(57)【要約】  プルシアンブルーナノ粒子と少なくとも１つの免疫療法処置の併用療法。アルカリ性条件下で増強された安定性を有するナノ粒子を含む安定で官能化されたプルシアンブルーナノ粒子、ならびに光熱処置および併用免疫療法処置を含む、プルシアンブルーナノ粒子を使用するがん、新生物、および腫瘍処置の方法。
2019512486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象を処置するための組合せ方法であって、
プルシアンブルーナノ粒子、前記ナノ粒子を含有する組成物、または前記ナノ粒子を含む細胞をそれを必要とする対象に投与すること、
前記対象を少なくとも１つの他の免疫療法で処置すること、および
前記対象を光熱的に処置すること
を含み、
任意で、前記免疫療法は、前記プルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしているまたは他の方法で会合しているＴ細胞を投与することを含み、
任意で前記対象はがんを有する、組合せ方法。
【請求項２】
前記プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３】
前記プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーから本質的になる、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４】
前記プルシアンブルーナノ粒子が、プルシアンブルーを前記光熱処置に関与させるのに十分な量でプルシアンブルーを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項５】
前記プルシアンブルーが、化学式：
ＡｘＢｙＭｚ［Ｍ’（ＣＮ６］ａ・ｎ（Ｈ２Ｏ）
（式中、
Ａは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
Ｂは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
Ｍは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
Ｍ’は、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
ｘは、０．１〜約１であり；
ｙは、０〜約１であり；
ｚは、０．１〜約４であり；
ａは、０．１〜約４であり；
ｎは、０．１〜約２４である）
を有する化合物または組成物を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項６】
前記プルシアンブルー成分が、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２７１４８７号により開示されるプルシアンブルー化合物のうちのいずれか１つ以上を含む、から本質的になる、またはからなる、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、約１ナノメートル〜約１０ミクロンの範囲の平均直径を有する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長でピーク光子吸収を示す、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子が、光熱変換過程または他の機構により、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量が０．１〜１００℃の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が、約０．１％〜約９０％の範囲の光熱変換効率で、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中での前記プルシアンブルー成分の分解（たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解）を低減するまたは妨げる少なくとも１つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、血液、血漿、ＣＳＦ、組織液、リンパ液または他の体液中にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０分間または前記ナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意で前記ナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意で前記ナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、前記プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つ、２つまたは３つの保護層を含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、コーティングを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、ＡＤＯＧＥＮ（登録商標）４６４、ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）６１１２、ＢＲＩＪ（登録商標）５２、ＢＲＩＪ（登録商標）９３、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ４、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｏ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２０、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−８９０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９７０、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＤＡ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＨＣＳ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＯＪ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＥ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＨ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）Ａ、ポリ（エチレングリコール）ソルビタンテトラオレエート、ポリ（エチレングリコール）ソルビトールヘキサオレエート、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、ソルビタンモノパルミテート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールエトキシレート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳ−３００、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＡ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＮ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＯフッ素系界面活性剤、アクリル酸（ＡＡ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＰＡ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム（ＡＯＴ）、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（ＡＭＡ−８０）、Ａｍｐｈｉ−Ｄｅｘ、アクリロニトリル（ＡＮ）、ビス（２−ピリジルメチル）−オクタデシルアミン（ＢＰＭＯＤＡ）、ＢＲＩＪ（登録商標）３０（ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（［Ｃ４ｍｉｍ］ＰＦ６）、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（ＣＡ８９７）、ＣＭＣ−Ａ９、カルボキシメチル化ポリ（エチレングリコール）（ＣＭＰＥＧ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＭＡ−Ｃｌ）、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、ドデカン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（ＤＤＡ−ＨＥＥＥ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（ＤｅＴＡＢ）、ドデシルメルカプタン（ＤＤＭ）、デキストランエステル（ＤｅｘＥｓｔ）、ＳＧ１ベース二機能性アルコキシアミン（ＤＩＡＭＡ−Ｎａ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタクリル酸ドデシル（ＤＭＡ）、メタクリル酸（ジメチルアミノ）エチル（��ＭＡＥＭＡ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）（ＤＭＭＡ−ＰＳ）、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、メタクリル酸コポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ブチレン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＫＬＥ３７２９）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ｍＰＥＯ−ＰＬＡ）、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ポリアニリン−ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＡＮＩ−ＰＳＳ）、ポリ（γ−ベンジル−１−グルタメート）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＢＧ−ＰＥＯ）、ポリ（ε−カプロラクタム）（ＰＣＬ）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー（ＰＥ／Ｆ６８）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシルブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（ヘプタデカフルオロデシルアクリレート）（ＰＨＤＦＤＡ）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ラクチド−フマレート）（ＰＬＡＦ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリドフマレート）（ＰＬＧＦ）、ポリ（ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、プルロニックＦ−１０８、ポリ（α，β−ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＭＡＡ））、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）エチレンジアミンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８）、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、４−（ｖ−アクリロイルオキシアルキル）オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＯＢＳ）、メタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）、５−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル（ＳＭＴＡＰＥ）、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、ソルビタントリオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）、および過硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が、好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、前記ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも１つの緩衝剤を含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つの保護層を含み、任意で、前記保護層がｐＨ７．０〜８．０で安定であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．５で安定である、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が、血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間前記プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも１つの天然または合成ポリマーコーティングをさらに含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子を細胞に（たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に）ターゲティングする少なくとも１つの薬剤、たとえば、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、またはたとえば、ビオチン、（ストレプト）アビジン、もしくは標的細胞上に天然に存在するもしくは位置する相補的部分に結合する他の成分をさらに含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２２】
前記ナノ粒子が二機能性または多機能性であり、前記ナノ粒子が、
光熱療法に適した波長で、たとえば、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長でピーク光子吸収を示し、および／または
腫瘍、がん、悪性、もしくは新生物細胞もしくは他の標的細胞に特異的に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれる、および／または
免疫系の細胞成分に、たとえば、Ｔ細胞もしくはマクロファージに特異的に結合する、および／または
前記ナノ粒子が投与される対象の免疫系の少なくとも１つの成分と、たとえば、Ｔ細胞もしくはマクロファージと相互作用する少なくとも１つの受容体、リガンドもしくは他の部分を含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２３】
前記ナノ粒子が二または多機能性であり、前記ナノ粒子が、がん、新生物もしくは腫瘍細胞に、または他の標的細胞に、または標的細胞の成分、もしくはこれから放出される物質に結合する少なくとも１つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、（ストレプト）アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２４】
前記ナノ粒子が二または多機能性であり、前記ナノ粒子が、非悪性細胞または血小板、たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞に結合する少なくとも１つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよく、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、（ストレプト）アビジン、または非悪性細胞もしくは血小板上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよい、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２５】
前記プルシアンブルーナノ粒子が、ケモカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ、もしくは他のサイトカイン、抗体もしくは抗体断片、アプタマー、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、宿主免疫系と相互作用する１つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤、たとえば、前記標的細胞に影響を及ぼす免疫応答を誘導または促進する、たとえば、がん、悪性、新生物、もしくは腫瘍細胞の成長、転移を阻害する、もしくは破壊する免疫療法応答を誘導する免疫調節剤をさらに含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２６】
前記プルシアンブルーナノ粒子が、標的細胞中への前記ナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する、１つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、抗体（たとえば、抗腫瘍抗原抗体）、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する少なくとも１つの免疫調節剤、薬物、または物質で前記対象を処置することを含み、任意で、前記少なくとも１つの他の免疫療法が、前記ナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合している、免疫調節剤、薬物または物質により媒介されてもよい、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのケモカインまたは他のサイトカインで前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのコロニー刺激因子で前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのインターフェロンで前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのインターロイキンで前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのＴＮＦまたは他のアポトーシス誘導サイトカインで前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つの抗体または抗体断片、たとえば、腫瘍もしくはがん関連抗原に結合する抗体、またはたとえば、がん、新生物もしくは腫瘍に対する免疫応答を調節する抗体で前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのアプタマー、センスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドで前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、細胞、たとえば、自家性または組織適合免疫細胞で前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞で前記対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体（たとえば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＤ２、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２）、チェックポイント阻害剤、または生物学的製剤（たとえば、必ずしもプルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしていない抗原特異的Ｔ細胞または抗原提示細胞）からなる群から選択される少なくとも１つ以上の薬剤で前記対象を処置することを含み、前記薬剤は、任意で前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合によって結合しているまたは会合しており、前記ケモカインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるケモカインから選択してもよく、前記サイトカインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるサイトカインから選択してもよい、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの他の免疫療法が、その全体が参照により組み込まれる、Ｇａｌｕｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５（２４）：１２４７２−１２５０８（２０１４）により記載される免疫療法の群から選択される免疫療法で対象を処置することを含む、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項３９】
ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００％もしくはそれよりも多く、または前記ナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減する、あるいは、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象（複数可）の生存率と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、４８、もしくは６０ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、平均生存期間を増やす、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４０】
ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００％もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４１】
前記対象が、がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍、または過形成、疣贅、もしくは異常な細胞増殖に関連している他の状態を有する、あるいはウイルス、細菌、真菌、酵母、または寄生虫に感染している、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４２】
前記対象が、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を有する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４３】
前記対象が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がんを有する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４４】
前記対象が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がんを有する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４５】
前記対象が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成を有する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４６】
前記対象が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、または寄生虫感染を有する、請求項１に記載の組合せ方法。
【請求項４７】
プルシアンブルーナノ粒子および請求項１に記載の免疫療法を実施するのに適した少なくとも１つの免疫療法剤を含む組成物であって、前記免疫療法剤が、抗体（たとえば、抗腫瘍抗原抗体）、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、前記免疫系を調節する免疫調節剤、薬物、または物質であり、前記免疫療法剤が前記プルシアンブルーナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合していてもよい、組成物。
【請求項４８】
プルシアンブルーナノ粒子と組み合わせて細胞または血小板を含む、請求項１に記載の方法を実施するのに適した組成物であって、前記細胞が、任意で、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、および樹状細胞からなる群から選択され、標的細胞、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞と選択的に相互作用する、認識する、または結合する、組成物。
【請求項４９】
プルシアンブルーナノ粒子および請求項１に記載の免疫療法を実施するための少なくとも１つの免疫療法剤を含むキットであって、任意で、前記ナノ粒子および免疫療法成分を投与するための、印刷された、コンピュータ可読のまたはリンクアドレスされた説明書、たとえば、投与量、投与経路、レジメン、および投与部位を含んでもよく、前記ナノ粒子および免疫療法成分を組み合わせた形態で、または異なる容器中の別々の成分として含有していてもよく、そのような成分は乾燥したまたは濃縮された形態で存在し、適切な復元用媒体、緩衝剤または生理的希釈剤を伴っていてもよい、キット。
【請求項５０】
標的細胞に対して、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞に対して少なくとも１つの免疫療法作用を示す、または示すように操作もしくは処理されているプルシアンブルーナノ粒子を含み、それと共有結合または非共有結合によって会合している細胞。
