(57)【要約】本発明は、固相対象物を利用した核酸抽出方法に関するものであって、該対象物内で核酸試料とイミドエステル化合物との間の複合体を形成させることにより、従来の核酸抽出方法に比べて、より簡単でありながらも、低コストで多量と高純度との核酸を分離し、特に、核酸の抽出に利用する薄膜装置は、従来のシリコン基板に比べて、親水性が向上することにより、より効率的に核酸を抽出することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）と、
前記改質された対象物上に核酸試料と下記化学式１で表される化合物とを注入し、核酸と前記化合物との間の複合体を形成させる段階（第２段階）と、
前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第３段階）と、
を含む核酸抽出方法。
【化１】
2019516380.tif 000011
前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【請求項２】
前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記対象物は、薄膜装置、磁性ビーズまたはナノ粒子のうち何れか１つであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
前記核酸は、メチル化されたＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項６】
前記改質は、対象物内にシラン化合物を流入させて改質することを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項７】
前記シラン化合物は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）であることを特徴とする請求項６に記載の核酸抽出方法。
【請求項８】
前記第１段階以前に対象物にプラズマ処理を通じて洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項９】
前記核酸試料は、真核細胞、バクテリア細胞、ウイルス細胞、全血または尿由来の試料であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１０】
前記第２段階で改質された対象物上にタンパク質分解酵素及び溶出緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項１１】
入口ホールと出口ホールとがそれぞれ貫設された上部薄膜と、
前記上部薄膜から離隔配置された下部薄膜と、
その入口端及び出口端が、前記上部薄膜の入口ホール及び出口ホールにそれぞれ対応して連通するマイクロチャネルが内側にパターン形成され、前記マイクロチャネルの入口部と連通する注入路が、前記入口端に隣接して形成され、前記上部薄膜と下部薄膜との間に配されるマイクロチャネルチャンバと、
前記上部薄膜及び下部薄膜の各側部を密封して、前記マイクロチャネルチャンバを密封させる密封手段と、
を含む核酸抽出用薄膜装置。
【請求項１２】
前記上部薄膜の入口ホールと前記マイクロチャネルの入口端とを連通する第１チュービングアダプダと、
前記上部薄膜の出口ホールと前記マイクロチャネルの出口端とを連通する第２チュービングアダプダと、
をさらに含む請求項１１に記載の核酸抽出用薄膜装置。
【請求項１３】
前記上部薄膜の入口ホールを通じて、前記マイクロチャネルの入口端には、下記化学式１で表される化合物を注入し、
前記マイクロチャンバの注入路を通じて核酸サンプルを注入することを特徴とする請求項１１に記載の核酸抽出用薄膜装置。
【化２】
2019516380.tif 000012
前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【請求項１４】
前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸抽出用薄膜装置。
【請求項１５】
前記マイクロチャネルは、複数回折り曲げられるようにパターンされたことを特徴とする請求項１１から請求項１４のうち何れか一項に記載の核酸抽出用薄膜装置。
【請求項１６】
前記マイクロチャネルは、拡張された断面を有する複数の拡張部と、前記拡張部よりも縮小された断面を有する複数の縮小部と、を含むが、
前記拡張部と縮小部は、交互に配されたことを特徴とする請求項１５に記載の核酸抽出用薄膜装置。
【請求項１７】
下記化学式１で表される化合物を有効成分として含む核酸抽出効率増進用組成物。
【化３】
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前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【請求項１８】
前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸抽出効率増進用組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、タンパク質分解酵素及び溶出緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項１７に記載の核酸抽出効率増進用組成物。
【請求項２０】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１７に記載の核酸抽出効率増進用組成物。
【請求項２１】
請求項１７から請求項２０のうち何れか一項に記載の組成物を含む核酸抽出効率増進用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相対象物を利用した核酸抽出方法に係り、より詳細には、多様な真核細胞、バクテリア細胞、ウイルス細胞、または体液（ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ）を含んだ核酸供給源から簡便な方法で核酸を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、疾病状態を確認するための重要な分析手段であり、ＤＮＡ生体標識子（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、突然変異またはＤＮＡメチル化は、研究者が癌の原因を探すように助け、疾病の初期段階の間の疾病の状態を診断し、観察することはもとより、予後と監視とに対する大きな機会の提供に重要な糸口を提供する。
【０００３】
