(57)【要約】  ＲＳＶに対する抗体（好ましくは、完全ヒト抗体Ｒ６６）、それをコードする核酸、それを含むベクター及び宿主細胞、並びにその調製方法。上記ＲＳＶに対する抗体（好ましくは、完全ヒト抗体Ｒ６６）の、ＲＳＶ関連疾患の予防及び治療における使用、及びＲＳＶ検出における使用。上記ＲＳＶに対する抗体は、好ましくは、完全ヒトモノクローナル抗体であり、他の動物（例えば、マウス）由来の抗ＲＳＶ抗体と比べて、種差による免疫原性が大幅に減少し、特異性が良好で、親和力が高く、臨床に適用されると、副作用を大幅に軽減させることができる。
2019507103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体は、
配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１本の重鎖ＣＤＲ、及び／又は
配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１本の軽鎖ＣＤＲを含有する、抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、
配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する３本の重鎖ＣＤＲ、及び／又は
配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する３本の軽鎖ＣＤＲを含有する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含有する、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重抗体、Ｆｄ及びＦｄ’断片から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体の単一重鎖、単一軽鎖又はその抗原結合断片を有するシングルドメイン抗体、キメラ抗体、抗体融合タンパク質抗体、抗体／抗体断片−因子融合タンパク質、又は抗体／抗体断片−化学複合体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項７】
重鎖ＣＤＲをコードする、配列番号：５、配列番号：７、及び配列番号：９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び／又は
軽鎖ＣＤＲをコードする、配列番号：１１、配列番号：１３、及び配列番号：１５から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列番号：１に示される、重鎖可変領域をコードする核酸、及び／又は
配列番号：２に示される、軽鎖可変領域をコードする核酸を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸を有するベクター。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項９に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターで形質転換されたものである請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５に記載の抗体、融合タンパク質又は複合体、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、或いは請求項１０若しくは請求項１１に記載の宿主細胞の、ＲＳＶ関連疾患を予防又は治療するための治療剤の調製における使用。
【請求項１３】
前記ＲＳＶ関連疾患は、ウイルス性肺炎、間質性肺炎、細気管支炎からなる群より選択される請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０若しくは請求項１１に記載の宿主細胞の、ＲＳＶを検出するための検出試薬の調製における使用。
【請求項１５】
治療有効量に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０若しくは請求項１１に記載の宿主細胞、及び１種又は複数種の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含有する、ＲＳＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
以下のステップ（１）〜（４）を含む抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片の調製方法であって
ステップ（１）において、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ分子、及び前記ＤＮＡ分子と作動可能に連結される発現調節配列を含み、
ステップ（２）において、前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
ステップ（３）において、前記抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片の発現に適した条件下で前記宿主細胞を培養し、
ステップ（４）において、分離精製して前記抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片を得る、抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片の調製方法。
【請求項１７】
