(57)【要約】  本発明は、細胞又は細胞の集団が分泌する分泌可溶性物質（免疫グロブリンなどの）を細胞表面で捕捉することにより、細胞又は細胞の集団を同定する、分離する及び特徴付ける方法に関する。これは、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた多重特異性タンパク質複合体上で、分泌された分子に対する結合特異性とその細胞又は細胞の集団に対して特異的な表面抗原に対する結合特異性を組み合わせることにより達成される。本方法は、病態及び／又は予後に関連している細胞集団を同定することにより臨床試験又は個別化療法の準備で患者の階層化などの研究及び実験目的で使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた（heterodimerically-tethered）二重特異性タンパク質複合体を用いる方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体とする繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体又はその結合断片、及び抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくは結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される多重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは細胞表面タンパク質（すなわち、細胞表面マーカー）に対して特異的であり、Ｂは前記細胞から分泌される目的の可溶性分子を捕捉し（例えば、結合する）、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ）複合体形態ではない又はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態の融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、分析しようとする細胞に導入するステップ、及び
ｉｉ）成分Ａ又はＢにより目的の可溶性分子の捕捉（例えば、結合）を検出するステップ
を含む上記方法。
【請求項２】
前記目的の可溶性分子が、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、走化性因子、ロイコトリエン、プロスタグランジン、血管作動性アミン、酵素、補体及び補体の断片、脂質、スフィンゴ脂質、第二メッセンジャー成分（例えば、一酸化窒素、サイクリックＡＭＰ、等）、ビタミン、ミネラル、陽イオン、陰イオン、糖、凝固因子、急性期タンパク質、ガンマグロブリン（免疫グロブリンを含む）、アルブミン、可溶性細胞膜受容体、細胞発現タンパク質のスプライスバリアント、核酸、小さな膜小胞（エキソソーム、微小胞、リポソーム、等などの）、分泌ペプチド、免疫複合体並びに死んでいる又は死にかけている細胞由来の細胞内タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的の可溶性分子がサイトカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サイトカインが、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５  ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６ａ、ＩＬ−３６ｂ、ＩＬ−３６ｇ、ＩＬ−３７ａ、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、ＴＮＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ３、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｅ、ＩＦＮｋ、ＩＦＮｗ、ＩＦＮｇ、ＩＦＮｌ１、ＩＦＮｌ２、ＩＦＮｌ２、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２、ＴＧＦｂ３、ＣＬＣ、ＣＮＴＦ、レプチン、ＯＰＧ、ＬＩＦ、ニューロポイエチン、オンコステインＭ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、アディポネクチン、アペリン、キメリン、ビスファチン、スクレロスチン、及びＤＫＫ−１を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記目的の可溶性分子がケモカインである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ケモカインが、ＣＣＬ１、２、３、４、５、６、７、８、９／１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、ＣＸＣＬ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２及びＣＸ３ＣＬ１を含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の可溶性分子が免疫グロブリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
Ｂが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びその断片を含む群から選択される特定の抗体アイソタイプに対して特異的である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ａが免疫グロブリン中のマーカーに対して特異的ではない、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞表面マーカーが、安定的に発現される細胞系譜マーカー（cell lineage marker）及び非系譜細胞(non-lineage cells)上で安定的に発現されるマーカーから選択され、例えば、系譜細胞マーカーがＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＬｉｎ−１〜３を含む群から選択される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ａが抗体分泌細胞（Ｂ細胞及び／又は形質細胞を含む）のマーカー又はＴ細胞マーカーに対して特異的である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ａが、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５（及びそのすべてのアイソフォーム）、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０（ＣＤ３８又はＣＤ１３８などの）を含む群から選択されるＢ細胞／形質細胞マーカーに対して特異的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ａが、細胞の表面の免疫グロブリンの一部として発現される、抗体軽鎖の定常領域（その断片を含む）又は抗体重鎖の定常領域であるＢ細胞マーカーに対して特異的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記マーカーが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びその断片を含む群から選択される抗体アイソタイプに対して特異的である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｂが抗体アイソタイプに対して特異的ではない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記マーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５（及びそのすべてのアイソフォーム）を含む群から選択されるＴ細胞表面マーカーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
Ａが、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ａが、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片（Ｆａｂ断片など）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ａが抗原、例えば、細胞の表面で発現される受容体に対するリガンドである、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が前記抗原に対して特異的なその表面で免疫グロブリンを発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂが、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｂが、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片（Ｆａｂ断片など）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂがリガンドを含む抗原である、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｘが、タンパク質成分ＡのＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
Ｘが、抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｙが、タンパク質成分ＢのＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｙが、抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｘが、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドである場合、ＹはｓｃＦｖ又はｓｄＡｂなどの抗体又はその結合断片であり、ＸがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドなどの抗原である、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＹがｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｙがペプチドである場合、Ｘは抗体又はｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂなどのその結合断片であり、ＹがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｘはペプチドなどの抗原である、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ペプチドが５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＸとＹの間の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＸとＹの間の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｘ又はＹが、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸１〜３８）に特異的であるｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項１から３１までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項３４】
ｓｃＦｖが５２ＳＲ４（配列番号３、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
Ｘ又はＹがペプチドＧＣＮ４（配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸１〜３８）である、請求項１から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
タンパク質成分Ｂによる可溶性分子の捕捉が標識されたタンパク質を用いて検出される、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
標識されたタンパク質が完全長抗体などの抗体又はその結合断片である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ｅｘ  ｖｉｖｉ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の重特異性タンパク質複合体が並行して用いられる、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記用いられる複数の二重特異性タンパク質複合体において、Ａが固定された特異性を有しＢの特異性が変動する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記用いられる複数の二重特異性複合体において、Ｂが固定された特異性を有しＡの特異性が変動する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記二重特異性タンパク質複合体を並行して分析するためにグリッドフォーマットが用いられる、請求項４０から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記二重特異性タンパク質複合体を並行して分析するためにマルチプレックスフォーマットが用いられる、請求項４０から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
Ａ−Ｘがまず、分析しようとする前記細胞に添加される、請求項１から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
Ｂ−Ｙがそれに続いて添加される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ａ−Ｘ：Ｂ−Ｙが予め形成された複合体として、分析しようとする細胞に添加される、請求項１から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記捕捉が、検出された前記細胞上でさらなる生物学的機能を誘導する又は妨げる（例えば、細胞増殖の阻害又はアポトーシスの誘導）、請求項１から４７までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた多重特異性タンパク質複合体における２つの結合特異性を組み合わせて、可溶性分子をそれを生成した細胞へ細胞表面捕捉することによって、その細胞又は細胞の集団の同定、分離及び特徴付けを促進する方法、多重特異性タンパク質複合体のライブラリー／マルチプレックス、並びにそのキット及び組成物に関する。本開示は、例えば、病態及び／又は予後に関連している細胞集団を同定することにより患者集団を特徴付けるアッセイにおいて使用するためなどの、研究及び実験目的で使用するための、前記新規多重特異性タンパク質複合体にさらに関する。本開示は前記多重特異性複合体を調製する方法にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
分泌された可溶性分子は細胞機能のキーとなるメディエータであり、細胞系譜がどのような条件下で及びいつその可溶性分子を生成するのかを理解することは天然での及び疾患での複雑な細胞生物学の中心である。単一細胞からの分泌を研究する方法が存在するが、その方法はすべて限界がある。一部の方法は、単一細胞画像処理、又はマイクロエングレービング（Nat. Biotech. 2006. 24. 703-707; Clin. Immunol. 2008. 129. 10-18）などの複雑な技術を必要とする。二重特異性抗体捕捉（Eur. J.Immunol.1999. 29. 4053-4059）などのフローサイトメトリーによる使用のためのもっと簡単な方法が報告されており、いくつかの細胞／サイトカイン組合せで市販されている（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ）が、これらの方法は、細胞表面マーカーと可溶性分子特異性の組合せが予め定義されている特注の試薬の作製が必要である。したがって、細胞機能及び系譜の研究のための任意の細胞表面マーカー特異性と任意の可溶性分子特異性を組み合わせる簡単なモジュラー方式の必要性が存在する。
【０００３】
既知の（従来の）多重特異性フォーマットの調製は時間がかかり労働集約的である。
【０００４】
典型的には、単一の二重特異性抗体構築物では、少なくとも２つの可変領域を発見ベクターの起源（例えば、ファージディスプレイ、ハイブリドーマ又は単一Ｂ細胞クローニング）から適切な二重特異性発現ベクターにサブクローニングする必要があり、二重特異性体のそれぞれのアームが発現され、こうして得られた二重特異性抗体は精製されなければならない。多数の機能的疑問を有する試料（単数又は複数）を調べようと試みて可変領域の多数の対を組み合わせようとすると、このクローニング及びそれに続く発現努力はすぐに著しい実施上の障害(significant practice bottleneck)になる。
【０００５】
例えば、５０の独特の抗体が１０の細胞表面標的のパネルに対して利用可能であり、５０の独特の抗体が１０の可溶性分子のパネルに対して利用可能であれば、総数で２５００の二重特異性抗体が潜在的に産生されうる（Ｘ−Ｙグリッドとして想定される）。当技術分野で公知の二重特異性抗体フォーマットを使えば、これは少なくとも１００の個々のクローニング反応（５０−Ｘと５０−Ｙ）、その後の２５００の抗体発現実験が必要になると考えられる。開始のモノクローナル抗体の数を１００まで増やせば、クローニング反応の最小数は２００（１００−Ｘと１００−Ｙ）まで、発現数は１０，０００まで増えることになる。
【０００６】
一般的に、この「発現の障害(expression bottleneck)」の根本原因は、上記のフォーマットは、最終二重特異性構築物の「半分」を構成する両方のタンパク質鎖が同じ細胞において単一発現実験内で同時に発現される必要があることである。したがって、多くのフォーマットでは、２５００の二重特異性抗体を産生するためには、２５００の発現実験が必要になる。
【０００７】
二重特異性抗体フォーマットがモノシストロン性（すなわち、単鎖タンパク質としてクローニングされ発現される）、例えば、単鎖ダイアボディである場合、クローニング実験の数が上に与えられた数についてそれぞれ２５００及び１０，０００になると考えられるので、「発現障害」はさらに悪化する。
【０００８】
さらに、発現後、所望の構築物を単離するためには大規模な精製が必要になる可能性がある。
【０００９】
一部の二重特異性アプローチはクローニングの量を減らすために二重特異性構築物に共通の軽鎖を用いるが、これでは発現実験の数は減らない。さらに、共通の軽鎖などの共通鎖を使用すれば、抗体は重鎖などの１つの鎖のみを通じて十分高い親和性でその抗原に結合する必要があるので開始抗体可変ドメインを見つけるのがより困難になるために、抗体発見という難問はさらに難しくなる。
【００１０】
ＤＶＤ−Ｉｇ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＤｕｏＢｏｄｉｅｓ、（Ｇｅｎｍａｂ）、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（Ｍｅｒｕｓ）を含む成功している治療薬として潜在的に機能することができると考えられる多くの有望な二重特異性抗体フォーマットが現在開発されている。しかし、それぞれの場合、これらのフォーマットは、例えば、大規模臨床試験において、患者由来の細胞集団の分析及び／又は特徴付けに理想的に適しているわけではない。
【００１１】
新しい医学的処置（新しい医薬）は多くの場合、患者の亜集団でのみ効果的である。しかし、そのような集団を同定するためには、いかなる根底にあるパターンでも同定可能であるように大量のデータを収集する必要がある。
【００１２】
多くの場合、データは、遺伝子のセットの上方調節及び下方調節に関する証拠を提供する転写情報の形態で収集される。この情報は価値があるが、これらの変化がタンパク質レベルでどのように反映されるのかはこの情報からでは分からない。
【００１３】
タンパク質レベルの変化は、遺伝子転写、エピジェネティック調節、タンパク質転写、タンパク質翻訳、タンパク質修飾、及び代謝機能の変化などの多くの入力の結果を反映しているので、その変化は細胞健康及び機能のより総合的な尺度を表す。したがって、タンパク質の分析は、指摘される理由により適しており、さらに、健康状態及び疾患状態で細胞集団と亜集団を感度良く区別するのに使用することが可能である。細胞サブセットの特徴付けは細胞表面タンパク質の定量化により決定可能であるが、現在、細胞分泌産物（タンパク質、脂質、核酸、等を含むことが可能であるが、これらに限定されない）は、細胞が固体又は半固体マトリックス中に保持されていなければ細胞識別子として使用することはできない。したがって、血液又は間質液などの水性環境において測定することも可能である分泌された細胞産物を捕捉する最適のシステムの必要性が存在する。さらに、複雑な細胞の混合物中で機能し、その産物を生成する細胞の分泌産物のみを捕捉し近接している他の細胞が生成する分泌産物は捕捉しないことが可能である技法の必要性も存在する。
【００１４】
我々は、可溶性分子を生成する細胞を同定する真の潜在力は、細胞標的及び可溶性標的上の所与のエピトープに結合する選択が限られている二重特異性又は多重特異性抗体を設計し試験するよりも、二重特異性若しくは多重特異性抗体又はタンパク質リガンドの大きく多様な組合せパネルを柔軟に組み合わせることができてはじめて達成することが可能であることを提案する。これを促進するためには、容易に構築され、その分子を生成する細胞の表面に分泌された分子を捕捉することで、その細胞を同定することができる能力についてスクリーニングすることが可能な多数の多様な多重特異性タンパク質の産生を可能にするフォーマット及び方法が必要とされる。このアプローチは、細胞の生物学的機構及び／又は下位集団についての新発見につながる同定をさらに可能にする。
【００１５】
したがって、特異性の組合せが異なる結合ドメインを有する多数の多重特異性タンパク質複合体を産生しスクリーニングすることができれば有用であると考えられる。特に、多数の異なる多重特異性タンパク質複合体で試料（単数又は複数）を迅速に効率的にスクリーニングすることができるのは有用だと考えられる。
【００１６】
カップリング及びコンジュゲーション技法は、抗体薬物コンジュゲートを作製すること及びｉｎ  ｖｉｖｏターゲティング技術のために存在している。１つのそのような方法は化学的架橋であるが、関連したタンパク質をホモ二量体及び他の望ましくない副産物から精製する必要がある場合があるので、これは労働集約的である。さらに、化学修飾ステップはタンパク質の完全性を変化させ、したがって、安定性が不十分になる又は生物学的機能が変わってしまうことがある。その結果、化学的架橋結合による二重特異性抗体の産生は多くの場合非効率的であり、抗体活性も消失してしまうことがある。
【００１７】
二重特異性抗体を製造する別の方法は、工学的に操作された細胞が無作為に会合する２つの重抗体鎖及び２つの軽抗体鎖を発現する、細胞融合（例えば、ハイブリッドハイブリドーマ）によるものである。選択される４つの可変因子が存在するので、これにより１０の可能な二重特異性抗体組合せが作製され、そのうちのいくつか（多くの場合に、１つのみ）の組合せのみが望ましいと考えられる。したがって、細胞融合による二重特異性抗体の産生は、生産収率が低く、産生されたその他の二重特異性抗体から所望の二重特異性抗体を単離するためには追加の精製ステップも必要になる。これらの短所のせいで時間も費用も増加する。
【００１８】
組換えＤＮＡ技法も二重特異性抗体を産生するために用いられてきた。例えば、組換えＤＮＡ技法を使用して「ノブイントゥホール（knob into hole）」二重特異性抗体も産生された。「ノブイントゥホール」技法は、ＣＨ３ドメインインターフェイスで多量体化ドメインに立体的に相補的な突然変異を工学的に作製する（例えば、Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621 (1996); Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)参照; 米国特許第５，７３１，１６８号及び米国特許第７，１８３，０７６号も参照）。この戦略の１つの制約は、同じ細胞で発現される場合、誤対合並びに望ましくない及び／又は不活性な分子の形成を防ぐためには２つの親抗体の軽鎖は同一でなければならない点である。それぞれの二重特異性体（その重及び軽鎖）は単一細胞で発現されなければならず、タンパク質産物は一般に約２０％のホモ二量体を含有しており、これはその後に精製により取り除かれる。
【００１９】
他のアプローチは、完全長ＩｇＧ４分子における鎖の自然な交換に基づいている（Ｇｅｎｍａｂ  Ｄｕｂｏｄｙ）。しかし、このアプローチもＦｃ領域なしでは構築物を調製することができないので困難を抱えている。Ｆｃ領域は生物活性に寄与することが可能なので、そのような分子が複雑な機能的アッセイにおいて試験される場合、観察される活性がＦｃを含む二重特異性分子での可変領域、Ｆｃ又は両方の組合せに基づいているのかどうかを確証するのは困難な場合がある。さらに、その交換は動的過程であり、これは所与の試料内で活性種が何であるのかに関して困難をもたらす場合がある。
【００２０】
したがって、上で考察された技術的課題に取り組み、その分泌産物物質に基づいて細胞集団を同定する最適化法を与える新しい方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を用いる、例えば、細胞により分泌される可溶性分子（単数又は複数）に関して細胞の集団を同定する又は特徴付けるための方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり；
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり；
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体とする繋であり；
：はＸとＹの間の結合相互作用であり；
Ａは、抗体若しくはその結合断片、又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり；
Ｂは、抗体若しくは結合断片又は抗原（例えば、タンパク質リガンドを含む）から選択される多重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり；
Ｘは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第１の結合パートナーであり；
Ｙは、抗原又は抗体若しくはその結合断片から独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり；
Ａは細胞表面タンパク質、例えば、細胞表面マーカーに対して特異的であり、Ｂは細胞から分泌される目的の可溶性分子を捕捉し（例えば、結合する）、
ただし、Ｘが抗原である場合、ＹはＸにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的な抗体又はその結合断片であり、
ｉ）複合体形態ではない又はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体形態の融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙの組合せを、分析しようとする細胞に導入するステップ、及び
ｉｉ）成分Ａ又はＢにより目的の可溶性分子の捕捉（例えば、結合）を検出するステップ
を含む上記方法が提供される。
