(57)【要約】  ３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を含む、イソブテンを製造する方法であって、前記３−メチルクロトン酸が３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって得られる、または前記３−メチルクロトン酸が３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって得られる方法が記載される。３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を、例えば３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、好ましくはＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）またはゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）を使用することによって達成できることが記載される。
2019500022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を含む、イソブテンを製造する方法であって、
（ａ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって前記３−メチルクロトン酸を提供するステップ、または
（ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって前記３−メチルクロトン酸を提供するステップ
をさらに含む方法。
【請求項２】
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換が３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換が、
（ａ）ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する単一酵素反応；
（ｂ）チオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を使用することによって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する単一酵素反応；または
（ｃ）（ｉ）最初に３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに酵素的に変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られた３−メチルクロトニルリン酸エステルを前記３−メチルクロトン酸に酵素的に変換するステップと
を含む２つの酵素ステップ
によって達成され得る、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの酵素的変換がリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）を使用することによって達成され、前記３−メチルクロトニルリン酸エステルの前記３−メチルクロトン酸への酵素的変換がアクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．２．−）、好ましくはプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）を使用することによって達成される、請求項４（ｃ）に記載の方法。
【請求項６】
３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって前記３−メチルクロトニル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、
（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）
を使用することによって達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって前記３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）を使用することによって達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって前記３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼを使用することによって達成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換が、ヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．−．−）を使用することによって達成される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
アセトンとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への酵素的縮合によって前記３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を提供するステップをさらに含む、請求項１から３および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
アセトンとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への酵素的縮合が、アセトンのオキソ（すなわち、Ｃ＝Ｏ）基の炭素原子と活性化アセチル基を提供する化合物のメチル基との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を使用することによって達成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アセト酢酸のアセトンへの酵素的変換によって前記アセトンを提供するステップをさらに含む、請求項１から３および１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アセト酢酸のアセトンへの酵素的変換が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）を使用することによって達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換によって前記アセト酢酸を提供するステップをさらに含む、請求項１から３および１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換が、
（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１１）；または
（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸に転移することができる酵素
を使用することによって達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）（ｉ）最初にアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに酵素的変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られたマロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを前記アセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に縮合するステップと
を含む２つの酵素ステップ；または
（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する単一酵素反応
を含む、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換によって、前記アセトアセチル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）を使用することによって達成される、請求項１９（ａ）（ｉ）に記載の方法。
【請求項２１】
マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮合が、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）を使用することによって達成される、請求項１９（ａ）（ｉｉ）に記載の方法。
【請求項２２】
２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの直接酵素的縮合が、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を使用することによって達成される、請求項１９（ｂ）に記載の方法。
【請求項２３】
（ｉ）請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素；および
（ｉｉ）請求項１（ａ）、４または５のいずれか一項に記載の酵素
を発現する組換え生物または微生物。
【請求項２４】
請求項６または７に記載の酵素をさらに発現する、請求項２３に記載の組換え生物または微生物。
【請求項２５】
請求項８または９に記載の酵素をさらに発現する、請求項２４に記載の組換え生物または微生物。
【請求項２６】
請求項１０または１１に記載の酵素をさらに発現する、請求項２５に記載の組換え生物または微生物。
【請求項２７】
（ｉ）請求項１から３のいずれか一項に記載の酵素；および
（ｉｉ）請求項１（ｂ）または１２に記載の酵素
を発現する組換え生物または微生物。
【請求項２８】
請求項１３または１４に記載の酵素をさらに発現する、請求項２７に記載の組換え生物または微生物。
【請求項２９】
請求項１５または１６に記載の酵素をさらに発現する、請求項２８に記載の組換え生物または微生物。
【請求項３０】
請求項１７または１８に記載の酵素をさらに発現する、請求項２９に記載の組換え生物または微生物。
【請求項３１】
請求項１９に記載の酵素をさらに発現する、請求項２６または３０に記載の組換え生物または微生物。
【請求項３２】
請求項２０から２２のいずれか一項に記載の酵素をさらに発現する、請求項３１に記載の組換え生物または微生物。
【請求項３３】
イソブテンを製造するための、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の組換え生物または微生物の使用。
【請求項３４】
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素を発現する、請求項３３に記載の組換え生物または微生物の使用。
【請求項３５】
３−メチルクロトン酸からイソブテンを製造するための、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素の使用。
【請求項３６】
３−メチルクロトン酸および請求項２３から３２のいずれか一項に記載の組換え生物もしくは微生物；または３−メチルクロトン酸および請求項１から２２のいずれか一項に記載の酵素を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を含むイソブテンを製造する方法であって、前記３−メチルクロトン酸が３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって得られる、または前記３−メチルクロトン酸が３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって得られる、方法に関する。３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換は、例えば３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、好ましくはＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）またはゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）を使用することによって達成することができる。さらに、前記３−メチルクロトニル−ＣｏＡは、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって得ることができる。
【背景技術】
【０００２】
多数の化学化合物が現在石油化学製品から得られている。アルケン（例えば、エチレン、プロピレン、様々なブテンまたはペンテンなど）が、例えばポリプロピレンまたはポリエチレンを製造するためにプラスチック工業で、また化学工業の他の領域および燃料の他の領域で使用されている。
ブチレンは４つの形態で存在し、その１つであるイソブテン（イソブチレンとも呼ばれる）は、メチル−ｔｅｒｔ−ブチル−エーテル（ＭＴＢＥ）、自動車燃料用のアンチノック添加剤の組成物の構成素となる。イソブテンはまたイソオクテンを製造するために使用することもでき、イソオクテンを今度はイソオクタン（２，２，４−トリメチルペンタン）に還元することができる；イソオクタンの非常に高いオクタン価が、イソオクタンをいわゆる「ガソリン」エンジンにとっての最良の燃料にしている。イソブテンなどのアルケンは現在、石油製品の接触分解によって（またはヘキセンの場合、石炭もしくはガスからのフィッシャー−トロプシュ法の派生物によって）製造されている。そのため、製造コストは油の価格と密接に連動している。さらに、接触分解はしばしば、工程の複雑さおよび製造コストを増加させるかなりの技術的困難を伴う。
イソブテンなどのアルケンの生物学的経路による製造が、地球化学的循環と調和した持続可能な生産工程という面で必要とされている。発酵および蒸留工程が食品加工業界で既に存在していたので、第一世代のバイオ燃料はエタノールの発酵製造において得られた。特に長鎖アルコール（ブタノールおよびペンタノール）、テルペン、直鎖アルカンおよび脂肪酸の製造を包含する第二世代のバイオ燃料の製造は試験段階にある。２つの近年の概説が、この分野の研究の一般的な概要を提供している：Ladygina et al. (Process Biochemistry 41 (2006), 1001)およびWackett (Current Opinions in Chemical Biology 21 (2008), 187)。酵母ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）によるイソ吉草酸のイソブテンへの変換が記載されている（Fujii et al. (Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 583)）が、この反応の効率、１００万分の１／分未満または約１０００分の１／日は、工業用途からかけ離れている。反応機構はFukuda et al. (BBRC 201 (1994), 516)によって解明され、オキソフェリル基ＦｅＶ＝Ｏの還元によってイソ吉草酸を脱炭酸するチトクロムＰ４５０酵素を伴う。この経路によるイソブテンの大規模生合成は、１分子のロイシンを合成および分解して１分子のイソブテンを形成することを要するので、極めて好ましくないと考えられる。また、反応を触媒する酵素が補助因子としてヘムを使用し、細菌における組換え発現および酵素パラメータの改善をほとんど与えない。これら全ての理由のために、この経路が工業開発の基礎として働く可能性は非常に低いように思われる。他の微生物が自然にイソ吉草酸からイソブテンをわずかに製造することができると記載されている；得られる収率はロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）で得られたものよりさらに低い（Fukuda et al. (Agric. Biol. Chem. 48 (1984), 1679)）。
Gogerty et al. (Appl. Environm. Microbiol. 76 (2010), 8004-8010)およびvan Leeuwen et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (2012), 1377-1387)は、提案される経路の最後のステップが、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを使用することによる、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸（３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）とも呼ばれる）の変換である、酵素的変換によるアセトアセチル−ＣｏＡからのイソブテンの製造を記載している。３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸からイソブテンを製造するためのこの反応は国際公開第２０１０／００１０７８号パンフレットにも記載されている。Ｇｏｇｅｒｔｙら（同所より）およびｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎら（同所より）において、３−ヒドロキシ−３−メチル酪酸の製造が、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを介した３−メチルクロトニル−ＣｏＡの変換によって達成されることが提案されている。再生可能な資源からイソブテンを製造する方法の効率および可変性をさらに改善するために、イソブテンおよびその前駆体を提供するための代替経路が必要とされる。
【０００３】
本発明は、３−メチルクロトン酸（３−メチル−２−ブテン酸とも呼ばれる）のイソブテンへの酵素的変換を含む、イソブテンを製造する方法を提供することによってこの要求を満たす。
【０００４】
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換は脱炭酸反応である。脱炭酸は、カルボキシル基を除去し、二酸化炭素（ＣＯ２）を放出する化学反応である。
３−メチルクロトン酸の脱炭酸は米国特許出願公開第２００９／００９２９７５号明細書で既に示唆されているが、この変換に関する実験的証拠はない。米国特許出願公開第２００９／００９２９７５号明細書では、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）から得られるＰＡＤ１と呼ばれる核酸配列が記載されており、脱炭酸酵素をコードすると開示されている。この酵素は、組換え生物における選択的マーカーとして有用であることが示唆されているが、「弱酸」を選択剤として使用できることが記載されている。中でも、潜在的「弱酸」として、３−メチルクロトン酸が言及されている。しかしながら、実際には、上記ＰＡＤ１がデカルボキシラーゼ活性を提供しないことが分かったのは後になってからであった。
実際、細菌ｕｂｉＤおよびｕｂｉＸまたは相同の真核生物ｆｄｃ１およびｐａｄ１遺伝子は、非酸化的可逆的脱炭酸に関係している。フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）とフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）の組み合わせ作用が、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のフェニルアクリル酸の脱炭酸に必須であると考えられている（J. Biosci. Bioeng. 109, (2010), 564-569; AMB Express, 5:12 (2015) 1-5; ACS Chem. Biol. 10 (2015), 1137-1144）。
近年、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）として記載される上記酵素ファミリーが、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとして特徴付けられ、デカルボキシラーゼとしてもはや特徴付けられなくなった。Ｆｄｃ１（ＰＡＤではなく）が可逆的デカルボキシラーゼ活性を唯一担い、新たな種類の補助因子、すなわち会合したＵｂｉＸ（またはＰａｄ１）タンパク質によって合成されるプレニル化フラビンを要することが示された。よって、このＰＡＤ酵素の実際の酵素活性は、（ＤＭＡＰまたはＤＭＡＰＰと呼ばれるジメチルアリルリン酸またはピロリン酸からの）プレニル部分によるフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）補助因子の変換として同定されている。
したがって、先行技術の信条と対照的に、実際のデカルボキシラーゼは、修飾ＦＭＮ（プレニル化ＦＭＮ）と会合したフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）である。修飾ＦＭＮ（プレニル化ＦＭＮ）（ＰＡＤ酵素によって提供される）と会合したフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）のこの機構が近年記載され、これは驚くべき酵素機構、すなわち１，３−双極子環付加を介したα，β−不飽和酸脱炭酸を含む。さらに、このＦＤＣデカルボキシラーゼの構造が近年解かれている（Nature 522 (2015), 497-501；Nature, 522 (2015), 502-505；Appl. Environ. Microbiol. 81 (2015), 4216- 4223）。
上記ファミリーの酵素の使用が上記の米国特許出願公開第２００９／００９２９７５号明細書でα−β不飽和カルボン酸の末端アルケンへの変換について以前記載されている一方で、国際公開第２０１２／０１８６２４号パンフレットは、芳香族、２，４−ペンタジエン酸および１，３−ブタジエンを生合成するための微生物および方法に関し、国際公開第２０１３／０２８５１９号パンフレットは、２，４−ペンタジエン酸、ブタジエン、プロピレン、１，３−ブタンジオールおよび関連アルコールを製造するための微生物および方法に関する。
さらに、国際公開第２０１３／１８６２１５号パンフレットは、脂肪族モノ不飽和カルボン酸をＦｄｃ１ポリペプチドおよびＰａｄ１ポリペプチドと接触させるステップを含む、モノ不飽和アルケンを調製する方法を記載している。しかしながら、国際公開第２０１３／１８６２１５号パンフレットでは、Ｆｄｃ１ポリペプチドとＰａｄ１ポリペプチドの両方がデカルボキシラーゼ活性を有する酵素として分類されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
対照的に、本発明では、上記の酵素を、イソブテンの製造を最終的にもたらす経路に人工的に含める形での実装がなされる。よって、主な態様では、本発明は、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換（図１に示されるステップＩ）を含む、イソブテンを製造する方法であって、
（ａ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）によって３−メチルクロトン酸を提供するステップ、または
（ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換（図１に示されるステップＩＩ）によって３−メチルクロトン酸を提供するステップ
をさらに含む方法に関する。
好ましくは、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換が３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成される。
【０００６】
３−メチルクロトン酸を介して３−メチルクロトニル−ＣｏＡから、または３−メチルクロトン酸を介して３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）からイソブテンを製造する方法は、多くの生化学反応に使用される代謝における中心成分および重要な鍵分子であるアセチル−ＣｏＡから始まるイソブテンを製造する経路に組み込むことができる。対応する反応を図１に模式的に示す。
【０００７】
そのため、本発明はまた、図１に模式的に示され、以下でさらに詳細に説明される２つの代替経路を介して、アセチル−ＣｏＡから始まり、３−メチルクロトン酸（次いで、これは最終的にイソブテンに変換される）をもたらす経路に関する。
【０００８】
アセトアセチル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸を介したアセチルＣｏＡからイソブテンへの酵素的変換の経路
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換：図１に示されるステップＩ
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を図２Ｂに模式的に示す。
本発明によると、３−メチルクロトン酸（３−メチル−２−ブテン酸または３，３−ジメチルアクリル酸とも呼ばれる）のイソブテン（イソブチレンまたは２−メチルプロペンとも呼ばれる）への酵素的変換を脱炭酸によって達成することができる。「脱炭酸」は、一般的にカルボキシル基を除去し、二酸化炭素（ＣＯ２）を放出する化学反応である。
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を、好ましくは３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成することができる。本発明によると、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼは、脱炭酸反応で３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換することができる酵素である。
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）
からなる群から選択される。
【０００９】
よって、一態様によると、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を、好ましくは３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成することができ、前記３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼはＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼである。
ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼを利用する３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換は、２つの酵素、すなわちＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ（３−メチルクロトン酸のイソブテンへの実際の脱炭酸を触媒する）と、それに伴う、修飾フラビン補助因子を提供する会合したＦＭＮプレニルトランスフェラーゼによって触媒される２つの連続的ステップの反応に依拠する。フラビン補助因子は、好ましくはＦＭＮまたはＦＡＤであり得る。ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド；リボフラビン−５’−リン酸とも呼ばれる）は、酵素リボフラビンキナーゼによってリボフラビン（ビタミンＢ２）から産生される生体分子であり、種々の反応の補欠分子族として機能する。ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）は、代謝のいくつかの重要な反応に関与する酸化還元補助因子、より具体的には補欠分子族である。
【００１０】
よって、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において、第１のステップで、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を（修飾）フラビン由来補助因子に修飾する。この修飾は、前記ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼによって触媒される。ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼは、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）のフラビン環を（修飾）プレニル化フラビン補助因子にプレニル化する。この反応を図２Ａに模式的に示す。第２のステップで、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの実際の変換が、前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼが、会合したＦＭＮプレニルトランスフェラーゼによって提供されたプレニル化フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を使用する、１，３−双極子環付加に基づく機構を介して前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼによって触媒される。この反応を図２Ｂに模式的に示す。
【００１１】
好ましい実施形態では、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を（修飾）フラビン由来補助因子に修飾する前記プレニルトランスフェラーゼが、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）型タンパク質、または密接に関連する原核生物酵素ＵｂｉＸ、原核生物のユビキノン生合成に関与する酵素である。
大腸菌（Escherichia coli）では、タンパク質ＵｂｉＸ（３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼとも呼ばれる）がユビキノン生合成の第３のステップに関与することが示されている。
このタンパク質は反応
【００１２】
【化１】
2019500022.tif 000003
を触媒する。
さらに、酵母の相同タンパク質（Ｐａｄ１）のノックアウトが、フェニルアクリル酸に対する感受性を付与することが示され、この酵素がフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼとして機能することを示している。大腸菌（E.coli）菌株はまた、ＵｂｉＸに加えて、Ｐａｄ１と呼ばれる第２のパラログも含む。そのアミノ酸配列は、ＵｂｉＸと５２％の同一性および出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼＰａｄ１とわずかに高い配列同一性を示す。酵母Ｐａｄ１との高い配列類似性にもかかわらず、大腸菌（E.coli）Ｐａｄ１はフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ活性を有するように見えない。その機能は未知であり、Ｐａｄ１は安息香酸の誘導体からカルボン酸基を除去し得るが、置換フェノール酸からは除去しない。
【００１３】
よって、好ましい実施形態では、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）の対応する（修飾）フラビン由来補助因子への修飾が、ＦＭＮ含有タンパク質フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）によって触媒される。フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）の対応する修飾フラビン由来補助因子への修飾に関与する酵素は、最初にデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．−）としてアノテーションを付与された。いくつかのフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）にここでＥＣ２．５．１−としてフラビンプレニルトランスフェラーゼとしてアノテーションを付与する。
より好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を対応する（修飾）フラビン由来補助因子に修飾するＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとして、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）型タンパク質を使用し、前記フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）型タンパク質が、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ５Ａ８Ｌ８）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ３Ｆ７１５）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３３７５１）またはクリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｅ６Ｒ９Ｚ０）から得られる。
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）型タンパク質が、それぞれ配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有する、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ５Ａ８Ｌ８；配列番号４０）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ３Ｆ７１５；配列番号４１）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３３７５１；配列番号４２）またはクリプトコッカス・ガッティ（Cryptococcus gattii）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｅ６Ｒ９Ｚ０；配列番号４３）から得られるフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）型タンパク質である。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）型タンパク質が、配列番号４０〜４３からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４０〜４３のいずれかと少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を対応する（修飾）フラビン由来補助因子に修飾する酵素活性を有する酵素である。
【００１５】
配列同一性の決定に関しては、以下を適用するものとする：比較する配列が同じ長さを有さない場合、同一性の程度とは、長い配列中のアミノ酸残基と同一である短い配列中のアミノ酸残基の割合を指す、または短い配列中のアミノ酸残基と同一である長い配列中のアミノ酸残基の割合を指す。好ましくは、これは、長い配列中のアミノ酸残基と同一である短い配列中のアミノ酸残基の割合を指す。配列同一性の程度は、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬなどの適切なコンピュータアルゴリズムを使用して、当技術分野で周知の方法によって決定することができる。
Ｃｌｕｓｔａｌ解析法を使用して、特定の配列が例えば、参照配列と少なくとも６０％同一であるかどうかを決定する場合、デフォルト設定を使用することができ、または設定は好ましくは以下の通りである：アミノ酸配列の比較について、マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；伸長ギャップペナルティ：０．０５；遅延分岐：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列比較については、伸長ギャップペナルティを好ましくは５．０に設定する。
好ましい実施形態では、ＣｌｕｓｔａｌＷ２をアミノ酸配列の比較に使用する。ペアワイズ比較／アラインメントの場合、好ましくは以下の設定を選択する：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．１。多重比較／アラインメントの場合、好ましくは以下の設定を選択する：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．２；ギャップ距離：５；エンドギャップなし。
好ましくは、同一性の程度を配列の完全長にわたって計算する。
配列番号４０〜４３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列中の本明細書以下に示される位置に相当する位置に位置するアミノ酸残基は、当技術分野で公知の方法によって当業者により同定され得る。例えば、このようなアミノ酸残基は、当の配列を配列番号４０〜４３のいずれか１つに示される配列と整列させる、および配列番号４０〜４３のいずれか１つの上記の位置に相当する位置を同定することによって、同定することができる。アラインメントは、例えばリップマン−ピアソン法（Science 227 (1985), 1435）またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを使用することによって、当業者に公知の手段および方法で行うことができる。このようなアラインメントで、最大相同性をアミノ酸配列中に存在する保存されたアミノ酸残基に割り当てることが好ましい。
好ましい実施形態では、ＣｌｕｓｔａｌＷ２をアミノ酸配列の比較に使用する。ペアワイズ比較／アラインメントの場合、好ましくは以下の設定を選択する：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．１。多重比較／アラインメントの場合、好ましくは以下の設定を選択する：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．２；ギャップ距離：５；エンドギャップなし。
好ましくは、同一性の程度を配列の完全長にわたって計算する。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）の対応する（修飾）フラビン由来補助因子への修飾が、ＵｂｉＸ（最初にＥＣ４．１．１．−としてアノテーションを付与された）とも呼ばれるＦＭＮ含有タンパク質３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼによって触媒される。上記のように、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）の対応する修飾フラビン由来補助因子への修飾に関与する酵素は、最初にデカルボキシラーゼとしてアノテーションを付与された。いくつかのフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）にここでＥＣ２．５．１−としてフラビンプレニルトランスフェラーゼとしてアノテーションを付与する。
より好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を対応する（修飾）フラビン由来補助因子に修飾するＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとして、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼ（ＵｂｉＸとも呼ばれる）を使用し、前記３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼ（ＵｂｉＸとも呼ばれる）が、大腸菌（Escherichia coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＧ０３）、枯草菌（Bacillus subtilis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０８６ＷＸＧ４）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０７２ＺＣＷ８）またはエンテロバクター属（Enterobacter）種ＤＣ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｗ７Ｐ６Ｂ１）から得られる。
さらにより好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼ（ＵｂｉＸとも呼ばれる）が、それぞれ配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する大腸菌（Escherichia coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＧ０３；配列番号４４）、枯草菌（Bacillus subtilis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０８６ＷＸＧ４；配列番号４５）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０７２ＺＣＷ８；配列番号４６）またはエンテロバクター属（Enterobacter）種ＤＣ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｗ７Ｐ６Ｂ１；配列番号４７）から得られる３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼ（ＵｂｉＸとも呼ばれる）である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼが、配列番号４４〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４４〜４７のいずれかと少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を対応する（修飾）フラビン由来補助因子に修飾する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）の対応する（修飾）フラビン由来補助因子への修飾がフラビンプレニルトランスフェラーゼによって触媒される。
【００１９】
上記のように、実際の脱炭酸、すなわち３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換は、ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼが上記の会合したＦＭＮプレニルトランスフェラーゼのいずれかによって提供されるプレニル化フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を使用する１，３−双極子環付加に基づく機構を介してＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼによって触媒される。
【００２０】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸を触媒する前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼがフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）によって触媒される。フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）は酵素クラスＥＣ４．１．１．−に属する。
さらにより好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０３０３４）、エンテロバクター属（Enterobacter）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｖ３Ｐ７Ｕ０）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ４５３６１）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ２Ｒ０Ｐ７）またはカンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ９ＷＪ６６）から得られるフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）を使用する。
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）が、それぞれ配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１および配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有する、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０３０３４；配列番号４８）、エンテロバクター属（Enterobacter）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｖ３Ｐ７Ｕ０；配列番号４９）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ４５３６１；配列番号５０）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ２Ｒ０Ｐ７；配列番号５１）またはカンジダ・ドゥブリニエンシス（Candida dubliniensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ９ＷＪ６６；配列番号５２）から得られるフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）である。
【００２１】
別のより好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換がプロトカテク酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）を使用する。
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換がプロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）によって触媒される。ＰＣＡデカルボキシラーゼ（ＡｒｏＹとも呼ばれる）は、以下の反応、すなわちプロトカテク酸（ＰＣＡ）のカテコールへの酵素的変換を触媒することが知られている（Johnson et al., Metabolic Engineering Communications 3 (2016), 111）：
【００２２】
【化２】
2019500022.tif 000004
この酵素は種々の生物で生じ、例えばエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）種およびセディメンティバクター・ヒドロキシベンゾイクス（Sedimentibacter hydroxybenzoicus）で記載されている。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるＰＣＡデカルボキシラーゼが、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ９ＡＭ６）、レプトリングビア属（Leptolyngbya）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｓ３Ｕ６Ｄ８）またはファスコラークトバクテリウム属（Phascolarctobacterium）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｒ６ＩＩＶ６）から得られるＰＣＡデカルボキシラーゼである。
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるＰＣＡデカルボキシラーゼが、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（配列番号７８）、レプトリングビア属（Leptolyngbya）種（配列番号８０）またはファスコラークトバクテリウム属（Phascolarctobacterium）種（配列番号８１）から得られる酵素である。
本発明の好ましい実施形態では、ＰＣＡデカルボキシラーゼが、配列番号７８、８０および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号７８、８０および８１のいずれかと少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）が、配列番号４８〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４８〜５２のいずれかと少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸を触媒する前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼが、上記フェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）と密接に関連する酵素、すなわち３−ポリプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＵｂｉＤとも呼ばれる）である。３−ポリプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．−として分類されるＵｂｉＤデカルボキシラーゼファミリーに属する。
より好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、ヒポクレア・アトロビリディス（Hypocrea atroviridis）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｇ９ＮＬＰ８）、スファエルリナ・ムシバ（Sphaerulina musiva）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｍ３ＤＦ９５）、ペニシリウム・ロッケフォルティ（Penicillium roqueforti）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｗ６ＱＫＰ７）、フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．リコペルシシ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｗ９ＬＴＨ３）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｊ８ＴＲＮ５）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス・パラシチカス（Aspergillus parasiticus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、グロスマニア・クラビゲラ（Grosmannia clavigera）、大腸菌（Escherichia coli）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＡＢ４）、バチルス・メガテリウム（Bacilus megaterium）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｄ５ＤＴＬ４）、メタノサーモバクター属（Methanothermobacter）種ＣａＴ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｔ２ＧＫＫ５）、マイコバクテリウム・ケロネー（Mycobacterium chelonae）１５１８（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｘ８ＥＸ８６）またはエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｖ３ＤＸ９４）から得られる３−ポリプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＵｂｉＤ）を使用する。
