(57)【要約】  本開示は、哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を特定の組織（複数可）または器官（複数可）へと、定方向分化を通じて転換するための方法に関する。特に、本開示は、分化した胚体内胚葉から形成される胃底部組織及び／またはオルガノイドの形成に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃底部組織の形成を誘導するインビトロ方法であって、
ａ）哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を、ｗｎｔ経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と第１の期間接触させるステップであって、
前記第１の期間は、前記胚体内胚葉から３次元後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な長さの期間である、ステップと、
ｂ）前記３次元後部前腸スフェロイドを、基底膜マトリックス中で成長因子、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、前記ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸とともに第２の期間懸濁させるステップであって、前記第２の期間は、胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）を含む胃底部系譜を誘導するのに十分な長さの期間である、ステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｈＦＧＯを前記ｗｎｔ経路活性化因子及び前記ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子とともに第３の期間培養するステップと、
ｄ）ステップｃの前記ｈＦＧＯを前記ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、前記ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、及びＦＧＦ１０とともに第４の期間培養するステップと、
ｅ）ステップｄの前記ｈＦＧＯをＭＥＫ阻害因子と第５の期間接触させるステップであって、前記第５の期間は、機能的胃底部細胞タイプを含む前記胃底部組織を形成するのに十分な期間である、ステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の期間は、３日間±２４時間であり、前記レチノイン酸は、前記期間±２４時間の３日目に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の期間は、３日間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の期間は、１１日間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第４の期間は、１０日間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第５の期間は、２日間の期間±２４時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップｅ）は、前記胃底部ｈＧＯをＢＭＰ４シグナル伝達の活性化因子と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記機能的胃底部細胞タイプは、プロトンポンプタンパク質を発現し、かつ酸を分泌する傍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的胃底部細胞タイプは、ペプシノーゲンを分泌する主細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップｅは、ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１上皮を発達させるのに十分な期間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップｄ及びステップｅは、系譜マーカーＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＰＧＣ、及びＧＨＲＬの安定した発現を与えるのに十分な期間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記胚体内胚葉は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、及び後腸細胞、多能性幹細胞由来の胚体内胚葉、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉から選択される前駆細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記胚体内胚葉は、多能性幹細胞をアクチビン、成長因子のＴＧＦベータスーパーファミリーのＢＭＰ下位群、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子と接触させることに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＷＮＴ経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６から選択される１つ以上の分子である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子は、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップは、インビトロで行われる、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかによって産生された胃組織を含む組成物であって、前記胃組織は、神経支配及び／または血管がないことを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）をｗｎｔ経路活性化薬及びＥＧＦシグナル伝達経路活性化薬と第１の期間、かつＭＥＫ阻害因子と第２の期間接触させるステップを含む、胃底部組織の形成を誘導するインビトロ方法であって、前記第１及び第２の期間は、機能的胃底部細胞タイプを形成するのに十分な期間実施され、
前記ｈＦＧＯは、３次元後部前腸スフェロイドを、基底膜マトリックス中で、成長因子、ｗｎｔ経路活性化薬、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と、前記３次元後部前腸スフェロイドを前記ｈＦＧＯへ変換するのに十分な期間接触させることによって得られ、
前記３次元後部前腸スフェロイドは、哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞をｗｎｔ経路活性化薬、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化薬、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と接触させることによって得られる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月５日出願の米国仮特許出願第６２／３３２，１９４号に対する優先権及び利益を主張し、その内容がすべて参照により組み込まれる。
【０００２】
政府支援条項
本発明は、Ａｌｌ  １６４９１及びＤＫ０９２４５６の下での政府の支援を用いて行われた。当該政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
胃疾患が地球規模で蔓延しているにもかかわらず、ヒトの胃の胃底部上皮を研究するための適切なモデルは少数である。ヒト胃底部型胃オルガノイド（ｈＦＧＯ）の開発は、ヒトの胃の生理学、病理生理学、及び薬剤開発の分子レベルの基礎を研究するための新規のかつ強力なモデルシステムであろう。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を特定の組織（複数可）または器官（複数可）へと、定方向分化を通じて転換するための方法に関する。特に、本開示は、分化した胚体内胚葉から形成される胃底部組織及び／またはオルガノイドの形成に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
当業者は、以下に説明する図面が、単に説明目的のためにのみあることを理解するであろう。図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を限定するよう企図するものではない。
【０００６】
【図１】Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達は、マウスにおける胚性胃底部の特異性に必要である。ａ：Ｐｄｘ１及びＳｏｘ２を前庭（ａ）において発現させたのに対し、Ｐｄｘ１は、１８．５日胚でＡｔｐ４ｂ発現傍細胞によって識別されるように、胃底部（ｆ）に存在しなかった。ｂ：Ａｘｉｎ２：ＬａｃＺレポーター胚由来の１０．５日胚の前腸のＸ−ｇａｌ染色は、Ｗｎｔ活性が、胃の前部に制限されているが、後部胃からは除外されていることを示した。ｃ：胃上皮におけるβカテニンの欠失は、胃の胃底部領域へのＰｄｘ１の前部増殖を生じた。ｄ：１８．５日のＳｈｈＣｒｅ／＋βカテニンｆｌ／ｆｌ（ｃＫＯ）胚において、Ｐｄｘ１を胃のいたるところに発現させたが、例外は、壁細胞含有上皮のいくらかの残余のパッチにおいてであった。挿絵１ａ〜１ｃ及び２ａ〜２ｃはそれぞれ、対照の胃及びｃＫＯ胃における箱で囲まれた領域を示す。ｅ、ｃＫＯ胃において、Ｃｔｎｎｂ１は、モザイク状欠失を呈し、壁細胞は、Ｃｔｎｎｂ１の十分な上皮において分化しかしなかった。目盛尺：２５０μｍ（ａ）、２００μｍ（ｃ）、及び５００μｍ（ｄ及びｅ）。
【図２】βカテニンの活性化は、ヒト前腸前駆体スフェロイドからの胃底部の発達を促進する。ａ：胃底部及び前庭の両方のｈＧＯのための分化プロトコルの図式化した図。ｂ、ｃ：９日後に、ＣＨＩＲ処理したオルガノイドは、ＰＤＸ１の減少、ＩＲＸ２、ＩＲＸ３及びＩＲＸ５の増加、ならびに胃マーカーＳＯＸ２またはＧＡＴＡ４の変化がないことを呈した。＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、ｎ＝３の生物学的複製物、データは４回の独立した実験を代表。ｄ：ｈＦＧＯは、ｈＡＧＯに匹敵して生育しただけでなく、腺出芽形態形成（白色の矢頭）も呈した。ｅ：両方のｈＧＯは、ＣＤＨ１、ＫＲＴ８、及びＣＴＮＮＢ１ならびに胃マーカーＧＡＴＡ４及びＣＬＤＮ１８を発現する上皮を含有していた。ｈＡＧＯは、ほぼ遍在的なＰＤＸ１発現を呈したのに対し、ｈＦＧＯは、呈しなかった。目盛尺：５０μｍ（ｃ）、５００μｍ（ｄ）及び１００μｍ（ｅ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図３】ｈＧＯにおける粘膜及び内分泌細胞系譜の分化。ａ：胃の胃底部及び前庭の腺において認められた共有されかつ異なる系譜の模式図。ｂ：前庭及び胃底部のｈＧＯは両方とも、ＭＵＣ５ＡＣ陽性表面粘膜細胞及びＭＵＣ６陽性粘膜頸細胞を含有した。ｃ、ｄ：ｈＦＧＯは、傍内分泌マーカーＳＹＰを発現する内分泌細胞を含有した。異なるホルモン細胞タイプをｈＦＧＯにおいて識別し、これには、ＧＨＲＬ発現内分泌細胞、ＳＳＴ発現内分泌細胞、及びヒスタミン発現内分泌細胞を含んでいた。前庭特異的Ｇ細胞マーカーであるＧＡＳＴは、ｈＡＧＯでは発現したが、ｈＦＧＯでは発現せず、逆に、ＧＨＲＬは、ｈＦＧＯにおいて多量であった。＊＊：ｐ<０．０１、両側スチューデントｔ検定、ｈＡＧＯ及びｈＦＧＯにおいてそれぞれｎ＝８及び２４の生物学的複製物、データは６回の独立した実験を代表。ｅ：ｈＡＧＯは、プロ内分泌転写因子ＮＥＵＲＯＧ３（＋ｄｏｘ）の発現に応じて、前庭特異的ＧＡＳＴ発現内分泌細胞を生じる能力があったが、ｈＦＧＯはそうではなかった。＊：ｐ<０．０１、両側スチューデントｔ検定、ｎ＝４の生物学的複製物、データは３回の独立した実験を代表。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図４】ｈＦＧＯにおける主細胞の形成。ａ：ｈＦＧＯは、ＭＩＳＴ１及びペプシノーゲンＣ（ＰＧＣ）の両方に陽性の細胞を有していた。ｂ：尖端のＰＧＣ染色を有する一群の細胞を有する腺を示すパネル（ａ）における箱で囲まれた領域の高解像度。ｃ：ｈＦＧＯは、ｈＡＧＯと比較して、主細胞マーカーＰＧＡ５（１０００倍）、ＰＧＣ（１００倍）、及びＭＩＳＴ１（１０倍超）の有意に高い発現を有していた。＊＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物、データは４回の独立した実験を代表。ｄ：主細胞を示す密なチモーゲン果粒を含有するｈＦＧＯ細胞の透過電子顕微鏡写真。ｅ：ＭＥＫ阻害因子（ＰＤ０３）の有無の下でのｈＡＧＯと比較したｈＦＧＯのペプシノーゲンタンパク質含有量。＊＊：ｈＡＧＯと比較してｐ<０．０００１、両側スチューデントｔ検定、ｈＡＧＯ、対照ｈＦＧＯ及びｈＦＧＯ（ＰＤ０３非含有）においてそれぞれ、ｎ＝８、１２、及び１１の生物学的複製物。目盛尺：２００μｍ（ａ）、２５μｍ（ｂ）、及び１０μｍ（ｄ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図５】ｈＦＧＯにおける機能的傍細胞の分化を駆動する経路の識別。ａ：傍細胞遺伝子ＡＴＰ４、ＡＴＰ４Ｂ、及びＧＩＦの発現は、ベースラインで卵胞と比較して、ｈＦＧＯの１０〜１００倍の増加を呈したが、ＰＤ０３／ＢＭＰ４の２日間のパルスへｈＦＧＯを曝露することによって劇的に亢進した。＊＊：ｈＡＧＯと比較してｐ<０．０５、＃：対照ｈＦＧＯと比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、ｎ＝４の生物学的複製物、データは１５回の独立した実験を代表。ｂ：ＰＤ０３／ＢＭＰ４を用いた処理後のＡＴＰ４Ｂ発現傍細胞の刺激された分化。ｃ：ｈＦＧＯ由来の傍細胞は、インビボでの成熟マウス胃底部上皮において認められる傍細胞と類似していた。ｄ：傍細胞を想起させる小管構造を有するｈＦＧＯ細胞の透過型電子顕微鏡写真。ｅ：ヒト胃底部腺の上皮及びｈＦＧＯ上皮を、表面上皮におけるＭＵＣ５ＡＣ発現細胞、及び腺性単位におけるＡＴＰ４Ｂ発現傍細胞へと組織化した。ｆ；ＳＮＡＲＦ−５Ｆの管腔注射によるヒスタミンに応じたオルガノイドにおける管腔ｐＨの分析。ｈＦＧＯにおける管腔ｐＨは迅速に低下したのに対し、ｈＡＧＯは応答を呈しなかった。オルガノイドをファモチジンまたはオメプラゾールのいずれかで前処理することによって、酸性化を遮断した。ｈＦＧＯ（ヒスタミン）、ｈＦＧＯ（ヒスタミン及びファモチジン）、ｈＦＧＯ（ヒスタミン及びオメプラゾール）、及びｈＡＧＯ（ヒスタミン）のそれぞれにおけるｎ＝９、９、７、及び４の生物学的複製物、データは３回の独立した実験を代表。ｇ：単離したマウス胃腺及びｈＦＧＯにおける小管型パターンでのヒスタミン誘導性アクリジンオレンジ（ＡＯ）色素の６０分後の蓄積。目盛尺：１００μｍ（ｂ）、１０μｍ（ｃ）、１０μｍ（ｄ）、１００μｍ（ｅ；ヒト胃底部）、２０μｍ（ｅ；ｈＦＧＯ）、及び１０μｍ（ｇ）。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図６】インビボで発達中の胃において規定中の分子ドメイン。ａ：マウス胚の胃（１４．５日胚）におけるＳｏｘ２、Ｐｄｘ１、及びＧａｔａ４の分析は、胃底部（ｆ）がＳｏｘ２＋Ｇａｔａ４＋Ｐｄｘ１−であるのに対し、前庭（ａ）がＳｏｘ２＋Ｇａｔａ４＋Ｐｄｘ１＋であることを示した。前胃（ｆｓ）は、Ｓｏｘ２を発現したが、Ｇａｔａ４もＰｄｘ１も発現しなかった。ｂ：定量的ＰＣＲによって分析した１４．５日胚のマウス胃の摘出した領域を示す明視野立体顕微鏡写真。ｆｓ：前胃、ｆ：胃底部、ａ；前庭、ｄ：十二指腸、ｃ：ｂにおける摘出された領域を、既知の局所的に発現したマーカー（Ｓｏｘ２、Ｐ６３、Ｇａｔａ４、Ｐｄｘ１、及びＣｄｘ２）についての定量的ＰＣＲによって分析して、微量摘出の正確性を確証した。摘出した１４．５日胚の胃の領域の定量的ＰＣＲ分析は、推定上の胃底部マーカーＩｒｘ１、Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ３、Ｉｒｘ５、及びＰｉｔｘ１は、前庭と比較して胃底部において豊富であることを示した。１箇所の摘出領域当たりのｎ＝４の生物学的複製物。目盛尺：５００μｍ。