
結果を、以下の表７および図２にまとめた。
【０１０１】
2019514887.tif 000010
【０１０２】
実施例３．２ｃ−超微細構造解析
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて超微細構造解析を行った。ＳＥＭ  Ｚｅｉｓｓ  Ｓｉｇｍａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅでサンプルを観察した。２０００倍の倍率で行った。
【０１０３】
創傷の角膜上皮に起因するスコアは、移動する上皮細胞の特徴的な変化に基づくものであった：
０（標準：損傷した表面の欠如）、
１（維持および再生または角膜上皮細胞層）、
２（完全な再生ではない）および
３（再上皮化の欠如）。
【０１０４】
結果は、以下の表８および図３にまとめられている。
【０１０５】
2019514887.tif 000011
【図１】
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【図２】
2019514887.tif 000013
【図３】
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【国際調査報告】
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