さらにより好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される３−ポリプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＵｂｉＤ）が、それぞれ配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５および配列番号７９に示されるアミノ酸配列を有する、大腸菌（Escherichia coli）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＡＢ４；配列番号５３）、バチルス・メガテリウム（Bacilus megaterium）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｄ５ＤＴＬ４；配列番号５４）、メタノサーモバクター属（Methanothermobacter）種ＣａＴ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｔ２ＧＫＫ５；配列番号５５）、マイコバクテリウム・ケロネー（Mycobacterium chelonae）１５１８（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｘ８ＥＸ８６；配列番号５６）、ヒポクレア・アトロビリディス（Hypocrea atroviridis）（配列番号５７）、スファエルリナ・ムシバ（Sphaerulina musiva）（配列番号５８）、ペニシリウム・ロッケフォルティ（Penicillium roqueforti）（配列番号５９）、フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．リコペルシシ（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）（配列番号６０）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）（配列番号６１）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（配列番号６２）、アスペルギルス・パラシチカス（Aspergillus parasiticus）（配列番号６３）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（配列番号６４）、グロスマニア・クラビゲラ（Grosmannia clavigera）（配列番号６５）またはエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）（配列番号７９）から得られる３−ポリプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＵｂｉＤ）である。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、３−ポリプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＵｂｉＤ）が、配列番号５３〜６５および配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５３〜６５のいずれかと少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００２５】
上記のように、別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましくはアコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）であり得る。このデカルボキシラーゼは、上記デカルボキシラーゼについて記載されているように、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとの会合を要しないので、プレニル化補助因子の提供を要しない。
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換がアコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）によって触媒される。アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）は以下の反応を触媒すると記載されている：
【００２６】
【化３】
2019500022.tif 000005
この酵素は種々の生物で生じ、例えばアスペルギルス・イタコニカス（Aspergillus itaconicus）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、ヒト（Homo sapiens）およびマウス（Mus musculus）で記載されている。好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用されるアコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）が、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｂ３ＩＵＮ８）、ヒト（Homo sapiens）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ６ＮＫ０６）またはマウス（Mus musculus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５４９８７）から得られるアコニット酸デカルボキシラーゼである。
【００２７】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用されるアコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）が、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）から得られるアコニット酸デカルボキシラーゼ（配列番号６６）である。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、アコニット酸デカルボキシラーゼが、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００２９】
上記のように、別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましくはメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）であり得る。このデカルボキシラーゼは、上記デカルボキシラーゼについて記載されているように、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとの会合を要しないので、プレニル化補助因子の提供を要しない。
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換がメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）によって触媒される。メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼは以下の反応：
【００３０】
【化４】
2019500022.tif 000006
すなわちカルボキシル化を触媒すると記載されているが、これらを使用して脱炭酸の反応を触媒することもできる。メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばニンジン（Daucus carota）、ダイズ（Glycine max）、オオムギ（Hoedeum vulgare）、エンドウ（Pisum sativum）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トウモロコシ（Zea mays）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）種、レンズマメ（Lens culinaris）、ヒト（Homo sapiens）、ウシ（Bos taurus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、マウス（Mus musculus）、マダイ（Pagrus major）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）、シュードモナス・アミグダリ（Pseudomonas amygdali）、アシダミノコッカス・フェルメンタンス（Acidaminococcus fermentans）、大腸菌（Escherichia coli）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）種およびアクロモバクター属（Achromobacter）種で記載されている。
【００３１】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用されるメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）が、シュードモナス・アミグダリ（Pseudomonas amygdali）から得られるメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（配列番号６７）である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、配列番号６７のアミノ酸配列または配列番号６７と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用されるメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）が、ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）から得られるメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼである。ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）では、ｌｉｕＢ遺伝子が２つのサブユニットＡｉｂＡおよびＡｉｂＢを有する酵素をコードする（Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1304-1308）。ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）から得られるメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、グルタコニル−ＣｏＡトランスフェラーゼサブユニットＡおよびＢ（配列番号１００および１０１）としてアノテーションを付与されたヘテロ二量体酵素である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼが、配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列または配列番号１００もしくは１０１と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００３５】
上記のように、別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましくはゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）であり得る。このデカルボキシラーゼは、上記デカルボキシラーゼについて記載されているように、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとの会合を要しないので、プレニル化補助因子の提供を要しない。
よって、別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）によって触媒される。ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼは自然に以下の反応を触媒する：
【００３６】
【化５】
2019500022.tif 000007
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物および細菌で生じる。酵素は、例えばニンジン（Daucus carota）、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、シュードモナス属（Pseudomonas）種、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）およびシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）で記載されている。
【００３７】
別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましくは６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）であり得る。
よって、別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）によって触媒される。６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）は自然に以下の反応を触媒する：
【００３８】
【化６】
2019500022.tif 000008
この酵素は種々の生物、特に真核生物および原核生物、例えば細菌および真菌で生じる。酵素は、例えばアスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｔ１ＰＲＥ６）、ペニシリウム・グリセオフルバム（Penicillium griseofulvum）およびバルサ・フリエシイ（Valsa friesii）で記載されている。
【００３９】
好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用される６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）が、アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）から得られる６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（配列番号６８）である。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼが、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、脱炭酸を介して３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００４１】
別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましくは２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）であり得る。
よって、別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）によって触媒される。２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）は自然に以下の反応を触媒する：
【００４２】
【化７】
2019500022.tif 000009
この酵素は種々の生物、特に原核生物、例えば細菌で生じる。酵素は、例えばボルデテラ属（Bordetella）種、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｂ０ＶＸＭ８）、プチダ菌（Pseudomonas putida）およびラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）で記載されている。
【００４３】
好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用される２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）が、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）（配列番号６９）から得られる２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼである。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼが、配列番号６９のアミノ酸配列または配列番号６９と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、脱炭酸を介して３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００４５】
別の可能性では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましくは５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）であり得る。
【００４６】
よって、別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が、５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）によって触媒される。５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）は自然に以下の反応を触媒する：
【００４７】
【化８】
2019500022.tif 000010
この酵素は原核生物、例えば細菌で生じると記載されている。酵素は、例えば大腸菌（E.coli）およびサルモネラ・ダブリン（Salmonella dublin）で記載されている。
【００４８】
好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において本発明の方法に使用される５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）が、サルモネラ・ダブリン（Salmonella dublin）から得られる５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（配列番号７０）である。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼが、配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、脱炭酸を介して３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００５０】
３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換：図１に示されるステップＩＩ
本発明の方法によりイソブテンに変換される３−メチルクロトン酸自体は酵素反応によって提供され得る。
本発明によると、３−メチルクロトン酸は、図１に模式的に示される様々な経路を介して提供することができる。
よって、１つの選択肢によると、３−メチルクロトン酸自体は、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって提供することができる。３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換（図１に示されるステップＩＩ）を図３に模式的に示す。
【００５１】
本発明によると、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の前記３−メチルクロトン酸への酵素的変換は、好ましくはβ−ヒドロキシ酸（すなわち、例えば３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ））のα，β−不飽和酸（すなわち、例えば３−メチルクロトン酸）への脱水を触媒する酵素を使用する。「脱水」という用語は一般的に、Ｈ２Ｏの除去を伴う反応を指す。３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）脱水を触媒する酵素は、図３に示される反応を触媒する酵素である。好ましくは、このような酵素はヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．−．−）のファミリーに属する。
ＥＣ４．２．−．−（すなわち、ヒドロリアーゼ）として分類されるこのような酵素の好ましい例は：
アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）；
フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）；および
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）
である。
【００５２】
よって、１つの好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換がアコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）の使用によって達成される。アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）（アコニターゼヒドラターゼとも呼ばれる）は以下の反応を触媒する酵素である：
【００５３】
【化９】
2019500022.tif 000011
この酵素は、真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物から知られている。酵素は、例えばアセル・シュードプラタヌス（Acer pseudoplatanus）、アドベネラ・カシミレンシス（Advenella kashmirensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、セレウス菌（Bacillus cereus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、バクテロイデス・フラジリス（Bacterioides fragilis）、ウシ（Bos taurus）、線虫（Caenorhabditis elegans）、シトラス・クレメンティナ（Citrus clementina）、イヌ（Canis lupus familiaris）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、大腸菌（E. coli）、ダイズ（Glycine max）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、クマネズミ（Rattus rattus）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・リポリチカ（Saccharomycopsis lipolytica）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、シロガラシ（Sinapis alba）、アルファルファ根粒菌（Sinorhizobium meliloti）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、イノシシ（Sus scrofa）、トラメテス・サンジーナ（Trametes sanguinea）、ブルセイトリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、キサトモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、キサトモナス・エウベシカトリア（Xanthomonas euvesicatoria）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）およびトウモロコシ（Zea mays）で記載されている。
好ましい実施形態では、アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）が、アドベネラ・カシミレンシス（Advenella kashmirensis）（ＴｒＥＭＢＬ受託番号Ｂ３ＴＺＥ０）、バクテロイデス・フラジリス（Bacterioides fragilis）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＲＰ８７）、線虫（Caenorhabditis elegans）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ２３５００）、シトラス・クレメンティナ（Citrus clementina）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｄ３ＧＱＬ０、Ｄ３ＧＱＬ１またはＤ３ＧＱＬ２）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＦＸ３またはＱ９ＮＦＸ２）、大腸菌（E. coli）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ３６６８３またはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２５５１６）、ヒト（Homo sapiens）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２１３９９またはＱ９９７９８）、マウス（Mus musculus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２８２７１）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＥＲ３４またはＱ６３２７０）、イノシシ（Sus scrofa）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１６２７６）またはブルセイトリパノソーマ（Trypanosoma brucei）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＪＱ８またはＱ９ＮＪＱ９）のものである。
【００５４】
好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への変換において本発明の方法に使用されるアコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）が大腸菌（E. coli）から得られるアコニターゼ（配列番号７１）である。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態では、アコニターゼが、配列番号７１のアミノ酸配列または配列番号７１と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換がフマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）の使用によって達成される。フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）（フマラーゼヒドラターゼとも呼ばれる）は以下の反応を触媒する酵素である：
【００５７】
【化１０】
2019500022.tif 000012
この酵素は、真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物から知られている。酵素は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ブタ回虫（Ascaris suum）、アゾトバクター・ビネランジイ（Azotobacter vinelandii）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、カンピロバクター・フィタス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、エルウィニア属（Erwinia）種、大腸菌（E. coli）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、ヒト（Homo sapiens）、森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、エンドウ（Pisum sativum）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、ピュロバクルム・ニュートロフィルム（Pyrobaculum neutrophilum）、ドブネズミ（Rattus novegicus）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、出芽酵母（Sacchoromyces cerevisiae）、トマト（Solanum lycopersicum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・サーモブルガリス（Streptomyces thermovulgaris）、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、イノシシ（Sus scrofa）、サーマス属（Thermus）種、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）およびトウモロコシ（Zea mays）で記載されている。
好ましい実施形態では、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９３０３３またはＱ９ＦＩ５３）、ブタ回虫（Ascaris suum）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＲＮ８）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２８２７１）、大腸菌（E. coli）（Ｐ０５０４２）、ヒト（Homo sapiens）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７９５４）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（Ｐ９ＷＮ９３）、ピュロバクルム・ニュートロフィルム（Pyrobaculum neutrophilum）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｂ１Ｙ９３１またはＢ１Ｙ９３２）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５５２５０）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazekii）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＺＣＱ４）、出芽酵母（Sacchoromyces cerevisiae）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８４１７）、ストレプトマイセス・サーモブルガリス（Streptomyces thermovulgaris）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ａ５Ｙ６Ｊ１）またはスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３９４６１）のものである。
【００５８】
好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への変換において本発明の方法に使用されるフマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）が大腸菌（E. coli）から得られるフマラーゼ（配列番号７２）である。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、フマラーゼが、配列番号７２のアミノ酸配列または配列番号７２と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換がエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）の使用によって達成される。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）は以下の反応を触媒する：
【００６１】
【化１１】
2019500022.tif 000013
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、通常はアシル−ＣｏＡ上の第２の炭素原子と第３の炭素原子との間の二重結合を水和させる酵素である。しかしながら、この酵素を使用して逆方向の反応を触媒することもできる。
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）はまた、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼとも呼ばれる。両酵素は同じ反応を触媒するが、これらの酵素の一方の名称は対応する反応の一方向を示し、他方の名称は逆反応を示す。反応が可逆的であるので、両方の酵素の名称を使用することができる。
クロトナーゼとしても知られているこの酵素は本来、脂肪酸を代謝してアセチル−ＣｏＡとエネルギーの両方を産生するのに関与している。このクラスに属する酵素は、例えばラット（ドブネズミ（Rattus novegicus））、ヒト（ヒト（Homo sapiens））、マウス（マウス（Mus musculus））、イノシシ（イノシシ（Sus scrofa））、ウシ（Bos taures）、大腸菌（E. coli）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）およびクロストリジウム・アミノブチリカム（Clostridium aminobutyricum）で生じることが記載されている。このような酵素のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、例えばラット、ヒトおよび枯草菌（Bacillus subtilis）および炭疽菌（Bacillus anthracis）で決定されている。原則として、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への変換を触媒することができる任意のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）を本発明の文脈で使用することができる。好ましい実施形態では、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが、ガラクトマイセス・レッシイ（Galactomyces reessii）のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Dhar et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28 (2002), 81-87）、枯草菌（Bacillus subtilis）のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｇ４ＰＢＣ３；配列番号３８）または炭疽菌（Bacillus anthracis）のエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８１ＹＧ６；配列番号３９）である。
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼが、配列番号３８もしくは３９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号３８もしくは３９のいずれか１つと少なくともｘ％相同であり、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの活性を有するアミノ酸配列を示し（ｘは３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）、このような酵素が本明細書上記で示されるように３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に変換することができる。配列同一性の決定に関しては、本明細書の上記と同じものを適用する。
【００６２】
アセトンとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への酵素的縮合：図１に示されるステップＩＩＩ
本発明の方法により３−メチルクロトン酸に変換される３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）自体は酵素反応、すなわちアセトンとアセチル−ＣｏＡの前記３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への酵素的縮合によって提供され得る。アセトンとアセチル−ＣｏＡの前記３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への縮合（図１に示されるステップＩＩＩ）を図４に模式的に示す。
【００６３】
よって、本発明はまた、最初にアセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に縮合し、次いで、これを３−メチルクロトン酸に変換する、アセトンからイソブテンを製造する方法に関する。さらに、次いで、３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに変換する。
【００６４】
本発明によると、アセトンとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への縮合は、好ましくはアセトンのオキソ（すなわち、Ｃ＝Ｏ）基の炭素原子と、アセチル−ＣｏＡ、特にアセチル−ＣｏＡのメチル基との間の共有結合の形成を触媒することができる酵素を使用する。この反応スキームによると、アセトンのオキソ基が求電子試薬として反応し、アセチル−ＣｏＡのメチル基が求核試薬として反応する。アセトンとアセチル−ＣｏＡの変換の一般的な反応を図４に示す。アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合することができる酵素は当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第２０１１／０３２９３４号パンフレットに記載されている。
【００６５】
好ましくは、アセトンとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）への酵素的縮合に使用される酵素は、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）の活性を有する酵素および／またはＰｋｓＧタンパク質および／またはＣ−Ｃ結合開裂／縮合リアーゼ、例えばＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）の活性を有する酵素である。ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼは種々の生物について記載されている。
様々な生物のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの例を配列番号１〜１６に示す。配列番号１は線虫（Caenorhabditis elegans）（Ｐ５４８７１、遺伝子バンクＦ２５Ｂ４．６）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号２はシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母；Ｐ５４８７４）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号３は出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母；Ｐ５４８３９、遺伝子バンクＣＡＡ６５４３７．１）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号４はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（シロイヌナズナ；Ｐ５４８７３）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号５はキイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）（粘菌；Ｐ５４８７２、遺伝子バンクＬ２１１４）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号６はチャバネゴキブリ（Blattella germanica）（チャバネゴキブリ；Ｐ５４９６１、遺伝子バンクＸ７３６７９）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号７はニワトリ（Gallus gallus）（ニワトリ；Ｐ２３２２８、遺伝子バンクＣＨＫＨＭＧＣＯＡＳ）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号８はヒト（Homo sapiens）（ヒト；Ｑ０１５８１、遺伝子バンクＸ６６４３５）の細胞質ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号９はヒト（Homo sapiens）（ヒト；Ｐ５４８６８、遺伝子バンクＸ８３６１８）のミトコンドリアＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１０はキイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）（粘菌；Ｑ８６ＨＬ５、遺伝子バンクＸＭ＿６３８９８４）のミトコンドリアＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１１は表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）（Ｑ９ＦＤ７６）のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１２はファーメンタム菌（Lactobacillus fermentum）（Ｂ２ＧＢＬ１）のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１３はハイパーサーマス・ブチリカス（Hyperthermus butylicus）（Ａ２ＢＭＹ８）のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１４はクロロフレクサス・アグリガンス（Chloroflexus aggregans）（Ｂ８Ｇ７９５）のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１５はデルブリュッキ菌（Lactobacillus delbrueckii）（Ｑ１ＧＡＨ５）のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示し、配列番号１６はスタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）Ｑ４Ｌ９５８（野生型タンパク質と比較してＩ９８＞Ｖの差がある）のＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの配列を示す。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼが、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１〜１６のいずれかと少なくともｎ％同一であり、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼの活性を有する配列を含む酵素である（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）。
配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００６７】
アセトンとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシイソ吉草酸への縮合に使用することができるタンパク質の別の例はＰｋｓＧタンパク質である。本出願の文脈において、「ＰｋｓＧタンパク質」または「ＰｋｓＧタンパク質の活性を有するタンパク質／酵素」という用語は、ＰｋｓＧタンパク質によって自然に触媒される反応、すなわち、アセチル−Ｓ−ＡｃｐＫ（Ａｃ−Ｓ−ＡｃｐＫ）から、ＰｋｓＬタンパク質のチオール化ドメインの１つと結合したβ−ケトチオエステルポリケチド中間体への−ＣＨ２ＣＯＯ−の移動を触媒することができる任意の酵素を指す。これは、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼによって触媒される反応と類似であるが、ホスホパンテテイル（phosphopantetheyl）部分のアセチル−チオエステルが補酵素Ａの部分ではなくキャリアタンパク質に結合するという違いを有する反応である。自然に触媒する反応ではＰｋｓＧタンパク質はアセチル−Ｓ−ＡｃｐＫからアクセプターにアセチル基を移動するが、ＰｋｓＧタンパク質が通常はＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼによって触媒される反応、すなわちアセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡから始まるＨＭＧ  ＣｏＡの合成も行うことができることが以前に示された。
ＰｋｓＧタンパク質の例を配列番号１７および１８に示す。好ましくは、ＰｋｓＧタンパク質は、配列番号１７または１８と少なくともｎ％同一であり、ＰｋｓＧタンパク質の活性を有するアミノ酸配列を含む酵素である（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）。
配列番号１７は枯草菌（Bacillus subtilis）（Ｐ４０８３０）のＰｋｓＧタンパク質のアミノ酸配列を示し、配列番号１８はマイコバクテリウム・マリヌム（Mycobacterium marinum）（Ｂ２ＨＧＴ６）のＰｋｓＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列同一性の決定に関しては、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼに関連して上記と同じものを適用する。
【００６８】
「Ｃ−Ｃ結合開裂／縮合リアーゼ」の例としては、特に、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１３）、ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１４）または４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．３９）として分類される酵素が挙げられる。イソプロピルリンゴ酸シンターゼは以下の反応を触媒する：
【００６９】
【化１２】
2019500022.tif 000014
このような酵素の例は、ウシ流産菌（Brucella abortus）（菌株２３０８；Ｑ２ＹＲＴ１）の対応する酵素およびハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）（菌株ＫＣＴＣ２３９６；Ｑ２ＳＦＡ７）の対応する酵素である。
【００７０】
ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１４）は以下の化学反応を触媒する酵素である：
【００７１】
【化１３】
2019500022.tif 000015
４−ヒドロキシ−２−ケト吉草酸アルドラーゼは以下の化学反応を触媒する：
【００７２】
【化１４】
2019500022.tif 000016
【００７３】
ＥＣ番号ＥＣ４．１．３．４で「ＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼ」または「ＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの活性を有するタンパク質／酵素」として分類される酵素の例を配列番号１９〜２５に示す。配列番号１９はトウモロコシ（Zea mays）（受託番号Ｂ６Ｕ７Ｂ９、遺伝子バンクＡＣＧ４５２５２）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２０はゼブラダニオ（Danio rerio）（ゼブラフィッシュ（Brachydanio rerio）；Ａ８ＷＧ５７、遺伝子バンクＢＣ１５４５８７）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２１はウシ（Bos taurus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ２９４４８）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２２はヒト（Homo sapiens）（ミトコンドリア、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ３５９１４、遺伝子バンクＨＵＭＨＹＭＥＧＬＡ）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２３はプチダ菌（Pseudomonas putida）（Ｑ８８Ｈ２５）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２４はアシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）（Ｂ７Ｈ４Ｃ６）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示し、配列番号２５はサーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（Ｑ７２ＩＨ０）のＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの配列を示す。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態では、ＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼが、配列番号１９〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１９〜２５のいずれかと少なくともｎ％同一であり、ＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼの活性を有する配列を含む酵素である（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）。
配列同一性の決定に関しては、ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼに関連して上記と同じものを適用する。
【００７５】
アセト酢酸のアセトンへの酵素的変換：図１に示されるステップＩＶ
本発明の方法により３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に変換されるアセトン自体は酵素反応、すなわちアセト酢酸のアセトンへの酵素的変換によって提供され得る。アセト酢酸のアセトンへの変換（図１に示されるステップＩＶ）を図５に模式的に示す。この反応は脱炭酸反応であり、アセトンを産生することができる生物、すなわちクロストリジウム（Clostridium）属の生物で自然に起こる反応である。
【００７６】
よって、本発明はまた、最初にアセト酢酸をアセトンに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにアセチル−ＣｏＡと縮合して３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にし、次いで、これを３−メチルクロトン酸に変換する、アセト酢酸からイソブテンを製造する方法に関する。さらに、次いで、前記３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに変換する。
【００７７】
