(57)【要約】本発明は、組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しているＶＳＶを含み、かつ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、およびＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルスに関する。本発明はさらに、組換え腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸、および該核酸を含むベクターに関する。本発明はさらに、本発明のｒＶＳＶ、上記核酸、または上記ベクターを含む医薬組成物に関し、さらに、遺伝子送達ツールとしての、および／または腫瘍検出のための使用に関する。本発明はさらに、医療において使用するための、特に、がんの診断、予防、および／または処置のための、組換え腫瘍崩壊水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含み、
ＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しており、かつ、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質
を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルス。
【請求項２】
ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、Ｆ３ａａ改変Ｆタンパク質であり、
かつ／または、プロテアーゼ切断部位における、好ましくはＬ２８９位における、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばＬ２８９Ａを含み、
かつ／または、ＶＳＶの前記Ｇタンパク質が、前記改変融合タンパク質およびＮＤＶのＨＮタンパク質で置き換えられている、
請求項１に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス。
【請求項３】
ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、配列番号１０もしくは配列番号１２のアミノ酸配列、
または、配列番号１０もしくは１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、配列番号９もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列、
または、配列番号９もしくは１１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、
かつ／あるいは、ＮＤＶの該ＨＮタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列、
または、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの該ＨＮタンパク質が、配列番号５のヌクレオチド配列、
または、配列番号５のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、
請求項１または２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクターであって、
任意選択で、
−  レポーター遺伝子（複数可）、
例えば、ＨＳＶ１−ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、チロシナーゼ、
−  標的細胞（複数可）または組織に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、腫瘍細胞（複数可）または腫瘍（複数可）に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの免疫刺激性遺伝子、
ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、もしくはＢ７−Ｈ３などの免疫チェックポイント阻害性抗体、および／または
ワクチン接種のための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（標的とされる該腫瘍に対して特異的）、
−  あるいはそれらの組合せ
をさらに含む、ベクター。
【請求項６】
配列番号１３のヌクレオチド配列、
または、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
または、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、
請求項４に記載の核酸または請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
（ｉ）請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターと、
（ｉｉ）任意選択で、薬学的に許容されるキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）と
を含む医薬組成物。
【請求項８】
薬物（複数可）、
例えば、
化学療法剤（複数可）、
放射線療法剤（複数可）、
腫瘍ワクチン（複数可）、
免疫チェックポイント阻害薬（複数可）、
細胞搬送系（複数可）、
小分子阻害薬（複数可）、
塞栓剤（複数可）、
遮蔽ポリマー（複数可）
をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、動脈内投与のために、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射のために製剤化される、
請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物の、遺伝子送達ツール、ウイルスの生体内分布の（非侵襲的）画像化としての、および／または腫瘍検出のための使用。
【請求項１１】
医療において使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
がんの診断、予防、および／または処置において使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍崩壊療法において使用するための、請求項１２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、ベクター、または医薬組成物。
【請求項１４】
他の療法、例えば、
細胞搬送系、
例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、
例えば、腫瘍ワクチン、もしくは免疫チェックポイント阻害薬、
および／または
標準的な腫瘍療法、
例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓術、小分子阻害薬
との組合せで使用するためのものであり、
かつ／あるいは、投与が、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である、
請求項１２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、ベクター、または医薬組成物。
【請求項１５】
がんの診断、予防、および／または処置の方法であって、
それを必要とする被験体に、治療量の、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、
好ましくは、該投与が、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しているＶＳＶを含み、かつ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、およびＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルスに関する。本発明はさらに、組換え腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸、および該核酸を含むベクターに関する。本発明はさらに、本発明のｒＶＳＶ、上記核酸、または上記ベクターを含む医薬組成物に関し、さらに、遺伝子送達ツールとしての、および／または腫瘍検出のための使用に関する。本発明はさらに、医療において使用するための、特に、がんの診断、予防、および／または処置のための、組換え腫瘍崩壊水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍崩壊ウイルス（ＯＶ）は、選択的に複製し、周囲の正常組織を生かしつつ腫瘍細胞を殺滅するその固有の能力のために、がん処置用の治療剤の新規のクラスを表わす（Ｌｏｒｅｎｃｅら、１９９４年；Ｃｏｆｆｅｙら、１９９８年；Ｋｉｒｎら、２００１年；Ｐｅｎｇら、２００１年）。ＯＶ療法は、本来的に腫瘍選択的であるか、または腫瘍細胞内で優先的に成長するように操作を加えられているかのいずれかである複製適格ウイルスの使用を伴う。悪性形質転換の過程の間に遺伝子異常が蓄積して、成長および生存に有利ながん細胞をもたらす。多くのＯＶは、これらの細胞におけるそれ自身の複製を支えるために、このような細胞内シグナル伝達経路における欠陥を利用する。特に、多くのがん細胞では、正常細胞において侵襲性ウイルスに対する自然免疫応答の重要な機構である、インターフェロン（ＩＦＮ）を分泌するかまたはそれに応答する能力が損なわれている。これらの欠陥は、腫瘍細胞が生産的な抗ウイルス防御を行うことを妨げ、したがって、ＯＶの複製は、これらの細胞において特異的に支持される。
【０００３】
腫瘍崩壊ウイルスは、感染した腫瘍細胞の直接的な殺滅、ならびに、腫瘍に対して向けられ、近隣の感染していない腫瘍細胞の破壊をもたらしうる、腫瘍脈管構造の破壊および適応免疫応答の誘導などの間接的な効果の両方により、その効果を発揮する。さらに、プラスミドＤＮＡから組換えウイルスベクターを操作により作製しレスキューすることを可能にする遺伝子系が利用可能である。このようにして、ウイルスを改変し、腫瘍特異性を増加させたり、または治療用遺伝子および／もしくはレポーター遺伝子を発現させたりすることができる。
【０００４】
過去１０年間にわたり、向上したＯＶ療法の開発において著しい進歩がなされ、種々のベクターが治験に入った（Ｋｉｒｎら、２００１年；Ｅｖｅｒｔｓおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ、２００５年；ＰａｔｅｌおよびＫｒａｔｚｋｅ、２０１３年）。近年、組換え単純ヘルペスウイルスＩベクターが、臨床薬剤としての使用がＦＤＡにより承認された初めての腫瘍崩壊ウイルスとなり（Ａｍｇｅｎの２０１５年１０月２７日のプレスリリース）、欧州における承認が続くと予想されている。しかしながら、一般に、治験結果は、信頼でき予測的な前臨床モデルの不足を理由として、また、免疫適格宿主におけるほとんどのＯＶ療法に対する不十分な腫瘍応答を理由として、期待はずれであることが多い。
【０００５】
