(57)【要約】  本発明は、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示する、ＩｇｄＥと命名される新しい連鎖球菌プロテアーゼに関する。本発明は、記載された連鎖球菌プロテアーゼを使用してＩｇＧを切断するインビトロの方法、この方法を使用してＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせること、ならびにこの方法を使用してＩｇＧを検出することにさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する、（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が配列番号３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料と、特異的システインプロテアーゼ活性が生ずることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記切断産物の同定および／または単離をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記同定および／または単離が、ゲル電気泳動または質量分析法による分析を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦｃおよびＦａｂフラグメントを生じさせるために使用される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＩｇＧを検出するために使用される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）試料を、請求項１に記載のポリペプチドと、前記ポリペプチドのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および
（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切断フラグメントの存在についてモニターすること
を含み、前記特異的切断フラグメントの存在が試料中のＩｇＧを示す、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示する新しい連鎖球菌プロテアーゼに関する。本発明は、連鎖球菌感染の治療およびそれに対するワクチン接種、病原性のＩｇＧ抗体により媒介される状態、例えば自己免疫性疾患などの治療、ならびにバイオテクノロジーのための新しい手段の開発にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性細菌は、それらの宿主にコロニーをつくって侵略する種々の戦略を発達させており、広範囲のビルレンス因子が、成長を促進して、宿主の免疫応答からの回避を媒介するために使用される。病原性細菌は、絶滅の明白なリスクを避けるために、両方の自然免疫応答に対処するだけでなく、最も重要なことであるが、特異的免疫グロブリンにも対処しなければならない。特異的Ｉｇは、補体に基づく、および／または食作用に基づく免疫応答を開始することによる適応免疫系の中心である。Ｉｇは、可撓性ヒンジ領域を通してＦｃエフェクター部分と連結している抗原を認識する可変性のＦａｂ領域からなる。Ｆｃ領域は、食作用細胞の特異的受容体との接触を媒介するか、またはＣ１ｑと結合することにより補体の古典的経路を開始させる。したがって、ヒンジ領域は、数種の微生物のプロテアーゼのための標的であり、例には、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）からのＩｄｅＳ（von Pawel-Rammingen et al. 2002. EMBO J. 21、1607-161）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphymonas ginivalis）からのギンギパインＫ（Gingipain K）（Vincents et al. 2011. FASEB J. 10, 3741-3750）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からのＳｓｐＡ（Prokesova et al. 1992. Immunol. Lett. 31. 259-265）が含まれる。
【０００３】
連鎖球菌感染は、ヒトならびにブタ、ウマおよびウシのような家畜に共通する。連鎖球菌感染は、比較的緩和な疾患から重症の生命を脅かす状態まで、重症度がさまざまである。連鎖球菌感染の防御、予防および治療においてヒトおよび獣医学的ワクチンで使用することができる連鎖球菌抗原の供給の必要性は大きい。
【０００４】
厳密な配列特異性を有するプロテアーゼは、バイオテクノロジー的手段として有用である。免疫グロブリンを分解するプロテアーゼは、医学的に使用することができて、例えば、ＩｇＧを特異的に分解するプロテアーゼは、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防のために使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、連鎖球菌（streptoccoci）由来のＩｇＧを分解する酵素の新規なファミリーを同定し、精製して特徴付けた。この酵素のファミリーは、免疫グロブリンＧを分解する酵素としてＩｇｄＥと命名され、以前に特徴付けられたＩｄｅＳファミリーの連鎖球菌の免疫グロブリンを分解するプロテアーゼと区別されるシステインプロテアーゼであり、ＩｇＧのヒンジ領域の効率的な切断を高度の特異性をもって媒介する。
【０００６】
該酵素は、Ｓ．スイス（S. suis）の株で同定されて、ＩｇｄＥｓｕｉｓと命名され；Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株で同定されて、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅと命名され；Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株で同定されてＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓと命名され；Ｓ．エクイ（S. equi）の株で同定されて、ＩｇｄＥｅｑｕｉと命名され；Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株で同定されて、ＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓと命名された。
【０００７】
Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥは、ブタＩｇＧに対して高度に特異的であることが示されている。ＩｇＭを切断するプロテアーゼＩｄｅＳｓｕｉｓと同様に、１１２１アミノ酸の大きいタンパク質は、該タンパク質のＮ末端部分にタンパク質分解活性ドメインを保有する。Ｎ末端の４７０アミノ酸からなる短縮型Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥタンパク質がＩｇＧ切断活性を保持するので、フルサイズのタンパク質は、インビトロではＩｇＧ切断のために必須ではない。
【０００８】
Ｓ．スイス（S. suis）のＩｇｄＥによるブタＩｇＧの切断は、２つのＩｇＧ重鎖間で共有結合のジスルフィド結合を形成しているように思われるヒンジ領域システイン残基のちょうどＮ末端で起こった。したがって、ＩｇＧ切断は、６４ｋＤａのＦｃフラグメントおよび２つのＦａｂフラグメントの形成をもたらす。この切断パターンは、ＩｇＧをより低いヒンジ領域で加水分解して、それにより１つのＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび２つの同一の１／２Ｆｃフラグメントを生じさせるＳ．ピオゲネス（S. pyogenes）のＩｇＧエンドペプチダーゼＩｄｅＳ（von Pawel-Rammingen ibid）およびＩｇＭのＣ末端を鎖内ジスルフィド結合から切断して遊離の１／２Ｆｃフラグメントを生じさせるＩｄｅＳｓｕｉｓ（Seele et al. 2015. J. Vet. Res. 46, 45）と区別される。
【０００９】
Ｓ．スイス（S. suis）は、例えば、ヒトおよびブタで髄膜炎を引き起こし得る。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）は、例えば、ヒトおよびウシで髄膜炎および敗血症を引き起こし得る。Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）は、例えば、ブタで気道感染、ブタ腺疫を起こし得る。Ｓ．エクイ（S. equi）は、例えば、ウマで気道感染、腺疫を起こし得る。
【００１０】
ＩｇｄＥファミリーのプロテアーゼは、連鎖球菌感染の予防および治療に、例えば、連鎖球菌感染に対する免疫化のためのワクチンなどで使用される。ＩｇｄＥ抗体は、連鎖球菌感染と関連する状態の受動免疫化および治療でさらに使用される。ＩｇｄＥプロテアーゼは、新しいバイオテクノロジー的手段を開発するためにも有用であり、さらにＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態、例えば、自己免疫性疾患、移植拒絶、手術後の治療および後天性血友病などを治療または予防するために使用される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象において免疫応答を生じさせることに使用するための単離されたＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【００１２】
単離されたＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせることができる、それらのいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は、好ましくは、連鎖球菌である。
【００１３】
第１の態様の一実施形態において、本発明は、対象において免疫応答を生じさせることに使用するための：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号１のフラグメント、配列番号１の変異体、もしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）対象において、連鎖球菌、好ましくは、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号３のフラグメント、配列番号３の変異体、もしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）対象において、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号５のフラグメント、配列番号５の変異体、もしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号７のフラグメント、配列番号７の変異体、もしくは配列番号７の変異体のフラグメント；または
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号９のフラグメント、配列番号９の変異体、もしくは配列番号９の変異体のフラグメント
を含み；好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である、ＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【００１４】
好ましくは、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。
【００１５】
第１の態様の別の実施形態において、本発明は、ＩｇｄＥポリペプチドを対象に投与することを含む、前記対象において免疫応答を生じさせる方法を提供する。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのＩｇｄＥポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
ＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉまたはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌に対する免疫応答を生じさせることができる、それらの任意の変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
【００１８】
第２の態様の一実施形態において、本発明は、対象において、ポリヌクレオチド免疫応答を生じさせることに使用するための：
（ａ）ポリペプチド配列番号１もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列；
（ｂ）ポリペプチド配列番号３もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列；
（ｃ）ポリペプチド配列番号５もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列；
（ｄ）ポリペプチド配列番号７もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列；または
（ｅ）ポリペプチド配列番号９もしくは上で定義されたそれらの変異体もしくはフラグメントをコードする配列
を含む、ＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
第２の態様の別の実施形態において、本発明は、対象において、免疫応答を生じさせることに使用するための：
（ａ）配列番号２もしくはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｅ）ＩｇｄＥシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答を生じさせることができる配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のいずれかのフラグメント；
（ｆ）配列番号４もしくはそれに相補的な配列；
（ｇ）（ｆ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｈ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｉ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｊ）配列（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のいずれかの、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｋ）配列番号６もしくはそれに相補的な配列；
（ｌ）（ｋ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｍ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｎ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする、配列（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）もしくは（ｎ）のいずれかのフラグメント；
（ｐ）配列番号８もしくはそれに相補的な配列；
（ｑ）（ｐ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｒ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｓ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；または
（ｔ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする配列（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）もしくは（ｓ）のいずれかのフラグメント；
（ｕ）配列番号１０もしくはそれに相補的な配列；
（ｖ）（ｕ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｗ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｘ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；または
（ｙ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードする、配列（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）もしくは（ｘ）のいずれかのフラグメント
を含むＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。
【００２１】
好ましくは、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。
【００２２】
第２の態様の別の実施形態において、本発明は、ＩｇｄＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、前記対象において免疫応答を生じさせる方法を提供する。
【００２３】
第３の態様において、本発明は、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防に使用するための単離されたＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【００２４】
ＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉまたはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するそれらのいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
【００２５】
第３の態様の一実施形態において、本発明は、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防に使用するための：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメントもしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメントもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメントもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメントもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むＩｇｄＥポリペプチドを提供する。
