(57)【要約】  本開示は、ヒストンのエピジェネティックな修飾を検出するための方法、ヒトヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２の阻害剤を含む組成物、および癌の処置のためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量すること、
総Ｈ３レベルを定量すること、および
個々の細胞集団の免疫表現型を解析すること
を含むフローサイトメトリー法。
【請求項２】
前記個々の細胞集団が、被検体から得られる細胞の集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法。
【請求項４】
前記細胞の集団が、前記被検体から得られる末梢血からまたは末梢血単核細胞の集団から単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞の集団が、リンパ系細胞を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞の集団が、骨髄系細胞を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の集団が、骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞、赤芽球、巨核球、骨髄芽球、血小板、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、前単球、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞、ＭＤＣ１ｃ細胞、ＭＤＣ２細胞、肥満細胞、リンパ系幹細胞もしくは前駆細胞、胸腺細胞、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ／Ｔ）細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、形質細胞、ナチュラルキラーＢ（ＮＫ／Ｂ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞、またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の集団が、細胞表面抗原または細胞表面抗原の組み合わせの発現によって特徴付けられる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞表面抗原が、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞表面抗原または前記その組み合わせが、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の集団が、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１＋、および／もしくはＣＤ３４７＋である骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ７１＋である赤芽球；ＣＤ６１＋である巨核球；ＣＤ６１＋である血小板；ＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ１４−である顆粒球；ＣＤ１２３＋である好塩基球；ＣＤ４４＋である好酸球；ＣＤ１５＋および／もしくはＣＤ１６＋である好中球；ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１６−、および／もしくはＨＬＡ−ＤＲ＋である単球；ＣＤ１ｃ＋であるＭＤＣ１ｃ細胞；ＣＤ１４１＋であるＭＤＣ２細胞；ＣＤ１１７＋である肥満細胞；ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１７＋であるリンパ系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ２＋および／もしくはＣＤ３＋であるＴリンパ球（Ｔ細胞）；ＣＤ８＋である細胞障害性Ｔ細胞；ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞；ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋である調節性Ｔ細胞；ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋であるＮＫ／Ｔ細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ２５＋およびＣＤ３０＋である活性化Ｔ細胞；ＣＤ１９＋および／もしくはＣＤ２０＋であるＢ細胞；ＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋、および／もしくはＣＤ３０＋である活性化Ｂ細胞；ＣＤ１３８＋である形質細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＢ細胞；ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ３０４＋である形質細胞様樹状細胞；またはその任意の組み合わせを含む、本質的にからなる、またはからなる、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の集団が、Ｂ細胞を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の集団が、Ｔ細胞を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞の集団が、単球を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記単球が、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６−；ＣＤ１４ｌｏｗおよびＣＤ１６＋；もしくはＣＤ１４ｈｉｇｈおよびＣＤ１６ｌｏｗ単球またはその任意の組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞の集団が、顆粒球を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記顆粒球が、好中球、好酸球、もしくは肥満細胞またはその任意の組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒストン３のリシン２７のトリメチル化の定量が、前記細胞の集団におけるヒストン３におけるトリメチル化リシン２７のレベルを測定すること、前記細胞の集団におけるヒストン３の総レベルを測定すること、および前記細胞の集団における総ヒストン３レベルに対するヒストン３におけるトリメチル化リシン２７レベルの比率を計算することを含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被検体から血液サンプルまたは血球のサンプルを得ることをさらに含む、請求項２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞の集団を単離することをさらに含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離が、フローサイトメトリーによる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記フローサイトメトリーが、１つ以上の細胞表面抗原の発現に基づく、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体が、
（ａ）治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することが予定されていたもしくは予定されている、または
（ｂ）コントロールもしくは参照値と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３量の増加が同定される、請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化の定量が、被検体が、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与される前におよびその後に実行される、請求項２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
治療有効量のＥＺＨ２阻害剤が、被検体に投与される期間に、前記被検体におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化をモニターするために使用される、請求項２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
被検体由来のサンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾を定量するための方法であって、
（ａ）透過処理サンプルを得るために透過処理組成物と前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞を接触させること；
（ｂ）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３内のエピトープに特異的に結合する第１の蛍光複合抗体と前記透過処理サンプルを接触させること；
（ｃ）Ｈ３内のエピトープに特異的に結合する第２の蛍光複合抗体と前記透過処理サンプルを接触させること；
（ｄ）前記第１の蛍光複合抗体からの第１の蛍光シグナルを検出すること；
（ｅ）前記第２の蛍光複合抗体からの第２の蛍光シグナルを検出すること；および
（ｄ）前記第１の蛍光シグナルの値を前記第２の蛍光シグナルの値によって割ること、それによって、前記サンプルにおける前記ヒストンの前記エピジェネティックな修飾を定量することを含む、エピジェネティック修飾されたＨ３の量を決定すること
を含む方法。
【請求項２８】
前記第１の蛍光複合抗体または前記第２の蛍光複合抗体のいずれかと前記透過処理サンプルを接触させる前に、細胞のサイズによって前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞をソートすることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞の免疫表現型を解析することをさらに含み、
細胞型特有のマーカー上の第３のエピトープに特異的に結合する第３の蛍光複合抗体と前記サンプルを接触させること、および
前記第３の蛍光複合抗体からの第３の蛍光シグナルを検出すること
を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞型特有のマーカーが、細胞表面抗原である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞表面抗原が、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
その必要がある被検体由来のサンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾のステータスをモニターするための方法であって、
（ａ）事象の前に、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法に従って、ヒストンのエピジェネティックな修飾の第１の量を決定すること；
（ｂ）前記事象後に、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法に従って、前記ヒストンの前記エピジェネティックな修飾の第２の量を決定すること；および
（ｃ）前記第１の量を前記第２の量と比較すること
を含み、増加は、前記事象後のエピジェネティックな修飾の増加を示し、減少は、前記事象後のエピジェネティックな修飾の低下を示す方法。
【請求項３３】
前記事象が、前記被検体へのＥＺＨ２阻害剤の投与を含む処置である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被検体が、癌を有するまたは癌と診断されている、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記エピジェネティックな修飾が、ヒストン３のリシン２７のメチル化である、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
その必要がある被検体における癌を処置するための方法であって、
治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を前記被検体に投与することを含み、前記被検体が、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法に従って、Ｈ３の量と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量が増加しているとして同定される方法。
【請求項３７】
前記透過処理組成物が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｔｗｅｅｎ−２０、サポニン、ジギトニン、およびｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドである、請求項２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記透過処理組成物が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記透過処理組成物は、約０．２５ｗｔ／ｖｏｌ％〜約５ｗｔ／ｖｏｌ％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の蛍光シグナルが、フローサイトメトリーによって検出される、請求項２７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の蛍光シグナルが、フローサイトメトリーによって検出される、請求項２７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第３の蛍光シグナルが、フローサイトメトリーによって検出される、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプルが、血液、皮膚、リンパ液、リンパ組織、骨髄、血液腫瘍、液性腫瘍、および固形腫瘍を含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記血液サンプルが、赤血球、リンパ球、Ｂ細胞、単球、好酸球、好塩基球、好中球、血小板、またはその組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルが、Ｂ細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記リンパ組織および／またはリンパ液のサンプルが、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、血液、リンパ液、またはその組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記骨髄のサンプルが、造血幹細胞、間質幹細胞、骨髄組織、黄色骨髄、赤血球、白血球、またはその組み合わせを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
第１の蛍光結合抗体または第２の蛍光結合抗体と固定サンプルを接触させる前に、前記固定サンプルを得るために固定組成物と前記サンプルにおける少なくとも１つの細胞を接触させることをさらに含む、請求項２７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記固定組成物が、メタノールフリー組成物である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記固定組成物が、約１％〜約１０％の濃度のホルムアルデヒドを含むメタノールフリー組成物である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ホルムアルデヒドを含む前記メタノールフリー組成物が、約４％の濃度である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、
【化１】
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またはその薬学的に許容される塩である、請求項３３〜５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被検体が、ヒトである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヒトが、１８歳以下である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記被検体が、癌を有する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌が、リンパ腫である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記リンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胚中心由来リンパ腫、非胚中心由来リンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、および他の非ホジキンリンパ腫亜型から選択される、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２５１，３２２号明細書および２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，８７７号明細書に対する優先権および利益を主張し、それぞれの内容は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
たとえばヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）によるメチル化によるヒストンの修飾は、遺伝子発現の変化に関連する。詳細には、ＨＭＴは、ヒストンタンパク質の特定のリシン残基およびアルギニン残基上への１つ以上のメチル基（メチルマーク）の転移によって遺伝子発現を調節する。ヒストンタンパク質配列の遺伝子変化は、ＨＭＴ活性を変化させ、結果として、遺伝子発現の調節を誤り、ヒストン上へのメチルマークの異常な転移をもたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＥＺＨ２における突然変異および／またはこのヒストンメチルトランスフェラーゼの過剰活性は、様々な種類の癌に関連してきた。抗癌処置に使用するための有効なＥＺＨ２阻害剤の必要性があるが、未だ対処されていない。さらに、被検体におけるエピジェネティックな修飾を評価するための方法の必要性があるが、未だ対処されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示のいくつかの態様は、関心のある細胞または組織においてエピジェネティックな修飾を決定するための方法、戦略、およびアッセイを提供する。本開示のいくつかの態様は、被検体における疾患、たとえば癌に関連するエピジェネティックな修飾を検出する、決定する、および／またはモニターするための方法、戦略、およびアッセイを提供する。本開示のいくつかの態様は、関心のある細胞および組織においてエピジェネティックなステータスを測定することによる、疾患の状態の検出のための方法、戦略、およびアッセイを提供する。たとえばフローサイトメトリーによって、生物学的サンプルにおけるエピジェネティックな修飾、たとえばヒストンメチル化を測定するための方法およびアッセイもまた、本明細書において提供される。たとえば、被検体、組織、または細胞における疾患の状態の検出のための；被検体における疾患または障害に関連する細胞または組織、たとえば癌細胞または腫瘍が、疾患または障害に関連するエピジェネティックな修飾を調整するための治療剤による処置に対して、たとえばＥＺＨ２阻害剤による処置に対して感受性であるかどうかを決定するための；およびエピジェネティックモジュレーターによる、たとえばＥＺＨ２阻害剤による、被検体における標的細胞または組織の、たとえば腫瘍の処置の効果をモニターするための本明細書において提供される方法、戦略、およびアッセイは、有用である。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量すること、総Ｈ３レベルを定量すること、および個々の細胞集団の免疫表現型を解析することを含むフローサイトメトリー法を提供する。この方法のいくつかの実施形態では、個々の細胞集団は、被検体から得られる細胞の集団を含む。
【０００６】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、リンパ系細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、骨髄系細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞、赤芽球、巨核球、骨髄芽球、血小板、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、前単球、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞、ＭＤＣ１ｃ細胞、ＭＤＣ２細胞、肥満細胞、リンパ系幹細胞もしくは前駆細胞、胸腺細胞、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ／Ｔ）細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、形質細胞、ナチュラルキラーＢ（ＮＫ／Ｂ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞、またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、被検体から得られる末梢血からまたは末梢血単核細胞の集団から単離される。
【０００７】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞表面抗原または細胞表面抗原の組み合わせの発現によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである。
【０００８】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１＋、および／もしくはＣＤ３４７＋である骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ７１＋である赤芽球；ＣＤ６１＋である巨核球；ＣＤ６１＋である血小板；ＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ１４−である顆粒球；ＣＤ１２３＋である好塩基球；ＣＤ４４＋である好酸球；ＣＤ１５＋および／もしくはＣＤ１６＋である好中球；ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１６−、および／もしくはＨＬＡ−ＤＲ＋である単球；ＣＤ１ｃ＋であるＭＤＣ１ｃ細胞；ＣＤ１４１＋であるＭＤＣ２細胞；ＣＤ１１７＋である肥満細胞；ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１７＋であるリンパ系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ２＋および／もしくはＣＤ３＋であるＴリンパ球（Ｔ細胞）；ＣＤ８＋である細胞障害性Ｔ細胞；ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞；ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋である調節性Ｔ細胞；ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋であるＮＫ／Ｔ細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ２５＋およびＣＤ３０＋である活性化Ｔ細胞；ＣＤ１９＋および／もしくはＣＤ２０＋であるＢ細胞；ＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋、および／もしくはＣＤ３０＋である活性化Ｂ細胞；ＣＤ１３８＋である形質細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＢ細胞；ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ３０４＋である形質細胞様樹状細胞；またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなる。