【請求項５１】
生細胞、不活化非増殖性細胞（たとえば、放射線または化学剤により処理されている細胞）または死んだもしくは断片化した細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
悪性細胞または他の標的細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５３】
非悪性細胞、たとえば、免疫細胞または少なくとも１つのがん、新生物または腫瘍エピトープを特異的に認識する細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５４】
幹細胞、臍帯血細胞、または他の免疫的無感作細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５５】
少なくとも１種のヒト単核末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５６】
ペプチド抗原（複数可）をパルスされているまたはペプチド抗原（複数可）に曝露されている、自家性、同種、異種または合成抗原提示細胞に、たとえば、がん、新生物または腫瘍の１つ以上の抗原または病原体の１つ以上の抗原または１つ以上の自己抗原を表すオーバーラップペプチドライブラリーに曝露することにより刺激されている少なくとも１つのヒト単核末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５７】
Ｔ細胞（細胞傷害性、ヘルパー、デルタ−ガンマ、およびＮＫ細胞型を含む）、プレＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５８】
マクロファージまたは単球である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５９】
Ｂ細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６０】
好中球、好酸球、好塩基球または他の白血球である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６１】
がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞由来の少なくとも１つの抗原もしくはエピトープ、あるいは過形成、疣贅、異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも１つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６２】
副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態由来の少なくとも１つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６３】
白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを特異的に認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６４】
神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６５】
良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６６】
前記ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６７】
前記ナノ粒子を細胞に結合させる部分をさらに含み、前記部分がビオチンまたは（ストレプト）アビジンであり、前記ナノ粒子がそれぞれ（ストレプト）アビジンまたはビオチンを含む、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６８】
前記細胞に結合する部分および標的細胞に結合する部分を含む少なくとも１つの二機能性または多機能性ナノ粒子を含む、請求項５０に記載の細胞。
【請求項６９】
少なくとも１つの検出可能マーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、請求項５０に記載の細胞。
【請求項７０】
少なくとも１つ以上の非細胞性薬剤に共有結合または非共有結合によって会合しているプルシアンブルーナノ粒子を含むコンジュゲートであって、
前記非細胞性薬剤が、任意で、分子、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、酵素、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ポリエチレングリコール、一本鎖ポリマー、フラーレン；高次分子構造体、たとえば、四次タンパク質構造体、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様粒子、またはカプシド；架橋ポリマー、凝集体、ナノ粒子（金、銀、ニッケル、鉄、銅、亜鉛、またはその酸化物およびセラミックを含むナノ粒子；シリカナノ粒子；磁性ナノ粒子；放射性ナノ粒子；細胞傷害性ナノ粒子；重合体ミセルナノ粒子；ポリマー被覆鉄酸化物ナノ粒子；タンパク質充填ナノ粒子、セリウム酸化物ナノ粒子；ならびに任意でタンパク質分子または化学療法剤に結合しているナノダイアモンドを含む）、マイクロ粒子、リポソーム、ミセル、または他の非細胞性構造物を含んでいてもよく；
前記コンジュゲートが標的細胞上で少なくとも１つの免疫療法作用を示す、たとえば、がん、悪性、新生物、または腫瘍細胞の成長、転移、代謝、アポトーシス、または増殖を阻害する、コンジュゲート。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの非細胞性薬剤が、標的細胞上の少なくとも１つ以上の決定基に結合する、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７２】
前記少なくとも１つの非細胞性薬剤が、標的細胞上または前記標的細胞周辺の免疫細胞上の少なくとも１つ以上の受容体と相互作用する、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７３】
前記少なくとも１つの非細胞性薬剤が、二機能性または多機能性であり、前記プルシアンブルーナノ粒子と前記標的細胞の両方に結合することができ、または標的細胞上と前記標的細胞に隣接する免疫細胞上の両方の決定基に結合することができる、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７４】
前記非細胞性薬剤が、ケモカイン、たとえば、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるケモカインのうちのいずれかを含む、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７５】
前記非細胞性薬剤が、サイトカイン、たとえば、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるサイトカインのうちのいずれかを含む、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７６】
前記非細胞性薬剤が、オリゴデオキシヌクレオチド、たとえば、標的細胞にまたはその成分に結合するアプタマー、核酸ベクターまたは構築物、センスまたはアンチセンスＤＮＡまたはｓｉ−ＲＮＡを含むＲＮＡを含む、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７７】
前記非細胞性薬剤が、抗体（たとえば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＤ２、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、および抗ＣＤ５２）、二特異性抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合部分、または抗体のＣＤＲ；特に標的細胞または標的細胞特異的抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体または抗体成分あるいは前記標的細胞上または前記標的細胞近傍の細胞上の受容体と特異的に相互作用する抗体または抗体成分を含む、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７８】
前記非細胞性薬剤がチェックポイント阻害剤である、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項７９】
前記非細胞性薬剤が、少なくとも１つのがん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞、抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８０】
前記非細胞性薬剤が、過形成、疣贅、または異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしく寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも１つの抗原もしくはエピトープに由来する少なくとも１つの抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８１】
前記非細胞性薬剤が、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍または関連する状態由来の少なくとも１つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８２】
前記非細胞性薬剤が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８３】
前記非細胞性薬剤が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８４】
前記非細胞性薬剤が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８５】
前記ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８６】
前記プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が共有結合している、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８７】
前記プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が、たとえば、前記ナノ粒子上のビオチンまたは（ストレプト）アビジンの前記非細胞性薬剤上の（ストレプト）アビジンまたはビオチンへのそれぞれの結合を介して、非共有結合している、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８８】
前記非細胞性薬剤が、二機能性であり、前記非細胞性薬剤に結合する部分および標的細胞に結合するまたは相互作用する部分を含む少なくとも１つの二機能性または多機能性プルシアンブルーナノ粒子を含む細胞を認識するまたは相互作用する、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項８９】
抗がん剤、毒素または放射性薬剤を含むがこれらの限定されない、少なくとも１つの検出可能なマーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、請求項７０に記載のコンジュゲート。
【請求項９０】
被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中での前記プルシアンブルー成分の分解（たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解）を低減するまたは妨げる少なくとも１つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、プルシアンブルーナノ粒子。
【請求項９１】
血液、血漿、ＣＳＦ、組織液、リンパ液または他の体液中にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０分間または前記ナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意で前記ナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意で前記ナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、前記プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９２】
血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子の前記プルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つ、２つまたは３つの保護層を含む、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９３】
ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９４】
コーティングを含む、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９５】
ＡＤＯＧＥＮ（登録商標）４６４、ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）６１１２、ＢＲＩＪ（登録商標）５２、ＢＲＩＪ（登録商標）９３、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ４、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｏ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２０、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−８９０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９９０、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＤＡ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＨＣＳ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＯＪ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＥ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＨ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）Ａ、ポリ（エチレングリコール）ソルビタンテトラオレエート、ポリ（エチレングリコール）ソルビトールヘキサオレエート、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、ソルビタンモノパルミテート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールエトキシレート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳ−３００、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＡ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＮ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＯフッ素系界面活性剤、アクリル酸（ＡＡ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＰＡ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム（ＡＯＴ）、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム（ＡＭＡ−８０）、Ａｍｐｈｉ−Ｄｅｘ、アクリロニトリル（ＡＮ）、ビス（２−ピリジルメチル）−オクタデシルアミン（ＢＰＭＯＤＡ）、ＢＲＩＪ（登録商標）３０（ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（［Ｃ４ｍｉｍ］ＰＦ６）、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（ＣＡ８９７）、ＣＭＣ−Ａ９、カルボキシメチル化ポリ（エチレングリコール）（ＣＭＰＥＧ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＭＡ−Ｃｌ）、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、ドデカン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（ＤＤＡ−ＨＥＥＥ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（ＤｅＴＡＢ）、ドデシルメルカプタン（ＤＤＭ）、デキストランエステル（ＤｅｘＥｓｔ）、ＳＧ１ベース二機能性アルコキシアミン（ＤＩＡＭＡ−Ｎａ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタクリル酸ドデシル（ＤＭＡ）、メタクリル酸（ジメチルアミノ）エチル（ＤＭＡＥＭＡ）、��−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）（ＤＭＭＡ−ＰＳ）、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、メタクリル酸コポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ブチレン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＫＬＥ３７２９）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ｍＰＥＯ−ＰＬＡ）、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ポリアニリン−ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＡＮＩ−ＰＳＳ）、ポリ（γ−ベンジル−１−グルタメート）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＢＧ−ＰＥＯ）、ポリ（ε−カプロラクタム）（ＰＣＬ）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー（ＰＥ／Ｆ６８）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシルブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（ヘプタデカフルオロデシルアクリレート）（ＰＨＤＦＤＡ）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ラクチド−フマレート）（ＰＬＡＦ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリドフマレート）（ＰＬＧＦ）、ポリ（ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、プルロニックＦ−１０８、ポリ（α，β−ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＭＡＡ））、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）エチレンジアミンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８）、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、４−（ｖ−アクリロイルオキシアルキル）オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＯＢＳ）、メタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）、５−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル（ＳＭＴＡＰＥ）、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、ソルビタントリオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）、および過硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９６】
好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、前記ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも１つの緩衝剤を含む、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９７】
血液、血漿またはリンパ液中での前記ナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つの保護層を含み、任意で、前記保護層がｐＨ７．０〜８．０で安定であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．５で安定である、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９８】
血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間前記プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも１つの天然または合成ポリマーコーティングを含む、請求項９０に記載のナノ粒子。
【請求項９９】
請求項９０に記載のナノ粒子を投与することを含む、光熱療法または組み合わされた光熱と免疫療法を必要とする対象を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる２０１６年３月８日出願の米国仮特許出願第６２／３０５，２５３号の優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる２０１４年３月１４日出願の米国特許出願第１４／２１３，３８０号、現在は米国特許出願公開第２０１４０２７１４８７Ａ１号、表題「ＰＲＵＳＳＩＡＮ  ＢＬＵＥ−ＩＮＳＰＩＲＥＤ  ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＳ  ＦＯＲ  ＭＵＬＴＩＭＯＤＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＹ（マルチモーダルイメージングおよび療法のためのプルシアンブルー誘発構築物）」にも関連する。本明細書に引用される参考文献も、特に引用により参照される主題については参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、免疫療法およびプルシアンブルーナノ粒子を利用する光熱療法の分野に属する。そのような併用療法の例は、プルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートされ腫瘍および病原性微生物の抗原を標的にする抗原特異的Ｔ細胞の使用、神経芽細胞腫または他の種類のがん、腫瘍もしくは悪性腫瘍の処置のためのプルシアンブルー光熱療法と組み合わせた阻害剤、たとえば、ＭＥＫ阻害剤またはチェックポイント阻害剤の使用を含む。本明細書で明らかにされるように、これらの療法を組み合わせれば、疾患の重症度を低減するのにより優れた驚くべき利点を提供する。
【発明の背景】
【０００４】
本明細書で提供される「背景」説明は、本開示の文脈を一般的に提示することを目的とする。現在名を挙げられている発明者の研究、それがこの背景の段落に記載される限り、ならびに提出時に他の点では先行技術としての資格がないことがある説明の側面は、明示または黙示を問わず、本開示に対する先行技術として認められていない。本発明の種々の側面および態様に関連する背景は、以下の段落および実施例において提供される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、プルシアンブルーナノ粒子を安定化させ、神経芽細胞腫、他のがん、ならびに、免疫療法を用いた処置に適している他の疾患、障害または状態を処置する免疫療法と組み合わせて使用することが可能であることを本明細書で明らかにする。併用療法の１つの成分はプルシアンブルーナノ粒子であり、これは官能化してもよい。もう１つの成分は１つ以上の免疫療法剤、たとえば、免疫調節剤、たとえば、チェックポイント阻害剤、抗体、またはＴ細胞および他の免疫細胞を含む免疫療法剤である。本発明の特定の側面は、１つ以上の免疫療法剤およびその適用と組み合わせた多機能性セラノスティック（theranostic）プルシアンブルーナノ粒子からなる併用療法に向けられている。これらの併用療法は、ナノ免疫療法と呼ばれるが、２つの重要な成分：１）プルシアンブルーナノ粒子および２）少なくとも１つの免疫療法を含む。２つの療法は、同時に、逐次に（もう一方の前に１つを）、または２つの成分が互いに結合している（本明細書に記載されるコンジュゲーション技法を使用して）単一実体として投与することが可能である。
【０００６】
本発明のいくつかの態様に従ったプルシアンブルーナノ粒子はセラノスティックな特長を示す。これらの特長があるせいでナノ粒子は診断および治療用に同時に使用することができる。いくつかの態様では、プルシアンブルーナノ粒子は：（１）小サイズ、たとえば、１〜４００ｎｍの範囲の直径、（２）ターゲティングリガンドのナノ粒子への結合を可能にする高表面積対体積比、（３）技法を使用して、たとえば、蛍光画像法もしくはＭＲＩにより画像化もしくは視覚化される能力、（４）キャリーもしくは標的療法剤として機能する能力、たとえば、光熱療法剤としてのその使用、および／または（５）生物学的流体、たとえば、血液、血漿、組織液、リンパ液、ＣＳＦ、等中で分解する能力を有することになる。
