(57)【要約】  古典的なＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ類縁体以外のアミン置換モルホリノオリゴヌクレオチド、及びこれらのオリゴヌクレオチドを高収率で効率的に合成する方法が提供される。チオホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホルアミデートジエステル、及びアルキルホスホルアミデートのリンカーを有するモルホリノオリゴヌクレオチド。修飾されていないＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡの他の類縁体を含むキメラを作製することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的なＤＮＡ又はＲＮＡと、天然ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ複合体よりも安定な二重鎖を形成し、ＲＮアーゼＨ１と活性であり、標準的な脂質試薬を使用して細胞にトランスフェクトされ得る。したがって、これらの類縁体は、多くの適用に有用である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2019534862.tif 000009
（式中、
Ｂはそれぞれ独立して、核酸塩基（アデノシン、グアノシン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン）、又はシリル保護基若しくは酸不安定性の保護基若しくは塩基不安定性の保護基で保護された核酸塩基であり、
Ｘは、酸素若しくは硫黄、メチル、エチル、任意のＣ３〜７アルキル、５員〜７員の脂肪族環若しくは芳香環、カルボキシレート、アセテート若しくはホルメートの誘導体、アミン、又は任意の直鎖若しくは分岐鎖のＣ１〜５アルキルで置換されたアミンであり、
Ｙは酸素又は硫黄であり、
Ｒはそれぞれ独立して、ガラス基体、ポリスチレン樹脂、ジメトキシトリチル保護基、リン誘導体、ＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオシド／オリゴヌクレオチド、トリメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル、任意のシリル、又は式Ｉの別のモルホリノに連結され、ここで、リンカーは、ホスフェート／ホスホロチオエート／ボラノホスフェート結合を有するホスホロジアミデートリンカー、又はホスホロアミデートリンカー、ホスフェート結合若しくはチオ結合、又は上に記載されるＸを有するモルホリノ環との任意の他の結合である）の化学構造を含む単量体サブユニットを含むオリゴマー。
【請求項２】
前記核酸塩基性保護基が、
【化２】
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から選択される、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
２個〜４０個の単量体のサブユニットを含む、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項４】
下記の化学構造：
【化３】
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（ここで、
Ｂはそれぞれ独立して、核酸塩基（アデノシン、グアノシン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン）、又はシリル保護基若しくは酸不安定性の保護基若しくは塩基不安定性の保護基で保護された核酸塩基であり、
Ｒはそれぞれ独立して、ガラス基体、ポリスチレン樹脂、ジメトキシトリチル保護基、リン誘導体、ＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオシド／オリゴヌクレオチド、トリメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル、任意のシリル、又は式Ｉの別のモルホリノに連結され、ここで、リンカーは、ホスフェート／ホスホロチオエート／ボラノホスフェート結合を有するホスホロジアミデートリンカー、又はホスホロジアミデートリンカー、ホスフェート結合若しくはチオ結合である）を有するホスホルアミダイトシントン。
【請求項５】
前記核酸塩基保護基が、
【化４】
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から選択される、請求項４に記載のホスホルアミダイトシントン。
【請求項６】
ホスホロジアミダイト単量体を作製する方法であって、
ａ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチルリボ−塩基を過ヨウ素酸ナトリウム及び二ホウ酸アンモニウムと接触させてジヒドロキシリボースモルホリノ単量体を生成することと、
ここで、前記塩基が、保護基によってヌクレオシドアミノ基において保護されていてもよいチミジン、シトシン、アデニン、及びグアニンの１つである；
ｂ．前記ジヒドロキシリボースモルホリノ単量体上のヒドロキシル基をシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元してモルホリノ単量体を生成することと、
ｃ．ジクロロメタン中の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト及び４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）で前記モルホリノ単量体をホスフィチル化してホスホロジアミダイト単量体を生成することと、
を含む、方法。
【請求項７】
前記ヌクレオシドアミノ基における前記保護基が、請求項４又は請求項５に記載の任意の他の保護基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の、少なくとも１つの単量体サブユニットを含むオリゴマーを形成する方法であって、
ａ．ポリスチレン／ＣＰＧ支持体に連結された５’−未保護−２’−デオキシリボヌクレオシドを準備することと、
ｂ．前記５’−未保護−２’−デオキシリボヌクレオシドと、４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）を含む無水アセトニトリル中の請求項３に記載のホスホルアミダイトとを反応させてホスホルアミダイトジエステルヌクレオチド間結合を有する二量体を生成することと、
ｃ．前記二量体のホウ素化、又は硫化、又は酸化の少なくとも１つを含む、前記二量体を化学的に活性化することと、
ｄ．前記二量体をキャッピングすることと、
ｅ．前記二量体を脱トリチル化することと、
ｆ．工程ｂ〜工程ｅを繰り返して前記オリゴマーを伸長することと、
ｇ．モルホリノボランホスホロアミデート単量体を、テトラヒドロフラン中のヨウ素及びジメチルアミンと接触させて、モルホリノホスホロアミデートをＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯに変換することと、
ｈ．前記オリゴマーを、水酸化アンモニウム及びエチレンジアミンを含む溶液と接触させて、前記ポリスチレン支持体から前記オリゴマーを除去することと、
を含む、方法。
【請求項９】
前記活性化工程ｃが、前記二量体のホウ素化を含み、前記伸長工程ｆの後、前記接触工程ｇの前に、前記ヌクレオチド間結合からシアノエチル基を除去する追加工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性化工程ｃが、前記二量体のホウ素化を含み、前記接触工程ｇの後、工程ｈの前に、前記単量体をテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のＴＨＦ溶液と接触させて前記単量体からＢＩＢＳ保護基を除去する追加工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記反復合成工程ｆが市販のＤＮＡ合成装置で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
硫化してチオモルホリノ結合を生成した後、前記合成されたオリゴマーが、以下の表のＯＤＮ１〜ＯＤＮ１１から選択される少なくとも１つのオリゴマーである、請求項８に記載の方法。
【表１】
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【請求項１３】
相補的なＤＮＡ又はＲＮＡと、天然ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ複合体よりも安定な二重鎖を容易に形成するチオモルホリノヌクレオチド間結合を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項８に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ＲＮアーゼＨ１酵素活性を活性化する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項８に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
酵素活性を不活性化する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項８に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
標準的な脂質試薬を使用して細胞に容易にトランスフェクトされる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項８に記載の方法によって形成されるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年５月３１日付けで出願された米国仮特許出願第６２／５１３，０８９号及び２０１６年９月２０日付けで出願された米国仮特許出願第６２／３９７，２７７号の利益を主張するものである。これらの出願はどちらも引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本開示は、モルホリノオリゴヌクレオチド及びその誘導体を合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
モルホリノオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡに対するそれらの高親和性、様々なヌクレアーゼに対する抵抗性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性、及び低毒性によりアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬としての使用に有望である。ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ；化合物３、図１）は、非イオンヌクレオチド間結合と、ＤＮＡのデオキシリボースに置き換わるモルホリノとを有する。これらのＮ，Ｎ−ジメチルアミノホスホラジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライシングを干渉するとともに、翻訳を妨げることによって遺伝子発現を阻害し（非特許文献１）、細胞ヌクレアーゼに抵抗性であり（非特許文献２、非特許文献３）、ＤＮＡよりも高いＲＮＡ結合親和性を有する（非特許文献４）。ＰＭＯの治療法の開発は、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療及び出血性のフィロウイルス科のマールブルグウイルスの感染の予防に対する臨床試験において行われている（特許文献１及び特許文献２）。さらに、ＰＭＯは、ナノテクノロジーにおける適用（非特許文献５）及び表面ハイブリダイゼーション（非特許文献６）について考察されている。
【０００４】
残念なことに、ＰＭＯに対するこれらの有望な適用は、効率的な合成方法論がないことから非常に限定されている。自動合成装置でＤＮＡ及びＲＮＡを化学的に作製する標準法とは対照的に、現在、ＰＭＯはポリスチレン樹脂上で５’から３’方向に合成されている。第１段階として、５’−ヒドロキシル−Ｎ−トリチル−モルホリノヌクレオシドとＮ，Ｎ−ジメチルアミノジクロロホスホルアミデートとの縮合は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノクロロホスホロアミデートシントンを生成する。塩基の存在下でのカップリングは、上記樹脂に付着した二量体をもたらす。酸による更なる脱トリチル化は、上記サイクルを繰り返すことによって伸長され得る二量体を生成する。このアプローチには、幾つかの認識される課題がある。例えば、縮合収率が低く（ジチミジンモルホリノの回収収率は４５％であった）、長い反応時間を必要とする。さらに、５’−クロロ−ホスホロアミデート単量体は不安定であり、多量の塩基の存在下で２つのモルホリノ単量体をカップリングすることは困難である（非特許文献７）。さらに、このアプローチは、多くの実験室では容易に利用することができない、特殊な手順、技術及び材料（例えば、膨潤性ポリスチレン樹脂、特有の反応容器、及び脱トリチル化剤としてのトリフルオロ酢酸のピリジニウム塩）を必要とする。
【０００５】
最近では、ポリチミジンＰＭＯの合成に対するＨ−ホスホネート化学を使用して新たな方法が開発された。このアプローチにも課題が存在する。例えば、Ｈ−ホスホネート中のリン原子は、求電子性であり、孤立電子対を欠くことから、ほとんどのＰ（ＩＩＩ）化合物よりも周囲条件下での酸化にはるかに抵抗性である。さらに、Ｈ−ホスホネートモルホリノ二量体の形成に対するカップリング収率は低い（７７％）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／００４０１６２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／００３８４６２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Summerton, J. Biochim. Biophys. Acta 1999, 1489, 141-158
【非特許文献２】Hudziak, et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996, 6, 267-272
【非特許文献３】Arora, et al. J. Pharm. Sci. 2002, 91, 1009-18.
【非特許文献４】Summerton, J. E. Morpholinos and Related Antisense Biomolecules (Janson, C. G., and During, M. J., Eds.), 2003, Kluwer/Plenum Publishers.