腫瘍崩壊ウイルス療法の治療有効性は、多くの場合、より安全なウイルスが減弱した治療効果をもたらす一方で、強力なベクターは毒性に関連付けられることが多いなど、安全性とのトレードオフになる。見込みのある前臨床データにもかかわらず、臨床薬剤としての水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の開発は、齧歯動物および非ヒト霊長類において野生型ＶＳＶによる処置に応答して重度の神経毒性が観察されたという事実により、実質的に妨げられてきた（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｐｏｏｌら、２００２年；Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００７年）。安全性の側面に加えて、高い腫瘍内力価のＶＳＶがその短いライフサイクルの結果として急速に蓄積することで、早期かつ強力な自然免疫応答がもたらされ、これにより、宿主から除去される前に効率的に拡散して腫瘍塊全体を破壊するウイルスの能力が大幅に限定される（Ａｌｔｏｍｏｎｔｅら、２００８年）。
【０００６】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、ヒトにおける魅力的な安全性プロファイルを有する強力な腫瘍崩壊剤であることが示されているが、トリ種はこのウイルスの自然宿主であるため、ＮＤＶの使用は、鳥類および家禽産業に対する環境リスクを提示する。ＮＤＶの亜病原性株および短潜伏期性株は腫瘍崩壊ウイルスとして最も有効であることが示されているが、これらは２００８年からＵＳＤＡにより指定病原体（ｓｅｌｅｃｔ  ａｇｅｎｔｓ）に分類されており、それらの使用が禁止されているため、臨床薬剤へのＮＤＶの開発が大幅に阻まれている（ｗｗｗ．ｓｅｌｅｃｔａｇｅｎｔｓ．ｇｏｖ）。
【０００７】
腫瘍崩壊ＶＳＶベクターの安全性を改善するため、研究者らは種々の手法を調査してきた。まず、５１位においてマトリックス（Ｍ）タンパク質のアミノ酸組成を変更するヌクレオチド置換または欠失を保有する組換えＶＳＶは、細胞性転写および核細胞質間ＲＮＡ輸送を阻害する内在性Ｍタンパク質の能力に干渉し、抗ウイルス性細胞応答を始動させる。これらのベクターは野生型よりも安全であることが示されているが、腫瘍内複製も減弱され（Ｓｔｏｊｄｌら、２００３年；Ｅｂｅｒｔら、２００５年）、この手法の治療的価値は限定されている。ＶＳＶの安全性を改善するための別の方策は、ウイルスの指向性を改変するためにｍｉＲＮＡ標的配列をウイルスゲノムに組み込むことを伴うが、これらのベクターもさほど有効ではない（Ｅｄｇｅら、２００８年；Ｋｅｌｌｙら、２０１０年）。
【０００８】
ＮＤＶゲノムに操作を加えてトリ種における病原性を限定するための様々な試みが探究されている。例えば、特許出願第ＷＯ２０１５／０３２７５５（Ａ１）号を参照されたい。これらの改変が安全性を本当に改善するか否か、およびこれらの改変がベクターの腫瘍崩壊能に及ぼす効果は、現時点では不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０３２７５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、腫瘍崩壊ウイルス療法のための改善した手段および方法、ならびに改善した腫瘍崩壊ウイルスが、当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、この目的は、組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含み、
ＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しており、かつ、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質
を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルスによって解決される。
【００１２】
本発明によれば、この目的は、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸によって解決される。
【００１３】
本発明によれば、この目的は、本発明の核酸を含むベクターによって解決される。
【００１４】
本発明によれば、この目的は、
（ｉ）本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、またはベクターと、
（ｉｉ）任意選択で、薬学的に許容されるキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）と
を含む医薬組成物によって解決される。
【００１５】
本発明によれば、この目的は、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物の、遺伝子送達ツール、および／もしくはウイルスの生体内分布の（非侵襲的）画像化としての、ならびに／または腫瘍検出のための使用によって解決される。
【００１６】
本発明によれば、この目的は、医療において使用するための、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を提供することによって解決される。
【００１７】
本発明によれば、この目的は、がんの診断、予防、および／または処置において使用するための、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を提供することによって解決される。
【００１８】
本発明によれば、この目的は、がんの診断、予防、および／または処置の方法であって、
それを必要とする被験体に、治療有効量の、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法によって解決される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明をより詳細に以下に記述する前に、本明細書に記述される特定の方法論、プロトコール、および試薬は様々でありうるため、本発明はそれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は特定の実施形態を記述することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的では、本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【００２０】
本明細書において、濃度、量、および他の数値データは、範囲形式で表現または提示される場合がある。このような範囲形式は、便宜および簡潔さのために使用されるに過ぎず、したがって、範囲の限界として明確に挙げられている数値を含むだけでなく、その範囲内に包含されるすべての個別の数値または部分範囲も、各数値および部分範囲が明確に挙げられているかのように含むものと、柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例示として、「２０〜１００ヌクレオチド」の数値範囲は、明確に挙げられた２０〜１００の値を含むだけでなく、示された範囲内の個別の値および部分範囲も含むものとして解釈すべきである。したがって、この数値範囲内に含まれるのは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、…９７、９８、１００などの個別の値、および、例えば２５〜３５、２０〜４０、２５〜５０などの部分範囲である。これと同じ原理が、「少なくとも２５ヌクレオチド」など、数値を１つだけ挙げる範囲に適用される。さらに、このような解釈は、範囲の広さまたは記述されている特徴に関わらず適用されるべきである。
【００２１】
腫瘍崩壊ウイルスおよびＶＳＶベクター
上記で論じたように、本発明は、組換え腫瘍崩壊ウイルスを提供する。
【００２２】
特に、本発明は、ＶＳＶの糖タンパク質タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がシュードタイプ化されている組換え腫瘍崩壊ＶＳＶウイルスを提供する。
【００２３】
開発中の最も見込みのあるＯＶベクタープラットフォームの中には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）がある。
【００２４】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ラブドウイルス科のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＶＳＶベクターは、高い腫瘍内力価および後の腫瘍細胞溶解をもたらす、その本来の腫瘍特異性および急速な複製サイクルのため、非常に魅力的な腫瘍崩壊剤である。
【００２５】
ＶＳＶのゲノムは、５つの主要なタンパク質：糖タンパク質（Ｇ）、ラージポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、および核タンパク質（Ｎ）をコードする、マイナスセンスＲＮＡの単一分子である。総ゲノムは約１１，０００ヌクレオチドである。
【００２６】
ＶＳＶのＧタンパク質は、ウイルス進入を可能にする。これは、宿主細胞上に存在するＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）またはＬＤＬＲファミリーメンバーへのウイルス付着を媒介する。結合後、ＶＳＶ−ＬＤＬＲ複合体は急速に形質膜陥入する。これは次に、エンドソーム膜とのウイルスエンベロープの融合を媒介する。ＶＳＶは、部分的にクラスリン被覆された小胞を介して細胞に進入する；ウイルスを含有する小胞は、従来の小胞よりも多くのクラスリンおよびクラスリンアダプターを含有する。ウイルスを含有する小胞は、アクチン装置の成分をその相互作用のために動員し、これにより、自身の取り込みを誘導する。複製は細胞質内で生じる。
【００２７】
ＶＳＶのＬタンパク質は、ゲノムの半分によってコードされ、リンタンパク質と組み合わさってｍＲＮＡの複製を触媒する。
【００２８】
ＶＳＶのＭタンパク質は、８３１ヌクレオチド長であって、２２９アミノ酸のタンパク質に翻訳するｍＲＮＡによってコードされる。予測されるＭタンパク質配列は、膜会合を促進しうる長い疎水性または非極性のドメインを一切含有しない。このタンパク質は塩基性アミノ酸に富み、高度に塩基性のアミノ末端ドメインを含有する。
ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ完全ゲノム  配列番号１
ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０２４２８．１
ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ  Ｇタンパク質  配列番号２および３
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３６３３．１を参照されたい。
【００２９】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、パラミクソウイルス科のトリウイルスである。このファミリーのメンバーは、一本鎖の線状ＲＮＡを有する。総ゲノムは約１６，０００ヌクレオチドである。ウイルスの複製は、宿主細胞の細胞質内で起こる。
【００３０】
