(57)【要約】  本発明は、分化細胞にＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＨｎｆ４ａおよび／またはＥｍｘ２を過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化細胞にＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法。
【請求項２】
前記分化細胞にＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａを過剰発現させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分化細胞にＥｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分化細胞にＨｎｆ４ａ、Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記分化細胞にＥｍｘ２、Ｈｎｆ４ａ、Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記腎細胞が腎尿細管細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記腎細胞が腎尿細管上皮細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分化細胞が線維芽細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記線維芽細胞が胚性線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞が成体線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記分化細胞が、腎臓を冒す障害に関連する遺伝子の改変を有する非ヒト動物から採取されたものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子がＰｋｄ１またはＰｋｄ２である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記過剰発現させることが、（ａ）Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａをコードする１つまたは複数の核酸を準備することと、（ｂ）前記１つまたは複数の核酸を前記分化細胞に導入して形質導入細胞またはトランスフェクト細胞を得ることと、（ｃ）前記形質導入細胞またはトランスフェクト細胞をＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａの過剰発現が可能な条件下で培養することとを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の核酸が、Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａ、Ｐａｘ８またはその組合せをコードし前記コードされた遺伝子の過剰発現の誘導することが可能なプロモーターと作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む、プラスミドまたはベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｅｍｘ２が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｈｎｆ１ｂが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｈｎｆ４ａが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｐａｘ８が、配列番号４で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記分化細胞または前記腎細胞の腎臓を冒す障害に関連する少なくとも１つの遺伝子を改変することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記改変することが、前記腎臓を冒す障害に関連する遺伝子を破壊することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子がＰｋｄ１またはＰｋｄ２である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法によって得られる、腎細胞。
【請求項２６】
腎臓を冒す障害に関連する少なくとも１つの遺伝子に改変を有する、請求項２５に記載の腎細胞。
【請求項２７】
前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、請求項２６に記載の腎細胞。
【請求項２８】
前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、請求項２６または２７に記載の腎細胞。
【請求項２９】
前記遺伝子がＰｋｄ１またはＰｋｄ２である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の腎細胞。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれか１項の腎細胞の腎毒性試験、薬理学的スクリーニングまたは疾患モデル化への使用。
【請求項３１】
前記疾患モデル化が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される腎臓を冒す障害のモデル化を含む、請求項３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
末期腎疾患は米国の主要な公衆衛生上の負担の１つであり、１年間の新たな症例の発生数は１００，０００例増大している１。このため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腎細胞作製が腎疾患に関連する研究および再生医療の主要な課題となっている。
【０００２】
多能性細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで腎細胞の運命に方向付ける研究がいくつかある。定められた成長因子カクテルまたは化学的化合物の存在下で培養した胚性幹細胞または誘導多能性細胞（ｉＰＳＣ）は腎細胞の特徴を獲得した２〜６。これらの多段階のプロトコルは腎臓の胚分化の経路を再現することを目的としたものであり３、６、分節化したネフロンが含まれ２、４、内皮細胞および腎間質に取り囲まれた５自己組織化腎臓様オルガノイドを生じた。これと異なる方法では、近位尿細管細胞系の無細胞抽出物によって骨髄由来間葉系幹細胞の条件を整え、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで尿細管様細胞を形成させている７。しかし、上記の方法はいずれも、多能性または多分化能性の幹細胞集団が入手可能であるかどうかに左右され、複雑な分化プロトコルが含まれる。さらに、ヒトＥＳＣを使用すれば倫理的な問題が発生し、ｉＰＳＣ由来細胞は現時点で、腫瘍原性リスクによりその臨床使用が制限されている８。
【０００３】
直接的な再プログラミングはｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の細胞型を作製する代替法の１つである９。線維芽細胞などの分化細胞を定められた転写因子により再プログラムし、多能性段階を迂回して臓器特異的細胞型にすることができる。線維芽細胞はニューロン１０、オリゴデンドロサイト１１、１２、心筋細胞１３、肝細胞１４〜１６またはセルトリ細胞１７に直接プログラムされたことはあるが、腎細胞型には未だプログラムされたことはない。これまで、６つの転写因子、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ２、Ｏｓｒ１、Ｅｙａ１、Ｈｏｘａ１１、Ｓｎａｉ２の発現にバルプロ酸処理を組み合わせることにより、近位尿細管細胞系を前駆細胞段階への脱分化が誘導されている１８。しかし、この方法には生きた腎尿細管が必要であり、このため、腎疾患の大部分の臨床状況でのその使用は制限されている。線維芽細胞の成熟腎細胞型への直接的な再プログラミングはこれまでに報告されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ある特定の組合せで胚性線維芽細胞および成体線維芽細胞を誘導腎尿細管上皮細胞に変換する４つの転写因子、つまりＥｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａおよびＰａｘ８を特定し、この誘導腎尿細管上皮細胞をｉＲＥＣと命名した。再プログラムされたｉＲＥＣは、ｍＲＮＡ発現プロファイルが初代尿細管細胞と類似しており、腎尿細管上皮の形態学的特徴および機能的特徴を示す。これらは、脱細胞化した腎足場において腎オルガノイドに統合され、尿細管構造を形成する。
【０００５】
したがって、本発明は以下の実施形態（１）〜（３３）に関する：
（１）分化細胞にＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法。
（２）前記分化細胞にＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａを過剰発現させることをさらに含む、項（１）の方法。
（３）前記分化細胞にＥｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、項（１）または（２）の方法。
（４）前記分化細胞にＨｎｆ４ａ、Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、項（１）または（２）の方法。
（５）前記分化細胞にＥｍｘ２、Ｈｎｆ４ａ、Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８を過剰発現させることを含む、項（１）〜（４）のいずれか１項の方法。
（６）腎細胞が腎尿細管細胞である、項（１）〜（５）のいずれか１項の方法。
（７）腎細胞が腎尿細管上皮細胞である、項（１）〜（５）のいずれか１項の方法。
（８）分化細胞が哺乳動物細胞である、項（１）〜（７）のいずれか１項の方法。
（９）分化細胞がヒト細胞である、項（１）〜（８）のいずれか１項の方法。
（１０）分化細胞が線維芽細胞である、項（１）〜（９）のいずれか１項の方法。
（１１）線維芽細胞が胚性線維芽細胞である、項（１０）の方法。
（１２）線維芽細胞が成体線維芽細胞である、項（１０）の方法。
（１３）分化細胞が、腎臓を冒す障害に関連する遺伝子の改変を有する非ヒト動物から採取されたものである、項（１）〜（１２）のいずれか１項の方法。
（１４）前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、項（１３）の方法。
（１５）前記遺伝子がＰｋｄ１またはＰｋｄ２である、項（１３）または（１４）の方法。
（１６）前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、項（１３）〜（１５）のいずれか１項の方法。
（１７）前記過剰発現させることが、（ａ）Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａをコードする１つまたは複数の核酸を準備することと、（ｂ）前記１つまたは複数の核酸を分化細胞に導入して形質導入細胞またはトランスフェクト細胞を得ることと、（ｃ）前記形質導入細胞またはトランスフェクト細胞をＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａの過剰発現が可能な条件下で培養することとを含む、項（１）〜（１６）のいずれか１項の方法。
（１８）前記１つまたは複数の核酸が、Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａ、Ｐａｘ８またはその組合せをコードしそのコードされた遺伝子の過剰発現の誘導することが可能なプロモーターと作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む、プラスミドまたはベクターである、項（１７）の方法。
（１９）前記Ｅｍｘ２が、配列番号１で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項（１）〜（１８）のいずれか１項の方法。
（２０）前記Ｈｎｆ１ｂが、配列番号２で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項（１）〜（１９）のいずれか１項の方法。
（２１）前記Ｈｎｆ４ａが、配列番号３で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項（１）〜（２０）のいずれか１項の方法。
（２２）前記Ｐａｘ８が、配列番号４で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項（１）〜（２１）のいずれか１項の方法。
（２３）前記分化細胞または前記腎細胞の腎臓を冒す障害に関連する少なくとも１つの遺伝子を改変することをさらに含む、項（１）〜（２２）のいずれか１項の方法。
（２４）前記改変することが、前記腎臓を冒す障害に関連する遺伝子を破壊することを含む、項（２３）の方法。
（２５）前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、項（２３）または（２４）の方法。
（２６）前記遺伝子がＰｋｄ１またはＰｋｄ２である、項（２３）〜（２５）のいずれか１項の方法。
（２７）項（１）〜（２６）のいずれか１項の方法によって得られる、腎細胞。
（２８）腎臓を冒す障害に関連する少なくとも１つの遺伝子に改変を有する、項（２７）の腎細胞。
（２９）前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、項（２８）の腎細胞。
（３０）前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、項（２８）または（２９）の腎細胞。
（３１）前記遺伝子がＰｋｄ１またはＰｋｄ２である、項（２８）〜（３０）のいずれか１項の腎細胞。
（３２）項（２７）〜（３１）のいずれか１項の腎細胞の腎毒性試験、薬理学的スクリーニングまたは疾患モデル化への使用。
（３３）前記疾患モデル化が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ）などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、ＣＡＫＵＴ、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される腎臓を冒す障害のモデル化を含む、項（３２）の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】体系的な選択基準により候補再プログラミング因子が特定されることを示す図である。（ａ）腎臓再プログラミング因子を特定するのに用いた戦略および基準の模式図。ＴＦ：転写因子。（ｂ）肝臓、脳および腎臓組織の転写因子の絶対発現レベルおよび相対発現レベルを示す散布図２３。肝細胞およびニューロンへの再プログラミングに使用して成功を収めた因子が赤色で強調されている。破線は、絶対発現量の第５０百分位数および相対発現量の第９５百分位数のレベルを表す。赤い四角で囲まれた領域には腎細胞型に対する５５の候補再プログラミング因子が含まれている。（ｃ）Ｅ１４マウス腎臓切片および段階２６のＸｅｎｏｐｕｓのホールマウント胚標本での示される遺伝子に関するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの代表的な画像。図８〜９には画像一式が含まれている。スケールバーは５００μｍである（ｃ）。
【図２】４つの転写因子によりマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に腎細胞運命を誘導することが可能であることを示す図である。（ａ）腎臓再プログラミング因子を特定するのに用いた実験手順の模式図。成体ＫＳＰ−Ｃｒｅ；ｍＴＯＭ／ｍＧＦＰレポーターマウスの腎臓切片は、腎尿細管に膜ＧＦＰ発現（ｍＧＦＰ）および残りの組織に膜トマト赤の蛍光（ｍＴＯＭ）を示す。（ｂ）レポーターマウスの四肢に由来するＭＥＦを未処理で放置する（０因子）か、または１３の転写因子のプールを形質導入し（１３ＴＦ）、ウイルスによる形質導入から７日後、ＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞の有無をフローサイトメトリー（ＦＣ）により解析した。共焦点像は、ＧＦＰ＋細胞（緑）、ｍＴＯＭ＋細胞（赤）およびヘキストによる核染色（青）を示している。（ｃ）様々な１３ＴＦ−１の組合せでのＧＦＰ＋細胞の割合をＦＣにより評価した；０ＴＦ：未処理ＭＥＦ；ＣＦＰ：シアン蛍光タンパク質。破線は１３のＴＦのプールのＧＦＰ＋細胞の割合の平均値を示している。（ｄ）様々な８ＴＦ−１の組合せでのＧＦＰ＋細胞の割合をＦＣにより評価したもの。（ｅ）４つのＴＦ（Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａ、Ｐａｘ８）のプールを形質導入したＧＦＰ＋細胞のＦＣ解析および代表的な共焦点像。（ｆ）４つのＴＦ、３つのＴＦの組合せまたは単一の因子を過剰発現するＭＥＦのＧＦＰ＋細胞のＦＣ解析。（ｇ）４ＴＦ処理細胞の培養３１日後のＦＣ解析および代表的な共焦点像。（ｈ）ＭＥＦにおけるレンチウイルス感染から１週間後の再プログラミング効率。ＬＶ：低ウイルス濃度；ＨＶ：高ウイルス濃度；ＭＣ：多シストロン性ベクター；ＣＨＩＲ：ＣＨＩＲ９９０２１；ＶＩＴＣ：ビタミンＣ；ＶＡ：バルプロ酸；ＡＺＡ：５−アザシチジン；ＦＯＲＳ：フォルスコリン。破線は４ＴＦ  ＨＶ処理細胞のＧＦＰ＋細胞の割合の平均値を示している。エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）、アスタリスクは、スチューデントの対応のないｔ検定により評価した陽性対照（１３ＴＦ（ｃ）、８ＴＦ（ｄ）、４ＴＦ（ｆ）および４ＴＦ  ＨＶ（ｈ））に対する有意差を表し、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５であり、スケールバーは１００μｍである（ａ、ｂ、ｅ、ｇ）。
