(57)【要約】本発明は、ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項２】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の構造式は式Ｉに示されることを特徴とする請求項１に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
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（式中、Ｒ１はヒドロキシ基又はカルボニル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水素又はグリコシル基であり、グリコシル基はヘキサピラノース、ペンタピラノース、ヘキサフラノース、ペンタフラノース又はこれらから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基である。）
【請求項３】
式Ｉ中、Ｒ１はヒドロキシ基であることを特徴とする請求項２に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項４】
式Ｉ中、Ｒ４は水素であることを特徴とする請求項２又は３に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項５】
Ｒ２は水素、Ｒ３は水素又はグリコシル基であり、好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノース又はこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノースのジグリコシル基又はトリグリコシル基であることを特徴とする請求項４に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項６】
Ｒ２はグリコシル基、Ｒ３は水素又はグリコシル基であり、好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノース又はこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノースのジグリコシル基又はトリグリコシル基であることを特徴とする請求項４に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項７】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は下記構造式を有することを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
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【請求項８】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の構造式は式ＩＩ、式ＩＶ又は式ＩＸであることを特徴とする請求項７に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項９】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物及びその組成物とヒトに利用可能なほかの佐剤を用いて、錠剤、顆粒剤、湯剤又はカプセルを製造することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【請求項１０】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、肺線維化組織間質におけるコラーゲン蓄積を減少させる薬物及び／又はサプリメントであり、又は
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、炎症程度を軽減させて、コラーゲン形成を抑制し、肺組織を保護することができる抗肺線維症薬及び／又はサプリメントであり、又は
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、抗炎及び肺胞上皮細胞間質化を抑制して肺線維症を防止する薬物及び／又はサプリメントであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺線維症を予防・治療する技術分野に属し、ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＰＦ）は、リンパ球、マクロファージ等の炎症細胞の肺間質での浸潤、線維芽細胞の増殖及び線維性結合組織の肺間質への沈着を特徴とする慢性間質性肺疾患である。肺線維症は、肺内部および外部からの様々な病原因子により発症するものであり、一連の慢性肺損傷又は疾患が後期になった結果であって、人間の健康に深刻な害を与える。肺線維症の病因としては、遺伝性免疫不全、ウイルス感染、薬物及び化学品、放射線、空気汚染（スモッグ、喫煙、粉塵）等の要因を含む。肺線維症は、病態生理学的過程が複雑で、初期では肺の炎症を主とし、大量の炎症細胞が浸潤して、肺胞壁でびまん性肥厚が見られ、中後期では大量のコラーゲン線維が生成して、沈着し、肺胞が変形して閉鎖し、正常な肺組織構造が破壊されて、機能が失われてしまう。肺線維症の臨床症状は主に刺激性乾性咳、拘束性換気障害、進行性呼吸困難、拡散能力低下及び低酸素血症等がある。近年、肺線維症の発症率は年々増加していて、有効な臨床治療手段がなく、死亡率の高い疾患であり、従来の治療薬は、抗炎症、免疫抑制、抗凝血を主とし、グルココルチコイドホルモン、シクロホスファミド、シクロスポリン、コルヒチン及びペニシラミン等が臨床的によく使用されるが、治療効果が低く且つ副作用が強い。このため、有効な抗肺線維症薬の開発は、現在の医学分野において緊迫な課題となっている。
【０００３】
関連研究から明らかなように、生体内の多くのサイトカインは肺線維症の形成・発展に影響を及ぼし、例えば、線維症形成を促進するトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＰＤＧＦ）等、局所的な損傷と炎症反応に関与する腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）等が挙げられる。これらサイトカイン同士及び炎症細胞、肺組織細胞との相互作用によって、肺組織の炎症又は免疫損傷が深刻化されて、線維芽細胞の増殖と分化を刺激し、細胞外基質の産生と沈着を促進し、肺線維化過程に重要な役割を果たす。その中でも、ＴＧＦ−β１は、筋線維芽細胞の表現型変換を促進して、複数種のサイトカインの合成、分泌を刺激し、細胞の増殖と分化を制御する等、非常に重要な役割を果たし、強い線維形成因子と言え、細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の合成分泌を刺激できるとともに、マトリックス分解酵素成分の活性を変化させ、ＥＣＭの沈着を直接悪化させる。肺線維症の発症マカニズムにおいて、肺線維芽細胞の活性化と増殖が重要な役割を果たし、それによって、前線維形成因子を大量放出し、さらに平滑筋アクチンα−ＳＭＡの発現とコラーゲンの蓄積を向上させ、ＥＣＭの沈着が生じ、最終的に肺線維症を引き起こす。現在、前線維形成因子の抑制を出発点とした肺線維症治療薬の開発について研究は盛んに行っている。
