(57)【要約】  本発明は、良好なワクチン特性およびウイルス複製を維持する一方で血清学的検出を回避する能力を突然変異ペスチウイルスに付与するキメラＥｒｎｓ遺伝子を含む突然変異ペスチウイルスを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異Ｅｒｎｓ遺伝子がキメラＥｒｎｓ遺伝子であり、キメラＥｒｎｓ遺伝子が５’部分および３’部分からなり、ここで、該５’部分がキメラＥｒｎｓ遺伝子の６０〜９５％に相当し、該３’部分がキメラＥｒｎｓ遺伝子の残部に相当し、該５’部分が、突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の対応部分からなり、該３’部分が、突然変異ペスチウイルスに対して遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の対応部分からなることを特徴とする、Ｅｒｎｓ遺伝子が突然変異しているゲノムを有する突然変異ペスチウイルス。
【請求項２】
突然変異ペスチウイルスが、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）およびボーダー病ウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスである、請求項１記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項３】
遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子が、アンテロープ（Ａｎｔｅｌｏｐｅ）ペスチウイルス、ボンゴワナ（Ｂｕｎｇｏｗａｎｎａｈ）ウイルス、ノルウェーラットペスチウイルス、非定型ブタペスチウイルス（ＡＰＰＶ）およびナカキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ）ペスチウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子である、請求項２記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項４】
遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子が、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶ、ボーダー病ウイルス、トナカイペスチウイルス、キリンペスチウイルスおよびＨｏｂｉペスチウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子である、請求項２または３記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項５】
突然変異ペスチウイルスが弱毒化ペスチウイルスである、請求項１〜４のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項６】
突然変異ペスチウイルスが、Ｎｐｏ遺伝子が突然変異しているゲノムを有する、請求項５記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項７】
突然変異ペスチウイルスがＢＶＤＶであり、該ＢＶＤＶが細胞変性性生物型のものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルス。
【請求項８】
ペスチウイルスゲノム内のＥｒｎｓ遺伝子を、請求項１記載のキメラＥｒｎｓ遺伝子へと突然変異させることを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルスの構築方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載の、または請求項８記載の方法により入手可能な突然変異ペスチウイルスを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルスまたは請求項９記載の宿主細胞またはそれらの任意の組合せと医薬上許容される担体とを含む動物用ワクチン。
【請求項１１】
・宿主細胞の培養物に請求項１〜７のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルスを感染させる工程、
・宿主細胞の感染培養物をインキュベートする工程、
・該培養物またはその一部を回収する工程、および
・該培養物またはその一部を医薬上許容される担体と混合する工程
を含む、請求項１０記載のワクチンの製造方法。
【請求項１２】
動物用ワクチンにおける使用のための、請求項１〜７のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルスまたは請求項９記載の宿主細胞またはそれらの任意の組合せ。
【請求項１３】
動物用ワクチンの製造のための、請求項１〜７のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルスまたは請求項９記載の宿主細胞またはそれらの任意の組合せ。
【請求項１４】
動物におけるペスチウイルスによる感染または疾患の関連徴候の予防または低減のための、請求項１０記載のワクチンの使用。
【請求項１５】
請求項１０記載のワクチンを動物に投与することを含む、動物におけるペスチウイルスによる感染または疾患の関連徴候の予防または低減のための方法。
【請求項１６】
請求項１０記載のワクチンを動物に投与する工程を含む、ペスチウイルスによる感染または疾患の関連徴候の予防または低減のために動物にワクチン接種する方法。
【請求項１７】
ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスに感染した動物から、請求項１０記載のワクチンでワクチン接種された動物を識別するための方法であって、ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質には特異的に結合しない、Ｅｒｎｓタンパク質に対する抗体を使用することを含む方法。
【請求項１８】
該抗体が、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶおよびボーダー病ウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来するＥｒｎｓタンパク質に特異的に結合する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
本発明のワクチンでワクチン接種された動物を、該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスによる感染に関して診断するための方法であって、
・該ワクチン接種動物からサンプルを得る工程、および
・該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス、または該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質を使用することにより、該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスに対する抗体の存在に関して、イムノアッセイにおいて該サンプルを試験する工程
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項記載の突然変異ペスチウイルスまたは該突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質を含む診断試験キット。
【請求項２１】
請求項１０記載のワクチンと請求項２０記載の診断試験キットとの併用による、偶蹄目動物の集団におけるペスチウイルスによる感染を防除するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は獣医ウイルス学およびワクチン学の分野に関する。より詳細には、本発明は、突然変異Ｅｒｎｓ遺伝子を含有する突然変異ペスチウイルス、その突然変異ペスチウイルスのワクチンおよび医学的用途、突然変異ペスチウイルスおよびワクチンの製造方法、ならびに突然変異ペスチウイルスまたはその突然変異Ｅｒｎｓ遺伝子を使用する診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科のペスチウイルス属は、農業に経済的に関連する多数の動物病原性ウイルスを含む。ペスチウィルスは世界中で見出され、偶蹄目内の動物の種々の種に感染しうる。主なウイルスメンバーは、反芻動物およびブタに感染するウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタに感染するブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ならびに反芻動物およびブタに感染するボーダー病ウイルスである。異なるペスチウイルス間には様々な度合の血清学的交差反応が生じ、これはそれらの血清診断において多大な困難をもたらす。
【０００３】
ペスチウイルスビリオンはエンベロープを有し、約１２ｋｂの一本鎖線状プラス鎖ＲＮＡゲノムを有するヌクレオカプシドを含む。該ゲノムは４つの構造タンパク質および８つの非構造タンパク質をコードし、約３９００アミノ酸の１つの大きなポリタンパク質に翻訳され、ついでこれはウイルスおよび宿主プロテアーゼにより切断される。ペスチウイルスの特徴の詳細な総説は、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＩＳＢＮ−１０：０７８１７１８３２５）におけるフラビウイルスに関する章に記載されている。ペスチウイルス分子生物学はＴａｕｔｚら（２０１５，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．９３，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ｐ．４７−１６０）に概説されている。
【０００４】
ペスチウイルス糖タンパク質の特徴の総説はＷａｎｇら（２０１５，Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．７，ｐ．３５０６−３５２９）に記載されている。免疫優性タンパク質はエンベロープ糖タンパク質ＥｒｎｓおよびＥ２、ならびに非構造タンパク質ＮＳ３であり、これらのうち、Ｅ２はウイルス中和抗体を誘導する。Ｅｒｎｓエンベロープ糖タンパク質はペスチウイルス属のウイルスに特有であり、多くの機能を有し、そのＮ末端およびＣ末端には、ポリタンパク質からそれを遊離するための切断シグナルが存在する。Ｅｒｎｓタンパク質の中央領域はＲＮアーゼ活性に関連しており、これは二本鎖ＲＮＡを妨げることが可能であり、このようにして、感染宿主細胞によるインターフェロン応答に影響を及ぼす。Ｅｒｎｓタンパク質のＣ末端側は膜結合シグナルを有する。現在公知のＥｒｎｓ遺伝子は６６６〜６８１ヌクレオチド長であり、２２２〜２２７アミノ酸のＥｒｎｓタンパク質をコードしている。該文献においては、Ｅｒｎｓタンパク質はＥ０（Ｅゼロ）、ｇｐ４８またはｇｐ４４−４８とも称される。
【０００５】
ペスチウイルス属内には、血清学的および遺伝学的に密接に関連しているウイルスの中心群が存在する。この中心群は、４つの公式ウイルス種、すなわち、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶおよびボーダー病ウイルスからなる。Ｅｒｎｓタンパク質に基づく関連性に関しては、幾つかの非公式種、すなわち、トナカイおよびキリンからの分離体、ならびにＨｏＢｉペスチウイルス（ＨｏＢｉ様またはＢＶＤＶ−３とも称される）もその群に含まれる。現在公知のペスチウイルス「種」の関連性の概要を示しているＨａｕｓｅら（２０１５，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９６，ｐ．２９９４−２９９８）を参照されたい。その参考文献の２９９７頁の図１、パネルＣに、Ｅｒｎｓタンパク質の関連性が示されている。
【０００６】
この中心群から血清学的および／または遺伝的に、より遠縁にあたるペスチウイルスの幾つかの分離体または（部分）ゲノムが公知であり、より多くのものが発見され続けている。Ｅｒｎｓタンパク質に基づく中心群に対する関連性における距離が増加する順に並べると、アンテロープ（Ａｎｔｅｌｏｐｅ）ペスチウイルス（プロングホーンとも称される）、ボンゴワナ（Ｂｕｎｇｏｗａｎｎａｈ）ウイルス、ノルウェーラットペスチウイルス（ＮＲＰＶ）となり、最も遠いのは非定型ブタペスチウイルス（ＡＰＰＶ）およびナカキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ）ペスチウイルス（ＲａＰＶ）である。
【０００７】
ボンゴワナ（Ｂｕｎｇｏｗａｎｎａｈ）ペスチウイルスはブタにおける心筋炎、死産および死亡の原因因子として２００３年にオーストラリアで特定された。ボンゴワナウイルスの特徴づけはＫｉｒｋｌａｎｄら（２０１５，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，ｖｏｌ．１７８，ｐ．２５２−２５９）に記載されている。また、ボンゴワナウイルスはＷＯ  ２００７／１２１．５２２の主題である。
【０００８】
ノルウェーラットペスチウイルスはＦｉｒｔｈら（２０１４，Ｍｂｉｏ，ｖｏｌ．５，ｅ０１９３３−１４）に記載されており、ＡＰＰＶはＨａｕｓｅら，２０１５（前掲）に記載されており、ＲａＰＶはＷｕら（２０１２，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８６，ｐ．１０９９９−１１０１２）に記載されている。
【０００９】
ＣＳＦＶは、ブタにとってしばしば致命的な重篤な出血性疾患であるブタコレラを引き起こす。この重篤な臨床疾患は動物に多大な苦痛を与え、商業的養豚およびその産品に依存する分野に相当な経済的損失をもたらす。胎仔の経胎盤感染によるＣＳＦＶの垂直感染が生じる可能性がある。また、ブタが慢性的に感染して、ウイルスの持続的な水平伝播が生じうる。
【００１０】
ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）は、ウシの最も蔓延しているウイルス性疾患の１つの原因因子である。このウイルスは世界中のほとんどのウシ集団において流行しており、種々の症状を引き起こし、これらのうち、生殖器疾患および呼吸器疾患が最も顕著である。
【００１１】
ＢＶＤＶは、種々の遺伝子型および生物型を有する点で生物学的に多様である。遺伝子型ＢＶＤＶ−１および−２は、現在、別々の種とみなされており、構造糖タンパク質Ｅ１およびＥ２において遺伝的差異を有する。ＢＶＤＶ−１および−２のどちらの種においても、高毒性または低毒性の株が記載されている。幾つかの亜遺伝子型が生じており、野外で見出されており、それらの流行は様々であり、現在重要なのは１ｂ、１ｆ、２ａおよび２ｃである。
【００１２】
ＢＶＤＶ生物型における差異は、細胞変性性（ｃｐ）または非細胞変性性（ｎｃｐ）のいずれにおいても、非構造遺伝子ＮＳ２およびＮＳ３における遺伝的差異により決定される。どちらの生物型も胎盤を通過し、胎仔に感染しうるが、ｎｃｐ形態のみが子ウシの持続的感染（ＰＩ）を引き起こしうる。ＰＩ子ウシの誕生がＢＶＤＶの疫学の基礎となる。なぜなら、これらの動物は、一般に、しばらくの間は無症候性であるが、感染性ＢＶＤＶウイルスを生涯にわたって撒き散らし、それらの群れおよびそれらの周辺を汚染するからである。また、これらのＰＩ動物は、「粘膜病」と称される致命的なＢＶＤＶ疾患を、しばしば１年以内に発症する。ｃｐ型ＢＶＤＶは、ＮＳ２遺伝子の突然変異により、ＰＩ動物において進化すると考えられている。ｃｐ生物型はより急性の症状を引き起こすが、宿主動物においては、ｎｃｐ生物型よりも排除が容易である。
【００１３】
ＢＶＤＶ関連疾患、すなわち、中絶、死産、出血性症候群および粘膜病の概要に関しては、「メルク獣医マニュアル（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」（１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ編，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）を参照されたい。
【００１４】
ペスチウイルス感染および／またはその誘発疾患に対するワクチン接種は一般的な方法であり、多数のタイプのワクチンが商業的に入手可能である。そのようなワクチンは、生（すなわち、複製性）もしくは不活化ペスチウイルス、または更にはウイルスサブユニットに基づくものでありうる。
【００１５】
幾つかの国においては、緊急ワクチン接種および／または感染動物の殺処分のような、ペスチウイルスの防除のための政府の計画が存在する。ＢＶＤＶに関しては、ワクチン接種による胎仔の防御と共に、ＰＩ動物の検出および排除が重要である。しかし、ウイルス保有野生動物からの再感染により、根絶は困難である。また、ペスチウイルスに対する抗体に関して血清陽性である動物については、国境を越える輸送が制限されうる。これは包括的なワクチン接種体制の適用を妨げる。
【００１６】
したがって、ワクチン接種動物から感染動物を血清学的に「識別」すること（すなわち、ＤＩＶＡ）を可能にするワクチンの開発に注力されている。このタイプの識別試験の基本原理は、野生型微生物による動物の感染から血清学的に識別されうる陽性（追加的特徴）または陰性（欠損した特徴）「マーカー」機能を有するワクチンでの標的動物のワクチン接種である。例えば、該マーカーワクチンにおいては、野生型微生物に存在する１以上の抗原が欠損していてもよい。ついで感染宿主はその抗原に関して血清陽性となり、一方、ワクチン接種体は適切なアッセイ系においてその抗原に関して血清陰性のままである。
【００１７】
根絶および防除計画を監視するための診断試験の使用においては、該試験の感度および特異性が十分なレベルであることが重要である。なぜなら、この点で欠陥があれば、どちらにしても深刻な結果が生じうるからである。すなわち、偽陽性は動物の不必要な隔離または殺処分につながる可能性があり、偽陰性は、未検出キャリア動物の越境輸送により、病原体の広がりを引き起こしうる。疑わしい場合は、陰性評価動物は数週間後に再検査されうる。