【図３】ｉＲＥＣに上皮の特性がみられることを示す図である。（ａ）ｉＲＥＣおよびＭＥＦの位相差像はそれぞれ上皮および間葉細胞の形態を示している。（ｂ）ｉＲＥＣおよびＭＥＦのコロニー形成をクリスタルバイオレット染色により評価した；培養２週間後にＭＥＦおよびｉＲＥＣにより形成されたコロニーの定量化。（ｃ）微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）像および共焦点像：直交図（右上パネル）および共焦点ｚスタックの３Ｄ再構築（右下パネル）で観察されるように、密に播種したｉＲＥＣにはドーム形成がみられる；密に播種したｉＲＥＣの１ｍｍ２当たりのドームの定量化。（ｄ）未処理ＭＥＦおよび４ＴＦ処理ＭＥＦにおいてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された示される遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現レベル。（ｅ）ｉＲＥＣおよびＭＥＦの上皮マーカータンパク質（ＺＯ−１、Ｅカドヘリン、Ｅｐｃａｍ）および間葉マーカータンパク質（ビメンチン）の免疫蛍光染色。エラーバーはＳＥＭであり、有意差はスチューデントの対応のないｔ検定により評価したものであり、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５である。スケールバーは５０μｍ（ａ、ｅ）、１ｃｍ（ｂ）、１００μｍ（ｃ）である。
【図４】ｉＲＥＣの遺伝子発現パターン全体が初代腎上皮細胞に類似していることを示す図である。（ａ）ＭＥＦ、ｉＲＥＣおよびＫｓｐ−Ｃｒｅ；ｍＴＯＭ／ｍＧＦＰ腎からＧＦＰに関する細胞分取により単離したレポーター陽性初代ＲＥＣ（各グループともｎ＝４）の遺伝子発現プロファイルを比較したｃＤＮＡマイクロアレイデータの階層的クラスタリングおよびヒートマップ画像。青色はダウンレギュレーションを表し、赤色はアップレギュレーションを表す。ＭＥＦの１．５倍アップレギュレート／ダウンレギュレートされたｉＲＥＣの遺伝子についてクラスタリングを実施した（ｐ＜０．０００５）。（ｂ）ＣｅｌｌＮｅｔで作成したヒートマップであり、各行は、示される細胞型または組織を表し、各列は、独立して再プログラムした３つのｉＲＥＣ培養物のうちの１つを表す。分類スコアを代表する値が（黒〜緑に）色分けされている。（ｃ）ＣｅｌｌＮｅｔによって決定され既に公開されている直接再プログラムされた細胞型およびｉＲＥＣの分類スコア３４。（ｄ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定したＭＥＦ、ｉＲＥＣおよび全腎ライセートの腎マーカー遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現レベル。有意差はスチューデントの対応のないｔ検定により評価したものであり、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５である；エラーバーはＳＥＭである。（ｅ）ｉＲＥＣ再プログラミング因子（黄色の丸）の予測標的遺伝子の転写回路網。青色はダウンレギュレーションを表し、赤色はアップレギュレーションを表す。（ｆ）ｉＲＥＣおよびＭＥＦの示される腎尿細管タンパク質の免疫蛍光染色。（ｇ）ｉＲＥＣのネフロン分節限定発現を示すタンパク質に関する免疫染色（左パネル）および様々なネフロン分節に沿った発現パターンを示す表（右パネル）３９である；Ｓ１は近位尿細管の第一分節であり；Ｓ２は近位尿細管の第二分節であり；Ｓ３は近位尿細管の第三分節であり；ＳＤＬはヘンレ係蹄の短い下行脚であり；ＬＤＬＯＭは髄質外層のヘンレ係蹄の長い下行脚であり；ＬＤＬＩＭは髄質内層のヘンレ係蹄の長い下行脚であり；ｔＡＬはヘンレ係蹄の細い上行脚であり；ｍＴＡＬは髄質にあるヘンレ係蹄の太い上行脚であり；ｃＴＡＬは皮質にあるヘンレ係蹄の太い上行脚であり；ＤＣＴは遠位曲尿細管であり；ＣＮＴは結合尿細管であり；ＣＣＤは皮質集合管であり；ＯＭＣＤは髄質外層集合管であり；ＩＭＣＤは髄質内層集合管である。（ｈ）４ＴＦ再プログラミング混合物からＨｎｆ４ａを除いた後に差次的にアップレギュレートされた遺伝子のＲＮＡ−Ｓｅｑ発現解析（０ＴＦ対４ＴＦ、未分取）。Ｘ軸：近位から遠位までの発現パターンに従って順位を付けた遺伝子。Ｙ軸：３ＴＦ（Ｈｎｆ４ａを除いたもの）処理細胞と４ＴＦ処理細胞のｌｏｇ２  ＲＰＭ発現の差。スケールバーは５０μｍである（ｆ、ｇ）。
【図５】ｉＲＥＣに腎尿細管上皮細胞の機能的特性がみられることを示す図である。（ａ）３ＤＭａｔｒｉｇｅｌで増殖させたＭＥＦおよびｉＲＥＣの微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）像。（ｂ）３ＤＭａｔｒｉｇｅｌで増殖させてトマト赤（ＴＯＭ）を発現したＭＥＦおよびＧＦＰを発現したｉＲＥＣの共焦点生細胞像。核をヘキストで染色した。（ｃ）内腔形成の定量化（％）、３Ｄ構造物の最大直径（μｍ）および播種した細胞１００個当たりの球体の数；ｎ．ｄ．＝検出不可能。（ｄ）３ＤＭａｔｒｉｇｅｌで増殖させたｉＲＥＣおよびＭＥＦの示されるタンパク質に関する免疫染色。核をヘキストで染色した。代表的な共焦点像は球体の最大直径の平面を示している。（ｅ）３ＤＭａｔｒｉｇｅｌで増殖させたｉＲＥＣの透過型電子顕微鏡像。ＴＪ：タイトジャンクション；Ｍ：微絨毛；ＢＭＬ：基底膜様マトリックス；Ｎ：核。（ｆ）示される時間の間ａｌｅｘａ−６４７標識アルブミンとインキュベートしたＭＥＦおよびｉＲＥＣの代表的な画像。（ｇ）ＭＥＦおよびｉＲＥＣの６０分間にわたるアルブミン取込みの経時的定量化。（ｈ）シスプラチン（６μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）もしくはタクロリムス（４０μＭ）で処理したＭＥＦおよびｉＲＥＣまたは未処理対照のアポトーシス細胞の定量化（％）。（ｉ）ゲンタマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）処理後のフローサイトメトリーによるＫＩＭ−１＋ＭＥＦおよびＫＩＭ−１＋ｉＲＥＣの解析。（ｊ）未処理のＭＥＦおよびｉＲＥＣ、シスプラチン単独またはシスプラチンとシメチジンで処理したＭＥＦおよびｉＲＥＣのアポトーシス細胞の割合。エラーバー：ＳＥＭ、スチューデントの対応のないｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５；スケールバーは５０μｍ（ａ、ｂ、ｄ、ｆ）、５００ｎｍ（ｅ）である。
【図６】ｉＲＥＣが再集合腎オルガノイドに統合され、脱細胞化された腎臓を再配置させることを示す図である。（ａ）再集合アッセイの模式図。ＧＦＰ＋ｉＲＥＣおよびＥ１３  ＴＯＭ＋腎をトリプシンで消化して１：１０の比で混合し、気相液相界面培養で増殖させた。（ｂ）ＫＳＰ−Ｃｒｅ  ＧＦＰ＋ｉＲＥＣまたはＧＦＰ形質導入対照ＭＥＦとともに再集合させた腎オルガノイドの共焦点ライブイメージング。白い四角で囲った領域が右パネルに拡大されて示されている。（ｃ）ＭＥＦまたはｉＲＥＣとともに再集合させた腎オルガノイドの示されるタンパク質に関する免疫染色。（ｄ）ラミニンを染色した後の再集合体全体のタイルスキャン共焦点像および白い四角で囲った領域の拡大図。（ｅ）ラミニンで染色された再集合尿細管の基底膜の内側または外側で検出されたＧＦＰ＋ｉＲＥＣおよびＧＦＰ＋ＭＥＦの定量化。エラーバー：ＳＥＭ、スチューデントの対応のないｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１。（ｆ）再配置アッセイの模式図。野生型腎を１％ＳＤＳで脱細胞化し、ｉＲＥＣｓを注入した；ＫＳＰ−Ｃｒｅ  ＧＦＰ＋ｉＲＥＣとともに再配置させＥカドヘリンの免疫染色を実施した脱細胞化腎の共焦点像および３Ｄ再構築。核をヘキストで染色した。ＥＣＭ：細胞外マトリックス、ＭＩＰ：共焦点ｚスタックの最大強度投影。スケールバーは５０μｍ（ｂ、ｃ、ｆ）、２００μｍ（ｄ）である。
【図７】ヒト線維芽細胞の再プログラミングを示す図である。（ａ）未処理ヒト線維芽細胞および４ＴＦ処理ヒト線維芽細胞の位相差像および示されるタンパク質の免疫染色。（ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した示される遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現レベル。有意差はスチューデントの対応のないｔ検定により評価したものであり、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５である；エラーバー：ＳＥＭ。（ｃ）３ＤＭａｔｒｉｇｅｌで培養した未処理ヒト線維芽細胞およびヒト誘導腎上皮細胞（ｈ−ｉＲＥＣ）。共焦点ｚスタックの最大強度投射が示されている。（ｄ）Ｍａｔｒｉｇｅｌで増殖したｈ−ｉＲＥＣ球体をアクチン（ファロイジン）およびβ−カテニンで染色したもの。（ｅ）フローサイトメトリーにより測定した４ＴＦとＳＶ４０またはＳＶ４０単独で処理した後のＰＲＯＭ１＋／ＥＰＣＡＭ＋二重陽性ヒト線維芽細胞の割合（上パネル）およびＣＤＨ１６−ＧＦＰ＋細胞の割合（下パネル）。（ｆ）ヒト線維芽細胞（０ＴＦ）、ＣＨ１６−ＧＦＰ＋分取ｈ−ｉＲＥＣ（４ＴＦ）およびヒト腎臓のＲＮＡ−Ｓｅｑ発現解析のヒートマップ。差次的に調節された遺伝子（０ＴＦ対４つのＴＦ、ｐ＜０．０００１）を階層的にクラスター化した。各クラスターの遺伝子数が右側に示されている（ピアソンの相関係数０．７）。スケールバーは５０μｍ（ａ）、１００μｍ（ｃ）、２０μｍ（ｄ）である。
【図８】既知の再プログラミング因子の定量的発現データにおける分布を示す図である。（ａ）脳、肝臓、心臓、精巣、胸腺および筋組織における転写因子（ＴＦ）の絶対発現レベルおよび相対発現レベルを示す散布図。示される細胞型（青色）への再プログラミングに使用して成功を収めたＴＦが赤色で強調されている。破線は、絶対発現量の第５０百分位数および相対発現量の第９５百分位数のレベルを表す。ＴＦの組合せは、下に参考文献として挙げられている研究によるものである。（ｂ）Ｘｅｎｏｐｕｓのホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験のまとめ：段階３８の空間的発現パターン。白色、灰色および黒色の四角は、Ｘｅｎｏｐｕｓ前腎の様々な分節内での検出不可能な遺伝子発現、弱い遺伝子発現および強い遺伝子発現を表す。ＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３：近位尿細管分節１、２および３。ＩＴ１、ＩＴ２：中間尿細管分節１および２。ＤＴ１、ＤＴ２：遠位尿細管分節１および２。ＣＴ：結合尿細管（左パネル）。Ｘｅｎｏｐｕｓ発生の段階２２、２６、３３および３８における時間的発現パターン（右パネル）。（ｃ）Ｅ１２〜Ｅ１７のマウス胚腎臓における転写因子発現のまとめ。Ｅ１２〜Ｅ１７の胚腎臓の連続切片を作成し、示される遺伝子をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した。腎原基内での空間的発現パターンを求め、Ｅ１２の尿管芽（ｕｂ）および後腎間葉（ｍｍ）ならびにＥ１３〜Ｅ１７の腎間葉（ｎｍ）、基質／間質（ｓｔｒ）、腎小胞／糸球体（ｒｖ／ｇ）および尿細管上皮（ｔｅ）内での発現について切片を解析した。
【図９】Ｘｅｎｏｐｕｓ胚における候補再プログラミング因子のホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す図である。示される遺伝子のホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）。段階２２、２６、３３および３８のＸｅｎｏｐｕｓ胚にＷＩＳＨを実施した。拡大図は前腎領域を示している。スケールバーは５００μｍである。
【図１０】マウスの腎臓発生過程での候補再プログラミング転写因子の発現を示す図である。様々な転写因子の発現の間での比較性が増大するように同じ胚の連続切片を用いた、Ｅ１２〜Ｅ１７のマウス腎原基および胚腎臓のパラフィン切片でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、示される２０の転写因子のｍＲＮＡ発現を可視化した。スケールバーは２００μｍ（Ｅ１２、Ｅ１３）、５００μｍ（Ｅ１４〜Ｅ１７）である。
【図１１】ｉＲＥＣは多シストロン性レンチウイルスベクターにより誘導することが可能であり、成体尾端線維芽細胞から作製することが可能であることを示す図である。（ａ）フローサイトメトリー（ＦＣ）のゲート設定に用いた膜−トマト赤マウス（ＴＯＭ  ＣＴＬ）および膜−ＧＦＰマウス（ＧＦＰ  ＣＴＬ）から得た対照ＭＥＦのＦＣ解析。ＭＩＸ  ＣＴＬ：膜−トマト赤ＭＥＦと膜−ＧＦＰ  ＭＥＦの混合物。（ｂ）２Ａペプチド配列により隔てられた４つの再プログラミング因子（Ｐａｘ８、Ｈｎｆ１ｂ、Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ４ａ）を示す多シストロン性構築物のベクターマップ。レンチウイルスの骨格としてｐＷＰＸＬｄを用いた。（ｃ）２Ａコンセンサスペプチドモチーフに対する抗体を用いて２Ａタグ化ＴＦの発現を制御した。ＧＦＰトランスフェクト細胞を対照とした。（ｄ）多シストロン性ベクターを保有するレンチウイルスで処理したＫＳＰ−ＣｒｅレポーターＭＥＦの培養３９日後のＧＦＰ＋細胞のＦＣ解析。（ｅ）４ＴＦ（Ｐａｘ８、Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ４ａおよびＨｎｆ１ｂ）を有する高力価レンチウイルス感染から１週間後および５週間後のＭＥＦ、若齢ＴＴＦ（Ｐ７）および成体ＴＴＦ（Ｐ６０）におけるＧＦＰ＋細胞の有無に関するＦＣ解析；代表的なＦＣプロットが示されており、ＧＦＰ＋細胞の割合が各実験の標準誤差とともに示されている。（ｆ）０ＴＦまたは４ＴＦで処理した成体ＴＴＦの示されるタンパク質に対する免疫染色。スケールバーは５０μｍ（ｆ）である。
【図１２】ｉＲＥＣのトランスクリプトーム解析を示す図である。（ａ）ヒト（左の図表）およびマウス（中央および右の図表）のｉＲＥＣでＭＥＦまたは初代ＲＥＣの１０倍アップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子の遺伝子発現プロファイル全体のＲＰＫＭ（マップしたリード１００万個当たりの１キロベース当たりのリード）中央値３０、３１。エラーバー：分位範囲。（ｂ）腎尿細管分節において差次的に調節された示される遺伝子の遺伝子発現全体のＲＰＫＭ中央値３９。エラーバー：分位範囲。（ｃ）ｉＲＥＣでＭＥＦの１０倍アップレギュレートされた遺伝子の遺伝子オントロジーターム解析。
【図１３】ｉＲＥＣの分節アイデンティティおよび安定性を示す図である。（ａ）未処理ＭＥＦおよび４ＴＦ処理ＭＥＦの感染後第１日、第８日および第２９日における前駆細胞および分化マーカーのｑＰＣＲ経時解析。胚および成体の腎臓を対照とした。（ｂ）ＭＥＦ、ｉＲＥＣおよびＩＭＣＤ−３細胞のＧＦＰとＥＰＣＡＭ、ＡＱＰ１およびＡＴＰ１Ａ１の発現を解析したＦＣ。各象限内にある細胞の割合が記載されている。（ｃ）分節限定発現を示すタンパク質に関してＦＣにより検出したｉＲＥＣの共免疫染色。ＬＴＬ（ロータス・テトラゴノロブス（Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ））染色により近位尿細管細胞を検出した。（ｄ）顕微解剖した成体ラット尿細管分節における１３の候補再プログラミング因子の発現レベル３９。（ｅ）Ｈｎｆ４ａまたはＥｍｘ２により調節される遺伝子に関するＲＮＡシーケンシングに基づく発現解析。左パネルは、４ＴＦ処理ＭＥＦで未処理ＭＥＦに比して少なくとも１ｌｏｇ２変化（反復セットの統計、ｐ＜０．０００１）だけ差次的にアップレギュレートされた遺伝子および３因子のみ（Ｅｍｘ２またはＨｎｆ４ａを除いたもの）で処理したＭＥＦにおいて差次的にアップレギュレートされた遺伝子の発現強度ヒートマップを示している。右パネルは、尿細管分節における同遺伝子の発現のヒートマップを示している３９。両ヒートマップとも、近位分節Ｓ１〜Ｓ３（上）と集合管組織（下）の間の発現の差の中央値に従って遺伝子が分類されている。（ｆ）外因性再プログラミング因子を検出したｑＲＴ−ＰＣＲ解析。ｉＲＥＣ  ＥＸ：ＣＲＥ発現後に外因性再プログラミング因子を除去するためＬｏｘＰを含むプロウイルスを用いて作製したもの。ｉＲＥＣ：構成的発現のためｌｏｘＰ部位を含まないプロウイルスを用いて作製したもの。（ｇ）ｉＲＥＣおよびｉＲＥＣ  ＥＸの示されるタンパク質に対する免疫染色。（ｈ）ＭＥＦおよびｉＲＥＣ  ＥＸでｑＲＴ−ＰＣＲにより求めた示される遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル。（ｉ）１０代（Ｐ１０）、２０代（Ｐ２０）および４０代（Ｐ４０）継代後のＫｉ−６７陽性ｉＲＥＣおよびＫｉ−６７陽性ＭＥＦの相対的割合。異なる文字は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くチューキーの事後検定（ｐ＜０．０５）により評価した有意差を表す。（ｊ）Ｐ２０およびＰ４０のｉＲＥＣおよびＭＥＦでｑＰＣＲにより求めたｐ１６  ｍＲＮＡの相対レベル。ｎｓはスチューデントのｔ検定で有意ではないことを表す。（ｋ）培養１か月後および３か月後のｉＲＥＣの腎臓分化マーカーのｑＰＣＲ解析。エラーバー：ＳＥＭ、スチューデントの対応のないｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１４】マウスｉＲＥＣでの細胞毒性試験ならびにヒトｉＲＥＣの誘導効率および特異性の改善を示す図である。（ａ）シスプラチンで処理したＭＥＦ（赤線）およびｉＲＥＣ（黒線）または未処理対照のアポトーシス細胞の定量化（％）。エラーバー：ＳＥＭ、スチューデントの対応のないｔ検定、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。（ｂ）ゲンタマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）で処理したｉＲＥＣおよびＭＥＦにおけるＫＩＭ１発現のＦＣ解析。（ｃ）４ＴＦ処理後にＦＣにより求めたマウス線維芽細胞およびヒト線維芽細胞のＴＨＹ−１−細胞またはＥＰＣＡＭ＋細胞の割合。（ｄ）ＳＶ４０（ラージＴ抗原）、４ＴＦまたはＳＶ４０と４ＴＦで処理した後にフローサイトメトリーにより求めたＴＨＹ−１−ヒト線維芽細胞およびＥＰＣＡＭ＋ヒト線維芽細胞の割合。（ｅ）４つのＴＦで処理した後にフローサイトメトリーにより求めたＣＤＨ１６−ＧＦＰ＋レポーターマウス線維芽細胞およびヒト線維芽細胞の割合。線維芽細胞にＣＤＨ１６−ＧＦＰレポータープラスミドおよびＳＶ４０を形質導入し、レポーターが安定に組み込まれたＧＦＰ−細胞を選択し、４つのＴＦを感染させた。
