(57)【要約】  癌におけるストレス誘導性突然変異誘発のためのオミクスシグネチャーおよびそれに関連する方法を提供する。有利には、シグネチャーを特徴づけることができ、スコアを計算してそれがなければオミクスデータから得ることができない治療法のための有用なガイダンスを提供することができる。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルからオミクスデータを得る工程と、
前記オミクスデータにおいてＳＮＶを決定する工程であって、前記ＳＮＶは損傷乗り越え合成に関連していることを特徴とする工程と、
ＳＮＶのクラスターを同定し、かつ少なくとも１つのクラスターの形状を前記少なくとも１つのクラスターの中心に対するＳＮＶの度数分布に関して計算する工程と、
前記少なくとも１つのクラスターの前記形状に基づいてスコアを計算する工程と
を含む、オミクスデータを解析する方法。
【請求項２】
前記オミクスデータは全ゲノム配列データを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルは、健康な組織、原発性腫瘍、再発性腫瘍および転移のうちの少なくとも１つからのものである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＮＶはプライベートＳＮＶである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記損傷乗り越え合成は、Ｒｅｖ１、ｐｏｌエータ（ｐｏｌ  η）、ｐｏｌカッパ／ｄｉｎＢ（ｐｏｌ  κ）、ｐｏｌシータ（ｐｏｌ  θ）、ｐｏｌミュー（ｐｏｌ  μ）およびｐｏｌイオタ（ｐｏｌ  ι）からなる群から選択されるＴＬＳポリメラーゼに関連する突然変異パターンを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＳＮＶのグループが少なくとも３つのＳＮＶを含み、任意の２つの連続するＳＮＶ間の距離が２５ｋｂ未満であり、かつそのようなグループを偶然に発見する確率が前記ゲノムにおける総突然変異観察率によって与えられる負の二項回帰に従って０．０１未満である場合に、前記グループをクラスターの一部であると決定する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記クラスターの質量中心から２５０ｋｂまでの距離の関数としてＳＮＶイベントの累積分布を計算することによって前記少なくとも１つのクラスターの形状を計算する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記スコアは、前記ＳＮＶの一様分布からの逸脱の程度を測定し、かつ正規化された累積分布ｆ（ｘ）と期待値ｘとの差を積分することによって計算する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルは、健康な組織、原発性腫瘍、再発性腫瘍および転移のうちの少なくとも１つからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＮＶはプライベートＳＮＶである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記損傷乗り越え合成は、Ｒｅｖ１、ｐｏｌエータ（ｐｏｌ  η）、ｐｏｌカッパ／ｄｉｎＢ（ｐｏｌ  κ）、ｐｏｌシータ（ｐｏｌ  θ）、ｐｏｌミュー（ｐｏｌ  μ）およびｐｏｌイオタ（ｐｏｌ  ι）からなる群から選択されるＴＬＳポリメラーゼに関連する突然変異パターンを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＮＶのグループが少なくとも３つのＳＮＶを含み、任意の２つの連続するＳＮＶ間の距離が２５ｋｂ未満であり、かつそのようなグループを偶然に発見する確率が前記ゲノムにおける総突然変異観察率によって与えられる負の二項回帰に従って０．０１未満である場合に、前記グループをクラスターの一部であると決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記クラスターの質量中心から２５０ｋｂまでの距離の関数としてＳＮＶイベントの累積分布を計算することによって、前記少なくとも１つのクラスターの形状を計算する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記スコアは、前記ＳＮＶの一様分布からの逸脱の程度を測定し、かつ正規化された累積分布ｆ（ｘ）と期待値ｘとの差を積分することによって計算する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記スコアは単一の組織ソースに対して計算する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍サンプルからオミクスデータを得る工程と、
前記オミクスデータにおいてＳＮＶを決定する工程であって、前記ＳＮＶデータは損傷乗り越え合成に関連している工程と、
ＳＮＶのクラスターを同定し、かつ少なくとも１つのクラスターの形状を前記少なくとも１つのクラスターの中心に対するＳＮＶの度数分布に関して計算する工程と、
前記少なくとも１つのクラスターの前記形状に基づいてスコアを計算する工程と、
前記スコアを生存予測と関連づける工程と、
を含む、癌患者の生存を予測する方法。
【請求項１７】
前記ＳＮＶはプライベートＳＮＶである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記スコアを前記腫瘍サンプルの原発組織に対して正規化する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が原発性腫瘍である場合、より高いスコアは高い生存を予測する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が再発性腫瘍または転移である場合、より高いスコアは低い生存を予測する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１０月５日に出願された米国仮出願第６２／４０４，７５６号、２０１６年１１月１８日に出願された第６２／４２４，２６９号、２０１７年１月１２日に出願された第６２／４４５，６５１号および２０１７年３月２７日に出願された第６２／４７７，２０１号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は、癌におけるストレス誘導性突然変異の同定／特性評価である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の記載は本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書に提供されている情報はいずれも、先行技術であることまたは現在特許請求されている発明に関連するものであるということ認めるものではなく、具体的または暗黙的に参照されているどの刊行物も先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願があたかも参照によって具体的かつ個々に示されているかのように同程度に参照によって組み込まれる。組み込まれる参考文献における用語の定義または使用は本明細書に提供されているその用語の定義と矛盾していたりそれに反していたりする場合は、本明細書に提供されているその用語の定義を適用し、参考文献における定義は適用しない。
【０００５】
体細胞突然変異はヒトの体の全ての細胞に存在し、かつ一生を通じて生じる。それらは、ＤＮＡ複製機構の本来備わっている僅かな非忠実性、外因性もしくは内因性突然変異原への曝露、ＤＮＡの酵素修飾および欠陥ＤＮＡの修復を含む複数の突然変異プロセスの結果である。癌の突然変異解析は、典型的に１つ以上の選択された遺伝子または分子プロファイルを用いる事後調査として行われる。場合によっては、機能的欠陥または異常調節の予測を可能にする個々の遺伝子における突然変異を同定することができ、次いでそれらを１種以上の薬物の標的にする。例えば、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳおよびＡＬＫにおける突然変異を肺癌において検出することができたり、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦおよびＮＲＡＳにおける突然変異を結腸直腸癌において検出したりすることができる。他の場合には、構造突然変異を慢性骨髄性白血病患者において検出することができ、この突然変異は典型的に染色体９と２２との転座の融合産物であり、キナーゼ機能の異常が生じる。しかし、そのような解析の有用性は、特定の遺伝子産物およびそのような産物を標的にするために利用可能な薬物の理解に限定される場合が多い。なおさらに、そのような解析の結果は、対応するタンパク質が発現されない場合には臨床的に関連がないこともある。
【０００６】
ごく最近では、ゲノム全体の突然変異シグネチャーが収集および解析された。例えば、ＣＯＳＭＩＣデータベース、すなわちＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ（ＣＧＣ）は、その突然変異が因果的に癌に関与している遺伝子をカタログ化するための進行中の試みである。ＣＯＳＭＩＣデータベースは、遺伝子およびそのような遺伝子に含まれる突然変異の大きな一覧ならびに突然変異シグネチャーの収集物を含む。ここでは、３０種の突然変異シグネチャーは、４０の異なる種類のヒトの癌全体にわたるほぼ１１，０００のエクソームおよび１，０００超の全ゲノムの解析に基づいている。これらの解析は、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）、国際癌ゲノムコンソーシアム（ＩＣＧＣ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）によって作成されたキュレートされたデータ、および論文審査のある専門誌に公開されている自由に利用可能な体細胞突然変異の大きなセットに基づいている。情報価値はあるが、そのような突然変異パターンは実用的な情報を提供することができない場合が多い。さらに、全ての突然変異シグネチャーを特定の病因によって完全に説明することができるわけではない。
【０００７】
従って、突然変異シグネチャー、それらの根底にある病因および臨床用途を同定するためのシステムおよび方法がなお必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の主題は、１種以上の突然変異シグネチャー、それらの根底にある病因および臨床用途を同定するための各種システムおよび方法に関する。最も典型的には、シグネチャーは全ゲノムまたはエクソーム配列データから同定され、進化的に初期の単細胞生物において一般に認められる祖先の適応的突然変異応答に起因し得る。特にそのような応答の病因は、臨床的関連を有する集成値を作成することができる複数の特異的機構に基づいている。
【０００９】