前記抗ＲＳＶ抗体は、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体である請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体又はその抗原結合断片に関し、特に、完全ヒト抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト化抗体は、ヒト抗体の対応する部分でマウス抗体における抗原特異性に対して重要でない領域を置換することにより調製することができる。このようにして得られた組換え抗体にはマウスの配列が残っているため、それを患者に投与すると、患者において免疫応答反応（ヒト抗マウス応答）を引き起こす場合が多い。従って、非ヒト配列を含まない完全ヒト抗体の調製が望まれている。ヒト化抗体について、例えば、ファージディスプレイ技術によりヒト抗体ライブラリーを構築して選別することにより、ヒト化抗体を得ること、免疫ヒトドナー由来のリンパ球を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植することにより、ヒト化抗体を得ること、又は、遺伝子工学技術により、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作ることでヒト化抗体を得ることが報告されている。病原性抗原に対する完全ヒト化抗体は、臍帯血を大量に選別してＩｇＭ天然成分全体を含む臍帯血を分離することにより得ることもできる（例えば、米国特許Ｎｏ．６，３９１，６３５を参照）。しかし、上記方法では、低親和性抗体を得たり、特定の免疫応答を有するヒトドナーに依存する必要があったりする問題がある。
【０００３】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ；「合胞体ウイルス」と略称され、パラミクソウイルス科に属する）は、小児のウイルス性肺炎を引き起こす最も一般的な病原であり、間質性肺炎及び細気管支炎を引き起こすことができる。北京では、４８％のウイルス性肺炎及び５８％の細気管支炎が合胞体ウイルスにより引き起こされ（１９８０〜１９８４）、広州では、小児肺炎及び細気管支炎の３１．４％が合胞体ウイルスにより引き起こされ（１９７３〜１９８６）、米国では、２０％〜２５％の幼児肺炎及び５０％〜７５％の細気管支炎が合胞体ウイルスにより引き起こされたということである。
【０００４】
ＲＳＶ感染の潜伏期間は２〜８日（一般的に４〜６日）である。合胞体ウイルス肺炎は、典型的に、単球の間質浸潤である。主な症状は、肺胞中隔の増大及び単球を主とする間質細胞（リンパ球、形質細胞及びマクロファージを含む）の浸出である。さらに、肺胞腔に浮腫液で満たされ、硝子膜形成が観察される。いくつかの症例において、細気管支壁のリンパ球浸潤も観察された。肺内で実質的に壊死領域を伴う浮腫が現れ、肺胞の填塞、実質病変及び凹みが引き起こされる場合があった。いくつかの症例において、肺胞腔内で多核融合細胞が現れ、形状は麻疹性巨細胞と類似するが、核内封入体は見つからなかった。
【０００５】
ＲＳＶは、２つの主要な表面糖タンパク質Ｆ、Ｇを有する。２つの糖タンパク質（９０ＫＤａ及び６８ＫＤａ）は、ウイルス粒子表面に曝される。９０ＫＤａの高グリコシル化Ｇタンパク質は、ウイルス粒子を標的細胞に結合する。６８ＫＤａのＦタンパク質は、ウイルス膜と細胞との融合、及び合胞体の形成を媒介する。上記Ｆ、Ｇ表面糖タンパク質は、主要なタンパク質であり、核タンパク質Ｎ及び被覆タンパク質Ｍ２は、比較的小さい保護活性を有する。抗Ｇ糖タンパク質のモノクローナル抗体は、抗Ｆ糖タンパク質のモノクローナル抗体と比較してウイルスを中和する可能性が小さく、且つ融合活性を有しない。Ｆ糖タンパク質のアミノ酸配列は、ヒト感染に関連するＲＳＶのサブグループと約９０％の同一性を有する。
【０００６】
現在市販されている唯一の抗ＲＳＶモノクローナル抗体は、未熟児のＲＳＶ感染予防のためにのみ承認されている、抗Ｆタンパク質抗体である。該抗体は、名称がパリビズマブＳｙｎａｇｉｓ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ製）で、ヒト化マウスモノクローナル抗体であり、呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質によりウイルスの下気道への拡散を阻止する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片、好ましくは抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の一態様は、抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片に関する。上記抗体は、
配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１本の重鎖ＣＤＲ、及び／又は
配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１本の軽鎖ＣＤＲを含有する。
【０００９】
さらに、上記抗体又はその抗原結合断片において、上記抗体は、
配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する３本の重鎖ＣＤＲ、及び／又は
配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する３本の軽鎖ＣＤＲを含有する。
【００１０】
好ましくは、上記抗体又はその抗原結合断片において、
配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び／又は配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、上記抗体は、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体Ｒ６６である。
【００１１】
必要に応じて、本発明の上記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重抗体、Ｆｄ及びＦｄ’断片から選択される。
【００１２】
本発明の別の態様は、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体Ｒ６６に関する。モノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖、軽鎖（ＫＡＰＰＡ）の核酸配列は、それぞれ配列番号：１、及び配列番号：２に示され、その対応する重鎖、軽鎖（ＫＡＰＰＡ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３、及び配列番号：４に示される。
【００１３】
