(57)【要約】  本発明は、例えば、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体の使用を通じて治療活動のために免疫応答を刺激する、免疫応答を阻害する、組織再生を指示する又は組織損傷を予防するために細胞を制御し方向付ける方法を対象とする。成分Ａは細胞の表面にＸを提示することができ、エフェクター細胞の表面に発現されるタンパク質（マーカーを含む）に結合することができ、又はＡ−Ｘはエフェクター細胞の表面に発現され、Ｂは目的の標的細胞又は組織上のエピトープに対して特異的である。Ｘ：ＹはＸとＹの間の結合相互作用により形成されるヘテロ二量体繋であり、ＸとＹはＡ及びＢと一緒になって選択された細胞の制御及び方向付けを支援し達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体若しくはその結合断片、タンパク質リガンド、細胞表面タンパク質の１つ若しくは複数の成分又はその複合体又はそれらの組合せから選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは細胞の表面にＸを提示し；
Ｂは目的の標的細胞又は組織上のエピトープに対して特異的であり；
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを
細胞の集団に導入するステップを含む、上記方法。
【請求項２】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、好ましくは、細胞内シグナル伝達領域Ｎ末端及び／又はＣ末端に、膜貫通ドメインを含み、任意選択でスペーサー領域をさらに含む二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａ−Ｘはエフェクター細胞の表面に発現され；
Ｂは標的細胞に特異的に結合し、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを、又は
ｉｉｉ．融合タンパク質Ａ−Ｘをコードする核酸及び任意選択で融合タンパク質Ｂ−Ｙをコードする核酸を、又は
ｉｖ．融合タンパク質Ｂ−Ｙ及び融合タンパク質Ａ−Ｘをコードする核酸を、又は
ｖ．Ｘが細胞の表面に提示される、Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞、及び融合タンパク質Ｂ−Ｙを
細胞の集団に導入するステップを含む上記方法。
【請求項３】
Ｘ又はＹのうちの１つが完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ又はｓｃＦｖであり、もう一方がペプチドなどの抗原である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｘ又はＹがペプチドＧＣＮ４又はその断片（配列番号１若しくは配列番号１のアミノ酸１〜３８、又は配列番号７６から９８に示される）に対して特異的である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｘ又はＹがｓｃＦｖ又はＶＨＨである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが５２ＳＲ４（配列番号３若しくは配列番号３のアミノ酸１〜２４３又は配列番号９９〜１００）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｘ及びＹで定義される抗原がペプチドである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｘ又はＹの抗原（及びペプチド）が非哺乳動物からである、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘ又はＹの抗原（及びペプチド）が低い免疫原性を有する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｘ又はＹがペプチドＧＣＮ４又はその断片（配列番号１若しくは配列番号１のアミノ酸１〜３８、又は配列番号７６から９８）である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＸとＹの間の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＸとＹの間の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
エフェクター細胞にＡ−ＸをトランスフェクトすることによりＡ−Ｘが発現されて、少なくともＸが細胞の表面で発現される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
膜貫通ドメインが、天然であり又は合成供給源由来であり、例えば天然供給源が膜結合タンパク質、膜貫通タンパク質又はその機能的断片である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ又はベータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ及びＣＤ１５４を含む群から選択されるタンパク質の膜貫通領域（単数又複数）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ａがスペーサードメインを含む（又はさらに含む）、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
スペーサードメインが細胞上で天然に発現されるタンパク質、例えば、表面発現免疫グロブリン由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
スペーサーが、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域、並びにヒトＣＤ２８の細胞外ドメインと組み合わされたヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を含む群から選択されるタンパク質のスペーサードメインを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ａが細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に接続されている、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
Ａが細胞内シグナル伝達ドメインに接続されていない、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
エフェクター細胞が、細胞応答、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン又はケモカインなどの可溶性分子の放出ができる細胞である、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞応答が、食作用、細胞傷害性並びに／或いは抗体及び／又はサイトカインの産生である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ａ−Ｘがその上で発現されるエフェクター細胞が、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好中球、好酸球又は好塩基球、好ましくは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞又はＴ細胞である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ａ−Ｘがその上で発現されるエフェクター細胞が血液脳関門を越え、Ｂが、アルファシヌクレイン、タウアイソフォーム、Ａベータアミロイド、ベータセクレターゼ、ガンマセクレターゼ、ＴＤＰ４３、スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ１、プリオンタンパク質又はハンチンチンタンパク質などの中枢神経系発現標的に結合する、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂが、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、又はｓｃＦｖである、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｂが、Ｆａｂ断片などのＦａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的細胞が、例えば疾患又は病態に関連している異常な機能を有する細胞である、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的細胞が、がん、自己免疫、感染、変性症、神経変性又は神経炎症などの疾患に関連している細胞である、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
Ｂが、安定的に発現される細胞系譜マーカー及び非系譜細胞上で安定的に発現されるマーカーから選択される標的細胞上の細胞表面マーカーに対して特異的である、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的細胞上の細胞表面マーカーが、例えば、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＮＣＡＭ、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＫＤＲ、Ｔａｇ−７２から選択される腫瘍抗原である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的細胞上の細胞表面マーカーが、ＨＥＲ受容体、例えば、ＨＥＲ１、２、３又は４である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的細胞がＴ細胞又はＢ細胞であり、前記細胞マーカーがＢ細胞マーカー又はＴ細胞マーカーである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｂ細胞マーカーが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５（すべての又は特定のアイソフォーム）、ＣＤ４３、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４、ＢＣＭＡ及びＩＬ−６Ｒを含む群から選択され、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０（ＣＤ３８又はＣＤ１３８など）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｂ細胞マーカーが、前記細胞の表面で免疫グロブリンの一部として発現される抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域にある、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記マーカーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びそれらの断片を含む群から選択される抗体アイソタイプに対して特異的である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記マーカーがＴ細胞マーカーであり、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５を含む群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
Ｘが、タンパク質成分ＡのＮ末端又はＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
Ｙが、タンパク質成分ＢのＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
Ｙが、抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞の養子細胞移入又は移植を含み、Ｘが前記細胞の表面に提示されている、請求項１から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ｉ．Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞が最初に投与される；又は
ｉｉ．融合タンパク質Ｂ−Ｙが最初に投与される、
請求項１から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ｉ．Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞が最初に投与され、その後に融合タンパク質Ｂ−Ｙが投与される；又は
ｉｉ．融合タンパク質Ｂ−Ｙが最初に投与され、その後にＡ−Ｘを発現しているエフェクター細胞が投与される、
請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
エフェクター細胞が融合タンパク質Ｂ−Ｙと同時に投与される、請求項１から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのさらなる代わりのＢ−Ｙが投与される、請求項１から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体又はその結合断片、及びタンパク質（例えば、タンパク質リガンドなどの抗原を含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、非哺乳動物抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、非哺乳動物抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質（マーカーを含む）に特異的に結合し；
Ｂは標的細胞に特異的に結合し、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを
細胞の集団に導入するステップを含む、上記方法。
【請求項４７】
Ｘ又はＹのうちの１つは完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ又はｓｃＦｖであり、もう一方はペプチドなどの抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
Ｘ又はＹが、ペプチドＧＣＮ４又はその断片（配列番号１若しくは配列番号１のアミノ酸１〜３８又は配列番号７６から９８に示される）に対して特異的である、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｘ又はＹが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項４６から４８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｓｃＦｖが５２ＳＲ４（配列番号３若しくは配列番号３のアミノ酸１〜２４３又は配列番号９９〜１００）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｘ及びＹで定義される抗原がペプチドである、請求項４６から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ペプチドが５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｘ又はＹの抗原（及びペプチド）が対応する哺乳動物配列を有さない、請求項４６から５２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
Ｘ又はＹの抗原（及びペプチド）が低い免疫原性を有する、請求項４６から５３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
Ｘ又はＹが、ペプチドＧＣＮ４又はその断片（配列番号１若しくは配列番号１のアミノ酸１〜３８又は配列番号７６から９８）である、請求項４６から５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ＸとＹの間の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、請求項４６から５５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ＸとＹの間の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば８００、７００、６００、５００、４００若しくは３００ｐＭなどである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記二重特異性タンパク質複合体が２つ以下のｓｃＦｖ及び／又は少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’断片を含む、請求項４６から５７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
Ａが、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する、請求項４６から５８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
Ａが、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、及び抗原、例えば、前記細胞の表面で発現される受容体に対するリガンドから独立して選択される、請求項４６から５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記エフェクター細胞が、細胞応答、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン又はケモカインなどの可溶性分子の放出ができる細胞である、請求項４６から６０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞応答が、食作用、細胞傷害性及び／又は抗体の産生及び／又はサイトカイン応答である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ａが結合しているエフェクター細胞上の細胞タンパク質／マーカーは、目的の細胞セット又はサブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１から−３から選択される、請求項４６から６２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記エフェクター細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好中球、好酸球又は好塩基球を含む群から選択される、請求項４６から６３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記エフェクター細胞がＢ細胞であり、Ｂ細胞マーカーがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５（すべての又は特定のアイソフォーム）、ＣＤ４３、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４、ＢＣＭＡ及びＩＬ−６Ｒを含む群から選択され、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０（ＣＤ３８又はＣＤ１３８など）である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｂ細胞マーカーが、前記細胞の表面で免疫グロブリンの一部として発現される抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域にある、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記マーカーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む群から選択される抗体アイソタイプに対して特異的である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記エフェクター細胞がＴ細胞であり、Ｔ細胞マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５を含む群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
