(57)【要約】  透析患者から採取したサンプルを、微生物の存在について分析する方法であって、（ｉ）サンプルを（Ｉ）（ａ１）指標化合物と、（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素とを含む第１の報告手段と接触させるステップと、（ii）この報告手段を検査するステップとを含む、前記方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
透析患者から採取したサンプルを、微生物の存在について分析する方法であって、
（ｉ）前記サンプルを
（Ｉ）
（ａ１）指標化合物と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と
を含む第１の報告手段
と接触させるステップと、
（ii）前記報告手段を検査するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
サンプルが腹膜透析排出液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉ）が、サンプルを、（II）第２の報告手段と接触させるステップをさらに含み、前記第２の報告手段が、
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）選択因子と
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１及び／又は第２の報告手段における指標化合物が、水溶性テトラゾリウム塩、好ましくはＷＳＴ−９である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１及び／又は第２の報告手段における、微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素が、Wilkins Chalgren培地である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１及び／又は第２の報告手段が電子メディエーターをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
電子メディエーターが、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（ｍＰＭＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
選択因子が、グラム陽性微生物の増殖を阻害する、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
選択因子がバンコマイシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉ）が、サンプルを、（III）（ａ３）指標化合物を含む白血球検出手段と接触させるステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
指標化合物（ａ３）が、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
白血球検出手段が、（ｄ）緩衝剤をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ii）が、第１の報告手段、第２の報告手段、及び白血球検出手段を検査するステップを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
液体を汚染しうる微生物を検出及び／又は特定するためのデバイスであって、前記液体を受け入れるように配置されている２つのチャネルを含み、
第１のチャネルが、
（ａ１）指標化合物と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と
を含む第１の報告手段を収容し、
第２のチャネルが、
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）微生物の増殖を選択的に阻害する選択因子と
を含む第２の報告手段を収容する、
前記デバイス。
【請求項１５】
（ａ３）指標化合物を含む白血球検出手段を含む第３のチャネルをさらに含む、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
第１及び第２のチャネルがそれぞれ、電子メディエーターをさらに含み、第３のチャネルが緩衝剤をさらに含む、請求項１４又は１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
チャネルがケーシング内に保持され、前記ケーシングが、前記チャネルの中身を観察するための覗き窓を有する、請求項１４〜１６のいずれかに記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症、詳細には腹膜炎と関連する微生物を、好ましくは細胞も検出するための方法及びデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
迅速で、信頼でき、正確な微生物感染の検出は、感染症の治療及び予防、特に、腹膜透析を受けている患者の感染症の治療及び予防において、死活に関わる部分である。
【０００３】
腎不全に罹患している患者において微生物感染を検出できることは、特に重要である。進行した慢性腎不全の患者は、２つの形態の腎置換療法（ＲＲＴ，renal replacement therapy）、すなわち、腹膜透析（ＰＤ，peritoneal dialysis）及び血液透析（ＨＤ，haemodialysis）を受けることにより治療される場合がある。
【０００４】
ＰＤが患者にとってより好都合であり（家で行うことができ、患者に最大の自由及び融通性を与える）、より少ない通院しか要さず、より低コストであるにも関わらず、英国及び他の多くの国々では、ＨＤが最も一般的に使用されるＲＲＴである。しかし、ＰＤは、ＨＤよりも、重篤な感染症のリスクが高くなっており、多くの場合、感染が明らかになる頃には、生命に関わるものとなりかねない。
【０００５】
現在、患者は、自身への感染の注意喚起のために、非特異的な疼痛及び発熱の症状、及び／又は透析排出液が濁っていることに気付くことを頼りとしている。ＰＤ患者は、自身のＰＤ排出液バッグの後ろに文面（新聞など）の頁を当てておくように一般に指導され、文面が不明瞭になれば（すなわち、排出液が濁っていくことによる）、担当臨床医と連絡を取るように助言されている。この手法の問題は、判断が多少主観的であることである。さらに、排出液の「濁り」は、微生物感染に反応を示している白血球がＰＤ液に侵入することにより引き起こされるのが普通である。微生物の力価があまりに高くなる結果、それ自体で混濁を引き起こすことになるのはまれである。したがって、ＰＤ液は、感染当初はおそらく澄んでおり、患者によって白血球応答が呼び起こされたときにしか濁るようにならない。したがって、濁りが観察される頃には、感染症が大いに進展し、健康にとって深刻なリスクとなってしまいかねないというのが事実である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、使用者に、より早期の段階で、サンプルの微生物汚染が存在することを明確に注意喚起するために使用することのできるデバイス及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、透析患者から採取したサンプルを、微生物の存在について分析する方法であって、
（ｉ）サンプルを
（Ｉ）
（ａ１）指標化合物（indicator compound）と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と
を含む第１の報告手段（reporting means）
と接触させるステップと、
（ii）報告手段を検査するステップと
を含む方法が提供される。
【０００８】
本発明は、透析患者から採取したサンプルにおいて微生物を検出する方法に関する。サンプルは、腹膜透析排出液を含むことが好ましい。
【０００９】
本発明は、微生物の存在についてのサンプルの分析を含む。
【００１０】
本明細書全体を通して、「微生物」が引き合いに出され、この用語は、肉眼に見えないすべての生活形を包含すると理解すべきである。したがって、用語「微生物」は、例えば、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、及び藻類を包含しうる。本発明を使用して、細菌、真菌、原生動物、及び藻類からなる群から選択される１又は２以上の微生物を特定、検出、及び／又は定量化できることが好ましい。本発明を使用して、細菌、特に病原性細菌を検出することが好ましい。
【００１１】
本発明は、グラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌の存在を検出するのに使用することができる。細菌は、染色特性に基づき、グラム陽性及びグラム陰性生物として分類される。
【００１２】
「グラム陽性細菌」とは、厚いペプチドグリカン細胞壁を有し、外膜をもたず、したがって、クリスタルバイオレットで染まる細菌を意味する。腹膜透析では、グラム陽性細菌によって引き起こされる感染は、多くの場合、皮膚共生生物の所産であることが多い透析カテーテルの汚染を示差する。
【００１３】
「グラム陰性細菌」とは、内膜、外膜、及び薄いペプチドグリカン層を有する細菌を意味する。したがって、こうした細菌は、クリスタルバイオレット染色を留めることができない。
【００１４】
本発明は、腹膜透析排出液が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（特に、多耐性黄色ブドウ球菌−ＭＲＳＡ）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、サンギス菌（Streptococcus sanguis）、フェシウム菌（Enterococcus faecium）、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、霊菌（Serratia marcescens）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、セレウス菌（Bacillus cereus）、又はグラム陰性桿菌から選択される１又は２以上の微生物で汚染されているか否かを確かめるのに使用されることが最も好ましい。
