(57)【要約】  本発明は、イヌＩＬ−４Ｒαに対する高い結合アフィニティおよび特異的配列を有するイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体を提供する。本発明はまた、イヌのアトピー性皮膚炎の治療における、これらの抗体の使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌＩｇＧ重鎖とイヌカッパ軽鎖とを含む、インターロイキン４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）に特異的に結合する単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、イヌカッパ軽鎖が３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）を含み、イヌＩｇＧ重鎖が３つの重鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）を含み、
（ａ）ＣＤＲＬ１が配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３の保存的修飾変異体を含み、
（ｂ）ＣＤＲＬ２が配列番号４４のアミノ酸配列または配列番号４４の保存的修飾変異体を含み、
（ｃ）ＣＤＲＬ３が配列番号４５のアミノ酸配列または配列番号４５の保存的修飾変異体を含み、
（ｄ）ＣＤＲＨ１が配列番号４６のアミノ酸配列または配列番号４６の保存的修飾変異体を含み、
（ｅ）ＣＤＲＨ２が配列番号４７のアミノ酸配列または配列番号４７の保存的修飾変異体を含み、および
（ｆ）ＣＤＲＨ３が配列番号４８のアミノ酸配列または配列番号４８の保存的修飾変異体を含む、単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ＣＤＲＬ１が配列番号４３のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項３】
ＣＤＲＬ２が配列番号４４のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項４】
ＣＤＲＬ３が配列番号４５のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項５】
ＣＤＲＨ１が配列番号４６のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項６】
ＣＤＲＨ２が、配列番号４７を含むアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項７】
ＣＤＲＨ３が配列番号４８のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項８】
ＩｇＧ重鎖が、配列番号２８、配列番号２８の保存的修飾変異体、配列番号３０、配列番号３０の保存的修飾変異体、配列番号３２および配列番号３２の保存的修飾変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項９】
カッパ軽鎖が、配列番号３４、配列番号３４の保存的修飾変異体、配列番号３６、配列番号３６の保存的修飾変異体、配列番号３８および配列番号３８の保存的修飾変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項１０】
該イヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメントが、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列からの１以上のアミノ酸残基においてイヌＩＬ−４Ｒαに結合する、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
該抗体が、イヌＩＬ−４Ｒαに結合する場合、Ｔ２７、Ｙ３７、Ｓ１６４、Ｔ１６５、Ｋ１６７およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される、配列番号４の少なくとも１以上のアミノ酸残基に結合する、請求項１０記載の単離されたイヌ化抗体。
【請求項１２】
イヌＩＬ−４Ｒαに結合し、イヌインターロイキン４（ＩＬ−４）へのイヌＩＬ−４Ｒαの結合を遮断する、前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
前記請求項のいずれか１項記載の単離されたイヌ化抗体の軽鎖をコードする単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２記載の単離されたイヌ化抗体の重鎖をコードする単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１４記載の単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号３３、配列番号３５および配列番号３７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１３記載の単離された核酸。
【請求項１７】
請求項１３、１４、１５、１６またはそれらの組合せのいずれか記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載の１以上の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む４０個以下のアミノ酸残基からなる単離されたペプチド。
【請求項２０】
請求項１９記載の単離されたペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２１】
非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体のＦｃ領域をも含む、請求項２０記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２記載の抗体、あるいは請求項１９記載のペプチド、あるいは請求項２０または２１記載の融合タンパク質、あるいは請求項１３、１４、１５または１６記載の核酸、あるいは請求項１７記載の発現ベクター、あるいはそれらのいずれかの組合せと、医薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２２記載の医薬組成物の治療的有効量をイヌに投与することを含む、イヌのアトピー性皮膚炎の治療方法。
【請求項２４】
ａ．該核酸が発現され、それにより、軽鎖および重鎖可変領域を含むポリペプチドを産生する条件下、請求項１８記載の宿主細胞を培地内で培養し、
ｂ．該ポリペプチドを宿主細胞または培地から回収することを含む、ＩＬ−４に結合するイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１５年１２月１８日付け出願の第６２／２６９，４８６号および２０１６年９月２９日付け出願の第６２／４０１，３６８号（それらの両方の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、イヌＩＬ−４Ｒαに対する高い結合アフィニティおよび特異的配列を有する、ヒトＩＬ−４Ｒαに対するイヌ化ヒト抗体に関する。本発明はまた、イヌのアトピー性皮膚炎の治療における、本発明の抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫系は、感染症および癌から宿主を防御するために協同的に機能する常在性および再循環性の特殊化細胞のネットワークを含む。この機能を免疫系が果たす能力は、白血球により分泌されるインターロイキンと総称されるタンパク質の一群の生物活性に大きく依存している。詳細に研究されているインターロイキンとしては、インターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）として特定されている２つの重要な分子が挙げられる。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、ＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、マクロファージ、マスト細胞および好塩基球を含む多数の細胞型により分泌されうる密接に関連した２つのタンパク質である。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は多数の重複機能を示し、Ｔ細胞依存性体液性免疫応答の発生に決定的に重要である。全体的な構造、細胞源および生物学的機能におけるそれらの類似性にもかかわらず、これらのサイトカインのそれぞれは或る特殊化された機能を媒介し、これは、これらのインターロイキンがそれらの共通の生物活性および特有の生物活性の両方を媒介する受容体および下流シグナリング経路を特定することを目的とした多くの研究を刺激している。
【０００４】
ＩＬ−４は、２つの受容体、すなわち、Ｉ型およびＩＩ型ＩＬ−４受容体に高いアフィニティで結合することが現在公知である。Ｉ型ＩＬ−４受容体は、ＩＬ−４受容体α鎖と、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−１５を含む幾つかの他のインターロイキンの受容体の一部でもある共通のγＣ鎖とからなる。ＩＩ型ＩＬ−４受容体はＩＬ−４受容体α鎖およびＩＬ−１３受容体α１鎖からなる。一方、ＩＬ−１３はＩＩ型ＩＬ−４受容体に結合し、そしてＩＬ−１３受容体α２と称される特有の受容体に結合する。ＩＬ−１３受容体α２へのＩＬ−１３の結合はシグナルを伝達せず、この受容体は可溶性形態でも分泌される。したがって、ＩＬ−１３受容体α２は、しばしば、デコイ受容体と称される。
【０００５】
種々の種からのＩＬ−４タンパク質をコードする遺伝子がクローニングされ、細菌および哺乳類細胞において発現されている。例えば、成熟ヒトＩＬ−４は、１５Ｋｄの推定分子量を有する１２９アミノ酸の分泌ポリペプチドであることを、ヒトＩＬ−４をコードするｃＤＮＡが示している［Ｙｏｋｏｔａら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８３（１６）：５８９４−５８９８（１９８６）］。イヌＩＬ−４タンパク質をコードするｃＤＮＡも特定されており、ヒトＩＬ−４に対して４０％の同一性を有する１３２アミノ酸のポリペプチドをコードすることが示されている［ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋａａｉｊら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４９：１４２−１４３（１９９９）］。ヒトＩＬ−１３をコードする遺伝子がクローニングされ、種々の宿主系において発現されている［Ｍｉｎｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２４８−５０（１９９３）］。成熟ＩＬ−１３は、１２．４Ｋｄの見掛け分子量を有する分泌ポリペプチドであることを、ヒトＩＬ−１３をコードするｃＤＮＡが示している。イヌＩＬ−１３をコードするｃＤＮＡも特定されている［Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：７７９−７８５（２０００）］。推定イヌＩＬ−１３成熟ポリペプチドは１１１アミノ酸からなり、ヒトＩＬ−１３に対して６１．８％の同一性を有する。
【０００６】
ヒトおよびマウスＩＬ−４受容体α鎖をコードする遺伝子がクローニングされ、種々の宿主系において発現されている。例えば、ヒトＩＬ−４受容体α鎖をコードするｃＤＮＡはＧａｌｉｚｚｉら［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２（７）：６６９−６７５（１９９０）］により記載されており、マウスＩＬ−４受容体α鎖をコードするｃＤＮＡはＭｏｓｌｅｙら［Ｃｅｌｌ，５９（２）：３３５−３４８（１９８９）］により記載されている。ヒトＩＬ−４受容体α鎖のｃＤＮＡは、２４アミノ酸残基のシグナル配列を含む８２５アミノ酸残基をコードしている。マウスタンパク質はヒト受容体より１５アミノ酸残基短いが、アミノ酸レベルで５０％の全体的配列同一性を有する。
【０００７】
ウマ、イヌおよびネコＩＬ−４受容体α鎖をコードする遺伝子も開示されている［ＵＳ  ７，２０８，５７９  Ｂ２を参照されたい］。また、イヌＩＬ−４受容体αのアイソフォームの１つに対応すると推定されるｃＤＮＡがＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出されうる（配列番号１）。したがって、本発明は、ＩＬ−４受容体α鎖ｃＤＮＡを決定すること、およびそのコード化ポリペプチド配列を明確に決定することを実施した。
【０００８】
ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、細胞外病原体（例えば、組織または管腔生息寄生生物）に対する防御に必要なＴｈ２免疫応答の発生のための決定的に重要なサイトカインであるが、どちらのサイトカインもヒトおよび動物における種々のアレルギー疾患（喘息およびアトピー性皮膚炎を含む）の病理発生に関連づけられている。喘息はヒトにおける一般的な呼吸器疾患である。この疾患は肺炎、外部刺激に対する気管支気道の過敏性および気管支壁組織の構造的修飾により特徴づけられる。アレルギー性喘息の病態生理はＶａｔｒｅｌｌａら［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ７：１２３−１３０（２０１４）］により概説されている。喘息は、大量のＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生しアレルギー性気道における免疫炎症応答を調整するＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞により維持される。喘息応答の理解における最近の進歩は、疾患の病理発生においてＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方により果たされる重要な役割を強調している。例えば、どちらのサイトカインもＩｇＭからＩｇＥへのＢ細胞における免疫グロブリンアイソタイプの切り換えを刺激し、このアレルゲン特異的ＩｇＥは気道におけるマスト細胞脱顆粒および炎症メディエーターの放出に寄与する。また、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は共に気管支平滑筋の収縮を増強し、好酸球の気道リクルートメントを刺激し、これは好酸球上の対応受容体に対するアレルゲン結合ＩｇＥの架橋に応答して脱顆粒をも引き起こしうる。また、ＩＬ−１３は粘液分泌をも刺激し、気道リモデリングを促進し、これは杯細胞の過形成、コラーゲンの沈着および気道平滑筋細胞の増殖を刺激することにより生じる。したがって、ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、気管支収縮および気道機能亢進の増強を含む喘息発作の発現を招く病理学的変化に密接に関与していることが今や明らかである。
【０００９】
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、免疫系調節不全および表皮障壁異常により特徴づけられる再発性掻痒性炎症性皮膚疾患である。ＡＤの病理学的および免疫学的特性は広範な研究の対象となっている［Ｒａｈｍａｎら，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ＆  Ａｌｌｅｒｇｙ−ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  １０：４８６−４９６（２０１１）およびＨａｒｓｋａｍｐら，Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ３２：１３２−１３９（２０１３）に概説されている］。ＡＤはヒトにおける最も一般的な皮膚疾患であり、米国の成人集団の２〜１０％を冒し、全世界で小児の約２５％を冒す。ヒトにおいては、ＡＤ皮膚病変はＴｈ２細胞、好酸球、マスト細胞および樹状細胞の浸潤により特徴づけられる。ＡＤの急性期においては、これらの病変は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を含むＴｈ２型サイトカインの優勢な発現を示す。ＡＤはＩｇＥの循環レベルの上昇によっても特徴づけられ、皮膚のＣＤ４＋  Ｔｈ２細胞におけるＩＬ−４およびＩＬ−１３の発現と正に相関する。ＡＤはＴｈ２疾患として分類されているが、Ｔｈ１、Ｔｈ２２およびＴｈ１７のような他のＴ細胞サブセットも疾患の病理発生に寄与している可能性がある。世界中でＡＤの発生率が増加しているにもかかわらず、症状が局所薬によって適切に抑制されない患者に利用可能な治療選択肢は経口コルチコステロイド、経口シクロスポリンおよび狭帯域ＵＶＢ光線療法に限られる。これらの療法は常に有効なわけではなく、それらの使用は種々の安全性の影響を伴う。最近、ヒトＩＬ−４Ｒαに特異的なヒトモノクローナル抗体が、ヒト化免疫系を有するように操作されたトランスジェニックマウスから作製され、これらの抗体の幾つかはアトピー性皮膚炎の治療のためのヒトにおけるそれらの治療的有用性に関して広範に試験されている［例えば、ＵＳ２０１５００１７１７６  Ａ１を参照されたい］。
【００１０】
アトピー性皮膚炎は伴侶動物、特にイヌにおいても一般的な疾患であり、イヌにおいて、その罹患率はイヌの全頭数の約１０〜１５％であると推定されている。イヌおよびネコにおけるＡＤの発生病理［Ｎｕｔｔａｌｌら，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｃｏｒｄｓ  １７２（８）：２０１−２０７（２０１３）に概説されている］はヒトにおけるＡＤの場合との有意な類似性を有し、それらには、ＩＬ−４およびＩＬ−１３サイトカインの優勢を含むＣＤ４−  Ｔｈ２偏向性サイトカイン環境ならびに種々の免疫細胞による皮膚浸潤が含まれる。ヒトの場合と同様に、イヌおよびネコにおけるアトピー性皮膚炎に対する現在の療法はシャンプーおよび保湿剤のような緩和療法、または経口もしくは全身性コルチコステロイドおよび経口シクロスポリンの使用による対症療法に依存している。ヒトのＡＤの場合と同様に、これらの療法は、疾患の根底にあるメカニズムに対処するものではなく、重大な安全性および有効性の問題を有する。したがって、伴侶動物におけるＡＤの安全かつ有効な治療選択肢に対する満たされていない医学的需要が存在する。そのような治療は、好ましくは、疾患の根底にあるメカニズムを妨げるものであるべきである。
【００１１】
本明細書におけるいずれの参考文献の引用も、そのような参照が本出願の「先行技術」として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概括
本発明は、イヌＩＬ−４Ｒαに対する高い結合アフィニティを有し、イヌＩＬ−４および／またはＩＬ−１３へのイヌＩＬ−４Ｒαの結合を遮断する能力を有するイヌ化ヒト（すなわち、ヒト化免疫系を有するように操作されたトランスジェニックマウスから作製されたもの）抗ヒトＩＬ−４Ｒアルファ抗体に関する。本発明はまた、アトピー性皮膚炎のような疾患および／または状態の治療における、そのような抗体の使用に関する。
【００１３】
したがって、本発明は、イヌＩｇＧ重鎖とイヌカッパまたはラムダ軽鎖とを含む、インターロイキン４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）に特異的に結合する単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。このタイプの特定の実施形態においては、イヌカッパまたはラムダ軽鎖は３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち、ＣＤＲ軽１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ軽３（ＣＤＲＬ３）を含み、イヌＩｇＧ重鎖は、哺乳類ＩＬ−４Ｒα抗体から得られる３つの重鎖ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ重１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ重３（ＣＤＲＨ３）を含む。本発明のイヌ化抗体およびそのフラグメントの特定の実施形態はイヌＩＬ−４Ｒαに結合し、および／またはイヌインターロイキン４（ＩＬ−４）へのイヌＩＬ−４Ｒαの結合を遮断する。