本発明は、上記Ｒ６６抗体への重鎖及び／又は軽鎖アミノ酸配列の導入、置換及び／又は欠失により形成される、同じ機能を有する抗体にも関する。
【００１４】
本発明は、上記Ｒ６６抗体の抗原結合断片、特にＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重抗体、Ｆｄ及びＦｄ’断片からなる群より選択される抗原結合断片にも関する。
【００１５】
本発明は、上記抗体（好ましくは、Ｒ６６）の単一重鎖及び／又は単一軽鎖を有するシングルドメイン抗体、キメラ抗体、抗体融合タンパク質抗体、抗体／抗体断片−因子融合タンパク質、又は抗体／抗体断片−化学複合体にも関する。
【００１６】
本発明は、上記抗体をコードする核酸を提供する。該核酸は、
重鎖ＣＤＲをコードする、配列番号：５、配列番号：７、及び配列番号：９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び／又は
軽鎖ＣＤＲをコードする、配列番号：１１、配列番号：１３、及び配列番号：１５から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含有する。
【００１７】
好ましくは、本発明の上記核酸は、
配列番号：１に示される、重鎖可変領域をコードする核酸、及び／又は配列番号：２に示される、軽鎖可変領域をコードする核酸を含有する。
【００１８】
本発明の別の態様は、抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）の調製方法を提供する。該調製方法は、以下のステップ（１）〜（４）を含む。
ステップ（１）において、発現ベクターを提供し、上記発現ベクターは、本発明の抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）をコードするＤＮＡ分子、及び上記ＤＮＡ分子と作動可能に連結される発現調節配列を含有する。
ステップ（２）において、上記発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。
ステップ（３）において、上記抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）の発現に適した条件下で上記宿主細胞を培養する。
ステップ（４）において、分離精製して上記抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）を得る。
【００１９】
本発明の別の態様は、本発明の抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）の核酸配列を有するベクター、及び上記核酸配列又はベクターを有する宿主細胞を提供する。
【００２０】
上記ベクターは、組換え発現ベクターであり得る。
【００２１】
上記宿主細胞は、２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝癌細胞、５４９Ａ細胞、３Ｔ３細胞、及び他の様々な細胞系であり得る。
【００２２】
本発明の別の態様は、本発明の抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）、核酸、ベクター又は宿主細胞の、ＲＳＶ関連疾患を予防又は治療するための治療剤の調製における使用に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＲＳＶ関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。該医薬組成物中の治療有効量に本発明の抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）、核酸、ベクター又は宿主細胞、及び１種又は複数種の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含有する。該薬学的に許容されるベクター又は賦形剤は、当業者に知られているものであり、生理的に相容性がある水性及び非水性ベクター、安定剤、防腐剤、可溶化剤、酸化防止剤、溶剤、分散媒体、コート層、緩衝液、血清タンパク質等を含む。
【００２４】
上記ＲＳＶ関連疾患は、ウイルス性肺炎、間質性肺炎、細気管支炎からなる群より選択される。
【００２５】
本発明の別の態様は、本発明の抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体）、核酸、ベクター又は宿主細胞の、ＲＳＶを検出するための検出試薬の調製における使用に関する。
【００２６】
本発明が提供する抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、抗ＲＳＶモノクローナル抗体）は、完全ヒト抗体であることが好ましい。該全ヒト抗体は、他の動物（例えば、マウス）由来の抗ＲＳＶ抗体と比べて、種差による免疫原性が大幅に減少し、特異性が良好で、親和力が高く、臨床に適用されると、副作用を大幅に軽減させることができる。また、本発明の抗ＲＳＶ抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）は、ＲＳＶ  Ｆ抗原に特異的に結合することができるため、ＲＳＶの診断及び検出にも良好に適用できる。人に使用されるときに、マウス抗体による副作用が発生することはない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、Ｒ６６を精製した後の電気泳動図である。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡ実験によりモノクローナル抗体Ｒ６６とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  Ａ２）との結合を検出することを示す。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ実験によりモノクローナル抗体Ｒ６６とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  ＲＳＳ−２）との結合を検出することを示す。