ＤＮＡのような核酸は、タンパク質のような他の成分に比べて、非常に低い生理的濃度で存在するために（例えば、全血マイクロリットル当たり数十ナノグラムのＤＮＡ対数十マイクログラムのタンパク質）、臨床試料からＤＮＡを効果的に抽出し、予備濃縮することは、増幅及び検出のような以後の工程に非常に重要である。メチル化されたＤＮＡ（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ）の場合には、このような問題はさらに重要である。
【０００４】
ＤＮＡメチル化（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、正常な真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）内で遺伝子発現及び染色質組織化の調節に決定的役割を果たす。ＤＮＡメチル化は、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）環の５−炭素上にメチル基を共有添加することにより、発生し、５−メチルシトシンを生成する。このようなメチル基は、ＤＮＡの主溝（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）に突出して転写を効果的に阻害する。
【０００５】
哺乳動物ＤＮＡで、５−メチルシトシンは、ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）の約４％で、主にシトシン−グアノシンジヌクレオチド（ＣｐＧｓ）から発見される。そのようなＣｐＧ部位は、ヒトゲノム全体において予想される頻度よりもさらに低く発生するが、ＣｐＧ島と称される小さな長さのＤＮＡでは、さらに頻繁に発見される。
【０００６】
このような島は、転写が始まる所である、遺伝子のプロモーター部位内または付近で典型的に発見される。ほとんどＣｐＧ部位が多くメチル化されたゲノムＤＮＡとは異なって、生殖細胞系列組織（ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ）で、及び正常な体細胞のプロモーターでのＣｐＧ島は、非メチル化されたまま残っており、遺伝子発現を引き起こす。
【０００７】
ＤＮＡメチル化は、非常に関連したＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素（ＤＮＭＴ）群によって仲裁され、これらは、メチル基をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンに伝達する。ＤＮＭＴによって確立されたメチルシトシンは、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質ＭｅＣＰ２、ＭＢＤに対する結合部位として作用する。
【０００８】
ヒストン脱アセチル化酵素、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、及びＡＴＰ−依存性染色質リモデリング酵素（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）との相互作用を通じて、ＭＢＤは、転写に抑圧的なコンパクト化された染色質環境でメチル化されたＤＮＡを翻訳する。特に、ＭＢＤは、ＭｅＣＰ２タンパク質のメチルＣｐＧ結合ドメインであり、これは、任意の配列にある対称的にメチル化されたＣｐＧｓに結合し、メチル化依存性転写抑制の仲栽に参加する。たとえＭｅＣＰ２が生体内で独占的にメチル化されたＤＮＡ断片物に結合するという強力な証拠があるとしても、試験管で、ＭｅＣＰ２のＤＮＡメチル化−独立的結合活性が、また一致的に文書に説明されており、これは、一般的な試験管内のＤＮＡ分析に適切に使われる。
【０００９】
最近、生命工学を含めた診断医学、薬物医学、代謝医学など多様な分野で高純度に精製された核酸の使用量が増えることによって、多様な生物試料からより迅速かつ純粋に核酸を分離しようとする努力が続いている。
【００１０】
しかし、現在まで核酸の分離方法において、最も大きく発展した部分は、誘電体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、タンパク質、細胞残骸粒子など細胞溶解溶液内に含まれた多種の物質から特異的に核酸のみを吸着させる担体に関する技術などほとんどの研究の焦点は、核酸を吸着させる物質に関する研究と開発とに集中されている限界があった。
【００１１】
これにより、より迅速かつ純粋に核酸を分離するために、なによりも細胞残骸粒子とタンパク質変性凝集物、他の多様な細胞分解物質から迅速に所望の核酸のみを分離することができる技術の開発が切実な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、従来方式であるキアゲンを含んだ核酸抽出時に、大型装備（遠心分離機及び磁石など）が必要なあらゆる商用化キットを利用した核酸抽出方法に比べて、簡単でありながらも、低コストで多様な核酸供給源から多量と高純度との核酸を抽出することができる抽出方法及び装置を提供するところにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を果たすために、本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；前記改質された対象物上に核酸試料と下記化学式１で表される化合物とを注入し、核酸と前記化合物との間の複合体を形成させる段階（第２段階）；及び前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第３段階）；を含む核酸抽出方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、入口ホールと出口ホールとがそれぞれ貫設された上部薄膜；前記上部薄膜から離隔配置された下部薄膜；その入口端及び出口端が、前記上部薄膜の入口ホール及び出口ホールにそれぞれ対応して連通するマイクロチャネルが内側にパターン形成され、前記マイクロチャネルの入口部と連通する注入路が、前記入口端に隣接して形成され、前記上部薄膜と下部薄膜との間に配されるマイクロチャネルチャンバ；及び前記上部薄膜及び下部薄膜の各側部を密封して、前記マイクロチャネルチャンバを密封させる密封手段；を含む核酸抽出用薄膜装置を提供する。
【００１５】
また、本発明は、下記化学式１で表される化合物を有効成分として含む核酸抽出効率増進用組成物を提供する。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