【００１４】
ある実施形態においては、イヌ軽鎖はカッパ鎖である。このタイプの特定の実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４３のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４３の保存的修飾変異体（すなわち、保存的に修飾された変異体）を含む。他の実施形態においては、ＣＤＲＬ２は配列番号４４のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ２は配列番号４４の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＬ３は配列番号４５のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ３は配列番号４５の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、イヌＩｇＧ重鎖のＣＤＲＨ１は配列番号４６のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号４６の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＨ２は配列番号４７のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ２は配列番号４７の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＨ３は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ３は配列番号４８の保存的修飾変異体を含む。
【００１５】
特定の実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号４４のアミノ酸配列または配列番号４４の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号４５のアミノ酸配列または配列番号４５の保存的修飾変異体を含む。
【００１６】
他の特定の実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号４６のアミノ酸配列または配列番号４６の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号４７のアミノ酸配列または配列番号４７の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号４８のアミノ酸配列または配列番号４８の保存的修飾変異体を含む。
【００１７】
より詳細な実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号４４のアミノ酸配列または配列番号４４の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号４５のアミノ酸配列または配列番号４５の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号４６のアミノ酸配列または配列番号４６の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号４７のアミノ酸配列または配列番号４７の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号４８のアミノ酸配列または配列番号４８の保存的修飾変異体を含む。
【００１８】
より一層詳細な実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号４４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号４５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号４６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号４７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある他の実施形態においては、イヌ軽鎖はカッパ鎖であり、ここで、ＣＤＲＬ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４９の保存的修飾変異体を含む。他の実施形態においては、ＣＤＲＬ２は配列番号５０のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ２は配列番号５０の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＬ３は配列番号５１のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ３は配列番号５１の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、イヌＩｇＧ重鎖のＣＤＲＨ１は配列番号５２のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号５２の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＨ２は配列番号５３のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ２は配列番号５３の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＨ３は配列番号５４のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ３は配列番号５４の保存的修飾変異体を含む。
【００２０】
特定の実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４９のアミノ酸配列または配列番号４９の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５０のアミノ酸配列または配列番号５０の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号５１のアミノ酸配列または配列番号５１の保存的修飾変異体を含む。
【００２１】
他の特定の実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号５２のアミノ酸配列または配列番号５２の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号５３のアミノ酸配列または配列番号５３の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号５４のアミノ酸配列または配列番号５４の保存的修飾変異体を含む。
【００２２】
より詳細な実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４９のアミノ酸配列または配列番号４９の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５０のアミノ酸配列または配列番号５０の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号５１のアミノ酸配列または配列番号５１の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号５２のアミノ酸配列または配列番号５２の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号５３のアミノ酸配列または配列番号５３の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号５４のアミノ酸配列または配列番号５４の保存的修飾変異体を含む。
【００２３】
より一層詳細な実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号４９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号５３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
他の実施形態においては、イヌ軽鎖はカッパ鎖であり、ここで、ＣＤＲＬ１は配列番号５５のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号５５の保存的修飾変異体を含む。他の実施形態においては、ＣＤＲＬ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ２は配列番号５６の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＬ３は配列番号５７のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＬ３は配列番号５７の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、イヌＩｇＧ重鎖のＣＤＲＨ１は配列番号５８のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号５８の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ２は配列番号５９の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＣＤＲＨ３は配列番号６０のアミノ酸配列を含む。関連実施形態においては、ＣＤＲＨ３は配列番号６０の保存的修飾変異体を含む。
【００２５】
特定の実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号５５のアミノ酸配列または配列番号５５の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５６のアミノ酸配列または配列番号５６の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号５７のアミノ酸配列または配列番号５７の保存的修飾変異体を含む。
【００２６】
他の特定の実施形態においては、ＣＤＲＨ１は配列番号５８のアミノ酸配列または配列番号５８の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列または配列番号５９の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号６０のアミノ酸配列または配列番号６０の保存的修飾変異体を含む。
【００２７】
より詳細な実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号５５のアミノ酸配列または配列番号５５の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５６のアミノ酸配列または配列番号５６の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号５７のアミノ酸配列または配列番号５７の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号５８のアミノ酸配列または配列番号５８の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列または配列番号５９の保存的修飾変異体を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号６０のアミノ酸配列または配列番号６０の保存的修飾変異体を含む。
【００２８】
より一層詳細な実施形態においては、ＣＤＲＬ１は配列番号５５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号５６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号５８のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号５９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号６０のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
本発明の或る実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は、配列番号２７のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。関連実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は配列番号２８の保存的修飾変異体を含む。他の実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は配列番号３０のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。関連実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は配列番号３０の保存的修飾変異体を含む。更に他の実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は配列番号３２のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。関連実施形態においては、ＩｇＧ重鎖は配列番号３２の保存的修飾変異体を含む。
【００３０】
ある実施形態においては、カッパ軽鎖は配列番号３４のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、カッパ軽鎖は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。関連実施形態においては、カッパ軽鎖は配列番号３４の保存的修飾変異体を含む。ある実施形態においては、カッパ軽鎖は配列番号３６のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、カッパ軽鎖は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。関連実施形態においては、カッパ軽鎖は配列番号３６の保存的修飾変異体を含む。他の実施形態においては、カッパ軽鎖は配列番号３８のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、カッパ軽鎖は、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。関連実施形態においては、カッパ軽鎖は配列番号３８の保存的修飾変異体を含む。
【００３１】
より詳細な実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖とを含む。関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列の保存的修飾変異体を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列の保存的修飾変異体を含むカッパ軽鎖とを含む。更に他の関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖の保存的修飾変異体とを含む。更に他の関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列の保存的修飾変異体を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖とを含む。
【００３２】
他の特定の実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖とを含む。関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３０を含むＩｇＧ重鎖の保存的修飾変異体と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖の保存的修飾変異体とを含む。更に他の関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖の保存的修飾変異体とを含む。更に他の関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖の保存的修飾変異体と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖とを含む。
【００３３】
別の特定の実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖とを含む。関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖の保存的修飾変異体と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖の保存的修飾変異体とを含む。更に他の関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖の保存的修飾変異体とを含む。更に他の関連実施形態においては、単離されたイヌ化抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ重鎖の保存的修飾変異体と、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８のアミノ酸配列を含むカッパ軽鎖とを含む。
【００３４】
本発明はまた、キメラ重鎖および軽鎖ヒト−イヌ抗体を提供する。ある実施形態においては、キメラヒト−イヌ重鎖は配列番号１６のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、キメラヒト−イヌ重鎖は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。ある抗体においては、キメラヒト−イヌカッパ鎖は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、キメラヒト−イヌカッパ鎖は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。
【００３５】
他の実施形態においては、キメラヒト−イヌ重鎖は配列番号２０のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、キメラヒト−イヌ重鎖は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。ある抗体においては、キメラヒト−イヌカッパ鎖は配列番号２２のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、キメラヒト−イヌカッパ鎖は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。
【００３６】
更に他の実施形態においては、キメラヒト−イヌ重鎖は配列番号２４のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、キメラヒト−イヌ重鎖は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。ある抗体においては、キメラヒト−イヌカッパ鎖は配列番号２６のアミノ酸配列を含む。このタイプの特定の実施形態においては、キメラヒト−イヌカッパ鎖は、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。
【００３７】
本発明は、イヌＩＬ−４Ｒαに特異的に結合する前記の抗体および／またはその抗原結合性フラグメントを含み、ここで、それらがイヌＩＬ−４Ｒαに結合する場合、該抗体は配列番号３９および／または配列番号４０および／または配列番号４１および／または配列番号４２内の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合する。より一層詳細な実施形態においては、該抗体は、Ｔ２７、Ｙ３７、Ｓ１６４、Ｔ１６５、Ｋ１６７からなる群から選択される、配列番号４の少なくとも１以上のアミノ酸残基に結合する。そのようなタイプの特定の実施形態においては、該抗体および／またはその抗原結合性フラグメントはイヌＩＬ−４Ｒαに結合し、イヌＩＬ−４へのイヌＩＬ−４Ｒαの結合を遮断する。
