(57)【要約】本発明は、哺乳動物におけるヘルペスウイルス科(Herpesviridae)のウイルスの感染を処置および/または予防するのに有用な組成物および方法を提供する。特定の態様において、ウイルスはヒトサイトメガロウイルスを含む。2019514966.tif 000025
2019514966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象におけるヘルペスウイルス科(Herpesviridae)のウイルスによる感染を処置および/または予防する方法であって、その必要のある前記対象に、
バルノクタミド(2-エチル-3-メチルペンタンアミド)
2019514966.tif 000019
;
tert-ブチルエチルアセトアミド(TED; 2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド)
2019514966.tif 000020
; ならびに
式(I)
2019514966.tif 000021
の分子であって、式中
aが0、1、2、3または4であり、
bが1、2または3であり、
cが1、2または3であり、かつ
Rが、HおよびC1〜C4アルキルからなる群より選択される、
前記分子
からなる群より選択される少なくとも1つの化合物、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物の治療的有効量を投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２】
aが0である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
RがHまたはCH3である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
RがHであり、aが0であり、bが1であり、cが1であり、かつ前記化合物が構造(II)
2019514966.tif 000022
の分子、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
RがCH3であり、aが0であり、bが0であり、cが1であり、かつ前記化合物が構造(III)
2019514966.tif 000023
の分子、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
(II)が、(2R,3R)、(2R,3S)、(2S,3R)および(2S,3S)からなる群より選択されるジアステレオ異性体、またはそれらの任意の混合物である、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
(III)が、(2R,3R)、(2R,3S)、(2S,3R)および(2S,3S)からなる群より選択されるジアステレオ異性体、またはそれらの任意の混合物である、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が鏡像異性的におよび/またはジアステレオ異性的に純粋な形態である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が鏡像異性体のおよび/またはジアステレオ異性体の混合物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、少なくとも薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物または製剤の一部である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2型、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ならびにヒトヘルペスウイルス(HHV)6、7および8型からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスがCMVを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物の投与が、前記対象において顕著な抗けいれん効果を有しない、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物の投与が、前記対象において顕著な気分安定効果および/または気分調整効果を有しない、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス感染を処置および/または予防するのに有用な1つまたは複数のさらなる薬剤が前記対象にさらに投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記1つまたは複数のさらなる薬剤が、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、ホミビルセン、アシクロビル、およびバラシクロビルからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物および前記1つまたは複数のさらなる薬剤が前記対象に同時投与される、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物および前記1つまたは複数のさらなる薬剤が共製剤化される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、経口、経鼻、吸入、局所、頬側、直腸、胸膜、腹膜、腹腔内、膣、筋肉内、皮下、経皮、硬膜外、気管内、耳内、眼内、くも膜下腔内、羊水内、臍帯内および静脈内経路からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって前記対象に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が妊娠している、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が新生児である、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が免疫抑制状態である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が出生前の胎児である、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
前記胎児を妊娠中である女性が免疫抑制状態である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
バルノクタミド(VCD; 2-エチル-3-メチルペンタンアミド);
tert-ブチルエチルアセトアミド(TED; 2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド); ならびに
式(I)
2019514966.tif 000024
の分子であって、式中
aが0、1、2、3または4であり、
bが1、2または3であり、
cが1、2または3であり、かつ
Rが、HおよびC1〜C4アルキルからなる群より選択される、
前記分子
からなる群より選択される少なくとも1つの化合物、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物と、
ウイルス感染を処置および/または予防するのに有用な1つまたは複数のさらなる薬剤と
を含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
ウイルス感染が、ヘルペスウイルス科由来のウイルスを含む、請求項26に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
ウイルスがCMVを含む、請求項27に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも1つの化合物が、バルノクタミド、2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド(TED)、2-イソプロピル-3-メチルペンタンアミド(SID)および3-メチル-2-プロピルペンタンアミド(SPD)からなる群より選択されるか、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である、請求項26に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年5月6日付で出願された米国仮特許出願第62/332,821号に対する35 U.S.C. § 119(e)の下での優先権を主張するものであり、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたCA161048、CA175577、CA188359およびNS079274の下での政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ウイルスは、他の生物の生きた細胞内でのみ複製する小さな感染性因子である。ウイルスは、動物および植物から微生物まで、あらゆるタイプの生命体に感染することができる。細胞に感染していない場合、または感染細胞の内部にいない場合、ウイルスは、以下の2つまたは3つの部分を含む、ビリオンとしても知られる、ウイルス粒子として存在する: (i) DNAまたはRNAのいずれかより作出された遺伝物質; (ii) 遺伝物質を取り囲み保護する、キャプシドと呼ばれる、タンパク質コート; および場合によっては(iii) 細胞外にいるときにタンパク質コートを取り囲む脂質のエンベロープ。これらのウイルス粒子の形状は、一部のウイルス種の単純らせん形および二十面体形から、他の種のより複雑な構造にまで及ぶ。平均的なビリオンは、平均的な細菌のサイズの約100分の1である。
【０００４】
ウイルスは、ウイルス粒子内の遺伝物質、およびその物質が複製される方法に関して多くの変異を示す。ウイルスは、例えばDNAウイルス(ゲノム複製が細胞の核内で行われる)、RNAウイルス(複製が細胞質内で通常行われる; これらのウイルスは一本鎖(ss)または二本鎖(ds)遺伝物質を含みうる); および逆転写ウイルス(その粒子中にssRNAまたはdsDNAを含む)であることができる。
【０００５】
サイトメガロウイルスは、ヘルペスウイルス目(Herpesvirales)の、およびヘルペスウイルス科(Herpesviridae)のウイルスの属である。この属には現在、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)としても知られる、ヒトヘルペスウイルス5型(HHV-5)の種を含む8つの種が存在している。
【０００６】
hCMVは、AIDS患者および移植レシピエントを含む、免疫抑制状態の個体における最も一般的かつ潜在的に生命を脅かす感染性合併症である。
【０００７】
毎年およそ30,000人の米国の子供において新たに診断される、CMV感染は、未成熟CNSでのCMVに対する未成熟な生得的かつ全身的免疫応答の低い効力により、(胎児および幼児における)発達中の脳に特に損傷を与えている。CMVは、先天性出生異常の主要なウイルス性原因であり、新生児哺乳動物および免疫抑制状態個体における心筋炎、肺炎、眼疾患および脳炎を含む深刻な問題、ならびに感染胎児における小頭症、皮質菲薄化および小脳形成不全を含む先天性異常を引き起こす。これによって、CMVは最も一般的な重度に障害を引き起こす周産期感染性因子とされる。脳内のCMV感染は、失明、難聴、IQの低下および他の認知および感覚欠損に関連する。さらに、小児および青年における周産期CMV感染と自閉症スペクトル障害(ASD)との間には関連があるようである。残念なことに、CMVに対する現在の抗ウイルス剤の使用は、毒性、わずかな効力、および薬物耐性によって著しく制限される。特に、現在の抗CMV薬の催奇性、急性毒性および長期毒性、ならびに発がん性のために、先天性CMV感染に利用できる処置はない。これらの深刻な副作用は、抗CMV作用の機序であるDNAポリメラーゼの阻害に関連している。薬物耐性CMV株の出現も課題を提起しており、有効なCMVワクチンを現在利用することができない。
【０００８】
哺乳動物におけるウイルス感染を処置および/または予防するために使用することができる化合物および/または組成物が当技術分野において必要とされている。そのような化合物および/または組成物は、感染した哺乳動物に対する最小限の毒性効果(例えば、催奇性および肝臓損傷等)でウイルス感染に対して有効であるべきである。本発明はこれらの要求に応える。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、哺乳動物対象におけるヘルペスウイルス科のウイルスによる感染を処置および/または予防する方法を提供する。本発明はさらに、ヘルペスウイルス科のウイルスによる感染を処置および/または予防するのに有用な薬学的組成物を提供する。
【００１０】
特定の態様において、本方法は、その必要のある対象に、
バルノクタミド(2-エチル-3-メチルペンタンアミド)
2019514966.tif 000003
;
tert-ブチルエチルアセトアミド(TED; 2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド)
2019514966.tif 000004
; および
式(I)
2019514966.tif 000005
(式中aが0、1、2、3または4であり; bが1、2または3であり; cが1、2または3であり; かつRが、HおよびC1〜C4アルキルからなる群より選択される)の分子
からなる群より選択される少なくとも1つの化合物、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物の治療的有効量を投与する段階を含む。
【００１１】
特定の態様において、aは0である。他の態様において、RはHまたはCH3である。さらに他の態様において、RはHであり、aは0であり、bは1であり、cは1である。さらに他の態様において、化合物は構造(II)の分子、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である。
2019514966.tif 000006
さらに他の態様において、RはCH3であり、aは0であり、bは0であり、cは1である。さらに他の態様において、化合物は構造(III)の分子、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である。
2019514966.tif 000007
【００１２】
特定の態様において、(II)は、(2R,3R)、(2R,3S)、(2S,3R)および(2S,3S)からなる群より選択されるジアステレオ異性体、またはそれらの任意の混合物である。他の態様において、(III)は、(2R,3R)、(2R,3S)、(2S,3R)および(2S,3S)からなる群より選択されるジアステレオ異性体、またはそれらの任意の混合物である。さらに他の態様において、化合物は、鏡像異性的におよび/またはジアステレオ異性的に純粋な形態である。さらに他の態様において、化合物は鏡像異性体のおよび/またはジアステレオ異性体の混合物である。さらに他の態様において、化合物は、少なくとも薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物または製剤の一部である。
【００１３】
特定の態様において、ウイルスは、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2型、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ならびにヒトヘルペスウイルス(HHV)6、7および8型からなる群より選択される少なくとも1つを含む。他の態様において、ウイルスはCMVを含む。
【００１４】
特定の態様において、化合物の投与は、対象において顕著な抗けいれん効果を有しない。他の態様において、化合物の投与は、対象において顕著な気分安定効果および/または気分調整効果を有しない。
【００１５】
特定の態様において、対象には、ウイルス感染を処置および/または予防するのに有用な1つまたは複数のさらなる薬剤がさらに投与される。他の態様において、1つまたは複数のさらなる薬剤は、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、ホミビルセン、アシクロビル、およびバラシクロビルからなる群より選択される少なくとも1つを含む。さらに他の態様において、化合物および1つまたは複数のさらなる薬剤は対象に同時投与される。さらに他の態様において、化合物および1つまたは複数のさらなる薬剤は共製剤化される。さらに他の態様において、化合物は、経口、経鼻、吸入、局所、頬側、直腸、胸膜、腹膜、腹腔内、膣、筋肉内、皮下、経皮、硬膜外、気管内、耳内、眼内、くも膜下腔内、羊水内、臍帯内および静脈内経路からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって対象に投与される。さらに他の態様において、化合物の治療的有効量は、約0.001 mg/日〜約10,000 mg/日に及ぶ。
【００１６】
特定の態様において、対象はヒトである。他の態様において、対象は妊娠している。さらに他の態様において、対象は新生児である。さらに他の態様において、対象は免疫抑制状態である。さらに他の態様において、対象は出生前の胎児である。 さらに他の態様において、胎児を妊娠中である女性は免疫抑制状態である。
【００１７】
特定の態様において、薬学的組成物は、VCD、TED、および式(I)
2019514966.tif 000008
(式中aが0、1、2、3または4であり; bが1、2または3であり; cが1、2または3であり; かつRが、HおよびC1〜C4アルキルからなる群より選択される)の分子
からなる群より選択される少なくとも1つの化合物、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物と; ウイルス感染を処置および/または予防するのに有用な1つまたは複数のさらなる薬剤とを含む。
【００１８】
特定の態様において、ウイルス感染は、ヘルペスウイルス科由来のウイルスを含む。他の態様において、ウイルスはCMVを含む。さらに他の態様において、少なくとも1つの化合物は、バルノクタミド、2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド(TED)、2-イソプロピル-3-メチルペンタンアミド(SID)および3-メチル-2-プロピルペンタンアミド(SPD)からなる群より選択されるか、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明を例示する目的で、本発明の特定の態様が図面に描かれている。しかしながら、本発明は、図面に描かれた態様の正確な配置および手段に限定されない。
【００２０】
【図１】図1A〜1Eは、バルプロエートおよびバルプロミドがmCMVに逆の影響を及ぼすという知見を例示する。図1A: 代表的な顕微鏡視野は、感染の多重度(MOI) 0.4を用いたmCMVの接種前にVPA (1mM)または媒体で前処理(24時間)されたNIH/3T3細胞のCMV GFPレポーター蛍光(上)および位相差(下)を示す。48 hpiで捕捉した写真; スケールバー50 μm。図1B: 棒グラフは、mCMV感染のVPA用量依存的増加、Aと同じその他の条件を示す。図1C: VPD (1mM)であり、その他の条件は図1Aと同じ。図1D: 棒グラフは、mCMV感染のVPD用量依存的減少、図1Aと同じその他の条件を示す。図1E: ウイルス接種の4、24、および72時間前にVPDまたは媒体に曝露されたNIH/3T3細胞であり、その他の条件は図1Aと同じ。mCMV感染の時間依存的プレインキュベーション薬物誘導減少を示す。図1B、図1D、図1E: 8個の培養物の平均±SEM。＊＊＊p < 0.001, ＊＊p < 0.01, 対照と比較して、ボンフェローニ(Bonferroni)の事後検定によるANOVA。図1Eにおいて、p < 0.01, 72時間 vs 24時間の前処理; p < 0.001, 72時間 vs 4時間の前処理。
【図２】図2A〜2Eは、バルノクタミドがmCMVおよびhCMVの両方を阻害するという知見を例示する。図2A: 顕微鏡視野は、mCMV(MOI 0.4)の接種前にVCD (1mM)または媒体で前処理(24時間)されたNIH/3T3細胞のGFP蛍光(上)および位相差(下)を示す。48 hpiで捕捉した写真; スケール50 μm。図2B〜2C: mCMV感染(MOI 0.4)の用量依存的(図2B)および時間依存的（図2C）VCD媒介性減少。図2D: 高MOI(4.0)mCMVを用いたVCD用量依存的減少。感染細胞を24 hpi、その他の条件はAと同じで計数した。図2E: hCMV(MOI 0.1)を接種した正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いたVCD用量依存的減少。感染細胞を72 hpi、その他の条件はAと同じで計数した。図2B〜2E: 8個の培養物の平均±SEM。＊＊＊p < 0.001, ＊＊p < 0.01, ＊p < 0.05, 一元配置ANOVA、ボンフェローニの事後検定。図2Eにおいて、p < 0.01, 72時間 vs 24時間の前処理; p < 0.001, 72時間 vs 4時間の前処理。
【図３−１】図3A〜3Nは、バルプロミドおよびバルノクタミドがインビボでmCMVを阻害し、感染新生仔の出生後の発達を有意に改善するという知見を例示する。図3A: 新生仔のmCMV感染および化合物投与を示す時系列。DOB, 出生日; PND, 出産後日数; i.p., 腹腔内; s.c., 皮下。図3B: ログランク(Log-rank) (Mantel-Cox)検定によって評価したPND 49での生存率; N = 11〜13マウス/群。図3C〜3J: 出生後の身体発育の改善。写真は、媒体(VEH, mCMV)と比較してVPDおよびVCD処置産仔の成長の改善を示す(図3C)。グラフは平均±SEMを示す; 明確にするために、VEH群についてエラーバーを示し(図3D〜3F)または示していない(図3G〜3J)。N = 6〜9マウス/群; 混合モデルANOVA (Newman Keuls検定); VPDおよびVCD vs CTR (対照/非感染新生仔) (図3D)、ならびにVPDおよびVCD vs VEH (図3D〜3J)。
