(57)【要約】  本発明は、腫瘍学における生物学的診断法の分野に関する。それは、腫瘍細胞セクレトームの１若しくは複数の要素、特に１若しくは複数のペプチドまたはタンパク質、特に、１若しくは複数の腫瘍マーカーを検出することによって腫瘍細胞を検出および／または特徴づけする方法および装置に関する。また、本発明は、腫瘍細胞の液滴の検出および／または特徴づけ、ならびにそれらの調製方法にも関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞（９０）を検出および／または特徴づけするための方法であって、以下の：
−  キャリア流体（８）に含有された複数の液滴（６）の供給であって、前記液滴（６）のうちの少なくとも１個が、主軸（Ｘ）に沿った長尺物を規定する粒子（１２）の少なくとも１個の凝集体（１０）を含み、少なくともいくつかの液滴（６）が、前記凝集体に固定させることができる腫瘍細胞のセクレトームの少なくとも１個の標的要素を産生することができる細胞（９０）を含有し；
−  前記凝集体（１０）上への腫瘍細胞のセクレトームの標的要素（３７）の固定の少なくとも１個の物理的パラメータ特徴の計測；および
−  前記少なくとも１個の物理的パラメータの計測からの腫瘍細胞（９０）の検出および／または特徴づけ、
を含む方法。
【請求項２】
前記方法が、単一の腫瘍細胞を検出および／または特徴づけするための方法であって、以下の：
−  キャリア流体（８）に含有された複数の液滴（６）の供給であって、前記液滴（６）のうちの少なくとも１個が、主軸（Ｘ）に沿った長尺物を規定する粒子（１２）の少なくとも１個の凝集体（１０）を含み、少なくともいくつかの液滴（６）が、単一細胞（９０）を含み；
−  前記単一細胞（９０）が前記凝集体（１０）に固定されることができる腫瘍細胞のセクレトームの少なくとも１個の標的要素（３７）を産生することができる条件および十分な時間にわたる単一細胞含有（９０）液滴（６）のインキュベーション；
−  少なくとも１個の物理的パラメータの計測であって、それぞれの物理的パラメータは、前記凝集体（１０）上の腫瘍細胞のセクレトームからの別個の標的要素（３７）の固定に特徴的であり；および
−  前記少なくとも１個の物理的パラメータの計測からの単一腫瘍細胞（９０）の検出および／または特徴づけ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞（９０）が、生体液に由来し、かつ、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）から成る群から選択される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記計測ステップが、前記液滴（６）内の複数の点に局所的な少なくとも１個の物理的パラメータの計測を含み、ここで、前記計測ステップが、前記液滴（６）内で計測された値の積分の決定を含むことが好ましい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記計測ステップが、前記液滴の循環を伴わずに、マイクロ流体チャンバー内で実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下の：
−  前記液滴を循環（２２）の中に入れるためのセットおよび複数の分類領域（９４、９６）、ならびに分類領域（９４、９６）に向けて前記液滴または一部の前記液滴を選択的に誘導するための手段（９８）を含むデバイスを提供し；
−  前記液滴（６）または一部の前記液滴の分類の決定であって、前記決定は、前記複数の分類領域（９４、９６）のうちの１個を選択的に選び出すことであり；
−  前記決定ステップ中で選択された前記液滴（６）の前記分類領域への前記液滴（６）、前記液滴の一部のそれぞれの輸送、
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１個の液滴が、少なくとも２個の別個のシグナリング実体（３４）を含み、ここで、前記２個のシグナリング実体（３４）のそれぞれが、前記凝集体（１０）上で別個の標的要素（３７）と複合体を形成することができ、ここで、前記方法が、再配置されたシグナリング実体（３４）のそれぞれの濃度を示すシグナルを計測することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくともいくつかの液滴（６）が、前記腫瘍細胞セクレトームの１若しくは複数の要素を分泌、切断または放出することができる腫瘍細胞を含み、ここで、前記腫瘍細胞セクレトームの各要素が別個の標的要素（３７）であり、ここで、前記シグナルの計測が前記再配置されたシグナリング実体（３４）のそれぞれの濃度を示し、それにより、前記腫瘍細胞セクレトームの（単数もしくは複数の）要素の定量化を可能にする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞（９０）を検出および／または特徴づけするための装置であって、以下の：
−  キャリア流体（８）に含有された複数の液滴（６）を供給するためのセットであって、ここで、前記少なくとも１個の液滴（６）が、主軸（Ｘ）に従って長尺物を規定する粒子（１２）の少なくとも１個の凝集体（１０）を含み、ここで、少なくともいくつかの液滴（６）が、前記凝集体（１０）に固定されることができる標的要素（３７）を産生することができる腫瘍細胞（９０）を含有する、
を含み、
前記装置が、前記凝集体（１０）上への標的要素（３７）の固定に特徴的な物理的パラメータの計測のためのセットを含むことを特徴とし、
ここで、前記装置が、加えて、任意に以下の：
−  前記液滴（２２）を循環に入れるためのセット、
−  前記液滴の分類決定のためのセット、
−  前記分類決定に従って液滴をソーティングするセット、
を含む装置。
【請求項１０】
腫瘍細胞（９０）を検出および／または特徴づけするための液滴であって、主軸（Ｘ）に沿った長尺物を規定する粒子（１２）の凝集体（１０）を形成することができる複数の粒子、および腫瘍細胞（９０）、そして、任意に、前記凝集体（１０）上に固定されることを目的とした腫瘍細胞（９０）のセクレトームの少なくとも１個の標的要素（３７）を含む液滴。
【請求項１１】
腫瘍細胞を検出および／または特徴づけするための液滴（６）を調製するための方法であって、以下の：
−  液滴（６）を形成することを目的とした流体塊（８６）において、主軸（Ｘ）に沿った長尺物を規定する凝集体（１０）を形成することができる粒子（１２）、および複数の細胞（９０）の分散であって、ここで、少なくともいくつかの細胞（９０）が、腫瘍細胞のセクレトームの標的要素（３７）を産生することができる腫瘍細胞であり、次いで、
−  各液滴が複数の粒子（１２）を含み、一方で少なくともいくつかの前記液滴（６）が、加えて、細胞（９０）を含むような、液滴（３２）の形態での流体塊（８６）の分散、そして、
−  任意に、主軸（Ｘ）に沿って長尺物を規定する粒子（１２）の少なくとも１個の凝集体（１０）を各液滴（６）中で形成することであって、ここで、粒子（１２）の前記凝集体（１０）が、前記分散後に各液滴（６）中で形成される、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍学における生物学的診断法の分野に関する。それは、腫瘍細胞の１若しくは複数のセクレトーム要素、特に１若しくは複数のペプチドまたはタンパク質、特に、１若しくは複数の腫瘍マーカーを検出することによって腫瘍細胞を検出および／または特徴づけする方法および装置に関する。また、本発明は、腫瘍細胞の液滴の検出および／または特徴づけ、ならびにそれらの調製方法にも関する。
【０００２】
２０１４年９月に発行された刊行物Nature Reviews Cancer, volume 14, p.623-6131中の論文「Challenges in circulating tumor cell research」には、循環腫瘍細胞を検出するための様々な技術が記載されている。
【０００３】
頭字語ＥＰＩＳＰＯＴ（上皮免疫スポット）によって一般的に示される循環腫瘍細胞を検出するための方法は、従来技術、特にＥＰ１ ５０６ ４０７によって知られている。この技術は、固形癌を患っている患者の生体サンプル中の循環腫瘍細胞の検出を、これらの細胞によって放出された腫瘍マーカーを検出することによって可能にする。それは、１ウェルあたり２．１０5個の細胞の割合にて、固体培養面（着目の腫瘍マーカーに特異的な抗体がこの固体培養面に固定されている）、特に９６ウェルプレート上への細胞の堆積、それに続く、これらの細胞を培養、その後の、前記細胞の洗浄、そして、特異的標識抗体による着目の腫瘍マーカーの検出を伴う。
【０００４】
しかしながら、斯かる方法によって得られる分解能は限定されている。実際には、検出されたタンパク質は同じウェル内の別の細胞に由来する。どの細胞が何を分泌したかを知ることは難しい。そのシグナルは、細胞の不均一性に関する情報を提供していない。加えて、それらの遺伝子型を分析するために細胞を回収することは困難である。
【０００５】
本発明は、より正確で、かつ、信頼性が高い検出方法を提供することを目指す。
ＷＯ２００９／０１１８０８Ａ１は、液滴の中にタンパク質を固定する活性を測定するための方法を記載している。
【０００６】
Nature Protocols内で２０１３年４月４日にMazutisらによってオンライン発表された「Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics」は、この原理を例示している。
【０００７】
マウスハイブリドーマは、抗マウス抗体でコートされたビーズを含む液滴内にカプセル化される。ハイブリドーマは抗体を分泌する。フルオロフォアとカップリングされた二次抗体により、分泌抗体の存在を明らかにすることが可能になる。二次抗体の分布は、分泌抗体が存在しない場合、液滴中で均質であるが、抗体が存在する場合、ビーズ上に再配置される。そのため、この方法は、特定の細胞の活性を測定する際に非常に選択性が高い。
【０００８】
その一方、斯かる方法には様々な欠点がある。細胞とビーズを区画化するための方法は無作為である。液滴内のビーズの数は、ポアソン分布則によって推定されることがある。同様に、液滴内の細胞の数も、独立のポアソン分布則によって推定されることがある。ビーズと液滴の初期濃度は、液滴１個あたり平均して１個の細胞と１個のビーズを有するように調整される。そのため、一部の液滴のみが、実施される分析の目的となる。
【０００９】
そのうえ、相当なサイズを有する、液滴１個あたり単一のビーズの存在は、本方法の実施にとって好ましくない。実際には、二次抗体はビーズの表面全体に分布する。そのため、当該方法のダイナミックレンジは、ビーズ１個あたりの利用可能な外側表面によって制限される。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、既存の方法よりも信頼性が高く、かつ、高感度な分析方法を提供することであり、従って、細胞、腫瘍、特に、単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞の凝集体を検出するおよび／または特徴づけするために、単一のまたは凝集体の形態のいずれかの、生細胞のセクレトームの分析を可能にする。
【００１１】
この目的のために、本発明の対象は、腫瘍細胞を検出および／または特徴づけするための方法であって、以下：
−  キャリア流体に含有された複数の液滴を供給し、ここで、前記液滴のうち少なくとも１個が、主軸に沿った長尺物を規定する粒子の少なくとも１個の凝集体を含み、ここで、少なくともいくつかの液滴が、前記凝集体に固定されることができる腫瘍細胞の少なくとも１個の標的セクレトーム要素を産生することができる細胞を含み；
−  前記凝集体上への腫瘍細胞の標的セクレトーム要素の固定に特有の少なくとも１個の物理的パラメータを計測し；そして
−  前記少なくとも１個の物理的パラメータの計測から腫瘍細胞を検出および／または特徴づけすること、
を含む。
【００１２】
より具体的には、本発明による腫瘍細胞を検出および／または特徴づけする方法は、以下：
−  キャリア流体に含有された複数の液滴を提供し、ここで、前記液滴が、主軸に沿った長尺物を規定する粒子の凝集体を形成することができる複数の粒子を含み、ここで、少なくともいくつかの液滴が細胞を含有し；
−  細胞を含む液滴において、前記細胞が、前記凝集体に固定されることができる腫瘍細胞の少なくとも１個の標的セクレトーム要素を産生することができるような条件下、および十分な時間にわたり、複数の液滴をインキュベートし；
−  主軸に沿った長尺物を規定する粒子の少なくとも１個の凝集体の、各液滴における形成；
−  少なくとも１個の物理的パラメータを計測し、ここで、それぞれの物理的パラメータが、前記凝集体上の腫瘍細胞のセクレトームと異なって標的要素の固定に特有であり；そして
−  少なくとも１個の物理的パラメータの計測から腫瘍細胞を検出および／または特徴づけすること、
を含む。
【００１３】
細胞とは、単一の細胞または細胞の凝集体、特に、腫瘍細胞の凝集体であることが疑われる凝集体である。
【００１４】
腫瘍細胞の凝集体とは、オリゴクローナル起源のものであるので、いくつかの原発性腫瘍細胞の接着またはグループ化によってもたらされる。腫瘍細胞の凝集体は、典型的には２〜１５個の腫瘍細胞を含み得る。それらは、実質的に腫瘍細胞から成るが、また、限られた数の、白血球、血小板などの他のタイプの細胞を含み得る。
【００１５】
そのため、本発明による方法は、以下のステップ：
−  キャリア流体に含有された複数の液滴を提供し、ここで、少なくとも１個の液滴が、主軸に沿った長尺物を規定する粒子の少なくとも１個の凝集体を含み、ここで、少なくともいくつかの液滴が単一細胞を含有し；
−  前記単一細胞が、前記凝集体に固定されることができる腫瘍細胞の少なくとも１個の標的セクレトーム要素を産生することができるような条件下、および十分な時間にわたり、単一細胞を含有する液滴をインキュベートし；
−  少なくとも１個の物理的パラメータを計測し、ここで、それぞれの物理的パラメータが、前記凝集体上の腫瘍細胞のセクレトームと異なって標的要素の固定に特有であり；そして
−  少なくとも１個の物理的パラメータの計測から単一の腫瘍細胞を検出および／または特徴づけすること、
を含む、特に単一の腫瘍細胞を検出および／または特徴づけするための方法に関する。
【００１６】
「単一細胞液滴」とは、液滴が単一細胞を含むことを意味する。
「単一腫瘍細胞含有液滴」とは、液滴が腫瘍細胞である単一細胞を含むことを意味する。
【００１７】
本発明との関連において、腫瘍細胞は、ハイブリドーマなどの、腫瘍細胞と別の細胞との人工的な融合によって作製された細胞でない。
【００１８】
特に、その方法は、そのセクレトームが特定の標的要素を含む単一細胞を含んでいる液滴の存在を決定するか、または液滴を選択することさえ意図しており、ここで、この標的要素は、腫瘍細胞のセクレトームの分子、特に、腫瘍マーカーである。
【００１９】
細胞のセクレトームは、培養細胞の条件培地中に存在する要素（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、もしくは核酸などの有機または無機分子、あるいは小胞）のセットである。
