(57)【要約】  本発明は、弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列に関する。本発明者らは、地域流行性ゲノム配列に元々存在していたｍｉＲ−４２７９のためのいくつかの結合部位を修復するために、流行性ゲノム配列の非常に特定の位置においていくつかの特定の置換を導入した。また、本発明者らは、Ｅタンパク質上のＮグリコシル化部位の無効化をもたらす突然変異であって、ギラン・バレー症候群の原因となる自己抗体の生成を防止するであろう突然変異をさらに導入した。本発明者らは、高力価のウイルスを産生する能力に影響を与えずに細胞変性効果の劇的な減少をもたらすウイルスのさらなる突然変異を生産した。特に、本発明は、ｍｉＲ−４２７９のための少なくとも１つの結合部位が修復されている配列番号１によって表される配列を特徴とするゲノム配列に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ−４２７９のための少なくとも１つの結合部位が修復されている配列番号１を特徴とする、ゲノム配列。
【請求項２】
２７０７位のアデノシン（Ａ）をチミン（Ｔ）で置換し、２７１３位のグアニン（Ｇ）をアデノシン（Ａ）で置換し、２７１６位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、第１の結合部位が修復されている、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項３】
３３３１位のシチジン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換し、３３３２位のシチジン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換し、３３４３位のシチジン（Ｃ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、第２の結合部位が修復されている、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項４】
５１０６位のグアニン（Ｇ）をアデノシン（Ａ）で置換し、５１１３位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換し、５１１６位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、第３の結合部位が修復されている、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項５】
５９６２位のシトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換し、５９７１位のグアニン（Ｇ）をアデノシン（Ａ）で置換することによって、第４の結合部位が修復されている、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項６】
６２１１位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換し、６２２０位のチミン（Ｔ）をシチジン（Ｃ）で置換することによって、第５の結合部位が修復されている、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項７】
流行株のゲノム配列において、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの結合部位が修復されている、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項８】
配列番号２によって表される配列からなる、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項９】
１５２位、１５６位又は１５８位の少なくとも１つのアミノ酸残基が突然変異されているタンパク質Ｅをコードする、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項１０】
１５２位のイソロイシン残基（Ｉ）がトレオニン残基（Ｔ）で置換されており、１５６位のトレオニン残基（Ｔ）がイソロイシン残基（Ｉ）で置換されており、ヒスチジン残基（Ｈ）がチロシン残基（Ｙ）で置換されているタンパク質Ｅをコードする、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項１１】
配列番号３によって表される配列からなる、請求項１に記載のゲノム配列。
【請求項１２】
請求項１に記載のゲノム配列を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載のゲノム配列によってコードされる、弱毒化ジカウイルス。
【請求項１４】
請求項１３に記載の弱毒化ジカウイルスを含む、ワクチン組成物。
【請求項１５】
被験体においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発するための方法であって、治療有効量の請求項１４に記載のワクチン組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ジカウイルスは蚊媒介性フラビウイルスであり、１９４７年にウガンダで、黄熱をモニタリングするネットワークによって、サルにおいて初めて同定された。その後、それは、１９５２年にウガンダ及びタンザニア連合共和国で、ヒトにおいて確認された。アフリカ、米国、アジア及び太平洋では、ジカウイルス疾患の発生が記録されている。１９６０年代から１９８０年代にアフリカ及びアジア全域で、典型的には軽度の病気を伴うヒト感染が見出された。ジカ感染によって引き起こされた疾患の最初の大発生は、２００７年にヤップ（ミクロネシア連邦）の島から報告された。２０１５年７月にブラジルで、ジカウイルス感染とギラン・バレー症候群との間の関連が報告された。