【００２２】
本開示内では、融合タンパク質の用語「Ａ−Ｘ」及び「Ｙ−Ｂ」は「Ｘ−Ａ」又は「Ｂ−Ｙ」として相似的に示されることもある。同じことがヘテロ二量体繋「Ｘ：Ｙ」を表す用語にも当てはまり、これは本明細書では「Ｙ：Ｘ」として示すことも可能である。
【００２３】
一実施形態では、Ｂにより捕捉される目的の可溶性分子は、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、走化性因子、ロイコトリエン、プロスタグランジン、血管作動性アミン、酵素、補体及び補体の断片、脂質、スフィンゴ脂質、第二メッセンジャー成分（例えば、一酸化窒素、サイクリックＡＭＰ、等）、ビタミン、ミネラル、陽イオン、陰イオン、糖、凝固因子、急性期タンパク質、ガンマグロブリン（免疫グロブリンを含む）、アルブミン、可溶性細胞膜受容体、細胞発現タンパク質のスプライスバリアント、核酸、小さな膜小胞（エキソソーム、微小胞、リポソーム、等などの）、分泌ペプチド、免疫複合体並びに死んでいる又は死にかけている細胞由来の細胞内タンパク質からなる群から選択される。
【００２４】
細胞は１つ又は複数のサイトカインを分泌することがある。したがって、一実施形態では、サイトカインは、例えば、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５  ＩＬ−１６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６ａ、ＩＬ−３６ｂ、ＩＬ−３６ｇ、ＩＬ−３７ａ、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、ＴＮＳＦ１、ＴＮＦＳＦ２、ＴＮＦＳＦ３、ＴＮＦＳＦ４、ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳＦ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｅ、ＩＦＮｋ、ＩＦＮｗ、ＩＦＮｇ、ＩＦＮｌ１、ＩＦＮｌ２、ＩＦＮｌ２、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ２、ＴＧＦｂ３、ＣＬＣ、ＣＮＴＦ、レプチン、ＯＰＧ、ＬＩＦ、ニューロポイエチン（Neuropoietin）、オンコステイン（Oncostain）Ｍ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、アディポネクチン、アペリン、キメリン、ビスファチン、スクレロスチン、及びＤＫＫ−１である。
【００２５】
本開示の二重特異性複合体は、単離、試験のため、中和、ターゲティングのため、及び／又は細胞機能若しくは健康の調節のために、サイトカイン産生細胞を検出する目的で用いることができる。これには多くの用途があり、例えば、一部のサイトカイン産生細胞は、例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−１３及びＩＬ−５の群から選択される１つ又は複数のサイトカインを分泌することにより、喘息などの肺疾患において有害な機能を有すると考えられている。
【００２６】
一実施形態では、目的の可溶性分子は、例えば、ＣＣＬ１、２、３、４、５、６、７、８、９／１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、ＣＸＣＬ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２及びＣＸ３ＣＬ１を含む群から選択されるケモカインである。
【００２７】
一実施形態では、可溶性の分泌された分子は免疫グロブリン、例えば、免疫グロブリンの特定のアイソタイプであり、例えば、Ｂは細胞により分泌される免疫グロブリンの抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域に対して特異的である。したがって、一実施形態では、Ｂは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びその断片を含む群から選択される特定の抗体アイソタイプに対して特異的である。
【００２８】
一般に、Ｂが細胞から分泌される免疫グロブリンに対して特異的である場合、例えば、Ｂは分泌された免疫グロブリンの定常領域（ＣＬ又はＣＨ１などの）のエピトープに対して特異的である抗体又は結合断片である場合、Ａは一般に、その特定の免疫グロブリン以外の細胞表面マーカーに向けられる（又は対して特異的である）。
【００２９】
したがって、本開示の方法を使用すれば、分泌された免疫グロブリン又は重鎖若しくは軽鎖成分などのその断片のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスを区別する）を検出する及び／又は定量化することが可能である。これにより、Ａ−Ｘ：Ｂ−Ｙ複合体を使用して形質細胞を列挙し検出することが可能になる。
【００３０】
したがって、本方法は、免疫グロブリンサブクラス特異的応答の単離、例えば、他のサブクラスのＩｇＧを排除してＩｇＧ４の特異的捕捉に適用することが可能であり、これはＩｇＧ４関連疾患を有する患者集団の検出に有用になる可能性がある。
【００３１】
代わりに、Ｂは、細胞から分泌される免疫グロブリンの結合ドメインに特異的に結合することができる抗原であってもよく、例えば、Ｂは細胞から分泌される免疫グロブリンに特異的に結合する抗原である。一実施形態では、Ｂは、自己抗原、腫瘍抗原、感染病原体、ハプテン、又はこれらの全タンパク質若しくはそのペプチド断片を含む担体を含む群から選択される抗原であるが、これらに限定されない。
【００３２】
本方法は、単離、試験又はターゲティングのための抗体産生細胞、例えば、自己抗体又は病原体特異的抗体産生形質細胞の検出を目的に用いてもよい（特に、表面ＩｇＧ陰性細胞の場合に）。
【００３３】
一実施形態では、Ａは、安定的に発現される細胞系譜マーカー及び非系譜細胞（すなわち、系譜マーカーに対する抗原により染色されない細胞）上で安定的に発現されるマーカーを含む群から選択される細胞表面マーカーに結合する。
【００３４】
一実施形態では、細胞マーカーは、目的の細胞セット又はサブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３から選択される。
【００３５】
一実施形態では、細胞マーカーは抗体分泌細胞のマーカー（形質細胞を含むＢ細胞などの）又はＴ細胞マーカーから選択される。
【００３６】
一実施形態では、Ｂ細胞マーカーは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、Ｂ２２０（ＣＤ４５としても知られる）、ＣＤ４３、ＣＤ８１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４、ＢＣＭＡ及びＩＬ−６Ｒを含む群から独立して選択され、例えば、ＣＤ３８又はＣＤ１３８などのＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ１９又はＣＤ２０である。
【００３７】
一実施形態では、Ｂ細胞の表面で発現される免疫グロブリンは抗体分泌細胞のマーカー（Ｂ細胞マーカー及び／又は形質細胞マーカーなどの）として用いられ、例えば、Ｂ細胞マーカーは、細胞の表面の免疫グロブリンの一部として発現される、抗体軽鎖の定常領域又は抗体重鎖の定常領域である。
【００３８】
したがって、一実施形態では、Ａは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びその断片を含む群から選択される特定の抗体アイソタイプに対して特異的である。これらのマーカーはクラススイッチ抗体を同定するのに特に有用になる可能性がある。
【００３９】
一般に、ＡもＢも、１つの二重特異性タンパク質複合体内で同時に免疫グロブリンに対して両方とも特異的であるわけではない。
【００４０】
したがって、一実施形態では、方法はＡ−Ｘを細胞表面マーカーにドッキングすることを用い、もう一方のアームＢ−Ｙは分泌された免疫グロブリンを捕捉するのに用いられる。
【００４１】
したがって、別の実施形態では、非系譜細胞上で安定的に発現される細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ４５であり、タンパク質成分Ａ−ＸはＡ部分を介してＣＤ４５に対して特異的であり、もう一方のアームＢ−Ｙ中のＢは分泌された免疫グロブリンを捕捉するのに用いられる。
【００４２】
一実施形態では、Ａは、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５を含む群から選択されるＴ細胞表面マーカーに対して特異的である。
【００４３】
Ｔ細胞は、表面マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ１９６（ＣＣＲ６）並びにその組合せの異なる発現レベルに基づいて異なる集団に分類することが可能である。しかし、Ｔ細胞状態に関する重要な情報は、マーカーＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５のうちの１つ又は複数の表面発現を分析することにより得ることが可能である。
【００４４】
Ｔリンパ球は一般に、ＣＤ４５及びＣＤ３について少なくとも陽性である。
【００４５】
細胞傷害性Ｔ細胞はマーカーＣＤ４５、ＣＤ３及びＣＤ８について陽性である場合がある。
【００４６】
調節Ｔ細胞はマーカーＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３について陽性である場合がある。
【００４７】
Ｔヘルパー細胞はＣＤ４５、ＣＤ３及びＣＤ４について陽性である場合がある。
【００４８】
したがって、本開示では、第１の選択は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体（又はその成分）を用いて、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤＲＯから選択されるマーカーに対して特異的なＡを用いて実施され、第２の選択は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体（又はその成分）を用いて、例えば、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９及びＣＤ４５から選択されるマーカーに対して特異的なＡを用いて実施されることが想定される。
【００４９】
ナチュラルキラー細胞は、マーカー、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３１、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１５８、ＣＤ１５９、ＣＤ１６２Ｒ、ＣＤ２２３、ＣＤ２４４について陽性であり、ＣＤ３について陰性である場合がある。
【００５０】
単球／骨髄細胞又は単球／骨髄細胞サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される単球／骨髄細胞又は単球／骨髄細胞サブセットの抗原は、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４等があり得るがこれらに限定されない。
【００５１】
樹状細胞又は樹状細胞サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される樹状細胞又は樹状細胞サブセットの抗原は、ＣＤ８５、ＣＤ２０５、ＣＤ２０９等があり得るがこれらに限定されない。
【００５２】
好中球又は好中球サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好中球又は好中球サブセットの原は、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１７０等があり得るがこれらに限定されない。
【００５３】
好塩基球又は好塩基球サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好塩基球又は好塩基球サブセットの抗原は、表面ＩｇＥ、ＣＤ１２３、ＣＤ２０３ｅ、ＦｃｅＲ１ａ等があり得るがこれらに限定されない。
【００５４】
好酸球又は好酸球サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される好酸球又は好酸球サブセットの抗原は、シグレック−８、ＣＤ２９４等があり得るがこれらに限定されない。
【００５５】
マスト細胞又はマストサブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現されるマスト細胞又はマストサブセットの抗原は、表面ＩｇＥ、ＦｃｅＲ１ａ、ＣＤ１１７等があり得るがこれらに限定されない。
【００５６】
血小板／巨核球又は血小板／巨核球サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される血小板／巨核球又は血小板／巨核球サブセットの抗原は、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ／ｂ／ｃ／ｄ、ＣＤ５１、ＣＤ１１０等があり得るがこれらに限定されない。
【００５７】
造血前駆細胞又は造血前駆細胞サブセット上で全タンパク質若しくは全タンパク質のより小さなペプチドとして発現される造血前駆細胞又は造血前駆細胞サブセットの抗原は、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ９０、ＣＤ１００、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２４３、ＣＤ３３８、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−５、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９、ＴＲＡ−２−５４等があり得るがこれらに限定されない。
【００５８】
脳／神経系、内分泌系、血液／免疫系、肝臓、腎臓、心臓及び骨格筋、皮膚／骨／関節、消化管、肺、男性組織及び女性組織を含むあらゆる組織又は細胞サブセット上の表面マーカー。
【００５９】
細胞が、例えば、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＮＣＡＭ、ＧＤ２、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ７０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＫＤＲ、Ｔａｇ−７２、等を含む一覧から選択される腫瘍抗原を発現している表面マーカー。
【００６０】
一実施形態では、２つよりも多い選択が用いられる。
【００６１】
一実施形態では、第１の選択は第２の選択が実施される前に実施される（すなわち、第２の選択は順次実施される）。
【００６２】
一実施形態では、第１の選択と第２の選択は、例えば、マルチプレックスとして同時に実施され、異なるフルオロフォアなどの異なる標識が２つ又はそれよりも多い選択に用いられる。有利なことに、選択がマルチプレックスとして実施される場合、細胞の所望の集団は本質的に１ステップで単離することが可能である。
【００６３】
したがって、一実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体はその分泌表現型に基づいて細胞集団の同定のために使用することが可能である。この例は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞上のＩＬ−１７を捕捉して、自己免疫の発症及び維持に関連付けられてきたＴヘルパー１７細胞を同定する又は単離することである。
【００６４】
理論に縛られたくはないが、ＣＤ４及びＣＸＣＲ３並びに／又はＣＤ４及びＣＸＣＲ５発現は自己免疫疾患では歪められることがある。ＣＤ４及びＣＣＲ６発現は器官特異的自己免疫疾患では歪められることがある。ＣＤ８発現はＧＶＨＤでは歪められることがある。ＣＤ４、ＣＣＲ４、Ｃｒｔｈ２発現はアレルギー及び喘息では歪められることがある。
【００６５】
本開示の抗体フォーマットは、二重特異性タンパク質複合体が容易に会合可能であり、これらの複合体を使用して、患者（及び、血液試料などのそれ由来のｅｘ  ｖｉｖｏ試料）をスクリーニングし、疾患機序及び／若しくは予後についての洞察を得て並びに／又は患者サブグループを定義し及び／若しくは患者をサブグループに割り当てることが可能なような抗体フォーマットである。
【００６６】
本開示の抗体複合体は、
・細胞から分離された可溶性因子、又は
・抗原
に対して特異的なＢとしてのさらなるｓｄＡｂと組み合わせて、必要な細胞の表面に複合体を固定するのに用いる細胞表面マーカーに対して特異的なＡとしての単一ドメイン抗体ｓｄＡｂを含むように迅速に調製することが可能である。
【００６７】
したがって、本開示に従った二重／多重特異性フォーマットは、細胞及び細胞集団の検出、同定、単離、分離特徴付け及び／又は定量化に有用である。
【００６８】
一実施形態では、Ａは、抗原、リガンド、受容体、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖから独立して選択され、例えば、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖ、特に、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００６９】
一実施形態では、タンパク質成分Ａはタンパク質、例えば、細胞の表面で発現される受容体に対するリガンドである。
【００７０】
好ましくは、ＡはｓｃＦｖ又はＦａｂ断片である。
【００７１】
一実施形態では、タンパク質成分Ｂは、抗原、リガンド、受容体、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖから独立して選択され、例えば、完全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖ、特に、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００７２】
本方法は、例えば、図３及び４に示されるように、タンパク質成分Ａ又はＢで表される抗体又は結合断片が、細胞により分泌される目的の可溶性分子にも結合する抗原に結合するような状況で用いることもできることは理解されるべきである。
【００７３】
好ましくは、ＢはｓｃＦｖ又はＦａｂ断片である。
【００７４】
一実施形態では、タンパク質成分Ｂはタンパク質、例えば、リガンド又は可溶性受容体である。
【００７５】
一実施形態では、成分Ｂは、例えば、図７に示されるように、目的の可溶性分子を直接捕捉することが可能な抗原である。
【００７６】
一実施形態では、Ｘは、タンパク質成分ＡのＣ末端に、任意選択でＡにより表されるＦａｂ断片又はＦａｂ’断片中の重鎖のＣ末端などの抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている。
【００７７】
一実施形態では、Ｘは、Ａにより表されるＦａｂ断片又はＦａｂ’断片などの、抗体又はその結合断片の軽鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている。
【００７８】
一実施形態では、Ｘはリンカー、特に本明細書に開示されるリンカーを介して接続されている。
【００７９】
一実施形態では、Ｙは、タンパク質成分ＢのＣ末端に、任意選択でＢにより表されるＦａｂ断片又はＦａｂ’断片中の重鎖などの抗体又はその結合断片の重鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている。
【００８０】
一実施形態では、Ｙは、Ｂにより表されるＦａｂ断片又はＦａｂ’断片中の抗軽鎖のＣ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている。
【００８１】
一実施形態では、Ｘは、Ａにより表されるのがどちらであろうと、ｓｃＦｖのＮ末端又はＦａｂ断片若しくはＦａｂ’断片中の重鎖のＮ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている。
【００８２】
一実施形態では、Ｙは、Ｂにより表されるｓｃＦｖのＮ末端に、任意選択でリンカーを介して融合されている。
【００８３】
一実施形態では、可変ＸはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ又はｓｄＡｂなどの抗体結合断片（特に、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ）であり、Ｙ可変はペプチドなどの抗原である。
【００８４】
一実施形態では、可変ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ又はｓｄＡｂなどの抗体結合断片（特に、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ）であり、Ｘはペプチドなどの抗原である。
【００８５】
一実施形態では、可変Ｘ又はＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、又はｓｄＡｂであり、もう一方の可変はペプチド、例えば、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８）に対して特異的なＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、又はｓｄＡｂである。
【００８６】
一実施形態では、可変Ｘ又はＹはｓｃＦｖ又はｓｄＡｂであり、もう一方の可変はペプチドである。
【００８７】
一実施形態では、Ｘ又はＹはｓｃＦｖ  ５２ＳＲ４（表１Ａに示される配列番号３又は配列番号３、９９若しくは１００のアミノ酸１から２４３）である。Ｘ又はＹがＧＣＮ４に結合するＦａｂ又はＦａｂ’断片である場合、Ｘ又はＹはｓｃＦｖ  ５２ＳＲ４由来のＶＨ及びＶＬ領域を含んでいてもよいことは認識されるであろう。
【００８８】
一実施形態では、ＸはｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドである場合、ＹはｓｃＦｖ又はｓｄＡｂなどの抗体又はその結合断片であり、ＸがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドなどの抗原である。
【００８９】
一実施形態では、ＹはｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｙがペプチドである場合、ＸはｓｃＦｖ又はｓｄＡｂなどの抗体又は結合断片であり、ＹがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｘはペプチドなどの抗原である。
【００９０】
一実施形態では、Ｘ又はＹはペプチドＧＣＮ４（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８）又はそのエピトープ断片である。配列番号１に従ったＧＣＮ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号２として配列番号１Ａに示されている（表１Ａ）。
【表１】
2019507104.tif 000002
【００９１】
ＧＣＮ４ペプチドの他の変異体は表１Ｂ（配列番号７５〜９７）に示されており、太字のアミノ酸は任意選択であり、斜字体のアミノ酸はリンカーの配列を形成する。
【表２】
2019507104.tif 000003
【００９２】
Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ融合物は種々の配向で産生することができ、これはそのような融合物をコードするポリヌクレオチド構築物がＸ又はＡを両方の配向（ＡのＣ末端がＸのＮ末端に融合されているＡ−Ｘ又はＸのＣ末端がＡのＮ末端に融合されているＸ−Ａ）で発現するように設計できることを意味すると理解されるべきである。同じことがＹ−Ｂ融合物に当てはまる。Ａ、Ｘ、Ｙ又はＢが融合物のＮ末端にあるかどうかと無関係に、そのような融合物を産生するポリヌクレオチド配列は、細胞外放出を支援するために、融合物のちょうどＮ末端に、シグナルペプチド配列をコードするように設計されたヌクレオチド配列を含むことになる。シグナルペプチドは最終的には成熟融合物から切断される。好ましいシグナルペプチド配列は表１Ａに配列番号１０１〜１０４で示されている。
【００９３】
一実施形態では、Ｘはリンカー、特に本明細書に開示されるリンカーを介して接続される。
【００９４】
一実施形態では、Ｙはリンカー、特に本明細書に開示されるリンカーを介して接続される。
【００９５】
一実施形態では、リンカーは、ＡＡＡＳＧＧＧ  配列番号７４、ＡＳＧＧＧ  配列番号７３、ＡＳＧＧＧＧ  配列番号７１、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  配列番号１８、及びＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ  配列番号７５から選択される。
【００９６】
Ａ又はＢはＦａｂであり対応するＸ又はＹがペプチドである場合、それぞれのＸ又はＹにとってのリンカーは、例えば、ＡＳＧＧＧ又はＡＳＧＧＧＧ又はＡＡＡＳＧＧＧ  配列番号７２でもよい。
【００９７】
Ａ又はＢはｓｃＦｖであり対応するＸ又はＹがペプチドである場合、リンカーは、例えば、ＡＳＧＧＧ又はＡＳＧＧＧＧ又はＡＡＡＳＧＧＧでもよい。
【００９８】
Ａ又はＢはｓｃＦｖであり対応するＸ又はＹがｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、リンカーは、例えば、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳから選択してもよい。
【００９９】
一実施形態では、Ｘ又はＹは５から２５アミノ酸長の範囲のペプチドである。
【０１００】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば８００、７００、６００、５００、４００、若しくは３００ｐＭなどである。
【０１０１】
本開示の二重特異性タンパク質複合体は、ユニットＡ−Ｘ又はユニットＢ−Ｙを発現するのは難しくはないので、スクリーニングにおいて使用するのに適している。それぞれのユニット（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）の発現後に必要な精製の量は最小である又は実際不必要である。二重特異性複合体は、適切なユニットを混合するだけで、すなわち、コンジュゲーション及びカップリング化学反応に頼らなくても１対１のモル比で形成することが可能である。結合パートナーＸとＹは、必要なヘテロ二量体二重特異性複合体を形成するのに有利になるように平衡を動かす。さらに、ヘテロ二量体化の後の複合体形成後の精製はほとんど又は全く必要としない。したがって、多数のＡ−Ｘ及びＢ−Ｙを容易に調製し組み合わせることが可能である。
【０１０２】
一実施形態では、Ａ及び／又はＢはＦｃ領域を含む。
【０１０３】
一実施形態では、本開示の構築物中のＡ及び／又はＢはＦｃ領域を欠く。
【０１０４】
一実施形態では、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体で用いられる１つ又は複数のｓｃＦｖはジスルフィド安定化されている。
【０１０５】
Ｆｃ断片ＣＨ２−ＣＨ３を欠く二重特異性複合体を調製しスクリーニングする能力は、観察される生物活性が実際に複合体中の可変領域対のみに起因することも保証する。本発明の二重特異性複合体の単純さ及びそれを調製する方法の簡単さは、特徴付け、単離目的、等のための迅速で広範なスクリーニングという文脈では大きな利点となる。
【０１０６】
一実施形態では、タンパク質成分Ｂによる目的の可溶性分子の捕捉は、標識されたタンパク質を用いて検出される。標識されたタンパク質は、抗原、完全長抗体などの抗体又はその結合断片でもよい。
【０１０７】