【００２６】
好ましくは、ＩｇｄＥポリペプチドは：
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントまたは配列番号３の変異体のフラグメント；
を含む、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅポリペプチドであり得る。
【００２７】
第３の態様の別の実施形態において、本発明は、治療的有効量のＩｇｄＥポリペプチドを対象に投与することを含む、ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療、防御または予防のための方法を提供する。
【００２８】
ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態は、自己免疫性疾患、移植拒絶、手術後の治療および後天性血友病であり得る。
【００２９】
第４の態様において、本発明は、ＩｇＧを、システインプロテアーゼ活性を有するＩｇｄＥポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法を提供する。
【００３０】
ＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を保持する、それらのいずれかの変異体もしくはフラグメントである。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は好ましくは連鎖球菌である。
【００３１】
第４の態様の一実施形態において、本発明は、ＩｇＧを、ＩｇｄＥポリペプチドと接触させることを含むＩｇＧの切断のためのインビトロの方法であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメントもしくは配列番号１の変異体のフラグメント。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメントもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメントもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメントもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１
の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含む方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、ＩｇｄＥポリペプチドは：
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；または
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントもしくは配列番号３の変異体のフラグメント
を含むＩｇｄＥａｇａｌａｃポリペプチドであり得る。
【００３３】
第４の態様の別の実施形態において、本発明は、ＩｇＧを、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するＩｇｄＥポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧのＦｃまたはＦａｂフラグメントを生じさせるためのインビトロの方法を提供する。
【００３４】
第５の態様において、本発明は、ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害する物質を同定する方法を提供する。該方法は；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを、候補物質と、該物質の不在下におけるＩｇＧのシステイン活性を可能にする条件下で接触させること、
ｂ）候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と比較して決定すること、
ｃ）それにより、該物質が、ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定すること
を含むことができる。
【００３５】
ＩｇＧ分解の定量分析は、実施例１で説明されるように実施することができる。
【００３６】
本発明による方法で試験され得る候補化合物は、「低分子」として一般的に知られる簡単な有機分子、例えば、分子量が２０００ダルトン未満のものを含む。該方法は、化合物ライブラリー、例えば、合成ペプチドライブラリーおよびペプチドファージライブラリーを含むペプチドライブラリーなどをスクリーニングするために使用することもできる。他の適当な分子は、ポリヌクレオチド配列、およびＩｇｄＥのＩｇＧを分解する活性を調整する任意の他の分子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清におけるＩｇＧ分解活性。  （Ａ）Ｓ．スイス（S. suis）株１０および１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓの濃縮された（２０×）培養上清を２％ブタ血漿と、３７℃で１６時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。約３２ｋＤａの分解産物（＊）が観察された。（Ｂ）硫酸アンモニウムにより分別沈殿されたＳ．スイス（S. suis）株１０の培養上清の抗ＩｇＧウェスタンブロット分析。２０〜４０％および４０〜６０％硫酸アンモニウム飽和分画と、３７℃で１６時間、１％ブタ血漿のインキュベーション後、ＩｇＧ分解産物（＊）が得られた。レーン１は、タンパク質のサイズ標準を示す化学発光シグナルの検出前の膜の写真の画像である。（Ｃ）全ての試験血清型のＳ．スイス（S. suis）株の培養上清がＩｇＧを切断させた。濃縮された（１０×）培養上清を１％ブタ血漿と３７℃で１６時間インキュベートして、抗ＩｇＧウェスタンブロットにより分析した。変化する強度の約３２ｋＤａにおけるＩｇＧ切断産物（＊）が全てのレーンで観察された。異なるウェスタンブロットの画像を１つの図に集めた。
【図１−２】Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清におけるＩｇＧ分解活性（図１−１の続き）。
【図２】Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの活性部位の同定。  （Ａ）ＩｇｄＥおよび潜在的な活性部位の残基を置換した異なるｒＩｇｄＥ構築物およびＣ末端短縮変異体の模式的例示。分泌シグナルペプチド（残基１〜３７）は薄い灰色でマークし、トランスグルタミナーゼドメインはボックスで囲み、潜在的な活性部位の残基および置換を示した。（Ｂ）３．３μＭのブタＩｇＧを、３７℃で１６時間、大腸菌（E. coli）細胞が発現した異なるｒＩｇｄＥ構築物の可溶性分画とインキュベートした。反応を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＩｇＧ切断（＊）は、ｒＩｇｄＥ、ｒＩｇｄＥＤ３４８ＡおよびｒＩｇｄＥΔＣとのインキュベーションで起こったが、ｒＩｇｄＥＣ３０２ＳまたはｒＩｇｄＥＨ３３３Ａとでは起こらなかった。３７ｋＤａの弱いタンパク質のバンドは、溶解物調製において存在する汚染物質であり、ＩｇｄＥ活性とは関係がない。
【図３】組換えＳ．スイス（S. suis）のＩｇｄＥの時間経過および阻害剤プロファイル。  切断（Ａ）の時間経過を連続サンプリングによりモニターした後、還元条件下でクーマシーフルオルオレンジ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、続いて切断産物をデンシトメトリーで定量した。１．６７μＭのブタＩｇＧを０．２μＭの精製ｒＩｇｄＥΔＣとインキュベートした。終夜の切断（１６時間）を１００％相対切断と定めた。阻害剤のプロファイル（Ｂ）のために、２５０μＭおよび２．５μＭの各阻害剤の存在下で初期切断をモニターした。阻害されない対照の初期切断活性を１００％相対活性と定めた。ＤＭＳＯ対照は、２５０μＭのＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２と相関する。データは３回の実験の平均±ＳＥＭとして表す。阻害されない対照（＊）またはＤＭＳＯ対照（○）との差を、Ｄｕｎｎｅｔｔの複数の比較試験により、有意性を＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）および＜０．００１（＊＊＊または○○○）のＰ値に設定して分析した。
【図４】Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧの重鎖をヒンジ領域で切断する。  反応を、非還元（Ａ）および還元（Ｂ）クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。３．３μＭのＩｇＧを、１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（−）３７℃で１６時間インキュベートした。（Ｃ）観察された切断パターンおよび切断部位により、１つのＩｇＧ重鎖が最初にＩｇｄＥにより加水分解されて１つの遊離のＦａｂフラグメント（Ｆａｂ）および単一の切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）を生じ、第２ステップで他の重鎖が加水分解されて、１つのＦｃフラグメント（Ｆｃ）および２つのＦａｂフラグメントが生ずるモデルが提案される。
【図５−１】ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧに高度に特異的である。  （Ａ）２％ブタ血漿を１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（−）インキュベートした。反応を、抗ブタＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロットにより還元条件下で分析した。ＩｇＧの切断のみが観察された（＊）。（Ｂ）０．５ｍｇ／ｍｌの異なる種のＩｇＧを、１０ｎＭ精製のｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（−）インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ブタ（＊）以外のどの他の種から誘導されたＩｇＧの切断も観察されなかった。３７ｋＤａの弱いタンパク質バンドは、溶解物調製において存在する汚染物質であり（レーン２を参照されたい）、ＩｇｄＥ活性と関係がない。異なるゲルの画像を１つの図にまとめた。
【図５−２】ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧに高度に特異的である（図５−１の続き）。
【図６−１】内因性ＩｇＧのＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥによる分解。  Ｓ．スイス（S. suis）のＩｇｄＥは、健常ブタおよびそれぞれの病変を有するブタの全ての試験体液で、内因性ＩｇＧを分解する。（サイズを矢印で示した）。他の分解産物は観察できなかった。体液を１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥと（＋）またはそれなしで（−）、３７℃で１６時間インキュベートした。反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および抗ＩｇＧウェスタンブロット（Ｂ）により還元条件下で分析した。タンパク質サイズ標準を示すレーンは、化学発光シグナルの検出前の膜の写真画像である。異なるゲルの画像を１つの図にまとめた。
【図６−２】内因性ＩｇＧのＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥによる分解（図６−１の続き）。
【図７】ＩｇｄＥは、Ｓ．スイス（S. suis）によるＩｇＧ切断のために必要であり、ＩｇＧ切断はＩｄｅＳｓｕｉｓと独立である。  Ｓ．スイス（S. suis）株１０、１０ΔｉｇｄＥ、１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓおよび１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓΔｉｇｄＥの濃縮された（１０×）上清を、１％ブタ血漿と３７℃で１６時間インキュベートした。反応を抗ＩｇＧウェスタンブロット（Ａ）または抗ＩｇＭウェスタンブロット（Ｂ）により還元条件下で分析した。ＩｇＧ分解（＊）は、株１０および１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓの上清とインキュベートしたときにのみ観察され、それに対してＩｇＭ分解（＊）は、株１０および１０ΔｉｇｄＥの上清とのインキュベーションでのみ観察された。
【図８】Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清におけるＩｇＧ分解活性検出の阻害剤プロファイル。  Ｓ．スイス（S. suis）の株１０の濃縮された（１０×）培養上清を、クラス特異的プロテアーゼ阻害剤の存在下でブタ血漿とインキュベートした。反応を抗ＩｇＧウェスタンブロットにより還元条件下で分析した。ＩｇＧの切断産物は、０．１〜１ｍＭのＡＥＢＳＦ、０．１〜５ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＥ−６４、いかなる阻害剤もなし、および１／２００希釈完全阻害剤カクテル（星印でマークした）とインキュベートしたときに観察され、それに対して、５ｍＭのＡＥＢＳＦ、２５０μＭのＥ−６４、濃縮された上清なし（−Ｃ）、０．１〜５ｍＭのＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２、０．１〜５ｍＭのヨードアセトアミドおよび１／５０希釈完全阻害剤カクテルとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
【図９】ｒＩｇｄＥΔＣ精製の代表的なクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるモニタリング。  発現プラスミドを保有する大腸菌（E. coli）をＩＰＴＧで誘発して、その溶解物から、ｒＩｇｄＥΔＣを精製した。Ｈｉｓ−ＺＺタグ付きｒＩｇｄＥΔＣを含有するＮｉ２＋−親和性クロマトグラフィー精製の溶出物を、Ｔｅｖ−プロテアーゼとインキュベートして、Ｈｉｓ−ＺＺ−タグを除去した後、第２回のＮｉ２＋−親和性クロマトグラフィー精製を行なった。タグのないｒＩｇｄＥΔＣを含有するこの精製ステップの流通分画２および３を溜めて、緩衝液をＰＢＳと交換してさらなる実験に使用した。ｒＩｇｄＥΔＣの部分分解に基づいて、５０ｋＤａの周囲の２つの主要なバンドをこれらの分画で観察することができる。
【図１０−１】ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒトＩｇＧ１を特異的に切断する。  （Ａ）ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅを、６種の異なる種のポリクローナルＩｇＧと３７℃で１８時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分解産物を星印（＊）により示す。異なるゲルの画像を、図を作成するために使用した。（Ｂ）ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅを、ヒトまたはウシ血清と３７℃で１８時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分解産物を星印（＊）により示す。（Ｃ）ヒトおよびブタ血清と３７℃で１８時間インキュベートしたｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅの粗抽出物を用いたウェスタンブロット。ヒトおよびブタのポリクローナルＩｇＧに対するそれぞれの抗体で膜を処理した。分解産物を星印（＊）により示す。（Ｄ）ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅを、ヒトＩｇＧのサブクラスならびにヒトＩｇＡおよびＩｇＭと３７℃で１８時間インキュベートして、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分解産物を星印（＊）により示す。異なるゲルの画像を、図を作成するために使用した。
【図１０−２】ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒトＩｇＧ１を特異的に切断する（図１０−１の続き）。
【図１０−３】ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒトＩｇＧ１を特異的に切断する（図１０−２の続き）。
【図１１】ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清ＩｇＧ１を、単一の切断されたＩｇＧ１にまで完全に分解する。  ヒト血清およびモノクローナルヒトＩｇＧ１を、ｒＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅの存在（＋）または不在（−）下で３７℃で１８時間インキュベートして、ヒトＩｇＧ１特異的抗体を用いて非還元条件下でウェスタンブロットにより分析した。
【図１２−１】ｒＩｇｄＥｅｑｕｉは、ウマＩｇＧ７のみを切断する。  ０．６μＭの組換えウマＩｇＧサブタイプまたは血清ＩｇＧを、３７℃で１６時間、ｒＩｇｄＥｅｑｕｉを発現する大腸菌（E. coli）細胞の可溶分画の存在（＋）または不在（−）下でインキュベートした。反応を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＩｇＧ切断（＊）は、ＩｇＧ７および血清ＩｇＧとのインキュベーションで起こった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、クーマシーフルオルオレンジタンパク質ゲル染色（Ａ）で染色するかまたはウサギ抗ウマＩｇＧＨ＆Ｌ（ＨＲＰ）ａｂ６９２１を用いてウェスタンブロット（Ｂ）分析にかけるかのいずれかを行なった。