本発明によると、アセト酢酸の前記アセトンへの変換は、好ましくはアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）を使用する。この酵素をコードするいくつかの生物のヌクレオチド配列、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２３６７０およびＰ２３６７３）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）（クロストリジウム（Clostridium）ＭＰ；Ｑ９ＲＰＫ１）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Clostridium pasteurianum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ８１３３６）、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium）種（菌株ＢＴＡｉ１／ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１８２；Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ５ＥＢＵ７）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）（ＡＴＣＣ  １０３９９  Ａ９ＬＢＳ０）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ３ＭＡＥ３）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）ＦＭＨ  Ａ５ＸＪＢ２、バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ｂ４７１）、バークホルデリア・アンビファリア（Burkholderia ambifaria）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０ｂ５Ｐ１）、バークホルデリア・フィトファーマンス（Burkholderia phytofirmans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ２Ｔ３１９）、バークホルデリア属（Burkholderia）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ３８ＺＵ０）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ２ＴＬＮ８）、ラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）、（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ２ＵＩＧ７）、ストレプトマイセス・ノガラター（Streptomyces nogalater）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＥＹＩ７）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８２ＮＦ４）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ５ＺＸＱ９）、ラクトバチルス・サリヴァリゥス（Lactobacillus salivarius）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１ＷＶＧ５）、ロドコッカス属（Rhodococcus）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０Ｓ７Ｗ４）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８９０Ｇ０）、エンドウ根粒菌（Rhizobium leguminosarum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１Ｍ９１１）、カゼイ菌（Lactobacillus casei）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０３Ｂ６６）、野兎病菌（Francisella tularensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０ＢＬＣ９）、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythreae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ４ＦＫＲ９）、コラルカエウム・クリプトフィルム（Korarchaeum cryptofilum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ１Ｌ３Ｎ６）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ７Ｚ８Ｋ８）、トウモロコシごま葉枯病菌（Cochliobolus heterostrophus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ８ＮＪＱ３）、スルホロブス・イスランディカス（Sulfolobus islandicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｃ３ＭＬ２２）および野兎病菌（Francisella tularensis）亜種ホラークティカ（holarctica）（菌株ＯＳＵ１８）のａｄｃ遺伝子が当技術分野で知られている。
【００７８】
好ましい実施形態では、アセト酢酸のアセトンへの変換において本発明の方法に使用されるアセト酢酸デカルボキシラーゼが、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２３６７０およびＰ２３６７３）から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）である。
【００７９】
アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換：図１に示されるステップＶａおよびステップＶｂ
本発明の方法によりアセトンに変換されるアセト酢酸自体は酵素反応、すなわちアセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換によって提供され得る。アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への変換は２つの異なる経路によって達成することができる。１つの可能性は、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡチオエステルをアセト酢酸に加水分解することによる、アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への変換である。この反応（図１に示されるステップＶａ）を図６に模式的に示す。別のより好ましい態様では、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸上に転移し、アセト酢酸とアセチル−ＣｏＡの形成を得る。この反応（図１に示されるステップＶｂ）を図７に模式的に示す。
【００８０】
よって、本発明はまた、最初にアセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにアセトンに変換し、次いで、これをアセチル−ＣｏＡと縮合して３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にし、次いで、これを３−メチルクロトン酸に変換する、アセトアセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法に関する。さらに、次いで、前記３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに変換する。
【００８１】
言及されるように、一態様では、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡチオエステルを加水分解してアセト酢酸を得る。本発明のこの態様によると、アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換が、好ましくは自然にこの反応を触媒するアセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１１）を使用することによって達成される。
アセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１１）は以下の反応を触媒する：
【００８２】
【化１５】
2019500022.tif 000017
この酵素は種々の生物で知られており、例えば真核生物で記載されている。酵素は、例えばウシ（Bos taurus）、ドバト（Columba livia）、ニワトリ（Gallus gallus）、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）またはドブネズミ（Rattus norvegicus）で記載されている。よって、好ましい実施形態では、酵素がウシ属（Bos）、ハト属（Columba）、ニワトリ属（Gallus）、ハツカネズミ属（Mus）、タイヘイヨウサケ属（Oncorhynchus）、アナウサギ属（Oryctolagus）およびクマネズミ属（Rattus）からなる群から選択される属のものである。より好ましい実施形態では、酵素がウシ（Bos taurus）、ドバト（Columba livia）、ニワトリ（Gallus gallus）、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）またはドブネズミ（Rattus norvegicus）からなる群から選択される種のものである。ウシ（Bos taurus）、ドバト（Columba livia）、ニワトリ（Gallus gallus）、ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）およびドブネズミ（Rattus norvegicus）。
言及されるように、別のより好ましい可能性では、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸上に転移して、アセト酢酸とアセチル−ＣｏＡの形成を得る。本発明のこの可能性によると、アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換は、好ましくはアセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸上に転移することができる酵素を使用することによって達成される。
【００８３】
好ましくは、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸上に転移することができるこのような酵素は、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）のファミリーに属する。
よって、本発明は、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸上に転移することができる酵素、好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）を使用することによって、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に酵素的変換する方法に関する。本発明の方法に使用できるアセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への変換を触媒する酵素の好ましい例は、酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）として分類される酵素である。
酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）は以下の反応を触媒する：
【００８４】
【化１６】
2019500022.tif 000018
酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）は種々の生物から、例えば大腸菌（E. coli）から公知であり、大腸菌では、ａｔｏＤ遺伝子およびａｔｏＡ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ７６４５８およびＰ７６４５９）によってコードされている。酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）からも公知であり、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）では、ｃｔｆＡＢ遺伝子によってコードされている。よって、本発明の好ましい実施形態では、大腸菌（E. coli）から得られ、ａｔｏＤ遺伝子およびａｔｏＡ遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ７６４５８およびＰ７６４５９）によってコードされている、またはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）から得られ、ｃｔｆＡＢ遺伝子によってコードされている酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）がアセトアセチルＣｏＡのアセト酢酸への変換に使用される。
【００８５】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換：図１に示されるステップＶＩ：
３−メチルクロトン酸は、以下に記載される別の可能な経路によって提供することができる。
【００８６】
よって、別の実施形態では、イソブテンに変換される３−メチルクロトン酸自体が別の酵素反応、すなわち３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって提供され得る。３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への変換（図１に示されるステップＶＩ）を図８に模式的に示す。
【００８７】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への変換は、例えば異なる方法で、例えば以下に記載され、図１（図１に示されるステップＶＩａ、ステップＶＩｂまたはステップＶＩｃ）に示される３つの代替酵素経路によって達成することができる。
【００８８】
よって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換は、
（ａ）好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する単一酵素反応（図１に示されるステップＶＩａ）；
（ｂ）好ましくはチオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を使用することによって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する単一酵素反応（図１に示されるステップＶＩｂ）；または
（ｃ）（ｉ）最初に３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに酵素的に変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られた３−メチルクロトニルリン酸エステルを前記３−メチルクロトン酸に酵素的に変換するステップと
を含む２つの酵素ステップ（図１に示されるステップＶＩｃ）
によって達成され得る。
【００８９】
よって、１つの可能性は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−メチルクロトニルリン酸エステルを介した３−メチルクロトン酸への二段階変換である。他の２つの選択肢は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換を含む。これら３つの選択肢を以下で論じる。
【００９０】
したがって、一実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換が、（ｉ）最初に３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに酵素的に変換するステップと；（ｉｉ）次いでこうして得られた３−メチルクロトニルリン酸エステルを前記３−メチルクロトン酸に酵素的に変換するステップと、を含む２つの酵素ステップ（図１のステップＶＩｃに示される）によって達成され得る。対応する反応を図１１に模式的に示す。
【００９１】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの変換は、例えばリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）の使用によって達成され得る。
リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）は自然に以下の反応を触媒する：
【００９２】
【化１７】
2019500022.tif 000019
リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）が、ブチリル補酵素Ａ（ブチリル−ＣｏＡ）に加えて、いくつかの基質、特にアセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡ、バレリル−ＣｏＡおよびイソバレリル−ＣｏＡを使用できることが、Wiesenborn et al. (Appl. Environ. Microbiol. 55 (1989), 317-322)およびWard et al. (J. Bacteriol. 181 (1999), 5433-5442)によって記載されている。
酵素はいくつかの生物、特に細菌および原虫で生じることが記載されている。一実施形態では、酵素が原虫ダシトリカ・ルミナンチウム（Dasytricha ruminantium）のものである。好ましい実施形態では、リン酸ブチリルトランスフェラーゼが、細菌、好ましくはバチルス属（Bacillus）、ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）、エンテロコッカス属（Enterococcus）またはクロストリジウム属（Clostridium）、より好ましくはエンテロコッカス属（Enterococcus）またはクロストリジウム属（Clostridium）の細菌、さらにより好ましくはバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、クロストリジウム・サッカロアセトブリチカム（Clostridium saccharoacetobutylicum）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sprorogenes）またはフェカリス菌（Enterococcus faecalis）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼである。最も好ましくは、酵素が、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）のものであり、特にｐｔｂ遺伝子（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｆ０Ｋ６Ｗ０；Wiesenborn et al. (Appl. Environ. Microbiol. 55 (1989), 317-322))によってコードされる酵素である、またはフェカリス菌（Enterococcus faecalis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｋ４ＹＲＥ８；Ward et al. (J. Bacteriol. 181 (1999), 5433-5442)）のものである。
【００９３】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの変換が、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）菌株ＡＴＣＣ８２４のリン酸ブチリルトランスフェラーゼを使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２６に示す。
当然、配列番号２６のこのアミノ酸を正確に示す酵素のみを使用できるわけではない。配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一である配列を含む酵素を使用することも可能である。好ましくは、配列同一性は配列番号２６に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％または９０％、さらにより好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、特に好ましくは少なくとも９９％であり、酵素は３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに変換する酵素活性を有する。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの変換が、枯草菌（Bacillus subtilis）、好ましくはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５４５３０を有する枯草菌（Bacillus subtilis）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼを使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７３に示す。
本発明の好ましい実施形態では、リン酸ブチリルトランスフェラーゼが、配列番号７３のアミノ酸配列または配列番号７３と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの変換が、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、好ましくはＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｓ４ＢＺＬ５を有するフェカリス菌（Enterococcus faecalis）のリン酸ブリチルトランスフェラーゼを使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７４に示す。
本発明の好ましい実施形態では、リン酸ブチリルトランスフェラーゼが、配列番号７４のアミノ酸配列または配列番号７４と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【００９６】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）は自然に以下の反応を触媒する：
【００９７】
【化１８】
2019500022.tif 000020
リン酸アセチルトランスフェラーゼが基質としてブチリル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡも使用できることがVeit et al. (J. Biotechnol.140 (2009), 75-83)によって記載されている。
ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースのこの酵素ファミリーについての受託番号はＩＰＲ０１２１４７およびＩＰＲ００２５０５である、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ００２５０５」
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ０１２１４７
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ００２５０５）
ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ０１５１５も参照されたい。
【００９８】
この酵素は種々の生物、特に細菌および真菌で記載されている。よって、１つの好ましい実施形態では、酵素が、好ましくは大腸菌属（Escherichia）、クロロゴニウム属（Chlorogonium）、クロストリジウム属（Clostridium）、ベイヨネラ属（Veillonella）、メタノサルシナ属（Methanosarcina）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ルエゲリア属（Ruegeria）、サルモネラ属（Salmonella）、アゾトバクター属（Azotobacter）、ブラディリゾビウム属（Bradyrhizobium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ムーレラ属（Moorella）、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）、シノリゾビウム属（Sinorhizobium）、連鎖球菌属（Streptococcus）、サーモトガ属（Thermotoga）またはバチルス属（Bacillus）の、より好ましくは種、大腸菌（Escherichia coli）、クロロゴニウム・エロンガツム（Chlorogonium elongatum）、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・アシディウリシ（Clostridium acidiurici）、ベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）、メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、ルエゲリア・ポメロイ（Ruegeria pomeroyi）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、アゾトバクター・ビネランジイ（Azotobacter vinelandii）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）、ファーメンタム菌（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、アルファルファ根粒菌（Sinorhizobium meliloti）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）または枯草菌（Bacillus subtilis）の細菌の酵素である。別の好ましい実施形態では、酵素が、好ましくはサッカロマイセス属（Saccharomyces）、より好ましくは種、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の真菌の酵素である。
【００９９】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの変換が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）菌株ＡＴＣＣ１３０３２のリン酸アセチルトランスフェラーゼを使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。
当然、配列番号２７のこのアミノ酸を正確に示す酵素のみを使用できるわけではない。配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一である配列を含む酵素を使用することも可能である。好ましくは、配列同一性は配列番号２７に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％または９０％、さらにより好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、特に好ましくは少なくとも９９％であり、酵素は３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに変換する酵素活性を有する。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１００】
３−メチルクロトニルリン酸エステルの３−メチルクロトン酸への変換は、例えばＥＣ２．７．２．−として分類される酵素、すなわちホスホトランスフェラーゼを使用することによって達成することができる。このような酵素はアクセプターとしてカルボキシ基を使用する。よって、３−メチルクロトニルリン酸エステルの３−メチルクロトン酸への変換は、例えばアクセプターとしてのカルボキシ基を有する酵素（ＥＣ２．７．２．−）を使用することによって達成することができる。好ましい実施形態では、３−メチルクロトニルリン酸エステルの３−メチルクロトン酸への変換が、プロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）を使用することによって達成される。
【０１０１】
酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）は自然に以下の反応を触媒する：
【０１０２】
【化１９】
2019500022.tif 000021
酪酸キナーゼが酪酸に加えていくつかの基質、例えば吉草酸、イソ酪酸、イソ吉草酸および酢酸ビニルを使用できることが、例えばHartmanis (J. Biol. Chem. 262 (1987), 617-621)によって記載されている。この酵素は種々の生物、特に細菌で記載されている。１つの好ましい実施形態では、酵素が細菌、好ましくはクロストリジウム属（Clostridium）、ブチリビブリオ属（Butyrivibrio）、サーモトガ属（Thermotoga）または腸球菌属（Enterococcus）の細菌のものである。クロストリジウム属（Clostridium）が好ましい。より好ましくは、酵素が、種、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・プロテオクラスティクム（Clostridium proteoclasticum）、クロストリジウム・チロブチリカム（Clostridium tyrobutyricum）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）、ブチリビブリオ・ヒュンガティ（Butyrivibrio hungatei）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）またはエンテロコッカス・デューランス（Enterococcus durans）の細菌のものである。クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）が好ましい。この生物について、２種の酪酸キナーゼが記載されている：酪酸キナーゼ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ４５８２９）および酪酸キナーゼＩＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９７ＩＩ１９）。
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニルリン酸エステルの３−メチルクロトン酸への変換が、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、好ましくはカゼイ菌（Lactobacillus casei）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｋ０Ｎ５２９）の酪酸キナーゼまたはゲオバチルス属（Geobacillus）、好ましくはゲオバチルス属（Geobacillus）種（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｌ８Ａ０Ｅ１）の酪酸キナーゼを使用することによって達成される。これらのタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７５および配列番号７６に示す。
本発明の好ましい実施形態では、酪酸キナーゼが、配列番号７５もしくは７６のアミノ酸配列または配列番号７５もしくは７６と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトニルリン酸エステルを３−メチルクロトン酸に変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１０３】
分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）は自然に以下の反応を触媒する：
【０１０４】
【化２０】
2019500022.tif 000022
（式中、「アルキル」は２−メチルブタン酸、ブタン酸、イソブタン酸、ペンタン酸またはプロピオン酸であり得る）。プロピオン酸との後者の反応は、スピロヘータの分岐鎖脂肪酸キナーゼについて記載されている（J. Bacteriol. 152 (1982), 246-54)。
この酵素はいくつかの細菌で生じると記載されている。よって、１つの好ましい実施形態では、酵素が、好ましくはスピロヘータ属（Spirochaeta）またはサーモトガ属（Thermotoga）、より好ましくはサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）の細菌の酵素である。
【０１０５】
プロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）は自然に以下の反応を触媒する：
【０１０６】
【化２１】
2019500022.tif 000023
【０１０７】
【化２２】
2019500022.tif 000024
この酵素はいくつかの細菌、特に腸内細菌科（Enterobacteriaceae）で生じることが記載されている。よって、１つの好ましい実施形態では、酵素が、好ましくはサルモネラ属（Salmonella）または大腸菌属（Escherichia）、より好ましくは種、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）または大腸菌（Escherichia coli）の細菌の酵素である。
【０１０８】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトニルリン酸エステルの３−メチルクロトン酸への変換が、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、好ましくはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）菌株ＡＴＣＣ７００７２０のプロピオン酸キナーゼを使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に示す。
当然、配列番号２８のこのアミノ酸を正確に示す酵素のみを使用できるわけではない。配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一である配列を含む酵素を使用することも可能である。好ましくは、配列同一性は配列番号２８に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％または９０％、さらにより好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、特に好ましくは少なくとも９９％であり、酵素は３−メチルクロトニルリン酸エステルを３−メチルクロトン酸に変換する酵素活性を有する。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニルリン酸エステルの３−メチルクロトン酸への変換が、大腸菌（Escherichia coli）、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）菌株Ｋ１２のプロピオン酸キナーゼを使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。
当然、配列番号２９のこのアミノ酸を正確に示す酵素のみを使用できるわけではない。配列番号２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一である配列を含む酵素を使用することも可能である。好ましくは、配列同一性は配列番号２９に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％または９０％、さらにより好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、特に好ましくは少なくとも９９％であり、酵素は３−メチルクロトニルリン酸エステルを３−メチルクロトン酸に変換する酵素活性を有する。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１０９】
酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）は自然に以下の反応を触媒する：
【０１１０】
【化２３】
2019500022.tif 000025
この酵素はいくつかの生物、特に細菌および真核生物で生じることが記載されている。１つの好ましい実施形態では、酵素が、メタノサルシナ属（Methanosarcina）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、エタノリゲネンス属（Ethanoligenens）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ロセオバリウス属（Roseovarius）、連鎖球菌属（Streptococcus）、サルモネラ属（Salmonella）、アコレプラズマ属（Acholeplasma）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、アジェロマイセス属（Ajellomyces）、バチルス属（Bacillus）、ボレリア属（Borrelia）、ケトミウム属（Chaetomium）、クロストリジウム属（Clostridium）、コクシジオイデス属（Coccidioides）、ヒトヨタケ属（Coprinopsis）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、カプリアビダス属（Cupriavidus）、デスルホビブリオ属（Desulfovibrio）、腸球菌属（Enterococcus）、大腸菌属（Escherichia）、エタノリゲネス（Ethanoligenes）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、乳酸桿菌属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、リステリア属（Listeria）、メソプラズマ属（Mesoplasma）、ムーレラ属（Moorella）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、オセアノバチルス属(Oceanobacillus）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ロドシュードモナス属（Rhodospeudomonas）、ロセオバリウス属（Roseovarius）、サルモネラ属（Salmonella）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、サーモトガ属（Thermotoga）またはベイヨネラ属（Veillonella）の細菌、より好ましくは種、メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、エタノリゲネンス・ハルビネンス（Ethanoligenens harbinense）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Propionibacterium acidipropionici）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・エンテリカ（Streptococcus enterica）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Acholeplasma laidlawii）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アジェロマイセス・カプスラツス（Ajellomyces capsulatus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ケトミウム・グロボスム（Chaetomium globosum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、コプリノプシス・シネレア（Coprinopsis cinerea）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、デスルホビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、大腸菌（Escherichia coli）、エタノリゲネス・ハービネンス（Ethanoligenes harbinense）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、デルブリュッキ菌（Lactobacillus delbrueckii）、アシドフィルス菌（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、メソプラズマ・フローラム（Mesoplasma florum）、メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、オセアノバチルス・イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Propionibacterium freudenreichii）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニッチ（Propionibacterium acidipropionici）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodospeudomonas palustris）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）またはベイヨネラ・パルブラ（Veillonella parvula）の細菌のものである。
別の好ましい実施形態では、酵素が、真菌、好ましくはアスペルギルス属（Aspergillus）、ジベレラ属（Gibberella）、ヒポクレア属（Hypocrea）、マグナポルテ属（Magnaporthe）、ファエオスファエリア（Phaeosphaeria）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、フィトフトラ属（Phytophthora）、スクレロティニア属（Sclerotinia）、ウンシノカルプス（Uncinocarpus）、ウスチラゴ属（Ustilago）またはアカパンカビ属（Neurospora）の真菌、さらにより好ましくは種、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigates）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、ハイポクレア・ジェコリナ（Hypocrea jecorina）、イネいもち病菌（Magnaporthe grisea）、ファエオスファエリア・ノドルム（Phaeosphaeria nodorum）、白色腐朽菌（Phanerochaete chrysosporium）、フィトフトラ・ラモルム（Phytophthora ramorum）、フィトフトラ・ソジャエ（Phytophthora sojae）、スクレロチニア・スクレロチオルム（Sclerotinia sclerotiorum）、ウンシノカルプス・レッシイ（Uncinocarpus reesii）、トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）またはアカパンカビ（Neurospora crassa）の真菌の酵素である。
【０１１１】
さらに好ましい実施形態では、酵素が、植物または藻類、好ましくはクラミドモナス属（Chlamydomonas）、さらにより好ましくは種、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）の酵素である。
別の実施形態では、酵素が、エントアメーバ属（Entamoeba）、より好ましくは種、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）の生物のものである。
【０１１２】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニルリン酸エステルへの変換に適した上記の酵素ファミリーは、進化的に関連しており、共通の配列シグネチャーを含むことが示されている。これらのシグネチャーはＰｒｏｓｉｔｅデータベースにおいて参照され、記載される：
ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｓｉｔｅ／ｎｉｃｅｄｏｃ．ｐｌ？ＰＳ０１０７５
Gao et al. (FEMS Microbiol. Lett. 213 (2002), 59-65)は、とりわけ、それぞれリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）および酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）をコードする、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）のｐｔｂ遺伝子およびｂｕｋ遺伝子で形質転換された遺伝子組換え大腸菌（E. coli）を既に記載している。これらの大腸菌（E. coli）はＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を産生できることが示されている。
【０１１３】
上記のように、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への変換は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する２つの代替変換によって達成することもできる。
【０１１４】
好ましくは、一実施形態では、チオエステルヒドロラーゼ（以下でチオエステラーゼ（Ｅ３．１．２．−）と呼ばれる）のファミリーに属する酵素を使用することにより、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのチオエステル結合を３−メチルクロトン酸に加水分解することによって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する。この反応を図１０に模式的に示す。
好ましいチオエステルヒドロラーゼ（Ｅ３．１．２．−）についての例は、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）およびアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）である（図１に示されるステップＶＩｂ）。
【０１１５】
代替実施形態では、好ましくはＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）のファミリーに属する酵素を使用することにより、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する。この反応を図９に模式的に示す。
好ましいＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）についての例は、プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）およびスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）である（図１に示されるステップＶＩａ）。
【０１１６】
チオエステラーゼ（ＴＥ；チオエステルヒドロラーゼとも呼ばれる）はＥＣ３．１．２として分類される酵素である。現在、チオエステラーゼはＥＣ３．１．２．１〜ＥＣ３．１．２．３０として分類されるが、まだ分類されていない／未分類のＴＥはＥＣ３．１．２．−に属する酵素としてグループ分けされる。Cantu et al. (Protein Science 19 (2010), 1281-1295)は、一次構造に関して互いに関連のないチオエステラーゼの２３ファミリーが存在すると記載している。しかしながら、同じファミリーの全てのメンバーは本質的に同じ三次構造を有すると仮定される。チオエステラーゼは、カルボキシル基と硫黄原子との間のチオエステル結合を加水分解する。
好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に変換するために本発明による方法に使用されるチオエステラーゼが、
−  アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）；
−  パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２）；
−  ３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．４）；
−  オレオイル−［アシルキャリアタンパク質］ヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１４）；
−  ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）；
−  ＡＤＰ依存性中鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１９）；および
−  アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）
からなる群から選択される。
【０１１７】
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）を使用することによって達成される。アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
アセチル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→酢酸＋ＣｏＡ
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばドブネズミ（Rattus norvegicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ９９ＮＢ７）、マウス（Mus musculus）、イノシシ（Sus scrofa）、ウシ（Bos taurus）、ニワトリ（Gallus gallus）、広鼻下目（Platyrrhini）、ヒツジ（Ovis aries）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、ブタ回虫（Ascaris suum）、ヒト（Homo sapiens）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８ＷＹＫ０）、エンドウ（Pisum sativum）、キュウリ（Cucumis sativus）、キビ属（Panicus）種、トウゴマ（Ricinus communis）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）、トウモロコシ（Zea mays）、ダイズ（Glycine max）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei brucei）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、トリパノソーマ・ディオニシ（Trypanosoma dionisii）、トリパノソーマ・ベスペルチリオニス（Trypanosoma vespertilionis）、クリチディア・ファシキュラータ（Crithidia fasciculata）、クロストリジウム・アミノワレリクム（Clostridium aminovalericum）、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermaentans）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）およびメタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）で記載されている。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換がパルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２）を使用することによって達成される。パルミトイル−ＣｏＡヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
パルミトイル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→パルミチン酸＋ＣｏＡ
