(57)【要約】本開示は、生体の脳回路を解析する方法を有する。本開示の方法は、光遺伝学を使用して個体の脳の第１領域を刺激して、脳の異なる領域の機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）と組み合わせて、脳の第１領域と第２領域との個々のニューロン間の動的機能的結合を判定するステップを含み得る。この方法は、脳の第３領域を同定するステップをさらに含み得て、第３領域のニューロンは第１領域と第２領域との間の動的機能的結合に介在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の脳の生体内回路解析の方法であって、
ｉ）第１セットの光パルスおよび第２セットの光パルスを用いて脳の第１領域を照射するステップであり、
前記第１セットは前記第２セットとは異なる光パルスの時間パターンを持ち、
前記第１領域は、前記第１領域のニューロンによって発現した第１光活性化ポリペプチドの活性化時に、前記第１セットおよび前記第２セットの光パルスを使用して、活動電位を生成するニューロンを含み、前記活動電位は前記第１セットおよび前記第２セットの光パルスの時間パターンを用いて定量的に拡大縮小する周波数で生成されるステップ、
ｉｉ）脳の第２領域において複数の脳領域の機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）スキャンニングを使用して、前記第１セットの光パルスによって誘発された神経活動中の第１変化と、前記第２セットの光パルスによって誘発された神経活動中の第２変化とを測定するステップ、ならびに、
ｉｉｉ）測定された第１変化と測定された第２変化との間の第１差異に基づいて、前記第１領域のニューロンから前記第２領域のニューロンへの動的機能的結合を同定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
同定するステップｉｉｉ）は、
測定された第１変化と測定された第２変化との間の前記第１差異を計算するステップ、および、
測定された第１変化と測定された第２変化とが定性的または定量的に異なる場合、前記第１領域のニューロンから前記第２領域のニューロンへの第１機能的結合は、動的機能的結合であることを判定するステップ
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１差異は、前記第１セットおよび前記第２セットの光パルスの時間パターン中の差異と比較して、非直線的である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１差異はサインの変化である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
定量的に異なる時間パターンは、光パルスの異なる周波数および／またはパルス幅を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１領域は脳の第１内部領域である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記脳の第１内部領域は、視床、感覚皮質、不確帯（ＺＩ）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、前頭前皮質（ＰＦＣ）、側座核（ＮＡｃ）、扁桃体（ＢＬＡ）、黒質、腹側淡蒼球、淡蒼球、背側線条体、腹側線条体、視床下核、海馬、歯状回、帯状回、嗅内皮質、嗅覚皮質、一次運動皮質、および小脳からなる群から選択された少なくとも一部分の領域を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１領域は、前記第１セットおよび前記第２セットの光パルスを発信するように構成された１つ以上の光ファイバーで照射される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
光パルスによって照射される前記第１領域の容積は１００ｍｍ3 以下である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１領域と前記第２領域とは解剖学的に脳の異なる領域である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１領域のニューロンは興奮性ニューロンである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
脳はニューロンを含む第３領域を有し、前記第３領域のニューロンの活動は前記第１領域のニューロンの活動によって変調されており、
ｉｖ）第３セットの光パルスを用いた前記第３領域の照射および非照射を伴って、前記第１セットの光パルスによって前記第１領域を照射するステップであり、
前記第３領域のニューロンの活動の変調は、前記第３領域の照射があると、前記第３領域のニューロンによって発現された第２光活性化ポリペプチドの活性化によって、中断されるステップ、
ｖ）前記第３領域の非照射時に、前記第１セットの光パルスによって誘発された神経活動中の第３変化と、前記第３セットの光パルスによる前記第３領域の照射を伴って、前記第１セットの光パルスによって誘発された神経活動中の第４変化とを、前記第２領域において測定するステップ、ならびに、
ｖｉ）測定された第３変化と測定された第４変化との間の第２差異に基づいて、動的機能的結合の調節結節を同定するステップであり、
前記調節結節は前記第３領域のニューロンを含み、前記第３領域のニューロンは前記第１領域および前記第２領域のニューロン間の機能的結合を有するステップ
を含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
同定するステップｖｉ）は、
測定された第３変化と測定された第４変化との間の前記第２差異を計算するステップ、および、
前記第２差異が定性的または定量的な差異である場合に、前記第３領域のニューロンは測定された第１変化に介在することを判定するステップ
を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２差異の大きさは前記第１差異より小さい請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
測定するステップｖ）は、電気生理学を使用して神経活動中の変化を測定するステップを含む請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３領域は脳の第２内部領域である請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記脳の第２内部領域は、視床、感覚皮質、不確帯（ＺＩ）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、前頭前皮質（ＰＦＣ）、側座核（ＮＡｃ）、扁桃体（ＢＬＡ）、黒質、腹側淡蒼球、淡蒼球、背側線条体、腹側線条体、視床下核、海馬、歯状回、帯状回、嗅内皮質、嗅覚皮質、一次運動皮質、および小脳、からなる群から選択された少なくとも一部分の領域を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第３領域は、前記第３セットの光パルスを発信するように構成された１つ以上の光ファイバーで照射される請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１領域と前記第２領域とは解剖学的に脳の異なる領域である請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１光活性化ポリペプチドは光活性化イオンチャネルである請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２光活性化ポリペプチドは光活性化イオンポンプである請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記個体は哺乳動物である請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記個体は麻酔をかけられている請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
個体の脳の生体内回路解析の方法であって、
ｉ）発現された光活性化ポリペプチドの光誘起活性化があると、脱分極または過分極するように構成されたニューロンを含む脳の第１領域と、脳の第２領域との間で、前記第２領域を含む複数の脳領域のｆＭＲＩスキャンニングに関連して第１ニューロン集団の神経活動の光誘起変調を使用して、動的機能的結合を判定するステップ、ならびに、
ｉｉ）動的機能的結合の調節結節を同定するステップであり、
前記調節結節は第３領域のニューロンを含み、前記第３領域のニューロンは、電気生理学および／または機能イメージングを組み合わせて神経活動の光誘起変調を使用して、前記第１領域および前記第２領域のニューロン間の機能的結合を有するステップ
を含む方法。
【請求項２５】
前記第３領域のニューロンは、光刺激に反応して脱分極または過分極するように構成される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１領域と前記第２領域とは解剖学的に脳の異なる領域である請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１領域のニューロンは興奮性ニューロンである請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
判定するステップｉ）は、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を実行するステップを含む請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
神経組織の機能研究は、定義済み刺激を用いて１つ以上のニューロンを刺激するステップと、この１つ以上のニューロンの出力反応を測定するステップとを含む。ニューロンを刺激する方法および出力反応を測定する方法は、光遺伝学、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、電気生理学、脳波検査法（ＥＥＧ）、および行動モニタリングを含む。
【０００２】
光遺伝学は光活性化ポリペプチド（チャネルとポンプ）を使用して、光依存的方法で光活性化ポリペプチドを発現するニューロン活動を変調する。
【０００３】
血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）ｆＭＲＩは、非侵襲性全脳イメージングに関して広く普及している技術である。ＢＯＬＤシグナルは、神経活動に続いて脳血流（ＣＢＦ）、脳血液量（ＣＢＶ）、および脳酸素消費量（ＣＭＲＯ2 ）の複合的変化を反映する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、生体の脳回路を解析する方法を有する。本開示の方法は、光遺伝学を使用して個体の脳の第１領域を刺激して、脳の異なる領域の機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）と組み合わせて、脳の第１領域と第２領域との個々のニューロン間の動的機能的結合を判定するステップを含み得る。この方法は、脳の第３領域を同定するステップをさらに含み得て、第３領域のニューロンは第１領域と第２領域との間の動的機能的結合に介在する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示す画像である。
【図１Ｂ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示すグラフである。
【図１Ｃ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示す画像である。
【図１Ｄ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示す図である。
【図１Ｅ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示すグラフである。
【図１Ｆ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示す図である。
【図１Ｇ】本開示の実施形態に従って、中心視床の標的刺激が正の血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）の変化および刺激部位でのニューロン発火の増加を誘発することを示すグラフである。
【図２Ａ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示す画像である。
【図２Ｂ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示す画像である。
【図２Ｃ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示す画像である。
【図２Ｄ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示す画像である。
【図２Ｅ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示すグラフである。
【図２Ｆ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示すグラフである。
【図２Ｇ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示すグラフである。
【図２Ｈ】本開示の実施形態に従って、誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付けを示すグラフである。
【図３Ａ】誘発された皮質活動のサインは、本開示の実施形態に従って、中心視床刺激の周波数に依存することを示すグラフである。
【図３Ｂ】誘発された皮質活動のサインは、本開示の実施形態に従って、中心視床刺激の周波数に依存することを示すグラフである。
【図３Ｃ】誘発された皮質活動のサインは、本開示の実施形態に従って、中心視床刺激の周波数に依存することを示す図である。
【図３Ｄ】誘発された皮質活動のサインは、本開示の実施形態に従って、中心視床刺激の周波数に依存することを示すグラフである。
【図３Ｅ】誘発された皮質活動のサインは、本開示の実施形態に従って、中心視床刺激の周波数に依存することを示すグラフである。
【図４Ａ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示す図である。
【図４Ｂ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示すグラフである。
【図４Ｃ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示すグラフである。
【図４Ｄ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示すグラフである。
【図４Ｅ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示すグラフである。
【図４Ｆ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示すグラフである。
【図４Ｇ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示すグラフである。
【図４Ｈ】本開示の実施形態に従って、不確帯（ＺＩ）において周波数依存のスピンドル状発振が誘発されることを示す画像である。
【図５Ａ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示す画像である。
【図５Ｂ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示す画像である。
【図５Ｃ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示す図である。
【図５Ｄ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示すグラフである。
【図５Ｅ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示すグラフである。
【図５Ｆ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示すグラフである。
【図５Ｇ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示すグラフである。
【図５Ｈ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示すグラフである。
【図５Ｉ】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は、本開示の実施形態に従って、正常な不確帯処理に依存することを示す画像である。
【図６Ａ】睡眠中の動物の中心視床の光遺伝学的刺激は、本開示の実施形態に従って、周波数依存の方法で脳状態を変調することを示すグラフである。
【図６Ｂ】睡眠中の動物の中心視床の光遺伝学的刺激は、本開示の実施形態に従って、周波数依存の方法で脳状態を変調することを示すグラフである。
【図６Ｃ】睡眠中の動物の中心視床の光遺伝学的刺激は、本開示の実施形態に従って、周波数依存の方法で脳状態を変調することを示すグラフである。
【図６Ｄ】睡眠中の動物の中心視床の光遺伝学的刺激は、本開示の実施形態に従って、周波数依存の方法で脳状態を変調することを示すグラフである。
【図７】ＣａＭＫＩＩａポジティブ細胞を標的としたＣｈＲ２特異性を示す画像である。
【図８】遠隔標的のＣｈＲ２−ＥＹＦＰの代表的蛍光画像を示す画像であり、右中心視床においてトランスフェクトされたリレーニューロンから前脳への大量投射を示す。
【図９Ａ】本開示の実施形態に従って、光遺伝学を用いた広範な周波数依存的前脳漸増は、中心視床の髄板内核の刺激とは異なることを示すグラフである。
【図９Ｂ】本開示の実施形態に従って、光遺伝学を用いた広範な周波数依存的前脳漸増は、中心視床の髄板内核の刺激とは異なることを示すグラフである。
【図１０Ａ】中心視床による前脳の周波数依存的漸増とそれの皮質性ＢＯＬＤシグナル極性の制御は、パルス幅が一定に保たれる場合に保存されることを示す画像である。
【図１０Ｂ】中心視床による前脳の周波数依存的漸増とそれの皮質性ＢＯＬＤシグナル極性の制御は、パルス幅が一定に保たれる場合に保存されることを示すグラフである。
【図１０Ｃ】中心視床による前脳の周波数依存的漸増とそれの皮質性ＢＯＬＤシグナル極性の制御は、パルス幅が一定に保たれる場合に保存されることを示すグラフである。
【図１１】１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された抑制期間に発生する皮質性棘波は、本開示の実施形態に従って、不均一経時分布を呈示することを示すグラフおよび図表である。
【図１２】本開示の実施形態に従って、不確帯におけるｅＮｐＨＲ発現の広視野蛍光画像を示す画像であり、一定のスケールで活性化ｅＮｐＨＲ（つまり抑制ニューロン）の推定コーンをオーバレイしてある。
【図１３】睡眠中のラットについて前置刺激活動は、刺激の複数周波数にわたって一貫性があることを示すグラフであり、本開示の実施形態に従って、デルタ、シータ、アルファ、およびベータ帯域のＥＥＧ帯域電力で定量化してある。
【図１４−１】脱分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号１〜４）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１４−２】脱分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号５〜９）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１４−３】脱分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号１０〜１４）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１４−４】脱分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号１５〜２０）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−１】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号２１〜２４）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−２】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号２５〜２８）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−３】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号２９〜３３）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−４】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号３４〜３８）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−５】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号３９〜４３）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−６】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号４４〜４８）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【図１５−７】過分極性光活性化ポリペプチドのアミノ酸配列とその誘導体（配列番号４９〜５１）を示し、これは本開示の実施形態に従って本方法で使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本開示では用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは直線形であり得て、修飾アミノ酸を有し得て、および非アミノ酸によって離断され得る。用語はまた、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、燐酸化、またはラベリング成分との接合などの任意の他の操作など、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。本開示に言う用語「アミノ酸」とは、天然および／または非天然、または合成のアミノ酸を指し、グリシン、およびＤまたはＬ光学異性体の両方、およびアミノ酸アナログとペプチドミメティクスを含む。
【０００７】
用語「遺伝子改変」とは、異種核酸（例えば細胞に外因性の核酸）の細胞への導入に続いて細胞内で誘起された永続的または一時的な遺伝子変化を指す。遺伝子変化（「改変」）は、異種核酸をホスト細胞のゲノムに埋め込むことで、または一時的または安定的に染色体外因子として異種核酸を維持することで達成され得る。ここで細胞が真核細胞の場合、永続的遺伝子変化は核酸を細胞のゲノムに導入することで達成され得る。遺伝子改変の好適な方法として、ウィルス感染、トランスフェクション、結合、原形質融合、電気穿孔法、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、および同種のものを含む。
【０００８】
「複数」とは、少なくとも２つのメンバーを含む。特定の場合において、複数は少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０6 個、少なくとも１０7 個、少なくとも１０8 個、または少なくとも１０9 個、またはそれ以上のメンバーを含み得る。
【０００９】
本開示に言う「実質的」とは、関連する基本機能を変更することがない変更を許容しうる任意の定量的発現量の改変に適用され得る。
【００１０】
本開示に言う「個体」とは、本開示に記載の方法および技術に従う任意の好適な動物であり得て、いくつかの場合では個体は、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類などを含む脊椎動物であり得る。個体は、例えばヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、サル、非人類霊長類など、任意の好適な哺乳動物であり得る。
【００１１】
本開示に言う「セット」とは、１つ以上の因子を含み得る。
【００１２】
本開示に言う「機能的」とは、生理学的に適切な、つまり生きている有機体に通常発生する処理を実施するために適切な、処理を記述するために使用され得る。処理は、基底の生理的に適切な処理を代表する、または直接または間接にその処理の読み取りである、測定された現象であり得る。
【００１３】
本開示に言う「結合」とは、例えば細胞（ニューロンを含む）、組織領域（脳領域など）、組織、臓器など、２つの異なるエンティティ間の構造的および／または機能的な関係を指し得る。２つの脳領域間の機能的関係は、２つの領域の間の直接および／または間接の構造的結合（例えばシナプス結合）によって達成され得る。
【００１４】
本開示に言う「神経活動」とは、ニューロンの電気的活動（例えばニューロンの膜電位の変化）、ならびに１つ以上のニューロンの電気的活動の間接的指標を指し得る。したがって神経活動は、電場電位の変化、細胞内イオン濃度（例えば細胞内カルシウム濃度）の変化、および例えば機能的磁気共鳴画像法において血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）シグナルによって測定される場合のように、ニューロンの電気的活動によって誘起された磁気共鳴の変化を指し得る。
【００１５】
本開示に言う「動的」とは、時間次元において変化する処理を記述するために適用され得る。
【００１６】
本開示に言う「定量的」とは、大きさによって規定される数値的特性、または大きさに関連する数値的特性を指す、または入力パターンが変化することに伴って出力が変化するシステム（例えば脳回路）を記述するための数値的特性を指す。
【００１７】
本開示に言う「定性的」とは、数量の大きさによって規定されない特性を指し得る。例えば定性的判定は、有・無またはオン・オフの結果を判定するような判定を含み得る。
【００１８】
本開示に言う「内部」とは、身体の外面の外側から視覚的または光学的にアクセスできない身体の任意の部分を指す。特定の場合において、この部分は身体の０．１ｍｍ以上の深さの表面下であり得る。
【００１９】
本発明をさらに詳細に記述する前に、本発明は、説明されている、もちろん変更し得る特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。また本開示で使用されている用語は特定の実施形態を説明するためにのみ使用されており、および本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ制限されるので、用語に制限する意図はないと理解されるべきである。
【００２０】
値範囲が与えられている場合、その間にある値は、文脈上明らかに別段の規定がない限り、下限値の単位の１／１０までその範囲の上下限の間に入り、およびその記載範囲内の他の任意の記載値またはその間にある値は本発明内に含まれると理解されるべきである。このような小範囲の上下限は別途小範囲に含まれ得るが、およびまた本発明内に含まれ、記載範囲において特別に除外された限度に従う。記載範囲が限度の一方または両方を含む場合、その含まれる限度の一方または両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００２１】