特に好ましい一態様では、本発明者らは、サンプルからオミクスデータを得る工程と、オミクスデータにおいてＳＮＶを決定するさらなる工程とを含み、ＳＮＶは損傷乗り越え合成に関連していることを特徴とする、オミクスデータを解析する方法を企図する。さらに別の工程では、ＳＮＶのクラスターを同定し、かつ少なくとも１つのクラスターの形状をクラスターの中心に対するＳＮＶの度数分布に関して計算する。最後に、少なくとも１つのクラスターの形状に基づいてスコアを計算する。
【００１０】
最も典型的には、オミクスデータは全ゲノム配列データを含み（但し、全エクソームデータも企図される）、かつ／または、サンプルは健康な組織、原発性腫瘍、再発性腫瘍および／または転移からのものである。ＳＮＶはプライベートＳＮＶであり、かつ損傷乗り越え合成は、Ｒｅｖ１、ｐｏｌエータ（ｐｏｌ  η）、ｐｏｌカッパ／ｄｉｎＢ（ｐｏｌ  κ）、ｐｏｌシータ（ｐｏｌ  θ）、ｐｏｌミュー（ｐｏｌ  μ）およびｐｏｌイオタ（ｐｏｌ  ι）などの誤りがちなＴＬＳポリメラーゼに関連する突然変異パターンを有することがなおさらに一般に好ましい。
【００１１】
さらに企図される態様では、ＳＮＶのグループが少なくとも３つのＳＮＶを含み、任意の２つの連続するＳＮＶ間の距離が２５ｋｂ未満であり、かつそのようなグループを偶然に発見する確率がゲノムにおける総突然変異観察率によって与えられる負の二項回帰に従って０．０１未満である場合に、そのグループをクラスターの一部であると決定する。さらに、クラスターの質量中心から２５０ｋｂまでの距離の関数としてＳＮＶイベントの累積分布を計算することによって少なくとも１つのクラスターの形状を計算することも企図される。追加または代わりとして、ＳＮＶの一様分布からの逸脱の程度を測定すること、および正規化された累積分布ｆ（ｘ）と期待値ｘとの差を積分することによって、このスコアを計算してもよい。
【００１２】
本発明の主題のさらなる好ましい態様では、本発明者らは、腫瘍サンプルからオミクスデータを得る工程と、オミクスデータにおいてＳＮＶを決定するさらなる工程とを含み、ＳＮＶデータは損傷乗り越え合成に関連していることを特徴とする、癌患者の生存を予測する方法も企図する。次いで、ＳＮＶのクラスターを同定し、かつ少なくとも１つのクラスターの形状を少なくとも１つのクラスターの中心に対するＳＮＶの度数分布に関して計算する。少なくとも１つのクラスターの形状に基づいてスコアを計算し、次いでこのスコアを患者の生存予測と関連づける。
【００１３】
最も典型的には、ＳＮＶはプライベートＳＮＶであり、かつ／または当該スコアを腫瘍サンプルの原発組織に対して正規化する。さらに、最も典型的な例では、腫瘍が原発性腫瘍である場合、より高いスコアは高い生存を予測し、かつ／または腫瘍が再発性腫瘍または転移である場合、より高いスコアは低い生存を予測する。
【００１４】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、添付の図面に沿った好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】遺伝子年齢に従う正常サンプルおよび癌サンプルのエンリッチメント比（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｒａｔｉｏ）を示すグラフである。
【図２】遺伝子年齢に従う癌サンプルの突然変異パターンを示すグラフである。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは遺伝子年齢に従う癌サンプル（３Ａ）および単一遺伝子病（３Ｂ）の突然変異パターンを示すグラフである。
【図４】劣性ＣＯＳＭＩＣ癌遺伝子の機能エンリッチメントネットワークを示すグラフである。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは遺伝子年齢に従う癌サンプル（３Ａ）および単一遺伝子病（３Ｂ）の突然変異ホットスポットパターンを示すグラフである。
【図６】クラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図７】ＴＬＳを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図８】ＡＰＯＢＥＣを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図９】ＡＩＤを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図１０】組織ごとに分類されたクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図１１】組織ごとに分類されたＴＬＳを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図１２】組織ごとに分類されたＡＰＯＢＥＣを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図１３】組織ごとに分類されたＡＩＤを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合を示すグラフである。
【図１４】組織ごとに分類されたＳＩｔＨスコアを示すグラフである。
【図１５】生存および死亡患者の原発性腫瘍におけるＳＩｔＨスコアを示すグラフである。
【図１６】生存および死亡患者の転移性／再発性腫瘍におけるＳＩｔＨスコアを示すグラフである。
【図１７】正常サンプルおよび癌サンプルにおける突然変異への寄与を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
癌は、多細胞集合体において生存するように適合した細胞における単細胞挙動への先祖返りであると言われている。そのような仮説の必然的結果は、多細胞性に有害な細胞レベルの形質を抑制する作用機構を破壊するための癌における突然変異を必要とする。さらに、そのような機構は多細胞性の出現と一緒または後に進化すべきであった。そのため、癌における体細胞突然変異は多細胞性の出現（１０００百万年［ＭＹ］＝１０億年）よりも若い遺伝子において頻繁に生じるという説と、癌において頻繁に突然変異する遺伝子およびその突然変異は多細胞性と一緒（５００〜１０００ＭＹ）または後（＜５００ＭＹ）に進化した癌表現型の出現にとって機能上重要であり、従って、より若い遺伝子に偏った年齢分布を示すという説の２つが関連するが異なる仮説に至る。
【００１７】
本発明者らは、全てのヒト遺伝子の進化年齢を調査し、次いで正常な生殖系列および癌コンテキストの両方についてそれらの年齢およびゲノム位置との関連で突然変異の確率およびそれらの生物学的機能を調べた。注目すべきことに本発明者らは、遺伝子サイズについて調整されたゲノム全体にわたって一様なランダム突然変異のモデル下で、５００ＭＹ未満の遺伝子は両方の場合においてより頻繁に突然変異するということを発見した。逆説的に、ＣＯＳＭＩＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓにおいて定められている原因遺伝子はこの年齢群において枯渇していた。機能エンリッチメント解析を使用してこの予期せぬ結果を説明する場合、本発明者らは、劣性遺伝病表現型を有するＣＯＳＭＩＣ遺伝子がＤＮＡ修復および細胞周期制御のために豊富であるということを発見した。これらの経路において突然変異していない遺伝子は細菌におけるそれらの根底にあるストレス誘導性突然変異にオルソロガスであり、これにより一塩基多様性のクラスター化が生じる。ＣＯＳＭＩＣ遺伝子は、突然変異クラスターを観察する確率が高い領域においてあまり一般的ではなかったが、それらは他のヒト遺伝子と比較して突然変異クラスターを有する可能性が約２倍高かった。従ってこれらの結果は、原核生物の中で進化したストレスに対するこの古くからの突然変異応答は生殖系列および免疫系において多様性を維持するために勝手に用いられたが、元の表現型は癌において復帰されることを示唆している。従って、本発明者らは、ストレス誘導性突然変異応答に対する先祖返りを、因果的に癌に関与している遺伝子が位置する「保護された」ゲノム空間を有効に探すことを許容し、かつ癌の特徴である高い適応能力および同時に生じる治療抵抗性の根底にある癌の顕著な特徴とみなす。
【００１８】
以下でより詳細にさらに説明するように、古い劣性癌遺伝子の機能アノテーションにより、ストレス誘導性突然変異が癌におけるゲノムの不安定性において役割を担い、かつ癌において認められる突然変異クラスターが保存されたストレス誘導性突然変異誘発応答の分子シグネチャーであることを表すという仮説に至った。細菌においてストレス誘導性突然変異応答を機構的に促進する誤りがちなポリメラーゼにオルソロガスなヒトにおける遺伝子は、ＤＮＡ損傷の複製バイパス中に用いられる損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）のための特殊なＤＮＡポリメラーゼとなった。これらのポリメラーゼは特定の種類のＤＮＡ損傷を認識し、かつ損傷したＤＮＡを忠実に複製するが、損傷していないＤＮＡに対しては低い規模の忠実度を示す。従って、Ｓ期の間に生じたかＳ期まで持続したＤＮＡ損傷では、これらのいわゆる誤りがちなＤＮＡポリメラーゼが複製中に用いられ、一塩基突然変異の全体的増加を生じさせる。正常細胞では、細胞周期によるＤＮＡ修復の厳重に制御された調節は、細胞周期を停止させ、かつミスマッチ認識および修復のための時間を許容するか、あるいは極端な場合には少なくとも体細胞系統においてアポトーシス応答を生成することによって、これらのＴＬＳ突然変異の大部分の次の細胞分裂への伝播を防止する。
【００１９】
これについても以下でより詳細に示すように、ストレス誘導性突然変異誘発機構は標的療法などの広範囲の治療法に対する抵抗性におけるＴＬＳ活性の役割を予測することができるため、その結果は癌の臨床管理にとって重要な意味を有する。治療抵抗性を理解するための現在のパラダイムは、細胞内不均一性により治療に対する先験的な異なる感受性を有する複数のクローン亜集団が生じることを主張している。治療はクローン選択を引き起こすボトルネックを生み出す。この選択は、その集団において固定されるようになった突然変異イベントが治療後にそれらの頻度を劇的に変化させることができるという観察から推測される。次いで生き残っているクローンは、進行中の不安定性により事後にそれらの多様性を再確立する。治療法に対する抵抗性は、それが先験的に存在し、かつクローンの一掃を生き残るという理由、またはその集団が細胞レベルで再多様化するにつれて抵抗性が発達するという理由のいずれかにより生じる。
【００２０】
対照的に、ストレス誘導性突然変異の表現型は、ボトルネックそれ自体が抵抗性の獲得を生じさせる細胞間のゲノム多様性の主要な促進物であると予測する。さらに、クローン選択および細胞間多様性の再生の両方が同時に生じる。腫瘍形成がほとんどの場合に何年もかけて生じることを認める場合、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異の阻害剤に対する抵抗性の急速かつほぼ普遍的な獲得は、これが実際に生じていることを示唆するものである。有効な治療法に対する抵抗性が獲得される速度は、所与の腫瘍がどの程度ロバストにストレス誘導性突然変異プログラムを活性化させたかによって決まる可能性が高い。治療動態は、腫瘍進行に対するストレス誘導性突然変異の影響を最小限に抑えるのに非常に重要である可能性が高く、その際は曝露の強度および持続期間の両方が役割を担う。