【００１５】
本発明は、サンプルを第１の報告手段と接触させるステップを含む。「報告手段」とは、サンプル中の微生物の存在（又は非存在）を報告する働きをする組成物又はその成分を指すものとする。
【００１６】
報告手段の「活性化」又は「始動」への言及は、報告手段の変化、適切な例では、微生物の存在を示す陽性の結果を指す。
【００１７】
報告手段は、（ａ１）指標化合物を含む。
【００１８】
指標化合物は、微生物が存在するとき、観察可能な変化を遂げるいかなる化合物でもよい。
【００１９】
観察可能な変化は、光吸収、沈殿形成、泡形成、温度変化、又は他の測定可能な質の変化である場合がある。
【００２０】
測定可能な変化は、色の変化であることが好ましい。指標化合物は、微生物の存在下では、微生物が存在しないときとは異なる色であるのが適切である。指標化合物は、報告手段組成物をサンプルと接触させる前に、当初の色を有するのが適切である。サンプル中に微生物が存在する場合、指標化合物は、色変化を遂げることが好ましい。指標化合物は、無色から有色、有色から無色、又は第１の色から第１の色とは異なる第２の色へと変化する場合がある。
【００２１】
当業者なら、生じる色変化は、発色団領域に影響を及ぼす、指標化合物の構造の変化によるものであるのが適切であるということを理解されよう。
【００２２】
指標（indicator）は、微生物の存在下で無色から有色へと変化することが好ましい。
【００２３】
適切な指標の例としては、クリスタルバイオレット、石炭酸フクシン（Carbol fuchsine）、サフラニン（Safronin）、ニグロシン、インディアンインク、ヨウ素、チール・ネールゼン、ヘマトキシリン、エオシンＹ／黄味のエオシン、パパニコロー、オレンジＧ、黄味のライトグリーンＳＦ、ビスマルクブラウンＹ、ナイルブルー／ナイルブルーＡ、ナイルレッド／ナイルブルーオキサゾン、マッソン・トリクローム、ロマノフスキー、ライト、ジェンナー、レーシュマン、ギムザ、銀、スダンIII、スダンIV、オイルレッドＯ、スダンブラックＢ、コンクリン、マラカイトグリーン、四酸化オスミウム／テトラオキシド、ローダミン、アクリジンオレンジ、カルミン、クーマシーブルー、ＤＡＰＩ、エオシンＢ、臭化エチジウム、酸性フクシン（Acid fuchsine）、ヘキスト、メチレングリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド／トルイレンレッド、及びＨＤＴＭＡ／ＣＴＡＢが挙げられる。
【００２４】
使用することのできるさらなる指標の例としては、レザズリン（例えば、アラマーブルー）及び１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（アンプレックスレッド）が挙げられる。指標は、検出される微生物の内因性酵素によって活性化されることが好ましく、指標は、細胞の還元酵素（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ還元酵素）の作用によって活性化されることがより好ましい。
【００２５】
指標化合物は、酸化還元指標であることが好ましい。
【００２６】
指標化合物は、サンプル中の微生物の活動によって還元されるのが適切である。
【００２７】
指標化合物は、テトラゾリウム化合物であることが好ましい。
【００２８】
適切なテトラゾリウム化合物には、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）、２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド（ＸＴＴ，2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium）、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ，water soluble tetrazolium salt）、例えば、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−７、ＷＳＴ−８、ＷＳＴ−９、ＷＳＴ−１０、又はＷＳＴ−１１、インドニトロテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ，indonitrotetrazolium chloride）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ，Nitrobluetetrazolium）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ，Tetranitro blue tetrazolium）、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウム（ＴＣＮＢＴ，Thiocarbamyl nitro blue tetrazolium）、テトラゾリウムレッド（ＴＲ，Tetrazolium red）、テトラゾリウムバイオレット（ＴＶ，tetrazolium violet）、ネオテトラゾリウムクロリド、及び５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ，5-cyano-2, 3-ditolyl tetrazolium chloride）が含まれる。
【００２９】
指標化合物は、水溶性テトラゾリウム塩であることがより好ましい。
【００３０】
水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）は、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−７、ＷＳＴ−８、ＷＳＴ−９、ＷＳＴ−１０、又はＷＳＴ−１１から選択されるのが適切である。
【００３１】
指標化合物は、ＷＳＴ−９又はその誘導体であることが最も好ましい。ＷＳＴ−９は、化学式が、２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−［４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩であり、化学構造は、
【００３２】
【化１】
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である。
【００３３】
第１の報告手段は、（ｂ）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素をさらに含む。
【００３４】
培地及び／又は栄養素が報告手段に含まれて、微生物の増殖又は倍加が助長される結果、通常は指標化合物の色の変化によって、報告手段が始動しうる。
【００３５】
開発作業の間、本発明者らは、いくつかの要素が、指標化合物の分解をもたらしうる可能性があり、又は指標化合物の誤った始動（すなわち、微生物非存在下での報告シグナルの生成）をもたらす場合があることを見出した。本発明者らは、微生物増殖を支持又は助長する適正な培地及び／又は栄養素の選択が、本発明によるデバイスを開発する際、重要な技術的関門となることを見出した。
【００３６】
培地及び／又は栄養素は、
（ｉ）生存可能な微生物を報告手段に保持し、一部の実施形態では、微生物増殖及び／又は分裂を支持又は助長する、
（ii）保持及び検出する必要のある微生物が狭域であるか広域であるかを考慮に入れる、
（iii）閾値濃度の微生物非存在下で指標を誤って始動させない、
（iv）報告手段の成分のいずれかを分解又は不活性化しない
ように選択することが好ましい。
【００３７】
報告手段において使用される培地及び／又は栄養素は、ＷＳＴと共に３７℃で終夜インキュベートしてもＷＳＴのホルマザンへの変換を引き起こさない、培地又はブロスであることが好ましい。別法として、報告手段において使用される培地及び／又は栄養素は、ＷＳＴと共に２４℃で８〜２４時間インキュベートしてもＷＳＴのホルマザンへの変換を引き起こさない、培地又はブロスであることが好ましい。ＷＳＴのホルマザンへの変換は、ＷＳＴと混合された培地溶液の光学密度を経時的に測定することにより検定することができる。
【００３８】
本発明において使用することのできる培地／栄養素の例には、ミューラーヒントン、ブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ，brain heart infusion broth）、及びWilkins Chalgren培地が含まれる。培地／栄養素は、ブレインハートインフュージョン及びWilkins Chalgren培地から選択されることが好ましい。Wilkins Chalgren培地を第１の報告手段において使用することが最も好ましい。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明の方法のステップ（ｉ）は、サンプルを、（II）第２の報告手段と接触させるステップをさらに含む場合があり、第２の報告手段は、
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）選択因子と
を含む。
【００４０】
第２の報告手段中に存在する指標化合物（ａ２）は、第１の報告手段に関して規定した指標化合物から適切に選択される。第２の報告手段において使用される指標化合物は、第１の報告手段において使用されるものと同じでもよく、又は異なってもよい。第１の報告手段と第２の報告手段において同じ指標化合物が使用されることが好ましい。
【００４１】
第２の報告手段において使用される指標化合物（ａ２）は、酸化還元指標であることが好ましい。指標化合物（ａ２）は、水溶性テトラゾリウム塩であることが好ましい。水溶性テトラゾリウム塩は、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−７、ＷＳＴ−８、ＷＳＴ−９、ＷＳＴ−１０、又はＷＳＴ−１１から選択されることが好ましい。第２の報告手段中に存在する指標化合物（ａ２）は、ＷＳＴ９であることが最も好ましい。
【００４２】
第２の報告手段（ｂ２）中の、微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素は、第１の報告手段に関して規定した培地及び／又は栄養素から適切に選択することができる。
【００４３】
第２の報告手段において使用される培地及び／又は栄養素（ｂ２）は、第１の報告手段において使用されるものと同じ又は異なる場合がある。
【００４４】
第１の報告手段と第２の報告手段において、同じ培地及び／又は栄養素が使用されることが好ましい。