【図４】図４は、モノクローナル抗体Ｒ６６のＣＤＲ分析結果を示し、Ｒ６６＿ＨＣがＲ６６の重鎖、Ｒ６６＿ＫＣがＲ６６の軽鎖である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の目的、技術的解決手段、及び利点をより明らかにするために、以下、具体的な実施態様及び図面により本発明をさらに詳しく説明する。これらの説明は、例示的なもので、本発明の範囲を制限しないことが理解されるべきである。また、以下の説明では、本発明の概念を混乱させることを避けるために、既知の構造及び技術についての叙述を省略する。
【００２９】
実施例１  抗ＲＳＶ完全ヒト化抗体Ｒ６６の調製
１、Ｒ６６の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の人工合成
配列が配列番号：１に示すようなモノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖可変領域、配列が配列番号：２に示すようなモノクローナル抗体Ｒ６６の軽鎖（ＫＡＰＰＡ）可変領域の核酸配列をＧＥＮＥＷＩＺ社に人工合成してもらった。
【００３０】
人工合成して得られたＲ６６重鎖可変領域、軽鎖可変領域をテンプレートとし、それぞれＴａｑ酵素、ｄＮＴＰｓ、及びプライマーを加え、ＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲ産物を得た。
【００３１】
２、組換え抗体の発現ベクターの構築
高速ＤＮＡ産物精製キット（康為世紀から購入）によりＰＣＲ産物を回収して４０μｌのＰＣＲ産物を得た。
【００３２】
それぞれＲ６６の重鎖可変領域、軽鎖可変領域の目的断片をダブルダイジェスト（Ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。ダブルダイジェスト系は以下の通りである。ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩをそれぞれ０．５μｌ、１０＊ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを３μｌ、ＰＣＲ産物を２６μｌとし、３７℃の恒温で５ｈ保持した。
【００３３】
改変された発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）；ＧＥＮＥＷＩＺ社によって、予めヒト抗体重鎖／軽鎖の定常領域をこの発現ベクターに導入した）をダブルダイジェストした。ダブルダイジェスト系は以下の通りである。即ち、ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩをそれぞれ０．５μｌ、１０＊ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを３μｌ、ベクターを１μｇとし、３０μｌまでＨ２Ｏを添加し、３７℃の恒温で３０ｍｉｎ行う。その後、２μｌのルカリホスファターゼ及び３．５μｌの１０＊ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を加えて均一に混合し、３７℃の恒温水槽で２ｈ保持した。
【００３４】
上記目的断片及びベクターのダブルダイジェスト系で使用されたＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、１０＊ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒは、いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【００３５】
ダブルダイジェストされたＲ６６の重鎖可変領域、軽鎖可変領域の目的断片にそれぞれ１％アガロースゲル電気泳動を行い、ＵＶメーターにより結果を観察した。ナイフで目的バンドを切り出し、重量を量っておいたＥｐ管に入れ、高速アガロースゲルＤＮＡ回収キット（康為世紀から購入）により各目的断片を回収した。
【００３６】
各目的断片をそれぞれベクターに結合した。結合系は以下の通りである。即ち、ベクターを２μｌ、目的断片を１５μｌ、Ｔ４ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢから購入）を１μｌ、緩衝液を２μｌとし、均一に混合した後、１６℃の恒温水槽で２ｈ保持した。
【００３７】
各目的断片のすべての結合産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセルに加え、静かに均一に混合して、氷浴で３０ｍｉｎ保持した。４２℃で９０ｓ熱ショックした後、氷浴に速やかに置いて５ｍｉｎ保持した。次いで、８００μＬ培地を加え、３７℃で振とう（１００ｒ／ｍｉｎ）しながら１ｈインキュベートした。培養菌液を１００００ｒｐｍで１５ｓ遠心分離して８００ｕｌの上澄みを除去し、再懸濁して沈殿させ、得られた沈殿物をすべてアンピシリンナトリウム（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃のインキュベータに正方向に入れて１ｈ培養した後、転倒してコロニーがはっきりと見られるまで一晩培養した。シングルコロニーを取ってアンピシリンナトリウム（１００μｇ／ｍＬ）を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で振とうしながら１５ｈ培養した。高純度プラスミドミニキット（康為世紀から購入）でプラスミドを抽出し、Ｒ６６の重鎖（ＲＨ６６）、Ｒ６６の軽鎖（ＲＫ６６）をそれぞれ含有するプラスミドを得、シーケンシングに供した。
【００３８】
シーケンシングの結果として、モノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖可変領域、軽鎖（ＫＡＰＰＡ）可変領域の核酸配列は、それぞれ配列番号：１、及び配列番号：２に示され、対応する重鎖可変領域、軽鎖（ＫＡＰＰＡ）可変領域のアミノ酸配列分は、それぞれ配列番号：３、及び配列番号：４に示される。
【００３９】
実施例２  モノクローナル抗体Ｒ６６の発現及び精製