【００２１】
従って本発明者らは、それ未満であると腫瘍細胞の適応度が損なわれるが、高い突然変異は誘導されないというストレス誘導の閾値効果が存在すると仮定する。従って、より低い用量をより頻繁に与えることは、癌の進行を長期的に制御するのにより有効であり得る。これは、累積用量が全ての腫瘍が致死的な薬物抵抗性を獲得した持続投与レジメンで与えられた用量を満たすかそれを超える場合であっても、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体黒色腫の患者由来の異種移植片の間欠投与により致死的な薬物抵抗性に達することができないという結果となることを示す最近の研究によって支持されている（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３；４９４：２５１−２５５）。同様に、新しく診断された多発性骨髄腫における患者の予後は、レナリドマイド＋低用量デキサメタゾンのレジメンを用いた場合に、より低い毒性でありながらも同じであったかより良好であった（Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；１１：２９−３７）。乳癌の前臨床的モデルでは、最初に大きい用量のパクリタキセルを使用して腫瘍成長率をプラトーになるまで促進した後に、腫瘍サイズの変化に基づいてその後に調節された規則的な用量を与える適応治療処置により、腫瘍成長の長期間の安定化および高い生存が生じた（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１６；８：３２７ｒａ２４−３２７ｒａ２４）。これは、最大耐用量を使用する手法から最小有効用量を使用する手法、すなわちメトロノミックまたは適応治療戦略の使用へ、および慢性疾患としての癌の「治癒」から管理への治療パラダイムの基本的な切り替えを示唆している。
【００２２】
さらに、ストレス誘導性突然変異プログラムにおいて細胞によって使用される様々な機構に基づいて、以下でより詳細にさらに考察するように、治療に対する癌の反応または素因を突然変異シグネチャーから予測することができる。本発明者らは数ある発見の中でも、癌における体細胞突然変異がクラスターで生じ、かつ癌が正常もしくはシミュレートされたデータのいずれかよりもより大きな多様性のクラスター形状を有する尖ったクラスターを有することに注目した。さらに、これについても以下でより詳細に示すように、癌におけるクラスターの形状は原発組織によって決まる。正常および癌の両方におけるクラスターにおけるＳＮＶの大多数はＴＬＳを示唆するモチーフを有し、かつＴＬＳはＡＰＯＢＥＣまたはＡＩＤのいずれかよりもクラスター形状により寄与する。最後に、このデータは、癌がストレス誘導性突然変異誘発の保存された機構を使用して体細胞突然変異を生じさせるという仮説を支持するものである。
【実施例】
【００２３】
Ｉ．進化的考察
【００２４】
遺伝子時系列解析：遺伝子の相同性は遺伝子ファミリーの進化史を表す。従って、あらゆる他の生物種で認められるヒト遺伝子のオルソログは共通の祖先から分岐されたものと推測することができる。従って、オルソロガス遺伝子を遺伝子ファミリーにグループ化することにより、遺伝子ファミリーの中に含められる全ての生物種の最後の共通祖先の分岐時間によってヒト遺伝子の年齢を同定することができる。
【００２５】
この手法を相同性の定義に従わせると、より正確な遺伝子ファミリーの構築により遺伝子年齢のより良好な推定が得られる。本発明者らは、３つの関連する相同性データベースを見て、生命の全ての界を最も多く包含し、かつ最もロバストなヒト遺伝子ファミリーを有するものを同定した。本発明者らは、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ／Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｐａｎ−Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｍｐａｒａ（リリース２２、１９，７５６の遺伝子）、ＮＣＢＩ  ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（１８，３０４の遺伝子）およびＨＯＧＥＮＯＭ（ヌクレオチドデータベースからの１７，０８６の遺伝子）を考察した。本発明者らがこれらのデータベースを選択した理由は、これらが全ての分類群にわたる多くの生物種を包含しており、かつ洗練された系統発生的一致方法を用いるタンパク質および遺伝子配列比較の両方を使用して、タンパク質コード遺伝子およびｎｃＲＮＡ遺伝子の全セットにわたる進化樹を予測することができるからである（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００９；１９：３２７−３３５）。解析に基づいて本発明者らは、時系列方法において遺伝子ファミリーを作成するための最良の選択肢として、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ／Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｐａｎ−Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｍｐａｒａデータベースを選択した。
【００２６】
次いで、本発明者らは、ＴｉｍｅＴｒｅｅデータベースに従ってヒトと各対応する遺伝子ファミリーにおいて代表される全ての生物種との最大の系統発生的分岐時間として遺伝子年齢を決定した（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６；２２：２９７１−２９７２）。進化樹における共通祖先の年齢は常に、そこから分岐している全ての生物種間の分岐時間よりも古く、従ってこの尺度は遺伝子の最小で期待される年齢の推定を与える。
【００２７】
癌遺伝子リスト：サンガーの癌における体細胞突然変異カタログ（ＣＯＳＭＩＣ：Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）は、ヒトの癌における体細胞突然変異の包括的リソースである。本発明者らは、因果的に癌に関与していた突然変異を有する４５８の遺伝子を調べ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ）、ＣＯＳＭＩＣアノテーションに従って優性、劣性またはその両方としてそれぞれをカタログ化した。この分類は、癌表現型を観察するために単一の対立遺伝子（優性）または複数の対立遺伝子（劣性）を突然変異させなければならないか否かに基づいている。
【００２８】
ゲノム解析：本発明者らは、計７６４個のサンプル：膵臓（２６２）、前立腺（１９８）、卵巣（１１５）、骨（９７）、皮膚（５９）、血液（２６）、脳（４）および未知の原発組織を有する３個のサンプルのために、国際癌ゲノミクスコンソーシアム（ＩＣＧＣ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）データポータル（リリース１９）の全ゲノム配列（ＷＧＳ）サンプルからコールされた多様体を得た。本発明者らは、１０００ゲノムプロジェクトにおけるＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｄｉｃｅｓデータベース（リリース２０１３０５０２）から正常組織多様体データも得た。この場合、本発明者らは、プライベート多様性（すなわち、ドナーには存在するがどちらの親にも存在しない）を同定するために、１３０種のＷＧＳトリオサンプルを調べた。本発明者らは、このデータを解析して、複雑な多塩基多様性、部分欠失／挿入および他のＤＮＡ再編成を含む二本鎖切断（ＤＳＢ）イベントならびに１つまたは２つの塩基の欠失、挿入および置換を表す一塩基多様体（ＳＮＶ）の両方のゲノム位置を同定した。本発明者らは、鎖のスリッページがより大きな再編成の原因となり得る単一ヌクレオチド、ジヌクレオチドおよびトリヌクレオチドの繰り返しを含む領域における変化もＳＮＶとして分類した。
【００２９】
先験的に本発明者らは、クラスタリング解析のバイアスを回避するために、体細胞の超突然変異に関与することが知られている領域において生じる全てのイベントを除外した（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；７：２４８−２５４；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１２；４６：４２４−４３５）。２つのＳＮＶ間の距離が２５ｋｂ未満であり、そのクラスターが少なくとも３つのＳＮＶを有し、かつそのようなＳＮＶのグループ化を偶然に発見する確率が０．０１未満であった場合に、ＳＮＶのグループをクラスターの中にあるものと決定した。各染色体を跨ぐ１ｋｂの間隔内部で観察されるクラスター中心の数を評価することによって、クラスターのホットスポット形成（ｈｏｔｓｐｏｔｔｉｎｇ）を決定した。間隔におけるイベントの期待値は、イベントの総数を染色体における間隔の数で割ることによって与えられた。本発明者らは二項検定を用いて、イベントの観察数がイベントの一様分布に基づいてより大きいか、より小さいか、統計学的に期待される値に近いか否かを決定し、それに応じて間隔をホット、コールドまたはヌル領域として定める。
【００３０】
機能エンリッチメント解析：本発明者らは、ＤＡＶＩＤの機能エンリッチメントクラスタリングツール（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７；３５：Ｗ１６９−Ｗ１７５）を使用して、各種遺伝子リストにおいて過剰提示される細胞機能を決定した。このツールは複数のオントロジーを跨ぐエンリッチメントについて遺伝子セットを評価し、次いで得られた豊富な機能を、豊富な機能内の遺伝子の帰属関係の重複を最大化することによって定義されるクラスターにグループ化する。本発明者らは、特に定めがない限り全てのヒト遺伝子を比較のための背景リストとして用いて、それらのＥｎｓｅｍｂｌ  ＩＤおよびエンリッチメントによって遺伝子を命名した。全ての解析のためにデフォルトのオントロジーおよび厳密性の設定を使用した。本発明者らは、クラスター内の３つ以上のカテゴリについてＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇで補正されたｐ値が０．０５未満であった場合に機能エンリッチメントを報告した。
【００３１】
進化年齢の関数としてのヒト遺伝子の突然変異の頻度：癌の隔世遺伝モデルは、癌表現型がある程度まで進化的に保存されているが、そうでない場合は発癌進行により再活性化される抑制された「遺伝子サブルーチン」であるということを前提としている。１）癌における体細胞突然変異は多細胞性の出現（１０００百万年［ＭＹ］）よりも若い遺伝子において生じるという説と、２）癌において頻繁に突然変異する遺伝子およびその突然変異は多細胞性と一緒（５００〜１０００ＭＹ）または後（＜５００ＭＹ）に進化した癌サブルーチンの出現にとって機能上重要であり、従ってより若い遺伝子に偏った年齢分布を示すという説の、このモデルから得られる２つが関連するが異なる仮説が存在する。