【非特許文献５】Paul, et al., Chem. Commun., 2013, 49, 11278-80
【非特許文献６】Tercero, et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131:4953
【非特許文献７】Bhadra, et al., Tetrahedron Letters 2015, 56: 4565-68
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
先の不利点はそれぞれ、本開示の方法によって克服される。さらに、本開示の方法は、以下で更に十分に検討される他の利点を達成する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）及びＰＭＯ−ＤＮＡキメラを合成する新たな方法を提供する。これらの方法は、ホスホスホロジアミデートヌクレオチド間結合を含むオリゴマーが、自動ＤＮＡ合成装置において高収率でホスホルアミダイト化学を使用して作製され得ることから、非常に強健である。上記プロセスは、モルホリノホスホルアミダイトをＤＮＡに組み込むことから始まり、ホウ素化、そしてその後の様々なアミンの存在下でのヨウ素による酸化によって、多様なＰＭＯ及びＰＭＯ−ＤＮＡキメラのセットが形成される。上記方法は、一般的であり、多数のＰＭＯ結合の合成をもたらす。クロロホスホルアミデートシントンを使用する手順とは異なり、本開示のより反応性のホスホルジアミダイトシントンは、高収率でこれらの類縁体を合成するために使用され得る。これらの類縁体を集合させるため、カップリング中の、ジシアノイミダゾールを介するモルホリノホスホルジアミダイトのジイソプロピルアミノ成分の選択的活性化が使用される。
【００１０】
有利には、先に開発されたＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯシントンが５’から３’の方向でこれらの類縁体を合成するように設計される化学とは異なり、モルホリノホスホルジアミダイトと２’−デオキシヌクレシドシントンの両方が３’から５’方向のオリゴヌクレオチドの合成に対して設計されたことから、ＰＭＯ及びＰＭＯ−ＤＮＡキメラは、ＤＮＡ合成装置で合成され得る。さらに、この新たなアプローチは、適切なアミンによるヨウ素の酸化によって多様なＰＭＯキメラを生成するために使用され得るボランホスホルアミデートヌクレオチド間結合を使用することによって成り立つ。例えば、とりわけＰＭＯ−ＬＮＡ、ＰＭＯ−ＲＮＡ、ＰＭＯ−ＤＮＡホスホロチオエート／ホスホロジチオエート、及びＰＭＯ−ＤＮＡホスホノアセテート／ホスホノホルメートのキメラが、これらの方法を使用して作製され得る。
【００１１】
様々な生物学及び生化学の適用におけるそれらの使用可能性について、これらのＰＭＯ−ＤＮＡキメラは、他のいくつかの類縁体に対して３つの可能性のある利点を示した。例えば、アミノモルホリノホスホロジアミデート誘導体は、修飾されていないＤＮＡ／ＲＮＡ又は標準的なＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ類縁体のいずれかよりも、相補的なＤＮＡ
又はＲＮＡとより安定な二重鎖を形成することがわかった（ＲＮＡとの二重鎖形成で１つの修飾当たりＮ，Ｎ−ジメチル類縁体よりもおよそ１．７５倍安定）。さらに、これらのＰＭＯ−ＤＮＡキメラは、ＲＮアーゼＨ１と活性である。これは、完全に置換されたＰＭＯがＲＮアーゼＨ１と不活性である標準的なＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ類縁体と比べて有望である。これらのキャップ／ギャップＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯキメラは、ＲＮアーゼＨ１を活性化することによって、生物学における様々な適用に有用な種々の生化学的特性を有する類縁体を提供する（例えば、アミノアミデート誘導体は、二重鎖形成に対して安定性が増強されている）。相補的なＲＮＡとの（修飾されていない二重鎖と比較した）これらのＰＭＯ−ＤＮＡキメラの安定化の増加によって、この種のキャップ／ギャップ類縁体は、より短い一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができるため、オフターゲット効果を減少する。さらに、これらのＰＭＯ−ＤＮＡキメラを一般的に良く知られているトランスフェクト用試薬を使用して容易に細胞にトランスフェクトすることができ、マイクロインジェクション、ＰＭＯとＤＮＡとのハイブリダイゼーション、及びエトキシル化ポリエチレンイミンによる送達、又はペプチド若しくは樹状分子トランスポーターのいずれかとの共役等の手法によるＰＭＯの送達に関連する課題を排除する。
【００１２】
したがって、本開示は、わずかな副生成物の形成を伴って、ＰＭＯ誘導体を合成する効率的でコスト効率の良い方法を提供する、ＰＭＯ合成方法論を提供する。これらの合成方法は、本発明者らの先に報告したヨウ素及びアミンの存在下でのボランホスホネートＤＮＡのホスホルアミデートＤＮＡへの立体選択的変換を組み込むことで（Paul, S., Roy, S., Monfregola, L., Shang, S., Shoemaker, R., Caruthers, M. H., J. Am. Chem. Soc.
2015, 137:3253-64）、本開示の合成方法の３つの顕著な利点をもたらす：
１）これらの方法は、ホスホルアミダイト化学を使用する標準的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成方法と独立しており（orthogonal）、また適合性であることから、ＰＭＯ合成は通常のＤＮＡ合成装置で行うことができ、
２）Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノホスホロアミデートモルホリノ以外のヌクレオチド間結合を有するＰＭＯを初めて合成することができ、
３）これらの合成方法は、ＰＭＯ−ＤＮＡキメラの合成を可能とする。これらのキメラは、アニオン性であることから、水溶性であり、ＲＮＡにハイブリダイズすることで、ＲＮアーゼＨを活性化する。
【００１３】
本概要は、本発明の完全な範囲（extent and scope）を代表するものであると意図されるものでも、解釈されるものでもない。さらに、本明細書での「本開示」又はその態様への言及は、本開示の或る特定の実施形態を意味すると理解され、必ずしも全ての実施形態を特定の記載に限定すると解釈されるものではない。本開示は本概要並びに添付の図面及び発明を実施するための形態に様々な詳細度で説明され、本開示の範囲に関する限定は本概要に要素、構成要素等を含める又は含めないことによっては表されない。本開示の付加的な態様は、発明を実施するための形態から特に図面と考え合わせることでより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＤＮＡ（１）、ＲＮＡ（２）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノホスホルジアミデートモルホリノ（３）、及びボランホスホルアミデートモルホリノ（４）のオリゴヌクレオチドの化学構造を示す図である。
【図２】Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドの合成に対する現在のアプローチを表す合成スキームの図である。モルホリノのナンバリングにおいて、第１級ヒドロキシル基は６’でなくてはならないが、本開示の適用上、通常の核酸化学と関係づけるためこのヒドロキシル基を５’と示す。
【図３】ＢＩＢＳ保護モルホリノホスホルジアミダイトシントンの合成を表す合成スキームの図である。反応条件：（ｉ）ルチジン（４．０当量）及び１，４−ジオキサン；（ｉｉ）１．０Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ；（ｉｉｉ）ＤＭＴ−Ｃｌ（１．２当量）、ピリジン；並びに（ｉｖ）ＮａＩＯ４（１．１当量）、（ＮＨ４）２Ｂ４Ｏ７（１．１当量）、ＭｅＯＨ；（ｖ）ＮａＣＮＢＨ３（２．０当量）、ＡｃＯＨ（２．０当量）、ＭｅＯＨ；（ｖｉ）Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）（ＮｉＰｒ２）２（１．２当量）、４，５−ジシアミノイミダゾール（０．５当量）、及びＣＨ２Ｃｌ２。
【図４】ＢＩＢＳ保護ホスホルアミダイトを使用して、ホスホルジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）に対する固相合成の合成スキームを示す図である。化合物ＦはＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−ホスホロジアミデートヌクレオチド間結合のみを有するＰＭＯであり、「ｘ」はＮ，Ｎ−ジエチルアミノ−ＰＭＯヌクレオチド単位の選択数であり、化合物Ａはチミジンリボヌクレオシドであるが、このリボヌクレオシドは、４つの２’−デオキシリボヌクレオシド又はモルホリノヌクレオシドのいずれかによって置き換えられていてもよい。シトシン、アデニン、及びグアニンの塩基が使用される例では、塩基は、ビス（ｔｅｒｔブチル）イソプロピルシリル（ＢＩＢＳ）基によって保護されなくてはならない。
【図５】シリル保護基の除去後に行われた酸化的アミノ化反応におけるジメチルアミノの使用によって引き起こされたシトシンのＣ−４位及びＣ−６位における置換を示す図である。
【図６】Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ三量体の合成（左パネル）、及び全反応混合物のＬＣＭＳ分析によるＬＣプロファイル（右パネル）を表す図である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｆは、ＯＤＮ２７トランスフェクションの蛍光顕微鏡検査による可視化を示す図である。血清低減培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中のＯＤＮ２７（１００ｎＭ）をＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  １を使用してＨｅＬａ細胞へトランスフェクトした後、３７℃で１８時間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、緩衝ホルマリン溶液を使用して固定した。細胞の核をＤＡＰＩ（青色）によって対比染色した。図７Ａ及び図７Ｄは、ＯＤＮ２７のフルオレセイン局在化の画像である。図７Ｂ及び図７Ｅは、同じ細胞における核のＤＡＰＩ局在化の画像である。図７Ｃは、図７Ａ及び図７Ｂによる画像の画像オーバーレイである。図７Ｆは、図７Ｄに示される細胞の位相コントラスト画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
別段の指示がない限り、以下の用語は下記の意味を有する。
【００１６】
「オリゴヌクレオチド類縁体」の用語は、修飾された骨格構造、例えば、天然のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに見られる標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、並びに任意に、修飾された糖部分、例えばリボース部分又はデオキシリボース部分以外のモルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。類縁体は、標準的なポリヌクレオチド塩基に対するワトソン−クリック型塩基対合による水素結合が可能な塩基を維持し、ここで、類縁体骨格は、オリゴヌクレオチド類縁体分子と、標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間の配列特異的様式のかかる水素結合を可能とするような塩基を提示する。好ましい類縁体は、実質的には帯電していないリン含有骨格を有するものである。
【００１７】
「核酸塩基」は、核酸の合成に使用され得る限り特に限定されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、及びアデニル基、グアニル基等のプリン塩基を含む。「任意に保護された核酸塩基」は、例えば、アデニル基、グアニル基又はシトシル基において保護され得るアミノ基を有する核酸塩基を意味し、アミノ基がモルホリノヌクレオチドのモルホリン環窒素原子の脱保護条件下で維持可能な保護基によって保護される核酸塩基が好ましい。
【００１８】
「アミノ保護基」は、特に限定されず、その例として、Greene's PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 4th edition, Wiley-Interscience, 2006等に記載される保護基が挙げられる。「アミノ保護基」の具体例として、ピバロイル基、ピバロイルオキシメチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、ジメチルホルムアミジニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基等が挙げられる。それらの中でも、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、アセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基及びジメチルホルムアミジニル基が好ましい。さらに、核酸塩基のカルボニル基は保護されてもよく、例えば、フェノール、２，５−ジクロロフェノール、３−クロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２−ホルミルフェノール、２−ナフトール、４−メトキシフェノール、４−クロロフェノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、４−アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４−ピバロイルオキシベンジルアルコール、４−ニトロフェネチルアルコール、２−（メチルスルホニル）エタノール、２−（フェニルスルホニル）エタノール、２−シアノエタノール、２−（トリメチルシリル）エタノール、ジメチルカルバモイルクロリド、ジエチルカルバモイルクロリド、エチルフェニルカルバモイルクロリド、１−ピロリジンカルボニルクロリド、４−モルホリンカルボニルクロリド、ジフェニルカルバモイルクロリド等を反応させることで保護され得る。
【００１９】