Ｂが、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、又はｓｃＦｖである、請求項４６から６８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
Ｂが、Ｆａｂ断片などの、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記標的細胞が、例えば疾患又は病態に関連している異常な機能を有する細胞である、請求項４６から７０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記標的細胞が、がん、自己免疫、感染、変性症、神経変性又は神経炎症などの疾患に関連している、請求項４６から７１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
Ａ−Ｘがその上で発現されるエフェクター細胞が血液脳関門（ＢＢＢ）を越え、Ｂが、アルファシヌクレイン、タウアイソフォーム、Ａベータアミロイド、ベータセクレターゼ、ガンマセクレターゼ、ＴＤＰ４３、スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ１、プリオンタンパク質又はハンチンチンタンパク質などの中枢神経系発現標的に結合する、請求項４６から７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
Ｂが、安定的に発現される細胞系譜マーカー及び非系譜細胞上で安定的に発現されるマーカーから選択される標的細胞上の細胞表面マーカーに対して特異的である、請求項４６から７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的細胞上の細胞表面マーカーが、例えば、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＮＣＡＭ、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＫＤＲ、Ｔａｇ−７２から選択される腫瘍抗原である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的細胞上の細胞表面マーカーが、ＨＥＲ受容体、例えば、ＨＥＲ１、２、３又は４である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的細胞上の細胞マーカーが、Ｂ細胞マーカー又はＴ細胞マーカーである、請求項４６から７２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｂ細胞マーカーが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、Ｂ２２０（ＣＤ４５としても知られる）、ＣＤ４３、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４、ＢＣＭＡ及びＩＬ−６Ｒを含む群から選択され、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０（ＣＤ３８又はＣＤ１３８など）である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｂ細胞マーカーが、前記細胞の表面で免疫グロブリンの一部として発現される抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域にある、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記マーカーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む群から選択される抗体アイソタイプに対して特異的である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５を含む群から選択されるＴ細胞マーカーである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
Ｘが、タンパク質成分ＡのＮ末端又はＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項４６から８１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
Ｘが、抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
Ｙが、タンパク質成分ＢのＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項４６から８３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
Ｙが、抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ｉ．Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞が最初に投与される；又は
ｉｉ．融合タンパク質Ｂ−Ｙが最初に投与される、
請求項４６から８５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
ｉ．Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞が最初に投与され、その後に融合タンパク質Ｂ−Ｙが投与される；又は
ｉｉ．融合タンパク質Ｂ−Ｙが最初に投与され、その後にＡ−Ｘを発現しているエフェクター細胞が投与される、
請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記エフェクター細胞が融合タンパク質Ｂ−Ｙと同時に投与される、請求項４６から８５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
細胞を輸送する（例えば、細胞の標的を変更する又は養子細胞を方向付ける）ため及び／又は抗体若しくはその断片を送達するための細胞輸送の使用のための、請求項１から８８までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、治療活動のために免疫応答を刺激する、免疫応答を阻害する、又は組織再生を指示するように細胞を制御し方向付ける方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体は患者の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで方向付けを変えるのに使用することが可能であり、これはがんにおいてＴ細胞を標的に向けるのにもっとも広く使用されてきた（Muller et al BioDrugs (2010) : 24, 89-98）。これらの分子を作製するのは複雑なことから、これは主に少数の組合せに限定されてきた。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を方向変更させるのに使用されている別の方法は、Ｔ細胞にキメラ抗原受容体を形質導入し（ＣＡＲ−Ｔ細胞）、次にこれらの細胞を患者に移入することである（Nat. Revs. Drug Disc. 2015. 14. 499-509）。最適な構築物を作製するのは複雑であり重篤な副作用の余地もあるために、その適用はがんなどの重病に限定されている。
【０００４】
１）標的化及びシグナル伝達分子を、ＣＡＲ−Ｔアプローチなどの養子的に移入された細胞に形質導入する；
２）標的化分子のみを養子的に移入された細胞に形質導入する；及び
３）二重特異性抗体アプローチのように細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで標的化する、
などの複数の機構により細胞を方向変更させるための多くの異なる分子及び選択肢をモジュラー様式で柔軟に作製することができる必要性が存在する。
【０００５】
Ｔ細胞上のＣＤ３に対して特異的な１つの結合ドメイン及びペプチドＥ５Ｂ９に対して特異的なもう１つの結合ドメインを有するモジュラー二重特異性抗体アプローチ（２つの一本鎖Ｆｖを含む）も用いられた。Ｅ５Ｂ９に対して特異的なｓｃＦｖはＴ細胞を腫瘍細胞に向けるのに使用される。ＣＤ３３及びペプチドＥ５Ｂ９に対して特異的なｓｃＦｖを含む融合タンパク質は腫瘍細胞の表面でＣＤ３３に結合する。次に、ペプチドＥ５Ｂ９はＴ細胞上の二重特異性体のｓｃＦｖに結合するのに利用可能であり、その結果同じＴ細胞を腫瘍細胞へと標的変更することになる（Arndt et al in Leukemia (2014) 28, 59-69）。
【０００６】
ペプチドＥ５Ｂ９はＬａ／ＳＳ抗原に由来する。抗Ｌａ／ＳＳ−Ｂ自己抗体は最初、シェーグレン症候群患者の血清中の自己抗体を沈殿させると記述され、ＳｊＴと呼ばれた。Ｌａ／ＳＳ−Ｂに対する自己抗体は全身性エリテマトーデス及び亜急性皮膚ループスでも一般に見出される。
【０００７】
したがって、Ｅ５Ｂ９ペプチド／標的化分子の使用は既存の自己抗体により制限され得るリスクがあり得る。
【０００８】
ＩｇＧ標的化特性を獲得するためにＣＤ１６を利用して移植細胞特性を送達するモジュラー法が報告されている（Cancer Res 2013 74 (1) 93-103）。しかし、エフェクター細胞のＣＤ１６特性はいかなるヒトＩｇＧにも結合でき、自己抗体にｉｎ  ｖｉｖｏで結合できると考えられるため、移植Ｔ細胞は、急性自己免疫を生み出す自己抗原及び自己組織に向けられる。
【０００９】
標的変更をするために当技術分野で開発中の他のアプローチも潜在的な有害作用、例えば、自己抗体の生成又はサイトカインストームの刺激を有する。したがって、標的変更という考え方は有用であるが、現在のアプローチはすべて深刻なオフターゲット効果を刺激する潜在性がある。
【００１０】
本方法はこれらの問題に１つ又はそれよりも多い方法で取り組もうとするものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標的変更が起こることが可能であるように、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を細胞に導入する方法を提供することにより上記問題に取り組む。この方法は、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで方向付けるように患者に直接適用することが可能であり、又は細胞の患者への養子移入において利用することが可能であり、がんを含むがこれに限定されない多くの疾患徴候に潜在的に適用可能である。
【００１２】
本発明は、細胞標的変更、及び抗体積荷を送達するための細胞輸送の機能又は利用のための、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体の多数の異なる組合せの作製、最適な組合せのスクリーニング及び同定をさらに促進する。
【００１３】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体若しくはその結合断片、タンパク質リガンド、細胞表面タンパク質の１つ若しくは複数の成分又はその複合体又はその組合せから選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは細胞の表面にＸを提示し；
Ｂは目的の標的細胞又は組織上のエピトープに対して特異的であり；
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを
細胞の集団に導入するステップを含む、上記方法が提供される。
【００１４】
本開示内では、融合タンパク質の用語「Ａ−Ｘ」及び「Ｙ−Ｂ」は「Ｘ−Ａ」又は「Ｂ−Ｙ」として相似的に示される場合がある。同じことがヘテロ二量体繋を表す用語「Ｘ：Ｙ」にも当てはまり、これは本明細書では「Ｙ：Ｘ」としても示すことが可能である。
【００１５】
一例では、本発明は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、好ましくは、細胞内シグナル伝達領域Ｎ末端及び／又はＣ末端に、膜貫通ドメインを含み、任意選択でスペーサー領域をさらに含む二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａ−Ｘはエフェクター細胞の表面で発現され；
Ｂは標的細胞に特異的に結合し、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを、又は
ｉｉｉ．融合タンパク質Ａ−Ｘをコードする核酸及び任意選択で融合タンパク質Ｂ−Ｙをコードする核酸を、又は
ｉｖ．融合タンパク質Ｂ−Ｙ及び融合タンパク質Ａ−Ｘをコードする核酸を、又は
ｖ．Ｘが細胞の表面に提示される、Ａ−Ｘを発現しているエフェクター細胞及び融合タンパク質Ｂ−Ｙを
細胞の集団に導入するステップを含む、上記方法を提供する。
【００１６】
一例では、本発明は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体又はその結合断片、及びタンパク質（例えば、タンパク質リガンドなどの抗原を含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、非哺乳動物抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、非哺乳動物抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質（マーカーを含む）に特異的に結合し；
Ｂは標的細胞に特異的に結合し、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを
細胞の集団に導入するステップを含む、上記方法を提供する。
【００１７】
一例では、本発明は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体又はその結合断片、及びタンパク質（例えば、タンパク質リガンドなどの抗原を含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくは結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質（マーカーを含む）に特異的に結合し；
Ｂは標的細胞に特異的に結合し、
ただし、二重特異性複合体には２つ以下のｓｃＦｖが存在し、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂを
細胞の集団に導入するステップを含む、上記方法を提供する。
【００１８】
方法は、血液試料若しくは組織試料若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された細胞などの患者から得られた試料でｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏで、又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。
【００１９】
したがって、本開示は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体若しくはその結合断片、タンパク質リガンド；細胞表面タンパク質の１つ若しくは複数の成分又はその複合体又はその組合せから選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくはその結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原、非哺乳動物抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原、非哺乳動物抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは細胞の表面にＸを提示し；
Ｂは目的の標的細胞又は組織上のエピトープに対して特異的であり、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ．複合体形態ではない融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せ、又は
ｉｉ．ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態のＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ
の治療有効量をそれを必要とする患者（すなわち、細胞の集団はｉｎ  ｖｉｖｏである）に投与するステップを含む、上記方法を提供する。
【００２０】
特に、本発明に従った方法は、細胞を輸送する（例えば、細胞の標的変更をする又は養子細胞を方向付ける）ため及び／又は抗体若しくはその断片を送達するための細胞輸送の使用のためのものである。
【００２１】
したがって、一例では、処置又は予防において使用するためのＡ−Ｘ、Ｂ−Ｙ、Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せ及びＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂの複合体の使用が提供される。
【００２２】
したがって、一例では、特に、本明細書で開示される疾患又は状態のための医薬の製造において使用するためのＡ−Ｘ、Ｂ−Ｙ、Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せ及びＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂの複合体の使用が提供される。
【００２３】
したがって、一例では、処置又は予防において使用するためのその表面でＡ−Ｘを発現するエフェクター細胞の使用が提供される。
【００２４】
したがって、一例では、特に、本明細書で開示される疾患又は状態のための医薬の製造において使用するためのその表面でＡ−Ｘを発現するエフェクター細胞の使用が提供される。
【００２５】
したがって、一例では、処置又は予防において使用するためのＢ−Ｙと組み合わせたその表面でＡ−Ｘを発現するエフェクター細胞の使用が提供される。
【００２６】
したがって、一例では、特に、本明細書で開示される疾患又は状態のための医薬の製造において使用するためのＢ−Ｙと組み合わせたその表面でＡ−Ｘを発現するエフェクター細胞の使用が提供される。
【００２７】
一例では、本発明はその表面でＸ又はＡ−Ｘを発現するエフェクター細胞を提供する。
【００２８】
