(57)【要約】同時に２個の標的細胞に結合することができ、複合疾病の治療に潜在性が大きく、安定しており、非常に特異的なヘテロダイマー免疫グロブリン構造体、例えば、天然ＩｇＧの望ましい特性は、維持しながら、望ましくない重鎖・軽鎖ミスペアリングがない二重特異性抗体を生産する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合構成員、及び前記ＦｃＲ結合構成員に共有結合で連結された１以上の認識モイエティを含むヘテロダイマーであり、前記ＦｃＲ結合構成員は、１以上の二硫化結合によって互いに結合された第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドは、それぞれ免疫グロブリン重鎖不変領域の少なくとも一部を含み、前記第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる下記位置に少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６及びＤ３９９、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１、Ｙ４０７及びＫ４０９、または
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６及びＫ４０９、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１、Ｄ３９９、及びＹ４０７；
ここで、前記第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、自体より互いにさらに高い二量体化親和性を有するヘテロダイマー。
【請求項２】
前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドのいずれの前記免疫グロブリン重鎖不変領域の２個のＣＨ３ドメインで発生することを特徴とする請求項１に記載のヘテロダイマー。
【請求項３】
前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記のうち少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１または２に記載のヘテロダイマー：
ａ）Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１ＫまたはＬ３５１Ｗ；
ｂ）Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６ＷまたはＴ３６６Ｖ；
ｃ）Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｇ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９ＴまたはＤ３９９Ａ；
ｄ）Ｙ４０７Ｌ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ｆ、Ｙ４０７ＴまたはＹ４０７Ｈ；及び
ｅ）Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９ＱまたはＫ４０９Ｒ。
【請求項４】
前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＩのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー：
グループＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；及び
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ
グループＩＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｑ；及び
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ａ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｒ。
【請求項５】
前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＩＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＶのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー：
グループＩＩＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；及び
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ
グループＩＶ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｔ；及び
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ａ。
【請求項６】
前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＶのａ）〜ｈ）の構成員のうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー：
グループＶ：
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ；及び
ｈ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ。
【請求項７】
少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＶＩのａ）〜ｈ）の構成員のうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１〜３、及び請求項５うちいずれか１項に記載のヘテロダイマー：
グループＶＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ；及び
ｈ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ。
【請求項８】
前記ＦｃＲ結合構成員は、Ｆｃドメインを含むことを特徴とする請求項１〜７のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー。
【請求項９】
前記Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃドメインに由来することを特徴とする請求項８に記載のヘテロダイマー。
【請求項１０】
前記ＩｇＧＦｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２Ｆｃドメイン、ＩｇＧ３Ｆｃドメイン及びＩｇＧ４Ｆｃドメインで構成された群から選択される一つを含むことを特徴とする請求項９に記載のヘテロダイマー。
【請求項１１】
前記１以上の認識モイエティは、抗原結合断片（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、膜受容体の細胞外ドメイン、細胞膜受容体のペプチドリガンド、サトカイン、凝固因子、親和性タグ、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー。
【請求項１２】
前記１以上の認識モイエティは、２個の認識モイエティを含み、前記２個の認識モイエティは、それぞれＦａｂ断片を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヘテロダイマー。
【請求項１３】
前記２個の断片は、同一ではないことを特徴とする請求項１２に記載のヘテロダイマー。
【請求項１４】
前記ヘテロダイマーは、免疫グロブリン類似分子を含むことを特徴とする請求項１３に記載のヘテロダイマー。
【請求項１５】
前記ヘテロダイマーは、二重特異性抗体を含むことを特徴とする請求項１３または１４に記載のヘテロダイマー。
【請求項１６】
前記１以上の認識モイエティは、２個の認識モイエティを含み、前記２個の認識モイエティは、Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖ断片を含むことを特徴とする請求項１１に記載のヘテロダイマー。
【請求項１７】
１ｍＭジチオトレイトールを含む生理学的条件下の水溶液に存在下で、前記溶液が、前記第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチドのうち一つ、及びその同質の認識モイエティ以外のポリペプチドは、根本的に含まない場合において、溶液内全体ポリペプチド型重量基準で、前記第１ポリペプチド及び第２ポリペプチド、並びに前記第１ポリペプチドまたは前記第２ポリペプチドの同質認識モイエティで存在するホモダイマー型のただ１つの重量が５０％未満であることを特徴とする請求項１〜１６のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー。
【請求項１８】
前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖであることを特徴とする請求項１〜１７のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー。
【請求項１９】
前記ヘテロダイマーは、第１重鎖及び第２重鎖、及び第１軽鎖及び第２軽鎖を含み、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、同じではなく、前記第１軽鎖及び前記第２軽鎖は、同一ではないことを特徴とする請求項１３に記載のヘテロダイマー。
【請求項２０】
前記Ｆａｂ断片及び前記ｓｃＦｖ断片は、グループＶＩＩのａ）〜ｄ）から選択される認識モイエティ対から選択される  ことを特徴とする請求項１６に記載のヘテロダイマー：
グループＶＩＩ：
ａ）ＨＥＲ２に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ；
ｂ）Ｔｒｏｐ２に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ；
ｃ）ＣＤ２０に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ；及び
ｄ）ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ。
【請求項２１】
前記同一ではない２個のＦａｂ断片は、ＨＥＲ２に特異的に結合する第１Ｆａｂ断片、及びＣＤ２０に特異的に結合する第２Ｆａｂ断片であることを特徴とする請求項１３に記載のヘテロダイマー。
【請求項２２】
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドのうち少なくとも一つは、配列番号１６〜３１、配列番号３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４８，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６８，６９，７０及び７１のうち少なくとも一つを含むアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１〜２１のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー。
【請求項２３】
前記ＦｃＲ結合構成員は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦｃαＲＩ、Ｆｃα／μＲ、ＦｃＲｎ、及びその組み合わせからなる群から選択されるＦｃ受容体に結合可能であることを特徴とする請求項１〜２２のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマー。
【請求項２４】
前記ＦｃＲ結合構成員は、ＦｃＲｎに結合可能であることを特徴とする請求項２３に記載のヘテロダイマー。
【請求項２５】
前記Ｆｃ受容体への結合は、ＡＤＣＣを誘発することを特徴とする請求項２３に記載のヘテロダイマー。
【請求項２６】
請求項１〜２５のうちいずれか１項に記載のヘテロダイマーの製造する方法であり、前記方法は、：
１）第１宿主細胞及び第２宿主細胞は、互いに分離されており、前記第１宿主細胞内において、前記第１ポリペプチドをコーディングする１以上の核酸、及び前記第２宿主細胞内において、前記第２ポリペプチドをコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）分離された前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを還元させる段階と、
３）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを組み合わせ、結果混合物を生成する段階と、
４）前記結果混合物を酸化させる段階と、
５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含む方法。
【請求項２７】
第１重鎖、第２重鎖、第１軽鎖及び第２軽鎖を有する二価非相同免疫グロブリンを含むヘテロダイマーの製造する方法であり、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、同じではなく、前記第１軽鎖及び前記第２軽鎖は、同じではなく、前記第１重鎖及び前記第２重鎖の一部が、前記二価非相同免疫グロブリンのＦｃ領域を形成し、前記方法は、
１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１重鎖及び前記第１軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）前記第１重鎖及び前記第１軽鎖を共に、かつ前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を共に還元させる段階と、
３）前記第１重鎖、前記第１軽鎖、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を組み合わせ、結果混合物を生成する段階と、
４）前記結果混合物を酸化させる段階と、
５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含み、
前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＶＩＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＸのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含むものである方法：
グループＶＩＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ
グループＩＸ：
ａ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｑ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ａ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｒ。
【請求項２８】
第１重鎖、第２重鎖、第１軽鎖及び第２軽鎖を有する二価非相同免疫グロブリンを含むヘテロダイマーの製造する方法であり、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、同じではなく、前記第１軽鎖及び前記第２軽鎖は、同じではなく、前記第１重鎖及び前記第２重鎖の一部が、前記二価非相同免疫グロブリンのＦｃ領域を形成し、前記方法は、
１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１重鎖及び前記第１軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）前記第１重鎖及び前記第１軽鎖を共に、かつ前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を共に還元させる段階と、
３）前記第１重鎖、前記第１軽鎖、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を組み合わせ、結果混合物を生成する段階と、
４）前記結果混合物を酸化させる段階と、
５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含み、
前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＸＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＸＩＩＩのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含むことである方法：
グループＸＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ
グループＸＩＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｔ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ａ。
【請求項２９】
重鎖、軽鎖、及びＦｃ鎖に連結されたｓｃＦｖ断片を含む二価非相同タンパク質を含むヘテロダイマーを製造する方法であり、前記重鎖、及び前記ｓｃＦｖ断片に連結された前記Ｆｃ鎖の一部がＦｃ領域を形成し、前記方法は、
１）宿主細胞内において、前記重鎖及び前記軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び前記Ｆｃ鎖に連結された前記ｓｃＦｖ断片をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含み、
前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＸＩＶのａ）〜ｈ）、及びグループＸＶのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含むものである方法：
グループＸＩＶ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ
グループＸＶ：
ａ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｑ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ａ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｒ。
【請求項３０】
重鎖、軽鎖、及びＦｃ鎖に連結されたｓｃＦｖ断片を含む二価非相同タンパク質を含むヘテロダイマーの製造する方法であり、前記重鎖、及び前記ｓｃＦｖ断片に連結された前記Ｆｃ鎖の一部がＦｃ領域を形成し、前記方法は、
１）宿主細胞内において、前記重鎖及び前記軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び前記Ｆｃ鎖に連結された前記ｓｃＦｖ断片をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含み、
前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＸＶＩのａ）〜ｈ、）及びグループＸＶＩＩのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含むものである方法：
グループＸＶＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ、または
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ
グループＸＶＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｔ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ａ。
【請求項３１】
第１重鎖、第２重鎖、第１軽鎖及び第２軽鎖を有する二価非相同免疫グロブリンを含むヘテロダイマーの製造する方法であり、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、同じではなく、前記第１軽鎖及び前記第２軽鎖は、同じではなく、前記第１重鎖及び前記第２重鎖の一部が、前記二価非相同免疫グロブリンのＦｃ領域を形成し、前記方法は、
１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１重鎖及び前記第１軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）前記第１重鎖及び前記第１軽鎖を共に、かつ前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を共に還元させる段階と、
３）前記第１重鎖、前記第１軽鎖、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を組み合わせ、結果混合物を生成する段階と、
４）前記結果混合物を酸化させる段階と、
５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含み、
前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、グループＸのａ）〜ｈ）よる構成員のうちいずれか一つを含むものである方法：
グループＸ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ。
【請求項３２】
第１重鎖、第２重鎖、第１軽鎖及び第２軽鎖を有する二価非相同免疫グロブリンを含むヘテロダイマーの製造する方法であり、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、同じではなく、前記第１軽鎖及び前記第２軽鎖は、同じではなく、前記第１重鎖及び前記第２重鎖の一部が、前記二価非相同免疫グロブリンのＦｃ領域を形成し、前記方法は、
１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１重鎖及び前記第１軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階と、
２）前記第１重鎖及び前記第１軽鎖を共に、かつ前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を共に還元させる段階と、
３）前記第１重鎖、前記第１軽鎖、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を組み合わせ、結果混合物を生成する段階と、
４）前記結果混合物を酸化させる段階と、
５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階と、を含み、
前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、グループＸＩのａ）〜ｈ）よる構成員のうちいずれか一つを含むものである方法：
グループＸＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ；及び
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ。
【請求項３３】
前記１以上の核酸は、ベクターまたはベクター系内に含有されたものである請求項２６〜３２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベクターまたはベクター系は、ｐＣＤＮＡベクターから変形されたプラスミドベクターｐＸ０ＧＣを含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターまたはベクター系は、１つの細胞または多くの細胞に導入したものであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つの細胞またはさまざまな細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦまたはＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４及びＥｘｐｉＣＨＯ細胞のうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記還元させる段階は、
ｉ）２−アミノエタンチオール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン、その誘導体、及びその組み合わせのうちいずれか一つを含む還元剤を追加する段階と、
ｉｉ）約４゜Ｃで少なくとも約３時間還元させる段階と、
ｉｉｉ）前記還元剤を除去する段階と、を含むことを特徴とする請求項２６〜２８、並びに請求項３１及び３２うちいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記還元剤は、ＤＴＴを約０．１ｍＭ以上の濃度で含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記還元剤は、脱塩カラムを介して除去されることを特徴とする請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記酸化させる段階は、少なくとも約５時間空気で酸化させる段階を含むことを特徴とする請求項２６〜２８、請求項３１，３２、及び請求項３７〜３９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記酸化させる段階は、
ｉ）Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸、その誘導体、またはその組み合わせを含む酸化剤を追加する段階と、
ｉｉ）約４゜Ｃで少なくとも約５時間酸化させる段階と、
ｉｉｉ）前記酸化剤を除去する段階と、を含むむことを特徴とする請求項２６〜２８，請求項３１，３２、及び請求項３７〜３９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記酸化剤は、Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸を約０．５ｍＭ以上の濃度で含むものであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法は、分離させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項２６〜４０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜２５うちいずれか１項に記載の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドのうち少なくとも一つをコーディングする核酸。
【請求項４５】
前記核酸は、配列番号３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７のうち少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項４４に記載の核酸。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載の核酸を含むベクターまたはベクター系。
【請求項４７】
前記ベクターまたはベクター系は、ｐＣＤＮＡベクターから変形されたプラスミドベクターｐＸ０ＧＣを含むことを特徴とする請求項４６に記載のベクターまたはベクター系。
【請求項４８】
請求項４６または４７の前記ベクターまたはベクター系を含む細胞。
【請求項４９】
前記細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦまたはＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、及びＥｘｐｉＣＨＯ細胞のうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項３５に記載の細胞。
【請求項５０】
薬学的に許容可能な担体と、
下記のうちいずれか一つと、含む薬学的組成物：
ｉ）請求項１〜２６のうちいずれか１項に記載の前記ヘテロダイマー、
ｉｉ）請求項４４または４５に記載の核酸、
ｉｉｉ）請求項４６または４７に記載のベクターまたはベクター系、
ｉｖ）請求項４８または４９による細胞、及び
ｖ）その組み合わせ。
【請求項５１】
それを必要とする個体において、疾病または障害の治療または予防の方法であり、前記方法は、請求項５０に記載の薬学的組成物を前記個体に投与する段階を含むものである方法。
【請求項５２】