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図７】βカテニンｃＫＯ胚の分析。ａ：１２．４日胚及び１４．５日胚までに、異所性Ｐｄｘ１発現をｃＫＯ胚の背側胃上皮のいたるところ及び最も近位の胃上皮で観察した。ｂ：１４．５日胚のｃＫＯ前腸の摘出した領域の定量的ＰＣＲ分析（図６のｂ）は、胃底部及び前胃部におけるＰｄｘ１の有意な上方調節を示した。逆に、Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ３、及びＩｒｘ５は、これらの近位の領域において顕著に減少した。＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、各遺伝子型について摘出した領域につきｎ＝３の生物学的複製物。ｃ：１８．５日胚から摘出した内臓の立体顕微鏡写真は、ｃＫＯ胚が既に報告した通り肺の非形成を呈することを実証した。消化管、特に胃は、大きさが劇的に減少した。ｄ：１８．５日胚での免疫蛍光染色は、Ｃｔｎｎｂ１のモザイク欠失パターンを明らかにした。箱で囲まれた領域を図１に示す。ｅ：１８．５日胚のｃＫＯ胃において、Ｃｔｎｎｂ１染色を欠失する組換え腺は、傍細胞を含有していなかったのに対し、頑強な傍細胞の分化は、Ｃｔｎｎｂ１陽性腺において観察された。目盛尺：２００μｍ（ａ）、５００μｍ（ｄ）、及び５０μｍ（ｅ）。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図８】ｈＧＯにおける胃底部の運命の適切な誘導及びプロトコルの効率。ａ：発明者は、ＣＨＩＲ処理が胃底部の識別を確立するのにどれだけ長く必要であるかを研究した。３４日後までの対照成長培地中でのオルガノイドの簡潔なＣＨＩＲ処理（６〜９日間）及びその後の成長は結果的に、前庭マーカーＰＤＸ１を発現する胃底部オルガノイドを生じ、短期間のＣＨＩＲ処理が胃底部の運命を安定させないことを示唆した。次に、発明者は、ＣＨＩＲへのより長い曝露が胃底部の運命を保持するのに必要であるかどうかを検査し、少なくとも２９日後までの連続的な処理のみが前庭マーカーＰＤＸ１の少量の発現を維持することができることを発見した。＊：対照前庭ｈＧＯと比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物、データは２回の独立した実験を代表。ｂ、ｃ：プロトコルの経過にわたって、ＰＤＸ１は、ＣＨＩＲ処理したオルガノイドにおいて低いままであったのに対し、ＩＲＸ５発現は、持続的に上昇した。＊：ｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定、時点あたりｎ＝３の生物学的複製物。ｄ：６日胚の後部前腸スフェロイドから初期胃オルガノイド（２０日胚）への転換は、ｈＡＧＯプロトコル及びｈＦＧＯプロトコルの両方において８０％超ほど効率的である。ｅ：２０日胚で、ｈＦＧＯ上皮は、約９０％のＧＡＴＡ４＋／ＳＯＸ２＋／ＰＤＸ１−であるのに対し、ｈＡＧＯ上皮は、約９０％のＧＡＴＡ４＋／ＳＯＸ２＋／ＰＤＸ１＋である。＊＊：ｐ<０．００１、両側スチューデントｔ検定、実験あたりｎ＝４の生物学的複製物であって、２回の独立した実験が示されている。目盛尺：１００μｍ（ｃ）及び２００μｍ（ｄ）。
【図９】前腸前駆体から小腸の運命を誘導するためのＷｎｔ／βカテニン活性化のＢＭＰ依存性。ａ：小腸特異的転写因子ＣＤＸ２は、９日後も２０日後もＣＨＩＲ処理したｈＧＯにおいて有意に誘導されなかった。ｂ：ヒト小腸オルガノイド（ｈＩＯ）と比較した場合、胃底部ｈＧＯも前庭ｈＧＯも、ＭＵＣ２、ＣＣＫ、及びＳＣＴを含む、小腸細胞タイプと関連した遺伝子を発現しなかった。＊：ｈＩＯと比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物。ｃ：前後の運命は、ＷＮＴ及びＢＭＰの活性によって協調して制御されている。ＢＭＰ阻害因子ノギンの存在下で、Ｗｎｔ／βカテニン経路活性にもかかわらず、オルガノイドはすべて、前腸を維持した（ＳＯＸ２＋）が、ＢＭＰ４の存在下では、オルガノイドはすべて、後側化した（ＣＤＸ２＋）。ＢＭＰ阻害状態におけるＷｎｔ（ＣＨＩＲ）の活性化は結果的に、胃底部パターンを生じた（ＳＯＸ２＋、ＰＤＸ１−、ＣＤＸ２−）のに対し、ＷＮＴ（ＣＨＩＲ）の活性化及びＢＭＰ４の添加は結果的に、小腸の運命を生じた（ＣＤＸ２＋）。＊：類似のノギン処理条件と比較してｐ<０．０５、両側スチューデントｔ検定。ｎ＝３の生物学的複製物。ｄ：ヒト組織の免疫蛍光染色は、ＣＬＤＮ１８が小腸では認められない胃特異的上皮マーカーであることを明らかにした。目盛尺：２００μｍ。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図１０】ｈＦＧＯは、関連する間充織層によって支持される組織化した腺を含有する。ａ：透過電子顕微鏡写真は、ｈＦＧＯ腺が、狭小尖端膜とともに組織化した構造を呈することを実証した。ｂ：ｈＦＧＯ及びｈＡＧＯの両方は、支持層であるＦＯＸＦ１＋／ＶＩＭ＋未分化線維芽細胞を含有していた。目盛尺：５μｍ（ａ）及び１００μｍ（ｂ）。
【図１１】ヒト胃オルガノイドにおける局所特異的細胞分化。ａ：前庭及び胃底部ｈＧＯは、粘膜細胞マーカーＭＵＣ５ＡＣ及びＭＵＣ６のかなりの発現を呈した。ｂ：透過電子顕微鏡写真において示されるように、ｈＦＧＯは、分化した主細胞への前駆体である粘膜頸細胞と一致した果粒パターンを呈する多量の細胞を含有していた。ｃ：ＮＥＵＲＯＧ３欠乏性ｈＥＳＣ株に由来するｈＧＯにおけるＮＥＵＲＯＧ３の外来性発現は、ＳＹＰ陽性内分泌細胞の頑強な分化を誘導した。ｈＡＧＯ及びｈＦＧＯの両方が、ＧＨＲＬ発現内分泌細胞及びＳＳＴ発現内分泌細胞を形成したが、ＧＡＳＴ＋  Ｇ細胞の特異性は、ｈＡＧＯにおいてのみ観察された。ｄ：ｈＧＯ及びヒト胃生検組織における細胞系譜マーカーの発現比較。定量的ＰＣＲ分析は、ｈＧＯがいくつかの系譜マーカー（ＭＵＣ５ＡＣ、ＡＴＰ４Ｂ）のかなりの発現レベルを呈する一方で、他の遺伝子が、完全に分化した成体ヒト胃において認められるよりも非常に低レベルで発現する（ＡＴＰ４Ａ、ＰＧＡ５、及びＰＧＣ）ことを実証した。目盛尺：５μｍ（ｂ）及び１００μｍ（ｃ）。エラーバーは、標準偏差（ａ）及び平均値の標準誤差（ｂ）を表す。
【図１２】マウス主細胞発生の分析。ａ：後期胚期と同じくらい早く機能的マーカー（Ａｔｐ４ｂ）を発現する傍細胞とは異なり、主細胞遺伝子産物は、発生のかなり後期まで検出することはできなかった。胚（１８．５日胚）及び若齢個体（Ｐ１２）の胃において、Ｇｉｆ及びＰｇｃは、まだ発現しておらず、主細胞が、胃上皮における他の系譜よりも発生上非常に遅く成熟することを示した。ｂ：Ｐｇｃがないにもかかわらず、Ｐ１２マウスの胃は、主細胞特異的マーカーである核ＭｉＳＴ１を発現する多量の腺細胞を含有していた。したがって、主細胞は、実際により早期に特異化するが、終末分化マーカーの頑強な発現を発生させるために数週間かかった。目盛尺：１００μｍ（ａ）及び２００μｍ（ｂ）。
【図１３】胃底部ｈＧＯにおける傍細胞の分化を促進する経路のためのスクリーニング。ａ：傍細胞の分化を誘導することのできる成長因子／小分子について検査するために、示されたアゴニストまたはアンタゴニストへｈＦＧＯを２日間（３０〜３２）曝露した後、３４日後に分析した。異なる経路のスクリーニング実験において、ＰＤ０３を用いたＭＥＫ阻害のみが、ＡＴＰ４Ａ／Ｂの発現を頑強に誘導することが発見された。ｂ：培地からのＥＧＦの減少または除去は、ＭＥＫ阻害の効果を再現するのに十分ではなかった。ｃ：傍細胞発生を誘導するＰＤ０３／ＢＭＰ４の能力は、前庭ｈＧＯがＰＤ０３／ＢＭＰ４に応じて胃底部マーカーを発現しなかったので、胃底部ｈＧＯに限定されていた。ｄ：ＰＤ０３／ＢＭＰ４への曝露は、胃底部ｈＧＯにおけるＡＴＰ４Ａ及びＡＴＰ４Ｂの発現を迅速に高めた。ｅ：ＰＤ０３／ＢＭＰ４を用いた傍細胞発生の誘導は、主細胞（ＰＧＡ５及びＰＧＣ）及び内分泌細胞（ＣＨＧＡ）の分化に有意に影響しなかった。ｆ：ｈＦＧＯ分化プロトコルの各期における操作は、いかなる単一のステップの除去もＡＴＰ４Ａ／Ｂ発現の喪失をもたらしたので、頑強な傍細胞分化に必要であった。エラーバーは、標準偏差（ａ〜ｃ）及び平均値の標準誤差（ｄ〜ｆ）を表す。
【図１４】胃オルガノイドにおける生でのインビトロｐＨモニタリング。ａ：色素ＳＮＡＦＲ５Ｆは、５〜８のｐＨ範囲にわたって応答性を呈し、このことは、傍細胞仲介性酸分泌に応じた生理学的変化を検出するのに十分適していた。ｂ：ヒスタミン添加の前（黒丸）及び６０分後（白丸）に記録した培地及び管腔のｐＨ測定。前庭ｈＧＯは、ヒスタミンに対して応答しなかったのに対し、胃底部ｈＧＯは、ヒスタミンに応答して管腔ｐＨを低下させた。ファモチジンまたはオメプラゾールのいずれかを用いたオルガノイドの前処理によって、酸性化を阻害した。さらに、オメプラゾールは、ヒスタミン曝露の前に胃底部オルガノイドのｐＨを上昇させるのに十分であり、このことは、胃底部オルガノイドにおけるベースラインの酸分泌を示唆していた。培地のｐＨは、いかなるオルガノイドも変化させなかった。＊＊＊：ヒスタミン前と比較してｐ<０．００１、＄＄＄：ヒスタミンなしでの管腔ｐＨと比較してｐ<０．００１、＃＃＃：ヒスタミンありでの管腔ｐＨと比較してｐ<０．００１、両側スチューデントｔ検定。ｃ：ｈＦＧＯは、腺の管腔を裏打ちする細胞のほぼすべてにおいてアクリジンオレンジ（ＡＯ）が蓄積した傍細胞の密な腺を含有していた。ｄ：ＡＯ蓄積は、ｈＦＧＯの傍細胞における小管型パターンで観察された。目盛尺：１０μｍ。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図１５】ヒト胃オルガノイドの連続継代。ａ：ｈＧＯにおける胃幹細胞の存在を判定するための実験の概略図。ｂ：ＥＧＦのみを含有する培地中で断片を生育させたとき、新たなオルガノイドを形成するよう生育も増殖もしなかった。しかしながら、培地へのＣＨＩＲ及びＦＧＦ１０の添加は、新たに形成されたオルガノイドへの個々の断片の生育を支持するのに十分であった。ｃ：２回の継代後、ｈＦＧＯは、ＰＧＣ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ５ＡＣ、及びＧＨＲＬを含む、胃表現型と一致する遺伝子をなおも発現した。胃の同一性を維持しながら連続継代を受けるこの能力は、ｈＦＧＯが、成体胃幹細胞と類似の特性を有する細胞を含有するという結論を支持している。ｄ：継代したｈＦＧＯは、いくつかの分化した胃細胞タイプと関係するマーカーを発現したが、ＡＴＰ４Ｂなどの傍細胞と関係する遺伝子を発現しなかった。さらに、傍細胞の分化は、継代前ではＭＥＫ阻害を通じて誘導することができたのに、ＭＥＫ阻害を通じて誘導することはできなかった。エラーバーは、標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
別段の記載がない限り、用語は、当業者による従来の使用により理解されるものとする。
【０００８】
本明細書で使用する場合、「胃底部組織」という用語は、酸産生傍細胞及びプロテアーゼ産生主細胞を含むがこれらに限定されない胃底部細胞タイプを含有する体において認められる胃上皮の胃底部タイプを意味する。
【０００９】
本明細書で使用する場合、「胚体内胚葉（ＤＥ）細胞」という用語は、原腸形成の過程によって生じる３つの主要な胚葉のうちの１つを意味する。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「ｗｎｔシグナル伝達経路」という用語は、ｗｎｔ／ベータカテニン経路を意味しており、ベータカテニンタンパク質を通じて作用する、Ｗｎｔリガンドと縮れた（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）細胞表面の受容体とによって仲介されるシグナル伝達経路である。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「ｗｎｔ経路」などの経路に関する「活性化因子」という用語は、Ｗｎｔ／ベータカテニン標的が増加するよう、Ｗｎｔ／ベータカテニン経路を活性化する物質を意味する。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子」という用語は、ＦＧＦ標的が増加するよう、ＦＧＦ経路を活性化する物質を意味する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子」という用語は、すなわち、ＢＭＰ経路に干渉してＢＭＰ標的を減少させる物質である。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「成長因子」という用語は、成長、増殖、形態形成または分化を含むがこれらに限定されない細胞過程を刺激することのできる物質を意味する。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「胃底部系譜」は、体の胃における胃底部上皮において認められる細胞タイプを意味する。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１上皮」という用語は、列挙したタンパク質を発現する上皮を意味する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、マーカーの「安定した発現」という用語は、成長環境の変更の際に変化しない発現を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「全能性幹細胞（全能幹細胞としても知られる）」という用語は、胚細胞タイプ及び胚体外細胞タイプへと分化することのできる幹細胞である。このような細胞は、完全な、生存可能な生体を構成することができる。これらの細胞は、卵と精子細胞との融合から生じる。受精卵の最初の数回の分裂によって生じる細胞も全能性である。
【００１９】
本明細書で使用する場合、ＰＳ細胞としても一般に知られる「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、ほぼすべての細胞、すなわち、内胚葉（胃内部裏打ち、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、生殖器）、及び外胚葉（表皮組織及び神経系）を含む３つの胚葉（胚上皮）のいずれかに由来する細胞へと分化することのできるいかなる細胞も包含する。ＰＳＣは、胚（胚性生殖細胞を含む）に由来する、またはある特定の遺伝子の発現を強制することによって成体細胞などの非多能性細胞の誘導を通じて得られた、全能性細胞の子孫であり得る。
【００２０】
本明細書で使用する場合、ｉＰＳ細胞としても通常略記される「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、ある特定の遺伝子の「強制的な」発現を誘導することによって、成体細胞など、通常は非多能性である細胞から人工的に得られるタイプの多能性幹細胞を指す。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「前駆細胞」という用語は、１つ以上の前駆細胞が、本明細書に説明する方法を通じてそれ自体を新たにするまたは１つ以上の特化した細胞タイプへと分化する能力を獲得する、当該方法において使用することのできる何らかの細胞を包含する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性であり、または多能性となる能力を有する。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性を獲得するために外部因子（例えば、成長因子）処理へ供される。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、全能性幹細胞、多能性幹細胞（人工または非人工）、多分化能幹細胞、及び単分化能幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、胚、幼児、青少年、または成人に由来し得る。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、多能性が遺伝子操作またはタンパク質／ペプチド処理を介して与えられるような処理へ供された体細胞であり得る。
【００２２】