【図１２−２】ｒＩｇｄＥｅｑｕｉは、ウマＩｇＧ７のみを切断する（図１２−１の続き）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿０１２０２７７２０．１、ＷＰ＿０４４６８７７１７．１、ＷＰ＿０４５００２８９３．１、ＷＰ＿０４４９８１１６６．１、ＷＰ＿０４４７７０４３２．１、ＷＰ＿０４３０４１５２７．１、ＷＰ＿０１４９１７３０７．１、ＷＰ＿０４４９８１１４１．１、ＷＰ＿０４４７６６０３１．１、ＷＰ＿０４４７８０６２８．１、ＷＰ＿０４４９８０４８１．１、ＷＰ＿０４４７６８３０４．１、ＷＰ＿０４３０３３１７６．１、ＷＰ＿０４４７７２５７３．１、ＡＢＱ４２８８３．１、ＡＢＱ４２８８２．１、ＡＢＱ４２８８４．１、ＡＢＱ４２８８５．１、ＷＰ＿０２４４０２６０４．１、ＷＰ＿０４４６７１８０３．１、ＷＰ＿０１４６３９０００．１、ＷＰ＿０１４６３６４９９．１、ＷＰ＿０４４４７５２７０．１、ＷＰ＿０４４６８３０４９．１、ＷＰ＿０４４６８２６０３．１、ＷＰ＿０４４９８２６７４．１、ＷＰ＿０２４４０６２１２．１、ＷＰ＿０２４４０２３７６．１、ＷＰ＿０２４３８２８６０．１、ＷＰ＿０４４６８４００５．１、ＷＰ＿０４４６８８０５５．１、ＷＰ＿０４４７５４１５３．１、ＷＰ＿０２４４１２９４１．１、ＷＰ＿０２９１７２８０５．１、ＡＥＲ１５９３２．１、ＷＰ＿０２４４１４４９３．１、ＷＰ＿０４４７６２５６０．１、ＷＰ＿０２４４１７７７１．１、ＷＰ＿０４４６７５２８１．１、ＷＰ＿０４４６６６８１９．１、ＷＰ＿０４３０３２９８０．１、ＷＰ＿０４４６７１７５５．１、ＷＰ＿０２４４１６３６３．１、ＡＢＬ８４３５４．１、ＡＢＬ８４４１３．１、ＷＰ＿０４４７５８８９９．１、ＷＰ＿０２４３９３９１９．１、ＷＰ＿０１４７３６３２１．１、ＷＰ＿０２４３８３６２０．１、ＷＰ＿０４４４７５４８８．１、ＷＰ＿０２４３８６７００．１、ＷＰ＿０２４３８１９５１．１、ＷＰ＿０２４３９０５７９．１、ＷＰ＿０２３３７１４１９．１、ＷＰ＿０４４７７２５７６．１、ＷＰ＿０４４７６６７７４．１、ＷＰ＿０４４６７２５９６．１、ＷＰ＿０４３０２８７５２．１、ＷＰ＿０４４７７１５０８．１、ＷＰ＿０２４３８３８５１．１、ＷＰ＿０２４３８８９５７．１、ＷＰ＿０２４３９４９５９．１、ＷＰ＿０２９１７４６３２．１、ＷＰ＿０４４７５２１２０．１、ＷＰ＿０４４６７８０７７．１、ＷＰ＿００２９３８２６２．１、ＷＰ＿０４４７６９９９１．１、ＷＰ＿０４４７７０６８１．１、ＷＰ＿０４４７４９７３６．１、およびＷＰ＿０４４７７１３９２．１として見出すことができる。
【００３９】
配列番号２は、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【００４０】
配列番号３は、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株ＣＣＵＧ４２０８から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）からのＩｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＥＰＵ２１３４２．１、ＥＦＶ９８１６１．１、ＣＡＤ４７５５４．１、ＥＰＵ２３９３９．１、ＥＰＷ７１９７２．１、ＥＰＴ９９２６１．１、ＥＰＶ９０３２９．１、ＥＧＳ２６８２５．１、ＥＰＶ８４８８８．１、ＣＦＱ５２８１１．１、ＥＰＴ８４７８０．１、ＥＰＴ９９０７４．１、ＣＣＷ４２９３６．１、ＣＣＷ４０８４８．１、ＥＡＯ７０４５０．１、ＥＰＵ７４８３８．１、ＥＰＴ５１２３６．１、ＥＰＵ７７７６１．１、ＥＰＴ３６２８０．１、ＷＰ＿０１１０５８３８１．１、ＥＰＴ５９８６０．１、ＥＰＴ３９１７０．１、ＥＰＴ３８７３４．１、ＣＦＱ２５５６８．１、ＥＰＵ４０８７７．１、ＷＰ＿０２５１９３６１９．１、ＷＰ＿０００４４０３２９．１、ＷＰ＿０００４４０３３３．１、ＷＰ＿０００４４０３３０．１、ＷＰ＿０００４４０３３１．１、ＷＰ＿０４７１９９１５４．１、ＷＰ＿００１９０１２０６．１、ＷＰ＿０２５１９３２７３．１、ＷＰ＿０２５１９４９２３．１、ＷＰ＿０００４４０３３４．１、ＷＰ＿０２５１９５５５９．１、ＷＰ＿０４７２０００４３．１、ＷＰ＿０４１１６５７７３．１、ＥＰＵ３３３０７．１、ＣＦＷ６６６２０．１、ＷＰ＿０４１９８１１９１．１、ＷＰ＿０００４４０３３２．１、ＷＰ＿０４７２００２６１．１、ＷＰ＿０２９６９２０８３．１、ＷＰ＿０１７７７０８７０．１、ＷＰ＿０２５１９７８８５．１、ＥＡＯ７５１５３．１、ＷＰ＿００１８８４４７２．１、ＥＡＯ６２４５２．１、ＷＰ＿０２５１９５７７６．１、ＷＰ＿０４７２００２８０．１、ＣＦＷ６６６１８．１、およびＥＡＯ７５１５５．１として見出すことができる。
【００４１】
配列番号４は、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）の株ＣＣＵＧ４２０８から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【００４２】
配列番号５は、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株ＤＳＭ２０７２５から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）からのＩｇｄＥのアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿００３０８５２６９．１として見出すことができる。
【００４３】
配列番号６は、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）の株ＤＳＭ２０７２５から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【００４４】
配列番号７は、Ｓ．エクイ（S. equi）の株ｓｓｐズーエピデルミクス（zooepidemicus）＃１から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．エクイ（S. equi）からのＩｇｄＥの追加のアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＫＤＥ０１９８０．１、ＫＩＳ０７６６８．１、ＫＩＳ０８７０７．１、ＫＩＳ１９９７１．１、ＷＰ＿０４３０３８７９５．１、ＷＰ＿０４３０３６６０２．１、ＷＰ＿０３７５８４０７６．１、ＫＩＳ２０８９６．１、ＡＩＡ６８８０４．１、ＷＰ＿０４３０２９５２２．１、ＷＰ＿０１２６７８２５９．１、ＷＰ＿０４２６７０３２３．１、ＷＰ＿０４３０４０３２４．１、およびＷＰ＿０１４６２２５４６．１として見出すことができる。
【００４５】
配列番号８は、Ｓ．エクイ（S. equi）株ｓｓｐズーエピデルミクス（zooepidemicus）＃１から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号９は、Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１３８１から単離されたＩｇｄＥのアミノ酸配列である。Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）からのＩｇｄＥのアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋで、アクセッション番号ＷＰ＿００７８９５６７６．１として見出すことができる。
【００４７】
配列番号１０は、Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の株ＡＴＣＣＢＡＡ−１３８１から単離されたＩｇｄＥをコードする核酸配列である。
【００４８】
配列番号１１は、Ｓ．スイス（S. suis）から単離されたＩｇｄＥのＣ末端短縮型変異体のアミノ酸配列である。
【００４９】
ＩｇｄＥポリペプチド
本発明によるＩｇｄＥポリペプチドは、好ましくは、ＩｇｄＥｓｕｉｓ、ＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅ、ＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓ、ＩｇｄＥｅｑｕｉ、またはＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓポリペプチド、またはシステインプロテアーゼ活性を保持するそれらの任意の変異体もしくはフラグメントであり、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる。変異体は、別の細菌からのＩｇｄＥポリペプチドであってもよい。細菌は、好ましくは連鎖球菌である。
【００５０】
ＩｇｄＥポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１のアミノ酸配列；または配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１の任意のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれか１つの変異体；または配列番号１、３、５、７、９、１１のフラグメント；またはＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれか１つの変異体を含むことができる。
【００５１】
ＩｇｄＥポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１のアミノ酸配列；または配列番号１、３、５、７、９、または１１の任意のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるそれらのいずれか１つの変異体；または配列番号１、３、５、７、９、１１のフラグメント；または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるそれらのいずれか１つの変異体を含むことができる。
【００５２】
連鎖球菌は、Ｓ．スイス（S. suis）、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）、Ｓ．エクイ（S. equi）、またはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）であり得る。
【００５３】
好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、または１１の配列のいずれかを含むかまたはそれらからなる。
【００５４】
該ポリペプチドは、それに加えて、シグナル配列またはＮ末端メチオニンを含むことができる。
【００５５】
変異体ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、配列番号１、３、５、７、９、または１１中のものからそれぞれ変化したものであるが、ＩｇｄＥと同じ必須の特性または基本的機能性を保持する。それゆえ、変異体ポリペプチドは、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示することができ、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる。好ましくは、免疫応答は保護免疫応答である。好ましくは、免疫応答は、免疫化された対象において、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥの、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。注目に値することとして、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を欠くＩｇｄＥ変異体は、それでも、免疫化された対象において、免疫応答を向上させることができ、感染性連鎖球菌のＩｇｄＥのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を中和することができる抗体を生じさせる。そのようなＩｇｄＥ変異体は、本発明によるＩｇｄＥ変異体に含まれる。
【００５６】
典型的には、約７０％を超える同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％および特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有し、配列番号１、３、５、７、９、または１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、タンパク質の変異体と考えられる。そのような変異体は、該ペプチドが基本的なＩｇｄＥの機能性を維持する限り、対立遺伝子の変異体およびタンパク質配列内における単一のアミノ酸またはアミノ酸群の欠失、改変または付加を含んでいてもよい。配列番号１、３、５、７、９、または１１の変異体の同一性は、配列番号１、３、５、７、９、または１１で示される配列、またはより好ましくは、配列番号１、３、５、７、９、または１１の全長にわたる少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００またはそれを超える隣接アミノ酸の領域にわたって測定することができる。上で列挙した下限の任意のものが、上で列挙した上限の任意のものと組み合わされて本発明のポリペプチドの長さについての範囲を提供することができることは認識されるであろう。例えば、ポリペプチドは、５０から２５０アミノ酸の長さ、または１００から３００アミノ酸の長さであることもできる。ポリペプチドは、１００から５８６アミノ酸の長さ、１５０から５００アミノ酸の長さまたは１００から４００アミノ酸の長さであることもできる。
【００５７】
アミノ酸の同一性は、任意の適当なアルゴリズムを使用して計算することもできる。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、その初期設定で使用される）（Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を計算するため、または配列を並べるために使用することができる（例えば、等価のまたは対応する配列を同定するなど（典型的には、それらの初期設定で）、例えばAltschul S. F. (1993) J MoI Evol 36: 290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J MoI Biol 215: 403-10に記載されているように）。
【００５８】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に入手することができる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列されたときに、若干正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすかのいずれかの問題の配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列のペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、前出）。これらの最初の隣接ワードのヒットはそれらを含有するＨＳＰを見出すための調査を開始するための手がかりとして役立つ。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向におけるワードヒットの拡大は、累積アラインメントスコアがその最大の獲得値から量Ｘだけ低下したとき；１つもしくは複数の負のスコアの残留アラインメントの蓄積に基づいて、累積スコアが、ゼロもしくはそれ未満になるとき；またはいずれかの配列の端部に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期値として、ワードの長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89: 10915-10919を参照されたい）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００５９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率を示す。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比率の最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満であるならば、ある配列は、別の配列と同様であると考えられる。
【００６０】
変異体の配列は、典型的には、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０またはそれを超えて、アミノ酸の位置が異なる（それは、おそらく、アミノ酸の置換、欠失または挿入による）。例えば、１から５０、２から３０、３から２０または５から１０個のアミノ酸の置換、欠失または挿入がなされ得る。置換は、好ましくは、例えば、以下の表１による保存的置換である。アミノ酸は、第２の欄中の同じブロック中で、好ましくは、第３の欄の同じ行中で、互いに置換されてもよい。
【００６１】
【表１】
2019506866.tif 000002
特に断りのない限り、改変は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を、同様の化学構造、同様の化学的性質または同様な側鎖体積の他のアミノ酸で置き換える。導入されたアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有することができる。あるいは、保存的置換は、予め存在する芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することもできる。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり、下の表Ａ１で定義された２０種の主要なアミノ酸の性質に従って選択することができる。アミノ酸が同様な極性を有する場合、これは、表Ａ２におけるアミノ酸側鎖についてのヒドロパシースケールを参照して決定することができる。
【００６２】
【表２】
2019506866.tif 000003
【００６３】
【表３】
2019506866.tif 000004
好ましくは、ポリペプチドは、システイン残基およびヒスチジン残基を、典型的にはシステインプロテアーゼで見出される間隔で含む。例えば、配列番号１では、これらの残基は、位置３０２および位置３３３に見出される。触媒的三連構造を完成するアスパラギン酸残基は、位置３４８に見出される。
【００６４】