前記疾病または障害は、自家免疫疾患、移植片に対する免疫反応、アレルギー反応、感染、神経変性疾患、腫瘍疾患及び細胞増殖性障害、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、潰瘍性大腸カタル、クローン病、全身紅斑性ループス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、拡張型心筋病症類似疾病、シェーグレン症候群、アレルギー接触皮膚炎、多発筋肉炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、白班、インシュリン依存性糖尿病、ベーチェット症候群、慢性甲状腺炎、パーキンソン病、ハンチントン病、マチャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頚部扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、及びその組み合わせを含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記個体は、ヒトであることを特徴とする請求項５１または５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、天然ＩｇＧ抗体の望ましい特性は、維持しながら、望ましくない重鎖−軽鎖ミスペアリング（ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇ）のない安定しており、非常に特異的な免疫グロブリン構造体に関する。
【０００２】
本出願は、その開示が参照として本明細書に含まれた２０１６年９月２９日付けで出願された中国特許出願一連番号ＣＮ２０１６１０８６３８１４７に優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
単一特異性を有し、標的抗原上の単一抗原決定基とのみ相互作用する単一クローン抗体（ｍＡｂ）は、癌、感染疾患及び自家免疫疾患及び感染性疾患のような多くの疾病治療に使用されてきた。しかし、これまで、そのような治療分子のうちいかなるものも、シグナルカスケード間の混線はもとより、疾病媒介分子伝達経路の重複性と係わる、癌または感染疾患のような疾病の内在的な複合性により、単一作用剤として十分な効能を示すことができなかった。そのようなｍＡｂが単一標的抗原とのみ相互作用するために、最適の治療効果を提供し難かったのである。多重標的、または１つの標的への多重部位の同時遮断は、向上した治療効能を示すのである。さらには、多重抗原／抗原決定基をして、単一の多重特異性分子を標的化させることは、治療法が単一分子からなるために、新薬開発の複雑さを低減させる。２以上の単一特異性分子組み合わせを使用する場合と比較し、患者及び医療従事者のいずれにもさして複雑ではない。
【０００４】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）または多重特異性分子は、当該技術分野で周知されている。二重特異性抗体を作るための初期試みにおいては、二作用結合試薬を利用し、２個の現存ＩｇＧ分子、２個のＦａｂ’、または２個の（Ｆａｂ’）２断片の化学的接合体と係わりがあった。しかし、そのような種類の化学的接合ＢｓＡｂは、二重特異性分子の生成のための労動強度、ヘテロダイマー精製の困難さ、ホモダイマー、及び本来の単一クローン抗体の除去、及び低い収率における制限があった。
【０００５】
他種のＢｓＡｂ分子は、ハイブリッド融合細胞、または異なる抗体を分泌する２個の融合細胞の体細胞交雑によって生成されたクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）である。Ｉｇ重鎖及びＩｇ軽鎖の任意的対合により、可能な対のＩｇＧ混合物の約１／１０のみが作用可能なＢｓＡｂを生産する。それにより、精製化が複雑であって生産収率が低い。
【０００６】
ＷＯ／２０１３０６０８６７は、混合された２個のホモダイマー免疫グロブリンの還元を介したヘテロダイマー二重特異性抗体の量産方法を記載する。その結果、ホモダイマーのＣＨ３ドメイン内への非対称変異の導入によって起きたＦａｂ−ａｒｍ交換後の鎖間二硫化結合の再酸化が起こる。
【０００７】
ＷＯ／２００９０８９００４は、静電気の観点からホモダイマー形成に有利ではないが、静電気の観点からヘテロダイマー形成には有利なＣＨ３−ＣＨ３界面内への１以上の帯電されたアミノ酸変異の導入を介したヘテロダイマータンパク質製造方法を扱う。
【０００８】
ＵＳ５，１７３，１６８は、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」戦略を使用したヘテロダイマーＩｇＧ製造方法を記載する。比較的小さいアミノ酸側鎖を、比較的大きいアミノ酸側鎖で代替することにより、第１鎖のＣＨ３ドメイン界面にある「ノブ（ｋｎｏｂ）」がまず生成される。そして、比較的大きいアミノ酸側鎖を、比較的小さいアミノ酸側鎖で代替することにより、第２鎖のＣＨ３界面内のホール（ｈｏｌｅ）が生成される。「ノブ及びホール」相互作用は、ヘテロダイマーＩｇＧ形成に有利であり、ホモダイマー形成には有利ではない。
【０００９】
ＷＯ／２０１２０５８７６８は、構造的及び計算的なモデリング誘導タンパク質工学技術と共に、陰性及び陽性のデザインを含むＩｇＧ１ＣＨ３ドメインに導入された突然変異に由来するヘテロダイマーＩｇＧの生成方法を開示する。
【００１０】
新生児Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎは、その２つがいずれも非共有相互作用と結合し、主用組織的合成複合体Ｉ系列（ＭＨＣＩ）ファミリーと相同性を共有する１つの膜貫通重鎖（Ｐ５１サブユニットα鎖）、及び１つの可溶軽鎖（Ｐ１４サブユニットβ鎖）のヘテロダイマー受容体を含む。ＦｃＲｎは、いくつかの重要な生物学的機能を有している。ＦｃＲｎは、輸送受容体であり、ＩｇＧ及びアルブミンと結合し、多様な細胞障壁を通過する。例えば、ＦｃＲｎは、母親ＩｇＧ抗体を胎児に移し、妊娠期間の間、新生児体液免疫を提供する。ＦｃＲｎ及びＩｇＧとアルブミンとのｐＨ依存的相互作用は、周期蓄積、及びタンパク質の分解減少を介して、血清半減期延長に重要である（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１５  Ａｕｇ  ３０；  ９１：１０９−２４；  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１５  Ｍａｙ  １５；  １９４（１０）：  ４５９５−６０３；  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７  Ｓｅｐ；  ７（９）：  ７１５−２５）。ＦｃＲｎ及びＩｇＧの結合部位は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの界面にあり、アミノ酸残基２５３，３１０及び４３５を含む（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．  ２０１５  Ｎｏｖ；  ２６８（１）：  ２５３−６８  ａｎｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１５  Ｏｃｔ；  ６７（２  Ｐｔ  Ａ）：  １３１−４１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本開示は、ヘテロダイマー免疫グロブリン構造体、その製造及びその利用方法に係り、例えば、上昇された安定性及び特異性を有する変形された不変領域を有する二重特異性抗体に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
それにより、第１様態において、本開示は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合構成員、及び前記ＦｃＲ結合構成員に共有結合で連結された１以上の認識モイエティを含むヘテロダイマーに係わるものである。前記ＦｃＲ結合構成員は、１以上の二硫化結合によって互いに結合された（ｊｏｉｎｅｄ）第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む。前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドは、それぞれ免疫グロブリン重鎖不変領域の少なくとも一部を含む。前記第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、下記位置に少なくとも５個のアミノ酸置換を含む：
【００１３】
１）前記第１ポリペプチド内の３６６及び３９９、並びに前記第２ポリペプチド内の３５１，４０７及び４０９、または
２）前記第１ポリペプチド内の３６６及び４０９、並びに前記第２ポリペプチド内の３５１，３９９及び４０７；
ここで、前記第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、自体より互いにさらに高い二量体化親和性を有する。
【００１４】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記置換のうち少なくとも一つを含む：
ａ）前記第２ポリペプチド内Ｌ３５１の、グリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはトリプトファン；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６の、ロイシン、プロリン、トリプトファンまたはバリン；
ｃ）前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチド内のＤ３９９の、システイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニル、トレオニンまたはアラニン；
ｄ）前記第２ポリペプチド内Ｙ４０７の、ロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニンまたはヒスチジン；及び
ｅ）前記第１ポリペプチド及び／または前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９の、システイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミン酸またはアルギニン。
【００１５】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＩのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含む：
【００１６】
グループＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００１７】
グループＩＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｑ；並びに
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ａ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｒ。
【００１８】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＩＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＶのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含む：
【００１９】
グループＩＩＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２ポリペプチド内Ｌの３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００２０】
グループＩＶ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｔ；並びに
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ａ。
【００２１】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＶのａ）〜ｈ）の構成員のうちいずれか一つを含む：
【００２２】
グループＶ：
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ。
【００２３】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＶＩのａ）〜ｈ）の構成員のうちいずれか一つを含む：
【００２４】
グループＶＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ。
【００２５】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒを含む。一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖを含む。一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖを含む。
【００２６】
一部実施例において、前記ＦｃＲ結合構成員は、Ｆｃドメインを含む。一部実施例において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧＦｃドメインに由来するものである。一部実施例において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ＩｇＧ２Ｆｃドメイン、ＩｇＧ３Ｆｃドメイン及びＩｇＧ４Ｆｃドメインのうちいずれか一つである。
【００２７】
一部実施例において、前記ＦｃＲ結合構成員は、Ｆｃ受容体に特異的に結合することができる。一部実施例において、前記Ｆｃ受容体は、新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）である。一部実施例において、前記Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦｃαＲＩ、Ｆｃα／μＲ、ＦｃＲｎ、及びその組み合わせのうちいずれか一つである。一部実施例において、前記Ｆｃ受容体への結合は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発する。
【００２８】
一部実施例において、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドのうち少なくとも１つの配列は、配列番号１６〜３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４８，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６８，６９，７０及び７１を含む。
【００２９】
一部実施例において、前記ＦｃＲ結合構成員に共有結合で連結された前記１以上の認識モイエティは、抗原結合断片（Ｆａｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、膜受容体の細胞外ドメイン、細胞膜受容体のペプチドリガンド、サトカイン、及び親和性タグのうち少なくとも一つを含む。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、Ｆａｂ断片及びｓｃＦｖ断片を含む。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティ２個のｓｃＦｖ断片を含む。一部実施例において、前記２個のｓｃＦｖ断片は、同一ではない。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティ２個のＦａｂ断片を含む。一部実施例において、前記２個のＦａｂ断片は、同一ではない。一部実施例において、前記ヘテロダイマーは、２個の同一ではないＦａｂ断片を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）類似分子を含む。
【００３０】
一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、ＨＥＲ２を認識する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、ＰＤ−Ｌ１を認識する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、Ｔｒｏｐ２を認識する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、ＣＤ３を認識する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、ＣＤ２０を認識する。
【００３１】
一部実施例において、認識は、特異的結合を含む。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、特異的にＨＥＲ２に結合する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、特異的にＰＤ−Ｌ１に結合する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、特異的にＴｒｏｐ２に結合する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、特異的にＣＤ３に結合する。一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、特異的にＣＤ２０に結合する。
【００３２】
一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、下記グループＶＩＩのａ）〜ｄ）から選択される認識モイエティ対を含む：
【００３３】
グループＶＩＩ：
ａ）ＨＥＲ２に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ；
ｂ）Ｔｒｏｐ２に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ；
ｃ）ＣＤ２０に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ；並びに
ｄ）ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ。
【００３４】
一部実施例において、前記１以上の認識モイエティは、ＨＥＲ２に特異的に結合するＦａｂ、及びＣＤ２０に特異的に結合するＦａｂを含む。
【００３５】
一部実施例において、前記ヘテロダイマーは、同一ではない第１重鎖、及び同一ではない第２重鎖、並びに同一ではない第１軽鎖、及び同一ではない第２軽鎖を含む。
【００３６】
他の一様態において、本開示は、ヘテロダイマーを製造する方法に係わるものである。一部実施例において、前記方法は、１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１ポリペプチドをコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２ポリペプチドをコーディングする１以上の核酸を発現させる段階、２）分離された前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを還元させる段階、３）前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドを組み合わせ、結果混合物を生成する段階、４）前記結果混合物を酸化させる段階、並びに５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階を含む。
【００３７】
他の一様態において、本開示は、ヘテロダイマーを製造する方法に係わり、前記ヘテロダイマーは、同一ではない第１重鎖及び第２重鎖、及び同一ではない第１軽鎖及び第２軽鎖を有する二価非相同免疫グロブリンを含む。一部実施例において、前記方法は、１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１重鎖及び前記第１軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階、２）前記第１重鎖及び前記第１軽鎖を共に、かつ前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を共に還元させる段階、３）前記第１重鎖、前記第１軽鎖、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を組み合わせ、結果混合物を生成する段階、４）前記結果混合物を酸化させる段階、そして５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階を含む。一部実施例において、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、前記二価非相同免疫グロブリンのＦｃ領域を形成する。
【００３８】
一部実施例において、前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＶＩＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＸのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含む：
【００３９】
グループＶＩＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００４０】
グループＩＸ：
ａ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｑ；並びに
ｈ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ａ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｒ。
【００４１】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、グループＸのａ）〜ｈ）よる構成員のうちいずれか一つを含む：
【００４２】
グループＸ：
ａ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ；そして
ｈ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ。
【００４３】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、グループＸＩのａ）〜ｈ）よる構成員のうちいずれか一つを含む：
【００４４】
グループＸＩ：
ａ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ，Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ，Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ，Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ，Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ，Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ；そして
ｈ）前記第１重鎖内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ，Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ。
【００４５】
他の一様態において、本開示は、ヘテロダイマーを製造する方法に係わり、前記ヘテロダイマーは、同一ではない第１重鎖及び第２重鎖、及び同一ではない第１軽鎖及び第２軽鎖を含む免疫グロブリンヘテロダイマーを含む。一部実施例において、前記方法は、１）前記第１宿主細胞及び前記第２宿主細胞は、互いに分離されており、第１宿主細胞内において、前記第１重鎖及び前記第１軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び第２宿主細胞内において、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階、２）前記第１重鎖及び前記第１軽鎖を共に、かつ前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を共に還元させる段階、３）前記第１重鎖、前記第１軽鎖、前記第２重鎖及び前記第２軽鎖を組み合わせ、結果混合物を生成する段階、４）前記結果混合物を酸化させる段階、及び５）形成されたヘテロダイマーを回収する段階を含む。一部実施例において、前記第１重鎖及び前記第２重鎖は、前記二価非相同免疫グロブリンのＦｃ領域を形成する。
【００４６】
一部実施例において、前記Ｆｃドメインは、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＸＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＸＩＩＩのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含む：
【００４７】
グループＸＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００４８】
グループＸＩＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｔ；並びに
ｈ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ａ。
【００４９】
他の一様態において、本開示は、ヘテロダイマーを製造する方法に係わり、前記ヘテロダイマーは、重鎖、軽鎖、及びＦｃ鎖に連結されたｓｃＦｖ断片を含む二価非相同タンパク質を含み、前記重鎖、及び前記ｓｃＦｖ断片に連結された前記Ｆｃ鎖の一部がＦｃ領域を形成する。一部実施例において、前記方法は、１）宿主細胞内において、前記重鎖及び前記軽鎖をコーディングする１以上の核酸、及び前記Ｆｃ鎖に連結された前記ｓｃＦｖ断片をコーディングする１以上の核酸を発現させる段階、並びに２）形成されたヘテロダイマーを回収する段階を含む。
【００５０】
一部実施例において、前記Ｆｃ領域は、少なくとも５個のアミノ酸置換を含み、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＸＩＶのａ）〜ｈ）、及びグループＸＶのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含む：
【００５１】
グループＸＩＶ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００５２】
グループＸＶ：
ａ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｑ；並びに
ｈ）前記第１重鎖内Ｄ３９９Ａ及び前記第２重鎖内Ｋ４０９Ｒ。
【００５３】
一部実施例において、前記少なくとも５個のアミノ酸置換は、下記グループＸＶＩのａ）〜ｈ）、及びグループＸＶＩＩのａ）〜ｈ）それぞれからのいずれか１つの構成員の組み合わせのうちいずれか一つを含む：
【００５４】
グループＸＶＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ、または
ｈ）前記第１重鎖内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２重鎖内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００５５】
グループＸＶＩＩ：
ａ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ｔ；並びに
ｈ）前記第１重鎖内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２重鎖内Ｄ３９９Ａ。
【００５６】
ヘテロダイマーを製造する方法に係わる本様態の一部実施例において、前記核酸は、ベクターまたはベクター系に位置する。一部実施例において、前記ベクターまたはベクター系は、ｐＣＤＮＡベクターから変形されたプラスミドベクターｐＸ０ＧＣを含む。
【００５７】
ヘテロダイマーを製造する方法に係わる本様態の一部実施例において、前記宿主細胞は、ヒト胚芽腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、またはＨＥＫ２９３から変形されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ及びＨＥＫ２９３Ｆ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはＣＨＯから変形されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４及びＥｘｐｉＣＨＯ、並びにその組み合わせを含む。
【００５８】
ヘテロダイマーを製造する方法に係わる本様態の一部実施例において、還元を含む前記段階は、２−アミノエタンチオール、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、その化学的誘導体、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む１以上の還元剤を含む。一部実施例において、前記方法は、約２゜Ｃ〜８゜Ｃ、例えば、３゜Ｃ〜６゜Ｃ、及び４゜Ｃで還元する段階をさらに含み、選択的に、およそ少なくとも３時間（例えば、３〜８時間、４〜７時間、及び５〜６時間）遂行される。さらなる実施例において、前記方法は、１以上の還元剤を除去する段階を含む。一部実施例において、前記１以上の還元剤を除去する段階は、脱塩方法を含む。