【図１５】再プログラミングにはＨｎｆ１ｂとＰａｘ８の過剰発現で十分であることを示す図である。Ｐａｘ８およびＨｎｆ１ｂのみを過剰発現させた以外は図２ｂについて記載した通りに実験を実施した。培養３週間後にＫｓｐ−Ｃｒｅ陽性細胞を検出した。
【図１６】（ａ）Ｐｄｋ１ｆｌ／ｆｌマウスから単離したＭＥＦを４つのＴＦの発現によりｉＲＥＣに再プログラムした。単一細胞の分取後に得たクローン（レーン１〜３）および未分取細胞集団（レーン４、５）をｌｏｘＰが導入された対立遺伝子を切除するためのＣｒｅまたはフリッパーゼで処理するか、または処理せずに対照とした。例としてクローン７の代表的なゲル画像が示されている。未分取集団をピューロマイシンで処理して、Ｃｒｅ発現細胞を選択した。下のバンドは切除された対立遺伝子（Ｐｋｄ１−／−）を表し、上のバンドは野生型対立遺伝子である。（ｂ）フリッパーゼまたはＣｒｅで処理しクローン性に拡大したｉＲＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌ内に播種し、１週間増殖させ、ファロイジン（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で染色した。画像は共焦点ｚスタックの最大強度投射である。（ｃ）Ｐｋｄ２の第一エキソンをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で標的化した後の野生型ｉＲＥＣのサンガーシーケンシングクロマトグラム。ＰＡＭ配列が黒い囲みで示されており、太字の配列はｓｇＲＮＡ標的である。注目すべきなのは、ＰＡＭのすぐ３’側にある予測切断部位のクロマトグラムがスクランブル状になっていることであり、これは未分取細胞集団でインデル形成が成功したことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
本発明は、分化細胞に少なくともＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａを過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法に関する。本発明の方法は、分化細胞でのＨｎｆ１ｂおよびＰａｘ８の過剰発現を必要とする。好ましくは、Ｈｎｆ１ｂ、Ｐａｘ８およびＨｎｆ４ａを過剰発現させる。より好ましくは、Ｈｎｆ１ｂ、Ｐａｘ８およびＥｍｘ２を過剰発現させる。最も好ましくは、Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｐａｘ８およびＨｎｆ４ａを過剰発現させる。
【０００８】
本明細書で使用される「分化細胞」という用語は、体細胞系に分化する過程にあるか、または最終分化した細胞を指す。例えば、胚細胞は、腸を裏打ちする上皮細胞に分化し得る。分化細胞は、例えば胎仔または生きた新生動物から単離され得る。
【０００９】
好ましくは、分化細胞は線維芽細胞である。その他の適切な分化細胞の型としては、単核食細胞系（ＭＰＳ）（＝レティキュロエノセリアル（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）系）およびその他の腎細胞型の細胞が挙げられる。
【００１０】
線維芽細胞
本明細書で使用される「線維芽細胞」という用語は、間葉起源の細胞を指す。線維芽細胞は結合組織にみられる。線維芽細胞はアクチン−ミオシンフィラメント、マトリックス要素（コラーゲン線維、細網線維線維および弾性線維）ならびにグリコサミノグリカンおよび糖タンパク質を合成し、これらは不定形の細胞間物質として分泌される。線維芽細胞としては、結合組織幹細胞、マトリックス合成細胞およびその他のタンパク質合成細胞、収縮性細胞および貪食細胞が挙げられる。活性な線維芽細胞は、多量に存在する小胞体（ＥＲ）、ゴルジ複合体およびリボソームを特徴とする。
【００１１】
線維芽細胞は胚形成過程で特に重要な役割を果たす。線維芽細胞は、タンパク質を合成する以外にも、骨格の構造、筋細胞の位置、神経線維の成長パターンおよび皮膚の組織化を決定する。線維芽細胞は、胚細胞に膠原原線維を付着させ、それを適切に整列させて、発生中の生物体の部分を形成することにより組織化機能を果たす。線維芽細胞はヒトの発生期の間および成人期全体を通じて、疎性結合組織および密性結合組織の両方を合成および維持し続ける。線維芽細胞は、リンホカイン、サイトカインおよび成長因子などのいくつかの化学誘引物質に応答して移動し、コラゲナーゼを含めた様々な分解酵素および合成酵素ならびにプロスタグランジン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、補体成分およびスーパーオキシドジスムターゼを含めた他の細胞の機能を調節し得る生成物を産生することにより、常に組織を再構築および修復する。線維芽細胞の重要性は、それが結合組織の主要な細胞外成分でありヒト体内に最も多量に存在するタンパク質であるコラーゲンを産生することに起因し得る。
【００１２】
線維芽細胞およびマトリックスタンパク質の生物学については、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ，第２版，Ｇａｌｌｉｎら（１９９２）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ  ７４７−７７３でＰｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅおよびＫａｎｇにより論じられている。
【００１３】
一実施形態では、線維芽細胞は胚性線維芽細胞である。本明細書で使用される「胚性」という用語は、線維芽細胞が採取される、すなわち線維芽細胞が胚から採取される胚齢、好ましくはＥ１１．５〜Ｅ１４．５の胚齢を指す。
【００１４】
別の実施形態では、線維芽細胞は成体線維芽細胞である。本明細書で使用される「成体」という用語は、線維芽細胞が採取される、すなわち、線維芽細胞が成体対象から採取される歳を指す。本発明による成体対象は８週齢を上回るものである。
【００１５】
さらに別の実施形態では、線維芽細胞は生後線維芽細胞である。生後線維芽細胞は通常、生後間もない、例えば生後１週間以内または生後約１週間の新生仔対象から採取される。
【００１６】
線維芽細胞は、以下の抗体、すなわち、（ｉ）ビメンチンと結合することが可能な抗体、（ｉｉ）プロリル−４−ヒドロキシラーゼと結合することが可能な抗体および（ｉｉｉ）抗体ＴＥ−７（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社が販売、カタログ番号ＣＢＬ２７１；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．ら（１９８４）．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（４）：１１４９−１１６８も参照されたい）のうち１つまたは複数のものを用いる免疫細胞化学により同定され得る。
【００１７】
実施形態Ａでは、線維芽細胞は、抗体ＴＥ−７により認識される表面抗原を保有する。実施形態Ｂでは、線維芽細胞はビメンチンを発現する。実施形態Ｃでは、線維芽細胞はプロリル−４−ヒドロキシラーゼを発現する。本発明のさらなる態様は、実施形態ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣおよびＡとＢとＣの組合せである。
【００１８】
腎細胞
本明細書で使用される「腎細胞」という用語は、腎細胞の特徴を有するか、腎臓内に存在するか、または後腎間葉もしくは尿管芽を起源とする細胞を指す。
【００１９】
本発明に従って得られる腎細胞は、好ましくは遺伝子Ｐａｘ２、Ｌｈｘ１、Ｓｌｃ６ａ１８、Ｓｌｃ１７ａ１および／またはＬｒｐ２を発現し、かつ／あるいはその起源である線維芽細胞に比して、上記の遺伝子のうち１つまたは複数の遺伝子のアップレギュレーションを示す。
【００２０】
好ましくは、腎細胞は腎尿細管細胞である。最も好ましくは、腎細胞は、カドヘリン１６とも呼ばれるマーカータンパク質「腎特異的カドヘリン」を発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（２９）：１７５９４−１７６０１；およびＳｈｅｎら（２００５）Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．１８（７）：９３３−９４０ならびにそこに引用されている参考文献も参照されたい）。カドヘリン１６に対する抗体は市販されている。
【００２１】
最も好ましくは、腎細胞は腎表皮細胞、例えば腎尿細管上皮細胞である。腎上皮細胞は通常、腎上皮細胞の膜にタンパク質のＺＯ−１、Ｅカドヘリン（ＣＤＨ１）およびＥｐＣＡＭが存在することを特徴とする。
【００２２】
腎上皮細胞は、好ましくはＥカドヘリンをコードするＣｄｈ１およびＣｄｈ６を発現し、かつ／または上記遺伝子の発現は、腎上皮細胞が起源とする線維芽細胞のものよりも高い。
【００２３】
さらに、腎細胞は好ましくは、ビメンチンが陰性であるか、または少なくとも腎細胞でのビメンチンの発現が、それが起源とする線維芽細胞よりも有意に低い。
【００２４】
特に明示されない限り、本明細書で発現レベルに言及する場合はいずれも、実施例に明記される定量的リアルタイムＰＣＲにより測定されるものを指す。
【００２５】
転写因子
ＥＭＸ２遺伝子は、ショウジョウバエの「空の気門」遺伝子のホモログであるホメオボックス含有転写因子をコードする。ヒトのこの遺伝子に関する研究は、３つの組織、すなわち背側終脳、嗅上皮およびウロジェネシャル（ｕｒｏｇｅｎｅｔｉａｌ）系におけるその発現に焦点が当たられてきた。同遺伝子は発生過程で、背側終脳の吻側側方で低く尾側内側で高い勾配で発現し、新皮質を画定された機能領域にパターン化すると考えられている。同遺伝子は胚および成体の嗅上皮にも発現し、そこで真核翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）と複合体を形成し、ｍＲＮＡの輸送または翻訳を調節するものと思われる。発生段階にある泌尿生殖器系では上皮組織に発現し、ＨＯＸＡ１０による負の調節を受ける。選択的スプライシングにより、異なるタンパク質をコードする複数の転写産物バリアントが生じる。
【００２６】
ＥＭＸ２タンパク質のヒトオルソログは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０４７４３で保管されているアミノ酸配列を有する。アイソフォーム１はアクセッション番号Ｑ０４７４３−１であるのに対し、アイソフォーム２はアクセッション番号Ｑ０４７４３−２である。
【００２７】
アイソフォーム１は、詳細には以下のようにｃＤＮＡ配列によりコードされている：
【表１】
2019506899.tif 000002
【００２８】
アイソフォーム２は、詳細には以下のようにｃＤＮＡ配列によりコードされている：
【表２】
2019506899.tif 000003
【００２９】
ヒトＥＭＸ２、そのオルソログまたはその機能的フラグメントをコードする任意のヌクレオチド配列を本発明に従って使用することができる。ＥＭＸ２をコードする核酸は、配列番号１［アクセッション番号ＮＭ＿００４０９８］で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。マウス線維芽細胞の再プログラミングには、アクセッション番号ＮＭ＿０１０１３２．２で示されるヌクレオチド配列を使用することができる。
【００３０】
Ｈｎｆ１ｂ遺伝子は、転写因子のホメオドメイン含有スーパーファミリーのメンバーをコードする。タンパク質は、ホモ二量体または関連タンパク質の肝細胞核因子１アルファとのヘテロ二量体としてＤＮＡと結合する。この遺伝子は、ネフロン発生において機能することが示されており、胚膵臓の発生を調節する。この遺伝子に変異があると、腎嚢胞腎臓、糖尿病症候群および非インスリン依存性糖尿病を来たし、一部のタイプの癌ではこの遺伝子発現が変化している。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコードする複数の転写産物バリアントが明らかにされている。
【００３１】
ＨＮＦ１Ｂのヒトオルソログは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５６８０で定められるアミノ酸配列を有する。これにはアクセッション番号Ｐ３５６８０−１、Ｐ３５６８０−２、Ｐ３５６８０−３およびＰ３５６８０−４で定められるアイソフォームが含まれる。
【００３２】
対応するｍＲＮＡ配列としては、特に限定されないが、以下のアクセッション番号で定められるヌクレオチド配列が挙げられる：ＢＣ０１７７１４．１、ＸＭ＿０１１５４６８２１．１、ＮＭ＿００６４８１．１、ＮＭ＿０００４５８．３、ＸＭ＿０１１５４６８１９．１、ＸＭ＿０１１５４６８２２．１、ＸＭ＿０１１５２５１６２．１、ＮＭ＿００１１６５９２３．３、ＸＭ＿０１１５２５１６３．１、ＸＭ＿０１１５２５１６０．１、ＸＭ＿０１１５４６８２３．１、ＸＭ＿０１１５４６８２０．１、ＮＭ＿００１３０４２８６．１、ＸＭ＿０１１５２５１６１．１およびＸＭ＿０１１５２５１６４．１。
【００３３】
ヒトＨＮＦ１Ｂ、そのオルソログまたはその機能的フラグメントをコードする任意のヌクレオチド配列を本発明に従って使用することができる。ＨＮＦ１Ｂをコードする核酸は、配列番号２［アクセッション番号ＢＣ０１７７１４．１］で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。マウス線維芽細胞の再プログラミングには、アクセッション番号ＮＭ＿００９３３０．２で示されるヌクレオチド配列を使用することができる。
【００３４】
ＨＮＦ４Ａタンパク質は、ホモ二量体としてＤＮＡと結合する核転写因子である。コードされるタンパク質は、複数の肝臓遺伝子の発現を調節する転写因子である肝細胞核因子１アルファを含めた複数の遺伝子の発現を制御する。この遺伝子の変異は一遺伝子常染色体優性非インスリン依存性１型糖尿病と相関があるとされている。この遺伝子の選択的スプライシングにより、複数の異なるアイソフォームをコードする複数の転写産物バリアントが生じる。
【００３５】
ＨＮＦ４Ａのヒトオルソログは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４１２３５で定められるアミノ酸配列を有する。これには、アクセッション番号Ｐ４１２３５−１、Ｐ４１２３５−２、Ｐ４１２３５−３、Ｐ４１２３５−４、Ｐ４１２３５−５、Ｐ４１２３５−６およびＰ４１２３５−７で定められるアイソフォームが含まれる。
【００３６】
対応するｍＲＮＡ配列としては、特に限定されないが、以下のアクセッション番号で定められるヌクレオチド配列が挙げられる：ＮＭ＿００１２８７１８２．１、ＮＭ＿００１０３０００３．２、ＮＭ＿１７５９１４．４、ＸＭ＿００５２６０４０７．２、ＮＭ＿００１０３０００４．２、ＮＭ＿００１２８７１８３．１、ＮＭ＿１７８８４９．２、ＸＭ＿０１１５２８７９７．１、ＮＭ＿０００４５７．４、ＮＭ＿００１２８７１８４．１、ＮＭ＿１７８８５０．２、ＮＭ＿００１２５８３５５．１およびＸＭ＿０１１５２８７９８．１。
【００３７】
ヒトＨＮＦ４Ａ、そのオルソログまたはその機能的フラグメントをコードする任意のヌクレオチド配列を本発明に従って使用することができる。ＨＮＦ１Ｂをコードする核酸は、配列番号３［アクセッション番号ＮＭ＿０００４５７．４］で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。マウス線維芽細胞の再プログラミングには、アクセッション番号ＮＭ＿００８２６１．２で示されるヌクレオチド配列を使用することができる。
【００３８】
Ｐａｘ８遺伝子は転写因子のペアードボックス（ＰＡＸ）ファミリーのメンバーをコードする。この遺伝子ファミリーのメンバーは通常、ペアードボックスドメイン、オクタペプチドおよびペア型ホメオドメインが含まれるタンパク質をコードする。この核タンパク質は、甲状腺濾胞細胞の発生および甲状腺特異的遺伝子の発現に関与する。この遺伝子の変異は甲状腺形成不全、甲状腺濾胞癌および非定型濾胞甲状腺腫と相関があるとされている。異なるアイソフォームをコードする選択的にスプライスされた転写産物バリアントが記載されている。
【００３９】
ＰＡＸ８のヒトオルソログは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ０６７１０で定められるアミノ酸配列を有する。これには、アクセッション番号Ｑ０６７１０−１、Ｑ０６７１０−２、Ｑ０６７１０−３、Ｑ０６７１０−４およびＱ０６７１０−５で定められるアイソフォームが含まれる。
【００４０】
対応するｍＲＮＡ配列としては、特に限定されないが、以下のアクセッション番号で定められるヌクレオチド配列が挙げられる：ＢＣ００１０６０、ＸＭ＿０１１５１１７９２．１、ＮＭ＿０１３９５１．３、ＮＭ＿０１３９５２．３、ＮＭ＿０１３９５３．３、ＸＭ＿０１１５１１７９０．１、ＸＭ＿０１１５１１７９３．１、ＮＭ＿０１３９９２．３、ＮＭ＿００３４６６．３、ＸＭ＿０１１５１１７９４．１およびＸＭ＿０１１５１１７９１．１。
【００４１】
ヒトＰＡＸ８、そのオルソログまたはその機能的フラグメントをコードする任意のヌクレオチド配列を本発明に従って使用することができる。ＰＡＸ８をコードする核酸は、配列番号４［アクセッション番号ＢＣ００１０６０］で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。マウス線維芽細胞の再プログラミングには、アクセッション番号ＮＭ＿０１１０４０．４で示されるヌクレオチド配列を使用することができる。
【００４２】
本明細書で使用される「過剰発現」という用語は、遺伝子をコードする核酸をトランスフェクトした宿主細胞における所与の遺伝子の発現レベルが、非トランスフェクト宿主細胞におけるその遺伝子の内因性発現レベルよりも高いことを意味する。例えば、Ｅｍｘ２をコードする発現ベクターをトランスフェクトした線維芽細胞が、非トランスフェクト線維芽細胞よりも高いＥｍｘ２核酸の発現レベルを示す場合、そのトランスフェクト細胞にはＥｍｘ２の過剰発現が存在する。
【００４３】
発現レベルは、好ましくは定量的リアルタイムＰＣＲにより測定する。
【００４４】
以下の供給源から線維芽細胞を入手し得る：
Ｅ１１．５〜Ｅ１４．５胚の四肢からマウス胚性線維芽細胞を入手し得る。
約１週齢のマウスの尾端から生後マウス線維芽細胞を入手し得る。
約８週齢のマウスの尾端から成体マウス線維芽細胞を入手し得る。
健常な少年、例えば６歳の少年の包皮からヒト包皮線維芽細胞を入手し得る。
胎児皮膚からヒト胎児線維芽細胞を入手し得る（例えば、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入することができる）。
