(57)【要約】本発明は、リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ｐＩＴＩＭ）に結合するドメインを含むシグナル伝達改変タンパク質を提供する。シグナル伝達改変タンパク質は、機能的ホスファターゼドメインを欠く。本発明はまた、このようなシグナル伝達改変タンパク質を発現する細胞、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と一緒にこのようなシグナル伝達改変タンパク質を共発現する細胞を提供する。ＰＤ１などの分子によるＴ細胞阻害の経路は、図１に概略的に示される。ＰＤ１がメンバーである阻害性受容体のクラスは、ＩＴＩＭ（免疫チロシン阻害性モチーフ）として公知の阻害性モチーフを含有する。それらのリガンドを認識すると、ＩＴＩＭは、ｌｃｋなどの膜結合キナーゼによってリン酸化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ｐＩＴＩＭ）に結合するドメイン；および
（ｉｉ）膜局在化ドメイン
を含む、シグナル伝達改変タンパク質。
【請求項２】
前記膜局在化ドメインが、ミリストイル基、パルミトイル基および／またはプレニル基を含む、前記請求項のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項３】
前記膜局在化ドメインが、細胞内において膜中またはその付近に位置する実体に結合する、請求項１に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項４】
前記膜局在化ドメインがＣＤ４またはＣＤ８に結合する、請求項３に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項５】
前記膜局在化ドメインが、配列番号１３に示されているアミノ酸、または細胞内において発現されるとＳＴＭＰの膜局在化を引き起こすその一部であるかまたはそれを含む、前記請求項のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項６】
前記膜局在化ドメインが膜貫通ドメインであるかまたはそれを含む、請求項１に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項７】
前記ｐＩＴＩＭ結合ドメインがＳＨ２ドメインを含む、前記請求項のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項８】
前記ＳＨ２ドメインがＳＨＰ−１  ＳＨ２ドメインを含む、請求項７に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項９】
前記ＳＨ２ドメインがＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含む、請求項７に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１０】
前記ｐＩＴＩＭ結合ドメインがＳＨＰ−１  ＳＨ２ドメインおよびＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含む、請求項７に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１１】
機能的ホスファターゼドメインを欠く、前記請求項のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１２】
前記ホスファターゼドメインが部分的または完全に欠失している、請求項１１に記載のシグナル伝達タンパク質。
【請求項１３】
不活性化ホスファターゼドメインを含む、請求項１１に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１４】
前記ホスファターゼドメインが、野生型ホスファターゼドメインと比較して、それを非機能的にする１つまたはそれを超えるアミノ酸変異を含む、請求項１２または１３に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１５】
前記ホスファターゼドメインが１つまたはそれを超えるシステイン−セリン置換を含む、請求項１４に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１６】
前記ホスファターゼドメインが非機能的ＳＨＰ−１ホスファターゼドメインである、請求項１１〜１５のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１１に示されている配列を含む、請求項１６に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１８】
前記ホスファターゼドメインが非機能的ＳＨＰ−２ホスファターゼドメインである、請求項１１〜１５のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項１９】
配列番号１２に示されている配列を含む、請求項１８に記載のシグナル伝達改変タンパク質。
【請求項２０】
前記請求項のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質を含む、細胞。
【請求項２１】
第１のシグナル伝達改変タンパク質のｐＩＴＩＭ結合ドメインがＳＨＰ−１  ＳＨ２ドメインを含み；第２のシグナル伝達改変タンパク質のｐＩＴＩＭ結合ドメインがＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含む２つのシグナル改変タンパク質を含む、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も含む、請求項２０または２１に記載の細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれかに記載のシグナル伝達改変タンパク質をコードする、核酸配列。
【請求項２４】
ｉ）請求項２３に記載の第１の核酸配列；および
ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸構築物。
【請求項２５】
請求項２３に記載の核酸配列または請求項２４に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項２６】
複数の請求項２０〜２２のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
疾患の処置および／または予防において使用するための、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
疾患を処置および／または予防するための方法であって、請求項２６に記載の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２９】
免疫チェックポイント阻害剤を前記被験体に投与する工程も含み、前記免疫チェックポイント阻害剤が非ＩＴＩＭ媒介性経路を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ４経路阻害剤であるかまたはそれを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＴＬＡ４経路阻害剤がＣＴＬＡ４抗体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
以下：
（ｉ）被験体から細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）請求項２３に記載の核酸配列、請求項２４に記載の核酸構築物、または請求項２５に記載のベクターを前記細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を前記被験体に投与する工程
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項２６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３４】
