(57)【要約】本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩の固相ペプチド合成方法又は組換え産生方法に関する。さらに提供されるのは、α１−アドレナリン受容体拮抗薬及び血管弛緩剤、一酸化窒素増強剤、抗血栓剤、抗アテローム硬化剤、ドキソルビシン誘発心毒性に対する保護剤、老化防止及び強壮剤、栄養補助剤、健康補助剤、又は化粧品原料としてのジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩の使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩の固相ペプチド合成方法であって、前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記方法は、
（ａ）Ｆｍｏｃで保護され、任意選択でさらに適切に側鎖保護された、アミノ酸、ジペプチド及び／又はオリゴペプチドをＣ末端からＮ末端へ線状に段階的にカップリングさせることにより、固体支持体上でジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを合成する工程であって、配列番号１の２４位に対応する位置でのグリシン残基の付加はＦｍｏｃ−（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨによって媒介される工程；
（ｂ）固体支持体からジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを切断し、そのペプチドを脱保護する工程；さらにその後、
（ｃ）ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの有機酸化的フォールディングを実施して、天然のジスルフィド結合を形成する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）は、
（ｉ）固体支持体に結合した第１のアミノ酸から保護化学基を除去することにより、第１のアミノ酸を脱保護する工程；
（ｉｉ）第２のアミノ酸上の化学基を活性化して、第１のアミノ酸とカップリングさせるための第２のアミノ酸を調製する工程；
（ｉｉｉ）活性化された第２のアミノ酸を脱保護された第１のアミノ酸にカップリングさせて、第１及び第２のアミノ酸からペプチドを形成する工程；及び
（ｉｖ）ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドが合成されるまで、複数のアミノ酸の脱保護及びカップリングを連続的に行い、ペプチド鎖を成長させる工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロ波エネルギーを印加することによって、前記脱保護、前記活性化、及び前記カップリングのうちの少なくとも１つを加速することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
有機酸化的フォールディングは非水性条件で行われ、有機溶媒中で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
有機酸化的フォールディングは、システアミン及び／又はモルホリンを含む有機溶媒、好ましくはＤＭＳＯ及び／又はイソプロパノール中でジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドをフォールディングすることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
有機酸化的フォールディングは４℃で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
フォールディングされたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩を組換え的に調製する方法であって、前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記方法は、
（ａ）ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有するマルトース結合タンパク質、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有するエンテロキナーゼ切断配列、及びジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を含むポリペプチドをコードしている工程；
（ｂ）ポリペプチドの産生を可能にする条件下において増殖培地中で宿主細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収する工程；及び
（ｃ）エンテロキナーゼを用いてポリペプチドを切断することにより、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を生成する工程
を含む方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドは配列番号６７〜８０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
エンテロキナーゼ切断の前に、好ましくはアミロース樹脂精製により、組換え生産されたポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
エンテロキナーゼ切断後に、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は逆相クロマトグラフィーにより、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を精製することをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、α１−アドレナリン受容体アンタゴニスト及び血管弛緩薬としての使用。
【請求項１３】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、一酸化窒素増強剤としての使用。
【請求項１４】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、抗血栓剤としての使用。
【請求項１５】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、抗アテローム性動脈硬化剤としての使用。
【請求項１６】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、ドキソルビシン誘発心毒性に対する保護剤としての使用。
【請求項１７】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、老化防止及び強壮剤としての使用。
【請求項１８】
ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、栄養補助剤、健康補助剤、又は化粧品原料としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、天然のジスルフィド結合を有するジンセンチド（ｇｉｎｓｅｎｔｉｄｅ）又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩の固相ペプチド合成又は組換え産生方法、及び調製されたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人参（ｇｉｎｓｅｎｇ）は何千年もの間使われてきた伝統的な漢方薬である。それは全ての薬用植物の中で最も広く使われており、そして最も価値のあるものの１つである。人参は、非常に長く広範に使用されていることから、一般的に安全であることが証明されている。
【０００３】
植物ペプチド及びタンパク質は通常、薬用植物の生物活性成分としてはあまり研究されない。ジンセンチドは、人参に含まれる高システインペプチドの一種で、生理活性ペプチドや創薬の最たるものとして活用される可能性がある。しかしながら、植物からのジンセンチドの単離は、通常、面倒で費用がかかる。したがって、当技術分野では、ジンセンチドを調製する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを調製するための合成方法及び組換え方法、ならびにそれらの使用を提供することによって、当技術分野における前述の必要性を満たす。
【０００５】
第１の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩の固相ペプチド合成方法に関し、この方法は以下の工程：
（ａ）Ｆｍｏｃで保護され、任意選択でさらに適切に側鎖保護された、アミノ酸、ジペプチド及び／又はオリゴペプチドをＣ末端からＮ末端へ線状に段階的にカップリングさせることにより、固体支持体上でジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを合成する工程であって、配列番号１の２４位に対応する位置でのグリシン残基の付加はＦｍｏｃ−（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨによって媒介される工程；
（ｂ）固体支持体からジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを切断し、そのペプチドを脱保護する工程；さらにその後、
（ｃ）ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの有機酸化的フォールディングを実施して、天然のジスルフィド結合を形成する工程
を含む。
【０００６】
様々な実施形態において、工程（ａ）は以下の工程：
（ｉ）固体支持体に結合した第１のアミノ酸から保護化学基を除去することにより、第１のアミノ酸を脱保護する工程；
（ｉｉ）第２のアミノ酸上の化学基を活性化して、第１のアミノ酸とカップリングさせるための第２のアミノ酸を調製する工程；
（ｉｉｉ）活性化された第２のアミノ酸を脱保護された第１のアミノ酸にカップリングさせて、第１及び第２のアミノ酸からペプチドを形成する工程；及び
（ｉｖ）ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドが合成されるまで、複数のアミノ酸の脱保護及びカップリングを連続的に行い、ペプチド鎖を成長させる工程
を含む。
【０００７】
様々な実施形態では、上記方法は、マイクロ波エネルギーを印加することによって、前記脱保護、前記活性化、及び前記カップリングのうちの少なくとも１つを加速することを含む。
【０００８】
様々な実施形態では、有機酸化的フォールディングは非水性条件で行われ、有機溶媒中で行われる。
様々な実施形態において、有機酸化的フォールディングは、システアミン及び／又はモルホリンを含む有機溶媒、好ましくはＤＭＳＯ及び／又はイソプロパノール中でジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドをフォールディングすることを含む。
【０００９】
様々な実施形態において、有機酸化的フォールディングは４℃で行われる。
様々な実施形態において、上記方法は、フォールディングされたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することを含む。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩を組換え的に調製する方法に関し、この方法は以下の工程：
（ａ）ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有するマルトース結合タンパク質、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有するエンテロキナーゼ切断配列、及びジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を含むポリペプチドをコードしている工程；
（ｂ）ポリペプチドの産生を可能にする条件下において増殖培地中で宿主細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収する工程；及び
（ｃ）エンテロキナーゼを用いてポリペプチドを切断することにより、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を生成する工程
を含む。
【００１１】
様々な実施形態において、ポリペプチドは配列番号６７〜８０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
種々の実施形態では、上記方法は、エンテロキナーゼ切断の前に、好ましくはアミロース樹脂精製により、組換え生産されたポリペプチドを精製することをさらに含む。
【００１２】
様々な実施形態において、上記方法は、エンテロキナーゼ切断後に、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は逆相クロマトグラフィーにより、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を精製することをさらに含む。
【００１３】
第３の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、α１−アドレナリン受容体アンタゴニスト及び血管弛緩薬としての使用に関する。
【００１４】
第４の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、一酸化窒素増強剤としての使用に関する。
【００１５】
第５の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、抗血栓剤としての使用に関する。
【００１６】
第６の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、抗アテローム性動脈硬化剤としての使用に関する。
【００１７】
第７の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、ドキソルビシン誘発心毒性に対する保護剤としての使用に関する。
【００１８】
第８の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、老化防止及び強壮剤としての使用に関する。
【００１９】
第９の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の、栄養補助剤、健康補助剤、又は化粧品原料としての使用に関する。
【００２０】
