(57)【要約】  ３０を超える塩基対を有する転写後化学修飾二重鎖ＲＮＡ（ＭｄｓＲＮＡ）を記載する。ＭｄｓＲＮＡは、標的生物における遺伝子発現を阻害する。ＭｄｓＲＮＡの作製及び使用方法も記載する。
2019534005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写後修飾二重鎖ＲＮＡ（ＭｄｓＲＮＡ）を含む組成物であって、前記ＭｄｓＲＮＡが、３０を超えるヌクレオチド塩基対を有する二重鎖ＲＮＡを含み、前記ヌクレオチドの少なくとも５％は、独立して式（Ｉ）：
【化１】
2019534005.tif 000018
（式中、ｎは、０又は１であり、Ｒ1は、ヒドロカルビル若しくは置換ヒドロカルビルであり又はそれを含み、塩基は、独立して、核酸塩基であり又はそれを含む。）
を含む、組成物。
【請求項２】
Ｒ1が、アルキル；置換アルキル；アルケニル；置換アルケニル；アルキニル；置換アルキニル；アリール；置換アリール；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル若しくはＣ１〜Ｃ１０アルキニル（アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状である）；ｎ＝１の場合、水素；メチル；エチル；プロピル；イソプロピル；ブチル；イソブチル；ｔｅｒｔ−ブチル；ペンチル；ヘキシル；シクロヘキシル；ヘプチル；オクチル；ノニル；デシル；ビニル；アリル；エチニル；ベンジル；シンナミル；Ｃ６〜Ｃ１４アリール；Ｃ６〜Ｃ１４置換アリール；ヘテロシクリル；Ｃ５〜Ｃ１４ヘテロシクリル；フェニル；一若しくは二置換フェニル（前記置換基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される）；２−ニトロフェニル；４−ニトロフェニル；２；４−ジニトロフェニル；２−トリフルオロメチルフェニル；４−トリフルオロメチルフェニル；スチリル；Ｃ８〜Ｃ１６置換スチリル；２−アミノフェニル；一若しくは二置換２−アミノフェニル（前記置換基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される）；Ｎ−アルキル−２−アミノフェニル若しくはＮ−アリール−２−アミノフェニル（アルキルは、式−ＣmＨ2m+1（ｍは、１２以下の整数である）を有し、アリールは芳香族部分である）；２−アミノ−３−メチル−フェニル；２−アミノ−５−クロロフェニル；２−メチル−５−クロロフェニル；Ｎ−メチル−２−アミノ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａ−２−ｍｉｎｏ）フェニル；Ｎ−エチル−２−アミノフェニル；Ｎ−プロピル−２−アミノフェニル；Ｎ−ブチル２−アミノフェニル；Ｎ−ペンチル−２−アミノフェニル；Ｎ−メチル−２−アミノ−４−ニトロフェニル；２−メチル−３−フリル；２−メチルニコチル若しくはＮ−トリフルオロメチル−２−アミノフェニル；シラニル；置換シラニル；Ｃ１〜Ｃ１０アルキルシラニル；Ｃ３〜Ｃ１２トリアルキルシラニル；Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル；Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルケニル；Ｃ２〜Ｃ１２アルキルチオアルキル；アルキルスルホニル；Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル；Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキル；Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルケニル若しくはＣ１〜Ｃ１０アミノアルキル；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＨ3、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＨ又は−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＯＯＲ4（ｐは、２〜８の整数であり、Ｒ4は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである）；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＣＯＯＨ；−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）4ＯＨ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6ＯＨ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＯＨ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＣＯＯＭｅ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）4ＯＭｅ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6ＯＭｅ；−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＯＭｅ；−ＣＨ2ＯＣＨ3；−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ3；又は−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ＣＯ）n−Ｒ1が、２，４−ジニトロフェニル、ベンゾイル又はＮ−メチルアントラノイルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記リボヌクレオチドの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも６０％又は少なくとも９０％が、独立して式（Ｉ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭｄｓＲＮＡが、標的宿主内の発現ＲＮＡに対してホモロジー及び／又は相補性を有する配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記標的宿主が、動物、昆虫、真菌、植物、原生動物又は雑草である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記昆虫、真菌又は雑草が：鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ〉、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）、半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）、コロラドハムシ、トウモロコシルートワーム、ヒアリ、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、コナガ、ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）、ボタンタケ目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・アベナセア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅａ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、オオホナガアオゲイトウ（Ｐａｌｍｅｒ  Ａｍａｒａｎｔｈ）、シロザ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｌａｍｂｓｑｕａｒｔｅｒｓ）、ヒメムカシヨモギ（Ｈｏｒｓｅｗｅｅｄ）、アサガオ（Ｍｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌｏｒｙ）、アマランサス（Ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）、ショクヨウガヤツリ（Ｎｕｔｓｅｄｇｅ）、ホウキギ（Ｋｏｃｈｉａ）、ブタクサ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｒａｇｗｅｅｄ）、オオブタクサ（Ｇｉａｎｔ  Ｒａｇｗｅｅｄ）及びベラドンナ（Ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ）からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＭｄｓＲＮＡが、標的宿主内の遺伝子の発現を低減する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
賦形剤、担体、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、肥料からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＭｄｓＲＮＡが、５重量％未満、約１重量％未満、約０．９重量％未満、約０．８重量％未満、約０．７重量％未満、約０．６重量％未満、約０．５重量％未満、約０．４重量％未満、約０．３重量％未満、約０．２重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０１重量％未満又は約０．００１重量％未満の量で存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＭｄｓＲＮＡを形成するための二重鎖ＲＮＡの転写後化学修飾方法であって、
ａ）３０を超える塩基対を有する非修飾二重鎖ＲＮＡを含む非修飾ｄｓＲＮＡ（ＵｄｓＲＮＡ）混合物を、水及び非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒の混合物を含む溶液中で形成することと、
ｂ）前記ＵｄｓＲＮＡ混合物を約３０〜９５℃に加熱することと、
ｃ）反応関与体を約３０〜９５°に加熱することであって、前記反応関与体は：
ｉ）Ｒ2−Ｘ［式（ＩＩ）］を含むアルキル化剤（式中、Ｒ2は、Ｒ1であり、Ｘは、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノである）、又は
ｉｉ）Ｒ3−Ｘ［式（ＩＩＩ）］を含むアシル化剤（式中、Ｒ3は、Ｒ1−（ＣＯ）であり、Ｘは、ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、塩化物、シアン化物、イミダゾリド、アルカノイルオキシである）、又は
からなる群から選択される、加熱することと、
ｄ）前記反応関与体を前記ＵｄｓＲＮＡ混合物に加えることと、
ｅ）前記組み合わせたＵｄｓＲＮＡ混合物及び反応関与体を、前記反応関与体がリボース２’ヒドロキシルを化学修飾して式（Ｉ）を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、約３０〜９５℃に加熱することにより前記ＭｄｓＲＮＡを形成することと、
ｆ）場合により前記ＭｄｓＲＮＡを単離又は精製することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記反応関与体が、ＮＭＩＡ、ＢｚＣＮ又はＦＤＮＢを含む、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記非プロトン性溶媒が：ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル及びウレア又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記ＵｄｓＲＮＡ混合物中の非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒の混合物の割合が、１５％〜９５％、４０％〜９５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記ＵｄｓＲＮＡ混合物が、前記反応関与体を加える前に３０〜８０℃で０〜３０分間インキュベートされる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記反応関与体を加える前又は後のいずれかに、前記ＵｄｓＲＮＡ混合物に触媒が加えられる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記触媒が：ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，６−ジベンジル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＢｎｓＤＭＡＰ）、１，６−ジエチル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＥｔｓＤＭＡＰ）及び１，６−ジメチル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＭｅｓＤＭＡＰ）、アミジン、イソチオウレア、グアニジン、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ａｚａｂｅｎｔｒｉａｚｏｌｅ）（ＨＯＡｔ）又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
ＵｄｓＲＮＡ：反応関与体のモル比が、約１：３〜約１：３００、約１：１０、約１：１０〜約１：５０、約１：５０〜約１：１００又は約１：１００〜約１：２００である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
動物、植物、原生動物又は真菌宿主における発現された遺伝子の発現を阻害する方法であって、有効量の請求項１〜１１のいずれかの組成物を前記宿主に適用することを含む、方法。
【請求項２０】
前記ＭｄｓＲＮＡが、植物、種子、餌又は土壌に適用される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月７日出願の米国仮特許出願第６２／４１８，５８１号及び２０１７年１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／４４６，７２２号による優先権を主張するものであり、これら出願の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＭｄｓＲＮＡが標的植物、動物（昆虫を含む）又は真菌に関する遺伝子発現を阻害することが可能であるように、化学修飾ヌクレオチドを有する約３０塩基対（ｂｐ）よりも長い修飾二重鎖ＲＮＡ（ＭｄｓＲＮＡ）の組成物について記載する。そのような組成物は、作物保護に用途を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、天然に存在する生物学的プロセスであり、このプロセスにより二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は配列特異的方法で標的遺伝子発現をサイレンシング（ノックダウン）する。細胞酵素は、ｄｓＲＮＡを使用して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び非翻訳ＲＮＡを含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を標的化及び切断する。ＲＮＡｉは、植物、真菌及び動物を含む多くの真核生物内で起こることが既知であり、遺伝子発現の選択的かつ効率的な調節のための大きな可能性を提供する。
【０００４】
ｄｓＲＮＡは、ｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡの配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖を有し、センス鎖は、ｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡの配列と実質的に同一である。センス及びアンチセンス配列は、別個のＲＮＡ鎖又は単一の鎖上に存在し得る。単一の鎖上に存在する場合、相補的な配列は、ハイブリダイズしないヘアピン又はループ配列によって接続される。
【０００５】
先行技術に記載される、作物を冒す標的化される雑草、昆虫及び真菌に対するＲＮＡｉ媒介による遺伝子抑制は、外因的に供給される非修飾ｄｓＲＮＡ（ＵｄｓＲＮＡ）を使用して達成されている（米国特許第９，１２１，０２２号；Ｉｖａｓｈｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５；米国特許出願公開第２０１６０２１５２９０号；Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。ｄｓＲＮＡが昆虫内でＲＮＡｉを誘導するのに使用され、昆虫の食餌中に供給される場合、効率的な取り込み及び加工のために時には６０塩基対（ｂｐ）又はより長いｄｓＲＮＡが必要であることが見出されている（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０００６】
約３０塩基対（ｂｐ）を超える長さのＵｄｓＲＮＡの調製は、インビトロ転写（Ｔｉｍｍｏｎｓ  ２００６）及び発酵（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）により達成されている。作物保護用途に必要なＵｄｓＲＮＡの調製及び精製のための商業的に実現可能な大規模方法が記載されている（米国特許出願公開第２０１６０１７７２９９号）。しかしながら、ＵｄｓＲＮＡは、環境及び宿主内のヌクレアーゼによる分解に感受性であり、遺伝子発現の阻害の有効性が低減されている（Ｂａｕｍ  ２０１６）。
【０００７】
ＤｓＲＮＡ分解は、化学的手段により修飾されたヌクレオチドを有する小型（＜３０ｂｐ）干渉ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の化学合成を用いることにより、インビトロ及びインビボ研究において及びヒト治療法のために対処されている（Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。化学修飾ヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡの製剤は、単鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）鎖の伸長において付加される各ヌクレオチドに関する保護−脱保護の連続的な化学反応を含む（Ｍｉｃｕｒａ  ２００２）。そのようなプロセスの複雑さ及び出費は、ＲＮＡｉを誘発する約３０ｂｐよりも長いＲＮＡ分子（ＲＮＡｉトリガー）において有意に増大する。リボースの２’−ＯＨ位で化学修飾されたヌクレオチドを使用した、昆虫を標的とする化学的に合成されるｓｉＲＮＡも記載されているが（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、数グラムを超える量又は約３０ｂｐを超える長さの化学修飾ｄｓＲＮＡを調製するためには、修飾ｓｉＲＮＡの費用及び合成の複雑さは、経済的に実現可能でも又は十分に拡張可能でもない。
【０００８】
単鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の転写後化学修飾は、米国特許６，８６７，２９０号に記載されるように、分析目的で使用されている。２’−ＯＨ位において化学修飾されたｓｓＲＮＡは、続くステップにおいてＵｄｓＲＮＡを製造するための鋳型として記載され、それにより増幅のための手段と、その後の微量の非修飾ｓｓＲＮＡの検出とを提供する。ｓｓＲＮＡ修飾は、水が５％以下存在するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を溶媒として使用して行われた。
【０００９】
分析目的のためのｓｓＲＮＡの転写後化学修飾は、Ｍｅｒｉｎｏ（２００５）によっても記載されている。Ｍｅｒｉｎｏは、１０％  ＤＭＳＯを含む水性媒体中でｓｓＲＮＡをＮ−メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ）と反応させて、一本鎖ヌクレオチドにおけるＮ−メチル−アンスラニル酸の２’−Ｏ−エステルを生成した。この方法による誘導体化は非効率であった。反応容器内の１５％未満のｓｓＲＮＡ鎖が修飾され、修飾されたものは、平均で、ｓｓＲＮＡ鎖当たりＮＭＩＡの単一の２’−Ｏ−エステルを有した。これらの条件下で、ｄｓＲＮＡは、８０倍超の低い効率で反応し、ステム領域内の０．１８％未満のヌクレオチドが修飾され、ステム末端の１つヌクレオチド内（即ち、単鎖領域の１ヌクレオチド内）のみで修飾された。同様の結果が他の反応関与体とのＲＮＡの反応に関して観察されている（Ｎｏｄｉｎ  ２０１５）。１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）、シアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）、２−メチル−３−フロ酸イミダゾリド（ＦＡＩ）及び２−メチルニコチン酸イミダゾリド（ＮＡＩ）は、ＲＮＡの２’−リボースエステルを転写後に生成するのに使用されたが、同様に低い割合の修飾を有し、修飾は不対ヌクレオチド又はそれらに隣接する対ヌクレオチドで主に起こった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＲＮＡｉは、農業及び都市環境における有害生物及び雑草の低減、管理又は制御に対する有望な手法を提供する。しかしながら、ＵｄｓＲＮＡ又は高度に修飾された合成ｓｉＲＮＡからなるＲＮＡｉトリガーを使用する現在のＲＮＡｉ技術は、農業又は都市環境での使用のためには、法外な費用がかかる。更に、現在のｓｉＲＮＡ生成は、十分な拡張性を有さない。大規模で経済的に製造することができ、使用の時点まで分解に抵抗するよう十分に安定であり、有効な殺虫性又は除草性応答を引き出すのに十分活性であり、哺乳動物、とくにヒト及び環境に安全であると考慮されるに十分な選択性を有する、農業及び都市用途のためのＲＮＡｉトリガーが必要とされている。
【００１１】
本発明者らは：３０ヌクレオチド長を超えるセンス配列と、３０ヌクレオチド長を超えるアンチセンス配列とを有する、３０を超える塩基対を有する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み、センス配列及びアンチセンス配列は、少なくとも８５％相補的であり、ｄｓＲＮＡヌクレオチドの少なくとも５％は、転写後に化学修飾されている、転写後化学修飾二重鎖ＲＮＡ（ＭｄｓＲＮＡ）を記載する。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、３０を超える、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００の塩基対を有する。いくつかの実施形態では、センス及びアンチセンス配列は、独立して、３０を超える、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００ヌクレオチド長である。転写後化学修飾は、環境内、及びいくつかの宿主生物による消化中の長いｄｓＲＮＡの安定性を改善する。しかしながら、化学修飾は環境内で最終的な分解を受けやすく、それにより環境に対する負の影響を低減する。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を発現している宿主生物への送達又は適用後、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は他の機構の生物学的プロセスを介して、標的遺伝子の発現を阻害又はノックダウンする。記載されるＭｄｓＲＮＡは、容易に拡張可能な方法で、経済的に製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
いくつかの実施形態では、転写後化学修飾は、リボース２’−ＯＨ修飾を含む。いくつかの実施形態では、リボース２’−ＯＨ修飾は、独立して：
【化１】
2019534005.tif 000003