「セクレトーム」という用語は、特定の意味で、培養細胞の条件培地（conditioned medium）中に存在するプロテオーム（すなわち、細胞によって発現されたタンパク質およびペプチドのすべて）の一部を指す。
【００２０】
これらの分子、特に、タンパク質またはペプチドは：
−  （小胞体やゴルジ体が関与するいわゆる「古典的な」経路、あるいは、例えば、膜輸送体タンパク質による能動輸送、または再循環エンドソームもしくは空胞のエキソサイトーシスによる分泌などのいわゆる「非古典的」経路によって）分泌される。これは、例えば、タンパク質、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マンマグロビン、ヒトカリクレイン３（ｈＫ３）、「ヒト腺性カリクレイン」（ｈＫ２）、チログロブリン、ＣＡ１９−９タンパク質、ＣＡ１５−３、ＣＡ１２５（「ＣＡ」は「癌抗原」の略語である）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、カテプシンＤ、α−フェトプロテイン、Ｓ１００タンパク質、またはＦＧＦ−２もしくはＥＧＦの場合である。
−  細胞外ドメインが酵素的に切断される膜タンパク質の場合には、それらの細胞外ドメインで切断され、そして、（タンパク質を除いた）細胞外培地中に放出される。例えば、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ（上皮細胞成長因子受容体）またはＭＵＣ１マーカーが切断タンパク質である；または
−  細胞によって放出される。放出された分子は、例えばタンパク質、クレアチンキナーゼ１９（サイトケラチン１９）など、分泌経路の異なる経路により、例えば、出芽により、細胞によって分泌された非膜タンパク質である。
【００２１】
また、エクソソームは、腫瘍細胞のセクレトームの一部でもある。これらは、小さいサイトゾルを囲む脂質二重膜から成る小胞である。エクソソームのサイトゾルは、タンパク質、二本鎖ＤＮＡを含み得るが、しかし、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含んでいてもよい。エクソソームは、腫瘍細胞が受容細胞の活性を調節するために発癌性タンパク質および／または核酸を輸送することを可能にし、その結果、腫瘍原性、腫瘍増殖、転移方法、および薬剤抵抗性において役割を果たしている。
【００２２】
本発明による方法は、個別にまたは技術的に実現可能なあらゆる組み合わせに従って採用される以下の特徴の１もしくは複数を含んでもよい：
ｉ）粒子が磁性粒子であり、有利には常磁性粒子であり、好ましくは超常磁性粒子である；
ｉｉ）液滴を提供するステップが：
−  液滴を形成するための流体塊（mass of fluid）中での粒子の分散、次いで、
−  液滴の形態の流体塊の分散；
−  主軸に沿った長尺物を規定する、粒子の少なくとも１個の凝集体の各液滴中での形成、ここで、前記粒子の凝集体は、分散後に各液滴中で形成される；
を含む；
【００２３】
ｉｉｉ）標的要素が、腫瘍細胞のセクレトームの要素である；
ｉｖ）標的要素が、腫瘍細胞のセクレトームのペプチドまたはタンパク質である；
ｖ）標的要素が、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、特に腫瘍細胞のｍｉＲＮＡである；
ｖｉ）標的要素が、腫瘍細胞のエクソソームである；
【００２４】
ｖｉｉ）少なくともいくつかの液滴が、標的要素を産生することができる産生実体（productive entity）を含み、ここで、前記産生実体が、単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞の凝集体、特に、単一の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）、またはＣＴＣもしくはＤＴＣの凝集体である；
ｖｉｉｉ）方法が、測定ステップの前に、検出軸に沿って凝集体の主軸を配向させるステップを含む；
ｉｘ）方法が、各測定について異なる検出軸に従って凝集体の主軸を配向させるステップを伴った、複数の計測ステップを含む；
【００２５】
ｘ）方法が：
−  液滴循環のセットと検出領域を含むデバイスを提供する；
−  検出領域に向けた液滴の輸送、ここで、液滴内の計測が検出領域内で実施されること、
を含む；
【００２６】
ｘｉ）方法が：
−  液滴循環のセットと複数の分類領域を含むデバイス、および液滴または一部の液滴を分類領域に向けて選択的に誘導する手段を提供し；
−  液滴または一部の液滴を分類するための決定、ここで、前記決定は、複数の分類領域の中から分類領域を選択的に選び出すことから成り；
−  決定ステップで選ばれた液滴の分類領域への液滴または一部の液滴の輸送、
を含む；
【００２７】
ｘｉｉ）少なくとも１個の液滴が、少なくとも１個の標的要素、前記標的要素を補足することができる少なくとも１個の捕捉要素、および捕捉要素法によって捕捉される可能性がある標的要素と複合体を形成することができる少なくとも１個のシグナリング実体（signaling entity）を含み、ここで、前記方法は、凝集体上での少なくとも１個のシグナリング実体の再配置または濃度を示すシグナルを計測することを含む；
【００２８】
ｘｉｉｉ）少なくとも１個の液滴が、少なくとも１個の標的要素、前記標的要素と複合体を形成することができる少なくとも１個の第１のシグナリング実体、および前記標的要素と複合体を形成することができる少なくとも１個の異なる第２のシグナリング実体を含み、ここで、前記方法は、凝集体上のそれぞれの再配置されたシグナリング実体の濃度を示すシグナルを計測することを含む；
【００２９】
ｘｉｖ）少なくとも１個の液滴が、少なくとも１個の標的要素、前記標的要素と複合体を形成することができる少なくとも１個のシグナリング実体、および前記標的要素と複合体を形成することができる少なくとも１個の定量化実体を含み、ここで、前記方法が：
−  凝集体上に再配置されたシグナリング実体の濃度を表すシグナルを計測し；
−  凝集体上に再配置された定量化実体の濃度を表すシグナルを計測し；
−  再配置された量子化実体（quantization entity）のシグナルに対する再配置されたシグナリング実体のシグナルの比から、標的要素とシグナリング実体との解離定数を決定すること、
を含む；
【００３０】
ｘｖ）少なくとも１個の液滴が、少なくとも２個の別個のシグナリング実体を含み、ここで、前記２個のシグナリング実体のそれぞれが、凝集体上で別個の標的要素との複合体を形成することができ、ここで、前記方法は、再配置されたシグナリング実体のそれぞれの濃度を表すシグナルを計測することを含む；
【００３１】
ｘｖｉ）少なくともいくつかの液滴が産生実体を含み、ここで、前記産生実体が、腫瘍細胞のセクレトームの要素を産生することができる細胞であり、ここで、前記腫瘍細胞のセクレトームの各部材が個別の標的要素である一方で、再配置されたシグナリング実体のそれぞれの濃度を示すシグナルの計測が、セクレトームの（単数もしくは複数の）要素の定量化を可能にする；
【００３２】
ｘｖｉｉ）物理的パラメータの計測が、放射能、比色定量または蛍光測定である；
ｘｖｉｉｉ）液滴のうちの少なくとも１個が、標的要素を分泌できる細胞を含み、方法が、前記細胞によって標的要素が液滴中に分泌される間のインキュベーションステップを含む；
【００３３】
ｘｉｘ）方法が、液滴のうちの少なくとも１個において凝集体から離れて位置する第１の点で局所的に物理的パラメータを計測し、そして、同じ液滴内の凝集体の近傍に位置する第２の点で局所的に、同じ物理的パラメータを計測するステップを含む；
【００３４】
ｘｘ）最大粒子サイズが、液滴直径の５０％未満である；
ｘｘｉ）液滴が、少なくとも１個のシグナリング実体を含有し、物理的パラメータの計測が、液滴内での、または凝集体に対するシグナリング実体の位置に依存する；
【００３５】
ｘｘｉｉ）プロデューサー実体（producer entity）が、要素、特に、腫瘍細胞のセクレトームのタンパク質およびペプチドから成る群から選択される複数の標的要素を産生する；
【００３６】
ｘｘｉｉｉ）方法が、産生実体（producing entity）の少なくとも１個の特徴を決定するステップを含む；
ｘｘｉｖ）分類を決定するステップが、計測ステップ後に存在する；
ｘｘｖ）液滴が超常磁性粒子を含有し、ここで、前記液滴または一部の液滴が、磁場、電場、誘電泳動、電気合体（electrocoalescence）、または表面弾性波から選択される誘導手段によって分類領域に向けて誘導される；
【００３７】
ｘｘｖｉ）一部の液滴が、磁力によって抽出され、ここで、前記抽出部分が、副液滴（auxiliary droplet）を形成し、かつ、凝集体を含有する；
【００３８】
ｘｘｖｉｉ）粒子が、標的要素を固定されるように構成された捕捉要素を用いて機能化され、一方で、各液滴が、標的要素を固定することができるシグナリング実体を含む；
【００３９】
ｘｘｖｉｉｉ）シグナリング実体が、蛍光、放射性である、または着色されている；
ｘｘｉｘ）物理的パラメータの計測が、クロモメトリー（chromometry）、蛍光または放射能の計測である；
【００４０】
ｘｘｘ）物理的パラメータの計測が、液滴内の蛍光、クロモメトリーまたは放射能シグナルの位置を含む；
【００４１】
ｘｘｘｉ）物理的パラメータの計測が、液滴内の凝集体に関する蛍光、クロモメトリーまたは放射能のシグナルの位置を含む；
ｘｘｘｉｉ）物理的パラメータの計測が、好ましくは凝集体のレベルにて、液滴内の蛍光、クロモメトリーまたは放射能のシグナルの強度を計測することを含む；
【００４２】
ｘｘｘｉｉｉ）物理的パラメータの計測が、好ましくは凝集体のレベルにて、液滴内の蛍光、クロモメトリーまたは放射能のシグナルの位置および／または強度の経時的な変動を含む；
【００４３】
ｘｘｘｉｖ）各液滴が、少なくとも２個の別個のシグナリング実体を含み、ここで、前記２個のシグナリング実体のそれぞれが、凝集体上で別個の標的要素と複合体を形成することができ、ここで、各シグナリング実体が、個別の蛍光チャンネルの蛍光である；
【００４４】
ｘｘｘｖ）細胞が腫瘍細胞、特に単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞の凝集体である；
ｘｘｘｖｉ）細胞、特に単一細胞または細胞の凝集体が、生体液に由来し、かつ、循環腫瘍細胞および播種性腫瘍細胞から成る群から選択される；
【００４５】
ｘｘｘｖｉｉ）測定ステップが、液滴内に位置した複数の点で局所的な少なくとも１個の物理的パラメータの計測を含み、ここで、前記測定ステップが、液滴内の測定値の積分の決定を含むことが好ましい；
【００４６】
ｘｘｘｖｉｉｉ）測定ステップが、液滴の循環を伴わずに、マイクロ流体チャンバー内で実施される；
【００４７】
ｘｘｘｉｘ）方法が：
−  液滴の循環のセット、複数の分類領域、および分類領域に向けて液滴または一部の液滴を選択的に誘導するための手段を含むデバイスの提供；
−  液滴または一部の液滴に対する分類決定、ここで、前記決定は、複数の分類領域の中から選択的に分類領域を選び出すことを伴う；
−  決定ステップ中に選択された液滴の分類領域に向けた液滴、または一部の液滴それぞれの輸送；
−  任意選択により、さらに、分類領域への輸送によって選別された液滴を採集し、次いで、選別され採集された液滴を溶解し、さらにまた、前記液滴を溶解し、選別され溶解された液滴内に含有された生きた腫瘍細胞を採集すること、
を含み；
【００４８】
ｘｌ）少なくとも１個の液滴が少なくとも２個の別個のシグナリング実体を含み、ここで、前記２個のシグナリング実体のそれぞれが、凝集体上で別個の標的要素と複合体を形成することができ、ここで、前記方法が、再配置されたシグナリング実体のそれぞれの濃度を示すシグナルを計測することを含む；
【００４９】
ｘｌｉ）少なくともいくつかの液滴が、腫瘍細胞セクレトームの１若しくは複数の要素を分泌、切断、または放出することができる単一の細胞または細胞の凝集体を含み、ここで、腫瘍細胞セクレトームの各要素は、個別の標的要素であり、ここで、再配置されたシグナリング実体のそれぞれの濃度を示すシグナルの測定が、腫瘍細胞セクレトームの（単数もしくは複数の）要素の定量化を可能にする。
【００５０】
本発明はまた、単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞の凝集体の形態のいずれかで、腫瘍細胞を検出および／または特徴づけするための装置であって、以下の：
−  キャリア流体中に含有された複数の液滴を供給するセット、ここで、前記液滴のうちの少なくとも１個が、主軸に沿った長尺物を規定する粒子の少なくとも１個の凝集体を含み、ここで、少なくともいくつかの液滴は、前記凝集体に固定されるように構成された標的要素を産生することができる単一の腫瘍細胞または細胞を凝集体の形態で含有する、
を含む装置であって、
【００５１】
前記装置が、凝集体上への標的要素の固定に特有の物理的パラメータの計測のセットを含むことを特徴とし、ここで、任意選択で、以下の：
−  液滴の循環のセット、
−  液滴の分類決定セット、
−  分類決定に従った液滴ソーティングセット、
をさらに含む装置にも関する。
【００５２】
本発明の対象はまた、主軸に沿った長尺物を規定する粒子の凝集体を形成することができる複数の粒子、および単一または腫瘍細胞の凝集体の形態での腫瘍細胞、そして、任意選択で、腫瘍細胞セクレトームの少なくとも１個の標的要素（腫瘍細胞の凝集体の形態に特有であって、前記凝集体に固定されることができる）を含む、単一または腫瘍細胞の凝集体の形態のいずれかの、腫瘍細胞の検出および／または特徴づけのための液滴でもある。
【００５３】
本発明の対象はまた、以下の：
−  液滴を形成することを目的とした流体塊中に、主軸に沿った長尺物を規定する凝集体を形成するのに好適な粒子、および複数の細胞を分散させ、ここで、前記細胞の少なくともいくつかが、腫瘍細胞のセクレトームの標的要素を産生することができる腫瘍細胞であり、次いで、
−  各液滴が複数の粒子を含み、加えて、少なくともいくつかの液滴が、単一細胞または細胞の凝集体の形態を含むような、液滴の形態での流体塊の分散、そして、
−  任意選択で、主軸に沿った長尺物を規定する、粒子の少なくとも１個の凝集体を各液滴中で形成すること、ここで、前記粒子の凝集体は、分散後に各液滴中で形成される、を含む、単一または腫瘍細胞の凝集体の形態のいずれかの、腫瘍細胞の検出および／または特徴づけのための液滴の調製方法でもある。
【００５４】
特に「単一細胞」モードによる、本発明は、例示のためだけに示された以下の説明を読み、添付図面を参照することで、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明による第１の分析装置の主要な要素の略図を示す。
【図２】第１の装置を用いた方法ステップ（method step）の略図を示す。
【図３】第１の装置を用いた方法ステップの略図を示す。
【図４】本発明による異なる方法ステップ中の本発明による第２の装置の一部の写真を示す。
【図５】本発明による異なる方法ステップ中の本発明による第２の装置の一部の写真を示す。
【図６】本発明による異なる方法ステップ中の本発明による第２の装置の一部の写真を示す。