【０００７】
併用療法の第２の成分は１つ以上の免疫療法からなる。これらは、免疫応答を直接的にまたは間接的に調節するまたは影響を及ぼすことにより、たとえば、特定の細胞性、体液性、または他の免疫応答を抑制する、安定化する、誘導するまたは増強することにより、疾患を処置するように機能する。免疫療法の例は、免疫調節剤、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体、たとえば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＧＤ２を使用すること；または免疫細胞、たとえば、ＮＫ細胞もしくは抗原特異的Ｔ細胞の投与を含む。
【０００８】
本発明は、２つの別々であるが相乗的療法：療法、たとえば、プルシアンブルーナノ粒子を使用する光熱療法と少なくとも１つの免疫療法を組み合わせる。併用療法は、組合せ中の個別の療法よりも顕著に優れている処置成績を提供する。これらの優れた成績は２つの個別の療法の効果の加算としてだけでは説明できない。たとえば、併用療法は、併用療法の個別の成分を使用した場合のわずか１２．５％生存および０％生存と比べて、侵襲性がんを有するマウスの５５％での完全な腫瘍縮小および長期生存期間をもたらす。
【０００９】
本発明の種々の側面は、免疫療法と組み合わせたプルシアンブルーナノ粒子の組み合わせを使用する方法を含み、ナノ粒子はｉｎ  ｖｉｖｏで投与された後に官能化され安定であってもよい。本発明のこれらのおよび他の側面は以下の開示および特許請求の範囲においてさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】水中でのＰＢ  ＮＰの安定性、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴ特性。図１Ａ）ＤＬＳを使用して水中でＰＢ  ＮＰのサイズ（流体力学的径）を測定した。図１Ｂ）Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法を使用して４００〜１１００ｎｍの波長間でＰＢ  ＮＰの吸光度を測定した。図１Ｃ）４つの濃度のＰＢ  ＮＰを８０８ｎｍレーザー（１．２５Ｗ／ｃｍ２）で１０分間照射し、温度を毎分測定した。黒：１．０ｍｇ／ｍＬ、ブルー：０．１ｍｇ／ｍＬ、赤：０．０１ｍｇ／ｍＬ  ＰＢ  ＮＰ。灰色実線は水のみであることを示している。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図２】ＰＢ  ＮＰの安定性、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴ特性に対するＰＢＳの効果。図２Ａ）ＤＬＳを使用してＰＢＳ中でＰＢ  ＮＰの流体力学的径を測定した。図２Ｂ）Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法を使用して、ＰＢＳに０、２、２４、および４８時間接触させた後、４００〜１１００ｎｍの波長間でＰＢ  ＮＰの吸光度を測定した。図２Ｃ）ＰＢＳ中のＰＢ  ＮＰを８０８ｎｍレーザー（１．２５Ｗ／ｃｍ２）で１０分間照射し、温度を毎分測定した。黒：１．０ｍｇ／ｍＬ、ブルー：０．１ｍｇ／ｍＬ、赤：０．０１ｍｇ／ｍＬ  ＰＢ  ＮＰ。灰色点線はＰＢＳのみであることを示している。矢印および値は、水中でのその特性と比べたＰＢＳ中のＰＢ  ＮＰのＰＴＴ能力の減少を述べている。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図３】ＰＢＳ中でのＰＢ  ＮＰの安定性、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴ特性に対するアルブミンコーティングの効果。図３Ａ）ＤＬＳを使用してＰＢＳ中でアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰの流体力学的径を測定した。図３Ｂ）Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法を使用して、ＰＢＳに０、２、２４、および４８時間接触させた後、４００〜１１００ｎｍの波長間でアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰの吸光度を測定した。図３Ｃ）水（実線）またはＰＢＳ（点線）中１ｍｇ／ｍＬアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰをＮＩＲレーザー（１．２５Ｗ／ｃｍ２）で１０分間照射し、温度を毎分測定した。矢印および値は、水中でのその特性と比べたＰＢＳ中のアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰのＰＴＴ能力の減少を述べている。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図４】ＰＢＳ中でのＰＢ  ＮＰの安定性、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴ特性に対するＬｂＬコーティングの効果。図４Ａ）ＤＬＳを使用してＰＢＳ中でＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰの流体力学的径を測定した。図４Ｂ）Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法を使用して、ＰＢＳに０、２、２４、および４８時間接触させた後、４００〜１１００ｎｍの波長間でＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰの吸光度を測定した。図４Ｃ）水（実線ブルー）またはＰＢＳ（点線ブルー）中１ｍｇ／ｍＬ  ＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰをＮＩＲレーザー（１．２５Ｗ／ｃｍ２）で１０分間照射し、温度を毎分測定した。比較のため、水（実線赤）およびＰＢＳ（点線赤）中非被覆ＰＢ  ＮＰも含まれた。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図５】ＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰの表面電荷。ＬｂＬコーティング合成のそれぞれの層化工程（layering step）後ナノ粒子のゼータ電位を測定した。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図６】神経芽細胞腫細胞に対するＰＢ  ＮＰベースのＰＴＴの効果。Ｎｅｕｒｏ２ａ神経芽細胞腫細胞は、対照媒体（control media）、８０８ｎｍレーザー単独（１０分、１．２５Ｗ／ｃｍ２）、ＰＢ  ＮＰ（０．１ｍｇ／ｍＬ、２４時間）単独、またはＰＢ  ＮＰ（０．１ｍｇ／ｍＬ、２４時間）＋８０８ｎｍレーザー単独（１０分、１．２５Ｗ／ｃｍ２）で処置した。細胞生存率（％生存率）はＸＴＴアッセイ２時間後に読み取った。＊＊＊他のすべての群と比べてｐ＜０．０００１。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図７】ＰＢ  ＮＰのＰＴＴ特性に対するｐＨの効果。非被覆ＰＢ  ＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を水、ＰＢＳまたはｐＨ１０もしくは１２の溶液中で２４時間インキュベートし、次に９６ウェルプレートに移した。前記の条件を使用してそれぞれのウェルでＰＴＴを実施し、温度を測定した。平均±標準偏差、ｎ＝３。
【図８】プルシアンブルーナノ粒子のいくつかの態様を描く概要図。示されるように、プルシアンブルー組成物が異なれば異なる吸光度特性が示される。
【図９】神経芽細胞腫の光熱免疫療法のためのチェックポイント阻害と組み合わされたプルシアンブルーナノ粒子ベースの光熱療法。Ａ）ｐＨ依存安定性を示すプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）をｉ．ｔ．（局所的に）腫瘍内に注射する。Ｂ）低出力近赤外（ＮＩＲ）レーザーは、腫瘍の腫瘍作用（tumor effecting）光熱療法（ＰＴＴ）内でＰＢＮＰを照射し、これにより腫瘍細胞死が生じる。Ｃ）ＰＴＴは免疫応答も誘発し、腫瘍領域へのリンパ球およびＴ細胞の浸潤が増加する。Ｄ）ｉ．ｐ．（全身的に）投与される抗ＣＴＬＡ−４は免疫抑制を逆転させ、内在性免疫細胞、特にＴ細胞の抗腫瘍免疫応答の制御を解く。上記方法が組み合わされて、神経芽細胞腫のマウスモデルにおいて改善された腫瘍応答および腫瘍再チャレンジ（tumor rechallenge）に対する免疫の発現をもたらす。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＣａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（２０１７）７７１−７８１のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図１０】ＰＢＮＰのｐＨ依存特性。（図１０Ａ〜１０Ｃ）ｐＨ５．５（図１０Ａ）、ｐＨ７．０（図１０Ｂ）、およびｐＨ７．４（図１０Ｃ）での７日間にわたるＰＢＮＰの可視ＮＩＲスペクトルはわずかに酸性（５．５）および中性（７．０）ｐＨでＰＢＮＰ安定性を示し、わずかにアルカリ性ｐＨ（７．４）ではＰＢＮＰ安定性は減少していた。挿入図：それぞれ５．５、７．０、および７．４のｐＨでの７日目のＰＢＮＰ写真。（図１０Ｄ〜１０Ｆ）ｐＨ５．５（図１０Ｄ）、ｐＨ７．０（図１０Ｅ）、およびｐＨ７．４（図１０Ｆ）での７日間にわたる（０日目：ブルー、７日目：赤）ＰＢＮＰの動的光散乱分析は、わずかに酸性（５．５）および中性（７．０）ｐＨでは７日間にわたり検出可能なＰＢＮＰ集団およびわずかにアルカリ性ｐＨ（７．４）では７日目に検出不能なＰＢＮＰ集団を図示している。（図１０Ｇ〜１０Ｉ）ｐＨ５．５（図１０Ｇ）、ｐＨ７．０（図１０Ｈ）、およびｐＨ７．４（図１０Ｉ）での７日目のＰＢＮＰのＴＥＭ画像は、わずかに酸性（５．５）および中性（７．０）ｐＨでは検出可能なＰＢＮＰおよびわずかにアルカリ性ｐＨ（７．４）では検出不能なＰＢＮＰを示している。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＣａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（２０１７）７７１−７８１のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図１１】ＰＢＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏＰＴＴ能力。図１１Ａは、ｐＨ５．５および７．４での変動する濃度のＰＢＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏＰＴＴ能力を示しており、ｐＨが高いほど加熱が下がることを示している。図１１Ｂは、８０８ｎｍ  ＮＩＲレーザーで１０分間、１．８７５Ｗ／ｃｍ２で照射された５０マイクロリットル（１ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＮＰを腫瘍内に注射することにより達成した温度を示している。挿入図は注射部位で達成された約５０〜５５℃の増加した温度のヒートマップを示しており、この温度は腫瘍領域の外側では約３７℃の体温まで急速に低下する。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＢＮＰベースのＰＴＴの有効性。（Ａ〜Ｂ）（図１２Ａ）ＰＴＴ後に腫瘍量の減量を示しているＰＴＴ処置腫瘍担持マウスおよび（図１２Ｂ）腫瘍成長を示している無処置腫瘍担持マウスの代表的な画像（スケールバー＝腫瘍生物発光強度；ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。（図１２Ｃ）無処置（黒）および無処置対照と比べてＰＴＴ処置マウスで遅くなった腫瘍成長を示しているＰＴＴ処置（赤）腫瘍担持マウスについての正規化された腫瘍成長曲線（ｎ≧５／群）。低いほうの３つのトレース（赤）；他の高いほうのトレース（黒）。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＣａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（２０１７）７７１−７８１のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図１３】ＰＢＮＰベースのＰＴＴの免疫賦活性効果。図１３Ａ）無処置および図１３Ｂ）ＰＴＴ処置マウスの腫瘍におけるＣＤ４５＋細胞の代表的散布図。図１３Ｃ）無処置およびＰＴＴ処置マウスの腫瘍での％ＣＤ４５＋細胞。後者はＰＴＴ処置対無処置マウスの腫瘍においてＣＤ４５＋細胞の有意に高い百分率を示す（ｐ＝０．０２９４）。図１３Ｄ）無処置および図１３Ｅ）ＰＴＴ処置マウスの腫瘍におけるＣＤ３＋細胞の代表的散布図。図１３Ｆ）無処置およびＰＴＴ処置マウスの腫瘍での％ＣＤ３＋細胞。後者はＰＴＴ処置対無処置マウスの腫瘍においてＣＤ３＋細胞の有意に高い百分率を示す（ｐ＝０．０４２４）；（この研究ではｎ≧４／群）。
【図１４】神経芽細胞腫マウスモデルにおける腫瘍縮小および長期生存期間に対する光熱免疫療法（ＰＴＴ＋抗ＣＴＬＡ−４療法）の効果。図１４Ａ）完全な腫瘍縮小を示しているＰＴＴ＋抗ＣＴＬＡ−４で処置された長期生存マウスの代表的画像（スケールバー＝腫瘍生物発光強度；ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。図１４Ｂ）ＰＴＴ＋抗ＣＴＬＡ−４で処置された（青紫）または無処置のままにされた（黒）腫瘍担持マウスについての正規化された腫瘍成長曲線。（図１４Ｃ）ＰＴＴ＋抗ＣＴＬＡ−４、ＰＢＮＰ単独、抗ＣＴＬＡ−４単独、ＰＴＴ単独で処置されたまたは無処置の神経芽細胞腫マウスのカプラン・マイヤー生存時間プロット。光熱免疫療法を受けたマウスはその他の群のマウスと比べて有意に高い長期生存期間（Ｎ１００日）を示した（対数順位検定；ｐｂ０．０５）；（ｎ≧５／群）。（図１４Ｄ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇した神経芽細胞腫担持マウスのカプラン・マイヤー生存期間プロット。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を枯渇させる（ｎ＝５／群）と光熱免疫療法の治療応答を効果的に抑止した（対数順位検定；ｐｂ０．００５）。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＣａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（２０１７）７７１−７８１のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図１５】光熱免疫療法処置長期生存マウスでの腫瘍再チャレンジの効果。（図１５Ａおよび図１５Ｂ）（図１５Ａ）光熱免疫療法処置マウスでの腫瘍再チャレンジに対する保護および（図１５Ｂ）無感作無処置マウスでの腫瘍成長を示す代表的画像（スケールバー＝腫瘍生物発光強度；ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）。（図１５Ｃ）無処置マウス（無感作、黒）および長期生存光熱免疫療法処置マウス（再チャレンジ、橙色）における１０６のＮｅｕｒｏ２ａ細胞でのチャンレンジ後の腫瘍成長曲線。後者は無感作群の進行と比べて再チャレンジ群での保護を示している。（図１５Ｄ）無感作マウスと比べて再チャレンジ群での有意に高い長期生存期間を示すカプラン・マイヤー生存時間プロット（対数順位検定；ｐｂ０．０５）；（ｎ≧３／群）。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＣａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３（２０１７）７７１−７８１のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図１６】併用療法の利点を図解する概要図。
【図１７】細胞傷害性Ｔリンパ球上へのプルシアンブルーナノ粒子の成功裏の結合を描く模式図を展開する。（Ａ）発明者らは、蛍光アビジン被覆ＰＢＮＰがビオチン化ＣＴＬの表面にコンジュゲートされている模式図を提案する。（Ｂ）細胞−ナノ粒子コンジュゲーション直後（１日目）に撮影されたジャーカット細胞（ＤＡＰＩ＋）上へのＰＢＮＰ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８＋）の成功裏のコンジュゲーションを立証する共焦点顕微鏡画像（２０×）；スケールバー＝１０μｍ。（Ｃ＆Ｄ）Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８＋集団により示される場合の、フローサイトメトリーを使用してＰＢＮＰコーティングの持続性を評価した；細胞はＣＤ３＋としてプレゲート（pre-gate）された、ｎ＝３。ＰＢＮＰ：プルシアンブルーナノ粒子。
【図１８】プルシアンブルーナノ粒子バックパックド（backpacked）Ｔ細胞はＰＴＴの薬剤として機能的である。（図１８Ａ）ＰＢＮＰ単独、Ｔｃ単独、およびバックパックドＰＢＮＰ−ＴｃのＵＶ可視スペクトル；６８０〜７２０ｎｍの範囲のピークは、近赤外域での光吸収を示しており、光熱療法の薬剤としての潜在的性能を強調している。（図１８Ｂ）近赤外レーザー（０．９８Ｗ）単独、Ｔ細胞を有するウェル単独、ＰＢＮＰを有するウェル単独、およびバックパックドＰＢＮＰ−Ｔｃを有するウェルへの１０分間曝露、続いて冷却させるための室温での１０分間に応答した培養ウェルの温度プロファイル。（図１８Ｃ）前述の事柄での加熱および冷却温度はモニターされ、ナノ粒子−バックパックドＴ細胞と比べた場合の我々のナノ粒子の光熱変換効率を計算するのに使用した。Ｎ＝３。
【図１９】ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を用いた併用光熱免疫療法のための細胞バックパッキング（cellular backpacking）。ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞機能性が細胞バックパッキングにより損なわれることはないことを確定するのが必要不可欠であった。（図１９Ａ）無刺激のままにしておいた、またはｐｐ６５ペプチドをパルスされている標的細胞と共培養されるのいずれかで、２４時間増殖させておいた、単独でのまたはＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物でのＣＦＳＥ標識されたＴ細胞を描く代表的ヒストグラム。（図１９Ｂ）細胞増殖の集計結果、ｎ＝３、結果は３つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。（図１９Ｃ）その表現型を決定するためにフローサイトメトリーにより発明者らがアッセイしたＴ細胞およびバックパックドＰＢＮＰ−Ｔｃ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの集計結果が示されており；ｎ＝３、結果は３つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。（図１９Ｄ）非特異的（アクチン）、汎特異的（ＰＨＡ）または特異的（ｐｐ６５ペプチド）刺激への応答でＴ細胞およびＰＢＮＰ−Ｔｃ上で実施されたＥＬＩＳｐｏｔからのＩＦＮガンマ産生Ｔ細胞の集計結果；ｎ＝３、結果は３つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。（図１９Ｅ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、Ｔ細胞単独、ＰＢＮＰ単独プラス近赤外レーザーでの１０分間での共培養、またはＰＢＮＰ−Ｔｃでの共培養続いて近赤外レーザーでの１０分間への応答における標識標的細胞（ｐｐ６５ペプチド提示ＰＨＡ芽細胞）の生存率を調べるために実行された。負の対照は単独で培養された標的細胞（上左）であり、正の対照はＤＭＳＯと一緒に培養された標的細胞（上右）であった。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞（上）、ＰＢＮＰ単独プラスレーザー（中央）、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物プラスレーザー（下）との共培養での標的細胞生存率を描く代表的ヒストグラム。（図１９Ｆ）どちらかのモダリティ単独ならびに併用ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物プラスレーザーでの標的細胞生存率の有意な低減を示している上記からの集計結果；ｎ＝３、結果は３つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。
【図２０】ＥＢＶ特異的ＣＴＬを用いた併用光熱免疫療法のための細胞バックパッキング。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞機能性が細胞バックパッキングにより損なわれることはないことを確定するのが必要不可欠であった。（図２０Ａ）無刺激のままにしておいたまたは照射ＬＣＬ標的細胞（天然にＥＢＶ発現している）と共培養されるのいずれかで、２４時間増殖させておいた、単独でのまたはＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物でのＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を描く代表的ヒストグラム。（図２０Ｂ）細胞増殖の集計結果、ｎ＝３、結果は２つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。（図２０Ｃ）その表現型を決定するためにフローサイトメトリーにより発明者らがアッセイしたＴ細胞およびバックパックドＰＢＮＰ−Ｔｃ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの集計結果が示されており；ｎ＝３、結果は２つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。（図２０Ｄ）非特異的（アクチン）、汎特異的（ＰＨＡ）または特異的（照射ＬＣＬ）刺激への応答でＴ細胞およびＰＢＮＰ−Ｔｃ上で実施されたＥＬＩＳｐｏｔからのＩＦＮガンマ産生Ｔ細胞の集計結果；ｎ＝３、結果は２つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。（図２０Ｅ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、Ｔ細胞単独、ＰＢＮＰ単独プラス近赤外レーザーでの１０分間での共培養、またはＰＢＮＰ−Ｔｃでの共培養続いて近赤外レーザーでの１０分間への応答における標識標的細胞（ＬＣＬ細胞）の生存率を調べるために実行された。負の対照は単独で培養された標的細胞（上左）であり、正の対照はＤＭＳＯと一緒に培養された標的細胞（上右）であった。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞（上）、ＰＢＮＰ単独プラスレーザー（中央）、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物プラスレーザー（下）との共培養での標的細胞生存率を描く代表的ヒストグラム。（図２０Ｆ）どちらかのモダリティ単独ならびに併用ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物プラスレーザーでの標的細胞生存率の有意な低減を示している上記からの集計結果；ｎ＝３、結果は２つの別々のドナーを用いて行った実験を示している。
【図２１−１】プルシアンブルーナノ粒子コンジュゲーションは細胞傷害性Ｔリンパ球表現型または機能に影響を与えない。（図２１Ａ＆２１Ｂ）２４時間の抗原特異的刺激に続くＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を描く代表的ヒストグラムおよび集計データ。（図２１Ｃ＆２１Ｄ）フローサイトメトリーによりアッセイされるＣＴＬ表現型の代表的ドットプロットおよび集計データ。ＰＢＮＰ：プルシアンブルーナノ粒子。（図２１Ｅ）変動する表面ナノ粒子濃度での刺激されたＣＴＬ±ＰＢＮＰコーティングによるサイトカイン産生の集計結果。（図２１Ｆ）ＣＴＬ±ＰＢＮＰコーティングにより媒介される細胞傷害性への応答でのＥＢＶ＋標的細胞の生存率；ｎ＝７。ＰＢＮＰ：プルシアンブルーナノ粒子。
【図２１−２】プルシアンブルーナノ粒子コンジュゲーションは細胞傷害性Ｔリンパ球表現型または機能に影響を与えない。（図２１Ａ＆２１Ｂ）２４時間の抗原特異的刺激に続くＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を描く代表的ヒストグラムおよび集計データ。（図２１Ｃ＆２１Ｄ）フローサイトメトリーによりアッセイされるＣＴＬ表現型の代表的ドットプロットおよび集計データ。ＰＢＮＰ：プルシアンブルーナノ粒子。（図２１Ｅ）変動する表面ナノ粒子濃度での刺激されたＣＴＬ±ＰＢＮＰコーティングによるサイトカイン産生の集計結果。（図２１Ｆ）ＣＴＬ±ＰＢＮＰコーティングにより媒介される細胞傷害性への応答でのＥＢＶ＋標的細胞の生存率；ｎ＝７。ＰＢＮＰ：プルシアンブルーナノ粒子。
【図２２】細胞傷害性Ｔリンパ球に安定的にコンジュゲートされたプルシアンブルーナノ粒子は光熱療法の薬剤として機能的である。（図２２Ａ）ＣＴＬ、ＰＢＮＰ、およびＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物のＶｉｓ−ＮＩＲスペクトル：６８０〜７２０ｎｍでのピークは、ＮＩＲ域での光吸収を示している。（図２２Ｂ）ＮＩＲレーザーへの１０分間曝露、続いて室温での冷却への応答での種々の群の温度プロファイル。（図２２Ｃ＆２２Ｄ）ＣＴＬ±ＰＢＮＰ±レーザーでの共培養への応答での標的細胞生存率を描く集計データおよび標識標的細胞の代表的ヒストグラム（生細胞プレゲーティング（live cell pregating）を用いて）；ｎ＝７。ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球；ＮＩＲ：近赤外；ＰＢＮＰ：プルシアンブルーナノ粒子。