前記疾患が癌である、請求項２７に記載の使用のための医薬組成物、または請求項２８〜３２のいずれかに記載の方法、または請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
請求項２０〜２２のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、請求項２３に記載の核酸配列、請求項２４に記載の核酸構築物、または請求項２５に記載のベクターを前記細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項３６】
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ｐＩＴＩＭ）に結合するシグナル伝達改変タンパク質（ＳＴＭＰ）に関する。細胞において発現されると、ＳＴＭＰは、ＰＤ１などの阻害性免疫受容体分子上のｐＩＴＩＭへの結合について、ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２と競合する。これは、ＳＨＰ−１／ＳＨＰ−２によるＩＴＡＭドメインの脱リン酸化を減少させ、それにより、これらの分子によって媒介される免疫活性化の阻害を遮断しまたは減少させる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞に移植する。ＣＤ１９に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｂ細胞悪性疾患の処置のための臨床状況において試験されており、特に、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）において有望な結果を示している。Ｂ−ＡＬＬにおけるＣＤ１９特異的ＣＡＲ療法の初期研究では、いくつかの施設において７０〜９１％の範囲の奏効率が示されている。しかしながら、ＣＬＬおよびリンパ腫などの他のＢ細胞悪性疾患を有する患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法に対する全奏効は、あまり印象的なものではなかった。さらに、固形がんを標的化するＣＡＲ  Ｔ細胞に関して存在する臨床データがほとんどないので、奏効率はさらに低い。これらのより控えめな応答の理由は完全には明らかではないが、腫瘍免疫微小環境が重要な役割を果たす可能性がある。
【０００３】
腫瘍免疫微小環境は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、一度腫瘍塊に入ると遭遇する免疫学的シグナルの背景である。この微小環境は典型的には阻害性であり、調節性または抑制性細胞、例えば調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ならびにＴ細胞上の阻害性受容体に結合してＴ細胞抗腫瘍反応を妨害し得る阻害性リガンド、例えばプログラム細胞死受容体（ＰＤ−１）およびＣＴＬＡ４からなり得る。
【０００４】
免疫チェックポイントは、付帯的組織損傷を最小化するために、自己寛容を維持し、末梢組織における生理学的免疫反応の持続期間および大きさをモジュレートするために重要な多数の阻害性免疫経路を指す。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する主要な免疫耐性機構として、特定の免疫チェックポイント経路を選出することが現在明らかである。
【０００５】
固形腫瘍について、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を開発する場合、免疫チェックポイント阻害を克服するための戦略が必要であろう。
【０００６】
図２に要約されているように、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の状況において免疫チェックポイントシグナルをモジュレートする試みでは、様々な系が開発されている。
【０００７】
最も簡単なアプローチは、遮断抗体の事前投与または同時投与である（図２Ａ）。これに関して、２つの主要なクラスの抗体が使用されている：ＣＴＬＡ４を遮断するもの、およびＰＤ１／ＰＤＬ１を遮断するもの。このアプローチの利点は、それが技術的に簡単であり、ＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化するだけではなく、天然に存在する腫瘍常在性腫瘍特異的Ｔ細胞も活性化し得ることである。このアプローチの不都合な点は、抗体があらゆる場所においてＴ細胞に影響を与えるので、腫瘍コアへの抗体の不十分な生体内分布および全身毒性の可能性である。また、免疫関連有害事象（ＩＲＡＥ）は、チェックポイント遮断で処置された患者において頻繁であり、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂで処置された患者の最大９０％および抗ＰＤ−１  ｍＡｂで処置された患者の７０％において起こると報告されている。
【０００８】
開発されている他のアプローチは、遮断をＣＡＲ  Ｔ細胞に組み込む。例えば、チェックポイント遮断ｓｃＦｖの局在化分泌を引き起こすようにＣＡＲ  Ｔ細胞を操作することが可能である（図２Ｂ）。あるいは、ゲノム編集ツールを使用して、またはｓｉＲＮＡを使用してサイレンシングして、ＰＤ１受容体の遺伝子などの免疫チェックポイント関連遺伝子をＣＡＲ  Ｔ細胞上で破壊し得る（図２Ｃ）。あるいは、ＣＡＲ  Ｔ細胞上で、「デコイ」ＰＤ１受容体を発現させ得る。これらの細胞組み込みアプローチは、生体内分布が限定的ではなく、全身毒性のリスクがないという利点を有する。ｓｃＦｖ分泌アプローチは、隣接天然Ｔ細胞も活性化され得るという利点を有する。
【０００９】
しかしながら、これまでに提案されているアプローチはすべて、それらが１つの特異的阻害性受容体のみを遮断するという重大な欠点に悩まされている。実際、多数の異なるリガンド：受容体相互作用によって誘発される多数の阻害経路がある。１つの阻害経路の遮断は、他の分子を使用して腫瘍が特異的免疫チェックポイント遮断を相殺することを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞のチェックポイント媒介性阻害の問題に対処するための代替的なアプローチが必要である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】即時Ｔ細胞阻害経路の図。ＰＤ１などの阻害性免疫受容体の活性化は、ＩＴＩＭドメインのリン酸化をもたらす。これらは、ＰＴＰＮ６のＳＨ２ドメインによって認識される。認識されると、ＰＴＰＮ６は膜近位領域に動員され、続いてそのホスファターゼドメインがＩＴＡＭドメインを脱リン酸化して、免疫活性化を阻害する。
【００１２】
【図２】腫瘍微小環境によるＣＡＲ−Ｔ細胞の阻害を回避するための他のアプローチならびにそれらの相対的な利点および不都合な点を示す概略図：Ａ．全身性ＰＤ１またはＰＤＬ１遮断と共に投与したＣＡＲ  Ｔ細胞利点：簡単、ＴＩＬも活性化不都合な点：全身毒性、腫瘍コアへの不十分な浸透、単一の阻害性受容体Ｂ．ＰＤ１またはＰＤＬ１遮断ｓｃＦｖを分泌するようにも操作したＣＡＲ  Ｔ細胞利点：ＴＩＬも活性化、遮断の腫瘍コアの良好な浸透不都合な点：依然として全身毒性の可能性、単一の阻害性受容体を標的化Ｃ．ＰＤ１を発現しないようにも操作したＣＡＲ  Ｔ細胞利点：全身毒性なし不都合な点：ＴＩＬが活性化されない。単一の阻害性受容体のみを標的化。Ｄ．本発明のシグナル伝達改変タンパク質を発現するようにも操作したＣＡＲ  Ｔ細胞利点：全身毒性なし。複数の阻害性受容体を遮断不都合な点：ＴＩＬが活性化されない。
【００１３】
【図３】遮断シグナル系の図  ホスファターゼドメインを含まない切断型ＰＴＰＮ６が過剰発現され、全長ＰＴＰＮ６と競合して、ＩＴＩＭシグナル伝達を低減する。
【００１４】
【図４】ＳＴＭＰは免疫学的シナプスにおいて有効に濃縮されるので、ＳＴＭＰの膜局在化は遮断効果を増強し得るａ）ＰＴＰＮ６によるＴ細胞活性化の阻害を説明する概略図ｂ）ＰＴＰＮ６媒介性阻害は、膜に繋留されたＳＴＭＰによって遮断される
【００１５】