本発明の前述の全ての態様によれば、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドと、その全配列にわたって少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、又は７４％、好ましくは少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、又は８４％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本発明は、非限定的な例及び添付の図面と併せて考慮されるとき、詳細な説明を参照することによってより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ジンセンチドの強壮効果の模式図。ＴＰ１：配列番号１。
【図２】ジンセンチドの化学合成のための概略フロー図。
【図３】合成ジンセンチドＴＰ１の酸化的フォールディング戦略。
【図４】ＵＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ‐ＭＳを用いた天然及び合成ジンセンチドＴＰ１の比較。
【図５】１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲを用いた天然及び合成ジンセンチドＴＰ１の比較。
【図６】一酸化窒素生成に対する天然及び合成ジンセンチドＴＰ１の機能比較。
【図７】ジンセンチドのための組換え発現スキーム。ペプチド断片ＤＤＤＤＫ：配列番号６６。
【図８】ＩＰＴＧはＭＢＰ−ＴＰ１融合タンパク質の発現を誘導した。
【図９】アミロースカラムによるＭＢＰ−ＴＰ１融合タンパク質の精製。Ｓ−細胞溶解物；ＦＴ−カラムフロースルー；Ｗ１−１回目の洗浄；Ｗ２−２回目の洗浄；Ｅ−溶出タンパク質。
【図１０】エンテロキナーゼによるＭＢＰタグの除去。
【図１１】エンテロキナーゼ切断前後の質量分析プロファイル。
【図１２】天然型及び還元型ｋＢ１のＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳプロファイル。パネルＡ及びＢは、天然及び還元ｋＢ１のＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれ天然型及び還元型を表す「Ｎ」及び「Ｒ」を用いて示す。パネルＣ及びＤは、対応するピークＮ及びＲのＭＳプロファイルを示す。パネルＥ及びＦは、パネルＣ及びＤにおけるＭＳ結果の拡大プロファイルであり、これら２つの質量の間の差を実証している。
【図１３】異なる塩基の効果を示す、ｋＢ１の酸化的フォールディングのＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル。Ａ．条件は５〜５０％の異なる濃度のピリジンを含有した。Ｂ．条件は、５〜１５％の異なる濃度のイミダゾールを含有した。Ｃ．条件は、５〜３０％の異なる濃度のモルホリンを含んでいた。全ての条件は１００μＭペプチド、１００ｍＭシステアミン及び１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含んでいた。プロファイルは１時間行われた反応を示す。「Ｒ」及び「Ｎ」は、ｋＢ１の還元型及び天然型を表す。「Ｉ」は中間体型のｋＢ１を表す。
【図１４】酸化還元剤としてのシステアミン及びＤＭＳＯの効果を示す、ｋＢ１の酸化的フォールディングのＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル。「Ｒ」及び「Ｎ」はｋＢ１の還元型及び天然型を表し、一方、「Ｉ」はフォールディング中間体を表す。
【図１５】還元剤として異なるチオールを用いたｋＢ１の酸化的フォールディングのＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル。Ａ．還元されたｋＢ１；Ｂ．１０ｍＭのメルカプト酢酸を含有する条件；Ｃ．１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有する条件；Ｄ．１０ｍＭシステアミンを含む条件。「Ｒ」及び「Ｎ」は、ｋＢ１の還元型及び天然型を表し、一方、Ｉはフォールディング中間体を表す。全ての条件は、１００μＭのペプチド、１００ｍＭのチオール、１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、８５％の２−プロパノール及び５％のモルホリンを含んでいた。
【図１６】天然ｋＢ１（赤色）と合成ｋＢ１（青色）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの比較。両方のペプチドをｐＨ４．３の９０％Ｈ２Ｏ／１０％Ｄ２Ｏに溶解した。スペクトルは、２９８ＫでＮＭＲ分光計（６００ＭＨｚ）によって得た。
【図１７】植物材料からのジンセンチド精製のためのスキーム。
【図１８】ジンセンチドＴＰ１、ＴＰ３及びＴＰ８はフェニレフリン誘発大動脈輪収縮に拮抗した。
【図１９】ジンセンチドＴＰ１はＫＣｌ誘発性収縮大動脈輪に拮抗しない。
【図２０】１Ｄ  ＮＭＲによるジンセンチドＴＰ１のＤ２Ｏ交換。
【図２１】ジンセンチドのアミノ酸配列、二次構造及び三次構造。一次構造及び二次構造（左上）、合成及び天然ＴＰ１の全体的な形状（右上）、ＴＰ１の疎水性表面のＣＰＫモデル（中央のパネル）、及びＮＭＲにより決定されたＴＰ５及びＴＰ８の３Ｄ構造（下のパネル）。ＴＰ１：配列番号１。
【図２２】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用した、（Ａ）オタネニンジン（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ）、（Ｂ）アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）及び（Ｃ）サンシチニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）の根の水性抽出物の質量分析プロファイル。
【図２３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用した、オタネニンジン（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ）の（Ａ）根、（Ｂ）種子、（Ｃ）葉及び（Ｄ）花の水性抽出物の質量分析プロファイル。
【図２４】ジンセンチドＴＰ１のｄｅ  ｎｏｖｏシーケンス。キモトリプシン及びトリプシンによるＳ−還元ペプチドの酵素的消化は、それぞれ２４５９（配列番号１３１）及び２８３１（配列番号１３２）のｍ／ｚ値をそれぞれ有する１つの主要断片を生成した。断片の配列は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳから生成されたｂ−イオン及びｙ−イオンを使用して推定された。
【図２５】（Ａ）部分的Ｓ−還元及びＳ−アルキル化ジンセンチドＴＰ１のＨＰＬＣプロファイル。ピーク１、２、３、Ｎ、及びＲＡは、それぞれ３ＳＳ、２ＳＳ、１ＳＳ、天然ペプチド、及び完全Ｓ−ＮＥＭアルキル化ペプチドを含んでいた。ジンセンチドＴＰ１ジスルフィドマッピングの略図も示されている。（Ｂ）ジスルフィド結合マッピングによって決定された、ジンセンチドＴＰ１の推定アンフォールディング経路。我々の実験条件では、最初に３ＳＳ種を生成するためにＣｙｓＩ−ＩＶ結合が、続いて２ＳＳ種を生成するためにＣｙｓＶ−ＶＩＩＩ結合が、次いで１ＳＳ種を生成するためにＣｙｓＩＩＩ−ＶＩＩ結合が、そして最後にＣｙｓＩＩ−ＶＩ結合が還元されるようにした。ＴＰ１：配列番号１。
【図２６】オタネニンジン（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ）、アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ）及びサンシチニンジン（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）からのジンセンチドをコードする転写物は、ＮＣＢＩデータベースからのトランスクリプトームデータのｄｅ  ｎｏｖｏアセンブリから推定された。使用したトランスクリプトームデータは以下の通りである：サンシチニンジン花（ＳＲＸ３７８８７８）、アメリカニンジン花（ＳＲＸ０６２２６７）、オタネニンジン花（ＳＲＸ１８１２６３）、オタネニンジン花（ＳＲＸ３７８８７３）、サンシチニンジン葉（ＳＲＸ３７８８８０）、アメリカニンジン種子（ＳＲＸ５２９３６５）、オタネニンジン根（ＥＲＸ１３７４６０）。ＳＰａｓｅ：シグナルペプチダーゼ。アミノ酸配列は、配列番号１３３〜１４６に記載されている。
【図２７】ジンセンチドＴＰ１がヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ−ＣＳ）からの細胞性ＮＯ合成を増加させることを示す。比較すると、ジンセンチドＴＰ１は、ＮＯ放出をジンセノサイドＲｂ１及びＲｇ１の両方に対し３倍の強さ及び規模で増大させる。ジンセンチドＴＰ１、ＴＰ３、ＴＰ８及び合成ＴＰ１は同等の細胞ＮＯ放出を示す。
【図２８】ジンセンチドＴＰ１は内皮の一酸化窒素合成酵素を活性化する。ＨＵＶＥＣ−ＣＳ細胞におけるリン酸化ｅＮＯＳ（ｐ−ｅＮＯＳ）蓄積に対するジンセンチドＴＰ１の用量依存的及び時間依存的効果に関する代表的なウエスタンブロット分析。全ての結果は、３つの別々の実験からの平均値±標準誤差として表した。＊ジンセンチドｔＰ１処理群と比較してＰ＜０．０５。
【図２９】ジンセンチドＴＰ１誘導性一酸化窒素形成はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達に関与する。ＨＵＶＥＣ−ＣＳ細胞を、ジンセンチドＴＰ１及び（Ａ）ＭＫ２２０６（Ａｋｔ阻害剤）又は（Ｂ）ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）に１時間曝露した。細胞内ＮＯ産生をＤＡＦ−２ＤＡ染色によって測定し、標準化蛍光強度として表した。（Ｃ）ＨＵＶＥＣ−ＣＳ細胞におけるＡｋｔリン酸化に対するジンセンチドＴＰ１の時間依存的効果の代表的なウエスタンブロット分析。全ての結果は、３つの別々の実験からの平均値±標準誤差として表した。＊ジンセンチドＴＰ１処理群と比較してＰ＜０．０５。
【図３０】１Ｄ  ＮＭＲによるジンセンチドＴＰ１のＤ２Ｏ交換。
【図３１】ジンセンチドＴＰ１は、（Ａ）Ｈｕｈ７細胞における細胞傷害活性及び（Ｂ）溶血作用を示さない。ジンセンチドＴＰ１はＴＨＰ−１細胞からの（Ｃ）ＩＬ−６、（Ｄ）ＩＬ−８、（Ｅ）ＩＬ−１０、及び（Ｆ）ＴＮＦ−α放出を誘導しない。ＬＰＳを陽性対照として使用した。全ての結果は平均値±標準誤差として表した（ｎ＝３）。＊対照群と比較してＰ＜０．０５。
【図３２】ジンセンチドＴＰ１はＰ２ｙ１２活性化に拮抗する。ジンセンチドＴＰ１、ジンセノサイドＲｂ１及びＲｇ１を、Ｐ２ｙ１２活性化を誘導するために６．４ｎＭの２−メチルチオ−ＡＤＰを使用したＰ２ｙ１２アレスチンバイオセンサーアッセイを用いてアンタゴニストモードで試験した。Ｐ２ｙ１２活性化は、相対発光単位によって測定され、ブランクに対する阻害の百分率として表された。
【図３３】１Ｄ  ＮＭＲによるジンセンチドＴＰ１のＤ２Ｏ交換。
【図３４】ジンセンチドＴＰ１はｉｎ  ｖｉｖｏで血小板凝集を阻害する。１０ｍｇ／ｋｇのジンセンチドＴＰ１をＳＤラットに２０分間静脈内注射した。多血小板血漿を遠心分離によって単離した。ＡＤＰ又はアラキドン酸刺激時の血小板凝集を調べた。
【図３５】プルダウンアッセイ、それに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びウエスタンブロット分析により、ジンセンチドＴＰ１がＥＳＡＭと相互作用することが明らかになった。
【図３６】ジンセンチドＴＰ１は基底単球の内皮への接着を阻害した。ジンセンチドＴＰ１をＣＦＳＥ標識ＴＨＰ−１単球細胞及びＨＵＶＥＣ−ＣＳ内皮単層と共に１時間インキュベートした。接着阻害ペプチド（ＧＲＧＤＳＰ）を対照として使用した。
【図３７】ヘパリンＨＰＬＣアフィニティーカラムを用いたジンセンチドのヘパリン結合特性。ジンセンチドＴＰ１、ＴＰ３及びＴＰ９はヘパリンＨＰＬＣアフィニティーカラムに保持されたが、ＴＰ２、ＴＰ５、ＴＰ８及びＳＩＧＧＩＲ（陰性対照）は保持されなかった。
【図３８】（Ａ）ＣｌｕｓＰｒｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０サーバを使用した、ジンセンチドＴＰ１（配列番号１）と硫酸ヘパリンとの間の相互作用のモデリング。（Ｂ）ヘパリンＨＰＬＣアフィニティーカラムを使用した、ヘパリン結合についての合成ペプチドＡｃ−ＫＳＧＧＡＷ−ＮＨ２（配列番号１４７）とそのアラニン置換アナログ（Ａｃ−ＡＳＧＧＡＷ−ＮＨ２（配列番号１４８）、Ａｃ−ＫＡＧＧＡＷ−ＮＨ２（配列番号１４９）及びＡｃ−ＫＳＧＧＡＡ−ＮＨ２（配列番号１５０）との比較。
【図３９】ジンセンチドの存在下又は非存在下でのＤＯＸ処理後のゼブラフィッシュ胚の代表的な画像。
【図４０】ジンセンチド処理後のゼブラフィッシュ胚の心拍。
【図４１】ジンセンチドとＤＯＸの同時処理後の心室収縮性の比較。
【図４２】ジンセンチド又はジンセノサイドで処理した後のＨ９ｃ２細胞の細胞生存率。
【図４３】ジンセンチド又はジンセノサイドＲｇ１、Ｒｂ１及びＲｅとＤＯＸとの同時処理後のＨ９ｃ２細胞の細胞生存率。
【図４４】ＤＯＸ処理乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における細胞生存率に対するジンセンチドの効果。
【図４５】マウスへの静脈内注射及び経口投与後のジンセンチドの血漿中濃度。
【図４６】ＨＵＶＥＣ‐ＣＳ細胞プロテオームに対するジンセンチド（ＴＰ１）の効果。細胞をジンセンチドで処理し、全細胞プロテオームをＴＭＴベースの定量的プロテオームアプローチによって調べた。（ａ）発明されたデータセットのＴＭＴ比分布。（ｂ）ジンセンチド処理中のＨＵＶＥＣ−ＣＳ細胞において差次的に発現されたタンパク質。（ｃ）ジンセンチド処理後に差次的に調節されたタンパク質の機能分類。（ｄ）ジンセンチド処理後のＴＥＲＦ２の相対タンパク質レベル。
【図４７】低酸素ＨＵＶＥＣ‐ＣＳ細胞プロテオームに対するジンセンチド（ＴＰ１）の効果。
【図４８】低酸素内皮細胞への白血球接着に対するジンセンチドの効果。
【図４９】内皮細胞における低酸素誘導性接着分子発現に対するジンセンチドの効果。
【図５０】低酸素内皮細胞におけるアンフォールディングされたタンパク質の蓄積に対するジンセンチドの効果。
【図５１】低酸素内皮細胞におけるアンフォールディングされたタンパク質の応答経路に対するジンセンチドの効果。
【図５２】内皮細胞のアポトーシス経路に対するジンセンチドの効果。
【図５３】低酸素内皮細胞の生存率に対するジンセンチドの効果。
【図５４】ジンセンチドは、心筋細胞、血管平滑筋細胞、及び筋細胞においてアンフォールディングされたタンパク質を減少させた。
【図５５】ジンセンチドは低酸素内皮細胞における活性酸素種産生を減少させた。
【図５６】ジンセンチドは低酸素内皮細胞における一酸化窒素産生を増加させた。