実施例１で得られたＲ６６の重鎖（ＲＨ６６）を含有するプラスミド及びＲ６６の軽鎖（ＲＫ６６）を含有するプラスミドにより、それぞれ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。まず、Ｏｐｔｉ−ＭｅＭ（１Ｘ）ｂｕｆｆｅｒでそれぞれプラスミド及びＰＥＩを希釈し、そしてＰＥＩ−Ｏｐｔｉ−ＭｅＭ混合物をプラスミド−Ｏｐｔｉ−ＭｅＭ混合物管にゆっくりと加え、室温で２０分間静置した後、ＰＥＩとプラスミドの混合物を細胞懸濁液に加えた。トランスフェクション時の細胞濃度は０．２５〜０．５×１０６細胞／ｍｌであり、細胞のトランスフェクションには、１ウェルあたり、Ｒ６６重鎖を含有する２．５μｇのプラスミド＋Ｒ６６軽鎖を含有する２．５μｇのプラスミド＋１０μｇのＰＥＩを用いた。トランスフェクション終了後、３７℃で４８ｈ培養した後、上澄みを収集し、ＥＬＩＳＡで上澄みを検出した。
【００４０】
ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ）を用いて発現された抗体タンパク質を精製した。Ｒ６６を発現する２９３Ｔ細胞培養物の上澄みをそれぞれ収集し、１００００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを取り、上澄みを平衡緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７．４）で平衡させたｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに加え、１０ベッド体積の同様の平衡緩衝液で洗浄し、さらに、５ベッド体積の溶出緩衝液（０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ２．５）で洗浄した後、最初の３ベッド体積を収集し、収集された溶出液に１／１０体積の中和液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ９．０）を加えて均一に混合した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に加え、５０００Ｇ、４℃で２０ｍｉｎ遠心分離し、タンパク質を濃縮し、さらにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓに上記平衡緩衝液を加え、５０００Ｇ、４℃で２０ｍｉｎ遠心分離した後、新しい平衡緩衝液を交換し、３回繰り返すことにより、それぞれ濃縮されたＲ６６抗体タンパク質を得た後、それぞれ１．５ｍｌの遠心管に移し、サンプリングしてタンパク質の含有量を測定し、その後４℃で保存した。
【００４１】
精製されたＲ６６抗体を取り電気泳動した結果を図１に示す。ここで、レーンＭは、標準タンパク質であり、レーンＲ６６は、精製されたＲ６６抗体であり、２つの明らかなバンドは、それぞれ約５０ＫＤａの重鎖及び約２２ＫＤａの軽鎖である。
【００４２】
実施例３  Ｒ６６抗体のＥＬＩＳＡ検出
使用した試薬
ＰＢＳ（１Ｘ）：ＰＢＳ（１０Ｘ）及び脱イオン水で調製される。
ＰＢＳＴ：ＰＢＳ（１Ｘ）に最終濃度が０．０５％となるまでＴｗｅｅｎ−２０を加える。
ブロッキング液：ＰＢＳ（１Ｘ）＋２％ＢＳＡ＋２％新生仔ウシ血清；使用直前に調製。
希釈液：ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ；抗体希釈用。
停止液：６ｍｌ  ９５％−９８％の濃硫酸を１８０ｍｌ水にゆっくりと加え、冷却しておく。
一次抗体：本発明により精製されたＲ６６抗体を作業濃度が１０μｇ／ｍｌになるように希釈した。
二次抗体：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入）；１．５ｍｌのＲＮａｓｅフリーの水で完全に溶解しておく。
【００４３】
ＰＢＳ（１Ｘ）（ｐＨ７．４）緩衝液でＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  Ａ２）及びＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  ＲＳＳ−２）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．から購入）を希釈してコーティング抗原とした。コーティング抗原溶液の最終濃度を２ｎｇ／μｌとし、１００μｌコーティング抗原溶液を吸い取って９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに加え、２−８℃でコーティングして一晩保持した。その後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、各ウェルに２００μｌのブロッキング液を加え、３７℃で２ｈブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＢＳＴで５回洗浄（保持時間：１分間／回）した。
【００４４】
抗体希釈液（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ）で一次抗体を１０倍に希釈した。即ち、高圧滅菌された７本の１．５ｍｌ遠心分離管を取り、各管にそれぞれ２７０μｌの抗体希釈液を加え、ワーキング溶液から３０μｌの一次抗体溶液を取り出してボルテックスミキサーで均一に混合した後、１：１０希釈と標記し、１：１０希釈の溶液から３０μｌを取って次の管に入れ、同様にしてそれぞれ１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００、１：１０００００、１：１００００００、１：１０００００００とし、１００μｌ／ウェルで対応するウェルに加え、２つの並列実験を行い、２つのブランクウェルを作り、一次抗体の代わりにＰＢＳＴを使用し、３７℃で９０ｍｉｎインキュベートした後、ＰＢＳＴで５回洗浄した。
【００４５】
抗体希釈液（ＰＢＳＴ＋１％ＢＳＡ）で二次抗体を５０００倍に希釈し、各ウェルに１００μｌを加え、３７℃で１ｈインキュベートした後、ＰＢＳＴで５回洗浄し、１００μｌ／ウェルでＴＭＢ発色液を加え、室温で１５ｍｉｎインキュベートし、その後Ｈ２ＳＯ４停止液を加えて反応を止めた。マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０値を読み取った。