【００３２】
本発明者らは、１９，７５６のヒト遺伝子をＥｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ相同性データベースに従って遺伝子ファミリーに割り当てることによってそれらの進化年齢を確立することにより、第１の仮説を試験した。次いで、本発明者らは遺伝子ファミリーのヒトのメンバーの年齢を、ヒトと対応する遺伝子ファミリーにおいて代表される生物種との間の最大の系統発生的分岐時間として定めた。次に本発明者らは、正常組織および癌の両方における突然変異の頻度を各遺伝子の進化年齢の関数として調査した。正常組織では、本発明者らは、１０００ゲノムプロジェクト全ゲノム解読トリオデータ（上では「正常」と呼んでいる）から得られた１２９人の個体からのプライベートＳＮＶを解析した。一様なランダム突然変異の帰無モデルでは、所与の遺伝子についての突然変異の頻度は遺伝子の長さによって決まるため、本発明者らはより多くの突然変異を蓄積するためにより長い遺伝子を期待する。本発明者らが突然変異の頻度を進化年齢に対して厳密に考察した場合、５００ＭＹ齢未満の遺伝子は、他の年齢群と比較してより低い頻度で突然変異した。興味深いことに、本発明者らが遺伝子の長さをそれらの進化年齢に対して考察した場合、５００ＭＹよりも若い遺伝子は、全ての他の年齢群と比較して平均してより短かった。本発明者らは、１つの塩基対当たりの突然変異の期待数を決定することによってこの観察を調整し、次いで、各遺伝子における突然変異の観察数と期待数との比を計算し、倍率変化によるエンリッチメントスコアを作成した。
【００３３】
図１は、それらのサイズについて５００ＭＹよりも若い遺伝子が突然変異する可能性がより高かったことを実証している。また、遺伝子における突然変異は遺伝子外での突然変異よりも１０％低い頻度であった。ここではエンリッチメント比は、一様なランダム突然変異の帰無仮説に従う期待値に対する遺伝子の突然変異観察率（１つの塩基対当たりの突然変異）である。本発明者らは、遺伝子を後生動物以降（５００ＭＹ未満）、後生動物（５００ＭＹ〜１０００ＭＹ）および後生動物以前（１０００ＭＹ超）の年齢に対応する３つの主要な年齢群にカテゴリ化し、各群についてエンリッチメント比の分布を作成した。５００ＭＹ齢よりも若い遺伝子は正常（パネルＡ）および癌（パネルＢ）の両方において有意により頻繁に突然変異する。また、遺伝子の年齢が高くなるにつれて突然変異の頻度は低下する。ｐ値はいずれの場合も、３つの群間でのテューキーの範囲検定によって与えられるｐ値とペアワイズｔ検定比較との間で最大であるものを採用する。
【００３４】
次いで、本発明者らは、癌において同様のパターンが存在するか否かについて取り組んだ。本発明者らは、単純な体細胞突然変異および構造突然変異の両方についてコールを有する全ゲノム解読を有するＩＣＧＣのリリース１９からの７６４個のサンプルを解析した。同じ帰無モデル推定では、癌細胞における遺伝子は、ゲノムの非遺伝子領域と比較して１５％低い突然変異を有していた。従って、癌は正常組織において認められるパターンを反復しており、すなわち突然変異は大部分が遺伝子外で生じ、遺伝子内で生じる突然変異は５００ＭＹよりも若い遺伝子においてより頻繁である。
【００３５】
本発明者らは、図２に示すように、ゲノムにおいて非一様であるがランダムな分布と同等である正常組織において観察された分布に対して癌における突然変異のパターンも調査した。ここでは各ヒト遺伝子について、突然変異の期待数は正常の突然変異パターン、すなわちデータセットにおいて記録される正常の突然変異の頻度×癌突然変異の総数に基づいて得られる。従って、エンリッチメント比（ＲＥ）は、遺伝子において観察される癌突然変異と期待される突然変異の数との比として計算される。過剰突然変異した遺伝子はＲＥ＞１．５を有し、過小突然変異した遺伝子はＲＥ＜−１．５を有する。凡例における数は各遺伝子セットのサイズである。棒先端にあるバツ印（Ｘ）は、そのカテゴリが全てのヒト遺伝子のセットから無作為サンプルを抽出するブートストラップ検定に従ってｐ＜０．０１で統計的に有意である（ＢＳＱ＜１％、表１を参照）エンリッチメントを示す。下側のパネルのボックスプロットは分位数分布を示し、黒色の垂直線は中央値であり、黄色の菱形は平均であり、黒色の点は異常値である。
【００３６】
本発明者らは、正常に対して遺伝子＜５００ＭＹの過剰な突然変異はさらに一層顕著になるが、１０００ＭＹよりも古い遺伝子は典型的に過剰突然変異しないということを観察した。過剰突然変異する遺伝子の平均年齢は全ての遺伝子の平均年齢よりも有意に低く、故に第１の仮説が確認される。＜５００ＭＹの年齢群についてより詳細に調べると、本発明者らは、癌が実際には５００ＭＹよりも若い遺伝子において突然変異プロセスを大いに異常調節するように見えることを発見した。この年齢群におけるより大きな数の遺伝子は、期待数を超えるかそれに満たない突然変異を有する。これらの結果は、癌における体細胞突然変異が進化的に若い遺伝子において優先的に生じていることを示唆している。
【００３７】
癌において頻繁であって因果的に突然変異する遺伝子は全体として多細胞性の出現よりも進化的に若い（＜１０００ＭＹ）という第２の仮説を試験するために、本発明者らは、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  ＣｅｎｓｕｓにおいてＣＯＳＭＩＣによって収集されている癌において因果的に突然変異することが実証されている遺伝子の進化年齢を評価した。モデル予測とは対照的に、ＣＯＳＭＩＣ遺伝子の年齢分布の一般的な特性は全ての他のヒト遺伝子の分布とは有意に異なっておらず（図３Ａを参照）、例えば１つのサンプルとして、それは全てのヒト遺伝子の年齢分布の代表である。しかし、表１から分かるように、２つの分布間にサブグループ化の差が存在することは明らかである。ＣＯＳＭＩＣリストは以前に報告されているように、多細胞性の発生に対応する年齢（５００〜１０００ＭＹ）を有する遺伝子が豊富であり、多細胞構造を達成するように進化した機能の破壊によって癌が少なくとも部分的に促進されるという考えを支持している。この結果は、単一遺伝子疾患であるメンデル型遺伝病（ＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ）から、図３Ｂを参照）に関与する遺伝子のリストにも該当することに言及しなければならず、これは、恐らく初期多細胞性（１０００〜１５００ＭＹ）により進化した遺伝子の過剰提示を除けば癌に特有の特徴ではないことを示唆している。興味深いことに、若い遺伝子は癌および正常組織において突然変異する可能性がより高いにも関わらず、ＣＯＳＭＩＣおよびＯＭＩＭリストはどちらも５億年よりも若い年齢を有する遺伝子が枯渇している。
【００３８】
より詳細には、図３Ａは、ＣＯＳＭＩＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓからの優性（緑色）および劣性（橙黄色）遺伝子の年齢分布を示す。灰色の棒はＥＮＳＥＭＢＬにおける全てのヒト遺伝子の年齢分布を表し、青色は全てのＣＯＳＭＩＣ遺伝子の年齢分布を表す。凡例内の数は各遺伝子セットのサイズである。棒先端にあるバツ印（Ｘ）は、そのカテゴリが遺伝子エンリッチメントスコア方法およびブートストラップ検定に従って統計的に有意である（ＢＳＱ＜１％、表１を参照）エンリッチメントを示す。従って、第２の仮説では、青色の棒が＜５００ＭＹおよび５００〜１０００ＭＹの両方においてエンリッチメントにより左に偏るはずであると予測されるが、これは観察されていない。非常に若い遺伝子（５００ＭＹ未満）の過小提示および５００〜１５００ＭＹの優性遺伝子の過剰提示は統計的に有意である。劣性セットの右への明瞭な偏りは統計的に有意でもある（全ての他のセットとの平均の差についてのｔ検定はｐ＜０．０１を有する）。これは、劣性遺伝子が無作為抽出から期待されるものよりも古いということを暗示している。図３Ｂは、ＯＭＩＭデータベースからの単一遺伝子メンデル型遺伝病についての類似した年齢分布を示す。癌において観察される優性表現型と劣性表現型との間の遺伝子年齢分布における一般的なパターン、特に古い年齢への劣性遺伝子の偏りおよび非常に若い遺伝子の過小提示はこれらの遺伝子セットで反復される。この場合、中くらいの年齢の優性遺伝子の顕著な過剰提示は検出されない。そのような年齢層の癌遺伝子のエンリッチメントは、多細胞性の出現中に進化した調節機能の破壊に関連している可能性が高い。
【００３９】
ＣＯＳＭＩＣは、異なる突然変異モードを有する４５８の遺伝子、すなわち優性表現型を生じさせるために単一の突然変異対立遺伝子（３４３）を必要とするもの、および劣性表現型（１０１）を生じさせるために細胞内の全ての対立遺伝子を変化させることを必要とするものを含む。このリスト内の１２の遺伝子は明確に定められた分子遺伝学的性質を有していない。なお、優性遺伝子のセットは癌遺伝子とかなり重複しており（癌遺伝子とみなされる２６４の遺伝子のうち２６０が優性である）、腫瘍抑制遺伝子は劣性遺伝子と重複している（７２の腫瘍抑制遺伝子のうち７０が劣性である）。但し、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓの遺伝子の４分の１（１２２）超を癌遺伝子または腫瘍抑制因子のいずれかとして分類することはできないが、それらをそれらの表現型発現（優性または劣性）に従ってなお分類することはできる。
【００４０】
本発明者らは、劣性突然変異を有する遺伝子は全てのヒト遺伝子に対して有意により古いが（図３Ａ、表１）、優性突然変異を有する遺伝子は多細胞性の出現に対応する年齢で過剰提示されたということを観察した。この点において、癌は単一遺伝子疾患であるメンデル型遺伝病に類似しており（図３Ｂ）、これは優性または劣性表現型を有する遺伝子の年齢において差も示す。
【００４１】
表１は、ＣＯＳＭＩＣおよびＯＭＩＭ遺伝子の両方についての５億年の遺伝子年齢ビンのエンリッチメントスコアの一覧表である。ここでは、スコアは年齢カテゴリにおける遺伝子のエンリッチメント（＞１）または枯渇（＜１）を示す。ｐ値またはＢＳＱのいずれかによって決定される１とは統計学的に異なるスコアは太字で示されている。
【表１】
2019535081.tif 000003
ａエンリッチメントおよびｐ値はＺｅｅｂｅｒｇら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００３；４：Ｒ２８）において示されているように計算し、エンリッチメントスコアは、カテゴリに含まれる全てのヒト遺伝子の割合で割ったカテゴリのリスト内の遺伝子の割合である。ｐ値はフィッシャーの正確確率検定によって計算し、次いでＲのｓｔａｔｓパッケージのｐ．ａｄｊｕｓｔ関数で実行されるＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇの方法を用いる多重比較のために調整した。太字のスコアは０．０５未満のｐ値を有する。