により表される構造を含み、式中、ｎは、０又は１であり、Ｒ1は、ヒドロカルビル若しくは置換ヒドロカルビルであり又はそれを含み、塩基は、独立して、非限定的に：アデニン、グアニン、シトシン又はウラシル等の核酸塩基を含む（１’、２’、３’、４’及び５’は、リボース環における炭素原子位置を示す）。
【００１３】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル又は置換アリールであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル又はＣ１〜Ｃ１０アルキニルであり得、アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、アリール、置換アリール、Ｃ６〜Ｃ１４アリール又はＣ６〜Ｃ１４置換アリールであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ５〜Ｃ１４ヘテロシクリル又は置換Ｃ５〜Ｃ１４ヘテロシクリルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、スチリル、Ｃ８〜Ｃ１６置換スチリル、２−アミノフェニル又は置換２−アミノフェニルであり得る。いくつかの実施形態では、ｎ＝１であり、Ｒ1は、Ｎ−アルキル−２−アミノフェニル又はＮ−アリール−２−アミノフェニル（ａｍｉｎｏｐｈｅｎｈｙｌ）であり得、アルキルは、式−ＣmＨ2m+1（ｍは、１２以下の整数である）を有し、アリールは、芳香族部分である。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキルチオアルキル、アルキルスルホニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルケニル又はＣ１〜Ｃ１０アミノアルキルであり得る。いくつかの実施形態では、ｎ＝０であり、Ｒ1は、シラニル、置換シラニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルシラニル又はＣ３〜Ｃ１２トリアルキルシラニルであり得る。いくつかの実施形態では、ｎ＝０であり、Ｒ1は、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＨ3、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＨ又は−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＯＯＲ4であり得、ｐは２以上の整数であり、Ｒ4は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡの２’−ＯＨ位で化学的に置換されたリボース環の数は、ＭｄｓＲＮＡのリボース環の総数の５％〜１００％の範囲である。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡの２’−ＯＨ位で化学的に置換されたリボース環の数は、ＭｄｓＲＮＡのリボース環の総数の５％を超え、１０％を超え、２０％を超え、２５％を超え、３０％を超え、４０％を超え、５０％を超え、６０％を超え、７０％を超え、７５％を超え、８０％を超え又は９０％を超える。ＭｄｓＲＮＡの化学修飾ヌクレオチドは、ランダムであり得る。換言すれば、化学修飾ヌクレオチドは、互いに隣接し、又は１、２、３若しくはそれを超える非修飾ヌクレオチドにより分離され得る。
【００１５】
３０を超える塩基対を有するＵｄｓＲＮＡを転写後化学修飾して、ＭｄｓＲＮＡを製造する容易に拡張可能な方法を記載し、ここでｄｓＲＮＡヌクレオチドの少なくとも５％は、式（Ｉ）を含む。いくつかの実施形態では、ＵｄｓＲＮＡ転写後修飾化学修飾プロセスは：
（ａ）３０を超える塩基対を有するＵｄｓＲＮＡの混合物を、水及び非プロトン性溶媒を含む溶液中で形成することと、
（ｂ）混合物に、適切な量の：
ｉ）Ｒ2−Ｘ［式（ＩＩ）］を含むアルキル化剤、（式中、Ｒ2は、Ｒ1であり、Ｘは、ヒドロキシル、ハロゲン又はシアノである）又は
ｉｉ）Ｒ3−Ｘ［式（ＩＩＩ）］を含むアシル化剤、（式中、Ｒ3は、Ｒ1−（ＣＯ）であり、Ｘは、Ｈ、ＯＮａ、塩化物、シアン化物、アルカノイルオキシ又は環状無水物である）を加えることと、
（ｃ）アルキル化剤又はアシル化剤がリボース２’ヒドロキシルと反応して、式（Ｉ）を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、混合物を約３０℃〜約９５℃に加熱することによりＭｄｓＲＮＡを形成することと、
（ｄ）場合により、式（Ｉ）を有する修飾ヌクレオチドを含むＭｄｓＲＮＡを単離又は精製することと、を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、化学修飾プロセスは、ステップ（ｂ）及び／又は（ｃ）中に触媒を加えることを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ2は、ヒドロカルビル又は置換ヒドロカルビル、ヘテロシクリル、シラニル又は置換シラニル、メチルスルホニルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル又は置換アリールであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル又はＣ１〜Ｃ１０アルキニルであり得、アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、アリール又はＣ６〜Ｃ１４置換アリールであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、Ｃ５〜Ｃ１４ヘテロシクリルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ2は、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＯＯＲ4であり得、ｐは２以上の整数であり、Ｒ4は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｒ3は、アルカノイル、置換アルカノイル、ベンゾイル、置換ベンゾイル、シンナモイル、置換シンナモイル（ｃｉｎｎａｌｍｏｙｌ）、アントラノイル又は置換アントラノイルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ3は、Ｃ１〜Ｃ１０アルカノイル若しくは置換アルカノイル、アロイル若しくはＣ６〜Ｃ１４置換アロイル、シンナモイル若しくはＣ８〜Ｃ１６置換シンナモイル、又はアントラノイル若しくは置換アントラノイルであり得る。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の環状無水物は、イサト酸無水物、Ｎ−アルキルイサト酸無水物又はＮ−アリールイサト酸無水物であり得、アルキルは式−ＣmＨ2m+1を有し、ｍは１２以下の整数である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのアルキル化剤は、フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＦＤＮＢ）であり得る。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのアシル化剤は、Ｎ−メチルイサト酸（ｍｅｔｈｙｌｉｓａｔｏｏｉｃ）無水物（ＮＭＩＡ）又はシアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、動物、真菌又は植物内で発現された標的遺伝子に対する配列ホモロジーを含む。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、発現されたＲＮＡに対する配列ホモロジーを含む。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現を阻害する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、二重鎖ＲＮＡを転写後修飾して、ＭｄｓＲＮＡを形成する方法を記載し、該方法は、
ａ）３０を超える塩基対を有する非修飾二重鎖ＲＮＡを含む非修飾ｄｓＲＮＡ（ＵｄｓＲＮＡ）混合物を、水及び非プロトン性溶媒を含む溶媒中で形成することと、
ｂ）前記ＵｄｓＲＮＡ混合物を約３０〜９５℃に加熱することと、
ｃ）反応関与体を約３０〜９５°に加熱することであって、反応関与体は、：
ｉ）Ｒ2−Ｘ［式（ＩＩ）］を含むアルキル化剤（式中、Ｒ2は、Ｒ1であり、Ｘは、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノである）、又は
ｉｉ）Ｒ3−Ｘ［式（ＩＩＩ）］を含むアシル化剤、（式中、Ｒ3は、Ｒ1−（ＣＯ）−であり、Ｘは、ＯＨ、ＯＮａ、ＯＫ、塩化物、シアン化物、イミダゾリド、アルカノイルオキシである）、又は
からなる群から選択される、加熱することと、
ｄ）反応関与体をＵｄｓＲＮＡ混合物に加えることと、
ｅ）反応関与体がリボース２’ヒドロキシルを化学的に修飾して、式（Ｉ）を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、ＵｄｓＲＮＡ混合物及び反応関与体を約３０〜９５℃に加熱することによりＭｄｓＲＮＡを形成することと、
ｆ）場合によりＭｄｓＲＮＡを単離又は精製することと、を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、標的遺伝子の発現の阻害が、動物、真菌若しくは雑草を殺滅し、動物、真菌若しくは雑草の成長若しくは食欲を阻害し、又は、動物、真菌若しくは雑草の繁殖を遅延させるように選択される。標的遺伝子の発現の阻害は、動物、真菌若しくは雑草を制御し、動物、真菌若しくは雑草を殺滅し、動物、真菌若しくは雑草の成長若しくは食欲を阻害し、又は、動物、真菌若しくは雑草の繁殖を遅延させることができる。いくつかの実施形態では、昆虫、真菌又は植物は、農業的に有意なものである。いくつかの実施形態では、農業的に有意な動物、真菌又は植物は、昆虫、真菌又は雑草である。昆虫は、非限定的に：鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ〉（カブトムシ等）、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）（チョウ又はガ等）、膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）（ハバチ、カリバチ、ハナバチ及びアリ等）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）（ハエ等）又は半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）（ナンキンムシ等）であり得る。真菌は、非限定的に：ボタンタケ目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓａｎ）であり得る。雑草は、特定の状況又は位置において望ましくないと考えられる植物である。雑草は、非限定的に、オオホナガアオゲイトウ（Ｐａｌｍｅｒ  Ａｍａｒａｎｔｈ）、シロザ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｌａｍｂｓｑｕａｒｔｅｒｓ）、ヒメムカシヨモギ（Ｈｏｒｓｅｗｅｅｄ）、アサガオ（Ｍｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌｏｒｙ）、アマランサス（Ｗａｔｅｒｈｅｍｐ）、ショクヨウガヤツリ（Ｎｕｔｓｅｄｇｅ）、ホウキギ（Ｋｏｃｈｉａ）、ブタクサ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｒａｇｗｅｅｄ）、オオブタクサ（Ｇｉａｎｔ  Ｒａｇｗｅｅｄ）又はベラドンナ（Ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ）であり得る。いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡを使用して、農業又は都市環境における動物、真菌又は植物を制御し、動物、真菌若しくは植物を殺滅し、動物、真菌若しくは植物の成長、食欲若しくは給餌を阻害し、又は、動物、真菌若しくは植物の繁殖を遅延させることができる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、植物標的遺伝子は、植物内の遺伝子の発現の阻害が、植物成長、生存能、品質又は収穫高を増大させるように選択される。
【００２４】
動物、真菌又は植物における標的遺伝子の発現の阻害に好適なＭｄｓＲＮＡの作製方法を記載し、該方法は：
ａ）宿主動物、真菌、植物内の標的遺伝子を特定することと、
ｂ）少なくとも３０塩基対を有するｄｓＲＮＡを発現するための発現ベクターを作製することであって、ｄｓＲＮＡは標的遺伝子に対する配列ホモロジーを含む、作製することと、
ｃ）発現ベクターを使用して、ＵｄｓＲＮＡ転写産物を生成することと、
ｄ）転写産物を転写後修飾して、ＭｄｓＲＮＡを生成することと、
ｅ）場合によりＭｄｓＲＮＡを精製することと、を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＭｄｓＲＮＡの大規模製造に使用することができる。ＵｄｓＲＮＡの大規模生産（転写）は、当該技術分野で利用可能な方法を用いて達成することができ、該方法は、非限定的に：インビトロ転写（Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）、細菌又は酵母発現系を使用する反応器内での発酵（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、植物発現系の使用、及び／又は、所望のポリヌクレオチドの転写と、バクテリオファージＱβ又はＭＳ２のもの等の自己集合バクテリオファージカプシドタンパク質の発現とのカップリング（米国特許第２０１６０２０８２２１号及び米国特許第２０１４０３０２５９３号）を含む。次いで、ＵｄｓＲＮＡは、記載されるように化学修飾され得る。いくつかの実施形態では、Ｑβ又はＭＳ２ウイルス様粒子内のＵｄｓＲＮＡは、化学修飾され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、記載されるＭｄｓＲＮＡを含む組成物を記載する。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡ含有組成物は、農業用途用に配合される。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは：賦形剤、担体、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、肥料、溶媒、界面活性剤、結合剤、充填剤、湿潤剤、増粘薬剤、泡制御剤、分散剤、錠剤崩壊剤、ｐＨ調整剤、キレート化剤、保存剤及び色素を含む群から選択される１つ以上の薬剤と組み合わされ、又は該薬剤を含む組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、組成物の５０重量％未満で含まれる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、侵入（例えば、昆虫、真菌又は雑草侵入による）を処置、制御、制限は低減するための方法を提供し、該方法は、記載されるＭｄｓＲＮＡの１つ以上を含む組成物を、潜在的侵入の侵入範囲に適用することを含む。侵入又は潜在的な侵入の範囲は、農業環境であり得る。農業環境には、非限定的に、田畑、果樹園及び畜産経営が含まれる。農業範囲内の昆虫、真菌又は雑草における標的遺伝子の発現の阻害により、昆虫、真菌又は植物を原因とする作物損害、又は収穫高の低下を、ＭｄｓＲＮＡによる処理の非存在下で測定された損害又は収穫高の低下と比較して低減することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、非限定的に農作物植物を含む植物における標的遺伝子の発現を低減する方法を記載し、該方法は、記載されるＭｄｓＲＮＡの１つ以上を含む組成物を、植物に適用することを含む。植物は、研究室、温室、苗畑、田畑、果樹園又は他の農業環境又は他の自然環境内にあり得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡを含む組成物は、噴霧等によって田畑に適用される。いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡを含む組成物は、その上で昆虫又は真菌が給餌される植物表面に適用される。摂取された後、記載されるＭｄｓＲＮＡは、有害生物の腸を裏打ちする細胞により吸収され、処理され、宿主標的遺伝子転写産物を標的とする有効なＲＮＡｉトリガーを生成して、標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＵｄｓＲＮＡと比較した、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩによる消化に対するＭｄｓＲＮＡの耐性の増大を示す画像。ＵｄｓＲＮＡはＢｚＣＮにより修飾されてＭｄｓＲＮＡを生成し、約４０％のヌクレオチドが修飾された。次いでＵｄｓＲＮＡ及びＭｄｓＲＮＡをＲＮａｓｅ  ＩＩＩで処理した。次いで、ＲＮＡｅ  ＩＩＩ消化の前（レーンＡ）及び後（レーンＢ）のＵｄｓＲＮＡ及びＭｄｓＲＮＡサンプルを、電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【図２】３つのスーパーＤＭＡＰ求核試薬を表す化学構造：Ａ  １，６−ジベンジル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＢｎｓＤＭＡＰ）、Ｂ  １，６−ジエチル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＥｔｓＤＭＡＰ）、及びＣ  １，６−ジメチル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＭｅｓＤＭＡＰ）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明者らは、３０を超える、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００塩基対を有し、リボース環の少なくとも５％が２’−ＯＨ位において転写後化学修飾されているＭｄｓＲＮＡを記載する。本発明者らは、ＭｄｓＲＮＡを含む組成物、並びにＭｄｓＲＮＡの作製及び使用方法も記載する。ＭｄｓＲＮＡは、配列特異的な方法で、例えばＲＮＡ干渉又はアンチセンス機構を介して、昆虫、真菌及び／又は植物等の農業的に有意な有害生物における遺伝子発現を阻害することが可能である。非修飾二重鎖ＲＮＡ（ＵｄｓＲＮＡ）の転写後修飾のためのプロセスも記載する。本発明者らは更に、ＭｄｓＲＮＡを含む組成物を使用した、農業又は都市環境内での有害生物の阻害又は制御方法を記載する。
【００３２】
ＭｄｓＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含み、ｄｓＲＮＡは、少なくとも３０塩基対のヌクレオチド（塩基対）を含み、ヌクレオチドリボースの少なくとも５％は、転写後修飾されている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００塩基対の長さを有する。ＭｄｓＲＮＡセンス鎖はセンス配列を含み、ＭｄｓＲＮＡアンチセンス鎖はアンチセンス配列を含む。アンチセンス配列は、標的遺伝子転写ｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ（即ち、発現ＲＮＡ）に存在するヌクレオチド配列に対して１００％（完全に）相補的、又は少なくとも９０％（実質的に）相補的、又は少なくとも８０％（部分的に）相補的である。センス配列は、アンチセンス配列に対して１００％（完全に）相補的、又は少なくとも９０％（実質的に）相補的、又は少なくとも８０％（部分的に）相補的である。センス配列はまた、標的遺伝子ｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡに存在するヌクレオチド配列（標的配列）と１００％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも８０％同一であり得る。センス配列及び対応するアンチセンス配列は、互いに部分的に（少なくとも８０％）、実質的に（９０％）又は完全に（１００％）相補的である。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡと、標的遺伝子転写ｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ配列の対応する配列との間の相補性（アンチセンス配列）又は同一（センス配列）の領域は、３０を超える、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、３０を超える、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００ヌクレオチド長の連続配列を含み、該配列は、標的遺伝子転写ｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ内の対応する連続配列に対して１００％相補的又は少なくとも８０％相補的である。ＭｄｓＲＮＡセンス及びアンチセンス配列は、同じ長さであり得又は異なる長さであり得る。好適なセンス及びアンチセンス配列は、当該技術分野で容易に入手可能な既知の方法を用いて特定することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡセンス鎖は、アンチセンス鎖に接続される。センス鎖は、ハイブリダイズしないヘアピン又はループ配列を介してアンチセンス鎖に接続され得る。ループ配列は、約４〜１００又はそれを超えるヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、ループは、１５０以上のヌクレオチド長である（Ｈａｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、非限定的に：プロモーター配列、５’配列、３’配列、ターミネーター配列及びポリＡ配列を含む１つ以上の追加の配列を更に含む。
【００３５】
プロモーターは、遺伝子の転写を開始させるＤＮＡの領域（配列）である。プロモーターは、細菌プロモーター、古細菌プロモーター、真核生物プロモーター又はＰｏｌ  Ｉ、Ｐｏｌ  ＩＩ若しくはＰｏｌｌ  ＩＩＩプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、細菌プロモーターは、転写開始部位から約３５ｂｐ上流に配列５’−ＴＴＧＡＣＡ−３’を含み、転写開始部位から約１０ｂｐ上流に配列５’−ＴＡＴＡＡＴ−３’を含む。異なる発現システムとの使用に好適な他のプロモーターは、当該技術分野にて周知である。
【００３６】
ＭｄｓＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡの塩基対ヌクレオチドの５％超がリボース２’−ＯＨ位において転写後化学修飾される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、リボース２’−ＯＨ位に置換を含む。いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡは、バックボーンリボース２’−ＯＨ位において化学的に置換されたヌクレオチドを含み、化学的に置換されたヌクレオチドは、独立して式（Ｉ）：
【化２】
2019534005.tif 000004
