(57)【要約】  本発明は、グルカゴン様ペプチド１類似体を精製する方法であって、二次元逆相高速液体クロマトグラフィーのプロトコルを含み、第１の工程は、リン酸緩衝液およびアセトニトリルを含む移動相を使用して、７．０から７．８の間のｐＨ値で行われ、第２の工程は、トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを含む移動相を使用して、３．０未満のｐＨ値で行われる方法に言及する。
2019512552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リラグルチドを精製するための方法であって、
ａ）リラグルチドと少なくとも１種の不要な構成成分を含む液体組成物Ｃを準備する工程と；
ｂ）組成物Ｃを、７．０から７．８の間のｐＨで、第１の逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、リン酸緩衝水溶液ＡＢ１およびアセトニトリルを含む移動相を使用し、溶出を、リラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に上昇させることによって実行する工程と；
ｃ）工程ｂ）で得られたプールされたリラグルチドを含有する画分を、３．０未満のｐＨで、第２の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを含む移動相を使用し、溶出を、精製したリラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に上昇させることによって実行する工程
とを含む前記方法。
【請求項２】
工程ｂ）のリン酸緩衝水溶液ＡＢ１は、好ましくは５ｍＭから５０ｍＭの濃度の、リン酸アンモニウム緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）の勾配はアセトニトリル１９から６７％（ｖ／ｖ）であり、および／または工程ｃ）の勾配はアセトニトリル３１から１００％（ｖ／ｖ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）で使用される移動相内のトリフルオロ酢酸濃度は、０．０５〜０．５％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｄ）工程ｃ）で得られたリラグルチドを、７．０から７．８の間のｐＨで、第３の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、緩衝水溶液ＡＢ２のアセトニトリルとの混合物を移動相として使用し、溶出を、精製したリラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に上昇させることによって実行する工程
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝水溶液ＡＢ２は、
−  リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの混合物、
−  リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムの混合物、
−  酢酸カリウム、および
−  酢酸ナトリウム
からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）および／もしくは工程ｃ）ならびに／または存在する場合は工程ｄ）の、すべてまたは一部は、４〜２５℃、好ましくは４〜１０℃の範囲から選択される温度で行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）およびｃ）ならびに存在する場合は工程ｄ）で使用される固定相は、Ｃ８に結合したシリカまたはＣ１８に結合したシリカである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サイズ排除クロマトグラフィーの工程ｅ）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドを脱塩する工程ｆ）をさらに含み、好ましくは、脱塩は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または限外濾過によって実施される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
それぞれの工程のすべてまたは一部は、４〜２０℃、好ましくは４〜１０℃の範囲から選択される温度で行われる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）は、７．０から７．５の範囲から選択されるｐＨで、乾燥された粗製のリラグルチドペプチドをリン酸緩衝水溶液ＡＢ０に溶解することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記粗製のリラグルチドペプチドは、固相ペプチド合成と、それに続く、トリフルオロ酢酸に媒介される切断および切断組成物からのペプチドの沈殿によって得られる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
精製されたリラグルチドは、６．６〜７．９、好ましくは７．０から７．８、最も好ましくは７．０から７．５の範囲から好ましくは選択されるｐＨで凍結乾燥される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、９９％より高い純度で含有し、ｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の取り込みにより酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２つの酸素原子の取り込みによって酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉｉ）２５位のＴｒｐの代わりにキヌレニンを含む任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｖ）Ｇｌｙ３１を欠くリラグルチドの欠失体のそれぞれを、検出可能なレベルで含有するが、０．５％を超えて、好ましくは０．３％を超えて、より好ましくは０．２％を超えて、最も好ましくは０．１％を超えて含有しない、前記組成物ＬＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、工業的規模または実験室規模でのペプチド精製の分野に関する。本発明は、リラグルチドのようなグルカゴン様ペプチド１類似体を有効に精製する方法を対象とする。
【０００２】
好ましい実施形態では、本発明は、グルカゴン様ペプチド１類似体を精製する方法であって、二次元逆相高速液体クロマトグラフィーのプロトコルを含み、第１の工程は、リン酸緩衝液およびアセトニトリルを含む移動相を使用して、７．０から７．８の間のｐＨ値で行われ、第２の工程は、トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを含む水性移動相を使用して、３．０未満のｐＨ値で行われる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＧＣＧ遺伝子（ＨＧＮＣ：４１９１）は、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を含む複数の関連するペプチドをコードする。これらは、かなりの配列相同性を共有し（図１を参照のこと）、血糖のホメオスタシス、腸の細胞増殖、および満腹を制御することにおいて重要である。ＧＬＰ−１機能の異常は、肥満、食後の反応性低血糖、および２型糖尿病に関連付けられてきた。よって、ＧＬＰ−１類似体は、薬剤研究において非常に興味深い。アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）に見られるペプチドホルモンエクセンディン−４の変異体および誘導体ならびにそのＧＬＰ−１ペプチドの変異体および誘導体は、広範囲にわたって研究されている。市販されている薬物は、エクセナチドおよびリキシセナチドを含み、いずれも、ＧＬＰ−１由来のリラグルチドと同様に、エクセンディン−４ペプチドから導出される。
【０００４】
ＮＮ２２１１としても知られている、リラグルチドである（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）は、２型糖尿病の処置に対してと、関連する共存症を有する成人の肥満の処置に対して承認されている。
【０００５】
この物質は、組換え技術によって工業的規模で製造されている。特許文献１には、発現した親ペプチドをＮα−ヘキサデカノイル−Ｇｌｕ（ＯＮＳｕ）−ＯｔＢｕと組換えによって反応させて、リラグルチドを得ることについて記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ１９９８／００８８７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リラグルチドのようなグルカゴン様ペプチドの全化学合成のための大規模での方法を提供することが望ましい。化学ペプチド合成は、文献に広範囲にわたって記載されている。ペプチドの化学合成への２つの標準手法は区別することができ、すなわち液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）および固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）である。さらに、混成の手法を利用することができ、ここで、上記の技術のうちの一方によって、最初に断片が合成され、次いで、もう一方の手法を使用して一緒に接合される。溶液ペプチド合成とも称されるＬＰＰＳは、均質な反応媒体中で行う。連続的なカップリングにより、所望のペプチドが得られる。ＳＰＰＳでは、不溶性ポリマー樹脂に、そのＣ末端によって固定されたペプチドは、その配列を構成する保護されたアミノ酸の連続的付加によってアセンブルされる。成長する鎖は不溶性支持体に結合しているため、過剰な試薬および可溶性副生成物は簡単な濾過によって除去することができる。しかし、特に、大きなペプチドの合成に対して、脱保護の間に、または分解によって形成された副生成物に加えて、樹脂結合副生成物が蓄積する可能性がある。結果として、最終生成物の精製は非常に困難である場合がある。
【０００８】
グルカゴン様ペプチドの精製は、その凝集する傾向により、特に労力を要する。グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチドは、酸性ｐＨで凝集し易いことが知られている（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１  （１９６９）  ３７〜４２頁）。本発明は、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１類似体の製造および精製、特にリラグルチドの精製のための方法を提供する。
【０００９】
特許出願ＣＮ−Ａ  １０３２７５２０８は、Ｃ１８カラム、および０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液とアセトニトリルまたは１％の酢酸水溶液とアセトニトリルからなる酸性の移動相を使用する逆相高速クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含むリラグルチドのための精製プロトコルを開示している。全体的な収率は、わずか２０．２％であると示されている。
【００１０】
