(57)【要約】  本発明は、精子の分離に関する。特に、本発明は、精子の電気泳動分離におけるポリビニルアルコール膜の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動による精子の分離における少なくとも１つのポリマー膜の使用であって、前記膜がポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含む、前記使用。
【請求項２】
ＰＶＡを含む前記膜が、ポリアクリルアミド（ＰＡｍ）を含有しない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＰＶＡを含む前記膜が、電場の通過を許容するが精子の通過を許容しない膜（制限膜）である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記制限膜が、１５ｋＤａ未満、好ましくは５ｋＤａ未満の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記制限膜が、キャスティングおよびアニーリング法によって作製されたものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＰＶＡを含む前記膜が、多孔性サイズ排除膜（分離膜）である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記分離膜が、１０μｍ未満、好ましくは８μｍ未満、より好ましくは５μｍ未満の孔径を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記分離膜が、非溶媒誘起転相法（non-solvent induced phase inversion method）およびその後のポストアニーリングによって作製されたものである、請求項６または請求項７に記載の使用。
【請求項９】
精子を第１の溶液から第２の溶液中に分離する方法であって、
ＰＶＡを含む第１の制限膜と第２の制限膜との間に配された分離膜を含む膜スタックに前記第１の溶液を提供するステップであり、前記第１の溶液が、前記第１の制限膜と前記分離膜との間に位置し、かつ、前記分離膜が、予め選択された孔径を有する、前記提供するステップ、および
前記スタックにわたって電場を印加するステップ
を含み、
負電荷を有しかつ前記予め選択された孔径より小さい前記第１の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、前記分離膜を通過して、前記分離膜と前記第２の制限膜との間に位置する前記第２の溶液中に移動する、
前記方法。
【請求項１０】
前記制限膜および前記分離膜が、ＰＡｍを含有しない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離膜が、ＰＶＡを含む、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
精子を第１の溶液から第２の溶液中に分離する方法であって、
ＰＶＡを含む分離膜によって前記第１の溶液および前記第２の溶液を分離するステップであり、前記分離膜が、予め選択された孔径を有する、前記分離するステップ、
前記第１の溶液および前記第２の溶液にわたって電場を印加するステップであり、負電荷を有しかつ前記予め選択された孔径より小さい前記第１の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、前記分離膜を通過して前記第２の溶液中に移動する、前記印加するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記分離膜が、ＰＡｍを含有しない、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、オーストラリア仮特許出願第２０１６９０４２６３号（出願日：２０１６年１０月２０日）の優先権を主張し、該仮出願の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、精子の分離に関する。特に、本発明は、精子の電気泳動分離のためのポリビニルアルコール膜の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書の全体を通じての先行技術のいかなる議論も、そのような先行技術が広く公知であること、またはその分野における技術常識の一部を形成することを認めるものと決して考えてはならない。
【０００４】
生殖補助技術（ＡＲＴ）にとって大きな課題の１つは、迅速、効率的、かつ機能的な、精子を損傷することなく単離できる精子の調製方法を開発することである。
【０００５】