【図７】本発明による異なる方法ステップ中の本発明による第２の装置の一部の写真を示す。
【図８】本発明による第３の装置の略図を示す。
【図９】液滴の離隔および読み取りのセットを示す。
【図１０】液滴の離隔および読み取りのセットを示す。
【図１１】液滴を生成するためのデバイスを示す。
【図１２】液滴を生成するためのデバイスを示す。
【図１３】一方法を実装するステップ中の液滴の略図を示す。
【図１４】方法の適用に関する実施例を示す。
【図１５】方法の適用に関する実施例を示す。
【図１６】方法の適用に関する実施例を示す。
【図１７】方法の適用に関する実施例を示す。
【図１８】方法の適用に関する実施例を示す。
【図１９】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２０】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２１】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２２】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２３】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２４】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２５】方法の適用に関する実施例を示す。
【図２６】方法の適用に関する実施例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
第１の装置
本発明による、液滴の内容物を分析し、かつ、単一または腫瘍細胞の凝集体の形態のいずれかで、腫瘍細胞を検出および／または特徴づけするため第１の装置１が図１に示されている。
【００５７】
装置１は、キャリア流体８に含有される複数の液滴６の供給セット４を含み、液滴６の少なくとも一部は、主軸Ｘに従って長尺物を規定する、粒子１２の少なくとも１個の凝集体１０含む。
【００５８】
長尺物は、細長い形状を有する物体である。細長い形状は、主軸に対して垂直方向のその長さよりも長い主軸に沿った長さを有する。よって、球は細長くない。例えば、楕円形の物体、円錐、棒または非球形の卵形は細長い形状を有する。
【００５９】
装置１は、液滴中の物理的パラメータの計測セット１４をさらに含む。
【００６０】
計測セット１４は、例えば、液滴のうち少なくとも１個における凝集体１０から離れて位置する第１の点１６における局所的な、物理的パラメータの計測、および同じ液滴内の凝集体１０の近傍にある第２の点１８における局所的な、同じ物理的パラメータの計測を実施することができる。
【００６１】
装置１はまた、循環セット２２、循環導管２４および検出領域２６を含むデバイス２０を備える。
【００６２】
循環セット２２は、導管２４内のキャリア液８において各液滴６を連続的な液滴の列として循環させることができる。
【００６３】
供給セット４は、充填セット２８および凝集セット３０を備える。供給セット４は、離隔セット３１をさらに備える。
【００６４】
充填アッセンブリ２８は、粒子１２の分散体を含む複数の初期液滴３２を供給することができ、初期液滴３２の少なくとも１個は、腫瘍細胞９０のセクレトームの少なくとも１個の標的要素３７をさらに含む。
【００６５】
離隔セット３１は、液滴の列の２個の連続する液滴６を離間すること、すなわち、２個の連続する液滴の間の距離を大きくすることができる。例えば、離隔セット３１は、キャリア流体入口８を備える。離隔セットの例は図９および図１０に示される。
【００６６】
キャリア流体８は、液滴の列の２個の連続する液滴６を分離して、それら液滴の接触を防ぐことができる。あるいは、液滴６の分離は、機械デバイスによって実施されてもよい。
【００６７】
液滴６およびキャリア流体８の内相を形成する流体は、実質的に非混和性である。例えば、液滴６は水性内相を含み、キャリア流体８は有機相または油相である。
【００６８】
キャリア流体８は有利にはフッ素化オイルである。
【００６９】
キャリア流体８または液滴の内相を形成する流体は、例えば米国特許第２０１０／０１０５１１２号に記載されているような、接触した２個の液滴６の融合を防ぐことができる界面活性剤、またはさらにRainDance Technologies製の界面活性剤ＥＡを有利には含む。
【００７０】
「実質的に非混和性である」とは、一般に、２５℃および周囲圧力にて計測された、キャリア流体８中で液滴を形成する流体の溶解度が、１％未満であることを意味する。
【００７１】
液滴６のサイズは、例えば１μｍ〜１０００μｍの間に含まれる。液滴６の容積は、有利には０．１ピコリットル〜１マイクロリットルである。
【００７２】
供給された液滴６は実質的に単分散する。これは、液滴６の多分散度が５％未満であることを意味する。
【００７３】
図示された例では、液滴６は球形である。あるいは、液滴６は、導管２４の循環軸Ｙに沿って細長い形状であってもよい。あるいは、液滴６は、循環軸Ｙに垂直な軸に沿って平らにされた円盤（ｐｕｃｋ）の形状であってもよい。
【００７４】
液滴の組成
各初期液滴３２は、ベース流体（base fluid）、ベース流体中の固体粒子１２の分散体、および複数のシグナリング実体３４を含む。さらに、少なくとも１個の初期液滴３２は、細胞９０、好ましくは単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞の凝集体、および任意選択で、腫瘍細胞セクレトームの少なくとも１個の標的要素３７を含む。
【００７５】
先に示されているとおり、液滴６の容積は、有利には０．１ピコリットル〜１マイクロリットルである。細胞の容積は、約１ピコリットルである。単一細胞または腫瘍細胞の凝集体をカプセル化するために、単一細胞に関して、２０〜１５０ピコリットル、例えば、２０〜５０ピコリットル、または３０〜４０ピコリットルの液滴容積であり、あるいは、特に細胞の凝集体に関しては、３０〜４０ピコリットルであってもよいが、有利には６０〜１５０ピコリットル、または８０〜１２０ピコリットルの液滴容積から選択される。
【００７６】
単一細胞と凝集体の分析は、同時または連続して行われてもよい。同時分析に関して、細胞凝集体をカプセル化することができる液滴容積（例えば、６０〜１５０ピコリットル、典型的には約１００ｐｌ）を使用することが有利である。連続分析に関して、単一細胞と細胞凝集体を分離し、それに続いて、一方で、単一細胞の、そして、もう一方で、細胞凝集体の個別のカプセル化のために、（Sajeesh and Sen, Microfluidics and Nanofluidics 2014, 17, 1-52に記載された技術を用いた）統合分離システムが使用されてもよい。あるいは、単一細胞および細胞凝集体は、小容積（例えば、２０〜５０ピコリットル）の液滴中にカプセル化されてもよく、前記細胞凝集体はソートされ、それに続いて、前記細胞凝集体を含む液滴に対して容積が増加される。単一細胞と細胞凝集体の分離はまた、本発明の実施前に行われてもよく、次に、単一細胞と細胞凝集体は、連続して、かつ、個別に分析される。
【００７７】
液滴は、初めは、ベース流体、典型的には、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなどのように哺乳動物細胞の（特に、ヒト細胞の）培養に合わせた培地中に細胞を含み、ここで、前記ベース流体は、その時、細胞のセクレトームの要素を欠いている。セクレトーム要素は、単一細胞からの分泌、切断または放出によって、ベース流体中に時間と共に蓄積する。
【００７８】
ベース流体は、特に単一細胞が腫瘍細胞であるかまたは細胞凝集体が腫瘍細胞を含むかもしくはそれらから成るとき、液滴内の単一細胞または細胞凝集体が、凝集体に結合されることができる腫瘍細胞のセクレトームの少なくとも１個の標的要素を産生することができるように設計される。
【００７９】
例えば、液滴中にカプセル化された、単一または細胞凝集体の形態の各腫瘍細胞９０は、標的要素３７を産生することができる。特に、腫瘍細胞９０は、タンパク質またはペプチドなどのセクレトーム要素、特に腫瘍を指し示すタンパク質またはペプチドを分泌、切断、または放出する。単一または細胞凝集体の形態の腫瘍細胞は、特に循環腫瘍細胞または播種性腫瘍細胞である。
【００８０】
粒子１２は、細長い形状の凝集体１０を形成するためのものである。例えば、粒子１２は、磁場を印加すると磁気モーメントを獲得する超常磁性粒子である。超常磁性は、強磁性またはフェリ磁性材料が小粒子またはナノ粒子の形態にあるとき、それらの材料に現れる挙動である。十分に小さいサイズの粒子では、温度の影響下で磁化の向きが自発的に反転することがある。本明細書における「磁性粒子」という用語は、超常磁性粒子を指す。
【００８１】
磁性粒子１２は、例えば、Dynal（Life Technologies）、AdemtechまたはMiltenyiによって供給される粒子の中から選択される。
【００８２】
粒子１２は例えばナノメートル単位である。したがって、粒子１２の最大寸法は１μｍ未満であり、例えば、５０〜１，０００ｎｍの間に含まれる。粒子１２は有利には実質的に単分散する。例えば、粒子１２の最大寸法間の変動は厳密に１０％未満である。液滴６中の粒子１２のサイズおよび数は、所望の数の凝集体を形成するように選択される。粒子１２の最大寸法サイズは、液滴６の直径の５０％未満である。
【００８３】
粒子１２の濃度によって、コロイド安定性が得られる。
【００８４】
液滴６中の粒子１２の濃度は、粒子１２が液滴６の容積の０．１〜５％の間、例えば１．７％となるものである。
【００８５】
一例において、３３ピコリットルの各液滴６は、平均して、３００ｎｍの直径を有する５００個の粒子１２を含有する。
【００８６】
粒子１２は最初に、初期液滴３２中で均質な分散体を形成する。これらは、初期液滴３２の容積中に実質的に均一に分布している。したがって、粒子１２の濃度は、初期液滴３２の全体にわたって均質になる。
【００８７】
粒子１２は、表面材料からなる生体分子の結合を可能にする表面を有利には有する。例えば、粒子１２は、ＣＯＯＨまたはＮＨ2官能基を有するポリマーで覆われる。
【００８８】
有利には、この表面材料はまた、液滴中での粒子１２の自発的な凝集を制限できる。
【００８９】
さらに、前記表面材料は、例えば、凝集体における１個のビーズの材料とその隣接ビーズの材料との間の非特異的結合により、凝集体１０の安定性を有利には促進できる。
【００９０】
粒子１２は有利には機能化される。このことは、粒子１２の表面材料が機能性要素を含むことを特に意味する。
【００９１】
図示された例では、機能性要素として、捕捉要素３６を含む。捕捉要素３６は、例えば、標的要素３７を捕捉することができる。捕捉要素３６は、標的要素３７を介してシグナリング実体３４に間接的に結合することができる。
【００９２】
単一または凝集体の形態での腫瘍細胞によって分泌または放出される、あるいは単一または凝集体の形態で腫瘍細胞から切断される標的要素３７は、粒子１２捕捉要素３６の両方によって、およびシグナリング実体３４によって認識される。
【００９３】
標的要素３７がセクレトームタンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物またはエクソソームであるとき、捕捉要素３６が、標的要素３７に向けられたか、または特異的なポリクローナル抗体または（複数のコピーの）モノクローナル抗体によって有利には構成される。
【００９４】
標的要素３７がセクレトームの標的核酸、例えばｍｉＲＮＡなどであるとき、捕捉要素３６が、前記標的核酸の配列に相補的である配列を含むまたはそれらから成る標的核酸、好ましくは核酸にハイブリダイズする（複数のコピーの）核酸によって有利には構成される。捕捉核酸は、典型的には、例えば１０〜２００、１０〜１００、１０〜５０、または１０〜３０ヌクレオチドから成るＤＮＡ配列である。
【００９５】
標的要素３７がエクソソームであるとき、捕捉要素３６は、膜に存在するタンパク質に向けられた抗体によって、Kuhnら（Integr Biol, 2012, 4, 1550-1555）に記載の、固体表面、例えば粒子上に固定された脂質またはステロールによって、有利には構成される。
【００９６】
標的要素の性質に依存する、同じ様式で、シグナリング実体３４は、（ｉ）標的要素３７に向けられたかまたは特異的なポリクローナル抗体または（複数のコピーの）モノクローナル抗体、ここで、前記モノクローナルまたはポリクローナル抗体が検出できるように標識される、または（ｉｉ）標的核酸の配列に相補的な配列を含むかまたはそれらから成る標的核酸、好ましくは核酸にハイブリダイズするシグナリング核酸（多重コピー）によって有利には構成され、ここで、前記シグナリング核酸は検出できるように標識される。
【００９７】
マーカーは、典型的には、抗体または核酸に直接的または間接的にカップリングされた放射性要素、発色団化合物、フルオロフォア、または酵素であり得る。
【００９８】
液滴６中のこれらの標的要素３７の存在が、後で記載されるような、凝集体１０へのシグナリング実体３４の再配置を可能にする。
【００９９】
その一方、単一細胞が腫瘍細胞でないとき、細胞凝集体が腫瘍細胞を含まないとき、または単一細胞または細胞凝集体が腫瘍細胞セクレトームの標的要素３７を産生しないか、または十分な量でないとき、シグナリング実体３４は凝集体１０上に再配置されない。
【０１００】
よって、凝集体へのシグナリング実体３４の再配置は、単一または凝集体の形態での細胞が、標的要素３７を分泌、切断または放出することを検出し、そして、それにより：
−  前記標的要素が腫瘍細胞または腫瘍細胞型の特異的マーカーであれば、前記細胞が腫瘍細胞であるという特徴づけ、および／または
−  前記標的要素３７が細胞のセクレトームの一部であるという特徴づけ、
を可能にする。
【０１０１】
いくつかの別個の標的要素３７が探索されるとき、別個のシグナリング実体と別個の捕捉要素が結合する。それらの再配置は、例えば、別個の蛍光チャンネルにより、別個のシグナリング実体と別個の捕捉要素によって独立に検出される。
【０１０２】
別個の標的要素と結合する別個のシグナリング実体３４の各再配置は、前記細胞が結合した標的要素３７を分泌、切断または放出するのを検出することを可能にする。
【０１０３】
凝集セット３０は、主軸Ｘに沿った粒子１２の凝集体を生成することができる。
【０１０４】
凝集セット３０は、例えば、導管２４の両側に位置する２個の磁石３８を含む。磁場の向きは循環軸Ｙに対して平行ではなく、有利には循環軸Ｙに対して垂直である。凝集アッセンブリ３０は、各液滴６内に細長い凝集体を形成することを可能にする。
【０１０５】
一実施形態において、磁石３８は永久磁石である。
【０１０６】
あるいは、凝集セット３０は非永久磁石を備える。
【０１０７】
あるいは、凝集セット３０は、特定の液滴においてのみ細長い凝集体１０を生成するために、活性モードから非活性モードに切り替えることができる。
【０１０８】
例えば、粒子１２の各凝集体１０は、主軸Ｘに沿って配向された柱（column）を含む。柱の高さは、液滴６の直径の５０％〜１００％の間に有利には含まれる。柱の幅は、例えば柱の高さの６０％未満である。
【０１０９】