本発明で使用されるＩｇｄＥポリペプチドのフラグメントは、それがＩｇＧを分解するＩｇｄＥのシステインプロテアーゼ活性を保持し、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる限り、典型的には少なくとも１０、例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれを超えるアミノ酸の長さ、１００、１５０、２００、２５０または３００アミノ酸までの長さである
【００６５】
本発明で使用されるポリペプチドは、化学的に改変されていても、例えば、翻訳後に改変されていてもよい。例えば、それらは、グリコシル化されていても、リン酸化されていても、または改変されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。それらは、ヒスチジン残基の付加により改変されて、それらの精製を容易にすることも、またはシグナル配列の添加により細胞膜中への挿入を促進することもできる。そのような改変されたポリペプチドは、本明細書で使用される用語「ポリペプチド」の範囲内に入る。
【００６６】
典型的には、本発明により使用するためのポリペプチドは、免疫グロブリンシステインプロテアーゼ活性、特にＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を提示する。好ましくは、該ポリペプチドは、ＩｇＧを、ヒンジ領域で、より特定して重鎖のヒンジ領域で切断する。好ましくは、切断は、ＩｇＧのＦｃおよびＦａｂフラグメントの産生をもたらす。好ましくは該活性は、ＩｇＧに特異的である。ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性は、適当なアッセイ手段により決定することができる。例えば、試験ポリペプチドを、３７℃などの適当な温度でＩｇＧとインキュベートしてもよい。そのとき、出発原料および反応産物を、所望のＩｇＧ切断産物が存在するかどうかを決定するために、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析することもできる。典型的には、この切断産物は３２ｋＤａのフラグメントである。典型的には、この最初の切断の後、ＩｇＧのさらなる分解はない。切断がＩｇＧのヒンジ領域で起こったことを検証するために、切断産物をＮ末端の配列決定にかけることができる。
【００６７】
ポリペプチドのシステインプロテアーゼ活性は、阻害の研究により、さらに特徴付けることができる。好ましくは、活性は、プロテアーゼ阻害剤であるペプチド誘導体Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２により、および／またはヨード酢酸により阻害される。
【００６８】
ポリペプチドのＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性は、該ポリペプチドは、他のクラスのＩｇ、すなわちＩｇＭ、およびＩｇＡを、ＩｇＧの切断を可能にする条件下で、これらの免疫グロブリンとインキュベートしたときに、分解することができないことにおいて、一般的にＩｇＧ特異的である。Ｓ．スイス（S. suis）、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）、およびＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）からのＩｇｄＥは、ブタＩｇＧに特異的であることが見出された。Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）からのＩｇｄＥは、ヒトＩｇＧに、特にヒトＩｇＧ１に特異的であることが見出された。Ｓ．エクイ（S. equi）からのＩｇｄＥは、ウマＩｇＧに、特にウマＩｇＧ７に特異的であることが見出された。
【００６９】
本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に単離された形態であってもよい。該ポリペプチドは、ポリペプチドの意図される目的に干渉しないと思われる担体または希釈剤と混合されて、それでもなお実質的に単離されていると考えられ得ることが理解されるであろう。本発明で使用するためのポリペプチドは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、実質的に精製された形態は、調製物中のポリペプチドの重量の５０％超、例えば８０％、９０％、９５％または９９％超が、本発明のポリペプチドである調製物中のポリペプチドを一般的に含むであろう。
【００７０】
本発明で使用するためのポリペプチドは、ＩｇｄＥポリペプチドを発現する任意の適当な生物体から単離することができる。典型的には、ＩｇｄＥポリペプチドは、適当なＩｇｄＥを発現する連鎖球菌株から単離される。適当な生物体および株は、多くの技法により同定され得る。例えば、連鎖球菌の株は、ｉｇｄＥ遺伝子の存在について、最初に試験することができる。ポリヌクレオチドのプライマーまたはプローブは、例えば、配列番号２、４、６、８、または１０に基づいて設計することができる。適当なプライマーの例は、配列番号１２〜２２で設計される。次に、ｉｇｄＥ遺伝子の存在を、プライマーを使用してＰＣＲにより、またはプローブの株のゲノムのＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより検証することができる。
【００７１】
ポリヌクレオチド
本発明によるポリヌクレオチドは：（ａ）配列番号４、５、６、８、もしくは１０のコード配列；（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、かつ／もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができる配列；または（ｄ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるポリペプチドをコードする、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）で定義された配列のいずれか１つのフラグメントを含むかまたはそれらからなることができる。
【００７２】
典型的には、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。しかしながら、ポリヌクレオチドはＲＮＡポリヌクレオチドであることもある。ポリヌクレオチドは、単鎖であることも二本鎖であることもあり、そのうちに、合成されたまたは改変されたヌクレオチドを含むこともある。本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列またはコード配列の相補体と、バックグラウンドを超えるレベルで有意にハイブリダイズすることができる。バックグラウンドのハイブリダイゼーションが起こることもあり、それは、例えば、ＤＮＡライブラリーに存在する他のＤＮＡのためである。本発明のポリヌクレオチドと配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列またはコード配列の相補体との間の相互作用により生ずるシグナルレベルは、他のポリヌクレオチドと配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列の間の相互作用の、典型的には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強力である。相互作用の強度は、例えば、プローブを例えば３２Ｐで放射性標識することにより測定することもできる。選択的ハイブリダイゼーションは、培地の使用条件を高いストリンジェンシーにして典型的には達成することができる。しかしながら、そのようなハイブリダイゼーションは、当技術分野において知られた任意の適当な条件下で実施することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989を参照されたい）。例えば、高いストリンジェンシーが必要とされるならば、適当な条件は、６０℃から６５℃までにおいて０．１から０．２×ＳＳＣを含む。より低いストリンジェンシーが必要とされるならば、適当な条件は、６０℃で２×ＳＳＣを含む。
【００７３】
配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列は、ヌクレオチド置換、例えば１、２または３から１０、２５、５０または１００箇所の置換により改変することもできる。あるいはまたはそれに加えて、配列番号２、４、６、８、１０のポリヌクレオチドは、１箇所もしくは複数の挿入および／もしくは欠失により、ならびに／またはいずれかもしくは両方の端部における延長により改変することもできる。シグナル配列などの追加の配列が含まれてもよい。改変されたポリヌクレオチドは、一般的に、ＩｇｄＥに特異的なシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／または対象において連鎖球菌に対する免疫応答を向上させることができるポリペプチドをコードする。改変される配列が、例えば上の表１で示されるように翻訳されるときに、変性した置換が行われることもあり、かつ／または保存的アミノ酸置換を生ずる置換が行われることもある。
【００７４】
配列番号２、４、６、８、または１０のＤＮＡコード配列の相補体に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、一般的に、配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列のそれぞれに、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００個の隣接ヌクレオチドの領域にわたって、または最も好ましくは配列番号２、４、６、８、または１０の全長にわたって、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するであろう。配列同一性は、例えば上で記載された任意の適当な方法によって決定することができる。
【００７５】
配列同一性の上記の程度と最小サイズとの任意の組合せが、本発明のポリヌクレオチドを定義するために使用され得るが、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたるより高い配列同一性）が好ましい。したがって、例えば、２０、好ましくは３０ヌクレオチドにわたる少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが本発明の一態様を形成し、４０ヌクレオチドにわたる少なくとも９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドも同様である。ポリヌクレオチドのフラグメントは、好ましくは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチドの長さであろう。それらは、典型的には、４０、５０、６０、７０、１００または１５０までのヌクレオチド長さであろう。フラグメントは、１５０ヌクレオチドより長い長さ、例えば２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００ヌクレオチドまでの長さ、またはさらに配列番号２、４、６、８、または１０のコード配列のそれぞれ短い５、１０もしくは１５ヌクレオチドなどの少数のヌクレオチドまでであり得る。
【００７６】
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、組換えで、合成で、または当業者にとって利用可能な任意の手段によって産生することができる。それらは、標準的技法によりクローニングすることもできる。ポリヌクレオチドは、典型的には単離および／または精製された形態で提供される。
【００７７】
一般的に、短いポリヌクレオチドは、所望の核酸配列の、一度に１つのヌクレオチドの段階的製造を含む合成手段により産生されるであろう。自動化された技法を使用してこのことを達成するための技法は、当技術分野で容易に利用することができる。
【００７８】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組換え手段を使用して、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を使用して産生されるであろう。このことは、クローニングすることが望まれるｉｇｄＥ遺伝子の領域に対する一対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）を作製して、該プライマーを細菌細胞から得られたＤＮＡと接触させて、ポリメラーゼ連鎖反応を、所望の領域の増幅を生じさせる条件下で実施し、増幅されたフラグメントを単離して（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することにより）増幅されたＤＮＡを回収することを含むであろう。プライマーは、適当な制限酵素認識部位を含有するように設計することができ、その結果、増幅されたＤＮＡは、適当なクローニングベクター中にクローニングされ得る。適当なプライマーは、例えば、配列番号１２〜２２におけるものである。
【００７９】
そのような技法は、本明細書に記載されたｉｇｄＥ遺伝子配列の全てまたは一部を得るために使用することができる。一般的に本明細書で言及された技法は当技術分野において周知であるが、特にSambrook et al. (1989)を引用することができる。本明細書に記載されたＩｇｄＥポリヌクレオチドは、インビトロ、インビボまたはエックスビボで行われ得る、本発明で使用するためのポリペプチドの産生において利用価値を有する。ポリヌクレオチドは、それら自体の価値で治療薬として使用されてもよく、または組換えタンパク質合成に関与することもある。
【００８０】
本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、典型的には、組換え複製可能なベクター中に組み込まれる。該ベクターは、該核酸を適合性の宿主細胞中で複製するために使用することができる。それゆえ、本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、ＩｇｄＥポリヌクレオチドを、複製可能はベクター中に導入して、該ベクターを適合性宿主細胞に導入し、該宿主細胞を、ベクターの複製を生じさせる条件下で成長させることにより作製することができる。
【００８１】
好ましくは、ベクターは、ＩｇｄＥポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。そのような発現ベクターは、分子生物学の分野で日常的に構築されて、例えば、プラスミドＤＮＡおよび適当な開始剤、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えば、タンパク質発現を可能にするために必要であり得て正しい配向で位置するポリアデニル化シグナルなどの使用を含むこともできる。他の適当なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関連するさらなる例として、本発明者らはSambrook et al. (1989)を引用する。
【００８２】
好ましくは、ベクター中の本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によりコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動的に連結しており、すなわち該ベクターは、発現ベクターである。用語「作動的に連結している」とは、記載された成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並列を指す。プロモーターなどの調節配列は、コード配列に「作動的に連結して」、コード配列の発現が、調節配列と適合性の条件下で達成されるように位置する。
【００８３】
ベクターは、例えば、複製の起源、任意選択で前記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび任意選択でプロモーターの調節因子を提供されたプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであり得る。ベクターは、典型的にはインビボで使用されるように適合されている。
【００８４】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計されている宿主細胞と適合性となるように選択することができる。哺乳動物のプロモーター、例えば、βアクチンプロモーターなどが使用され得る。組織特異的プロモーターは、特に好ましい。ウイルスのプロモーター、例えばマウスのモロニー白血病ウイルスの長い末端反復（MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、ＨＳＶプロモーター（ＨＳＶ  ＩＥプロモーターなど）、またはＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も使用することができる。ウイルスのプロモーターは、当技術分野で容易に入手することができる。ベクターは、真核生物ゲノムの配列、好ましくは哺乳動物ゲノムの配列に相同性の配列を含むポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチドの側にある配列をさらに含むこともできる。このことは、相同性組換えにより、本発明のポリヌクレオチドの真核生物細胞のゲノム中への導入を可能にするであろう。特に、ウイルスの配列が側面に位置する発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを、哺乳動物細胞に送達するために適当なウイルスのベクターを調製するために使用することができる。適当なウイルスのベクターの他の例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよび、レンチウイルスを含むレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよびＨＰＶウイルスが含まれる。これらのウイルスを使用する遺伝子移転技法は、当業者に知られている。レトロウイルスベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に安定に統合するために使用することができる。複製に欠陥のあるアデノウイルスベクターは、対照的に、エピソームにとどまり、それゆえ一過性発現を可能にする。
【００８５】
疾患および状態
ＩｇｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、病原性ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態を治療または予防するために使用することもできる。病原性のＩｇＧ抗体が、多くの異なる疾患および状態の病原性に関与していることは、当技術分野において周知である。その結果として、そのような疾患における病原性のＩｇＧ抗体の効果は、ＩｇｄＥポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して阻害することができる。