スイムアップ技術および密度勾配遠心分離は、精子を分離するためにＡＲＴ産業によって広く採用されているが、欠点を有する。スイムアップ技術は、精子の運動性に依存し、精子運動性に障害がある患者にとって効果的な技術ではない。スイムアップ技術はまた、精液試料が白血球で汚染されている場合、精子を酸化ストレスにさらすことがある（Aitken & Clarkson, J. Androl. 1988, 9: 367-376；Baker et al., Fertil. Steril. 1996, 65: 411-419）。不連続密度勾配を通じた遠心分離は、スイムアップ技術に関連する問題の一部を克服し、ＡＲＴのための精子の分離の標準的な方法として広く認められている（Aitken et al., Biol. Reprod. 1998, 59: 1037-1046）。しかしながら、不連続密度勾配法は、少数の運動性精子を含有する試料または液化が乏しい試料では効果的でない（Mortimer, Reprod. Fertil. Dev. 1994, 6: 25-31）。さらには、該方法は、精子において酸化的ＤＮＡ損傷のレベルを増加させることがある（Aitken et al., Hum. Reprod. 2010, 25: 2415-2426）。
【０００６】
電気泳動による精子の分離は、精子を分離するためのスイムアップ技術および密度勾配遠心分離の実行可能な代替となる。この方法は、良好な質の精子は負電荷を有することによって特徴付けられるという観察に基づく（Ainsworth et al., Human Reprod. 2005, 20: 2261-2270）。
【０００７】
電気泳動は、電場の影響下での液体に対する分散粒子の運動である。特定の大きさおよび／または電荷の高分子または細胞の通過を許容する多孔性膜との電気泳動の組合せは、高分子または細胞の分離および／または精製を可能とする。
【０００８】
高分子または細胞の電気泳動分離において、２つの液体を接触させるために多孔性サイズ排除膜（分離膜）が使用され、これらの液体の間で高分子または細胞の移動が、分離膜に垂直に生成された電場の影響下で起こる（Galier & Roux-de Balmann, J. Membrane Sci. 2004, 241: 79-87；Saxena et al.,Adv. Colloid Interface Sci. 2009, 145: 1-22）。分離膜の両側に位置する２つの制限膜を使用して試料チャンバーおよび回収チャンバーが形成される（図１）。制限膜は非常に小さい孔径を有し、イオン性緩衝液と共に使用された時に、膜間圧力で水溶液を保持するが、電流を伝導する（Horvath et al., Electrophoresis 1994, 15(1), 968-971）。
【０００９】
電気泳動は、精子の分離において従前より使用されており（米国特許出願第８，１２３，９２４号明細書；Aitken et al., Hum Reprod. 2011, 26(8): 1955-1964）、単離された精子はＤＮＡ損傷（Ainsworth et al., Human Reprod. 2005, 20: 2261-2270）または酸化ストレス（Aitken et al., Hum Reprod. 2011, 26(8): 1955-1964）を比較的有しない。簡潔に述べれば、（負に荷電した）生存可能な精子は、正のカソードに向かって泳動し、分離膜を通過する。生存可能でない精子および他の細胞は、動かず、負極に向かって泳動し、または分離膜を通過できない（図２を参照）。
【００１０】
しかしながら、精子の電気泳動分離のための既存の方法は、ＡＲＴにおける分離された精子の使用を損なわせるポリアクリルアミド（ＰＡｍ）制限膜の使用を伴う。これは、膜中に毒性のアクリルアミド（Ａｍ）単量体が存在する可能性があり、これが分離された精子を汚染することがあるためである。
【００１１】
したがって、精子の電気泳動分離において使用するために好適な代替的な膜であって、製造が容易かつ安全であり、かつ、膜を通過するまたは膜と接触する精子を汚染しない、膜が必要である。
【００１２】
先行技術の欠点の少なくとも１つを克服しもしくは改善し、または有用な代替を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）膜が精子の電気泳動分離において使用するために好適であることを発見した。
【００１４】
一態様では、本発明は、電気泳動による精子の分離における少なくとも１つのポリマー膜の使用であって、該膜がＰＶＡを含む、使用に関する。
【００１５】
一態様では、ＰＶＡを含む膜は、ＰＡｍを含有しない。
【００１６】
別の実施形態では、ＰＶＡを含む膜は、電場の通過を許容するが精子の通過を許容しない膜（制限膜）である。
【００１７】
別の実施形態では、ＰＶＡを含む膜は、多孔性サイズ排除膜（分離膜）である。
【００１８】
