(57)【要約】  静電的相互作用を介して高流動で、タンパク質、核酸、他の生物学的若しくは他の生体分子、化合物又は溶質を分離するためのマルチブロック重合体材料、その調製方法及びその使用に関し、自己組織化ブロック重合体材料が、マクロ細孔、メソ細孔又はミクロ細孔のうち少なくとも１つを有し、細孔のうち少なくとも一部がイソポーラスであり、少なくとも１つの重合体ブロックが、イソポーラス構造において帯電された大きな表面領域を提供するために静帯電又は反応性官能基を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロ細孔、メソ細孔又はミクロ細孔のうち少なくとも１つを有する、帯電した自己組織化ブロック重合体材料であって、前記細孔のうち少なくとも一部がイソポーラスであり、前記材料は、静帯電又は反応性官能基を有する少なくとも１つの重合体ブロックを含み、前記材料は、官能基上の帯電部分によって部分的又は定量的に官能基化された大きな領域、小さな領域及び隙間の領域を有して、前記材料上に静止電荷をもたらし、高流動でのタンパク質、核酸、他の生物学的若しくは他の生体分子、化合物又は溶質の分離のために、帯電された大きな表面及びイソポーラス構造を提供する、材料。
【請求項２】
非対称構造又は対称構造である、請求項１に記載の材料。
【請求項３】
単一の一体構造においてマクロ多孔性のドメイン及びメソ多孔性の壁構造をさらに有する、請求項２に記載の材料。
【請求項４】
連続しているマクロ多孔性のドメインをさらに有する、請求項３に記載の材料。
【請求項５】
前記材料は、約１乃至２００ｎｍのサイズを含むメソ細孔、及び、少なくとも５０ｎｍ以上であるサイズを含むマクロ細孔を有する、請求項４に記載の材料。
【請求項６】
官能基化反応が、利用可能な単位上に部分的又は完全な静止電荷を提供する、請求項５に記載の材料。
【請求項７】
前記ブロックの少なくとも一部が静止電荷を有する、請求項５に記載の材料。
【請求項８】
前記静止電荷は正電荷であり、帯電した官能基化単位が、四級化ピリジンを含む四級化アミン基、四級化ジエチルアミノエチル基、又は、四級化ジメチルアミノエチル基である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の材料。
【請求項９】
前記静止電荷は負電荷であり、帯電した官能基化単位がスルホン酸基である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の材料。
【請求項１０】
以下の構造
ａ．Ａ−Ｂ−Ｃ、
ｂ．Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ、
ｃ．Ａ−Ｂ−Ａ−Ｃ、
ｄ．Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ、
ｅ．Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ、
ｆ．Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｃ−Ａ、又は
ｇ．少なくとも３つの異なるブロックであるＡ、Ｂ及びＣを有する、高次のブロック構造（例えば、ヘキサブロック、ヘプタブロック、オクタブロック、ノナブロック、デカブロック等）
に従って、マクロ細孔、メソ細孔又はミクロ細孔のうち少なくとも１つを有する少なくともブロックＡ、Ｂ及びＣを含む、イソポーラスの帯電したマルチブロック重合体材料であって、前記細孔のうち少なくとも一部がイソポーラスであり、少なくとも１つの重合体ブロックが、静帯電又は反応性官能基を有する、材料。
【請求項１１】
ａ．ブロックのうち少なくとも１つが、低Ｔｇのブロック（≦２５℃）である、又は
ｂ．前記ブロックのうち少なくとも１つが、静止電荷、又は、後に化学物質と反応して静止電荷を生成する反応性官能基を含む、請求項１０に記載の材料。
【請求項１２】
前記構造はＡ−Ｂ−Ｃである、請求項１０又は１１に記載の材料。
【請求項１３】
帯電したイソポーラスのマルチブロック重合体材料を形成する方法であって、少なくともブロックの一部が帯電部分を含む、方法。
【請求項１４】
帯電したイソポーラスのマルチブロック重合体材料を形成する方法であって、少なくともブロックの一部が反応性官能基を含み、次に、前記反応性官能基の少なくとも一部と反応して静止電荷を導入する化学物質と前記材料を接触させる、方法。
【請求項１５】
標的生体分子を、該標的生体分子を有する他の生体分子又は他の溶質の混合物から分離するプロセスであって、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の材料と前記生体分子の混合物を接触させて、前記標的生体分子を分離する及び／又は除去するステップを含むプロセス。
【請求項１６】
前記静止電荷は正電荷であり、式Ｒ−Ｘによって定められた四級化剤によって提供され、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１〜Ｃ１２の置換又は未置換の直鎖、環状又は分岐状アルキル又はアルケニル基であり、Ｘは、ハライド（Ｆ−、Ｃｌ−、Ｉ−、Ｂｒ−）又は−−ＯＳＯ２ＣＨ３等の脱離基である、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の材料。
【請求項１７】
前記静止電荷は、式Ｒ−Ｗ−（Ｒ）−ＣＨ２−Ｘを有する四級化剤によって定められ、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１〜Ｃ１２の置換又は未置換のアルキル、アルケニル又はアリール基であり、Ｗは、酸素、ケイ素、硫黄又は窒素等のヘテロ原子であり、Ｘは、ハライド（Ｆ−、Ｃｌ−、Ｉ−、Ｂｒ−）又は−−ＯＳＯ２ＣＨ３等の脱離基であり、このクラスの四級化剤の一部の例が、Ｘ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ５、Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３及びＸ−ＣＨ２ＣＨ２−モルホリンである、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の材料。
【請求項１８】
前記静止電荷は、式Ｒ−（Ｗ）−ＣＯＣＨ２−Ｘのアシル化合物である四級化剤によって提供され、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０のアルキル又はアルケニル、又は、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基であり、Ｗは、酸素又は窒素等のヘテロ原子であり、Ｘは、ハライド（Ｆ−、Ｃｌ−、Ｉ−、Ｂｒ−）又は−−ＯＳＯ２ＣＨ３等の脱離基であり、このクラスのアシル化剤の適した例が、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯ２ＣＨ３、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２及びＸ−ＣＨ２ＣＯＮ（ＣＨ３）２を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、２０１６年４月２８日に出願した米国仮特許出願第６２／３２８，７０７号に基づく優先権を主張するものであり、参照により全内容を本出願において援用する。
【０００２】
本願は、静電的相互作用を介して溶質を分離するための、イソポーラス材料（ｉｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を含むマルチブロック重合体セパレータ、その調製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質の発現、構造及び機能の理解における主要な進歩にもかかわらず、複雑な混合物からのタンパク質の精製には問題が残っている。しばしば細胞培養液中の標的分子は、分離の複雑さを増大させる、例えば、宿主タンパク質、細胞残屑、ＤＮＡ、ウイルス及びエンドトキシン等、多種多様な外来性成分又は偶発性成分さえも含む。標的タンパク質は、環境条件に対して非常に敏感であることが多くあり、容易に変性させられるか、又さもなければ、損傷を受ける可能性がある。
【０００４】