一実施形態では、Ｘ又はＹは、表１の配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１〜３８に示されるペプチドＧＣＮ４又はその断片に対して特異的であり、太字のアミノ酸は任意選択であり、イタリック体のアミノ酸はリンカー配列である。配列番号１に従ったＧＣＮ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号２に示されている。
【表１】
2019500032.tif 000002
【００２９】
一実施形態では、Ｘ又はＹのうちの１つは完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ＶＨＨ又はｓｃＦｖであり、もう一方はペプチド、例えば、ｓｃＦｖ  ５２ＳＲ４（表１に示される配列番号３、９９若しくは１００又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）などのｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００３０】
したがって、一実施形態では、Ｘ又はＹのうちの１つは、例えば、５から２５アミノ酸長の範囲のペプチドであり、例えば、ペプチドは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５アミノ酸長である。
【００３１】
Ｘ及びＹのうちの少なくとも１つが抗原／ペプチドである一実施形態では、Ｘ及びＹのうちの少なくとも１つは、類似する又は同一の配列を有する対応する哺乳動物抗原又はペプチドがない、特に対応するヒト配列がない非哺乳動物抗原／ペプチドである。
【００３２】
一実施形態では、Ｘ又はＹで用いられる抗原（ペプチドを含む）は低い免疫原性を有する（すなわち、投与された場合強い抗体応答を刺激しない（ｉｎ  ｖｉｖｏで））。
【００３３】
一実施形態では、Ｘ又はＹのうちの１つはペプチドＧＣＮ４又はその断片（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１〜３８）である。ＧＣＮ４ペプチドの他の変種は表２に示されており、太字のアミノ酸は任意選択であり、イタリック体のアミノ酸はリンカー配列を形成する。
【００３４】
有利なことに、このペプチドは酵母由来であり、哺乳動物（特にヒト）タンパク質又はペプチドに対応物がない。さらに、このペプチドは５２ＳＲ４などのｓｃＦｖに高親和性で結合することが可能である。さらに、このペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏでは高い免疫原性ではない。
【表２】
2019500032.tif 000003
【００３５】
Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ融合物は様々な配向で作製することができ、これはそのような融合物をコードするポリヌクレオチド構築物がＸ又はＡを両方の配向で発現するように設計できることを意味すると理解されるべきである。同じことがＹ−Ｂ融合物にも当てはまる。言い換えると、それぞれＸ及びＹのＣ末端に融合されているＡ及びＢが発現されてもよいし、又はそれぞれＡ及びＢのＣ末端に融合されているＸ及びＹが発現されてもよい。Ａ、Ｘ、Ｙ又はＢが融合物のＮ末端にあるかどうかと無関係に、そのような融合物を生じるポリヌクレオチド配列は、融合物が細胞外放出へと向けられるのを支援し最終的に成熟融合物から切断されるシグナル配列をコードするように設計されているヌクレオチド配列を含むことになる。好ましいシグナル配列は表１に配列番号１０１から１０４で示されている。
【００３６】
一実施形態では、方法は、ヘテロ二量体繋Ｘ：Ｙを形成するＸとＹの間の相互作用を介して、Ａ−Ｘそれ自体又はＡの結合パートナーを発現しているエフェクター細胞をＢ−Ｙを有するＢの結合パートナーである標的抗原に向けるために融合タンパク質のＡ−ＸとＢ−Ｙの間に高親和性相互作用を提供する。
【００３７】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、ＸとＹの間の結合親和性は９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば８００、７００、６００、５００、４００、若しくは３００ｐＭなどである。
【００３８】
一実施形態では、Ａは、少なくともＸが細胞の表面で発現されるように、例えば、細胞にＡ−Ｘをトランスフェクトすることによりエフェクター細胞上で発現される。この特定の実施形態では、シグナル配列はＸのＮ末端にあり、ＡはＸのＣ末端にある（シグナル配列−Ｘ−Ａ）ことになる。
【００３９】
一実施形態では、Ａは、エフェクター細胞の表面のタンパク質に対して特異的である。
【００４０】
これら両方の実施形態では、Ａは、Ｂに融合しているＹとヘテロ二量体繋を形成するＸの細胞表面提示を促進する。
【００４１】
ＡがＴ細胞などのエフェクター細胞の表面にＸを提示する場合、例えば、Ｔ細胞の集団が選択され、次に、以下のもの：
・融合タンパク質としてのＡ−Ｘ、又は
・ポリヌクレオチド配列、例えば、細胞の表面で少なくともＸを発現するのに適切なＡ−ＸをコードするＤＮＡ配列（ベクターなどの）のトランスフェクション、
がｅｘ  ｖｉｖｏで導入されてもよい。
【００４２】
代わりに、ＡがＴ細胞などのエフェクター細胞の表面にＸを提示する場合、例えば、Ｔ細胞の集団が選択され、次に、以下のもの：
・融合タンパク質としてのＡ−Ｘ、
・任意選択で適切な担体と組み合わせて、ポリヌクレオチド配列、例えば、細胞の表面で少なくともＸを発現するのに適切なＡ−ＸをコードするＤＮＡ配列（ベクターなどの）、
がｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで導入されてもよい。
【００４３】
本明細書で使用される「細胞の集団」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の集団でもよく、１つ又は複数の細胞型の混合物を含有していてもよい。
【００４４】
Ｘは、例えば、任意選択でスペーサー領域を通じて隣接して、膜貫通ドメインの配列をＡに組み込むことによりエフェクター細胞の表面に提示してもよい。
【００４５】
一実施形態では、膜貫通ドメインは天然であり又は合成供給源由来であり、例えば天然供給源が膜結合タンパク質、膜貫通タンパク質又はその機能的断片であり、例えば、膜貫通ドメイン(transmembrane domain)は、Ｔ細胞受容体のアルファ又はベータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ及びＣＤ１５４を含む群から選択されるタンパク質の膜貫通領域（単数又複数）(a transmembrane region or regions)を含む。
【００４６】
代わりに、膜貫通ドメインは合成でもよく、その場合、膜貫通ドメインは主としてロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含むことになり、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインのそれぞれの末端に見出されることになる。任意選択で、好ましくは２から１０アミノ酸長の短いオリゴ−又はポリペプチドリンカーは、キメラ受容体の膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間に連鎖を形成してもよい。グリシン−セリンダブレットは特に安定なリンカーを提供する。
【００４７】
Ａ成分は、標的細胞上のＹとの結合のために細胞表面でＡが生物学的に適切な配向でＸを提示することを可能にするスペーサー領域をさらに含んでいてもよい。
【００４８】
Ａがエフェクター細胞の表面で発現される場合、Ａはスペーサー領域、例えば、表面発現免疫グロブリン、特に、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域、並びにヒトＣＤ２８の細胞外ドメインと組み合わされたヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を含む群から選択されるタンパク質に由来するスペーサー領域などの細胞上で天然に発現されるタンパク質由来のスペーサードメインをさらに含んでいてもよい。
【００４９】
スペーサードメイン又は領域は、天然に存在する細胞表面発現タンパク質、又はその誘導体若しくは変異体中の膜貫通ドメインとリガンド結合ドメインの間のドメインでもよい。
【００５０】
ＮからＣ末端Ｘ−Ａの配向であるそのようなＸ−Ａ融合物の好ましい実施形態（リンカー−膜貫通領域）は表３（配列番号１０５〜１０８）に示されている。
【００５１】
Ａが一実施形態でエフェクター細胞の表面で発現される場合、Ａは細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に接続されている。
【００５２】
したがって、一実施形態では、エフェクター細胞はＡ−Ｘでのトランスフェクションにより追加の又は増強された細胞活性を与えられ、それによってＡは膜貫通領域及び１つ又は複数のシグナル伝達領域を含む。
【００５３】
そのようなＸ−Ａ融合物の好ましい実施形態（Ｘ−Ａ−リンカー−膜貫通領域−細胞内シグナル伝達配列）は表３（配列番号１０９〜１１６）に示されており、イタリック体のアミノ酸はスペーサーであり、下線が引かれたアミノ酸は膜貫通領域であり、太字のアミノ酸は細胞内シグナル伝達ペプチドである。さらに好ましくは、そのような融合物は、配列番号１０１から１０４に示されている配列などのしかしこれらに限定されないシグナルペプチド配列と一緒に発現される。
【表３−１】
2019500032.tif 000004
【表３−２】
2019500032.tif 000005
【表３−３】
2019500032.tif 000006
【表３−４】
2019500032.tif 000007
【００５４】
Ａが一実施形態でエフェクター細胞の表面で発現される場合、Ａは細胞内シグナル伝達ドメインに接続されていない。
【００５５】
本開示の態様では、Ａが、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質に結合するという事実のおかげでＸはエフェクター細胞の表面に提示され、例えば、Ａは完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ（ＶＨＨ、ＶＬ、ＶＨ）、ｓｃＦｖ、及び抗原、例えば、エフェクター細胞の表面で発現される受容体に対するリガンドから独立して選択される。
【００５６】
一実施形態では、Ａは、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質に結合する（に対して特異的である）。
【００５７】
一実施形態では、エフェクター細胞は細胞応答、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン又はケモカインなどの可溶性分子の放出が可能である細胞である。
【００５８】
エフェクター細胞の例は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性、グランザイム陽性、パーフォリン陽性又はグラニュライシン陽性細胞）、腸管上皮内リンパ球（又は他の類似する組織常在性リンパ球）、Ｂ細胞（例えば、グランザイム陽性Ｂ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞（又はＣＤ１ｄ陽性Ｔ細胞）、ガンマデルタＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好中球、好酸球、好塩基球及び血小板などの標的細胞を死滅させることができる細胞を含むことができる。これらのエフェクター細胞は、Ｆｃ受容体相互作用を介した抗体依存性細胞傷害、食作用若しくは細胞貪食、補体の動員又は細胞表面受容体をライゲートすることによるエフェクター細胞殺傷の直接的認識活性化などの複数の機構によりその効果を与えることができる。代わりに、細胞はプログラム細胞死を誘導する（例えば、Ｆａｓリガンド又は類似の死受容体の上方調節を介して）ことが可能であり又は細胞を死滅させることも可能であるサイトカインなどの細胞毒性可溶性メディエータを放出することが可能である。
【００５９】
一実施形態では、Ａは、エフェクター細胞の表面で発現されるタンパク質に直接結合する。
【００６０】
一実施形態では、エフェクター細胞の表面上の細胞タンパク質／マーカーは、目的の細胞セット又はサブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１から−３由来である。
【００６１】
一実施形態では、エフェクター細胞上のタンパク質／マーカーは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５（すべての又は特定の個々のアイソフォーム）、ＣＤ４３、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４、ＢＣＭＡ及びＩＬ−６Ｒを含む群から選択されるＢ細胞マーカーであり、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０（ＣＤ３８又はＣＤ１３８など）である。
【００６２】
一実施形態では、エフェクター細胞上のタンパク質／マーカーはＢ細胞マーカーであり、Ｂ細胞マーカーは細胞の表面上の免疫グロブリンの一部として発現される抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域にあり、例えば、マーカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む群から選択される抗体アイソタイプに対して特異的である。
【００６３】
一実施形態では、エフェクター細胞上のタンパク質／マーカーは、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５（すべての又は特定の個々のアイソフォーム）を含む群から選択されるＴ細胞マーカーである。
【００６４】
一実施形態では、Ａが結合可能である、又はその上でＡを発現することが可能な細胞を同定するのに使用可能であるエフェクター細胞及びエフェクター細胞上の抗原は以下を含む：
・Ｂ細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるＢ細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９等であるがこれらに限定されない、
・Ｔ細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるＴ細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０などであるがこれらに限定されない、
・正常ＮＫ細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるＮＫ細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ９６、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６２Ｒ、ＣＤ２２３、ＣＤ２４４等であるがこれらに限定されない、
・単球／骨髄細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される単球／骨髄細胞サブセット抗原、これは、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４等であるがこれらに限定されない、
・樹状細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される樹状細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ８５、ＣＤ２０５、ＣＤ２０９等であるがこれらに限定されない、
・好中球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好中球サブセット抗原、これは、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１７０等であるがこれらに限定されない、
・好塩基球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好塩基球サブセット抗原、これは、表面ＩｇＥ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０３ｅ、ＦｃｅＲ１ａ等であるがこれらに限定されない、
・好酸球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好酸球サブセット抗原、これは、シグレック−８、ＣＤ２９４等であるがこれらに限定されない、
・マスト細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるマストサブセット抗原、これは、表面ＩｇＥ、ＦｃｅＲ１ａ、ＣＤ１１７等であるがこれらに限定されない、
・血小板／巨核球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される血小板／巨核球サブセット抗原、これは、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ／ｂ／ｃ／ｄ、ＣＤ５１、ＣＤ１１０等であるがこれらに限定されない、
・造血前駆細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される造血前駆細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ９０、ＣＤ１００、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２４３、ＣＤ３３８、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−５、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９、ＴＲＡ−２−５４等であるがこれらに限定されない、
・血液脳関門（ＢＢＢ）を越える細胞。
【００６５】
本明細書で提供される方法では、Ｂは標的細胞に結合することができる。
【００６６】
一実施形態では、Ｂは安定的に発現される細胞系譜マーカー及び非系譜細胞上で安定的に発現されるマーカーから選択される標的細胞上の細胞表面マーカーに対して特異的である（例えば、ただし、Ａ及びＢは同じ細胞型を標的としている同じ細胞表面マーカーに対して特異的ではない）。
【００６７】
一実施形態では、標的細胞は、疾患関連である細胞又は組織であって、標的細胞上に帯びることになる細胞活性を運ぶことが可能なエフェクター細胞を向けるのが望ましい細胞又は組織を含む。
【００６８】
一実施形態では、標的細胞は、例えば疾患又は病態に関連している異常な機能を有する細胞である。標的細胞の例は、がん、自己免疫、感染又は変性症などの疾患に関連している細胞又は組織を含む。例は腫瘍細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞を含む。
【００６９】
一実施形態では、Ｂは、標的細胞が、例えば、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＮＣＡＭ、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＫＤＲ、Ｔａｇ−７２から選択される腫瘍抗原である表面マーカーに対して特異的である。
【００７０】