別の実施形態では、ＰＶＡは、６，０００〜１８６，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲内の分子量を有する。
【００１９】
別の実施形態では、膜中のＰＶＡの濃度は、５〜４０％ｗ／ｗ、好ましくは５〜１５％ｗ／ｗの範囲内である。
【００２０】
別の実施形態では、膜は、追加のポリマーをさらに含む。
【００２１】
別の実施形態では、追加のポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）である。
【００２２】
別の実施形態では、追加のポリマーの分子量は、１，０００〜６０，０００Ｄａの範囲内である。
【００２３】
別の実施形態では、膜中の追加のポリマーの濃度は、０．５〜３％ｗ／ｗの範囲内である。
【００２４】
別の実施形態では、制限膜は、１５ｋＤａ未満の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する。
【００２５】
別の実施形態では、制限膜は、５ｋＤａ未満のＭＷＣＯを有する。
【００２６】
別の実施形態では、分離膜は、１０μｍ未満の孔径を有する。
【００２７】
別の実施形態では、分離膜は、８μｍ未満の孔径を有する。
【００２８】
別の実施形態では、分離膜は、５μｍ未満の孔径を有する。
【００２９】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能な精子の通過を許容する。
【００３０】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能でない精子または精子以外の細胞種の通過を許容しない。
【００３１】
別の実施形態では、膜は、支持基材を含む。
【００３２】
別の実施形態では、該基材は、不織材料であり、かつ親水性の性質である。好適な材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ＰＶＡ、ナイロン、セルロースおよびセルロース誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
別の実施形態では、制限膜は、キャスティングおよびアニーリング法によって作製される。
【００３４】
別の実施形態では、制限膜を作製する方法は、
・ポリマー溶液の調製ステップ、
・適切なキャスティング装置／タンクでのキャスティングステップ、
・膜の乾燥ステップ、
・適切な温度のオーブン中でのアニーリングステップ、および
・冷却および貯蔵ステップ
を含む。
【００３５】
別の実施形態では、分離膜は、非溶媒誘起転相法（non-solvent induced phase inversion method）およびその後のポストアニーリングによって作製される。
【００３６】
別の実施形態では、分離膜を作製する方法は、
・ポリマー溶液の調製ステップ、
・適切なキャスティング装置／タンクでのキャスティングステップ、
・非溶媒誘起転相ステップ、
・適切な温度のオーブン中でのアニーリングステップ、および
・冷却および貯蔵ステップ
を含む。
【００３７】
別の実施形態では、該転相プロセスにおいて使用される非溶媒は、アルコール系である。
【００３８】
別の実施形態では、アルコール系は、エタノールおよびメタノールを含む。
【００３９】
別の実施形態では、アルコール系は、イソプロピルアルコールおよびアセトンを含む。
【００４０】
別の態様では、本発明は、精子を第１の溶液から第２の溶液中に分離する方法に関し、該方法は、
第１の制限膜と第２の制限膜との間に配された分離膜を含む膜スタックに第１の溶液を提供するステップであり、制限膜がＰＶＡを含み、第１の溶液が、第１の制限膜と分離膜との間に位置し、かつ、分離膜が、予め選択された孔径を有する、提供するステップ、および
スタックにわたって電場を印加するステップ
を含み、
負電荷を有しかつ予め選択された孔径より小さい第１の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、分離膜を通過して、分離膜と第２の制限膜との間に位置する第２の溶液中に移動する。
【００４１】
別の実施形態では、制限膜および分離膜は、ＰＡｍを含有しない。
【００４２】
別の実施形態では、分離膜は、ＰＶＡを含む。
【００４３】
別の実施形態では、分離膜は、ポリカーボネートを含む。
【００４４】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能な精子の通過を許容する。
【００４５】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能でない精子または精子以外の細胞種の通過を許容しない。
【００４６】
別の態様では、本発明は、精子を第１の溶液から第２の溶液中に分離する方法に関し、該方法は、