２０１５年１０月にブラジルで、ジカウイルス感染と小頭症との関連が報告された。ジカウイルスは、Aedes属、熱帯地方では主にAedes aegyptiの感染蚊によって刺されることで人々に主に伝染される。通常、Aedesの蚊は日中に刺し、早朝及び午後／夕方にピークに達する。これは、ジカウイルス、チクングニャ熱及び黄熱病を伝染する同じ蚊である。ジカウイルスの性的伝染も可能である。輸血などの他の伝染様式が調査されている。通常、ジカウイルス疾患は軽度であり、特定の処置を必要としない。ジカウイルスにかかっている人々は、多くの休息を取り、十分な水分を飲み、普通薬で痛み及び発熱を処置すべきである。症候が悪化した場合、医療及びアドバイスを求めるべきである。現在、利用可能なワクチンはない。ＷＨＯの専門家は、妊婦及び出産期の女性で使用するのに安全な弱毒化ワクチン及び他の非生ワクチンの開発を優先すべきであると提案している。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【０００４】
発明の詳細な説明：
本発明は、特に妊婦のワクチン接種に安全であるという利点を提供する、弱毒化突然変異体ジカウイルスをコードするゲノム配列に関する。特に、本発明者らは、地域流行性ゲノム配列に元々存在していたｍｉＲ−４２７９のためのいくつかの結合部位を修復するために、流行性ゲノム配列の非常に特定の位置においていくつかの特定の置換を導入した。また、本発明者らは、Ｅタンパク質上のＮグリコシル化部位の無効化をもたらす突然変異であって、ギラン・バレー症候群の原因となる自己抗体の生成を防止するであろう突然変異をさらに導入した。本発明者らは、高力価のウイルスを産生する能力に影響を与えずに細胞変性効果の劇的な減少をもたらすウイルスのさらなる突然変異を生産した。
【０００５】
したがって、本発明の第１の目的は、ｍｉＲ−４２７９のための少なくとも１つの結合部位が修復されている流行株のゲノム配列に関する。
【０００６】
本明細書で使用される場合、「ジカウイルス」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。ジカウイルスは、５’ＮＣＲ及び３’ＮＣＲとして公知の領域に隣接する２つの非コード領域を有する１０７９４塩基長のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子である。ジカウイルスのオープンリーディングフレームは、キャプシド（Ｃ）、前駆膜（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）及び非構造タンパク質（ＮＳ）にその後切断されるポリタンパク質をコードする。Ｅタンパク質は、ビリオン表面の大部分を構成し、宿主細胞結合及び膜融合などの複製の態様に関与する。ＮＳ１、ＮＳ３及びＮＳ５は、高度に保存された大きなタンパク質であるが、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ４Ａ及びＮＳ４Ｂタンパク質は、より小さな疎水性タンパク質である。翻訳、ＲＮＡパッケージング、環化、ゲノム安定化及び認識に関与し得る４２８ヌクレオチドが３’ＮＣＲに位置する。３’ＮＣＲはループ構造を形成し、５’ＮＣＲは、メチル化ヌクレオチドキャップ又はゲノム連結タンパク質を介した翻訳を可能にする。
【０００７】
「流行株」という用語は、流行性感染症の原因となるジカ株を指す。特に、流行株は、配列番号１によって表されるゲノム配列を特徴とする。いくつかの実施態様では、流行ジカ株は、ジカ株ＢｅＨ８１９０１５（Ｇｅｎｂａｎｋ＃ＫＵ３６５７７８）を指す。
【０００８】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ｍｉＲＢａｓｅアクセッションナンバーでデータベースhttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/から公的に入手可能なｍｉＲＮＡ配列を指す。したがって、ｍｉＲ−４２７９は、それ自体公知である。
【０００９】
いくつかの実施態様では、２７０７位のアデノシン（Ａ）をチミン（Ｔ）で置換し、２７１３位のグアニン（Ｇ）をアデノシン（Ａ）で置換し、２７１６位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、第１の結合部位が修復されている。
【００１０】
いくつかの実施態様では、３３３１位のシチジン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換し、３３３２位のシチジン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換し、３３４３位のシチジン（Ｃ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、第２の結合部位が修復されている。
【００１１】
いくつかの実施態様では、５１０６位のグアニン（Ｇ）をアデノシン（Ａ）で置換し、５１１３位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換し、５１１６位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換することによって、第３の結合部位が修復されている。
【００１２】
いくつかの実施態様では、５９６２位のシトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換し、５９７１位のグアニン（Ｇ）をアデノシン（Ａ）で置換することによって、第４の結合部位が修復されている。
【００１３】
いくつかの実施態様では、６２１１位のアデノシン（Ａ）をグアニン（Ｇ）で置換し、６２２０位のチミン（Ｔ）をシチジン（Ｃ）で置換することによって、第５の結合部位が修復されている。
【００１４】