【０００９】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、Ｂ細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００１０】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、Ｔ細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００１１】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、単球を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６−；ＣＤ１４ｌｏｗおよびＣＤ１６＋；もしくはＣＤ１４ｈｉｇｈおよびＣＤ１６ｌｏｗ単球またはその任意の組み合わせである。
【００１２】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、顆粒球を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、顆粒球は、好中球、好酸球、もしくは肥満細胞またはその任意の組み合わせである。
【００１３】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、ヒストン３のリシン２７のトリメチル化を定量することは、細胞の集団におけるヒストン３におけるトリメチル化リシン２７のレベルを測定すること、細胞の集団におけるヒストン３の総レベルを測定すること、および細胞の集団における総ヒストン３レベルに対するヒストン３におけるトリメチル化リシン２７レベルの比率を計算することを含む。
【００１４】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、方法は、被検体から血液サンプルまたは血球のサンプルを得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の集団を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離は、フローサイトメトリーによる。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーは、１つ以上の細胞表面抗原の発現に基づく。いくつかの実施形態では、単離は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による。いくつかの実施形態では、単離は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）による。
【００１５】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、被検体は、（ａ）治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することが予定されていたもしくは予定されている、または（ｂ）コントロールもしくは参照値と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３量の増加が同定される。
【００１６】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化の定量は、被検体が、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与される前におよびその後に実行される。
【００１７】
本開示のフローサイトメトリー法のいくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤が、被検体に投与される期間に、被検体におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化をモニターするために使用される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法を提供する。この方法のいくつかの実施形態では、
【００１９】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、リンパ系細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、骨髄系細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞、赤芽球、巨核球、骨髄芽球、血小板、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、前単球、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞、ＭＤＣ１ｃ細胞、ＭＤＣ２細胞、肥満細胞、リンパ系幹細胞もしくは前駆細胞、胸腺細胞、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ／Ｔ）細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、形質細胞、ナチュラルキラーＢ（ＮＫ／Ｂ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞、またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、被検体から得られる末梢血からまたは末梢血単核細胞の集団から単離される。
【００２０】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、細胞表面抗原または細胞表面抗原の組み合わせの発現によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである。
【００２１】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１＋、および／もしくはＣＤ３４７＋である骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ７１＋である赤芽球；ＣＤ６１＋である巨核球；ＣＤ６１＋である血小板；ＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ１４−である顆粒球；ＣＤ１２３＋である好塩基球；ＣＤ４４＋である好酸球；ＣＤ１５＋および／もしくはＣＤ１６＋である好中球；ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１６−、および／もしくはＨＬＡ−ＤＲ＋である単球；ＣＤ１ｃ＋であるＭＤＣ１ｃ細胞；ＣＤ１４１＋であるＭＤＣ２細胞；ＣＤ１１７＋である肥満細胞；ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１７＋であるリンパ系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ２＋および／もしくはＣＤ３＋であるＴリンパ球（Ｔ細胞）；ＣＤ８＋である細胞障害性Ｔ細胞；ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞；ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋である調節性Ｔ細胞；ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋であるＮＫ／Ｔ細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ２５＋およびＣＤ３０＋である活性化Ｔ細胞；ＣＤ１９＋および／もしくはＣＤ２０＋であるＢ細胞；ＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋、および／もしくはＣＤ３０＋である活性化Ｂ細胞；ＣＤ１３８＋である形質細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＢ細胞；ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ３０４＋である形質細胞様樹状細胞；またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなる。
【００２２】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、Ｂ細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００２３】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、Ｔ細胞を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００２４】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、単球を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６−；ＣＤ１４ｌｏｗおよびＣＤ１６＋；もしくはＣＤ１４ｈｉｇｈおよびＣＤ１６ｌｏｗ単球またはその任意の組み合わせである。
【００２５】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、細胞の集団は、顆粒球を含む、から本質的になる、またはからなる。いくつかの実施形態では、顆粒球は、好中球、好酸球、もしくは肥満細胞またはその任意の組み合わせである。
【００２６】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、ヒストン３のリシン２７のトリメチル化の定量は、細胞の集団におけるヒストン３におけるトリメチル化リシン２７のレベルを測定すること、細胞の集団におけるヒストン３の総レベルを測定すること、および細胞の集団における総ヒストン３レベルに対するヒストン３におけるトリメチル化リシン２７レベルの比率を計算することを含む。
【００２７】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、方法は、被検体から血液サンプルまたは血球のサンプルを得ることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞の集団を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離は、フローサイトメトリーによる。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーは、１つ以上の細胞表面抗原の発現に基づく。いくつかの実施形態では、単離は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による。いくつかの実施形態では、単離は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）による。
【００２８】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、被検体は、（ａ）治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与することが予定されていたもしくは予定されている、または（ｂ）コントロールもしくは参照値と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３量の増加が同定される。
【００２９】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、ヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化の定量は、被検体が、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を投与される前におよびその後に実行される。
【００３０】
被検体から得られる細胞の集団におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化を定量することを含む方法のいくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤が、被検体に投与される期間に、被検体におけるヒストンＨ３のリシン２７のトリメチル化をモニターするために使用される。
【００３１】
本開示は、被検体由来のサンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾を定量するための方法であって、（ａ）透過処理サンプルを得るために透過処理組成物とサンプルにおける少なくとも１つの細胞を接触させること；（ｂ）Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３内のエピトープに特異的に結合する第１の蛍光複合抗体と透過処理サンプルを接触させること；（ｃ）Ｈ３内のエピトープに特異的に結合する第２の蛍光複合抗体と透過処理サンプルを接触させること；（ｄ）第１の蛍光複合抗体からの第１の蛍光シグナルを検出すること；（ｅ）第２の蛍光複合抗体からの第２の蛍光シグナルを検出すること；および（ｄ）第１の蛍光シグナルの値を第２の蛍光シグナルの値によって割ること、それによって、サンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾を定量することを含む、エピジェネティック修飾されたＨ３の量を決定することを含む方法を提供する。
【００３２】
ヒストンのエピジェネティックな修飾を定量する方法は、第１の蛍光複合抗体または第２の蛍光複合抗体のいずれかと透過処理サンプルを接触させる前に、細胞のサイズによってサンプルにおける少なくとも１つの細胞をソートすることをさらに含んでいてもよい。
【００３３】
ヒストンのエピジェネティックな修飾を定量する方法は、サンプルにおける少なくとも１つの細胞の免疫表現型を解析することを含んでいてもよく、細胞型特有のマーカー上の第３のエピトープに特異的に結合する第３の蛍光複合抗体とサンプルを接触させること、および第３の蛍光複合抗体からの第３の蛍光シグナルを検出することを含む。本開示の方法のある実施形態では、細胞型特有のマーカーは、細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択されてもよい。
【００３４】
本開示は、その必要がある被検体由来のサンプルにおけるヒストンのエピジェネティックな修飾のステータスをモニターするための方法であって、（ａ）事象の前に、上記に提供される任意の方法に従って、ヒストンのエピジェネティックな修飾の第１の量を決定すること；（ｂ）上記に提供される任意の方法に従って、ヒストンのエピジェネティックな修飾の第２の量を決定すること；および（ｃ）第１の量を第２の量と比較することを含み、増加は、事象後のエピジェネティックな修飾の増加を示し、減少は、事象後のエピジェネティックな修飾の低下を示す方法を提供する。ある実施形態では、事象は、被検体へのＥＺＨ２阻害剤の投与を含む処置である。被検体は、癌を有していてもよいまたは癌と診断されてもよい。エピジェネティックな修飾は、ヒストン３のリシン２７のメチル化であってもよい。
【００３５】
本開示は、その必要がある被検体における癌を処置するための方法であって、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を被検体に投与することを含み、被検体は、上記の方法のいずれかに従って、Ｈ３の量と比較してＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量が増加しているとして同定される方法を提供する。
【００３６】
方法の透過処理組成物は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、Ｔｗｅｅｎ−２０、サポニン、ジギトニン、およびｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される試薬を含んでいてもよい、からなってもよい、またはから本質的になってもよい。一実施形態では、透過処理組成物は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）である。ある実施形態では、透過処理組成物は、約０．２５ｗｔ／ｖｏｌ％および約５ｗｔ／ｖｏｌ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールｐ（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル）である。
【００３７】
本開示の方法のある実施形態では、第１の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって検出される。本開示の方法のある実施形態では、第２の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって検出される。本開示の方法のある実施形態では、第３の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって検出される。方法のある実施形態では、第１、第２、および第３の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって同時に検出されてもよい。方法のある実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーによって同時に検出することができる。
【００３８】
本開示の方法によれば、サンプルは、血液、皮膚、リンパ液、リンパ組織、骨髄、血液腫瘍、液性腫瘍、および固形腫瘍を含んでいてもよい、からなってもよい、またはから本質的になってもよい。一態様では、血液サンプルは、赤血球、リンパ球、Ｂ細胞、単球、好酸球、好塩基球、好中球、血小板、またはその組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなる。サンプルは、Ｂ細胞を含んでいてもよい、からなってもよい、またはから本質的になってもよい。
【００３９】
本開示の方法によれば、サンプルは、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、血液、リンパ液、またはその組み合わせを含んでいてもよい、からなってもよい、またはから本質的になってもよい。骨髄サンプルは、造血幹細胞、間質幹細胞、骨髄組織、黄色骨髄、赤血球、白血球、またはその組み合わせを含んでいてもよい、からなってもよい、またはから本質的になってもよい。
【００４０】
本開示の方法は、第１の蛍光結合抗体または第２の蛍光結合抗体と固定サンプルを接触させる前に、固定サンプルを得るために固定組成物とサンプルにおける少なくとも１つの細胞を接触させることをさらに含んでいてもよい。本開示の方法の固定組成物は、メタノールフリー組成物であってもよい。固定組成物は、約１％〜約１０％の濃度のホルムアルデヒドを含むメタノールフリー組成物であってもよい。メタノールフリー固定組成物は、約４％の濃度のホルムアルデヒドを含んでいてもよい。
【００４１】
本開示の方法のある実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、
【化１】
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またはその薬学的に許容される塩である。
【００４２】
本開示の方法の被検体は、ヒトであってもよい。ヒト被検体は、１８歳以下であってもよい。本開示の方法の被検体は、癌を有していてもよい。本開示の方法のある実施形態では、癌は、リンパ腫である。例示的なリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胚中心由来リンパ腫、非胚中心由来リンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、および他の非ホジキンリンパ腫亜型を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００４３】
前述の概念およびさらに詳細に下記に議論される、さらなる概念の組み合わせはすべて（ただし、そのような概念が互いに矛盾していないことを条件とする）、本明細書において開示される本発明の主題の一部であるとして企図されることが十分に理解されるべきである。特に、本開示の最後に見られる、主張される主題の組み合わせはすべて、本明細書において開示される本発明の主題の一部であるとして企図される。参照により組み込まれる任意の開示においても見られてもよい本明細書において明示的に用いられる用語は、本明細書において開示される特定の概念と最も一致している意味が与えられるべきであることもまた、十分に理解されるべきである。
【００４４】
他のシステム、プロセス、および特徴は、以下の図面および詳細な説明について検討する際に当業者らに明らかになるであろう。あらゆるそのようなさらなるシステム、プロセス、および特徴は、本明細書の範囲内に含まれ、本開示の範囲内にあり、かつ添付の請求項によって保護されることが意図される。
【００４５】
特許または出願書類は、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を有するこの特許または特許出願刊行物のコピーは、依頼および必要な料金の支払いと同時に特許庁によって提供されるであろう。
【００４６】
当業者は、図面が、主として説明を目的とするものであり、本明細書において記載される本発明の主題の範囲を限定するようには意図されないことを理解するであろう。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、ある場合には、本明細書において開示される本発明の主題の様々な態様は、様々な特徴についての理解を容易にするために、図面において誇張してまたは拡大して示されてもよい。図面において、同様の参照記号は、通常、同様の特徴（たとえば機能的に類似するおよび／または構造的に類似するエレメント）を指す。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】図１Ａは、血液サンプルと接触させた後の様々な透過処理条件の比較を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。一連のフローサイトメトリープロットは、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、およびＨＬＡ−ＤＲ（ＬＮ３）を含む血球由来の表面エピトープの検出に対する様々な処置条件（すなわち透過処理なし、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、７０％メタノール）の効果を示す。以下のカラーコードをすべての条件に適用する：事象はすべて、黒色に塗る；リンパ球はすべて、赤色に塗る；Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９−）は、濃青色に塗る；ＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球は、紫色に塗る；ＮＫ細胞は、濃緑色に塗る；樹状細胞は、淡青色に塗る；Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）は、黄色に塗る；顆粒球および単球は、薄緑色に塗る；単球（ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）は、オレンジ色に塗る；顆粒球（ＣＤ１４−ＨＬＡ−ＤＲ−）は、栗色に塗る。