を含み、式中、ｎは、０又は１であり、Ｒ1は、ヒドロカルビル若しくは置換ヒドロカルビルであり又はそれを含み、塩基は、独立して、非限定的に：アデニン、グアニン、シトシン又はウラシル等の核酸塩基を含む（１’、２’、３’、４’及び５’は、リボース環における炭素原子位置を示す）。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｒ1は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール又は置換アリールであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル又はＣ１〜Ｃ１０アルキニルであり得、アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ビニル、アリル、エチニル、ベンジル、シンナミル等であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ６〜Ｃ１４アリール又はＣ６〜Ｃ１４置換アリールであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、ヘテロシクリル又はＣ５〜Ｃ１４ヘテロシクリルであり得る。いくつかの実施形態では、ｎ＝０であり、Ｒ1は、フェニル、一又は二置換フェニルであり得、置換基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される。いくつかの実施形態では、ｎ＝０であり、Ｒ1は、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、２−トリフルオロメチルフェニル又は４−トリフルオロメチルフェニルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、スチリル又はＣ８〜Ｃ１６置換スチリルであり得る。いくつかの実施形態では、ｎ＝１であり、Ｒ1は水素である。いくつかの実施形態では、ｎ＝１であり、Ｒ1は、フェニル、一若しくは二置換フェニル２−アミノフェニル又は一若しくは二置換２−アミノフェニルであり得、置換基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される。いくつかの実施形態では、ｎ＝１であり、Ｒ1は、Ｎ−アルキル−２−アミノフェニル又はＮ−アリール−２−アミノフェニルであり得、アルキルは、式−ＣmＨ2m+1（ｍは、１２以下の整数である）を有し、アリールは、芳香族部分である。いくつかの実施形態では、ｎ＝１であり、Ｒ1は、２−アミノ−３−メチル−フェニル、２−アミノ−５−クロロフェニル、２−メチル−５−クロロフェニル、Ｎ−メチル−２−アミノ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａ−２−ｍｉｎｏ）フェニル、Ｎ−エチル−２−アミノフェニル、Ｎ−プロピル−２−アミノフェニル、Ｎ−ブチル２−アミノフェニル、Ｎ−ペンチル−２−アミノフェニル、Ｎ−メチル−２−アミノ−４−ニトロフェニル、２−メチル−３−フリル、２−メチルニコチル又はＮ−トリフルオロメチル−２−アミノフェニルであり得る。いくつかの実施形態では、ｎ＝０であり、Ｒ1は、シラニル、置換シラニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルシラニル又はＣ３〜Ｃ１２トリアルキルシラニルであり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルコキシアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキルチオアルキル、アルキルスルホニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホニル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルケニル又はＣ１〜Ｃ１０アミノアルキルであり得る。Ｃ１〜Ｃ１０は、Ｃ１、Ｃ��、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０を含む。同様に、Ｃ２〜Ｃ１２は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１及びＣ１２を含む。同じく、Ｃ５〜Ｃ１４、Ｃ６〜Ｃ１４、Ｃ８〜Ｃ１６、Ｃ３〜Ｃ１２は、所定の範囲内の個々の可能な式の各々を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ｎ＝０であり、Ｒ1は、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＨ3、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＨ又は−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＯＯＲ4であり得、ｐは、２以上の整数であり、Ｒ4は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである。いくつかの実施形態では、ｐは、２〜８の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ1は、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）4ＯＨ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6ＯＨ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＯＨ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＣＯＯＭｅ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）4ＯＭｅ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6ＯＭｅ、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）8ＯＭｅ、−ＣＨ2ＯＣＨ3、−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ3又は−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3であり得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡのリボース環の１０％超、２０％超、２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超又は９０％超は、２’−ＯＨ位で置換されている。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡのリボース環の５〜９５％、１０〜９５％、２０〜９５％、３０〜９５％、４０〜９５％、５０〜９５％、６０〜９５％、７０〜９５％、８０〜９５％、９０〜９５％、１０〜９０％、１０〜８０％、１０〜７０％、１０〜６０％、１０〜５０％、１０〜４０％、０〜３０％又は１０〜２５％は、２’−ＯＨ位で置換されている。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｄｓＲＮＡのリボース環の１つ以上の２’−ＯＨ基において化学修飾を含む疎水性部分を有するＭｄｓＲＮＡコンストラクトを記載する。疎水性部分は、ＭｄｓＲＮＡの親油性の特性を増大させ、それらの有機溶媒中での溶解度の増大、及び水中での溶解度の低下をもたらす。本発明者らは、リボース環の４０％がベンゾイル基で化学修飾されたＭｄｓＲＮＡは、対応するＵｄｓＲＮＡと比較して水中の溶解度が３０％低いことを観察した。疎水性の増大は、生体膜を横切るＭｄｓＲＮＡの拡散を増大又は向上させ得る。拡散の増大は、より低い濃度で有害生物宿主内の標的遺伝子ノックダウンを改善し、それにより適用の全費用を低減することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化学修飾ｄｓＲＮＡコンストラクトに関する計算されたオクタノール／水分配係数（Ｋｏｗ）又はＨＬＢは、増大する。リボース環の４０％がベンゾイル基で化学修飾された、いくつかのＭｄｓＲＮＡは、対応するＵｄｓＲＮＡと比較して、Ｋｏｗが１５倍を超えて増大した。リボース環の４０％が（の）Ｎ−メチルアンスラニル基で化学修飾された、いくつかのＭｄｓＲＮＡは、対応するＵｄｓＲＮＡと比較して、Ｋｏｗが３０倍を超えて増大した。生体膜を横切る化学修飾ｄｓＲＮＡの、予想される拡散率は、より高い。より高い拡散は、遺伝子発現の阻害におけるＭｄｓＲＮＡの有効性の増大をもたらすと見なされている。
【００４２】
いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡは、それらの対応する非修飾ｄｓＲＮＡよりも安定である。安定性の増大は、宿主又は環境のリボヌクレアーゼによるＭｄｓＲＮＡの分解を低減するため、送達及び／又は有効性を改善することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡコンストラクトは、二重鎖リボヌクレアーゼによる分解に対して、改善された安定性を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、記載されるＭｄｓＲＮＡは、宿主生物における標的遺伝子発現を阻害又はノックダウンする。標的遺伝子発現の阻害は、宿主生物の生存率の低下に繋がる場合がある。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の阻害は、宿主生物の成長、勢い、疾病抵抗性、生存能、乾燥耐性等の改善に繋がる場合がある。いくつかの実施形態では、宿主によるＭｄｓＲＮＡの摂取により標的遺伝子発現の阻害がもたらされる。理論に束縛されるものではないが、摂取されたＭｄｓＲＮＡは、宿主の細胞機構によってＲＮＡｉトリガーに加工され、これは次いでＲＮＡ干渉により遺伝子発現を阻害し得ると考えられる。
【００４５】
当業者は、本発明の教示が、アプタマー、アンチセンス、ｍＲＮＡ及び他の長いＲＮＡの調製において有用なｓｓＲＮＡの安定性を改善するよう適合され得ることを理解するであろう。当業者は、本発明の教示が、例えば中でも蠕虫、アメーバ、外寄生生物、寄生真菌又は原虫を原因とする寄生虫症の処置に関して示される、ヒト又は動物の抗寄生虫活性成分の製剤において有用なＲＮＡの安定性を改善するよう適合され得ることを理解するであろう。
【００４６】
ＵｄｓＲＮＡの転写後修飾
本発明者らは、化学反応関与体がリボースの２’−ＯＨ位の十分なヒドロキシルと反応して、記載されるＭｄｓＲＮＡを生成するように、ＵｄｓＲＮＡを好適な範囲の反応条件下で好適な化学反応関与体と反応させることを記載する。記載される製剤は、改善された有効性を提供し、かつ拡張可能である。それらは、農業及び／又は都市使用のために経済的に製造されるように十分大きい体積で行うことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）を含むＭｄｓＲＮＡを形成するためのＵｄｓＲＮＡの転写後修飾は：
（ａ）所望のＵｄｓＲＮＡを、水及び非プロトン性溶媒を含む溶媒混合物と約３０℃〜約８０℃の温度で接触させることと、
（ｂ）場合によりＵｄｓＲＮＡ溶媒混合物を触媒と接触させることと、
（ｃ）混合物を：
（ｉ）Ｒ2−Ｘ［式（ＩＩ）］を含むアルキル化剤、又は
（ｉｉ）Ｒ3−Ｘ［式（ＩＩＩ）］を含むアシル化剤から選択される化学反応関与体と接触させることと、
（ｃ）場合によりＵｄｓＲＮＡ溶媒混合物を１つ以上の触媒と接触させることと、
（ｄ）反応関与体がＵｄｓＲＮＡを所望の程度に修飾するのに必要な時間の間、約３０℃〜約９５℃に加熱することにより、ＭｄｓＲＮＡを形成することと、を含む。
【００４８】
好適な非プロトン性溶媒としては、非限定的に：ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、ＴＨＦ、ジオキサン、アセトニトリル及びウレアが挙げられる。溶媒混合物中の非プロトン性溶媒の割合は、４０％〜９５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％であり得る。溶媒混合物の温度は、約３０℃〜約８０℃又は約５０℃〜約７０℃又は約６０℃〜約７０℃で様々であり得る。
【００４９】
好適な触媒としては、非限定的に：ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）、１，６−ジベンジル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＢｎｓＤＭＡＰ）、１，６−ジエチル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＥｔｓＤＭＡＰ）、１，６−ジメチル−１，３ａ，６，８−テトラアザ−１，２，３，４，５，６−ヘキサヒドロフェナレン（ＭｅｓＤＭＡＰ（Ｒｙｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０））、アミジン、イソチオウレア、グアニジン、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ａｚａｂｅｎｔｒｉａｚｏｌｅ）（ＨＯＡｔ）が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のＲ2は、Ｒ1である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のＲ2は、非限定的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アリール、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキニル、アリール、置換Ｃ６〜Ｃ１４アリール、Ｃ５〜Ｃ１４ヘテロシクリル又は（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）pＣＯＯＲ4であり得、ｐは、２以上の整数であり、Ｒ4は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである。アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状であり得る。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のＸは、非限定的に、ヒドロキシル、ハロゲン又はシアノであり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、好適な式（ＩＩ）のアルキル化剤としては、非限定的に：塩化エチル、塩化プロピル、塩化ブチル、塩化ベンジル、１−フルオロ−２−ニトロベンゼン，１−フルオロ−４−ニトロベンゼン、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、クロロ−２，４−ジニトロベンゼン、フルオロ−２−トリフルオロメチルフェニル、フルオロ−４−トリフルオロメチルフェニル、エチルアルコール、ｎ−ブチル臭化物、オクタンニトリル、４−ブロモアニソール、シンナミルアルコール及び塩化トリメチルシリル（ｔｒｉｍｅｈｙｌｓｉｌｙｌ）が挙げられる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のＲ3は、Ｒ1−（ＣＯ）である。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のＲ3は、非限定的に、Ｃ１〜Ｃ１０アルカノイル、置換アルカノイル、ベンゾイル、アロイル、Ｃ６〜Ｃ１４置換アロイル、シンナモイル、Ｃ８〜Ｃ１６置換シンナモイル、アントラノイル又は置換アントラノイルであり得る。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）のＸは、非限定的に、Ｈ、ＯＮａ、塩化物、シアン化物、アルカノイルオキシ又は環状無水物であり得る。好適な無水物としては、非限定的に、イサト酸無水物、置換イサト酸無水物、Ｎ−アルキルイサト酸無水物及びＮ−アリールイサト酸無水物が挙げられ、アルキルは、式−ＣmＨ2m＋１を有し、式中、ｍは５以上の整数であり、アリールは芳香族部分である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の好適なアシル化剤としては、非限定的に、塩化ホルミル、塩化アセチル、塩化ブタノイル、塩化ピバロイル、塩化ベンゾイル、シアン化ベンゾイル、酢酸無水物、プロピオン無水物、酪酸無水物、吉草酸無水物、Ｎ−メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ）、Ｎ−エチルイサト酸無水物、Ｎ−プロピルイサト酸無水物、Ｎ−ブチルイサト酸無水物、Ｎ−ペンチルイサト酸無水物、１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物、Ｎ−トリフルオロメチルイサト酸無水物、３−メチルイサト酸無水物、５−クロロイサト酸無水物、５−クロロイサト酸無水物、２−メチル−３−フロ酸イミダゾリド及び２−メチルニコチン酸イミダゾリドが挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＵｄｓＲＮＡとアルキル化又はアシル化剤とのモル比は、約１：３〜約１：３００の範囲である。いくつかの実施形態では、ＵｄｓＲＮＡとアルキル化又はアシル化剤とのモル比は、約１：３〜約１：１０、約１：１０〜約１：５０、約１：５０〜約１：１００又は約１：１００〜約１：２００の範囲である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、ＵｄｓＲＮＡをＮＭＩＡと反応させる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、ＵｄｓＲＮＡをＢｚＣＮと反応させる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、ＵｄｓＲＮＡをＦＤＮＢと反応させる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、ＵｄｓＲＮＡをＢｚＣＮと反応させる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＵｄｓＲＮＡに触媒が加えられ、次いでこれを、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、ＮＭＩＡ、ＢｚＣＮ又はＦＤＮＢと反応させる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、触媒は、ＮＭＩＡ、ＢｚＣＮ又はＦＤＮＢをＵｄｓＲＮＡに加えた後に、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、加えられる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＤＭＡＰは、ＮＭＩＡ又はＢｚＣＮをＵｄｓＲＮＡに加えた後、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、加えられる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、炭酸カリウムは、ＦＤＮＢをＵｄｓＲＮＡに加えた後、１５％〜９０％のジメチルスルホキシドを含む溶媒混合物中、４０℃〜７０℃の温度範囲で約３０分間、加えられる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、反応後、ＭｄｓＲＮＡを含む混合物を約２５℃に急速に冷却し、その後、水又は他の好適な溶媒を急速に加える。
【００６４】
いくつかの実施形態では、反応後、ＭｄｓＲＮＡを含む混合物を、３０分間を超える時間をかけて約２５℃に徐々に冷却し、その後、水又は他の好適な溶媒を、３０分間を超える時間をかけて加える。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡを構成する、化学的に誘導体化されたＲＮＡ分子を単離及び精製する。ＭｄｓＲＮＡは、場合により、沈殿、抽出、部分的に混和性の溶媒を用いた抽出、限外濾過吸着、当該技術分野で既知の他の方法、又はそれらの組み合わせによって単離精製され得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、水で希釈後のＭｄｓＲＮＡを含む約２５℃の混合物は、更に約４℃に冷却され、ＭｄｓＲＮＡを含む不溶性画分は、場合により、濾過、デカンテーション、部分的に混和性の溶媒を用いた抽出、遠心分離、限外濾過又はそれらの組み合わせによって回収される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、エタノール、メタノール又はアルコールの混合物で希釈後のＭｄｓＲＮＡを含む約２５℃の混合物は、更に約−２０℃に冷却され、ＭｄｓＲＮＡを含む不溶性画分は、場合により、濾過、デカンテーション、部分的に混和性の溶媒を用いた抽出、遠心分離、限外濾過又はそれらの組み合わせによって回収される。
【００６８】
ここにて本明細書に記載される方法は、例に記載されるものからの配列を修飾して、標的化宿主生物内の標的化遺伝子の配列を反映することによって、異なる宿主内の異なる遺伝子を標的とするように修飾することができる。従って、記載される例は、任意の所定の宿主細胞における特定の遺伝子を抑制するのに最高のＲＮＡｉ効果を得るためのツールと、そのようなＲＮＡｉトリガーを大量に生産するための手段とを当業者に提供する。
【００６９】
宿主生物における遺伝子の阻害に好適なＭｄｓＲＮＡ
本発明者らは、宿主生物における標的遺伝子の阻害に好適なＭｄｓＲＮＡの形成方法を記載し、該方法は：
ａ）宿主生物内でｍＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡを発現している標的遺伝子を特定することと、
ｂ）発現ＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＵｄｓＲＮＡを発現するための発現ベクターを作製することと、
ｃ）ＵｄｓＲＮＡ転写産物を生成することと、
ｄ）転写産物を転写後修飾して、ＭｄｓＲＮＡを生成することと、
ｅ）場合によりＭｄｓＲＮＡを精製することと、を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明者らは、宿主内で標的遺伝子の発現を阻害するための組成物の生成方法を記載し、該方法は：
ａ）標的遺伝子を選択することであって、標的遺伝子は、宿主内でＲＮＡを発現する、選択することと、
ｂ）発現ＲＮＡの配列の少なくとも一部分をコードするｄｓＲＮＡ転写産物を生成することと、
ｃ）ｄｓＲＮＡ転写産物を転写後に化学修飾して、標的遺伝子の発現を阻害することが可能なＭｄｓＲＮＡを形成することと、
ｄ）場合によりＭｄｓＲＮＡを精製することと、を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、宿主生物は、農業有害生物であり得る。農業有害生物は、非限定的に、農産物に対して、又は農産物の生産に対して、又は動物若しくはヒト集団に対して負の影響を有する、又は有する可能性がある動物、真菌又は植物であり得る。農業有害生物は、非限定的に、昆虫、真菌又は雑草あり得る。負の影響は、作物収穫高若しくは産物収穫高の低下、又は疾病の伝播若しくは蔓延、又は果物若しくは野菜のより低い品質であり得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、農業有害生物の成長又は繁殖に必要な遺伝子である。そのような必須遺伝子の例としては、非限定的に、脱皮又は他の幼虫発達事象の制御、アクチン又は他の細胞構造成分に関与する遺伝子、及び標的有害生物の生存能に必須の実質的に任意の遺伝子が挙げられる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターを使用して、ＲＮＡ転写産物を生成する。ＵｄｓＲＮＡを発現するための発現ベクターは、当該技術分野で周知である。発現ベクターは、センス配列及びアンチセンス配列、又はセンス配列及びアンチセンス配列の両方を有するＲＮＡを発現することができる。センス配列を発現するための発現ベクターは、高頻度で、相補的な又は対応するアンチセンス配列を発現するための発現ベクターと対にされる。いくつかの実施形態では、センス及びアンチセンスベクターは、別個に転写され、続いてＲＮＡ転写産物は、センス及びアンチセンス配列の塩基対合を可能にする条件下で組み合わされ得る。センス及びアンチセンス配列の両方を発現するための発現ベクターは、センス及びアンチセンス配列を含む別個の転写産物を発現することができる。いくつかの実施形態では、センス及びアンチセンス配列の両方を発現するための発現ベクターは、単一の転写産物上にセンス及びアンチセンス配列の両方を発現することができる。センス及びアンチセンス配列の両方を含む転写産物は、ヘアピン又はループ配列を含む。