幾つかの場合、カルボニル保護基は特に導入されなくてもよい。さらに、上に言及される基に加えて、任意の位置（複数の場合もある）で、任意の１個〜３個の置換基（例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシ基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等）によって置換された核酸塩基である、修飾された核酸塩基（例えば、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロムウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等）もまた、「核酸塩基」に包含される。
【００２０】
オリゴヌクレオチド類縁体中の実質的に帯電していないリン含有骨格は、サブユニット結合の大半、例えば６０％〜１００％が生理学的ｐＨにおいて帯電しておらず、１個のリン原子を含むものである。類縁体は、５個〜４０個のサブユニット、典型的には約８個〜２５個、好ましくは約１２個〜２５個の単量体のサブユニットを含む。類縁体は、標的配列に対して正確な配列相補性を有してもよく、又は以下に定義されるように、およその相補性を有してもよい。
【００２１】
オリゴヌクレオチド類縁体の「単量体」又は「サブユニット」は、該類縁体の１つのヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）単位を指す。該用語は、付着されたサブユニット間結合を有する又は有しないヌクレオチド単位を指すが、「帯電したサブユニット」を指す場合、電荷は、典型的にはサブユニット間結合（例えば、ホスフェート又はホスホロチオエートの結合）内にある。
【００２２】
「モルホリノオリゴヌクレオチド類縁体」は、図４に示される形態のモルホリノサブユニット構造で構成されるオリゴヌクレオチド類縁体であり、ここで、該構造は、１原子〜３原子の長さのリン含有結合によって共に連結され、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素につなげ、「Ｂ」部分は、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリン又はピリミジンの塩基対合部分である。プリン又はピリミジンの塩基対合部分は、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、又はチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、結合の特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、及び同第５，５０６，３３７号に詳しく記載され、それらの全てが引用することにより本明細書の一部をなす。
【００２３】
図４に示されるサブユニット及び結合は、６原子反復単位骨格に使用される（ここで、６個の原子は、モルホリノ窒素、接続されたリン原子、５’環外炭素にリン原子を連結する原子（通常は酸素）、５’環外炭素、及び次のモルホリノ環の２個の炭素原子を含む）。これらの構造では、５’環外モルホリノ炭素をリン基に連結する原子は、硫黄、窒素、炭素又は酸素であってもよい。リンからのＸ部分ペンダントは、塩基特異的水素結合を妨げない任意の安定した基であり、フルオロ、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ及び環状アミンを含むアルキルアミノを含み、それらはいずれも、塩基特異的結合が妨害されない限り様々に置換され得る。アルキル、アルコキシ及びチオアルコキシは、１個〜１０個の炭素原子を含んでもよい。アルキルアミノは低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ６）置換を指すことが好ましく、環状アミンは、任意に酸素、窒素及び硫黄から選択される１個〜２個の追加のヘテロ原子を含む、５員又は７員の窒素複素環であることが好ましい。Ｙは硫黄又は酸素である。
【００２４】
好ましいモルホリノオリゴマーは、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーであり、本明細書においてＰＭＯと称される。かかるオリゴマーは、図４に示されるようなモルホリノサブユニット構造で構成され、式中、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ又はＮＲ２（ここで、Ｒは低級アルキル、好ましくはメチルである）、Ｙ＝Ｏ、及びＺ＝Ｏであり、Ｂは、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に対して結合するのに有効なプリン又はピリミジンの塩基対合部分である。また、図４において、式中、Ｘ＝低級アルコキシ、例えばメトキシ又はエトキシ、Ｙ＝ＮＨ又はＮＲ（ここで、Ｒは低級アルキルである）、Ｙ＝Ｏである、代替的なホスホロジアミデート結合を有する構造も好ましい。
【００２５】
特にアルキル基、アルコキシ基、チオアルキル基又はアルキルアミノ基に関して「置換される（された）」の用語は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノ等のヘテロ原子を含有する置換基、又はカルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸等の様々な酸若しくはエステルによる炭素上の水素原子の置換を指す。また、「置換される」の用語は、アルキル、カルボニル、又は他の炭素を含有する基によるヘテロ原子上の水素原子（アミン水素等）の置換を指す場合もある。
【００２６】
配列は、逆平行配置でハイブリダイゼーションが起こる場合に互いに「相補的」であると記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドに対して「相補的」となり得る。ターゲッティング配列は、標的配列に対して「およその」又は「実質的な」相補性を有していても、依然として本発明の目的で機能し得る。本開示のオリゴヌクレオチド類縁体は、好ましくは、１０個のヌクレオチドのうち標的配列と多くても１個のミスマッチ、好ましくは２０個のうち多くても１個のミスマッチを有する。代替的には、本開示のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に示される例示的なターゲッティング配列と、少なくとも９０％の配列相同性、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有する。したがって、本開示の方法によって作製されるオリゴマーは、アンチセンス療法に適用可能な疾患状態を治療するために投与される場合に治療用アンチセンス分子として特に有用である。
【００２７】
実質的に４５℃超、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃〜８０℃又はそれよりも高いＴｍにより、生理学的条件下でオリゴマーが標的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチド類縁体は、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズ」する。かかるハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件に相当する。所与のイオン強度及びｐＨにおいて、Ｔｍは、５０％の標的配列が相補性ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。ここでも、かかるハイブリダイゼーションは、正確な相補性を有する場合と同じく、標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの「およその」又は「実質的な」相補性によって起こり得る。
【００２８】
「ヌクレアーゼ抵抗性」オリゴマー分子（オリゴマー）は、その骨格が、非ハイブリダイズ形態又はハイブリダイズ形態で、体内の一般的な細胞外及び細胞内のヌクレアーゼによるヌクレアーゼ切断に対して実質的に抵抗性であるものを指し、すなわち、該オリゴマーは、そのオリゴマーが曝露される体内の通常のヌクレアーゼ条件下でほとんど又は全くヌクレアーゼ切断を示さない。
【００２９】
「ヘテロ二重鎖」は、オリゴヌクレオチド類縁体と標的ＲＮＡの相補性部分との間の二重鎖を指す。「ヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖」は、ヘテロ二重鎖が、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡの複合体を切断することができるＲＮアーゼＨ等の細胞内及び細胞外のヌクレアーゼによるｉｎ  ｖｉｖｏ分解に実質的に抵抗性であるように、その相補的な標的に対するアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重鎖を指す。
【００３０】
本開示のオリゴヌクレオチド類縁体は、細胞内の標的ＲＮＡ配列に特異的に結合することが好ましい。かかる結合の塩基特異性は配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列が相補的である一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。
【００３１】
上に上述されるように、アンチセンスオリゴマーは、ウイルスゲノム、好ましくは５’−ＣＳ又は３’−ＣＳのいずれかの標的化部分に向けられた塩基配列を有する。さらに、オリゴマーは、感染した宿主細胞に投与された場合、例えば、感染した動物被験体に投与された場合に、感染ウイルスを有効に標的とすることができる。この要件は、オリゴマー化合物が（ａ）哺乳動物細胞によって積極的に取り込まれる能力を有する場合、及び（ｂ）一旦取り込まれると、約５０℃よりも高いＴｍで標的ｓｓＲＮＡと二重鎖を形成する場合に満たされる。
【００３２】
以下に記載されるように、細胞によって取り込まれる能力は、オリゴマー骨格が実質的に帯電していないことを必要とし、好ましくはオリゴマー構造が細胞膜を越える積極的な又は促進された輸送に対する基質として認識されることを必要とする。オリゴマーが標的ＲＮＡと安定な二重鎖を形成する能力は、上に言及される因子、標的に関するアンチセンスオリゴマーの長さ及び相補性の程度、Ａ：Ｔ塩基マッチに対するＧ：Ｃの比、並びに任意のミスマッチ塩基の位置と並んで、オリゴマー骨格にも依存する。アンチセンスオリゴマーの細胞ヌクレアーゼに抵抗する能力は、生存、及び細胞の細胞質へのオリゴマーの最終的な送達を促進する。
【００３３】
以下の方法は、任意の所与の実質的に帯電していない骨格を、これらの要件を満たすその能力について試験するのに有用である。
【００３４】
細胞による積極的な又は促進された取り込み
アンチセンスオリゴマーは、遊離（非複合体化）形態で投与された場合に宿主細胞膜を越える促進された若しくは積極的な輸送によって、又は複合体化形態で投与された場合にエンドサイトーシス機構によって宿主細胞により取り込まれ得る。
【００３５】
作用物質が遊離形態で投与される例では、アンチセンス化合物は、実質的に無電荷でなくてはならず、そのサブユニット間結合の大半は生理学的ｐＨで帯電していないことを意
味する。この技術を支持して行われた実験は、少数の正味の電荷、例えば、１５−ｍｅｒ〜２０−ｍｅｒのオリゴマーに対して１〜２の電荷は、実際、実質的に帯電していない骨格を有する特定のオリゴマーの細胞取り込みを増強することができることを示す。電荷は、オリゴマー自体、例えば骨格結合において保有されてもよく、又は末端荷電基付加物（terminal charged-group appendages）であってもよい。帯電した結合の数は、帯電して
いない結合４つ当たり１個以下の帯電した結合であることが好ましい。上記数は、帯電していない結合１０個当たり１個以下、又は帯電していない結合２０個当たり１個以下の帯電した結合であることがより好ましい。一実施形態では、オリゴマーは完全に帯電していない。
【００３６】
また、オリゴマーは、反対の電荷がほぼ等しい数で存在する限り、負及び正に帯電した両方の骨格結合を含んでもよい。オリゴマーは、いずれかの電荷の３個〜５個を超える一連の（run）連続するサブユニットを含んでいないことが好ましい。例えば、オリゴマー
は、所与の数のアニオン性結合、例えば、ホスホロチオエート又はＮ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート結合、及びＮ，Ｎ−ジエチレンジアミンホスホルアミデート等の匹敵する数のカチオン性結合を有してもよい。正味荷電は、中性又は多くてもオリゴマー１個当たり１〜２の正味荷電であることが好ましい。
【００３７】
実質上又は完全に帯電していないことに加えて、アンチセンス剤は、細胞膜を越えてオリゴマーの輸送を促進する、又は積極的にオリゴマーを輸送することができる、メンブレントランスポーター系に対する基質（すなわち、膜タンパク質（単数又は複数））であることが好ましい。この特徴は、以下の通り、オリゴマー相互作用又は細胞取り込みに関する幾つかの試験のうち１つによって特定され得る。
【００３８】
第１の試験は、オリゴマー化合物の細胞表面上の選択された帯電したオリゴマーを置き換える能力、又は細胞表面上の選択された帯電したオリゴマーによって置き換えられる能力を調べることによって、細胞表面受容体における結合を評価する。約１０ｎＭ〜３００ｎＭの最終オリゴマー濃度で典型的には蛍光標識されている所与の量の試験オリゴマーと共に細胞をインキュベートする。すぐ後に、例えば１０分〜３０分後（試験オリゴマーの著しい内部移行が生じ得る前に）、徐々に濃度を増加させて置き換え化合物を添加する。試験化合物が細胞表面受容体に結合することができる場合、置き換え化合物が試験化合物を置き換えることが観察される。置き換え化合物が試験化合物濃度の１０倍以下の濃度で５０％の置き換えをもたらすことが示される場合、その試験化合物は、置き換え化合物と同じ細胞輸送システムに対する認識部位で結合すると見なされる。
【００３９】
第２の試験は、試験化合物が、標識されたレポーター、例えば蛍光レポーターを細胞へと輸送する能力を調べることにより、細胞輸送を測定する。約１０ｎＭ〜３００ｎＭの最終濃度で添加された標識試験化合物の存在下で細胞をインキュベートする。３０分間〜１２０分間のインキュベーションの後、細胞内の標識について、例えば顕微鏡検査によって細胞を調べる。顕著な細胞内標識の存在は、試験化合物が促進された又は積極的な輸送によって輸送される証拠である。
【００４０】