【図５】切断型ＳＨＰ−１（ＰＴＰＮ６）または切断型ＳＨＰ−２を使用したＰＤ−１シグナルの遮断。ＰＤ１と、ＣＡＲのみ（ＦＭＣ６３）；またはＣＡＲおよび切断型ＳＨＰ−１もしくはＣＡＲおよび切断型ＳＨＰ−２を含有するバイシストロン性構築物のいずれかとをＰＢＭＣ細胞に共形質導入した。これらの細胞を、ＣＤ１９、ＰＤＬ１またはその両方を形質導入したＳｕｐＴ１細胞と４８時間共培養し、ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図６】実施例２において試験した構築物を説明する概略図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の態様の概要
ＰＤ１などの分子によるＴ細胞阻害の経路は、図１に概略的に示される。ＰＤ１がメンバーである阻害性受容体のクラスは、ＩＴＩＭ（免疫チロシン阻害性モチーフ）として公知の阻害性モチーフを含有する。それらのリガンドを認識すると、ＩＴＩＭは、ｌｃｋなどの膜結合キナーゼによってリン酸化される。リン酸化されると、次いで、これらのＩＴＩＭは、わずか２つのＳＨ２タンパク質（ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２）の１つによって認識される。これらのタンパク質は、それらがホスファターゼを含有するという点において、ＳＨ２含有タンパク質のクラスでユニークである。ＩＴＩＭに動員されると、このホスファターゼは、Ｔ細胞活性化に関連する重要な残基を脱リン酸化する。
【００１７】
本発明者らは、機能的ホスファターゼドメインを欠く形態のＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２の発現がＣＡＲ  Ｔ細胞阻害を遮断し得ることを示した。
【００１８】
このアプローチは、いくつかの利点を有する：それは簡単であり；全身毒性を引き起こさず；最も重要なことには、広範囲の阻害経路を遮断する。
【００１９】
本発明者らはまた、免疫学的シナプス部位において、細胞膜のＳＴＭＰを「濃縮する」ことによって効果を増強することが可能であることを見出した。
【００２０】
第1の態様では、本発明は、
（ｉ）リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ｐＩＴＩＭ）に結合するドメイン；および
（ｉｉ）膜局在化ドメイン
を含む、シグナル伝達改変タンパク質を提供する。
【００２１】
膜局在化ドメインは、ミリストイル基、パルミトイル基および／またはプレニル基を含み得る。
【００２２】
膜局在化ドメインは、細胞内において膜中またはその付近に位置する実体に結合し得る。膜局在化ドメインはＣＤ４またはＣＤ８に結合し得る。
【００２３】
膜局在化ドメインは、配列番号１３に示されているアミノ酸、または細胞内において発現されるとＳＴＭＰの膜局在化を引き起こすその一部であってもよいし、それを含んでもよい。
【００２４】
膜局在化ドメインは、膜貫通ドメインであり得るかまたはそれを含み得る。
【００２５】
ｐＩＴＩＭ結合ドメインは、ＳＨ２ドメイン、例えばＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２  ＳＨ２由来のＳＨ２ドメインを含み得る。
【００２６】
シグナル伝達改変タンパク質は、機能的ホスファターゼドメインを欠き得る。
【００２７】
ホスファターゼドメインは、部分的または完全に欠失され得る。
【００２８】
シグナル伝達改変タンパク質は、不活性化ホスファターゼドメインを含み得る。
【００２９】
ホスファターゼドメインは、野生型ホスファターゼドメインと比較して、それを非機能的にする１つまたはそれを超えるアミノ酸変異を含み得る。変異は、例えば、１つまたはそれを超えるシステイン残基の欠失または置換を伴い得る。変異は、システイン−セリン置換であり得る。
【００３０】
ホスファターゼドメインは、非機能的ＳＨＰ−１ホスファターゼドメイン、例えば配列番号１１として示されている配列を含む変異型ＳＨＰ−１ホスファターゼドメインであり得る。
【００３１】
ホスファターゼドメインは、非機能的ＳＨＰ−２ホスファターゼドメイン、例えば配列番号１２として示されている配列を含む変異型ＳＨＰ−２ホスファターゼドメインであり得る。
【００３２】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のシグナル伝達改変タンパク質を含む細胞を提供する。
【００３３】
従う細胞は、第１のシグナル伝達改変タンパク質のｐＩＴＩＭ結合ドメインがＳＨＰ−１  ＳＨ２ドメインを含み；第２のシグナル伝達改変タンパク質のｐＩＴＩＭ結合ドメインがＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含む、上で規定された通りの２つのシグナル改変タンパク質を含み得る。
【００３４】
細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も含み得る。
【００３５】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従うシグナル伝達改変タンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【００３６】
第４の態様では、本発明は、
ｉ）本発明の第３の態様に従う第１の核酸配列；および
ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列
を含む、核酸構築物を提供する。
【００３７】
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様に従う核酸配列または本発明の第４の態様に従う核酸構築物を含む、ベクター。
【００３８】
第６の態様では、複数の本発明の第２の態様に従う細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００３９】
第７の態様では、疾患の処置および／または予防において使用するための、本発明の第６の態様に従う医薬組成物が提供される。
【００４０】
第８の態様では、疾患を処置および／または予防するための方法であって、本発明の第６の態様に従う医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００４１】
方法は、免疫チェックポイント阻害剤を前記被験体に投与する工程も含み得、前記免疫チェックポイント阻害剤が非ＩＴＩＭ媒介性経路を阻害する。例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４抗体などのＣＴＬＡ４経路阻害剤であってもよいし、それを含んでもよい。
【００４２】
ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２を遮断するＳＴＭＰを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞と一緒に全身性ＣＴＬＡ４遮断を組み合わせることは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、２つのクラスの阻害性シグナルに対して耐性であることを意味する。それはまた、局所Ｔ細胞がＣＴＬＡ４阻害から解放され、それが許容可能なレベルの全身毒性をもたらし得ることを意味する。
【００４３】
方法は、以下：
（ｉ）被験体から細胞含有試料を単離する工程；
（ｉｉ）本発明の第３の態様に従う核酸配列、本発明の第４の態様に従う核酸構築物、または本発明の第５の態様に従うベクターを前記細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を前記被験体に投与する工程
を含み得る。
【００４４】
第９の態様では、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第６の態様に従う医薬組成物の使用が提供される。
【００４５】
疾患は癌であり得る。癌は固形腫瘍であり得る。
【００４６】