【０００４】
肺脂質過酸化損傷も、肺損傷を引き起こすと共に、マクロファージが活性化されてサイトカインを放出して肺線維症の形成を促進するメカニズムの一つである。マロンアルデヒド（ＭＤＡ）は生体の脂質過酸化による主な産物の一つであり、ＭＤＡレベルは生体の酸素ラジカル除去能及びラジカルによる細胞損傷の重篤度を間接的に反映することができる。一酸化窒素（ＮＯ）の濃度が高すぎる場合、過量の毒性中間体が生成し、細胞損傷を深刻化させ、肺組織でのＮＯの大量生成は肺損傷を深刻化させたり、肺線維芽細胞の増殖を促進する作用がある。これらの酸化関連指標の体内の代謝異常は肺肺線維症の発症や発展を促進し、そのバランスを調整することは、肺線維症の治療に有益である。
【０００５】
ブレオマイシンを気管内投与して、ラット肺線維症を誘発する動物モデルは、国内外の肺線維症薬物を研究するための古典的な動物モデルであり、該方法で再現された肺線維症動物モデルはヒト肺線維症に近く、且つ短時間で組織の炎症や線維化を誘発して、体内の酸化と抗酸化のブランスを崩して、前炎症性サイトカインＩＬ−６、線維化促進マーカーＴＧＦ−β１、α−ＳＭＡ等の発現を増加させ、細胞外マトリックスの沈着及び線維組織増殖を発生させて肺線維症を発症することができる。
【０００６】
現在、肺線維症治療薬はグルココルチコイド、細胞毒性薬物、免疫抑制剤、免疫調節剤を主とし、特効薬がない。これに鑑み、肺線維症を高効率で安全的に治療できる新規薬物を研究することが必要である。
【０００７】
これまで、ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の抗肺線維症における応用の報告はなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の新しい医薬用途、即ち、肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における用途を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
【００１０】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の構造式は式Ｉに示される。
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（式中、Ｒ１はヒドロキシ基又はカルボニル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水素又はグリコシル基であり、グリコシル基はヘキサピラノース、ペンタピラノース、ヘキサフラノース、ペンタフラノース又はこれらから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基である。）
【００１１】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ１はヒドロキシ基である。
【００１２】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ４は水素である。
【００１３】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ２は水素、Ｒ３は水素又はグリコシル基であり、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノース又はこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノースのジグリコシル基又はトリグリコシル基である。
【００１４】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ２はグリコシル基であり、Ｒ３は水素又はグリコシル基であり、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノース又はこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノースのジグリコシル基又はトリグリコシル基である。
【００１５】
さらに、前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、下記構造式を有する。それぞれモグロシドＩＩＩｅ（式ＩＩ）、モグロシドＩＩＩＡ１（式ＩＩＩ）、モグロシドＩＶｅ（式ＩＶ）、モグロシドＶ（式Ｖ）、モグロシドＩＩＡ２（式ＶＩ）、Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ  Ｉ  Ｅ１（式ＶＩＩ）、１１−オキソ−モグロシドＶ（式ＶＩＩＩ）又はモグロール（式ＩＸ）である。
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【００１６】
より好ましくは、前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の構造式は式ＩＩ、式ＩＶ又は式ＩＸである。
【００１７】
上記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用であって、式Ｉに示される化合物及びその組成物とヒトに利用可能なほかの佐剤とを用いて、錠剤、顆粒剤、湯剤又はカプセルを製造する。
【００１８】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、肺線維化組織間質におけるコラーゲン蓄積を減少させる薬物及び／又はサプリメントである。
【００１９】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、炎症程度を軽減させて、コラーゲン形成を抑制し、肺組織を保護することができる抗肺線維症薬及び／又はサプリメントである。
【００２０】
前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、抗炎及び肺胞上皮細胞間質化を抑制して肺線維症を防止する薬物及び／又はサプリメントである。
【発明の効果】
【００２１】