【図２３】ＰＤ９０１はＥＲＫ活性化を遮断することによりＭＰＮＳＴをｉｎ  ｖｉｔｒｏで効果的に処置する。（図２３ａ）マウスＭＰＮＳＴ（Ｍ２）細胞は、ウェスタンブロットにより可視化した場合の溶媒（ＤＭＳＯ）処置Ｍ２細胞と比べて１μＭのＰＤ９０１での４時間または８時間処置された場合ｐ−ＥＲＫタンパク質発現の顕著な減少を示す。（図２３ｂ）Ｍ２細胞は、ＰＤ９０１の濃度を増加させていって４８時間処置した場合生存率の減少を示す（ＩＣ５０＝１μＭ）。（図２３ｃ）０．１、１、および１０μＭのＰＤ９０１で２４時間処置されたＭ２細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、アポトーシス（水色、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ集団）と後期アポトーシス／ネクローシス（濃青色、７ＡＡＤ＋集団）の両方を介して細胞死を受ける。（図２３ｄ）０．１、１、および１０μＭのＰＤ９０１で２４時間処置されたＭ２細胞は、フローサイトメトリーにより測定した場合、濃度依存性の様式でＧ０／Ｇ１期に細胞周期停止を受ける。すべてのプロットでのデータは平均±標準偏差として表される（ｎ≧３／群）；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＳｗｅｅｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３７０３５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３７０３５（２０１６）のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図２４】ＰＢＮＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏではＭＰＮＳＴのＰＴＴのための効果的な薬剤として機能する。（図２４ａ）ＰＢＮＰは、動的光散乱により測定した場合、単分散粒径分布（monodisperse size distributions）を示す（平均流体力学的径＝６８．１ｎｍ）。挿入図：ＰＢＮＰは透過型電子顕微鏡を使用して可視化した場合その特徴的な立体形態を示す（スケールバー＝１００ｎｍ）。（図２４ｂ）ＰＢＮＰは、８０８ｎｍ  ＮＩＲレーザーを用いて１．５Ｗ／ｃｍ２で１０分間照射すると、熱電対を使用して１分間隔で測定した場合、ＰＢＮＰの濃度が増加するに従ってさらに高い温度まで熱くなる。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；１０分で近接するもっと低い濃度の温度と比べた場合。（図２４ｃ）Ｍ２細胞の生存率は種々の用量のＰＴＴにさらされた場合、２４時間後に測定すると、減少する（１．５Ｗ／ｃｍ２で１０分間８０８ｎｍレーザー照射ありまたはなしで、ＰＢＮＰ濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．０５ｍｇ／ｍＬの範囲である）。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；適合対照と比べた場合。（図２４ｄ）さまざまな用量のＰＴＴで処置されたＭ２細胞は、細胞が加熱されて生じる温度域に応じて、アポトーシス（水色、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ集団）および／または後期アポトーシス／ネクローシス（濃青色、７ＡＡＤ＋集団）を介して細胞死の引き金を引くことが可能である；フローサイトメトリーにより定量化される。すべてのプロットでのデータは平均±標準偏差として表される（ｎ≧３／群）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；群中の他のすべての試料と比べて。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＳｗｅｅｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３７０３５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３７０３５（２０１６）のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図２５】ＰＤ９０１とＰＴＴは相乗的に組み合わされてＭＰＮＳＴについてｉｎ  ｖｉｔｒｏで改善された処置成績をもたらす。（図２５ａ）低および高用量のＰＤ９０１およびＰＴＴで処置されたＭ２細胞は、２４時間後同一条件下で個別に投与されたいずれかの療法と比べて、併用療法（ＰＤ９０１プラスＰＴＴ）処置群で細胞生存率の有意な減少を示す。低ＰＤ９０１：０．１２５μＭ；低ＰＴＴ０．００５ｍｇ／ｍＬ＋１．５Ｗ／ｃｍ２  ８０８ｎｍレーザー１０分間；低コンボ：低ＰＤ９０１と低ＰＴＴ両方の処置；高ＰＤ９０１：１．０μＭ；高ＰＴＴ０．０５ｍｇ／ｍＬ＋１．５Ｗ／ｃｍ２  ８０８ｎｍレーザー１０分間；高コンボ：高ＰＤ９０１と高ＰＴＴ両方の処置。データは平均±標準偏差として表される（ｎ≧３／群）。＊ｐ＜０．０５。（図２５ｂ）溶媒、高ＰＤ９０１、高ＰＴＴ、高コンボで４時間処置され、続いて収穫され、溶解され、ｐ−ＥＲＫについて調査されたＭ２細胞は、ＰＤ９０１と高コンボ群の両方でｐ−ＥＲＫ発現の完全な根絶および高ＰＴＴ処置群での明白な減少を示している。アクチンはローディングコントロール（loading control）として使用された。（ｃ）ＰＤ９０１はＰＴＴと相乗的に組み合わされて、等価用量でのいずれかの処置単独以上にｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭ２細胞生存率を減少させる。５０，０００  Ｍ２細胞は増加する用量のＰＤ９０１、ＰＴＴ、または組合せで処置され、生存率はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により２４時間後に測定された。データ点は平均±標準偏差を表す；ｎ＝３／群。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＳｗｅｅｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３７０３５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３７０３５（２０１６）のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【図２６】ＰＤ９０１とＰＴＴは組み合わされてｉｎ  ｖｉｖｏでＭＰＮＳＴ進行を減少し生存期間を増加する。ＭＰＮＳＴ担持Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊマウスは、腫瘍が径で１０ｍｍに到達した後：無処置（ｎ＝５、黒）、５ｍｇ／ｋｇ  ＰＤ９０１（Ｎ＝５、青）、ＰＴＴ（ｎ＝５、赤；１．５Ｗ／ｃｍ２で１．０ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＮＰ）、またはＰＤ９０１＋ＰＴＴ（ｎ＝５、紫；ＰＤ９０１とＰＴＴ両方の処置）で処置した。ＰＤ９０１は経口胃管栄養法により毎日投与した。ＰＢＮＰは腫瘍内に投与し、ＰＴＴは１０分間に１回実施した。動物は腫瘍が径で２０ｍｍに到達するまたは苦痛の兆候を示すと安楽死させた。（図２６ａ）腫瘍進行は毎日キャリパーにより測定した。それぞれのラインは１マウスを表す。挿入図：腫瘍は処置の８時間後に収穫され、組織学的検査のために加工され、Ｈ＆Ｅで染色され、顕微鏡により可視化された；スケールバー＝２０μｍ。（図２６ｂ）生存時間はカプラン・マイヤー曲線により図示される。対数順位検定によりすべての群と比べた場合＊ｐ＜０．０５。（この図凡例中での色への言及の解釈については、読者はＳｗｅｅｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６，３７０３５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ３７０３５（２０１６）のウェブ版を参照し、この文献は参照により組み込まれる）。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
定義
「プルシアンブルー粒子（複数可）またはナノ粒子（複数可）」とは、好ましくは、光熱療法中対象への投与に適している量および形態でプルシアンブルーを含有する粒子のことである。この定義は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２７１４８７号により記載されるプルシアンブルー組成物を含むがこれらに限定されない。
【００１２】
これらの粒子は、化学式：ＡｘＢｙＭｚ［Ｍ’（ＣＮ６］ａ・ｎ（Ｈ２Ｏ）（式中、Ａは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；Ｂは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；Ｍは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；Ｍ’は、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；ｘは、０．１〜約１であり；ｙは、０〜約１であり；ｚは、０．１〜約４であり；ａは、０．１〜約４であり；ｎは、０．１〜約２４である）成分を含有していてもよい。
【００１３】
これらの粒子は好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００ｎｍを含む、約１ナノメートル〜約１０ミクロンまたはこの範囲内の任意の中間値の範囲の平均直径を有する。
【００１４】
有利なことに、これらの粒子は、光熱変換過程または他の機構により、約６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００〜約１，２００ｎｍ（ならびにこの範囲内のすべての中間値）の範囲の波長でのピーク光子吸収を示す。ナノ粒子は好ましくは、約６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００〜約１，２００ｎｍ（ならびにこの範囲内のすべての中間値）の範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量は約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０〜約１００℃ならびにこの範囲内のすべての中間値の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす。プルシアンブルーナノ粒子は、約０．１％〜約９０％の範囲の光熱変換効率で、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換してもよい。
【００１５】
いくつかの態様では、プルシアンブルーナノ粒子は、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解、たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解を低減するまたは妨げる少なくとも１つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている。いくつかの態様では、配合されたまたは被覆されたナノ粒子は、血液、血漿、ＣＳＦ、組織液、リンパ液または他の体液中にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間；および／またはナノ粒子が前記標的細胞に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間；および／またはナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分が分解されにくくなる。
【００１６】
プルシアンブルーナノ粒子は、血液、血漿、リンパ液または他の体液もしくは成分中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つ、２つまたは３つの保護層を有していてもよい。プルシアンブルーナノ粒子は、ナノシェル、リポソーム、ミセル、もしくはリポソーム様合成粒子を含有するまたはこれらの形態でもよい。プルシアンブルーナノ粒子は、コーティング、たとえば、生分解性、生体保護性（bioprotective）、持続性もしくは徐放性コーティング、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングを含んでいてもよい。保護層は、任意で、ｐＨ７．０〜８．０で安定であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．５で安定である、あるいは血液、血漿もしくはリンパ液中でまたはわずかにアルカリ性の生理的溶液中で安定であるように処方してもよい。
【００１７】
例となるコーティングは、ＡＤＯＧＥＮ（登録商標）４６４、ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）６１１２、ＢＲＩＪ（登録商標）５２、ＢＲＩＪ（登録商標）９３、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ４、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｏ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２０、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−８９０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９７０、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＤＡ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＨＣＳ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＯＪ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＥ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＨ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）Ａ、ポリ（エチレングリコール）ソルビタンテトラオレエート、ポリ（エチレングリコール）ソルビトールヘキサオレエート、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、ソルビタンモノパルミテート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールエトキシレート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳ−３００、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＡ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＮ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＯフッ素系界面活性剤、アクリル酸（ＡＡ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＰＡ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウム塩（ＡＯＴ）、ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム塩（ＡＭＡ−８０）、Ａｍｐｈｉ−Ｄｅｘ、アクリロニトリル（ＡＮ）、ビス（２−ピリジルメチル）−オクタデシルアミン（ＢＰＭＯＤＡ）、ＢＲＩＪ（登録商標）３０（ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（［Ｃ４ｍｉｍ］ＰＦ６）、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（ＣＡ８９７）、ＣＭＣ−Ａ９、カルボキシメチル化ポリ（エチレングリコール）（ＣＭＰＥＧ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＭＡ−Ｃｌ）、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、ドデカン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（ＤＤＡ−ＨＥＥＥ）、臭化デシルトリメチルアンモニウム（ＤｅＴＡＢ）、ドデシルメルカプタン（ＤＤＭ）、デキストランエステル（ＤｅｘＥｓｔ）、ＳＧ１ベース二機能性アルコキシアミン（ＤＩＡＭＡ−Ｎａ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタクリル酸ドデシル（ＤＭＡ）、メタクリル酸（ジメチルアミ��）エチル（ＤＭＡＥＭＡ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）（ＤＭＭＡ−ＰＳ）、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、メタクリル酸コポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ブチレン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＫＬＥ３７２９）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ｍＰＥＯ−ＰＬＡ）、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ポリアニリン−ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＡＮＩ−ＰＳＳ）、ポリ（γ−ベンジル−１−グルタメート）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＢＧ−ＰＥＯ）、ポリ（ε−カプロラクタム）（ＰＣＬ）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー（ＰＥ／Ｆ６８）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシルブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（ヘプタデカフルオロデシルアクリレート）（ＰＨＤＦＤＡ）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ラクチド−フマレート）（ＰＬＡＦ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリドフマレート）（ＰＬＧＦ）、ポリ（ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、プルロニックＦ−１０８、ポリ（α，β−ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＭＡＡ））、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）エチレンジアミンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８）、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、４−（ｖ−アクリロイルオキシアルキル）オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＯＢＳ）、メタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）、５−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル（ＳＭＴＡＰＥ）、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、ソルビタントリオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）、および過硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む１つ以上のコーティングを含むがこれらに限定されない。
【００１８】
プルシアンブルーナノ粒子は、他の成分、たとえば、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤または他の活性（たとえば、薬物または生物学的に活性な薬剤）もしくは不活性成分を含有していてもよい。
【００１９】
プルシアンブルーナノ粒子は、ターゲティング薬剤、たとえば、Ｔ細胞または他の免疫細胞にコンジュゲートしている、または他の方法で結合もしくは会合していてもよく、あるいは細胞（たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に）、組織または他の解剖学的部位にターゲティングする少なくとも１つの薬剤に配合または被覆されていてもよい。ターゲティング薬剤は、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、または薬剤、たとえば、標的細胞、組織もしくは解剖学的部位上に天然に存在しているもしくは位置している相補的部分に結合するビオチン、（ストレプト）アビジン、もしくは他の成分を含む。いくつかの態様では、プルシアンブルーナノ粒子は、二または多機能性であり、がん、新生物もしくは腫瘍細胞、または他の標的細胞、組織もしくは解剖学的部位に、あるいは標的細胞、組織もしくは部位の成分またはそこから放出される物質に結合する少なくとも１つの部分をさらに含有することが可能である。ターゲティング薬剤は、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、（ストレプト）アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的な天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい。プルシアンブルーナノ粒子は、標的細胞中へのナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する１つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤を含有していてもよい。
【００２０】
「免疫細胞」は、リンパ球、たとえば、ＴおよびＢリンパ球、ガンマ−デルタＴ細胞、およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されず、これらの細胞は特定の抗原、たとえば、プリオン、ウイルス、細菌、酵母、真菌、寄生虫、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原、または特定の疾患、障害もしくは状態に関連する他の抗原を認識してもよい。他の免疫細胞は白血球を含むが、これは顆粒球でも無顆粒白血球（agranulocytes）でもよい。免疫細胞の例は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球およびマクロファージを含む。樹状細胞、ミクログリア、および他の抗原提示細胞もこの定義に含まれる。免疫細胞は、プルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートされたもしくは組み合わされた養子療法（adoptive therapy）で使用するまたはプルシアンブルーナノ粒子の前に、同時に、もしくは後で投与してもよい。
【００２１】
「免疫療法」は、免疫系成分により、たとえば、抗体もしくは免疫細胞により、または免疫系を刺激する、阻害するもしくは他の方法で調節する薬物もしくは他の薬剤により媒介される療法を含む。これらは、抗体（たとえば、抗腫瘍抗原抗体）、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する、免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系に影響を及ぼす免疫調節剤、薬物または物質を含む。免疫調節剤、薬物または他の物質は、プルシアンブルーナノ粒子に結合している、組み込まれている、または他の方法で会合していてもよい。
【００２２】
免疫療法は、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＭａｒｃｈ  ７，２０１７）またはｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＭａｒｃｈ  ７，２０１７）に記載されているケモカインおよびサイトカインを含む１つ以上のケモカインまたはサイトカインの投与を含んでいてもよく、これらの情報は両方とも参照により組み込まれる。免疫療法は、チェックポイント阻害剤を含むがこれに限定されない抗体媒介療法も含んでいてよい。そのような抗体は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＤ２、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、および／または抗ＣＤ５２抗体を含んでいてもよい。
【００２３】
「併用免疫療法」とは、本明細書に記載されるプルシアンブルーナノ粒子を用いた処置と少なくとも１つの免疫療法の組合せのことである。そのような併用免疫療法は、ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象（複数可）と比べて、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００％もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減してもよく、あるいは、そのような併用免疫療法は、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象（複数可）の生存率と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、４８、もしくは６０ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く平均生存期間を増やす。他の非腫瘍疾患、障害または状態の進行または症状の類似の低減は、持続性または再発性感染症を含む、非腫瘍疾患、障害または状態に向けられた併用免疫療法から生じてもよい。そのような非癌性状態は、異常な細胞増殖にまたはプリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母、もしくは寄生虫による感染に関連している過形成、疣贅、または他の状態を含む。