【００４５】
第２の報告手段中の、微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素は、ブレインハートインフュージョンブロス及びWilkins Chalgren培地から選択される。
【００４６】
第２の報告手段は、（ｃ）選択因子をさらに含む。
【００４７】
「選択因子」とは、ある特定の微生物の複製を阻止し、増殖を低減し、又は死滅を増加させ、他の微生物の増殖又は死滅速度に影響を及ぼさない、第２の報告手段内に組み込まれる場合のある薬剤を意味する。これに感受性のある微生物による、デバイスのいかなる活性化も防ぐ、十分な量の選択因子が報告手段に含まれるべきであることは理解されよう。
【００４８】
疑義を回避するために、第１及び／又は第２の報告手段の活性化に言及するとき、指標化合物は、観察可能な変化、適切には色変化を遂げていることを意味する。当業者ならば、微生物が閾値濃度に達すれば、観察可能な変化が起こることを理解されよう。
【００４９】
当業者なら、閾値濃度は、各報告手段の構成要素及びその量に応じて決まることを理解されよう。この点は、当業者によって、各報告手段を製剤する際に考慮に入れられる。
【００５０】
本発明による選択因子は、第１及び第２の報告手段の活性化が比較されるとき、異なるタイプの微生物の識別を可能にするのに適する。
【００５１】
一実施形態では、細菌に対して広域活性を有するが、他のタイプの微生物以上に細菌に選択的である選択因子が選択される。
【００５２】
別の実施形態では、選択因子は、狭域活性を有する薬剤（例えば、限られた数の細菌種に対してしか抗生活性をもたない薬剤）である場合もある。そのような狭域選択因子は、サンプルが特定の微生物を含有することを使用者が見込んでいる場合では、デバイスを設計する際に選択因子として有用である。例として、ナリジクス酸ナトリウムは、シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）に対して使用される狭域薬剤である。この薬剤は、シュードモナス属の種による感染があるか否かを特定するように設計されたデバイスにおける第２のチャネルにおける選択因子として使用される場合がある（第１の報告手段の活性化、しかし、第２の報告手段はこれを示さない）。
【００５３】
別の実施形態では、選択因子によって、グラム陰性微生物の増殖が妨げられる。この実施形態によれば、第１と第２両方の報告手段が活性化されることで、第２のチャネルにおける選択因子によって指標化合物の活性化が妨げられなかったため、対象がグラム陽性微生物に感染していることが示される。（第２でなく）第１の報告手段だけが活性化されれば、使用者によって、グラム陰性感染があることが確かめられる。硫酸ポリミキシンＢ、ゲンタマイシン、又はモノバクタム化合物は、主としてグラム陰性感染に使用されており、本発明のこの実施形態に従って使用することのできる抗生物質である。
【００５４】
グラム陽性微生物は、腹膜炎の発症においてよくある問題である。したがって、本発明の好ましい一実施形態によれば、選択因子によって、グラム陽性微生物の増殖が妨げられる。この実施形態によれば、第１と第２両方の報告手段が活性化されることで、第２の報告手段における選択因子によって指標化合物の吸収可能な変化が妨げられなかったため、対象がグラム陰性微生物に感染していることが示される。しかし、（第２でなく）第１の報告手段だけが活性化されれば、使用者によって、グラム陽性感染があることが確かめられる。
【００５５】
Fusidin（フシジン酸）は、グラム陽性感染があるか否かを確かめるための選択因子として使用することができる。Fusidinは、主としてグラム陽性細菌に対して有効である静菌性抗生物質である。
【００５６】
グラム陽性生物の増殖を阻害する好ましい選択因子は、バンコマイシンである。
【００５７】
有用となりうる他の適切な抗生物質には、他のグリコペプチド、例えば、テラバンシンやテイコプラニン、又はリポペプチド、例えば、ダプトマイシンが挙げられる。
【００５８】
本発明の方法のステップ（ｉ）では、サンプルを、（Ｉ）第１の報告手段、及び任意に（II）第２の報告手段と接触させる。
【００５９】
第１及び第２の報告手段における指標化合物、培地及び／又は栄養素、並びに（必要に応じて）選択因子の量は、報告手段をサンプルと混合した後に得られる結果としての組成物中の最終濃度が適正となるように選択される。サンプルに報告手段を混合して得られるこうした混合物を、本明細書では、「被験液体」と呼ぶ場合がある。
【００６０】
第１及び第２の報告手段中の指標化合物の量は、これが提供される容器の大きさ、及び試験用に確保されるように設計されたサンプルの体積に応じて決まる。試験される液体中の指標化合物（好ましくはＷＳＴ−９）の最終濃度が、０．０１ｍＭより高く、より好ましくは０．０７５ｍＭより高くなるような十分な量の指標化合物が報告手段に含まれることが好ましい。指標化合物は、結果としての組成物中の最終濃度が０．０７５〜１．５ｍＭ、より好ましくは０．１〜１２．０ｍＭの範囲になる量で提供されることが好ましい。
【００６１】
例えば、ＷＳＴ−９は、最終濃度が０．０７５〜１．５ｍＭの範囲、より好ましくは０．１〜１２．０ｍＭの範囲となる量で使用される場合がある。報告手段中の指標化合物（好ましくはＷＳＴ−９）の最も好ましい濃度は、０．２ｍＭ〜６．０ｍＭの範囲、特に、約０．６ｍＭ（例えば、０．６±１．０ｍＭ）である。最も好ましい濃度（０．６ｍＭ）において、これは、被験液体に０．３８ｍｇ／ｍｌのＷＳＴ−９が含まれるのに等しい。好ましい一実施形態では、報告手段は、約１６ｍＬの液体を受け入れるように設計されたチャネル内に提供される。したがって、そのようなチャネルは、約６．０４ｍｇのＷＳＴ−９を含有する。
【００６２】
微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素は、最終濃度が、試験される液体中１〜５０ｇ／Ｌの範囲、好ましくは２〜４０ｇ／Ｌの範囲になる量で存在することが好ましい。一実施形態では、約３３ｇ／ＬのWilkins Chalgren培地が液体中に見出されてもよい（推奨される培地濃度）。しかし、好ましい実施形態では、約２〜１８ｇ／Ｌを、液体中の最終濃度として使用することができる（例えば、１１．６ｇ／Ｌ）。例として、１６ｍＬの液体を受け入れるように設計されたチャネルは、約１００〜５５０ｍｇのWilkins Chalgren培地を含有するのが理想的である。
【００６３】
本発明者らは、液体に対して１０ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度、例えば、液体１ｍＬあたり０．１μｇ〜１００μｇが、試験用液体中の選択因子の適切な最終濃度であることを見出した。選択因子（好ましくは、抗生物質）の必要量は、化合物の性質及びその効力に応じて決まる。［ｙｅｓ？］選択因子がバンコマイシンである好ましい一実施形態では、濃度は、５〜４０μｇ／ｍＬ、例えば約１６μｇ／ｍＬであることが好ましい。例として、１６ｍＬの液体を受け入れるように設計されたチャネルは、約２５６μｇのバンコマイシンを含有するのが理想である。
【００６４】
第１及び第２の報告手段組成物は、１又は２以上のさらなる成分を含んでもよい。
【００６５】
一部の実施形態では、指標化合物の活性化は、酸化還元酵素系の活性を増進する電子メディエーターが報告手段に含まれるとき、（例えば、活性化の閾値及び色の強度に関して）最適化される。したがって、好ましい実施形態では、第１の報告手段は、電子メディエーターを含む。第２の報告手段も、電子メディエーターを含むことが好ましい。
【００６６】
電子メディエーターの例は、当業者によく知られている。例えば、Fultz及びDurst（Analytica Chimica Acta 140 (1992) 1-18）が挙げている電子メディエーター。
【００６７】
適切な電子メディエーターには、ビオロゲン、フェンゾニウム、フェノチアジン、ナフィタン、フェナジン、インジゴ、インダミン、インドフェノール、アントラキノン、ナフトキノン、ベンゾキノン、及びベンザミンが含まれる。
【００６８】
電子メディエーターは、メナジオン又はフェナジン電子メディエーターから選択されることが好ましい。
【００６９】
適切なフェナジン電子メディエーターには、メト硫酸Ｎ−メチルフェナジン（ｍＰＭＳ，N-methyl phenazine methosulphate）、メト硫酸フェナジン（ＰＭＳ，phenazine methosulphate）、エト硫酸フェナジン（ＰＥＳ，phenazine ethosulphate）、ピオシアニン、サフラニンＯ、サフラニンＴ、フェノサフラニン、ベンゾフェナジン、及びニュートラルレッドが含まれる。
【００７０】
好ましい電子メディエーターは、メナジオン、メト硫酸フェナジン（ＰＭＳ）及びその誘導体（例えばエト硫酸フェナジン）である。報告手段に含めるのに特に好ましい一電子メディエーターは、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（ｍＰＭＳ，1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate）である。
【００７１】
電子メディエーター（好ましくはｍＰＭＳ）は、その最終濃度が被験液体中に０．００１ｍＭより高くなるように、第１及び／又は第２の報告手段に含まれることが好ましい。例えば、電子メディエーター（好ましくはｍＰＭＳ）は、第１及び／又は第２の報告手段において、０．００１〜０．１ｍＭの範囲、より好ましくは０．００５〜０．０５ｍＭの範囲で使用される場合がある。一実施形態では、１６ｍＬの液体を受け入れるように設計されたチャネルは、約１００〜３００μｇのｍＰＭＳを含有するのが理想である。
【００７２】
好ましい一部の実施形態では、本発明は、透析患者から採取したサンプルを、微生物の存在について分析する方法であって、
（ｉ）サンプルを
（Ｉ）
（ａ１）指標化合物と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｅ１）電子メディエーターと
を含む第１の報告手段、及び
（II）
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）選択因子と、
（ｅ２）電子メディエーターと
を含む第２の報告手段
と接触させるステップと、
（ii）報告手段を検査して、微生物が存在するか否かを判定するステップと
を含む方法を提供する。
【００７３】