また、アンチセンス化合物は複合化形態で投与されてもよく、ここで、複合化剤は、典型的にはポリマー、例えば、アンチセンス化合物上の任意の正味電荷と反対の電荷を持つ、カチオン性の脂質、ポリペプチド又は非生物学的カチオン性ポリマーである。アニオン性オリゴヌクレオチドとカチオン性脂質又は他のポリマー成分との間の二重層複合体を含む、複合体を形成する方法がよく知られている。例えば、カチオン性脂質であるＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トルメチルアンモニウムクロリド）及び中性リン脂質ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含むリポソーム組成物であるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）が広く使用されてい
る。投与後、複合体は、典型的にはエンドソーム体における粒子カプセル化を含む、エンドサイトーシス機構を通して細胞によって取り込まれる。
【００４１】
また、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマーの５’末端又は３’末端に連結されたアルギニンに富むペプチドとのコンジュゲート形態で投与されてもよい。ペプチドは、典型的には、８個〜１６個のアミノ酸であり、アルギニンと、フェニルアラニン及びシステインを含む他のアミノ酸との混合物からなる。ペプチドコンジュゲートオリゴマーに対する細胞の曝露は、細胞内取り込み及びＲＮＡ標的への送達の増強をもたらす。
【００４２】
代替的には、標識化合物を動物に投与し、オリゴマーが投与されてから数時間後に動物から採取した体液試料を標的ＲＮＡとのヘテロ二重鎖の存在についてアッセイする、単純なｉｎ  ｖｉｖｏ試験によって、任意の所与の骨格を有するオリゴマーの必須の特性を確認することができる。
【００４３】
ＲＮアーゼＨに対する実質的な抵抗性
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明するため２つの一般的な機構が提案されている。第１に、オリゴヌクレオチドとウイルスＲＮＡとの間に形成されるヘテロ二重鎖は、ＲＮアーゼＨに対する基質として作用し、標的ＲＮＡの切断をもたらす。このクラスに属する又はそれに属することが提案されるオリゴヌクレオチドとして、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル及びホスホジエステル（修飾されていない「天然」オリゴヌクレオチド）が挙げられる。かかる化合物は、オリゴマー：ＲＮＡ二重鎖構造中のウイルスＲＮＡをＲＮアーゼＨによる加水分解に曝露して、機能を喪失させる。
【００４４】
「立体遮断物質（steric blockers）」、或いは「ＲＮアーゼＨ不活性」又は「ＲＮア
ーゼＨ抵抗性」と称される第２のクラスのオリゴヌクレオチド類縁体は、ＲＮアーゼＨに対して基質として作用することが観察されておらず、標的ＲＮＡの核細胞質輸送、スプライシング、翻訳、又は複製を立体的に遮断することによって作用すると考えられる。このクラスは、メチルホスホネート、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、特定の２’−Ｏ−アリル又は２’−Ｏ−アルキル修飾オリゴヌクレオチド、及びＮ３’→Ｎ５’ホスホルアミデートを含む。
【００４５】
試験オリゴマーを、試験化合物と共に、ＲＮＡ：オリゴマー二重鎖を形成させ、その後、標準的なアッセイ条件下で二重鎖をＲＮアーゼＨと共にインキュベートすることによって、そのＲＮアーゼＨ抵抗性についてアッセイすることができる。ＲＮアーゼＨへの曝露後、ゲル電気泳動法又は質量分析によって、無傷の二重鎖の有無をモニターすることができる。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ取り込み
迅速試験は、所与のアンチセンスオリゴマー型が上に言及される必要な特性、すなわち高いＴｍ、宿主細胞によって積極的に取り込まれる能力、及びＲＮアーゼＨに対する実質的な抵抗性を提供することを確認するため存在する。この方法は、正しく設計されたアンチセンス化合物が、哺乳動物被験体に投与された場合に標的ＲＮＡの相補的な部分と安定なヘテロ二重鎖を形成し、その後、該ヘテロ二重鎖が尿（又は他の体液）中に現れるという発見に基づく。この方法の詳細は、「標的ＲＮＡを検出する非侵襲的方法（Non-Invasive Method for Detecting Target RNA）」（非侵襲法）と題される米国特許出願第０９／７３６，９２０号に提示され、その開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。簡潔には、既知のＲＮＡに対して標的化された塩基配列を有する評価される骨格を含む試験オリゴマーが、動物、例えば哺乳動物被験体に注入される。アンチセンスオリゴマーは、宿主ＲＮＡ又は感染ウイルスのＲＮＡを含む、任意の細胞内ＲＮＡに対して向けられてもよい。投与から数時間後（典型的には８時間後〜７２時間後）、アンチセンス−ＲＮＡ
ヘテロ二重鎖の存在について尿をアッセイする。ヘテロ二重鎖が検出される場合、その骨格は、本発明のアンチセンスオリゴマーにおける使用に適している。
【００４７】
オリゴマーは、哺乳動物被験体に対して適切である場合には、後の分析を容易にするため、例えば蛍光又は放射性のタグによって標識されてもよい。アッセイは、任意の好適な固相又は流体のフォーマットであってもよい。一般的には、固相アッセイは、最初にヘテロ二重鎖分析物を固相支持体、例えば粒子又はポリマー又は試験片基体に結合させ、結合したヘテロ二重鎖の存在／量を検出することを含む。流動相のアッセイでは、分析物の試料を、典型的には、干渉する試料成分を除去するために前処理する。オリゴマーを標識する場合、ヘテロ二重鎖の存在は、標識タグを検出することによって確認される。非標識化合物については、ヘテロ二重鎖は、固相フォーマットの場合には免疫アッセイによって、又は溶液若しくは懸濁液のフォーマットの場合には質量分析若しくは他の既知の方法によって検出され得る。
【００４８】
例示的なオリゴマー骨格
オリゴヌクレオチド類縁体で使用され得る非イオン結合の例を図４に示す。これらの図では、Ｂは、好ましくはアデニン、シトシン、グアニン及びウラシルから選択されるポリヌクレオチド中の塩基に対して、塩基特異的水素結合によって結合するのに有効なプリン又はピリミジンの塩基対合部分を表す。好適な骨格構造として、カーボネート（Ｒ＝Ｏ）結合及びカルバメート（Ｒ＝ＮＨ２）結合；アルキルホスホネート結合及びホスホトリエステル結合（Ｒ＝アルキル又は−Ｏ−アルキル）；アミド結合；スルホン結合及びスルホンアミド結合（Ｒ１、Ｒ２＝ＣＨ２）；並びにチオホルムアセチル結合（２Ｅ）が挙げられる。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物に関して、増強された二重鎖及び三重鎖の安定性を有すると報告されている。３’−メチレン−Ｎ−メチルヒドロキシアミノ化合物も報告されている。
【００４９】
好ましいオリゴマー構造は、帯電していない結合によってつながった塩基対合部分を持つモルホリノに基づくサブユニットを採用する。アンチセンスオリゴマーを含むモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、共有の米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、及び同第５，５０６，３３７号に詳述され、それらの全てが引用することによって明らかに本明細書の一部をなす。
【００５０】
モルホリノに基づくサブユニットの重要な特性として、安定な、帯電していない骨格結合によってオリゴマー形態で連結される能力；形成されるポリマーが、Ｔｍの高い標的ＲＮＡ含む相補性塩基標的核酸と、更には１０塩基〜１４塩基の短いオリゴマーともハイブリダイズし得るように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン又はウラシル）を支持する能力；哺乳動物細胞へと積極的に輸送されるオリゴマーの能力；及びＲＮアーゼ分解に抵抗するオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の能力が挙げられる。
【００５１】
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する骨格構造は、帯電していないリン含有サブユニット結合によって連結される、図４に示されるモルホリノサブユニット型が挙げられる。図４は、５原子反復ユニット骨格を形成するリン含有結合を示し、ここで、モルホリノ環は１原子ホスホアミド結合によって連結される。図４は、６原子反復単位骨格をもたらす結合を示す。この構造では、５’モルホリノ炭素をリン基に連結する原子は、硫黄、窒素、炭素であってもよく、又は好ましくは酸素であってもよい。リンからのＸ部分のペンダントは、フッ素、アルキル若しくは置換アルキル、アルコキシ若しくは置換アルコキシ、チオアルキル若しくは置換チオアルキル、又はモルホリン若しくはピペリジン等の環状構造を含む、非置換、一置換若しくは二置換の窒素であってもよい。アルキル、
アルコキシ、及びチオアルコキシは、１個〜６個の炭素原子を含むことが好ましい。Ｙ部分は、硫黄又は酸素であり、好ましくは酸素である。
【００５２】
上で言及されるように、実質的に帯電していないオリゴマーは、有利には、限られた数の、例えば５個毎の帯電していない結合当たり最大約１個、より好ましくは１０個毎の帯電していない結合当たり最大約１個の帯電した結合を含む。したがって、幾つかの帯電した結合、例えば帯電したホスホルアミデート又はホスホロチオエートもまた、オリゴマーに組み込まれ得る。
【００５３】
本開示の別の態様は、ポリスチレン支持体に連結された５’−未保護−２’−デオキシリボヌクレオシドから開始し、この５’−未保護−２’−デオキシリボヌクレオシドを、４，５−ジシアミノイミダゾール（ＤＣＩ）を含む無水アセトニトリル中でホスホルアミダイトシントン（すなわち、単量体）と反応させて、ホスホルアミダイトジエステルヌクレオチド間結合を有する二量体を生成することを含む、モルホリノ含有オリゴヌクレオチド類縁体を製造する方法を提供する。次いで、二量体のホウ素化、硫化、又は酸化のいずれかによって上記二量体を化学的に活性化する。次いで、二量体をキャップし、脱トリチル化する。これらの工程（キャッピング及び脱トリチル化の工程によってホスホルアミダイトシントンを付加する）は、成長するオリゴマーに単量体を付加することによってオリゴマーを伸長させる（二量体から三量体、四量体、五量体、六量体等へと段階的に成長させる）ため、所望に応じて繰り返す。次いで、モルホリノホスホロアミデートオリゴマーをテトラヒドロフラン中のヨウ素及びジメチルアミンと接触させて、モルホリノボランホスホロアミデートをＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯに変換する。次いで、オリゴマーを水酸化アンモニウム及びエチレンジアミンを含む溶液と接触させて、ポリスチレン支持体からオリゴマーを除去する。これらのオリゴマーに対する反復する単量体の付加は、一般的な市販のＤＮＡ合成装置で行われてもよく、それにより、費用効率の高いやり方で合成の効率及び速度が大幅に増強され得る。
【００５４】
本開示の合成方法における使用に対する例示的な単量体として、以下：
【化１】
2019534862.tif 000003
（式中、
Ｂ又はＢ＊は、シリル保護基、又は酸不安定性保護基、又は塩基不安定性保護基であってもよく、
Ｘ＝シアノエチル若しくはその誘導体、アルキル、チオアルキル、チオカルボニル、カルボキシレート、アセテート、又はホルメート誘導体であり、
Ｒ＝ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、又は任意のシリルに基づく保護基であり、
Ｒ１及びＲ２は独立して、イソプロピル、Ｃ２〜２０直鎖若しくは分岐鎖のアルキル鎖、又は５員〜７員の脂肪族環である）からなる群から選択される化学構造を有するホスホルアミダイトが挙げられる。
【００５５】
本明細書に引用される各々の刊行物又は特許は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００５６】
ここで一般的に記載される開示は、本開示の実施形態の或る特定の態様の単なる例示を
目的として含まれる以下の実施例を参照することでより容易に理解される。実施例は、他の技法及び方法が特許請求の範囲を満たし、特許請求される開示の範囲から逸脱することなく用いることができることが上記の教示及び以下の実施例から当業者により認識されるように、本開示を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１
Ｎ−ジ−ｔｅｒｔブチルイソブチル保護モルホリノホスホルアミダイトの合成
ボランホスホルアミデートモルホリノ結合を生成するため、必要な４塩基全てに対してホスホラジアミダイトシントンを開発した（図３の合成スキームを参照されたい）。文献プロトコル（Zhang, et al., Tetrahedron Letters 2008, 49, 3570、Pattanayak, et al., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2012, 31, 763-782）に従ってホスホラジアミダイトチミジンモルホリノ単量体シントンの合成を行った。最初に、アルゴン雰囲気下、チミジンを無水ピリジン中のジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ）により処理して、５’Ｏ−ＤＭＴｒ−チミジン（７）を生じ、それを、その後過ヨウ素酸ナトリウム、続いて二ホウ酸アンモニウムで処理して、２’，３’−ジヒドロキシル−モルホリノ−チミジンを生成した（図示していない）。弱酸性条件下でシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して２’及び３’のヒドロキシル基の還元を行い（更なる精製を行わない）、チミンモルホリノ単量体（８）を生成した。その後、アルゴン雰囲気下、ジクロロメタン中の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト及び４，５−ジシアミノイミダゾール（ＤＣＩ）による化合物（８）のホスフィチル化によって、基本単位のチミジンシントン（９）を収率８６％で作製した。チミジンシントン（９）は塩基保護を必要としない。
【００５８】
また、本発明者らは、同様のプロトコルに従って５’−ジメトキシトリチル−モルホリノチミジン−３’−Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラジアミダイトを合成したが、シアノエチルホスホラジアミダイトとの固相カップリングはＯ−メチル相当物よりも効率的であることを見出した。
【００５９】
シトシン、アデニン、及びグアニンの対応する単量体の合成は、先に報告される様々なプロトコル（Roy, S., Olesiak, M., Shang, S., Caruthers, M. H., J. Am. Chem. Soc.