【００５９】
ヘテロダイマーを製造する方法に係わる本様態の一部実施例において、酸化を含む前記段階は、Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸、その化学的誘導体、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む１以上の酸化剤と関連する。一部実施例において、前記方法は、約２゜Ｃ〜８゜Ｃ、例えば、３゜Ｃ〜６゜Ｃ、及び４゜Ｃで酸化する段階をさらに含み、選択的に、およそ少なくとも５時間（例えば、５時間〜４日、５時間〜３日、及び５時間〜１日）遂行される。一部実施例において、前記方法は、回収段階及び／または精製段階をさらに含む。
【００６０】
他の一様態において、本開示は、本開示の任意様態によるヘテロダイマーの一部分をコーディングする核酸に係わるものである。一部実施例において、前記核酸配列は、配列番号３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７のうちいずれか一つ、または配列番号３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７のうち１以上と、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。一部実施例において、前記核酸配列は、厳格な条件下において、配列番号３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７のうち１以上と混成される配列を含む。一部実施例において、前記核酸配列は、配列番号３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７のうち１以上と相補的な配列を含む。
【００６１】
他の一様態において、本開示は、本開示の任意様態によるヘテロダイマーの一部分をコーディングする少なくとも１つの核酸を含むベクターまたはベクター系に係わるものである。一部実施例において、前記ベクターまたはベクター系は、ｐＣＤＮＡベクターから変形されたプラスミドベクターｐＸ０ＧＣを含む。
【００６２】
他の一様態において、本開示は、本開示の任意様態によるヘテロダイマーの一部分をコーディングする任意の核酸を含むベクターまたはベクター系を含む宿主細胞に係わるものである。一部実施例において、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３から変形されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ及びＨＥＫ２９３Ｆ、並びにＣＨＯ、またはＣＨＯから変形されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４及びＥｘｐｉＣＨＯのうちいずれか一つである。
【００６３】
他の一様態において、本開示は、本開示の任意様態によるヘテロダイマーの一部分を再構築的に製造する方法に係わるものである。一部実施例において、前記方法は、少なくとも本開示の任意様態によるヘテロダイマーの第１重鎖及び第２重鎖をコーディングする１以上の核酸を含むベクターまたはベクター系を含む宿主細胞を提供する段階、前記核酸を発現させる段階、及び再構築的に製造したヘテロダイマーを回収する段階を含む。
【００６４】
他の一様態において、本開示は、前記ヘテロダイマー、及び薬学的に許容可能な担体、防腐剤または賦形剤を含む組成物に係わるものである。
【００６５】
他の一様態において、本開示は、前記ヘテロダイマーを必要とする個体に投与する方法に係わるものである。一部実施例において、前記個体は、疾病または疾患を治療するために、ヘテロダイマーを投与される。他の実施例において、前記個体は、疾病または疾患を予防するために、ヘテロダイマーを投与される。一部実施例において、前記個体は、哺乳類である。一部実施例において、前記個体は、ヒトである。
【００６６】
一部実施例において、前記疾病または疾患は、自家免疫疾患、移植片に対する免疫反応、アレルギー反応、感染、神経変性疾患、腫瘍疾患及び細胞増殖性障害、またはその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。一部実施例において、前記自家免疫疾患は、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、潰瘍性大腸カタル、クローン病、全身紅斑性ループス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、拡張型心筋病症類似疾病、シェーグレン症候群、アレルギー接触皮膚炎、多発筋肉炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、白班、インシュリン依存性糖尿病、ベーチェット症候群、慢性甲状腺炎、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。一部実施例において、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マチャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。一部実施例において、前記腫瘍疾患及び細胞増殖性障害は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頚部扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。
【００６７】
他の一様態において、本開示は、  医学における使用のための前記ヘテロダイマ  に係わるものである。
【００６８】
他の一様態において、本開示は、ヘテロダイマーの疾病または疾患の治療への用途に係わるものである。一部実施例において、前記疾病または疾患は、自家免疫疾患、移植片に対する免疫反応、アレルギー反応、感染、神経変性疾患、腫瘍疾患及び細胞増殖性障害、またはその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。
【００６９】
他の一様態において、本開示は、薬剤製造において、前記ヘテロダイマーの用途に係わるものである。
【００７０】
他の一様態において、本開示は、疾病または疾患の治療のための薬剤製造において、前記ヘテロダイマーの用途に係わるものである。一部実施例において、前記ヘテロダイマーは、本開示の任意様態によるヘテロダイマーである。一部実施例において、前記疾病または疾患は、自家免疫疾患、移植片に対する免疫反応、アレルギー反応、感染、神経変性疾患、腫瘍疾患及び細胞増殖性障害、またはその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】例示的なｐＤｉｓ３ベクターを示す。Ｃｍｖは、サイトメガロウイルスプローモーター、ｓｐは、信号ペプチド、ＳＵＭＯは、小さいユビキチン関連変更遺伝子タグ（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｔａｇ）、Ｆｃは、結晶性断片、ＢＧＨは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂｇｈ−ポリＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号、ＨＡは、ヒトインフルエンザ血球凝集素、ＰＵＣｏｒｉは、ｐＵＣの複製原点、Ｈｙｇｒｏは、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子、ｏｒｉＰは、エプスタイン・バールウイルス複製原点である。
【図２】ヘテロダイマーＦｃライブラリーの構造を示す。
【図３】ホモダイマー及びヘテロダイマーのペアリングを示す。
【図４】図４は抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの一般的な構造を示す。
【図５】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの溶出ピークを示す。
【図６】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図７】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの純度分析を示す。
【図８】１０ｍｇ／ｍＬ及び４０゜Ｃ（Ａ）、並びに１ｍｇ／ｍＬ及び４０゜Ｃ（Ｂ）の異なる濃度での抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの安定性を示す。
【図９】ＦｃＲｎへの抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの結合親和度を示す。
【図１０】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの、ＳＫ−ＢＲ−３及びＪｕｒｋａｔ：イソタイプ（Ａ）、抗ＨＥＲ２ｍＡｂ（Ｂ）、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３四価ホモダイマーＢｓＡｂ（Ｃ）または抗ＨＥＲ２／ＣＤ３二価ヘテロダイマーＢｓＡｂ（Ｄ）への同時結合を示す。
【図１１】異なる標的細胞：ＳＫ−ＢＲ３（Ａ）及びＢＴ−４７４（Ｂ）に対する抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの生体外細胞毒性を示す。
【図１２】腹腔内に投与された抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの１回投与量の薬物動力学的（ＰＫ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ）プロファイルを示す。
【図１３】抗Ｔｒｏｐ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１４】抗Ｔｒｏｐ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーのＴｒｏｐ−２結合親和度を示す。
【図１５】抗Ｔｒｏｐ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの、ＢｘＰＣ−３及びＪｕｒｋａｔ：イソタイプ（Ａ）、抗ＣＤ３ｍＡｂ（Ｂ）、抗Ｔｒｏｐ−２ｍＡｂ（Ｃ）または抗Ｔｒｏｐ−２／ＣＤ３ヘテロダイマーＢｓＡｂ（Ｄ）への同時結合を示す。
【図１６】Ｈ１６５０（Ａ）及びＢｘＰＣ−３（Ｂ）に対する抗Ｔｒｏｐ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの生体外細胞毒性を示す。
【図１７】腹腔内に投与された抗Ｔｒｏｐ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの１回投与量の薬物動力学的（ＰＫ）プロファイルを示す。
【図１８】抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１９】１０ｍｇ／ｍＬ及び４０゜Ｃ（Ａ）及び１ｍｇ／ｍＬ及び４０゜Ｃ（Ｂ）の異なる濃度での抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの安定性を示す。
【図２０】抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２１】抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーのＰＤ−Ｌ１結合親和度を示す。
【図２２】抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの、Ｈ４６０及びＪｕｒｋａｔ：イソタイプ（Ａ）、抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂ（Ｂ）、抗ＣＤ３ｍＡｂ（Ｃ）または抗ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ３ヘテロダイマーＢｓＡｂ（Ｄ）への同時結合を示す。
【図２３】異なる細胞：ＨＣＣ８２７（Ａ）及びＨ１６５０（Ｂ）に対する抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの生体外細胞毒性を示す。
【図２４】抗ＣＤ２０発現結果物の溶出ピークを示す。
【図２５】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの一般的な構造を示す。
【図２６】ハーフマーの一般的な構造を示す。
【図２７】還元結果物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２８】還元結果物の大きさ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ−ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を示す。
【図２９】酸化結果物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３０】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの溶出ピークを示す。
【図３１】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３２】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの純度テスト結果を示す。
【図３３】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの分析を示す。
【図３４Ａ】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの質量スペクトル（図３４Ａ）を示す。
【図３４Ｂ】抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの関連配列整列（図３４Ｂ）を示す。太線は、二次ＭＳで予測したところと同一アミノ酸を示し、点線は、一次ＭＳで予測したところと同一ペプチドを示し、暗い部分ではないアミノ酸は、「見い出されない」ということを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
本開示は、ヘテロダイマー免疫グロブリン類似構造体に係り（必ずしも、そうであるばかりではない）、例えば、向上された安定性及び治療効果を構造体に付与する変形された重鎖不変領域（例えば、Ｆｃ領域）を有する二重特異性抗体に係わるものである。そのような構造体は、天然ＩｇＧの有益な特性を維持し、軽鎖と重鎖との不一致がない。本開示は、追加して、前記免疫グロブリン構造体を製造する方法に係り、一般的に、ヘテロダイマーを生産するための２個の「半抗体（ｈａｌｆ  ｂｏｄｉｅｓ）」または「ハーフマー」の間の還元反応及び後続酸化反応を介して行われる。本開示のヘテロダイマーは、１以上の二硫化結合によって互いに結合された（ｊｏｉｎｅｄ）２個の同一ではない半抗体またはハーフマーによって構成されると見られる。ハーフマーは、変異された免疫グロブリン重鎖、またはその断片の一本鎖、及びそれに結合された認識モイエティ（鎖に対する「同質の」認識モイエティと記載）を含み、一般的な生理学的条件下で、共有結合によって結合される。そのようなハーフマーは、重鎖不変領域に変形を有するように設計されるが、それにより、ホモダイマー形成が、一般的に、好まれたり支持されたりする還元条件下において、非共有結合力によるホモダイマーへの形成が抑制される一方、ヘテロダイマー結合は、還元条件下において、同一に２個の相補的に設計されたハーフマー間で好まれる。「ヘテロダイマー結合」により、共有結合力はもとより、結合の非共有結合力も含まれると理解される。本明細書において、「半抗体」または「ハーフマー」は、一般的な生理学的条件下において、Ｆｃ受容体結合構成員、及び１つのポリペプチド鎖と結合した認識モイエティを一般的に形成する普通の２個のうち、ただ１つのポリペプチド鎖を有するという意味において、全体免疫グロブリンヘテロテトラマーの「半分」、または免疫グロブリン（例えば、ｓｃＦｖｓ）の誘導体を含む分子または分子複合体を意味する。例えば、前述の半抗体またはハーフマーは、特定の変異を含む免疫グロブリン重鎖（または、その断片）、並びに共有結合、または疎水力及び水素結合のような非共有相互作用を介して互いに結合された免疫グロブリン軽鎖（または、その断片）によっても構成され、「一価」とも考慮される。また、そのような「一価」の半抗体またはハーフマーは、ヒンジ領域を含む一本鎖及び非Ｆａｂ認識モイエティ、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または受容体の結合ドメインに、例えば、共有結合を介して連結された特定の変異を有する免疫グロブリン重鎖のＣＨ２領域及びＣＨ３領域でも構成される。既存の例に該当する例示的な「ハーフマー」または「半抗体」は、１本の免疫グロブリン重鎖、及び１本の軽鎖が存在する図２６に示されている通りである。
【００７３】
本開示のヘテロダイマーの生成物収率は、天然抗体の収率と類似しており、前記方法は、簡便であって扱いが容易である。一実施例において、前記ヘテロダイマーは、２個の異なる「半抗体」から構成され、それぞれの半抗体は、特定変異を有する完全なＩｇ重鎖、及び完全なＩｇ軽鎖によって構成される。一般的に、前記半抗体は、別途に発現されるが、例えば、異なる２個の細胞において別途に精製され、還元剤追加によって別途に還元され、共に混合されて酸化され、ヘテロダイマーを形成する。他の一実施例において、前記ヘテロダイマーは、２個の異なるハーフマーで構成され、１つのハーフマーは、特定変異を有する完全な重鎖、及び完全な軽鎖から構成され、他の１つのハーフマーは、非Ｆａｂ認識モイエティに連結された特定変異を有するＦｃＲ結合重鎖断片である。本開示のヘテロダイマーは、単一細胞株を使用しても、発現及び精製される。例示的な還元試薬は、例えば、２−アミノエタンチオール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、及びその化学的誘導体を含むが、それらに制限されるのではない。例示的な酸化試薬は、例えば、Ｌ−ジヒドロアスコルビン酸及びその化学的誘導体を含むが、それらに制限されるものではない。
【００７４】
本開示のヘテロダイマーは、前記ヘテロダイマー上のＣＨ３ドメインの５個の特定、非システイン変異で特徴づけられる。５個の変異は、Ｔ３６６、Ｄ３９９、Ｌ３５１、Ｙ４０７及びＫ４０９である。本明細書において、アミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによるものであり、例えば、その開示が参照として本明細書に含まれたＥｄｅｌｍａｎら，  １９６９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：  ７８−８に記載された通りである。Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスナンバリングは、例えば、標的抗体を、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスにより、共通配列と比較することができる。例えば、前記５個の変異は、Ｔ３６６Ｌ、Ｄ３９９Ｒ、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖを含んでもよい。しかし、本発明が、それに厳格に制限されるものではない。例えば、Ｔ３６６における変異は、非制限的な例示としても、下記を含んでもよい：Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｐ、Ｔ３６６Ｃ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｒ及びＴ３６６Ｗ。Ｄ３９９における変異は、非制限的な例示としても、下記を含んでもよい：Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｃ、Ｄ３９９Ｈ、Ｄ３９９Ｖ、Ｄ３９９Ｔ、Ｄ３９９Ａ、Ｄ３９９Ｐ、Ｄ３９９Ｎ、Ｄ３９９Ｉ、Ｄ３９９Ｈ、Ｄ３９９Ｓ、Ｄ３９９Ｇ及びＤ３９９Ｍ。Ｌ３５１における変異は、非制限的な例示としても、下記を含んでもよい：Ｌ３５１Ｅ、Ｌ３５１Ｇ、Ｌ３５１Ｒ、Ｌ３５１Ｙ、Ｌ３５１Ｔ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｗ、Ｌ３５１Ｖ、Ｌ３５１Ｐ及びＬ３５１Ｄ。Ｙ４０７における変異は、非制限的な例示としても、下記を含んでもよい：４０７Ｌ、Ｙ４０７Ｐ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｒ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｈ及びＹ４０７Ｆ。Ｋ４０９における変異は、非制限的な例示としても、下記を含んでもよい：Ｋ４０９Ｖ、Ｋ４０９Ｃ、Ｋ４０９Ｐ、Ｋ４０９Ａ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｑ、Ｋ４０９Ｒ、Ｋ４０９Ｔ、Ｋ４０９Ｓ、Ｋ４０９Ｍ、Ｋ４０９Ｙ及びＫ４０９Ｎ。
【００７５】
例示的な実施例において、Ｔ３６６及びＤ３９９における変異は、第１ポリペプチド上、すなわち、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおいてであり、Ｌ３５１、Ｙ４０７及びＫ４０９における変異は、第２ポリペプチド上、すなわち、第２重鎖のＣＨ３ドメインにおいてでもある。本発明は、それに明確に制限されるものではないが、そのような組み合わせは、良好な安定性及び結合活性を有した最適の自発的なヘテロダイマー形成を算出する。各ハーフマーは、その相補的なハーフマー「パートナー」または鎖に対して、強い引力を有し、自体に対しては強い反発力を有する。そして、ヘテロダイマー形成が非常に強く誘発され、ホモダイマー形成があまり強く誘発されない。十分に酸化可能な生理学的条件下の水溶液に、２個の構成ハーフマーのうち、ただ一つだけ存在する場合、存在する実際ポリペプチド型は、ハーフマー型、２個のハーフマーが非共有力によって結合され、折り畳まれていないホモダイマー型を含んでもよい。そのような溶液において、前記水溶液が相補的な「他の」ハーフマーのような前述のハーフマー以外のポリペプチドは、根本的に含まれない場合、ホモダイマー型である前記ポリペプチド型部分は、顕著に抑制される。言い方を変えれば、十分な量の還元剤を含む生理学的条件下において、第１ポリペプチド鎖または第２ポリペプチド鎖、及びそれに結合された認識モイエティ（ポリペプチド鎖に対する「同質の」認識モイエティ）のうち、ただ一つだけ水溶性媒体に導入される場合、そのようなポリペプチド鎖、及びその同質の認識モイエティは、ホモダイマーを形成する傾向がなく、溶液の他のポリペプチドは、根本的に含まれていない場合、水溶液内において、ハーフマーとして維持される傾向がある。水溶液におけるそのような導入は、例えば、宿主細胞における発現を含む。同様に、十分な量の還元剤を含む生理学的条件下において、２個のそのようなポリペプチド鎖と、その同質の認識モイエティとが水溶液に導入される場合、相応するヘテロダイマーだけではなく、その構成ハーフマーも、存在することができるが、ホモダイマー形成は、抑制される。還元剤の存在下において、ホモダイマー形成の比率は、一般的に、前記水溶液の他のポリペプチドが根本的に含まれていない場合、水溶液に存在する全体ポリペプチド型（ハーフマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、折り畳まれていない種など）の重量基準で、５０％未満である。例えば、還元剤の存在下において、前記第１ポリペプチド、前記第２ポリペプチド、認識モイエティに共有結合に結合された前記第１ポリペプチド、または認識モイエティに共有結合で連結された第２ポリペプチドによって形成されたホモダイマーの（重量）の比率は、５０％未満である。例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、またはそれ未満でもある。
【００７６】
特定実施例において、前記還元剤は、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システイン、システインヒドロクロリド、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、システインジチオトレイトール、ジチオールブチルアミン、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、及び／またはその組み合わせによって構成された群から選択される。一部実施例において、還元剤濃度は、タンパク質濃度に比べ、モル超過１〜１００倍（例えば、２０〜５０倍）である。一部実施例において、還元剤の濃度は、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭでもある。十分な量でも使用される代表的な還元剤は、ジチオトレイトール１ｍＭ以上、２−メルカプトエチルアミン５０ｍＭ以上及びシステイン５０ｍＭ以上を含む。一部実施例において、タンパク質酸化に先立ち、タンパク質とのインキュベーションに続いて、還元剤は、除去される。
【００７７】
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドは、共有結合または柔軟なリンカを介して、認識モイエティにも別途に連結され、前記認識モイエティは、以下に制限されるものではないが、抗原結合断片、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）、受容体認識リガンドまたはリガンド認識受容体を含む。共有結合は、外の電子殻を共有する二つ、またはそれ以上の原子間化学的連結を含む。そのような電子が飽和状態に至る場合、安定して形成される化学的構造は、共有結合と知られている。言い方を変えれば、共有結合は、互いに同一であるか、あるいは異なる元素からの原子間の電子対共有による相互作用を含む。本開示において、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとの共有結合は、以下に制限されるものではないが、１つのアミノ酸のアミノ基が他のアミノ酸のカルボキシ基と反応するときに合成される水（Ｈ２Ｏ）分子の放出を誘発するアナミド（ａｎａｍｉｄｏ）アミド結合、または１アミノ酸分子のアミノ基と相互作用する他の化合物、及びそのポリマーのエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基またはアルデヒド基によって合成されるアナミド結合またはアミド結合を含む。前記柔軟なリンカは、短いアミノ酸配列またはポリマーを含んでもよい。そのようなアミノ酸配列は、以下に制限されるものではないが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）を含む。
【００７８】
Ｔ３６６、Ｄ３９９、Ｌ３５１、Ｙ４０７及びＫ４０９における変異の他の組み合わせは、明らかに本発明の範囲内に属する。例えば、下記グループＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＩのａ）〜ｈ）からの組み合わせのうちいずれか一つである：
【００７９】
グループＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｗ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００８０】
グループＩＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｒ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｎ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｇ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｉ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ｔ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｑ；並びに
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｄ３９９Ａ及び前記第２ポリペプチド内Ｋ４０９Ｒ。
【００８１】
下記グループＩＩＩのａ）〜ｈ）、及びグループＩＶのａ）〜ｈ）からの組み合わせのうちいずれか一つである：
【００８２】
グループＩＩＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ及びＹ４０７Ｌ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ及びＹ４０７Ｌ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ及びＹ４０７Ａ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ及びＹ４０７Ｐ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｔ６６Ｗ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ及びＹ４０７Ｐ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ及びＹ４０７Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ及びＹ４０７Ｔ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｔ３６６Ｌ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ及びＹ４０７Ｈ。
【００８３】
グループＩＶ：
ａ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｖ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｃ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｐ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｓ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｆ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｑ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ｔ；並びに
ｈ）前記第１ポリペプチド内Ｋ４０９Ｒ及び前記第２ポリペプチド内Ｄ３９９Ａ。
【００８４】
グループＶのａ）〜ｈ）よる構成員のうちいずれか一つである：
グループＶ：
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｖ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＫ４０９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＫ４０９Ｐ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｎ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＤ３９９Ｇ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＫ４０９Ｓ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＤ３９９Ｉ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＫ４０９Ｆ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｖ及びＤ３９９Ｔ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＫ４０９Ｑ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＤ３９９Ａ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＫ４０９Ｒ。
【００８５】
グループＶＩのａ）〜ｈ）よる構成員のうちいずれか一つである：
グループＶＩ：
ａ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｖ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｒ；
ｂ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｃ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｇ、Ｙ４０７Ｌ及びＤ３９９Ｃ；
ｃ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｐ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａ及びＤ３９９Ｃ；
ｄ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｖ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｎ；
ｅ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｗ及びＫ４０９Ｓ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｄ、Ｙ４０７Ｐ及びＤ３９９Ｇ；
ｆ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｐ及びＫ４０９Ｆ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｐ、Ｙ４０７Ｆ及びＤ３９９Ｉ；
ｇ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｖ及びＫ４０９Ｑ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｋ、Ｙ４０７Ｔ及びＤ３９９Ｔ；そして
ｈ）前記第１ポリペプチド内のＴ３６６Ｌ及びＫ４０９Ｒ、並びに前記第２ポリペプチド内のＬ３５１Ｗ、Ｙ４０７Ｈ及びＤ３９９Ａ。
【００８６】
前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドは、それぞれ重鎖を含んでもよい。前記本発明のヘテロダイマー構造体は、二重特異性抗体を含んでもよいが、それに特別に制限されるものではない。例えば、前記ヘテロダイマー構造体は、１以上のｓｃＦｖ断片、１以上のＦａｂ断片、例えば、ｓｃＦｖ断片及びＦａｂ断片、または２個のＦａｂ断片を含んでもよい。前記ヘテロダイマーのポリペプチドの例示的な配列は、特別に制限されるものではないが、下記の配列番号のうち一つを含む：配列番号１６〜３１、配列番号３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４８，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６８，６９，７０及び７１。下記の配列番号のうち一つと、少なくとも７０％配列同一性を有する変異型配列も含まれる（生物学的活性は、維持する）：配列番号１６〜３１、配列番号３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４８，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６８，６９，７０及び７１。例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を有することができる。追加して、配列番号１６〜３１、配列番号３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４８，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６８，６９，７０及び７１のうちいずれか一つは、１以上の保存的置換を有するが、依然として、本開示の範囲内にある。
【００８７】
本開示の二重特異性ヘテロダイマー抗体は、第１重鎖と第２重鎖との１以上の二硫化結合を形成する。該二硫化結合は、同一細胞における発現中に形成されるか、あるいは生体外において、酸化剤追加による酸化反応を介しても形成される。そのような二硫化結合形成は、ハーフマーが発現されて精製され、還元剤追加によって還元され、共に混合されて酸化され、ヘテロダイマーを形成する実施例でなされる。
【００８８】
本発明のヘテロダイマーは、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦｃαＲＩ、Ｆｃα／μＲ及びＦｃＲｎのうち１に結合可能である。例示的な実施例において、該ヘテロダイマーは、ＦｃＲｎに対する結合力を維持することができる。本明細書において、ＦｃＲｎは、ＭＨＣクラスＩヘテロダイマー受容体ファミリーと構造的に相同であるということを示すが、非共有相互作用によって共に組み合わされるクラスＩ膜貫通重鎖（ｐ５１サブユニット、アルファ鎖）及び溶解性軽鎖（ｐ１４サブユニット、ベータ鎖）を含む。ＩｇＧ上のＦｃＲｎの結合部位は、ＣＨ２−ＣＨ３界面に位置する。最も重要なアミノ酸部位は、２５３、３１０及び４３５である。
【００８９】
それらの自然な構造により、本発明のヘテロダイマーは、（必ずしもその限りではないが）１以上の抗原に同時に標的する。例示的な実施例において、該抗原は、ＨＥＲ２、ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＯＰ２、ＣＤ３及び／またはＣＤ２０のうち一つを含む。しかし、本発明は、それに厳格に制限されるものではない。それは、本開示が、安定性、血清半減期、及び治療効果向上のための抗体／免疫グロブリン構造体の不変領域（ＣＨ３）の変形に係わるものであるからである。従って、本開示の根本的な技術は、ただ１つの標的抗原に結合する単一クローン抗体に適用される。それは、例えば、公知の治療抗体を含んでもよい。そのような抗体は、変形された不変領域を有することによる向上された安定性の利点を有する。そのような場合、前記第１ポリペプチド上及び前記第２ポリペプチド上（または、連結された）の認識モイエティは、同一に維持され、「半抗体」または「ハーフマー」の間の差は、  排他的に  ＣＨ３領域にあるもよい。
【００９０】
本開示の変形の利点を有する公知の治療単一クローン抗体は、下記のうち一つである非制限的な抗体を含んでもよい：３Ｆ８、８Ｈ９、３Ｆ８、８Ｈ９、アバゴボマブ、アブシキマブ、アビツズマブ、アブリルマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アデュカヌマブ、アファセビクマブ（Ａｆａｓｅｖｉｋｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブペゴル（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、ペンテト酸アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトックス、アネツマブラブタンシン（Ａｎｅｔｕｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、アニフロールマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ、アセリズマブ、アテゾリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、アベルマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベゲロマブ（Ｂｅｇｅｌｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブレセルマブ（Ｂｌｅｓｅｌｕｍａｂ）、ブリナツモマブ、ブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブロソズマブ、ボコシズマブ、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ、ブロスマブ、カビラリズマブ（Ｃａｂｉｒａｌｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カロツキシマブ（Ｃａｒｏｔｕｘｉｍａｂ）、カツマキソマブ、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫接合体、セデリズマブ、セルグツズマブアムナロイキン、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コドリツズマブ、コルツキシマブラブタンシン、コナツムマブ、コンシズマブ、ＣＲ６２６１、クレネズマブ、クロテドマブ、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブペゴル、ダラツムマブ、デクトレクマブ、デムシズマブ、デニンツズマブマホドチン、デノスマブ、デパツキシズマブマホドチン、デルロツキシマブビオチン、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ジリダブマブ（Ｄｉｒｉｄａｖｕｍａｂ）、ドマグロズマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、ドゥシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エミシズマブ、エナバツズマブ、エンフォルツマブベドチン、エンリモマブペゴル、エノブリツズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレ��ズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィバツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フィリブマブ、フランボツマブ、フレチクマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、イゴボマブ、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インデュサツマブベドチン、イネビリズマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ラムパリズマブ、ラナデルマブ、ランドグロズマブ、ラプリツキシマブエムタンシン、レブリキズマブ、レマレソマブ、レンダリズマブ、レンジルマブ、レルデリムマブ、レクサツムマブ、リビビルマブ、リファシツズマブベドチン、リゲリズマブ、リロトマブサテトラキセタン（Ｌｉｌｏｔｏｍａｂ  ｓａｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロキベトマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルリズマブペゴル、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、ＭＡＢｐ１、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マツズマブ、マブリリムマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミルベツキシマブソラブタンシン、ミツモマブ、モガムリズマブ、モナリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナラツキシマブエムタンシン、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ナビシキズマブ（Ｎａｖｉｃｉｘｉｚｕｍａｂ）、ナビブマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オピシヌマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パムレブルマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パソツキシズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピンツモマブ、プラクルマブ、プロザリズマブ、ポガリズマブ、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、プレザリズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、キリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラルパンシズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ、リサンキズマブ、リツキシマブ、リババズマブペゴル、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロバルピツズマブテシリン、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サシツズマブゴビテカン、サマリズマブ、サペリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブベドチン、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、タレクスツマブ、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ、テツロマブ、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、チガツズマブ、チルドラキズマブ、チモルマブ、チソツマブベドチン、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、ウトミルマブ、バダスツキシマブタリリン、バンドルツズマブベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ、バルリルマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボバリリズマブ、ボロシキマブ、ボルセツズマブマホドチン、ボツムマブ、キセンツズマブ（Ｘｅｎｔｕｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、ゾリモマブアリトクス、及びその組み合わせ。
【００９１】
該標的は、下記のうち一つである非制限的な標的を含んでもよい：β−アミロイド、４−１ＢＢ、５ＡＣ、５Ｔ４、α−フェト蛋白質、アンジオポエチン、ＡＯＣ３、Ｂ７−Ｈ３、ＢＡＦＦ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＭＹＣ、Ｃ２４２抗原、Ｃ５、ＣＡ−１２５、ＣＣＬ１１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ１２５、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１２７、ＣＤ１５、ＣＤ１５２、ＣＤ１４０、ＣＤ１９、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＦＤ、ＣＧＲＰ、ＣＬＤＮ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＤＫＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＲ５、ＥＧＦＬ７、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＡＰ、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ−８、ＧＰＮＭＢ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＧＦ、ＨＩＶ−１、ＨＳＰ９０、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＣＤ２２１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＨＥ、ＩＬ−１、ＩＬ２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−９、ＩＬ−１２ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ２３Ａ、インテグリン、ＩＴＧＡ２、ＩＧＴＢ２、ルイスＹ抗原、ＬＦＡ−１、ＬＯＸＬ２、ＬＴＡ、ＭＣＰ−１、ＭＩＦ、ＭＳ５Ａ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＳＬＮ、ミオスタチン、ＭＭＰ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、ＮＣＡ−９０、ＮＦＧ、ＮＯＧＯ−Ａ、Ｎｏｔｃｈ  １、ＮＲＰ１、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、Ｐ２Ｘ上科、ＰＣＳＫ９、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＲＡＮＫＬ、ＲＨＤ、ＲＯＮ、ＴＲＮ４、血清アルブミン、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＳＩＲＰα、ＳＯＳＴ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＳＴＥＡＰ１、ＴＡＧ−７２、ＴＥＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＦＰＩ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ上科、ＴＲＡＩＬ上科、Ｔｏｌｌ類似受容体、ＷＮＴ上科、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＷＦ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザＡ血球凝集素、狂犬病ウイルス、ＨＩＶウイルス、単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、及びその組み合わせ。
【００９２】
本開示のヘテロダイマー構造体は、本明細書に記載されたＣＨ３ドメイン内の特定５個のアミノ酸置換以外にも、１以上の置換、欠失、付加及び／または挿入を有することができる。例えば、抗原または細胞のような他のポリペプチドへの結合能が顕著に落ちていないのであるならば、特定アミノ酸は、タンパク質構造において、他のアミノ酸でも置換される。結合能及びタンパク質特性は、タンパク質の生物学的活性を決定するために、生物学的な機能または活性の著しい損失がなければ、タンパク質配列内において、特定アミノ酸配列置換がなされる。多くの場合、ポリペプチド変異体は、１以上の保存的置換を含む。
【００９３】
本開示のヘテロダイマー構造体は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または溶媒を含む薬学的組成物の形態でも提供される。前記組成物は、１以上の他の抗体または治療剤のようなさらなる薬学的活性成分を選択的に含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、例えば、他の免疫刺激剤、抗癌剤、抗ウイルス剤またはワクチンなどと共に、複合治療にも投与される。特定実施例において、該組成物は、ヘテロダイマーを、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬまたは２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。一部実施例において、前記ヘテロダイマーは、１ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
【００９４】
前記薬学的組成物は、任意数の賦形剤を含んでもよい。利用可能な賦形剤は、担体、表面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散剤または懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、保存剤、等張剤、及びその組み合わせを含む。適する賦形剤の選択及び利用は、参照により、その開示が本明細書に含まれたＧｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  Ｅｄ．  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）に記載されている。
【００９５】
望ましくは、薬学的組成物は、（例えば、注射または注入を介する）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊椎または表皮への投与に適する。投与経路により、活性化合物は、酸の活性化及び不活性化が可能な他の自然条件から保護するための物質にもコーティングされる。本明細書において、「非経口投与」は、腸及び局所への投与以外の、一般的に注射による投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄腔内、皮膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、器官経由、皮下、表皮下、皮膜下、関節内、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内への注射及び注入を含む。代案として、本発明に記載された抗体は、局所、表皮または粘膜の経路投与のような非経口経路にも投与される。例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所にも投与される。
【００９６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な塩の形態でもある。「薬学的に許容可能な塩」は、親化合物の望ましい生物学的活性を維持し、望ましくない毒性効果を伝達しない塩をを意味する。そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。該酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸のような無毒性無機酸に由来するものはもとより、脂肪族のモノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸のような無毒性有機酸に由来するものを含む。該塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムのようなアルカリ土類金属に由来するものはもとより、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインのような無毒性有機アミンに由来するものを含む。
【００９７】
薬学的に許容可能な組成物は、液体形態または固体形態でもある。必ずしもその限りではないが、一般的に、固体剤形は、単独または数回の服用のための投与以前、凍結乾燥されて溶液に投与される。そのような剤形は、極限気温またはｐＨに露出されないでこそ、熱による変性を防止することができる。そのために、本開示の抗体組成物は、生物学的に適切なｐＨ範囲内で剤形化されなければならない。保管時、適切なｐＨ範囲を維持するために、緩衝された溶液が一般的に必要であるが、剤形化及び投与の間、期間がさらに長い液体剤形の場合に特にそうである。一般的に、液体及び固体の剤形は、さらに長い期間の間、安定性を維持するために、低温（一般的に、２゜Ｃ〜８゜Ｃ）での保管が要求される。剤形化された抗体組成物、特に液体剤形は、保管時、タンパク質加水分解を予防したり最小化させたりするために、以下に制限されるものではないが、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン及び／またはプロピルパラベンを有効濃度（一般的に、＜１％ｗ／ｖ）で含む細菌発育阻止剤を含んでもよい。該細菌発育阻止剤は、一部患者には使用が禁止される。従って、凍結乾燥された剤形は、そのような成分を含んだり含まなかったりする溶液にも再構成される。以下に制限されるものではないが、凍結保護剤として（以下に制限されるものではないが、ソルビトール、マンニトール、グリセロール及びズルシトールのようなポリヒドロキシ炭化水素、及び／またはショ糖、乳糖、麦芽糖またはトレハロースのような二糖類を含む）、糖分のようなさらなる成分は、緩衝液体または固体抗体剤形にも投入され、（以下に制限されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌを含む）適切な塩が投入される。そのような抗体剤形、特に長期保管のために考案された液体剤形は、２℃〜８℃以上の温度での長期間安定性を促進させると共に、非経口注入に有用な剤形製造に有用な範囲の総浸透圧に依存するのである。例えば、必ずしもその限りではないが、総浸透圧の有効範囲（溶液中の総分子数）は、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌである。ショ糖またはソルビトールのような凍結保護剤の量は、溶液の総浸透圧が適切な範囲内において維持されるように、剤形内の塩量に依存するであろう。従って、塩非含有剤形は、約５％〜約２５％のショ糖を含んでもよいが、必ずしもその限りではない。
【００９８】