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ８ＧＹＷ７）、エンドウ（Pisum sativum）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）、ブミレリオプシス・フィリフォルミス（Bumilleriopsis filiformis）、エレモスファエラ・ウィリディス（Eremosphaera viridis）、モウゲオチア・スカラリス（Mougeotia scalaris）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、ロドトルラ・アウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、出芽酵母（Saccharaomyces cerevisiae）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、線虫（Caenorhabditis elegans）、マウス（Mus musculus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ５８１３７）、ヒト（Homo sapiens）、広鼻下目（Platyrrhini）、ウシ（Bos taurus）、イヌ（Canis lupus familiaris）、イノシシ（Sus scrofa）、モルモット（Cavia porcellus）、ハト（Columba）種、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）、ゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、アナウサギ（Oryctolagus cuniculus）、ニワトリ（Gallus gallus）、マガモ（Anas platyrhynchos）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、枯草菌（Bacillus subtilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・ベネゼエレ（Streptomyces venezuelae）および大腸菌（E. coli）で記載されている。
【０１１９】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．４）を使用することによって達成される。３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→３−ヒドロキシイソ酪酸＋ＣｏＡ
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ヒト（Homo sapiens）、イヌ（Canis lupus familiaris）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、セレウス菌（Bacillus cereus）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）で記載されている。
【０１２０】
さらに別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、オレオイル−［アシルキャリアタンパク質］ヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１４）を使用することによって達成される。オレオイル−［アシルキャリアタンパク質］ヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
オレオイル−［アシルキャリアタンパク質］＋Ｈ２Ｏ→オレイン酸＋［アシルキャリアタンパク質］
この酵素は種々の植物および細菌で生じる。酵素は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アリウム・アンペロプラスム（Allium ampeloprasum）、ニホンカボチャ（Curcurbita moschata）、クフェア・カロフィラ（Cuphea calophylla）、クフェア・フッケリアナ（Cuphea hookeriana）、クフェア・ランセオラータ（Cuphea lanceolata）、クフェア・ライティ（Cuphea wrightii）、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Umbellularia californica）、コリアンダー（Coriandrum sativum）、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）、アブラヤシ属（Elaeis）種、ギニアアブラヤシ（Elaeis guineensis）、ダイズ（Glycine max）、アボカド（Persea americana）、エンドウ（Pisum sativum）、シロガラシ（Sinapis alba）、アメリカニレ（Ulmus americana）、トウモロコシ（Zea mays）、カラシナ（Brassica juncea）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラッシカ・ラパ亜種カンペストリス（Brassica rapa subsp. campestris）、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）、トウゴマ（Ricinus communis）、クスノキ（Cinnamomum camphorum）、マカダミア・テトラフィラ（Macadamia tetraphylla）、マグニフェラ・インディカ（Mangifera indica）、マフア・ロンギフォリア（Madhuca longifolia）、ポプルス・トメントサ（Populus tomentosa）、ロウバイ（Chimonanthus praecox）、ワタ（Gossypium hirsutum）、ディプロクネマ・ブチラセア（Diploknema butyracea）、ヒマワリ（Helianthus annuus）および化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）で記載されている。
【０１２１】
さらに別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）を使用することによって達成される。ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
アシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→カルボン酸＋ＣｏＡ
この酵素は種々の動物で生じ、例えばマウス（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）およびゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）で記載されている。
【０１２２】
さらに別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、ＡＤＰ依存性中鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１９）を使用することによって達成される。ＡＤＰ依存性中鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
アシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→カルボン酸＋ＣｏＡ
この酵素は種々の動物で生じ、例えばドブネズミ（Rattus norvegicus）およびゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）で記載されている。
【０１２３】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を使用することによって達成される。アシル−ＣｏＡヒドロラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
アシル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→カルボン酸＋ＣｏＡ
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ロドトルラ・オウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、ブミレリオプシス・フィリフォルミス（Bumilleriopsis filiformis）、エレモスファエラ・ヴィリディス（Eremosphaera viridis）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、マウス（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、ヒト（Homo sapiens）、イノシシ（Sus scrofa）、ウシ（Bos taurus）、イヌ（Canis lupus familiaris）、モルモット（Cavia porcellus）、モンゴルキヌゲネズミ（Cricetus griseus）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、マガモ（Anas platyrhynchos）、ニワトリ（Gallus gallus）、線虫（Caenorhabditis elegans）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisia）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、大腸菌（Escherichia coli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）種、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、アルガリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、プチダ菌（Pseudomonas putida）、アミコラトプシス・メディテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）およびマイコバクテリウム・フレイ（Mycobacterium phlei）で記載されている。好ましい実施形態では、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼが、大腸菌（Escherichia coli）、プチダ菌（Pseudomonas putida）またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の酵素であり、より好ましくは大腸菌（E. coli）のＹｃｉＡ酵素またはインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のその密接に関連したホモログＨＩ０８２７である（Zhuang et al., Biochemistry 47 (2008), 2789-2796）。インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のＹｃｉＡ酵素は、プロピオニル−ＣｏＡのプロピオン酸への加水分解を触媒することが記載されている（Zhuang et al., Biochemistry 47 (2008), 2789-2796）。別の好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼが、プロピオニル−ＣｏＡを加水分解することが記載されているヒト（Homo sapiens）（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＮＰＪ３）の酵素である（Cao et al., Biochemistry 48 (2009), 1293-1304）。
特に好ましい酵素は、上記のインフルエンザ菌（Haemophilus influenza）菌株Ｒ２８６６（配列番号３０）のアシル−ＣｏＡヒドロラーゼＹｃｉＡ酵素およびヒト（Homo sapiens）（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９ＮＰＪ３；配列番号３１）のアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ酵素である。酵素、大腸菌（E. coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０Ａ８Ｚ０；配列番号３２）のアシル−ＣｏＡチオエステルヒドロラーゼ、大腸菌（E. coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０ＡＧＧ２；配列番号３３）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２およびプチダ菌（Pseudomonas putida）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８８ＤＲ１；配列番号３４）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＩＩも特に好ましい。この酵素はプロピオン酸の生合成について大腸菌（E. coli）でこの反応を効率的に触媒することが既に記載されているので（Tseng and Prather, P.N.A.S. 2012, 109(44),p17925-17930）、大腸菌（E. coli）Ｋ１２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０ＡＧＧ２）のチオエステラーゼＴｅｓＢが特に好ましい。
【０１２４】
別の好ましい実施形態では、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼが、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼのファミリーから得られる酵素である。１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼのこのファミリーの酵素は以下の反応を触媒することが知られている：
１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ→１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸＋ＣｏＡ
これらの酵素はしばしばＹｄｉｌチオエステラーゼとも呼ばれる。このファミリーの酵素は種々の生物で生じ、例えば大腸菌（Escherichia coli）およびサルモネラ菌（Salmonella enterica）で記載されている。
よって、本発明の３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換に特に好ましいアシル−ＣｏＡヒドロラーゼは、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼのファミリーに属する酵素、より好ましくは大腸菌（Escherichia coli）から得られる１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（配列番号８２）またはサルモネラ菌（Salmonella enterica）から得られる１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトイル−ＣｏＡヒドロラーゼ（配列番号８３）である。
【０１２５】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるアシル−ＣｏＡヒドロラーゼが、配列番号３０〜３４および配列番号８２および８３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号３０〜３４および配列番号８２および８３のいずれか１つと少なくともｘ％相同であり、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼの活性を有するアミノ酸配列を示し（ｘは３０〜１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）、このような酵素が３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への変換を触媒することができる。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１２６】
上記のように、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡのＣｏＡ基をカルボン酸に転移することができるＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）として分類される酵素を使用することによって達成することもできる。
ＣｏＡ−トランスフェラーゼは全ての系統線の生物で見られる。ＣｏＡ−トランスフェラーゼのほとんどは２つの周知の酵素ファミリー（以下でファミリーＩおよびＩＩと呼ばれる）に属し、細菌の嫌気性代謝経路で同定された第３のファミリーが存在する。様々なファミリーを記載する概説はHeider (FEBS Letters 509 (2001), 345-349)に見出すことができる。
ファミリーＩは、例えば以下のＣｏＡ−トランスフェラーゼを含む：
３−オキソ酸について：ＥＣ２．８．３．５またはＥＣ２．８．３．６に分類される酵素；
短鎖脂肪酸について：ＥＣ２．８．３．８またはＥＣ２．８．３．９に分類される酵素；
コハク酸について：スクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、すなわちＥＣ２．８．３．１８に分類される酵素（Mullins et al., Biochemistry 51(2012), 8422-34; Mullins et al., J. Bacteriol. 190 (2006), 4933-4940も参照されたい）。
ファミリーＩのほとんどの酵素は、ＣｏＡドナーとしてスクシニル−ＣｏＡまたはアセチル−ＣｏＡを自然に使用する。これらの酵素は、異なる凝集状態の２つの異なるサブユニットを含む。２つの保存されたアミノ酸配列モチーフが同定されている：
Ｐｒｏｓｉｔｅｓ項目ＰＳ０１２７３（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｓｉｔｅ／ｐｒｏｓｉｔｅ−ｓｅａｒｃｈ−ａｃ？ＰＤＯＣ００９８０）
ＣＯＡ＿ＴＲＡＮＳＦ＿１，ＰＳ０１２７３；補酵素Ａトランスフェラーゼ記号１（パターン）
コンセンサスパターン：
［ＤＮ］−［ＧＮ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＡ］（３）−Ｇ−Ｇ−Ｆ−ｘ（３）−Ｇ−ｘ−Ｐ
および
Ｐｒｏｓｉｔｅｓ項目ＰＳ０１２７３（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｓｉｔｅ／ｐｒｏｓｉｔｅ−ｓｅａｒｃｈ−ａｃ？ＰＤＯＣ００９８０）
ＣＯＡ＿ＴＲＡＮＳＦ＿２，ＰＳ０１２７４；補酵素Ａトランスフェラーゼ記号２（パターン）
コンセンサスパターン：
［ＬＦ］−［ＨＱ］−Ｓ−Ｅ−Ｎ−Ｇ−［ＬＩＶＦ］（２）−［ＧＡ］
Ｅ（グルタミン酸）は活性部位残基である。
【０１２７】
ＣｏＡ−トランスフェラーゼのファミリーＩＩは、クエン酸リアーゼ（ＥＣ２．８．３．１０）およびシトラマル酸リアーゼ（ＥＣ２．８．３．１１）のホモ二量体α−サブユニットからなる。これらの酵素は、共有結合ＣｏＡ誘導体を含むアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の移動を触媒する。このような酵素がインビトロで遊離ＣｏＡ−チオエステル、例えばクエン酸リアーゼの場合、アセチル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡ、ブチリル−ＣｏＡ（Dimroth et al., Eur. J. Biochem. 80 (1977), 479-488）、ならびにシトラマル酸リアーゼの場合、アセチル−ＣｏＡおよびスクシニルＣｏＡも受容することが示された（Dimroth et al., Eur. J. Biochem. 80 (1977), 469-477）。
【０１２８】
Ｈｅｉｄｅｒ（同所より）によると、ＣｏＡ−トランスフェラーゼのファミリーＩＩＩは、ホルミル−ＣｏＡ：シュウ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、スクシニル−ＣｏＡ：（Ｒ）−ベンジルコハク酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、（Ｅ）−シンナモイル−ＣｏＡ：（Ｒ）−フェニル酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼおよびブチロベタイニル−ＣｏＡ：（Ｒ）−カルニチンＣｏＡ−トランスフェラーゼからなる。さらなる数のファミリーＩＩＩは、クロロフレクサス・オウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）の独立栄養性ＣＯ２固定におけるその機能が、Ｌ−リンゴ酸をＣｏＡドナーとしてのスクシニルＣｏＡを有するＣｏＡチオエステルに活性化することであるスクシニル−ＣｏＡ：Ｌ−リンゴ酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼである（Friedman S. et al. J. Bacteriol. 188 (2006), 2646-2655）。このファミリーのＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、ファミリーＩおよびＩＩのアミノ酸配列と低い程度の配列同一性しか示さない。これらのＣｏＡ−トランスフェラーゼは原核生物および真核生物で生じる。
【０１２９】
好ましい実施形態では、本発明による方法に使用されるＣｏＡ−トランスフェラーゼが、本明細書上記で記載されるファミリーＩまたはＩＩに属するＣｏＡ−トランスフェラーゼである。
好ましくは、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換のために本発明による方法に使用されるＣｏＡ−トランスフェラーゼは、
−  プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）；
−  酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）；および
−  酪酸−アセト酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．９）
からなる群から選択される。
【０１３０】
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）を使用することによって達成される。酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１３１】
【化２４】
2019500022.tif 000026
この酵素は種々の細菌で生じ、例えばアナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、ユウバクテリウム・ハリイ（Eubacterium hallii）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Faecalibacterium prausnitzii）、ロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、コプロコッカス属（Coprococcus）種および大腸菌（Escherichia coli）で記載されている。
【０１３２】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、酪酸−アセト酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．９）を使用することによって達成される。酪酸−アセト酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１３３】
【化２５】
2019500022.tif 000027
この酵素は、真核生物および原核生物、例えば動物および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばウシ（Bos taurus）、クロストリジウム属（Clostridium）種および大腸菌（Escherichia coli）で記載されている。
【０１３４】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）を使用することによって達成される。プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１３５】
【化２６】
2019500022.tif 000028
この酵素は原核生物を含む種々の生物で生じ、酵素は、例えばクロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、クロストリジウム・プロピオニクム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム・プロピオニクム（Clostridium propionicum）ＪＣＭ１４３０、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）およびエメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）で記載されている。
【０１３６】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、スクシニル−ＣｏＡ：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって達成される。スクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１３７】
【化２７】
2019500022.tif 000029
この酵素は原核生物を含む種々の生物で生じ、酵素は、例えばアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、ウシ胎仔トリコモナス（Tritrichomonas foetus）、ウシ胎仔トリコモナス（Tritrichomonas foetus）ＡＴＣＣ３０９２４およびブルセイトリパノソーマ（Trypanosoma brucei）で記載されている。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への直接変換が、メガスフェラ属（Megasphaera）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｓ７ＨＦＲ５）から得られるＣｏＡ−トランスフェラーゼ、本明細書上記で定義されるＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）に属する酵素を使用することによって達成される。
好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるＣｏＡ−トランスフェラーゼが、メガスフェラ属（Megasphaera）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｓ７ＨＦＲ５；配列番号８４）から得られるＣｏＡ−トランスフェラーゼである。
本発明の好ましい実施形態では、ＣｏＡ−トランスフェラーゼが、配列番号８４のアミノ酸配列または配列番号８４と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１３９】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換：上記ステップＶＩの代替経路
別の好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への変換が、最初に３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルブチリル−ＣｏＡに酵素的に変換し、次いで、これを３−メチル酪酸に酵素的に変換し、次いで最終的に、これを３−メチルクロトン酸に変換する代替経路によって達成される。３−メチルブチリル−ＣｏＡおよび３−メチル酪酸を介した３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸へのこの代替変換を図３２に模式的に示す。
【０１４０】
したがって、本発明は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルブチリル−ＣｏＡに酵素的に変換し、次いで、これを３−メチル酪酸に酵素的に変換し、次いでこれを３−メチルクロトン酸に変換し、次いでこれを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０１４１】
第１の酵素的変換、すなわち、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換は不飽和化反応、すなわち、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの二重結合Ｃ＝Ｃの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの還元である。３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの酵素的変換、すなわち、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの二重結合の還元は、例えばＥＣ１．３．＿．＿として分類される酵素を使用することによって達成することができる。ＥＣ１．３．＿．＿として分類される酵素は、ドナー分子のＣＨ−ＣＨ基に作用するオキシドレダクターゼである。このサブクラスは、２個の炭素原子間の炭素−炭素単結合の炭素−炭素二重結合への変換を可逆的に触媒する酵素を含む。ＥＣ１．３のサブクラスはアクセプターに応じて分類される。１つの好ましい実施形態では、酵素が、ＥＣ１．３．＿．＿として分類され、補助因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する酵素である。１つの特に好ましい実施形態では、酵素が補助因子としてＮＡＤＰＨを使用する酵素である。好ましい実施形態では、酵素が、
−  アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ１．３．１．８）；
−  エノイル−［アシルキャリアタンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｓｉ特異的）（ＥＣ１．３．１．１０）；
−  シス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ１．３．１．３７）；
−  トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ１．３．１．３８）；
−  エノイル−［アシルキャリアタンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｒｅ特異的）（ＥＣ１．３．１．３９）；および
−  クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８６）
からなる群から選択される。
【０１４２】
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換が、アシルＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ１．３．１．８）を使用することによって達成される。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１４３】
【化２８】
2019500022.tif 000030
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばウシ（Bos taurus）、ドブネズミ（Rattus novegicus）、マウス（Mus musculus）、ハト（Columba）種、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）、アリウム・アンペロプラスム（Allium ampeloprasum）、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ストレプトコッカス・コリヌス（Streptococcus collinus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）で記載されている。
【０１４４】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換が、エノイル−［アシルキャリアタンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｓｉ特異的）（ＥＣ１．３．１．１０）を使用することによって達成される。エノイル−［アシルキャリアタンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｓｉ特異的）は以下の反応を触媒する酵素である：
【０１４５】
【化２９】
2019500022.tif 000031
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばベニバナ（Carthamus tinctorius）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ストレプトコッカス・コリヌス（Streptococcus collinus）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、セレウス菌（Bacillus cereus）、ジンジバリス菌（Porphyromonas gingivalis）、大腸菌（Escherichia coli）およびサルモネラ菌（Salmonella enterica）で記載されている。
【０１４６】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換が、シス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ１．３．１．３７）を使用することによって達成される。シス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）は以下の反応を触媒する酵素である：
【０１４７】
【化３０】
2019500022.tif 000032
この酵素は大腸菌（Escherichia coli）で生じることが記載されている。
【０１４８】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換が、トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）（ＥＣ１．３．１．３８）を使用することによって達成される。トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）は以下の反応を触媒する酵素である：
【０１４９】
【化３１】
2019500022.tif 000033
この酵素は、真核生物および原核生物、例えば植物、動物および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばヒト（Homo sapiens）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、マウス（Mus musculus）、モルモット（Cavia porcellus）、線虫（Caenorhabditis elegans）、ファレノプシス・アマビリス（Phalaenopsis amabilis）、ワタ（Gossypium hirsutum）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス・コリヌス（Streptococcus collinus）および大腸菌（Escherichia coli）で記載されている。
【０１５０】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換が、エノイル−［アシルキャリアタンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｒｅ特異的）（ＥＣ１．３．１．３９）を使用することによって達成される。エノイル−［アシルキャリアタンパク質］レダクターゼ（ＮＡＤＰＨ、Ｒｅ特異的）は以下の反応を触媒する酵素である：
【０１５１】
【化３２】
2019500022.tif 000034
この酵素は真核生物および原核生物、例えば動物および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばニワトリ（Gallus gallus）、ハト（Pigeon）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、モルモット（Cavia porcellus）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびジンジバリス菌（Porphyromonas gingivalis）で記載されている。
【０１５２】
さらに好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルブチリル−ＣｏＡへの変換が、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．８６）を使用することによって達成される。クロトニル−ＣｏＡレダクターゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１５３】
【化３３】
2019500022.tif 000035
この酵素は真核生物および原核生物、例えば動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばウシ（Bos taurus）、サリノスポラ・トロピカ（Salinospora tropica）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、ストレプトマイセス・コリヌス（Streptomyces collinus）、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）およびストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）で記載されている。
【０１５４】
第２の酵素的変換、すなわち３−メチルブチリル−ＣｏＡの３−メチル酪酸への変換は、様々な酵素的変換によって達成することができる。１つの可能性は、加水分解反応を介した直接変換である。別の可能性はＣｏＡ−トランスフェラーゼによって触媒される反応を介した直接変換であり、第３の可能性は３−メチルブチリルリン酸エステルを介した二段階変換である。
よって、本発明によると、３−メチルブチリル−ＣｏＡの３−メチル酪酸への酵素的変換は、
（ａ）好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって、３−メチルブチリル−ＣｏＡを３−メチル酪酸に直接変換する単一酵素反応；
（ｂ）好ましくはチオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を使用することによって、３−メチルブチリル−ＣｏＡを３−メチル酪酸に直接変換する単一酵素反応；または
（ｃ）（ｉ）最初に３−メチルブチリル−ＣｏＡを３−メチルブチリルリン酸エステルに酵素的に変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られた３−メチルブチリルリン酸エステルを前記３−メチル酪酸に酵素的に変換するステップと
を含む２つの酵素ステップ
によって達成され得る。
【０１５５】
ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）、チオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）、３−メチルブチリル−ＣｏＡを３−メチルブチリルリン酸エステルに変換することができる酵素および３−メチルブチリルリン酸エステルを前記３−メチル酪酸に変換することができる酵素についての好ましい実施形態に関して、本発明によるステップＶＩａ、ステップＶＩｂおよびステップＶＩｃの酵素的変換に関して上記と同じものを適用する。
【０１５６】
第３の酵素的変換、すなわち３−メチル酪酸の３−メチルクロトン酸への変換は、例えば２−エン酸レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．３１）によって達成することができる。２−エン酸レダクターゼは自然に以下の反応を触媒する酵素である：
【０１５７】
【化３４】
2019500022.tif 000036
この酵素は真核生物および原核生物、例えば動物、真菌および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばチコリー（Cichorium intybus）、ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）、トマト（Solanum lycopersicum）、アブシディア・グラウカ（Absidia glauca）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ロドスポリデウム属（Rhodosporidium）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、クロストリジウム・クライベリ（Clostridium kluyveri）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、クロストリジウム・ゴニー（Clostridium ghonii）、クロストリジウム・マンゲノティ（Clostridium mangenotii）、クロストリジウム・オセアニクム（Clostridium oceanicum）、クロストリジウム・ソルデリ（Clostridium sordellii）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム・スティックランディ（Clostridium sticklandii）、クロストリジウム・チロブチリカム（Clostridium tyrobutyricum）、アクロモバクター属（Achromobacter）種、バークホルデリア属（Burkholderia）種、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、カゼイ菌（Lactobacillus casei）、プチダ菌（Pseudomonas putida）、シュワネラ属（Shewanella）種、エルシニア・ベルコビエリ（Yersinia bercovieri）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ムーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）およびペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Peptostreptococcus anaerobius）で記載されている。クロストリジウム（Clostridiae）のエン酸レダクターゼは、例えばTischler et al. (Eur. J. Bioche. 97 (1979), 103-112)に記載されている。
【０１５８】
３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＶＩＩ
上記の方法のいずれかにより、本発明の方法により３−メチルクロトン酸に変換される（さらに上記の方法のいずれかにより、本発明の方法によりイソブテンにさらに変換される）３−メチルクロトニル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわち３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって提供され得る。３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を図１２に模式的に示す。
【０１５９】
したがって、本発明は、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチルクロトン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０１６０】
３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換は、様々な酵素によって触媒され得る。本発明によると、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの前記３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換は、好ましくは（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）を使用する（図１のステップＶＩＩに示されるように）。
【０１６１】
メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）およびゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）ならびにこれらの酵素クラスの好ましい酵素は既に上記されている。したがって、これらの酵素に関して、上記と同じものを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換に適用する。
【０１６２】
別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換が、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、例えばｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）の３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼによって触媒される。この遺伝子は２つのサブユニットＡｉｂＡおよびＡｉｂＢを有する酵素をコードする（Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1304-1308）。
この酵素は、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換の文脈でミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）から得られるメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼとして既に上記されている。
２つのサブユニットＡｉｂＡおよびＡｉｂＢを有するｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）から得られる同じ酵素（Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1304-1308）は、配列番号１００および１０１を参照して上記されており、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換にも使用することができる。
本発明の好ましい実施形態では、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼが、配列番号１００のアミノ酸配列または配列番号１００と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。本発明の別の好ましい実施形態では、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼが、配列番号１０１のアミノ酸配列または配列番号１０１と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
本発明の別の好ましい実施形態では、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼが、配列番号１００および１０１のアミノ酸配列の組み合わせまたは配列番号１００および１０１と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有するヘテロ二量体酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１６３】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＶＩＩＩ
３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換される３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわち３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって提供され得る；図１３を参照されたい。
【０１６４】
したがって、本発明はまた、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチルクロトン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０１６５】
本発明によると、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換は、自然に起こり、例えば、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）として分類される酵素によって触媒される酵素脱水反応である。したがって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換は、好ましくは３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）を使用する（図１のステップＶＩＩＩに示されるように）。
３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼは以下の反応を触媒する酵素である：
【０１６６】
【化３５】
2019500022.tif 000037
この酵素は真核生物および原核生物、例えば植物、動物および細菌を含む種々の生物で生じる。酵素は、例えばニチニチソウ（Catharanthus roseus）、ヒト（Homo sapiens）、ウシ（Bos taurus）、ヒツジ（Ovis aries）、アシネトバクター属（Acinetobacter）種、ミキソコッカス属（Myxococcus）種およびプチダ菌（Pseudomonas putida）で記載されている。好ましい実施形態では、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼが、ミキソコッカス属（Myxococcus）種の酵素であり、さらにより好ましくは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するまたは配列番号３５と少なくともｘ％相同であり、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼの活性を有するアミノ酸配列を示し（ｘは３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）、本明細書上記で示されるように３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換することができる酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１６７】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの変換はまた、例えばミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）で同定されており、ｌｉｕＣ遺伝子によってコードされる３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａデヒドラターゼ活性を使用することによって達成することもできる（Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), 1304-1308）。ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）から得られる３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素ＡデヒドラターゼはＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１Ｄ５Ｙ４を有する。