前記式において、ｎは、５〜７の整数である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による核酸抽出方法を利用すれば、多様な真核細胞、バクテリア及びウイルス細胞、または体液を含んだ核酸供給源から簡便でありながらも、迅速に核酸を抽出するだけではなく、核酸抽出時に、薄膜装置を利用する場合、従来のシリコン基板に比べて、親水性が向上することにより、より効率的に核酸を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】薄膜を利用した核酸抽出用同型二機能性イミドエステル［ＨＩＮＴ］システムの原理を示す模式図である。
【図２】薄膜装置の構成を示す分解図である。
【図３】ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）の濃度変化によるＤＮＡ抽出効率を示す図面である。
【図４】乳癌細胞を用いて、従来のキアゲンキットと本発明によるＤＴＳ分析、そして、ＤＴＳ分析時に使われるＤＭＳと類似した化合物であるジメチルアジプイミデート（ＤＭＡ）を利用した分析によるＤＮＡ抽出効率を示す図面である。
【図５】本発明によるＤＴＳ分析、ＤＴＳ分析時に使われるＤＭＳと類似したＤＭＡとを利用した分析によって抽出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅効率を示す図面である。
【図６】マイクロ流体チャンバを具体的に示す図面である。
【図７】ＨＩＮＴシステムに適用してＲＮＡ及びＤＮＡ抽出した結果を示す。ＨＩｓ［ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）及びジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）］の有無による注入ＤＮＡ（１μｇのヒトゲノミクスＤＮＡ）の回収率を測定結果（Ａ）、ＤＭＳ濃度（１００、５０、２０、ａｎｄ  １０ｍｇ／ｍｌ）を異ならせて、癌細胞から抽出したＤＮＡの量（Ｂ）及び純度（Ｃ）、システムから抽出された２種の濃度（１×１０３及び１×１０６）のＲＮＡで１８Ｓ遺伝子増幅を行った結果（Ｄ）、ＤＭＳ濃度（５０〜２５０ｍｇ／ｍｌ）によって、システムから抽出されたＤＮＡでＡｃｔｉｎ遺伝子増幅を行った結果（Ｅ）。Ｌ：ＤＮＡ  ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒ、Ｑ：Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔで抽出したＲＮＡ、Ｎ：陰性対照群。
【図８】癌細胞のＲＮＡ抽出にＨＩＮＴシステムを適用した結果を示す。（Ａ）ＡＧＳ（胃癌細胞株）、（Ｂ）ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞株）及び（Ｃ）ＭＣＦ７（乳癌細胞株）の結果である。（Ｄ）抽出されたＲＮＡから１８Ｓ遺伝子をＰＣＲ増幅した結果である。（Ｅ）単一段階逆転写ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＨＣＴ１１６細胞の濃度によるサイクル数（ＣＴ）を確認した結果である。
【図９】癌細胞のＤＮＡ抽出にＨＩＮＴシステムを適用した結果を示す。（Ａ）ＡＧＳ（胃癌細胞株）及び（Ｂ）ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞株）の結果である。（Ｃ）ＨＣＴ１１６細胞の濃度によって、ＤＭＳを適用してＨＩＮＴシステムから抽出されたＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲサイクル数を確認した結果である。（Ｄ）Ｅ．ｃｏｌｉ濃度を異ならせて、ＨＩＮＴシステムから抽出されたＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。
【図１０】ＨＩＮＴシステムに臨床サンプルを適用した結果を示す。（Ａ）重症熱性血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）患者の血しょうからウイルスＲＮＡを抽出した結果である。（Ｂ）ツツガムシ病（ＳＴ）患者の血清からバクテリアＤＮＡを抽出した結果。
【図１１】ＨＩＮＴシステムにＤＭＡ、ＤＭＰまたはＤＭＳを適用時に、ＤＮＡ増幅効率を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２１】
本発明の発明者らは、核酸試料から核酸を分離及び抽出することができる抽出方法を開発して、核酸試料と下記化学式１で表される化合物との間の複合体を形成させることにより、従来の核酸抽出方法に比べて、より簡単でありながらも、低コストで多量と高純度との核酸を分離し、大型装備を使用せずとも、現場即時型診断が可能であることを明らかにして、本発明を完成した。
【００２２】
本発明は、対象物にアミン基を導入して改質する段階（第１段階）；前記改質された対象物上に核酸試料と下記化学式１で表される化合物とを注入し、核酸と前記化合物との間の複合体を形成させる段階（第２段階）；及び前記複合体が形成された対象物に溶出緩衝液を処理して核酸を抽出する段階（第３段階）；を含む核酸抽出方法を提供する。
【００２３】
【化２】
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【００２４】
前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【００２５】
望ましくは、前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数である。
【００２６】
前記対象物は、薄膜装置、磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）のうち何れか１つであり、これに制限されるものではない。
【００２７】
前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのうち何れか１つを含み、これに制限されるものではない。
【００２８】
前記核酸は、メチル化されたＤＮＡを含み、これに制限されるものではない。
【００２９】
前記改質は、対象物内にシラン化合物を流入させて改質し、これに制限されるものではない。
【００３０】
前記シラン化合物は、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＡＰＴＥＳ）であり、これに制限されるものではない。
【００３１】
前記第１段階以前に対象物にプラズマ処理を通じて洗浄する段階をさらに含み、これに制限されるものではない。
【００３２】
前記第２段階及び第３段階の間に、前記複合体が形成された対象物を洗浄する段階をさらに含み、これに制限されるものではない。