好ましい一部の実施形態では、本発明の方法のステップ（ｉ）は、サンプルを、（III）（ａ３）指標化合物を含む白血球検出手段（a leukocyte detection means）と接触させるステップをさらに含む場合がある。
【００７４】
指標化合物は、色変化指標であることが好ましい。指標化合物は、酸化還元指標であることが好ましい。
【００７５】
指標化合物（ａ３）は、試験用液体、すなわち、サンプルと白血球検出手段を混合した後に得られる混合物中の白血球細胞が閾値濃度に達したとき、色変化を遂げることが好ましい。
【００７６】
当業者なら、閾値濃度は、白血球検出手段の構成要素及びその量に応じて決まることを理解されよう。これらは、当業者によって適宜調整することができる。
【００７７】
白血球細胞の閾値濃度は、試験用液体に対して１０５白血球細胞／ｍｌであることが好ましい。
【００７８】
１０５白血球細胞／透析液ｍｌという濃度は、ＰＤ患者において感染症を診断するための、国際的に認められている基準である。
【００７９】
国際腹膜透析学会（ＩＳＰＤ，International Society for Peritoneal Dialysis）によれば、（少なくとも２時間の停滞時間後）白血球（ＷＢＣ）が１００／μＬより多い排出液細胞カウントは、腹膜炎が原因である可能性が最も高い炎症の存在を示唆する（Li et al., 2010. Peritoneal Dialysis-related Infections Recommendations: 2010 Update, Peritoneal Dialysis International, 30: 393-423）。
【００８０】
白血球検出手段における使用に適する指標化合物には、クリスタルバイオレット、石炭酸フクシン、サフラニン、ニグロシン、インディアンインク、ヨウ素、チール・ネールゼン、ヘマトキシリン、エオシンＹ／黄味のエオシン、パパニコロー、オレンジＧ、黄味のライトグリーンＳＦ、ビスマルクブラウンＹ、ナイルブルー／ナイルブルーＡ、ナイルレッド／ナイルブルーオキサゾン、マッソン・トリクローム、ロマノフスキー、ライト、ジェンナー、レーシュマン、ギムザ、銀、スダンIII、スダンIV、オイルレッドＯ、スダンブラックＢ、コンクリン、マラカイトグリーン、四酸化オスミウム／テトラオキシド、ローダミン、アクリジンオレンジ、カルミン、クーマシーブルー、ＤＡＰＩ、エオシンＢ、臭化エチジウム、酸性フクシン、ヘキスト、メチレングリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド／トルイレンレッド、及びＨＤＴＭＡ／ＣＴＡＢが含まれる。
【００８１】
使用することのできるさらなる指標の例としては、レザズリン（例えば、アラマーブルー）及び１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（アンプレックスレッド）が挙げられる。指標は、検出される白血球の内因性酵素によって活性化されることが好ましく、指標は、細胞の還元酵素（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ還元酵素）の作用によって活性化されることがより好ましい。
【００８２】
白血球検出手段において使用される好ましい指標化合物は、テトラゾリウム化合物である。
【００８３】
白血球検出手段における使用に好ましい指標化合物には、例えば、ＸＴＴ（２，３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド）、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）、又は水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）、例えば、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３、ＷＳＴ−４、ＷＳＴ−５、ＷＳＴ−７、ＷＳＴ−８、ＷＳＴ−９、ＷＳＴ−１０、ＷＳＴ−１１が含まれうる。別法として、インドニトロテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウム（ＴＣＮＢＴ）、テトラゾリウムレッド（ＴＲ）、テトラゾリウムバイオレット（ＴＶ）、ネオテトラゾリウムクロリド（ＮＴＣ）、及び５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリドＣＴＣ）を含む他のテトラゾリウム塩を使用してもよい。
【００８４】
指標化合物（ａ３）は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）であることが好ましい。
【００８５】
指標化合物（ａ３）（適切な例ではＭＴＴ）は、試験用液体中の最終濃度が、液体１ｍＬあたり少なくとも１０μｇ、好ましくは液体１ｍＬあたり少なくとも５０μｇ、より好ましくは液体１ｍＬあたり少なくとも１００μｇ、例えば、液体１ｍＬあたり少なくとも１９０μｇとなる量で提供されることが好ましい。
【００８６】
指標化合物（ａ３）（適切な例ではＭＴＴ）は、試験用液体１ｍＬあたり１０００μｇまで、適切な例では液体１ｍＬあたり７５０μｇまで、好ましくは６００μｇ／ｍＬまで、適切な例では５５０μｇ／ｍＬまで、好ましくは液体１ｍＬあたり５００μｇまでの量で提供される場合がある。
【００８７】
白血球検出手段は、（ｄ）緩衝剤をさらに含むことが好ましい。
【００８８】
緩衝剤は、試験用液体中のｐＨが４〜８、好ましくは５〜７、より好ましくは６〜６．５に保たれるように選択されることが好ましい。
【００８９】
ｐＨをこの範囲内に保つことのできる適切ないかなる緩衝剤を使用してもよい。適切な緩衝剤は、当業者の知るところとなり、例えば、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid）、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２，２’，２”−ニトリロトリエタノール（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ，2,2-bis(hydroxymethyl)-2,2’,2”-nitrilotriethanol）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ，N-(2-acetamido)iminodiacetic acid）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ，piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid)）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ，N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ，3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン，1,3-bis(tris(hydroxymethyl)methylamino)propane）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ，N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ，3-morpholinopropane-1-sulfonic acid）、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ，2-[(2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethanesulfonic acid）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ，3-(N,N-bis[2-hydroxyethyl]amino)-2-hydroxypropanesulfonic acid）、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ，2-hydroxy-3-[tris(hydroxymethyl)methylamino]-1-propanesulfonic acid）、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（ＴＲＩＺＭＡ，2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）／ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物−水和物（ＰＯＰＳＯ，piperazine-N,N’-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)/piperazine-1,4-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid) dihydrate - hydrate）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinepropanesulfonic acid）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ，N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine）、ジグリシン（ＧＬＹ−ＧＬＹ，diglycine）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（ＢＩＣＩＮＥ，N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ，N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(4-butanesulfonic acid)）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ，N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid）、及び２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ，2-amino-2-methyl-1,3-propandiol）が含まれる。