第９の態様では、本発明の第２の態様に従う細胞を作製するための方法であって、本発明の第３の態様に従う核酸配列、本発明の第４の態様に従う核酸構築物、または本発明の第５の態様に従うベクターを前記細胞に導入する工程を含む、方法が提供される。
【００４７】
細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
【００４８】
詳細な説明
シグナル伝達改変タンパク質
本発明は、シグナル伝達改変タンパク質（ＳＴＭＰ）に関する。ＳＴＭＰは、Ｔ細胞におけるシグナル伝達をモジュレートし得る。例えば、それは、ＰＤ１などのＩＴＩＭ含有分子によるＴ細胞活性化の阻害を減少させまたは遮断し得る。本発明のＳＴＭＰは、リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ｐＩＴＩＭ）に結合するドメインを含む。
【００４９】
本発明のＳＴＭＰは、機能的ホスファターゼドメインを欠く。ＳＴＭＰはホスファターゼを含み得ないか、またはそれは、部分的もしくは完全に不活性なホスファターゼを含み得る。ホスファターゼは、例えば、１つまたはそれを超えるアミノ酸の切断または変異によって不活性化され得る。
【００５０】
ｐＩＴＩＭ結合ドメイン
本発明のＳＴＭＰは、リン酸化免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ｐＩＴＩＭ）に結合するドメインを含む。
【００５１】
ＩＴＩＭは、免疫系の多くの阻害性受容体の細胞質尾部に見られる保存的アミノ酸配列（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）である。ＩＴＩＭを有する阻害性受容体がそれらのリガンドと相互作用した後、それらのＩＴＩＭモチーフは、Ｓｒｃキナーゼの酵素によってリン酸化される。
【００５２】
免疫阻害性受容体、例えばＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、キラー阻害受容体ファミリー（ＫＩＲ）（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３を含む）は、ＩＴＩＭを含有する。本発明のＳＴＭＰのｐＩＴＩＭ結合ドメインは、これらのタンパク質の１つまたはそれよりも多くに由来するリン酸化ＩＴＩＭに結合し得る。
【００５３】
ｐＩＴＩＭ結合ドメインは、ＳＨ２ドメインを含み得る。
【００５４】
ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）ドメイン
細胞内シグナル伝達経路は、タンパク質の可逆的な翻訳後修飾（リン酸化、ユビキチン化およびアセチル化を含む）によって開始および制御される。
【００５５】
ＳＨ２ドメインはモジュールタンパク質ドメインであり、アダプターとして機能し、それらの各タンパク質結合パートナー（多くの場合は細胞表面受容体）におけるリン酸化ペプチドに結合することによって、タンパク質間相互作用を媒介する。典型的には、ＳＨ２ドメインは、より長いペプチドモチーフが標的タンパク質内にある状況ではリン酸化チロシン残基に結合し、ＳＨ２ドメインは、最大クラスの公知のｐＴｙｒ認識ドメインを表す。
【００５６】
ＳＨ２ドメインは、いかなる内在性の触媒活性も欠くが、多くの場合、それらは独立の触媒ドメインにカップリングされて、特異的な入力シグナルに応じて、これらの触媒ドメインを特定の細胞内位置に、または適切な基質、活性化因子もしくは阻害因子の近位に局在化するように機能する。加えて、ＳＨ２ドメインはまた、アダプタータンパク質ドメインに連結されて見られ得るので、大きな多タンパク質複合体の形成において働き得る。
【００５７】
本発明のＳＴＭＰタンパク質は、ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２由来の１つまたはそれを超えるＳＨ２ドメインを含み得る。
【００５８】
ＳＲＣホモロジー領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１（ＳＨＰ−１）
ＳＨＰ−１は、チロシン−タンパク質ホスファターゼ非受容体タイプ６（ＰＴＰＮ６）としても公知である。それは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーである。
【００５９】
ＳＨＰ−１のＮ末端領域は、ＳＨＰ−１とその基質との相互作用を媒介する２つのタンデムＳＨ２ドメインを含有する。Ｃ末端領域は、チロシンプロテインホスファターゼドメインを含有する。
【００６０】
ＳＨＰ−１は、多くの阻害性免疫受容体またはＩＴＩＭ含有受容体に結合して、それからのシグナルを伝搬することができる。このような受容体の例としては、限定されないが、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１およびＫＩＲ３ＤＬ３が挙げられる。
【００６１】
ヒトＳＨＰ−１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２９３５０を有する。この配列は５９５アミノ酸長であり、配列番号１として示されている。
【化１】
2019535292.tif 000002
【００６２】
以下の表に示されているように、ＳＨＰ−１の３つの代替アイソフォームもある：
【表１】
2019535292.tif 000003
【００６３】
本発明のＳＴＭＰは、ＳＨＰ−１  ＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。これに関して、ＳＴＭＰは、配列番号２として示されている配列を含み得るか、またはこれからなり得る。
【化２】
2019535292.tif 000004
【００６４】
ＳＨＰ−１は、配列のＮ末端、配列番号２として示されている配列の残基４〜１００および１１０〜２１３において、２つのＳＨ２ドメインを有する。したがって、本発明のＳＴＭＰは、配列番号３および４として示されている配列の一方または両方を含み得る。
【化３】
2019535292.tif 000005
【化４】
2019535292.tif 000006
【００６５】
改変体配列が、ｐＩＴＩＭドメインに結合することができるＳＨ２ドメイン配列である限り、ＳＴＭＰは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号２、３または４の改変体を含み得る。例えば、改変体配列は、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３の細胞質尾部におけるリン酸化チロシン残基に結合することができる。改変体配列は、ＳＨＰ−１のアイソフォーム２、３または４に由来する場合、配列番号２、３または４と同等の配列であり得る。
【００６６】
ＳＨＰ−２
ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ−１ＤおよびＰＴＰ−２Ｃとしても公知のＳＨＰ−２も、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＳＨＰ−１のように、ＳＨＰ−２は、そのＮ末端における２つのタンデムＳＨ２ドメインと、それに続くプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインとからなるドメイン構造を有する。不活性状態では、Ｎ末端ＳＨ２ドメインはＰＴＰドメインに結合し、活性部位への潜在的基質のアクセスを遮断する。したがって、ＳＨＰ−２は、自己阻害される。標的ホスホ−チロシル残基に結合すると、Ｎ末端ＳＨ２ドメインはＰＴＰドメインから放出され、自己阻害を緩和することによって酵素を触媒的に活性化する。
【００６７】
ヒトＳＨＰ−２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３５２３５−１を有する。この配列は５９７アミノ酸長であり、配列番号５として示されている。
【化５】
2019535292.tif 000007
【００６８】
以下の表に示されているように、ＳＨＰ−２の２つの代替アイソフォームもある：
【表２】
2019535292.tif 000008
【００６９】