【図３−２】図3A〜3Nは、バルプロミドおよびバルノクタミドがインビボでmCMVを阻害し、感染新生仔の出生後の発達を有意に改善するという知見を例示する。図3C〜3J: 出生後の身体発育の改善。写真は、媒体(VEH, mCMV)と比較してVPDおよびVCD処置産仔の成長の改善を示す(図3C)。グラフは平均±SEMを示す; 明確にするために、VEH群についてエラーバーを示し(図3D〜3F)または示していない(図3G〜3J)。N = 6〜9マウス/群; 混合モデルANOVA (Newman Keuls検定); VPDおよびVCD vs CTR (対照/非感染新生仔) (図3D)、ならびにVPDおよびVCD vs VEH (図3D〜3J)。
【図３−３】図3A〜3Nは、バルプロミドおよびバルノクタミドがインビボでmCMVを阻害し、感染新生仔の出生後の発達を有意に改善するという知見を例示する。図3K: 写真は、VCDで処置した感染新生仔(右)と比べて感染/未処置産仔(左)の毛皮の発達遅延を強調している。顕著な成長差も明白である。図3L: 写真は開眼の示差的状態を示す。図3M〜3N: PND 1から10までVPD、VCD、またはVEHで処置した感染新生仔をPND 12で安楽死させ、肝臓および肺からの組織サンプルをプラークアッセイによるウイルス滴定のために収集した。個々のマウスのウイルス力価(記号)および中央値(水平バー)が示されている; 点線は検出限界を表す; ns, 有意ではない、＊p < 0.05, ＊＊p < 0.01, ＊＊＊p < 0.001、一元配置ANOVA、ボンフェローニの事後検定。
【図４−１】図4A〜4Iは、バルプロミドおよびバルノクタミドがCMVの細胞への結合を阻害するという知見を例示する。図4A〜4B: mCMV-GFP (MOI 0.1)を感染させたNIH/3T3細胞(t=0)をVPD、VCDまたは媒体(100 μM)に同時(0〜48 hpi)に、またはウイルス接種から2時間後(2〜48 hpi)にもしくは12時間後(12〜48 hpi)に曝露した。48 hpiで計数したGFP陽性細胞の捕捉写真。図4Aにおいて、スケール100 μm。図4C: mCMV (MOI 0.1)を感染させたネズミ線維芽細胞に、ウイルス攻撃と同時にVPD、VCDまたは媒体(100 μM)を投与した。2時間のインキュベーション後、培養物をPBSで3回すすぎ、新鮮な薬物を含まない培地と交換した。48 hpiで収集した結果。図4D: 薬物(100 μM)/未希釈mCMV混合物を37℃または4℃で2時間インキュベートした。細胞接種の前に、溶液を10 nM (無効薬物濃度)に希釈した。
【図４−２】図4A〜4Iは、バルプロミドおよびバルノクタミドがCMVの細胞への結合を阻害するという知見を例示する。図4E〜4F: CMV結合および融合に関連する疑問に対処するピクトグラム詳細実験(図4E)。感染性を48 hpiで評価した; HS, ヘパラン硫酸(図4F)。図4G: VPD、VCD、または媒体前処理から24時間後、培養物を2回すすぎ、ウイルス接種(MOI 0.1)前に薬物を含まない培地を与えた。バー: 8個の培養物(図4B〜4Dおよび4G)ならびに12個の培養物(図4F)の平均±SEM。＊＊＊p < 0.001, ＊＊p < 0.01, ボンフェローニの事後検定による一元配置ANOVA。図4H〜4I: VPD、VCDまたは媒体を用いたmCMV感染NIH/3T3細胞(MOI 1)のプラークアッセイ。ウイルスプラークサイズを5 dpiで測定した。100 μMのVCD (上)または媒体(下)における代表的なプラーク; スケール300 μm(図4H)。60個のランダムなプラークの平均直径; 0.1 μMでp < 0.05、1 μMでp < 0.01、100 μMおよび1 mMでp < 0.001, vs 媒体。SEM, 右上側のバー(図4I)。
【図５】図5A〜5Fは、バルプロミドが異なる細胞型においてmCMV感染を阻害し、ウイルス媒介性細胞死を減少させるという知見を例示する。図5A: 高力価mCMV-GFP (MOI 4)の接種前にVPDまたは媒体(10 mM)で前処理(24時間)したNIH/3T3細胞のGFP蛍光(上)および位相差(下)下の代表的な顕微鏡視野の画像。60 hpiで捕捉した写真; スケールバー100 μm。図5B〜5D; 棒グラフは、NIH/3T3 (図5B)、不死化Neuro-2a (図5C)および初代マウスグリア(図5D)細胞におけるmCMV感染のVPD用量依存的減少であって、その他の条件は図5Aと同じものを示す。GFP陽性細胞を計数することによって24 hpiで感染性を評価した。図5E〜5F: ウイルス媒介性細胞傷害に及ぼすVPDの保護効果を、赤色蛍光エチジウムホモ二量体(EthD-1)アッセイによって評価した。画像は、ウイルス接種(MOI 0.4)前に24時間10 mMのVPDまたは媒体で前処理したNIH/3T3細胞の赤色蛍光顕微鏡写真を示す。72 hpiで、EthD-1を細胞に添加した。20分後、写真を収集し(図5E)、赤色蛍光標識細胞を計数した(図5F)。図5Eにおいて、スケールバー50 μm。8個の培養物の平均±SEMとして提示したデータ; ＊＊＊p < 0.001, ＊＊p < 0.01,および＊p < 0.05 ボンフェローニの事後検定によるANOVAを用いて対照と比較した場合。
【図６Ａ】図6A〜6Cは、バルプロミドがヒトCMVを阻害するという知見を例示する。図6A: 正常ヒト皮膚線維芽細胞を、hCMV-GFP接種(MOI 0.1)の前に24時間、表示濃度のVPDまたは媒体で処理した。結果を72 hpiで読み取った。8個の培養物の平均±SEMとして提示したデータ。＊＊＊p < 0.001, ＊p < 0.05, 一元配置ANOVA (ボンフェローニの事後検定)。
【図６Ｂ】図6A〜6Cは、バルプロミドがヒトCMVを阻害するという知見を例示する。図6B: ヒト膠芽腫細胞を、ウイルス接種(MOI 4)の前に48時間10 mM、3 mM、1 mM、300 μM、100 μM、および30 μMのVPDまたは媒体に曝露した。GFP陽性細胞を48 hpiで計数した。6個の培養物の平均±SEMとして提示したデータ。＊＊＊p < 0.001, ＊p < 0.05, 一元配置ANOVA (ボンフェローニの事後検定)。
【図６Ｃ】図6A〜6Cは、バルプロミドがヒトCMVを阻害するという知見を例示する。図6C: hCMV gBに対する免疫染色を行って、GFP発現に及ぼすVPDの潜在的阻害効果を排除した。ヒト皮膚線維芽細胞をウイルス攻撃(MOI 1)の前に24時間VPDまたは媒体(1 mM)に曝露した。赤色のhCMV gB免疫反応性および青色(DAPI)の細胞核を伴う代表的な視野は、VPDが感染細胞の相対数を低減させたことを示し、VPD媒介性のhCMV阻害(対照と比較して56% ± 7%; 平均±SEM, n=5)を裏付けている。スケールバー50 μm。
【図７】バルプロミドが水疱性口内炎ウイルス感染に及ぼす効果がなかったという知見を例示する。24時間1 mMのVPDまたは媒体で前処理し、VSV-GFP (MOI 0.001)を感染させたVero細胞のGFP蛍光(上)および位相差(下)下の代表的な顕微鏡視野の画像。薬物媒介阻害効果は同定されなかった(対照と比較して101% ± 5%; 6個の培養物の平均±SEM)。24 hpiで捕捉した写真; スケールバー50 μm。
【図８】バルプロミドおよびバルノクタミドへの短時間の曝露がウイルス産生を有意に減少させるという知見を例示する。mCMV-GFP (MOI 0.1)を感染させたネズミ線維芽細胞に、ウイルス攻撃と同時にVPD、VCD、または媒体(100 μM)を投与した。2時間のインキュベーション後、培養物をPBSで2回すすぎ、新鮮な薬物を含まない培地と交換した。72 hpiの細胞培養上清を回収し、NIH/3T3細胞にてプラーク滴定した。6個の培養物の平均±SEMとして提示したデータ; ＊＊＊p < 0.001, ボンフェローニの事後検定による一元配置ANOVA。
【図９】バルプロミドおよびバルノクタミドが非感染新生仔において安全だと思われるという知見を例示する。非感染産仔に、PND 1からPND 20まで、体重の評価時、皮下に1日1回、生理食塩水(CTR)、媒体(VEH)、VPDまたはVCD (1.4 mg/mL) 20 μLを投与した。バーは平均±SEM, 一元配置ANOVAを表す; N = 8マウス/実験群。
【図１０】CMVプラークサイズがVPD、VCD、SPD、およびSIDによって低減されることを例示するグラフを含む。CMV感染プラークサイズを、さまざまな濃度の4つの抗CMV薬、およびCMVを減弱させないVPAの存在下において測定した。4つ全ての薬物が効果的であった。SPDはインビトロでわずかに大きな有効性を示した。
【図１１】図11A〜11Cは、sec-ブチルプロピルアセトアミドがインビボでmCMVを阻害し、CMVに感染した新生仔の生存および出生後の発達を有意に改善するという知見を例示する。図11A: Log-rank (Mantel-Cox)検定によって評価したPND 30での生存率; N = 9〜13マウス/群。図11B〜11C: 出生後体細胞発達の改善。図11B: 媒体(VEH, mCMV, 右)と比較してSPD処理産仔(左)の成長の改善を例示する。図11C: グラフは平均±SEMを示す; N = 9マウス/群; ＊p < 0.05, ＊＊p <0.01, ＊＊＊p < 0.001, 混合モデルANOVA (Newman Keuls検定); グラフの上部に示したSPD vs CTR (対照/非感染新生仔)の有意性、およびグラフの下部に示したSPD vs VEHの有意性。
【図１２】図12A〜12Eは、出生日の腹腔内接種後のmCMV複製の動態を例示する。出生日(DOB, 0日目)に新生仔マウスに750 PFUのmCMVを感染させた。全血、肝臓、脾臓および脳におけるウイルス負荷を、表示時点での定量的PCR (qPCR)によって評価し、採取した組織/血液1グラム/mL当たりのlog10ゲノムコピーとして表した。図12Aにおいて、各記号は個々のマウスを表し、水平バーは群の平均値を示す; 図12B〜12Eにおいて、データを平均±SEMとして7〜10匹のマウス/時点で提示する。検出限界(LoD, 点線)未満のウイルス力価を2 log10ゲノムコピーとしてプロットした。図12Aにおいて、＊＊p <0.01, ＊＊＊ < 0.001, ＊＊＊＊ <0.0001; ボンフェローニの事後検定による一元配置ANOVA; dpi, 感染後の日数。
【図１３】新生仔マウスの感染後の脳におけるmCMV-GFPの散在性の広範囲にわたる分布を例示する。出生後8日目(P8)およびP12のマウス脳の代表的な冠状切片におけるmCMV GFPレポーター発現によるウイルス感染細胞の検出。P12マウス脳の遡上皮質(RS ctx)、一次および二次体性感覚皮質(S1/S2)、髄様皮質(Ect)、周皮質(Prh)、梨状皮質(Pir)、海馬(hippo)および歯状回(DG)、側脳室(LV)、脳梁の外包および内包(それぞれecおよびic)、視床下部外側野(LH)、ならびに視床核(Th Nu)において単一の感染細胞または小さな感染病巣を同定することができる。D3V, 背側第3脳室(パネルA)。パネルB〜Dは、パネルAにおける囲み領域の拡大である。P8脳における側脳室の感染および隣接脳実質への拡散(パネルE)。パネルFにおいて、パネルEにおける囲み領域の拡大。cc, 脳梁。運動皮質(M1)および梨状皮質における、ならびに線条体(CPu, 尾状核)における感染を示すP12脳の顕微鏡写真(パネルG)。P8動物の髄質および橋におけるmCMV感染細胞の大きな病巣(パネルH〜I)。スケールバー50 μm (パネルH)、100 μm (パネルA、D、E、G、I)、200 μm (パネルCおよびF)、ならびに400 μm (パネルB)。
【図１４】発生中の脳の小脳、海馬および皮質における神経細胞のCMV感染を例示する。顕微鏡写真は、8 dpiでNeuNおよびカルビンジンD-28K染色により評価した場合の、内部顆粒層(パネルA)およびプルキンエ細胞(パネルB)におけるニューロンを含む、さまざまな小脳細胞型のGFP標識を示す。写真は、海馬の異なる領域の感染(パネルC)、CA1野における錐体細胞のウイルス関与の拡大(ボックス領域) (パネルD)、および歯状回(DG)における感染ニューロン(パネルE)を示す。運動皮質の錐体ニューロンにおける強力なGFP発現(パネルF); ニューロン病変の徴候である基底樹状突起の数珠状局面に注意されたい。視覚野におけるニューロン感染の顕微鏡写真(パネルG)。スケールバー100 μm (パネルA〜E, G)、50 μm (パネルF)。
【図１５】図15A〜15Bは、バルノクタミドが、出生日に腹腔内感染したマウスの脳におけるmCMV負荷を抑制するという知見を例示する。新生仔マウスにP0で750 PFUのmCMVを腹腔内感染させ、P1からP21まで媒体(mCMV+VEH)またはVCD (mCMV+VCD)のいずれかを皮下に投与するように無作為化した。ウイルス負荷を、特定の時点でqPCRにより大脳および小脳で別々に定量し、収集された組織1グラム当たりlog10のゲノムコピーとして表した。データを平均±SEMとして提示する; n = 7〜10マウス/時点。検出限界(LoD, 点線)未満のウイルス力価を2 log10ゲノムコピーとしてプロットした。ns, 有意ではない, ＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ < 0.001, ＊＊＊＊ <0.0001; 反復測定としての出生後日数での二元配置ANOVA。
【図１６】皮下注射されたバルノクタミドが脳に入り、脳内でのmCMV複製を抑制するという知見を例示する。出生後3日目に2×104 PFUのmCMVを頭蓋内感染させたマウスの脳におけるmCMV負荷の定量。大脳(左)および小脳(右)におけるウイルス量を、P3からP8まで皮下に媒体(VEH)またはVCDのいずれかを受けたP9マウスでのqPCRによって計算し、採取した組織のグラム当たりのゲノムコピーとして表した。平均±SEM; n = 8マウス/時点。＊＊ <0.01, ＊＊＊ < 0.001, マンホイットニー(Mann-Whitney) U検定。
【図１７−１】図17A〜17Hは、mCMV感染によって誘発された神経学的マイルストーンの獲得遅延がバルノクタミド療法によって完全に救済されるという知見を例示する。グラフ(x軸は出生後日数である)は、立ち直り反射(図17A)、断崖回避(図17B)、前肢の把握および踏み直り反射(図17C〜17D)、負の走地性(図17E)、水平スクリーン試験(図17F)、スクリーンクライミング試験(図17G)、ならびに髭置き直し反射(図17H)によって評価されたmCMV感染産仔(黒灰色の三角形)の神経発達遅延を示す。mCMV感染VCD処置動物(黒緑色の三角形)は、媒体(VEH, 白抜きの灰色の丸)またはVCD (白抜きの緑色の丸)のいずれかを受けた非感染対照と同様の神経学的応答を示した。平均±SEM, n = 20〜24匹のマウス(9〜12匹の雄)/実験群; ns, 有意ではない、＊p < 0.05, ＊＊ < 0.01, ＊＊＊ < 0.001, ＊＊＊＊ <0.0001; 反復測定としての出生後日数での二元配置ANOVA。非感染対照(CTR + VEHおよびCTR + VCD)との比較のため感染した未処置マウス(mCMV + VEH)線の隣に、ならびにVCD処置した感染産仔(mCMV + VCD)との比較のため対照線の隣に示した有意性。
【図１７−２】図17A〜17Hは、mCMV感染によって誘発された神経学的マイルストーンの獲得遅延がバルノクタミド療法によって完全に救済されるという知見を例示する。グラフ(x軸は出生後日数である)は、立ち直り反射(図17A)、断崖回避(図17B)、前肢の把握および踏み直り反射(図17C〜17D)、負の走地性(図17E)、水平スクリーン試験(図17F)、スクリーンクライミング試験(図17G)、ならびに髭置き直し反射(図17H)によって評価されたmCMV感染産仔(黒灰色の三角形)の神経発達遅延を示す。mCMV感染VCD処置動物(黒緑色の三角形)は、媒体(VEH, 白抜きの灰色の丸)またはVCD (白抜きの緑色の丸)のいずれかを受けた非感染対照と同様の神経学的応答を示した。平均±SEM, n = 20〜24匹のマウス(9〜12匹の雄)/実験群; ns, 有意ではない、＊p < 0.05, ＊＊ < 0.01, ＊＊＊ < 0.001, ＊＊＊＊ <0.0001; 反復測定としての出生後日数での二元配置ANOVA。非感染対照(CTR + VEHおよびCTR + VCD)との比較のため感染した未処置マウス(mCMV + VEH)線の隣に、ならびにVCD処置した感染産仔(mCMV + VCD)との比較のため対照線の隣に示した有意性。
【図１８】図18A〜18Eは、mCMV感染マウスにおける小脳媒介性の運動機能障害がバルノクタミド処置によって改善されるという知見を例示する。写真は、mCMV感染マウスにおいて後肢が腹部に後退した常同の挟み込み応答(中央)、ならびに非感染対照(左)においておよびmCMV感染したVCD処置動物(右)において後肢を広げた正常応答を示す(図18A)。後肢の位置による抱擁応答の採点(図18B)。VCD処置した感染動物および非感染対照と比較して、垂直支柱試験での感染した未処置マウスにおける自発運動時間(TLA)の増加(図18C)。チャレンジング梁横断試験による細かい運動神経とバランスの研究。感染マウスは、対照マウスよりも、梁を横断するために多くの時間を必要とし(図18D)、より多くスリップする(図18E)。両方の側面は、VCD投与によって改善される。平均±SEM; n = 10〜13マウス/群。＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ <0.001, ＊＊＊＊ <0.0001; 図18B〜18Dにおけるダン(Dunn)の事後検定を用いたクラスカル・ワリス(Kruskal-Wallis)検定, 図18Eにおける反復測定およびボンフェローニの事後比較による二元配置ANOVA。
【図１９Ａ】図19A〜19Dは、初期発生中のCMV感染が青年期マウスでの社会的行動および探索的活動に障害を引き起こすという知見を例示する。3チャンバ試験による、VCD処置有りまたは無しでの、感染マウスおよび対照マウスにおける社会性(図19A)および社会的新規性の選好(図19B)評価。CMV感染マウスは、対照マウスと比較して規則的な社会性を示すが、既知のマウスよりも新規のマウスに対する好みがない。社会的新規性に対するこの選好欠如は、VCD投与によって回復される。平均±SEM; n=10〜13マウス/社会的行動の群; ns, 有意ではない、＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ <0.001, ＊＊＊＊ < 0.0001; 図19A〜19Bにおける反復測定およびボンフェローニの事後比較による二元配置ANOVA。
【図１９Ｂ】図19A〜19Dは、初期発生中のCMV感染が青年期マウスでの社会的行動および探索的活動に障害を引き起こすという知見を例示する。3チャンバ試験による、VCD処置有りまたは無しでの、感染マウスおよび対照マウスにおける社会性(図19A)および社会的新規性の選好(図19B)評価。CMV感染マウスは、対照マウスと比較して規則的な社会性を示すが、既知のマウスよりも新規のマウスに対する好みがない。社会的新規性に対するこの選好欠如は、VCD投与によって回復される。平均±SEM; n=10〜13マウス/社会的行動の群; ns, 有意ではない、＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ <0.001, ＊＊＊＊ < 0.0001; 図19A〜19Bにおける反復測定およびボンフェローニの事後比較による二元配置ANOVA。
【図１９Ｃ】図19A〜19Dは、初期発生中のCMV感染が青年期マウスでの社会的行動および探索的活動に障害を引き起こすという知見を例示する。探索的活動は、新規環境における立ち上がり(図19C)およびノーズポーク(図19D)事象の定量によって評価された。mCMV感染動物において同定された事象数の減少を伴う探索的行動の変化は、VCDによって救済される。平均±SEM; n=18〜22マウス/探索的活動の群; ns, 有意ではない、＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ <0.001, ＊＊＊＊ < 0.0001; 図19C〜19Dにおけるダンの事後検定を用いたクラスカル・ワリス検定。
【図１９Ｄ】図19A〜19Dは、初期発生中のCMV感染が青年期マウスでの社会的行動および探索的活動に障害を引き起こすという知見を例示する。探索的活動は、新規環境における立ち上がり(図19C)およびノーズポーク(図19D)事象の定量によって評価された。mCMV感染動物において同定された事象数の減少を伴う探索的行動の変化は、VCDによって救済される。平均±SEM; n=18〜22マウス/探索的活動の群; ns, 有意ではない、＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ <0.001, ＊＊＊＊ < 0.0001; 図19C〜19Dにおけるダンの事後検定を用いたクラスカル・ワリス検定。
【図２０】図20A〜20Bは、バルノクタミドがmCMV感染によって誘発された脳成長不全を反転させるという知見を例示する。写真は、非感染対照(左)と比較して、感染した未処置マウス(mCMV, 中央)での脳サイズの減少を示す。VCD処置は、正常な脳の成長(mCMV+VCD, 右)を回復する(図20A)。脳 対 体重比の計算による出生後脳成長におけるVCD媒介性の利益の定量。平均±SEM; n=10マウス/群(3同腹仔); ns, 有意ではない、＊＊p <0.01, ＊＊＊ < 0.001; ボンフェローニの事後検定による一元配置ANOVA (図20B)。