【００９０】
本明細書における使用に特に好ましい一緩衝剤は、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）である。
【００９１】
一部の実施形態では、白血球検出手段は、（ｅ３）電子メディエーターをさらに含む場合がある。適切な電子メディエーターには、第１及び第２の報告手段に関して本明細書に予め記載しているものが含まれる。
【００９２】
好ましい実施形態では、白血球検出手段は、電子メディエーターを含まない。
【００９３】
電子メディエーターは、存在する場合、メナジオン又はフェナジン化合物から選択されることが好ましい。好ましい電子メディエーターは、メト硫酸フェナジン（ＰＭＳ）及びその誘導体（例えばエト硫酸フェナジン）である。報告手段に含めるのに特に好ましい一電子メディエーターは、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（ｍＰＭＳ）である。
【００９４】
本発明の方法のステップ（ｉ）では、サンプルを、
（Ｉ）
（ａ１）指標化合物と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と
を含む第１の報告手段、及び任意に、
（II）
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）選択因子と
を含む第２の報告手段、及び任意に、
（III）
（ａ３）指標化合物と、任意に
（ｄ）緩衝剤と
を含む白血球検出手段
と接触させる。
【００９５】
一部の実施形態では、本発明の第１の態様の第１のステップ（ｉ）は、サンプルを第１の報告手段（Ｉ）及び第２の報告手段（II）と接触させるステップを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明の第１の態様の第１のステップ（ｉ）は、サンプルを第１の報告手段（Ｉ）及び白血球検出手段（III）と接触させるステップを含む。
【００９７】
好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）は、サンプルを、第１の報告手段（Ｉ）、第２の報告手段（II）、及び白血球検出手段（III）と接触させるステップを含む。
【００９８】
本発明の方法のステップ（ｉ）では、サンプルを、
（Ｉ）
（ａ１）指標化合物と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｅ１）電子メディエーターと
を含む第１の報告手段、及び
（II）
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）選択因子と、
（ｅ２）電子メディエーターと
を含む第２の報告手段、及び
（III）
（ａ３）指標化合物と、任意に
（ｄ）緩衝剤と
を含む白血球検出手段
と接触させることが好ましい。
【００９９】
本発明の第１の態様の方法は、報告手段を検査するステップ（ii）をさらに含む。このステップは、微生物が存在するか否かを判定するために実施するのが適切である。
【０１００】
当業者なら、この検査は、報告手段をサンプルと接触させたときに得られる結果としての組成物に対してとなることを理解されよう。本明細書では、これを「被験液体」と呼ぶ場合もある。
【０１０１】
ステップ（ii）は、第１の報告手段及び第２の報告手段を検査するステップを含むことが好ましい。
【０１０２】
一部の実施形態では、ステップ（ii）は、第１の報告手段及び白血球検出手段を検査するステップを含む。
【０１０３】
ステップ（ii）は、第１の報告手段、第２の報告手段、及び白血球検出手段を検査するステップを含むことが最も好ましい。
【０１０４】
第１の報告手段（Ｉ）、存在する場合第２の報告手段（II）、及び存在する場合白血球検出手段（III）は、サンプル中に存在する微生物及び白血球の、報告手段、及び存在する場合白血球検出手段への移行を促進、助長、又は誘発するのに適する期間及び条件下、サンプルに曝すべきである。報告手段へと首尾よく移行した微生物は、微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素の中で維持し、又は倍加させてもよい。この時点で、手段（Ｉ）、（II）、及び（III）は、微生物の存在を使用者に報告するのに必要な反応を報告手段に完遂させるために、サンプルと接触させておいてよい。別法として、サンプルと共に一定期間インキュベートした後、サンプルを、第１及び第２の報告手段、並びに存在する場合白血球検出手段から離し、報告手段組成物及び白血球検出組成物を検査する前に、さらに一定期間インキュベートすることができる。
【０１０５】
インキュベートする期間は、試験されるＰＤ液の性質、またインキュベートを行う温度に応じて決まることは理解されよう。好ましくは、組成物は、少なくとも２時間、好ましくは少なくとも４時間インキュベートすべきである。こうした組成物は、通常、４〜２４時間、好ましくは４〜１８時間、より好ましくは４〜１２時間インキュベートすることができる。好ましいインキュベート時間は、４時間、６時間、８時間、１０時間、又は１２時間である。
【０１０６】
組成物は、室温でインキュベートすることができる。本発明の一実施形態では、組成物は、２０℃、３０℃、又はより好ましくは３７℃でインキュベートされる場合がある。好ましい一実施形態では、組成物は、組成物を所望のインキュベート温度（例えば３７℃）に保つインキュベーターに入れられ、又は載せられる場合がある。
【０１０７】
インキュベートは、３０〜３９℃、好ましくは約３７℃の温度で、好ましくは４〜１０時間、好ましくは８〜１２時間かけて行うのが適切である。一部の実施形態では、デバイスは、インキュベーター内に収まるように成形される場合がある。
【０１０８】
組成物は、インキュベートした後、例えば、約４℃に冷却することが好ましい。この冷却ステップによって、微生物の活動が阻害され、したがって、インキュベート終了後、化合物のそれ以上の活性化は軽減される。
【０１０９】
ステップ（ii）は、第１の報告手段の色、並びに存在する場合第２の報告手段及び／又は白血球検出手段の色を検査するステップを含むことが好ましい。
【０１１０】
一部の実施形態では、第１の報告手段、並びに存在する場合第２の報告手段及び／又は白血球検出手段の色は、色見本と比較される場合がある。第１及び／若しくは第２の報告手段及び／又は白血球検出手段が１つ又は複数のデバイス内に設けられているとき、色見本は、１つ又は複数のデバイスの一端をなしていてもよい。
【０１１１】
好ましい実施形態では、第２の報告手段における選択因子によって、グラム陽性微生物の増殖が妨げられ、デバイスの使用者が、グラム陽性感染とグラム陰性感染を見分けることが可能になる。第１又は第２のどちらの報告手段も活性化されていなければ、排出液の微生物汚染が存在しない、又は排出液における微生物の力価が臨床上有意なレベルより低いことが使用者に知らされる。そのようなレベルは、ＰＤ排出液中によく見出される微生物を別にすれば、特定の微生物次第となり、臨床上有意なレベルは、通常、１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１０５ｃｆｕ／ｍＬ、又はこれを上回るレベルである。
【０１１２】
第１の報告手段が活性化されれば、排出液が微生物で汚染されていることが使用者に知らされる。第１の報告手段が活性化され、第２の報告手段が活性化されないことで、微生物汚染がグラム陽性であることが示されるのに対し、第１と第２の両方の報告手段が活性化されることで、微生物汚染が、（グラム陽性微生物も存在するかに関わりなく）グラム陽性細菌以外の微生物を含むことが示される。
【０１１３】
白血球検出手段が活性化されることで、閾値濃度より高い濃度で白血球が存在することが示され、感染症であることが示唆される。
【０１１４】
一部の実施形態では、第１の報告手段及び／又は第２の報告手段は、白血球の増殖、代謝、及び／又は倍加を妨げる白血球阻害剤をさらに含む場合がある。細菌の存在下で白血球細胞を選択的に阻害するいかなる薬剤を使用してもよい。これは、第１又は第２の報告手段に存在する白血球細胞がこれらの手段を始動させないことを確実にする助けとなりうる。適切な白血球阻害剤には、サポニン及び界面活性剤が含まれる。適切な界面活性剤には、両性、非イオン、及びアニオン界面活性剤が含まれる。
【０１１５】
適切なアニオン界面活性剤には、アルキル硫酸エステル、アルキルエーテル硫酸エステル、脂肪酸、カルボン酸、アルキル又はアリールスルホン酸、イセチオン酸、アルキルリン酸エステル、スルホコハク酸、タウリン酸、サルコシン酸、スルホ酢酸、乳酸、アシルアミノ酸、及びホスホン酸の塩が含まれる。
【０１１６】
適切な非イオン界面活性剤には、脂肪アルコール、アルコキシル化アルコール、アルコキシル化フェノール、アルキルアミンオキシド、アルキルホスフィンオキシド、アルキルスルホキシド、ソルビタン及びスクロースエステル、アルキルポリグルコシド、及びアルコキシル化アルキルポリグルコシドが含まれる。
【０１１７】
適切な両性界面活性剤には、アルキルベタイン、アルキルスルタイン、及びアンホ酢酸塩が含まれる。
【０１１８】
好ましい界面活性剤は、アニオン界面活性剤、特に、硫酸化合物である。
【０１１９】
好ましい一細胞阻害剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，sodium dodecyl sulfate）である。
【０１２０】
アニオン界面活性剤は、適切な例では、被験液体の量を基準として０．００１〜５ｗｔ％、好ましくは０．０１〜１ｗｔ％の量で提供される場合がある。
【０１２１】
一部の実施形態では、白血球検出手段は、細菌の増殖、代謝、及び／又は倍加を妨げる抗菌剤を含む場合がある。白血球の存在下で細菌を選択的に阻害するいかなる薬剤を使用してもよい。これは、白血球検出手段に存在する細菌がこうした手段を始動させないことを確実にする助けとなりうる。
【０１２２】
適切な抗菌剤は、当業者の知るところとなり、例えば、広域抗生物質が含まれる。
【０１２３】
適切な抗菌剤の例としては、ペニシリン及びペニシリン合剤、メロペネム、クロラムフェニコール、第２及び第３世代セファロスポリン、エリスロマイシン、第１世代セファロスポリン（すなわち、セファレキシン）、ダプトマイシン、グリコペプチド、例えばバンコマイシン、シプロフロキサシン、並びにアミノグリコシド、例えばゲンタマイシンが挙げられる。
【０１２４】
これらは、適切な例では、被験液体中に０．０１〜１ｍｇ／ｍＬとなる量で含まれる。