よって、好ましい実施形態では、本発明の方法に使用される３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａデヒドラターゼが、ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）から得られる酵素（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号１Ｄ５Ｙ４；配列番号９８）である。
本発明の好ましい実施形態では、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａデヒドラターゼが、配列番号９８のアミノ酸配列または配列番号９８と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１６８】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換はまた、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒトラターゼまたはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼを使用することによって達成することもできる。３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒトラターゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは同じ反応を触媒するが、これらの酵素の一方の名称は対応する反応の一方向を示し、他方の名称は逆反応を示す。反応が可逆的であるので、両方の酵素の名称を使用することができる。
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼはＥＣ４．２．１．−として分類される酵素に属する。
３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒトラターゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼは、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）種、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanii）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｄ５ＹＤＤ４）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＨＺＶ７）、マリノバクター・サントリニエンシス（Marinobacter santoriniensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｍ７ＣＶ６３）、シュードモナス・ナックムッシイ（Pseudomonas knackmussii）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｌ８ＭＱＴ６）、シュードモナス・フレキシビリス（Pseudomonas flexibilis）およびアルカニボラックス・ディセロレイ（Alcanivorax dieselolei）ならびにトウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ４ＰＥＮ０）、バチルス属（Bacillus）種ＧｅＤ１０（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｎ１ＬＷＧ２）およびラビリスリックス・ルテオラ（Labilithrix luteola）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｋ１ＰＮ１９）で同定されている。
【０１６９】
好ましい実施形態では、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換するために本発明の方法に使用される３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒトラターゼ／エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが、シュードモナス属（Pseudomonas）種（配列番号８５）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumanii）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｄ５ＹＤＤ４；配列番号８６）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＨＺＶ７；配列番号８７）、マリノバクター・サントリニエンシス（Marinobacter santoriniensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＨＺＶ７；配列番号８８）、シュードモナス・ナックムッシイ（Pseudomonas knackmussii）（配列番号８９）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｌ８ＭＱＴ６；配列番号９０）、シュードモナス・フレキシビリス（Pseudomonas flexibilis）（配列番号９１）、アルカニボラックス・ディセロレイ（Alcanivorax dieselolei）（配列番号９２）、トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ４ＰＥＮ０；配列番号９５）、バチルス属（Bacillus）種ＧｅＤ１０（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｎ１ＬＷＧ２；配列番号９６）またはラビリスリックス・ルテオラ（Labilithrix luteola）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ０Ａ０Ｋ１ＰＮ１９；配列番号９７）から得られる酵素である。
本発明の好ましい実施形態では、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒトラターゼ／エノイル−ＣｏＡヒドラターゼが、配列番号８５〜９２および配列番号９５〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号８５〜９２および配列番号９５〜９７のいずれかと少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１７０】
アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＩＸ
３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換される３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ自体は、酵素的変換、すなわちアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって提供され得る；図１４を参照されたい。
【０１７１】
したがって、本発明はまた、アセトアセチル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初にアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに縮合し、次いで、これを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチルクロトン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
本発明によると、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合は、好ましくは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼを使用する（図１のステップＩＸ参照）。
【０１７２】
アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡの縮合は、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼとも呼ばれる）によって自然に触媒される反応である。よって、好ましくは、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの縮合は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼとも呼ばれる）を使用する。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼはＥＣ２．３．３．１０に分類される（以前は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼはＥＣ４．１．３．５として分類されていたが、ＥＣ２．３．３．１０に移された）。「ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ」という用語は、アセチル−ＣｏＡがアセトアセチル−ＣｏＡと縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する反応を触媒することができる任意の酵素を指す（図１４参照）。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼはメバロン酸経路の一部である。イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の合成について、２つの経路、すなわちメバロン酸経路とグリセルアルデヒド３−リン酸−ピルビン酸経路が同定されている。ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは、アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡの生物学的クライゼン縮合を触媒し、β−ケトチオラーゼ、脂肪酸シンターゼ（β−ケトアシルキャリアタンパク質シンターゼ）およびポリケチドシンターゼを含むアシル縮合酵素のスーパーファミリーのメンバーである。
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは種々の生物について記載されている。多数の供給源からのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするアミノ酸および核酸配列も入手可能である。一般的に、これらの配列は低い程度の全体配列同一性を共有するにすぎない。例えば、ブドウ球菌属（Staphylococcus）または連鎖球菌属（Streptococcus）の酵素はヒトおよびトリのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼとわずか約２０％の同一性しか示さない。いくつかの情報源では、細菌ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼおよびその動物の対応物がわずか約１０％の全体配列同一性しか示さないことが報告されている（Sutherlin et al., J. Bacteriol. 184 (2002), 4065-4070）。しかしながら、アセチル化および縮合反応に関与するアミノ酸残基は細菌および真核生物ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ間で保存されている（Campobasso et al., J. Biol. Chem. 279 (2004), 44883-44888）。３つのＨＭＧ−シンターゼ酵素の三次元構造が決定され、酵素反応にとって重大なアミノ酸が原則としてよく特徴付けられている（Campobasso et al., loc. cit.; Chun et al., J. Biol.Chem. 275 (2000), 17946-17953; Nagegowda et al., Biochem. J. 383 (2004), 517-527; Hegardt, Biochem. J. 338 (1999), 569-582）。真核生物では、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの２つの形態、すなわち、サイトゾル型とミトコンドリア型が存在する。サイトゾル型は、コレステロールおよび他のイソプレノイドの産生において重要な役割を果たし、ミトコンドリア型はケトン体の産生に関与する。
原則として、特に原核生物または真核生物の、任意のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ酵素を本発明の文脈で使用することができる。
原核生物ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（Campobasso et al., loc. cit.；Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ８７）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ７６）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ８２）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）（Sutherlin et al., loc. cit.；Ｕｎｉｒｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ７１；配列番号９９）、フェシウム菌（Enterococcus faecium）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ６６）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ５６）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＦＤ６１）およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（受託番号ＡＥ０００８５７）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）（ＮＣＢＩ受託番号ＢＢ０６８３）で記載されている。さらなるＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは、例えば国際公開第２０１１／０３２９３４号パンフレットに記載されている。好ましいＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼは分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ５４８７４）の酵素である。特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼが、配列番号３６もしくは配列番号９９に示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号３６もしくは配列番号９９と少なくともｘ％相同であり、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を有するアミノ酸配列を示し（ｘは３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）、このような酵素がアセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの縮合を触媒することができる。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１７３】
アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶ
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換される、またはアセト酢酸に変換されるアセトアセチル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわちアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換によって提供され得る。
本発明によると、アセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの変換は様々な経路によって達成することができる。１つの可能性は、最初にアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換し（図１に示されるステップＸＩＶ）、次いで、前記マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡにさらに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことである。別の可能性は、単一酵素反応で２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことである。これらの反応をそれぞれ図１５（ステップＸＩＩＩ）、図１６（ステップＸＩＶ）および図１７（ステップＸＶ）に模式的に示す。
【０１７４】
よって、本発明はまた、アセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初にアセチル−ＣｏＡを上記の経路のいずれかによってアセトアセチル−ＣｏＡに変換し、次いで、これをアセチル−ＣｏＡと縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡにし、次いで、これを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これをメチルクロトン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
さらに、本発明はまた、アセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初にアセチル−ＣｏＡを上記の経路のいずれかによってアセトアセチル−ＣｏＡに変換し、次いで、これをアセト酢酸に変換し、次いで、これをアセトンに変換し、次いで、これをアセチル−ＣｏＡと縮合して３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にし、次いで、これを本明細書上記で記載されるように３−メチルクロトン酸に変換する方法に関する。さらに、次いで、前記３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに変換する。
【０１７５】
本発明によると、アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの酵素的変換は、好ましくはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）を使用する（図１に示されるステップＸＩＶ）。この自然に起こる反応は、ＡＴＰを利用してＣＯ２をアセチル−ＣｏＡ上に固定して、マロニル−ＣｏＡをもたらす。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）として分類される酵素は以下の反応を触媒する：
アセチル−ＣｏＡ＋ＡＴＰ＋ＣＯ２→マロニル−ＣｏＡ＋ＡＤＰ
【０１７６】
さらに、本発明によると、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換は、好ましくはアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）を使用する（図１に示されるステップＸＶ）。これは自然に起こる反応であり、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを脱炭酸反応で縮合する。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）として分類される酵素は、以下の反応によりアセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換を触媒する。
アセチル−ＣｏＡ＋マロニル−ＣｏＡ→アセトアセチル−ＣｏＡ＋ＣｏＡ＋ＣＯ２
この反応は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）と呼ばれる酵素によって触媒される。この酵素をコードする遺伝子は、土壌単離グラム陽性ストレプトマイセス属（Streptomyces）種菌株ＣＬ１９０でテルペノイド産生のためのメバロン酸経路遺伝子クラスターで同定された（Okamura et al., PNAS USA 107 (2010), 11265-11270, 2010）。さらに、アセトアセチル−ＣｏＡ産生のためのこの酵素を使用する生合成経路が近年大腸菌（E. coli）で開発された（Matsumoto K et al., Biosci. Biotechnol. Biochem, 75 (2011), 364-366）。
【０１７７】
あるいは、アセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換は、２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接変換する単一酵素反応からなる。好ましくは、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を使用することによって達成される。
よって、アセトアセチル−ＣｏＡを、例えば国際公開第２０１３／０５７１９４号パンフレットに記載されるようにアセチル−ＣｏＡから製造することができる。そのため、本発明によると、アセチル−ＣｏＡを、例えば以下の反応によってアセトアセチル−ＣｏＡに変換することができる：
【０１７８】
【化３６】
2019500022.tif 000038
この反応は、自然に起こる反応であり、ＥＣ２．３．１．９として分類されるアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素によって触媒される。このクラスに属し、２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡおよびＣｏＡへの上記の変換を触媒する酵素は、全ての界の生物、すなわち植物、動物、真菌、細菌等で生じ、文献に広く記載されている。このような酵素についてのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、種々の生物、例えばヒト（Homo sapiens）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）およびカンジダ（Candida）について決定されており、名称は単なる例示である。原則として、任意のアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を本発明の文脈で使用することができる。１つの好ましい実施形態では、酵素がクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４５３５９）のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼである。特に好ましい実施形態では、本発明の方法に使用されるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼが、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有する、または配列番号３７と少なくともｘ％相同であり、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの活性を有するアミノ酸配列を示し（ｘは３０〜１００の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）、このような酵素が本明細書上記で示されるようにアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換することができる。
配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０１７９】
本発明の経路で生じる代謝産物の酵素再利用：図１に示されるステップＸａ、Ｘｂ、ＸＩおよびＸＩＩ
アセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造するための本発明の上記の方法は、図１８のステップＸａ、ステップＸｂ、ステップＸＩおよびステップＸＩＩに示される以下の反応の１つまたは複数を補うことができる。
これらのステップは、イソブテンを製造するための上記の方法のいずれかと同時に起こり得る代替生物変換に関する。
よって、本発明は、３−メチルクロトン酸（またはアセチル−ＣｏＡからイソブテンへの記載される経路中の上記の中間体のいずれか）からイソブテンを製造するための上記の方法のいずれかであって、さらに
ａ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを転移して、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得る（図１９に模式的に示されるステップＸａ）；および／または
ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２０に模式的に示されるステップＸｂ）；および／または
ｃ）３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２１に模式的に示されるステップＸＩ）；および／または
ｄ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２２に模式的に示されるステップＸＩＩ）
方法に関する。
【０１８０】
以下でさらに詳細に記載され、イソブテンを製造するための上記の方法のいずれかと同時に起こり得るこれらの反応は、いくつかの理由で有益である。第１に、エノイル−ＣｏＡ（例えば、３−メチルクロトニル−ＣｏＡなど）の水和が水性媒体中のインビボでの好ましい反応であることが知られている。したがって、上記の反応は、経路「漏出」の場合でさえ、イソブテンの前駆体、すなわち３−メチルクロトン酸に向かう代謝流量を３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）および／または３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの方向で駆動することを許す可能性を表す。第２に、上記変換は、有益なことに、チオエステル基の移動を介したチオエステルＣｏＡ結合中のエネルギーの保存を伴う。
【０１８１】
図１８のステップＸａに示されるように、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換と、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）へのＣｏＡの移動により３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得ること
よって、第１の態様では、イソブテンに変換される３−メチルクロトン酸が、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを転移して、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得る酵素反応によって提供され得る（図１８に示されるステップＸａ）。この反応を図１９に模式的に示す。
【０１８２】
よって、本発明はまた、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）からイソブテンを製造する方法であって、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを転移して、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得る方法に関する。さらに、次いで、こうして製造された３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに酵素的に変換する。
【０１８３】
さらに、本発明はまた、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）および３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−メチルクロトン酸および３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを製造する方法であって、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを転移して、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得る方法に関する。
【０１８４】
本発明によると、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを転移して、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得る、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）および３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸および３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの変換は、好ましくは３−メチルクロトニル−ＣｏＡのＣｏＡ基をカルボン酸、すなわち３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に転移することができるＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）として分類される酵素を使用する。
ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）ならびにこの酵素クラスの好ましい酵素は既に上記されている。したがって、これらの酵素に関して、上記と同じものを、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）および３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸および３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの変換に適用する。
好ましくは、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換と、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）へのＣｏＡの移動によって、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得ることにおいて本発明による方法に使用されるＣｏＡ−トランスフェラーゼは、
−  プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）；
−  酢酸ＣｏＡ−トランスフェターゼ（ＥＣ２．８．３．８）；および
−  酪酸−アセト酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．９）
からなる群から選択されるＣｏＡ−トランスフェラーゼである。
プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェターゼ（ＥＣ２．８．３．８）および酪酸−アセト酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．９）ならびにこれらの酵素クラスの好ましい酵素は既に上記されている。したがって、これらの酵素に関して、上記と同じものを、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）および３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸および３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの変換に適用する。
【０１８５】
図１８のステップＸｂに示される３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換
上記の方法（ステップＸａ）に加えてまたはその代わりに、３−ヒドロキシイソ吉草酸の前記３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換によって、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを提供することもできる（図１８に示されるステップＸｂ）。この反応では、３−ヒドロキシイソ吉草酸がアシル−ＣｏＡと反応して３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡおよび酸をもたらす。この反応を図１９に模式的に示す。
好ましくは、前記アシル−ＣｏＡはアセチル−ＣｏＡである。
【０１８６】
よって、本発明はまた、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）から３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを製造する方法であって、３−ヒドロキシイソ吉草酸がアシル−ＣｏＡ、好ましくはアセチル−ＣｏＡと反応して３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡおよびそれぞれの酸をもたらす方法に関する。
【０１８７】
好ましくは、この変換は、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）として分類される酵素を使用することによって達成される。ステップＸｂの文脈における前記ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）の好ましい実施形態に関して、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換と、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）へのＣｏＡの移動によって３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを得る（図１８に示されるステップＸａ）ことにおいてＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）に関して上記と同じものを必要な変更を加えて適用する。
【０１８８】
図１８のステップＸＩに示される３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換
上記の方法（ステップＶＩＩ）に加えてまたはその代わりに、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１８に示されるステップＸＩ）酵素反応によって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを提供することができる。この可逆的反応は、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに脱水する脱水反応であり、これを図２１に模式的に示す。
よって、本発明はまた、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換し、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを上記の方法のいずれかにより３−メチルクロトン酸にさらに酵素的に変換する方法に関する。さらに、次いで、こうして製造された３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに酵素的に変換する。
【０１８９】
本発明によると、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換は、好ましくは
（ｉ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）；
（ｉｉ）長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．７４）；
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１１６）；
（ｉｖ）３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒトラターゼ（ＥＣ４．２．１．５５）；
（ｖ）３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアタンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５９）；
（ｖｉ）クロトニル−［アシルキャリアタンパク質］ヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．５８）；
（ｖｉｉ）３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアタンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．６０）；
（ｖｉｉｉ）３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアタンパク質］デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．６１）；または
（ｉｘ）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）
を使用する。
【０１９０】
本発明による方法の好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換が、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）を使用することによって達成される。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）ならびにこの酵素クラスの好ましい酵素は既に上記されている。したがって、これらの酵素に関して、上記と同じものを３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換に適用する。
【０１９１】
本発明による方法の別の好ましい実施形態では、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換が、長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．７４）を使用することによって達成される。長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．７４）は以下の反応を触媒する：
【０１９２】
【化３７】
2019500022.tif 000039
この酵素は、リアーゼ、具体的には炭素−酸素結合を切断するヒドロリアーゼのファミリーに属する。この酵素クラスの系統名は長鎖−（３Ｓ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡヒドロリアーゼである。この酵素は長鎖エノイル補酵素Ａヒドラターゼとも呼ばれ、ミトコンドリアにおける脂肪酸伸長および脂肪酸代謝に関与する。この酵素はいくつかの生物、例えばドブネズミ（Rattus norvegicus）（Wu et al., Org. Lett. 10 (2008), 2235-2238）、イノシシ（Sus scrofa）およびモルモット（Cavia porcellus）（Fong and Schulz, J. Biol. Chem. 252 (1977), 542-547; Schulz, Biol. Chem. 249 (1974), 2704-2709）で生じ、原則として、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの変換を触媒することができる任意の長鎖エノイル−ＣｏＡヒドラターゼを本発明の方法に使用することができる。
【０１９３】
図１８のステップＸＩＩに示される３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換
上記の方法（ステップＸａまたはステップＸｂ）に加えてまたはその代わりに、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の前記３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換（図１８に示されるステップＸＩＩ）によって、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを提供することもできる。補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）が固定されるこの一般的な反応を図２２に模式的に示す。
【０１９４】
よって、本発明はまた、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）からイソブテンを製造する方法であって、最初に３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに変換し、次いで、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換し、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを上記の方法のいずれかにより３−メチルクロトン酸にさらに酵素的に変換する方法に関する。さらに、次いで、こうして製造された３−メチルクロトン酸を本明細書上記で記載されるようにイソブテンに酵素的に変換する。
【０１９５】
さらに、本発明はまた、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）から３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを製造する方法に関する。
【０１９６】
本発明によると、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換は、好ましくは炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ（ＥＣ６．２．１．−）のファミリーに属する酵素を使用する。補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）が固定される３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換の一般的な反応は、２つの代替機構を介して、炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ（ＥＣ６．２．１．−）のファミリーに属する酵素によって触媒され得る。第１の代替反応では、図２３に模式的に示されるように、補酵素Ａが固定される前に、アシル−ＡＭＰが中間体として産生される。第２の代替反応では、図２４に模式的に示されるように、補酵素Ａが固定される前に、アシルリン酸が中間体として産生される。
【０１９７】
補酵素Ａが固定された補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）となる前に、アシル−ＡＭＰ中間体（すなわち、アシルアデニル酸中間体３−ヒドロキシイソバレリル−アデノシン一リン酸）が産生され、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる、炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ（ＥＣ６．２．１．−）のファミリーに属する酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（ＩｎｔｅｒＰｒｏ４４．０；リリース２０１３年９月２５日）において、ＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ０２０８４５、ＡＭＰが結合する、保存された部位 （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ０２０８４５）およびＩＰＲ０００８７３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩＰＲ０００８７３）として言及される共通の構造モチーフを共有する。Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素の受託番号はＰＦ００５０１である。
【０１９８】
第１の代替反応（図２３に模式的に示されるように補酵素Ａが固定される前にアシル−ＡＭＰが中間体として産生される）に関して、補酵素Ａが固定された補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）となる前に、アシル−ＡＭＰ中間体（すなわち、アシルアデニル酸中間体３−ヒドロキシイソバレリル−アデノシン一リン酸）が産生され、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる、炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ（ＥＣ６．２．１．−）の上記ファミリーに属し、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）から３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを製造する方法に使用され得る酵素の例を以下の表Ａに要約する：
【０１９９】
【表１】
2019500022.tif 000040
【０２００】
好ましい実施形態では、アシルアデニル酸中間体を介した３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換を、例えばブタン酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．２）を使用することによって達成することができる。
ブタン酸：ＣｏＡリガーゼは以下の反応を触媒する酵素である：
ＡＴＰ＋カルボン酸＋ＣｏＡ→ＡＭＰ＋二リン酸＋アシル−ＣｏＡ
これらの酵素はブタン酸代謝に関与する。これらの酵素の出現は、原核生物および真核生物、特に細菌、藻類、真菌、植物および動物を含む多数の生物について、例えばメタノバクテリウム・フォルミクム（Methanobacterium formicum）、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、パエシロマイセス・バリオッティ（Paecilomyces variotii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、キイロタマホコリカビ（Dictyostelium discoideum）、モルモット（Cavia porcellus）、ヒツジ（Ovis aries）、イノシシ（Sus scrofa）、ウシ（Bos taurus）、マウス（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）およびヒト（Homo sapiens）について記載されている。
【０２０１】
好ましい実施形態では、アシルアデニル酸中間体を介した３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの酵素的変換が、メタノバクテリウム・フォルミクム（Methanobacterium formicum）から得られるブタン酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）（ＥＣ６．２．１．２）を使用することによって達成される。前記タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７７に示す。
本発明の好ましい実施形態では、ブタン酸：ＣｏＡリガーゼ（ＡＭＰ形成）が、配列番号７７のアミノ酸配列または配列番号７７と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０２０２】
第２の代替反応（図２４に模式的に示されるように補酵素Ａが固定される前にアシルリン酸が中間体として産生される）に関して、補酵素Ａが固定された補酵素Ａ（ＣｏＡＳＨ）となる前に、アシルリン酸中間体（すなわち、アシルリン酸中間体３−ヒドロキシイソバレリルリン酸）が産生され、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる、炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ（ＥＣ６．２．１．−）の上記ファミリーに属し、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）から３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを製造する方法に使用され得る酵素の例を以下の表Ｂに要約する：
【０２０３】
【表２】
2019500022.tif 000041
【０２０４】
３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡおよび３−メチル−３−ブテン酸を介したアセチルＣｏＡからイソブテンへの酵素的変換の代替経路
上記の代替として、本発明はまた、同様に図１に示される代替経路を介したイソブテンを製造する方法であって、３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換によってイソブテンを製造する方法に関する。よって、本発明は、３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を含む、イソブテンを製造する方法を提供する。好ましくは、３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換が、３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成される。
【０２０５】
この代替経路によると、本発明は、３−メチル−３−ブテン酸からイソブテンを製造する方法のみに関するわけではない。むしろ、以下でさらに詳細に概説されるように、この変換は、好ましくは多くの生化学反応に使用される中心成分および代謝における重要な鍵分子であるアセチル−ＣｏＡから始まるイソブテンを製造するための経路に組み込まれている。
【０２０６】
そのため、本発明はまた、２個のアセチル−ＣｏＡ分子をアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に縮合する、アセチル−ＣｏＡから始まる経路に関する。あるいは、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに酵素的に変換し、次いで、これを、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって前記アセトアセチル−ＣｏＡに変換することができる。
さらに、こうして製造されたアセトアセチル−ＣｏＡを、以下の手短に要約される経路を介して、３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（次いで、これを最終的に、イソブテンに変換する）ことができる。
この経路では、こうして製造されたアセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡにさらに酵素的に変換することができる。さらに、こうして製造された３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡにさらに酵素的に変換することができる。さらに、こうして製造された３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる。さらに、こうして製造された３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを、その後の酵素反応で、３−メチル−３−ブテン酸にさらに変換することができる（次いで、最終的にこれを上記および下記のようにイソブテンに変換することができる）。