一実施形態では、Ｂは、ＴＳＨＲ（甲状腺刺激ホルモン受容体、甲状腺）、ＣＤ３１（血管内皮）、ＣＤ４１（血小板）、ＣＤ１０３（上皮内リンパ球）、ＣＤ１１７（造血性幹細胞）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ、肺上皮）、クララ細胞分泌タンパク質（ＣＣ１６、肺上皮）、ｖＷＦ（血管内皮）を含む群から選択される標的細胞抗原に対して特異的である。
【００７１】
一実施形態では、標的細胞上の表面マーカーに対して特異的なＢはＨＥＲ受容体、例えば、ＨＥＲ１、２、３又は４である。
【００７２】
一実施形態では、Ｂは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、Ｂ２２０（ＣＤ４５としても知られる）、ＣＤ４３、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４、ＢＣＭＡ及びＩＬ−６Ｒを含む群から選択される標的細胞上のＢ細胞マーカー、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０（ＣＤ３８又はＣＤ１３８など）に対して特異的である。
【００７３】
一実施形態では、Ｂは、細胞の表面上の免疫グロブリンの一部として発現される抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域にあるＢ細胞マーカーに対して特異的であり、例えば、マーカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ及びＩｇＭを含む群から選択される抗体アイソタイプに対して特異的である。
【００７４】
一実施形態では、Ｂは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５を含む群から選択されるＴ細胞マーカーに対して特異的である。
【００７５】
一実施形態では、Ｂが結合することができる標的細胞及び標的細胞上の抗原は以下を含む：
・Ｂ細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるＢ細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３５、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９等であるがこれらに限定されない、
・Ｔ細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるＴ細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１６０等であるがこれらに限定されない、
・正常ＮＫ細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるＮＫ細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ９６、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６２Ｒ、ＣＤ２２３、ＣＤ２４４等であるがこれらに限定されない、
・単球／骨髄細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される単球／骨髄細胞サブセット抗原、これは、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４等であるがこれらに限定されない、
・樹状細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される樹状細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ８５、ＣＤ２０５、ＣＤ２０９等であるがこれらに限定されない、
・好中球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好中球サブセット抗原、これは、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１７０等であるがこれらに限定されない、
・好塩基球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好塩基球サブセット抗原は、表面ＩｇＥ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０３ｅ、ＦｃｅＲ１ａ等であるがこれらに限定されない、
・好酸球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好酸球サブセット抗原は、シグレック−８、ＣＤ２９４等であるがこれらに限定されない、
・マスト細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるマストサブセット抗原は、表面ＩｇＥ、ＦｃｅＲ１ａ、ＣＤ１１７等であるがこれらに限定されない、
・血小板／巨核球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される血小板／巨核球サブセット抗原、これは、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ／ｂ／ｃ／ｄ、ＣＤ５１、ＣＤ１１０等であるがこれらに限定されない、
・造血前駆細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される造血前駆細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ９０、ＣＤ１００、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２４３、ＣＤ３３８、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−５、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９、ＴＲＡ−２−５４等であるがこれらに限定されない、
・赤血球又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される赤血球サブセット抗原、これは、ＣＤ２３３、ＣＤ２３５ａ／ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、Ｔｅｒ１１９等であるがこれらに限定されない、
・内皮細胞又はそのような細胞上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される内皮細胞サブセット抗原、これは、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ等であるがこれらに限定されない、
を含む。
【００７６】
一実施形態では、Ａが血液脳関門を越えるエフェクター細胞上で発現される場合、Ｂは、アルファシヌクレイン、タウアイソフォーム、Ａベータアミロイド（Ａｂｅｔａ  ａｍｙｌｏｉｄ）、ベータセクレターゼ、ガンマセクレターゼ、ＴＤＰ４３、スーパーオキシドジスムターゼＳＯＤ１、プリオンタンパク質又はハンチンチンタンパク質などの中枢神経系発現標的に結合することができる。
【００７７】
エフェクター細胞は、Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂにより標的細胞に向けられる所望の細胞活性を天然に有することがある。
【００７８】
代わりに、エフェクター細胞は、特に、Ａがシグナル伝達領域を含む場合、Ａ−Ｘをコードするポリヌクレオチド配列をエフェクター細胞にトランスフェクトすることにより活性が増強又は導入され得る。
【００７９】
ヘテロ二量体繋Ｘ：Ｙが形成されると、エフェクター細胞と標的細胞を互いに近づける。これによりエフェクター機能は標的細胞に効果、例えば、標的細胞の破壊及び／又は標的細胞機能の調節を発揮することができる。
【００８０】
エフェクター細胞を方向付けることによる標的細胞の破壊又は標的細胞機能の調節は、皮膚、胃、腸、腎臓、膀胱、精巣、前立腺、乳房、卵巣、脂肪、骨格筋、肺、骨、膵臓、リンパ節及びＣＮＳを含むがこれらに制限されない複数の組織型を冒す広範囲な疾患において治療潜在力を有する可能性がある。筋線維芽細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、破骨細胞／芽細胞／細胞（cytes）、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び好酸球などの多数の細胞型は、その細胞を調節する、阻害する、活性化する又は除去することが可能である炎症、自己免疫、新生物及び腫瘍原性病態に関与しているこれらの組織を横切って標的とすることが可能である。標的とすることができると考えられる状態の例は、任意の自己免疫状態（例えば、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、関節リウマチ、特発性肺線維症）、上皮及び血液系腫瘍、血管新生、アレルギー性炎症疾患、線維症、骨疾患（例えば、骨粗鬆症）、白血球ホメオスタシス（例えば、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び樹状細胞機能）の調節不全により引き起こされる炎症性疾患、神経炎症及び神経変性疾患を含む。
【００８１】
Ａが膜貫通ドメインに加えて細胞表面でＸを提示するように細胞発現される場合、Ａは任意選択でＮ末端スペーサー領域を含んでいてもよい。
【００８２】
一実施形態では、方法はＡ−Ｘを細胞表面マーカーにドッキングさせることを用い、もう一方のアームＢ−Ｙは、目的の細胞を標的としてその細胞をＡ−ＸがＸ：Ｙにより形成されるヘテロ二量体繋を通じて結合されている細胞の近傍に保持するのに用いられる。
【００８３】
一実施形態では、Ａは、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ（ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ）、ｓｃＦｖ、タンパク質及びタンパク質リガンド；細胞表面タンパク質の１つ若しくは複数の成分、例えば、膜貫通ドメイン、又は複合体、例えば、膜貫通ドメイン及びエフェクター細胞の表面で発現される受容体に対するリガンド、或いはその組合せから独立して選択される。
【００８４】
一実施形態では、Ｂは、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ（ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ）、ｓｃＦｖ、及び抗原、例えば、標的細胞の表面で発現される受容体に対するリガンドから独立して選択され、例えば、完全長抗体、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片、特に、Ｆａｂ断片などのＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、又はｓｄＡｂ、又はｓｃＦｖである。
【００８５】
一例では、Ａ及びＢは両方ともＴ又はＢ細胞に結合できるが、同じマーカーを介して結合はしない。
【００８６】
一例では、ＡがＢ又はＴ細胞マーカーに対して特異的でない場合、ＢはＢ又はＴ細胞マーカーに対して特異的であってもよい。
【００８７】
Ａが膜貫通ドメインを含む場合、Ｘは、任意選択でスペーサーを介して、タンパク質ＡのＮ末端に結合している細胞表面に提示されてもよい。
【００８８】
Ａ−Ｘが融合タンパク質であり、細胞表面で発現されない場合、特にＡが抗体又はその結合断片である場合、Ｘは、例えば、重鎖のＣ末端上などのタンパク質のＣ末端で提示されてもよい。
【００８９】
一実施形態では、Ｘはリンカー、例えば、本明細書に開示されるリンカーを介してＡに接続又は連結されている。
【００９０】
一実施形態では、ＸはＡに直接連結／融合されている（すなわち、リンカーは用いられていない）。
【００９１】
一実施形態では、Ｙはタンパク質ＢのＣ末端に連結／接続され、例えば、Ｂにより表される抗体又は結合断片の重鎖のＣ末端に連結される。
【００９２】
一実施形態では、ＹはＢに直接連結／融合されている（すなわち、リンカーは用いられていない）。
【００９３】
一実施形態では、Ｙはリンカー、例えば、本明細書に開示されるリンカーを介してＢに接続又は連結されている。
【００９４】
一実施形態では、リンカーは、ＡＡＡＳＧＧＧ  配列番号７４、ＡＳＧＧＧ  配列番号７３、ＡＳＧＧＧＧ  配列番号７１、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  配列番号１８、及びＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ  配列番号７５から選択される。
【００９５】
Ａ又はＢはＦａｂであり対応するＸ又はＹがペプチドである場合、それぞれのＸ又はＹへのリンカーは、例えば、ＡＳＧＧＧＧ、ＡＳＧＧＧ、ＡＡＡＳＧＧＧ  配列番号７４でもよい。
【００９６】
Ａ又はＢはｓｃＦｖであり対応するＸ又はＹがペプチドである場合、リンカーは、例えば、ＡＳＧＧＧ、ＡＳＧＧＧＧ又はＡＡＡＳＧＧＧでもよい。
【００９７】
Ａ又はＢはｓｃＦｖであり対応するＸ又はＹがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、リンカーは、例えば、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳから選択してもよい。
【００９８】
一実施形態では、Ｘが表面で発現されるように、表面にＸを提示するエフェクター細胞、例えば、Ａ−Ｘを発現している細胞の養子移入を含む処置の方法が提供される。
【００９９】
細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方でトランスフェクトする技法を含む、養子細胞移入／治療又は移植のための方法は当技術分野では周知である（Feldmann et al., 2015, Seminars in Oncology, 42, 4, 626-639 and Dunkin et al., 2014, Digestive Diseases, 32, 61-66）。
【０１００】
本開示の抗体フォーマットは、二重特異性タンパク質複合体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで容易に組み立てることが可能であり、これらの複合体を使用して患者を処置することが可能であるようになっている。
【０１０１】
ユニットＡ−Ｘ又はユニットＢ−Ｙを発現するのは難しくはない。それぞれのユニット（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）の発現後に必要とされる精製の量は最小限である又は事実上不必要である。二重特異性複合体は、関連するユニットを混合するだけで、すなわち、コンジュゲーション及びカップリング化学反応に頼らずとも１対１のモル比で形成することが可能である。結合パートナーのＸとＹは必要なヘテロ二量体二重特異性複合体を形成するのに有利になるよう平衡を動かす。さらに、ヘテロ二量体化後の複合体の形成の後には精製はほとんど必要としないか全く必要としない。したがって、多数のＡ−Ｘ及びＢ−Ｙを容易に調製し組み合わせることが可能である。
【０１０２】
一実施形態では、Ａ及び／又はＢはＦｃ領域を含む。
【０１０３】
一実施形態では、本開示の構築物中のＡ及び／又はＢはＦｃ領域を欠く。
【０１０４】
一実施形態では、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体中に用いられる１つ又は複数のｓｃＦｖはジスルフィド安定化されている。
【０１０５】
Ｆｃ断片ＣＨ２−ＣＨ３を欠く二重特異性複合体を調製する能力は、観察される生物活性が実際に複合体中の可変領域対のみに起因することも保証する。本発明の二重特異性複合体の単純さ及びそれを調製する方法の簡単さは、特徴付け、単離目的、等のための迅速で広範なスクリーニングという文脈では大きな利点となる。
【０１０６】
一実施形態では、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂは、処置のために複合体を細胞に導入する前にＡ−ＸとＢ−Ｙをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより調製される。したがって、一実施形態では、方法はＡ−ＸとＢ−Ｙを接触させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップを含む。
【０１０７】
一実施形態では、成分Ａ−ＸとＢ−Ｙは別々の融合タンパク質として、しかし処置のためにほぼ同時に細胞に導入され、細胞の試料に添加後一体となって複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを形成する。
【０１０８】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは先ず処置のために細胞に添加され（ｉｎ  ｖｉｖｏでを含む）、後にそれぞれ対応する試薬、Ｂ−Ｙ及びＡ−Ｘが添加される。時間差は、例えば、１５分から２４時間でもよい。第２の融合タンパク質を添加した後にはじめて複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂが形成される。
【０１０９】
したがって、一実施形態では、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で同時発現されることはない。これは、そのおかげで、例えば、１００の融合タンパク質を発現し、場合によっては精製することが可能になり、１００の融合タンパク質を種々の並べ替えで続いて混合すれば１０，０００のヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体を提供することが可能になり、そのうちの５，０００が類のない対であるので、有利である。
【０１１０】
しかし、必要に応じて、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で発現することができる。
【０１１１】
結合パートナーＸ及びＹは互いに対して親和性を有し、ベルクロ（登録商標）の生物学的等価物又はバーと磁石として機能し、複合体を１つに保持する。有利なことに、これは、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＹ−ＹＢは、その融合タンパク質を互いに混ぜ合わせるだけで容易に会合して二重特異性タンパク質複合体になることが可能であることを意味する。したがって、本開示の二重特異性タンパク質複合体はモジュラー構造体を有し、これのおかげで２つの異なるタンパク質を、例えば、格子状の様式で抗原特異性の異なる組合せを用いた二重特異性タンパク質複合体の並べ替えの大きなパネルを作製するために容易に会合させることが可能になる。これにより、種々の疾患状態の処置において使用するための多数の二重特異性タンパク質複合体の効率的で組織的なスクリーニングが可能になる。
【０１１２】
ＸとＹが互いに対して特異的であることを考慮すると、このせいで、ホモ二量体を形成する能力が著しく減少する。本明細書ではＸとＹは合わせて結合対又は結合パートナーと呼ばれる。一実施形態では、Ｘは他のＸに対して高い親和性を持たない。一実施形態では、Ｙは他のＹに対して高い親和性を持たない。有利なことに、ＸとＹがホモ二量体を形成しないとき、このことが望ましくない単一特異性タンパク質複合体の形成を妨げ、所望の二重特異性タンパク質複合体の収量を増やし、単一特異性タンパク質複合体を除去するための面倒な精製ステップの必要性をなくす。