一実施形態では、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂは、複合体を、分析しようとする細胞に導入する前にＡ−ＸとＢ−Ｙをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより調製される。したがって、一実施形態では、方法はＡ−ＸとＢ−Ｙを接触させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップを含む。
【０１０８】
一実施形態では、成分Ａ−ＸとＢ−Ｙは、別々の融合タンパク質としてしかしほぼ同じ時間に、分析しようとする細胞に導入され、細胞の試料に添加後一体となって複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを形成する。
【０１０９】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙはまず、分析しようとする細胞に添加され、その後それぞれ対応する試薬Ｂ−Ｙ及びＡ−Ｘが添加される。時間差は、例えば、１５分から２４時間であってもよい。第２の融合タンパク質を添加後にはじめて、複合体Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂが形成される。
【０１１０】
一実施形態では、本開示に従った複数の二重特異性タンパク質複合体は並行して用いられ、例えば、Ａは固定された特異性を有していてもよく、タンパク質成分Ｂにおいて異なる特異性を有する種々のＢ−Ｘが用いられる。代わりに、Ｂは固定された特異性を有していてもよく、Ａの特異性は変化してもよい。代わりに、ＡとＢは両方とも変化してもよい。
【０１１１】
一実施形態では、本開示の方法はグリッドフォーマットで実施される。
【０１１２】
一実施形態では、本開示の方法はマルチプレックスフォーマットで実施される。
【０１１３】
一実施形態では、本開示の方法はｅｘ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【０１１４】
したがって、一実施形態では、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で同時発現されることはない。これは、そのおかげで、例えば、１００の融合タンパク質を発現し、場合によっては精製することが可能になり、１００の融合タンパク質を種々の並べ替えで続いて混合すれば１０，０００のヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体を提供することが可能になり、そのうちの５，０００が類のない対であるので、有利である。
【０１１５】
これとは対照的に、ある種の先行技術の方法では二重特異性の同時発現が必要であり、したがって、１０，０００の複合体では、１０，０００のトランスフェクション、発現及び精製が必要になる。
【０１１６】
しかし、明白な代替物は、技術的にさらに難問であるが、同じ細胞でＡ−ＸとＢ−Ｙを発現させることを含む。
【０１１７】
有利なことに、これは、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＹ−ＹＢは、その融合タンパク質を互いに混ぜ合わせるだけで容易に会合して二重特異性タンパク質複合体になることが可能であることを意味する。したがって、本開示の二重特異性タンパク質複合体は、抗原結合特異性の、例えば、グリッド状の様式での異なる組合せを有する二重特異性タンパク質複合体の並べ替えの大きなパネルを作製するために、２つの異なるタンパク質を容易に会合することを可能にするモジュラー構造を有する。これのおかげで、相加的、相乗的又は新規の生物学的機能を検出するための多数の二重特異性タンパク質複合体の効率的で系統的なスクリーニングが可能になる。
【０１１８】
ＸとＹが互いに対して特異的であることを考慮すると、このせいで、ホモ二量体を形成する能力が著しく減少する。本明細書ではＸとＹは合わせて結合対又は結合パートナーと呼ばれる。一実施形態では、Ｘは他のＸに対して高い親和性を持たない。一実施形態では、Ｙは他のＹに対して高い親和性を持たない。有利なことに、ＸとＹがホモ二量体を形成せず、このことが望ましくない単一特異性タンパク質複合体の形成を妨げ、所望の二重特異性タンパク質複合体の収量を増やし、単一特異性タンパク質複合体を除去するための面倒な精製ステップの必要性をなくす。
【０１１９】
これにより、大半の先行技術の方法では効率的に得ることができない収量及び／又は精度を持つ二重特異性タンパク質複合体の迅速な会合が可能になり、特に、先行技術の方法では一般に大規模な精製ステップが必要になる。本発明では二重特異性複合体の収量は典型的には７５％又はそれよりも高い。
【０１２０】
さらに、所与の抗原又はエピトープに対する複数の結合領域（可変領域などの）を生物学的機能における微妙な差異を同定するために平行に調べることが可能である。これにより、所与の抗原対に対する可変領域配列の組合せを調査し最適化することが可能になる。
【０１２１】
有利なことに、Ｘ及びＹ成分のせいで、融合タンパク質の異なる並べ替えから構成される二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスを迅速に容易に会合させることができる。
【０１２２】
本方法は、生物学的機能について予め考えられた着想に頼ってはいない。さらに、本方法は、目的の可溶性分子を捕捉すると、検出された細胞（単数又は複数）上で、細胞増殖の阻害又はアポトーシスの誘導などの、それに続く生物学的機能を誘導する又は妨げることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】ペプチド−Ｆａｂ（図中Ｙ−ＢはそれぞれＦａｂ−Ｙと標識されている）に複合体化したＦａｂ−ｓｃＦｖ（図中Ａ−ＸはそれぞれＦａｂ−Ｘと標識されている）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンに結合しており（対して特異的であり）、検出システムは、例えば、細胞から分泌された免疫グロブリンの定常領域に結合する標識された抗体である。
【図２】ｓｃＦｖ−Ｆａｂ（図中Ｙ−ＢはそれぞれＦａｂ−Ｙと標識されている）に複合体化したＦａｂ−ペプチド（図中Ａ−ＸはそれぞれＦａｂ−Ｘと標識されている）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンに結合しており（対して特異的であり）、検出システムは、例えば、細胞から分泌された免疫グロブリンの定常領域に結合する標識された抗体である。
【図３】ペプチド−Ｆａｂ（図中Ｙ−ＢはそれぞれＦａｂ−Ｙと標識されている）と複合体化しているＦａｂ−ｓｃＦｖ（図中Ａ−ＸはそれぞれＦａｂ−Ｘと標識されている）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンにも結合している抗原に結合し（対して特異的であり）、検出システムは標識された抗体である。Ｆａｂ  Ｂ及び分泌された免疫グロブリンは抗原上の異なるエピトープに結合する。
【図４】ｓｃＦｖ−Ｆａｂ（それぞれＹ−Ｂ）に複合体化しているＦａｂ−ペプチド（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンにも結合している抗原に結合し（対して特異的であり）、検出システムは標識された抗体である。Ｆａｂ  Ｂ及び分泌された免疫グロブリンは抗原上の異なるエピトープに結合する。
【図５】ペプチド−Ｆａｂ（それぞれＹ−Ｂ）と複合体化しているＦａｂ−ｓｃＦｖ（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンに結合し（対して特異的であり）、検出システムは、細胞から分泌された免疫グロブリンにも結合している抗原（任意選択で標識もされる）に結合する標識された抗体である。すなわち、標識された抗体は分泌された免疫グロブリンを間接的に標識している。
【図６】ｓｃＦｖ−Ｆａｂ（それぞれＹ−Ｂ）に複合体化しているＦａｂ−ペプチド（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンに結合し（対して特異的であり）、検出システムは細胞から分泌された免疫グロブリンにも結合している抗原（任意選択で標識もされる）に結合する標識された抗体である。すなわち、標識された抗体は分泌された免疫グロブリンを間接的に標識している。
【図７】ペプチド−抗原（それぞれＹ−Ｂ）と複合体化しているＦａｂ−ｓｃＦｖ（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、抗原Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンが特異的に結合しており、検出システムは、例えば、分泌された免疫グロブリンの定常領域に結合している標識された抗体である。
【図８】ｓｃＦｖ−抗原（それぞれＹ−Ｂ）と複合体化しているＦａｂ−ペプチド（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、抗原Ｂは細胞から分泌された免疫グロブリンが特異的に結合しており、検出システムは、例えば、分泌された免疫グロブリンの定常領域に結合している標識された抗体である。
【図９Ａ】ペプチド−Ｆａｂ（それぞれＹ−Ｂ）と複合体化しているＦａｂ−ｓｃＦｖ（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌される分子に特異的に結合し、検出システムは可溶性分子に結合する標識された抗体である。Ｆａｂ  Ｂ及び検出標識された抗体は可溶性分子上の異なるエピトープに結合する。
【図９Ｂ】ｓｃＦｖ−Ｆａｂ（それぞれＹ−Ｂ）と複合体化しているＦａｂ−ペプチド（それぞれＡ−Ｘ）を示す図であり、Ｆａｂ  Ａは細胞表面受容体に結合しており（対して特異的であり）、Ｆａｂ  Ｂは細胞から分泌される分子に特異的に結合し、検出システムは可溶性分子に結合する標識された抗体である。Ｆａｂ  Ｂ及び検出標識された抗体は可溶性分子上の異なるエピトープに結合する。
【図１０】本発明による二重特異性タンパク質複合体の一般的構造及び会合の模式図である。
【図１１】本発明による二重特異性タンパク質複合体の形成を示す図であり、ＡはそのＣ末端で５２ＳＲ４  ｓｃＦｖにより表されるＸを融合しているＦａｂであり、ＢはそのＣ末端でＧＣＮ４ペプチド（７Ｐ１４Ｐ）により表されるＹを融合しているＦａｂである。
【図１２】抗体複合体結合のフローサイトメトリー検出を示すグラフである。
【図１３】ＧＣＮ４ペプチドに対する５２ＳＲ４  ｓｃＦｖのＳＰＲ親和性決定を示す表とグラフである。
【図１４】精製されたＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）及び精製されたＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）のサイズ排除クロマトグラムである。
【図１５】精製されたＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）及びＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）を示すサイズ排除クロマトグラムである。
【図１６】Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）１対１混合物の５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ濃度でのサイズ排除クロマトグラムである。
【図１７】ヒトＩｇＧ結合を示すグラフである。
【図１８】形質細胞に結合する抗ＣＤ１３８を示すグラフである。
【図１９】偽トランスフェクト細胞は中黒バーであり、ＣＤ１３８のみトランスフェクト細胞は縦の黒線であり、ＩｇＧのみトランスフェクト細胞は横の黒線であり、二重トランスフェクト（ＣＤ１３８及びＩｇＧ）細胞は黒点のバーである。
【図２０】ＣＤ１３８Ｆａｂ−Ｙは中黒バーとして示され、ＣＤ４５Ｆａｂ−Ｙは斜め縞バーとして示されている。二次抗体のみは白バーとして示されている。
【図２１】Ｔ細胞  ＩｇＧ捕捉は白バーで示され、形質細胞捕捉は中黒バーで示されている。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
検出が標識されたタンパク質、例えば、タンパク質成分Ａ又はＢの一部に結合する抗体である、これらの図の変形が想定されている。
【０１２５】
検出が、例えば、図６にある標識されたタンパク質であり、標識された抗原が用いられ、次にさらなる標識された抗体が必ず用いられる、これらの図の変形が想定されている。
【０１２６】
本明細書で使用される「二重特異性タンパク質複合体」とは、ヘテロ二量体繋により一緒に保持される２つのタンパク質を含む分子（本明細書で二重特異性成分と呼ばれるＡ及びＢは本明細書では二重特異性のそれぞれ第１のタンパク質成分及び第２のタンパク質成分とも呼ばれる）のことである。一実施形態では、タンパク質のうちの１つ又は両方は結合ドメインを有しており、例えば、タンパク質のうちの１つ又は両方は抗体又はその断片である（特に、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片）。
【０１２７】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、結合パートナーＸ又はＹに融合しているタンパク質成分Ａ又はＢを含む（必要に応じて）。一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子構築物から組換え技法により発現される、例えば、ＤＮＡ構築物から宿主において発現される翻訳タンパク質である。本開示の文脈では、融合タンパク質の鍵となる特徴の１つは、このタンパク質が細胞から「単一タンパク質／ユニット」として発現することが可能であることである（当然のことながら、Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片を含む融合タンパク質の場合では、２つの鎖が存在することになるが、これは本明細書の目的のために、１つの鎖、典型的には重鎖が、場合によって本明細書で下に記載されるリンカーを介して、必要に応じてそのＣ末端でＸ又はＹに融合されている単一タンパク質と見なすことになる）。
【０１２８】
ヘテロ二量体繋Ｘ：Ｙの機能は、ＡとＢの相乗的機能をもたらす、又は例えば、本明細書に記載される方法を用いて、同定することができるように、タンパク質ＡとＢを互いの近傍に保持することである。
【０１２９】
本明細書で用いられる場合「ヘテロ二量体繋」とは、２つの結合パートナーを一緒に保持するのに十分である全体的親和性を有する互いの間の相互作用：（結合などの）を形成する２つの異なる結合パートナーＸとＹを含む繋のことである。一実施形態では、Ｘ及び／又はＹはホモ二量体を形成するには不適切である。
【０１３０】
ヘテロ二量体的に繋がれたヘテロ二量体繋は本明細書では互換的に使用される。
【０１３１】
一実施形態では、本明細書で用いられる「ホモ二量体を形成するには不適切な」とは、ホモ二量体よりもＸ−Ｙのヘテロ二量体の形成のほうが好ましい、例えば、形成された後は、熱力学的に安定ななどのより安定している形態のことである。一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は一価である。
【０１３２】
一実施形態では、Ｘ−Ｙ相互作用はＸ−Ｘ又はＹ−Ｙ相互作用よりも都合がよい。このせいで、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙが混合されると、ホモ二量体Ｘ−Ｘ又はＹ−Ｙの形成は減少する。典型的には、１対１モル比の混合に続いて７５％を超えるヘテロ二量体が形成される。
【０１３３】
例えば、本開示による融合タンパク質及び／又は二重特異性タンパク質複合体を精製するために、必要に応じて、カラムクロマトグラフィーなどの精製ステップ（特に、１ステップ精製）を用いることができる。
【０１３４】
一実施形態では、典型的には凝集体レベルは低いけれども、それぞれの融合タンパク質に発現後精製ステップが提供される。したがって、一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合に先立って、融合タンパク質（単数又は複数）は実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で用いられる実質的に純粋な形態とは、融合タンパク質が９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％単量体である場合のことである。
【０１３５】
一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【０１３６】
一実施形態では、それぞれの融合タンパク質ユニットは異なる発現実験／実行で発現される。
【０１３７】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体を産生するために混合前には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。一実施形態では、混合前及び／又は後には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【０１３８】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体形成後には精製は必要ではない。一実施形態では、混合後及び一般には追加の精製なしで、組成物の少なくとも５０％は所望の二重特異性タンパク質複合体であり、例えば、組成物の少なくとも６０、６５、７０、７５、８０％は必要とされる二重特異性タンパク質複合体である。
【０１３９】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、１．５対１又は２対１などのＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙで０．８対１から３対１である。
【０１４０】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、特にモル比で、１．５対１又は２対１などのＢ−Ｙ対Ａ−Ｘで０．８対１から３対１である。
【０１４１】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられるＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙの比は、１対１、特に１対１モル比である。
【０１４２】
本開示は、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙを、例えば、１対１モル比で混合することを含む、本開示に従った二重特異性複合体を調製する方法までにも及ぶ。
【０１４３】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。
【０１４４】
一実施形態では、混合は分析しようとする細胞を含有する試料中で起こり、すなわち、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙは、個々の融合タンパク質を導入後互いに相互作用する。
【０１４５】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、すなわち、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙは対象の身体内で互いに相互作用してヘテロ二量体繋を、その結果、二重特異性タンパク質複合体を形成する。
【０１４６】
一実施形態では、ＸとＹは互いに完全に特異的であり、細胞内又は対象の身体内では他のいかなるペプチド／タンパク質とも結合しない。これは、例えば、ＸとＹが標的細胞中にも標的対象身体中にも天然に存在しないことを保証することによって達成することが可能である。これは、例えば、対象にとっては異なっている種又は実体（例えば、酵母タンパク質）由来であるＸ又はＹを選択し、それに対しもう１つの可変因子が特異的であることを保証することによって達成することが可能である。有利なことに、これにより融合タンパク質Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙが望ましくない標的へ結合して、それによって望まれない非特異的な効果を生じるのが妨げられる。
【０１４７】
一実施形態では、結合パートナーのうちの１つ（又は少なくとも１つ）はホモ二量体を形成することができず、例えば、結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化する。
【０１４８】
一実施形態では、結合パートナーの両方がホモ二量体を形成することができず、例えば、ペプチド結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化し、それに特異的なｓｄＡｂが用いられる。
【０１４９】
本明細書で用いられるホモ二量体も凝集体も形成することができないとは、ホモ二量体又は凝集体を形成する傾向が低い又はないことである。本明細書で用いられる低いとは、例えば、混合又は発現又は精製後、４、３、２、１、０．５％若しくはそれ未満の凝集体などの、５％又はそれ未満のことである。
【０１５０】
融合タンパク質中の少量の凝集体又はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体中に残存するものは一般に本開示のスクリーニング法に最小限の効果を及ぼす。したがって、一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）及び／又は二重特異性タンパク質複合体（単数又は複数）の精製は方法においては、特に混合ステップ後には用いない。
【０１５１】
一実施形態では、：は、水素結合及び静電気相互作用などの、引力、例えば、ファンデルワールス力に基づく、特に、抗原（ペプチドなどの）に対する抗体特異性に基づく結合相互作用である。
【０１５２】
一実施形態では、：は、クリックケミストリーなどの特定の化学的相互作用から形成される共有結合である。一実施形態では、：は共有結合ではない。一実施形態では、コンジュゲーション／カップリング化学反応は本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製するのに用いられない。
【０１５３】
本明細書で用いられる「複合体を形成する」とは、結合相互作用又は化学反応を含む相互作用のことであり、この相互作用は複合体が会合し融合タンパク質が一緒に保持される適切な条件下で融合タンパク質成分Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが接触するときには十分に特異的で強力である。
【０１５４】
本明細書で用いられる「一緒に保持される」とは、Ｘ：Ｙ結合後、複合体を１つの分子であるかのように取り扱うことができ、多くの場合に単一分子のように振る舞い機能するようにその成分（融合タンパク質）を互いに近傍に保持することである。一実施形態では、保持によって複合体は本明細書で開示される方法において使用するのに適したものになる、すなわち、少なくとも１つの機能スクリーニングにおいて使用するのに適したものになる。
【０１５５】
本明細書で用いられる特異性とは、例えば、相互作用におけるパートナー、例えば、Ｘ：Ｙ若しくはＡと抗原若しくはＢと抗原が互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、無関係の非パートナータンパク質への結合のバックグランドレベルと比べて、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０１５６】
本明細書で用いられるＸとＹに関する特異性とは、相互作用にある結合パートナーＸとＹが互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０１５７】
一実施形態では、結合相互作用は可逆的である。一実施形態では、結合相互作用は基本的に非可逆的である。
【０１５８】
本明細書で用いられる基本的に非可逆的であるとは、抗体又は結合断片の遅いオフレート（解離定数）のことである。
【０１５９】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は低い解離定数を有する。低い解離定数の例には、１〜９×１０−２ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１〜９×１０−３ｓ−１、１〜９×１０−４ｓ−１、１〜９×１０−５ｓ−１、１〜９×１０−６ｓ−１、１〜９×１０−７ｓ−１が含まれる。特に適した解離定数には、２×１０−４ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１×１０−５ｓ−１、１×１０−６ｓ−１又は１×１０−７ｓ−１が含まれる。
【０１６０】
理論に縛られたくはないが、低い解離定数（オフレートとも呼ばれる）であれば分子は、二重特異性タンパク質複合体が特に機能スクリーニングアッセイにおいて有用になるほど安定していることができると考えられる。
【０１６１】
一実施形態では、ＸとＹの互いに対する親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００若しくは５０ｐＭ又はそれよりも強い。
【０１６２】
親和性は実体のオンレートとオフレートから計算される値である。本明細書で用いられる場合用語「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、ペプチド）の間の非共有結合的相互作用の総計の強さのことである。その結合パートナーに対する分子の親和性は一般に解離定数（ＫＤ）により表すことが可能である。親和性は、表面プラズモン共鳴法、特にＢＩＡコアなどの本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することが可能である。
【０１６３】
しかし、複合体を１つにまとめておく能力は親和性のことだけではない。理論に縛られたくはないが、実際に、３つの重大な成分：オンレート、オフレート及び親和性があると本発明者らは仮定している。親和性の計算はオンレートとオフレートに基づいている。したがって、オンレートが低くオフレートが速い場合には、親和性は低くなり、それでは二重特異性タンパク質複合体を１つにまとめておくのに十分ではなくなる。しかし、遅いオンレートは遅いオフレートにより埋め合わせされて、全体的に適切な親和性をもたらすことができると考えられる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、高いオンレートは複合体を１つにまとめておくのに十分である場合がある。
【０１６５】
複合体で用いられる結合パートナー（Ｘ及びＹ）が遅いオンレートを有する場合、成分を混合して複合体を形成させた後に追加の時間が必要になる可能性がある。
【０１６６】
結合パートナー間の親和性が十分に高い場合、二重特異性タンパク質複合体のタンパク質（Ａ及びＢ）の親和性がその標的に弱い結合しかしなくても、二重特異性タンパク質複合体は、その所望の生物学的機能を実施することが可能である場合がある。逆に、タンパク質（Ａ及びＢ）がその標的に強く結合することができる場合、結合パートナー（Ｘ及びＹ）の互いに対する親和性がさらに低くても同じ生物学的機能を達成することが可能である場合がある。言い換えると、結合パートナー間のさらに高い親和性が標的に対するもっと低い親和性の埋め合わせができる及び逆も同じであるように「三位一体」の関係が存在する。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＨ１などの重鎖中の定常ドメインとＣＫａｐｐａなどの軽鎖中の定常ドメインの間の相互作用は、本開示に従った二重特異性複合体の形成及び／又は安定性に寄与する。したがって、本開示の二重特異性複合体のある特定の実施形態でＦａｂ又はＦａｂ’断片を用いることは有利である。
【０１６８】
一実施形態では、本開示の二重特異性複合体はエフェクター機能のある成分を含まない、例えば、複合体はＣＨ１及びＣＫａｐｐａ又はＣＬａｍｂｄａ以外の定常ドメインを含まない、特にＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４及びその組合せを含む群から独立して選択される定常ドメインを含まない。一実施形態では、本開示の二重特異性複合体はＦｃ領域を欠く。