【００７４】
センス及びアンチセンス配列に加えて、発現ベクターは、典型的には、プロモーター配列及びターミネーター配列を含む。発現ベクターはまた、追加の転写５’及び３’配列を含むことができる。発現ベクターはまた、所望のＲＮＡ内に転写されないが、クローニングを補助するのに使用される（例えば多重クローニング部位）又は複製（例えば、複製の開始点）、選択（アンピシリン耐性）若しくはファージパッケージングを促進する配列を含むことができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、センス配列は、アンチセンス配列に対して１００％未満、相補的であるように設計される。センス鎖は、挿入、欠失、ミスマッチ又は挿入、欠失若しくはミスマッチの組み合わせを有することができる。いくつかの実施形態では、センス配列は、５〜３３ヌクレオチド毎に追加のヌクレオチド（挿入）を含む。いくつかの実施形態では、センス配列は、５〜３３ヌクレオチド毎に追加のジヌクレオチド（挿入）を含む。いくつかの実施形態では、センス配列は、５〜３３ヌクレオチド毎に削除ヌクレオチド（欠失）を含む。いくつかの実施形態では、センス配列は、５〜３３ヌクレオチド毎にミスマッチ変異を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＵｄｓＲＮＡの生成に使用されるＤＮＡ配列が記載される。記載されるＤＮＡ配列は、異なる宿主動物、真菌又は植物が発現した標的遺伝子に基づいて、異なるアンチセンス配列をコードする。ＤＮＡ配列から生成されたＵｄｓＲＮＡは、修飾されてＭｄｓＲＮＡを形成する。次いで、ＭｄｓＲＮＡは精製され、宿主動物、真菌又は植物に供給又は適用されて、宿主における標的遺伝子の発現の低下がもたらされ得る。
【００７７】
他の標的遺伝子に対して相補性を有するアンチセンス配列をコードするＵｄｓＲＮＡを生成するためのＤＮＡ配列は、当該技術分野で利用可能な知識及び技術を用いて容易に生成される。
【００７８】
ＵｄｓＲＮＡの転写後修飾、及びＭｄｓＲＮＡの精製は、上記に記載した通りである。
【００７９】
記載されるような修飾及び使用のためのＵｄｓＲＮＡの形成は、当該技術分野で典型的な任意の手段により行うことができる。ＲＮＡ転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を生成する例示的な方法としては、非限定的に、インビトロ転写（Ｔｉｍｍｏｎｓ  ２００６）、古細菌、細菌、酵母、植物若しくは哺乳動物細胞内での発現を用いた発酵（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）及び／又は所望のポリヌクレオチドの転写と、バクテリオファージＱβ又はＭＳ２のもの等の自己集合バクテリオファージカプシドタンパク質の発現とのカップリング（米国特許第２０１６０２０８２２１号及び米国特許第２０１４０３０２５９３号）が挙げられる。作物保護用途に必要なＵｄｓＲＮＡの調製及び精製のための商業的に実現可能な大規模方法が記載されている（米国特許出願公開第２０１６０１７７２９９号）。次いで、ＵｄｓＲＮＡは、記載されるように化学修飾され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＭｄｓＲＮＡの大規模製造に使用することができる。いくつかの実施形態では、大規模製造とは、１グラムを超える量におけるものを意味する。いくつかの実施形態では、大規模製造とは、１キログラムを超える量におけるものを意味する。いくつかの実施形態では、大規模製造とは、１００キログラムを超える量におけるものを意味する。いくつかの実施形態では、大規模製造とは、１メートルトンを超える量におけるものを意味する。
【００８１】
農業／農薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明者らは、記載されるＭｄｓＲＮＡを含む組成物を記載する。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡ含有組成物は、農業用途用に配合される（農薬組成物）。
【００８２】
本明細書で使用されるとき、農薬組成物は、有効量の少なくとも１つのＭｄｓＲＮＡ及び場合により１つ以上の許容可能な担体又は賦形剤を含む。担体及び賦形剤は、安全性に関して適切に評価されており、組成物中に意図的に含められるＭｄｓＲＮＡ以外の物質である。賦形剤は、ａ）製造中のＭｄｓＲＮＡの加工を補助する、ｂ）ＭｄｓＲＮＡの安定性若しくはバイオアベイラビリティを保護し、支持し若しくは向上させる、ｃ）生成物の同定を補助する、及び／又はｄ）貯蔵若しくは使用中のＭｄｓＲＮＡの送達の全般的な安全性、有効性の任意の他の特質を向上させるように作用することができる。許容可能な担体又は賦形剤は、不活性物質であり得又はあり得ない。本明細書で使用されるとき、「有効量」は、意図される結果を生じるためのＭｄｓＲＮＡの量を指す。
【００８３】
担体及び賦形剤としては、非限定的に：吸収促進剤、抗付着剤（ａｎｔｉ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、結合剤、緩衝剤（ｐＨ調整剤）、キレート化剤、コーティング剤、着色剤、送達向上剤、デキストラン、右旋糖、希釈剤、錠剤崩壊剤、分散剤、乳化剤、増量剤、充填剤、泡制御剤、流動促進剤、保水剤、滑沢剤、油、色素、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖、界面活性剤、懸濁剤、徐放マトリクス、甘味剤、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤及び湿潤剤が挙げられる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は：除草剤、殺真菌剤、殺虫剤及び肥料を含む群から選択される１つ以上の薬剤を含む。
【００８５】
記載されるＭｄｓＲＮＡ及びＭｄｓＲＮＡを含む組成物は、このような材料を植物上に又は餌中に適用することを容易にするため、及び田畑内又は都市環境内で使用するために、当業者に既知の多数の異なる方法で加工され得る。本明細書に開示する、記載されるＭｄｓＲＮＡ及びＭｄｓＲＮＡを含む組成物は、キット、容器、パック又はディスペンサー内に包装又は収容され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、２つ以上の異なるＭｄｓＲＮＡを含む。ＭｄｓＲＮＡは、同じ標的遺伝子に相補的な異なるアンチセンス配列、同じ又は異なる宿主における異なる標的（ｔｒａｇｅｔ）遺伝子に相補的な異なるアンチセンス配列、異なる又は同様の長さ、及び異なる又は同様の転写後修飾を有することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、乳化可能な農業用濃縮物である。いくつかの実施形態では、乳化可能な農業用濃縮物は、非限定的に；担体、賦形剤、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、肥料又はそれらの組み合わせであり得る少なくとも１つの薬剤を更に含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、１つ以上の除草剤を含む。好適な除草剤の非限定的な例としては、非限定的に、イミダゾリノン、アセトクロール、アシフルオルフェン、アクロニフェン、アクロレイン、ＡＫＨ−７０８８、アラクロール、アロキシジム、アメトリン、アミドスルフロン、アミトロール、アンモニウムスルファメート、アニロホス、アシュラム、アトラジン、アザフェニジン、アジムスルフロン、ＢＡＳ  ６２０Ｈ、ＢＡＳ  ６５４  ００Ｈ、ＢＡＹ  ＦＯＥ  ５０４３、ベナゾリン、ベンフルラリン、ベンフレセート、ベンスルフロン−メチル、ベンスライド、ベンタゾン、ベンゾフェナップ、ビフェノックス、ビラナホス、ビスピリバック−ナトリウム、ブロマシル、ブロモブチド、ブロモフェノキシム、ブロモキシニル、ブタクロール、ブタミホス、ブトラリン、ブトロキシジム、ブチレート、カフェンストロール、カルベタミド、カルフェントラゾン−エチル、クロルメトキシフェン、クロラムベン、クロルブロムロン、クロリダゾン、クロリムロン−エチル、クロロ酢酸、クロロトルロン、クロルプロファム、クロルスルフロン、クロルタール−ジメチル、クロルチアミド、シンメチリン、シノスルフロン、クレトジム、クロジナホップ−プロパルギル、クロマゾン、クロメプロップ、クロピラリド、クロランスラム−メチル、シアナジン、シクロエート、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シハロホップ−ブチル、２，４−Ｄ、ダイムロン、ダラポン、ダゾメット、２，４ＤＢ、デスメジファム、デスメトリン、ジカンバ、ジクロベニル、ジクロルプロップ、ジクロルプロップ−Ｐ、ジクロホップ−メチル、ジフェンゾクアットメチルスルフェート、ジフルフェニカン、ジメフロン、ジメピペレート、ジメタクロル、ジメタメトリン、ジメテナミド、ジメチピン、ジメチルアルシン酸、ジニトラミン、ジノカップ、ジノテルブ、ジフェナミド、ジクアットジブロミド、ジチオピル、ジウロン、ＤＮＯＣ、ＥＰＴＣ、エスプロカルブ、エタルフルラリン、エタメツルフロン−メチル、エトフメセート、エトキシスルフロン、エトベンザニド、フェノキサプロップ−Ｐ−エチル、フェヌロン、硫酸第一鉄、フラムプロップ−Ｍ、フラザスルフロン、フルアジホップ−ブチル、フルアジホップ−Ｐ−ブチル、フルクロラリン、フルメツラム、フルミクロラク−ペンチル、フルミオキサジン、フルオメツロン、フルオログリコフェン−エチル、フルポキサム、フルプロパネート、フルピルスルフロン−メチル−ナトリウム、フルレノール、フルリドン、フルロクロリドン、フルロキシピル、フルルタモン、フルチアセト−メチル、ホメサフェン、フォサミン、グルホシネート−アンモニウム、グリホセート、グリホシネート、ハロスルフロン−メチル、ハロキシホップ、ＨＣ−２５２、ヘキサジノン、イマザメタベンズ−メチル、イマザモックス、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルロン、イミダジリノン、インダノファン、イノキシニル、イソプロツロン、イソウロン、イソキサベン、イソキサフルトール、ラクトフェン、レナシル、リヌロン、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＡ−チオエチル、ＭＣＰＢ、メコプロップ、メコプロップ−Ｐ、メフェナセット、メタミトロン、メタザクロル、メ��ベンズチアズロン、メチルアルソン酸、メチルジムロン、メチルイソチオシナネート、メトベンズロン、メトブロムロン、メトラクロル、メトスラム、メトクスロン、メトリブジン、メトスルフロン−メチル、モリネート、モノリニュロン、ナプロアニリド、ナプロパミド、ナプタラム、ネブロン、ニコスルフロン、ノナン酸、ノルフルラゾン、オレイン酸（脂肪酸）又はベンカルボリザリン（ｂｅｎｃａｒｂｏｒｙｚａｌｉｎ）、オキサジアルギル、オキサジアゾン、オキサスルフロン、オキシフロルフェン、パラクアットジクロリド、ペブレート、ペンジメタリン、ペンタクロロフェノール、ペンタノクロル、ペントキサゾン、石油、フェンメディファム、ピクロラム、ピペロホス、プレチラクロール、プリミスルフロン−メチル、プロジアミン、プロメトン、プロメトリン、プロパクロル、プロパニル、プロパキザホップ、プロパジン、プロファム、プロピソクロル、プロピザミド、プロスルホカルブ、プロスルフロン、ピラフルフェン−エチル、ピラゾリネート、ピラゾスルフロン−エチル、ピラゾキシフェン、ピリブチカルブ、ピリデート、ピリミノバック−メチル、ピリチオバック−ナトリウム、キンクロラク、キンメラク、キノクラミン、キザロホップ、キザロホップ−Ｐ、リムスルフロン、セトキシジム、シズロン、シマジン、シメトリン、塩素酸ナトリウム、ＳＴＳ系（スルホニルウレア）、スルコトリオン、スルフェントラゾン、スルホメツロン−メチル、スルホスルフロン、硫酸、タール油、２，３，６−ＴＢＡ、ＴＣＡ−ナトリウム、テブタム、テブチウロン、テルバシル、テルブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、ニルクロル、チアゾピル、チフェンスルフロン−メチル、チオベンカルブ、チオカルバジル、トラルコキシジム、トリ−アラート、トリアスルフロン、トリアジフラム、トリベヌロン−メチル、トリクロピル、トリエタジン、トリフルラリン、トリフルスルフロン−メチル、ベルノレート及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、１つ以上の殺真菌剤を含む。好適な殺真菌剤としては、非限定的に、３，３’−エチレンビス（テトラヒドロ−４，６−ジメチル−２Ｈ−１，３，５−チアジアジン−２−チオン）、亜鉛又はマンガンエチレンビス（ジチオカルバメート）、ビス（ジメチルジチオカルバモイル）ジスルフィド、亜鉛プロピレン−ビス−（ジチオカルバメート）、ビス（ジメチルジチオカルバモイル）エチレンジアミン、ニッケルジメチル−ジチオカルバメート、メチル１−（ブチルカルバモイル）−２−ベンゾイミダゾールカルバメート、１，２−ビス（３−メトキシカルボニル−２−チオウレイド）ベンゼン、１−イソプロピルカルバモイル−３−（３，５−ジクロロフェニル）−ヒダントイン、カリウムＮ−ヒドロキシメチル−Ｎ−メチルジチオカルバメート及び５−メチル−１０−ブトキシカルボニルアミノ−１０，１１−デヒドロジベンゾ（ｂ，ｆ）アゼピン等のカルバミン酸塩殺真菌剤；亜鉛ビス（１−ヒドロキシ−２（１Ｈ）ピリジンチオネート）及び２−ピリジンチオール−１−オキシドナトリウム塩等のピリジン殺真菌剤；Ｏ，Ｏ−ジイソプロピルエチルアミンＳ−ベンジルホスホロチオエート及びＯ−エチルＳ，Ｓ−ジフェニルジチオホスフェート等のリン殺真菌剤；Ｎ−（２，６−ジエチルフェニル）フタルイミド及びＮ−（２，６−ジエチルフェニル）−４−メチルフタルイミド等のフタルイミド殺真菌剤；Ｎ−トリクロロメチルチオ−４−シクロキセン−１，２−ジカルボキシイミド及びＮ−テトラクロロエチルチオ−４−シクロキセン−１，２−ジカルボキシイミド等のジカルボキシイミド殺真菌剤；５，６−ジヒドロ−２−メチル−１，４−オキサチン−３−カルボキサニリド−４，４−ジオキシド及び５，６−ジヒドロ−２−メチル−１，４−オキサチン−３−カルボキサニリド等のオキサチン殺真菌剤；２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、２−オキシ−３−クロロ−１，４−ナフトキノン銅硫酸塩等のナフトキノン殺真菌剤；ペンタクロロニトロベンゼン；１，４−ジクロロ−２，５−ジメトキシベンゼン；５−メチル−ｓ−トリアゾール（３，４−ｂ）ベンゾチアゾール；２−（チオシアノメチルチオ）ベンゾチアゾール；３−ヒドロキシ−５−メチルイソオキサゾール；Ｎ−２，３−ジクロロフェニルテトラクロロフタルアミド酸；５−エトキシ−３−トリクロロメチル−１−２，４−チアジアゾール；２，４−ジクロロ−６−（Ｏ−クロロアニリノ）−１，３，５−トリアジン；２，３−ジシアノ−１，４−ジチオ−アントラキノン；銅８−キノリネート、ポリオキシン；バリダマイシン；シクロヘキシミド；メタンアルソン酸鉄；ジイソプロピルエチルアミン−１，３−ジチオラン−２−イリデンマロネート；３−アリルオキシ−１，２−ベンゾイソチアゾール−１，１−ジオキシド；カスガマイシン；ブラストサイジンＳ；４，５，６，７−テトラ−クロロフタリド；３−（３，５−ジクロロフェニル）−５−エテニル−５−メチルオキサゾリジン−２，４−ジオン；Ｎ−（３，５−ジクロロフェニル）−１，２−ジメチルシクロプロパン−１，２−ジカルボキシイミド；Ｓ−ｎ−ブチル−５’−パラ−ｔ−ブチルベンジル−Ｎ−３−ピリジルジチオカルボニルイミデート；４−クロロフェノキシ−３，３−ジメチル−１−（１Ｈ，１，３，４−トリアゾール−１−イル）−２−ブタノン；メチル−Ｄ，Ｌ−Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−Ｎ−（２’−メトキシアセチル）アラニネート；Ｎ−プロピル−Ｎ−［２−（２，４，６−トリクロロフェノキシ）エチル］ホスホロ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−１−カルボキサミド；Ｎ−（３，５−ジクロロフェニル）−スクシンイミド；テトラクロロイソフタロニトリル；２−ジメチルアミノ−４−メチル−５−ｎ−ブチル−６−ヒドロキシピリジミン；２，６−ジクロロ−４−ニトロアニリン；３−メチル−４−クロロベンゾチアゾール−２−オン；１，２，５，６−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２，１−Ｉ，ｊ］ホスホロ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−２−オン；３’−イソプロポキシ−２−メチル−ベンズアニリド；１−［２−（２，４−ジクロロフェニル）−４−エチル−１，３−ジオキソラン−２−イルメチル］−１Ｈ，１，２，４−トリアゾール；１，２−ベンゾイソチアゾリン−３−オン；塩基性塩化銅；塩基性硫酸銅；Ｎ’−ジクロロフルオロメチルチオ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−フェニルスルファミド；エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノ−プロピル）チオカルバメート塩酸塩；ピオマイシン（ｐｉｏｍｙｃｉｎ）；Ｓ，Ｓ−６−メチルキノキサリン−２，３−ジイルジチオ−カーボネート；亜鉛及びマンネブ（ｍａｎｎｅｂ）の複合体；ジ−亜鉛ビス（ジメチルジチオカルバメート）エチレンビス（ジチオカルバメート）及びグリホセート；クロロタロニル系殺真菌剤、アゾキシストロビン、ピラクロストロビン及びトリフロキシストロビン等のストロビルリン系殺真菌剤；並びにミクロブタニル、プロピコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール等のトリアゾール系殺真菌剤、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、１つ以上の殺虫剤を含む。好適な殺虫剤としては、非限定的に、Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−（２−イソプロピル−４−メチル−６−ピリミジニル）ホスホロチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−２−［（エチルチオ）エチル］ホスホロジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＯ−（３−メチル−４−ニトロフェニル）−チオホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−（Ｎ−メチルカルバモイルメチル）−ホスホロジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−（Ｎ−メチル−Ｎ−ホルミルカルバモイルメチル）ホスホロ−ジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−２−［（エチルチオ）エチル］ホスホロジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジエチルＳ−２−［（エチルチオ）エチル］ホスホロジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチル−１−ヒドロキシ−２，２，２−トリクロロエチルホスホネート、Ｏ，Ｏ−ジエチル−Ｏ−（５−フェニル−３−イソオキサゾリル）ホスホロチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＯ−（２，５−ジクロロ−４−ブロモフェニル）ホスホロチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＯ−（３−メチル−４−メチルメルカプトフェニル）−チオホスフェート、Ｏ−エチルＯ−ｐ−シアノフェニルフェニル−ホスホロチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｓ−（１，２−ジカルボエトキシエチル）ホスホロジチオエート、２−クロロ−（２，４，５−トリクロロフェニル）ビニルジメチルホスフェート、２−クロロ−１−（２，４−ジクロロフェニル）−ビニルジメチルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＯ−ｐ−シアノフェニルホスホロチオエート、２，２−ジクロロビニルジメチルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−２，４−ジクロロフェニルホスホロチオエート、エチルメルカプトフェニルアセテートＯ，Ｏ−ジメチルホスホロ−ジチオエート、Ｓ−［（６−クロロ−２−オキソ−３−ベンゾオキサゾリニル）メチル］Ｏ，Ｏ−ジエチルホスホロジチオエート、２−クロロ−１−（２，４−ジクロロフェニル）ビニルジエチルホスフェート、Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−（３−オキソ−２−フェニル−２Ｈ−ピリダジン−６−イル）ホスホロチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−（１−メチル−２−エチルスルフィニル）−エチルホスホロチオレート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−フタルイミドメチルホスホロジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジエチルＳ−（Ｎ−エトキシカルボニル−Ｎ−メチルカルバモイルメチル）ホスホロジチオエート、Ｏ，Ｏ−ジメチルＳ−［２−メトキシ−１，３，４−チアジアゾール−５−（４Ｈ）−Ｉ−（４）−メチル］ジチオホスフェート、２−メトキシ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾオキサホスホリン２−スルフィド、Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−（３，５，６−トリクロロ−２−ピリジル）ホスホロチエート、Ｏ−エチルＯ−２，４−ジクロロフェニルチオノベンゼンホスホネート、Ｓ−［４，６−ジアミノ−ｓ−トリアジン−２−イル−メチル］Ｏ，Ｏ−ジメチルホスホロジチオエート、Ｏ−エチルＯ−ｐ−ニトロフェニルフェニルホスホロチオエート、Ｏ，Ｓ−ジメチルＮ−アセチルホスホロアミドチオエート、２−ジエチルアミノ−６−メチルピリジミン−４−イル−ジエチルホスホロチオネート、２−ジエチルアミノ−６−メチルピリジミン−４−イル−ジメチルホスホロチオネート、Ｏ，Ｏ−ジエチルＯ−Ｎ−（メチルスルフィニル）フェニルホスホロ−チオエート、Ｏ−エチルＳ−プロピルＯ−２，４−ジクロロフェニルホスホロジチオエート及びｃｉｓ−３−（ジメトキシホスフィノキシ）Ｎ−メチル−ｃｉｓ−クロトンアミド等のリン酸殺虫剤；１−ナフチルＮ−メチルカルバメート、Ｓ−メチルＮ−［メチルカルバモイルオキシ］チオアセトイミデート、ｍ−トリルメチルカルバメート、３，４−キシリルメチルカルバメート、３，５−キシリルメチルカルバメート、２−ｓｅｃ−ブチルフェニルＮ−メチルカルバメート、２，３−ジヒドロ−２，２−ジメチル−７−ベンゾフラニルメチル−カルバミン酸塩、２−イソプロポキシフェニルＮ−メチルカルバメート、１，３−ビス（カルバモイルチオ）−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロパン塩酸塩及び２−ジエチルアミノ−６−メチルピリジミン−４−イル−ジメチルカルバメート等のカルバミン酸塩殺虫剤；並びにＮ，Ｎ−ジメチルＮ’−（２−メチル−４−クロロフェニル）ホルムアミジン塩酸塩、硫酸ニコチン、ミルベマイシン、６−メチル−２，３−キノキサリンジチオ環状Ｓ，Ｓ−ジチオカーボネート、２，４−ジニトロ−６−ｓｅｃ−ブチルフェニルジメチル−アクリレート、１，１−ビス（ｐ−クロロフェニル）２，２，２−トリクロロエタノール、２−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシ）イソプロピル−２’−クロロエチルスルファイト、アゾキシベンゼン、ジ−（ｐ−クロロフェニル）−シクロプロピルカルビノール、ジ［トリ（２，２−ジメチル−２−フェニルエチル）スズ］オキシド、１−（４−クロロフェニル）−３−（２，６−ジフルオロベンゾイル）ウレア、Ｓ−トリシクロヘキシルスズＯ，Ｏ−ジイソプロピルホスホロジチオエート等の他の殺虫剤、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、１つ以上の肥料を含む。