【０１１３】
これにより、大半の先行技術の方法では効率的に得ることができない収量及び／又は精度を持つ二重特異性タンパク質複合体の迅速な会合が可能になり、特に、先行技術の方法では一般に大規模な精製ステップが必要になる。本発明では二重特異性複合体の収量は典型的には７５％又はそれよりも高い。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】細胞の表面で発現されるＡ−Ｘ融合タンパク質（Ａは細胞内シグナル伝達ドメインに接続されていない表面タンパク質でありＸはｓｃＦｖである）を示しており、Ｂは標的細胞又は組織の表面のエピトープに対して特異的なＦａｂであり、ＹはＸに対して特異的なペプチドである。Ｂ−Ｙについての代わりのフォーマットも提供されている。
【図２】細胞の表面で発現されるＡ−Ｘ融合タンパク質（Ａは細胞内シグナル伝達ドメインに接続されている表面タンパク質［本明細書ではキメラ受容体とも呼ばれる］でありＸはｓｃＦｖである）を示しており、Ｂは標的細胞又は組織の表面のエピトープに対して特異的なＦａｂであり、ＹはＸに対して特異的なペプチドである。Ｂ−Ｙについての代わりのフォーマットも提供されている。
【図３】Ａ−Ｘを示しており、Ａは細胞（エフェクター細胞）の表面で発現される抗原に対して特異的であるＦａｂ又はＦａｂ’であり、ＸはＹに対して特異的である一本鎖Ｆｖである。Ｂは標的細胞又は組織の表面のエピトープに対して特異的なＦａｂであり、ＹはＸに対して特異的なペプチドである。Ｂ−Ｙについての代わりのフォーマットも示されている。
【図４】細胞の表面で発現されるＡ−Ｘ融合タンパク質（Ａは細胞内シグナル伝達ドメインに接続されている表面タンパク質［本明細書ではキメラ受容体とも呼ばれる］でありＸはｓｃＦｖである）を示しており、Ｂは標的細胞上の表面抗原に対して特異的なＦａｂであり、Ｙはペプチドである。代わりに、Ｂは２つのＹペプチドを含む完全長抗体である。
【図５】Ａ−Ｘを示しており、Ａは細胞（エフェクター細胞）の表面で発現される抗原に対して特異的であるＦａｂ又はＦａｂ’であり、ＸはｓｃＦｖであり、Ｂは標的細胞上の表面抗原に対して特異的なＦａｂであり、Ｙはペプチドである。代わりに、Ｂは２つのＹペプチドを含む完全長抗体である。
【発明を実施するための形態】
【０１１５】
本明細書で使用される「二重特異性タンパク質複合体」とは、ヘテロ二量体繋により一緒に保持される２つのタンパク質を含む分子（本明細書で二重特異性成分と呼ばれるＡ及びＢは本明細書では二重特異性のそれぞれ第１のタンパク質成分及び第２のタンパク質成分とも呼ばれる）のことである。一実施形態では、タンパク質のうちの１つ又は両方は結合ドメインを有しており、例えば、タンパク質のうちの１つ又は両方は抗体又はその断片である（特に、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片、そのような複合体はＦａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂとも呼ばれる）。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合「融合タンパク質」は、結合パートナーＸ又はＹに融合しているタンパク質成分Ａ又はＢを含む（必要に応じて）。一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子構築物から組換え技法により発現される、例えば、ＤＮＡ構築物から宿主において発現される翻訳タンパク質である。本開示の文脈では、融合タンパク質の鍵となる特徴の１つは、このタンパク質が細胞から「単一タンパク質／ユニット」として発現することが可能であることである（当然のことながら、Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片を含む融合タンパク質の場合では、２つの鎖が存在することになるが、これは本明細書の目的のために、１つの鎖、典型的には重鎖が、場合によって本明細書で下に記載されるリンカーを介して、必要に応じてそのＣ末端でＸ又はＹに融合されている単一タンパク質と見なすことになる）。
【０１１７】
ヘテロ二量体繋Ｘ：Ｙの役目は、Ａ及びＢ又はそこに付加されている細胞の機能が果たせるようにタンパク質ＡとＢを互いに近接して保持しておくことである。
【０１１８】
本明細書で使用される用語「ヘテロ二量体繋」とは、２つの結合パートナーを一緒に保持するのに十分である全体的親和性を有する互いの間で相互作用：（結合などの）を形成する２つの異なる結合パートナーＸ及びＹを含む繋のことである。一実施形態では、Ｘ及び／又はＹはホモ二量体を形成するには不適切である。
【０１１９】
ヘテロ二量体的に繋がれたヘテロ二量体繋は本明細書では互換的に使用される。
【０１２０】
一実施形態では、本明細書で用いられる「ホモ二量体を形成するには不適切な」とは、ホモ二量体よりもＸ−Ｙのヘテロ二量体の形成のほうが好ましい、例えば、形成された後は、熱力学的に安定ななどのより安定している形態のことである。一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は一価である。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「タンパク質リガンド」とは、細胞表面タンパク質（膜貫通結合受容体などの）の結合パートナー（リガンド、サイトカイン、ケモカインなどの）を意味する。
【０１２２】
本明細書で使用される「細胞表面タンパク質又はその複合体の成分」とは、細胞表面タンパク質の限定された領域を意味し、膜貫通領域、細胞内シグナル伝達領域及び同類の物を含むがこれらに限定されない。
【０１２３】
一実施形態では、Ｘ−Ｙ相互作用はＸ−Ｘ又はＹ−Ｙ相互作用よりも都合がよい。このせいで、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙが混合されると、ホモ二量体Ｘ−Ｘ又はＹ−Ｙの形成は減少する。典型的には、１対１モル比の混合に続いて７５％を超えるヘテロ二量体が形成される。
【０１２４】
必要に応じて、例えば、本開示に従った融合タンパク質ユニット及び／又は二重特異性タンパク質複合体を精製するために、カラムクロマトグラフィーなどの精製ステップ（特に、１ステップ精製）を用いることができる。
【０１２５】
一実施形態では、精製ステップはそれぞれの融合タンパク質の発現後に提供されるが、典型的には凝集体レベルは低い。したがって、一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合に先立って、融合タンパク質（単数又は複数）は実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で用いられる場合実質的に純粋な形態とは、融合タンパク質が９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％単量体である場合のことである。
【０１２６】
一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【０１２７】
一実施形態では、それぞれの融合タンパク質ユニットは異なる発現実験／実行で発現される。
【０１２８】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体を産生するために混合前には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。一実施形態では、混合前及び／又は後には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【０１２９】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体形成後には精製は必要ではない。一実施形態では、混合後及び一般には追加の精製なしで、組成物の少なくとも５０％は所望の二重特異性タンパク質複合体であり、例えば、組成物の少なくとも６０、６５、７０、７５、８０％は必要とされる二重特異性タンパク質複合体である。
【０１３０】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられるＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙの比は、１対１、特に１対１モル比である。
【０１３１】
本開示は、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙを、例えば、１対１モル比で混合することを含む、本開示に従った二重特異性複合体を調製する方法までにも及ぶ。
【０１３２】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。
【０１３３】
一実施形態では、混合は細胞、例えば、前記融合タンパク質を発現している宿主細胞中で起こる。
【０１３４】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、すなわち、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙは対象の身体内で互いに相互作用してヘテロ二量体繋を、その結果、二重特異性タンパク質複合体を形成する。
【０１３５】
１つの成分、例えば、Ａ−Ｘが投与される又は導入され、さらなる成分Ｂ−Ｙが添加されてヘテロ二量体繋を形成するまでＡ−Ｘは活性化されないので、これは有利である。
【０１３６】
一実施形態では、ＸとＹは互いに完全に特異的であり、細胞内又は対象の身体内では他のいかなるペプチド／タンパク質とも結合しない。これは、例えば、ＸとＹが標的細胞中にも標的対象身体中にも天然に存在しないことを保証することによって達成することが可能である。これは、例えば、対象にとっては異なっている種又は実体（例えば、酵母タンパク質）由来であるＸ又はＹを選択し、それに対しもう１つの可変因子が特異的であることを保証することによって達成することが可能である。有利なことに、これにより融合タンパク質Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙが望ましくない標的へ結合して、それによって望まれない非特異的な効果を生じるのが妨げられる。
【０１３７】
一般に、Ｘ又はＹのうちの少なくとも１つはペプチドなどの抗原になる。本開示では、Ｘ又はＹで用いられるペプチドなどの抗原は非哺乳動物であるように選択されてきた。それは、哺乳動物タンパク質に類似しないし同一でもないなどの、哺乳動物タンパク質由来ではない。一実施形態では、Ｘ又はＹで用いられるペプチド又は抗原は、同じ長さにわたり哺乳動物配列に９０％同一である若しくは類似している又はそれよりも少ない（８５、８０、７５、７０、６５、６０％又はそれより少ないなどの）。上で考察されたように、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられた場合にＸ：Ｙが互いに対して特異的であることを保証するのに役立ち、患者に対するオフターゲット効果のリスクを下げる。
【０１３８】
一実施形態では、結合パートナーのうちの１つ（又は少なくとも１つ）はホモ二量体を形成することができず、例えば、結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化する。
【０１３９】
一実施形態では、結合パートナーの両方がホモ二量体を形成することができない。
【０１４０】
本明細書で用いられる場合、ホモ二量体も凝集体も形成することができないとは、ホモ二量体又は凝集体を形成する傾向が低い又はないことである。本明細書で用いられる場合低いとは、例えば、混合又は発現又は精製後、４、３、２、１、０．５％若しくはそれ未満の凝集体などの、５％又はそれ未満のことである。
【０１４１】
ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体中の融合タンパク質又は残渣の少量の凝集体は、本開示のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体の医薬組成物では許容可能であってもよい。
【０１４２】
一実施形態では、：は、水素結合及び静電気相互作用などの、引力、例えば、ファンデルワールス力に基づく、特に、抗原（ペプチドなどの）に対する抗体特異性に基づく結合相互作用である。
【０１４３】
一実施形態では、コンジュゲーション／カップリング化学反応は本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製するのに用いられない。
【０１４４】
本明細書で用いられる場合「複合体を形成する」とは、結合相互作用又は化学反応を含む相互作用のことであり、この相互作用は複合体が会合し融合タンパク質が一緒に保持される適切な条件下で融合タンパク質成分Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが接触するときには十分に特異的で強力である。
【０１４５】
本明細書で用いられる場合「一緒に保持される」とは、Ｘ：Ｙ結合後、複合体を１つの分子であるかのように取り扱うことができ、多くの場合に単一分子のように振る舞い機能するようにその成分（融合タンパク質）を互いに近傍に保持することである。一実施形態では、保持によって複合体は本明細書で開示される方法において使用するのに適したものになる、すなわち、少なくとも１つの機能スクリーニングにおいて使用するのに適したものになる。
【０１４６】
本明細書で用いられる場合特異性とは、例えば、相互作用におけるパートナー、例えば、Ｘ：Ｙ若しくはＡと抗原若しくはＢと抗原が互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、無関係の非パートナータンパク質への結合のバックグランドレベルと比べて、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０１４７】
本明細書で用いられる場合ＸとＹに関する特異性とは、相互作用にある結合パートナーＸとＹが互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０１４８】
一実施形態では、結合相互作用は可逆的である。一実施形態では、結合相互作用は基本的に非可逆的である。
【０１４９】
本明細書で用いられる場合基本的に非可逆的であるとは、抗体又は結合断片の遅いオフレート（解離定数）のことである。
【０１５０】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は低い解離定数を有する。低い解離定数の例には、１〜９×１０−２ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１〜９×１０−３ｓ−１、１〜９×１０−４ｓ−１、１〜９×１０−５ｓ−１、１〜９×１０−６ｓ−１、１〜９×１０−７ｓ−１が含まれる。特に適した解離定数には、２×１０−４ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１×１０−５ｓ−１、１×１０−６ｓ−１又は１×１０−７ｓ−１が含まれる。
【０１５１】
理論に縛られたくはないが、解離定数（オフレートとも呼ばれる）が低ければ、処置において二重特異性タンパク質複合体が有用になるほど分子が安定的になると考えられる。
【０１５２】
別の実施形態では、Ｘ及びＹの互いに対する親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、９００ｐＭよりも強く、８００、７００、６００、５００、４００若しくは３００ｐＭなどである。
【０１５３】
親和性は実体のオンレートとオフレートから計算される値である。本明細書で使用される用語「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、ペプチド）の間の非共有結合的相互作用の総計の強さのことである。その結合パートナーに対する分子の親和性は一般に解離定数（ＫＤ）により表すことが可能である。細胞表面マーカーは実体、例えば、細胞を同定する及び／又は単離するために単独で又は他の表面マーカーと組み合わせて用いられる細胞の表面で発現されるタンパク質である。マーカーは細胞の系譜若しくは細胞の活性化状態、細胞により発現される分子又は同類の物に関連していてもよい。
【０１５４】
一実施形態では、細胞表面マーカーは、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＮＣＡＭ、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＫＤＲ、Ｔａｇ−７２などの腫瘍抗原である。
【０１５５】
別の実施形態では、細胞表面マーカーは、血管から脳へのタンパク質、細胞及び他の分子の血液脳関門を通る移入をもたらす膜タンパク質（例えば、トランスポーター）などのタンパク質である。
【０１５６】
別の実施形態では、細胞表面マーカーは、血液脳関門を越えることができる細胞上にある。
【０１５７】
膜貫通ドメイン又は領域は本明細書では互換的に用いられて、細胞膜にまたがり、それによって細胞内ドメインと細胞外ドメインを架橋するタンパク質を指す。例えば、国際公開第２００４／０３９８４０号及び国際公開第２００７／０６０４０６号を参照されたい。この両方の文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
膜貫通領域は一般に、Ａ−Ｘを細胞膜に固定する役目を果たし（したがって、細胞外リガンド結合領域は膜結合性である）、いかなるタンパク質（又はそのようなタンパク質をコードする核酸）も含む。そのような領域は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ、ベータ、又はゼータ鎖のすべて又は一部、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４、インターロイキン受容体、ＴＮＦ−Ｒ、チロシンキナーゼ受容体又はインターフェロン受容体、又はコロニー刺激因子受容体などのサイトカイン受容体などの広範な供給源に由来することが可能である。代わりに、膜貫通領域は合成でもよい。適切な合成膜貫通領域は主に、ロイシン及びバリンなどの疎水性アミノ酸を含むことになる。
【０１５９】
Ａが膜貫通領域を含む場合、スペーサー領域は任意選択で膜貫通領域のＮ末端に含まれてもよい。さらに、細胞内シグナル伝達領域は任意選択でその膜貫通領域のＣ末端に含まれてもよい。
【０１６０】
本明細書で用いられる場合スペーサードメインとは、Ａの膜貫通領域をＸから分離するポリペプチド領域のことであり、人工のＴ細胞受容体（Cytotherapy 2003 5 (3) 211-226）の場合と同様に、最適エフェクター細胞機能には必要である場合がある。スペーサー領域の例は、免疫グロブリン、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣなどの天然に発現される細胞表面分子に由来するドメインである。これらの分子由来の領域の組合せを組み合わせてもよい。特定の例は、記載されている（J.Immunol 1998 161 2791-2797）ように、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域又はヒトＣＤ２８の細胞外ドメインと組み合わせたヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を含む。
【０１６１】