アップストリーム技術は、５ｇ／Ｌを超えるプロダクトタイターをもたらすことができ、高処理の精製の必要性を駆り立てている。従来、生体分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換カラムを含むクロマトグラフィーに大きく依存してきた。しかし、これらのクロマトグラフィー技術は、処理量に制限があり、ダウンストリームのバイオプロセスの高コストの大きな一因となる。
【０００５】
限外ろ過（ＵＦ）は、タンパク質の濃縮及び製剤化のためのダウンストリームのバイオプロセスの後期において頻繁に使用される。例えば、トラックエッチド又は位相反転された市販のＵＦ膜がある。トラックエッチドメンブレンは、非常に均一の細孔を有して、選択的な分離を可能にしているが、細孔密度が低いために低い処理量を被っている。一方、位相反転膜は、はるかに大きい流動を可能にするが、不均一の細孔を有し、選択的な分離を達成することができない。流動の制限により、トラックエッチドメンブレンがベンチスケールの研究のためにほとんど独占的に使用され、位相反転膜はダウンストリームの生物製剤プロセスにおいて広く使用されている。位相反転膜は、広範な正規対数の孔径分布を経験的に示し、効果的な分画のためにタンパク質のモル質量において６〜１０倍の差を必要としている。この孔径の変動は、膜を横切る不均一な流れのパターンを引き起こし、破過曲線を広げ、媒体容量（ｍｅｄｉａ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を減少させる。
【０００６】
膜構造及び化学官能性における欠乏は、濃縮及び製剤化ステップへのその使用を大きく制限している。従って、ラボスケールアップの検証に対しても、当然ながら、医学的に関連しているタンパク質の商業規模の製造に対しても、タンパク質精製方法を改善する必要がある。出願人は、イソポーラス材料の物理的構造の独特の調整を化学官能性と組み合わせて、静電的相互作用を介して類似のサイズの溶質を促進及び分離することにより、先行技術の制限を克服する高処理量及び高分解能の分離の適用をもたらす、例えば、フィルム、膜、シート及びチューブ等のイソポーラスの帯電したマルチブロック重合体材料の生成が可能になるということを見出した。
【０００７】
複雑な混合物からの他の生体分子の分離も特に困難であり得る。例えば、核酸を診断のために全血から単離することができる。全血からのＤＮＡの単離は、赤血球、タンパク質及び塩を含む様々な長さスケールの溶質のため、特に難しい分離である。ＤＮＡ単離の１つの方法は、複雑な混合物から負に帯電したＤＮＡを単離するために静電的相互作用を使用することである。それにもかかわらず、既存の膜技術を介した分離が困難であるため、全血からＤＮＡを単離するための効果的な膜技術は商品化されていない。出願人は、本明細書に記載の発明が、全血からの核酸の分離及び濃縮を可能にすることを見出した。
【０００８】
帯電した多孔性材料は、バイオフィルム発達の防止に効果的である。例えば、創傷に対する包帯材としてそのような材料を使用することにおいて、多孔性材料は、水蒸気、窒素及び酸素のような気相化学物質の通過を可能にする。しかし、バイオフィルムが発達すると、創傷治癒を阻止する恐れがある。本明細書に記載の帯電した多孔性材料を使用して、バイオフィルムの発達を阻止することができる。加えて、帯電した多孔性材料は、創傷治癒特性をさらに強化し、創傷ケア用途に寄与するために、抗菌化学物質を用いてさらに官能基化することができる。
【０００９】
クロマトグラフィーカラムも、電荷及びサイズを含む様々な物理的及び化学的特徴に基づき種を分離するために広範に使用されてきたが、クロマトグラフィーは処理量に制限があり、高価であることが多い。本明細書に記載の帯電した多孔性材料を使用して、電荷及びサイズに基づき溶質を分離することができる。例えば、静電的相互作用を介して膜に結合した種は、溶出剤の勾配を材料に通すことによって膜から引き離すことができる。このようにして、勾配分離を行うことができる。或いは、固定された組成の溶出剤を膜に通すことによって、種の選択対象を膜から引き離すことができる。固定された組成は、所望の種の選択対象のみを引き離すのに適している。このようにして、均一濃度の分離を行うことができる。さらに、一連の溶出を行うことができ、各溶出は、さらなる種の選択対象を引き離すのに適した固定された組成のものである。このようにして、段階溶出を行うことができる。
【００１０】
電荷とサイズの併用効果を使用して、生体分子を含む溶質を分画することに対する強い関心があった。しかし、この有望なアプローチのさらなる発展における主要な制限要因は、既存の膜プラットフォームの不均一な孔径である。図１は、孔径分布による問題を例示している。大きな孔径の領域（５）は、矢印（３５）によって表されるよりも大きな流れの部分を表す矢印（３０）によって示されているように、より小さい孔径の領域（１０）よりも多くの流体の流れを運ぶ。帯電した部位は、大きな孔径の領域において結合した種で急速に満たされ、そのような種が膜から逃げることを可能にし、小さな孔径の領域は結合し続ける。従って、結合を目的とする種のブレークスルーが、細孔全てが均一のサイズである場合に起こるよりも少ない量の処理量にて起こる。
【００１１】
出願人は、孔径の均一性を高めて、歴史的な膜プラットフォームの正規対数の孔径分布の広がりを減らすことによってこの問題を解決した。例えば、本発明の膜の一実施形態では、図２において示されているように、ほぼ同一の孔の単一層（１５）が膜の下流表面上に形成される。この層は、膜の上流部分における孔径分布に関係なく、等しい大きさの流れの矢印（２０）及び（２５）によって示されているように、流れを均一に分布させる流れに対する抵抗の大部分に寄与する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７００，９０２
【特許文献２】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，５６５，７８２
【特許文献３】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０１１０２４０５５０
【特許文献４】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０１３０１９３０７５
【特許文献５】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ２００５０８２５０１
【特許文献６】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００９０１７３６９４
【特許文献７】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ２０１２／１５１４８２
【特許文献８】ＥＰ２７０５０７７Ａ２
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｚｙｄｎｅｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒｉｙｅｌ，Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，３５−４６，（２０００）
【非特許文献２】Ｓｈｕｋｌａ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｍｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２８，２５３−２６１，（２０１０）
【非特許文献３】Ｃｌｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．，３４，１９０−１９４（２０１３）
【非特許文献４】Ｎｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，ＤＯＩ  １０．１０２１／Ｉａ２０４３９ｐ，ｗｅｂ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ２８  Ｊｕｎｅ  ２０１１
【非特許文献５】Ｐｈｉｌｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１，２８９２−２９００（２０１１）
【非特許文献６】Ｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．，４５１，２２６６２−２２７５（２０１４）