【図１Ｂ】図１Ｂは、血球サンプル由来のＣＤ１６表面エピトープの検出に対するメタノールフリー処置条件と比較した、５０％メタノール処置の比較を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、血球の混合集団へのＣＤ３抗体の様々なクローンの結合を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、血球サンプルとの接触後に得られる結果として生ずる蛍光シグナルに対する、フルオロフォア複合体選択の比較（すなわちＣＤ３−ＡＰＣ−Ｈ７と比較したＣＤ３−Ｖ５００）を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、血球サンプルとの接触後に得られる結果として生ずるフローサイトメトリーシグナルに対する、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体滴定（すなわち１：５０、１：１００、１：１５０）の効果を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。１：１５０の条件（オレンジ色）は、このグラフにおいて左手のピークで示される。１：１００の条件（青色）は、このグラフにおいて中央のピークで示される。１：５０の条件（赤色）は、このグラフにおいて右手のピークで示される。
【図３Ａ】図３Ａは、処置していない条件と比較した、ＥＺＨ２阻害剤であるＥＰＺ００７２１０（本明細書において化合物Ｄとも呼ばれる）と接触させた後のＯＣＩ−ＬＹ１９細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化状態を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。ＥＰＺ００７２１０条件は、左（明るいグレーまたは赤色）のピークによって示され、そのままの条件は、右（濃いグレーまたは青色）のピークによって示される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株におけるヒストンＨ３の検出を示すフローサイトメトリープロットを示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＥＰＺ００７２１０により処置したまたは処置していないＯＣＩ−ＬＹ１９細胞においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体と接触させた後にフローサイトメトリーによって検出される平均蛍光発光を示す図である。ＥＰＺ００７２１０による処置後のまたは処置していない条件のＯＣＩ−ＬＹ１９細胞において総ヒストンＨ３抗体と接触させた後にフローサイトメトリーによって検出される平均蛍光発光もまた、図３Ｃにおいて示される。
【図４Ａ】図４Ａは、細胞のＨ３Ｋ２７メチル化状態に対する、様々な濃度のＥＰＺ００７２１０とのＷＳＵ細胞株およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株のインキュベートの効果を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスは、以下のＥＰＺ００７２１０濃度、ＤＭＳＯのみ（黄色）、０．３ｎＭ（淡青色）、１ｎＭ（マゼンタ）、４ｎＭ（ピンク）、１２ｎＭ（濃緑色）、３７ｎＭ（薄緑色）、１１１ｎＭ（オレンジ色）、３３３ｎＭ（濃い青緑色）、および１０００ｎＭ（赤色）とのインキュベーション後のフローサイトメトリープロットで示される。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＷＳＵ細胞株およびＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株と接触させるためにＥＰＺ００７２１０を利用した用量応答研究の結果を示す１対のウェスタンブロット分析（およびブロットの結果を定量するそれらの対応するグラフ）を示す図である。ＩＣ５０は、挿入図として示す。クロマチンフローサイトメトリーおよびヒストンウェスタンは、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞について一致することが分かったが、ＷＳＵ細胞については異なり、これは、もしかすると、ＷＳＵ細胞の固有の自家蛍光発光が強いことによるかもしれない。
【図５Ａ】図５Ａは、抗体のパネルを使用する血球サンプルにおける細胞表面エピトープおよび核エピトープのフローサイトメトリーによる同時の検出を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。フローサイトメトリープロット上に示される抗体のパネルは、ＣＤ３−Ｖ５００−Ｃ（ＳＫ７）、ＣＤ１９−ＡＰＣ（ＨＩＢ１９）、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７（ＣＤ１６）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭΨＰ９）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＬＮ３）、Ｈ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ−４８８である。以下のカラーコードを適用する：事象はすべて、黒色に塗る；リンパ球はすべて、赤色に塗る；Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９−）は、濃青色に塗る；ＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球は、紫色に塗る；ＮＫ細胞は、濃緑色に塗る；樹状細胞は、淡青色に塗る；Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）は、黄色に塗る；顆粒球および単球は、薄緑色に塗る；単球（ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）は、オレンジ色に塗る；顆粒球（ＣＤ１４−ＨＬＡ−ＤＲ−）は、栗色に塗る。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗体のパネルを使用する血球サンプルにおける細胞表面エピトープおよび核エピトープのフローサイトメトリーによる同時の検出を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。フローサイトメトリープロット上に示される抗体のパネルは、ＣＤ３−Ｖ５００−Ｃ（ＳＫ７）、ＣＤ１９−ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂ７３．１）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭΨＰ９）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＬＮ３）、Ｈ３−Ａｌｅｘａ６４７、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ−４８８である。以下のカラーコードを適用する：事象はすべて、黒色に塗る；リンパ球はすべて、赤色に塗る；Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９−）は、濃青色に塗る；ＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球は、紫色に塗る；ＮＫ細胞は、濃緑色に塗る；樹状細胞は、淡青色に塗る；Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）は、黄色に塗る；顆粒球および単球は、薄緑色に塗る；単球（ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）は、オレンジ色に塗る；顆粒球（ＣＤ１４−ＨＬＡ−ＤＲ−）は、栗色に塗る。
【図５Ｃ】図５Ｃは、抗体のパネルを使用する血球サンプルにおける細胞表面エピトープおよび核エピトープのフローサイトメトリーによる同時の検出を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。フローサイトメトリープロット上に示される抗体のパネルは、ＣＤ３−Ｖ５００−Ｃ（ＳＫ７）、ＣＤ１９−ＡＰＣ（ＨＩＢ１９）、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７（ＣＤ１６）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭΨＰ９）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＬＮ３）、Ｈ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ−４８８である。以下のカラーコードを適用する：事象はすべて、黒色に塗る；リンパ球はすべて、赤色に塗る；Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９−）は、濃青色に塗る；ＣＤ３−ＣＤ１９−リンパ球は、黄色に塗る；ＮＫ細胞は、濃緑色に塗る；樹状細胞は、淡青色に塗る；Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）は、紫色に塗る；顆粒球および単球は、薄緑色に塗る；単球（ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）は、オレンジ色に塗る；顆粒球（ＣＤ１４−ＨＬＡ−ＤＲ−）は、栗色に塗る。右端のパネルに関して、高い左のピークは単球（濃青色）を示し、高い右のピークはＴ細胞（マゼンタ）を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、抗体のパネルを使用する血球サンプルにおける細胞表面エピトープおよび核エピトープのフローサイトメトリーによる同時の検出を示す一連のプロットおよび対応するグラフを示す図である。フローサイトメトリープロット上に示される抗体のパネルは、ＣＤ３−Ｖ５００−Ｃ（ＳＫ７）、ＣＤ１９−ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂ７３．１）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭΨＰ９）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＬＮ３）、Ｈ３−Ａｌｅｘａ６４７、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ−４８８である。左上のパネルに関して、高い左のピークは単球（濃青色）を示し、高い右のピークはＴ細胞（マゼンタ）を示す。右上のパネルに関して、高い右のピークはＴ細胞（マゼンタ）を示し、高い右のピークは単球（濃青色）を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト末梢血サンプルから得られた代表的なフローサイトメトリーデータを示す一連の棒グラフを示す図である。代表的なフローサイトメトリーデータを、同じドナーから得て、異なる抗体パネルの抗体により処理した。図６Ａの左側の棒グラフにおいて、抗体の以下のパネルをフローサイトメトリー手順に使用した：ＣＤ３−Ｖ５００−Ｃ（ＳＫ７）、ＣＤ１９−ＡＰＣ（ＨＩＢ１９）、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７（ＣＤ１６）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭΨＰ９）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＬＮ３）、Ｈ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ−４８８。図６Ｂの右側の棒グラフにおいて、抗体の以下のパネルをフローサイトメトリー手順に使用した：ＣＤ３−Ｖ５００−Ｃ（ＳＫ７）、ＣＤ１９−ＢＶ４２１（ＨＩＢ１９）、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂ７３．１）、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＭΨＰ９）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ＬＮ３）、Ｈ３−Ａｌｅｘａ６４７、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ−４８８。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒト末梢血サンプルから得られた代表的なフローサイトメトリーデータを示す一連の棒グラフを示す図である。代表的なフローサイトメトリーデータは、同じ抗体パネルにより処理した異なるドナーから得た。
【図７】図７は、細胞表面特異的抗体、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびヒストンＨ３に対する抗体と接触させた血液サンプルから得たフローサイトメトリーデータを示す図である。図７のグラフは、血球のタイプおよびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスの間の比較を示す。
【図８】図８は、ＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ−６４３８の投与の効果を確認することを目的としたインビボげっ歯動物用量応答研究から得られた結果を示す一連のフローサイトメトリープロットを示す図である。図８におけるフローサイトメトリーデータプロットは、コントロール、ビヒクルのみの処置を受けたげっ歯動物から取得した血液サンプルから得られたデータを示す。
【図９】図９は、げっ歯動物が特定の投薬量のＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ−６４３８を受けたげっ歯動物インビボ用量応答研究のサンプルのフローサイトメトリー分析から得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）データを示す一連の棒グラフを示す図である。研究におけるげっ歯動物は、ビヒクル処置、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、または５００ｍｇ／ｋｇのＥＰＺ−６４３８化合物を受けた。この研究のデータは、フローサイトメトリーアッセイから得た一連の棒グラフとして示される。
【図１０】図１０は、５００ｍｇ／ｋｇのＥＰＺ−６４３８によるマウスの処置後のＨ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルに対する個々の細胞集団の寄与を示すフローサイトメトリーデータから得られた棒グラフを示す図である。フローサイトメトリーアッセイにおいて使用される表面マーカーは、単球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および顆粒球におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスの決定を可能にした。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーアッセイまたはＥＬＩＳＡのいずれかによって評価される様々な濃度のＥＰＺ−６４３８の投与後のＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害パーセンテージを示す棒グラフを示す図である。全ＰＢＭＣにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害の量を単球のＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害と比較する。研究においてげっ歯動物に投与したＥＰＺ−６４３８の濃度は、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、または５００ｍｇ／ｋｇとした。フローサイトメトリーは黒色の棒によって示し、ＥＬＩＳＡは赤色の棒によって示し、単球は青色の棒によって示した。
【図１２】図１２は、ＦＡＣＳ後のマウス末梢血についてのゲーティングスキームを示すグラフの集合を示す図である。
【図１３】図１３は、マウス末梢血集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチルマークの蔓延を示す図である。
【図１４】図１４は、タゼメトスタットに対するマウス白血球集団の特異な感受性を示す一連のグラフを示す図である。
【図１５】図１５は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３阻害全体に対する細胞型寄与を示す図である。
【図１６】図１６は、クロマチンフローサイトメトリー対ＥＬＩＳＡのＨ３Ｋ２７ｍｅ３定量化を示す図である。
【図１７】図１７は、ＥＺＨ２突然変異体および野生型細胞株におけるＥＰＺ００７２１０に対する用量応答を示す一連のプロットを示す図である。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスは、以下のＥＰＺ００７２１０濃度、ＤＭＳＯのみ（黄色）、０．３ｎＭ（淡青色）、１ｎＭ（マゼンタ）、４ｎＭ（ピンク）、１２ｎＭ（濃緑色）、３７ｎＭ（薄緑色）、１１１ｎＭ（オレンジ色）、３３３ｎＭ（濃い青緑色）、および１０００ｎＭ（赤色）とのインキュベーション後のフローサイトメトリープロットで示される。
【図１８】図１８は、ＦＡＣＳ後のヒト末梢血についてのゲーティングスキームを示す一連のプロットを示す図である。以下のカラースキームを適用する：顆粒球は、赤色に塗り、単球は、青色に塗り、Ｔ細胞は、青色に塗り、Ｂ細胞は、マゼンタに塗る。
【図１９】図１９は、ヒト末梢血集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチルマークの相対的な蔓延を示す図である。
【図２０】図２０は、タゼメトスタット処置によるＮＨＬ治験におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害を示す１対のグラフを示す図である。
【図２１】図２１は、サイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）、サイクル２  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）、および／またはサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）に８００ｍｇ  ＢＩＤタゼメトスタットを投薬した５１人の患者から集められた血液に対するＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３フローによって単離された単球についての第ＩＩ相薬力学を示す図である。
【図２２】図２２は、サイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）、サイクル２  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）、および／またはサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）に８００ｍｇ  ＢＩＤタゼメトスタットを投薬した５１人の患者から集められた血液に対するＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３フローによって単離された顆粒球についての第ＩＩ相薬力学を示す図である。
【図２３】図２３は、サイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）、サイクル２  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）、および／またはサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）に８００ｍｇ  ＢＩＤタゼメトスタットを投薬した５１人の患者から集められた血液に対するＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３フローによって単離されたＴ細胞についての第ＩＩ相薬力学を示す図である。Ｔ細胞は、タゼメトスタット暴露の１５日目（サイクル１  １５日目）にＨ３Ｋ３７ｍｅ３の中程度であるが、統計的に著しい増加を示し、その後、３０日目（サイクル２、１日目）にベースラインに戻った。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
導入
クロマチン構造のエピジェネティックな修飾は、遺伝子発現が調節される機序である。クロマチンは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質（たとえばヒストン）の複合体からなる。エピジェネティックな修飾は、他のプロセスの中でも、クロマチンのアセチル化およびメチル化を含む。異常なエピジェネティックな修飾および様々な種類の疾患の間の関係は、以前に示された。エピジェネティックな修飾における変化に関連する疾患は、様々な種類の癌、神経変性障害、炎症状態、および口の疾患を含む。
【００４９】
様々な機序によるヒストンの修飾（たとえばメチル化、アセチル化、リン酸化、およびユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）は、エピジェネティックな調節に関係する。ヒストンは、５つのファミリーに分類される。ヒストンのこれらのファミリーは、Ｈ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４である。これらのヒストンファミリーは、コアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）ならびにリンカーヒストン（Ｈ１およびＨ５）としてさらに分類される。コアヒストンは、集まって、１組の８つのタンパク質になり、ＤＮＡが周囲を覆うヒストン八量体を作る。ヒストン八量体は、各コアヒストンの２つのコピーから構成される。ヒストンの修飾（たとえばＨＭＴを介してのメチル化による）は、遺伝子発現における変化に関連する。ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）は、遺伝子発現をコントロールする調節系の一部を構成する。ＨＭＴは、特定のヒストンアミノ酸、すなわちリシン残基およびアルギニン残基上へのメチルマーク（たとえば１つ、２つ、または３つのメチル基）の転移によって、遺伝子発現を調節する。遺伝子変化は、ＨＭＴ活性を変化させてもよく、結果として、調節の誤った遺伝子発現およびヒストン上へのメチルマークの結果として生ずる異常な転移により、ＨＭＴを腫瘍形成性にする。