分離膜によって第１の溶液および第２の溶液を分離するステップであり、分離膜が、ＰＶＡを含み、かつ予め選択された孔径を有する、分離するステップ、
第１の溶液および第２の溶液にわたって電場を印加するステップであり、負電荷を有しかつ予め選択された孔径より小さい第１の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、分離膜を通過して第２の溶液中に移動する、印加するステップ
を含む。
【００４７】
別の実施形態では、分離膜は、ＰＡｍを含有しない。
【００４８】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能な精子の通過を許容する。
【００４９】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能でない精子または精子以外の細胞種の通過を許容しない。
【００５０】
別の態様では、本発明は、精子を分離するための電気泳動システムに関し、該システムは、
第１の液体チャンバーおよび第２の液体チャンバーを画定する２つの制限膜の間に配された分離膜であり、制限膜がＰＶＡを含む、分離膜、および
第１の液体チャンバーから第２の液体チャンバーへと分離膜を通過する電場を提供するための手段
を含む。
【００５１】
別の実施形態では、制限膜および分離膜は、ＰＡｍを含有しない。
【００５２】
別の実施形態では、分離膜は、ＰＶＡを含む。
【００５３】
別の実施形態では、分離膜は、ポリカーボネートを含む。
【００５４】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能な精子の通過を許容する。
【００５５】
別の実施形態では、分離膜は、生存可能でない精子または精子以外の細胞種の通過を許容しない。
【００５６】
本発明の文脈では、「含む」（comprise）、「含むこと」（comprising）などの語は、排他的な意味ではなく、包括的な意味、すなわち、「含むがそれに限定されない」という意味として解釈されるべきである。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「分離膜」という用語は、多孔性のサイズ排除膜を意味する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「制限膜」という用語は、電場の通過を許容するが、精子の通過を許容しない膜を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ＰＡｍ」という用語は、ポリアクリルアミドを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ＰＶＡ」という用語は、ポリ（ビニルアルコール）を意味する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、膜に関する「ＭＷＣＯ」または「分画分子量」という用語は、少なくとも９０％の溶質が膜によって保持される溶質の最小分子量（ダルトン）、または膜によって９０％保持される分子のおおよその分子量を指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、膜に関する「孔径」という用語は、膜によって保持される高分子または細胞の直径を指す。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】電気泳動分離の作動原理。高分子または細胞の分画は、高分子の電荷もしくは電気泳動移動度の差異、または高分子の半径の差異による膜サイズ排除のいずれかを通じて達成される。
【図２】電気泳動による精子の分離の作動原理。生存可能な精子は、正のカソードに向かって泳動し、分離膜を通過する。
【図３】ＣＳ１０電気泳動分離装置。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
本明細書に詳述するある特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、他の実施形態により同じまたは類似の結果を達成することができる。本発明の変形および改良は当業者に自明であり、本発明は、全てのそのような改良および均等物をカバーすることが意図される。
【００６５】
本発明は、精子の電気泳動分離におけるＰＶＡ膜の使用に関する。
【００６６】
ＰＶＡの使用は、精子の分離において使用するためのいくつもの利点を有する：ＰＶＡは親水性であり、不特定のタンパク質の吸着による膜ファウリングを低減させ得る；生体
適合性かつ中性であり、低い電気浸透（膜にわたって印加された電位によって引き起こされる膜を通じたバルク液体の流れ）での膜の製作（fabrication）を補助する。
【００６７】