【非特許文献７】Ｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４１，５３０（２０１３）
【非特許文献８】Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．Ｅ  ２１ａ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｈ．Ａｈｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄ．，Ｔｈｉｅｍｅ，１９９５
【非特許文献９】ｖａｎ  Ｒｅｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｋｓｅｎａ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉ．１２９，１９−２９（１９９７）
【非特許文献１０】Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４０６，６４９９−６５１２（２０１４）
【非特許文献１１】Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ９，ｅ８７８３８（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、静電的相互作用を介して生体分子を含む溶質を分離するための、イソポーラスのマルチブロック重合体材料、ひとまとめにして材料を有するフィルタ／セパレータ、その調製方法及びその使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の帯電した自己組織化ブロック重合体材料は、マクロ細孔、メソ細孔又はミクロ細孔のうち少なくとも１つを有し、細孔のうち少なくとも一部がイソポーラスであり、少なくとも１つの重合体ブロックは、静帯電又は反応性官能基を有する。材料は、官能基上の帯電部分によって部分的又は定量的に官能基化された大きな、小さな及び隙間の領域（ｍａｊｏｒ，  ｍｉｎｏｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ）を有して、材料上に静止電荷をもたらし、高流動でのタンパク質、核酸、他の生物学的若しくは他の生体分子又は溶質の容易な分離のために、帯電された大きな表面及びイソポーラス構造を提供する。
【００１６】
本発明のイソポーラスの帯電したマルチブロック重合体材料は、マクロ細孔、メソ細孔又はミクロ細孔のうち少なくとも１つを有する少なくともブロックＡ、Ｂ及びＣを含み、細孔のうち少なくとも一部がイソポーラスであり、少なくとも１つの重合体ブロックは、静帯電又は反応性官能基を有し、さらに、以下の式
Ａ−Ｂ−Ｃ                （Ｉ）、
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ            （ＩＩ）
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ            （ＩＩＩ）
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｂ−Ａ        （ＩＶ）
Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｃ−Ａ        （Ｖ）
によって定められる。
【００１７】
本発明のマルチブロック重合体は、一般的に、ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、（Ｘ）ｎを有するとして定められ、ｎ＝０〜７であり、Ｘは、同じであっても異なっていてもよく、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧから選択される。Ａ、Ｂ又はＣのうちの１つに適したブロックは、低Ｔｇブロック（≦２５℃）であるが、ブロックのうちの１つが低Ｔｇブロックである場合、少なくとも１つの他のブロックは、高Ｔｇブロック（＞２５℃）であるという条件付きである。少なくとも１つのブロックは、静止電荷を有するか、又は、反応して静止電荷を生成し得る反応性官能基を有さなければならない。Ｄ、Ｅ、Ｆ又はＧに適したブロックには：ポリ（ブタジエン）、ポリ（イソブチレン）、ポリ（ブチレン）、ポリ（イソプレン）ポリ（エチレン）、ポリ（スチレン）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸ｎ−ブチル）、ポリ（メタクリル酸−２−ヒドロキシエチル）、ポリ（メタクリル酸グリシジル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（スルホン）、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（ｎ，ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（２−ビニルピリジン）、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）、ポリ（アミド酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリ（乳酸）、ポリ（イソシアネート）、ポリ（シアノアクリル酸エチル）、ポリ（エチレングリコールメチルエーテルメタクリレート）、ポリ（アクリロニトリル）、ポリ（ヒドロキシスチレン）、ポリ（α−メチルスチレン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（スチレンスルホン酸）、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリ（ペンタフルオロスチレン）、ポリ（２−（パーフルオロヘキシル）エチルメタクリレート）が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明は、限定されることなく、支持された又は支持されていない３次元の膜、フィルム、シート、チューブ、又は、ヘリカル若しくはスパイラルの形態のもの等の材料であって、帯電部分を有する官能基化されたイソポーラスのブロック重合体を含む材料を含み、その材料を、高処理の電荷に基づく分離に適したものにする。
【００１９】
本発明は、溶質の静電特徴にもサイズにも基づき溶質分離を促進する静止電荷を有するイソポーラスのマルチブロック重合体を含む。
【００２０】
本発明は、タンパク質分画、及び、分析的及び産業的なタンパク質分画のための単離に対する高流動での官能基化されたセパレータを含む。
【００２１】
本発明はイソポーラス材料に関し、イソポーラス材料は、実験室であろうと、スケールアップ又は商業的環境であろうと、タンパク質生成及び分析のための例えば１つの正に帯電したタンパク質及び１つの中性タンパク質の静電反発等を介した、タンパク質等の類似のサイズの分子の分離、患者特異的生体分子を含む生体分子特異的な分子等の類似のサイズの分子の分離を促進する。
【００２２】
本発明は、静電的相互作用を介した類似のサイズのタンパク質の分離を促進するイソポーラス材料、その調製方法及びその使用に関し、イソポーラス材料は、静電的相互作用を介した核酸の分離を促進し、静電的相互作用を介した帯電した生体分子の分離を促進する。
【００２３】
本発明は、静電的相互作用を介したマトリックスメタロプロテイナーゼの選択的分離を促進するイソポーラス材料に関する。
【００２４】
本発明は、三次元のフィルム、チューブ、スパイラル、シート等、様々な構成の帯電したイソポーラス材料に関する。
【００２５】
帯電したイソポーラス材料は、異なる電荷状態を有する類似のサイズのタンパク質を静電気的に分離するための、少なくとも１０の選択性及び／又は５０Ｌｍ−２ｈｒ−１ｂａｒ−１の透過性を有する。
【００２６】
本発明は、本明細書において開示される、大きい表面及び均一の孔径を有する階層的に多孔性の材料を形成する少なくとも１つの化学反応性官能基化重合体ブロックを有する自己組織化マルチブロック重合体又は自己組織化マルチブロック共重合体（ＭＢＰ又はＢＣＰ）の材料を含む。これらのイソポーラス材料の反応領域は、反応性単位と末端又は架橋剤との反応によって部分的又は定量的に官能基化されて、電荷の程度が、例えば利用可能な反応性単位の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％等、少なくとも２０％乃至９０％であるように、材料上に静止電荷を生成する。