【００１８】
ワクチンウイルスと野外ウイルスとの識別は、一般に、分子生物学的技術、例えばＰＣＲを用いて可能であるが、何らかの免疫診断アッセイにより、ＤＩＶＡ原理を適用することが通常は好ましい。そのようなアッセイは、感染後に相当な時間が経過した後でさえも、大規模で適用可能であり、比較的安価である。
【００１９】
よく使用される診断試験はＥＬＩＳＡのような酵素イムノアッセイである。ペスチウイルスに関する商業的ＥＬＩＳＡ試験は、一般に、免疫優性タンパク質であるＥｒｎｓ、Ｅ２またはＮＳ３の１つに基づいており、該抗原またはそれに対する抗体のいずれかを検出する。具体例を以下に示す。
【００２０】
ＢＶＤＶに関して：ＢＶＤＶ  ＮＳ３に関する阻害ＥＬＩＳＡであるＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＢＶＤＶ抗体ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）；およびＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ抗原検出のためのＥＬＩＳＡであるＩＤＥＸＸ  ＢＶＤＶ  ＰＩ  Ｘ２試験。
【００２１】
ＣＳＦＶに関して：ＣＳＦＶ  Ｅ２に対する抗体を検出するための間接ＥＬＩＳＡであるＣＳＦＶ  Ｅ２抗体試験キット（Ｂｉｏｃｈｅｃｋ）；ＣＳＦＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体を検出するＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ  Ｅｒｎｓ  ＥＬＩＳＡ；およびＣＳＦＶ抗原に関する二重抗体サンドイッチ直接ＥｌｉｓａであるＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ抗原ＥＬＩＳＡキット（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。
【００２２】
これまでに幾つかの生弱毒化ペスチウイルスワクチンが記載されている。これらのワクチンウイルスは遺伝子検査により野外ウイルスから識別されうるが、それらは不十分な血清学的マーカー能を有する。例えば、ＢＶＤＶの場合、生弱毒化ワクチン株はＷＯ  ２００５／１１１．２０１［Ｎｐｒｏ遺伝子において及びＥｒｎｓ遺伝子において突然変異を有するペスチウイルス突然変異体（好ましくはｎｃｐ生物型のＢＶＤＶ）を記載している］、およびＷＯ  ２００８／０３４．８５７（Ｎｐｒｏ遺伝子の一部が欠失しているｃｐ生物型のペスチウイルス突然変異体を記載している）に記載されている。Ｚｅｍｋｅら（２０１０，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４２，ｐ．６９−８０）も参照されたい。
【００２３】
ＷＯ  ２０１４／０３３．１４９は、ＮＳ３タンパク質からのヘリカーゼドメイン２のエピトープに突然変異を有するペスチウイルスを記載している。
【００２４】
同様に、ｖａｎ  Ｇｅｎｎｉｐら（２００１，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐ．４４７−４５９）は、抗ＣＳＦＶ抗体による認識を回避するためのＢＶＤＶ  ＥｒｎｓまたはＥ２遺伝子を含有する生キメラＣＳＦＶを記載している。しかし、抗Ｅｒｎｓ抗血清に対する残存血清学的交差反応性が偽陽性反応を尚も引き起こした。
【００２５】
最後に、ＣＳＦＶ  Ｅ２−タンパク質を発現するＢＶＤＶバックボーンからなるＣＳＦＶマーカーワクチン（Ｓｕｖａｘｙｎ（商標）ＣＳＦマーカー，Ｚｏｅｔｉｓ）が欧州において認可された。
【００２６】
結果として、生弱毒化ペスチウイルスマーカーワクチンの選択肢はごくわずかである。その理由の１つは、野生型ウイルスとの明確かつ検出可能な血清学的差異を有したままで、有効な免疫防御をもたらすことと、良好なウイルス複製を示すワクチンウイルスの特性とのバランスにおいて、問題が生じたことである。
【００２７】
一例はＬｕｏら（２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．３０，ｐ．３８４３−３８４８およびＷＯ  ２０１０／０６４．１６４）に記載されている。これらの著者は、完全なＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ遺伝子を、例えばトナカイ、キリン、プロングホーン・アンテロープ（Ｐｒｏｎｇｈｏｒｎ  Ａｎｔｅｌｏｐｅ）からのペスチウイルスからのＥｒｎｓ遺伝子により置換した。該著者は、それらの最も遠縁のプロングホーン・アンテロープのドナーペスチウイルスからのＥｒｎｓ遺伝子を使用した際に血清学的交差反応性が最も低下したと報告している。しかし、ＢＶＤＶ−プロングホーンＥｒｎｓキメラウイルスは、試験された全ての候補体のなかで最悪の度合の複製をも示した。
【００２８】
したがって、他のペスチウイルスに対する特異的血清学的交差反応性を欠くが、尚も良好なウイルス複製を示し、ペスチウイルス感染および／または疾患に対する有効な免疫防御を誘導する改良されたペスチウイルスマーカーワクチンウイルスを提供することにより、先行技術における欠点を克服し、当分野における要求に応えることが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００２９】
驚くべきことに、キメラＥｒｎｓ遺伝子を有する突然変異ペスチウイルスを提供することにより、この目的が達成可能であり、したがって、先行技術における１以上の欠点が克服されうることが見出された。ここで、該キメラＥｒｎｓ遺伝子は、５’側の大部分においては、遠縁ペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子に基づくものであり、３’側にある該キメラＥｒｎｓ遺伝子の残りの部分は近縁ペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子に基づく。
【００３０】
ペスチウイルスにおいて、その元のＥｒｎｓ遺伝子を、受容ペスチウイルスに対して遠縁であるペスチウイルスに由来する異種Ｅｒｎｓ遺伝子により完全に置換すると、生じる突然変異ペスチウイルスの複製が著しく低下し、または更には停止することを、本発明者らは見出した。
【００３１】
これは先行技術からの教示と完全に一致していた。例えば、Ｌｕｏら（前掲）を参照されたい。また、Ｒｉｃｈｔｅｒら（２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４１８，ｐ．１１３−１２２）は、ボンゴワナウイルス由来のＥｒｎｓ遺伝子を有する突然変異ＢＶＤＶで同じことを経験している。Ｒｉｃｈｔｅｒらは、複製に対するこの影響を克服することを試み、挿入異種Ｅｒｎｓ遺伝子のシグナルペプチド切断部位に対する修飾（バイシストロニック構築物の作製、または切断部位における１つのヌクレオチドの欠失の作製）を行った。しかし、これらの修飾はいずれも、突然変異ＢＶＤＶの生存能を回復させることはできなかった。この影響がなぜ生じたのか、およびこれが克服可能なのかどうか又はどうすれば克服可能なのかは、全く不明であった。
【００３２】
本発明者らは、驚くべきことに、突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子を含む突然変異ペスチウイルスの複製能を回復させる方法を見出した。これは、該遠縁Ｅｒｎｓ遺伝子に、遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の３’側を付与することによるものである。
【００３３】
突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の５’側からのキメラＥｒｎｓ遺伝子の５’部分は、突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓタンパク質に対する抗血清を使用した場合に、突然変異ペスチウイルスを血清学的にほぼ検出不能にする。これは優れた血清学的マーカー機能となり、例えば、野生型ペスチウイルスによる感染に関するワクチン接種動物のスクリーニングの際に、誤解を招く交差反応性のリスクが非常に低い。
【００３４】
また、突然変異ペスチウイルスに対して遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の３’側からのキメラＥｒｎｓ遺伝子の３’部分は、突然変異ペスチウイルスが、そのＥｒｎｓ遺伝子に対する突然変異が存在しない場合とほぼ同じレベルで複製することを可能にする。これは、ウイルスが製造目的で増幅される場合および生ワクチンとして適用される際の動物における複製の両方において、突然変異ペスチウイルスが十分に高い力価まで複製することを可能にするのに重要である。
【００３５】
また、突然変異Ｅｒｎｓ遺伝子の３’側における置換による、複製能のこの回復が、突然変異Ｅｒｎｓ遺伝子の５’部分における置換により得られた、Ｅｒｎｓタンパク質に対する血清学的交差反応の著しい低下を妨げず、または逆転させなかったという知見も、非常に重要であった。
【００３６】
したがって、本発明は、特徴の意外かつ有利な組合せ、すなわち、非常に有効な免疫防御および血清学的マーカー能とほとんど低下しない複製能とを有する突然変異ペスチウイルスの製造および使用を可能にする。
【００３７】
突然変異ペスチウイルスに対して遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の３’側におけるこの置換が突然変異ペスチウイルスの複製を回復させる理由は現在公知ではない。これらの観察を説明しうるいずれの理論またはモデルによっても束縛されることを本発明者らは望まないが、どうやら、「遠縁」Ｅｒｎｓ遺伝子自体は、突然変異ペスチウイルスの生存能および複製に重要な何らかの機能または効果をもたらしたり、誘導したりせず、あるいは少なくとも十分にはそれらをもたらさないようである、と本発明者らは推測している。突然変異ペスチウイルスに対して遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の３’側を付与して初めて、欠損機能が回復する。
【００３８】
したがって、１つの態様において、本発明は、突然変異Ｅｒｎｓ遺伝子がキメラＥｒｎｓ遺伝子であり、キメラＥｒｎｓ遺伝子が５’部分および３’部分からなり、ここで、該５’部分がキメラＥｒｎｓ遺伝子の６０〜９５％に相当し、該３’部分がキメラＥｒｎｓ遺伝子の残部に相当し、該５’部分が、突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の対応部分からなり、該３’部分が、突然変異ペスチウイルスに対して遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の対応部分からなることを特徴とする、Ｅｒｎｓ遺伝子が突然変異しているゲノムを有する突然変異ペスチウイルスに関する。
【００３９】
本発明における「突然変異」ウイルスは、１以上の点においてその親ウイルスから遺伝的に異なるウイルスである。同様のことが「突然変異」遺伝子にも当てはまる。典型的には、突然変異ウイルスまたは突然変異遺伝子は遺伝的操作によりインビトロで構築されている。
【００４０】
突然変異は、原則として、任意の適切な技術により施されうる。ウイルスゲノム上の突然変異の正味の結果は挿入、欠失および／または置換でありうる。
【００４１】
ペスチウイルスを、例えば元のＥｒｎｓ遺伝子を異種Ｅｒｎｓ遺伝子により置換することにより、突然変異させる方法は、当技術分野においてよく知られている。これらは、典型的には、ペスチウイルスゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーの使用を含み、ＢＶＤＶの場合には、これは、例えば、Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓら（１９９６，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７０，ｐ．８６０６−８６１３）に記載されているｐＡ／ＢＶＤＶであり、ＣＳＦＶの場合には、Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓら（１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７１，ｐ．５５５−５６７）に記載されているｐＡ／ＣＳＦＶである。
【００４２】
該ｃＤＮＡコピーは、クローニング、トランスフェクション、組換え、選択および増幅を含むよく知られた分子生物学的技術による操作を可能にする。ついで、得られた突然変異ペスチウイルス構築物からインビトロでＲＮＡを転写し、ついでこれを適切な宿主細胞内にトランスフェクトして、突然変異ペスチウイルスの第１世代複製ウイルスを得ることが可能である。
【００４３】
これら及び他の技術は以下のような標準的なテキストに詳細に説明されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ｌｎｃ．，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０８７９６９６５４０）；および“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｊ．ＢａｒｔｌｅｔｔおよびＤ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）。突然変異ペスチウイルスの構築のための詳細な方法は本明細書にも記載されており、例示されている。
【００４４】
したがって、当業者は、通常の方法および材料のみを使用して、これらの技術を容易に適用することが可能であろう。
【００４５】
本発明における「ペスチウイルス」は、ペスチウイルス属に属するウイルスとしてよく知られている。そのようなウイルスは、その分類群のメンバーの特徴的な特性、例えば形態学的、ゲノム的および生化学的特徴、ならびに生物学的特徴、例えば生理学的、免疫学的または病理学的挙動を示す。当分野で公知のとおり、微生物の分類はそのような特徴の組合せに基づく。したがって、本発明はまた、それらから任意の方法で、例えば亜種、株、分離物、遺伝子型、変異体、サブタイプまたはサブグループなどとして細分されるペスチウイルスをも含む。
【００４６】
本発明において使用されるペスチウイルスのサンプルは、勿論、感染動物から単離されうるが、より簡便には、それらは大学または（寄託）機関から公的に入手可能である。
【００４７】
本発明における個々のペスチウイルスは特定の種および属において現在分類されているかもしれないが、新たな洞察が新たな又は異なる分類群への再分類をもたらしうるため、そのような分類学的分類はやがて変化しうることが当業者に明らかであろう。しかし、これは、微生物自体、その遺伝的もしくは抗原的レパートリー、または他のウイルスに対する遺伝的関連性のレベルを変化させることはなく、単にその学名または分類を変化させるに過ぎない。したがって、そのような再分類微生物は依然として本発明の範囲内である。
【００４８】
本発明における「遺伝子」なる語は、特定のタンパク質をコードする核酸またはゲノム領域を示すために用いられる。ペスチウイルスの場合、ゲノムは１つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、これはポリタンパク質に翻訳される。したがって、この場合、そのポリタンパク質の、１つの特定のタンパク質の遺伝子は、ＯＲＦと同一ではなく、それ自身のプロモーター、開始コドンおよび終止コドンを有さない。
【００４９】
「Ｅｒｎｓ遺伝子」はその生物学的特性によって容易に同定可能である。例えば、それはペスチウイルスゲノムの最初の４分の１の部分（５’側の２５％）に位置し、コアタンパク質の遺伝子の直下流（３’側）、かつ、Ｅ１タンパク質遺伝子の直上流（５’側）に位置する。Ｅｒｎｓタンパク質はペスチウイルスビリオン内に存在し、ＲＮアーゼ活性を有する。Ｅｒｎｓタンパク質の有意な部分が環境中に分泌され、したがって、ウイルス培養培地または動物宿主血清において検出されうる。
【００５０】
ペスチウイルスポリタンパク質におけるコード化Ｅｒｎｓタンパク質は、両側で、特徴的なシグナルペプチドおよび切断部位に隣接しており、（現在公知の種においては）２１０〜２２７アミノ酸長である。
【００５１】
比較アラインメントにより、Ｅｒｎｓ遺伝子またはタンパク質は容易に認識される。これは、特に、ペスチウイルスＥｒｎｓ遺伝子およびタンパク質の、多数のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、公的データベースから入手可能だからである。例えば、本発明において使用される個々のペスチウイルス種または非定型分離体のＥｒｎｓ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＶＤＶ−１：Ｕ６３４７９；ＢＶＤＶ−２：Ｕ１８０５９；ＣＳＦＶ：Ｘ８７９３９；ボーダー病ウイルス：ＡＦ０３７４０５；ＨｏＢｉ：ＡＢ８７１９５３；キリン：ＮＣ００３６７８；トナカイ：ＡＦ１４４６１８；アンテロープ：ＮＣ０２４０１８；ボンゴワナ：ＮＣ０２３１７６；ＮｒＰＶ：ＮＣ０２５６７７；ＡＰＰＶ：ＫＲ０１１３４７；およびＲａＰＶ：ＪＱ８１４８５４（部分ゲノム，Ｅ１〜ＮＳ３からの断片）におけるそのペスチウイルスの公開ゲノム配列におけるＥｒｎｓ遺伝子でありうる。
【００５２】
例示として挙げると、本発明において使用されるＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ遺伝子はＢＶＤＶ−１株ＣＰ７からのＥｒｎｓ遺伝子であることが可能であり、そのウイルスゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６３４７９、ヌクレオチド１１７９〜１８５９（これは６８１ヌクレオチド長である）から入手可能である。これは配列番号１に表されている。この遺伝子は２２７アミノ酸のＢＶＤＶ−１  ＣＰ７  Ｅｒｎｓタンパク質をコードしており、これは配列番号２に表されている。