【００３８】
本発明は更に、配列番号３９および／または配列番号４０のアミノ酸配列を含む８０個以下のアミノ酸残基からなる抗原ペプチド（単離された抗原ペプチドを含む）を提供する。関連実施形態においては、抗原ペプチド（単離されたペプチドを含む）は、配列番号３９および／または配列番号４０のアミノ酸配列を含む６０個以下のアミノ酸残基からなる。他の実施形態においては、抗原ペプチドは、配列番号３９および／または配列番号４０のアミノ酸配列からの６〜３２個のアミノ酸残基からなる。更に他の実施形態においては、抗原ペプチドは、配列番号３９および／または配列番号４０のアミノ酸配列からの１２〜２４個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態においては、抗原ペプチドは６〜４０個のアミノ酸残基からなり、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態においては、抗原ペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列からの６〜１１個のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態においては、抗原ペプチドは６〜４０個のアミノ酸残基からなり、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態においては、抗原ペプチドは６〜１１個のアミノ酸残基からなり、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明は更に、前記抗原ペプチドのいずれかを含む融合タンパク質を提供する。特定の実施形態においては、融合タンパク質はそのような抗原ペプチドと、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体のＦｃ領域とを含む。より詳細な実施形態においては、融合タンパク質は非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含む。ある実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はマウスＩｇＧである。別の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はヒトＩｇＧである。他の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はウマＩｇＧである。更に他の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はブタＩｇＧである。更に他の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はウシＩｇＧである。
【００４０】
特定の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１である。他の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はＩｇＧ２ａである。更に他の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はＩｇＧ３である。更に他の実施形態においては、非イヌ哺乳類ＩｇＧ抗体はＩｇＧ４である。
【００４１】
他の実施形態においては、融合タンパク質は前記抗原ペプチドのいずれかとマルトース結合性タンパク質とを含む。更に他の実施形態においては、融合タンパク質は前記抗原ペプチドのいずれかとベータ−ガラクトシダーゼとを含む。更に他の実施形態においては、融合タンパク質は前記抗原ペプチドのいずれかとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとを含む。更に他の実施形態においては、融合タンパク質は前記抗原ペプチドのいずれかとチオレドキシンとを含む。更に他の実施形態においては、融合タンパク質は前記抗原ペプチドのいずれかとＧｒｏ  ＥＬとを含む。更に他の実施形態においては、融合タンパク質は前記抗原ペプチドのいずれかとＮｕｓＡとを含む。
【００４２】
本発明は更に、本発明の抗原ペプチドおよび対応融合タンパク質をコードする核酸（単離された核酸を含む）を提供する。本発明はまた、これらの核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００４３】
本発明は更に、本発明のイヌ化抗体の軽鎖のいずれか１つまたはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸を提供する。このタイプの特定の実施形態においては、核酸は、単離された核酸である。同様に、本発明は更に、本発明のイヌ化抗体の重鎖のいずれか１つまたはその抗原結合性フラグメントをコードする核酸を提供する。このタイプの特定の実施形態においては、核酸は、単離された核酸である。本発明は更に、本発明の（単離されている又はその他の）核酸の１以上を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本発明の１以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４４】
特定の実施形態においては、該抗体は組換え抗体またはその抗原結合性フラグメントである。関連実施形態においては、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、一本鎖抗体を形成するように柔軟性リンカーにより連結されている。
【００４５】
特定の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントはＦａｂフラグメントである。他の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントはＦａｂ’フラグメントである。更に他の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは（Ｆａｂ’）２フラグメントである。更に他の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントはジアボディである。特定の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントはドメイン抗体である。特定の実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントはラクダ化単一ドメイン抗体である。
【００４６】
特定の実施形態においては、イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体または抗原結合性フラグメントは、治療されるイヌ対象におけるＴｈ２免疫応答の発生をモジュレーションし、それにより、アトピー性皮膚炎の症状を改善する。
【００４７】
本発明は更に、本明細書に開示されているイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸を提供する。関連実施形態においては、そのような抗体または抗原結合性フラグメントは、イヌ対象におけるアトピー性皮膚炎を治療するための医薬の製造のために使用されうる。代替的に又は組合せて、本発明は、診断用途のための、本発明の抗体または抗体フラグメントのいずれかの使用を提供する。更に追加的な実施形態においては、本明細書に開示されてるイヌ化抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを含むキットを提供する。
【００４８】
更に追加的な実施形態においては、本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかをコードする単離された核酸を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書に記載されている発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関する。特定の実施形態においては、本発明のこれらの核酸、発現ベクターまたはポリペプチドは抗体の製造方法において有用である。
【００４９】
本発明は更に、抗体またはその抗原結合性フラグメントを医薬上許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物を含む。また、本発明は、イヌＴｈ２免疫応答の発生をモジュレーションする方法を提供し、該方法は、そのような医薬組成物の治療的有効量を、それを要する対象に投与することを含む。ある実施形態においては、該方法はアトピー性皮膚炎の治療に使用される。
【００５０】
本発明のこれらの及び他の態様は、後記の「図面の簡単な説明」および「詳細な説明」を参照することにより、より良く理解されるであろう。
【００５１】
詳細な説明
イヌＩＬ−４受容体アルファタンパク質とヒトＩＬ−４受容体アルファタンパク質との間には６６％のアミノ酸同一性しか存在しない。更に、これらの受容体の細胞外ドメインのみを比較しても、アミノ酸同一性は僅か６８％である。この事実にもかかわらず、ＩＬ−４ＲαのヒトＥＣＤに対する幾つかのヒト化抗体をイヌＩＬ−４Ｒαとのそれらの反応性に関してスクリーニングした。注目すべきことに、ヒトＩＬ−４Ｒαタンパク質の細胞外ドメインに特異的であると以前に確認されていたこれらのヒト化抗体の１つは、驚くべきことに、イヌＩＬ−４Ｒα鎖にも結合することが判明した。更に驚くべきことに、この抗体は、イヌＩＬ−４の、そのイヌＩＬ−４Ｒα鎖への結合を遮断しうることが判明した。したがって、後記で開示されているとおり、この抗体のイヌ化はイヌにおける治療的有用性を有する。
【００５２】
略語
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、以下の略語を用いる。
【００５３】
ＡＤＣＣ    抗体依存性細胞傷害；
ＣＤＣ    補体依存性細胞傷害；
ＣＤＲ    Ｋａｂａｔ（カバト）番号付け系を用いて定められた、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域；
ＣＨＯ    チャイニーズハムスター卵巣；
ＥＣ５０    ５０％の効力または結合をもたらす濃度；
ＥＬＩＳＡ    酵素結合イムノソルベントアッセイ；
ＦＲ    抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域；
ＨＲＰ    ホースラディッシュペルオキシダーゼ；
ＩＦＮ    インターフェロン；
ＩＣ５０    ５０％の抑制をもたらす濃度；
ＩｇＧ    免疫グロブリンＧ；
Ｋａｂａｔ    Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔ［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］により開発された免疫グロブリンアライメントおよび番号付け系；
ｍＡｂ    モノクローナル抗体（また、ＭａｂまたはＭＡｂ）；
ＭＴＴ    （３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）；
ＭＯＡ    作用メカニズム；
ＮＨＳ    正常ヒト血清；
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応；
ＰＫ    薬物動態；
ＳＥＢ    スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ；
ＴＴ    破傷風トキソイド；
Ｖ領域    異なる抗体間で配列が可変性であるＩｇＧ鎖のセグメント。それは軽鎖内のＫａｂａｔ残基１０９および重鎖内の１１３まで伸長する；
ＶＨ    免疫グロブリン重鎖可変領域；
ＶＫ    免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域。
【００５４】
定義
本発明がより容易に理解されうるように、幾つかの科学技術用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書中で用いる他の全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有する。
【００５５】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数形の語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、その対応複数対象物を含む。
【００５６】
「活性化」は、それが細胞または受容体に適用される場合、文脈により又は明示的に特に示されていない限り、リガンドでの細胞または受容体の活性化または処理（治療）を意味しうる。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、突然変異タンパク質、および抗体由来の結合性化合物を含む。「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド模倣体を含む。
【００５７】
「活性化」は、内的メカニズムにより及び外的もしくは環境要因により調節される細胞活性化を意味しうる。
【００５８】
分子の「活性」は、リガンドへの又は受容体への該分子の結合、あるいは触媒活性；遺伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「活性」は、自然または適応免疫系の成分のモジュレーションを意味しうる。
【００５９】
「投与」および「治療（処理）」は、それが動物、例えばイヌ対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合には、該動物、例えばイヌ対象、細胞、組織、器官または生物学的流体との外因性医薬、治療用物質、診断剤または組成物の接触を意味する。細胞の処理は、該細胞との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」および「処理（治療）」は、試薬、診断剤、結合性化合物または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）処理をも意味する。「対象（被験者）」なる語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコまたは他の非ヒト哺乳動物）、最も好ましくはイヌを含む。
【００６０】
本明細書中で用いる、例えば抗体のアミノ酸配列における、別のアミノ酸残基での「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基で「アミノ酸残基を置換すること」と同意義であり、アミノ酸配列内の特定の位置における特定のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基により置換されていることを示す。そのような置換は特別に設計可能であり、すなわち、例えば組換えＤＮＡ技術により、アミノ酸配列内の特定の位置においてアラニンをセリンで意図的に置換することが可能である。あるいは、より自然な選択過程により、例えば、細胞により産生された抗体がその抗原（例えば、エピトープまたはその一部を含有するもの）上の所与領域に結合する能力に基づいて、および／または置換対象であるＣＤＲと同じ標準構造を保有する特定のＣＤＲを抗体が含むように、抗体の特定のアミノ酸残基またはアミノ酸残基の鎖を１以上のアミノ酸残基により置換することが可能である。そのような置換は「変異体」ＣＤＲおよび／または変異体抗体を与えうる。
【００６１】
「治療する（処理する）」または「治療（処理）」は、治療用物質（例えば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを含有する組成物）を、該物質が治療活性を示す１以上の疾患症状を有する又は疾患を有すると疑われるイヌ対象または患者に内的または外的に投与することを意味する。
【００６２】
典型的には、該物質は、いずれかの臨床的に測定可能な度合によるそのような症状の退縮の誘導またはそのような症状の進行の抑制により、治療対象または集団における１以上の疾患症状を軽減および／または改善するのに有効な量で投与される。いずれかの特定の疾患症状を軽減するのに有効である治療用物質の量（「治療的有効量」とも称される）は患者（例えば、イヌ）の病態、年齢および体重、ならびに対象において所望の応答を惹起する医薬組成物の能力のような要因によって変動しうる。疾患症状が軽減または改善したかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために獣医または他の熟練医療提供者により典型的に用いられるいずれかの臨床的測定により評価されうる。本発明の或る実施形態（例えば、治療方法または製造品）は全ての対象における標的疾患症状の軽減において有効であるとは限らないかもしれないが、それは、当技術分野で公知のいずれかの統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ２検定、マン（Ｍａｎｎ）およびホイットニー（Ｗｈｉｔｎｅｙ）によるＵ検定、クルスカル−ワリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンケーレ−テルプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定およびウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）検定により決定される統計的に有意な対象数において、標的疾患症状を軽減するべきである。
【００６３】
「治療（処理）」は、それがヒト、獣医学的対象（例えば、イヌ）または研究対象に適用される場合には、治療的処置ならびに研究および診断適用を意味する。「治療（処理）」は、それがヒト、獣医学的対象（例えば、イヌ）もしくは研究対象または細胞、組織もしくは器官に適用される場合には、イヌもしくは他の動物対象、細胞、組織、生理学的区画または生理的流体との本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの接触を含む。
【００６４】
本明細書中で用いる「イヌ」なる語は、特に示されていない限り、全ての飼いイヌ、カニス・ループス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）またはカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を含む。
【００６５】
本明細書中で用いる「ネコ」なる語はネコ（Ｆｅｌｉｄａｅ）科の任意のメンバーを意味する。この科のメンバーは野生、動物園および家畜メンバー、例えば、ネコ（Ｆｅｌｉｎａｅ）亜科の任意のメンバー、例えばネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、ヒョウ、ユキヒョウ、パンサー、北米山（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｍｏｕｎｔａｉｎ）ライオン、チーター、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカルまたはそれらの任意の交雑種を含む。ネコはまた、飼いネコ、純血および／または雑種伴侶ネコ、見世物（ショー）用ネコ、実験用ネコ、クローン化ネコおよび野生または野良ネコを含む。
【００６６】
本明細書中で用いる「イヌフレーム」なる語は、本明細書においてＣＤＲ残基と定められている超可変領域残基を除くイヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を意味する。大多数の実施形態においては、イヌ化抗体に関しては、天然イヌＣＤＲのアミノ酸配列は両鎖において対応外来ＣＤＲ（例えば、ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体由来のもの）で置換されている。所望により、例えば、後記のとおり、イヌ抗体における外来ＣＤＲのコンホメーションを維持するために、および／またはＦｃ機能を修飾するために、イヌ抗体の重鎖および／または軽鎖は幾つかの外来非ＣＤＲ残基を含有するように修飾されうる。したがって、別の種からの抗体からのＣＤＲ（例えば、ヒト抗体からのＣＤＲ）を含むイヌＩｇＧ重鎖と、他の種からの抗体のＣＤＲを含むイヌカッパ軽鎖とを含むイヌ化抗体は、該イヌ化抗体が、そのＣＤＲの代わりにそのような他の種からの抗体の特定されているＣＤＲを含むイヌＩｇＧ重鎖（または修飾イヌＩｇＧ、例えば、本明細書に開示されているもの）と、そのＣＤＲの代わりにそのような他の種からの抗体の特定されているＣＤＲを含むイヌカッパ軽鎖（または修飾イヌカッパ軽鎖）とを含むことを示す。