【００２７】
自己組織化マルチブロック共重合体の帯電した材料は、約１〜２００ｎｍのサイズ、全単位のサイズ、及び、その間に及ぶサイズを含むメソ細孔、及び、少なくとも５０ｎｍ以上のサイズを含むマクロ細孔を有する。
【００２８】
＞５０Ｌｍ−２ｈｒ−１ｂａｒ−１、＞１００Ｌｍ−２ｈｒ−１ｂａｒ−１、＞２００Ｌｍ−２ｈｒ−１ｂａｒ−１の透水率にて、帯電した１つ又は複数の溶質を効果的に分離する、本明細書において記載される自己組織化マルチブロックのイソポーラスの帯電した材料が開示される。サイズ排除及び電荷相互作用の二重分離方法論は、関心のあるタンパク質、核酸、治療化合物又は他の分子若しくは化合物の高処理のバイオプロセスを駆り立てる。
【００２９】
１つの正に帯電したタンパク質及び１つの中性タンパク質の静電反発を介して類似のサイズのタンパク質を分離するために、静止正電荷（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅ）を有する自己組織化マルチブロックのイソポーラスの帯電した材料が開示される。
【００３０】
１つの正に帯電したタンパク質及び１つの中性タンパク質の静電反発を介して類似のサイズのタンパク質を分離する、静止負電荷（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅ）を有する自己組織化マルチブロックのイソポーラスの帯電した材料が開示される。
【００３１】
電荷相互作用を介して核酸を分離する、静止正電荷を有する自己組織化マルチブロックのイソポーラスの帯電した材料が開示される。
【００３２】
電荷相互作用を介して生体分子を分離する、静止正電荷を有する自己組織化マルチブロックのイソポーラスの帯電した材料が開示される。
【００３３】
電荷相互作用を介して生体分子を分離する、静止負電荷を有する自己組織化マルチブロックのイソポーラスの帯電した材料が開示される。
【００３４】
イソポーラスの分離層と接触する全ての種が強制的に同じ静電環境を経験させられるため、５〜１００ｎｍのサイズ、全単位のサイズ、及び、その間に及ぶサイズの細孔のイソポーラスの性質は、電荷分離に特に有益である。細孔のサイズが多分散過ぎる場合、溶質が異なる電荷環境を経験する可能性があり、例えば、静電荷相互作用は、距離の関数として劇的に低下するため、いかなる電荷分離の効果もなく大きい細孔の中心を通過する。高い多孔度、及び場合によっては階層的な構造が、大きい表面に寄与し、従って分離に利用可能な多量の電荷に寄与する。結合及び溶出機構を用いた動作において、これは大きな結合能力も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】大きな孔径分布を有する膜を通る流路の概略図である。この構造における流れは、不均質な流れの分布をもたらす。矢印（３５）によって表されているものよりも大きな流れの部分を表す矢印（３０）によって示されるように、大きな孔径の領域（５）は、より小さい孔径の領域（１０）より多くの流体の流れを運ぶ。
【図２】膜の下流表面上に、以下に記載される本発明の材料を使用したほぼ同一の細孔の単一層（１５）を含む膜を通る流路の概略図である。この層は、等しいサイズの流れの矢印（２０）及び（２５）によって示されるように、膜の上流部分の孔径分布に関係なく、流れを均一に分布させる流れに対する抵抗の大部分に寄与する。
【図３】本発明によるトリブロックターポリマーＩＳＶ（ポリ（イソプレン−ｂ−スチレン−ｂ−４−ビニルピリジン））の化学構造を示した図である。ポリ（イソプレン）ブロック（Ｉ）は破線、ポリ（スチレン）ブロック（Ｓ）は灰色、ポリ（４−ビニルピリジン）ブロック（Ｖ）は黒色である。ピリジンは、Ｖブロック上に正電荷を導入するために四級化することができる。
【図４】四級化ポリ（４−ビニルピリジン）の化学構造を示した図であり、ここで、−Ｒは、以下に定義される任意の化学基であり、Ｘは、負の対イオンである。
【図５】本発明に従って、反応して正に帯電したピリジニウム及びペンダントアミド基を有するヨードアセトアミド−四級化Ｐ４ＶＰ（右）を形成するポリ（４−ビニルピリジン）（Ｐ４ＶＰ）及びヨードアセトアミド（左）の化学構造を示した図である。
【図６】未処理のイソポーラス材料（左）、次に、本発明に従って、イソポーラス材料の表面上に、付着した化学基（球）及び静止正電荷（「＋」）を有する官能基化材料（右）を示した材料官能基化の概略図である。
【図７】本発明に従って、反応して架橋Ｐ４ＶＰ（右）を形成する複数のポリ（４−ビニルピリジン）（Ｐ４ＶＰ）単位及びジヨードブタン（左）の化学構造を示した図である。
【図８】本発明に従って、非四級化膜（上、破線）及び四級化膜（下、灰色の実線）のＦＴＩＲ特徴を示した図である。１６００ｃｍ−１での特徴的な増加は、帯電したピリジニウムへの複素環アミンの変換を示している。１７００ｃｍ−１でのバンドの出現は、四級化の間に導入されたアミドＣ＝Ｏ結合に由来する。
【図９】非四級化膜及び四級化膜を使用した単一溶質タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）（黒色）及び二成分タンパク質混合物（Ｄ）及び（Ｅ）の拒絶挙動を例示した５つのチャートＡ〜Ｅのグラフ比較を示した図である。Ｍｇｂは、黒抜きのバーで同定され、Ｌｙｓ及びＣｙｔＣは斜めの黒色及び白色のバーによって同定される。タンパク質溶液の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬであった。
【図１０】以下に記載されるように、ヨードアセトアミドによって四級化された４つのＩＳＶ膜（本発明の材料）に結合し且つそこから溶出される４００ｂｐ（黒色のバー）及び２００ｂｐ（斜めの黒色及び白色のバー）のＤＮＡ断片の収率を表したグラフを示した図である。
【図１１】本発明に従って、０．６ｘ緩衝液で溶出された２００ｂｐ（黒色のバー）及び６００ｂｐ（斜めの黒色及び白色のバー）のＤＮＡ断片の相対的回収を表したグラフを示した図である。
【図１２】本発明に従って、負に帯電した核酸断片（６５）、小さい帯電していない溶質及び溶媒分子（５５）並びに大きな細胞成分（６０）を有する溶液で検証した、正に帯電した（５０）イソポーラス材料の層（１５）の概略図である。非核酸成分は、サイズ排除機構により膜を通過又は膜によって保持され、廃棄され、核酸は膜に静電気的に結合し、その後サイズ選択的に溶出される。
【図１３】本発明に従って、正に帯電した分子（７０）、小さな帯電していない溶質及び溶媒分子（５５）を有する溶液で検証した、正に帯電した（５０）イソポーラス材料（１５）の概略図である。帯電していない分子は、サイズ排除により材料を通過又は材料によって保持される。正に帯電した分子は、電荷反発により拒絶される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下の説明では、本明細書の一部を構成する添付の図面を参照することができ、図面においては、実施することができる特定の実施形態が例示として示されている。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施するのを可能にするように詳細に記載されており、他の実施形態を利用してもよいということ、及び、本発明の範囲から逸脱することなく、構造的、論理的及び電気的変更を加えてもよいということを理解されたい。従って、いかなる実施例、実施形態又は実験手順の説明は、限定的な意味で解釈されることはない。
【００３７】
標的分子溶液及び標的分子自体のいずれか又はその両方の複雑さは、いくつかの工程を要求することが多くあり、時間がかかり且つ高価なプロセスであり、全てが、効果的な分離と高処理とのバランスをとる必要性により悪化する。イソポーラス膜の化学的官能基化を介して改善されることになる２つの重要な性能パラメータは、
【００３８】
【数１】
2019514687.tif 000003
として定義されるふるい係数Ｓであって、ＣＦ及びＣＦは、それぞれ透過液及び供給液における関心のあるタンパク質の濃度である、ふるい係数Ｓと、
【００３９】
【数２】
2019514687.tif 000004