【００５３】
同様に、ボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ０２３１７６からのヌクレオチド１２２８〜１８９３により表されるＥｒｎｓ遺伝子が使用可能であり、これは６６６ヌクレオチド長であり、配列番号３に表されている。コード化ボンゴワナＥｒｎｓタンパク質は配列番号４に示されている。本明細書における配列番号３および４はＷＯ２００７／１２１．５２２のそれぞれ配列番号６および１８と同一であることに留意されたい。
【００５４】
本明細書に示されている配列においては、ヌクレオチドは標準的なＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコードのＤＮＡで表される。しかし、当業者に理解されるとおり、天然のペスチウイルスゲノム配列はＲＮＡ形態であり、この場合、ＴはＵとなる。
【００５５】
遺伝子が「キメラ」だと言えるのは、それが、元々は連結されていなかった複数の部分の集合、例えば、異なるウイルス分離体または種からの同じ遺伝子の部分の集合である場合である。キメラ遺伝子はキメラタンパク質をコードし、これは実際には融合タンパク質である。「５’部分」および「３’部分」なる語は、本明細書において定められているキメラＥｒｎｓ遺伝子を一緒になって構成する２つの部分を示すために使用される。明らかに、５’部分はキメラＥｒｎｓ遺伝子の５’（上流）側に位置し、キメラＥｒｎｓ遺伝子の最初のヌクレオチドから開始する。３’部分はキメラＥｒｎｓ遺伝子の３’（下流）側に位置し、その遺伝子の最終ヌクレオチドで終わる。
【００５６】
本明細書中で用いる「部分」なる語はそれ自体では或るサイズまたはサイズの分割部分を意味するものではない。逆に、本発明における「５’部分」は、本明細書中で定められている「３’部分」より大きなキメラＥｒｎｓ遺伝子断片を含む。
【００５７】
・「５’部分はキメラＥｒｎｓ遺伝子の６０〜９５％に相当する」、および
・「３’部分はキメラＥｒｎ遺伝子の残部に相当する」。
【００５８】
どちらもキメラＥｒｎｓ遺伝子の全長にわたって単純に計算され、「残部」は、５’部分には存在しないキメラＥｒｎｓ遺伝子の残りを意味することが、当業者に明らかであろう。したがって、実際、３’部分はキメラＥｒｎｓ遺伝子のその３’側における５〜４０％に相当し、５’部分のサイズに左右される。
【００５９】
当業者に理解されるとおり、得られる突然変異ペスチウイルスのリーディングフレーム内にシフトが導入されないように、キメラＥｒｎｓ遺伝子の全ヌクレオチド長は３の倍数である必要がある。
【００６０】
当業者は、通常の方法および材料のみを使用して、この要件を満たすために、そして尚も本発明の範囲内で機能するように、その場合ごとに、キメラＥｒｎｓ遺伝子の５’または３’部分の長さを計算し、最適化することが十分に可能である。
【００６１】
記載されているとおり、本明細書中で定められているキメラＥｒｎｓ遺伝子を一緒になって形成する２つの部分は、異なる起源を有し、これは、それらの異なる機能をもたらす。その点で重要なのは、これらの部分が由来するペスチウイルスと、本発明の突然変異ペスチウイルスとの遺伝的関連性のレベルである。遺伝的関連性のこの評価の基準はＥｒｎｓ遺伝子である。一方においては、キメラＥｒｎｓ遺伝子の５’部分および３’部分のドナーペスチウイルスからのＥｒｎｓ遺伝子、そして他方においては、本発明において突然変異に付される前の突然変異ペスチウイルス（すなわち、本発明の突然変異ペスチウイルスを作製するために使用された親ペスチウイルス）中に存在したＥｒｎｓ遺伝子を比較する。
【００６２】
したがって、ペスチウイルスが本発明の突然変異ペスチウイルスから「遺伝的に遠縁」または「遺伝的に近縁」であるかどうかは、キメラＥｒｎｓ遺伝子の５’および３’部分のドナーＥｒｎｓ遺伝子と、本発明の突然変異ペスチウイルスの元のＥｒｎｓとの間のヌクレオチド配列同一性のレベルに基づいて決定される。
【００６３】
これらの比較を容易にするために、異なるペスチウイルスの元のＥｒｎｓ遺伝子は、アクセッション番号が前記に記載されているＧｅｎＢａｎｋに公開されているＥｒｎｓ遺伝子である。
【００６４】
例えば、本発明の突然変異ペスチウイルスがＣＳＦＶである場合、もう１つのペスチウイルスに対する遺伝的関連性のレベルは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ８７９３９のＣＳＦＶ  Ｅｒｎｓ遺伝子を、前記の他のペスチウイルスからのドナーＥｒｎｓ遺伝子と比較することにより決定される。
【００６５】
本発明における遺伝的関連性はヌクレオチド配列アラインメントにより決定される。そのようなアラインメントは、多数の利用可能なコンピュータプログラムの１つを使用して簡便に行われうる。例えば、２つの配列を整列（アライメント）させること、またはデータベースに対してクエリー配列を整列させることは、ＮＣＢＩインターネットウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ上で、公的に利用可能なプログラムスイートであるＢＬＡＳＴ（登録商標）を使用し、デフォルトパラメータを使用して行われうる。あるいは、幾つかの配列の多重アライメントは、ＭＥＧＡ（Ｔａｍｕｒａら，２０１３，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｅｖｏｌ．，ｖｏｌ．３０，ｐ．２７２５−２７２９）を使用して簡便に行われうる。
【００６６】
ヌクレオチド配列アライメントのスコアは長さに依存し、キメラＥｒｎｓ遺伝子の部分の長さは変動しうるため、前記の元のＥｒｎｓ遺伝子の全体に対してキメラＥｒｎｓ遺伝子の全体を単に整列させ、ついで、キメラＥｒｎｓ遺伝子のどの部分がペスチウイルスのどの種または分離体に由来するのかを特定し、その部分の長さがどれくらいかを特定することにより、アライメントを行う。
【００６７】
結果として、キメラＥｒｎｓ遺伝子の部分がどのペスチウイルスに由来するのかを特定し、該部分の長さを特定した後、キメラＥｒｎｓ遺伝子において使用されたＥｒｎｓ遺伝子の部分と突然変異ペスチウイルスの対応する元のＥｒｎｓ遺伝子との間のヌクレオチド配列同一性が、プログラム「Ｂｌ２ｓｅｑ」をデフォルトパラメータで使用した場合に７０％未満である場合には、Ｅｒｎｓ遺伝子は、本発明の突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来する、と本発明に関して判定される。
【００６８】
逆に、Ｅｒｎｓ遺伝子のその部分と突然変異ペスチウイルスの対応する元のＥｒｎｓ遺伝子との間のヌクレオチド配列同一性が、プログラム「Ｂｌ２ｓｅｑ」をデフォルトパラメータで使用した場合に７０％以上である場合には、本発明に関しては、Ｅｒｎｓ遺伝子は本発明の突然変異ペスチウイルスの元のＥｒｎｓ遺伝子に対して「遺伝的に近縁」のペスチウイルスに由来する。
【００６９】
実際、これは、ペスチウイルスＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶ、ボーダー病ウイルス、トナカイ、キリンおよびＨｏｂｉペスチウイルスが互いに「遺伝的に近縁」であり、これらのそれぞれがアンテロープ、ボンゴワナ、ＮＲＰＶ、ＡＰＰＶおよびＲａＰＶ由来のＥｒｎｓ遺伝子に対して「遺伝的に遠縁」であることを意味する。
【００７０】
これはＨａｕｓｅｎら（前掲）の２９９７頁の図１、パネルＣの系統樹にも示されている。
【００７１】
「対応部分」は、キメラＥｒｎｓ遺伝子の５’または３’部分が元のＥｒｎｓ遺伝子における類似したサイズおよび位置の部分により形成されることを意味する。例えば、本明細書中で定められているキメラＥｒｎｓ遺伝子の実施形態の１つにおいて、５’部分がキメラＥｒｎｓ遺伝子の８５％に相当する場合には、対応部分は、本発明の突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の５’側における８５％である。
【００７２】
同様の理屈がキメラＥｒｎｓ遺伝子の３’部分に適用される。５’部分が例えば８５％である場合には、３’部分はキメラＥｒｎｓ遺伝子の「残り」の１５％に相当し、「対応部分」は、本発明の突然変異ペスチウイルスに遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子の３’側における１５％である。
【００７３】
１つの実施形態においては、キメラＥｒｎｓ遺伝子において使用されるそのＥｒｎｓ遺伝子の部分と突然変異ペスチウイルスの対応する元のＥｒｎｓ遺伝子との間のヌクレオチド配列同一性が、プログラム「Ｂｌ２ｓｅｑ」をデフォルトパラメータで使用した場合に６５％未満である場合には、Ｅｒｎｓ遺伝子は本発明の突然変異ペスチウイルスから遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来する。
【００７４】
好ましくは、遺伝的に遠縁は、プログラム「Ｂｌ２ｓｅｑ」をデフォルトパラメータで使用した場合に、そのＥｒｎｓ遺伝子の部分と突然変異ペスチウイルスの対応する元のＥｒｎｓ遺伝子との間の６０％未満、５５％未満または更には５０％未満（この順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性を意味する。
【００７５】
逆に、１つの実施形態においては、キメラＥｒｎｓ遺伝子において使用されるそのＥｒｎｓ遺伝子の部分と突然変異ペスチウイルスの対応する元のＥｒｎｓ遺伝子との間のヌクレオチド配列同一性が、プログラム「Ｂｌ２ｓｅｑ」をデフォルトパラメータで使用したアライメントの際に７５％を超える場合には、Ｅｒｎｓ遺伝子は本発明の突然変異ペスチウイルスから遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来する。
【００７６】
好ましくは、遺伝的に近縁は、プログラム「Ｂｌ２ｓｅｑ」をデフォルトパラメータで使用した場合に、キメラＥｒｎｓ遺伝子におけるそのＥｒｎｓ遺伝子の部分と突然変異ペスチウイルスの対応する元のＥｒｎｓ遺伝子との間の８０％超（すなわち、８０％を超える）、８５％超または更には９０％超（この順に好ましくなる）のヌクレオチド配列同一性を意味する。
【００７７】
１つの実施形態においては、キメラＥｒｎｓ遺伝子の５’部分はキメラＥｒｎｓ遺伝子の約６５〜約９３％、好ましくは、キメラＥｒｎｓ遺伝子の約７０〜約９３％、約７５〜約９１％、または更には約８０〜約９０％（その順に好ましくなる）である。
【００７８】
本発明においては、「約」なる語と共に示されている数字は、その数字が、示されている値の周辺で±２５％変動しうることを意味し、好ましくは、約は、示されている値の周辺の±２０％を意味し、より好ましくは、約は、示されている値の周辺の±１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２％を意味し、または更には、約は、示されている値の周辺の±１％を意味する（その順に好ましくなる）。
【００７９】
ペスチウイルス属の現在公知のメンバーのなかで、ＢＶＤＶ、ＣＳＦＶおよびボーダー病ウイルスが農業分野に最大の経済的影響を及ぼす。
【００８０】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスは、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）およびボーダー病ウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスである。
【００８１】
本発明の突然変異ペスチウイルスがＢＶＤＶ、ＣＳＦＶまたはボーダー病ウイルスに基づく場合、遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子は、アンテロープ（Ａｎｔｅｌｏｐｅ）ペスチウイルス、ボンゴワナ（Ｂｕｎｇｏｗａｎｎａｈ）ウイルス、ノルウェーラットペスチウイルス、ＡＰＰＶまたはナカキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ）ペスチウイルスである。
【００８２】
したがって、本発明の突然変異ペスチウイルスの１つの実施形態においては、遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子は、アンテロープペスチウイルス、ボンゴワナウイルス、ノルウェーラットペスチウイルス、非定型ブタペスチウイルス（ＡＰＰＶ）およびナカキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ  ａｆｆｉｎｉｓ）ペスチウイルス（ＲａＰＶ）からなる群から選択されるペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子である。
【００８３】
更に、本発明の突然変異ペスチウイルスがＢＶＤＶ、ＣＳＦＶまたはボーダー病ウイルスに基づく場合、遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子は、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶ、ボーダー病ウイルス、トナカイペスチウイルス、キリンペスチウイルスまたはＨｏｂｉペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子である。
【００８４】
したがって、本発明の突然変異ペスチウイルスの１つの実施形態においては、遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子は、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶ、ボーダー病ウイルス、トナカイペスチウイルス、キリンペスチウイルスおよびＨｏＢｉペスチウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子である。
【００８５】
本発明の突然変異ペスチウイルスの有利な使用はマーカーワクチンとしての使用である。そのマーカーワクチンが生ワクチンとして適用される場合、突然変異ペスチウイルスは、動物に投与するのに十分な程度に安全となるように、低減した毒性を有する必要がある。
【００８６】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスは弱毒化ペスチウイルスである。
【００８７】
本発明においては、ペスチウイルスが「弱毒化」されていると言えるのは、該ウイルスが、同じ種または分離体（例えば、野生型分離体）の別のウイルスと比較して低減した毒性を有する場合である。実際、弱毒化は、感染標的動物の全身にわたる拡散（例えば、胎仔感染）の低減、疾患（の徴候）のような病状の誘発の低減、および／または環境中への広がりの低減を示すと意図される。
【００８８】
ペスチウイルスが実際に弱毒化されているかどうか、およびその弱毒化レベルが本発明の突然変異ペスチウイルスのための親ウイルスとしての使用に十分であるかどうか（例えば、生ワクチンにおけるその使用に関するもの）は、インビトロまたはインビボのいずれかの標準的な方法を用いて簡便に決定されうる。例えば、２つのペスチウイルス変異体（１つはその突然変異体を有し、１つはその変異体を有さない）を並べて比較することにより、これは行われうる。例えば、細胞培養または実験感染動物におけるウイルス複製速度に対する突然変異の効果を比較し、種々の組織または器官におけるウイルスの存在を検査し、動物または胎仔における疾患の臨床的、巨視的または微視的徴候をモニターすることにより、これは行われうる。
【００８９】
その弱毒化を得るための１つの方法は、生弱毒化ワクチンとしての使用に許容されるレベルまでその毒性を低減する更なる突然変異を該突然変異ペスチウイルスに付与することによるものである。
【００９０】
本発明の突然変異ペスチウイルスを弱毒化しうる更なる突然変異の例としては、ＮｐｒｏまたはＮＳ３遺伝子における突然変異が挙げられる。
【００９１】
ＮＳ３における突然変異は、好ましくは、ＷＯ  ２０１４／０３３．１４９に記載されている突然変異であり、これにより、ペスチウイルスは、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインに位置するエピトープの突然変異を有していて、該エピトープは、野生型ペスチウイルスにおけるそのエピトープに対するモノクローナル抗体に対して、もはや反応性ではない。
【００９２】
代替的または追加的に、更なる突然変異はＮｐｒｏ遺伝子内に位置する。そのような突然変異は、本発明の突然変異ペスチウイルスにおけるその他の修飾と良好に組合されるレベルの弱毒化をもたらしうる。
【００９３】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスは、Ｎｐｒｏ遺伝子が突然変異したゲノムを有する。
【００９４】
好ましい実施形態においては、Ｎｐｒｏ遺伝子に対する突然変異は、ＷＯ  ２００８／０３４．８５７に記載されている突然変異であり、これにより、Ｎｐｒｏ遺伝子は、ＮｐｒｏのＮ末端の１２アミノ酸をコードするＮｐｒｏ遺伝子の５’部分を除いて、欠失される。
【００９５】
生弱毒化マーカーワクチンとして使用される突然変異ペスチウイルスの安全性または有効性を増強するために、更なる突然変異または弱毒化が行われうる。
【００９６】
１つの特に有用な改変はＷＯ  ２０１２／０３８．４５４に記載されている。この発明は、異なる遺伝子型のＢＶＤＶウイルスを１つのワクチンにおいて組合わせた場合に生じる干渉を防ぐ。ＷＯ  ２０１２／０３８．４５４に記載されているとおり、１つの遺伝子型のＢＶＤＶペスチウイルスを、それ自身のＥ２遺伝子の代わりに別の遺伝子型のＢＶＤＶのＥ２遺伝子を含むように突然変異させる。その効果は、そのようなＥ２キメラＢＶＤＶが次いで、その元のＥ２遺伝子以外は同じウイルスバックボーンを有するＢＶＤＶと１つのワクチンにおいて組合されうることである。これらの２つのウイルスは、それぞれのものに対する免疫応答の発生に、もはや干渉しないであろう。
【００９７】
したがって、本発明の突然変異ペスチウイルスの１つの実施形態においては、突然変異ペスチウイルスはＢＶＤＶに基づいており、該ＢＶＤＶは１つの遺伝子型のものであるが、その元のＥ２遺伝子の代わりに別の遺伝子型のＢＶＤＶからのＥ２遺伝子を含む。