これは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、かつ、健康な細胞に害が及ばないようにしながら腫瘍細胞内で複製し溶解を引き起こすその先天的な能力のために腫瘍崩壊ウイルスとして開発されたという点で、ＶＳＶと同様である（Ａｌｔｏｍｏｎｔｅら、２０１０年；Ｖｉｇｉｌら、２００７年）。第Ｉ〜ＩＩ相臨床試験はＮＤＶに関して有望であることを示し、療法に関連する毒性が最小限であることを示唆する。腫瘍崩壊剤としてのＮＤＶの主要な利益は、血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）タンパク質から構成されるウイルスエンベロープが、標的細胞へのウイルス付着および融合を媒介するだけでなく、感染細胞をそれらの近隣の感染していない細胞に融合させ、ウイルスの拡散および腫瘍細胞死滅化のための強力な機構をもたらしもすることである。さらに、新たなエビデンスは、細胞−細胞の融合により引き起こされたシンシチウム形成がマルチモーダルな細胞死応答をもたらし、これがウイルスの直接的な腫瘍崩壊効果と相乗作用して、腫瘍破壊の強力な機構となりうることを示している（Ｃｕａｄｒａｄｏ−Ｃａｓｔａｎｏら、２０１５年）。
【００３１】
ニューカッスル病ウイルスの２つのタンパク質がエンベロープ内に挿入される。これらは、血球凝集素／ノイラミニダーゼタンパク質（ＨＮ）および融合タンパク質（Ｆ）である。これら２つのタンパク質は、ウイルスの病毒性およびウイルスがいかに宿主細胞に感染するかを決定する際に重要である。
【００３２】
血球凝集素／ノイラミニダーゼタンパク質は、次の問題の２つの部分を有する。（１）血球凝集素部分。これは、付着タンパク質であり、赤血球を含む宿主細胞の膜の外側にある受容体に結合する。（２）ノイラミニダーゼ部分は、宿主細胞の膜からのウイルスの放出を助ける酵素の活性部位である。この酵素の活性は、ウイルスが赤血球から溶離するのにかかる時間に影響を及ぼす。
【００３３】
融合タンパク質Ｆは、ウイルスエンベロープを宿主細胞の膜に融合させる。これにより、ウイルスゲノムによる宿主細胞の透過が可能になる。融合が生じるためには、天然融合タンパク質の形状が変化しなければならない。この変化は、宿主細胞プロテアーゼがそのタンパク質を特定の切断部位で切断するときに起こる。これが起こった後、融合タンパク質が活性化され、細胞の膜に融合することができるようになる。切断部位の周りのアミノ酸の配列が、そのタンパク質の切断を活性化させうるプロテアーゼの範囲を決定する。したがって、この配列が病毒性を決定する。
【００３４】
ＮＤＶ  Ｆタンパク質は、細胞膜とのウイルスの融合、およびシンシチウムの形成による細胞から細胞へのウイルス拡散に関与する。Ｆタンパク質内の多塩基性切断部位（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）の存在は、広範なプロテアーゼによるタンパク質切断および活性化を可能にし、短潜伏期性ウイルス株の病毒性の決定要因である。
【００３５】
高度に減弱した長潜伏期性Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１  ＮＤＶ株の腫瘍崩壊効力を増加させるため、多塩基切断部位（ｐｏｌｙｂａｓｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）がＦタンパク質に導入され、ｒＮＤＶ／Ｆ３ａａが生成された（Ｖｉｇｉｌら、２００７年）。結果として生じたウイルスは、胚発育卵における平均死亡時間に基づいて中等度の病毒性の表現型しか呈さなかった一方で、ウイルスは大きなシンシチウムを形成し、がん細胞におけるその複製が向上し、様々な動物腫瘍モデルにおいて腫瘍崩壊効果の向上をもたらした。長潜伏期性ＮＤＶであるＬａ  Ｓｏｔａ株のＦタンパク質を類似した様式で改変したとき、同様の所見が示された（Ｐｅｅｔｅｒｓら、１９９９年）。本発明者らは、Ｆ３ａａ改変融合タンパク質内のアミノ酸２８９におけるロイシンからアラニンへの単一のアミノ酸置換（Ｌ２８９Ａ）が、Ｆ３ａａ変異のみを保有するウイルスよりも、実質的により大きなシンシチウム形成および腫瘍壊死をもたらし、さらなる毒性が一切ないことをさらに実証した（Ａｌｔｏｍｏｎｔｅら、２０１０年）。
【００３６】
ｒＮＤＶ／Ｆ３ａａ株の融合活性および腫瘍崩壊活性は、ｒＮＤＶ／Ｆ３ａａを生成する、Ｆタンパク質の残基２８９におけるロイシンからアラニンへの点変異（Ｌ２８９Ａ）により、さらに向上させることができる。同所性免疫応答肝腫瘍ラットモデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｌｉｖｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ）において、肝動脈注入による変異体ウイルスの投与は、有意なシンシチウム形成および壊死をもたらし、これは、元のｒＮＤＶ／Ｆ３ａａウイルスによる処置と比べて有意な２０％の生存期間延長につながった（Ａｌｔｏｍｏｎｔｅら、２０１０年）。
ＮＤＶ  Ｈｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１完全ゲノム  配列番号４
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３７５８２３
ＮＤＶ  ＨＮタンパク質  配列番号５および６
核酸およびアミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３７５８２３およびＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９１２２７０を参照されたい。
ＮＤＶ  Ｆタンパク質  配列番号７および８
核酸およびアミノ酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３７５８２３およびＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ９１２２７１を参照されたい。
【化１】
2019516374.tif 000002
ＮＤＶ  Ｆ３ａａ改変融合タンパク質  配列番号９および１０
【化２】
2019516374.tif 000003
【化３】
2019516374.tif 000004
Ｌ２８９Ａを有するＮＤＶ  Ｆ３ａａ改変融合タンパク質  配列番号１１および１２
【化４】
2019516374.tif 000005
【化５】
2019516374.tif 000006
【００３７】
上記で論じたように、本発明は、ＶＳＶの糖タンパク質タンパク質がシュードタイプ化されている組換え腫瘍崩壊ＶＳＶウイルスを提供する。
【００３８】
近年、ウイルスの糖タンパク質を異種ウイルスのものに交換すること（「シュードタイプ化」）の概念は、ウイルスの指向性を変更する有効な手段として実証されている。この手法を使用すると、ウイルス骨格は無傷に保たれ、したがって、感受性細胞におけるウイルス複製は最小限に抑えられるはずであるとする仮説が立てられている。１つのグループは、リンパ性脈絡髄膜炎（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｍｉｎｇｉｔｉｓ）ウイルスのエンベロープタンパク質（ＬＣＭＶ−ＧＰ）でシュードタイプ化されたＶＳＶベクターを記述しており、これは、野生型ベクターよりも向神経性が有意に低いことが示されている（Ｍｕｉｋら、２０１１年）。同様に、ＶＳＶの糖タンパク質を麻疹ウイルスのものと交換し、単鎖可変抗体断片を用いて改変して、別個の表面受容体を発現するがん細胞に対してＶＳＶを再標的化させた（Ａｙａｌａ−Ｂｒｅｔｏｎら、２０１２年）。
【００３９】
本発明において、組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含み、
ＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しており、かつ、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質
を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルスが提供される。
【００４０】
好ましい実施形態では、ＮＤＶの改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、Ｆ３ａａ改変Ｆタンパク質であり、
かつ／または、プロテアーゼ切断部位における、好ましくはＬ２８９位における、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばＬ２８９Ａを含む。
【００４１】
好ましい実施形態では、ＶＳＶのＧタンパク質は、改変融合タンパク質およびＮＤＶのＨＮタンパク質に置き換えられている。
【００４２】
組換え腫瘍崩壊ウイルスは、さらに、ＶＳＶの残りのタンパク質、すなわちラージポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、および核タンパク質（Ｎ）を含む。
【００４３】
例えば、ＶＳＶの内在性糖タンパク質は、全長ＶＳＶゲノムをコードするプラスミドから欠失している場合がある。改変融合タンパク質を含むＮＤＶ糖タンパク質（ＮＤＶ／Ｆ（Ｌ２８９Ａ））および血球凝集素−ノイラミニダーゼを含むＮＤＶ糖タンパク質（ＮＤＶ／ＨＮ）は、ＶＳＶマトリックス（Ｍ）遺伝子とラージポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子との間に別個の転写ユニットとして挿入されていてもよい。例えば、図１を参照されたい。
【００４４】
本発明のｒＶＳＶ（ベクター）のある実施形態では、ＮＤＶの改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号１０のアミノ酸配列［＝Ｆ３ａａタンパク質のａａ配列］もしくは配列番号１２のアミノ酸配列［＝Ｆ３ａａタンパク質／Ｌ２８９Ａのａａ配列］、
または、配列番号１０もしくは１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、配列番号９のヌクレオチド配列［＝Ｆ３ａａタンパク質のヌクレオチド配列］もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列［＝Ｆ３ａａタンパク質／Ｌ２８９Ａのヌクレオチド配列］、
または、配列番号９もしくは１１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４５】
本発明のｒＶＳＶ（ベクター）のある実施形態では、ＮＤＶのＨＮタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列、
または、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶのＨＮタンパク質は、配列番号５のヌクレオチド配列、または、配列番号５のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４６】
上記で論じたように、本発明は、本発明の腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸を含む。
【００４７】
上記で論じたように、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを含む。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明のベクターは、
−  レポーター遺伝子（複数可）、
例えば、ＨＳＶ１−ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、チロシナーゼ、
−  標的細胞（複数可）または組織に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、腫瘍細胞（複数可）または腫瘍（複数可）に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの免疫刺激性遺伝子、
ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、もしくはＢ７−Ｈ３などの免疫チェックポイント阻害性抗体、および／または
ワクチン接種のための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（標的とされる腫瘍に対して特異的）、
−  あるいはそれらの組合せ
をさらに含む。
【００４９】
ある実施形態では、本発明の核酸またはベクターは、配列番号１３のヌクレオチド配列［＝完全なウイルス／ベクター構築物のヌクレオチド配列］、
または、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列［＝ウイルス／ベクター構築物によりコードされるタンパク質のａａ配列］をコードするヌクレオチド配列、
または、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【００５０】
配列番号１３は、完全なウイルス／ベクター構築物のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４〜１７ならびに１２および６は、配列番号１３によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示し、すなわち、次の通りである：
配列番号１４  タンパク質ＶＳＶ−Ｎのアミノ酸配列、
配列番号１５  タンパク質ＶＳＶ−Ｐのアミノ酸配列、
配列番号１６  タンパク質ＶＳＶ−Ｍのアミノ酸配列、
配列番号１２  タンパク質ＮＤＶ−Ｆ３ａａ（Ｌ２８９Ａ）のアミノ酸配列、
配列番号６  タンパク質ＮＤＶ−ＨＮのアミノ酸配列、
配列番号１７  タンパク質ＶＳＶ−Ｌのアミノ酸配列。
【００５１】
医薬組成物
上記で論じたように、本発明は、
（ｉ）本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または本発明の核酸、または本発明のベクターと、
（ｉｉ）任意選択で、薬学的に許容されるキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）と
を含む医薬組成物を提供する。
【００５２】
一実施形態では、医薬組成物は、薬物（複数可）、
例えば、
化学療法剤（複数可）、
放射線療法剤（複数可）、
腫瘍ワクチン（複数可）、
免疫チェックポイント阻害薬（複数可）、
細胞搬送系（複数可）、
小分子阻害薬（複数可）、
塞栓剤（複数可）、
遮蔽ポリマー（複数可）
をされに含む。
【００５３】
一実施形態では、医薬組成物は、全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、動脈内投与のために、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ）、脳内、脳室内、および硝子体内の注射のために製剤化されている。
【００５４】
遺伝子送達ツールとしての、および／または腫瘍検出のための使用
上記で論じたように、本発明は、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物の、
−  遺伝子送達ツール、
および／もしくは
−  ウイルスの生体内分布の（非侵襲的）画像化としての、
ならびに／または
−  腫瘍検出のための、
使用を提供する。
【００５５】
ある実施形態では、本発明のベクターは、標的細胞（複数可）または組織に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、腫瘍細胞（複数可）または腫瘍（複数可）に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの免疫刺激性遺伝子、
ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、もしくはＢ７−Ｈ３などの免疫チェックポイント阻害性抗体、および／または
ワクチン接種のための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（標的とされる腫瘍に対して特異的）を含む。
【００５６】
ある実施形態では、本発明のベクターは、レポーター遺伝子（複数可）、
例えば、ＨＳＶ１−ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、チロシナーゼを含み、
そのため、例えば、ウイルスの生体内分布の非侵襲的画像化または腫瘍検出のために好適である。
【００５７】
医学的使用
上で議論したように、本発明は、医療において使用するための、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を提供する。
【００５８】
上で議論したように、本発明は、がんの診断、予防、および／または処置において使用するための、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を提供する。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、腫瘍崩壊療法において使用するための、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を提供する。
【００６０】
本明細書で使用される「腫瘍崩壊ウイルス療法」という用語は、腫瘍退縮を誘導するための、腫瘍崩壊ウイルス、それらをコードする核酸、またはそれぞれのベクターの投与による、がんの治療を指す。
【００６１】
一実施形態では、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物は、他の療法との組合せで使用するために提供される。
【００６２】
前記他の療法は、
細胞搬送系、
例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、
例えば、腫瘍ワクチン、もしくは免疫チェックポイント阻害薬、
および／または
標準的な腫瘍療法、
例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓術、小分子阻害薬
でありうる。
【００６３】
一実施形態では、投与は、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である。
【００６４】
がんの診断、予防、および／または処置の方法
上で議論したように、本発明は、がんの診断、予防、および／または処置の方法であって、
それを必要とする被験体に、治療有効量の、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、またはベクターの治療有効量は、所望の治療結果、特に腫瘍退縮をもたらす量である。
【００６６】
組換えウイルス、核酸、ベクター、またはそれらの医薬組成物（複数可）は、好ましくは、例えば数日間から最長数週間までの一定期間にわたり、複数サイクルで投与される。
【００６７】
一実施形態では、投与は、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である。
【００６８】
一実施形態では、本発明の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、もしくはベクター、または本発明の医薬組成物は、他の療法との組合せで提供され、それを必要とする被験体に投与される。
【００６９】
前記他の療法は、
細胞搬送系、
例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、
例えば、腫瘍ワクチン、もしくは免疫チェックポイント阻害薬、
および／または
標準的な腫瘍療法、
例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓術、小分子阻害薬
でありうる。
【００７０】
好ましい実施形態のさらなる記述
本発明は、内在性糖タンパク質が欠失しており、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変エンベロープタンパク質で交換されている、シュードタイプ化されたＶＳＶベクターを開示する。
【００７１】
多塩基プロテアーゼ切断部位の導入により、ＮＤＶのＨｉｔｃｈｎｅｒ  Ｂ１株の融合タンパク質を改変すると（ｒＮＤＶ／Ｆ３ａａ）、外来性プロテアーゼの非存在下で広範な細胞における効率的なシンシチウム形成が可能になることが、これまでに実証されている（Ｖｉｇｉｌら、２００７年）。本発明者らは、Ｆ３ａａ改変融合タンパク質内のアミノ酸２８９におけるロイシンからアラニンへの単一のアミノ酸置換（Ｌ２８９Ａ）が、Ｆ３ａａ変異のみを保有するウイルスよりも、実質的により多くのシンシチウム形成および腫瘍壊死をもたらし、さらなる毒性が一切ないことをさらに実証した（Ａｌｔｏｍｏｎｔｅら、２０１０年）。
【００７２】
本発明に従い、前記改変された超融合性（ｈｙｐｅｒｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）Ｆタンパク質を、ＮＤＶ  ＨＮ付着タンパク質と併せて、ＶＳＶ  Ｇ欠失ベクターに挿入した。
【００７３】
これら２つの強力な腫瘍崩壊ベクターのハイブリッドを作製することにより、本発明者らは、各ウイルスの有益な特色を統合すると同時に、それぞれの安全性の懸念を排除する。
【００７４】
結果として得られるベクターはＶＳＶ骨格を有し、したがって、野生型ＶＳＶの急速な複製サイクルを維持する。さらに、ＮＤＶのＨＮおよび超融合性Ｆタンパク質の組み込みを理由として、組換えウイルスは向上したシンシチウム形成を誘導し、ウイルスの効率的な腫瘍内拡散、ならびに腫瘍細胞死および抗腫瘍免疫応答の誘導の強力な機構が可能になる。この方策を使用すると、ＮＤＶに関連付けられる環境上の脅威を伴わずに、融合性ウイルスの利益を達成することができる。
【００７５】
さらに、内在性ＶＳＶ糖タンパク質が欠失していることから、ベクターに関連付けられる神経毒性はないはずである。最後に、ＮＤＶは、腫瘍細胞において上方制御されるシアル酸残基を介して標的細胞に付着するため（Ｂｕｌｌら、２０１４年）、本発明者らは、シュードタイプ化されたベクターを用いて、さらなる形質導入による腫瘍の標的化を達成することができる。
【００７６】
多数のシュードタイプ化されたＶＳＶベクターが野生型ＶＳＶよりも安全なベクターとして既に報告されているが、本発明者らの特異的なウイルス改変は、より安全であることに加えて、ＶＳＶエンベロープタンパク質の、ＮＤＶのものとの置換が、より強力なウイルスをもたらすという点で異なる。
【００７７】
さらに本発明者らは、安全性に悪影響を与えることなく、結果として得られる組換えウイルスの有効性をさらに改善するために、ＮＤＶ  Ｆタンパク質の変異バージョンを導入する。
【００７８】
この糖タンパク質交換の利益には、次の３つの部分からなる：
１．内在性ＶＳＶ糖タンパク質に関連付けられる向神経性は、ＶＳＶエンベロープの欠失および非向神経性ＮＤＶエンベロープタンパク質の導入により回避されうる；
２．腫瘍細胞は、ＮＤＶの天然の受容体であるシアル酸残基の上方制御を介して標的化されうる；そして
３．ウイルス拡散および腫瘍細胞殺滅は、ＮＤＶ  Ｆタンパク質の高度に融合性の変異体バージョンの導入により有意に向上しうる。
【００７９】
本発明者らの構築物は、安全性および有効性の両方の改善を同時にもたらす。
【００８０】
本発明のシュードタイプ化されたウイルスは、野生型ベクターを上回る明らかな利点として、改善した安全性および向上した有効性を提示する。