ＷＯ  ２０１１／１６１００７は、ＧＬＰ−１誘導体の精製のための方法を開示している。この方法は、二次元ＲＰ−ＨＰＬＣに関し、ここで、移動相中の有機溶媒はアセトニトリルであり、第２の次元は、８．０から１１．０の間のｐＨで、塩基性緩衝液を使用して行われる。
【００１１】
好ましい実施形態では、Ｃ１８カラムは、第１の次元の移動相としてｐＨ２．４のリン酸アンモニウム／アセトニトリル、および第２の次元の移動相としてｐＨ９．５の炭酸アンモニウム／アセトニトリルを用いて使用される。報告されている最大純度は９７．４％である。したがって、純度は、所望されるほど高くなく、特に、ＷＯ  ２０１１／１６１００７で使用された塩基性緩衝剤は蒸発可能ではないため、ペプチドは、ペプチドの保存に対する欠点を有する場合のある塩基性緩衝液中で得られる。塩基性緩衝剤の除去には追加の脱塩工程が必要とされる場合がある。
【００１２】
ＥＰ−Ａ  ２  ８１３  ５１４には、リラグルチドの精製のための方法が開示されている。この方法は、三次元ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製に関し、第１の次元の固定相としてオクチルシランにより結合したシリカおよび移動相として水性のイソプロパノール／ＴＦＡ／アセトニトリル系；第２の次元の固定相としてシアノシランにより結合したシリカおよび移動相として水性の過塩素酸／アセトニトリル系；ならびに第３の次元の固定相としてオクチルシランにより結合したシリカおよび移動相として水性のアンモニア／アセトニトリル系を用いる。面倒な手順で、異なる固相および完全に異なる移動相を使用する３つの連続するＨＰＬＣ精製工程を用いているが、報告された最大純度は９８．７％である。
【００１３】
ＷＯ  ２０１４／１９９３９７には、Ｃ８カラムと、移動相としてＴＦＡ／メタノール／アセトニトリル系を使用するＲＰ−ＨＰＬＣを用いる混成の手法によって合成された粗製のリラグルチドの精製について開示されている。得られた組成物は、大量の毒性メタノールを含む。得られた純度は９７％より高いことが報告されている。
【００１４】
ＷＯ  ２０１０／０６６７３４には、ペプチドの精製のための向流クロマトグラフィーの使用について開示されている。逆相カラムおよび陰イオン交換カラムが固定相として使用される。ここでは、対イオンに基づく方法が、むしろ理論に基づいて記載されている。この方法は、むしろ複雑である。
【００１５】
ＷＯ  ２０００／０５５２０３およびＷＯ  ２０００／０５５１８４には、イオン交換クロマトグラフィーによるペプチドの精製について開示されている。同様に、ＷＯ  ２００５／０１９２６１には、イオン交換クロマトグラフィーによって、ラセミ夾雑物からリラグルチドを分離する方法について記載されている。
【００１６】
このような方法から得られた組成物は、所望されるより多いかなりの量の塩を含むことが多く、これらをさらなる精製工程において除去しなければならない。
【００１７】
ＷＯ２０１１／１０７４４７には、ＲＰ−ＨＰＬＣによる種々のペプチドの精製について開示されており、移動相のｐＨは、ペプチドの等電点の１単位以内に保たれ、溶出は、好ましくは、酸性範囲のｐＨ勾配によって実行される。
【００１８】
ＥＰ−Ｂ  １  ６６４  １０９には、ＲＰ−ＨＰＬＣによるペプチドの精製について開示されており、移動相は、アルコールと、ｐＨをｐＨ４〜１０の範囲から選択される設定値にしっかりと制御する緩衝液を含む。
【００１９】
ＷＯ  ２０１６／００５９６０には、リラグルチドに対する２工程の精製スキームが開示されており、変則的なＣ１８シリカ媒体−１０ミクロンの粒径と、ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓを含む移動相を使用する第１の精製工程について記載されている。第２の工程では、５ミクロンの粒径のＣ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体と、０．１％のＴＦＡを含む移動相が使用される。溶出は、アセトニトリルのステップグラジエントによって実行される。プールされた画分の平均純度は９７％と示され、したがって、所望されるほど高くない。さらに、２つの異なる固定相の使用は経済的ではない。
【００２０】
多くの先行技術にもかかわらず、高純度のグルカゴン様ペプチド１類似体および誘導体の工業的生産を可能にする改良法に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
驚くべきことに、高純度のリラグルチドの製造のための簡単な方法が見出された。第１に、７．０から７．８の間のｐＨ（７．０≦ｐＨ＜７．８）を有する第１のリン酸緩衝液含有移動相を使用し、続いて、酸性ｐＨの第２のＴＦＡ含有移動相を使用する２つの連続したクロマトグラフィーの工程を用いることが有利であることが見出された。カラムの目詰まりを十分に回避することができ、同じ固定相を両方の工程で使用することができることが見出された。実施された実験では、再現性のよい高い収率および９８．８％より高い（９９％より高い場合さえある）プールされた画分の高純度を達成することができた。
【００２２】
概して、いくつかの略語および定義が、本発明全体を通して使用される：
ＡＣＮ    アセトニトリル
ＡｃＯＨ    酢酸
Ｂｏｃ    ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル
ＤＴＥ    １，４−ジチオエリトリオール
ＤＴＴ    １，４−ジチオトレイトール
ＥＤＴ    １，２−エタンジチオール
Ｆｍｏｃ    ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＧＬＰ−１    グルカゴン様ペプチド１
ＧＬＰ    グルカゴン様ペプチド
ＨＰＬＣ    高速液体クロマトグラフィー
本明細書で使用する用語ＨＰＬＣは、ＵＨＰＬＣを含む。
ＬＣ−ＭＳ    液体クロマトグラフィー−質量分析
ＬＰＰＳ    液相ペプチド合成
ＮＨ４ＯＡｃ    酢酸アンモニウム
ＲＰ−ＨＰＬＣ    逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＥＣ    サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰＰＳ    固相ペプチド合成
ｔＢｕ      ｔｅｒｔブチル
ＴＥＡＰ    トリエチルアンモニウムホスフェート
ＴＦＡ    トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ    トリイソプロピルシラン
ＵＨＰＬＣ    超高速液体クロマトグラフィー
【００２３】
他に示されていなければ、ｐＨ値は、それぞれの水溶液が使用される温度について示される。
【００２４】
アミノ酸は、その正式名称（例示：アラニン）、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５による３文字コード（例えば、Ａｌａ）、または１文字コード（例えば、Ａ）によって互換的に言及される。エナンチオマー型が明示的に特定されていなければ、一般的にＬ−アミノ酸に言及している。しかし、本発明は、同様に、Ｄ−アミノ酸および他の立体異性体を使用して実践されうる。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的に理解される。他に示されていなければ、ペプチド配列は、本明細書において、Ｎ末端（左）から始まってＣ末端（右）で終わるように示される。表１は、同等であり、この明細書全体で互換的に使用される異なる表記を例示する。
【００２６】
【表１】
2019512552.tif 000003
【００２７】
アミノ酸誘導体について、以下の表記を使用する：アルファアミノ基における置換（Ｎα）は、アミノ酸記号の左に示され、ハイフンによって分離されており、アルファカルボキシ基における置換は、アミノ酸記号の右に示され、ハイフンによって分離されており、側鎖における置換は、アミノ酸記号の直ぐ右の括弧内に示されている。修飾されていないアルファアミノ酸では、アルファアミノ基（Ｎα）における置換はプロトン（Ｈ−）であり、アルファカルボキシ基における置換はヒドロキシ（−ＯＨ）である。
【００２８】
分枝状ジペプチドでは、この表記は、入れ子形式でつながっている。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨは、Ｆｍｏｃで保護されたアルファアミノ基と遊離のアルファカルボキシル基を有するＬｙｓ誘導体であって、その側鎖がＢｏｃで保護されたアルファアミノ基とＯｔＢｕで保護されたカルボキシル基を有するグルタミル部分で置換されているＬｙｓ誘導体を指す。グルタミル部分は、そのガンマカルボキシル基を介してＬｙｓ側鎖にアミド結合を形成する。
【００２９】
ペプチドの一部である置換されたアミノ酸に対して、類似の表記が使用される。例えば、Ａａａ１−Ａａａ２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−Ａａａ４−Ａａａ５は、分枝状のペンタペプチドを指し、ここで、３位のＬｙｓ側鎖は、Ｂｏｃ保護されたアルファアミノ基とＯｔＢｕ保護されたカルボキシル基を有する、アミド結合したグルタミル部分で置換されている。よって、前記アミド結合は、Ｌｙｓのイプシロンアミノ基とＧｌｕのガンマカルボキシル基の間にある。
【００３０】
用語「グルカゴン様ペプチド」またはＧＬＰは、本明細書で使用する場合、前述の任意の誘導体だけでなく、ＧＣＧ遺伝子（ＨＧＮＣ：４１９１）、エクセンディンおよびその類似体から導出される同族のペプチドを指す。図１は、プロトタイプのグルカゴン様ペプチドの配列アラインメントを示す。
【００３１】
用語「グルカゴン様ペプチド１類似体」および「ＧＬＰ−１類似体」は、本明細書で使用する場合、互換的に使用される。本明細書で使用する場合、これらは、ＧＬＰ−１受容体に結合することができるペプチドに関する。ＧＬＰ−１（７−３７）の誘導体および類似体ならびにエクセンディン４（１−３９）の誘導体および類似体、例えば、エクセナチド、リキシセナチド、およびリラグルチドは、好ましいＧＬＰ−１類似体である。例示的に、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号４に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド鎖、より好ましくは、配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチド鎖、特に、配列番号４に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド鎖を含み、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０に対する相同体であるリシン部分における修飾も含む。相同性は、本明細書で使用する場合、好ましくは、配列番号４の配列全体にわたって決定される配列相同性である。本明細書で使用する場合、配列相同性は、当技術分野で公知の配列相同性の任意の定義を指す。特に、配列相同性は、本出願の出願日のバージョンの国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）によって決定された配列相同性として理解される。
【００３２】
用語「類似体（複数可）」は、本明細書で使用する場合、その配列が、第１のペプチド配列の５０％までのアミノ酸部分の置き換えによって、および／もしくは１０％までのアミノ酸部分の欠失によって、ならびに／または１０アミノ酸部分までの付加によって、前記第１のペプチド配列から導出されるペプチドに使用される。好ましい類似体は、第１のペプチド配列の２０％までのアミノ酸部分の置き換えによって、および／もしくは１０％までのアミノ酸部分の欠失によって、ならびに／または１０アミノ酸までの付加によって、前記第１のペプチド配列から導出される。