細胞内シグナル伝達領域は、細胞内メッセンジャー系を直接的に又は間接的に生成することになるシグナルの発生に関与することが可能ないかなるタンパク質（又はそのようなタンパク質をコードする核酸）も含む。特定の細胞内メッセンジャー系は、チロシンキナーゼ経路、ＭＡＰキナーゼ経路、若しくはタンパク質キナーゼＣ経路などの１つ若しくは複数のキナーゼ経路；Ｇタンパク質若しくはホスホリパーゼ媒介経路；カルシウム媒介経路；ｃＡＭＰ若しくはｃＧＭＰ媒介経路；或いはインターロイキン、例えば、ＩＬ−２などの１つ若しくは複数のサイトカイン、又はＮＦκＢ、ＮＦＡＴ若しくはＡＰ−１などの転写因子の合成を伴う１つ若しくは複数の経路を含む。細胞内シグナル伝達領域は協調的に作用するように選択されるのがもっとも好ましい。
【０１６２】
細胞内シグナル伝達領域は１つ又は複数の天然に存在するタンパク質シグナル伝達配列に由来していてもよい。適切な例は、限定せずに、ゼータ、エータ又はイプシロン鎖の一部などのＴＣＲに由来する配列を含み、ＴＣＲゼータ鎖の第１（ＴＣＲζ１）、第２（ＴＣＲζ２）及び第３（ＴＣＲζ３）の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＦｃＲＩＩＩγ又はＦｃＲＩγなどのＦｃＲγ、ＦｃＲＩβなどのＦｃＲβ；ＣＤ３γ；ＣＤ３δ；ＣＤ３ε；及びＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄを含む。特に好ましいＩＴＡＭは、ＴＣＲζ１、ＴＣＲζ２、ＴＣＲζ３及びＦｃεＲＩγ；ＣＤ４；ＣＤ８；並びにＦｃ受容体のガンマ鎖由来のＩＴＡＭを含む。
【０１６３】
シグナル伝達領域は、−ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＴＢＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＨＨＬＡ２、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４８、ＣＤ２４４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ブチロフィリン又はシグレックファミリーメンバーを含む活性化又は阻害性免疫チェックポイント受容体又はリガンド（Nat Rev Drug Discovery. 2015. 14. 561-584）に由来することが可能である。
【０１６４】
本明細書で用いられる場合、キメラ受容体とは、異なる起源由来の２つの配列を細胞、特にエフェクター細胞上に移植する操作された受容体のことである。
【０１６５】
二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面、例えば、ビーズに繋ぎ留めることができる、又は二重特異性タンパク質複合体は、例えば、ウェル内で若しくは液滴内で液体（例えば、溶液又は培養液）の形態で懸濁されることもできる。
【０１６６】
一実施形態では、結合対の第１の結合パートナーＸと第２の結合パートナーＹのうちの少なくとも１つは、独立してペプチド及びタンパク質から選択され、例えば、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーはペプチドである。
【０１６７】
適切なペプチドには、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ヒト及びマウスＦｏｓはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１１００及びＰ０１１０１を有し、ヒト及びマウスＪｕｎはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号０５４１２及び０５６２７を有する）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素のアミノ酸９８から１０６に対応するＨＡタグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ及びＦＬＡＧを含む群を含む。他のペプチドも本開示において使用するのに適切と予想されており、特に適切なペプチドはタンパク質精製のためのアフィニティータグである。なぜならば、そのようなペプチドはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０１６８】
一実施形態では、ペプチドはＥ５Ｂ９ではない。
【０１６９】
本明細書で使用される用語「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の短いポリマーのことであり、ペプチドは２〜１００の範囲で、例えば、６から９８、７から９７、８から９６又は５から２５などの５から９９のアミノ酸を含有する。一実施形態では、本開示で用いられるペプチドは５０アミノ酸残基又はそれよりも少ない、例えば、４０、３０、２０、１０又はそれよりも少ないアミノ酸配列である。ポリペプチドとタンパク質は本明細書では互換的に用いられる。一実施形態では、タンパク質は抗体又は抗体断片である。
【０１７０】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書では結合部位とも呼ばれる）を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチド、等などの標的抗原への特異的結合ができる免疫グロブリン分子のことである。
【０１７１】
本明細書で使用されるように、「抗体分子」には抗体及びその結合断片が含まれる。
【０１７２】
本明細書で用いられる場合「抗体断片」とは、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない抗体結合断片のことである（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217参照）。これらの抗体断片を作製し製造するための方法は当技術分野では周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181参照）。本開示で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、国際特許出願ＷＯ０５／００３１７０及び国際特許出願ＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は複数の特異性体、例えば、二重特異性体を含んでいてもよく又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２参照）。
【０１７３】
本明細書で用いられる場合「結合断片」とは、断片をペプチド又は抗原に対して特異的であると特徴付けることができるほどの十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができる断片のことである。
【０１７４】
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬ（可変軽）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片並びに重鎖のＶＨ（可変重）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片のことである。一例では、Ｆａｂ断片の重鎖配列はＣＨ１の鎖間システインで「終わる」。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ断片は一価である。
【０１７５】
本明細書で用いられる場合Ｆａｂ’断片とは、ヒンジ領域の全て又は一部をさらに含むＦａｂ断片のことである。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ’断片は一価である。
【０１７６】
本明細書で使用される用語「単鎖Ｆｖ」又は略記して「ｓｃＦｖ」とは、（例えば、ペプチドリンカーにより）連結されたＶＨとＶＬ抗体ドメインを含んだかたちで単一ポリペプチド鎖を形成する抗体断片のことである。重及び軽鎖の定常領域はこのフォーマットでは取り除かれている。本明細書で用いられる場合単鎖Ｆｖには、そのジスルフィド安定化バージョンが含まれ、これはペプチドリンカーに加えてジスルフィド結合が可変領域間に存在する。
【０１７７】
ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、可変領域が分離し再び一体となることに関係する動力学的に呼吸する一部の可変領域の傾向を取り除くことができる。本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体」とは、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片のことである。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０１７８】
一実施形態では、抗体結合断片及び／又は二重特異性抗体複合体はＦｃ領域を含まない。本明細書で用いられる場合「Ｆｃ領域を含まない」とは、非存在であるＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４などのもっと低い定常ドメインのことである。しかし、ＣＨ１、ＣＫａｐｐａ／ＣＬａｍｂｄａなどの定常ドメインは存在する場合がある。
【０１７９】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０１８０】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０１８１】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質Ａ及び／又は第２のタンパク質Ｂは抗体又は抗体断片である。そのような二重特異性タンパク質複合体は二重特異性抗体複合体と呼ぶこともできる。
【０１８２】
二重特異性タンパク質複合体は、ＸとＹにより一体に繋ぎ合わされている、細胞表面に結合することができるタンパク質と細胞から分泌される可溶性分子に結合することができるタンパク質を含む。
【０１８３】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は二重特異性抗体複合体である。
【０１８４】
一実施形態では、本明細書で用いられる場合「二重特異性抗体複合体」とは、少なくとも２つの抗体結合部位を含み、成分抗体、断片又は両方がヘテロ二量体繋により一体に複合体化されている二重特異性タンパク質複合体のことである。
【０１８５】
本明細書で用いられる場合、複合体化された（又はとの複合体で）とは、一般に、Ａ−ＸとＢ−Ｙが相互作用Ｘ：Ｙにより一体に繋ぎ合わされている場合のことである。
【０１８６】
本明細書で用いられる場合複合体化されていないとは、Ａ−ＸとＢ−Ｙが別々の分子である場合のことである。
【０１８７】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体で用いられるそれぞれの抗体又は断片は１つの結合部位を含む、すなわち、それぞれの結合部位は標的抗原ごとに一価である。
【０１８８】
本明細書で用いられる場合、抗原とは、適切な条件下では身体を刺激して自身に対する抗体を産生させる分子のことである。
【０１８９】
融合タンパク質（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）で用いられる完全長抗体又は抗体断片は、単一特異性、一価、多価又は二重特異性でもよい。
【０１９０】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶＨＨ又は類似のものである。
【０１９１】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又は類似のものである。
【０１９２】
本明細書で用いられる場合、「単一特異性」とは、１つの標的抗原のみに結合する能力のことである。
【０１９３】
本明細書で用いられる場合、「一価」とは、単一の結合部位を有し、したがって、標的抗原に１回のみ結合するだけである抗体又は抗体断片のことである。
【０１９４】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０１９５】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０１９６】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０１９７】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０１９８】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０１９９】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０２００】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、１つは抗原ＣＤ３３に特異的であり１つは抗原ＣＤ３に特異的である２つのｓｃＦｖ又は代わりにこれら２つの抗原に特異的な二重特異性複合体フォーマットを含む融合タンパク質ではない。
【０２０１】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、ペプチドＥ５Ｂ９に連結されたＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（又は代わりに別の抗体フォーマット）を含む融合タンパク質ではない。
【０２０２】
本明細書で用いられる場合「結合ドメイン又は部位」は、抗体のうち抗原／エピトープに接触しそれとの結合相互作用に関与する部分である。一実施形態では、結合ドメインは少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば、可変ドメイン又はその誘導体の同族対などの可変ドメイン又はその誘導体の対を含有する。
【０２０３】
一実施形態では、結合ドメインは、特に、結合ドメインがＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨなどのドメイン抗体である場合には、３つのＣＤＲを含む。一実施形態では、結合ドメインは２つの可変ドメイン及び６つのＣＤＲ及びフレームワークを含み、合わせてこれらのエレメントは、抗原／エピトープとの抗体又は結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
【０２０４】
本明細書で用いられる場合「同族対」とは、前もって形成されたカップルとして宿主から単離される重軽鎖対のことである。この定義は、宿主由来の初めの対合が保持されていないライブラリーから単離される可変ドメインを含まない。同族対は有利である可能性がある。なぜならば、同族対は宿主において成熟された親和性である場合が多く、したがって、その対が特異的である抗原に対して高い親和性を有する可能性があるからである。
【０２０５】
本明細書で用いられる場合「天然に存在するドメインの誘導体」は、例えば、望ましくない特性を取り除くことなどによりドメインの特性を最適化するために、天然に存在する配列中の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が置き換えられている又は欠失しているが、ドメインの特徴的な特色（単数又は複数）は保持されていることを指すことを意図している。改変の例は、グリコシル化部位、又は溶媒曝露リシンを取り除く改変である。これらの改変は、関連するアミノ酸残基を保存的アミノ酸置換で置き換えることにより達成することが可能である。
【０２０６】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体又はその抗体／断片成分は処理されて、標的抗原（単数又は複数）に対する改善された親和性を提供する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異する（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発菌種の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及び性的ＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールにより得ることが可能である。Vaughanら（上記）は親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【０２０７】
一実施形態では、第１の抗体又は抗体断片（Ａ）は第１の抗原に対して特異的であり、第２に抗体又は抗体断片（Ｂ）は第２の抗原に対して特異的であり、一般に第１と第２の抗原は異なっている。有利なことに、二重特異性抗体複合体は２つの異なる抗原に対して特異的であることができる。これは、それぞれ異なる実体上に位置している２つの異なる抗原へ抗体複合体が結合し、それによって２つの実体を物理的に互いにすぐ近傍に近づける可能性を表す。
【０２０８】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂであってよい。
【０２０９】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂ’であってよい。
【０２１０】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はｓｃＦｖであってよい。
【０２１１】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１（Ａ）若しくは第２（Ｂ）の抗体／断片又は第１と第２の抗体／断片の両方はＶＨＨである。
【０２１２】
便宜上、本開示の二重特異性タンパク質複合体は本明細書ではＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂと呼ばれる。Ａ及びＢ並びにＸ及びＹは本技術の説明を支援するために言及される名目ラベルである。
【０２１３】
本明細書で用いられる場合「付加されている（attached）」とは、その例が下で考察されるペプチドリンカーなどのリンカーを介して直接的に又は間接的に連結している又は結合していることである。直接的に連結しているには、一つに融合している（例えば、ペプチド結合）又は化学的にコンジュゲートしているが含まれる。
【０２１４】
本明細書で用いられる場合「結合パートナー」とは、結合対の１つの成分部分のことである。
【０２１５】
一実施形態では、結合パートナーの親和性は高く、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００ｐＭ又はそれよりも強いなどの５ｎＭ又はそれよりも強い。
【０２１６】
本明細書で用いられる場合「結合対」とは、互いに特異的に結合する二つの結合パートナーのことである。結合対の例には、ペプチドとそれに特異的な抗体若しくは結合断片、又は酵素とリガンド、又は酵素とその酵素の阻害剤が含まれる。
【０２１７】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０２１８】
Ｘが抗体又はその結合断片である場合、Ｙはタンパク質又はペプチド、特に、ペプチドである。
【０２１９】
一実施形態では、第２のパートナー（Ｙ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０２２０】
Ｙが抗体又はその結合断片である場合、Ｘはタンパク質又はペプチド、特に、ペプチドである。
【０２２１】
一実施形態では、Ａが抗体又はその断片である場合、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片（Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２２２】