本発明のＳＴＭＰは、ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。これに関して、ＳＴＭＰは、例えば配列番号５のアミノ酸６〜１０２を含むＳＨＰ−２の第１のＳＨ２ドメイン、もしくは例えばＳＨＰ−２のアミノ酸１１２〜２１６を含むＳＨＰ−２の第２のＳＨ２ドメインを含み得るか、またはこれからなり得る。ＳＴＭＰは、配列番号６、７もしくは８として示されている配列を含み得るか、またはこれからなり得る。ＳＴＭＰは、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する配列番号６、７または８の改変体を含み得る。例えば、改変体配列は、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３の細胞質尾部におけるリン酸化チロシン残基に結合することができる。改変体配列は、ＳＨＰ−２のアイソフォーム２または３に由来する場合、配列番号６、７または８と同等の配列であり得る。
【化６】
2019535292.tif 000009
【００７０】
ホスファターゼドメイン
ヒトＳＨＰ−１ホスファターゼおよびＳＨＰ−２ホスファターゼドメインの配列は、それぞれ配列番号９および１０として示されている。
【化７】
2019535292.tif 000010
【００７１】
本発明のＳＴＭＰは、ホスファターゼドメインを欠き得るか、または非機能的ホスファターゼドメインを含み得る。例えば、それは、部分欠失ホスファターゼドメインまたは不活性化ホスファターゼドメインを含み得る。
【００７２】
切断型ホスファターゼドメイン
本発明のＳＴＭＰはホスファターゼドメインを完全に欠き得る。例えば、ＳＴＭＰは、一方または両方のＳＨＰ−１／ＳＨＰ−２  ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＳＨＰ−１／ＳＨＰ−２ホスファターゼを除去するために切断され得る。
【００７３】
あるいは、切断型ホスファターゼが、それが由来する野生型ホスファターゼと比較して減少した下流タンパク質脱リン酸化能力を有するという条件で、本発明のＳＴＭＰは、ホスファターゼの一部、例えば配列番号９または１０として示されている配列の一部を含む部分切断型ホスファターゼを含み得る。切断型ホスファターゼは、残存ホスファターゼ活性を有効に有し得ない。
【００７４】
不活性化ホスファターゼドメイン
本発明のＳＴＭＰは、減少したＩＴＡＭ含有タンパク質脱リン酸化能力を有するかまたはそれを有しないように不活性化されたホスファターゼドメイン、例えばＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２ホスファターゼまたはその誘導体を含み得る。
【００７５】
ホスファターゼは、例えば、野生型配列と比較して減少したホスファターゼ活性を有するように、１つまたはそれを超えるアミノ酸変異を含み得る。
【００７６】
変異は、例えば、付加、欠失または置換であり得る。
【００７７】
変異は、１つまたはそれを超えるシステイン残基の欠失または置換を含み得る。
【００７８】
改変体ホスファターゼ配列は、配列番号９として示されている配列に対してシステイン２１０への変異を有し得る。これは、全長ＳＨＰ−１配列（アイソフォーム１）の４５３位である。変異は、システインからセリンへの置換であり得る。Ｃ２１０Ｓ置換を有する改変体配列は、配列番号１１として示されている（Ｃ２１０Ｓ置換は、太字および下線で示されている）。
【化８】
2019535292.tif 000011
【００７９】
改変体ホスファターゼ配列は、配列番号１０として示されている配列に対してシステイン２１７への変異を有し得る。これは、全長ＳＨＰ−２配列（アイソフォーム１）の４６３位である。変異は、システインからセリンへの置換であり得る。Ｃ２１７Ｓ置換を有する改変体配列は、配列番号１２として示されている（Ｃ２１７Ｓ置換は、太字および下線で示されている）。
【化９】
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【００８０】
膜局在化ドメイン
本発明のＳＴＭＰは、膜局在化ドメインを含み得る。膜局在化ドメインは、細胞膜またはその近くへのＳＴＭＰの「集中」を引き起こし得る。
【００８１】
膜局在化ドメインは、膜繋留であり得るかまたはそれを含み得る。膜繋留は、転写因子およびプロテアーゼ認識部位を膜近位に局在化することができる任意の配列、シグナルまたはドメインであり得る。例えば、膜繋留は、ミリストイル化シグナルまたは膜貫通ドメインであり得る。
【００８２】
膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるアルファヘリックスである。膜貫通部分を供給するために、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインが使用され得る。当業者であれば、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して、タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲を決定し得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造（すなわち、膜を貫通するために十分な長さの疎水性アルファヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列）であることを考慮して、人工的に設計されたＴＭドメインも使用され得る（米国特許第７０５２９０６号には、合成膜貫通成分が記載されている）。
【００８３】
膜貫通ドメインは、良好な安定性を与えるＣＤ２８に由来し得る。
【００８４】
あるいは、膜局在化ドメインは、例えば膜近位実体に結合することによって、細胞膜に位置するタンパク質または他の実体にＳＴＭＰを誘導し得る。ＳＴＭＰは、例えば、免疫シナプスに関与する分子、例えばＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８に結合するドメインを含み得る。
【００８５】
ミリストイル化
ミリストイル化は、ミリスチン酸由来のミリストイル基がアミド結合によってＮ末端グリシン残基のアルファ−アミノ基に共有結合する脂質化改変である。ミリスチン酸は、ｎ−テトラデカン酸としても公知である１４炭素飽和脂肪酸である。改変は、翻訳と同時にまたは翻訳後的に付加され得る。Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）は、細胞の細胞質におけるミリスチン酸付加反応を触媒する。疎水性ミリストイル基は細胞膜中のリン脂質と相互作用するので、ミリストイル化は、それが結合するタンパク質の膜標的化を引き起こす。
【００８６】
本発明のＳＴＭＰは、ＮＭＴ酵素によってミリストイル化され得る配列を含み得る。本発明のＳＴＭＰは、細胞において発現される場合、ミリストイル基を含み得る。
【００８７】
ＳＴＭＰは、ＮＭＴ酵素によって認識されるコンセンサス配列、例えばＮＨ２−Ｇ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｓ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８を含み得る。
【００８８】
パルミトイル化
パルミトイル化は、タンパク質のシステインへの、およびあまり頻繁ではないがセリンおよびトレオニン残基への脂肪酸、例えばパルミチン酸の共有結合である。パルミトイル化は、タンパク質の疎水性を増強し、膜会合を誘導するために使用され得る。（パルミチン酸とタンパク質との間の結合は、チオエステル結合であることが多いので）プレニル化およびミリストイル化とは対照的に、通常、パルミトイル化は可逆的である。逆反応は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼによって触媒される。
【００８９】
Ｇタンパク質を介したシグナル伝達では、αサブユニットのパルミトイル化、γサブユニットのプレニル化、およびミリストイル化は、Ｇタンパク質がその受容体と相互作用し得るように、原形質膜の内面へのＧタンパク質の繋留に関与する。
【００９０】