さらに、凝集セット３０は、例えば、凝集体を優先軸（preferential axis）に沿って配向させることができる。図示された例では、凝集体１２の軸Ｘは、循環導管２４内の液滴６の循環軸Ｙに対して垂直になっている。
【０１１０】
計測セット１４は、例えば、循環軸Ｙに対して垂直のまたは傾斜した軸Ｘ’に沿って延びる線に沿って、蛍光強度を光学的に計測することができるレーザー線を含む。
【０１１１】
計測セット１４は、検出領域２６において液滴内の計測を実施することができる。
【０１１２】
レーザー線の軸Ｘ’は、検出領域２６内の凝集体Ｘの軸に対して有利には平行である。
【０１１３】
キャリア流体８の流量が一定である場合、レーザー線によって得られるシグナルの経時的計測値（measurement overtime）は、レーザー線の前を通過する液滴６の空間走査に対応する。これにより、連続的に複数の計測点、特に、凝集体１０から離れて位置する少なくとも１個の第１の計測点１６、および凝集体１０の近傍において凝集体１０のより近くに位置する第２の計測点１８を得ることが可能になる。
【０１１４】
実際には、計測セット１４に面した漸進的通過の間に、液滴６の長手方向寸法にわたって、複数の連続的計測点が取られる。
【０１１５】
図１〜図３に示される例では、シグナリング実体３４は蛍光性である。
【０１１６】
循環導管２４は、供給セット４から計測セット１４への循環方向において循環軸Ｙに沿った液滴６、３２の循環を可能にするためのものである。
【０１１７】
循環導管２４は１ｍｍ以下の内径を有利には有する。
【０１１８】
循環導管２４は、循環軸Ｙに沿って細長くなっている。循環導管２４は、円形または楕円形のような丸い輪郭を有する交差断面、あるいは長方形の輪郭などの多角形の導管による交差断面を有する。
【０１１９】
循環導管２４は、例えば、計測セット１４による光学パラメータの計測を可能にする半透明材料で規定される。あるいは、循環導管２４は、検出領域２６内に少なくとも１つの透明計測窓を規定する。
【０１２０】
循環導管２４の壁は、キャリア流体８に対して不浸透性である。
【０１２１】
例えば、循環導管２４は、有利には１ｍｍ未満の内部寸法を有する毛管内に規定される。あるいは、循環導管２４は、マイクロ流体チップ内に規定される。
【０１２２】
液滴循環セット２２は、導管２４内で液滴６、３２を循環方向に１個ずつ移動させるためのものである。
【０１２３】
循環セット２２は、例えば、キャリア流体８に制御流量を適用することが可能なシリンジポンプを備える。あるいは、循環セット２２は、圧力制御器を備えてもよい。
【０１２４】
第１の装置を用いた分析方法
今度は、第１の装置１に適用される本発明による第１の分析方法について説明する。
【０１２５】
前述した装置１が供給される。前述のような初期液滴３２は、キャリア流体８中に調製される。
【０１２６】
好ましくは、粒子１２は各初期液滴３２中で均質に分散される。初期液滴３２に対する個々の粒子１２の小さなサイズを考慮すると、各初期液滴３２は、例えば１０個を超える多数の個々の粒子１２を含有する。粒子１２を１個も含まない初期液滴３２を得る確率は、非常に低いか、または０である。
【０１２７】
いくつかの液滴６は、標的要素３７を分泌、放出または切断する単一の腫瘍細胞９０を含む。
【０１２８】
好ましくは、シグナリング実体３４は、各初期液滴３２内に均質に分散する。
【０１２９】
初期液滴３２内には、特定の親和性を有する要素間に結合が形成される。
【０１３０】
一例において、各標的要素３７は、シグナリング実体３４および捕捉要素３６に結合される。シグナリング実体３４は、このようにして粒子１２上に再配置される。
【０１３１】
以下において、「再配置した」実体とは、凝集体１０に結合する実体に関する。
【０１３２】
初期液滴３２は、循環セット２２によって導管２４内でキャリア流体８と一緒に循環する。
【０１３３】
少なくとも１個の初期液滴３２は、凝集セット３０に導かれる。主軸Ｘに沿った長尺物を規定する、粒子１２の凝集体１０は、凝集セット３０によって初期液滴３２内で形成される。
【０１３４】
好ましくは、粒子１２が磁性粒子である場合、粒子１２は凝集セット３０の各磁石３８の前を通過する間に主軸Ｘに沿って整列する。
【０１３５】
長尺物を含む液滴６は、検出領域２６へと運ばれる。物理的パラメータは、計測セット１４によって、液滴６のうち少なくとも１個における少なくとも１個の第１の点１６にて局所的に計測される。
【０１３６】
特定の用途では、物理的パラメータは、計測セット１４によって、液滴６のうち少なくとも１個における少なくとも１個の第１の点１６において局所的に計測され、同じ物理的パラメータが、計測セット１４によって、同じ液滴６における凝集体１０近傍の少なくとも１個の第２の点１８において局所的に計測される。
【０１３７】
計測
図２は、例として、異なる液滴６について得られた異なる計測値を示している。グラフは、レーザー線によって経時的に計測された蛍光強度を示している。
【０１３８】
蛍光強度は、シグナリング実体３４の波長特性の範囲内で計測されている。この例では、蛍光強度は、粒子１２の波長特性の範囲内でさらに計測されており、粒子１２は蛍光性である。したがって、凝集体１０をより容易に位置づけることができる。
【０１３９】
レーザー線上で計測されたシグナリング実体３４の蛍光に対応する蛍光強度４０は、図２において、異なる液滴６ごとに点線で示されている。
【０１４０】
粒子１２の蛍光に対応する蛍光強度４１は、図２において、異なる液滴６ごとに実線で示されている。
【０１４１】
計測ステップは、液滴内に位置する複数の点において局所的に物理的パラメータを決定することを含む。計測ステップは、複数の点における計測値の累積、例えば液滴６内での計測値の積分の決定をさらに有利には含む。
【０１４２】
図示された第１の液滴４２は、異なるシグナリング実体３４が粒子１２上に再配置していない液滴６である。シグナリング実体３４の分布は、液滴６内で均質になっている。蛍光強度シグナルは、プラトー４４として計測される。
【０１４３】
図示された第２の液滴４８は、シグナリング実体３４の一部が粒子１２上に再配置した液滴６である。実際には、これらのシグナリング実体３４は、捕捉要素３６によって捕捉された標的要素３７に結合している。この場合、凝集体１０の近傍での蛍光強度は、液滴６の残り部分よりも顕著である。プラトー５２に加えてピーク５０を有する蛍光強度シグナルが計測されている。
【０１４４】
凝集体１０から遊離しているシグナリング実体３４が少ないため、第２の液滴４８のプラトー５２の高さは、第１の液滴４２のプラトー４４の高さよりも低くなっている。
【０１４５】
図示された第３の液滴５６は、シグナリング実体３４の大部分が凝集体上に再配置した液滴である。蛍光強度シグナルは、ピーク５８およびプラトー５９を有する。より多くのシグナリング実体３４が粒子１２によって捕捉され、したがって、凝集体１０の近傍に位置しているため、計測されたピーク５８の高さは、第２の液滴４８において計測されたピーク５０の高さよりも高くなっている。
【０１４６】
図３は、再配置したシグナリング実体３４の濃度を推定するために使用されるパラメータの選択を示している。
【０１４７】
時間ｔに対するシグナルＳを示す図３には、より高いシグナルピークを有する（左側および右側の）１つの凝集体または２つの凝集体（中央）を含有する、３個の液滴が示されている。有用なパラメータは、シグナルの極大値（Ｍａｘで示される）または所定の閾値を基準とするシグナルの積分値（Ｉｎｔ）であってもよい。
【０１４８】
第１の方法は、各液滴６におけるシグナルの極大値（Ｍａｘ）、すなわち凝集体上に再配置したシグナルピークの高さによって、この濃度を推定することからなる。
【０１４９】
より精密な第２の方法は、例えば図３に示すように、各液滴６について、ユーザーによって設定された閾値を超えたシグナルの積分値（Ｉｎｔ）を計算することからなる。この方法は、シグナルの分散を制限する上でより興味深いことがある。
【０１５０】
これらのシグナル処理方法はともに、リアルタイムで実施することができる。
【０１５１】
他の方法、例えばこれらのアプローチの組み合わせは、例えば再配置したシグナリング実体３４および再配置していないシグナリング実体３４両方の計測に適用することができる。
【０１５２】
本発明は、液滴６中の標的要素３７の濃度の計測をさらに可能にする。
【０１５３】
これを行うための単純なケースは、以下の条件：
−  捕捉要素３６が、標的要素の少なくとも９０％超、有利には全体を凝集体上に捕捉するのに十分な量存在し、標的要素３７に対する十分な親和性を有し；
−  シグナリング実体３４の濃度が標的要素３７の濃度よりも大きく、シグナリング実体３４と標的要素３７との間の解離定数Ｋｄが標的要素３７の濃度よりも小さく、有利には１０倍超である、という条件に当てはまる場合である。これは、典型的には、サブナノモルのＫｄを有するモノクローナル抗体のような最適な用量の試薬が使用されるケース、および１ナノモル濃度超の標的要素３７の濃度を検出することが意図されるケースである。
【０１５４】
「ナノモル濃度」は、１ナノモル／Ｌを意味すると理解される。
【０１５５】
これらの特定の条件下において、各標的要素３７の存在により、捕捉要素３６−標的要素３７−シグナリング実体３４複合体の形成がもたらされる。したがって、標的要素３７の濃度は、凝集体１０に再配置したシグナリング実体３４のシグナルに比例する。その他の条件は、定量化の達成を可能にし、捕捉要素３６、または標的要素３７に対するシグナリング実体３４の濃度および親和性を変更することにより当業者には明らかであろう。
【０１５６】
適用：腫瘍細胞の検出
標的要素が腫瘍細胞のセクレトームの特異的マーカーである場合、その検出は、カプセル化された単一のまたは凝集した腫瘍細胞を検出するために十分であり得る。
【０１５７】
標的要素が腫瘍細胞のセクレトームの特有のマーカーであるが、腫瘍細胞に対して特異的でない場合、腫瘍細胞のセクレトームの特有のマーカーを構成する１若しくは複数の他の標的要素と組み合わせたその検出は、単一のカプセル化細胞が腫瘍細胞であることを検出することを可能にし得る。
【０１５８】
計測ステップに従って、液滴、単一細胞としてまたは細胞の凝集体でカプセル化された細胞の腫瘍性質に関する情報を得る。
【０１５９】
この情報は、どの液滴が他の計測または用途のために下流で回収される必要があるか知ることを可能にする。
【０１６０】
これにより、その方法は、種々雑多な細胞を含む生体サンプルから単離された腫瘍細胞を検出することを可能にする。非腫瘍細胞または標的要素を産生しない腫瘍細胞は、それらの液滴が標的要素を含んでいないため、シグナリング実体が再配置されないので、同定される。従って、この方法は、生体サンプルからの細胞集団中の腫瘍細胞を検出するか、さらにはカウントすることを可能にする。
【０１６１】
適用：腫瘍細胞の特徴づけ
カプセル化単一細胞が腫瘍細胞だけである場合、標的要素の計測は、単一の腫瘍細胞による標的要素の産生に関連する情報、例えば、濃度、を得ることを可能にし得る。
【０１６２】
カプセル化細胞の凝集体が１若しくは複数の腫瘍細胞を含有する場合、標的要素の計測は、細胞の凝集体による標的要素の産生に関連する情報、例えば、濃度、を得ることを可能にし得る。
【０１６３】
計測ステップに従って、情報は、液滴中にカプセル化された各腫瘍細胞の１若しくは複数の特徴、または液滴中にカプセル化された１若しくは複数の腫瘍細胞を含む各凝集体に関して得られる。
【０１６４】
この情報は、腫瘍細胞の不均一または特性に関する情報を得ることを可能にする。
【０１６５】
適用：腫瘍細胞の検出と特徴づけ
計測中、情報は、例えば、標的要素を検出し、そして、その濃度を計測することによって、細胞の腫瘍性質、および腫瘍細胞の特徴の両方に対して得ることができる。
【０１６６】
加えて、複数の標的要素を検出することによって、多量の情報を同時に得ることができる。例えば、特定の標的要素は腫瘍マーカーであり、そして、セクレトームの他の要素、例えばタンパク質またはペプチドなどは、特異的な腫瘍マーカーではない。
【０１６７】
計測ステップに従って、液滴中にカプセル化された各腫瘍細胞の特徴に関する情報が得られる。
この情報は、腫瘍細胞の不均一と様々な機構に関する情報を得ることを可能にする。
【０１６８】
第２の装置
図４〜図７は、本発明による第２の装置６０の一部分を示す。
【０１６９】
この第２の装置６０は、デバイス２０がチャンバー６２を備える点で第１の装置１と異なる。チャンバー６２は、複数の循環路６４および複数の分離パッド６６を含む。
【０１７０】
その他のチャンバーもありうる。一代替例において、チャンバーは、文献ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３９６に記載される分離パッドを含まない。
【０１７１】
チャンバー６２は、凝集ステップまたは配向ステップ中、および計測ステップ中に、キャリア流体８中の複数の液滴６を貯蔵するためのものである。
【０１７２】
第２の装置６０の計測セットは、チャンバー６２内に存在する複数の液滴６の物理的パラメータを同時に計測できる点で、第１の装置１の計測セット１４と異なる。
【０１７３】
図４は、キャリア流体８中の初期液滴３２を含有するチャンバー６２を示す。磁性粒子１２の分散体を目視できる。図５は、液滴中で凝集体１０が形成された後の同じチャンバー６２を示す。複数の細長い凝集体が各液滴６内に形成されている。図６は、同じデバイス６０内の、細長い凝集体１０を有する複数の液滴６を示す。液滴６の性質および量は、液滴１個当たり単一の細長い凝集体１０のみが存在するように調整されている。液滴６当たり単一の凝集体１０が存在することにより計測が容易になる。図７は、同じ検出軸Ｄに沿って凝集体を配向させるステップの後の同じチャンバー６２を示す。
【０１７４】
第２の装置を用いた分析方法
この第２の装置６０からの本発明による分析方法は、例えば、液滴６が検出器の前を循環することによってではなく、チャンバー６２全体を同時に計測することによって、計測が複数の液滴６に対して同時に行われるという点で、前述の方法と異なる。
【０１７５】
この方法の一つの利点は、液滴が静止しているので、経時的に同じ液滴の物理的パラメータの計測を反復することが可能であり、これにより、セクレトームの要素の分泌動態を決定することができる点である。
【０１７６】
この方法はまた、計測ステップの前に、検出軸Ｄに沿って凝集体１０の主軸Ｘを配向させるステップを含むという点でも異なる。
【０１７７】
有利には、可変方位（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の磁場を印加することにより、検出軸を増加することができる。このアプローチは、液滴中の他の非磁性物体からの凝集体１０の識別、または渦流シグナルの低減が可能であるという利点を有する。例えば、バックグラウンド蛍光ノイズを低減することができる。例えば、異なる軸に沿った検出は、凝集体１０上でのシグナリング実体３４の再配置を、液滴６内の別の物体、例えば細胞上でのシグナリング実体３４の再配置から区別することを可能にする。
【０１７８】
この概念の実現は、第１の方位Ｄ１において凝集体１０の主軸Ｘを整列させるために磁場Ｂ１を印加し、次いで、Ｄ１に対して垂直な第２の方位Ｄ２に沿って凝集体１０の主軸Ｘを整列させるために、Ｂ１に対して垂直な磁場Ｂ２を印加することからなる。