別途規定がない限り、本開示で使用されている技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を持つ。本開示に記載のものと同様または同等の方法または材料はまた、本発明の実施またはテストのために使用され得るが、ここでは好ましい方法および材料が記述される。本開示で言及されたすべての公開公報は、その公開公報が関連して引用された方法および／または材料を開示し、説明するために、参照によって本開示に組み込まれる。
【００２２】
本明細書および特許請求の範囲に言う単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の規定がない限り、複数の指示対象を含むということに留意されねばならない。したがって、例えば「１つのニューロン」への参照は、そのような複数のニューロンを含み、および「光活性化ポリペプチド」への参照は、１つ以上の光活性化ポリペプチドおよび当業者には既知のその均等物などへの参照を含む。さらに特許請求の範囲は、任意のオプション要素を除外するように起草され得ることに留意されたい。従って本明細書は、請求項要素の列挙に関連して、または「否定的」制限の使用に関連して、「もっぱら」、「のみ」、および同種の用語などのそのような排他的用語を使用するための先行詞の役割を果すことを目的とする。
【００２３】
明確にするためにいうと、別々の実施形態という文脈で記述されている本発明の特定の諸特徴も、また単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが認識されよう。逆に簡潔にいうと、単一の実施形態という文脈で記述されている本発明の様々な特徴もまた、個別に、または任意の好適な下位組み合わせにおいて提供され得る。本発明に係る実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって明確に包含されており、および各々およびすべての組み合わせが個別に明示的にここで開示されたかのように、ここに開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素のすべての下位組み合わせもまた、本発明によって明確に包含されており、および各々およびすべての下位組み合わせが個別に明示的にここで開示されたかのように、ここに開示される。
【００２４】
本開示で言及された公開公報は、それがもっぱら本出願の出願日に先立つ開示であるために提供される。このことは、本発明が先願発明によるかかる公開に先行する資格がないということを承認したと解釈してはならない。さらに、記載の公示期日は実際の公示日と異なり得るが、これは別途確認される必要がある。
【００２５】
本開示は、生体の脳回路を解析する方法を提供する。本開示の方法は、光遺伝学を使用して個体の脳の第１領域を刺激して、脳の異なる領域の機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）スキャニングと組み合わせて、脳の第１領域と第２領域との個々のニューロン間の動的機能的結合を判定するステップを含み得る。この方法は、脳の第３領域を同定するステップをさらに含み得て、この第３領域のニューロンは、電気生理学的記録法と組み合わせて光遺伝学的刺激を使用して、第１領域と第２領域との間の動的機能的結合に介在する。本方法を任意の好適な脳回路に適用することで、例えば１領域の特異的に活性化されたニューロンと、活性化されたニューロンによって動的に調節された第２領域のニューロンと、動的調節に介在する第３領域のニューロンとの間の機能的結合など、脳の異なる領域間の機能的結合を細胞レベルで明らかにし得る。
【００２６】
本開示の方法は、好適なニューロン刺激と、必要に応じて神経活動測定プロトコルとの任意の数の組み合わせを使用して、異なる脳領域間の機能的結合を判定し得る。好適なプロトコルとして、電気生理学、神経活動の光誘起変調、脳波検査法（ＥＥＧ）記録法、機能イメージング、および行動解析を含む。電気生理学は、単極、多電極、および／または電場電位記録法を含み得る。神経活動の光誘起変調は、本開示で詳しく説明したように任意の好適な光遺伝学方法を含み得る。機能イメージングは、ｆＭＲＩと、遺伝的エンコードインジケータ（例えばカルシウムインジケータ、電位インジケータ、など）を使用する任意の機能イメージングプロトコルとを含み得る。行動解析は、覚醒、記憶（水迷路アッセイなど）、コンディショニング（恐怖条件付けなど）、感覚反応（例えば視覚的、体性感覚的、聴覚的、味覚的、および／または嗅覚的キューに対する反応）に関する行動アッセイなど、任意の好適な行動アッセイを含み得る。
【００２７】
ｆＭＲＩなどのいくつかのプロトコルは、神経活動の非侵襲性で脳全体の測定代表値を提供する。電気生理学などのいくつかのプロトコルは、細胞解像度と神経活動の迅速な指標、ならびに細胞解像度と神経活動の迅速な制御を提供する。光遺伝学などのいくつかのプロトコルは、定義済みニューロン群において、空間的に標的とされ、時間的に規定された活動電位発火の制御を提供する。アッセイの適切な組み合わせは、機能的脳回路の解剖に使用され得る。いくつかの場合、この組み合わせは以下の組み合わせ、光遺伝学とｆＭＲＩ、光遺伝学と電気生理学、光遺伝学とＥＥＧ、光遺伝学と行動解析を含む。例えばＥＥＧと行動解析、ｆＭＲＩと電気生理学、電気生理学と行動解析など、任意の他の好適な組み合わせもまた、使用され得る。
【００２８】
ここに開示された方法は、前述のようにニューロン刺激と活動測定プロトコルの１つ以上との異なる組み合わせを使用することで、１つの生きた個体（例えばマウスまたはラット１匹、ヒト１人、１つの非ヒト哺乳動物）において異なる脳領域間の因果関係の解明に適する。したがっていくつかの実施形態において、脳の機能回路は単一動物において、光遺伝学とｆＭＲＩ、光遺伝学と電気生理学、光遺伝学とＥＥＧ、および光遺伝学と行動解析の１つ以上の組み合わせを使用してアッセイされる。いくつかの実施形態において、脳の機能回路は単一動物において、光遺伝学とｆＭＲＩ、光遺伝学と電気生理学、光遺伝学とＥＥＧ、および光遺伝学と行動解析のすべてを使用してアッセイされる。単一動物においてアッセイの異なる組み合わせを実施する順序は、任意の好適な順序であり得る。いくつかの場合ではアッセイの組み合わせは、光遺伝学とｆＭＲＩ、光遺伝学とＥＥＧ／光遺伝学と行動解析、および光遺伝学と電気生理学の順序で実施されるが、ここでペア「光遺伝学とＥＥＧ」と「光遺伝学と行動解析」とは、任意の順序で実施され得る。プロトコルの他の組み合わせは、プロトコルと光遺伝学の組み合わせのうち任意のものの前後の任意の好適なポイントで実施され得る。
【００２９】
概して本方法の具現例は、脳の第１領域においてニューロンの定義済みセットの光遺伝学的刺激の組み合わせを使用するステップと、ｆＭＲＩを用いて脳をスキャンすることで全脳レベルでの反応を測定して、脳の第１領域と第２領域との間の動的機能的結合を判定するステップとを含み得る。したがって第１領域のニューロンは、例えば光活性化イオンチャネルなど、光活性化ポリペプチドを含むように改変され得て、光活性化ポリペプチドは、適切な波長、照射量、および照射強度の光刺激を用いて第１領域を刺激した時に、例えば脱分極または過分極など、ニューロンの活動を変調するように構成される。いくつかの場合では、第１領域のニューロンは光活性化ポリペプチドを発現する。いくつかの場合では第１領域のニューロンは、例えば光活性化ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列と、任意の他の適切な調節因子とを含むＤＮＡ構築物のウィルス感染などによって、遺伝子的に改変されて、光活性化ポリペプチドを発現する。本開示で詳しく記述したように、任意の好適な光活性化ポリペプチドが使用され得る。
【００３０】
光活性化ポリペプチドの活性化に使用される光刺激は、例えば周波数、パルス幅、デューティサイクル、波長、強度などを特徴とする光パルスを含み得る。いくつかの場合では光刺激は、２つ以上の異なる光パルスのセットを含み、光パルスの各セットは光パルスの異なる時間パターンを特徴とする。時間パターンは、周波数、期間（つまり光刺激の全期間）、パルス幅、デューティサイクルなどを含むがそれに限定されない任意の好適なパラメータを特徴とし得る。
【００３１】
１セットの光パルスの特性の変動は、照射されたニューロン活動の差異に反映し得る。ニューロンが光活性化ポリペプチドの活性化によって脱分極されるいくつかの場合では、光パルスの周波数の増加は照射されたニューロンにおいて活動電位発火の周波数の増加を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、照射されたニューロンにおいて活動電位発火の周波数は、光パルスの周波数の増加に定量的に対応する。いくつかの場合では光パルスの周波数の直線的増加は、照射されたニューロンにおいて活動電位発火の周波数における直線的、または非直線的ではあるが単調な、増加を誘起し得る。
【００３２】
異なる光パルスのセットによる刺激に対する反応は、脳の異なる領域についてｆＭＲＩによって測定され得て、および各領域における反応の比較は、脳の第１領域と、１つ以上の他の領域とへの光刺激によって刺激されたニューロン間の機能的結合を示し得る。光刺激が時間パラメータ（例えば周波数またはパルス幅の変化）によって定量的に異なる光パルスセットを含むいくつかの場合では、ｆＭＲＩによって測定された場合に、直線的でない（例えば第１領域における興奮性ニューロンの活動電位発火振動数の増加は、第２領域における反応の対応する増加を招かない）脳の第２領域における光刺激への反応は、第１領域のニューロンの活動電位発火の時間パターンによっては、第１領域のニューロンと第２領域のニューロンとの間に機能的結合があることを示し得る。光パルスの変動とｆＭＲＩ反応の変動との間の非直線的関係は、非単調な関係または定性的関係であり得る。いくつかの場合では光パルスの定量的変化は、ｆＭＲＩ血液酸素濃度依存性（ＢＯＬＤ）反応（例えば正または負のＢＯＬＤ反応は、光パルスの周波数によって測定される）のサインの変化を引き起こし得る。
【００３３】
例えば第１セットの光パルスおよび異なる時間パターンを持つ第２セットの光パルスを用いて脳の第１領域が照射されると、第１領域のニューロンは、第１セットと第２セットの光パルスによって誘起された活動電位を生成し得る。次いでｆＭＲＩは、脳の第２領域における活動を測定するために使用され得る。いくつかの場合では、第２領域における第１セットの光パルスによって誘起された神経活動の第１変化は、ｆＭＲＩによって測定され得る。加えて第２領域における第２セットの光パルスによって誘起された神経活動の第２変化もまたｆＭＲＩによって測定され得る。いくつかの適用例において、神経活動における測定された第１変化と神経活動における測定された第２変化との間に差があり得る。神経活動における測定された第１変化と神経活動における測定された第２変化との間の差に基づいて、脳の第１領域と脳の第２領域とのニューロン間の動的機能的結合が同定され得る。例えば脳の第１領域と脳の第２領域とのニューロン間の動的機能的結合は、神経活動における測定された第１変化と測定された第２変化との間の差を計算することによって同定され得る。神経活動における測定された第１変化と測定された第２変化との間の計算された差が定性的または定量的に異なる場合、これは脳の第１領域のニューロンから脳の第２領域のニューロンへの動的機能的結合が存在するということの指標であり得る。
【００３４】
いくつかの場合では光刺激は、２セットの光パルスを含み、２セットは光パルスの周波数が異なるなど、異なるパラメータ値を有する特徴がある。２セットの光パルスの周波数が相違する場合、デューティサイクルは同じであったり、相違したりし得る。いくつかの場合では周波数が異なる２セットの光パルスは、パルス幅が同じである。他の事例において、周波数が異なる２セットの光パルスはパルス幅が異なる。
【００３５】
１セットの光パルスは、任意の好適な周波数を有し得る。いくつかの場合では１セットの光パルスは、光刺激期間全体を通して維持された単一パルスの光を含む。いくつかの場合では１セットの光パルスは、例えば０．５Ｈｚ以上、１Ｈｚ以上、５Ｈｚ以上、１０Ｈｚ以上、２０Ｈｚ以上、３０Ｈｚ以上、４０Ｈ以上、５０Ｈｚ以上、または６０Ｈｚ以上、または７０Ｈｚ以上、または８０Ｈｚ以上、または９０Ｈｚ以上、または１００Ｈｚ以上など０．１Ｈｚ以上の周波数を有し、および例えば１０，０００Ｈｚ以下、１，０００Ｈｚ以下、５００Ｈｚ以下、４００Ｈｚ以下、３００Ｈｚ以下、２００Ｈｚ以下、１００Ｈｚなど１００，０００Ｈｚ以下の周波数を有する。いくつかの場合では１セットの光パルスは、例えば１〜１０，０００Ｈｚ、１〜１，０００Ｈｚ、５〜５００Ｈｚ、または１０〜１００Ｈｚなど０．１〜１００，０００Ｈｚの範囲の周波数を有する。
【００３６】
いくつかの場合では２セットの光パルスは、異なるパルス幅など、異なるパラメータ値を有する特徴がある。２セットの光パルスのパルス幅が異なる場合、２セットの光パルスのデューティサイクルは同じであったり、相違したりし得る。いくつかの場合ではパルス幅が異なる２セットの光パルスは、周波数が同じである。他の事例において、パルス幅が異なる２セットの光パルスは、周波数が異なる。
【００３７】
光パルスは、任意の好適なパルス幅を有し得る。いくつかの場合ではパルス幅は、例えば０．５ｍｓ以上、１ｍｓ以上、３ｍｓ以上、５ｍｓ以上、７．５ｍｓ以上、１０ｍｓ以上、を含む１５ｍｓ以上、または２０ｍｓ以上、または２５ｍｓ以上、または３０ｍｓ以上、または３５ｍｓ以上、または４０ｍｓ以上、または４５ｍｓ以上、または５０ｍｓ以上など０．１ｍｓ以上であり、および例えば１００ｍｓ以下、９０ｍｓ以下、８０ｍｓ以下、７０ｍｓ以下、６０ｍｓ以下、５０ｍｓ以下、４５ｍｓ以下、４０ｍｓ以下、３５ｍｓ以下、３０ｍｓ以下、２５ｍｓ以下、２０ｍｓ以下など、５００ｍｓ以下である。いくつかの実施形態において、パルス幅は例えば０．５〜１００ｍｓ、１〜８０ｍｓ、１〜６０ｍｓ、または１〜５０ｍｓ、または１〜３０ｍｓなど０．１〜５００ｍｓの範囲である。
【００３８】
いくつかの場合では２セットの光パルスは、異なるデューティサイクルなど、異なるパラメータ値を有する特徴がある。デューティサイクルは、パルス化シグナルについての「定時」に関する百分率（比）であり、および以下のように計算され得る。
デューティサイクル＝（パルス幅）／周波数
【００３９】
２セットの光パルスのデューティサイクルが異なる場合、２セットの光パルスのパルス幅および／または周波数は同じであったり、相違したりし得る。いくつかの場合では異なるデューティサイクルを有する２セットの光パルスは、パルス幅が異なり、および周波数が異なる。他の事例において、異なるデューティサイクルを有する２セットの光パルスは、パルス幅が異なり、および周波数が同じである。他の事例において、異なるデューティサイクルを有する２セットの光パルスは、パルス幅が同じで、および周波数が異なる。
【００４０】
いくつかの場合では２セットの光パルスは、同じデューティサイクルを有する特徴がある。２セットの光パルスのデューティサイクルが同じ場合、２セットの光パルスのパルス幅および／または周波数は相違し得る。いくつかの場合では同じデューティサイクルを有する２セットの光パルスは、パルス幅が異なり、および周波数も異なる。
【００４１】
パルスのデューティサイクルは、任意の好適なデューティサイクルであり得る。いくつかの場合ではデューティサイクルは、例えば５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、または３０％以上、または３５％以上、または４０％以上、または４５％以上、または５０％以上など１％以上であり、および例えば７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、６５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、または３５％以下、または３０％以下など、８０％以下であり得る。特定の実施形態において、デューティサイクルは例えば５〜７０％、５〜６０％、１０〜５０％、または１０〜４０％など、１〜８０％の範囲である。
【００４２】
光パルスを脳の領域に送信する光ファイバーの先端で測定した場合の、光パルスの平均電力値は、任意の好適な電力であり得る。いくつかの場合ではこの電力は例えば０．５ｍＷ以上、１ｍＷ以上、１．５ｍＷ以上、２ｍＷ以上、または２．５ｍＷ以上、または３ｍＷ以上、または３．５ｍＷ以上、または４ｍＷ以上、または４．５ｍＷ以上、または５ｍＷ以上など０．１ｍＷ以上であり得て、および例えば５００ｍＷ以下、２５０ｍＷ以下、１００ｍＷ以下、５０ｍＷ以下、４０ｍＷ以下、３０ｍＷ以下、２０ｍＷ以下、１５ｍＷ以下、１０ｍＷ以下、または５ｍＷ以下など１，０００ｍＷ以下であり得る。いくつかの実施形態において、この電力は例えば０．５〜１００ｍＷ、０．５〜５０ｍＷ、１〜２０ｍＷ、１〜１０ｍＷ、または１〜５ｍＷなど、０．１〜１，０００ｍＷの範囲である。
【００４３】
光パルスの波長および強度は変化し得て、および光活性化ポリペプチドの活性化波長、脳の領域の光透過性、脳の照射される所望の容積、などに依存し得る。
【００４４】
光パルスによって照射された脳領域の容積は、任意の好適な容積であり得る。いくつかの場合では照射された容積は、例えば０．００５ｍｍ3 以上、０．００１ｍｍ3 以上、０．００５ｍｍ3 以上、０．０１ｍｍ3 以上、０．０５ｍｍ3 以上、０．１ｍｍ3 以上など、０．００１ｍｍ3 以上であり、および例えば５０ｍｍ3 以下、２０ｍｍ3 以下、１０ｍｍ3以下、５ｍｍ3 以下、１ｍｍ3 以下、０．１ｍｍ3 以下など１００ｍｍ3 以下である。特定の場合では、照射された容積は、例えば０．００５〜２０ｍｍ3 、０．０１〜１０ｍｍ3 、０．０１〜５ｍｍ3 、０．０５〜１ｍｍ3 など、０．００１〜１００ｍｍ3 の範囲である。
【００４５】
本方法の別の態様として、前述のように第１領域と第２領域との間の動的機能的結合に介在し得る脳の第３領域においてニューロンを同定するステップを含む。したがって、第３領域のニューロンは、例えば第１領域と第２領域との間の動的機能的結合の調節結節などの結節を表すと言い得て、第３領域のニューロンは第１領域および第２領域両方への機能的結合を有する。いくつかの場合では、動的機能的結合の調節結節を同定するステップは、前述のように電気生理学、神経活動の光誘起変調、ＥＥＧ、機能イメージング（例えばｆＭＲＩ）、および行動解析の１つ以上を使用するステップを含み得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、第１領域と第２領域との間の動的機能的結合に介在し得る脳の第３領域におけるニューロンは、第１領域と第２領域との間の機能的結合の動的特性に基づいて、第３領域のニューロンの平常活動を中断させる効果を測定することで同定され得る。第３領域のニューロンの平常活動が動的機能的結合にとって必要な場合、第３領域のニューロンは動的機能的結合の調節結節を表し得る。
【００４７】
第３領域のニューロンの平常活動は、任意の好適な方法を使用して中断され得る。いくつかの場合ではこの活動は、例えば第３領域のニューロンにおいて、光活性化ポリペプチドを活性化させるための適切な光刺激を用いた第３領域の照射を介して、正常に活性化されたニューロンに対する光活性化イオンポンプなど、光活性化ポリペプチドを活性化することで中断される。第２領域におけるニューロン反応の変化を、第１領域のニューロンにおいて光活性化ポリペプチドを活性化する第１セットの光パルスと比較することで、第１領域と第２領域との間の動的機能的結合における第３領域のニューロンの役割は、第３領域を照射する第３セットの光パルスの有無で、判定され得る。したがって、第３領域のニューロンの平常活動を中断させる第３領域の照射が、第２領域におけるニューロンの第１セットの光パルスに対する反応を減少、終止、またはさもなければ変更させる場合、第３領域のニューロンは動的機能的結合に介在し得る。いくつかの場合では第２領域におけるニューロンの第１セットの光パルスに対する反応は、例えば３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、および１００％以内など、２０％以上減少され得る。いくつかの場合では第２領域におけるニューロンの第１セットの光パルスに対する反応は、サインの変化を含み得る（例えば、第３領域のニューロンの平常活動による発火頻度の減少が、第３領域のニューロンの平常活動の中断により発火頻度の増加に切り替わる）。
【００４８】
例えば、脳の第３領域における調節結節の有無は、光パルスのセットを用いて脳の第３領域を照射したり、照射しないことで、脳の第１領域（脳の第２領域への動的機能的結合がある）を照射することで判定され得る。第１セットの光パルスを用いた脳の第１領域の照射があると、第１領域のニューロンは第１セットの光パルスによって誘起された活動電位を生成し得る。加えて脳の第３領域は、同時に第３セットの光パルスによって照射され得る。第３領域の照射があると、第３領域のニューロンの活動は、例えば本開示で記述されているように、第３領域におけるニューロンが光活性化ポリペプチドを発現すると、中断され得る。次いで神経活動は、脳の第１領域と動的機能的に結合する脳の第２領域において（例えばｆＭＲＩで）測定され得る。例えばｆＭＲＩは、脳の第２領域において第１セットの光パルスによって誘起された神経活動における第３変化を、脳の第３領域を照射することなしに、測定するために使用され得る。いくつかの場合では、脳の第３領域を照射せずに、脳の第２領域において第１セットの光パルスによって誘起された神経活動の測定された第３変化は、脳の第１領域と第２領域との間の動的機能的結合のベースライン測定を提供する。加えて第２領域において第１セットの光パルスによって誘起された神経活動における第４変化もまた、脳の第３領域を第３セットの光パルスによって照射している間に測定され得る。いくつかの適用例において、神経活動における測定された第３変化と測定された神経活動における測定された第４変化との間に差があり得る。神経活動における測定された第３変化と神経活動における測定された第４変化との間の差に基づいて、脳の第３領域における調節結節が同定され得る。脳の第３領域における調節結節の存在は、脳の第３領域と脳の第１領域との間の機能的結合および／または脳の第３領域と脳の第２領域との間の機能的結合の指標であり得る。例えば脳の第３領域における調節結節は、神経活動における測定された第３変化と測定された第４変化の間の差を計算することによって同定され得る。神経活動における測定された第３変化と測定された第４変化との間の計算された差が定性的または定量的に異なる場合、これは脳の第３領域において調節結節が存在するということの指標であり得る。例えば、神経活動における測定された第３変化と測定された第４変化との間の計算された差が定性的または定量的に異なる場合、これは、脳の第３領域と脳の第１領域との間に機能的結合があり、および／または脳の第３領域と脳の第２領域との間に機能的結合があることの指標であり得る。
【００４９】
光遺伝学的刺激は、任意の好適な方法を使用して実施され得る。好適な方法は、例えば米国特許第８，８３４，５４６号に記載されており、その特許を参照によってここに組み込む。脳の好適な領域のニューロンの活動は光によって変調されるが、このニューロンは便利な方法を使用して光活性化ポリペプチドを発現するように改変され得る。いくつかの場合では脳領域のニューロンは、遺伝子的に改変されて光活性化ポリペプチドを発現する。いくつかの場合ではニューロンは、例えば光活性化ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、遺伝子的に改変され得る。ウイルスベクターは、細胞型、時期、誘発因子の存在などに従って光活性化ポリペプチドの発現を制御する任意の好適な制御因子（例えばプロモーター、エンハンサー、組換え部位など）を含み得る。
【００５０】
好適なニューロン特異的制御配列は、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えばＥＭＢＬ  ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照；また例えば米国特許第６，６４９，８１１号、米国特許第５，３８７，７４２号も参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；神経フィラメントプロモーター（例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモーター（例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：７−１９；およびＬｌｅｗｅｌｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６：１１６１を参照）；セロトニン受容体プロモーター（例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えばＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：２３６３−２３８４（１９８７）およびＮｅｕｒｏｎ  ６：５８３−５９４（１９９１）を参照）；ＧｎＲＨプロモーター（例えばＲａｄｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３４０２−３４０６（１９９１）を参照）；Ｌ７プロモーター（例えばＯｂｅｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：２２３−２２６（１９９０）を参照）；ＤＮＭＴプロモーター（例えばＢａｒｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６４８−３６５２（１９８８）を参照）；エンケファリンプロモーター（例えばＣｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：３７９３−３８０５（１９８８）を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子−βプロモーター（例えばＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：５２−６０を参照）；運動ニューロン−特異的遺伝子Ｈｂ９プロモーター（例えば米国特許第７，６３２，６７９号；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１：３２９５−３３０６を参照）；およびＣａ（2+）−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩα）プロモーターのαサブユニット（例えばＭａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３２５０を参照）、を含むがそれだけに限らない。他の好適なプロモーターとして、伸張因子（ＥＦ）１αおよびドーパミン輸送体（ＤＡＴ）プロモーターを含む。
【００５１】
いくつかの場合では光活性化ポリペプチドの細胞型特異的発現は、例えばＣｒｅ−Ｌｏｘ組換え、Ｆｌｐ−ＦＲＴ組換えなど、組換えシステムを使用することで達成され得る。組換えを使用した遺伝子の細胞型特異的発現は、例えばＦｅｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ｊｕｌ；１１（７）：７６３；およびＧｏｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｅｈａｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５  Ｊｕｌ  ２；９：１５２に記載されており、これらを参照によってここに組み込む。
【００５２】
いくつかの場合では光活性化ペプチドを含むニューロンのある脳の領域は、１つ以上の光ファイバーを使用して照射される。光ファイバーは任意の好適な方法で、例えばレーザー光源または発光ダイオード（ＬＥＤ）光源など、好適な光源から発射された光を脳の領域に導くように構成され得る。光ファイバーは任意の好適な光ファイバーであり得る。いくつかの場合では光ファイバーは、マルチモード光ファイバーである。光ファイバーはコア径を規定するコアを含み得て、光源からの光はコアを通り抜ける。光ファイバーは任意の好適なコア径を有し得る。いくつかの場合では光ファイバーのコア径は、例えば２０μｍ以上、３０μｍ以上、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、８０μｍ以上など１０μｍ以上であり、および例えば５００μｍ以下、２００μｍ以下、１００μｍ以下、７０μｍ以下など１，０００μｍ以下である。いくつかの実施形態において、光ファイバーのコア径は、例えば２０〜５００μｍ、３０〜２００μｍ、４０〜１００μｍなど１０〜１，０００μｍの範囲である。