本発明のＳＴＭＰは、パルミトイル化され得る配列を含み得る。本発明のＳＴＭＰは、細胞において発現されると膜局在化を引き起こすさらなる脂肪酸を含み得る。
【００９１】
プレニル化
プレニル化（イソプレニル化または脂質化としても公知である）は、タンパク質または化合物への疎水性分子の付加である。プレニル基（３−メチル−ブタ−２−エン−１−イル）は、ＧＰＩアンカーのような脂質アンカーと同様に、細胞膜への結合を容易にする。
【００９２】
タンパク質のプレニル化は、標的タンパク質のＣ末端システインへのファルネシルまたはゲラニル−ゲラニル部分のいずれかの転移を含む。細胞においてプレニル化を行う３つの酵素（ファルネシルトランスフェラーゼ、ＣａａｘプロテアーゼおよびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩ）がある。
【００９３】
本発明のＳＴＭＰは、プレニル化され得る配列を含み得る。本発明のＳＴＭＰは、細胞において発現されると膜局在化を引き起こす１つまたはそれを超えるプレニル基を含み得る。
【００９４】
ＣＤ４／ＣＤ８結合配列
本発明のＳＴＭＰの膜局在化配列は、細胞膜に、その中にまたはその近くに位置する実体、例えばタンパク質に結合し得る。
【００９５】
例えば、膜局在化配列は、ＣＤ４またはＣＤ８に結合し得る。
【００９６】
配列番号１３として示されているｌｃｋのアミノ末端配列は、以下のように、３つの異なるタイプの膜局在化配列を含む：
・ミリストイル化の基質であるＮ−ミリストイルグリシン（灰色で強調表示）
・パルミトイル化の基質である２つのＳ−パルミトイルシステイン（太字および斜体で示されている）
・ＣＤ４／ＣＤ８結合に必要な亜鉛クラスプに関与する２つのシステイン残基（下線）。
【化１０】
2019535292.tif 000013
【００９７】
本発明のＳＴＭＰの膜局在化配列は、配列番号１３からのミリストイル化配列、パルミトイル化配列およびＣＤ４／ＣＤ８結合配列のいずれか１つまたはそれよりも多くを含み得る。膜局在化ドメインは、配列番号１３、または少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％のアミノ酸同一性を有するその改変体であって、ＳＴＭＰを細胞膜に局在化する能力を保持するその改変体を含むかまたはそれからなり得る。
【００９８】
配列番号１３またはその改変体を含むかまたはそれからなる膜局在化配列は、ｐＩＴＩＭ結合ドメインから、ＳＴＭＰ配列のＮ末端に位置し得る。
【００９９】
核酸
一態様では、本発明は、本発明のＳＴＭＰをコードする核酸を提供する。
【０１００】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義語であることを意図する。
【０１０１】
当業者であれば、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることを理解する。加えて、当業者であれば、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、ルーチンな技術を使用して、本明細書記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ると理解されよう。
【０１０２】
本発明にしたがう核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、単鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ると理解すべきである。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【０１０３】
ヌクレオチド配列に関して、用語「改変体」、「相同体」または「誘導体」は、配列からのまたは配列への１つ（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変異、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
【０１０４】
核酸構築物
一態様では、本発明は、本発明のＳＴＭＰを別のタンパク質と共発現する核酸構築物を提供する。核酸構築物は、本発明のＳＴＭＰをコードする核酸配列；および別のタンパク質をコードする核酸を含み得る。
【０１０５】
本発明は、本発明のＳＴＭＰをキメラ抗原受容体と共発現する核酸構築物を提供する。核酸構築物は、（ｉ）本発明のＳＴＭＰをコードする核酸配列；および（ｉｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含み得る。
【０１０６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＤ３ゼータなどのＩＴＡＭ含有エンドドメインを含む活性化ＣＡＲであり得る。
【０１０７】
核酸構築物は、２つまたはそれより多くのタンパク質の発現を可能にする核酸配列を含み得る。例えば、それは、２つの核酸配列間の切断部位をコードする配列を含み得る。新生ポリペプチドが生成されると、いかなる外部切断活性も必要とせずに、それが２つのタンパク質に直ぐに切断されるように、切断部位は自己切断性であり得る。
【０１０８】
【化１１】
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の配列を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断ペプチドを含む様々な自己切断部位が公知である：
【０１０９】
共発現配列は、代替的に、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）であっても、内部プロモーターであってもよい。
【０１１０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
古典的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、通常膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーをエンドドメインに結び付ける。
【０１１１】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ゼータのガンマ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導されたエンドドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ゼータの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。
【０１１２】
ＣＡＲエンコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。レンチウイルスベクターも使用され得る。こうして、多数のがん特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【０１１３】
したがって、典型的には、ＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むかまたはこれと会合する細胞内ドメインを含む。
【０１１４】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含め、多数の抗原結合ドメインが当技術分野では知られている。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対する十分な親和力をもつペプチド；単一ドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）などの人工単一バインダー；またはＴ細胞受容体から誘導された単鎖を含み得る。
【０１１５】
抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。例えば、抗原結合ドメインは、腫瘍細胞表面受容体についての可溶性リガンド（例えば、サイトカインまたはケモカインなどの可溶性ペプチド）であるタンパク質／ペプチドに基づくドメイン；または膜結合リガンドもしくは結合対のカウンターパートを腫瘍細胞で発現させるための受容体の細胞外ドメインを含み得る。