【００３３】
前記核酸試料は、真核細胞、バクテリア細胞、ウイルス細胞、全血または尿由来の試料であり、これに制限されるものではない。
【００３４】
前記第２段階で改質された対象物上にタンパク質分解酵素及び溶出緩衝液をさらに含み、これに制限されるものではない。
【００３５】
また、本発明は、入口ホールと出口ホールとがそれぞれ貫設された上部薄膜；前記上部薄膜から離隔配置された下部薄膜；その入口端及び出口端が、前記上部薄膜の入口ホール及び出口ホールにそれぞれ対応して連通するマイクロチャネルが内側にパターン形成され、前記マイクロチャネルの入口部と連通する注入路が、前記入口端に隣接して形成され、前記上部薄膜と下部薄膜との間に配されるマイクロチャネルチャンバ；及び前記上部薄膜及び下部薄膜の各側部を密封して、前記マイクロチャネルチャンバを密封させる密封手段；を含む核酸抽出用薄膜装置を提供する。
【００３６】
前記上部薄膜の入口ホールと前記マイクロチャネルの入口端とを連通する第１チュービングアダプダ；及び前記上部薄膜の出口ホールと前記マイクロチャネルの出口端とを連通する第２チュービングアダプダ；をさらに含みうる。
【００３７】
前記上部薄膜の入口ホールを通じて、前記マイクロチャネルの入口端には、下記化学式１で表される化合物を注入し、前記マイクロチャンバの注入路を通じて核酸サンプルを注入することができる。
【００３８】
【化３】
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【００３９】
前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【００４０】
望ましくは、前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数である。
【００４１】
前記マイクロチャネルは、複数回折り曲げられるようにパターンされうる。
【００４２】
前記マイクロチャネルは、拡張された断面を有する複数の拡張部と、前記拡張部よりも縮小された断面を有する複数の縮小部と、を含むが、前記拡張部と縮小部は、交互に配置される。
【００４３】
以下、本発明の図面を根拠にして、本発明をより詳細に説明する。
【００４４】
本発明による核酸分析は、薄膜装置内でＤＭＳを利用した核酸分析であるＤＴＳ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ／Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  Ｓａｍｐｌｅ）分析であって、試料溶出／培養、洗浄及び溶出の３つの段階を含んでおり、遠心分離せずに行う。例えば、シラン化合物として３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を通じて薄膜装置を改質し、このような改質によって、疎水性である薄膜装置を親水性に転換させる。
【００４５】
前記改質された薄膜装置上に核酸試料、及び溶出緩衝液とＤＭＳ溶液とを注入する。前記核酸のアミノ基とＤＭＳの二機能性アミン反応基との相互作用による核酸とＤＭＳとの間に架橋メカニズムを用いて、核酸とＤＭＳとの間の複合体を形成させ、試料からＤＮＡを抽出することができる。
【００４６】
また、本発明は、下記化学式１で表される化合物を有効成分として含む核酸抽出効率増進用組成物を提供する。
【００４７】
【化４】
2019516380.tif 000006
【００４８】
前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【００４９】
望ましくは、前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数である。
【００５０】
前記組成物は、タンパク質分解酵素及び溶出緩衝液をさらに含み、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、これに制限されるものではない。
【００５１】
また、本発明は、前記組成物を含む核酸抽出効率増進用キットを提供する。
【００５２】
一方、本発明で使われた化学式１で表される化合物は、二機能性イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓ）を含んでいるために、本明細書では、同型二機能性イミドエステル（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓ；ＨＩｓ）とも名付け、前記ＨＩｓは、核酸と迅速かつ強く互いに結合して複合体を形成し、アミン反応性基に改質された対象物の表面に捕獲されて、高効率の核酸抽出が可能である。
【００５３】
【化５】
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【００５４】
前記式において、ｎは、５〜１０の整数である。
【００５５】
望ましくは、前記化学式１で表される化合物で、ｎは、５〜７の整数である。
【００５６】
本発明で使用したＨＩｓは、ジメチルピメリミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ；ＤＭＰ）及びジメチルスベルイミデート（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ；ＤＭＳ）であり、これと化学構造が類似した化合物であるジメチルアジプイミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ；ＤＭＡ）を使用して比較実験を行った。ＤＭＰ（化学式２）、ＤＭＳ（化学式３）及びＤＭＡ（化学式４）の化学構造は、次の通りである。
【００５７】
【化６】
2019516380.tif 000008
【００５８】
【化７】
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【００５９】
【化８】
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【００６０】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００６１】
＜実施例１＞薄膜装置製作及び前処理
【００６２】
１．薄膜装置製作
【００６３】
レーザカットティング機器（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて容易にかつ迅速に本発明の薄膜装置を製作した［図２参照］。まず、前記薄膜装置は、上部薄膜と下部薄膜、そして、上部薄膜と下部薄膜との間に挿入されたマイクロ流体チャンバで構成され、前記マイクロ流体チャンバは、核酸供給源からＤＮＡを抽出するために、チャンバ内の流路によって互いに連結された多数のスロット型マイクロウェルからなっている。