【００５３】
特定の実施形態において、クラッデングは光ファイバーのコアの少なくとも一部分を囲む。例えばクラッデングは、実質的に光ファイバーの外周面全体を囲み得る。いくつかの場合ではクラッデングは、光源から光を受信する光ファイバー先端、および脳の標的領域にあるニューロンに光を発信する光ファイバーの対向する端など、光ファイバーの端には存在しない。クラッデングは、任意の好適なタイプのクラッデングであり得る。いくつかの場合では、クラッデングは光ファイバーのコアより屈折率が低い。クラッデングの好適な材料として、プラスチック、樹脂、および同種のもの、およびそれらの組み合わせを含むがそれだけに限らない。
【００５４】
いくつかの場合では光ファイバーは、外側コーティングを含む。外側コーティングは、クラッデング表面に配置され得る。コーティングは、実質的に光ファイバーの外周面全体を囲み得る。いくつかの場合ではコーティングは、光源から光を受信する光ファイバー先端、および脳の標的領域にあるニューロンに光を発信する光ファイバーの対向する端など、光ファイバーの端には存在しない。コーティングは生物学的に適合するコーティングであり得る。生物学的に適合するコーティングとして、組織、液体、または光ファイバーが差し込まれた対象に存在する他の物質に有意には反応しないコーティングを含む。いくつかの場合では生物学的に適合するコーティングは、光ファイバーが使用されている周辺環境に対して不活性の（つまり実質的に反応しない）材料から構成される。
【００５５】
脳の標的領域に埋め込まれた光ファイバーの端部は、光ファイバーを通して出力された光刺激を用いて、脳の領域を照射するために好適な任意の好適な構成を有し得る。いくつかの場合では光ファイバーは、光ファイバーの遠位端にまたはその近傍にある取付け装置を含み、光ファイバーの遠位端は対象に差し込まれた端部に対応する。いくつかの場合では取付け装置は光ファイバーに接続するように構成され、および対象の頭部など対象への光ファイバーの取り付けを容易にする。任意の好適な取付け装置が使用され得る。いくつかの場合では取付け装置は、例えば金属の口金、セラミックの口金、またはプラスチックの口金などの口金を含む。口金は、光ファイバーを保持して取り付けるために好適な任意の寸法を有し得る。いくつかの場合では口金は、例えば０．７５〜２．５ｍｍ、または１〜２ｍｍなど、０．５〜３ｍｍの範囲の直径を有する。
【００５６】
特定の実施形態において、本開示の方法は、任意の好適な電子部品を使用して脳の領域を照射するように使用される様々な光部品を制御および／または調整するように実施され得る。光部品（例えば光源、光ファイバー、レンズ、対物レンズ、ミラー、および同種のもの）は、例えば光パルスを用いて脳の領域を照射する光源を調整するために、制御部によって制御され得る。この制御部は光源の駆動部を含み得て、この駆動部は、光パルスの周波数、パルス幅、デューティサイクル、波長、強度などを含むがそれに限定されない、光パルスに関連する１つ以上のパラメータを制御する。制御部は、光源の部品（例えばコリメータ、シャッター、フィルタホイール、可動ミラー、レンズなど）と通信し得る。
【００５７】
演算ユニット（例えばコンピュータ）は、本開示の方法において、１つ以上の制御部を通して光刺激を制御および／または調整するため、およびｆＭＲＩによる脳の領域のスキャンからのデータを解析するために使用され得る。演算ユニットは、測定されたｆＭＲＩ画像を解析する任意の好適な部品を含み得る。したがって演算ユニットは、以下のもののうち１つ以上、プロセッサ、コンピュータ可読媒体などの非一時的コンピュータ可読メモリー、キーボード、マウス、タッチパネルなどの入力装置、モニター、画面、スピーカーなどの出力装置、有線または無線のネットワークインターフェースなどのネットワークインターフェース、および同種のものを含み得る。
【００５８】
ｆＭＲＩは、任意の好適な方法を使用して実施され得る。好適な方法は、例えば米国特許第８，８３４，５４６号に記載されており、その特許を参照によってここに組み込む。
【００５９】
本方法（光遺伝学的に神経活動を刺激するおよび／または測定するため）における脳の関心領域は変化し得て、および任意の好適な領域であり得る。特定の実施形態において、脳領域は、解剖的および／または機能的に規定された脳の領域である。例えばここで記述されているように光パルスによって照射された脳の第１領域と脳の第２領域とは、解剖的に脳の異なる領域であり得る。同様にいくつかの適用例において、脳の第３領域は第１領域と第２領域との間の動的機能的結合を調節するが、その第３領域は脳の第１領域および第２領域とは解剖的に別個であり得る。脳が哺乳類の脳であるいくつかの場合では、脳の関心領域は、視床（中心視床を含む）、感覚皮質（体性感覚皮質を含む）、不確帯（ＺＩ）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、前頭前皮質（ＰＦＣ）、側座核（ＮＡｃ）、扁桃体（ＢＬＡ）、黒質、腹側淡蒼球、淡蒼球、背側線条体、腹側線条体、視床下核、海馬、歯状回、帯状回、嗅内皮質、嗅覚皮質、一次運動皮質、および小脳、の少なくとも一部分から選択される。いくつかの場合では異なる脳領域（例えば第１脳領域および第２脳領域）は最小でも、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、７つ以上など１つ以上のシナプス結合によって分離されており、および最小でも例えば１２個以下、１０個以下、８つ以下、６つ以下など、１５個以下のシナプス結合によって分離される。いくつかの実施形態において、異なる脳領域は最小でも例えば１〜１２シナプス結合、１〜１０シナプス結合、２〜８シナプス結合、３〜６シナプス結合など、１〜１５シナプス結合によって分離される。
【００６０】
脳領域に存在する対象ニューロンは、任意の好適なタイプのニューロンであり得る。いくつかの場合ではこのニューロンは、抑制性ニューロンまたは興奮性ニューロンである。いくつかの場合ではこのニューロンは、感覚ニューロン、介在ニューロン、または運動ニューロンである。いくつかの場合ではこのニューロンは、制限なしでドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性神経、グルタミン酸作動性神経、またはペプチド作動性神経である。
【００６１】
光活性化ポリペプチド
上記で要約したように本開示の態様は、例えば発現する光活性化ポリペプチドを有するニューロンを含む様々な脳領域を含む。光活性化ポリペプチドは、光活性化イオンチャネルまたは光活性化イオンポンプであり得る。光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ポリペプチドに活性化波長の光を照射した場合に、１つ以上のイオンをニューロンの原形質膜を通過可能にすることに適する。光活性化タンパク質はイオンポンプタンパク質を特徴とし得て、このタンパク質は少数のイオンが光の光子によって原形質膜を通過することを容易にする、またはイオンチャネルタンパク質を特徴とし得て、このタンパク質はチャネルが開いている場合にイオン流が自在に原形質膜を貫流することを可能にする。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、活性化波長の光によって活性化された場合にニューロンを脱分極する。図１４は、制限なしで好適な脱分極性光活性化ポリペプチドを示す。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、活性化波長の光によって活性化された場合にニューロンを過分極する。図１５は、制限なしで好適な過分極性光活性化ポリペプチドを示す。
【００６２】
いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは青色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは緑色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは黄色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは橙色光によって活性化される。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは赤色光によって活性化される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、細胞内で発現された光活性化ポリペプチドは、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）輸出シグナル、膜輸送シグナル、および／またはＮ末端ゴルジ輸出シグナルからなる群から選択された１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合され得る。光活性化タンパク質の哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光活性化ポリペプチドのＮ末端に、Ｃ末端に、またはＮ末端とＣ末端との両方に、融合され得る。いくつかの場合では、光活性化ポリペプチドの哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、内部的に光活性化ポリペプチド内部で融合される。オプションとして光活性化ポリペプチドと１つ以上のアミノ酸配列モチーフとは、リンカーによって分離され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、タンパク質の細胞原形質膜への輸送を高める輸送シグナル（ＴＳ）の追加によって改変され得る。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含み得る。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００６５】
輸送配列は、例えば約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸など、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを持ち得る。
【００６６】
光活性化ポリペプチドと共に使用するために好適なＥＲ輸出配列は、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものを含む。ＥＲ輸送配列は、例えば約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸など、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さを持ち得る。
【００６７】
使用するために好適なシグナル配列は、以下の１つなどのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド（例えばＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳ（配列番号５９））、２）ニューロン性ニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド（例えばＭＡＧＨＳＮＳＭＡＬＦＳＦＳＬＬＷＬＣＳＧＶＬＧＴＥＦ（配列番号６０））、３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えばＭＧＬＲＡＬＭＬＷＬＬＡＡＡＧＬＶＲＥＳＬＱＧ（配列番号６４））、および４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えばＭＲＧＴＰＬＬＬＶＶＳＬＦＳＬＬＱＤ（配列番号６１））。
【００６８】
シグナル配列は、例えば約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸など、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸の長さを持ち得る。
【００６９】
いくつかの実施形態において、タンパク質中のシグナルペプチド配列は、欠失され得る、または相違するタンパク質からのシグナルペプチド配列で置換され得る。
【００７０】
光活性化ポリペプチドの実施例は、例えば国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に記載されており、この出願を参照によってここに組み込む。本開示で使用される代表的な光活性化ポリペプチドが、以下に詳細に説明される。
【００７１】
脱分極性光活性化ポリペプチド
ＣｈＲ
いくつかの態様において、脱分極性光活性化ポリペプチドはコナミドリムシに由来するが、細胞に光を照射した場合、ポリペプチドは細胞膜をはさんで陽イオンを輸送可能である。別の実施形態において光活性化ポリペプチドは、配列番号１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。コナミドリムシ由来の光活性化陽イオンチャネルタンパク質を活性化するために使用される光は、約４６０〜約４９５ｎｍの波長を有し得るか、または約４８０ｎｍの波長を有し得る。加えて、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスは、光活性化タンパク質を活性化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスを用いてのコナミドリムシ由来の光活性化陽イオンチャネルの活性化は、光活性化陽イオンチャネルを発現するニューロンの脱分極を引き起こし得る。光活性化陽イオンチャネルタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光活性化陽イオンチャネルタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えて光活性化陽イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光活性化プロトンポンプタンパク質は、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【００７２】
いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換とＥ１２３Ｔ置換とを含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換とＥ１２３Ａ置換とを含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、およびＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、およびＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換とＥ１２３Ｔ置換とを含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽イオンチャネルは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換とＥ１２３Ａ置換とを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものを含み得る。リンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【００７４】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含み得る。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【００７５】
特定の実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質は、配列番号２で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有し得る。
【００７６】
他の実施形態において、光活性化ポリペプチドは、タンパク質の網膜結合ポケットのキー位置で特異的アミノ酸置換を有し得る、階段関数オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化階段関数オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号１のアミノ酸残基Ｃ１２８で変異を有し得る。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号１でＣ１２８Ａ変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号１でＣ１２８Ｓ変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号１でＣ１２８Ｔ変異を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号１のアミノ酸残基Ｄ１５６で変異を有し得る。他の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号１のアミノ酸残基Ｃ１２８とＤ１５６との両方で変異を有し得る。一つの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号１でＣ１２８ＳとＤ１５６Ａとの変異を有する。別の実施形態においてＳＳＦＯタンパク質は、配列番号１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み得て、およびアミノ酸１２８でアラニン、セリン、またはトレオニンを含み、およびアミノ酸１５６でアラニンを含む。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号１でＣ１２８Ｔ変異を含み得る。いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は配列番号１でＣ１２８ＴとＤ１５６Ａとの変異を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ここで述べたＳＦＯタンパク質またはＳＳＦＯタンパク質は、細胞に青色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。他の実施形態において、この光は約４４５ｎｍの波長を有し得る。加えていくつかの実施形態において、ＳＦＯとＳＳＦＯ光電流の長期安定性により、この光は単一パルスの光としてまたは離隔パルスの光として出力し得る。いくつかの実施形態において、単一パルスの光または離隔パルスの光を用いたＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、開示された階段関数オプシンタンパク質と安定化階段関数オプシンタンパク質とのうち各々は、光への反応においてニューロン膜の脱分極において使用するために特異的な特性と特徴とを有し得る。
【００７９】
ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号で見つかり得て、その開示全体を参照によってここに組み込む。
【００８０】
いくつかの場合では、ＣｈＲ２ベースのＳＦＯまたはＳＳＦＯは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【００８１】
特定の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号４で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００８２】
オオヒゲマワリ光活性化ポリペプチド
いくつかの実施形態において、好適な光活性化ポリペプチドはオオヒゲマワリ（ＶＣｈＲ１）由来の陽イオンチャネルであり、例えば約５２５ｎｍ〜約５５０ｎｍ、例えば５４５ｎｍなど、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍの波長の光を用いた照射によって活性化される。いくつかの実施形態において、光活性化イオンチャネルタンパク質は、配列番号５で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列とを含む。光活性化イオンチャネルタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光活性化イオンチャネルタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えて光活性化イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光活性化イオンチャネルタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送する能力を好適に保持する。
【００８３】
いくつかの場合では、ＶＣｈＲ１光活性化陽イオンチャネルタンパク質は、配列番号５で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、およびシグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択された哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフとを含む。いくつかの実施形態において、光活性化陽子イオンチャネルは、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、光活性化イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、光活性化イオンチャネルタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、光活性化イオンチャネルタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【００８４】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列とを含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【００８５】
特定の実施形態において、ＶＣｈＲ１タンパク質は、配列番号６で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００８６】
ＶＣｈＲ１に基づく階段関数オプシンと安定化階段関数オプシン
他の実施形態において、光活性化ポリペプチドはＶＣｈＲ１に基づくＳＦＯまたはＳＳＦＯである。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５のアミノ酸残基Ｃ１２３で変異を有し得る。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５中でＣ１２３Ａ変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５中でＣ１２３Ｓ変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５中でＣ１２３Ｔ変異を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５のアミノ酸残基Ｄ１５１で変異を有し得る。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５のアミノ酸残基Ｃ１２３およびＤ１５１の両方で変異を有し得る。一つの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は配列番号５中でＣ１２３ＳとＤ１５１Ａの変異を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質またはＳＳＦＯタンパク質は、細胞に青色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。いくつかの実施形態において、光は約５６０ｎｍの波長を有し得る。加えていくつかの実施形態において、ＳＦＯとＳＳＦＯとの光電流の長期安定性により、光は単一パルスの光としてまたは離隔パルスの光として出力される。いくつかの実施形態において、単一パルスの光または離隔パルスの光を用いたＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、開示された階段関数オプシンタンパク質と安定化階段関数オプシンタンパク質とのうち各々は、光への反応においてニューロン膜の脱分極において使用するため特異的な特性と特徴とを有し得る。
【００８９】
いくつかの場合ではＶＣｈＲ１ベースのＳＦＯまたはＳＳＦＯは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【００９０】
Ｃ１Ｖ１キメラ陽イオンチャネル
他の実施形態において、光活性化陽イオンチャネルタンパク質はオオヒゲマワリのＶＣｈＲ１タンパク質由来のＣ１Ｖ１キメラタンパク質およびコナミドリムシ由来のＣｈＲ１タンパク質であり、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２の膜貫通ヘリックスによって置換された少なくとも第１および第２の膜貫通ヘリックスを有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、光に反応し、および細胞に光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質はさらに、キメラ光感受性タンパク質の第２および第３の膜貫通ヘリックス間に位置する細胞内ループドメイン内での置換を含み、細胞内ループドメインの少なくとも一部分は、ＣｈＲ１の対応する部分によって置換される。別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５に伸びるＣｈＲ１の対応する部分によって置換され得る。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質はさらに、キメラ光感受性タンパク質の第３膜貫通ヘリックス内での置換を含み、第３膜貫通ヘリックスの少なくとも一部分は、ＣｈＲ１の対応する配列によって置換される。さらに別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３に伸びるＣｈＲ１の対応する部分によって置換され得る。別の実施形態においてＣ１Ｖ１キメラタンパク質は、配列番号７で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、細胞に緑色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在する。いくつかの実施形態において、光は約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は約５４２ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、細胞に紫色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得ない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞に約４０５ｎｍの波長の光を用いて照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得ない。加えていくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスは、Ｃ１Ｖ１タンパク質を活性化するために使用され得る。
【００９２】
いくつかの場合ではＣ１Ｖ１ポリペプチドは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列とを含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【００９３】
特定の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号８で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【００９４】
Ｃ１Ｖ１多様体