【０１６９】
細胞表面マーカーは、実体、例えば、細胞を同定する及び／又は単離するために単独で又は他の表面マーカーと組み合わせて用いる細胞表面で発現されるタンパク質である。マーカーは細胞の系譜若しくは細胞の活性化状態、細胞により発現される分子又は同類の物と関連していることがある。
【０１７０】
本明細書で用いられる目的の可溶性分子とは、細胞により分泌され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの前記分子は分泌後沈殿しない分子のことである。細胞により分泌される可溶性分子の例は本明細書に提供されており、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、走化性因子、ロイコトリエン、プロスタグランジン、血管作動性アミン、酵素、補体及び補体の断片、脂質、スフィンゴ脂質、第二メッセンジャー成分（例えば、一酸化窒素、サイクリックＡＭＰ、等）、ビタミン、ミネラル、陽イオン、陰イオン、糖、凝固因子、急性期タンパク質、ガンマグロブリン（免疫グロブリンを含む）、アルブミン、可溶性細胞膜受容体、細胞発現タンパク質のスプライスバリアント、核酸、小さな膜小胞（エキソソーム、微小胞、リポソーム、等などの）、分泌ペプチド、免疫複合体並びに死んでいる又は死にかけている細胞由来の細胞内タンパク質を含む。
【０１７１】
本明細書で用いられる「マルチプレックス」とは、本開示に従った複数の二重特異性タンパク質複合体を、例えば、同一物の分析からの読み出し情報の絡まりを解く必要があるように、同じポットで本質的に同時に組み合わせることである。
【０１７２】
一実施形態では、同時にとは、シグナル出力が本質的に同じ時間に機器により分析される共存分析のことである。このシグナルは得られた結果を解釈するためには逆重畳積分が必要になることがある。
【０１７３】
有利なことに、複数の二重特異性タンパク質複合体を試験すれば、分子を分泌している細胞の、したがって、新しい興味深い生物学的機構の同定を求めて多数の二重特異性タンパク質複合体をさらに効率よくスクリーニングすることが可能になる。
【０１７４】
一実施形態では、マルチプレックスは、特に、グリッド２から１００の第１及び第２の融合タンパク質（Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙ）において混合することから作製される、２から数十万のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、例えば、２から１００，０００又は２から１０，０００などの２から５００，０００の前記複合体を含む。一実施形態では、マルチプレックスは、例えば、２から９００、２から８００、２から７００、２から６００、２から５００、２から４００、２から３００、２から２００、２から１００、２から９０、３から８０、４から７０、５から６０、６から５０、７から４０、８から３０、９から２５、１０から２０又は１５などの２から１０００の二重特異性タンパク質複合体を含む。
【０１７５】
一実施形態では、このマルチプレックス中のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質の数はｎ２であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれよりも多い。
【０１７６】
一実施形態では、方法は、グリッド又はアレイ、例えば、マイクロタイタープレートで実施され、マイクロプレートのそれぞれのウェルは異なる二重特異性タンパク質複合体を含有することができる。二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面、例えば、ビーズに繋ぎ留めることができる、又は二重特異性タンパク質複合体は、例えば、ウェル内で若しくは液滴内で液体（例えば、溶液又は培養液）の形態で懸濁されることもできる。
【０１７７】
一実施形態では、マルチプレックス中のすべての「Ａ」は異なるタンパク質であり、好ましくは標的抗原に結合する抗体若しくはその結合断片であり、すべての「Ｂ」は異なるタンパク質であり、好ましくは標的抗原に結合する抗体若しくはその結合断片である。
【０１７８】
一実施形態では、マルチプレックスは下で考察されるグリッド、例えば、８×８、１６×１６又は１６×２０で提供され、これはそれぞれ６４、２５６又は３２０試料に等しい。
【０１７９】
本明細書で用いられる「グリッド」とは、タンパク質Ａ（Ａ−Ｘで）などの１つの可変因子はＸ軸（水平軸）などの１つの軸に沿って変え、タンパク質Ｂ（Ｂ−Ｙで）などの別の可変因子はＹ軸（垂直軸）などのもう１つの軸に沿って変える２次元プロット又はアレイのことである。この配置は可変因子の種々の組合せ（並べ替え）を系統的に評価することを支援する。
【０１８０】
一実施形態では、アレイは９６ウェルプレート上で提供され、分析される試料はその倍数、すなわち、９６、１９２、３８４、等でもよい。
【０１８１】
有利なことに、グリッド配置は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の生物学的機能を効率的にスクリーニングするのに特に有利である。図３はそのようなグリッドの例を示しており、４つの第１の融合タンパク質は４つの第２の融合タンパク質と容易に組み合わせて１６の二重特異性タンパク質複合体を産生することが可能である。
【０１８２】
スクリーニンググリッドの他の変動は当業者には明らかであり、例えば、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）中の第１のタンパク質（Ａ）は一定に保ち、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｘ）中の第２のタンパク質（Ｂ）は変化させる。これは、予め選択された第１のタンパク質との相乗的機能について多数の異なる第２のタンパク質を迅速にスクリーニングするために有用であり得る。
【０１８３】
別の実施形態では、タンパク質Ａは、それぞれの抗体変異体が同じ抗原に特異的であるが可変領域の異なる組合せを有するように、タンパク質Ａの抗体可変領域を変えることにより１つの軸に沿って変化する。タンパク質Ｂは一定に保つことができる又は同じ様式で変化する若しくは抗原特異性がＢタンパク質について変化する（グリッドを横切る又は下る）ように変化することもできる。
【０１８４】
一実施形態では、本開示に従った「共通の」第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）がそれぞれのウェル内に存在することができる。次に、本開示に従った一定範囲の異なる第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）をそれぞれのウェル内に分注することができる。それに続いて、２つの結合パートナー（Ｘ及びＹ）の特異的な結合相互作用は２つの融合タンパク質を物理的に近づけて二重特異性タンパク質複合体を形成させる。これにより、すべてが第１の標的細胞抗原に結合している（Ａが結合している）がそれぞれの二重特異性タンパク質複合体に異なっていてもよい第２の可溶性標的抗原（Ｂが結合している）にも結合することができる二重特異性タンパク質複合体を含むアレイが得られる。
【０１８５】
一実施形態では、Ａ−Ｘ融合タンパク質は同じ細胞表面標的抗原に対して異なる可変領域を含み、Ａ−Ｘ中の可変領域と組み合わされた場合、Ｂが結合する所与の標的抗原の可変領域及び／又はエピトープの最適化を可能にする。
【０１８６】
一実施形態では、Ｂ−Ｙ融合タンパク質は同じ可溶性標的抗原に対して異なる可変領域を含み、Ａ−Ｘ中の可変領域と組み合わされた場合、Ｂが結合する所与の標的抗原の可変領域及び／又はエピトープの最適化を可能にする。
【０１８７】
当業者であれば、マルチプレックス中のそれぞれの位置の二重特異性タンパク質複合体の所望の特異性を容易に制御することが可能であるように、上記の異なる変動も認識している。これにより、そのようなマルチプレックスが結合及び機能的アッセイにおいて使用された場合、二重特異性タンパク質複合体の異なる組合せの効率的なスクリーニングが可能になる。一実施形態では、要因計画を用いてグリッドで用いられる可変因子を定義する。
【０１８８】
一実施形態では、本開示の方法はハイスループット分析に貢献する。
【０１８９】
一実施形態では、複数の二重特異性タンパク質複合体は平行して又は基本的の同時に試験される。
【０１９０】
本開示の方法により同定される細胞は、ＦＡＣＳ、磁気ビーズ、マイクロ流体技術又は当技術分野で利用可能な別の方法などの技法を用いて選別することが可能である。
【０１９１】
一実施形態では、結合対の第１の結合パートナーＸと第２の結合パートナーＹのうちの少なくとも１つは、独立してペプチド及びタンパク質から選択され、例えば、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーはペプチドである。
【０１９２】
適切なペプチドには、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ヒト及びマウスＦｏｓはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１１００及びＰ０１１０１を有し、ヒト及びマウスＪｕｎはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号０５４１２及び０５６２７を有する）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素のアミノ酸９８から１０６に対応するＨＡタグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ及びＦＬＡＧを含む群を含む。他のペプチドも本開示において使用するのに適切と予想されており、特に適切なペプチドはタンパク質精製のためのアフィニティータグである。なぜならば、そのようなペプチドはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０１９３】
一実施形態では、ペプチドはＥ５Ｂ９ではない。
【０１９４】
本明細書で用いられる場合用語「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の短いポリマーのことであり、ペプチドは２〜１００の範囲で、例えば、６から９８、７から９７、８から９６又は５から２５などの５から９９のアミノ酸を含有する。一実施形態では、本開示で用いられるペプチドは５０アミノ酸残基又はそれよりも少ない、例えば、４０、３０、２０、１０又はそれよりも少ないアミノ酸配列である。
【０１９５】
一実施形態では、タンパク質は抗体又は抗体断片である。
【０１９６】
本明細書で用いられる場合用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書では結合部位とも呼ばれる）を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチド、等などの標的抗原への特異的結合ができる免疫グロブリン分子のことである。
【０１９７】
本明細書で使用されるように、「抗体分子」には抗体及びその結合断片が含まれる。
【０１９８】
本明細書で用いられる「抗体断片」又は抗体の「抗原結合断片」とは、天然に存在するものであれ人工的なものであれ、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、二、三又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない抗体の断片のことである（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217参照）。
【０１９９】
これらの抗体断片を作製し製造するための方法は当技術分野では周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181参照）。本開示で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、国際特許出願ＷＯ０５／００３１７０及び国際特許出願ＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は複数の特異性体、例えば、二重特異性体を含んでいてもよく又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２参照）。
【０２００】
本明細書で用いられる「抗原結合断片」とは、ペプチド又は抗原に対して特異的な断片を特徴付けるのに十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができる断片のことである。
【０２０１】
本明細書で用いられる場合用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬ（可変軽）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片並びに重鎖のＶＨ（可変重）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片のことである。一例では、Ｆａｂ断片の重鎖配列はＣＨ１の鎖間システインで「終わる」。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ断片は一価である。
【０２０２】
本明細書で用いられるＦａｂ’断片とは、ヒンジ領域のすべて又は一部をさらに含むＦａｂ断片のことである。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ’断片は一価である。
【０２０３】
本明細書で用いられる場合用語「単鎖Ｆｖ」又は略記して「ｓｃＦｖ」とは、（例えば、ペプチドリンカーにより）連結されたＶＨとＶＬ抗体ドメインを含んだかたちで単一ポリペプチド鎖を形成する抗体断片のことである。重及び軽鎖の定常領域はこのフォーマットでは取り除かれている。本明細書で用いられる単鎖Ｆｖには、そのジスルフィド安定化バージョンが含まれ、これはペプチドリンカーに加えてジスルフィド結合が可変領域間に存在する。
【０２０４】
ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、可変領域が分離し再び一体となることに関係する動力学的に呼吸する一部の可変領域の傾向を取り除くことができる。本明細書で用いられる場合用語「単一ドメイン抗体」とは、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片のことである。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨ又はＶＬ又はｓｄＡｂが含まれる。
【０２０５】
本明細書で用いられる場合用語「ｓｄＡｂ」又は「単一ドメイン抗体（単数又は複数）」とは、単一の抗原結合ドメインを含む分子のことである。ｓｄＡｂは人工的に作られても天然に存在するものでもよく、ＶＨのみ、ＶＬのみ、ラクダ科ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体、ＩｇＮＡＲなどのサメ由来抗体を含むがこれらに限定されない。
【０２０６】
一実施形態では、抗体結合断片及び／又は二重特異性抗体複合体はＦｃ領域を含まない。本明細書で用いられる「Ｆｃ領域を含まない」とは、非存在であるＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４などのもっと低い定常ドメインのことである。しかし、ＣＨ１、ＣＫａｐｐａ／ＣＬａｍｂｄａなどの定常ドメインは存在する場合がある。
【０２０７】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０２０８】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０２０９】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質Ａ及び／又は第２のタンパク質Ｂは抗体又は抗体断片である。そのような二重特異性タンパク質複合体は二重特異性抗体複合体と呼ぶこともできる。
【０２１０】
二重特異性タンパク質複合体は、ＸとＹにより１つに繋ぎ合わされた、細胞表面に結合することができるタンパク質と細胞から分泌される可溶性分子に結合することができるタンパク質を含む。
【０２１１】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は二重特異性抗体複合体である。
【０２１２】
一実施形態では、本明細書で用いられる「二重特異性タンパク質複合体」とは、少なくとも２つの抗体結合部位を含み、成分抗体、断片又は両方がヘテロ二量体繋で１つに複合体化されている二重特異性タンパク質複合体のことである。
【０２１３】
本明細書で用いられる複合体化されたとは一般に、Ａ−ＸとＢ−Ｙが相互作用Ｘ：Ｙにより１つに繋ぎ合わされている場合のことである。
【０２１４】
本明細書で用いられる複合体化されていないとは、Ａ−ＸとＢ−Ｙが別々の分子の場合のことである。
【０２１５】
一実施形態では、Ｂ及び検出のための標識された抗体（例えば、抗体、断片又は抗体と断片の組合せ）は同じ抗原を標的とし、例えば、同じ標的抗原上の２つの異なるエピトープに結合する。別の実施形態では、Ｂ及び検出のための標識された抗体（例えば、抗体、断片又は抗体と断片の組合せ）は異なる抗原特異性を有し、例えば、２つの異なる標的抗原に結合することがある。
【０２１６】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体で用いられるそれぞれの抗体又は断片は１つの結合部位を含む、すなわち、それぞれの結合部位は標的抗原ごとに一価である。
【０２１７】
本明細書で用いられる場合、抗原とは、適切な条件下では身体を刺激して自身に対する抗体を産生させる分子のことである。抗原は、通常、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質及び合成若しく天然に存在する化学化合物又はその組合せである。本明細書で使用されるように、用語「抗原」は好ましくは、糖タンパク質などのタンパク質又はタンパク質と膜脂質などの脂質の複合体、特にＣＤ４５及び免疫グロブリンのことである。融合タンパク質（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）で用いられる完全長抗体又は抗体断片は、単一特異性、一価、多価又は二重特異性でもよい。
【０２１８】
有利なことに、２つの二重特異性抗体又は抗体断片を使用することにより、本開示の二重特異性抗体複合体は潜在的に最大４つの異なる抗原に特異的であることができる（すなわち、複合体は四重特異性であることができる）。これにより結合活性タイプ効果を調べることができる。
【０２１９】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｄＡｂ又は類似のものである。
【０２２０】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又は類似のものである。
【０２２１】
本明細書で用いられる場合「単一特異性」とは、１つの標的抗原のみに結合する能力のことである。
【０２２２】
本明細書で用いられる場合「一価」とは、単一の結合部位を有し、したがって、標的抗原に１回のみ結合するだけである抗体又は抗体断片のことである。
【０２２３】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０２２４】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０２２５】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０２２６】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０２２７】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０２２８】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０２２９】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、１つは抗原ＣＤ３３に特異的であり１つは抗原ＣＤ３に特異的である２つのｓｃＦｖ又は代わりにこれら２つの抗原に特異的な二重特異性複合体フォーマットを含む融合タンパク質ではない。
【０２３０】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、ペプチドＥ５Ｂ９に連結されたＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（又は代わりに別の抗体フォーマット）を含む融合タンパク質ではない。
【０２３１】
本明細書で用いられる場合「結合ドメイン又は部位」は、抗体のうち抗原／エピトープに接触しそれとの結合相互作用に関与する部分である。一実施形態では、結合ドメインは少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば、可変ドメイン又はその誘導体の同族対などの可変ドメイン又はその誘導体の対を含有する。
【０２３２】
一実施形態では、結合ドメインは、特に、結合ドメインがＶＨ、ＶＬ又はｓｄＡｂなどのドメイン抗体である場合には、３つのＣＤＲを含む。一実施形態では、結合ドメインは２つの可変ドメイン及び６つのＣＤＲ及びフレームワークを含み、合わせてこれらのエレメントは、抗原／エピトープとの抗体又は結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
【０２３３】
本明細書で用いられる場合「同族対」とは、前もって形成されたカップルとして宿主から単離される重軽鎖対のことである。この定義は、宿主由来の初めの対合が保持されていないライブラリーから単離される可変ドメインを含まない。同族対は有利である可能性がある。なぜならば、同族対は宿主において成熟された親和性である場合が多く、したがって、その対が特異的である抗原に対して高い親和性を有する可能性があるからである。
【０２３４】
本明細書で用いられる場合「天然に存在するドメインの誘導体」は、例えば、望ましくない特性を取り除くことなどによりドメインの特性を最適化するために、天然に存在する配列中の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が置き換えられている又は欠失しているが、ドメインの特徴的な特色（単数又は複数）は保持されていることを指すことを意図している。改変の例は、グリコシル化部位、ＧＰＩアンカー、又は溶媒曝露リシンを取り除く改変である。これらの改変は、関連するアミノ酸残基を保存的アミノ酸置換で置き換えることにより達成することが可能である。
【０２３５】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体又はその抗体／断片成分は処理されて、標的抗原（単数又は複数）に対する改善された親和性を提供する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異する（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発菌種の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及び性的ＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールにより得ることが可能である。Vaughanら（上記）は親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【０２３６】
一実施形態では、第１の抗体又は抗体断片（Ａ）は第１の抗原に対して特異的であり、第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）は第２の抗原に対して特異的であり、一般に、第１と第２の抗原は異なっている。これにより、抗体複合体が、それぞれが異なる実体上に位置している２つの異なる抗原に結合し、それによって２つの実体を物理的に互いに近接させる可能性が提供される。
【０２３７】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂであってよい。
【０２３８】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂ’であってよい。
【０２３９】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はｓｃＦｖでもよい。
【０２４０】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１（Ａ）若しくは第２（Ｂ）の抗体／断片又は第１と第２の抗体／断片の両方はｓｄＡｂである。
【０２４１】
便宜上、本開示の二重特異性タンパク質複合体は本明細書ではＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂと呼ばれる。Ａ及びＢ並びにＸ及びＹは本技術の説明を支援するために言及される名目ラベルである。
【０２４２】
本明細書で用いられる場合「付加されている（attached）」とは、その例が下で考察されるペプチドリンカーなどのリンカーを介して直接的に又は間接的に連結している又は結合していることである。直接的に連結しているには、一つに融合している（例えば、ペプチド結合）又は化学的にコンジュゲートしているが含まれる。
【０２４３】
本明細書で用いられる場合「結合パートナー」とは、結合対の１つの成分部分のことである。
【０２４４】
一実施形態では、結合パートナーの親和性は高く、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００ｐＭ又はそれよりも強いなどの５ｎＭ又はそれよりも強い。
【０２４５】
本明細書で用いられる場合「結合対」とは、互いに特異的に結合する二つの結合パートナーのことである。結合対の例には、ペプチドとそれに特異的な抗体若しくは結合断片、又は酵素とリガンド、又は酵素とその酵素の阻害剤が含まれる。
【０２４６】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はｓｄＡｂが含まれる。
【０２４７】
Ｘが抗体又はその結合断片である場合、Ｙはタンパク質又はペプチド、特に、ペプチドである。
【０２４８】
一実施形態では、第２のパートナー（Ｙ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はｓｄＡｂが含まれる。
【０２４９】
Ｙが抗体又はその結合断片である場合、Ｘはタンパク質又はペプチド、特に、ペプチドである。
【０２５０】
一実施形態では、Ａが抗体又はその断片である場合、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片（Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２５１】
別の実施形態では、Ｂが抗体又はその断片である場合、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２５２】
一実施形態では、Ｘは抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙは抗体又は断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２５３】