として定義される透水率Ｌｐであって、ＪＶは、容積測定の濾液流動であり、ΔＰは、膜間圧力（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）である、透水率Ｌｐである。
【００４０】
ナノポーラス膜又は限外濾過膜を含む分離は、典型的には、サイズ選択性に焦点を当ててきたが、静電的相互作用が、タンパク質溶質の選択性及び透過性に重要な影響を及ぼす。タンパク質の等電点（ｐＩ）は、生体分子が正味電荷を示さないｐＨである。タンパク質ｐＩのｐＨより下の溶液では、分子は正に帯電しているが、タンパク質ｐＩより高いｐＨでは、分子は負に帯電している。そのような電荷特徴は、溶液のｐＨ並びにイオン強度を調整し、選択性及び処理量を一桁分まで改善することによって、ナノポーラス膜又は限外濾過膜を用いたタンパク質濾過に活用されてきた。さらに、タンパク質のサイズと電荷との間に強固な関係が存在し、効果的なタンパク質のサイズは、静電遮蔽の減少によりイオン強度が低下するに従い増大する。最近では、帯電したナノポーラス膜又は限外濾過膜と処理条件とを組み合わせることによって、タンパク質の選択性がさらに改善されることが示されてきた。
【００４１】
従来の電荷に基づく膜分離から本発明の特徴を区別する１つの鍵は、広範な孔径分布を有するナノポーラス膜又は限外濾過膜に対抗した、イソポーラス膜の構造における集中した細孔分布の使用である。これによって、単純化された処理条件及び高い作動圧力が可能になり、全体的により高い透過性が生じる。
【００４２】
供給液が膜表面に平行に通過するタンジェンシャルフロー構成における最適化された帯電した限外濾過膜の分離に対するこれまでの研究により、約１５〜２００Ｌｍ−２ｈｒ−１の平均透過流束が生じた（非特許文献１）。対照的に、狭い「集中した」孔径分布を有する本発明の自己組織化膜は、８５０Ｌｍ−２ｈｒ−１までの透過流束を示している。例えば、濃度分極及び膜汚染等、特定のパフォーマンス制限要因が高流動で増強される（非特許文献２）けれども、静電特性と組み合わせた物理的な膜の特徴の組み合わせは、既存の膜に基づくタンパク質の分離を凌ぐパフォーマンスを可能にする。
【００４３】
本発明に対する適したイソポーラスＢＣＰ材料膜は、自己組織化するものである。典型的には、そのようなイソポーラス有機膜の調製は、少なくとも部分的に揮発性である１つ又は複数の溶媒にＢＣＰ（又はＭＢＰ）重合体を溶解させ、溶媒の少なくとも一部が蒸発するように定められた条件下で溶液を流し込み、次に、例えば膜／フィルム等の結果として生じる材料を相分離溶媒系と接触させることを含む。そのような手順は、一般的に、例えば、それぞれ全体が参考として援用される特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５及び非特許文献６に記載されている。
【００４４】
適したブロック重合体から多孔性膜を形成する別の方法は、非特許文献７に記載されているような「ＳＩＭ２ＰＬＥ」（スピノーダル分解により誘発されるマクロフェーズ分離及びメソフェーズ分離プラスすすぎによる抽出）のプロセスである。このプロセスでは、適したＢＣＰが第一に調製され、適した有機溶媒において別のオリゴマー重合体と混合され、混合された溶液を流し込んで、高温での部分的な溶媒の蒸発によって階層的に多孔性の膜が形成される。最終段階で、オリゴマー重合体は、すすぎによって（ＢＣＰの）結果として生じる膜から除去される。膜の厚さ、孔径及び構造は、溶媒及び重合体の濃度、溶媒除去の時間及び温度、並びに、他の実験的因子の選択によって要望通り調整することができる。「ＳＩＭ２ＰＬＥ」プロセスに対する適した第２のオリゴマー重合体は、水溶性であり、水で洗浄することによってＢＣＰから除去することができるものである。一実施形態では、ポリ（エチレンオキシド）ＰＥＯ等の他の可溶性オリゴマー重合体も使用することができるが、ポリ（アクリル酸）又はＰＡＡが、第２のオリゴマー重合体として使用される。
【００４５】
一実施形態では、自己組織化するブロック共重合体は、低Ｔｇ（≦２５℃）を有する重合体ブロックを含む。この低Ｔｇのブロックは、機械的靭性を提供し、材料の加工性及び取り扱い性を下げる。別のブロックは、機械的安定性を提供するＴｇ＞２５℃を有するべきである。ブロックの少なくとも１つは、材料に帯電を導入するために化学的に修飾することができる、又は、すでに帯電している少なくとも１つの官能基を有する重合体であるべきである。
【００４６】
一実施形態では、官能基を有する重合体ブロックは、化学的に修飾可能な官能基として芳香族窒素複素環を有する。この実施形態では、適した芳香族複素環には、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、キノロン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、フェナジン、イソキサゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、トリアゾール、テトラゾール等が含まれるが、これらに限定されない。好ましい芳香族窒素複素環は、窒素上にイオン化水素を有さないものであり；すなわち、窒素は、芳香族環の完全なる一部分である。ピリジン及びその誘導体は、特に好ましい複素環である。芳香族複素環基を有する重合体の他の例には、ポリ（２−ビニルピリジン）又はポリ（４−ビニルピリジン）（Ｐ２ＶＰ又はＰ４ＶＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の一実施形態では、例えば膜等の自己組織化イソポーラス材料を形成するために使用されるブロックは、ＩＳＶ、トリブロック又はターポリマーポリ（イソプレン−ｂ−スチレン−ｂ−４−ビニルピリジン）であり、ブロック（包括的構造ＡＢＣに対応するＩ、Ｓ、Ｖ）を示す図３を参照されたい。
【００４８】
この実施形態では、トリブロックターポリマー構造は、約０．３０体積分率のポリイソプレン（ＰＩ）、０．５５体積分率のポリスチレン（ＰＳ）、及び０．１５体積分率のポリ（４−ビニルピリジン）（Ｐ４ＶＰ）を有する。ＰＩ、ＰＳ及びＰ４ＶＰの体積分率は：０．２０≦ＰＩ≦０．４０（例えばブロックＡ）；０．４５≦ＰＳ≦０．６５（例えばブロックＢ）；０．０５≦Ｐ４ＶＰ≦０．３５（例えばブロックＣ）；に及ぶ。この材料の構造は、良好な機械的特性を提供すると同時に、小さな孔径を可能にする。ＩＳＶターポリマーの出発原料は、アニオン重合を介して合成されてもよい。一部の実施形態では、イソポーラス（狭い孔径分布）のフィルムが、表面層（本明細書では最上層とも呼ばれる）及びバルク層を有する。適した表面層は、ある範囲の厚さを有する。例えば、表面層は、ｎｍまでの全ての値及びその間の範囲を含む５ｎｍから５００ｎｍの厚さを有し得る。表面層は、表面層の深さに亘って延びる複数の細孔を有する。表面層における孔径（例えば直径）は、１ｎｍから２００ｎｍに及び、ｎｍまでの全ての値及びその間の範囲を含む。
【００４９】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載される膜の表面細孔の密度は、少なくとも１０１４の細孔／ｍ２、又は、少なくとも１０１５の細孔／ｍ２である。狭い又は集中した（最大の細孔直径対最小の細孔直径の比（ｄｍａｘ／ｄｍｉｎ）として定義される）孔径分布は１乃至３であり、０．１までの全ての値及びその間の範囲を含む。
【００５０】
様々な例において、（ｄｍａｘ／ｄｍｉｎ）は、例えば１、１．５、２、２．５又は３及びその全ての範囲等、３未満である。例えば、フィルムは、ほぼ単分散のメソ細孔を有する表面層を含む。一実施形態では、イソポーラス表面層は、少なくとも１×１０１４細孔／ｍ２の細孔密度及び３未満の孔径分布（ｄｍａｘ／ｄｍｉｎ）を有する。
【００５１】
上記の実施形態の一部において、ＩＳＶターポリマーのＰ４ＶＰ材料は、鋳放し材料マトリックスの表面に存在し、Ｐ４ＶＰのｐＫａに近い屈曲点を示す膜のｐＨ依存性透水率によっても、各ブロックのナノメートルスケールの相分離を示す染色された透過型電子顕微鏡画像によっても確認される。
【００５２】
上記の実施形態の一部（５３〜５５）において記載されているように、イソポーラス材料は、膜の表面に存在し、四級化剤に利用可能な窒素複素環を有する重合体ブロックを有し、表面は、細孔の隙間の表面を含む。例えば、共重合体がＰ４ＶＰ（弱塩基）を有する上記の実施形態では、Ｐ４ＶＰは、種々の化学物質を使用して四級化され、図４において示されているように、膜上に静止正帯電が生じる。