いくつかの態様において、好適な光活性化ポリペプチドは置換されたまたは変異されたアミノ酸配列を含み、変異体ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持するが、またいくつかの特異的態様において変更された特性を所持し得る。例えばここで記述されている変異体光活性化Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞原形質膜上の両方で増加したレベルの発現と、異なる光波長、とりわけ赤色光に曝された場合の反応変化と、および／またはキメラＣ１Ｖ１ポリペプチドが、低脱感作と、高速解除と、他の光活性化陽イオンチャネルを用いた最小限のクロス活性化のための低紫色光活性化と、および／または動物細胞における強い発現の特性と、を有するところのその特性の組み合わせとを示し得る。
【００９５】
したがって好適な光活性化タンパク質は、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分の網膜結合ポケット全体にわたってキー位置において特異的アミノ酸置換を有し得るＣ１Ｖ１キメラ光活性化タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号７のアミノ酸残基Ｅ１２２でアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号７のアミノ酸残基Ｅ１６２で置換を含む。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号７のアミノ酸残基Ｅ１６２およびＥ１２２の両方で置換を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞に光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。いくつかの実施形態において、光は緑色光である。他の実施形態において、光は約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は約５４６ｎｍの波長を有する。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞に赤色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在する。いくつかの実施形態において、赤色光は約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質は、細胞に紫色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在しない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞に約４０５ｎｍの波長の光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在しない。加えていくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスは、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を活性化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、周波数１００Ｈｚを有する光パルスを用いたＣ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極を引き起こし得る。
【００９７】
他の態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞に光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。いくつかの実施形態において、光は緑色光であり得る。他の実施形態において、光は約５３５ｎｍ〜約５４０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、光は約５４２ｎｍの波長を有し得る。他の実施形態において、光は約５３０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞に紫色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在しない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞に約４０５ｎｍの波長の光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在しない。加えていくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスは、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、周波数１００Ｈｚを有する光パルスを用いたＣ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発シナプス除去を引き起こし得る。
【００９８】
他の態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質は、細胞に光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。いくつかの実施形態において、光は緑色光であり得る。他の実施形態において、光は約５４０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、光は約５４６ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／１６２変異体キメラタンパク質は、細胞に紫色光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在しない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞に約４０５ｎｍの波長の光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在しない。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／１６２変異体キメラタンパク質は、Ｅ１２２／１６２で変異を欠くＣ１Ｖ１変異体キメラタンパク質に比較して、または他の光活性化陽イオンチャネルタンパク質に比較して、紫色光に曝された場合は低い活性化を示し得る。加えていくつかの実施形態において、約１００Ｈｚの時間周波数を有する光パルスは、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を活性化するために使用され得る。いくつかの実施形態において、周波数１００Ｈｚを有する光パルスを用いたＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１２６２変異体キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異体キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発シナプス除去を引き起こし得る。
【００９９】
いくつかの場合ではＣ１Ｖ１多様体ポリペプチドは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１００】
Ｃ１Ｃ２キメラ陽イオンチャネル
他の実施形態において、光活性化陽イオンチャネルタンパク質は、コナミドリムシからのＣｈＲ１とＣｈＲ２タンパク質由来のＣ１Ｃ２キメラタンパク質であり、このタンパク質は光に反応し、および細胞に光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。別の実施形態において光活性化ポリペプチドは、配列番号９で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。光活性化陽イオンチャネルタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光活性化陽イオンチャネルタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えて光活性化陽イオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光活性化プロトンポンプタンパク質は、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含み得る。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１０３】
特定の実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、配列番号１０で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
ＲｅａＣｈＲ
いくつかの態様において、脱分極性光活性化ポリペプチドは、コナミドリムシ由来の脱分極性光活性化ポリペプチドの赤色シフト多様体であり、そのような光活性化ポリペプチドは本開示では「ＲｅａＣｈＲポリペプチド」、または「ＲｅａＣｈＲタンパク質」、または「ＲｅａＣｈＲ」と呼ばれる。別の実施形態において光活性化ポリペプチドは、配列番号１１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＲｅａＣｈＲポリペプチドを活性化するために使用される光は、約５９０〜約６３０ｎｍの波長を有し得るか、または約６１０ｎｍの波長を有し得る。ＲｅａＣｈＲタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節する光活性化陽イオンチャネルタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＲｅａＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＲｅａＣｈＲは、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含み得る。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１０７】
特定の実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質は、配列番号１２で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
ＳｄＣｈＲ
いくつかの態様において、脱分極性光活性化ポリペプチドはシェルフェリアデュビア由来のＳｄＣｈＲポリペプチドであるが、細胞に光を照射した場合、ＳｄＣｈＲポリペプチドは細胞膜をはさんで陽イオンを輸送可能である。いくつかの場合ではＳｄＣｈＲポリペプチドは、配列番号１３で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＳｄＣｈＲポリペプチドを活性化するために使用される光は、約４４０〜約４９０ｎｍの波長を有し得るか、または約４６０ｎｍの波長を有し得る。ＳｄＣｈＲタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＳｄＣｈＲタンパク質の能力を増減したり、し得る。いくつかの適用例においてＳｄＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＳｄＣｈＲタンパク質は、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１１１】
特定の実施形態において、ＳｄＣｈＲタンパク質は、配列番号１４で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
ＣｎＣｈＲ１
いくつかの態様において、脱分極性光活性化ポリペプチドは例えばＣｎＣｈＲ１など、クラミドモナス・ノクチガマに由来し得るが、細胞に光を照射した場合、ＣｎＣｈＲ１ポリペプチドは細胞膜をはさんで陽イオンを輸送可能である。いくつかの場合ではＣｎＣｈＲ１ポリペプチドは、配列番号１５で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＣｎＣｈＲ１ポリペプチドを活性化するために使用される光は、約５６０〜約６３０ｎｍの波長を有し得るか、または約６００ｎｍの波長を有し得る。ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＣｎＣｈＲ１タンパク質の能力を増減したり、し得る。いくつかの場合ではＣｎＣｈＲ１タンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＣｎＣｈＲ１タンパク質は、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１１５】
特定の実施形態において、ＣｎＣｈＲ１タンパク質は、配列番号１６で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎ
他の実施形態において、光活性化陽イオンチャネルタンパク質はクロロモナス・スブジビザのＣｓＣｈＲタンパク質由来のＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎキメラタンパク質とクラミドモナス・ノクチガマ由来のＣｎＣｈＲ１タンパク質とであり、このタンパク質のＮ末端は、ＣｎＣｈＲ１のアミノ酸配列の残基７９〜３５０が後に続くＣｓＣｈＲの残基１〜７３のアミノ酸配列を含み、光に反応し、および細胞に光を照射した場合に、細胞中の脱分極性電流に介在し得る。別の実施形態においてＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎポリペプチドは、配列番号１７で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１１８】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１１９】
特定の実施形態において、ＣｓＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、配列番号１８で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
ＳｈＣｈＲ１
いくつかの態様において、脱分極性光活性化ポリペプチドは、例えばＳｈＣｈＲ１などスチゲオクロニウム・ヘルベチクムに由来し得るが、細胞に光を照射した場合、ＳｈＣｈＲ１ポリペプチドは細胞膜をはさんで陽イオンを輸送可能である。いくつかの場合ではＳｈＣｈＲ１ポリペプチドは、配列番号１９で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。スチゲオクロニウム・ヘルベチクム由来のＳｈＣｈＲ１タンパク質を活性化するために使用される光は、約４８０〜約５１０ｎｍの波長を有し得るか、または約５００ｎｍの波長を有し得る。ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＳｈＣｈＲ１タンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＳｈＣｈＲ１タンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＳｈＣｈＲ１タンパク質は、細胞膜をはさんで陽イオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１２３】
特定の実施形態において、ＳｈＣｈＲ１タンパク質は、配列番号２０で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
他の好適な脱分極性光活性化ポリペプチドは、例えばＫｌａｐｏｅｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  １１：３３８に記載されている。
【０１２５】
光活性化ポリペプチド過分極化
Ａｒｃｈ
いくつかの実施形態において、好適な光活性化ポリペプチドはアーキロドプシン（Ａｒｃｈ）プロトンポンプ（例えばハロルブルム・ソドメンス由来のプロトンポンプ）であり、このプロトンポンプは細胞に光を照射した場合に、細胞の原形質膜をはさんで１つ以上の陽子を輸送できる。光は約５３０〜約５９５ｎｍの波長を有し得るか、または約５６０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、配列番号２１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。Ａｒｃｈタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に有して、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／またはニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送するＡｒｃｈタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＡｒｃｈタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＡｒｃｈタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルから選択された、ニューロンの原形質膜への輸送を高める、少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含み得る。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１２８】
特定の実施形態において、Ａｒｃｈタンパク質は、配列番号２２で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
ＡｒｃｈＴ
いくつかの実施形態において、好適な光活性化タンパク質はアーキロドプシン（ＡｒｃｈＴ）プロトンポンプ（例えばハロルブルムｓｐ．ＴＰ００９由来のプロトンポンプ）であり、このプロトンポンプは細胞に光を照射した場合に、細胞の原形質膜をはさんで１つ以上の陽子を輸送できる。光は約５３０〜約５９５ｎｍの波長を有し得るか、または約５６０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、ＡｒｃｈＴタンパク質は、配列番号２３（ＡｒｃｈＴ）で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＡｒｃｈＴタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／またはニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送するＡｒｃｈＴタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＡｒｃｈＴタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＡｒｃｈＴタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１３０】
いくつかの場合ではＡｒｃｈＴポリペプチドは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１３１】
特定の実施形態において、ＡｒｃｈＴタンパク質は、配列番号２４で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
ＧｔＲ３
いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、青色光に反応し、およびグィラルディア・セータ由来のプロトンポンプタンパク質であり、プロトンポンプタンパク質は、細胞に青色光を照射した場合に、細胞中の過分極性電流に介在でき、そのようなタンパク質は本開示では「ＧｔＲ３タンパク質」または「ＧｔＲ３ポリペプチド」と呼ばれる。光は約４５０〜約４９５ｎｍの波長を有し得るか、または約４９０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、配列番号２５（ＧｔＲ３）で示される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＧｔＲ３タンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＧｔＲ３タンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＧｔＲ３タンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＧｔＲ３タンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜を過分極する能力を好適に保持する。
【０１３３】
いくつかの場合ではＧｔＲ３タンパク質は、配列番号２５で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、およびシグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択された哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、光活性化プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳ（配列番号５９）を含む。いくつかの実施形態において、先頭の１９アミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳ（配列番号５９）によって置換される。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。ＧｔＲ３タンパク質は、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１３５】
特定の実施形態において、ＧｔＲ３タンパク質は、配列番号２６で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
Ｏｘｙ
いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質はオキシリス・マリーナ（Ｏｘｙ）プロトンポンプであり、このプロトンポンプは細胞に光を照射した場合に、細胞の原形質膜をはさんで１つ以上の陽子を輸送できる。光は約５００〜約５６０ｎｍの波長を有し得るか、または約５３０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、配列番号２７で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。Ｏｘｙタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／またはニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送するＯｘｙタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＯｘｙタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＯｘｙタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択されたニューロンの原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。Ｏｘｙタンパク質は、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１３８】
いくつかの場合ではＯｘｙポリペプチドは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１３９】
特定の実施形態において、Ｏｘｙタンパク質は、配列番号２８で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１４０】
Ｍａｃ
いくつかの実施形態において、光活性化プロトンポンプタンパク質（ここでは「Ｍａｃタンパク質」と呼ばれる）は光に反応し、およびレプトスファエリア・マヌランス由来であり、細胞に５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの光を照射した場合に、Ｍａｃプロトンポンプタンパク質は細胞膜をはさんでプロトンをポンピングし得る。光は約５２０ｎｍ〜約５６０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの場合ではＭａｃタンパク質は、配列番号２９または配列番号３０（Ｍａｃ、Ｍａｃ３．０）で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。Ｍａｃタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＭａｃタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＭａｃタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＭａｃタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜をはさんで陽子をポンピングする能力を好適に保持する。
【０１４１】
他の態様において、Ｍａｃタンパク質は、配列番号２９で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、およびシグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択された哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｍａｃタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものを含み得る。Ｍａｃタンパク質は、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１４２】
いくつかの場合ではＭａｃポリペプチドは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１４３】
光活性化プロトンポンプタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号で見つかり得て、その開示全体を参照によってここに組み込む。
【０１４４】
ＮｐＨＲ
いくつかの場合では、好適な光活性化塩素ポンプタンパク質はナトロモナス・ファラオニスに由来し、そのようなタンパク質は本開示では「ＮｐＨＲタンパク質」または「ＮｐＨＲポリペプチド」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質はアンバー色光ならびに赤色光に反応し得て、ＮｐＨＲタンパク質にアンバー色光または赤色光を照射した場合に、ニューロン中の過分極性電流に介在し得る。ＮｐＨＲタンパク質を活性化し得る光の波長は、５８０ｎｍ〜６３０ｎｍの間であり得る。いくつかの実施形態において、光は約５８９ｎｍの波長であり得る、または光は約６３０ｎｍより大きい（例えば約７４０ｎｍ未満の）波長を有し得る。別の実施形態において、光は約６３０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、連続光パルスに曝された場合、少なくとも約９０分の間に神経膜を過分極し得る。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列と少なくとも約７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。加えて、ＮｐＨＲタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＭａｃタンパク質の能力を増減したり、し得る。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＮｐＨＲタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜を過分極する能力を好適に保持する。