【００６４】
前記マイクロ流体チャンバを製作するために、３００μｍの厚さの両面テープ（１００μｍの厚さの両面テープの間に挟持された１００μｍの厚さのポリエステル膜）にマイクロ流体チャンバデザインをレーザカットティング機器で切断してマイクロ流体チャンバを製作した。薄膜（上部及び下部）は、レーザカットティング機器を用いてマイクロ流体チャンバと同じ寸法で切断した。
【００６５】
前記上部薄膜に貫通孔である入口（ｉｎｌｅｔ）と出口（ｏｕｔｌｅｔ）とを製作した。レーザカットティングマイクロ流体チャンバの上部及び下部の表面に永久接着剤を用いて、それぞれレーザカットティング薄膜（上部及び下部）を接着させた。前記マイクロ流体チャンバの高さは、約３００μｍであり、総体積は、３００μlであった（３００μlの量、８．４ｃｍ×３．７ｃｍ）。
【００６６】
核酸供給源を注入するためのチュービングアダプダは、３ｍｍの厚さを有するキャストアクリルシート（ＭＡＲＧＡ  ＣＩＰＴＡ、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）を両面テープの一面に付着し、レーザカットティング機器で切断及び穿孔して製造した。前記製造されたチュービングアダプダは、マイクロ流体チャンバの流入口と排出口とにそれぞれ付着した。以後、あらかじめ切断されたタイゴンチュービング（ＡＡＣ０２５４８；Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＵＳＡ）をアダプダの孔に位置させた後、エポキシを使用して密封した。
【００６７】
このように製作された薄膜装置は、多様な容量の核酸試料（１００μl、３００μl、及び５００μl）を処理することができるという長所がある。
【００６８】
２．薄膜装置前処理
【００６９】
前記薄膜装置を利用したＤＮＡ分析のために、薄膜装置内部を１０分間酸素プラズマで処理した後、前記プラズマ処理された薄膜装置を６５℃で１０〜６０分間２％  ３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含有した水溶液に浸漬させた後、脱イオン水で完全に洗浄した。洗浄後、薄膜装置を硬化（ｃｕｒｅ）させるために、前記洗浄された薄膜装置を迅速に窒素気流下で乾燥させて、薄膜装置をアミンで改質した。
【００７０】
Ｄｒｏｐ  Ｓｈａｐｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＤＳＡ１００、ＫＲＵＳＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用したアミン改質された薄膜装置の水接触角の測定を通じて温度及び培養時間によって薄膜装置の親水性が非常に変化したことが分かった。６５℃で１０分間前記薄膜装置をＡＰＴＥＳでシラン化（ｓｉｌａｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、前記薄膜表面の親水性は増加した（約３０〜４０℃）。
【００７１】
＜実施例２＞ＤＴＳ分析
【００７２】
本発明では、予め製作された薄膜装置にジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）を適用した核酸分析法をＤＴＳと名付け、以下、実験でＤＴＳ分析を行った。
【００７３】
すなわち、前記アミンで改質された薄膜装置（３００μlの量、８．４ｃｍ×３．７ｃｍ）を用いてＤＮＡを抽出するために、先に最適化された分析溶液を準備した。前記最適化された分析溶液は、１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．０）を含有する溶出緩衝液、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、１０％のトリトンＸ−１００をＤＭＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）と混合して準備した後、核酸分析試料として細胞、バクテリア、血液または尿由来の各試料１００μlを前記分析溶液２００μlと混合した。
【００７４】
前記混合された核酸分析試料と分析溶液とが混合された混合液をアミンで改質された薄膜装置の上部基板入口に流入させ、マイクロ流体チャンバ内に前記混合液が移動しながら、ＤＭＳの２個のアミン基とＤＮＡとが結合し、また、薄膜装置内の改質されたアミン基とＤＮＡとが結合して複合体を形成してＤＮＡを分離することができた。この際、薄膜装置は、核酸分析試料からＤＮＡを十分に抽出するために、２０分間恒温（５６℃）を保持した培養器またはコントローラ（Ａｌｐｈａ  Ｏｍｅｇａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を含んだ熱電冷却器（ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｏｌｅｒ；ＴＥＣ）のうち何れか１つに置いておいた。
【００７５】
ＤＭＳ−ＤＮＡ複合体のうち、異物を除去するために、ＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（１０ｍＭの重炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．６）を使用してＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの量と純度とを測定した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて２６０ｎｍ（ＤＮＡ）及び２８０ｎｍ（タンパク質）での試料の光学密度の比率を決定した。従来のＤＮＡ抽出法と本発明のＤＴＳ分析とを比較するために、知られた方法（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用して分析した。
【００７６】
図３のように、ＤＭＳ濃度別にＤＮＡ結合力を確認した結果、ＤＭＳ濃度が５０〜１００ｍｇ／ｍｌである時、ＤＮＡ結合効率が最も高いと確認された。
【００７７】
＜実施例３＞ＤＴＳ分析を利用した真核細胞からのＤＮＡ抽出
【００７８】