【図５７】ＮＣＢＩとＯｎｅＫｐトランスクリプトームデータベースからのジンセンチド様前駆体配列。アミノ酸配列は、配列番号１５１〜２００に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の詳細な説明は、例示として、本発明を実施することができる特定の詳細及び実施形態を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分詳細に記載されている。本発明の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用して構造的及び論理的な変更を加えることができる。いくつかの実施形態は１つ又は複数の他の実施形態と組み合わせて新しい実施形態を形成することができるので、様々な実施形態は必ずしも相互に排他的ではない。
【００２４】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「１つ」及び「その」、「前記」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単語「又は」は「及び」を含むことを意図している。用語「含む」は「含有する」を意味する。矛盾がある場合は、用語の説明を含めて本明細書が優先されるものとする。
【００２５】
第１の態様において、本発明はジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩の固相ペプチド合成方法に関し、前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記方法は以下の工程：
（ａ）Ｆｍｏｃで保護され、任意選択でさらに適切に側鎖保護された、アミノ酸、ジペプチド及び／又はオリゴペプチドをＣ末端からＮ末端へ線状に段階的にカップリングさせることにより、固体支持体上でジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを合成する工程であって、配列番号１の２４位に対応する位置でのグリシン残基の付加はＦｍｏｃ−（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨによって媒介される工程；
（ｂ）固体支持体からジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを切断し、そのペプチドを脱保護する工程；さらにその後、
（ｃ）ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの有機酸化的フォールディングを実施して、天然のジスルフィド結合を形成する工程
を含む。
【００２６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合によって結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを指す。この用語はまた、天然に又は人工的に、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、又はリン酸化により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。用語「アミノ酸」は天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を指し、Ｄ型及びＬ型両方の光学異性体、アミノ酸アナログ（例えば、ノルロイシンはロイシンのアナログである）及び当技術分野で公知の誘導体を含む。本明細書で使用される「天然アミノ酸」という用語は、２０個の天然に存在するＬ−アミノ酸、すなわちＧｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及びＴｒｐ（Ｗ）に関する。一般に、本願の文脈では、ペプチド及びポリペプチドはＮ末端からＣ末端への方向で示されている。
【００２７】
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳動物への投与にとって安全かつ有効であり、かつ所望の生物学的活性を有する、目的のペプチドの塩を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、比較範囲にわたって２つの配列が同一である程度（すなわち、核酸についてはヌクレオチドごとに、ペプチドについてはアミノ酸ごとに）を指す。これは、比較範囲にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較範囲内の位置の総数（つまり範囲の大きさ）で除し、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。
【００２９】
配列同一性は常にその全長にわたって参照配列に関して計算されることに留意すべきである。これに関連して、本明細書で使用される「比較範囲」という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列を参照配列と比較することができる、連続したヌクレオチド又はアミノ酸位置の概念的セグメントを指す。比較範囲内のヌクレオチド又はアミノ酸配列の一部は、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得るが、参照配列は２つの配列の最適なアラインメントのために付加又は欠失を含まない。
【００３０】
比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１、２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０、４８：４４３のアラインメントアルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１９８８、８５：２４４４の類似性検索方法によって；又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（限定するものではないが、カリフォルニア州マウンテンビューのＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓによるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ；及びＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，米国のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＴＦＡＳＴＡを含む）によって実行され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ  １９８８，７３：２３７−２４４；ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  １９８９、５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８，１６：１０８８１−１０８９０；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９９２、８：１５５−１６５；及びＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４、２４：３０７−３３１に十分に説明されている。アラインメントもまた、検査及び手動アラインメントによってよく行われている。
【００３１】
本明細書に記載のペプチド配列は、ペプチド中に存在し得るジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）についてのいかなる情報も含まずに、ペプチドの一次構造、すなわちアミノ酸の配列のみを規定することに留意すべきである。ジスルフィド架橋は、ペプチド中に存在する２つの異なるチオール基（−ＳＨ）の酸化的フォールディングによって生成される。本明細書に記載のペプチドは少なくとも８つの異なるチオール基（すなわち、それぞれチオール基を含む８つのシステイン残基）を含み、理論的には０、１、２、３、４又はそれ以上の分子内ジスルフィド架橋を形成し得る。しかしながら、本願全体の文脈におけるペプチドは、表１に示すような天然のジスルフィド結合性（すなわち、ＣｙｓＩ−ＩＶ、ＣｙｓＩＩ−ＶＩ、ＣｙｓＩＩＩ−ＶＩＩ、及びＣｙｓＶ−ＶＩＩＩ）を含むことを理解すべきである。
【００３２】
本願によるジンセンチド及びジンセンチド様ペプチドの好ましい実施形態は、表１及び表２に記載されている。
【００３３】
【表１】
2019535702.tif 000002
【００３４】
【表２−１】
2019535702.tif 000003
【００３５】
【表２−２】
2019535702.tif 000004
【００３６】
固相ペプチド合成又は「ＳＰＰＳ」はペプチドの直接化学合成を指し、不溶性支持体がペプチド鎖の成長の際のアンカーとして使用され、これは典型的には一度に１つのアミノ酸を構築する。固相に結合したペプチドの遊離Ｎ末端アミンは、Ｎ保護アミノ酸単位に結合している。次いでこの単位を脱保護して、さらなるアミノ酸単位を結合することができる新しいＮ末端アミンを露出させる。ＳＰＰＳの一般原則は、そのようなカップリング−洗浄−脱保護−洗浄工程の繰り返しサイクルの１つであり、所望の配列及び長さのペプチドが合成されるまで、典型的には一度に１つのアミノ酸を添加する。当業者には理解されるように、原則として、単一のアミノ酸の代わりにＮ−保護ペプチドを１つ又は複数の伸長サイクルで成長鎖に結合することが可能である。本発明はまた、典型的には最大２０アミノ酸、好ましくは最大１０アミノ酸、より好ましくは最大５アミノ酸、さらにより好ましくは最大４アミノ酸の長さを有する、１つ又は複数のより大きなＮ保護ペプチド、又はオリゴペプチドが成長鎖に付加される方法を包含する。特に好ましい実施形態では、本明細書で定義される方法が提供され、ここで工程ａ）はアミノ酸、ジペプチド及び／又はトリペプチド、好ましくはアミノ酸及び／又はジペプチドを成長中のペプチド鎖に段階的にカップリングすることを含む。本発明の最も好ましい実施形態では、工程ａ）は、成長中のペプチド鎖への単一アミノ酸又は構成単位（例えば、アミノ酸対）の段階的カップリングを含む。
【００３７】
好ましくは、本発明によれば、成長中のペプチドは末端カルボキシル基を介して樹脂に固定される。しかしながら、側鎖残基を介して成長中のペプチド鎖の固定を可能にする特定のリンカーの使用もまた想定されており、それが好ましい場合もあり得る。
【００３８】
ＳＰＰＳ用の固体支持体は典型的には固体の不溶性支持体材料である。本発明の目的のために、そのような固体支持体は、第１のアミノ酸（又はペプチド）を固定するための部位を含む。ペプチドを固定するためのそのような機能部位はリンカーと呼ばれる。必要に応じて、他のリンカー部分、例えば、より特化された、例えばより酸に不安定なリンカーなどを、予め製造された固体支持体上の最初の不可欠なリンカーにグラフトしてもよく、それはしばしば「ハンドル」と呼ばれる。高分子有機樹脂支持体は最も一般的な種類の固体支持体材料であり、典型的には等分布の官能基を有する高度に溶媒和されたポリマーを含む。例としては、ポリスチレン（ＰＳ）；ポリアクリルアミド（ＰＡ）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ＰＥＧ−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）又はＰＥＧ−ポリアクリルアミド（ＰＥＧ−ＰＡ）；及び他のＰＥＧベースの支持体が挙げられる。本発明は、固体支持体材料に関して特に限定されない。２−クロロトリチルクロリド樹脂、Ｗａｎｇ樹脂（４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂）及びＰＡＭ樹脂（４−ヒドロキシメチル−フェニルアセトアミドメチル）は、本発明の方法に特に適した固体支持体材料である。他の適切な例としては、限定するものではないが：ＰＥＧ−ＨＭＰＢ（４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸で官能化された架橋ＰＥＧ）；Ｒｉｎｋアミド樹脂（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル−フェノキシ−樹脂）；及びメリフィールド樹脂（ジビニルベンゼンで架橋されたスチレンとクロロメチルスチレンとのコポリマー）が挙げられる。固体支持体材料は、化学的に不活性で合成条件に耐えることができることに加えて、いくつかの要件を満たすべきである。固体支持体粒子は、好ましくは慣用の均一サイズであり、機械的に堅牢であり、容易に濾過ができ且つ溶媒への接近性が高く、試薬の浸透及び微細構造内でのペプチド鎖の拡大を可能にする。本発明で使用される樹脂は、典型的には標準メッシュサイズであり、それは約５０〜５００メッシュ、より好ましくは１００〜４００メッシュである。
【００３９】
上記のように、本方法は、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）Ｎ−保護アミノ酸及びペプチドを成長鎖に付加する、いわゆる「ＦｍｏｃＳＰＰＳ」方法に関する。固体支持体ペプチド合成におけるＦｍｏｃ保護は、その除去が非常に穏やかな塩基性条件（例えば、ピペリジン溶液）でよく、ペプチドと樹脂との間の酸に不安定なリンカーを乱さないため、重要な利点を有する。ＦｍｏｃＮ保護アミノ酸は市販されている。さらに、ＦｍｏｃＮ保護アミノ酸又はペプチドを製造するための反応は、当業者にとって技術常識である。
【００４０】
成長中のペプチド鎖に付加するために導入される各アミノ酸もまた、適切な場合には、側鎖保護基で保護されていることが好ましく、それは典型的には酸に不安定である。この目的に適した保護基は当技術分野において周知である。グルタミン及びアスパラギン酸のために一般的に用いられるカルボキシ保護基は、例えば、Ｍｐｅ、Ｏ−１−アダマンチル、Ｏ−ベンジルであり、あまり一般的ではないが単にアルキルエステルを使用してもよい。簡便には、ｔｅｒｔ−ブチル基が典型的にそして好ましく使用される。チロシンは、典型的には、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル又はＺ−、より好ましくは２−ブロモ−Ｚ−エステルなどの保護基によって保護することができる。２−クロロ−トリチルもしくは４−メトキシ又は４，４’−メトキシ−トリチル基などのトリチルアルコール保護基を使用することも同様に可能である。好ましくは、トリチル又はｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）保護基、最も好ましくはｔＢｕ保護基が使用され、これはチロシル側鎖がｔｅｒｔ−ブチルエーテルに修飾されることを意味する。ｔＢｕ基は強酸性条件下でのみ効果的に除去される。適切なアルギニン保護基には、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラニル−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、アダマンチルオキシ−カルボニル及びイソボルニルオキシ−カルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチレンクロマンスルホニル−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）及びその４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３，５，６−テトラメチルホモログ（Ｔａｒｔ）又はＢｏｃが挙げられ、これらは強酸性条件下でのみ切り離される。好ましくは、Ｐｂｆ、Ｐｍｃ、Ｍｔｒ、最も好ましくはＰｂｆが使用される。強酸性条件下、通常は水性媒体中での側鎖の全体的な脱保護の際に、脱保護されたチロシンのバイスタンダーアルキル化はＰｍｃ、Ｍｔｒ及びＰｂｆでは観察されない。セリン及びスレオニンは、典型的には、例えば、ｔｅｒｔ−ブチル又はトリチル、最も好ましくはｔｅｒｔ−ブチルによって保護され得る。他の、例えばベンジルでの保護態様（ただし、最終的にあまり望ましくない条件下で除去を必要とするのであまり好ましくない）も同様に可能である。同様の考察がリジンの保護にも当てはまる。典型的にかつ好ましくは、ＬｙｓはＢｏｃで保護される。トリプトファンは、固相合成中に必ずしも保護される必要はないが、典型的にはＢｏｃによる保護が考えられる。側鎖保護基に関して、上述のことは天然のＬ−アミノ酸及びそれらのＤ型ホモログの両方に有効である。
