(57)【要約】【課題】現在、臨床試験において、抗ＬＡＧ−３治療はわずかしかなく、治療として認可されたものはなく、それゆえ、がん治療の関連において用いることができる、ＬＡＧ−３を標的とする追加の分子を開発する必要性が依然としてある。【解決手段】  本発明は、リンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する特異的結合要素に関する。特異的結合要素は、好ましくは、その特異的結合要素のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループに位置し得るＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。本発明の特異的結合要素は、例えばがん治療に、適用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する特異的結合要素であって、当該特異的結合要素のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含み、前記ＬＡＧ−３結合部位が、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含み、前記アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤが前記ＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、前記アミノ酸配列ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥが前記ＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する、特異的結合要素。
【請求項２】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＥＦループ中に、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の特異的結合要素。
【請求項３】
（i）前記配列番号１に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基１１から１８に位置し、及び／又は
（ii）前記配列番号３に示されるアミノ酸配列が、前記ＣＨ３ドメインの残基９２から１０１に位置し、
アミノ酸残基の番号付けが、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）の番号付けスキームによる、請求項１又は２に記載の特異的結合要素。
【請求項４】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、以下の配列：
（i）ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２、８、及び１８）；
（ii）ＳＮＧＱＰＥＤＮＹ（配列番号１３）；
（iii）ＳＮＧＹＰＥＩＥＦ（配列番号２３）；
（iv）ＳＮＧＩＰＥＷＮＹ（配列番号２８）；
（v）ＳＮＧＹＡＥＹＮＹ（配列番号３３）；
（vi）ＳＮＧＹＫＥＥＮＹ（配列番号３８）；
（vii）ＳＮＧＶＰＥＬＮＶ（配列番号４３）；又は
（viii）ＳＮＧＹＱＥＤＮＹ（配列番号４８）
の１つをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項５】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の特異的結合要素。
【請求項６】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２、２８、又は３８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の特異的結合要素。
【請求項７】
前記ＬＡＧ−３抗原結合部位が、前記ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の特異的結合要素。
【請求項８】
配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列が、当該特異的結合要素の前記ＣＨ３ドメインの残基４３から７８に位置し、残基が、ＩＭＧＴの番号付けスキームに従って番号付けされる、請求項４から７のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項９】
前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインである、請求項１から８のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項１０】
前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである、請求項９に記載の特異的結合要素。
【請求項１１】
配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項１２】
配列番号５、３０、又は４０に示される前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１１に記載の特異的結合要素。
【請求項１３】
配列番号５に示される前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１２に記載の特異的結合要素。
【請求項１４】
ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の前記ＣＨ２ドメインを含む、請求項１４に記載の特異的結合要素。
【請求項１６】
ヒトＩｇＧ１の前記ＣＨ２ドメインを含む、請求項１５に記載の特異的結合要素。
【請求項１７】
前記ＣＨ２ドメインが、配列番号５３又は配列番号５４に示される配列を有する、請求項１６に記載の特異的結合要素。
【請求項１８】
配列番号６、７、１１、１２、１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３６、３７、４１、４２、４６、４７、５１、又は５２に示される配列を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項１９】
配列番号６、７、３１、３２、４１、又は４２に示される配列を含む、請求項１８に記載の特異的結合要素。
【請求項２０】
配列番号６又は７に示される配列を含む、請求項１９に記載の特異的結合要素。
【請求項２１】
前記ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分をさらに含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項２２】
前記ヒンジ領域又はその部分が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ヒンジ領域又はその部分である、請求項２１に記載の特異的結合要素。
【請求項２３】
前記ヒンジ領域又はその部分が、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域又はその部分である、請求項２２に記載の特異的結合要素。
【請求項２４】
前記ヒンジ領域又はその部分が、配列番号５７又は配列番号５８に示される配列を有する、請求項２３に記載の特異的結合要素。
【請求項２５】
当該特異的結合要素が、第２の抗原結合部位をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の特異的結合要素。
【請求項２６】
前記第２の抗原結合部位が、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位である、請求項２５に記載の特異的結合要素。
【請求項２７】
抗体分子である、請求項２５又は２６に記載の特異的結合要素。
【請求項２８】
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子である、請求項２７に記載の抗体分子。
【請求項２９】
ヒトＩｇＧ１分子である、請求項２８に記載の抗体分子。
【請求項３０】
前記抗体分子のＣＤＲに基づいた抗原結合部位が、免疫系調節物質である分子と結合する、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３１】
前記免疫系調節物質が、免疫調節性受容体又は免疫調節性受容体のリガンドである、請求項３０に記載の抗体分子。
【請求項３２】
前記ＣＤＲに基づいた抗原結合部位が、免疫系阻害剤又は活性化因子である分子に特異的である、請求項３０に記載の抗体分子。
【請求項３３】
前記ＣＤＲに基づいた抗原結合部位が、免疫系阻害剤である分子に特異的である、請求項３２に記載の抗体分子。
【請求項３４】
前記ＣＤＲに基づいた抗原結合部位が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（CTLA-4）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有−３（TIM-3）、ＣＤ７３、並びにコロニー刺激因子１受容体（CSF1R）からなる群から選択される抗原に特異的である、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３５】
特異的結合要素又は抗体分子が、免疫系調節物質、細胞傷害性分子、放射性同位元素、又は検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項１から３４のいずれか一項に記載の特異的結合要素又は抗体分子。
【請求項３６】
前記免疫系調節物質又は前記細胞傷害性分子がサイトカインである、請求項３５に記載の特異的結合要素又は抗体分子。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の特異的結合要素又は抗体分子をコードする核酸。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３９】
請求項３２に記載の核酸又は請求項３８に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の特異的結合要素又は抗体分子を産生する方法であって、請求項３９に記載の組換え宿主細胞を、前記特異的結合要素又は前記抗体分子の産生のための条件下で培養する工程を含む、方法。
【請求項４１】
前記特異的結合要素又は前記抗体分子を単離及び／又は精製する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の前記特異的結合要素又は前記抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
患者においてがんを処置する方法における使用のための、請求項１から３６のいずれか一項に記載の特異的結合要素又は抗体分子。
【請求項４４】
患者においてがんを処置する方法であって、請求項１から３６のいずれか一項に記載の特異的結合要素又は抗体分子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の使用又は請求項４４に記載の方法のための特異的結合要素又は抗体分子であって、がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、線維肉腫、腎細胞癌、メラノーマ、膵がん、乳がん、多形神経膠芽腫、肺がん、頭頚部がん、胃がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、精巣がん、陰茎がん、白血病、多発性骨髄腫、扁平上皮がん、精巣がん、食道がん、カポジ肉腫、及び中枢神経系（CNS）リンパ腫、肝細胞癌、上咽頭がん、メルケル細胞癌、及び中皮腫からなる群から選択される、特異的結合要素又は抗体分子。
【請求項４６】
方法が、抗腫瘍ワクチンを患者に投与する工程をさらに含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の使用又は方法のための特異的結合要素又は抗体分子。
【請求項４７】
方法が、化学療法剤を患者に投与する工程をさらに含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の使用又は方法のための特異的結合要素又は抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本ケースは、２０１６年６月２０日に出願された米国特許出願第６２／３５２４７０号に関係し、その出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、リンパ球活性化遺伝子３（LAG-3）と結合する特異的結合要素に関する。特異的結合要素は、好ましくは、その特異的結合要素のＣＨ３ドメインの２つ以上の構造的ループに位置し得るＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。本発明の特異的結合要素は、例えばがん治療に、適用される。
【背景技術】
【０００３】
リンパ球活性化遺伝子−３（LAG-3; CD223）は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、ＣＤ４に、遺伝子的及び構造的に関係している（もっとも、たった２０％配列同一性を有するだけである）。ＣＤ４のように、ＬＡＧ−３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合するが、ＣＤ４より高い親和性で結合する（ＫＤ＝６０ｎＭ）。ＬＡＧ−３は、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｐＤＣ、Ｂ細胞、γδＴ細胞上に発現し、免疫抑制に、特に一定の割合の制御性Ｔ細胞（Treg）における持続性の強い発現を通して、関与する（Liangら、2008）。
【０００４】
ＬＡＧ−３遺伝子は、ヒト１２番染色体上に、ＣＤ４遺伝子に隣接して位置し、８個のエクソンに及ぶ。５個の選択的転写産物があり、そのうちの２個がタンパク質産物：完全長膜貫通タンパク質及び選択的にスプライシングされた可溶性単量体型を生じる。完全長転写産物は、７０ｋＤａの分子量をもつ、５２５アミノ酸のタンパク質をコードし、機能活性を有し、一方、可溶性型は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を結合しないと思われ、その機能はわかっていない。ヒト完全長ＬＡＧ−３タンパク質は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＬＡＧ−３との９３％配列同一性及びＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（イエハツカネズミ）ＬＡＧ−３との７０％配列同一性を有する。
【０００５】
ＬＡＧ−３は、４個の細胞外Ｉｇ様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）、及びＬＡＧ−３シグナル伝達に関与する細胞質部分を有する膜貫通タンパク質である。細胞質ドメインは、ＬＡＧ−３関連タンパク質（LAP）に関連するＥＰ（グルタミン酸／プロリン）モチーフ、及びＴ細胞機能のＬＡＧ−３調節に必要とされると考えられるＫＩＥＥＬＥモチーフを有する。ＥＰモチーフの役割に関するレポートは、それが、ＬＡＧ−３のＴ細胞表面膜への輸送に関与し得（Baeら、2014）、又はＴ細胞活性化中のＳＴＡＴ５の下流シグナル伝達を調節することに直接、関与し得（Durhamら、2014）、又はもしかすると、両方であり得ると示唆している。
【０００６】
Ｔ細胞上のＬＡＧ−３の免疫抑制機構は、ＬＡＧ−３の活性化Ｔ細胞への架橋により作動され、その結果として、Ｔ細胞活性化中のカルシウム流及びＩＬ−２放出の減少を生じると考えられている（Huardら、1997）。抗原提示細胞（APC）上において、ＬＡＧ−３陽性制御性Ｔ細胞によるＭＨＣ  ＩＩ分子との結合は、ＩＬ−１２分泌の減少、及び活性化の「二次シグナル」であるＣＤ８６の下方制御を引き起こし（Liangら、2008）、その結果、不適切な活性化及び／又はＡＰＣによる抗原提示の低下からＴ細胞アネルギーを生じる。ＬＡＧ−３ノックアウトマウスモデルは、穏やかなリンパ球過剰増殖だけで、生存可能であり（Workmanら、2003）、ＬＡＧ−３が中程度の免疫「ブレーキ」として働くことを示している。
【０００７】
ＬＡＧ−３とＭＨＣクラスＩＩとの間のこの抑制性相互作用はまた、ＴｒｅｇとＣＤ４陽性Ｔ細胞との間に起こることが提案されている（Segaら、2014）。Ｔｒｅｇは、抑制性サイトカイン（IL-10及びTGFβなど）の放出、炎症性代謝の操作（CD73異化アデノシンなど）、ＡＰＣ成熟の制御、又は制御性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞との間の直接的相互作用のいずれかにより、免疫応答を抑制する。ＭＨＣクラスＩＩ陽性ＴｒｅｇがＭＨＣクラスＩＩ陰性Ｔｒｅｇより抑制性であり（Baecher-Allenら、2006）、エフェクターＴ細胞上に発現したＬＡＧ−３との直接的相互作用を通して免疫応答を活発に抑制するという証拠がヒトにおいてある。ＬＡＧ−３陰性Ｔｒｅｇは、通常のＴ細胞増殖を抑制することができるが、ＬＡＧ−３陰性ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ免疫抑制に抵抗性である。この過程は、トロゴサイトーシスとして公知の過程を通してヒトＴ細胞間で起こり（Segaら、2014）、それにより、ＴｒｅｇがＡＰＣ成熟を阻止するだけでなく、ＭＨＣクラスＩＩを獲得して、プライミングされたＬＡＧ−３陽性ＣＤ４  Ｔ細胞を抑制すると言われた。
【０００８】
ＬＡＧ−３発現はまた、繰り返された抗原刺激のマーカーである。がんにおいて、Ｔ細胞は、一般的に、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３などの免疫抑制因子の発現を含む、「疲弊した」表現型の形をとり（Wherryら、2011）、その場合、その細胞は、抗原に応答して、適切に増殖し、かつケモカインを分泌する一般的能力をもたない。これらの免疫抑制因子の阻害は、免疫閾値を低下させ、Ｔ細胞による適切な抗がん応答を（再び）可能にする。前臨床モデルにおいて、これは、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１に対するアンタゴニスト抗体を用いて裏付けられており、その場合、腫瘍量の減少が見られた。アンタゴニスト抗体によるＬＡＧ−３阻害は、腫瘍微小環境において免疫応答を再活性化すると考えられ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＬＡＧ−３の発現が、疲弊した表現型と関連しており、Ｔｒｅｇ上のＬＡＧ−３の発現が、強力な免疫抑制能力と関連している。ＬＡＧ−３をブロックする抗体は、Ｔエフェクター細胞の増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性を増加させ、Ｔｒｅｇ抑制因子活性を減少させて、腫瘍成長の減少をもたらす。
【０００９】
ヒト腫瘍において、ＬＡＧ−３の発現の増加は、ヒト腎細胞癌、並びにメラノーマ及びリンパ腫などの他の腫瘍からの腫瘍浸潤リンパ球（TIL）上に見出された（Demeureら、2001; Wolchockら、2013）。重要なことには、ＬＡＧ−３はまた、慢性ウイルス感染症（Workmanら、2005）及びがん（Workmanら、2003）を有する患者におけるＴ細胞機能不全と密接に相関している。ＬＡＧ−３はまた、様々なヒトがんにおいて腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇについての表面マーカーとして同定されている（Camisachiら、2010; Gandhiら、2006）。
【００１０】
がん（固形及び血液系悪性腫瘍）において、免疫抑制をなくし、可能であれば抗原提示を増強するためのヒトＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体が、臨床開発中である。
【００１１】
ＬＡＧ−５２５及びＩＭＰ−７０１（Novartis AG）は、ＬＡＧ−３に対するヒト抗体であり、腎がん（腎細胞がん）；非小細胞肺がん（NSCLC）；上咽頭がん；結腸直腸がん；メラノーマ；胃がん、及び食道胃接合部腺癌において、それぞれ、第ＩＩ相及び第Ｉ相臨床研究に進んでいる。
【００１２】
抗ＬＡＧ−３抗体ＢＭＳ−９８６０１６（Bristol-Myers Squibb Company）は、現在、卵巣がん；ＮＳＣＬＣ；結腸直腸がん；子宮頚がん；メラノーマ；胃がん；膀胱がん；頭頚部がん；扁平上皮癌；腎細胞癌について第Ｉ相臨床試験中であり、単剤療法としてか、又は併用療法の一部としてかのいずれかで、ＮＳＣＬＣ；再発性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；難治性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；メラノーマ；非ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫；間慢性リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；難治性多発性骨髄腫；及び間慢性多発性骨髄腫において第ＩＩ相研究中である。
【００１３】
ＬＡＧ−３に対するさらなる抗体もまた、前臨床開発中である。
【００１４】
しかしながら、現在、臨床試験において、抗ＬＡＧ−３治療はわずかしかなく、治療として認可されたものはなく、それゆえ、がん治療の関連において用いることができる、ＬＡＧ−３を標的とする追加の分子を開発する必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【００１５】
発明の言明
広範なスクリーニング及び親和性成熟プログラム後、本発明者らは、分子のＣＨ３ドメイン内に、ＬＡＧ−３に特異的な結合部位を含む、１０個の特異的結合要素を同定することができた。これらの分子は、ヒトＬＡＧ−３とカニクイザルＬＡＧ−３の両方に対して高い親和性を有することが示された。ヒトＬＡＧ−３に対する高親和性は、ヒト患者における、例えば、ＬＡＧ−３を発現する腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を含有するがんの処置において有利であることが予想され、一方、ヒトＬＡＧ−３に対する親和性に匹敵する、カニクイザルＬＡＧ−３に対する高親和性は、カニクイザル疾患モデルにおける特異的結合要素の性質の評価に有用であることが予想される。このことについての理由は、その得られた結果が、ヒト及びカニクイザルＬＡＧ−３に対するその親和性により高い変動性を有する分子がカニクイザルモデルで試験される場合より、ヒト患者における特異的結合要素の効果を予測する可能性がより高いということである。