【００４６】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより上記ＥＬＩＳＡ結果を分析することにより、Ｒ６６抗体及びＳｙｎａｇｉｓ抗体のＥＣ５０値を得た。
【００４７】
その結果は、発現及び精製されたＲ６６抗体とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  Ａ２）及びＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  ＲＳＳ−２）との結合には用量依存性があることを示す。それによって、Ｒ６６抗体とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  Ａ２）及びＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  ＲＳＳ−２）との結合は特異的であることが明らかになった。
【００４８】
図２から分かるように、Ｒ６６抗体とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  Ａ２）の結合のＣ５０値は０．００１７９１μｇ／ｍＬで、ＳｙｎａｇｉｓのＥＣ５０値（０．００４８８１μｇ／ｍＬ；Ｓｙｎａｇｉｓを用いて同様の条件でＥＬＩＳＡを行い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより分析して得られた値）より低い。図３から分かるように、Ｒ６６抗体とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  ＲＳＳ−２）の結合のＥＣ５０値は、それぞれ０．００１４６３μｇ／ｍＬであり、ＳｙｎａｇｉｓのＥＣ５０値（０．００１８７８μｇ／ｍＬ；Ｓｙｎａｇｉｓを用いて同様の条件でＥＬＩＳＡを行い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより分析して得られた値）より低い。これらの説明により、本発明のＲ６６抗体はＳｙｎａｇｉｓよりも高い感度を有することが明らかになった。
【００４９】
実施例４  モノクローナル抗体Ｒ６６のＣＤＲの測定：モノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲの測定
抗体可変領域の配列情報をＩｇＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６．１）に導入し、ヒト可変領域のオリジナルの配列ライブラリーと比較分析し、抗体の可変領域から３つのフレームワーク領域（ＦＲ）及び２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を画定した。その後、抗体配列をＩＭＧＴ  Ｈｉｇｈ  Ｖ−Ｑｕｅｓｔシステムに導入し、上記と同じライブラリーを用いて比較してＣＤＲ３及びＦＲ４を確定した。なお、すべての抗体配列の番号付けはＫＡＢＡＴシステムに基づく。結果を図４に示す。
【００５０】
上記結果から分かるように、このモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示され、対応するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：５、配列番号：７、及び配列番号：９に示される。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示され、対応するヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：１１、配列番号：１３、及び配列番号：１５に示される。
【００５１】
本発明の上記実施形態は本発明の原理を例示的に説明又は解釈するためのものに過ぎず、本発明を制限しないことが理解されるべきである。従って、本発明の趣旨及び範囲内で行われるいずれの変更、均等な置換、改善などはすべて本発明の保護範囲に含まれるべきである。また、本発明に添付される特許請求の範囲は、その範囲及び境界、又は当該範囲及び境界の等価形式内のすべての変形例及び修正例を含むことが意図される。
【図１】
2019507103.tif 000003
【図２】
2019507103.tif 000004
【図３】
2019507103.tif 000005
【図４】
2019507103.tif 000006
【配列表】
2019507103000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月23日(2018.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体は、
配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１本の重鎖ＣＤＲ、及び／又は
配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１本の軽鎖ＣＤＲを含有する、抗ＲＳＶ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、
配列番号：６、配列番号：８、及び配列番号：１０に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する３本の重鎖ＣＤＲ、及び／又は
配列番号：１２、配列番号：１４、及び配列番号：１６に示されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する３本の軽鎖ＣＤＲを含有する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／又は