【０２０７】
３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換：図１に示されるステップＸＶＩ
本発明によると、３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を脱炭酸によって達成することができる。「脱炭酸」は一般的に、カルボキシル基を除去し、二酸化炭素（ＣＯ２）を放出する化学反応である；図２５を参照されたい。
【０２０８】
３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換は、好ましくは３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成することができる。本発明によると、３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼは、３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに変換することができる酵素である。
好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
からなる群から選択される。
【０２０９】
他の好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼが、６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）からなる群から選択される。
【０２１０】
上記の実施形態に関して、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）、プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）、６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）について、本発明の他の方法に関連して上記と同じものを適用する。
【０２１１】
３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換：図１に示されるステップＸＶＩＩａ、ＸＶＩＩｂまたはＸＶＩＩｃ
３−メチル−３−ブテン酸自体は、酵素反応、すなわち３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換によって提供され得る；図２６を参照されたい。
【０２１２】
したがって、本発明は、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０２１３】
本発明によると、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への変換は、例えば３つの異なる代替酵素経路、すなわち：
（ａ）好ましくはＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に直接変換する単一酵素反応（図２７参照）；
（ｂ）好ましくはチオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に直接変換する単一酵素反応（図２８参照）；または
（ｃ）（ｉ）最初に好ましくはリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）を使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルに酵素的に変換するステップと；
（ｉｉ）次いで好ましくはアクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．２．−）、好ましくはプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）を使用することによって、こうして得られた３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルを前記３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換するステップと
を含む２つの酵素ステップ（図２９参照）
によって達成することができる。
【０２１４】
上記実施形態に関して、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、プロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）、スクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）、チオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、アセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）、アクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．２．−）、プロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）および分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）について、本発明の他の方法に関連して上記と同じものを適用する。
【０２１５】
３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＸＶＩＩＩ
３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわち３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの酵素的変換によって提供され得る；図３０を参照されたい。
【０２１６】
したがって、本発明は、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
さらに、本発明は、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを製造する方法に関する。
本発明によると、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの変換は、好ましくは
（ａ）（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）、
（ｂ）リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）多機能性タンパク質のＣｕｒＦのＮ末端ドメインまたは３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、好ましくはｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）の３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；または
（ｃ）４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼファミリーの酵素
を使用することによって達成することができる。
【０２１７】
上記の実施形態に関して、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）および３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、好ましくはｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）の３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼについて、本発明の他の方法に関連して上記と同じものを適用する。
【０２１８】
好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの変換が、リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）多機能性タンパク質のＣｕｒＦのＮ末端ドメインによって触媒される。リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）多機能性タンパク質のＣｕｒＦのＮ末端ドメインは、リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）のＣｕｒＦ多機能性タンパク質のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）／非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）のドメインである。ＣｕｒＦのこのＮ末端ドメインは、結晶構造の研究によりクロトナーゼスーパーファミリーに属するタンパク質として分類されており、これは自然に３−メチルグルタコニル−ＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質）の３−メチル−クロトニル−ＡＣＰへの脱炭酸を触媒する。ＡＣＰとＣｏＡの両分子は共通のホスホパンテテイン部分を有するので（図３１に示されるように）、ＡＣＰはＣｏＡに類似である。さらに、ＡＣＰとＣｏＡの両方が生物学的酸とチオエステルを形成することができる（J. Biol. Chem. 289: 35957-35963 (2007) and Chemistry & Biology 11:817-833 (2004)）。
【０２１９】
別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの変換が、４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼファミリー（ＥＣ４．１．１．７７）の酵素によって触媒される。
【０２２０】
４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）は以下の反応を触媒する：
【０２２１】
【化３８】
2019500022.tif 000042
この酵素は種々の生物から知られており、例えばボルデテラ属（Bordetella）種、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、プチダ菌（Pseudomonas putida）およびラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）で記載されている。よって、好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの変換に使用される４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼが、ボルデテラ属（Bordetella）、カプリアビダス属（Cupriavidus）、ゲオバチルス属（Geobacillu）、シュードモナス属（Pseudomonas）またはラルストニア属（Ralstonia）、より好ましくは種、ボルデテラ属（Bordetella）種、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus nector）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、プチダ菌（Pseudomonas putida）およびラルストニア・ピッケティ（Ralstonia pickettii）から得られる４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼである。さらにより好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの変換に使用される４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ０ＶＸＭ８）の４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼである。
【０２２２】
好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの変換において本発明の方法に使用される４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼが、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）から得られ、配列番号６９に示されるアミノ酸配列を有する。
【０２２３】
本発明の好ましい実施形態では、４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼが、配列番号６９のアミノ酸配列または配列番号６９と少なくともｎ％同一である配列（ｎは１０〜１００の整数、好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である）を含み、脱炭酸を介して３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換する酵素活性を有する酵素である。配列同一性の決定に関しては、上記と同じものを適用する。
【０２２４】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＶＩＩＩ
上記の方法のいずれかにより３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換され得る３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわち３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって提供され得る。
【０２２５】
したがって、本発明はまた、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０２２６】
本発明によると、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換は、自然に起こり、例えば３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）として分類される酵素によって触媒される酵素脱水反応である。したがって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換は、好ましくは３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）を使用する。
【０２２７】
上記の実施形態に関して、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）として分類される酵素について、本発明の他の方法に関連して上記と同じものを適用する。
【０２２８】
アセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＩＸ
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわち既に上で詳細に記載されているアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって提供され得る。
【０２２９】
したがって、本発明はまた、アセトアセチル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初にアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに縮合し、次いで、これを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０２３０】
アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換：図１に示されるステップＸＩＩＩ、ステップＸＩＶおよびステップＸＶ
アセトアセチル−ＣｏＡ自体は、酵素反応、すなわち既に上で詳細に記載されているいくつかの異なる経路を介したアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換によって提供され得る。
【０２３１】
よって、本発明はまた、アセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造する方法であって、最初にアセチル−ＣｏＡを上記の経路のいずれかによってアセトアセチル−ＣｏＡに変換し、次いで、これをアセチル−ＣｏＡと縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡにし、次いで、これを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに変換し、次いで、これを３−メチル−３−ブテン酸にさらに変換し、次いで、これを本明細書上記で記載されるようにイソブテンにさらに変換する方法に関する。
【０２３２】
上で概説されるように３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡおよび３−メチル−３−ブテン酸を介したアセチル−ＣｏＡのイソブテンへの酵素的変換のための代替経路を要約すると、本発明はまた、以下の項目１〜２６によって特徴付けられる以下の実施形態に関する：
１．３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を含む、イソブテンを製造する方法。
２．３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換が３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成される、項目１に記載の方法。
３．３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である、項目２に記載の方法。
４．３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換によって、３−メチル−３−ブテン酸を提供するステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
５．３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換が、
（ａ）ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に直接変換する単一酵素反応；
（ｂ）チオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に直接変換する単一酵素反応；
（ｃ）（ｉ）最初に３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルに酵素的に変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られた３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルを前記３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換するステップと
を含む２つの酵素ステップ
によって達成される、項目４に記載の方法。
６．前記３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルへの酵素的変換がリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）を使用することによって達成され、前記３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルの前記３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換がアクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．２．−）、好ましくはプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）を使用することによって達成される、項目５（ｃ）に記載の方法。
７．３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの酵素的変換によって３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、項目１から４のいずれか１つに記載の方法。
８．３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、
（ａ）（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）、
（ｂ）リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）多機能性タンパク質のＣｕｒＦのＮ末端ドメインまたは３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、好ましくはｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）の３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；または
（ｃ）４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼファミリーの酵素
を使用することによって達成される、項目７に記載の方法。
９．３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、項目１から８のいずれか１つに記載の方法。
１０．３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）を使用することによって達成される、項目９に記載の方法。
１１．アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、項目１から１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼを使用することによって達成される、項目１１に記載の方法。
１３．（ａ）（ｉ）最初にアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに酵素的変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られたマロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを前記アセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に縮合するステップと
を含む２つの酵素ステップ；または
（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する単一酵素反応
を含む、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換によって、アセトアセチル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、項目１から１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）を使用することによって達成される、項目１３（ａ）（ｉ）に記載の方法。
１５．マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮合が、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）を使用することによって達成される、項目１３（ａ）（ｉｉ）に記載の方法。
１６．２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの直接酵素的縮合が、アセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を使用することによって達成される、項目１３（ｂ）に記載の方法。
１７．（ｉ）項目１から３のいずれか１つで定義される酵素；および
（ｉｉ）項目４から６のいずれか１つで定義される酵素
を発現する組換え生物または微生物。
１８．項目７または８で定義される酵素をさらに発現する、項目１７に記載の組換え生物または微生物。
１９．項目９または１０で定義される酵素をさらに発現する、項目１８に記載の組換え生物または微生物。
２０．項目１１または１２で定義される酵素をさらに発現する、項目１９に記載の組換え生物または微生物。
２１．請求項１３で定義される酵素をさらに発現する、項目２０に記載の組換え生物または微生物。
２２．請求項１４から１６のいずれか一項で定義される酵素をさらに発現する、項目２１に記載の組換え生物または微生物。
２３．イソブテンを製造するための項目１７から２２のいずれか１つで定義される組換え生物または微生物の使用。
２４．３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素を発現する、項目２３に記載の組換え生物または微生物の使用。
２５．３−メチル−３−ブテン酸からイソブテンを製造するための３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素の使用。
２６．３−メチル−３−ブテン酸および項目１７から２２のいずれか１つで定義される組換え生物もしくは微生物；または３−メチル−３−ブテン酸および項目１から１６のいずれか１つで定義される酵素を含む組成物。
【０２３３】
本発明による方法は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビトロ反応は、細胞を使用しない反応、すなわち、無細胞反応であると理解される。よって、インビトロは、好ましくは無細胞系を意味する。「インビトロ」という用語は、一実施形態では、単離された酵素（またはおそらく必要な補助因子を場合により含む酵素系）の存在下を意味する。一実施形態では、本方法に使用される酵素が精製された形態で使用される。
【０２３４】
本方法をインビトロで行うために、反応のための基質と酵素を、酵素が活性になり酵素的変換が起こるのを可能にする条件（緩衝液、温度、補助基質、補助因子等）下でインキュベートする。それぞれの生成物を産生するのに十分な時間、反応を進行させる。それぞれの生成物の産生を、当技術分野で公知の方法、例えばおそらくは質量分析検出と連結したガスクロマトグラフィーによって測定することができる。酵素は、酵素反応が起こるのを可能にする任意の適切な形態であり得る。これらは精製もしくは部分的に精製されていてもよいし、または粗細胞抽出物もしくは部分的に精製された抽出物の形態であってもよい。酵素を適切な担体に固定化することも可能である。
【０２３５】
別の実施形態では、本発明による方法が、本発明の上記される本発明による方法の変換のための上記の酵素を産生する生物、好ましくは微生物の存在下、培養で行われる。本発明による方法を行うために微生物を使用する方法は、「インビボ」法と呼ばれる。本発明による方法の変換のための上記の酵素を自然に産生する微生物またはこのような酵素の１つもしくは複数を発現する（過剰発現を含む）ように遺伝子組換えされた微生物を使用することが可能である。よって、微生物は、本発明による方法の変換のための上記の酵素を発現する、すなわちそのゲノム中に、このような酵素をコードするヌクレオチド配列を有し、これらの酵素を過剰発現するよう改変された操作された微生物であり得る。発現は構成的に、または誘導もしくは調節様式で起こり得る。
別の実施形態では、微生物が、本発明による方法の変換のための上記の１つまたは複数の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む１個または複数の核酸分子の導入によって遺伝子組換えされた微生物であり得る。核酸分子を微生物のゲノムに安定的に組み込むことができ、またはこれが染色体外様式で、例えばプラスミド上に存在してもよい。
このような遺伝子組換え微生物は、例えば本発明による方法の変換のための上記の酵素を自然には発現せず、このような酵素を発現するよう遺伝子組換えされた微生物、あるいはこのような酵素を自然に発現し、前記微生物中のそれぞれの活性を増加させるために遺伝子組換えされた、例えば核酸、例えばそれぞれの酵素（複数可）をコードするベクターおよび／または酵素をコードする内因性ヌクレオチド配列の前のプロモーターの挿入で形質転換された微生物であり得る。
しかしながら、本発明は、好ましくは上記の酵素をそれらが自然状態で存在するレベルで発現する、自然状態で見られる天然微生物を除外する。その代わり、本発明のおよび本発明の方法に使用される微生物は、それがそのゲノム中に通常は存在しない本発明の外因性酵素を発現する（過剰発現を含む）よう遺伝子組換えされたかどうか、またはそれが外因性酵素を過剰発現するよう操作されたかどうかにかかわらず、好ましくは非天然微生物である。
よって、本発明に関連して使用される酵素および（微）生物は、好ましくは非天然酵素または（微）生物である、すなわち、これらは天然酵素もしくは微生物とは有意に異なるまたは自然状態で生じない酵素または（微）生物である。酵素に関して、好ましくはこれらは自然状態でその形では生じない天然酵素の変異体である。このような変異体には、例えば、改善された特性、例えば高い酵素活性、高い基質特異性、高い温度耐性などを示す、特に分子生物学的方法によって調製された突然変異体が含まれる。（微）生物に関して、これらは、好ましくは遺伝子組換えにより天然生物とは異なる、本明細書上記で記載される遺伝子組換え生物である。遺伝子組換え生物は、自然には生じない、すなわち、自然状態では見ることができず、外来核酸分子の導入により天然生物とは実質的に異なる生物である。
本明細書上記で記載される外因性または内因性酵素を過剰発現することによって、酵素の濃度は、自然状態で見られるものより実質的に高く、そのため、それぞれの酵素について非自然物を使用する本発明の反応を予想外に促進し得る。好ましくは、過剰発現酵素の濃度は、全宿主細胞タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％または４０％である。
「非自然」基質は、外因性酵素と共に微生物中に実際に共存し得るが、自然状態でそれぞれの酵素によって作用されない分子であると理解される。他の基質が好まれる（例えば、「自然基質」）ので、この「非自然」基質は、自然状態では微生物によって変換されない。よって、本発明は、自然状態で見られない環境中の上記の酵素と共に非自然基質を利用することを企図する。
【０２３６】
よって、本発明の文脈において、微生物が、それぞれの酵素活性を自然では有さないが、対応する酵素の発現を可能にするヌクレオチド配列を含むよう遺伝子組換えされる微生物であることも可能である。同様に、微生物はまた、それぞれの酵素活性を自然に有するが、例えば対応する酵素をコードする外因性ヌクレオチド配列の導入または内因性産生を過剰発現（非自然）レベルに増加させるための酵素をコードする内因性遺伝子用のプロモーターの導入によって、このような活性を増強させるよう遺伝子組換えされる微生物であり得る。
対応する酵素を自然に発現する微生物を使用する場合、それぞれの活性が微生物中で過剰発現するようにこのような微生物を改変することが可能である。これは、例えば対応する遺伝子のプロモーター領域の突然変異、または遺伝子の高い発現を保証するプロモーターをもたらすための高発現プロモーターの導入を行うことによって達成することができる。あるいは、高い活性を示す酵素をもたらすために遺伝子自体を突然変異させることも可能である。
本発明による方法の変換のための上記の酵素を発現する微生物を使用することによって、本発明による方法を、酵素を分離する必要も精製する必要もなく、培養培地中で直接行うことが可能である。
【０２３７】
一実施形態では、本発明による方法に使用される生物が、本発明による方法の変換のための上記の少なくとも１つの酵素をコードする外来核酸分子を含むよう遺伝子組換えされた微生物である。本文中の「外来」または「外因性」という用語は、核酸分子が前記微生物中で自然には生じないことを意味する。これは、核酸分子が同じ構造でも微生物中の同じ位置でも生じないことを意味する。１つの好ましい実施形態では、外来核酸分子が、プロモーターとそれぞれの酵素をコードするコード配列とを含む組換え分子であって、コード配列の発現を駆動するプロモーターがコード配列に関して異種性である組換え分子である。この文脈における「異種性」は、プロモーターが前記コード配列の発現を自然に駆動するプロモーターではなく、異なるコード配列の発現を自然に駆動するプロモーターである、すなわち、それが別の遺伝子から得られる、または合成プロモーターもしくはキメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、プロモーターが微生物に対して異種性のプロモーター、すなわち、それぞれの微生物中で自然には生じないプロモーターである。さらにより好ましくは、プロモーターが誘導性プロモーターである。様々な種類の生物、特に微生物での発現を駆動するためのプロモーターは当業者に周知である。
さらなる実施形態では、核酸分子が、コードされている酵素が微生物にとって内因性でない、すなわち、遺伝子組換えしないと微生物によって自然には発現されないという点で、微生物にとって外来である。換言すれば、コードされる酵素が微生物に関して異種性である。外来核酸分子は、染色体外型で、例えばプラスミドとして微生物中に存在し得る、または染色体に安定に組み込まれ得る。安定な組み込みが好ましい。よって、遺伝子組換えは、例えば酵素（複数可）をコードする対応する遺伝子（複数可）を染色体に組み込むこと、または酵素をコードする配列の上流にプロモーターを含むプラスミドから酵素（複数可）を発現すること（プロモーターおよびコード配列は、好ましくは異なる生物に由来する）、または当業者に公知の任意の他の方法にあり得る。
【０２３８】
本発明の文脈における「微生物」という用語は、細菌ならびに真菌、例えば酵母を指し、藻類および古細菌も指す。１つの好ましい実施形態では、微生物が細菌である。原則として、任意の細菌を使用することができる。本発明による方法に使用するために好ましい細菌は、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ザイモモナス属（Zymomonas）または大腸菌属（Escherichia）の細菌である。特に好ましい実施形態では、細菌が大腸菌属（Escherichia）に属し、さらにより好ましくは種、大腸菌（Escherichia coli）に属する。別の好ましい実施形態では、細菌が種、プチダ菌（Pseudomonas putida）、または種、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、または種、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、または種、枯草菌（Bacillus subtilis）に属する。
サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）などの好極限性細菌またはクロストリジウム科（Clostridiae）の嫌気性細菌を使用することも可能である。
別の好ましい実施形態では、微生物が真菌、より好ましくはサッカロマイセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）またはピキア属（Pichia）、さらにより好ましくは種、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、クリベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）、クリベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・トルラ（Pichia torula）またはピキア・ウチリス（Pichia utilis）の真菌である。
別の実施形態では、本発明による方法が、上記の本発明による変換のための少なくとも１つの酵素を発現する光合成微生物を使用する。好ましくは、微生物が光合成細菌または微細藻類である。さらなる実施形態では、微生物が藻類、より好ましくは珪藻類に属する藻類である。本発明による方法に、異なる微生物が上記の異なる酵素を発現する微生物の組み合わせを使用することも考えられる。対象となる酵素を発現するための微生物の遺伝子組換えを以下でさらに詳細に記載する。
【０２３９】
好ましい実施形態では、本発明の方法が、アセチル−ＣｏＡの漏出を回避し、それによってアセチル−ＣｏＡの細胞内濃度を増加させるために、遺伝子組換えされる生物、好ましくは微生物を使用する。アセチル−ＣｏＡの細胞内濃度の上昇をもたらす遺伝子組換えは当技術分野で公知である。理論に拘束されないが、このような生物、好ましくは、微生物は、好ましくは以下の遺伝子を欠失または不活性化することによって遺伝子組換えされ得る：
ΔａｃｋＡ（酢酸キナーゼ），Δｌｄｈ（乳酸デヒドロゲナーゼ），ΔａｄｈＥ  （アルコールデヒドロゲナーゼ），ΔｆｒｄＢおよび／またはΔｆｒｄＣ（フマル酸レダクターゼおよびフマル酸デヒドロゲナーゼ）。
あるいは、または上記欠失のいずれかに加えて、パントテン酸キナーゼをコードする遺伝子ｐａｎＫ／ｃｏａＡを過剰発現させ、それによってＣｏＡ／アセチル−ＣｏＡ細胞内プールを増加させることによって、生物または微生物に対する遺伝子組換えを行うことができる。
アセチル−ＣｏＡの漏出を回避するこれらの組換えは当技術分野で公知であり、対応する組換え生物が、ＡＴＦ２を発現する大腸菌（E. coli）菌株によって外因性イソアミルアルコールを酢酸イソアミルに生物変換するための方法に使用されている（Metab. Eng. 6 (2004), 294-309）。
【０２４０】
別の実施形態では、本発明の方法が、（細胞）培養物の形態、好ましくは液体細胞培養物の形態でそれぞれの酵素活性物（複数可）を有する生物、好ましくは微生物を用意するステップ、それぞれの酵素の発現を可能にする適切な条件下、発酵槽（通常、バイオリアクターとも呼ばれる）で生物、好ましくは微生物を培養するその後のステップを含み、本明細書上記で記載される本発明の方法の酵素的変換を行うステップをさらに含む。適切な発酵槽またはバイオリアクター装置および発酵条件は当業者に公知である。バイオリアクターまたは発酵槽は生物学的に活性な環境を支持する当技術分野で公知の任意の製造もしくは設計された装置またはシステムを指す。よって、バイオリアクターまたは発酵槽は、生物、好ましくは微生物および／または生化学的に活性な物質、すなわちこのような生物から得られる上記の酵素（複数可）または上記の酵素（複数可）を有する生物を含む、本発明の方法などの化学反応／生化学反応を行う容器であり得る。バイオリアクターまたは発酵槽中で、この方法は好気性または嫌気性であり得る。これらのバイオリアクターは、一般的に円筒状であり、リットル〜平方メートルの大きさに及び得、通常、ステンレス鋼製である。この点に関して、理論によって拘束されないが、発酵槽またはバイオリアクターを、その全てが当技術分野で一般的に公知であるバッチ培養法、流加培養法、灌流培養法またはケモスタット培養法で生物、好ましくは微生物を培養するのに適したように設計することができる。
培養培地は、それぞれの生物または微生物を培養するのに適した任意の培養培地であり得る。
【０２４１】
好ましい実施形態では、本発明による方法が、本方法によって製造されるイソブテンを回収するステップを含む。例えば、本発明による方法を、必要な酵素を発現する対応する微生物を発酵させることによってインビボで行う場合、当業者に公知の方法によって発酵オフガスからイソブテンを回収することができる。
【０２４２】
好ましい実施形態では、本発明は、３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換することができる本明細書上記で記載される微生物を使用する本明細書上記で記載される方法であって、微生物を培養培地で培養するステップを含む方法に関する。
【０２４３】
本発明による方法に使用される酵素は、天然酵素、または例えば、酵素活性、安定性等を変化させるもしくは改善する突然変異もしくは他の変更を導入することによって天然酵素から得られる酵素であり得る。
タンパク質の所望の酵素活性を修飾および／または改善する方法は当業者に周知であり、これらには、例えばランダム変異誘発または部位特異的変異誘発およびその後の所望の特性を有する酵素の選択またはいわゆる「定向進化」の手法が含まれる。
例えば、原核細胞の遺伝子組換えのために、対応する酵素をコードする核酸分子を、突然変異誘発またはＤＮＡ配列の組換えによる配列組換えを可能にするプラスミドに導入することができる。標準法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA参照）により、塩基交換を行うことまたは天然もしくは合成配列を付加することが可能になる。ＤＮＡフラグメントは、フラグメントに相補的なアダプターおよびリンカーを使用することによって連結することができる。さらに、適切な制限部位を提供するまたは過剰なＤＮＡもしくは制限部位を除去する操作手段を使用することができる。挿入、欠失または置換が可能な場合、インビトロ突然変異誘発、「プライマー修復」、制限またはライゲーションを使用することができる。一般的に、配列解析、制限解析ならびに生化学および分子生物学の他の方法を分析方法として行う。次いで、得られた酵素変異体を、上記のアッセイで所望の活性、例えば酵素活性について、特に増加した酵素活性について試験する。
上記のように、本発明の方法に使用されるまたは本発明の組成物に含まれる微生物は、対応する酵素をコードする核酸分子の導入によって遺伝子組換えされた微生物であり得る。よって、好ましい実施形態では、微生物が、本発明による方法の変換のための上記の少なくとも１つの酵素の増加した活性を有するよう遺伝子組換えされた組換え微生物である。これは、例えば、対応する酵素をコードする核酸で微生物を形質転換することによって達成することができる。微生物の遺伝子組換えの詳細な説明を以下でさらに示す。好ましくは、微生物に導入される核酸分子は、微生物に関して異種性の核酸分子である、すなわち、これは前記微生物中で自然には生じない。
本発明の文脈において、「増加した活性」は、遺伝子組換え微生物中の酵素の発現および／または活性が、対応する非組換え微生物中よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％または５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％または８０％、特に好ましくは少なくとも９０％または１００％高いことを意味する。さらにより好ましい実施形態では、発現および／または活性の増加が少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも５００％であり得る。特に好ましい実施形態では、発現が、対応する非組換え微生物中よりも少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍高い。
「増加した」発現／活性という用語はまた、対応する非組換え微生物が対応する酵素を発現せず、結果として非組換え微生物中の対応する発現／活性が０である状況も包含する。好ましくは過剰発現酵素の濃度が、全宿主細胞タンパク質の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％または４０％である。
細胞中の所与のタンパク質の発現レベルを測定する方法は当業者に周知である。一実施形態では、発現レベルの測定が、対応するタンパク質の量を測定することによって行われる。対応する方法は当業者に周知であり、これらには、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等が含まれる。別の実施形態では、発現レベルの測定が、対応するＲＮＡの量を測定することによって行われる。対応する方法は当業者に周知であり、これらには、例えばノーザンブロットが含まれる。
【０２４４】
本発明の文脈において、「組換え」という用語は、微生物を、野生型または非組換え微生物と比較して、上で定義される酵素をコードする核酸分子を含むよう遺伝子組換えを行うことを意味する。上で定義される酵素をコードする核酸分子は単独でまたはベクターの一部として使用することができる。
核酸分子は、核酸分子に含まれるポリヌクレオチドと作動可能に連結した発現制御配列をさらに含むことができる。本明細書の全体にわたって使用される「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄまたはｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、発現制御配列と適合性の条件下で発現が達成されるような、１つまたは複数の発現制御配列と発現させるポリヌクレオチド中のコード領域との間の結合を指す。
発現は、異種性ＤＮＡ配列の、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真菌ならびに細菌中での発現を保証する調節エレメントは当業者に周知である。これらは、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル、標的シグナルなどを包含する。ベクターに関する説明と合わせて例を以下でさらに示す。
核酸分子と合わせて使用するためのプロモーターは、その起源に関しておよび／または発現させる遺伝子に関して同種または異種であり得る。適切なプロモーターは、例えば、構成的発現を与えるプロモーターである。しかしながら、外的影響によって決定される時点でのみ活性化されるプロモーターを使用することもできる。人工および／または化学誘導型プロモーターが本文脈で使用され得る。
ベクターは、ベクター内に含まれる前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結した発現制御配列をさらに含むことができる。これらの発現制御配列は、細菌または真菌中での翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を保証するのに適し得る。
さらに、分子生物学で通例の方法（例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA参照）によって異なる突然変異をポリヌクレオチドに挿入して、おそらく改変された生物学的特性を有するポリペプチドの合成をもたらすことが可能である。点突然変異の導入は、例えば、アミノ酸配列の修飾がポリペプチドの生物学的活性または調節に影響を及ぼす位置で考えられる。
さらに、修飾された基質または生成物特異性を有する突然変異体を調製することができる。好ましくは、このような突然変異体は、増加した活性を示す。あるいは、基質結合活性を失うことなく、その触媒活性を消失させる突然変異体を調製することができる。
さらに、突然変異を上で定義される酵素をコードするポリヌクレオチドに導入することによって、遺伝子発現速度および／または前記ポリヌクレオチドによってコードされる酵素の活性を減少または増加させることが可能である。
細菌または真菌に対する遺伝子組換えを行うために、上で定義される酵素またはこれらの分子の一部をコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡ配列の組換えによる突然変異誘発または配列組換えを可能にするプラスミドに導入することができる。標準法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照）により、塩基交換を行うことまたは天然もしくは合成配列を付加することが可能になる。ＤＮＡフラグメントは、フラグメントにアダプターおよびリンカーを適用することによって互いに接続することができる。さらに、適切な制限部位を提供するまたは過剰なＤＮＡもしくは制限部位を除去する操作手段を使用することができる。挿入、欠失または置換が可能な場合、インビトロ突然変異誘発、「プライマー修復」、制限またはライゲーションを使用することができる。一般的に、配列解析、制限解析ならびに生化学および分子生物学の他の方法を分析方法として行う。
よって、本発明によると、上記のポリヌクレオチド、核酸分子またはベクターを真菌または細菌に導入することを含む、真菌または細菌に対する遺伝子組換えを行うことによって、組換え微生物を製造することができる。
それぞれの酵素をコードするポリヌクレオチドを、上記の活性のいずれかを有するポリペプチドの製造をもたらすよう発現させる。様々な発現系の概要は、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 385-516、Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)およびSawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれる。酵母発現系の概要は、例えばHensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279)、Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19)、Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93、Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496)、Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745)およびBuckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)によって与えられる。
発現ベクターは文献に広く記載されている。概して、これらは、選択マーカー遺伝子および選択された宿主中での複製を保証する複製起点を含むだけでなく、細菌またはウイルスプロモーター、およびほとんどの場合、転写のための終止シグナルも含む。プロモーターと終止シグナルとの間に、一般的に、コードＤＮＡ配列の挿入を可能にする少なくとも１つの制限部位またはポリリンカーが存在する。選択された宿主生物内で活性である場合、対応する遺伝子の転写を自然に制御するＤＮＡ配列をプロモーター配列として使用することができる。しかしながら、この配列を他のプロモーター配列に交換することもできる。遺伝子の構成的発現を保証するプロモーターまたは遺伝子の発現の計画的な制御を可能にする誘導型プロモーターを使用することが可能である。これらの特性を有する細菌およびウイルスプロモーター配列は文献で詳細に記載されている。微生物（例えば、大腸菌（E. coli）、出芽酵母（S. cerevisiae））中での発現のための調節配列は文献に十分に記載されている。下流配列の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えばＴ７プロモーター（Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89）、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481；DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25）、ｌｐ１、ｒａｃ（Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100）である。ポリペプチドの合成のために、好ましくは誘導型プロモーターが使用される。これらのプロモーターは通常、構成的プロモーターよりも高いポリペプチド収率をもたらす。最適量のポリペプチドを得るために、二段階プロセスが通常使用される。最初に、宿主細胞を最適条件下で比較的高い細胞密度まで培養する。第２のステップで、使用されるプロモーターの種類に応じて、転写を誘導する。これに関しては、ラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）によって誘導され得るｔａｃプロモーターが特に適している（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25）。転写のための終止シグナルも文献に記載されている。
上記のポリヌクレオチドまたはベクターによる宿主細胞の形質転換は、例えば、Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に記載される標準法によって行うことができる。宿主細胞を、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素等に関して、使用される特定の宿主の要件を満たす栄養培地で培養する。
【０２４５】
ステップＩおよびステップＩＩの酵素を発現し、場合によりステップＩＩＩ、ステップＩＶおよびステップＶの酵素をさらに発現し、場合によりステップＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶの酵素をさらに発現する組換え生物または微生物