【００８１】
さらに、この特定のベクターにはまた、これまでに報告されているシュードタイプ化されたＶＳＶベクターを上回る利点がある。ＶＳＶ−ＧＰベクター（ＬＣＭＶ−ＧＰでシュードタイプ化されたもの）は安全性プロファイルの向上を示す、ＮＤＶのものと比較して、ＬＣＭＶ糖タンパク質により得られるさらなる治療機構はない（Ｍｕｉｋら、２０１１年）。麻疹ウイルス（ＭＶ）は、パラミクソウイルス科のメンバーであり、かつそのエンベロープも血球凝集素および融合タンパク質からなるという点でＮＤＶと同様であるが、ｒＶＳＶ−ＭＶベクター（Ａｙａｌａ−Ｂｒｅｔｏｎら、２０１２年）は、融合性（ｆｕｓｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増加させる改変を一切含有せず、シンシチウム形成において本発明者らの超融合性ＶＳＶ−ＮＤＶよりも効率が低い可能性がある。さらに、ＭＶは、３つの別個の受容体：ＣＤ４６、シグナルリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）、およびネクチン４を介して標的細胞に付着する。しかしながら、ＳＬＡＭ陽性免疫細胞の感染は免疫抑制をもたらし、ネクチン４陽性気道上皮細胞の感染は呼吸性排出（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ）およびウイルス伝染をもたらし、これらは両方とも、腫瘍崩壊ウイルスによる療法の望ましくない副作用である。したがって、ＳＬＡＭおよびネクチン４とのＭＶ  Ｈの相互作用を取り除く改変（Ｌｉｕら、２０１４年）または付着タンパク質を腫瘍特異的受容体に再標的化する改変（Ａｙａｌａ−Ｂｒｅｔｏｎら、２０１２年）が、ｒＶＳＶ−ＭＶベクターとの関連において、シュードタイプ化されたウイルスを腫瘍に再標的化するための方策として行われてきた。しかしながら、ＭＶエンベロープの天然の付着機構に対するこれらの制限は、組換えウイルスを確実に減弱させる。実際、ネクチン４およびＣＤ４６は、ＭＶ  Ｈ上に実質的に重複する受容体結合表面を有し、ネクチン４結合の妨害は、ＣＤ４６への付着を損ない、腫瘍崩壊効果の大幅な減少をもたらすことが示された（Ｌｉｕら、２０１４年）。最後に、ヒト集団の大部分は麻疹ウイルスのワクチン接種を受けているため、ウイルスエンベロープに対する高レベルの循環抗体は、ｒＶＳＶ−ＭＶベクターの中和に関与する可能性がある。
【００８２】
したがって、本発明者らのｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターは、その超融合性の特色、一般人口における既存の免疫の欠如、およびＶＳＶまたはＮＤＶと比較して減弱が予想されないことを理由として、これまでに報告されているシュードタイプ化されたベクターよりも優れている。
【００８３】
以下の実施例および図面は、本発明を例示するが、本発明をそれらに限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ＮＤＶの糖タンパク質を発現する組換えシュードタイプ化ＶＳＶ構築物を示す図である。全長ＶＳＶゲノムをコードするプラスミドからＶＳＶの内在性糖タンパク質を欠失させた。改変融合タンパク質を含むＮＤＶ糖タンパク質（ＮＤＶ／Ｆ（Ｌ２８９Ａ））および血球凝集素−ノイラミニダーゼを含むＮＤＶ糖タンパク質（ＮＤＶ／ＨＮ）を、ＶＳＶマトリックス（Ｍ）遺伝子とラージポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子との間に別個の転写ユニットとして挿入した。確立された逆遺伝学系を使用し、それぞれのシュードタイプ化されたＶＳＶベクターをレスキューした。
【００８５】
【図２】図２は、ｒＶＳＶ−ＮＤＶがＨＣＣ細胞株において複製し、完全な細胞傷害性を引き起こすことができることを示す図である。ヒトＨＣＣ細胞株であるＨｕｈ７（Ａ、Ｂ）およびＨｅｐＧ２（Ｃ、Ｄ）を、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させた。１時間の感染後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を細胞に添加した。感染後の様々な時点で、ＬＤＨアッセイ（Ｂ、Ｄ）による細胞傷害性測定のために上清のアリコートを収集し、ＴＣＩＤ５０アッセイ（Ａ、Ｃ）による細胞内力価測定のために細胞単層を溶解させた。実験は三連で行い、データは平均＋／−標準偏差として提示されている。
【００８６】
【図３】図３は、ｒＶＳＶ−ＮＤＶ感染がＨＣＣ細胞における急速なシンシチウム形成をもたらすことを示す図である。シュードタイプ化されたｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターが腫瘍細胞においてシンシチウム形成を誘導する能力を評価するために、様々なＨＣＣ細胞株を０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ−ＮＤＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶに感染させ、感染後の様々な時点で顕微鏡により観察した。さらなる細胞を対照としてＰＢＳで処理した。代表的なヒトＨＣＣ細胞株としてＨｕｈ７細胞が示されており、代表的な画像は２００倍の拡大率でキャプチャした。
【００８７】
【図４】図４は、ＮＤＶエンベロープタンパク質でのＶＳＶのシュードタイプ化がＩＦＮの抗ウイルス作用に対するベクターの感受性を変更しないことを示す図である。Ｉ型ＩＦＮに対するｒＶＳＶ−ＮＤＶの感受性を評価するために、ＩＦＮ感受性細胞株（Ａ５４９）を、０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ−ＮＤＶ、ｒＶＳＶ、およびｒＮＤＶに感染させた。感染の４８時間後に細胞を溶解させ、細胞内ウイルス力価をＴＣＩＤ５０アッセイにより測定した。実験は三連で行い、平均値＋／−標準偏差が示されている。
【００８８】
【図５】図５は、ｒＶＳＶ−ＮＤＶの複製および細胞傷害性が初代ヒト肝細胞において実質的に減少することを示す図である。初代ヒト肝細胞を０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させた。細胞溶解物を様々な時点で細胞内ウイルス力価のＴＣＩＤ５０分析に供した。さらに、ＬＤＨアッセイによる細胞傷害性測定のために様々な時点で上清のアリコートを収集した。実験は二連で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行い、平均＋／−標準偏差が示されている。
【００８９】
【図６】図６は、ｒＶＳＶ−ＮＤＶの複製および細胞傷害性が初代マウスニューロンにおいて実質的に減少することを示す図である。初代マウスニューロンを０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させた。細胞溶解物を様々な時点で細胞内ウイルス力価のＴＣＩＤ５０分析に供した。標準的なＭＴＳアッセイを使用し、さらなるウェルを細胞生存率についてアッセイした。実験は二連で行い、平均＋／−標準偏差が示されている。
【００９０】
【図７】図７は、シュードタイプ化されたｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターが免疫原性細胞死を引き起こすことを示す図である。Ｈｕｈ７細胞を４８時間にわたり０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させたか、または偽感染させた。馴化培地を濃縮し、放出されたＨＭＧＢ１、Ｈｓｐ７０、およびＨｓｐ９０の検出のために１０μｇのタンパク質をウェスタンブロット分析に供した。
【００９１】
【図８】図８は、シュードタイプ化されたｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターが免疫不全マウスでｒＶＳＶと比較して向上した安全性を示すことを示す図である。免疫不全の雄ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、１０６  ＴＣＩＤ５０の用量におけるｒＶＳＶ−ＮＤＶまたはｒＶＳＶ−ＧＦＰ（図では簡略化のためにｒＶＳＶと称される）の尾静脈注射により処置した。マウスは毎日モニタリングし、人道的なエンドポイントにおいて安楽死させた。体重変化は、注射に関する時間に対してプロットし（左）；血液中のウイルス力価は、１日目および７日目にＴＣＩＤ５０分析により測定し（中央）；生存の割合は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍａｉｅｒ生存曲線によってプロットした（左）。
【００９２】
【図９】図９は、１０６  ＴＣＩＤ５０のｒＶＳＶで処置されたマウスが肝臓および脳における病理学的変化を明らかにしたことを示す図である。肝臓のＨ／Ｅ染色は、核溶解を伴う肝細胞の変性により指し示された、ｒＶＳＶ処置後の肝細胞の小群の壊死を明らかにした（左上パネル）。ｒＶＳＶ適用後の脳幹における急性壊死が、核濃縮および核崩壊を呈する、変性しているグリア細胞と共に観察された（右上パネル）。グリア細胞の変性は、カスパーゼ３の免疫組織化学染色によってさらに確認できた（右下）。代表的な画像が示されており、スケールバーは５０μｍに等しい。毒性の徴候を示した後にｒＶＳＶを与えたマウスの脳および肝臓の組織溶解物からウイルス力価を定量した。平均＋ＳＥＭが示されている。
【実施例】
【００９３】
１．  材料および方法
１．１  ウイルス
これまでに記述されているように（Ｈｕａｎｇら、２００３年）、ＧＦＰレポーターを発現する組換えＶＳＶ（本明細書では「ｒＶＳＶ」と称される）を操作してレスキューした。これまでに記述されているように（Ａｌｔｏｍｏｎｔｅら、２０１０年）、Ｆ３ａａ（Ｌ２８９Ａ）変異を保有し、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現する組換えＮＤＶ（本明細書では「ｒＮＤＶ」と称される）を操作してレスキューした。
【００９４】
全長ＶＳＶゲノムをコードするプラスミド（ｐＶＳＶ−ＸＮ２）をまず改変し、ＮＤＶのＦ３ａａ（Ｌ２８９Ａ）改変融合タンパク質（Ｅｂｅｒｔら、２００４年）をＧ遺伝子とＬ遺伝子との間のさらなる転写ユニットとして発現させることにより、組換えｒＶＳＶ−ＮＤＶを産生した。内在性ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）をＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限酵素での消化によって欠失させた。これらの制限酵素は、それぞれ、Ｇの５’および３’非コード領域内の特有の制限部位を認識する。Ｇ欠失プラスミドの自己ライゲーション後、ＮＤＶ  Ｆ遺伝子に続く特有のＮｈｅＩ制限部位において短いオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、ＨＮ遺伝子の挿入のための多重クローニング部位を作製した。Ｇ欠失ＶＳＶ−ＮＤＶ／Ｆ３ａａ（Ｌ２８９Ａ）プラスミドにおける新しく組み込まれた制限部位内への挿入のために、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ制限部位をそれぞれＰＣＲ産物の５’末端および３’末端に導入するプライマーを用い、全長ＮＤＶゲノムをコードするプラスミドからＰＣＲによりＨＮ遺伝子を増幅した。結果として得られたプラスミドを配列分析に供して、ＰＣＲ挿入物の忠実度のほか、遺伝子間の転写開始配列および転写終止配列ならびに遺伝子順序を確認した。最後に、マイナス鎖ＲＮＡウイルスをレスキューするための確立された逆遺伝学系（Ｌａｗｓｏｎら、１９９５年）を使用し、ここでは「ｒＶＳＶ−ＮＤＶ」と称される感染性ウイルスをレスキューした。