【０１２５】
組成物（Ｉ）及び（II）及び／又は（III）は、方法において使用されるとき、個々の容器に別々に提供される場合がある。
【０１２６】
組成物（Ｉ）及び（II）及び／又は（III）は、存在する場合、別々に提供される場合もあり、又は同じデバイスの一端として提供される場合もある。
【０１２７】
本発明の第２の態様によれば、液体を汚染しうる微生物を検出及び／又は特定するためのデバイスが提供され、前記デバイスは、液体を受け入れるように配置されている２つのチャネルを含み、
第１のチャネルは、
（ａ１）指標化合物と、
（ｂ１）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と
を含む第１の報告手段を収容し、
第２のチャネルは、
（ａ２）指標化合物と、
（ｂ２）微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素と、
（ｃ）微生物の増殖を選択的に阻害する選択因子と
を含む第２の報告手段を収容する。
【０１２８】
第２の態様の好ましい特色は、第１の態様に関して規定したとおりである。ここで、本発明の第１及び第２の態様のさらなる好ましい特色について記載する。
【０１２９】
一部の実施形態では、第１の態様の方法は、第２の態様のデバイスを使用して実施される。
【０１３０】
本発明によるデバイスが、種々様々な液体において微生物を検出又は特定するのに使用できることは理解されよう。本デバイスは、産業又は環境の場において排出液を試験するのに有用である。本デバイスは、生物学的液体（例えば、気管支肺胞洗浄液、血清、脳脊髄液、尿など）の試験に使用することが好ましく、本デバイスを、ＰＤ排出液における微生物の検出又は特定に使用することが最も好ましい。
【０１３１】
第１のチャネルに存在する第１の報告手段は、第１の態様に関して規定したとおりであることが好ましい。指標化合物は、水溶性テトラゾリウム塩であることが好ましい。
【０１３２】
第１の報告手段は、（ｅ１）電子メディエーターをさらに含むことが好ましい。
【０１３３】
第２のチャネルに存在する第２の報告手段組成物は、第１の態様に関して規定したとおりであることが好ましい。指標化合物は、水溶性テトラゾリウム塩であることが好ましい。
【０１３４】
第２の報告手段は、（ｅ２）電子メディエーターをさらに含むことが好ましい。
【０１３５】
第２の態様のデバイスは、（ａ３）指標化合物を含む白血球検出手段を含む第３のチャネルをさらに含むことが好ましい。
【０１３６】
第３のチャネルに設けられる白血球検出手段は、第１の態様に関して規定したとおりであることが好ましい。
【０１３７】
白血球検出手段は、（ｄ）緩衝剤をさらに含むことが好ましい。
【０１３８】
一部の実施形態では、白血球検出手段は、（ｅ３）電子メディエーターをさらに含む場合がある。
【０１３９】
第２の態様の他の好ましい特色は、第１の態様に関して規定したとおりである。
【０１４０】
ここで、本発明の第１及び第２の態様のさらなる好ましい特色について規定する。
【０１４１】
本発明の第１の態様は、透析患者から採取したサンプルを、微生物の存在について分析する方法であって、
（ａ）本発明の第２の態様によって提供されるデバイスを、分析するサンプルと接触させるステップと、
（ｂ）報告手段を検査するステップと
を含む方法となることが好ましい。
【０１４２】
デバイスのチャネルは、報告手段の成分を保持することができ、サンプル液体を導入することのできる、適切ないかなる器でもよい。チャネルの中身が、デバイスの使用者によって容易に観察できるようなデバイスも、設計すべきである。
【０１４３】
好ましい一実施形態では、各チャネルは、報告手段を含有するバッグであり、各バッグは、液体を受け入れるための、それに接続した管を有する。このようなバッグは、当業界でよく知られているいくつかの材料から形成される場合があり、好ましい一実施形態では、このようなバッグは、ＰＶＣから形成される。
【０１４４】
バッグは、２枚のＰＶＣシートを、シールする前に２枚のシートの間に置かれた報告手段の成分と一緒にシールすることにより形成されることが好ましい。シートの少なくとも一方は、（中身を見るために）透明にすべきであり、一方のシートが透明であり、他方のシートが不透明、好ましくは白色であることが好ましい。
【０１４５】
図２に、チャネルがバッグを含む本発明の一実施形態を図示し、実施例２に、そのようなバッグをいかに形作ることができるかについて記載する。
【０１４６】
チャネルは、特に、（図２に示すように）管系に接続したバッグであるとき、適切なケーシング内に収容されるのが理想的であることは理解されよう。
【０１４７】
好ましい一部の実施形態では、ケーシングには、使用者が、第１及び存在する場合第２の報告手段並びに存在する場合白血球検出手段の色を、チャートに示された色と比較できるようにする、色見本が組み込まれている。チャート上の色は、微生物及び／又は白血球の存在下／非存在下で予想される色の実例になる。
【０１４８】
図１には、チャネルの保持に使用することのできるケーシング／容器の部類を示す。容器は、チャネル内の報告手段及び白血球検出手段の上に並べられている３つの覗き窓を上面に備えていて、使用者は、チャネルにある液体が微生物に感染しているか否かを観察することが可能になる。好ましい一実施形態では、報告手段及び白血球検出手段の成分は、カプセル内に収容されている。こうしたカプセルは、液体がチャネルに導入されると溶解して、その中身を液体の中に放出する。指標化合物がＷＳＴ化合物であるとき、デバイスの使用者は、液体が感染／汚染されていなければ澄んだ又は麦藁色に濁った液体を認めるが、微生物が液体に感染している場合、第１及び／又は第２のチャネル内の液体は、暗色／紫色に変わる（ＷＳＴがホルマザンに還元される）。ＭＴＴが、使用指標化合物である場合では、白血球細胞が存在すると、白血球チャネルは、青に変わり、感染が示される。
【０１４９】
実施例２に、Tyvek蓋を有する熱形成されたブリスタートレーの形態である最も好ましいケーシングを備えたデバイスの組立てを記載する。
【０１５０】
液体は、いくつかの方法で、デバイスのチャネルそれぞれに適用される場合がある。例えば、チャネルが、管を取り付けたバッグである、本発明の実施形態では、滅菌注射器を使用して液体サンプルを吸い上げ、注射器を管に取り付けることにより、液体をチャネルに挿入することができる。次いで、チャネル内の液体によって、報告手段の成分の混合が可能になり、適切な期間インキュベートされた後、液体中の微生物によって、指標が、例えば色変化を遂げる。別法として、液体は、デバイスにポンプで送られ、又はそれどころか重力によって入る場合もある（すなわち、液体は、液体容器より下に置かれたデバイスに流れ込む）。
【０１５１】
報告手段及び白血球検出手段の成分（例えば、指標化合物、微生物増殖を支持又は助長する培地及び／又は栄養素など）は、チャネル内に直接挿入される粉末を構成している場合がある。例えば、チャネルは、報告手段又は白血球検出手段の各成分が注入されるバッグを含む場合がある。
【０１５２】
しかし、各チャネル／バッグは、ある種の媒体に載せられ、又は詰められている、報告若しくは白血球検出手段又はその個々の成分を収容していることが好ましい。そのような媒体は、本発明に従ってデバイスを製造する最適な方法を設計するのに有用であり、デバイス、又は少なくとも報告及び／若しくは白血球検出手段の成分が滅菌される必要があるとき、特に有用となりうる。
【０１５３】
いくつかの媒体が使用される場合がある。例えば、報告又は白血球検出手段の成分は、フィルターディスクに適用されている、濃縮された溶液にされる場合がある。次いで、フィルターディスクを、関係のある成分が保持されるように乾燥させ、次いで、フィルターディスクをチャネル内に置く。一実施形態によれば、選択因子（例えば、バンコマイシン）がフィルターディスクに適用される場合もある。例として、６ｍｍのワットマン又はOxoidフィルターディスクに、報告手段又は白血球検出手段成分（例えば、指標化合物、選択因子、又は電子メディエーター）の濃縮保存液２０μｌを含浸させることができる。こうしたディスクは、次いで、（例えば、３７℃で１８時間又は完全に乾くまで）乾燥させるべきである。次いで、乾燥したディスクを、該当するチャネルに挿入することができる。別法として、ディスクを濃縮保存溶液に浸漬してもよい。
【０１５４】
一部の実施形態では、市販品として入手可能な、含浸フィルターディスクを使用することができる。
【０１５５】
別法として、報告手段又は白血球検出手段の成分を、適切な結合剤及び賦形剤と組み合わせて錠剤を形成し、錠剤をチャネル内に置くこともできる。
【０１５６】
報告手段、白血球検出手段、又はその成分のための媒体は、１又は複数のカプセルであることが好ましい。一実施形態では、１つのチャネルのすべての成分が１つのカプセル内に保持される。別の実施形態では、チャネルは、２つ以上のカプセルを収容し、報告手段又は白血球検出手段の成分が異なるカプセル内に収容される場合もある。
【０１５７】
本発明において使用されるカプセルは、試験される液体に接触したとき、溶解すべきであり、また無色であるか、又は少なくとも、報告手段の可視化に影響を及ぼさない色であるのが理想的である。カプセルは、当業界でよく知られており、当業者なら、カプセルを挿入する必要のある特定のチャネルに合うカプセルを容易に選択することができる。好ましいカプセルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）又はゼラチンから形成されたものでよい。
【０１５８】
使用するカプセルの大きさは、報告手段又は白血球検出手段（又はチャネルに導入する必要のあるその成分）の量に応じて決まり、したがって、ひいては、チャネルの大きさ、及びチャネルに保持されるように設計されている液体の量に応じて決まる。例として、本発明者らは、１６ｍＬ程度の試験用液体を受け入れるように設計されたチャネルに、５号サイズのCapsugel Vcapカプセルが適切に使用できることを見出した。
【０１５９】
一実施形態では、第１又は第２の報告手段のすべての成分が、単一のカプセル内に保持される。例えば、カプセルは、ＷＳＴ−９、Wilkins Chalgren培地、ｍＰＭＳ、及び任意にバンコマイシンを含有する場合がある。
【０１６０】
一実施形態では、白血球検出手段は、１６ｍＬ程度の試験用液体を受け入れるように設計されたチャネルにおいて使用されるカプセル内に保持される。
【０１６１】