【００６７】
「免疫応答」なる語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および前記細胞または肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用であって、癌細胞、病原体に感染した細胞もしくは組織または侵襲病原体に対する選択的損傷、破壊、または哺乳動物の体（例えば、イヌの体）からのそれらの排除をもたらす作用を意味する。
【００６８】
イヌ化抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体
本発明は、イヌＩＬ−４Ｒαに結合する単離されたイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメント、およびそのような抗体またはそのフラグメントの使用を提供する。
【００６９】
本明細書中で用いるイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体は、哺乳類ＩＬ−４Ｒαに特異的に結合するイヌ化抗体を意味する。
【００７０】
哺乳類ＩＬ−４Ｒα、そして特にイヌＩＬ−４Ｒαに特異的に結合する抗体は、他の抗原と比較して哺乳類ＩＬ−４Ｒαへの優先的結合を示す抗体であるが、この特異
性は絶対的な結合特異性を要しない。イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体がイヌＩＬ−４Ｒαに「特異的」である（または特異性を伴って結合する）とみなされるのは、その結合が、イヌのサンプルにおける他のイヌタンパク質の活性を不適切に妨げることなく、例えば、診断場面における偽陽性または治療場面における副作用のような望ましくない結果をもたらすことなく、イヌから得られた生物学的サンプル中のイヌＩＬ−４Ｒαの存在を決定するものである場合、あるいはそれがイヌＩＬ−４Ｒαの活性を変化させうる場合である。イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体に必要な特異性の度合は該抗体の意図される用途に左右されうるが、いずれにせよ、意図される目的の用途に対するその適合性によって定められる。想定される方法の抗体、または抗体の抗原結合性部位に由来する結合性化合物が、その抗原またはその変異体もしくは突然変異タンパク質に、特異性を伴って結合するのは、それが、いずれかの他のイヌ抗原に対するアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きなアフィニティを有する場合である。
【００７１】
本明細書において、与えられた配列（この場合はイヌＩＬ−４Ｒα）を含むポリペプチドに抗体が特異的に結合すると言えるのは、それが、イヌＩＬ−４Ｒαの配列を含むポリペプチドには結合するが、イヌＩＬ−４Ｒαのアミノ酸配列を欠く他のイヌタンパク質には結合しない場合である。例えば、イヌＩＬ−４Ｒαを含むポリペプチドに特異的に結合する抗体はイヌＩＬ−４ＲαのＦＬＡＧ（登録商標）タグ付き形態には結合しうるが、他のＦＬＡＧ（登録商標）タグ付きイヌタンパク質には結合しない。
【００７２】
特に示されていない限り、本明細書中で用いる「抗体フラグメント」または「抗原結合性フラグメント」は、抗体の抗原結合性フラグメント、すなわち、完全長抗体により結合される抗原（例えば、イヌＩＬ−４Ｒα）に特異的に結合する能力を保有する抗体フラグメント、例えば、１以上のＣＤＲ領域を保有するフラグメントを意味する。抗原結合性フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ジアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体およびナノボディが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
典型的には、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、その活性がモル基準で表された場合、（対応する親抗体と比較した場合に）そのイヌＩＬ−４Ｒα結合活性の少なくとも１０％を保有する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは親抗体としてのイヌＩＬ−４Ｒα結合アフィニティの少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保有する。また、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、その生物活性を実質的に改変しない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的変異体」または「機能保存変異体」と称される）を含みうると意図される。
【００７４】
「単離（された）抗体」は精製状態を意味し、そのような状況においては、該分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質、例えば細胞残渣および増殖培地を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離（された）」なる語は、そのような物質の完全な非存在、または水、バッファーもしくは塩の非存在を意味するものではないが、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在してはならない。
【００７５】
各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体の抗原結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結合部位は一般に同じである。典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、特定のエピトープへの結合が可能になるように、フレームワーク領域により整列されている。一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５（１９７８）；Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に基づいている。
【００７６】
本明細書中で用いる「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらす、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）からのアミノ酸残基を含む［配列により抗体のＣＤＲ領域を定める、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい；また、構造により抗体のＣＤＲ領域を定める、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたい］。本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる語は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定められている超可変領域残基を除く可変ドメイン残基を意味する。
【００７７】
イヌＩｇＧの、４つの公知ＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、それらはＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄと称される。２つの公知軽鎖サブタイプはラムダおよびカッパと称される。イヌＴｈ２免疫応答の発生のモジュレーションに加えて、ＩＬ−４Ｒαに対するイヌまたはイヌ化抗体は最適には以下の２つの特性を有する：
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のようなエフェクター機能を欠いている；ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィーに基づく技術のような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
【００７８】
本明細書中で用いる「イヌ化抗体」なる語は、イヌフレームまたは修飾イヌフレームと共に、ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体からの３個の重鎖ＣＤＲおよび３個の軽鎖ＣＤＲを含む抗体を意味する。イヌ化抗体の有効性を更に最適化して、例えば、イヌＩＬ−４Ｒαへのその結合を増強する、および／またはイヌＩＬ−４へのイヌＩＬ−４Ｒαの結合を遮断するその能力を増強する、本明細書に例示されている１以上のアミノ酸変化を、修飾イヌフレームは含む。
【００７９】
「相同性」は、最適にアライメント（整列）された２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を意味する。それらの２つの比較される配列の両方における位置が同一塩基またはアミノ酸単量体サブユニットにより占拠されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンにより占拠されている場合、該分子はその位置において相同である。相同性の割合（％）は、２つの配列により共有される相同位置の数を、比較される位置の総数で割り算し、１００を掛け算したものである。例えば、２つの配列における位置の１０個中６個が、それらの配列が最適にアライメントされた場合に、一致（マッチ）している又は相同である場合、それらの２つの配列は６０％相同である。一般に、該比較は、最大相同性（％）を与えるように２つの配列がアライメントされた場合に行われる。
【００８０】
「単離された核酸分子」は、該単離ポリヌクレオチドが天然で見出される場合のポリヌクレオチドの全部または一部を伴っておらず、あるいはそれが天然で連結していないポリヌクレオチドに連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそれらの何らかの組合せを意味する。本開示の目的においては、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は無傷染色体を含まない、と理解されるべきである。特定されている核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定されている配列に加えて、１０個まで又は更には２０個まで又はそれ以上の他のタンパク質またはその一部もしくは断片のコード配列を含むことが可能であり、あるいは、挙げられている核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含むことが可能であり、および／あるいは、ベクター配列を含むことが可能である。
【００８１】
「制御配列」なる語は、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、所望により、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを用いることが公知である。
【００８２】
核酸が「機能的に連結」されていると言えるのは、それが別の核酸配列に対して機能的な関係で配置されている場合である。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていると言えるのは、それが、該ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、それが該配列の転写に影響を及ぼす場合であり、あるいはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていると言えるのは、翻訳を促進するようにそれが位置している場合である。一般に、「機能的に連結（されている）」は、連結されているそれらのＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的であり、かつ、リーディングフェーズにおけるものであることを意味する。しかし、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は簡便な制限部位における連結により達成される。そのような部位が存在しない場合には、通常の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。また、核酸配列が本発明で提供される場合、それは停止コドンを含みうる、と容易に理解されるはずである。しかし、停止コドンは互換性であるため、配列における特定の停止コドンの含有はその配列の必要部分とみなされるべきではない。
【００８３】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は互換的に用いられ、全てのそのような表示は後代を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる語は、導入（トランスファー）の数には無関係に、初代対象細胞、およびそれに由来する培養を含む。また、意図的な又は故意でない突然変異のため、全ての後代は厳密に同一のＤＮＡ含有物を有するわけではないと理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異体後代も含まれる。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
【００８４】
本明細書中で用いる「生殖系列配列」は未再構成免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を意味する。いずれかの適当な未再構成免疫グロブリン配列源が用いられうる。ヒト生殖系列配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのウェブサイト上でＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖系列データベースから得られうる。マウス生殖系列配列は、例えば、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１（２００５）］に記載されているとおりに得られうる。
【００８５】
抗イヌＩＬ−４Ｒα抗体の特性
本発明は、キメラおよびイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体を提供し、また、疾患の治療、例えばイヌにおけるアトピー性皮膚炎の治療における該抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。イヌにおいては、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと称される４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、イヌＩｇＧの、４つの異なるサブクラスに対応し、それらはＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣおよびＩｇＧＤと称される。２つの重鎖のそれぞれは１つの可変ドメイン（ＶＨ）、ならびにＣＨ−１、ＣＨ−２およびＣＨ−３と称される３つの定常ドメインからなる。ＣＨ−１ドメインは、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」と称されるアミノ酸配列を介してＣＨ−２ドメインに連結されている。
【００８６】
これらの４つの重鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列はＴａｎｇら［Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９−２７０（２００１）］により最初に特定された。これらの重鎖のアミノ酸およびＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である。例えば、ＩｇＧＡ重鎖のアミノ酸配列はアクセッション番号ＡＡＬ３５３０１．１を有し、ＩｇＧＢはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０２．１を有し、ＩｇＧＣはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０３．１を有し、ＩｇＧＤはアクセッション番号ＡＡＬ３５３０４．１を有する。イヌ抗体はまた、２つのタイプの軽鎖、すなわち、カッパおよびラムダを含有する。これらの軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られうる。例えば、カッパ軽鎖アミノ酸配列はアクセッション番号ＡＢＹ  ５７２８９．１を有し、ラムダ軽鎖はアクセッション番号ＡＢＹ  ５５５６９．１を有する。
【００８７】
本発明においては、４つのイヌＩｇＧ  Ｆｃフラグメントのそれぞれのアミノ酸配列は、Ｔａｎｇら（前掲）により決定された、ＣＨ１およびＣＨ２ドメインの特定された境界に基づく。イヌＩＬ−４Ｒαに結合するイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体には、ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα  ＣＤＲと共に、イヌＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−ＢおよびＩｇＧ−Ｄ重鎖ならびに／またはイヌカッパ軽鎖を含む抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明は、イヌＩＬ−４Ｒαに結合し、Ｉ型またはＩＩ型ＩＬ−４受容体へのイヌＩＬ−４およびイヌＩＬ−１３の結合を遮断するキメライヌおよびヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体（好ましくは、単離されているもの）、ならびに／またはイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体、またはそれらの抗原結合性フラグメントを提供する。
【００８８】
本発明は更に、イヌ化抗体を与えるように対応軽鎖と釣り合いうる完全長イヌ重鎖を提供する。したがって、本発明は更に、イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体（単離されたイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体を含む）を提供し、また、疾患および／または病態の治療、例えばイヌにおけるアトピー性皮膚炎の治療における該抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法を提供する。
【００８９】
本発明はまた、イヌフラグメント結晶化可能領域（ｃＦｃ領域）を含むイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体を提供し、ここで、ｃＦｃは、１以上のエフェクター機能が増強し、低減し、または消失するよう遺伝的に修飾されている。本発明の１つの態様においては、遺伝的に修飾されたｃＦｃは１以上のエフェクター機能を低減し、または消失させる。本発明のもう１つの態様においては、遺伝的に修飾されたｃＦｃは１以上のエフェクター機能を増強する。ある実施形態においては、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、遺伝的に修飾されたイヌＩｇＧＢ  Ｆｃ領域である。もう１つのそのような実施形態においては、遺伝的に修飾されたｃＦｃ領域は、遺伝的に修飾されたイヌＩｇＧＣ  Ｆｃ領域である。特定の実施形態においては、エフェクター機能は、増強、低減または消失する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。もう１つの実施形態においては、エフェクター機能は、増強、低減または消失する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。更にもう１つの実施形態においては、ｃＦｃ領域は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの両方を増強し、低減し、または消失させるために遺伝的に修飾されている。