一実施形態では、Ｘは抗体若しくは断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端にリンカー（ＡＳＧＧＧＧ  配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ  配列番号７２又はＡＳＧＧＧ  配列番号７３又はＡＡＡＳＧＧＧ  配列番号７４などの）又は当技術分野で公知の若しくは本明細書の下に記載されている他の任意の適切なリンカーを介して結合しており、Ｙは抗体若しくは断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端にリンカー（ＡＳＧＧＧＧ  配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ  配列番号７２又はＡＳＧＧＧ  配列番号７３又はＡＡＡＳＧＧＧ  配列番号７４などの）を介して結合している。
【０２５４】
適切な結合対（Ｘ又はＹ）の例は、ＧＣＮ４（配列番号１又はＨＩＳタグを欠く、配列番号１のアミノ酸１〜３８）又はその変異体（例えば、配列番号７６〜９８により示される配列のうちのいずれか）及びＧＣＮ４に対して特異的であるｓｃＦｖである、５２ＳＲ４（配列番号３又はＨＩＳタグを欠く、配列番号３のアミノ酸１から２４３）又はその変異体を含んでいてもよい。
【０２５５】
一実施形態では、第１の結合パートナー（通常はＸ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１に示される）又はその断片若しくは変異体（例えば、Ｈｉｓタグなし又は配列番号７６〜９８により示される配列のうちのいずれか）であり、第２の結合パートナー（通常はＹ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂ（例えば、配列番号３、９９又は１００に示される）又はその変異体である。
【０２５６】
一実施形態では、第１の結合パートナー（通常はＸ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂ（例えば、配列番号３、９９又は１００に示される）又はその変異体であり、第２の結合パートナー（通常はＹ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１に示される）又はその断片若しくは変異体（例えば、配列番号７６〜９８により示される配列のうちのいずれか）である。
【０２５７】
ＧＣＮ４変異体には、配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。ＧＣＮ４変異体には、ヌクレオチド配列配列番号２によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号２にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２５８】
ＧＣＮ４に特異的な適切なｓｃＦｖは５２ＳＲ４（配列番号３）又はその変異体（配列番号９９又は１００）である。５２ＳＲ４の変異体には配列番号３に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。５２ＳＲ４の変異体には、ヌクレオチド配列番号４によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号４にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる配列に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２５９】
本発明者らは、単鎖抗体５２ＳＲ４及びペプチドＧＣＮ４は本開示の二重特異性タンパク質複合体において使用するのに適した結合対であることを見出していた。
【０２６０】
代わりに、いかなる適切な抗体／断片及び抗原（ペプチドなどの）でもＸ及びＹとして用いることができる。好ましくは、そのようなＸとＹの対からは、Ａ−ＸとＹ−Ｂが１対１のモル比で組み合わされると７５％よりも多くのヘテロ二量体が得られる。
【０２６１】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）及び第２の結合パートナー（Ｙ）はタンパク質である。
【０２６２】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はリガンドである又はその逆もまた同じである。
【０２６３】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はその酵素の阻害剤である又はその逆もまた同じである。
【０２６４】
本明細書で用いられる場合「活性断片」とは、アミノ酸断片のことであり、これは実体では全アミノ酸配列よりも少なく、基本的に同じ生物活性又は関連する生物活性、例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの５０％を超える活性を保持している。
【０２６５】
別の実施形態では、第１の結合パートナーＸはグルタチオン（ＧＳＨ）であり第２の結合パートナーＹはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である又はその逆もまた同じである。
【０２６６】
別の実施形態では、ＸはＦｏｓでありＹはＪｕｎである又はその逆もまた同じである。
【０２６７】
別の実施形態では、ＸはＨｉｓでありＹは抗Ｈｉｓである又はその逆もまた同じである。
【０２６８】
別の実施形態では、結合対はカルモジュリン結合ペプチドでありＹはカルモジュリンである又はその逆もまた同じである。
【０２６９】
別の実施形態では、Ｘはマルトース結合タンパク質でありＹは抗マルトース結合タンパク質若しくはその断片である又はその逆もまた同じである。
【０２７０】
他の酵素−リガンド組合せも結合パートナーにおいて使用するために想定している。タンパク質精製のための当技術分野で公知の親和性タグも適切である。なぜならば、これらのタグはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０２７１】
「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示している。「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示している。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンの代わりに用いることができる。多くの場合互いに代わりに用いることが可能な他のアミノ酸には、
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−  システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０２７２】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
【０２７３】
一実施形態では、第１又は第２の結合パートナー（Ｘ又はＹ）はタンパク質又はペプチドである。
【０２７４】
リンカーは、融合タンパク質を接続するのに有用であり可能である任意の構造成分であってもよい。一実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は１つ又は複数のペプチドリンカーを含む。リンカーは融合タンパク質中の種々の位置に取り込むことができる。例えば、リンカーは結合パートナーとそれに付加されているタンパク質の間に導入することができる。
【０２７５】
一実施形態では、リンカーはペプチドリンカーであり；代替物は脂質又は糖リンカー又は化学化合物でもよい。
【０２７６】
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」とは、アミノ酸配列を有するペプチドのことである。一定範囲の適切なペプチドリンカーは当業者には公知であろう。
【０２７７】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の結合パートナーはペプチドリンカーを介してそのそれぞれのタンパク質に結合されている。
【０２７８】
一実施形態では、融合タンパク質は翻訳融合であり、すなわち、融合タンパク質が発現されるもとの遺伝子構築物を含む宿主細胞において発現される融合タンパク質である。
【０２７９】
一実施形態では、融合タンパク質は、場合によってはペプチドリンカーを介してＡの重鎖をＸに及び／又はＢの重鎖をＹに融合させることにより調製される。
【０２８０】
一実施形態では、ペプチドリンカーは５０アミノ酸長又はそれよりも少なく、例えば、２０アミノ酸又はそれよりも少ない。
【０２８１】
一般に、融合タンパク質を組換え的に発現させるほうが効率的であり、したがって、宿主細胞において発現させることが可能な直接ペプチド結合又はペプチドリンカーが有利である可能性がある。
【０２８２】
一実施形態では、リンカーは、配列番号５から７２に示される配列（表２、３及び４）又はＰＰＰに一致する配列から選択される。
【表３】
2019507104.tif 000004
【表４−１】
2019507104.tif 000005
【表４−２】
2019507104.tif 000006
【０２８３】
強固なリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６９）、ＰＰＰＰ（配列番号７０）及びＰＰＰが含まれる。
【表５】
2019507104.tif 000007
【０２８４】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を産生する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を作製するステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を作製するステップと、
（ｃ）ステップａ）及びｂ）において調製された第１（Ａ−Ｘ）と第２（Ｂ−Ｙ）の融合タンパク質を一緒に混合するステップと
を含む上記方法が提供される。
【０２８５】
典型的にはステップ（ｃ）におけるＡ−ＸとＢ−Ｙの混合は１対１のモル比である。
【０２８６】
一実施形態では、本開示の複合体中で用いられるそれぞれの融合タンパク質は、発現実験において宿主細胞（単数又は複数）での発現により産生される。
【０２８７】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を発現させるステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を発現させるステップと、
を含み、
融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが同じ宿主細胞又は異なる宿主細胞から発現される上記方法が提供される。
【０２８８】
本明細書で用いられる場合、異なる宿主細胞とは、同じ種類（同じクローン種でさえ）の細胞を含む、個々の細胞のことである。
【０２８９】
一実施形態では、発現は一過性発現である。一過性発現の使用は、精製に頼らずに二重特異性複合体を生成する能力と組み合わされると極めて有利である。これにより、一過性トランスフェクションは安定なトランスフェクションよりもはるかに簡単であり資源多消費ではないので、二重特異性タンパク質複合体を産生する迅速な方法が得られる。
【０２９０】
一実施形態では、発現は安定な発現である、すなわち、そこでは問題になっている融合タンパク質をコードするＤＮＡは宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれている。
【０２９１】
一実施形態では、同じ又は異なるポリヌクレオチド配列上のＡ−Ｘをコードするポリヌクレオチド及びＢ−Ｙをコードするポリヌクレオチドは機能アッセイの一部として細胞内にトランスフェクトされ、タンパク質が細胞内で発現される及び／又はそこから放出される。特に、ポリヌクレオチドは同じ又は異なるプラスミド上に一過性にトランスフェクトされる。
【０２９２】
Ａ−ＸとＢ−Ｙの混合は、一般的に、ＸとＹが相互作用できる条件で成し遂げられる。一実施形態では、融合タンパク質は、細胞培養条件下で細胞培養培地においてインキュベートされ、例えば、融合タンパク質は３７℃／５％ＣＯ２環境において９０分間インキュベートされる。
【０２９３】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は水性環境で混合され、例えば、１つの融合タンパク質はビーズ又はプレートなどの固体表面に結合させることができ、もう一方の融合タンパク質は水溶液／懸濁液中でそれに対して導入することが可能である。固相であれば過剰な成分及び試薬は容易に洗い流すことができる。一実施形態では、どちらの融合物も固相に付加されておらず、液体／溶液／培養液中で混合しているだけである。したがって、一実施形態では、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは水性媒体中で遊離のタンパク質として混合している。
【０２９４】
有利なことに、本開示の方法を用いれば、異種対間（すなわち、第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］と第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］の間）で形成され、同種対間（すなわち、２つの第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］間又は２つの第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］間）の相互作用が最小化されている複合体を調製することが可能である。したがって、本方法により、ホモ二量体複合体の混入を最小限にして又はなしで、多数の二重特異性タンパク質複合体を調製することが可能になる。本開示の構築物及び方法の利点は、Ａ−ＸとＢ−Ｙの比がＡ−ＸとＢ−Ｙの特性により制御され、特に、モル比１対１を達成することが可能である点である。この制御の要素は、ある種に先行技術の方法よりも著しい改良点である。
【０２９５】
存在する場合、本開示の二重特異性抗体複合体又は抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、複合体又は抗体分子の提唱されている機能、特に、必要になる可能性のあるエフェクター機能を考慮して、選択することができる。例えば、定常領域ドメインはヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療的使用を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされるときは、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。代わりに、抗体分子が治療目的を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用できることは認識されるであろう。例えば、Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108に記載されている２４１位のセリンがプロリンに交換されているＩｇＧ４分子を使用することができる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。
【０２９６】
抗体は種々の翻訳後修飾を受けることができることも当業者であれば理解するであろう。これらの修飾の種類及び程度は多くの場合、抗体を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に依拠する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変動が含まれる場合がある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基残基（リシン又はアルギニンなどの）の喪失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは非存在でもよい。
【０２９７】
本開示は、上記の１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物であって、例えば、ホモ二量体複合体の混入を最小限にする又はなしで本開示に従ったヘテロ二量体二重特異性複合体を主に含む上記組成物も提供する。
【０２９８】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０２９９】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０３００】
一実施形態では、形成された複合体はさらなる精製ステップを必要とせず、したがって、組成物は未精製二重特異性複合体を含む。
【０３０１】
一実施形態では、形成された複合体は１回の精製ステップ、例えば、カラムクロマトグラフィーを必要とする。
【０３０２】
一実施形態では、方法は、例えば、本開示に従った融合タンパク質の発現後及び融合タンパク質を混合する前に、少なくとも１回の精製ステップをさらに含む。
【０３０３】
一態様では、本開示は、本明細書で定義される融合タンパク質、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、融合タンパク質又は前記二重特異性タンパク質複合体を含む組成物、マルチプレックス、アレイ、ライブラリーに関する。
【０３０４】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は溶液又は懸濁液中にある。
【０３０５】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面上に固定されている。
【０３０６】
一実施形態では、マルチプレックスはアレイの形態、例えば、９６又は３８４ウェルプレートなどのマイクロプレート中にある。そのようなアレイは、所望の機能性を備えた二重特異性タンパク質複合体を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて容易に実行することが可能である。
【０３０７】
別の実施形態では、二重特異性タンパク質複合体はビーズにコンジュゲートされている。
【０３０８】
上で定義される融合タンパク質は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の成分である。一態様では、本開示は本明細書に記載される融合タンパク質に関する。
【０３０９】
追加の態様では、上で定義される２つ又はそれよりも多い融合タンパク質を含むライブラリーが提供される。
【０３１０】
本明細書で使用される用語「ライブラリー」とは、組み合わせれば本開示に従った少なくとも２つの異なる二重特異性抗体複合体を形成することが可能な、本開示の２つ若しくはそれよりも多い二重特異性抗体複合体又は本開示の複数の融合タンパク質のことである。本明細書全体を通じて記載されるように、用語「ライブラリー」はその最も広い意味で使用され、サブライブラリーも包含することができる。
【０３１１】
有利なことに、ライブラリーは、特定の結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）又は第２の結合パートナー（Ｙ）のいずれかが付加されている一定範囲の異なる融合タンパク質を含むことができる。一実施形態では、ライブラリーの一部は、それぞれが結合パートナーＸに連結しているタンパク質／抗体／断片を含み、ライブラリーの残りはそれぞれが結合パートナーＹに連結している同じタンパク質／抗体／断片を含む。したがって、これにより、１つの融合タンパク質に結合対の第１の結合パートナーが付加されておりもう一方の融合タンパク質に結合対の第２の結合パートナーが付加されている限り、任意の２つの融合タンパク質を容易に組み合わせて本開示の二重特異性タンパク質複合体を形成することが可能になる。
【０３１２】
一実施形態では、本発明の二重特異性タンパク質複合体は治療応用に適しており、疾患の処置に新規の治療薬を提供することができる。したがって、追加の態様では、治療において使用するための上記の二重特異性タンパク質複合体が提供される。
【０３１３】
一実施形態では、本開示の方法のために入手される又は入手可能な融合タンパク質が提供される。
【０３１４】
一実施形態では、本開示の方法から入手される又は入手可能な二重特異性抗体複合体が提供される。
【０３１５】
一実施形態では、本開示に従った方法により同定される可変領域組合せを含む二重特異性又は多特異性抗体分子が提供される。
【０３１６】
一実施形態では、本開示の方法から得られる融合タンパク質、二重特異性抗体複合体又は二重特異性／多特異性抗体分子を含む医薬組成物などの組成物が提供される。
【０３１７】
薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、種々の異なる成分を組成物に含めることが可能である。組成物は、場合により、本発明の抗体の集団の特徴を変えることができる追加の分子を含み、それによって、例えば、抗体の機能を減少する、安定化する、遅らせる、調節する及び／又は活性化することができる。組成物は、固体又は液体形態でもよく、なかんずく、粉末、錠剤、溶液又はエアロゾルの形態でもよい。
【０３１８】
本開示は、本発明の二重特異性タンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において使用するための及び病態又は障害の処置用の薬物の製造のための本発明の二重特異性タンパク質複合体の使用が提供される。
【０３１９】
病態又は障害は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性及び寄生性）、感染に関連するエンドトキシンショック、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病（Pilonidal disease）、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着（surgical adhesions）、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎；多発性硬化症、ループス（全身性エリトマトーデスなどの）及びギランバレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫媒介炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞並びに粥状動脈硬化などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低酸症（hypochlorhydia）並びに乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎がんなどのがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにその転移型からなる群から選択することができる。
【０３２０】
本開示は、本発明の二重特異性タンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において及び薬物の製造において使用するための本発明の二重特異性タンパク質複合体の使用が提供される。
【０３２１】
組成物は、通常薬学的に許容される担体を含むことになる無菌の医薬組成物の一部として普通、供給されることになる。本発明の医薬組成物は薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。
【０３２２】
本発明は、本発明の抗体分子又は二重特異性抗体複合体を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加して混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のための工程も提供する。
【０３２３】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、本発明の組成物の所望の特徴を増強する薬学的に許容される製剤担体、溶液又は添加物のことである。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤及び炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアに被包することが可能である。製剤は、一般に、無菌の製造工程を用いて実質的に無菌の形態で提供されることになる。
【０３２４】
これには、製剤のために使用される緩衝溶媒溶液の濾過による生産及び無菌化、無菌緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌懸濁、並びに当業者によく知られている方法による製剤の無菌容器中への分注が含まれることがある。
【０３２５】
薬学的に許容される担体はそれ自体が、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきではないし、毒性を持つべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０３２６】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０３２７】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。そのような担体であれば、患者による摂取のために、医薬組成物を、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することができる。
【０３２８】
本発明の二重特異性タンパク質複合体は溶媒中に分散させて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の二重特異性タンパク質複合体は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することが可能である。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０から５．０のｐＨを達成するために１ｍｌの水あたり０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥した抗体から作ることが可能である。
【０３２９】
薬学的に許容される担体の徹底的な検討はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。
【０３３０】
二重特異性抗体複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）は医薬又は診断組成物中で唯一の活性成分であってもよく、或いは他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴うことができる。他の適切な活性成分には、トレランスを誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０３３１】
追加の実施形態では、本開示に従った抗体、断片又は組成物は、追加の医薬活性剤、例えば、コルチコステロイド（フルチカゾンプロピオン酸エステルなどの）及び／若しくはベータ２アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール又はホルモテロールなどの）又は細胞成長及び増殖阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド（cyclophosphmide）、メトトレキサートなどの）又は代わりにＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて用いられる。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０３３２】
医薬組成物は治療的有効量の本発明の二重特異性抗体複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）を適切に含む。
【０３３３】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的とされた疾患若しくは状態を処置する、寛解する若しくは予防する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。任意の抗体では、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデルにおいて、通常、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類においてのどちらかで推定することが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用すればヒトにおける有用な用量及び投与のための経路を決定することが可能である。