ｂブートストラップ分位数（ＢＳＱ：Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  ｑｕａｎｔｉｌｅ）スコア：所与の遺伝子セットのために、同じサイズの１０，０００の無作為サンプルを１９，７５６の時系列ヒト遺伝子を親リストから非復元抽出し、それぞれ１つについて年齢分布を計算する。年齢群のＢＳＱスコアは、実際の観察される頻度値がサンプル抽出集団において対応する年齢群に含まれる百分位数である。故に、１％未満の任意のＢＳＱ値はその観察が無作為抽出によって全くあり得ないことを示す。
【００４２】
古くからの劣性遺伝子はＤＮＡ修復および細胞周期制御のために豊富である：癌を引き起こす遺伝子は最も高い頻度の突然変異を有する年齢ビンにおいて過小提示されるという逆説は、劣性遺伝子に対して優性遺伝子の機能を決定することによって明らかにされる突然変異の頻度の変化を説明する根底にある機構が存在し得ることを示唆している。背景リストとして全てのヒト遺伝子を使用するＤＡＶＩＤを用いるＣＯＳＭＩＣ遺伝子の機能アノテーションおよびエンリッチメント解析により、優性突然変異を有するＣＯＳＭＩＣ遺伝子が転写因子および転写調節、免疫系の発達、受容体チロシンキナーゼおよびシグナル伝達、「幹細胞性」および形態形成のために豊富であることが明らかになった。劣性表現型を有するＣＯＳＭＩＣ遺伝子は、ＤＮＡ修復および細胞周期制御に関連する機能のために豊富であり、９億５千万年よりも古い年齢を有する遺伝子は図４に示すようにそのようなエンリッチメントを促進した。ここでは、ネットワークにおける各ノードはＤＡＶＩＤにおいて戻されるような機能的に関連する遺伝子のグループを表す（遺伝子オントロジー、オルソロジー、機能アノテーションなど）。ノードのサイズはその中の遺伝子の数を表す。ノード間のリンクは、グループ間の遺伝子の重複を表し、その幅は遺伝子の数を表す。ノードの色は、遺伝子グループのクラスター化のさらなる層を明らかにする凡例において定義されている一般的な機能カテゴリを示す。ｐ＜０．００２およびＦＤＲ＜０．０５であるノードのみがプロットされている。
【００４３】
その結果は非常に顕著であったため、比較のために使用される背景リスト（劣性癌遺伝子、全ての癌遺伝子または全てのヒト遺伝子）に関わらず持続した。ＤＮＡ修復に関与する劣性表現型を有する遺伝子は、特に二本鎖切断（ＤＳＢ）修復およびヌクレオチド切断修復機構に集中していた。これらのプロセスに関与する遺伝子の進化史を見て、本発明者らは、ＲＥＶ１、ＲＥＶ３Ｌ、ＰＯＬＫ、ＰＯＬＨ、ＰＯＬＩ、ＰＯＬＤ１、ＤＭＣ１およびＰＯＬＤＩＰ２などの同じＤＮＡ修復経路内の突然変異していない遺伝子はストレスに対する適応的突然変異応答の根底にある細菌の遺伝子とオルソロガスであることに気づいた。二本鎖切断の感知後のＳＯＳ応答の開始により、細菌が高忠実度の複製および修復から誤りがちな修復に切り替わるにつれて、ＤＳＢの近くにおいて一塩基対突然変異および遺伝子増幅イベントの両方の割合の増加が生じる。
【００４４】
癌はストレス誘導性突然変異誘発の分子シグネチャーを示す：細菌における適応的突然変異プロセスにより、各ＤＳＢの周りにＳＮＶのクラスターの形態の分子指紋が生じる。注目すべきことに、ＳＮＶクラスターは実際に癌において報告されているが、これらの報告では一様なランダム突然変異のモデルに関する進化史またはゲノム分布をこれまでのところ考察することができていない。クラスターの有無は、ゲノム進化と生物および細胞段階での選択との相互作用によって制約されることがあるため、これは重要である。これらの欠点に対処するために、本発明者らは、ＤＳＢの証拠を示した全ゲノム解読データ（ＩＣＧＣリリース１９）を使用した。次いで本発明者らは、各サンプルにおいてＳＮＶがクラスター形成したか否かを評価した。７つの異なる部位（膵臓、前立腺、骨、卵巣、皮膚、血液および脳）からの７６４個の腫瘍サンプルのうち、６６８個（８７．４％）がＳＮＶのクラスター形成の証拠を有していた。これらのクラスターは必ずしも、１ｋｂ以下の突然変異間距離を有する６つ以上の突然変異として定義されるカタエギスを表すわけではないが、クラスター形成の定義はカタエギスイベントをキャッチする。クラスター形成が癌における体細胞突然変異の特性であるか否か、あるいは一般に突然変異の根底にある基本的プロセスを表すか否かを評価するために、本発明者らは対照として１０００のゲノムからの正常データに対して同じ解析を行った。驚くべきことに、全ての正常サンプルもＳＮＶのクラスター形成の証拠を有していた。
【００４５】
本発明者らはサンプル、例えばクラスターが生じる可能性がより高いゲノムの領域全体を考察した際に、クラスターの「ホットスポット形成」を示唆する正常および癌の両方のゲノム全体にわたってクラスターの非ランダムな空間分布において特徴的な差を観察した。本発明者らは、サンプル全体にわたるクラスターホットスポット形成の領域を同定し、それらの領域における遺伝子の年齢ならびにそれらの領域が進化的再利用切断点領域（ＥＢＲ：ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅ−ｕｓｅｄ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）または有羊膜類相同シンテニーブロック（ＨＳＢ：ａｍｎｉｏｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｙｎｔｅｎｙ  ｂｌｏｃｋ）と重複しているか否かを見て、それらの領域の進化史を調査した。ＥＢＲは、有羊膜類進化中に構造再配置を繰り返し受けたゲノムの領域である。対照的に、ＨＳＢは、生物種全体にわたる有意な配列同一性だけでなく遺伝子順序も示す領域であり、従ってゲノム進化を通してインタクトなブロックとして移動した保存された配列の領域を表す。これに基づいて、本発明者らは、ＥＢＲの遺伝子はＨＳＢの遺伝子よりも若いと予測する。先行研究は、ＳＮＰがＨＳＢよりもＥＢＲにおいてより多く認められることを実証した。従って本発明者らは、クラスターホットスポットがＥＢＲと共局在化し、ＨＳＢにおいて可能性がより低く、かつＣＯＳＭＩＣ遺伝子において豊富であることを期待することができる。
【００４６】
ヒト遺伝子を「後生動物」（１０００ＭＹ齢未満）または「後生動物以前」（１０００ＭＹ齢超）のいずれかとして分類する場合に、本発明者らは、後生動物以前の遺伝子のセットはＨＳＢと重複し、かつＥＢＲから排除されていることを発見した。表２は、遺伝子年齢およびＣＯＳＭＩＣ遺伝子状態とゲノム再配置のための進化的に重要な領域との関連を示し、ここでは＞１のオッズ比はエンリッチメントを示し、＜１のオッズ比は枯渇を示す（ＨＳＢ：相同シンテニー領域；ＥＢＲ：進化的再利用切断点領域）。後生動物遺伝子は、ＨＳＢから排除され、かつＥＢＲにおいて豊富である正反対のパターンを有していた。ＣＯＳＭＩＣリスト上の遺伝子はＨＳＢに優先的に位置し、かつＥＢＲから排除されていた。
【表２】
2019535081.tif 000004
【００４７】
正常サンプルにおける突然変異を考察する際は、その解析が全てのＳＮＶクラスターを含んでいたのか、あるいは遺伝子と重複しているものだけを含んでいたか否かに関わらず、クラスター化ホットスポットはＥＢＲと共局在化し、かつＨＳＢから排除されていた。表３は、正常な末梢血におけるゲノム再配置のための進化的に重要な領域を有するクラスターホットスポットの共局在化を示す。ここでは、プライベートＳＮＶ（トリオ比較により決定）のゲノム全体にわたるクラスター化ならびに遺伝子と重複していたクラスター化のみ（ＨＳＢ：相同シンテニー領域；ＥＢＲ：進化的再利用切断点領域）を見て、その比較を実行した。
【表３】
2019535081.tif 000005
【００４８】
そのリスト内の遺伝子は、他の遺伝子と比較してクラスターを有する可能性が僅かにより高かったが（オッズ比ＯＲ＝１．３８９、９５％信頼区間ＣＩ＝１．１２４−１．７２４、ｐ値＝０．００１９２）、ＣＯＳＭＩＣ遺伝子は正常サンプルにおいてホットスポット領域から排除されていたことに注目すべきである。これは、癌が正常な環境下で僅かにのみより突然変異しやすいゲノムの一部における摂動によって促進されることを示唆している。さらに、正常サンプルにおけるクラスターホットスポットは、より若い遺伝子と重複していた（ホットスポット外の１３８０ＭＹに対してホットスポット内の１１５７ＭＹ、ｔ検定＝−９．８９２７、ｄｆ＝２８２５．４、ｐ値＜２．２×１０−１６）。ＳＮＶクラスターホットスポット形成の証拠を示す遺伝子は、嗅覚受容体、糖タンパク質、Ｃ型レクチン、酸化還元酵素機能、ステロイド代謝／チトクロームＰ４５０機能、セリンプロテアーゼ、酸素結合および色素タンパク質において豊富であった。表４は、遺伝子と重複するクラスターに基づいて、正常な末梢血および腫瘍の両方におけるＣＯＳＭＩＣ遺伝子のクラスターホットスポットとの重複（すなわち、クラスターのクラスター化）を示す。
【表４】
2019535081.tif 000006
【００４９】
他方、癌サンプルにおいて観察される突然変異では、クラスター化しているホットスポットは典型的にはより若い遺伝子と重複していた（ホットスポットにおける平均遺伝子年齢はホットスポット外の遺伝子の１３６０ＭＹ齢に対して１０３５ＭＹ齢であった、ｔ＝−１０．４１２、ｄｆ＝１００７．８、ｐ＜２．２．×１０−１６）。正常データとは異なり、ＨＳＢまたはＥＢＲのいずれかとのホットスポットの重複は、当該解析に含まれるクラスターに依存していた。ゲノム規模では、ホットスポットはＨＳＢから排除されていたが、遺伝子と重複していたクラスターの中には排除もエンリッチメントも存在しなかった。遺伝子と重複するクラスターのみを考察した場合、ホットスポットはＥＢＲにおいてより多く認められた。但し、本発明者らがゲノム全体にわたって全てのクラスターを解析した場合、ホットスポットはＥＢＲから優先的に排除されていた。正常データと同様に、ＣＯＳＭＩＣ遺伝子は癌においてクラスターホットスポットから排除されていた。但し、ＣＯＳＭＩＣ遺伝子は、他の遺伝子と比較してほぼ２倍でクラスターを含んでいる可能性がより高かった（ＯＲ＝１．８７３、９５％ＣＩ：１．５４６−２．２７２、ｐ値＝４．３８６×１０−１１）。これは、クラスターホットスポットが進化によりゲノムに対して課せられる制約によって促進され、かつクラスター形成の機構により通常は進化的に立ち入り禁止区域であるゲノム空間において突然変異を生じさせることができることを示唆している。ホットスポットにおいてクラスターと重複する遺伝子の機能エンリッチメントは癌においても異なっていた。
【００５０】
癌におけるホットスポットは、細胞外糖タンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、特に嗅覚受容体、細胞間接着、細胞膜に固有の分子種、ＩｇおよびＥＧＦ様ドメイン、リガンド開口型イオンチャネル、細胞膜傷害複合体成分／パーフォリン、補体９、カドヘリン、Ｓｕｓｈｉドメイン、カリウムチャネル、Ｋａｚａｌプロテイナーゼ阻害剤、フィブロネクチンＩＩＩ、グリコシル化、糖タンパク質、タンパク質を加水分解して排出する機構ならびに最後にＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩが豊富である遺伝子と共局在化していた。
【００５１】