発生生物学において、細胞分化は、あまり特化していない細胞がより特化した細胞タイプとなる過程である。本明細書で使用する場合、「定方向分化」という用語は、あまり特化していない細胞が、特定の特化した標的細胞タイプとなる過程を説明する。特化した標的細胞タイプの特異性は、始原細胞の運命を定義または変更するために使用することのできる何らかの適用可能な方法によって決めることができる。例示的な方法は、遺伝子操作、化学処理、タンパク質処理、及び核酸処理を含むがこれらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「細胞構成要素」という用語は、個々の遺伝子、タンパク質、ｍＲＮＡ発現遺伝子、及び／または例えば、当業者によって生物学的実験において（例えば、マイクロアレイまたは免疫組織化学によって）典型的に測定される、タンパク質修飾度（例えば、リン酸化）などの何らかの他の種々の細胞の成分またはタンパク質の活性である。生存系、一般的なヒト疾患、ならびに遺伝子の発見及び構造決定に関する生化学的過程の複雑なネットワークと関連した有意な発見は、研究過程の一部として、細胞構成要素量の適用に今では起因し得る。細胞構成要素量のデータは、バイオマーカーを識別し、疾患のサブタイプを区別し、毒性の機序を識別するのに役立ち得る。
【００２４】
胚細胞由来の多能性幹細胞
いくつかの実施形態において、重要なステップとは、多能性である、または多能性となるよう誘導することのできる幹細胞を得ることである。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞に由来し、これが順に、初期哺乳類胚の多能性細胞に由来し、制限されない未分化の増殖をインビトロですることができる。胚性幹細胞とは、初期胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。胚盤胞から胚性幹細胞を得るための方法は、当該技術分野で周知である。ヒト胚性幹細胞Ｈ９（Ｈ９−ｈＥＳＣ）は、本出願において説明される例示的な実施形態において使用されるが、本明細書で説明される方法及びシステムが、いかなる幹細胞に対しても応用可能であることは、当業者によって理解されるであろう。
【００２５】
本発明に従った実施形態において使用することのできる追加の幹細胞は、米国国立幹細胞バンク（ＮＳＣＢ）、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ）ヒト胚性幹細胞研究センターによって管理されるデータベース、Ｗｉ  Ｃｅｌｌ研究所ＷＩＳＣ細胞バンク、ウィスコンシン大学幹細胞及び再生医療センター（ＵＷ−ＳＣＲＭＣ）、Ｎｏｖｏｃｅｌｌ社（カリフォルニア州サンディエゴ市）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ  ＡＢ社（スウェーデン国ヨーテボリ市）、ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｔｅ社（シンガポール国）、ならびにプリンストン大学及びペンシルベニア大学によって管理される幹細胞データベースによって提供されるものまたはこれらにおいて説明されるものを含むが、それらに限定されない。本発明に従った実施形態において使用することのできる例示的な胚性幹細胞は、ＳＡ０１（ＳＡ００１）、ＳＡ０２（ＳＡ００２）、ＥＳ０１（ＨＥＳ−１）、ＥＳ０２（ＨＥＳ−２）、ＥＳ０３（ＨＥＳ−３）、ＥＳ０４（ＨＥＳ−４）、ＥＳ０５（ＨＥＳ−５）、ＥＳ０６（ＨＥＳ−６）、ＢＧ０１（ＢＧＮ−０１）、ＢＧ０２（ＢＧＮ−０２）、ＢＧ０３（ＢＧＮ−０３）、ＴＥ０３（１３）、ＴＥ０４（１４）、ＴＥ０６（１６）、ＵＣ０１（ＨＳＦ１）、ＵＣ０６（ＨＳＦ６）、ＷＡ０１（Ｈ１）、ＷＡ０７（Ｈ７）、ＷＡ０９（Ｈ９）、ＷＡ１３（Ｈ１３）、ＷＡ１４（Ｈ１４）を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
胚性幹細胞に関するより詳細なことは、例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９１）：１１４５−１１４７、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ，２００５，"Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＥＣ）ｃｅｌｌｓ：ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｃｏｉｎ，"Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３３：１５２６−１５３０、Ｍａｒｔｉｎ  １９８０，"Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９（４４５８）：７６８−７７６、Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ，１９８１，"Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ２９２（５８１９）：１５４−１５６、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，"Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ，"Ｌａｎｃｅｔ  ３６５（９４７１）：１６３６−１６４１において認めることができ、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、ある特定の幹細胞関連遺伝子を成体線維芽細胞などの非多能性細胞へとトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは典型的には、レトロウイルスなどのウイルスベクターを通じて達成される。トランスフェクトした遺伝子は、マスター転写調節因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）及びＳｏｘ２を含むが、他の遺伝子が誘導効率を高めることが示唆されている。３〜４週間後、少数のトランスフェクトした細胞は、多能性幹細胞と形態学的に及び生化学的に類似することとなり始め、典型的には形態学的選別、倍加時間を通じて、またはレポーター遺伝子及び抗生物質による選別を通じて単離される。本明細書で使用する場合、ｉＰＳＣは、マウスにおける第１世代ｉＰＳＣ、第２世代ｉＰＳＣ、及びヒト人工多能性幹細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、レトロウイルスシステムを使用して、４つの中心となる遺伝子を用いてヒト線維芽細胞を多能性幹細胞へと形質転換する。すなわち、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃである。代替的な実施形態において、レンチウイルスシステムを使用して、体細胞をＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８で形質転換する。ｉＰＳＣにおいて発現が誘導される遺伝子は、Ｏｃｔ−３／４（例えば、Ｐｏｕ５ｆｌ）、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）、Ｋｌｆファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリーのある特定のメンバー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、及びＮ−ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬＩＮ２８を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
いくつかの実施形態において、非ウイルス系技術を採用して、ｉＰＳＣを作製する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスを用いて、必要な４つの遺伝子をマウスの皮膚細胞及び肝細胞のＤＮＡへと輸送し、結果的に、胚性幹細胞と同一の細胞を生じることができる。アデノウイルスは、それ自体の遺伝子のいかなるものも、標的とされる宿主と結合しないので、腫瘍をつくり出す危険性は排除される。いくつかの実施形態において、初期化は、プラスミドを介して、ウイルストランスフェクション系を全く使用することなく達成することができるが、効率は非常に低い。他の実施形態において、タンパク質の直接的な送達を使用して、ｉＰＳＣを作製し、したがって、ウイルスまたは遺伝子修飾についての必要性を排除する。いくつかの実施形態において、マウスｉＰＳＣの作製は、類似の方法論を用いて可能であり、ポリアルギニンアンカーを介してある特定のタンパク質を細胞へと運搬する細胞の反復処理は、多能性を誘導するのに十分であった。いくつかの実施形態において、多能性誘導遺伝子の発現は、低酸素条件下で体細胞をＦＧＦ２で処理することによっても亢進することができる。
【００２９】
胚性幹細胞に関するより詳細なことは、例えば、Ｋａｊｉ  ｅｔ  ａｌ，２００９，"Ｖｉｒｕｓ  ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７７１−７７５、Ｗｏｌｔｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９，"ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，"Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：７６６−７７０、Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００８，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４９−９５３、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，"Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，"Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２（５９０３）：９４５−９４９、及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，"Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，"Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（５）：３８１−３８４において認めることができ、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、例示的なｉＰＳ細胞株は、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ１９−９、ｉＰＳ−ＤＦ４−３、ｉＰＳ−ＤＦ６−９、ｉＰＳ（包皮）、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）、及びｉＰＳ（ＩＭＲ９０）を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
ＤＥ発生と関連するシグナル伝達経路の機能に関するより詳細なことは、例えば、Ｚｏｒｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，２００９，"Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，"Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５：２２１−２５１、Ｄｅｓｓｉｍｏｚ  ｅｔ  ａｌ，２００６，"ＦＧＦ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｇｕｔ  ｔｕｂｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ａｘｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，"Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １２３：４２−５５、ＭｃＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ，２００７，"Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，"１３４：２２０７−２２１７、Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｌｔｏｎ，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７：１５６３−１５７２、ｄｅ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ，２００３，"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，"Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６０（７）：１３２２−１３３２において認めることができ、これらの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３２】
多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ）から胚体内胚葉を産生するためのいかなる方法も、本明細書に説明される方法へ応用可能である。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、桑実胚から得られる。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、幹細胞である。これらの方法において使用される幹細胞は、胚性幹細胞を含むことができるが、これらに限定されない。胚性幹細胞は、胚性内部細胞塊からまたは胚性生殖堤から得ることができる。胚性幹細胞または胚性生殖細胞は、ヒトを含む種々の哺乳類種を含むがこれらに限定されない種々の動物種から得ることができる。いくつかの実施形態において、ヒト胚性幹細胞を使用して、胚体内胚葉を作製する。いくつかの実施形態において、ヒト胚性生殖細胞を使用して、胚体内胚葉を産生する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣを使用して、胚体内胚葉を産生する。
【００３３】
ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、胃底部上皮を含有する胃オルガノイドへと分化させるための方法が、本明細書に開示される。発明者はまず、胚性胃底部発生における鍵となる事象を識別した後、当該事象を再現して、主張する組成物に到達した。発明者は、マウス胚におけるＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達の中断が胃底部上皮から前庭上皮への転換をもたらすのに対し、ｈＰＳＣ由来の前腸前駆体におけるβ−カテニンの活性化が、ヒト胃底部型胃オルガノイド（ｈＦＧＯ）の発生を促進することを発見した。次に、発明者は、ｈＦＧＯを用いて、主細胞及び機能的傍細胞を含む胃底部細胞タイプの上皮の形態形成及び分化における複数のシグナル伝達経路について、時間的に異なる役割を識別した。ｈＦＧＯは、ヒト胃底部及びその系譜の発生を研究するための強力な新モデルであるが、ｈＦＧＯは、ヒト胃の生理学、病理生理学、及び薬剤開発の分子レベルの基礎を研究するための決定的な新モデルシステムも表す。
【００３４】
一態様において、胃底部組織の形成を誘導するインビトロ方法が開示される。当該方法は、以下のステップを含み得る。
【００３５】
ａ）哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞をｗｎｔ経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ４）、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子（例えば、ノギン）、及びレチノイン酸と第１の期間接触させるステップ。Ｗｎｔシグナル伝達は、Ｗｎｔ３ａ様タンパク質を用いて、または例えば、ＧＳＫ３βを阻害するカイロン様化学物質を介して活性化され得る。第１の期間は、３日間±２４時間であり得る。レチノイン酸は、第１の期間±２４時間の３日目に添加され得る。一態様において、第１の期間は、胚体内胚葉から３次元後部前腸スフェロイドを形成するのに十分な期間実施され得る。
【００３６】
ｂ）該３次元後部前腸スフェロイドを、基底膜マトリックス中で成長因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸とともに第２の期間懸濁させるステップ。第２の期間は、３日間±２４時間であり得る。第２の期間は、胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）を含む胃底部系譜を誘導するのに十分な長さの期間実施され得る。