【００１６】
特異的結合要素はまた、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて高い活性を有することが示され、そのことにより、ＬＡＧ−３の阻害の増強を通してヒト患者において向上した効力を予測するものであると予想される。
【００１７】
マウスＬＡＧ−３と結合する特異的結合要素の代替マウス型もまた、本発明者らによって調製され、その特異的結合要素が、第２の腫瘍抗原に対する、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位をさらに含む場合、がんの同系マウスモデルにおいて腫瘍成長を有意に阻害する能力があることが示された。腫瘍環境におけるマウス及びヒトＬＡＧ−３の類似した作用機構に基づいて、腫瘍量を減少させることに効力を示すマウス研究は、ヒトがん患者における臨床治療的有用性へと変換できることが予想される。したがって、これらのデータに基づいて、特異的結合要素が、ヒト患者においてＬＡＧ−３を発現するがんを処置する方法に適用されるだろうことが予想される。
【００１８】
したがって、第１の態様において、本発明は、リンパ球活性化遺伝子３と結合する特異的結合要素であって、その特異的結合要素のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む、特異的結合要素を提供する。
【００１９】
ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤは、好ましくは、特異的結合要素のＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、アミノ酸配列ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥは、好ましくは、ＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する。
【００２０】
例えば、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、特異的結合要素のＣＨ３ドメインの構造ループ領域に位置し得、構造ループ領域は、好ましくは、２個以上の構造ループを含み、ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。
【００２１】
さらなる例として、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、特異的結合要素のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループへと操作され得、ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。
【００２２】
上記で言及されているように、ＬＡＧ−３結合部位の配列は、好ましくは、特異的結合要素のＣＨ３ドメインの２個以上の構造ループに位置する。好ましい実施形態において、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインのＡＢループ中に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＥＦループ中に、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８に位置し、及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基９２から１０１に位置し、アミノ酸残基の番号付けは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）の番号付けスキームによる。
【００２４】
特異的結合要素のＬＡＧ−３抗原結合部位は、以下の配列：
（i）ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２、８、及び１８）；
（ii）ＳＮＧＱＰＥＤＮＹ（配列番号１３）；
（iii）ＳＮＧＹＰＥＩＥＦ（配列番号２３）；
（iv）ＳＮＧＩＰＥＷＮＹ（配列番号２８）；
（v）ＳＮＧＹＡＥＹＮＹ（配列番号３３）；
（vi）ＳＮＧＹＫＥＥＮＹ（配列番号３８）；
（vii）ＳＮＧＶＰＥＬＮＶ（配列番号４３）；又は
（viii）ＳＮＧＹＱＥＤＮＹ（配列番号４８）
の１つを、好ましくは特異的結合要素のＣＨ３ドメインのＣＤループ中にさらに含み得る。
【００２５】
好ましくは、特異的結合要素のＬＡＧ−３抗原結合部位は、以下の配列：ＣＨ３ドメインのＣＤループにおける配列番号２、２８、又は３８に示されるアミノ酸配列の１つを、好ましくは特異的結合要素のＣＨ３ドメインのＣＤループ中にさらに含む。より好ましくは、特異的結合要素のＬＡＧ−３抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインのＣＤループ中に、配列番号２に示されるアミノ酸配列をさらに含む。
【００２６】
配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、特異的結合要素のＣＨ３ドメインの残基４３から７８に位置し、その残基は、ＩＭＧＴの番号付けスキームに従って番号付けされる。
【００２７】
ＬＡＧ−３抗原結合部位の配列以外の、特異的結合要素のＣＨ３ドメインの配列は、特に限定されるということはない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインなどのヒト免疫グロブリンＧドメイン、最も好ましくは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインの配列は当技術分野において公知である。
【００２８】
好ましい実施形態において、特異的結合要素は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示されるＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号５、３０、又は４０に示されるＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、配列番号５に示されるＣＨ３ドメインを含む。あるいは、特異的結合要素は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０、好ましくは配列番号５、３０、又は４０、より好ましくは配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ３ドメインを含み得る。
【００２９】
特異的結合要素は、ＣＨ２ドメインをさらに含み得る。ＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ分子における場合のように、ＣＨ３ドメインのＮ末端に位置する。特異的結合要素のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は、当技術分野において公知である。好ましい実施形態において、特異的結合要素は、配列番号５３に示される配列を有するＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン、又は配列番号５３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＨ２ドメインを含む。
【００３０】
好ましい実施形態において、特異的結合要素は、配列番号６、７、１１、１２、１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３６、３７、４１、４２、４６、４７、５１、若しくは５２に示される配列、又は配列番号６、７、１１、１２、１６、１７、２１、２２、２６、２７、３１、３２、３６、３７、４１、４２、４６、４７、５１、若しくは５２に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。より好ましくは、特異的結合要素は、配列番号６、７、３１、３２、４１、若しくは４２に示される配列、又は配列番号６、７、３１、３２、４１、若しくは４２に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。さらにより好ましくは、特異的結合要素は、配列番号６若しくは７に示される配列、又は配列番号６若しくは７に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む。
【００３１】
好ましくは、特異的結合要素は、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分を含む。免疫グロブリンヒンジ領域は、２つのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン配列が会合して、二量体を形成するのを可能にする。好ましくは、ヒンジ領域又はその部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその部分である。より好ましくは、ヒンジ領域又はその部分は、ＩｇＧ１ヒンジ領域又はその部分である。ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の配列は、配列番号５７に示されている。特異的な結合要素の部分を形成し得る適切な短縮型ヒンジ領域は、配列番号５８に示されている。このヒンジ領域は、実施例において試験されたＦｃａｂ分子に存在し、完全長ヒンジ領域はニセｍＡｂ２型式で存在した。したがって、特異的結合要素は、好ましくは、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分を含み、ヒンジ領域は、配列番号５７若しくは配列番号５８に示される配列を有し、又はヒンジ領域は、配列番号５７若しくは配列番号５８に示される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。あるいは、特異的結合要素は、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分を含み得、ヒンジ領域は、配列番号５７又はその断片に示される配列を含み、前記断片は、配列番号５７のアミノ酸残基の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個若しくはそれ以上、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、又は少なくとも１４個を含む。
【００３２】
特異的結合要素のＣＨ３ドメインにおけるＬＡＧ−３抗原結合部位に加えて、特異的結合要素は、１つ又は複数の追加の抗原結合部位をさらに含んで、二重特異性又は多重特異性分子を生じ得る。好ましくは、特異的結合要素は、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含む。ＣＤＲに基づいた抗原結合部位は、天然に存在する免疫グロブリン分子に見出され、それらの構造は当技術分野において周知である。特異的結合要素がＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含む場合、特異的結合要素は、好ましくは、抗体分子である。抗体分子は、それが、本明細書で定義されているようなＣＨ３ドメイン及びＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含むならば、特に限定されるということはない。好ましい実施形態において、抗体分子は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子などのヒト免疫グロブリンＧ分子、より好ましくはヒトＩｇＧ１分子である。ヒト免疫グロブリンＧ分子の配列は当技術分野において公知であり、ＣＨ３ドメイン、又は本明細書に開示されているようなＣＨ３ドメイン配列をそのような分子へ導入することは、当業者にいかなる困難も提示することはないだろう。
【００３３】
特異的結合要素が１つ又は複数のＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含む場合、そのＣＤＲに基づいた抗原結合部位は、好ましくは、免疫系調節物質である分子と結合する。免疫系調節物質の例には、免疫調節性受容体、及び免疫調節性受容体のリガンドが挙げられる。好ましくは、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位は、免疫系阻害剤又は活性化因子、最も好ましくは免疫系阻害剤と結合する。好ましい免疫系阻害剤の例は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（CTLA-4）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有−３（T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3）（TIM-3）、ＣＤ７３、並びにコロニー刺激因子１受容体（CSF-1R）である。ある特定の実施形態において、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位は、ＰＤ−Ｌ１に対する結合部位ではない。
【００３４】
特異的結合要素は、免疫系調節物質、細胞傷害性分子、放射性同位元素、又は検出可能な標識にさらにコンジュゲートされ得る。免疫系調節物質は、サイトカインであり得る。
【００３５】
本発明はまた、本発明の特異的結合要素又は抗体分子をコードする核酸、加えて、そのような核酸を含むベクターを提供する。
【００３６】
本発明の核酸又はベクターを含む組換え宿主細胞もまた提供される。そのような組換え宿主細胞は、本発明の特異的結合要素を産生するために用いられ得る。したがって、本発明の特異的結合要素又は抗体分子を産生する方法であって、特異的結合要素又は抗体分子の産生のための条件下で組換え宿主細胞を培養する工程を含む、方法もまた提供される。方法は、特異的結合要素又は抗体分子を単離及び／又は精製する工程をさらに含み得る。
【００３７】
本発明の特異的結合要素及び抗体は、治療的適用、特にがん処置などのヒトにおける治療的適用に適用されることが予想される。したがって、本発明による特異的結合要素又は抗体分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【００３８】
本発明はまた、患者においてがんを処置する方法における使用のための、本発明の特異的結合要素又は抗体分子を提供する。患者においてがんを処置する方法であって、本発明による特異的結合要素又は抗体分子の治療的有効量を患者に投与する工程を含む、方法もまた提供される。患者におけるがんの処置のための薬物の製造における使用のための、本発明による特異的結合要素又は抗体分子の使用がさらに提供される。本明細書で言及される場合、患者は、好ましくはヒト患者である。処置は、抗腫瘍ワクチン及び／又は化学療法剤を患者に投与する工程をさらに含み得る。
【００３９】
本発明者らは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせての、本発明による特異的結合要素のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む特異的結合要素でのＴＩＬの処理が、ＴＩＬによるＬＡＧ−３発現の低下を生じることを示している。ＬＡＧ−３発現の低下は、ＬＡＧ−３の阻害効果を低下させ、それにより、ＴＩＬが疲弊を克服することを可能にすることが予想される。いったんＴＩＬが活性化したならば、それらは、腫瘍により発現したネオ抗原を認識し、それに対する応答を開始し、それにより腫瘍量を低減することができるだろうと予想される。
【００４０】
したがって、本発明の特異的結合要素は、ＰＤ−Ｌ１と結合する抗体分子などのＰＤ−Ｌ１と結合する第２の特異的結合要素と組み合わせて、患者へ投与され得る。
【００４１】
したがって、さらなる態様において、本発明は、患者においてがんを処置する方法における使用のための、本発明の特異的結合要素又は抗体分子であって、方法が、本発明の特異的結合要素又は抗体分子、及びＰＤ−Ｌ１と結合する第２の特異的結合要素を患者に投与する工程を含む、本発明の特異的結合要素又は抗体分子に関する。
【００４２】
本発明はまた、患者においてがんを処置する方法における使用のための、ＰＤ−Ｌ１と結合する特異的結合要素であって、方法が、特異的結合要素、及び本発明の特異的結合要素又は抗体分子を患者に投与する工程を含む、特異的結合要素に関する。
【００４３】
本発明はさらに、治療的有効量の本発明による特異的結合要素又は抗体分子、及びＰＤ−Ｌ１と結合する第２の特異的結合要素を患者に投与する工程を含む、患者においてがんを処置する方法に関する。患者におけるがんの処置のための薬物の製造のための、本発明による特異的結合要素又は抗体分子の使用であって、処置が、本発明による特異的結合要素又は抗体分子、及びＰＤ−Ｌ１と結合する第２の特異的結合要素を患者に投与する工程を含む、使用も提供される。
【００４４】
本発明の特異的結合要素又は抗体分子、及びＰＤ−Ｌ１と結合する特異的結合要素は、同時に、別々に、又は逐次的に、患者に投与され得る。
【００４５】
この関連において、本発明の特異的結合要素又は抗体分子は、第２の抗原に対するＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含まない場合がある。したがって、本発明の特異的結合要素又は抗体分子は、ＬＡＧ−３と結合するのみであり得る。
【００４６】
ＰＤ−Ｌ１を結合する特異的結合要素は抗体分子、又はその断片であり得る。ＰＤ−Ｌ１を結合する抗体分子は、当技術分野において公知である。抗体分子は、ヒト又はヒト化型であり得る。抗体分子は、好ましくは、モノクローナル抗体分子である。抗体分子の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプのサブクラス、加えてそれらの断片である。ＰＤ−Ｌ１を結合する特異的結合要素は、ＬＡＧ−３抗原結合部位を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】２回目の親和性成熟後に同定された以下の９個のＦｃａｂ：ＦＳ１８−７−３２；ＦＳ１８−７−３３；ＦＳ１８−７−３６；ＦＳ１８−７−５８；ＦＳ１８−７−６２；ＦＳ１８−７−６５；ＦＳ１８−７−７８；ＦＳ１８−７−８８；及びＦＳ１８−７−９５の、親Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９に対する配列アラインメントを示す図である。
【図１Ｂ】これらのＦｃａｂのそれぞれの、親Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９の配列との配列同一性を示す図である。
【図２】ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、代替抗マウスＬＡＧ−３  ＦｃａｂがマウスＬＡＧ−３を阻害し、ｍＩＬ−２の放出をもたらすことを示す図である。ベンチマーク抗マウスＬＡＧ−３  ｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７Ｗは、ｍＩＬ−２放出の増加を示すが、最大放出は、抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂのそれより有意に低い。ＷＴ  Ｆｃａｂは、このアッセイにおいて活性を示さなかった。
【図３】ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ニセｍＡｂ２型式における抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９が、カニクイザルＬＡＧ−３を阻害し、ｍＩＬ−２の放出をもたらすことを示す図である。ベンチマーク抗ＬＡＧ−３  ｍＡｂ、２５Ｆ７は、ｍＩＬ−２放出の増加を示したが、最大放出は、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂのそれのおよそ３分の２であった。
【図４】代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−１０８−２９、及びマウスＴＩＭ−３、ＣＤ７３、ＣＳＦ−１Ｒ、又はＣＴＬＡ−４に特異的なＦａｂ領域を含むｍＡｂ２分子が、ＩｇＧ対照処置マウスと比較して、ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおいて、腫瘍成長を有意に低下させ得ることを示す図である。
【図５】抗体処理のＴ細胞ＬＡＧ−３発現への効果を示す図である。ＦＳ１８−２９／４４２０、Ｓ１、ＦＳ１８−２９／４４２０、及びＳ１、又は対照抗体４４２０で処理されたＣＤ８（Ａ）、ＣＤ４（Ｂ）、及びＦｏｘＰ３（Ｃ）腫瘍浸潤リンパ球（TIL）上のＬＡＧ−３発現が、最後のｍＡｂ２／抗体投与後の３日目及び７日目、それぞれに対応する、腫瘍接種後の１９日目及び２３日目において示されている。ＬＡＧ−３発現は、２３日目において、ＦＳ１８−２９／４４２０及びＳ１の組合せでの処理後に減少したが、個々に投与されたＦＳ１８−２９／４４２０又はＳ１は、ＬＡＧ−３発現において皆無かそれに近い減少を生じた。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、ＬＡＧ−３と結合する特異的結合要素に関する。具体的には、本発明の特異的結合要素は、その特異的結合要素の定常ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。用語「ＬＡＧ−３」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、ヒトＬＡＧ−３、マウスＬＡＧ−３、及び／又はカニクイザルＬＡＧ−３を指し得る。好ましくは、用語「ＬＡＧ−３」はヒトＬＡＧ−３を指す。
【００４９】
用語「特異的結合要素」は、ＬＡＧ−３抗原結合部位を含む定常ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン又はその断片を記載する。好ましくは、特異的結合要素は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２又はＣＨ３ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインが、ＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。好ましい実施形態において、特異的結合要素はさらに、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分を含む。そのような分子はまた、本明細書において、抗原結合性Ｆｃ断片、又はＦｃａｂ（商標）とも呼ばれる。特異的結合要素は、部分的に、又は全体的に合成で作製され得る。
【００５０】