興味深いことに、若い遺伝子のホットスポットエンリッチメントは、本発明者らが正常および癌データの両方について突然変異していた遺伝子の年齢分布を比較した際に、さらに一層明らかであった。図５Ａは、正常サンプルデータにおいて突然変異していた全ての遺伝子の年齢分布（青色）、一様なランダム分布から期待されるような中立レベルの突然変異を有する遺伝子（緑色）およびホットスポット内の遺伝子（橙黄色）を示す。灰色の棒は全てのヒト遺伝子の年齢分布を表す。凡例内の数は各遺伝子セットのサイズである。バツ印（Ｘ）は、そのカテゴリにおけるエンリッチメントがブートストラップ検定に従って統計的に有意である（ＢＳＱ＜１％）ことを示す。下側のパネルのボックスプロットは分位数分布を示し、黒色の垂直線は中央値であり、黄色の菱形は平均であり、黒色の点は異常値である。図５Ｂは、癌データのための同等のプロットを示す（ＩＣＧＣリリース１９）。両方のプロットにおいてホットスポットに関与する遺伝子（赤色）の年齢分布を観察すると、それらの非常に大きな割合は非常に若い（５００ＭＹ未満）。これは、それらが一般に全ての観察される突然変異のセットにおいて過小提示されているという事実にも関わらず、ゲノムにおいてホットスポット形成を生じさせる突然変異活性がより若い遺伝子を優先的に攻撃していることを示唆している。
【００５２】
実際には、同じグループの遺伝子が一般的な突然変異のために有意に過小提示されているという事実にも関わらず、より若い遺伝子がホットスポットと重複する遺伝子のセットにおいて大いに過剰提示されているということが観察された。若い遺伝子が顕著により短いという事実と組み合わせて、これらの観察は、若い遺伝子における突然変異のパターンが標的にされ、場合によってはいくつかの形態の制御下で、ゲノムにおいてクラスターホットスポットを生成するどんな機構にも強力に曝されることを示唆している。
【００５３】
ＩＩ．機構的考察
【００５４】
ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーのシトシンデアミナーゼの作用は突然変異クラスター形成に寄与することが知られているが、ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣシグネチャーは、癌ゲノムにおいて観察されるクラスターの５０％を説明することができない。ＳＯＳ応答を開始するのに十分なさらなる細胞ストレスのコンテキストで二本鎖切断（ＤＳＢ）がＤＮＡにおいて生じる際に、細菌におけるストレス誘導性突然変異誘発が生じる。これにより、ＤｉｎＢによって促進される突然変異クラスター形成が生じ、ここでは突然変異の存在量がＤＳＢからの距離の関数として減衰するが、１ＭＢまでの離れた場所でも背景突然変異誘発率を超えたままである。ヒトにおいては、ＤｉｎＢとオルソロガスである遺伝子は損傷乗り越え合成（ＴＬＳ）に特化するようになった。大部分の腫瘍を特徴づける細胞周期の異常調節およびＤＮＡ修復は、癌におけるＴＬＳの必要性を論理的に増加させる。従って本発明者らは、癌におけるストレス誘導性突然変異誘発はＴＬＳによって促進されるＳＮＶの尖ったクラスターを生じさせるという仮説を立てた。
【００５５】
以下では、本発明者らは、ＩＣＧＣデータベース（リース１９）のＷＧＳからの体細胞突然変異および構造多様体コールならびにＷＧＳを有する１０００ゲノムプロジェクトにおける１３０トリオに由来するプライベート新生突然変異を有する７６４の症例からのデータを使用した。ＳＮＶコンテキストは参照および突然変異対立遺伝子の両方に基づいて決定し、１つの機構（ＴＬＳ、ＡＰＯＢＥＣまたはＡＩＤ）のみを割り当てることができる場合にコールし、これによりＴＬＳイベントの実際の数を過小評価した。本発明者らは、癌における新生プライベート突然変異および体細胞突然変異の両方においてＳＮＶの総数が増加するにつれて、クラスターの数、クラスターにおけるＳＮＶの割合およびクラスターの平均サイズも増加するということを観察した。
【００５６】
正常では、クラスターにおいて生じているＳＮＶの１５．２％の中央値は、ＡＰＯＢＥＣおよびＡＩＤのそれぞれの０．５３％および１．６％と比較して、ＴＬＳを示す配列コンテキストにおいて生じる。対照的に、癌ではＴＬＳはクラスターにおけるＳＮＶの３０．６％の中央値を占める。ＡＰＯＢＥＣおよびＡＩＤはそれぞれ２．３％および２．６％を占める。本発明者らは、ストレス誘導性不均一性（ＳＩｔＨ）スコアという名前の経験的な累積分布に基づくクラスター形状の尺度を考案した。そのスコアは−１〜１の範囲であり、どの程度鋭く尖ったクラスターであるかを定量化し、ここでは、より多くの正数は推定上のＤＳＢに対する距離における突然変異負荷のより速い減衰を示す。正常では、ＳＩｔＨスコアは０．４５７〜０．５７８の範囲であり、中央値は０．５０４である。癌では、ＳＩｔＨスコアは０．１７〜０．９９９の範囲であり、その中央値は０．４６であり、臓器部位によって有意に変化する（ＡＮＯＶＡ、Ｆ＝４４．９６、ｐ＜２．２×１０−１６）。本発明者らは、その特定のコンテキストにおいて単にＳＮＶに由来し、かつ変数として臓器部位を含むＳＩｔＨスコアの追加の線形モデルを用いて、ＴＬＳ、ＡＰＯＢＥＣおよびＡＩＤのＳＩｔＨスコアへの寄与をさらに評価した。注目すべきことに、本発明者らは、正常および癌の両方においてＴＬＳがＳＩｔＨスコアに有意に寄与する唯一のコンテキストであるいうことを見出した。従って、本発明者らは、癌において認められたクラスター形成は主にＴＬＳによって促進され、かつこれらのクラスターはストレス誘導性突然変異誘発のプロセスに典型的な形状を有すると結論づける。
【００５７】
本発明者らは各種解析に基づき、ＴＬＳがＡＰＯＢＥＣまたはＡＩＤよりも鋭く尖ったクラスターに寄与するということを今発見した。このコンテキストにおいて、当然のことながらＴＬＳポリメラーゼの多くならびにＡＰＯＢＥＣおよびＡＩＤは、以下の表５に例示的に列挙されているような配列特異的コンテキストならびに特徴的な突然変異プロファイルの両方を有する。
【表５】
2019535081.tif 000007
【００５８】
従って本発明者らは、正常サンプルおよび癌サンプルの両方で同定される全てのＳＮＶの配列コンテキストを調査して、観察されるクラスターの形状に寄与する潜在的な突然変異機構を同定した。このパターンへの突然変異コンテキストの相対的寄与は複雑である。正常組織では、図６から分かるように比例的にクラスター中に存在するＳＮＶの数は比較的一定であり、中央値は３５．５％（範囲：３０．６〜４１．７％）であり、ここでは突然変異負荷が正常組織からの新生プライベート突然変異において増加した場合、クラスターにおけるＳＮＶの割合は一定のままである。図７から分かるように、クラスターにおけるＳＮＶの約１５．２％がＴＬＳコンテキストにおいて生じ（１３．２〜１９．４％）、クラスターにおけるＳＮＶの割合に対して一定である。ここでは、そのグラフはクラスターにおけるＳＮＶの割合が正常組織からの新生プライベート突然変異において増加する場合にＴＬＳコンテキストを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合が一定のままであることを示す。破線は２つの測定値間の１：１の割合の増加を表す。ＡＰＯＢＥＣは０．５３％（０．３６〜２．１％）を占め、ＡＩＤは別の１．６％（１．２〜２．４％）を表す。ここでは、図８および図９から分かるように、これらのパターンはどちらもクラスターにおけるＳＮＶの割合に対して一定である。癌では、クラスターにおけるＳＮＶの割合は３．３％の中央値（０〜８２．８％、図５）により変化する。ＴＬＳコンテキストはクラスターにおけるＳＮＶの３０．６％の中央値（０〜１００．０％、図６）を占める。ＡＰＯＢＥＣは２．３％の中央値（０〜５０．０％、図７）を有し、ＡＩＤは２．６％の中央値（０〜３３．３％、図８）を有する。正常および癌の両方において、ＴＬＳコンテキストを有するＳＮＶはＡＰＯＢＥＣまたはＡＩＤのいずれかよりもクラスター形成に寄与する。
【００５９】
図１０は、突然変異負荷が腫瘍からの体細胞突然変異において増加する場合にクラスターにおけるＳＮＶの割合が原発組織と共に変化することを例示的に示し、図１１は、クラスターにおけるＳＮＶの割合が癌における体細胞突然変異において増加する場合にＴＬＳを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合が増加することを示す。破線は２つの測定値間の１：１の割合の増加を表す。図１２は、クラスターにおけるＳＮＶの割合が増加し、かつ癌における体細胞突然変異では原発組織に依存する場合に、ＡＰＯＢＥＣを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合が変化することを例示的に示し、図１３はクラスターにおけるＳＮＶの割合が増加し、かつ癌における体細胞突然変異では原発組織に依存する場合にＡＩＤを有するクラスターにおけるＳＮＶの割合が変化することを実証している（図１１〜図１３の破線は２つの測定値間の１：１の割合の増加を表す）。
【００６０】
６６８個の腫瘍のための総ＳＩｔＨスコアを全ゲノム解読データから計算した（ＩＣＧＣ、リリース１９）。図１４から分かるように、そのスコアは０．０９〜０．９９６の範囲であり、臓器部位によって有意に異なっていた（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝５．６４×１０−１５）。臓器部位を調整した後、本発明者らは、ＳＩｔＨスコアにより患者生存を予測することができるが、そのサンプルが原発性腫瘍であるか否か、あるいは転移であるか再発であるか否かに応じて異なる効果を有するということを発見した。最も注目すべきことは、原発性腫瘍では、より大きな正のＳＩｔＨスコアはより良好な患者生存を予測する（コックス比例ハザード回帰、危険率（ＨＲ）＝０．１８５７、９５％ＣＩ：０．０６４７８〜０．５３２２、ｐ＝０．００１７３、図１５）。しかし、再発および転移性腫瘍をグループとして考察する場合、ＳＩｔＨスコアはＨＲが２８．３２である場合により悪い生存を予測する（コックス比例ハザード回帰、９５％ＣＩ：３．１９〜２５１．３、ｐ＝０．００２６９、図１６）。従って、患者の疾患の治療状態の知識はスコアを予測する際の重要因子である。
【００６１】
別の視点から見ると、図１７に例示的に示されているように、ＴＬＳは全体的に見てより大きな数のＳＮＶに寄与し、かつＡＰＯＢＥＣまたはＡＩＤのいずれかよりもクラスターに寄与する。ＴＬＳは正常において認められるＳＮＶの約１５％に寄与し（パネルＡ）、かつ癌においてはＳＮＶの約４５％近くになる（パネルＢ）。この量はＳＮＶの総数が増加する場合であっても一定のままである。ＴＬＳモチーフを有するクラスターにおけるＳＮＶの数はゲノム規模で分布を反映している（パネルＣおよびＤ）。
【００６２】
例示的な計算：本発明者らは、癌サンプルからの全ゲノム解読データにおいて適応的突然変異表現型の証拠を検出するための一連のツールを企図する。この表現型に関連する分子機構は、推定上の二本鎖切断イベントの中心にある一塩基対突然変異（ＳＮＶ）の正規分布および約二百キロベースの対応する減衰距離を有する分子指紋を生成することが期待される。構造再配置の修復は典型的に一塩基多様性の補正よりも効率的であるため、二本鎖切断それ自体はゲノムのデータにおいて検出されない場合があるが、ＳＮＶクラスター化の証拠は誤りがちな修復機構の痕跡としてなお存在する。従って、ＳＮＶのクラスター化されたグループの質量中心の周りの突然変異の頻度の減衰は、その解析を二本鎖切断（ＤＳＢ）の周りのＳＮＶ分布の検出に限定せずに同定する。