【０３３４】
ヒト対象についての正確な治療的有効量は、疾病状態の重症度、対象の全般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び回数、薬物組合せ（単数又は複数）、反応感受性及び治療に対するトレランス／応答に依拠することになる。この量はルーチンな実験方法により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇになる。代わりに、用量は１日あたり１０から１００、２００、３００又は４００ｍｇなどの１日あたり１から５００ｍｇであってよい。医薬組成物は、所定量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で都合よく提示することができる。
【０３３５】
組成物は患者に独立して投与してもよいし、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次又は別々に）投与してもよい。
【０３３６】
本発明の抗体分子が投与される用量は、処置される状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されているのか又は既存の状態を処置するために使用されているのかどうかに依拠する。投与回数は抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依拠することになる。抗体分子の半減期が短い（例えば、２から１０時間）場合、１日あたり１又は複数用量を与える必要がある場合もある。代わりに、抗体分子の半減期が長い（例えば、２から１５日）場合、１日あたり１回、１週間あたり１回又は１若しくは２か月ごとに１回でも用量を与えるだけでよい場合もある。
【０３３７】
本開示では、最終製剤のｐＨは抗体又は断片の等電点の値に類似してはいない。なぜならば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれよりも上のｐｌが適切である場合があるからである。理論に縛られたくはないが、これは最終的に最終製剤に改善された安定性をもたらすことができる、例えば、抗体又は断片は溶液のままであると考えられる。
【０３３８】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されないいかなる数の経路によっても投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。
【０３３９】
組成物の直接送達は、一般的には、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に注射により実現される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は対象の特定の組織にも投与することが可能である。投薬処置は単回服用予定でも複数回服用予定でもよい。
【０３４０】
生成物が注射又は注入目的である場合、油性又は水性溶媒中の懸濁液、水溶液又は乳化液の形態を帯びることができ、生成物は懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。代わりに、二重特異性タンパク質複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）は、適切な無菌液体と一緒に使用する前の復元のために乾燥形態でもよい。消化管を使用する経路により組成物を投与するつもりであれば、組成物は抗体を分解から保護ししかし消化管から吸収された後は二重特異性タンパク質複合体を放出する薬剤を含有する必要があることになる。
【０３４１】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイル包みに充填された単回用量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、容積が、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中に単位用量を含有する。
【０３４２】
本明細書で使用される用語「変異体」とは、対応する野生型ペプチド又はタンパク質のアミノ酸又はヌクレオチド配列と比べた場合、少なくとも１つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列変化を含有するペプチド又はタンパク質のことである。変異体は対応する野生型ペプチド又はタンパク質に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％配列同一性を含むことができる。しかし、変異体は、対応する野生型ペプチド又はタンパク質に実質的に類似する機能を示すのであれば、８０％未満の配列同一性を含むことが可能である。
【０３４３】
抗原には、Ｔ細胞若しくはＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害剤、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、成長因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、成長因子、ホルモン若しくは酵素などの可溶性分子又はそのイオンチャネル、エピトープ、断片及び翻訳後修飾形態が含まれる。
【０３４４】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は１つ又は２つの細胞表面受容体特異性を含む。
【０３４５】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は１つ又は２つのサイトカイン又はケモカイン特異性を含む。
【０３４６】
本開示に従った方法により同定される対になった標的に対する抗体又は断片は、実験用試薬、アッセイ用試薬又は治療薬として使用するのに適したいかなるフォーマットにも組み込むことができる。
【０３４７】
したがって、一態様では、本開示は、任意のフォーマットの対としての抗体断片又はその組合せの使用に及び、その例は上に与えられている。
【０３４８】
本開示は、特定の抗原特異性を備えた前記新規のフォーマットを含む医薬組成物などの組成物までも及ぶ。
【０３４９】
追加の態様では、本開示は処置におけるフォーマット及び組成物の使用を含む。
【０３５０】
一実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を使用すれば、対象の抗原（単数又は複数）の活性を機能的に変えることができる。例えば、二重特異性タンパク質複合体は前記抗原（単数又は複数）の活性を直接的に又は間接的に中和する、拮抗する又は刺激することができる。
【０３５１】
本開示は、例えば、本開示の方法で使用するための、複合体化した形態の又は複合体化していない形態のＡ−Ｘ及びＢ−Ｙを含むキットにも及ぶ。
【０３５２】
別の実施形態では、キットは使用のための説明書をさらに含む。
【０３５３】
さらに別の実施形態では、キットは１つ又は複数の機能アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
【０３５４】
一実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質、二重特異性タンパク質複合体、マルチプレックス、グリッド、ライブラリー、組成物、等は実験用試薬としての使用を目的とする。
【０３５５】
追加の態様では、ヌクレオチド配列、例えば、上で定義される融合タンパク質及び／又は二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３５６】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３５７】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性又は多特異性抗体分子をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３５８】
本明細書の開示は上で定義されるヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。
【０３５９】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それがすでに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。ベクターの例は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをそこにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、それが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能であり、そこではベクターはそれに続いて宿主ゲノムと一緒に複製される。プラスミドはもっとも一般的に使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、用語「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。
【０３６０】
ベクターを構築することができる一般的な方法、すなわち、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。これに関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０３６１】
本明細書で使用される用語「選択可能なマーカー」とは、その発現によってマーカー遺伝子を含有するベクターを形質転換されている又はトランスフェクトされている細胞を同定することができるようになるタンパク質のことである。広範囲の選択マーカーが当技術分野では公知である。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカーは、例えば、蛍光マーカーなどの視覚的に同定可能なマーカーでも可能である。蛍光マーカーの例には、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその種々のコンジュゲートが含まれる。
【０３６２】
本開示の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本開示の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のためにはいかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも使用することができる。細菌、例えば、大腸菌及び他の微生物系を使用してもよいし、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０３６３】
本開示は、本開示に従った融合タンパク質の産生のための工程であって、本開示のベクターを含有する宿主細胞を、本開示の分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現するのに適した条件下で培養し、分子を単離することを含む上記工程も提供する。
【０３６４】
本開示の二重特異性タンパク質複合体は診断／検出キット中で使用することができ、抗原特異性の特定の組合せを備えた二重特異性タンパク質複合体が使用される。例えば、キットは、両方が同じ細胞型上に存在している２つの抗原に対して特異的である二重特異性抗体複合体を含み、両方の抗原が首尾よく検出される場合にのみ確定診断を下すことができる。非複合体形態の２つの別々の抗体又は抗体断片よりもむしろ本開示の二重特異性抗体複合体を使用することにより、検出の特異性を大いに増強することが可能になる。
【０３６５】
一実施形態では、二重特異性抗体複合体は固体表面に固定される。固体表面は例えば、チップ又はＥＬＩＳＡプレートであってもよい。
【０３６６】
試料中で第１と第２のペプチドの存在を検出するための本開示の二重特異性タンパク質複合体の使用がさらに提供され、二重特異性複合体は検出剤として使用される。
【０３６７】
本開示の二重特異性抗体複合体は、例えば、結合した抗体−抗原複合体の検出を促進する蛍光マーカーにコンジュゲートすることができる。そのような二重特異性抗体複合体は免疫蛍光顕微鏡のために使用することが可能である。代わりに、二重特異性抗体複合体はウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡのためにも使用することができる。
【０３６８】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に従った抗体又は断片）を精製するための工程が提供される。
【０３６９】
一実施形態では、本開示に従った融合タンパク質又は二重特異性タンパク質複合体を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され抗体は非結合画分に維持されるように、アニオン交換クロマトグラフィーを非結合モードで実施するステップを含む、上記工程が提供される。ステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施することができる。
【０３７０】
工程は、例えば、ｐＨ約４〜５で実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕捉ステップをさらに含むことができる。
【０３７１】
工程は、生成物及び工程関連不純物が生成物ストリームから適切に分離されることを確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含むことができる。
【０３７２】
精製工程は、濃縮及びダイアフィルトレーションステップなどの１つ又は複数の限外濾過ステップも含むことができる。
【０３７３】
上で使用される「精製された形態」は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも多い純度などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０３７４】
本明細書の文脈では、「含む（comprising）」は「含む（including）」と解釈するべきである。
【０３７５】
ある種の要素を含む開示の態様は、関連する要素「からなる」又は「基本的にからなる」別の実施形態に及ぶことも意図されている。
【０３７６】
本明細書で用いられるプラスの実施形態は本開示の排除的なある種の態様の土台の役を果たすことができる。
【０３７７】
二重特異性複合体に関係する方法の文脈における開示は、複合体それ自体に等しく当てはまり、逆もまた同じである。
【実施例】
【０３７８】
（例１）
本開示の二重特異性抗体複合体ＦａｂＢ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）：５２ＳＲ４−ＦａｂＡの構築
図１０及び１１は本開示の代表的な二重特異性抗体複合体を示している。二重特異性抗体複合体は第１と第２の融合タンパク質で構成されている。
【０３７９】
第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）は、Ｆａｂ断片（可溶性抗原ＩＬ−６に対する特異性を有するＦａｂ  Ａ（Ｆａｂ＃１とも呼ばれる））を含み、このＦａｂ断片はペプチドリンカーＡＳＧＧＧＧ  配列番号７１を介してＸ  ｓｃＦｖ（クローン５２ＳＲ４  配列番号３）に結合しており、このリンカーはＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端及びｓｃＦｖのＶＬドメインに連結されている。ｓｃＦｖそれ自体もそのＶＬとＶＨドメインの間に位置するペプチドリンカーを含有している。
【０３８０】
第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）はＦａｂ断片（細胞表面抗原ＣＤ３に対する特異性を有するＦａｂ  Ｂ［Ｆａｂ＃２とも呼ばれる］）を含む。しかし、第１のタンパク質と比べて、Ｆａｂ断片はペプチドリンカーＡＳＧＧＧ  配列番号７３を介してＹ  ペプチドＧＣＮ４（クローン７Ｐ１４Ｐ配列番号１）に付加されており、このリンカーはＦａｂ断片のＣＨ１ドメインに連結されている。
【０３８１】
ｓｃＦｖ、Ｘは結合パートナーＹ、ＧＣＮ４に対して特異的であり相補的である。その結果、２つの融合タンパク質が互いに接触すると、ｓｃＦｖとＧＣＮ４ペプチドの間の非共有結合相互作用が起こり、それによって２つの融合タンパク質が二重特異性抗体複合体の形態で物理的に保持される。
【０３８２】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）５２ＳＲ４は、ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）で免疫されたマウスの脾臓由来のリボソームディスプレイＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖライブラリーを構築しパニングすることにより導かれた（Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135）。さらなる２００４年の論文では、ランダム化されたライブラリーのリボソームディスプレイを再び使用して報告された５ｐＭに対する５２ＳＲ４の親和性成熟を記載している（Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877）。
【０３８３】
Ｂｅｒｇｅｒら（Berger C,  Weber-Bornhauser S, Eggenberger Y, Hanes J,  Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153）により１９９９年論文に記載されている通り、ＧＣＮ４ペプチドはプロリン残基の７及び１４位での封入により酵母転写因子ＧＣＮ４から導かれ、したがって、ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）はｓｃＦｖ結合すると単量体状態のままである。
【０３８４】
ＧＣＮ４ペプチド及び５２ＳＲ４  ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は、２つの別々のベクターの、ＣＨ１を含有し抗体ＶＨ領域を受け入れるようにすでに設計されている社内重鎖Ｆａｂ発現ベクターの下流にクローニングした。
【０３８５】
次に、抗ＩＬ−６抗体及び抗ＣＤ３抗体由来のＶＨ領域はこれら２つの重鎖ベクターに別々にクローニングされた。
【０３８６】
ＧＣＮ４ペプチド及び５２ＳＲ４  ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ第１及び第２のベクターの、ＣＫを含有し抗体ＶＬ領域を受け入れるように設計されている社内軽鎖Ｆａｂ発現ベクターの下流に別々にクローニングした。
【０３８７】
抗ＩＬ−６抗体及び抗ＣＤ３抗体由来のＶＬ領域は、適切な重鎖ベクターと同時発現してＦａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ペプチドタンパク質を発現するために社内軽鎖発現ベクターのＣＫを備えたフレームに別々にクローニングした。
【０３８８】
次に、ベクターを配列決定して、クローニングが成功しており、それに続いて細胞が、それぞれ抗ＩＬ−６抗体及び抗ＣＤ３抗体由来のＶ領域を備えたＦａｂ−ｓｃＦｖとＦａｂ−ペプチドタンパク質を別々に発現したことを確認した。
【０３８９】
（例２）
細胞表面及び可溶性抗原に同時に共会合することが可能である非共有結合二重特異性抗体を形成するｓｃＦｖ：ペプチド相互作用のフローサイトメトリー実証
図１２は、ｓｃＦｖ：ペプチド結合相互作用を使用して形成される２つの異なる二重特異性抗体複合体の抗原特異性を実証するフローサイトメトリー実験の結果を示している。
【０３９０】
第１の二重特異的抗体複合体は、以下の２つの融合タンパク質：
１．抗ＣＤ３Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４）；及び
２．抗抗原ＩＬ−６Ｆａｂ−ペプチド（ＧＣＮ４）
を使用して構築した。
【０３９１】
第２の二重特異的抗体複合体は、以下の２つの融合タンパク質：
１．抗ＣＤ３Ｆａｂ−ペプチド（ＧＣＮ４）；及び
２．抗抗原ＩＬ−６Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４）
を使用して構築した。
【０３９２】
したがって、２つの二重特異性抗体複合体は同じＦａｂ断片及び同じ結合パートナー（すなわち、５２ＳＲ４及びＧＣＮ４）を有していた。２つの二重特異性抗体複合体間の違いは、どのＦａｂ断片がどの結合パートナーに付加されているかにあった。
【０３９３】
複合体を形成しない対照混合物は以下の融合タンパク質：
１．抗ＣＤ３Ｆａｂ：ＧＣＮ４；及び
２．抗ＩＬ−６Ｆａｂ：ＧＣＮ４
から作製した。
【０３９４】
ＣＤ３に結合する二重特異性抗体複合体の能力を実証するため、複合体をＣＤ３を発現するジャーカット細胞と一緒にインキュベートした。ＩＬ−６に結合する二重特異性抗体複合体の能力を実証するため、ジャーカット細胞上で一度ＣＤ３に結合した複合体をそれに続いてビオチン化抗原ＩＬ−６に接触させた。次に、ビオチン化抗原ＩＬ−６は蛍光的に標識されたストレプトアビジンを使用して検出した。
【０３９５】
次に、ジャーカット細胞をＦａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー装置にかけた。ジャーカット細胞は、自身はＩＬ−６に結合している二重特異性抗体複合体に結合しているときだけ標識され得、これによって、二重特異性抗体複合体が細胞表面ＣＤ３と可溶性抗原ＩＬ−６の両方に結合できることを示されるのであるが、このフローサイトメトリーでは、蛍光的に標識されたジャーカット細胞は、いずれも合体を形成することができないペプチドに融合されている２つの融合タンパク質と一緒にインキュベートされたジャーカット細胞から分離することが可能である。
【０３９６】
図１２のＦＡＣＳプロットは、両方の二重特異性抗体複合体についての著しい移動（黒い背景の上の細い線及び太い線）を示しており、こうして二重特異性抗体複合体が両方の標的抗原に首尾よく結合できること、両方の標的抗原に結合する能力は、所与のＦａｂ断片がｓｃＦｖ又はペプチドに連結しているかどうかとは無関係に保持されることが実証されている。
【０３９７】
抗ＩＬ−６ＦａｂにＣ末端で融合しているそれぞれペプチド又はｓｃＦｖのそれに続く捕捉は、最終層において蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出されるビオチン化抗原ＩＬ−６のさらなる捕捉を可能にする。したがって、ＦＡＣＳプロットに示されている結果は、本開示の二重特異性抗体複合体が細胞表面及び可溶性抗原に同時に首尾よく結合できることを示している。
【０３９８】
（例３）
ｓｃＦｖ：ペプチド相互作用のビアコア実証
図１３は、ｓｃＦｖ：ペプチド（すなわち、５２ＳＲ４：ＧＣＮ４）相互作用の親和性を実証する表面プラズモン共鳴トレースを示している。表面プラズモン共鳴はビアコア３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。実験はすべて２５℃で実施した。ストレプトアビジン（社内で作製）はアミンカップリング化学反応を介してＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定し、最終レベルはおおよそ１７５０応答単位であった。ＨＢＳ−Ｎ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、固定化及びペプチド捕捉のためのランニング緩衝液として使用した。ＨＢＳ−Ｎ中のビオチン−ＧＣＮ４ペプチドの５μｌ注射液（１０ｎＭ、Ｍ．Ｗ．４３６０）を使用して、固定化されたストレプトアビジン上でのおおよそ６ＲＵの捕捉を達成した。ランニング緩衝液は、抗ＧＣＮ４（５２ＳＲ４）ｓｃＦｖ結合動態学の測定のためにＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に切り替えた。３０ｎＭからのＦａｂ−ｓｃＦｖ（社内で作製）の３倍連続希釈、又はＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液対照は、流速３０μｌ／分で固定化ＧＣＮ４ペプチド上に注入した（３分会合、１５分解離）。表面は、２Ｍのグアニジン−ＨＣｌの２回の連続６０秒注入により流速１０μｌ／分でそれぞれの注入後に再生した。標準手順に続いて、ダブル参照バックグランド減算結合曲線（Double referenced background subtracted binding curves）を３０００  ＢＩＡＥｖａｌソフトウェア（バージョン４．１）を使用して解析した。動態学パラメータは、１対１結合モデルアルゴリズムをフィットさせることから決定した。データは、ｓｃＦｖがペプチドに対して５１６ｐＭの親和性を有することを示している。
【０３９９】
（例４）
結合アッセイのためのＦａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ［Ａ−Ｘ］）及びＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）の作製
クローニング戦略：ＤＮＡ配列中に隣接する制限酵素部位のある抗体可変領域ＤＮＡは、ＰＣＲ又は遺伝子合成により作製された。これらの部位は可変重鎖ではＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏｌであり、可変軽鎖ではＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩであった。これにより重可変領域は２つの重鎖ベクター（ＦａｂＢ−Ｙを備えたｐＮＡＦＨ及びＦａｂＡ−Ｘを備えたｐＮＡＦＨ）へのライゲーションを受け入れやすくなる。なぜならば、ベクターが相補的制限部位を有するからである。これにより、可変領域はマウス定常領域及びペプチドＹ（ＧＣＮ４）又はｓｃＦｖ  Ｘ（５２ＳＲ４）の上流（又は５’）にライゲートされ、全リーディングフレームが作製される。軽鎖は、再び同じ相補的制限部位を使用する標準社内マウス定常カッパベクター（ｐＭｍＣＫ又はｐＭｍＣＫ  Ｓ１７１Ｃ）にクローニングした。ｐＭｍＣＫ  Ｓ１７１Ｃベクターは可変領域がウサギから単離された場合に使用する。クローニング事象は、全オープンリーディングフレームに隣接するプライマーを使用する配列決定により確認した。
【０４００】
ＣＨＯＳを培養する：浮遊ＣＨＯＳ細胞を、２ｍＭ（１００×）ｇｌｕｔａｍｘを補充したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に前順応させた。細胞は、振盪インキュベーター器（Ｋｕｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上、１４０ｒｐｍで撹拌して対数増殖期に維持し、８％ＣＯ２を補充して３７℃で培養した。
【０４０１】
電気穿孔トランスフェクション：トランスフェクションに先立って、細胞数及び生存率をＣＥＤＥＸ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定し、必要量の細胞（２×１０８細胞／ｍｌ）を遠心コニカルチューブに移して１４００ｒｐｍで１０分間回転させた。ペレット状細胞は無菌Ｅａｒｌｓ平衡塩類溶液に再懸濁させ、１４００ｒｐｍでさらに１０分間回転させた。上澄みは捨てペレットは所望の細胞密度まで再懸濁した。
【０４０２】
最終濃度２×１０８細胞／ｍｌ混合で４００μｇ及び８００μｌのベクターＤＮＡはキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）にピペットを使って入れ、社内電気穿孔システムを使用して電気穿孔した。