したがって、本明細書に用いられる場合、用語「特異的結合要素」は、断片を含み、ただし、前記断片が、その特異的結合要素のＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインなどの定常ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含むという条件である。したがって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書に用いられる場合、用語「特異的結合要素」は、「特異的結合要素又はその断片」の等価物である。
【００５１】
好ましい実施形態において、特異的結合要素は抗体分子である。用語「抗体分子」は、抗体分子の断片を包含し、ただし、そのような断片は、ＬＡＧ−３抗原結合部位を含む、ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３ドメイン、好ましくはＣＨ３ドメインなどの定常ドメインを含むという条件である。抗体分子はヒト又はヒト化型であり得る。抗体分子は、好ましくは、モノクローナル抗体分子である。抗体分子の例は、免疫グロブリンＧなどの免疫グロブリンアイソタイプ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などのそれらのアイソタイプのサブクラス、加えてそれらの断片である。
【００５２】
モノクローナル抗体及び他の抗体を利用し、かつ組換えＤＮＡテクノロジーの技術を用いて、最初の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。そのような技術は、ＣＤＲ又は可変領域を異なる免疫グロブリンへ導入することを含み得る。一つの免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリンへの導入は、例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ、又はＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されている。同様の技術が、ＬＡＧ−３抗原結合部位を提供する関連の定常ドメイン配列に使用することができた。あるいは、特異的結合要素を産生するハイブリドーマ又は他の細胞は、遺伝子変異又は他の変化を受けやすくあり得、それは、産生する抗体の結合特異性を変化させる場合もあるし、変化させない場合もある。
【００５３】
抗体はいくつかの方法で改変することができるため、用語「特異的結合要素」は、天然であろうと、全体的又は部分的合成であろうと、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物、及び相同体を網羅すると解釈されるべきである。ＣＨ３ドメインを含む抗体断片の例は、抗体のＦｃドメインである。ＣＤＲ配列とＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の例はミニボディであり、それは、ＣＨ３ドメインに連結したｓｃＦｖを含む（Huら（1996）、Cancer Res.、56（13）:3055-61）。
【００５４】
本発明の特異的結合要素は、ＬＡＧ−３と結合する。この関連における結合は、特異的結合を指し得る。用語「特異的」は、特異的結合要素が、それの特異的結合パートナー、ここではＬＡＧ−３、以外の分子とのいかなる有意な結合も示さないだろうという状況を指し得る。用語「特異的」はまた、特異的結合要素が、いくつかの抗原により所有される特定のエピトープ、例えば、ＬＡＧ−３上のエピトープに対して特異的である場合にも適用でき、その場合、特異的結合要素は、エピトープを所有する様々な抗原と結合することが可能になると予想される。
【００５５】
ＬＡＧ−３は、その最も密接に関連するタンパク質である、ＣＤ４と、４０％配列同一性を共有する。本発明者らは、配列番号１から３に示されるアミノ酸配列を含むＦＳ１８−７−９  ＦｃａｂをＣＤ４との結合について試験した。ＦＳ１８−７−９  Ｆｃａｂは、ＣＤ４との結合を示さず、特異的結合要素がＬＡＧ−３を特異的に結合することを実証した。したがって、好ましい実施形態において、本発明の特異的結合要素のＬＡＧ−３結合部位は、ＣＤ４と結合せず、又はＣＤ４とのいかなる有意な結合も示さない。
【００５６】
本発明の特異的結合要素は、好ましくは、ＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。ＬＡＧ−３抗原結合部位は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４ドメインなどの特異的結合要素の定常ドメインに位置する。好ましくは、ＬＡＧ−３抗原結合部位は、特異的結合要素のＣＨ３ドメインに位置する。ＬＡＧ−３結合部位は、好ましくは、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含む。これらの配列は、実施例に記載されているような広範なスクリーニング及び特徴付けのプログラム後に本発明者らにより同定されたリード抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂクローンの全部に存在した。
【００５７】
配列番号１及び２に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、特異的結合要素の定常ドメインの構造ループに位置する。新しい抗原結合部位を生じさせるための抗体定常ドメインの構造ループ領域への配列の導入は、例えば、ＷＯ２００６／０７２６２０及びＷＯ２００９／１３２８７６に記載されている。
【００５８】
抗体定常ドメインの構造ループは、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループを含む。ＣＨ３ドメインにおいて、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８、４３から７８、及び９２から１０１に位置し、そのアミノ酸残基の番号付けはＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（IMGT）の番号付けスキームによる。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、定常ドメインのＡＢループに位置する。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、定常ドメインのＥＦループに位置する。より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基１１から１８に位置し、及び／又は配列番号３に示されるアミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインの残基９２から１０１に位置し、そのアミノ酸残基の番号付けはＩＭＧＴの番号付けスキームによる。
【００５９】
加えて、特異的結合要素は、好ましくは、特異的結合要素の定常ドメインの構造ループに、配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８、より好ましくは、配列番号２、２８、又は３８、さらにより好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。構造ループは、好ましくは、ＣＤループであり、定常ドメインは、好ましくは、ＣＨ３ドメインである。配列番号２、８、１３、１８、２３、２８、３３、３８、４３、又は４８に示されるアミノ酸配列は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの残基４３から７８に位置し、そのアミノ酸残基の番号付けはＩＭＧＴの番号付けスキームによる。
【００６０】
本発明の特異的結合要素は、（図１Ａに示されているように）ＣＨ３ドメインの位置３６にグルタミン酸残基（E）及び／又は位置８５．２にチロシン残基（Y）をさらに含み得、そのアミノ酸残基の番号付けはＩＭＧＴの番号付けスキームによる。特に、配列番号８に示されるＣＤ構造ループ領域を含む特異的結合要素は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの位置３６にグルタミン酸残基（E）をさらに含む。同様に、配列番号１８に示されるＣＤ構造ループ領域を含む特異的結合要素は、好ましくは、ＣＨ３ドメインの位置８５．２にチロシン残基（Y）をさらに含む。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合要素は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメイン、好ましくは、配列番号５、３０、又は４０に示される配列を有するＣＨ３ドメイン、より好ましくは、配列番号５に示される配列を有するＣＨ３ドメインを含む。
【００６２】
本発明の特異的結合要素は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み得、ＣＨ３ドメイン配列は、配列番号５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０に示される配列のＣ末端側すぐにリジン残基（K）をさらに含む。したがって、例えば、本発明の特異的結合要素は、配列番号５に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＣＨ３ドメインを含み得、配列番号５に示される配列のＣ末端にリジン残基を有する。その場合、そのようなＣＨ３ドメインの配列は以下の通りである：
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号１３５）
【００６３】
加えて、本発明の特異的結合要素は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４分子のＣＨ２ドメインなどの免疫グロブリンＧ分子のＣＨ２ドメインを含み得る。好ましくは、本発明の特異的結合要素は、ＩｇＧ１分子のＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインは、配列番号５３に示される配列を有し得る。
【００６４】
特異的結合要素のＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩなどの１つ若しくは複数のＦｃγ受容体及び／又は補体とのＣＨ２ドメインの結合を低下させ、又は抑止するための変異を含み得る。ヒトＩｇＧドメインのＣＨ２ドメインは、通常、Ｆｃγ受容体及び補体と結合し、本発明者らは、Ｆｃγ受容体との結合の低下が、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）を低下させ、補体との結合の低下が、特異的結合要素の補体依存性細胞傷害（CDC）活性を低下させるだろうと推論する。１つ又は複数のＦｃγ受容体及び補体へのＣＨ２ドメインの結合を低下させ、又は抑止するための変異は、公知であり、Ｂｒｕｈｎｓら（２００９）及びＸｕら（２０００）に記載された「ＬＡＬＡ変異」を含む。したがって、特異的結合要素は、ＣＨ２ドメインを含み得、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの位置４及び５にアラニン残基を含み、その番号付けは、ＩＭＧＴの番号付けスキームによる。例えば、特異的結合要素は、配列番号５４に示される配列を含み、有し、又はそれからなるＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む。
【００６５】
本発明による特異的結合要素は、第２の抗原結合部位、好ましくは、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含み得る。用語「ＣＤＲに基づいた抗原結合部位」は、６個のＣＤＲ残基で構成される特異的結合要素可変領域の抗原結合部位を指す。
【００６６】
第２の抗原結合部位は、好ましくは、腫瘍抗原に特異的である。より好ましくは、第２の抗原結合部位は、免疫調節性受容体、又は免疫調節性受容体についてのリガンドなどの免疫系調節物質である分子と結合し得る。例えば、第２の抗原結合部位は、免疫系阻害剤又は活性化因子、好ましくは免疫系阻害剤である分子と結合し得る。免疫系阻害剤の例には、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（CTLA-4）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有−３（TIM-3）、並びにコロニー刺激因子１受容体（CSF1R）が挙げられる。
【００６７】
腫瘍抗原などの所定の抗原に対する抗体分子、及びそのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は、十分、当業者の能力の範囲内であり、多くの適切な技術が当技術分野において公知である。さらに、様々な免疫系調節物質に対する、ＣＤＲ配列を含む抗体は当技術分野において公知である。したがって、当業者は、本明細書に記載されているようなＬＡＧ−３結合部位に加えて、第２の抗原に対するＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含む特異的結合要素を調製することに何の困難もないだろう。
【００６８】
本発明の特異的結合要素はまた、本明細書に開示された構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列のバリアントを含み得る。適切なバリアントは、配列変化又は変異の方法、及びスクリーニングを用いて得ることができる。好ましい実施形態において、１つ又は複数のバリアント配列を含む特異的結合要素は、ＬＡＧ−３に対する結合特異性及び／又は結合親和性などの、親の特異的結合要素の機能的特性の１つ又は複数を保持する。例えば、１つ又は複数のバリアント配列を含む特異的結合要素は、好ましくは、（親の）特異的結合要素と同じ親和性、又はそれより高い親和性で、ＬＡＧ−３と結合する。親の特異的結合要素は、バリアント特異的結合要素へ組み込まれているアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を含まない特異的結合要素である。
【００６９】
例えば、本発明の特異的結合要素は、本明細書に開示された構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列を含み得る。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合要素は、配列番号４、５、又は１３５に示されるＣＨ３ドメイン配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有するＣＨ３ドメイン配列を含む。
【００７１】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の特異的結合要素は、配列番号６又は７に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列と少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有する、ＣＨ３及びＣＨ２ドメイン配列を含む。
【００７２】
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムＧＡＰ（Wisconsin GCGパッケージ、Accelerys Inc、San Diego USA）を参照して定義される。ＧＡＰは、２つの完全な配列をアラインメントするために、マッチの数を最大限にし、かつギャップの数を最小限にするＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる。一般的に、ギャップ生成ペナルティー＝１２及びギャップ伸長ペナルティー＝４を有するデフォルトパラメータが用いられる。ＧＡＰの使用は好ましくあり得るが、他のアルゴリズムが用いられてもよく、例えば、一般的にデフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴ（Altschulら、（1990）J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を用いる）、ＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman （1988）PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith及びWaterman（1981）J. Mol Biol. 147: 195-197）、又はＡｌｔｓｃｈｕｌら（1990）上記のＴＢＬＡＳＴＮプログラムである。特に、ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔアルゴリズム（Nucl. Acids Res.（1997）25 3389-3402）が用いられ得る。
【００７３】
本発明の特異的結合要素はまた、本明細書に開示された構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列と比較して、１個又は複数のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）、好ましくは、２０個若しくはそれ未満の変化、１５個若しくはそれ未満の変化、１０個若しくはそれ未満の変化、５個若しくはそれ未満の変化、４個若しくはそれ未満の変化、３個若しくはそれ未満の変化、２個若しくはそれ未満の変化、又は１個の変化を有する構造ループ、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、ＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、軽鎖、又は重鎖の配列を含み得る。特に、特異的結合要素の１つ又は複数のフレームワーク領域に変化が生じ得る。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明の特異的結合要素は、配列番号４、５、又は１３５に示されるＣＨ３ドメイン配列と比較して、１個又は複数のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）、好ましくは、２０個若しくはそれ未満の変化、１５個若しくはそれ未満の変化、１０個若しくはそれ未満の変化、５個若しくはそれ未満の変化、４個若しくはそれ未満の変化、３個若しくはそれ未満の変化、２個若しくはそれ未満の変化、又は１個の変化を有するＣＨ３ドメイン配列を含み得る。
【００７５】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の特異的結合要素は、配列番号６又は７に示されるＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列と比較して、１個又は複数のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）、好ましくは、２０個若しくはそれ未満の変化、１５個若しくはそれ未満の変化、１０個若しくはそれ未満の変化、５個若しくはそれ未満の変化、４個若しくはそれ未満の変化、３個若しくはそれ未満の変化、２個若しくはそれ未満の変化、又は１個の変化を有するＣＨ３及びＣＨ２ドメイン配列を含む。
【００７６】
ＬＡＧ−３との結合において本発明の特異的結合要素と競合し、又は本発明の特異的結合要素と同じ、ＬＡＧ−３上のエピトープと結合する特異的結合要素も企図され、特異的結合要素は、好ましくは、特異的結合要素のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む。２つの抗体による抗原における競合を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、２つの抗体による抗原との結合の競合は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて決定することができる。抗体により結合されたエピトープをマッピングするための方法は、同様に、当技術分野において公知である。
【００７７】
本発明の特異的結合要素は、好ましくは、１×１０−９Ｍの親和性（KD）又はそれより高い親和性で、ＬＡＧ−３と結合する。例えば、本発明の特異的結合要素は、８×１０−１０Ｍの親和性（KD）又はそれより高い親和性で、ＬＡＧ−３と結合し得る。
【００７８】
ＬＡＧ−３などの同族抗原との特異的結合要素の結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴法（SPR）により決定することができる。細胞表面上に発現したＬＡＧ−３などの同族抗原との特異的結合要素の結合親和性は、フローサイトメトリにより決定することができる。
【００７９】
Ｆｃａｂの結合部位は、極めて近接して位置する２つの結合部位を有する相対的にコンパクトな抗体断片を形成するため、Ｆｃａｂはモノクローナル抗体より小さい結合界面を有する。対照的に、典型的なｍＡｂのＦａｂアームは、可動性ヒンジ領域により隔てられている。Ｆｃａｂの２つの抗原結合部位はまた、典型的なｍＡｂのそれらと比較した場合、お互いに空間的に近接している。このより小さい結合界面及び２つの結合部位の可動性の低減に基づけば、抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、モノクローナル抗体ベンチマークと類似した親和性及び作用強度でＬＡＧ−３と結合し、かつそれを阻害することができることは驚くべきことであった。
【００８０】
本発明の特異的結合要素は、好ましくは、細胞の表面上に発現したＬＡＧ−３と結合する能力がある。その細胞は、好ましくは、がん細胞である。
【００８１】
特異的結合要素が、第２の抗原に特異的な、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位などの第２の抗原結合部位を含む場合、特異的結合要素は、好ましくは、ＬＡＧ−３及び第２の抗原と同時に結合する能力がある。好ましくは、特異的結合要素は、ＬＡＧ−３及び第２の抗原と同時に結合する能力があり、ＬＡＧ−３及び第２の抗原は、単一細胞の表面上、又は２つの別々の細胞の表面上に発現している。
【００８２】
本発明の特異的結合要素は、ヒトＬＡＧ−３、マウスＬＡＧ−３、及び／又はカニクイザルＬＡＧ−３と結合し得る。好ましくは、本発明の特異的結合要素は、ヒトＬＡＧ−３と結合する。
【００８３】
一実施形態において、本発明の特異的結合要素は、ＰＤ−Ｌ１に対する抗原結合部位、例えば、ＣＤＲに基づいた抗原結合部位を含む、抗体分子などの特異的結合要素ではない。
【００８４】
ある特定の例において、本発明の特異的結合要素は、（i）ＰＤ−Ｌ１に対するＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び（ii）特異的結合要素のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位を含む、抗体分子などの特異的結合要素ではない。