【００３３】
用語「誘導体（複数可）」は、本明細書で使用する場合、化学反応によって、第１の化合物から得ることのできる化合物を指す。結果として、誘導体は、置換基の存在または非存在によって、第１の化合物と異なる。例えば、ＳＰＰＳにおいて使用するためのアミノ酸誘導体は、普通、少なくともアミノ酸保護基の存在によって、導出されるアミノ酸と異なる。
【００３４】
本発明は、リラグルチドのようなＧＬＰ−１類似体を有効に精製するための方法を対象とする。
【００３５】
本明細書で使用されるＧＬＰ−１類似体は、当技術分野で公知の任意の対イオン、例えば、陰イオンまたは陽イオン、例えば、塩化物イオン、酢酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、切断溶液の任意のイオン（例えば、ＴＦＡイオン、臭素イオン、過塩素酸イオン、アンモニウムイオン）および／または保護基の残基の陽イオンもしくは陰イオンなどを、場合により保有することが、当業者によって理解されるであろう。さらに、ペプチドは、場合により、共有結合または非共有結合により、微量の１種またはそれ以上の捕捉剤、例えば、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、アニソール、チオアニソールまたは１，２−エタンジチオールに会合している。
【００３６】
以下の教示はリラグルチドに関することが多いが、同様に、それらを任意の他のＧＬＰ−１類似体に適用することができることが理解されるべきである。
【００３７】
特に、本発明の一態様は、リラグルチドの精製のための方法であって、以下の工程ａ）からｃ）：
ａ）リラグルチドと少なくとも１種の不要な構成成分を含む液体組成物Ｃを準備する工程と；
ｂ）組成物Ｃを、７．０から７．８の間のｐＨで、第１の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、リン酸緩衝水溶液ＡＢ１およびアセトニトリルを含む移動相を使用し、溶出を、リラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に上昇させることによって実行する工程と；
ｃ）工程ｂ）で得られたプールされたリラグルチドを含有する画分を、３．０未満のｐＨで、第２の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルを含む移動相を使用し、溶出を、精製したリラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に上昇させることによって実行する工程
とを含む方法に関する。
【００３８】
一実施形態では、本発明の方法は、さらに、
ｄ）工程ｃ）で得られたリラグルチドを、７．０から７．８の間のｐＨで、第３の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、緩衝水溶液ＡＢ２のアセトニトリルとの混合物を移動相として使用し、溶出を、精製したリラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を徐々に上昇させることによって実行する工程
を含む。
【００３９】
用語「リラグルチドと少なくとも１種の不要な構成成分を含む液体組成物Ｃを準備する」は、リラグルチドと少なくとも１種の不要な構成成分を含有する任意の液体組成物を得る工程として、最も広い意味で理解される。リラグルチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって準備される。例示的に、リラグルチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）もしくは液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）またはその組合せから得ることができる。あるいは、簡単なポリペプチド鎖は、バイオテクノロジーによる方法から得ることもでき、得られたポリペプチド鎖は、次に、化学／合成手段によって修飾される。
【００４０】
用語「不要な構成成分」は、本明細書において、不純物とみなされる任意の化合物に対して、最も広い意味で使用される。特に好ましい種類の不純物は、リラグルチドの合成および保存の間に形成され、アミノ酸、ペプチドおよびその誘導体からなる群から選択される。特に、ペプチド合成の間の早期連鎖停止、ペプチド合成の間の少なくとも１つのアミノ酸の脱落または意図しない付加、保護基の不完全な除去、アミノ酸のカップリングまたはＦｍｏｃ脱保護工程の間に起こる副反応、分子間または分子内縮合反応、固体支持体からのペプチドの切断の間の副反応、ラセミ化、任意の他の種類の異性体形成、脱アミド、（部分的）加水分解、および凝集体形成などのプロセスから生じる、アミノ酸、ペプチド、およびその誘導体からなる群から選択される不純物が包含される。グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチドが凝集体を形成する傾向にあること、および低ｐＨ値によってこのプロセスが促進されることが多い、すなわち、低ｐＨ値は不安定化条件を表すことが当技術分野で周知である（例えば、Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ  １２：４１１〜４１９頁を参照のこと）。上記で概説したように、このようなプロセスから得られたペプチドの夾雑物は、「関連する物質」と称されることもある。
【００４１】
特に好ましい実施形態では、不要な構成成分はペプチドの不純物である。本明細書で使用する場合、発現「ペプチドの不純物」は、不要なペプチドの化合物を指し、特に、ＨＭＷ不純物、精製されるペプチドの誘導体、精製されるペプチドのトランケートされた変異体、精製されるペプチドの欠失体、およびこのようなトランケートされた変異体および欠失体の誘導体を含む。ペプチドの不純物は、ＲＰ−ＵＨＰＬＣを含む適切な分析クロマトグラフィーによって日常的に決定される。
【００４２】
一実施形態では、不要な構成成分は、精製されるペプチドの共有結合または非共有結合による凝集体を含む。このような不要な構成成分は、生理学的に不活性であるか、または未知の生理作用を有するものであり、５０００Ｄａより大きい分子量を有する。不要な構成成分は、本明細書において、「高分子量（ＨＭＷ）不純物」と称される。別の実施形態では、不要な構成成分は、精製されるペプチドの誘導体、例えば、アミノ酸側鎖の酸化もしくは加水分解の結果物および／またはペプチド合成の間に形成された副生成物である。別の実施形態では、不要な構成成分は、精製されるペプチドのトランケートされた変異体またはこのようなトランケートされた変異体の誘導体である。本明細書で使用する場合、表現「トランケートされた変異体」は、ペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端で１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠く、所与のペプチドの連続する断片、すなわち、ギャップのない部分配列を指す。別の好ましい実施形態では、不要な構成成分は、精製されるペプチドの欠失体またはこのような欠失体の誘導体を含む。本明細書で使用する場合、表現「欠失体」は、精製されるペプチドの変異体を指し、それらの一次配列が単一または多数のアミノ酸を欠くという点で異なる。「脱落した」アミノ酸は、もとのペプチド配列内の任意の位置にある。したがって、トランケーション変異体は、特異的な種類の欠失体とみなすことができる。
【００４３】
特に好ましい実施形態では、精製されるペプチドはリラグルチドである。最も好ましい実施形態では、本発明による方法により、ペプチドの不純物を除去し、本質的に純粋なリラグルチドの調製物を得ることが可能となる。本発明の方法により、分析クロマトグラフィーによって、２０５から２３０ｎｍの間の波長でのＵＶ検出を好ましくは用いて、実測された相対的ピーク面積について評価すると、任意の個々のペプチドの不純物を０．５％以下しか含有しない本質的に純粋なリラグルチドが得られることが示された。
【００４４】
リラグルチド欠失体は、好ましくは、リラグルチドのペプチド骨格の一次配列（配列番号４）から４個までのアミノ酸を欠いているという点でリラグルチドの分子構造と異なり、場合により、２〜５個のアミノ酸側鎖において、または配列番号４のＬｙｓ２０に対応するＬｙｓ部分の（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））置換基においてさらなる変更を有する、２７〜３０個の連続するアミノ酸からなるペプチドである。
【００４５】
言い換えれば、リラグルチドの欠失体は、長さが２７から３０個のアミノ酸部分のペプチドと定義され、配列番号４の全長に対して計算して、配列番号４との少なくとも８０％の相同性を共有し、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に、修飾、例えば、（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））置換基を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、不要な構成成分は、少なくとも１種のＴｒｐ（Ｏ）２５−リラグルチド、ならびに／または少なくとも１種のＴｒｐ（２Ｏ）２５−リラグルチドおよび／もしくはＫｙｎ２５−リラグルチドならびに／またはＧｌｙ３１を欠くリラグルチド欠失体を含む。
【００４７】
本出願の文脈では、表現「Ｔｒｐ（Ｏ）２５−リラグルチド」は、２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の導入によって酸化されるリラグルチド誘導体を示すために使用される。表現「Ｔｒｐ（２Ｏ）２５−リラグルチド」は、２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２個の酸素原子の導入によって酸化されるリラグルチド誘導体を示すために使用される。最後に、「Ｋｙｎ２５−リラグルチド」という表現は、キルレニンが２５位のＴｒｐ位を置換しているリラグルチド誘導体を示すために使用される。
【００４８】
本明細書に記載されている本発明の実施形態は、合成後に得られた粗製の調製物からリラグルチドを単離するために使用するのが有利である。本発明は、リラグルチド合成の具体的方法に決して制限されないが、好ましい実施形態は、化学的に合成されたリラグルチドペプチドの精製に関する。リラグルチドペプチドは、例えば、適切に保護されたアミノ酸とジペプチド誘導体を使用するＦｍｏｃ固相ペプチド合成によって合成することができる。
【００４９】
好ましくは、組成物Ｃは、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）式Ｉ：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ１−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（式中、Ｂ１はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）またはＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）
のペプチドを含む溶液Ｓを準備する工程と；
（ｉｉ）溶液Ｓをジイソプロピルエーテルとアセトニトリルを含む逆溶媒と混合することによって、工程（ｉ）のペプチドを沈殿させる工程であり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（１０：１）の範囲内にある、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を、好ましくは濾過および／または遠心分離によって、単離する工程