【００２４】
併用免疫療法は、ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００％もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減してもよい。他の非腫瘍疾患、障害または状態の再発またはぶり返しの類似の低減は、持続性または再発性感染症を含む、非腫瘍疾患、障害または状態に向けられた併用免疫療法から生じてもよい。そのような非癌性状態は、異常な細胞増殖にまたはプリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母、もしくは寄生虫による感染に関連している過形成、疣贅、または他の状態を含む。
【００２５】
併用免疫療法は、プルシアンブルーナノ粒子を用いた処置とＧａｌｕｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５（２４）：１２４７２−１２５０８（２０１４）により記載される免疫療法のうちの１つ以上を含んでいてもよく、前記文献は参照によりその全体を組み込まれる。
【００２６】
「チェックポイント阻害剤」は、抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害を含むがこれに限定されず、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の阻害剤を含む。そのような阻害剤の例は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびアテゾリズマブを含む。免疫チェックポイントの調節は、免疫系機能に影響を及ぼし、刺激性でも阻害性でも可能である。
【００２７】
「ＭＥＫ阻害剤」は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２を阻害する化学物質または薬物である。これらはＰＤ９０１、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブまたはＸＬ５１８、ビニメチニブ（Binimetinib）（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２）、およびセルメチニブを含むがこれらに限定されない。
【００２８】
「がん、新生物、腫瘍、または悪性腫瘍」は、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を含むがこれらに限定されない。
【００２９】
実施例で使用されるようにおよび他の方法ではっきりと明記されていない場合を含む、ここの明細書および特許請求の範囲で使用されているように、すべての数字は、用語「実質的に」、「約」または「おおよそ」が、たとえその用語がはっきりと表れていなくとも、前置きされているかのように読んでよい。語句「約」または「おおよそ」は、記載されている値および／または位置が値および／または位置の妥当な予想範囲内であることを示すために大きさおよび／または位置を記載する場合に使用してもよい。たとえば、数値は、表示値（または値域）の＋／−０．１％、表示値（または値域）の＋／−１％、表示値（または値域）の＋／−２％、表示値（または値域）の＋／−５％、表示値（または値域）の＋／−１０％、表示値（または値域）の＋／−１５％、表示値（または値域）の＋／−２０％、等である値を有していてもよい。本明細書で列挙される任意の数値域は、その中に包含される全てのサブレンジを含むことが意図されている。
【００３０】
用語「生体適合性の」とは、対象にとって実質的に無毒性である物質のことである。本明細書に記載されるように、「生体適合性の」が生物学的に適合する試料または移植片に関連して使用される場合、「生体適合性の」とは、患者に移植されその患者にとって無毒性である人工的なまたは外来性の試料または移植片のことである。本発明の大半の態様では、生体適合性のプルシアンブルーおよび免疫療法成分の使用を必要とする。
【００３１】
「生分解性の」は一般に、可溶性種にまで腐食するまたはそれ自体対象にとって無毒性（生体適合性）であり、対象が代謝する、排出する、または排泄することができるもっと小さな単位または化学種にまで生理的条件下で分解する材料と本明細書では呼ばれる。いくつかの態様では、本発明に従った組織は生分解性材料に接触している、または組織の上にもしくは中にこの材料を組み込んでいていてもよい。本発明の大半の態様では、生分解性のプルシアンブルーおよび免疫療法成分の使用を必要とする。
【００３２】
投与様式。併用療法はいかなる適切な適用様式によっても、たとえば、静脈内に（ｉ．ｖ．）、腹腔内に（ｉ．ｐ．）、筋肉内に（ｉ．ｍ．）、鼻腔内に、経口的に、皮下に（ｓ．ｃ．）、腫瘍内に、インサイチューに（たとえば、直視下手術部位に）、等、およびいかなる適切な送達デバイスで投与してもよい（Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９），（２００３），７２７−７３５）。プルシアンブルーおよび免疫療法成分は、同じまたは異なる様式で投与してもよく、たとえば、プルシアンブルーナノ粒子は標的部位に注射し免疫療法免疫細胞または抗体は静脈内に投与してもよい。それぞれの製剤を入手するための手段および方法は当業者には公知である（たとえば、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”，Ｓａｒｆａｒａｚ  Ｎｉａｚｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，２００４参照）。
【００３３】
光／照射源／レーザー。当業者であれば光熱療法のための適切な照射源を選択することが可能である。そのような源の例は、約７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２０００ｎｍ波長に及び、出力が約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４〜５Ｗ／ｃｍ２の範囲のＮＩＲレーザーまたはその等価物である。これらの範囲は中間の値およびサブレンジをすべて含む。
【００３４】
特徴または要素が本明細書で別の特徴または要素「上」にあると呼ばれる場合、特徴もしくは要素はもう一方の特徴もしくは要素上に直に存在することが可能でありまたは介在する特徴および／もしくは要素が存在していてもよい。これとは対照的に、特徴または要素が本明細書で別の特徴または要素「上に直に」あると呼ばれる場合、介在する特徴または要素は存在しない。特徴または要素が別の特徴または要素に「接続」、「結合」または「連結」していると呼ばれる場合、特徴または要素はもう一方の特徴または要素に直接的に接続、結合または連結していることが可能であり、または介在する特徴もしくは要素が存在していてもよいことも理解されるであろう。これとは対照的に、特徴または要素が別の特徴または要素に「直接的に接続」、「直接的に結合」または「直接的に連結」していると呼ばれる場合、介在する特徴または要素は存在しない。１つの態様に関して記載されているまたは示されているが、そのように記載されているまたは示されている特徴および要素は他の態様に適用することが可能である。別の特徴に「隣接して」配置されている構造または特徴への言及は、隣接する特徴と重複するまたはその下にある部分を有してもよいことも当業者であれば認識するであろう。
【００３５】
本発明の非限定的な態様は、以下の組成物および方法を含む。
【００３６】
態様
１．対象を処置するための組合せ方法であって、
（ｉ）プルシアンブルーナノ粒子、ナノ粒子を含有する組成物、またはナノ粒子を含む細胞をそれを必要とする対象に投与すること、および
（ｉｉ）対象を光熱的に処置すること、および
（ｉｉｉ）対象を少なくとも１つの他の免疫療法で処置することを含み、任意で、前記方法が、プルシアンブルーナノ粒子を含む抗原特異的Ｔ細胞を投与することを含む、組合せ方法。
２．プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーを含む、態様１に記載の組合せ方法。
３．プルシアンブルーナノ粒子がプルシアンブルーから本質的になる、態様１または２のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４．プルシアンブルーナノ粒子が、プルシアンブルーを前記光熱処置に関与させるのに十分な量でプルシアンブルーを含む、態様１から３のいずれか１つに記載の組合せ方法。
５．プルシアンブルーが、化学式：
ＡｘＢｙＭｚ［Ｍ’（ＣＮ６］ａ・ｎ（Ｈ２Ｏ）
（式中、
Ａは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
Ｂは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
Ｍは、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
Ｍ’は、任意の酸化状態のＶＯ”Ｃａ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｓｒ、ｌｒ、Ｎｂ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、ＴＩ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｄ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｂａ、Ｈｆ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｐｔ、Ｈｇ、Ｌａ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、ＤｙおよびＨｏならびにその任意の組合せのうちの少なくとも１つを表し；
ｘは、０．１〜約１であり；
ｙは、０〜約１であり；
ｚは、０．１〜約４であり；
ａは、０．１〜約４であり；
ｎは、０．１〜約２４である）
を有する化合物または組成物を含む、から本質的になる、またはからなる、態様１から４のいずれか１つに記載の組合せ方法。
６．プルシアンブルー成分が、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２７１４８７号により開示されるプルシアンブルー化合物のうちのいずれか１つ以上を含む、から本質的になる、またはからなる、態様１から５のいずれか１つに記載の組合せ方法。
７．ナノ粒子が、約１ナノメートル〜約１０ミクロンの範囲の平均直径を有する、態様１から６のいずれか１つに記載の組合せ方法。
８．ナノ粒子が、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長でピーク光子吸収を示す、態様１から７のいずれか１つに記載の組合せ方法。
９．ナノ粒子が、光熱変換過程または他の機構により、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、態様１から８のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１０．ナノ粒子が、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換し、発生した熱量が０．１〜１００℃の範囲のナノ粒子温度の増加をもたらす、態様１から９のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１１．ナノ粒子が、約０．１％〜約９０％の範囲の光熱変換効率で、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長を有する吸収された入射光を熱に変換する、態様１から１０のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１２．ナノ粒子が、被覆されていない、配合されていないまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解（たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解）を低減するまたは妨げる少なくとも１つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、態様１から１１のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１３．ナノ粒子が、血液、血漿、ＣＳＦ、組織液、リンパ液または他の体液中にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意でナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意でナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、態様１から１２のいずれか１つに記載の組合せ方法。本明細書に記載される方法は、組織の外科的除去、組織の外科的曝露、または光熱効果を誘導する放射線へのもしくは免疫療法で使用される薬剤への標的組織の曝露を促進する他の技法と併せて実行してもよい。
１４．ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つ、２つまたは３つの保護層を含む、態様１から１３のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１５．ナノ粒子が、ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、態様１から１４のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１６．ナノ粒子が、コーティングを含む、態様１から１５のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１７．ナノ粒子が、ＡＤＯＧＥＮ（登録商標）４６４、ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）６１１２、ＢＲＩＪ（登録商標）５２、ＢＲＩＪ（登録商標）９３、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ４、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｏ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２０、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−８９０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９７０、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＤＡ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＨＣＳ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＯＪ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＥ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＨ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）Ａ、ポリ（エチレングリコール）ソルビタンテトラオレエート、ポリ（エチレングリコール）ソルビトールヘキサオレエート、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、ソルビタンモノパルミテート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールエトキシレート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳ−３００、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＡ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＮ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＯフッ素系界面活性剤、アクリル酸（ＡＡ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＰＡ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートナトリウム塩（ＡＯＴ）、ジヘキシルスルホサクシネートナトリウム塩（ＡＭＡ−８０）、Ａｍｐｈｉ−Ｄｅｘ、アクリロニトリル（ＡＮ）、ビス（２−ピリジルメチル）−オクタデシルアミン（ＢＰＭＯＤＡ）、ＢＲＩＪ（登録商標）３０（ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（［Ｃ４ｍｉｍ］ＰＦ６）、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（ＣＡ８９７）、ＣＭＣ−Ａ９、カルボキシメチル化ポリ（エチレングリコール）（ＣＭＰＥＧ）、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウム塩化物（ＣＴＭＡ−Ｃｌ）、ジドデシルジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ドデカン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（ＤＤＡ−ＨＥＥＥ）、デシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＤｅＴＡＢ）、ドデシルメルカプタン（ＤＤＭ）、デキストランエステル（ＤｅｘＥｓｔ）、ＳＧ１ベース二機能性アルコキシアミン（ＤＩＡＭＡ−Ｎａ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタクリル酸ドデシル（ＤＭＡ）、メタクリル酸（ジ��チルアミノ）エチル（ＤＭＡＥＭＡ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）（ＤＭＭＡ−ＰＳ）、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、メタクリル酸コポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ブチレン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＫＬＥ３７２９）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ｍＰＥＯ−ＰＬＡ）、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ポリアニリン−ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＡＮＩ−ＰＳＳ）、ポリ（γ−ベンジル−１−グルタメート）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＢＧ−ＰＥＯ）、ポリ（ε−カプロラクタム）（ＰＣＬ）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー（ＰＥ／Ｆ６８）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシルブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（ヘプタデカフルオロデシルアクリレート）（ＰＨＤＦＤＡ）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ラクチド−フマレート）（ＰＬＡＦ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリドフマレート）（ＰＬＧＦ）、ポリ（ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、プルロニックＦ−１０８、ポリ（α，β−ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＭＡＡ））、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）エチレンジアミンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８）、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、４−（ｖ−アクリロイルオキシアルキル）オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＯＢＳ）、メタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）、５−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル（ＳＭＴＡＰＥ）、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、ソルビタントリオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）、および過硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、態様１から１６のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１８．ナノ粒子が、好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも１つの緩衝剤を含む、態様１から１７のいずれか１つに記載の組合せ方法。
１９．ナノ粒子が、血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つの保護層を含み、任意で、前記保護層がｐＨ７．０〜８．０で安定であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．５で安定である、態様１から１８のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２０．ナノ粒子が、血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも１つの天然または合成ポリマーコーティングをさらに含む、態様１から１９のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２１．ナノ粒子が、ナノ粒子を細胞に（たとえば、がん、腫瘍または新生物細胞に）ターゲティングする少なくとも１つの薬剤、たとえば、腫瘍関連もしくは腫瘍特異的抗原に結合する抗体もしくは他のリガンド、またはたとえば、ビオチン、（ストレプト）アビジン、もしくは標的細胞上に天然に存在するもしくは位置する相補的部分に結合する他の成分をさらに含む、態様１から２０のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２２．ナノ粒子が二機能性または多機能性であり、前記ナノ粒子が、
光熱療法に適した波長で、たとえば、約６００ｎｍ〜約１，２００ｎｍの範囲の波長でピーク光子吸収を示し、および／または
腫瘍、がん、悪性、もしくは新生物細胞もしくは他の標的細胞に特異的に結合するもしくはエンドサイトーシスによって取り込まれる、および／または
免疫系の細胞成分に、たとえば、Ｔ細胞もしくはマクロファージに特異的に結合する、および／または
前記ナノ粒子が投与される対象の免疫系の少なくとも１つの成分と、たとえば、Ｔ細胞もしくはマクロファージと相互作用する少なくとも１つの受容体、リガンドもしくは他の部分を含む、態様１から２１のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２３．ナノ粒子が二または多機能性であり、ナノ粒子が、がん、新生物もしくは腫瘍細胞に、または他の標的細胞に、または標的細胞の成分、もしくはこれから放出される物質に結合する少なくとも１つの部分をさらに含み、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、（ストレプト）アビジン、または標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である天然もしくは外来性の受容体もしくはリガンドでもよい、態様１から２２のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２４．ナノ粒子が二または多機能性であり、ナノ粒子が、非悪性細胞または血小板、たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞に結合する少なくとも１つの部分をさらに含み、前記部分が抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマーまたは標的細胞上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよく、前記部分が、抗体、エピトープ結合抗体断片、アプタマー、ビオチン、（ストレプト）アビジン、または非悪性細胞もしくは血小板上のリガンドもしくは受容体に相補的である受容体もしくはリガンドでもよい、態様１から２３のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２５．プルシアンブルーナノ粒子が、ケモカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ、もしくは他のサイトカイン、抗体もしくは抗体断片、アプタマー、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、または免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されない、宿主免疫系と相互作用する１つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤、たとえば、標的細胞に影響を及ぼす免疫応答を誘導または促進する、たとえば、がん、悪性、新生物、もしくは腫瘍細胞の成長、転移を阻害する、もしくは破壊する免疫療法応答を誘導する免疫調節剤をさらに含む、態様１から２４のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２６．プルシアンブルーナノ粒子が、標的細胞中へのナノ粒子のエンドサイトーシスを促進する、１つ以上の化学基、物質、コーティングまたは他の薬剤をさらに含む、態様１から２５のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２７．少なくとも１つの他の免疫療法が、抗体（たとえば、抗腫瘍抗原抗体）、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する少なくとも１つの免疫調節剤、薬物、または物質で対象を処置することを含み、任意で、前記少なくとも１つの他の免疫療法が、ナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合している、免疫調節剤、薬物または物質により媒介されてもよい、態様１から２６のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２８．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのケモカインまたは他のサイトカインで対象を処置することを含む、態様１から２７のいずれか１つに記載の組合せ方法。