多様な肥料が組成物中に含ませるのに好適である。肥料は、単一栄養素肥料（Ｎ、Ｐ又はＫ）、二成分肥料（例えばＮＰ、ＮＫ又はＰＫ）、ＮＰＫ肥料又は多栄養素肥料（例えば、カルシウム、マグネシウム、硫黄、銅、鉄、マンガン、モリブデン、亜鉛、ホウ素、ケイ素、コバルト又はバナジウムの１つ以上を提供することができる）であり得る。肥料は、天然起源又は合成起源のものであり得る。肥料は、液体又は固体であってもよく、遅延又は制御放出を提供してもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、組成物中に５０重量％未満、含まれる。いくつかの実施形態では、農業組成物中のＭｄｓＲＮＡの量は、組成物の５重量％未満である。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、約１重量％未満、約０．９重量％未満、約０．８重量％未満、約０．７重量％未満、約０．６重量％未満、約０．５重量％未満、約０．４重量％未満、約０．３重量％未満、約０．２重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０１重量％未満又は約０．００１重量％未満の量で組成物中に存在する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、液体として配合される。液体製剤は、下記に記載される重量割合で、ＭｄｓＲＮＡ及び他の薬剤を全成分の溶解が達成されるまで液体中で混合することにより調製され得る。液体は、水性、イオン性又は有機液体であり得る。好適な液体としては、非限定的に、水、アルコール（例えば、メタノール及びエタノール）、ケトン（例えば、アセトン、メチルエチルケトン及びシクロヘキサノン）、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン及びメチルナフタレン）、脂肪族炭化水素（例えば、ヘキサン及びケロシン）、エステル（例えば、酢酸エチル及び酢酸ブチル）、ニトリル（例えば、アセトニトリル及びイソブチロニトリル）、エーテル（例えば、ジオキサン及びジイソプロピルエーテル）、酸アミド（例えば、ジメチルホルムアミド及びジメチルアセトアミド）及びハロゲン化炭化水素（例えば、ジクロロエタン、トリクロロエチレン及び四塩化炭素）が挙げられる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、液体製剤は、水性製剤である。いくつかの実施形態では、水性製剤は、水、ＭｄｓＲＮＡ及び他の薬剤のみを含む。いくつかの実施形態では、追加の化合物、溶媒又は補助剤が水性製剤に提供される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、粉末又は細粉として配合される。粉末又は細粉は、粉末又は細粉を作物に直接適用する（即ち、作物への散布により）のに好適であるよう顆粒化されてもよく、又は水等の溶媒に最終的に溶解されるために顆粒化されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、凍結乾燥物である。典型的には、ＭｄｓＲＮＡ及び他の薬剤は、一緒に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭｄｓＲＮＡ及び他の薬剤は、別々に凍結乾燥され得る。
【００９６】
多様な好適な固体及びガス状担体が、組成物中に使用され得る。好適な固体担体としては、非限定的に、粘土（例えば、カオリン粘土、珪藻土、合成水和二酸化ケイ素、アタパルジャイト粘土、ベントナイト及び酸粘土）、タルク、増量剤、無機鉱物（例えば絹雲母、粉末化石英、粉末化硫黄、活性炭、炭酸カルシウム及び水和シリカ）の微粉末又は顆粒、及び化学肥料用の塩（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、ウレア及び塩化アンモニウム）が挙げられる。好適なガス状担体としては、例えば、ブタンガス、二酸化炭素及びフルオロカーボンガスが挙げられる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は分散剤を含む。分散剤の例としては、非限定的にメチルセルロース、ポリビニルアルコール、リグニン硫酸ナトリウム、高分子アルキルナフタレンスルホネート、ナトリウムナフタレンスルホネート、ポリメチレンビスナフタレンスルホネート、中性化ポリオキシエチル化誘導体及び環置換アルキルフェノールホスフェートが挙げられる。安定剤を使用して安定なエマルションを生成することもできる。例示的な安定剤としては、非限定的にケイ酸マグネシウムアルミニウム及びキサンタンゴムが挙げられる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、スプレーとしてエアロゾルの形態で配合される。エアロゾルスプレーとして配合される場合、組成物は一般に噴射剤と共に圧力下で容器に入れられる。好適な噴射剤の例としては、フルオロトリクロロメタン及びジクロロジフルオロメタンが挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、農薬組成物は、種子を含む。いくつかの実施形態では、農薬組成物は、抗真菌薬ＭｄｓＲＮＡ及び種子を含む。いくつかの実施形態では、農薬組成物は、ＭｄｓＲＮＡ、種子を含み、更に殺真菌剤を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、殺真菌性組成物（殺真菌剤を含む農薬組成物）中のＭｄｓＲＮＡの量は、殺真菌性組成物の約５重量％未満、約１重量％未満、約０．９重量％未満、約０．８重量％未満、約０．７重量％未満、約０．６重量％未満、約０．５重量％未満、約０．４重量％未満、約０．３重量％未満、約０．２重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０５重量％未満、約０．０１重量％未満又は約０．００１重量％未満である。殺真菌性組成物の重量は、種子の重量を含まない。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、殺真菌性組成物は、種皮中に存在し、又は種子の内部に存在する。いくつかの実施形態では、殺真菌性組成物は、該組成物が種子の外面を完全に又は部分的に覆うように種子上に形成される。種子を被覆する方法は、当該技術分野にて既知である。
【０１０２】
農業有害生物の制御方法
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡ又はＭｄｓＲＮＡを含む組成物を使用して農業有害生物を制御し又は農業有害生物侵入を処置する。ＭｄｓＲＮＡは、有害生物に、又は有害生物により占められる範囲に、又は有害生物の食物源に投与され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、有害生物を処置又は制御するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、有害生物は、動物、真菌又は雑草である。本方法は、１つ以上の記載されるＭｄｓＲＮＡを含む組成物を、処理するべき範囲に適用することを含む。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡは、５重量％未満の量で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、表面に直接適用される。いくつかの実施形態では、表面は、その上で標的化動物又は真菌有害生物が給餌される植物表面である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、標的宿主内の標的遺伝子の遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、ＭｄｓＲＮＡ又はＭｄｓＲＮＡ含有組成物の適用後、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％低減される。いくつかの実施形態では、農業有害生物の死亡率は、ＭｄｓＲＮＡ又はＭｄｓＲＮＡ含有組成物の適用後、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％増大する。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、有害生物の制御とは、ＭｄｓＲＮＡによる処置の非存在下で測定された作物損害、収穫高罹患率、成長、食欲、摂取又は繁殖の低下と比較して、作物損害、若しくは有害生物を原因とする収穫高の低下を低減し、又は有害生物の罹患率を増大させ、有害生物の成長若しくは食欲若しくは摂取を阻害し、又は有害生物の繁殖を遅延させることを意味する。
【０１０６】
作物用途
いくつかの実施形態では、本発明者らは、雑草以外の標的植物における標的遺伝子の発現を低減する方法を記載し、該方法は、記載されるＭｄｓＲＮＡの１つ以上を含む組成物を植物に適用することを含む。いくつかの実施形態では、植物は、作物植物である。作物植物は、植物、利益又は生存のために成長及び収穫され得る植物である。作物植物は、非限定的に、食物植物、園芸植物、花卉園芸植物又は工業用植物であり得る。いくつかの実施形態では、植物は、栽培植物である。植物は、研究室、温室、苗畑、田畑、果樹園又は他の農業環境、庭園又は他の天然若しくは都市環境内に存在し得る。いくつかの実施形態では、標的植物は、特定の状況又は位置に望ましいと見なされる植物である。
【０１０７】
昆虫侵入
いくつかの実施形態では、動物は、昆虫である。いくつかの実施形態では、昆虫は、鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）である。鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）は、非限定的に、キクイムシ、ニレハムシ、ツヤハダゴマダラカミキリ、シバンムシ、アメリカマツノキクイムシ、キムネクロナガハムシ又はコロラドハムシであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）である。鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）は、非限定的に、ヨトウムシ、コーンイヤーワーム、モンシロチョウ又はコットンボールワームであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）である。膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）は、非限定的に、カミアリ、アルゼンチンアリ、オオアリ、ハキリアリ、サスライアリ、ウィートステムソーフライ（ｗｈｅａｔ  ｓｔｅｍ  ｓａｗｆｌｙ）、カラマツハラアカハバチ、マツハバチ又はトコジラミであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）である。双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）は、ハエ、蚊、ブヨ又は潜葉性昆虫であり得るがこれに限定される。いくつかの実施形態では、昆虫は、半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）である。半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）は、非限定的に、アブラムシ、ヨコバイ、害虫（ｂｕｇ）、コナジラミ、コナカイガラムシ又はノミであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、西洋トウモロコシルートワームである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、昆虫は、１つ以上の従来の既知の殺虫剤に対する耐性を有する昆虫である。いくつかの実施形態では、ヒアリ等の昆虫は、生物多様性に対して負の影響（Ｗｏｊｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１及び／又は殺虫剤に対する耐性（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）を有する可能性がある。いくつかの実施形態では、蚊等の昆虫は、非限定的に：マラリア、デング熱、ジカ熱及びチクングニア熱等の疾病の媒介物として、ヒトの健康に影響を与える可能性がある（Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。いくつかの実施形態では、ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）等の昆虫は、カンキツグリーニング病の媒介物である（Ｔｉｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【０１０９】
鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａｎ）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）及び半翅類（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）昆虫有害生物は、直接注入により又はｓｉＲＮＡ前駆体で処理した植物物質上の給餌により導入されるＲＮＡｉに感受性であることが既知である。ネイキッドＲＮＡの田畑適用は、一般に、環境特異的及び非特異的分解に対するＲＮＡの感受性に起因して実用的ではない（Ｂａｕｍ  ２０１６）。更に、ＲＮＡは、給餌の過程中、及び昆虫の腸内の通過中に分解を非常に受けやすい。例えば、一般的には、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）は鞘翅類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ〉よりも遥かに激しくＲＮＡを分解するように思われ、このことはＲＮＡｉ媒介による制御方法に対するそれらの比較的乏しい感受性の原因であり得る。記載されるＭｄｓＲＮＡの安定性は、ＲＮＡｉ経路へ送達される前にＭｄｓＲＮＡを宿主ヌクレアーゼから保護し、非特異的環境分解を制限する役割を果たす。にもかかわらず、記載されるＭｄｓＲＮＡは、環境面での安全を考慮するように十分に生分解性である。
【０１１０】
１つ以上のＭｄｓＲＮＡを含む組成物は、昆虫感染を予防するために、感染に先立って植物に適用することができる。組成物はまた、昆虫感染を処置するために、感染の徴候の出現後に適用されてもよい。組成物は、処置される植物部分に応じて多様な方法で適用することができる。例として、組成物は、種子の昆虫感染を予防するために、種まきの前に植物種子に適用することができる。組成物は、新たに種まきした種子の昆虫侵入を防止するために、種まきの時又は種まきの直前に土壌に適用することができる（即ち、発芽前として）。いくつかの実施形態では、組成物は、昆虫侵入の処置又は予防のいずれかのために、植物の発芽後に植物に、又は、発芽後に植物の葉に適用することができる（即ち、発芽後として）。例示的な実施形態では、適用は発芽期、実生成長期、栄養成長期及び生殖成長期中に行われる。いくつかの実施形態では、適用は、栄養成長期及び生殖成長期中に行われる。
【０１１１】
発芽前種子への組成物の適用は、フィルムコーティング、ペレット化、カプセル化、ドラムコーティング及び流動床コーティング等の様々な種子被覆技術を含むことができる。発芽後植物への適用は、噴霧又は農薬散布技術を含むことができる。
【０１１２】
有効量の組成物は、当該技術分野で一般に既知のいくつかの方法によって、植物又は種子に適用することができる。当業者が認識するように、「有効量」を含む組成物の量は、植物及びその生成段階、真菌標的、並びに環境条件に応じて様々であり得、及び様々であろう。一般的に言えば、典型的な適用の場合、植物又はその子孫は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０重量％の活性成分の濃度を提供するのに十分な組成物の量で処置される。本方法は、植物又はその子孫に対する組成物の１回を超える適用を含むことが想定される。例えば、適用回数は、約１〜約５回以上の範囲であり得る。本明細書に詳細に記載される適用は、植物の生活環の同じ又は異なる段階で行われ得る。
【０１１３】
真菌感染
いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡを使用して真菌感染を処置又は予防する。いくつかの実施形態では、真菌は、非限定的に、ベンチュリア属（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）、ポドスフェラ属（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）、エリシフェ属（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）、モノリニア属（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ）、ミコスフェレラ属（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）、ウンシヌラ属（Ｕｎｃｉｎｕｌａ）；担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）、ヘミレイア属（Ｈｅｍｉｌｅｉａ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、プッチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）、不完全菌（Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）、ボトリティス属（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リンコスポリウム属（Ｒｈｙｎｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）、セルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、ピリクラリア属（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、シュードセルコスポレラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）、卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅ  ｆｕｎｇｉ）、フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）、ペロノスポラ属（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）、ブレミア属（Ｂｒｅｍｉａ）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、プラスモパラ属（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）、ダイズさび病菌（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  Ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）、Ｐ・メイボミアエ（Ｐ．ｍｅｉｂｏｍｉａｅ）、スクレロフトラ・マクロスポラ（Ｓｃｌｅｒｏｐｔｈｏｒａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）、スクレロフトラ・レイイシエ（Ｓｃｌｅｒｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｙｉｓｓｉａｅ）、スクレロスポラ・グラミニコラ（Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ペロノスクレロスポラ・ソルギ（Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓｏｒｇｈｉ）、ペロノスクレロスポラ・フィリピネシス（Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ）、ペロノスクレロスポラ・サッカリ（Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｓａｃｃｈａｒｉ）ペロノスクレロスポラ・メイディス（Ｐｅｒｏｎｏｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ  ｍａｙｄｉｓ）、フィソペラ・ゼアエ（Ｐｈｙｓｏｐｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、セルコスポラ・ゼアエ−メイディス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ）、コレトトリチャム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）、ボタンタケ目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、エクセロヒルム・ツルキクム（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、カバティエル・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌｕ  ｚｅａｅ）、ビポラリス・メイディス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）、ギベレラ・アベナセア（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ａｖｅｎａｃｅａ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）又はフサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）であり���る。いくつかの実施形態では、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）の処理は、マイコトキシンの産生、脱メチル化阻害剤（ＤＭＩ）に基づく殺真菌剤に対する耐性の出現の危険性、又はテブコナゾールのような従来のＤＭＩに関する発癌性の懸念を低減することができる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、記載される農薬組成物は、真菌感染を予防するために、感染に先立って植物に適用することができる。いくつかの実施形態では、記載される農薬組成物は、真菌感染を処置するために、感染の徴候の出現後に植物に適用されてもよい。組成物は、処置される植物部分に応じて多様な方法で適用することができる。例として、組成物は、種子の真菌感染を予防するために、種まきの前に植物種子に適用することができる。組成物は、新たに種まきした種子の微生物侵入を防止するために、種まきの時又は種まきの直前に土壌に適用することができる（即ち、発芽前として）。いくつかの実施形態では、組成物は、微生物侵入の処置又は予防のいずれかのために、植物の発芽後に植物に、又は、発芽後に植物の葉に適用することができる（即ち、発芽後として）。例示的な実施形態では、適用は発芽期、実生成長期、栄養成長期及び生殖成長期中に行われる。より典型的には、適用は、栄養成長期及び生殖成長期中に行われる。