【図２１−１】図21A〜21Hは、バルノクタミドがmCMV感染マウスにおいて小脳発生を実質的に改善するという知見を例示する。対照(左)および感染マウスVCD有り(右, mCMV+VCD)またはVCD無し(中央, mCMV)における代表的な蛍光Nissl染色小脳域の顕微鏡写真。VCDによって救済された、感染未処理小脳の転葉遅延に留意されたい; スケールバー200 μm (図21A)。グラフは、総脳面積(3矢状切片/動物, 動物5匹/群, 3同腹仔)の割合として表した小脳域を描く(図21B)。カルビンジンD-28K染色による小脳プルキンエ細胞(PC)および分子層(ML)を示す顕微鏡写真。感染した、未処理小脳(中央)は、非感染対照(左)と比較してPCの喪失および薄いMLを示す; VCDは両方のパラメータを改善する(右)。スケールバー200 μm (図21C)。平均±SEM; ns, 有意ではない、＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ < 0.001; ボンフェローニの事後検定による一元配置ANOVA。
【図２１−２】図21A〜21Hは、バルノクタミドがmCMV感染マウスにおいて小脳発生を実質的に改善するという知見を例示する。500 μmの第一裂(prf, 両側)に沿ったPC数(図21D)ならびにML (図21E)および内部顆粒層(IGL)の厚さ(図21F)の定量(3矢状切片/マウス, 5匹/群, 3同腹仔)。平均±SEM; ns, 有意ではない、＊p <0.05, ＊＊ <0.01, ＊＊＊ < 0.001; ボンフェローニの事後検定による一元配置ANOVA。
【図２１−３】図21A〜21Hは、バルノクタミドがmCMV感染マウスにおいて小脳発生を実質的に改善するという知見を例示する。感染した未処理小脳において同定された異所性PC (矢頭)の蛍光顕微鏡写真; スケールバー100 μm(図21G)。顕微鏡写真は、P30のmCMVに感染した、未処理小脳における外顆粒層(EGL)の病理学的持続性を示す(中央); 非感染対照(左)および感染したVCD処理小脳(右)において同じ時点でEGLを同定することはできなかった; スケールバー200 μm (図21H)。
【図２２】図22A〜22Cは、バルノクタミドが、細胞へのウイルス付着をブロックすることによってヒト胎児星状細胞におけるhCMVの感染性および複製を抑制するという知見を例示する。ヒト胎児星状細胞を、MOI 0.1を用いてのhCMVの接種の前に、VCD (100 μM)または媒体(VEH)で前処理(1時間)した。VCD処理は、48 hpiでのGFP陽性細胞計数(図22A)およびウイルス収量アッセイ(図22B)によって評価されるように、hCMVの感染性および複製を減少させた。ウイルス接種したヒト胎児星状細胞を4℃または37℃で1時間VCDまたは媒体(100 μM)に曝露して、細胞へのhCMV付着(「結合ウイルス」)および内部移行(「内部移行ウイルス」)を評価した。ウイルスDNAをqPCRによって定量し、結果を、対照に対する%として表した(媒体処理培養物を100%と見なした) (図22C)。グラフは、各々が三つ組で行われた3回の別々の実験の平均を表し、エラーバーは標準誤差に対応する。ns, 有意ではない、＊＊＊ p <0.001, ＊＊＊＊ <0.0001, 図22Aおよび22Cにおける対応のないスチューデントのt検定, 図22BにおけるマンホイットニーU検定; 図22Cにおいて有意性は、各アッセイにおけるVCD処理培養物と媒体処理培養物との間の比較をいう。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の局面において、哺乳動物におけるヘルペスウイルス科のウイルスの感染を処置および/または予防するために特定の化合物を使用することができるという予期せぬ発見に関する。特定の態様において、ウイルスはサイトメガロウイルス(CMV)を含む。他の態様において、ウイルスはエプスタイン・バーウイルス(EBV)を含む。さらに他の態様において、ウイルスは、限定されるものではないが、CMV、EBV、単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2型、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV、水疱瘡とも呼ばれる)、ならびにヒトヘルペスウイルス(HHV)6、7または8型などの、ヘルペスウイルス科に属するウイルスを含む。さらに他の態様において、ウイルスは水疱性口内炎ウイルスではない。さらに他の態様において、ウイルスはシンドビスウイルスではない。
【００２２】
本発明は、対象におけるヘルペスウイルス科のウイルスの感染を処置および/または予防する方法を含む。特定の態様において、本発明は、対象におけるCMV感染を処置する方法を含む。他の態様において、対象は妊娠している。さらに他の態様において、対象は新生児である。さらに他の態様において、対象は出生前の胎児である。さらに他の態様において、対象はヒトである。
【００２３】
バルプロエート(VPA)は、広く使われている抗てんかん薬であり、双極性障害、てんかん、神経因性疼痛および片頭痛を含む、複数の精神医学的および神経学的疾患の処置に利用されている。VPA療法の重要な副作用には、肝毒性および催奇形性が含まれる。ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)に対するVPAの阻害作用は、この薬物が神経管欠損、骨格異常および胎児発達中の自閉症に及ぼす有害作用の根底をなす。より有効で低い毒性のVPA抗てんかん同族体であるバルプロミド(VPD)は、双極性障害の気分安定剤として25年以上使用されてきた。VPAとは対照的に、VPDはHDAC阻害活性を欠いている。
【００２４】
VPAおよびVPDはエプスタインバーウイルス(EBV)の潜伏期からの再活性化を弱めるが、VPAはHIV、VSV、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよびベータヘルペスウイルスHHV-6およびhCMVを含む多種多様の他のウイルスの感染および複製を、HDAC阻害を含む機構を介して増強する。これらの増強効果は、神経障害の処置のためのAIDS患者におけるおよび発作を経験している先天性CMV感染新生児におけるVPAの使用に対する懸念を生じさせる。
【００２５】
本明細書において実証されるように、神経障害を処置するために長年使われている薬物であるVPDおよびVCDは、インビトロおよびインビボの両方でヒトCMVおよびマウスCMVの両方の予期せぬ、実質的かつ特異的な阻害を引き起こす。特定の非限定的な態様において、薬物は、CMV感染の初期段階をブロックすることによって作用する。これらの薬物の強力な抗CMV活性は、GFPレポーター発現および免疫細胞化学の両方で測定した場合の感染細胞数の低減、細胞死の低減、ウイルスプラークサイズの低減、インビボ生存の増加ならびにCMV誘発性の健康障害の低減を含む、複数の一連の証拠によって実証される。これらの化合物の抗CMV活性は決して記述されることはなかった。CMV阻害は、抗けいれん薬および気分安定化の目的のために使われる治療レベルより低い低薬物濃度で起こる。さらに、非感染新生仔マウスへの薬物投与は、有害な応答を誘発しなかった(図9)。特定の態様において、ヒトで用いるのに安全なVCDは、発達中のおよび全身免疫の低減した状態でのCMV感染によって引き起こされる重大な問題を低減するために用いることができる。
【００２６】
本明細書において実証されるように、生後3週間のVCDの投与は、新生仔マウスにおける神経学的マイルストーンの適時獲得を回復させ、若年マウスにおける長期運動および行動転帰を救済した。脳の大きさの減少、小脳形成不全およびニューロンの損失を含む、CMV媒介性脳欠損は、VCDによって実質的に弱められた。VCDを投与された非感染対照マウスの神経発達に及ぼす有害な副作用は検出されなかった。これらのデータは、神経発達の重要な期間中のVCDが脳におけるCMV複製を効果的に抑制し、即時および長期の神経学的転帰の両方を安全に改善できることを示す。VCDを用いたCMV感染ヒト胎児星状細胞の処理は、利用可能な抗CMV薬とは異なる機構である、細胞へのウイルス粒子付着のブロックによってウイルス感染性および複製の両方を低減させた。
【００２７】
本明細書において実証されるように、早期の個体発生の間に脳外に投与された低用量VCDは、少なくとも2つの異なる作用部位を介して感染マウスの発達中の脳内のmCMVを効果的に抑制する。VCDはmCMVの末梢レベルを低減させ、それにより脳への進入に利用可能なウイルス量を減少させる。第2に、VCDは脳内で直接作用して、既存の脳CMV感染をブロックする。本研究においてCMVをブロックする用量は、新生仔げっ歯類実験において発作を減弱させるために使われる用量よりも低い。VCDの抗ウイルス作用は、投与直後から始まり、出生後の脳発達の重要な期間中、脳全体のCMVレベルを効果的に減衰させる。このウイルス負荷の減少は、VCDで処置した感染新生仔マウスにおける正常な初期神経学的転帰の同時回復を伴う。運動障害ならびに社会的および探索的行動障害も、ウイルス誘発性の脳成長不全および小脳発達の乱れも含む、遅発性の神経行動障害は、新生仔期にVCDを投与されたCMV感染若年マウスでは救済され、長期にわたる有益な効果を示唆している。VCDで処置した非感染対照マウスの神経発達に及ぼす有害な副作用は観察されなかった。
【００２８】
新生仔マウス脳は、新生児ヒト脳よりも実質的に発達が遅い。脳急成長のタイミング、初期の神経発生、接続の確立および精緻化、髄鞘形成、ならびに神経新生に基づいて、出生時のマウスCNSは、後期第1期/早期第2期ヒト胎児CNSと同等であるものと提唱されている。これは、ヒトの脳発達およびhCMV感染のための重要な期間である。マウス産仔を出生日に感染させることにより、この動物モデルは、発達中の脳に及ぼすCMVの効果を研究するための有益な手段となる。感染した新生仔マウスは、小頭症、小脳低形成、神経細胞喪失、神経発達遅延、運動障害および行動障害を含む、先天的に感染したヒト乳児において報告されたものと同様の脳病理および神経学的症状を示す。これらのデータは、早期脳発達中のCMV感染および新規抗CMV処置を調べるためのこのインビボモデルの有効性を支持している。
【００２９】
部分的に有効であるにもかかわらず、ガンシクロビルおよびそのプロドラッグであるバルガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、ならびにホミビルセンを含む、現在利用可能なCMV抗ウイルス薬は、毒性作用および催奇形作用の両方を示す。この理由のため、それらは、妊娠女性または感染した胎児もしくは新生児の処置のために承認または推奨されておらず、かくしてそれを必要としうる人々に最大でまたは最善で遅延となる処置を与えることができず、初期の脳発達中のCMV誘発脳障害の潜在的予防または改善を妨げている。あまり重症に感染していないヒト乳児も、認知障害および運動障害、行動障害、視覚障害、ならびに聴覚障害を含む、遅発性の神経学的合併症のリスクがあるため、全ての感染新生児において使用できる、より安全なインビボプロファイルを有する抗CMV化合物の開発は、実質的に有効であろう。
【００３０】
VCDは、初期発生の異なる動物モデルを利用したいくつかの研究において催奇性または毒性活性を示さず、成体での神経精神障害を処置するために長年にわたって安全に使用されている。その安全性プロファイルのさらなる確認は、薬物媒介性抗けいれん薬および気分安定化作用の前臨床および臨床研究から得られている。VCDは低いμM用量レベルで、ガンシクロビルと比較してわずかに低減した有効レベルで有効である; それにもかかわらず、インビボでの実質的なCMV阻害が皮下送達で観察された。新生仔マウスに関する研究は、VCDの強力な抗CMV作用を同定した。
【００３１】
CMV複製の種特異性は、動物モデルにおけるhCMVに対する新規抗ウイルス薬の活性の試験を妨げる。ネズミおよびヒトCMVは類似のゲノムを共有し、mCMVに対して有効な抗CMV薬はhCMVに対しても活性である可能性が高い。VCDによるヒト胎児星状細胞のhCMV感染の減弱は、本マウスインビボモデルの有用性を裏付けるものであり、VCDが発達中のおよび成体のヒト脳におけるhCMVに対しても有効であることを示唆している。いずれの理論によっても限定されることを望まないが、VCDは、処置に現在利用可能なhCMV抗ウイルス薬のものとは異なる作用機序である、細胞膜へのhCMVの付着をブロックすることによって、作用するようである。特定の非限定的な態様において、VCDは、薬物耐性CMV株の出現が実質的な課題となった免疫抑制状態成体での治療的選択肢である。他の密接に関連した分子、例えば、バルプロミドもまたCMVを減弱しうるが、しかしバルプロミドは、ウイルス感染を増強できるバルプロエートに代謝されうるので、VCDはバルプロエートへの変換がないためさらに良い選択肢である。
【００３２】
本明細書において実証されるように、皮下低用量VCDは、発生中のマウス脳におけるmCMV複製を効果的かつ安全に減弱させ、ウイルス誘発性の脳障害および有害な神経学的転帰からこれらの動物を救う。さらに、VCDは、細胞表面へのウイルス付着をブロックすることによって、ヒト胎児脳細胞におけるhCMV複製を抑制する。VCDは既に臨床的に利用可能であり、早期開発の複数モデルにおいて安全であることが証明され、抗CMV作用の新規機構を示すことを考慮すると、発生中のヒトの脳におけるCMV感染を処置するために治療的に用いることができる。
【００３３】
定義
別途定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同一の意味を有する。本明細書において記述されているものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実践または試験において用いることができるが、例示的な方法および材料が記述される。本明細書において用いられる場合、以下の各用語は、この節においてそれに関連付けられる意味を有する。
【００３４】
一般に、本明細書において用いられる命名法ならびに細胞培養、腫瘍学、分子遺伝学、ウイルス学、薬理学および有機化学における実験室手順は、当技術分野において周知でかつ一般的に利用されるものである。
【００３５】
標準的な技法は、生化学的および/または生物学的操作のために用いられる。技法および手順は、一般に、当技術分野における従来の方法および本明細書を通して提供される種々の一般的な参考文献(例えば、Sambrook and Russell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubel et al., 2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)にしたがって行われる。
【００３６】
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、該冠詞の文法上の対象が1つまたは2つ以上(すなわち少なくとも1つ)であることをいうように本明細書において用いられる。例として、「1つの(an)要素」とは1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【００３７】
量、時間的持続時間などのような測定可能な値をいう場合に本明細書において用いられる「約」とは、指定された値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%の変動、およびさらにより好ましくは±0.1%の変動であって、開示される方法を行うのに適切である変動を包含するように意図されている。
【００３８】
本明細書において用いられる場合、「類似体(analog)」、「類似体(analogue)」または「誘導体」という用語は、1つまたは複数の化学反応によって別の化合物または分子から調製された化合物または分子をいうように意図される。したがって、類似体は、本明細書において記述される任意の小分子阻害剤の構造と類似の、もしくはそれに基づく構造であることができ、および/または類似のもしくは異なる代謝挙動を有しうる。
【００３９】
「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、疾患が寛解しなければ動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことである。対照的に、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持可能であるが、動物の健康状態が障害の非存在下の場合よりも好ましくない、健康状態のことである。処置されないままでも、障害は動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こすわけではない。
【００４０】
本明細書において用いられる「阻害する」という語句は、分子、反応、相互作用、遺伝子、mRNA、および/もしくはタンパク質の発現、安定性、機能もしくは活性を測定可能な量だけ低減すること、または完全に抑止することを意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子およびmRNAに結合する、刺激を部分的にまたは完全にブロックする、活性化を低下する、抑止する、遅延する、タンパク質、遺伝子およびmRNAの安定性、発現、機能および活性を不活性化する、減じるまたは下方制御する化合物、例えば、アンタゴニストである。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「薬学的組成物」または「組成物」という用語は、本発明の範囲内で有用な少なくとも1つの化合物と薬学的に許容される担体との混合物を意味する。薬学的組成物は、対象に対する化合物の投与を容易にする。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明の範囲内で有用な化合物がその意図される機能を行うことができるようにそれを患者内でまたは患者に運ぶまたは輸送することに関与する、液体もしくは固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物または担体を意味する。典型的には、そのような構築物は身体の1つの器官または部分から身体の別の器官または部分に運ばれるまたは輸送される。各担体は、本発明の範囲内で有用な化合物を含む製剤の他の成分と適合性があって、患者に有害ではないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例としては、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖; コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン; セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体; トラガント末; 麦芽; ゼラチン; タルク; カカオバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤; ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油; プロピレングリコールなどのグリコール; グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール; オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル; 寒天; 水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤; 界面活性剤; アルギン酸; パイロジェンフリー水; 等張食塩水; リンゲル液; エチルアルコール; リン酸緩衝液; ならびに薬学的製剤に使用される他の無毒で適合性のある物質が挙げられる。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、本発明の範囲内で有用である化合物の活性と適合性があって、患者に生理学的に許容される、あらゆるコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。補足的な活性化合物も本組成物に組み入れることができる。「薬学的に許容される担体」は、本発明の範囲内で有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含みうる。本発明の実施において使用される薬学的組成物に含まれうる他のさらなる成分は、当技術分野において公知であり、例えば参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記述されている。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される塩」という専門用語(language)は、無機酸、無機塩基、有機酸、無機塩基を含む、薬学的に許容される非毒性の酸および塩基から調製された投与化合物の塩、その溶媒和物、水和物および包接化合物をいう。適当な薬学的に許容される酸付加塩は無機酸または有機酸から調製されうる。無機酸の例としては、硫酸塩、硫酸水素塩、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、ならびにリン酸(リン酸水素塩およびリン酸二水素塩を含む)が挙げられる。適切な有機酸は脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環、カルボン酸およびスルホン酸クラスの有機酸から選択することができ、その例としてはギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(パモ酸)、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が挙げられる。本発明の化合物の適当な薬学的に許容される塩基付加塩としては例えば、例えばカルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩および亜鉛塩などのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩を含む金属塩が挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩としては、例えばN,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N-メチルグルカミン)およびプロカインなどの塩基性アミンから作製される有機塩も挙げられる。全てのこれらの塩は、対応する化合物から、例えば適切な酸または塩基と該化合物とを反応させることにより調製されうる。