【００４１】
したがって、様々な実施形態において、工程（ａ）は以下の工程：
（ｉ）固体支持体に結合した第１のアミノ酸から保護化学基を除去することにより、第１のアミノ酸を脱保護する工程；
（ｉｉ）第２のアミノ酸上の化学基を活性化して、第１のアミノ酸とカップリングさせるための第２のアミノ酸を調製する工程；
（ｉｉｉ）活性化された第２のアミノ酸を脱保護された第１のアミノ酸にカップリングさせて、第１及び第２のアミノ酸からペプチドを形成する工程；及び
（ｉｖ）ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドが合成されるまで、複数のアミノ酸の脱保護及びカップリングを連続的に行い、ペプチド鎖を成長させる工程
を含む。
【００４２】
ジンセンチド配列中の豊富なグリシン及びシステイン残基は、通常、それらの化学合成、特にＣ末端において合成上の課題を提起する。固相法を用いた段階的合成によるジンセンチドの合成の試みは失敗しているが、これはＣ末端フラグメントが凝集体を形成し、合成の成功を妨げたためである。本明細書に記載の方法はこれらの課題を解決する。特に、戦略的に選択されたグリシン残基、すなわち配列番号１の２４位に対応する位置のものは、合成中の凝集を防ぐために可逆的保護基によってアルキル化される。Ｆｍｏｃ−（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨはこの位置でのグリシン残基の付加に使用され、一方、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨが他の位置でのグリシン残基の導入に使用されてもよい。
【００４３】
Ｆｍｏｃペプチド合成のためのカップリング剤は当該分野で周知である。カップリング剤は、混合無水物（例えば、プロパンホスホン酸無水物）又は他のアシル化剤、例えば活性化エステル又は酸ハロゲン化物（例えば、イソブチルクロロホルメートすなわち「ＩＣＢＦ」）であり得るか、又はカルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ジイソプロピル−カルボジイミド、ジシルヘキシル−カルボジイミド）、活性化ベンゾトリアジン誘導体（例えば、３−（ジエトキシホスホリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンすなわち「ＤＥＰＢＴ」）又はウロニウム又はベンゾトリアゾールのホスホニウム塩誘導体であり得る。鎖伸長における最良の収率、短い反応時間及びラセミ化に対する保護を考慮すると、カップリング剤は、遊離カルボン酸官能基を活性化することができるベンゾトリアゾールのウロニウム塩及びホスホニウム塩からなる群から選択され、反応は塩基の存在下で行われることが好ましい。そのようなウロニウム又はホスホニウムカップリング塩の好適で同様に好ましい例は、例えば、ＨＢＴＵ（Ｏ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，’Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＡＯＰ、ＨＣＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−６−クロロ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＣＴＵ（Ｏ−１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＴＯＴＵ（Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＡＰｙＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシビス−（ピロリジノ）−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）である。
【００４４】
Ｆｍｏｃアミノ酸のペプチドへのカップリングのために、カルボキシル基は通常活性化されている。これは反応を早めるために重要である。活性化基には２つの主な種類：カルボジイミド及びトリアゾロールがある。これらの活性化カップリング添加剤の使用は、高活性化ウロニウム又はホスホニウム塩カップリング剤を使用するときに特に好ましい。最も好ましくは、カップリング添加剤は、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体（又は１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体）又はＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアジン誘導体である。適切な例には、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）及びＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアジン誘導体が特に好ましく、最も好ましい実施形態において、カップリング試薬添加剤はヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンである。最も一般的なカルボジイミドは、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）である。
【００４５】
Ｆｍｏｃアミノ酸の活性化は、典型的には塩基試薬の存在下で行われる。好ましくは、塩基試薬は、その共役酸がｐＫａ７．５〜１５、より好ましくはｐＫａ７．５〜１０のｐＫａ値を有する弱塩基であり、その塩基は好ましくは三級の立体障害アミンである。そのさらに好ましい例は、ヒューニッヒ塩基（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアニリン、２，４，６−トリアルキルピリジン、２，６−トリアルキルピリジン又はＮ−アルキル−モルホリンであり、アルキルは直鎖又は分岐鎖のＣ１〜Ｃ４アルキル、より好ましくはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）又はコリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）であり、最も好ましくはコリジンである。
【００４６】
カップリング反応における様々な反応物の量は、大きく変動させてもよく、また、大きく変動すると考えられる。試薬は典型的には反応を加速させそしてそれを完了させるために大過剰に使用される。典型的には、Ｆｍｏｃ−アミノ酸の量に対する固体支持体の量は、約１：１〜１：１０の範囲のモル比であろう。一実施形態では、固体支持体の量対Ｆｍｏｃ−アミノ酸の量対活性化化合物の量は、約１：４のモル比である。反応時間、温度、及びｐＨなどのカップリング工程のための反応条件は、本発明の範囲から逸脱することなく変化し得る。カップリング温度は、特にホスホニウム又はウロニウムタイプのカップリング剤を使用する場合、通常１５〜３０℃の範囲である。典型的には、約２０〜２５℃の温度がカップリングのために適用される。
【００４７】
様々な実施形態では、方法は、マイクロ波エネルギーを印加することによって脱保護する工程、活性化する工程、及びカップリングする工程のうちの少なくとも１つを加速することを含む。
【００４８】
脱保護、活性化、カップリング、及び切断工程の間に反応容器の内容物に適用されるマイクロ波エネルギーは、これらの反応を完了するのに必要な時間の長さを大幅に減少させる。マイクロ波エネルギーを印加するための方法は、熱の蓄積を最小限にしながら最速の反応時間を提供するようにマイクロ波源によって緩和されてもよく、したがってより多くのマイクロ波エネルギーが印加されてもよく、反応内容物の熱に関連する劣化は生じない。この方法は、マイクロ波エネルギーを短時間で大量にスパイクすることを含み得るが、これに限定されない。
【００４９】
この方法は、マイクロ波エネルギーの印加中及び印加の合間に、最終の切断工程まで、及びそれを含めて、反応容器つまりはその内容物を冷却することを含んでもよい。この方法の冷却機構は、アミノ酸伸長サイクルの間に動作し、本明細書において用語「サイクル」は、あるアミノ酸を別のアミノ酸に連結するのに必要な脱保護、活性化、及びカップリングを指すために使用される。冷却システムはまた、所与のサイクルにおけるマイクロ波エネルギーの印加中及び印加の合間に動作して、反応内容物のバルク温度を低く保つことができる。冷却システムは、完成ペプチドが樹脂から切断されるときにも動作することができる。あるいは、温度を厳密に制御するのではなく電力を制御することによっても、反応の進行に対する所望の制御は提供され得る。
【００５０】
上記の配列番号１〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの一次構造、すなわちアミノ酸配列のみを定義しており、ペプチド中に存在し得るジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）についての情報は含まないことに留意されたい。
【００５１】
ジスルフィド架橋は、ペプチド中に存在する２つの異なるチオール基（−ＳＨ）の酸化的フォールディングによって生成される。本明細書に記載のペプチドは、８つの異なるチオール基（すなわち、それぞれチオール基を含む８つのシステイン残基）を含み、したがって、０、１、２、３、又は４つの分子内ジスルフィド架橋を形成することができる。可能なジスルフィド架橋結合パターン（システイン対合）の数は、結合するシステインの数と共に急速に増加する。
【００５２】
天然の細胞内ジスルフィド結合を形成するために、本明細書に記載の合成方法に続いて合成ペプチドの酸化的フォールディングが行われる。ペプチド又はタンパク質の酸化的フォールディングは、その還元型から、天然の分子と同一のジスルフィド結合を有する酸化されたフォールディング型への１つ又は複数の天然のジスルフィド結合の同時形成を指す。ペプチド又はタンパク質中のジスルフィドはその構造を安定化してその生物学的活性を維持する。多くの生理活性ペプチドはシステインに富んでおり、２〜５個のジスルフィド結合を含んでいる。しかしながら、合成又は組換えペプチド又はタンパク質、特にシステインに富むものの酸化的フォールディング又はリフォールディングは、ジスルフィド交換反応による正しいジスルフィド結合形成を容易にするために、緩衝水溶液中及び還元剤と酸化剤のペアの存在下で常に行われる。しかしながら、水溶液中での酸化的フォールディングは、異性体生成物及びデッドエンド生成物を生成することの予測不可能性のために、それらの製造における制限的工程である。各ジスルフィド対を段階的に選択的に形成する化学選択的ジスルフィドアプローチは正しい対合ジスルフィド結合を達成することができるが、その方法は面倒でありそして一般に低収率に悩まされる。高システインペプチドに対する酸化的フォールディングのアプローチには、空気酸化、及び酸化的フォールディングと呼ばれることがある、常に塩基性ｐＨの水性媒体中での強酸化剤又は還元／酸化型グルタチオンの使用が含まれる。本発明では、非水性条件下において有機溶媒中で行われるペプチドの超高速酸化的フォールディング（有機酸化的フォールディング）が達成された。水性酸化的フォールディングと比較して、有機酸化的フォールディングは著しく速い。
【００５３】
様々な実施形態において、有機酸化的フォールディングは、システアミン及び／又はモルホリンを含む有機溶媒（好ましくはＤＭＳＯ及び／又はイソプロパノール）中で、例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、８４．３６％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、５％（ｖ／ｖ）モルホリン及び０．６４％（ｖ／ｖ）システアミン（１０Ｍ）を含むフォールディング緩衝液中でジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドをフォールディングすることを含む。
【００５４】
様々な実施形態において、有機酸化的フォールディングは４℃で行われる。
本明細書に記載される有機酸化的フォールディングの方法は、数分以内に、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は５９分以内、好ましくは５分以内にシステインに富むペプチドの天然のジスルフィド結合の形成を可能にすると考えられ、これは水性酸化的フォールディングなどの当技術分野において既知の従来の方法よりも著しく速い。
【００５５】
様々な実施形態において、方法は、フォールディングされたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製することを含む。
【００５６】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の方法によって調製されたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、表１に記載のように４つの天然ジスルフィド結合を有すると考えられる。調製されたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは天然ペプチドと同一であり、それと機能的に区別がつかない。
【００５７】
本明細書に記載の固相ペプチド合成及び有機酸化的フォールディングの方法は、他の高システインペプチドの調製にも使用できることに留意すべきである。そのような使用もまた本出願の範囲内である。
【００５８】
第２の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩を組換え的に調製する方法に関し、前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、この方法は以下の工程：