【０４０３】
Ｆａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ「Ａ−Ｘ」）及びＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）は別々にトランスフェクトした
トランスフェクトされた細胞は、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｘ及び抗生物質有糸分裂阻害剤（１００×）溶液（５００中１）で強化したＰｒｏＣＨＯ５培養液を含有する１×３Ｌエルレンマイヤーフラスコに直接移し、細胞は３７℃、５％ＣＯ２及び１４０ｒｐｍに設定したＫｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター器で振盪しながら培養した。栄養補助剤２ｇ／ＬのＡＳＦ（味の素）をトランスフェクションの２４時間後に添加し、さらに１３日間の培養のために温度を３２℃まで下げた。４日目、３ｍＭの酪酸ナトリウム（ｎ−酪酸ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５８８７）を培養物に添加した。
【０４０４】
１４日目、培養物はチューブに移し、４０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離後上澄みを細胞から分離した。保持した上澄みは０．２２μｍのＳＡＲＴＯＢＲＡＮ（登録商標）Ｐ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍのガンマゴールド濾過器を通してさらに濾過した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０４０５】
大規模（１．０Ｌ）精製：Ｆａｂ−Ａ及びＦａｂ−Ｂは、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓシステム及びＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌ前充填ニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して親和性捕捉により精製した。培養上澄みは０．２２μｍの無菌濾過を行い、ｐＨは必要な場合にはカラムに充填する前に弱酸又は弱塩基で中性に調整した。１５〜２５ｍＭイミダゾールを含有する二次洗浄ステップを使用して、弱い結合の宿主細胞タンパク質／非特異的Ｈｉｓ結合物をいずれもニッケル樹脂から移動させた。溶出は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋２５０ｍＭイミダゾールを用いて実施し、２ｍｌの画分を収集した。１カラム容積を溶出に入れ、系は１０分間休止させて、溶出ピークを締め、したがって、全溶出量は減少する。一番きれいな画分をプールし、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍの濾過を行った。最終プールはＡ２８０  Ｓｃａｎ、ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元された及び非還元の）により、内毒素についてはＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０４０６】
（例５）
二重特異性複合体特徴付け
Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ試薬の精製：フォーマットＦａｂ−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ）及びＦａｂ−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド−Ｈｉｓ）を標準ＣＨＯ発現後以下の通りに精製した。浄化した細胞培養上澄みは１Ｌのステリカップを使用して０．２２μｍ無菌濾過した。ｐＨを測定し必要な場合にはｐＨ７．４に調整した。調製された上澄みは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に平衡化された５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐニッケルエクセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に５ｍｌ／分で充填した。カラムは１５ｍＭイミダゾール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、その後、２５０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で溶出した。溶出に続いて２８０ｎｍでの吸光度及び溶出ピークを収集した。ピーク溶出液はＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析され；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。十分な純度の試料は、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜付きのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中に透析濾過し、スイングアウトローターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。生成物品質が十分でない場合は、ニッケルカラム溶出液を濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で平衡化されたＸＫ１６／６０又はＸＫ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムのいずれかに適用した。カラムは、それぞれ１ｍｌ／分又は２．６ｍｌ／分で均一濃度勾配のＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて展開させた。画分を収集し、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析され；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。選択した画分はプールし、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜付きのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、スイングアウトローターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。
【０４０７】
溶液中の二重特異性製剤の分析
実験１
精製したＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）及び精製したＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）を１対１モル比で混合し、全タンパク質濃度は５００μｇ／ｍｌにして、環境温度で一晩インキュベートした。対照は、混合している場合と同じ濃度の混合物の個々の部分からなっていた。１００μｌの試料及びそれぞれの対照をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上に注入し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させた。検出は２８０ｎｍの吸光度によった（図１４参照）。
【０４０８】
図１４のサイズ排除クロマトグラムは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）対照は全ピーク面積の９２％の主ピークを有し、保持時間は８．６１０計量分であることを示している。Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）対照は全ピーク面積の９４％の主ピークを有し、保持時間は１０．７６７計量分である。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ対照について測定された保持時間は、同じ条件下で実行したＢｉｏＲａｄゲル濾過標準（１５１−１９０１）の保持時間から作成した標準曲線を使用することによりそれぞれ９５ｋＤａ及び３５ｋＤａの見かけ分子量に変換された。これらの見かけ分子量は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ペプチド分子について予想される見かけ分子量と一致している。Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）混合物の主ピークは９．２８９計量分の保持時間を有している。これは上記と同じく、１８７ｋＤａの見かけ分子量に変換される。この見かけ分子量は１つのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）と１つのＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）の対合について予想される見かけの分子量と一致している。この主ピークは全ピーク面積の８４％でもあり、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）の大半が１対１の二重特異性タンパク質複合体を形成していることが示唆される。主ピークの後で溶出している小さな追加の肩部及びピークは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）及びＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）開始物質と一致している。
【０４０９】
実験２
精製したＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）を１対１モル比で混合し、全タンパク質濃度は５００μｇ／ｍｌにした。次に、この混合物のアリコートは、濃度５０μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌまでＰＢＳ  ｐＨ７．４で希釈した。５００μｇ／ｍｌの混合物に混合している場合と同じ濃度の混合物の個々の部分からなる対照も設定した。混合物及び対照はすべて環境温度で一晩インキュベートした。１００μｌのすべての試料及び対照をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上に注入し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させた。検出は２１４ｎｍの吸光度によった（図１５、図１６及び表１参照）。
【０４１０】
図１５のサイズ排除クロマトグラムは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）対照が全ピーク面積の９１％の主ピークを有し、保持時間は８．６３４計量分であることを示している。Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）対照は全ピーク面積の９７％の主ピークを有し、保持時間は９．３６１計量分である。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ対照について測定された保持時間は、同じ条件下で実行したＢｉｏＲａｄゲル濾過標準（１５１−１９０１）の保持時間から作成した標準曲線を使用することによりそれぞれ１０９ｋＤａ及び５５ｋＤａの見かけ分子量に変換された。これらの見かけ分子量は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ペプチド分子について予想される見かけ分子量と一致している。Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）混合物の主ピークは８．０１６計量分の保持時間を有している。これは上記と同じく、１９８ｋＤａの見かけ分子量に変換された。この見かけ分子量は１つのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）と１つのＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）の対合について予想される見かけの分子量と一致している。この主ピークは全ピーク面積の８２％でもあり、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）の大半が１対１の複合体を形成していることが示唆される。主ピークの後で溶出している２つの小さなピークは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）及びＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）開始物質と一致している。
【０４１１】
図１６のサイズ排除クロマトグラムは、５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ濃度でのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）１対１混合物についてである。トレースはすべて、類似する保持時間並びに類似する相対的ピーク高及び面積を有する試料間で対応するピークについて類似している。パーセントピーク面積は表５で対照されており（５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌでの、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）１対１モル比混合物についてのサイズ排除ピーク面積データ。ピークは吸光度２１４ｎｍで検出された）、それぞれのピークの％は混合物を希釈するとかなり一定のままである。これは、Ｆａｂ−Ｘ／Ｆａｂ−Ｙ１対１複合体が試験されたすべての濃度で複合体として残っていることを示している。Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの７５％は、複合体では４０ｎＭの濃度に相当する５μｇ／ｍｌまで混合物を希釈した場合でも１対１複合体として存在している。
【表６】
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【０４１２】
したがって、これらの実験の結果は、高割合のＦａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの融合タンパク質が所望の二重特異性複合体を形成しており、残存する単量体は最小限の割合であり、ホモ二量体形成の証拠はないことを示している。
【０４１３】
（例６）
抗ＣＤ１３８及び抗ＣＨ１  Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙの結合の実証
ヒト形質細胞上で発現されるＣＤ１３８に対して特異的なＶ領域及び分泌されたヒトＩｇＧを検出するためのヒトＣＨ１に対するＶ領域を発現させ精製し、ヒト形質細胞へのヒトＩｇＧの捕捉のための前複合体形成(pre-complex formation)の個々の結合活性について試験した。
【０４１４】
Ｂ細胞培養及び単離による抗体発見
ウサギを、ヒトＣＤ１３８を発現しているＲａｂ−９細胞又は精製ヒトＦａｂタンパク質の３用量で免疫した。
【０４１５】
Ｂ細胞培養物はZublerら(1985)により記載された方法に類似する方法を使用して調製した。手短に言えば、免疫化ウサギからの脾臓又はＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、３％活性化脾細胞培養上澄み及びガンマ線照射突然変異ＥＬ４マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェル  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を備えたバーコード化９６ウェル組織培養プレートにおいてウェル当たりおおよそ２０００〜５０００細胞の密度で、５％ＣＯ２環境において３７℃で７日間培養した。
【０４１６】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体の存在は、ＣＤ１３８を発現しているＨＥＫ２９３細胞又は精製ＣＤ１３８又はＦａｂタンパク質を使用する均一蛍光ベース結合アッセイを使用して判定された。スクリーニングでは、Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅ液体ハンドラーを使用して、バーコード化９６ウェル組織培養プレート由来の１０μｌの上澄みを標的抗原又はタンパク質をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を含有するバーコード化３８４ウェル黒壁アッセイプレートに移した。結合はヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム上で読み取った。
【０４１７】
対象のウェルの選択からの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、デコンボリューションを実施してＢ細胞の不均一集団を含有する所与のウェルにおいて抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にした。これは蛍光フォーカス法（Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; EP1570267B1）を使用して達成した。手短に言えば、陽性ウェル由来の免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、標的抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又はビオチン化標的抗原及びヤギ抗ウサギＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１対１２００最終希釈で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかと混合した。３７℃での１時間の静置インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞はそのＢ細胞を取り囲んでいる蛍光ハローの存在のために同定することができた。いくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンは、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたが、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレーターを用いて選び取り、ＰＣＲチューブ内に蓄積した。蛍光フォーカス法を使用して、直接免疫化ウサギの骨髄由来のＢ細胞の不均一集団からも抗原特異的Ｂ細胞を同定した。
【０４１８】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単一細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ発現ベクターのための重及び軽鎖構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体が容積５ｍｌの６ウェル組織培養プレートで発現された。発現の５〜７日後、上澄みを収穫した。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０４１９】
小規模ＦａｂＡ−Ｘ及びＦａｂＢ−Ｙの作製
Ｅｘｐｉ２９３細胞はＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液において、最終濃度０．５×１０６生細胞／ｍＬまでルーチン的に継代し、軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０４２０】
トランスフェクションの日、自動細胞計測器（Ｖｉ−ＣＥＬＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞生存率及び濃度を測定した。最終細胞濃度２．５×１０６生細胞／ｍＬを達成するため、適切な容積の細胞懸濁系を無菌２５０ｍＬエルレンマイヤー振盪フラスコに添加し、５０ｍＬトランスフェクションごとに新鮮な予熱したＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液を添加することにより４２．５ｍＬの容積まで養育した。
【０４２１】
トランスフェクションごとに脂質ＤＮＡ複合体を調製するため、全体で５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、１３５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液に希釈した。すべての希釈物を穏やかに混合し室温で長くても５分間インキュベートし、その後それぞれのＤＮＡ溶液をそれぞれの希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬に添加して、全容積５ｍＬを得た。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物は穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートしてＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を形成させた。
【０４２２】
ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体インキュベーションを終わらせた後、５ｍＬのＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体をそれぞれの振盪フラスコに添加した。振盪フラスコは軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０４２３】
トランスフェクションのおおよそ１６〜１８時間後、２５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれの振盪フラスコに添加した。
【０４２４】
細胞培養物はトランスフェクション７日後に収穫した。細胞は５０ｍＬ回転チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、４０００ｒｐｍで３０分間回転させ、その後０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して無菌濾過した。浄化し無菌濾過した上澄みは４℃で保存した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより判定した。
【０４２５】
小規模（５０ｍｌ）精製：Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの両方を、小規模真空ベースの精製システムを使用する親和性捕捉により別々に精製した。手短に言えば、５０ｍｌの培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過し、その後５００μＬのＮｉセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。次に、上澄みビーズ混合物は約１時間転がし、その後上澄みは吸引を適用して取り除いた。次に、ビーズはＷａｓｈ１（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．２）及びＷａｓｈ２（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。溶出は５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて実施した。溶出画分はＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍ濾過した。最終プールはＡ２８０スキャン、ＳＥ−ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）により、内毒素ではＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０４２６】
抗ヒトＩｇＧ結合アッセイ
全ヒトＩｇＧを室温で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬでＮｕｎｃ  ＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。いくつかのプレートはアッセイのための陰性対照として被覆せずにおいた。プレートはＰＢＳ０．０１％  Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次にＰＢＳ１％  ＢＳＡ（１ウェル当たり２００μＬ）で１時間ブロックした。プレートはＰＢＳ０．０１％  Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。抗ＣＨ１  Ｆａｂ’Ｘｄｓ、抗ＣＨ１  Ｆａｂ’Ｙ及び抗ＣＤ１３８  Ｆａｂ’Ｙ（陰性対照として）をＰＢＳ１％  ＢＳＡで１／３連続希釈により１μｇ／ｍＬから滴定し、１ウェル当たり１００μＬでｈＩｇＧ被覆プレートに添加した。プレートは２時間インキュベートした。プレートはＰＢＳ０．０１％  Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。過酸化水素コンジュゲート抗マウスＩｇＧをＰＢＳ１％  ＢＳＡで１００００中１に希釈し、１ウェル当たり１００μＬで添加し、１時間インキュベートした。プレートはＰＢＳ０．０１％  Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。１００μＬのＴＭＢをそれぞれのウェルに添加し、プレートは２０分間発現させておき、その後５０μＬのＴＭＢ停止液で反応を停止させた。ウェル吸光度はＳｙｎｅｒｇｙ２上、４５０ｎｍで読み取った。
【０４２７】
図１７は、Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙフォーマットの両方で、抗ヒトＣＨ１  Ｖ領域（ＶＲ３８８）がヒトＩｇＧに結合可能であることを示している。
【０４２８】
ＣＤ１３８結合アッセイ
高レベルのＣＤ１３８を発現しているｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した形質芽細胞を９６ウェルＵプレートに５×１０４／ウェルで沈着させ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ５％のＦＣＳ、２ｍＭのアジ化ナトリウム）に希釈した抗ヒトＣＤ１３８Ｆａｂ’Ｙのそれぞれの１μｇ／ｍＬと一緒に氷上で３０分間インキュベートした。細胞はそれぞれのウェルに１００μＬのＦＡＣＳバッファーを添加することにより洗浄し、５００ｇで５分間回転させた。ＦＡＣＳバッファーは吸引し、第２の洗浄ステップはＦＡＣＳバッファーの１ウェル当たり２００μＬを添加することにより実行し、続いて５００ｇで５分間回転させた。ＦＡＣＳバッファーはもう１度吸引し、細胞ペレットは、プレートを１４００ｒｐｍで１０秒間プレート振盪機に置くことによりほぐした。ＦＡＣＳバッファーに１対２００で希釈した二次検出抗体（ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  １１５−０９５−０７２）を１ウェル当たり１００μＬで細胞に添加した。細胞は検出Ａｂと一緒に氷上で３０分間インキュベートし、上記の通りもう１度洗浄した。細胞は直ちにｉＱｕｅ上に獲得した。ＦＬ−１の幾何平均はＰｒｉｓｍにプロットした。
【０４２９】
図１８は、異なる抗ＣＤ１３８  Ｖ領域結合を有するＦａｂ−Ｙ構築物のヒト形質細胞への結合を示している。