【００３７】
ｃ）ステップｂ）のｈＦＧＯをｗｎｔ経路活性化因子及びＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子とともに第３の期間培養するステップ。第３の期間は、例えば、１１日間±２４時間であり得る。
【００３８】
ｄ）ステップｃのｈＦＧＯをｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、及びＦＧＦ１０とともに第４の期間培養するステップ。第４の期間は、例えば、１０日間±２４時間であり得る。
【００３９】
ｅ）ステップｄの該ｈＦＧＯをＭＥＫ阻害因子と第５の期間接触させるステップ。ＭＥＫ阻害因子は、例えば、ＰＤ０３２５９０１であり得る。第５の期間は、２日間±２４時間、または機能的胃底部細胞タイプを含む胃底部組織を形成するのに十分な期間であり得る。
【００４０】
一態様において、ステップｅ）は、胃底部ｈＧＯをＢＭＰ４シグナル伝達の活性化因子と接触させるステップをさらに含み得る。ある特定の態様において、ステップｅは、ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１上皮を発達させるのに十分な期間実施され得る。
【００４１】
一態様において、機能的胃底部細胞タイプは、プロトンポンプタンパク質を発現し、かつ酸を分泌する傍細胞であり得る。一態様において、機能的胃底部細胞タイプは、ペプシノーゲンを分泌する主細胞であり得る。
【００４２】
一態様において、ステップｄ及びステップｅは、系譜マーカーＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＰＧＣ、及びＧＨＲＬの安定した発現を与えるのに十分な期間実施される。
【００４３】
一態様において、胚体内胚葉は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、及び後腸細胞、多能性幹細胞由来の胚体内胚葉、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉から選択される前駆細胞に由来し得る。
【００４４】
一態様において、胚体内胚葉は、多能性幹細胞をアクチビン、成長因子のＴＧＦベータスーパーファミリーのＢＭＰ下位群、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子と接触させることに由来し得る。
【００４５】
Ｗｎｔ／ベータカテニン経路を活性化するための多くの方法がある（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｎｕｓｓｅｌａｂ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｎｔ／を参照されたい）。適切ないくつかの存在するｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子は、以下を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
タンパク質系活性化因子Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ８らを含むがこれらに限定されないＷｎｔリガンド、活性化型Ｗｎｔ縮れ受容体、（ＬＲＰ）共受容体、Ｒ−スポンジンタンパク質、Ｄｋｋタンパク質、Ｗｎｔリガンドの分泌及び輸送の調節因子（Ｗｎｔのないヤマアラシ）、ベータカテニン分解ＡＰＣ及びＧＳＫ３ベータ阻害を阻害すること、活性化型ベータカテニン、恒常的に活性化型のＴＣＦ／Ｌｅｆタンパク質を含むがこれらに限定されないＷｎｔリガンド活性の修飾因子。
【００４７】
化学的活性化因子：Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達を活性化するかまたは阻害するかのいずれかである２８個を超える既知の化学物質がある。いくつかの活性化因子は、ＧＳＫ３−ベータ阻害薬ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ−２１６７６３、リチウム、ヤマアラシ阻害因子ＩＷＰ、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９、ＳＦＲＰ阻害因子ＷＡＹ−３１６６０６、ベータカテニン活性化因子ＤＣＡを含むが、これらに限定されない。
【００４８】
一態様において、ＷＮＴ経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６から選択される１つ以上の分子であり得、例えば、Ｗｎｔ３ａ、または例えば、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＷｎｔ３ａであり得る。
【００４９】
適切なＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子は、以下を含む。ＦＧＦリガンドであるＦＧＦ２、４、５、８ら、ＦＧＦ受容体の活性化型。ＭＡＰＫタンパク質、ＭＥＫタンパク質、ＥＲＫタンパク質及びこれらの活性を調節する化学物質を含む、ＦＧＦ受容体及び当該受容体の下流のシグナル伝達成分を刺激するタンパク質及び化学物質。ＦＧＦシグナル伝達は、Ｓｐｒｏｕｔｙタンパク質ファミリーメンバーを含むがこれらに限定されないＦＧＦシグナル伝達経路の阻害因子を阻害することによって活性化することができる。
【００５０】
一態様において、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子は、例えば、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、及びこれらの組み合わせから選択され得、当該前駆細胞は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＭＰ阻害薬と接触させられ得る。
【００５１】
一態様において、当該ステップは、インビトロで実施される。
【００５２】
一態様において、上述の方法（複数可）により産生される胃組織を含む組成物が開示される。胃組織は、例えば、神経支配及び／または血管がないことを特徴とし得る。
【００５３】
一態様において、胃底部組織の形成を誘導するインビトロ方法が開示される。当該方法は、胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）をｗｎｔ経路活性化薬及びＥＧＦシグナル伝達活性化薬と第１の期間、ＭＥＫ阻害因子と第２の期間接触させるステップを含み得（当該ＭＥＫ阻害因子はＰＤ０３２５９０１であり得る）、当該第１及び第２の期間は、機能的胃底部細胞タイプを形成するのに十分な期間実施され、
【００５４】
当該ｈＦＧＯは、３次元後部前腸スフェロイドを基底膜マトリックス中で成長因子、ｗｎｔ経路活性化薬、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と、当該３次元後部前腸スフェロイドを当該ｈＦＧＯへ転換するのに十分な期間接触させることによって得られ、
【００５５】
当該３次元後部前腸スフェロイドは、哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞をＷＮＴ経路活性化薬、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化薬、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と接触させることによって得られる。
【実施例】
【００５６】
近年、３次元インビトロオルガノイドシステムの開発においてかなりの進展があった１，２。オルガノイドは、構造上の複雑性及び細胞の多様性を従来の細胞培養方法の互換性及び拡張性と組み合わせる強力な実験モデルであることが立証されてきた。多能性幹細胞（ＰＳＣ、胚性幹細胞及び人工ＰＳＣの両方を含む）の定方向分化を通じてのオルガノイド発生は、出発材料源に制限がないこと、組織の外科的獲得の必要のないこと、及び遺伝的操作の容易なことを含む他のアプローチを上回るいくつかの利点を提唱する。さらに、ＰＳＣ系の方法は、正常な及び異常なヒト発生に潜む機序の直接的な調査を可能にする３。しかしながら、ＰＳＣを特異的なオルガノイドタイプへと分化させることは、正常な器官発生の頑強な分子レベルの知識による。胃などのいくつかの器官について、胚発生を駆動する分子レベルの経路の理解において大きな隔たりがある。
【００５７】
胃は、哺乳類において最も構造上多様な器官のうちの１つである４。ヒトにおいて、胃粘膜は概して、２つのタイプの上皮腺からなる５，６。胃のより近位の解剖学的部分、すなわち内体及び胃底部にあるのが酸分泌腺であり、傍細胞、プロテアーゼ産生主細胞、粘液産生細胞、及び内分泌細胞を含む。より遠位の前庭及び幽門にある前庭型の腺はたいてい、粘膜細胞及び内分泌細胞を含有する。命名法の解剖学特異的及び種特異的システムを簡素化するために、「胃底部」及び「前庭」という用語は、胃上皮のこれら２つの組織学的タイプを広範に説明するために使用される。発明者は、ｈＰＳＣの分化を、正常な前庭細胞タイプを有する純粋な前庭上皮を含有する３次元胃組織（ヒト胃オルガノイド（ｈＧＯ））へと定向化する方法を既に開発した７。前庭ｈＧＯ（ｈＡＧＯ）は、胃における前庭系譜配置及び宿主−微生物相互作用を研究するための頑強なシステムであるが、胃底部の生物学及び疾患に関する研究はできない。より近年では、Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌは、マウスＥＳＣを、種々のタイプのマウス胃組織を含むオルガノイドへと分化させることに成功した８。しかしながら、このアプローチは、マウスＥＳＣの凝集及び自発的な分化を用いており、その結果として生じるオルガノイドは異質的であり、このことは重層上皮の存在によって立証された。そのうえ、種の違いは、ヒト胃疾患をモデル化するために、マウス胃を最適よりも下回させる９。したがって、ヒト胃底部上皮の頑強かつ効率的なＰＳＣ由来のモデルは、胃生物学の分野で有意な前進を表すであろう。
【００５８】
胚性器官の発生は、隣接する組織間の一連の有益な手掛かりによって誘導され１０，１１、ｈＰＳＣから特異的な系譜への分化は、インビトロでの直接的な分化に対するこれらのシグナルの使用に著しく依存してきた。発明者は既に、段階を踏んだ分化アプローチを識別して、ｈＡＧＯを生じ、それによりｈＰＳＣを胚体内胚葉へと分化させ、後部前腸へとパターン形成した後、予定前庭上皮へと特化させた７。発明者は、胃底部及び前庭が、後部前腸前駆体の共通の集団に由来し、このことが、適切なシグナルとともに提供された場合、胃底部系譜へと定向化され得るという仮説を立てた。しかしながら、インビボでの胃底部発生を駆動する機序がこれまでわかっていないことを考慮して、発明者はまず、近位−遠位軸に沿って胚胃をパターン形成するシグナル伝達経路を識別しなければならなかった。
【００５９】
胚胃パターン形成
胚発生中の胃底部特異性を調節する経路の研究に助力するために、発明者は、マウス胚を分析して、予定胃底部と予定前庭と予定前胃とを区別することのできる分子マーカーを識別した。１４．５日胚で、発明者は、Ｓｏｘ２が前腸器官系譜前部において発現したのに対し、Ｇａｔａ４が腺性胃上皮へと制限されることを発見した。Ｇａｔａ４＋部内で、Ｐｄｘ１は、予定前庭領域に特異的であったので（図６のａ）、胚性胃底部は、Ｓｏｘ２＋Ｇａｔａ＋Ｐｄｘ１−であると考えられる。さらに、発明者は、公開されたマイクロアレイデータセット（ＧＳＭ３２６６４８−ＧＳＭ３２６６５０１２及びＧＳＭ８０８０９−ＧＭＳ８０８１６１３）及び１４．５日胚前腸の摘出した領域を分析して、転写因子Ｉｒｘ２、Ｉｒｘ３、及びＩｒｘ５の発現が、前庭と比較して胚性胃底部において１０倍超多量であることを実証し（図６のｂ、ｃ）、このことは、当該転写因子の発現が、腺性胃上皮の領域間をさらに区別することができることを示した。
【００６０】
分子レベルで、胃の予定胃底部及び前庭部は、１０．５日胚によって既に確立された（図６のａ）。発生中の当該時点で、正準のＷｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔレポーターマウスアキシン２−ｌａｃＺ系を用いて示されるように、近位の胃において活性があったが、遠位の胃１４においては、ほとんどまたは全く活性を呈さなかった（図１のｂ）。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の調節は、幽門−十二指腸境界を確立するうえでの役割を担っていることがわかっているが１４，１５、胃上皮パターン形成におけるその役割は、研究されていなかった。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達が胃底部をインビボで確立するために機能的に必要とされるかどうかを判定するために、発明者は、Ｓｈｈ−ｃｒｅ（Ｓｈｈ−ｃｒｅ；βカテニンｆｌ／ｆｌ＝ｃＫＯ）を用いて前腸上皮におけるβカテニン（Ｃｔｎｎｂ１）を欠失させた。Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の崩壊は結果的に、胃底部の同一性を喪失させ、このことは、１０．５日胚の胃底部における異所性Ｐｄｘ１の発現によって実証された（図１のｃ）。異所性Ｐｄｘ１をまず、胃底部上皮の腹側半分に制限し、このことは、このＳｈｈ−ｃｒｅ系統を用いて既に報告された組換え活性と一致していた１６が、次に、１４．５日胚までに近位の胃の大部分及びより大きな曲面を含むよう、経時的に増殖させた（図７のａ）。さらに、胃底部マーカーＩｒｘ２、Ｉｒｘ３、及びＩｒｘ５の発現は、ｃＫＯ胚において劇的に減少した（図７のｂ）。集約的に、これらのデータは、胚性マウス胃において前庭の運命を抑圧しながら、胃底部の同一性の初期特化に必要とされるので、上皮Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達が、胃パターン形成を調節するという結論を支持している。
【００６１】
その後の細胞分化に及ぼす初期Ｗｎｔ／βカテニン仲介性パターン形成の異常性の影響を判定するために、発明者は、１８．５日胚時のｃＫＯ胚を分析した。ｃＫＯ胚における胃は、１８．５日胚において奇形となり、大きさが減少し（図１のｄ及び図７のｃ〜ｄ）、発生後期中の胃の成長を促進するうえでのＷｎｔ／βカテニンの役割を示唆した。そのうえ、ｃＫＯ胃は、上皮の最近位領域のいたるところで異所性Ｐｄｘ１の発現とともに完全に誤パターン形成していた（図１のｄ）。Ａｔｐ４ｂの発現によって標識される胃底部細胞タイプである傍細胞は、ＣＫＯ胃において減少し（図１のｄ）、βカテニン欠乏性上皮においては完全に非存在であった（図１のｅ）。対照的に、発生した傍細胞は、βカテニン発現上皮においてのみ観察された（図１のｅ及び図７のｄ〜ｅ）。まとめると、これらのインビボデータは、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達が胃底部の特化を誘導し、かつ前庭の同一性を阻害する、というモデルを支持している。さらに、この初期パターン形成の崩壊は、傍細胞のその後の細胞の自律喪失と一致しており、細胞分化が発生のパターン形成の欠損に対して二次的に損なわれることを示唆している。
【００６２】
ｈＰＳＣからの胃底部ｈＧＯの分化
発明者は次に、発生中のヒト胃の胃底部−前庭パターンを確立するうえでのＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の役割を研究した。胃の分化の初期をモデル化するために、発明者は、高い信頼度で初期胃発生の正常期を再現する、ｈＰＳＣを前庭様胃オルガノイドへと分化させるための既に説明したプロトコルを用いて出発した７。３次元後部前腸スフェロイド（ＳＯＸ２＋ＨＮＦ１β＋）を用いて出発して、発明者は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達の刺激が、胃の特化期の間に前庭（ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１＋）よりもむしろ胃底部（ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１−）の系譜へと後部前腸上皮を定向化するかどうかを検査した（図２のａ）。実際、βカテニンをＧＳＫ３阻害因子ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で３日間活性化した結果、９日後にＰＤＸ１のほぼ完全な抑止を生じるとともに、ＩＲＸ２、ＩＲＸ３、及びＩＲＸ５の発現を有意に増加させた（図２のｂ〜ｃ）。重要なことに、ＳＯＸ２及びＧＡＴＡ４のレベルは、ＣＨＩＲ処理によって影響されず、スフェロイドがそれらの胃の同一性を保有していることを確証した。したがって、ＣＨＩＲ曝露は結果的に、ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１上皮の形成を生じるとともに、予定胃底部上皮と一致した兆候であるＩＲＸ発現の増加が生じた。