【０１１６】
抗原結合ドメインは、抗原の天然リガンドに基づき得る。
【０１１７】
抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリーからの親和性ペプチドまたは新たに設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。  
【０１１８】
スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、空間的に抗原結合ドメインをエンドドメインから分離させるためのスペーサー配列を含み得る。可撓性スペーサーは、抗原結合ドメインを異なる方向で配向させることにより、結合を促進し得る。
【０１１９】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にわたるＣＡＲの配列である。
【０１２０】
膜貫通ドメインは、膜において熱力学的に安定しているいかなるタンパク質構造であってよい。これは、典型的には幾つかの疎水性残基で構成されるアルファ・へリックスである。いかなる膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインでも、本発明の膜貫通部分を供給するのに使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および範囲は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を用いて当業者により決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち膜にわたるのに十分な長さを有する疎水性アルファへリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であるとすれば、人工的に設計されたＴＭドメインもまた使用され得る（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通成分について記載している）。
【０１２１】
膜貫通ドメインは、ＣＤ２８から誘導され得、良好な受容体安定性を与える。
【０１２２】
活性化エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。それは、ＣＡＲの細胞内ドメインの部分であってもよいし、それに会合してもよい。抗原認識後、受容体がクラスター形成し、天然ＣＤ４５およびＣＤ１４８は、シナプスから排除され、シグナルは細胞へ伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータのエンドドメイン成分である。これは、抗原が結合された後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない可能性があるので、追加の共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと併用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得るか、または３つ全部が一緒に使用され得る。
【０１２３】
ＣＡＲが活性化エンドドメインを含む場合、該細胞は、ＣＤ３−ゼータエンドドメイン単独、ＣＤ２８またはＯＸ４０どちらかのエンドドメインと共にＣＤ３−ゼータエンドドメインまたはＣＤ２８エンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３−ゼータエンドドメインを含み得る。
【０１２４】
ＩＴＡＭモチーフを含有する任意のエンドドメインは、活性化エンドドメインとして作用し得る。
【０１２５】
ベクター
本発明は、本発明に従う１つまたは複数の核酸配列あるいは構築物を含むベクター、またはベクターのキットも提供する。そのようなベクターを使用して核酸配列または構築物を宿主細胞に導入し、そうすることで核酸配列または構築物によってコードされるタンパク質を発現させることができる。
【０１２６】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターまたは合成ｍＲＮＡであってよい。
【０１２７】
ベクターは、Ｔ細胞細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができるものであってよい。
【０１２８】
細胞
本発明はまた、本発明のＳＴＭＰ、核酸および／または核酸構築物を含む免疫細胞などの細胞に関する。
【０１２９】
細胞は、細胞溶解性免疫細胞であり得る。
【０１３０】
細胞溶解性免疫細胞は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプであるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。
【０１３１】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。
【０１３２】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。
【０１３３】
記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１３４】
以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１３５】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。
【０１３６】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。
【０１３７】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０１３８】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。
【０１３９】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。
【０１４０】
本発明の細胞は、上記で挙げた細胞タイプのいずれでもよい。
【０１４１】
本発明のＳＴＭＰを発現する細胞は、患者自身の末梢血（第１者）から、またはドナー末梢血（第２者）からの造血幹細胞移植の状況において、または非関連ドナーからの末梢血（第３者）から生体外で作製され得る。
【０１４２】
あるいは、細胞は、例えば、Ｔ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の生体外分化から誘導され得る。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化細胞系も使用され得る。
【０１４３】
これらのすべての実施形態において、細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つにより受容体構成成分およびシグナル伝達構成成分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより生成される。
【０１４４】
本発明の細胞は、被験体由来の生体外細胞であり得る。細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料から得てもよい。細胞は、本発明の核酸配列または構築物で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により活性化および／または拡大され得る。
【０１４５】
本発明の細胞は、
（ｉ）被験体または上記で挙げた他の供給源からの細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）本発明に従う核酸配列または構築物による細胞の形質導入またはトランスフェクション
により作製され得る。
【０１４６】
組成物
本発明はまた、本発明の複数の細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０１４７】