とを含む方法によって製造されたリラグルチドまたはその塩を含む。
【００５０】
より好ましくは、組成物Ｃに含まれる粗製のリラグルチドの全量が、上記の方法によって得られたものである。
【００５１】
特に好ましい態様では、組成物Ｃは、以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）式Ｉ：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ１−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（式中、Ｂ１はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）またはＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）
のペプチドを含む溶液Ｓを準備する工程であり、
前記溶液Ｓの準備は、
（ｉ−ａ）固相：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ２−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
（式中、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）またはＬｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）であり、Ｒ１はカルボン酸保護基であり、少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を保有する）
にコンジュゲートされた前駆体ペプチドを準備する工程と；
（ｉ−ｂ）前駆体ペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む切断組成物を用いて、樹脂から切断する工程を含み、
工程（ｉ）から得られた前記溶液Ｓは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水ならびにチオール捕捉剤および／またはシラン捕捉剤から選択される１種またはそれ以上の捕捉剤を含む、工程と；
（ｉｉ）溶液Ｓをジイソプロピルエーテルとアセトニトリルからなる逆溶媒と混合することによって、工程（ｉ）のペプチドを沈殿させる工程であり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（５：１）の範囲内にある、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を、好ましくは濾過および／または遠心分離によって、単離する工程
とを含む方法によって製造された粗製のリラグルチドまたはその塩を含む。
【００５２】
当業者であれば、式Ｉのペプチドが、１文字コード：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ  （配列番号４）（式中、アミノ酸配列の２０位のリシル部分（Ｌｙｓ２０、Ｋ２０）が修飾されている）で書かれた、簡単なリラグルチドのポリペプチド鎖の誘導体を指すことに直ぐに気付く。より詳細には、Ｌｙｓ２０のイプシロンアミノ基が、アミド結合を介して、グルタミル部分のガンマカルボキシル基（γ−Ｇｌｕ、γ−Ｅ）のガンマカルボキシル基にコンジュゲートしている。グルタミル部分は、そのアミノ基を介して、パルミチン酸＝ヘキサデカン酸部分にコンジュゲートしているか、または遊離ＮＨ２（アルファアミノ基、Ｎα）を保有する。
【００５３】
好ましくは、式Ｉのペプチドは、いずれの保護基も（本質的に）有さず、Ｌｙｓ２０の部分を除いて、アミノ酸側鎖で他の修飾を有さない。したがって、式Ｉのペプチドは、好ましくは、十分に保護されていないペプチドであり、好ましくはさらに修飾されない。
【００５４】
用語「保護基」は、本明細書で使用する場合、官能基の化学的修飾によって分子に導入され、次のプロセス工程において、前記基を反応からブロックする、例えば、アミノ酸側鎖の副反応を妨害する基として、最も広い意味で理解される。アミノ保護基の例は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ基であり、カルボン酸保護基の例は、メチルエステル、ベンジルエステル、またはｔｅｒｔブチルエステルのような未反応性エステルである。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「樹脂」および「［樹脂］」は、ＳＰＰＳのために使用可能な支持体構造として最も広い意味で理解される。好ましくは、樹脂はビーズ様構造を有する。用語「樹脂」、「固相」および「支持体」は、本明細書において、交換可能に使用される。
【００５６】
本出願の文脈では、用語「捕捉剤」は、ＳＰＰＳ後のペプチドの樹脂からの切断の間、および／または保護基の除去の間に、副反応を抑制するために反応混合物に添加される化合物を指すために使用される。切断組成物において使用される典型的な捕捉剤は、「チオール捕捉剤」（例えば、ＥＤＴ、ＤＴＥ、ＤＴＴ、およびベータ−メルカプトエタノール）および「シラン捕捉剤」（例えば、ＴＥＳおよびＴＩＰＳ）である。
【００５７】
さらに、通常使用される捕捉剤は、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、アニソール、ｍ−クレゾールもしくはｐ−クレゾール、２−Ｍｅ−インドール、Ａｃ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ、またはトリプタミンを含む。当業者であれば、使用可能な非常に様々な捕捉剤を十分に認識している。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、精製方法の工程ａ）は、乾燥された粗製のリラグルチド沈殿物を得ること、および７．０から７．８、好ましくは７．０から７．５の範囲から選択されるｐＨで、前記乾燥された沈殿物を適切な緩衝液に溶解して、リラグルチドと少なくとも１種の不要な構成成分を含む液体組成物Ｃを得ることに関する。好ましい実施形態では、工程ａ）は、６．６〜７．９、好ましくは７．０から７．８、最も好ましくは７．０から７．５の範囲から選択されるｐＨで、乾燥された粗製のリラグルチドペプチドをリン酸緩衝水溶液ＡＢ０に溶解することを含む。特に好ましいリン酸緩衝液は、７．０から７．５の範囲から選択されるｐＨのリン酸水素ナトリウムまたはリン酸水素アンモニウムである。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、粗製のリラグルチドペプチドは、固相ペプチド合成、続いて、トリフルオロ酢酸に媒介される切断および切断組成物からのペプチドの沈殿によって得られる。
【００６０】
本出願の目的として、用語「精製していない」および「粗製の」は、本質的に、合成および単離プロセスの直接的な生成物であり、特定の精製工程に未だ付されていない、リラグルチドのようなペプチドの調製物を示すために互換的に使用される。化学合成によって、通常、およそ５０から７０％の純度を有する粗製のリラグルチド調製物が得られる。しかし、液体組成物Ｃは、１００％未満の任意の純度の程度（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％を超える純度）によって特徴付けられ、本発明は、部分的に精製したリラグルチド組成物にも有利に適用されることが理解されるべきである。
【００６１】
本発明の文脈では、用語「精製した」は、特定の精製工程、例えば、分取クロマトグラフィーに供されたペプチド組成物を示すために使用される。このような組成物は、高度にまたは部分的に精製される。
【００６２】
他に記載されていなければ、ペプチドの純度は、本明細書において、「ＨＰＬＣ純度」として、すなわち２０５から２３０ｎｍの間の波長での、すなわちペプチド結合の吸収極大でのＵＶ検出を用いる分析逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で実測される相対ピーク面積として示される。言い換えれば、値は、２０５から２３０ｎｍの間の波長でのＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって得られるクロマトグラムにおいて、すべての実測されたピークの面積の合計で割った、所与のピーク面積の面積％として決定される。この尺度は、この分野での常識であり、当業者は、生成物に特異的なＲＰ−ＨＰＬＣプロトコルを日常的に考案し、米国薬局方で示される確立されたガイドラインに従った定量を実施する。ペプチドの夾雑物の検出に対するＲＰ−ＨＰＬＣプロトコルの適性は、日常的に、ＬＣ−ＭＳによってピーク純度を決定することによって評価される。それらの類似構造に起因して、すべてのペプチドの構成成分が同じ吸収を有するという仮定のもと、質量百分率［％（ｗ／ｗ）］として表現された純度に対するプロキシとして、ＲＰ−ＨＰＬＣ純度を使用することができる。
【００６３】
当業者は、クロマトグラフィー精製のための試料を調製する方法を十分に認識している。例えば、乾燥された粗製のリラグルチド調製物を、温度およびｐＨを適宜調整しながら水性相において穏やかに撹拌することによって溶解させる。本発明者らは、特に、粗製のリラグルチド調製物を溶解するのに適する、６．６〜７．９、好ましくは７．０〜７．８のｐＨ、特に、７．０〜７．５のｐＨの緩衝水溶液を見出した。さらなる例として、試料は、不活性ガスの下で保持されるかもしくは超音波処理に供され、脱炭酸反応に供され、特定の加水分解に供され、かつ／または濾過もしくは遠心分離によって非液体組成物から分離される。試料の濃度は、とりわけ、乾燥、凍結乾燥、溶媒の部分的蒸発、もしくは限外濾過によって、かつ／または、場合によって、試料ローディング緩衝液中にペプチド調製物を溶解もしくは希釈することによって、調整することができる。
【００６４】
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、周知であり、ペプチド精製およびペプチド試料分析のために、すなわち調製および分析の用途で、広く使用されている。この技術は、試料の種々の構成成分と疎水性固定相の間の疎水性会合に基づき、この会合は、移動相に含まれる溶媒によって破壊される。試料の構成成分の分画溶出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｌｕｔｉｏｎ）は、一般的に、移動相内の溶媒の濃度を徐々に上昇させることによって達成される。
【００６５】
実用的観点から、この勾配は、通常、移動相を構成する第１の溶離液と第２の溶離液の比率を変化させることによって得られる：慣例によって緩衝液Ａと称される第１の緩衝液は、適切な緩衝水溶液中に少量の溶媒を含み、一方、慣例により緩衝液Ｂと称される第２の緩衝液は、前記緩衝水溶液中に多量の溶媒を含む。したがって、移動相における緩衝液Ｂの比率を上昇させることによって、より疎水性の構成成分を固定相から溶出することができる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語ＨＰＬＣは、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ、ＵＰＬＣとも表示される）も含む。好ましい一実施形態では、ＨＰＬＣはＵＨＰＬＣである。より好ましくは、ＵＨＰＬＣは逆相ＵＨＰＬＣであり、したがって、ＲＰ−ＵＨＰＬＣとも表示される。したがって、特に好ましい実施形態では、ＨＰＬＣはＲＰ−ＵＨＰＬＣである。
【００６７】