【０１１５】
発芽前種子への組成物の適用は、フィルムコーティング、ペレット化、カプセル化、ドラムコーティング及び流動床コーティング等の様々な種子被覆技術を含むことができる。発芽後植物への適用は、噴霧又は農薬散布技術を含むことができる。
【０１１６】
有効量の組成物は、当該技術分野で一般に既知のいくつかの方法によって、植物又は種子に適用することができる。当業者が認識するように、「有効量」を含む組成物の量は、植物及びその生成段階、真菌標的並びに環境条件に応じて様々であり得、及び様々であろう。一般的に言えば、典型的な適用の場合、植物又はその子孫は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０重量％の活性成分の濃度を提供するのに十分な組成物の量で処置される。本方法は、植物又はその子孫に対する組成物の１回を超える適用を含むことが想定される。例えば、適用回数は、約１〜約５回以上の範囲であり得る。本明細書に詳細に記載される適用は、植物の生活環の同じ又は異なる段階で行われ得る。
【０１１７】
定義
本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチド以外のリボヌクレオチド（２’−ヒドロキシルヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡにおけるヌクレオチドの少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が、合成後修飾されている。修飾ヌクレオチドは、非限定的に、リボース２’−ＯＨ置換を有するヌクレオチドを含む。
【０１１８】
転写ＲＮＡは、無細胞転写システム、古細菌、細菌若しくは真核生物細胞、又は古細菌、細菌若しくは真核生物細胞抽出物により、ＤＮＡ配列又はベクターから転写されたＲＮＡ分子である。
【０１１９】
非修飾ｄｓＲＮＡは、化学修飾されていないＲＮＡ分子である。
【０１２０】
遺伝子発現を阻害、下方調節又はノックダウンすることは、遺伝子から転写されたＲＮＡのレベル、又はＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベルにより測定して、遺伝子の発現が、ＭｄｓＲＮＡの非存在下で観察されるものを下回って低減されることを意味する。いくつかの実施形態では、ＭｄｓＲＮＡによる遺伝子発現の阻害、下方調節又はノックダウンは、対照の活性核酸又はスクランブル配列若しくは不活性化ミスマッチを有する核酸の存在下で観察されるレベルを下回る。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「配列」又は「ヌクレオチド配列」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用した文字の連続で記載され、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドに重要な、核酸塩基、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシドの連続又は順序を指す。
【０１２２】
本明細書で使用される用語「アシル」は、単独で又は他の基の一部として、有機カルボン酸の基ＣＯＯＨからのヒドロキシル基の除去により形成される部分、例えばＲＣ（Ｏ）−を示し、Ｒは、Ｒ1、Ｒ1Ｏ−、Ｒ1Ｒ2Ｎ−又はＲ1Ｓ−であり、Ｒ1は、ヒドロカルビル、ヘテロ置換ヒドロカルビル又はヘテロシクロであり、Ｒ2は、水素、ヒドロカルビル又は置換ヒドロカルビルである。
【０１２３】
本明細書で使用される用語「アシルオキシ」は、単独で又は他の基の一部として、酸素結合（Ｏ）を介して結合した上記に記載したアシル基、例えばＲＣ（Ｏ）Ｏ−を示し、Ｒは、用語「アシル」に関連して定義した通りである。
【０１２４】
本明細書で使用される用語「アリル」は、単純なアリル基（ＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ2−）を含む化合物だけではなく、置換アリル基、又は環系の一部を形成するアリル基を含む化合物も指す。
【０１２５】
本明細書で使用される用語「アルキル」又は「アルキル基」は、任意の炭素原子から水素原子を除去することにより、アルカンから誘導される一価基、−ＣnＨ2n+1を記載する。アルキル基は、直鎖又は分枝鎖又は環状であり得、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ヘキシル等を含む。本明細書で使用されるとき、低級アルキル基は、主鎖中に１〜８個の炭素原子を含み、２０個までの炭素原子を含む。
【０１２６】
本明細書で使用される用語「アルケニル」は、１つの炭素−炭素二重結合を有し、一般式−ＣnＨ2n-1を有する非環式分枝状又は非分枝状炭化水素である。水素原子の１つ以上は、置換されていてもよい。アルキル基は、直鎖又は分枝鎖であり得、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ヘキセニル等を含む。本明細書で使用されるとき、アルケニルは、主鎖中に２〜８個の炭素原子を含み、２０個までの炭素原子を含む。
【０１２７】
本明細書で使用される用語「アルコキシド」又は「アルコキシ」は、アルコールのコンジュゲート基部である。アルコールは、直鎖、分枝状、環式であり得、アリールオキシ化合物を含む。
【０１２８】
本明細書で使用される用語「アルキニル」は、炭素−炭素三重結合及び一般式−ＣnＨ2n-3を有する非環式分枝状又は非分枝状炭化水素である。それらは、直鎖又は分枝鎖であり得、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル、ヘキシニル等を含む。本明細書で使用されるとき、主鎖中の２〜８個の炭素原子及び２０個までの炭素原子を含む低級アルキニル。
【０１２９】
本明細書で使用される用語「芳香族」は、単独で又は他の基の一部として、場合により置換された、非局在化電子を含む平面状のホモ−又はヘテロ環式共役環又は環系を示す。芳香族基は、環部分に５〜１４個の原子を含む単環式（例えばフラン又はベンゼン）、二環式又は三環式基であり得る。用語「芳香族」は、以下に定義する「アリール」基を包含する。
【０１３０】
本明細書で使用される用語「アリール」又は「Ａｒ」は、単独で又は他の基の一部として、場合により置換されたホモ環式芳香族基を示す。アリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ビフェニル又は置換ナフチル等の、環部分に６〜１０個の炭素を含む単環式又は二環式基であり得る。
【０１３１】
本明細書で使用される用語「カルボシクロ」又は「炭素環式」は、単独で又は他の基の一部として、環の原子の全部が炭素である、場合により置換された、芳香族又は非芳香族のホモ環式環又は環系を示す。いくつかの実施形態では、カルボシクロ」又は「炭素環式」基は、各環に５又は６個の炭素原子を含む。例示的な置換基としては、以下の基の１つ以上が挙げられる：ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アルキル、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケノキシ、アリール、アリールオキシ、アミノ、アミド、アセタール、カルバミル、カルボシクロ、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシル、ケト、ケタール、ホスホロ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、ニトロ及びチオ。
【０１３２】
本明細書で使用される用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、単独で又は他の基の一部として、塩素、臭素、フッ素及びヨウ素を指す。
【０１３３】
用語「ヘテロ原子」は、炭素及び水素以外の原子を指す。
【０１３４】
本明細書で使用される用語「ヘテロ芳香族」は、単独で又は他の基の一部として、少なくとも１つの環に少なくとも１つのヘテロ原子を有する、場合により置換された芳香族基を示す。いくつかの実施形態では、ヘテロ芳香族基は、各環に５又は６個の原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ芳香族基は、環に１又は２個の酸素原子及び／又は１〜４個の窒素原子を含み、炭素を介して分子の残りの部分に結合している。例示的な基としては、フリル、ベンゾフリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾニル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル、カルバゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、イミダゾピリジル等が挙げられる。例示的な置換基としては、以下の基の１つ以上が挙げられる：ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アルキル、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケノキシ、アリール、アリールオキシ、アミノ、アミド、アセタール、カルバミル、カルボシクロ、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシル、ケト、ケタール、ホスホロ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、ニトロ及びチオ。
【０１３５】
本明細書で使用される用語「ヘテロシクロ」又は「複素環式」は、単独で又は他の基の一部として、少なくとも１つの環に少なくとも１つのヘテロ原子を有する、場合により置換された、完全飽和又は不飽和の、単環式又は二環式の芳香族又は非芳香族基を示す。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロ又は複素環式基は、各環に５又は６個の原子を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロ基は、環に１又は２個の酸素原子及び／又は１〜４個の窒素原子を有し、炭素又はヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合している。例示的なヘテロシクロ基は、上記に記載したヘテロ芳香族を含む。例示的な置換基としては、以下の基の１つ以上が挙げられる：ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アルキル、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケノキシ、アリール、アリールオキシ、アミノ、アミド、アセタール、カルバミル、カルボシクロ、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシル、ケト、ケタール、ホスホロ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）、ニトロ及びチオ。
【０１３６】
本明細書で使用される用語「炭化水素」及び「ヒドロカルビル」は、専ら炭素及び水素元素を含む有機化合物又は基を記載する。これらの部分はアルキル、アルケニル、アルキニル及びアリール部分を含む。これらの部分はまた、アルカリール、アルケナリール及びアルキナリール等の、他の脂肪族又は環式炭化水素基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル及びアリール部分を含む。特に示さない限り、これらの部分は１〜２０個の炭素原子を含む。
【０１３７】
本明細書に記載される「置換ヒドロカルビル」部分は、炭素以外の少なくとも１つの原子で置換されたヒドロカルビル部分であり、ここで該部分は、炭素鎖原子が窒素、酸素、ケイ素、リン、ホウ素又はハロゲン原子等のヘテロ原子で置換された部分、及び炭素鎖が追加の置換基を含む部分を含む。これらの置換基は、アルキル、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケノキシ、アリール、アリールオキシ、アミノ、アミド、アセタール、カルバミル、カルボシクロ、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシル、ケト、ケタール、ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ）、ニトロ及びチオを含む。
【実施例】
【０１３８】
実施例１  ２’−ＯＨ置換アデノシン３’，５’−環式一リン酸塩（ｃＡＭＰ）の調製。単純なサロゲート基質、アデノシン３’，５’−環式一リン酸塩（ｃＡＭＰ）を使用して、ＮＭＩＡとの反応から得られた生成物をＨＰＬＣ／ＭＳを用いて同定及び定量化した。実施例３に記載されているｄｓＲＮＡに使用されたものと同じ反応条件下で、ｃＡＭＰをＮＭＩＡと反応させた。約７５％の変換が観察された。予想された親イオン（４６２Ｄａ）の単一の生成物ピークがＨＰＬＣ／ＭＳにより観察された。
【０１３９】
次いで生成物を弱塩基性加水分解に供した。これらの条件下で、この生成物ピークはもはや観察されず、対応するヌクレオシドとして同定された他のピークが観察された。形成されたヌクレオシドの量は、加水分解前に存在したヌクレオチドとほぼ同じ量として測定され、ＮＭＩＡは専らリボースの２’−ＯＨと反応したことが示された。
【０１４０】
実施例２  ＵｄｓＲＮＡの調製。化学修飾のための続く反応における記載される方法を試験するために、既知の配列のＵｄｓＲＮＡを調製した。５’末端にバクテリオファージＳＰ６プロモーター、コロラドハムシ（レプチノターサ・デケムリネエータ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）系統ＦｒｅｅｖｉｌｌｅアクチンｍＲＮＡ、ジェンバンク配列ＩＤ：ｇｂ｜ＫＪ５７７６１６．１、ヌクレオチド１−２９７）からのβアクチン（配列番号１３）の２９７ｂｐ断片に対応するセンス及びアンチセンス鎖、並びに３’末端にＮｃｏＩ制限部位を含むＣＰＢ＿β−Ａ＿ｄｓ（配列番号３）を、関心対照の領域のＰＣＲ増幅によりクローン化し、続いてｃｏｌＥ１起源、マルチクローニング部位及びアンピシリン耐性遺伝子（配列番号１）を含むＧｅｎｅＡｒｔ（商標）／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）のｐＭＡプラスミド内に連結し、バクテリオファージＳＰ６ポリメラーゼがプラスミド内に挿入されたクローン化断片を転写するように配向した。プラスミドを使用してＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）細胞を形質転換した。プラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で、０．８に等しいＯＤ（６００ｎｍ）まで成長させた。ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の説明書に従ってプラスミドを単離した。ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、コンストラクト内に導入された制限部位にて単離プラスミドを切断した。消化後、鋳型を１．５％アガロースゲル上の電気泳動により精製し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して製造業者の説明書に従って単離した。転写は、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＰ６  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して製造業者の説明書に従って行った。手短には、ＲＮＡ転写後、ＤＮＡ鋳型をＤＮＡｓｅとのインキュベーションにより除去し、次いでフェノール：クロロホルムを用いた抽出により精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７、０．１％  ＳＤＳ中のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１００クロマトグラフィーにより精製した。ＮａＣｌを加えて０．３Ｍに到達させた。ＲＮＡ  １μｇ当たり０．１ｎｇのＲＮＡｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて３７℃で３０分間インキュベーションすることにより、一本鎖ＲＮＡを消化した。ＲＮＡｓｅ  Ａ  １ｎｇ当たり２００ｎｇのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて３７℃で１時間インキュベーションすることによりＲＮａｓｅ  Ａを除去した）。ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿ｄｓ＿ｄｓと命名されたＲＮＡ生成物を、２．５容積のエタ��ールを用いた沈殿により回収した。遠心分離により得られたペレットを風乾させ、水に溶解し、使用まで−２０℃で貯蔵した。記載される他の全てのＤＮＡコンストラクトを同様の方法でクローン化及び転写し、得られたＲＮＡコンストラクトを同様の方法で単離した。
【０１４１】
ＤＮＡコンストラクトＣＰＢ＿β−Ａ＿１−１４＿ｍｕｔ（配列番号２５）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−２２＿ｍｕｔ（配列番号２６）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−３３＿ｍｕｔ（配列番号２７）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−５＿ｍｕｔ（配列番号２８）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−７＿ｄｅｌ（配列番号２９）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−７＿ｍｕｔ（配列番号３０）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−７＿ｉｎｓ（配列番号３１）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−１０（配列番号３２）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿２−７＿ｍｕｔ（配列番号３３）、ＲＩＦＡ＿Ａ＿２−７＿ｉｎｓ（配列番号３４）、ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓＤＮＡ（配列番号３５）及びＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ（配列番号３６）は、ＤＮＡコンストラクトＣＰＢ＿β−Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ（配列番号３）を使用して調製したＲＮＡ転写産物に関して記載されるものと同様の方法で、ＲＮＡ転写産物を使用して別々に調製した。得られたＲＮＡ生成物は、それらが由来するＤＮＡコンストラクトに従って命名され、即ちＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−１４＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−２２＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−３３＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−５＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−７＿ｄｅｌ、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−７＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−７＿ｉｎｓ、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−１０、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿２−７＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿２−７＿ｉｎｓ、ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓＤＮＡ及びＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ＿ｄｓと命名された。
【０１４２】
ＤＮＡコンストラクトＣＰＢ＿β−Ａ＿１−５＿ｍｕｔ（配列番号４）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｄｅｌ（配列番号５）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｍｕｔ（配列番号６）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｉｎｓ（配列番号７）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−１０＿ｍｕｔ（配列番号８）、ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔ（配列番号１１）及びＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｉｎｓ（配列番号１２）を使用して、ＤＮＡコンストラクトＣＰＢ＿β−Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ（配列番号３）を使用して調製したＲＮＡ転写産物に関して記載されるものと同様の方法で、ＲＮＡ転写産物を別々に調製することができる。得られたＲＮＡ生成物は、それらが由来するＤＮＡコンストラクトに従って命名され、即ちＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｄｅｌ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｉｎｓ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−１０＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｉｎｓと命名される。同様のＵｄｓＲＮＡを、他の宿主内の他の遺伝子に対して作製することができる。
【０１４３】
実施例３  ２’−Ｎ−メチルアントラノエート（ｍｅｔｈｙｌａｎｔｈｒａｎｏａｔｅ）ＭｄｓＲＮＡの調製。ＮＭＩＡとｄｓＲＮＡの間の効率的な反応を可能にする、記載される方法を、ＭｄｓＲＮＡの調製に関して本明細書に記載されるように、実施例２で調製したＵｄｓＲＮＡを本明細書に記載されるＮＭＩＡと反応させることにより試験した。
【０１４４】
１２．５μＬのＲＩＦＡ−Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ（配列番号１６）の３．２ｇ／Ｌ水溶液を１７．５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に加え、６７℃に温め、この温度に保った。６７℃で１５分後、６７℃に予熱した４０μＬのＮＭＩＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の９７ｇ／Ｌ  ＤＭＳＯ溶液を加え、混合した。その直後に、６７℃に予熱した１０μＬの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の４０．３ｇ／Ｌ  ＤＭＳＯ溶液を加え、混合した。従って、反応が行われた溶媒は、８４体積％のＤＭＳＯ及び１６体積％の水から構成された。混合物を同じ温度で３０分間保ち、次いで約１時間かけて室温に冷却させた。溶液を４４０μＬの水と混合し、２４μＬの５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を加え、混合した。粗生成物を遠心分離により分離した。ペレットを６ｍＬの水に溶解し、３，０００ダルトンの名目上分子量制限を有する再生セルロース膜Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で濾過して、０．５ｍＬの残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を得るまで生成物を更に精製した。１２回の追加の濾過を行い、得られた各残留物に１．５ｍＬの水を加えた。最後の限外濾過後に５００μＬの水性生成物を得た。