【０１４５】
いくつかの場合ではＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列と少なくとも約７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）輸出シグナルとを含む。このＥＲ輸出シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合され得る、または、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルはアミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）を含むが、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、ＥＲ輸出シグナルはアミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含むが、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルはアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）を含む。
【０１４６】
使用に好適な小胞体（ＥＲ）輸出配列は、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものを含む。ＥＲ輸出配列は、例えば約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸など、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸の長さを持ち得る。
【０１４７】
他の態様においてＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、（例えばＮｐＨＲタンパク質の原形質膜への輸送を高め得る）輸送シグナルとを含む。輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合され得る、または、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合され得る。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはリンカーによってコアアミノ酸配列に関連付けられ得て、この配列は約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものであり得る。ＮｐＨＲタンパク質は、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含み得る。
【０１４８】
いくつかの態様において、ＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択された哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。ＮｐＨＲタンパク質はまた、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置し得る。他の実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはアミノ酸配列ＭＴＥＴＬＰＰＶＴＥＳＡＶＡＬＱＡＥ（配列番号６２）を含む。別の実施形態においてＮｐＨＲタンパク質は、少なくとも９５％配列番号３１に等しいアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
さらに他の態様においてＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列を含み、配列番号３１のＮ末端シグナルペプチドは欠失または置換される。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチドなどの）が使用され得る。光活性化タンパク質はさらに、ＥＲ輸出シグナルおよび／または膜輸送シグナルを含み得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質はＮｐＨＲタンパク質であり、このタンパク質は配列番号３１で示される配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲタンパク質はさらに、小胞体（ＥＲ）輸出シグナル、および／または膜輸送シグナルを含む。例えばＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列および小胞体（ＥＲ）輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３１で示される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列は、リンカーを通してＥＲ輸出シグナルに関連付けられる。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルはアミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）を含むが、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、ＥＲ輸出シグナルはアミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含むが、ここでＸは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルはアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）を含む。いくつかの実施形態においてＮｐＨＲタンパク質は、配列番号３１で示される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルを含む。他の実施形態においてＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号３１で示される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルを含む。他の実施形態においてＮｐＨＲタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号３１で示される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、膜輸送シグナル、およびＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、配列番号３１で示される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列とリンカーによって関連付けられる。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはリンカーを通してＥＲ輸出シグナル関連付けられる。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。このリンカーは、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質はさらにＮ末端シグナルペプチドを含む。
【０１５１】
光活性化塩素ポンプタンパク質に関するさらなる開示は米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号と第２０１０／０１４５４１８号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出し得るが、それぞれの開示全体を参照によってここに組み込む。
【０１５２】
ドナリエラ・サリナ光活性化ポリペプチド
いくつかの実施形態において、好適な光活性化イオンチャネルタンパク質は、例えばドナリエラ・サリナ由来のＤｓＣｈＲタンパク質であり、イオンチャネルタンパク質は、細胞に光を照射した場合に、細胞中の過分極性電流に介在し得る。光は約４７０ｎｍ〜約５１０ｎｍの波長を有し得るか、または約４９０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、配列番号３４で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ＤｓＣｈＲタンパク質は、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を追加的に含み得て、光感度を増減したり、特定の光波長感度を増減したり、および／または細胞の原形質膜の分極状態を調節するＤｓＣｈＲタンパク質の能力を増減したり、し得る。加えてＤｓＣｈＲタンパク質は、１つ以上の保守的アミノ酸置換、および／または１つ以上の非保守的アミノ酸置換を含み得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含むＤｓＣｈＲタンパク質は、光への反応においてニューロンの原形質膜をはさんでイオンを輸送する能力を好適に保持する。
【０１５３】
いくつかの場合ではＤｓＣｈＲタンパク質は、配列番号３４で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ輸出シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択された哺乳類細胞の原形質膜への輸送を高める少なくとも１つの（１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ輸出シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドと、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルと、Ｃ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ輸出シグナルとＣ末端輸送シグナルとはリンカーによって関連付けられる。このリンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００の長さのアミノ酸のうち任意のものである。ＤｓＣｈＲタンパク質は、例えば黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を含むがそれに限定されない蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ輸出シグナルは輸送シグナルよりＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルはＥＲ輸出シグナルよりＣ末端側に位置する。
【０１５４】
いくつかの場合ではＤｓＣｈＲポリペプチドは、膜輸送シグナルおよび／またはＥＲ輸出シグナルを含む。いくつかの実施形態において輸送シグナルは、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。他の実施形態において、輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６）を含む。使用するために好適な輸送配列は、ヒト内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））の輸送配列などのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合ではＥＲ輸出シグナルは、例えばＶＸＸＳＬ（ここでＸは任意のアミノ酸、配列番号５２）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号５３）、ＶＬＧＳＬ（配列番号５４）など）、ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号５５）、ＦＸＹＥＮＥ（配列番号５７）（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８）、および同種のものである。
【０１５５】
特定の実施形態において、ＤｓＣｈＲタンパク質は、配列番号３５で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５６】
Ｃ１Ｃ２ベースのアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、光活性化アニオンチャネルポリペプチドはＣ１Ｃ２タンパク質である。いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質のアミノ酸配列は、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ｔ２８５Ｎ、Ｖ２８１Ｋ、および／またはＮ２９７Ｑの１つ以上の変異をアミノ酸配列に導入することで改変される。いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２タンパク質は、前記リストのアミノ酸置換９つすべてを含むタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列を含み、その結果Ｃ１Ｃ２ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号３６に示す配列となる。
【０１５７】
いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｃ１Ｃ２（配列番号３６）のアミノ酸配列に比較してＴ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ｔ２８５Ｎ、Ｖ２８１Ｋおよび／またはＮ２９７Ｑから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、または９のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列に比較してＴ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、およびＴ２８５Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列に比較してＶ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ｖ２８１Ｋ、およびＮ２９７Ｑの置換を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３６に示す通りである。いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、配列番号３６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３６に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは膜輸送シグナルを含み得る（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドはＥＲ輸出シグナルを含み得る（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、Ｃ１Ｃ２ポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。したがって特定の実施形態において、Ｃ１Ｃ２タンパク質は、配列番号３６で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態においてＣ１Ｃ２ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｃ２（配列番号３６）のアミノ酸配列ベースであり、このアミノ酸配列は、Ｃ１Ｃ２の先頭５０のＮ末端アミノ酸をタンパク質ＣｈＲ２（ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ）（配列番号６３）からのアミノ酸１〜１１で置換することで改変される。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは「ｉｂＣ１Ｃ２」と呼ばれ、配列番号４０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４０に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４０に示す通りである。いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４０に示すアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。したがって特定の実施形態において、ｉｂＣ１Ｃ２タンパク質は、配列番号４０で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドはタンパク質Ｃ１Ｃ２（配列番号３６）のアミノ酸配列ベースであり、１６７位のシステインアミノ酸残基はトレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、例えばＳｗｉＣｈＲＣＴなど好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらにＴ１６７を含む。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含み、さらに、Ｔ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において、光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化ポリペプチドは、光電流の長期安定性を示す。いくつかの実施形態において、先頭５０のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドはタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列ベースであり、１６７位のシステインアミノ酸残基はアラニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ＳｗｉＣｈＲＣＡは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ａ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含み、さらにＡ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において、先頭５０のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドはタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列ベースであり、１６７位のシステインアミノ酸残基はセリン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ＳｗｉＣｈＲＣＳは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ａ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含み、さらに、Ｓ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において、先頭５０のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１６３】
特定の実施形態において、ＳｗｉＣｈＲタンパク質は、配列番号３９で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ＳｗｉＣｈＲは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、また、Ｎ１９５またはＡ１９５を含み、さらに、Ａ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含み、また、Ａ１６７を含み、さらに、Ｎ１９５またはＡ１９５を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号３８に示す通りである。いくつかの実施形態において、先頭５０のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、前述改変の１つ以上を有するタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列ベースであり、元１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基はアラニン残基によって置換されている。特定の実施形態において、タンパク質の先頭５０のＮ末端アミノ酸はタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１により置換されており、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸残基（配列番号３６に示すＣ１Ｃ２アミノ酸配列の元１９５位に対応）はアラニン残基により置換される。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、前述改変の１つ以上を有するタンパク質Ｃ１Ｃ２のアミノ酸配列ベースであり、元１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基はアスパラギン残基によって置換されている。特定の実施形態において、タンパク質の先頭５０のＮ末端アミノ酸はタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１により置換されており、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸残基（配列番号３６に示すＣ１Ｃ２アミノ酸配列の元１９５位に対応）はアスパラギン残基により置換される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ａ１２８、Ｔ１２８またはＳ１２８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４０に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含み、さらにＡ１２８、Ｔ１２８またはＳ１２８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４０に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１６８】
ＣｈＲ２ベースのアニオンチャネルタンパク質
いくつかの実施形態において、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、タンパク質ＣｈＲ２のアミノ酸配列ベースである。ＣｈＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４２に示す。いくつかの実施形態において、ＣｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列は、Ａ５９Ｓ、Ｅ９０Ｓ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１２３Ｓ、Ｑ１１７Ｋ、Ｈ１３４Ｒ、Ｖ２４２Ｋ、Ｔ２４６Ｎおよび／またはＮ２５８Ｑの１つ以上の変異をアミノ酸配列に導入することで改変される。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、前記リストのアミノ酸置換９つすべてを含むタンパク質ＣｈＲ２のアミノ酸配列を含み、その結果ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４２に示される（ｉＣｈＲ２）。
【０１６９】
いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドｉＣｈＲ２は、配列番号４２に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、ＣｈＲ２（配列番号１）のアミノ酸配列に比較してＡ５９Ｓ、Ｅ９０Ｓ、Ｅ１０１Ｓ、Ｅ１２３Ｓ、Ｑ１１７Ｋ、Ｈ１３４Ｒ、Ｖ２４２Ｋ、Ｔ２４６Ｎおよび／またはＮ２５８Ｑから選択された１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのアミノ酸置換を含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態において好適な光活性化ポリペプチド（「ｉＣｈＲ２」）は、配列番号４２に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｋ２４２、Ｎ２４６、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４２に示す通りである。いくつかの実施形態においてｉＣｈＲ２ポリペプチドは、配列番号４２に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｋ２４２、Ｎ２４６、Ｑ２５８、およびＮ１５６またはＡ１５６、およびＴ１２８、Ａ１２８またはＳ１２８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、または１１個を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４２に示す通りである。いくつかの実施形態においてｉＣｈＲ２ポリペプチドは、配列番号４２に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｋ２４２、Ｎ２４６、およびＱ２５８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４２に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは膜輸送シグナルを含み得る（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、ｉＣｈＲ２ポリペプチドはＥＲ輸出シグナルを含み得る（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、ｉＣｈＲ２ポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含み得る。したがって特定の実施形態において、ｉＣｈＲ２タンパク質は、配列番号４３で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
Ｃ１Ｖ１ベースのアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列ベースである。Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列は、配列番号４４に示す。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質のアミノ酸配列は、Ｔ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ａ２８５Ｎ、Ｐ２８１Ｋ、および／またはＮ２９７Ｑの１つ以上の変異をアミノ酸配列に導入することで改変される。いくつかの実施形態において過分極性光活性化ポリペプチドは、前記リストのアミノ酸置換９つすべてを含むタンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列を含み、その結果ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４４に示される。
【０１７２】
いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ｉＣ１Ｖ１は、配列番号４４に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｃ１Ｖ１（配列番号７）のアミノ酸配列に比較してＴ９８Ｓ、Ｅ１２９Ｓ、Ｅ１４０Ｓ、Ｅ１６２Ｓ、Ｖ１５６Ｋ、Ｈ１７３Ｒ、Ａ２８５Ｎ、Ｐ２８１Ｋおよび／またはＮ２９７Ｑから選択された１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのアミノ酸置換を含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ｉＣ１Ｖ１は、配列番号４４に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４４に示す通りである。いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチド（「ｉＣ１Ｖ１」と呼ぶ）は、配列番号４４に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｎ１９５を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４４に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４４に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４４に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。したがって特定の実施形態において、ｉＣ１Ｖ１タンパク質は、配列番号４５で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、タンパク質Ｃ１Ｖ１（配列番号７）のアミノ酸配列ベースであり、このアミノ酸配列は、Ｃ１Ｖ１の先頭５０のＮ末端アミノ酸をタンパク質ＣｈＲ２（ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ）（配列番号６３）からのアミノ酸１〜１１で置換することで改変されている。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチド、ｉｂＣ１Ｖ１は、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチド（「ｉｂＣ１Ｖ１」と呼ぶ）は、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｎ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。いくつかの実施形態において、好適な光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４６に示すアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。したがって特定の実施形態において、ｉｂＣ１Ｖ１タンパク質は、配列番号４７で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、好適な過分極性光活性化ポリペプチドはタンパク質Ｃ１Ｖ１（配列番号７）のアミノ酸配列ベースであり、１６７位のシステインアミノ酸残基はトレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｔ１６７を含む。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４４に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含み、さらに、Ｔ１６７、Ｓ１６７またはＡ１６７を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４４に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９８、Ｓ１２９、Ｓ１４０、Ｓ１６２、Ｋ１５６、Ｒ１７３、Ｎ２８５、Ｋ２８１、およびＱ２９７を含み、また、Ｔ１６７、Ｓ１６７またはＡ１６７を含み、さらに、Ａ１９５またはＮ１９５を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。いくつかの実施形態において、先頭５０のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極性光活性化ポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、前述した改変の１つ以上を有するタンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列ベースであり、元１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基はアラニン残基によって置換されている。特定の実施形態において、タンパク質の先頭５０のＮ末端アミノ酸はタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１により置換されており、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸残基（配列番号７に示すＣ１Ｖ１アミノ酸配列の元１９５位に対応）はアラニン残基により置換される。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、前述した改変の１つ以上を有するタンパク質Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列ベースであり、元１９５位のアスパラギン酸アミノ酸残基はアスパラギン残基によって置換されている。特定の実施形態において、タンパク質の先頭５０のＮ末端アミノ酸はタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１により置換されており、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸残基（配列番号７に示すＣ１Ｖ１アミノ酸配列の元１９５位に対応）はアスパラギン残基により置換される。
【０１７８】
いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチド、ｉｂＣ１Ｖ１は、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｔ１２８、Ａ１２８またはＳ１２８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含み、さらに、Ｔ１２８、Ａ１２８またはＳ１２８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適なアニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、また、Ｔ１２８、Ａ１２８またはＳ１２８を含み、さらに、Ａ１５６またはＮ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。いくつかの実施形態において好適な過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４６に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含み、また、Ｔ１２８、Ａ１２８またはＳ１２８を含み、さらに、Ａ１５６またはＮ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４６に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極性光活性化ポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、好適な過分極性光活性化ポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１８０】
ＲｅａＣｈＲベースのアニオンチャネルポリペプチド
いくつかの実施形態において、標記過分極性光活性化ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列ベースである。ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列は、配列番号１１に示す。いくつかの実施形態において、ＲｅａＣｈＲタンパク質のアミノ酸配列は、Ｔ９９Ｓ、Ｅ１３０Ｓ、Ｅ１４１Ｓ、Ｅ１６３Ｓ、Ｖ１５７Ｋ、Ｈ１７４Ｒ、Ａ２８６Ｎ、Ｐ２８２Ｋおよび／またはＮ２９８Ｑの１つ以上の変異をアミノ酸配列に導入することで改変される。いくつかの実施形態において過分極性光活性化ポリペプチドは、前記リストのアミノ酸置換９つすべてを有するタンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列を含み、その結果ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４８に示される。
【０１８１】
いくつかの実施形態において標記光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、ＲｅａＣｈＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列に比較してＴ９９Ｓ、Ｅ１３０Ｓ、Ｅ１４１Ｓ、Ｅ１６３Ｓ、Ｖ１５７Ｋ、Ｈ１７４Ｒ、Ａ２８６Ｎ、Ｐ２８２Ｋ、および／またはＮ２９８Ｑから選択された１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つのアミノ酸置換を含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態において標記光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ｉＲｅａＣｈＲは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４８に示す通りである。いくつかの実施形態において標記光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４８に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。したがって特定の実施形態において、ｉＲｅａＣｈＲタンパク質は、配列番号４９で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態において標記光活性化アニオンチャネルポリペプチド、ｉＲｅａＣｈＲは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｎ１９６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４８に示す通りである。いくつかの実施形態において標記光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８を含み、さらに、Ｎ１９６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４８に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列ベースであり、アミノ酸配列は、ＲｅａＣｈＲの先頭５１のＮ末端アミノ酸をタンパク質ＣｈＲ２（ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ）（配列番号６３）からのアミノ酸１〜１１で置換することで改変されている。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチド、ｉｂＲｅａＣｈＲは、配列番号５０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含む。ここでアミノ酸付番は配列番号５０に示す通りである。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号５０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号５０に示す通りである。いくつかの実施形態において、標記光活性化アニオンチャネルポリペプチドは、配列番号５０に示すアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。したがって特定の実施形態において、ｉｂＲｅａＣｈＲタンパク質は、配列番号５１で示される配列と少なくとも７５％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、タンパク質ＲｅａＣｈＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列ベースであり、アミノ酸配列は、ＲｅａＣｈＲの先頭５１のＮ末端アミノ酸をタンパク質ＣｈＲ２（ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ）（配列番号６３）からのアミノ酸１〜１１で置換することで改変されている。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｎ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号１１に示す通りである。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含み、さらに、Ｎ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号１１に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、標記過分極性光活性化ポリペプチドはタンパク質ＲｅａＣｈＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列ベースであり、１６８位のシステインアミノ酸残基はトレオニン残基によって置換されている。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｔ１６８、Ｓ１６８またはＡ１６８を含む。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８を含み、さらに、Ｔ１６８、Ｓ１６８またはＡ１６８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号１１に示す通りである。いくつかの実施形態において、先頭５１のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチド、ｉＲｅａＣｈＲは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、また、Ａ１９６またはＮ１９６を含み、さらに、Ｔ１６８、Ｓ１６８またはＡ１６８を含み、ここでアミノ酸付番は配列番号４８に示す通りである。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号４８に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ９９、Ｓ１３０、Ｓ１４１、Ｓ１６３、Ｋ１５７、Ｒ１７４、Ｎ２８６、Ｋ２８１、およびＱ２９８を含み、また、Ａ１９６またはＮ１９６を含み、さらにＴ１６８、Ｓ１６８またはＡ１６８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号４８に示す通りである。いくつかの実施形態において、先頭５１のアミノ酸はＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧ（配列番号６３）によって置換される。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、標記過分極性光活性化ポリペプチドは、前述した改変の１つ以上を有するタンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列ベースであり、元１９６位のアスパラギン酸アミノ酸残基はアラニン残基によって置換されている。特定の実施形態において、タンパク質の先頭５１のＮ末端アミノ酸はタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１により置換されており、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸残基（配列番号１１に示すＲｅａＣｈＲアミノ酸配列の元１９６位に対応）はアラニン残基により置換される。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、標記過分極性光活性化ポリペプチドは、前述した改変の１つ以上を有するタンパク質ＲｅａＣｈＲのアミノ酸配列ベースであり、元１９６位のアスパラギン酸アミノ酸残基はアスパラギン残基によって置換されている。特定の実施形態において、タンパク質の先頭５１のＮ末端アミノ酸はタンパク質ＣｈＲ２からのアミノ酸１〜１１により置換されており、１５６位のアスパラギン酸アミノ酸残基（配列番号１１に示すＲｅａＣｈＲアミノ酸配列の元１９６位に対応）はアスパラギン残基により置換される。
【０１９０】
いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチド、ｉｂＲｅａＣｈＲは、配列番号５０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、さらに、Ｔ１２８、Ｓ１２８またはＡ１２８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号５０に示す通りである。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号５０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含み、さらにＴ１２８を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号５０に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチド、ｉｂＲｅａＣｈＲは、配列番号５０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つを含み、また、Ｔ１２８、Ｓ１２８またはＡ１２８を含み、さらに、Ａ１５６またはＮ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号５０に示す通りである。いくつかの実施形態において標記過分極性光活性化ポリペプチドは、配列番号５０に示すアミノ酸配列と少なくとも５８％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また、Ｓ５９、Ｓ９０、Ｓ１０１、Ｓ１２３、Ｋ１１７、Ｒ１３４、Ｎ２４６、Ｋ２４２、およびＱ２５８を含み、また、Ｔ１２８、Ｓ１２８またはＡ１２８を含み、さらに、Ａ１５６またはＮ１５６を含む。ここでアミノ酸付番は配列番号５０に示す通りである。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドはＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））を含む。これらの実施形態のいずれか１つにおいて、標記アニオンチャネルポリペプチドは、膜輸送シグナル（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号５６））およびＥＲ輸出シグナル（例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号５８））の両方を含む。
【０１９２】
効用
本開示の方法にはさまざまな利用法がある。前述のように本開示の方法は、機能的脳回路を解剖および解析するために使用される。いくつかの場合、本方法は機能回路において、解剖的および／または機能的に規定されたニューロンの新しい役割を同定する方法を提供し得る。いくつかの場合、脳の領域間の解剖的または構造的結合は結合の機能的役割についての洞察を与えるために十分ではなく、および本開示の方法が機能的結合を明らかにし得る。
【０１９３】
いくつかの場合、本方法は相関データのみ使用可能な脳の領域間の機能的結合について、細胞レベルで因果関係を確立する方法を提供し得る。したがっていくつかの場合、本方法は脳回路における相関性の観察の基底にある因果関係の有無を実証し得る。
【０１９４】
特定の実施形態において、本方法は、光活性化ポリペプチドの選択的発現と脳領域の選択的照射との組み合わせを介して、異なる時間周波数で選択的に特定のニューロン集団を活性化する方法を提供するが、ここで各周波数で活性化されるニューロン数は実質的に同一である。したがって、機能的結合にある脳の第２領域での反応にあたって第１領域を活性化する光パルスの周波数増加の影響は、主として周波数の変更によると考えられ、例えば周波数依存的方法により多くのニューロンが漸増するなど他の要因によるものではない。
【０１９５】
本方法はまた、例えば中心視床、島葉、帯状、視床下核（ＳＴＮ）、淡蒼球内節（ＧＰＩ）、不確帯（ＺＩ）など脳領域の脳深部刺激（ＤＢＳ）の影響を探査するために使用され、痛み、うつ病、依存症、アルツハイマー病、注意欠陥障害、自閉症、無オルガスム症、脳性小児まひ、双極性うつ病、単極性うつ病、てんかん、全般性不安障害、急性頭部外傷、快楽主義、肥満、強迫障害（ＯＣＤ）、急性とう痛、慢性とう痛、パーキンソン病、遷延性植物状態、恐怖症、外傷後ストレス障害、脳卒中後のリハビリテーション／リジェネシス、頭部後外傷、社交不安障害、トゥーレット症候群、出血性卒中、虚血性脳卒中などの様々な神経疾患の治療に使用され得る。本方法はいくつかの場合、世界の脳ダイナミクスならびに細胞レベル機能回路において、定義済みニューロン集団の光パルス周波数またはパルス幅など、刺激の単一パラメータの影響を探査する方法を提供し得る。
【０１９６】
実施例
以下の実施例は当業者に本発明を使用する方法を完全に開示し、および説明するために提示されており、および発明者が発明者の発明として見なすものの範囲を制限することを意図したものではなく、また以下の実験が実施されたすべてのまたは唯一の実験であると示すことを意図したものでもない。使用された数（例えば数量、温度、など）に関して正確性を確保するための努力が費やされたが、いくつかの実験エラーおよび偏差は考慮すべきである。別途指定がない限り、部品は部品数×重量、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、および圧力は大気圧またはその近傍である。例えば、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロベース）、ｐｌ（ピコリットル）、ｓまたはｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈまたはｈｒ（時）、ａａ（アミノ酸）、ｋｂ（キロベース）、ｂｐ（塩基対）、ｎｔ（ヌクレオチド）、ｉ．ｍ．（分子内の）、ｉ．ｐ．（腹腔内の）、ｓ．ｃ．（皮下の）、および同種のものなどの標準略語が使用され得る。
【０１９７】
実施例１：材料および方法
動物。スプラーグドーリーラット、メス（＞１１週齢、２５０〜３５０ｇ）を、全視床注入の被検体として使用した。動物は個別ケージに入れ、各１２時間の明暗周期下におき、食料および水分は自由に与えた。動物の飼育と実験上の操作とは、米国立衛生研究所、カリフォルニ大学ロサンゼルス校（ＵＣＬＡ）、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）、およびスタンフォード大学ＩＡＣＵＣのガイドラインに厳密に従った。
【０１９８】
ウィルス注入およびファイバー固定。スタンフォード大学のＤｅｉｓｓｅｒｏｔｈ研究室から、ｐＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩａ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥプラスミドを得た。ノースカロライナ大学チャペルヒル校のベクトルコアで、濃縮ウィルスが産生された。イソフルラン（導入に５％、維持に２〜３％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を使ってラットに麻酔をかけて、定位フレームに固定した。滅菌手術の標準手順に従った。痛みを最小限に抑えるためブプレノルフィンが投与された。目には人工涙液をさした。頭部を剃髪し、正中切開に続いて７０％エタノールおよびｂｅｔａｄｉｎｅでむき出しの頭皮を消毒した。歯科用ドリルを用いて標的座標上で小さく頭骨切開を実施した。マイクロシリンジポンプ制御装置を使い、３４ゲージ針（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を通して１５０ｎｌ／ｍｉｎの速度で、中心視床または対照実験用の他の皮質下標的における所望の座標に２マイクロリットルのウィルスを注入した。Ｉ）ＣＬおよびＰＣ中心視床細胞核（−３．２ｍｍＡＰ、＋１．５ｍｍＭＬ、−５．６ｍｍＤＶ、ｎ＝４７イメージング用動物）、ＩＩ）後内側腹側核（−２．５ｍｍＡＰ、＋２．６ｍｍＭＬ、−６．０ｍｍＤＶ）、ＩＩＩ）視床前核（−３．１ｍｍＡＰ、＋１．８ｍｍＭＬ、−５．３ｍｍＤＶ）、ＩＶ）視床後核（−４．６ｍｍＡＰ、＋１．８ｍｍＭＬ、−５．０ｍｍＤＶ）、Ｖ）中間海馬（−５．８ｍｍＡＰ、＋５．２ｍｍＭＬ、−３．４ｍｍＤＶ、ｎ＝８動物）。注入はすべて右半球で実施された。ゆっくり抜き出す前に、注射針はさらに１０分間その場所に置いておかれた。カスタマイズされたガイドカニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ製）または光ファイバーカニューレ（Ｄｏｒｉｃ  Ｌｅｎｓｅｓ  Ｉｎｃ．製）を頭がい骨に取り付けて、ｍｅｔａｂｏｎｄ（Ｐａｒｋｅｌｌ）を使用して固定した。切開は縫合され、また、動物は麻酔から回復するまで加熱パッドの上に置かれた。手術後の４８時間毎日２回、不快症状を最小限に抑えるためブプレノルフィンを皮下に注入した。４７の中心視床動物の元のコホートを、さらに標的座標から０．８５ｍｍ未満の埋め込み場所でスクリーニングした後に、１８の群に絞り込んだ（Ｔ２磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンを用いて推定、図１Ｂ）。視床活性化の欠落により２つの動物を除外し、解析には１６の動物が残った。
【０１９９】
ラットの第２コホートにおいて、前述のように中心視床へのＣｈＲ２注入の完了後、ノースカロライナ大学チャペルヒル校ベクトルコアで産生された濃縮ＡＡＶ５−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０−ｍＣｈｅｒｒｙウィルスが右不確帯に注入された（−３．９６ｍｍＡＰ、＋２．８ｍｍＭＬ、＋７．４ｍｍＤＶ、ｎ＝４動物）。両方の注入は同じ手術で実施された。０．５マイクロリットルのｅＮｐＨＲウィルスが３４ゲージ針を通して１００ｎｌ／ｍｉｎの速度で注入された。注入に続いて、ゆっくり抜き出す前に、注射針は約１０分間その場所に置いておかれた。回復についての詳細は、前述と同じである。
【０２００】
光遺伝学機能的ＭＲＩ（ｏｆＭＲＩ）のデータ取得。ＵＣＬＡで、７Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｅｃ小動物ＭＲＩシステムを使用して機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）スキャニングが実施された。最初に、５％イソフルランを使って動物を麻酔にかけて、耳および歯を固定するカスタムメイドのＭＲＩ適合クレードルに固定する前に挿管された。外径３９ｍｍ、内径２５ｍｍの特注設計の送受信単ループ表面コイルを頭がい骨上の関心領域の上中央に置いて、信号対雑音比を最大化した。コア径６２．５μｍの光ファイバーを４７３ｎｍのレーザー源（Ｌａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）に接続して、埋込式光ファイバーカニューレに連結した。単一のｏｆＭＲＩスキャンは、６つの２０ｓ光パルス列（１０、４０、または１００Ｈｚ、順序はランダム）、１分間に１回出力し、それが６分続くブロックデザインで構成された。各セッションは、５〜６回の連続的なスキャンにより採取を行った。実験全体で、光ファイバー出力電力は２．５ｍＷに校正された。全周波数にわたって３０％のデューティサイクルを使用して全光出力量を維持し、結果として１０、４０、および１００Ｈｚのそれぞれについて３０、７．５、および３ｍｓの一意のパルス幅になった。プローブ場所を確認済みの第２コホート動物を使用した一連の対照実験（ｎ＝３）において、パルス幅は一定の３ｍｓを保ちながらデューティサイクルは変化した（図１０）。