本出願の文脈では、表現「炭化水素に結合したシリカ」は、その表面に化学的に結合した炭化水素部分を有する多孔性シリカ粒子またはシリカゲルから作製されたクロマトグラフィーの固定相を指す。化学結合の種類および結合した炭化水素部分の化学的性質は様々であることが理解される。例えば、本出願に関して使用するための固定相は、４から１８、好ましくは８から１８個の炭素原子の化学結合した炭化水素部分を有する多孔性シリカ粒子から作製される。このような炭化水素部分は、好ましくは、直鎖状アルキル鎖である。炭化水素に結合したシリカの好ましい種類は、４個（Ｃ４）、６個（Ｃ６）、８個（Ｃ８）、１０個（Ｃ１０）、１２個（Ｃ１２）、１４個（Ｃ１４）、１６個（Ｃ１６）または１８個（Ｃ１８）の炭素原子を有する炭化水素部分を有する。炭化水素に結合したシリカの特に好ましい種類は、４個（Ｃ４）、８個（Ｃ８）、１２個（Ｃ１２）または１８個（Ｃ１８）の炭素原子の分岐していないアルキル鎖、すなわち、ブチル、オクチル、ドデシル、またはオクタデシル部分を有する。Ｃ８に結合したシリカ、特にｎ−オクチルに結合したシリカ、および／またはＣ１８に結合したシリカ、特にｎ−オクタデシルに結合したシリカは、本発明による方法の工程ｂ）、ｃ）、および場合によりｄ）において使用するための、さらにより好ましい固定相である。工程ｂ）およびｃ）および場合によりｄ）において使用される固定相は、工程のそれぞれにおいて同一であるかまたは異なっている。好ましくは、固定相は同一である。特に好ましくは、単一の固定相（すなわち、単一のカラム）が、工程ｂ）およびｃ）ならびに場合によりｄ）において使用される。
【００６８】
本出願の文脈では、表現「Ｃ８に結合したシリカ」は、その表面に化学的に結合したＣ８炭化水素部分、好ましくは直鎖状オクチル、すなわちｎ−オクチル部分を有する多孔性シリカ粒子またはシリカゲルから作製されたクロマトグラフィーの固定相を示すために使用される。さらに、表現「Ｃ１２に結合したシリカ」は、その表面に化学的に結合したＣ１２炭化水素部分、好ましくは直鎖状ドデシル、すなわちｎ−ドデシル部分を有する多孔性シリカ粒子またはシリカゲルから作製されたクロマトグラフィーの固定相を示すために使用される。同様に、用語「Ｃ１８に結合したシリカ」または「ＯＤＳ」は、その表面に化学的に結合したＣ１８炭化水素部分、好ましくは直鎖状オクタデシル、すなわちｎ−オクタデシル部分を有する多孔性シリカ粒子またはシリカゲルから作製されたクロマトグラフィーの固定相を指すために、本明細書において、互換的に使用される。
【００６９】
広範囲の炭化水素に結合したシリカ材料が市販されている。本発明において使用することができる固定相の例として、それぞれ、Ｄａｉｓｏ、ＹＭＣ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、およびＡｋｚｏＮｏｂｅｌによって製造されたＤａｉｓｏｇｅｌ（商標）  Ｃ１８  ＯＤＳ、Ｄａｉｓｏ  ＯＤＳ−Ｂｉｏ、Ｄａｉｓｏ−ＯＤＳ−Ａ−ＨＧ  Ｃ１８、Ｄａｉｓｏｇｅｌ（商標）  Ｃ８−Ｂｉｏ、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ、ＹＭＣ  Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ８−Ｌ、Ｌｕｎａ  Ｃ８、Ｌｕｎａ  Ｃ１８、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）  Ｃ１８、およびＫｒｏｍａｓｉｌ（商標）  Ｃ８がある。
【００７０】
シリカ粒子は、直径２から２００マイクロメーター、好ましくは２．５から２０マイクロメーター、好ましくは５〜１５マイクロメーター、および最も好ましくは１０マイクロメーターのものであり、５０から１０００Å、好ましくは８０から４００Å、好ましくは１００から３００Å、最も好ましくは（約）１００Åの孔径を有する。
【００７１】
本発明のＲＰ−ＨＰＬＣ工程で使用される移動相は、一般的に、水性構成成分と溶媒としてのアセトニトリルを含む。有機修飾剤のようなさらなる構成成分が存在する場合がある。溶出は、溶媒としてのアセトニトリルの濃度を徐々に上昇させることによって実行される。いずれの理論にも拘泥されることを望むものではないが、溶媒は、組成物Ｃの構成成分の固定相への会合と競合すると考えられる。線速度を維持するために、専門家は、カラムの直径に応じ、用いられる機器および固定相の仕様書を考慮に入れて、移動相の流量を調整する。
【００７２】
本発明による方法の工程ｂ）、すなわちＲＰ−ＨＰＬＣ精製スキームの第１の次元は、７．０から７．８の間のｐＨ値で、例えば、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８のｐＨ値で、好ましくは７．５から７．８のｐＨ値で行われる。ｐＨ値は、移動相の水性構成成分において、その工程がリン酸緩衝液の使用によって行われる温度で調整される。好ましくは、リン酸緩衝液は、５から５０ｍＭの濃度で使用される。任意の種類のリン酸緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸アンモニウムが使用される。好ましい一実施形態では、工程ｂ）のリン酸緩衝水溶液ＡＢ１は、好ましくは５から５０ｍＭの濃度のリン酸アンモニウムである。任意の種類のアセトニトリル勾配を、固定相からのリラグルチドの溶出に使用することができ、勾配プロファイルがこの工程で達成可能な精製に影響を与えることが理解される。好ましい実施形態では、工程ｂ）の勾配は、アセトニトリル１９から６７％（ｖ／ｖ）である。アセトニトリル１９から６７％（ｖ／ｖ）の直線勾配が特に好ましい。
【００７３】
本発明による方法の工程ｃ）、すなわちＲＰ−ＨＰＬＣ精製スキームの第２の次元は、３未満のｐＨ値で行われる。ｐＨ値は、移動相の水性構成成分における０．０５〜０．５％（ｖ／ｖ）のＴＦＡの存在によって決定される。好ましい実施形態では、工程ｃ）で使用される移動相内のＴＦＡ濃度は、０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲から選択される。任意の種類のアセトニトリル勾配を、固定相からのリラグルチドの溶出に使用することができ、勾配プロファイルがこの工程で達成可能な精製に影響を与えることが理解される。好ましい実施形態では、工程ｃ）の勾配は、アセトニトリル３１から１００％（ｖ／ｖ）である。アセトニトリル３１から１００％（ｖ／ｖ）の直線勾配が特に好ましい。
【００７４】
場合により、工程ｄ）、すなわちＲＰ−ＨＰＬＣ精製の第３の次元は、リラグルチド調製物の純度をさらに改善するために行われる。前記工程は、７．０から７．８の間のｐＨ値で、例えば、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、または７．８のｐＨ値で、好ましくは７．５から７．８のｐＨ値で行われる。ｐＨ値は、移動相の水性構成成分において、その工程が緩衝液ＡＢ２の使用によって行われる温度で調整される。好ましくは、緩衝液は、５から１００ｍＭの濃度で使用される。任意の種類の緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、炭酸ナトリウム、または炭酸カリウムが使用される。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、前記緩衝水溶液ＡＢ２は、リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムの混合物、リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムの混合物、酢酸カリウム、および酢酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００７６】
特に好ましい実施形態では、酢酸ナトリウム緩衝液が使用される。任意の種類のアセトニトリル勾配を、固定相からのリラグルチドの溶出に使用することができ、勾配プロファイルがこの工程で達成可能な精製に影響を与えることが理解される。好ましい実施形態では、工程ｃ）の勾配は、アセトニトリル１９から６７％（ｖ／ｖ）である。アセトニトリル１９から６７％（ｖ／ｖ）の直線勾配が特に好ましい。
【００７７】
本発明の一実施形態では、精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィーの工程ｅ）をさらに含む。
【００７８】
この工程ｅ）は、場合により、工程ａ）〜ｄ）のいずれかの後に行われる。好ましくは、工程ｅ）は、工程ｃ）の後に、または存在する場合は工程ｄ）の後に行われる。
【００７９】
サイズ排除液体クロマトグラフィーは、ペプチド化学の分析および調製の用途で周知である。この方法は、試料の一部の構成成分だけが孔の一部に侵入することができるように孔径が選択された多孔質材料の固定相の使用に依拠する。結果として、種々の構成成分によって直面する利用できる体積が、各構成成分の見かけの分子サイズに応じて変化する。したがって、試料の構成成分は、それらの見かけのサイズの順にカラムから溶出され、大きな分子が最初に溶出する。理想的には、試料の構成成分は固定相の表面と相互作用せず、その結果、溶出時間の差は、各構成成分が侵入することができる溶質体積の差に排他的に起因する。結果として、移動相の組成は、クロマトグラフィー分離に直接影響を及ぼさず、試料の特性または下流の処理工程の必要性の観点で調整することができる。
【００８０】
高分子量の夾雑物の分離、または塩の除去のいずれかのために、ＲＰ−ＨＰＬＣ工程の後に、サイズ排除クロマトグラフィーを用いることが予想される。目的に応じて、当業者は、適切な粒子および孔径分布を有する固定相を選択する。本発明で使用するために好ましい固定相は、１００〜３００Å（例えば、１００、１２５、１４５、２００もしくは３００Å）の孔径、または０．７〜１０ｋＤａ（例えば、０．７ｋＤａ未満、１．５ｋＤａ未満、０．１〜７ｋＤａ、１〜５ｋＤａもしくは１０ｋＤａ未満）もしくは１．５〜３０ｋＤａの分子量の範囲、および２〜５マイクロメーターまたは２０〜３００マイクロメーターの粒径を有する。適切な市販品には、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ５０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）  ＢＥＨ  ２００、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｙａｒｒａ（商標）  ＳＥＣ−２０００、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）  ＳｕｐｅｒＳＷ２０００、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ−２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）  ＨＷ−４０（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）ペプチド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）３０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。好ましい移動相は、超純水、ｐＨ７．５の１０ｍＭのリン酸水素ナトリウム水溶液、または試料と相溶性の任意の緩衝液／溶媒系を含む。
【００８１】
好ましい実施形態では、方法は、ペプチドを脱塩する工程ｆ）をさらに含み、好ましくは、脱塩は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または限外濾過によって実施される。
【００８２】