【０１４５】
１０μＬの５Ｍ  ＮａＯＨ水溶液で処理した、上記で得られた４０μＬの水性の精製生成物の完全加水分解後に、生成物の誘導体化度を概算した。得られたＮ−メチルアントラニル酸及びＲＮＡヌクレオチドの２５４ｎｍでのＵＶ吸光度を、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器と連結したＨＰＬＣを使用して定量化した。ＵｄｓＲＮＡの約９３％のヌクレオチドが反応したことが見出された。反応混合物中のＮＭＩＡのより低い濃度を用いて、より低い誘導体化度、即ち１３％〜５６％を得た。反応は、４７℃もの低い反応温度及び６９％もの低いＤＭＳＯにおいても行った。
【０１４６】
ＵｄｓＲＮＡとＮＭＩＡとの間の反応は、異なる条件下で行うこともできる。反応は、５分間〜３０分間継続させ、３７℃〜９５℃の温度で、１０％ＤＭＳＯ〜６４％  ＤＭＳＯ、及び１１％水〜７５％水、及び１１％酢酸エチル〜３３％酢酸エチルの溶媒中、０．０４Ｍ〜０．０９ＭのＮａＣｌ濃度を有して、ＤＭＡＰの代わりに又はＤＭＡＰと組み合わせてＢｎｓＤＭＡＰ、ＥｔｓＤＭＡＰ及びＭｅｓＤＭＡＰ（図２に示す）の組み合わせを使用して、行うことができる。高い温度、高い％であるが１００％よりも低いＤＭＳＯ、及び低いＮａＣｌ濃度は、低い温度、低い％のＤＭＳＯ若しくは１００％に近いＤＭＳＯ、又は高いＮａＣｌ濃度よりも、より高い誘導体化度に繋がることが認められる。
【０１４７】
実施例２で調製した以下のＵｄｓＲＮＡコンストラクトも、別々にＮＭＩＡと反応させることができる：非限定的に、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−５＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｄｅｌ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｉｎｓ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−１０＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔ、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｉｎｓを含む。得られた誘導体化ＲＮＡコンストラクトは、元のＲＮＡに接頭辞ＮＭＩＡ＿を加えて命名され、即ちＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｄｅｌ、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｍｕｔ、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｉｎｓ、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−１０＿ｍｕｔ、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔ、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｉｎｓと命名される。
【０１４８】
実施例４  ２’−ベンゾエートＭｄｓＲＮＡの調製。ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ（配列番号１６）の１２．５μＬの３．２ｇ／Ｌ水溶液を、３７．５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯに加え、６７℃に温め、この温度で保った。６７℃で１５分後、６７℃に予熱した１０μＬの４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の４０．３ｇ／Ｌ  ＤＭＳＯ溶液を加え、混合した。その直後に、６７℃に予熱した２０μＬのＢｚＣＮ（ＢＯＣ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）の２１８ｇ／Ｌ  ＤＭＳＯ溶液を加え、混合した。混合物を同じ温度で３０分間保ち、次いで約１時間かけて室温に冷却させた。ＭｄｓＲＮＡの単離は、実施例３に記載したものと同様に行った。
【０１４９】
生成物の誘導体化を実施例３に記載したように概算した。約４０％のＵｄｓＲＮＡヌクレオチドが化学修飾されていた。反応混合物中のＢｚＣＮのより低い濃度を用いて、より低い誘導体化度、即ち２６％〜１７％を得た。
【０１５０】
実施例５  ２’−（２，４−ジニトロフェノキシ）ＭｄｓＲＮＡの調製。１２．５μＬのＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ＿ｄｓ（配列番号１６）の３．２ｇ／Ｌ水溶液を４５．５μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に加え、６７℃に温め、この温度で保った。６７℃で１５分後、６７℃に予熱した２０μＬのＦＤＮＢ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１１８ｇ／Ｌ  ＤＭＳＯ溶液を加え、混合した。その直後に、２μＬの炭酸カリウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の２０．７ｇ／Ｌ水溶液を加え、混合した。混合物を同じ温度で３０分間保ち、次いで約１時間かけて室温に冷却させた。ＭｄｓＲＮＡの単離は、実施例３に記載したものと同様に行った。生成物の誘導体化を実施例３に記載したように概算し、基質ｄｓＲＮＡの約２３％のヌクレオチドが反応したことが見出された。反応混合物中のＦＤＮＢのより低い濃度を用いて、より低い誘導体化度、即ち６％及び２％を得た。
【０１５１】
実施例６  ＭｄｓＲＮＡの特性のＵｄｓＲＮＡの特定との比較。実施例４に記載した、約４０％のそのヌクレオチドがＢｚＣＮと反応したＭｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｅ  ＩＩＩによる消化に対するその安定性を試験することにより更に特徴づけた。ＭｄｓＲＮＡは、ＵｄｓＲＮＡと比較して、ＲＮＡｅ  ＩＩＩによる消化に対して有意に改善された安定性を有することが見出された。
【０１５２】
例えば、実施例４に記載したＢｚＣＮを用いた化学修飾の前及び後の約６００ｎｇのＲＮＡのサンプルを、別個の実験で、１単位のＲＮＡｅ  ＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）と共に、供給者により推奨される緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ2）中で３７℃で２０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡを加えて最終濃度５０ｍＭとした。ＲＮＡｅ  ＩＩＩによる消化後に得られた約３００ｎｇのＲＮＡを、９５℃で１０分間加熱することにより変性させ、６％ポリアクリルアミドＴＢＥ−ウレアゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を７０℃で変性させるＮＯＶＥＸ（登録商標）内の電気泳動により分析した。ＲＮＡバンドを臭化エチジウム染色（０．２μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により可視化した。図１は、ＵｄｓＲＮＡがＲＮＡｅ  ＩＩＩ処理により完全に分解されたことを示す（ＲＮＡｅ  ＩＩＩとのインキュベーションの前（レーンＡ）及び後（レーンＢ）のバンドを比較されたい）。対照的に、ＭｄｓＲＮＡはＲＮＡｅ  ＩＩＩ処理に耐性を示し、ＲＮＡｅ処理後に有意な完全長ＲＮＡが尚存在する（ＲＮＡｅ  ＩＩＩとのインキュベーションの前（レーンＡ）及び後（レーンＢ）のバンドを比較されたい）。
【０１５３】
実施例３、４及び５で調製したＭｄｓＲＮＡ材料の、対応するＵｄｓＲＮＡ基質の水溶性よりも低い水溶性が、それらの精製中に観察された。この疎水性の増大は、単にＮａＣｌ濃度を増大することによって水溶液から沈殿させることにより、単離目的で有利に使用された。更に、誘導体化度が増大するにつれて水溶性が低下した。従って、そのようなＭｄｓＲＮＡ  ＲＮＡｉトリガーは、対応するＵｄｓＲＮＡ基質よりも、疎水性の生体膜を通してより容易に拡散することが予想される。
【０１５４】
実施例７  コロラドハムシ侵入に対するＭｄｓＲＮＡの有効性。コロラドハムシのβ−アクチン遺伝子を標的とするＭｄｓＲＮＡが、同じ遺伝子を標的とするＵｄｓＲＮＡと比較して、同様の又はより高い有効性を示すか否かを決定するために、コロラドハムシβ−アクチン遺伝子を標的とするＭｄｓＲＮＡを、記載されるように生成する。
【０１５５】
実施例２で調製したＵｄｓＲＮＡ及び実施例３に記載したように調製したＭｄｓＲＮＡを使用して、コロラドハムシに対するそれらの有効性を試験することができる。各処理又は対照サンプルをジャガイモ葉のディスクの表面に適用した。対照サンプルは、転写後誘導体化非関連ＵｄｓＲＮＡ（ネガティブコントロール）を含む。ジャガイモ葉ディスクの表面に対する水等の追加の対照実験も行う。この処理は試験開始前に葉表面を乾燥させる。前処理期間中、全ての食物をコロラドハムシ幼虫容器から除去し、処理葉の導入前に幼虫を４時間飢餓させる。飢餓期間後、幼虫をペトリ皿内の処理したジャガイモ葉上に置き、ここで幼虫は、葉組織が食い尽くされるまでディスク上で給餌される。幼虫は、別々の時間に、処理したジャガイモ葉上で複数回給餌されてもよく（通常のジャガイモ葉の食餌を付与される）、次いで死亡率について毎日監視される。最後の暴露後、幼虫を未処理ジャガイモ葉上で一定期間又は死亡まで、いずれかが最初に起こるまで維持する。実験期間中、死亡率の評価を毎日行う。
【０１５６】
実施例３で調製したＭｄｓＲＮＡは、必須アクチン遺伝子の発現の抑制によって、コロラドハムシの殺滅において実施例２で調製した非誘導体化ＲＮＡコンストラクトと同様の又はそれより高い有効性を有することが予想される。水又は転写後誘導体化非関連ＲＮＡコンストラクト（ネガティブコントロール）で処理したコホートは、死亡率を殆ど又は全く示さないことが予想され、ＮＭＩＡとの反応により誘導体化されたそのようなＲＮＡコンストラクトがコロラドハムシに対して本来有毒ではないことを示す。転写後にＮＭＩＡで誘導体化されたβ−アクチンＲＮＡを含むＭｄｓＲＮＡを消費しているコホートにおける幼虫の高い死亡率は、転写後にＮＭＩＡで誘導体化されたＲＮＡコンストラクトが遺伝子発現阻害剤を構成することを示す。転写後にＮＭＩＡで誘導体化されたβアクチンＲＮＡを含むＭｄｓＲＮＡを消費しているコホートおけるコロラドハムシの、非誘導体化ＲＮＡコンストラクトの死亡率と同様の又はそれより高い死亡率は、ＮＭＩＡによる転写後修飾誘導体化により引き出される改善を示す。
【０１５７】
同様の実験を、コロラドハムシ又は他の標的宿主における他の標的遺伝子を有するＭｄｓＲＮＡを使用して行うことができる。
【０１５８】
実施例８  ＭｄｓＲＮＡの田畑有効性。ＭｄｓＲＮＡがＵｄｓＲＮＡと比較して環境分解に対して同様に耐性又はより耐性であるか否かを決定するために、それらを田畑、研究室又は温室内の植物上の葉に適用することができる。適用後の様々な日に、処理した葉を植物から切り取り、標的昆虫に給餌することができる。記載されるＭｄｓＲＮＡを、観察される標的宿主活性の低下又は標的宿主の罹患率の増大に関して、ＵｄｓＲＮＡ及び対照ＲＮＡと比較することができる。
【０１５９】
ＭｄｓＲＮＡ及び対照ＵｄｓＲＮＡはまた、田畑内で成長した植物に適用し、葉表面上で様々な日数の間、乾燥させて、ｄｓＲＮＡの残存率を試験することができる。
【０１６０】
ＭｄｓＲＮＡは、環境分解に対する耐性の増大を示し、また処理した植物の葉上で給餌されている標的宿主の罹患率の増大をもたらすことが予想される。ＭｄｓＲＮＡを消費しているコホートにおける標的宿主の罹患率の増大は、ＭｄｓＲＮＡが宿主の処置又は制御に有効であることを示す。
【０１６１】
実施例９  西洋トウモロコシルートワーム侵入に対するＭｄｓＲＮＡの有効性。ＭｄｓＲＮＡが宿主生物における標的遺伝子発現を効果的に阻害する能力は、西洋トウモロコシルートワーム配列含有ＲＮＡを転写するための、及び転写されたＲＮＡを記載されるように転写及び修飾した後、得られたＭｄｓＲＮＡを加工及び供給するための、ＤＮＡ配列を構築することによって試験することができる。Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）は、宿主昆虫に供給された際に西洋トウモロコシルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）Ｓｎｆ７オルソログ、ＤｖＳｎｆ７の発現の抑制に有効なＲＮＡｉ前駆体を生成することを報告された西洋トウモロコシルートワーム配列を記載している。西洋トウモロコシルートワームＤｖＳｎｆ７遺伝子は、生物のエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ−ＩＩＩ）の重要な構成要素をコードし、この必須遺伝子の有意な抑制は幼虫の死をもたらす。転写後誘導体化ＲＮＡコンストラクトは、実施例３に記載されたものと同様に調製される。
【０１６２】
ダイエットオーバーレイ（ｄｉｅｔ  ｏｖｅｒｌａｙ）方法論を用いてバイオアッセイを行う。市販の西洋トウモロコシルートワーム食餌を、ＳＣＲ食餌（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ、Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、ＮＪ）に関する製造業者のガイドラインに従って、０．０６％（ｖ／ｖ）のホルマリン、ｐＨを９に上昇させるための１０％  ＫＯＨ（ｖ／ｖ）、及び０．６２％（ｗ／ｖ）の凍結乾燥トウモロコシ根組織の追加を含む、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）により記載されるいくつかの調整を用いて調製する。２００μＬの融解食餌を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の２４ウェル内にピペッティングし、室温で凝固させる。０．５ｎｇ〜５００ｎｇの範囲の既知の量の試験サンプル、及びおよそ２〜２００ｎｇの非誘導体化又は誘導体化ＲＮＡを含む対照サンプルを、各ウェル内に重ねる。非誘導体化対照は、実施例２に記載したＲＮＡ＿ＣＰＢ＿ｄｓと同様に調製したＲＮＡ＿ＷＣＲ＿ＤｖＳｎｆ７＿ｄｓを含み、これはＤｖＳｎｆ７遺伝子（ポジティブコントロール）の抑制により西洋トウモロコシルートワームの殺滅に有効であるとＢｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）により記載されている。導体化対照は、西洋トウモロコシルートワーム（ネガティブコントロール）とは完全に非関連の転写後誘導体化ＲＮＡを含む。プレートを風乾し、ウェル当たり１つの幼虫を加える。プレートをＭｙｌａｒで密封し、＃１又は＃２虫ピンにより各ウェルに通気口を加え、２７℃で１２日間インキュベートする。１０匹の幼虫のコホートに、個々のＤｖＳｎｆ７  ＭｄｓＲＮＡ又は対照配列の各々を給餌して、各実験サンプル又は対照に関する１０個のデータ点を提供する。成長阻害（毎日の写真から評価した幼虫サイズ）及び死亡率を各コホートに関して決定する。
【０１６３】
実験の各実験及び対照コホートは、１０の同一の処理を受ける１０匹の個々の幼虫からなっている。個々の幼虫が全用量を消費することを確実にする唯一の方法のため、各幼虫は、隔離して投与される。実験手順の過程で死んだ任意の幼虫を処理して、総ｍＲＮＡを回収し、更なる分析を行い得るまでサンプルを−８０℃で保存する。
【０１６４】
１２日間の実験期間が完了した後、各コホートの成長率及び総死亡率を評価し、残りの生きた幼虫を犠牲にし、総ｍＲＮＡを回収する。転写後誘導体化非関連ＲＮＡコンストラクトで処理したコホートは、死亡率を殆ど又は全く示さないことが予想され、ＮＭＩＡとの反応により誘導体化されたそのようなＲＮＡコンストラクトが幼虫に対して本来有毒ではないことを示す。ポジティブコントロールで処理したコホートは、高い死亡率を示すことが予想され、このｄｓＲＮＡによるＤｖＳｎｆ７遺伝子発現の抑制が、それを消費する幼虫の死をもたらすというＢｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）の観察と一致する。転写後にＮＭＩＡで誘導体化されたＢｏｌｏｇｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）のＲＮＡを含むＭｄｓＲＮＡを消費しているコホートにおける幼虫の高い死亡率は、転写後にＮＭＩＡで誘導体化されたＲＮＡコンストラクトが有効なＲＮＡｉトリガーを構成することを示す。
【０１６５】
全ての場合、アクチン遺伝子の発現を標準的なマーカーに対して定量化し、結果を各実験コホートが示す死亡率と比較することによりｍＲＮＡサンプルを分析する。低下した無傷ＤｖＳｎｆ７  ｍＲＮＡは、遺伝子発現の有効なＲＮＡｉ抑制を示す。無傷ＤｖＳｎｆ７  ｍＲＮＡは、ｑＰＣＲ、ｑｒｔＰＣＲ、差次的ノーザンブロット分析又は同様の定量化方法により測定することができる。
【０１６６】
西洋トウモロコシルートワームに対する他の配列、及び他の宿主生物内の他の標的に対する配列を使用して、同様の実験行うことができる。給餌の方法は、宿主生物に対応させるために変更される。いくつかの実施形態では、これらの実験は、最も強力なＲＮＡ配列を特定するために行われる。ＭｄｓＲＮＡは大規模で製造することもでき、農業用途用に配合することができる。
【０１６７】
実施例１０  ヒアリ（ＲＩＦＡ）に対するＭｄｓＲＮＡの有効性。ＭｄｓＲＮＡが宿主昆虫内の遺伝子発現を効果的に阻害する能力を、ＲＩＦＡ（ソレノプシス・インビクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ）Ｂｕｒｅｎ）アクチン筋肉（ＬＯＣ１０５２０５８１６、ジェンバンク：ＸＭ＿０１１１７５３３７．１を標的とするＭｄｓＲＮＡを生成することにより試験した。ヒアリのアクチン遺伝子は、生物の筋肉の重要な構成要素をコードし、この必須遺伝子の有意な抑制により昆虫の死がもたらされる。ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓを実施例２に記載したように調製した。得られたＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓの７つのアリコートを、実施例３に記載したようにＮＭＩＡと、実施例４に記載したようにＢｚＣＮと、及び実施例５に記載したようにＦＤＮＢと別々に反応させた。得られた７つのＭｄｓＲＮＡは、ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ２＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ２＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ及びＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓと命名された。
【０１６８】
Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）により記載されたものと同様の単純なバイオアッセイを用いて、ＭｄｓＲＮＡ  ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ２＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ２＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ及びＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓが必須遺伝子発現を抑制することによりＲＩＦＡを殺滅及び阻害する能力を試験した。このバイオアッセイは、２０匹の働きアリのグループに、１日当たり５０μＬの、１０％ショ糖水溶液中の既知の濃度の試験物質を含む液体を４日間供給し、働きアリの死亡率を測定することを含んでいた。各コホートは、各々、２０匹のアリの４つの複製からなっていた。試験条件下で、試験ＲＮＡを加えない１０％ショ糖溶液を１０日間供給されたアリの死亡率は、１０％であった。
【０１６９】
アリの高い死亡率は、ＭｄｓＲＮＡ  ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ２＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ２＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ及びＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓを消費したコホートで観察された。これらの結果は、ＭｄｓＲＮＡがＲＩＦＡの殺滅に有効であることを示した。下記の表に示すように、ＭｄｓＲＮＡを消費したコホートにおいて、３倍の濃度のＵｄｓＲＮＡ（ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿ｄｓ）を供給されたＲＩＦＡと比較して、同様の又はより高い死亡率が観察され、ＭｄｓＲＮＡの有意により高い有効性が示された。
【０１７０】
【表１】
2019534005.tif 000005
【０１７１】
非関連ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓの７つのアリコートを、実施例３に記載したようにＮＭＩＡと、実施例４に記載したようにＢｚＣＮと、及び実施例５に記載したようにＦＤＮＢと別々に反応させることができる。得られた７つの化学修飾非関連ＲＮＡは、ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ２＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ２＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓ及びＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＧＦＰ＿ｄｓと命名される。これらの化学修飾非関連ＲＮＡは、死亡率を殆ど又は全く示さないと予想され、ＮＭＩＡ、ＢｚＣＮ又はＦＤＮＢとの反応により誘導体化されたそのようなＲＮＡコンストラクトが、アリに対して本来有毒ではないことを示す。
【０１７２】
別個の実験において、ＲＩＦＡアクチンの配列（配列番号１７）を含むＲＩＦＡ＿Ａ＿１−９＿ｄｅｌ（配列番号１８）を、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｄｅｌの調製に関して実施例２に記載したように、ＲＮＡ転写産物ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−９＿ｄｅｌの調製に使用することができる。転写後誘導体化ＲＮＡコンストラクトＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＲＩＦＡ＿Ａ＿１−９＿ｄｅｌは、実施例３に記載したＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＷＣＲ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿１−７＿ｄｅｌと同様に調製し、上記に記載したように試験する。