【００６３】
発明者は次に、ＣＨＩＲ処理したスフェロイドが、胃底部様上皮を含有するさらに成熟したｈＧＯへとさらに発達するかどうかを判定するよう探索した。興味深いことに、６〜９日後のＣＨＩＲの３日間パルスは、ｈＧＯがより後期にＰＤＸ１＋前庭表現型へと最終的に逆戻りするので、胃底部同一性を不可逆的に特化させるのに十分ではなかった。しかしながら、少なくとも２９日後までのＣＨＩＲ処理を介したＷｎｔ刺激の持続は、胃底部遺伝子発現の安定した誘導をもたらした（図８のａ）。このことは、インビボでの胚胃発生の間のＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の長期活性と一致していた。先行研究は、胚胃における異所性Ｗｎｔ活性化が小腸の運命を促進することを示した１４，１５が、ＣＨＩＲ処理したｈＧＯは、小腸マーカーＣＤＸ２、ＭＵＣ２、ＣＣＫ、またはＳＣＴの有意な増加を呈さなかった（図８のｅ及び図９のａ〜ｂ）。発明者はさらに、ノギンをＢＭＰ４と置き換えると、小腸転写因子の頑強な発現をもたらすので、ＣＤＸ２が、ＢＭＰシグナル伝達の同時阻害により、Ｗｎｔ／βカテニン活性化にもかかわらず抑制されたままであることを実証した（図９のｃ）。
【００６４】
局所的な部分が初期発生において一旦確立されると、原始胃上皮は、最終的な細胞タイプの成長、腺形態形成、及び分化の期間を経る。発明者は既に、ｈＡＧＯが形態学的発生及び細胞発生に関して類似の進行を受けることを示した７。ＣＨＩＲ処理したｈＦＧＯは、播種したスフェロイド全部の７５〜９０％がオルガノイドへと生育するので、ｈＡＧＯと比較して類似の速度及び効率で生育した（図８のｄ）。２０日後、両タイプのｈＧＯは、細胞の９０％超で胃ＳＯＸ２／ＧＡＴＡ４の兆候を発現する上皮を含有していたのに対し、ＰＤＸ１は、ｈＡＧＯに制限された（ｈＡＧＯにおいて８７．１±８．４％及びｈＦＧＯにおいて３．９±２．０％、ｐ＝３．０７×１０−６、図８のｅ）。オルガノイドは、その発生の間、個々の胃の同一性を維持した（図８のｂ〜ｃ）。３４日後までに、ｈＦＧＯ及びｈＡＧＯは、ＣＤＨ１＋ＣＴＮＢ１＋ＫＲＴ８＋の極性のある円柱状上皮を含んでおり、当該上皮は、胃特異的１７クローディンＣＬＤＮ１８（図２のｅ及び図９のｄ）、及び匹敵する未分化の間充織細胞（図１０のｂ）を遍在的に発現した。１つの顕著な違いは、ｈＦＧＯがオルガノイド上皮から発芽した組織化した腺を有する異なる構造を有する（図２のｄ〜ｅ及び図１０のａ）のに対し、ｈＡＧＯは、複雑な折り畳み及び原始的な腺様組織化を有するが、まれに腺芽を有することであった７。したがって、胃底部を特化させる新規のＷｎｔ／βカテニン依存性機序は、ヒトにおいて保存され、発生中の胃底部に分子レベルで似ている腺上皮を有する３次元ｈＦＧＯを生じるよう操作することができる。
【００６５】
部位特異的胃細胞分化
分化した前庭胃細胞タイプをまず、約２７日後のｈＡＧＯにおいて検出した後、マウス胃における生後発達の最初の数週間１８と類似の３４日後までに増加した７。３４日後に、ｈＦＧＯは、予期した通り、ｈＡＧＯと同様に、ＭＵＣ５ＡＣ＋表面粘膜細胞及びＭＵＣ６＋粘膜頸細胞の両方を含有していた（図３のａ〜ｂ及び図１１のａ）。ｈＦＧＯは、種々の内分泌細胞タイプも形成した（図３のｃ）が、ホルモンＧＡＳＴの発現は、ｈＡＧＯに特異的であったのに対し、ＧＨＲＬは、ｈＦＧＯにおいて１０倍高く（図３のｄ）、正常胃内分泌パターンと一致していた１９。ｈＧＯの部位特異的コンピテンスを機能的に定義するために、発明者は、誘導系を用いて、プロエンドクリン（ｐｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）転写因子ＮＥＵＲＯＧ３を過剰発現させた。ｈＧＯの両サブタイプにおけるＮＥＵＲＯＧ３の発現は結果的に、パンエンドクリン（ｐａｎ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）マーカーＳＹＰならびに共通の胃ホルモンＳＳＴ及びＧＨＲＬの頑強な発現を生じた（図１１のｃ）。しかしながら、ｈＡＧＯのみがＧＡＳＴ発現Ｇ細胞を生じるようコンピテントであり、ｈＦＧＯはそうではなく（図３のｅ及び図１１のｃ）、ヒト胃におけるＧ細胞の前庭特異的分布と一致していた１９。
【００６６】
胃底部特異的分泌系譜である主細胞は、酸分泌腺の基部に存在し、予備幹細胞のあるタイプとして提唱されてきた２０。ｈＦＧＯは、主細胞特異的２１転写因子ＭＩＳＴ１の上皮発現を呈し（図４のａ）、プロ酵素ＰＧＡ５及びＰＧＣについての転写産物を１００〜１０００倍増加させ（図４のｃ）、ＥＬＩＳＡによって測定される有意に高いペプシノーゲン含有量を含有していた（図４のｅ）。しかしながら、転写産物レベルは、成人胃において認められるものの１％未満であり（図１１のｄ）、ペプシノーゲン陽性細胞は、免疫組織化学によってまれにしか検出することはできなかった（図４のｂ〜ｃ）。これと一致して、チモーゲン果粒含有細胞２２は、ＴＥＭによって識別された（図４のｄ）が、まれであった。対照的に、より未成熟の粘膜顆粒パターンを有する細胞は多量であった（図１１のｂ）。インビボの主細胞は出生後の最初の数週間、頑強なペプシノーゲン発現を呈しない（図１２のａ〜ｂ）ので、発明者は、主細胞が、ｈＦＧＯにおいて存在するが、未成熟であると結論付けた。ｈＦＧＯはそれゆえ、主細胞の成熟を調節する内因性機序と外因性機序とを分離するための頑強なプラットフォームを表す。
【００６７】
傍細胞分化を制御する経路
ベースラインで、ｈＦＧＯは、プロトンポンプ（ＡＴＰ４Ａサブユニット及びＡＴＰ４Ｂサブユニットからなる）を介して胃管腔を酸性化する胃底部腺に関して定義する細胞タイプである少数の傍細胞（ＰＣ）しか含有しなかった（図５のａ〜ｂ）。ＰＣ集団を増大させる効率的な方法の識別は、ＰＣ集団の発生を駆動するシグナル伝達機序の理解がないので、理解しづらいままであった。発明者はそれゆえ、ＰＣ分化を調節するうえでの役割についての候補シグナル伝達経路を機能的にスクリーニングするためのプラットフォームとしてＰＳＣ由来のｈＦＧＯを用いた。スクリーニングのため、発明者は、３０日後のｈＦＧＯをシグナル伝達アゴニストまたはアンタゴニストへ２日間曝露し、３４日後にＰＣ分化を分析した。シグナル伝達操作の大部分が明らかな効果を有していなかったが、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ０３）を用いたＭＥＫ経路の一過性阻害は結果的に、ＡＴＰ４Ａ及びＡＴＢ４Ｂの両方の実質的な上方調節を生じた（図１３のａ）。さらに、ＢＭＰ４だけではＰＣ遺伝子発現に影響しなかったが、ＰＤ０３の効果を亢進することができた（データ非表示）。したがって、ＰＤ０３／ＢＭＰ４の２日間パルスは、ＰＣマーカーＡＴＰ４Ａ、ＡＴＰ４Ｂ及びＧＩＦの迅速かつ頑強な発現を誘導するのに十分であった（図５のａ〜ｂ及び図１３のｄ）。興味深いことに、この効果は、培地からＥＧＦまたはＦＧＦを単純に除去することによって観察されることはなく（図１３のｂ）、ＰＣ分化をｈＦＧＯ培養へ制限することに起因するＭＥＫ／ＥＲＫの上流の内因性シグナル伝達相互作用があるようであることを示唆した。さらに、ＰＤ０３／ＢＭＰ４処理は、ＰＣ系譜に影響しただけであり（図１３のｅ）、ｈＡＧＯにおいてＰＣを誘導することはできず（図１３のｃ）、胃上皮の初期パターン形成がその最終的な分化能を規定することをさらに強調した。
【００６８】
３４日後にｈＦＧＯ上皮は、ヒト胃へかなり組織化されているのが呈され、それとともに、表面ドメインを裏打ちする粘膜細胞及びＰＣは、腺部分の中に濃縮していた（図５のｅ）。そのうえ、傍細胞の形態は、インビボでの成熟傍細胞とよく似ていた（図５のｃ）。インビボでのＰＣとの類似性及び透過型電子顕微鏡で観られるような管状小胞微細構造（図５のｄ）を考慮すると、発明者は、ｈＦＧＯにおけるＰＣが適切な刺激に対する応答において酸を分泌する能力を呈するであろうと仮説を立てた。ｐＨ感受性色素（ＳＮＡＲＦ５Ｆ）を用いてリアルタイム共焦点顕微鏡で測定すると（図１４のａ）、ｈＦＧＯは、Ｈ２アンタゴニストであるファモチジンまたはＨ＋Ｋ±ＡＴＰアーゼアンタゴニストであるオメプラゾールのいずれかによって遮断されたヒスタミンに応答して管腔ｐＨの迅速かつ顕著な低下を生じた（図５のｆ及び図１４のｂ）。ヒスタミンに対する細胞応答を可視化するために、ｈＧＯを、酸性区画において金属イオン封鎖したときにオレンジ色へとシフトする蛍光色素であるアクリジンオレンジ（ＡＯ）とともに培養した２３。単離したマウス胃腺と同様に、ＡＯは、ヒスタミンに応じて、ｈＦＧＯ腺における酸性化細胞小胞の中に蓄積した（図５のｇ及び図１４のｃ〜ｄ）。これらのデータは、ＰＣが酸誘導刺激に応じて、分泌性小管構造の適切な変化を受けたことを示す。
【００６９】
インビボでの分化した胃細胞系譜は、未分化の幹細胞または前駆細胞の共通のプールに由来すると考えられている。ここで、発明者は、遺伝的手段（内分泌細胞のＮＥＵＲＯＧ３仲介性調節）を通じて、または外因性シグナル伝達経路（ＰＣに対するＰＤ０３／ＢＭＰ４）の操作によってのいずれかで、ｈＦＧＯにおける細胞タイプの相対的な比を変化させる能力を実証した。これらの観察は、ｈＦＧＯが成体胃から単離されたものと類似した胃幹細胞の集団を含有し得るという仮説をもたらした。実際、発明者は、解離した３４日後のｈＦＧＯが、新たなオルガノイドを生じるよう連続的に継代することができることを発見した（図１５のａ〜ｂ）。継代したｈＦＧＯ由来のオルガノイドの再生育は、初代胃組織オルガノイドを生育させるのに使用するのと類似の高濃度Ｗｎｔ及び高濃度ＦＧＦ培地に依存していた２４，２５。２回の継代後、ｈＦＧＯは、系譜マーカーであるＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＰＧＣ、及びＧＨＲＬの発現を維持したが、当該系譜マーカーは、ＰＣを含有しておらず、傍細胞系譜のＰＤ０３／ＢＭＰ４仲介性誘導に対して不応性であった（図１５のｃ〜ｄ）。この知見は、真に酸分泌粘膜に由来するにもかかわらず、ＰＣを頑強に生じない、成体幹細胞由来の胃オルガノイドにおいて観察されたものと類似していた２０，２６。したがって、ｈＧＯ及び成体胃オルガノイドの長期培養におけるＰＣコンピテンスを保存する条件を識別することは重要であろう。
【００７０】
要約すると、発明者は、ｈＰＳＣを新たな組織タイプへと分化させることへインビボ及びインビトロでの発見を基にした研究を直接適用した。発明者は、マウスにおける胃発生中の胃底部ドメインを特化させるうえでのＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達の新規の機能を定義し、ｈＰＳＣを３次元ヒト胃底部オルガノイドへ分化させることを定向化するための機序についての基礎として、Ｗｎｔ調節を使用した。マウス及びヒトの両方において、Ｗｎｔ仲介性胃底部特化によって、ＰＣのその後の形成がもたらされた。この定向性分化プロトコルの初期における胃底部特異的操作は、頑強なＰＣ誘導をもたらした（図１３のｆ）。先行報告は、間充織因子Ｂａｒｘ１が、Ｗｎｔシグナル伝達を抑止するよう間接的に作用し、胃における小腸遺伝子発現を防止するのに役立つことを識別した１４，１５。本研究が、上皮Ｗｎｔ／βカテニン機能を識別したこと及び先行研究が間充織経路を識別したことを考慮すると、Ｗｎｔ／βカテニンは、上皮対間充織における異なる役割を有し得るようであると思われる。例えば、Ｗｎｔ／βカテニンについての間充織の役割は、ＢＭＰなどの他のシグナル伝達経路を調節することができ２７、このことは、Ｗｎｔと初期内胚葉から小腸特化を促進するためにＷｎｔと協同することを、本データが示す（図７及び図９のｃ）ヒト胃オルガノイドシステムは、動物モデルとの組み合わせで間充織及び上皮においてこれらのシグナル伝達経路がどのように相互作用して初期胚消化管発生を調整するのかを精査するために有用であろう。
【００７１】
異なる系譜への胃前駆細胞の分化を制御する経路も欠失している。発明者は、ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達が、傍細胞特化を強力に抑止することを識別する、この新たなｈＧＯプラットフォームの有用性を実証した。これらの知見と一致して、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ依存性経路のトランスジェニック活性化は、インビボでの傍細胞の喪失をもたらした２８，２９。それゆえ、ｈＧＯは、胃底部及び前庭における正常な細胞のホメオスタシスに関与するシグナル伝達機序を識別及び研究するための新たなかつ追跡可能なヒトモデルシステムである。さらに、発生プログラムの異常な調節も、内体／胃底病理がしばしば、傍細胞の萎縮３０〜３２、前庭型組織学的特徴３３、さらにはＰｄｘ１３４の誤発現と関係しているので、胃疾患にも寄与し得る。したがって、これらの経路のターゲティングは、ＭＥＫの薬理学的阻害が異形成のマウスモデルにおける正常傍細胞の分化を修復するのに十分であることをＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．が近年実証した３５ので、臨床的な有用性を有し得る。さらに、前庭型及び胃底部型の両ｈＧＯを今や確立したので、これらのヒト胃組織がどのように生理学的に相互作用し、感染及び損傷に異なって応答し、薬理学的処置に応答するのかを研究することは可能である。
【００７２】
方法
マウス実験
以下の遺伝的マウス系統をジャクソン研究室から得、シンシナティこども病院研究財団動物施設に収容し、ＩＡＣＵＣプロトコル（０ｂ０９０７４）によって維持した。アキシン２：ＬａｃＺ（ストック番号００９１２０）、Ｓｈｈ：Ｃｒｅ（ストック番号００５６２２）、及びｌｏｘＰが導入されたβカテニン（ストック番号００４１５２）。膣栓が観察された午前を０．５日胚と記し、基準交尾を用いて種々の期における胚を作製し、これをホールマウント染色または組織解剖のいずれかのために収集した。少なくとも２匹の同腹胚を、検討した各発生期において分析した。雌雄両方の胚を分析した。
【００７３】
多能性幹細胞培養
ヒト胚性幹細胞株ＷＡ０１（ＨＩ、ＷｉＣｅｌｌから入手）をシンシナティこども病院医学センターの多能性幹細胞施設によって供給した。細胞の識別を短いタンデム反復分析（マイクロサテライトＳＴＲ分析、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認し、細胞をマイコプラズマ混入について所定の通り検査した（マイコアラートマイコプラズマ検出キット、Ｌｏｎｚａ）。多能性細胞をｍＴｅｓＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＨＥＳＣ定性化マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフィーダーのない条件下で維持した。コロニーを、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４日間ごとに継代した。
【００７４】
後部前腸スフェロイドの分化
胃オルガノイドの定向性分化のためのプロトコルを、本発明者らの先行プロトコル７から応用し、表１は、各期についての培地及び成長因子の完全なリストを含んでいる。分化のために、ｈＰＳＣを単一の細胞へと、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解離し、Ｙ−２７６３２含有ｍＴｅｓＲ１（１０μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）中で、ウェルあたりおよそ２００，０００個の細胞密度で２４穴プレート中へ播種した。翌日、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を３日間添加することによって、細胞を胚体内胚葉（ＤＥ）へと分化させた。培地にＮＥＡＡ（１×、Ｇｉｂｃｏ）及び規定ＦＢＳ（ｄＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も１日後、２日後、及び３日後にそれぞれ０％、０．２％、及び２．０％補充した。さらに、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を初日に添加した。その後、細胞をＣＨＩＲ９９０２１（２μΜ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＦＧＦ４（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びノギン（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）へ、ＮＥＡＡ及び２．０％ｄＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で３日間曝露することによって、ＤＥを後部前腸内胚葉へと分化させた。レチノイン酸（２μΜ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を最終日に添加した。培地を毎日交換した。この過程は結果的に、３次元後部前腸スフェロイドの自律的な形成を生じた。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