【０２０１】
ｆＭＲＩスキャンニングの際は、動物を磁石のアイソセンターに配置し、さらに送風機と校正済み気化器、およびＯ2 （３５％）、Ｎ2 Ｏ（６３．５％）、イソフルラン（１．３〜１．５％）の混合物を使用した軽麻酔下で人為的に換気を行った（４５〜６０ストローク／分）。安定した（血液酸素濃度依存性）ＢＯＬＤシグナルを確保するため、呼気のＣＯ2 を３〜４％に維持し、加熱空気流を使用して体温を３６．５〜３７．５℃に保った。ｆＭＲＩスキャンニングに先立ってファストスピンエコーシーケンスを用いてＴ２重み付き高解像度解剖画像を得て、脳の損傷を確認し、光ファイバーの場所を検証した（面内分解能：１３７μｍ、視界（ＦＯＶ）：３５×３５ｍｍ2 、スライス厚：０．５ｍｍ、コロナルスライス：３２）。グラジェントエコー（ＧＲＥ）ＢＯＬＤ法を使用して、光刺激時のｆＭＲＩ画像を得た。ｆＭＲＩ画像の取得は、３５×３５ｍｍ2 の面内視野（ＦＯＶ）および０．５×０．５×０．５ｍｍ3 の空間解像度を得るように設計されており、スライディングウィンドウ再構成を用いて繰り返し時間（ＴＲ）毎に画像を更新した。２次元マルチスライスグラジェントエコーシーケンスは４インターリーブスパイラルリードアウト（９６，９７）、３０°フリップ角、７５０ｍｓＴＲ、および１２ｍｓエコー時間を使用し、その結果２３個のコロナルスライス（１２８×１２８マトリックスサイズ）を得た。スパイラルｋ空間サンプルは、２次元グリッド再構成法を通して再構成された。最後に前述の画像処理装置（ＧＰＵ）ベースのシステムを使用して、リアルタイム動き補正を実施した。スパイラルアーチファクトおよび大きな動きを示す脳境界での活性化について注意深く目視検査を行うことで同定される有意の動きのスキャンは、解析から除外された。この除外条件は、データ収集の前に設定された。
【０２０２】
ｆＭＲＩデータ解析。すべてのｆＭＲＩデータ処理は、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）ソフトウェア環境（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）とｍｒＶｉｓｔａ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ；ｗｅｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｖｉｓｔａ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ＭｒＶｉｓｔａ）を使用して実施された。同じ刺激パラダイムとスキャンニングセッションの連続的スキャンに属する動き補正した画像について、最初にまとめて平均化した。次いで平均の４次元（４Ｄ）画像を、６自由度剛体変換を使用して共通座標フレームに位置合わせした。同じ動物に同じ周波数（通常は１、最大でも４）で複数のスキャンセッションを実施した場合、各セッションの結果得られた画像は、任意の被検体間解析を行う前に最初にまとめて平均化し、全動物被検体からの画像に均しくウェイトを付けながら、最高の信号対雑音比（ＳＮＲ）を実現した。
【０２０３】
各ボクセルの時系列は、この動物個体の画像において、刺激に先立って収集された３０秒のベースライン期間と比較したＢＯＬＤシグナルの変調率として計算された。また、１分のウィンドウサイズでトレンド除去するＢｏｘｃａｒ関数を実施して、スキャナードリフトの可能性を補正した。次に、各ボクセルの時系列について、全周波数要素の二乗和で除算した反復刺激ブロック（つまり１／６０Ｈｚ）の周波数でのフーリエ変換の大きさとして、コヒーレンス値を計算した。０．３５より大きいコヒーレンス値のボクセルは、刺激に有意に同調したと見なされた。ガウス雑音および４７０以内の自由度（統計的パラメトリックマッピング（ＳＰＭ）ソフトウェア環境を使用して計算）を仮定すると、このしきい値のボンフェローニ補正Ｐ値は１０-9未満であると推定し得る。活性化容積（図２）は有意ボクセル数として定義されたが、この数値はボクセルあたりの容積で乗算された定義済み関心領域内で正の反応を示した。正の反応は、間隔［０，π／２］∪［３π／２，２π］のフェーズとして同定された。フェーズは、正弦波としてモデル化された場合の反応の時間的シフトを表し、および反復刺激ブロックの周波数（つまり１／６０Ｈｚ）での各ボクセルのフーリエ変換の引数として計算された。
【０２０４】
血液動態学的反応関数（ＨＲＦ）は、ボクセルの６サイクルの６０ｓ平均反応、６分の時系列で計算された。図に表示される時系列とＨＲＦとは、動物にまたがっての対応ＲＯＩにおいて０．３５より大きいコヒーレンス値を持つボクセルの平均時系列または平均ＨＲＦを平均することで生成された。いくつかの場合では第１データポイントの値は、刺激発現からの相対的変調率を定義するために、各ボクセルのＨＲＦから減算された。
【０２０５】
平均活性化マップ（図２）を生成するため、同じ刺激場所と周波数の実験から得た４ＤのｆＭＲＩ画像は、まとめて動物全体にまたがって正規化され、平均化された。次いで平均化された画像を、上記フーリエドメイン解析に従って処理した。コヒーレンス値は、しきい値０．３５を上回るコヒーレンスを持つ全ボクセルにオーバレイされた。正および負の反応それぞれについて、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）の「ｈｏｔ」と「ｗｉｎｔｅｒ」関数を使用して生成された温冷カラーマップを使用して、体性感覚皮質に対する負のＢＯＬＤの定位を図示した。これらの活性化マップは、デジタル標準ラット脳アトラスを使って対応するＴ２重み付き解剖画像にオーバレイされた。同じアトラスはセグメントＲＯＩにも使用された。代表的動物の図１０において、同じ解析パイプラインを活性化マップに使用した。
【０２０６】
脳波図（ＥＥＧ）の電極埋込み。動物亜集団におけるｏｆＭＲＩ実験の完了と共に、ＥＥＧ電極が埋込まれた。外科的準備と回復についての詳細は、ウィルス注入で使用されたものと同一であった。２ｃｍの絶縁電線（３０ゲージ、Ｒ３０Ｙ０１００、ＷｉｒｅＷｒａｐｐｉｎｇＷｉｒｅ、Ｏ．Ｋ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）に取り付けられたステンレス製ネジ（０〜８０、直径１．５ｍｍ、Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ）をＥＥＧ電極として使用し、および歯科用セメントを使用して頭がい骨に固定した。記録用電極は、ブレグマの約２ｍｍ前、および２ｍｍ中心線の右側に取り付けられた。基準電極は、ブレグマの約５ｍｍ前に、および３ｍｍ中心線の左側に取り付けられた。
【０２０７】
ビデオＥＥＧの取得と解析。ビデオＥＥＧ記録の前に、光ファイバーの連結とＥＥＧの結線とのため、５％以下のイソフルランで約５分間、動物を麻酔にかけた。次いで動物は光および音が制御された実験室に移されたが、動物はそこで自由に動くことが許された。動物が麻酔から回復してその後１５分間睡眠した後に（動きの欠如とリアルタイムのＥＥＧ出力読み取りで示す）、行動実験が開始された。それぞれの実験について、動物は５分間の睡眠の間ビデオに記録され、その後２０秒光刺激を与え（１０、４０、または１００Ｈｚ、４７３ｎｍレーザー、２．５ｍＷレーザー電力、デューティサイクル３０％）、および次いで５分間、刺激後の期間を与えた。この実験を通して、ＭＰ１５０データ取得ユニットおよびＥＥＧ１００Ｃアンプ（ＢｉｏｐａｃＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，ＳａｎｔａＢａｒｂａｒａ、ＣＡ）、ＥＬ２５４Ｓ  Ａｇ−ＡｇＣｌ電極とＧｅｌ１０２導電性ＥＥＧペーストを使用して、１ｋＨｚでＥＥＧデータを取得した。デジタルカメラを使用して実験をビデオに記録した。すべての行動実験は、動物の光サイクルの間に実施された。
【０２０８】
ＥＥＧ記録はＢｉｏｐａｃ  Ａｃｑｋｎｏｗｌｅｄｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、経験豊富な実験内容を知らない脳波測定者によって、正常、低電位速波脳波、棘波、棘徐波、または進展する電子写真発作の最適カテゴリーの１つに分類された。ビデオクリップと各ＥＥＧ記録でペアを作り、ビデオクリップを睡眠（つまり変化なし）、覚醒（動物は機敏で探索している）、欠神発作（動物は刺激が持続するあいだ動かず凍ったように見えるが、刺激が終わると睡眠状態に戻る）、またはけいれん発作のカテゴリーのうちの１つに分類して、さらに動物の脳状態を診断した。観察された行動反応は、すべてこれらのカテゴリーの１つに分類され得た。図１３の帯域電力は、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）のｂａｎｄｐｏｗｅｒ関数を使用して数値化され、および０Ｈｚからサンプリングレートの半分（５００Ｈｚ）までのシグナルの全電力によって正規化された。
【０２０９】
生体内電気生理学。ｏｆＭＲＩとＥＥＧとの行動実験の完了時に、動物の亜集団において生体内電気生理学実験を実施した。導入のため５％のイソフルランで動物に麻酔をかけて、任意の頭骨切開が完了するまで２〜３％のイソフルランで麻酔を維持した。記録セッションの間、イソフルランを０．８〜１．２％に保つとともに、人工涙液で目に点眼した。図４および図５の記録は、ｆＭＲＩ実験と同一の換気条件下で実施されたものである。定位フレームの中に動物を固定した後、関心領域の上で歯科用ドリルを使用して小さく頭骨切開を実施した。刺激について、中心視床に埋込まれたカニューレを、光ファイバーを介して２．５ｍＷの出力電力レベルの４７３ｎｍレーザー源（Ｌａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続した。不確帯に埋込まれたカニューレは、２．５〜３．０ｍＷに校正された５９３ｎｍレーザー源（Ｌａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に接続された。鋭い１６チャネル微小電極アレイは、定位装置（ＮｅｕｒｏＮｅｘｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１ｘ１６標準モデルリニア電極アレイ、ローカル皮質記録用、Ｖ１−１６−Ｐｏｌｙ２多極アレイ、ＺＩ記録用、０．３５±０．５ＭΩインピーダンス）を使用して記録部位を標的に取り付けられた。ステンレス製基準ネジを小脳上に配置した。連続的電場電位と単一ユニットのスパイキング事象を、Ｐｌｅｘｏｎ  ｏｍｎｉｐｌｅｘシステムとｐｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌソフトウェア（Ｐｌｅｘｏｎ  Ｉｎｃ．，ＴＸ、ＵＳＡ）とを使用して記録した。ＣｈＲ２のみ活性化された場合、２０秒間刺激なしのまま記録を実施し、その後１０、４０、または１００Ｈｚ、３０％デューティサイクルで反復刺激サイクル（２０ｓオン、４０ｓオフ）を実施した。ＣｈＲ２およびｅＮｐＨＲが一緒に活性化された場合、同じ刺激パラダイムが続くが、ただしＣｈＲ２興奮発現の５ｓ前に、３０ｓの連続的５９３ｎｍ光出力の期間を開始した。ｅＮｐＨＲのみ活性化された場合（図５Ｄ）、２０ｓまたは３０ｓの連続的な５９３ｎｍ光出力の期間、および繰り返しサイクルの間に４０ｓまたは３０ｓの光出力なしの期間をそれぞれ適用した。単一ユニット反応について、Ｐｌｅｘｏｎ  Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒを使用してニューロンシグナル（１５０Ｈｚ〜８ｋＨｚ）を増幅およびバンドパスフィルターした。シグナルは４０ｋＨｚでデジタル化して処理され、リアルタイムで活動電位を抽出した。電場電位を分離するため、ローパスフィルター（２００Ｈｚ遮断周波数、４極Ｂｅｓｓｅｌフィルター）を使用し、シグナルは１ｋＨｚにダウンサンプリングした。図４の不確帯記録の間、ＭＰ１５０データ取得ユニットとＥＥＧ１００Ｃアンプ（Ｂｉｏｐａｃ）とを使用して、１ｋＨｚで同時ＥＥＧデータを収集した。
【０２１０】
不確帯電気生理学解析。図４の解析について、電場電位記録は２Ｈｚの遮断周波数でハイパスフィルターして呼吸アーチファクトを除去した。次いで刺激間に発生するスピンドル状発振（ＳＬＯ）は、事後カスタムアルゴリズムを使用して各試験ベースで数値化された。手短かにいうと、記録値の大きさが絶対平均を上回って少なくとも６標準偏差に到達した場合、ＳＬＯが同定された。先行する５００ｍｓの期間に記録がこの値を越えず、および次の５００ｍｓを越える期間に少なくともサンプルの２％がこの値を上回った場合、ＳＬＯがカウントされた。この定量化の方法は、視覚的に識別可能な大振幅発振を正確に捕捉した（図４Ｄ参照）。
【０２１１】
蛍光イメージングと免疫組織化学。生体内ｏｆＭＲＩ、行動実験、および電気生理学的実験が完了すると、組立ボックス内でイソフルランを用いてラットを深く麻酔にかけて、および０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とＰＢＳ中の４％氷冷パラアルデヒド（ＰＦＡ）とを経心的に潅流させた。脳が抽出されて、および４℃で夜通し４％ＰＥＡ中で固定された。脳は４℃でＰＥＡ中、１０％、２０％、および３０％スクロース中で平衡化された。冠状断面（５０μｍ）が凍結ミクロトーム（ＨＭ  ４３０  Ｓｌｉｄｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で準備された。連続断面（５００μｍ間隔）は、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＥＬ６０００）に取り付けられ、蛍光顕微鏡を用いて検査された。定量的免疫組織化学（図７）について、浮動断面は、５％正常ロバ血清、および０．４％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使って６０分間処理された。次いで断面は４℃で４８時間、マウスモノクローナルＣａＭＫＩＩα（ＣａＭＫＩＩα、１：５００、０５−５３２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に対する一次抗体にさらされた。ＰＢＳを使って洗浄した後、断面はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（１：２５０、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使い、２時間室内温度で培養された。次いでスライスは洗浄されて取り付けられた（ＤＡＰＩ−Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）。レーザー共焦点顕微鏡を用いて免疫蛍光法を評価した（Ｌｅｉｃａ  ＣＴＲ  ６５００）。
【０２１２】
高解像度、全脳蛍光イメージング（図１Ａ、図４Ｈ、および図８）について、凍結脳は、ステンレス製Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ベースモールドとＮｅｇ−５０埋込み媒体（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｔｈｅｒｍｏ）、ｎ＝２動物）を使用して埋め込まれた（１０３）。凍結後、Ｎｅｇ−５０埋込み脳は、スライドに直接取り付けされた断面すべてについて、Ｍｉｃｒｏｍ（登録商標）  ＨＭ５５０低温保持装置の上で、テープ転写法を使用して切断された。代替の２０μｍにカットされた断面は分離されて２つの異なる脳ごとの系列を形成した。断面材料の１スライド系列は、チオニンベースのプロトコルを使用し、ＤＰＸ封入剤を用いて封入して、ニッスル細胞体染色法向けに処理された。代替系列は脱水され、蛍光イメージング用にＤＰＸを用いて直接に封入された。０．４６μｍ／ピクセルでＨａｍａｍａｔｓｕ  ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ（登録商標）  ２．０−ＨＴシステムを使用し、トライパスフィルターキューブを使用した１２ビット深度で蛍光スキャンを用いて、ホールスライドデジタルイメージングを実施した。無損失ｊｐ２（ＪＰＥＧ２０００）へのデータ変換に続いて、剛性２次元（２Ｄ）画像変換を使用して、個々の脳断面を位置合わせして登録された。
【０２１３】
統計情報。Ｍａｔｌａｂ（登録商標）において、すべての統計的検定が実施された。解析全体にわたってノンパラメトリック検定が使用された。視床と不確帯とでの生体内電気生理学的測定について、片側ウィルコクソン符号順位検定を使用して、予備刺激期間と刺激期間との間の発火頻度の変化の評価を行った。図３Ｇの感覚皮質での測定について、検定の両側バージョンを使用して発火頻度増減の評価を行った。表１の結果について、平均前置刺激発火頻度（２０ｓビン）を、片側ウィルコクソン符号順位検定を使用して、複数比較について未補正の、２０ｓの刺激期間を通して４回の５ｓビンの平均発火頻度と比較した。片側ウィルコクソン順位和検定を使用して、ｅＮｐＨＲ活性化が中心視床刺激に連結された場合に、ＳＬＯ発生の差異（図４Ｅ）、ならびに皮質発火または不確発火の変化について評価を行った（図５Ｆおよび図５Ｈ）。電気生理学的結果について、繰り返し試験間で非依存性を想定した。この試験について他のすべての想定は満たされた。図２Ｅ〜Ｇの容積測定の比較について、片側ウィルコクソン符号順位検定を使用して、１０Ｈｚと４０Ｈｚとの間および１０Ｈｚと１００Ｈｚとの間で、ＢＯＬＤ活性化の容積増加を同定した（複数比較について補正を実施）。概して分散は比較対象群にわたって類似していることに注意。α＝０．０５カットオフレベルで、有意性が判定された。サンプルサイズを推定するために、統計的方法は使用されなかった。変化を周波数と比較するために使用されたすべての統計的検定（図２Ｅ〜２Ｇ、および図９Ｂ）は、各周波数で使用した動物の数を等しくしてペアで実施された。
【０２１４】
実施例２：中心視床リレーニューロンの高周波刺激は、生体内で広範な前脳活性化を推進
中心視床の特異的役割を調査するため、光遺伝学的技術を適用して空間的、時間的に高精度な方法で中継細胞を制御した。チャネルロドプシン２（ＣｈＲ２）と蛍光レポータータンパク質ＥＹＦＰとを搭載したアデノ随伴ウィルスを用いて、ＣａＭＫＩＩａプロモーターの制御下で、中心視床の右のＣＬおよびＰＣの髄板内核に定位注入を実施した。このプロモーターは、主として興奮性ニューロン中で発現するが、視床中のその興奮性ニューロンの大多数は中継細胞である。バルク注入領域内の同定された細胞のうち３５％がＥＹＦＰポジティブで、ＥＹＦＰポジティブ細胞のうち９７％は共発現ＣａＭＫＩＩａであり、興奮性ニューロンの刺激に対して高い感度を示した（ｎ＝２ラット、８３１細胞、図７）。ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現はこれらの２つの細胞核（図１Ａ）を越えて広がったが、髄板内核の標的刺激は、高解像度のＴ２重み付き構造ＭＲ画像によって確認されたように、（ａ）埋め込まれた光ファイバーの定位固定（図１Ｂ、１Ｃ）、および（ｂ）空間的に限定された照射によって達成された（図１Ａ、１Ｂ）。４７匹のラットは当初、定位標的としての中心視床を使用して注入およびカニューレされた（−３．２ｍｍ  ＡＰ、＋１．５ｍｍ  ＭＬ、−５．５ｍｍ  ＤＶ）。ただし、髄板内核は比較的小さく、および正確に標的とすることが困難である。それゆえこの動物のサブセットのみ、Ｔ２重み付きＭＲＩスキャンを使用して、光ファイバーチップの場所の経験的に観察された分布に基づいて使用された（図１Ｂ、標的座標から＜０．８５ｍｍの距離）。正確に位置指定された埋め込み場所を持つ１８のラットのうち、２つのラットはｆＭＲＩ活動の一般的な非存在−刺激部位の中にあって最も注目すべき−を示して除外され、さらなる解析のために１６匹の動物が残った。
【０２１５】
図１．中心視床の標的刺激は、正のＢＯＬＤ変化を誘発し、刺激部位でのニューロン発火を増加させる。（図１Ａ）代表的な広視野蛍光画像は、拡大して示した興奮した組織の推定コーンでオーバレイされたように、中心視床全体にわたってロバストなＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現を示す。（図１Ｂ）高解像度構造ＭＲＩスキャンを使用して推定された、４７匹のラットの初期コホート中の経験的に観察された光ファイバー埋め込み場所。この動物のうち１８匹は、中心視床に正確に位置指定された埋め込み場所を持つ（標的部位から＜０．８５ｍｍ、破線の円と十字形とで示す）。２匹の動物は、視床活性化の欠落に基づいて除外され、それ以上の解析にはｎ＝１６のラットが残された。黒点は、解析に使用された１６匹の動物の埋め込み座標を示す。灰色の点は、３１匹の却下された動物の埋め込み座標を示す。（図１Ｃ）矢印でマークされた埋め込み場所の推定に使用された、代表的なＴ２重み付き解剖学的ＭＲＩスキャン。（図１Ｄ）ｏｆＭＲＩ実験の際に取得された２３個のコロナルスライスの概略図。スライス番号は、図２の活性化マップに対応する。（図１Ｅ）同側視床ＲＯＩ（図２Ｄ参照）内で有意に変調されたボクセルの平均時系列は、青色のバーで示した１０、４０、１００Ｈｚでの繰り返しの２０ｓ刺激期間の際にロバストな正のＢＯＬＤ反応を示す。値は平均値±動物全体のｓ．ｅ．ｍ．である（各周波数に対してそれぞれ、ｎ＝１６、１０、および１６）。（図１Ｆ）中心視床光刺激の際の局所生体内オプトロード記録の図。差し込み図は記録されたニューロンの棘波波形を示す。（図１Ｇ）この３つの試験された周波数の各々での光刺激の際に、中心視床内で発火頻度の増加を示す記録されたニューロンの代表的ペリイベント時間ヒストグラム。図７も参照。
【０２１６】
図７．ＣａＭＫＩＩａポジティブ細胞を標的としたＣｈＲ２の特異性。免疫組織化学では、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰが中心視床中のＣａＭＫＩＩａポジティブニューロンを特異的に標的としていることが確認されている。バルク注入領域内の同定された細胞のうち３５％がＥＹＦＰポジティブで、ＥＹＦＰポジティブ細胞のうち９７％は共発現ＣａＭＫＩＩａである（ｎ＝２ラット、８３１細胞）。縮尺バー、１０μｍ。
【０２１７】
髄板内核に限定された小容積の直接興奮した組織を実現するために、直径６２．５μｍの光ファイバーを使用した。ＣｈＲ２の活性化には１ｍＷ／ｍｍ2 の強度が必要であると仮定すると、本実験において（２．５ｍＷ）光ファイバーのチップから出た比出力は、ＣｈＲ２＋ニューロンが興奮する１．０８ｍｍの侵入深さおよび０．０８ｍｍ3 の容積に対応する。図１Ａは、標的細胞核に対応するこの侵入深さと活性化コーン（発散半角１１．７°）とを図示し、刺激は上手に中心視床に限定されていることを示す。この２つのファクター（ＭＲ検証の定位ファイバー固定と小容積の興奮した組織）は、ここに報告した影響が主に中心視床内の興奮性リレーニューロンの刺激に由来することを示す。
【０２１８】
中心視床中でトランスフェクトしたニューロンの解剖学的結合を探索するため、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ発現の生体外蛍光顕微鏡画像を収集した。ウィルス性トランスフェクションの拡散のため（図１Ａ）、報告された蛍光は隣接する視床核からの投射も反映することが可能である。にもかかわらず公知の中心視床の投射系に一致して、前頭皮質および線条体を含む前脳の全体にわたってＥＹＦＰ発現軸索が観察された（図８）。特に内側前頭前皮質、外側前頭前皮質、帯状皮質、運動皮質、および感覚皮質はすべて強い投射を受けた。このインプットは表面層に非常に収束性があり、中間層にも中程度ではあるが弱い投射が存在した。さらに投射は、両側の皮質および線条体に関するウィルス注入に対して有意に同側半球に限定されていた。この解剖学的結合は中心視床がどのように脳状態に影響を及ぼし得るかという理解に強力な基礎を提供するが、この回路のダイナミックな性質−例えば中心視床の異なる周波数での刺激がどのように別個の行動反応に導き得るか−をほとんど説明しない。それゆえ、この大量前脳投射の機能的有意性を解剖して、中心視床刺激によって誘発された大規模な空間的、時間的ダイナミックスを可視化するため、光刺激を同時生体内全脳機能イメージングと組み合わせた。
【０２１９】
図８．遠隔標的のＣｈＲ２−ＥＹＦＰの代表的蛍光画像は、右中心視床においてトランスフェクトされたリレーニューロンから前脳への大量投射を図示する。下２列は、定量ｏｆＭＲＩ解析に使用された皮質領域および線条体領域の拡大画像を示す。上２列は、この拡大画像が由来する全脳スライスを示す。ＥＹＦＰ発現軸索投射は主として、同側半球と皮質中の表面層とに局在する。
【０２２０】
光遺伝学ｆＭＲＩ実験の際に、面内分解能０．５×０．５ｍｍ2 、厚さ０．５ｍｍの２３個のコロナルスライスを、スパイラルｋ空間軌道とスライディングウィンドウ再構成アルゴリズムを使用してフレームレート７５０ｍｓで得て、全脳をカバーする高時空間解像度を実現した（ブレグマ＋５．２〜−５．３ｍｍ、図１Ｄ）。新しい逆ガウスニュートン法も使用して、可能な運動アーチファクトを補正し、光遺伝学的に誘発された反応を検出するロバスト性を最適化した。それぞれの実験について、２０ｓの期間の刺激が１０、４０、または１００Ｈｚで６分間の間、毎分出力された。この形式の連続的定常状態の刺激は、臨床ＤＢＳで使用されたアプローチを模倣し、光遺伝学的刺激によってロバストなｆＭＲＩ反応を誘発することが示された。実際に３つすべての周波数での刺激は、結果として光出力と大きく同期した刺激部位で、光活性化で増加したロバストな正の血液−酸素−レベル−依存（ＢＯＬＤ）シグナルとなり、次第に刺激の終りに続くベースラインに復帰した（図１Ｅ）。このＢＯＬＤシグナルがベースのニューロン発火パターンを反映したことを確認するため、中心視床でのオプトロードを使用して刺激を用いて単一ユニットの同時記録を実施した（図１Ｆ）。ｆＭＲＩシグナルに一致して、１０、４０、１００Ｈｚでの刺激はすべて、ローカルニューロン発火頻度のロバストな増加となった（図１Ｇ、ｎ＝５ニューロン、Ｐ＜０．０５、２０ｓ予備刺激と刺激期間との間のウィルコクソン符号順位検定、各ニューロンについて１２試験を実施）。
【０２２１】
刺激の周波数は、同側性および対側性のＢＯＬＤ活性化の範囲を、視床中の局所および下流、シナプスによって連結された脳領域、と決定することに影響を与えたが、本開示では、ブロック刺激パラダイムに有意に同期した正のＢＯＬＤシグナルとして規定された（実施例１参照）。一般に、１０Ｈｚの刺激に比較して４０Ｈｚと１００Ｈｚとの刺激によって、より多くの容積の脳組織が活性化され、前頭皮質野および線条体が高周波数で強く活性化された（図２Ａ〜２Ｃ）。漸増パターンにおけるこの空間的差異を定量化するため、正で統計的に有意で、選択ＲＯＩにおいて刺激によって誘発されたＢＯＬＤシグナルの全容積を計算した（図２Ｄ）。低（１０Ｈｚ）および高（４０Ｈｚと１００Ｈｚ）刺激周波数間の活性化容積のこの差異は、視床、線条体、および内側前頭前皮質、外側前頭前皮質、帯状皮質、運動皮質、および感覚皮質で有意であった（図２Ｅ〜Ｇ）。線条体活動は主として背側肝に局在し、腹側領域において無視できる活動が発生した（図２Ｂ、Ｃ）。さらに、ＢＯＬＤ活性化は概して同側半球に限定されていた、ただ１０Ｈｚの刺激に比較して１００Ｈｚの刺激の際には、対側線条体、外側前頭前皮質、運動皮質、および感覚皮質における活性化容積はすべて有意に大きかった（図２Ｆ〜Ｈ）。
【０２２２】