【００８６】
疾患または状態は、自己免疫疾患であり得る。そのような疾患には、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、再生不良性貧血、自己免疫性胃炎、自己免疫性聴覚喪失、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性脳下垂体炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ球増殖症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、ベーチェット病、水胞性類天疱瘡、心筋症、慢性炎症性脱髄多発神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、腹腔の疾患、クローン病、ＣＲＥＳＴ症候群、Ｄｅｇｏｓ疾患、後天性表皮水疱症、原発性混合クリオグロブリン血症、巨細胞動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、突発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、川崎病、メニエル症候群、混合結合組織病、モーレン潰瘍、多発性硬化症、重症筋無力症、葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、１型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ−１）、２型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ−２）、３型多腺性自己免疫性症候群（ＰＡＳ−３）、多発性筋炎／皮膚筋炎、原発胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー症候群、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、亜急性甲状腺炎、交感神経眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、真性１型糖尿病、白斑、ホヒト・小柳・原田病またはウェゲネル肉芽腫症が含まれる。好ましくは自己免疫性疾患は関節リウマチ（ＲＡ）である。
【００８７】
疾患または状態は喘息であり得る。喘息は急性または慢性喘息であり得る。
【００８８】
ＩｇＧは、補体系の古典的経路を活性化する。それゆえ、ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、補体活性化が患者にとって有害な疾患および状態を治療するために使用することができる。例えば、ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、移植に誘導された障害、例えば移植拒絶（同種移植および異種移植拒絶など）および移植片対宿主病を治療するために使用することができる。移植誘導障害は患者における組織または器官の移植に基づいて起こり得る。
【００８９】
ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、手術後の治療に、例えば、心臓バイパス手術を受けた患者の治療にも使用される。
【００９０】
さらに、ＩｇｄＥポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、後天性血友病の治療のために、すなわち、凝血因子に対する自己抗体を発生させた血友病患者でＩｇＧを除去するために使用することができる。
【００９１】
本明細書において使用する用語「対象」は、任意の哺乳動物の対象、例えば、ヒト、ブタ、ウマ、および任意のウシなどを含む。
【００９２】
インビトロの方法
本発明は、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９もしくは１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するそれらの変異体；または
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する（ａ）もしくは（ｂ）のいずれかのそれらのフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法を包含する。
【００９３】
好ましい実施形態において、アミノ酸配列は配列番号３である。ＩｇＧの切断のためのインビトロの方法は、ＩｇＧを：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｃ）ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントまたは配列番号３の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む。
【００９４】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＩｇＧに、特にヒトＩｇＧ１に特異的である。さらに、ポリペプチドは、軽鎖がカッパ型であるかまたはラムダ型であるかに拘わらず、図４に示されるようにＩｇＧ１を切断する。
【００９５】
該ポリペプチドはＩｇＧシステインプロテアーゼであり、それは、典型的には、配列番号１の位置２６５、２９６および３１１に対応する位置に、システイン残基、ヒスチジン残基およびアスパラギン酸残基を含む触媒部位を備えることができる。例えば、配列番号３には、システイン残基、ヒスチジン残基およびアスパラギン酸残基が、位置２６２、２９３および３０８に見出される。ポリペプチドの変異体およびフラグメントは、典型的にはこれらの残基を保持している。
【００９６】
本発明の方法は、該ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料と、特異的システインプロテアーゼ活性が起こることを可能にする条件下でインキュベートすることを含む。該方法は、切断産物の同定および／または単離をさらに含む。分析は、当技術分野において知られた任意の適当な方法によることができる。幾つかの場合に、分析は、ゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または質量分析法による。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、インビトロの方法は、ＩｇＧのＦｃまたはＦａｂフラグメントを生じさせるために使用される。該方法は、ＩｇＧを本発明のポリペプチドと接触させることを含む。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態において、本発明の方法は、ＩｇＧを検出するために使用される。これは、（ｉ）試料を、ポリペプチドと、ポリペプチドのＩｇＧ特異的システインプロテアーゼ活性を可能にする条件下で接触させること；および（ｉｉ）ＩｇＧ特異的切断フラグメントの存在についてモニターすることを含むこともでき；ここで、特異的切断フラグメントの存在は試料中のＩｇＧを示す。
【実施例】
【００９９】
[実施例１]
Ｓ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥの同定
細菌株および成長条件
Ｓ．スイス（S. suis）の株１０は、突然変異生成およびブタの実験的感染のために幾つかの研究で使用されたことのある毒性の血清型２の株である（Smith et al. 1999. Infect. Immun. 67, 1750-1756）。株１０Ｍ７はＨｉｌｄｅ  Ｓｍｉｔｈ（ＡＷＧ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）の好意により提供された（Smith et al. 1996. Infect. Immun. 64, 4409-4412）。連鎖球菌は、コロンビア寒天プレート上で６％のヒツジ血液を添加して、またはＢａｃｔｏＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）中、嫌気性条件下にて３７℃で成長させた。大腸菌（Eschrichia coli）株は、Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）中で培養した。適当な場合に、抗生物質を、カナマイシンについては５０μｇ／ｍｌおよびゲンタマイシンについては２０μｇ／ｍｌ添加した。
【０１００】
動物由来の材料
実験的に感染させたコブタからの試料を先行する研究中に取り出した。この動物実験のためのプロトコルは、ドイツのニーダーザクセン州動物実験委員会消費者保護および食物安全局（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｏｗｅｒ  Ｓａｘｏｎｉａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ）により承認された（承認番号３３．９−４２５０２−０４−０７／１２４３）。殺菌アッセイのために従来のコブタからの血液のコレクションを、ドイツのザクセン州地方事務所（ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｏｆｆｉｃｅ  ｉｎ  Ｓａｘｏｎｉａ）でＮ１９／１４として登録した。動物試験は、実験および他の科学的目的のために使用される脊椎動物保護のためのヨーロッパ協定（ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ）（ヨーロッパ条約シリーズｎｏ．１２３（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｔｒｅａｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，  ｎｏ．１２３）：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ．ｃｏｅ．ｉｎｔ／Ｔｒｅａｔｙ／ｅｎ／Ｔｒｅａｔｉｅｓ／Ｈｔｍｌ／１２３．ｈｔｍ）およびドイツの動物保護法（Ｇｅｒｍａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）で概説された原則および勧告に厳密に従って実施した。
【０１０１】
ＩｇＧを分解する活性の同定
Ｓ．スイス（S. suis）の株１０Ｍ７の培養物を、ＯＤ６００約０．６で収穫して、培養上清を０．２２μＭのＥｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ膜フィルター（ミリポア）を通して滅菌濾過した後、培養上清を硫酸アンモニウムを用いて３０％飽和まで分画した。生じた沈殿を廃棄して、硫酸アンモニウムを残存上清に添加し、最終の濃度を５０％飽和にした。第２の沈殿を、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）を添加して出発時の体積の１／１００に再懸濁して、同じ緩衝液に対する緩衝液交換を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により実施した。この材料を、ＦＰＬＣによりＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに分画した。タンパク質を直線的ＮａＣｌグラジエントにより溶出させて、約０．２Ｍ  ＮａＣｌで溶出した分画が、ＩｇＧを分解する活性を含有することが見出された。活性分画をサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００ＨＲ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけて、そこでＩｇＧを分解する活性は、約３７ｍｌの溶出体積で溶出した。活性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、タンパク質バンドを質量分析法の分析にかけた。
【０１０２】
質量分析法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、Ｕｍｅａタンパク質分析施設（Ｕｍｅａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって実施された。ＭＳ分析のためのペプチドは、トリプシンを使用してゲル内消化により調製して（改変された配列決定規格、Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｅａｓｙ  ｎａｎｏ  ＬＣシステム（Ｐｒｏｘｅｏｎ）に連結された、ＨＣＴ  ｕｌｔｒａ  ＥＴＤ  ＩＩ  イオン捕捉装置（Ｂｒｕｋｅｒ）ＥＳＩを使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのデータセットについての処理、デコンヴォルーションおよび化合物検出は、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（４．０  ＳＰ４、Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して実施した。処理されたデータセットのピークリストファイルを使用するデータベース検索は、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ＮＣＢＩｎｒデータベースの細菌配列で実施した。検索パラメーターは、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ両方の様式について、ならびに酸化によるメチオニンの、プロピオンアミド誘導およびＮ末端アセチル化によるシステインの可変改変について、０．３Ｄａの質量誤差を許容した。
【０１０３】
ＩｇＧを分解する能力についてのＳ．スイス（S. suis）株のスクリーニング
１５種の異なるＳ．スイス（S. suis）株（表２）の培養上清を、ＯＤ６００約０．６で単離して、飽和した硫酸アンモニウム溶液の添加により５０％の最終の飽和に濃縮した。Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ脱塩カラム７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるＰＢＳに対する緩衝液交換に続いて、沈殿をＰＢＳ中で出発時の１／２０の体積に再懸濁した。Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清の５０％硫酸アンモニウム沈殿分画を、ＩｇＧ分解を分析するために使用した。
【０１０４】
【表４】
2019506866.tif 000005
ΔｉｇｄＥ欠失株の発生
ｉｇｄＥのインフレーム欠失は、原理的にSeele et al., 2013（J. Bacteriol. 195, 930-940）におけるように、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０を用いて実行した。感熱性のベクターｐＳＥＴ５＿ΔｉｇｄＥを構築するために、６１８ｂｐの５’−ｉｇｄＥアンプリコンを、プライマーｐｒｅＰｒｏＩｇｄＥＰｓｔＩ（ＴＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧ、配列番号１２）およびｐｏｓｔＳＳＩｇｄＥＢａｍＨＩ（ＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＣ、配列番号１３）を用いて生じさせ、６１２ｂｐの３’−ｉｇｄＥアンプリコンをプライマーｐｒｅＥｎｄＩｇｄＥＢａｍＨＩ（ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣ、配列番号１４）およびｐｏｓｔＥｎｄＩｇｄＥＥｃｏＲＩ（ＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧＴＴＡＴＴＧＴＡＧＣＧ、配列番号１５）を用いて生じさせた。これらのアンプリコンを、プライマーの名で指示された制限酵素を用いてｐＳＥＴ５（１８）中にクローニングしてｐＳＥＴ５＿ΔｉｇｄＥを生じさせた。欠失クローンを、選択的ＰＣＲ分析ならびにプライマーＩｇｄＥ−ｓｅｑ＿ｆｒｗ（ＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧ、配列番号１６）およびＩｇｄＥ−ｓｅｑ＿ｒｅｖ（ＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＴＴＧＡＴＡＣＣ、配列番号１７）を使用して、ゲノムのアンプリコンの配列決定により確認した。
【０１０５】
配列の分析
配列の分析を、ＳＩＢ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｏｒｔａｌ  Ｅｘｐａｓｙ（www.expasy.ch）を使用して実施した。ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０を走らせて、推定上のシグナルペプチドおよびそれぞれの切断部位を同定した（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。潜在的な活性部位の残基を同定するために、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのインシリコモデル化を、ＳＷＩＳＳ−モデル（http://swissmodel.expasy.org/）を使用して実施した。推定上の膜貫通領域を、コンセンサス予測ウェブサーバーＴＯＰＣＯＮＳ（http://topcons.cbr.su.se/）の最終アクセッション２０１５−１１−０６を使用して同定した。
【０１０６】
ＤＮＡ技法およびプライマー配列
プライマーをゲノムＳ．スイス（S. suis）Ｐ１／７中の遺伝子ＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０に基づいて設計した。全てのＰＣＲを、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実行した。全ての得られたプラスミドを制限分析、ＰＣＲおよび配列決定により確認した。
【０１０７】
Ｓ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥのクローニングおよびＩｇｄＥ突然変異体の発生