前腸スフェロイド−胃オルガノイドの３次元培養
後部前腸スフェロイドを収集し、既に説明した通り３６、３次元培養システムへと移した。簡潔には、スフェロイドを５０μｌのマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁し、２４穴プレート中へ液滴として播種した。マトリゲルを組織培養インキュベータ中で１０分間凝固させておいた後、成長因子及び／または小分子アゴニストを含有する塩基成長培地（ＢＧＭ）で層状化した。ＢＧＭは、Ｎ２（１×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７（１×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＨＥＰＥＳ（１０μＭ、Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した高度ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）からなった。６〜９日後の間、スフェロイドをＲＡ及びノギンとともに培養し、前庭系譜を特化させた。胃底部特化のために、ＣＨＩＲをこの期の間に添加した。前庭ｈＧＯをその後、ＥＧＦのみを有するＢＧＭ中で培養した。胃底部ｈＧＯを６〜３０日後からＣＨＩＲへ連続的に曝露した。さらに、ＣＨＩＲによって駆動される腺形態形成を亢進することが示された（データ非表示）ので、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２０〜３０日後から胃底部ｈＧＯへ添加した。２０日後、オルガノイドを収集し、１：１０〜１：２０の希釈で再播種した。
【００７７】
傍細胞分化を高める因子を識別するためのスクリーニング実験のために、ｈＦＧＯを３０日後まで生育させたのち、個々のシグナル伝達経路のアゴニスト及びアンタゴニストへ２日間曝露した。ＤＡＰＴ（１μΜ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ４３１５４２（１０μΜ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＤ０３２５９０１（２μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ガストリン（１０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、デキサメタゾン（５０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＷｎｔ５ａ（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。処理後、ｈＦＧＯをさらに２日間、３４日後まで生育させた後、定量的ＰＣＲによって分析した。
【００７８】
ＲＮＡ単離及び定量的ＰＣＲ
既に説明した通り、全ＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）を用いて単離し、ｃＤＮＡへと転換した７。Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ  ６（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて定量的ＰＣＲを実施し、プライマー配列を以下に列挙する。
【００７９】
プライマー配列
定量的ＰＣＲに使用したプライマーは以下であった。
ｈＡＴＰ４Ａ、順方向５’−ＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣ−３’、逆方向５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＡＧＴＧＡＧ−３’、
ｈＡＴＰ４Ｂ、順方向５’−ＡＣＣＡＣＧＴＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＴＡ−３’、逆方向５’−ＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＧＴＴＡＣ−３’、
ｈＡＸＩＮ２、順方向５’−ＣＴＧＧＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＴＡＧＣＣＡ−３’、逆方向５’−ＡＧＴＧＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＧＧＡＡＡＣ−３’、
ｈＣＣＫ、順方向５’−ＣＧＧＴＣＡＣＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴ−３’、逆方向５’−ＣＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡ−３’、
ｈＣＤＸ２、順方向５’−ＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣ−３’、逆方向５’−ＡＴＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＧＣ−３’、
ｈＣＨＧＡ、順方向５’−ＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＣ−３’、逆方向５’−ＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣ−３’、
ｈＧＡＰＤＨ、順方向５’−ＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ−３’、逆方向５’−ＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧ−３’、
ｈＧＡＳＴ、順方向５’−ＣＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡ−３’、逆方向５’−ＡＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＡＧ−３’、
ｈＧＡＴＡ４、順方向５’−ＴＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣ−３’、逆方向５’−ＧＣＣＣＧＴＡＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧ−３’、
ｈＧＨＲＬ、順方向５’−ＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＣ−３’、逆方向５’−ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧ−３’、
ｈＧＩＦ、順方向５’−ＣＡＴＴＴＴＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧ−３’、逆方向５’−ＧＣＡＣＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＴＣＣＴＡＴ−３’、
ＭＲＸ２、順方向５’−ＧＴＧＧＴＧＴＧＣＧＣＧＴＣＧＴＡ−３’、逆方向５’−ＧＧＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＣ−３’、
ＭＲＸ３、順方向５’−ＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＧＡＴＡＡＧＡＣＣＡ−３’、逆方向５’−ＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡ−３’、
ＭＲＸ５、順方向５’−ＧＧＴＧＴＧＴＧＧＴＣＧＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’、逆方向５’−ＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＡ−３’、
ｈＭＩＳＴ１、順方向５’−ＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＡＴ−３’、逆方向５’−ＣＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧ−３’、
ｈＭＵＣ２、順方向５’−ＴＧＴＡＧＧＣＡＴＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡ−３’、逆方向５’−ＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧ−３’、
ｈＭＵＣ５ＡＣ、順方向５’−ＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＣＣＡＴＡＴ−３’、逆方向５’−ＣＣＡＡＧＣＧＴＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧ−３’、
ｈＭＵＣ６、順方向５’−ＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＧＴＴＣＡＡＧ−３’、逆方向５’−ＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＣＡＴＣ−３’、
ｈＰｄｘ１、順方向５’−ＣＧＴＣＣＧＣＴＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣ−３’、逆方向５’−ＣＣＴＴＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＴＣ−３’、
ｈＳＣＴ、順方向５’−ＧＧＴＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＧＧＣＣＣ−３’、逆方向５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＡＣＡＴＧＣＣ−３’、
ｈＳＯＸ２、順方向５’−ＧＣＴＴＡＧＣＣＴＣＧＴＣＧＡＴＧＡＡＣ−３’、逆方向５’−ＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＣＡＡＣＴＣ−３’、
ｍＣｄｘ２、順方向５’−ＴＣＴＧＴＧＴＡＣＡＣＣＡＣＣＣＧＧＴＡ−３’、逆方向５’−ＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＣＧＡＧＴＧＧＡＴＧ−３’、
ｍＧａｔａ４、順方向５’−ＣＣＡＴＣＴＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴ−３’、逆方向５’−ＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＴＣＴＣ−３’、
ｍＧａｐｄｈ、順方向５’−ＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣ−３’、逆方向５’−ＣＧＴＣＣＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴ−３’、
ｍＩｒｘ１、順方向５’−ＡＡＴＡＡＧＣＡＧＧＣＧＴＴＧＴＧＴＧＧ−３’、逆方向５’−ＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＧＣＡＧＡＴ−３’、
ｍＩｒｘ２、順方向５’−ＡＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＡＴＡＧＧＣＣＧ−３’、逆方向５’−ＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＡＣＧＴＧ−３’、
ｍＩｒｘ３、順方向５’−ＡＴＡＡＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＴＣＣ−３’、逆方向５’−ＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡ−３’、
ｍＩｒｘ５、順方向５’−ＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＣＧＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’、逆方向５’−ＧＣＴＡＣＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＡ−３’、
ｍＰｄｘ１、順方向５’−ＡＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＣＴ−３’、逆方向５’−ＴＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣ−３’、
ｍＰｉｔｘ１、順方向５’−ＧＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣ−３’、逆方向５’−ＧＣＴＴＡＧＧＣＧＣＣＡＣＴＣＴＣＴＴ−３’、
ｍＳｏｘ２、順方向５’−ＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧＧＧ−３’、逆方向５’−ＡＣＡＡＧＡＧＡＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴ−３’、
ｍＴｒｐ６３、順方向５’−ＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡ−３’、逆方向５’−ＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＡＴＴＡＣＣＣＧ−３’。
【００８０】
免疫蛍光染色
組織を４％パラホルムアルデヒド中、４℃で一晩固定した後、ＰＢＳで完全に洗浄した。ホールマウント免疫蛍光染色のため、胚を既に説明した通り加工した３７。簡潔には、胚をＤｅｎｔのブリーチ液（４：１：１のＥｔＯＨ：ＤＭＳＯ：３０％  Ｈ２Ｏ２）中で、室温で２時間透過処理し、メタノール連続洗浄を通じて再水和させた。次に、胚を１時間ブロッキングし、１次抗体中で一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、１次抗体中で一晩４℃でインキュベートし、完全に洗浄した。パラフィン包埋のために、組織をエタノール連続洗浄で脱水し、キシレン中で洗浄した後、パラフィン中に包埋した。染色のため、スライドを脱パラフィン化し、再水和させた。抗原賦活化をクエン酸緩衝液中で、スチーマーの中で４５分間実施した。１次抗体を４℃で一晩インキュベートした。１次抗体後、スライドをＰＢＳ中で洗浄した後、２次抗体（１：５００の希釈）とともに１時間室温でインキュベートした。２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をロバ中で作製し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、５９４、または６４７へ共役させた。
【００８１】
１次抗体