図１も参照されたい。
【００９５】
１．２  細胞株
２つのヒトＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ−７）をＤｒ．Ｕｌｒｉｃｈ  Ｌａｕｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のＬ−グルタミン（２００ｍＭ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸、および１％のピルビン酸ナトリウムを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。Ａ５４９細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得し、ＨＣＣ細胞株と同じ培地中で培養した。公益国営財団Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＨＴＣＲ）ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の指針に従い、肝臓腫瘍の外科的切除を受けた患者（Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスならびにヒト免疫不全ウイルスに対して陰性）から初代ヒト肝細胞を得た。肝細胞はＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で維持した。初代胎児性一次皮質ニューロンがＥ１６．５マウスの皮質から切り離され、Ｓｔｅｆａｎ  Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒの研究室（ＤＺＮＥ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された。Ｂ２７（２％）、０．５ｍＭのグルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、ニューロン培養物を維持した。細胞株および初代細胞はすべて、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベータ内で維持した。
【００９６】
１．３  顕微鏡による分析
ヒトＨＣＣ細胞株であるＨｕｈ７およびＨｅｐＧ２をおよそ９０％の培養密度で６ウェル皿に蒔き、０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶのいずれかに感染させたか、または偽感染させた。感染の１６時間後、２４時間後、および４８時間後に、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０ＣＦＬ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）において２００倍の拡大率で細胞を可視化し、顕微鏡に取り付けられたＣａｎｏｎ  Ｐｏｗｅｒｓｈｏｔ  Ａ６２０カメラを用いて代表的な画像をキャプチャした。
【００９７】
１．４  ＩＦＮ用量応答アッセイ
インターフェロン感受性Ａ５４９細胞をウェル当たり１０５細胞の密度で２４ウェル皿に蒔き、一晩培養した。翌日の夕方、培養培地に直接添加した異なる濃度（０、１００、５００、および１０００ＩＵ／ｍｌ）のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎで細胞を前処理した。一晩のインキュベーション後、細胞を０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶのいずれかに感染させた。感染の４８時間後、細胞を１００μｌのＰＢＳ中に収集し、３回の冷凍−解凍サイクルにより溶解させた。細胞溶解物のＴＣＩＤ５０分析によって腫瘍内ウイルス力価を決定した。
【００９８】
１．５  成長曲線（ＴＣＩＤ５０アッセイ）
ＨＣＣ細胞株（Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２）、ならびに初代ヒト肝細胞および初代マウスニューロンにおいて、ウイルス成長曲線を完成した。
【００９９】
ＨＣＣ細胞株をウェル当たり３．５×１０５細胞の密度で６ウェル皿に蒔き、一方でＰＨＨおよびニューロンは、ウェル当たり１０５細胞の密度でコラーゲン被覆２４ウェル皿に播種した。各細胞株を０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、およびｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させた。感染は、３７℃で１時間にわたり、１ｍｌのＰＢＳ（６ウェル皿）または２５０μｌのＰＢＳ（２４ウェル皿）において行った。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地を添加した。細胞内ウイルス力価のＴＣＩＤ５０分析のために、感染の０、１６、２４、４８、および７２時間後に細胞溶解物を収集した。
【０１００】
１．６  細胞傷害性アッセイ（ＬＤＨまたはＭＴＳアッセイ）
感染したＨＣＣ細胞株（Ｈｕｈ７およびＨｅｐＧ２）および初代ヒト肝細胞の細胞生存率を、細胞培養物上清から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｒｏｇｅｎａｓｅ）（ＬＤＨ）を測定することによって分析した。成長曲線実験において行ったように細胞を蒔き、感染させ、洗浄した。感染の２４、４８、および７２時間後に、上清のアリコートを収集し、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＬＤＨ放出を定量した。各時点において、ウイルス感染後のＬＤＨ放出を、最大ＬＤＨ放出対照に対する百分率として計算した。偽処理した細胞の上清中で検出されたベースラインＬＤＨレベルを、実験のウェルから取得した値から減算した。
【０１０１】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用したＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイにより、ニューロンの細胞生存率を分析した。ニューロンを５×１０４細胞／ウェルの密度でコラーゲン被覆９６ウェル皿に播種し、偽処理したか、または０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、もしくはｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させた。感染の２４、４８、および７２時間後に、製造元のプロトコールに従って細胞生存率を測定した。感染していない対照と比較した実験試料の細胞生存率の差として細胞傷害性を計算した。
【０１０２】
１．７  ウェスタンブロット
Ｈｕｈ７細胞をおよそ９０％の培養密度で６ウェルプレートに蒔き、４８時間にわたり０．０１のＭＯＩでｒＶＳＶ、ｒＮＤＶ、またはｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させたか、または偽感染させた。馴化培地を収集し、１０ｋＤのカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して約２００μｌまで濃縮した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してタンパク質濃度を定量し、１０μｇの各試料を７．５％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、続いてニトロセルロース膜上に移した。ＨＭＧＢ１およびＨｓｐ９０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）ならびにＨｓｐ７０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）に対する特異的抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした適切な二次抗体とを使用して、タンパク質バンドを検出した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅウェスタンブロット検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用し、バンドを可視化した。
【０１０３】
２．  結果
組換えＶＳＶ−ＮＤＶベクター（図１）を、複製および細胞傷害性について、腫瘍細胞において、また健康な肝細胞およびニューロンにおいても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴付けた。本発明者らは、２つのヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株を代表的な腫瘍細胞として使用し、ｒＶＳＶ−ＮＤＶを、複製し細胞を殺滅するその相対的な能力に関して、ｒＶＳＶおよびｒＮＤＶと比較した。ｒＶＳＶ−ＮＤＶの複製は、野生型ベクターと比較すると少し遅延したが、感染の約７２時間後に同様の力価に達することができ、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで完全な細胞殺滅をもたらした（図２）。
【０１０４】
ウイルス誘導性シンシチウム形成を観察するため、顕微鏡撮影のために、さらなる細胞を、ｒＶＳＶ−ＮＤＶならびに親ｒＶＳＶおよびｒＮＤＶに感染させた。腫瘍細胞の顕微鏡による分析により、ｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染させたウェル内では、シンシチウムの複数のフォーカスが感染後１６時間までに明らかになったが、一方、これは、ｒＮＤＶに感染させたものにおいては有意に遅延していた。予想通り、ｒＶＳＶで処理した細胞はシンシチウムを形成しなかったが、これらは、ＶＳＶ感染に典型的な細胞変性効果（ＣＰＥ）に対する感受性が高く、感染の１６時間後よりも早期に生じた（図３）。
【０１０５】
糖タンパク質交換がＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の抗ウイルス作用に対するベクターの感受性を偶発的に損失させたことを排除するために、ＩＦＮ用量応答を行った。健康な細胞はＩＦＮ応答遺伝子によってウイルスを効率的に除去することができるが、腫瘍細胞はそのＩＦＮシグナル伝達経路に欠陥があることが多いため、Ｉ型ＩＦＮに対するＶＳＶの優れた感受性は、腫瘍特異性の鍵となる機構である。このアッセイは、Ｉ型ＩＦＮに対するｒＮＤＶの相対的な非感受性を明らかにしたが、ｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターはＩＦＮの添加によって急速に減弱し、ｒＶＳＶで観察されたものと同様のレベルまで低減した（図４）。
【０１０６】