２９．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのコロニー刺激因子で対象を処置することを含む、態様１から２８のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３０．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのインターフェロンで対象を処置することを含む、態様１から２９のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３１．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのインターロイキンで対象を処置することを含む、態様１から３０のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３２．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのＴＮＦまたは他のアポトーシス誘導サイトカインで対象を処置することを含む、態様１から３１のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３３．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つの抗体または抗体断片、たとえば、腫瘍もしくはがん関連抗原に結合する抗体、またはたとえば、がん、新生物もしくは腫瘍に対する免疫応答を調節する抗体で対象を処置することを含む、態様１から３２のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３４．少なくとも１つの他の免疫療法が、少なくとも１つのアプタマー、センスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドで対象を処置することを含む、態様１から３３のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３５．少なくとも１つの他の免疫療法が、細胞、たとえば、自家性または組織適合免疫細胞で対象を処置することを含む、態様１から３４のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３６．少なくとも１つの他の免疫療法が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、または樹状細胞で対象を処置することを含む、態様１から３５のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３７．少なくとも１つの他の免疫療法が、ケモカイン、サイトカイン、オリゴデオキシヌクレオチド、抗体（たとえば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＤ２、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ５２）、チェックポイント阻害剤、または生物学的製剤（たとえば、必ずしもプルシアンブルーナノ粒子にコンジュゲートしていない抗原特異的Ｔ細胞または抗原提示細胞）からなる群から選択される少なくとも１つ以上の薬剤で対象を処置することを含み、前記薬剤は、任意で前記ナノ粒子に共有結合または非共有結合によって結合しているまたは会合しており、前記ケモカインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるケモカインから選択してもよく、前記サイトカインは、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるサイトカインから選択してもよい、態様１から３７のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３８．少なくとも１つの他の免疫療法が、その全体が参照により組み込まれる、Ｇａｌｕｚｚｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５（２４）：１２４７２−１２５０８（２０１４）により記載される免疫療法の群から選択される免疫療法で対象を処置することを含む、態様１から３７のいずれか１つに記載の組合せ方法。
３９．ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００％もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍負荷、腫瘍転移、または腫瘍成長速度を低減する、あるいは、ナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独で処置された対象（複数可）の生存率と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、４８、もしくは６０ヶ月、またはナノ粒子もしくは免疫療法での別々の処置の総計よりも多く、平均生存期間を増やす、態様１から３８のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４０．ナノ粒子ベースの療法単独でまたは免疫療法単独で処置された対象と比べて、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００％もしくはそれよりも多く、またはナノ粒子ベースの療法単独でもしくは免疫療法単独での別々の処置の総計よりも多く、腫瘍再発を低減する、態様１から３９のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４１．前記対象が、がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍、または過形成、疣贅、もしくは異常な細胞増殖に関連している他の状態を有する、あるいはウイルス、細菌、真菌、酵母、または寄生虫に感染している、態様１から４０のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４２．前記対象が、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態を有する、態様１から４１のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４３．前記対象が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がんを有する、態様１から４２のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４４．前記対象が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がんを有する、態様１から４３のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４５．前記対象が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア（hemihyperplasia）、乳房過形成（hyperplasia of the breast）、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成（compensatory liver hyperplasia）を有する、態様１から４４のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４６．対象が、ウイルス、細菌、酵母、真菌、または寄生虫感染を有する、態様１から４５のいずれか１つに記載の組合せ方法。
４７．プルシアンブルーナノ粒子および態様１のいずれか１つに記載の免疫療法を実施するのに適した少なくとも１つの免疫療法剤を含む組成物であって、前記免疫療法剤が、抗体（たとえば、抗腫瘍抗原抗体）、抗体のエピトープ結合部分、細胞傷害性コンジュゲートを含む抗体コンジュゲート、放射性薬剤、他の腫瘍標的剤、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、免疫応答を調節する薬物または他の薬剤、標的細胞と相互作用する、認識する、または結合する免疫細胞または操作された細胞を含むがこれらに限定されない、免疫系を調節する免疫調節剤、薬物、または物質であり、前記免疫療法剤がプルシアンブルーナノ粒子と共有結合または非共有結合によって会合していてもよい、組成物。
４８．プルシアンブルーナノ粒子と組み合わせて細胞または血小板を含む、態様１から４６のいずれか１つに記載の方法を実施するのに適した組成物であって、前記細胞が、任意で、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、マスト細胞、顆粒球、および樹状細胞からなる群から選択され、標的細胞、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞と選択的に相互作用する、認識する、または結合する、組成物。
４９．プルシアンブルーナノ粒子および態様１から４６のいずれか１つに記載の免疫療法を実施するための少なくとも１つの免疫療法剤を含むキットであって、任意で、ナノ粒子および免疫療法成分を投与するための、印刷された、コンピュータ可読のまたはリンクアドレスされた（link-addressed）説明書、たとえば、投与量、投与経路、レジメン、および投与部位を含んでもよく、ナノ粒子および免疫療法成分を組み合わせた形態で、または異なる容器中の別々の成分として含有していてもよく、そのような成分は乾燥したまたは濃縮された形態で存在し、適切な復元用媒体、緩衝剤または生理的希釈剤を伴っていてもよい、キット。
５０．標的細胞に対して、たとえば、がん、悪性、新生物または腫瘍細胞に対して少なくとも１つの免疫療法作用を示す、または示すように操作もしくは処理されているプルシアンブルーナノ粒子を含み、それと共有結合または非共有結合によって会合している細胞。
５１．生細胞、不活化非増殖性細胞（たとえば、放射線または化学剤により処理されている細胞）または死んだもしくは断片化した細胞である、態様５０に記載の細胞。
５２．悪性細胞または他の標的細胞である、態様５０から５１のいずれか１つに記載の細胞。
５３．非悪性細胞、たとえば、免疫細胞または少なくとも１つのがん、新生物または腫瘍エピトープを特異的に認識する細胞である、態様５０から５２のいずれか１つに記載の細胞。
５４．幹細胞、臍帯血細胞、または他の免疫的無感作細胞（immunologically naive cell）である、態様５０から５３のいずれか１つに記載の細胞。
５５．少なくとも１種のヒト単核末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞である、態様５０から５４のいずれか１つに記載の細胞。
５６．ペプチド抗原（複数可）をパルスされているまたは曝露されている、自家性、同種、異種または合成抗原提示細胞に、たとえば、がん、新生物または腫瘍の１つ以上の抗原または病原体の１つ以上の抗原または１つ以上の自己抗原を表すオーバーラップペプチドライブラリーに曝露することにより刺激されている少なくとも１つのヒト単核末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞である、態様５０から５５のいずれか１つに記載の細胞。
５７．Ｔ細胞（細胞傷害性、ヘルパー、デルタ−ガンマ、およびＮＫ細胞型を含む）、プレＴ細胞またはＴ細胞前駆細胞である、態様５０から５６のいずれか１つに記載の細胞。
５８．マクロファージまたは単球である、態様５０から５７のいずれか１つに記載の細胞。
５９．Ｂ細胞である、態様５０から５８のいずれか１つに記載の細胞。
６０．好中球、好酸球、好塩基球または他の白血球である、態様５０から５９のいずれか１つに記載の細胞。
６１．がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞由来の少なくとも１つの抗原もしくはエピトープ、あるいは過形成、疣贅、異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも１つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、態様５０から６０のいずれか１つに記載の細胞。
６２．副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物もしくは腫瘍または関連状態由来の少なくとも１つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、態様５０から６１のいずれか１つに記載の細胞。
６３．白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを特異的に認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、態様５０から６２のいずれか１つに記載の細胞。
６４．神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん
由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、態様５０から６３のいずれか１つに記載の細胞。
６５．良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識するＴ細胞または他の免疫細胞である、態様５０から６４のいずれか１つに記載の細胞。
６６．ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、態様５０から６５のいずれか１つに記載の細胞。
６７．ナノ粒子を細胞に結合させる部分をさらに含み、前記部分がビオチンまたは（ストレプト）アビジンであり、ナノ粒子がそれぞれ（ストレプト）アビジンまたはビオチンを含む、態様５０から６６のいずれか１つに記載の細胞。
６８．前記細胞に結合する部分および標的細胞に結合する部分を含む少なくとも１つの二機能性または多機能性ナノ粒子を含む、態様５０から６７のいずれか１つに記載の細胞。
６９．少なくとも１つの検出可能マーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、態様５０から６８のいずれか１つに記載の細胞。
７０．少なくとも１つ以上の非細胞性薬剤に共有結合または非共有結合によって会合しているプルシアンブルーナノ粒子を含むコンジュゲートであって、
前記非細胞性薬剤が、任意で、分子、たとえば、ケモカイン、サイトカイン、酵素、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、ポリエチレングリコール、一本鎖ポリマー、フラーレン；高次分子構造体、たとえば、四次タンパク質構造体、ウイルス、ウイロイド、ウイルス様粒子、またはカプシド；架橋ポリマー、凝集体、ナノ粒子（金、銀、ニッケル、鉄、銅、亜鉛、またはその酸化物およびセラミックを含むナノ粒子；シリカナノ粒子；磁性ナノ粒子；放射性ナノ粒子；細胞傷害性ナノ粒子；重合体ミセルナノ粒子；ポリマー被覆鉄酸化物ナノ粒子；タンパク質充填ナノ粒子、セリウム酸化物ナノ粒子；ならびに任意でタンパク質分子または化学療法剤に結合しているナノダイアモンドを含む）、マイクロ粒子、リポソーム、ミセル、または他の非細胞性構造物を含んでいてもよく；
前記コンジュゲートが標的細胞上で少なくとも１つの免疫療法作用を示す、たとえば、がん、悪性、新生物、または腫瘍細胞の成長、転移、代謝、アポトーシス、または増殖を阻害する、コンジュゲート。
７１．少なくとも１つの非細胞性薬剤が、標的細胞上の少なくとも１つ以上の決定基に結合する、態様７０に記載のコンジュゲート。
７２．少なくとも１つの非細胞性薬剤が、標的細胞上または標的細胞周辺の免疫細胞上の少なくとも１つ以上の受容体と相互作用する、態様７０または７１に記載のコンジュゲート。
７３．少なくとも１つの非細胞性薬剤が、二機能性または多機能性であり、プルシアンブルーナノ粒子と標的細胞の両方に結合することができ、または標的細胞上と標的細胞に隣接する免疫細胞上の両方の決定基に結合することができる、態様７０、７１または７２に記載のコンジュゲート。
７４．非細胞性薬剤が、ケモカイン、たとえば、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるケモカインのうちのいずれかを含む、態様７０から７３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７５．非細胞性薬剤が、サイトカイン、たとえば、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（最後のアクセスＦｅｂｒｕａｒｙ  １２，２０１６）に記載されるサイトカインのうちのいずれかを含む、態様７０から７４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７６．非細胞性薬剤が、オリゴデオキシヌクレオチド、たとえば、標的細胞にまたはその成分に結合するアプタマー、核酸ベクターまたは構築物、センスまたはアンチセンスＤＮＡまたはｓｉ−ＲＮＡを含むＲＮＡを含む、態様７０から７５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７７．非細胞性薬剤が、抗体（たとえば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＤ２、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＤ４７、抗ＣＤ２０、および抗ＣＤ５２）、二特異性抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合部分、または抗体のＣＤＲ；特に標的細胞または標的細胞特異的抗原もしくはエピトープに特異的に結合する抗体または抗体成分あるいは標的細胞上または標的細胞近傍の細胞上の受容体と特異的に相互作用する抗体または抗体成分を含む、態様７０から７６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７８．非細胞性薬剤がチェックポイント阻害剤である、態様７０から７７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
７９．非細胞性薬剤が、少なくとも１つのがん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍細胞、抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、態様７０から７８のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８０．非細胞性薬剤が、過形成、疣贅、または異常な細胞増殖に関連する他の状態に、またはウイルス、細菌、もしく寄生虫による感染もしくは日和見感染に関連する少なくとも１つの抗原もしくはエピトープに由来する少なくとも１つの抗原もしくはエピトープに結合する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマー、または他のリガンドである、態様７０から７９のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８１．非細胞性薬剤が、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、悪性腫瘍もしくはがん処置関連貧血、血管肉腫、星状細胞腫、基底細胞癌、胆道がん、膀胱がん、骨がん、脳転移、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド、子宮頸がん、軟骨肉腫、悪性腫瘍もしくはがん処置関連血液凝固障害、結腸がん、頭蓋咽頭腫、類腱腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、食道がん、線維肉腫、胃がん、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠芽腫、神経膠腫、組織球増殖症、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、軟膜腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、肝臓がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、奇胎妊娠、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（Ｍ−ＧＵＳ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、上咽頭がん、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、乏突起神経膠腫、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、松果体実質性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、唾液腺がん、類上皮肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、皮膚がん、精巣がん、膣がん、外陰部がん、もしくはワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはその転移からなる群から選択される小児、非小児、もしくは成人がん、悪性腫瘍、新生物、もしくは腫瘍または関連する状態由来の少なくとも１つの抗原もしくはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様７０から８０のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８２．非細胞性薬剤が、白血病、脳もしくは他の中枢神経系腫瘍、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ならびに骨がん、またはその転移からなる群から選択される小児がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを特異的に認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様７０から８１のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８３．非細胞性薬剤が、神経芽細胞腫、黒色腫もしくは転移性黒色腫、または非小細胞肺がん由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様７０から８２のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８４．非細胞性薬剤が、良性もしくは腫瘍性前立腺過形成、クッシング病、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、ヘミハイパープラシア、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成、脂腺過形成、または代償性肝臓過形成由来の少なくとも１つの抗原またはエピトープを認識する、抗体、抗体の抗原結合部分、アプタマーまたは他のリガンドである、態様７０から８３のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８５．ナノ粒子を細胞に結合させる、天然もしくは外来性の受容体、エピトープ、または他の部分をさらに含む、態様７０から８４のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８６．プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が共有結合している、態様７０から８５のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８７．プルシアンブルーナノ粒子と非細胞性薬剤が、たとえば、ナノ粒子上のビオチンまたは（ストレプト）アビジンの非細胞性薬剤上の（ストレプト）アビジンまたはビオチンへのそれぞれの結合を介して、非共有結合している、態様７０から８６のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８８．非細胞性薬剤が、二機能性であり、前記非細胞性薬剤に結合する部分および標的細胞に結合するまたは相互作用する部分を含む少なくとも１つの二機能性または多機能性プルシアンブルーナノ粒子を含む細胞を認識するまたは相互作用する、態様７０から８７のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
８９．抗がん剤、毒素または放射性薬剤を含むがこれらの限定されない、少なくとも１つの検出可能なマーカーまたは免疫療法剤をさらに含む、態様７０から８８のいずれか１つに記載のコンジュゲート。
９０．被覆され、配合されまたは組み合わされていない他の点では同一のナノ粒子と比べて、血液、血漿またはリンパ液中でのプルシアンブルー成分の分解（たとえば、ヒドロキシルイオンまたは他の反応性成分との接触により引き起こされる分解）を低減するまたは妨げる少なくとも１つの物質を被覆されている、配合されているまたは組み合わされている、プルシアンブルーナノ粒子。