2013, 135:6234-41）を使用して最初にヌクレオシドアミノ基をビス（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル（ＢＩＢＳ）で保護することによって開始した。
【００６０】
２，６−ルチジンの存在下での５’，３’，２’−トリ−Ｏ−アセチルシチジン（１０）とＢＩＢＳ−ＯＴｆ（Ｔｆ＝トリフレート）との反応により、アルゴン雰囲気下で６０℃にて２時間撹拌した後に収率７６％の１１を得た。しかしながら、１５及び２０からの１６及び２１の合成は、それぞれ、２５％〜３１％（１６）及び７４％（２１）の収率ではるかに長い反応時間（３日間）を必要とした。図３の合成スキームに表されるように、これらの保護（シリル化）リボヌクレオシド（１１、１６、２１）を最初に水酸化アンモニウムで処理し、アセチル保護基を除去して５’−ジメトキシ−トリチル化合物（１２、１７、２２）、その後モルホリノ誘導体（１３、１８及び２３）に変換した。これらの化合物を使用して、ホスホルジアミダイトシントン１４、１９及び２４を生成した。
【００６１】
モルホリノヌクレオシドの合成に対する基本手順
５’−ジメトキシトリチル保護ヌクレオシドをメタノールに溶解した後、１．２当量の過ヨウ素酸ナトリウム及び二ホウ酸アンモニウム四水和物（１．２当量）を添加した。混合物を室温で３時間撹拌したところ、ＴＬＣは出発材料の完全な消費を示した。反応混合物をセライト（celite）のパッドを通して濾過し、活性化された粉体の４Ａ°モレキュラーシーブ（０．４ｇ／ｍｍｏｌ）に添加した後、それぞれ２．０当量のシアノ水素化ホウ
素ナトリウム及び氷酢酸を添加した。その後、反応混合物を４時間〜５時間撹拌したところ、中間体ジオールは完全に還元された。反応混合物をセライトのパッドを通して濾過し、蒸発乾固させた。生成物をクロロホルムに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生成物をシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。全ての例において、シリカゲルスラリーを、追加の５％トリエチルアミンを含む出発溶離液の混合物を用いて作製した。スラリーを注いだ後、トリエチルアミンを含まない２カラム容量の出発溶媒混合物でカラムを洗浄した。８、１３及び１８を１９：１のクロロホルム：メタノールまでのクロロホルムの勾配を使用して溶出した。１：１の酢酸エチル：ヘキサンから７：３の酢酸エチル：ヘキサンへの勾配を使用して、化合物２３を精製した。以下の欄に記載される全ての収率は、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ＢＩＢＳ保護ヌクレオシドから開始する２工程に対して得られたものを表す。
【００６２】
５’−ジメトキシトリチルモルホリノチミジン（８）：収率：５３％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：７．４６〜７．４４（２Ｈ，ｍ）、７．３５〜７．２０（７Ｈ，ｍ）、６．８５〜６．８１（４Ｈ，ｍ）、５．７８〜５．７５（１Ｈ，ｄｄ）、４．０２〜３．９８（１Ｈ，ｍ）、３．７９（６Ｈ，ｓ）、３．２８〜３．２５（１Ｈ，ｍ）、３．１６〜３．１２（１Ｈ，ｄｄ）、３．０８〜３．０４（２Ｈ，ｍ）、２．４３（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１６４．２２、１５８．４９、１５０．４５、１４４．７２、１３５．９０、１３５．７８、１３５．３２、１３０．０６、１３０．０３、１２８．１２、１２７．８１、１２６．８３、１１３．１０、１１３．０９、１１０．８２、８６．０２、８０．９０、６４．４３、５５．２０、４５．９３、１１．８４。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６１．２３１４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６３】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチルモルホリノシチジン（１３）：収率：６４％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：７．５９〜７．５８（１Ｈ，ｄ）、７．５３〜７．５１（２Ｈ，ｍ）、７．４１〜７．２５（７Ｈ，ｍ）、６．９１〜６．８７（４Ｈ，ｍ）、５．８８〜５．８７（１Ｈ，ｄ）、５．７９〜５．７６（１Ｈ，ｄｄ）、４．７０（１Ｈ，ｂｓ）、４．０３〜４．００（１Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．２９〜３．２４（２Ｈ，ｍ）、３．１４〜３．１０（１Ｈ，ｍ）、３．０４〜３．００（１Ｈ，ｄ）、２．６７〜２．６２（１Ｈ，ｍ）、２．５２〜２．４６（１Ｈ，ｍ）、２．１５〜２．０８（１Ｈ，ｍ）、１．１８〜１．１７（１９Ｈ，ｍ）、１．０７〜１．０３（８Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１６８．２５、１５８．６３、１５４．５７、１４５．０６、１４０．５０、１３６．０２、１３５．９５、１３０．０６、１３０．０２、１２８．１１、１２７．８８、１２６．７３、１１３．０６、９６．３５８８．９５、８１．７６、７７．９４、６４．７０、５５．１７、５０．０１、４７．３２、４６．３０、２８．６８、２６．２４、２６．１４、２４．８２、２１．０２、２０．７２、２０．６７、１１．６５。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：７２７．４０４７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６４】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチルモルホリノアデノシン（１８）：収率：６１％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．３８（１Ｈ，ｓ）、８．０１（１Ｈ，ｓ）、７．５１〜７．４８（２Ｈ，ｍ）、７．３９〜７．２４（７Ｈ，ｍ）、６．８８〜６．８５（４Ｈ，ｍ）、５．９０〜５．８６（１Ｈ，ｄｄ）、４．１１〜４．０８（１Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．３３〜３．２６（２Ｈ，ｍ）、３．１５〜３．１０（２Ｈ，ｍ）、２．７９〜２．７３（１Ｈ，ｍ）、２．１９〜２．１２（１Ｈ，ｍ）、１．２２〜１．０２（２７Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１５８．６４、１５８．１１、１５２．５５、１４８．９２、１４４．９７、１４４．９６、１３７．７６、１３５．９０、１３０．０４、１２８．０６、１２７．８０、１２６．７４、１２１．６０、１２１．５２、１１７．７９、１１７．７
１、１１３．０４、８６．０６、８０．４４、７６．８９、６４．３９、６０．１４、５９．８８、５０．１６、４９．９３、４８．４９、４７．３６、４７．１２、４６．０８、４６．００、４３．９３、４３．８３、４３．７１、２６．８２、２６．２８、２６．１９、２４．８０、２４．３６、２４．２７、２４．１８、２１．０４、２０．８１、２０．７９、２０．３５、２０．０７。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：７５１．４２３８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６５】
Ｎ２−Ｏ６−ビス［ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチルモルホリノグアノシン（２３）：収率：４７％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：７．８０（１Ｈ，ｓ）、７．５１〜７．４９（２Ｈ，ｍ）、７．３９〜７．３２（６Ｈ，ｍ）、７．２８〜７．２５（１Ｈ，ｍ）、６．８９〜６．８７（４Ｈ，ｍ）、５．７４〜５．７１（１Ｈ，ｍ）、４．０５（１Ｈ，ｂｓ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．３１〜３．２６（１Ｈ，ｍ）、３．２３〜３．１５（２Ｈ，ｍ）、３．１３〜３．０７（１Ｈ，ｍ）、２．７６〜２．７０（１Ｈ，ｍ）、２．２６〜２．１９（１Ｈ，ｍ）、２．１５〜２．０９（１Ｈ，ｍ）、１．９３（１Ｈ，ｂｓ）、１．２１〜１．１８（３６Ｈ，ｍ）、１．０９〜１．０７（２Ｈ，ｍ）、１．０３−０．９９（１６Ｈ，ｍ）。１３Ｃ
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１６０．６９、１５９．３９、１５８．６２、１５４．１０、１４５．０１、１３５．５６、１３５．８５、１３０．０２、１２８．０６、１２７．７９、１２６．７３、１１６．８４、１１３．０６、８５．９９、８０．７３、７７．４１、６４．４２、６０．２３、４９．８３、４７．７８、２６．３１、２４．８９、２４．７２、２１．９４、２１．４０、２０．７３。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：９６５．５９４４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６６】
再び図３を参照すると、適切に保護されたシントン（９、１４、１９又は２４）の合成に対する手順は、以下の通りである。
【００６７】
上に記載される５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ−ＢＩＢＳ保護モルホリノヌクレオシド（８、１３、１８又は２３）を真空下で一晩乾燥した。それらを無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した後、アルゴン下で１．２当量の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトを添加した。０．５当量の４，５−ジシアノイミダゾールを添加した後、室温にてアルゴン雰囲気下で５時間に亘って撹拌しながら反応を進行させた。この時、ＴＬＣは出発材料の完全な変換を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、最初に５％ＮａＨＣＯ３溶液で、次いでブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって生成物を精製した。追加の５％トリエチルアミンを含む出発溶離液の混合物を用いて、シリカゲルスラリーを作製した。スラリーを注いだ後、トリエチルアミンを含まない２カラム容量の出発溶媒混合物でカラムを洗浄した。ホスホルジアミダイト化合物９、１４、１９及び２４を３：７の酢酸エチル：ヘキサンから１：１の酢酸エチル：ヘキサンへの勾配を使用して精製した。
【００６８】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチルモルホリノチミン−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルジアミダイト（９）：収率：８６％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１２７．２１、１２６．０８。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）δ：９．５１（１Ｈ，ｂｓ）、７．５０〜７．４７（２Ｈ，ｍ）、７．３８〜７．２５（８Ｈ，ｍ）、６．８９〜６．８６（４Ｈ，ｍ）、５．７８〜５．７５（０．５Ｈ，ｄｄ）、５．６５〜５．６２（０．５Ｈ，ｄｄ）、４．０８〜４．０２（１Ｈ，ｍ）、３．９９〜３．８６（３Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．６５〜３．５２（２Ｈ，ｍ）、３．４８〜３．３４（１Ｈ，ｍ）、３．３１〜３．２７（１Ｈ，ｍ）、３．１３〜３．０９（１Ｈ，ｍ）、２．７５〜２．６８（２Ｈ，ｍ）、２．５３〜２．４７（２Ｈ，ｍ）、１．９６（３Ｈ，ｍ）、１．２５〜１．１８（１２Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２