【００４５】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏで実施する段階のみを含む。したがって、この実施形態に従って生きたヒトまたは動物の体にいかなる段階も実施することはない。
【００４６】
本発明の方法は、好ましくは、（ａ）ＨＮＦ１ｂおよびＰＡＸ８ならびに任意選択でＥＭＸ２および／またはＨＮＦ４ａをコードする１つまたは複数の核酸を準備する段階；（ｂ）前記１つまたは複数の核酸を線維芽細胞に導入して形質導入線維芽細胞を得る段階；および（ｃ）Ｈｎｆ１ｂおよびＰａｘ８ならびに任意選択でＥｍｘ２および／またはＨｎｆ４ａの過剰発現が可能な条件下で前記形質導入線維芽細胞を培養する段階を含む。
【００４７】
ＥＭＸ２、ＨＮＦ１ｂ、ＨＮＦ４ａおよび／またはＰＡＸ８をコードする核酸は非環状核酸であり得る。しかし、好ましくは、ＥＭＸ２、ＨＮＦ１ｂ、ＨＮＦ４ａおよび／またはＰＡＸ８をコードする核酸は環状核酸、より好ましくはプラスミドまたはベクターに含まれている。核酸は通常、線維芽細胞に遺伝子発現を誘導することが可能なプロモーター配列と作動可能に連結されている。適切なプロモーターとしては、特に限定されないが、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＣＡＧおよびＴＲＥが挙げられる。
【００４８】
ＥＭＸ２、ＨＮＦ１ｂ、ＨＮＦ４ａおよび／またはＰＡＸ８をコードする核酸は、４つの別個のプラスミド上またはベクター上にあり得る。しかし、好ましくは、本発明に従って使用するプラスミドまたはベクターは、ＥＭＸ２、ＨＮＦ１ｂ、ＨＮＦ４ａおよびＰＡＸ８からなる群より選択される少なくとも２つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、本発明に従って使用するプラスミドまたはベクターは、ＥＭＸ２、ＨＮＦ１ｂ、ＨＮＦ４ａおよびＰＡＸ８からなる群より選択される少なくとも３つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用するプラスミドまたはベクターは、タンパク質ＥＭＸ２、ＨＮＦ１ｂ、ＨＮＦ４ａおよびＰＡＸ８をコードするヌクレオチド配列を含む。つまり、プラスミドまたはベクターは、４つの遺伝子Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａおよびＰａｘ８またはその機能的等価物すべてのコード配列を含む。
【００４９】
核酸、プラスミドまたはベクターは、それ自体が既知の技術を用いて線維芽細胞または分化細胞に導入することができる。
【００５０】
目的とするタンパク質を発現させるのに十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するのに適した方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｅｔｈｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５，１９８１；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６，１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら，欧州特許第１１７，０６０号；および欧州特許第１１７，０５８号を参照されたい。哺乳動物細胞については、哺乳動物細胞に遺伝物質を導入するのによく用いられる方法として、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｒｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７，１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法またはＨａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ（Ｆｏｃｕｓ  １５：７３，１９９３）のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）法が挙げられる。米国特許第４，３９９，２１６号には、哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な態様がＡｘｅｌにより記載されている。哺乳動物細胞に遺伝物質を導入する様々な技術については、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７，１９９０およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２，１９８８を参照されたい。
【００５１】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、核酸を導入する段階は、トランスフェクション試薬で細胞（例えば、ヒトまたはその他の動物の体細胞）内に核酸を送達することを含む。ただし、本発明は、用いるトランスフェクション法の性質により限定されることはない。実際、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に核酸を送達することが可能な既知のまたは今後明らかにされる任意のトランスフェクション工程が企図され、細胞が単離細胞または真核組織もしくは器官を含む細胞を含むかどうかを問わず、培養中または生命維持培地中の前記細胞内に核酸を送達する方法、あるいはヒト、動物、植物または真菌などの生体内の細胞内にｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を送達する方法がこれに含まれる。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬は脂質（例えば、リポソーム、ミセルなど）を含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬はナノ粒子またはナノチューブを含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬はカチオン化合物（例えば、ポリエチレンイミンまたはＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクション法は、電流を用いて細胞内にｍＲＮＡを送達するもの（例えば、エレクトロポレーションによるもの）である。
【００５２】
核酸は、組込みベクターまたは非組込みベクターなどのベクターを用いて、トランスフェクションまたは形質導入により細胞内に導入することができる。本明細書で特に注目されるのが、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、細胞と接触させる前にベクターをビリオン内にパッケージングすることにより形質導入される。導入後、力価決定因子（１つまたは複数）をコードするＤＮＡセグメント（１つまたは複数）が染色体外（例えば、エピソームプラスミド上）に位置するか、または細胞染色体（１つまたは複数）内に安定に組み込まれ得る。
【００５３】
ウイルスをベースとする遺伝子導入および発現ベクターは、非分裂性細胞およびトランスフェクトが困難な細胞を含めた大部分の細胞型に遺伝物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで効率的かつ確実に送達することを可能にする遺伝子構築物である。ゲノムＤＮＡ内に組み込まれたウイルスベースの構築物によって高い発現レベルが得られる。ベクターは、目的とする転写因子をコードするＤＮＡセグメントに加え、そのＤＮＡセグメントの上流および下流にそれぞれ作動可能に連結された転写プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む。ベクターは、単一の力価決定因子をコードする単一のＤＮＡセグメントまたは複数の力価決定因子コードＤＮＡセグメントを含み得る。単一の細胞に複数のベクターを導入することができる。ベクターは任意選択で、ベクターを取り込んで発現する細胞を特定するための選択マーカーをコードし得る。一例として、ベクターが細胞に抗生物質耐性を付与する場合、培地に抗生物質を添加して、細胞内へのベクター導入が成功したかどうかを確認することができる。実施例では、組込みベクターを用いて概念実証を示すことができる。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターは組込みベクターであるが、非組込みベクターを使用することもできる。このようなベクターは必要に応じて、再プログラミング後に希釈により細胞からなくすことができる。適切な非組込みベクターにはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベクターがある。それぞれその全体が記載された場合と同様に参照により本明細書に組み込まれるＲｅｎ  Ｃ，ら，Ａｃｔａ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ．３７：６８−７３（２００５）；およびＲｅｎ  Ｃ，ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：１３３８−１３４７（２００６）。
【００５４】
本明細書に記載されるベクターは、それを治療に使用する際の安全性を高め、適切な発現エレメントおよび治療遺伝子を含むよう当該技術分野で認められている技術を用いて構築および操作することができる。本発明での使用に適した発現ベクターを構築するための標準的技術は当業者に周知であり、全体が記載された場合と同様に参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１）などの刊行物にみることができる。
【００５５】
トランスフェクションまたは形質導入後、通常は、細胞を適切な条件下で培養して、トランスフェクトした遺伝子を過剰発現させる。線維芽細胞に遺伝子を導入してからその細胞が腎細胞に変換されるまでの培養期間は通常、少なくとも５日、好ましくは少なくとも１０日または５〜３０日、好ましくは１０〜２０日、例えば１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日または２０日である。
【００５６】
適切な培養条件としては、特に限定されないが、実施例に記載されるものが挙げられる。
【００５７】
本明細書に記載される方法により得られた腎細胞は次いで、実施例に示されるように、さらなる用途のために収集または回収することができる。
【００５８】
考え得る用途としては、特に限定されないが、腎毒性試験、薬理学的スクリーニングまたは疾患モデル化が挙げられる。本発明の腎細胞を用いてモデル化することができる疾患としては、特に限定されないが、腎尿細管を冒す病態、輸送不全（例えば、バーター症候群）、腎尿細管を冒す代謝症候群（例えば、シチノーシス（ｃｙｔｉｎｏｓｉｓ））、繊毛関連疾患（例えば、ネフロン癆）、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、腎臓および尿路の先天性奇形（ＣＡＫＵＴ）、腎嚢胞性疾患、間質性疾患および腫瘍性腎疾患；腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症が挙げられる。
【００５９】
本発明による再プログラミングおよび／またはそれにより得られた腎細胞を用いて、遺伝子改変動物モデルからｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルを開発することができる。
【００６０】
本発明に従って得られた腎細胞にヒト腎疾患に関連する遺伝子の直接的破壊をもたらすことができる。本発明の細胞を用いて、例えば疾患関連遺伝子を直接標的とすることにより、新規なｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルを作製することができる。これは嚢胞性腎疾患に限らず、とりわけ輸送不全（例えば、バーター症候群）、腎尿細管を冒す代謝症候群（例えば、シスチン症）または繊毛関連疾患（例えば、ネフロン癆）を含めた腎尿細管を冒す任意の病態に容易に適用することができる。
【００６１】
（実施例）
結果
腎細胞運命を誘導する転写因子の特定
候補腎臓再ログラミング因子の不偏選択の基準を定めるため（図１ａ）、本発明者らは、様々な成人ヒト組織のあらゆる既知の転写因子の定量的ｍＲＮＡ発現データを解析した２３（図１ｂおよび図８ａ）。これまでに特定された再プログラミング因子の特徴の１つに、その標的組織における絶対発現量が多く、他の組織と比較しても相対発現量が多いことがある。これらの基準に基づき、５５の候補腎臓再プログラミング因子からなるセットを明らかにすることができた。
【００６２】
腎臓アイデンティティの核となる調節因子は、初期腎臓発生の過程で進化的に維持された機能を有するものと思われる。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）前腎の発生および機能の中心的側面には哺乳動物の腎臓発生との顕著な類似点がみられる２４。このため、本発明者らは、Ｘｅｎｏｐｕｓを用いて５５のヒト候補因子に対するオーソロガス遺伝子の比較ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションスクリーニングを実施した（図１ｃおよび図８ｂ、９）。３８の遺伝子が前腎において明確な発現を示し；１８の遺伝子が最も早い時点（段階２２）で検出された。マウス後腎の発生過程では、胚齢１２（Ｅ１２）〜Ｅ１７の腎原基に同様の初期の組織限定的発現が検出された（図１ｃおよび図１０）２５〜２７。
【００６３】
潜在的再プログラミング因子の第三選択基準として、ヒトの先天性腎疾患またはマウスの腎機能喪失表現型に関連する遺伝子を腎臓発生に不可欠なものであると考え、これをさらに検討した。このような段階的選択により潜在的再プログラミング因子の数を１３の候補にまで減らし、その腎細胞運命誘導能を機能的に試験した。
【００６４】
Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａおよびＰａｘ８が線維芽細胞をｉＲＥＣに変換する
本発明者らは最初、個々の候補再プログラミング因子または候補再プログラミング因子の組合せが哺乳動物細胞を腎細胞運命に方向付けることができるかどうかを試験した。候補因子は腎臓全体の発現データに基づき予測したものであるため、腎臓の主要な細胞型を構成する尿細管上皮細胞を誘導することを目的とした。
【００６５】
尿細管細胞アイデンティティへの運命変換を検出するため、腎尿細管特異的カドヘリン１６プロモーター（Ｃｄｈ１６／Ｋｓｐ−Ｃｒｅ（腎特異的タンパク質））の制御下にＣｒｅリコンビナーゼを保有するマウスと、膜直列二量体トマト赤／膜ＧＦＰ（ｍＴＯＭ／ｍＧＦＰ）二重蛍光レポーターを有するマウスとを交配した２８。得られたマウスでは、Ｃｒｅ媒介性組換えにより腎尿細管上皮細胞に特異的に膜ＧＦＰの発現が誘導され、非Ｃｒｅ発現細胞では赤色蛍光が維持される（図２ａ）。腎前駆細胞が混入する可能性を排除するため、レポーター系を保有するＥ１３齢胚の四肢からマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離した。次に、レンチウイルスによる形質導入により単離ＭＥＦに候補転写因子を発現させ、ＧＦＰレポーターの発現をフローサイトメトリーにより解析した（図２ａおよび図１１ａ）。
【００６６】
全１３の候補因子の混合物を形質導入したところ、形質導入から１週間後に細胞の０．１％がＧＦＰを発現した（図２ｂ）。腎臓運命誘導に必要な最小限の因子のセットを明らかにするため、１３の転写因子からなるプールから個々の候補を体系的に除いた（１３ＴＦ−１；図２ｃ）。Ｆｏｘｃ１、Ｇａｔａ３、Ｈｎｆ１ａ、Ｌｈｘ１およびＴｆａｐ２ｂを除いたところ、ＧＦＰ陽性細胞の割合が増大した。その結果、これらの因子を以後の実験から除外した（８ＴＦ−１；図２ｄ）。４つの因子Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａおよびＰａｘ８をそれぞれ１３の因子または８の因子からなるプールから除外したところ、ＧＦＰ陽性細胞の割合が有意に減少した（図２ｃ、２ｄ）。その結果、この４つの因子を組み合わせて発現させることにより、ＧＦＰ陽性細胞の平均の割合が０．６％に増大した。重要なのは、この４つの因子のうち、個別に過剰発現させてレポーター活性を誘導することができたものはなかったということである（図２ｅ、２ｆ）。レンチウイルスによる形質導入から３１日後、ＧＦＰ陽性細胞の割合は１１．２％に増大した（図２ｇ）。
【００６７】
次に、いずれの条件が再プログラミング効率を増大させるのかを体系的に試験した。ウイルス力価を増大させたところ、培養１週間後にレポーター活性化の割合が３倍になり（図２ｈ）、５週間後にはＧＦＰ＋細胞が最大２３．８％となった（図１１ｅ）。既に再プログラミングを促進することが示されている物質であるビタミンＣ、ＣＨＩＲ９９０２１、バルプロ酸、５アザシチジンまたはフォルスコリン２９、３０、３１はＧＦＰ陽性細胞の割合に何ら効果を示すことはなかった。同様に、単一の多シストロン性ベクターから全４種類の転写因子を発現させても変換効率は増大しなかった（図２ｈおよび図１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ）。しかし、ＳＶ４０ラージＴ抗原３２を同時発現させたところ、感染から１週間後に再プログラミング効率が５．４％までさらに増大した（図２ｈ）。
【００６８】
生後線維芽細胞を同じように再プログラミングに使用することができるかどうかを評価するため、生後７日（Ｐ７）のマウスまたは成体（Ｐ６０）マウス由来の尾端線維芽細胞に４つの因子を形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞が検出されたことから、腎臓上皮運命への再プログラミングが胚性線維芽細胞に限定されないことがわかった（図１１ｅ、１１ｆ）。
【００６９】
結論として、胚線維芽細胞および生後線維芽細胞の腎尿細管特異的レポーター発現を活性化させるためには、４つの因子（すなわち、Ｅｍｘ２、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ４ａ、Ｐａｘ８）の組合せがあれば十分である。それ以降、得られた細胞を誘導腎尿細管上皮細胞（ｉＲＥＣ）と称した。
【００７０】
ｉＲＥＣは上皮の特徴を示す