１、肺線維症は、多くの肺部疾患又は肺損傷が後期になった通常の病理学的変化であり、臨床研究の結果から、グルココルチコイドで肺線維症後患者を治療すると、患者の生存率に有意な変化はなかったことが示され、現在、明確な治療薬はない。本発明は、潤肺止咳効能を有する漢方薬ラカンカから製造されるものである。現在、モグロシド類成分が肺線維症の治療に利用できるという報告はなく、本発明者は、インビボ実験で該モグロシドＩＩＩｅ、モグロシドＩＶｅ及びモグロシド類成分のアグリコンであるモグロールがいずれもブレオマイシン誘発肺線維症を顕著に改善することを証明した。本発明のモグロシドＩＩＩｅ、モグロシドＩＶｅ及びモグロールはいずれも良好な安定性を有し、関連疾患の治療薬の製造に用いられ得る。
２、具体的に、本発明の実験結果から明らかなように、実施例１のモグロシドＩＩＩｅ投与群では、Ｍａｓｓｏｎ染色病理切片は、投与群の肺線維症が有意に改善され、モグロシドＩＩＩｅ投与群の肺胞洗浄液における白血球数はモデル群よりも有意に低く、投薬後２８日目、肺組織におけるＴＮＦ−α含有量及びコラーゲン沈着を示すＨＹＰ、ＴＧＦ−β１含有量はモデル群よりも有意に低く（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）、それは、モグロシドＩＩＩｅが肺線維症の各期に一定の治療効果を有することを表し、インビボ実験によれば、炎症を軽減させて、コラーゲン形成を抑止し肺組織を保護する作用を有することが示されている。
インビトロ実験によれば、モグロシドＩＩＩｅは抗炎症作用を有することが示唆されており、１０−１００μＭの範囲では、モグロシドＩＩＩｅはＬＰＳで誘発されたＲＡＷ２６４．７細胞中のＮＯレベルを用量依存的に抑制し、この結果からも、モグロシドＩＩＩｅはＴＧＦ−β１で誘発されたＩＩ型肺胞上皮細胞Ａ５４９の上皮間質化を抑制するという役割が示され、モグロシドＩＩＩｅは、抗炎症及び肺胞上皮細胞間質化を抑制することで抗肺線維薬の作用を発揮できることを示す。このため、モグロシドＩＩＩｅはモデルマウスの肺線維症に対し一定の治療効果を有する。
３、本発明に使用されている実験材料は、入手しやすく、低コストで、抽出物の活性が明確で、実用的価値が高い原植物に由来する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】モグロシドＩＩＩｅによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスの体重変化の傾向図である。対照群に比較して、＃ｐ＜０．０５；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図２】モグロシドＩＩＩｅによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスの肺係数変化への影響である。対照群に比較して、＃＃ｐ＜０．００１；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図３】モグロシドＩＩＩｅによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルの各群マウスの肺組織の線維化程度への影響（Ｍａｓｓｏｎ染色）である。対照群に比較して、＃＃ｐ＜０．０１；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図４】モグロシドＩＩＩｅによるブレオマイシン誘発肺線維症マウスの肺組織におけるＨＹＰ含有量への影響である。対照群に比較して、＃ｐ＜０．０５；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５。
【図５】モグロシドＩＩＩｅによるＴＧＦ−β１誘発後のヒト肺胞ＩＩ型上皮細胞におけるα−ＳＭＡ発現量への影響である。対照群に比較して、＃＃ｐ＜０．０１；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５。
【図６】モグロシドＩＶｅによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスの体重変化の傾向図である。対照群に比較して、＃ｐ＜０．０５；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図７】モグロシドＩＶｅによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスの肺係数の変化への影響である。対照群に比較して、＃＃ｐ＜０．００１；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図８】モグロシドＩＶｅによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルの各群マウスの肺線維症重篤度（Ｍａｓｓｏｎ染色）への影響である。対照群に比較して、＃＃ｐ＜０．０１；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図９】モグロールによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルマウスの体重変化の傾向図である。対照群に比較して、＃ｐ＜０．０５；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【図１０】モグロールによるブレオマイシン誘発肺線維症モデルの各群マウスの肺組織の肺線維症重篤度（Ｍａｓｓｏｎ染色）への影響である。対照群に比較して、＃＃ｐ＜０．０１；モデル群に比較して、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１；陽性対照薬：酢酸プレドニゾン。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
式Ｉに示されるククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用。
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（式中、Ｒ１はヒドロキシ基又はカルボニル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は水素又はグリコシル基であり、グリコシル基はヘキサピラノース、ペンタピラノース、ヘキサフラノース、ペンタフラノース及びこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基である。）
【００２４】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ１はヒドロキシ基である。
【００２５】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ４は水素である。