一部の実施形態では、第１及び／若しくは第２の報告手段及び／又は白血球検出手段の成分は、賦形剤と混合され、次いでカプセル充填に使用される。好ましい賦形剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又はその誘導体である。ＰＶＰは、誤った始動を引き起こさず、又は色変化を隠さなかったため、好ましい。それどころか、本発明者らは、驚いたことに、ＰＶＰが、ＷＳＴ−９がホルマザンに還元されるときに生じる色変化を増進し、強化するらしいことを見出した。
【０１６２】
好ましい一部の実施形態では、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が賦形剤として使用される。これは、例えば、報告手段の成分を賦形剤と混合する必要がある状況（例えば、錠剤を形成するとき、又はカプセル充填を円滑にするため）においてありうる。
【０１６３】
一部の実施形態では、第１の報告手段がポリビニルピロリドンを含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、第２の報告手段がポリビニルピロリドンを含む。
【０１６５】
被験液体中のＰＶＰの最終濃度は、０．２５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰより高いことが好ましく、より好ましくは、少なくとも０．８％（ｗ／ｖ）ＰＶＰとすべきである。本発明の一実施形態によれば、ＰＶＰの最終濃度は、約１．２５％（ｗ／ｖ）にすべきである。本発明の別の実施形態では、ＰＶＰの最終濃度は、約３．０％（ｗ／ｖ）までになる場合がある。当業者なら、カプセルなどにおいて賦形剤として使用するＰＶＰの量は、こうした好ましい範囲内にあるＰＶＰの最終濃度を視野に入れながら調整してよいことを理解されよう。
【０１６６】
好ましい一部の実施形態では、第１のチャネルが、Wilkin Chalgren培地、ＷＳＴ−９、ｍＰＭＳ、及びＰＶＰを含む第１の報告手段を含み、第２のチャネルが、Wilkins Chalgren培地、ＷＳＴ−９、ｍＰＭＳ、バンコマイシン、及びＰＶＰを含む第２の報告手段を含み、第３のチャネルが、ＭＴＴ及びＭＥＳ緩衝剤を含む白血球検出手段を含む。
【０１６７】
各チャネルの成分は、適切ないかなる形態で提供されてもよい。それらの成分は、粉末、錠剤、ゲル、溶液、又はペーストとして提供される場合がある。
【０１６８】
各成分が、カプセル内に粉末状の形態で提供されることが好ましい。各カプセルは、個々の成分を１又は２以上含む場合がある。
【０１６９】
第１のチャネルは、１又は２以上のカプセルを含む場合がある。
【０１７０】
第２のチャネルは、１又は２以上のカプセルを含む場合がある。
【０１７１】
第３のチャネルは、１又は２以上のカプセルを含む場合がある。
【０１７２】
好ましい一部の実施形態では、第１の報告手段の成分のすべてが、単一のカプセルに提供される。
【０１７３】
好ましい一部の実施形態では、第２の報告手段の成分のすべてが、単一のカプセルに提供される。
【０１７４】
好ましい一部の実施形態では、白血球検出手段の成分のすべてが、単一のカプセルに提供される。
【０１７５】
一部の実施形態では、各チャネルが、単一のカプセルを含む。
【０１７６】
本発明の一実施形態では、第１のチャネルは、
（１）Wilkins Chalgren培地を含有するカプセルと、
（２）ＷＳＴ−９とＰＶＰの混合物を含有するカプセルと、
（３）ｍＰＭＳとＰＶＰの混合物を含有するカプセルと
を含む第１の報告手段を収容し、
第２のチャネルは、
（１）Wilkins Chalgren培地を含有するカプセルと、
（２）ＷＳＴ−９とＰＶＰの混合物を含有するカプセルと、
（３）ｍＰＭＳとＰＶＰの混合物を含有するカプセルと、
（４）バンコマイシンを含浸させた濾紙と
を含む第２の報告手段を収容し、
第３のチャネルは、
（１）ＭＴＴを含有するカプセルと、
（２）ＭＥＳ緩衝剤を含有するカプセルと
を含む白血球検出手段を含む。
【０１７７】
本発明の第２の態様によるデバイスを使用すると、微生物汚染又は感染を、早い段階で簡便に検出することができる。これは、治療をより速やかに開始することができ、それだけ感染症／汚染をより容易にコントロールできるということである。
【０１７８】
液体が臨床サンプルであるとき、微生物が早期に検出されることで、対象をより早くから治療することが可能になり、これによって、ひいては、感染症（例えば、ＲＲＴ患者における腹膜炎）と関連する罹病率及び死亡率が低減される。早期の治療は、入院の必要を減らし、それによって費用が節約されるため、公共医療のためにもなる。さらに、ＰＤ排出液を試験する場合、腹膜炎がコントロール及び／又は予防されることで、ＰＤでの患者の現状維持が可能になる。
【０１７９】
本発明の第２の態様によるデバイスでは、有利なことに、液体中にいる微生物のタイプについての追加の情報も提供される。この情報は、臨床医が最善の治療を選択したいと望むとき（例えば、デバイスがＰＤ排出液などの臨床サンプルの試験に使用されるとき）、重要である。
【０１８０】
本発明の好ましい使用は、臨床液体サンプルを試験するための使用、特に、診療室、患者の自宅、及び「診療現場」である他の場所での使用である。
【０１８１】
本発明の最も好ましい使用は、患者が腹膜炎を発症している又は発症したことがあるか否かを評価するためにＰＤ排出液を試験するための使用である。ＰＤ排出液は、収集され、次いで病棟で試験される場合もあり、又は試験のために検査室に発送される場合さえある。しかし、デバイスは、患者の腹部に存在していたＰＤ排出液を必要な時間をかけて除去するときに患者が従う決まった手順に統合されることが好ましい。
【０１８２】
本発明によるデバイスは、持続的外来腹膜透析（ＣＡＰＤ，Continuous ambulatory peritoneal dialysis）のために守られる手順と共に使用できるように、又はそれと統合さえできるように適合させることが好ましい。ＣＡＰＤでは、重力を使用して液体が腹腔の外に排出され、新鮮な液体と入れ替えられる。各交換には、３０分程度かかり、ほとんどの患者は、１日あたり４回の交換を行う必要がある。
【０１８３】
本発明によるデバイスは、自動腹膜透析（ＡＰＤ，Automated peritoneal dialysis）において使用される装置と共に使用できるように、又はそれと統合さえできるように適合させることが最も好ましい。ＡＰＤは、腹部の内外に液体を移動させる機器を使用して、夜間、患者が眠っている間に、通常は８〜９時間かけて行われるのが普通である。機器は、ベッド脇のテーブルの上に置いたままにされるほど小型である。本発明によるデバイスは、このような機器からの排出液ラインに適合しうるように、したがって、排出液を、ポンプで送り出されて廃棄物になる前に微生物汚染について試験できるように設計されることが好ましい。
【０１８４】
好ましい実施形態では、本発明のデバイスのチャネルは、ケーシング内に設けられる。ケーシングは、チャネルの中身の観察を可能にする１又は２以上の覗き窓を有するのが適切である。
【０１８５】
デバイスが３つのチャネルを有する好ましい一部の実施形態では、各チャネルに１つずつ、３つの覗き窓が設けられる。
【０１８６】
好ましい一部の実施形態では、ケーシングは、使用者が、各チャネルにおいて目に見える色をチャート上の色と比較するのを可能にする色見本を含む。これにより、微生物及び／又は白血球がチャネルに存在するかどうかの指標が適切に得られる。
【０１８７】
適切な例では、色見本は、色見本とチャネルが隣り合うように、覗き窓に近接した範囲に設けることができる。
【０１８８】
好ましい実施形態では、本発明は、実質的に、本説明及び図面に記載するとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
ここで、本発明について、以下の図を参照しながら詳細に説明する。
【図１】本発明において使用することのできるデバイスの上面及び２側面からの斜視図である。
【図２】図１のデバイス内のチャネルの透視図である。
【図３】報告手段、及び微生物なし（対照）又は１０４〜１０６ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（ＳＡ，Staphylococcus aureus）若しくは緑膿菌（ＰＡ，Pseudomonas aeruginosa）を含んでいる管の写真である。上の列の管は、選択因子を含有しなかったが、下の列は、バンコマイシンを含有していた。
【図４】上の列の写真は、非感染排出液バッグの外観、並びに排出液バッグからのＰＤ排出液と共に０時間及び８時間インキュベートした後のチャネル１及び２（第１及び第２の報告手段）の像を示し、下の列の写真は、臨床医が感染したことを疑った排出液バッグの外観、並びに疑わしい排出液バッグからのＰＤ排出液と共に０時間及び８時間インキュベートした後の（デバイスケーシングから取り出された）チャネルの像を示す。
【図５】インキュベート前並びに０時間及び１０時間のインキュベート後の白血球検出手段を示す写真である。
【図６】各チャネルについて、考えられる帰趨、及び感染に関してそれが何を示唆するのかを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１９０】
図１は、本発明によるデバイス１の上面及び２側面からの斜視図である。デバイスは、上面において透明な覗き窓３、４、５を有する不透明なプラスチックケーシング２を含む。第１の覗き窓３は、ケーシング内に収容された第１のチャネル３０の真上に並べられ、第２の覗き窓４は、ケーシング内に収容された第２のチャネル４０の真上に並べられ、第３の覗き窓５は、ケーシング内に収容された第３のチャネル５０の真上に並べられる。覗き窓３、４、５は、チャネルの中身をデバイスの使用者が観察できるような位置にある。使用時、液体は、入口６から導入され、管系（図１には示さず）を通って、報告手段を収容するチャネル（これも図１には示さず）に流れ込む。
【０１９１】