本発明者らは次に、ｒＶＳＶ−ＮＤＶの安全性を評価するために、正常な初代ヒト肝細胞およびマウスニューロンにおいて成長曲線を完成させかつ細胞傷害性アッセイを行った。シュードタイプ化されたベクターの複製は経時的に極めてわずかしか観察することができず、力価は初代肝細胞において感染の４８時間後に対照ＶＳＶベクターよりもおよそ５ログ（５  ｌｏｇｓ）低く、同じ時点でｒＮＤＶよりも３ログ低かった（図５）。ほぼすべての肝細胞がｒＶＳＶへの感染の７２時間後までに死滅したが、ｒＶＳＶ−ＮＤＶに感染した細胞におけるＬＤＨアッセイにより細胞傷害性を観察することができなかった（図５）。同様に、ｒＶＳＶ−ＮＤＶの力価は、調査したすべての時点で初代マウスニューロンにおいて対照ＶＳＶベクターよりも有意に低く、これは、ＰＢＳ処理ニューロンにおいて観察されたものと同様のレベルの細胞生存率に対応した（図６）。まとめると、ｒＶＳＶ−ＮＤＶは、健康な初代細胞における複製のエビデンスをほとんど示さず、皆無かそれに近いｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性をもたらし、ｒＶＳＶおよびｒＮＤＶの両方より実質的に安全なウイルスであることを示した。
【０１０７】
ｒＮＤＶについてシンシチウム形成を介して示されるように、シュードタイプ化されたｒＶＳＶベクターが免疫原性細胞死を誘導するかどうかを決定するため、本発明者らは、感染したＨｕｈ７細胞からの高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）ならびに熱ショックタンパク質７０および９０の放出を調査した。４８時間の感染後、本発明者らは、ｒＶＳＶ感染細胞の上清中に放出された比較的低いレベルのＨＭＧＢ１、Ｈｓｐ７０、およびＨｓｐ９０を観察した。しかしながら、ｒＮＤＶおよびｒＶＳＶ−ＮＤＶの両方による感染は、分泌された３つすべての免疫原性細胞死に関するマーカーの高いレベルをもたらした（図７）。これらの結果は、シュードタイプ化されたｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターへの感染により引き起こされた強力な直接的な細胞傷害性に加えて、このウイルスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ処置が、腫瘍に対して向けられる実質的な免疫応答をもたらしうることを示す。
【０１０８】
シュードタイプ化されたｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性を評価するため、およそ８週齢の免疫不全雄ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、マウス当たり１０６  ＴＣＩＤ５０の用量のｒＶＳＶ−ＮＤＶまたは対照ｒＶＳＶ−ＧＦＰウイルスのいずれかの尾静脈注射（Ｎ＝６）により処置した。マウスの体重および全体的な身体的外見を毎日モニタリングし、人道的なエンドポイントにおいてマウスを安楽死させた。１日目、３日目、７日目、１４日目、および安楽死のときに、血清化学および循環ウイルス力価の分析のために血液をサンプリングした。ｒＶＳＶ−ＧＦＰを与えた２匹のマウスは、処置後の最初の週の間に体重が急速に減少し始め、６匹すべてが、処置後１１日から１７日の間に急性的に死亡したか、または、極度の体重減少、脱水、苦痛の徴候（姿勢の変化、運動障害、孤立など）、および／もしくは神経毒性の徴候（四肢の麻痺および回転行動）を理由として安楽死させられた（図８）。さらに、処置後１日目および７日目に血液から感染性ウイルス力価を回収することができた（図８、中央）。対照的に、ｒＶＳＶ−ＮＤＶを与えたマウスは、無視できる量の体重が減少しただけで健康に見え、研究全体を通して正常な挙動を呈した。これらのマウスのうち３匹は、主要臓器の組織学的分析のため処置後２１日に安楽死させ、一方残りの動物は処置後６０日間にわたりモニタリングし、６０日の時点で病理学的分析のために安楽死させた。分析したいずれの時点でも、ｒＶＳＶ−ＮＤＶで処置したマウスの血液中で感染性ウイルス力価を検出することはできなかった。肝機能（ＧＰＴ）および腎機能（ＢＵＮおよびクレアチニン）の血漿測定値は、いずれの処置群についても異常な値を示さなかった（データは示さない）。
【０１０９】
組織切片は、検体の処置群に対して盲検の病理学者により検査された。組織学的分析は、２１日目または６０日目のいずれかに安楽死させた、ｒＶＳＶ−ＮＤＶ処置マウスから切り取った組織において、主要な病理学的所見がないことを明らかにした。さらに、ｒＶＳＶ−ＮＤＶで処置したマウスでは、脳または肝臓の組織内で検出可能な力価を観察することはできなかった（データは示さない）。全く対照的に、同じ用量のｒＶＳＶ−ＧＦＰを与えたマウスは、重い類洞内の浮腫、単一細胞および小群の壊死を伴う中程度の急性肝炎、ならびに肝組織のアポトーシスを呈した（図９）。さらに、核濃縮および核崩壊（ｋａｒｙｏｒｈｅｘｉｓ）を呈する、変性しているグリア細胞と共に、脳幹における急性壊死を観察することができた。グリア細胞の変性は、カスパーゼ３の免疫組織化学染色によってさらに確認された。組織溶解物のＴＣＩＤ５０分析は、剖検時に肝臓および脳における感染性ＶＳＶの定量可能なレベルを明らかにした。
【０１１０】
前出の記述、特許請求の範囲、および／または添付の図面において開示される特色は、別々でも、またそれらの組合せにおいても、本発明をその多様な形態で実現するための材料となりうる。
【０１１１】
参考文献
【表１−１】
2019516374.tif 000007
【表１−２】
2019516374.tif 000008
【図１】
2019516374.tif 000009
【図２】
2019516374.tif 000010
【図３】
2019516374.tif 000011
【図４】
2019516374.tif 000012
【図５】
2019516374.tif 000013
【図６】
2019516374.tif 000014
【図７】
2019516374.tif 000015
【図８】
2019516374.tif 000016
【図９】
2019516374.tif 000017
【配列表】
2019516374000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月20日(2018.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含み、
ＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しており、かつ、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質
を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルス。
【請求項２】
ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、Ｆ３ａａ改変Ｆタンパク質であり、
かつ／または、プロテアーゼ切断部位における、好ましくはＬ２８９位における、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばＬ２８９Ａを含み、
かつ／または、ＶＳＶの前記Ｇタンパク質が、前記改変融合タンパク質およびＮＤＶのＨＮタンパク質で置き換えられている、
請求項１に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス。
【請求項３】
ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、配列番号１０もしくは配列番号１２のアミノ酸配列、
または、配列番号１０もしくは１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、配列番号９もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列、
または、配列番号９もしくは１１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、
かつ／あるいは、ＮＤＶの該ＨＮタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列、
または、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの該ＨＮタンパク質が、配列番号５のヌクレオチド配列、
または、配列番号５のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、
請求項１または２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸を含むベクターであって、
任意選択で、
−  レポーター遺伝子（複数可）、
例えば、ＨＳＶ１−ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、チロシナーゼ、
−  標的細胞（複数可）または組織に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、腫瘍細胞（複数可）または腫瘍（複数可）に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの免疫刺激性遺伝子、
ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、もしくはＢ７−Ｈ３などの免疫チェックポイント阻害性抗体、および／または
ワクチン接種のための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（標的とされる該腫瘍に対して特異的）、
−  あるいはそれらの組合せ
をさらに含む、ベクター。
【請求項６】
配列番号１３のヌクレオチド配列、
または、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
または、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、
請求項４に記載の核酸または請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
（ｉ）請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターと、
（ｉｉ）任意選択で、薬学的に許容されるキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）と
を含む医薬組成物。
【請求項８】
薬物（複数可）、
例えば、
化学療法剤（複数可）、
放射線療法剤（複数可）、
腫瘍ワクチン（複数可）、
免疫チェックポイント阻害薬（複数可）、
細胞搬送系（複数可）、
小分子阻害薬（複数可）、
塞栓剤（複数可）、
遮蔽ポリマー（複数可）
をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、動脈内投与のために、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射のために製剤化される、
請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを含む組成物、あるいは請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、遺伝子送達ツールとしての、ウイルスの生体内分布の（非侵襲的）画像化における、および／または腫瘍検出における使用のための、組成物または医薬組成物。
【請求項１１】
医療において使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを含む組成物、あるいは請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