この工程ｆ）は、場合により、任意の工程ａ）〜ｅ）のいずれかの後に行われる。好ましくは、工程ｆ）は、工程ｃ）の後に、または存在する場合は工程ｄ）もしくはｅ）の後に行われる。本発明の一実施形態では、工程ｅ）およびｆ）は、場合により同一であり、すなわち、脱塩する工程は、適切な固定相を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを用いて実施される。例えば、脱塩する工程は、固定相としてのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ−２５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  Ｇ−５０、またはＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ペプチド、ならびに、均一溶媒による溶出のための移動相としての、アルコールまたはアセトニトリルのような有機溶媒と場合により混合した超純水を使用することを含む。
【００８３】
本明細書で使用する場合、表現「脱塩（する）」および「塩の除去」は、試料の塩含有量を低減する任意の方法の工程に対して互換的に使用される。例えば、塩含有量は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または９９％超まで減少される。好ましい実施形態では、緩衝液の陰イオンの量は、検出レベル未満のレベルに低減される。脱塩は、任意の適切な方法によって実施される。上述のサイズ排除クロマトグラフィーの他に、通常使用される周知の選択肢は、透析、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過である。限外濾過は、圧力に推進される分離プロセスであり、少量の緩衝液と溶媒分子を通過させるが目的のペプチドを保持する半透膜の使用に依拠する。
【００８４】
本発明の目的として、３ｋＤａ以下、例えば、３ｋＤａ、２ｋＤａ、１ｋＤａまたはそれ未満の分画分子量を有する膜を使用することが好ましい。膜を通過する液体は、「透過液」または「濾液」と称され、一方、膜に保持される試料は「被保持物」と称される。膜の細孔の目詰まりを回避するために、タンジェンシャルフロー濾過形式（クロスフロー濾過としても知られる）を用いることが有利である。本発明の目的として、アセトニトリルのような有機溶媒と適合する膜を使用することが好ましい。特に好ましい実施形態では、１ｋＤａの分画分子量を有するポリエーテルスルホン膜が使用される。しかし、適切な分画分子量を提供する限り、フィルターは、濾過の文脈で公知の任意の材料、例えば、プラスチック（例えば、ナイロン、ポリスチレン）、金属、合金、ガラス、セラミック、セロファン、セルロース、または複合材料などのものであることが理解されるべきである。フィルターは、疎水性または親水性である。フィルターの表面は、中性であるか、または正に帯電しているか、または負に帯電している。
【００８５】
当業者は、本発明の方法を適切な読み取り技術と日常的に組み合わせるであろう。例えば、クロマトグラフィーの工程は、２０５〜２３０ｎｍまたは２８０ｎｍの波長で溶出液のＵＶ吸光度をフォローし、かつ／または溶出液の導電性をフォローすることによってモニタリングされる。さらに、クロマトグラフィーは、質量分析、サイズ排除ＵＨＰＬＣ、イオン交換ＵＨＰＬＣおよび／もしくは逆相ＵＨＰＬＣ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ならびに／または細胞ベースの機能アッセイによる、オンラインまたはオフラインの分析と組み合わされる。
【００８６】
ペプチドの質の劣化を回避するために、当業者は、試料の保存を含む精製工程の条件を、注意深くかつ日常的に最適化する。精製工程の終わりまで、画分は、とりわけ、プールされ、沈殿され、スプレー乾燥され、凍結乾燥され、凍結され、冷蔵され、希釈され、濃縮され、かつ／または安定化するための緩衝液、塩基、酸もしくは他の物質と混合される。影響を受けやすい材料を安定化条件の下で取り扱うことは、優れた実務である。例えば、別の不安定な条件を補填するためには、低温、例えば、４℃から１５℃の範囲で作業することが有利である。さらなる例として、６．６〜７．９、好ましくは７．０から７．８、最も好ましくは７．０から７．５の範囲から好ましくは選択されるｐＨで、リラグルチド調製物を凍結乾燥させることが有利である。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態では、クロマトグラフィー精製工程ｂ）および／もしくはｃ）ならびに／または存在する場合は工程ｄ）の、すべてまたは一部は、４〜２５℃、好ましくは４〜２０℃、最も好ましくは４〜１０℃の範囲から選択される温度で行われる。同様に、任意の場合によるさらなる精製工程、すなわちサイズ排除クロマトグラフィー工程（工程ｅ））および／または脱塩工程（工程ｆ））のすべてまたは一部は、４〜２５℃、好ましくは４〜２０℃、最も好ましくは４〜１０℃の範囲から選択される温度で行われる。
【００８８】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は：
ａ）場合により７．０から７．５の範囲から選択されるｐＨのリン酸緩衝水溶液に溶解された、リラグルチドおよび少なくとも１種の不要な構成成分を含む液体組成物Ｃを準備する工程と；
ｂ）組成物Ｃを、７．０から７．８の間のｐＨで、第１の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、アセトニトリルおよび５から５０ｍＭの濃度のリン酸アンモニウム緩衝水溶液を含む混合物を移動相として使用し、溶出を、リラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を、アセトニトリル１９から６７％（ｖ／ｖ）に徐々に上昇させることによって実行する工程と；
ｃ）工程ｂ）で得られたプールされたリラグルチドを含有する画分を、３．０未満のｐＨで、第２の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、０．０５〜０．５％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸溶液およびアセトニトリルを含む混合物を移動相として使用し、溶出を、精製したリラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を、３１から１００％（ｖ／ｖ）に徐々に上昇させることによって実行する工程と；
ｄ）場合により、工程ｃ）で得られたリラグルチドを、７．０から７．８の間のｐＨで、第３の逆相ＨＰＬＣ精製に供する工程であり、炭化水素に結合したシリカを固定相として使用し、緩衝水溶液ＡＢ２のアセトニトリルとの混合物を移動相として使用し、溶出を、精製したリラグルチドを含有する画分を回収しながら移動相内のアセトニトリル濃度を、１９から６７％（ｖ／ｖ）に徐々に上昇させることによって実行する工程と；
ｅ）場合により、工程ｃ）またはｄ）のいずれかにおいて得られたリラグルチドをサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程と；
ｆ）場合により、工程ｃ）、ｄ）またはｅ）のいずれかにおいて得られたリラグルチドをペプチドの脱塩に供する工程であり、脱塩が、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたは限外濾過によって実施される工程
とを含み、
工程ｂ）および工程ｃ）ならびに存在する場合は工程ｄ）、ｅ）および／またはｆ）は、４〜２５℃の範囲から選択される温度で行われ、
好ましくは、工程ｂ）およびｃ）ならびに存在する場合は工程ｄ）で使用される固定相は、Ｃ８に結合したシリカまたはＣ１８に結合したシリカである。
【００８９】
以下の例に示されるように、本発明の方法により、非常に純粋なリラグルチドの調製が可能となり、９９．０％を超える純度を常に達成することができる。それでも、微量のいくつかの欠失生成物（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ）が検出され得た。これらは、特に、リラグルチドペプチド主鎖の一次配列（配列番号４）から４個までのアミノ酸を欠いているという点でリラグルチドの分子構造と異なり、場合により、２〜５個のアミノ酸側鎖において、または配列番号４のＬｙｓ２０に対応するＬｙｓ部分の（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））置換基においてさらなる変更を有する、２７〜３０個の連続するアミノ酸からなる、微量のペプチドである。言い換えれば、リラグルチドの欠失体は、長さが２７から３０個のアミノ酸部分のペプチドと定義され、配列番号４の全長に対して、計算して、配列番号４との少なくとも８０％の相同性を共有し、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に、修飾を含む。
【００９０】
当業者は、このようなリラグルチドの欠失体は、場合によってであり必然的にではないが、Ｎおよび／またはＣ末端のアミノ酸部分でトランケートされていることを直ちに理解するであろう。これに追加してまたは代替して、末端ではないアミノ酸も欠損している。上述のように、配列相同性は、本出願の出願日のバージョンの国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）によって決定される配列相同性として理解される。これは、各アミノ酸部分が比較される配列のカウンターパートに整列させられ、中間に欠損しているアミノ酸部分を残しておき、配列番号４の全長に対する相同性の百分率が算出されることを意味する。
【００９１】
行われた実験では、ＲＰ−ＵＨＰＬＣによって２２０ｎｍで測定した相対的ピーク面積として決定したペプチドの夾雑物が、０．３％（ｗ／ｗ）を超える相対的存在量で検出されなかった（図２の例示を参照のこと）。これは、本発明の態様および好ましい実施形態も反映する。相対的ピーク面積は、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって２２０ｎｍで得られるクロマトグラムで実測されたすべてのピークの面積の合計で割った、所与のピーク面積の面積％として決定される。これは、ペプチドの夾雑物の検出に適する任意の生成物特異的ＲＰ−ＨＰＬＣプロトコルを使用して行うことができる。分析方法の適性は、日常的に、ＬＣ−ＭＳによって決定した主要なピーク純度について評価される。当業者は、それらの類似構造に起因して、すべてのペプチド構成成分が同一または少なくとも同等の応答因子を有し、その結果、ＲＰ−ＨＰＬＣによって２２０ｎｍで測定した相対的ピーク面積が、すべてのペプチド構成成分の合計質量に対する、重量パーセントで表された所与のペプチドの、％（ｗ／ｗ）で示される相対的存在量に十分に相関することを直ちに理解するであろう。
【００９２】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、任意の単一のリラグルチド誘導体、リラグルチドのトランケーション変異体、リラグルチドのトランケーション変異体の誘導体、リラグルチドの欠失体、またはリラグルチドの欠失体の誘導体を、０．５％を超えて含有しない組成物ＬＣに関する。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、任意の単一のリラグルチドの欠失体を０．３％を超えて含有せず、リラグルチドの欠失体が、２７から３０個のアミノ酸長のペプチドであり、配列番号４の全長に対して、配列番号４と少なくとも８０％の相同性を共有し、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む組成物ＬＣに関する。