（ａ）ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を有するマルトース結合タンパク質、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を有するエンテロキナーゼ切断配列、及びジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を含むポリペプチドをコードしている工程；
（ｂ）ポリペプチドの産生を可能にする条件下において増殖培地中で宿主細胞を培養し、培地からポリペプチドを回収する工程；及び
（ｃ）エンテロキナーゼを用いてポリペプチドを切断することにより、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩を生成する工程
を含む。
【００５９】
ポリペプチドは、宿主細胞又は無細胞系において組換え発現させることができる。ポリペプチドは、任意の既知の十分に確立された発現系及び組換え細胞培養技術を用いて産生され得る。ポリペプチドはまた、ヤギ又は植物などのトランスジェニック生物の宿主細胞において産生されてもよい。
【００６０】
本発明の目的のための「宿主細胞」という用語は、目的のポリペプチドの産生のためのポリヌクレオチドの発現、すなわち転写及び翻訳に一般的に使用される任意の細胞を指す。特に、「宿主細胞」という用語は原核生物、下等真核生物、植物、昆虫細胞又は哺乳動物細胞培養系に関する。宿主細胞には、限定するものではないが、細菌、微生物、植物又は動物の細胞、例えば大腸菌、枯草菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、又はＣＨＯ細胞が含まれる。
【００６１】
ポリペプチドの組換え産生のためには、典型的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが単離され、さらなるクローニング（増幅）又は発現のためにプラスミドなどの複製可能なベクターに挿入される。様々な実施形態において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プラスミドなどのベクターに含まれる。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を輸送することができるポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、ベクターは「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。本明細書に開示されるベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製することができるか（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）、又は宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。
【００６２】
組換え技術を使用する場合、ポリペプチドは細胞内で、ペリプラズム空間で産生されるか、又は培地に直接分泌され得る。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、第１工程として、宿主細胞又は溶解断片のいずれかの粒子状デブリが、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９２；１０：１６３−１６７は、大腸菌のペリプラズム空間に分泌されるポリペプチドを単離するための手順を記載している。ポリペプチドは、可溶性のフォールディングされた状態で直接得ることができるか、又は封入体の形態で回収した後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで復元することができる。さらなる選択肢は、酸化的細胞内環境を有する特定の宿主株の使用であり、それによりサイトゾル中にジスルフィド結合を形成することが可能になる（Ｖｅｎｔｕｒｉ  Ｍ、Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｃ、Ｈｕｎｔｅ  Ｃ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；３１５、１−８）。
【００６３】
様々な実施形態において、ポリペプチドは配列番号６７〜１３０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する。
【００６４】
【表３−１】
2019535702.tif 000005
【００６５】
【表３−２】
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【００６６】
【表３−３】
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【００６７】
【表３−４】
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【００６８】
【表３−５】
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【００６９】
【表３−６】
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【００７０】
組換え生産されたポリペプチドはエンテロキナーゼ切断部位（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、配列番号６６）のＣ末端の直後でエンテロキナーゼによってさらに切断され、その結果、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドがさらなる精製のために遊離される。
【００７１】
種々の実施形態では、この方法は、エンテロキナーゼ切断の前に、好ましくはアミロース樹脂精製により、組換え生産されたポリペプチドを精製することをさらに含む。
細胞によって産生されたポリペプチドは、任意の従来の精製技術を使用して、例えばゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィーによって、又は好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は逆相クロマトグラフィーによって精製することができる。本発明の特定のポリペプチドに使用される精製方法の選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００７２】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の方法を用いて組換え生産されたジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは、天然のジスルフィド結合を有することで、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの有機酸化的フォールディングを不要にする。
【００７３】
それらの高い配列類似性のために、本明細書に記載されるジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドは類似の生物学的機能を有すると考えられる。
さらに、本発明のジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドを含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるポリペプチドもまた、上で詳述した方法を使用して調製することができることを理解されたい。これは後述する用途にも使用できる。そのような調製方法及びそれらのポリペプチドの使用もまた本願の範囲内である。本明細書に記載のジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド及びポリペプチドは、実質的に不純物を含まないことが好ましいが、未反応の出発物質、副生成物、分解生成物、及び宿主細胞の残留成分などの多くの起源に由来し得る外来化合物又は不純物をなお含み得る。
【００７４】
人参植物又は天然源由来のジンセンチド関連化合物を含有する植物から２〜５ｋＤａのＭＷを有するペプチドを濃縮するための、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は精製に関連する方法によって濃縮された画分、ならびに以下に記載された栄養補助剤、医薬品又は化粧品用途におけるそれらの使用もまた、本願の範囲内であることが理解されるべきである。
【００７５】
第３の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、α１−アドレナリン受容体アンタゴニスト及び血管弛緩薬としての使用に関する。
【００７６】
第４の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、一酸化窒素増強剤としての使用に関する。
【００７７】
第５の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、抗血栓剤としての使用に関する。
【００７８】
第６の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、抗アテローム性動脈硬化剤としての使用に関する。
【００７９】
第７の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、ドキソルビシン誘発心毒性に対する保護剤としての使用に関する。
【００８０】
第８の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、老化防止及び強壮剤としての使用に関する。
【００８１】
第９の態様において、本発明は、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩、あるいは、クロマトグラフィー、サイズ排除、又は人参植物もしくはジンセンチド又はそのジンセンチド様ペプチドを含む植物からの精製に関連する方法による濃縮画分の使用であって、（ｉ）配列番号１〜６４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）（ｉ）のペプチドとその全配列にわたって少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する前記ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチドの、栄養補助剤、健康補助剤、又は化粧品原料としての使用に関する。
【００８２】
本明細書で使用される「栄養補助剤」という用語は、食事を補完し、例えばビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、又はアミノ酸など、食事で欠けているか又は十分な量を摂取できないような栄養素を提供することを目的とする物質を指す。本明細書で使用される「健康補助剤」という用語は、動物及び／又はヒト用の食品及び食品補助剤、食品の栄養強化剤、栄養補助食品、機能性（及び医療用）食品及び栄養サプリメントを含む。本明細書で使用される「化粧品原料」という用語は、スキンコンディショニング剤及び老化防止剤などの、化粧品用途のための化粧品配合物に含まれ得る任意の作用剤を指す。
【００８３】
本発明の前述の第３から第９の態様の様々な実施形態において、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩は、商業的に入手されるか、天然源から単離されるか、又は好ましくは本明細書に記載の方法によって合成的に又は組換え的に調製されるかを問わず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的に活性な薬剤として使用され得る。これは、様々な実施形態において、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は動物）に、症状、疾患又は障害の適切であると考えられる治療又は予防に有効な量で、単独で又は１つ以上の他の作用剤と組み合わせて（同時に、順次又は別々に）投与することができる。そのような症状、疾患又は障害には、高血圧、虚血性心疾患、血栓症、アテローム性動脈硬化症、勃起不全、脳卒中、心筋梗塞、心不全、癌、加齢及び加齢関連疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【００８４】
したがって、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩は、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物として製剤化することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、１つの臓器又は体の一部から別の臓器又は体の一部にペプチドを運搬又は輸送するのに関与する、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、又は溶媒封入材料などの薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そして患者に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；コーンスターチ、ポテトスターチなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、座薬用ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；滅菌蒸留水；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝溶液；ポリエステル、ポリカーボネート又はポリ無水物；及び医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合性物質。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、１９９５）に、典型的な担体及び医薬製剤を調製する従来の方法が開示されているので参照されたい。
【００８５】
当業者はまた、適切な製剤は特定の用途のために選択される投与経路に依存し、本発明のペプチドを対象に投与する適切な経路及び様式は個々の場合に応じて決定されるべきであることを理解するであろう。
【００８６】
本発明の組成物は、タンパク質性薬物又は核酸ベースの薬物に対して治療上有効な任意の非経口又は非経口（経腸）経路を介して投与することができる。非経口適用方法としては、例えば注射液、注入液又はチンキ剤の形態での、皮内、皮下、筋肉内、気管内、鼻腔内、硝子体内又は静脈内注射及び注入技術、ならびに、例えばエアロゾル混合物、スプレー又は粉末の形態での、エアロゾルの導入及び吸入が挙げられる。肺薬物送達についての概説、すなわちエアロゾルの吸入（鼻腔内投与にも使用することができる）又は気管内注入のいずれかによるものについては、例えばＰａｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃ  ２００４；Ｖｏｌ．１第３３８〜３４４頁）によって提供されている。非経口投与様式は、例えば丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤又は懸濁剤の形態での経口投与、あるいは、坐剤の形態での直腸内投与である。本発明のペプチドは、従来の非毒性の薬学的に許容される賦形剤又は担体、添加剤及びビヒクルを所望に応じて含む製剤で全身的又は局所的に投与することができる。