【０１７９】
第３の装置
本発明による第３の装置７０を図８に示す。この第３の装置７０は、分類セット７２をさらに備える点で第１の装置１と異なる。
【０１８０】
さらに、第３の装置７０は、充填セット２８が、内相入口領域７４並びにキャリア流体入口領域７６および連結領域７８を含むという点で、第１の装置１と異なる。充填セット２８は、インキュベーション領域７９をさらに含む。
【０１８１】
内相入口領域７４は、第１の入口導管８０、第２の入口導管８２、および合流導管８４を備える。
【０１８２】
第１の入口導管８０は、液滴の内相の一部分を形成することを意図とした第１の流体塊８６を導入することを意図するものである。この例では、第１の内部流体塊は、粒子１２および複数のシグナリング実体３４を含んでいる。
【０１８３】
第２の入口導管８２は、液滴内相の一部分を形成するための第２の流体塊８８の入口を意図するものである。この例では、第２の内部流体塊は、標的要素３７を産生する腫瘍細胞９０を含むことができる細胞懸濁液を含む。
【０１８４】
第２の流体塊中の細胞９０の濃度は、有利には液滴の相当な部分が１個の細胞９０のみを含有する、例えば液滴の１０％超が１個の細胞９０を含有することになる。
【０１８５】
合流導管８４は、内相を形成するための流体塊８６、８８両方の配給を可能にする。
【０１８６】
キャリア流体入口領域７６は、キャリア流体８の入口を意図するものである。図示された例では、キャリア流体８は、２つの入口導管９２を通って流入する。
【０１８７】
連結領域７８は、キャリア流体入口領域７６と内相入口領域７４とを連結する。特に、連結領域は、合流導管８４をキャリア流体入口導管９２に連結する。
【０１８８】
連結領域７８は、初期液滴３２を形成することができる。本明細書に図示された連結領域７８は、流体力学的集束連結部（hydrodynamic focusing junction）である。流体力学的集束連結部の例は、図１１および図１２に示される。あるいは、初期液滴３２は、Ｔ形連結部において形成される。
【０１８９】
流体塊８６と流体塊８８との混合物を含む初期液滴３２が形成される。初期液滴３２は、粒子１２およびシグナリング実体３４の分散体を含む。
【０１９０】
少なくとも特定の初期液滴３２は、単一または細胞凝集体の形態での、細胞９０をさらに含む。
【０１９１】
インキュベーション領域７９は、連結領域７８の下流に位置する。インキュベーション領域は、単一または細胞凝集体の形態での、細胞９０による標的要素３７の分泌を可能にするためのものである。
【０１９２】
有利には、チップは、インキュベーション領域７９内の酸素を供給するかまたは交換する手段を含む。
【０１９３】
あるいは、インキュベーションは、デバイス２０の外部で実施される。
【０１９４】
第３の装置７０はまた、デバイス２０が、複数の分類領域９４、９６、および液滴または一部の液滴を分類領域９４、９６に向けて選択的に誘導するための手段９８をさらに含むという点でも異なる。
【０１９５】
分類領域９４、９６は、検出領域２６の下流に位置する。導管２４は、２つの出口導管１０２、１０４を有する分岐１００を備える。第１の分類領域９４は、第１の液滴群１０６を受け取るための第１の出口導管１０２を備える。第２の分類領域９６は、第２の液滴群１０８を受け取るための第２の出口導管１０４を備える。あるいは、デバイス２０は、選別基準の数に応じて、より多くの分類領域９４、９６を備える。
【０１９６】
選択的に液滴を誘導するための手段９８は、例えば、磁力によって１個の液滴６を分類領域９４、９６へと誘導することができる。
【０１９７】
あるいは、液滴６は電極によって誘導される。
【０１９８】
例えば、液滴は、誘電泳動によって、電流を有する電気合体（electrocoalescence with a current）によって、または弾性表面波（ＳＡＷ）によって、分類領域へと誘導される。
【０１９９】
第３の装置を用いた分析方法
次に、本発明による第３の装置７０による分析方法について説明する。
【０２００】
前述の装置７０が供給される。磁性粒子１２およびシグナリング実体３４の懸濁液が調製され、第１の入口導管８０に注入される。
【０２０１】
細胞懸濁液を含み得る細胞９０の懸濁液が調製され、第２の入口導管８２に注入される。
【０２０２】
キャリア流体８が供給され、キャリア流体入口導管９２に注入される。
【０２０３】
流体８６、８８は、循環セット２２によって動き始める。初期液滴３２は、連結領域７８において形成される。
【０２０４】
方法は、単一または細胞凝集体の形態での細胞９０が、分析されるべき腫瘍の細胞セクレトームの標的要素３７、例えば、腫瘍細胞セクレトームのタンパク質またはペプチドを分泌、切断または放出できる、インキュベーションステップをさらに含む。これにより、インキュベーションは、特にそれが単一細胞の形態であるとき、細胞９０にとって、腫瘍細胞のセクレトームの少なくとも１個の標的要素３７を産生することができる条件下、かつ、十分な時間にわたって実施される。
【０２０５】
典型的には、インキュベーションステップは、特に患者の生体液から新たに回収した細胞の分析のために、５分間〜３２時間、例えば、約１〜２４時間、または２〜９時間続く。あるいは、インキュベーションステップは、特に解凍した細胞の分析のために、３２〜７２時間、例えば、約３２〜４８時間、例えば、約３６時間続いてもよい。
【０２０６】
一般的に、インキュベーションは、５％のＣＯ2を用いて、３７±１℃にて実施される。そのインキュベーションは、バッファーまたは適当な培地の存在下で典型的には実施される。
【０２０７】
本発明による方法の一つの利点は、本発明による方法の感度のため、特許出願ＥＰ１ ５０６ ４０７に記載のＥＰＩＳＰＯＴ分析法と比較して、インキュベーションステップの継続期間が短縮され得る点である。同等なインキュベーション時間を用いた、少ない容積の液滴中のセクレトーム要素の蓄積のため、検出されるべきセクレトーム要素の濃度は、ＥＰＩＳＰＯＴ法と比較して、本発明による方法ではより高くなる。そのため、本発明による方法の実施は、より速く、かつ、より高感度である。
【０２０８】
液滴６は、有利には、３日間以上液滴中で細胞９０を生かしておくための培地を含む。それは、典型的には、血清の有無にかかわらず、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、のための培地である。
【０２０９】
インキュベーションステップは、デバイス２０のインキュベーション領域７９において実施される。
【０２１０】
あるいは、これらのステップは、デバイス２０の外部で実施される。
【０２１１】
凝集体１０の形成ステップおよび計測ステップは、第１の装置１による分析方法と同様である。
【０２１２】
この方法は、計測ステップの後に分析ステップが続くという点で異なっている。分析ステップは、所定の基準に従って液滴６が群１０６、１０８のいずれに属するかを決定し、計測ステップの後に液滴６ごとに分類決定を行うことを可能にする。
【０２１３】
分類決定に従い、液滴６は、誘導手段９８により分類領域９４、９６のいずれかに誘導される。
【０２１４】
図８に示される例では、強い蛍光強度シグナルの大部分が凝集体１０の近傍に局在化した液滴１０６が、第１の分類領域９４に誘導される。第１の群１０６の液滴は、例えば図２における第３の液滴５６に対応する。
【０２１５】
これらの液滴１０６は、例えば、その中でセクレトームが標的要素３７を含む、唯一であるかまたは腫瘍細胞の凝集体の形態で腫瘍細胞９０を含有する。液滴１０６は、任意選択で回収され、それらの内容物、特にそこに含まれる（単数もしくは複数の）腫瘍細胞が、他の技術によって分析され得るか、あるいは、単一または腫瘍細胞の凝集体の形態での腫瘍細胞９０が再び培養される。
【０２１６】
異なるシグナル、特に液滴１０８における実質的に均質なシグナルが計測された液滴１０８は、別の分類領域９６へと誘導される。第２の群の液滴１０８は、例えば、細胞９０を含有しない液滴、および十分な量または質で腫瘍細胞セクレトームの標的要素３７を産生しない単一細胞９０を含有する液滴を含む。
【０２１７】
生きた腫瘍細胞９０がそれらのセクレトームによって同定され、そして、選別されると、もしかすると、例えば、トランスクリプトーム（遺伝子発現のためのメッセンジャーＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ）、ゲノム、エピゲノム、またはプロテオームの分析などのその後の多数の分析が、液滴の溶解、および液滴内の生きた腫瘍細胞９０の再カプセル化後に実施されてもよい（Alix-Panabieres C, Pantel K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov 2016）。
【０２１８】
トランスクリプトーム分析、特にｍＲＮＡ、腫瘍細胞（特にＣＴＣ）の分析は、薬物感受性および抵抗性に対する非常に重要な情報を明らかにし得る。例えば、転移性および去勢抵抗性前立腺癌における、ＡＲＶ７ ｍＲＮＡの発現では、そのリガンドに対する結合ドメインを持っていないが、活性ＣＴＣを持続する切断型アンドロゲン受容体が、抗アンドロゲン治療法（エンザルタミドおよび／またはアビラテロンを使用する治療法を含む）の失敗を予測させた。しかしながら、ＣＴＣがこのＡＲＶ７ ｍＲＮＡを発現する患者は、タキサン感応性を維持し、そして、ＣＴＣにおけるこのＡＲＶ７スプライス変異体の検出は、これらの患者における適当な治療の選択のためのマーカーになり得る。
【０２１９】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の主要調節因子であるので、潜在的診断マーカーおよび抗癌治療法のための標的になった。インサイチュハイブリダイゼーション技術のおかげで、単一細胞のスケールでの大型ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−１０ｂ）を分析することが可能である。
【０２２０】
ゲノム分析に関して、遺伝子内の突然変異は、治療標的または標的療法の有効性に影響する標的の下流のシグナル伝達タンパク質をコードする。例えば、ＥＧＦＲ突然変異は、肺癌の抗ＥＧＦＲ治療法に影響し、そして、ＫＲＡＳ突然変異−下流ＥＧＦＲタンパク質−は、結腸癌の抗ＥＧＦＲ治療法の有効性を妨げる。最近、結腸直腸癌を患っている患者から入手した何百ものＣＴＣの分析は、ＫＲＡＳ突然変異に関する強い患者内および患者間不均一を示した。変異ＫＲＡＳ遺伝子を担持するＣＴＣは、抗ＥＧＦＲ治療法を逃れるので、それらの早期検出が患者の治療選択を導くのに重要になり得る。
【０２２１】
液滴中で分析された細胞は、エマルションから脱カプセル化されてもよい。エマルションを脱カプセル化するための適切な方法は、５％ ｖ／ｖの１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロ−１−オクタノール（Sigma-Aldrich）の添加と、それに続く１時間のインキュベーションを含む。相が、遠心分離（例えば、３００ｇにて５分間）によって分離され、細胞が２つの相、水相とフッ化相の界面にて回収される。
【０２２２】
細胞の採集を容易にするために、方法は、２つの相の間の遠心分離前に、水相の密度とフッ化相の密度の間の密度（例えば、１．１０ｇ／ｍｌ）の、第３の層の導入を含んでもよい。一般的に、第３の層は、細胞との接触に好適な浸透圧の水溶液である。好適な溶液は、例えば、５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、３ｍＭのＫＣＬ、０．３ｍＭのＣａＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５から成る溶液１００ｍｌ中に２７．６ｇのＮｙｃｏｄｅｎｚ（Progen）を溶解することによって調製される。次いで、細胞は、水相とフッ化相の界面に位置する第３の層中で採集され、これにより、細胞と共にフッ化相を取り出すことを回避する。
【０２２３】
本発明の利点
液滴のサイズに比べて小さいサイズの粒子１２の分散体を使用することにより、液滴６中の粒子１２の均質分布が確保され、したがって各液滴６中に相当なサイズの凝集体１０が形成されることがほぼ確実になる。
【０２２４】
全体として、この方法は、単一細胞または細胞凝集体を含む液滴中の腫瘍細胞セクレトームの要素、例えば、腫瘍細胞セクレトームのタンパク質またはペプチドなどをアッセイする／定量化することを可能にする。
【０２２５】
細長い凝集体１０の形成は、単一のビーズをカプセル化するMazutisら（Nat prot 2013）に記載の試験と比較して、より良好なシグナル対ノイズ比およびより大きなダイナミックレンジを得ることを可能にする。実際に、シグナリング実体３４により生成されるシグナルは、表面積が等しい球体の幅よりも小さい幅に集中する。したがって、図２に示されるピークの高さは、再配置した同数のシグナリング実体３４では、単一のビーズの場合よりも高くなる。
【０２２６】
この方法は、多くの生物学的分析方法で使用することができる。本発明による方法は、複数のタイプのセクレトーム要素、特にセクレトームのタンパク質またはペプチドに適用され得る。
【０２２７】
特に、本願発明は、単一または腫瘍細胞の凝集体の形態のいずれかで、腫瘍細胞の表現型のタイピング、セクレトーム分析、および分子分析をすることによって、リアルタイムで、癌の液状生検検体を非常に完全な形で分析することを可能にする。
【０２２８】
本発明による装置は、１つの技術要素として、より複雑なデバイス、特に高速大量処理スクリーニングデバイス、ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ、実験室用計器、ロボットまたはその他のデバイス内の「ポイントオブケア」デバイスに組み込むことができる。
【０２２９】
さらに、本発明による方法は、診断、薬物の発見、標的の発見、薬物の鑑定を可能にする複雑な手順に組み込むことができる。
【０２３０】
さらに、本発明によるマイクロ流体システムおよび本発明による方法は、他の種類のマイクロ流体部品に組み合わせるか含めてもよく、最先端技術において公知となっている他のマイクロ流体機能と組み合わせるか含めてもよい。
【０２３１】
本発明は、各種光学的方法、特に光学検出方法と組み合わせたとき、さらに特に有用になりうる。
【０２３２】
本方法は、例えば、セクレトーム中の標的要素３７の存在、分泌、放出または切断された標的要素３７の濃度、を決定し、その結果、液滴６中で標的要素３７を産生する腫瘍細胞の特徴を確立する際に適用できる。
【０２３３】
この方法は、興味深い特徴を有する、特に単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞の凝集体を含有している、液滴のさらなる選別、捕捉および抽出を可能にする。
【０２３４】
一例において、この方法はサンドイッチの形成を含み、標的要素３７は、一方では粒子１２の捕捉要素３６に結合し、他方ではシグナリング実体３４に結合し、シグナリング実体３４は蛍光性である。
【０２３５】
一例において、捕捉要素３６は、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体である。一例において、シグナリング実体３４は、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗体である。一例において、標的要素３７は、ペプチドまたはセクレトームタンパク質である。