【００９８】
好ましい実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスはＢＶＤＶ−１に基づいており、その元のＥ２遺伝子の代わりにＢＶＤＶ−２のＥ２遺伝子を含む。
【００９９】
この改変はまた、例えば、突然変異ペスチウイルスがＢＶＤＶ−１ウイルスに基づいており、ＢＶＤＶ−１  Ｅ２遺伝子を含む場合に、本発明の突然変異ペスチウイルスに含まれうる。逆の組合せも勿論可能であり、この場合、本発明の突然変異ペスチウイルスのバックボーンはＢＶＤＶ−２に基づいており、ＢＶＤＶ−２  Ｅ２遺伝子を含む。
【０１００】
１つの実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスはＢＶＤＶであり、該ＢＶＤＶは細胞変性性生物型のものである。
【０１０１】
本発明の突然変異ペスチウイルスの１つの実施形態においては、キメラＥｒｎｓ遺伝子は、遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子として、ボンゴワナウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子を含む。
【０１０２】
そのような突然変異ペスチウイルスは優れたマーカー機能を有することが判明した。なぜなら、該コード化キメラＥｒｎｓタンパク質は、抗ボンゴワンナウイルス抗血清を使用した場合にのみ検出可能であり、他のペスチウイルスまたはそれらのＥｒｎｓタンパク質に対する抗血清を使用した場合には検出可能でないことが見出されたからである。
【０１０３】
好ましい実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスはＢＶＤＶに基づいており、遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子としてボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子を含むキメラＥｒｎｓ遺伝子を含み、該キメラＥｒｎｓ遺伝子の３’部分は該キメラＥｒｎｓの約１０％および約２０％であり、ＢＶＤＶに由来する。
【０１０４】
本発明の突然変異ペスチウイルスの好ましい実施形態においては、突然変異ペスチウイルスはＢＶＤＶ−１に基づいており、配列番号５に記載されているキメラＥｒｎｓ遺伝子を含む。
【０１０５】
配列番号５のキメラＥｒｎｓ遺伝子は６８７ヌクレオチド長であり、適切なリーディングフレームを有する。したがって、この場合、キメラＥｒｎｓ遺伝子の３’部分と突然変異ペスチウイルス（ここではＢＶＤＶ−１）との間の関連性のレベルは１００％であり、これは遺伝的に近縁だとみなされる。
【０１０６】
ＢＶＤＶ−１株ＣＰ７のＥｒｎｓ遺伝子（元のＥｒｎｓ遺伝子は６８１ｎｔ長である）の（対応）３’側から１０８ヌクレオチドである本明細書中で定められているこのキメラＥｒｎｓ遺伝子のこの３’部分の長さの比率に関しては、このキメラＥｒｎｓ遺伝子においては、本明細書中で定められている３’部分はこのキメラＥｒｎｓ遺伝子の（１０８／６８７）＝１５．７％である。
【０１０７】
配列番号６は、配列番号５によりコードされるキメラＥｒｎｓ遺伝子のアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
配列番号５におけるボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子（配列番号３）の５’部分は元のＥｒｎｓ遺伝子の対応長（５７９ヌクレオチド）（ここでは、アクセッション番号Ｕ６３４７９のＢＶＤＶ−１  Ｅｒｎｓ遺伝子）に対して６５％のヌクレオチド配列同一性を有する。これは遺伝的に遠縁とみなされる。
【０１０９】
そのような突然変異ペスチウイルスの構築および使用は後記の実施例の節において詳細に記載されている。
【０１１０】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明において定められているキメラＥｒｎｓ遺伝子に関する。
【０１１１】
本発明の突然変異ペスチウイルスを構築するために、キメラＥｒｎｓ遺伝子が使用されうる。該遺伝子は、修飾およびクローニングを容易にするためのプラスミドもしくは他のビヒクル、またはＰＣＲ増幅産物中に含まれうる。該遺伝子または該プラスミドは、標準的な分子生物学的技術を用いて、ＰＣＲにより、または細菌培養において増幅されうる。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、キメラＥｒｎｓ遺伝子は配列番号５に示されている。
【０１１３】
本発明の突然変異ペスチウイルスの更なるまたは追加的な改変または突然変異が想定されうる。これらは１以上の組合せとしても適用されうる。したがって、本発明の突然変異ペスチウイルスの１つの実施形態においては、以下のものからなる群から選択される条件の１以上または全てが適用される：
・突然変異ペスチウイルスは更なる突然変異を含み、これはＮｐｒｏ遺伝子内に位置し、突然変異ペスチウイルスを弱毒化する；
・突然変異ペスチウイルスは１つの遺伝子型のＢＶＤＶに基づいているが、その元のＥ２遺伝子の代わりに別の遺伝子型のＢＶＤＶからのＥ２遺伝子を含む；
・遺伝的に遠縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子は、ボンゴワナウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子である；
・遺伝的に近縁のペスチウイルスに由来するＥｒｎｓ遺伝子は、ＢＶＤＶ−１またはＢＶＤＶ−２に由来するＥｒｎｓ遺伝子である；
・突然変異ペスチウイルスはｃｐ生物型ＢＶＤＶ−１またはｃｐ生物型ＢＶＤＶ−２に基づいている；および
・キメラＥｒｎｓ遺伝子は配列番号５に表されているものである。
【０１１４】
本発明の突然変異ペスチウイルスの構築においては、種々の実施形態が導入されうる種々の方法が存在する。例えば、本発明の突然変異ペスチウイルスは、本明細書に記載されているキメラＥｒｎｓ遺伝子の導入により作製されうる。次に、該突然変異ペスチウイルスに更なる突然変異および変異が加えられうる。
【０１１５】
しかし、より好ましいアプローチは、本明細書に記載されているキメラＥｒｎｓ遺伝子を、その他の実施形態の１以上を既に有するペスチウイルス内に導入し、このようにして幾つかの追加的特徴を有する本発明の突然変異ペスチウイルスを得ることでありうる。例えば、これは、確立されたワクチン株であるペスチウイルスに適用されうる。このようにして、その確立されたワクチンに、その複製および免疫防御を維持したまま、効率的なマーカー特性が付与されうる。
【０１１６】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、ペスチウイルスゲノム内のＥｒｎｓ遺伝子を、本明細書に記載されているキメラＥｒｎｓ遺伝子へと突然変異させることを含む、本発明の突然変異ペスチウイルスの構築方法を提供する。
【０１１７】
本発明の方法の適用に必要な方法および材料は十分に当業者の通常の能力の範囲内であり、本明細書に詳細に記載されており、当技術分野でよく知られている。
【０１１８】
１つの実施形態においては、本発明の方法は、確立されたワクチン株として使用されるペスチウイルスに適用され、例えば、不活化ワクチン、例えば、ＢＶＤＶに関しては、Ｂｏｖｉｌｉｓ（登録商標）ＢＶＤ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｂｏｖｉｄｅｃ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｐｒｅｇｓｕｒｅ（登録商標）ＢＶＤ（Ｚｏｅｔｉｓ）；ボーダー病およびＢＶＤＶに関しては、Ｍｕｃｏｂｏｖｉｎ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）において適用される。
【０１１９】
あるいは好ましくは、本発明の方法は、確立された生弱毒化ペスチウイルスワクチン株、例えば、ＢＶＤＶに関しては、Ｍｕｃｏｓｉｆｆａ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）；およびＣＳＦＶに関しては、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＣＳＦ  Ｌｉｖｅ（ＭＳＤ  ＡＨ）；Ｓｕｖａｘｙｎ  ＣＳＦ（Ｚｏｅｔｉｓ）；またはＲｉｅｍｓｅｒ  Ｓｃｈｗｅｉｎｅｐｅｓｔ  ｖａｋｚｉｎｅ［Ｒｉｅｍｓのブタ熱ワクチン］（ＩＤＴ  Ｄｅｓｓａｕ）において適用される。
【０１２０】
本発明の方法において、および本発明の突然変異ペスチウイルスの増幅のためには、該ウイルスは適切な宿主細胞において産生される。これは、突然変異ウイルスが未だ複製形態でない場合には、そのような宿主細胞内への核酸のトランスフェクションによるものでありうる。あるいは、複製形態の場合には、突然変異ペスチウイルスをそのような宿主細胞上に接種し、自然複製により増幅させる。
【０１２１】
宿主細胞は初代細胞、例えば、動物組織から調製された初代細胞でありうる。しかし、好ましくは、宿主細胞は、絶えず増殖する樹立細胞系からのものである。
【０１２２】
ウイルス複製周期における或る時点で、そのような宿主細胞は本発明の突然変異ペスチウイルスを含有する。
【０１２３】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の突然変異ペスチウイルスを含む宿主細胞、または本発明の方法により入手可能な宿主細胞に関する。
【０１２４】
ペスチウイルスの複製のための適切な宿主細胞は当技術分野においてよく知られており、例えば大学または（寄託）機関から、一般に公的に入手可能である。本発明の宿主細胞の製造および培養のための方法、培地および材料は当技術分野でよく知られている。
【０１２５】
適切な宿主細胞の例としては、例えば以下のような細胞系が挙げられる：ウシ細胞系、例えばＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙウシ腎臓）；ブタ細胞系、例えばＰＫ１５（ブタ腎臓）またはＳＴＥ（ブタ精巣上皮細胞）；汎用細胞系、例えばＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓細胞）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）またはＰＴ細胞（ヒツジ上皮腎臓細胞）。
【０１２６】
前記のとおり、本発明の突然変異ペスチウイルスの有利な使用はマーカーワクチンとしての使用である。
【０１２７】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の突然変異ペスチウイルスまたは本発明の宿主細胞またはそれらの任意の組合せと医薬上許容される担体とを含む動物用ワクチンに関する。
【０１２８】
「ワクチン」は、固有の医学的効果を有する組成物であることがよく知られている。ワクチンは、免疫学的に活性な成分と、医薬上許容される担体とを含む。「免疫学的に活性な成分」は、防御免疫応答を誘導する、標的の免疫系により認識される１以上の抗原分子（ここでは、本発明の突然変異ペスチウイルス）である。該応答は標的の先天性および／または後天性免疫系からのものであることが可能であり、細胞性および／または体液性のタイプのものでありうる。
【０１２９】
ワクチンは、一般に、例えば、ウイルス量を減少させること又は宿主動物におけるウイルス複製の持続時間を短縮することにより、感染のレベルまたは度合を低下させるのに有効である。
【０１３０】
また、あるいは恐らくはその結果として、ワクチンは、一般に、そのようなウイルス感染もしくは複製により又はその結果として又はその感染に対する動物の応答により引き起こされうる疾患の症状を軽減または改善するのに有効である。
【０１３１】
本発明のワクチンの効果は、ペスチウイルスによる感染を、および／またはそのようなウイルス感染もしくは複製に関連した疾患の徴候を、免疫応答の誘導、例えばウイルス中和抗体の誘導および／または細胞性免疫応答の誘導により、動物において予防または軽減することである。
【０１３２】
そのようなワクチンは、口語的に、ペスチウイルス「に対する」ワクチンまたは「ペスチウイルスワクチン」と称されうる。
【０１３３】
ペスチウイルスに対するワクチンの有効性の判定は、例えば、ワクチン接種後またはチャレンジ感染後の免疫応答をモニターすること、例えば、標的の疾患徴候、臨床スコア、血清学的パラメータをモニターすること、あるいは病原体を再分離すること、およびこれらの結果を、模擬ワクチン接種動物において見られるワクチン接種−チャレンジ応答と比較することにより行われうる。
【０１３４】
あるいは、あるレベルを超えるウイルス中和抗体が防御と相関することが知られている場合には、ワクチンの有効性を実証するのに、血清学的検査で十分でありうる。
【０１３５】
本発明のワクチンが意図される「動物」は、ペスチウイルスによる感染に対して感受性である動物である。主として、これらは哺乳（非ヒト）動物であり、偶蹄目動物のメンバーである。本発明によるワクチンのための好ましい標的動物は反芻動物およびブタであり、より好ましくは、ウシ、ヒツジおよびブタである。
【０１３６】
本発明のワクチンは、本発明の突然変異ペスチウイルスと本発明の宿主細胞との任意の「組合せ」を含みうる。これは、後記のとおり、ワクチンが製造されうる種々の方法を指す。１つの例は、該ウイルスおよび該（感染）宿主細胞の両方を含む、本発明の突然変異ペスチウイルスの完全培養物の採取である。
【０１３７】
本発明のワクチンは生ワクチン、不活化ワクチンもしくはサブユニットワクチンまたはそれらの任意の組合せでありうる。
【０１３８】
「不活化」ワクチンは、何らかの不活化方法により非複製性にされた微生物を含むワクチンである。不活化の一般的方法は、例えば、熱、放射線または化学物質、例えばホルマリン、ベータ−プロピオラクトン、二成分エチレンイミンもしくはベータ−エタノールアミンを適用することによるものである。
【０１３９】
最初に不活化される突然変異ペスチウイルスは、ウイルス培養物から、例えば細胞ペレット、培養上清または全培養から誘導されうる全ウイルス粒子である。不活化方法はウイルス粒子のタンパク質、脂質および／または核酸に影響を及ぼすため、これは或る程度は損傷されうる。それでも、このタイプのワクチンは一般に全ウイルス不活化ワクチンと称される。
【０１４０】
適切な不活化方法の選択は十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
【０１４１】
あるいは、本発明のワクチンまたはその一部はサブユニットワクチンでありうる。これは、ウイルス粒子の部分の１以上の分画または単離のための１以上の（追加的）工程を適用することにより、生ウイルスまたは不活化ウイルスから製造されうる。これは、例えば、抽出物、画分、ホモジネートまたは超音波処理物を調製することを含み、それらは全て、当技術分野でよく知られている。
【０１４２】
しかし、本発明のワクチンの好ましい形態は生ワクチンである。「生」なる語はウイルス因子に関しては生物学的に不適切であるが、それはこの分野では一般に使用される。したがって、本発明における「生」なる語は、不活化されていない、複製能を有する（すなわち、複製性である）本発明の突然変異ペスチウイルスに関するものである。
【０１４３】
本発明のワクチンは、本発明の突然変異ペスチウイルスの特性ゆえに、ペスチウイルスＥｒｎｓタンパク質に関するマーカーワクチンとして、適切な試験によるスクリーニングと組合せて有利に使用されうる。
【０１４４】
好ましい実施形態においては、本発明のワクチンは生弱毒化マーカーワクチンである。
【０１４５】
生弱毒化ワクチンは一般に凍結乾燥形態で製造される。これは、凍結温度を超える温度での長期貯蔵を可能にする。凍結乾燥のための方法は当業者に公知であり、種々の規模の凍結乾燥のための装置が商業的に入手可能である。
【０１４６】
したがって、１つの実施形態においては、本発明のワクチンは凍結乾燥形態である。
【０１４７】
凍結乾燥形態はケークであることが可能であり、あるいはリオスフィア（ｌｙｏｓｐｈｅｒｅ）またはそれらの両方であることが可能である（ＥＰ  ７９９．６１３に記載されているとおり）。
【０１４８】
凍結乾燥ワクチンを還元（再構成）するためには、それを、生理的に許容される希釈剤中に懸濁させる。これは、ワクチンの最高品質を確保するために、通常、投与直前に行う。希釈剤は典型的には水性であり、例えば、滅菌水または生理食塩水でありうる。ワクチンを還元するために使用される希釈剤はそれ自体が、追加的化合物、例えばアジュバントを含みうる。
【０１４９】
本発明の凍結乾燥ワクチンのもう１つの実施形態においては、ワクチン用希釈剤は、活性ワクチン組成物を含む凍結乾燥形態とは別に供給される。その場合、凍結乾燥ワクチンおよび希釈剤組成物は、一緒になって本発明のワクチンを具体化するパーツのキット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）を構成する。
【０１５０】
したがって、本発明の凍結乾燥ワクチンの好ましい実施形態においては、該ワクチンは、少なくとも２つの容器（１つの容器は凍結乾燥ワクチンを含み、１つの容器は水性希釈剤を含む）を含有するパーツのキットである。
【０１５１】
「医薬上許容される担体」は、例えば液体、例えば水、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。より複雑な形態においては、担体は、例えば、更なる添加剤、例えば安定剤または保存剤を含むバッファーでありうる。
【０１５２】
本発明のワクチンはアジュバントをも含みうる。これは、ワクチンが不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンである場合に特に有用である。しかし、生ワクチンもアジュバントを含みうるが、それは、長期貯蔵の際にもワクチンウイルスの生存度を低下させないように注意深く選択されるべきである。
【０１５３】