【００６３】
多様性データの準備：ＷＧＳからの構造的および単一体細胞（ＳＳＭ）多様体データをこの解析のために考察する。より具体的には、構造変化およびコピー数多型の両方をＤＳＢと呼ぶが、突然変異体とワイルド参照配列とのレーベンシュタイン距離が２塩基よりも大きいＳＳＭイベントをＤＳＢと呼び、それ以外をＳＮＶと呼ぶ。先の分類規則に対する例外とみなされるが、突然変異がＮＮＮ  ＡＧ（Ｃ｜Ｔ）またはＧＮＮ  ＣＡＧ形態である場合にそれをＳＮＶと呼ぶ。ＤＳＢを２つの異なるイベント、すなわち異なる染色体に存在する可能性のある開始および終了位置として考察する。ＳＮＶは一塩基上に局所化される単一のイベントであり、そのイベントが１塩基超の長さである場合に開始位置を使用し、ヒトゲノムの公知の体細胞超突然変異領域（ＳＨＭ）に位置する観察されるイベントは当該解析から捨てられる。
【００６４】
突然変異の頻度および突然変異対立遺伝子の頻度：ＷＧＳデータのセット全体にわたって、固有のゲノム座標および特定の突然変異パターンによって与えられ、かつ固有の鍵識別子でアノテートされる全ての固有の突然変異を計数する。サンプル集団全体における各突然変異の頻度を推定し、適応的突然変異表現型のコンテキストの中に入れることができる。各サンプルにおける各多様性についても、総読み取り数および突然変異対立遺伝子読み取り数を考慮して、サンプル内の突然変異対立遺伝子の読み取り頻度を推定する。これを使用して同じ突然変異イベント中に生じた可能性のある相関する多様体を同定することができる。
【００６５】
進化史との関連性を有するゲノムの領域：本発明者らの一連の解析中にヒトゲノムの進化的切断点領域（ＥＢＲ）および相同シンテニーブロック（ＨＳＢ）を考慮する。このために、これらの領域をそれらの座標に基づいて定め、これらの領域における帰属関係について多様性イベントをアノテートする。さらに、遺伝子領域に重複しているイベントもアノテートする。
【００６６】
突然変異モチーフ解析：突然変異位置の各方向で１０塩基のコンテキストを用いて、突然変異体をそれらの対応するワイルド参照配列と比較する。これは各突然変異パターンをＴＬＳ、ＡＰＯＢＥＣおよびＡＩＤ機構に特異的なモチーフと一致させるために行う。この方法は、各多様性においてワイルド配列および突然変異体配列の両方を有する規則的な発現を評価する工程と、それに応じて各モチーフの一致をアノテートする工程とを含む。以下の表６に示すように一致規則を実行することができる。
【表６】
2019535081.tif 000008
【００６７】
突然変異クラスターの検出：少なくとも３つの多様性を含み、任意の２つの連続する多様性間の距離が２５ｋｂ未満であり、かつそのようなグループ化を偶然に発見する確率がゲノムにおける総突然変異観察率によって与えられる負の二項回帰に従って０．０１未満である場合に、ＳＮＶのグループをクラスターの一部であると決定する。具体的には、クラスターは以下のように構築される。
【００６８】
連続する近い多様性のグループ（＜２５ｋｂの多様性間距離を有する）を発見する。いずれの場合も本発明者らは、クラスターにおけるＳＮＶ多様性の数を「サイズ」と呼び、塩基対において与えられるゲノム空間におけるクラスターのスパンを「長さ」と呼ぶ。
【００６９】
所与のグループが少なくとも３つのＳＮＶイベントのサイズを有する場合に、そのクラスター化の有意性（ｐ値）を試験することができる：
・ｋは、第１のイベント後のこのクラスターにおけるイベントの数である；ｋ＝（サイズ）−１
・ｘは、クラスターにおける「失敗」の数である；ｘ＝（長さ）−（ｋ＋１）
・ｐは、ゲノムにおける単位塩基当たりの突然変異観察率である。
・負の二項分布（ＮＢ）は、指定された数ｘの失敗が生じる前の確率ｐの独立し、かつ同じく分散されたベルヌーイ試行の配列における成功数ｋの離散的確率分布である。関数ＮＢｘ，ｐ（ｋ）は台ｋを有し、ＣＮＢｘ，ｐ（ｋ）は対応する累積分布関数であり、Ｉｐは正規化された不完全なベータ関数である：
【数１】
2019535081.tif 000009
・ＣＮＢｘ，ｐ（ｋ）に従うクラスターのｐ値が、ＳＮＶが統計学的に期待されるよりも互いに近いことを示す０．０１未満である場合、そのグループをクラスターとしてカテゴリ化する。
・ｐ値が０．０１未満でなく、かつグループサイズが３よりも大きい場合、グループの最後のメンバーを脱落させ、少なくしたグループを用いて再度ｐ値を評価する。
・有意なグループが見つかるか残りのグループのサイズが３未満になるまで、最後の工程を繰り返す。
・各ＷＧＳサンプルにおいて近いＳＮＶの全ての可能なグループをこのように評価し、かつ有意なクラスターを同定し、固有の鍵で記録するが、いずれの場合も「質量中心」（クラスター質量中心のゲノム位置）を計算し、開始および終了位置、サイズおよび長さのような他の特性と共に集計する。
【００７０】
クラスター形状の検出：ストレス誘導性不均一性（ＳＩｔＨ）のコンテキストでは、本発明者らは、クラスター中心を背景レベルを超える頻度を有する多様性の蓄積を誘導した推定上のＤＳＢである可能性が高い位置として処理した。従って、ＳＩｔＨのシグネチャーは、そのような中心の周りにより高い濃度の突然変異を有し、かつそこから距離が離れるにつれて対応する減衰が生じるものとして明らかなものでなればならない。ＳＮＶの全てのクラスターを同定したら、ＳＮＶイベントの累積分布Ｆ（Ｘ）をクラスター質量中心から２５０ｋｂまでの距離の関数Ｘとして計算する。ＳＮＶイベントの分布が一様にランダムであり（従ってクラスター中心から離れるにつれて減衰しない）という帰無仮説を採用すると、イベントのＳＮＶの累積数は評価距離と共に比例的に増加することが期待される。なお、このプロセスで考察されるイベントはクラスターにおけるイベントのみに制約されないが、２５０Ｋｂの距離までのクラスターの中心の周りの全てのイベントに制約される。距離を２５０ｋｂで正規化し、かつ累積分布を２５０ｋｂよりも近いイベントの数で正規化して、本発明者らは全てのクラスター累積分布曲線を単位２Ｄボックスにマップする：
【数２】
2019535081.tif 000010
【００７１】
帰無仮説は恒等関数ｆ（ｘ）＝ｘとして表されるものであり、例えば、中心までのサイズの半分の間隔（ｘ＝０．５）は全長において観察されるイベント数の半分を含む（すなわち、ｆ＝０．５）など。
【００７２】
異なるクラスター中心は互いに２５０ｋｂよりも近い可能性がある。従って、累積分布を構築するために使用される間隔にある多様性は、慎重に行われない場合に原理上２重にカウントされることがあり、紛らわしい結果を引き起こす。この問題を回避するために、ゲノム空間を２５０ｋｂと連続するクラスター間の半分の距離との間の最小数によって定められるクラスター間隔「ドメイン」によりモザイク状にした。ｘの正規化は、全てのクラスター間の一定の長さスケールを維持するために２５０ｋｂに維持する。
【００７３】
検出されるＤＳＢの位置も有することを考慮すると、それらの位置に基づいて同じプロセスを行うことができる。この場合、修復されてないＤＳＢの周りの減衰が検出されるであろう。
【００７４】
本発明者らは、この方法の後に２種類の累積分布を構築した。１つは個々のクラスターのスケールで構築したものである。また、各ＷＧＳサンプルにおいて観察される全ての累積分布を一緒にまとめることによって、代表的な総曲線を作成することができる。全てを各サンプルにおいて観察される曲線Ｆ（Ｘ）に追加することによって正規化し、かつ次いで中心から２５０ｋｂ以内で観察されるイベントの総数によって正規化することにより、これを行う。サンプルごとに得られる曲線は、中心から特定の距離ｘだけ離れているＳＮＶ多様性を観察する確率がいくつであるかを示す。
【００７５】
ＳＩｔＨスコア：上記観察を考慮して、本発明者らは、以下のように正規化された累積分布ｆ（ｘ）と期待値ｘとの差を積分することにより、帰無仮説（すなわち、その多様性は一様に分散されている）からの逸脱の程度の尺度を定めた：
【数３】
2019535081.tif 000011
【００７６】
この尺度は、ｘに対してｆ（ｘ）をプロットすることにより例示することができる。帰無仮説は対角線ｙ＝ｘによって表される。Ｓの値はｆ（ｘ）と恒等関数との間の（符号付き）面積であり、次いでＳＥ［−１，１］として基準化するために２を掛ける。Ｓが１に近づくにつれて、起点に近いより小さい窓はランダム一様分布から期待されるものよりも多くのイベントを含み、これはＳＮＶイベントがクラスター中心の近くに集中し、かつ距離と共に急激に減衰することを示す。負の値はイベントが典型的に質量中心から枯渇し、かつクラスターのエッジで集中すること示し、ゼロに近いＳの値は、イベントの濃度が主として２５０ｋｂの間隔長さにわたって一様であることを示し、これは帰無仮説を支持するものである。本発明者らは、これを体細胞ＳＮＶの分布のＳＩｔＨスコアを呼ぶ。必要とされる解析レベルに応じて、本発明者らはクラスター特異的ＳＩｔＨスコアおよび総ＳＩｔＨスコアの両方を作成する。一般にクラスターＳＩｔＨスコアは少数のイベントを用いて計算する傾向があるため、大きく揺動することがある。従って、これらのスコアは、ゲノムの異なる部分において生じているプロセスの不均一性を扱うのには良いが、統計誤差を生じやすい。他方、サンプルの総ＳＩｔＨスコアはよりロバストであり、かつサンプルの良好な全般的説明を行うが、単一サンプル内の不均一性が分からない場合がある。
【００７７】
特に、企図される方法および計算により癌におけるストレス誘導性突然変異誘発の同定が可能になることを理解すべきである。有利には、本発明の主題に係る方法および計算は、ＡＩＤまたはＡＰＯＢＥＣシグネチャーのみの解析よりも実質的に正確であり、一般的な機構的イベント（すなわち、ストレス誘導性突然変異応答に対する先祖返り）に基づく包括的突然変異解析も提供する。本明細書に記載されているＳＩｔＨスコアは数ある利点の中でも、原発性腫瘍ならびに再発性癌および転移における患者生存の予測にも適し得る。さらに、癌治療における治療投与量は、ストレス誘導性突然変異応答として検出可能な検出されるストレスレベルに基づいて調節することもでき、次いでこれをＳＩｔＨスコアによって定量化する。例えば投与量は、最大耐性用量からストレス誘導性突然変異応答を誘発するのに有効であって、次いで患者の免疫系によって攻撃することができるより多くのエピトープを産生するのに十分であり得る用量まで減少させることができる。
【００７８】
累積関数Ｆ（Ｘ）の構築段階（すなわち、クラスターが定められた後）で異なるフィルタを適用することができるため、コード領域（遺伝子）の内もしくは外でのみ生じるイベントまたは特定の突然変異モチーフを提供するイベントに特異的なＳＩｔＨスコアを推定することができる（以下を参照）。ＳＩｔＨスコアは、検出されるＤＳＢの中心にある間隔を参照して計算することもできる。総ＳＩｔＨスコアでは、伝搬誤差は以下のとおりである（計数統計誤差を想定している）：
【数４】
2019535081.tif 000012
【００７９】