膜ベースの電気泳動装置は、典型的に、少なくとも２つのチャンバーを形成する多数の膜を収容するカートリッジ、好適な電源に接続された各々の電極チャンバー中のカソードおよびアノード、試料、緩衝液および電解質のためのリザーバー、試料、緩衝液および電解質を通すためのポンプ、ならびに電気泳動中に必要とされる温度に試料、緩衝液および電解質を維持するための冷却手段を含む。カートリッジは、少なくとも３つの実質的に平坦な膜を含有し、これらの膜は、互いに対して間隔を置いて配されて、試料または溶媒が通過できる２つのチャンバーを形成する。分離膜が２つの制限膜の間に配される。カートリッジが装置に装着されている時に、制限膜は電極に隣接して位置する。カートリッジの例はＡＵ７３８３６１に記載されている。膜ベースの電気泳動の説明は、ＵＳ５，０３９，３８６およびＵＳ５，６５０，０５５に見出すことができる。等電分離の応用における使用のために特に好適な装置は、ＷＯ０２／２４３１４に見出すことができる。
【００６８】
本発明において使用するために好適な１つの電気泳動装置は、
（ａ）第１の電解質チャンバー、
（ｂ）第２の電解質チャンバー、
（ｃ）第１の電解質チャンバーと第２の電解質チャンバーとの間に配された第１の試料チャンバー、
（ｄ）第１の電解質チャンバーと第２の電解質チャンバーとの間に配された第１の試料チャンバーに隣接して配された第２の試料チャンバー、
（ｅ）第１の試料チャンバーと第２の試料チャンバーとの間に配され、第１の試料チャンバーおよび第２の試料チャンバーの内容物の実体的な対流混合（convective mixing）を防止する、分離膜、
（ｆ）第１の電解質チャンバーと第１の試料チャンバーとの間に配され、第１の電解質チャンバーおよび第１の試料チャンバーの内容物の実体的な対流混合を防止する、第１の制限膜、
（ｇ）第２の試料チャンバーと第２の電解質チャンバーとの間に配され、第２の電解質チャンバーおよび第２の試料チャンバーの内容物の実体的な対流混合を防止する、第２の制限膜、および
（ｈ）第１の電解質チャンバー中および第２の電解質チャンバー中に配された電極
を含む。
【００６９】
電気泳動装置は、
（ｉ）電解質リザーバー、
（ｊ）第１の試料リザーバーおよび第２の試料リザーバー、
（ｋ）電解質リザーバーから第１の電解質チャンバーおよび第２の電解質チャンバーに電解質を供給するための手段、および
（ｌ）少なくとも第１の試料リザーバーから第１の試料チャンバーに、または第２の試料リザーバーから第２の試料チャンバーに試料または液体を供給するための手段
の１つまたは複数をさらに含んでもよい。
【００７０】
装置は、
（ｍ）第１の電解質リザーバーおよび第２の電解質リザーバー、および
（ｎ）第１の電解質リザーバーから第１の電解質チャンバーに電解質を、および第２の電解質リザーバーから第２の電解質チャンバーに電解質を供給するための手段
をさらに含んでもよい。
【００７１】
装置は、
電解質チャンバーを通るように電解質リザーバーから電解質を循環させて、電解質チャンバー中に電解質ストリームを形成するための手段、および
各々の第１の試料チャンバーおよび第２の試料チャンバーを通るように第１の試料リザーバーおよび第２の試料リザーバーのそれぞれから内容物を循環させて、各々の試料チャンバー中に第１の試料ストリームおよび第２の試料ストリームを形成するための手段、
第１の試料リザーバー中または第２の試料リザーバー中の試料を除去しかつ置換するための手段、および
電解質および試料溶液の温度を維持するための手段
の１つまたは複数をさらに含んでもよい。
【００７２】
ＰＶＡ制限膜および分離膜の作製および特徴付けは、２０１６年４月２２日に出願された米国仮出願第６２／３２６，３３１号明細書（その内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。簡潔に述べれば、ＰＶＡ制限膜は、キャスティングおよびアニーリングによって作製され、制限膜において主となる安定化機構は結晶性ドメインの形成による非共有結合性架橋であり、ＰＶＡ分離膜は、多孔性構造物を生成するためのキャスティングおよび非溶媒誘起転相の組合せ、およびその後のポストアニーリングによって作製される。
【００７３】
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００７４】
実施例１−ＰＶＡ制限膜の作製
ＰＶＡストック溶液を調製するために、既知量の高純度の水を丸底フラスコに加えた。フラスコをサーモスタット制御した油浴（９０℃）中に入れ、還流下で攪拌した。既知の質量のＰＶＡを所望の濃度（％ｗ／ｗ）が達成されるまで加えた。溶解していないゲルが観察されなくなるまで９０℃でスラリーを攪拌し、粘性の溶液を形成させた。その後、溶液を還流下でさらに３０分攪拌してＰＶＡの完全な溶解を確実にした。溶液を穏やかに混合すると共に室温にゆっくりと冷却させた後、計量した。必要な場合、高純度の水を加えて正味質量を開始質量に戻して、所望の濃度（％ｗ／ｗ）とした。その後、溶液を室温で３０分間穏やかに攪拌した後、攪拌せずに終夜静置して、同伴した泡を除去した。