【０１７３】
実施例１１  大麦のフサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）侵入に対するＭｄｓＲＮＡの有効性。本明細書に記載される材料が、宿主真菌内でＲＮＡｉ応答を効果的に誘発する能力を、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）（ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ））のチトクロムＰ４５０ラノステロールＣ−１４α−脱メチル化酵素（ＣＹＰ５１）遺伝子を標的とするＭｄｓＲＮＡを生成し、該ＭｄｓＲＮＡをフサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）に送達することにより試験する。ＣＹＰ５１Ａ、ＣＹＰ５１Ｂ及びＣＹＰ５１Ｃ遺伝子の区分を含むセンス鎖、ＦＧ＿ＣＹＰ３（配列番号１９、米国特許出願第２０１６０２１５２９０号でＣＹＰ３ＲＮＡと命名）及びその対応するアンチセンス鎖、ＦＧ＿ＣＹＰ３＿アンチセンス（配列番号９）を有するｄｓＲＮＡを、Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）に記載されているように調製する。得られたＵｄｓＲＮＡの５つのアリコートを、別個に、実施例３に記載したようにＮＭＩＡと、実施例４に記載したようにＢｚＣＮと、及び実施例５に記載したようにＦＤＮＢと反応させる。得られた５つのＭｄｓＲＮＡは、ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ及びＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿ｄｓと命名される。
【０１７４】
別個の実験において、ＦＧ＿ＣＹＰ３配列（配列番号１９）を含むＦＧ＿ＣＹＰ３＿２−１０＿ｍｕｔ（配列番号２０）を使用して、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔを調製するために実施例２に記載したものと同様の方法で、ＲＮＡ転写産物ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿２−１０＿ｍｕｔを調製する。ＣＹＰ３配列は、フサリウム・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）由来の３つのチトクロムＰ４５０ラノステロールＣ−１４α−デメチラーゼ遺伝子ＣＹＰ５１Ａ、ＣＹＰ５１Ｂ及びＣＹＰ５１Ｃの部分配列を含み、これらの遺伝子の有意な抑制は春大麦（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））の感染に対する耐性をもたらす。ＭｄｓＲＮＡ  ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿２−１０＿ｍｕｔは、実施例３に記載したＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＷＣＲ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔと同様に調製される。
【０１７５】
Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）により記載されたものと同様の単純なバイオアッセイを用いて、宿主真菌における遺伝子発現を効果的に阻害する材料の能力を試験する。春大麦（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））品種Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐｒｏｍｉｓｅを人工気候室内で、１８℃／１４℃（日中／夜間）での１６時間の明期（２４０μｍｏｌ  ｍ-2ｓ-1光束密度）及び６５％相対湿度下で成長させる。３週齢の大麦植物の脱離した葉を、１％寒天を含む正方形のペトリ皿（１２０ｘ１２０ｘ１７ｍｍ）内に移動する。試験物質及びネガティブコントロール（緑色蛍光タンパク質を標的とするｄｓＲＮＡ）物質を５００μＬの水中で、プレート当たり約１〜１００μｇの試験物質又は対照物質に対応する約２〜２００ｎｇ／μＬの既知の最終濃度に希釈する。噴霧フラスコ（１０ｍＬ容量）を使用して葉に噴霧する。フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）を合成低栄養寒天培地上で培養する（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。６枚の脱離葉を含む各皿に、試験物質又は対照物質を均一に噴霧し、４８時間後にフサリウム・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）（２ｘ１０4分生子／ｍＬを含む２０μＬの溶液）を滴下接種（ｄｒｏｐ−ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ）する。プレートを１つの近ＵＶ管（ＰｈｉｌｌｉｐｓＴＬＤ３６Ｗ／０８）及び１つの白色光管（ＰｈｉｌｌｉｐｓＴＬＤ  ３６Ｗ／８３０ＨＦ）からの一定の照明の下で、室温でインキュベートする。
【０１７６】
接種から６日後、異なる実験にてＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ又はＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿２−１０＿ｍｕｔで処理した葉は、対照の噴霧により処理した葉よりも実質的に小さい褐色の病変を発生することが予想される。真菌ＤＮＡレベルの定量的リアルタイムＰＣＲ分析を用いて、ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ、ＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＣＹＰ３＿ｄｓ又はＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＦＧ＿ＣＹＰ３＿２−１０＿ｍｕｔで処理した葉に関する真菌成長の低下を確認することができる。これらの結果は、転写後にＮＭＩＡで誘導体化されたＲＮＡコンストラクトを含むＭｄｓＲＮＡ含有組成物が、植物の真菌疾病の制御に有用な、有効なＲＮＡｉトリガーを構成することを示すであろう。
【０１７７】
フサリウム・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）に対する他の配列、及び他の宿主真菌内の他の標的に対する配列を使用して同様の実験行うことができる。供給の方法は、宿主生物に対応するように変更される。いくつかの実施形態では、これらの実験は、最も強力なＲＮＡ配列を特定するために行われる。ＭｄｓＲＮＡは大規模で製造することもでき、農業用途用に配合することができる。
【０１７８】
実施例１２  コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）侵入に対するＭｄｓＲＮＡの有効性。ＭｄｓＲＮＡが宿主鱗翅類（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）における遺伝子発現を阻害する能力は、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ、ＥＣ３．１．１．７）遺伝子の１つを標的とするＭｄｓＲＮＡを生成し、このＭｄｓＲＮＡをコナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）に送達することにより試験することができる。コナガのアセチルコリンエステラーゼ遺伝子は、神経伝達物質アセチルコリンの加水分解を触媒して神経伝達を終結させるのに必須の酵素をコードし、この必須遺伝子の有意な抑制は死をもたらす。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ、ＥＣ３．１．１．７）遺伝子（配列番号２１、ジェンバンク：ＡＹ０６１９７５．１、ヌクレオチド＃  ５１２−８１０）を標的とするｄｓＲＮＡを、配列ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ（配列番号９）を使用して、実施例２に記載したものと同様に調製した。ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓと命名された、得られたＵｄｓＲＮＡの５つのアリコートを、別個に、実施例３に記載したものと同様にＮＭＩＡと、実施例４に記載したものと同様にＢｚＣＮと、及び実施例５に記載したものと同様にＦＤＮＢと反応させた。得られた５つのＭｄｓＲＮＡはＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ及びＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓと命名された。
【０１７９】
別個の実験において、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ、ＥＣ３．１．１．７）遺伝子（ジェンバンク：ＡＹ０６１９７５．１ヌクレオチド＃  ５１２−８１０）（配列番号２１）の１つの一区分を含むＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔ（配列番号２２）を使用して、ＲＮＡ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔの調製について実施例２で記載したものと同様の方法で、ＲＮＡ転写産物ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔを調製することができる。転写後誘導体化ＲＮＡコンストラクト（ＭｄｓＲＮＡ）ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔは、実施例３に記載されたＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＷＣＲ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔと同様に調製することができる。
【０１８０】
バイオアッセイを、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）により記載されたように葉−噴霧方法を用いてインビトロで行う。コナガ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）の集団は、最初に殺虫剤フリーキャベツ田畑から収集され、キャベツ葉上で２５±１℃で、１６：８時間の明：暗の光周期及び６０〜７０％相対湿度で、蛹化まで維持される。試験及び対照物質をキャベツ葉の各面上に均一に被覆して、既知の濃度でサンドイッチを形成する。コナガ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）の２齢の幼虫が各処理に使用され、昆虫を試験前に１２時間飢餓させる。０．０３μｇ／ｃｍ2〜３００μｇ／ｃｍ2の範囲の既知の量のＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔ、水のみの対照を含む対照サンプル、コナガに対して完全に非関連のＲＮＡ配列、及び非誘導体化サンプルＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔを、１０〜２００（μｇ／ｍｌ）の範囲の濃度で噴霧する。新鮮なキャベツディスク（直径２ｃｍ）をペトリ皿（直径９ｃｍ）内の湿潤フィルター紙上に置く。コナガ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）の１０匹の２齢の幼虫を葉に移動し、噴霧する（１ｍＬ溶液）。ＭｄｓＲＮＡ又は対照の各濃度を、４つの複製で適用する。処置した幼虫を処理葉上で、２６±１℃、６０〜７０％相対湿度、及び１６：８時間（明：暗）光周期で７２時間給餌し、幼虫の死亡率を７２時間後に記録する。幼虫は、触れるのに応答した動きを停止した際に死んだものと見なす。成長阻害（毎日の写真から評価した幼虫サイズ）及び死亡率を各コホートに関して決定する。実験手順の過程で死んだ任意の幼虫を処理して、総ｍＲＮＡを回収し、更なる分析を行い得るまでサンプルを−８０℃で保存する。
【０１８１】
７２時間の実験期間の完了後、各コホートの成長率及び総死亡率を評価し、残りの生きた幼虫を犠牲にし、総ｍＲＮＡを回収する。非関連ＲＮＡで処理したコホートは、死亡率を殆ど又は全く示さないことが予想され、そのような転写後誘導体化されたＲＮＡコンストラクトが幼虫に対して本来有毒ではないことを示す。ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ又はＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔを消費しているコホートにおける幼虫の死亡率の増大は、ＭｄｓＲＮＡが宿主内での遺伝子発現の阻害に有効であることを示す。ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ及びＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔを消費しているコホートと比較して、ＮＭＩＡ１＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＮＭＩＡ３＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２、ＢｚＣＮ１＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＢｚＣＮ３＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ、ＦＤＮＢ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿ｄｓ又はＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＤＢＭ＿ＡＣｈＥ２＿２−１０＿ｍｕｔを消費しているコホートにおける幼虫の同様の又はより高い死亡率は、ＭｄｓＲＮＡがＵｄｓＲＮＡよりも高い有効性を有することを示す。
【０１８２】
全ての場合、ＡＣｈＥ２遺伝子の発現を標準的なマーカーに対して定量化し、結果を各実験コホートが示す死亡率と比較することによりｍＲＮＡサンプルを分析する。低下した無傷ＡＣｈＥ２  ｍＲＮＡは、遺伝子発現の有効な抑制を示す。無傷ＡＣｈＥ２  ｍＲＮＡは、ｑＰＣＲ、ｑｒｔＰＣＲ、差次的ノーザンブロット分析又は同様の定量化方法により測定することができる。
【０１８３】
コナガ（Ｐ．ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）に対する他の配列、及び他の宿主ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａにおける他の標的に対する配列を使用して、同様の実験を行うことができる。給餌方法は、宿主鱗翅類（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）に対応するように変更される。いくつかの実施形態では、これらの実験は、最も強力なＲＮＡ配列を特定するために行われる。ＭｄｓＲＮＡは大規模で製造することもでき、農業用途用に配合することができる。
【０１８４】
実施例１３  殺虫剤−耐性ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）に対するネオニコチノイド殺虫剤の適用後のＭｄｓＲＮＡの有効性。記載されるＭｄｓＲＮＡを、殺虫剤等の既知の処理と組み合わせて、侵入の処置又は調節を更に向上させることができる。ミカンキジラミ（Ｄｉａｐｈｏｒｉｎａ  ｃｉｔｒｉ）チトクロムＰ４５０様遺伝子の３つの区分（ジェンバンク：ＸＭ＿０１７４４８２１１．１ヌクレオチド＃  １３５７−１４３６、ジェンバンク：ＸＭ＿０１７４４６５６６．１ヌクレオチド＃  １８７８−１９５７、ジェンバンク：ＸＭ＿０１７４４３３７０．１ヌクレオチド＃  ８５４−９３３；配列番号２３）を含む、ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔ（配列番号２４）等のＭｄｓＲＮＡを製造し、ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）等の昆虫、又はその上で昆虫が給餌される植物に局所適用することができる。続いて、ネオニコチノイド等の殺虫剤を昆虫又は植物に局所適用することができる。代替的に、殺虫剤は最初に又はＭｄｓＲＮＡと同時に適用される。ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子は、殺虫剤に耐性の昆虫内の生体異物化合物の代謝に関与する酵素をコードし、これらの遺伝子の有意な抑制は、殺虫剤の投与後に死をもたらす。ＭｄｓＲＮＡ  ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔは、実施例３に記載したＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＷＣＲ＿ＣＰＢ＿β−Ａ＿２−７＿ｍｕｔと同様に調製する。これらのＣＹＰ４遺伝子を標的とするＭｄｓＲＮＡを生成し、実験対照と共にミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）成虫に局所適用した後、ネオニコチノイド殺虫剤イミダクロプリドを適用する。
【０１８５】
バイオアッセイを、Ｋｉｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により記載されたように葉−噴霧方法を用いてインビトロで行う。Ｆｌｏｒｉｄａ内、例えばＰｏｌｋ  Ｃｏｕｎｔｙ又はＬａｋｅ  Ｃｏｕｎｔｙ内の商業的なかんきつ園からミカンキジラミ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）の田畑集団を収集し、それらの大部分は殺虫剤耐性である。ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔの精製サンプル、ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）に対して完全に非関連のＲＮＡ配列、及び非誘導体化サンプルＲＮＡ＿ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔを、ＲＮＡａｓｅフリー水を使用して段階希釈して、所望の濃度のＲＮＡｉトリガー及び対照サンプルを得る。（０．５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）の範囲の濃度のＲＮＡｉトリガー及び対照、並びにＲＮＡａｓｅフリー水のみを使用した他のネガティブコントロールを使用して、ミカンキジラミ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）成虫を処置する。孵化から数時間以内にミカンキジラミ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）成虫にＣＯ2下で麻酔をかける。０．１〜２００ｎｇの試験及び対照サンプルを含む０．２ｍＬの液滴を、１０ｍＬ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して、胸部の腹側に局所適用する。５匹の処置成虫を各々、Ｔｉｗａｒｉ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂａｍａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ」Ｊ  Ｅｃｏｎ  Ｅｎｔｏｍｏｌ  １０５：５４０−５４８に記載されているように、食物源として寒天ベッドの上にて柑橘類の葉の円板で裏打ちした６０ｍｍのプラスチック使い捨てペトリ皿内に置く。ミカンキジラミ（Ａｓｉａｎ  ｃｉｔｒｕｓ  ｐｓｙｌｌｉｄ）成虫を有するペトリ皿を、２５±１℃及び５０±５％相対湿度で、１４：１０時間の明：暗の光周期で、成長チャンバ内で７２時間保つ。
【０１８６】
次いで、処置した成虫を、殺虫剤溶液で処理した葉ディスクを収容する新しいペトリ皿に移動する。手短には、Ｔｉｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１に記載されているように、葉円板（直径６０ｍｍ）を切り取り、アセトン中で作製した殺虫剤溶液中に３０秒間浸漬し、ドラフト内で１時間風乾させた後、ペトリ皿内に配置する。分析等級のイミダクロプリドのＬＤ50投与量（０．０２ｎｇ活性成分／ｍｌアセトン）は、Ｔｉｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１により以前に決定されている。ミカンキジラミ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）成虫の死亡率を２４時間後に評価する。各５匹の昆虫を有する５つの複製（ペトリ皿）を、試験したミカンキジラミ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）集団の各々に関して行う。生きている昆虫を毎日計数する。
【０１８７】
非関連ＲＮＡで前処理されたコホートは、死亡率を殆ど又は全く示さないと予想され、そのような転写後誘導体化ＲＮＡコンストラクトが、殺虫剤耐性を抑制しないことを示す。ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔで前処理したコホートにおける昆虫の死亡率の増大は、ＭｄｓＲＮＡがＲＮＡｉ応答を引き出すのに有効であることを示す。ＲＮＡ＿ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔで前処理したコホートと比較して、ＮＭＩＡ＿ＲＮＡ＿ＡＣＰ＿ＣＹＰ４＿２−１０＿ｍｕｔで前処理したコホートにおける昆虫の同様の又はより高い死亡率は、ＭｄｓＲＮＡが非誘導体化ＲＮＡｉトリガーを超える改善をもたらすことを示す。
【０１８８】
ミカンキジラミ（Ｄ．ｃｉｔｒｉ）に対する他の配列、及び他の宿主有害生物の他の標的に対する配列を使用して、同様の実験行うことができる。ＭｄｓＲＮＡはまた、非限定的に殺真菌剤、除草剤及び他の殺虫剤を含む他の有害生物処置と組み合わせることができる。給餌方法は、宿主生物に対応させるために変更される。いくつかの実施形態では、これらの実験は、最も強力なＲＮＡ配列を特定するために行われる。ＭｄｓＲＮＡは大規模で製造することもでき、農業用途用に配合することができる。
【０１８９】
実施例１４  サンプル配列。上記の実施例に言及された配列。転写後修飾のためのＵｄｓＲＮＡの生成、及び宿主生物内の標的遺伝子の発現の阻害における使用に使用できる追加の例示的な配列を提供する。
【０１９０】
【表２】
2019534005.tif 000006
【０１９１】
【表３】
2019534005.tif 000007
【０１９２】
【表４】
2019534005.tif 000008
【０１９３】
【表５】
2019534005.tif 000009
【０１９４】
【表６】
2019534005.tif 000010
【０１９５】
【表７】
2019534005.tif 000011
【０１９６】
【表８】
2019534005.tif 000012
【０１９７】
【表９】
2019534005.tif 000013
【０１９８】
【表１０】
2019534005.tif 000014
【０１９９】
【表１１】
2019534005.tif 000015
【０２００】
【表１２】
2019534005.tif 000016
【０２０１】
【表１３】
2019534005.tif 000017
【図１】
2019534005.tif 000019
【図２】
2019534005.tif 000020
【配列表】
2019534005000001.app
【国際調査報告】
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