「アジュバント」はよく知られたワクチン成分であり、一般には、標的の免疫応答を非特異的に刺激する物質である。多種多様なアジュバントが当技術分野で公知である。不活化／サブユニットワクチンのためのアジュバントの例としては、フロイント完全または不完全アジュバント、ビタミンＥ、アルミニウム組成物、例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、Ｐｏｌｙｇｅｎ（商標）、非イオン性ブロック重合体およびポリアミン、例えばデキストラン硫酸、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標）、ピラン、サポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ（商標）またはＱ−ｖａｃ（商標）が挙げられる。サポニンおよびワクチン成分はＩＳＣＯＭ（商標）において組合されうる。
【０１５４】
更に、アジュバントとしては、ペプチド、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン、および鉱油、例えばＢａｙｏｌ（商標）またはＭａｒｋｏｌ（商標）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）または軽（パラフィン）油、あるいは非鉱油、例えばスクアレン、スクアランまたは植物油、例えばオレイン酸エチルを使用する油エマルションがしばしば使用される。また、ＩＳＡ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃから入手）またはＤｉｌｕｖａｃＦｏｒｔｅ（商標）のような組合せ製品が有利に使用されうる。
【０１５５】
ワクチンエマルションは油中水型（ｗ／ｏ）、水中油型（ｏ／ｗ）、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）または二重油エマルション（ＤＯＥ）などの形態でありうる。
【０１５６】
あるいは、そして生ワクチンとの使用により好適なものとして、他の免疫刺激性成分、例えばサイトカインまたは免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドが本発明のワクチンに添加されうる。
【０１５７】
免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮＯ）である。好ましいＩＮＯはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９アゴニスト、例えば、ＷＯ  ２０１２／０８９．８００（Ｘ４ファミリー）、ＷＯ  ２０１２／１６０．１８３（Ｘ４３ファミリー）またはＷＯ  ２０１２／１６０．１８４（Ｘ２３ファミリー）に記載されているものである。
【０１５８】
本発明のワクチンは、その用量、体積、経路または処方に関して最適な方法で、そして標的動物の年齢、性別または健康状態に関して最適な方法で、標的動物に投与されるべきである。当業者はワクチン投与のためのそのような最適条件を完全に決定することが可能である。不活化またはサブユニットペスチウイルスワクチンの場合、投与は、典型的には、筋肉内、皮下または皮内注射による。本発明の生弱毒化ワクチンに関しては、「粘膜」経路、例えば鼻腔内または眼内経路も適切でありうる。
【０１５９】
したがって、１つの実施形態においては、本発明のワクチンは非経口経路により、好ましくは、筋肉内、皮下または皮内経路により投与される。
【０１６０】
本発明の生ワクチンは注射によっても投与されうる。あるいは、使用される突然変異ペスチウイルスの具体的な特性に応じて、それは粘膜、経口または呼吸経路により適用されうる。
【０１６１】
１つの実施形態においては、本発明のワクチンは粘膜経路により、好ましくは、鼻腔内または眼内経路により投与される。
【０１６２】
好ましくは、生ワクチンは、大量適用の方法、例えば噴霧により、または飼料もしくは飲料水を介して適用される。
【０１６３】
本発明のワクチンは、有利には、別の抗原、微生物またはワクチン成分と組合せて、混合ワクチンにされうる。本発明のワクチンの個々の形態の特徴に応じて、その組合せを作る方法は注意深く選択する必要がある。そのような選択は当業者の通常の能力の範囲内である。
【０１６４】
したがって、１つの実施形態においては、本発明のワクチンは、少なくとも１つの追加的な免疫活性成分を含むことを特徴とする。
【０１６５】
「追加的な免疫活性成分」は抗原、免疫増強物質および／またはワクチンであることが可能であり、そのいずれもがアジュバントを含みうる。追加的な免疫活性成分は、抗原の形態である場合には、獣医学的に重要な任意の抗原成分からなることが可能である。好ましくは、追加的な免疫活性成分は、標的動物に対して病原性であるもう１つの微生物に基づいており、またはそれに由来する。それは、例えば生物学的または合成分子、例えばタンパク質、炭水化物、リポ多糖、タンパク質性抗原コード化核酸を含みうる。また、そのような核酸を含む宿主細胞、またはそのような核酸を含有する生組換え担体微生物も、核酸または追加的免疫活性成分を運搬し又は発現させる方法でありうる。あるいは、追加的免疫活性成分は、分画または死滅微生物、例えば寄生生物、細菌またはウイルスを含みうる。
【０１６６】
追加的免疫活性成分はまた、免疫増強物質、例えばケモカイン、または前記の免疫刺激性核酸を含みうる。あるいは、本発明のワクチン自体が或るワクチンに添加されうる。
【０１６７】
本発明にとっての混合ワクチンの有利な有用性は、それがペスチウイルスに対する免疫応答だけでなく、標的動物の他の病原体に対する免疫応答をも誘導し、一方、ワクチン接種のための動物の取扱いが１回しか必要でなく、それにより、動物に対する不快感ならびに時間および労働コストが低減されることである。
【０１６８】
そのような追加的免疫活性成分の例は、原則として、本発明のペスチウイルスワクチンの標的でもある動物のワクチン接種に適した全てのウイルス病原体、細菌病原体および寄生生物病原体またはそれらの一部である。
【０１６９】
標的動物に重要なそのような病原体の例としては以下のものが挙げられる。
【０１７０】
ブタの場合：ブタサーコウイルス、ブタ生殖呼吸症候群ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、エリジペロスリックス属種（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｅｃ．）およびボルデテラ属種（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）。
【０１７１】
ウシの場合：ネオスポラ属種（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｓｐｅｃ．）、ジクチオカウルス属種（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）、クリプトスポリジウム属種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、オステルタジア属種（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ  ｓｐｅｃ．）、ウシロタウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、ウシコロナウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ウシヘルペスウイルス）、ウシパラミクソウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、ブルータングウイルス、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、スタフィロコッカス属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃ．）、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、マンヘミア属種（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｅｃ．）、ヘモフィルス属種（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｅｃ．）およびフソバクテリウム属種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）。
【０１７２】
ヒツジの場合：トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、小反芻獣疫ウイルス、ブルータングウィルス、シュマレンバーグ（Ｓｃｈｍａｌｌｅｎｂｅｒｇ）ウイルス、マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃ．）、ブルセラ属種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、コクシエラ属種（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クラミジア属種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｅｃ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｅｃ．）およびマンヘミア属種（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｐｅｃ．）。
【０１７３】
したがって、追加的免疫活性成分はもう１つのペスチウイルスおよび／またはペスチウイルスワクチンであることも可能であり、それらの一方または両方は生、不活化またはサブユニットワクチンでありうる。
【０１７４】
当業者は、本発明のワクチンの有効性、安全性および安定性を確保する一方で、そのような組合せを作ることが十分に可能である。
【０１７５】
本発明のワクチンの製造は当技術分野でよく知られており、当業者の通常の能力の範囲内である。そのような製造方法は、製造されるワクチンのタイプに応じて、一般に、例えばインビトロ細胞培養における、本発明の突然変異ペスチウイルスの製造、回収、および製剤化（処方）のための工程を含む。
【０１７６】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、
・宿主細胞の培養物に本発明の突然変異ペスチウイルスを感染させる工程、
・宿主細胞の感染培養物をインキュベートする工程、
・該培養物またはその一部を回収する工程、および
・該培養物またはその一部を医薬上許容される担体と混合する工程
を含む、本発明のワクチンの製造方法に関する。
【０１７７】
この方法における種々の時点で、追加的工程、例えば追加的処理、例えば精製または保存の工程が加えられうる。
【０１７８】
次に、該製造方法は、更なる医薬上許容される賦形剤、例えば安定剤、担体、アジュバント、希釈剤、エマルションなどと混合することを含みうる。ついで、製造されたワクチンは適切なサイズの容器内に分配される。該製造方法の種々の段階は、適切な試験により、例えば、抗原の質および量に関する免疫学的試験により、不活化（適用可能な場合）、無菌性および外来物質の非存在に関する微生物学的試験により、そして最終的には、ワクチンの有効性および安全性を判定するためのインビトロまたはインビボ実験によりモニターされる。これらは全て、当業者によく知られており、薬局方のような政府による規定書、ならびに“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）のようなハンドブックに規定されている。
【０１７９】
本発明におけるワクチンは、所望の適用経路および所望の効果に合致した、動物標的への投与に適した形態として製造される。
【０１８０】
該ワクチンは、懸濁液、溶液、分散液またはエマルションのような注射液として製剤化（処方）されうる。あるいは、該ワクチンは凍結乾燥形態で製剤化されうる。一般に、ワクチンは無菌状態で製造される。
【０１８１】
本発明のワクチンの適用経路に応じて、ワクチンの組成を適合させることが必要かもしれない。これは十分に当業者の能力の範囲内であり、一般に、ワクチンの有効性、安定性または安全性の微調整を含む。これは、ワクチン用量、量、頻度、経路を適合させることにより、別の形態または製剤のワクチンを使用することにより、あるいはワクチンのその他の成分（例えば、安定剤またはアジュバント）を適合させることにより行われうる。
【０１８２】
本発明のワクチンの動物用量当たりに使用される本発明の突然変異ペスチウイルスの厳密な量はワクチンのタイプおよび処置される標的動物に左右される。生ワクチンの場合、これは、典型的には、不活化ワクチンの場合より少ない。なぜなら、生ウイルスは複製しうるからである。目安としては、本発明の生ワクチンの用量は、約１×１０１〜約１×１０７の、本発明の突然変異ペスチウイルスの組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）／動物を含有する。本発明の不活化ワクチンの用量は不活化形態の本発明の突然変異ペスチウイルスの約１×１０２〜約１×１０９  ＴＣＩＤ５０／動物のペンダント（ｐｅｎｄａｎｔ）を含む。
【０１８３】
本発明の突然変異ペスチウイルスのウイルス粒子を計数および定量するための方法はよく知られている。
【０１８４】
本発明のワクチンの体積／動物用量は、処置が意図される標的動物および意図される適用経路に応じて最適化されうる。典型的には、不活化ワクチンは０．１〜５ｍｌ／動物の用量で投与される。生ワクチンの用量は、適用経路に応じて、更に変動する。
【０１８５】
本発明のワクチンの免疫学的有効量の決定または用量当たりのワクチンの体積の最適化は共に十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１８６】
もう１つの態様においては、本発明は、動物用ワクチンにおける使用のための、本発明の突然変異ペスチウイルスまたは本発明の宿主細胞またはそれらの任意の組合せに関する。
【０１８７】
もう１つの態様においては、本発明は、動物用ワクチンの製造のための、本発明の突然変異ペスチウイルスまたは本発明の宿主細胞またはそれらの任意の組合せに関する。
【０１８８】
もう１つの態様においては、本発明は、動物におけるペスチウイルスによる感染または疾患の関連徴候の予防または軽減のための、本発明のワクチンの使用に関する。
【０１８９】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のワクチンを動物に投与することを含む、動物におけるペスチウイルスによる感染または疾患の関連徴候の予防または軽減のための方法に関する。
【０１９０】
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のワクチンを動物に投与する工程を含む、動物のワクチン接種の方法に関する。
【０１９１】
したがって、本発明のワクチンはペスチウイルスによる感染の確立および進行の両方を妨げるため、本発明のワクチンは予防的もしくは治療的処置またはその両方として使用されうる。
【０１９２】
その点において、本発明のワクチンによるウイルス負荷の低減のもう１つの有利な効果はウイルスの体外排出およびそれによるウイルスの伝播（後代への垂直伝播ならびに群れまたは集団内および地域内の水平伝播の両方）の予防または低減である。結果として、本発明のワクチンの使用はペスチウイルスの蔓延の低減につながる。
【０１９３】
したがって、本発明の更なる態様は、
・集団内または地域内のペスチウイルスの蔓延を低減するための本発明のワクチンの使用、および
・集団内または地域内のペスチウイルスの蔓延を低減するための本発明のワクチン
である。
【０１９４】
本発明のワクチンを標的生物に適用するための投与計画は、ワクチンの製剤、畜産の実用面に適合した様態の、免疫学的に有効な量の単一用量または複数用量におけるものでありうる。
【０１９５】
好ましくは、動物へのストレスを軽減し、労働コストを低減するために、本発明のワクチンの投与計画は、標的動物が要しうる他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに統合される。これらの他のワクチンは、それらの登録使用に適合する様態で、同時に、共に、または連続的に投与されうる。
【０１９６】
標的動物における有効な免疫防御の確立が可能な限り早期に、本発明のワクチンを適用することが有利である。これはまた、標的における母体由来抗体のレベルおよび妥当性をも反映したものであろう。
【０１９７】
前記のとおり、本発明の突然変異ペスチウイルスおよび本発明のワクチンは、ＤＩＶＡの原理を適用する方式に特に適している。これは、突然変異ペスチウイルスが、強力なマーカーワクチン特性をワクチンに付与するからである。これは、ワクチンが生ワクチンである場合（例えば、それが不活化されている場合）またはサブユニットワクチンである場合の両方に当てはまる。
【０１９８】
本発明のワクチンは、該ワクチンウイルスとは異なるペスチウイルスのＥｒｎｓタンパク質には容易に特異的に結合しえない、Ｅｒｎｓタンパク質に対する抗体を、ワクチン接種動物において誘導する。このことは、スクリーニングアッセイを案出する幾つかの方法を可能にする。
【０１９９】
一方においては、有効なワクチン接種に関してスクリーニングする陽性マーカーとして本発明の突然変異ペスチウイルスを特異的に検出するためのアッセイが案出されうる。そのようなアッセイは、本発明の突然変異ペスチウイルスにより発現されるＥｒｎｓタンパク質に対する抗体を使用するか、あるいは突然変異ペスチウイルスまたはそのＥｒｎｓタンパク質を検出抗原として使用するであろう。
【０２００】
他方においては、陰性マーカースクリーニングとして、本発明のワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルスとは異なるペスチウイルスを陽性検出するためのアッセイが案出されうる。したがって、本発明のワクチンの有利なマーカー特性のおかげで、ペスチウイルスワクチン接種動物においてさえも、非ワクチンウイルスのこの検出はいずれかの病原性野生型野外ウイルスによる感染に関するスクリーニングを可能にするであろう。そのようなアッセイは、本発明の突然変異ペスチウイルスにより発現されるＥｒｎｓを認識しないＥｒｎｓに対する抗体を使用するか、あるいは病原性ウイルスまたはそのＥｒｎｓタンパク質を検出のために使用するであろう。