【００５３】
この実施形態における四級化剤は、標的とされている特定の溶質の精製を最適化するように選ばれる。有用な方法において適用することができる作用物質（ａｇｅｎｔ）の多くの特徴がある。例えば、帯電した材料の親水性／疎水性の程度は、一部のタンパク質にとって重要な考慮事項であり得る。親水性／疎水性を制御するために、四級化剤は、例えば、残基のＣｌｏｇＰの値又は範囲（親水性／疎水性の程度を反映する測定値）に従って選択することができる。例えば、より親水性の環境が望ましい場合、比較的低いＣｌｏｇＰを材料に残すヨードアセトアミド、ヨード酢酸又はクロトン酸等の四級化剤が選ばれてもよい。より疎水性の環境が望ましい場合、相対的に高いＣｌｏｇＰを材料に残すドデシルヨージド等の四級化剤が選ばれてもよい。使用することができるＣｌｏｇＰ以外の親水性／疎水性の程度の他の測定基準がある。例えば、四級化後の材料の接触角に対して最適な値又は範囲があってもよい。導入された官能基（例えば、カルボン酸、アミド）は、後の化学反応にも有用であり得るか、又は、有用な官能性（例えば、ｐＨ応答、熱応答、溶媒耐性）であり得る。
【００５４】
上記の実施形態における四級化剤は、ＢＣＰの窒素複素環と反応して正に帯電した複素環を形成する任意の適した化合物である。本発明の１つの特徴は、正電荷の量を制御するために電荷の程度又は量を変えることができることである。これは、精製されているタンパク質に対する全電荷の最適化を可能にする。四級化後の膜の電荷密度（四級化の程度に対応）は、ＦＴＩＲ及びＮＭＲによって決定することができる。
【００５５】
上記の実施形態の四級化剤の１つの群は、式Ｒ−Ｘによって定められる化合物であり、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１〜Ｃ２０の置換又は未置換の直鎖、環状又は分岐状アルキル又はアルケニル基であり、Ｘは、ハライド（Ｆ−、Ｃｌ−、Ｉ−、Ｂｒ−）又は−−ＯＳＯ２ＣＨ３等の脱離基である。典型的には、脱離基は、アルキル又はアルキレン基上の末端基（すなわち末端に位置する基）であり、未置換のｓｐ３炭素（すなわち、−ＣＨ２−Ｘ）に結合して、反応性を最大にするであろう。アルキル又はアルキレン基は、骨格に１〜２４の炭素原子を有してもよい。直鎖アルキル基の例として、メチル、エチル、ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル及びドデシルが挙げられるが、これらに限定されない。環状アルキル基の一例は、−ＣＨ２−シクロヘキサンである。
【００５６】
上記の実施形態の分岐状アルキル基の例は、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２及び−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２である。アルケニル基の例は、ゲラニル（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−Ｘ）であろう。置換アルキル基の例は、ベンジル（Ｘ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５）であろう。置換反応による四級化が好ましいけれども、適したオレフィンへの付加反応によって複素環を四級化することが可能であろう。例えば、Ｑが電子求引性基であるＨ２Ｃ＝ＣＨＱ化合物との反応によって、Ｈｅｔ＋−ＣＨ２−ＣＨＱの形態の四級化複素環が生じ、ここでＱは電子求引性基である。このクラスの作用物質の例として、メタクリル酸エチル又はメチルアクリルアミドが挙げられるであろう。
【００５７】
上記の実施形態の別のクラスの四級化剤は、式Ｒ−Ｗ−（Ｒ）−ＣＨ２−Ｘによって定められ、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１〜Ｃ１２の置換又は未置換のアルキル、アルケニル又はアリール基であり、Ｗは、酸素、ケイ素、硫黄又は窒素等のヘテロ原子であり、Ｘは、上記の脱離基である。このクラスの四級化剤の一部の例が、Ｘ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ５、Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３及びＸ−ＣＨ２ＣＨ２−モルホリンであろう。
【００５８】
別のクラスの四級化剤は、式Ｒ−（Ｗ）−ＣＯＣＨ２−Ｘのアシル化合物であり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４、より好ましくはＣ１〜Ｃ１０のアルキル又はアルケニル、又は、Ｃ６〜Ｃ１０のアリール基であり、Ｗは、酸素又は窒素等のヘテロ原子であり、Ｘは、上記の脱離基である。このクラスのアシル化剤の適した例が、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯ２ＣＨ３、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２及びＸ−ＣＨ２ＣＯＮ（ＣＨ３）２を含む。
【００５９】
上記の実施形態の適した四級化化合物には、ブロモブタン、ブロモ−ＰＥＧ、ブロモプロピオン酸、ブロモ吉草酸、クロロアセトアミド、クロロブタン、クロロ酪酸、クロトン酸、ジヨードブタン、ヨードブタン、ヨードアセトアミド及びヨードプロピオン酸を含む四級化が含まれるが、これらに限定されない。ヨードアセトアミドは、低い蒸気圧、比較的低い危険性、安価で容易に入手可能であり、水溶性、制御可能な四級化、親水性、及び膜の選択的な層の保存性等、多くの望ましい特徴のために特に興味深いものである。これらの特徴は、この四級化プロセスを、帯電した膜の大量生産に対して容易にスケーラブルにする。以下に示す膜を四級化するために使用される最終条件は：６．６ｍＭの水溶性のヨードアセトアミド、６０℃、１時間であった。求核置換反応により、以下に示すように、材料中にペンダントアセトアミド基を有する正に帯電したピリジニウムが得られる。
【００６０】
上記の実施形態において、ヨードアセトアミドは、ポリ（４−ビニルピリジン）と反応し、膜上に静止電荷が得られる。この反応は、膜上の末端アミド及び持続性の正電荷をもたらす。
【００６１】
全反射式フーリエ変換赤外分光法（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）を使用して、非四級化膜及び四級化膜を特徴づけた。図８において見られるように、四級化プロセスの特徴的なピークを、ヨードアセトアミドで処理した膜において観察した。１６４０ｃｍ−１での特徴的な増加は、帯電したピリジニウムへの複素環アミンの変換を示している。１７００ｃｍ−１でのバンドの出現は、四級化中に導入されたアミドＣ＝０結合に由来する。１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法の測定値によって、１５．９％のビニルピリジンプロトンは化学的環境を変えず、標準化した条件を使用した８４．１％の四級化変換を意味しているということが示された。ヨードアセトアミドで処理した膜についてだけでなく、上記の他の化学基についても類似の実験を行い、温度、試薬濃度及び反応時間を変えたことは注目に値する。ヨードアセトアミドに対する反応時間を増やすことによって、１６４０ｃｍ−１及び１７００ｃｍ−１でのピーク強度が増加したけれども、１時間の反応が、かなりの割合の４−ビニルピリジンモノマーを変換し、高帯電特徴を膜に伝えるのに十分であった。
【００６２】
複素環との２つの反応部位を有し、架橋剤として役立つ、上記の実施形態の適した二官能性の四級化剤には、式Ｘ−Ｒ−Ｘ、Ｘ−ＣＨ２−ＣＯ−（Ｗ）−Ｒ−（Ｗ）−ＣＯＣＨ２−Ｘ、又は、Ｘ−ＣＨ２−（Ｒ）−Ｗ−（Ｒ）−ＣＨ２−Ｘによって定められる架橋剤が含まれ、式中、Ｒは、アルキル基、アルケニル基又はアリール基であり、Ｗは、酸素又は窒素等のヘテロ原子であり、さらに、Ｘは、上記の脱離基である。架橋剤は、対称的でなくてもよく；すなわち、１つの反応性基は、第２の反応性基とは異なっていてもよい。二官能性の四級化基の例として、Ｘ−（ＣＨ２）４−Ｘ、Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｘ、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、メチレンビスアクリルアミドの誘導体、及び、Ｎ−１−ヒドロキシル−２，２−ジメトキシエチルアクリルアミドの誘導体が挙げられる。１，４−ジヨードブタン等の架橋剤は、膜の機械的完全性の増加及び化学的抵抗性の増強の可能性のため、特に興味深いものである。