いくつかの実施態様では、流行株のゲノム配列において、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つの結合部位が修復されている。
【００１５】
いくつかの実施態様では、ゲノム配列は、配列番号２によって表される配列からなる。
【００１６】
いくつかの実施態様では、流行株のゲノム配列は、タンパク質Ｅ上のＮグリコシル化部位の無効化をもたらす少なくとも１つの突然変異をさらに含む。いくつかの実施態様では、本発明のゲノム配列は、１５２位、１５６位又は１５８位の少なくとも１つのアミノ酸残基が突然変異されているタンパク質Ｅをコードする。いくつかの実施態様では、本発明のゲノム配列は、１５２位のイソロイシン残基（Ｉ）がトレオニン残基（Ｔ）で置換されているタンパク質Ｅをコードする。いくつかの実施態様では、本発明のゲノム配列は、１５６位のトレオニン残基（Ｔ）がイソロイシン残基（Ｉ）で置換されているタンパク質Ｅをコードする。いくつかの実施態様では、本発明のゲノム配列は、ヒスチジン残基（Ｈ）がチロシン残基（Ｙ）で置換されているタンパク質Ｅをコードする。いくつかの実施態様では、本発明のゲノム配列は、１５２位のイソロイシン残基（Ｉ）がトレオニン残基（Ｔ）で置換されており、１５６位のトレオニン残基（Ｔ）がイソロイシン残基（Ｉ）で置換されており、ヒスチジン残基（Ｈ）がチロシン残基（Ｙ）で置換されているタンパク質Ｅをコードする。
【００１７】
いくつかの実施態様では、ゲノム配列は、配列番号３によって表される配列からなる。
【００１８】
本発明のゲノム配列は、弱毒化ジカウイルスの生産に特に適切である。本明細書で使用される場合、「弱毒化」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、特に、低毒性にされているウイルスである。特に、本発明の弱毒化突然変異体ジカウイルスは、非病原性である。本明細書で使用される場合、「非病原性」という用語は、非毒性であるか、又は病気、特にギラン・バレー症候群を誘発することができないことを意味するために本明細書で使用される。
【００１９】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のゲノム配列によってコードされる弱毒化ジカウイルスに関する。
【００２０】
いくつかの実施態様では、リコンビナントＤＮＡ技術によって本発明の弱毒化突然変異体ジカウイルスを得、本発明のゲノム配列を標準的なタンパク質発現ベクターにクローニングし、これを使用して適切な宿主細胞を感染させる。次いで、宿主細胞を培養して所望のウイルスを発現させ、これを所望の程度まで精製し、適切なワクチン製品に製剤化し得る。
【００２１】
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のゲノム配列を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、典型的には、ウイルスを増殖させるために適切な細胞株である。適切な細胞株としては、哺乳動物細胞、例えばＶｅｒｏ細胞、ＡＧＭＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ−１又はＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、初代細胞株、例えば胎児アカゲザル肺（ＦＲｈＬ−２）細胞、ＢＳＣ−１細胞及びＭＲＣ−５細胞又はヒト二倍体線維芽細胞、並びに鳥類細胞、ニワトリ又はアヒル胚由来細胞株、例えばＡＧＥ１細胞及び初代ニワトリ胚線維芽細胞及び蚊細胞株、例えばＣ６／３６が挙げられる。細胞の成長を支援することができる培地を培養物に供給する。所望のウイルス力価が達成されるまで、培養液中で宿主細胞を数日間維持する。場合により、数日間以上の期間にわたってウイルスを断続的又は連続的に得ることができる連続灌流系で、細胞を維持する。非連続培養条件下では、感染後３〜７日まで少なくとも約１０６〜１０７PFU/mlのウイルス力価が望ましい。ウイルスを回収するために、低速遠心分離を含む当技術分野で公知の一般的な方法によって、又はろ過によって、ウイルスを収集する。前記ウイルスを濃縮するための方法は当業者の範囲内であり、例えば、限外ろ過、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による沈殿が挙げられる。ウイルスを精製するための方法は当業者に公知であり、典型的には、連続若しくは多段階スクロース勾配、サイズ排除、イオン交換、吸着若しくはアフィニティーカラムを使用したカラムクロマトグラフィーによる精製、又はポリマー二相系若しくは多相系における分配による精製、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ウイルス陽性画分をアッセイするための方法としては、プラークアッセイ、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイ及び／又は抗原アッセイ、例えばイムノアッセイが挙げられる。
【００２２】
いくつかの実施態様では、収集された本発明の弱毒化突然変異体ジカウイルスは不活性にされる。本明細書で使用される場合、「不活性」という用語は、例えばin vitroで複製され、次いでウイルスがもはや複製不可能になるように化学的又は物理的手段を使用して殺傷されたウイルスを包含する。例えば、生弱毒化ウイルスは、化学薬剤、例えばホルムアルデヒド、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）若しくは過酸化水素を使用して、又は紫外線照射を使用して、又は２つ以上の不活性化工程の組み合わせ（これは、同じものでもよいし又は異なるものでもよく、例えば、任意の組み合わせでホルムアルデヒド及びＢＰＬ、ホルムアルデヒド及びＵＶ照射、ＢＰＬ及びＵＶ照射、過酸化水素及びＢＰＬ、過酸化水素及びＵＶ照射などであり得る）を使用することによって不活性化され得る。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、本発明の弱毒化ジカウイルスを含むワクチン組成物に関する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」という用語は、ヒトへの投与に適切な組成物であって、ジカウイルスなどの病原体に対する特異的免疫応答を誘発することができる組成物である。