【００８７】
本発明の一実施形態では、医薬は哺乳動物、特にヒトに非経口投与される。対応する投与方法としては、例えば注射液、注入液又はチンキ剤の形態での、皮内、皮下、筋肉内、気管内、又は静脈内注射及び注入技術、ならびに、例えばエアロゾル混合物、スプレー又は粉末の形態での、エアロゾルの導入及び吸入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
適用される本発明のペプチドの投与量は、所望の予防効果又は治療的応答を達成するために広い範囲内で変動し得る。それは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの半減期に依存するであろう。さらに、最適投与量は、ペプチドの体内分布、投与方法、治療される疾患／障害の重症度、ならびに患者の病状に依存するであろう。必要に応じて、ペプチドは、持続放出製剤、例えば、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ（商標）又はＯｃｔｏＤＥＸ（商標）のようなリポソーム分散液又はヒドロゲルベースのポリマーミクロスフェアで投与することもできる（参照：Ｂｏｓら、Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ：Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ  ２００３：１〜６）。利用可能な他の持続放出製剤は、例えばＰＬＧＡ系ポリマー（ＰＲ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＰＬＡ−ＰＥＧ系ヒドロゲル（Ｍｅｄｉｎｃｅｌｌ）及びＰＥＡ系ポリマー（Ｍｅｄｉｖａｓ）である。したがって、本発明のペプチドは、薬学的に許容される原料ならびに確立された調製方法を用いて組成物として製剤化することができる（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｌ．とＧｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルバニア州フィラデルフィア）。医薬組成物を調製するために、薬学的に不活性の無機又は有機賦形剤を使用することができる。例えば丸剤、粉剤、ゼラチンカプセル剤又は坐剤を調製するために、例えばラクトース、タルク、ステアリン酸及びそれらの塩、脂肪、ワックス、固体又は液体ポリオール、天然油及び硬化油を使用することができる。使用前に溶液又はエアロゾル混合物に再構成される溶液、懸濁液、エマルジョン、エアロゾル混合物又は粉末を製造するための適切な賦形剤には、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、及びそれらの適切な混合物、ならびに植物油が含まれる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド又はそれらの塩は、局所的な皮膚の若返り及び／又は老化防止組成物を提供するために当技術分野において公知の任意の化粧品組成物に含まれ得る。
【００９０】
製剤は、細菌捕集フィルターによる濾過を含む多数の手段によって、又は使用直前に滅菌水又は他の滅菌媒体に溶解又は分散することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を包含させることによって滅菌することができる。
【００９１】
上記のジンセンチド又はジンセンチド様ペプチド及び組成物の治療用途又は化粧用途の組成物及び方法もまた、本願の範囲内である。
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。しかしながら、本発明は例示された実施形態に限定されないことを理解されたい。
【００９２】
実施例
材料及び方法
Ｆｍｏｃ化学によるペプチド固相合成の一般的手順
ペプチド−ヒドラジドについては、最初に、２−クロロトリチルクロリド樹脂を脱水ＤＣＭ中でしばらく膨潤させ、脱水ＤＭＦ中の５％ヒドラジンを直接添加した。０．５時間後、樹脂をＤＣＭ（３×）、ＤＭＦ（３×）、及びＤＣＭ（３×）で洗浄した。次に、典型的なＦｍｏｃＳＰＰＳプロトコルを用いてペプチドをヒドラジン−トリチル樹脂上に集めた。全てのアミノ酸を４当量の樹脂中で使用し、４当量のＰｙＢｏｐ及び８当量のＤＩＥＡによって予備活性化した。アミノ酸を１〜２時間カップリングさせた後、樹脂をＤＣＭ（３×）、ＤＭＦ（３×）、及びＤＣＭ（３×）で洗浄した。各アミノ酸カップリング工程の間に、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン中で連続したα−アミノ基脱保護（５分、１０分）を行った。最後に、切断試薬：９０％ＴＦＡ、５％ＥＤＴ、２．５％ＴＩＳ及び２．５％水の混合物を用いてペプチド−ヒドラジドを樹脂から遊離させた。エーテルから沈殿させた後、粗ペプチド−ヒドラジドを分取ＨＰＬＣにより精製し、分子量をＥＳＩ−ＭＳにより決定した。
【００９３】
システイニルペプチドについては、最初に、２当量のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを脱水ＤＣＭ（溶解性のために少量の脱水ＤＭＦを含む）に溶解させ、５当量（アミノ酸に対し）のＤＩＥＡで膨潤させた２−クロロトリチルクロリド樹脂に加えた。１時間の反応後、樹脂をＤＣＭ（３×）、ＤＭＦ（３×）、及びＤＣＭ（３×）で洗浄した。残りの反応性トリチル基をキャッピングするために、樹脂をメタノールと１５分間反応させた。システイン残基が樹脂上に付着したら、アミノ酸カップリング、α−アミノ基の脱保護及び最終的なペプチド切断を上記と同じ手順に従って実施した。
【００９４】
マイクロ波補助による自動ペプチド合成
マイクロ波補助によるペプチド合成は、ＣＥＭマイクロ波ペプチド合成装置、リバティ１を用いてマニュアルの指示に従って０．１ｍｍｏｌ及び０．２５ｍｍｏｌで行った。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨをペプチドＣ末端部分に使用した。Ｆｍｏｃ脱保護は、０．１ＭのＨＯＢｔを含有する２０％ピペリジン／ＤＭＦ中で行った。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ保護アミノ酸のカップリングは、ＤＭＦ中のＰｙＢｏｐによって活性化された５当量のアミノ酸によって達成された。マイクロ波合成に使用したパラメータを以下の表に示した。
【００９５】
【表４】
2019535702.tif 000011
【００９６】
ペプチド合成の完了後、ペプチドを９０％ＴＦＡ、５％ＥＤＴ、２．５％ＴＩＳ及び２．５％水の混合物中で切断した。その後、エーテルによって沈殿させたペプチドをフォールディング反応に直接使用した。
【００９７】
ペプチド−ヒドラジドとシステイニルペプチドのライゲーション
簡単に説明すると、最初にＦｍｏｃ−ペプチドヒドラジドを６ＭのＧｄｎ−ＨＣｌを含むｐＨ３．０の０．２Ｍのリン酸緩衝液中で、ｐＨ３．０の亜硝酸ナトリウム（ペプチドに対し５当量）により−２０℃で２０分間酸化させてペプチドアジドを形成した。２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）（最終濃度１％）を添加し、ｐＨを７．０に調整した後、ペプチドチオエステルが形成された。最後に、このペプチドチオエステルは、システイニル−ペプチドと化学選択的に反応して、ライゲーション部位に天然のアミド結合を生成することによって全長ペプチドを生成した。ライゲーションした全長ペプチドからのＦｍｏｃの除去は、ＴＣＥＰを含む２０％ピペリジン中で２０分間行った。
【００９８】
還元型ペプチドの天然型へのフォールディング
ほとんどのジンセンチド及び高システインペプチドについて、フォールディングは、システアミン／シスタミンを含有する０．１Ｍの（ＮＨ）４ＨＣＯ３中の２０％ＤＭＳＯ中で行った。ペプチド：システアミン：シスタミンの比は約１：２００：１０であった。ペプチドの溶解度に応じて、１０％ＴＦＥ、５％又は１０％ＩＰＡを含めることができる。ペプチドをごく少量のＤＭＳＯに溶解し、次いでフォールディング緩衝液に添加し、４℃で一晩フォールディングさせた。フォールディング後、反応物の緩衝液を交換し、Ｓｅｋ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジを使用することによって濃縮した。濃縮したフォールディング混合物をＨＰＬＣを用いて精製し、純粋なフォールディング生成物を得た。
【００９９】
有機酸化的フォールディングのために、ペプチドを非常に少量のＤＭＳＯに溶解し、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、８４．３６％（ｖ／ｖ）イソプロパノール、５％（ｖ／ｖ）モルホリン及び０．６４％（ｖ／ｖ）システアミン（１０Ｍ）を含むフォールディング緩衝液に添加して、４℃で５分間フォールディングさせた。フォールディング後、反応物の緩衝液を交換し、Ｓｅｋ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジを使用することによって濃縮した。濃縮したフォールディング混合物をＨＰＬＣを用いて精製し、純粋なフォールディング生成物を得た。
【０１００】
ジンセンチドの組換え発現
ジンセンチドの組換え発現のための全体的な戦略
１．標的配列をベクターにクローニングし、ここでジンセンチドは、ペリプラズムシグナル配列−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＣ末端に、間にＤＤＤＫ切断配列を介して融合させた（エンテロキナーゼはＤＤＤＫのＣ末端で切断することができる）。
【０１０１】
２．プラスミドを大腸菌に形質転換し、アンピシリン含有寒天プレートを用いて選択した。
３．単一コロニーを採取し、数リットルのアンピシリン含有ＬＢブロス中３７℃で、光学密度が約０．６に達するまで２００ｒｐｍで振盪しながら培養した。
【０１０２】
４．誘導を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて１６℃で一晩行った。
５．細胞溶解物をアミロースアフィニティーカラムにロードし、マルトースを用いて溶出した。そして
６．エンテロキナーゼをマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の切断に使用した。
【０１０３】
７．陰イオン交換及び逆相ＨＰＬＣを用いて、組換え発現されたジンセンチドを精製した。
オタネニンジン、アメリカニンジン、又はサンシチニンジンからのジンセンチドの単離及び精製
オタネニンジン、アメリカニンジン、又はサンシチニンジンの約１ｋｇの乾燥根、葉、種子又は花を１０リットルの水で抽出した。濾過後、濾液をＣ１８フラッシュカラム（Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ、米国）にロードし、７０％エタノールで溶出した。次に溶出画分をＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）にロードし、１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出し、続いて限外濾過（ＶｉＶａｆｌｏｗ２００、２０００ＭＷＣＯハイドロスタット）した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（島津、日本）によってさらに精製した。移動相Ａ（０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）及び移動相Ｂ（０．０５％ＴＦＡ／ＡＣＮ）の線形勾配をＣ１８カラム（２５０×２２ｍｍ、５μｍ、３００Å）（Ｇｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ、米国）で使用した。
【０１０４】
本発明は、我々の健康期間を延ばすためのペプチド原性強壮剤としてのジンセンチドの合成及び使用に関する。ペプチド強壮剤の役割は、細胞及び生物の老化の時間的経過を延ばすことである。これらは加齢性疾患に介入し、活発で健康的な加齢を促進する。特にジンセンチドは、癌、心血管疾患、炎症状態、ストレス、その他の代謝状態などの多数の慢性及び老年関連疾患の根本的な原因である心血管疾患及び虚弱性に対処することができる。図１は、ジンセンチドの強壮効果を示す略図である。ジンセンチドの合成及び使用法については、次のセクションで説明する。
【０１０５】
１．ジンセンチドの製造
２．ラット大動脈輪のα１−アドレナリン受容体拮抗薬及び血管弛緩薬としてのジンセンチド
３．一酸化窒素増強剤としてのジンセンチド
４．抗血栓薬としてのジンセンチド
５．抗アテローム性動脈硬化薬としてのジンセンチド
６．ドキソルビシン誘発心毒性に対する保護剤としてのジンセンチド
７．老化防止剤及び強壮剤としてのジンセンチド
実施例１：ジンセンチドの製造
ジンセンチド配列中に豊富なグリシン及びシステインは、それらのジンセンチドの合成において、特にＣ末端において合成の課題を提起した。固相法を用いた段階的合成によるジンセンチドの合成の試みは失敗しているが、これはＣ末端フラグメントが凝集体を形成し、合成の成功を妨げたためである。したがって、本発明では、これらの合成の課題を克服するためのジンセンチドの化学合成の段階的固相合成戦略を説明した。特に、戦略的に選択されたＧｌｙ残基を可逆的保護基でアルキル化して凝集を防ぎ、代表的な例としてジンセンチドＴＰ１の合成を成功させた。
【０１０６】
ジスルフィド結合形成のための有機酸化的フォールディングシステムが発明された。本発明を使用すると、高システインペプチドの天然ジスルフィド結合の形成が数時間ではなく数分以内（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は５９分以内）になるという点で、酸化的フォールディングが１０００倍加速される。本発明は反応収率も向上させ、目に見えるペプチド沈殿を生じることなく高ペプチド濃度で実施することができる。さらに、この方法で使用される全ての試薬は安価であり、これは合成を経済的に有利にする。したがって、それはシステインに富むペプチドの大規模生産に適用することができる。
【０１０７】
ジンセンチドの組換え発現は、ジンセンチドの製造のための化学物質の使用が排除されるので有利である。さらに、組換え発現プラットフォームを使用して産生された発現されたジンセンチドは、フォールディングされた状態にあり、酸化的フォールディングを行う第２の工程が不要になる。
【０１０８】
発明の技術的説明