【０２３６】
一例において、捕捉要素３６は、核酸、特にＤＮＡプローブまたはアプタマーである。一例において、シグナリング実体３４は、核酸、特にＤＮＡプローブである。一例において、標的要素３７は、セクレトームの核酸、特に二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【０２３７】
一例において、捕捉要素３６は、膜に存在するまたは膜に結合されたタンパク質に向けられた、脂質またはステロールに向けられた、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはナノボディ、あるいは、アプタマーである。一例において、シグナリング実体３４は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。一例において、標的要素３７はエクソソームである。別の例において、捕捉要素３６−標的要素３７またはトリプレット捕捉要素３６−標的要素３７−シグナリング実体３４のいくつかの組は、別個の性質のいくつかの標的要素３７の存在を検出するために、同時に分析されてもよい。
【０２３８】
例えば、図１３における液滴に示されているように、液滴は、性質の異なる複数の標的要素３７ａ、３７ｂ、およびそれぞれ標的要素３７ａ、３７ｂのいずれかと複合体を形成することができる複数のシグナリング実体３４ａ、３４ｂを含む。凝集体１０の特定の粒子１２は、第１の標的要素３７ａの捕捉に適合した捕捉素子３６ａを含み、他の粒子は、第２の標的要素３７ｂの捕捉に適合した別の捕捉要素３６ｂを含む。
【０２３９】
いくつかの用途において、粒子１２の凝集は可逆的である。
【０２４０】
一部の場合において、標的要素３７の存在は、凝集を不可逆にし、凝集セット３０における形成時に凝集体１０を固化させる。したがって、凝集体１０は、標的要素３７を含有する液滴６中にのみ、安定的に先在する。標的要素３７を含有しない液滴では、凝集体１０が読み取り領域２６に入っていない限り、粒子１２凝集の可逆性により、凝集体１０は溶解する。選択された磁化および流体工学の条件において、凝集体１０は、この前凝集体が存在する場合にのみ、自身を形成し配向させることが可能になる。前凝集体は、シグナリング実体３４を介するよりも別の方法により、閾値要素３７を含有する液滴に、図２に従うピークの取得を限定する。
【０２４１】
本発明によって、特に、生体液から単離した腫瘍細胞の検出および／または特徴づけにおける適用を見出した。各細胞は、腫瘍細胞セクレトームの多数の要素、特に、特定の数のタンパク質またはペプチド、特に、腫瘍細胞を同定するための１若しくは複数の腫瘍マーカーをインビトロにおいて放出、分泌または切断し得る。本発明はまた、単一または細胞の凝集体の形態の、細胞のセクレトームを試験または特徴づけすることを可能にし、そしてそれが、特に本発明による腫瘍細胞を検出する方法によって、それらの特徴を前もってまたは同時に、腫瘍細胞と同定されたであろう。
【０２４２】
腫瘍細胞は、例えば、血液から単離された、略語「ＣＴＣ」によって以下に示される、生きた循環腫瘍細胞、または骨髄から単離された、頭文字「ＤＴＣ」によって以下に示される、生きた播種性腫瘍細胞、またはその他の生体液、例えば、尿または脳脊髄液（ＣＳＦ）由来の生きた腫瘍細胞である。
【０２４３】
遠隔転移をもたらすことができる侵襲性の転移性癌細胞は、本発明が適用される細胞の中に入っている。特に、血流中の凝集性ＣＴＣは、単離されたＣＴＣよりはるかに高い転移可能性を有する可能性がある。
【０２４４】
本発明には、生きたＣＴＣの分析を可能にし、これにより、これらの細胞の機能性を試験する利点があるが、それに対して、従来技術の技術は、分析前にＣＴＣの分離および固定を伴う。
【０２４５】
腫瘍細胞とは、固形癌または液性癌（白血病、リンパ腫）の癌細胞であってもよい。
例えば、腫瘍細胞は、固形癌、例えば、乳房、前立腺、結腸、直腸、甲状腺、皮膚、肝臓、睾丸、卵巣などの癌を患っている患者の生体液から単離され得る。
【０２４６】
腫瘍細胞は、特にヒト細胞または、例えば、齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）、霊長目動物（例えば、サル）、イヌ科の動物（例えば、イヌ）またはネコ科の動物（例えば、ネコ）などの動物細胞である。
【０２４７】
有利には、細胞は、それらのカプセル化の前に標識される。実際には、細胞は、細胞または細胞凝集体のレベルで（単数もしくは複数の）標識化抗体によって発せられたシグナルを検出することによってカプセル化細胞またはカプセル化細胞の凝集体の腫瘍性質を同定するために、例えば１若しくは複数の膜腫瘍マーカーに向けられた１若しくは複数の（例えば、蛍光色素を用いた）標識化抗体であらかじめ標識されてもよい。この検出は、静的な様式などで循環液滴に対して実施されてもよい。
【０２４８】
例として、（単数もしくは複数の）標的要素は、例えばＣＫ１９などのサイトケラチンであってもよい。
【０２４９】
あるいは、（単数もしくは複数の）標的要素は、例えば、（乳房のための）マンマグロビン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）または（前立腺のための）ヒトカリクレイン３（ｈＫ３）などの組織マーカーであってもよい。
【０２５０】
あるいは、（単数もしくは複数の）標的要素は、例えば、「ヒト腺性カリクレイン」（ｈＫ２）、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、チログロブリン、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）、ＣＡ−１２５、カテプシンＤ、α−フェトプロテイン、Ｓ１００タンパク質、繊維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの間葉系マーカーであってもよい。
【０２５１】
一例において、単一の腫瘍細胞９０は、前立腺腫瘍細胞であり、そして、少なくとも１個の標的要素３７は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。このマーカーは、前立腺癌に特異的である。粒子１０にグラフトされた捕捉要素３６は、抗ＰＳＡ一次抗体である。シグナリング要素３４は、特に、例えばＡｌｅｘａ５５５などの蛍光色素を用いて標識される抗ＰＳＡ二次抗体である。このマーカーは、前立腺癌に非常に特異的である；独特のその存在は、細胞を、前立腺癌由来の腫瘍細胞と特徴づけることを可能にする。
【０２５２】
別の例では、数種類のマーカーが、腫瘍細胞を特徴づけるように、組み合わせで検出される。例えば、一部のマーカーは、あるタイプの癌に特異的でないが、２個の別個のマーカーの同時存在は、癌のタイプを同定することを可能にする。癌のタイプを同定するのに好適なマーカー組み合わせの選択は、当業者の能力の範疇にある。
【０２５３】
よって、ＶＥＧＦマーカーは、多くの腫瘍細胞のセクレトームに存在している。しかしながら、他のマーカーを伴ったその存在は、癌を特徴づけることを可能にする。同様に、ＦＧＦ２マーカーのみの存在は、それ自体は、癌を特徴づけするために不十分である。
【０２５４】
図１３に示される実施例において、これにより、いくつかのタイプの分泌標的要素の存在を分析することが可能である。それぞれのサンドイッチ型免疫学的アッセイでは、単一の腫瘍細胞９０によって分泌された別個の標的要素３７ａ、３７ｂを検出する。
【０２５５】
そのため、それぞれの蛍光シグナルの計測は、細胞の性質または表現型に関する情報を有することを可能にする。好ましくは、シグナリング実体３６は蛍光色素を含む。別個の蛍光色素は、好ましくは別個の標的要素のそれぞれの特異的結合パートナー、および特に別個の腫瘍マーカーに関連している。
【０２５６】
よって、その特に有利な実施形態において、本発明による方法は、ＥＰＩＳＰＯＴ多様性蛍光性タイプの方法によるＣＴＣまたはＤＴＣの検出を可能にし、そしてそれは、別個の組の抗体と別個の蛍光色素を使用する。蛍光色素の例としては、緑色のＡｌｅｘａ４８８、赤色のＡｌｅｘａ５５５、青色のＡｌｅｘａ３５０などが挙げられる。
【０２５７】
単一の腫瘍細胞について分析され得る標的要素３７の数は、捕捉要素およびシグナリング実体と機能化粒子の組を選択することによって、実験の上流で選択される。例えば、９個超の別個の蛍光チャンネルに関して測定をおこなうことが可能である。これは、例えば、９種類を超える単一の腫瘍細胞のセクレトーム要素の同時測定が実施されることを可能にする。
【０２５８】
腫瘍細胞の獲得
本発明の有利な特徴によると、検出方法は、生体サンプル中に存在するＣＴＣまたはＤＴＣを濃縮する予備的なステップを含む。
【０２５９】
生体サンプルの細胞の濃縮は、細胞表面上に発現されるマーカーの発現、細胞のサイズ、密度または電荷に基づいてもよい。例えば、ＣＴＣは、白血球除去または濾過によって血液から単離され得る。
【０２６０】
生体サンプルの細胞の濃縮は、例えば、上皮細胞の膜特異的タンパク質、例えば、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）の発現に基づく、細胞の陽性ソーティングか、またはＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６によって例示されるような、望ましくない造血細胞の表面上の特異的マーカーの発現に基づく陰性細胞のソーティングのいずれかから成り得る。
【０２６１】
細胞は、大細胞を保持し、より小さいサイズの造血細胞が通過する膜濾過器の使用によってそれらのサイズに従って選別されてもよい。細胞は、特定のグラジエントによる遠心分離によってそれらの密度に従って選別されてもよい。
【０２６２】
細胞は、誘電泳動の使用によりＣＴＣ／ＤＴＣが造血細胞のものと異なる荷電を有しているので、それらの電荷に従って誘電泳動によって選別されてもよい。
【０２６３】
当業者に知られている生存細胞を得るためのその他の濃縮方法が、本発明の目的に好適である。そのため、それは、ＣＴＣ／ＤＴＣの機能性を維持するために、ＣＴＣ／ＤＴＣの固定または透過化を実装しない方法である（Alix-Panabieres and Pantel, Expert Rev Mol Diagn 2015; 15(11): 1411-7）。
【０２６４】
濃縮ステップ後に得られた細胞はまた、液滴中の腫瘍であると同定され得る。一実施形態によると、濃縮された細胞は、１若しくは複数の腫瘍細胞表面マーカーに向けられた（特に蛍光による）標識抗体で標識される。次いで、腫瘍細胞は、それらの膜で、特に蛍光によって、標識されるようになる。一例として、細胞は、（１）いずれかの上皮細胞を同定するために細胞表面のＥｐＣＡＭおよび／またはＥ−カドヘリンの発現を検出するための、抗ＥｐＣＡＭ蛍光抗体および／または抗Ｅ−カドヘリン蛍光抗体、および／または（２）前立腺の腫瘍細胞を同定するための蛍光抗ＰＳＭＡ抗体（前立腺特異的膜抗原）、および／または（３）上皮−間葉移行（ＥＭＴ）を経験した間葉系細胞を同定するための抗蛍光性抗Ｎ−カドヘリン、および／または（４）ＥＭＴ中に過少発現されず、かつ、上皮および間葉系腫瘍細胞の検出を可能にする新しいマーカー、プラスチン３を標的化する抗プラスチン３抗体、によって標識され得る。このステップは、サンプルの細胞のカプセル化に先行し、そして、ＣＴＣまたはＤＴＣの表現型を決定することを可能にする。
【０２６５】
本発明は、理論上、液滴の数が制限されないので、実施の際に、例えば、最大１００，０００個、さらには最大１，０００，０００個の液滴にさえ到達し得るので、特に有利である。これにより、細胞を含まない液滴または非濃縮細胞を有することが可能である。カプセル化細胞が腫瘍性でない場合、シグナルが異なるので、その液滴は処分される。これにより、システムは、精製を精緻なものにすることを可能にする。そのため、それは、ＣＴＣが豊富でない生体サンプルからの実施に好適である。
これは、血中の希少な腫瘍細胞、例えばＣＴＣなどを検出するのに特に有利である。
【実施例】
【０２６６】
この方法の適用例を以下に説明する。
【０２６７】
以下の実施例の手順は、
−  粒子１２、シグナリング実体３４および標的要素、または液滴中で標的要素を生成できるか、それを放出できるか、もしくはそれを切断できる細胞を含有する、複数の水溶液の調製、
−  液滴生成チップの入口での前記水溶液の注入、
−  試験の全試薬を含む液滴の生成、
−  液滴を含有する溶液のインキュベーション、
−  本発明による装置（実施例１および２はそれぞれ第１の装置１または第２の装置６０に相当する）への液滴の注入、
−  試験の結果の計測、
−  任意選択で計測値に応じた液滴の選別、
を含む。
【０２６８】
実施例１：液滴生成およびタイプ１液滴計測用デバイス
区画化とも称される、液滴の生成は、試薬溶液およびオンチップサンプル溶液をを混合した後に行う。
【０２６９】
試薬およびサンプルの変質を避けるために、区画化まで溶液を氷中に保存する。
【０２７０】
区画化を開始する直前に、ミネラルオイル（Sigma Aldrich、#330760）を満たした１ｍＬのHamilton製シリンジに接続したタンクへと、試薬溶液を吸引する。
【０２７１】
スクリーニング対象サンプルを、区画化の直前に希釈標準溶液と混合し、次に、あらかじめフッ素化オイル（3M、NOVEC HFE-7500）を満たしたガラスバイアルに移し、そのバイアルを氷上で４℃に維持する。
【０２７２】
有利にはＰＴＦＥ製の内径０．３ｍｍキャピラリー（Fischerから販売、#11919445）により、バイアルおよび試薬溶液のタンクを液滴形成用デバイスに接続することを可能にする。
【０２７３】
これらの溶液の両方を、液滴形成用チップに注入し、両溶液のそれぞれの等容積を含む液滴の生成を可能にする。
【０２７４】
液滴の容積は、フッ素化オイルの流量に基づいてユーザーが選択する。有利には、液滴の容積は３３ピコリットルである。フッ素化オイルはキャリア流体８となる。キャリア流体８は液滴を含むエマルションの連続相を形成する。
【０２７５】
試験試薬の溶液とスクリーニング対象試験サンプルの溶液とを、同じ流速で、有利には各溶液について２００マイクロリットル／時間で、チップに注入する。流速は、標準シリンジポンプシステム、例えばCetoni製ｎｅＭＥＳＹＳポンプによって、または圧力制御ポンプ、例えばFluigentによって市販されているシステムによって、向上する。
【０２７６】
液滴は、図１１および図１２に示される流体力学的集束連結部において生成される。ここで、外相は、２質量％／容積の界面活性剤（例えば、２つのペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ）尾部（分子量約６，０００ｇ／ｍｏｌ）および１つのＰＥＧ頭部（約６００ｇ／ｍｏｌ）を含むトリブロックコポリマーを添加した、フッ素化オイル（3M、NOVEC HFE-7500）である。
【０２７７】
図１１および図１２は、他の試薬と混合された磁性ビーズを含有する流れと、右側に位置する流体力学的集束連結部における液滴形成前のサンプルを含有する流れとを混合することを可能にする流れ集束デバイスを表している。図１１において、磁性粒子の直径は５００ｎｍであり、図１２において、磁性粒子の直径は２００ｎｍである。