【００７５】
適切なポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）を水中に所望の濃度（％ｗ／ｗ）まで溶解することによって水中のＰＥＧまたはＰＶＰＯＮのストック溶液を調製した。
【００７６】
ＰＶＡ制限膜はキャスティングおよびアニーリング法によって作製した。適切な質量のＰＶＡ溶液、添加物溶液（ＰＥＧまたはＰＶＰＯＮ、様々なＭＷ）および高純度のＨ２Ｏを混合することによって膜キャスティング溶液を調製した。溶液を最低３０分間攪拌して全ての成分がよく混合されることを確実にし、その後３０分間室温で静置して同伴した泡の収集を可能とした。２層のＰＥＴ基材を含む膜キャスティングタンクに膜をキャストした。空気乾燥後、膜を１１０℃で１時間アニールした後、解析の前に高純度のＨ２Ｏ中で４８時間膨らませた。膜の配合の詳細を表１に列記する。
【表１】
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【００７７】
実施例２−ＰＶＡ分離膜の作製
制限ＰＶＡ膜について記載した通りにＰＶＡ、ＰＥＧおよびＰＶＰＯＮストック溶液を調製した。
【００７８】
非溶媒誘起転相によってＰＶＡ分離膜を作製した。第１の事例では、特徴付けを容易にするためにいかなる支持基材も用いずに、様々な孔径を有する膜を作製した。適切な質量のＰＶＡ溶液（８９ｋｇ／ｍｏｌ）、添加物溶液（ＰＥＧまたはＰＶＰＯＮ、様々なＭＷ）および高純度のＨ２Ｏを混合することによって膜キャスティング溶液を調製した。溶液を最低３０分間攪拌して全ての成分がよく混合されるのを確実にし、その後３０分間室温で静置して同伴した泡の収集を可能とした。ステンレス鋼ディスク（内径＝５５ｍｍ、ウェルの深さ＝１ｍｍ）中に形成された機械加工されたウェルに膜をキャストし、５分間空気乾燥した後、非溶媒凝固浴（２００ｍＬ）に浸漬した。
【００７９】
Ｈ２Ｏ、メタノール（ＭｅＯＨ）およびエタノール（ＥｔＯＨ）の体積比を変化させることによって非溶媒浴の組成を変えた。膜を凝固浴中に最低６０分間保持した。乾燥による膜の縮みおよび孔の崩壊を低減させるために、凝固の後に、膜をアセトン浴（１００ｍＬ）に１５分間浸漬させた後に取り出し、ガラスプレート上に置き、空気乾燥した。空気乾燥後、膜を１１０℃で１時間アニールした後、解析の前に２×１００ｍＬの高純度のＨ２Ｏ中で４８時間膨らませた。ＰＥＧ添加物を含むＰＶＡ分離膜の配合を表２に示す。高分子量ＰＶＡ（８９〜９８ｋｇ／ｍｏｌ）から製作された水和膜の強度は非常に良好であり、ピンセットで容易に操作することができ、伸縮させることができる。
【表２】
2019534043.tif 000004
【００８０】
ＰＶＰＯＮ添加物を含むＰＶＡ分離膜の配合を表３に示す。
【表３】
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【００８１】
実施例３−精子の分離におけるＰＶＡ膜の使用
ＮｕＳｅｐ  ＣＳ１０電気泳動装置を使用してＰＡｍおよびＰＶＡ制限膜を比較する試験を実行した。ＣＳ１０装置の構成の模式図を図３に示す。ＣＳ１０装置は、実行時間、電圧および循環緩衝液の速度の精密な制御を可能とし、広範な試料の処理のために好適である。
【００８２】
適切なダイを使用して制限膜および分離膜を必要な大きさに切り取り、カートリッジ中で組み立てた。カートリッジは、２つの制限膜に挟まれた分離膜を含む。カートリッジを電気泳動のためにＣＳ１０装置に挿入した。
【００８３】
ウシ精子の電気泳動
８μｍのポリカーボネート分離膜および、（ａ）ＰＡｍ制限膜または（ｂ）ＰＶＡ制限膜のいずれか、を用いてＣＳ１０装置でウシ精子試料の電気泳動を行った。試料を３５ボ
ルト、５０ｍＡの最大電流および５分の実行時間で処理した。オリジナルの試料、回収試料および保持／残留試料をエオシン−ニグロシン（ＥＮ）で染色して精子生存能力を評価し、またアニリンブルー（ＡＢ）で染色してＤＮＡ断片化を評価した。１００倍の光学顕微鏡下で目視により運動性を評価した。
【００８４】
ＰＡｍ制限膜についての結果を表４に示す。
【表４】
2019534043.tif 000006
【００８５】
ＰＶＡ制限膜についての結果を表５に示す。
【表５】
2019534043.tif 000007
【００８６】
ヒト精子の電気泳動
８μｍのポリカーボネート分離膜および、（ａ）ＰＡｍ制限膜または（ｂ）ＰＶＡ制限膜のいずれか、を用いてＣＳ１０装置でヒト精子試料の電気泳動を行った。上記の通りに試料を処理し、解析した。
【００８７】
ＰＡｍ制限膜についての結果を表６に示す。