９１．血液、血漿、ＣＳＦ、組織液、リンパ液または他の体液中にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０分間またはナノ粒子ががん、新生物もしくは腫瘍細胞もしくは他の標的細胞と接触するのに十分な他の時間、および任意でナノ粒子が前記標的細胞に結合するまたはエンドサイトーシスによって取り込まれるのに十分な時間、および任意でナノ粒子が光熱処置中に適用される放射線を吸収するのに十分な時間、プルシアンブルー成分の分解を実質的に妨げる、態様９０に記載のナノ粒子。
９２．血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子のプルシアンブルー成分とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つ、２つまたは３つの保護層を含む、態様９０または９１に記載のナノ粒子。
９３．ナノシェル、リポソーム、ミセル、またはリポソーム様合成粒子を含む、態様９０、９１または９２に記載のナノ粒子。
９４．コーティングを含む、態様９０から９３のいずれか１つに記載のナノ粒子。
９５．ＡＤＯＧＥＮ（登録商標）４６４、ＡＬＫＡＮＯＬ（登録商標）６１１２、ＢＲＩＪ（登録商標）５２、ＢＲＩＪ（登録商標）９３、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ４、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｏ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１０、ＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ２０、エチレンジアミンテトラキス（エトキシレート−ブロック−プロポキシレート）テトロール、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−２１０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−５２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−７２０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＯ−８９０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＤＭ−９９０、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＤＡ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＨＣＳ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＯＪ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＥ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）ＳＨ、ＭＥＲＰＯＬ（登録商標）Ａ、ポリ（エチレングリコール）ソルビタンテトラオレエート、ポリ（エチレングリコール）ソルビトールヘキサオレエート、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレン−ブロック−ポリ（エチレングリコール）、ソルビタンモノパルミテート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールエトキシレート、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ−１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１１４、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−４０５  ｒｅｄｕｃｅｄ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳ−３００、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＡ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＮ、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＯフッ素系界面活性剤、アクリル酸（ＡＡ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＰＡ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートナトリウム塩（ＡＯＴ）、ジヘキシルスルホサクシネートナトリウム塩（ＡＭＡ−８０）、Ａｍｐｈｉ−Ｄｅｘ、アクリロニトリル（ＡＮ）、ビス（２−ピリジルメチル）−オクタデシルアミン（ＢＰＭＯＤＡ）、ＢＲＩＪ（登録商標）３０（ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル）、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート（［Ｃ４ｍｉｍ］ＰＦ６）、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（ＣＡ８９７）、ＣＭＣ−Ａ９、カルボキシメチル化ポリ（エチレングリコール）（ＣＭＰＥＧ）、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）、セチルトリメチルアンモニウム塩化物（ＣＴＭＡ−Ｃｌ）、ジドデシルジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ドデカン酸２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルエステル（ＤＤＡ−ＨＥＥＥ）、デシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＤｅＴＡＢ）、ドデシルメルカプタン（ＤＤＭ）、デキストランエステル（ＤｅｘＥｓｔ）、ＳＧ１ベース二機能性アルコキシアミン（ＤＩＡＭＡ−Ｎａ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、メタクリル酸ドデシル（ＤＭＡ）、メタクリル酸（ジメチルアミノ��エチル（ＤＭＡＥＭＡ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）（ＤＭＭＡ−ＰＳ）、ドデシルメルカプタン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、メタクリル酸コポリマー（ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ１００−５５）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ブチレン）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＫＬＥ３７２９）、ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）、モノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（乳酸）（ｍＰＥＯ−ＰＬＡ）、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＯＴＡＢ）、ポリアニリン−ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＡＮＩ−ＰＳＳ）、ポリ（γ−ベンジル−１−グルタメート）−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＢＧ−ＰＥＯ）、ポリ（ε−カプロラクタム）（ＰＣＬ）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）コポリマー（ＰＥ／Ｆ６８）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシルブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（ヘプタデカフルオロデシルアクリレート）（ＰＨＤＦＤＡ）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ラクチド−フマレート）（ＰＬＡＦ）、ポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリドフマレート）（ＰＬＧＦ）、ポリ（ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、プルロニックＦ−１０８、ポリ（α，β−ｌ−リンゴ酸）（ＰＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＭＡＡ））、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）エチレンジアミンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８）、ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＳＳ）、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、４−（ｖ−アクリロイルオキシアルキル）オキシベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＡＢＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＯＢＳ）、メタクリル酸ステアリル（ＳＭＡ）、５−スルホイソフタル酸ジメチルエステルナトリウム塩改変テトラカルボン酸終端ポリエステル（ＳＭＴＡＰＥ）、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、ソルビタントリオレート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）、および過硫酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む、から本質的になる、またはからなるポリマーからなる群から選択されるコーティングを含む、態様９０から９４のいずれか１つに記載のナノ粒子。
９６．好ましくは徐放形態で、またはヒドロキシルイオンもしくは他の反応性種を中和し、したがって、ナノ粒子のプルシアンブルー成分の分解を阻害するコーティングとして、少なくとも１つの緩衝剤を含む、態様９０から９５のいずれか１つに記載のナノ粒子。
９７．血液、血漿またはリンパ液中でのナノ粒子とヒドロキシルイオンの間の接触を低減するまたは妨げる少なくとも１つの保護層を含み、任意で、前記保護層がｐＨ７．０〜８．０で安定であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．５で安定である、態様９０から９６のいずれか１つに記載のナノ粒子。
９８．血液、血漿もしくはリンパ液、またはわずかにアルカリ性の生理的溶液中にある間プルシアンブルー成分の実質的分解を妨げる少なくとも１つの天然または合成ポリマーコーティングを含む、態様９０から９７のいずれか１つに記載のナノ粒子。
９９．態様９０から９８のいずれか１つに記載のナノ粒子を投与することを含む、光熱療法または組み合わされた光熱と免疫療法を必要とする対象を処置するための方法。
【００３７】
［実施例］
生理的に安定なプルシアンブルーナノ粒子
プルシアンブルーは、ＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合からなる面心立体格子構造を有する混合原子価ヘキサシアノ鉄酸鉄ナノ粒子で構成された古くからの色素である。プルシアンブルーナノ粒子（ＰＢ  ＮＰ）は撮像および治療能力を有するが、ヒドロキシルイオンはＰＢ  ＮＰ格子のＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合を攻撃して、分解を引き起こす。この１０年間にわたり、プルシアンブルーナノ粒子（ＰＢ  ＮＰ）は、その合成およびその特性を目的に合わせるのが容易なので、生物医学研究において撮像および治療応用での使用について調査されることが増えてきている。撮像および治療応用でのＰＢ  ＮＰの使用は、その固有の生理的安定性を暗黙のうちに示している。しかし、多くの生理液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液の特徴的性質である、わずかにアルカリ性の溶液中で行われた研究では、過剰なヒドロキシルイオンの存在下ではＰＢ  ＮＰが不安定であることが示唆されており、ヒドロキシルイオンがＰＢ  ＮＰ格子のＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合を攻撃して、その急速な分解を引き起こすからである。本発明者らは、生理溶液中でのＰＢ  ＮＰ安定性の根底にある機構を解明することによりこれら外見上は矛盾する所見を説明しようと努めた。
【００３８】
第一に、ヒト血液／リンパ液のモル浸透圧濃度／イオン濃度を模倣するのに使用されるわずかにアルカリ性の生理緩衝液である、リン酸緩衝食塩水中でのＰＢ  ＮＰの分解が説明される。次に、血清の主成分であるアルブミンで被覆された場合の、ナノ粒子上でのタンパク質コロナの形成による保護効果を示す、ＰＢ  ＮＰの改善された安定性および遅くなった分解が実証される。したがって、生理溶液中での調節可能な分解動力学を与えるための生体適合性ポリマーでＰＢ  ＮＰを被覆する交互積層（layer-by-layer）戦略が実行される。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの撮像および治療応用における使用のための目的に適合可能な分解特性を有する安定なＰＢ  ＮＰの設計が可能になる。生理溶液中のタンパク質はＰＢ  ＮＰを分解から部分的に保護し、交互積層ポリマーコーティングアプローチを実行してＰＢ  ＮＰ分解を制御することが可能であることを発明者らは認識した。
【００３９】
プルシアンブルーナノ粒子（ＰＢ  ＮＰ）は、多様な生物医学応用における使用について最近まで調査されてきた混合原子価鉄ベースのシアノ金属酸ナノ粒子である。ＰＢ  ＮＰはＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合からなる面心立体格子構造を有する。Ｍ．Ｓｈｏｋｏｕｈｉｍｅｈｒ，Ｅ．Ｓ．Ｓｏｅｈｎｌｅｎ，Ａ．Ｋｈｉｔｒｉｎ，Ｓ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄ．Ｈｕａｎｇ，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，９７（２０１０）５８を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＢ  ＮＰは、放射性被曝の処置のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を受けており（ラディオガルダーゼとして市販されている）、臨床的に放射性セシウムおよびタリウム中毒を効果的に処置するのに使用されてきた。Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｚｉｊｌ，Ｈ．Ｃ．Ｊｏｏｒｅ，Ａ．ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｆ．Ｃ．Ｗｉｅｒｃｋｘ，Ｔ．Ｊ．Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｇｌｅｒｕｍ，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３１（１９９３）５５３；Ｐ．Ｊ．Ｆａｕｓｔｉｎｏ，Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｊ．Ｐｒｏｇａｒ，Ｃ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，Ｎ．Ｓａｄｒｉｅｈ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｙ，Ｅ．Ｌｅｕｔｚｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｐｌａｃｅ，Ｅ．Ｐ．Ｄｕｆｆｙ，Ｆ．Ｈｏｕｎ，Ｓ．Ａ．Ｌｏｅｗｋｅ，Ｖ．Ｊ．Ｍｅｃｏｚｚｉ，Ｃ．Ｄ．Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｋｈａｎ，Ａ．Ｓ．Ｈｕｓｓａｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｌｙｏｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，４７（２００８）１１４；Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｐ．Ｊ．Ｆａｕｓｔｉｎｏ，Ｊ．Ｊ．Ｐｒｏｇａｒ，Ｃ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，Ｎ．Ｓａｄｒｉｅｈ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｙ，Ｅ．Ｌｅｕｔｚｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｐｌａｃｅ，Ｅ．Ｐ．Ｄｕｆｆｙ，Ｌ．Ｘ．Ｙｕ，Ｍ．Ａ．Ｋｈａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｌｙｏｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３５８（２００８）１８７；およびＨ．Ｈ．Ｋａｍｅｒｂｅｅｋ，Ａ．Ｇ．Ｒａｕｗｓ，Ｍ．ｔｅｎ  Ｈａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．ｖａｎ  Ｈｅｉｊｓｔ，Ａｃｔａ  Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．，１８９（１９７１）３２１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。さらに、ＰＢ  ＮＰは、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）剤、光音響画像剤、およびマルチモーダイルイメージング剤、たとえば、組合せＭＲＩ／蛍光撮像法および組合せコンピュータ断層撮影（ＣＴ）／光音響撮像法を含む撮像剤としてのその使用を記載している公表された研究において実証されているように、撮像能力を有するように合成されてきた。Ｍ．Ｆ．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｓ．Ｙａｄａｖｉｌｌｉ，Ｒ．Ｗ．Ｓｚｅ，Ｊ．Ｎａｚａｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．，９（２０１４）２５８１；Ｍ．Ｓｈｏｋｏｕｈｉｍｅｈｒ，Ｅ．Ｓ．Ｓｏｅｈｎｌｅｎ，Ｊ．Ｈａｏ，Ｍ．Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，Ｃ．Ｆｌａｓｋ，Ｘ．Ｆａｎ，Ｊ．Ｐ．Ｂａｓｉｌｉｏｎ，Ｓ．Ｂａｓｕ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄ．Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０（２０１０）５２５１；Ｗ．Ｚｈｕ，Ｋ．Ｌｉｕ，Ｘ．Ｓｕｎ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｌｉ，Ｌ．Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｚ．Ｌｉｕ，ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，７（２０１５）１１５７５；Ｘ．Ｌ���ａｎｇ，Ｚ．Ｄｅｎｇ，Ｌ．Ｊｉｎｇ，Ｘ．Ｌｉ，Ｚ．Ｄａｉ，Ｃ．Ｌｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈｕａｎｇ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４９（２０１３）１１０２９；Ｍ．Ｆ．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｈ．Ａ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｐ．Ｒ．Ｙｏｏｎ，Ｌ．Ｓ．Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｓ．Ｒ．Ｓａｈａ，Ｊ．Ｐａｇｌｉｏｎｅ，Ｒ．Ｗ．Ｓｚｅ，ａｎｄ  Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５（２０１４）１２９；Ｊ．Ｍ．Ｖｏｊｔｅｃｈ，Ｊ．Ｃａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，Ｍ．Ｆ．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｒ．Ｗ．Ｓｚｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，９８（２０１５）ｅ５２６２１；およびＬ．Ｊｉｎｇ，Ｘ．Ｌｉａｎｇ，Ｚ．Ｄｅｎｇ，Ｓ．Ｆｅｎｇ，Ｘ．Ｌｉ，Ｍ．Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｌｉ  ａｎｄ  Ｚ．Ｄａｉ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５（２０１４）５８１４を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＢ  ＮＰは、治療応用にも使用されてきた。具体的に、ＰＢ  ＮＰはこれまで光熱療法（ＰＴＴ）用に使用され、この療法は限定された近赤外線（ＮＩＲ）波長（６５０〜９００ｎｍ）での吸収ピークを示すＰＢ  ＮＰの特性を利用する。Ｇ．Ｆｕ，Ｗ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｌｉ，Ｙ．Ｊｉｎ，Ｌ．Ｊｉａｎｇ，Ｘ．Ｌｉａｎｇ，Ｓ．Ｆｅｎｇ，Ｚ．Ｄａｉ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，２５（２０１４）１６５５；およびＨ．Ａ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｌ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｍ．Ｆ．Ｄｕｍｏｎｔ，Ａ．Ｄ．Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｒ，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，４（２０１４）２９７２９を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、ＰＢ  ＮＰは低出力ＮＩＲレーザーに曝露されると熱が上がる。ＰＢ  ＮＰベースのＰＴＴを使用すれば、ナノ粒子の腫瘍内および静脈内注入後腫瘍を切除する（熱的に破壊する）ことが可能になる。Ｌ．Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｇｏｎｇ，Ｗ．Ｚｈｕ，Ｊ．Ｌｉｕ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｚ．Ｌｉｕ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３５（２０１４）９８４４を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。他のグループは、磁気誘導化学療法、併用ＰＴＴ／化学療法、光熱的に増強された遺伝子または薬物送達用におよびＰＢ  ＮＰが治療と診断薬の両方として機能するセラノスティック使用のためにＰＢ  ＮＰを同様に使用してきた。Ｍ．Ｂ．Ｚａｋａｒｉａ，Ａ．Ａ．Ｂｅｌｉｋ，Ｃ．Ｈ．Ｌｉｕ，Ｈ．Ｙ．Ｈｓｉｅｈ，Ｙ．Ｔ．Ｌｉａｏ，Ｖ．Ｍａｌｇｒａｓ，Ｙ．Ｙａｍａｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ｃ．Ｗｕ，Ｃｈｅｍ．Ａｓｉａｎ  Ｊ．，１０（２０１５）１４５７；Ｐ．Ｘｕｅ，Ｋ．Ｋ．Ｃｈｅｏｎｇ，Ｙ．Ｗｕ  ａｎｄ  Ｙ．Ｋａｎｇ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ｂ．，１２５（２０１５）２７７；Ｍ．Ｗｕ，Ｑ．Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｊ．Ｌｉｕ，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，５（２０１５）３０９７０；Ｘ．Ｄ．Ｌｉ，Ｘ．Ｌ．Ｌｉａｎｇ，Ｆ．Ｍａ，Ｌ．Ｊ．Ｊｉｎｇ，Ｌ．Ｌｉｎ，Ｙ．Ｂ．Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｓ．Ｆｅｎｇ，Ｇ．Ｌ．Ｆｕ，Ｘ．Ｌ．Ｙｕｅ  ａｎｄ  Ｚ．Ｆ．Ｄａｉ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ．，１２３（２０１４）６２９；およびＰ．Ｘｕｅ，Ｊ．Ｂａｏ，���．Ｗｕ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｙ．Ｋａｎｇ，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，５（２０１５）２８４０１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００４０】