代案として、塩非含有ソルビトール系剤形は、約３％〜約１２％のソルビトールを含んでもよいが、必ずしもその限りではない。該塩非含有剤形は、有効浸透圧レベルを維持するために、それぞれの凍結保護剤の増大した範囲を保証するということは言うまでもない。そのような剤形は、（以下に制限されるものではないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及びＭｎＣｌ２を含む）二価陽イオン、及び（以下に制限されるものではないが、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０（登録商標））、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標））及びポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））、以下に制限されるものではないが、Ｂｒｉｊ  ５８（登録商標）及びＢｒｉｊ  ３５（登録商標）のようなポリオキシエチレンアルキルエーテル類、トリトンＸ−１００、トリトンＸ１１４、ＮＰ４０、スパン８５のようなその他類、及び非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）のプルロニックシリーズを含む）非３２イオン性を含んでもよい。該細菌発育阻止剤を含む任意の組み合わせは、本開示の抗体含有剤形にも有用に含まれる。本開示のヘテロダイマーは、また免疫グロブリン分子（例えば、ペギル化）の一般的な一部分ではない付加的な化学的モイエティを含む抗体である「化学的誘導体」でもある。そのようなモイエティは、塩基性分子の可溶性、半減寿命、吸水性などを向上させることができる。代案として、前記モイエティは、塩基性分子の望ましくない副作用を弱化させることができるか、あるいは塩基性分子の毒性を低減させることができる。本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液または分散液の形態でもある。本発明の薬学的組成物は、また高濃縮薬物濃度に適するマイクロエマルジョン、リポソーム、または他の整列された構造にも製剤化される。
【００９９】
本開示のヘテロダイマー構造体は、同時に、多重標的分子に結合可能であり、それにより、複合疾病の治療にさらに効果的である。本開示のヘテロダイマー構造体は、例えば、ウイルス性感染または細菌性感染、代謝性障害または自家免疫障害、あるいは癌またはその他細胞増殖性障害のような疾病または障害の治療を必要とする個体にも投与される。一部実施例において、該自家免疫疾患は、関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬、多発性硬化症（ＭＳ）、潰瘍性大腸カタル、クローン病、全身紅斑性ループス（ＳＬＥ）、糸球体腎炎、拡張型心筋病症類似疾病、シェーグレン症候群、アレルギー接触皮膚炎、多発筋肉炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、白班、インシュリン依存性糖尿病、ベーチェット症候群、慢性甲状腺炎、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。一部実施例において、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、マチャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。一部実施例において、前記腫瘍疾患及び細胞増殖性障害は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頚部扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆嚢癌、肝臓癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、前立腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黒色腫、及びその組み合わせのうち少なくとも一つを含む。
【０１００】
本開示は、さらには、本開示のヘテロダイマー構造体の１以上ポリペプチドをコーディングする１以上の核酸に係わるものである。前記１以上の核酸は、下記配列番号のうち一つをコーディングする：配列番号１６〜３１、配列番号３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４８，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６８，６９，７０及び７１。一部実施例において、前記１以上の核酸は、下記配列番号のうち一つを含む配列番号：３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７。下記配列番号のうち一つと、少なくとも７０％配列同一性を有する変異型配列も含まれる：配列番号３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４７，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２、及び配列番号６４〜６７。例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、またはそれ以上の配列同一性を有することができる。該変異体核酸配列は、コドン最適化されたものでもある。本明細書において、コドン最適化は、合成タンパク質のアミノ酸配列の変化なしに（または、最小限の変化だけある）、すなわち、同一突然変異として、遺伝子（例えば、変形されていない核酸対比の移植遺伝子）発現の増加または最大化のための核酸の生体外突然変異誘発を意味する。コドン最適化は、特に効率的な可溶性タンパク質発現を促進するものであり、タンパク質発現を１，０００倍まで上昇させることができる。変化されたコドンは、一般的に、宿主細胞解読システムによって使用されるものではない。
【０１０１】
本発明の範囲内において、核酸配列は、普通であるものから非常に厳格である条件下において、本開示の核酸または断片（または、相補的な配列）と混成化可能である。該混成化技術は、分子生物学分野において周知されている。例えば、テストのための適切な条件は、５×ＳＳＣ，０．５％  ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液での先洗浄、５×ＳＳＣ、５０℃〜６０℃での一晩混成化、０．１％  ＳＤＳ溶液を含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ及び０．２×ＳＳＣのそれぞれで、２０分間２回洗浄する段階を含む。代案として、適切な厳格混成化条件は、例えば、混成化温度が６０℃〜６５℃、または６５℃〜７０℃に上昇されたことを除いては、前述の条件を含む。
【０１０２】
本開示の核酸は、ベクターまたはベクター系にも含有される。該ベクターは、必ずしもその限りではないが、例えば、プラスミドでもある。他の明確に非制限的な組み換えベクターは、シャトルベクター及び発現ベクターを含む。一般的に、プラスミド構造体は、複製原点（例えば、ＣｏｌＥ１原点）及び選別マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性）を含んでもよい。該発現ベクターは、例えば、本開示によるヘテロダイマー構造体の発現に必要な制御配列または調節要素を含むベクターを含んでもよい。他の明確に非制限的な組み換えベクターは、当該技術分野で周知されており、例えば、λファージベクターのようなファージベクター、非複製アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ｐＳＶ・ｐＣＭＶシリーズのプラスミドベクター、牛痘ウイルスベクター及びレトロウイルスベクターのようなその他ウイルスベクター、バクロウイルスベクター、コスミド、人工染色体を含んでもよい。該ベクターは、哺乳類発現ベクターでもある。例えば、該ベクターは、哺乳類細胞内に形質導入され、安定した形質導入の場合、ＤＮＡは、同種組み換えを介して、遺伝体にも合わせられる。または代案として、細胞は、一時的に形質導入される。一般的に、最も操作に多用されるベクターは、複製原点、多重クローニング部位及び選別マーカーを有し、前述のような系を有するベクター（例えば、多重プラスミドのようなベクター系を含む）は、本発明の範囲に含まれると見られる。哺乳類発現ベクターのための一般的なプローモーターは、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０プローモーターを含む。ＥＦ−１プローモーターのような非ウイルス性プローモーターも、知られている。例示的なベクターは、ｐＣＤＮＡベクターから変形されたプラスミドベクターｐＸ０ＧＣを含む。
【０１０３】
本開示は、また本開示によるベクターまたはベクター系を含む宿主細胞に係わるものである。当業者は、異なる細胞種類は、異なるヘテロダイマー構造体結果物を算出することができ、結果物の治療薬効に影響を及ぼすということを理解するであろう。例えば、該宿主細胞は、（必ずしもその限りではないが、）下記の細胞種類を含んでもよい：ヒト胚芽腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、またはＨＥＫ２９３から変形されたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｅ及びＨＥＫ２９３Ｆ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはＣＨＯから変形されたＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＥｘｐｉＣＨＯ及び関連細胞株。当該技術分野において、その他細胞株は、ＮＳ０鼠腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６ヒト細胞、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、及びＥ．ｃｏｌｉのようなバクテリア細胞を含む。細胞非含有発現系は、例えば、転写／解読に必要な細胞成分を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物を基本に含む。真核細胞非含有系及び哺乳類細胞非含有系は、当該技術分野において周知されている。例えば、麦芽細胞非含有発現系、及びその開示が参照として本明細書に含まれたＢｒｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．  １２６１：  １２９−４０に記載されたものなどがある。一部組み換え抗体生産系は、収獲前に、宿主細胞の表面上に組み換え抗体を発現させ、他のものなどは、収集用培地に抗体を単純に放出する。そのような変形は、本開示の範囲内にあると意図される。
【０１０４】
本明細書において、用語「抗体（Ａｂ：ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、最も広い意味に使用され、具体的には、単一クローン抗体、多クローン抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体及び多重反応抗体）、及び抗体断片を含むが、それに制限されるものではない、任意の天然、あるいは部分的にまたは完全に合成された免疫グロブリンを含んでもよい。従って、本明細書内の任意文脈で使用される用語「抗体」は、任意の特異的結合構成員、免疫グロブリンクラス及び／またはイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、Ｉｇ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖または関連個体）、及び（ｓｃＦｖ）２を含むが、それらに制限されるものではない生物学的に関連した断片またはその特異的結合構成員を含むが、それらに制限されるものではない。
【０１０５】
本明細書において、用語「抗体断片」は、本明細書で検討されたように、公知の技術を介して得た抗体断片、及び当業者が得ることができるものを含んでもよい。そのために、前述の「抗体」の定義に加え、用語「抗体」は、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域のような完全な抗体の一部分を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質をさらに含んでもよい。そのような抗体は、天然資源に由来したり、部分的にまたは全体的に、合成によって生産されたりもする。該抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；二重体及び線形抗体があるが、それらに制限されるものではない。
【０１０６】
本明細書において、用語「抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」または「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲｓ（例えば、自然殺（ＮＫ：ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞、好中球及び大食細胞）を発現する（例えば、非特異的）細胞毒性細胞が、標的細胞上の接合抗体を認識し、次に、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現し、単核球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【０１０７】
本明細書において、用語「二重特異性抗体」は、単一抗原上、または２個の異なる抗原上の２個の異なる抗原決定基に結合可能な抗体を意味する。該抗原決定基は、連続アミノ酸（線形抗原決定基）またはタンパク質の三次フォールディングによって並べておかれた非連続アミノ酸（配座抗原決定基（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ））からも形成される。連続アミノ酸から形成された抗原決定基は、一般的に、溶媒変性に露出されたまま維持され、三次フォールディングによって形成された抗原決定基は、一般的に、溶媒変性を伴い、治療時に失うことになる。該抗原決定基は、一般的に、独特の空間配座を有する少なくとも一般的に３個以上、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。本開示の二重特異性抗体は、二価、三価または四価でもある。本明細書において、「−価の」、「−街」、「−街（複数）」、またはその他文法的な変形は、抗体分子内における抗原結合部位の数を意味する。そのような抗原認識部位は、同一抗原決定基または異なる抗原決定基を認識することができる。
【０１０８】
本明細書において、用語「担体」は、採用された服用量及び濃度で、それに露出された細胞、または哺乳類に非毒性である薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を含んでもよい。薬学的に許容可能な担体は、一般的に、水溶性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容可能な担体の例は、以下に制限されるものではないが、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他有機酸のような緩衝液；以下に制限されるものではないが、アスコルビン酸を含む抗酸化剤；（約１０残基未満）低分子量ポリペプチド；以下に制限されるものではないが、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；以下に制限されるものではないが、ポリビニルピロリジンのような親水性ポリマー；以下に制限されるものではないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；以下に制限されるものではないが、グルコース、マンノ−オスまたはデキストリンのような単糖類、二糖類、及びその他炭水化物類；以下に制限されるものではないが、ＥＤＴＡのようなキレート試薬；以下に制限されるものではないが、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；以下に制限されるものではないが、ナトリウムのような塩形成相対イオン；及び／または以下に制限されるものではないが、ＴＷＥＥＮ．のような非イオン性界面活性剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びプルロニックを含む。そのような成分の任意組み合わせは、細菌発育阻止剤を含んでもよく、本開示の剤形を充填するのに有用でもある。
【０１０９】
本明細書において、用語「保存的配列変形」または「保存的置換」は、本発明のヘテロダイマー免疫グロブリン構造体の結合特性に、有意に影響を及ぼしたり変化させたりしない標的抗原決定基、または本発明の抗体、及びその抗原結合部分のアミノ酸変形を意味する。そのような保存的変形は、アミノ酸の置換、付加及び欠失を含む。該変形は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような公知の標準技術を利用し、本発明の抗体に導入することができる。該保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基で代替されるものである。そのような置換は、一般的に、疎水性度、親水性度、電荷、大きさのようなアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づくものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。そのようなファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【０１１０】
本明細書において、用語「細胞外ドメイン」または「膜受容体の細胞外ドメイン」は、相応する抗原またはリガンドを認識してそれに結合し、細胞表面上の膜貫通ドメインの受容体に固定し、細胞内キナーゼ活性関連細胞内ドメインまたは信号伝達経路と係わる細胞外領域を含む分子認識配列を意味する。リガンドは、膜受容体の細胞外ドメインによって認識して結合するタンパク質、小さいペプチドまたは化合物を意味する。免疫原性、類似分裂促進のような刺激剤は、多様な細胞が、低分子量可溶性タンパク質を生産するように誘導することができる。先天免疫及び適応性免疫、造血作用、細胞成長、ＡＰＳＣ多能性細胞を調節し、損傷された組織を復旧する。サトカインは、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍懐死因子上科、コロニー刺激因子、ケモカイン、成長因子にも分類される。タンパク質発現タグは、標的タンパク質のＮ−末端またはＣ−末端に付加されたアミノ酸配列を意味し、小さいペプチドまたは長いアミノ酸でもある。タグの追加は、タンパク質の正確なフォールディングを促進することができ、タンパク質の分離及び精製にも使用される。それは、細胞において、タンパク質の分解低減に有用である。以下に制限されるものではないが、一般的に使用されるタグは、ＨＡ、ＳＵＭＯ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＧＦＰ及びＦｌａｇを含む。
【０１１１】
本明細書において、用語「Ｆａｂ断片」は、抗原結合断片（Ｆａｂ）の断片である認識モイエティを意味し、それは、統合された軽鎖、並びに重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む抗体分子の両アームと同一である。
【０１１２】
本明細書において、用語「Ｆｃ」は、ＣＨ２及びＣＨ３の不変ドメインで構成され、エフェクタの分子または細胞、例えば、Ｆｃ受容体と相互作用する免疫グロブリンの相互作用領域である「結晶質断片」領域を意味する。
【０１１３】
本明細書において、用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、Ｆｃ領域（例えば、抗体または抗体断片のＦｃ領域）に結合する受容体の記述に使用される。該用語は、母体ＩｇＧを胎児に伝達する新生児受容体であるＦｃＲｎを含む。その他のＦｃ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦｃαＲＩ及びＦｃα／μＲのうち任意の一つを含む。
【０１１４】
本明細書で使用された用語「相同性」は、２つの組成物間で共有された構造の存在を意味する。タンパク質と係わって用語「相同性」は、２以上のアミノ酸間及び／またはペプチド配列間の（例えば、百分率で表示される）重畳量を意味する。核酸と係わって用語「相同性」は、２以上の核酸配列間（例えば、百分率で表示される）の重畳量を意味する。本明細書において、２個の配列間の百分率（％）相同性は、２個の配列間の百分率同一性に相応する。２個の配列間の百分率同一性は、配列によって共有される同一位置数の関数であり（％相同性＝同一位置数／総位置数×１００）、前記２個配列の最適整列のために導入する必要があるギャップ数、及び各ギャップの長さを考慮する。配列の比較、及び２個の配列間の百分率同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用しても得られる。そのような相同性は、配列対整列方法、多重配列整列方法、構造整列方法及び／または系統発生分析方法を含む整列ツール及び／またはアルゴリズムを介して、当該技術分野に広く公知されている。保存的置換において配列が異なる場合、百分率配列同一性は、置換の保守的性質を矯正するために、上向き調整されるが、必ずしもその限りではない。そのような調整を行うための手段は、当該技術分野において周知されている。一般的に、必ずしもその限りではないが、それは、完全な不一致ではなく、部分的なものとして、保存的置換をスコアリングすることにより、百分率配列同一性を向上させることを含む。従って、例えば、同一アミノ酸に１点を付与し、非保存的置換に０点を付与した場合、保存的置換に０と１との間の点数が付与される。
【０１１５】
本明細書において、用語「免疫グロブリン」は、４５０〜５５０のアミノ酸残基のさらに長い配列を含み、５５，０００〜７０，０００Ｄａのさらに高い相対分子量を有する２個の重鎖、及び約２１０アミノ酸残基のさらに短い配列を含み、約２４，０００Ｄａのさらに小さい相対分子量を有する２個の軽鎖（Ｌ鎖）を含む４個のポリペプチド鎖を有する対称構造を意味する。可変領域（Ｖ領域：ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と知られた異なる免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の１１０アミノ酸配列の終端側のＮ−末端と、不変領域（Ｃ領域：ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）と知られた比較的不変のＣ−末端に近い残余アミノ酸配列との間には、大きい差がある。重鎖の可変領域は、全体重鎖配列の約１／４を占め、重鎖の不変領域は、全体重鎖配列の約３／４を占める。ＩｇＧは、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれるＨ鎖を有する３個の不変領域を有する。該不変領域は、免疫グロブリン分子及び免疫反応を活性化させる部位のうち１つの骨格である。本発明において、該不変領域は、第１ポリペプチドが第２ポリペプチドと相互作用する領域と係わり、前記領域は、ＣＨ３ドメインに位置したアミノ酸を含む。そのようなアミノ酸は、以下に制限されるものではないが、以下のものを含む：グルタミン３４７、チロシン３４９、トレオニン３５０、ロイシン３５１、セリン３５４、アルギニン３５５、アスパラギン酸３５６、グルタミン酸３５７、リシン３６０、セリン３６４、トレオニン３６６、ロイシン３６８、リシン３７０、アスパラギン３９０、リシン３９２、トレオニン３９４、プロリン３９５、バリン３９７、アスパラギン酸３９９、セリン４００、フェニルアラニン４０５、チロシン４０７、リシン４０９及びリシン４３９。
【０１１６】
本明細書において、用語「精製された」または「分離され」抗体、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、自然に結合された他のタンパク質、脂質及び核酸から分離されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。前記ポリペプチド／タンパク質は、精製された製剤の乾燥重量を基準に、少なくとも１０％（すなわち、１０％〜１００％の任意百分率、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％）を構成することができる。純度は、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析のような任意の適切な標準方法によっても測定される。
【０１１７】
本明細書において、用語「ｓｃＦｖ」は、単一鎖可変断片を意味する。該ｓｃＦｖは、リンカペプチドに連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質を言う。前記リンカペプチドは、約５〜４０長のアミノ酸、約１０〜３０長のアミノ酸、または約５，１０，１５，２０，２５，３０，３５または４０長のアミノ酸に由来する。例示的なリンカは、次の通りである：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７２）。
【０１１８】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合」及び「特異的に結合」は、他の抗原ではなく、選定された抗原上の抗原決定基への抗体結合を意味し、一般的に、抗体は、選定された抗原、例えば、Ｈｅｒ２，ＰＤ−Ｌ１，Ｔｒｏｐ２，ＣＤ３及び／またはＣＤ２０上の抗原決定基を分析物として、かつ前記抗体をリガンドとして使用するビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））２０００機器による平衡透析、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術抗原陽性細胞に対する抗体の結合に係わるスキャッチャード分析によって決定するとき、該抗体は、約１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、またはそれより以下のような約１０−６Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、選定された抗原または密接した関連抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対する親和度より、少なくとも２倍さらに大きい親和度で選定された抗原に結合する。
【０１１９】
本明細書において、用語「個体」または「患者」は、治療が行われる生物学的系を意味する。生物学的系は、例えば、個別細胞、細胞体系（例えば、細胞培養物）、器官、組織または多細胞有機物を含んでもよい。本発明の個体は、鳥類、爬虫類、哺乳類などを含んでもよい。望ましくは、哺乳類は、齧歯類及びヒトを含む霊長類を含む。
【０１２０】
本明細書において、用語「治療する」または疾病の「治療」は、疾病の症状または徴候を軽減させるために、薬物を１以上の（ヒトまたはそれ以外）患者に投与する段階を含むプロトコル実行を意味する。該軽減は、疾病の症状または徴候の発生前や発生時に行われる。そのために、「治療する」または「治療」は、疾病の「予防すること」または「予防」を含む。それに加え、「治療する」または「治療」は、症状または徴候の完全な軽減を要求せず、治癒を要求せず、特異的に患者に小さい影響を有するプロトコルを含む。
【０１２１】
本明細書において、用語「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸変形（例えば、置換、挿入または欠失）により、重鎖サブユニット配列が異なるヘテロダイマー変異体を含む、天然配列Ｆｃ領域（その一部分）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。例示的な本開示のアミノ酸変形は、ＣＨ３領域内のＴ３６６Ｌ、Ｄ３９９Ｒ、Ｌ３５１Ｅ、Ｙ４０７Ｌ及び／またはＫ４０９Ｖを含む。
【０１２２】
本明細書及び添付される特許請求の範囲において、単数形態の「ある（ａ）」、「及び」並びに「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に言及されない限り、複数形態も含む。
【０１２３】
用語「およそ」は、当業者により、基底数値から実質的に異なると見られない数値の範囲を意味する。例えば、用語「およそ」は、言及された数値の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内の数値はもとより、文脈で定義する言及された数値の間にある数値も意味する。
【０１２４】
本明細書において、用語「結合構成員」は、例えば、Ｆｃ受容体のような標的に特異的に結合するタンパク質または（抗体またはその断片のような）タンパク質複合体、小分子のような作用剤を意味する。Ｆｃ受容体結合構成員は、Ｆｃ受容体に特異的に結合する作用剤を意味する。用語「特異的結合」、「特異的に結合」などは、溶液内または反応混合物内の他の分子またはモイエティに比べ、優先的に分子に結合するものを意味する。一部実施例において、結合構成員と、それに特異的に結合する標的との親和性は、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ以下のような１０−６Ｍ以下のＫｄ（解離定数）で特徴づけられる。