【００９０】
エフェクター機能を欠くイヌＩｇＧの変異体を作製するために、幾つかの突然変異体イヌＩｇＧＢ重鎖を作製した。これらの変異体は、重鎖アミノ酸配列のＦｃ部分における以下の単一の又は組合された置換の１以上を含みうる：Ｐ４Ａ、Ｄ３１Ａ、Ｎ６３Ａ、Ｇ６４Ｐ、Ｔ６５Ａ、Ａ９３ＧおよびＰ９５Ａ。変異体重鎖（すなわち、そのようなアミノ酸置換を含有するもの）を発現プラスミド内にクローニングし、軽鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドと共にＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞から発現され精製された無傷抗体をＦｃγＲＩおよびＣ１ｑへの結合に関して評価して、免疫エフェクター機能の媒介に関するそれらの可能性を評価した［ＷＯ  ２０１５０９１９１０  Ａ２および米国特許出願第１５／１０５，２１１号（それらの両方の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい］。
【００９１】
本発明はまた、対応天然ＩｇＧＤヒンジ領域の代わりに以下のものからのヒンジ領域を含む修飾イヌＩｇＧＤを使用する。
【００９２】
ＩｇＧＡ：      ＦＮＥＣＲＣＴＤＴＰＰＣＰＶＰＥＰ（配列番号６１）；
ＩｇＧＢ：      ＰＫＲＥＮＧＲＶＰＲＰＰＤＣＰＫＣＰＡＰＥＭ（配列番号６２）；または
ＩｇＧＣ：      ＡＫＥＣＥＣＫＣＮＣＮＮＣＰＣＰＧＣＧＬ（配列番号６３）。
【００９３】
あるいは、ＩｇＧＤヒンジ領域は、セリン残基をプロリン残基で置換することにより遺伝的に修飾されうる：すなわち、ＰＫＥＳＴＣＫＣＩＰＰＣＰＶＰＥＳ（配列番号６４）（天然に存在するセリン残基は、下線および太字で示されているプロリン残基（Ｐ）により置換されている）。そのような修飾は、ｆａｂアーム交換を欠くイヌＩｇＧＤを与えうる。修飾イヌＩｇＧＤは、組換えＤＮＡ技術の標準的な方法［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）］を用いて構築されうる。これらの変異体を構築するために、イヌＩｇＧＤのアミノ酸配列をコードする核酸は、それが修飾ＩｇＧＤをコードするように修飾されうる。ついで該修飾核酸配列はタンパク質発現のために発現プラスミド内にクローニングされる。
【００９４】
イヌＩＬ−４Ｒαに結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書に記載されているヒト抗ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１、２、３、４、５または６個を含みうる。そのような１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは、独立して、後記のもののＣＤＲ配列から選択されうる。もう１つの実施形態においては、イヌＩＬ−４Ｒαに結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体カッパ軽鎖と、ヒト重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧとを含む。
【００９５】
他の実施形態においては、本発明は、配列番号４３、４４および／または４５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含むイヌ抗体カッパ軽鎖と、配列番号４６、４７および／または４８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧとを有する一方で、所望の結合および機能特性を尚も示す、イヌＩＬ−４Ｒαに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。更に他の実施形態においては、本発明は、配列番号４９、５０および／または５１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含むイヌ抗体カッパ軽鎖と、配列番号５２、５３および／または５４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧとを有する一方で、所望の結合および機能特性を尚も示す、イヌＩＬ−４Ｒαに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。更に他の実施形態においては、本発明は、配列番号５５、５６および／または５７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含むイヌ抗体カッパ軽鎖と、配列番号５８、５９および／または６０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧとを有する一方で、所望の結合および機能特性を尚も示す、イヌＩＬ−４Ｒαに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、所望の結合および機能特性を尚も示す一方で０、１、２、３、４または５個の保存的または非保存的アミノ酸置換を含有する前記ＣＤＲアミノ酸配列の１以上を有するカッパ軽鎖とのＩｇＧ重鎖配列の組合せを含むイヌフレームを含む。
【００９６】
配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸が、それらの２つの配列が最適に整列（アライメント）された場合に、同等位置で同じである度合を意味する。１つのアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」であると本明細書中で用いているのは、両方の配列のアミノ酸残基が同一である場合である。したがって、アミノ酸配列が第２のアミノ酸配列に対して５０％「同一」であるのは、それらの２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合である。配列比較は、与えられたタンパク質（例えば、比較されているタンパク質またはポリペプチドの一部）に含まれるアミノ酸残基の連続的ブロックにわたって行われる。特定の実施形態においては、選択された欠失または挿入が考慮され、これは、それがなければ２つのアミノ酸配列の間の対応を改変しうるものである。
【００９７】
配列類似性は同一残基および非同一の生化学的に関連したアミノ酸を含む。類似特性を共有し、交換可能でありうる生化学的に関連したアミノ酸が検討される。
【００９８】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質におけるアミノ酸が、類似特性（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、バックボーンコンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換されることを意味し、ここで、該変化は、該タンパク質の生物活性を改変することなく頻繁に施されうる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している［例えば、Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．；１９８７）を参照されたい］。また、構造的または機能的に類似したアミノ酸の置換は、生物活性を損なう可能性が低い。典型的な保存的置換を以下の表１に示す。
【表１】
2019506146.tif 000003
【００９９】
本発明の抗体の機能保存変異体も本発明に含まれる。本明細書中で用いる「機能保存変異体」は、抗原アフィニティおよび／または特異性のような所望の特性が変化することなく１以上のアミノ酸残基が変化している抗体またはフラグメントを意味する。そのような変異体は、類似特性を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換、例えば、前記表１の保存的アミノ酸置換を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
核酸
本発明は更に、本明細書に開示されているイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体およびその抗原結合性フラグメントの免疫グロブリン鎖をコードする核酸を含む。例えば、本発明は、後記配列表に列挙されている新規核酸、ならびに本発明で提供されるアミノ酸配列を含むペプチドおよびタンパク質をコードする核酸の全てを含む。
【０１０１】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択される）により比較を行った場合に、本発明で提供される抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一である、より好ましくは少なくとも約９０％同一である、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）同一であるアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。本発明は更に、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択される）により比較を行った場合に、参照アミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも約７０％類似している、好ましくは少なくとも約８０％類似している、より好ましくは少なくとも約９０％類似している、最も好ましくは少なくとも約９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）類似しているアミノ酸配列を含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１０２】
配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸が、それらの２つの配列が最適に整列（アライメント）された場合に、同等位置で同じである度合を意味する。配列類似性は同一残基および非同一の生化学的に関連したアミノ酸を含む。類似特性を共有し、交換可能でありうる生化学的に関連したアミノ酸が検討される。
【０１０３】
以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴアルゴリズム：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０（１９９４）；アライメント・スコアリング・システム：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５−３５２（１９７８）；Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３（１９７８），Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８（１９７８），Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５（１９９１）；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）；アライメント統計学：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９（１９９４）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）。
【０１０４】
本発明はまた、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターを提供し、ここで、該核酸は、宿主細胞が該ベクターでトランスフェクトされた場合に宿主細胞により認識される制御配列に機能的に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。また、抗体または抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを含有する宿主細胞を培地内で培養し、宿主細胞または培地から抗原またはその抗原結合性フラグメントを単離することを含む、本明細書に開示されている抗体またはその抗原結合性フラグメントの製造方法を提供する。
【０１０５】
エピトープ結合および結合アフィニティ
本発明のキメラ（ヒト／イヌ）およびイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントはイヌＩＬ−４へのイヌＩＬ−４Ｒαの結合を抑制することが可能であり、配列番号３９および／または４０および／または４１および／または４２のアミノ酸配列の１以上を含むエピトープに結合する
イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体は、後記実施例に記載されているとおりに組換え的に製造されうる。本明細書に開示されている抗体またはフラグメントの発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系を包含する。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多数の他の細胞系を包含する。哺乳類宿主細胞はヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を包含する。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有するのかを決定することにより選択される。使用されうる他の細胞系としては、昆虫細胞系、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合性部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合性フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合には、該宿主細胞における該抗体の発現（またはより好ましくは、該宿主細胞が培養される培地内への該抗体の分泌）を可能にするのに十分な期間にわたって該宿主細胞を培養することにより、該抗体が産生される。
【０１０６】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から回収されうる。更に、生産細胞系からの本発明の抗体（またはそれからの他の部分）の発現は、幾つかの公知技術を用いて増強されうる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、一定条件下で発現を増強するための一般的アプローチである。ＧＳ系は欧州特許第０  ２１６  ８４６号、第０  ２５６  ０５５号および第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号において全体的または部分的に考察されている。
【０１０７】
一般に、個々の細胞系またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、該細胞系またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有するであろう。したがって、抗体の個々のグリコシル化パターンは、該抗体を製造するために使用される個々の細胞系またはトランスジェニック動物に左右されるであろう。しかし、本発明で提供される核酸分子によりコードされる、または本発明で提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、該抗体が有しうるグリコシル化パターンには無関係に、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態においては、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体が有利でありうる。なぜなら、これらの抗体は、インビトロおよびインビボの両方において、それらのフコシル化対応物より高い効力を典型的に示すことが示されているからである［例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；Ｕ．Ｓ．６，９４６，２９２およびＵ．Ｓ．７，２１４，７７５を参照されたい］。
【０１０８】
本発明は更に、本明細書に開示されているイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体の抗体フラグメントを含む。該抗体フラグメントにはＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれ、これは例えばペプシンによるＩｇＧの酵素的切断により製造されうる。Ｆａｂフラグメントは、例えば、ジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元により製造されうる。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によりＶＨ−ＣＨ１鎖に連結されたＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、今度は２つのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、ジスルフィド架橋が間に位置しているＦｃ領域の部分を含む。ＦｖフラグメントはＶＬまたはＶＨ領域である。
【０１０９】
１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、重鎖定常領域、例えばイヌ定常領域、例えばＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄイヌ重鎖定常領域またはそれらの変異体を含む。もう１つの実施形態においては、該抗体または抗原結合性フラグメントは、軽鎖定常領域、例えばイヌ軽鎖定常領域、例えばラムダまたはカッパイヌ軽鎖領域またはそれらの変異体を含む。限定的ではない例示として挙げると、イヌ重鎖定常領域はＩｇＧ−Ｄ由来であることが可能であり、イヌ軽鎖定常領域はカッパ由来であることが可能である。
【０１１０】
抗体の改変操作
本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体は、例えば該抗体の特性を改善するために、親（すなわち、イヌ）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のフレーム残基に対する修飾を含むように操作されている。
【０１１１】
実験用途および診断用途
本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントは、イヌＩＬ−４Ｒαタンパク質に関する診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織または血清におけるその発現の検出においても有用でありうる。そのような診断方法は種々の疾患診断において有用でありうる。例えば、そのような方法は以下の工程を含む。
【０１１２】
（ａ）イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントで基体（例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えばプラスチックプレートの表面）をコーティングすること；
（ｂ）イヌＩＬ−４Ｒαの存在に関して試験されるべきサンプルを該基体に適用すること；
（ｃ）該プレートを洗浄して、該サンプル中の未結合物質を除去すること；
（ｄ）ＩＬ−４Ｒα抗原に同様に特異的である検出可能な様態で標識された抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用すること；
（ｅ）該基体を洗浄して、未結合標識抗体を除去すること；
（ｆ）標識抗体が酵素結合体である場合には、蛍光シグナルへと酵素により変換される化学物質を適用すること；および
（ｇ）標識抗体の存在を検出すること。
【０１１３】
もう１つの実施形態においては、該標識抗体はペルオキシダーゼで標識され、これはＡＢＴＳ［例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な変色をもたらす。あるいは、該抗体は、検出可能な放射性同位体（例えば、３Ｈ）で標識され、これは、シンチラントの存在下、シンチレーションカウンターにより検出されうる。本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体はウエスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット法において使用されうる。