【００８５】
さらなる例において、本発明の特異的結合要素は、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３と結合する、抗体分子などの特異的結合要素ではなく、抗体分子は、
（i）ＰＤ−Ｌ１に対するＣＤＲに基づいた抗原結合部位、及び
（ii）抗体分子のＣＨ３ドメインに位置するＬＡＧ−３抗原結合部位
を含み、ＬＡＧ−３結合部位が、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）及びＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）を含み、アミノ酸配列ＷＤＥＰＷＧＥＤが、ＣＨ３ドメインの第１の構造ループに位置し、アミノ酸配列ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥがＣＨ３ドメインの第２の構造ループに位置する。本発明の特異的結合要素は、治療剤又は検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。この場合、特異的結合要素は、コンジュゲートと呼ばれ得る。例えば、特異的結合要素は、免疫系調節物質、細胞傷害性分子、放射性同位元素、又は検出可能な標識とコンジュゲートされ得る。免疫系調節物質又は細胞傷害性分子はサイトカインであり得る。検出可能なマーカーは、放射性同位元素、例えば、非治療的放射性同位元素であり得る。
【００８６】
特異的結合要素は、ペプチド結合又はリンカーを用いて、治療剤又は検出可能な標識とコンジュゲートされ得、すなわち、融合ポリペプチド内に、前記治療剤又は検出可能な標識、及び特異的結合要素又はそのポリペプチド鎖コンポーネントを含む。コンジュゲーションのための他の手段には、化学的コンジュゲーション、特に、二機能性試薬を用いる（例えば、DOUBLE-REAGENTS（商標）架橋試薬選択ガイド（Cross-linking Reagents Selection Guide）、Pierceを使用する）架橋が挙げられる。
【００８７】
したがって、特異的結合要素及び治療剤又は検出可能な標識は、お互いに直接的に、例えば、任意の適切な化学結合を通して、又はリンカー、例えば、ペプチドリンカーを通して、接続され得る。
【００８８】
ペプチドリンカーは、短くあり得る（アミノ酸の２から２０個、好ましくは２から１５個の残基ひと続き）。ペプチドリンカー配列の適切な例は当技術分野において公知である。１つ又は複数の異なるリンカーが用いられ得る。リンカーは、約５アミノ酸長であり得る。
【００８９】
化学結合は、例えば、共有結合又はイオン結合であり得る。共有結合の例には、ペプチド結合（アミド結合）及びジスルフィド結合が挙げられる。例えば、特異的結合要素と治療剤又は診断剤は、共有結合的に連結され得る。例えば、ペプチド結合（アミド結合）による。したがって、特異的結合要素及び治療剤又は診断剤は、単一鎖ポリペプチドとして産生（分泌）され得る。
【００９０】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードする単離された核酸を提供する。当業者は、当技術分野で周知の方法を用いて、そのような核酸を調製することに困難もないだろう。単離された核酸は、本発明の特異的結合要素を、例えば、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳類の宿主細胞における発現により発現するのに用いられ得る。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、又はＮＳ０細胞などの哺乳類細胞である。核酸は、一般的に、発現のための組換えベクターの形をとって提供される。
【００９１】
単離された核酸は、例えば、ＦＳ１８−７−９（ＣＨＯコドン最適化ヌクレオチド配列）、ＦＳ１８−７−９（ＨＥＫ２９３発現型ヌクレオチド配列）、ＦＳ１８−７−３２、ＦＳ１８−７−３３、ＦＳ１８−７−３６、ＦＳ１８−７−５８、ＦＳ１８−７−６２、ＦＳ１８−７−６５、ＦＳ１８−７−７８、ＦＳ１８−７−８８、及びＦＳ１８−７−９５のＣＨ３ドメイン、それぞれをコードする配列番号１３６、４、９、１４、１９、２４、２９、３４、３９、４４、又は４９に示される配列を含み得る。
【００９２】
そのような核酸及びベクターを含むインビトロ宿主細胞は、本発明の特異的結合要素を発現するためのそれらの使用であるように、本発明の一部であり、その後、その特異的結合要素は、細胞培養から精製され、任意選択により薬学的組成物へ製剤化され得る。したがって、本発明は、本発明の組換え宿主細胞を特異的結合要素の産生のための条件下で培養する工程を含む、本発明の特異的結合要素を産生する方法をさらに提供する。上記で言及されているような適切な宿主細胞を培養するための方法は、当技術分野において周知である。方法は、特異的結合要素を単離及び／又は精製する工程をさらに含み得る。方法はまた、特異的結合要素を、任意選択により薬学的に許容される賦形剤又は下記のような他の物質と共に、薬学的組成物へ製剤化する工程を含み得る。
【００９３】
ＬＡＧ−３は、免疫系の細胞上に発現することが知られている。特に、ＬＡＧ−３は、腫瘍環境内の疲弊したＴ細胞、及び限られた数のがん細胞上に発現することが知られている。加えて、本発明者らは、ＬＡＧ−３と結合する特異的結合要素の使用が、がんの同系マウスモデルにおいて腫瘍成長を抑制するのに有効であることを示している。
【００９４】
したがって、本発明の特異的結合要素は、患者においてがんを処置する方法に用いられ得る。患者は、好ましくは、ヒト患者である。
【００９５】
本発明の特異的結合要素を用いて処置されるがんの細胞は、例えばそれらの細胞表面上に、ＬＡＧ−３を発現し得る。一実施形態において、処置されるがんの細胞は、例えばそれらの細胞表面上に、ＬＡＧ−３を発現することが決定されている場合がある。例えば、Ｂ細胞リンパ腫は、それらの細胞表面上にＬＡＧ−３を発現することが示されている。細胞表面上での抗原の発現を決定するための方法は、当技術分野において公知であり、それには、例えば、フローサイトメトリが挙げられる。
【００９６】
下記の実施例３は、本発明の特異的結合要素が、マウスにおいて、ＬＡＧ−３発現ＴＩＬなどの、高レベルのＬＡＧ−３発現免疫細胞を有する腫瘍を処置するために用いることができることを示している。したがって、加えて、又は代替として、本発明の特異的結合要素を用いて処置されるがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３発現免疫細胞を含み得る。ＬＡＧ−３発現ＴＩＬなどのＬＡＧ−３発現免疫細胞は、多くのがんにおける腫瘍細胞の間に存在する。一実施形態において、本発明の特異的結合要素を用いて処置されるがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３発現免疫細胞を含有することが決定されている。腫瘍において、又は腫瘍の周辺において、ＬＡＧ−３発現免疫細胞の存在を決定するための方法は、当技術分野において公知である。
【００９７】
本発明の特異的結合要素を用いて処置されるがんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、卵巣がん、前立腺がん、結腸直腸がん、線維肉腫、腎細胞癌、メラノーマ、膵がん、乳がん、多形神経膠芽腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、胃がん（stomach cancer）（胃がん（gastric cancer））、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、精巣がん、陰茎がん、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、又は慢性リンパ芽球性白血病）、多発性骨髄腫、扁平上皮がん、精巣がん、食道がん（例えば、食道胃接合部の腺癌）、カポジ肉腫、及び中枢神経系（CNS）リンパ腫、肝細胞癌、上咽頭がん、メルケル細胞癌、及び中皮腫からなる群から選択され得る。これらのがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３を発現する、ＴＩＬなどの免疫細胞を含有することが公知であるか、又は予想される。
【００９８】
抗ＬＡＧ−３抗体を用いる、腎細胞癌、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、上咽頭がん、結腸直腸がん、メラノーマ、胃がん（stomach cancer）（胃がん（gastric cancer））、食道がん（例えば、食道胃接合部の腺癌）、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、及び多発性骨髄腫の処置は、臨床試験において調べられており、有望な結果が示されている。したがって、本発明の特異的結合要素を用いて処置されるがんは、腎細胞癌、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、上咽頭がん、結腸直腸がん、メラノーマ、胃がん（stomach cancer）（胃がん（gastric cancer））、食道がん（例えば、食道胃接合部の腺癌）、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、白血病（例えば、慢性リンパ性白血病）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、緩徐進行性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫）、又は多発性骨髄腫であり得る。
【００９９】
本発明の特異的結合要素を用いる処置についての好ましいがんは、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、膀胱がん、頭頚部がん（頭頚部の扁平上皮癌）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、胃がん（gastric cancer）、膵がん、及び肝細胞癌である。これらのがんの腫瘍は、ＬＡＧ−３発現免疫細胞を含むこと、及びそれらの細胞表面上にＰＤ−Ｌ１を発現するか、又はＰＤ−Ｌ１を発現する免疫細胞を含むかのいずれかであることがわかっている。
【０１００】
適用が、乳がんなどの特定の型のがんを指す場合、これは、関連組織、この場合、乳房組織の悪性形質転換を指す。異なる組織、例えば卵巣組織の悪性形質転換が起源であるがんは、乳房などの身体の別の場所において転移性病変を生じ得るが、それにより、本明細書で言及されているような乳がんではなく、卵巣がんである。
【０１０１】
がんは原発性又は続発性がんであり得る。したがって、本発明の特異的結合要素は、患者においてがんを処置する方法に用いられ得、そのがんは原発性腫瘍及び／又は腫瘍転移である。
【０１０２】
本発明の特異的結合要素は、患者、好ましくはヒト患者の処置の方法に用いられるように設計される。特異的結合要素は、通常、薬学的組成物の形で投与され、その薬学的組成物は、特異的結合要素に加えて、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つのコンポーネントを含み得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤、又は当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、無毒であるべきであり、かつ活性成分の効力に干渉すべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、その投与経路は、注射、例えば、静脈内又は皮下注射により得る。特異的結合要素は、静脈内に、又は皮下に投与され得る。
【０１０３】
液体薬学的組成物は、一般的に、水、石油、動物油又は植物油、ミネラルオイル又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
【０１０４】
静脈内注射、又は苦痛の部位における注射について、特異的結合要素、又は特異的結合要素を含む薬学的組成物は、好ましくは、発熱物質を含まず、かつ適切なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形をとる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性媒体を用いて適切な溶液を調製する能力が十分、ある。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が使用され得る。薬学的製剤の調製のための多くの方法は当業者に公知である。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照。
【０１０５】
本発明による特異的結合要素を含む組成物は、処置される状態に依存して、単独で、又は他の処置と組み合わせて、同時に若しくは逐次的に、又は別の治療剤との混合調製物として、投与され得る。例えば、本発明の特異的結合要素は、処置される疾患、例えば、上記で言及されているようながんについての既存の治療剤と組み合わせて、投与され得る。例えば、本発明の特異的結合要素は、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種（がんワクチン接種とも呼ばれる）、放射線治療、免疫療法、腫瘍退縮ウイルス、キメラ抗原受容体（CAR）Ｔ細胞治療、又はホルモン治療などの第２の抗がん治療と組み合わせて、患者に投与され得る。
【０１０６】
本発明の特異的結合要素が、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線治療などの抗がん治療におけるアジュバントとして働き得ることが予想される。理論に縛られるつもりはないが、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線治療の一部としての特異的結合要素の患者への投与は、化学療法、抗腫瘍ワクチン接種、又は放射線治療の単独で達成されるものより大きい、がん関連抗原ＬＡＧ−３に対する免疫応答を引き起こすだろうことが考えられる。例えば、抗ＬＡＧ−３治療は、マウスにおいて、ウイルスに基づいた病態を処置することに良い効力を示している（Blackburn SDら、2009, Nature Immunology 10（1）: 29-37）。
【０１０７】
したがって、患者においてがんを処置する方法は、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質と組み合わせて、本発明による特異的結合要素の治療的有効量を患者に投与する工程を含み得る。化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質は、好ましくは、問題になっているがんについての化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質、すなわち、問題になっているがんの処置において有効であると示されている化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質である。問題になっているがんについて有効であると示されている適切な化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射線核種、免疫療法剤、腫瘍退縮ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン治療のための作用物質の選択は、十分、当業者の能力の範囲内である。
【０１０８】
例えば、方法が、化学療法剤と組み合わせて、本発明による特異的結合要素の治療的有効量を患者に投与する工程を含む場合、化学療法剤は、タキサン、細胞傷害性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ＿ＲＡＦ酵素阻害剤、アルキル化剤、白金類似体、ヌクレオシド類似体、サリドマイド誘導体、抗悪性腫瘍性化学療法剤その他からなる群から選択され得る。タキサンには、ドセタキセル、パクリタキセル及びｎａｂ−パクリタキセルが挙げられる；細胞傷害性抗生物質には、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、及びバルルビシンが挙げられる；チロシンキナーゼ阻害剤には、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コビメチニブ（cobemitinib）、及びトラメチニブが挙げられる；ＰＡＲＰ阻害剤には、ニラパリブ（piraparib）が挙げられる；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤には、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられる；アルキル化剤には、ダカルバジン、シクロホスファミド、テモゾロミドが挙げられる；白金類似体には、カルボプラチン、シスプラチン、及びオキサリプラチンが挙げられる；ヌクレオシド類似体には、ゲムシタビン及びアザシチジンが挙げられる；抗悪性腫瘍剤には、フルダラビンが挙げられる。本発明における使用に適した他の化学療法剤には、メトトレキセート、デファクチニブ、エンチノスタット、ペメトレキセド、カペシタビン、エリブリン、イリノテカン、フルオロウラシル、及びビンブラスチンが挙げられる。
【０１０９】
がんの処置のためのワクチン接種ストラテジーは、診療所で実行されており、かつ科学文献（例えば、Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines）内で詳細に論じられている。これは、主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）有り又は無しのどちらの場合にしても、ワクチン接種の方法として、自己又は同種異系のがん細胞を用いることにより、免疫系を促して、その自己又は同種異系のがん細胞により発現する様々な細胞マーカーに対して応答させるためのストラテジーを含む。ＧＭ−ＣＳＦは、抗原提示において強い応答を誘発し、前記ストラテジーと共に使用される場合、特によく働く。
【０１１０】
投与は、「治療的有効量」であり得、これは、患者に利益を示すのに十分である。そのような利益は、少なくとも１つの症状の寛解で少なくともあり得る。したがって、特定化された疾患の「処置」は、少なくとも１つの症状の寛解を指す。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、処置されることになっているものの性質及び重症度、処置されることになっている特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達の部位、特異的結合要素の型、投与方法、投与のスケジューリング、並びに医師に知られた他の因子に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、症状の重症度及び／又は処置されることになっている疾患の進行に依存し得る。特異的結合要素の適切な用量は、当技術分野において周知である（Ledermannら（1991）Int. J. Cancer 47: 659-664; 及びBagshaweら（1991）Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。本明細書中、又は投与されることになっている特異的結合要素に適切である場合にはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（2003）に示された特定の投与量が用いられ得る。特異的結合要素の治療的有効量又は適切な用量は、そのインビトロ活性と動物モデルにおけるインビボ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効な投与量のヒトへの外挿のための方法は公知である。正確な用量は、処置される領域のサイズ及び位置や、特異的結合要素の正確な性質などの数々の要因に依存する。処置は、毎日、週２回、毎週、又は毎月の間隔で、医師の裁量で繰り返される場合がある。処置は、手術の前及び／又は後に与えられる場合があり、外科的処置の解剖学的部位に直接、投与又は適用され得る。
【０１１１】
本発明のさらなる態様及び実施形態は、以下の実験的例証を含む本開示を考慮すれば、当業者に明らかであろう。
【０１１２】
本明細書で言及された全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１３】
本明細書に用いられる場合、「及び／又は」は、その他のものの有無に関わらず、その２つの特定された特徴又はコンポーネントのそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、ちょうどあたかもそれぞれが本明細書に個々に示されているかのように、（i）Ａ、（ii）Ｂ、及び（iii）ＡとＢのそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。
【０１１４】
文脈が他に指示しない限り、上記で示された特徴の記載及び定義は、本発明のいかなる特定の態様又は実施形態にも限定されず、記載されている全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０１１５】
以下、本発明のある特定の態様及び実施形態を、例として、上記の図を参照して例証する。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
Ｆｃａｂ分子の選択及び特徴付け
１．１  抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂのナイーブ選択及び親和性成熟
１．１．１  ナイーブ選択