【０２０１】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスに感染した動物から、本発明のワクチンでワクチン接種された動物を識別するための方法であり、該方法は、ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質には特異的に結合しない、Ｅｒｎｓタンパク質に対する抗体を使用することを含む。
【０２０２】
本発明における「抗体」は、エピトープに特異的に結合しうる免疫グロブリンタンパク質またはその一部である。血清診断のためには、抗体は、典型的には、ＩｇＧまたはＩｇＭ型のものである。抗体は無傷もしくは部分抗体、例えば、一本鎖抗体、または抗原結合領域を含有する免疫グロブリンの一部でありうる。抗体部分が抗原結合部位を尚も含有する限り、それらは、異なる形態のもの、それらの部分の（合成）構築物でありうる。免疫グロブリンのよく知られたサブフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂもしくはＦｄフラグメント、Ｖｈドメイン、またはそのようなフラグメントもしくはドメインの多量体が挙げられる。また、抗体は、検出を促進または増強するために１以上の方法で標識されうる。
【０２０３】
診断アッセイにおける試薬として使用される抗体は、一般に、ドナー動物を標的抗原で（過剰）免疫し、動物の血清から産生抗体を回収することにより製造される。よく知られているドナーはウサギおよびヤギである。もう１つの例は、卵黄中に高レベルの抗体、いわゆるＩｇＹを産生しうるニワトリである。あるいは、抗体はインビトロで製造可能であり、例えば、不死化Ｂリンパ球培養物（ハイブリドーマ細胞）から、よく知られたモノクローナル抗体技術により製造可能であり、それに関する工業的規模の製造系が公知である。また、抗体またはそのフラグメントは、クローン化Ｉｇ重鎖および／または軽鎖遺伝子の発現により、組換え発現系において発現されうる。これらは全て、当業者によく知られている。
【０２０４】
当技術分野でよく知られているとおり、ある標的に「対する」抗体はその標的上のエピトープに特異的な抗体であり、ここで、該標的は特定の分子または実体である。抗体（またはそのフラグメント）がエピトープに特異的だと言えるのは、それがそのエピトープに選択的に結合しうる場合である。
【０２０５】
本発明における抗体は、それに対する標的に基づいて言及される。例えば、ＣＳＦＶに対する抗体は「ＣＳＦＶ抗体」と称され、「Ｅｒｎｓ抗体」はＥｒｎｓタンパク質に対する抗体である（別名：抗Ｅｒｎｓ抗体など）。
【０２０６】
抗体がエピトープに「特異的に結合」しうるか否かは当業者によって容易に評価されうる。例えば、阻害に基づくイムノアッセイの結果の特異性は、該阻害が、該アッセイにおいて使用される抗原または抗体の濃度と相関することを実証することにより決定されうる。例えば競合結合アッセイを用いて、コーティングされた抗体への抗体結合を５０％阻害するために、どれだけの抗原が要求されるのかが決定されうる（Ｂｒｕｄｅｒｅｒら，１９９０，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．，ｖｏｌ．１３３，ｐ．２６３）。
【０２０７】
本発明の突然変異ペスチウイルスのＥｒｎｓタンパク質を認識しない、Ｅｒｎｓタンパク質に対する抗体は、当技術分野で公知であり、あるいは通常の方法を用いて得られうる。ペスチウイルスＥｒｎｓタンパク質に関する、記載されているＥＬＩＳＡ試験は、例えばＣＳＦＶまたはＢＶＤＶ−１に対して産生された抗Ｅｒｎｓ抗体を使用する。例えば、Ｇｒｅｇｏら（２００７，Ｊ．ｏｆ  Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．１９，ｐ．２１−２７）を参照されたい。これらは本発明の突然変異ペスチウイルスのＥｒｎｓには特異的に結合しない。
【０２０８】
したがって、本発明のもう１つの有利な使用は、ペスチウイルスＥｒｎｓ抗体に基づく既存試験が本発明の方法において使用されうることである。
【０２０９】
本発明の動物を識別するための方法は、農業経済的に最も重要なペスチウイルスにとって特に重要である。
【０２１０】
したがって、本発明の動物を識別するための方法の１つの実施形態においては、抗体は、ＢＶＤＶ−１、ＢＶＤＶ−２、ＣＳＦＶおよびボーダー病ウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来するＥｒｎｓタンパク質に特異的に結合する。
【０２１１】
本発明の識別方法は、免疫診断アッセイの任意の適切な方法を用いて行われうる。
【０２１２】
しばしば、そのような免疫診断アッセイは、シグナル強度を増強するための工程、および未結合、非特異的または望ましくない成分を洗い流すための１以上の工程を有する。陽性シグナルの検出は種々の方法により実施可能であり、例えば、変色、蛍光または粒径変化を光学的に検出することにより、あるいは免疫複合体における放射能標識抗原または抗体を検出することにより実施可能である。同様に、試験の物理的形態は多種多様であることが可能であり、例えば、マイクロタイタープレート、膜、ディップスティック、バイオセンサーチップ、ゲルマトリックスまたは溶液［これは（マイクロ）担体粒子、例えばラテックス、金属またはポリスチレンなどを含む］を使用することが可能である。
【０２１３】
そのような免疫診断アッセイの個々の設定の選択は、通常、投入サンプルのタイプ、所望の試験感度（陽性サンプルを正確に特定するもの）および試験特異性（真陽性サンプルと真陰性サンプルとを正確に識別するもの）により決定される。そのような特性は、免疫応答の強度および時機、または微生物の存在に左右される。更に、試験の経済的要件、例えば大規模での適用可能性およびコストが、個々の形態の選択にとって決定的に重要となりうる。
【０２１４】
よく知られた免疫診断試験としては、ラジオイムノアッセイ、免疫拡散、免疫蛍光、免疫沈降、凝集、溶血、中和、および「酵素結合イムノソルベントアッセイ」、すなわち、ＥＬＩＳＡが挙げられる。大規模試験の場合には特に、液体の処理の自動化ならびに／または結果の読取および処理の自動化が要件となりうる。これはまた、従来のアッセイを、より現代的で小型化された例えばＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）における形態で置換することを要しうる。
【０２１５】
ＥＬＩＳＡは容易に拡張可能であり、非常に高感度でありうる。もう１つの利点はその結果のダイナミックレンジである。なぜなら、サンプルは希釈範囲内で試験されうるからである。試験特性に応じて、また、読取に使用される技術装置の設定に応じて、結果は吸光度の任意単位で表され、典型的には、０．１〜２．５光学濃度（ＯＤ）単位で、または「ブロッキング％」として表される。通常、適切な陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルが加えられ、ほとんどの場合、サンプルは多重に試験される。一定の基準サンプル（の希釈範囲）を加えることにより標準化が得られ、それはまた、陽性または陰性を決定するために予め設定された値に或るスコアを合致させることを可能にし、生物学的意義との相関（例えば、効力に対する抗原量、または免疫防御のレベルに対する抗体量）を可能にする。
【０２１６】
ＥＬＩＳＡ法の多数の変法が公知であるが、典型的には、これらは、固相（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）への抗原または抗体の固定化を用いる。抗体が固定化されている場合、試験は「捕捉」または「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡと称される。次に、試験サンプルを加え、リガンド（例えば、検出すべき抗原または抗体）を結合させる。ついで検出用物質（抗体、抗原または他の結合成分）を加える。これは、しばしば、標識に結合しており、例えば、分光光度的に測定されうる呈色反応を誘発しうる酵素に結合している。他のタイプの標識は発光、蛍光または放射能を利用しうるであろう。標識化検出用物質の使用は、試験感度を高めるためにシグナル強度の増幅をもたらすことを意図しているが、バックグラウンド信号を導入してシグナル対ノイズ比を低下させることも可能である。
【０２１７】
ＥＬＩＳＡ法の変法においては、競合結合の導入により試験特異性が改善され、この場合、該試験は「競合」、「阻害」、「干渉」、二重認識、「ブロッキングＥＬＩＳＡ」と称される。そのようなアッセイにおいては、試験サンプルにおける因子（抗体または抗原）は、固相に固定化された分子（抗原または抗体）への結合に関して、標識化検出用抗体／抗原と競合する。これは最大標識シグナルの低下を引き起こし、これは、競合因子の存在または量を測定するための高感度法である。結果は最大ＥＬＩＳＡシグナルの阻害の百分率として表されうる。
【０２１８】
酵素イムノアッセイに対する一般的な言及は、種々の刊行物、とりわけ、例えば以下のような標準的な実験テキストに見られる：‘Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（４ｔｈ  ｅｄ．：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ，ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’；Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｄ編，２０１３，ＩＳＢＮ−１０：００８０９７０３７０）；および‘Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ’（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４９，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，ＩＳＢＮ−１０：０８９６０３７２８２）。代替書としては、例えば以下のような商業的供給業者からのマニュアルが挙げられる：“Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ＥＬＩＳＡ”，ＫＰＬ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ，２０１３；および“Ａｓｓａｙ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｍａｎｕａｌ”，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．，ｃｈａｐｔｅｒ：Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋ．Ｃｏｘら，Ｍａｙ  ２０１２。
【０２１９】
ＢＶＤＶの検出および防除に関する総論としては、ＯＩＥ，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ  ２０１５（ＮＮ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．４．８）が挙げられる。
【０２２０】
１つの実施形態においては、本発明の動物の識別方法はＥＬＩＳＡを適用する。これはブロッキングＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡのような任意のタイプのものでありうる。そのような試験は、要求される識別の個々のタイプのために最適化され、微調整されうる。また、これは、検出されるペスチウイルスのタイプまたは抗体のタイプ、およびスクリーニングされる動物試験サンプルのタイプに左右されうる。当業者は、要求される動物識別を行うのに十分な程度に特異的かつ選択的な試験結果を得るために、これらの技術を適用し、最適化を行うことが十分に可能である。
【０２２１】
これらの方法は今や、ＤＩＶＡの原理の有効な適用、ならびに大規模なスクリーニングおよび根絶計画の作成および実施を可能にする。
【０２２２】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明のワクチンでワクチン接種された動物を、該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスによる感染に関して診断するための方法に関するものであり、該方法は、
・該ワクチン接種動物からサンプルを得る工程、および
・該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス、または該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質を使用することにより、該ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスに対する抗体の存在に関して、適切なイムノアッセイにおいて該サンプルを試験する工程
を含む。
【０２２３】
明らかに、その逆も当てはまる。
【０２２４】
したがって、１つの実施形態においては、本発明の感染の診断方法は、Ｅｒｎｓタンパク質に対する抗体（該抗体は、ワクチンに含まれていた突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質には特異的に結合しない）を使用して、ワクチンに含まれる突然変異ペスチウイルス以外のペスチウイルスの存在に関してサンプルを試験する工程を含む。
【０２２５】
サンプルの採取および調製のための方法は当技術分野においてよく知られている。そのようなサンプルは、検出すべきウイルスまたは抗体の十分な量が存在する任意のタイプの生物学的サンプルでありうる。典型的には、これらのサンプルは血液、血清、乳、精液、尿、糞便、または耳穿刺のような組織サンプルでありうる。
【０２２６】
例えば非ワクチンペスチウイルスの検出のための「適切なイムノアッセイ」を構成するものはサンプル、ウイルス、または実施する試験の他のパラメータの詳細に左右されうる。そのような試験の選択および最適化は十分に当業者の通常の能力の範囲内である。典型的には、本発明の突然変異ペスチウイルス、または該突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質が検出抗原として使用されうる。該ウイルスは不活化され、ウイルスまたはキメラＥｒｎｓは、例えば、そのようなイムノアッセイにおいて使用される支持マトリックスにコーティングされうる。
【０２２７】
好ましい実施形態においては、そのようなイムノアッセイはＥＬＩＳＡである。
【０２２８】
本発明の識別方法および本発明の診断方法を容易にするために、本発明は、これらの方法を実施するための診断試験キットの使用およびアセンブリも提供する。
【０２２９】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明の突然変異ペスチウイルス、または該突然変異ペスチウイルスにより発現されるキメラＥｒｎｓタンパク質を含む診断試験キットに関する。
【０２３０】
本発明の診断試験キットの好ましい実施形態においては、該突然変異ペスチウイルスは不活化形態で含まれている。
【０２３１】
「診断試験キット」は、本発明の識別方法または本発明の診断方法を実施するためのパーツのキットに関する。該キットは、該方法を適用するための１以上の成分、特に、本発明の突然変異ペスチウイルス、または本発明において記載されているキメラＥｒｎｓタンパク質を含む。該突然変異ペスチウイルスまたはキメラＥｒｎｓタンパク質は簡便な形態で及び容器内に含まれるべきであり、所望により、サンプルの希釈およびインキュベーション、ブロッキングまたは洗浄のためのバッファーと共に、ならびに、所望により、該方法をどのように実施すべきかの説明、および結果をどのように読取り解釈すべきかの説明と共に含まれる。
【０２３２】
１つの実施形態においては、該キットは、複数のウェルを有する容器、例えばマイクロタイタープレートを含みうる。該容器のウェルは、本発明の方法において使用される１以上の成分を含有するように処理されうる。
【０２３３】
本発明の診断試験キットの好ましい実施形態においては、本発明の突然変異ペスチウイルスまたはキメラＥｒｎｓタンパク質はマイクロタイタープレートのウェルに固定化される。
【０２３４】
本発明の診断試験キットに、所望により含まれていてもよい説明は、例えば、キットの構成成分を含有する箱に記載されていてもよく、その箱内の小冊子上に存在していてもよく、あるいは、該キットの配給業者などからインターネットウェブサイト上で閲覧可能またはインターネットウェブサイトからダウンロード可能であってもよい。
【０２３５】
本発明においては、該診断試験キットはまた、本発明の方法を含むアッセイにおける併用のための、例えばインターネットウェブサイト上の（商業的販売に関連した）挙げられているパーツの提供物でありうる。
【０２３６】
例えば本発明の診断キットは「コンパニオン診断剤」とも称される。なぜなら、それは、マーカーワクチン、例えば本発明のワクチンとの併用に特に適しているからである。それらの併用により、動物の集団における野生型ペスチウイルスの蔓延を低減するための有効な防除計画を適用することが今や可能となった。
【０２３７】
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、本発明のワクチンと本発明の診断試験キットとの併用による、偶蹄目動物の集団における野生型ペスチウイルスによる感染を防除するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】組換え親ウイルスＢＶＤＶ−１ｂ（Ｃｐ７）およびＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ（Ｃｐ７ ΔＮｐｒｏ）と比較した場合の、Ｐ２３におけるＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナ（Ｃｐ７ ΔＮｐｒｏ ＥｒｎｓＢｕｎｇｏ）クローン１および１０の多段階増殖曲線動態。ＫＯＰ−Ｒ細胞に０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。