【００４４】
「薬学的有効量」および「有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供するための薬剤の非毒性であるが十分な量をいう。その結果は、疾患もしくは障害の徴候、症状もしくは原因の低減および/もしくは緩和、または生物学的系の任意の他の所望の改変であることができる。任意の個々の場合における適切な有効量は、当業者により通常の実験を用いて判定されうる。「薬学的製剤」とは、担体、溶媒、賦形剤および/または塩が製剤の活性成分(例えば、本発明の化合物)と適合しなければならないことをさらに意味する。「薬学的製剤」および「薬学的組成物」という用語は一般に交換可能であり、それらは本出願の目的のためにそのように用いられることが当業者によって理解される。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防」または「予防すること」という用語は、疾患、障害および/または状態の1つまたは複数の症状または特徴の発症を部分的または完全に予防するまたは遅延させる任意の方法をいう。予防は、疾患状態に曝露されうる、または疾患状態の素因を有しうるが、疾患状態の症状をまだ経験していないまたは呈さない対象において、疾患状態の臨床症状を発症させないこと、すなわち、疾患の発症を阻害することである。疾患、障害、および/または状態の徴候を示さない対象に予防を施すことができる。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、投与が企図される「対象」、「患者」または「個体」という用語は、ヒト(すなわち、任意の年齢群の男性もしくは女性、例えば小児対象(例えば、幼児、子供、青年)もしくは成人対象(例えば、若年成人、中年成人もしくは高齢成人)および/または他の霊長類(例えば、カニクイザル、アカゲザル); ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および/もしくはイヌのような商業的に関連する哺乳動物を含む、哺乳動物; ならびに/あるいはニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、および/もしくはシチメンチョウのような商業的に関連する鳥類を含む、鳥類を含むが、これらに限定されることはない。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「治療的有効量」という用語は、患者に投与される場合、疾患または障害の症状を処置、最小化および/または改善する、本発明の化合物の量である。「治療的有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患状態およびその重症度、処置される患者の年齢などに応じて変化するであろう。当業者は治療的有効量を、自身の知識および本開示を考慮して日常的に判定することができる。
【００４８】
「処置する」、「処置すること」および「処置」という用語は、本明細書において記述される治療的または予防的措置をいう。「処置」の方法は、そのような処置を必要とする対象、例えば、疾患もしくは障害に罹患している対象、またはそのような疾患もしくは障害を最終的に獲得しうる対象に、障害もしくは再発性障害の1つもしくは複数の症状を予防、治癒、遅延するため、その症状の重症度の軽減するため、またはその症状を改善するため、あるいはそのような処置の非存在下で予想されるものを超えて対象の生存を延長するため、本発明の組成物を投与することを利用する。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、以下の略語が提示される: ACV, アシクロビル; CDV, シドホビル; CMV, サイトメガロウイルス; ds, 二本鎖; EBV, エプスタイン・バーウイルス; FOS, ホスカルネット; hCMV, ヒトサイトメガロウイルス; GCV, ガンシクロビル; HDAC, ヒストンデアセチラーゼ; HHV-5, ヒトヘルペスウイルス5型; HIV, ヒト免疫不全ウイルス; HSV, 単純ヘルペスウイルス; mCMV, マウスCMV; SID, sec-ブチルイソプロピルアセトアミド(または2-イソプロピル-3-メチルペンタンアミド); SIN, シンドビスウイルス; SPD, sec-ブチルプロピルアセトアミド(または3-メチル-2-プロピルペンタンアミド); ss、一本鎖; VACV, バラシクロビル; VCD, バルノクタミド; VGCV, バルガンシクロビル; VPA, バルプロエート; VPD/VPM, バルプロミド; VSV, 水疱性口内炎ウイルス; VZV, 水痘帯状疱疹ウイルス; TED, tert-ブチルエチルアセトアミド(または2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド)。
【００５０】
範囲: 本開示を通じて、本発明のさまざまな局面を範囲の形式で提示することができる。範囲の形式の記述は、便宜のためおよび簡潔にするためにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、その範囲内の全ての可能な部分範囲および個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００５１】
化合物および組成物
本発明の範囲内で有用な化合物は、非限定的に、以下を含む:
バルプロミド(VPDまたはVPM; 2-プロピルペンタンアミド):
2019514966.tif 000009
; 
バルノクタミド(VCD; 2-エチル-3-メチルペンタンアミド)
2019514966.tif 000010
; 
tert-ブチルエチルアセトアミド(TED; 2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド)
2019514966.tif 000011
、および
式(I)
2019514966.tif 000012
(式中aが0、1、2、3または4であり; bが1、2または3であり; cが1、2または3であり; かつRが、HおよびC1〜C4アルキルからなる群より選択される)の分子、
またはそれらの溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物。
【００５２】
特定の態様において、aは0である。他の態様において、RはHである。さらに他の態様において、Rは0であり、aは0である。さらに他の態様において、aは0であり、bは1であり、cは1である。
【００５３】
特定の態様において、RはHであり、aは0であり、bは1であり、cは1であり、化合物は構造(II)の化合物、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である。
2019514966.tif 000013
【００５４】
特定の態様において、RはCH3であり、aは0であり、bは0であり、cは1であり、化合物は構造(III)の化合物、またはその溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物である。
2019514966.tif 000014
【００５５】
特定の態様において、化合物(II)は、(2R,3R)、(2R,3S)、(2S,3R)および(2S,3S)からなる群より選択されるジアステレオ異性体、またはそれらの任意の混合物である。
【００５６】
特定の態様において、化合物(III)は、(2R,3R)、(2R,3S)、(2S,3R)および(2S,3S)からなる群より選択されるジアステレオ異性体、またはそれらの任意の混合物である。
【００５７】
特定の態様において、化合物(I)、(II)または(III)は、鏡像異性的におよび/またはジアステレオ異性的に純粋な形態である。他の態様において、化合物(I)、(II)または(III)は、鏡像異性体のおよび/またはジアステレオ異性体の混合物である。
【００５８】
本発明の化合物は1つまたは複数の立体中心を保有しえ、各立体中心は独立して(R)配置または(S)配置で存在しうる。特定の態様において、本明細書において記述される化合物は光学活性体またはラセミ体として存在する。本明細書において記述される化合物は、本明細書において記述される治療上有用な特性を有するラセミ体、光学活性体、位置異性体および立体異性体、またはそれらの組み合わせを包含する。光学活性体の調製は、再結晶技術によるラセミ体の分割、光学活性出発原料からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を用いるクロマトグラフィー分離を非限定的な例として含む任意の適当な様式で実現される。本明細書においてラセミ体の式で例示される化合物は、2つの鏡像異性体もしくはそれらの混合物、または2つもしくはそれ以上のキラル中心が存在する場合、全てのジアステレオ異性体もしくはそれらの混合物のいずれかをさらに表す。
【００５９】
特定の態様において、本発明の化合物は、互変異性体として存在する。全ての互変異性体は、本明細書において列挙される化合物の範囲内に含まれる。
【００６０】
本明細書において記述される化合物は、同一の原子数を有するが自然界に通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子で1つまたは複数の原子が置き換えられた同位体標識化合物も含む。本明細書において記述される化合物への包含に適した同位体の例としては2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P、および35Sが挙げられるが、これらに限定されることはない。特定の態様において、重水素のような、より重い同位体による置換は、より大きな化学的安定性をもたらす。同位体標識化合物は、別の様式で利用される非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を用いる任意の適当な方法によってまたはプロセスによって調製される。
【００６１】
特定の態様において、本明細書において記述される化合物は、発色団もしくは蛍光部分、生物発光標識、または化学発光標識の使用を含むが、これらに限定されない、他の手段によって標識される。
【００６２】
本明細書において提供される態様の全てにおいて、適当な任意の置換基の例は、主張される発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の化合物は、本明細書において提供される置換基のいずれか、または置換基の組み合わせを含みうる。
【００６３】
本発明は、本発明の範囲内で有用な任意の化合物を含む薬学的組成物を含む。本明細書において記述される薬学的組成物は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製されうる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を担体または1つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要または望ましい場合には、生成物を所望の単回または複数回投薬単位に成形または包装することを含む。
【００６４】
塩
本明細書において記述される化合物は酸および/または塩基と塩を形成することができ、そのような塩は本発明に含まれる。特定の態様において、塩は薬学的に許容される塩である。「塩」という用語は、本発明の方法の範囲内で有用な遊離酸および/または遊離塩基の付加塩を包含する。「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的用途での有用性を与える範囲内の毒性プロファイルを有する塩を意味する。本発明の実践における有用性、例えば本発明の方法の範囲内で有用な化合物の合成、精製または製剤化の過程における有用性を有するにもかかわらず薬学的に許容されない塩は、高い結晶性などの特性を有することがある。
【００６５】
適当な薬学的に許容される酸付加塩は無機酸または有機酸から調製されうる。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸(硫酸塩および硫酸水素塩)、ならびにリン酸(リン酸水素塩およびリン酸二水素塩を含む)が挙げられる。適切な有機酸は脂肪族、脂環式、芳香族、芳香脂肪族、複素環、カルボン酸およびスルホン酸クラスの有機酸から選択することができ、その例としてはギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、マロン酸、サッカリン、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(パモ酸)、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が挙げられる。
【００６６】
本発明の化合物の適当な薬学的に許容される塩基付加塩には、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩および亜鉛塩のようなアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩および遷移金属塩を含む金属塩が含まれる。薬学的に許容される塩基付加塩には、例えばN,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N-メチルグルカミンとしても知られる)およびプロカインのような塩基性アミンから作出される有機塩も含まれる。全てのこれらの塩は、対応する化合物から、例えば適切な酸または塩基と該化合物とを反応させることにより調製されうる。
【００６７】
併用療法
特定の態様において、本発明の化合物は、哺乳動物においてウイルス感染を処置するのに有用な少なくとも1つのさらなる化合物と同時に用いられる場合に本発明の方法において有用である。
【００６８】
哺乳動物においてウイルス感染を処置するのに有用なさらなる化合物の非限定的な例は以下である: ガンシクロビル(GCV) [9-(1,3-ジヒドロキシ-2-プロポキシメチル)グアニン]; 2'-デオキシグアノシンの非環状ヌクレオシド類似体であり、ウイルスDNAポリメラーゼを阻害する; バルガンシクロビル(VGCV): より高い経口生物学的利用能を有する、GCVのプロドラッグ; ホスカルネット(FOS): ウイルスDNAポリメラーゼを阻害するピロリン酸類似体; シドホビル(CDV) [(S)-1-(3-ヒドロキシ-2-ホスホニルメトキシプロピル)シトシン]: dCMPの非環状ヌクレオシドホスホネート類似体であり、ウイルスDNAポリメラーゼを阻害することにより作用する; ホミビルセン
2019514966.tif 000015
: hCMV主要即時初期遺伝子座に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド; アシクロビル(ACV) [9-(2-ヒドロキシエトキシメチル)グアニン): 2'-デオキシグアノシンの類似体であり、ウイルスDNAポリメラーゼを阻害する; バラシクロビル(VACV): 改善された経口生物学的利用能を有する、ACVのプロドラッグ。
【００６９】
相乗効果は、例えばシグモイド-Emax方程式(Holford & Scheiner, 19981, Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453)、Loewe相加性方程式(Loewe & Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326)メジおよびアン効果方程式(Chou & Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55)のような適当な方法を用いて計算されうる。本明細書の他の箇所で言及した各方程式を実験データに適用することで、薬物組み合わせの効果を評価するために役立つ対応グラフを作成することができる。本明細書の他の箇所で言及した方程式に関連する対応グラフは、それぞれ濃度-効果曲線、アイソボログラム曲線および組み合わせ指数曲線である。
【００７０】
方法
本発明は、その必要のある対象において哺乳動物におけるヘルペスウイルス科のウイルスの感染を処置および/または予防する方法を含む。本方法は、本発明において企図される化合物、またはその任意の溶媒和物、塩、鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはそれらの任意の混合物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。
【００７１】
特定の態様において、化合物は、少なくとも薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物または製剤の一部である。
【００７２】
特定の態様において、化合物の投与は、対象において顕著な抗けいれん効果を有しない。他の態様において、化合物の投与は、対象において顕著な気分安定効果および/または気分調整効果(抗片頭痛効果を含む)を有しない。
【００７３】
特定の態様において、対象には、ウイルス感染を処置および/または予防するのに有用な1つまたは複数のさらなる薬剤がさらに投与される。特定の態様において、化合物および1つまたは複数のさらなる薬剤は対象に同時投与される。他の態様において、化合物および1つまたは複数のさらなる薬剤は共製剤化される。
【００７４】
特定の態様において、化合物は、経口、経鼻、吸入、局所、頬側、直腸、胸膜、腹膜、腹腔内、膣、筋肉内、皮下、経皮、硬膜外、気管内、耳内、眼内、くも膜下腔内、羊水内、臍帯内および静脈内経路からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって対象に投与される。他の態様において、化合物の治療的有効量は、約0.001 mg/日〜約10,000 mg/日に及ぶ。さらに他の態様において、化合物は毎日投与される。他の態様において、化合物は休息(投与なし)日1日で週6日投与される。さらに他の態様において、化合物は休息日2日で週5日投与される。さらに他の態様において、化合物は休息日3日で、1日1回、週4日投与される。さらに他の態様において、化合物は休息日4日で、1日1回、週3日投与される。さらに他の態様において、化合物は休息日6日で、1日1回、週1日投与される。投与日は、連続していてもよく、または1日もしくは複数の休息日と交互であってもよい。
【００７５】
特定の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、対象はヒトである。さらに他の態様において、対象は妊娠している。さらに他の態様において、対象は新生児である。さらに他の態様において、対象は出生前の胎児である。
【００７６】
投与/投与量/製剤
投与計画は、有効量を構成するものに影響を与えうる。治療用製剤は、本発明において企図される疾患または障害の発症の前または後に対象に投与されうる。さらに、いくつかの分割投薬量および時差投薬量が毎日もしくは順次投与されてもよく、あるいは用量は連続注入されてもよく、またはボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性が示す通り、比例的に増やされまたは減らされうる。
【００７７】
患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに対する本発明の組成物の投与は、公知の手順を用い、本発明において企図される疾患または障害を処置するために有効な投与量および期間で行われうる。治療効果を達成するために必要な治療用化合物の有効量は、患者における疾患または障害の状態; 患者の年齢、性別、および体重; ならびに本発明において企図される疾患または障害を処置するための治療用化合物の能力のような要因によって変化しうる。投与量計画は、最適な治療応答を提供するように調整されうる。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与されてもよく、あるいは治療状況の緊急性が示す通り用量が比例的に低減されてもよい。本発明の治療用化合物の有効な容量範囲の非限定的な例は、約1〜5,000 mg/kg体重/日である。本発明を実践するのに有用な薬学的組成物は、1 ng/kg/日〜10,000 mg/kg/日の用量を送達するために投与されうる。他の態様において、化合物の治療的有効量は、約10 μg/kg/日〜約1,000 mg/kg/日に及ぶ。さらに他の態様において、化合物の治療的有効量は、約100 mg/kg/日である。
【００７８】
当業者は、関連性のある要因を検討し、過度の実験なしに治療用化合物の有効量に関する判定を行うことができるであろう。
【００７９】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性であることなく、所望の、特定患者に対する治療応答、組成および投与様式を実現するために有効な活性成分の量を得るように変動しうる。
【００８０】
特に、選択される投与量レベルは、利用される特定の化合物の活性、投与の時間、化合物の排泄の速度、処置の期間、化合物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因を含む種々の要因に依存する。
【００８１】
当技術分野において通常の知識を有する医師、例えば内科医または獣医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に判定し処方しうる。例えば、内科医または獣医は、薬学的組成物において利用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るために必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで投与量を徐々に増加させることができる。
【００８２】
特定の態様において、投与の容易さおよび投与量の均一性のため、投与量単位形態で化合物を製剤化することが有利である。本明細書において用いられる投与量単位形態とは、処置される患者用の単位投薬量として適した物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的媒体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の治療用化合物を含有する。本発明の投与量単位形態は、(a) 治療用化合物の独自の特徴および実現すべき特定の治療効果、ならびに(b) 本発明において企図される疾患または障害の処置用にそのような治療用化合物を調合/製剤化する技術分野において内在する限界により規定され、かつそれに直接依存する。