免疫蛍光染色に使用する抗体を、抗原、宿主種、製造元及びカタログ番号、ならびに染色に使用する希釈とともに列挙する。Ａｔｐ４ｂ、ウサギ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ８４３０４、１：５００；Ｃｄｈ１、ヤギ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ６４８、１：５００；Ｃｄｈ１、マウス、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６１０１８２、１：５００；Ｃｄｘ２、マウス、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  ＭＵ３９２Ａ、１：５００、Ｃｌｄｎ１８、ウサギ、Ｓｉｇｍａ  ＨＰ  Ａ０１８４４６、１：２００；Ｃｔｎｎｂ１、ウサギ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ７１９０、１：１００；ＦｏｘＦ１、ヤギ、Ｒ&Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆ４７９８、１：５００、ガストリン、ウサギ、Ｄａｋｏ  Ａ０５６８、１：１，０００；Ｇａｔａ４、ヤギ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ１２３７、１：２００；Ｇｉｆ、ウサギ、Ｓｉｇｍａ  ＨＰ  Ａ０４０７７４、１：１００；Ｇｈｒｌ、ヤギ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃｌ０３６８、１：２００；ヒスタミン、ウサギ、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ  ２２９３９、１：１，０００；Ｋｒｔ８、ラット、ＤＳＨＢトロマール−ｓ；１：１００；Ｍｉｓｔ１、ウサギ、Ｓｉｇｍａ  ＨＰ  Ａ０４７８３４、１：２００；Ｍｕｃ５ａｃ、マウス、Ａｂｃａｍ  ａｂ３６４９、１：５００；Ｍｕｃ６、マウス、Ａｂｃａｍ  ａｂ４９４６２、１：１００；Ｐｄｘ１、ヤギ、Ａｂｃａｍ  ａｂ４７３８３、１：５，０００；Ｐｇｃ、ヒツジ、Ａｂｃａｍ  ａｂ３１４６４、１：１０，０００；Ｓｓｔ、ヤギ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ７８１９、１：１００；Ｓｙｐ、モルモット、シナプス系１０１００４、１：１，０００；ビメンチン、ヤギ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ７５５７、１：２００
【００８２】
撮像
ニコンＡＩＲｓｉ倒立型共焦点顕微鏡上で、共焦点撮像を実施した。ホールマウント撮像のため、胚をメタノール中で脱水し、Ｍｕｒｒａｙのクリア液（２：１の安息香酸ベンジル：ベンジルアルコール）中で透明にした直後に撮像した。染色後、スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）でマウントし、室温で一晩空気乾燥させた。
【００８３】
透過型電子顕微鏡
透過型電子顕微鏡のために、ｈＧＯを既に説明した通り加工した７。簡潔には、オルガノイドを３％グルタルアルデヒド中で固定し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中で洗浄し、１時間の４％四酸化オスミウムについてインキュベートした。これらをその後、洗浄した後、エタノール中で連続脱水し、酸化プロピレン／ＬＸ１１２中で最終的に包埋した。次に、組織を切片化し、２％酢酸ウラニル、次いでクエン酸鉛で染色した。画像を日立透過電子顕微鏡上で可視化した。
【００８４】
ペプシノーゲンＥＬＩＳＡ
製造元の説明書により、ヒトペプシノーゲンＩ型（ＰＧＩ）ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＥＨＰＧＩ）を用いてＥＬＩＳＡを行った。簡潔には、３４日後のｈＧＯを細胞回収溶液（Ｃｏｍｉｎｇ）中に４℃で１時間収集及びインキュベートした後、ＰＢＳ中で洗浄した。オルガノイドをＲＩＰＡ緩衝液で可溶化した後、高速で室温で３０分間激しくボルテックスした。溶解液をペレット化し、上清を−８０℃で収集及び保存した。ＥＬＩＳＡのために、試料及び標準物質を技術的な複製物中で実施した。反応物をμＱｕａｎｔマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ）上で測定した。４５０ｎｍでの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度を減算した。
【００８５】
酸分泌アッセイ
酸分泌アッセイを既に説明した通り実施した（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。ｈＧＯをチャンバー付きのカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で生育させ、チャンバーを倒立型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７１０）上に置き、実験を５％ＣＯ２及び３７℃の条件下で実施した（インキュベーションチャンバー、ＰｅＣｏｎ、ドイツ国エルバッハ）。
【００８６】
新鮮に単離したマウス胃底部腺または培養したｈＧＯをアクリジンオレンジ（１０μＭ）とともにインキュベートした後、アクリジンオレンジ蛍光を４５８ｎｍまたは４８８ｎｍで励起させ、画像を６００〜６５０ｎｍ（赤色）または５００〜５５０ｎｍ（緑色）でそれぞれ収集した。その一方で、ｈＧＯの管腔ｐＨをモニターするために、供給電圧比例ｐＨ感受性色素、５−（及び−６）−カルボキシＳＮＡＲＦ  ５Ｆ（５ｍＭストック：励起５６０ｎｍ、発光５６５〜６０５（緑色）及び６２０〜６８０（赤色）ｎｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を管腔中へ微量注入し（４６〜９２ｎｌ）、モニターした。蛍光色素を培地中へも添加した。ヒスタミン（１００μΜ；Ｓｉｇｍａ）を培地へ添加した一方で、ファモチジン（１００μΜ；Ｓｉｇｍａ）またはオメプラゾール（１００μΜ；Ｓｉｇｍａ）をヒスタミンの少なくとも３０分前にプレインキュベートした。画像をＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、ペンシルベニア州ダウニングタウン地区）を用いて分析した。背景補正した６２０〜６８０／５６５〜６０５ｎｍ比の値を、標準曲線を用いてｐＨへ変換した。
【００８７】
統計分析
統計的な有意性を、対形成していないスチューデントＴ検定、または一元配置分散分析をＤｕｎｎｅｔｔの多重比較事後検査とともに用いて判定した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【００８８】
統計、及び実験の再現性
統計分析を使用しないで、実験試料の規模を決め、特別な無作為化法を使用せず、研究者は実験中盲検ではなかった。統計方法及び基準を図の凡例において説明する。胃底部ｈＧＯの分化のためのプロトコルを、実験室における７名の独立したユーザによって、２０回超、完了を成功させた。事例全部において、示されるデータは、複数の実験を代表する単一の実験に由来する。
【００８９】
例示的な組み合わせ
以下の例は、本明細書の教示が組み合わされ得または適用され得る種々の非徹底的な方法に関する。以下の例は、本出願においてまたは本出願書類のその後の提出において、いかなるときにも呈され得るいかなる請求項の網羅も制限するよう企図するものではないことは理解されるべきである。ディスクレーマーは企図していない。以下の例は、単に説明目的以下のために提供されている。本明細書の種々の教示が数多くの他の方法において配置及び適用され得ることは熟慮される。いくつかの変法が、以下の例において引用されるある特定の特徴を省略し得ることも熟慮される。それゆえ、以下に引用される態様または特徴はいずれも、本発明者らによって、または本発明者らに対して関心のある相続人によって、後日明白に示されていない限り、決定的とみなされるべきではない。何らかの請求項が、本出願において、または以下に引用されるもの以外のさらなる特徴を含む本出願と関連するその後の出願において存在する場合、当該さらなる特徴は、特許性に関するいかなる理由についても追加されたと仮定されてはならない。
【００９０】
例１．胃底部組織は、インビトロで生じ、以下のステップを含む。
【００９１】
ａ）哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞を、ｗｎｔ経路活性化因子、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＦＧＦ４）、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子（例えば、ノギン）、及びレチノイン酸と第１の期間接触させ、当該第１の期間は、当該胚体内胚葉から３次元後部前腸スフェロイドを形成するのに十分であり、
ｂ）３次元後部前腸スフェロイドを、成長因子、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸を有する基底膜マトリックス（例えば、マトリゲル）中で、胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）を含む胃底部系譜を誘導するのに十分な第２の期間懸濁し、
ｃ）ステップｂ）のｈＦＧＯをｗｎｔ経路活性化因子及びＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子の存在下で、第３の期間培養し、
ｄ）ステップｃのｈＦＧＯをｗｎｔシグナル伝達経路活性化因子、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、及びＦＧＦ１０とともに第４の期間培養し、
ｅ）ステップｄのｈＦＧＯをＭＥＫ阻害因子と、機能的胃底部細胞タイプを含む胃底部組織を形成するのに十分な期間の第５の期間接触させる（ＭＥＫ阻害因子は、例えば、ＰＤ０３２５９０１であり得る）。
【００９２】
例２．例１の方法であって、当該第１の期間は、３日間±２４時間であり、かつ当該レチノイン酸は、当該期間±２４時間の３日目に添加される
【００９３】
例３．例１〜２に記載の方法であって、当該第２の期間は、３日間±２４時間である
【００９４】
例４．例１〜３に記載の方法であって、当該第３の期間は、１１日間±２４時間である
【００９５】
例５．例１〜４のいずれかに記載の方法であって、当該第４の期間は、１０日間±２４時間である
【００９６】
例６．例１〜５のいずれかに記載の方法であって、当該第５の期間は、２日間の期間±２４時間である
【００９７】
例７．例１〜６のいずれかに記載の方法であって、ステップｅ）は、当該胃底部ｈＧＯをＢＭＰ４シグナル伝達活性化因子と接触させるステップをさらに含む。
【００９８】
例８．例１〜７のいずれかに記載の方法であって、当該機能的胃底部細胞タイプは、プロトンポンプタンパク質を発現し、かつ酸を分泌する傍細胞である。
【００９９】
例９．例１〜８のいずれかに記載の方法であって、当該機能的胃底部細胞は、ペプシノーゲンを分泌する主細胞である。
【０１００】
例１０．例１〜９のいずれかに記載の方法であって、当該ステップｅは、ＳＯＸ２＋ＧＡＴＡ＋ＰＤＸ１上皮を発生させるのに十分な期間実施される。
【０１０１】
例１１．例１〜１０のいずれかに記載の方法であって、当該ステップｄ及びステップｅは、系譜マーカーＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＰＧＣ、及びＧＨＲＬの安定した発現を与えるのに十分な期間実施される。
【０１０２】
例１２．例１〜１１のいずれかに記載の方法であって、当該胚体内胚葉は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、人工多能性幹細胞、中胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、後部内胚葉細胞、及び後腸細胞、多能性幹細胞由来の胚体内胚葉、胚性幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞から選択される多能性幹細胞に由来する胚体内胚葉から選択される前駆細胞に由来する。
【０１０３】
例１３．例１〜１２のいずれかに記載の方法であって、当該胚体内胚葉は、多能性幹細胞をアクチビン、成長因子のＴＧＦベータスーパーファミリーのＢＭＰ下位群、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、及びこれらの組み合わせから選択される１つ以上の分子と接触させることに由来する。
【０１０４】
例１４．例１〜１３のいずれかに記載の方法であって、当該ＷＮＴ経路活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６から選択される１つ以上の分子であり、例えば、Ｗｎｔ３ａ、または例えば、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＷｎｔ３ａである。
【０１０５】
例１５．例１〜１４のいずれかに記載の方法であって、当該ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子は、例えば、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、及びこれらの組み合わせから選択され、当該前駆細胞は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＭＰ阻害薬と接触させられる。ＢＭＰ阻害因子は、ＢＭＰシグナル伝達経路を阻害することのできるタンパク質及び／または化学物質であり得る。
【０１０６】
例１６．例１〜１５のいずれかに記載の方法であって、当該ステップは、インビトロで実施される。
【０１０７】
例１７．例１〜１６のいずれかに記載の胃組織を含む組成物が産生される。胃組織は、神経支配及び／または血管がないことを特徴とする。
【０１０８】
例１８．胃底部組織は、以下のステップを介して形成される。胃底部ｈＧＯ（ｈＦＧＯ）をｗｎｔ経路活性化薬及びＥＧＦシグナル伝達経路活性化薬と第１の期間、かつＭＥＫ阻害因子と第２の期間接触させるステップを含み（当該ＭＥＫ阻害因子は、例えば、ＰＤ０３２５９０１であり得る）、当該第１及び第２の期間は、機能的胃底部細胞タイプを形成するのに十分な期間実施され、
当該ｈＦＧＯは、３次元後部前腸スフェロイドを、基底膜マトリックス中で、成長因子、ｗｎｔ経路活性化薬、ＥＧＦシグナル伝達経路活性化因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と、当該３次元後部前腸スフェロイドを前記ｈＦＧＯへ変換するのに十分な期間接触させることによって得られ、
当該３次元後部前腸スフェロイドは、哺乳類胚体内胚葉（ＤＥ）細胞をｗｎｔ経路活性化薬、ＦＧＦシグナル伝達経路活性化薬、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害因子、及びレチノイン酸と接触させることによって得られる。
【０１０９】
参考文献
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８．Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｔ．−Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７，９８４−９９３（２０１５）。
【０１１７】
９．Ｐｅｅｋ，Ｒ．Ｍ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎｓ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  &  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  １，５０−５５（２００８）。
【０１１８】
１０．Ｚｏｍ，Ａ．Ｍ．&  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５，２２１−２５１（２００９）。
【０１１９】
１１．Ｋｒａｕｓ，Ｍ．Ｒ．−Ｃ．&  Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎ，Ａ．Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｈａｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２２，３４７−３５３（２０１２）。
【０１２０】
１２．Ｓｈｅｒｗｏｏｄ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．−Ｙ．Ａ．&  Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．２３８，２９−４２（２００９）。
【０１２１】
１３．Ｒｏｔｈ，Ｒ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  ２０  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＣＮＳ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，６７−８０（２００６）。