５％  ＣＯ２雰囲気、３７℃の湿った培養器で１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）を補充した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のプラスチック培養プレートで６個の真核細胞（ＭＣＦ−７（乳房）、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（肺）、ＣａＣｏ−２（大腸）、Ｔ２４（膀胱）、Ｕ９３７（リンパ球）及びＪｕｒｋａｔ（末梢血液））をそれぞれ培養した後、実施例２と同じ方法で真核細胞からＤＮＡを抽出するが、ゲノムＤＮＡを抽出するために、タンパク質分解酵素であるプロテイナーゼＫを処理した。そして、比較のために、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキットを用いて真核細胞からＤＮＡを抽出した。
【００７９】
ＤＮＡの量と純度とを確認するために、Ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ＰＣＲ）を行った。一部の遺伝子（ＨＲＡＳ、Ａｃｔｉｎ及びＲＡＲβ）の順方向及び逆方向プライマーを約２４塩基対の正常長さで合成した。Ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲは、１５分間９５℃で初期変性段階；９５℃、４５秒、５９℃、４５秒（ＲＡＲβ）、及び７２℃、４５秒の４５サイクル；及び７２℃、１０分間最終延長段階からなっている。５〜１０μlのＤＮＡを１×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、２５ｐｍｏｌの各プライマー、及びＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１ユニットを含む総体積２５μlで増幅した。リアルタイムＰＣＲ分析のために、次の段階がＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス）から提供された方法を下記のように変形した。５〜１０μlのＤＮＡを４μlのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒミックス、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１×ＰＣＲ緩衝液２μl（キアゲン）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、及び蒸溜水を含む総体積２０μlで増幅した。９５℃で１０分間最初に予備処理した後、９５℃、１０秒、５８℃、３０秒（ＨＲＡＳ及びアクチン遺伝子に対して）、及び１０秒間７２℃を５０サイクルを行い、３０秒間４０℃で冷却段階を経た。ＳＹＢＲ緑色信号を有した増幅された生成物は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行った。
【００８０】
抽出されたＤＮＡからＲＡＲβの後成学的変異を調査するために、前記ＤＮＡを単一反応チューブで２０分間３７℃でＭｓｐＩまたはＨｐａＩＩ溶液（１５０μl）のうち何れか１つと混合してＤＮＡを分解した。前記分解工程後、制限酵素の不活性化のために、前記単一反応チューブを１０分間８０℃で放置した。前記不活性化工程によって、前記分解されたＤＮＡは、従来のＰＣＲを使用して量分析で得たＲＡＲβ遺伝子の後成学的分析のために、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用した。
【００８１】
一方、乳癌細胞を用いて、従来のキアゲンキットと本発明によるＤＴＳ分析、そして、ＤＴＳ分析時に使われるＤＭＳと類似した化合物であるＤＭＡを利用した分析によるＤＮＡ抽出効率を比較分析した結果、図４のように、ＤＭＳを利用した分析では、ＤＮＡと結合して乳癌細胞からＤＮＡを抽出することができたが、一方、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）を利用した分析では、乳癌細胞からＤＮＡを抽出することができなかった。
【００８２】
そして、図５のように、ＤＭＳを用いて抽出したＤＮＡをＰＣＲ増幅した結果、ＤＭＡを利用した分析に比べて、増幅効率が２５％向上した。
【００８３】
＜実施例４＞ＤＴＳ分析を利用したバクテリア細胞からのＤＮＡ抽出
【００８４】
バクテリア細胞でＤＴＳ分析能を確認するために、ＤＴＳ分析を用いて抽出されたＤＮＡを使用して、ＰＣＲ基盤のＤＮＡ増幅を実施した。あらゆるプライマーは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、マイコバクテリウムアブセサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウムゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）及びサルモネラ菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｔｒａｉｎｓ）（サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｎｅｗｐｏｒｔ）、及びサルモネラ・セントポール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓａｉｎｔｐａｕｌ））の常用プライマーを使用した。
【００８５】
最適化の反応のために、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）を含有する溶出緩衝液、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、１０％のトリトンＸ−１００及びリゾチーム２０ｍｇ／ｍＬをＤＭＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。本発明のＤＴＳ方法の有効性を検証するために、一般的なＰＣＲを行った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１ブルー菌株を５０μl／ｍｌのテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）とＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地に接種し、シェイキング状態（ｓｈａｋｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で３７℃で一日間培養し、１０３〜１０７のコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）の試料を試験のために使用した。ＤＴＳ分析及びキアゲンキット分析で使用するために、培養させた大腸菌、マイコバクテリウムアブセサス、マイコバクテリウムゴルドネ及びサルモネラ菌株（サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・ニューポート、及びサルモネラ・セントポール）からバクテリアＤＮＡを抽出した。