【００２５】
本発明のワクチン組成物は、一定量の本発明の生弱毒化ジカウイルス又は一定量の本発明の不活性弱毒化ジカウイルスを含む。
【００２６】
本発明のワクチン組成物はまた、免疫応答を誘発又は増強することができる１つ以上のさらなる成分、例えば賦形剤、担体及び／又はアジュバントを含み得る。「アジュバント」は、薬剤の非存在下における抗原の投与と比較して、抗原特異的免疫応答の発生を増強する薬剤である。一般的なアジュバントとしては、抗原が吸着されるミネラル（又は、ミネラル塩、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシホスフェート）の懸濁液を含むアルミニウム含有アジュバントが挙げられる。本開示との関連では、アジュバントは、任意のこのようなアルミニウム塩の非存在下で製剤化されるアルミニウム（ミョウバン）不含アジュバントである。ミョウバン不含アジュバントとしては、油エマルジョン及び水エマルジョン、例えば油中水型及び水中油型（並びに、二重エマルジョン及び可逆的エマルジョンを含むそれらの変形物）、リポサッカライド、リポポリサッカライド、免疫刺激性核酸（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様レセプターアゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８及びＴＬＲ９アゴニスト）、並びにこのような成分の様々な組み合わせが挙げられる。薬学的に許容し得る担体及び賦形剤は周知であり、当業者によって選択され得る。例えば、担体又は賦形剤は、好ましくは、バッファーを含み得る。場合により、担体又は賦形剤はまた、溶解性及び／又は安定性を安定化する少なくとも１つの成分を含有する。可溶化剤／安定剤の例としては、界面活性剤、例えばラウロイルサルコシン及び／又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。代替的な可溶化剤／安定剤としては、アルギニン及びガラス形成ポリオール（例えば、スクロース、トレハロースなど）が挙げられる。多数の薬学的に許容し得る担体及び／又は薬学的に許容し得る賦形剤が当技術分野で公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 5th Edition (1975)に記載されている。したがって、当業者であれば、適切な賦形剤及び担体を選択して、選択された投与経路による被験体への送達に適切な製剤を生産し得る。適切な賦形剤としては、限定されないが、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａｔ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋並びに他の二価カチオン関連塩、ジチオスレイトール、ジチオエリトロール(Dithioerytrol)及びβ−メルカプトエタノールが挙げられる。他の賦形剤は、界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−００、ＮＰ−４０、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む）であり得る。ヒト被験体への投与のためのものを含むワクチン組成物��調製は、一般に、Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995、New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Md., U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム内への封入は、例えば、Fullertonの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質のコンジュゲーションは、例えば、Likhiteの米国特許第４，３７２，９４５号及びArmor et alの米国特許第４，４７４，７５７号に記載されている。典型的には、各用量のワクチン組成物における抗原の量は、典型的な被験体において有意な有害副作用を伴わずに免疫防御応答を誘導する量として選択される。これとの関連における免疫防御は、感染に対する完全な防御を必ずしも意味しない；それは、症候又は疾患、特にウイルスに関連する重度の疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特異的免疫原が用いられるかに応じて変動し得る。一般に、各ヒト用量は、不活性化ウイルス ０．０５〜１００μg、例えば不活性化ジカウイルスの各株 約０．１μg（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５μg）〜約５０μg、例えば約０．５μg〜約３０μg、例えば約１μg、約２μg、約３μg、約４μg、約５μg、約１０μg、約１５μg、約２０μg又は約２５μgを含むと予想される。典型的には、ワクチン組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射用として調製される；注射前に液体の溶液又は懸濁液に適切な固体形態も調製され得る。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、被験体においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発するための方法であって、治療有効量の本発明のワクチン組成物を該被験体に投与することを含む方法に関する。