ｉ．表１は、ジンセンチドのアミノ酸配列を示す。
ｉｉ．図２は、ジンセンチドの化学合成の概略フローを示す
ｉｉｉ．図３は、合成ジンセンチドＴＰ１の酸化的フォールディング戦略を示す。
【０１０９】
ｉｖ．図４、５、６は、合成ジンセンチドが天然ジンセンチドと同一であり、人参から得られた天然ジンセンチドと機能的に区別がつかないことを示す。
Ｖ．図７〜１１は、ジンセンチドの組換え発現スキームを示す。
【０１１０】
酸化的フォールディングは、ペプチド及びタンパク質中にジスルフィド結合を形成するためのアプローチに関する。この方法では、還元された又は部分的に酸化されたペプチドは、有機溶媒及び相溶性の有機還元剤及び酸化剤（レドックス剤）を用いて非水性系で完全に酸化される。
【０１１１】
本発明の理論的根拠は、酸化的フォールディングがＳＮ２反応であるチオール−ジスルフィド交換反応によって媒介されるという観察に基づいている。そのような反応は、攻撃的なチオール求核剤が水によって溶媒和されている水性条件におけるよりも有機溶媒において強く好まれる。酸化的フォールディング条件において水を排除することは、チオール−ジスルフィド交換反応、ひいては酸化プロセスを加速するはずである。
【０１１２】
本発明では、４つの主要成分、すなわち有機塩基、有機溶媒、構造促進共溶媒及びレドックス剤が導入される。ピリジン、イミダゾール又はモルホリンなどの有機塩基は、ジスルフィド形成のための適切な塩基性を提供するために使用され、有機溶媒は、チオール−ジスルフィド交換反応が、文献における一般的な実践である水性条件におけるよりも１０００倍速い環境を提供する。さらに、構造促進共溶媒及びレドックス剤はフォールディング生成物の正しいジスルフィド対形成を確実にする。トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）などの構造促進溶媒を使用して、天然の二次構造が優先的に形成され、それによってシステインの天然のペアを近接させて正しいジスルフィド結合を形成する。システアミンなどの有機溶媒適合性還元剤及び酸化剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用して、誤ったジスルフィド結合をチオール−ジスルフィド交換反応によって正しいジスルフィド結合にシャッフルすることができる。
【０１１３】
還元ペプチドは、固相／液相合成又は組換え発現によって合成することができる。次にそれを精製し凍結乾燥する。還元ペプチドを穏やかな酸化剤としても作用する純粋なＤＭＳＯに溶解し、有機溶媒で最終濃度０．１ｍＭ〜１ｍＭに希釈する。続いて、有機塩基及び還元剤を添加する。還元剤が有機溶媒に溶けない場合は、少量の水に溶かすことができる。水の最終体積は混合物全体の２０％を超えないようにするのが好ましい。
【０１１４】
一例として、環状ペプチドカラタ（ｋａｌａｔａ）Ｂ１（ｋＢ１）をフォールディングするために前述の手順が使用される。ストックとして完全に還元したｋＢ１をＤＭＳＯに溶解する。ペプチドストックを希釈するために有機溶媒として２−プロパノールを添加する。次にピリジン、イミダゾール又はモルホリンを含む有機塩基及び還元剤システアミンを加える。各条件は、様々な濃度の溶媒及び塩基と共に、１００μＭ  ｐｆの還元型ｋＢ１、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及び１００ｍＭシステアミンを含む。
【０１１５】
・図１２は、天然及び還元型ｋＢ１のＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳプロファイルを示す。
・表４は、様々な溶媒の組み合わせによるｋＢ１の酸化的フォールディング条件を示す。
【０１１６】
・図１３は、異なる塩基の効果を示す、ｋＢ１の酸化的フォールディングのＲＰ−ＵＰＬＣプロファイルを示す。
・図１４は、ｋＢ１の酸化的フォールディングのＲＰ−ＵＰＬＣプロファイル、ならびにレドックス剤としてのシステアミン及びＤＭＳＯの効果を示す。
【０１１７】
・図１５は、還元剤として異なるチオールを用いたｋＢ１の酸化的フォールディングのＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルを示す。
・図１６は、有機酸化的フォールディングによって調製された天然及び合成のｋＢ１の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル比較を比較する。
【０１１８】
【表５】
2019535702.tif 000012
【０１１９】
実施例２．ラット大動脈輪のα１アドレナリン受容体拮抗薬及び血管弛緩薬としてのジンセンチド
・本発明は、ジンセンチドＴＰ１が血管弛緩特性を有することを示す。
【０１２０】
・植物ペプチド及びタンパク質は、薬用植物の生物活性成分としてはあまり研究されないことが多い。他のペプチド及びタンパク質とは異なり、複数の分子内ジスルフィド結合は高システインペプチドを安定化させ、それらを熱、酸及び酵素的分解に対して非常に安定にする。本発明は、高システインペプチドであるジンセンチドＴＰ１が、８つのシステイン残基（４つの安定なジスルフィド結合）及び独特の擬似環状構造を有し、それを熱、酸、血清及びタンパク質分解に対して安定にすることを示す。
【０１２１】
・高システインペプチドは分子内ジスルフィド架橋によって高度に架橋されている。これは嵩高い疎水性側鎖を外側に露出させ、分子の表面をより親油性にする。また、Ｄ２Ｏの遅い交換は、ジンセンチドの水素結合が外側に露出するのではなく分子内で結合していることを示している。これらの特性はジンセンチドを水から脱溶媒和する。したがって、ジンセンチドの独特の特徴は、内因性の細胞透過性及び腸管吸収を改善し、それを経口的に活性にすることができる。
【０１２２】
技術的な説明
・図１７は、人参植物からのジンセンチドの概略的な精製を示す。ＴＰ１（本明細書では天然ジンセンチドＴＰ１と呼ぶ）を含む全てのジンセンチドは、溶媒−溶媒分配、イオン交換、サイズ排除、及び逆相高圧液体クロマトグラフィーによって、高い均質性まで精製された。異なる植物組織からのジンセンチドの収量は１０倍を超えて変動し、最高収量は種子及び花から（０．２〜０．４％）であり、最低収量は根及び葉から（０．０１〜０．０３％）である。したがって、１ｋｇの乾燥した花又は種子から、４００ｍｇ近くのジンセンチドを得ることができた。
【０１２３】
・表１は、ジンセンチドのアミノ酸配列を示す。
・図１８及び１９は、ジンセンチドＴＰ１、ＴＰ３及びＴＰ８がフェニレフリン誘発大動脈輪収縮を弛緩させるが、ＫＣｌ誘発収縮大動脈輪は弛緩させないことを示す。ジンセンチドＴＰ１の血管運動反応を調べるために、単離した胸部大動脈をＫＣｌ（３０ｍＭ）又は選択的α１−アドレナリン受容体アゴニスト、フェニレフリン（０．１μＭ）で予め収縮させた。等尺性張力を大動脈輪収縮の測定値として記録した。ｅｘ  ｖｉｖｏの結果は、ジンセンチドＴＰ１がフェニレフリン誘発大動脈輪収縮を用量依存的に阻害するが（ｐ＜０．０５）、ＫＣｌ投与群では阻害しないことを示した。
【０１２４】
・表５は、ジンセンチドＴＰ１が代謝的に安定であることを示す
・図２０は、Ｄ２Ｏのゆっくりとした交換を示しており、これは、ジンセンチドＴＰ１の広範な水素結合ネットワークがそれらの構造的安定性を付与することを示している。
【０１２５】
・図２１は、ＴＰ１の配列、その二次構造、合成及び天然ＴＰ１の全体的な形状、ＴＰ１の疎水性表面のＣＰＫモデル、及びＴＰの３Ｄ構造を示す。
【０１２６】
【表６】
2019535702.tif 000013
【０１２７】
実施例３．一酸化窒素増強剤としてのジンセンチド
・本発明は、ジンセンチドＴＰ１が一酸化窒素合成を誘導することを示す。人参中のジンセノサイドのＲｇ１及びＲｂ１などの主要なメンバーと比較して、ジンセンチドＴＰ１は一酸化窒素合成においてジンセノサイドＲｇ１及びＲｂ１よりも有効である。
【０１２８】
・植物性ペプチドやタンパク質は薬用植物の生理活性成分としてはあまり研究されないことが多い。他のペプチド及びタンパク質とは異なり、複数の分子内ジスルフィド結合は高システインペプチドを安定化させ、それらを熱、酸及び酵素的分解に対して非常に安定にする。本発明は、高システインペプチドであるジンセンチドＴＰ１が、８つのシステイン残基（４つの安定なジスルフィド結合）及び独特の擬似環状構造を有し、それを熱、酸、血清及びタンパク質分解に対して安定にすることを示す。
【０１２９】
・ジンセンチドは高システインペプチドであり、分子内ジスルフィド架橋によって高度に架橋されている。ジンセンチドは長さが３１アミノ酸であり、４つのジスルフィド架橋を含むことから、ジンセンチドは、４つのジスルフィド結合で占められた内側コアを有するインサイドアウト配置を有する。結果として、そのような構造的配置は、嵩高い疎水性側鎖を外側に露出させ、分子の表面をより親油性にする。実際、ジンセンチドの表面は、３Ｄ  ＮＭＲによって決定されるように概して疎水性アミノ酸からなる。また、ジンセンチドは非常にコンパクトであり、ＮＭＲ研究におけるＤ２Ｏのゆっくりとした交換によって示されるように、安定した内部水素結合の広範なネットワークを有する。内部水素結合は、ジンセンチド構造を安定化するだけでなく、水との外部水素結合からジンセンチドを脱溶媒和する。同時に、ジンセンチドのこれらの独特の特徴は、それらの細胞透過性及び腸管吸収を改善し、それらを生物学的に利用可能にする。言い換えれば、ジンセンチドは小分子のような安定性と経口バイオアベイラビリティーを有するが、小分子よりもオンターゲット特異性を高め、オフ分子の副作用の可能性を減らすという大きなフットプリントを有する。
【０１３０】
発明の技術的説明
・表１は、ジンセンチドのアミノ酸配列を示す。
・図２２は、最も一般的に使用されているオタネニンジン、アメリカニンジン、及びサンシチニンジンの３種のジンセンチドのプロファイルを示す。
【０１３１】
・図２３は、オタネニンジンのジンセンチドの組織分布を示す。
・図２４は、ジンセンチドＴＰ１のｄｅ  ｎｏｖｏシーケンスを示す。
・図２５は、ジンセンチドＴＰ１のジスルフィド結合性を示す。
【０１３２】
・図２６は、オタネニンジン、アメリカニンジン、及びサンシチニンジンの全３種類の一般的に使用されているジンセンチドをコードする転写産物を示す。
・図２７は、ジンセンチドＴＰ１がヒト内皮細胞からの細胞内ＮＯ合成を増加させることを示す（ＨＵＶＥＣ−ＣＳ）。比較すると、ジンセンチドＴＰ１は、ＮＯ放出をジンセノサイドＲｂ１及びＲｇ１の両方に対し３倍の強さ及び規模で増大させる。ジンセンチドＴＰ１、ＴＰ３、ＴＰ８及び合成ＴＰ１は同等の細胞ＮＯ放出を示す。
【０１３３】
・図２８は、ジンセンチドＴＰ１がリン酸化ｅＮＯＳ（ｐ−ｅＮＯＳ）の蓄積を誘導することを示す。１μＭのジンセンチドＴＰ１は、約３０分でｐ−ｅＮＯＳの蓄積を誘導した。
【０１３４】
・図２９は、ジンセンチドＴＰ１誘導性一酸化窒素形成はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達に関与することを示す。
・表５は、ジンセンチドＴＰ１が代謝的に安定であることを示す
・図３０は、Ｄ２Ｏのゆっくりとした交換を示しており、これは、ジンセンチドＴＰ１の広範な水素結合ネットワークがそれらの構造的安定性を付与することを示している。
【０１３５】
・図３１は、ジンセンチドＴＰ１が細胞に対して細胞傷害性ではなく、赤血球に対して溶血性であることを示す。ジンセンチドＴＰ１は免疫原性ではない。
実施例４．抗血栓薬としてのジンセンチド
・本発明は、ジンセンチドＴＰ１がＰ２ｙ１２活性化に対して拮抗作用を有することを示す。人参中の主なジンセノサイドと比較して、ジンセンチドＴＰ１は、Ｐ２ｙ１２活性化の拮抗においてジンセノサイドＲｇ１及びＲｂ１よりも有効である。ジンセンチドＴＰ１はｉｎ  ｖｉｖｏでも抗血小板凝集作用を発揮する。
【０１３６】
・植物性ペプチドやタンパク質は薬用植物の生理活性成分としてはあまり研究されないことが多い。他のペプチド及びタンパク質とは異なり、複数の分子内ジスルフィド結合は高システインペプチドを安定化させ、それらを熱、酸及び酵素的分解に対して非常に安定にする。本発明は、高システインペプチドであるジンセンチドＴＰ１が、８つのシステイン残基（４つの安定なジスルフィド結合）及び独特の擬似環状構造を有し、それを熱、酸、血清及びタンパク質分解に対して安定にすることを示す。
【０１３７】
・高システインペプチドは分子内ジスルフィド架橋によって高度に架橋されている。これは嵩高い疎水性側鎖を外側に露出させ、分子の表面をより親油性にする。また、Ｄ２Ｏの遅い交換は、ジンセンチドの水素結合が外側に露出するのではなく分子内で結合していることを示している。これらの特性はジンセンチドを水から脱溶媒和する。したがって、ジンセンチドの独特の特徴は、内因性の細胞透過性及び腸管吸収を改善し、それを経口的に活性にすることができる。
【０１３８】
発明の技術的説明
・表１は、ジンセンチドのアミノ酸配列を示す。
・図３２は、ジンセンチドＴＰ１がＰ２ｙ１２活性化に拮抗することを示す。比較すると、ジンセンチドＴＰ１はジンセノサイドＲｂ１及びＲｇ１の両方よりも有効である。
【０１３９】
・図３４は、ジンセンチドＴＰ１がｉｎ  ｖｉｖｏで血小板凝集を阻害することを示す
・表４は、ジンセンチドＴＰ１が熱、酸、タンパク質分解、及び血清媒介性分解に対して安定であることを示す。
【０１４０】
・図３３は、Ｄ２Ｏのゆっくりとした交換を示しており、これは、ジンセンチドＴＰ１の広範な水素結合ネットワークがそれらの構造的安定性を付与することを示している。
実施例５．抗アテローム性動脈硬化薬としてのジンセンチド
・本発明は、ジンセンチドＴＰ１が、アテローム性動脈硬化症の管理に有用であり得る単球接着に拮抗する内皮細胞選択的接着分子バインダーであることを示す。それは、既知のＲＧＤ由来の接着防止剤よりも５倍強力である。
【０１４１】
・植物性ペプチドやタンパク質は薬用植物の生理活性成分としてはあまり研究されないことが多い。他のペプチド及びタンパク質とは異なり、複数の分子内ジスルフィド結合は高システインペプチドを安定化させ、それらを熱、酸及び酵素的分解に対して非常に安定にする。本発明は、高システインペプチドであるジンセンチドＴＰ１が、８つのシステイン残基（４つの安定なジスルフィド結合）及び独特の擬似環状構造を有し、それを熱、酸、血清及びタンパク質分解に対して安定にすることを示す。
【０１４２】
・高システインペプチドは分子内ジスルフィド架橋によって高度に架橋されている。これは嵩高い疎水性側鎖を外側に露出させ、分子の表面をより親油性にする。また、Ｄ２Ｏの遅い交換は、ジンセンチドの水素結合が外側に露出するのではなく分子内で結合していることを示している。これらの特性はジンセンチドを水から脱溶媒和する。したがって、ジンセンチドの独特の特徴は、内因性の細胞透過性及び腸管吸収を改善し、それを経口的に活性にすることができる。
【０１４３】
・本発明は、いくつかのジンセンチドがヘパリンアフィニティーカラムに結合することを示す。これは原材料からのジンセンチドの精製に役立つ。
・遺伝子組換え発現のための新しいアフィニティータグとして有用であり得るジンセンチド由来の新しいヘパリン結合配列を同定した。
【０１４４】