【００８３】
特定の態様において、本発明の組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化される。他の態様において、本発明の薬学的組成物は、治療的有効量の本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。さらに他の態様において、本発明の化合物は、組成物中の唯一の生物学的に活性な薬剤(すなわち、ウイルス感染を処置することができる)である。さらに他の態様において、本発明の化合物は、組成物中で治療有効量の唯一の生物学的に活性な薬剤(すなわち、ウイルス感染を処置することができる)である。
【００８４】
担体は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、その適当な混合物、ならびに植物油を例えば含有する溶媒または分散媒でありうる。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持することができる。微生物の作用の阻止を各種抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどで実現することができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウム、またはマンニトールおよびソルビトールのような多価アルコールを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含めることでもたらすことができる。
【００８５】
特定の態様において、本発明の組成物は、1日当たり1〜5回またはそれ以上の範囲の投与量で患者に投与される。他の態様において、本発明の組成物は、1日1回、2日に1回、3日に1回〜週1回、および2週間に1回を含むが、これらに限定されない、投与量の範囲で患者に投与される。当業者には、本発明のさまざまな組み合わせ組成物の投与頻度が、年齢、処置される疾患または障害、性別、全身健康状態、および他の要因を含むが、これらに限定されない、多くの要因に応じて個体ごとに異なるということは容易に明らかである。したがって、本発明を、任意の特定の投与量計画に限定されると解釈すべきではなく、任意の患者に投与される正確な投与量および組成は、主治医が患者に関する全ての他の要因を考慮に入れて判定する。
【００８６】
特定の態様において、本発明の組成物は、化学療法の標準コースが完了した後に投与される。他の態様において、本発明の組成物は、維持および/または予防処置として投与される。特定の態様において、化合物の維持および/または予防処置は、約1 mg/kg/日〜約1,000 mg/kg/日に及ぶ。さらに他の態様において、化合物の治療的有効量は約10〜500 mg/kg/日である。さらに他の態様において、維持および/または予防処置は、1日1回および毎日投与される。さらに他の態様において、維持および/または予防処置は、1日1回、週6日、週に休息日1日で投与される。さらに他の態様において、維持および/または予防処置は、1日1回、週5日、休息日2日で投与される。さらに他の態様において、維持および/または予防処置は、1日1回、週4日、休息日3日で投与される。さらに他の態様において、維持および/または予防処置は、1日1回、週3日、休息日4日で投与される。投与日は、連続していてもよく、または1日もしくは複数の休息日と交互であってもよい。
【００８７】
投与用の本発明の化合物は、約1 μg〜約10,000 mg、約20 μg〜約9,500 mg、約40 μg〜約9,000 mg、約75 μg〜約8,500 mg、約150 μg〜約7,500 mg、約200 μg〜約7,000 mg、約3050 μg〜約6,000 mg、約500 μg〜約5,000 mg、約750 μg〜約4,000 mg、約1 mg〜約3,000 mg、約10 mg〜約2,500 mg、約20 mg〜約2,000 mg、約25 mg〜約1,500 mg、約30 mg〜約1,000 mg、約40 mg〜約900 mg、約50 mg〜約800 mg、約60 mg〜約750 mg、約70 mg〜約600 mg、約80 mg〜約500 mg、ならびにそれらの間の任意のおよび全ての整数増分または部分増分の範囲でありうる。
【００８８】
いくつかの態様において、本発明の化合物の用量は、約1 mg〜約2,500 mgである。いくつかの態様において、本明細書において記述される組成物において用いられる本発明の化合物の用量は、約10,000 mg未満、または約8,000 mg未満、または約6,000 mg未満、または約5,000 mg未満、または約3,000 mg未満、または約2,000 mg未満、または約1,000 mg未満、または約500 mg未満、または約200 mg未満、または約50 mg未満である。同様に、いくつかの態様において、本明細書において記述される第2の化合物の用量は、約1,000 mg未満、または約800 mg未満、または約600 mg未満、または約500 mg未満、または約400 mg未満、または約300 mg未満、または約200 mg未満、または約100 mg未満、または約50 mg未満、または約40 mg未満、または約30 mg未満、または約25 mg未満、または約20 mg未満、または約15 mg未満、または約10 mg未満、または約5 mg未満、または約2 mg未満、または約1 mg未満、または約0.5 mg未満、ならびにそれらの任意のおよび全ての整数増分または部分増分である。
【００８９】
特定の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の化合物を単独でまたは第2の医薬剤(pharmaceutical agent)と組み合わせて保持する容器; および本発明において企図される疾患または障害の1つまたは複数の症状を処置、予防または軽減するために該化合物を用いるための使用説明書を含む、包装された薬学的組成物を対象にする。
【００９０】
製剤は、従来の賦形剤、すなわち、腹腔内、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または当技術分野で公知の任意の他の適当な投与様式に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質と混ぜ合わせて利用されうる。薬学的調製物は、滅菌され、所望の場合には補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝液に影響を与えるための塩類、着色剤、香味剤および/または芳香物質などと混合されうる。それらはまた、所望の場合には他の活性薬剤と組み合わされうる。
【００９１】
本発明の組成物のいずれかの投与経路には、腹腔内、経口、経鼻、直腸、膣内、非経口、頬側、舌下または局所が含まれる。本発明で用いるための化合物は、経口または非経口、例えば、経皮、経粘膜(例えば、舌下、舌、(経) 頬側、(経)尿道、膣(例えば、経膣的および膣周囲に)、鼻(腔内)および(経)直腸)、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内(intragastrical)、髄腔内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、羊水内、臍帯内および局所投与用のような、任意の適当な経路による投与のために製剤化されうる。
【００９２】
適当な組成物および投与量形態には、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、丸剤、ゲルカプセル剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ剤、経皮パッチ剤、ゲル剤、散剤、ペレット剤、マグマ剤、舐剤、クリーム剤、ペースト剤、プラスター剤、ローション剤、ディスク剤、坐薬、経鼻または経口投与用液体スプレイ剤、吸入用乾燥粉末製剤またはエアロゾル製剤、膀胱内投与用組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用であろう製剤および組成物は、本明細書において記述される特定の製剤および組成物に限定されないと理解されるべきである。
【００９３】
経口投与
経口適用の場合、錠剤、糖衣錠剤、液剤、液滴剤、坐剤またはカプセル剤、カプレット剤およびゲルカプセル剤が特に適している。経口使用が意図される組成物は、当技術分野において公知である任意の方法にしたがって調製することができ、そのような組成物は、錠剤の製造に適した、不活性で無毒の薬学的賦形剤からなる群より選択される1つまたは複数の剤を含有することができる。そのような賦形剤には、例えば、ラクトースのような不活性希釈剤; コーンスターチのような造粒剤および崩壊剤; デンプンのような結合剤; ならびにステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤が含まれる。錠剤はコーティングされていなくてもよく、またはそれらは品位を与えるためもしくは活性成分の放出を遅延させるため公知の技法によってコーティングされてもよい。経口使用のための製剤はまた、活性成分が不活性希釈剤と混合された硬ゼラチンカプセルとして提示されてもよい。
【００９４】
経口投与の場合、本発明の化合物は、結合剤(例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース); 増量剤(例えば、コーンスターチ、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸カルシウム); 滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ); 崩壊剤(例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン); または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に許容される賦形剤で従来の手段により調製された錠剤またはカプセル剤の形態であってもよい。所望の場合、錠剤は適当な方法およびコーティング材料、例えばColorcon, West Point, Pa.から入手可能なOPADRY(商標)フィルムコーティングシステム(例えば、OPADRY(商標) OY Type、OYC Type、Organic Enteric OY-P Type、Aqueous Enteric OY-A Type、OY-PM TypeおよびOPADRY(商標) White, 32K18400)などを用いてコーティングされてもよい。経口投与のための液体調製物は、溶液、シロップまたは懸濁液の形態でありうる。液体調製物は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは硬化食用脂); 乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシアゴム); 非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール); および保存剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸)のような薬学的に許容される添加剤で従来の手段により調製されうる。
【００９５】
活性成分の出発粉末または他の粒子状材料を改質するための造粒技法は薬学分野において周知である。典型的には、粉末を結合剤材料と混合して、「造粒物」といわれるより大きく恒久的な易流動性の凝集体または顆粒にする。例えば、溶媒を用いる「湿式」造粒プロセスは、粉末を結合剤材料と一緒にし、湿式造粒塊の形成を生じさせる条件下で水または有機溶媒で湿らせ、次に造粒塊から必ず溶媒を蒸発させることを一般に特徴とする。
【００９６】
溶融造粒は一般に、本質的に水または他の液体溶媒の添加の非存在下での粉末材料または他の材料の造粒を促進するための、室温で固体または半固体である(すなわち相対的に低い軟化点または融点の範囲を有する)材料の使用に本質がある。低融点固体は、融点範囲の温度に加熱される際に液化して結合剤または造粒媒体として作用する。液化固体は、それが接触する粉末材料の表面上に拡散し、冷却時に、最初の材料が一緒に結合した固体造粒塊を形成する。次に得られた溶融造粒物を、経口剤形を調製するために、錠剤プレスに供するかまたはカプセル化することができる。溶融造粒は、固体分散体または固溶体を形成することで活性成分(すなわち薬物)の溶解速度および生物学的利用能を向上させる。
【００９７】
米国特許第5,169,645号では、改善された流動性を有する直接圧縮性ワックス含有顆粒が開示されている。顆粒は、ワックスを溶融物中で特定の流動性向上添加剤と混合した後、混合物を冷却および造粒する際に得られる。特定の態様において、ワックスと添加剤との溶融組み合わせ中でワックスそれ自体のみが溶融し、他の場合では、ワックスと添加剤との両方が溶融する。
【００９８】
本発明はまた、本発明の1つまたは複数の化合物の遅延放出をもたらす層、および本発明において企図される疾患または障害の処置のための医薬の即時放出をもたらすさらなる層を含む、多層錠剤を含む。ワックス/pH感受性重合体混合物を用いて、活性成分が封入された胃不溶性組成物を得ることができ、これによりその遅延放出が確実になる。
【００９９】
非経口投与
本明細書において用いられる場合、薬学的組成物の「非経口投与」は、対象の組織への物理的開口、および組織内の開口部を通じた薬学的組成物の投与を特徴とする、任意の投与経路を含む。したがって、非経口投与には、組成物の注射、外科的切開を通じての組成物の適用、組織貫通性非外科的創傷を通じての組成物の適用などによる薬学的組成物の投与が含まれるが、これらに限定されることはない。特に、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、羊水内注射、臍帯内注射、胸骨内注射および腎透析注入技法を含むが、これらに限定されないように企図される。
【０１００】
非経口投与に適した薬学的組成物の製剤は、活性成分と滅菌水または滅菌等張食塩水のような薬学的に許容される担体との組み合わせを含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、包装または販売されうる。注射用製剤は、例えばアンプル中、または保存料を収容する複数用量容器中の単位投与量形態で調製、包装または販売されうる。非経口投与のための製剤には懸濁剤、液剤、油性または水性媒体中乳剤、ペースト剤、および埋め込み式持続放出または生分解性製剤が含まれるが、これらに限定されることはない。そのような製剤は、懸濁化剤、安定剤または分散剤を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のさらなる成分をさらに含みうる。非経口投与のための製剤の1つの態様において、活性成分は、再構成組成物の非経口投与の前に適当な媒体(例えば、発熱物質を含まない滅菌水)で再構成するための、乾燥(すなわち、粉末または顆粒)形態で提供される。
【０１０１】
薬学的組成物は、滅菌注射用の水性または油性の懸濁剤または液剤の形態で調製、包装または販売されうる。この懸濁剤または液剤は、公知の技術にしたがって製剤化することができ、活性成分に加えて、本明細書において記述される分散剤、湿潤剤または懸濁化剤などのさらなる成分を含みうる。そのような滅菌注射用製剤は、例えば水または1,3-ブタンジオールのような無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いて調製されうる。他の許容される希釈剤および溶媒にはリンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノグリセリドまたはジグリセリドのような不揮発性油が含まれるが、これらに限定されることはない。有用な他の非経口的に投与可能な製剤には、有効成分を微結晶形態で、リポソーム調製物中に、または生分解性重合体系の一成分として含む製剤が含まれる。持続放出または埋め込み用組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、難溶性重合体または難溶性塩のような薬学的に許容される重合体材料または疎水性材料を含みうる。
【０１０２】
制御放出製剤および薬物送達システム
特定の態様において、本発明の製剤は短期放出、急速オフセット、ならびに制御放出、例えば持続放出、遅延放出およびパルス放出製剤でありうるが、これらに限定されることはない。
【０１０３】
持続放出という用語は、その通常の意味で使用されるものであり、長期間にわたって薬物を徐々に放出しかつ、必ずというわけではないが長期間にわたって薬物の実質的に一定の血中レベルをもたらしうる、薬物製剤設計をいう。期間は1ヶ月またはそれ以上の長さでありえ、ボーラス形態で投与される同一量の剤よりも長期の放出であるべきである。
【０１０４】
持続放出のために、化合物に持続放出性を与える適当な重合体または疎水性材料とともに化合物は製剤化されうる。したがって、本発明の方法のなかで有用な化合物は、例えば注射によって微粒子の形態で、または埋め込みによってウエハもしくはディスクの形態で投与されうる。
【０１０５】
本発明の1つの態様において、持続放出製剤を用いて、本発明の化合物を、患者に単独でまたは別の医薬剤と組み合わせて投与する。
【０１０６】
遅延放出という用語は、その通常の意味で本明細書において用いられるものであり、薬物投与に続く一定の遅延の後に初回の薬物放出を提供しかつ、必ずというわけではないが約10分から最大約12時間の遅延を含みうる、薬物製剤設計をいう。
【０１０７】
パルス放出という用語は、その通常の意味で用いられるものであり、薬物投与後にパルス状の薬物の血漿中プロファイルを生じるように薬物の放出を提供する、薬物製剤設計をいう。
【０１０８】
即時放出という用語は、その通常の意味で用いられるものであり、薬物投与後直ちに薬物の放出を行う薬物製剤設計をいう。
【０１０９】
本明細書において用いられる場合、短期とは、薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、約10分または約1分、およびそれらの任意のまたは全ての整数増分もしくは部分増分までの任意の期間およびそれらを含む任意の期間をいう。
【０１１０】
本明細書において用いられる場合、急速オフセットとは、薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、約10分または約1分、およびそれらの任意のおよび全ての整数増分もしくは部分増分までの任意の期間およびそれらを含む任意の期間をいう。
【０１１１】
投薬
本発明の化合物の治療的有効量または用量は、患者の年齢および体重、患者の現在の医学的状態、ならびに本発明において企図される疾患または障害の進行に依存する。当業者は、これらのおよびその他の要因に応じて適切な投与量を判定することができる。
【０１１２】
本発明の化合物の適当な用量は、1日当たり約0.01 mg〜約5,000 mg、例えば約0.1 mg〜約1,000 mg、例えば、約1 mg〜約500 mg、例えば1日当たり約5 mg〜約250 mgの範囲内でありうる。用量は、単回の投与量でまたは複数回の投与量で、例えば1日当たり1〜5回またはそれ以上で投与されうる。複数回の投与量が用いられる場合、各投与量は同じであっても異なっていてもよい。例えば、1日当たり1 mgの用量が2回の0.5 mg用量として、用量の間の間隔約12時間で投与されうる。
【０１１３】
1日当たりに投薬される化合物の量は、非限定的な例において、毎日、1日おき、2日ごと、3日ごと、4日ごと、または5日ごとに投与されうることが理解される。例えば、1日おきの投与では、月曜日に5 mg/日の用量が開始され、水曜日に1回目の後続5 mg/日の用量が投与され、金曜日に2回目の後続5 mg/日の用量が投与される、などでありうる。
【０１１４】
患者の状態が改善した場合、医師の裁量により、本発明の阻害剤の投与は任意で連続的に与えられてもよい; あるいは、投与される薬物の用量は、一時的に低減され、または一定の時間(すなわち、「休薬期間」)、一時的に停止される。休薬期間の長さは、ほんの一例として、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、15日、20日、28日、35日、50日、70日、100日、120日、150日、180日、200日、250日、280日、300日、320日、350日、または365日を含め、2日から1年の間で任意で変化してもよい。休薬期間の間の用量低減には、ほんの一例として、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%を含め、10%〜100%が含まれる。
【０１１５】
患者の状態の改善が起こると、必要に応じて維持および/または予防用量が投与される。続いて、投与量もしくは投与頻度、またはその両方は、疾患または障害に応じて、改善された疾患が維持されるレベルまで低減される。特定の態様において、患者は、症状および/または感染の再発時に、長期間にわたって断続的な処置を必要とする。
【０１１６】
本発明の方法で用いるための化合物は、単位投与量形態で製剤化されうる。「単位投与量形態」という用語は、処置を受ける患者のための単位投与量として適当な物理的に別個の単位をいい、各単位は、任意により適当な薬学的担体に関連して、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。単位投与量形態は、単回の日用量のためまたは複数回(例えば、1日当たり約1〜5回またはそれ以上の回数)の日用量の1回分のためでありうる。複数回の日用量が用いられる場合、単位投与量形態は、投薬ごとに同じであっても異なっていてもよい。
【０１１７】