【０１１４】
そのような方法は本発明の一部を構成し、例えば以下のことを含む。
【０１１５】
（ｉ）結合イヌＩＬ−４Ｒαまたはその断片の存在に関して試験すべき膜または他の固体基体を本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させること。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにおいてイヌＩＬ−４Ｒαの存在に関して試験すべきタンパク質が（例えば、該ゲルにおける電気泳動分離の後で）トランスファー（転移）されたニトロセルロースまたはビニル系［例えば、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）］膜の形態をとりうる。該膜をイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させる前に、該膜を、所望により、該膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合させるために、例えば脱脂乾燥乳などでブロッキングしてもよい。
【０１１６】
（ｉｉ）該膜を１回以上洗浄して、未結合イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび他の未結合物質を除去すること；ならびに
（ｉｉｉ）結合したイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントを検出すること。
【０１１７】
結合抗体または抗原結合性フラグメントの検出は、検出可能な様態で標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）に該抗体または抗原結合性フラグメントを結合させ、該二次抗体の存在を検出することによるものでありうる。
【０１１８】
本明細書に開示されているイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体およびその抗原結合性フラグメントは免疫組織化学的方法にも使用されうる。そのような方法は本発明の一部を構成し、例えば、（１）イヌＩＬ−４Ｒαの存在に関して試験すべき細胞を本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体およびその抗原結合性フラグメントと接触させ、（２）該細胞上または該細胞内の該抗体またはフラグメントを検出することを含む。該抗体または抗原結合性フラグメント自体が検出可能な様態で標識されている場合、それは直接的に検出されうる。あるいは、該抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可能な様態で標識された、検出される二次抗体に結合されうる。
【０１１９】
イメージング技術には、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放出型コンピュータ断層撮影）またはＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）が含まれる。標識には、例えばヨウ素−１２３（１２３Ｉ）およびテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）（例えば、ＳＰＥＣＴイメージングと組合されるもの）、または１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏまたは１８Ｆ（例えば、ＰＥＴイメージングと組合されるもの）、またはインジウム−１１１が含まれる［例えば、Ｇｏｒｄｏｎら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：３８５−４４０（２００５）を参照されたい］。
【０１２０】
医薬組成物および投与
イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントの医薬組成物または無菌組成物を製造するためには、それを医薬上許容される担体または賦形剤と混合する［例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい］。
【０１２１】
治療用および診断用物質の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水性の溶液または懸濁液の形態で、許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造されうる［例えば、Ｈａｒｄｍａｎら，（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら，（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら，（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい］。１つの実施形態においては、本発明の抗ＩＬ−４Ｒα抗体を酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５〜６）中で適当な濃度に希釈し、ＮａＣｌまたはスクロースを等張化のために加える。安定性を増強するために、追加的物質、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０が加えられうる。
【０１２２】
単独で又は別の治療剤と組合せて投与される該抗体組成物の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により決定されうる。毒性効果と治療効果との用量比は治療係数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様においては、高い治療係数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、イヌにおける使用のための投与量の範囲の決定において使用されうる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。該投与量は、使用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。
【０１２３】
投与様式は様々でありうる。適当な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、経皮または動脈内が含まれる。特定の実施形態においては、イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントは注射のような侵襲的経路により投与されうる。本発明の他の実施形態においては、イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体もしくはその抗原結合性フラグメントまたはその医薬組成物は静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、または吸入、エアゾール運搬により投与される。非侵襲的経路（例えば、経口、例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤）による投与も本発明の範囲内である。
【０１２４】
組成物は、当技術分野で公知の医学的装置を使用して投与されうる。例えば、本発明の医薬組成物は皮下注射針（例えば、予め充填されたシリンジまたは自動注入装置を含む）での注射により投与されうる。本明細書に開示されている医薬組成物は、例えば米国特許第６，６２０，１３５号、第６，０９６，００２号、第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されている装置のような無針（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ）皮下注射装置によっても投与されうる。
【０１２５】
本明細書に開示されている医薬組成物は注入によっても投与されうる。医薬組成物を投与するための良く知られたインプラントおよびモジュールの例には、米国特許第４，４８７，６０３号（これは、制御された速度で医薬を分注するための移植可能な微量注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２３３号（これは、正確な注入速度で医薬を運搬するための医薬注入ポンプを開示している）、米国特許第４，４４７，２２４号（これは、連続的薬物運搬のための可変流量移植可能注入装置を開示している）、米国特許第４，４３９，１９６号（これは、マルチチャンバ・コンパートメントを有する浸透性薬物運搬系を開示している）に開示されているものが含まれる。多数の他のそのようなインプラント、運搬系およびモジュールは当業者によく知られている。
【０１２６】
あるいは、イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体を全身的ではなく局所的に、例えば、しばしば、デポー剤または徐放製剤により、関節または病変内に該抗体を直接注射することにより投与することが可能である。更に、標的化薬物運搬系により、例えば、免疫病理学的に特徴づけられる関節炎関節または病原体誘発性病変を標的化する組織特異的抗体で被覆されたリポソーム中で、イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体を投与することが可能である。該リポソームは罹患組織に標的化され、罹患組織により選択的に取り込まれるであろう。
【０１２７】
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状の程度、治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近可能性を含む幾つかの要因に左右される。好ましくは、投与レジメンは、標的病態における改善をもたらすのに十分な治療用抗体を運搬する一方で、同時に、望ましくない副作用を最小にする。したがって、運搬される生物学的物質の量は、部分的には、個々の治療用抗体、および治療される状態の重症度に左右される。治療用抗体の適当な用量を選択する際の指針が利用可能である［例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ（編）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２（２０００）を参照されたい］。
【０１２８】
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野で知られている又は疑われているパラメータまたは因子を用いて、獣医によりなされる。一般に、用量は、最適用量より幾分少ない量から開始し、ついで、負の副作用と比較して所望または最適効果が得られるまで、少しずつ増量する。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。
【０１２９】
本明細書に開示されている抗体または抗原結合性フラグメントは、連続的注入により、または例えば、毎日、週１〜７回、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、年１回などで投与されうる。投与は、例えば、静脈内、皮下、局所、経口、鼻腔内、直腸、筋肉内、脳内、脊髄内に、または吸入により行われうる。毎週の全用量は、一般に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ以上である［例えば、Ｙａｎｇら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８（２００２）；Ｌｉｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４（２００３）を参照されたい］。また、対象の血清中のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体の予め決められた目標濃度、例えば０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌ以上を達成するよう、投与は行われうる。他の実施形態においては、本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体は皮下または静脈内に、毎週、隔週、「４週間ごと」、毎月、隔月または年４回で、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／対象で投与される。
【０１３０】
本明細書中で用いる「抑制する」または「治療する」または「治療」は、障害に関連した症状の発生の遅延および／またはそのような障害の症状の重症度の軽減を含む。該用語は更に、既存の無制御の又は望ましくない症状の改善、追加的な症状の予防、およびそのような症状の根本原因の改善または予防を含む。したがって、該用語は、障害、疾患もしくは症状を有する脊椎動物対象、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発生する可能性を有する脊椎動物対象に、有益な結果がもたらされていることを示す。
【０１３１】
本明細書中で用いる「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」なる語は、単独で又は追加的な治療用物質と共に細胞、組織または対象に投与された場合に、疾患もしくは病態の症状の１以上またはそのような疾患もしくは病態の進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効である、本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を意味する。治療的有効量は更に、症状の少なくとも部分的な改善、例えば関連医学的状態の治療、治癒、予防または改善、あるいはそのような状態の治療、治癒、予防または改善の率の増加をもたらすのに十分な該結合性化合物の量を意味する。治療的有効量は、単独で投与される個々の有効成分に適用される場合には、その成分のみに関するものである。治療的有効量は、組合せ体に適用される場合には、組合せ投与、連続投与または同時投与のいずれで投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、有効成分の組合された量を意味する。治療用物質の有効量は、少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の、診断尺度またはパラメータの改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するために主観的尺度が用いられる場合には、主観的尺度における改善をもたらしうる。
【０１３２】
他の組合せ（併用）療法
既に記載されているとおり、本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメントは１以上の他の治療用物質（例えば、アトピー性皮膚炎を治療するために使用される医薬組成物）と共投与されうる。該抗体は（免疫複合体として）該物質に連結されることが可能であり、あるいは該物質とは別々に投与されうる。後者（別々の投与）の場合、該抗体は該物質の前、後または同時に投与可能であり、あるいは他の公知療法と共投与されうる。
【０１３３】
キット
更に、医薬上許容される担体および／または本明細書に記載されているアトピー性皮膚炎を治療するために使用される医薬（これらに限定されるものではない）を含む１以上の追加的成分と共に、ＩＬ−４Ｒαに特異的に結合する本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメント（例えば、本発明のイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体またはその抗原結合性フラグメント）（これらに限定されるものではない）を含む１以上の成分を含むキットを提供する。アトピー性皮膚炎を治療するために使用される医薬および／または結合性組成物は、純粋な組成物として、または医薬組成物において医薬上許容される担体と組合せて製剤化されうる。
【０１３４】
１つの実施形態においては、該キットは、配列番号２８、３０および／もしくは３２の重鎖アミノ酸配列を配列番号３４、３６および／もしくは３８の軽鎖アミノ酸配列と共に含むイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体の本発明の結合性組成物またはその医薬組成物を１つの容器（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル）内に、そしてその医薬組成物および／またはアトピー性皮膚炎を治療するために使用される医薬をもう１つの容器（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル）内に含む。
【０１３５】
もう１つの実施形態においては、該キットは、単一の共通の容器内に、所望により医薬組成物において、一緒に製剤化される１以上の治療剤成分と所望により組合されていてもよい、結合性組成物成分（例えば、配列番号２８、３０および／もしくは３２の重鎖アミノ酸配列を配列番号３４、３６および／もしくは３８の軽鎖アミノ酸配列と共に含むイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒα抗体）と医薬上許容される担体とを含む、本発明の組合せを含む。
【０１３６】
該キットが対象への非経口投与のための医薬組成物を含む場合、該キットは、そのような投与を行うための装置を含みうる。例えば、該キットは前記の１以上の皮下注射針または他の注射装置を含みうる。該キットはまた、該キットにおける医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含みうる。一般に、そのような情報は、封入されている医薬組成物および剤形を有効かつ安全に使用することにおいてペット所有者および獣医を補助する。例えば、本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書（インサート）において供給されうる：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性パラメータ、適応症および用法、禁忌、警告、予防策、有害反応、過剰投薬、適切な投与量および投与、供給方法、適切な保存条件、参考資料、製造業者／流通業者情報ならびに／または特許情報。
【０１３７】
便宜上、本明細書に開示されている抗体または特異的結合性物質は、キットとして、すなわち、診断用または検出用アッセイを行うための説明を伴う所定量の試薬のパッケージ化された組合せとして提供されうる。該抗体が酵素で標識されている場合には、該キットは、該酵素により要求される基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体）を含む。また、他の添加物、例えば安定剤、バッファー（例えば、ブロッキングバッファーまたは細胞溶解バッファー）などが含まれうる。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度をもたらすように大きく変動しうる。特に、該試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解時に与える賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１Ａは、ＥＬＩＳＡによって決定された、ｃＩＬ−４Ｒαに対するヒト−イヌキメラ抗体の結合アフィニティを示す。該ヒト−イヌキメラのヒト部分は以下のヒト化抗体から得た：Ａｂ１（Ｍ１）、Ａｂ１２（Ｍ１２）およびＡｂ３７（Ｍ３７）［Ｕ．Ｓ．８，８７７，１８９］；５Ａ１、１２Ｂ５、２７Ａ１およびＡｂ６３（６３）［Ｕ．Ｓ．７，１８６，８０９］；ならびにＤｕｐｉ  Ｈ−Ｃ［ＵＳ  ２０１５００１７１７６］。イソ（Ｉｓｏ）対照（Ｉｓｏ  Ｃｔｒ）は、ｃＩＬ４Ｒαに無関係なイヌ抗原に対して産生されたイヌ化マウス抗体である。図１Ｂは、ＥＬＩＳＡにより決定された、イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖に対するキメラヒト−イヌ抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ−Ｃ）およびイヌ化モノクローナル抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２）の用量依存的結合反応性を示す。ｃＩＬ−４Ｒαに無関係なイヌ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体を対照（ｍＡｂ対照）として使用した。