本発明はまた、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現する組換え生物または微生物に関する。
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換することができる酵素が、本明細書上記で定義される３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼである。より好ましくは、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、本明細書上記で定義される
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である。
【０２４６】
別の好ましい実施形態では、この組換え生物または微生物が、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）からなる群から選択される組換え生物または微生物である。
【０２４７】
３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）およびゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）ならびに前記３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、前記プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）、前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、前記会合したＦＭＮプレニルトランスフェラーゼ、前記アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、前記メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）および前記ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）の好ましい実施形態、ならびに前記６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２４８】
好ましい実施形態では、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現する組換え生物または微生物が、３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換することができる酵素が本明細書上記で定義されるヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．−．−）、好ましくは本明細書上記で定義されるアコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）である組換え生物または微生物である。
ヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．−．−）、アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）ならびに前記ヒドロリアーゼ（ＥＣ４．２．−．−）、前記アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、前記フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）および前記エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２４９】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する生物または微生物である。好ましい実施形態では、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合することができる酵素が、本明細書上記で定義されるＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）またはＰｋｓＧタンパク質またはＣ−Ｃ結合開裂／縮合リアーゼの活性を有する酵素、例えばＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）である。
ＨＭＧ  ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．３．１０）、ＰｋｓＧタンパク質、Ｃ−Ｃ結合開裂／縮合リアーゼの活性を有する酵素およびＨＭＧ  ＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．４）ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５０】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素、好ましくは本明細書上記で記載されるアセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）をさらに発現する生物または微生物である。アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換することができる前記酵素および前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．４）ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５１】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素、好ましくは本明細書上記で記載される
（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１１）；または
（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸に転移することができる酵素
をさらに発現する生物または微生物である。
好ましい実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸に転移することができる酵素が、本明細書上記で記載されるＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくは酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）である。
アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換することができる前記酵素、前記アセトアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１１）、アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を転移することができる前記酵素、ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）および前記酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５２】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、
（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および
（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または
（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素
を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する生物または微生物である。
好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換することができる酵素が、本明細書上記で記載されるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）である。
別の好ましい実施形態では、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合することができる酵素が、本明細書上記で記載されるアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）である。
好ましい実施形態では、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合することができる酵素が、本明細書上記で記載されるアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）である。
アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換することができる酵素、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合することができる酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）、アセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合することができる酵素およびアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５３】
ステップＩおよびステップＶＩの酵素を発現し、場合によりステップＶＩＩ、ステップＶＩＩＩおよびステップＩＸの酵素をさらに発現し、場合によりステップＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶの酵素をさらに発現する組換え生物または微生物
本発明はまた、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現する組換え生物または微生物に関する。
【０２５４】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換することができる酵素が、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、好ましくは本明細書上記で定義される
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である。
３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、会合したＦＭＮプレニルトランスフェラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）およびゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５５】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換することができる酵素が、
（ａ）本明細書上記で記載されるＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）（図１に示されるステップＶＩａ）である、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換することができる酵素；または
（ｂ）本明細書上記で記載されるチオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）（図１に示されるステップＶＩｂ）である、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に直接変換することができる酵素
である。
別の好ましい実施形態では、組換え生物または微生物が、以下の２つの酵素、すなわち、
（ｃ）（ｉ）本明細書上記で記載される３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに酵素的に変換することができる酵素；および
（ｉｉ）本明細書上記で記載される３−メチルクロトニルリン酸エステルを３−メチルクロトン酸に変換することができる酵素（図１に示されるステップＶＩｃ）
を発現する組換え生物または微生物である。
【０２５６】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニルリン酸エステルに変換することができる酵素が、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）であり、３−メチルクロトニルリン酸エステルを３−メチルクロトン酸に変換することができる酵素が、本明細書上記で記載される、アクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．２．−）、好ましくはプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）である。
上記の酵素に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５７】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、本明細書上記で記載される３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素、好ましくは（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）をさらに発現する生物または微生物である。
前記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５８】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素、好ましくは３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）をさらに発現する生物または微生物である。
前記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２５９】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素、好ましくは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼをさらに発現する生物または微生物である。
前記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
さらなる態様では、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現する（かつ場合により３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現し、場合により３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現し、場合によりアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合することができる酵素をさらに発現する）上記組換え生物または微生物が、好ましくは
２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素
を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する生物または微生物である。
別の好ましい実施形態では、組換え生物または微生物が、以下の２つの酵素、すなわち、
（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および
（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素
を発現する組換え生物または微生物である。
【０２６０】
好ましい実施形態では、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換することができる酵素が、本明細書上記で記載されるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）である。
別の好ましい実施形態では、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合することができる酵素が、本明細書上記で記載されるアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）である。
好ましい実施形態では、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合することができる酵素が、本明細書上記で記載されるアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）である。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２６１】
３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡおよび３−メチル−３−ブテン酸を介したアセチル−ＣｏＡからイソブテンへの酵素的変換のための代替経路の組換え生物または微生物：ステップＸＶＩおよびステップＸＶＩＩの酵素を発現し、場合によりステップＸＶＩＩＩ、ステップＶＩＩＩおよびステップＩＸの酵素をさらに発現し、場合によりステップＸＩＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶの酵素をさらに発現する組換え生物または微生物
上記のように、３−メチルクロトン酸を介してイソブテンを製造するための上記の第１の経路の代替では、本発明はまた、３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換によって、イソブテンを製造する代替経路を介したイソブテンを製造する方法に関する。以下で、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡおよび３−メチル−３−ブテン酸を介したアセチル−ＣｏＡからイソブテンへの酵素的変換のためのこの代替経路の組換え生物または微生物を記載する。
【０２６２】
本発明はまた、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現する組換え生物または微生物に関する。
【０２６３】
好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換することができる酵素が、本明細書上記で記載される３−メチル−３−ブテン酸カルボキシラーゼ、より好ましくは本明細書上記で記載される
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと会合したＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である。
【０２６４】
別の好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテン酸カルボキシラーゼが、本明細書上記で記載される６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）からなる群から選択される。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２６５】
好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換することができる酵素が、
（ａ）本明細書上記で記載されるＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１８）（図１に示されるステップＸＶＩＩａ）である３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換することができる酵素
である。
別の好ましい実施形態では、組換え生物または微生物が、以下の２つの酵素、すなわち、
（ｂ）本明細書上記で記載されるチオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）（図１に示されるステップＸＶＩＩｂ）である、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に直接変換することができる酵素；または
（ｃ）本明細書上記で記載される
（ｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルに酵素的に変換することができる酵素；および
（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルを前記３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換することができる酵素（図１に示されるステップＸＶＩＩｃ）
を発現する組換え生物または微生物である。
【０２６６】
好ましい実施形態では、前記３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルに酵素的に変換することができる酵素が、リン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）またはリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）であり、３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換することができる酵素が、本明細書上記で記載される、アクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．２．−）、好ましくはプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）である。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２６７】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素、好ましくは本明細書上記で記載される
（ａ）（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；あるいは
（ｂ）リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）多機能性タンパク質のＣｕｒＦのＮ末端ドメインまたは３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、好ましくはｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）の３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；あるいは
（ｃ）４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼファミリーの酵素
をさらに発現する生物または微生物である。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２６８】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素、好ましくは３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１８）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）またはエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）をさらに発現する生物または微生物である。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２６９】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現する生物または微生物である。
好ましい実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合することができる酵素が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼである。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２７０】
さらなる態様では、上記組換え生物または微生物が、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる１つまたはいくつかの酵素をさらに発現する生物または微生物である。
１つの好ましい実施形態では、組換え生物または微生物が、酵素、すなわち
（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および
（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素
の組み合わせを発現する。
代替実施形態では、組換え生物または微生物が、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を発現する。
第１の上記実施形態に関して、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換することができる酵素は、好ましくは本明細書上記で記載されるアセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）である。
さらに、マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合することができる酵素は、本明細書上記で記載されるアセトアセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）である。
第２の上記実施形態に関して、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合することができる酵素は、好ましくは本明細書上記で記載されるアセチル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）である。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２７１】
ステップＸａ、Ｘｂ、ＸＩおよびＸＩＩの付加的／補足的経路の酵素を発現する組換え生物または微生物
上記のように、アセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造するための本発明の上記方法は、図１８のステップＸａ、ステップＸｂ、ステップＸＩおよびステップＸＩＩに示され、本明細書の上で詳細に記載される反応の１つまたは複数を補足することができる。
【０２７２】
よって、さらなる態様では、本発明は、本明細書上記で記載される
ａ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを移動させて、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡをもたらす（図１９に模式的に示されるステップＸａ）ことができる酵素；および／または
ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２０に模式的に示されるステップＸｂ）ことができる酵素；および／または
ｃ）３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２１に模式的に示されるステップＸＩ）ことができる酵素；および／または
ｄ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２２に模式的に示されるステップＸＩＩ）ことができる酵素
を付加的にさらに発現する上記組換え生物または微生物のいずれかに関する。
【０２７３】
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２７４】
上記微生物は、好ましくは細菌、酵母または真菌である。別の好ましい実施形態では、生物が植物またはヒト以外の動物である。細菌、組換え生物または微生物の他の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上記と同じものを適用する。
【０２７５】
本発明はまた、イソブテンを製造するための上記組換え生物または微生物のいずれかの使用に関する。よって、本発明はさらに、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現し、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現し、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現し、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現し、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素をさらに発現し、（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する使用に関する。
より好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の上記使用のいずれかであって、前記組換え生物または微生物が３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素を発現する使用に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２７６】
本発明はさらに、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現し、（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する使用に関する。
より好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の上記使用のいずれかであって、前記組換え生物または微生物が３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素を発現する使用に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２７７】
本発明はさらに、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現する使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現し、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現し、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現し、（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する使用に関する。
より好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の上記使用のいずれかであって、前記組換え生物または微生物が３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素を発現する使用に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２７８】
さらなる態様では、本発明は、イソブテンを製造するための上記組換え生物または微生物のいずれかの使用であって、前記生物または微生物が、本明細書上記で記載される
ａ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを移動させて、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡをもたらす（図１９に模式的に示されるステップＸａ）ことができる酵素；および／または
ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２０に模式的に示されるステップＸｂ）ことができる酵素；および／または
ｃ）３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２１に模式的に示されるステップＸＩ）ことができる酵素；および／または
ｄ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２２に模式的に示されるステップＸＩＩ）ことができる酵素
を付加的にさらに発現する生物または微生物である、使用に関する。
【０２７９】
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２８０】
本発明はさらに、３−メチルクロトン酸からイソブテンを製造するための、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素の使用に関する。
本発明はさらに、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素およびアセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素、アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素およびアセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素；アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素、アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素およびアセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素；アセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素、アセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素、アセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素ならびに（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素の使用に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２８１】
本発明はさらに、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素および３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素および３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素およびアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素およびアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素ならびに（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素の使用に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２８２】
本発明はさらに、３−メチル−３−ブテン酸からイソブテンを製造するための３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素の使用に関する。
本発明はさらに、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素および３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素およびアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素の使用に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、イソブテンを製造するための、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素；３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素およびアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素ならびに（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素の使用に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２８３】
さらなる態様では、本発明は、イソブテンを製造するための酵素の上記使用のいずれかであって、付加的に本明細書上記で記載される
ａ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを移動させて、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡをもたらす（図１９に模式的に示されるステップＸａ）ことができる酵素；および／または
ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２０に模式的に示されるステップＸｂ）ことができる酵素；および／または
ｃ）３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２１に模式的に示されるステップＸＩ）ことができる酵素；および／または
ｄ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２２に模式的に示されるステップＸＩＩ）ことができる酵素
を使用する使用に関する。
【０２８４】
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【０２８５】
さらに、本発明は、３−メチルクロトン酸と組換え生物または微生物とを含む組成物であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素を発現する、および／またはアセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する、および／またはアセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素をさらに発現する、および／またはアセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素をさらに発現する、および／または（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する組成物に関する。
さらに、本発明は、３−メチルクロトン酸、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および／または（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）ことができる酵素；および／またはアセトンとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）に酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＩＩ）ことができる酵素；および／またはアセト酢酸をアセトンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＶ）ことができる酵素；および／またはアセトアセチル−ＣｏＡをアセト酢酸に変換する（図１に示されるステップＶａまたはＶｂ）ことができる酵素；および／または（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素を含む組成物に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２８６】
さらに、本発明は、３−メチルクロトン酸と組換え生物または微生物とを含む組成物であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および／または（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素を発現する、および／または３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する、および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する、および／またはアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現する、および／または（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する組成物に関する。
【０２８７】
さらに、本発明は、３−メチルクロトン酸と、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩ）ことができる酵素；および／または（ｉｉ）３−メチルクロトニル−ＣｏＡを３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩａ、ＶＩｂまたはＶＩｃ）ことができる酵素；および／または３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩ）ことができる酵素；および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素；および／またはアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素；および／または（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素とを含む組成物に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２８８】
さらに、本発明は、３−メチル−３−ブテン酸と組換え生物または微生物とを含む組成物であって、前記組換え生物または微生物が（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および／または（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素を発現する、および／または３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する、および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素をさらに発現する、および／またはアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素をさらに発現する、および／または（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素をさらに発現する組成物に関する。
さらに、本発明は、イソブテンを製造するための、３−メチル−３−ブテン酸と、（ｉ）３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩ）ことができる酵素および／または（ｉｉ）３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩ）ことができる酵素；および／または３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＸＶＩＩＩ）ことができる酵素；および／または３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを３−メチルグルタコニル−ＣｏＡに酵素的に縮合する（図１に示されるステップＶＩＩＩ）ことができる酵素；および／またはアセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＸ）ことができる酵素；および／または（ａ）（ｉ）アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに変換する（図１に示されるステップＸＩＶ）ことができる酵素；および（ｉｉ）マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに縮合する（図１に示されるステップＸＶ）ことができる酵素；または（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する（図１に示されるステップＸＩＩＩ）ことができる酵素を含む、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに酵素的に変換することができる酵素とを含む組成物に関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法および組換え生物または微生物について上記と同じものを、イソブテンを製造するための組換え生物または微生物の使用に適用する。
【０２８９】
さらなる態様では、本発明は、生物または微生物が、本明細書上記で記載される
ａ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを移動させて、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡをもたらす（図１９に模式的に示されるステップＸａ）ことができる酵素；および／または
ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２０に模式的に示されるステップＸｂ）ことができる酵素；および／または
ｃ）３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２１に模式的に示されるステップＸＩ）ことができる酵素；および／または
ｄ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２２に模式的に示されるステップＸＩＩ）ことができる酵素
を付加的にさらに発現する生物または微生物である、上記組成物のいずれかに関する。
【０２９０】
さらなる態様では、本発明は、本明細書上記で記載される
ａ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換し、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）にＣｏＡを移動させて、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡをもたらす（図１９に模式的に示されるステップＸａ）ことができる酵素；および／または
ｂ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２０に模式的に示されるステップＸｂ）ことができる酵素；および／または
ｃ）３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡを３−メチルクロトニル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２１に模式的に示されるステップＸＩ）ことができる酵素；および／または
ｄ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）を３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡに酵素的に変換する（図２２に模式的に示されるステップＸＩＩ）ことができる酵素
をさらに付加的に含む上記組成物のいずれかに関する。
上記酵素ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物の使用に適用する。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】３−メチルクロトン酸を介したアセチル−ＣｏＡからのイソブテン製造のための人工経路を示す図である。さらに、経路中で起こり得る代謝産物の酵素再利用をステップＸａ、Ｘｂ、ＸＩおよびＸＩＩに示す。
【図２】（図２Ａ）フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の対応する修飾（プレニル化）フラビン補助因子への酵素プレニル化の概略反応を示す図である。（図２Ｂ）３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図３】３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図４】アセチル−ＣｏＡとアセトンの３−ヒドロキシイソ吉草酸への酵素的縮合の概略反応を示す図である。
【図５】アセト酢酸のアセトンへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図６】アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡチオエステルを加水分解してアセト酢酸を得ることによる、アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図７】アセトアセチル−ＣｏＡのＣｏＡ基を酢酸に転移して、アセト酢酸およびアセチル−ＣｏＡの形成をもたらすことによる、アセトアセチル−ＣｏＡのアセト酢酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図８】３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図９】図１に示されるステップＶＩａを介した３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図１０】図１に示されるステップＶＩｂを介した３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素反応の概略反応を示す図である。
【図１１】図１に示されるステップＶＩｃを介した３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への酵素反応の概略反応を示す図である。
【図１２】３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図１３】３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図１４】アセチル−ＣｏＡとアセトアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡへの酵素的縮合の概略反応を示す図である。
【図１５】２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮合の概略反応を示す図である。
【図１６】アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図１７】マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮合の概略反応を示す図である。
【図１８】３−メチルクロトン酸を介したアセチル−ＣｏＡからのイソブテン製造の経路中に起こり得る代謝産物の酵素再利用ステップ（同様に図１に示されるステップＸａ、Ｘｂ、ＸＩおよびＸＩＩ）を示す図である。
【図１９】３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素反応と、同時に３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）へのＣｏＡの移動によって３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡが得られる概略反応を示す図である。
【図２０】３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２１】３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２２】３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの一般的酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２３】３−ヒドロキシイソバレリル−アデノシン一リン酸を介した３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２４】３−ヒドロキシイソバレリルリン酸エステルを介した３−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２５】３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２６】３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２７】ＣｏＡ−トランスフェラーゼを使用することによる３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２８】チオエステルヒドロラーゼを使用することによる３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図２９】３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルを介した二段階反応での３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図３０】３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの酵素的変換の概略反応を示す図である。