【００２６】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ２は水素、Ｒ３は水素又はグリコシル基であり、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノース又はこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノースのジグリコシル基又はトリグリコシル基である。
【００２７】
好ましくは、式Ｉ中、Ｒ２はグリコシル基、Ｒ３は水素又はグリコシル基であり、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノース又はこれから構成されるジグリコシル基、トリグリコシル基、テトラグリコシル基、より好ましくは、前記グリコシル基はヘキサピラノースのジグリコシル基又はトリグリコシル基である。
【００２８】
さらに、前記モグロシド類化合物は以下の化合物から選択される一種である。モグロシドＩＩＩｅ（式ＩＩ）、モグロシドＩＩＩ  Ａ１（式ＩＩＩ）、モグロシドＩＶｅ（式ＩＶ）、モグロシドＶ（式Ｖ）、モグロシドＩＩ  Ａ２（式ＶＩ）、Ｍｏｇｒｏｓｉｄｅ  Ｉ  Ｅ１（式ＶＩＩ）、１１−オキソ−モグロシドＶ（式ＶＩＩＩ）又はモグロール（式ＩＸ）。
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【００２９】
より好ましくは、前記ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物は、モグロシドＩＩＩｅ（式ＩＩ）、モグロシドＩＶｅ（式ＩＶ）又はモグロール（式ＩＸ）である。
【００３０】
ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物の肺線維症の予防及び／又は治療薬及び／又はサプリメントの製造における応用では、式Ｉに示される化合物及びその組成物とヒトに利用可能なほかの佐剤とを用いて、錠剤、顆粒剤、湯剤又はカプセルを製造する。
【００３１】
前記薬物及び／又はサプリメントは、肺線維化組織間質におけるコラーゲン蓄積を減少させる薬物及び／又はサプリメントである。
【００３２】
前記薬物及び／又はサプリメントは、炎症程度を軽減させて、コラーゲン形成を抑制し、肺組織を保護することができる抗肺線維症薬及び／又はサプリメントである。
【００３３】
前記薬物及び／又はサプリメントは、抗炎症及び肺胞上皮細胞間質化を抑制して肺線維症を防止する薬物及び／又はサプリメントである。
【００３４】
本発明では、研究によりモグロシド類化合物がブレオマイシン誘発マウス肺線維症を改善することを証明する。インビボ実験では、Ｍａｓｓｏｎ染色後の肺組織病理切片を観察し、各群の肺係数、体重変化、最終体重を測定し、及び各時期で各群のマウス肺胞洗浄液における白血球の数、ＴＮＦ−α含有量、及び、肺組織におけるＨＹＰ、ＴＧＦ−β１含有量と、α−ＳＭＡの発現を検出した。インビトロ実験では、モグロシド類化合物がＬＰＳ誘発マウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７によるＮＯ放出及びＴＧＦ−β１誘発ヒト肺ＩＩ型上皮細胞間質化を有意に抑制し、誘発後の上皮細胞間質化後のα−ＳＭＡ高発現を低下できることを調べた。実験結果から、本発明に係るモグロシド類化合物は、モデルマウスの肺組織の線維化程度を改善し、モデル肺組織のコラーゲン沈着を低下させ、上皮間質化を改善させることができ、マウス肺線維症モデルに対し治療作用を示し、肺線維症の治療用の新しい医療用途がある。
【００３５】
以下、実施例を参照しながら本発明の実施形態についてさらに説明するが、本発明は下記実施例の範囲に限制されない。
【００３６】
本発明では、モグロシドＩＩＩｅ（実施例１）、モグロシドＩＶｅ（実施例２）及びモグロール（実施例３）を例として、モグロシド類化合物の抗肺線維症の一部の薬力学試験及び結果を検証する。
【００３７】
本発明のモグロシドＩＩＩｅ、モグロシドＩＶｅ及びモグロールの製造
天然ラカンカから抽出されたラカンカ由来総グリコシドのうち、モグロシドＶの含有量は最も高く、ラカンカ由来総グリコシドをβ−グルコシダーゼで加水分解すると、酵素分解時間によって、異なる割合のモグロシドを含有する抽出物は得られ得る。モグロールは、酸加水分解で調製できるモグロシド類化合物のアグリコンである。
モグロシドＩＩＩｅは、市販されているラカンカ抽出物を用いて、マクロポーラス樹脂、高圧逆相分取クロマトグラフィーで分離して、純度９５％以上のものとして得た。又は、中国特許２０１０１０５６１０２９９に記載のモグロシドIVの製造方法に従って、市販されているラカンカ抽出物をβ−グルコシダーゼで加水分解した後、マクロポーラス樹脂、高圧逆相分取クロマトグラフィーで分離して、純度９５％以上のものとして得た。
モグロシドＩＶｅは、市販されているラカンカ抽出物を用いて、マクロポーラス樹脂、高圧逆相分取クロマトグラフィーで分離して、純度９５％以上のものとして得た。又は、中国特許２０１０１０５６１０２９９に記載のモグロシドIVの製造方法に従って、市販されているラカンカ抽出物をβ−グルコシダーゼで加水分解した後、マクロポーラス樹脂、高圧逆相分取クロマトグラフィーで分離して、純度９５％以上のものとして得た。
モグロールは、市販されているラカンカ抽出物を用いて、５％硫酸で加水分解し、シリカゲル精製を行って、純度９５％以上のものとして得た。
【００３８】
実施例１  モグロシドＩＩＩｅによるブレオマイシン誘発マウスの肺線維化改善
【００３９】
上記モグロシドＩＩＩｅを用いて、下記インビボ薬力学試験を行った。ブレオマイシンを気管内注射してマウス肺線維症モデルを誘発させることは，世界中、一般的に使われている方法であり、ヒト肺間質線維症に近かった。
【００４０】
１．１  実験方法
【００４１】
ＩＣＲマウス、雄性、体重２５−３０ｇ、１００匹、揚州比較医学センターにより提供。
【００４２】
マウス２０匹を空白対照群（図１の対照群）として、残りの８０匹についてモデルを作成して、上記すべてのマウスに４％の抱水クロラールを１０ｍｌ／ｋｇ腹腔内注射し麻酔し、マウスを麻酔した後、マウスを固定して、マウスの首を消毒し、はさみでマウスの首の皮膚を縦に切断して気管を露出させ、注射器を気管に刺し、空白対照群のマウスには生理食塩水を注射し、残りのマウスにはブレオマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）を注射した直後、マウスボードを立て、マウスボードを回転させて、マウスの呼吸を観察し、創傷を縫合し、縫合位置にペニシリン注射液を１−２滴滴下した。手術後のマウスを乾いたクリーンなケージに入れて休ませて、約１−２ｈ後、意識が戻り、それ以降、正常に飼育した。
【００４３】