【表６】
2019534043.tif 000008
【００８８】
ＰＶＡ制限膜についての結果を表７に示す。
【表７】
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【００８９】
ＰＡｍ膜およびＰＶＡ膜の比較
ウシおよびヒトの精子の分離におけるＰＡｍ制限膜およびＰＶＡ制限膜の比較を表８に示す。
【表８】
2019534043.tif 000010
【００９０】
ウシまたはヒトの精子の分離についてＰＶＡ制限膜とＰＡｍ制限膜との間で統計的に有意な差は観察されなかった。したがって、ＰＶＡ制限膜は、精子の分離のためにＰＡｍ制限膜の代用となり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月21日(2018.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動による精子の分離における少なくとも１つの物理架橋された生体適合性ポリマー膜の使用であって、前記膜がポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含む、前記使用。
【請求項２】
ＰＶＡを含む前記膜が、ポリアクリルアミド（ＰＡｍ）を含有しない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＰＶＡを含む前記膜が、電場の通過を許容するが精子の通過を許容しない膜（制限膜）である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記制限膜が、１５ｋＤａ未満、好ましくは５ｋＤａ未満の分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記制限膜が、キャスティングおよびアニーリング法によって作製されたものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＰＶＡを含む前記膜が、多孔性サイズ排除膜（分離膜）である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記分離膜が、１０μｍ未満、好ましくは８μｍ未満、より好ましくは５μｍ未満の孔径を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記分離膜が、非溶媒誘起転相法（non-solvent induced phase inversion method）およびその後のポストアニーリングによって作製されたものである、請求項６または請求項７に記載の使用。
【請求項９】
精子を第１の溶液から第２の溶液中に分離する方法であって、
ＰＶＡを含む第１の物理架橋された生体適合性ポリマー制限膜と第２の物理架橋された生体適合性ポリマー制限膜との間に配された分離膜を含む膜スタックに前記第１の溶液を提供するステップであり、前記第１の溶液が、前記第１の制限膜と前記分離膜との間に位
置し、かつ、前記分離膜が、予め選択された孔径を有する、前記提供するステップ、および
前記スタックにわたって電場を印加するステップ
を含み、
負電荷を有しかつ前記予め選択された孔径より小さい前記第１の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、前記分離膜を通過して、前記分離膜と前記第２の制限膜との間に位置する前記第２の溶液中に移動する、
前記方法。
【請求項１０】
前記制限膜および前記分離膜が、ＰＡｍを含有しない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離膜が、ＰＶＡを含む物理架橋された生体適合性ポリマー分離膜である、請求項９または請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
精子を第１の溶液から第２の溶液中に分離する方法であって、
ＰＶＡを含む物理架橋された生体適合性ポリマー分離膜によって前記第１の溶液および前記第２の溶液を分離するステップであり、前記分離膜が、予め選択された孔径を有する、前記分離するステップ、
前記第１の溶液および前記第２の溶液にわたって電場を印加するステップであり、負電荷を有しかつ前記予め選択された孔径より小さい前記第１の溶液中の精子が、アノードに向かって移動し、かつ、前記分離膜を通過して前記第２の溶液中に移動する、前記印加するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記分離膜が、ＰＡｍを含有しない、請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
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