【０１２５】
本明細書において、用語「認識モイエティ」は、高レベルの選択性でもって、標的分子（例えば、抗原、リガンド、受容体、基質）と特異的に相互作用する作用剤の領域を意味する。代表的な認識モイエティは、抗体の可変領域、抗体可変領域の構造変異体、受容体の結合ドメイン、リガンドの結合ドメイン、または酵素の結合ドメインを含む。本開示において、認識モイエティは、それに結合された鎖に係わる同質認識モイエティと確認される。該結合は、文脈及び周辺内容により、自然のこととして、共有性または非共有性でもある。例えば、本開示の二重特異性ヘテロダイマー抗体は、各鎖に共有結合で連結された認識モイエティを有し、そのような二重特異性抗体のハーフマーは、十分な還元条件下において、少なくとも部分的に構成鎖と非共有的にも結合される。
【０１２６】
本明細書において、用語「生理学的条件」または「生理学的条件（複数）」は、一部変数（例えば、温度）が、生きている有機物において、観察可能な一般的な範囲外にもあが、本開示の二重特異性ヘテロダイマー抗体の一部作用は、支援する有機物、細胞系または条件が自然に発生しうる周辺環境の条件または条件（複数）を意味する。該生理学的条件の非制限的な例は、哺乳類細胞のような細胞で発見される温度、イオン強度、ｐＨ及びイオン濃度（例えば、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋）である。約２゜Ｃ〜４０゜Ｃ（例えば、２０゜Ｃ〜４０゜Ｃ）の温度範囲、約１大気圧、約６〜８のｐＨ、約１〜２０ｍＭのグルコース濃度、大体の大気酸素濃度、及び地球重力が生理学的条件である。本明細書において、用語は、条件特定において、他の具体的制限事項とも組み合わされる。そのような場合、該用語は、特定される条件の文脈内において、適切に解釈されなければならない。例えば、記載された水溶液が、２゜Ｃ〜４゜Ｃのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）内の１ｍＭジチオトレイトールのように、１ｍＭジチオトレイトールを含む生理学的条件、及び十分な還元条件下にあるならば、該溶液が、全体的に、言葉通り、還元剤存在下でも抗体作用を支援するという意味ではなく、ジチオトレイトールを除いては、溶液内の残り要素または変数が支援する範囲内であると考慮される。
【０１２７】
本明細書において、用語「根本的に非含有」は、当業者に公知のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、（キラルＨＰＬＣ、キラルＨＰＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳなどを含む）ＨＰＬＣ、薄層クロマトグラフィ、質量分析法、偏光測定法、気体クロマトグラフィ質量分析法のような一般的な検出方法及びプロトコルでも検出が不可能なポリペプチドのような特定成分のレベルを意味する。
【０１２８】
本開示に公開された刊行物は、本開示出願日以前に発表されたものである。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような出版物に先駆けている資格がないということを認めると解釈されるものではない。また、提供される刊行物の日付は、実際の公開日付と異なりもし、それは、独自的に確認されるものである。
【０１２９】
本文に引用された各出願及び特許だけではなく、前述の出願及び特許それぞれに引用された各文献または参照文献、特許または非特許文献（それぞれ発行された特許の審査中、「出願引用文献」を含む）、それら出願及び特許のうちいずれか一つに相応し、かつ／または優先権を主張するＰＣＴ及び海外出願または特許、並びにそれぞれの出願引用文献に引用されたり参照されたりする文献のそれぞれは、本明細書に、その開示が参照として明示的に含まれる。さらに一般的には、文書または参照文献は、本明細書において、特許請求の範囲の前に、参照リストまたは本文自体に引用され、それらそれぞれの文書または参照文献（「本明細書に引用された参照文献」）だけではなく、（製造業体の仕様、指針などを含む）本明細書に引用された参照文献に引用された文書または参照文献は、その開示が参照として本明細書に明示的に含まれる。
【０１３０】
下記非制限的な実施例でもって、本開示を追加して説明する。
【実施例】
【０１３１】
実施例１．ヘテロダイマースクリーニングのための変異部位
ヘテロダイマー化を促進するために、ＩｇＧ１重鎖領域のＣＨ３ドメインに、変異が導入された。２個のＩｇＧ１同種ＣＨ３ドメイン（以下、ＣＨ３−Ａ及びＣＨ３−Ｂと表記する）間の相互作用において、最も重要なアミノ酸は、その開示が参照として本明細書に含まれたＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１０，  ２８５：  １９６３７−１９６４６に記載されている。タンパク質データバンク（ＰＤＢ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）から、２７抗体配列を検索し、接触基準方法による基準により、アミノ酸を選択した。界面残基は、残基の側鎖重原子が、第２鎖の任意残基重原子から、距離が４．５Å以内に制限的に位置すると定義される。
【０１３２】
ＣＨ３界面内アミノ酸は、付加して、アラニン変異スクリーニングされ、解離の自由エネルギー変化及びグアニジンヒドロクロリド変性によるアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）は、野生型と比べ、エネルギーに最も多く影響を及ぼしたアミノ酸を選別するために検出された。その結果、Ｔｈｒ３６６，Ｌｅｕ３６８，Ｐｈｅ４０５，Ｔｙｒ４０７，Ｌｙｓ４０９内変異は、２ｋｃａｌ／モル超過の自由エネルギー変化を誘発した。また、その開示が参照として本明細書に含まれたＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８  Ｊｕｎ  ３０；  ３７（２６）：  ９２６６−７３を参照されたい。界面でのアミノ酸の距離は、さらに、Ｐｙｍｏｌ及びＤＳソフトウェアで分析した。表１は、その結果を示す。界面間の水素結合は、イタリック体及び下線で表示されている。界面でのアミノ酸の距離、及びアラニン変異スキャニング結果に基づいて、ヘテロダイマー形成を促進する下記変異部位が選別された：前記第１ポリペプチド／ＣＨ３ドメイン内のＴｈｒ３６６、Ａｓｐ３９９、及び前記第２ポリペプチド／ＣＨ３ドメイン内のＬｅｕ３５１、Ｔｙｒ４０７、及びＬｙｓ４０９．
【０１３３】
【表１】
2019535650.tif 000002
【０１３４】
実施例２．Ｆｃヘテロダイマーに対する真核細胞ディスプレイライブラリー構築
２．１．Ｆｃヘテロダイマーに対するディスプレイベクター構築
ＦｃヘテロダイマーのディスプレイベクターｐＤｉｓ３は、ディスプレイベクターｐＤｉｓｐｌａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ６６０２０）から変形された。ＰＤＧＦＲ遺伝子及びそのｍｙｃ遺伝子は、ＮｏｔＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ−０１８９Ｓ）／ＳｆｉＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ−０１２３Ｓ）消化によって欠失された。ｐＤｉｓｐｌａｙベクターのプラスミドを、下記プライマーを使用して増幅し、多重クローニング部位（ＭＣＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を作った：ＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴ（配列番号１）及びＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ（配列番号２）。そのようなプライマーは、それぞれＮｏｔＩ／ＳｆｉＩ制限部位を有する。ＭＣＳは、ＮｏｔＩ／ＳｆｉＩ制限部位によって切断され、前述の消化されたベクターに挿入された。中間結果物であるｐＤｉｓｖｅｃｔｏｒをその結果として得た。
【０１３５】
ｐＤｉｓ内Ｆ１  ｏｒｉ遺伝子は、欠失され、Ｏｒｉｐは、下記方法によって挿入された。Ｏｒｉｐ遺伝子は、ｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｖｅｔｏｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５７４１０８）から、ＳｓｐＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ１０３２Ｓ）制限部位を含む下記プライマーを使用して増幅された：５’−ＡＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣ（配列番号３）、５’−ＣＡＧＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴ（配列番号４）。その後、Ｏｒｉｐ遺伝子は、Ｓｓｐによって切断され、Ｓｓｐ消化されたｐＤｉｓベクターに結紮された。その結果、ｐＤｉｓ１ベクターを得た。その後、新耐性（ｎｅｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子は、ＡｖｒＩＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１７４Ｓ）消化により、ｐＤｉｓ１ベクターで欠失された。ＡｖｒＩＩ制限部位を追加するために、下記プライマーを使用し、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ０４４５０）の増幅により、ハイグロ耐性遺伝子が挿入された：上流プライマー５’−ＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＴＡＧＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧ（配列番号５）、５’−ＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡ（配列番号６）。消化後、ハイグロ遺伝子をｐＤｉｓ１ベクターに挿入し、ｐＤｉｓ２ベクターを得た。
【０１３６】
ＤＮＡ配列（配列番号７）が中国ＧＥＮＥＷＩＺによって合成された。該配列は、左側から右側に、ＳＵＭＯ遺伝子（ＣｈａｍｐｉｏｎＴＭ  ｐＥＴ  ＳＵＭＯベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ３０００１）、ヒトＦｃ遺伝子（以下、ＣＨ３−Ａドメインを含むＦｃ１と称する）、牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化信号、（ｐディスプレイベクターからの）信号ペプチド遺伝子、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）遺伝子（９８番〜１０６番のアミノ酸からのジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）：ＮＣ＿００７３６２．１）及びヒトＦｃ遺伝子（以下、ＣＨ３−Ｂドメインを含むＦｃ２と称する）を含む。２個の酵素制限部位Ｓｆｉ及びＰｓｔは、全体遺伝子配列の正反対に位置する。Ｆｃ配列、ＳＵＭＯ配列及びＨＡ配列は、哺乳類コドン偏向によって最適化された。Ｆｃ１ドメインは、ＢｇＩＩＩ／ＳａｃＩＩ制限部位を有し、Ｆｃ２ドメインは、ＢｓｒＧ／ＳａＩＩ制限部位を有する。使用された酵素制限部位は、Ｆｃアミノ酸配列を変化させない。ＤＮＡ配列及びｐＤｉｓ２は、Ｓｆｉ／Ｐｓｔを使用して消化され、ｐＤｉｓ２に結紮された。その結果、図１に示されているように、ベクターｐＤｉｓ３を得た。
【０１３７】
２．２．ヘテロダイマーＦｃライブラリーの構築
ｐＵＣ５７−ＴＣＺＨＣ（ＧＥＮＥＷＩＺ、中国）は、自然ヒトＦｃ配列を含む。Ｆｃ１のアミノ酸位置３６６及び３９９を、２０種の異なる自然アミノ酸で任意的に変異させ、コドンＮＮＳを縮重させる（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）縮重プライマーを使用し、ｐＵＣ５７−ＴＣＺＨＣを、増幅を介して、第１部位特異的任意のＦｃ配列を製造した。上流プライマーは、ＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＮＮＳＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣ（配列番号８）であり、下流プライマーは、ＧＴＣＣＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＳＮＮＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＴＴ（配列番号９）である。
【０１３８】
第２Ｆｃ遺伝子は、下記プライマーを使用し、ｐＵＣ５７−ＴＣＺＨＣから増幅された：上流プライマーＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣ（配列番号１０）及び下流プライマーＣＧＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴ（配列番号１１）。
【０１３９】
部位特異的任意のＦｃ１断片は、下記プライマーを使用し、重畳延長によって共にスプライスされた：５’−ＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡ（配列番号１２）及び５’−ＣＧＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＣＴ（配列番号１３）。
【０１４０】
Ｆｃ１断片は、ＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ、ＣａｔＮｏ．Ｒ０１４４Ｓ）及びＳａｃＩＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１５７Ｓ）の制限部位において、ｐＤｉｓ３ベクターにサブクローンされた。脱塩構造体は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ電気穿孔装置を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０菌株に形質転換された。
【０１４１】
形質転換体は、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む選択的寒天培地に直接プレーティングされた。変異されたライブラリーサイズは、コロニー数によって計算された。２０コロニーが任意に選択され、ＤＮＡシーケンシングによる挿入多様性を確認した。Ｆｃ１部位特異的任意の変異ライブラリーは、反復電気穿孔による１０５量に達するまで構造化された。
【０１４２】
Ｆｃ１部位特異的任意の変異ライブラリー抽出に、プラスミド抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２７１０６）を使用する。該ライブラリーは、Ｆｃ１＋Ｆｃ２部位特異的任意の変異ライブラリー構築のためのテンプレートとして使用する。部位特異的任意のＦｃ２断片は、ＢｓｒＧＩ制限部位及びＳａｌ制限部位の５’及び３’それぞれを追加するために、Ｆｃ１ライブラリー内において、縮重プライマーを使用してクローンされた：５’−ＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＣＣＮＮＳＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧ（配列番号１４）及び５’−ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＧＳＮＮＧＧＡＳＮＮＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴ（配列番号１５）。
【０１４３】
該プライマーには、ＢｓｒＧＩ部位及びＳａｌＩ部位があり、該方法は、ＮＮＳコドンを使用し、３５１，４０７及び４０９部位のＦｃに２０アミノ酸を導入する。Ｆｃ２断片、及び（ＢｓｒＧＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ３５７５Ｌ）消化及びＳａｌ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ３１３８Ｌ）消化による）線形化されたＦｃ２ベクターは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ電気穿孔装置を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０菌株に共形質転換された。
【０１４４】
該形質転換体は、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む選択的寒天培地に直接プレーティングされた。Ｆｃ１＋Ｆｃ２部位特異的任意の変異ライブラリーは、反復電気穿孔による３×１０８量に達するまで構造化された。ヘテロダイマーＦｃライブラリー構築過程は、図２に示されている。Ｆｃ１＋Ｆｃ２ライブラリーのプラスミドは、選択的寒天培地からの個別コロニー任意選別を介して、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｌｕｓ  ９６  ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１８１）を使用して抽出された。
【０１４５】
精製されたプラスミドは、９６ウェルプレートで、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ  Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９００７）に形質導入された。形質導入前日、２９３−Ｆ細胞は、サブ培養され、一晩育つように拡張された。形質導入日、細胞が遠心分離によって収集され、新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３３８００１）で、２００×１０５生細胞／ｍＬの最終密度で再懸濁された。プラスミド（最終濃度３６．６７μｇ／ｍＬ）は、ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、最終濃度５５μｇ／ｍＬ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３８９６）を使用し、定められたモル比で、一時的に共形質導入され、３７℃で１時間、混合及びインキュベーションされた。新鮮な培地は、形質導入体積１９倍に付加され、続けてインキュベーションされた。細胞培養上澄み液は、形質導入後、５〜６日目に収獲された。
【０１４６】
図３から分かるように、２個の異なるタグを有するヘテロダイマーＦｃ上澄み液において、５種の構造を有する。ヘテロダイマーは、ＥＬＩＳＡによって検出された。簡潔に言って、９６ウェルプレートを、ｐＨ９．６炭酸塩緩衝液において、抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１８１１８１）でコーティングし、ＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ−３５６３）で洗浄した。プレート表面上の任意非特異的結合部位は、５％脱脂乳を含むＰＢＳＴによって遮断された。前記プレートは、ＰＢＳＴで洗浄した。上澄み液を、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈し、プレートに付加した。その後、２５℃で１時間インキュベーションした。アンバウンド（ｕｎｂｏｕｎｄ）サンプルを除去するために、該プレートをＰＢＳＴで洗浄した。抗ＳＵＭＯ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１７９９０７）ラベリングされたビオチンを、５％脱脂乳を含むＰＢＳＴで希釈し、プレートに付加した。その後、２５℃で１時間インキュベーションした。前記プレートは、ＰＢＳＴで洗浄した。その後、二次抗体、ストレプトマイシンアビジンラベリングされたホースラディッシュ過酸化酵素（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５９６５３）を、５％脱脂乳を含むＰＢＳＴで希釈し、プレートに付加した。その後、２５℃で１時間インキュベーションした。前記プレートは、ＰＢＳＴで洗浄した。酵素による色相変化を観察するために、１０分間、ＴＭＢ（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５２１４）を付加した。１Ｍ着色を中止するために、Ｈ２ＳＯ４を付加した。マイクロプレート読取り機で、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１４７】
最も高いＯＤ数値を有する２０個のクローンを、各スクリーニングラウンドにおいて選別し、相応する細胞を９６ウェルプレートで拡張させた。タンパク質−Ａアガロースクロマトグラフィ（ＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡ０４２２−Ｓ１）を使用し、培養上澄み液からタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。最も高いヘテロダイマー化収率を有するクローンを得て、多回のラウンドスクリーニング後、ＤＮＡシーケンシングを介して確認した。結果は、下記表２の通りである：陽性クローンのアミノ酸配列は、配列番号１６〜３１に示された通りである。
【０１４８】
【表２】
2019535650.tif 000003
【０１４９】
実施例３．ヘテロダイマー抗体発現のためのベクター構築
抗ＨＥＲ２抗体の重鎖及び軽鎖をコーディングするＸ０ＧＣ発現ベクターが構築された。抗体可変領域配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２で得た。使用した重鎖の不変ドメインは、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ１）であった。可変軽鎖（ＶＬ）をコーディングする核酸配列は、配列番号３２であり、アミノ酸配列は、配列番号３３であった。軽鎖の不変ドメイン（ＣＬ）をコーディングする核酸配列は、配列番号３４であり、アミノ酸配列は、配列番号３５であった。可変重鎖（ＶＨ）をコーディングする核酸配列は、配列番号３６であり、アミノ酸配列は、配列番号３７であった。不変重鎖（ＣＨ）をコーディングする核酸配列は、配列番号３８であり、アミノ酸配列は、配列番号３９であった。
【０１５０】
下記のような重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を介して、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨは、増幅された。反応系は、Ｈ２Ｏ  ８．９μＬ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ重合酵素緩衝液４μｌ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ４μＬ、上流プライマー１μＬ、下流プライマー１μＬ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ重合酵素（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ−５３０Ｌ）０．１μＬ及びテンプレート１μＬであった。１．５％アガロースゲル電気泳動で、可変断片及び不変断片のＰＣＲ結果物を分離し、ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ９２８２）を使用して回収した。可変断片の上流プライマー、及び不変断片の下流プライマーと共に回収した可変断片及び不変断片をテンプレートにし、次ラウンドのＰＣＲを行った。軽鎖または重鎖の完全な長さの断片を回収以後に得た。断片及びＸ０ＧＣベクターは、同一のｃｏＲＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ３１０１Ｌ）制限部位／ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ３１０４Ｌ）制限部位を使用し、それぞれ消化及び連結した。該消化系は、１０×反応緩衝液３２μＬ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ  ０．５μＬ、再生断片３μＬ、Ｈ２Ｏ  １４．５μＬであった。反応は、３７℃で３時間行われた。ライゲーション系は、１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液２μＬ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０２Ｖ）０．５μＬ、再生断片３μＬ、再生ベクター３μＬ、Ｈ２Ｏ  １１．５μＬであった。該反応は、常温で１２時間行われた。該構造体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α菌株（ＴＩＡＮＧＥＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＢ１０４、中国）内に形質転換され、真核細胞内における発現のために、プラスミドは、抗体の重鎖（Ｆｃ１）または軽鎖と共に生成された。
【０１５１】
Ｘ０ＧＣ発現ベクターは、抗ＨＥＲ２抗体の重鎖をコーディングするように構築された。不変重鎖領域内の配列は、ＩｇＧ１（Ｆｃ２）（配列番号４０）であった。アミノ酸配列は、配列番号４１であった。抗体の重鎖発現プラスミドは、真核細胞において、抗体の重鎖（Ｆｃ２）発現に使用した。
【０１５２】
Ｘ０ＧＣ発現ベクターは、抗ＣＤ２０抗体の重鎖及び軽鎖をコーディングするように構築された。該抗体の可変配列は、その開示が参照として本明細書に含まれたＵＳ５，７３６，１３７から得ることができる。不変重鎖領域内の配列は、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ１）であった。可変軽鎖（ＶＬ）をコーディングする核酸配列は、配列番号４２であり、アミノ酸配列は、配列番号４３であった。不変軽鎖（ＣＬ）のアミノ酸配列は、配列番号３５であった。可変重鎖（ＶＨ）をコーディングする核酸配列は、配列番号４４であり、アミノ酸配列は、配列番号４５であった。不変重鎖（ＣＨ）をコーディングする核酸配列は、配列番号４６または４７であり、アミノ酸配列は、配列番号４８または４９であった。発現ベクターは、前述のように得た。抗体の軽鎖または重鎖の発現プラスミドは、真核細胞において、抗体の重鎖（ＦＣ１またはＦｃ２）または軽鎖の発現に使用した。
【０１５３】
前述のように、Ｘ０ＧＣ発現ベクターは、抗Ｔｒｏｐ−２抗体の重鎖及び軽鎖をコーディングするように構築された。該抗体の可変配列は、その開示が参照として本明細書に含まれたＷＯ２００３−０７４５６６から得ることができる。不変重鎖内の配列は、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ１）であった。可変軽鎖（ＶＬ）をコーディングする核酸配列は、配列番号５０であり、アミノ酸配列は、配列番号５１であった。不変軽鎖（ＣＬ）のアミノ酸配列は、配列番号３５であった。可変重鎖（ＶＨ）の核酸配列は、配列番号５２であり、アミノ酸配列は、配列番号５３であった。不変重鎖（ＣＨ）をコーディングする核酸配列は、配列番号５４であり、アミノ酸配列は、配列番号５５であった。
【０１５４】
前述のように、Ｘ０ＧＣ発現ベクターは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖をコーディングするように構築された。該抗体の可変配列は、その開示が参照として本明細書に含まれたＵＳ２０１０−０２０３０５６から得ることができる。不変重鎖領域内の配列は、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ１）であった。可変軽鎖の核酸配列は、配列番号５６であり、可変軽鎖のアミノ酸配列銀配列番号５７であり、不変軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５であり、可変重鎖の核酸配列は、配列番号５８であり、可変重鎖のアミノ酸配列は、配列番号５９であり、不変重鎖の核酸配列は、配列番号６０であり、不変重鎖のアミノ酸配列は、配列番号６１であった。
【０１５５】