ｉＲＥＣの特徴を明らかにするため、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によりＧＦＰ陽性細胞を単離し、培養して拡大した。ｉＲＥＣは特徴的な上皮の形態を示し、コンフルエントまで増殖させると堅固な上皮層を形成した（図３ａ）。まばらに播種した細胞は培養２週間後にコロニーを形成し、ｉＲＥＣはクローン形成性の拡大が可能であることが示唆された１７（図３ｂ）。密に増殖させたｉＲＥＣでは、腎上皮細胞の特徴の１つであり溶質の輸送および水流入を示すドーム様構造が頻繁にみられた３３（図３ｃ）。
【００７１】
次に、腎尿細管で強い発現を示す上皮細胞接着分子のｍＲＮＡレベルを解析した。Ｃｄｈ１転写産物およびＣｄｈ６転写産物の両方ならびにＫｓｐ−Ｃｒｅレポーター活性化から予測された通りＣｄｈ１６（Ｋｓｐ）がｉＲＥＣに盛んに発現した（図３ｄ）。
【００７２】
さらに、ＺＯ−１、Ｅカドヘリン（ＣＤＨ１）およびＥＰＣＡＭの免疫染色では、ｉＲＥＣにこれらの上皮マーカータンパク質の膜局在化がみられたが、ＭＥＦにはみられなかった（図３ｅ）。これとは対照的に、ＭＥＦに中間径フィラメントタンパク質であり間葉細胞を標識するビメンチンが存在したが、ｉＲＥＣには存在しなかった。このように、ｉＲＥＣは再プログラミングの過程で上皮細胞アイデンティティを獲得し、間葉系の表現型を喪失した。
【００７３】
ｉＲＥＣは発現プロファイルが初代尿細管細胞と類似している
次に、ｉＲＥＣの転写プロファイル全体をＰ７  Ｋｓｐ−Ｃｒｅ  ｍＴＯＭ／ｍＧＦＰマウスからＦＡＣＳにより単離した初代腎尿細管およびＭＥＦと比較して評価した。マイクロアレイデータの階層的クラスタリング解析から、ＭＥＦよりも初代腎尿細管上皮細胞の方がｉＲＥＣと類似していることがわかった（図４ａ）。
【００７４】
最近、操作した細胞がその標的組織にどの程度類似しているかを示す定量的尺度が導入された（ＣｅｌｌＮｅｔ）３４。この分類スコアの算出は、遺伝子調節ネットワークの活性化に基づくものであり、０（類似性なし）から１（識別不能）までの幅がある。ＣｅｌｌＮｅｔ解析から、ｉＲＥＣが他のいずれの細胞型と比較しても腎組織に最も類似していることがわかった（図４ｂ）。ただし、残存線維芽細胞の特徴も検出された。ｉＲＥＣの平均分類スコアは０．３０であり、直接変換されたニューロン（０．３４）および心筋細胞のスコアと同程度であった（０．２７）（図４ｃ）。このように、ｉＲＥＣと腎臓の特徴との類似度は他のこれまでの再プログラミング法と一致する。
【００７５】
本発明者らはさらに、腎特異的マーカー遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。マイクロアレイのデータを確認し、腎臓に豊富な転写産物のなかでもとりわけ、Ｐａｘ２またはＬｈｘ１などの腎臓発生の転写調節因子、腎特異性の高いアミノ酸輸送体Ｓｌｃ６ａ１８、有機アニオン輸送体Ｓｌｃ１７ａ１および受容体タンパク質Ｌｒｐ２の強力なアップレギュレーションを検出した（図４ｄ）。
【００７６】
再プログラミング時のｉＲＥＣに対する主要な転写の変化を検討するため、公開されているＲＮＡシーケンシング発現データセット３５、３６を用いて、本発明者らのデータセットで差次的調節がみられた遺伝子の発現レベルと、様々なマウス組織およびヒト組織とを関連付けた。ｉＲＥＣでＭＥＦの１０倍アップレギュレートされた遺伝子は腎臓に最も大量に発現し、ダウンレギュレートされた遺伝子はＭＥＦに強く発現した（図１２ａ）。ｉＲＥＣで初代尿細管細胞に比してアップレギュレートされた遺伝子は主として近位尿細管に発現した（図１２ｂ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析により、ｉＲＥＣでは尿細管に発現するイオンチャネルおよび輸送体の発現が増大した（図４ｄ）のと同じように、１０倍アップレギュレートされた遺伝子では膜貫通輸送活性に関連するカテゴリーが有意に増大していることがわかった（図１２ｃ）。本発明者らは、ｉＲＥＣのｍＲＮＡ発現プロファイルが腎組織のものに最も類似していると結論付けた。
【００７７】
４つのＴＦのコンビナトリアルな作用が標的遺伝子の発現を調節し、ｉＲＥＣの転写回路を開始させる仕組みを探るため、４つの再プログラミング因子の１６４の推定直接標的遺伝子を取り出し３７、そのｉＲＥＣでの発現レベルをＭＥＦと比較して解析した（図４ｅ）。興味深いのは、Ｐａｘ２、Ｌｈｘ１およびＨｎｆ１ａなどの腎尿細管発生の際立った調節因子が、４つの再プログラミング因子のうち少なくとも１つの因子の強力に誘導された標的であったことである。ｉＲＥＣおよび初代尿細管細胞では、ＭＥＦに比してネフロン前駆細胞マーカーＯｓｒ１がダウンレギュレートされた。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析では、形質導入から１日後、１週間後または４週間後にＳｉｘ２、Ｅｙａ１またはＧａｔａ３などの発生に重要な前駆細胞マーカーが有意にアップレギュレートされないことが確認され、ｉＲＥＣが腎前駆細胞ではなく分化細胞であることが示唆された（図１３ａ）。以上の解析結果をまとめると、４つの再プログラミング因子のコンビナトリアルな作用は、ｉＲＥＣアイデンティティの再プログラミングおよび維持に寄与すると思われる下流転写因子の限られたセットの発現を調節することがわかる。
【００７８】
本発明者らは次に、ｉＲＥＣにおける腎尿細管遺伝子のｍＲＮＡ転写産物レベルの高いことがタンパク質発現にも反映されるかどうかを明らかにしようとした。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰ１Ａ１）のアルファ１サブユニットは、ナトリウム排泄を制御することにより血圧調節に寄与する３８。ＡＴＰ１Ａ１は、その細胞内局在および機能と一致するように、ｉｎ  ｖｉｖｏでｉＲＥＣの側方膜に検出された（図４ｆおよび図１３ｂ）。転写因子ＰＡＸ２の免疫染色では核の染色がみられ、膜にアクアポリン１（ＡＱＰ１）が検出された（図４ｆ）。このように、ｉＲＥＣは解析したタンパク質の正確な細胞内局在を示した。
【００７９】
ｉＲＥＣは複数の尿細管分節を示す
ｉＲＥＣの全体的なプロファイリングにより、様々なネフロン分節を代表する遺伝子の発現が検出された（図１２ｂ）。免疫染色およびフローサイトメトリーでは分節特異的タンパク質の不均一な発現が確認され、ｉＲＥＣには様々な尿細管分節アイデンティティの細胞が含まれることが示唆された（図４ｇおよび図１３ｃ）。
【００８０】
４つの再プログラミング因子のうち２つの因子、すなわち、近位尿細管のＨｎｆ４ａおよび集合管のＥｍｘ２は、重複することのない異なる分節特異的発現を示す３９（図１３ｄ）。興味深いのは、広範囲に発現する２つの因子であるＰａｘ８およびＨｎｆ１ｂはｉＲＥＣ再プログラミングに不可欠な促進因子であり（図２ｆ）、Ｅｍｘ２またはＨｎｆ４ａが欠落してもなお、頻度は低いもののレポーターの活性化が可能であることである。本発明者らは、後者の２つの因子が異なる尿細管分節アイデンティティに導くよう作用するのではないかと考えた。４因子の代わりに３因子のみを形質導入した細胞の遺伝子発現プロファイル全体を解析したところ、Ｅｍｘ２ではなくＨｎｆ４ａが欠落すると、近位尿細管に豊富な遺伝子の発現が減少することが確認された（図４ｈおよび図１３ｅ）。本発明者らは、尿細管分節アイデンティティが再プログラミング混合物の緻密な組成によって調節されている可能性があり、Ｈｎｆ４ａが近位尿細管細胞の特徴の指定に寄与すると結論付けた。
【００８１】
ｉＲＥＣは安定に再プログラムされ培養して拡大することが可能である
ｉＲＥＣ細胞アイデンティティが外因性再プログラミング因子を除去した後も維持されるかどうかを明らかにするため、Ｋｓｐ−Ｃｒｅ発現時に効率的に削除され得るｌｏｘＰ部位含有プロウイルスにより４つの因子を導入した。培養５週間後、このｉＲＥＣには、４つの再プログラミング因子の外因性発現はみられなかったものの、上皮の形態および腎マーカー遺伝子の発現は維持されていた（図１３ｆ、１３ｇ、１３ｈ）。
【００８２】
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適用の可能性を示す重要な特徴である、ｉＲＥＣを培養して拡大することがどの程度可能であるかを明らかにした。ｉＲＥＣは少なくとも４０代継代して増殖することができ、Ｋｉ６７、ｐ１６および腎マーカーの遺伝子発現によるモニタリングでは細胞の老化の徴候も脱分化の徴候もみられなかった（図１３ｉ、１３ｊ、１３ｋ）。本発明者らは、ｉＲＥＣが安定に再プログラムされ、外因性転写因子の継続的発現に依存することはなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大可能であると結論付けた。
【００８３】
ｉＲＥＣは腎尿細管上皮細胞の形態学的および機能的特徴を示す
次に、三次元細胞外マトリックスにおけるｉＲＥＣの挙動の特徴を明らかにした。ｉＲＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌ  ３Ｄ培養で増殖させたところ、一貫して中央に内腔のある球体を形成した（図５ａ、５ｂ、５ｃ）。これとは対照的に、ＭＥＦは不規則で構造化されていない集塊を形成するにとどまり、明確な組織化はみられなかった。ｉＲＥＣ由来の球体は、タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１の頂部局在を伴う強い頂底極性、ファロイジン染色によって示される頂部のアクチン蓄積および基底外側部のβカテニン局在を示した（図５ｄ）。同様に、ｉＲＥＣの基底外側部にＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼアルファ１の局在が検出され、メガリン（ＬＲＰ２）は頂部局在を示し（図５ｄ）、それらの腎尿細管上皮細胞における細胞内局在との一致がみられた。機械感覚チャネルＴＲＰＶ４が主として頂端膜に検出された。間葉マーカーであるビメンチンの染色はｉＲＥＣ球体には全くみられなかった（図５ｄ）。
【００８４】
本発明者らはさらに、透過型電子顕微鏡により３Ｄ球体の超微細構造解析を実施した。ｉＲＥＣは、極性のある立方上皮細胞のように見え、複雑なタイトジャンクションが確立され、頂部表面から複数の内腔微絨毛が伸長していた（図５ｅ）。球体は、基底膜物質を思わせる密着した電子密度の高い細胞外マトリックスに取り囲まれていた（図５ｅ）。アポリポタンパク質受容体メガリン（ＬＲＰ２）はエンドサイトーシスによるアルブミンを含めたタンパク質の取込みを媒介する４０。その顕著な発現に基づき、ｉＲＥＣの蛍光標識したアルブミンの取込みを試験した。ｉＲＥＣの蛍光強度はＭＥＦに比して有意に増大し（図５ｆ、５ｇ）、ｉＲＥＣがエンドサイトーシス活性を有することがわかる。
【００８５】
ｉＲＥＣは腎毒性物質に対して感受性である
急性腎損傷は、シスプラチン、ゲンタマイシンおよびタクロリムスなどの腎毒性物質による高頻度の有害作用として腎尿細管細胞が損傷を受けることにより起こる。３種類の薬物のいずれについても、処理ｉＲＥＣの方がＭＥＦよりもアポトーシスの割合が有意に高かった（図５ｈおよび図１４ａ）。腎損傷分子１（ＫＩＭ１）は尿細管損傷に特異的なバイオマーカーであり４１、ゲンタマイシン処理後にｉＲＥＣで著明に増大した（図５ｉおよび図１４ｂ）。腎尿細管細胞内へのシスプラチン取込みは、一部が有機カチオン輸送体２（Ｏｃｔ２）により媒介される４２。Ｏｃｔ２の阻害剤であることが知られているシメチジン４３１ｍＭとのインキュベーションによって、シスプラチンがｉＲＥＣに引き起こした毒性を低下させることができたことは注目すべきことである（図５ｊ）。このように、ｉＲＥＣは、尿細管上皮細胞と同様に腎毒性物質に対して応答し、腎毒性試験に使用され得る。
【００８６】
ｉＲＥＣは脱細胞化した腎臓において腎オルガノイドに統合され尿細管構造を形成する
胚腎細胞の単細胞懸濁液は再集合し、尿管芽および初期尿細管などの胚腎構造を含めた腎オルガノイドに自己組織化することができる４４。ｉＲＥＣがこの能力を共有しているかどうかを試験するため、ｍＴｏｍａｔｏを構成的に発現するＥ１３胚腎臓を分解して単細胞懸濁液とし、ＧＦＰを発現するｉＲＥＣまたはＭＥＦと混合し、次いで再集合させ培養した（図６ａ）。ＭＥＦは尿細管構造に統合されず、主として間質にみられるか、または集合体から排除されることさえあったが、ｉＲＥＣは尿細管上皮構造に統合された（図６ｂ）。ラミニンの免疫染色により、ｉＲＥＣは上皮細胞が隣接する連続的な基底膜層を共有していることが示された（図６ｃ）。ｉＲＥＣおよび天然の尿細管細胞には近位尿細管マーカーのＬＴＬおよびメガリンが同じようにみられ、ｉＲＥＣが腎微小環境内で分化および極性化することが示された（図６ｃ、６ｄ、６ｅ）。このように、ｉＲＥＣは自己組織化腎オルガノイドの形成に関与している可能性がある。
【００８７】
次に、ｉＲＥＣが他の細胞型の不在下、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構造による誘導のみでも集合して尿細管になるかどうかを問うた。このため、ｉＲＥＣの誘導構造物として、インタクトの三次元ＥＣＭを有し脱細胞化した腎足場を用いた４５。この場合、ｉＲＥＣは脱細胞化した腎臓内で長く一部が入り組んだ尿細管になった（図６ｆ）。移植片の７７％に再細胞化が起こり、組織化された頂底極性を示す尿細管が生じた。このように、ｉＲＥＣには、予め形成された誘導構造物に沿って腎足場を再配置させる能力がある。
【００８８】
ヒト腎上皮細胞の誘導
次に、ヒト線維芽細胞も腎上皮細胞運命へ再プログラミングすることが可能であるかどうかを試験した。ヒト線維芽細胞にＥＭＸ２、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４ＡおよびＰＡＸ８を組み合わせて過剰発現させたところ、マウスｉＲＥＣに類似した上皮形態を有する細胞が得られた（図７ａ）。４ＴＦで処理したヒト細胞には、ｉＲＥＣと同程度の膜βカテニン、核ＰＡＸ２を含めたマーカーの発現および近位尿細管特異的ＬＴＬの陽性染色がみられた（図７ａ）。４ＴＦで処理した後、腎臓の転写因子、接着分子および輸送体のｍＲＮＡレベルが線維芽細胞に比してアップレギュレートされた（図７ｂ）。
【００８９】
再プログラムされたヒト線維芽細胞の割合を増大させるため、最初に上皮細胞を分取することによって再プログラムされた細胞を濃縮した。マウス線維芽細胞、ヒト線維芽細胞ともに、４ＴＦの発現により上皮細胞接着分子ＥＰＣＡＭ（ＣＤ３２６）がアップレギュレートされたが、線維芽細胞マーカーＴＨＹ−１（ＣＤ９０）の発現は減少した（図１４ｃ）。このため、レンチウイルス感染から３週間後、ＣＤ３２６＋ＣＤ９０−細胞の分取によりヒトｉＲＥＣ（ｈ−ｉＲＥＣ）を単離した（図１４ｄ）。分取したｈ−ｉＲＥＣは３Ｄ球体を形成し（図７ｃ）、頂部のアクチン蓄積および基底外側部のβカテニン発現（図７ｄ）によって図示されるように、極化されていた。
【００９０】
本発明者らはさらに、ヒト細胞の再プログラミン効率の最適化を目指した。本発明者らのこれまでのＭＥＦでの観察結果と同様に、形質導入から４週間後、ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現によりＣＤ３２６＋ＣＤ９０−細胞の割合が６．５％に増大した（図１４ｄ）。
【００９１】
分取の特異性を増強するため、腎マーカー発現のみられる細胞を濃縮した。このため、近位尿細管細胞に特異的にみられる糖タンパク質であるプロミニン１（Ｐｒｏｍ−１、ＣＤ１３３）４６に関して分取した（図７ｅ）。追加の戦略を用いて、ヒト腎特異的ＣＤＨ１６プロモーターの制御下にＧＦＰレポータープラスミドを導入し（図７ｅおよび図１４ｅ）、これにより再プログラムされた細胞の識別に成功を収めた。
【００９２】
ＣＤＨ１６レポーター活性化に関して分取した細胞のＲＮＡシーケンシングによる差次的発現プロファイリングでは、ｈ−ｉＲＥＣが線維芽細胞よりもヒト組織の近くでクラスターを形成することがわかった（図７ｆ）。このように、ＥＭＸ２、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＮＦ４ＡおよびＰＡＸ８の発現により、ヒト線維芽細胞も同様にヒト腎上皮様細胞に再プログラムすることができた。
【００９３】
ｉＲＥＣの疾患モデル化への使用：
線維芽細胞のｉＲＥＣへの再プログラミングをヒト疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの開発に利用できるかどうか評価するため、本発明者らは２つの戦略に従った。最初に、常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）のマウスモデルに由来するＭＥＦをｉＲＥＣへの再プログラミングに用いた。このマウスはｌｏｘＰが導入されたＰｋｄ１対立遺伝子（Ｐｋｄ１ｔｍ２Ｇｇｇ）を保有し、この対立遺伝子はＣｒｅリコンビナーゼ発現時に切除され得る５９。Ｐｋｄ１の構成的ノックアウトは胚に致命的なものであるが、このマウスにＣｒｅを条件的に導入すると、ヒトに観察される嚢胞性腎疾患表現型が再現されることが示されている６０。
【００９４】
４ＴＦの強制発現によりＰｄｋ１ｆｌ／ｆｌＭＥＦを再プログラムした。得られたｉＲＥＣの一部のうち、単一細胞を細胞分取により単離し、クローン性に拡大した。ｑＰＣＲにより尿細管特異的マーカー遺伝子の発現を保持していることが確認されたクローンをさらなる解析に用いた。レンチウイルスによるＣｒｅリコンビナーゼの発現により、ｌｏｘＰが導入された対立遺伝子を切除し、フリッパーゼが発現すること、またはウイルスが形質導入されていないことを陰性対照とした（図１６ａ）。３ＤＭａｔｒｉｇｅｌ培養では、再プログラムされた細胞から、極性化した上皮球状体が発生した（図１６ｂ）。このことは、ｉＲＥＣへの再プログラミングを用いて遺伝子改変動物モデルからｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルを開発することが可能であることを示している。
【００９５】
第二の方法では、ｉＲＥＣにヒト腎疾患に関連する遺伝子の直接的破壊をもたらすことができるかどうかを試験した。このため、野生型ＭＥＦ由来のｉＲＥＣにおいて、変異があると患者にＡＤＰＫＤを引き起こすこともあるＰｋｄ２をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で標的化した。Ｐｋｄ２の第一エキソンを標的とするＣａｓ９およびガイドＲＮＡを発現させたところ、サンガーシーケンシングにより検出されるゲノム遺伝子座の破壊がもたらされた（図１６ｃ）。このように、ｉＲＥＣを用いて、疾患関連遺伝子を直接標的とすることにより新規なｉｎ  ｖｉｔｒｏ疾患モデルを作製することができる。これは嚢胞性腎疾患に限らず、とりわけ輸送不全（例えば、バーター症候群）、腎尿細管を冒す代謝症候群（例えば、シスチン症）または繊毛関連疾患（例えば、ネフロン癆）を含めた腎尿細管を冒す任意の病態に容易に適用することができる。
【００９６】
方法
動物