シグナルペプチドのコード配列（アミノ酸３８〜１１２１をコードする）を欠くＳ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥ遺伝子を、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０の染色体ＤＮＡから、プライマーＩｇｄＥ−ｆｒｗ＿ＮｃｏＩ（ＧＴＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＣＧ、配列番号１８）およびＩｇｄＥ−ｒｅｖ＿ＮｏｔＩ（ＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＣ、配列番号１９）を使用するテンプレートとして増幅して、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で消化した後、ｐＥＴ＿ＺＺ＿１ａ中にクローニングした。挿入された全体を配列決定して、Ｓ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥのクローニングおよび配列を検証した。得られたＳ．スイス（S. suis）の株１０ｉｇｄＥの配列は、Ｓ．スイス（S. suis）の０５ＺＹＨ３３の配列のうちの１つと同じであり、３２個のアミノ酸の挿入を含有しており、Ｓ．スイス（S. suis）Ｐ１／７のＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０と比較した。
【０１０８】
推定上の活性部位の残基Ｃ３０２からＳへ、Ｈ３３３からＡへ、およびＤ３４８からＡへという特異的突然変異生成を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびプライマーＩｇｄＥ−Ｃ３０２Ｓ（ＡＡＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴ、配列番号２０）、ＩｇｄＥ−Ｈ３３３Ａ（ＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧ、配列番号２１）およびＩｇｄＥ−Ｄ３４８Ａ（ＴＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧ、配列番号２２）を用いて、メーカーの使用説明に従って実施した。
【０１０９】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのＮ末端４７０アミノ酸からなるＩｇｄＥΔＣは、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ｐＺＺ１ａ中の全長ｉｇｄＥを消化することにより創出した。消化されたプラスミドを精製して再連結し、大腸菌（E. coli）中に形質転換した。
【０１１０】
組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの発現および精製
ｐＥＴ＿ＺＺ＿１ａ  ｉｇｄＥ、ｉｇｄＥＣ３０２Ｓ、ｉｇｄＥＨ３０２Ａ、ｉｇｄＥＤ３０２ＡまたはｉｇｄＥΔＣを保有する大腸菌（E. coli）ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）＿ＲＩＬ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）単離物を、ＯＤ６０００．６まで３０℃で成長させた。タンパク質の発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて１２℃で誘発し、インキュベーションをさらに２２時間継続した。
【０１１１】
細胞をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ＨＴタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）により溶解して粗抽出物を得、またはＳｔａｎｓｔｅｄ高圧細胞粉砕機（Ｓｔａｎｓｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄ  Ｐｏｗｅｒ）により５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５％グリセリン、４０μＭイミダゾール中で精製した。Ｈｉｓ−ＺＺのタグが付いたタンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で標準プロトコルを使用して精製した。タグをＴｅｖ−プロテアーゼによる酵素的切断により５℃で２０時間除去し、続いて第２回の精製をＨｉｓＴｒａｐＦＴで行なった。タグの付いていないｒＩｇｄＥを含有するフロースルーを収集した。組換えＩｇｄＥΔＣを、上で記載されたように高収率で精製して、純度を全長ｒＩｇｄＥと比較した。
【０１１２】
ＩｇＧ分解の定性分析
濃縮されて分画された培養上清中におけるＩｇＧ切断活性をモニターするために、試料を１％ブタ血漿とＰＢＳ中で３７℃で１６時間インキュベートした後、ウェスタンブロット分析した。
【０１１３】
ＩｇＧプロテアーゼの触媒型を同定するために、ＩｇＧ分解反応を、０．１〜５ｍＭのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、０．１〜５ｍＭのＥＤＴＡ、５０〜２５０μＭのＥ６４（Ｓｉｇｍａ）、０．１〜５ｍＭのＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２（Ｂａｃｈｅｍ）、０．１〜５ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）または１／２００から１／５０希釈の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で実施した。
【０１１４】
ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌのブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）または他の種（ヒト、ヤギ、ウシ、ウマおよびマウス；全てＳｉｇｍａ）のＩｇＧを、上記のＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥ構築物を保有する誘発された大腸菌（E. coli）の粗抽出物または１０ｎＭの精製ｒＩｇｄＥのいずれかと３７℃で１６時間インキュベートした後、還元または非還元いずれかの条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
【０１１５】
ブタ体液中における内因性ＩｇＧの分解を分析するために：心膜液、腹腔液および関節液は１／１０；血清は１／５０希釈後に；脳脊髄液については無希釈で使用した。脳脊髄液および関節液は、Ｓ．スイス（S. suis）感染により引き起こされた線維素化膿性髄膜炎および滑膜炎を有するコブタからまたは病変のないコブタからのものである。そうでなければ、ＩｇＧ分解の分析は、上記のように精製ｒＩｇｄＥで実施して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析の両方によって分析した。実験は、少なくとも３回繰り返して、代表的分析を示す。
【０１１６】
ＩｇＧ分解の定量分析
時間経過分析および阻害剤プロファイルのために、ＩｇＧ分解反応を、０．２５ｍｇ／ｍｌのブタＩｇＧおよび２μＭの精製ＩｇｄＥΔＣを用いてＰＢＳ中３７℃で、阻害せずに、または２．５μＭまたは２５０μＭのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ）、ＥＤＴＡ、Ｅ−６４（Ｓｉｇｍａ）、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）、またはＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２（Ｂａｃｈｅｍ）の存在下で実施した。２５０μＭのＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２中のＤＭＳＯ含有率に対応する０．２７５％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を溶媒対照として使用した。反応液を連続的に試料として採取して、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。タンパク質のバンドは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる染色により検出した。ＩｇＧ分解産物を、ＬＡＳ４０００撮像システム（冨士フィルム）を用いる撮像により濃度計で定量化し、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ソフトウェアを用いて分析した。時間経過実験のために、阻害されない終夜の切断を１００％相対切断として設定した。阻害剤プロファイルのために、初期切断速度を切断産物の初期増大（０〜２５％の相対切断）から計算して、阻害されない反応の初期切断速度を１００％相対活性として設定した。実験は、少なくとも３連で実施した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０を使用して実施した。
【０１１７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための試料は、還元または非還元いずれかの試料緩衝液を用いて調製し、９５℃に５分間加熱した。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥをクーマシーブルー（Ｓｉｇｍａ）、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかで染色して、またはウェスタンブロット分析のためにＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブロットした。０．１％ＰＢＳ−ツイーン中で、膜を５％乾燥粉乳でブロッキングし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体とインキュベートした。ヤギ抗ブタＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびヤギ抗ブタＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：２５，０００に希釈して、ヤギ抗ブタＩｇＡ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：１２，５００に希釈した。膜を０．１％ＰＢＳ−ツイーンで徹底的に洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ選択ウェスタンブロット検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてメーカーの使用説明に従って現像し、ＬＡＳ４０００撮像システム（冨士フィルム）により写真撮影した。
【０１１８】
Ｎ末端のエドマン配列決定
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥで処理されたブタＩｇＧを、前に説明したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム／２０％ＭｅｔＯＨをブロット緩衝液として用いて、半乾燥ブロットによりＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に移した。該膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ（Ｓｉｇｍａ）で染色して、乾燥後、約３２ｋＤａの分解産物を正確に切り出した。分解産物のＮ末端のエドマン配列決定を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ベルリン、ドイツ）により実施して、配列Ｗ／Ｃ  ＰＩＣＰＡＣＥを得た。最初の位置配列決定は、強いトリプトファンピークおよびシステイン位置に弱いピークのみを生ずる汚染に多分基づいて複雑であった。しかしながら、ＢＬＡＳＴ相同性の検索で、配列を疑う余地のないスコアのブタＩｇＧヒンジ領域配列が、システイン残基を対応する位置に含有した。システインは、プロピオンアミド改変されたシステインのシグナルにより同定されたが、それにも拘わらずシステインは較正標準の部分ではない。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡ
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに対するＩｇＧ力価を検出するために、Ｍａｘｉｓｏｒｂ（登録商標）プレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸塩緩衝液を使用して０．６μｇのｒＩｇｄＥタンパク質でコートした。コーティング後、プレートを０．１％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）を加えたＰＢＳで３回洗浄して、ＰＢＳ中５％の粉乳で３７℃で２時間ブロッキングした。全ての試料および対照を、１：１００の希釈で出発して、ＰＢＳＴ中における４回の２倍希釈の（陽性参照血清：６個）２連シリーズで測定した。Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに特異的なＩｇＧ抗体を検出するために、プレートを、ヤギ抗ブタＩｇＧ−ＨＲＰ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ１００−１０５Ｐ）と、１：１００００の希釈で３７℃で１時間インキュベートした。全てのインキュベーションステップは、３７℃で振盪機上で実施して、各インキュベーションステップ後、プレートをＰＢＳＴで洗浄した。プレートを、２，２−アジノ−ジ−［３−エチルベンジチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）および０．００３％Ｈ２Ｏ２を基質として用いて現像した。吸光度は、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ）で測定した。光学密度を、バックグラウンドを差し引いた後対数の直線的回帰分析により抗体濃度に変換した。各試料についてのＥＬＩＳＡユニットは、２つのシリーズの４回希釈の各々について計算されたユニットの平均として定義された。Ｓ．スイス（S. suis）の株１０を用いた実験的感染後２０日に採取された血清試料から得られたＥＬＩＳＡ値を、任意に１００ＥＬＩＳＡユニットに設定して、一方、初乳を奪われたコブタから誘導された血清試料からのＥＬＩＳＡ値を陰性対照として使用した。
【０１２０】
結果
Ｓ．スイス（S. suis）はＩｇＧ切断酵素を分泌する。
Ｓ．スイス（S. suis）の細胞外酵素のタンパク質分解活性を、Ｓ．スイス（S. suis）の株１０の濃縮された上清および同系遺伝子型のＩｇＭプロテアーゼ突然変異体１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓと、推定上の基質としての２％ブタ血漿とをインキュベートすることにより分析した。３時間のインキュベーションの後、反応混合物を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。興味深いことに、野生株１０および同系遺伝子型のＩｇＭプロテアーゼ突然変異体１０ΔＩｄｅＳｓｕｉｓの両方の細菌培養上清から得られた血漿タンパク質のバンドのパターンは、ブタ血漿対照にはなかった約３２ｋＤａの追加のタンパク質バンドを含有した（図１Ａ）。３２ｋＤａバンドを切り出して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法にかけ、Ｓ．スイス（S. suis）におけるＩｇＧタンパク質分解活性の存在を示すＩｇＧ分解産物と同定した。この発見を確認して、タンパク質分解活性はＳ．スイス（S. suis）の分泌された酵素に基づくことを立証するために、細菌培養物の成長上清を、硫酸アンモニウムの量を増大させて（０から８０％の飽和まで）添加することにより分画した。分画は、ブタ血漿を用いてＩｇＧ切断活性について試験して、ＩｇＧの分解フラグメントを、特異的ポリクローナル抗ブタＩｇＧ抗体を使用してウェスタンブロットにより検出した。２０から６０％硫酸アンモニウムで飽和した沈殿は、ＩｇＧ切断活性を明確に示して、観察されたＩｇＧタンパク質分解活性は、最近記載されたＩｇＭプロテアーゼＩｄｅＳｓｕｉｓ（Seele、前出）と別物であり、Ｓ．スイス（S. suis）の培養上清中の分泌されたタンパク質に基づくことを示した（図１Ｂ）。
【０１２１】
臨床的に意味のある血清型２の数種の株を含む１５種の異なるＳ．スイス（S. suis）の株の培養上清；血清型２の２つのヒト単離物、および追加の血清型を代表する一組の株（表２）を、上記のようにウェスタンブロットにより分析した。全ての株について、約３２ｋＤａのＩｇＧ切断産物をウェスタンブロット分析により検出することができて（図１Ｃ）、ＩｇＧ分解活性は、異なるＳ．スイス（S. suis）の株の間でも保存されることが示された。
【０１２２】
Ｓ．スイス（S. suis）の新規プロテアーゼであるＩｇｄＥの精製および配列の特徴