ＡＢ（残基１４から１８）及びＥＦ（残基９２から１０１）ループ内にランダム化を有するヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（IMGTの番号付け１．４から１３０）を示すナイーブファージライブラリーを、組換えＦｃタグ付きヒトＬＡＧ−３（LAG-3 Fc）抗原（R&D systems、2319-L3-050）での選択に用いた。ライブラリーを、プロテインＡ（Life Technologies、10002D）又はプロテインＧ（Life Technologies、10004D）ビーズ上に捕獲された抗原を用いて３ラウンドで選択した。そのアウトプットをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、陽性結合剤をサブクローニングし、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔピキア発現キット（Life Technologies、K1740-01）を用いてピキア・パストリス（Pichia pastoris）において、可溶性Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）として発現させた。その後、Ｆｃａｂを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（GE Healthcare）において組換えヒトＬＡＧ−３  Ｆｃとの結合についてスクリーニングした。簡単に述べれば、ＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D systems、2319-L3-050）を、７２００ＲＵの密度で、アミンカップリング（GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、ＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-100012）にカップリングさせた。Ｆｃａｂを、ＨＢＳ−Ｐ（GE Healthcare、BR100368）バッファー中に希釈し、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭで３分間、注入し、その後、５分間、バッファー中で解離させた。参照を引いたデータ（LAG-3 Fcフローセル２−ブランクフローセル）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて分析して、結合を同定した。その後、Ｆｃａｂを、ＨＥＫ細胞に発現したヒトＬＡＧ−３（pcDNA5FRTベクター［Life Technologies、V6010-20］にクローニングされたLAG-3）との結合について試験した（方法論についてセクション1.4.5を参照）。簡単に述べれば、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ヒトＬＡＧ−３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて組織培養フラスコから剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート中に播種した。Ｆｃａｂを、１００μｌ体積中、５μＭの細胞と、４℃で１時間、インキュベートした。そのプレートを洗浄し、二次抗体（抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、１００μｌを細胞へ加え、４℃で３０分間、インキュベートした。そのプレートを洗浄し、細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。そのプレートを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）において読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏＸを用いて分析した。その後、Ｆｃａｂを、リポフェクタミン（Life Technologies、11668-019）を用いるＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ２９３細胞（Life Technologies、R780-07）への形質転換により、哺乳類細胞内に発現させた。ＬＡＧ−３結合性Ｆｃａｂを、Ａ３７５細胞（ATCC、CRL-1619）上のヒトＭＨＣクラスＩＩの組換えＬＡＧ−３  Ｆｃとの結合の阻害について（実施例1.6における方法論を用いて）試験した。３��ウンドのファージ選択から５４個の固有のＦｃａｂ配列が同定され、これらのＦｃａｂのうちの１２個が、ＢＩＡｃｏｒｅ分析によりＬＡＧ−３  Ｆｃと結合し、及び／又はＬＡＧ−３発現ＨＥＫ細胞と結合することが決定された。選択されたＦｃａｂのうちの３個はまた、ＬＡＧ−３のＭＨＣクラスＩＩとの相互作用を阻害することができ、親和性成熟のために選択された。その３つのＦｃａｂは、ＦＳ１８−３、ＦＳ１８−７、及びＦＳ１８−２１と名付けられた。
【０１１７】
１．１．２  親和性成熟
１回目の親和性成熟
６個のファージディスプレイ親和性成熟ライブラリーを、上記のナイーブ選択プロセスを用いて同定された３個のＦｃａｂのそれぞれのＡＢループにおける５個の残基（残基１４から１８）、及びＥＦループにおける５個の残基（残基９２から９４及び９７から９８）か又は８個の残基（残基９２から９４及び９７から１０１）のいずれかの残基をランダム化することにより構築した。
【０１１８】
親和性成熟ライブラリーを、（上記のように）組換えヒトＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D systems、2319-L3-050）及びヒトＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を用いて選択した。そのアウトプットをファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、陽性結合剤をサブクローニングし、ＨＥＫ  Ｅｘｐｉ２９３細胞において、可溶性Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）として発現させた（pTT5ベクター[National Research Council of Canada]にクローニングされたFcabは、ExpiFectamine 293トランスフェクションキット[Life Technologies、A14524]を用いて、Expi293F細胞[Life technologies、A14527]へトランスフェクションされた）。その後、ＨＥＫ発現可溶性Ｆｃａｂを、細胞に発現したヒトＬＡＧ−３との結合、細胞に発現したカニクイザルＬＡＧ−３との結合（実施例1.4.3のような方法論）、及びＭＨＣクラスＩＩの組換えＬＡＧ−３  Ｆｃとの結合をブロックする能力（実施例1.6においてのような方法論）についてスクリーニングした。ブロックするＦｃａｂを、それらが、Ｔ細胞活性化アッセイにおいてＩＬ−２分泌のＬＡＧ−３誘導性阻害を逆転させることができるかどうかを決定するためにさらに試験した（実施例2.1においてのような方法論）。これらのスクリーニング方法を用いて、６個の親和性成熟ライブラリーから６１個の固有の抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが同定された。ＦＳ１８−７系列由来の親和性成熟したＦｃａｂは、カニクイザルＬＡＧ−３と最高レベルの交差反応性を生じることが示された。カニクイザルＬＡＧ−３  Ｆｃとの最強の結合及びＴ細胞活性化アッセイにおける最高の活性を有する、この系列由来の３個のＦｃａｂ（FS18-7-7、FS18-7-9、及びFS18-7-11と名付けられた）を、さらなる親和性成熟のために選択した。これらの３個のＦｃａｂはまた、ＬＡＧ−３  Ｆｃの、細胞に発現したＭＨＣクラスＩＩとの相互作用をブロックすることが示された。
【０１１９】
２回目の親和性成熟
１回目の親和性成熟からの３個のＦｃａｂ（FS18-7-7、FS18-7-9、及びFS18-7-11）のプールを用いて、さらなる親和性成熟ライブラリーを作製した。ＣＤループを、ＥＬＬＡ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製のランダム化プライマーを用いて、激しくランダム化した。ＣＤループにおけるアミノ酸位置の一部（残基４５．１から７８）を、システインを除くアミノ酸の等モルの配分を用いてランダム化した。変異性ＰＣＲもまた、ＣＨ３ドメイン配列全体に渡って実行して、結合を増強する可能性がある追加の変異を導入した。
【０１２０】
親和性成熟ライブラリーを、ファージにおいて作製し、ビオチン化組換えＬＡＧ−３  ａｖｉ−Ｆｃ（BPS Bioscience、71147）及びＨＥＫ  ｈＬＡＧ−３細胞に対して選択を実施し、ファージＥＬＩＳＡにより、組換えＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D systems、2319-L3-050）との結合についてスクリーニングした。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において８６個の固有のＦｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）が発現した。選択されたＦｃａｂをまた、上記のように、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて活性についてスクリーニングした。Ｔ細胞活性化アッセイにおける最高活性を有する２回目の親和性成熟中に同定された９個のＦｃａｂ（FS18-7-32、FS18-7-33、FS18-7-36、FS18-7-58、FS18-7-62、FS18-7-65、FS18-7-78、FS18-7-88、及びFS18-7-95）、加えて親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−９をその後、下記のようにさらに特徴付けた。これらの９個のＦｃａｂの、親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−９に対する配列アラインメントは、図１Ａに示されている。図１Ｂは、９個のＦｃａｂクローンのそれぞれの、親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−９とのパーセンテージ配列同一性を詳述する。その他の２個の親のＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−７及びＦＳ１８−７−１１の親和性成熟から生じたＦｃａｂは、ＦＳ１８−７−９の親和性成熟から生じたものほど有望な候補ではなく、それゆえに、さらに探究されなかった。
【０１２１】
１．２  マウスＬＡＧ−３に特異的な代替Ｆｃａｂの選択
上記のナイーブ選択プロトコールを用いて選択されたＦｃａｂ  ＦＳ１８−７を用いて、マウスＬＡＧ−３に対して選択するためのファージライブラリーを作製した。２ラウンドの親和性成熟を実施し、高親和性、マウスＬＡＧ−３との特異的結合を示したＦｃａｂクローン、ＦＳ１８−７−１０８−２９及びＦＳ１８−７−１０８−３５が、親和性成熟後に選択された。Ｔ細胞活性化アッセイにおけるマウスＬＡＧ−３を阻害するＦＳ１８−７−１０８−２９及びＦＳ１８−７−１０８−３５の能力が確認された。Ｏｃｔｅｔ（Forteo Bio）を用いるエピトープマッピングにより、抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ（上記のように２回目の親和性成熟後に選択された）と、ヒトＬＡＧ−３との結合において競合することが示された。抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂと抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂとの間に４から８個の残基の違いがある。したがって、抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、マウスにおいて、抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの結合及び機能についての適切な代替となることが予想される。
【０１２２】
１．３  ニセｍＡｂ２の構築及び発現
上記の１．１及び１．２で同定されたリード抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ及び抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂを含む「ニセ」ｍＡｂ２を、ｍＡｂ２型式におけるこれらのＦｃａｂの特徴付けを可能にするために調製した。これらのニセｍＡｂ２を、抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、及び抗ＦＩＴＣ抗体４４２０の可変領域（詳細として、配列番号８３、配列番号８４、及び配列番号８５参照）から調製した（Bedzyk, W. D.ら、1989及びBedzyk, W. D.ら、1990）。重鎖のＣＨ２ドメインにおいてＬＡＬＡ変異を含むニセｍＡｂ２（配列番号６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、及び８１）とそれを含まないニセｍＡｂ２（配列番号６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、及び８２）の両方が調製され（詳細として、下記のセクション1.5参照）、抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０の軽鎖（配列番号８５）をさらに含んだ。ニセｍＡｂ２を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において一過性発現により産生させ、ｍＡｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプロテインＡカラムを用いて精製した。
【０１２３】
１．４  ＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
１．４．１  表面プラズモン共鳴法（SPR）により決定される場合のヒトＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（GE Healthcare）を用いて、ヒトＬＡＧ−３に対するニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの親和性を測定した。アミンカップリングキット（GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare、BR1005-30）のフローセル４にヒトＬＡＧ−３−Ｆｃ（R&D Systems、2319-L3-050）を固定化し、フローセル３に参照としてのバッファーを固定化した。ＬＡＧ−３−Ｆｃを、酢酸ナトリウム、ｐＨ５（ForteoBio、18-1069）中５μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分の流速で１２秒間、注入し、続いて、エタノールアミンの注入による表面の非活性化を４２０秒間、行った。固定化レベルは１５８ＲＵであった。ニセｍＡｂ２（又は対照抗ヒトLAG-3 mAb、25F7）を、ＨＢＳ−Ｐバッファー（GE Healthcare、BR-1003-68）中に、４μｇ／ｍｌから２倍希釈系列で希釈した。対照ｍＡｂ／ニセｍＡｂ２を注入し、３０μｌ／分で２４０秒間の会合時間、及び３０μｌ／分で３００秒間の解離時間であった。表面を、２５ｍＭ  ＮａＯＨを１００μｌ／分で３０秒間、用いて、再生した。データは、速度定数を計算するために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて、二重参照を引き算され、分析された。ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂは、０．８から１．１ｎＭの範囲の、ヒトＬＡＧ−３に対する親和性を有し（表１）、その親和性は、ベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７の親和性と類似している。これは、驚くべきことであり、なぜなら、Ｆｃａｂの結合部位は、極めて接近して位置する２つの結合部位を有する相対的にコンパクトな抗体断片を形成するため、Ｆｃａｂは、モノクローナル抗体より小さい結合界面を有するからである。対照的に、典型的なｍＡｂのＦａｂアームは、可動性ヒンジ領域により隔てられている。このより小さい結合界面及びその関連した、Ｆｃ領域における２つの結合部位の可動性の低減に基づけば、抗ＬＡＧ−３  Ｆｃａｂが、ベンチマーク抗体２５Ｆ７と類似した親和性及び作用強度でＬＡＧ−３と結合し、かつそれを阻害することができることは予想外であった。
【０１２４】
【表１】
2019522490.tif 000002
【０１２５】
１．４．２  ＳＰＲにより決定された場合の、マウスＬＡＧ−３に対するマウスＬＡＧ−３に特異的な代替Ｆｃａｂの結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（GE Healthcare）を用いて、マウスＬＡＧ−３に対するマウスＬＡＧ−３に特異的な代替Ｆｃａｂの親和性を測定した。アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０（ForteBio、18-1069）中に希釈されたｍＬＡＧ−３  Ｆｃ（R&D Systems、3328-L3-050）をＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-1000-12）に直接、コーティングした。フローセル１を、９５０ＲＵで、マウスＦｃ（SinoBiological、51094-MNAH）でコーティングし、フローセル２を、ｍＬＡＧ−３  Ｆｃでコーティングした。Ｆｃａｂを、ＨＢＳ−Ｐバッファー（GE Healthcare、BR-1003-68）中に希釈し、様々な濃度（１００ｎＭから４倍希釈）で、２０μｌ／分で３分間、注入し、その後、バッファー中で１２分間、解離させた。チップを、１０ｍＭ  グリシン  ｐＨ２．５の３０μｌ／分、３０秒間の注入により再生した。データは、速度定数を計算するために、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２ソフトウェアを用いて、二重参照を引き算され、分析された。試験された代替Ｆｃａｂは、表２に示されているように、１桁のナノモル濃度親和性でマウスＬＡＧ−３と結合した。
【０１２６】
【表２】
2019522490.tif 000003
【０１２７】
１．４．３  フローサイトメトリにより決定される場合の、細胞上に発現したヒトＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
ＬＡＧ−３を過剰発現する細胞株の作製
レンチウイルス形質導入方法論を用い、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステム（Clontech、カタログ番号631249）を使用して、ヒト、カニクイザル、又はマウスのＬＡＧ−３を過剰発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を作製した。マウスＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号９６）、ヒトＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号９５）、又はカニクイザルＬＡＧ−３  ｃＤＮＡ（配列番号９７）を含有するＬｅｎｔｉ−Ｘ発現ベクター（pLVX）（Clontech、カタログ番号631253）を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングミックスを用いて、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞株（Clontech、カタログ番号632180）へ同時トランスフェクションして、ウイルスを作製した。ＤＯ１１．１０細胞株に、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステムで、作製されたレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。
【０１２８】
ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの、ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞（ヒトLAG-3をトランスフェクションされたDO11.10細胞株）に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて測定した。ｍＡｂ２希釈溶液及び対照ｍＡｂ希釈溶液（２×最終濃度）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）中に３連で調製した。ＤＯ１１．１０：ＬＡＧ−３細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中に調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）中、５０μｌ／ウェル、細胞４×１０−６個／ｍｌで播種した。ｍＡｂ２希釈溶液又は対照ｍＡｂ（抗ヒトLAG-3 mAb、25F7）希釈溶液５０μｌを、細胞を含有するウェルに加え（最終体積１００μｌ）、４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中１：１０００希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトFc-488抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を加え、暗闇中４℃で３０分間、インキュベートした。プレートを洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、４００４３）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中、１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答（log (agonist) vs response）を用いてフィッティングした。全ての試験された、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂ、及びベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ、２５Ｆ７は、表３に示されているように、１．２から２．１ｎＭの範囲の類似した親和性（EC50）でヒトＬＡＧ−３を結合した。
【０１２９】
【表３】
2019522490.tif 000004
【０１３０】
１．４．４  フローサイトメトリにより決定された場合の、細胞上に発現したカニクイザルＬＡＧ−３に対するＦｃａｂの結合親和性
ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの、カニクイザルＬＡＧ−３を発現する細胞（カニクイザルLAG-3をトランスフェクションされたDO11.10細胞株）に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて測定した。ｍＡｂ２希釈溶液及び対照ｍＡｂ希釈溶液（２×最終濃度）を、１×ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）中に３連で調製した。ＤＯ１１．１０：ＬＡＧ−３細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ（Sigma、A7906）中に調製し、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）中、５０μｌ／ウェル、細胞４×１０−６個／ｍｌで播種した。ｍＡｂ２希釈溶液又は対照ｍＡｂ（抗ヒトLAG-3 mAb、25F7）希釈溶液５０μｌを、細胞を含有するウェルに加え（最終体積１００μｌ）、４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、その後、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中１：１０００希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトFc-488抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を加え、暗闇中４℃で３０分間、インキュベートした。プレートを洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中、１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いてフィッティングした。試験された、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂは、０．５から０．６ｎＭ親和性でカニクイザルＬＡＧ−３と結合し、カニクイザルにおける毒性学研究は、ヒトに見られた効果を予測すると予想されることを示している（表４参照）。ベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ、２５Ｆ７は、カニクイザルＬＡＧ−３を１５分の１の親和性（EC50）で結合する（表４）。
【０１３１】
【表４】
2019522490.tif 000005
【０１３２】
１．４．５  フローサイトメトリにより決定された場合の、細胞上に発現したマウスＬＡＧ−３に対する、代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ及び抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの結合親和性
ｍＬＡＧ−３を過剰発現するＨＥＫ細胞の作製
マウスＬＡＧ−３配列（配列番号９６）を、ｐｃＤＮＡ５ＦＲＴベクター（Life Technologies、V6010-20）に、ＫｐｎＩ（NEB、R0142）及びＮｏｔＩ（NEB、R0146）制限消化を用いてサブクローニングした。その後、ベクターを、Ｆｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３  ＨＥＫ細胞株（Life Technologies、R780-07）へ、リポフェクタミン２０００（Life Technologies、11668-019）を用いて形質転換した。形質転換されたＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ２９３細胞を、１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中、３から４週間、安定的に形質転換された細胞のコロニーが明らかになるまで成長させた。これらのコロニーを、１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）の存在下で増幅し、ＰＥコンジュゲート化抗マウスＬＡＧ−３（クローンC9B7W、BD Biosciences、552380）を用いて、マウスＬＡＧ−３発現について試験した。
【０１３３】
代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含有する）の、細胞に発現したマウスＬＡＧ−３に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ｍＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。Ｆｃａｂ（又は対照mAb）の希釈系列を、１００μｌ体積中で細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（Fcabについて、抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098、又はC9B7Wについて、抗ラットIgG（H+L）、Alexa Fluor 488コンジュゲート、ThermoFisher、A-11006）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、１００μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。その後、プレートを洗浄し、細胞を、１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いてフィッティングした。試験されたＦｃａｂは、マウスＬＡＧ−３と類似した親和性で結合した（表５参照）。ベンチマークＬＡＧ−３  ｍＡｂ、Ｃ９Ｂ７Ｗ（2B Scientific、BE0174-50MG）は、マウスＬＡＧ−３を、Ｆｃａｂの１７分の１の親和性（EC50）で結合する（表５）。
【０１３４】
【表５】
2019522490.tif 000006
【０１３５】
ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９の、細胞に発現したマウスＬＡＧ−３に対する親和性を、フローサイトメトリを用いて決定した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-1-6）、１００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンＢ（Melford Laboratories Ltd、Z2475）、１５μｇ／ｍｌ  ブラストサイジン（Melford Laboratories Ltd、B1105）、及び１μｇ／ｍｌ  ドキシサイクリン（Sigma、D9891）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長した、ｍＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ細胞を、組織培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離した。細胞を、１５００ｒｐｍ、４℃、３分間で遠心分離して、細胞をペレット化することにより収集し、その後、１×ＤＰＢＳ中に再懸濁し、その後、Ｖ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に３０μｌにおいて細胞１．２×１０５個／ウェルで播種した。ｍＡｂ２（又は対照mAb）の希釈系列の１：１体積を加え、細胞と４℃で１時間、インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体（抗ヒトFc-488、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）をＰＢＳ中１：１０００希釈し、６０μｌを、４℃で３０分間、細胞に加えた（プレートは暗闇中に保った）。その後、プレートを洗浄し、細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を含有するＰＢＳ  ６０μｌ中に再懸濁した。プレートを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（BD Bioscience）を用いて読み取った。死細胞を除去し、ＦＩＴＣチャネル（488nm/530/30）における蛍光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答を用いてフィッティングした。ニセｍＡｂ２型式における抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９は、代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９−１０８についての２．６ｎＭのＥＣ５０と比較して、１９ｎＭのＥＣ５０でマウスＬＡＧ−３と結合した（表６）。ヒトｍＡｂ、２５Ｆ７は、マウスＬＡＧ−３との少しの検出可能な結合も示さず、ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−９が、２５Ｆ７のエピトープとは異なる、ＬＡＧ−３上の結合エピトープを有することを示している。
【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
１．５  Ｆｃ受容体に対するＦｃａｂの結合親和性
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおけるＬＡＬＡ変異の導入は、Ｆｃγ受容体結合を低下させることが公知である（Bruhns, P.ら（2009）及びXu, D.ら（2000））。ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ＬＡＬＡ変異が、Ｆｃγ受容体に対するＦｃａｂ（ニセmAb2型式における）の結合親和性を低下させていることを確認した。ヒトＦｃγＲ結合アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（GE Healthcare）において、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂを用いて実施した。ヒトＦｃγＲ（R&D Systems、1257-FC、1330-CD、1875-CD、4325-FC）を、アミンカップリング（アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50）を用いて、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップ（GE Healthcare、BR-1005-30）上に、ＦｃγＲＩについて３７０ＲＵ、ＦｃγＲＩＩＩについて２６４ＲＵ（高親和性ヒトＦｃγＲ）、並びにＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂについて５００ＲＵ（低親和性ヒトＦｃγＲ）の表面密度で固定化した。各固定化されたチップについて、１つのフローセルを、バックグラウンドの引き算のためにブランクのままにしておいた。ＦｃγＲを、酢酸ナトリウム  ｐＨ５（ForteBio、18-1069）中５μｇ／ｍｌの濃度を用いて固定化し、１０μｌ／分の流速、１５秒サイクルで、必要とされる固定化レベルに達するまで、注入した。
【０１３８】
高親和性ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩについて、２００μｇ／ｍｌのｍＡｂ又はニセｍＡｂ２を、チップに渡って、３０μｌ／分の流速で３分間、流し、続いて、５分間の解離を行った。ランニングバッファーは、ＨＢＳ−Ｐ（0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、0.005% v/v Surfactant P20、GE Healthcare、BR-1003-68）であった。低親和性ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂについて、ニセｍＡｂ２の濃度を、５００μｇ／ｍｌまで増加した。
【０１３９】
陽性対照は、野生型ＩｇＧ１アイソタイプｍＡｂであり、それを、対照ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１  ｍＡｂ並びに無関係の標的に対するモノクローナルＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプｍＡｂと比較した。フローセルを、１０ｍＭ  水酸化ナトリウム（VWR、28244.262）を１００μｌ／分の流速で３０秒間、注入することにより再生した。データ分析を、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア  バージョン３．２  ＲＣ１を用いて、ブランクフローセル（固定化ＦｃγＲを含まない）に対して二重参照し、試験ｍＡｂ２からバッファーサイクルを引き算することにより実施した。結果は表７に示されている。
【０１４０】
【表７】
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【０１４１】
試験された全てのニセｍＡｂ２（全て、上記に示されているようなLALA変異を含む）は、ＬＡＬＡ変異を含まない対照抗体（ニセmAb IgG1）と比較して、試験されたＦｃγ受容体との結合の有意な低下を示し、ＬＡＬＡ変異が、これらのニセｍＡｂ２によるＦｃγ受容体結合を低下させており、したがって、そのｍＡｂ２のＡＤＣＣ活性を低下させることが予想されることを示している。
【０１４２】
１．６  ＭＨＣクラスＩＩのＬＡＧ−３との結合のブロッキング
Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを有する;配列番号５８）の、組換えヒト又はマウスＬＡＧ−３  ＦｃとヒトＭＨＣクラスＩＩとの間の相互作用をブロックする能力を、ヒトＭＨＣクラスＩＩを発現するメラノーマ細胞株である、Ａ３７５細胞とのＬＡＧ−３  Ｆｃの結合を測定することにより研究した。１０％  ＦＢＳ（Life Technologies、10270-106）を含有するＤＭＥＭ（Life Technologies、61965-026）中で成長したＡ３７５（ATCC、CRL-1619）細胞を、細胞培養フラスコから細胞解離バッファー（Life Technologies、13151-014）を用いて、剥離し、細胞２×１０５個／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Costar、3897）に播種した。プレートを、１５００ｒｐｍ、４℃で３分間、遠心分離して、細胞をペレット化した。関連濃度のＦｃａｂ又は対照ｍＡｂを、１μｇ／ｍｌ  ＬＡＧ−３  Ｆｃ（ヒトLAG-3-Fc  R&D Systems、2319-L3-050、又はマウスLAG-3 Fc  R&D Systems、3328-L3-050）と、１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ  １００μｌ中、４℃で１時間、インキュベートした。ＬＡＧ−３／Ｆｃａｂ混合物をＡ３７５細胞に加え、４℃で１時間、インキュベートした。細胞を洗浄した。二次抗体（Alexa Fluor 488コンジュゲート化ヤギ抗ヒトFc F(ab’)2、Jackson Immunoresearch、109-546-098、又はヤギ抗マウスIgG (H+L) 488コンジュゲート、Life Technologies、A-1101）をＰＢＳ中に１：１０００希釈し、１００μｌを細胞に、４℃で３０分間、加えた（プレートを暗闇中に保った）。細胞をＰＢＳ中で１回、洗浄し、ＰＢＳ  １００μｌ＋１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Biotium、40043）中に再懸濁した。プレートをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（BD Biosciences）で読み取り、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、解析した。
【０１４３】
両方の抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂは、ヒトＭＨＣクラスＩＩのマウスＬＡＧ−３との相互作用を阻害することができたが、対照抗マウスＬＡＧ−３  ｍＡｂ（C9B7W、2B Scientific、BE0174-50MG）は阻害することができなかった（表８参照）。
【０１４４】
【表８】
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【０１４５】
試験された抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂもまた、ヒトＭＨＣクラスＩＩのヒトＬＡＧ−３との相互作用を、対照抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ（25F7）と類似した作用強度で阻害することができた。
【０１４６】
【表９】
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【０１４７】
実施例２
ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるＦｃａｂ分子の活性
２．１  ヒトＬＡＧ−３  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるリードＦｃａｂの活性
ＬＡＬＡ変異を含有するリードＦｃａｂ（短縮型ヒンジを有する;配列番号５８）のパネルを、ＤＯ１１．１０に基づいたＴ細胞活性化アッセイにおいて試験した。
【０１４８】
細胞培養培地及びペプチド：
・ＤＯ１１．１０細胞培養培地：ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Gibco、A11138-03）
・実験培地：ピューロマイシンを含まない完全ＤＯ１１．１０培養培地
・Ａ２０細胞培養培地：ＲＰＭＩ（Gibco、61870-010）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）
・ＯＶＡペプチド（MW=1773.9Ｄａ）：Ｈ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ−ＯＨ（Pepscan）
【０１４９】
細胞
・ＤＯ１１．１０  ｈＬＡＧ−３：（上記のような）ヒトＬＡＧ−３を過剰発現するためにレンチウイルスベクターを形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞
・Ａ２０：ＭＨＣクラスＩＩを発現するＢＡＬＢ／ｃ  Ｂ細胞リンパ腫株（ATCC、TIB-208）
【０１５０】
Ｆｃａｂ又はベンチマークｍＡｂの希釈溶液を、実験培地２００μｌ中に調製した。Ｆｃａｂを、実験培地中において４×１０５個／ｍｌ  ＤＯ１１．１０  ＬＡＧ−３細胞と、１：１（１７０μｌ＋１７０μｌ）で混合し、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間、インキュベートした。Ａ２０細胞２×１０５個／ｍｌの実験培地を、１μＭ  ＯＶＡペプチドと３０分間、インキュベートした。Ａ２０細胞３６０μｌ＋ＯＶＡの混合物を、ＤＯ１１．１０  ＬＡＧ−３細胞／Ｆｃａｂ混合物３６０μｌに加えた。その後、細胞を、深型ウェルプレートにおいて混合し、混合物２００μｌ／ウェルで、９６ウェル丸底プレートにおいて培養した。アッセイを３連で実行した。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。上清を収集し、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88、又はR&D systems、SM2000）を用いて、製造会社の使用説明書に従ってアッセイした。プレートを、Ｇｅｎ５ソフトウェア、ＢｉｏＴｅｋでプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から引き算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータのロジスティク曲線フィットに基づいた（Gen5ソフトウェア、BioTek）。ｍＩＬ−２の濃度を、Ｆｃａｂ又はベンチマークｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、その結果生じた曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答方程式を用いてフィッティングした。結果は表１０に示されている。
【０１５１】
【表１０】
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【０１５２】
ヒトリードＦｃａｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、１から２ｎＭの範囲の作用強度を有する、有意な活性を示す。Ｆｃａｂは、ベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７よりわずかに向上した作用強度を生じる。Ｔ細胞活性化アッセイにおける向上した作用強度は、ＬＡＧ−３の阻害の増強を通してヒト患者において向上した効力を予測すると予想される。
【０１５３】
２．２  マウスＬＡＧ−３  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにける代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂの活性
ＬＡＬＡ変異を含有する代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ（短縮型ヒンジを含む;配列番号５８）を、ＤＯ１１．１０に基づいたＴ細胞活性化アッセイにおいて試験した。
細胞培養培地及びペプチド：
・ＤＯ１１．１０細胞培養培地：ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Gibco、A11138-03）
・実験培地：ピューロマイシンを含まない完全ＤＯ１１．１０培養培地
・Ａ２０細胞培養培地：ＲＰＭＩ（Gibco、61870-010）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）
・ＯＶＡペプチド（MW=１７７３．９Ｄａ）：Ｈ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ−ＯＨ（Pepscan）
【０１５４】
細胞
・ＤＯ１１．１０  ｍＬＡＧ−３：（上記のような）マウスＬＡＧ−３を過剰発現するためにレンチウイルスベクターを形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞
・Ａ２０：ＭＨＣクラスＩＩを発現するＢＡＬＢ／ｃ  Ｂ細胞リンパ腫株（ATCC、TIB-208）
【０１５５】