図２．誘発されたｆＭＲＩシグナルの空間的特徴付け。（図２Ａ〜２Ｃ）興奮性中心視床リレーニューロンを１０、４０、１００Ｈｚで刺激した際の脳全体の活動のコヒーレンス平均値マップ。暖色は正のＢＯＬＤ反応を示し、他方寒色は負のＢＯＬＤ反応を示す（方法を参照）。（図２Ｄ）空間的ｏｆＭＲＩ活性化パターンの定量解析に使用された関心領域（ＲＯＩ）。（図２Ｅ）同側視床における活動容積量（コヒーレンス＞０．３５の正のシグナル）は、４０Ｈｚと１００Ｈｚとの刺激の際の方が１０Ｈｚの刺激の際より有意に大きい。視床漸増は、比較的対側性側に限定される。（図２Ｆ）同側線条体の活性化は、４０Ｈｚと１００Ｈｚとの刺激の際の方が１０Ｈｚの刺激の際より有意に大きい。対側線条体の活性化は全周波数にわたって限定されるが、それでも１０Ｈｚから１００Ｈｚに向かって増加する。（図２Ｇ）内側前頭前皮質と外側前頭前皮質とは４０Ｈｚおよび／または１００Ｈｚの際の刺激の方が１０Ｈｚの刺激の際より有意に大きい活性化容積を示す。対側半球の活動は試験した全周波数にわたって限定されているが、それでも１０Ｈｚから１００Ｈｚに向かって増加する。（図２Ｈ）帯状皮質、運動皮質、および体性感覚皮質の活性化はそれぞれ、４０Ｈｚと１００Ｈｚとの際の方が１０Ｈｚの刺激の際より大きい。対側運動皮質および感覚皮質もまた、４０Ｈｚおよび／または１００Ｈｚの刺激の際により大きい範囲で活性化される。図２Ａ〜図２Ｃの縮尺バーは２ｍｍを表す。図２Ｅ〜図２Ｈの星印は、１０Ｈｚ対４０Ｈｚと１０Ｈｚ対１００Ｈｚとについて刺激の有意な差異を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、片側ウィルコクソン符号順位検定、複数比較のために補正。エラーバーは平均値±動物全体のｓ．ｅ．ｍ．を表す。それぞれ１０、４０、１００Ｈｚについてｎ＝１６、１０、および１６の動物である。ｉ−（同側性）、ｃ−（対側性）、Ｃｇ（帯状皮質）、ＭＣ（運動皮質）、ＭＰＦＣ（内側前頭前皮質）、ＬＰＦＣ（外側前頭前皮質）、ＳＣ（感覚皮質）、Ｓｔｒ（線条体）、Ｔｈ（視床）の略称を使用。また図８、図９Ａ〜図９Ｂ、および図１０Ａ〜図１０Ｃを参照。
【０２２３】
この結果は、中心視床が前脳に及ぼした広範な駆動効果の直接で領域特異的視覚効果をもたらし、また覚醒調節についての先行する解剖学的および生理学的研究を、皮質性線条体活性化の空間的に正確な定量的指標に関連付ける。例えば誘発された反応は、視床皮質投射の一側性の性質に一致するが（図８）、対側皮質はなお中心視床の一側性刺激によって、とりわけ高周波時に変調され得ることが判明する。重要なことに、他の視床核の刺激は、線条体と皮質とにおいて同様に広範な活動を誘発できなかった（図９Ａ）。さらに１０Ｈｚと４０Ｈｚとの刺激間の前脳活性化における大きな差異は、他の形式の皮質下刺激について観察されず（図９Ｂ）、これが中心視床の独特な特性であることを示唆した。
【０２２４】
図９Ａ〜９Ｂ．光遺伝学による広範で周波数依存の前脳の漸増は、中心視床の髄板内核の刺激とは異なる。（図９Ａ）中心視床の４０Ｈｚ刺激の際の線条体活性化と皮質活性化の容積（つまり０．３５より大きなコヒーレンスによる正のＢＯＬＤシグナル）を、他の視床核の刺激の際の活性化容積と共に示す。中心視床は、結果として線条体領域と前頭前皮質領域、および前頭皮質領域に有意の漸増を生む唯一の標的である。（図９Ｂ）中心視床刺激の周波数依存効果を中間海馬（ＩＨ）刺激の効果と比較。１０Ｈｚより４０Ｈｚで線条体、運動皮質、および感覚皮質でより多くの容積を有意に漸増させる中心視床刺激とは違い（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、片側ウィルコクソン符号順位検定）、海馬刺激の際のこの領域の漸増は周波数に対する有意の依存性を示さなかった。視野界の差異による海馬刺激について、活性化データはＭＰＦＣまたはＬＰＦＣで利用できなかった（Ｎ／Ａ）ことに注意。ｉ−（同側性）、ｃ−（対側性）、Ｃｉｎｇ．ｃｔｘ（帯状皮質）、ＭＰＦＣ（内側前頭前皮質）、ＬＰＦＣ（外側前頭前皮質）、Ｓｅｎｓ．ｃｔｘ（感覚皮質）の略称を使用する。
【０２２５】
この実験を通して、３０％の一定デューティサイクルを使用して、周波数にわたって全光出力量を維持し、考えられる発熱アーチファクトを制御した。全刺激周波数に対して２０ｓのパルス列が保たれ、ニューロンの適応による差異の可能性を防止するため、一定のデューティサイクルの維持は各周波数について一意のパルス幅を必要とした（つまり１０、４０、１００Ｈｚについてそれぞれ３０、７．５、および３ｍｓ）。パルス幅のこの変化が前脳漸増における上記差異の主要原因である可能性を除外するため、３ｍｓのパルス幅を維持しながら刺激を繰り返した。誘発されたｆＭＲＩ反応の可視化および定量化は、周波数による皮質活性化と線条体活性化との増加が維持されたことを示す（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。このデータは、刺激周波数が前脳ｆＭＲＩ活性化の変調の主要ファクターであったことを示唆している。
【０２２６】
図１０Ａ〜１０Ｃ．中心視床による前脳の周波数依存的漸増とそれの皮質性ＢＯＬＤシグナル極性の制御とは、パルス幅が一定に保持される場合に維持される。（図１０Ａ）３ｍｓの一定パルス幅を使用して興奮性中心視床リレーニューロンを１０、４０、１００Ｈｚで刺激した際の、脳全体の活動の代表的コヒーレンスマップ。暖色は正のＢＯＬＤ反応を示し、他方寒色は負のＢＯＬＤ反応を示す（実施例１を参照）。（図１０Ｂ）皮質および線条体における正のＢＯＬＤ反応の定量化（ｎ＝３動物）。灰色のラインは、１００Ｈｚ刺激に正規化された動物特異的結果を示す。黒色のラインは、動物全体の平均値を示す。６つの領域すべては、デューティサイクルと全光出力量を一定に維持するためにパルス幅が変化する場合に、本研究の主結果に一致して、周波数とともに漸増の増加を示す。関心領域（ＲＯＩ）は図２で使用された領域と同じである。（図１０Ｃ）一定のパルス幅３ｍｓを使用して１０、４０、１００Ｈｚで中心視床を刺激した際に、体性感覚皮質中で誘発された血液動態反応関数。本研究の主な結果と一致して、１０Ｈｚで負のＢＯＬＤシグナルが誘発され、他方遅いおよび早い正のＢＯＬＤ反応がそれぞれ４０Ｈｚと１００Ｈｚとで誘発された。
【０２２７】
実施例３：中心視床刺激周波数は、皮質性興奮／抑制のバランスを制御
低周波数および高周波数の中心視床刺激の際に誘発された皮質性反応の時間的ダイナミックスが次に調査された。標的とした興奮性ニューロンの活性化にもかかわらず、体性感覚皮質は１０Ｈｚ刺激の際に強い負のＢＯＬＤシグナルを示し、ベースライン活動の抑制を示唆した（図２Ａ、３Ａ、３Ｂ）。対照的に４０、１００Ｈｚでの中心視床刺激は、体性感覚皮質でＢＯＬＤシグナルの正の変化を引き起こした（図２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ）。したがって、異なる周波数での同じ興奮性集団の刺激は、下流標的で完全に反対の反応を招いた。重要なことに、対照実験においてパルス幅が一定に保たれた場合にこの反応が維持されたことで、刺激周波数がこの効果を制御する主要なファクターであることを示す（図１０Ａと１０Ｃ）。
【０２２８】
図３．誘発された皮質活動のサインは、中心視床刺激の周波数に依存する。（図３Ａ、３Ｂ）中心視床の１０Ｈｚの刺激は、同側体性感覚皮質の全体にわたって強い負のＢＯＬＤシグナルを誘発するが、他方４０Ｈｚと１００Ｈｚとの刺激は正の反応を誘発する。時系列は、図２Ｄで規定された感覚皮質ＲＯＩに由来する。血液動態反応関数（ＨＲＦ）は、青色バーで示した単一の２０ｓの刺激期間に対する平均的反応を示す。エラーバーは平均値±動物全体のｓ．ｅ．ｍ．を表す。１０、４０、１００Ｈｚそれぞれについてｎ＝１６、１０、および１６。（図３Ｃ）興奮性中心視床リレーニューロンを刺激した際の、体性感覚皮質での生体内記録の図。差し込み図は記録されたニューロンの棘波波形を示す。（図３Ｄ、３Ｅ）記録されたニューロンの代表的なペリイベント時間ヒストグラム、および刺激前、刺激中または刺激後の、２０ｓ期間の際の発火頻度の対応する定量化。体性感覚皮質内の神経発火頻度は、１０Ｈｚの中心視床刺激の際に減少したが、ただし４０Ｈｚと１００Ｈｚの刺激の際には増加した（それぞれｎ＝１７試験、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、予備対オン、両側ウィルコクソン符号順位検定、詳細な解析については表１参照）。値は平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、図１０も参照。
【０２２９】
以前の研究では周波数に依存する極性変化についての類似した研究成果が示唆されたが、異なる周波数での興奮性ニューロンの選択的刺激に起因する下流の正および負のＢＯＬＤシグナルはまだ、電気生理学によって可視化されておらず、また検証されていない。このシグナルのニューロン的な裏付けを規定するため、体性感覚皮質において中心視床刺激の際に単一ユニットの細胞外記録法が実施された（図３Ｃ）。ｏｆＭＲＩ実験の際に観察されたＢＯＬＤ活動に一致して、１０Ｈｚの刺激は予備刺激期間と刺激期間との間にニューロン発火頻度の減少を招いた（図３Ｄ，３Ｅ、ｎ＝１１の記録されたニューロンのうちの１０）。逆に４０Ｈｚおよび１００Ｈｚでの刺激はともに、ニューロン発火の増加を引き起こした（図３Ｄ，３Ｅ、ｎ＝１１の記録されたニューロンのうちの１１）。誘発された発火頻度は刺激中に変化するように見えたため、２０ｓの刺激のうちの連続する５ｓの期間の際に、平均発火頻度に対する予備刺激発火頻度を特別に比較した（つまり０〜５ｓ、５〜１０ｓ、１０〜１５ｓ、および１５〜２０ｓ、未補正のＰ＜０．０５、ウィルコクソン符号順位検定、各ニューロンで１７試験を実施）。面白いことに、１０Ｈｚ刺激の際の発火頻度の減少が、主として刺激開始後５〜１５ｓの間隔で発生したが、他方４０Ｈｚ刺激の際の発火頻度の増加は主として最初の１０ｓに生じた（表１）。他方１００Ｈｚ刺激の際のニューロン発火頻度の増加は概して２０ｓ刺激期間の全体にわたって維持された（表１）。そのような相違は、視床皮質経路の短期可塑性を反映し得て、この視床皮質経路は以前に周波数依存特性を示していたものである。また刺激前後時間ヒストグラムは、抑制の際に発生する棘波事象が不均一な経時分布を有し、この分布は光発現の後６ｍｓ〜３４ｍｓの間にピークを迎えたことを明らかにした（図１１）。このデータは、１０Ｈｚでのグルタミン酸作動性視床皮質入力が時に活動電位を生成したことを示唆している。ただしとりわけ、すべての光パルスが直接の活動電位を招くわけではない。
【０２３０】
表１．感覚皮質の単一ユニット記録から得た電気生理学の結果。また表１−ソースデータ１を参照のこと。
【０２３１】
【表１】
2019500946.tif 000002
【０２３２】
図１１．１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動される抑制期間に発生する皮質性棘波は、不均一経時分布を示す。（上部パネル）６匹の動物について１０Ｈｚの中心視床刺激の際の体性感覚皮質中の棘波事象の平均刺激前後時間ヒストグラム（ＰＳＴＨ）。解析は、各動物について抑制された最大数のニューロンを有した５ｓの時間ビンに限定された。棘波カウントを個々の３０ｍｓの光パルス発現に位置合わせし、５ｓ刺激期間の際に出力された５０パルスを合計し、試験全体を平均し、各抑制されたニューロンについて５ｍｓの間隔でビニングすることで、ＰＳＴＨを計算した。ヒストグラムは２０ｓの予備刺激ベースライン期間の対応する棘波カウント値で正規化し（破線で表す）、また、各動物のニューロン全体にわたって平均をとった。斜線部の長方形は３０ｍｓの光パルスを表す。棘波事象は大多数の１００ｍｓ刺激中断期間にベースラインに対して減少したが、それでも発生する棘波事象は不均一分布を有し、その分布のピークは刺激発現後の６〜３４ｍｓであることに注意。このパターンは、いくつかの視床刺激は、予備刺激レベルに比較して活動の純抑制にもかかわらず、皮質中に棘波事象を誘起することを示唆する。呈示の動物は、表１中のＣｈＲ２電気生理学実験に使用された２つと、図５中のＣｈＲ２−ｅＮｐＨＲを組み合せた電気生理学実験に使用された４つとを含む。（下の表）体性感覚皮質における抑制性ニューロンについての、ＰＳＴＨピークレイテンシーと棘波忠実度の概要。ピークレイテンシーは、各ニューロンのＰＳＴＨについて最大の棘波カウントのある５ｍｓビンとして定義された。棘波忠実度は、３０ｍｓパルスの際に少なくとも１つの棘波を誘発する所定の抑制５ｓビンの光パルスのパーセンテージを表す。値は平均値±図と表中の細胞にまたがるｓ．ｔ．ｅ．を表す。
【０２３３】
同時に、このｏｆＭＲＩと電気生理学データとは、体性感覚皮質全体にわたる神経活動が、低周波数の中心視床刺激で抑制されて、および高周波数の刺激で増加することを示す。刺激は中心視床に位置する細胞体の興奮性ニューロンに限定されたため、刺激周波数と皮質興奮／抑制との間の因果関係はニューロンの初期発火パターンに起因し得る。この結果はシステム神経科学中の成長する文献に追加され、ニューロン集団の発火パターンが、特異的時間的コードによって下流領域に非常に異なる−反対でさえある−影響を及ぼすことを示唆する。
【０２３４】
実施例４：低周波中心視床刺激は不確帯発振を駆動
刺激が興奮性ニューロンに限定された場合、１０Ｈｚ刺激の際の皮質の抑制はＧＡＢＡ作動性集団の周波数依存変調に関係あり得ると仮定された。ラットにおける自然発生的欠神発作中の１０Ｈｚの棘徐波活動の強力なＧＡＢＡ作動変調に関与している、不確帯（ＺＩ）の反応特性を調査した。解剖学的にみてＺＩは直接のＧＡＢＡ作動投射を、体性感覚視床核と感覚皮質とに送信する。機能的にいえばＺＩもまた、ＧＡＢＡ作動抑制を通して高次視床核で処理する感覚情報を選択的にゲート制御する。不確帯の関与を調査するため、中心視床の１０Ｈｚまたは４０Ｈｚでの同時光遺伝学的刺激の際に、この領域で単一ユニットと電場電位の電気生理学的記録とを実施した（図４Ａ）。ＥＥＧ記録が前頭皮質において同時に収集されて、ＺＩ活動と全脳覚醒状態との関係を直接に評価したが、この関係は主として前脳ＥＥＧを用いて測定された。不確帯は、定位的局在およびこの領域の明確な体性感覚性表現を使用して標的とされた。電極は、硬膜から−３．９６ｍｍＡＰ、＋２．２〜２．６ｍｍＭＬ、＋６．７〜７．２ｍｍＤＶを標的とした。不確帯は、適合する深さ指示値、多シナプス性反応に一致する棘波レイテンシー（１０ｍｓのオーダー、図４Ｂ）、および不確帯があるのは公知の対側ウィスカー刺激に反応する受容野、に従って同定された（６４）。電極は、当初ＶＰ視床の背側部分（不確帯の上約１．５ｍｍ）を通って下げられたが、この背側部分もまた、記録されたニューロンがそのような刺激に対応しなくなるまでウィスカー刺激に反応した。電極は次いで、記録されたニューロンがウィスカー刺激に反応して発火し、不確帯に到達したことを示すまで、さらに１．５ｍｍまで下げられた。
【０２３５】
図４．不確帯（ＺＩ）で周波数依存スピンドル状発振が誘発される。（図４Ａ）麻酔をかけた動物において中心視床を光刺激する際の、不確帯の生体内記録と前頭皮質中の同時ＥＥＧ記録との図。（図４Ｂ）個々の光パルスの発現に位置合わせし、パルスと試験全体を合計した、記録されたＺＩニューロンからの棘波活動の代表的ペリイベント時間ヒストグラム。ピーク棘波レイテンシーは、１０Ｈｚ（左）および４０Ｈｚ（右）の刺激では約１０ｍｓおよび約８ｍｓであり、中心視床中の刺激された集団から離れた少なくとも１つのシナプスで記録を実施したことを示唆する。上の概略図は、各周波数で２０ｓ続いた３０％デューティサイクルパルス列を図示する。（図４Ｃ）２０ｓ超の期間の刺激の代表的ペリイベント時間ヒストグラムは、１０Ｈｚと４０Ｈｚとの刺激の際にＺＩ発火の増加を示す。不確帯における２８の分離された単一ユニット（ｎ＝２動物）の中で、ほとんどが刺激の際の発火頻度について有意の増加を示した（ｎ＝２８ニューロンのうちそれぞれ２６と２２、Ｐ＜０．０５、各細胞について２０試験の片側ウィルコクソン符号順位検定を行った）。（図４Ｄ）中心視床の１０Ｈｚ（上）および４０Ｈｚ（下）刺激の際の同一チャネルと試験番号とに基づく代表的電場電位の記録。１０Ｈｚ刺激（黒色三角形でマーク）の際に、４つの振幅変調のスピンドル状発振（ＳＬＯ）が誘発されたが、他方４０Ｈｚの際に誘発されたものはなかった。差し込み図はＳＬＯのズームインを示す。（図４Ｅ）使用可能な１２チャネルのうち１１チャネルについて、１０Ｈｚ刺激の際のＳＬＯの数は４０Ｈｚ刺激より大きかった（ｎ＝２動物、各２０試験を実施、Ｐ＜０．０１、片側ウィルコクソン順位和検定）。（Ｆ）２つ以上のＳＬＯが１０Ｈｚ刺激の同じ２０ｓ期間に誘発された場合、事象間間隔の分布は６．６±０．２ｓに中心があった（ｓ．ｅ．ｍ．）。（図４Ｇ）中心視床刺激と同時ＺＩ記録の際に前頭皮質で収集された代表的ＥＥＧの記録。１０Ｈｚ刺激は棘徐波反応を誘発し、この反応は意識消失と知覚的意識とに関連し、他方４０Ｈｚ刺激は覚醒を示す低電位速波脳波反応を誘発する。（図４Ｈ）不確帯においてＣｈＲ２ポジティブ処理が観察され、中心視床刺激の際の漸増のベースを提供した。ｉ．Ｃ．：内包。
【０２３６】
２８個の分離されたＺＩニューロンのうち、過半数は１０Ｈｚおよび４０Ｈｚの両方で中心視床刺激の際の発火頻度の増加を示した（図４Ｃ、ｎ＝それぞれ２６、２２、Ｐ＜０．０５、２０ｓ予備刺激期間と刺激期間との間のウィルコクソン符号順位検定、各ニューロンで２０試験を実施）。ただし主たる差異は、１０Ｈｚ刺激の際に電場電位において大きな振幅変調スピンドル状発振（ＳＬＯ）が、４０Ｈｚ刺激より頻繁に有意に生じたことであった（図４Ｄ、４Ｅ）。この発振は、入眠の際に視床において観察された事柄と同様、事象間隔が約６．６±０．２（ｓ．ｅ．ｍ．）を中心としたことを示した（図４Ｆ）。（図４Ｇ）これに一致して前頭皮質における同時ＥＥＧ記録は、１０Ｈｚ刺激と低振幅の際の強い棘徐波変調と４０Ｈｚ刺激の際の高速発振を示したが、これらはそれぞれ意識消失と覚醒した脳状態とに関連している（図４Ｇ）。ＥＹＦＰ発現軸索はまた不確帯でも観察され（図４Ｈ）、中心視床リレーニューロンは不確帯に直接結合し得ることを示し、また、この反応に対する可能な解剖学的基質を提供した。
【０２３７】
実施例５：中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は誘発された不確帯活動に依存
４０Ｈｚではなく１０Ｈｚの中心視床刺激の際の不確帯におけるスピンドル状発振の観察は、この領域が中心視床駆動ネットワークに一意に係合し得ることを示す。ただし、不確帯において誘発された活動が、周波数依存の体性感覚皮質の抑制駆動において原因としての役割を演ずるか否かは不明である。この問題に取り組むため、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーに融合し、汎ニューロンｈＳｙｎプロモーターによって制御された抑制オプシンハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ）を、中心視床中でＣｈＲ２−ＥＹＥＰを発現する４匹の動物の不確帯に注入した（図５Ａ、５Ｂ、図１２）。（１）２０ｓまたは３０ｓの連続的ｅＮｐＨＲ活性化、および（２）連続的ｅＮｐＨＲ活性化の３０ｓ期間以内に実施される２０ｓ、１０Ｈｚの中心視床刺激という２つの新しい刺激パラダイムを探索した。単一ユニット記録を、不確帯と感覚皮質で、この２つのオプシンの同時活性化の際に同時に実施した（図５Ｃ）。
【０２３８】
図５．１０Ｈｚの中心視床刺激によって駆動された皮質性抑制は正常な不確帯処理に依存する。（図５Ａ）広視野蛍光画像は、右側不確帯に空間的に局在化したロバストなｅＮｐＨＲ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す。縮尺バー、１ｍｍ。（図５Ｂ）共焦点画像は、不確帯中のニューロンの体性膜に局在化したｅＮｐＨＲ−ｍＣｈｅｒｒｙを示す。縮尺バー、１０μｍ。８８２ＤＡＰＩ染色細胞のうち２０９がＺＩ（２４％、ｎ＝２動物）中にｍＣｈｅｒｒｙを共発現した。（図５Ｃ）それぞれＣｈＲ２とｅＮｐＨＲとを使用した中心視床の１０Ｈｚ刺激および不確帯の連続的（連続的）抑制の際の、皮質性電気生理学的記録の概略図。（図５Ｄ）不確帯の代表的ニューロンのペリイベント時間ヒストグラムで、この不確帯の発火頻度は、５９３ｎｍ光源を用いたｅＮｐＨＲ活性化の際に抑制されている。（図５Ｅ）不確帯における代表的ニューロンのペリイベント時間ヒストグラムで、この不確帯の発火頻度は、ｅＮｐＨＲ活性化の際の１０Ｈｚ中心視床刺激のあいだ、抑制されたままである（図４Ｃと比較）。（図５Ｆ）不確帯中のｅＮｐＨＲの活性化は、７０個のニューロンのうち６０個のニューロンで１０Ｈｚ中心視床刺激によって誘発された不確帯発火頻度の変化を有意に減少させる（Ｐ＜０．０５、片側ウィルコクソン順位和検定）。発火頻度の変化は、予備刺激レベルに正規化された。（図５Ｇ）代表的皮質ニューロンのペリイベント時間ヒストグラムは、１０Ｈｚ中心視床刺激によって誘発された抑制反応が不確帯中の同時抑制活動によって覆されることを示す。発火頻度は、平均予備刺激値に正規化される。（図５Ｈ）同時ｅＮｐＨＲ活性化を伴う、または伴わない１０Ｈｚ中心視床刺激の際の皮質発火頻度中に誘発された変化の定量化。中心視床刺激とｅＮｐＨＲ活性化とを組み合わせた場合、７６個の細胞のうち５０個の細胞が抑制の減少を示した（Ｐ＜０．０５、１ｓビンにまたがるウィルコクソン順位和検定）。発火頻度の変化は、予備刺激レベルに正規化された。（図５Ｉ）共焦点画像は、体性感覚皮質中の不確帯からのｍＣｈｅｒｒｙポジティブ軸索投射を示す。縮尺バー、２０μｍ。
【０２３９】
図１２．不確帯におけるｅＮｐＨＲ発現の広視野蛍光画像、一定のスケールで活性化ｅＮｐＨＲ（つまり抑制性ニューロン）の推定コーンを用いてオーバレイされている。侵入深さと容積とは、記載された方法と５ｍＷ／ｍｍ2 の光強度しきい値を使用してそれぞれ０．６４ｍｍと０．０２４ｍｍ3 と計算された。光ファイバーの直径１０５μｍ、ＮＡ０．２２、発散半角９．３°。侵入深さと活性化容積とは、光ファイバー先端で３ｍＷの光パワーに対応する。刺激座標は、−３．９６ｍｍＡＰ、＋２．４ｍｍＭＬ、および−６．７ｍｍＤＶに対応する。密なＧＡＢＡ作動性ニューロンの別の領域である視床網様核を参照のために示す。
【０２４０】
不確帯中の記録された７０個のニューロンのうち、５９３ｎｍ光の出力は、６２個のニューロンで発火の減少を招いたが（Ｐ＜０．０５、２０ｓ予備刺激期間と２０ｓまたは３０ｓ刺激期間との間でウィルコクソン符号順位検定、各ニューロンで１５〜２０の試験を実施）、抑制不確帯活動においてハロロドプシンの照射が成功したことを示した。誘発されたニューロン発火頻度の減少は通常、５９３ｎｍ光出力期間のあいだに継続した。（図５Ｄ）。ＺＩにおけるハロロドプシン活性化を中心視床の１０Ｈｚ刺激と組み合わせた場合、前述の不確帯発火の増加（図４Ｃ）は中断された。７０個のニューロンのうち６０個のニューロンにおいて、２０ｓの１０Ｈｚ中心視床刺激期間と予備刺激期間との間の不確帯発火頻度の差異は有意に減少し、同時にｅＮｐＨＲが活性化された（図５Ｆ、Ｐ＜０．０５、片側ウィルコクソン順位和検定、ｎ＝１０〜２０試験）。図５Ｅは、代表的ニューロンにおける１０Ｈｚ中心視床刺激の２０ｓ期間全体にわたって不確帯活動の抑制を図示する。このデータは、ハロロドプシンの活性化が、１０Ｈｚ中心視床刺激によって誘発された不確帯発火を有意に抑制し、また不確帯処理の中断に成功したことを示す。
【０２４１】
この不確帯の抑制が、中心視床刺激によって駆動された皮質活動に影響を及ぼしたか否かを判定するため、ｅＮｐＨＲの照射を伴う、または伴わないＣｈＲ２活性化によって誘発された体性感覚皮質の発火頻度の変化を数値化した。７６個の体性感覚皮質ニューロンを記録し、および中心視床刺激の２０ｓ期間をこれまでのように４つの５ｓビンに分割した。図３で呈示されたデータに一致して、６８個の細胞（８９％）が中心視床の１０Ｈｚ刺激の際に発火の減少を示した（未補正Ｐ＜０．０５、ウィルコクソン符号順位検定、各ニューロンについて１０〜１５試験を実施）。ただし目立ったことに、ｅＮｐＨＲｑによる不確帯活動の抑制はこの効果を覆した。動物全体で７６個のニューロンのうち５０個のニューロンが、中心視床刺激とｅＮｐＨＲ活性化とを組み合わせた場合に、抑制の減少を示した（図５Ｈ、Ｐ＜０．０５、１ｓビンにまたがるウィルコクソン順位和検定、各ニューロンについて１０〜２０試験を実施）。実際に、わずかの細胞が抑制反応から興奮反応に切り替わった。図５Ｇは、１０Ｈｚ中心視床刺激の際に抑制反応を示した１細胞の発火パターンを図示するが、この抑制反応は、不確帯が同時にｅＮｐＨＲによって抑制された場合に除去された。まとめるとこのデータは、１０Ｈｚ中心視床刺激の際の不確帯活動が体性感覚皮質に純抑制的影響を及ぼしたことを示唆する。直接の解剖学的結合を通してのこの影響の裏付けとして、感覚皮質（図５Ｉ）においてｍＣｈｅｒｒｙポジティブ軸索を観察したが、前述した不確帯皮質性投射のレポートと一致していた。この研究成果は、中心視床覚醒回路における不確帯の概念的に新しい役割を示す。
【０２４２】
実施例６：中心視床刺激は脳状態を周波数依存的に変調
最後に、この研究成果をより直接的に中心視床覚醒回路と前述した電気的刺激研究とに関連する行動に関連付けるため、睡眠中で無麻酔の動物において、映像とＥＥＧ記録とを同時に用いて、１０、４０、および１００Ｈｚの刺激を実施した（実施例１参照）。制御（前置刺激）活動は、デルタ、シータ、アルファ、およびベータバンドにおいてＥＥＧ帯域電力を用いて数値化したように、刺激周波数にわたって一貫していた（図１３）。１０Ｈｚ刺激の際に、過半数の動物は、刺激とその後の眠りに戻ることを通して擬死および行動停止を含む欠神発作を示す行動を示した（図６Ａ、ｎ＝４／７）。加えてもっとも一般的なＥＥＧ反応は、遅棘徐波発射への遷移であったが（図６Ｂ，Ｃ、ｎ＝５／７）、この発射は一般に意識消失に関連する。対照的に、４０Ｈｚと１００Ｈｚとの刺激は、覚醒状態への行動遷移を招いたが、探査と目標指向運動とに反映された（図６Ａ、ｎ＝それぞれ４／７と４／６）。同様にこの高周波刺激によって誘発された最も一般的なＥＥＧパターンは、低電位速波脳波反応であったが（図６Ｂ、ｎ＝それぞれ３／７および６／６）、皮質活性化と脱周期とを示した。まとめると、この現象はｏｆＭＲＩを用いて観察された皮質漸増および線条体漸増パターンに一致する。さらに行動実験（図６Ｃ，Ｄ）の際に誘発された遅棘徐波と低電位速波脳波ＥＥＧ反応とは麻酔状態で記録されたもの（図４Ｇ）と一致し、さらにｏｆＭＲＩによって明らかにされたネットワーク活性化パターンを本開示で報告された覚醒反応ならびに初期の刺激研究で報告されたものとに関連付ける。
【０２４３】
図６．睡眠中の動物における中心視床の光遺伝学的刺激は周波数依存的方法で脳状態を変調させる。（図６Ａ）過半数の動物（ｎ＝４／７）における低周波刺激（１０Ｈｚ）は行動欠神発作を誘発するが、他方高周波刺激（４０、１００Ｈｚ）は過半数の動物に目覚めを引き起こす（ｎ＝それぞれ４／７と４／６）。破線のボックスは、各周波数でもっとも一般的な反応を示し、付属の矢印は対応する睡眠からの遷移を示す。（図６Ｂ）低周波刺激は通常、ＥＥＧで棘徐波反応を誘発するが（ｎ＝５／７）、これは欠神発作において読み取った行動に一致する。高周波刺激の際にもっとも頻発するＥＥＧ反応は低電位速波脳波（ｎ＝３／７と６／６）であり、覚醒を示す。Ｎ：通常、ＳＷ：棘徐波、ｌｖｆ：低電位速波脳波、ｓ：棘波、ｅ：進展性発作。（図６Ｃ、６Ｄ）棘徐波と低電位速波脳波として分類された代表的ＥＥＧ反応のトレース。差し込み図は４ｓの拡大図を示す。重要なことに、このＥＥＧパターンは麻酔条件下で記録されたもの（図４Ｇ）に一致し、さらにｏｆＭＲＩを用いて可視化された反応を報告された行動反応に関連付ける。図１３も参照。
【０２４４】
図１３．前置刺激活動は、デルタ、シータ、アルファ、およびベータバンドにおいてＥＥＧ帯域電力を用いて数値化したように、睡眠中のラットの刺激周波数にわたって一貫している。
【０２４５】
本発明はその特異的実施形態に関して説明されてきたが、当業者には様々な変更をなし得ること、および本発明の主旨および範囲から逸脱せずに等価物に置き換え得ることを理解すべきである。加えて、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセスステップまたは複数プロセスに適合するため、本発明の目的、主旨および範囲には多くの改変を行い得る。そのような改変はすべて、以下に追加された特許請求の範囲内にあると意図される。
【０２４６】
相互参照
本出願は、２０１５年１２月９日に出願された米国特許仮出願第６２／２６５，２９１号の利益を主張するものであり、その出願全体を参照によってここに組み込む。
【０２４７】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、契約番号ＮＳ０８７１５９に従って米国立衛生研究所から授与された政府援助を得て実施された。政府機関は、当発明に特定の権利を得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2019500946.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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