）δ：１６４．０２、１６３．９６、１５８．６６、１５０．１３、１４４．９５、１３５．９２、１３５．９０、１３５．７９、１３５．６８、１３５．５２、１２９．９９、１２８．０７、１２７．７７、１２６．７７、１１７．８９、１１７．７４、１１３．０５、１１０．４８、１１０．３９、８６．０５、８０．５４、８０．４９、８０．２０、７７．３６、７７．２１、６４．３７、６０．０９、５９．８４、５５．２０、４９．０５、４８．８３、４７．５８、４７．０６、４６．８３、４５．８７、４５．７８、４３．９１、４３．７４、２４．３６、２４．２９、２４．２２、２４．２０、２０．７７、２０．３３、２０．６６、１２．２９。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：７２７．４０４７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００６９】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチル−モルホリノシトシン−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルジアミダイト（１４）：収率：８３％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１２６．３２、１２４．８８。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）δ：７．５８〜７．５５（１Ｈ，ｍ）、７．５０〜７．４８（２Ｈ，ｍ）、７．３８〜７．３１（６Ｈ，ｍ）、７．２８〜７．２４（１Ｈ，ｍ）、６．８８〜６．８５（４Ｈ，ｍ）、５．７９〜５．７６（１．５Ｈ，ｍ）、５．６３〜５．５９（０．５Ｈ，ｍ）、４．５４（１Ｈ，ｂｓ）、４．０４〜３．８７（３Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．７４〜３．７１（０．５Ｈ，ｍ）、３．６５〜３．４５（３Ｈ，ｍ）、３．３０〜３．２４（１．５Ｈ，ｍ）、３．１４〜３．１０（１Ｈ，ｍ）、２．８０〜２．７５（１Ｈ，ｍ）、２．７１〜２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．５５〜２．４６（１Ｈ，ｍ）、２．３８〜２．３１（１Ｈ，ｍ）、２．１１〜２．０７（１Ｈ，ｍ）、１．７８（１Ｈ，ｂｓ）、１．２５〜１．１５（３１Ｈ，ｍ）、１．０４〜１．０２（８Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１６８．１４、１５８．６１、１５４．４６、１４４．９８、１４０．６２、１４０．４２、１３５．９８、１３５．８８、１３０．０３、１２８．０７、１２７．７５、１２６．７１、１１７．９６、１１７．７５、１１３．０２、９６．２０、９６．０９、８５．９７、８１．６８、８１．３４、８１．２３、７７．０５、７７．００、６４．５０、６０．２１、６０．０９、５９．８５、５５．１８、４９．６３、４９．４１、４７．９８、４７．１３、４６．１８、４５．９１、４５．８３、４３．９６、４３．８４、４３．７７、２８．５８、２６．２１、２６．０７、２４．７８、２４．３８、２４．２６、２４．１７、２４．１２、２０．９８、２０．７６、２０．７１、２０．６２、２０．３１、２０．２３。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：９２７．５３２９（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７０】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチルモルホリノアデニン−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルジアミダイト（１９）：収率：７９％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１２７．９６、１２５．３６。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）：８．３８〜８．３７（１Ｈ，ｄ）、８．０１〜８．００（１Ｈ，ｄ）、７．５１〜７．４８（２Ｈ，ｍ）、７．３８〜７．３１（６Ｈ，ｍ）、７．２８〜７．２４（１Ｈ，ｍ）、６．８８〜６．８６（４Ｈ，ｍ）、５．９３〜５．９０（０．５Ｈ，ｍ）、５．８２〜５．７９（０．５Ｈ，ｍ）、５．３９（１Ｈ，ｂｓ）、４．１４〜４．１０（０．５Ｈ，ｍ）、４．０６〜４．０２（０．５Ｈ，ｍ）、４．０〜３．９０（２Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．７１〜３．６３（１Ｈ，ｍ）、３．６０〜３．５２（２．５Ｈ，ｍ）、３．４２〜３．３７（０．５Ｈ，ｍ）、３．３４〜３．３０（１Ｈ，ｍ）、３．１７〜３．１３（１Ｈ，ｍ）、３．０２〜２．９１（１Ｈ，ｍ）、２．７８〜２．７５（１Ｈ，ｍ）、２．７２〜２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．６６〜２．５９（１Ｈ，ｍ）、１．２６〜１．１８（３１Ｈ，ｍ）、１．１０〜１．０８（８Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１５８．６４、１５８．１１、１５２．５５、１４８．９２、１４４．９７、１３７．７６、１３５．９２、１３５．８０、１３０．０２、１２８．０６、１２７．７７、１２６．７４、１２１．６０、１１７．７９、１１７．７１、１１３．０４、８６．５０、８０．５０、８０．４４、８０．
３４、８０．２２、７６．９４、７６．８１、６４．３９、６０．１４、５９．９１、５５．１８、５０．１６、４９．９３、４８．４９、４８．４４、４７．３５、４７．１２、４６．０８、４６．００、４３．９５、４３．８３、４３．７１、２８．６２、２６．２８、２６．１９、２４．８０、２４．３５、２４．２９、２４．１８、２１．０４、２０．７９、２０．３６、２０．２７。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：９５１．５４３７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７１】
Ｎ２，Ｏ６−ビス［ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル］−５’−ジメトキシトリチル−モルホリノグアニン−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラジアミダイト（２４）：収率：８２％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１２７．６２、１２６．９９。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）：７．７９〜７．７６（１Ｈ，ｄ）、７．４９〜７．４５（２Ｈ，ｍ）、７．３７〜７．２９（６Ｈ，ｍ）、７．２７〜７．２３（１Ｈ，ｍ）、６．８７〜６．８４（４Ｈ，ｍ）、５．７６〜５．６４（１Ｈ，ｄｄ）、４．５５（１Ｈ，ｓ）、４．０５〜３．８８（３Ｈ，ｍ）、３．８２（６Ｈ，ｓ）、３．６７〜３．５４（３Ｈ，ｍ）、３．４９〜３．４５（１Ｈ，ｍ）、３．３２〜３．２３（１Ｈ，ｍ）、３．１９〜２．９０（２Ｈ，ｍ）、２．７１〜２．６８（２Ｈ，ｍ）、２．６１〜２．５４（１Ｈ，ｍ）、２．２３〜２．１６（１Ｈ，ｍ）、２．１３〜２．０６（１Ｈ，ｍ）、１．２７〜１．１５（４９Ｈ，ｍ）、１．０６−０．９７（２７Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１６０．６７、１５９．３８、１５８．６１、１５４．３３、１５４．０６、１４４．９６、１３６．４７、１３５．９０、１３５．７９、１３０．００、１２８．０２、１２７．７６、１２６．６９、１１７．５８、１１６．７７、１１３．０３、８５．９９、８０．６９、８０．５８、７９．５５、７９．４９、７６．９５、７６．４５、７６．３６、６４．２２、６０．２０、６０．１２、５９．８８、５９．８６、５５．１６、４９．７１、４９．４７、４７．７７、４７．６８、４７．４６、４７．２６、４５．９６、４５．８９、４３．９９、４３．８８、４３．７７、４３．６５、２８．７６、２８．０７、２６．３９、２６．３１、２６．２７、２４．８７、２４．６８、２４．４４、２４．３７、２４．２７、２４．１９、２１．９０、２１．３７、２０．８３、２０．７６、２０．７５、２０．６９、２０．３５、２０．３２、２０．２７、２０．２４。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１６５．７２０３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７２】
ＰＭＯ−ＤＮＡキメラの合成のため、５’−ＤＭＴ−２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイトシントン２６、２７及び２８を文献プロトコル（Roy, et al., J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 6234-6241）に従って作製した。化合物２５を商業的
に入手可能な供給元（Glen Research）から得た。
【００７３】
２６、２７及び２８の合成に対する一般法
５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ＢＩＢＳ保護２’−デオキシヌクレオシドを、アルゴンを吹き込んだ丸底フラスコに添加した。無水ジクロロメタン及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．２当量）をシリンジによって添加した。１．０当量のテトラゾール（Glen Researchから得たＣＨ３ＣＮ中０
．４Ｍ）をこの溶液に３０分かけて撹拌しながら滴加した。反応物を室温で２時間〜３時間撹拌し、このとき、ＴＬＣが出発材料の完全な消失を示した。反応混合物をジクロロメタン中に希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。生成物をシリカカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。追加の５％トリエチルアミンを含む出発溶離液の混合物を用いてシリカゲルスラリーを作製した。スラリーを注いだ後、トリエチルアミンを含まない２カラム容量の出発溶媒混合物でカラムを洗浄した。２６及び２７を３：７の酢酸エチル：ヘキサンから１：１の酢酸エチル：ヘキサンへの勾配を使用して精製した。２８を７：３のヘキサン：ジメチルエーテル混合物を使用して精製した。
【００７４】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジン３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２６）。収率：８７％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：１４８．６７、１４８．４３。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）δ：７．８８〜７．８０（１Ｈ，ｄｄ）、７．４９〜７．４５（２Ｈ，ｍ）、７．３７〜７．２７（７Ｈ，ｍ）、６．９０〜６．８６（４Ｈ，ｍ）、６．３５〜６．２９（１Ｈ，ｍ）、５．５３〜５．５１（１Ｈ，ｍ）、４．７１〜４．６２（１Ｈ，ｍ）、４．４９（１Ｈ，ｂｓ）、４．２０〜４．１６（１Ｈ，ｍ）、３．８９〜３．７７（７Ｈ，ｍ）、３．７２〜３．５８（３Ｈ，ｍ）、３．５１〜３．３５（２Ｈ，ｍ）、２．６８〜２．５８（２Ｈ，ｍ）、２．５２〜２．４９（１Ｈ，ｍ）、２．３０〜２．２２（１Ｈ，ｍ）、２．１１〜２．０４（１Ｈ，ｍ）、１．２９〜１．２５（１Ｈ，ｍ）、１．２３〜１．２０（９Ｈ，ｍ）、１．１４〜１．１０（２２Ｈ，ｍ）、１．０２−０．９７（９Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１５８．７１、１５５．０７、１４４．６８、１４０．６７、１３５．５８、１３０．１３、１２８．１５、１２７．８９、１２６．９０、１１７．７５、１１７．６０、１１３．１２、９６．１２、９６．０４、８６．６０、８５．８２、８５．７７、８５．１６、８５．１１、８４．９８、８４．９２、６２．９１、６２．６１、５８．６４、５８．２６、４３．３０、４３．１４、４０．７５、４０．５３、２８．５９、２６．１０、２４．７９、２４．３３、２４．２６、２０．６６、２０．４１、２０．１８。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：９２８．５２０１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００７５】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２７）。収率：８１％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：１４８．５１、１４８．４９。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）δ：８．３０（１Ｈ，ｓ）、７．９８〜７．９６（１Ｈ，ｄ）、７．４７〜７．４４（２Ｈ，ｍ）、７．３７〜７．３４（４Ｈ，ｍ）、７．３１〜７．２３（３Ｈ，ｍ）、６．８７〜６．８３（４Ｈ，ｍ）、６．４６〜６．４３（１Ｈ，ｍ）、４．８６〜４．７８（１Ｈ，ｍ）、４．３４〜４．２８（１Ｈ，ｍ）、３．９２〜３．８２（７Ｈ，ｍ）、３．７８〜３．６２（３Ｈ，ｍ）、３．４７〜３．３２（２Ｈ，ｍ）、３．０２〜２．９４（１Ｈ，ｍ）、２．７０〜２．５７（２Ｈ，ｍ）、２．５５〜２．５２（１Ｈ，ｍ）、２．１８〜２．１１（１Ｈ，ｍ）、１．２５〜１．１６（３０Ｈ，ｍ）、１．１０〜１．０８（３Ｈ，ｍ）、１．０３〜１．００（７Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１５８．６４、１５８．０９、１５２．３７、１４９．１９、１４４．８６、１３８．７２、１３５．８６、１３５．６７、１３０．１１、１２９．９９、１２８．０９、１２７．７８、１２６．７４、１２２．２７、１１７．７６、１１７．６４、１１３．０５、８６．３１、８５．６６、８５．４５、８４．２７、７４．１４、７３．９７、７３．５４、７３．３７、６３．６７、６３．５３、５８．５４、５８．２６、４３．３０、４３．１８、３９．０３、３８．９３、２８．６２、２６．２５、２６．２１、２４．８０、２４．４２、２４．３８、２４．３１、２１．０２、２０．７９、２０．４４、２０．３７、２０．２９、２０．２２。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：９５２．５２７９（Ｍ＋Ｈ）＋、９７４．５１３０（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【００７６】
Ｎ２−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）イソブチルシリル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２８）。収率：７９％。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）：１４９．０３、１４８．５２。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２，４００ＭＨｚ）δ：７．８３〜７．７７（１Ｈ，ｄ）、７．５１〜７．４８（２Ｈ，ｍ）、７．３９〜７．２４（７Ｈ，ｍ）、６．９０〜６．８６（４Ｈ，ｍ）、６．４１〜６．３８（１Ｈ，ｔ）、４．６５〜４．６０（１Ｈ，ｍ）、４．５４（１Ｈ，ｂｓ）、４．３０〜４．２８（１Ｈ，ｍ）、３．８６〜３．７６（７Ｈ，ｍ）、３．７３〜３．６１（３Ｈ，ｍ）、３．４３〜３．３３（２Ｈ，ｍ）、２．８