Ｘｅｎｏｐｕｓ胚を既に記載されている通りに培養し操作した５０。簡潔に述べれば、雌のカエルにヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｓｉｇｍａ社）を７００単位注射した。翌朝、卵母細胞を収集し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精させた。０．３×Ｍａｒｋ改変リンガー液（１Ｍ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２０ｍＭ  ＣａＣｌ２；５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中で胚を培養した。段階分けはＮｉｅｕｗｋｏｏｐおよびＦａｂｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｘｅｎｂａｓｅ．ｏｒｇ）に従った。ジャクソン研究所からＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ／Ｊマウスを購入し（＃００７６７６系統起源：Ｂ６．１２９（Ｃｇ））、ＫＳＰ−Ｃｒｅ／＋（＃０１２２３７  Ｂ６．Ｃｇ）マウスと交配させて腎尿細管上皮細胞を標識した。マウスをＳＰＦ施設にて固形飼料および水の自由摂取ならびに１２時間の昼夜サイクルで飼育した。繁殖および遺伝子型同定を標準法に従って実施した。動物実験はいずれも、米国国立衛生研究所の「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」およびドイツの動物福祉に関する法律に従って実施され、地方自治体による承認（フライブルク県庁Ｘ１２／０８ＪおよびＸ１３／０８Ｊ）を受けたものである。
【００９７】
細胞培養
腎組織が混入しないようＥ１３胚の四肢からマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を採取した。生後Ｐ７マウスおよび成体（Ｐ６０）マウスから尾端線維芽細胞（ＴＴＦ）を採取した。解剖用メスで組織を細切し、３７℃で３０分間、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで消化した。ＭＥＦ培地（ＭＥＦＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン）の添加によりトリプシン処理を停止させた。再懸濁後、細胞を遠心分離し、ペレットをＭＥＦＭに再懸濁させ、ゼラチンでコートした６ウェルプレート上で３日間、コンフルエントに達するまで平板培養した。ｑＲＴ−ＰＣＲ解析に用いる生後ヒト線維芽細胞を包皮から誘導した（ＨＦｏＦ）（倫理委員会番号５２１／１３）。ＦＡＣＳ、２Ｄ免疫染色および３Ｄ免疫染色に用いるヒト胎児皮膚線維芽細胞（ＨＦｅＦ）をＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（２３００）から入手した。１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ中でヒト細胞を培養した。ＭＥＦ、ＴＴＦおよびヒト線維芽細胞を液体窒素中で凍結させ、それ以上継代せずに再プログラミング実験に用いた。効率改善実験には、細胞培地に以下の物質を７日間添加した：ビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ社、５０μｇ／ｍｌ）；ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｉｇｍａ社、３μＭ）；フォルスコリン（ＦｏｃｕｓＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ社、１０μＭ）；バルプロ酸（Ｓｉｇｍａ社、１ｍＭ）；５−アザシチジン（Ｓｉｇｍａ社、２μＭ）。
【００９８】
ＣＤＨ１６レポーター細胞を作製するため、ＭＥＦおよびＨＦｅＦにＳＶ４０（Ａｄｄｇｅｎｅ：１２２４６）およびヒトＣＤＨ１６プロモーター−ＧＦＰをピューロマイシン耐性カセットとともに含むレンチウイルス（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ社、ＨＰＲＭ１２７２１−ＬｖＰＦ０２）を感染させた。４ＴＦ処理の前にレポーター細胞をピューロマイシン耐性およびＧＦＰ不発現に関して選択した（ＦＡＣＳによる判定）。
【００９９】
アルブミン取込みアッセイ
細胞をＡｌｅｘａ６４７標識アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａ３４７８５）と３７℃で０分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間および６０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳで５回洗浄してエンドサイトーシスを停止させた。細胞を４％ＰＦＡで固定し、４０倍レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ蛍光顕微鏡を用いて撮像した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、１時点当たり５つの視野の平均蛍光強度を算出した。
【０１００】
細胞毒性アッセイ
ＭＥＦおよびｉＲＥＣを以下の通りに薬物とインキュベートした：（シスプラチン（Ｔｅｖａ社）：６μｇ／ｍｌで２４時間；タクロリムス（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）：４０μＭで２４時間；ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ社）：１ｍｇ／ｍｌで４８時間）。上清および付着細胞（トリプシン処理により得た）を収集することにより細胞を回収した。薬物処理細胞および未処理対照を１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｄ１３０６）で５分間染色し、フローサイトメトリーで４０５ｎｍレーザーを用いて励起させることにより蛍光を測定した。４５０／５０ｎｍの通過帯域フィルターを用いてＤＡＰＩ染色細胞および未染色対照の発光を比較することにより死細胞を特定した。Ｋｉｍ−１発現解析では、ＭＥＦおよびｉＲＥＣをゲンタマイシンで処理し（１ｍｇ／ｍｌで４８時間）、Ｋｉｍ−１を染色し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｉｏｔｅｃ社、１３０−１０６−０２４）、フローサイトメトリーにより解析した。シスプラチン取込み阻害実験では、ＭＥＦおよびｉＲＥＣを未処理で放置するか、または６μｇ／ｍｌシスプラチン単独もしくは６μｇ／ｍｌシスプラチンと１ｍＭシメチジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃ４５２２）とともにインキュベートした。細胞を上記の通りに回収し解析した。実験を３連で実施し、３回反復した。
【０１０１】
３Ｄ細胞培養
３Ｄ細胞培養を既に記載されている通りにＭａｔｒｉｇｅｌで実施した５１。簡潔に述べれば、細胞をトリプシン処理し、５０μｍのセルストレーナーに通し、カウントした。１０，０００個の細胞を低濃度成長因子Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３５４２３０）１００μｌに懸濁させ、８ウェルμ−Ｓｌｉｄｅ（上記、８０８２６）に播種した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを３７℃で１５分間重合させた後、腎上皮成長培地（Ｌｏｎｚａ社、ＣＣ−３１９０）を添加した。７日後または球状体形成が明らかになったとき、細胞を撮像した。免疫蛍光染色用に細胞を４％ＰＦＡで固定した。
【０１０２】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、７３４０４）を用いて全ＲＮＡを単離した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、２０５３１１）を用いてＲＮＡ  １μｇを逆転写した。ＲＯＣＨＥ  ＬＣ４８０  ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒに１／５００〜１／５０の逆転写反応、遺伝子特異的プライマーおよびＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｔａｋｙｏｎ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、ＵＦ−ＮＳＣＴ−Ｂ０２１０）またはＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社、０４７０７５１６００１）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。各遺伝子について３つの生物学的レプリケートを解析した。いずれのレプリケートも３回測定した。データ解析では、既に記載されている通りに、２（−デルタＣ（Ｔ））法を用いて相対発現レベルを算出した後、スチューデントのｔ検定を用いて統計解析を実施した５２。使用したプライマーの配列を表１に記載する。
【０１０３】
【表３】
2019506899.tif 000004
2019506899.tif 000005
【０１０４】
ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
Ｘｅｎｏｐｕｓ胚のホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを段階２２、２６、３３および３８で実施した。以前記載した通りにジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識アンチセンスプローブを使用した５０。ｉｎ  ｓｉｔｕプローブを作製するため、プラスミドを直線化し、Ｔ７またはＳＰ６（Ｒｏｃｈｅ社、ＤＩＧ標識キット）で転写した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたジゴキシゲニンに対する抗体を用いて、結合したプローブを検出した（Ｒｏｃｈｅ社、１１０９３２７４９１０）。既に記載されている通りにパラフィン包埋マウス腎臓切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した５３。簡潔に述べれば、胚または切り取った腎原基を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で固定し、エタノール系列で脱水し、パラフィンで包埋して１０μｍの切片にした。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにジゴキシゲニン−ＵＴＰ標識アンチセンスプローブを使用し、標準的プロトコルに従ってエオシン対比染色を実施した５３。プローブ合成に使用したプラスミドは、著者から請求に応じて入手可能である。１段階当たり５個超の胚について特異的染色を検出した。ＷＩＳＨは再プログラミング因子を特定するスクリーニングの一環であったため、この実験を１回実施した。
【０１０５】
コロニー形成アッセイ
ＭＥＦまたはｉＲＥＣの細胞５０個を６ウェルプレートに播種し、１４日間増殖させた後、固定し、１０％エタノール溶液に溶かした０．１％クリスタルバイオレットで１５分間、室温にて染色した。３つの独立した実験の細胞を顕微鏡で目視検査することにより、コロニーをカウントした。
【０１０６】
マイクロアレイ解析
ＲＮｅａｓｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、７３４０４）を用いて、ＣＦＰ処理対照ＭＥＦ、ＧＦＰ分取ｉＲＥＣおよびＰ６  ｍＴＯＭ／ｍＧＦＰトランスジェニックマウスから抽出しＧＦＰ分取した初代腎ＫＳＰ−Ｃｒｅ尿細管細胞の全ＲＮＡを単離した。いずれの細胞もＲＮＡ抽出前に分取を実施した。全ＲＮＡ試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＷＴ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、オースティン、テキサス州、米国）で製造業者による記載通りに処理した。標識したフラグメントをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーションオーブン６４５内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＷＴ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  １．０／２．０アレイとハイブリダイズさせた。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、米国）を用いて洗浄および染色した後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇでアレイをスキャンし、個々のプローブのシグナル強度値を得た。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０を用いて生データからＣＥＬファイルを作成した。本発明者らは、さらなる解析にＰａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅソフトウェアを用いた（Ｐａｒｔｅｋ社）。対照プローブおよび問合せプローブを含めたＣＥＬファイルを取り込んだ。ＧＣ含有量およびプローブ配列に合わせて調整するよう予備バックグランド調整を設定し、ＲＭＡバックグラウンド補正を実施した。Ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化を用いてアレイを正規化し、Ｍｅｄｉａｎ  Ｐｏｌｉｓｈ法を用いてプローブセットの要約を実施した。プローブ値をｌｏｇ２に変換した。グループ間で差次的に発現した遺伝子を特定するため、Ｐａｒｔｅｋで一元ＡＮＯＶＡを実施した。本発明者らは、対比法としてＦｉｓｈｅｒの最小有意差法（ＬＳＤ）を用いた。アレイの結果はＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＭＴＡＢ−３６４８）に保管されている。
【０１０７】
ＲＮＡシーケンシング解析
事前にピューロマイシン処理も低バックグラウンドに関する選択も実施していないヒト線維芽細胞ｈ−ｉＲＥＣ（４ＴＦ、ＳＶ４０処理、ＧＦＰ高ＣＤＨ１６レポーター活性に関して分取）またはＭＥＦ、４ＴＦ、３ＴＦ（Ｐａｘ８を除いたもの）もしくは３ＴＦ（Ｈｈｎｆａを除いたもの）で処理し事前に分取を実施していないＭＥＦからＲＮＡ  ２μｇを単離した。ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（コンスタンツ、ドイツ）にてライブラリー調製およびシーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑシングルリード）を実施した。ＥＢＩ  ＳＲＡ（ＥＲＲ０３０８９３）からヒト腎臓試料を検索した。ｇａｌａｘｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ５４を用いて配列リードアライメント（ＴｏｐＨａｔ）を実施し、ＳｅｑＭｏｎｋソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｓｅｑｍｏｎｋ／）を用いてリードカウントを定量化した。階層的クラスタリングの前にグループ間のＡＮＯＶＡにより有意に差次的な発現を算出した。４−１処理細胞の解析では、有意にアップレギュレートされ（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）、ＭＥＦと４ＴＦ処理細胞との間に１ｌｏｇ２の差がみられる遺伝子を考慮に入れた。遺伝子をラット尿細管分節のＲＰＫＭ発現データ３９に対してマッピングし、近位分節（Ｓ１〜３）および集合管（ＣＮＴ、ＣＣＤ、ＯＭＣＤおよびＩＭＣＤ）における発現量中央値の間の差に従って分類した。関連するＲＮＡ−Ｓｅｑデータはすべて著者から入手可能であり、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｃｈｉｖｅに保管されることになる。
【０１０８】
分子クローン化およびレンチウイルス形質導入
段階３９のＸｅｎｏｐｕｓおよびＥ１５のマウス胚の腎臓由来の逆転写全ＲＮＡ単離物のｃＤＮＡから完全長またはフラグメントのＸｅｎｏｐｕｓ転写因子およびマウス転写因子をクローン化した。遺伝子特異的プライマーを用いて転写因子のコード配列を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＷＰＸＬｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ（番号１２２５８））にクローン化した。レンチウイルスを作製するため、リン酸カルシウムを用いてｐＷＰＸＬｄ、ｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、番号１２５５９）およびｐｓＰａｘ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、番号１２２６０）のプラスミドＤＮＡを２９３Ｔ細胞内に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、既に記載されている通りに、細胞上清を回収し、ポリエチレングリコール沈殿法を用いてウイルスを濃縮した５５。濃縮したウイルスを−８０℃で凍結させ、細胞の形質導入の直前に解凍した。ＭＥＦ、ＴＴＦ、ＨＦｏＦおよびＨＦｅＦの感染には、１０μｇ／ｍｌポリブレンを含有するＭＥＦＭでウイルス濃縮物を１：１００（高ウイルス力価）〜１：１０００（低ウイルス力価）に希釈し、細胞を１２時間インキュベートした。ウイルス感染を５〜７回反復した。ＭＥＦＭで７日間培養した後、ＭＥＦおよびＴＴＦのＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより解析した。最後のウイルス形質導入から１４日後、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によりＧＦＰ陽性ｉＲＥＣを単離し、さらなる解析のために拡大させた。最後の形質導入から２１〜２８日後、ＣＤ３２６＋ＣＤ９０−細胞、ＣＤ３２６＋ＣＤ１３３＋細胞またはＣＤＨ１６−ＧＦＰ＋細胞の分取により、再プログラムされたＨＦｅＦを特定した。
【０１０９】
ウエスタンブロット解析