【００８６】
バクテリア遺伝子の遺伝学的分析のために、ＤＴＳ分析及びキアゲンキット分析から抽出されたＤＮＡ２μlを１×ＰＣＲ緩衝液（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２５ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸、各プライマー２５ｐｍｏｌ、及びＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素１ユニットを含む総体積２５μlを使用して、１５分間９５℃で増幅した；９５℃、３０秒、６０℃、３０秒（マイコバクテリウムアブセサス、マイコバクテリウムゴルドネ及びサルモネラ菌株）及び７２℃、３０秒の４５サイクル；及び７２℃、７分間最終延長段階。ＰＣＲ増幅物は、ＰＣＲ生成物を臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）（シグマアルドリッチ）を含有した２％アガロースゲル上から分離するゲル電気泳動法で可視化された。前記ゲルは、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して可視化された。ＤＮＡ濃度及び純度の測定は、ＵＶ分光分析器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で行われた。
【００８７】
＜実施例５＞ＤＴＳ分析を利用したヒト体液からのＤＮＡ抽出
【００８８】
ヒトの体液でＤＴＳ分析能を検証するために、体液試料２００μl（全血及び尿）を前記薄膜装置に流入してＤＮＡを抽出した。まず、予め製作された薄膜装置内にプロテイナーゼＫとＤＭＳとを含んだ溶出緩衝液と体液試料とをそれぞれ流入した後、マイクロチャネルチャンバに移動させて、体液試料内のＤＮＡとＤＭＡとの間の複合体を形成させた後、実施例２と同じ方法でＤＮＡを抽出した。この際、溶出緩衝液と体液試料は、シリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）を使用して２個の他の入口にそれぞれ１．５ｍｌ／ｈｒの流速で１０分間流入させ、ＤＮＡの抽出及び精製のために、カートリッジを２０分間５６℃で培養した。そして、シリンジポンプによるＰＢＳ緩衝液流入のための入口の流速は、４ｍｌ／ｈｒで１０分間増加させた。最後に、抽出されたＤＮＡを１００μlの溶出緩衝液で溶出した。また、比較のために、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ヒルデン、ドイツ）を使用したゲノムＤＮＡの抽出に２００μlの全血または尿を使用した。あらゆる抽出されたＤＮＡは、ＵＶ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によってＤＮＡ濃度及び純度が決定された。
【００８９】
＜実施例６＞薄膜微細流体プラットフォームを利用した核酸抽出において、同型二機能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）イミドエステルの適用（ＨＩＮＴ戦略）
【００９０】
本発明者らは、以前実施例を通じて、薄膜装置内でＤＭＳを利用した核酸分析であるＤＴＳ分析を通じて、真核細胞または原核細胞を含む多様な試料からＤＮＡを抽出して分析した。
【００９１】
また、本発明者らは、薄膜−基盤の微細流体プラットフォームを使用してＲＮＡ及びＤＮＡをいずれも抽出することができる、薄膜を利用した核酸抽出用同型二機能性イミドエステル［ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓ（ＨＩｓ）ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍｓ；ＨＩＮＴ］システムを開発した（図６）。同型二機能性イミドエステル（ＨＩｓ）としては、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）及びジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）が使われ、メチルレン基及び二機能性イミドエステルギからなっている（図６Ａ）。薄膜−基盤の微細流体プラットフォームでは、単一チャネル上でサンプル溶解（ｌｙｓｉｓ）、洗浄及び溶出がなされた。ＨＩＮＴシステムを用いてサンプルからＲＮＡ及びＤＮＡを抽出するために、サンプル混合液、溶解緩衝液及びＨＩｓ（ＤＭＳまたはＤＭＰ）をピペットでシステムに注入しだが、前記システムは、核酸及びＨＩｓ複合体を捕獲するために、表面をアミン反応性基であらかじめ活性化させて使用した（図６Ｂ）。その後、ＲＮＡ抽出のためには、常温で１０〜２０分反応させ、ＤＮＡ抽出のためには、５６℃で２０分間反応させた。反応後、洗浄及び溶出過程を通じて核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を抽出することができた。
【００９２】
一方、ＨＩＮＴシステムが、核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）の抽出に有用に使われるか否かを確認するために、多様な癌細胞株及びバクテリア細胞株でシステムの基本的な特性を確認した。図７Ａでは、ＨＩｓ（ＤＭＳ及びＤＭＰ）の有無による注入ＤＮＡ（１μｇのヒトゲノミクスＤＮＡ）の回収率を測定した。ＤＭＳ（黒色）及びＤＭＰ（灰色）が含まれた実験群いずれもでは、９５％以上のＤＮＡが回収され、ＨＩｓが含まれていない実験群では、＜５０％ＤＮＡが回収された（図７Ａ）。ヒトゲノミクスＤＮＡ及びＲＮＡ抽出のためのシステムプロトコルを最適化するために、癌細胞株［１×１０６ｃｅｌｌｓの乳癌細胞株（ＭＣＦ７）または大腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）］を使用した。ハイクオリティー及び高容量の核酸を抽出するための最適化方法で、ＤＭＳ濃度（１００、５０、２０、ａｎｄ  １０ｍｇ／ｍｌ）を異ならせて、癌細胞から抽出したＤＮＡの量（図７Ｂ）及び純度（図７Ｃ）を測定した。ＤＮＡ抽出とは異なって、ＲＮＡは、分解が容易に起こるので、一般的にＲＮＡ抽出がさらに難しい。２種の濃度の癌細胞（１×１０３及び１×１０６）からＲＮＡを抽出するために、ＤＭＳまたはＤＭＰをＨＩＮＴシステムに適用した。