５〜２．４５（４Ｈ，ｍ）、２．２５〜２．１７（１Ｈ，ｍ）、２．１２〜２．０５（１Ｈ，ｍ）、１．２３〜１．１５（４８Ｈ，ｍ）、１．０６−０．９７（１８Ｈ，ｍ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２）δ：１６０．６４、１５９．２７、１５８．６７、１５４．２１、１４４．７７、１３６．２８、１３５．７１、１３５．６０、１３０．０８、１２８．１１、１２７．８７、１２６．８０、１１７．５６、１１７．１４、１１３．１３、８６．３９、８５．４０、８５．０９、８３．７９、８３．６３、６３．７８、６３．４８、５８．３７、５８．１６、４３．３４、４３．１８、４０．８８、４０．５５、２８．７４、２８．０９、２６．３０、２６．１７、２４．８９、２４．６９、２４．５２、２４．４５、２４．３６、２４．２９、２１．９０、２１．３７、２０．７７、２０．７３、２０．７１、２０．６２、２０．４０、２０．３３、２０．２２、２０．１５。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１１８８．６９０３（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【００７７】
実施例２
ＢＩＢＳ保護モルホリノホスホラジアミダイトを使用するモルホリノオリゴヌクレオチドの合成
一旦、実施例１に記載されるシントンが利用可能となると、次の目標は、ボランホスホロアミデートモルホリノ誘導体を作製し、これらの化合物を対応するＰＭＯに変換するため固相合成サイクルを最適化することであった。合成サイクルを図４及び表１に概説する。合成に先立って、ポリスチレン支持体に連結された２’−デオキシリボチミジン上の５’−ＤＭＴ基を、１０％トリメチルホスファイトボラン（ＴＭＰＢ）を含むクロロホルム中の０．５％トリフルオロ酢酸で除去した。
【００７８】
４，５−ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）を含む無水アセトニトリル中において、５’−未保護−２’−デオキシリボヌクレオシド（図４、化合物Ａ）をシントン９、１４、１９又は２４のうちの１つと反応させて（図４、「１．縮合」）、ホスホルアミダイトジエステルヌクレオチド間結合を有する二量体を生成した（図４、化合物Ｂ）。カップリングの待ち時間は３００秒であった。ホウ素化、キャッピング（図４、「２．ホウ素化」及び３．「キャッピング」）及び脱トリチル化（図４、「４．脱保護」）に続いて、このサイクルの反復は、ＰＭＯへの更なる変換の準備ができている生成物を生成した。
【００７９】
【表１】
2019534862.tif 000004
【００８０】
合成の後、支持体をアセトニトリルで洗浄し、ヌクレオチド間結合からシアノエチル基を除去するためトリエチルアミン：アセトニトリルの１：１混合物で６００秒間処理し（図４、「５．シアノエチルの除去」）、アセトニトリル及びジクロロメタンで数回洗浄して残留トリエチルアミンを除去し、乾燥した。次に、ポリスチレン支持体をカラムから取り去り、１．５ｍＬ容のネジ蓋ガラス反応バイアルに入れた。
【００８１】
モルホリノボランホスホロアミデートをＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯへ変換するため、モルホリノボランホスホロアミデートを０．０５Ｍヨウ素及び２．０Ｍジメチルアミンのテトラヒドロフラン溶液で一晩処理した（図４、「６．ヨウ素／ジメチルアミン」）。樹脂をアセトニトリルで繰り返し洗浄し、次いでオリゴヌクレオチドをテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）の１．０ＭＴＨＦ溶液で処理してＢＩＢＳ保護基を除去した（図４、「７．シリル脱保護」）。（Ｅｔ３ＮＨＦはホスホロジアミデート結合を加水分解したため、この試薬をこれらのシリル基を除去するため使用することはできなかった）。
【００８２】
シリル保護基の除去後に酸化的アミノ化反応を行った場合、シトシンのＮ−４におけるアミン置換が観察された（図５）。図４の反応工程６及び反応工程７に表されるように、脱シリル化に先立って酸化的アミノ化反応を行うことにより、この課題を克服した。
【００８３】
一旦シリル基が除去されると、３０％水酸化アンモニウムを使用してオリゴヌクレオチドを支持体から切断し（図４、「８．支持体からの切断」）、０．２μｍ遠心分離フィルターを使用してポリスチレン樹脂を除去し、溶液をＩｌｌｕｓｔｒａ  ＮＡＰ−２５カラムを通過させてフッ化塩を除去した。Ａｍｉｃｏｎ（商標）Ｕｌｔｒａ−１５  ３Ｋ遠心分離フィルター装置を使用し（より短い失敗した配列を除去するため）、各ＰＭＯを用いて追加の精製工程を行った。次いで、オリゴヌクレオチドを更なる特性評価及び他の研究に使用した。
【００８４】
この合成をＡＢＩ  ３９４合成装置で行った。全ての合成を、スクシネート結合を介して少量のポリスチレン固体支持体につなげられた５’−ＤＭＴ２’−デオキシチミジンを使用して０．２マイクロモルスケールで行った。モルホリノオリゴヌクレオチドの合成のため、カップリング時間を３００秒に増加させて標準的な２．０マイクロモルの合成サイクルを使用した。脱トリチル化工程の後にメタノールで洗浄した。全てのホスホルジアミダイト（９、１４、１９又は２４；０．１Ｍ）を無水ＣＨ３ＣＮに溶解した。１０％ＴＭＰＢを含む無水ＣＨＣｌ３中のＴＦＡの０．５％溶液を使用して、脱トリチル化を行った。ホウ素化に対する溶液（ＴＨＦ中、０．０５Ｍ  ＢＨ３−ＴＨＦ複合体）を使用に先立って新たに作製した。活性化（４，５−ジシアノイミダゾール）及びキャッピングのための試薬をGlen Researchから購入した。合成サイクルの段階的な説明を表１に記載する。
脱保護を以下の２工程で行った：固体支持体に連結されたボラン−ホスホルアミデートモルホリノオリゴヌクレオチドを、最初にトリエチルアミンの１：１アセトニトリル溶液で１０分間処理した後、アセトニトリルで広範囲に洗浄した。次いで、アルゴン流を使用して樹脂を乾燥し、ガラスバイアルに移した。ヨウ素（０．０５Ｍ）及びＴＨＦ中のジメチルアミン（２．０Ｍ）の溶液をガラスバイアルに添加した。アンモニアとの反応のため、同量のヨウ素をアンモニア（２．０Ｍ）のイソプロパノール溶液に溶解し、この溶液を樹脂に添加した。次いで、ガラスバイアルを２４時間に亘り機械的シェーカーに置いた。メチルアミン及びモルホリノジアミデート誘導体の合成のため、各アミンの２．０ＭＴＨＦ溶液を使用した。
【００８５】
樹脂の入ったバイアルを４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をピペットで除去した。その後、アセトニトリルの２ｍＬアリコートで樹脂を４回〜５回洗浄し、勢いよく振盪し、
４０００ｒｐｍで５分間遠心分離機に置き、上清を除去した。アミノ修飾モルホリノ誘導体については、イソプロパノールのアンモニア溶液を真空下で除去した。これらのモルホリノオリゴヌクレオチドを、一晩のフルオリド（テトラブチルアンモニウムフルオリドの１．０ＭＴＨＦ溶液１．０ｍＬ）処理によって脱シリル化した。次いで、樹脂から生成物を除去するため樹脂を３７％水酸化アンモニウム水１ｍＬで１時間処理し、０．２μｍ遠心分離フィルターを使用してポリスチレン樹脂ビーズを除去した。
【００８６】
Ｍｉｌｉｐｏｒｅ水０．５ｍＬを添加することによって各溶液の全容量を２．５ｍＬまで希釈し、ＰＭＯをＩｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＮＡＰ（商標）−２５カラム（GE Healthcare）を使用して脱塩した。最初に、これらのカラムを２５．０ｍＬの水で平衡化した。
水が重力流動によってゲル床に完全に入った後、２．５ｍＬの試料をカラムに充填し、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ水３．５ｍＬを使用して精製された試料を溶出した。ＡＭＩＣＯＮ（商標）Ｕｌｔｒａ−４  ３Ｋ装置を使用して、１０個超のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに対して第２の工程の精製を行った。Ｎａｐカラム精製後に蓄積した溶液（総容量３．５ｍＬ）をＡｍｉｃｏｎ装置に充填し、４０００×ｇで３０分間遠心分離した。濃縮溶質を、同様に、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ水３．０ｍＬで２回洗浄した。オリゴヌクレオチドを収集し、様々な実験に使用した。
【００８７】
５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ）によるウリジンモルホリノホスホルアミダイト（Ｂ＊＝ウラシルであることを除いて９に類似する）のｓｉＲＮＡ配列への組み込み、及び水性ヨウ素よる得られたモルホリノホスホルアミダイトヌクレオチド間結合の対応するホスホルアミデートモルホリノ結合へのその後の変換が報告されている（Tetrahedron Letters 2008, 49:3570-73、Bioorg. Med. Chem., 2009, 17:2441-46）。しかしながら、本発明者らは、化合物９、１４、１９及び２４においてＥＴＴ（ｐＫａ＝４．３）がモルホリン及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンの両方を活性化したことを見出した（図３）。その結果、モルホリンの活性化に続くホウ素化及びヨウ素／ジメチルアミン酸化が、それ以上伸長することができない５’−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ホスホロジアミデート（図４、化合物Ｃ）を有するキャップされたＰＭＯオリゴヌクレオチドをもたらすことから、それらの文献プロトコルに従って非常に低い収率の最終ＰＭＯ生成物が観察された（図４）。更にこの課題を考察するため、幾つかのより酸性が抑えられた活性化物質（テトラゾール、サッカリン−１−メチルイミダゾール、４，５−ジシアノイミダゾール）を試験して、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（ｐＫａ＝１１．１）と反応し得るが、モルホリン（ｐＫａ＝８．３）とは最小限しか反応し得ないものを同定した。ＯＤＮ１（表２）に対応する配列を有するＰＭＯの合成においてスクリーニングされた活性化物質のうち、４，５−ジシアノイミダゾール（ｐＫａ＝５．２、０．１２Ｍ、３００秒のカップリング時間を有する）は、低いレベルの副生成物と共に、最も高い収率（６７％）の所望のＰＭＯを生成した（補足情報、図Ｓ２）。カップリング工程の後に合成されたモルホリノホスホルアミダイトジエステル（図４、化合物Ｂ）がキャッピング溶液に不安定であるため、キャッピング工程に先立って、リン（ＩＶ）モルホリノ化合物（図４、化合物Ｄ）を生成するためホウ素化を行った。ホウ素化の後、支持体をアセトニトリルで洗浄し、無水酢酸を使用して失敗した配列をキャップし、１０％ＴＭＢＰ及び０．５％ＴＦＡのクロロホルム溶液を使用して脱トリチル化を行った（化合物Ｄはこれらの酸性脱トリチル化条件に対して安定であった）。
【００８８】
図４に概説されるこの合成手順を使用して、チミンヌクレオシド塩基のみを有する三量体を合成し、ヨウ素／Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンによってＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ誘導体へと変換し、アンモニアを用いて支持体から取り除いて、ＬＣＭＳによって分析した。ＬＣプロファイル（図６、右パネル）に示される４つの主なピークは、生成物の４つのジアステレオマーについて予測された質量スペクトルを有する（算出質量９０２．３、実測９０１．３）。粗製反応混合物による全てのピークの合わせた面積をこれらのジアステ
レオマーに対するピーク面積と比較することで、化合物２９は収率９４％と計算された。二量体が作製される同様の実験において、第１のカップリング収率は、他の報告される手順よりもはるかに良好な９６％ということがわかった（Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012,
22:1445-47、Tetrahedron Letters, 2015, 56;4565-68）。
【００８９】
【表２】
2019534862.tif 000005
【００９０】
このアプローチ使用してオリゴチミジン（表２、ＯＤＮ１及び２）及び４つ全ての塩基（表２、ＯＤＮ３〜８）を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯを合成し、ＬＣＭＳによって特性評価した。１２ヌクレオシド長〜１６ヌクレオシド長のＰＭＯはＲＮＡ発現の有効な阻害物質（スプライシングの妨害又はｍＲＮＡ翻訳の妨害のいずれかを介する）であることが確立されていたため、本発明者らは、次に、４つ全ての塩基を有する１６−ｍｅｒ（表２、ＯＤＮ８）の合成を行った。未精製の反応混合物のＬＣＭＳクロマトグラムは、収率（単離された１０  Ａ２６０単位）及びこのＯＤＮの質量分析の両方が満足できるものであったことを示した。
【００９１】
実施例３
ＰＭＯ−ＤＮＡキメラの合成
ＰＭＯ−ＤＮＡキメラの合成のため、４，５−ジシアミノイミダゾール（０．１２Ｍ及び３００秒のカップリング時間）及びＥＴＴ（０．２５Ｍ及び１８０秒のカップリング時間）を、モルホリノホスホルジアミダイトシントン（９、１４、１９又は２４）及び５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイト（２５、２６、２７又は２８）に対してそれぞれ使用した。縮合の後、モルホリノホスホルアミダイトジエステルをリン（ＩＶ）ボラン結合に変換し、ＴＨＦ／水／ピリジン中の０．０２Ｍヨウ素による標準的な酸化を使用してホスファイトトリエステルをホスフェートトリエステルに変換した。所望の配列／長さのＰＭＯ−ＤＮＡキメラが作製されるまでこれらの合成工程を繰り返した。表１はこれらの合成工程を概説する。
【００９２】
ＰＭＯ−ＤＮＡキメラは科学界にとって目新しく、様々な研究プロジェクトに有用であると証明されることができたため、幾つかのＰＭＯ−ＤＮＡキメラを合成した（表２、ＯＤＮ９〜１６）。最初に、これらのキメラを、４つのＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ結合