【図２】不活化ワクチン接種後の血清中和アッセイの結果。数字（３５２、３５３、３６５および３２１）は子ウシの耳標番号である。幅広の矢印はワクチン接種／追加接種の日を示す。
【図３】免疫蛍光阻害（ＩＦＩ）アッセイ。中央蛍光強度値を未感染細胞（対照ＷＢ２１０）の対照染色に対して正規化した。２つの実験の平均値および標準偏差が示されている。ＰＣは、ＢＶＤＶ−Ｉｄで免疫化されたウシ血清であり、ＮＣは、ＢＶＤＶ特異的抗体に関して陰性である血清である。
【図４】不活化抗原ワクチン接種試験からのウシ血清におけるＢＶＤＶ特異的抗体に関するＥＬＩＳＡアッセイの結果。パネルＡ：ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ抗体に関する競合Ｅｌｉｓａ：ウシ血清中のＢＶＤＶ Ｅｒｎｓ特異的抗体の存在下、固定化ＢＶＤＶへのＷＢ２１０（ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体）の結合が阻害され、競合ＥＬＩＳＡにおいて検出される。Ｂｕｎｇｏ−Ｅｒｎｓを含有する構築物で免疫化されたウシからの血清はＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ抗体ＷＢ２１０の結合を遮断することができなかった。パネルＢ：全抗ＢＶＤＶ抗体：ＢＶＤＶ全Ａｂ間接ＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ）を用いて、ウシ血清において全ＢＶＤＶ特異的抗体を検出した。Ｓ／Ｐ値が０．３より大きい場合、サンプルは陽性とみなされた。０ｄ＝初回免疫化前の初期採血；４９ｄｐｉ＝初回免疫化の４９日後。
【図５】本発明の生突然変異ペスチウイルス（クローン１  クローン１０）でワクチン接種されたウシの血清におけるＢＶＤＶに対する及びボンゴワナウイルスに対する中和抗体を測定するための血清中和アッセイの結果。
【図６】本発明の生突然変異ペスチウイルス（クローン１およびクローン１０）での生ウイルスワクチン接種により誘導されたＮＳ３特異的抗体の検出。ＢＶＤＶ  ｐ８０抗体（商標）競合ＥＬＩＳＡキット（ＩＤｖｅｔ）を経時的に使用することにより検出を行った。幅広の矢印はワクチン接種の日を示す。Ｓ／Ｎ％値が４０％未満である場合、サンプルは陽性とみなされた。
【図７】本発明の生突然変異ペスチウイルス（クローン１およびクローン１０）でのワクチン接種の４９日後のウシ血清におけるＢＶＤＶ特異的抗体の検出の結果。パネルＡ：ウシ血清におけるＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体の存在下、競合ＥＬＩＳＡにおいて検出されたとおり、固定化ＢＶＤＶへのｍｏａｂ  ＷＢ２１０（ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的）の結合が阻害される。検出用物質としてｍｏａｂ  ＷＢ２１０を使用した場合、クローン１および１０は共に、検出可能なＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体を誘導しなかった。パネルＢ：ウシ血清における全抗ＢＶＤＶ特異的抗体を検出するＢＶＤＶ全Ａｂ（商標）ＥＬＩＳＡの結果。Ｓ／Ｐ値が０．３より大きい場合、サンプルは陽性とみなされた。対照ウシ血清：ＢＶＤＶ陽性（ＰＣ）、ボンゴワナ陽性（ＰＣ  Ｂｕｎｇｏ）およびＢＶＤＶ陰性（ＮＣ）。
【０２３９】
つぎに、以下の非限定的な実施例により、本発明を更に詳細に説明することとする。
【０２４０】
実施例
実施例１：キメラＥｒｎｓ遺伝子の構築
キメラＥｒｎｓ遺伝子を、ＢＶＤＶワクチンウイルスの既存ｃＤＮＡクローン内に挿入するために構築した。該キメラＥｒｎｓ遺伝子はボンゴワナウイルス由来のＥｒｎｓ遺伝子から構築したが、該キメラＥｒｎｓ遺伝子の３’部分はＢＶＤＶ−１株ＣＰ７ウイルスに基づくものであった。
【０２４１】
用いた方法および材料は、実質的に、Ｚｅｍｋｅら（２０１０，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４２，ｐ．６９−８０）およびＲｉｃｈｔｅｒら（２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４１８，ｐ．１１３−１２２）により記載されている従来の研究に基づくものであった。ＲｉｃｈｔｅｒらはボンゴワナウイルスのｃＤＮＡクローンを記載している。
【０２４２】
Ｚｅｍｋｅらは、Ｎｐｒｏ欠失を有するＢＶＤＶ−１  ＣＰ７ウイルスのｃＤＮＡクローンの構築を記載している。このｃＤＮＡからレスキューされたウイルスがウシのワクチン接種に使用され、安全に弱毒化されており、ＢＶＤＶ−２ウイルスによる異種チャレンジに対して有効な免疫防御をもたらしうることが示された。
【０２４３】
ここで使用したクローニングプラスミドにおいては、ｃＤＮＡはプロモーター、開始コドンおよび停止コドンならびに／または有用な制限酵素部位（適切な場合）に隣接していた。
【０２４４】
完全合成感染性ｃＤＮＡクローンｐＢＶＤＶ−！ｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏに基づいて、ＢＶＤＶ−１  ＣＰ７  Ｅｒｎｓタンパク質をボンゴワナウイルスＥｒｎｓタンパク質で置換した。ボンゴワナウイルスＥｒｎｓタンパク質およびポリタンパク質上流局在Ｅ１タンパク質の適切なプロセシングのために、膜アンカー領域およびトランスポーターペプチドを含有するＣＰ７  ＥｒｎｓのＣ末端を維持した。
【０２４５】
ボンゴワナウイルスのＥｒｎｓコード領域を、Ｂｕｎｇｏ Ｅｒｎｓ Ｐｈ Ｆ（５‘−ＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣ−３‘）（配列番号７）およびＢｕｎｇｏ Ｅｒｎｓ ｏＴＰ Ｒ（５‘−ＣＧＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＡＡＣＣＧＴＣＡＡＣ−３‘）（配列番号８）ならびに鋳型ＤＮＡとしての合成プラスミドＢｕｎｇｏ Ｃ−Ｅ２ｍｏｄ ｐＭＫ ＲＱ（Ｇｅｎｅａｒｔ）を使用して合成した。
【０２４６】
ボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子を、以下の２つのプライマーを使用するＰＣＲにより、ボンゴワナｃＤＮＡ構築物（Ｒｉｃｈｔｅｒ，前掲）から単離した：カプシド遺伝子の末端から始まるボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子の５’側に対するプラスセンスプライマー：Ｂｕｎｇｏ Ｅｒｎｓ Ｐｈ Ｆ：５‘−ＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＡＴＧＧＧＡＡＣＣＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣ−３‘（配列番号７）および領域Ｅｒｎｓ  ＣＰ７／Ｅｒｎｓボンゴワナウイルスに対するマイナスセンスプライマー：ＢｕｎｇｏＥｒｎｓ ｏＴＰ Ｒ：５‘−ＣＧＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＧＧＴＧＴＡＡＣＣＧＴＣＡＡＣ−３‘（配列番号８）。６１９ｂｐのＰＣＲ断片、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用する制限フリー標的化クローニングによりプラスミドｐＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ内に挿入した。得られたｃＤＮＡ構築物をｐＢＶＤＶ−１ＣＰ７ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ−Ｂｕｎｇｏ／ＣＰ７（配列番号９）と命名した。
【０２４７】
あるいは、ボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子は、適切なＰＣＲまたはｒｔＰＣＲプライマーを使用して、配列番号３のＤＮＡコピーまたはボンゴワナウイルスゲノム単離物から得ることも可能であったであろう。
【０２４８】
用いた全ての方法および材料は標準的な技術であり、市販のキットおよびツールを製造業者の説明に従い使用した。簡潔に説明すると、クローニングプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増幅した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ（商標）またはＭｉｄｉ  Ｋｉｔを使用することにより、プラスミドＤＮＡを精製した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１サイクルシーケンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、配列決定を行った。ヌクレオチド配列を自動シーケンサー（３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取り、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐソフトウェアバージョン１１．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）およびＧｅｎｉｏｕｓ（商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ）を使用して分析した。
【０２４９】
実施例２：突然変異ペスチウイルスの回収および増幅：
新たに得られたｃＤＮＡ構築物ｐＢＶＤＶ−１ＣＰ７ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ−Ｂｕｎｇｏ／ＣＰ７をＳｍａＩ線状化ｃＤＮＡ構築物のインビトロＲＮＡ転写に使用した。これは、Ｔ７  ＲｉｂｏＭａｘ（商標）Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明に従い使用して行った。ＲＮＡの量をアガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色により推定した。トランスフェクションのために、１×１０７個のＫＯＰ−ＲもしくはＭＤＢＫ細胞または別の適切な反芻動物細胞系を、トリプシン溶液を使用して分離し、ＰＢＳで洗浄し、１〜５μｇのインビトロ合成ＲＮＡと混合し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）Ｘｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するエレクトロポレーション（８５０Ｖ、２５μＦ、１５６ωでの２つのパルス）に付した。ウイルス回収のために、トランスフェクト化細胞の上清を７２時間ｐ．ｔ．の時点で集め、適切な反芻動物細胞系内に接種した。感染力価をウイルスストックおよび増殖動力学実験のために決定した。該組換えウイルスの同一性を配列決定により確認した。
【０２５０】
トランスフェクト化細胞のインキュベーションの後、突然変異ＢＶＤＶペスチウイルスを得ることができた。幾つかのクローンを選抜し、これらをＫＯＰ−ＲまたはＭＤＢＫ細胞において幾つかの継代で増殖させて、複製性クローンを選択し、それらの力価を増幅させた。
【０２５１】
２０個以上のクローンからの組換えウイルスを継代し、数継代の後、ウイルス力価を、遠心分離により清澄化された細胞培養上清または全培養の清澄化凍結融解サンプルのいずれかにおいて調べた。上清中の力価は、通常、凍結融解サンプルにおけるものより僅かに高かった。更なる研究のために、２つの組換えウイルス（番号１および１０）を選択した。２０継代において、これらは共に、１×１０５  ＰＦＵ／ｍｌの力価まで増殖した。
【０２５２】
実施例３：増幅された突然変異ペスチウイルスの配列決定
２つの選択された組換えウイルスＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ｄＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナ，クローン番号１および１０を、それらの完全ゲノムのヌクレオチド配列決定に付して、関連突然変異が生じたかどうかを調べた。「次世代配列決定」アプローチを用いて、継代レベル１３および１９＋１で配列決定を行い、親ウイルスＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ｄＮｐｒｏと比較して非常に限られた数の突然変異しか観察されなかった。クローン１は、アミノ酸交換を引き起こす突然変異を有さず、ただ１つのサイレント突然変異をＣ  １５３１ＡにおけるＥ１におけるＰ１３に有していた。Ｐ１９＋１はボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子Ｃ１１５６Ｔにおける１つのサイレント突然変異、およびｎｔ  Ｇ１０７２３ＡにおけるＮＳ５Ｂ遺伝子に１つのサイレント突然変異を有していた。クローン１０は、アミノ酸交換を引き起こす幾つかの点突然変異を有していた。Ｐ１３はＧ／Ｃ７４１のカプシド遺伝子およびＥ２遺伝子Ｃ／Ａにおける混合集団を含有し、一方、Ｐ１９は、Ｇ３４１７ＣおよびＧ３９６８ＣにおけるＮＳ２遺伝子に、共にアミノ酸交換を引き起こす２つの点突然変異を有し、４つのサイレント突然変異（ＮＳ３遺伝子Ｇ６７４８Ａに１つ、Ａ７２４０ＣおよびＡ７３４８ＧにおけるＮＳ４Ｂ遺伝子に２つ、ならびにＡ８９０８ＧにおけるＮＳ５Ａ遺伝子に１つ）を有していた。
【０２５３】
これらがＲＮＡウイルスであり、比較的多数の継代で見られたことを考慮すると、これらは非常に良好な結果であった。したがって、調べた組換えウイルスの遺伝的安定性は十分に実証され、両者を更なる研究のために使用した。
【０２５４】
実施例４：多段階ウイルス増殖動態
ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナクローン１および１０を更に特徴づけるために、多段階増殖動態を調べた。
【０２５５】
ＫＯＰ−Ｒ細胞に、Ｐ２３において、ＢＶＤＶ−Ｉｂ（Ｃｐ７）、ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ（Ｃｐ７ ΔＮｐｒｏ）、ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナ（Ｃｐ７ ΔＮｐｒｏ ＥｒｎｓＢｕｎｇｏ）クローン１および１０を、０．１のｍ．ｏ．ｉ．で２時間にわたって接種した。適用ウイルス接種物を逆滴定（逆力価測定）して、実験で実際に用いた力価を決定した。インキュベーションの後、細胞を２回洗浄し、新鮮な培地を加え、接種後０、２４、４８、７２および９６時間の時点でで細胞を凍結させた。解凍後、清澄化細胞培養上清をＭＤＢＫ細胞に対して力価測定して、各時点に関するウイルス力価を決定した。ＢＶＤＶ  ＮＳ３タンパク質に特異的な抗体であるモノクローナル抗体ＷＢ１０３／１０５（ＡＰＨＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅｗ  Ｈａｗ，Ａｄｄｌｅｓｔｏｎｅ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫから入手可能）での免疫蛍光染色によりウイルスを検出し、力価を計算し、ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。実験は２回行った。１つの代表的実験の結果を図１に示す。
【０２５６】
ＥｒｎｓＢＶＤＶ ｓｙｎＣｐ７ ΔＮｐｒｏ ＥｒｎｓＢｕｎｇｏクローン１および１０ウイルスは、野生型ウイルスＢＶＤＶ−１  ＣＰ７と比較して低減した増殖を示したが、それらの複製は、組換えＢＶＤＶワクチンウイルスＢＶＤＶ１  ＣＰ７ ΔＮｐｒｏと比較して僅かに損なわれたに過ぎなかった。
【０２５７】
実施例５：ウシにおける突然変異ペスチウイルスワクチンの血清学的試験−不活化ワクチン
クローン１０ウイルスを２１継代まで更に増幅させた。培養上清を集め、使用まで保存した。それまでにクローン１０ウイルス（構築物：ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナ）の力価は４．６×１０５  ＰＦＵ／ｍｌまで改善した。ゲノム配列決定によりウイルスゲノム同一性が再び確認された。このウイルス材料を、ウシにおいて血清応答を誘発するその能力を試験するために使用した。
【０２５８】
以下のウイルス構築物を比較した。
【０２５９】
・ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ（ｄＮｐｒｏ）：Ｎｐｒｏ（１２個のＮ末端アミノ酸を除く）の弱毒化欠失を有するＢＶＤＶワクチン株；
・ＢＶＤＶ−Ｉｂ Ｅｒｎｓ ボンゴワナ（Ｅｒｎｓ−Ｂｕｎｇｏ）：配列番号５のキメラ遺伝子を含む、本発明の突然変異ペスチウイルス；
・クローン１０ウイルス（略称：ｄＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ  Ｂｕｎｇｏ）；配列番号５のキメラ遺伝子に隣接してＮｐｒｏ（Ｎ末端の１２ａａを除く）の欠失を含む、同様に本発明の突然変異ペスチウイルス；
・野生型ボンゴワナウイルス（ＢｕｎｇｏＶ）。
【０２６０】
５．１  ウイルス抗原の調製
４つ全てのウイルスからのウイルス培養上清を得、ＢＥＩを使用して不活化した。不活化を細胞上の２継代において検証し、ＢＶＤＶ  ＮＳ３およびボンゴワナＥｒｎｓに対する抗血清を使用する免疫蛍光により試験した。ウイルスの増殖は検出されず、完全な不活化が確認された。
【０２６１】
５．２  ワクチン接種：