医薬組成物はまた、非ＩＴＩＭ媒介性経路を阻害する免疫チェックポイント阻害剤を含み得る（次のセクションを参照のこと）。
【０１４８】
処置方法
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺すことができるものであればよい。
【０１４９】
本発明の細胞は、ウイルス感染症などの感染症の処置に使用され得る。
【０１５０】
本発明の細胞はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における、病的免疫応答の制御に使用され得る。
【０１５１】
本発明の細胞は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮体がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がんなどのがん性疾患の処置に使用され得る。
【０１５２】
本発明の細胞は、舌、口および咽頭のがんを含む口腔および咽頭のがん；食道がん、胃がんおよび結腸直腸がんを含む消化器系のがん；肝細胞癌および胆管癌を含む肝臓および胆道系のがん；気管支原性がんおよび喉頭のがんを含む呼吸器系のがん；骨肉腫を含む骨および関節のがん；メラノーマを含む皮膚のがん；乳がん；女性における子宮がん、卵巣がんおよび子宮頸がん、男性における前立腺がんおよび精巣がんを含む生殖器のがん；腎細胞癌および尿管（ｕｔｔｅｒｅｒ）もしくは膀胱の移行上皮癌を含む腎臓系（ｒｅｎａｌ  ｔｒａｃｔ）のがん；神経膠腫、多形神経膠芽腫および髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂａｓｔｏｍａ）を含む脳がん；甲状腺がん、副腎癌および多発性内分泌腫瘍症候群に随伴するがんを含む内分泌系のがん；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；多発性骨髄腫および形質細胞腫；急性および慢性の両方の、骨髄性またはリンパ性の白血病；ならびに神経芽細胞腫を含む他の部位および非特定部位のがんを処置するのに使用され得る。
【０１５３】
本発明の細胞による処置は、標準的手法で起こることが多い腫瘍細胞のエスケープまたは放出を防止するのを助け得る。
【０１５４】
前記方法は、免疫チェックポイント阻害剤を被験体に投与する工程を含み得、この免疫チェックポイント阻害剤は、非ＩＴＩＭ媒介性経路を阻害する。非ＩＴＩＭ媒介性とは、経路が、ＩＴＩＭ含有タンパク質、例えばＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１またはＫＩＲ３ＤＬ３を伴わないことを意味する。
【０１５５】
ＩＴＩＭ媒介性経路は、ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２によって媒介され得るのに対して、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２は、非ＩＴＩＭ媒介性経路に関与しない。
【０１５６】
免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４経路を阻害し得る。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりも高い親和性およびアビディティで、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても公知である）およびＣＤ８６（Ｂ７−２としても公知である）に結合するので、そのリガンドに関してＣＤ２８を打ち負かすことが可能である。ＣＴＬＡ４は阻害性シグナルをＴ細胞に伝達するのに対して、ＣＤ２８は刺激性シグナルを伝達する。
【０１５７】
ＣＴＬＡ４経路阻害剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブなどのＣＴＬＡ４抗体であり得る。
【０１５８】
あるいは、免疫チェックポイント阻害剤は、別の非ＩＴＩＭ媒介性経路、例えば、以下の分子：ＴＩＭ３、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳおよびＶＩＳＴＡの１つによって媒介される経路を阻害し得る。
【０１５９】
本発明はまた、被験体への別個の投与、後続投与または同時投与のためのキットであって、
（ｉ）複数の本発明の細胞；および
（ｉｉ）非ＩＴＩＭ媒介性経路を阻害する免疫チェックポイント阻害剤
を含むキットを提供する。
【０１６０】
以下、実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。
【実施例】
【０１６１】
実施例１−切断型ＳＨＰ−１（ＰＴＰＮ６）または切断型ＳＨＰ−２を使用したＰＤ−１シグナル遮断
以下の表に示されているように、ＰＢＭＣ細胞を形質導入した：
【表３】
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【０１６２】
細胞を、ＣＤ１９、ＰＤＬ１またはその両方を形質導入したＳｕｐＴ１細胞と共に４８時間共培養し、ＩＦＮγ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、図５に示されている。
【０１６３】
ＳｕｐＴ１標的細胞上のＰＤＬ１の存在は、ＩＦＮγ放出の減少を引き起こした。切断型ＳＨＰ−１または切断型ＳＨＰ−２構築物と共にＣＡＲを発現するＰＢＭＣでは、ＣＡＲのみを発現するものと比較して、ＩＦＮγ放出が増加した。これは、切断型ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２構築物が、標的細胞からのＰＤＬ１阻害性シグナルを成功裏に阻害したことを示している。
【０１６４】
実施例２−膜へのｄｎＳＨＰ１／ＳＨＰ２の局在化の効果の調査
ｄｎＳＨＰを膜に局在化するために、３つの異なる戦略を試験する：
（ｉ）選別自殺遺伝子（ｓｏｒｔ−ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）ＲＱＲ８への直接連結；
（ｉｉ）４８ｂｐ  Ｇ−Ｓリンカーを介した選別自殺遺伝子ＲＱＲ８への連結；および
（ｉｉｉ）ＣＤ２２分子（Ｖ５タグ付き）およびＣＤ１９分子膜貫通ドメインの２つの細胞外Ｉｇドメインへの連結
【０１６５】
試験した構築物は、以下および図６に示されている。
【表４】
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【０１６６】
ＣＤ３およびＣＤ２８抗体で２４時間活性化した後、ｄｎＳＨＰ可溶性または膜結合構築物でＰＢＭＣを形質導入する。形質導入の３日後、ＰＤ１−ＰＥおよび次のいずれかで染色して、構築物の発現を評価する：ＲＱＲ８を含有する構築物の場合にはｈＣＤ３４−ＡＰＣ；またはＶ５タグを有する構築物の場合にはＶ５−ＡＰＣ。形質導入細胞をＣＤ５６＋（ＮＫＴ細胞）集団について枯渇させ、続いて、培養物において維持する。
【０１６７】
９６ウェルプレート中、多数の２×１０５個の標的細胞を用いて、４：１のＥ：Ｔ比で、ＦＡＣＳベースの殺傷アッセイおよびＥＬＩＳＡのための共培養を行う。使用した標的細胞株は、ＣＤ１９を発現するかまたはＣＤ１９およびＰＤＬ１の両方を発現するＳｕｐＴ１細胞である。同じＥ：Ｔ比で非形質導入ＰＢＭＣ（ＮＴ）も標的細胞と共に培養し、対照として使用する。
【０１６８】
２４時間インキュベートした後、上清を回収して、その後のＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳＡにおいて使用する。細胞をスピンダウンし、７ＡＡＤおよびＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７で染色し、ＦＡＣＳ分析する。残りの標的細胞を生（７ＡＡＤ陰性）非Ｔ細胞（ＣＤ３陰性）集団として数える。
【０１６９】
上記の明細書で挙げた刊行物は全て、参照により本明細書に援用する。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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