ＳＤＳ／ＰＡＧＥによりタンパク質を分画し、ウエスタンブロットによるタンパク質検出に抗２Ａ−ペプチド抗体（ＡＢＳ３１、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた。
【０１１０】
免疫蛍光染色
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定した。透過処理では、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）と室温で１０分間インキュベートした。ＰＢＳ中、２％ウマ血清、５％ＢＳＡ、１％キンギョゼラチンで１時間ブロックした後、細胞を一次抗体と室温で６０分間インキュベートし、次いで、暗所にて二次蛍光コンジュゲート抗体と室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで１：２，０００に希釈したヘキスト３３３４２でＤＮＡを染色した。ブロッキング溶液１０％を含有するＰＢＳで一次抗体および二次抗体を希釈した。免疫蛍光染色に使用した抗体は以下の通りである：β−カテニン（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ社、ｓｃ７１９９、１：１００）、Ｅカドヘリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１３−１９００、１：１００）、Ｅｐｃａｍ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ７１９１６、１：１００）、ラミニン（Ｓｉｇｍａ社、Ｌ９３９３、１：１００）、ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓレクチン（ＬＴＬ）（Ｂｉｏｚｏｌ社、Ｂ−１３２５、１：１００）、メガリン（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ社、ｓｃ１６４７８、１：１００）、Ｎａ＋Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ７６７１、１：１００）、ＰＡＸ２（Ａｂｃａｍ社、ａｂ３７１２９、１：１００）、ファロイジン（Ｍｏｌ．Ｐｒｏｂｅｓ社、Ａ２２２８７、１：１００）、ＴＲＰＶ４（Ａｌｏｍｏｎｅ社、ａｃｃ−０３４、１：１００）、ビメンチン（Ｓｉｇｍａ社、Ｖ２２５８、１：１００）、ＺＯ−１（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ社、ｓｃ３３７２５、１：１００）、ＰＤＺＫ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社／Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、ＨＰＡ００６１５５ｍ、１：１００）、Ｂｓｔ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、ＢＰ−３、１：１００）、ＦＥＴＵＢ（ＧｅｎｅＴｅｘ社、ＧＴＸ１１２２６０、１：１００）。
【０１１１】
以下の二次抗体を使用した：ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ−６３３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａ−２１０９４、１：５００）、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ−６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａ−２１２４５、１：５００）、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａ−２１２３５、１：５００）、ロバ抗ヤギＡｌｅｘａ−６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａ−２１４４７、１：５００）。ビオチン化ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓレクチン（ＬＴＬ）（Ｂｉｏｚｏｌ社、Ｂ−１３２５、１：１００）をストレプトアビジンＡｌｅｘａ  ６５７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓ−３２３５７、１：５００）で標識した。実験を良好に３回反復した。
【０１１２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析では、細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）に再懸濁させ、５０μｍのセルストレーナーでろ過し、１３色ＬＣＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ＦＡＣＳ解析装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析した。ＧＦＰ陽性細胞の選択には、ＡＲＩＡ  ＩＩＩまたはＡＲＩＡＦｕｓｉｏｎ細胞分取装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いた。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社）またはＦＡＣＳ  ＤＩＶＡソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によりデータを解析した。マウス細胞およびヒト細胞の分取または解析には、以下の抗体を製造業者の指示に従って使用した：抗マウスＣＤ９０  Ａｌｅｘａ  ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、１０５３１７）、抗マウスＣＤ３２６  ＢＶ４２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、５６３２１４）、抗マウスＣＤ３２４  Ａｌｅｘａ  ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、１４７３０８）、抗マウスＣＤ１５７  ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、１４０２０７）、抗マウスＫｉ−６７  ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、６５２４０６）、抗ヒトＣＤ９０  ＦＩＴＣ（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９７−９３０）、抗ヒトＣＤ３２６  ＢＶ４２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、５６３１８０）、  抗ヒトＣＤ１３３  ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０−０９８−０４６）。Ｅカドヘリンを染色する前に、Ｎｕｎｃ  Ｕｐ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ細胞培養プレート（Ｓｉｇｍａ社、Ｚ６８８８００−６ＣＳ）上で細胞を増殖させ、トリプシン消化を実施せずに回収した。実験を良好に少なくとも３回反復した。
【０１１３】
腎臓の再集合
既に記載されている通りに腎臓の再集合を実施した５６。簡潔に述べれば、Ｅ１３胚マウス腎臓を２０個回収し消化した。胚腎細胞８０，０００個をｉＲＥＣまたは対照細胞８，０００個と混合し、遠心分離によりペレット化した。ペレットを低結合性ＰＣＲチューブに移し、３７℃で一晩集合させた。翌日、細胞集合体をｔｒａｎｓｗｅｌｌフィルター（Ｃｏｓｔａｒ社、３４５０）に移し、３７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した。再集合体を４％ＰＦＡで固定し、染色し、共焦点顕微鏡法により撮像した。
【０１１４】
脱細胞化した腎臓の再細胞化
再細胞化実験４５では、野生型の成体ラットまたは成体マウスの死体腎をヘパリン化ＰＢＳ（１０Ｕ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社、Ｈ３３９３）で１０回洗い流し、次いで、ＳＤＳ（Ｒｏｔｈ社、２３２６．３）の１％ＰＢＳ溶液中、脱細胞化が観察されるまで３〜５日間インキュベートした。この期間の間、６〜１２時間毎に腎臓をＳＤＳの１％ＰＢＳ溶液で繰り返し洗浄した。次いで、脱細胞化した腎臓をペニシリン／ストレプトマイシンと１００μｇ／ｍｌ  Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）とを含有するＰＢＳで５回すすいだ。トリプシン処理した細胞１０６個を２５Ｇ針で注入することにより臓器足場内にｉＲＥＣを播種した後、ＭＥＦＭで１４日間培養した。検出器が高感度の７４０ｎｍの２光子レーザーで自家蛍光を励起することにより細胞外マトリックスを可視化した。
【０１１５】
撮像
２５倍／０．８ＬＤ  ＬＣＩ−Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを備えたＬＳＭ−Ｉ−ＮＬＯ２  ５１０  ＭＥＴＡ顕微鏡（ともにＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて共焦点撮像を実施した。フルオロフォア（ヘキスト３３３４２、ＧＦＰ、トマト、Ａｌｅｘａ６４７）の励起を７４０ｎｍの２光子レーザーならびにそれぞれ４８８ｎｍ、５６１ｎｍおよび６３３ｎｍの単一光子レーザーで実施した。ＺＥＮソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ社）およびＩｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）を用いて画像解析を実施した。
【０１１６】
透過型電子顕微鏡
ＭＥＦおよびｉＲＥＣの３Ｄ培養物を０．１Ｍリン酸緩衝液中、４％ＰＦＡおよび１％グルタルアルデヒドで１時間、室温にて固定した。０．１Ｍ  ＰＢで洗浄した後、培養物を７０％エタノール中、４５分間の１％ＯｓＯ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）および１％酢酸ウラニル（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ドイツ）を用いてコントラストをつけた。脱水後、培養物をＤｕｒｃｕｐａｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ドイツ）に平板包埋した。Ｐｈｉｌｉｐｐｓ  ＣＭ１００透過型電子顕微鏡を用いて超薄切片（厚さ４０ｎｍ）を解析した。
【０１１７】
データ解析
様々なヒト組織のあらゆる転写因子に関する定量的発現データ２３を解析して、候補再プログラミング因子を特定した。標的組織での絶対発現量を他の全組織の中央値で除して相対発現量を求めた。転写回路解析を既に記載されている通りに実施し３７、オンラインプラットフォームｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓ．ｏｒｇ／を用いて再プログラミング因子の予測転写標的を検索した。マイクロアレイ実験のＭＥＦとｉＲＥＣとの間の差次的発現の値を各標的にマッピングし、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅを用いて可視化した５７。オンラインプラットフォームｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｎｅｔ．ｈｍｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／を用いてＣｅｌｌＮｅｔスコアを算出した３４。差次的に調節された遺伝子と公開されているＲＮＡｓｅｑデータとの比較では、マイクロアレイ解析に基づきｉＲＥＣとＭＥＦとの間で１０倍差次的に調節された遺伝子に生データ３５、３６をマッピングした。分子機能のＧＯターム解析では、１０倍差次的に調節された遺伝子をＤＡＶＩＤプラットフォームを用いて解析した５８。ＳｉｇｍａＳｔａｔを用いて統計解析を実施し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍでグラフを作成した。スチューデントのｔ検定を用いたとき、データは正規分布を示した。複数のグループをＡＮＯＶＡにより比較する場合、分散の差を求めた。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌでデータ解析を実施した。
【０１１８】
標本サイズを予め決定するにあたっては、いかなる統計学的方法も用いなかった。解析から除外した標本は一切なかった。標本の割り当て方を決定するにあたっては、無作為化の方法を一切用いなかった。実験は無作為化しなかった。実験または解析時に研究者を盲検化することはなかった。
【０１１９】
疾患モデル化へのｉＲＥＣの使用：
上記の通りに、Ｅ１３．５胚（Ｐｋｄ１ｔｍ２Ｇｇｇ）からＰｋｄ１ｆｌ／ｆｌＭＥＦを単離し再プログラミングを実施した。ＣｒｅリコンビナーゼおよびフリッパーゼをｐＷＰＸＬｄにサブクローン化し、レンチウイルスにより形質導入した。Ａｒｉａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒを用いて９６ウェルプレート内へのクローン選択を実施した。Ｐｋｄ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化には、プライマー５’−ｃａｃ  ｃｇｔ  ｇｃｃ  ｔｇｇ  ａｇｃ  ａｇｇ  ａｃｇ  ａａａ  ｇ−３’（配列番号６３）および５’−ｃａｃ  ｃｇｔ  ｇｃｃ  ｔｇｇ  ａｇｃ  ａｇｇ  ａｃｇ  ａａａ  ｇ−３’（配列番号６４）を用いて、Ｐｋｄ２の第一エキソンを標的とするｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ−Ｐｕｒｏ構築物を作製した。これらの構築物をｌｅｎｔｉＣａｓ９−ＢｌａｓｔとともにレンチウイルスによりｉＲＥＣに発現させた。プライマー：５’−ｇｃｃａｔｇｇｔｔａａｃｔｃｃａｇａｃｇ−３’（配列番号６５）および５’−ｇｃｇｃａｇｇｃａｇｔｔｇｔｃａａｇ−３’（配列番号６６）を用いてゲノム遺伝子座を増幅した。ＰＣＲ産物にサンガーシーケンシングを実施して、標的側の後ろにインデル形成の成功を示す不規則でスクランブル状のクロマトグラムを検出した。
【０１２０】
（参考文献）
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３．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｋｉｄｎｅｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４，５３−６７（２０１４）．
４．Ｔａｋａｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｒｅｎａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｋｉｄｎｅｙ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６，１１８−１２６（２０１４）．
５．Ｔａｋａｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，５６４−５６８（２０１５）．
６．Ｘｉａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｕｒｅｔｅｒｉｃ  ｂｕｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５，１５０７−１５１５（２０１３）．
７．Ｐａｐａｄｉｍｏｕ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１５）．
８．Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ：ａ  ｒｏａｄｍａｐ  ｔｏ  ｓａｆｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２７，１０５０−１０５６（２００９）．
９．Ｘｕ，Ｊ．，Ｄｕ，Ｙ．＆  Ｄｅｎｇ，Ｈ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １６，１１９−１３４（２０１５）．
１０．Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６３，１０３５−１０４１（２０１０）．
１１．Ｎａｊｍ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ，ｍｙｅｌｉｎｏｇｅｎｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，４２６−４３３（２０１３）．
１２．Ｙａｎｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，４３４−４３９（２０１３）．
１３．Ｉｅｄａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １４２，３７５−３８６（２０１０）．
１４．Ｄｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４，３９４−４０３（２０１４）．
１５．Ｈｕａｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７５，３８６−３８９（２０１１）．
１６．Ｓｅｋｉｙａ，Ｓ．＆  Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７５，３９０−３９３（２０１１）．
１７．Ｂｕｇａｎｉｍ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｅｒｔｏｌｉ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １１，３７３−３８６（２０１２）．
１８．Ｈｅｎｄｒｙ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ  ２４，１４２４−１４３４（２０１３）．
１９．Ｈｅｉｎａｎｉｅｍｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ−ｐａｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，５７７−５８３（２０１３）．