【００６３】
上記の実施形態の適した四級化剤は、材料の全体的な電荷並びに親水性／疎水性の程度を調整するために正又は負の電荷を有することができるさらなる官能基も含む。例えば、四級化剤は、アニオン性化合物、又は、水性の精製（ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の条件下でイオン化してアニオンを形成する化合物であり得る。これは、全体的な電荷が中性である双性イオンの複素環を形成する、及び、高極性の特徴を依然として保持しながら材料の正電荷を減少させるであろう。この種の作用物質の例として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ又は−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３Ｈ等のカルボン酸基又はスルホン酸基を有する化合物が挙げられる。或いは、四級化剤は、カチオン性化合物、又は、精製条件下でプロトン化される化合物である。この種の例として、−ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ（ＣＨ３）２＋又は−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３＋が挙げられるであろう。これにより、材料の全体的な正電荷が増加する。これらの種類の電荷制御四級化剤は、必要に応じて膜特性を制御するために親水性／疎水性制御剤と共に使用される。
【００６４】
タンパク質及び他の種類の生物学的材料は、光学活性であることが多いため、官能基化剤はキラルであってもよい。これは、ある程度のキラリティーを関連させる材料をもたらすであろう。適した光学活性アルキル化剤の例は、非特許文献８において見つけることができる。例えば、上記の実施形態の適したキラル四級化剤は、光学活性の第一級アルキルハライド又はメシレートを含むであろう。
【００６５】
電荷を導入するための材料の修飾は、修飾剤を有する溶液に調製されたままの膜を浸すことによって行われる。一部の実施形態において、電荷導入は定量的であり、全ての利用可能な反応部位の＞２０％、＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％又は＞９０％であるが、他の実施形態では、四級化の程度は定量未満あってもよい。四級化に対する適した溶媒は水である。しかし、作用物質の一部は、水における溶解度が限られている可能性があるため、水と（アルコール等の）有機補助溶媒との組み合わせが使用される。場合によっては、非水性有機溶媒又は有機溶媒の混合物を使用することが必要であり得る。このプロセスに対する典型的な条件は、適切な溶媒系において四級化剤を溶解し、２０乃至３０℃の温度での１乃至２４時間の反応時間で、２ｍＭ及び１００ｍＭの試薬濃度で膜を処理することであろう。場合によっては、より反応性の低い作用物質では、より長い反応時間及び高い温度を使用する必要があり得る。このプロセスの進行を、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して監視することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、可能な限り高い電荷密度が、帯電した溶質の最も選択的な電荷に基づく分離に望ましい。しかし、これらの場合であっても、膜は、様々なｐＨの供給溶液の高流動を保持しなければならない。膜のパフォーマンスは、加圧されたデッドエンド型攪拌式セル装置を利用して測定することができる。この装置は、１０乃至５０ｍＬの供給リザーバ、及び、約４ｃｍ２乃至約１３ｃｍ２の膜面積を使用することができる。
【００６７】
本発明の帯電したイソポーラス膜によって精製又は濃縮されることになるタンパク質又は他の生物学的に基づく材料のタイプ又は種類は限定されない。特に、供給原料は、哺乳動物、細菌、昆虫、ウイルス又は真菌の細胞株に由来するタンパク質であってもよく、典型的には、別のプロセスによって既に部分的に精製されていてもよい水性供給原料で使用される。発酵ブロスを供給原料として使用することも可能である。供給原料は、全血、希釈血液、血漿、血清であってもよい。供給原料は、上記の材料を使用して分離され得る核酸を有してもよい。
【００６８】
３つの関心のあるモデルタンパク質には、ミオグロビン（Ｍｇｂ）、リゾチーム（Ｌｙｓ）及びチトクロムＣ（ＣｙｔＣ）が含まれる。これらのタンパク質の典型的なモル質量及び等電点が表１において示されており、それらは、細胞培養液中に存在し得るタンパク質の代表である。タンパク質溶質を有する供給液での流動を、上記と同じ方法を使用して測定することができ、タンパク質拒絶を、紫外可視分光法、及び、供給液及び透過液に対する水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して定量的に測定することができる。計算される拒絶Ｒは、以下の式
【００６９】
【数３】
2019514687.tif 000005
のように、ふるい係数に関連がある。
【００７０】
【表１】
2019514687.tif 000006
ＨＰＬＣを用いた紫外可視検出は、タンパク質混合物を分離し、タンパク質濃度を定量的に決定する単純且つ迅速な方法である。
【００７１】
しかし、本発明の一部の実施形態では、供給原料は、例えばタンパク質Ｍｇｂ／Ｌｙｓ又はＭｇｂ／ＣｙｔＣ等、二成分（又はさらにより複雑な）溶質混合物を有してもよい。そのような混合物に対する１つの鍵となるパフォーマンスパラメータは、非特許文献９によって
【００７２】
【数４】
2019514687.tif 000007
として定められる選択性Ψであり、式中、Ｓ１及びＳ１は、より少ない及びより多い保持されたタンパク質に対するふるい係数である（非特許文献９）。このパラメータによって、帯電した膜及び未処理の膜の間の関連しているパフォーマンス特性の単純且つ直接的な比較が可能になる。
【００７３】
この例では、Ｍｇｂ／Ｌｙｓ及びＭｇｂ／ＣｙｔＣの成分はサイズが非常に類似しており、単純な限外濾過では分離することができない。中性のｐＨにていずれかの混合物を用いて本発明の膜を使用すると、Ｍｇｂは（その等電点のために）中性に帯電し、Ｍｇｂが混合物中に存在しない場合に対応する選択性で膜を通過する。Ｌｙｓ又はＣｙｔＣは、（その等電点のために）中性ｐＨで正に帯電すると予想され、同様に帯電した膜によって拒絶されることになる。本発明の膜は、５０ＬＭＨ／ｂａｒを超える流速でデッドエンドシステムにおいて少なくとも１０のそのような膜の対の選択性を達成するように設計されている。
【００７４】
【表２】
2019514687.tif 000008
一部の実施形態では、帯電したイソポーラス膜を使用した精製プロセスは、所望の材料の等電点の、その下及び上の生物学的材料を有する加圧された緩衝供給液流を使用することを含む。
【００７５】
別の実施形態では、帯電したイソポーラス材料は、核酸を単離するために使用される。上記の実施形態のように、ＩＳＶイソポーラス材料のＰ４ＶＰを四級化した後で、イソポーラス材料は正電荷を有する。ＤＮＡ断片の混合物に曝露されると、負に帯電したＤＮＡが膜に結合する。その後、少量の溶出緩衝液を使用して、ＤＮＡを膜から溶出することができる。４つの異なる膜における２００及び４００の塩基対（ｂｐ）に対する回収率が、図１０において示されている。溶出されたＤＮＡの収率を、ゲル電気泳動を使用して定量化し、４つの四級化膜に対して、２００及び４００ｂｐ断片の収率を定量化した。２００ｂｐに対して、収率は７１〜８５％まで変動し、変動係数（ＳＤ／平均）は８．８％であった。４００ｂｐの収率は非常に類似しており、６７〜８６％まで変動し、変動係数は１０．６％であった。他の市販のキットに対して最良の場合で約１０％から４９％に及ぶ相対標準偏差を有する市販のキット（非特許文献１０；非特許文献１１）と比較して、これらの結果は、イソポーラスの帯電した重合体材料を用いた極めて迅速なプロセスを使用した、非常に一貫した高いＤＮＡ回収を実証している。
【００７６】