Ｆｃａｂ又はベンチマークｍＡｂの希釈溶液を、実験培地２００μｌ中に調製した。Ｆｃａｂを、実験培地中において４×１０５個／ｍｌ  ＤＯ１１．１０  ＬＡＧ−３細胞と、１：１（１７０μｌ＋１７０μｌ）で混合し、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間、インキュベートした。Ａ２０細胞２×１０５個／ｍｌの実験培地を、１μＭ  ＯＶＡペプチドと３０分間、インキュベートした。Ａ２０細胞＋ＯＶＡの混合物３６０μｌを、ＤＯ１１．１０  ＬＡＧ−３細胞／Ｆｃａｂ混合物３６０μｌに加えた。その後、細胞を、深型ウェルプレートにおいて混合し、混合物２００μｌ／ウェルで、９６ウェル丸底プレートにおいて培養した。スクリーニングを３連でアッセイした。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。上清を収集し、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88、又はR&D systems、SM2000）を用いて、製造会社の使用説明書に従ってアッセイした。プレートを、Ｇｅｎ５ソフトウェア、ＢｉｏＴｅｋでプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から引き算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータのロジスティク曲線フィットに基づいた（Gen5ソフトウェア、BioTek）。ｍＩＬ−２の濃度を、Ｆｃａｂ又はベンチマークｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、その結果生じた曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答方程式を用いてフィッティングした。結果は表１１及び図２に示されている。
【０１５６】
【表１１】
2019522490.tif 000012
【０１５７】
マウス代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、２ｎＭの範囲の作用強度を有する、有意な活性を示した。代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂは、向上したＥＣ５０及びＩＬ−２放出の４倍の最大活性化から明らかであるように、ベンチマーク抗マウスＬＡＧ−３抗体より高い作用強度を生じた。ベンチマークと比較して、これらＦｃａｂの向上した作用強度及び最大活性化は、ＬＡＧ−３の阻害の向上を通して、ベンチマークと比較して、マウス効力研究において向上した活性を生じると予想される。
【０１５８】
２．３  カニクイザルＬＡＧ−３  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞活性化アッセイにおけるニセｍＡｂ２型式におけるＦＳ１８−７−９の活性
リードＦｃａｂの一つである、ＦＳ１８−７−９を、上記のようなＬＡＬＡ変異を含むニセｍＡｂ２型式において、カニクイザルＬＡＧ−３  ＤＯ１１．１０に基づいたＴ細胞活性化アッセイで試験した。
細胞培養培地及びペプチド：
・ＤＯ１１．１０細胞培養培地：ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Gibco、A11138-03）
・実験培地：ピューロマイシンを含まない完全ＤＯ１１．１０培養培地
・Ａ２０細胞培養培地：ＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）  １０％  ＦＢＳ（Gibco、10270-106）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco、11360-070）、１μｇ／ｍｌ  ピューロマイシン（Gibco、A11138-03）
・ＯＶＡペプチド（MW=1773.9Ｄａ）：Ｈ−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ−ＯＨ（Pepscan）
【０１５９】
細胞：
・ＤＯ１１．１０  ｃｙｎｏＬＡＧ−３：（上記のような）カニクイザルＬＡＧ−３を過剰発現するためにレンチウイルスベクターを形質導入されたＤＯ１１．１０  Ｔ細胞
・ＬＫ  ３５．２  ＰＬＶＸ：空のレンチウイルス（ｐＬＶＸ）ベクターを形質導入されたＢ細胞ハイブリドーマ
【０１６０】
ニセｍＡｂ２型式におけるＦＳ１８−７−９  Ｆｃａｂ（FS18-7-9/4420LALA）又はベンチマークｍＡｂの希釈溶液を、実験培地中に調製した。ＤＯ１１．１０細胞（細胞０．３×１０６個/ｍｌ）を、抗体と１：１比で３×最終濃度で混合した。抗体及び細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間、インキュベートした。ＬＫ  ３５．２細胞を、細胞３×１０５個／ｍｌ実験培地で、１．５μＭのＯＶＡペプチドと３０分間、インキュベートした。ＬＫ  ３５．２細胞＋ＯＶＡの７０μｌを、ＤＯ１１．１０／抗体  １４０μｌに加えた。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間、インキュベートした。上清を収集し、マウスＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience、88-7024-88、又はR&D systems、SM2000）を用いて、製造会社の使用説明書に従ってアッセイした。プレートを、Ｇｅｎ５ソフトウェア、ＢｉｏＴｅｋでプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで読み取った。５７０ｎｍの吸光度値を、４５０ｎｍの吸光度値から引き算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータのロジスティク曲線フィットに基づいた（Gen5ソフトウェア、BioTek）。ｍＩＬ−２の濃度を、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂ又はベンチマークｍＡｂのｌｏｇ濃度に対してプロットし、その結果生じた曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおけるｌｏｇ（アゴニスト）対応答方程式を用いてフィッティングした。結果は表１２及び図３に示されている。
【０１６１】
【表１２】
2019522490.tif 000013
【０１６２】
ニセｍＡｂ２型式におけるＦＳ１８−７−９  Ｆｃａｂは、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、５．６ｎＭの範囲の作用強度を有する、有意な活性を示した。具体的には、ニセｍＡｂ２型式におけるＦＳ１８−７−９  Ｆｃａｂは、向上したＥＣ５０及びＩＬ−２放出のより高い最大活性化から明らかであるように、ベンチマーク抗ヒトＬＡＧ−３抗体よりカニクイザルＬＡＧ−３に対して高い作用強度を生じた。Ｔ細胞活性化アッセイを用いて決定された場合、ベンチマークと比較して、ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂの、ヒトＬＡＧ−３及びｃｙｎｏ−ＬＡＧ−３へのＥＣ５０及び最大活性化は、より類似している（Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ベンチマークは、Ｆｃａｂより、ｃｙｎｏ−ＬＡＧ−３へのより低いＥＣ５０を有するが、ヒトＬＡＧ−３への類似したＥＣ５０を有する）。したがって、例えばニセｍＡｂ２型式における、Ｆｃａｂを用いるカニクイザルにおける研究の結果は、ヒト患者における応答の予測性がより高いと予想される。例えば、より高い作用強度がより高い毒性を生じるとすれば、カニクイザルモデルにおいて試験を行う場合にこのことが見られるだろうが、ヒトよりカニクイザルにおいて、より低い作用強度を有する分子は、ヒト患者において治験を開始するのに先立って、このことを見ることはないだろうことが予想される。
【０１６３】
実施例３
ニセｍＡｂ２型式におけるＦｃａｂのインビボの抗腫瘍効力
３．１  マウスにおけるインビボ試験のためのｍＡｂ２の調製
代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ、ＦＳ１８−７−１０８−２９を含むｍＡｂ２分子を調製した。ｍＡｂ２分子は、マウスＣＤ７３（TY11.8）、マウスＴＩＭ−３（RMT3-23）、マウスＣＳＦ−１Ｒ（AFS98）、又はマウスＣＬＴＡ−４（9D9）に特異的なＦａｂ領域を含み、ＭＣ３８同系マウス腫瘍成長モデルを用いてインビボ抗腫瘍活性について試験した。Ｆａｂ配列は以下のように供給された。
ラット抗マウスＴＩＭ−３抗体
クローン名  −  ＲＭＴ３−２３
参考文献  −  Ｎａｋａｙａｍａ，Ｍら、２００９。
マウス抗マウスＣＴＬＡ−４抗体
クローン名  −  ９Ｄ９
参考文献  −  米国特許出願第２０１１／００４４９５３号Ａ１。
ラット抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体
クローン名  −  ＡＦＳ９８
参考文献  −  Ｓｕｄｏ  Ｔら、１９９５。
ラット抗マウスＣＤ７３抗体
クローン名  −  ＴＹ１１．８
参考文献  −  Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｙ．ら、１９９８。
【０１６４】
インビボ実験のための対照抗体を作製するために、上記供給源のそれぞれからの重鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ１（G1m17）定常領域と連結し、上記供給源のそれぞれからの軽鎖可変領域を、ヒト定常領域（Km1）と、ヒトκＪ領域１（マウスκJ領域１が用いられる場合の9D9を除く）を介して連結した。インビボ研究のためのｍＡｂ２を、上記の再編成された構築物のＣＨ３ドメインの代わりにＦＳ１８−７−１０８−２９を用いることにより作製した。
【０１６５】
３．２  ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおけるｍＡｂ２の活性
この実験においてＭＣ３８腫瘍として用いられたＭＣ３８同系腫瘍モデルは、腫瘍環境及び腫瘍周辺における免疫細胞上のＬＡＧ−３発現の増加を生じる、高度に免疫原性であることが公知である。
【０１６６】
それぞれ、週齢８から１０週間かつ体重２０から２５ｇのＣ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River）を、研究開始の前の１週間、休養させた。全ての動物に、マイクロチップを埋め、固有の識別名を与えた。各コホートは１０匹のマウスを有した。ＭＣ３８結腸癌細胞株（S. Rosenberg、NIH）は、初めに、増殖され、保存され、その後、ＩＭＰＡＣＴ  Ｉプロトコールを用いる病原体についてのＩＤＥＸＸ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈによりプレスクリーニングされ、病原体が含まれないことが示された。ＭＣ３８細胞を、−１５０℃保存から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコにおける１０％  ＦＣＳ（Gibco、10270-106）を含むＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）２０ｍｌに加えた。各動物は、左脇腹に細胞２×１０６個の皮下注射を受けた。腫瘍細胞接種から７から８日後、この時点で腫瘍を生じなかったマウスを研究から除いた。ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全部を、注射前２４時間以内にＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより分析し、不純物についてチェックした。
【０１６７】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｋｇの最終濃度でマウスへ注射した。各マウスは、腹腔内（IP）注射によりｍＡｂ２分子又は対照抗体混合物を、腫瘍接種後８日目、１１日目、及び１４日目に受けた。腫瘍の正確な測定値をとり、問題になっている日における任意の薬物投与を実施し、マウスは、治験のリマインダーとして緻密な観察を受けた。腫瘍容積測定値を、ノギスで計って、腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を用いて、腫瘍容積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
式中、Ｌ＝最長軸；Ｓ＝最短軸。
試験は、腫瘍量が制限に近いと見なされる時点の２５日目に停止された。
【０１６８】
図４に示されているように、試験されたｍＡｂ２分子の全部が、ＩｇＧ対照で処置されたマウスと比較して有意な腫瘍成長阻害を示した。研究は、完全に機能する免疫系を有するマウスにおいて、ＴＩＭ−３、ＣＳＦ−１Ｒ、ＣＴＬＡ−４、又はＣＤ７３に関する阻害と組み合わせたＬＡＧ−３の阻害は、おそらく免疫系の活性の増加を通して、腫瘍成長の低下をもたらすことを示している。同系マウスモデルは、治療的標的を阻害する抗腫瘍効果を試験するための適切なマウス系として受け入れられ、ヒト治療用物質の開発を検証するために広く用いられている。ＣＴＬＡ−４阻害は、リンパ節においてＴ細胞プライミングの増加を生じることが示されている。いったんプライミングされたならば、Ｔ細胞は、腫瘍微小環境へ遊走し、そこで、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の遮断が、プライミングされたＴ細胞の活性化を増強し、その結果として、抗ＣＴＬＡ−４及び抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１組合せの相乗的抗腫瘍効果を生じる。これは、診療所におけるＰＤ−１とＣＴＬＡ−４組合せの効力の増加に反映される。同系ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＬＡＧ−３／ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ２により引き起こされる著明な腫瘍阻害が、同様の相乗作用：ＣＴＬＡ−４の阻害がＴ細胞プライミングを増加させること、及びＬＡＧ−３の阻害が腫瘍部位におけるＴ細胞活性化を増加させることを通してであることが仮定される。ＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３の二重阻害のより控えめな効果は、類似した作用様式で、疲弊したＴ細胞を抑制するＬＡＧ−３及びＴＩＭ−３に帰され得る。これらは、ＰＤ−１がＴ細胞上に存在した後に発現する二次シグナルである。ＰＤ−１阻害がまだ保持されたままで、ＴＩＭ−３及びＬＡＧ−３を阻害することは、穏やかな結果を達成し得るのみである。
【０１６９】
マクロファージは、免疫抑制性腫瘍環境を維持することにおいて重大な意味をもつ。ＣＳＦ−１Ｒのターゲティングは、マクロファージ分化の阻害及び生存シグナルの消失により、腫瘍関連マクロファージの減少を生じる。同系ＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＬＡＧ−３／ＣＳＦ−１Ｒ  ｍＡｂ２により引き起こされる著明な腫瘍阻害は、ＬＡＧ−３抗体が腫瘍部位においてＴ細胞活性化を増加させる、腫瘍環境におけるマクロファージ誘導性免疫抑制の放出に起因する相乗作用を通してであると仮定される。ＣＳＦ−１Ｒ及びチェックポイント阻害剤の組合せは、すでに診療所において評価されつつあり、ＣＳＦ−１ＲをＬＡＧ−３阻害と組み合わせることの生存率の情報を提供するのに役立つであろう。ＣＤ７３の遮断もまた、マクロファージの阻害を生じるが、ＣＤ７３／ＬＡＧ−３  ｍＡｂ２の中間の腫瘍抑制効果は、抗ＣＤ７３が、効力がより低いマクロファージ阻害剤であり得ることを示唆する。代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂは、配列において抗ヒトＦｃａｂと密接に関係している（及び、同じ親の抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂに由来している）ため、それらはどちらも、ヒトＬＡＧ−３とマウスＬＡＧ−３との間の相同性の違いに関わらず、ＬＡＧ−３（マウス及びヒト、それぞれ）の非常に類似したエピトープと結合する。結論として、代替抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２での処置後マウスに観察される結果が、抗ヒトＬＡＧ−３  Ｆｃａｂを含むｍＡｂ２でのヒト患者の処置を予測すると予想される。
【０１７０】
実施例５
Ｔ細胞ＬＡＧ−３発現へのＦｃａｂ処理の効果
ＦＳ１８−２９／４４２０と呼ばれる、ＬＡＬＡ変異を含有するＬＡＧ−３／ニセｍＡｂ２、ＦＳ１８−７−１０８−２９／４４２０（配列番号１３２及び８５）、ＬＡＬＡ変異を含有するベンチマークＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１（配列番号１２２及び１１９）、及びＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せのＴＩＬ  ＬＡＧ−３発現への効果を試験した。
【０１７１】
移植の当日、培養されたＭＣ３８．ＯＶＡ細胞を、対数期成長（培養密度約７５％）中に採取し、ＰＢＳ中、細胞１×１０７個／ｍＬの濃度で再懸濁した。まず各動物をイソフルランで麻酔し、その後、続いて、１×１０６  ＭＣ３８．ＯＶＡ細胞（懸濁液０．１ｍＬ）を各試験動物の左脇腹へ皮下移植することにより腫瘍を惹起した。腫瘍細胞移植から１１日後、動物を、決定論的ランダム化方法を用いて、３２から６２．５ｍｍ３の個々の腫瘍容積を有する５つの群へランダム化した。動物に、腫瘍接種後１２日目、１４日目、及び１６日目に１０ｍｇ／ｋｇ  抗体又はｍＡｂ２で投与し、腫瘍接種後１９日目及び２３日目に３匹の動物／群から腫瘍を収集した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）分散装置（Dissociator）を用いて、腫瘍を分散させ、その後、細胞を、７０μｍ細胞ストレーナーを通して篩にかけて、単一細胞懸濁液を得た。９６ウェルプレート上の細胞１×１０６個／ウェルを、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、１：３０００生存率染色及びＦｃブロック（抗CD16/32抗体）を行った。ＦＡＣＳ分析のために細胞を、ＣＤ４３、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、及びＬＡＧ−３に対する標識抗体を含むマスターミックスを用いて染色した。ＦｏｘＰ３細胞内染色について、細胞を固定し、ＦｏｘＰ３抗体での染色の前に透過処理した。試料を、コンペンセーションマトリックスを有し、かつ最低限５００，０００個の事象がカウントされるＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターに流した。
【０１７２】
この実験において、ＴＩＬは、抗体／ニセｍＡｂ２の３回目の用量が投与された後のＬＡＧ−３発現について調べられ、その時、対照処置と非対照処置の間で腫瘍の成長の分離が見られるが、その前に腫瘍サイズ間に大きな差があり、それは結果を歪め得る。この時点において、ＴＩＬにおけるＬＡＧ−３発現は、ＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せで処置された動物において顕著に減少したことが見出された。具体的には、図５に示されているように、ＣＤ８、ＣＤ４、及びＦｏｘＰ３腫瘍浸潤リンパ球（TIL）におけるＬＡＧ−３発現は、ＦＳ１８−２９／４４２０とＳ１の組合せでの処置後、２３日目までに減少したが、個々に投与されたＦＳ１８−２９／４４２０又はＳ１での処置は、ＴＩＬ上のＬＡＧ−３発現に、皆無かそれに近い効果を生じた。
【０１７３】
これらの結果は、ＬＡＧ−３及びＰＤ−Ｌ１の二重阻害が、ＴＩＬによるＬＡＧ−３発現の減少に必要とされることを示しているが、この現象は、ＬＡＧ−３又はＰＤ−Ｌ１に対する単一作用物質で処置された動物において見られなかったためである。理論に縛られるつもりはないが、二重の抗ＬＡＧ−３と抗ＰＤ−Ｌ１の処置が、ＴＩＬ上のＬＡＧ−３発現の減少をもたらし、それにより、ＬＡＧ−３の阻害効果を低下させ、ＴＩＬが疲弊を克服することを可能にすると考えられる。いったんＴＩＬが活性化したならば、それらは、腫瘍により発現したネオ抗原を認識し、それに対する応答を開始し、それにより、腫瘍量を低減し得ることが予想される。
【０１７４】
（配列表）
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−９  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−９  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号２）
ＦＳ１８−７−９  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのＣＨＯコドン最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３６）
GGCCAGCCCCGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCTGGGATGAGCCCTGGGGCGAGGATGTGTCTCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGCCCTACGACAGATGGGTGTGGCCCGACGAGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−３２  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−３２  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号８）
ＦＳ１８−７−３２  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAAATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−３３  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−３３  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＤＮＹ（配列番号１３）
ＦＳ１８−７−３３  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号１４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGGACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３３  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−３６  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−３６  ＣＤループ  −  ＳＮＧＱＰＥＮＮＹ（配列番号１８）