【図２】図２は、ＣＨＯ細胞上で発現されたイヌＩＬ−４受容体アルファとのイヌＩＬ−４の相互作用に対するイヌ化Ｄｕｐｉモノクローナル抗体の遮断活性を試験するためのＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
【図３】図３は、ＢａＦ３細胞上で発現されたイヌＩＬ−４受容体アルファに対するイヌ化Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２モノクローナル抗体の結合活性を試験するためのＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、ＢａＦ３細胞増殖に関する、対照非中和抗体と比較した場合のキメラヒト−イヌモノクローナル抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ−Ｃ）およびイヌ化モノクローナル抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２）の中和活性の関数としての細胞生存度を試験するためのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］細胞ベースアッセイの結果を示す。
【図５】図５は、イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖とイヌ化Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２モノクローナル抗体との間の相互作用のためのペプチドエピトープおよび特異的アミノ酸残基の接触を示す。エピトープの領域１は配列番号３９のアミノ酸配列内に存在するものとして特定され、一方、エピトープの領域２は配列番号４０のアミノ酸配列内に存在するものとして特定された。
【０１３９】
実施例
実施例１
イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖の特定およびクローニング
推定完全長イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖をコードするｃＤＮＡ（配列番号１）をＧｅｎｂａｎｋデータベース（アクセッション番号ＸＭ ５４７０７７．４）の検索により特定した。この推定ｃＤＮＡは、２５アミノ酸のリーダー配列を含む８２３アミノ酸（配列番号２）をコードしており、アクセッション番号ＸＰ ５４７０７７．３として特定される。成熟推定イヌＩＬ−４受容体α鎖タンパク質（配列番号４）はヒトＩＬ−４受容体α鎖（アクセッション番号ＮＰ ０００４０９．１）に対して６５％の同一性およびブタＩＬ−４受容体α鎖（アクセッション番号ＮＰ ９９９５０５．１）に対して７０％の同一性を共有する。成熟推定イヌＩＬ−４受容体α鎖タンパク質は、配列番号３として特定されているヌクレオチド配列によりコードされる。推定成熟ＩＬ−４受容体α鎖とヒトＩＬ−４受容体α鎖の公知配列との比較は成熟イヌＩＬ−４受容体α鎖タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を特定した。これは配列番号６と称される。成熟イヌＩＬ−４受容体α鎖のＥＣＤをコードするＤＮＡ配列は配列番号５として特定されている。
【化１】
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【０１４０】
実施例２
キメラおよびイヌ化ヒト抗ヒトＩＬ４Ｒαモノクロナール抗体
イヌにおけるアトピー性皮膚炎の治療を開発するために、ヒトＩＬ−４受容体アルファに対する公知ヒト化抗体［例えば、Ｕ．Ｓ．８，８７７，１８９、Ｕ．Ｓ．７，１８６，８０９およびＵＳ  ２０１５／００１７１７６  Ａ１を参照されたい］のいずれかがイヌＩＬ−４Ｒαにも結合しうるかどうかを知るための研究を行った。ヒトＩＬ−４受容体アルファに対するこれらのヒト化モノクローナル抗体の幾つかはイヌＩＬ−４Ｒαにも結合することが判明した。
【０１４１】
したがって、ＩＬ−４受容体アルファに対するキメラヒト−イヌ抗体を、これまでに開示されているＣＤＲ配列［後記表２を参照されたい］を使用して構築し、ついでイヌＩＬ−４Ｒαに対して試験した。簡潔に説明すると、選択された一群の抗体のそれぞれのＶＨおよびＶＬを、それぞれイヌＩｇＧＢ重鎖定常領域（ＣＨ１〜ＣＨ３）および軽鎖（カッパ）定常領域と遺伝的に合体（融合）させた［より詳細は後記を参照されたい］。ヒト−イヌ（Ｈ−Ｃ）キメラをＨＥＫ２９３細胞内で一過性に発現させ、ついでプロテインＡカラムを使用して精製した。個々のキメラ抗体の結合活性を、イヌＩＬ−４Ｒα（ｃＩＬ４Ｒα）でコードされたＥＬＩＳＡプレート上で試験した。図１ＡにおけるＥＬＩＳＡの結果が示しているとおり、ヒト−イヌキメラ抗体のほとんどはイヌＩＬ−４Ｒαに対して幾らかのアフィニティで結合可能であったが、驚くべきことに、１つの特定のキメラ抗体であるＤｕｐｉ  ＨＣは、イヌＩＬ−４Ｒαに対して、その他のいずれのものよりも有意に強力なアフィニティを示した。
【０１４２】
ついで、Ｄｕｐｉ  Ｈ−Ｃのものと同じＣＤＲを使用して、イヌ化抗体を構築した［より詳細な後記を参照されたい］。イヌＩＬ−４受容体アルファに対するキメラ（Ｄｕｐｉ  Ｈ−Ｃ）およびイヌ化抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２）の結合活性をＥＬＩＳＡにより比較した。図１Ｂに示されているとおり、該キメラ抗体および該イヌ化抗体は共に、イヌＩＬ−４Ｒαに対する強力なアフィニティを示している。これとは正反対に、対照イヌ化モノクローナル抗体（無関係なイヌ抗原に対して産生させたマウス抗体から得られたＣＤＲを含有するもの）は全く結合しなかった。
【表２】
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【０１４３】
イヌ化またはキメラ化操作のためには、ＩｇＧ重鎖を選択する必要があった。イヌＩｇＧの、選択される４つの公知ＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、それらはＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄと称される。２つの公知軽鎖サブタイプはラムダおよびカッパと称される。イヌＴｈ２免疫応答の発生のモジュレーションに加えて、ＩＬ−４Ｒαに対するイヌまたはイヌ化抗体は最適には以下の２つの特性を有する：
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のようなエフェクター機能を欠いている；ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィーに基づく技術のような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
【０１４４】
天然に存在するイヌＩｇＧアイソタイプはいずれも、両方の基準を満たしているわけではない［しかし、ＷＯ  ２０１５０９１９１０  Ａ２；米国特許出願第１５／１０５，２１１号（それらの両方の内容を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい］。例えば、ＩｇＧ−Ｂは、プロテインＡを使用して精製されうるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を有する。ＩｇＧ−Ｃも相当なＡＤＣＣ活性を有する。一方、ＩｇＧ−ＡはプロテインＡに弱く結合するが、望ましくないＡＤＣＣ活性を示す。更に、ＩｇＧ−ＤはＡＤＣＣ活性を示さないが、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄはいずれも、プロテインＡカラム上で精製できない。本発明は、ＩＬ−４Ｒαに特異的な突然変異イヌＩｇＧ−Ｂ抗体を提供することにより、この問題を克服する。そのような抗体はＡＤＣＣのようなエフェクター機能を欠き、業界標準のプロテインＡクロマトグラフィーを用いて容易に精製されうる。
【０１４５】
記載されている、エフェクター機能の低下したＩｇＧ−Ｂ変異体は、第１  ＩｇＧ−Ｂ変異体［ｃＩｇＧＢ（−）ＡＤＣＣ］（これにおいては、アスパラギン酸（Ｄ２７７）およびアスパラギン（Ｎ３２５）残基がアラニン残基へとそれぞれ変異している）、第２変異体［ｃＩｇＧＢ（＋）Ｄ−ヒンジ］（これにおいては、ＩｇＧ−Ｂのヒンジ領域がＩｇＧ−Ｄのヒンジ領域により置換されている）、および第３変異体［ｃＩｇＧＢ（＋）Ａ−ヒンジ］（これにおいては、ＩｇＧ−Ｂのヒンジ領域がＩｇＧ−Ａのヒンジ領域で置換されている）を含む。また、第２変異体および第３変異体は、第１変異体の同じアスパラギン酸およびアスパラギン残基の、アラニン残基での置換をも含む。本発明における突然変異しているアスパラギン酸およびアスパラギン残基の番号づけは、Ｔａｎｇら［Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，８０：２５９−２７０（２００１）］においてイヌＩｇＧ重鎖に関して記載されている番号づけ体系に基づく。
【化２】
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【０１４６】
キメラ抗ＩＬ−４受容体アルファ抗体の構築：
修飾イヌ定常重鎖（ＣＨ１〜ＣＨ３）を選択したら、抗ヒトＩＬ−４受容体アルファ  ｍＡｂ［ＵＳ  ２０１５／００１７１７６  Ａ１］の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を修飾イヌ定常重鎖のＤＮＡ配列に融合させて、キメラヒト−イヌ重鎖ＤＮＡ配列（配列番号１５）を得た。該コード化キメラヒト−イヌ重鎖は配列番号１６のアミノ酸配列を含む。同様に、抗ヒトＩＬ−４受容体アルファ  ｍＡｂの軽鎖可変領域［ＵＳ  ２０１５／００１７１７６  Ａ１］のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、定常イヌカッパ軽鎖のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合させて、キメラヒト−イヌ軽鎖ＤＮＡ配列（配列番号１７）を得た。該キメラヒト−イヌ軽鎖ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
修飾イヌ定常重鎖のＤＮＡ配列に融合した抗ヒトＩＬ−４受容体アルファｍＡｂ［ＵＳ８，８７７，１８９  Ｂ２］の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を使用して、類似したキメラ構築物を作製した。生じたキメラヒト−イヌ重鎖は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、キメラヒト−イヌ軽鎖は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる。
【０１４８】
同様に、修飾イヌ定常重鎖のＤＮＡ配列に融合した抗ヒトＩＬ−４受容体アルファｍＡｂ［ＵＳ７，１８６，８０９  Ｂ２］の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を使用して、キメラ構築物を作製した。該キメラヒト−イヌ重鎖は、配列番号２３のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、対応するキメラ抗体は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、該キメラヒト−イヌ軽鎖は、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、対応するキメラ抗体は配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
得られたキメラヒト−イヌ重鎖および軽鎖を、標準的な分子生物学技術を用いて、別々の発現プラスミド内にクローニングした。両方のプラスミドをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトし、発現された抗体を、プロテインＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞上清から精製した。
【０１５０】
キメラヒト−イヌ抗ＩＬ−４受容体アルファ抗体の構築：
いずれの特定のアプローチにも束縛されるものではないが、イヌおよびヒト配列の種々の含有物を有するイヌ化抗ＩＬ−４Ｒα  ｍＡｂの変異体の製造方法は以下の一般的スキームを含むものであった。
【０１５１】
ｉ）ヒトｍａｂのＶＨおよびＶＬ鎖のＤＮＡ配列を決定する。
【０１５２】
ｉｉ）ヒトｍａｂのＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲを特定する。
【０１５３】
ｉｉｉ）イヌＩｇＧの適切なＨ鎖およびＬ鎖を特定する。
【０１５４】
ｉｖ）イヌＩｇＧ  ＨおよびＬ鎖のＤＮＡ配列を記録する。
【０１５５】
ｖ）内因性イヌＨおよびＬ鎖ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、それぞれのヒトＣＤＲをコードするＤＮＡ配列で置換する。また、所望により、幾つかのイヌフレーム残基を、対応するヒトフレーム領域からの選択された残基で置換する。
【０１５６】
ｖｉ）工程（ｖ）からのＤＮＡを合成し、適切な発現プラスミド内にクローニングする。
【０１５７】
ｖｉｉ）プラスミドをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトする。
【０１５８】
ｖｉｉｉ）発現された抗体をＨＥＫ２９３上清から精製する。
【０１５９】
ｉｘ）精製された抗体をイヌＩＬ−４Ｒαへの結合に関して試験する。
【０１６０】
前記で概説した工程は、イヌおよびヒト配列の種々の含有物を有する変異体抗体のセットを与えた。
【０１６１】
イヌＩＬ−４受容体アルファに対する抗ヒトＩＬ−４受容体アルファモノクローナル抗体反応性の確認：
配列番号１６および配列番号１８によりコードされるキメラヒト−イヌ抗体を、イヌＩＬ−４受容体アルファに対する反応性に関して、以下のとおりに試験した。
【０１６２】
１．イムノプレートに２００ｎｇ／ウェルのＩＬ−４受容体アルファをコートし、プレートを４℃で一晩インキュベートする。
【０１６３】
２．０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳによりプレートを３回洗浄する。
【０１６４】
３．ＰＢＳ中の０．５％  ＢＳＡによりプレートを室温で４５〜６０分間、ブロッキングする。
【０１６５】
４．プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
【０１６６】
５．希釈プレートの各列または行において、キメラ抗体を０．３μｇ／ｍＬから３倍希釈する。
【０１６７】
６．希釈したキメラ抗体をイムノプレートの各列または行に移し、プレートを室温で４５〜６０分間インキュベートする。
【０１６８】
７．プレートをＰＢＳＴにより３回洗浄する。
【０１６９】
８．１：４０００希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗イヌＩｇＧをプレートの各ウェルに加え、プレートを室温で４５〜６０分間インキュベートする。
【０１７０】
９．プレートをＰＢＳＴにより３回洗浄する。
【０１７１】
１０．プレートの各ウェルにＴＭＢ基質を加え、プレートを室温で１０〜１５分間インキュベートして発色させる。
【０１７２】
１１．１００μＬの１．５Ｍ  リン酸を各ウェルに加えて、反応を停止させる。
【０１７３】
１２．５４０ｎｍの基準波長を用いて４５０ｎｍにおいてプレートを読取る。
【０１７４】
ヒト−イヌキメラＩＬ−４Ｒα（Ｄｕｐｉ  ｍＡｂ）抗体を、イヌＩＬ−４Ｒαに対する反応性に関して、前記のとおりにＥＬＩＳＡによりアッセイした。図１Ａおよび１Ｂに示されているとおり、該キメラヒト−イヌキメラＩＬ−４Ｒα抗体はイヌＩＬ−４Ｒαに用量依存的に強固に結合する。
【化３】
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【０１７５】
実施例３
イヌ化ヒト抗ヒトＩＬ−４Ｒαモノクローナル抗体
いずれの特定のアプローチにも束縛されるものではないが、イヌ化抗イヌＩＬ−４Ｒα  ｍＡｂを製造するために種々の組合せで混合されうるイヌ化重鎖および軽鎖の全体的な製造方法は以下のプロトコールで達成されうる。
【０１７６】
ｉ）既知の抗ヒトＩＬ−４Ｒαモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖のＣＤＲを特定する。ＣＤＲのアミノ酸配列を適切なＤＮＡ配列へと逆翻訳する。
【０１７７】
ｉｉ）イヌＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖（例えば、ＩｇＧ−Ｂの重鎖および軽カッパ鎖）の適切なＤＮＡ配列を特定する。
【０１７８】
ｉｉｉ）前記配列のイヌＩｇＧ  ＨおよびＬ鎖ＤＮＡの内因性ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を特定する。
【０１７９】
ｉｖ）内因性イヌＨおよびＬ鎖ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、所望の抗ＩＬ−４Ｒα  ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列で置換する。また、所望により、幾つかのイヌフレームワークアミノ酸残基をコードするＤＮＡを、所望の抗ＩＬ−４Ｒα  ｍＡｂフレームワーク領域からの選択されたアミノ酸残基をコードするＤＮＡで置換する。
【０１８０】
ｖ）工程（ｉｖ）からのＤＮＡを合成し、それを適切な発現プラスミドにクローニングする。
【０１８１】
ｖｉ）所望のイヌ化Ｈ鎖およびＬ鎖を含有するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクトする。
【０１８２】
ｖｉｉ）発現されたイヌ化抗体をＨＥＫ２９３上清から精製する。
【０１８３】
ｖｉｉｉ）精製されたイヌ化抗体をイヌＩＬ−４Ｒαへの結合に関して試験する。
【０１８４】
このようにして、３つのイヌ化Ｈ鎖および３つのイヌ化Ｌ鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を得た。それらを以下に示す。本発明は、それらの３つのイヌ化重鎖の１つと、それらの３つのイヌ化軽鎖の１つとの組合せより構成されるイヌ化抗体を提供する。このタイプの特定の実施形態においては、得られた抗体は、ＩＬ−４Ｒαとの最も強固な結合に関して選択される。
【０１８５】
前記のイヌ化抗体のＦｃ部分は、前記のとおりの及び２０１６年３月１８日付け出願の米国仮特許出願第６２／３１０，２５０号（その内容を参照により本明細書に組み入れることとする）［ＷＯ  ２０１５０９１９１０  Ａ２および米国特許出願第１５／１０５，２１１号（それらの両方の内容を参照により本明細書に組み入れることとする）も参照されたい］に記載されているとおりの、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を除去するためのイヌＩｇＧ−Ｂの修飾配列に基づいている。また、これらのイヌ化抗体のＦｃは、前記のとおり、ならびに米国仮特許出願第６２／３１０，２５０号、米国特許出願第１５／１０５，２１１号およびＷＯ  ２０１５０９１９１０Ａ２に開示されているとおり、他のイヌＩｇＧアイソタイプからの修飾Ｆｃで置換されうる。
【化４】
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【０１８６】
実施例４
イヌＩＬ−４受容体アルファに対するイヌ化抗体の遮断活性
イヌＩＬ−４受容体アルファを発現するＣＨＯ−ＤＧ４４安定細胞系を使用して、イヌＩＬ−４受容体アルファに対するイヌ化抗体の遮断活性に関する試験を行った。
【０１８７】
イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖を発現するＣＨＯ細胞系の構築およびリガンド遮断アッセイにおけるその使用：