発明の技術的説明
・表１は、ジンセンチドのアミノ酸配列を示す。
・図３５は、ジンセンチドＴＰ１が内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）とタンパク質間相互作用を示すことを示す。ＥＳＡＭは単球と内皮細胞との相互作用に関与する。
【０１４５】
・図３６は、ジンセンチドＴＰ１が単球接着に拮抗し、既知の接着阻害剤よりも５倍強力であることを示す
・図３７は、いくつかのジンセンチドがヘパリンバインダーであり、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーをアフィニティー精製に使用できることを示す
・図３８は、ジンセンチドＴＰ１由来の新規ヘパリン結合配列の同定を示す。タンパク質の組換え発現のために、この新しい配列は、ヘパリンアフィニティー精製を助けるためにＮ末端又はＣ末端に挿入され得る。効率的な細胞結合を促進するために、ヘパリン結合モチーフは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合し、細胞の細胞外マトリックスの主要部分を形成することが知られている。この新しいヘパリン結合モチーフは、細胞表面へのそれらの付着を促進するために他の材料にコンジュゲートさせることができる。したがって、この新規ヘパリン結合配列は、ペプチドの設計及びエンジニアリングにおいて、効率的な細胞結合を促進するために有用であり得、ならびに組換え発現におけるアフィニティー精製のためのタグとなる。
【０１４６】
実施例６．ドキソルビシン誘発心毒性に対する保護剤としてのジンセンチド
現在、ＤＯＸ誘発心毒性の発生を防ぐために４つの戦略が適用されている。しかし、これらの戦略には避けられない欠点がある。
【０１４７】
最初の戦略はＤＯＸの投与スケジュールを調整することである。いくつかの研究は、持続注入によるＤＯＸの投与がボーラス投与と比較して心毒性を減少させることができることを示した（ＬＥＧＨＡ，Ｓ．Ｓ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９８２．９６（２）：ｐ．１３３−１３９．）。しかしながら、無作為化試験では、注入投与が患者において転移を発症する傾向を優先的に増加させることを示した（Ｃａｓｐｅｒ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、１９９１．６８（６）：ｐ．１２２１−１２２９）。
【０１４８】
第２のアプローチは、ＤＯＸの構造を改変してアナログを合成することである。最も一般的に使用されている構造類似体であるエピルビシン及びミトキサントロンは、ＤＯＸよりも心毒性が低いが、それらの化学療法有効性はＤＯＸよりも低い（Ｌｅｈｅｎｂａｕｅｒ  Ｌｕｄｋｅ，Ａ．Ｒ．ら、Ｃａｎａｄｉａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００９．８７（１０）：ｐ．７５６−７６３）。
【０１４９】
第３の戦略は、投与後のピーク濃度を制御するためのＤＯＸの薬物製剤を開発することである。ＤＯＸのリポソームカプセル化は、ＤＯＸの半減期を延ばし、その小さいサイズのためにラットの心臓よりもむしろ腫瘍組織における蓄積を増加させることができるが、依然として高い蓄積用量で心機能不全の可能性が存在する（Ａｂｒａｈａｍ，Ｓ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２００５、３９１：ｐ．７１−９７）。
【０１５０】
ＤＯＸ誘発心毒性の危険性を減少させるための最後の計画は、心臓保護剤又は化合物との組み合わせである。しかしながら、それらは、ＤＯＸの治療能力に干渉するか、又はデキサゾキサン（Ｔｅｂｂｉ、Ｃ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００７．２５（５）：ｐ．４９３−５００）、Ｎ−アセチルシステイン（Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１９８３．１０（Ｓｕｐｐｌ  １）：ｐ．５３−５５）、ＧＳＨ、コエンザイムＱ１０、ビタミンＡ及びα−トコフェロール（Ｌｅｇｈａ，Ｓ．Ｓ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９８２．３９３（１）：ｐ．４１１−４１７）を含む癌患者において二次悪性腫瘍を誘発し得る。
【０１５１】
本明細書において、我々の予備的結果は、ジンセンチドがゼブラフィッシュモデル及びラット心筋細胞の両方においてＤＯＸ誘発心毒性を弱めたことを示す。また、ジンセンチドは、乳癌細胞の併用治療中にＤＯＸの抗癌能力を妨げることはない。
【０１５２】
高システインペプチドの新しい分類であるジンセンチドは、８個のシステイン残基を有する３１〜３３個のアミノ酸を含み、疑似環状システインノット構造に似ているため、熱、酸性及び酵素的分解に対して非常に耐性がある。加えて、マウスにおけるジンセンチドの薬物動態プロファイルは、それらが非毒性であり、経口投与が可能であり、血中で比較的安定であることを示した。これらの利点は、ジンセンチドを化学療法中の非常に有望な補助的心臓保護剤として引き立てる。
【０１５３】
発明の技術的説明
本発明は、ＤＯＸとジンセンチドとの併用投与によってＤＯＸ誘発心毒性を予防するためのアプローチを提供する。
【０１５４】
（１）ゼブラフィッシュにおけるジンセンチドの心保護
本発明において、心筋細胞でカルシウム感受性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するゼブラフィッシュトランスジェニック系統Ｔｇ（ｃｍ｜ｃ２：ｇＣａＭＰ）（Ｃｈｉ，Ｎ．Ｃ．ら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、２００８．６（５）：ｐ．ｅ１０９）を、ゼブラフィッシュ胚の心機能を視覚化し評価するために利用した。
【０１５５】
ゼブラフィッシュにおけるジンセンチドの悪影響は、高濃度で適用した時でも見られなかった。ゼブラフィッシュ胚に対するＤＯＸ誘発心毒性の主な副作用には、（１）心拍の減少、（２）心室収縮性、及び（３）心膜浮腫の誘発が含まれる。ＤＯＸ処理ゼブラフィッシュ胚へのジンセンチドの添加は、正常レベルに近い心拍数を回復させ、心膜浮腫のサイズを減少させた（図３９及び４０）。
【０１５６】
ゼブラフィッシュの心機能を評価するために、駆出率（ＥＦ）を収縮期及び拡張期の終わりに心室容積の測定によって決定した。ＥＦは、ＤＯＸ処理後に著しく減少したが、ジンセンチドとの併用治療後に著しく増加し、ほぼ正常に戻った。（図４１）、ゼブラフィッシュにおけるＤＯＸ誘発心毒性に対するジンセンチドの有意な心保護を実証している。
【０１５７】
ジンセンチドが心筋細胞におけるＤＯＸ誘発心毒性を弱めることができるか否かを同定するために、薬物処理後の細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定した。その結果、ジンセンチドは高濃度でも心筋細胞に明らかな毒性を示さず、オタネニンジンの主成分であるジンセノサイドＲｇ１、Ｒｂ１及びＲｅと比較して、心筋細胞の増殖を促進することが示された（図４２）。
【０１５８】
ＤＯＸとジンセンチドでの２４時間の共処理の後、Ｈ９ｃ２細胞の生存率はＤＯＸ単独処理と比較して約２０％増強された（図４３）。しかし、ジンセノサイドＲｇ１、Ｒｂ１及びＲｅは、ＤＯＸ処理中に心筋に対して保護効果を全く示さなかった。
【０１５９】
（２）乳癌細胞に対する抗癌効果に干渉しない
次に、ジンセンチドが乳癌細胞に対するＤＯＸの抗癌効果を低下させるか否かを調べた。ＤＯＸとジンセンチドでの共処理の後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞生存率は増強されなかった（図４４）。ジンセンチドは心筋細胞に対して保護効果を発揮するだけであり、腫瘍細胞に対するＤＯＸの治療効果に干渉しなかった。
【０１６０】
（３）マウスにおけるジンセンチドの薬物動態
マウスにおけるジンセンチドの薬物動態プロファイル（図４５）は、それらが経口で投与可能であり、血中で比較的安定であることを示す。ジンセンチドを投与された後のマウスには不快症状は観察されず、投与中及び投与の１ヶ月後に死亡は発生しなかった。これらの利点は、ジンセンチドを臨床使用における治療薬として開発するための強力な証拠を提供する。
【０１６１】
実施例７．老化防止及び強壮剤としてのジンセンチド
老化防止剤の大部分は一般に酸化防止剤として分類され、それは酸化ストレスを減少させて望ましくない老化関連プロセスから細胞を保護する。本発明において、ジンセンチドＴＰ１は、老化防止剤であることが開示されており、これはテロメア反復結合因子２（ＴＥＲＦ２）のレベルを低下させることによってテロメア短縮を直接防止する。
【０１６２】
抗酸化老化防止化合物とは異なり、ジンセンチドＴＰ１は酸化ストレス誘発老化を防ぐだけでなく、テロメア短縮プロセスをブロックすることによって全体的な老化プロセスを遅らせ、ストレスへの適応を促進する。
【０１６３】
従来のペプチド薬とは異なり、ジンセンチドＴＰ１は、消化管及び血清の両方におけるそれらの優れた安定性のために潜在的な経口活性剤であることが証明されている。
発明の技術的説明
ジンセンチドＴＰ１の機能を分子レベルで理解するために、ＨＵＶＥＣ−ＣＳ細胞を１μＭのＴＰ１で３０分間処理した。処理終了後、細胞を掻き取って回収し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を尿素溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した２５ｍＭ  ＴＥＡＢ中の８Ｍ尿素）中で溶解した。溶液中トリプシン消化技術を用いて、それぞれ２００μｇのタンパク質を消化する。得られたトリプシンペプチドをＴＭＴ試薬で標識し、高ｐＨ（ｐＨ約８）での逆相分画によって分離し、ナノＨＰＬＣを結合したＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計を使用して分析した。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢヒトタンパク質データベースを使用してマスコット検索エンジン（バージョン２．４．１）を使用してタンパク質同定及び定量化を実施し、ペプチドのリスト及び１％ＦＤＲカットオフを用いて合計５０５８個のタンパク質を同定した。対照条件を、ＴＭＴに基づく相対タンパク質定量のための分母として使用した。タンパク質存在量変化のカットオフレベルとして、カットオフ値０．８５及び１．１７を使用した（図４６ａ）。このアプローチを用いて、６２個及び１１３個のタンパク質が、ジンセンチド処理細胞において上方制御及び下方制御されていると同定された（図４６ｂ）。制御されたタンパク質をそれらの生物学的機能に従って分類した（図４６ｃ）。
【０１６４】
興味深いことに、テロメア反復結合因子２（ＴＥＲＦ２）のレベルは、３０分のＴＰ１処理後に有意に低下した（図４６ｄ）。ＴＰ１によるＴＥＲＦ２の減少は、テロメア短縮プロセスを遅くし、細胞老化を防止するはずである。したがって、ジンセンチドＴＰ１は特に血管細胞の老化過程を防ぎ、血管の柔軟性を維持する。それはまた他の老化関連の問題を減らすであろう。
【０１６５】
図４７は、低酸素内皮細胞プロテオームに対するジンセンチドＴＰ１の効果を示す。ジンセンチドＴＰ１は低酸素内皮細胞においてアンフォールディングされたタンパク質応答経路を誘導した。それはまた、アポトーシスシグナル伝達経路及び細胞接着経路を減少させる。
【０１６６】
図４８〜５３は、ジンセンチドＴＰ１が低酸素ストレスに対する内皮細胞の順応を促進することを示す。
図５４。ジンセンチドは、心筋細胞、血管平滑筋細胞、及び筋細胞におけるアンフォールディングされたタンパク質を減少させた。
【０１６７】
図５５。ジンセンチドは低酸素内皮細胞における活性酸素種産生を減少させた。
図５６。ジンセンチドは低酸素内皮細胞における一酸化窒素産生を増加させた。
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示内に含まれるより狭い種及び亜属の分類のそれぞれもまた本発明の一部を形成する。これは、属から任意の主題を除くというただし書き又は否定的な制限を伴う本発明の一般的な説明を含み、除かれた事項が本明細書に具体的に記載されているか否かは問わない。他の実施形態は特許請求の範囲内にある。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、それによって本発明がマーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。
【０１６８】
当業者は、本発明が目的を実行し、そして言及された目的及び利点、ならびにそれに固有のものを得るのによく適合していることを容易に認識するであろう。さらに、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置換及び改変がなされ得ることが当業者には容易に明らかであろう。本明細書に記載の組成物、方法、手順、処理、分子及び特定の化合物は例示的な好ましい実施形態であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨の範囲に包含されるそれらの変更及び他の使用が当業者に思い浮かぶであろう。本明細書における以前に発行された文献のリスト又は考察は、その文献が最新技術の一部であること、又は一般常識であることの自認として必ずしも解釈されるべきではない。
【０１６９】
本明細書に例示的に記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていないいずれかの要素又は複数の要素の不在下で、適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む」、「含有する」、「包含する」などは、限定的ではなく拡大的に読まれるべきである。したがって、「含む」又は「含み」や「含んでいる」などの変化形は、記載された整数又は整数群を含むことを意味するが、他の整数又は整数群を除外することを意味しないことが理解されよう。さらに、本明細書で使用されている用語及び表現は、説明の用語として使用されており、限定のためではなく、示され説明された特徴又はその一部の均等物を除外する意図はない。特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。したがって、本発明は例示的な実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示される本発明の変更形態及び変形形態は当業者に任されるものであり、そのような変更形態及び変形形態は本発明の範囲内にあると考えられることを理解されたい。
【０１７０】
本明細書中に引用された全ての文献及び特許文献の内容は、その全体が参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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