エピジェネティックなマーク、たとえばヒストンメチル化マークを検出するための以前の方法は、エピジェネティックモジュレーター（たとえばタゼメトスタット）による被検体の処置の間のそのようなエピジェネティックなマークの有意義な検出およびモニタリングを可能にしなかった。本開示のいくつかの態様は、細胞型が異なると、エピジェネティックモジュレーターの投与に対する反応が異なるという認識に関する。以前の方法と異なり、本開示の方法は、このばらつきを説明し、単離、濃縮、または精製細胞集団におけるエピジェネティックなマークの正確で有意義な決定およびモニタリングを可能にする。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、たとえば、被検体または被検体から得られるサンプルから細胞の亜集団を単離し、そのような亜集団におけるエピジェネティックなマーカーを測定することによって、臨床の場で使用することができる、費用および時間について効率的な分析を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、たとえば、細胞の亜集団を単離するための蛍光活性化セルソーター技術または磁気細胞選別技術およびそのような亜集団におけるエピジェネティックなマーカーを測定することによる細胞選別手順を組み込む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、疾患または疾患に関連するエピジェネティックな状態を診断するために、被検体がエピジェネティックモジュレーターによる処置についての候補となるかどうかを決定するために、および／または被検体における、細胞の標的集団に対する、たとえば、血球の亜集団におけるヒストンメチル化に対する、エピジェネティックな状態にある被検体に投与される、たとえばヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤などのようなエピジェネティックモジュレーターの効果をモニターするために、被検体におけるエピジェネティックなマークを評価するのに有用である。
【００５０】
エピジェネティックなバイオマーカーを決定するための方法
本開示は、Ｈ３メチル化マークの検出のための役立つ例を提供するが、本明細書において提供される方法は、このバイオマーカーに限定されない。本開示の方法、戦略、およびアッセイは、検出することができる任意のエピジェネティックな修飾（たとえばメチル化、アセチル化、リン酸化、およびユビキチン化）のステータスをモニターするために使用されてもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、エピジェネティックモジュレーターの投与に反応することが知られている、または疑われる標的細胞における任意のエピジェネティックな修飾のステータスをモニターするための手段を提供する。いくつかのそのような実施形態では、本開示の方法、戦略、およびアッセイは、関心のある細胞集団を単離するステップおよびその濃縮、単離、または精製細胞集団におけるエピジェネティックなマーク、たとえばヒストンメチル化マークを測定するステップを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、細胞の標的集団は、細胞の形状、サイズ、細胞表面タンパク質発現（細胞表面抗原を含むが、これらに限定されない）、エピジェネティックな修飾、またはその任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない１つ以上の物理的な特徴またはバイオマーカーによって同定されてもよい。エピジェネティックなおよびタンパク質の修飾は、バイオマーカーとして使用されてもよく、たとえばゲノム配列またはタンパク質配列のメチル化、アセチル化、ユビキチン化を含んでいてもよいが、これらに限定されなくてもよい。エピジェネティックなおよびタンパク質の修飾は、絶対的な（たとえば存在／不在）または相対的な用語（たとえば、未修飾部位もしくはタンパク質に対する修飾部位もしくはタンパク質の比率；全部位／利用可能な全部位もしくは総タンパク質に対する修飾部位もしくはタンパク質の比率；細胞当たりの修飾部位もしくはタンパク質の比率または亜集団もしくは細胞当たりの修飾細胞の数；外部標準（たとえば、癌の危険性を示すもしくは予測するための既知の閾値）と比較した修飾部位もしくはタンパク質の比率；またはその任意の組み合わせで測定されてもよい。上記に列挙されるバイオマーカーは、例示的なものであることが意図され、かつ本開示を限定しないことが理解されるであろう。さらなる適したバイオマーカーは、本開示および当技術分野における知識に基づいて当業者らに明らかになるであろう。
【００５３】
標的細胞集団は、血液から、たとえば末梢血からまたは末梢血単核細胞、リンパ系細胞、骨髄系細胞、骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞、赤芽球、巨核球、骨髄芽球、血小板、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、前単球、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞、ＭＤＣ１ｃ細胞、ＭＤＣ２細胞、肥満細胞、リンパ系幹細胞もしくは前駆細胞、胸腺細胞、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ／Ｔ）細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、形質細胞、ナチュラルキラーＢ（ＮＫ／Ｂ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞；またはその任意の組み合わせの集団から単離される細胞を含むが、これらに限定されない任意の適した細胞型を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞は、細胞表面抗原のまたは細胞表面抗原の組み合わせの存在または不在によって特徴付けられる。例示的な細胞表面抗原は、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、標的細胞集団は、生物学的サンプルから単離される細胞の亜集団または他の細胞に加えて亜集団を含む細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、細胞の亜集団は、細胞選別技術によって、たとえば磁気細胞選別またはフローサイトメトリーによって単離されてもよいまたは同定されてもよい。例示的な適した細胞選別技術は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）および磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本開示の方法、戦略、およびアッセイは、細胞集団または亜集団を、これらの集団が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％のまたは中間の任意のパーセンテージの、本明細書において標的細胞とも呼ばれる関心のある細胞を含有するまで、単離する、ソートする、および／または精製するための１つ以上のステップを含んでいてもよい。関心のある細胞は、関心のある１つ以上の物理的な特徴またはバイオマーカーを提示してもよい。その代わりにまたはさらに、関心のある細胞は、エピジェネティックモジュレーターによる処置に対して感受性であってもよいまたはエピジェネティックモジュレーターによる処置に対して感受性である組織もしくは被検体から単離されてもよいもしくは得られてもよい。いくつかの実施形態では、エピジェネティックモジュレーターによる処置に対して感受性である標的細胞の集団は、標的細胞集団およびそのような処置に対して感受性ではない他の細胞またはそのような処置に対して標的細胞集団よりも小さな感受性をもしくは混合性の反応を示す細胞を含む細胞のより大きな集団から単離される。
【００５６】
本開示の方法、戦略、およびアッセイは、エピジェネティックモジュレーターによる処置に対して感受性である細胞、組織、および／または被検体を同定するために使用されてもよい。本開示の方法、戦略、およびアッセイは、エピジェネティックモジュレーターによる処置の間の被検体、たとえばＥＺＨ２阻害剤（たとえばタゼメトスタット）を受けている被検体におけるエピジェネティックなマークの状態、たとえばヒストンメチル化のステータスをモニターするために使用されてもよい。本開示の方法、戦略、およびアッセイは、エピジェネティックモジュレーター（タゼメトスタットを含む）による被検体の処置の前に被検体から得られる細胞または組織におけるエピジェネティックなマークの第１のレベルを決定するステップ、治療有効量のエピジェネティックモジュレーターを投与するステップ、およびエピジェネティックモジュレーターによる処置後に被検体から得られる細胞または組織におけるエピジェネティックなマークの第２のレベルを決定するステップを含んでいてもよい。この方法は、各処置の後に、１回以上繰り返されてもよい。たとえば、被検体から得られる細胞または組織における第２のおよび／または次のレベルのエピジェネティックなマークは、エピジェネティックモジュレーターによる処置後、毎日、一日おき、毎週、１週間おき、毎月、または１か月おきに決定されてもよい。ある実施形態では、被検体から得られる細胞または組織における第２のおよび／または次のレベルのエピジェネティックなマークは、エピジェネティックモジュレーターによる処置後、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４時間おき；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日おき；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１２週間おき；１、２、３、４、５、もしくは６か月おきにまたは毎年決定されてもよい。
【００５７】
本開示の方法、戦略、およびアッセイは、特定の処置の転帰が達成されるまで、エピジェネティックモジュレーターによる処置の間の被検体、たとえばＥＺＨ２阻害剤（たとえばタゼメトスタット）を受けている被検体をモニターするために使用されてもよい。たとえば、本開示の方法、戦略、およびアッセイは、第２または次のレベルのエピジェネティックな修飾が、エピジェネティックな修飾の第１のレベルと比較して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、１００％ダウンレギュレートされるまたは低下するまで、エピジェネティックモジュレーターによる処置の間の被検体、たとえばＥＺＨ２阻害剤（たとえばタゼメトスタット）を受けている被検体をモニターするために使用されてもよい。本開示の方法、戦略、およびアッセイは、被検体が疾患（たとえば癌）からの寛解の期間に入るまで、エピジェネティックモジュレーターによる処置の間の被検体、たとえばＥＺＨ２阻害剤（たとえばタゼメトスタット）を受けている被検体をモニターするために使用されてもよい。本開示の方法、戦略、およびアッセイは、被検体が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２週間；１、２、３、４、５、もしくは６か月間；または１年間の期間、疾患または障害が無症状となるまで、エピジェネティックモジュレーターによる処置の間の被検体、たとえばＥＺＨ２阻害剤（たとえばタゼメトスタット）を受けている被検体をモニターするために使用されてもよい。
【００５８】
ある実施形態では、あるレベルのエピジェネティックなマークは、健康または正常と考えられてもよいのに対して、この「正常な」レベルを上回るまたは下回るずれは、異常であると考えられる。たとえば、いくつかの実施形態では、「正常な」エピジェネティックな状態に特徴的な適した参照レベルは、健康な被検体において測定されるエピジェネティックなマークのレベル、被検体の集団、たとえば健康な被検体の集団もしくは被検体の一般集団にわたって測定されるエピジェネティックなマークの平均レベル、または歴史的なもしくは実験的な値である。さらなる適した参照レベルは、本発明の開示に基づいて当業者らに明らかになるであろう、また、本開示は、この点で限定されるものではない。本開示の方法、戦略、およびアッセイは、その被検体におけるエピジェネティックな修飾のレベルが病理学的に高いまたは低いレベルから「正常な」レベルに戻るまで、エピジェネティックモジュレーターによる処置の間の被検体、たとえばＥＺＨ２阻害剤（たとえばタゼメトスタット）を受けている被検体をモニターするために使用されてもよい。ある実施形態では、「正常な」レベルは、関心のある状態についていかなる徴候も症状もなく、任意選択で、関心のある状態を発症する病歴および／または遺伝的危険因子が全くない個体におけるエピジェネティックな修飾のレベルを検出することによって確立されてもよい。
【００５９】
例示的な適した細胞集団
本開示の方法、戦略、およびアッセイは、１つの細胞型またはエピジェネティックモジュレーターの投与に対して細胞の混合集団（たとえば、同様の物理的特徴を有するもしくは同様のバイオマーカーを示す細胞について濃縮する前の生検材料もしくは生物学的サンプル由来の細胞の集団）よりも類似して反応する非常に関係のある亜型（たとえば共通の幹細胞前駆体もしくは組織型に由来する）の収集物を主に含むように単離された、濃縮された、または精製された細胞集団を含む。たとえば、本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、リンパ系細胞を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、骨髄系細胞を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞、赤芽球、巨核球、骨髄芽球、血小板、顆粒球、好塩基球、好酸球、好中球、前単球、単球、マクロファージ、骨髄系樹状細胞、ＭＤＣ１ｃ細胞、ＭＤＣ２細胞、肥満細胞、リンパ系幹細胞もしくは前駆細胞、胸腺細胞、Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ／Ｔ）細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、形質細胞、ナチュラルキラーＢ（ＮＫ／Ｂ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞様樹状細胞、またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、末梢血からまたは被検体から得られる末梢血単核細胞の集団から単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。
【００６０】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、細胞表面抗原または細胞表面抗原の組み合わせの発現によって特徴付けられる細胞を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＣＤ２７１、ＣＤ３４７、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、もしくはＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ９５、ＣＤ１５０、ＣＤ１８４、ＧＲ−１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、およびＨＬＡ−ＤＲまたはその任意の組み合わせである。
【００６１】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１＋、および／もしくはＣＤ３４７＋である骨髄系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ７１＋である赤芽球；ＣＤ６１＋である巨核球；ＣＤ６１＋である血小板；ＨＬＡ−ＤＲ＋およびＣＤ１４−である顆粒球；ＣＤ１２３＋である好塩基球；ＣＤ４４＋である好酸球；ＣＤ１５＋および／もしくはＣＤ１６＋である好中球；ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１６−、および／もしくはＨＬＡ−ＤＲ＋である単球；ＣＤ１ｃ＋であるＭＤＣ１ｃ細胞；ＣＤ１４１＋であるＭＤＣ２細胞；ＣＤ１１７＋である肥満細胞；ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１１７＋であるリンパ系幹細胞もしくは前駆細胞；ＣＤ２＋および／もしくはＣＤ３＋であるＴリンパ球（Ｔ細胞）；ＣＤ８＋である細胞障害性Ｔ細胞；ＣＤ４＋であるＴヘルパー細胞；ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋である調節性Ｔ細胞；ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋であるＮＫ／Ｔ細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ２５＋およびＣＤ３０＋である活性化Ｔ細胞；ＣＤ１９＋および／もしくはＣＤ２０＋であるＢ細胞；ＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋、および／もしくはＣＤ３０＋である活性化Ｂ細胞；ＣＤ１３８＋である形質細胞；ＣＤ５６＋であるナチュラルキラーＢ細胞；ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、およびＣＤ１６−であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ＣＤ３０４＋である形質細胞様樹状細胞；またはその任意の組み合わせを含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。
【００６２】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、Ｂ細胞を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。
【００６３】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、Ｔ細胞を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。
【００６４】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、単球を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。いくつかの実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋およびＣＤ１６−；ＣＤ１４ｌｏｗおよびＣＤ１６＋；もしくはＣＤ１４ｈｉｇｈおよびＣＤ１６ｌｏｗ単球またはその任意の組み合わせである。
【００６５】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、顆粒球を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。いくつかの実施形態では、顆粒球は、好中球、好酸球、もしくは肥満細胞またはその任意の組み合わせである。
【００６６】
本開示の方法、戦略、およびアッセイの細胞集団は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、１００％、または中間の任意のパーセンテージの関心のある細胞を含む、から本質的になる、またはからなるように単離されてもよい、濃縮されてもよい、または精製されてもよい。関心のある細胞は、関心のある１つ以上の物理的な特徴またはバイオマーカーを提示してもよい。
【００６７】
さらなる適した細胞集団は、本発明の開示に基づいて当業者らに明らかになるであろう、また、適した純度の適した細胞集団を単離するための適した細胞表面マーカーは、当業者らに知られているであろう。標的細胞集団は、当技術分野において知られている任意の適した細胞選別技術によって同定する、単離する、および／または精製することができる。適した細胞選別技術およびいくつかの例示的な適した標的細胞集団に特徴的な細胞表面マーカーは、いくつかの実施形態において、以下の１つ以上において記載されるものを含んでいてもよく、それぞれの内容は、全体が参照によって組み込まれる。Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３ｒｄ  ｅｄ．２０１１；ｂｙ  Ｔｅｒｅｓａ  Ｓ．Ｈａｗｌｅｙ（Ｅｄｉｔｏｒ），ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ（Ｅｄｉｔｏｒ）；ＩＳＢＮ−１０：１６１７３７９４９２；Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２００７，ｂｙ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｇ．Ｍａｃｅｙ（Ｅｄｉｔｏｒ）；ＩＳＢＮ−１０：１５８８２９６９１１；Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２００８，ｂｙ  Ｇｅｎｎａｒｏ  Ｄｅ  Ｌｉｂｅｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）；ＩＳＢＮ−１０：１５８８２９５８７７；Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ  Ｃａｒｌｅｔｏｎ  Ｃ．Ｓｔｅｗａｒｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｊａｎｅｔ  Ｋ．Ａ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ（Ｅｄｉｔｏｒ）；ＩＳＢＮ−１０：０４７１２３９５７７；Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌｓ）２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００；ｂｙ  Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒａｄｂｒｕｃｈ（Ｅｄｉｔｏｒ）；ＩＳＢＮ−１０：３６４２０８４９２３；様々な細胞型についての例示的な適したＣＤ抗原およびＣＤ抗原プロファイルのリストは、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．，ｂｙ  Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ  Ｊｒ，Ｔｒａｖｅｒｓ  Ｐ，Ｗａｌｐｏｒｔ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００１．；ＩＳＢＮ−１０：０８１５３３６４２ＸのＡｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩ，ＣＤ  Ａｎｔｉｇｅｎｓにおいて提供される。
【００６８】
ＥＺＨ２
ＥＺＨ２は、本開示の例示的なヒストンメチルトランスフェラーゼである。本開示は、あるエピジェネティックモジュレーター（たとえばＥＺＨ２阻害剤、特にタゼメトスタット）の機序の詳細な分析および使用を提供するが、本開示は、メチル化マーク、ＥＺＨ２阻害剤、またはタゼメトスタットに限定されない。本明細書において記載される方法、戦略、およびアッセイは、任意のエピジェネティックな修飾に適用されてもよく、任意のエピジェネティックモジュレーターの進行をモニターするために使用されてもよい。
【００６９】
ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＥＺＨ２は、様々な種類の癌に関連している。詳細には、ＥＺＨ２の突然変異および／または過剰活性が、リンパ腫、白血病、および乳癌などのような一連の癌において見つけられる。抗癌処置に使用するためのＥＺＨ２阻害剤として新規薬剤および混合細胞集団におけるエピジェネティックな修飾を評価するための新規方法の必要性が依然として存在する。
【００７０】
ＥＺＨ２はヒストンメチルトランスフェラーゼであり、ヒストンＨ３上のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のモノメチル化からトリメチル化を触媒するＰＲＣ２複合体の触媒サブユニットである。ヒストンＨ３−Ｋ２７トリメチル化は、ヒストン修飾部位の近位にある特定遺伝子の転写を抑制する機序である。このトリメチル化は、前立腺癌などの癌における発現変化を示す癌マーカーであることが知られている（たとえば、米国特許出願公開第２００３／０１７５７３６号明細書を参照されたい：その内容全体を、参照により本明細書に援用する）。他の研究から、ＥＺＨ２発現の調節異常、転写抑制、および悪性形質転換の間の機能的な連結を示す証拠が提供された。Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９（６９０７）：６２４−９  Ｋｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００（２０）：１１６０６−１１。