そのような処置計画の毒性および治療効力は、LD50 (集団の50%に対して致死的な用量)およびED50 (集団の50%において治療的に有効な用量)の判定を含むが、これらに限定されない、細胞培養または実験動物において任意で判定されてもよい。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療指数であり、これはLD50とED50との間の比として表される。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータが、ヒトに用いる投与量の範囲を定式化する際に任意で用いられてもよい。そのような化合物の投与量は、好ましくは、最低毒性を伴うED50を含む、血中濃度の範囲内にある。投与量は、採用される投与量形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で任意で変化してもよい。
【０１１８】
当業者は、本明細書において記述される具体的な手法、態様、特許請求の範囲および実施例の数多くの等価物を認識するか、または単なる日常的な実験を用いて確認できるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内にあって、本明細書に添付される特許請求の範囲によって網羅されるものと考えられよう。例えば、反応時間、反応サイズ/規模、ならびに実験試薬、例えば溶媒、触媒、圧力、雰囲気条件、例えば窒素雰囲気、および還元剤/酸化剤を含むが、これらに限定されない反応条件を、当技術分野で認識されている代替物によってかつ単に日常的な実験を用いて改変することは、本出願の範囲内であると考えるべきである。
【０１１９】
値および範囲を示す本明細書のあらゆる箇所において、範囲という形での記述が、単に便宜性および簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する硬直的な限定と解釈されるべきではないということを理解すべきである。したがって、これらの値および範囲が包含する全ての値および範囲は、本発明の範囲内に包含されるように意図される。さらに、これらの範囲内にある全ての値、および値の範囲の上限または下限も、本出願によって企図される。範囲に関する記述は、全ての可能な部分範囲、およびその範囲内の個々の数値、ならびに適切であれば範囲内の数値の部分整数を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、1〜6などの範囲に関する記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3および6を具体的に開示したものと考えるべきである。これは範囲の幅に関係なく当てはまる。
【０１２０】
以下の実施例は、本発明の局面をさらに例示する。しかしながら、それらは、本明細書に記載された本発明の教示または開示を決して限定するものではない。
【実施例】
【０１２１】
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は例示目的でのみ示されるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されず、むしろ、本明細書に示される教示の結果として明白な全ての変形物を包含する。
【０１２２】
実施例1:
A. 材料および方法
細胞
NIH/3T3 (CRL-1658)およびVero (CCL-81)細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC) (Manassas, VA)から購入し、正常ヒト皮膚線維芽細胞はCambrex (Walkersville, MD)から入手し、Neuro-2a (CCL-131)はA. Bordey (Yale University, New Haven, CT)により提供され、U-373 MG細胞はR. Matthews (Syracuse, CT)からの寄贈であった。Vero細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1% pen/strep (Invitrogen, Carlsbad, CA)を補充したEagle's Minimum Essential Medium (MEM)中で増殖および維持した。他の全ての細胞株は、10% FBSおよび1% pen/strepを補充したダルベッコ改変イーグル必須培地(DMEM)中で維持した。マウスグリアの初代培養は、P5マウスから採取し、DMEM中で維持した全脳組織を用いて確立された(van den Pol, et al., 1999, J. Neurosc. 10948-10965)。全ての培養物を、37℃で5% CO2を含有する加湿(humified)雰囲気中に保った。
【０１２３】
ウイルス
用いられる各ウイルスの簡単な説明を以下に示す。
【０１２４】
mCMV-GFP
EGFPを発現する組み換えmCMV (MC.55)は、K181株由来であった。ヒト伸長因子1α(EF1-α)プロモーターによって制御されるEGFP遺伝子を含む発現カセットを、前初期遺伝子(IE-2)部位に挿入した。ウイルス増殖およびプラークアッセイに、NIH/3T3細胞を用いた(van den Pol, et al., 1999, J. Neurosc. 10948-10965)。
【０１２５】
hCMV-GFP
EF1-αプロモーターの制御下でEGFPを発現する組み換えhCMVは、J.Vieira (University of Washington, Seattle)によって親切にも提供していただいた。ウイルス複製に影響を及ぼさずに改変を許容するものと思われる部位である、ヒトCMVゲノムのUS9とUS10との間に、EGFPをコードする遺伝子を挿入した。EGFP発現および複製能力を、正常ヒト線維芽細胞およびU-373ヒト神経膠芽腫細胞にて試験した(J. Vieira, et al., 1998, J. Virol. 72:8158-8165; Jarvis, et al., 1999, J. Virol. 73:4552-4560)。
【０１２６】
VSV-GFP
J. K. RoseおよびK. Dalton (Yale University, New Haven, CT)によって親切にも提供していただいた天然VSV Gタンパク質遺伝子下流の余分な遺伝子としてGFP-VSV G融合タンパク質を含むVSVインディアナ(Indiana)株の組み換え変種を、本研究において用いた。ウイルスをサル腎臓上皮細胞(Vero)にて維持した。ウイルス増殖およびプラークアッセイにVero細胞を用いた(van den Pol, et al., 2002, J. Virol. 76:1309-1327)。
【０１２７】
SIN-GFP
GFPを発現する組み換えSIN (アルファウイルス)は、J. M. Hardwick (Johns Hopkins University, Baltimore, MD)からの寄贈であった。ウイルスサブゲノムプロモーター重複コピーおよびBstEIIクローニング部位からなるコンストラクトを、SINゲノムプラスミドの3'調節領域に挿入した。クローニング部位は、関心対象の遺伝子、この場合はGFPの発現のために普遍的に用いることができる。ウイルス維持およびプラークアッセイに、Vero細胞を用いた(Hardwick & Levine, 2000, Methods Enzymol. 322:492-508)。
【０１２８】
列挙された全てのウイルスは、EGFPを細胞感染のレポーターとして発現する。緑色蛍光を利用して、感染細胞およびプラークを可視化した。プラーク力価は、細胞単層ならびにmCMV-GFPおよびhCMV-GFP (35)の場合にはカルボキシ-メチル-セルロース(CMC)に基づく粘性重層またはVSV-GFPおよびSIN-GFPの場合には0.5%の寒天重層を用いて標準的なプラークアッセイ技法により判定された。ウイルスストックを-80℃でアリコート中に保存した。実験ごとに、新しいアリコートのウイルスを解凍して使用した。
【０１２９】
化学物質
バルプロミド(カタログ番号V3640)、バルノクタミド(カタログ番号V4765)、バルプロエート(カタログ番号S0930000)、イベルメクチン(カタログ番号I88998)およびヘパラン硫酸ナトリウム塩(カタログ番号H7640)は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入された。バルプロエートおよびヘパラン硫酸を水に溶解して、それぞれ1 Mおよび1 mg/mLのストック溶液を得た。バルプロミド、バルノクタミド、sec-ブチルプロピルアセトアミド、sec-ブチルイソプロピルアセトアミド、tert-ブチルエチルアセトアミド、およびイベルメクチンをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、1 M (バルプロミド、バルノクタミド、sec-ブチルプロピルアセトアミド、sec-ブチルイソプロピルアセトアミド、tert-ブチルエチルアセトアミド)および100 mM (イベルメクチン)のストック溶液を得た。イベルメクチンを、チクングンヤ熱ウイルスおよび他のアルファウイルスに対して有効であることが示された濃度1 μMで用いた。
【０１３０】
感染の定量
細胞(NIH/3T3、Neuro-2a、マウスグリア、Vero、正常ヒト皮膚線維芽細胞、およびU-373)を、48ウェルディッシュ中に1ウェル当たり細胞40,000個の密度でプレーティングし、特定の濃度のVPA、VPD、VCD、イベルメクチン、または媒体での前処理のために培地(1ウェル当たり0.2 mL)を交換する前に終夜インキュベートした。薬物曝露4時間、24時間または72時間後に、細胞にウイルスを接種した。高MOIおよび低MOIの両方をhCMV-GFPおよびmCMV-GFPに用いた; 正確には、低MOIとして0.1 (hCMV, mCMV)および0.4 (mCMV)、ならびに高MOIとして1 (mCMV)および4 (mCMVおよびhCMV)。他の試験ウイルスは低MOI、すなわち0.001で用いた。
【０１３１】
いくつかの実験では、培養物にウイルスを接種し、同時に薬物に2時間（「短い薬物曝露」実験）または48時間（「薬物添加時間」実験）曝露した。「薬物添加時間」実験では、化合物の投与は、ウイルス攻撃と同時にだけでなく、ウイルス複製サイクルのどの段階が薬物によって影響されたかを評価するために、その後の時点(2時間および12時間)でも行われた。
【０１３２】
ウイルス産生および放出に及ぼす短い薬物曝露(2時間)の影響を試験するために、ウイルス収量低減アッセイを行った。NIH/3T3細胞にmCMV-GFP (MOI 0.1)を感染させ、同時に100 μMの化合物で処理した。ウイルス吸着を可能にするため、37℃で2時間のインキュベーション後、培養物をPBSで2回すすぎ、薬物を含まない培地を補充した。72 hpiの細胞培養上清を回収し、NIH/3T3単層上でプラーク滴定した。
【０１３３】
ウイルス複製の前初期段階に及ぼす影響を調べるため、24時間VPD (1 mM)に曝露されたNIH/3T3細胞に、赤色蛍光タンパク質tdTomatoを発現するCMVプロモーター(IE1/IE2)駆動レポータープラスミド(pCMV-tdTomato)をトランスフェクトした。
【０１３４】
遊離ビリオンに対する試験化合物の潜在的な殺ウイルス活性を評価するため(殺ウイルス活性アッセイ)、100 μmのVPD、VCDまたは媒体をmCMV-GFPの不希釈ストックに添加し、この化合物/ウイルス混合物を4℃または37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を培地で希釈して薬物の量を無効と同定された濃度、すなわち10 nMに低減させ、その後、残存mCMV-GFP感染性をNIH/3T3細胞にてプラーク滴定した。
【０１３５】
ウイルス結合および細胞膜への融合に及ぼす薬物効果を評価するため、培養物を最初に4℃(結合は可能であるが融合は不可能)で2時間、その後37℃で(融合およびウイルス複製サイクルの後続の段階を可能とするため)インキュベートした(Chan & Yurochko, 2014, Methods Mol. Biol. 1119:113-121)。結合実験では、NIH/3T3細胞を100 μMの薬物(VPD、VCD、もしくはHS)または媒体およびmCMV-GFP (MOI 0.1)に同時に曝露し、4℃で2時間インキュベートした。HSは、細胞表面へのCMV付着に対するその阻害活性のため、陽性対照として用いられた。次いで、培養物をPBSで2回すすぎ、結合していないビリオンおよび化合物を除去し、新鮮な薬物を含まない培地を補充し、ウイルス融合および吸着を可能とするために、37℃で2時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSで2回洗浄し、DMEM (75%)およびCMC (25%)を含有する粘性溶液で覆った(Zurbach, et al., 2014, Virol. J. 11:71-79)。融合実験では、単純(plain)培地にプレーティングした培養物にmCMV-GFP (MOI 0.1)を接種し、4℃で2時間インキュベートした。次いで、NIH/3T3を2回洗浄し、試験化合物(100 μM)に曝露し、37℃で2時間インキュベートした後、2回すすぎ、CMCに基づく溶液で覆った。感染力を両方の実験について48 hpiで評価した。
【０１３６】
感染細胞は、Olympus IX71蛍光顕微鏡(Olympus Optical, Tokyo, Japan)を用いGFP陽性細胞として同定された。各条件における1ウェル当たりの蛍光細胞の総数を数えた。各条件を少なくとも三つ組で試験し、全実験を2回繰り返した。顕微鏡は、Apple Macintoshコンピュータとインターフェースで接続されたSPOT RTデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)に接続された。条件(露光時間およびゲイン)は画像間で一貫して維持された。収集された画像のコントラストおよび色は、Adobe Photoshopを用いて補正された。
【０１３７】
細胞毒性アッセイ
エチジウムホモ二量体アッセイ(Molecular Probes, Eugene, OR)を用いて、製造業者の指示にしたがい死細胞を標識した。簡潔には、NIH/3T3細胞(1ウェル当たり9×104個)を48ウェルプレートに播種し、mCMV-GFP接種(MOI 0.4)前にVPDまたは媒体で24時間処理した。ウイルス攻撃から72時間後に、細胞を2回洗浄し、EthD-1をDMEM中の終濃度4 μMで添加した。37℃で20分のインキュベーション後、核の赤色蛍光に基づいて1ウェル当たりの死細胞の総数を計数した。各条件を四つ組で試験し、各実験を2回繰り返した。
【０１３８】
プラークサイズアッセイ
プラークサイズアッセイを用いて、ウイルス増殖に及ぼす薬物の効果を評価した。簡潔には、12ウェルプレート中の半集密NIH/3T3細胞にmCMV-GFPを用いて接種した。ウイルス吸着を可能にするための37℃で2時間のインキュベーション後、接種材料を除去し、DMEM (75%)およびCMC (25%)中で希釈された特定濃度のVPD、VCDまたは媒体を含有する粘性重層溶液の添加前に、培養物をPBSで3回洗浄した(Zurbach, et al., 2014, Virol. J. 11:71-79)。5日後、Wollmann, et al., 2015, J. Virol. 89:6711-6724)に記述されているようにウイルスプラークの相対的サイズを測定した(n = 60プラーク/条件)。各条件を少なくとも三つ組で試験し、実験を2回繰り返した。全ての測定は、同様の露光時間およびゲインで同時に行われた。
【０１３９】
動物の処置手順
Taconic Biosciences Inc (Hudson, NY)からの雄性および雌性Balb/c系統マウス(6〜8週齢)を、食料および水に自由にアクセスさせながら、一定温度(22±2℃)および湿度(55±5%)の下12時間:12時間の明周期で維持した。受精を確実とするために少なくとも1週間、1〜2匹の雌を同じ系統の雄と共生させた。妊娠後期が認められた場合に、妊娠した各雌を1匹ずつケージに入れ、午前8時30分および午後6時30分に毎日2回、出産について確認した。新生仔の腹腔内(i.p.)に、出産14時間以内に、DOB上の培地50 μL中750プラーク形成単位(PFU)のmCMV-EGFPを接種した。DOBをPND 0と見なした。対照動物は腹腔内に培地50 μLを受けた。感染した産仔を、PND 1からPND 21までウイルス接種後に開始して、生理食塩水20 μL中1.4 mg/mLの用量(およそ30 μg)で、1日1回、皮下(s.c.)注射により、VPD、VCD、または媒体(DMSO)を受けるように無作為に割り当てた。対照産仔には同量の薬物を含まない生理食塩水を与えた。マウスをPND 49まで生存について毎日モニターした。さらに、PND 0〜22の各日に、処置群の知識なしに、産仔を最も近い0.01 gまで秤量し、その体重および尾の長さを測定した。Scattoni, et al., 2008, PLoS One 3, 10.1371/journal.pone.0003067に記述されているように、成体マウスと比較して、髪の成長、まぶたの状態および耳介開展、ならびに切歯萌出も記録した。簡潔には、これらの体細胞変異を、以下のように半定量的に評価した: 0 = 状態の発生なし、1 = わずかな/不確定の状態、2 = 不完全な状態、および3 = 完全な成体様状態。
【０１４０】
臓器における感染性ウイルス負荷の検出のため、PND 1からPND 10まで生理食塩水/処理を受けた後に、対照および実験マウスの一部をPND 12で殺処理した。指定されたマウスをPBSで経心かん流して遊離ウイルスを洗い流し、ヒトにおける重篤な周産期感染に顕著に関与する2つの臓器である肝臓および肺から無菌条件下で組織サンプルを採取した。微小遠心管組織グラインダを用いPBS中で組織を機械的にホモジナイズした。得られた組織懸濁液の一部をNIH/3T3単層上にプレーティングし、プラークアッセイ技法を用いてウイルス力価を評価した(Zurbach, et al., 2014, Virol. J. 11:71-79)。
【０１４１】
統計分析
感染および細胞毒性の定量化のための実験において、ならびにプラーク低減アッセイにおいて、一元配置ANOVA、その後の事後分析(ボンフェローニの検定)を用い統計的有意性を判定した。データは、感染細胞または死細胞の割合として、および薬物 vs 媒体でのウイルス力価として、2つの独立した実験の平均 ± SEMとして提示される; 各独立した実験は、3つまたは4つの培養からなった; p値は薬物と対照(媒体)との比較をいう。体細胞発達のマーカーの場合、反復測定因子としてPNDを用いた混合モデルANOVAを使い、引き続いて有意なF値が判定された場合にのみNewman Keuls検定を行った。
【０１４２】
分析はGraphPad Prism 6.0およびSPSS Statistics 21で行い、有意性をp≦0.05に設定した。生存研究および体細胞発達パラメータの評価を、実験群に関して盲目的に行った。
【０１４３】
B. 考察
本明細書において実証されるように、本研究は、VPDがVPAと比較してCMV感染の増強の低減を引き起こすかどうかを試験することを含む。
【０１４４】
VPAはマウスCMV (mCMV)による感染を増加させた(図1A〜1B)。VPDは、低薬物濃度でさえ、強い用量依存性阻害効果を示した(図1C〜1E)。阻害は、高いウイルス力価および複数の細胞型で確認された(図5A〜5D)。VPD媒介性CMV阻害は細胞生存を増加させ(図5E〜5F)、長期間のプレウイルス薬物曝露はnM濃度で有効性を示した(図1E)。VPDは、ウイルス力価または細胞型とは無関係に、ヒトCMV感染を阻害した(図6A〜6B)。hCMV糖タンパク質Bの免疫細胞化学は、対照におけるよりもVPDで処理した培養物において少ないCMV免疫反応性細胞を示した(図6C)。
【０１４５】
薬物媒介性CMV阻害は、VPD抗ウイルス効果が異なるタイプのウイルスに普遍的であり、感染の先天性免疫ブロックを増強するように作用しうるかどうかの問題を提起した。この疑問に対処するため、本発明者らは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)およびシンドビスウイルス(SIN)を含む非関連ウイルスを試験した。VPDはVSV (図7)またはSIN (対照と比較して107% ± 3%)を阻害せず、VPD抗ウイルス作用がこれらの他のウイルスよりもCMVに特異的であることが示唆された。抗てんかん特性およびアルファウイルス感染を減弱することが知られている強い抗寄生虫活性を有する化合物ベルメクチンも試験した。イベルメクチンはCMVに対して効果がなく(対照と比較して99% ± 9%)、抗CMV効果がVPDおよびVCDに特異的であることが実証された。
【０１４６】
最初の実験は、CMVに対するVPDの強力かつ特異的な阻害効果を示した。しかしながら、催奇形性の動物モデルにおけるVPD安全性は、VPDがプロCMVおよび催奇性VPAに迅速に代謝される(80%超)ヒトには当てはまりえない。したがって、HDAC阻害活性も欠く、バルノクタミド(VCD)も試験した。VPDとは異なり、VCDはヒトでのその対応する遊離酸(バルノクト酸(valnoctic acid))への変換をほとんど示さない。VCDは軽度の精神安定剤として用いられ、急性躁病を軽減しうる。VCDは、用量依存的な様式で、マウス(図2A〜2D)およびヒトCMV (図2E)の両方を阻害し、低薬物濃度で阻害活性が明らかであった。
【０１４７】
次いで、VPDまたはVCDがインビボでCMVを抑制するかどうかを評価した。両薬物を重篤な周産期mCMV感染のマウスモデルにおいて評価した(図3A)。VPDおよびVCDは両方とも死亡率を3倍低減させ、生存率をmCMV感染産仔の23%から72%に増加させた(図3B)。VPDおよびVCDで処置された感染新生仔は、さらなる薬物利益を示した。処置は、CMV感染後の身体成長を増加させた。感染したマウスは、生後20日目に対照マウスよりもほぼ50%軽く、VPD処置またはVCD処置された感染産仔は、わずか18%の体重減少しか示さなかった(図3C〜3D)。薬物投与は、体および尾の長さ、眼瞼開裂、ならびに毛皮成熟を含む、体細胞発達の複数のパラメータを著しく改善した(図3E〜3L)。肝臓および肺におけるCMV負荷は、両方の化合物によって著しく減少した(図3M〜3N)。薬物は、早くも薬物処置の開始後5日目に、CMV感染新生仔の健康状態の有意な(p<0.05)改善をもたらした。