別の実施形態では、Ｂが抗体又はその断片である場合、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２２３】
一実施形態では、Ｘは抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙは抗体又は断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２２４】
一実施形態では、Ｘはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ配列番号７２などの）又は当技術分野で公知の若しくは本明細書の下で考察されている任意の他の適切なリンカーを介して、抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ配列番号７２などの）を介して、抗体又は断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２２５】
適切な結合対（Ｘ又はＹ）の例には、ＧＣＮ４（配列番号１又は７６〜９８又はＨＩＳタグを欠く、配列番号１又は７６〜９８のアミノ酸１〜３８）又はその変異体、及びＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖである５２ＳＲ４（配列番号３、９９又は１００又はＨＩＳタグを欠く配列番号３のアミノ酸１から２４３）又はその変異体を含むことができる。
【０２２６】
一実施形態では、第１の結合パートナー（名目上Ｘ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１、７６〜９８で示される）又はその断片若しくは変異体（例えば、Ｈｉｓタグなし）であり、第２の結合パートナー（名目上Ｙ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂ（例えば、配列番号３、９９又は１００に示される）又はその変異体である。
【０２２７】
一実施形態では、第１の結合パートナー（名目上Ｘ）はＧＣＮ４に対して特異的なｄｓＦｖ若しくはｓｄＡｂ（例えば、配列番号３に示される）又はその変異体であり、第２の結合パートナー（名目上Ｙ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１で示される）又はその断片若しくは変異体である。
【０２２８】
ＧＣＮ４変異体には、配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列が含まれる。ＧＣＮ４変異体には、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされる配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２２９】
ＧＣＮ４に対して特異的な適切なｓｃＦｖは５２ＳＲ４（配列番号３、９９若しくは１００又は配列番号３のアミノ酸１から２４３）又はその変異体である。５２ＳＲ４の変異体には配列番号３に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。５２ＳＲ４の変異体には、配列番号４のヌクレオチド配列によりコードされる配列に、少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２３０】
本発明者らは、単鎖抗体５２ＳＲ４及びペプチドＧＣＮ４は本開示の二重特異性タンパク質複合体において使用するのに適した結合対であることを見出していた。
【０２３１】
代わりに、いかなる適切な抗体／断片及び抗原（ペプチドなどの）でもＸ及びＹとして用いることができる。好ましくは、そのようなＸとＹの対からは、Ａ−ＸとＹ−Ｂが１対１のモル比で組み合わされると７５％よりも多くのヘテロ二量体が得られる。
【０２３２】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）及び第２の結合パートナー（Ｙ）はタンパク質である。
【０２３３】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はリガンドである又はその逆もまた同じである。
【０２３４】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はその酵素の阻害剤である又はその逆もまた同じである。
【０２３５】
本明細書で用いられる場合「活性断片」とは、アミノ酸断片のことであり、これは実体では全アミノ酸配列よりも少なく、基本的に同じ生物活性又は関連する生物活性、例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの５０％を超える活性を保持している。
【０２３６】
別の実施形態では、第１の結合パートナーＸはグルタチオン（ＧＳＨ）であり第２の結合パートナーＹはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である又はその逆もまた同じである。
【０２３７】
別の実施形態では、ＸはＦｏｓでありＹはＪｕｎである又はその逆もまた同じである。
【０２３８】
別の実施形態では、ＸはＨｉｓでありＹは抗Ｈｉｓである又はその逆もまた同じである。
【０２３９】
別の実施形態では、結合対はカルモジュリン結合ペプチドでありＹはカルモジュリンである又はその逆もまた同じである。
【０２４０】
別の実施形態では、Ｘはマルトース結合タンパク質でありＹは抗マルトース結合タンパク質若しくはその断片である又はその逆もまた同じである。
【０２４１】
他の酵素−リガンド組合せも結合パートナーにおいて使用するために想定している。タンパク質精製のための当技術分野で公知の親和性タグも適切である。なぜならば、これらのタグはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０２４２】
「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示している。「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示している。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンの代わりに用いることができる。多くの場合互いに代わりに用いることが可能な他のアミノ酸には、
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−  システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４３】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
【０２４４】
一実施形態では、第１又は第２の結合パートナー（Ｘ又はＹ）はタンパク質又はペプチドである。
【０２４５】
一実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は１つ又は複数のペプチドリンカーを含む。リンカーは融合タンパク質中の種々の位置に取り込むことができる。例えば、リンカーは結合パートナーとそれに付加されているタンパク質の間に導入することができる。
【０２４６】
一実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。
【０２４７】
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」とは、アミノ酸配列を有するペプチドのことである。一定範囲の適切なペプチドリンカーは当業者には公知であろう。
【０２４８】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の結合パートナーはペプチドリンカーを介してそのそれぞれのタンパク質に結合されている。
【０２４９】
一実施形態では、融合タンパク質は翻訳融合であり、すなわち、融合タンパク質が発現されるもとの遺伝子構築物を含む宿主細胞において発現される融合タンパク質である。
【０２５０】
一実施形態では、融合タンパク質は、任意選択でペプチドリンカーを介して、Ａの重鎖若しくは軽鎖をＸに及び／又はＢの重鎖若しくは軽鎖をＹに融合することにより調製される。
【０２５１】
一実施形態では、ペプチドリンカーは５０アミノ酸長又はそれよりも少なく、例えば、２０アミノ酸又はそれよりも少ない。
【０２５２】
一般に、融合タンパク質を組換え的に発現させるほうが効率的であり、したがって、宿主細胞において発現させることが可能な直接ペプチド結合又はペプチドリンカーが有利である可能性がある。
【０２５３】
一実施形態では、リンカーは配列５から７５に示される配列又はＰＰＰから選択される（表５、６、及び７）。
【表４】
2019500032.tif 000008
【表５−１】
2019500032.tif 000009
【表５−２】
2019500032.tif 000010
【０２５４】
（Ｓ）は配列１７から２０では自由選択である。別のリンカーはペプチド配列ＧＳでもよい。
【０２５５】
強固なリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６９）、ＰＰＰＰ（配列番号７０）及びＰＰＰが含まれる。
【表６】
2019500032.tif 000011
【０２５６】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を産生する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を作製するステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を作製するステップと、
（ｃ）ステップａ）及びｂ）において調製された第１（Ａ−Ｘ）と第２（Ｂ−Ｙ）の融合タンパク質を一緒に混合するステップと
を含む上記方法が提供される。
【０２５７】
典型的にはステップ（ｃ）におけるＡ−ＸとＢ−Ｙの混合は１対１のモル比である。
【０２５８】
一実施形態では、本開示の複合体中で用いられるそれぞれの融合タンパク質は、発現実験において宿主細胞（単数又は複数）での発現により産生される。
【０２５９】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を発現させるステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を発現させるステップと、
を含み、
融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが同じ宿主細胞又は異なる宿主細胞から発現される上記方法が提供される。
【０２６０】
本明細書で用いられる場合異なる宿主細胞とは、同じ種類（同じクローン種でさえ）の細胞を含む、個々の細胞のことである。
【０２６１】
一実施形態では、発現は一過性発現である。一過性発現の使用は、精製に頼らずに二重特異性複合体を生成する能力と組み合わされると極めて有利である。これにより、一過性トランスフェクションは安定なトランスフェクションよりもはるかに簡単であり資源多消費ではないので、二重特異性タンパク質複合体を産生する迅速な方法が得られる。
【０２６２】
一実施形態では、発現は安定な発現である、すなわち、そこでは問題になっている融合タンパク質をコードするＤＮＡは宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれている。
【０２６３】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は水性環境で混合され、例えば、１つの融合タンパク質はビーズ又はプレートなどの固体表面に結合させることができ、もう一方の融合タンパク質は水溶液／懸濁液中でそれに対して導入することが可能である。固相であれば過剰な成分及び試薬は容易に洗い流すことができる。一実施形態では、どちらの融合物も固相に付加されておらず、液体／溶液／培養液中で混合しているだけである。したがって、一実施形態では、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは水性媒体中で遊離のタンパク質として混合している。
【０２６４】
有利なことに、本開示の方法を用いれば、異種対間（すなわち、第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］と第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］の間）で形成され、同種対間（すなわち、２つの第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］間又は２つの第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］間）の相互作用が最小化されている複合体を調製することが可能である。したがって、本方法により、ホモ二量体複合体の混入を最小限にして又はなしで、多数の二重特異性タンパク質複合体を調製することが可能になる。本開示の構築物及び方法の利点は、Ａ−ＸとＢ−Ｙの比がＡ−ＸとＢ−Ｙの特性により制御され、特に、モル比１対１を達成することが可能である点である。この制御の要素は、ある種に先行技術の方法よりも著しい改良点である。
【０２６５】
存在する場合、本開示の二重特異性抗体複合体又は抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、複合体又は抗体分子の提唱されている機能、特に、必要になる可能性のあるエフェクター機能を考慮して、選択することができる。例えば、定常領域ドメインはヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療的使用を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされるときは、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。代わりに、抗体分子が治療目的を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用できることは認識されるであろう。例えば、Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108に記載されている２４１位のセリンがプロリンに交換されているＩｇＧ４分子を使用することができる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。
【０２６６】
抗体は種々の翻訳後修飾を受けることができることも当業者であれば理解するであろう。これらの修飾の種類及び程度は多くの場合、抗体を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に依拠する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変動が含まれる場合がある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基残基（リシン又はアルギニンなどの）の喪失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは非存在でもよい。
【０２６７】
本開示は、上記の１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物であって、例えば、ホモ二量体複合体の混入を最小限にする又はなしで本開示に従ったヘテロ二量体二重特異性複合体を主に含む上記組成物も提供する。
【０２６８】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０２６９】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０２７０】
一実施形態では、形成された複合体は１回の精製ステップ、例えば、カラムクロマトグラフィーを必要とする。
【０２７１】
一実施形態では、方法は、例えば、本開示に従った融合タンパク質の発現後及び融合タンパク質を混合する前に、少なくとも１回の精製ステップをさらに含む。
【０２７２】
一態様では、本開示は、本明細書で定義される融合タンパク質、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、融合タンパク質又は前記二重特異性タンパク質複合体を含む組成物、マルチプレックス、アレイ、ライブラリーに関する。
【０２７３】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は溶液又は懸濁液中にある。
【０２７４】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面上に固定されている。
【０２７５】
一実施形態では、マルチプレックスはアレイの形態、例えば、９６又は３８４ウェルプレートなどのマイクロプレート中にある。そのようなアレイは、所望の機能性を備えた二重特異性タンパク質複合体を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて容易に実行することが可能である。
【０２７６】
別の実施形態では、二重特異性タンパク質複合体はビーズにコンジュゲートされている。
【０２７７】
上で定義される融合タンパク質は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の成分である。一態様では、本開示は本明細書に記載される融合タンパク質に関する。
【０２７８】
一実施形態では、本開示の方法のために入手される又は入手可能な融合タンパク質が提供される。
【０２７９】
一実施形態では、本開示の方法から入手される又は入手可能な二重特異性抗体複合体が提供される。
【０２８０】
本開示は、例えば、本開示の方法において使用するための、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙを複合体化された又は複合体化されていない形態で含むキットにも及ぶ。
【０２８１】
別の実施形態では、キットは使用のための説明書をさらに含む。
【０２８２】
さらに別の実施形態では、キットは１つ又は複数の機能アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
【０２８３】
追加の態様では、ヌクレオチド配列、例えば、上で定義される融合タンパク質及び／又は二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０２８４】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０２８５】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性又は多特異性抗体分子をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０２８６】
本明細書の開示は、適切なプロモーターの制御下で、エフェクター細胞におけるＡ−Ｘの発現のためのなどの、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するのに適したベクターを含む、上に定義されるヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。