【００７１】
ＥＺＨ２メチル化活性は、胚中心Ｂ細胞の調節および活性化に重要な役割を果たす。ＥＺＨ２タンパク質レベルは、Ｂ細胞の活性化に伴って増大する。活性化後、Ｂ細胞はリンパ器官の胚中心に滞留し、そこで、抗アポトーシス遺伝子およびチェックポイント調節因子の抑制に関連した過程である体細胞高頻度変異が生じる。ＥＺＨ２メチル化事象は、ＣＤＫＮ１Ａ（細胞増殖に役割）、ＰＲＤＭ１（Ｂ細胞分化に役割）、およびＩＲＦ４（Ｂ細胞分化に役割）を含む、Ｂ細胞の増殖、分化、および成熟に関与する遺伝子を標的にする。
【００７２】
胚中心由来のＢ細胞の成熟および流出の後、Ｂ細胞内のＥＺＨ２レベルは低下する。しかしながら、Ｂ細胞成熟後のＥＺＨ２の存在および活性は、とりわけ胚中心Ｂ細胞リンパ腫を含む、いくつかの種類のリンパ腫に関連する。
【００７３】
ＥＺＨ２の異常な活性化または誤調節は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の多くの一般的な亜型：びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胚中心Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞リンパ腫を含む、非胚中心Ｂ細胞様びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫の他の亜型に見出されている。ＥＺＨ２の異常な活性化または誤調節はまた、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、および辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）に見出されている。
【００７４】
いくつかの種類のＥＺＨ２活性化突然変異が、記載された。ＥＺＨ２活性化突然変異は、ヒストン３リシン２７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）をもたらし、いくつかの腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングをもたらす。ある実施形態では、ヒトＥＺＨ２のＹ６４１突然変異、同じくＥＺＨ２のＹ６４１突然変異は、野生型ヒトＥＺＨ２のＹ６４１に対応するアミノ酸残基がチロシン以外のアミノ酸残基によって置換される、一種の活性化ＥＺＨ２突然変異を指す。
【００７５】
野生型ＥＺＨ２遺伝子を有する被検体は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３メチル化マークを有してもよいが、ＥＺＨ２遺伝子内の遺伝子変化は、ヒストンメチル化パターンの変化に関連する。アミノ酸Ｙ６４１（Ｙ６４６に等価、触媒ドメイン）のＦ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、またはＣへの変換をもたらすＥＺＨ２突然変異は、Ｈ３Ｋ２７の過剰トリメチル化をもたらし、リンパ腫形成を促進する。Ｈ３Ｋ２７のメチル化に影響を及ぼすさらなる遺伝的変化としては、ＥＺＨ２  ＳＥＴドメイン突然変異、ＥＺＨ２の過剰発現、他のＰＲＣ２サブユニットの過剰発現、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の機能喪失突然変異、およびＭＬＬ２の機能喪失を含む。ＥＺＨ２  Ｙ６４６突然変異についてヘテロ接合性である細胞は、ＥＺＨ２タンパク質についてホモ接合性の野生型（ＷＴ）である細胞またはＹ６４６突然変異についてホモ接合性である細胞と比較して、Ｈ３Ｋ２７の過剰トリメチル化をもたらす。
【００７６】
本開示の方法のエピジェネティック修飾ヒストンは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２／３、および／またはＨ４Ｋ２０ｍｅ３を含んでいてもよいが、これらに限定されない。ある実施形態では、エピジェネティック修飾ヒストンは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を含む。
【００７７】
本開示の方法のエピジェネティック修飾ヒストン内のエピトープは、少なくとも１つのメチル化アミノ酸残基を含んでいてもよい。メチル化アミノ酸残基は、少なくとも１つのメチル基を含んでいてもよい。ある実施形態では、メチル化アミノ酸残基は、１つのメチル基を含んでいてもよい。ある実施形態では、メチル化アミノ酸残基は、２つのメチル基を含んでいてもよい。ある実施形態では、メチル化アミノ酸残基は、３つのメチル基を含んでいてもよい。
【００７８】
本明細書において記載される方法のエピジェネティック修飾ヒストン内のエピトープは、非線状エピトープであってもよい。その代わりにまたはさらに、エピトープは、立体エピトープであってもよい。その代わりにまたはさらに、エピトープは、非線状エピトープであってもよい。その代わりにまたはさらに、エピトープは、非連続エピトープであってもよい。好ましくは、本開示のエピトープは、ヒトエピトープである。
【００７９】
本明細書において記載される方法のエピジェネティック修飾ヒストン内のエピトープは、少なくとも１つのメチル化リシン（Ｋ）を含んでいてもよい。少なくとも１つのメチル化リシン（Ｋ）は、Ｈ３またはＨ４に位置してもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのメチル化リシン（Ｋ）は、Ｈ３に位置する。ある実施形態では、少なくとも１つのメチル化リシン（Ｋ）は、Ｈ４に位置する。たとえば、あるメチル化リシン（Ｋ）は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２／３、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２／３、および／またはＨ３Ｋ２７ｍｅ２／３であってもよい。たとえば、あるメチル化リシン（Ｋ）は、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３であってもよい。
【００８０】
クロマチンフローサイトメトリーは、インビボにおける化合物処置に際してメチル化の状態における細胞型特異的な変化をモニターするための有効な手段である。クロマチンフローサイトメトリーは、化合物処置によるエピジェネティックな修飾をモニターする手段として細胞株において検証された。マウスインビボ用量応答研究およびヒト臨床試験におけるＰＤモニタリングは、個々の細胞型でのエピジェネティックな調節を定量する有効な手段としてクロマチンフローサイトメトリーを確立する。ヒストンメチル化の従来の手段にまさるこの手法の利点を考慮して、クロマチンフローサイトメトリーは、タゼメトスタットの進行中の第２相臨床試験および今後の臨床試験において、全血中白血球におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害の薬力学をモニターするために使用されるであろう。
【００８１】
本開示の方法によれば、活性化ＥＺＨ２突然変異は、Ｈ３Ｋ３７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３とも呼ばれる）をもたらしてもよい。
【００８２】
本開示の方法によれば、ヒストンメチル化のレベルを検出することは、いくつかの実施形態では、被検体由来の生物学的サンプルにおいてＨ３Ｋ２７トリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）のレベルを検出することを含む。ヒストンメチル化ステータスは、処置の開始前に、被検体が処置を受けている間に、および／または処置を終えた後に検出されてもよい。
【００８３】
本開示の方法によれば、本開示のある実施形態では、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルは、サンプル中の総Ｈのレベルとの比較によって比較されるおよび／または標準化される。本開示のある実施形態では、比較／標準化のステップは、シグナルの安定性および／または明確さを向上させる。本開示のある実施形態では、比較／標準化のステップは、シグナルの安定性の向上にとって不可欠である。本開示のある実施形態では、比較／標準化のステップは、アッセイ内およびアッセイ間のメチル化測定値の間の正確な比較を可能にする。
【００８４】
本開示の方法によれば、突然変異型ＥＺＨ２は、突然変異型ＥＺＨ２ポリペプチドをコードするポリペプチド配列または核酸配列を含んでいてもよい、から本質的になってもよい、またはからなってもよい。ある実施形態では、突然変異型ＥＺＨ２は、その基質ポケットドメインに１つまたは複数の突然変異を含む。たとえば、突然変異は、置換、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、欠失、または挿入であってもよい。ＥＺＨ２突然変異を検出する方法は、国際公開第２０１２／０３４１３２号パンフレット、国際公開第２０１３／１３８３６１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５−００９９７４７号明細書においてさらに記載され、それぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
【００８５】
本開示の方法は、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤を被検体に投与するステップを含んでいてもよい。その代わりにまたはさらに、本開示は、ＥＺＨ２阻害剤の投与後にＨ３Ｋ２７のエピジェネティックなステータスをモニターするための方法を提供する。したがって、本開示の方法は、ＥＺＨ２阻害剤による処置前におよび／または後に癌を有する被検体のＨ２Ｋ２７ｍｅ３ステータスを検出することならびに処置前の検出の結果を処置後の検出の結果と比較することを含み、検出の低下は、被検体のステータスの改善を示し、被検体に投与されるＥＺＨ２阻害剤の用量が治療的に有効であることを検証する。
【００８６】
本開示の方法に適したＥＺＨ２阻害剤は、
【化２】
2019500623.tif 000003
（ＥＰＺ−６４３８もしくはタゼメトスタットとも呼ばれる）またはその薬学的に許容される塩であってもよい。
【００８７】
好ましくは、本開示の方法の被検体は、ヒトであるが、被検体は、任意の種であってもよい。被検体は、男性であっても女性であってもよい。被検体は、任意の年齢であってもよい。ある実施形態では、ヒト被検体は、４０歳以下、３０歳以下、２０歳以下、または１０歳以下である。ある実施形態では、ヒト被検体は、１７歳以下である。
【００８８】
本開示の方法の被検体は、癌を有していてもよい。ある実施形態では、癌は、リンパ腫であってもよい。リンパ腫の例示的な形態は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、胚中心由来リンパ腫、非胚中心由来リンパ腫、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、バーキットリンパ腫、および他の非ホジキンリンパ腫亜型を含むが、これらに限定されない。
ＥＰＺ−６４３８（タゼメトスタット）
【００８９】
方法のＥＺＨ２阻害剤は、ＥＰＺ−６４３８（タゼメトスタット）：
【化３】
2019500623.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩を含む、から本質的になる、またはからなる。本開示の方法の被検体への投与のための組成物は、ＥＰＺ−６４３８（タゼメトスタット）またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容されるキャリアを含んでいてもよい、から本質的になってもよい、またはからなってもよい。
【００９０】
本明細書に記載のＥＰＺ−６４３８またはその薬学的に許容される塩は、野生型および突然変異型ＥＺＨ２の両方を標的にする能力がある。ＥＰＺ−６４３８は、経口で生物利用可能であり、他のヒストンメチルトランスフェラーゼと比較して高いＥＺＨ２選択性を有する（Ｋｉに基づく２０，０００倍超の選択性）。重要なことには、ＥＰＺ−６４３８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、遺伝学的に定義された癌細胞を死滅させる標的メチルマーク阻害を有する。また動物モデルでは、標的メチルマークの阻害に続く持続的なｉｎ  ｖｉｖｏ効力が示された。さらに本明細書に記載の臨床試験結果から、ＥＰＺ−６４３８の安全性および効力が示された。
【００９１】
ＥＰＺ−６４３８またはその薬学的に許容される塩は、約１００ｍｇ  ＢＩＤ〜約１６００ｍｇ  ＢＩＤなどのように１日約１００ｍｇ〜約３２００ｍｇの用量（たとえば、１００ｍｇ  ＢＩＤ、２００ｍｇ  ＢＩＤ、４００ｍｇ  ＢＩＤ、８００ｍｇ  ＢＩＤ、または１６００ｍｇ  ＢＩＤ）で被検体に投与されてもよい。ＥＰＺ−６４３８またはその薬学的に許容される塩は、ＮＨＬを処置するために、約１００ｍｇ  ＢＩＤ〜約１６００ｍｇ  ＢＩＤなどのように１日約１００ｍｇ〜約３２００ｍｇの用量（たとえば、１００ｍｇ  ＢＩＤ、２００ｍｇ  ＢＩＤ、４００ｍｇ  ＢＩＤ、８００ｍｇ  ＢＩＤ、または１６００ｍｇ  ＢＩＤ）で被検体に投与されてもよい。本開示の方法のある実施形態では、用量は、８００ｍｇ  ＢＩＤである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書で示される任意の方法において使用することができるＥＺＨ２阻害剤は、化合物Ａ〜Ｄのいずれか：
【化４】
2019500623.tif 000005
もしくはその立体異性体またはその薬学的に許容される塩および溶媒和物である。化合物Ｄはまた、本明細書においてＥＰＺ００７２１０とも呼ばれる。
【００９３】
ある実施形態では、本明細書で示される任意の方法において使用することができるＥＺＨ２阻害剤は、化合物Ｅ：
【化５】
2019500623.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書で示される任意の方法において使用することができるＥＺＨ２阻害剤は、以下の式を有するＧＳＫ−１２６：
【化６】
2019500623.tif 000007
その立体異性体、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物である。
【００９５】
ある実施形態では、本明細書で示される任意の方法において使用することができるＥＺＨ２阻害剤は、化合物Ｆ：
【化７】
2019500623.tif 000008
もしくはその立体異性体またはその薬学的に許容される塩および溶媒和物である。
【００９６】
ある実施形態では、本明細書で示される任意の方法において使用することができるＥＺＨ２阻害剤は、化合物Ｇａ〜Ｇｃのいずれか：
【化８】
2019500623.tif 000009
またはその立体異性体、薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物である。
【００９７】
ある実施形態では、本明細書で示される任意の方法において使用することができるＥＺＨ２阻害剤は、ＣＰＩ−１２０５またはＧＳＫ３４３である。
【００９８】
さらなる適したＥＺＨ２阻害剤は、当業者らに明らかであろう。本明細書において提供される戦略、処置法、方法、組み合わせ、および組成物のいくつかの実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、米国特許第８，５３６，１７９号明細書において記載されるＥＺＨ２阻害剤であり（他の化合物の中でもＧＳＫ−１２６について記載しており、国際公開第２０１１／１４０３２４号パンフレットに対応する）、それぞれの全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９９】
本明細書において提供される戦略、処置法、方法、組み合わせ、および組成物のいくつかの実施形態では、ＥＺＨ２阻害剤は、国際公開第２０１４／１２４４１８号パンフレットとして公開されるＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１５７０６において、国際公開第２０１３／１２０１０４号パンフレットとして公開されるＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２５６３９において、および米国特許出願公開第２０１５／０３６８２２９号明細書として公開される米国特許出願第１４／８３９，２７３号明細書において記載されるＥＺＨ２阻害剤であり、それぞれの全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１００】
一実施形態では、本明細書に開示の化合物は、化合物それ自体、すなわち遊離塩基または「裸の」分子である。別の実施形態では、化合物は、その塩、たとえば、裸の分子のモノＨＣｌ塩またはトリＨＣｌ塩、モノＨＢｒ塩またはトリＨＢｒ塩である。
【０１０１】
窒素を含有する本明細書に開示の化合物は、酸化剤（たとえば、３−クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）および／または過酸化水素）による処理によりＮ−オキシドに変換して、本明細書に開示の任意の方法に適した他の化合物にすることができる。したがって、提示し特許請求の範囲に記載する窒素含有化合物はすべて、原子価および構造により許容される場合、提示の化合物とそのＮ−オキシド誘導体（Ｎ→ＯおよびＮ＋−Ｏ−として示され得る）の両方を含むものと見なされる。さらに、他の例では、本明細書に開示の化合物中の窒素は、Ｎ−ヒドロキシ化合物またはＮ−アルコキシ化合物に変換することができる。たとえば、Ｎ−ヒドロキシ化合物は、酸化剤、たとえばｍ−ＣＰＢＡによる親アミンの酸化により調製することができる。さらに、提示し特許請求の範囲に記載する窒素含有化合物はすべて、原子価および構造により許容される場合、提示の化合物と、そのＮ−ヒドロキシ（すなわち、Ｎ−ＯＨ）誘導体およびＮ−アルコキシ（すなわち、Ｎ−ＯＲ（式中、Ｒは置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、３〜１４員炭素環または３〜１４員複素環である））誘導体との両方を包含すると見なされる。
【０１０２】
「異性」とは、化合物が同一の分子式を有するものの、その原子の結合順序またはその原子の空間配置が異なることを意味する。原子の空間配置が異なる異性体は「立体異性体」と呼ばれる。互いに鏡像でない立体異性体は「ジアステレオ異性体」と呼ばれ、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と呼ばれ、光学異性体と呼ばれることもある。逆のキラリティーの各エナンチオマー形を等量含む混合物は「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【０１０３】
同一でない４つの置換基に結合した炭素原子は「キラル中心」と呼ばれる。
【０１０４】
「キラル異性体」は、少なくとも１つのキラル中心を有する化合物を意味する。２つ以上のキラル中心を有する化合物は、個々のジアステレオマーとして存在することも、あるいは「ジアステレオマー混合物」と呼ばれるジアステレオマーの混合物として存在することも可能である。１つのキラル中心が存在する場合、立体異性体は、そのキラル中心の絶対配置（ＲまたはＳ）により特徴付けることができる。絶対配置とは、キラル中心に結合した置換基の空間配置を指す。検討対象のキラル中心に結合した置換基は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  Ｃａｈｎ，Ｉｎｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｅｌｏｇに従いランク付けされる。（Ｃａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒ．Ｅｄｉｔ．１９６６，５，３８５；ｅｒｒａｔａ  ５１１；Ｃａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９６６，７８，４１３；Ｃａｈｎ  ａｎｄ  Ｉｎｇｏｌｄ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５１（Ｌｏｎｄｏｎ），６１２；Ｃａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９５６，１２，８１；Ｃａｈｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．１９６４，４１，１１６）。
【０１０５】
「幾何異性体」は、存在する原因が二重結合またはシクロアルキルリンカー（たとえば、１，３−シルコブチル）の周りの回転障壁であるジアステレオマーを意味する。これらの配置は、接頭辞シスおよびトランス、またはカーン−インゴルド−プレローグ順位則に従い各基が分子の二重結合に関して同じ側または反対側にあることを示すＺおよびＥにより、その名称で区別される。
【０１０６】
本明細書に開示の化合物は、異なるキラル異性体または幾何異性体として図示し得ることが理解されよう。さらに、化合物がキラル異性体形または幾何異性体形を有する場合、すべての異性体形が本開示の範囲に含まれることを意図しており、化合物の名称は任意の異性体形を除外するものではないことも理解されるべきである。
【０１０７】
さらに、こうした構造および本開示で考察された他の化合物は、そのすべてのアトロピック（ａｔｒｏｐｉｃ）異性体を含む。「アトロピック（ａｔｒｏｐｉｃ）異性体」は、２つの異性体の原子が空間で異なって配置されている立体異性体の１種である。アトロピック（ａｔｒｏｐｉｃ）異性体が存在する原因は、中心結合の周りの大きな基の回転障壁により引き起こされる回転の束縛である。こうしたアトロピック（ａｔｒｏｐｉｃ）異性体は典型的には混合物として存在するが、クロマトグラフィー技術の最近の進歩の結果、特定の場合、２つのアトロピック（ａｔｒｏｐｉｃ）異性体の混合物を分離することが可能になっている。
【０１０８】
「互変異性体」は、２つ以上の構造異性体が平衡状態で存在し、ある異性体形から別の異性体形に容易に変換される、それらの構造異性体の１つである。この変換の結果、水素原子が、隣接する共役二重結合の変化を伴って形式的に移動する。互変異性体は、溶液中で互変異性体のセットの混合物として存在する。互変異性が可能である溶液においては、互変異性体の化学平衡に達する。互変異性体の正確な比率は、温度、溶媒およびｐＨを含むいくつかの要因によって異なる。互変異性化により相互変換可能な互変異性体の概念は、互変異性と呼ばれる。
【０１０９】
本明細書に開示の化合物は、それ自体だけでなく、該当する場合には、その塩およびその溶媒和物も含む。塩は、たとえば、アニオンとアリールまたはヘテロアリール置換ベンゼン化合物の正電荷を帯びた基（たとえば、アミノ）との間で形成することができる。好適なアニオンとして、クロリド、ブロミド、ヨージド、スルフェート、ビスルフェート、スルファメート、ニトレート、ホスフェート、シトレート、メタンスルホネート、トリフルオロアセテート、グルタメート、グルクロネート、グルタレート、マレート、マレエート、スクシネート、フマレート、タルトレート、トシレート、サリチレート、ラクテート、ナフタレンスルホネート、およびアセテート（たとえば、トリフルオロアセテート）が挙げられる。「薬学的に許容されるアニオン」という用語は、薬学的に許容される塩の形成に好適なアニオンをいう。同様に、塩は、カチオンとアリールまたはヘテロアリール置換ベンゼン化合物の負電荷を帯びた基（たとえば、カルボキシレート）との間でも形成することができる。好適なカチオンとして、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびアンモニウムカチオン、たとえばテトラメチルアンモニウムイオンが挙げられる。アリールまたはヘテロアリール置換ベンゼン化合物は、第四級窒素原子を含む塩をさらに含む。塩形態では、化合物と塩のカチオンまたはアニオンとの比は、１：１であることも、１：１以外の任意の比、たとえば、３：１、２：１、１：２もしくは１：３であることもある。