【００２８】
いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、成人又は幼児のヒトに投与される。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、妊婦に投与される。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、出産期の女性に投与される。いくつかの実施態様では、被験体は、ジカウイルスに以前に曝露された。
【００２９】
いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、ジカウイルス感染症及び／又はジカウイルス誘発性疾患の予防、改善又は処置に特に適切である。
【００３０】
ワクチン組成物は、異なる様々な経路によって投与され得るが、最も一般的には、ワクチン組成物は、筋肉内、皮下又は皮内投与経路によって送達される。一般に、ワクチン組成物は、中和抗体の産生及び防御に有効な用量で皮下、皮内又は筋肉内投与され得る。ワクチンは、投与製剤と適合する様式で、予防的及び／又は治療的に有効であるような量で投与される。投与すべき量は、一般には用量当たりウイルス ０．０５〜１００μgの範囲内であるが、処置すべき被験体、被験体の免疫系が抗体を合成する能力、及び所望の防御程度に依存する。投与すべきワクチンの正確な量は、施術者の判断に依存し得、各被験体に特有のものであり得る。
【００３１】
ワクチン組成物は、単回投与スケジュール又は好ましくは複数回投与スケジュールで与えられ得、この場合、主なワクチン接種過程は、１〜１０回の別個投与と、続いて、免疫応答の維持及び又は強化に必要なその後の時間間隔（例えば、第２の投与の場合には１〜４カ月）で与えられる他の投与と、必要な場合には数カ月後又は数年後のその後の投与とによるものであり得る。投与レジメンはまた、少なくとも部分的には被験体の必要性によって決定され、施術者の判断に依存するであろう。適切な免疫スケジュールの例は、第１の投与と、続いて、７日〜６カ月の第２の投与と、初回免疫後１カ月〜２年の任意選択の第３の投与とを含むか、又は防御免疫を付与すると予想される力価のウイルス中和抗体を誘発するために十分な他のスケジュールを含む。ワクチン組成物によるジカウイルスに対する防御免疫の生成は、１〜３回の接種からなる主な免疫過程後に合理的に予想され得る。これらは、十分なレベルの防御免疫を維持するように設計された間隔（例えば、２年ごと）の追加免疫によって補足され得る。
【００３２】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに例証する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、クローンＺＩＫＡｍｉｒの詳細を示す。
【実施例】
【００３４】
本発明者らは、地域流行性ゲノム配列に元々存在していたｍｉＲ−４２７９のためのいくつかの結合部位を修復するために、流行性ゲノム配列の非常に特定の位置においていくつかの特定の置換を導入した（図１）。次いで、子孫産生アッセイにおいて、（「ＺＩＫＡｍｉｒ」と命名した）クローンを流行クローンと比較した。簡潔に言えば、Ｖｅｒｏ細胞（１０ｅ５個／ウェル）を４８ウェル培養プレートに播種した。５％熱不活性化ＦＢＳを補充した培養培地中で、ウイルスサンプルの１０倍連続希釈物を２回反復で調製し、各希釈物 ０．１mLを細胞に追加した。プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。０．８％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を補充した培養培地 ０．１mlを各ウェルに追加し、続いて、３７℃で４日間インキュベーションした。ＣＭＣオーバーレイを除去し、最初に３．７％ＰＦＡで細胞を１０分間固定し、次いで、２０％エタノール中０．５％クリスタルバイオレットで染色した。プラークをカウントし、プラーク形成単位/mL（PFU.mL-1）として表した。表１に示されているように、流行性及び地域流行性ウイルスで観察された産生と比較して、子孫産生は減少する。
【表１】
2019522986.tif 000002
【００３５】
配列：
配列番号１：親ＺＩＫＶＢＲ１５−ＭＣ  ＢｅＨ８１９０１５のゲノム配列（１０，７２７ｎｔ）
【化１】
2019522986.tif 000003
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【００３６】
配列番号２：キメラＺＩＫＶＢＲ１５−ＭＣ突然変異体ｍｉＲ４２７９のゲノム配列（１０，８０７ｎｔ）
【化２】
2019522986.tif 000010
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【００３７】
配列番号３：キメラＺＩＫＶＢＲ１５−ＭＣ突然変異体ｍｉＲ４２７９のゲノム配列（１０，８０７ｎｔ）
太字及び下線−ｍｉＲターゲット配列；太字及び斜体  グリコシル化部位
【化３】
2019522986.tif 000016
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2019522986.tif 000021
【００３８】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献により、本発明が関係する技術水準が説明されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【図１】
2019522986.tif 000022
【配列表】
2019522986000001.app
【国際調査報告】
2019522986.tif 000023
2019522986.tif 000024
2019522986.tif 000025