ＰＣＲ比較実験のために、システムから抽出された２種の濃度のＲＮＡで１８Ｓ遺伝子増幅を行ったが、単一段階逆転写ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ及び単一段階逆転写ＲＴ−ＰＣＲを進行した。１８Ｓ遺伝子は、１０６（ＣＴ：１８．４２±０．４６  ｉｎ  ＤＭＳ、ＣＴ：１７．８６±０．３２  ｉｎ  ＤＭＰ）及び１０３（ＣＴ：３２．１５±０．０９  ｉｎ  ＤＭＳ、ＣＴ：３１．６０±０．２  ｉｎ  ＤＭＰ）細胞濃度でいずれも強く増幅された（図７Ｄ）。また、ＨＩＮＴシステムを利用したＤＮＡ抽出のために、多様な濃度のＤＭＳ（５０〜２５０ｍｇ／ｍｌ）と共に、２種の濃度の癌細胞（１×１０３及び１×１０６）を使用した。ＰＣＲ比較実験のために、システムから抽出された２種の濃度のＤＮＡでＡｃｔｉｎ遺伝子増幅を行ったが、ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを進行した（図７Ｅ）。Ａｃｔｉｎ遺伝子は、１×１０６  ｃｅｌｌｓ（ＣＴ：２２．１１±０．３１；図７Ｅ）及び１×１０３  ｃｅｌｌｓ（ＣＴ：３１．７３±０．０１）でいずれも増幅され、あらゆる濃度のＤＭＳ条件でも、いずれも増幅された。
【００９３】
ＲＮＡ抽出分析において、ＨＩＮＴシステムをさらに検証するために、ＡＧＳ（胃癌細胞株）、ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞株）及びＭＣＦ７（乳癌細胞株）を含む３種の癌細胞株からＲＮＡを抽出して分析したが、連続した希釈を通じて１×１０１〜１×１０５  ｃｅｌｌｓを使用した。ＨＩＮＴシステムを通じて抽出されたＲＮＡの量は、細胞数に依存的であることを確認することができた（図８Ａから図８Ｃ）。抽出されたＲＮＡから１８Ｓ遺伝子をＰＣＲ増幅した結果、３種の癌細胞株から抽出されたＲＮＡでいずれも強く増幅されることを確認した（図８Ｄ）。図８Ｅは、単一段階逆転写ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＨＣＴ１１６細胞の濃度によるサイクル数（ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ；ＣＴ）を確認した結果である。ＣＴ及び細胞濃度の間には、高い直線度（Ｒ２＝０．９９０７）を示した。
【００９４】
ＤＮＡ抽出分析において、ＨＩＮＴシステムをさらに検証するために、ＭＣＦ７、ＡＧＳ及びＨＣＴ１１６細胞からＤＮＡを抽出してＰＣＲ分析を行った。同じ濃度の細胞数（（１×１０６）を使用してＨＩＮＴシステムをＱｉａｇｅｎ  ｋｉｔと比較した。ＡＧＳ及びＨＣＴ１１６細胞と、ＤＭＳまたはＤＭＰを使用してＨＩＮＴシステムから抽出されたＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔから抽出されたＤＮＡの増幅効率と同等なレベルであった（図９Ａ及び図９Ｂ）。また、ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＤＭＳまたはＤＭＰを使用してＨＩＮＴシステムから抽出されたＤＮＡは、細胞数に依存的であると表われた。ＤＭＳを使用して実験した結果は、図９Ｃに示した。一方、多様なサンプルで、本システムの適用可能性を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉからバクテリアＤＮＡを抽出して分析したが、細胞濃度範囲は、１×１０３〜１×１０８ＣＦＵｓの範囲で使用した。連続して希釈されたサンプルから抽出されたＤＮＡｓでは、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子が強く増幅された。ＨＩＮＴシステムから抽出されたＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔから抽出されたＤＮＡの増幅効率と同等なレベルであった（図９Ｄ）。
【００９５】
また、重症熱性血小板減少症候群（Ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＳＦＴＳ）及びツツガムシ病（ｓｃｒｕｂ  ｔｙｐｈｕｓ；ＳＴ）のようなダニ媒介疾病サンプルからウイルスまたはバクテリア核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を抽出するに当たっても、ＨＩＮＴシステムを適用することができるか否かを確認した。Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ及びＨＩＮＴシステム（ＤＭＳ使用）を用いて、ＳＦＴＳ患者の血しょうからウイルスＲＮＡを抽出した。ＨＩＮＴシステムのＲＴ−ＰＣＲ増幅効率は、Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔと大きく差が出なかった（図１０Ａ）。また、Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ及びＨＩＮＴシステム（ＤＭＳ及びＤＭＰ使用）を用いて、ＳＴ患者の血しょうからバクテリアＤＮＡを抽出して分析した結果、ＨＩＮＴシステムのＲＴ−ＰＣＲ増幅効率は、Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔと同等なレベルであると表われた（図１０Ｂ）。
【００９６】
一方、本発明に使用したＤＭＳ及びＤＭＰと類似した化合物であるＤＭＡとの比較実験を行った。ＨＣＴ１１６癌細胞株を用いて、ＤＭＡ、ＤＭＳ及びＤＭＰをそれぞれ添加して、ＨＩＮＴシステムを通じてＤＮＡ抽出し、該抽出されたＤＮＡの増幅効率を比較した。図１１に示すように、ＤＭＡに比べて、ＤＭＳ及びＤＭＰの増幅効率が２ｃｙｃｌｅｓほど迅速に進められることを図１１（Ａ）で確認し、２ｃｙｃｌｅｓ差に対する効率を確認した時、ＰＣＲでは、理論上、増幅産物が１ｃｙｃｌｅごとに２倍ずつ増加するので、発現量を比較する場合に、Ｃｔ値の差を２の二乗を求めれば良いが、このように計算すれば、ＤＭＡに比べて、ＤＭＰとＤＭＳとを使用する場合、約４倍ほど効率が高いということを確認した（図１１Ｂ）。
【００９７】
以上のように、本発明は、たとえ限定された実施例と図面とによって説明されたとしても、本発明は、これによって限定されず、当業者によって本発明の技術思想と下記に記載される請求範囲の均等範囲内とで多様な修正及び変形が可能であるということはいうまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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