【図３１】ホスホパンテテイン部分の構造を示す図である。
【図３２】３−メチルブチリル−ＣｏＡおよび３−メチル酪酸を介した３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への変換の概略図である。
【図３３】出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質の触媒アッセイについて得られた典型的なＧＣクロマトグラムと実施例２で概説される対応する対照の重ね合わせを示す図である。
【図３４−１】（図３４ａ）「酵素アッセイ」（アッセイＡ、実施例３）と「酵素フリーアッセイ」（アッセイＨ、実施例３）について得られた典型的なＨＰＬＣクロマトグラム（３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルクロトン酸およびＣｏＡ−ＳＨの分析）の重ね合わせを示す図である。３−メチルクロトニル−ＣｏＡの消費と同時のＣｏＡ−ＳＨおよび３−メチルクロトン酸の産生が、リン酸ブチリルトランスフェラーゼと酪酸キナーゼを組み合わせた酵素アッセイで観察された。
【図３４−２】（図３４ｂ）「酵素アッセイ」（アッセイＡ、実施例３）と「酵素フリーアッセイ」（アッセイＨ、実施例３）について得られた典型的なＨＰＬＣクロマトグラム（ＡＤＰおよびＡＴＰの分析）の重ね合わせを示す図である。ＡＤＰの消費と同時のＡＴＰの産生が、リン酸ブチリルトランスフェラーゼと酪酸キナーゼを組み合わせた酵素アッセイで観察された。
【図３５】様々な酪酸キナーゼと組み合わせた枯草菌（Bacillus subtilis）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼを含む、酵素アッセイにおける３−メチルクロトン酸とＡＴＰの産生の結果を示す図である。さらに、対照アッセイにおける３−メチルクロトン酸とＡＴＰの産生が示されている。
【図３６】様々な酪酸キナーゼと組み合わせたフェカリス菌（Enterococcus faecalis）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼを含む、酵素アッセイにおける３−メチルクロトン酸とＡＴＰの産生の結果を示す図である。さらに、異なる対照アッセイにおける３−メチルクロトン酸とＡＴＰの産生が示されている。
【図３７】実施例５に概説されるプチダ菌（Pseudomonas putida）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＩＩを用いた酵素アッセイについて得られた典型的なＨＰＬＣクロマトグラムの例を示す図である。
【図３８】出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質および大腸菌（Escherichia coli）のＵｂｉＸタンパク質を過剰発現する（菌株Ａ）、または出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質のみを過剰発現する（菌株Ｂ）、または空のベクターを有する（陰性対照、菌株Ｃ）組換え大腸菌（E. coli）菌株における３−メチルクロトン酸からのイソブテンの製造について得られた典型的なクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図３９】実施例７で概説されるワンポット酵素アッセイおよび対応する対照における３−メチルクロトニル−ＣｏＡからのイソブテンの製造について得られた典型的なクロマトグラムの重ね合わせを示す図である。
【図４０−１】酵素アッセイ（ａ）および対照アッセイ（ｂ）についてのクロマトグラムを示す図である。ＣｏＡ−トランスフェラーゼの存在下（ａ）では、酢酸および３−メチルクロトニル−ＣｏＡから有意な量のアセチル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸が産生されたが、酵素を用いない対照アッセイ（ｂ）では、生成物が観察されなかった。
【図４０−２】酵素アッセイ（ａ）および対照アッセイ（ｂ）についてのクロマトグラムを示す図である。ＣｏＡ−トランスフェラーゼの存在下（ａ）では、酢酸および３−メチルクロトニル−ＣｏＡから有意な量のアセチル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸が産生されたが、酵素を用いない対照アッセイ（ｂ）では、生成物が観察されなかった。
【図４１】ＨＰＬＣに基づく分析から得られた３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ（ＭＧ−ＣｏＡ）ピーク面積を示す図である。
【図４２】大腸菌（Escherichia coli）において実現された、３−メチルクロトン酸を介したアセチル−ＣｏＡからのイソブテンの生合成のための代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２９２】
本明細書では、特許出願を含むいくつかの文献が引用される。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連しないと考えられるが、これにより全体が参照により組み込まれる。より具体的には、全ての参照文献が、あたかも各個々の文献が参照により組み込まれることを具体的かつ個別的に示されているのと同程度に参照により組み込まれる。
【０２９３】
本発明をここで以下の実施例を参照して記載するが、これらの実施例は単なる例示にすぎず、本発明の範囲の限定として解釈されるべきでない。
【実施例】
【０２９４】
一般的方法および材料
特に指定しない限り、実験で使用される全ての試薬および材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。細菌培養物の増殖およびタンパク質発現に適した材料および方法は当技術分野で周知である。
【実施例１】
【０２９５】
組換えタンパク質の遺伝子合成、クローニングおよび発現
試験する酵素の配列をオリゴヌクレオチド連結によって作製して、大腸菌（E. coli）（遺伝子はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）によって商業的に合成された）のコドン使用頻度を当てはめた。６個のヒスチジンコドンの伸長をメチオニン開始コドンの後に挿入して精製用のアフィニティータグを得た。こうして合成した遺伝子をｐＥＴ−２５ｂ（＋）発現ベクター（ベクターはＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）によって構成された）にクローニングした。大腸菌（Escherichia coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０ＡＧ０３）のＵｂｉＸタンパク質（３−オクタプレニル−４−ヒドロキシ安息香酸カルボキシリアーゼパートナータンパク質）をコードする遺伝子を含むベクターｐＣＡＮはＮＡＩＳＴ（奈良先端科学技術大学院大学、日本、ＡＳＫＡコレクション）から購入した。提供されたベクターは、メチオニン開始コドンの後に６個のヒスチジンコドンの伸長を含んでいた。
コンピテント大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（Ｄ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を標準的な熱ショック手順によってこれらのベクターで形質転換した。形質転換した細胞を、３０℃で６時間、ＺＹＭ−５０５２自動誘導培地（Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41, (2005), 207-234）を用いて振盪しながら（１６０ｒｐｍ）増殖させ、タンパク質発現を１８℃で一晩（約１６時間）続けた。大腸菌（E. coli）のＵｂｉＸを過剰発現する組換え菌株について、５００μＭのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を増殖培地に添加した。４℃、１００００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを−８０℃で保存した。
【０２９６】
タンパク質精製および濃度
培養細胞２００ｍｌからのペレットを氷上で解凍し、ＵｂｉＸタンパク質を過剰発現する組換え菌株の場合には１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５  ６ｍｌに再懸濁し、ＵｂｉＤタンパク質を過剰発現する組換え菌株の場合には５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭイミダゾールおよび５ｍＭ  ＤＴＴ  ６ｍｌに再懸濁した。ｌｙｓｏｎａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２０μｌを添加した。次いで、細胞を室温で１０分間インキュベートし、氷に２０分間戻し、音波処理３×１５秒間によって溶解を完了した。ＵｂｉＸタンパク質を含む細胞溶解物を氷上に取っておいた。次いで、ＵｂｉＤタンパク質を含む細菌抽出物を４℃、４０００ｒｐｍで４０分間の遠心分離によって清澄化した。清澄化した細菌溶解物をＰＲＯＴＩＮＯ−２０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）にロードし、６−Ｈｉｓタグ付きタンパク質の吸着を可能にした。カラムを洗浄し、対象となる酵素を１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５  ６ｍｌで溶出した。次いで、溶離液を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱塩し、酵素を、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に再懸濁した。
こうして精製したタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって推定すると８０％〜９０％の範囲だった。タンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での直接ＵＶ２８０ｎｍ測定およびＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。
【実施例２】
【０２９７】
ＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物の精製ＵｂｉＸタンパク質との会合によって触媒された３−メチルクロトン酸のイソブテンへのインビトロ脱炭酸
３−メチルクロトン酸の０．５Ｍストック溶液を水中で調製し、ＮａＯＨの１０Ｍ溶液でｐＨ７．０に調整した。
２つのＵｂｉＤタンパク質（表Ｃ）を実施例１に記載される手順によって精製した。
【０２９８】
以下の条件下、２ｍｌガラスバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で酵素アッセイを行った：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  ３−メチルクロトン酸
１ｍｇ／ｍｌ精製ＵｂｉＤタンパク質
５０μｌ溶解物はＵｂｉＸタンパク質を含んでいた。
アッセイの全体積は３００μｌであった。
一連の対照アッセイを並行して行った（表Ｃ）。
バイアルを密封し、３０℃で１２０分間インキュベートした。８０℃で２分間インキュベートすることによってアッセイを停止し、反応ヘッドスペースに形成されたイソブテンを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。
ＧＣ分析のために、ヘッドスペースガス１ｍｌを、１３０℃の等温モードを用いて、ＧＣアルミナカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ４５０システムで分離した。窒素を６ｍｌ／分の流量でキャリアガスとして使用した。
酵素反応生成物をイソブテン標準との比較によって同定した。これらのＧＣ条件下で、イソブテンの保持時間は２．４２分であった。３−メチルクロトン酸からのイソブテンの有意な生成が組み合わせアッセイ（ＵｂｉＤタンパク質＋ＵｂｉＸタンパク質）で観察された。ＵｂｉＸタンパク質のみを含む溶解物のインキュベーションはイソブテン生成をもたらさなかった。これらのデータは、アッセイに存在する２つの酵素が協力して３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸を行ったことを示している。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質を用いたアッセイで得られた典型的なクロマトグラムを図３３に示す。
【０２９９】
【表３】
2019500022.tif 000043
【実施例３】
【０３００】
枯草菌（Bacillus subtilis）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼとカゼイ菌（Lactobacillus casei）またはゲオバチルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼの組み合わせ作用によって触媒される、３−メチルクロトニル−ＣｏＡおよびＡＤＰの３−メチルクロトン酸およびＡＴＰへの変換
対応する酵素を得て、実施例１に記載される手順によって精製した。
酵素アッセイを０．２ｍｌの総反応体積で行った。
標準反応混合物は以下を含んでいた：
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
４ｍＭ  ３−メチルクロトニル−ＣｏＡ
４ｍＭ  ＡＤＰ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．２ｍｇ／ｍｌの精製した枯草菌（Bacillus subtilis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ５４５３０）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼ
０．２ｍｇ／ｍｌの精製したカゼイ菌（Lactobacillus casei）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｋ０Ｎ５２９）またはゲオバチルス属（Geobacillus）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｌ８Ａ０Ｅ１）の酪酸キナーゼ
一連の対照を並行して行った（アッセイＣ〜Ｈ  表Ｄ）。
【０３０１】
【表４】
2019500022.tif 000044
【０３０２】
アッセイを３０℃で振盪しながら２０分間インキュベートした。
インキュベーション期間後、反応培地を９０℃で４分間加熱することによって反応を停止した。試料を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、清澄化した上清をさらなる分析のために清潔なバイアルに移した。ＡＤＰおよび３−メチルクロトニル−ＣｏＡの消費、ならびにＡＴＰ、３−メチルクロトン酸および遊離補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）の形成を、ＨＰＬＣに基づく方法を用いてフォローした。
【０３０３】
ＡＤＰおよびＡＴＰのＨＰＬＣに基づく分析
カラム加熱モジュールおよびＲＩ検出器を備えた１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ＨＰＬＣ分析を行った。試料２μｌを、１．５ｍｌ／分の移動相流量を用いてＰｏｌａｒｉｓ  Ｃ  １８−Ａカラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）で分離した。Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ混合溶液（９９／１）（Ｖ／Ｖ）中８４ｍＭ硫酸を用いて分離を行った。これらの条件で、ＡＤＰおよびＡＴＰの保持時間はそれぞれ２．１３分および２．３３分であった。
３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルクロトン酸および遊離補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）のＨＰＬＣに基づく分析
カラム加熱モジュールおよびＵＶ検出器（２６０ｎｍ）を備えた１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ＨＰＬＣ分析を行った。試料１μｌを、１．５ｍｌ／分の移動相流量を用いてＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）で分離した。線形勾配（開始時間０分で０％Ｂ→８分で７０％Ｂ）の混合したＡ溶液（８．４ｍＭ硫酸を含むＨ２Ｏ）およびＢ溶液（アセトニトリル）を用いて分離を行った。これらの条件で、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルクロトン酸および遊離補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）の保持時間はそれぞれ５．３８分、５．７３分および４．０７分であった。
酵素アッセイＡおよび酵素フリーアッセイＨについて得られた典型的なクロマトグラムを図３４ａおよび図３４ｂに示す。
ＨＰＬＣ分析の結果を図３５に要約する。
得られたデータは、３−メチルクロトニル−ＣｏＡが３−メチルクロトン酸に変換され、同時にそれぞれ２つの酵素によって触媒される二段階反応でＡＤＰからＡＴＰが生成された（アッセイＡおよびＢ）ことを示している。よって、中間体３−メチルクロトニルリン酸エステルの形成、引き続いてこの中間体からＡＤＰへのリン酸基の移動、それによるＡＴＰの放出を通して変換が起こった。
リン酸ブチリルトランスフェラーゼを単独で使用した場合（アッセイＥ）、ＡＴＰの同時生成なしに一定量の３−メチルクロトン酸が生成された。この生成は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼの作用によって生成された３−メチルクロトニルリン酸エステルの自発的加水分解によるものである。
ＡＤＰを用いない対照アッセイ（アッセイＣおよびＤ）についても同様に３−メチルクロトン酸の生成が観察された。この生成もリン酸ブチリルトランスフェラーゼの作用によって生成された３−メチルクロトニルリン酸エステルの加水分解によるものであった。
【実施例４】
【０３０４】
フェカリス菌（Enterococcus faecalis）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼとカゼイ菌（Lactobacillus casei）またはゲオバチルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼの組み合わせ作用によって触媒される、３−メチルクロトニル−ＣｏＡおよびＡＤＰの３−メチルクロトン酸およびＡＴＰへの変換
対応する酵素を得て、実施例１に記載される手順によって精製した。
酵素アッセイを０．２ｍｌの総反応体積で行った。
標準反応混合物は以下を含んでいた：
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
４ｍＭ  ３−メチルクロトニル−ＣｏＡ
４ｍＭ  ＡＤＰ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．２ｍｇ／ｍｌの精製したフェカリス菌（Enterococcus faecalis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｓ４ＢＺＬ５）のリン酸ブチリルトランスフェラーゼ
０．２ｍｇ／ｍｌの精製したカゼイ菌（Lactobacillus casei）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｋ０Ｎ５２９）またはゲオバチルス属（Geobacillus）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｌ８Ａ０Ｅ１）の酪酸キナーゼ
一連の対照を並行して行った（アッセイＣ〜Ｈ  表Ｅ）。
【０３０５】
【表５】
2019500022.tif 000045
【０３０６】
アッセイを３０℃で振盪しながら２０分間インキュベートした。
インキュベーション期間後、反応培地を９０℃で４分間加熱することによって反応を停止した。試料を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、清澄化した上清をさらなる分析のために清潔なバイアルに移した。ＡＤＰおよび３−メチルクロトニル−ＣｏＡの消費、ならびにＡＴＰおよび３−メチルクロトン酸および遊離補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）の形成を、実施例３に記載される方法によってＨＰＬＣ分析によりフォローした。
ＨＰＬＣ分析の結果を図３６に要約する。
得られたデータは、３−メチルクロトニル−ＣｏＡが３−メチルクロトン酸に変換され、同時にそれぞれ２つの酵素によって触媒される二段階反応でＡＤＰからＡＴＰが生成された（アッセイＡおよびＢ）ことを示している。よって、中間体３−メチルクロトニルリン酸エステルの形成、引き続いてこの中間体からＡＤＰへのリン酸基の移動、それによるＡＴＰの放出を通して変換が起こった。
リン酸ブチリルトランスフェラーゼを単独で使用した場合（アッセイＥ）、ＡＴＰの同時生成なしに一定量の３−メチルクロトン酸が観察された。この生成は、リン酸ブチリルトランスフェラーゼの作用によって生成された３−メチルクロトニルリン酸エステルの加水分解によるものであった。
ＡＤＰを用いない対照アッセイ（アッセイＣおよびＤ）についても同様に３−メチルクロトン酸の生成が観察された。この生成もリン酸ブチリルトランスフェラーゼの作用によって生成された３−メチルクロトニルリン酸エステルの加水分解によるものであった。
【実施例５】
【０３０７】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸および遊離補酵素Ａへの酵素触媒加水分解
プチダ菌（Pseudomonas putida）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼＩＩをコードする遺伝子を実施例１に記載される手順によって合成した。
大腸菌（Escherichia coli）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼ２（ＴｅｓＢ）をコードする遺伝子を含むベクターｐＣＡＮをＮＡＩＳＴ（奈良先端科学技術大学院大学、日本、ＡＳＫＡコレクション）から購入した。提供されたベクターは、メチオニン開始コドンの後に６個のヒスチジンコドンの伸長を含んでいた。対応する酵素は実施例１に記載される手順によって製造した。
【０３０８】
酵素アッセイを０．２ｍｌの総反応体積で行った。
標準反応混合物は以下を含んでいた：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０
１０ｍＭ  ３−メチルクロトニル−ＣｏＡ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍｇ／ｍｌの精製した組換えチオエステラーゼ。
酵素を添加しない、または基質を添加しない対照アッセイを行った。
アッセイを３０℃で振盪しながら３０分間インキュベートし、アセトニトリル０．１ｍｌを添加することによって反応を停止し、次いで、ＨＰＬＣに基づく手順によって試料を分析した。
【０３０９】
３−メチルクロトニル−ＣｏＡの消費ならびに３−メチルクロトン酸および遊離補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）の形成のＨＰＬＣに基づく分析
カラム加熱モジュールおよびＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を備えた１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ＨＰＬＣ分析を行った。試料５μｌを、１．５ｍｌ／分の移動相流量を用いてＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）で分離した。線形勾配（開始時間０分で０％Ｂ→８分で７０％Ｂ）の混合したＡ溶液（８．４ｍＭ硫酸を含むＨ２Ｏ）およびＢ溶液（アセトニトリル）を用いて分離を行った。市販の３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルクロトン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＣｏＡ−ＳＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基準として使用した。これらの条件で、遊離補酵素Ａ（ＣｏＡ−ＳＨ）、３−メチルクロトニル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸およびの保持時間はそれぞれ４．０５分、５．３８分および５．８３分であった。
対照アッセイでは３−メチルクロトン酸シグナルは観察されなかった。
両試験チオエステラーゼが３−メチルクロトン酸の形成を伴う３−メチルクロトニル−ＣｏＡの加水分解を触媒した。プチダ菌（Pseudomonas putida）のアシル−ＣｏＡチオエステラーゼで得られたクロマトグラムの例を図３７に示す。
酵素アッセイで観察された３−メチルクロトン酸の生成を表Ｆに示す。
【０３１０】
【表６】
2019500022.tif 000046
【実施例６】
【０３１１】
大腸菌（Escherichia coli）のＵｂｉＸタンパク質と出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質の会合によって触媒される３−メチルクロトン酸のイソブテンへのインビボ脱炭酸
出芽酵母（S. cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ０３０３４）のＵｂｉＤタンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌（E. coli）中での発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成した。次いで、この試験遺伝子を、ＮｃｏＩ制限部位を有する順方向プライマーおよびＢａｍＨＩ制限部位を含む逆方向プライマーを用いて、ｐＭＫ−ＲＱベクター（ＧｅｎｅＡｒｔによって提供されるマスタープラスミド）からＰＣＲ増幅した。大腸菌（E. coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０ＡＧ０３）のＵｂｉＸタンパク質をコードする遺伝子を、ＮｄｅＩ制限部位を含む順方向プライマーおよびＫｐｎＩ制限部位を含む逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。以前記載したｐＣＡＮベクター（実施例１）がこのＰＣＲステップのための鋳型として働いた。これらの２つの得られたＰＣＲ産物（ＵｂｉＤタンパク質およびＵｂｉＸタンパク質）をｐＥＤｕｅｔ（商標）−１同時発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。構築した組換えプラスミドを配列決定によって検証した。コンピテント大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、標準的な熱ショック手順によってこのベクターで形質転換し、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ寒天プレート上に播いた（「菌株Ａ」と呼ぶ）。
出芽酵母（S. cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質の遺伝子のみを有するｐＥＴ−２５ｂ（＋）ベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）菌株もこの試験に使用した（「菌株Ｂ」と呼ぶ）。空のｐＥＴ−２５ｂ（＋）ベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）菌株をその後のアッセイで陰性対照として使用した（「菌株Ｃ」と呼ぶ）。
単一形質転換体を使用してアンピシリンを補足したＬＢ培地に接種し、引き続いて３０℃で一晩インキュベートした。この一晩培養液１ｍｌを使用してＺＹＭ−５０５２自動誘導培地３００ｍｌに接種した（Studier FW (2005)、局所的引用）。培養液を３０℃で２０時間、１６０ｒｐｍで振盪して増殖させた。
ＯＤ６００＝３０に相当する体積の培養物を取り出し、遠心分離した。ペレットを、グルコース（４５ｇ／Ｌ）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を含み、１０ｍＭ  ３−メチルクロトン酸を補足したＭＳ培地３０ｍｌ（Richaud C., Mengin-Leucreulx D., Pochet S., Johnson EJ., Cohen GN. and Marliere P, The Journal of Biological Chemistry, 268, (1993), 26827-26835）に再懸濁した。次いで、これらの培養液を、ねじ口で密封した１６０ｍｌボトル中、３０℃で２２時間振盪してインキュベートした。３０％ＮＨ４ＯＨを用いて、インキュベーションの８時間後に培養液のｐＨ値を８．５に調整した。
インキュベーション期間後、ヘッドスペースに生成されたイソブテンを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。ヘッドスペース気相１ｍｌを分離し、実施例２に記載される方法によって分析した。
空のベクターを有する対照菌株Ｃではイソブテンが形成されなかった。両遺伝子、出芽酵母（S. cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質と大腸菌（E. coli）のＵｂｉＸタンパク質を過剰発現する菌株Ａで最高のイソブテン生成が観察された。ＵｂｉＤタンパク質のみを過剰発現する菌株Ｂでは有意なイソブテン生成が観察された。よって、大腸菌（E. coli）の内因性ＵｂｉＸが出芽酵母（S. cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質を活性化するのにおそらく寄与し得る（図３８）。
【実施例７】
【０３１２】
枯草菌（Bacillus subtilis）のホスホトランスブチリラーゼ、ゲオバチルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼおよび出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質の会合によって触媒される３−メチルクロトニル−ＣｏＡからのイソブテンのワンポット酵素合成
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０３０３４）のＵｂｉＤ遺伝子および大腸菌（Escherichia coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＧ０３）のＵｂｉＸ遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ（商標）−１同時発現ベクター（実施例６）を使用して、実施例１に記載されるプロトコルによってＵｂｉＤタンパク質を製造および精製した。枯草菌（Bacillus subtilis）のホスホトランスブチリラーゼおよびゲオバチルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼを実施例４に記載されるように精製した。
酵素アッセイを０．３ｍｌの総反応体積で行った。
標準反応混合物は以下を含んでいた：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ３−メチルクロトニル−ＣｏＡ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＡＤＰ
０．０２ｍｇ／ｍｌの精製した枯草菌（Bacillus subtilis）のホスホトランスブチリラーゼ
０．０２ｍｇ／ｍｌの精製したゲオバチルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼ
１ｍｇ／ｍｌの精製した出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤ
触媒作用を３０℃で１８時間行った。
【０３１３】
ＵｂｉＤタンパク質を添加しない（対照Ａ）またはホスホトランスブチリラーゼを添加しない（対照Ｂ）または酪酸キナーゼを添加しない（対照Ｃ）または基質を添加しない（対照Ｄ）一連の対照アッセイを並行して行った。インキュベーション期間後、ヘッドスペースに生成されたイソブテンを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。ヘッドスペース気相１ｍｌを分離し、実施例２に記載される方法によって分析した。酵素アッセイ全体および対応する対照について得られた典型的なクロマトグラムの重ね合わせを図３９に示す。
ホスホトランスブチリラーゼ、酪酸キナーゼおよびＵｂｉＤタンパク質を含むアッセイで最高のイソブテン生成が観察された。ホスホトランスブチリラーゼを含まない対照アッセイ（対照Ｂ）および酪酸キナーゼを含まない対照アッセイ（対照Ｃ）も有意なイソブテン生成を示した。これらの結果は、３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メチルクロトン酸への自発的加水分解によって説明することができるだろう。よって、３−メチルクロトニル−ＣｏＡからのイソブテンの酵素産生は、中間体としての３−メチルクロトニルリン酸エステルおよび３−メチルクロトン酸の形成を通した３つの連続ステップによって達成することができる。
【実施例８】
【０３１４】
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸のためのＵｂｉＤタンパク質のインビトロスクリーニング
ＵｂｉＤタンパク質をコードするいくつかの遺伝子を、大腸菌（E. coli）中での発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）によって合成した。対応する酵素を実施例１に記載される手順によって精製した。試験酵素のリストを表Ｇに示す。
酵素アッセイを以下の条件下、２ｍｌガラスバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で行った：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  ３−メチルクロトン酸
１ｍｇ／ｍｌの精製ＵｂｉＤタンパク質
１００μｌの大腸菌（E. coli）のＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物
アッセイの総体積は３００μｌであった。
【０３１５】
ＵｂｉＤタンパク質を添加しないまたは酵素を添加しない一連の対照アッセイを並行して行った（表Ｇ）。
バイアルを密封し、３０℃で６０分間インキュベートした。８０℃で２分間インキュベートすることによってアッセイを停止し、反応ヘッドスペースに形成したイソブテンを、実施例２に記載される手順によって、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。
ＧＣ分析の結果を表Ｇに示す。対照反応ではイソブテン生成が観察されなかった。これらの結果は、このスクリーニングアッセイの条件下で試験した全てのＵｂｉＤタンパク質が、ＵｂｉＸタンパク質を含む大腸菌（E. coli）細胞溶解物の存在下で３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸を行うことができたことを示している。
【０３１６】
【表７】
2019500022.tif 000047
【実施例９】
【０３１７】
メガスフェラ属（Megasphaera）種の補酵素Ａトランスフェラーゼによって触媒される３−メチルクロトニル−ＣｏＡおよび酢酸の３−メチルクロトン酸およびアセチル−ＣｏＡへの変換
実施例１に記載される手順にしたがって酵素を製造および精製した。
酵素アッセイを０．２ｍｌの総反応体積で行った。
標準反応混合物は以下を含んでいた：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
５ｍＭ  ３−メチルクロトニル−ＣｏＡ
１０ｍＭ酢酸ナトリウム
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
３ｍｇ／ｍｌの精製したメガスフェラ属（Megasphaera）種（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｓ７ＨＦＲ５）のＣｏＡ−トランスフェラーゼ
酵素を添加しない、または３−メチルクロトニル−ＣｏＡを添加しない対照アッセイを行った。アッセイを３０℃で６時間インキュベートした。ＭｅＣＮ１００μｌを培地に添加することによってアッセイを停止した。試料を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、清澄化した上清をＨＰＬＣに基づく分析のために清潔なバイアルに移した。
カラム加熱モジュールおよびＵＶ検出器（２６０ｎｍ）を備えた１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、ＨＰＬＣ分析を行った。試料５μｌを、１．５ｍｌ／分の移動相流量を用いてＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）で分離した。線形勾配（開始時間０分で０％Ｂ→８分で７０％Ｂ）の混合したＡ溶液（８．４ｍＭ硫酸を含むＨ２Ｏ）およびＢ溶液（アセトニトリル）を用いて分離を行った。これらの条件で、３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、３−メチルクロトン酸およびアセチル−ＣｏＡの保持時間はそれぞれ５．２２分、５．７０分および４．２５分であった。
酵素アッセイでは有意な量のアセチル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸が観察されたが、対照では２つの化合物のいずれも観察されなかった。酵素アッセイでは有意な量のアセチル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸が観察されたが、対照アッセイではこれらの２つの化合物のいずれも形成されなかった。酵素および対照アッセイについての典型的なクロマトグラムを図４０に示す。
【実施例１０】
【０３１８】
ＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物の存在下で精製デカルボキシラーゼを用いて触媒される３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素脱炭酸
３−メチルクロトン酸の０．５Ｍストック溶液を水中で調製し、ＮａＯＨの１０Ｍ溶液でｐＨ７．０に調整した。
ａｒｏＹ遺伝子によってコードされるタンパク質およびＵｂｉＤタンパク質としてアノテーションを付与された１つのタンパク質を実施例１に記載される手順にしたがって製造した。
酵素アッセイを以下の条件下、２ｍｌガラスバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で行った：
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  ３−メチルクロトン酸
１ｍｇ／ｍｌの精製したＡｒｏＹまたはＵｂｉＤタンパク質
５０μｌのＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物
アッセイの総体積は３００μｌであった。
一連の対照アッセイを並行して行った（表Ｈ）。
バイアルを密封し、３０℃で１２０分間インキュベートした。８０℃で２分間インキュベートすることによってアッセイを停止し、反応ヘッドスペースに形成したイソブテンを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。
ＧＣ分析のために、ヘッドスペースガス１ｍｌを、１３０℃の等温モードを使用してＧＳ−アルミナカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＧＣ−４５０システムで分離した。窒素を６ｍｌ／分の流量でキャリアガスとして使用した。
酵素反応生成物をイソブテン標準との比較によって同定した。これらのＧＣ条件下で、イソブテンの保持時間は２．４２分であった。組み合わせたアッセイ（ＡｒｏＹまたはＵｂｉＤタンパク質＋ＵｂｉＸタンパク質）では３−メチルクロトン酸からの有意なイソブテン生成が観察された。ＵｂｉＸタンパク質のみを含む溶解物のインキュベーションはイソブテン生成をもたらさなかった。これらのデータは、ａｒｏＹ遺伝子によってコードされるタンパク質がＵｂｉＸタンパク質と会合して、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸を触媒できることを示している。
【０３１９】
【表８】
2019500022.tif 000048
【実施例１１】
【０３２０】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡへの酵素触媒脱水
実施例１に記載される手順にしたがって、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（以下でＥＣＨと略される、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼとも呼ばれる）をコードする遺伝子（表Ｉ）を合成し、対応する酵素をさらに製造した。２０ｍＭ  ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のストック溶液を水中で調製した。酵素アッセイを以下の条件下、０．２ｍｌの総体積で行った：
−  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５
−  １００ｍＭ  ＮａＣｌ
−  ２ｍＭの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）
−  ０．１ｍｇ／ｍｌの精製した３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ。
酵素アッセイを、２０ｍＭ基質２０μｌを添加することによって開始し、３０℃で１０分間実行し、アセトニトリル１００μＬを反応培地に添加することによって停止した。全ての酵素アッセイを２連で行った。次いで、試料を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、清澄化した上清をＨＰＬＣに基づく分析のために清潔なバイアルに移した。
カラム加熱モジュールおよびＵＶ検出器（２６０ｎｍ）を備えた１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、分析を行った。試料５μｌを、１．５ｍｌ／分の移動相流量を用いてＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）で分離した。線形勾配（開始時間０分で０％Ｂ→８分で７０％Ｂ）の混合したＡ溶液（８．４ｍＭ硫酸を含むＨ２Ｏ）およびＢ溶液（アセトニトリル）を用いて分離を行った。これらの条件で、ＨＭＧ−ＣｏＡ、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ（ＭＧ−ＣｏＡ）および遊離補酵素Ａの保持時間はそれぞれ４．２６分、４．７６分および３．９６分であった。図４１は、ＨＰＬＣに基づく分析から得られた３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ（ＭＧ−ＣｏＡ）ピーク面積を示している。
【０３２１】
【表９】
2019500022.tif 000049
【実施例１２】
【０３２２】
３−メチルクロトン酸を介してアセチル−ＣｏＡからイソブテンを製造するための微生物
この例は、内因性遺伝子を発現し、それによってイソブテン経路を構成する組換え大腸菌（E. coli）菌株によるイソブテンの直接製造を示す。ほとんどの生物と同様、大腸菌（E. coli）はグルコースをアセチル−ＣｏＡに変換する。３−メチルクロトン酸を介してアセチル−ＣｏＡをイソブテンに変換する（図４２）ためのこの試験で使用される酵素を表Ｊに要約する。
【０３２３】
【表１０】
2019500022.tif 000050
【０３２４】
大腸菌（E. coli）におけるイソブテン生合成経路の発現
大腸菌（E. coli）ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから直接増幅したＵｂｉＸタンパク質をコードする遺伝子を除いて、全ての対応する遺伝子を大腸菌（E. coli）中での発現のために最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成した。修正マルチクローニングサイト（ｐＵＣ１８  ＭＣＳ）（国際公開第２０１３／００７７８６号パンフレット）を含むｐＵＣ１８の修正版（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をｕｂｉＸ遺伝子の過剰発現に使用した。このプラスミドが組換え菌株にアンピシリン耐性を与えた。構築ベクターをｐＧＢ５７９６と命名し、対応するヌクレオチド配列を表Ｋに示す。
【０３２５】
【表１１−１】
2019500022.tif 000051
【０３２６】
【表１１−２】
2019500022.tif 000052
複製起点ｐＳＣを含む発現ベクターを遺伝子：ｔｈｌＡ、ＭｖａＳ、ｐｐＫＦ７０７＿３８３１、ＭＸＡＮ＿４２６４／ＭＸＡＮ＿４２６５、ＦＤＣ１の発現に使用した。このプラスミドが組換え菌株にスペクチノマイシン耐性を与えた。構築ベクターをｐＧＢ５７７１と命名し、対応するヌクレオチド配列を表Ｌに示す。
【０３２７】
【表１２−１】
2019500022.tif 000053
【０３２８】
【表１２−２】
2019500022.tif 000054
【０３２９】
【表１２−３】
2019500022.tif 000055
【０３３０】
【表１２−４】
2019500022.tif 000056
【０３３１】
【表１２−５】
2019500022.tif 000057
これらの組換えｐＧＢＥ５７７１およびｐＧＢＥ５７９６プラスミドを配列決定によって検証した。
ＭＧ１６５５大腸菌（E. coli）菌株をエレクトロコンピテント（electrocompetent）にし、ｐＧＢＥ５７７１およびｐＧＢＥ５７９６で、または陰性対照を作製するために対応する空のベクター（ｐＵＣ１８  ＭＣＳおよびｐＧＢ２０２１）で形質転換した。こうして製造した菌株を表Ｍに要約する。
【０３３２】
【表１３】
2019500022.tif 000058
次いで、形質転換細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を供給したＬＢプレートに播いた。プレートを３０℃で一晩インキュベートした。単離したコロニーを使用して、アンピシリン、スペクチノマイシンおよび０．５ｍＭフラビンモノヌクレオチドを補足したＺＹＭ−５０５２自動誘導培地１．４ｍｌ（Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41, (2005), 207-234）に接種した。これらの培養液を９６ディープウェルマイクロプレート中、３０℃および７００ｒｐｍ振盪で１６時間増殖させた。次いで、培養液を遠心分離し、ペレットを、グルコース（４５ｇ／Ｌ）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を含むＭＳ培地０．４ｍｌ（Richaud C., Mengin-Leucreulx D., Pochet S., Johnson EJ., Cohen GN. and Marliere P, The Journal of Biological Chemistry, 268, (1993), 26827-26835）に再懸濁した。培養液を９６ディープウェル密封マイクロプレート中３０℃、７００ｒｐｍ振盪で２４時間さらにインキュベートした。８０℃で５分間マイクロプレートをインキュベートすることによってイソブテンの製造を停止し、反応ヘッドスペースに形成したイソブテンを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。各酵素反応からのヘッドスペースガス１００μＬを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＢｒｕｃｋｅｒ  ＧＣ−４５０システムに注入した。試料中に存在する化合物を、１３０℃の等温モードを用いて、ＧＳ−アルミナカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたクロマトグラフィーによって分離した。窒素を６ｍｌ／分の流量でキャリアガスとして使用した。注入時、イソブテンのピーク面積を計算した；表Ｎ。
【０３３３】
【表１４】
2019500022.tif 000059
【図１】
2019500022.tif 000060
【図２】
2019500022.tif 000061
【図３】
2019500022.tif 000062
【図４】
2019500022.tif 000063
【図５】
2019500022.tif 000064
【図６】
2019500022.tif 000065
【図７】
2019500022.tif 000066
【図８】
2019500022.tif 000067
【図９】
2019500022.tif 000068
【図１０】
2019500022.tif 000069
【図１１】
2019500022.tif 000070
【図１２】
2019500022.tif 000071
【図１３】
2019500022.tif 000072
【図１４】
2019500022.tif 000073
【図１５】
2019500022.tif 000074
【図１６】
2019500022.tif 000075
【図１７】
2019500022.tif 000076
【図１８】
2019500022.tif 000077
【図１９】
2019500022.tif 000078
【図２０】
2019500022.tif 000079
【図２１】
2019500022.tif 000080
【図２２】
2019500022.tif 000081
【図２３】
2019500022.tif 000082
【図２４】
2019500022.tif 000083
【図２５】
2019500022.tif 000084
【図２６】
2019500022.tif 000085
【図２７】
2019500022.tif 000086
【図２８】
2019500022.tif 000087
【図２９】
2019500022.tif 000088
【図３０】
2019500022.tif 000089
【図３１】
2019500022.tif 000090
【図３２】
2019500022.tif 000091
【図３３】
2019500022.tif 000092
【図３４−１】
2019500022.tif 000093
【図３４−２】
2019500022.tif 000094
【図３５】
2019500022.tif 000095
【図３６】
2019500022.tif 000096
【図３７】
2019500022.tif 000097
【図３８】
2019500022.tif 000098
【図３９】
2019500022.tif 000099
【図４０−１】
2019500022.tif 000100
【図４０−２】
2019500022.tif 000101
【図４１】
2019500022.tif 000102
【図４２】
2019500022.tif 000103
【配列表】
2019500022000001.app
【国際調査報告】
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