【００９４】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、任意の単一のリラグルチドの欠失体を検出可能なレベルで含有するが０．３％を超えて含有せず、リラグルチドの欠失体が、２７から３０個のアミノ酸長のペプチドであり、配列番号４の全長に対して、配列番号４と少なくとも８０％の相同性を共有し、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む組成物ＬＣに関する。
【００９５】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準にして、９８．８％（ｗ／ｗ）より高い純度で含有し、配列番号４の全配列に対して配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有する２７から３０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列長の１つまたはそれ以上のポリペプチドを含有せず、場合により、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準にして、０．３％（ｗ／ｗ）を超える濃度で配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む組成物ＬＣを指す。
【００９６】
組成物ＬＣは、好ましくは、微量の（例えば、０．００１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）もしくはそれより多い、０．０１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）もしくはそれより多い、または０．１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）もしくはそれより多い、または１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）もしくはそれより多い）、配列番号４の全長に対して、配列番号４と少なくとも８０％の相同性を有する２７から３０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列長のこのようなポリペプチドを含み、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む。
【００９７】
非常に好ましくは、組成物ＬＣは、０．００１ｐｐｍから０．３％（ｗ／ｗ）の間の、より一層好ましくは０．０１ｐｐｍから０．２％（ｗ／ｗ）の間の、より一層好ましくは０．１ｐｐｍから０．１％（ｗ／ｗ）の間の、より一層好ましくは１ｐｐｍから０．０５％（ｗ／ｗ）の間の、特に１ｐｐｍから０．０１％（ｗ／ｗ）の間の、配列番号４の全長に対して、配列番号４と少なくとも８０％の配列相同性、特に少なくとも９０％の配列相同性を有する２７から３０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列長のこのようなポリペプチドを含み、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む。
【００９８】
好ましくは、組成物ＬＣは、リラグルチドを、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準にして、９９．１％（ｗ／ｗ）より高い、９９．２％（ｗ／ｗ）より高い、９９．３％（ｗ／ｗ）より高い、９９．４％（ｗ／ｗ）より高い、９９．５％（ｗ／ｗ）より高い、９９．６％（ｗ／ｗ）より高い、９９．７％（ｗ／ｗ）より高い、９９．８％（ｗ／ｗ）または９９．９％（ｗ／ｗ）より高い純度で含有する。
【００９９】
好ましい実施形態では、組成物ＬＣは、配列番号４の全長に対して、配列番号４と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％の配列相同性を有する２７から３０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列長の１つまたはそれ以上のポリペプチドを含有せず、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む。
【０１００】
より好ましい実施形態では、組成物ＬＣは、配列番号４の全長に対して、配列番号４に対応するそれぞれのアミノ酸配列または配列画分を有する２７から３０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列長のポリペプチドを含有せず、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０と相同なリシン部分に修飾を含む。
【０１０１】
好ましい実施形態によれば、組成物ＬＣは、上述のリラグルチドの欠失体を、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準にして、０．２５％（ｗ／ｗ）、０．２０％（ｗ／ｗ）、０．１５％（ｗ／ｗ）、０．１％（ｗ／ｗ）、０．０５％（ｗ／ｗ）、または０．０１％（ｗ／ｗ）を超える総濃度で含有しない。
【０１０２】
より好ましくは、組成物ＬＣは、リラグルチドの欠失体の特定の不純物を、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準にして、それぞれ０．１％（ｗ／ｗ）、０．０５％（ｗ／ｗ）、または０．０１％（ｗ／ｗ）を超える濃度で含有しない。
【０１０３】
特に好ましくは、組成物ＬＣは、１種またはそれ以上のリラグルチドの欠失体を、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準にして、０．００１ｐｐｍから０．３％（ｗ／ｗ）、より好ましくは０．０１ｐｐｍから０．１％（ｗ／ｗ）の間、特に０．０１ｐｐｍから０．０１％（ｗ／ｗ）の間の総濃度で含有する。
【０１０４】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の取り込みにより酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２個の酸素原子の取り込みによって酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉｉ）２５位のＴｒｐの代わりにキヌレニンを含む任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｖ）Ｇｌｙ３１を欠くリラグルチドの欠失体のそれぞれを、０．５％、好ましくは０．３％、より好ましくは０．２％、最も好ましくは０．１％を超えて含有しない組成物ＬＣに関する。
【０１０５】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の取り込みにより酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２個の酸素原子の取り込みによって酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉｉ）２５位のＴｒｐの代わりにキヌレニンを含むリラグルチド誘導体、および／またはｉｖ）Ｇｌｙ３１を欠くリラグルチドの欠失体のそれぞれを検出可能なレベルで含有するが、０．５％を超えて、好ましくは０．３％を超えて、より好ましくは０．２％を超えて、最も好ましくは０．１％を超えて含有しない組成物ＬＣに関する。
【０１０６】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の取り込みにより酸化されている任意のリラグルチド誘導体、およびｉｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２個の酸素原子の取り込みによって酸化されている任意のリラグルチド誘導体、およびｉｉｉ）２５位のＴｒｐの代わりにキヌレニンを含むリラグルチド誘導体、およびｉｖ）Ｇｌｙ３１を欠くリラグルチドの欠失体のそれぞれを、０．５％、好ましくは０．３％、より好ましくは０．２％、最も好ましくは０．１％を超えて含有しない組成物ＬＣに関する。
【０１０７】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、リラグルチドを、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の取り込みにより酸化されている任意のリラグルチド誘導体、およびｉｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２個の酸素原子の取り込みによって酸化されている任意のリラグルチド誘導体、およびｉｉｉ）２５位のＴｒｐの代わりにキヌレニンを含むリラグルチド誘導体のそれぞれを検出可能なレベルで含有するが、０．５％を超えて、好ましくは０．３％を超えて、より好ましくは０．２％を超えて、最も好ましくは０．１％を超えて含有しない組成物ＬＣに関する。
【０１０８】
好ましくは、上記百分率は、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定される。あるいは、上記百分率は、すべてのペプチド構成成分の合計質量を基準とする。
【０１０９】
好ましい実施形態によれば、組成物ＬＣは、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含み、リラグルチドを、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、９８．８％より高い、好ましくは９９％より高い純度で含有し、ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、ｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が単一の酸素原子の取り込みにより酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉ）２５位のＴｒｐの側鎖におけるインドール部分が２個の酸素原子の取り込みによって酸化されている任意のリラグルチド誘導体、および／またはｉｉｉ）２５位のＴｒｐの代わりにキヌレニンを含むリラグルチド誘導体、および／またはｉｖ）Ｇｌｙ３１を欠くリラグルチドの欠失体のそれぞれを検出可能なレベルで含有するが、０．５％を超えて、好ましくは０．３％を超えて、より好ましくは０．２％を超えて、最も好ましくは０．１％を超えて含有しない。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の実施形態による方法から得ることができるリラグルチドを含む組成物ＬＣであって、ａ）ＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として、かつｂ）ＵＶ検出を用いる分析サイズ排除クロマトグラフィーにおいて２２０ｎｍで実測した相対的ピーク面積として決定して、９９％より高い、好ましくは９９．５％より高い純度でリラグルチドを含有する組成物ＬＣに関する。
【０１１１】
好ましくは、組成物ＬＣにおいて、リラグルチドは本発明による方法から得られる。
【０１１２】
行われた実験および達成された結果を含む以下の図および実施例は、例示の目的のみのために提供され、特許請求の範囲の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】選択されたグルカゴン様ペプチドの配列アラインメントを示す図である。ＧＬＰ−１の配列と同一性を共有する部分を太字で記載している。
【図２】実施例２の二次元のリラグルチド精製を示すグラフである。出発材料として使用される粗製のリラグルチド調製物（粗製、１と表示される）の、ならびに第１の次元の精製（１Ｄ、プール（ＮＨ４）３ＰＯ４、ｐＨ７．５、２と表示される）および第２の次元の精製（２Ｄ、プールＴＦＡ、３と表示される）後に得られたプールされた画分の分析ＲＰ−ＨＰＬＣのトレースのオーバーレイが示されている。矢印は、第１の次元では除去されなかったが、第２の次元では除去された不要な構成成分を強調している。