２０．Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｃ．Ｆ．，Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ，Ｉ．Ｒ．＆  Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １２６６，７−１７（２０１２）．
２１．Ｒａｃｋｈａｍ，Ｏ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８，３３１−３３５（２０１６）．
２２．Ｌａｎｇ，Ａ．Ｈ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．＆  Ｍｅｈｔａ，Ｐ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ  ｅｘｐｌａｉｎ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｋｅｙ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １０，ｅ１００３７３４（２０１４）．
２３．Ｒａｖａｓｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｍａｎ．Ｃｅｌｌ  １４０，７４４−７５２（２０１０）．
２４．Ｒａｃｉｔｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｎｅｐｈｒｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ９，Ｒ８４（２００８）．
２５．Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＧＵＤＭＡＰ  ｄａｔａｂａｓｅ−−ａｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３８，２８４５−２８５３（２０１１）．
２６．ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＧＵＤＭＡＰ：ｔｈｅ  ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｔｏｍｙ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ  １９，６６７−６７１（２００８）．
２７．Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｋｉｄｎｅｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３９，１８６３−１８７３（２０１２）．
２８．Ｓｈａｏ，Ｘ．，Ｓｏｍｌｏ，Ｓ．＆  Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｐ．Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｒｅ／ｌｏｘ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ  １３，１８３７−１８４６（２００２）．
２９．Ｌｉｕ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ  ２  ｔｏ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ４，２１８３（２０１３）．
３０．Ｂａｒ−Ｎｕｒ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｉＰＳＣ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １１，１１７０−１１７６（２０１４）．
３１．Ｈｕａｎｇｆｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｓ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２６，７９５−７９７（２００８）．
３２．Ｈｕａｎｇ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １４，３７０−３８４．３３．Ｖａｌｅｎｔｉｃｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｔｃｈａｏ，Ｒ．＆  Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，Ｊ．Ｈｅｍｉｃｙｓｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｉｎ  ｄｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＭＤＣＫ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １００，２９１−３０４（１９７９）．
３４．Ｃａｈａｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．ＣｅｌｌＮｅｔ：ｎｅｔｗｏｒｋ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １５８，９０３−９１５（２０１４）．
３５．Ｃａｂｉｌｉ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２５，１９１５−１９２７（２０１１）．
３６．Ｓｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８８，１１６−１２０（２０１２）．
３７．Ｎｅｐｈ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｃｅｌｌ  １５０，１２７４−１２８６（２０１２）．
３８．Ｊａｉｔｏｖｉｃｈ，Ａ．＆  Ｂｅｒｔｏｒｅｌｌｏ，Ａ．Ｍ．Ｓａｌｔ，Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ８６，７３−７８（２０１０）．
３９．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｃｈｏｕ，Ｃ．Ｌ．＆  Ｋｎｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｄｅｅｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  Ｒｅｎａｌ  Ｔｕｂｕｌｅｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ：ＪＡＳＮ  ２６，２６６９−２６７７（２０１５）．
４０．Ｃｕｉ，Ｓ．，Ｖｅｒｒｏｕｓｔ，Ｐ．Ｊ．，Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．＆  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｅ．Ｉ．Ｍｅｇａｌｉｎ／ｇｐ３３０  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７１，Ｆ９００−９０７（１９９６）．
４１．Ｖａｉｄｙａ，Ｖ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８，４７８−４８５（２０１０）．
４２．Ｃｉａｒｉｍｂｏｌｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ２．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６７，１４７７−１４８４（２００５）．
４３．Ｙｏｎｅｚａｗａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒＯＣＴ２（Ｓｌｃ２２ａ２）ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７０，１８２３−１８３１（２００５）．
４４．Ｕｎｂｅｋａｎｄｔ，Ｍ．＆  Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｒｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｌｌｏｗｓ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ７７，４０７−４１６（２０１０）．
４５．Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｋｉｄｎｅｙ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９，６４６−６５１（２０１３）．
４６．Ｌｅｇｏｕｉｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｎａｌ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １６，１２（２０１５）．
４７．Ｎａｍ，Ｙ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４１，４２６７−４２７８（２０１４）．
４８．Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６，９１６−９２４（２００８）．
４９．Ｙｏｏ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＭｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７６，２２８−２３１（２０１１）．
５０．Ｌｉｅｎｋａｍｐ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｒｓｉｎ  ｒｅｌａｙｓ  Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８  ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｐｒｏｎｅｐｈｒｏｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７，２０３８８−２０３９３（２０１０）．
５１．Ｇｉｌｅｓ，Ｒ．Ｈ．，Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．＆  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｋ．３Ｄ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍＩＭＣＤ３  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｃｉｌｉｏｐａｔｈｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９，２７２５−２７３１（２０１４）．
５２．Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．＆  Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｄａｔａ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ（Ｔ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ３，１１０１−１１０８（２００８）．
５３．Ｎａｇｙ，Ａ．Ｇ．，Ｍ．；Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ，Ｋ．；Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｒ．［Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒａｓ］．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．，ｉｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ４５３−５０６（２００３）．
５４．Ａｆｇａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｇａｌａｘｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ：２０１６  ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）．
５５．Ｋｕｔｎｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｙ．＆  Ｒｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ＨＩＶ−１−ｂａｓｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４，４９５−５０５（２００９）．
５６．Ｘｉａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｕｒｅｔｅｒｉｃ  ｂｕｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９，２６９３−２７０４（２０１４）．
５７．Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ：ａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １３，２４９８−２５０４（２００３）．
５８．Ｈｕａｎｇ  ｄａ，Ｗ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｔ．＆  Ｌｅｍｐｉｃｋｉ，Ｒ．Ａ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｇｅｎｅ  ｌｉｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＡＶＩＤ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４，４４−５７（２００９）．
５９．Ｐｉｏｎｔｅｋ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｌｏｘｅｄ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  Ｐｋｄ１  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １５，３０３５−４３（２００４）．
６０．Ｒａｐｈａｅｌ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｋｄ１  ｉｎ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｕｓｅｓ  ａ  ｍｏｒｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈａｎ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ７５，６２６−３３（２００９）．
【図１−１】
2019506899.tif 000006
【図１−２】
2019506899.tif 000007
【図１−３】
2019506899.tif 000008
【図２−１】
2019506899.tif 000009
【図２−２】
2019506899.tif 000010
【図２−３】
2019506899.tif 000011
【図３−１】
2019506899.tif 000012
【図３−２】
2019506899.tif 000013
【図４−１】
2019506899.tif 000014
【図４−２】
2019506899.tif 000015
【図４−３】
2019506899.tif 000016
【図４−４】
2019506899.tif 000017
【図５−１】
2019506899.tif 000018
【図５−２】
2019506899.tif 000019
【図５−３】
2019506899.tif 000020
【図５−４】
2019506899.tif 000021
【図６−１】
2019506899.tif 000022
【図６−２】
2019506899.tif 000023
【図７−１】
2019506899.tif 000024
【図７−２】
2019506899.tif 000025
【図７−３】
2019506899.tif 000026
【図８−１】
2019506899.tif 000027
【図８−２】
2019506899.tif 000028
【図８−３】
2019506899.tif 000029
【図９】
2019506899.tif 000030
【図１０】
2019506899.tif 000031
【図１１−１】
2019506899.tif 000032
【図１１−２】
2019506899.tif 000033
【図１２−１】
2019506899.tif 000034
【図１２−２】
2019506899.tif 000035
【図１３−１】
2019506899.tif 000036
【図１３−２】
2019506899.tif 000037
【図１３−３】
2019506899.tif 000038
【図１３−４】
2019506899.tif 000039
【図１３−５】
2019506899.tif 000040
【図１４−１】
2019506899.tif 000041
【図１４−２】
2019506899.tif 000042
【図１５】
2019506899.tif 000043
【図１６】
2019506899.tif 000044
【配列表】
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【国際調査報告】
2019506899.tif 000045
2019506899.tif 000046
2019506899.tif 000047
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