配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含有する、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二重抗体、Ｆｄ及びＦｄ’断片から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体の単一重鎖、単一軽鎖又はその抗原結合断片を有するシングルドメイン抗体、キメラ抗体、抗体融合タンパク質抗体、抗体／抗体断片−因子融合タンパク質、又は抗体／抗体断片−化学複合体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項７】
重鎖ＣＤＲをコードする、配列番号：５、配列番号：７、及び配列番号：９から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び／又は
軽鎖ＣＤＲをコードする、配列番号：１１、配列番号：１３、及び配列番号：１５から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
配列番号：１に示される、重鎖可変領域をコードする核酸、及び／又は
配列番号：２に示される、軽鎖可変領域をコードする核酸を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸を有するベクター。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項９に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターで形質転換されたものである請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５に記載の抗体、融合タンパク質又は複合体、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、或いは請求項１０若しくは請求項１１に記載の宿主細胞の、ＲＳＶ関連疾患を予防又は治療するための治療剤の調製における使用。
【請求項１３】
前記ＲＳＶ関連疾患は、ウイルス性肺炎、間質性肺炎、細気管支炎からなる群より選択される請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０若しくは請求項１１に記載の宿主細胞の、ＲＳＶを検出するための検出試薬の調製における使用。
【請求項１５】
治療有効量に、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９に記載のベクター、又は請求項１０若しくは請求項１１に記載の宿主細胞、及び１種又は複数種の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤を含有する、ＲＳＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の別の態様は、抗ＲＳＶ完全ヒト化モノクローナル抗体Ｒ６６に関する。モノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖、軽鎖（ｋａｐｐｙ）の核酸配列は、それぞれ配列番号：１、及び配列番号：２に示され、その対応する重鎖、軽鎖（ｋａｐｐｙ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３、及び配列番号：４に示される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
実施例１  抗ＲＳＶ完全ヒト化抗体Ｒ６６の調製
１、Ｒ６６の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の人工合成
配列が配列番号：１に示すようなモノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖可変領域、配列が配列番号：２に示すようなモノクローナル抗体Ｒ６６の軽鎖（ｋａｐｐｙ）可変領域の核酸配列をＧＥＮＥＷＩＺ社に人工合成してもらった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
それぞれＲ６６の重鎖可変領域、軽鎖可変領域の目的断片をダブルダイジェスト（Ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。ダブルダイジェスト系は以下の通りである。ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩをそれぞれ０．５μｌ、１０ＸＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを３μｌ、ＰＣＲ産物を２６μｌとし、３７℃の恒温で５ｈ保持した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
改変された発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）；ＧＥＮＥＷＩＺ社によって、予めヒト抗体重鎖／軽鎖の定常領域をこの発現ベクターに導入した）をダブルダイジェストした。ダブルダイジェスト系は以下の通りである。即ち、ＮｈｅＩ／ＮｏｔＩをそれぞれ０．５μｌ、１０ＸＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを３μｌ、ベクターを１μｇとし、３０μｌまでＨ２Ｏを添加し、３７℃の恒温で３０ｍｉｎ行う。その後、２μｌのルカリホスファターゼ及び３．５μｌの１０Ｘｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を加えて均一に混合し、３７℃の恒温水槽で２ｈ保持した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
上記目的断片及びベクターのダブルダイジェスト系で使用されたＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、１０ＸＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒは、いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