【０１４８】
神経学的機能障害を処置するために何十年も使われているにもかかわらず、脳におけるVPDおよびVCDの作用機序は未だ完全には解明されていない。HDACのVPA媒介性阻害は、hCMVによる感染を増強する。VPDおよびVCDの両方がこのエピジェネティックな機能を欠いている。CMVに及ぼすVPDおよびVCDの作用への洞察を得るために、低濃度の薬物をmCMV感染の経過中の異なる時点で加えた(図4A〜4B)。感染後48時間(hpi) (0〜48 hpi)までのウイルス攻撃時から阻害剤が存在する場合、感染細胞数は50%に減少した; ウイルス感染の開始時(0〜2 hpi)に短時間の薬物曝露についても同様のCMV阻害が観察された(図4C)。しかしながら、ウイルス接種の2〜12時間後に化合物を添加した場合、阻害は確認されなかった。接種時に薬物を2時間曝露し、続いて薬物を洗い流すと、強力なCMV阻害がもたらされた(図8)。
【０１４９】
これらの結果は、VPDおよびVCDによって媒介されるCMVのブロックが感染プロセスの初期に発揮されることを示唆している。前初期(IE)1/2 CMVプロモーターは、CMV感染の最初の数時間で活性である。薬物がこのプロモーターに作用したかどうかを調べるために、tdTomato発現を駆動するCMV IE1/2を有するプラスミドを試験した。プラスミドトランスフェクション後の対照(96% ± 4%)と比較してVPDの存在下で赤血球数の減少は同定されず、VPDはCMV IE1/2プロモーターを阻害しないことが示唆された。殺ウイルス活性の可能性を、細胞接種の前にmCMVの不希釈ストックとともに化合物をプレインキュベートすることによって試験した。阻害剤をその後、細胞接種前に有効濃度未満に希釈した場合に力価が低減しないことによって立証されるように、ビリオンの直接不活性化は観察されなかった(図4D)。感染の初期段階には、細胞表面へのウイルス付着(結合)およびその後の浸透(融合)が伴う。いずれの理論によっても限定されることを望まないが、両方の薬物がウイルス結合を阻害しうる(図4E〜4F)。薬物/細胞相互作用分析は、化合物をウイルス接種前に除去した場合、抗ウイルス活性の損失を伴う可逆的薬物効果を示した(図4G)。いずれの理論によっても限定されることを望まないが、薬物のその細胞標的への結合の時間依存的増加は、低薬物濃度への長期細胞事前曝露で観察されたウイルス阻害の増強の根底をなす1つの機構を構成しうる(図1Eおよび2C)。VPDおよびVCDは、CMV感染細胞におけるプラークサイズの低減によって示されるように、CMV感染の広がりを減少させた(図4H〜4I)。
【０１５０】
さらに、以下の例示化合物を本発明の方法のなかで試験した: sec-ブチルプロピルアセトアミド(SPD; 3-メチル-2-プロピルペンタンアミド)、sec-ブチルイソプロピルアセトアミド(SID; 2-イソプロピル-3-メチルペンタンアミド)、およびtert-ブチルエチルアセトアミド(TED; 2-エチル-3,3-ジメチルブタンアミド)。
2019514966.tif 000016
【０１５１】
SPDはCMVの阻害において非常に有効であった(図10)。SPDはVCDの1炭素同族体である。VCDと同様に、SPDはその構造中に2つの立体形成(stereogenic)炭素を保有し、4つの異なる立体異性体として存在しうる。SPDおよびその個々の立体異性体は、生育中の動物に及ぼす催奇形効果を欠く。インビトロでのSPDは、同様の濃度でバルプロミドまたはバルノクタミドのいずれよりもわずかに有効であった(図10)。VPDおよびVCDを試験するために利用され、かつ同じ投与計画で利用される重症インビボ周産期感染の同じ動物モデルにおいて、SPDはVPDおよびVCDと同様の効力を示した(図11A〜11C)。SPDは、感染産仔の生存を3倍(図11A)、mCMV感染した未処置産仔の23%から67%に増加させ、出生後の身体成長を有意に改善した(図11B〜11C)。SPDで処置した新生仔は、生後20日目に対照マウスよりもわずか20%しか体重が減少しなかったが、感染した、未処置産仔は体重の50%減少を示した。
【０１５２】
実施例2:
A. 材料および方法
細胞株、ウイルスおよび化学物質:
正常ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)はCambrex (Walkersville, MD)から入手し、初代ヒト胎児脳星状細胞はScienceCell Research Laboratories (Carlsbad, CA)から入手した。HDF細胞を、10% FBSおよび1% pen/strep (Invitrogen, Carlsbad, CA)を補充したダルベッコ改変イーグル必須培地(DMEM)中で培養した。ヒト胎児星状細胞をポリ-L-リジンコーティング培養容器中で増殖させ、2% FBSおよび1% pen/strepを補充したAstrocyte Medium (ScienceCell)中で維持した。全ての培養物を、37℃で5% CO2を含有する加湿雰囲気中に保った。
【０１５３】
インビトロ実験の場合、EF1-αプロモーターの制御下で増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現する組み換えヒトCMV (hCMV, Toledo株) (EGFP-hCMV)を利用した(Jarvis, et al., 1999, J. Virol. 73:4552-4560)。正常ヒト線維芽細胞を用いて、ウイルスEGFP発現、複製能力、増殖を試験し、ウイルス力価を判定するためにはプラークアッセイによって試験した(Jarvis, et al., 1999, J. Virol. 73:4552-4560)。
【０１５４】
CMV複製は種特異的であり、インビボでCMVを研究するために、増強されたGFPを発現する組み換えマウスCMV (mCMV) CMV (MC.55, K181株) (van Den Pol, et al., 1999, J. Neurosci. 19:10948-10965)を用いた(Ornaghi, et al., 2016, Virology 499:121-135)。NIH/3T3細胞(ネズミ線維芽細胞)を、ウイルス増殖およびプラークアッセイによる力価滴定のために用いた(van Den Pol, et al., 1999, J. Neurosci. 19:10948-10965)。
【０１５５】
組み換えCMVは、Dr. E. Mocarski (Emory University, Atlanta)およびDr. J. Vieira (University of Washington, Seattle)によって提供された。
【０１５６】
緑色蛍光を利用して、感染細胞およびウイルスプラークを可視化した。ウイルス力価は、25%カルボキシ-メチル-セルロース(CMC)重層を用いて標準的なプラークアッセイにより判定した(Zurbach, et al., 2014, Virol. J. 11:71)。ウイルスストックを-80℃でアリコート中に保存した。実験ごとに、新しいアリコートのウイルスを解凍して使用した。
【０１５７】
バルノクタミド(カタログ番号V4765)を粉末としてSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から購入し、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して1 Mのストック溶液を得た。
【０１５８】
感染の定量:
hCMV感染に及ぼすVCDの効果を、ウイルス感染性アッセイおよびウイルス収量低減アッセイによって評価した。感染性アッセイの場合、ヒト胎児星状細胞を、48ウェルプレート中に1ウェル当たり細胞40,000個の密度で播種し、培地(1ウェル当たり0.2 mL)を100 μMのVCDまたは媒体による前処理のために交換する前に終夜インキュベートした。薬物曝露1時間後、細胞にhCMV (MOI 0.1)を接種し、ウイルス吸着を可能とするために37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、培養物をPBSで2回洗浄し、補充されたAstrocyte Medium (75%)およびCMC (25%)中100 μMのVCD/媒体を含有する粘性溶液で重層した。感染48時間後(hpi)にGFP陽性細胞を計数した。
【０１５９】
ウイルス収量低減アッセイにおいて、ウイルス吸着の後、細胞をPBSで2回洗浄し、試験される化合物を含有する新鮮な培地を補充した。72 hpiで、培地を収集し、HDF単層を用いたプラークアッセイによって力価測定し、ヒト胎児脳星状細胞における薬物媒介性ウイルス複製阻害を評価した。
【０１６０】
各条件における1ウェル当たりの蛍光細胞/プラークの総数を、Apple Macintoshコンピュータとインターフェースで接続されたSPOT RTデジタルカメラ(Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)に接続されたOlympus IX71蛍光顕微鏡(Olympus Optical, Tokyo, Japan)を用いて計数した。各条件を三つ組で試験し、全実験を2回繰り返した。カメラ設定(露光時間およびゲイン)は画像間で一定に保たれた。収集された画像のコントラストおよび色は、Adobe Photoshopを用いて最適化された。
【０１６１】
ウイルス侵入分析および定量的リアルタイムPCRアッセイ:
ヒト胎児星状細胞へのhCMV付着に及ぼすVCDの効果を評価するために、6ウェルプレート中90%集密の予冷培養物を、VCDまたは媒体(100 μM)で4℃にて1時間処理し、引き続いて予冷hCMV-GFP (MOI 0.1)による感染を行った。4℃で2時間のインキュベーション後、胎児星状細胞を冷PBSで3回すすいで付着していないビリオンを除去し、次いで定量的リアルタイムPCR (qPCR)アッセイを用いてウイルスDNA定量のためにトリプシン処理により回収した(Chan & Yurochko, 2014, Methods Mol. Biol. 1119:113-121)。胎児星状細胞へのhCMV内部移行を評価するために、単純培地中でプレーティングされた培養物にhCMV-GFP (MOI 0.1)を接種し、4℃で2時間インキュベートした。次いで、細胞を3回洗浄して結合していないウイルス粒子を除去し、qPCRによるDNA定量のためにトリプシン処理によって収集する前に、(ウイルス内部移行を可能とするために) 37℃で2時間100 μMのVCDまたは媒体に曝露した。
【０１６２】
QIAamp DNAミニキット(Qiagen, Germantown, MD)を用いて細胞からDNAを抽出し、既述(Ornaghi, et al., 2016, Virology 499:121-135)のように、hCMV UL132 (Pa03453400_s1)およびヒトアルブミン(Hs99999922_s1)遺伝子についてTaqManアッセイ(Life Technologies) (Gault, et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39:772-775; Fukui, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 52:2420-2427)を用いてqPCRを行った。非感染細胞由来のおよび鋳型なしのサンプルを陰性対照として役立てた。Bio-Rad iCycler-IQ装置(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いてサンプルを二つ組で実行し、結果をiCyclerソフトウェアで分析した。比較閾値サイクル(CT)法を用いてアルブミンに対する各サンプル中のウイルスDNAの量を計算し、DMSO処理したサンプルを100%として用いhCMV DNAを%ウイルス結合(「付着」段階)または内部移行(「内部移行」段階)として表した。
【０１６３】
動物の処置手順:
Taconic Biosciences Inc (Hudson, NY)からの雄性および雌性Balb/c系統マウス(6〜8週齢)を、食料および水に自由にアクセスさせながら、一定温度(22±2℃)および湿度(55±5%)の下12時間:12時間の明周期で維持した。受精を確実とするために少なくとも1週間、1〜2匹の雌を同じ系統の雄と共生させた。妊娠後期が認められた場合に、妊娠した各雌を1匹ずつケージに入れ、08:30および18:30に毎日2回、出産について確認した。発達中のマウスの脳におけるZikaウイルスの作用を研究するために最近記述された戦略と同様に、新生仔マウスの接種に焦点を当てた(van Den Pol, et al., J Neurosci 37:2161-2175)。
【０１６４】
mCMV感染のパラダイム:
新生仔には、出産14時間以内に出生日(DOB)に培地50 μL中で750個のプラーク形成単位(PFU)のmCMV-GFPを腹腔内(i.p.)接種した。DOBを生後日数(P) 0と見なした。対照動物には培地50 μLを腹腔内投与した。同腹仔数効果を避けるために、大きな同腹仔を最大8〜9匹の産仔に間引いた(Tanaka, et al., 1998, Reprod Toxicol 12:613-617)。感染産仔および対照産仔を、生理食塩水20 μL中1.4 mg/mLの用量(およそ30 μg)で、1日1回皮下(s.c.)注射によってVCDまたは媒体(DMSO)を受けるように無作為に割り当て、ウイルス接種後に開始してP1からP21まで実行した。mCMV誘発性疾患の徴候についてマウスを毎日モニターし、生存率を判定した; 離乳はP21で行われ、どちらの性別のマウスも試験が完了するまで別々に飼育し、その後に殺処理した。
【０１６５】
腹腔内経路に加えて、新生仔マウスの群において頭蓋内注射を行った。出生から3日後、培地1 μL中2×104 PFUのmCMV-GFPを凍結麻酔下で、耳と目の中間点から32ゲージの針を付けた10 μlのHamilton注射器を用い新生仔マウスの左脳半球に注射した。ウイルス接種後3時間から始めてP8まで、感染した産仔をVCDまたは媒体(DMSO)の日用量を受けるように無作為に割り当てた。死亡は起こらず、P9でマウスを安楽死させ、血液、肝臓、脾臓および脳を収集し、急速冷凍し、qPCR (n=8/実験群)によるウイルス力価分析が行われるまで-80℃で保存した。
【０１６６】
初期神経行動評価
腹腔内に感染させたマウスと対照のマウスの神経行動発達を、わずかに変更した一連のFox試験(Calamandrei, et al., 1999, Neurotoxicol. Teratol. 21:29-40)にしたがって評価した。毎日09：00から15：00までの概日周期の明サイクルで、P2からP14まで一日おきに、どちらの実験群であるかを非開示にして評価を行った。各被験動物を1匹ずつ、1日のほぼ同じ時刻に試験した。反射と反応を以下の順にスコア化した。
立ち直り反射: 背中を下にして置いた被験動物が回転して4脚全てで直立するまでに要した時間。
断崖回避: 切り立った部分やテーブルトップの縁に、前肢と顔が縁の上に来るように置いたマウスが向きを変えてエッジから這って離れる。
前肢把握反射: 前肢を鈍器で撫でると、足が屈曲し、器具をつかむ。
前肢踏み直り反射: 動物を吊り下げ、一方の足を固体の表面に接触させない状態で、もう一方の足の背をある物体の縁に接触させると、その足が持ち上がり、その物体の表面上に置く。
負の走地性: 45°の角度に保持された金網スクリーン(4×4 mm)上に頭を下にして置かれたマウスが約180°回転するために要した時間。
水平スクリーン試験: マウスをワイヤメッシュ(10×10 cm)に保持し、尻尾を掴んでメッシュじゅうを水平に推進させる。
スクリーンクライミング試験: マウスが、前肢と後肢の両方を使って垂直の画面(10×10 cm、90°)を登る。被験動物が垂直の画面の一番上に到達すると、最大反応の点数が当てられる。
髭置き直し反射: マウスを尾で吊し、マウスを下げて髭が固体の物体に接触させると、頭が上がり、物体をつかもうと前肢が伸ばされる。
【０１６７】
立ち直り反射と負の走地性についてはストップウォッチを使って秒単位で潜時を測定した。その他の行動変数は以下のように半定量的に評価した。0 =反応、または事象の発生なし(R/O)、1 =わずかな/不確実なR/O、2 =不完全なR/O、3 =完全な成犬様のR/O。時間で測定する反応は全て、最大60秒までに制限した。そのため、マウスが60秒以内に行動を示さなかった場合、マイルストーンがない場合は0/60秒と評価した(半定量的な評価/潜時)。
【０１６８】
この一連の試験で、新生仔期の機能発達および神経行動発達の詳細な評価が得られる。これは、測定された行動は、生後数週間の異なる段階でそれぞれ発現するからである。前庭機能、運動発達および運動活動性、協調および筋力に関する具体的な情報が、これらの試験を行うことによって得ることができる(St Omer, et al., 1991, Neurotoxicol. Teratol. 13: 13-20; Schneider & Przewlocki, 2005, Neuropsychopharmacology 30:80-89)。
【０１６９】
未成熟マウスの運動協調とバランスの評価:
VCDを投与したマウス、投与していないマウスの区別なく、感染マウスおよび対照マウスの運動パフォーマンスを、後肢抱擁試験、垂直支柱試験、およびチャレンジング梁横断試験によってP28からP30にかけて評価した。
【０１７０】
後肢抱擁試験では、マウスの尾を起始部近くで掴み静かに持ち上げ、後肢の位置を10秒間観察し、次の要領でスコアをつける。すなわち、後肢が一貫して腹部から離れる方向に外に伸ばされている場合はスコア0。1本の後肢が、吊り下げられている時間の50%超にわたって腹側に引っ込められている場合にはスコアは1となる。両方の後肢が、吊り下げられている時間の50%超にわたって腹部に向かって部分的に引っ込められている場合、スコア2が与えられる。両方の後肢が完全に引っ込められ、吊り下げられている時間の50%超にわたって腹部に接触している場合はスコア3と評価される(Tanaka, et al., 2004, Nat. Med. 10:148-154)。
【０１７１】
垂直支柱試験は、以前に確立されたプロトコル(Ogawa, et al., 1985, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 50:435-441)にしたがって実施した。簡略に述べると、マウスを垂直に粗面加工した支柱(直径8 mm、高さ55 cm)の一番上に、頭を下向きにして一匹ずつ置き、1回馴化のために下降させた。次に、頭を上向きにしてマウスを支柱の頂点に置いた。マウスが床に降りるのに要した時間を、最長120秒の範囲で自発運動時間(TLA)として記録した。マウスが落ちた場合、下向きに回転できなかった場合、または下降できなかった場合、デフォルトの自発運動時間値を120秒として記録した。1匹のマウスにつき3回試行させ、施行と試行の間に30秒の回復期間を置いた。
【０１７２】
チャレンジング梁横断試験は、既報の要領で実施した(Fleming, et al., 2004, J. Neurosci. 24:9434-9440)。梁は4つのセクション(それぞれ25 cm、全長1 m)から成り、各セクションの幅をそれぞれ変化させた。梁の最初の幅は3.5 cmとし、徐々に狭め、最後のセクションは0.5 cmとした。試験の感度を高め、微妙な運動障害を検出するため、梁の上部表面から1.0 cm下に、下枠(1 cm幅)を設置した(Brooks＆Dunnett、2009、Nat.Rev.Neurosci 10：519-529)。動物を、最も広いセクションから始まり狭く最も難しい部分で終わる梁を渡るように訓練した。梁の狭い方の端を動物のホームケージに直接つなげた。マウスがホームケージに向かって梁の長さ方向にわたっていくようにさらに促すために明るい光で梁起始点を照らした。試験前に2日間動物に訓練を施し、日当たり5回、試行させた。試験の当日、梁表面に対応する幅のメッシュグリッド(1 cm網目)を上に置き、グリッドと梁表面の間に1 cmの空間をあけた。動物がグリッド表面梁を渡る様子をビデオ撮影した。歩行は合計5回実施した。ビデオテープをスローモーションで再生し、後肢のスリップを観察し、マウス実験群に対して盲検化された研究者が5回の歩行全てについて梁を渡る時間を計測した。マウスが正面を向いて前進し、グリッドの隙間から、またはグリッド外に後肢がグリッド表面の下に0.5 cm以上(半分以上下に)スリップした場合にスリップを計数した。
【０１７３】
社会的行動と探索的行動分析:
既述された要領で(Schneider & Przewlocki, 2005, Neuropsychopharmacology 30:80-89)、適合させた小さなオープンフィールドでP30から40にかけて思春期マウスの探索的行動を評価した。装置は20.5×17×13 cm3(長さ×幅×高さ)のプラスチック製の長方形の箱から構成され、短い(穴2つ)壁と長い(穴3つ)壁に規則的な間隔で穴を配置し、定常蛍光天井灯で照らした。動物を装置の中心に置き、その動きを3分間にわたってビデオ録画した。探索的行動を、立ち上がりエピソードとノーズポーク(穴の中にマウスの鼻が入る)エピソードの回数でスコア化した。
【０１７４】
社会性と社会的新規性嗜好を、3つのコンパートメントからなる装置(Yang, et al.,2011, Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 8：Unit 8.26)を用い、5週齢で調査した。最初、実験動物と対照動物に10分間自由に装置を探索させた(馴化)。この社会的アプローチパラダイムでは、未知の同種(同性、ほぼ同じ週齢と体重)の動物を両脇のコンパートメントのいずれか1つに入れ、小さなワイヤオブジェクトで拘束した(「社会的ケージ」)。反対側のコンパートメントには、空のワイヤオブジェクトを置いた(「空ケージ」)。次いで、被験動物を中央のコンパートメントに放出し、3つのコンパートメントからなる装置を自由に10分間探索させた。行動をビデオで撮影し被験動物が3つのコンパートメントで過ごした時間(秒)と、社会的ケージと空のケージのすぐそばで過ごした時間(秒)について行動を評価した。社会的新規性パラダイムについては、もう一匹の未知の同種の動物を、以前空であったワイヤー・オブジェクト(「新規ケージ」)に入れた。実験マウスの行動を10分間記録し、既知の同種の動物と新規の同種の動物を探索するのに費やされた時間について評価した。