【０２７８】
第２のステップは収集ステップである。有利にはリング形磁石（Amazing magnets製H250H-DM）により発生させた磁場の下で４℃に維持したバイアルにより、液滴の収集を可能にする。短いキャピラリーにより、バイアルをチップに接続することを可能にする。理想的には、出力キャピラリーは２０ｃｍ未満であり、有利には１０ｃｍである。
【０２７９】
有利には３７℃にて２０〜９０分間、磁場下で、液滴がインキュベートされるように設定するが、時間およびインキュベーション温度は、実施される分析、並びに産生実体９０の種類および調査される標的要素３７の種類に依存する。
【０２８０】
インキュベーションの後に、エマルションを含有するバイアルを移し、常に磁場下で４℃に維持する。
【０２８１】
第１タイプのデバイスは、図１に記載された本発明によるデバイスである。
【０２８２】
液滴を含有するバイアルは再注入のためにチップに接続され、バイアルは、一方ではチップに接続され、他方では、圧力システム、加圧ポンプまたはシリンジおよびそのポンプに接続されて、循環セット２２を形成する。
【０２８３】
離隔セット３１は、チップに接続された２つのオイル入口を含む。これらの入口は、図９に示すように、エマルションの液滴を離隔することを可能にするオイル、有利にはフッ素化オイルを注入するためのものである。
【０２８４】
離隔オイルの流速は、有利にはそれぞれ３００マイクロリットル／時間に設定し、循環セットの流速は、有利には５０マイクロリットル／時間に設定し、流速および液滴の再注入周波数を調整して２５０〜１，０００Ｈｚの間に含まれる周波数が得られるようにする。
【０２８５】
一対の永久磁石３８、有利にはK&J Magneticsによって供給される#BC 14-N52を、主チャネル２４周囲のチップの両側に配置した。これらの磁石３８は、液滴再注入の際にビーズ凝集体を発生させ配向させるためのものである。
【０２８６】
液滴の分析および選別のために、設備、例えばレーザーまたは光電子増倍管を制御するためのソフトウェアを作製した。選別システムは、実時間でシグナルの分析を実施するためにＦＰＧＡカードを必要とする。
【０２８７】
離隔セット通過後、滴下１個ごとに計測を行い、図１０に示された読み取り領域の後で、これらの液滴を選別して所望の出口に向けることができる。
【０２８８】
選別および回収が所望される場合、選別液滴および非選別エマルションを氷上に収集し、標準的手順により液滴の内容物を回収する。
【０２８９】
実施例２：タイプ２の液滴の計測用デバイス（第２のデバイス６０）
第２タイプの計測デバイスは、二次元平面内で生成された液滴を貯蔵するためのチャンバーである。この例には、斯かるチャンバーを作製するための２つの可能な選択肢がある。
【０２９０】
第１の選択肢は、ＰＤＭＳにおける従来の微細製造によって作製されたチャンバーであり、図４〜図７に示されるような、チャンバーの崩壊を避けるために規則的に配置されたピラー（pillars）を有利には含む。
【０２９１】
第２の選択肢は、発明ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５１３９６によるガラスチャンバーである。有利には、このアプローチは、液滴を動かすことなく長期間（１時間超）にわたって液滴のインキュベーションを行うことを可能性にする。したがって、液滴形成後、斯かるチャンバー内に液滴を直接収集してもよい。
【０２９２】
一例において、計測デバイスは、例えば、ガラスチャンバー内の二次元読み出しデバイスである。磁場は、貯蔵チャンバーのいずれかの側に配置した、好ましくはK&J Magnetics, # BY042Ｋによって供給される１組の永久磁石３８によって作り出される。これらの磁石３８は、チャンバー内に貯蔵された液滴内のビーズ凝集体を発生させ配向させるためのものである。
【０２９３】
磁性ビーズラインに再配置されたシグナリング実体３４の蛍光シグナルは、落射蛍光顕微鏡法で計測される。
【０２９４】
実施例３：タイプ１計測デバイスにおける腫瘍マーカーの定量化
この実施例の目的は、腫瘍マーカーの定量化を実証することである。
この実施例では、標的要素３７は、腫瘍マーカー、より特に、スクリーニングされる溶液にすでに含まれている血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）血管新生マーカーであり、この実施例は細胞を実装しない。
【０２９５】
この実施例では、液滴は測定すると３３ピコリットルである。
【０２９６】
液滴の調製は：
−  粒子１２、シグナリング実体３４を含有する「試薬溶液」、および以下の実施例の標的要素を含有する「スクリーニング対象サンプル溶液」と称される、２種類の水溶液の調製、
−  液滴を生成するためにチップ入口に両方の水溶液を注入すること、
−  両方の溶液のそれぞれの等容積を含む液滴を生成すること、
−  タイプ１デバイス内で液滴を計測すること、
を含む。
【０２９７】
前記試薬溶液は：
−  粒子１２、コロイド状磁性粒子であって、ここでは、例えばストレプトアビジンを結合させた粒子（例えば、Ademtechのストレプトアビジンプラス粒子）などであり、そしてそれは、捕捉要素３６、例えばビオチンと結合させたＶＥＧＦ特異的抗体（例えば、抗体Ref 500-P10GBt、Peprotech）で機能化される。他の固定方法が可能であり、例えば、カルボキシルと１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）粒子の使用などが当業者に知られている；
−  シグナリング実体３４、ここでは、蛍光分子で機能化された、ＶＥＧＦに対する抗体、例えばＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳエステル）もしくは同様のもので機能化されたベバシズマブ（Montpellier University Hospitalによって供給）などである。フルオロフォアまたは機能化方法の他の組み合わせも可能である；および
−  液滴６の検出のための色素、例えば、スルホローダミンＢ、
を含む。
【０２９８】
これらの試薬を「希釈標準溶液」と称される溶液で希釈する。希釈標準溶液は：
−  ＲＰＭＩ１６４０（Eurobio, Ref CM1RPM00-01）、
−  Ｌ−グルタミン ２００ｍＭ／１００×（Eurobio, Ref CSTGLU00）：最終的に１％、
−  インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）１００×（GIBCO, Ref 51300-044）：最終的に１％、
−  非働化ウシ胎仔血清１０％（Eurobio, Ref CVFSVF00-01）、ＥＧＦ、ヒト（上皮細胞成長因子）−Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（Ref 130093564）：最終的に２０ｎｇ／ｍＬ、
−  ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）−Ｍｉｌｔｎｅｙｉ（Ref 130097750）：最終的に１０ｎｇ／ｍＬ、
−  抗生物質（１０，０００ＩＵ／５００ｍＬのペニシリンＧ＋１ｍｇ／５００ｍＬのゲンタマイシン）、
−  ２５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４にて、
−  ０．１％ ｖ／ｖのＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（Life Technologiesから供給）、
を含む。
【０２９９】
磁気コロイド粒子１２は使用前に処理する。粒子１２は、貯蔵溶液中のChemicellから供給される粒子（ScreenMAG）またはAdemtechから供給される粒子（Bio-Adembeads）である。有利には、ストレプトアビジン（または同様のもの）は、供給業者（Ademtechストレプトアビジンプラスビーズなど）によって粒子上にすでに固定されている。貯蔵溶液を取り除くために、これらを磁性媒体上に保持し、次いで、それらを１０ｗ／ｗ％、有利には粒子の初期容積の１０倍にて、過剰量のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（Sigma Aldrich）中に懸濁させ、そして、超音波浴中で４℃にて１５分間インキュベートする。
【０３００】
この処理の後、磁性コロイド状粒子１２をＰＢＳで２回洗浄し、希釈標準溶液中に懸濁させる。この溶液中に、捕捉分子のビオチン化バージョンを１時間かけて（室温）過剰に加える。
【０３０１】
有利には、粒子１２を２回洗浄し、希釈標準溶液中に懸濁させる。
蛍光試薬は、試薬の凝集体の痕跡を取り除くために、使用前に、少なくとも１２，０００ｇ、４℃にて５分間遠心分離する。
【０３０２】
スクリーニング対象サンプル溶液は：
−  捕捉要素３６によって捕捉することができる標的要素３７、ここでは、ＶＥＧＦ；および
−  希釈標準溶液、
を含む。
【０３０３】
スクリーニング対象サンプル溶液は、希釈標準溶液で希釈した様々な濃度の標的要素３７（ＶＥＧＦ）（例えば、Genscriptから供給される）を含む（上記を参照）。
スクリーニング対象サンプル溶液中の標的要素３７（ＶＥＧＦ）の濃度は、０ｎＭ、５ｎＭ、２０ｎＭまたは５０ｎＭである。
【０３０４】
試薬溶液は、以下の試薬：
−  捕捉要素３６で機能化された磁性粒子０．１６％ ｗ／ｖ、ここでは、先に記載したＶＥＧＦ特異的抗体、
−  ５０ｎＭの適切なシグナリング実体３４、ここでは、蛍光分子を結合した別の特異的ＶＥＧＦ抗体、
−  １μＭのスルホローダミンＢ（液滴のマーキング用）、
を含む。
【０３０５】
この溶液は、希釈標準溶液によって完成する（上記を参照）。
【０３０６】
これは、それぞれ０ｎＭ、２．５ｎＭ、１０ｎＭまたは２５ｎＭの標的要素３７（ＶＥＧＦ）を伴った４種類の別個のエマルションを得ることを可能にする。
【０３０７】
次いで、シグナリング実体３４、例えばＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８または６４７などのフルオロフォアの蛍光を計測するタイプ１デバイスによって、液滴を分析する。
【０３０８】
実施例４：タイプ１計測デバイスにおける同時の２種類の腫瘍マーカーの定量化
この実施例の目的は、同時に２種類のシグナリング実体（２種類の腫瘍マーカー）の定量化を実証することである。この実施例は、２種類の別個の標的要素３７を同時測定することが異なるが、すべての点で実施例３に類似している。２種類の標的実体は、腫瘍マーカー、ＶＥＧＦとＣＫ１９［サイトケラチン１９］である。
【０３０９】
試薬溶液は：
−  粒子１２、ここでは、コロイド状磁性粒子であり、適当な方法、例えばビオチン−ストレプトアビジン対などによって固定される、２種類の捕捉要素３６、ここでは、特異的ＶＥＧＦ抗体（Ref500-P10GBt、Peprotech）および特異的ＣＫ１９抗体（Progen、KS19.2）で機能化される、
−  第１のシグナリング実体３４、ここでは、好適なフルオロフォア、例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７とベバシズマブの結合体などで蛍光的にマーキングされた特異的ＶＥＧＦ抗体である、
−  第２のシグナリング実体３４、ここでは、フルオロフォアＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８によって蛍光的にマーキングされた（Progen、KS19.1）などの特異的ＣＫ１９抗体である、
−  液滴６の検出を可能にする色素、例えばスルホローダミンＢなど、
を含む。
【０３１０】
これらの試薬を、実施例２で使用したものと同一の希釈標準溶液と称される溶液で希釈する。
【０３１１】
スクリーニング対象サンプル溶液は、以下の：
−  第１の捕捉要素３６によって捕捉されることができる、第１の標的要素３７、ここでは、ＶＥＧＦ、
−  第２の補足要素３６によって捕捉されることが意図される、第２の標的要素３７、ここでは、ＣＫ１９、
−  希釈標準溶液、
を含む。
【０３１２】
スクリーニング対象サンプル溶液は、例えばGenscriptによって提供される、さまざまな濃度の第１の標的要素３７（ＶＥＧＦ）を含有する一方で、例えばMyBioSourceによって提供される、第２の標的要素３７（ＣＫ１９）を希釈標準溶液（上記を参照）で希釈する。
【０３１３】
スクリーニング対象サンプル溶液中の第１の標的要素３７（ＶＥＧＦ）の濃度は、以下のとおりである：０ｎｍ、２．５ｎｍ、１０ｎｍまたは２５ｎｍ。スクリーニング対象サンプル溶液中の第２の標的要素３７（ＣＫ１９）の濃度は、０ｎＭ、２．５ｎＭ、１０ｎＭまたは２５ｎＭである。２種類の標的要素の合計１６種類の濃度の組み合わせを調製する。
【０３１４】
液滴を、２種類のシグナリング実体３４上のフルオロフォア、例えばＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８と６４７などの蛍光を同時に計測するタイプ１デバイスによって分析する。
【０３１５】
実施例５：タイプ１計測デバイスによる単一細胞スケールにおける分泌腫瘍マーカーの定量化
【０３１６】
この実施例の目的は、単一細胞レベルで分泌された腫瘍マーカーを検出し、定量化する可能性を実証することである。この実施例は、標的要素３７（ＶＥＧＦ）がインキュベーションフェーズの間に液滴内の産生実体９０（細胞）によって分泌されることを除いて、あらゆる点で実施例３に類似している。細胞は、結腸癌ＣＴＣ株（ＬＣＣＲＨ研究室において得られたＣＴＣ−ＭＭＣ−４１．４）、またはＣＴＣ濃縮大腸癌患者の細胞集団のいずれかである。第２の場合では、ＣＴＣは、白血球除去を介してＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐプロトコール（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ手順）を用いて濃縮する。
【０３１７】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ技術を使用するＣＴＣの濃縮プロトコールは、以下のとおりである：
−  ＥＤＴＡチューブから５０ｍＬのファルコンに血液（１５ｍＬ）を移し；
−  全血１ｍＬあたり２０μｌのＲｏｓｅｔｔｅ ＳｔｅｍＣｅｌｌ（Human Circulating Epithelial Tumor Cell Enrichment - Ref15167）を加え；
−  Ｍａｃミックスにより少なくとも２０分間混合し、そして、ゆっくり転倒し；
−  供給業者によって推薦される血液量に応じて、ファルコン内に適当な容積のＦｉｃｏｌｌ（Lymphocyte Separation Medium）を入れ；
−  １／２ ＰＢＳ １×／２％ ＳＶＦで血液を希釈し；
−  溶液［血液＋ロゼット＋ＰＢＳ］をＦｉｃｏｌｌの表面にそっと堆積させ、そして、ブレーキなしで１２００ｇにて２０分間遠心分離機にかけ；
−  細胞のリング（循環腫瘍細胞が存在するところ）を伴ったＦｉｃｏｌｌの上部をすべて回収し；