【０１２２】
１４．Ｋｉｍ，Ｂ．−Ｍ．，Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｌｅｔｉｃｈ，Ｉ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｐ．Ｔ．&  Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｒ．Ａ．Ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂａｒｘ１  ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ８，６１１−６２２（２００５）。
【０１２３】
１５．Ｋｉｍ，Ｂ．−Ｍ．，Ｗｏｏ，Ｊ．，Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｕ，Ｃ．&  Ｓｈｉｖｄａｓａｎｉ，Ｒ．Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｘ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８，１０８１−１０８６（２０１１）。
【０１２４】
１６．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  ａｎｄ  ｆｏｒｅｓｔｏｍａｃｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３７，４１７１−４１７６（２０１０）。
【０１２５】
１７．Ｌａｍｅｒｉｓ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｌａｕｄｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．４８，５８−６９（２０１３）。
【０１２６】
１８．Ｋｅｅｌｅｙ，Ｔ．Ｍ．&  Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．Ｃｙｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １−ｒｅｌａｔｅｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９９，Ｇ１２４１−５１（２０１０）。
【０１２７】
１９．Ｃｈｏｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｔｒｕｍ．Ｇｕｔ  ６３，１７１１−１７２０（２０１４）。
【０１２８】
２０．Ｓｔａｎｇｅ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｔｒｏｙ＋  ｃｈｉｅｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｔ  ａｓ  ｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ａｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｅｌｌ  １５５，３５７−３６８（２０１３）。
【０１２９】
２１．Ｌｅｎｎｅｒｚ，Ｊ．Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＭＩＳＴ１  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃｈｉｅｆ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｗｈｏｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｌｏｓｔ  ｉｎ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ，ｄｙｓｐｌａｓｉａ，ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７，１５１４−１５３３（２０１０）。
【０１３０】
２２．Ｒａｍｓｅｙ，Ｖ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｃｕｓ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ−ｅｎｚｙｍｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｚｙｍｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍｉｓｔ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４，２１１−２２２（２００７）。
【０１３１】
２３．Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｎ．Ｗ．Ｇ，Ｙａｋｕｂｏｖ，Ｉ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．&  Ｓａｃｈｓ，Ｇ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋ  ｅｆｆｌｕｘ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  Ｈ−Ｋ−ＡＴＰａｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｉｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２１，８１−９１（２００５）。．
【０１３２】
２４．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｕｎｄｉｃ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｉｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎｄ．）５９３，１８０９−１８２７（２０１５）。
【０１３３】
２５．Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｇｒ５（＋ｖｅ）ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｒｉｖｅ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ  ａｎｄ  ｂｕｉｌｄ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ６，２５−３６（２０１０）。
【０１３４】
２６．Ｂａｒｔｆｅｌｄ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４８，１２６−１３６．ｅ６（２０１５）。
【０１３５】
２７．Ｎｉｅｌｓｅｎ．Ｃ，Ｍｕｒｔａｕｇｈ，Ｌ．Ｃ，Ｃｈｙｕｎｇ，Ｊ．Ｃ，Ｌａｓｓａｒ，Ａ．&  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｊ．Ｇｉｚｚａｒｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂａｐｘｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３１，１６４−１７４（２００１）。
【０１３６】
２８．Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｌｔｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４１，７７３−７８４（１９９６）。
【０１３７】
２９．Ｓｐｅｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １０−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２ｂ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｄｕｌｔ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７，ｅ４９１２７（２０１２）。
【０１３８】
３０．Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．&  Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ  ＩＩＩ．Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｏｘｙｎｔｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．ＡＪＰ：Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９１，Ｇ９９９−１００４（２００６）。
【０１３９】
３１．Ｈｕｈ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｏｆｆｅｙ，Ｒ．Ｊ．&  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｋ．Ｍｅｎｅｔｒｉｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｔｓ  Ｍｉｍｉｃｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５０，１０−１６（２０１６）。
【０１４０】
３２．Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｈ．&  Ｋｉｍ，Ｎ．Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｔｒｏｐｈｉｃ  ｇａｓｔｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  ２０，２５−４０（２０１５）。
【０１４１】
３３．Ｗｅｉｓ，Ｖ．Ｇ．&  Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＳＰＥＭ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｔａｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，１８９−１９７（２００９）。
【０１４２】
３４．Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｆｕｎｄｉｃ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｎｅｔｒｉｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ＴＧＦα  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２８，１２９２−１３０５（２００５）。
【０１４３】
３５．Ｃｈｏｉ，Ｅ．，Ｈｅｎｄｌｅｙ，Ａ．Ｍ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅａｃｈ，Ｓ．Ｄ．&  Ｇｏｌｄｅｎｒｉｎｇ，Ｊ．Ｒ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒａｓ  ｉｎ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃｈｉｅｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  Ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｕｌｌ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ０，（２０１５）。
【０１４４】
３６．ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，ＫＷ，Ｈｏｗｅｌｌ  ＪＣ，Ｗｅｌｌｓ，ＪＭ  &  Ｓｐｅｎｃｅ，ＪＲ，Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｒｏｍ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ６，１９２０−１９２８（２０１１）．
【０１４５】
３７．Ａｈｎｆｅｌｔ−Ｒｏｎｎｅ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｓ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５５，９２５−９３０（２００７）。
【０１４６】
百分率及び比率はすべて、別段の記載がない限り、重量により算出される。
【０１４７】
百分率及び比率はすべて、別段の記載がない限り、組成物全体に基づいて算出される。
【０１４８】
本明細書のいたるところで与えられるあらゆる最高数値限界が、あらゆる最低数値限界が本明細書に明確に記載されているかのように、当該最低数値限界を含むことは理解されるべきである。本明細書のいたるところで与えられるあらゆる最低数値限界は、あらゆる最高数値限界が本明細書に明確に記載されているかのように、当該最高数値限界を含むであろう。本明細書のいたるところで与えられるあらゆる数値範囲は、あらゆるより狭い数値範囲が本明細書にすべて明確に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲内に収まるこのようなより狭い数値範囲を含むであろう。
【０１４９】
本明細書に開示される寸法及び値は、列挙される実際の数値に厳格に制限されるものとして理解されることにはなっていない。代わりに、別段の指定がない限り、各このような寸法は、列挙される値及び当該値を取り囲む機能的に等価の範囲の両方を意味するよう企図される。例えば、「２０ｍｍ」と開示された寸法は、「約２０ｍｍ」を意味するよう企図される。
【０１５０】
いかなる相互参照したまたは関連する特許または出願も含む、本明細書に引用されるあらゆる文書は、別段の明確な排除またはさもなければ制限がない限り、本明細書によりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いかなる文書の引用も、本明細書で開示または請求されるいかなる発明に関しても、従来技術を認めているわけではなく、あるいはそれを単独で、またはいかなる他の参考文献もしくは参考文献類とのいかなる組み合わせにおいても、いかなるこのような発明も教示、示唆もしくは開示することを認めているわけではない。さらに、本文書における用語の何らかの意味または定義が、参照により組み込まれる文書における同じ用語の何らかの意味または定義と矛盾するほど、本文書における当該用語に割り当てられた意味または定義は規制されなければならない。
【０１５１】
本発明の詳細な実施形態が説明及び記載されてきたが、種々の他の変更及び改変が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行えることは、当業者に対して明白であろう。それゆえ、添付の特許請求の範囲において、本発明の範囲内にあるこのような変更及び改変をすべて網羅することが企図されている。
【図１】
2019514354.tif 000003
【図２】
2019514354.tif 000004
【図３】
2019514354.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019514354.tif 000009
【図８】
2019514354.tif 000010
【図９】
2019514354.tif 000011
【図１０】
2019514354.tif 000012
【図１１】
2019514354.tif 000013
【図１２】
2019514354.tif 000014
【図１３】
2019514354.tif 000015
【図１４】
2019514354.tif 000016
【図１５】
2019514354.tif 000017
【配列表】
2019514354000001.app
【国際調査報告】
2019514354.tif 000018
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