配列番号１のヌクレオチド配列を有する完全長イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖をコードする核酸を合成し、哺乳類発現ベクター内にサブクローニングした。得られたプラスミドをＣＨＯ  ＤＧ４４細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、該細胞を９６ウェルプレート内に希釈して単細胞クローンを得た。４週間のインキュベーションの後に約１３０個のクローンを得た。該クローンの全てを、クローン化インターロイキン−４受容体アルファ［ｃＩＬ−４Ｒα］の発現に関して、抗ｃＩＬ−４Ｒαモノクローナル抗体（６Ｂ２）を使用するＦＡＣＳによりスクリーニングした。３つのクローンを安定性評価のために選択し、これをＦＡＣＳにより２０継代にわたってモニターした。
【０１８８】
ＣＨＯ細胞の表面上で発現されたイヌＩＬ−４ＲアルファへのイヌＩＬ−４の結合をイヌＩＬ−４受容体アルファに特異的なモノクローナル抗体が遮断する能力を評価するために、リガンド遮断アッセイを準備した。
【０１８９】
試薬および装置：
・細胞増殖培地：ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地  ＋  ８ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ＋  ０．０１８％  Ｆ−６８；
・ＦＡＣＳバッファー：ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ染色（Ｓｔａｉｎ）バッファー（ＢＤカタログ番号５５４６５７）；
・Ｒ−フィコエリシン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）結合ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：ＳＢ６６）；
・イヌＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号７５４−ＣＬ／ＣＦ）；
・製造業者の推奨に従いイヌＩＬ−４をビオチン化するために使用されるＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋビオチン結合キットＡ型（Ｎｏｖｕｓ：７０４−００１０）
・フローサイトメーター：ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ；
・細胞系：イヌＩＬ−４受容体アルファを発現するＣＨＯ−ＤＧ４４安定細胞系。
【０１９０】
手順：
１．ＣＨＯ−ＤＨ４４−ｃａｎＩＬ−４Ｒα細胞を９６％以上の生存度で２〜４×１０６  細胞／ｍＬまで増殖させた。
【０１９１】
２．細胞を遠心沈降させ、上清を廃棄し、細胞を２×１０７  細胞／ｍＬまでＦＡＣＳバッファー中に懸濁させた。
【０１９２】
３．細胞をＵ型９６ウェルプレート内に分注（各ウェル５０μｌ）した。
【０１９３】
４．ＦＡＣＳバッファー中の抗イヌＩＬ−４Ｒα（Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２）ｍＡｂを９６ウェルプレート上で上部ウェルから下部ウェルへと５０μｇ／ｍＬから３倍希釈した。
【０１９４】
５．５０μｌの各希釈Ａｂを細胞プレート内に移し、ついで氷上で３０分間インキュベートした。
【０１９５】
６．細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
【０１９６】
７．細胞をＦＡＣＳバッファー中の０．３２μｇ／ｍＬのビオチン化イヌＩＬ−４の１００μｌ中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。
【０１９７】
８．細胞を２５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
【０１９８】
９．細胞をＦＡＣＳバッファー中のＲ−フィコエリシン結合ストレプトアビジン（１：１００希釈）の１００μｌ中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。
【０１９９】
１０．細胞を２５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
【０２００】
１１．細胞をＦＡＣＳバッファー中で３００μｌへと調整した。
【０２０１】
１２．ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩにより各サンプルに関して１０，０００個の細胞を読取った。
【０２０２】
１３．得られた読取り（リードアウト）をＦｌｏｗＪｏにより分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。
【０２０３】
図２は、ＣＨＯ細胞上で発現されたイヌＩＬ−４受容体アルファとのイヌＩＬ−４の相互作用に対するイヌ化Ｄｕｐｉ  ｍＡｂの遮断活性を試験するためのＦＡＣＳアッセイの結果を示す。これらの結果は、ＣＨＯ細胞上で発現されたＩＬ−４受容体アルファとのイヌＩＬ−４の相互作用に対するイヌ化Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２抗体の用量依存的遮断活性を示している。
【０２０４】
実施例５
イヌＩＬ−４Ｒαに対するイヌ化ＤＵＰＩ抗体の中和活性の試験
ＩＬ−４受容体アルファを発現するＢａＦ３細胞系の構築
ＢａＦ３はマウス前駆Ｂ細胞系であり、その細胞増殖はマウスＩＬ−３に依存的である。ヒトＩＬ−４受容体アルファ鎖を発現するＢａＦ３細胞はＩＬ−４の刺激で増殖することが示されている。このプロトコールは、イヌＩＬ−４受容体アルファ鎖を発現するＢａＦ３安定細胞系を作製するためのものであり、得られる細胞系はイヌＩＬ−４による刺激に際して増殖する。
【０２０５】
ＢａＦ３増殖培地は、１０％  ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｎｇ／ｍＬ  マウスＩＬ−３およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ  １６４０である。
【０２０６】
選択培地：ＩＬ−３がイヌＩＬ−４により置換された増殖培地。
【０２０７】
１．ＢａＦ３細胞のバイアルを３７℃で解凍し、融解細胞を３０ｍＬの増殖培地内に移し、１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。
【０２０８】
２．トランスフェクション前に細胞を３回継代する。トランスフェクションのためには、得られた細胞は９６％以上の生存度でなければならない。
【０２０９】
３．１×１０７個の生存細胞を遠心沈降させ、７００μＬのＲＰＭＩ  １６４０で再懸濁させる。
【０２１０】
４．細胞を氷上の４ｍｍギャップキュベット内に移し、ついで４０μｇのｐＴＴ５−ｃＩＬ−４ＲαプラスミドＤＮＡを１００μＬのＲＰＭＩ  １６４０中でキュベット内に加え、穏やかに混合する。
【０２１１】
５．細胞を２００Ｖ、１０００μＦでのエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、ついで、２５ｎｇ／ｍＬ  ｃＩＬ−４を含有する選択培地に移す。
【０２１２】
６．ついでプール化細胞を１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃でインキュベートして、ｃＩＬ−４のもとで増殖しうる細胞を回収する。
【０２１３】
７．プール細胞を、ｃＩＬ−４を含有する培地内で連続的に継代して、該細胞系を７継代にわたって安定化させる。
【０２１４】
８．単細胞クローンを限界希釈分析により選択する。
【０２１５】
図３は、前記のとおりに調製されたＢａＦ３細胞上で発現されたイヌＩＬ−４受容体アルファに対するイヌ化Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２モノクローナル抗体の結合活性を試験するＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
【０２１６】
ＢａＦ３細胞によるイヌＩＬ−４受容体アルファの発現を判定し、該細胞上のその受容体に対するイヌ化Ｄｕｐｉ抗体の結合活性を確認するためのＦＡＣＳアッセイ。
【０２１７】
１．イヌＩＬ−４を含有する選択培地内で１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃で前記細胞を増殖させる。
【０２１８】
２．アッセイの準備の前に、マウスＩＬ−３を含有する増殖培地内で細胞を２〜３回継代し、細胞生存度が９５％以上となるようにする。
【０２１９】
３．細胞を遠心沈降させ、上清を廃棄し、２５０μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄し、細胞を１×１０７  生存細胞／ｍＬまでＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させる。
【０２２０】
４．選択された抗体を、該細胞の、３つの個々の１００μＬアリコートに、５μｇ／ｍＬまでそれぞれ加え、細胞アリコートを分離するために、イヌ化ＤｕｐｉＨ２Ｌ２、陽性対照としてのイヌＩＬ−４Ｒαに対して産生されたイヌ化マウス抗体、および陰性対照としての無関係な抗原に対して産生されたイヌ化マウス抗体を加える。また、第４の細胞のアリコートには抗体が加えられていない。
【０２２１】
５．細胞を、穏やかに振とうしながら氷上で３０分間インキュベートし、ついで細胞を２５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄する。
【０２２２】
６．細胞を１００μｌのウサギ抗イヌＩｇＧ  ＦＩＴＣ中に再懸濁させ、穏やかに振とうしながら氷上で３０分間インキュベートする。
【０２２３】
７．２×２５０μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄する。
【０２２４】
８．細胞を３００μｌのＦＡＣＳバッファーに取る。
【０２２５】
９．ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩにより各サンプルに関して２０，０００個の細胞を読取る。
【０２２６】
図３に示されている得られたＦＡＣＳアッセイは４つの独立したピークを示しており、最初の２つのピークは、（ａ）ＢａＦ３細胞のみ、および（ｂ）無関係な抗原に対して産生されたイヌ化マウス抗体（陰性対照）と共にインキュベートされたＢａＦ３細胞に対応する。どちらの場合も、それらのピークは比較的狭く、色素（ＦＩＴＣ−Ａ）の量はバックグラウンド値に等しい（１０３を僅かに下回る位置に中央が配置されている）。これは結合イヌ抗体の非存在と合致する。図３における残りの２つのピークは、（ｃ）イヌＩＬ−４Ｒαに対して産生されたイヌ化マウス抗体（陽性対照）と共にインキュベートされたＢａＦ３細胞、および（ｄ）Ｄｕｐｉ  Ｈ２Ｌ２と共にインキュベートされたＢａＦ３細胞に対応する。これらの場合のどちらにおいても、それらのピークは幅広であり、色素（ＦＩＴＣ−Ａ）の量はバックグラウンド値よりも実質的に多い（１０４を僅かに上回る位置に中央が配置されている）。ＦＩＴＣ−Ａのこの増加は、それぞれ、イヌＩＬ−４Ｒαを発現するＢａＦ３細胞、ならびにイヌ化Ｄｕｐｉ  Ｈ２Ｌ２および陽性対照の、発現ＩＬ４Ｒαへの結合によるものである。要約すると、図３は、ｐＴＴ５−ｃＩＬ−４ＲαプラスミドによりトランスフェクトされたＢａＦ３細胞がイヌＩＬ４受容体アルファを発現しうること、およびイヌ化Ｄｕｐｉ抗体がその発現イヌＩＬ−４Ｒαに結合しうることを示している。
【０２２７】
イヌＩＬ−４受容体アルファに対するイヌ化Ｄｕｐｉ抗体の中和活性を試験するためのＭＴＴ細胞増殖アッセイ：
細胞系：前記のとおりのイヌＩＬ−４受容体アルファ鎖を発現するＢａＦ３安定細胞系。
【０２２８】
１．イヌＩＬ−４を含有する選択培地内で１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃で細胞を増殖させる。
【０２２９】
２．アッセイの準備の前に、マウスＩＬ−３を含有する増殖培地内で細胞を２〜３回継代する。アッセイのためには、得られる細胞は９６％以上の生存度でなければならない。
【０２３０】
３．細胞を１２５０ｒｐｍで３分間遠心沈降させ、飢餓培地（血清、ＩＬ−３およびＩＬ−４を含有しない基礎培地）中に４×１０６  生存細胞／ｍＬまで再懸濁させる。
【０２３１】
４．細胞を５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレート内に分注する（エッジ効果を避けるために、培地２００μＬ／ウェルとなるよう、最初および最後の列および行を残し、約０．２×１０６  生存細胞／ウェル）。
【０２３２】
５．出発濃度１ｍｇ／ｍＬの抗体を９６ウェルプレートにおいて飢餓培地内で２倍希釈する。
【０２３３】
６．５０μＬの希釈抗体を細胞プレートの各ウェル内に移し、穏やかに混合する。
【０２３４】
７．プレートを１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃で１〜２時間インキュベートする。
【０２３５】
８．飢餓培地中の１１０ｎｇ／ｍＬのイヌＩＬ−４溶液を調製し、ついで１０μＬ／ウェルで細胞プレート内に分注する。
【０２３６】
９．プレートを１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートする。
【０２３７】
１０．ＭＴＴに基づく色素溶液１５μＬを各ウェル内に加え、プレートを１２５ｒｐｍのシェーカーにおいて８％  ＣＯ２、３７℃で２〜４時間インキュベートして発色させる。
【０２３８】
１１．１００μＬの停止溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートする（プレートは４℃で一晩保存されうる）。
【０２３９】
１２．６５０ｎｍの基準を用いて５７０ｎｍでプレートを読取る。
【０２４０】
図４は、ＢａＦ３細胞増殖に関する、対照非中和抗体と比較した場合のキメラヒト−イヌモノクローナル抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ−Ｃ）およびイヌ化モノクローナル抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２）の中和活性を試験するためのＭＴＴ細胞ベースアッセイの結果を示す。Ｄｕｐｉ  Ｈ−ＣおよびＤｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２の両方の用量依存的中和活性はＢａＦ３細胞増殖の低下の観察をもたらしたが、対照非中和抗体は細胞増殖に対するこの効果をもたらさなかった。
【０２４１】
実施例６
イヌＩＬ−４Ｒαエピトープのマッピング
序論
対応コグネイトタンパク質抗原との抗体の相互作用は該抗体の特異的アミノ酸（パラトープ）とその標的抗原の特定のアミノ酸（エピトープ）との結合によって媒介される。エピトープは、免疫グロブリンによる特異的反応を引き起こす抗原決定基である。それは抗原の表面上のアミノ酸の一群からなる。
【０２４２】
関心のあるタンパク質は、種々の抗体により認識される幾つかのエピトープを含有しうる。抗体により認識されるエピトープは直鎖状エピトープまたはコンホメーションエピトープとして分類される。直鎖状エピトープはタンパク質におけるアミノ酸の一連の連続的配列により形成され、一方、コンホメーションエピトープは、一次アミノ酸配列においては不連続的である（例えば、遠く離れている）が三次元タンパク質フォールディングに際して合体するアミノ酸から構成される。
【０２４３】
エピトープマッピングは、抗体により認識されるその標的抗原上のアミノ酸配列（すなわち、エピトープ）を特定する方法を意味する。標的抗原上でモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により認識されるエピトープの特定は重要な用途を有する。例えば、それは新規治療剤、診断剤およびワクチンの開発を補助しうる。エピトープマッピングはまた、（例えば、アトピー性皮膚炎を治療するための）最適化治療用ｍＡｂの選択を補助し、その作用メカニズムの解明を助けうる。
【０２４４】
質量分析を用いるＩＬ−４受容体アルファエピトープのマッピング：
不連続的エピトープのマッピングは技術的に困難であり、専門的な技術、例えば、対応標的タンパク質とのモノクローナル抗体のＸ線共結晶解析、水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換、および／または酵素消化と組合された質量分析を要する。抗イヌＩＬ−４Ｒα  ｍＡｂ  ｃＤｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２により認識されるエピトープを特定するために、化学的架橋、高質量ＭＡＬＤＩ質量分析およびｎＬＣ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析に基づく方法を用いた（ＣｏｖａｌＸ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）。図５に示されているとおり、イヌＩＬ−４Ｒαのエピトープマッピングに対するこの技術の適用は、配列番号３９（アミノ酸配列：ＱＷＫＭＤＨＰＴＮＣＳＡＥＬＲＬＳＹＱＬＤ；領域１）および配列番号４０（アミノ酸配列：ＲＬＡＡＳＴＬＫＳＧＡ；領域２）（接触アミノ酸残基が太字で示されている）により表されるイヌＩＬ−４Ｒα鎖の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の２つの領域へのエピトープの位置の特定をもたらした。結果はまた、これら２つの領域が、ｃＤｕｐｉ  Ｈ２  Ｌ２抗体と接触しているＩＬ−４Ｒα鎖のアミノ酸、特に、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸２７位のスレオニン残基、アミノ酸３７位のチロシン残基、アミノ酸１６４位のセリン残基、アミノ酸１６５位のスレオニン残基、およびアミノ酸１６７位のリジン残基を含む。その結果は、エピトープがアミノ酸ＴＮＣＳＡＥＬＲＬＳＹの配列（配列番号４１；サブ領域１）および／またはＳＴＬＫ（配列番号４２；サブ領域２）のアミノ酸配列を含むことを示している。結果は、該エピトープがＴＮＣＳＡＥＬＲＬＳＹ（配列番号４１；亜領域１）のアミノ酸配列および／またはＳＴＬＫ（配列番号４２；亜領域２）のアミノ酸配列内に存在することを示している。
【０２４５】
更に、確実には予測できないが、イヌ化抗体（Ｄｕｐｉ  Ｈ２−Ｌ２）と接触していると決定されたイヌＩＬ−４Ｒα鎖配列内のアミノ酸残基はヒトＩＬ−４Ｒα配列の対応アミノ酸残基と同一であることが判明した。ヒトＩＬ−４Ｒα鎖のエピトープは開示されていないが、イヌＩＬ−４Ｒα鎖内の接触アミノ酸残基が対応ヒトＩＬ−４Ｒα配列におけるものと同一であるという本知見、および本明細書に報告されている交差反応性に基づけば、イヌＩＬ−４Ｒα配列内の、この抗体に関して現在特定されているエピトープはまた、ヒトＩＬ−４Ｒα配列内のエピトープである可能性が高いことが示唆される。
【表３】
2019506146.tif 000018
【０２４６】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明および添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０２４７】
前記の明細書は、当業者が本発明を実施しうるのに十分なものであるとみなされる。本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が前記説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【図１】
2019506146.tif 000019
【図２】
2019506146.tif 000020
【図３】
2019506146.tif 000021
【図４】
2019506146.tif 000022
【図５】
2019506146.tif 000023
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019506146.tif 000025
2019506146.tif 000026
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