【０２８７】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それがすでに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。ベクターの例は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをそこにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、それが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能であり、そこではベクターはそれに続いて宿主ゲノムと一緒に複製される。プラスミドはもっとも一般的に使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、用語「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。
【０２８８】
ベクターを構築することができる一般的な方法、すなわち、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。これに関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０２８９】
本明細書で使用される用語「選択可能なマーカー」とは、その発現によってマーカー遺伝子を含有するベクターを形質転換されている又はトランスフェクトされている細胞を同定することができるようになるタンパク質のことである。広範囲の選択マーカーが当技術分野では公知である。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカーは、例えば、蛍光マーカーなどの視覚的に同定可能なマーカーでも可能である。蛍光マーカーの例には、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその種々のコンジュゲートが含まれる。
【０２９０】
本開示の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本開示の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のためにはいかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも使用することができる。細菌、例えば、大腸菌及び他の微生物系を使用してもよいし、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０２９１】
本開示は、本開示に従った融合タンパク質の産生のための工程であって、本開示のベクターを含有する宿主細胞を、本開示の分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現するのに適した条件下で培養し、分子を単離することを含む上記工程も提供する。
【０２９２】
本開示の二重特異性抗体複合体は、例えば、結合した抗体−抗原複合体の検出を促進する蛍光マーカーにコンジュゲートすることができる。そのような二重特異性抗体複合体は免疫蛍光顕微鏡のために使用することが可能である。代わりに、二重特異性抗体複合体はウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡのためにも使用することができる。
【０２９３】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に従った抗体又は断片）を精製するための工程が提供される。
【０２９４】
一実施形態では、本開示に従った融合タンパク質又は二重特異性タンパク質複合体を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され抗体は非結合画分に維持されるように、アニオン交換クロマトグラフィーを非結合モードで実施するステップを含む、上記工程が提供される。ステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施することができる。
【０２９５】
工程は、例えば、ｐＨ約４〜５で実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕捉ステップをさらに含むことができる。
【０２９６】
工程は、生成物及び工程関連不純物が生成物ストリームから適切に分離されることを確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含むことができる。
【０２９７】
精製工程は、濃縮及びダイアフィルトレーションステップなどの１つ又は複数の限外濾過ステップも含むことができる。
【０２９８】
上で使用される「精製された形態」は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも多い純度などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０２９９】
本明細書の文脈では、「含む（comprising）」は「含む（including）」と解釈するべきである。
【０３００】
ある種の要素を含む開示の態様は、関連する要素「からなる」又は「基本的にからなる」別の実施形態に及ぶことも意図されている。
【０３０１】
本明細書で用いられるプラスの実施形態は本開示の排除的なある種の態様の土台の役を果たすことができる。
【０３０２】
二重特異性複合体に関係する方法の文脈における開示は、複合体それ自体に等しく当てはまり、逆もまた同じである。
【０３０３】
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection. Berger C,  Weber-Bornhauser S,  Eggenberger Y, Hanes J,  Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153
【実施例】
【０３０４】
（例１）
移植Ｔ細胞又はＮＫ細胞を方向付けてがん細胞を死滅させる（図２及び４に図示されている）
本例では、Ａ−ＸはＹ（ＧＣＮ４）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（配列番号９９又は１００に示される配列などのアミノ酸配列を有する５２ＳＲ４）と、スペーサー領域、膜貫通領域及び活性化シグナルをＴ細胞又はＮＫ細胞に送達することができるシグナル伝達領域を含むＡの融合物である。Ａの成分は、Ｔ細胞をがん細胞に向けるのに使用されるキメラ抗原受容体において一般的に使用されており（Nat Revs Drug Discovery 2015: vol 14 p 499-509）、Ｘ−Ａ  配列番号１０９〜１１６に示されるアミノ酸配列を有する成分が可能だと考えられる。Ｂ−Ｙは、Ｙ（配列番号７６〜９８に示されているアミノ酸配列を有するＧＣＮ４ペプチド）に融合されているがん抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。
【０３０５】
Ａ−Ｘ融合ポリヌクレオチド配列は患者への注入のために、Ｔ又はＮＫ細胞に送達されその上でタンパク質発現される。Ａ−Ｘは注入前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はＡ−Ｘを発現している細胞を注入し、その後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。
【０３０６】
Ｂ−Ｙの送達時間及び半減期は、細胞注入及び迅速な標的溶解の副作用を減らすように調整することが可能である。標的化は、Ｂ−Ｙの投与を中止することにより停止させることが可能である。疾患及び処置の経過中、Ｂ−Ｙ中のＢの特異性を変更することが可能である。これにより、腫瘍細胞逃避の場合には第２の腫瘍抗原への移植された細胞の再方向付けを促進する又は処置を終了させるための破壊のために移植細胞を標的とすることが可能になると考えられる。
【０３０７】
移植細胞特異性を送達するこのモジュラーの能力は、ＩｇＧ特異性の捕捉にＣＤ１６を利用する受容体（Cancer Res 2013 74 (1) 93-103）に優る利点を有する。なぜならば、これらはｉｎ  ｖｉｖｏで自己抗体に結合し、したがって、急性自己免疫を発生している自己抗原及び組織に移植Ｔ細胞を向けることが可能だと考えられるからである。一般に好まれる標的化された実体上でのみ発現されるＹに対するＸの特異性は、これを妨げると考えられる。
【０３０８】
（例２）
自己免疫を予防するために移植Ｔ調節細胞を選択された位置に向ける（図１に図示されている）
本例では、Ａ−Ｘは、Ｙ（配列番号７６〜９８に示されるアミノ酸配列を有するＧＣＮ４ペプチド）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（配列番号９９又は１００に示される配列などのアミノ酸配列を有する５２ＳＲ４））と、Ｘの細胞表面発現を促進するスペーサー領域、膜貫通領域を含むＡの融合物である。Ｘ−Ａは配列番号１０５〜１０９に示される配列などのアミノ酸配列を有する。Ｂ−Ｙは、Ｙ（ＧＣＮ４）に融合されている組織特異的抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。
【０３０９】
Ａ−Ｘ融合ポリヌクレオチド配列は患者への注入のために、Ｔ調節細胞に送達されその上でタンパク質発現される。Ａ−Ｘは注入前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はＡ−Ｘを発現している細胞を注入し、その後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。
【０３１０】
Ｂ−Ｙの送達時間及び半減期は、細胞注入及び迅速な標的溶解の副作用を減らすように調整することが可能である。疾患及び処置の経過中、Ｂ−Ｙ中のＢの特異性を変更することが可能である。これにより、異なる部位への移植細胞の再方向付けを促進する又は処置を終了させるための破壊のために移植細胞を標的とすることが可能になると考えられる。
【０３１１】
（例３）
広範な疾患の処置のために造血幹細胞を選択された位置に向けて増殖させる及び分化させる（図１に図示されている）
本例では、Ａ−Ｘは、Ｙ（配列番号７６〜９８に示されるアミノ酸配列を有するＧＣＮ４ペプチド）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（配列番号９９又は１００に示される配列などのアミノ酸配列を有する５２ＳＲ４））と、Ｘの細胞表面発現を促進するスペーサー領域、膜貫通領域を含むＡの融合物である。Ｘ−Ａは配列番号１０５〜１０９に示される配列などのアミノ酸配列を有する。Ｂ−Ｙは、Ｙ（ＧＣＮ４）に融合されている組織特異的抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。
【０３１２】
Ａ−Ｘ融合ポリヌクレオチド配列は患者への注入のために、造血幹細胞に送達されその上で発現される。Ａ−Ｘは注入前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はＡ−Ｘを発現している細胞を注入し、その後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。
【０３１３】
Ｂ−Ｙの送達時間及び半減期は、細胞注入及び迅速な標的溶解の副作用を減らすように調整することが可能である。疾患及び処置の経過中、Ｂ−Ｙ中のＢの特異性を変更することが可能である。これにより、異なる部位への移植細胞の再方向付けを促進する又は処置を終了させるための破壊のために移植細胞を標的とすることが可能になると考えられる。
【０３１４】
（例４）
Ｔ細胞又はＮＫ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで方向付けてがん細胞を死滅させる（図３及び５に図示されている）
本例では、Ａ−Ｘは、Ｙ（ＧＣＮ４）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４））と、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体を含むＡの融合物である。Ｂ−Ｙは、Ｙ（ＧＣＮ４）に融合されている組織特異的抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。
【０３１５】
Ａ−Ｘは送達前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はその後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。これにより、どちらが臨床的にもっとも有益になろうと、エフェクター又は標的細胞の前投与が可能になると考えられる。
【０３１６】
Ａ−ＸとＢ−Ｙのいずれか又は両方の送達時間及び半減期は処置を補完するように調整することが可能である。
【０３１７】
（例５）
自己免疫を予防するためにＴ調節細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで選択された位置に向ける（図３及び５に図示されている）
本例では、Ａ−Ｘは、Ｙ（ＧＣＮ４）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４））と、Ｔ調節細胞に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体を含むＡの融合物である。Ｂ−Ｙは、Ｙ（ＧＣＮ４）に融合されている組織特異的抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。
【０３１８】
Ａ−Ｘは送達前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はその後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。これにより、どちらが臨床的にもっとも有益になろうと、エフェクター又は標的細胞の前投与が可能になると考えられる。
【０３１９】
Ａ−ＸとＢ−Ｙのいずれか又は両方の送達時間及び半減期は処置を補完するように調整することが可能である。
【０３２０】
（例６）
広範な疾患の処置のために造血幹細胞を選択された位置に向けて増殖させる及び分化させる（図３及び５に図示されている）
本例では、Ａ−Ｘは、Ｙ（ＧＣＮ４）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４））と、造血幹細胞に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体を含むＡの融合物である。Ｂ−Ｙは、Ｙ（ＧＣＮ４）に融合されている組織特異的抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。
【０３２１】
Ａ−Ｘは送達前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はその後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。これにより、どちらが臨床的にもっとも有益になろうと、エフェクター又は標的細胞の前投与が可能になると考えられる。
【０３２２】
Ａ−ＸとＢ−Ｙのいずれか又は両方の送達時間及び半減期は処置を補完するように調整することが可能である。
【０３２３】
（例７）
スクリーニングのための複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂの使用
スクリーニングのための複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂの形成を使用して、例１から６の臨床シナリオを模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて分子の最適組合せをスクリーニングするためにＢ−Ｘ中の異なるＢ分子及びＡ−Ｙ中の異なるＡ分子を多数作製することが可能である。これにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞方向付け及び機能のための二重特異性フォーマットでの最適Ａ及びＢ分子の選択が促進されると考えられる。
【０３２４】
（例８）
神経変性及び／又は神経炎症疾患の処置のために血管脳関門を通過して抗体特異性を中枢神経系（ＣＮＳ）標的に向けることが可能な細胞を利用する（図３及び５に図示されている）
本例では、Ａ−Ｘは、Ｙ（ＧＣＮ４）に対する結合特異性を有するＸ（ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４））と、血管脳関門を越えることができるエフェクター細胞に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体を含むＡの融合物であり、或いはＡは血管脳関門を越えることができるエフェクター細胞の表面でのＸの発現を促進するタンパク質である。これらのエフェクター細胞はＢ−Ｙの積荷を運ぶように作用する。Ｂ−Ｙは、Ｙ（ＧＣＮ４）に融合されているＣＮＳ発現された抗原に対して特異的な抗体又は抗体断片若しくは誘導体であるＢの融合物である。ＣＮＳでのＢのその標的抗原への結合は治療効果を与える。
【０３２５】
Ａ−Ｘは送達前にＢ−Ｙとプレ複合体化することが可能である、又はその後にＢ−Ｙを患者に送達してＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで形成させることが可能である。これにより、臨床効果のためのガイダンス細胞の最適投与が可能になると考えられる。
【０３２６】
Ａ−ＸとＢ−Ｙのいずれか又は両方の送達時間及び半減期は処置を補完するように調整することが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０３２７】
配列番号１：＜２２３＞ＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）配列
配列番号２：＜２２３＞コードするＤＮＡ
配列番号３：＜２２３＞５２ＳＲ４  ｄｓ  ｓｃＦｖ配列
配列番号４：＜２２３＞コードするＤＮＡ
配列番号５〜１３：＜２２３＞柔軟なペプチドリンカー
配列番号１４〜２１：＜２２３＞柔軟なリンカー
配列番号２２：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２３：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２４：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２５：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２６：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２７〜５４：＜２２３＞柔軟なリンカー
配列番号５５〜６８：＜２２３＞リンカー
配列番号６９〜７０：＜２２３＞ペプチド配列
配列番号７１〜７５：＜２２３＞リンカー
配列番号７６〜９８：＜２２３＞ＧＣＮ４ペプチド変異体
配列番号９９〜１００：＜２２３＞５２ＳＲ４  ｓｃＦＶ変異体
配列番号１０１〜１０４：＜２２３＞シグナル配列
配列番号１０５〜１１６：＜２２３＞膜貫通領域および細胞内領域を有するＸ−Ａ融合物
【図１】
2019500032.tif 000012
【図２】
2019500032.tif 000013
【図３】
2019500032.tif 000014
【図４】
2019500032.tif 000015
【図５】
2019500032.tif 000016
【配列表】
2019500032000001.app
【国際調査報告】
2019500032.tif 000017
2019500032.tif 000018
2019500032.tif 000019
2019500032.tif 000020