この実施形態では、ＤＮＡ断片のサイズ選択的溶出も可能である。異なる希釈度の溶出緩衝液（０．６ｘ、０．３ｘ）を溶出に使用した。図１１は、２００ｂｐ断片と６００ｂｐ断片との０．６ｘ緩衝液溶出の相対収率を示している。より大きな６００ｂｐの収率は１／４以下まで減少し、６００ｂｐより大きい全てのバンドは検出可能ではなく、帯電したイソポーラス膜システムを、ＤＮＡの抽出、濃縮及びサイズ選択に使用することができるということを実証している。０．３ｘの緩衝液濃度では、２００ｂｐ断片さえも溶出されなかった。これらの結果は、非常に特異的なＤＮＡ断片サイズを標的とし、且つ、単に溶出条件を調整することによって単一の製品が多数のＤＮＡ単離の用途に使用されることを可能にする帯電した膜の強力な利点を示している。
【００７７】
別の実施形態では、ブロック共重合体は、包括的構造Ａ−Ｂ−Ａ−Ｃに対応するポリ（スチレン−ｂ−イソプレン−ｂ−スチレン−ｂ−４ビニルピリジン）である。Ｐ４ＶＰは、上記の実施形態のように静止電荷を生成するために四級化される。一部の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料は、二次元構造に形成される。他の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料は、三次元構造に形成される。
【００７８】
一実施形態では、イソポーラス材料上に静止電荷をもたらす反応が、材料の親水性を変化させる。別の実施形態では、イソポーラス材料上に静止電荷をもたらす反応が、さらなる化学反応又は材料の官能性に使用することができる官能基を材料に導入する。
【００７９】
一部の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料上の静止電荷は、例えば、四級化ピリジン基、四級化ジエチルアミノエチル基、四級化ジメチルアミノエチル基等、正である。他の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料上の静止電荷は、例えばスルホン酸基等、負である。一部の実施形態では、イソポーラス材料は、材料上に正電荷を生成するために化学物質を用いて四級化することができるアミン基（例えば、ピリジン、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノエチル等）を有する。一実施形態では、アミンは、例えば２−ヨードアセトアミド、２−ブロモエタノール等、ヨウ素、塩素及び臭素から選択される１つのハロゲンを有する単官能性アルキル化剤を用いて四級化される。一実施形態では、単官能性アルキル化剤は、式：Ｒ−Ｘを有し、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４置換又は未置換の直鎖、環状又は分岐状アルキル又はアルケニル基であり、Ｘはハロゲン基である。
【００８０】
別の実施形態では、単官能性アルキル化剤は、式：Ｒ−Ｗ−（Ｒ）−ＣＨ２−Ｘを有し、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４のアルキル、アルケニル又はアリール基であり、Ｗは、酸素、ケイ素、硫黄又は窒素等のヘテロ原子であり、Ｘはハロゲン基である。別の実施形態では、単官能性アルキル化剤は、式：Ｒ−（Ｗ）−ＣＯＣＨ２−Ｘを有し、式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２４のアルキル、アルケニル又はアリール基であり、Ｗは、酸素又は窒素等のヘテロ原子であり、Ｘはハロゲン基である。
【００８１】
別の実施形態では、複数のアミンが、例えば１，４−ジヨードブタン等、ヨウ素、塩素及び臭素から選択される２つ以上のハロゲンを有する多官能性アルキル化剤を用いて四級化される。
【００８２】
別の実施形態では、アミンは、例えばクロトン酸等、少なくとも１つの反応性二重結合を有するアルキル化剤を用いて四級化される。
【００８３】
一部の実施形態では、上記のアミン−アルキル化剤含有物のうち２つ以上が、イソポーラス材料上に電荷を導入するために使用される。
【００８４】
一部の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料上の電荷の程度は、少なくとも２０％から９０％である。他の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料上の電荷の程度は、全ての利用可能な単位の≦９０％である。
【００８５】
一実施形態では、帯電したイソポーラス材料は、抗菌剤を用いてさらに処理又は官能基化される。
【００８６】
一部の実施形態では、静止電荷を有するイソポーラス材料の幾何学的形状及び面積が制御される。一部の実施形態では、帯電した領域の幾何学的形状及び面積は、リソグラフィでパターン化されるか、又は、帯電した修飾材料の一部又は複数の部分を非修飾材料又は別の基板に付着させることによって達成されるか、又は、印刷又は押し出しを介して非修飾材料の一部又は複数の部分上にパターン化される。
【００８７】
一部の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料は、分離媒体として使用される。一部の実施形態では、イソポーラスの帯電した材料は、生体分子を他の生体分子から分離するために使用される。一実施形態では、標的生体分子はタンパク質である。別の実施形態では、標的生体分子は核酸である。
【００８８】
一部の実施形態では、分離媒体として帯電したイソポーラス材料を使用した分離機構には、標的の種が静電的相互作用によって材料に結合してそれを単離する結合及び溶出機構が含まれ、標的の種は、標的の種を回収するために、材料から解離することができる。
【００８９】
一部の実施形態では、分離媒体として帯電したイソポーラス材料を使用した分離機構には、電荷反発機構、サイズ選択機構、及び／又は濃縮機構が含まれる。
【００９０】
一部の実施形態では、結合及び溶出機構を有する分離媒体として帯電したイソポーラス材料を使用した分離機構は、化学選択的又はサイズ選択的溶出も含む。
【００９１】
一部の実施形態では、帯電したイソポーラス材料は、勾配分離、イソクラティック分離、又はステップ分離のために使用される。
【００９２】
一部の実施形態では、帯電したイソポーラス材料は、創傷の包帯又は絆創膏として使用されるか、又は、バイオフィルムの発達を調節するために使用される。
【００９３】
一部の実施形態では、帯電したイソポーラス材料は、２つ以上の帯電した材料と組み合わされて装置に一括されるか、又は、帯電したイソポーラス材料は、帯電していないイソポーラス材料と組み合わされて装置として一括される。
【００９４】
一部の実施形態では、帯電した材料は、プリーツパック、クロスフローカセット、中空繊維モジュール、シリンジフィルタ、カプセル、ピペットチップ、遠心チューブ、渦巻き形モジュール又はセンサ装置に一括される。
【００９５】
別の実施形態では、帯電した材料は平らなシートとして一括される。
【００９６】
一部の実施形態では、帯電したイソポーラス材料は、支持材料上に固定化されるか、又は、布地と直接一体化される。
【００９７】
一実施形態では、２つ以上の帯電したイソポーラス材料が、キットとして共に一括される。
【００９８】
別の実施形態では、帯電したイソポーラス材料を組み込んだ２つ以上の装置が、キットとして共に一括される。
【００９９】
別の実施形態では、少なくとも１つの帯電したイソポーラス材料が、結合した標的の種を結合後に溶出させるために、１つ又は複数の化学溶液と共に一括される。
【０１００】
図において同定される特徴の表
５      大きな孔径の領域
１０    小さな孔径の領域
１５    ほぼ同一の孔径の層
２０    均一の流れを示す矢印
２５    均一の流れを示す矢印
３０    より多くの流量を示す矢印
３５    より少ない流量を示す矢印
４０    電荷を導入するための官能基化反応
４５    官能基化反応から導入された官能基
５０    正に帯電した材料
５５    帯電していない溶質／溶媒分子
６０    細胞残屑等の大きな溶質
６５    負に帯電した核酸溶質
７０    正に帯電した溶質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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