【０１７５】
脳におけるmCMV分布の評価とウイルス媒介性脳異常:
感染後のある特定の時点で、マウスを過剰麻酔薬で安楽死させ、無菌の冷PBSの経心腔的潅流を実施し、次に4%パラホルムアルデヒドの経心腔的潅流を実施し、脳を摘出し、秤量した。次いで、脳を4%パラホルムアルデヒド中に終夜浸漬し、15%スクロース、次に30%スクロースで24時間凍結保護した後、組織凍結培地に含めた(一般データ)。一部の腹腔内感染マウスは脱水症状を発現し瀕死状態になり、回復の徴候を示さなかった。これらのマウスを、所定の殺処理時点前に安楽死させ、ウイルスに対する致死的応答を有するとして記録した。
【０１７６】
Leicaクライオスタットで切断した15 μm厚の切片をGFPレポーター発現の評価と脳における免疫蛍光分析に用いた。切片を室温(RT)で4時間乾燥させ、1×PBSで再水和させ、次いで免疫蛍光アッセイに使用した。簡単に説明すると、組織切片を、ニューロン細胞についてはモノクローナルマウス抗NeuN抗体(1:500、EMD Millipore)で、小脳プルキンエ細胞についてはポリクローナルウサギ抗カルビンジンD-28K(1:500、EMD Millipore)で、終夜4℃でインキュベートした。組織をリン酸緩衝液+ 0.4%トライトン(Triton)-Xで3回洗浄した。Alexa-594 (1:250) (Invitrogen)と抱合したヤギ抗マウスIgGおよびロバ抗ウサギIgGなどの二次抗体を室温で1時間アプライした後、洗浄した。一部のセクションにDAPIで標識した。Vectashield蛍光マウント用培地(Vector Laboratories)をマウントに使用した。
【０１７７】
蛍光顕微鏡(IX 71; Olympus Optical, Tokyo, Japan)を用いて画像を収集した。凍結切片を用いて形態学的測定を行い、ソフトウェアImage Jを用いて画像化した後、細胞数を定量した。カルビンジンD-28KとDAPIで染色した連続正中矢状小脳切片画像を用いて分子層(ML)と内部顆粒層(IGL)を評価した。各切片の一次裂溝の各側で3回測定し、1匹につき4切片を評価した。小脳領域については、青色蛍光Nissl染色(NeuroTrace, Thermo Fisher Scientific)で正中矢状脳切片(3切片/マウス)を染色し、2倍対物レンズを用いて画像を収集した。カルビンジンD-28Kで染色した切片(4切片/マウス)の細胞数を数え、500 μmの初期亀裂(両側)に沿ってプルキンエ細胞数を評価した。3つの異なる同腹仔から少なくともそれぞれ5匹の動物について全ての測定と定量化を行った。
【０１７８】
インビボでのウイルス拡散および複製の動態:
血液、肝臓、脾臓、および脳におけるmCMV複製の測定については、出生日にi.p.感染またはi.c.感染させてVCDか賦形剤のいずれかを投与したマウスを、接種後の複数の時点で殺処理し、サンプルを滅菌条件下で収集し、瞬間凍結し、定量的リアルタイムPCRを介したウイルス力価分析を実施するまで-80℃で保存した(n = 7〜10/実験群)。肝臓、脾臓、脳のウイルス負荷分析に使用したマウスに無菌の冷PBSを潅流し、血液中に含まれる可能性のあるウイルスを除去した。製造者の指示にしたがってQIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いてDNAを全て単離した。以下のプライマー;
2019514966.tif 000017
を用いてmCMV IE1遺伝子エクソン4の断片を増幅することによりTaqManアッセイ(Life Technologies)を用いて、定量PCRを行った。プローブ
2019514966.tif 000018
をレポーター色素FAM (Kosmac, et al., 2013, PLoS Pathog 9:e1003200)で標識した。qPCRは、iTaq Universal SYBR Probes Supermix(BioRad)および100 ngのDNAを用いる20 μLの反応混合物を用いて行った。サンプルは、二段階増幅プロトコルを使用して二回実行した。感染していないマウス由来の組織試料と鋳型なしのサンプルを陰性対照として用いた。ウイルス量は、mCMV DNAの連続10倍希釈液を用いて作成した標準曲線と比較した後、血液/組織1 mL/グラム(g)当たりのコピー数として表した。
【０１７９】
実験デザインと統計分析:
別途記載しない限り、運動行為、探索的行動、および脳形態計測の評価の統計学的有意性は、一元配置分散分析(ANOVA)かクラスカル・ワリス検定のいずれか、続いてボンフェローニとダンの事後検定によってそれぞれ決定した。初期神経行動発達、社会的行動、および時間経過に伴うウイルス負荷の推移を、反復測定混合モデルANOVAによって評価し、有意なF値が得られた場合は、次にNewman Keuls検定を行った。初期神経原性(neurontogeny)で性別による差は検出されなかったため、雄のマウスと雌マウス両方のデータを組み合わせた。運動行為、探索的行動、社会的行動の検査には雄のマウスのみを使用した。分析は全てGraphPad Prism 6.0で行い、p <0.05の場合に有意とした。神経行動評価は実験群を盲検化して行った。
【０１８０】
B. 考察
mCMVの末梢接種は、発達中の脳の広範な感染を引き起こす
出生日(DOB、生後0日)の新生仔マウスにおけるウイルスの腹腔内接種(i.p.)後のmCMV複製と播種の動態を特徴付けた。腹腔内注射から48時間後、mCMVが感染したマウスの血液中に、濃度はそれより劣るが脾臓と肝臓でも発見され、脳でもわずかながら検出された(図12A)。これらの4つの臓器のウイルス動態を50日間にわたって分析したところ、mCMVは血流に入った後、末梢標的臓器、すなわち肝臓と脾臓に迅速に進入し、複製を開始し注射後4日時点(dpi)で高ウイルス力価を生じた(図12B〜12D)。次には同様のウイルス力価が、注射後8日目になって初めて脳内で測定された(図12E)。脳に入った後、このウイルスは、P8からPl2の間のウイルスピークで肝臓と脾臓に見られたmCMV負荷(図12C〜12E)とほぼ同じmCMV負荷が測定されたことによって示唆されるように、その場で効果的に複製することができた。
【０１８１】
組織学的検査の結果、発達中のマウスの脳のmCMV-GFP感染は、広範囲に広がっており、その性格上、散在していた。単離された感染細胞と最大20〜25個の細胞を含む感染病巣が、同じ脳内の複数の離れた領域に見出すことができた。感染パターンも一様ではなく、脳によって、嗅球および核、皮質、脳梁、海馬、基底核、脈絡叢、中脳、橋、小脳、髄膜など、感染を示す領域はさまざまであった(図13、パネルA〜I)。mCMVは脊髄で検出されなかった。側脳室における脈絡叢の感染は、神経前駆細胞幹細胞局在部位である脳室にごく近接した脳実質の細胞が感染していることを示す所見と頻繁に関連していた(図13パネルE〜F)。視床および視床下部などの特定の脳領域の感染は、小脳、海馬、皮質などのその他の領域に比べて、あまり頻繁に観察されなかった。小脳は、試験した全ての脳(n = 20)においてウイルス感染を一貫して示す唯一の部位であり、プルキンエ細胞と顆粒ニューロンの両方で強力なGFP標識が見られた(図14、パネルA〜B)。海馬と大脳皮質のニューロンでもウイルスのGFPが確認された(図14、パネルC〜G)。皮質錐体細胞では、皮質表面に向かって伸びる頂端樹状突起と細胞体近くで分岐する基底樹状突起の両方にGFPが見られた。皮質中の感染したニューロンの中には、樹状突起に沿った異常な腫脹を特徴とする変性の徴候を示すものもあった(図14、パネルF)。
【０１８２】
総合すると、これらの結果は、腹腔内投与mCMVは末梢標的臓器で複製した後、新生仔マウスの発達中の脳に入り、非常に不均一な伝播パターンで、散在的で広範な感染を引き起こす。とはいえ、小脳がmCMVの感染好発部位となっているように思われる。
【０１８３】
皮下バルノクタミドは脳内のmCMV複製をブロックする
マウスを出生日に腹腔内感染させ、VCD皮下投与したマウスと被投与マウスの脳を比較した。脳内のCMV負荷を、ウイルス接種後の複数の時点で定量した。脳切片分析で観察されたウイルスの小脳領域選択性がウイルス複製レベルの上昇を伴っているか決定するために、大脳(皮質、海馬、視床、視床下部、線条体)と小脳を別々に評価した。VCDは、大脳と小脳の両方で、検出されるウイルス量を相当程度減少させ、試験した全ての時点で約100分の１から1000分の1に減少させた(図15A〜15B)。抗CMV効果は急速な発現を示し、小脳および大脳への投与からわずか1日後と3日後にそれぞれウイルス負荷を抑制した。非投与感染マウスの小脳では、感染開始時の小脳に比べてウイルス力価が上昇したことが確認され(P4: t = 3.704、p = 0.004、スチューデントの対応のあるt検定)、小脳が脳における初期mCMV標的化の優先的部位となっている可能性が示唆された。これらのデータは、脳で検出されたmCMV感染をVCDが減弱できる可能性があることを示している。CNSで観察されたVCDの抗ウイルス作用は、末梢すなわち、肝臓や脾臓におけるウイルス複製の薬剤媒介性低下の結果、したがって最終的に脳に進入できるウイルス量の低下の結果とも考えられる。
【０１８４】
VCDがCNSに入り、脳内で直接作用しmCMVを遮断できるかどうかを調べるために、P3に直接頭蓋内接種によって仔マウスに感染させた。P9に、非投与感染マウスの血液、肝臓、脾臓のmCMV負荷を分析したところ、CNSの外側にウイルスの広がりがないことが示された。VCDを投与された感染動物の大脳と小脳のウイルス力価は、非投与対照動物に比べ相当程度低く、100分の1よりも少なかった(大脳では2.99×105±9.06×104対2.47×108±1.22×108コピー数/組織g、p = 0.004；小脳では2.88×106±1.83×106対3.41×108±1.52×108コピー数/組織g、p = 0.0003、マンホイットニーU検定) (図16)。これらの結果は、皮下投与された低用量VCDがmCMV複製をインサイチューで効果的に抑制するのに十分な濃度で脳に入ることができることを示している。
【０１８５】
mCMVに感染した新生仔マウスの逆転における早期神経学的機能不全
初期発達中にCMVに感染したヒト乳児は、生後数ヵ月間の神経学的マイルストーンの獲得にかなりの遅延を示す場合がある。VCDは感染マウスのCNSにおいて強力な抗ウイルス活性を有し、ウイルス複製の急速な減弱を伴うことを示したので、これが新生仔マウスの初期神経学的転帰に好ましい治療効果をもたらすかどうかを検討した。
【０１８６】
立ち直り反射と触覚反射、運動協調、および筋力を調べるために、一連の試験を用いて神経行動学的評価を行った。これらの試験は、測定する行動が生後3週間の異なる期間でそれぞれ発現するので、新生児期の神経原性を詳細に検査することができる(Scattoni, et al., 2008, PLos One 3:e3067)。
【０１８７】
この実験、さらに本明細書の他の箇所のいくつかの実験で、非感染対照マウス群、VCD投与非感染対照マウス群、CMV感染マウス群、VCD投与CMV感染マウス群の4つのマウス群における神経機能を比較した。VCDを1日1回皮下投与した。
【０１８８】
出生日のCMV感染は、評価した全ての神経学的マイルストーンの異常な獲得を誘発し、感染マウスは、非感染対照マウスと同じような反応を示すのに6日間から10日間の遅延を示した(図17A〜17H)。次に、VCD投与新生仔マウスは、測定した全ての行動において、神経学的マイルストーンの適時の獲得を示した。VCDを投与された非感染マウスにも賦形剤を投与された非感染マウスにも初期神経原性に差は確認されなかった。総合すると、これらのデータは、初期発達中VCDを投与することで、感染した新生仔マウスで観察された短期間の神経発達アウトカムを安全に改善することができることを示している。
【０１８９】
感染した若齢マウスの長期神経行動転帰の改善
新生児期に神経学的遅延が見られたことを示すエビデンスが見られたCMV感染乳児では、長期の永続的な神経学的後遺症と行動的後遺症を発症するリスクが高まり、そのような症状は、生後1年後に遅れて発症する。運動機能異常が、よく観察される長期的な神経学的合併症である。最近では、小児および青年におけるASD様態の行動障害と初期発生時のCMV感染の間に関連があることが提唱されている。mCMVに感染した新生児マウスの初期神経原性の相当程度の改善をVCDがもたらしたことを考慮して、これらの有益な効果が、運動行為、社会的行動、探索的行動を含む遅発性神経行動異常を改善できるか調べた。
【０１９０】
運動行為
小脳は、マウスの脳におけるmCMV標的化の優先的部位であると思われる。後肢抱擁試験、垂直支柱試験、チャレンジング梁横断試験(Brooks & Dunnett, 2009, Nat. Rev. Neurosci. 10:519-529)を用いて、感染若年マウスと対照若年マウスにおける小脳媒介性運動機能を調べた。
【０１９１】
後肢抱擁試験は、小脳変性マウスモデルにおける重症度のスコアリングに広く使用されている小脳病態マーカーである。mCMV感染マウスのうち大多数(9/13)は抱擁試験に異常な反応を示し、尾を掴んでマウスを10秒間吊り下げると、両肢を部分的にまたは完全に腹部に引っ込めた(図18A〜18B)。VCD投与は、この変容行動を完全に逆転させ、感染していないマウスと同じような反応を回復させた。
【０１９２】
垂直支柱試験でマウスの頭を上にして垂直の木製の支柱の上に置くことによって、動物がうまく180°回転できるかどうか調べることができる(Brooks & Dunnett, 2009, Nat. Rev. Neurosci. 10:519-529)。mCMVに感染させた非投与若年マウスは、非感染対照マウスおよびmCMV感染VCD投与マウスのいずれと比べても、この動作を完了するのに長い時間を必要とした(図18C)。20匹の非投与感染マウスのうち3匹(15%)が試験に合格しなかった、すなわち、3回の試行全てで頭を下に向けることができなかったか、落下した。それに対し、VCD投与マウスまたは非感染対照マウスでは、この動作をできなかったマウスはなかった(p = 0.03、カイ二乗検定)。
【０１９３】
さらに、微細な運動協調とバランスは、チャレンジング梁横断試験で狭い1メートルの梁を渡って安全なプラットフォームに到達できるマウスの能力を評価することによって評価した(Brooks & Dunnett, 2009, Nat. Rev. Neurosci. 10:519-529)。初期発達中のCMV感染は、マウスが梁を渡るのに必要な時間とスリップ頻度を増加させた(図18D〜18E)。VCD投与により、mCMV感染マウスの協調とバランスが大幅に改善され、梁横断時間と記録されたスリップ回数がいずれも減少した。
【０１９４】
社会的行動および探索的行動
ASDは、社会的相互作用における広範囲にわたる障害と、制限された反復的行動および探索的活動の減少とによって特徴付けられる(American Psychiatry Association Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders第5版、2013)。周産期mCMV感染の若年マウスが社会的行動障害および探索的行動障害を示すかどうか調べるために、3室試験および改良した小規模オープンフィールド試験によって、マウスの社会的相互作用と新規環境探索を評価した。
【０１９５】
感染未投与のマウスは、初めての未知のマウスに遭遇したとき正常な社会性を示し、空のケージ(新規のもの)よりも同種のマウスの方を好んだ(図19A)。しかし、もう一匹未知のマウスが導入されたときには、社会的新規性に対する嗜好の欠如が確認され、既知のマウスと新規のマウスを調べるのに同じ時間を費やした(図19B)。VCD療法は、感染していない対照マウスにおいて見られたレベルとほぼ同じ社会的新規性応答を回復させ、2匹目の未知のマウスを調べる時間が長くなった。
【０１９６】
探索的活動は、3分間の試験セッション1回で新規な環境に曝露したマウスの立ち上がりとノーズポークの回数を定量化することによって評価した(図19C〜19D)。対照マウスに比べて、mCMV感染非投与マウスにおいて、立ち上がりとホールポーク両方の事象が相当程度減少したことが確認された。VCD投与を受けた感染マウスでは、正常レベルの探索的行動が回復した。
【０１９７】
バルノクタミドは、初期の発達においてmCMV誘発脳障害を緩和する
CMV感染乳児では、脳の大きさの低下や小脳の形成不全などなどのウイルス誘発性の脳異常を示すエビデンスとともに、初期発症神経発達遅延と長期恒久的神経行動障害が一般的に観察される。VCDは感染したマウスの脳において強力で速効性のある抗CMV活性を示し、短期、長期両方の神経行動転帰にとって有益であると思われるため、初期発達時の薬物治療がmCMV誘発脳障害に対しても治療作用を及ぼすことができるかどうかを調べた。
【０１９８】
脳重量対体重比を評価することにより、1ヵ月齢のマウスの脳の大きさを分析した(図20A〜20B)。この測定により、体細胞増殖の制限が存在する場合、出生後の脳成長と絶対的な脳重量を比較する客観的な評価が可能となる。皮下VCDは、mCMVによって誘発された不完全な脳成長を救済し、非感染対照マウスとほぼ同じ脳対体重比値を回復した。
【０１９９】
小脳の形成不全は、CMVに感染したヒトの乳児における一般的な放射線検査所見である。低力価のmCMVを腹腔内注射した新生児マウスにおいて出生後の小脳発達の一時的遅延が見られることが報告されている(Koontz, et al., 2008, J. Exp. Med. 205:423-435)。本感染マウスで、小脳が脳内のウイルス局在の優先的部位であることが確認された。VCDを投与されたまたは投与されなかった対照マウス、およびVCDを投与されたまたは投与されなかった感染マウスにおいて、小脳の構造と組織を調べた。発達中の脳のmCMV感染は、小脳発達の中断をもたらし、非感染対照マウスに比べ小脳の総面積は60%減少した(F = 8.56、p <0.001 ANOVA)(図21A〜図21B)。mCMV感染マウスでは、プルキンエ細胞(PC)とそれより薄い、PC樹状突起、顆粒細胞の平行繊維、バーグマングリア放射状突起、バスケット細胞、星状細胞からなる分子層(ML)の相当程度の減少が見られた(図21C〜21E)。小脳内部顆粒層(IGL)の厚さの減少も見られた(図21F)。PCの数が減少しただけでなく、正しく配置されていなかった(図21G)。さらに、外顆粒層(EGL)が、げっ歯動物の脳内のP21後には通常検出されないにもかかわらず、P30にmCMV感染非投与マウスにおいて確認できたが、対照マウスではEGLは見られなかった(図21H)。げっ歯類では、生後3週間のあいだに、PCの整列とその樹状突起の成熟、顆粒細胞前駆体の増殖、EGLからIGLへの内方向への移行が起こる。VCD投与は、感染した動物の小脳発達障害を救済し、正常な皮質層の厚さと発現を回復させ、PC数を著しく増加させた(図21C〜21H)。これらの薬物に媒介された好ましい作用が、最終的に、小脳の大きさの正常化をもたらした(図21A〜21B)。 VCDを投与された非感染対照マウスでは、賦形剤投与非感染対照マウスに比べ、脳の成長にもいずれの形態計測パラメータにも有害な副作用は検出されなかった。
【０２００】
ヒト胎児脳細胞におけるCMV感染のブロック
マウスCMVとヒトCMVは、非常に近いウイルスゲノム類似性を有しているが、それぞれの種特異性を保持している。mCMVのインビボモデルで観察された結果がヒトCMV (hCMV)に一般化されることを裏付けるために、脳においてウイルスの分散に重要な役割を果たす一般的な細胞標的であるヒト胎児星状細胞に対するVCDの作用を調べた。CMV-GFPレポーターを発現する細胞の定量化によって評価したところ、VCDは、胎児のヒト星状細胞のhCMV感染性を相当程度低下させた(図22A)。VCD存在下でウイルス複製も減少し、ウイルス力価が約100分の１に減少した(賦形剤投与培養物では4.92×105±5.84×104 PFU/ml、それに対しVCD投与培養物では6.31×103±3.06×103 PFU/mlであった(p <0.0001、マン-ホイットニーU検定)(図22B)。
【０２０１】
VCDは、線維芽細胞におけるCMV感染の初期段階で作用するようであり、関係しない水疱性口内炎ウイルスに対する抗ウイルス効果はない(Ornaghi, et al., 2016, Virology 499: 121-135)。hCMV複製サイクルのどの段階がヒト胎児星状細胞のVCDによって阻害されたかを決定するために、一連の実験を用いて、細胞表面へのウイルス付着と細胞質空間への浸透を評価した。これは、インキュベーション温度を4℃(ウイルスの付着を可能にするが、融合と内部移行はできない温度)から37℃(ウイルスの融合と内部移行が可能な温度)にシフトさせることによって達成した。qPCRによるウイルスゲノムの定量化は、VCDが胎児星状細胞へのhCMVの付着をブロックするようであることを示した(図22C)。VCDの存在下で細胞表面に結合したウイルスの量は、VCD非投与対照培養物に比べ60%減少した(p = 0.0007、対応のないスチューデントt検定)。VCDは、星状細胞におけるCMV融合/内部移行をブロックしないようであった。これは、CMVをブロックするVCDの機序が感染の初期段階で起こり、他の承認された抗CMV化合物のゲノム機序とは無関係と思われることを裏付けている。
【０２０２】
本明細書において引用された各々のおよび全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。本発明は、具体的な態様を参照して開示されたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、他の当業者によって本発明の他の態様および変形物が考案されうることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および同等の変形物の全てを含むと解釈されるものと意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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