モデルを作成してから７日目から、残りの８０匹のマウスを、モデル群、陽性薬（酢酸プレドニゾン）群、モグロシドＩＩＩｅ高用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、モグロシドＩＩＩｅ−Ｈ）、モグロシドＩＩＩｅ低用量群（１０ｍｇ／ｋｇ、モグロシドＩＩＩｅ−Ｌ）にランダムに分けて、各群を２０匹とした。
【００４４】
毎日、空白対照群、モデル群に生理食塩水、陽性薬群に６．６７ｍｇ／ｋｇ／ｄの酢酸プレドニゾン、モグロシドＩＩＩｅの高、低用量群にモグロシドＩＩＩｅをそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ及び１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ強制経口投与して、２８日目まで続け、１４、２８日目にマウスを殺した。体重を量って記録し、解剖して肺組織を摘出し、冷たい生理食塩水で洗浄して、吸収紙で乾燥させて重量を量り、肺係数を、肺係数＝肺重量（ｍｇ）／体重（ｇ）により計算した。左肺を４％中性ホルマリンに入れ固定し、アルコールで段階的に脱水して、キシレンで透明化させ、ワックスで浸漬し、パラフィンで包埋させた後、常法で切片し、Ｍａｓｓｏｎ染色を行い、肺組織の形態、肺損傷及び肺線維化の程度を観察した。残りの肺葉を個別に保存し、ＨＹＰ含有量の測定に用いた。
【００４５】
すべてのデータは平均数±ＳＤ（ｘ±ｓ）で示される。ＳＰＳＳ１１．５統計ソフトウェアを用いて処理し、統計には一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意な差を示す。
【００４６】
１．２  実験結果
【００４７】
１．２．１モグロシドＩＩＩｅによるモデルマウスの体重への影響
【００４８】
空白対照群に比較して、モデル群のマウスは、体重が大幅に減少し、且つ、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１又は０．０５）。モデル群のマウスの体重に比較して、投与１４、２８日間後、モグロシドＩＩＩｅ高、低用量群及び陽性薬物（酢酸プレドニゾン）群の体重はいずれも明らかに増加し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。モグロシドＩＩＩｅは、２０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの用量では、程度が異なるが、ブレオマイシン誘発肺線維症マウスの体質を改善し、肺線維症モデルマウスの体重低下程度を低減させることが示され、結果を図１に示す。
【００４９】
１．２．２  モグロシドＩＩＩｅによるモデルマウスの気管支肺胞洗浄液における白血球の数への影響
【００５０】
ブレオマイシンで誘発されたマウス肺組織損傷では、白血球の数が増加し、特に好中球が浸潤し、肺胞の炎症を引き起こし、炎症細胞は炎症メディエーターＮＯ、ＴＮＦ−α等及び様々なサイトカインを放出し、肺組織の損傷を深刻化させる一方、様々な成長因子を介してコラーゲン生成の過度の増加を促進した。本実験はキットの取り扱い書に従って正確に実施されており、１４日目の各群のマウスの気管支肺胞洗浄液における白血球の数を比色法で測定した（表１参照）。ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処理してから１４日目には、マウスの肺胞洗浄液における好中球とリンパ球は明らかに集まった。空白対照群に比較して、モデル群では、洗浄液における細胞総数と好中球の数は共に明らかに増えた（空白対照群に比較して、＃＃Ｐ＜０．０１）。モグロシドＩＩＩｅ処理後、肺胞洗浄液における細胞総数と好中球の数は、単独投与モデル群よりも明らかに低下した（モデル群に比較して、＊Ｐ＜０．０５）。モグロシドＩＩＩｅはＢＬＭ誘発炎症細胞の浸出を減らすことが明らかなになった。
【００５１】
表１  ブレオマイシン誘発後のマウスの気管支肺胞洗浄液における細胞総数及び好中球の数への影響（×１０４、ｎ＝５）
2019500375.tif 000012
【００５２】
１．２．３  モグロシドＩＩＩｅによるモデルマウスの肺係数への影響
【００５３】
空白対照群に比較して、モデル群のマウスの肺係数は、大幅に増加し、且つ、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１又は０．０５）。モデル群のマウスの肺係数に比較して、投与１４、２８日間後に、モグロシドＩＩＩｅ薬物群と酢酸プレドニゾン群の肺係数は共に明らかに低下し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。空白対照群に比較して、モデル群のマウスの肺係数は、明らかに増加し且つ差はすべて統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１又は０．０５）。モデル群のマウスの体重に比較して、投与１４、２１日間後、モグロシドＩＩＩｅ高、低用量群及び陽性薬物（酢酸プレドニゾン）群の肺係数は明らかに減少し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。モグロシドＩＩＩｅは２０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量で、程度が異なるが、ブレオマイシン誘発マウスの肺線維症を改善し、モデルマウスの肺線維症の発展を緩和させることが示されている（図２参照）。
【００５４】
１．２．４  モグロシドＩＩＩｅによるモデルマウスの肺組織への影響
【００５５】
２８日目の肺病理組織切片についてＭａｓｓｏｎ染色を行い、その結果、空白対照群のマウスの肺組織は、構造が完全で明瞭であり、肺胞中隔には肥厚が見られず、肺胞腔が透明で、腔内に明らかな浸出物がなく、線維芽細胞の増殖がなかった。空白対照群のマウスの肺組織では、細胞外マトリックスの主成分である、青色に染色された少量のコラーゲン線維は観察された。モデル群のマウスでは、肺胞構造が破壊され、肺胞中隔が広くなり、大量の炎症性細胞が浸潤し急性線維芽細胞が増殖し、大量のコラーゲンが沈着して、肺線維化が形成し、Ｍａｓｓｏｎ染色をしたところ、青色に染色された大量の緻密なコラーゲン線維は束状又は片状として沈着し、基本的に肺線維症の特徴と一致し、それにより、実験マウスの肺線維症モデルの製造に成功したことが示される。モグロシドＩＩＩｅで治療したところ、マウスの肺組織は、構造が完全で明瞭であり、肺胞中隔に僅かな肥厚が見られ、線維芽細胞の増殖の程度がすべてモデル群よりも低かった。陽性薬物である酢酸プレドニゾンで治療したところ、陽性群のマウスは、肺胞中隔が広く、肺胞腔が狭くなり、多くの線維芽細胞が増殖し、病変の程度がモデル群よりも軽減された。各投与群及び陽性薬群は、モデル群に比較して、線維化の程度が緩和した（図３参照）。
【００５６】
１．２．５  モグロシドＩＩＩｅによるモデルマウスの肺組織のＨＹＰ含有量への影響
【００５７】
ヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）は結合組織タンパク質の加水分解により得られたアミノ酸で、コラーゲン重量の約１４％を占め、コラーゲンの安定性にとって重要な役割を果たし、コラーゲンは多くのＨＰＹを含む唯一なタンパク質であるため、ＨＹＰ含有量の測定は組織におけるコラーゲン総量の変化を反映できる。消化法を用いて肺組織におけるＨＹＰの含有量を測定した。空白対照群に比較して、２８日目、モデル群の肺組織のＨＹＰ含有量は有意に増加し（Ｐ＜０．０１）、モデル群に比較して、薬物は、肺組織におけるＨＹＰ含有量を顕著に減少させた（Ｐ＜０．０５）。モグロシドＩＩＩｅは、５０ｍｇ／ｋｇ用量で、程度が異なるが、ブレオマイシン誘発マウスの肺線維症を改善し、モグロシドＩＩＩｅは、モデル肺組織のコラーゲン線維の含有量を減少させ、モデルマウスの肺線維症の発展程度を軽減させることが示されている（図４参照）。
【００５８】
１．２．６  モグロシドＩＩＩｅによるＴＧＦ−β１誘発ヒト肺胞ＩＩ型上皮細胞α−ＳＭＡレベルへの影響
【００５９】
肺胞上皮細胞は上皮細胞の上皮間質転換（ＥＭＴ）により間質細胞の表現型を得て、肺線維芽細胞と筋線維芽細胞の重要な供給源となった。この新しいモードでは、肺胞上皮間質化は線維症の主要な一環である。成熟細胞では、損傷は上皮細胞から間質細胞の表現型への転換を誘導できるため、多くの臓器の線維化に繋がる。上皮細胞から分化した線維芽細胞と筋線維芽細胞は一般的に、形態学的変化（例えば、立方形の細胞形態からロッド状又はシャトル状へ変わる）、線維芽細胞又は筋線維芽細胞の特異的マーカー（例えば、α−ＳＭＡ）の取得、上皮特異的マーカーの喪失（例えば、上皮細胞カドヘリン〔Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎとタイトジャンクションタンパク質）を経て、これら上皮組織と一体に融合する。インビトロ試験を通して、ＴＧＦ−β１によりＡ５４９細胞の皮細胞−間質細胞転換（ＥＭＴ）を誘発し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ方法でアクチンａ−ＳＭＡ発現レベルを分析し、ＥＭＴ過程でのシグナル伝達経路におけるモグロシドＩＩＩｅの肺線維症の発症メカニズムについての研究の意義を検討した。
【００６０】
本発明では、２−４代継代培養してよく成長しているＡ５４９細胞を１×ｌＯ５継代し、四群に分け、無血清ＤＭＥＭ培養液を加えて１２時間飢餓処理し、細胞を同じ成長レベルにして、モデル群では、無血清培地に濃度５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１を加え、陽性薬物群及びモグロシドＩＩＩｅ群（１００μＭ）では、濃度５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１及び対応した薬物を加えて、４８時間培養した後、倒立顕微鏡下で肺上皮細胞の変化を観察し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを用いて、ＴＧＦ一β１による、Ａ５４９細胞から間質細胞へ上皮転換のマーカータンパク質α−ＳＭＡの発現への影響を測定した。実験結果から明らかなように、空白対照群に比較して、Ａ５４９細胞にＴＧＦ−β１を加える場合、間質細胞マーカーα−ＳＭＡの発現は上昇し（Ｐ＜０．０１）、モグロシドＩＩＩｅは５０μＭ濃度でＴＧＦ−β１によるα−ＳＭＡを顕著に抑制した（図５参照）。
【００６１】
１．２．７  討論
【００６２】
モデル群に比較して、モグロシドＩＩＩｅ高、低用量群は、肺インデックスを大幅に減らし、高用量群では、肺組織におけるＨＹＰ含有量は有意に減少し（ｐ＜０．０５）、且つ、病理結果から、モグロシドＩＩＩｅ薬物群の肺組織の構造が明らかに改善され、肺胞構造の損傷及び肺胞中隔の肥厚程度が有意に軽減し、炎症性細胞浸潤が減少し、コラーゲン線維の含有量が減少することが示されている。空白対照群に比較して、モデル群マウスの肺胞洗浄液における好中球の数が明らかに増加し、このことから、モデル群では、ブレオマイシンは炎症反応を引き起こし、インビボ炎症カスケードを開始させることが示されている。薬物投与後、マウスの炎症及び線維症程度はある程度で軽減し、肺組織におけるＨＹＰ含有量は明らかに減少することから、薬物は、肺細胞を損傷から守って肺線維症を予防・治療することが示されている。インビトロ実験の結果から、モグロシドＩＩＩｅは５０μＭ濃度でＴＧＦ−β１による上皮間質化の誘発を抑制し、肺線維芽細胞マーカーα−ＳＭＡを低下させることが明らかになった。
【００６３】
前記のとおり、インビトロ・インビボ実験の結果から、モグロシドＩＩＩｅはブレオマイシンマウス肺線維症モデルの肺組織炎症及び肺線維化の程度、及び肺組織におけるコラーゲンの生成を改善するとともに、細胞増殖因子ＴＧＦ−β１によるヒト肺胞ＩＩ上皮細胞間質化を効果的に抑制することが分かり、モグロシドＩＩＩｅは肺線維症を治療するという新用途がある。
【００６４】
実施例２  モグロシドＩＶｅによるブレオマイシン誘発マウス肺線維の改善
【００６５】
上記モグロシドＩＶｅ（式ＩＶ）を用いて、下記インビボでの薬力学試験を行った。
【００６６】
２．１  実験方法
ＩＣＲマウス、雄性、体重２５−３０ｇ、１００匹、揚州比較医学センターにより提供。
【００６７】
マウス２０匹を空白対照群として、残りの８０匹についてモデルを作成して、上記すべてのマウスに４％の抱水クロラールを１０ｍｌ／ｋｇ腹腔内注射し麻酔し、マウスを麻酔した後、マウスを固定して、マウスの首を消毒し、はさみでマウスの首の皮膚を縦に切断して、ピンセットで筋膜と筋肉を縦方向に鈍的に引き裂き、気管を露出させ、注射器を気管に刺し、空白対照群のマウスには生理食塩水を注射し、残りのマウスにはブレオマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）を注射した直後、マウスボードを立て、マウスボードを回転させて、マウスの呼吸を観察し、回転後、７５％アルコールコットンで首の傷を消毒し、創傷を縫合し、縫合位置にペニシリン注射液を１−２滴滴下した。手術後のマウスを乾いたクリーンなケージに入れて休ませて、約１−２ｈ後、意識が戻り、それ以降、正常に飼育した。
【００６８】
モデルを作成してから７日目から、残りの８０匹のマウスを、モデル群、陽性薬（酢酸プレドニゾン）群、モグロシドＩＶｅ高用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、モグロシドＩＶｅ−Ｈ）、モグロシドＩＶｅ低用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、モグロシドＩＶｅ−Ｌ）にランダムに分けて、各群を２０匹とした。
【００６９】