【図３】限外濾過の間の時間に対する被保持物の導電性のプロットを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
実施例１：精製条件の決定
適切な精製条件を特定するために、小規模の実験を行った。表２の２列目に示した７種の移動相の緩衝剤を、表２の１行目の３〜６列に示した４種の異なる固定相について、それぞれ試験した。各移動相の緩衝剤を使用して、前記緩衝剤の水溶液中３％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルからなる緩衝液Ａ、および前記緩衝剤の水溶液中６７または８０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルからなる緩衝液Ｂを調製した。水溶液中の緩衝剤の濃度は、移動相の緩衝剤の性質に応じて、２０から４００ｍＭの間であった。
【０１１５】
表２のそれぞれの行は、４つの異なる１次元のＲＰ−ＨＰＬＣの実行、すなわち、試験した４つの固定相のそれぞれに対する１回の実行を表す。前記実行のそれぞれに対して、２列目のそれぞれの行で示した移動相の緩衝剤を用いて調製した緩衝液ＡおよびＢを使用した。以下の一般的プロトコルを適用した：Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳによって生成した粗製のリラグルチドペプチド（６０％以上の純度）を緩衝液Ａに溶解し、１８ｍｇを、Ｃ８またはＣ１８に結合したシリカからなる４つの異なる固定相に、並行実験でそれぞれ適用した（カラム寸法：２５０×４．６ｍｍ）。一般的に、プロトコルは、緩衝液Ａ中で１５分間カラムを平衡化させ、試料をローディングし、緩衝液Ａのみで１分間、その後、２０〜１００％の緩衝液Ｂの勾配で溶出することを含んだ。流量は０．６３ｍｌ／分であった。０．３７ｍｌの画分を回収し、逆相ＵＨＰＬＣで分析した。以下の表２は、相対的ピーク面積に関して、各実験の最も純度の高い画分で決定した純度を示す。前記相対的ピーク面積は、リラグルチドのピーク面積を分析ＵＨＰＬＣで実測されたすべてのピーク面積の合計で割ることによって算出し、すなわち、リラグルチドのピークの面積を総ピーク面積のパーセントで表現した。
【０１１６】
【表２】
2019512552.tif 000004
【０１１７】
結論：
１．種々のＣ８およびＣ１８固定相は同様の結果を示す。固定相のそれぞれについて、以下の観察結果があてはまった：
２．中性からやや塩基性（７．０≦ｐＨ＜８．０）の条件下で、リン酸アンモニウム緩衝液は、試験した他の緩衝液より驚くほど優れている（１〜４行の３〜６列を参照のこと）。
３．酸性条件下（ｐＨ＜３）で、ＴＦＡ緩衝液は、試験した他の緩衝液より驚くほど優れている（５〜７行の３〜６列を参照のこと）。
【０１１８】
実施例２：２つの次元のＲＰ−ＨＰＬＣ精製
精製は、第１の次元のｐＨ７．５でのクロマトグラフィー精製と、その後の、第２の次元の酸性条件下でのクロマトグラフィー精製を含んだ。
【０１１９】
Ｃ８−結合したシリカを充填した５ｃｍのＭＯＤｃｏｌカラム（Ｇｒａｃｅ）（樹脂層高およそ３２ｃｍ）を、２２０ｎｍで検出する（Ｋｎａｕｅｒ  ｓｍａｒｔｌｉｎｅ  ＵＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２５００）分取ＨＰＬＣシステム（Ｋｎａｕｅｒ  ＨＰＬＣ  ｐｕｍｐ  １８００）および自動画分コレクター（Ｂｕｃｈｉ  Ｃ−６６０）に使用した。精製プロトコルの両方の次元で、同じ固定相を使用した。Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳで生成した粗製のリラグルチド（６０％より高い純度）を出発材料として使用した。試料を、９０ｍｌ／分の流量でカラムにローディングした。各工程に対する詳細な溶出プロトコルを以下の表３および４に示す。第１の次元で使用した移動相の水性部分における緩衝剤の濃度は２０ｍＭであった。
【０１２０】
【表３】
2019512552.tif 000005
【０１２１】
第１のＲＰ−ＨＰＬＣ工程から得たプールした画分を、表４に示すようにさらに精製した。
【０１２２】
【表４】
2019512552.tif 000006
【０１２３】
第２の次元の精製後にプールした画分の純度は、分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣで評価して９８．８％であり、両工程後の全体の収率は３５％であった。粗製の出発材料と第１および第２のＨＰＬＣを通過した後にプールした画分の分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣトレースの比較により、両次元の精製の驚くべき相補性が実証された。各次元の精製は異なる不要な構成成分を除去し、その結果、両工程の組合せにより優れた生成物の純度が得られた（図２を参照のこと）。
【０１２４】
実施例３：２つの次元のＲＰ−ＨＰＬＣ精製
精製は、第１の次元のｐＨ７．７でのクロマトグラフィー精製と、その後の、第２の次元の酸性条件下でのクロマトグラフィー精製を含んだ。
【０１２５】
Ｃ８−結合したシリカを充填した５ｃｍのＭＯＤｃｏｌカラム（Ｇｒａｃｅ）（樹脂層高およそ３２ｃｍ）を、２２０ｎｍで検出する（Ｋｎａｕｅｒ  ｓｍａｒｔｌｉｎｅ  ＵＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２５００）分取ＨＰＬＣシステム（Ｋｎａｕｅｒ  ＨＰＬＣ  ｐｕｍｐ  １８００）および自動画分コレクター（Ｂｕｃｈｉ  Ｃ−６６０）に使用した。精製プロトコルの両方の次元で、同じ固定相を使用した。Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳで生成した粗製のリラグルチドを出発材料として使用した。試料を、４３ｍｌ／分（第１の次元）または６４ｍｌ／分（第２の次元）の流量でカラムにローディングした。各工程に対する詳細な溶出プロトコルを以下の表５および６に示す。
【０１２６】
【表５】
2019512552.tif 000007
【０１２７】
第１のＲＰ−ＨＰＬＣ工程から得たプールした主な画分を、表６に示すようにさらに精製した。
【０１２８】
【表６】
2019512552.tif 000008
【０１２９】
プールした主な画分の純度は９９．３８％であり、分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣで評価して、最も大きな非生成物のピークは０．１８％であった。言い換えれば、調製物は、分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣで評価して、０．３％を超える濃度の不要な構成成分を何も含有しなかった。
【０１３０】
驚くべきことに、精製工程の順序を交換する試み、すなわち、最初にＴＦＡ含有移動相を用いる実行を実施する試みは、カラムの目詰まりによって失敗した。
【０１３１】
実施例４：ＲＰ−ＨＰＬＣ精製、場合による第３の次元
Ｃ８−結合したシリカを充填した５ｃｍのＭＯＤｃｏｌカラム（Ｇｒａｃｅ）（樹脂層高およそ３２ｃｍ）を、２２０ｎｍで検出する（Ｋｎａｕｅｒ  ｓｍａｒｔｌｉｎｅ  ＵＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２５００）分取ＨＰＬＣシステム（Ｋｎａｕｅｒ  ＨＰＬＣ  ｐｕｍｐ  １８００）および自動画分コレクター（Ｂｕｃｈｉ  Ｃ−６６０）に使用した。上記に示す２つの次元の手法によって精製したリラグルチドを出発材料として使用した（純度：９９．２％）。カラムを緩衝液Ａ中で平衡化し、試料を４３ｍｌ／分の流量でカラムにローディングした。詳細な溶出プロトコルを以下の表７に示す。
【０１３２】
プールした主な画分の純度は、２２０ｎｍのＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣで評価して、９９．３５％であった。調製物は、０．３％を超える濃度のペプチドの不純物を何も含有しなかった。
【０１３３】
【表７】
2019512552.tif 000009
【０１３４】
実施例５：ＲＰ−ＨＰＬＣ精製、場合による第３の次元
Ｃ８−結合したシリカを充填した５ｃｍのＭＯＤｃｏｌカラム（Ｇｒａｃｅ）（樹脂層高およそ３２ｃｍ）を、２２０ｎｍで検出する（Ｋｎａｕｅｒ  ｓｍａｒｔｌｉｎｅ  ＵＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ２５００）分取ＨＰＬＣシステム（Ｋｎａｕｅｒ  ＨＰＬＣ  ｐｕｍｐ  １８００）および自動画分コレクター（Ｂｕｃｈｉ  Ｃ−６６０）に使用した。上記に示す２つの次元の手法によって精製したリラグルチドを出発材料として使用した。カラムを緩衝液Ａ中で平衡化し、試料を４３ｍｌ／分の流量でカラムにローディングした。詳細な溶出プロトコルを以下の表８に示す。
【０１３５】
【表８】
2019512552.tif 000010
【０１３６】
プールした主な画分の純度は、分析ＲＰ−ＵＨＰＬＣで評価して、９９．３６％であった。調製物は、０．３％を超える濃度のペプチドの不純物を何も含有しなかった。
【０１３７】
実施例６：限外濾過による脱塩
ＵＨＰＬＣで精製したリラグルチド（１．７ｌ、およそ３５ｇ／ｌに濃縮）を、１ｋＤａの分画分子量を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を備えた標準機器を使用するタンジェンシャルフロー濾過に供した。２．２バールの膜間圧および１ｌ／分の流量を適用し、３３ｍｌ／分の透過液量を実測した。被保持物中の体積損失は、超純水を一定量添加することによって補った。
【０１３８】
図３に示すように、被保持物の導電性に反映される塩含有量は、経時的に減少した。濾液の体積が被保持物の体積の１０倍に達した際に、被保持物は微量の残留塩しか含有しなかった。ＵＨＰＬＣ分析によって検出したペプチドの純度は９９．３であり、全体としての正味のペプチド収率は９１％であった。
【０１３９】
実施例７：精製の間の不要な構成成分の除去
Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳから得たリラグルチドを本発明の３つの次元の精製に供した。Ｃ８−結合したシリカを固定相として用い、移動相の水性構成成分は、第１の次元でリン酸緩衝液、第２の次元でＴＦＡおよび第３の次元で酢酸緩衝液を含有した。各工程の後に得られたプールした分画をＬＣ−ＭＳで分析して、精製プロトコルの効率を評価した。特定の優勢な不要な構成成分に関する結果を以下の表９にまとめる。濃度は、リラグルチドの主なピークの面積パーセントで示す。
【０１４０】
Ｇｌｙ３１を欠くリラグルチドトランケーション変異体および一酸素化Ｔｒｐ２５を有するリラグルチドは、第１の次元の精製によって有効に低減し、第２の次元の精製により、二酸素化Ｔｒｐ２５を有するリラグルチドのさらなる除去を達成し、第３の次元の精製により、Ｋｙｎ２５リラグルチドの制御を達成する。第３の次元の精製後に、プールした分画における分析クロマトグラフィーによって、０．５％を超えるレベルの他のペプチド
の不純物は検出できなかった。
【０１４１】
【表９】
2019512552.tif 000011
【図１】
2019512552.tif 000012
【図２】
2019512552.tif 000013
【図３】
2019512552.tif 000014
【配列表】
2019512552000001.app
【国際調査報告】
2019512552.tif 000015
2019512552.tif 000016
2019512552.tif 000017