精製の試行に先立って、硫酸アンモニウムによるプロテアーゼが富化された沈殿を、クラス特異的プロテアーゼ阻害剤の存在下でＩｇＧ切断活性について試験して、推定上のＩｇＧプロテアーゼを予備的に分類した。メタロプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡはＩｇＧ切断に影響しなかったが、それに対してセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦはＩｇＧ切断に中程度に干渉した。しかしながら、システインプロテアーゼ阻害剤Ｅ−６４、Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２およびヨードアセトアミドは、全てＩｇＧ分解活性を阻害するように思われた（図８）。したがって、活性部位のシステイン残基は、ＡＥＢＳＦ（２４、２５）により阻害され得るので、阻害剤全体のプロファイルは、ＩｇＧ切断プロテアーゼはシステインプロテアーゼのクラスに属するという仮定と最も一致する。精製するために、株１０の同系遺伝子型の突然変異体である株Ｓ．スイス（S. suis）１０Ｍ７を、培養上清中の高度に豊富なムラミニダーゼ放出タンパク質（ＭＲＰ）による低発現タンパク質の遮蔽を回避するために、使用した。細菌培養上清を、硫酸アンモニウム沈殿により分画して、沈殿をアニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にかけた。ＩｇＧ切断活性を示す試料を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質のバンドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法およびｐＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するＮＣＢＩデータベースに対する類似性検索により同定した。ＩｇＧタンパク質分解酵素の最初の特徴付けが、該プロテアーゼが最も分泌されるシステインプロテアーゼらしいことを示したので、同定されたタンパク質の配列を、ｉ）該タンパク質のコア内におけるシステイン残基の存在、およびｉｉ）分泌シグナルペプチドの存在についてスクリーニングした。ＩｇＭに特異的であることが以前に示されたＩｄｅＳｓｕｉｓの他に、２つの（１０のうちの）同定されたタンパク質が推定上の触媒的システイン残基を含有したが、唯１つだけがＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより予測されたシグナルペプチド配列およびコアシステイン残基の両方を含有した。このタンパク質は、Ｓ．スイス（S. suis）の血清型２株のゲノムの配列データベースにおける推定上のエクスポートされたタンパク質と注釈を付けられ（www.sanger.ac.uk）、株Ｐ１／７中のＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０と命名される。ＳＳＵ＿ＲＳ０８１５０は、該タンパク質内のアミノ酸１８８から２６５内のＮ末端半分に位置する推定上のトランスグルタミナーゼのコア配列モチーフを有する１１２１アミノ酸のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０１２０２７７２０）をコードする。膜タンパク質形態のＴＯＰＣＯＮＳｃｏｎｓｅｎｓｕｓ予測は、アミノ酸１０５９〜１０８０の間付近のＣ末端で推定上の膜貫通ヘリックスを同定した。予測されたサイズの１１８ｋＤａ（シグナル配列なし）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後の最初に精製されたタンパク質のバンドの推定されたサイズより若干小さく（データ掲載せず）、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上における低ｐＩ（ｐＩ  ４．６６）のタンパク質の僅かに遅い移動に基づく。全長の推定上のタンパク質配列を、ＮＣＢＩデータベースに対するｐＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用する類似性検索で���用した。この検索により、全長タンパク質は、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼデータベース（Rawlings et al. 2014. Nucleic Acids Res. 42, 503-509）のいかなる知られたプロテアーゼに対しても類似性がなく；いかなる真核生物のタンパク質に対しても類似性がないが、トランスグルタミナーゼコアモチーフを含有する該プロテアーゼのＮ端部の半分は、ストレプトコッカス・ポルシナス（Streptococcus porcinus）およびストレプトコッカス・シュードポルシナス（Streptococcus pseudoporcinus）の仮定上のタンパク質に対する若干の類似性（４８０〜４９２アミノ酸残基の領域において５４％の同一性）およびストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）の仮定上のタンパク質に対する若干の類似性（２６４から４０６アミノ酸残基の領域における４０％までの同一性）があることが明らかになった。プロテアーゼのＮ末端部分は、ストレプトコッカス・アガラクチアエ（Streptococcus agalactiae）およびストレプトコッカス・メリオニス（Streptococcus merionis）（約３２％同一性）の仮定上のタンパク質に対しても若干の類似性を示す。該推定上のタンパク質は、幾つかのデータベースでリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼＧおよびＥとして表示されているが、実験的に確認された機能の不在に基づいて、およびブタＩｇＧに対する酵素活性に基づいて、該タンパク質は、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）の免疫グロブリンＧを分解する酵素に対するＩｇｄＥと表示した。
【０１２３】
ＩｇｄＥは新規なシステインプロテアーゼである
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの配列は、阻害剤プロファイルに基づいて、触媒部位のシステインを表すと仮定される位置３０２における単一のシステイン残基の存在を明らかにする。知られたトランスグルタミナーゼドメイン構造をテンプレートとして使用した、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのインシリコの３Ｄモデル化（http://swissmodel.expasy.org）は、システイン３０２、ヒスチジン３３３およびアスパラギン酸３４８からなる潜在的な触媒的三連構造を含有するタンパク質のＮ末端部分における推定上の活性部位の裂溝を示した。
【０１２４】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの推定上のプロテアーゼドメインおよび触媒部位残基を同定するために、数通りの組換えＩｇｄＥ構築物を創出した（図２Ａ）。３つの推定上の触媒部位残基の全てを、突然変異体タンパク質、ＩｇｄＥＣ３０２Ｓ、ＩｇｄＥＨ３３３ＡおよびＩｇｄＥＤ３４８Ａをそれぞれ生じさせる部位特異的突然変異生成により置き換えた。それに加えて、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのＣ末端部分を欠く構築物を、ＸｈｏＩ制限酵素のカットバックにより創出した。これらの構築物を発現する大腸菌（E. coli）の粗可溶分画をブタＩｇＧとインキュベートして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの存在で、３２ｋＤａのＩｇＧ誘導バンドが現れて、組換えタンパク質はＩｇＧタンパク質分解活性を含有することが示された（図２Ｂ、レーン３）。アミノ酸４７１から１１２１を欠く組換えタンパク質がＩｇＧ切断活性のために十分であるので（図２Ｂ、レーン７）、ＩｇＧ切断活性は、タンパク質のＮ末端部分に帰属させることができた。突然変異体タンパク質とインキュベートしたブタＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は（図２Ｂ、レーン４〜６）、ｒＩｇｄＥＣ３０２ＳもｒＩｇｄＥＨ３３３ＡもＩｇＧ切断活性を示さなかったが、それに対してｒＩｇｄＥＤ３４８Ａは、若干低下したＩｇＧ切断活性を示したことを明らかにした。全体的にみて、これらのデータは、これらの３種の残基がＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの触媒部位の一部であることを強く示す。
【０１２５】
阻害剤のスクリーニングを、精製された組換えＩｇｄＥΔＣおよびクラス特異的プロテアーゼ阻害剤を用いて繰り返した。古典的トランスグルタミナーゼ酵素と対照的に、該プロテアーゼはＥＤＴＡの存在下で完全に活性であるが、それに対して、ＩｇｄＥはカルシウム依存性ではなく、システインクラスに特異的な阻害剤のヨードアセトアミドおよびＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２は、ＩｇＧタンパク質分解活性に効率的に干渉し、阻害剤の１２５倍モル過剰で１８時間のインキュベーション後でさえ、切断産物は全然検出することができなかった（図３）。セリンプロテアーゼ阻害剤のＡＥＢＳＦは、ＩｇｄＥΔＣを、１２５倍のモル過剰で中程度に阻害した。興味あることに、Ｅ−６４は、この実験の設定では精製ＩｇｄＥΔＣを阻害しなかったので、それは、ＩｄｅＳおよびＩｄｅＳｓｕｉｓのような他の連鎖球菌のＩｇプロテアーゼについて記載されたのと同様な狭い活性部位に基づくと思われる。しかしながら、非常に高濃度では、Ｅ−６４は、Ｓ．スイス（S. suis）培養上清のＩｇＧ切断活性に干渉した（図８）。Ｚ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２のシステインプロテアーゼに特異的な阻害剤は、構造的にシスタチンＣの阻害反応性部位に基づいて（Green and Shaw. 1981. J. Biol. Chem. 256, 1923-1928）１２５倍モル過剰でＩｇｄＥΔＣを完全に阻害した。ヨードアセトアミドおよびＺ−ＬＶＧ−ＣＨＮ２を用いる酵素活性の阻害ならびにＩｇｄＥＣ３０２ＳおよびＩｇｄＥＨ３３３Ａ突然変異体の酵素活性の欠損は、ＩｇｄＥがシステインプロテアーゼファミリーの新規かつこれまでのところ独特のメンバーであることを示唆する。
【０１２６】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧを、高い特異性でヒンジ領域において切断する
ブタＩｇＧの分解産物を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非還元条件下で観察されたバンドのパターンは、相互に接続するジスルフィド結合のちょうどＮ末端で、重鎖のヒンジ領域に位置する切断部位と一致する（図４Ａ）。還元条件下で得られたＩｇＧ分解産物（図４Ｂ）をＮ末端のエドマン配列決定にかけて、得られた配列Ｃ＊ＰＩＣＰＡＣＥは、ブタＩｇＧ２ａｂ、ＩｇＧ４ａｂ、およびＩｇＧ６ａｂサブタイプのヒンジ領域配列で見出された。共通のモチーフとしてＣＰＩＣＰＧＣＥを有する同様な配列が、ＩｇＧ１ａｂおよびＩｇＧ５ａｂサブタイプのヒンジ領域に存在するが、それに対してＩｇＧ３はヒンジ領域中にＣＰｘｘｘｘＣ配列を示した（表３）。
【０１２７】
【表５】
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還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された切断パターンは、同定された切断部位に加えて、第２のステップの加水分解が第２の重鎖を切断する前に、１つのＩｇＧ重鎖がホモダイマーのジスルフィド結合のちょうどＮ末端で加水分解される切断反応と一致する（図４Ｃ）。興味深いことに、ＩｇＧのヒンジ領域と同様な配列は、ブタのＩｇＡおよびＩｇＭの重鎖配列では見出すことができない。それゆえ、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥ特異性を、ブタＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡに対する特異的抗体を使用して、さらに研究した。組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥとインキュベートしたブタ血漿を、ウェスタンブロットにより分析して、ブタ血漿中のプロテアーゼはＩｇＧを標的とするが、ＩｇＡまたはＩｇＭを切断しないことが示された（図５Ａ）。
【０１２８】
プロテアーゼの宿主特異性を、精製Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥとヒト、ヤギ、ウシ、ウマおよびマウスのＩｇＧ製剤とのインキュベーションにより研究した（図５Ｂ）。興味深いことに、ブタＩｇＧのみがこの新規ＩｇＧプロテアーゼに対する基質であることが見出された。したがって、ＩｇｄＥは、際立った種特異性を示して、ブタＩｇＧのみを標的とする。
【０１２９】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの特異性をエックスビボでさらに評価するために、健常なまたは病気のコブタの体液を使用した。心膜液、腹腔、および関節からの体液、ならびに脳脊髄液および血清を、組換えＳ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥで処理して、ブタＩｇＧ特異的抗体を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ａ）およびウェスタンブロットにより分析した（図６Ｂ）。タンパク質バンドのパターンにおけるはっきりした変化は、症状を示すＩｇＧ切断産物の出現を除いて、心膜、腹腔および血清の試料中におけるｒＩｇｄＥの存在において観察することができなかった。ＩｇＧ、すなわち切断産物も、健常ブタの関節液および脳脊髄液中に存在しなかった。対照的に、臨床的徴候を有する、例えば髄膜炎および滑膜炎を患うコブタから得られた全ての体液は、炎症性応答の結果としてＩｇＧを含有し、再び症状を示す単一の３２ｋＤａバンドを、ｒＩｇｄＥで処理された全ての試料で観察することができた（図６）。Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥの特異性は、ブタ体液とプロテアーゼとのインキュベーション後のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、追加の分解産物は同定することができなかった観察により強調される。したがって、追加の基質が存在することは排除できないが、これらの結果は、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥが高度に特異的なＩｇＧプロテアーゼであり、Ｓ．スイス（S. suis）の以前に記載されたＩｇＡおよびＩｇＭを分解するプロテアーゼを補完することを示す（Seele前出; Zhang et al. 2010. Vet. Microbiol. 140, 171-175）。
【０１３０】
ＩｇｄＥは、Ｓ．スイス（S. suis）により発現される唯一のＩｇＧ切断酵素である
株１０および株１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓは、後者はＩｇＭ切断活性を欠くが、Ｓ．スイス（S. suis）ｉｇｄＥのインフレーム欠失突然変異体を生じさせるために使用された。野生株１０からの成長上清におけるＩｇＧおよびＩｇＭ切断活性を、特異的ポリクローナル抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を使用して、ウェスタンブロットにより決定した（図７）。予想されたように、野生株１０は、ＩｇＧおよびＩｇＭ切断活性を示したが（図７Ａおよび図７Ｂ、レーン３）、それに対して、同系遺伝子型の突然変異体株１０ΔｉｇｄＥの上清のみが、ＩｇＭ切断活性を含有して、ＩｇＧまたはＩｇＭのいずれの分解も二重突然変異体株１０ΔｉｄｅＳｓｕｉｓΔｉｇｄＥの上清で検出可能でなかった（図７Ａおよび図７Ｂ、レーン５）。したがって、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥは、ブタＩｇＧを切断するために必要かつ十分であり、他のＩｇＧ切断活性はこれらの実験条件下では放出されないと思われる。
【０１３１】
Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥのインビボにおける発現
離乳期のコブタは、初期には、初乳に由来する母の抗体により細菌感染から保護される。母の抗体のレベルは経時的に減少して、活性ＩｇＧに媒介される免疫が２週間後の初めに出現する。したがって、初乳由来のコブタの血清中のＩｇＧ抗体（ＳＣＤＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡ測定におけるバックグラウンド値を超えない。ＥＬＩＳＡを、ｒＩｇｄＥを抗原として用いて実施し、コブタからの異なる血清試料を、このＩｇＧプロテアーゼに向けられた抗体の存在について研究した。Ｓ．スイス（S. suis）の株１０を用いる実験感染後２０日に採取された血清試料は、ｒＩｇｄＥに対して非常に高い力価を含有した（１００  ＥＬＩＳＡユニットと定義した；材料および方法を参照されたい）。陰性対照として使用されたＳＣＤＰと対照的に、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥに対する特異的抗体の有意の量が、９匹の５〜６週齢の従来の離乳期コブタのうち７匹で検出可能であった（３６から９２の範囲のＥＬＩＳＡユニット）。これらの結果は、Ｓ．スイス（S. suis）ＩｇｄＥが、Ｓ．スイス（S. suis）によりインビボで発現された免疫原性抗原であることを示した。
【０１３２】
[実施例２]
他の連鎖球菌種からのＩｇｄＥの同定
全ての入手可能な連鎖球菌のゲノムのコード配列を、ＮＣＢＩ［ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/on Aug-21-2015]およびＰＡＴＲＩＣ[ftp://ftp.patricbrc.org/patric2/on Aug-25-2015］からダウンロードした。
【０１３３】
ＩｇｄＥのための参照配列として、本発明者らは、ＲｅｆＳｅｑ配列ＷＰ＿０１４６３６４９９．１を使用した。Ｓ．スイス（S. suis）からの該配列のみに存在するＮ末端シグナルペプチドおよびＣ末端領域を除去して、この後「ＩｇｄＥ＿ドメイン」と称するアミノ酸３８〜５２０を残した。
【０１３４】
ＩｇｄＥ＿ドメインを、ＮＣＢＩ配列ならびにＰＡＴＲＩＣ配列に対するｂｌａｓｔｐ検索におけるクエリー配列として使用した（全ての可能なプロテアーゼを保つためのＥ値カットオフ１）。得られたヒットを、今度は同じパラメーターを使用して同じデータベースに対するクエリー配列として使用した。合致した配列のリストから、本発明者らは、ＩｇｄＥがクエリーとして使用された場合に、第２回が第１回で合致した領域と重なる合致があった配列を選んだ。触媒部位で「Ｃ」を含有しない配列は、さらなる検討から除外して、同一の配列の場合に唯一のコピーのみを保った。
【０１３５】
見出された配列の多くは、Ｓ層タンパク質と、またはＳ層相同性ドメインＷを含有すると注釈される。これらは、同じゲノム中にしばしば２つ以上のコピーで存在して、触媒部位に元のＩｇｄＥ配列で見出されるＡｘＣモチーフに代わってＳｘＣまたはＧｘＣモチーフを有する。Ｐｆａｍに対して全ての配列を検索する場合に、これらの配列は、Ｐｆａｍモデル「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔ＿ｃｏｒｅ」にうまく適合する。ＩｇｄＥファミリーのメンバーではないこれらの配列を除外するために、Ｅ値が最大で１ｅ−６のＴｒａｎｓｇｌｕｔ＿ｃｏｒｅモデルに合致する全て配列を除外して、同様にＡｘＣモチーフを欠く配列も除外した。残る配列は、両方の端部で切られてＩｇｄＥ＿ドメイン配列と合致する部分のみを含有した。このことが同一の「ドメイン」配列を生じた場合に、唯１つのコピーのみが保たれた。