Ｘ０ＧＣ発現ベクターは、前述のように、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及びヒトＩｇＧ１（Ｆｃ２）の融合配列をコーディングするように構築した。該抗体の可変配列は、その開示が参照として本明細書に含まれたＵＳ７，１１２，３２４から得ることができる。不変重鎖内の配列は、ヒトＩｇＧ１（Ｆｃ２）であった。可変ドメインの核酸配列は、配列番号６２であり、可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号６３であり、不変ドメインの核酸配列は、配列番号：６４〜６７のうちいずれか一つであり、不変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号：６８〜７１のうちいずれか一つであった。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及びヒトＩｇＧ１（Ｆｃ２）の融合配列の発現プラスミドは、真核細胞内において、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及びヒトＩｇＧ１（Ｆｃ２）の融合配列発現に使用した。
【０１５６】
実施例４．ヘテロダイマー抗体の発現
抗体の重鎖及び軽鎖の２個の発現ベクターを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３−Ｆ  Ｃｅｌｌｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｒ７９００７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質導入した。形質導入前日、２９３−Ｆ細胞は、サブ培養され、一晩育つように拡張された。形質導入日、細胞が遠心分離で収集され、新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３３８００１）で、２００×１０５生細胞／ｍＬの最終密度で再懸濁された。プラスミド（最終濃度３６．６７μｇ／ｍＬ）は、ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、最終濃度５５μｇ／ｍＬ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３８９６）を使用し、定められたモル比で、一時的に共形質導入され、３７℃で１２０ｒｐｍで、１時間緩く混合及びインキュベーションされた。新鮮な培地は、形質導入体積１９倍に付加され、続けてインキュベーションされた。細胞培養上澄み液は、形質導入後、５〜６日目に収獲された。
【０１５７】
そのような発現ベクターを細胞内に形質導入した。抗体Ａの重鎖（ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ１）、抗体Ａの軽鎖、及び抗体Ｂ’ｓｃＦｖ、並びにヒトＩｇＧ１−Ｆｃ２の融合配列を共に形質導入した。それらは、細胞培養上澄み液内において、Ｆｃ１ホモダイマー、ｓｃＦｖ−Ｆｃ２ホモダイマー及びＦｃ１／ｓｃＦｖ−Ｆｃ２ヘテロダイマーとして存在した。Ｆｃ１とＦｃ２との相互反発効果により、Ｆｃ１／ｓｃＦｖ−Ｆｃ２ヘテロダイマーが主な結果物であった。さらには、Ｆｃ１及びＦｃ２は、ヘテロダイマーを形成する傾向が強い。
【０１５８】
ＥＬＩＳＡによる抗ＨＥＲ２−Ｆｃ１及び抗ＣＤ３−Ｆｃ２の収率は、７０〜１００ｍｇ／Ｌであった。カラム精製前、細胞残骸を除去するために、上澄み液を４℃で０．２２μｍフィルタでフィルタリングした。
【０１５９】
実施例５．抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマー抗体の精製
抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマー抗体の一般的な構造は、図４に示されている。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、培養上澄み液からタンパク質を精製した。収集したタンパク質を超微細濾過チューブ（１０ｋＤａ分子量カットオフ）で濃縮し、緩衝液をＰＢＳ溶液に変更した。その後、溶液の体積半分ほどに、最終濃度が１Ｍになるように、３Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を添加した。タンパク質を緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０）で希釈した。
【０１６０】
ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）タンパク質精製系も精製に使用した。タンパク質は、Ｓｏｕｒｃｅ  ｐｈｅｎｙｌ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、２２ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。タンパク質サンプルを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．０）で事前に平衡化されたカラムにローディングした。流速は、３ｍＬ／分であった。前記カラムは、緩衝液Ａで平衡化され、緩衝液Ａ（０％Ｂ）から、１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で１８０分間、勾配によって１５カラム体積で洗浄した。流速は、２ｍＬ／分であった。図５に示された分画をプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）し、超微細濾過チューブ（１０ｋＤａ分子量カットオフ）で濃縮し、緩衝液をＰＢＳ溶液に変更した。タンパク質は、０．２２μｍにフィルタし、４℃で保存した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図６に、その結果が示されている。大きさ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ−ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）測定時、純度は、９７．６５％であった（図７）。
【０１６１】
実施例６．ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の安定性テスト
完全密封されたヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖサンプル（１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ）を、４０℃のインキュベータ（ＢＩＮＤＥＲ、ＫＢＦ２４０）に保管した。大きさ排除高性能液体クロマトグラフィを使用し、２０μｇサンプルを、異なる時点（基礎線（０日）、１日、２日、５日、７日）によって安定性をテストした。大きさ排除高性能液体クロマトグラフィ条件は、下記の通りであった：（１）クロマトグラフィカラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ；（２）移動相：５ｍＭ  ＰＢＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．７；（３）流速：０．６ｍＬ／分；（４）ＵＶ検出波長：２８０ｎｍ；（５）獲得時間：３０分。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｉｎｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィを使用し、グラフを記録し、残留モノマー比率を計算するために、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  Ａｇｉｌｅｎｔを使用した。４０℃の実験条件下において、図８に示されているように、前記ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、有意な凝集を示さなかった。データは、前記ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖが、良好な熱的安定性を有するということを証明した。
【０１６２】
実施例７．ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体とＦｃＲｎとの結合活性
ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＦｃＲｎ結合活性を、ＥＬＩＳＡでテストした。簡潔に言って、ＥＬＩＳＡプレートを、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーにコーティングし、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）内において、一晩４℃で調節した。前記プレートは、ＰＢＳＴ（ｐＨ６．０）で５回洗浄した。プレートを遮断するために、ウェル（ｗｅｌｌ）当たり３００μＬの０．５％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴを追加し、前記プレートは、２５℃において、少なくとも１時間インキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、０．５％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに、１μｇ／ｍＬに希釈されたウェル当たり１００μＬのＦｃＲｎ−ｈｉｓタグ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＴ００９−Ｈ０８Ｈ）をそれぞれのウェルに付加し、前記プレートを２時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、０．５％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに、１：５，０００に希釈されたウェル当たり１００μＬのＦｃＲｎ−ｈｉｓマウス抗体（ＣＷＢＩＯ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＷ０２２８）を付加し、前記プレートを１時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、ウェル当たり１００μＬのホースラディッシュ過酸化酵素でラベリングされたＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ．ＮｏＡＢ７０６８）を付加し、前記プレートを、１時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、ウェル当たり１００μＬのＴＭＢを付加し、常温で１０分間着色した。ウェル当たり１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を付加し、反応を終結させた。４５０ｎｍでの光学密度をマイクロプレート読取り機で読み取った。図９に示されているように、ヘテロダイマー抗ＨＥＲ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ＦｃＲｎに結合する。
【０１６３】
実施例８−ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の生体外結合活性
流動細胞継受法（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ）を使用し、ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＨＥＲ２高発現ＳＫ−ＢＲ−３細胞への結合活性、及びＣＤ３高発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合活性をテストした。
【０１６４】
ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、それぞれ２％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨ３００８４．０３）を含む冷たいＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔ  Ｎｏ．１４１９０−２３５）である冷たい分析緩衝液で１回洗浄した。その後、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（１×１０６／チューブ）の部分標本を、冷たい分析緩衝液（２％  ＦＢＳを含む２００μＬのＤＰＢＳ）に再懸濁し、それを、暗い中で３０分間氷上で、０．５ｎＭのヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ、ホモダイマー四価抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３、抗ＨＥＲ２またはイソタイプ対照群（ヒト免疫グロブリン、Ｊｉａｎｇｘｉ  Ｂｏｙａ  Ｂｉｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｎｏ．Ｓ１９９９３０１２、中国）でインキュベーションした。Ｊｕｒｋａｔ細胞の部分標本を、そのようなサンプルの濃度を５ｎＭに変化させたことを除いては、類似して処理した。インキュベーションの終わりに、細胞を冷たい分析緩衝液で２回洗浄し、冷たい分析緩衝液に再懸濁し、５０倍に希釈した抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（ＺＳＧＢ−Ｂｉｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＺＦ０３０６、中国）と共に暗い中で、３０分間氷上でインキュベーションした。インキュベーションの終わりに、細胞を冷たい分析緩衝液で２回洗浄し、冷たいＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、流動細胞継受法を遂行した。表３及び表４にその結果が示されている。該結果は、抗原ＨＥＲ２、及びＣＤ３に結合されたヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体の活性が良好であるということを示す。
【０１６５】
【表３】
2019535650.tif 000004
【０１６６】
【表４】
2019535650.tif 000005
【０１６７】
実施例９．ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＨＥＲ２及びＣＤ３に対する同時結合活性
ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を使用し、ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体のＨＥＲ２及びＣＤ３に対する同時結合活性を、流動細胞継受法（ＦＡＣＳ）でテストした。
【０１６８】
ＰＫＨ２６キット（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＬＢＨ４５６８Ｖ）の使用マニュアルにより、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を染色した。簡潔に言って、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を収集し、無血清培地で１回洗浄し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、２×１０７細胞／ｍＬの細胞懸濁液内に準備し、ＰＫＨ２６を、ＰＫＨ２６キットのＤｉｌｕｅｎｔ  Ｃを使用し、４μＭにそれぞれ希釈した。その後、それらを共に１：１で混合し、ＰＫＨ２６濃度が２μＭであり、細胞密度が１×１０７細胞／ｍＬである混合物を得た。その後、前記混合物を、１分間常温でインキュベーションし、染色を終了させるために、同一体積のＦＢＳで１分間インキュベーションした。前記混合物を、４００ｇで１０分間遠心分離した後、完全培地で、２回洗浄して完全培地で再懸濁した。ＣＦＳＥキット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ３４５５４）の使用マニュアルにより、Ｊｕｒｋａｔ細胞を染色した。簡潔に言って、ＣＦＳＥを、ＰＢＳとの作用濃度０．５μＭに希釈し、３７℃で予熱した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離し、予熱されたＣＦＳＥ作用溶液で再懸濁した後、３７℃で１５分間インキュベーションした。染色したＪｕｒｋａｔ細胞を、５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離し、完全培地で再懸濁した後、３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を完全培地で１回洗浄した後、完全培地で再懸濁した。
【０１６９】
前記染色されたＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を遠心分離を介して収集した後、２％  ＦＢＳを含む冷たいＰＢＳである冷たい分析緩衝液で１回洗浄した。該細胞を、冷たい分析緩衝液に、５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を１：１比率で混合し、それぞれのチューブに、前記混合物の１００μＬ部分標本（すなわち、２．５×１０５  ＳＫ−ＢＲ−３細胞及び２．５×１０５  Ｊｕｒｋａｔ細胞）をピペッティングした。その後、１００μＬのヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖサンプルまたはイソタイプ対照群（ヒト免疫グロブリン、Ｊｉａｎｇｘｉ  Ｂｏｙａ  Ｂｉｏ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｓ１９９９３０１２）を付加した。分析緩衝液で希釈し、最終濃度は、５ｎＭであった。チューブを３０分間氷上でインキュベーションし、冷たい分析緩衝液で２回洗浄した後、５００μＬの冷たいＰＢＳで再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用し、流動細胞継受法を遂行した。
【０１７０】
図１０に示されているように、ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ＨＥＲ２高発現ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＣＤ３高発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に同時結合し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞の結合を誘発することができる。該結果は、前記ヘテロダイマーがＴ細胞を腫瘍細胞に集め、その結果、向上された癌細胞死滅活性を有するということを意味する。
【０１７１】
実施例１０．腫瘍細胞に対するヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の生体外細胞毒性
標的細胞（ＢＴ−４７４及びＳＫ−ＢＲ−３）を収集し、細胞密度２×１０５細胞／ｍＬで、完全培地（１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁した。標的細胞のＢＴ−４７４及びＳＫ−ＢＲ−３をそれぞれ５０μＬ／ウェル（ウェル当たり１×１０４細胞）で９６ウェルプレートに接種し、ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖサンプルを段階的に希釈した後、１００μＬ／ウェル量で完全培地で培養した。先立っての実験によれば、効果対比標的の比率（Ｅ／Ｔ）は、２０：１であった。エフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ細胞、Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣ−２７０２）を完全培地で、４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に再懸濁し、各ウェル当たり５０μＬ（ウェル当たり２×１０５細胞）を接種した。培養プレートを、３７℃の二酸化炭素インキュベータで４日間インキュベーションした。インキュベーション後、上澄み液を除去した後、該細胞を２００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄した後、エフェクタ細胞を除去した。１００μＬの完全培地、及び２０μＬのＭＴＳを付加した後、３７℃の二酸化炭素インキュベータで、２〜３時間インキュベーションした。マイクロプレート読取り機で、４９０ｎｍ（ＯＤ数値）での吸光度を読み取った。細胞毒性は、下記のように計算した：
【０１７２】
【数１】
2019535650.tif 000006
【０１７３】
図１１に示されているように、前記ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３及びＨＥＲ２高発現ＢＴ−４７４を、濃度依存的な方式で殺傷した。前記構造体の細胞毒性は、ハーセプチン（ＨＥＲ２ｍＡｂ）に比べ、はるかにすぐれており、それは、強い腫瘍細胞死滅活性を示す。
【０１７４】
実施例１１．マウスでのヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の薬物動力学的研究
ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖの薬物動力学的研究を、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＨＦＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入した８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスでテストした。１週間の順化後、マウスを任意に２グループ、各グループに２１マウスずつ割り当てた。単一クローン抗体ハーセプチン及びヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の１回投与量２０ｎｍｏｌ／ｋｇを、それぞれのマウス腹膜内に投与した。血液サンプルを、抗凝固剤なしに互い違いに、下記時点で眼球裏の出血からチューブを介して収集した：事前服用、１，３，６，１０，２４，４８，７２，９６，１２０，１６８，２１６，２６４，３１２時間後投与。各マウスを２時点ずつ出液させした。各時点で使用したマウスの数は、２匹である。血液サンプルを、常温で３０分〜１時間凝固させ、１０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離し、血清サンプルを収穫し、検出のために−８０℃で保管した。
【０１７５】
ハーセプチン、ＨＥＲ２／ＣＤ３ヘテロダイマーの濃度を決定するために、血清サンプルをＥＬＩＳＡで分析した。簡潔に言って、９６ウェルＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ分析プレートを、ウェル当たり１００μＬの組み換えヒトＨＥＲ２（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０００４−Ｈ０８Ｈ）で１μｇ／ｍＬにコーティングし、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で一晩４℃で置いた。前記プレートは、ＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｐ−３５６３）で５回洗浄した。該プレートを遮断するために、ウェル当たり３００μＬの５％脱脂乳を含むＰＢＳＴを追加し、前記プレートは、２５℃で少なくとも１時間インキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、１０％プーリングされたマウス血清で希釈されたウェル当たり１００μＬの血清サンプル、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴを、それぞれのウェルに付加し、前記プレートを２時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、５％脱脂乳を含むＰＢＳＴに、１：２，０００に希釈されたウェル当たり１００μＬの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＡＰ３０９Ｐ）を付加し、前記プレートを、１時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、ウェル当たり１００μＬのＴＭＢ（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ：５５５２１４）を付加し、常温で１０分間着色した。ウェル当たり１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を付加して反応を終結させた。４５０ｎｍでの光学密度をマイクロプレート読取り機で読み取った。
【０１７６】
図１２に示されているように、マウスにおける１回服用量の腹腔内注射（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）により、ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ハーセプチンと類似したＰＫプロファイルを示した。ヘテロダイマー抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖの薬物動力学的パラメーターは、次の通りである：半減寿命ｔ１／２は、１２９時間；ＡＵＣｌａｓｔは、３０，６１１ｎＭ・時間；Ｔｍａｘは、３時間；Ｃｍａｘは、２６４ｎＭ；Ｖｄは、８５ｍＬ／ｋｇ；ＣＬは、０．４５ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ；ＭＲＴｌａｓｔは、８８時間である。抗ＨＥＲ−２／抗ＣＤ３構造体のためのヘテロダイマー生産工程は、下記表５に要約される。
【０１７７】
【表５】
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【０１７８】
実施例１２．ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の精製
収穫した培養上澄み液を、実施例５に記載されているように精製した。精製された結果物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１３に、その結果が示されている。ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ結果物の純度は、９５％以上であった。
【０１７９】
実施例１３．ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の安定性及び生体外結合活性
ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体のＴｒｏｐ−２結合活性をＥＬＩＳＡでテストした。簡潔に言って、ＥＬＩＳＡプレートを、ウェル当たり１００μＬの組み換えヒトＴｒｏｐ−２（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０４２８−Ｈ０８Ｈ）で１μｇ／ｍＬにコーティングし、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で一晩４℃で置いた。前記プレートは、ＰＢＳＴで５回洗浄した。該プレートを遮断するために、ウェル当たり３００μＬの１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴを追加し、前記プレートは、２５℃で少なくとも１時間インキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈されたウェル当たり１００μＬのサンプルｄｍｆそれぞれのウェルに付加し、前記プレートを２時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに、１：２，０００に希釈されたウェル当たり１００μＬの抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ接合体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：ＡＰ３０９Ｐ）を付加し、前記プレートを、１時間２５℃でインキュベーションした。前記プレートを前述のように洗浄し、ウェル当たり１００μＬのＴＭＢ（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ：５５５２１４）を付加し、常温で１０分間着色した。ウェル当たり１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を付加して反応を終結させた。４５０ｎｍでの光学密度をマイクロプレート読取り機で読み取った。図１４に示されているように、ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、Ｔｒｏｐ−２に対して高い結合親和性を有する。ＣＤ３高発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用し、ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＣＤ３への結合活性を、流動細胞継受法（ＦＡＣＳ）によってテストした。ＦＡＣＳは、実施例８に記載されたことによって遂行した。表６に示されているように、Ｊｕｒｋａｔ細胞に高い親和性で結合した前記ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、その抗原であるＣＤ３に良好な活性で結合する。