【０１１０】
加えて、本明細書に開示の化合物、たとえば、化合物の塩は、水和もしくは非水和（無水）形態で存在しても、あるいは他の溶媒分子との溶媒和物として存在してもよい。水和物の非限定的な例として、一水和物、二水和物等が挙げられる。溶媒和物の非限定的な例として、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物等が挙げられる。
【０１１１】
「溶媒和物」は、化学量論量あるいは非化学量論量の溶媒を含む溶媒付加形態を意味する。一部の化合物は、結晶性固体状態で一定のモル比の溶媒分子を捕捉する傾向があり、したがって溶媒和物を形成する。溶媒が水の場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールの場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は１つの物質分子と１つまたは複数の水分子の組み合わせにより形成され、水はその分子状態をＨ２Ｏとして維持する。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「アナログ」という用語は、別の化学化合物と構造的に類似しているが、組成がやや異なる（異なる元素の原子による１つの原子の置き換え、または特定の官能基の存在、または別の官能基による１つの官能基の置き換えのように）化学化合物をいう。したがって、アナログは、参照化合物と機能および外観が類似または同様であるが、構造または起源が類似または同様でない化合物である。
【０１１３】
本明細書で定義した、「誘導体」という用語は、共通のコア構造を有するが、本明細書に記載するような様々な基で置換されている化合物をいう。たとえば、式（Ｉ）で表される化合物はすべて、アリールまたはヘテロアリール置換ベンゼン化合物であり、共通のコアとして式（Ｉ）を有する。
【０１１４】
本開示は、本化合物に存在する原子の同位体をすべて含むことを意図している。同位体は、同じ原子番号を有するが、異なる質量数を有する原子を含む。一般的な例として、限定するものではないが、水素の同位体としてトリチウムおよびジュウテリウムがあり、炭素の同位体としてＣ−１３およびＣ−１４がある。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、「処置すること」または「処置する」は、疾患、状態または障害の対処を目的とした患者の管理およびケアをいい、疾患、状態もしくは障害の症状または合併症を緩和するため、あるいは疾患、状態もしくは障害を除去するため本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを含む。
【０１１６】
本明細書に開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物はまた、疾患、状態または障害を予防するために使用してもよい。本明細書で使用する場合、「予防すること」または「予防する」は、疾患、状態もしくは障害の症状または合併症の発症を減少または除去することをいう。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「緩和する」という用語は、障害の徴候または症状の重症度を低下させるプロセスを記載することを意図している。重要な点として、徴候または症状は、除去することなく緩和することができる。好ましい実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物を投与すると徴候または症状が除去されるが、しかしながら、除去は必須ではない。効果的な投薬量は徴候または症状の重症度を低下させると予想される。たとえば、複数の部位で起こり得る癌などの障害の徴候または症状は、複数の部位の少なくとも１つで癌の重症度が低下すると緩和される。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、用語「重症度」は、疾患のステージまたは疾患の進行の可能性を指すことが意図される。癌との関連において、重症度は、癌が前癌性または良性状態から悪性状態に変化する可能性を典型的に指す。あるいは、またはさらに、重症度は、たとえば、ＴＮＭ方式（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（ＵＩＣＣ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）により認められた）により、あるいは他の当該技術分野において承認されている方法により癌の病期を記載し得る。癌の病期とは、原発腫瘍の位置、腫瘍の大きさ、腫瘍数およびリンパ節転移（癌のリンパ節への広がり）などの因子に基づく癌の程度または重症度をいう。あるいは、またはさらに、重症度は、当該技術分野において承認されている方法により腫瘍グレードを記載することを意図している（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。腫瘍グレードは、癌細胞が顕微鏡下でどのように異常に見えるか、そして腫瘍がいかに急速に増殖し広がる傾向があるかという観点から癌細胞を分類するのに使用するシステムである。腫瘍グレードを判定する際は、細胞の構造および増殖パターンなど多くの因子が考慮される。腫瘍グレードの判定に使用される具体的な因子は、各癌型によって異なる。重症度はまた、腫瘍細胞が同じ組織型の正常な細胞にどの程度類似しているかを示す、分化とも呼ばれる組織学的グレードもいう（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。さらに、重症度は、腫瘍細胞の核の大きさおよび形状と、分裂している腫瘍細胞の割合とを示す核グレードについてもいう（米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照されたい）。
【０１１９】
別の態様では、重症度は、腫瘍が増殖因子をどの程度分泌したか、細胞外マトリックスをどの程度分解したか、どの程度血管新生化したか、隣接した組織への接着をどの程度失ったか、あるいはどの程度転移したかをいう。さらに重症度は、原発腫瘍が転移した部位の数も示す。最後に、重症度は、様々な型および部位の腫瘍の処置のしにくさを含む。たとえば、手術不能な腫瘍、複数の器官に到達しやすい癌（血液系および免疫系の腫瘍）、および伝統的な処置に最も抵抗性があるものが、最も重度と見なされる。これらの状況において、被検体の平均余命の延長および／または疼痛の低下、癌性細胞の比率の低下または細胞が１つの系に限定されること、ならびに癌の病期／腫瘍グレード／組織学的グレード／核グレードの改善は、癌の徴候または症状の緩和と見なされる。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、「症状」という用語は、疾患、疾病、障害または体内に適切でないものがあることの兆しと定義される。症状は、症状を経験している個体が感じあるいは気付くものであるが、他人は容易に気付くことができない。他人は、非医療専門家と定義される。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「徴候」という用語も、体内に適切でないものがあることの兆しと定義される。ただし、徴候は、医師、看護師または他の医療専門家により確認することができるものと定義される。
【０１２２】
癌は、ほとんどすべての徴候または症状を引き起こし得る疾患群である。徴候および症状は、癌がどこにあるか、癌の大きさ、および癌が近くの器官または構造にどの程度影響を与えるかによって異なる。癌が広がる（転移する）場合、症状は体の様々な部分で現れることがある。
【０１２３】
癌を処置すると、腫瘍の大きさが小さくなることがある。腫瘍の大きさが小さくなることは、「腫瘍退縮」という場合もある。好ましくは、処置後、腫瘍の大きさは、処置前のその大きさと比較して５％以上縮小し；一層好ましくは、腫瘍の大きさは１０％以上縮小し；一層好ましくは２０％以上縮小し；一層好ましくは３０％以上縮小し；一層好ましくは４０％以上縮小し；なお一層好ましくは、５０％以上縮小し；最も好ましくは、７５％超縮小する。腫瘍の大きさは、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の大きさは、腫瘍の直径として測定してもよい。
【０１２４】
癌を処置すると、腫瘍容積が縮小することがある。好ましくは、処置後、腫瘍容積は、処置前のその大きさと比較して５％以上縮小し；一層好ましくは、腫瘍容積は１０％以上縮小し；一層好ましくは２０％以上縮小し；一層好ましくは３０％以上縮小し；一層好ましくは４０％以上縮小し；なお一層好ましくは５０％以上縮小し；最も好ましくは７５％超縮小する。腫瘍容積は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。
【０１２５】
癌を処置すると、腫瘍の数が減少する。好ましくは、処置後、腫瘍数は、処置前の数と比較して５％以上減少し；一層好ましくは、腫瘍数は１０％以上減少し；一層好ましくは２０％以上減少し；一層好ましくは３０％以上減少し；一層好ましくは４０％以上減少し；なお一層好ましくは５０％以上減少し；最も好ましくは７５％超減少する。腫瘍の数は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の数は、肉眼または特定の倍率で観察できる腫瘍をカウントすることにより測定することができる。好ましくは、特定の倍率は２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍または５０倍である。
【０１２６】
癌を処置すると、原発腫瘍部位から離れた他の組織または器官における転移病変の数が減少することがある。好ましくは、処置後、転移病変の数は、処置前の数と比較して５％以上減少し；一層好ましくは、転移病変の数は１０％以上減少し；一層好ましくは２０％以上減少し；一層好ましくは３０％以上減少し；一層好ましくは４０％以上減少し；なお一層好ましくは５０％以上減少し；最も好ましくは７５％超減少する。転移病変の数は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。転移病変の数は、肉眼または特定の倍率で観察できる転移病変をカウントすることにより測定することができる。好ましくは、特定の倍率は２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍または５０倍である。
【０１２７】
癌を処置すると、処置した被検体の集団の平均生存期間が、キャリアを単独投与した集団と比較して延長されることがある。好ましくは、平均生存期間は３０日を超えて；一層好ましくは６０日を超えて；一層好ましくは９０日を超えて；最も好ましくは１２０日を超えて延長される。集団の平均生存期間の延長は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の平均生存期間の延長は、たとえば、集団について活性化合物による処置の開始後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。集団の平均生存期間の延長はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回処置の終了後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。
【０１２８】
癌を処置すると、処置した被検体の集団の平均生存期間が、未処置被検体の集団と比較して延長されることがある。好ましくは、平均生存期間は３０日を超えて；一層好ましくは６０日を超えて；一層好ましくは９０日を超えて；最も好ましくは１２０日を超えて延長される。集団の平均生存期間の延長は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の平均生存期間の延長は、たとえば、集団について活性化合物による処置の開始後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。集団の平均生存期間の延長はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回処置の終了後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。
【０１２９】
癌を処置すると、処置した被検体の集団の平均生存期間が、本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、アナログもしくは誘導体ではない薬剤による単独療法を受けた集団と比較して延長されることがある。好ましくは、平均生存期間は３０日を超えて；一層好ましくは６０日を超えて；一層好ましくは９０日を超えて；最も好ましくは１２０日を超えて延長される。集団の平均生存期間の延長は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の平均生存期間の延長は、たとえば、集団について活性化合物による処置の開始後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。集団の平均生存期間の延長はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回処置の終了後の平均生存期間を計算することにより測定してもよい。
【０１３０】
癌を処置すると、処置した被検体の集団の死亡率がキャリアを単独投与した集団と比較して低下することがある。癌を処置すると、処置した被検体の集団の死亡率が未処置集団と比較して低下することがある。癌を処置すると、処置した被検体の集団の死亡率が、本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、アナログもしくは誘導体ではない薬剤による単独療法を受けた集団と比較して低下することがある。好ましくは、死亡率は２％超；一層好ましくは５％超；一層好ましくは１０％超；最も好ましくは２５％超低下する。処置した被検体の集団の死亡率の低下は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団の死亡率の低下は、たとえば、集団について活性化合物による処置の開始後の単位時間当たりの疾患関連死亡の平均数を計算することにより測定してもよい。集団の死亡率の低下はまた、たとえば、集団について活性化合物による初回処置の終了後の単位時間当たりの疾患関連死亡の平均数を計算することにより測定してもよい。
【０１３１】
癌を処置すると、腫瘍の成長率が低下することがある。好ましくは、処置後、腫瘍の成長率は処置前の数と比較して少なくとも５％低下し；一層好ましくは、腫瘍の成長率は少なくとも１０％低下し；一層好ましくは少なくとも２０％低下し；一層好ましくは少なくとも３０％低下し；一層好ましくは少なくとも４０％低下し；一層好ましくは少なくとも５０％低下し；なお一層好ましくは少なくとも５０％低下し；最も好ましくは少なくとも７５％低下する。腫瘍の成長率は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の成長率は、単位時間当たり腫瘍直径の変化により測定してもよい。
【０１３２】
癌を処置すると、腫瘍の再増殖が抑制されることがある。好ましくは、処置後、腫瘍の再増殖は５％未満であり；一層好ましくは、腫瘍の再増殖は１０％未満であり；一層好ましくは２０％未満であり；一層好ましくは３０％未満であり；一層好ましくは４０％未満であり；一層好ましくは５０％未満であり；なお一層好ましくは５０％未満であり；最も好ましくは７５％未満である。腫瘍の再増殖は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。腫瘍の再増殖は、たとえば、以前の腫瘍縮小後に、処置後生じた腫瘍の直径の増加を測定することにより測定してもよい。腫瘍の再増殖の抑制は、処置を中止した後に腫瘍が再発しないことにより示される。
【０１３３】
細胞増殖性障害を処置または予防すると、細胞増殖率が低下することがある。好ましくは、処置後、細胞増殖率は少なくとも５％低下し；一層好ましくは少なくとも１０％低下し；一層好ましくは少なくとも２０％低下し；一層好ましくは少なくとも３０％低下し；一層好ましくは少なくとも４０％低下し；一層好ましくは少なくとも５０％低下し；なお一層好ましくは少なくとも５０％低下し；最も好ましくは少なくとも７５％低下する。細胞増殖率は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。細胞増殖率は、たとえば、組織サンプルにおいて単位時間当たりに分裂している細胞数を測定することにより測定してもよい。
【０１３４】
細胞増殖性障害を処置または予防すると、増殖している細胞の比率が低下することがある。好ましくは、処置後、増殖している細胞の比率は少なくとも５％；一層好ましくは少なくとも１０％；一層好ましくは少なくとも２０％；一層好ましくは少なくとも３０％；一層好ましくは少なくとも４０％；一層好ましくは少なくとも５０％；なお一層好ましくは少なくとも５０％；最も好ましくは少なくとも７５％低下する。増殖している細胞の比率は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。好ましくは、増殖している細胞の比率は、たとえば組織サンプルにおいて分裂している細胞数を非分裂細胞の数と比較して定量することにより測定される。増殖している細胞の比率は、分裂指数と等価であり得る。
【０１３５】
細胞増殖性障害を処置または予防すると、細胞の増殖部位または領域の大きさが小さくなることがある。好ましくは、処置後、細胞の増殖部位または領域の大きさは、処置前のその大きさと比較して少なくとも５％縮小し；一層好ましくは少なくとも１０％縮小し；一層好ましくは少なくとも２０％縮小し；一層好ましくは少なくとも３０％縮小し；一層好ましくは少なくとも４０％縮小し；一層好ましくは少なくとも５０％縮小し；なお一層好ましくは少なくとも５０％縮小し；最も好ましくは少なくとも７５％縮小する。細胞の増殖部位または領域の大きさは、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。細胞の増殖部位または領域の大きさは、細胞の増殖部位または領域の直径または幅として測定してもよい。
【０１３６】
細胞増殖性障害を処置または予防すると、異常な外観もしくは形態を有する細胞の数または比率が低下することがある。好ましくは、処置後、異常な形態を有する細胞数は、処置前のその大きさと比較して少なくとも５％減少し；一層好ましくは少なくとも１０％減少し；一層好ましくは少なくとも２０％減少し；一層好ましくは少なくとも３０％減少し；一層好ましくは少なくとも４０％減少し；一層好ましくは少なくとも５０％減少し；なお一層好ましくは少なくとも５０％減少し；最も好ましくは少なくとも７５％減少する。異常な細胞外観または形態は、任意の再現可能な測定手段により測定することができる。異常な細胞形態は、たとえば倒立型培養顕微鏡を用いて顕微鏡観察により測定してもよい。異常な細胞形態は、核異型の形をとることがある。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「選択的に」という用語は、ある集団において別の集団より高頻度で起こる傾向があることを意味する。比較される集団は細胞集団であってもよい。好ましくは、本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、癌または前癌性細胞に選択的に作用するが、正常な細胞には作用しない。好ましくは、本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、ある分子標的（たとえば、標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）を調節するが、別の分子標的（たとえば、非標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）をあまり調節しないように選択的に作用する。本開示はまた、酵素、たとえばタンパク質メチルトランスフェラーゼの活性を選択的に阻害するための方法を提供する。好ましくは、あるイベントが集団Ｂと比較して集団Ａで２倍を超える高い頻度で起こる場合、そのイベントは、集団Ｂに対して集団Ａにおいて選択的に起こる。あるイベントが集団Ａで５倍を超える高い頻度で起こる場合、そのイベントは選択的に起こる。あるイベントが集団Ｂと比較して集団Ａで１０倍を超える高い頻度で；一層好ましくは５０倍を超える；なお一層好ましくは１００倍を超える；最も好ましくは１０００倍を超える高い頻度で、集団Ａで起こる場合、そのイベントは選択的に起こる。たとえば、細胞死は、正常な細胞と比較して癌細胞で２倍を超える頻度で起こる場合、癌細胞で選択的に起こるといえると考えられる。
【０１３８】
本明細書に開示の組成物、たとえば、本明細書に開示の任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、分子標的（たとえば、標的タンパク質メチルトランスフェラーゼ）の活性を調節することができる。調節とは、分子標的の活性を刺激または阻害することをいう。好ましくは、本明細書に開示の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が、前記化合物が存在しないこと以外は同じ条件下の分子標的の活性と比較して分子標的の活性を少なくとも２倍刺激または阻害する場合、その化合物は分子標的の活性を調節する。一層好ましくは、本明細書に開示の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物が、前記化合物が存在しないこと以外は同じ条件下の分子標的の活性と比較して分子標的の活性を少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍刺激または阻害する場合、その化合物は分子標的の活性を調節する。分子標的の活性は、任意の再現可能な手段により測定することができる。分子標的の活性はインビトロで測定しても、あるいはインビボで測定してもよい。たとえば、分子標的の活性は酵素活性アッセイまたはＤＮＡ結合アッセイによりインビトロで測定してもよいし、あるいは、分子標的の活性はレポーター遺伝子の発現をアッセイすることによりインビボで測定してもよい。
【０１３９】
本明細書に開示の組成物は、化合物の添加により分子標的の活性が、前記化合物が存在しないこと以外は同じ条件下の分子標的の活性と比較して１０％を超えて刺激または阻害されない場合、分子標的の活性をあまり調節しない。
【０１４０】
好ましくは、本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、生物学的作用を得るのに必要な投薬量で最低４倍の差、好ましくは１０倍の差、一層好ましくは５０倍の差を示す。好ましくは、本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、阻害範囲にわたりこの差を示し、この差の例としてＩＣ５０、すなわち、目的の分子標的の５０％阻害が挙げられる。
【０１４１】
本明細書において使用されるように、用語「フローサイトメトリー」は、関心のある細胞を流れている液体中に懸濁し、検出装置の前を細胞に通過させることによって特徴付けられる細胞のカウント、細胞選別、細胞の特徴付け、細胞の定量化、バイオマーカー検出、およびタンパク質工学において用いられる生物物理的な技術を指す。ある実施形態では、フローサイトメトリーは、細胞に付けられた蛍光化合物の存在または不在を評価するために使用され、任意選択で定量的な方式で実行される、レーザーベースのアッセイである蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）との関連において使用されてもよく、付けられた特定の蛍光化合物を有する細胞の数は、混合細胞サンプルから定量することができる。ある実施形態では、フローサイトメトリーは、任意選択で定量的な方式で実行される、細胞に付けられた磁気または常磁性化合物の存在または不在を評価するための方法である磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）との関連において使用されてもよく、付けられた特定の磁気または常磁性化合物を有する細胞の数は、混合細胞サンプルから定量することができる。