【０４３０】
抗体分泌細胞の同定のための方法
Ａ−Ｘは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−ＹはＦｃ又はＦａｂ’のいずれかを介して分泌された抗体に結合する。分泌された抗体はＸとＹの間の相互作用により細胞表面に捕捉される。次に細胞捕捉された抗体は、Ｆｃ又はＦａｂ’のいずれかに標識された抗抗体試薬を付加することにより検出することが可能である。分泌された抗体上のＢ−Ｙが結合するエピトープは、添加された検出抗体が認識するエピトープとは異なっている。例えば、図１を参照されたい。
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５（すべてのアイソフォームを含む）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（もっとも好ましくは、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは、抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３１】
（例７）
全又はアイソタイプ特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｙは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−ＸはＦｃ又はＦａｂ’のいずれかを介して分泌された抗体に結合する。分泌された抗体はＸとＹの間の相互作用により細胞表面に捕捉される。次に細胞捕捉された抗体は、Ｆｃ又はＦａｂのいずれかに標識された抗抗体試薬を付加することにより検出することが可能である。分泌された抗体上のＢ−Ｘが結合するエピトープは、添加された検出抗体が認識するエピトープとは異なっている。例えば、図２を参照されたい。
特定の例：
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５（すべてのアイソフォームを含む）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（例えば、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは、抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３２】
（例８）
抗原特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｙは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｘは、分泌された抗体もそれに対して特異的である抗原に結合する。それによって抗原はＸとＹの間の相互作用によりまず第１に細胞表面に捕捉され、次に分泌された抗体は抗原に結合し、それ自体が細胞表面に捕捉される。この時点で細胞捕捉されている分泌された抗体は、次に、Ｆｃ又はＦａｂのいずれかに標識された抗抗体試薬を付加することにより検出することが可能であり、汎又はアイソタイプ特異的であることが可能である。例えば、図３を参照されたい。
特定の例：
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（もっとも好ましくは、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは、目的のタグされた抗原から独立して選択してもよい。タグ＝ビオチン、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
検出抗体は抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
【０４３３】
（例９）
抗原特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｘは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは、分泌された抗体もそれに対して特異的である抗原に結合する。それによって抗原はＸとＹの間の相互作用によりまず第１に細胞表面に捕捉され、次に分泌された抗体は抗原に結合し、それ自体が細胞表面に捕捉される。この時点で細胞捕捉されている分泌された抗体は、次に、Ｆｃ又はＦａｂのいずれかに標識された抗抗体試薬を付加することにより検出することが可能であり、汎又はアイソタイプ特異的であることが可能である。例えば、図４を参照されたい。
特定の例：
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（もっとも好ましくは、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは、目的のタグされた抗原から独立して選択してもよい。タグ＝ビオチン、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
検出抗体＝抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的。
【０４３４】
（例１０）
抗原特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｘは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−ＹはＦｃ又はＦａｂ’のいずれかを介して分泌された抗体に結合する。分泌された抗体はＸとＹの間の相互作用により細胞表面に捕捉される。次に、抗原特異的細胞捕捉された抗体はタグ付の抗原、次に標識された抗タグ抗体試薬の付加により検出可能である。
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５  ＣＤ４５（すべてのアイソフォームを含む）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（もっとも好ましくは、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
例えば、図５を参照されたい。
Ｂは、抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３５】
（例１１）
抗原特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｙは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−ＸはＦｃ又はＦａｂ’のいずれかを介して分泌された抗体に結合する。分泌された抗体はＸとＹの間の相互作用により細胞表面に捕捉される。この抗原特異的細胞捕捉された抗体はタグ付の抗原、次に標識された抗タグ抗体試薬の付加により検出可能である。例えば、図６を参照されたい。
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５  ＣＤ４５（すべてのアイソフォームを含む）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（もっとも好ましくは、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは、抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３６】
（例１２）
抗原特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｘは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、抗原−Ｙは分泌された抗体に結合する。分泌された抗体はＸとＹの間の相互作用により細胞表面に捕捉される。次に、この抗原特異的細胞捕捉された抗体はＦｃ又はＦａｂのいずれかへの標識された抗抗体試薬の付加により検出可能であり、汎又はアイソタイプ特異的であることが可能である。例えば、図７を参照されたい。
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５  ＣＤ４５（すべてのアイソフォームを含む）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（例えば、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは抗原である。
検出抗体は、抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３７】
（例１３）
抗原特異的抗体産生細胞
Ａ−Ｙは抗体産生細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、抗原−Ｘは分泌された抗体に結合する。分泌された抗体はＸとＹの間の相互作用により細胞表面に捕捉される。次に、この抗原特異的細胞捕捉された抗体はＦｃ又はＦａｂのいずれかへの標識された抗抗体試薬の付加により検出可能であり、汎又はアイソタイプ特異的であることが可能である。例えば、図８を参照されたい。
Ａは、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１３８、抗ＣＤ４５  ＣＤ４５（すべてのアイソフォームを含む）、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１９、及び抗ＣＤ２０から独立して選択してもよい（もっとも好ましくは、抗ＣＤ３８及びＣＤ１３８）。
Ｂは抗原である。
検出抗体は、抗ＣＨ１、抗Ｃκ、抗Ｃλ、抗Ｆｃ汎アイソタイプ、抗Ｆｃ  ＩｇＧ１、２、３、４、ＩｇＥ又はＩｇＡ特異的から独立して選択してもよい。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３８】
（例１４）
可溶性分子分泌細胞の同定
単離、試験又はターゲティングのための可溶性分子を生成する細胞の同定を目的とする本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の使用
Ａ−Ｘは目的の可溶性分子を生成する細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは可溶性分子に結合する。分泌された可溶性分子はＸとＹの間の相互作用によりその細胞表面に捕捉される。次に、細胞捕捉された、分泌された分子（したがって、その分子を分泌した細胞）は、その可溶性分子に対して特異的な標識された抗体を添加することにより検出可能であり、この抗体はＢ−Ｙが標的とするエピトープとは異なるエピトープにおいて結合する必要があると考えられる。例えば、図９Ａを参照されたい。
Ａは、目的の細胞サブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｂは、任意の可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４３９】
（例１５）
可溶性分子分泌細胞の同定
単離、試験又はターゲティングのための可溶性分子を生成する細胞の同定を目的とする本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の使用
Ａ−Ｘは目的の可溶性分子を生成する細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは可溶性分子に結合する。分泌された可溶性分子はＸとＹの間の相互作用によりその細胞表面に捕捉される。次に、細胞捕捉された、分泌された分子（したがって、その分子を分泌した細胞）は、その可溶性分子に対して特異的な標識された抗体を添加することにより検出可能であり、この抗体はＢ−Ｙが標的とするエピトープとは異なるエピトープにおいて結合する必要があると考えられる。例えば、図９Ｂを参照されたい。
Ａは、目的の細胞サブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｂは、任意の可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４４０】
（例１６）
どの細胞型が特定の可溶性分子を生成するのかを確定するために細胞をスクリーニングする
混合細胞系においてどの細胞サブセットが目的の可溶性分子を生成するのかを同定するための本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の使用
Ａ−Ｘは目的の可溶性分子を潜在的に生成する細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは可溶性分子に結合する。多数の異なるＡ−Ｘ細胞表面特異性を、異なるアッセイにおいて選択された可溶性分子に向けてＢ−Ｙと複合体化することが可能である。分泌された可溶性分子はＸとＹの間の相互作用によりその細胞表面に捕捉される。次に、細胞捕捉された、分泌された分子（したがって、その分子を分泌した細胞）は、その可溶性分子に対して特異的であるがＢ−Ｙが標的とするエピトープとは異なるエピトープにおいて結合する標識された抗体を添加することにより検出可能である。異なるＡ−Ｘ特異性を使用するこの能力はどの細胞が特定の可溶性分子を分泌するのかの同定を促進する。
Ａは、目的の細胞サブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｂは、任意の可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４４１】
（例１７）
どの細胞型が特定の可溶性分子を生成するのかを確定するために細胞をスクリーニングする
混合細胞系においてどの細胞サブセットが目的の可溶性分子を生成するのかを同定するための本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の使用
Ａ−Ｘは目的の可溶性分子を潜在的に生成する細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは可溶性分子に結合する。多数の異なるＡ−Ｘ細胞表面特異性を、異なるアッセイにおいて選択された可溶性分子に向けてＢ−Ｙと複合体化することが可能である。分泌された可溶性分子はＸとＹの間の相互作用によりその細胞表面に捕捉される。次に、細胞捕捉された、分泌された分子（したがって、その分子を分泌した細胞）は、その可溶性分子に対して特異的であるがＢ−Ｙが標的とするエピトープとは異なるエピトープにおいて結合する標識された抗体を添加することにより検出可能である。異なるＡ−Ｘ特異性を使用するこの能力はどの細胞が特定の可溶性分子を分泌するのかの同定を促進する。
Ａは、目的の細胞サブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｂは、任意の可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４４２】
（例１８）
どの可溶性分子を特定の細胞型が産生するのかを確定するために細胞をスクリーニングする
混合細胞系においてどの可溶性分子を目的の特定の細胞サブセットが分泌するのかを同定するための本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の使用
Ａ−Ｘは目的の可溶性分子を集団潜在的に生成する混合細胞中の細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは可溶性分子に結合する。多数の異なるＢ−Ｙ可溶性分子特異性は選択された細胞表面分子に向けてＡ−Ｘと複合体化することが可能である。分泌された可溶性分子はＸとＹの間の相互作用によりその細胞表面に捕捉される。次に、細胞捕捉された、分泌された分子は、その可溶性分子に対して特異的であるがＢ−Ｙが標的とするエピトープとは異なるエピトープにおいて結合する標識された抗体を添加することにより検出可能である。異なるＢ−Ｙ特異性を容易に使用するこの能力はどの可溶性分子を特定の細胞が分泌するのかの同定を促進する。
Ａは、目的の細胞サブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｂは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等の任意の可溶性分子に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｘは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＹはＸに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４４３】
（例１９）
どの可溶性分子を特定の細胞型が産生するのかを確定するために細胞をスクリーニングする
混合細胞系においてどの可溶性分子を目的の特定の細胞サブセットが分泌するのかを同定するための本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の使用
Ａ−Ｘは目的の可溶性分子を集団潜在的に生成する混合細胞中の細胞上で発現される細胞表面受容体に結合し、Ｂ−Ｙは可溶性分子に結合する。多数の異なるＢ−Ｙ可溶性分子特異性は選択された細胞表面分子に向けてＡ−Ｘと複合体化することが可能である。分泌された可溶性分子はＸとＹの間の相互作用によりその細胞表面に捕捉される。次に、細胞捕捉された、分泌された分子は、その可溶性分子に対して特異的であるがＢ−Ｙが標的とするエピトープとは異なるエピトープにおいて結合する標識された抗体を添加することにより検出可能である。異なるＢ−Ｙ特異性を容易に使用するこの能力はどの可溶性分子を特定の細胞が分泌するのかの同定を促進する。
Ａは、目的の細胞サブセットを特徴付ける任意の細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１９６、ＣＤ２０９、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｌｉｎ−１〜３に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｂは、任意の可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等に対する抗体から独立して選択してもよい。
Ｙは抗ペプチドｓｃＦｖ又はｓｄＡｂ、例えば、５２ＳＲ４でもよい。
ＸはＹに結合するペプチド（例えば、ＧＣＮ４）でもよい。
【０４４４】
（例２０）
抗体分泌細胞からのＩｇＧ捕捉
抗体分泌Ｂ細胞の特徴の１つは、急速な分裂細胞から非分裂細胞へのその転換である。この転換中、抗体分泌速度は桁外れに上昇する。Ｂ細胞から形質細胞へのこの転換の顕著な特徴は、細胞表面ＩｇＧ（Ｂ細胞受容体（ＢｃＲ）としても知られる）をすべて失うことである。細胞表面ＩｇＧは細胞が産生する免疫グロブリンの種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、等）だけではなくその抗原特異性も特徴付けるのに使用することが可能である。細胞表面ＩｇＧのこのような変化には、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ１９などの古典的Ｂ細胞分化マーカーの進行性の消失も伴い、同時にＣＤ３８及びＣＤ１３８などの新しいマーカーが増加する。これらの変化の最終結果は、特に組織内では形質細胞は他の細胞との区別がはるかに難しくなることであり、細胞表面免疫グロブリンがなければ形質細胞の性質及び抗原特異性を確立するのがはるかに難しくなることがある。そのような細胞を同定するのに使用することが可能な現在の方法は、最善でも、細胞内ＩｇＧを測定するために細胞を固定し透過処理するプロトコルなどの、細胞の健康にとって有害である処置に頼っているくらいである。記載される方法は、特許請求されている技術を使用すれば、二重ターゲティング及び可溶性ＩｇＧを産生する細胞の細胞表面への可溶性ＩｇＧの捕捉を可能にし、細胞随伴性ＢｃＲを使用する適用に類似する適用を可能にする。これらには、表現型決定、抗原決定、細胞の分離及び選別が含まれる。さらに、この方法なら、分泌されたＩｇＧを捕捉するのにいかなる細胞受容体でも使用することが可能になり、いかなる系譜マーカーよりも高い密度まで発現される受容体を利用する利点があり、それでも系譜マーカーを独立して検出することも可能である。これは、さらに多くの分泌されたＩｇＧを細胞表面で捕捉することが可能であり、抗原に対する親和性がもっと弱い免疫グロブリンのさらに希なサブセットの同定が可能になることを意味する。さらに、この方法を使用すれば、すでに表面ＢｃＲを有する細胞表面への捕捉を増強することができる。この方法は、細胞表面結合パートナーと捕捉試薬の両方に関して柔軟性があり互換性がある。
【０４４５】
抗ＣＤ１３８及び抗ＣＨ１（ＩｇＧ重鎖定常領域１特異的）抗体は二重特異性抗体を形成するように設計されている特許請求されたフォーマットで発現された。抗ＣＤ１３８及び抗ＣＨ１が分泌されたＩｇＧを捕捉できるかどうかを試験するため、まずモデル系を使用した。ヒトＨＥＫ２９３細胞に、脂質ベースのトランスフェクションプロトコルを使用してヒトＣＤ１３８とヒトＩｇＧの遺伝子を同時トランスフェクトした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞に、空のベクター、ＣＤ１３８単独、ＩｇＧ単独のいずれかをトランスフェクトし、又はＣＤ１３８とＩｇＧを同時トランスフェクトした。二重特異性タンパク質複合体は、Ｆａｂ−Ｙフォーマット（Ｙは本明細書に記載されるＧＣＮ４ペプチド又はその任意のアイソフォーム／誘導体）で発現される抗ＣＤ１３８抗体をＦａｂ−Ｘフォーマット（Ｘは本明細書に記載される５２ＳＲ４）で発現される抗ＣＨ１抗体の等モル混合物と混合することにより作製した。これは滴定する前に１時間前インキュベートし、次に洗い落とす前のさらに１時間細胞と一緒にインキュベートした。ＣＤ１３８が細胞表面に結合しＩｇＧを捕捉する（結合ＣＨ１を通じて）場合、これは、ＡＰＣにコンジュゲートされたポリクローナルヤギ抗ヒト重及び軽（Ｈ＋Ｌ）鎖（ＩｇＧ）特異的抗体を用いて検出可能である。次に、この結合はフローサイトメーターを使用して検出可能である。図１９は、ＣＤ１３８とＩｇＧを同時トランスフェクトした細胞のみがポリクローナル抗ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ鎖特異的抗体を使用して検出することが可能であり、単独のＣＤ１３８又はＩｇＧをトランスフェクトした細胞は検出できないことを示している。別々の実験では、市販の抗ＣＤ１３８抗体を使用して、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上で発現されたＣＤ１３８のレベルを決定した（データは示されず）。この方法が一次ヒト抗体分泌細胞に適用可能かどうかを判定するため、ヒト形質芽細胞を、Jourdan et al (Blood. 114(25).pp5173)から改作したプロトコルに従って作製した。この方法はＣＤ１３８陽性でもある抗体分泌細胞（ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ  により決定した場合）を産生した。さらにこれらの細胞は、形質細胞又は形質芽細胞のもう１つの顕著な特徴でもある表面免疫グロブリンのレベルが非常に低いことが測定された。図２０は、培養されたヒト形質細胞に添加する前に抗ＣＨ１  Ｆａｂ−Ｘと前複合体化されたＣＤ１３８又はＣＤ４５  Ｆａｂ−Ｙの使用を比較している。１時間後、細胞を洗浄し細胞結合ＩｇＧはポリクローナル抗Ｈ＋Ｌ  ＡＰＣ抗体を使用して検出することができ、細胞表面捕捉はフローサイトメーターを使用して検出された。図２０のグラフは、試験された特定の構築物について、ヒト形質細胞の表面でのＩｇＧの捕捉ではＣＤ４５のほうがＣＤ１３８よりも成功していたことを示している。
【０４４６】
この技法が形質細胞とＴ細胞の混合細胞培養物（形質細胞対Ｔ細胞１対１又は１対９比）において有用となり得るかどうかを判定するために、全細胞濃度を１×１０４細胞／ｍｌに固定した。抗ＣＤ４５−Ｙ及び抗ＣＨ１−Ｘ組合せは１時間一緒に前インキュベートし、その後、前形成された二重特異性複合体を、形質細胞とＴ細胞の混合物を含有する培養物に洗い落とす前の５分間添加した。両方の細胞がほぼ等レベルのＣＤ４５を発現するので、Ｔ細胞も形質細胞も共にＩｇＧ（形質細胞のみが分泌することができる）を捕捉することができるはずである。細胞表面で捕捉されたＩｇＧは抗Ｈ＋Ｌ  ＡＰＣコンジュゲートされた抗体を使用して検出可能であり、形質細胞はそれぞれＣＤ１３８及びＣＤ３抗体を使用してＴ細胞から区別することが可能である。次に、細胞表面ＩｇＧ結合はフローサイトメーターを使用して検出された。図２１は、１対１（形質細胞対Ｔ細胞）の比でもＴ細胞は、形質細胞と比べてその細胞表面で捕捉したＩｇＧは極めて少なかったことを示している。形質細胞に結合する相対比はＴ細胞への結合の少なくとも１０倍であった。このデータは、特許請求された技術が、ＩｇＧを分泌する細胞により産生されバイスタンダー細胞によっては産生されないＩｇＧを選択的に捕捉することが可能であることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【０４４７】
配列番号１：＜２２３＞ＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）配列
配列番号２：＜２２３＞コードするＤＮＡ
配列番号３：＜２２３＞５２ＳＲ４  ｄｓ  ｓｃＦｖ配列
配列番号４：＜２２３＞コードするＤＮＡ
配列番号５〜１３：＜２２３＞柔軟なペプチドリンカー
配列番号１４〜２１：＜２２３＞柔軟なリンカー
配列番号２２：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２３：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２４：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２５：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２６：＜２２３＞柔軟なリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然に存在するいずれのアミノ酸であってもよい
配列番号２７〜５４：＜２２３＞柔軟なリンカー
配列番号５５〜６８：＜２２３＞リンカー
配列番号６９〜７０：＜２２３＞ペプチド配列
配列番号７１〜７５：＜２２３＞リンカー
配列番号７６〜９８：＜２２３＞ＧＣＮ４ペプチド変異体
配列番号９９〜１００：＜２２３＞５２ＳＲ４  ｓｃＦＶ変異体
配列番号１０１〜１０４：＜２２３＞シグナル配列
【図１】
2019507104.tif 000009
【図２】
2019507104.tif 000010
【図３】
2019507104.tif 000011
【図４】
2019507104.tif 000012
【図５】
2019507104.tif 000013
【図６】
2019507104.tif 000014
【図７】
2019507104.tif 000015
【図８】
2019507104.tif 000016
【図９Ａ−９Ｂ】
2019507104.tif 000017
【図１０】
2019507104.tif 000018
【図１１】
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【図１２】
2019507104.tif 000020
【図１３】
2019507104.tif 000021
【図１４】
2019507104.tif 000022
【図１５】
2019507104.tif 000023
【図１６】
2019507104.tif 000024
【図１７】
2019507104.tif 000025
【図１８】
2019507104.tif 000026
【図１９】
2019507104.tif 000027
【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019507104.tif 000031
2019507104.tif 000032
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