−  ＰＢＳ／ＳＶＦ２％ ｑｓ５０ｍｌで２回洗浄する。
【０３１８】
得られた細胞ペレットは、循環腫瘍細胞を含有しているので、本発明による単一細胞ＥＰＩＳＰＯＴに使用する準備ができている。
【０３１９】
スクリーニング対象サンプル溶液は、実施例３に記載した希釈標準溶液中に懸濁された細胞を含有する。有利には、液滴１個あたりの細胞の濃度は、液滴１個あたり細胞０．３個である。液滴３３ピコリットルを含むエマルションは、今回の場合、１ミリリットルあたり３０．１０6個超の液滴を含む。液滴１個あたり０．３個の細胞を有するためには、スクリーニング対象サンプル溶液中で１ミリリットルあたり約１８．１０6個の細胞の濃度（液滴に対して２回の濃縮）が必要となる。両方の水溶液は５０／５０の比で１個の液滴中に混合されるので、スクリーニング対象サンプル溶液中の細胞濃度は終濃度の２倍になることに留意しなければならない。
【０３２０】
実施例６：タイプ１計測デバイスにおける単一細胞のスケールで同時に分泌された２種類の腫瘍マーカーの定量化
【０３２１】
この実施例の目的は、単一細胞レベルで分泌された２種類の腫瘍マーカーを同時に検出し、定量化する可能性を実証することである。この実施例は、２種類の別個の標的要素３７を同時測定する点が異なるが、すべての点で実施例５に類似している。２種類の標的要素は、腫瘍マーカーＶＥＧＦとＣＫ１９であり、そしてそれらを実施例４のように計測される。
【０３２２】
実施例７：分泌腫瘍マーカーに従った細胞のソーティング
【０３２３】
この実験の目的は、分泌腫瘍マーカーに従った細胞のスクリーニングを実証することである。この実施例は、シグナリング実体３４上のフルオロフォアの蛍光に相当する大きい蛍光シグナルを伴った液滴が、Baretら（Lab Chip 2009, 9, 1850-1858）に記載の「誘電泳動活性化蛍光」（ＦＡＤＳ）によってソートされることを除いて、すべての点で実施例５に類似している。ソートされ、採集された液滴は壊され、細胞がMazutisら（Nat Prot 2013, 8, 870-891）に記載のとおり回収される。
【０３２４】
実施例８：２種類の分泌腫瘍マーカーに従った細胞のソーティング
【０３２５】
この実験の目的は、２種類の分泌腫瘍マーカーに従った細胞のスクリーニングを実証することである。この実施例は、２種類の別個の標的要素３７が同時計測されることは異なっているが、あらゆる点で実施例７に類似している。２個の標的要素３７は、腫瘍マーカーＶＥＧＦとＣＫ１９であり、そしてそれらを実施例４のように計測する。第１のシグナリング実体３４上のフルオロフォア、例えばＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８など、および第２のシグナリング実体３４のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７の蛍光に相当する大きい蛍光シグナルを伴った液滴が、Baretら（Lab Chip 2009, 9, 1850-1858）に記載の「誘電泳動活性化蛍光」（ＦＡＤＳ）によってソートされる。ソートされ、採集された液滴は壊され、細胞がMazutisら（Nat Prot 2013）に記載のとおり回収される。
【０３２６】
実施例９：タイプ２計測デバイス（第２の装置６０）における腫瘍マーカーの定量化
【０３２７】
この実施例の目的は、タイプ２デバイス、すなわち、液滴が単層の二次元で分布するチャンバーにおける腫瘍マーカーの定量化を実証することである。この実施例は、液滴を４０ピコリットルと計測し、かつ、タイプ２計測デバイスで分析する点で異なるが、すべての点で実施例３に類似している。２枚のガラススライド間に高さ３８μｍのチャンバーを作製する。入口および出口を上部ガラススライド上に作製し、それぞれ接続キャピラリーに接続するための標準コネクタを設ける。
【０３２８】
実施例１０：タイプ２計測デバイス（第２の装置６０）における同時の２種類の腫瘍マーカーの定量化
【０３２９】
この実施例の目的は、タイプ２デバイスにおける同時の２種類のシグナリング実体（２種類の腫瘍マーカー）の定量化を実証することである。この実施例は、実施例９のように、液滴を４０ピコリットルと計測し、タイプ２計測デバイスで分析することを除いて、すべての点で実施例４に類似している。
【０３３０】
実施例１１：タイプ２メーター（第２の装置６０）における単一細胞のスケールでの分泌腫瘍マーカーの動態学的および定量的計測
【０３３１】
この実施例の目的は、タイプ２デバイスにおける単一細胞のスケールでの分泌腫瘍マーカーの動態学的および定量的計測を実証することである。この実施例は、実施例９のように、液滴を４０ピコリットルと計測し、タイプ２計測デバイスで分析することを除いて、すべての点で実施例５に類似している。磁性ビーズライン上に再配置されたシグナリング実体３４の蛍光シグナルの、単一細胞のスケールでの、放出を計測することによって、標的要素３７（ＶＥＧＦ腫瘍マーカー）の分泌速度を決定し得る。
【０３３２】
実施例１２：タイプ２計測デバイス（第２の装置６０）における単一細胞のスケールでの同時に分泌された２種類の腫瘍マーカーの動態学的および定量的計測
【０３３３】
この実施例の目的は、タイプ２デバイスにおける単一細胞のスケールでの２種類の分泌腫瘍マーカーの同時の動態学的および定量的計測を実証することである。この実施例は、２種類の標的要素３７が同時計測される点で異なるが、実施例９のように、液滴を４０ピコリットルと計測し、タイプ２計測デバイスで分析することを除いて、あらゆる点で実施例６に類似している。２種類の標的実体は、腫瘍マーカーＶＥＧＦとＣＫ１９であり、そしてそれらを実施例１０のように検出する。
【０３３４】
磁性ビーズのライン上に再配置された２種類のシグナリング実体３４の蛍光シグナルの放出を、単一細胞のレベルで計測することによって、２種類の標的要素３７（ＶＥＧＦとＣＫ１９腫瘍マーカー）の分泌速度を決定し得る。
【０３３５】
実施事例
図１４は、タイプ１デバイスでの腫瘍マーカーの定量化を例示する。グラフは、緑色蛍光を計測するためのチャンネルについて得られたピーク強度値を示す。液滴は、ビオチン化抗ＰＳＡ抗体でコートされたビーズを含む。そのビーズは、アラインされて列を形成する。２５ｎＭのＰＳＡでは、二次抗ＰＳＡ抗体の蛍光が磁性ビーズ列に再配置され、そしてそれが、強度ピーク値を高める（ｎ＝２００，０００）。エラーバーは標準偏差を示す。同じ計測を、液滴中で３７℃にて１時間インキュベートしたＬｎＣＡＰ細胞を含有する液滴についておこなった。ＬｎＣＡＰは、ヒト前立腺癌から得られた上皮細胞株に由来する細胞である。
【０３３６】
図１５は、タイプ１デバイスにおける液滴のソーティングを示す。このグラフは、タイプ１デバイスにおけるＰＳＡ分泌細胞の計測の可能性を示す。３個の別個の液滴集団は、それらの異なる液滴コードにより識別され得る（マーカー、スルホローダミンＢの蛍光に該当し、横軸に沿って表される）。左から右に、我々は、ソートされる細胞、すなわち、陽性対照および陰性対照、のエマルションについて観察する。縦座標軸上に示される蛍光チャンネルで、ビーズの列上の抗ＰＳＡの再配置が説明される。黒色の長方形の中に含まれた液滴は、ＰＳＡの分泌および細胞の含有に関して陽性の液滴である。
【０３３７】
図１６は、タイプ１デバイスの液滴のソーティングを示す。このグラフは、細胞を含有する液滴エマルションからのＥｐＣＡＭ陽性液滴ソーティングのための選択ウィンドウを示す。充填は約５％である。これは、選択ウィンドウ内のＥｐＣＡＭ陽性と細胞充填との良好な相関関係を示す。縦座標軸は、液滴内で計測された極大値（すなわち、細胞に相当するピーク）を表す。Ｘ軸は、ピーク下のシグナルの積分を表す。
【０３３８】
図１７〜２０は、タイプ１デバイスにおける２種類の基準に基づくソーティングを例示する。図１７は、ＥｐＣＡＭ陽性細胞のソーティングに関する「ゲート５」選択ウィンドウを示す。図１８は、ＰＳＡ分泌細胞に関する「ゲート６」選択ウィンドウを示す。選択されるためには、２個の基準が満たされなければならない。すなわち、選択された液滴は、「ゲート５」および「ゲート６」ウィンドウ内に計測値がある液滴に相当する。
【０３３９】
図１９および２０の画像は、２個の基準：ＰＳＡの分泌（図１９）およびＥｐＣＡＭの発現（図２０）、に従って首尾よくソートされた液滴を表す。空の液滴（陰性対照）はまた、ディスプレイチャンバー内の着目の液滴の輸送を容易にするためにもソートされた。０．２％の着目の液滴を用いたエマルションから開始し、着目の液滴の２０％濃縮が得られた。液滴の輸送のために保存された陰性対照液滴をカウントすることによって、有効な液滴輸送は約９９％にて得られる。
【０３４０】
図２１〜２３は、タイプ２デバイスでの腫瘍マーカーの定量化を説明する。図２１（明視野における）および２２（蛍光チャンネルにおける）は、ＬＮＣＡＰ細胞によるＰＳＡの分泌を示す。これらの細胞は、液滴内で一時間インキュベートされ、そして、ＰＳＡの分泌が、円柱状の粒子凝集体上の蛍光の再配置をもたらす。
【０３４１】
図２３は、液滴テーブルから得られたＰＳＡの定量化のために検量線を例示する。その検量線は、無洗浄の免疫学的アッセイ実験に関して通常観察される形状を有する。タンパク質がビーズに結合する急増相（最大６０ｎＭ）の後に、ビーズの飽和による蛍光再配置の減少および遊離ＰＳＡ濃度の増加がある。データを平均および該平均の誤差タイプ（ＳＥＭ）として示す。
【０３４２】
この検量線は、２種類のそれぞれの抗体を用いて、異なる濃度のＰＳＡタンパク質の可溶性型から作成した。試薬、ビーズ、および検出試薬の濃度を、ＰＳＡ容量が約７０ｎＭになるように調整する。前記システムは、７０ｎＭを下回る最低濃度に対して非常に高感度である。（空の液滴において予想される最も強いシグナルに相当する）ホワイトリミットが１．０４７であると決定した。この値を、０ｎＭの濃度にて得られた平均値の１．０３１と比較する必要がある。検出限界、すなわち、区別できる最も小さいバックグラウンドの量は２．５ｎＭのＰＳＡであり、たった６０，０００個の分子に相当する。細胞を１時間インキュベートすることによって、毎秒１６個超の分子を分泌するすべての細胞が検出され得る。インキュベーション時間を２時間に延長することによって、この制限は、毎秒８個の分子を分泌する細胞などに低下され得る。他の分子に関して文献で報告されている分泌速度は、細胞型や分泌される画分によって毎秒１０〜１０，０００個の分子の間で変動し得る。これは、得られた桁が条件を満たしていることを示す。
【０３４３】
加えて、検量線は、高濃度にてシグナル増大を示す。例えば、約５００ｎＭのＰＳＡにて、シグナルは、バックグラウンドノイズと顕著に区別され得る。これは、非常に高い分泌レベルを有する細胞さえ検出され得るので、実験的開発にとって有利である。
【０３４４】
図２４および２５は、タイプ２デバイスでの腫瘍マーカーの定量化を説明する。図２４（明視野における）および２５（蛍光チャンネルにおける）は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞によるタンパク質ＣＫ１９の分泌を表す。ＳＫ−ＢＲ−３は、ヒト乳癌の腫瘍由来の細胞株である。
【０３４５】
ＣＫ１９は、通常、細胞膜の中に組み込まれたタンパク質である。しかしながら、それが、取り外されて、細長い凝集体に再配置され得る。
【０３４６】
ヒト前立腺癌（ＬｎＣＡＰ）由来の上皮細胞株を、ＰＳＡの細胞分泌を観察する実験のために使用する。
【０３４７】
タンパク質分泌が、生理的温度付近でしか観察されず、例えば２５℃などのより低温では観察できないので、我々は温度が重要因子であることがわかった。より低温では、シグナルは細胞に再配置され、粒子には再配置されず、ＰＳＡが膜に結合されたか、または似たような現象が起こったことを示した。
【０３４８】
ＬｎＣＡＰ株の細胞を、これらの細胞のＰＳＡ分泌のパーセンテージを決定するためにさらに使用した。文献と以前の経験を考慮し、我々は、すべての細胞がＰＳＡを継続的に産生するわけではないことを知っている。この実験の裏にある考えは、ＬｎＣＡＰ集団の中のＰＳＡを分泌する細胞のパーセンテージをまとめることである。この実験を３７℃にて実施し、そして、分泌シグナルを０、３０、および６０分の時点で計測する。
【０３４９】
以下の表は、モデルとしてＬｎＣＡＰ細胞を使用したＰＳＡ分泌実験の条件および結果を表す。
【０３５０】
【表１】
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【０３５１】
０分の時点で、蛍光再配置は、細長い凝集体のレベルでは見られない。しかしながら、検出試薬がいくつかの細胞の膜上に再配置されたのに気付いた。この現象は、恐らく培養条件と室温での遠心分離に関連しているであろう。我々は、３０分または６０分の時点での計測に関しても同じ観察をおこなったが、膜上に再配置された検出試薬を有する細胞数は着実に減少したが、その一方で、マーカーを分泌する細胞のパーセンテージは増大した。
【０３５２】
従って、我々は、個別にカプセル化されたＬｎＣＡＰ細胞の分泌パターンを分析し得る。
【０３５３】
図２６は、タイプ２デバイスでの分泌マーカーの動態学の計測を例示する。図２６は、１時間にわたり液滴中でカプセル化され、次いで、１０分間隔で計測された個々のＬｎＣＡＰ細胞に関するＰＳＡ分泌パターンを示す。
【０３５４】
ここで、個々の細胞の分泌速度は変動するが、同様の配分が他の細胞株でも見られたことを示す。我々はまた、分泌が通常の放出よりむしろ突然の動態学に従うことを示す。
【０３５５】
いくつかの細胞が８００個超のＰＳＡ分子を分泌しているが、その一方で、細胞の大部分がほんのわずかなＰＳＡ分子（１細胞あたり約１０個の分子）しか分泌していないか、または全く分泌していない（これらの細胞は示されていない）ことが観察された。
【０３５６】
血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出をシミュレートするために、ＬｎＣＡＰ細胞をＪｕｒｋａｔ細胞と混合した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒトリンパ球Ｔの不死化株に由来する。両細胞株を、１０％のＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で培養し、そして、液滴中にカプセル化した。これらの実験は、少量の細胞を検出することが実際に可能であることを示している。我々は、Ｊｕｒｋａｔ細胞中のさまざまな濃度のＬｎＣＡＰに関して実験をおこなった。蛍光標識を有している細胞のサイズが、検出に使用された。以下の表は、実験の結果を示している。
【０３５７】
【表２】
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【０３５８】
予備研究は、ＬｎＣＡＰの検出下限が０．０００１であり得ることを示している。
この実験は、液滴中のＰＳＡを検出するように構成され、そして、ＬｎＣＡＰ細胞が検出可能なレベルでＰＳＡを分泌すること示している。該実験は、他の細胞と人為的に混合した細胞における検出感度を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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