【０１３６】
ＩｇｄＥファミリーに属するプロテアーゼを、Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）、Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）、Ｓ．エクイ（S. equi）、およびＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）で同定した。該プロテアーゼをクローニングして発現させて、特徴付けた。
【０１３７】
[実施例３]
Ｓ．ポルシナス（S. porcinus）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓは、精製されたポリクローナルブタＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じた。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓをウシ、ウマ、ヒト、ヤギまたはマウスからの精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓはブタ血清中のＩｇＧを切断したが、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析によりＩｇＭまたはＩｇＡは検出されなかった。
・ブタＩｇＧの３２ｋＤａ分解産物のＮ末端配列は、ＣＰＩＣＰＡＣＥであることがＮ末端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質が、ブタＩｇＧ内のＳ．スイス（S. suis）からのＩｇｄＥと同じ切断部位を有することが示された。
・組換えＩｇｄＥｐｏｒｃｉｎｕｓは、容易に過剰発現されて高純度に精製された。
・全ての試験したＳ．ポルシナス（S. porcinus）の株は、それらの成長培養上清で、組換えタンパク質と同じブタＩｇＧ切断表現型を示した。
【０１３８】
[実施例４]
Ｓ．アガラクチアエ（S. agalactiae）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、精製ポリクローナルヒトＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じさせた（図１０）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、精製モノクローナルヒトＩｇＧ１カッパおよびＩｇＧ１ラムダを切断して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される３２ｋＤａの分解産物を生じさせた（図１０Ｄ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅをモノクローナルヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４とインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった（図１０Ｄ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅをウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびマウスからの精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった（図１０Ａ）。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清中のＩｇＧを切断したが、ＩｇＭまたはＩｇＡは、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析により検出されなかった。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは、ヒト血清ＩｇＧ１を完全に分解して単一の切断されたＩｇＧ１にする（図１１）。
・ヒトＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端配列は、Ｈ（またはＧまたはＳ）ＴＣＰＰＣＰＡＰＥであることがＮ末端のエドマン配列決定により示されて、このタンパク質はＩｇＧ１でヒンジ領域にパパインと同じ切断部位を有することを示し、システイン残基のＮ末端が重鎖間のＨ−Ｈ共有結合に関与すると考えられる。
・組換えＩｇｄＥａｇａｌａｃｔｉａｅは容易に過剰発現されて精製される。
【０１３９】
[実施例５]
Ｓ．エクイ（S. equi）から単離されたＩｇｄＥの性質
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉを発現する大腸菌（E. coli）の溶解物は、精製ポリクローナルウマＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された、３２ｋＤａの分解産物を生じさせる。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉをウシ、ヒト、ブタ、ヤギ、ラット、ウサギおよびマウスからの精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉはウマ血清中のＩｇＧを切断したが、ＩｇＭまたはＩｇＡは、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析により検出されなかった。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉは、精製モノクローナル組換えウマＩｇＧ７を切断して、３２ｋＤａの分解産物を生じさせ、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出された（図１２）。
・組換えＩｇｄＥｅｑｕｉを、組換えモノクローナルウマＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５またはＩｇＧ６とインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・ウマＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端のエドマン配列決定により示されたＮ末端配列は、（Ｇ）ＰＴＣＰＥＣＸＧＶである。この配列はウマＩｇＧ７のヒンジ領域に見出される。
【０１４０】
[実施例６]
Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）から単離されたＩｇｄＥの性質
・Ｓ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）の培養上清は、ブタＩｇＧの切断表現型を有したが、ヒトＩｇＧの切断表現型は有しなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、精製ポリクローナルヒトおよびブタＩｇＧを切断して、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出されるように、３２ｋＤａの分解産物を生じさせた。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓを、ウシ、ウマ、ヤギ、マウス、またはラットからの精製ポリクローナルＩｇＧとインキュベートしたときに、分解産物は観察されなかった。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、ヒトおよびブタ血清中のＩｇＧを切断したが、ブタ血清中のＩｇＭまたはＩｇＡは切断しないことが、抗ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡウェスタンブロット分析によりわかった。
・ブタＩｇＧの３２ｋＤａの分解産物のＮ末端配列は、Ｎ末端のエドマン配列決定により示されるようにＣＰＩＣＰＡＣＥであり、このタンパク質は、ブタＩｇＧ内のＩｇｄＥと同じ切断部位を有することが示される。
・組換えＩｇｄＥｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓは、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１ｐＬｙｓＳで容易に過剰発現された。
【０１４１】
本明細書に記載された本発明は、以下の態様にも関する。
１．  対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号１のフラグメント、配列番号１の変異体、または配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号３のフラグメント、配列番号３の変異体、または配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号５のフラグメント、配列番号５の変異体、または配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号７のフラグメント、配列番号７の変異体、または配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免疫応答を生じさせることができる配列番号９のフラグメント、配列番号９の変異体、または配列番号９の変異体のフラグメント；
を含むポリペプチド。
【０１４２】
２．  対象において免疫応答を生じさせることに使用するための態様１によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１４３】
３．  対象において免疫応答を生じさせることに使用するためのポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号２もしくはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｅ）配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）のいずれかのフラグメントであり、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．スイス（S. suis）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント。
（ｆ）配列番号４もしくはそれに相補的な配列；
（ｇ）（ｆ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｈ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｉ）（ｆ）もしくは（ｇ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｊ）配列（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）もしくは（ｉ）のいずれかのフラグメントであり、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．アガラクチアエ（S. agalactiae）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｋ）配列番号６もしくはそれに相補的な配列；
（ｌ）（ｋ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｍ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｎ）（ｋ）もしくは（ｌ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｏ）配列（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）もしくは（ｎ）のいずれかのフラグメントであり、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．ポルシナス（S. porcinus）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｐ）配列番号８もしくはそれに相補的な配列；
（ｑ）（ａ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｒ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｓ）（ｐ）もしくは（ｑ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；
（ｔ）配列（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）もしくは（ｓ）のいずれかのフラグメントであり、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．エクイ（S. equi）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント；
（ｕ）配列番号１０もしくはそれに相補的な配列；
（ｖ）（ｕ）で定義された配列に対する遺伝コードの結果として変性した配列；
（ｗ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｘ）（ｕ）もしくは（ｖ）で定義された配列との少なくとも７０％の同一性を有する配列；または
（ｙ）配列（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）もしくは（ｘ）のいずれかのフラグメントであり、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有し、かつ／もしくは対象において、連鎖球菌、好ましくはＳ．シュードポルシナス（S. pseudoporcinus）に対する免疫応答を生じさせることができるポリペプチドをコードするフラグメント
を含むポリヌクレオチド。
【０１４４】
４．  ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防に使用するためのポリペプチドであって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメントもしくは配列番号１の変異体のフラグメント。
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメントもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；または
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメントもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；または
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメントもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むポリペプチド。
【０１４５】
５．  ＩｇＧ抗体により媒介される疾患または状態の治療または予防に使用するための態様４によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０１４６】
６．  ＩｇＧを：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１の変異体；
（ｃ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１のフラグメントもしくは配列番号１の変異体のフラグメント；
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３の変異体；
（ｆ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号３のフラグメントもしくは配列番号３の変異体のフラグメント；
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号５のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５の変異体；
（ｉ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号５のフラグメントもしくは配列番号５の変異体のフラグメント；
（ｊ）配列番号７のアミノ酸配列；
（ｋ）配列番号７のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７の変異体；
（ｌ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号７のフラグメントもしくは配列番号７の変異体のフラグメント；
（ｍ）配列番号９のアミノ酸配列；
（ｎ）配列番号９のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９の変異体；
（ｏ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号９のフラグメントもしくは配列番号９の変異体のフラグメント；
（ｐ）配列番号１１のアミノ酸配列１；
（ｑ）配列番号１１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を有し、ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１の変異体；または
（ｒ）ＩｇＧを分解するシステインプロテアーゼ活性を有する配列番号１１のフラグメントもしくは配列番号１１の変異体のフラグメント
を含むポリペプチドと接触させることを含む、ＩｇＧを切断するためのインビトロの方法。
【０１４７】
７．ＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害する物質を同定する方法であって；
ａ）ＩｇｄＥポリペプチドおよびＩｇＧを候補物質と、該物質の不在下でＩｇＧシステイン活性を可能にする条件下で接触させるステップ、
ｂ）該候補物質の存在下で消化されたＩｇＧの量を、前記物質の不在下における場合と比較して決定するステップ、
ｃ）ｂ）で得られた結果に基づいて、該物質がＩｇｄＥポリペプチドのＩｇＧシステイン活性を活性化するかまたは阻害するかを決定するステップ
を含む方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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