【０１４２】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、キメラ抗体、可溶性のまたは結合した形態で標識することができる抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、およびヒト化抗体ならびにこれらに限定されないが、酵素的切断、ペプチド合成、または組換え技術などのような任意の知られている技術によって提供されるその断片を含むことが意図される。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、区別なく使用される。
【０１４３】
抗体が分子と特異的に反応し、それによって分子を抗体に結合させることができる場合、抗体は、分子に「結合することができる」と言われる。用語「エピトープ」は、抗体が結合することのできる、その抗体によって認識することもできる任意の分子の一部分を指すことが意図される。エピトープまたは「抗原決定基」は、通常、アミノ酸または糖側鎖などのような分子の化学的に活性な表面基からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。
【０１４４】
「抗原」は、抗体が結合することができ、そのうえ、その抗原のエピトープに結合することのできる抗体を産生するよう動物を誘導することができる分子または分子の一部分である。抗原は、１つ以上のエピトープを有していてもよい。エピトープは、抗体によって認識される抗原の一部である。上記に言及される特異な反応は、抗原が、その対応する抗体と高度に選択的な方式で反応し、他の抗原によって誘起されるかもしれない多くの他の抗体とは反応しないであろうということを示すことが意図される。
【０１４５】
本明細書に開示の組成物を細胞またはそれを必要とする被検体に投与すると、目的のタンパク質メチルトランスフェラーゼの活性が調節（たとえば、刺激または阻害）され得る。
【０１４６】
本明細書に開示の化合物、たとえば、本明細書に開示の任意の化合物または薬学的に許容される塩と１つまたは複数の他の治療剤、たとえばプレドニゾンとを含む組成物を、細胞またはそれを必要とする被検体に投与すると、細胞内標的（たとえば、基質）の活性が調節（たとえば、刺激または阻害）される。本明細書に開示の化合物を用いて、以下に限定されるものではないが、タンパク質メチルトラスフェラーゼなどいくつかの細胞内標的を調節することができる。
【０１４７】
活性化とは、組成物（たとえば、タンパク質または核酸）を所望の生物学的機能を発揮するのに好適な状態に置くことをいう。活性化することができる組成物はまた、不活性状態も有する。活性化組成物は、阻害性の生物学的機能または刺激性の生物学的機能を有しても、あるいはその両方を有してもよい。
【０１４８】
「活性化突然変異」は、増加したおよび／または恒常的な生物学的活性をもたらす突然変異である。たとえば、活性化突然変異は、生理学的活性化因子の非存在下において恒常的な生物学的活性をもたらす。本明細書において使用されるように、用語「活性化突然変異」は、「機能獲得型の」突然変異を含む。
【０１４９】
「線状エピトープ」は、アミノ酸のエピトープの線状配列（一次構造）によって抗体によって認識されるエピトープである。線状エピトープはまた、立体エピトープであってもよい。
【０１５０】
「立体エピトープ」は、エピトープの三次元の形状によって抗体によって認識されるエピトープである。
【０１５１】
「非連続エピトープ」は、三次元の形状および／または隣接していない残基またはその一部分によって抗体によって認識されるエピトープである。本開示の方法の「非線状」エピトープは、非連続エピトープからなってもよい、から本質的になってもよい、またはからなってもよい。
【０１５２】
「複合抗体」は、別の化合物に連結される抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）である。たとえば、複合抗体は、蛍光または発色性標識に連結することができる。
【０１５３】
上昇とは、組成物（たとえば、タンパク質または核酸）の所望の生物活性の増加をいう。上昇は、組成物の濃度の増加により起きてもよい。
【０１５４】
癌または細胞増殖性障害を処置すると、細胞死が起こることがあり、好ましくは細胞死により、ある集団で細胞の数が少なくとも１０％減少する。一層好ましくは、細胞死は、少なくとも２０％の減少；一層好ましくは少なくとも３０％の減少；一層好ましくは少なくとも４０％の減少；一層好ましくは少なくとも５０％の減少；最も好ましくは少なくとも７５％の減少を意味する。集団における細胞数は、任意の再現可能な手段により測定することができる。集団における細胞数は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡および光学顕微鏡により測定してもよい。細胞死を測定する方法は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１００（５）：２６７４−８，２００３に示される通りである。一態様では、細胞死はアポトーシスにより起こる。
【０１５５】
好ましくは、本明細書に開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の有効量は、正常な細胞に対してあまり細胞毒性を示さない。治療有効量の化合物の投与により細胞死が正常な細胞の１０％より多く誘導されない場合、治療有効量の化合物は正常な細胞に対してあまり細胞毒性を示さない。治療有効量の化合物の投与により細胞死が正常な細胞の１０％より多く誘導されない場合、治療有効量の化合物は正常な細胞の生存率にあまり影響を与えない。一態様では、細胞死はアポトーシスにより起こる。
【０１５６】
本明細書に開示のＥＺＨ２阻害剤またはその組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と細胞を接触させると、癌細胞の細胞死を選択的に誘導または活性化することができる。それを必要とする被検体に本明細書に開示の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与すると、癌細胞の細胞死を選択的に誘導または活性化することができる。本明細書に開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と細胞を接触させると、細胞増殖性障害に冒された１つまたは複数の細胞の細胞死を選択的に誘導することができる。好ましくは、それを必要とする被検体に本明細書に開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与すると、細胞増殖性障害に冒された１つまたは複数の細胞の細胞死が選択的に誘導される。
【０１５７】
本開示は、それを必要とする被験体に、本明細書に開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与することにより、癌を処置または予防する方法であって、本明細書に開示の組成物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を投与すると、以下の１つまたは複数：細胞周期の１つまたは複数の期（たとえば、Ｇ１、Ｇ１／Ｓ、Ｇ２／Ｍ）への細胞の蓄積、または細胞老化の誘導、または腫瘍細胞分化の促進による癌細胞増殖の防止；正常細胞において相当量の細胞死を起こすことのない、細胞毒性、ネクローシスまたはアポトーシスによる癌細胞の細胞死の促進、動物における治療係数が少なくとも２の抗腫瘍活性がもたらされる方法に関する。本明細書で使用する場合、「治療係数」は最大耐量を有効用量で除した値である。
【０１５８】
ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９７５），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０）が挙げられる。さらにこれらの文献は、本開示の態様の製造または使用の際に参照してもよいことは、言うまでもない。
【０１５９】
本明細書において開示される本発明をより理解しやすくするために、実施例が下記に提供される。これらの実施例は、説明のみを目的とし、本開示を限定するとして決して解釈されないものと理解されるべきである。
【実施例】
【０１６０】
実施例１：フローサイトメトリーによるエピジェネティックな修飾の検出
フローサイトメトリー手法によるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の検出についてのプロトコールを下記に示す。
【０１６１】
【表１】
2019500623.tif 000010
【０１６２】
【表２】
2019500623.tif 000011
【０１６３】
赤血球溶解および生死判別染色についてのプロトコール
１．２ｍｌの全血を５０ｍｌコニカルチューブに等分する。（注意：ＲＢＣ溶解が不十分になってしまうので、１本の５０ｍＬチューブに対して２ｍｌを超えないようにすること。しかしながら、２本の５０ｍＬチューブのペレットをステップ＃７で組み合わせ、１本の５ｍＬチューブにしてもよい。）
２．２０ｍｌの１×ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅを追加し、穏やかにボルテックスする。
３．光から保護し、ロッカーで室温で１５分間インキュベートする。
４．１５ｍＬ  ＰＢＳを追加し、５分間３００ｘｇで遠心分離する。
５．径が小さいチップで液体を吸引し（たとえば２０μｌ  Ｒａｉｎｉｎピペットチップ）、ペレットの上に１〜２ｍｌの液体を残す。細胞を吸引しないように気をつける。
６．残った液体においてペレットを再懸濁するために１ｍＬピペットを使用する。
７．懸濁液を５ｍＬ丸底ＦＡＣＳチューブに移す。
８．ＰＢＳを４ｍＬの容量まで追加し、５分間３００ｘｇで遠心分離する。
９．ＰＢＳを吸引し、残容量約５００μＬを残す。
１０．以下の２×２再懸濁技術を使用して細胞を洗浄する：２ｍＬ  ＰＢＳ（ＢＳＡまたはアジドを含有する染色溶液ではない）を追加し、ペレットを分離するために１ｍＬピペットを使用し、細胞を再懸濁し、さらに２ｍＬのＰＢＳを追加する。（注意：４ｍＬすべてを追加したり、ボルテックスによってまたは逆さにして再懸濁しないこと。再懸濁が不十分になってしまう。）
１１．５分間３００ｘｇで遠心分離する。
１２．ＰＢＳを吸引し、残容量５００μＬを残し、上記に詳述されるように４ｍＬ  ＰＢＳ中でペレットを再懸濁する（２×２技術）。
１３．４ｕＬの還元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔを追加する。
１４．光から保護し、ロッカーで室温で３０分間インキュベートする。
１５．５分間３００ｘｇで遠心分離し、２×２技術を介して４ｍＬ  ＰＢＳ中で再懸濁する。
１６．上記のように遠心分離し、上記のように吸引し、１ｍＬピペットにより２ｍＬ  ＰＢＳ中で再懸濁する。
１７．チューブにもう１ｍＬ追加する（合計３ｍＬ）。
１８．チューブに１ｍＬの１６％メタノールフリーホルムアルデヒドを追加する（４％の最終濃度）。
１９．光から保護し、ロッカーで室温で１５分間インキュベートする。
２０．上記のように遠心分離し、吸引し、４ｍＬ中で再懸濁する。
２１．上記のように遠心分離し、吸引する。
２２．２ｍＬの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を追加し、１ｍＬピペットにより再懸濁し、２ｍＬの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００をさらに追加する。
２３．光から保護し、ロッカーで室温で１５分間インキュベートする。
２４．上記のように遠心分離し、吸引し、４ｍＬ中で再懸濁する。
２５．上記のように遠心分離し、吸引する。
２６．２ｍＬのＢＤ染色バッファー中で再懸濁する。
２７．生存および非生存細胞をカウントする（透過処理された細胞はトリパンブルーを取込むであろう）。
２８．３〜５×１０６細胞／ｍＬに適切な容量で再懸濁する３。（注意：全血の２ｍＬアリコートについて期待される収量は＞８×１０６細胞となるはずである）。
２９．染色に進むまたは一晩、光から保護し、４℃で保存する。
【０１６４】
抗体染色についてのプロトコール
１．試験ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液を等分する（９６ウェルプレート）。
２．それぞれの試験ウェルに５ｕＬ  ＢＤヒトＦｃブロックを追加し、５回上下にピペッティングすることによって混合する。
３．穏やかに振盪させながら室温で１０分間インキュベートする。
４．それぞれの試験ウェルに１：７５で抗Ｈ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７を追加し、５回上下にピペッティングすることによって混合する。
５．穏やかに振盪させながら室温で４５分間インキュベートする。
６．表３に列挙する希釈で残りの抗体を追加する。
７．コンペンセーションコントロールを作る。（注意：電圧は、染色パネルに対して標準化するべきであり、毎日、既知の標準物質に対して検証するべきである（ＢＤ機器については、これは、使用前に、パネルについてのアプリケーション設定を作成し、ＣＳＴビーズにより較正することを意味する）。表面マーカー抗体はすべて、マウスκ抗体であり、ＢＤ  Ｃｏｍｐビーズに結合することができる。Ｈ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体は、ウサギＩｇＧであり、Ｂａｎｇｓ  ＬａｂｓプロテインＧビーズに結合することができる。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄは、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄコンペンセーションに使用されるべきである。）
８．５回上下にピペッティングすることによってすべてのウェルを混合する。
９．穏やかに振盪させながら室温で１時間インキュベートする。
１０．５分間３００ｘｇでプレートを遠心分離する。
１１．素早く手首を動かして流しの中にプレートをデカントし、その後、実験用ティッシュペーパーと速やかに穏やかに接触させる（遅れたり、動作を逆にしないこと）。
１２．２００μＬ  ＢＤ染色バッファーを試験＆コンペンセーションウェルに追加し、５回上下にピペッティングすることによって混合する。
１３．５分間３００ｘｇでプレートを遠心分離する。
１４．上記のようにデカントする。
１５．２００μＬ  ＢＤ染色バッファーを追加し、分析に進む。
【０１６５】
【表３】
2019500623.tif 000012
【０１６６】
実施例２：サンプル調製−透過処理方法の比較
血液サンプル中の表面エピトープ検出の保存に対する透過処理の効果を評価するために様々な透過処理方法を比較した。最終的に選ばれる透過処理技術は、表面マーカー同定に基づいた正確な集団の区別を可能にするべきである。図１（すなわち図１Ａおよび１Ｂ）は、血球の混合集団を、０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液、７０％メタノール溶液、またはＰＢＳのみ（透過処理溶液なし）と接触させた場合の表面エピトープＨＬＡ−ＤＲ（ＬＮ３）、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、およびＣＤ１９の保存の結果を示す。細胞をこれらの条件でインキュベートした後、細胞を洗浄し、表面エピトープ（たとえばＨＬＡ−ＤＲ（ＬＮ３）、ＣＤ１４、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、およびＣＤ１９）に向けられる抗体のカクテルと共にインキュベートした。細胞への抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価した。データは、７０％メタノールによる透過処理が、表面抗原を検出する能力における大幅な低下をもたらしたことを明らかに示す。図１は、７０％メタノールとのインキュベーションが、ＣＤ１９およびＣＤ１４エピトープ検出のほぼ完全な損失をもたらしたことを実証する。対照的に、０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液による透過処理は、試験した表面エピトープのあらゆる検出を可能にした。
【０１６７】
別の一連の実験を、メタノールなしの条件と比較した５０％メタノールによる血液サンプルの透過処理の比較に向けた。これらのデータを図１Ｂに示す。データは、表面マーカーＣＤ１６の検出が、メタノールなしの条件と比較して激減することを実証する。
【０１６８】
まとめると、これらのデータは、メタノールによる透過処理が、０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による透過処理と比較して、一連の表面エピトープの保存を可能にしないことを実証する。
【０１６９】
実施例３：表面マーカーを検出するための抗体の選択
一連の抗体クローンを、実施例１のフローサイトメトリープロトコールを使用して試験した。これらの実験の代表的な発見を図２（すなわち図２Ａおよび２Ｂ）に示す。データは、同一のエピトープを標的にする様々な抗体クローンが、サンプル調製技術に対して多種多様な耐性を有し、アイソタイプに基づいて特異な作用を有し、非特異的結合に関して差異を示し、最適な滴定濃度にばらつきがあったことを示す。図２Ａおよび２Ｃを参照されたい。同様の発見はまた、フルオロフォアの選択の際にも見つけられた。図２Ｂを参照されたい。特に、様々なフルオロフォアは、相対的な明るさ、機器の適合性、色素安定性、およびバックグラウンド蛍光レベルにおいてばらつきを示した。抗体および対応するフルオロフォアのフローサイトメトリー分析は、表２および３において示される抗体および希釈の同定を可能にした。
【０１７０】
実施例４：細胞サンプルにおけるＨ３Ｋ２７メチル化パターンのばらつきの評価
フローサイトメトリーを、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスを確認するために使用した。このフローサイトメトリー研究のための標準化コントロールとして、ヒストン３（Ｈ３）の総量をＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株において評価した。データを、図３（すなわち図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ）に示す。図３Ａにおけるフローサイトメトリープロットは、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株へのＥＰＺ００７２１０の追加が、処置していない未処理コントロールと比較して、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルの減少をもたらすことを示す。図３Ｂは、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株へのＥＰＺ００７２１０の追加が、検出される総Ｈ３の量に影響を与えないことを示す。これは、Ｈ３に結合する抗体を標準化コントロールとして使用することができることを示す。図３Ｃは、ＥＰＺ００７２１０とＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株を接触させた後にＨ３Ｋ２７ｍｅ３および総Ｈ３の存在についてフローサイトメトリーによって観察される平均蛍光強度を示す図である。
【０１７１】
概念実証として、用量応答実験を、ＷＳＵ細胞株（ＥＺＨ２突然変異体）およびＯＣＩ−ＬＹ１９（ＥＺＨ２）細胞株と共にＥＰＺ００７２１０を使用して行った。図４Ａを参照されたい。細胞株と接触させたＥＰＺ００７２１０の量は、以下のように条件ごとに変動した：０ｎＭ、０３ｎＭ、１ｎＭ、４ｎＭ、１２ｎＭ、３７ｎＭ、１１１ｎＭ、３３３ｎＭ、および１０００ｎＭ。データは、ＷＳＵ細胞株（ＥＺＨ２突然変異体）およびＯＣＩ−ＬＹ１９（ＥＺＨ２）細胞株の両方において、ＥＰＺ００７２１０暴露量が次第に高くなるにつれてＨ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルが減少したことを示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２の量は、ＷＳＵ細胞株（ＥＺＨ２突然変異体）において安定したままであったが、ＯＣＩ−ＬＹ１９細胞株と共にインキュベートしたＥＰＺ００７２１０の量が次第に高くなるにつれてＨ３Ｋ２７ｍｅ２シグナルが減少した。重要なことには、さまざまな濃度のＥＰＺ００７２１０への暴露後にいずれの細胞株においてもＨ３シグナルの総量に変化はなかった。フローサイトメトリーの観察を、ウェスタンブロットアッセイによって確認した。図４Ｂを参照されたい。
【０１７２】
まとめると、これらのデータは、一実施形態において、フローサイトメトリーが、実施例１において詳述されるプロトコールを使用して、ＥＺＨ２阻害剤への細胞のインビトロにおける暴露後のＨ３Ｋ２７メチル化状態における変化を評価するために使用することができることを示す。
【０１７３】
実施例５：表面抗原および核内抗原の検出のためのフローサイトメトリーアッセイの開発
表面抗原およびＨ３Ｋ２７メチル化状態の同時の検出を、フローサイトメトリーによって決定した。この一連の実験について、様々な抗体パネルを、もしあればどのパネルが様々な条件において強いシグナル検出をもたらすかを確認するために使用した。これらのパネルのそれぞれについて、バックグラウンドシグナル、クローンの性能、および滴定を個々に最適化した。パネルの開発における別の重要な検討は、明るさに基づいてエピトープとフルオロフォアをペアにすることであった。下記の表４は、アッセイした選択パネルを示す。表５Ａ〜５Ｃは、マーカーおよびこれらのマーカーが同定する細胞型をリストする。
【０１７４】
【表４】
2019500623.tif 000013
【０１７５】
【表５】
2019500623.tif 000014
【０１７６】
【表６】
2019500623.tif 000015
【０１７７】
【表７】
2019500623.tif 000016
【０１７８】
フローサイトメトリーによる血液サンプルにおける表面エピトープおよび核内抗原の同時の検出を、図５Ａ〜５Ｄに示す。図５Ａおよび５Ｂは、フローサイトメトリーによるいくつかの血球（たとえばＢ細胞、Ｔ細胞、単球、および顆粒球）の表面エピトープに対応する様々な抗原の検出を示す。図５Ｃは、パネル１の抗体を使用する代表的なフローサイトメトリー散布図およびヒストグラムプロットを示す。これらの散布図は、特定の種類の細胞のＨＫ２７ｍｅ３ステータスが、実施例１において記載されるプロトコールに従うフローサイトメトリーの使用によってかつ表４において列挙される抗体の使用によって同定することができることを示す。図５Ｄは、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体から得られるシグナルの標準化に使用される、ヒストン３（Ｈ３）に結合する抗体の包含を示す。これらのデータは、血液サンプルから得られる様々な種類の細胞において見つけられるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量のばらつきを示す。
【０１７９】
表面エピトープおよびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の抗体検出の再現性を、表４の様々な抗体パネルと１人のドナーから得られる血液サンプルを接触させることによって確認した。図６Ａを参照されたい。これらのデータは、２つの異なる抗体パネルにより染色した単一のサンプルで得られたＨ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルにおいて強い相関性があることを示す。ドナー間の再現性もまた、評価した。これらのアッセイについては、２人の別々のドナー由来の血液サンプルを、表４の抗体のパネルにより処理した。データは、ドナーサンプル間のＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量にわずかな差異があることを示すが、しかしながら、末梢血集団におけるシグナルの全体的なパターンは、保存されている。図６Ｂを参照されたい。