ホット／コールド領域：全てのサンプルからのクラスターデータを考察して、特定のセットのサンプルにおいて観察されるクラスターを有する可能性が高いまたは低いゲノムの領域を決定する。例えば、各染色体を２５０ｋｂのビンの中に分けることができ、サンプル全体の数を３つの異なる方法、すなわち各ビンにおいて観察されるクラスター中心の総数、各ビンにおいて観察されるクラスターのＳＮＶの総数および各ビンにおいて観察されるクラスターにおけるＤＳＢの総数で集計する。
【００８０】
いずれの場合もｐ値はビンごとに二項検定に従って計算する。
【００８１】
染色体における総イベント観察率（＝全てのビンに跨る全てのイベント／染色体の長さ）ｐ、ビンサイズｘ＝２５０ｋｂのために、ｋ個のイベントの確率密度が以下によって与えられる：
【数５】
2019535081.tif 000013
【００８２】
ｋ個以下のイベントを発見する確率は、以下によって与えられる：
【数６】
2019535081.tif 000014
【００８３】
ｋ個以下のイベントする発見する確率：
【数７】
2019535081.tif 000015
【００８４】
従って各ビンについて、ｋ＜ｐ・ｘ（イベントの期待数）である場合にｐ値はＣＢ−ｘ，ｐ（ｋ）であり、それ以外の場合にＣＢ＋ｘ，ｐ（ｋ）である。第１の事例では、ｐ値が＜０．０１である場合にビンは統計的に有意なイベントの枯渇を有し、これをコールドビンと呼ぶ。同じように第２の事例では、ｐ値が＜０．０１である場合にビンは統計的に有意なイベントの豊富さを有し、これをホットビンと呼ぶ。連続するコールドビンおよび連続するホットビンは全て互いに結合してコールドおよびホット領域を形成する。全ての他のビンを中立領域と呼ぶ。従って、ホットおよびコールド領域は、サンプルのセット全体を占めるクラスターイベントの存在量を超えるものまたはそれに満たないものを指す。
【００８５】
なお、コンピュータに関するあらゆる言語は、個々またはまとめて動作するサーバ、インタフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラまたは他の種類のコンピュータ装置などの、コンピュータ装置のあらゆる好適な組み合わせを含むように解釈されるべきである。これらのコンピュータ装置は、タンジブル、非一時的コンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に格納されているソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを備えることを理解すべきである。これらのソフトウェア命令は好ましくは、本開示の装置に関して以下で考察されているようにコンピュータ装置を役割、責任または他の機能を提供するように構成する。特に好ましい実施形態では、各種サーバ、システム、データベースまたはインタフェースは、場合によりＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開秘密鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、公知の金融取引プロトコルまたは他の電子情報交換方法に基づく標準化されたプロトコルまたはアルゴリズムを用いてデータをやり取りする。データ交換は好ましくはパケット交換型ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮまたは他の種類のパケット交換型ネットワークを通して行われる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効数字の数を踏まえ、かつ通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広範囲のいくつかの実施形態を説明している数値範囲およびパラメータは近似であるにも関わらず、具体例に記載されている数値は実行可能な程度に正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態で提示されている数値は、それらのそれぞれの試験測定値において認められる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいてもよい。さらに、文脈が反対の意を示していない限り、本明細書に記載されている全ての範囲はそれらの終点を含むものとして解釈されるべきであり、かつ非限定的範囲は商業的に実用的な値を含むように解釈されるべきである。同様に、全ての値リストは、文脈が反対の意を示していない限り中間値を含むものとして解釈されるべきである。
【００８７】
当業者には、本明細書中の本発明の概念から逸脱することなく既に記載されているもの以外のさらに多くの修飾が可能であることは明らかであるはずである。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を別として制約されるべきではない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、全ての用語は本文脈と一致する最も広い可能な方法で解釈されるべきである。特に、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的に要素、成分または工程を参照するものとして解釈されるべきであり、参照される要素、成分または工程は明示的に参照されていない他の要素、成分または工程と共に存在したり利用されたり組み合わせられたりしてもよいことを示す。本明細書中の説明で使用され、かつ以下の特許請求の範囲全体で使用されているように、「１つ（ａ）」「１つ（ａｎ）」および「その（前記）（ｔｈｅ）」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り複数の参照物を含む。また、本明細書中の説明で使用されているように、「〜の中の（ｉｎ）」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り「〜の中の（ｉｎ）」および「〜の上の（ｏｎ）」を含む。
【図１】
2019535081.tif 000016
【図２】
2019535081.tif 000017
【図３Ａ】
2019535081.tif 000018
【図３Ｂ】
2019535081.tif 000019
【図４】
2019535081.tif 000020
【図５Ａ】
2019535081.tif 000021
【図５Ｂ】
2019535081.tif 000022
【図６】
2019535081.tif 000023
【図７】
2019535081.tif 000024
【図８】
2019535081.tif 000025
【図９】
2019535081.tif 000026
【図１０】
2019535081.tif 000027
【図１１】
2019535081.tif 000028
【図１２】
2019535081.tif 000029
【図１３】
2019535081.tif 000030
【図１４】
2019535081.tif 000031
【図１５】
2019535081.tif 000032
【図１６】
2019535081.tif 000033
【図１７】
2019535081.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月4日(2019.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
クラスター形状の検出：ストレス誘導性不均一性（ＳＩｔＨ）のコンテキストでは、本発明者らは、クラスター中心を背景レベルを超える頻度を有する多様性の蓄積を誘導した推定上のＤＳＢである可能性が高い位置として処理した。従って、ＳＩｔＨのシグネチャーは、そのような中心の周りにより高い濃度の突然変異を有し、かつそこから距離が離れるにつれて対応する減衰が生じるものとして明らかなものでなればならない。ＳＮＶの全てのクラスターを同定したら、ＳＮＶイベントの累積分布Ｆ（Ｘ）をクラスター質量中心から２５０ｋｂまでの距離の関数Ｘとして計算する。ＳＮＶイベントの分布が一様にランダムであり（従ってクラスター中心から離れるにつれて減衰しない）という帰無仮説を採用すると、イベントのＳＮＶの累積数は評価距離と共に比例的に増加することが期待される。なお、このプロセスで考察されるイベントはクラスターにおけるイベントのみに制約されないが、２５０Ｋｂの距離までのクラスターの中心の周りの全てのイベントに制約される。距離を２５０ｋｂで正規化し、かつ累積分布を２５０ｋｂよりも近いイベントの数で正規化して、本発明者らは全てのクラスター累積分布曲線を単位２Ｄボックスにマップする：
【数２】
2019535081.tif 000035
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
ＳＩｔＨスコア：上記観察を考慮して、本発明者らは、以下のように正規化された累積分布ｆ（ｘ）と期待値ｘとの差を積分することにより、帰無仮説（すなわち、その多様性は一様に分散されている）からの逸脱の程度の尺度を定めた：
【数３】
2019535081.tif 000036
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
累積関数Ｆ（Ｘ）の構築段階（すなわち、クラスターが定められた後）で異なるフィルタを適用することができるため、コード領域（遺伝子）の内もしくは外でのみ生じるイベントまたは特定の突然変異モチーフを提供するイベントに特異的なＳＩｔＨスコアを推定することができる（以下を参照）。ＳＩｔＨスコアは、検出されるＤＳＢの中心にある間隔を参照して計算することもできる。総ＳＩｔＨスコアでは、伝搬誤差は以下のとおりである（計数統計誤差を想定している）：
【数４】
2019535081.tif 000037
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
染色体における総イベント観察率（＝全てのビンに跨る全てのイベント／染色体の長さ）ｐ、ビンサイズｘ＝２５０ｋｂのために、ｋ個のイベントの確率密度が以下によって与えられる：
【数５】
2019535081.tif 000038
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
ｋ個以下のイベントを発見する確率は、以下によって与えられる：
【数６】
2019535081.tif 000039
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
ｋ個以下のイベントする発見する確率：
【数７】
2019535081.tif 000040
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019535081.tif 000041
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2019535081.tif 000042
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７】
2019535081.tif 000043
【国際調査報告】
2019535081.tif 000044
2019535081.tif 000045
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