図２は、図１に示すケーシング２内に収容されるチャネル３０、４０、５０の透視図である。管系は、液体を、この実施形態では透明な上部面を有するバッグである第１のチャネル３０、第２のチャネル４０、及び第３のチャネル５０に伝える。管系は、液体及び報告手段が管系を上って逆流するのを防止する一方向弁３１、４１、５１、６１を含む。第１のチャネル３０内の報告手段は、ＷＳＴ−９、ｍＰＭＳ、Wilkins Chalgren培地、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）充填剤を含有する１又は２以上のカプセルを含む。第２のチャネル４０内の報告手段は、ＷＳＴ−９、ｍＰＭＳ、Wilkins Chalgren培地、ＰＶＰ充填剤を含有する１又は２以上のカプセルを含み、フィルターディスクに含浸させたバンコマイシンも備えられている。カプセルはそれぞれ、液体がチャネルに導入されると溶解する。報告手段の諸成分は、液体がチャネルに導入されると、有効に混ざり合う。第１のチャネルにおけるＷＳＴ−９は、液体中に微生物が存在する場合、暗い色のホルマザンに還元され、第２のチャネルにおけるＷＳＴ−９は、液体中に、バンコマイシンに抵抗性である微生物が存在する場合、暗い色のホルマザンに還元される。
【０１９２】
白血球検出手段５０は、１又は２以上のカプセル内に、ＭＴＴ及びＭＥＳ緩衝剤を含む。
［実施例］
【０１９３】
本発明者らは、液体の微生物汚染を検出するのに使用できる、市販品として入手可能な、小型で簡素な製品がなかったことに気付いた。特に、ＰＤ排出液などの液体中の微生物のタイプを識別するのに使用できる、利用可能なデバイスは存在しなかった。
【０１９４】
最初の原理実証実験を行って、微生物を識別／選択することができ、そのような報告手段が始動する閾値を制御することもできるデバイスを創出することができるか否かを確かめた。
【０１９５】
１．報告手段の成分の調製
ＷＳＴ−９、ｍＰＭＳ、及びＰＶＰを含む報告手段を、異なる８細菌種の存在下で試験した。１０５ＣＦＵ／ｍｌの全細菌によって、３７℃で８又は１０時間以内にテトラゾリウムが還元されて色変化を実現できたことが確かめられた。
【０１９６】
カプセル充填
空のカプセルをブランクとして秤量した。活性物の量を秤量し、それを５号サイズのカプセルに加えることにより、ＰＶＰ賦形剤と合わせた各活性成分（すなわち、ＷＳＴ−９、ｍＰＭＳ、及びバンコマイシン）のタップ密度を確かめた。ＰＶＰ賦形剤を加え、満杯になるまでカプセルに圧縮した。カプセルを再び秤量して、５号サイズのカプセルに充填するのに必要となる賦形剤の質量を各活性成分について確かめた。これを５回繰り返して、各活性物及び賦形剤について、カプセルの平均重量を取得した。
【０１９７】
１００倍の質量の各活性物及び賦形剤を調製し、十分に混合して、活性物が賦形剤の全域に均等に分布している、均質な粉末の混合物を生成した。これを使用して、Feton Fastlock Kitを用いながら１００個のカプセルに充填した。
【０１９８】
バンコマイシンフィルターディスクの調製
６ｍｍのワットマンフィルターディスクを、バンコマイシンの水中保存液に浸漬することにより含浸させた。これらを、３７℃で１８時間又は完全に乾くまで、単一シートとして乾燥させた。各ディスク上の抗生物質の最終濃度は、２５６μｇであった。
【０１９９】
２．本発明によるデバイスの組立て
自動腹膜透析（ＡＰＤ）機器（Baxter社）からのＰＤ排出液の微生物汚染を検出するためのデバイスは、以下の手順によって製造される。
【０２００】
チャネルの製作及びチャネルへの報告手段の装入
１．白色のＰＶＣ材料に、透明なＰＶＣを重ね合わせ、両方を９３ｍｍ×７０ｍｍに裁断する。
２．最も長い端を溶接し、バッグの中央を溶接することにより２つのチャネルを創出する。
３．上端において、２本の管（直径３．０ｍｍ、長さ２５ｍｍ）を、各チャネルに１本ずつ挿入し、管を取り囲んでシールすることにより固定する。
４．カプセルを、第１のチャネルとなるＰＶＣシートの間に挿入し、下端をシールする。
５．カプセル及びバンコマイシンフィルターディスクを、第２のチャネルとなるＰＶＣシートの間に挿入し、下端をシールする。
６．カプセルを、第３のチャネルとなるＰＶＣシートの間に挿入し、下端をシールする。
７．白色のＰＶＣ製一方向逆止め弁を、管のそれぞれに挿入する。
８．２本の軟質ＰＶＣ管を各弁に固定する。２本の管をＰＶＣ製Ｙ字コネクタによってつなげ、それに、長さ１メートルの単一の管を取り付ける。
【０２０１】
デバイスの組立て
９．バッグ／チャネル組立品を、熱形成されたブリスタートレーを含むケーシングに挿入し、ブリスタートレーにある予め形成された凹みに弁を押し込むことにより、組立品を固定する。
１０．ブリスタートレーの右側にある穴を通して管を送る。
１１．管の末端に、弁に続いて、排出液がそこからサンプル採取される腹膜透析消耗品と互換性のあるオスルアーロックを取り付ける。
１２．ルアーロックをキャップで保護する。
１３．ブリスターパックを、バッグチャネルを可視化することのできる２つの透明窓を有する不透明なTyvek蓋でシールする。
１４．ブリスタートレー及び管系を、ＰＥＴ／ＰＥ／Tyvekピールポーチに封入し、箱に入れて包装する。
【０２０２】
３．本発明によるデバイスにおいて使用されるチャネルの試験
透析排出液サンプルを、腹膜透析患者から、患者の腹膜を透析物で最短２時間満たすことにより取得した。この停滞時間の後、液体を腹膜から排出させ、デバイスのチャネルを、１チャネルあたり１６ｍｌで満たすことにより、サンプルを試験した。次いで、チャネルを３７℃で８時間インキュベートし、その後、結果を読み取った。
【０２０３】
図４に、患者が自動腹膜透析（ＡＰＤ）を受けていた診療室からのＰＤ排出液バッグで実施した２件の例示的な試験の第１及び第２のチャネルの写真を示す。
【０２０４】
上の列の写真は、申し分なく思われた患者から収集されたＰＤ排出液からのチャネルの外観を示している。３７℃で０時間及び８時間インキュベートした後のチャネルの写真を撮影しており、チャネル内の報告手段が、８時間インキュベートした後も活性化されなかったことを認めることができる。排出液バッグの写真も撮影しており、液体が比較的澄んでいるのを認めることができる。これらの結果から、患者が腹膜炎に罹患していないことが示唆され、その後、臨床医によって、患者が申し分ないままであることが確認された。
【０２０５】
下の列の写真は、調子が悪いと感じ始めていた患者から収集されたＰＤ排出液からのチャネルの外観を示している。３７℃で０時間及び８時間インキュベートした後のチャネルの写真も撮影した。排出液バッグについても写真を撮影しており、液体が濁っているように見えたのを認めることができる。図は、第１及び第２両方のチャネル内の報告手段が活性化されていたことを示している。これによって、患者が腹膜炎に罹患していること、及び腹膜炎が、グラム陰性生物によって引き起こされている可能性があることが示唆された（第２のチャネルにおけるバンコマイシンがレポーターの活性化を阻害しなかった）。２日後、臨床医が、病院の試験検査室からの確証を受け取って、患者がグラム陰性感染を起こしていることを確認した。デバイスによって、感染症、及び感染症のタイプまでもが、正確かつ迅速に（日常的な検査室の試験より２日早い）特定されたことが理解されよう。これには、臨床医が、デバイスを使用することで、腹膜炎の治療について、情報に基づいた早期の決断を下すことができるという大変な強みがある。これは、ひいては、患者の転帰を向上させ、金銭を節約することになり、また、早い段階で感染症の特定及び治療を済ますことのできる患者は、（ＨＤへの乗換えが求められるというより）ＰＤで現状維持される見込みがより高いという利点もある。
【０２０６】
本発明による白血球検出チャネルも調製した。このチャネルは、ＭＥＳでｐＨ６．５に緩衝処理されたＭＴＴを含有した。このチャネルを使用して、ＰＤ排出液サンプルを試験した。調子がよいと感じており、白血球細胞が閾値濃度を下回っていることが別途確認された患者からの澄んだ第１の液体サンプルを、調子が悪いと報告し、高濃度の白血球を含むことが別途確認された患者からの濁ったサンプルと共に試験した。図５には、上の列に、調子のよい患者からのサンプルを、当初と１０時間インキュベートした後について示す。下の列には、調子の悪い患者からのサンプルを示す。
【０２０７】
４．臨床の場における本発明によるデバイスの使用
ＰＤ排出液の微生物汚染をモニターするために、本発明によるデバイスを、自動腹膜透析（ＡＰＤ）機器（Baxter社）と併せて使用したときに、プロトコールを打ち立て、従った。
【０２０８】
デバイスの使用者には、次のように指示した。
１．手を入念に洗って乾かし、無菌技術を使用して、サンプル採取デバイスを汚染するリスクを減らす。
２．デバイス包装を開封する。
３．排出液サンプルライン上のクランプを確実に閉じるようにする。
４．サンプルラインからキャップを取り外す。
５．デバイスから赤いキャップを取り外す。キャップは取っておく。
６．デバイスをサンプルラインに接続し、ロックがかかるまでひねる。
７．デバイスを、床の上の、排液バッグの位置に置く。
８．治療を開始するときは、Baxter機器についての説明書に従う。
９．「最初の排出」の時点で、４０秒間待機する。
１０．サンプルライン上のクランプを開け、排出液でデバイスが満たされるようにする。これには、２分以下しかかからないはずである。
１１．デバイスが満杯になれば、サンプルライン上のクランプを閉じる。
１２．サンプルラインからデバイスの接続を絶ち、コネクタにキャップを締め直す。
１３．インキュベーターがプラグで確実にオンになるようにする。
１４．サンプル採取デバイスをインキュベーターに運び、中に入れる。
１５．扉を閉じ、スタートを押す。
１６．デバイスは、３７℃に温められ、この温度で１０時間インキュベートされたままとなり、その後、４℃（冷蔵庫温度）に冷却される。
１７．最短で１０時間後、デバイスを見ることができる。
１８．直ちにデバイスを見る準備ができていない場合、デバイスを、扉を閉じたインキュベーターに入れたままにすると、結果は確定したままとなる。デバイスを取り出したら、１時間以内に読み取らなければならない。
【０２０９】
５．デバイスの読み方の説明
図６に、本発明による３チャネルデバイスを使用して取得される場合のある、考えられる結果の概略図を提供しており、デバイスは、以下のものを含んでいる。
チャネル１（第１の報告手段）：
ＷＳＴ−９
ｍＰＭＳ
ＰＶＰ
チャネル２（第２の報告手段）：
ＷＳＴ−９
ｍＰＭＳ
ＰＶＰ
バンコマイシン
チャネル３（白血球検出手段）：
ＭＴＴ
ＭＥＳ
【図１】
2019534694.tif 000004
【図２】
2019534694.tif 000005
【図３】
2019534694.tif 000006
【図４】
2019534694.tif 000007
【図５】
2019534694.tif 000008
【図６】
2019534694.tif 000009
【国際調査報告】
2019534694.tif 000010
2019534694.tif 000011
2019534694.tif 000012
2019534694.tif 000013