【０１８０】
血球のタイプおよびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスの間の比較もまた、評価した。これらのアッセイのデータは、様々な種類の血球のタイプで見つけられたＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量に差異があることを明らかにした。図７を参照されたい。たとえば、Ｂ細胞は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３が多く存在するが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の１４％かつすべての末梢血白血球（ＷＢＣ）の３％しか構成していない。重要なことには、メチル化のレベルが高くかつ全体的に相当するものが少ない細胞型のシグナルの調節は、ウェスタンアッセイによってまたはＥＬＩＳＡアッセイにより検出することが困難である。しかしながら、これらの差異は、本明細書において記載されるフローサイトメトリーアッセイの使用によって確認することができる。
【０１８１】
実施例６：ＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ−６４３８の投与後のインビボ用量応答のフローサイトメトリーによる評価
インビボげっ歯動物用量応答研究を、ＥＺＨ２阻害剤ＥＰＺ−６４３８の投与の効果を確認するために実行した。この研究について、以下の投薬量条件を確立した：ビヒクルのみ、１２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、および５００ｍｇ／ｋｇ。ＥＰＺ−６４３８投与頻度は、合計７日間、口によって、１日当たり２回、１２時間ごととした。この期間の後、血液をげっ歯動物から集め、実施例１において記載されるように処理した。この研究については、抗体パネル１を使用した。データは、すべての蛍光チャネルで好適なシグナルおよび集団の分離があり、チューブ間で標識強度のばらつきがなかったことを示す。図８を参照されたい。血液の少量の凝固が細胞収量の低下をもたらしたこともまた、この研究において注意されたい。これらの研究から得られたデータを図９に要約する。結果は、単球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のみが、ＥＰＺ−６４３８の投与後に用量依存的なメチルマークの減少を示すことを示す。単球およびＮＫ細胞は、アッセイした白血球の９．２％および６．５％をそれぞれ含む。全体的なメチルマークの減少に関連しての単球およびＮＫ細胞集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３の量の減少は、末梢血において見つけられたこれらの細胞の組み合わせた量を考慮すると、１０％である。大量のＨ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルに対する個々の細胞の集団の寄与を、図１０に示す。
【０１８２】
フローサイトメトリーによって得たＨ３Ｋ２７ｍｅ３データを、大量の血球集団で実行したＥＬＩＳＡアッセイと比較した。図１１を参照されたい。図１０において示されるように、単球応答は、大量の集団よりもはるかに頑健であった（ｒｏｂｕｓｔ）。アッセイのこの比較は、フローサイトメトリーアッセイが、最も応答性の細胞集団（たとえば単球およびＮＫ細胞）を検査することによって、メチルマークにおける変化に対するより優れた感受性をもたらすことを明らかにする。フローサイトメトリーアッセイは、用量応答性の結果が、１００〜３００μＬの全血サンプルから可能であることをさらに支持する。
【０１８３】
実施例７：ＥＺＨ２阻害剤タゼメトスタットへの暴露後のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）患者の血液におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３薬力学のクロマチンフローサイトメトリーベースの評価は特定のＰＢＭＣ亜集団における異なる応答プロファイルを明らかにする
血液中のヒストンメチル化の薬力学（ＰＤ）のモニターは、大量の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）溶解物または精製ヒストンの分析に決まって依存してきた。これらの方法は、試験したすべての用量で（１００〜１６００ｍｇを毎日２回（ＢＩＤ）投薬）、タゼメトスタット第１相研究において集められた血液サンプルを使用するＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルにおいて変化をほどんど示さなかった。対照的に、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの著しい減少（５０％まで）が、４００〜１６００ｍｇ  ＢＩＤの範囲の用量の第１相研究で集められた投与後の皮膚生検材料において観察された。２つの代理の組織におけるタゼメトスタットに対する明らかに異なるＰＤ応答を考慮して、ＰＢＭＣサブセットにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを検査するためにフローサイトメトリーベースのエピジェネティックアッセイを開発することによって、ＰＢＭＣサブセットがタゼメトスタット暴露に対して特異的に応答するかもしれない可能性について調査した。
【０１８４】
進行中のタゼメトスタット第２相ＮＨＬ治験に登録されたＤＬＢＣＬまたはＦＬの患者の末梢血を投与前に（Ｃ１Ｄ１）ならびに２回の投与後の時点、サイクル１  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）およびサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１、３０日後のベースライン）で集めた。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３および総ヒストンＨ３（Ｈ３）抗体の蛍光染色とＢ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、および単球集団のフローサイトメトリーベースの免疫表現型の解析は、ＰＢＭＣサブセットにおける標準化Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルの定量化を可能にした。
【０１８５】
【表８】
2019500623.tif 000017
【０１８６】
最初の研究は、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０による最前線のＮＨＬ療法への先の暴露により大多数の患者においてＢ細胞集団が減っていることを示した。したがって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３シグナルの定量化は、この集団において可能でなかった。Ｔ細胞は、最も高い基礎Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを示し、単球および顆粒球がこれに続いた。タゼメトスタットへの暴露は、試験したすべての患者の血液から単離された単球および顆粒球においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３の減少をもたらした。観察された減少は、両方の投与後の時点で両方の細胞集団について統計的に有意であった（ｔ−検定：すべての症例においてｐ＜０．０００１）。対照的に、タゼメトスタット処置に対するＴ細胞の応答は、統計的に有意であったが、中程度であり、Ｃ１Ｄ１５でＨ３Ｋ２７ｍｅ３が一過性に増加し（ｐ＜０．０００１）、その後、Ｃ２Ｄ１でベースラインレベルに戻った。Ｔ細胞Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３動態のいくらかの多様性が、投与後の時点にわたって様々な患者から観察された。
【０１８７】
図１２は、末梢のマウス血液のフローサイトメトリー分析についての染色およびゲーティングスキームを示す。全血は、Ｎａヘパリンバキュテナー中に集め、その後赤血球を溶解した。細胞は、４％メタノールフリーホルムアルデヒド中で固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理した。処理した細胞をＦｃブロックし、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ４５Ｒ−ＢＶ４２１、ＣＤ４９ｂ−ＰＥ、ＣＤ１１ｂ−Ｖ５００、ＧＲ−１−ＰＥ−Ｃｙ７、Ｈ３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗体により染色した。
【０１８８】
図１３は、マウス末梢血集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチルマークの蔓延を示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルは、関心のあるそれぞれの集団について総Ｈ３含有量に対して標準化する。示す結果は、薬剤未処理マウス末梢血白血球集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３の順位を示す。
【０１８９】
図１４は、タゼメトスタットに対するマウス白血球集団の特異な感受性を示す。グラフにおいて示されるＥＺＨ２阻害剤タゼメトスタットによる７日間の用量応答研究の末梢血におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３の定量化は、白血球集団の特異な感受性を明らかにする：単球およびＮＫ細胞は、薬剤暴露に対して高い感受性を示す；Ｂ細胞、Ｔ細胞、および顆粒球は、低〜中の感受性を示す。本明細書において示される結果は、細胞型特有の、エピジェネティック阻害剤に対する特異なインビボ応答についての最初の説明になる。
【０１９０】
図１５は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３阻害全体に対する細胞型寄与を示す。標準化Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の阻害パーセントは、５００ｍｇ／ｋｇタゼメトスタットにより処置したマウスにおける集団組成パーセントに対してプロットする。グラフは、高度に感受性の単球およびＮＫ細胞集団が末梢血白血球全体のわずか１４％および６％しか構成しないことを示す。個々の集団の寄与に基づいた５００ｍｇ／ｋｇの用量でのＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３レベルの全体的な差異は、−１８．１％であった。
【０１９１】
図１６は、クロマチンフローサイトメトリー対ＥＬＩＳＡのＨ３Ｋ２７ｍｅ３定量化を比較する。示す結果は、従来のＥＬＩＳＡ定量化とよく一致していることを示す。クロマチンフローによる全体的な阻害は、すべての集団の一部の阻害の合計として計算した。
【０１９２】
図１７は、ＥＺＨ２突然変異体および野生型細胞株におけるＥＰＺ００７２１０に対する用量応答を示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ステータスは、以下のＥＰＺ００７２１０濃度、ＤＭＳＯのみ（黄色）、０．３ｎＭ（淡青色）、１ｎＭ（マゼンタ）、４ｎＭ（ピンク）、１２ｎＭ（濃緑色）、３７ｎＭ（薄緑色）、１１１ｎＭ（オレンジ色）、３３３ｎＭ（濃い青緑色）、および１０００ｎＭ（赤色）とのインキュベーション後のフローサイトメトリープロットで示される。細胞株は、４日間、ＥＰＺ００７２１０により処置し、その後、４％メタノール遊離ホルムアルデヒド中で固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で透過処理した。染色は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７、およびＨ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅを使用し、１つのウェルにおいて実行した。突然変異細胞株（ＷＳＵ）は、トリメチル化を示したが、ジメチル化Ｈ３Ｋ２７は示さなかった。野生型株（ＯＣＩ−ＬＹ１９）は、Ｈ３Ｋ２７のジメチル化およびトリメチル化の両方を示した。さらに、両方の細胞株は、ＥＰＺ００７２１０処置でＨ３Ｋ２７ｍｅ３の用量応答性を示した。ＥＺＨ２野生型細胞株もまた、阻害剤処置でＨ３Ｋ２７ｍｅ２の用量応答を示したが、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２は、突然変異体株において観察されなかった。総Ｈ３は、投薬量やＥＺＨ２突然変異ステータスにかかわらず、一定のままであった。実験は、クロマチンフローサイトメトリーが、阻害剤処置による個々のＨ３Ｋ２７メチル化状態の変化を検出することができ、１回のアッセイで複数のメチル化状態を区別することが可能であることを確認した。
【０１９３】
図１８は、ＦＡＣＳ後のヒト末梢血についてのゲーティングスキームを示す。以下のカラースキームを適用する：顆粒球は、赤色に塗り、単球は、青色に塗り、Ｔ細胞は、青色に塗り、Ｂ細胞は、マゼンタに塗る。全血は、Ｎａヘパリンバキュテナー中に集め、その後赤血球を溶解した。細胞は、４％メタノールフリーホルムアルデヒド中で固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理した。処理した細胞をＦｃブロックし、抗ＣＤ３−Ｖ５００、ＣＤ１９−ＢＶ４２１、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、ＣＤ１６−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｈ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８により染色した。
【０１９４】
図１９は、ヒト末梢血集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３メチルマークの相対的な蔓延を示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルは、関心のあるそれぞれの集団について総Ｈ３含有量に対して標準化する。示す結果は、薬剤未処理ヒト末梢血白血球集団におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３の順位を示し、順位は、いくらかの患者間のばらつきを示す（たとえば、Ｂ細胞は、何人かの個人においてＴ細胞よりもＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３が大きい）。
【０１９５】
図２０は、タゼメトスタット処置によるＮＨＬ治験においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害を示す。げっ歯動物研究において発見されたものと同様に、単球は、阻害剤処置に対して非常に感受性であることが示された。顆粒球もまた、ヒトにおいて高い感受性を示した。さらに、図において示していないデータは（Ｎ＝１）、応答が投薬の３０日目に持続していることを示唆する。図は、ヒト治験におけるフローサイトメトリーによるエピジェネティックな変化の薬力学的モニタリングの最初の実証になる。パネルＡ）は、サイクル１  １日目およびサイクル１  １５日目のＮＨＬ治験における患者の末梢血中の総Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３における変化を示す図である。パネルＢ）は、ベースライン（サイクル１  １日目）〜サイクル１  １５日目のＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３の変化のパーセントを示す図である。
【０１９６】
図２１は、サイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）、サイクル２  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）、および／またはサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）に８００ｍｇ  ＢＩＤタゼメトスタットを投薬した５１人の患者から集められた血液に対するＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３フローによって単離された単球についての第ＩＩ相薬力学を示す。単球は、タゼメトスタット暴露に応じたＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３の頑健な阻害を示す。サイクル２  １日目までの十分な長期的なデータセットを有する患者についての単球におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害のプロファイルは（４５日目に暴露）、わずかな患者間のばらつきを示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３阻害のプロファイルは、患者間で有意に変動する。特定のプロファイルは、いかなる臨床上の補助因子（たとえば年齢、性別、亜型）とも相関しない。
【０１９７】
図２２は、サイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）、サイクル２  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）、および／またはサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）に８００ｍｇ  ＢＩＤタゼメトスタットを投薬した５１人の患者から集められた血液に対するＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３フローによって単離された顆粒球についての第ＩＩ相薬力学を示す。顆粒球は、タゼメトスタット暴露に応じたＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３の頑健な阻害を示す。サイクル２  １日目までの十分な長期的なデータセットを有する患者についての単球におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害のプロファイルは（４５日目に暴露）、わずかな患者間のばらつきを示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３阻害のプロファイルは、患者間で有意に変動する。特定のプロファイルは、いかなる臨床上の補助因子（たとえば年齢、性別、亜型）とも相関しない。
【０１９８】
図２３は、サイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）、サイクル２  １５日目（Ｃ１Ｄ１５）、および／またはサイクル２  １日目（Ｃ２Ｄ１）に８００ｍｇ  ＢＩＤタゼメトスタットを投薬した５１人の患者から集められた血液に対するＨ３Ｋ２７ｍｅ３／Ｈ３フローによって単離されたＴ細胞についての第ＩＩ相薬力学を示す。Ｔ細胞は、タゼメトスタット暴露の１５日目（サイクル１  １５日目）にＨ３Ｋ３７ｍｅ３の中程度であるが、統計的に著しい増加を示し、その後、３０日目（サイクル２、１日目）にベースラインに戻った。サイクル２  １日目までの十分な長期的なデータセットを有する患者についての単球におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３阻害のプロファイルは（４５日目に暴露）、わずかな患者間のばらつきを示す。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３阻害のプロファイルは、患者間で有意に変動する。特定のプロファイルは、いかなる臨床上の補助因子（たとえば年齢、性別、亜型）とも相関しない。Ｔ細胞亜型（すなわちＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｒｅｇ）の組成の変化は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の変化について観察されるプロファイルに影響を及ぼすかもしれない。
【０１９９】
これらの結果は、クロマチンフローサイトメトリーが、タゼメトスタットにより処置されたＤＬＢＣＬおよびＦＬ患者の血液から単離されたＰＢＭＣサブセットにおけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３  ＰＤをモニターするのに有効な手段であることを示し、様々なＰＭＢＣサブセットは、著しく異なるＨ３Ｋ２７ｍｅ３  ＰＤプロファイルを示し、単球および顆粒球は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３レベルにおいて一貫した、著しい投与後の減少を示す。
【０２００】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、上記の添付の説明において記載される。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料をここでは記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および請求項から明らかになるであろう。本明細書および添付の請求項では、単数形は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示物をさらに含む。他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。
【０２０１】
本明細書に引用する特許および刊行物はすべて、それぞれのそのような刊行物または文書を参照によって本明細書に組み込むために詳細に個々に示しているかのように参照によって組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、いずれかが適当な従来技術であること認めることを意図するものではなく、その内容または日付について何ら承認することにならない。これまで本発明を書面による記載により説明してきたが、当業者であれば、本発明を種々の実施形態で実施することができること、および前述の記載および下記の例は説明を目的としたものであり、以下の特許請求の範囲の限定を目的としたものでないことを認識するであろう。細胞株または遺伝子の名称が使用される場合、略語および名称は、その他に言及されない限りまたは状況から明らかでない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）または  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の命名法に従う。
【０２０２】
本明細書において開示される本発明は、その精神または本質的な特徴を逸脱することなく他の特定の形態で実施することができる。前述の説明は、例説のためだけに示されるもので、本発明が、開示される詳細な形態に限定されないが、本明細書に添付される請求項によって限定されることが意図され、請求項と同等の意味および範囲内にある変化はすべて、請求項に包含されることが意図される。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ａ−３】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図５Ｃ−１】
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【図５Ｃ−２】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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