ＦＳ１８−７−３６  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号１９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＣＨ２＋ＣＨ３のアミノ酸配列（配列番号２１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−３６  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−５８  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−５８  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＰＥＩＥＦ（配列番号２３）
ＦＳ１８−７−５８  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号２４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATCCAGAAATCGAATTCAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCTTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYPEIEFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYPEIEFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−５８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYPEIEFKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−６２  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−６２  ＣＤループ  −  ＳＮＧＩＰＥＷＮＹ（配列番号２８）
ＦＳ１８−７−６２  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号２９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGATCCCAGAATGGAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６２  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGIPEWNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−６５  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−６５  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＡＥＹＮＹ（配列番号３３）
ＦＳ１８−７−６５  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号３４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATGCAGAATATAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−６５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYAEYNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−７８  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−７８  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＫＥＥＮＹ（配列番号３８）
ＦＳ１８−７−７８  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号３９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATAAAGAAGAAAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−７８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYKEENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−８８  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−８８  ＣＤループ  −  ＳＮＧＶＰＥＬＮＶ（配列番号４３）
ＦＳ１８−７−８８  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４４）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGGTTCCAGAACTGAACGTTAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４５）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−８８  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号４７）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGVPELNVKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５ループ領域のアミノ酸配列
ＦＳ１８−７−９５  ＡＢループ  −  ＷＤＥＰＷＧＥＤ（配列番号１）
ＦＳ１８−７−９５  ＣＤループ  −  ＳＮＧＹＱＥＤＮＹ（配列番号４８）
ＦＳ１８−７−９５  ＥＦループ  −  ＰＹＤＲＷＶＷＰＤＥ（配列番号３）。
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ３ドメインのヌクレオチド配列（配列番号４９）
GGCCAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCTGGGATGAGCCGTGGGGTGAAGACGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGTATCAGGAAGATAACTATAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGCCGTATGATAGGTGGGTTTGGCCGGATGAGTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT
Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５０）
GQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含むＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５１）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異を含まないＦｃａｂ  ＦＳ１８−７−９５  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５２）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSWDEPWGEDVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGYQEDNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVPYDRWVWPDEFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
「ＬＡＬＡ変異」（下線）を含むヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号５４）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
ＬＡＬＡ変異を含まない「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ＬＡＬＡ変異（下線）を含む「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号５６）
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号５７）
EPKSCDKTHTCPPCP
ヒトＩｇＧ１短縮型ヒンジ領域のアミノ酸配列（配列番号５８）
TCPPCP
ＬＡＬＡ変異（下線）を含む抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−２９のアミノ酸配列（配列番号５９）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、太字と下線で示される。
【表１３】
2019522490.tif 000014
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−２９のアミノ酸配列（配列番号６０）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＣＨ３ドメインのＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループは、太字と下線で示される。
【表１４】
2019522490.tif 000015
ＬＡＬＡ変異（下線）を含む抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−３５のアミノ酸配列（配列番号６１）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ領域は、太字と下線で示される。
【表１５】
2019522490.tif 000016
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＬＡＧ−３  Ｆｃａｂ  ＦＳ１８−７−１０８−３５のアミノ酸配列（配列番号６２）
ＣＨ３ドメインはイタリック体で示される。ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ領域は、太字と下線で示される。
【表１６】
2019522490.tif 000017
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表１７】
2019522490.tif 000018
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表１８】
2019522490.tif 000019
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３２／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表１９】
2019522490.tif 000020
抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３２／ＬＡＬＡ変異なしの重鎖のアミノ酸配列（配列番号６６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２０】
2019522490.tif 000021
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３３／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２１】
2019522490.tif 000022
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３３／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２２】
2019522490.tif 000023
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３６／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号６９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２３】
2019522490.tif 000024
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−３６／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２４】
2019522490.tif 000025
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−５８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２５】
2019522490.tif 000026
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−５８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２６】
2019522490.tif 000027
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６２／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２７】
2019522490.tif 000028
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６２／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表２８】
2019522490.tif 000029
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表２９】
2019522490.tif 000030
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−６５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３０】
2019522490.tif 000031
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−７８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３１】
2019522490.tif 000032
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−７８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３２】
2019522490.tif 000033
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−８８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号７９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３３】
2019522490.tif 000034
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−８８／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３４】
2019522490.tif 000035
ＬＡＬＡ変異を含む抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３５】
2019522490.tif 000036
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ヒトＬＡＧ−３／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−９５／４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３６】
2019522490.tif 000037
ＬＡＬＡ変異を含む抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３７】
2019522490.tif 000038
ＬＡＬＡ変異を含まない抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ  ４４２０軽鎖のアミノ酸配列（配列番号８５）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ＬＡＬＡ変異を含む抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８６）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表３８】
2019522490.tif 000039
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−２９／Ｓ１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８７）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表３９】
2019522490.tif 000040
ＬＡＬＡ変異を含む抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−３５／Ｓ１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８８）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４０】
2019522490.tif 000041
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＬＡＧ−３／ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ２  ＦＳ１８−７−１０８−３５／Ｓ１の重鎖のアミノ酸配列（配列番号８９）
ＣＤＲの位置は下線が引かれ、ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦループ配列は、太字と下線で示される。
【表４１】
2019522490.tif 000042
ＬＡＬＡ変異を含む抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号９０）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。ＬＡＬＡ変異の位置は太字で示される。
【表４２】
2019522490.tif 000043
ＬＡＬＡ変異を含まない抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１重鎖のアミノ酸配列（配列番号９１）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
抗マウスＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  Ｓ１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９２）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７重鎖のアミノ酸配列（配列番号９３）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
抗ヒトＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ２５Ｆ７軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９４）
ＣＤＲの位置は下線が引かれている。
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ヒトＬＡＧ−３のアミノ酸配列（配列番号９５）
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL
マウスＬＡＧ−３のアミノ酸配列（配列番号９６）
MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPELPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGKLLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYAAESSSGAHSARRISGDLKGGHLVLVLILGALSLFLLVAGAFGFHWWRKQLLLRRFSALEHGIQPFPAQRKIEELERELETEMGQEPEPEPEPQLEPEPRQL
カニクイザルＬＡＧ−３のアミノ酸配列（配列番号９７）
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPPQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPPVPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALRAGHLPLFLILGVLFLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPELEPEPELERELGPEPEPGPEPEPEQL
【０１７５】
参考文献
本明細書で言及された全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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