【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
実施例１４−ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＴｒｏｐ−２、及びＣＤ３に対する同時結合活性
ＢｘＰＣ３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を使用し、ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＴｒｏｐ−２及びＣＤ３に対する同時結合活性を、流動細胞継受法（ＦＡＣＳ）でテストした。ＦＡＣＳは、実施例９に記載されたところによって遂行した。ＰＫＨ２６キットの使用マニュアルによってＢｘＰＣ３細胞を染色し、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＦＳＥキットで染色した。図１５に示されているように、Ｔｒｏｐ−２高発現ＢｘＰＣ３細胞及びＣＤ３高発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への同時結合により、ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、ＢｘＰＣ３細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞の結合を誘発することができる。該結果は、前記ヘテロダイマーが、Ｔ細胞を腫瘍細胞に集め、その結果、向上された癌細胞死滅活性を有するということを意味する。
【０１８２】
実施例１５．腫瘍細胞に対するヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の生体外細胞毒性
標的細胞（Ｈ１６５０及びＢｘＰＣ）を収集し、細胞密度１×１０５細胞／ｍＬで、完全培地（１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁した。標的細胞であるＨ１６５０及びＢｘＰＣ−３を、それぞれ５０μＬ／ウェル（ウェル当たり５×１０３細胞）で９６ウェルプレートに接種し、ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖサンプルを段階的に希釈した後、１００μＬ／ウェルの量で完全培地に調節した。エフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ細胞、Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣ−２７０２）を、完全培地で２×１０６細胞／ｍＬまたは０．５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に再懸濁し、各ウェル当たり５０μＬ（ウェル当たり１×１０５細胞または０．２５×１０５細胞）を接種した。培養プレートを３７℃の二酸化炭素インキュベータで３日間インキュベーションした。インキュベーション後、上澄み液を除去した後、細胞を２００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄した後、エフェクタ細胞を除去した。１００μＬの完全培地、及び２０μＬのＭＴＳを付加した後、３７℃の二酸化炭素インキュベータで、２〜３時間インキュベーションした。マイクロプレート読取り機で、４９０ｎｍ（ＯＤ数値）での吸光度を読み取った。細胞毒性は、下記のように計算した：
【０１８３】
【数２】
2019535650.tif 000009
【０１８４】
図１６に（エフェクタ細胞と共に）示されているように、前記ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、高発現Ｔｒｏｐ−２癌細胞（非小細胞肺癌細胞Ｈ１６５０及びヒト膵臓癌細胞ＢｘＰＣ−３）を濃度依存的な方式で殺傷した。前記二重特異性抗体の死滅活性は、抗Ｔｒｏｐ−２ｍＡｂに比べ、はるかにすぐれており、それは、強い腫瘍細胞死滅活性を示す。
【０１８５】
実施例１６．マウスにおけるヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の薬物動力学的研究
ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖの薬物動力学的研究を、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＨＦＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入した８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスでテストした。注入、血液サンプル収集及び分析方法は、実施例１１に記載されたところによって遂行した。含まれた抗Ｔｒｏｐ２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖヘテロダイマーの濃度を決定するために、血清サンプルをＴｒｏｐ−２（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ：１０４２８−Ｈ０８Ｈ）でコーティングし、ＥＬＩＳＡで分析した。図１７に示されているように、マウスへの１回服用量の腹腔内注射（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）により、ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、抗Ｔｒｏｐ−２と類似したＰＫプロファイルを示した。ヘテロダイマー抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖの薬物動力学的パラメーターは、次の通りである：半減寿命ｔ１／２は、１６５時間；ＡＵＣｌａｓｔは、２６，０７２ｎＭ・時間；Ｔｍａｘは、６時間；Ｃｍａｘは、２０３ｎＭ；Ｖｄは、１０７ｍＬ／ｋｇ；ＣＬは、０．４５ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ；ＭＲＴｌａｓｔは、９２時間である。
【０１８６】
実施例１７．ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の精製
収穫した培養上澄み液を、実施例５に記載されているように精製した。精製された結果物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１８にその結果が示されている。ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ結果物の純度は、９５％以上であった。
【０１８７】
実施例１８．ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の安定性及び生体外結合活性
完全密封されたヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖサンプル（１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬ）を、４０℃のインキュベータ（ＢＩＮＤＥＲ、ＫＢＦ２４０）に保管した。大きさ排除高性能液体クロマトグラフィを使用し、２０μｇサンプルを、異なる時点（基礎線（０日）、１日、２日、５日、７日）によって安定性をテストした。図１９に示されているように、４０℃の実験条件下において、ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖの有意な凝集は、なかった。前記ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体が良好な熱的安定性を有するということを、該結果が示した（ＣＤ２０高発現）。ラージ（Ｒａｊｉ）細胞及び（ＣＤ３高発現）Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用し、ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＣＤ２０及びＣＤ３結合活性を、流動細胞継受法（ＦＡＣＳ）でテストした。ＦＡＣＳは、実施例８に記載されたことによって遂行した。表７及び表８に示されているように、ラージ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞に結合した前記ヘテロダイマー抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、抗原ＣＤ２０及び抗原ＣＤ３のいずれにも結合した構造体であるということを示した。
【０１８８】
【表７】
2019535650.tif 000010
【０１８９】
【表８】
2019535650.tif 000011
【０１９０】
実施例１９．ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の精製
収穫した培養上澄み液を、実施例５に記載されているように精製した。精製された結果物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図２０にその結果が示されている。ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ結果物の純度は、９５％以上であった。
【０１９１】
実施例２０．ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の生体外結合活性
ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体のＰＤ−Ｌ１結合活性をＥＬＩＳＡでテストした。ＥＬＩＳＡは、実施例１３に記載されたところによって遂行した。ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＤ−Ｌ１（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１００８４−Ｈ０８Ｈ）でコーティングした。図２１に示されているように、ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、ＰＤ−Ｌ１に対して高い結合親和性を有する。
【０１９２】
ＣＤ３高発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用し、ヘテロダイマー前記抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＣＤ３への結合活性を、流動細胞継受法（ＦＡＣＳ）によってテストした。ＦＡＣＳは、実施例８に記載されたところによって遂行した。表９に示されているように、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合した前記ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖは、その抗原であるＣＤ３に結合することを示す。
【０１９３】
【表９】
2019535650.tif 000012
【０１９４】
実施例２１．ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＰＤ−Ｌ１及びＣＤ３に対する同時結合活性
Ｈ４６０細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を使用し、ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖのＰＤ−Ｌ１及びＣＤ３に対する同時結合活性を、流動細胞継受法（ＦＡＣＳ）でテストした。工程は、実施例９に記載されたところによって遂行した。図２２に示されているように、前記ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、（ＰＤ−Ｌ１高発現）Ｈ４６０細胞及び（ＣＤ３高発現）Ｊｕｒｋａｔ細胞の結合を誘導することができる。該結果は、前記ヘテロダイマーが、Ｔ細胞を腫瘍細胞に集め、その結果、向上された癌細胞死滅活性を有するということを意味する。
【０１９５】
実施例２２．ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の生体外細胞毒性
標的細胞（Ｈ１６５０及びＨＣＣ８２７）を収集し、細胞密度１×１０５細胞／ｍＬで（１０％  ＦＢＳを含む）ＲＰＭＩ  １６４０完全培地に再懸濁した。標的細胞Ｈ１６５０及び標的細胞ＨＣＣ８２７を、それぞれ５０μＬ／ウェル（ウェル当たり５×１０３細胞）で９６ウェルプレートに接種し、ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖサンプルを段階的に希釈した後、１００μＬ／ウェル量で完全培地に調節した。エフェクタ細胞（ヒトＰＢＭＣ細胞、Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣ−２７０２）を完全培地で２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に再懸濁し、各ウェル当たり５０μＬ（ウェル当たり１×１０５細胞）を接種した。培養プレートを、３７℃の二酸化炭素インキュベータで３日間インキュベーションした。インキュベーション後、上澄み液を除去した後、細胞を２００μＬのＤＰＢＳで２回洗浄した後、エフェクタ細胞を除去した。１００μＬの完全培地及び２０μＬのＭＴＳを付加した後、３７℃の二酸化炭素インキュベータで、２〜３時間インキュベーションした。マイクロプレート読取り機で４９０ｎｍ（ＯＤ数値）での吸光度を読み取った。細胞毒性は、下記のように計算した：
【０１９６】
【数３】
2019535650.tif 000013
【０１９７】
図２３に（エフェクタ細胞と共に）示されているように、腫瘍細胞死滅活性を示した前記ヘテロダイマー抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＤ３−ｓｃＦｖ構造体は、ＰＤ−Ｌ１高発現癌細胞（非小細胞肺癌細胞Ｈ１６５０及び非小細胞肺癌細胞ＨＣＣ８２７）を濃度依存的な方式で殺傷した。
【０１９８】
実施例２３．Ｆａｂ−Ｆａｂフォーマット二重特異性抗体生産のための抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０の発現結果物精製
ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、親和性クロマトグラフィカラムＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、２２ｍＬ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に、４℃で精製に使用した。前記カラムを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＰＢＳＴ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で初期に平衡化し、５ｍＬ／分の流速で、基本線が安定化された後、細胞上澄み液をローディングした。その後、緩衝液Ａを使用し、平衡化を進めた。前記サンプルは、実施例４に記載された方式によって示されるＣＨ３ドメイン内アミノ酸変異が起きた抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０の発現結果物である。その後、前記カラムを、カラム体積５倍の緩衝液Ｂ１（緩衝液Ａ＋０．５Ｍアルギニン）で洗浄した後、所望するタンパク質の溶出ピークを収集するために、カラム体積５倍の緩衝液Ｂ２（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０）で溶出した。溶出段階の流速は、５ｍＬ／分であった。類似した結果を算出する抗Ｈｅｒ２結果物（表示されない）と共に、抗ＣＤ２０結果物に対する代表的なクロマトグラムが図２４に示されている。溶出ピークは、灰色に表示されて収集され、ｐＨを５．０に調整するために、１Ｍ酢酸ナトリウムを付加した。
【０１９９】
実施例２４．抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ２０自然ＩｇＧ類似ヘテロダイマー二重特異性抗体の精製
図２５に、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの一般的な構造が示されている。
ヘテロダイマーを形成するために、実施例２３の精製結果物を体外で再構築した。まず、超微細濾過濃度（１０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用し、緩衝液を、緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に変更した。前述の抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０の結果物それぞれの濃度を、緩衝液内で１ｍｇ／ｍＬに調整し、１／２００体積の１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）を付加した（ＤＴＴの最終濃度は、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭまたは２０ｍＭであった）。その後、４℃で、３〜８時間還元した。該還元過程中、抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０の発現結果物間に存在するホモダイマーのヒンジ領域内の二硫化結合は、開かれ、図２６に示されているように、１本の軽鎖、及び１つの重鎖を有する半抗体（または、ハーフマー）を形成する。還元段階後、サンプルを変性条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。類似した結果を算出する抗Ｈｅｒ２結果物（表示せず）と共に、抗ＣＤ２０結果物に係わる代表的な結果が、図２７に示されている。図面において、右側の２〜４レーンに示される４個の主バンドは、上から下に、それぞれＬＣ−ＨＣ−ＨＣ−ＬＣホモダイマー、ＨＣ−ＬＣハーフマー、ＨＣ及びＬＣである。図面に示されているように、ＤＴＴ濃度が上昇するほど、ただ２バンド（ＨＣ及びＬＣ）だけが示され、事実上、ホモダイマーが観察されない。ＰＢＳ内の１ｍＭ  ＤＴＴ存在下において、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析による抗Ｈｅｒ２クラス結果物（ｈａｌｆ  ｐｒｏｄｕｃｔ）（Ａ）及び抗ＣＤ２０クラス結果物（Ｂ）に係わる結果は、図２８に示されている。図２８に示されているように、ＤＴＴの濃度が１ｍＭ以上である場合、抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０の結果物いずれも、関連ポリヘプチジル種全体重量基準で、ホモダイマーの比率が１０％未満であり、半抗体分子（ハーフマー）の比率は、９０％超過であった。
【０２００】
還元された抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０ハーフマーを、モル比基準１：１で混合し、４℃で０．５〜２４時間再構築した。該再構築過程中、前記抗Ｈｅｒ２及び抗ＣＤ２０ハーフマーは、ＣＨ２／ＣＨ３間の非共有相互作用により、２種のハーフマーがほとんどいずれも共に支える抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーを形成した。その後、超微細濾過濃度（１０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用し、緩衝液を、緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に変更した。前記ヘテロダイマー二重特異性抗体の鎖間二硫化結合を形成するために、還元状態は、空気または酸化剤誘発酸化で終結した。酸化条件は、空気中に１日、３日、４日間露出すること、または４℃で１００ｍＭのＬ−デヒドロアスコルビン酸酸化剤の付加（最終タンパク質濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、最終酸化剤濃度は、０．５ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭである）し、その後、５または２４時間インキュベーションすることを含む。酸化後、結果物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図２９に、その結果が示されている。
【０２０１】
超微細濾過濃度（１０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用し、抗Ｈｅｒ２ハーフマー及び抗ＣＤ２０ハーフマーの還元・酸化で得た前記抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーを濃縮し、緩衝液組成物を１０ｍＭ  ＰＢＳＴ、ｐＨ５．８に変更した。ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００系（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とイオン交換クロマトグラフィカラムＳｏｕｒｃｅ  １５Ｓ（１６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．、１７ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、サンプルを４℃で精製した。前記カラムを、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、ｐＨ７．０）で初期に平衡化し、３ｍＬ／分の流速で基本線が安定化された後、前述のように処理したタンパク質溶液をローディングした。その後、緩衝液Ａを使用し、平衡化を進めた。続けて、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、ｐＨ７．０）から緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、ｐＨ５．８）までの勾配を使用し、前記カラムを２０カラム体積（１７０分間０％Ｂ〜１００％Ｂ、流速２ｍＬ／分）で洗浄した。表示された主要溶出ピークを収集した（図３０）。収集したタンパク質溶液を濃縮し、その緩衝液組成物を、さらに超微細濾過チューブ（１０ｋＤａ分子量カットオフ）を使用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に変更した。その後、保存のために、４℃で滅菌フィルタリングした。精製された結果物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図３１に、その結果が示されている。該結果物をＳＥＣ−ＨＰＬＣによっても分析した。図３２に、その結果が示されている。純度は、９７．３％であった。
【０２０２】
実施例２５．抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマー分析方法のためのセッティング
次に、５個のサンプルをＨＰＬＣで判別した：抗ＨＥＲ２クラス抗体、抗ＨＥＲ２ホモダイマー、抗ＣＤ２０クラス抗体、抗ＣＤ２０ホモダイマー及び抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマー。実験に係わる詳細な、内容は下記の通りである：（１）疎水性相互作用クロマトグラフィカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ、７．５ｍｍ  ＩＤｘ７．５ｃｍ、１０μｍ）；（２）移動相及び勾配：緩衝液Ａ：２０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．０、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．０；勾配は、４０分間４０％緩衝液Ｂから１００％緩衝液Ｂまで；（３）流速：０．５ｍＬ／分；（４）温度：２５℃；（５）検出波長：２８０ｎｍ。図３３に示された結果から、容易に確認することができるように、抗ＣＤ２０−Ｆｃ１ホモダイマー（図３３のピーク１）、抗ＨＥＲ２−Ｆｃ２ホモダイマー（図３３のピーク５）及び抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマー（図３３のピーク３）は、該方法を使用した異なる維持時間を介して、効果的に区分可能であった。それにより、実施例２４の結果物が、ホモダイマーではないヘテロダイマーであるということ確認した。
【０２０３】
実施例２６．質量スペクトルによる抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマー識別
抗ＨＥＲ２ホモダイマー、抗ＣＤ２０ホモダイマー及び抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマー３個のサンプルを、ＬＣ−ＭＳ方法で分析し、アミノ酸カバレージをテストした。前記サンプルをトリプシンで消化させ、３７℃で１８時間インキュベーションした。ＬＣ−ＭＳ条件は、次の通りであった：カラム：ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、３００Å、１．７μｍ、２．１ｍｍｘ１００ｍｍ；カラム温度：５０℃；流速：０．２ｍＬ／分；緩衝液Ａ：０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ：０．１％ギ酸／１００％アセトニトリル；溶出勾配：９０分間２〜３５％緩衝液Ｂ；２０分間３５〜４５％緩衝液Ｂ；電子噴霧イオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ソース：陽イオンモード；毛細管電圧：２．５ｋＶ；コーン電圧：２５Ｖ；スキャニング範囲：１００〜２５００Ｄａ；ＭＳｅ電圧：２０〜４０Ｖ。
【０２０４】
図３４は、抗ＨＥＲ２ホモダイマー、抗ＣＤ２０ホモダイマー及び抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーの基礎ピークイオン（ＢＰＩ：ｂａｓｅ  ｐｅａｋ  ｉｏｎ）クロマトグラム（図３４Ａ）、及び各サンプルに係わるアミノ酸カバレージ（図３４Ｂ）である。抗ＣＤ２０ホモダイマーのカバレージは、９９．７％であり、抗ＨＥＲ２ホモダイマーのカバレージは、１００％であり、抗ＨＥＲ２／抗Ｃ２０ヘテロダイマーのカバレージは、９９．４％であった。ＬＣ−ＭＳで得た抗ＣＤ２０ホモダイマーにおいて、２個の特定アミノ酸置換を含む抗ＣＤ２０軽鎖及びＣＤ２０重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７３及び７４である。ＬＣ−ＭＳで得た抗ＨＥＲ２ホモダイマーにおいて、３個の特定アミノ酸置換を含む抗ＨＥＲ２軽鎖及びＨＥＲ２重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５及び７６である。ＬＣ−ＭＳで得た抗ＣＤ２０／ＨＥＲ２ヘテロダイマーにおいて、２個の特定アミノ酸置換を含む抗ＣＤ２０軽鎖及び抗ＣＤ２０重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７７及び７８である。ＬＣ−ＭＳで得た抗ＣＤ２０／ＨＥＲ２ヘテロダイマーにおいて、３個の特定アミノ酸置換を含む抗ＨＥＲ２軽鎖及び抗ＨＥＲ２重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７９及び８０である。配列番号７４における位置６６にアミノ酸グリシン、及び位置６７にリシン、配列番号７８において、位置６６にアミノ酸グリシン、位置６７にリシン、位置２１８にリシン、位置３４３にアラニン、及び位置３４４にリシン、並びに配列番号８０において、位置２１７にアミノ酸リシン、位置３４２にアラニン、位置３４３にリシンのそれぞれは、ＬＣ−ＭＳ分析で発見されなかった。該結果は、抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ２０ヘテロダイマーが、予想通り同一配列を有するということを示す。
【０２０５】
当業者は、本開示の範囲及び思想を外れずに、多様な変形がなされるということを理解するであろう。従って、本明細書に記述された本発明の多様な実施例は、ただ例示的なものであり、本発明の範囲を制限する意図ではないということを理解しなければならない。本明細書に引用された全ての文献は、その開示が参照として含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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