各目的断片のすべての結合産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセルに加え、静かに均一に混合して、氷浴で３０ｍｉｎ保持した。４２℃で９０ｓ熱ショックした後、氷浴に速やかに置いて５ｍｉｎ保持した。次いで、８００μＬＬＢ培地を加え、３７℃で振とう（１００ｒ／ｍｉｎ）しながら１ｈインキュベートした。培養菌液を１００００ｒｐｍで１５ｓ遠心分離して８００ｕｌの上澄みを除去し、再懸濁して沈殿させ、得られた沈殿物をすべてアンピシリンナトリウム（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ固体培地に塗布し、３７℃のインキュベータに入れて一晩培養した。シングルコロニーを取ってアンピシリンナトリウム（１００μｇ／ｍＬ）を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で振とうしながら１５ｈ培養した。高純度プラスミドミニキット（康為世紀から購入）でプラスミドを抽出し、Ｒ６６の重鎖（ＲＨ６６）、Ｒ６６の軽鎖（ＲＫ６６）をそれぞれ含有するプラスミドを得、シーケンシングに供した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
シーケンシングの結果として、モノクローナル抗体Ｒ６６の重鎖可変領域、軽鎖（ｋａｐｐｙ）可変領域の核酸配列は、それぞれ配列番号：１、及び配列番号：２に示され、対応する重鎖可変領域、軽鎖（ｋａｐｐｙ）可変領域のアミノ酸配列分は、それぞれ配列番号：３、及び配列番号：４に示される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
実施例２  モノクローナル抗体Ｒ６６の発現及び精製
実施例１で得られたＲ６６の重鎖（ＲＨ６６）を含有するプラスミド及びＲ６６の軽鎖（ＲＫ６６）を含有するプラスミドにより、それぞれ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。まず、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（１Ｘ）ｂｕｆｆｅｒでそれぞれプラスミド及びＰＥＩを希釈し、そしてＰＥＩ−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物をプラスミド−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ混合物管にゆっくりと加え、室温で２０分間静置した後、ＰＥＩとプラスミドの混合物を細胞懸濁液に加えた。トランスフェクション時の細胞濃度は０．２５〜０．５×１０６細胞／ｍｌであり、細胞のトランスフェクションには、１ウェルあたり、Ｒ６６重鎖を含有する２．５μｇのプラスミド＋Ｒ６６軽鎖を含有する２．５μｇのプラスミド＋１０μｇのＰＥＩを用いた。トランスフェクション終了後、３７℃で４８ｈ培養した後、上澄みを収集し、ＥＬＩＳＡで上澄みを検出した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ）を用いて発現された抗体タンパク質を精製した。Ｒ６６を発現する２９３Ｔ細胞培養物の上澄みをそれぞれ収集し、１００００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを取り、上澄みを平衡緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、１５０ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７．４）で平衡させたｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに加え、１０ベッド体積の同様の平衡緩衝液で洗浄し、さらに、５ベッド体積の溶出緩衝液（０．１Ｍ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ２．５）で洗浄した後、最初の３ベッド体積を収集し、収集された溶出液に１／１０体積の中和液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液；ｐＨ９．０）を加えて均一に混合した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に加え、５０００ｇ、４℃で２０ｍｉｎ遠心分離し、タンパク質を濃縮し、さらにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓに上記平衡緩衝液を加え、５０００ｇ、４℃で２０ｍｉｎ遠心分離した後、新しい平衡緩衝液を交換し、３回繰り返すことにより、それぞれ濃縮されたＲ６６抗体タンパク質を得た後、それぞれ１．５ｍｌの遠心管に移し、サンプリングしてタンパク質の含有量を測定し、その後４℃で保存した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
図２から分かるように、Ｒ６６抗体とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  Ａ２）の結合のＣ５０値は１．７９１ｎｇ／ｍＬで、ＳｙｎａｇｉｓのＥＣ５０値（４．８８１ｎｇ／ｍＬ；Ｓｙｎａｇｉｓを用いて同様の条件でＥＬＩＳＡを行い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより分析して得られた値）より低い。図３から分かるように、Ｒ６６抗体とＲＳＶ−Ｆ（Ｓｔｒａｉｎ  ＲＳＳ−２）の結合のＥＣ５０値は、それぞれ１．４６３ｎｇ／ｍＬであり、ＳｙｎａｇｉｓのＥＣ５０値（１．８７８ｎｇ／ｍＬ；Ｓｙｎａｇｉｓを用いて同様の条件でＥＬＩＳＡを行い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにより分析して得られた値）より低い。これらの説明により、本発明のＲ６６抗体はＳｙｎａｇｉｓよりも高い親和性を有することが明らかになった。
【国際調査報告】
2019507103.tif 000007
2019507103.tif 000008
2019507103.tif 000009
2019507103.tif 000010
2019507103.tif 000011
2019507103.tif 000012