毎日、空白対照群、モデル群に生理食塩水、陽性薬群に６．６７ｍｇ／ｋｇ／ｄの酢酸プレドニゾン、モグロシドＩＶｅの高、低用量群に生理食塩水をそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（高用量群）及び２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ（低用量群）強制経口投与し、２８日目まで続け、体重を量って記録し、２８日目にマウスを殺し、解剖して肺組織を摘出し、肺係数を肺係数＝肺重量（ｍｇ）／体重（ｇ）により計算した。左肺を４％中性ホルマリンに入れ固定し、アルコールで段階的に脱水して、キシレンで透明化させ、ワックスで浸漬し、パラフィンで包埋させた後、常法で切片し、Ｍａｓｓｏｎ染色を行い、肺組織の形態、肺損傷及び肺線維化の程度を観察した。
【００７０】
すべてのデータは平均数±ＳＤ（ｘ±ｓ）で示される。ＳＰＳＳ１１．５統計ソフトウェアを用いて処理し、統計には一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意な差を示す。
【００７１】
２．２  実験結果
【００７２】
２．２．１  モグロシドＩＶｅによる肺線維症モデルマウスの体重への影響
【００７３】
空白対照群に比較して、モデル群のマウスは、体重が大幅に減少し、且つ、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１又は０．０５）。モデル群のマウスの体重に比較して、投与１４、２８日間後、モグロシドＩＶｅ高、低用量群及び陽性薬物（酢酸プレドニゾン）群の体重はいずれも明らかに増加し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。モグロシドＩＶｅは、５０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの用量では、程度が異なるが、ブレオマイシン誘発肺線維症マウスの体質を改善し、肺モデルのマウス体重低下程度を低減させることが示されている（図６参照）。
【００７４】
２．２．２  モグロシドＩＶｅによるモデルマウスの気管支肺胞洗浄液における白血球の数への影響
【００７５】
ブレオマイシンで誘発されたマウス肺組織損傷では、白血球の数が増加し、特に好中球が浸潤し、肺胞の炎症を引き起こし、炎症細胞は炎症メディエーターＮＯ、ＴＮＦ−α等及び様々なサイトカインを放出し、肺組織の損傷を深刻化させる一方、様々な成長因子を介してコラーゲン生成の過度の増加を促進した。本実験はキットの取り扱い書に従って正確に実施されており、ｎ１４日目の各群のマウスの気管支肺胞洗浄液における白血球の数を比色法で測定した（表２参照）。ブレオマイシン（ＢＬＭ）で処理してから１４日目には、マウスの肺胞洗浄液における好中球とリンパ球は明らかに集まった。空白対照群相に比較して、モデル群では、洗浄液における細胞総数と好中球の数は共に明らかに増えた（空白対照群に比較して、＃＃Ｐ＜０．０１）。処理後、肺胞洗浄液における細胞総数と好中球の数は、単独投与モデル群よりも明らかに低下した（モデル群に比較して、＊Ｐ＜０．０５）。モグロシドＩＶｅはＢＬＭ誘発炎症細胞の浸出を減らすことが明らかになった。
【００７６】
表２  ブレオマイシン誘発後のマウスの気管支肺胞洗浄液における細胞総数及び好中球の数への影響（×１０４、ｎ＝５）
2019500375.tif 000013
【００７７】
２．２．３  モグロシドＩＶｅによるモデルマウスの肺係数への影響
【００７８】
モデルを作成してから２８日目に、肺係数を測定した。空白対照群に比較して、モデル群のマウスの肺係数は、大幅に増加し、且つ、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１又は０．０５）。モデル群のマウスの肺係数に比較して、モグロシドＩＶｅ薬物群と酢酸プレドニゾン群の肺係数は共に明らかに低下し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。空白対照群に比較して、モデル群のマウスの肺係数は大幅に増加し、且つ、差は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１又は０．０５）。モデル群のマウスの体重に比較して、モグロシドＩＶｅ高、低用量群及び陽性薬物（酢酸プレドニゾン）群の肺係数は明らかに減少し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。モグロシドＩＶｅは５０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇ用量で、程度が異なるが、ブレオマイシン誘発マウスの肺線維症を改善し、モデルマウスの肺線維症の発展を緩和させることが示されている（図７参照）。
【００７９】
２．２．４  モグロシドＩＶｅによるモデルマウスの肺組織への影響
【００８０】
病理組織切片についてＭａｓｓｏｎ染色を行い、その結果、空白対照群のマウスの肺組織は、構造が完全で明瞭であり、肺胞中隔には肥厚が見られず、肺胞腔が透明性で、線維芽細胞の増殖がなかった。空白対照群のマウスの肺組織では、細胞外マトリックスの主成分である、青色に染色された少量のコラーゲン線維は観察された。モデル群のマウスでは、肺胞構造が破壊され、肺胞中隔が広くなり、大量のコラーゲンが沈着して、肺線維症が形成し、Ｍａｓｓｏｎ染色をしたところ、青色に染色された大量の緻密なコラーゲン線維は束状又は片状として沈着し、基本的に肺線維症の特徴と一致し、それにより、実験マウスの肺線維症モデルの製造に成功したことが示される。モグロシドＩＶｅで治療したところ、マウスの肺組織は、構造が完全で明瞭であり、肺胞中隔に僅かな肥厚が見られ、線維芽細胞の増殖の程度がすべてモデル群よりも低かった。各投与群及び陽性薬群は、モデル群に比較して、線維化の程度が緩和した（図８参照）。
【００８１】
２．２．５、討論
【００８２】
モデル群に比較して、モグロシドＩＶｅ高、低用量群は、肺インデックスを大幅に減らし、病理学的結果から分かるように、モグロシドＩＶｅとモグロール薬物群では、肺組織の構造が明らかに改善された。空白対照群に比較して、モデル群のマウスの肺胞洗浄液における好中球の数は明らかに増加し、このことから、モデル群では、ブレオマイシンは炎症反応を引き起こし、インビボ炎症カスケードを開始させることが示されている。薬物投与後、マウスの炎症及び線維症程度は、程度が異なるが、軽減することから、薬物は、肺細胞を損傷から守って肺線維症を予防・治療することが示されている。インビトロ実験の結果から、モグロシドＩＶｅはブレオマイシンマウス肺線維症モデルの肺組織炎症及び肺線維化の程度、及び肺組織におけるコラーゲンの生成を改善することが分かり、モグロシドＩＶｅは肺線維症を治療するという新用途がある。
【００８３】