がんの診断、予防、および／または処置において使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを含む組成物、あるいは請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍崩壊療法において使用するための、請求項１２に記載の組成物または医薬組成物。
【請求項１４】
他の療法、例えば、
細胞搬送系、
例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、
例えば、腫瘍ワクチン、もしくは免疫チェックポイント阻害薬、
および／または
標準的な腫瘍療法、
例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓術、小分子阻害薬
との組合せで使用するためのものであり、
かつ／あるいは、投与が、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である、
請求項１２に記載の組成物または医薬組成物。
【請求項１５】
がんの診断、予防、および／または処置のための、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または請求項４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターを含む組成物、あるいは請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、該組成物または該医薬組成物は被験体に投与されることを特徴とし、
好ましくは、該投与が、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である、
組成物または医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
したがって、本発明者らのｒＶＳＶ−ＮＤＶベクターは、その超融合性の特色、一般人口における既存の免疫の欠如、およびＶＳＶまたはＮＤＶと比較して減弱が予想されないことを理由として、これまでに報告されているシュードタイプ化されたベクターよりも優れている。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換え腫瘍崩壊ウイルスであって、
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含み、
ＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）が欠失しており、かつ、
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）、および
ＮＤＶの血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質
を含む、組換え腫瘍崩壊ウイルス。
（項目２）
ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、Ｆ３ａａ改変Ｆタンパク質であり、
かつ／または、プロテアーゼ切断部位における、好ましくはＬ２８９位における、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えばＬ２８９Ａを含み、
かつ／または、ＶＳＶの前記Ｇタンパク質が、前記改変融合タンパク質およびＮＤＶのＨＮタンパク質で置き換えられている、
項目１に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス。
（項目３）
ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、配列番号１０もしくは配列番号１２のアミノ酸配列、
または、配列番号１０もしくは１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの前記改変融合タンパク質（Ｆタンパク質）が、配列番号９もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列、
または、配列番号９もしくは１１のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ、
かつ／あるいは、ＮＤＶの該ＨＮタンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列、
または、配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、ＮＤＶの該ＨＮタンパク質が、配列番号５のヌクレオチド配列、
または、配列番号５のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、
項目１または２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス。
（項目４）
項目１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルスをコードする核酸。
（項目５）
項目４に記載の核酸を含むベクターであって、
任意選択で、
−  レポーター遺伝子（複数可）、
例えば、ＨＳＶ１−ｓｒ３９ＴＫ、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｌａｃＺ、チロシナーゼ、
−  標的細胞（複数可）または組織に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、腫瘍細胞（複数可）または腫瘍（複数可）に送達される遺伝子（複数可）、
例えば、
ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの免疫刺激性遺伝子、
ＰＤ−１、ＰＤ１−Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、もしくはＢ７−Ｈ３などの免疫チェックポイント阻害性抗体、および／または
ワクチン接種のための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（標的とされる該腫瘍に対して特異的）、
−  あるいはそれらの組合せ
をさらに含む、ベクター。
（項目６）
配列番号１３のヌクレオチド配列、
または、配列番号１３のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、
かつ／あるいは、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
または、配列番号６、１２、１４〜１７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、もしくは好ましくは少なくとも７０％もしくは８０％もしくは９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、
項目４に記載の核酸または項目５に記載のベクター。
（項目７）
（ｉ）項目１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または項目４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクターと、
（ｉｉ）任意選択で、薬学的に許容されるキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）と
を含む医薬組成物。
（項目８）
薬物（複数可）、
例えば、
化学療法剤（複数可）、
放射線療法剤（複数可）、
腫瘍ワクチン（複数可）、
免疫チェックポイント阻害薬（複数可）、
細胞搬送系（複数可）、
小分子阻害薬（複数可）、
塞栓剤（複数可）、
遮蔽ポリマー（複数可）
をさらに含む、項目７に記載の医薬組成物。
（項目９）
全身送達、腫瘍注射、静脈内投与、動脈内投与のために、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射のために製剤化される、
項目７または８に記載の医薬組成物。
（項目１０）
項目１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または項目４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または項目７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物の、遺伝子送達ツール、ウイルスの生体内分布の（非侵襲的）画像化としての、および／または腫瘍検出のための使用。
（項目１１）
医療において使用するための、項目１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または項目４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または項目７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１２）
がんの診断、予防、および／または処置において使用するための、項目１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または項目４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または項目７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１３）
腫瘍崩壊療法において使用するための、項目１２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、ベクター、または医薬組成物。
（項目１４）
他の療法、例えば、
細胞搬送系、
例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、間葉系幹細胞、
免疫療法、
例えば、腫瘍ワクチン、もしくは免疫チェックポイント阻害薬、
および／または
標準的な腫瘍療法、
例えば、ラジオ波焼灼療法、化学療法、塞栓術、小分子阻害薬
との組合せで使用するためのものであり、
かつ／あるいは、投与が、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である、
項目１２に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、核酸、ベクター、または医薬組成物。
（項目１５）
がんの診断、予防、および／または処置の方法であって、
それを必要とする被験体に、治療量の、項目１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍崩壊ウイルス、または項目４から６のいずれか一項に記載の核酸もしくはベクター、または項目７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、
好ましくは、該投与が、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、腫瘍への注射による投与、
ならびに／または、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿内、脳内、脳室内、および硝子体内の注射による投与である、
方法。
【国際調査報告】
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