各ウイルスに関して、４ｍｌのＢＥＩ不活化ウイルス抗原を１ｍｌのＰｏｌｙｇｅｎ（商標）アジュバントと１２％  ｖ／ｖの最終濃度まで混合した。この混合物を子ウシに１ｍｌ／用量の筋肉内注射により投与した（抗原当たり１頭の子ウシ）。該不活化ワクチン抗原含量は１０７〜１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌのペンダントであった。ただし、クローン１０ウイルス抗原の場合には、それは、３回のワクチン接種に関して、１０５〜１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの、より低い抗原含量を有していた。
【０２６２】
ワクチン接種スケジュールは以下のとおりであった：第０日：第１ワクチン接種；第２１日：第１追加ワクチン接種；第４２日：第２追加ワクチン接種。第０日、第２１日、第２８日、第３５日、第４２日および第４９日に血液サンプルを採取した。ついで、これらのサンプルからの血清を種々のアッセイにおいて試験した。
【０２６３】
５．３  血清学的試験
５．３．１  ウイルス中和アッセイ
血清中和アッセイを実施して、ＢＶＤＶ−１ｂおよび／またはボンゴワナウイルスに対して誘導された中和抗体の強度を測定した。
【０２６４】
ウシ血清を９６ウェルマイクロタイタープレート内でＬｏｇ２段階で希釈し、３０〜３００  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの生ウイルスＢＶＤＶまたはボンゴワナと共に３７℃で１時間インキュベートした。ついで、ウェル当たり１×１０５個のＭＤＢＫ細胞を加えた。ＢＶＤＶおよびボンゴワナウイルスの両方を認識する、ペスチウイルスＮＳ３タンパク質に対するモノクローナル抗体であるＷＢ１１２（ＡＰＨＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する、該細胞の免疫蛍光染色により、インキュベーションの３日後に、１ｍｌ当たりの中和用量５０％（ＮＤ５０）を決定した。
【０２６５】
結果は図２に示されており、両方の突然変異ペスチウイルスが、ＢＶＤＶワクチン株（ｄＮｐｒｏ）により誘導されたものに近い良好なＢＶＤＶ中和力価を誘導することが可能であったことを示している。クローン１０ワクチンからの力価は、抗原含量がより低いため、最初は低かったが、これは第１追加接種の後で直ちに改善された。ボンゴワナウイルスは抗ＢＶＤＶ抗体を誘導することができなかった。
【０２６６】
抗ボンゴワナ抗体に関しては、これらはボンゴワナウイルスワクチンによってのみ誘導された。このことは、突然変異ペスチウイルスＥｒｎｓ−Ｂｕｎｇｏおよびクローン１０におけるボンゴワナＥｒｎｓ遺伝子の大きな部分の発現でさえもボンゴワナ中和抗体を誘導しなかったことを示している。
【０２６７】
５．３．２  免疫蛍光阻害アッセイ
フローサイトメトリー実験を可能にするために、免疫蛍光阻害（ＩＦＩ）アッセイを開発した。
【０２６８】
ＩＦＩは、実質的に、Ｂｅｅｒら（２０００，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．７７，ｐ．１９５−２０８）に記載されているとおりに行った。簡潔に説明すると、ＭＤＢＫ細胞をＢＶＤＶ株ＮＣＰ７に感染させた。接種の３日後、該細胞を採取し、４％  パラホルムアルデヒドで室温で１５分間固定した。ついで該細胞を０．０１％  ジギトニンで室温で５分間透過処理し、ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。これらの細胞の１×１０５個を、ＦＡＣＳバッファーのみにおいて、またはＦＡＣＳバッファー中で１：２希釈された不活化ワクチン接種体からの１００μｌのウシ血清と共に、１時間インキュベートした。つぎに、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓタンパク質に特異的なモノクローナル抗体であるＷＢ２１０（ＡＰＨＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１００希釈し、それを加え、１０分間インキュベートした。ついで該細胞を３回洗浄し、ＡＬＥＸＡ４８８マーカーに結合した市販ヤギ抗マウス抗体１００μｌを加え、５分間インキュベートした。３回の洗浄工程の後、ＦＡＣＳｓｃａｎ（商標）ＣｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒおよびソフトウェアＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（共にＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、フローサイトメトリー分析を行った。
【０２６９】
感染細胞数を抗ＮＳ３染色（ＷＢ１１２）により決定したところ、それは１００％であることが判明した。ＷＢ２１０特異的結合の中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより、ＩＦＩ値を決定した。Ｂｕｎｇｏ Ｅｒｎｓによる未感染対照細胞の染色に関する中央蛍光強度を１００％阻害に設定した（Ｂｕｎｇｏ Ｅｒｎｓは存在せず、検出蛍光強度はバックグラウンドとして設定された）。ＢｕｎｇｏＶ感染細胞のＢｕｎｇｏ Ｅｒｎｓ特異的抗体染色に関するＭＦＩを０％阻害に設定した（Ｂｕｎｇｏ Ｅｒｎｓは検出抗体に完全に利用（アクセス）可能であった；対照に対して正規化された）。％阻害は、＝（ＭＦＩ  ＮＣＰ７  ＷＢ２１０−ＭＦＩサンプル）／ＭＦＩ  ＮＣＰ７＊１００として決定され、対照ＷＢ２１０に対して正規化された。
【０２７０】
試験された対照サンプルは、ＢＶＤＶ−Ｉｄ（ＰＣ）で免疫化されたウシ血清、およびＢＶＤＶ特異的抗体（ＮＣ）に関して陰性である血清であった。
【０２７１】
ＩＦＩアッセイの結果は図３に示されており、第４９日からのＢＶＤＶワクチン（ｄＮｐｒｏ）に対する血清ならびに陽性対照血清ＷＢ２１０およびＰＣのみが、カットオフ値（ＢＶＤＶ−Ｅｒｎｓ  ＷＢ２１０の８０％阻害）を超えるＩＦＩシグナルを示すことを示した。試験した他の血清は陰性またはカットオフ未満であった。
【０２７２】
これは、抗ＢＶＤＶ−Ｅｒｎｓ抗体が突然変異ペスチウイルス（Ｅｒｎｓ−Ｂｕｎｇｏまたはクローン１０）のワクチンのいずれによっても誘導されず、ＢＶＤＶワクチン自体（ｄＮｐｒｏ）によってのみ誘導されたことを証明している。
【０２７３】
５．３．３  競合ＥＬＩＳＡ
誘導されたＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓに特異的な抗体のレベルを決定することが可能となるように、商業的に入手可能な抗ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓモノクローナル抗体ＷＢ２１０に基づいて、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓに関する競合ＥＬＩＳＡを確立した。これを市販の全抗ＢＶＤＶ抗体試験と比較した。
【０２７４】
試薬およびプレートは、商業的に入手可能なＢＶＤＶ全（ｔｏｔａｌ）Ａｂ（商標）キット（Ｉｄｅｘｘ）から得た。このアッセイで使用した抗体はＷＢ２１０およびヤギ抗マウスＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）であった。１００μｌのサンプル希釈剤を各ウェルに適用し、該市販抗体をＰＢＳ−ＷＢ２１０中で１：４００希釈した。これらの抗体、および不活化ワクチン試験からのウシ血清を別個のチューブ内で混合し、該プレートに加え、室温で９０分間インキュベートした。該プレートをＰＢＳ  ＋  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ（商標）２０で５回洗浄した。二次抗体結合ヤギ抗マウスＰＯＤをＴＢＳ  ＋  ２％  脱脂粉乳  ＋  ２％  魚ゼラチン中で１：１０００希釈した。１ウェル当たり１００μｌを加え、３７℃で６０分間インキュベートした。その２回目のインキュベーションの後、該プレートをＰＢＳで再び５回洗浄し、適切に乾燥させた。１ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ基質を適用し、インキュベートした。３分後に停止溶液を加えた。４５０ｎｍの吸光度を測定した。％阻害値を以下のとおりに計算した：（ＯＤ  純粋Ａｂ  −  ＯＤサンプル）／ＯＤ  純粋Ａｂ  ＊  １００。
【０２７５】
商業的に入手可能なＢＶＤＶ全（ｔｏｔａｌ）Ａｂ（商標）間接ＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ）を製造業者の説明に従い行った。
【０２７６】
初回採血からの及び初回免疫化の４９日後（４９ｄｐｉ）のウシ血清を、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓの存在に関して、および全ＢＶＤＶ特異的抗体に関して試験した。
【０２７７】
対照血清は、過去の動物試験からのウシ血清：抗ＢＶＤＶ（ＰＣ）、抗ボンゴワナ（ＰＣ  Ｂｕｎｇｏ）および抗ＢＶＤＶ陰性（ＮＣ）であった。
【０２７８】
結果は図４に示されており、予想どおり、ＢＶＤＶワクチン（ｄＮｐｒｏ）で免疫化された動物の血清のみがＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体ＷＢ２１０の結合を阻害することを示した。一方、ＢＶＤＶワクチンで、そして突然変異ペスチウイルスＥｒｎｓ−Ｂｕｎｇｏまたはクローン１０の両方で免疫化された動物の血清においては、一般的なＢＶＤＶ特異的抗体が見出されたが、ボンゴワナウイルスでは見出されなかった。
【０２７９】
５．４  結論
本発明の突然変異ペスチウイルス：クローン１０およびＥｒｎｓ−ＢｕｎｇｏのＢＥＩ不活化ウイルス抗原での免疫化はどちらの場合にも頑強なレベルの抗ＢＶＤＶ特異的中和抗体を誘導した。ＢＶＤＶ中和抗体はこれらのレベルではＢＶＤＶ感染および疾患に対する防御と相関することが公知であるため、これらの結果は、これらの突然変異ペスチウイルスがＢＶＤＶ感染および疾患に対する有効な不活化ワクチンとして働きうることを実証した。
【０２８０】
また、実施した種々のアッセイにおいて、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体は全く見出されなかった。このことは、これらの突然変異ペスチウイルスが、ＢＶＤＶワクチンにおけるそれらの使用に際して、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓタンパク質に基づく非常に明確なマーカースクリーニングを可能にすることを示している。
【０２８１】
実施例６：ウシにおける突然変異ペスチウイルスワクチンの血清学的試験−生ワクチン
本発明の突然変異ペスチウイルス（クローン１および１０）の、今回は生ウイルスワクチンとしての、ワクチンおよびマーカー能の更なる研究を、ウシにおいて行った。
【０２８２】
６．１  ウイルス抗原の調製
ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナクローン１および１０をＩＦＮインヒビターＡの存在下でＫＯＰ−Ｒ細胞上で増殖させた。接種後第３日に清澄化培養上清を集め、ＭＤＢＫ細胞上で力価測定した。ＮＳ３の場合にはｍｏａｂ  ＷＢ１０３／１０５での免疫蛍光染色により力価を測定した。継代１９＋１の場合の力価は、クローン１および１０のウイルスに関して、それぞれ２．２および４．６×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、全く同等であった。それらの遺伝的安定性はこれまでに実証されていた。
【０２８３】
６．２  ワクチン接種
約６月齢の４頭の子ウシを免疫化した。そのうちの２頭はクローン１ウイルスで、２頭はクローン１０ウイルスで免疫化した。３回のワクチン接種日の接種量はクローン１０ウイルスに関しては約１×１０７であり、クローン１ウイルスに関しては約３×１０６であった。
【０２８４】
ワクチン接種スケジュールは以下のとおりであった：第０日：第１ワクチン接種；第２１日：第１追加ワクチン接種；第４２日：第２追加ワクチン接種。第０日、第２１日、第２８日、第４３日および第４９日に血液サンプルを採取した。ついで、これらのサンプルからの血清を種々のアッセイにおいて試験した。
【０２８５】
６．３  血清学的試験
６．３．１  中和抗体
ＢＶＤＶまたはボンゴワナウイルスに特異的な中和抗体の産生が前記のウイルス特異的血清中和アッセイにおいて確認された。結果を図５に示す。
【０２８６】
初回免疫化は、ＢＶＤＶに対して低い中和抗体力価（１．５〜１６  ＮＤ５０／ｍｌ）を誘導したが、第１追加ワクチン接種後に強力な増強効果が見られ、抗ＢＶＤＶ力価は２５６〜１０２４  ＮＤ５０／ｍｌまで上昇した。第２追加ワクチン接種は力価を更には顕著には増加させなかった。
【０２８７】
ボンゴワナウイルスに特異的な有意な中和抗体は時間を経ても全く検出されなかった。
【０２８８】
６．３．２  ＢＶＤＶ  ＮＳ３特異的抗体
ＢＶＤＶに対してワクチン接種されたウシにおいては一般に、中和抗体は主としてウイルスタンパク質Ｅ２に対するものである。ＮＳ３（ｐ８０）およびＥｒｎｓに対しても非中和抗体が産生される。しかし、有意なレベルの抗ＮＳ３抗体は、不活化ウイルス抗原によってではなく、複製性ウイルスの存在下でのみ誘導される。生ワクチンを使用してこれらの試験において誘導されたＮＳ３特異的抗体のレベルを測定するために、ＢＶＤＶ  ｐ８０抗体（商標）競合ＥＬＩＳＡキット（ＩＤｖｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）を製造業者の説明に従い使用した。
【０２８９】
結果は図６に示されており、第１追加ワクチン接種後の３週間の時点（第１免疫化後の第４２日）で、４頭全ての動物がＮＳ３特異的抗体に関して明らかに陽性であることが示された。
【０２９０】
６．３．３  競合ＥＬＩＳＡ
ＤＩＶＡアプローチの適合性の証拠として、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓに特異的な抗体のレベルを測定するために、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓに関する競合ＥＬＩＳＡを、ＷＢ２１０  ｍｏａｂを使用して行った。試験の準備および性能は前記のとおりであった。
【０２９１】
結果は図７に示されている。最も重要なことには、生ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナクローン１または１０で免疫化されたウシの血清においては、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ特異的抗体は全く見出されなかった。それでも、ＢＶＤＶ全Ａｂ（商標）間接ＥＬＩＳＡ（Ｉｄｅｘｘ）を使用して、全ＢＶＤＶ特異的抗体の存在が確認された。数値で示すと、動物２のクローン１０のＳ／Ｐ値は０．２７であり、カットオフ値のすぐ下であった。
【０２９２】
６．４  結論
本発明の突然変異ペスチウイルスから構成される不活化ワクチンでのワクチン接種の結果と同様に、これらの突然変異ペスチウイルス由来の生ワクチンでのワクチン接種も有効なワクチン接種および優れたマーカー機能を示した。
【０２９３】
これは、生ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ ボンゴワナウイルスクローン１またはクローン１０でウシを免疫化した場合には頑強なＢＶＤＶ特異的抗体応答が誘導されたからである。これは、ＮＳ３特異的、ＢＶＤＶ中和性および全ＢＶＤＶ特異的である抗体を使用して実証された。これは、生ウイルスまたは不活化ウイルスの両方の場合の、ＢＶＤＶに対するワクチンとしての適合性を証明した。
【０２９４】
重要なことに、ＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓ抗体を使用する競合ＥＬＩＳＡを用いた場合、これらの血清においてはＢＶＤＶ  Ｅｒｎｓに特異的な抗体は検出不可能であった。このことはＤＩＶＡマーカー原理の実施可能性を明らかに証明している。
【０２９５】
実施例７：進行中の更なる実験
実験動物における更なる試験が計画中である。現在進行中であるのは６月齢の若いウシの群（各群５頭）における試験である。この実験は、１回または２回の注射（ショット）ワクチン接種による、本発明の生弱毒化突然変異ペスチウイルスに関する異なるワクチン接種レジメンを試験する。比較のために、ＢＶＤＶの生弱毒化ワクチン株を並行して試験して、１回の注射の計画において弱毒化Ｎｐｒｏ欠失自体の弱毒化効果を比較する。該Ｎｐｒｏ欠失突然変異体は、ここで試験された突然変異ペスチウイルスの場合と全く同様に、ＮｐｒｏのＮ末端１２アミノ酸を尚も含有する。
【０２９６】
種々の群の組合せは以下のとおりに割り当てられる。
【０２９７】
１．非ワクチン接種対照；
２．ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ、１回の注射；
３．ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ Ｂｕｎｇｏ、クローン１、１回の注射；
４．ＢＶＤＶ−Ｉｂ ｓｙｎｔｈ ΔＮｐｒｏ Ｅｒｎｓ Ｂｕｎｇｏ、クローン１、初回および追加ワクチン接種。
【０２９８】
実験のタイムスケジュールは以下のとおりである：第１日：第１ワクチン接種；第２１日：第２ワクチン接種（群４）；第４２日：ＢＶＤＶ−１ｂチャレンジ；および第７０日：試験終了。
【０２９９】
血清採取を毎週行う。ワクチン接種用量は筋肉内経路の場合は１×１０６  ＴＣＩＤ５０である。チャレンジは、２×１０６  ＴＣＩＤ５０の用量のＢＶＤＶ−Ｉｂ  ＳＥ５５０８を使用して、鼻腔内経路により行う。
【０３００】
ワクチンおよびチャレンジの効果は、第１ワクチン接種後およびチャレンジ後、連続して１４日間まで、精製白血球をモニターし、ワクチンウイルスまたはチャレンジウイルスの鼻腔内排出を試験することにより（血清学および／またはＰＣＲによる識別）、ウイルス血症により確認する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019506850.tif 000009
2019506850.tif 000010
2019506850.tif 000011