実施例３  モグロールによるブレオマイシン誘発マウス肺線維化の改善
【００８４】
上記モグロール（式ＩＸ）を用いて、下記インビボでの薬力学試験を行った。
【００８５】
３．１  実験方法
【００８６】
ＩＣＲマウス、雄性、体重２５−３０ｇ、１００匹、揚州比較医学センターにより提供。
【００８７】
マウス２０匹を空白対照群として、残りの８０匹についてモデルを作成し、上記すべてのマウスに４％の抱水クロラールを１０ｍｌ／ｋｇ腹腔内注射し麻酔し、マウスを麻酔した後、マウスを固定して、マウスの首を消毒し、はさみでマウスの首の皮膚を縦に切断して、ピンセットで筋膜と筋肉を縦方向に鈍的に引き裂き、気管を露出させ、注射器を気管に刺し、空白対照群のマウスには生理食塩水を注射し、残りのマウスにはブレオマイシン（５ｍｇ／ｋｇ）を注射した直後、マウスボードを立て、マウスボードを回転させて、マウスの呼吸を観察し、回転後、７５％アルコールコットンで首の傷を消毒し、創傷を縫合し、縫合位置にペニシリン注射液を１−２滴滴下した。手術後のマウスを乾いたクリーンなケージに入れて休ませて、約１−２ｈ後、意識が戻り、それ以降、正常に飼育した。モデルを作成してから７日目から、残りのマウスを、モデル群、陽性薬（酢酸プレドニゾン）群、モグロール高用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、モグロール−Ｈ）、モグロール低用量群（２０ｍｇ／ｋｇ、モグロール−Ｌ）にランダムに分けて、各群を２０匹とした。
【００８８】
毎日、空白対照群、モデル群に生理食塩水、陽性薬群に７．０ｍｇ／ｋｇ／ｄの酢酸プレドニゾン、モグロールの高、低用量群にモグロールを２８日目まで持続して強制経口投与し、体重を量って記録した。２８日目にマウスを殺し、解剖して肺組織を摘出し、４％中性ホルマリンに入れ固定し、アルコールで段階的に脱水し、キシレンで透明化させ、ワックスで浸漬し、パラフィンで包埋させた後、常法で切片し、Ｍａｓｓｏｎ染色を行い、肺組織の形態、肺損傷及び肺線維化の程度を観察した。
【００８９】
すべてのデータは平均数±ＳＤ（ｘ±ｓ）で示される。ＳＰＳＳ１１．５統計ソフトウェアを用いて処理し、統計には一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用し、Ｐ＜０．０５は統計的に有意な差を示す。
【００９０】
３．２  実験結果
【００９１】
３．２．１  モグロールによる肺線維症モデルマウスの体重への影響
【００９２】
空白対照群に比較して、モグロール高、低用量群及び陽性薬物（酢酸プレドニゾン）群の体重はいずれも明らかに増加し。モグロールは、程度が異なるが、５０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの用量でブレオマイシン誘発の肺線維症マウスの体質を改善し、肺線維症モデルのマウス体重減少程度を低減することが示されている（図９参照）。
【００９３】
３．２．２  モグロールによるモデルマウスの気管支肺胞洗浄液における白血球の数への影響
【００９４】
ブレオマイシンで誘発されたマウス肺組織損傷では、白血球の数が増加し、特に好中球が浸潤し、肺胞の炎症を引き起こし、炎症細胞は炎症メディエーターＮＯ、ＴＮＦ−α等及び様々なサイトカインを放出し、肺組織の損傷を深刻化させる一方、様々な成長因子を介してコラーゲン生成の過度の増加を促進した。本実験はキットの取り扱いに従って正確に実施されており、１４日目の各群のマウスの気管支肺胞洗浄液における白血球の数を比色法で測定した（結果は表３参照）。空白対照群に比較して、ブレオマイシン誘発後のモデル群のマウス洗浄液における細胞総数と好中球の数は共に明らかに増えた（空白対照群に比較して、＃＃Ｐ＜０．０１）。モグロール（５０ｍｇ／ｋｇ）処理後、肺胞洗浄液における細胞総数と好中球の数は、単独投与モデル群よりも明らかに低下した（モデル群に比較して、＊Ｐ＜０．０５）。モグロールはＢＬＭ誘発炎症細胞の浸出を減らすことが明らかなになった。
【００９５】
表３  ブレオマイシン誘発後のマウスの気管支肺胞洗浄液における細胞総数及び好中球の数への影響（×１０４、ｎ＝５）
2019500375.tif 000014
【００９６】
３．２．３  モグロールによるモデルマウスの肺組織への影響
【００９７】
空白対照群マウスの肺組織に、細胞外マトリックスの主成分である、青色に染色された少量のコラーゲン線維は観察された。モデル群のマウスは、肺胞構造が破壊され、肺胞中隔が広くなり、大量のコラーゲンが沈着し、肺線維症が形成し、Ｍａｓｓｏｎ染色をしたところ、青色に染色された大量の緻密なコラーゲン線維が束状又は片状として沈着し、基本的に肺線維症の特徴と一致し、それにより、実験マウスの肺線維症モデルの製造に成功したことが示される。モグロール高、低用量（５０、２０ｍｇ／ｋｇ）で治療した後、マウスの肺組織は、構造が完全で明瞭であり、肺胞中隔に僅かな肥厚が見られ、線維芽細胞の増殖の程度はモデル群よりも低かった。各投与群は、モデル群に比較して、線維症の程度が緩和した（図１０参照）。
【００９８】
３．２．５、討論
【００９９】
モデル群に比較して、モグロール高、低用量群は、肺インデックスを大幅に減らし、病理学的結果から分かるように、モグロール薬物群では、肺組織の構造が明らかに改善された。空白対照群に比較して、モデル群のマウスの肺胞洗浄液における好中球の数は明らかに増加し、このことから、モデル群では、ブレオマイシンは炎症反応を引き起こし、インビボ炎症カスケードを開始させることが示されている。薬物投与後、マウスの炎症及び線維症程度は、程度が異なるが、軽減することから、薬物は、肺細胞を損傷から守って肺線維症を予防・治療することが示されている。モグロールは、ククルビタン型四環系トリテルペノイド類化合物のアグリコンとして、このような化合物の構造骨格における同一母核を有し、インビボ実験の結果から明らかなように、モグロールは、ブレオマイシンマウス肺線維症モデルの肺線維化の程度を改善し、それによって、このような成分の肺線維症の予防又は治療薬の製造における新用途が期待できる。
【図１】
2019500375.tif 000020
【図２】
2019500375.tif 000021
【図３】
2019500375.tif 000022
【図４】
2019500375.tif 000023
【図５】
2019500375.tif 000024
【図６】
2019500375.tif 000025
【図７】
2019500375.tif 000026
【図８】
2019500375.tif 000027
【図９】
2019500375.tif 000028
【図１０】
2019500375.tif 000029
【国際調査報告】
2019500375.tif 000030
2019500375.tif 000031
2019500375.tif 000032
2019500375.tif 000033