を含む一連の２１−ｍｅｒのオリゴチミジンとして作製した。これらの２１−ｍｅｒにおいて、モルホリノジアミデート結合を、５’末端若しくは３’末端のいずれかに隣接して、又は２１ｍｅｒの真ん中付近に近接して、またオリゴマーを通して第３位毎に置いた（表２；ＯＤＮ９、１０、１１、１２及び１３）。これらのキメラに対して、ヨウ素による活性化の際のジエチルアミンによるボランの置換は効率的に進行し、粗反応混合物のＬＣＭＳによる分析は、予想されるホスホロジアミデート結合がほぼ定量的収率で形成されたことを明らかにした。これらの有望な結果は、４つ全てのヌクレオ塩基を様々な場所に含み、多数のＰＭＯ結合を含むＰＭＯ−ＤＮＡキメラの合成（表２；ＯＤＮ１４、１５及び１６）をもたらした。反応混合物のＬＣＭＳ分析及び３１Ｐ  ＮＭＲは、予想されたＰＭＯ−ＤＮＡキメラが平均収率１０〜２０  Ａ２６０単位（０．２μＭの合成サイクルから）によって高収率で得られたことを実証した。これらの実験もまた、ジメチルアミンによる処理がスクシネート結合の計測可能な切断及び合成中に生成物の喪失をもたらさないことを実証した。
【００９３】
実施例４
アミノ結合、Ｎ−メチルアミノ結合及びモルホリノ結合を有するＰＭＯの固相合成
ボランホスホネート結合は、多数の求核分子による置き換えに対して、ヨウ素によって活性化され得ることが知られている。したがって、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ホスホロジアミデート結合を有するＰＭＯ類縁体を合成することによるこの新たな合成経路を試験することに加えて、本発明者らは、幾つかの新たなＰＭＯ−ＤＮＡ誘導体を生成するため他のアミンを使用することができるかどうか調べることにした。
【００９４】
最初に、このオリゴマーの中心付近に４つのボランホスホルアミデートモルホリノ結合を有するオリゴチミジン２１−ｍｅｒを合成した。このオリゴヌクレオチドを含む支持体を、ヨウ素酸化条件下でＮ−メチルアミン、アンモニア、及びモルホリンで処理した３つの試料に分け、その後、逆相カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。さらに、４つ全ての塩基及びアミノ−ホスホロジアミデートヌクレオチド間結合を有する混合配列のＰＭＯ−ＤＮＡキメラを合成し、ここでは、ジアミデート結合の位置をこれらのキメラの５’末端、３’末端、及び５’／３’末端に配置した。これらのＰＭＯの配列及びＬＣＭＳによる質量分析を表３に列挙する。収率は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯキメラについて得られたものに匹敵した。
【００９５】
【表３】
2019534862.tif 000006
【００９６】
実施例５
ＰＭＯ−ＤＮＡキメラの融解温度
修飾ＰＭＯ−ＤＮＡキメラの標的結合能力を評価するため、アミノ、メチルアミノ、モルホリノ及びジメチルアミノ−モルホリノヌクレオチド間結合を有する２’−デオキシオリゴチミジンを用いて二重鎖ハイブリダイゼーション研究を行った。二重鎖の全体濃度１
．０μＭ、バッファー（１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１）中１：１の比でＰＭＯ１１、１７、１８及び１９を２１ヌクレオチド長の２’−デオキシリボ−又はリボアデノシン−オリゴヌクレオチドと混合した。試料を９６℃で変性し、１５℃まで冷却した。その後、試料を１℃／分の速度で加熱し、Ａ２６０対時間を記録した。融解温度を半分解離の温度とし、一次導関数プロット（表４）から得た。
【００９７】
ＰＭＯ１１、１７、１８及び１９のＲＮＡヘテロ二重鎖の融解温度研究は、ホスホロジアミデートヌクレオチド間結合の導入が、修飾されていない二重鎖と比べてＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖を安定化したことを示した。安定化の増加傾向は、アミノ＞Ｎ−メチルアミノ＞Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ＞モルホリノであった。ＰＭＯ−ＤＮＡキメラに２’−デオキシリボアデノシン２１ｍｅｒと二重鎖を形成させる場合、モルホリノ類縁体を除いて、修飾されていないＤＮＡ・ＤＮＡ二重鎖のＴｍと比較すると、同様の傾向が観察された。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
実施例６
キメラＰＭＯ−ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮアーゼＨ１活性
Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ−ＤＮＡキメラを、ＲＮアーゼＨ１活性を刺激するそれらの能力について試験した。試験系は、５’−Ｏ−フルオレセイン標識ＲＮＡ及び相補性Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯキメラで構成された。
【０１００】
５’−フルオレセインＰＭＯ−ＤＮＡキメラの合成。ボランホスホルアミデートモルホリノキメラのＤＭＴ−ＯＮ合成の完了後、ＯＤＮを標準的なＤＮＡ合成サイクルを使用して、５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６−ＴＦＡ（Glen research）と共役させ
た。環外のアミンのヨウ素酸化反応及び脱シリル化を行った後、逆相ＨＰＬＣを使用してオリゴヌクレオチドを精製した（バッファーＡ：重炭酸トリエチルアンモニウム、０．０５Ｍ、バッファーＢ：アセトニトリル；０％→１００％Ｂ  ５０分間；５５℃；流速４．０ｍＬ／分）。精製されたＯＤＮを、１：１  ＮＨ４ＯＨ：ＣＨ３ＮＨ２の溶液１ｍＬに溶解し、６５℃で３時間加熱してトリフルオロアセトアミド基を除去した。反応混合物を乾燥し、２０ｍＭリン酸ナトリウム及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファー（２００マイクロＬ）（ｐＨ８．０）に溶解し、濃度を測定した。２０倍のモル過剰の５−（及び６−）カルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル（Thermo Fisher Scientific）をＤＭＳＯに溶解し、ＯＤＮ溶液に添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、４℃で３時間に亘って撹拌した。反応混合物を３００マイクロＬの水で希釈し、ＩＬＬＵＳＴＲＡ（商標）ＮＡＰ（商標）−５カラムを使用して過剰なＮＨＳ−フルオレセインを除去した。分析したＰＭＯは、いずれかの末端にＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯ結合、及び類縁体の中心に３−７ホスホジエステル結合を有するキャップ／ギャップ配列を含むオリゴチミジン１４−ｍｅｒ（ＯＤＮ２４〜ＯＤＮ２６、表５）であった。対照は、相補性ＤＮＡ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（それぞれＲＮアーゼＨ１活性を活性化するもの、
及び刺激しないもの）であった。これらのキャップ／ギャップオリゴヌクレオチド類縁体はいずれもＲＮＡ加水分解を活性化することがわかった。
【０１０１】
Ｅ．コリ（E. coli）ＲＮアーゼＨ１によるＲＮＡヘテロ二重鎖の加水分解。Ｅ．コリ
ＲＮアーゼＨ１（Promega）の実験を以前に記載される条件（J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:940-50）を使用して行った。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ
ＫＣｌ、９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び２５０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミンのアッセイバッファーを使用して、上記反応を行った。オリゴデオキシヌクレオチド又は修飾されたオリゴデオキシヌクレオチド（２００ｐｍｏｌ）及び５’−Ｏ−フルオレセイン標識相補性オリゴリボヌクレオチドをアッセイバッファー（３５μＬ）に添加した。Ｅ．コリのＲＮアーゼＨ１（３単位）の添加に続いて、２５℃で１２時間に亘り反応を行った。トラッキング色素を含む同じ容量の８０％ホルムアミドゲルローディングバッファーで反応混合物を希釈し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した（２０％、１９：１架橋、７Ｍ尿素）。全ての反応を３回繰り返して行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを使用して現像したゲルを分析した。
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
実施例７
細胞取り込み
脂質系トランスフェクション試薬を使用して細胞に帯電していないＰＭＯを送達することができないため、一般的に使用されるｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬であるＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  １の存在下で、これらのＰＭＯ−ＤＮＡキメラの細胞取り込みを調べた。ＰＭＯ−ＤＮＡキメラを合成し（ＯＤＮ２７、５’−ＦＬ−Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊ａｐａｐｃｐｃｐａｐｔｐｇｐａｐｔｐｇｐｔｐｇｐｃｐｔｐＧ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊ｔ、これらの略称の説明については表２を参照されたい）、ここで、内部の通常のヌクレオチドは、５’−末端及び３’−末端においてＮ，Ｎ−ジメチルアミノＰＭＯヌクレオチドに挟まれる。また、ＯＤＮ２７は、６炭素リンカーによってつながれたフルオレセイン色素（ＦＬ）を含んだ。Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ  １の存在下、生細胞及び固定した細胞を用いてＨｅＬａ細胞をＯＤＮ２７（１００ｎＭ濃度）でトランスフェクションし（図７）、それぞれ２０時間及び１８時間のインキュベーションの後、蛍光顕微鏡によって画像化した。
【０１０４】
顕微鏡画像によって観察される脂質トランスフェクション。ＯＤＮ２７原液を２００マイクロＬのＯｐｔｉＭＥＭで最終濃度０．１マイクロＭ  ＯＤＮまで希釈した。別々のエッペンドルフチューブにおいて、５．０マイクロＬのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  １を２００マイクロＬのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。ＯＤＮ２７の溶液２００マイクロＬとＤｈａｍａＦＥＣＴ  １溶液を混合し、２０分間平衡化させ、６００マイクロＬのＯｐｔｉＭＥＭを添加した。１０％ＦＢＳ及びペニシリンストレプトマイシン（penstrep）を含むＤＭＥＭ培地中、６ウェルプレートに置いたカバーガラス上、０．３×１０６細胞／ウェルでＨｅｌａ細胞を蒔いた。２４時間後、培地を除去し、８０％培養密度でトランスフェクショ
ンする前に、細胞を２回洗浄した（２．０ｍＬ  Ｄ−ＰＢＳ／洗浄）。Ｄ−ＰＢＳをＨｅｌａ細胞から取り除き、１．０ｍＬのトランスフェクション混合物を各ウェルに添加した。その後、細胞を３７℃で１８時間インキュベートし、２回洗浄した（２．０ｍＬ  Ｄ−ＰＢＳ／洗浄）。１０％の中性バッファーホルマリン１．０ｍＬで細胞を１５分間覆った。ホルマリン溶液を除去し、室温にて１０分間ＤＰＢＳ  ３．０ｍＬで細胞を覆った。カバーガラスをウェルから取り除き、封入剤としてＤＡＰＩを含むＦｌｏｕｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇを使用してカバースライドに上下逆さまに封入し、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃ４７４２−９５  ＣＣＤ及びＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＥＳデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＩＸ  ８１）を使用して観察した。
【０１０５】
細胞を１００ｎＭのＯＤＮ２７でインキュベートする場合に蛍光シグナルの増加が観察されたことから、トランスフェクションは用量依存的であった。蛍光は、主として核に分布されるよう見えるが、多くの類縁体に見られる共通の断続的な（punctuated）構造物を有しない細胞質分布の痕跡も存在する。
【０１０６】
本発明の上記実施例は例示及び説明目的で提示されている。さらに、これらの実施例は本発明を本明細書に開示される形態に限定することを意図していない。結果として、本明細書の教示に応じた変更及び修正、並びに関連分野の技術又は知識が本発明の範囲内となる。本明細書で与えられる実施例に記載される特定の実施形態は、本発明を実施するのに知られるベストモードを更に説明するものであり、当業者がかかる又は他の実施形態において本発明の特定用途又は使用に要求される様々な変更を加えて本発明を利用することが可能であることを意図している。添付の特許請求の範囲は従来技術によって許容される程度に代替的な実施形態を包含するように解釈されることを意図している。
【０１０７】
これは、かかる多項従属を認めない管轄特許庁における方式要件に適合するように、添付の請求項が多項従属を伴わずに起草される範囲で行われたに過ぎない。多項従属請求項を与えることによって含意され得る特徴の全ての可能性のある組み合わせが明示的に意図されるべきであり、また本発明の一部とされるべきであることに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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