撮像および治療応用のためにＰＢ  ＮＰの利用に暗に含まれているのがその生理的（ｉｎ  ｖｉｖｏ）安定性である。しかし、電気化学の分野での研究では、プルシアンブルーフィルムがセンサー用途で広範に使用されており、過剰なヒドロキシルイオンの存在下では不安定であることが示唆されている。Ｆ．Ｒｉｃｃｉ  ａｎｄ  Ｇ．Ｐａｌｌｅｓｃｈｉ，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２１（２００５）３８９；およびＦ．Ｒｉｃｃｉ，Ａ．Ａｍｉｎｅ，Ｇ．Ｐａｌｌｅｓｃｈｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍｏｓｃｏｎｅ  Ｄ，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１８（２００３）１６５を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの過剰なヒドロキシルイオンはＰＢ  ＮＰの格子構造を構成しているＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合を攻撃して、その急速な分解を引き起こす。Ｋ．Ｉｔａｙａ，Ｈ．Ａｋａｈｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９（１９８２）１４９８；およびＡ．Ｋａｒｙａｋｉｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，１３（２００１）８１３を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ちなみに、多くの生理溶液がわずかにアルカリ性のｐＨ（たとえば、血液ｐＨ約７．４、リンパ液＞７．４）を有する。したがって、ＰＢ  ＮＰはこれらのわずかにアルカリ性の生理溶液中では攻撃されて急速に分解されると考えられる。この情報の目標は、わずかにアルカリ性の生理溶液、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏでの撮像および治療応用で典型的に遭遇する条件でのＰＢ  ＮＰの安定性（または一過性の安定性）についてのこれら外見上は矛盾する所見を解明することである。発明者らは、生理溶液で観察されるＰＢ  ＮＰの安定性は、ナノ粒子上の保護的タンパク質コーティングの形成に起因すること、および生体適合性ポリマーを用いたＰＢ  ＮＰの事前コーティングにより、発明者らはその生理的安定性および分解を制御することが可能であると仮定した。
【００４１】
この仮説を試験するため、発明者らは先ずＰＢ  ＮＰの安定性および分解特性を確定した。これらの研究はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で行われ、これは生理溶液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液のモル浸透圧濃度およびイオン濃度を模倣するために使用されるわずかにアルカリ性の緩衝液（ＰＨ７．４）である。具体的には、発明者らは、動的光散乱（ＤＬＳ）、可視近赤外線（Ｖｉｓ−ＮＩＲ）分光法、およびＰＴＴを使用してＰＢ  ＮＰの安定性を定量化した。ＤＬＳはナノ粒子のサイズ（流動力学的径）に関する情報を提供し、安定なＰＢ  ＮＰが２０〜３００ｎｍの範囲の単分散粒径分布を示すと予想されるように、コロイド安定性および凝集に関する情報を提供するのに使用することが可能である。Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法はＰＢ  ＮＰ格子のＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合に関する情報を提供する。これらの結合は、ＰＢ  ＮＰ格子のシアン化物架橋を通じたＦｅＩＩとＦｅＩＩＩの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、６５０〜９００ｎｍ波長の範囲でピーク吸収を生じる。ヒドロキシルイオンに攻撃されると、Ｖｉｓ−ＮＩＲスペクトルにおけるＰＢ  ＮＰの特徴的な吸収ピークに減少が見られると予想される。さらに、発明者らはＰＴＴにおいて使用するためのＰＢ  ＮＰの能力を測定しようと努めた。分解したＰＢ  ＮＰ（ヒドロキシルイオンによる攻撃後）は、安定で機能的なＰＢ  ＮＰと同じ温度まで熱くなるとは予想されない。したがって、発明者らは、ＰＢ  ＮＰのこのＰＴＴ能力をその機能性の尺度として使用する。
【００４２】
次に、発明者らは、アルブミン被覆ＰＢ  ＮＰの安定性および分解特性を試験する。これらの研究を行う理論的根拠は、生理溶液中でのＰＢ  ＮＰ保護が起こるのは、ＰＢ  ＮＰ保護タンパク質コロナの形成に起因する可能性があることである。Ｔ．Ｃｅｄｅｒｖａｌｌ，Ｉ．Ｌｙｎｃｈ，Ｓ．Ｌｉｎｄｍａｎ，Ｔ．Ｂｅｒｇｇａｒｄ，Ｅ．Ｔｈｕｌｉｎ，Ｈ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．Ａ．Ｄａｗｓｏｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ｌｉｎｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０４（２００７）２０５０；およびＡ．Ｓ．Ｐｉｔｅｋ，Ｄ．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｅ．Ｍａｈｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｍｏｎｏｐｏｌｉ，Ｆ．Ｂａｌｄｅｌｌｉ  Ｂｏｍｂｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｋ．Ａ．Ｄａｗｓｏｎ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７（２０１２）ｅ４０６８５を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。概念実証として、発明者らはアルブミンを代表的なタンパク質として使用した。なぜならば、アルブミンがもっとも豊富な血清タンパク質であり血液中のナノ粒子上で作成されるタンパク質コロナの主成分であるからである。Ｓ．Ｔｅｎｚｅｒ，Ｄ．Ｄｏｃｔｅｒ，Ｓ．Ｒｏｓｆａ，Ａ．Ｗｌｏｄａｒｓｋｉ，Ｊ．  Ｋｕｈａｒｅｖ，Ａ．Ｒｅｋｉｋ，Ｓ．Ｋ．Ｋｎａｕｅｒ，Ｃ．Ｂａｎｔｚ，Ｔ．Ｎａｗｒｏｔｈ，Ｃ．Ｂｉｅｒ，Ｊ．Ｓｉｒｉｒａｔｔａｎａｐａｎ，Ｗ．Ｍａｎｎ，Ｌ．Ｔｒｅｕｅｌ，Ｒ．Ｚｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．Ｍａｓｋｏｓ，Ｈ．Ｓｃｈｉｌｄ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈ．Ｓｔａｕｂｅｒ，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５（２０１１）７１５５を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、ＤＬＳ、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴを使用して結果として得られるアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰの安定性および分解特性を確定した。しかし、多様な組成物を有する生理溶液中のタンパク質コーティング（たとえば、血清タンパク質）に頼ると、変わりやすい予測不可能なＰＢ  ＮＰ分解動態をもたらすことがある。したがって、発明者らは、結果として得られたナノ粒子に調節可能な分解動態を与えるために、合成後生体適合性ポリマーをＰＢ  ＮＰの表面に結合させる前述の交互積層（ＬｂＬ）アプローチを使用することにより生理的に安定なＰＢ  ＮＰを合成しようと努めた。ポリマーコーティング技法は文献によく説明されており、ナノ粒子の生体適合性および安定性を増加するのに役立ち、ならびに生体機能付与を支援する。Ｗ．Ｇ．Ｋｒｅｙｌｉｎｇ，Ａ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｍｏｎｅｍ，Ｚ．Ａｌｉ，Ｆ．Ａｌｖｅｓ，Ｍ．Ｇｅｉｓｅｒ，Ｎ．Ｈａｂｅｒｌ，Ｒ．Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｓ．Ｈｉｒｎ，Ｄ．Ｊ．ｄｅ  Ａｂｅｒａｓｔｕｒｉ，Ｋ．Ｋａｎｔｎｅｒ，Ｇ．Ｋｈａｄｅｍ−Ｓａｂａ，Ｊ．Ｍ．Ｍｏｎｔｅｎｅｇｒｏ，Ｊ．Ｒｅｊｍａｎ，Ｔ．Ｒｏｊｏ，Ｉ．Ｒ．ｄｅ  Ｌａｒｒａｍｅｎｄｉ，Ｒ．Ｕｆａｒｔｅｓ，Ａ．Ｗｅｎｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｊ．Ｐａｒａｋ，Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０（２０１５）６１９；Ａ．Ｑｕａｒｔａ，Ａ．Ｃｕｒｃｉｏ，Ｈ．Ｋａｋｗｅｒｅ  ａｎｄ  Ｔ．Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，４（２０１２）３３１９；およびＦ．Ｚｈａｎｇ，Ｅ．Ｌｅｅｓ，Ｆ．Ａｍｉｎ，Ｐ．Ｒｉｖｅｒａ  Ｇｉｌ，Ｆ．Ｙａｎｇ，Ｐ．Ｍｕｌｖａｎｅｙ  ａｎｄ  Ｗ．Ｊ．Ｐａｒａｋ，Ｓｍａｌｌ，７（２０１１）３１１３を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。我々のＰＢ  ＮＰは、最初は相反する電荷の２つのポリマー、ポリアリルアミン塩酸塩およびポリ（アクリル酸）で、引き続いてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆される。ペグ化はナノ粒子合成では広く使用される。なぜならば、ペグ化はナノ粒子の血液循環時間を増やし、疎水性ナノ粒子成分の水溶性を増やし、その免疫原性および抗原性を減少させることによりナノ粒子を免疫系による攻撃から遮断するからである。Ｊ．Ｖ．Ｊｏｋｅｒｓｔ，Ｔ．Ｌｏｂｏｖｋｉｎａ，Ｒ．Ｎ．Ｚａｒｅ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓ．Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．，６（２０１１）７１５を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＤＬＳ、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴを使用して、発明者らは続けて、ＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰが非被覆ＰＢ  ＮＰよりも遅い分解動態を示すかどうか、ＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰが生理溶液中で安定のままであるかどうかを試験した。このアプローチは、生理溶液中でのＰＢ  ＮＰの安定性および分解を制御するこの設計アプローチを利用するための基盤を提供した。
【００４３】
材料  すべての合成手順は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から入手される１８．２ＭΩｃｍの抵抗力を有する超純水を使用して行った。ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム三水和物（ＭＷ４２２．３９；Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］・３Ｈ２Ｏ）、鉄（ＩＩＩ）塩化六水和物（ＭＷ２７０．３；Ｆｅ（Ｃｌ）３・６Ｈ２Ｏ）、ウシ血清由来のアルブミン、ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ；ＭＷ１５，０００）、ポリ（アクリル酸）溶液（ＰＡＡ；ＭＷ２，０００）、およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ０−エチルカルボジイミド塩酸塩；ＥＤＣ）はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入した。８０８ｎｍ近赤外線（ＮＩＲ）レーザーはＬａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。最後に、アミノ（ｍ）−ＰＥＧ−ＮＨ２（ＭＷ５，０００）はＮａｎｏｃｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から購入した。
【００４４】
ＰＢ  ＮＰの合成  前述のようにＰＢ  ＮＰは室温（ＲＴ）で合成された。Ｇ．Ｆｕ，Ｗ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｘ．Ｙｕｅ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４８（２０１２）１１５６７、Ｎ．Ｗ．Ｒｏｅｈｍ，Ｇ．Ｈ．Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｇｌａｓｅｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４２（１９９１）２５７を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。手短に言えば、５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中６．８ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２．５×１０−５モル）の水溶液を、５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中１０．６ｍｇのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６・３Ｈ２Ｏ（２．５×１０−５モル）を含有する水溶液に激しい撹拌下で添加した。１５分間の撹拌後、こうして得られた沈殿物を遠心分離（５分間２０，０００×ｇ）により収集し、超音波処理を使用してＭｉｌｌｉ−Ｑ水ですすぎ、ナノ粒子を懸濁した（マイクロチップ超音波処理器プローブＭｏｄｅｌ  Ｑ１２５、ＱＳｏｎｉｃａ、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）。粒子を最終的にＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁する前に収集およびすすぎ工程は少なくとも３回繰り返した。ＰＢ  ＮＰおよびＰＢ  ＮＰを作成し使用するための方法も「ＰＲＵＳＳＩＡＮ  ＢＬＵＥ−ＩＮＳＰＩＲＥＤ  ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＳ  ＦＯＲ  ＭＵＬＴＩＭＯＤＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＡＮＤ  ＴＨＥＲＡＰＹ」という表題の米国特許出願公開第２０１４０２７１４８７号を参照することにより組み込まれ、前記特許文献は参照によりその全体を組み込まれる。
【００４５】
ナノ粒子コーティング法  ＰＢ  ＮＰをアルブミンで覆うために、ウシ血清由来の０．３ｍｇのアルブミンを１ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中１ｍｇのＰＢ  ＮＰに添加し、ボルテックスし、オービタルシェーカー上、室温で少なくとも２時間混合させておいた。ＰＢ  ＮＰとアルブミンの最適な相対比率は、我々が既に記載している方法を使用してＰＢ  ＮＰのアルブミン結合能力に関する先行研究を行うことにより決定した。ＰＢ  ＮＰをアルブミンに接触させた後、２０，０００×ｇで５分間の遠心分離によりアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰを収集し、上澄みを捨てることにより未結合アルブミンはすすぎ落とした。アルブミン被覆ＰＢ  ＮＰは短時間の超音波処理により０．５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁し、収集およびすすぎ工程は少なくとも３回繰り返した。最後の遠心分離後、粒子はＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁した。
【００４６】
Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．により記載されているＬｂＬアプローチを少し修正を加えて使用し、ＰＢ  ＮＰを被覆した。手短に言えば、１ｍｇ／ｍＬのＰＢ  ＮＰを１０ｍＬ、室温で３０分間超音波処理下で４ｍｇ／ｍＬのＰＡＨの水溶液に液滴で添加した。次に、この溶液は少なくとも４時間激しく撹拌し、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＰＡＨ被覆ＰＢ  ＮＰ（ＰＢ−ＰＡＨ）を収集し、上記の通りＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁した。次に、ＰＢ−ＰＡＨナノ粒子を、室温で３０分間超音波処理下で４ｍｇ／ｍＬのＰＡＡに液滴で添加し、少なくとも４時間激しく撹拌し、上記の通りにすすいで、ＰＡＡ被覆ナノ粒子（ＰＢ−ＰＡＨ−ＰＡＡ）を得た。次に、１０ｍｇ／ｍＬのｍ−ＰＥＧ−ＮＨ２を、室温で３０分間超音波処理下でＰＢ−ＰＡＨ−ＰＡＡナノ粒子の溶液に液滴で添加した。次に、１０ｍｇのＥＤＣを添加して、溶液は撹拌しながら一晩インキュベートさせた。最終のＬｂＬ被覆ナノ粒子（ＰＢ−ＰＡＨ−ＰＡＡ−ＰＥＧ）をすすぎ、上記の通りに再懸濁した。ＬｂＬコーティングのそれぞれの工程後のナノ粒子の表面電荷（ゼータ電位）は補足情報に記載されている（図５）。
【００４７】
動的光拡散（ＤＬＳ）およびゼータ電位  すべてのナノ粒子のサイズおよびゼータ電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｋ．）を使用して測定した。ＰＢ  ＮＰ懸濁液はＭｉｌｌｉ−Ｑ水またはＰＢＳのいずれかで作成され、サイズおよび電荷解析は製造業者の仕様書を使用して実施した。
【００４８】
Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光法  種々のナノ粒子のＶｉｓ−ＮＩＲ吸光度スペクトルはＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアを使用してＧｅｎｅｓｙｓ１０Ｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で測定した。ＰＢ  ＮＰ懸濁液はＭｉｌｌｉ−Ｑ水またはＰＢＳで作成され、解析は製造業者の使用説明書により実施した。
【００４９】
ＰＴＴおよび生存率研究  すべてのＰＴＴ研究は８０８ｎｍ  ＮＩＲレーザーを使用し出力１．２５Ｗ／ｃｍ２で実施した。１００μＬの総容積のナノ粒子および／または細胞を９６ウェルプレートに蒔き、１０分間照射した。経時的な温度測定は熱電対（Ｏｍｅｇａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して行った。ＰＴＴ後の細胞生存率は、代謝産物の吸光度が生存率の尺度として測定されるＸＴＴアッセイ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して測定した。代謝的に活性な細胞のミトコンドリアはテトラゾリウム塩をホルマザンに切断することができ、ホルマザンは４９０ｎｍでの吸光度により測定することが可能である。
【００５０】
ＰＢ  ＮＰはＰＴＴ剤として安定であり機能的であった
発明者らは、それに続く比較研究のベースラインとして、ＤＬＳ、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴを使用して合成されたＰＢ  ＮＰ（すなわち、水中でのＰＢ  ＮＰ懸濁物質）の安定性および機能性を測定した。ＤＬＳにより測定した場合、合成されたＰＢ  ＮＰは５８．７７ｎｍの平均流体力学的径を示した（図１Ａ）。ＰＢ  ＮＰのＶｉｓ−ＮＩＲスペクトルは、ＰＢ  ＮＰ格子（Ａｍａｘ＝７０５ｎｍ）のシアン化物架橋を通じたＦｅＩＩとＦｅＩＩＩの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、６５０〜９００ｎｍのその特徴的吸収帯を示した（図１Ｂ）。発明者らは、出力密度１．２５Ｗ／ｃｍ２で１０分間８０８ｎｍレーザーを使用して９６ウェルプレートにおいて変動する濃度のＰＢ  ＮＰ（０．０１〜１．０ｍｇ／ｍＬ）上でＰＴＴを実施した。ＰＴＴは濃度依存様式でＰＢ  ＮＰ加熱を生じ、１．０ｍｇ／ｍＬのＰＢ  ＮＰは１０分後もっとも高い加熱（７９．４℃）を示した（図１Ｃ）。さらに、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞を切除するＰＢ  ＮＰの能力を評価した。０．１ｍｇ／ｍＬのＰＢ  ＮＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏ２ａ）細胞を光熱的に切除することができ、ＸＴＴアッセイにより測定した場合、細胞生存率の有意な７０．６％減少を生じた（ｐ＜０．０００１、図６）。非処置対照ｎｅｕｒｏ２ａ細胞と比べた場合、ＮＩＲレーザー（ｐ＝０．６５）もＰＢ  ＮＰ（ｐ＝０．１３）も単独ではｎｅｕｒｏ２ａ細胞にいかなる細胞障害性も生じなかった。これらのデータは、水中でのＰＢ  ＮＰ懸濁物の固有の安定性を例示している。これらのデータは単分散粒径分布を示し、ＰＢ  ＮＰの格子構造を含む結合に応じて、ＮＩＲ波長でのピーク吸光度を示している。さらに、ＰＢ  ＮＰはＰＴＴ用の効果的薬剤であり；ＰＢ  ＮＰは劇的に熱くなりがん細胞を切除することができる。
【００５１】
ＰＢ  ＮＰは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において分解しその安定性および機能性を失う
ＰＢ  ＮＰは水中に懸濁させた場合の使用では安定で効果的であるが、わずかにアルカリ性の生理溶液、たとえば、ＰＢＳに遭遇すると急速に分解する。ＰＢＳは無機塩（タンパク質も細胞成分もない）で構成され、ｐＨ７．４で、血液およびリンパ液のｐＨを模倣する。発明者らは再びＤＬＳ、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴ経時的温度測定を利用して、ＰＢＳ中でのＰＢ  ＮＰの安定性および機能性を測定した。ＰＢ  ＮＰがＰＢＳ中に懸濁している場合、ＤＬＳはナノ粒子の流体力学的サイズの顕著な増加を示し（図２Ａ）、ＰＢＳ中でのナノ粒子の凝集および不安定性が示唆された。この凝集がコロイド不安定の結果ではなく、むしろナノ粒子分解の結果であることを確かめるため、発明者らはＶｉｓ−ＮＩＲ分光法を使用して構成要素ＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合の安定性を評価した。予想通り、ＰＢＳとの接触時間が増えるに従って、ＰＢ  ＮＰ特徴的ＮＩＲピークの顕著な減少（４８時間後最初のピーク強度の２５．６％まで減少する）が観察され、これはＰＢＳ中のわずかに過剰なヒドロキシルイオンによるＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合の攻撃に起因すると考えられる（図２Ｂ）。さらに、２４時間ＰＢＳに接触したＰＢ  ＮＰはＰＴＴの１０分後に水中のＰＢ  ＮＰが達成したほどの高温を生じることができない（濃度依存性、図２Ｃ）。したがって、ＰＢ  ＮＰはわずかにアルカリ性の生理溶液、たとえば、ＰＢＳ中ではＰＴＴ剤としてのその機能性を急速に失う。溶液のｐＨが１０および１２までさらに増加するとその効果ははるかに劇的になり、１０分間のＰＴＴ（１．２５Ｗ／ｃｍ２）はもはやＰＢ  ＮＰを、ＰＢ  ＮＰなしで照射された水またはＰＢＳの温度上昇と同一の３５℃より上に加熱することはできない（図７）。これらのデータにより、生理的媒体に存在するヒドロキシルイオンがＰＢ  ＮＰのＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合を攻撃して、その分解を引き起こすこと、およびこの効果は溶液のｐＨが増加するに従って加速され著しくなることが示唆される。したがって、アルカリ性溶液でのＰＢ  ＮＰのこのような分解挙動を考慮することが急務である。ｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇する多くの生理溶液、たとえば、ヒト血液およびリンパ液はわずかにアルカリ性であり、予想通りに、ＰＢＳで観察される様式に類似する様式でＰＢ  ＮＰを分解して、不定で予測できないナノ粒子特性をもたらすと考えられる。ここで注目すべきなのは、ＰＢ  ＮＰを使用する文献中の研究はＰＢ  ＮＰのこの分解現象を記載していないことである。したがって、発明者らは、いかなる特定の解釈にも縛られることなく、それらの研究で観察されたＰＢ  ＮＰの安定性は思いがけなくナノ粒子上の保護コーティングの形成から生じたと仮定する。この仮定された保護コーティングは、非被覆ＰＢ  ＮＰ上に形成されるタンパク質コロナにより、またはＰＢ  ＮＰ（一般に使用されているクエン酸塩キャッピングされたＰＢ  ＮＰを含む）を二機能化するのに使用されたコーティングにより作成することができると考えられる。
【００５２】
アルブミンコーティングはＰＢＳ中でのＰＢ  ＮＰの安定性および機能性を改善する
ＰＢ  ＮＰを覆うタンパク質（タンパク質コロナ）は生理緩衝液中でＰＢ  ＮＰを安定化するのに貢献するという仮説を試験するため、ＰＢ  ＮＰをウシ血清由来のアルブミンの層で被覆した。こうして得られたアルブミン被覆ナノ粒子の特性を前述のＤＬＳ、Ｖｉｓ−ＮＩＲ、およびＰＴＴを使用して分析した。アルブミン被覆ＰＢ  ＮＰは多粒径分布を有する多分散を示し、９１．２８ｎｍでの高強度ピークおよびもっと大きな粒径分布でのもっと低い強度ピーク（図３Ａ）はＰＢ  ＮＰを確実に安定化するのに血清タンパク質の使用に頼ることの固有の困難さを例証している。単分散アルブミン被覆ＰＢ  ＮＰを作成することが可能であることにここで言及するのは重要であるが、これには、ｉｎ  ｖｉｖｏでは起こらないタンパク質の濾過、超音波処理、および濃度最適化を含むかなりの後処理が必要である。さらに、Ｖｉｓ−ＮＩＲスペクトル上の特徴的なＰＢ  ＮＰピークは４８時間かけて５７．１％まで減少し（図３Ｂ）、これは非被覆ＰＢ  ＮＰの分解動態（図２Ｂ）よりもささやかな改善である。同様に、ＰＢＳ中のアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰはＰＴＴの１０分後に水中で得た温度に類似する温度（それぞれ５１．７対６０．３℃）に到達できなかったが、それでも熱くなることはできた（図３Ｃ）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＢ  ＮＰ安定性および機能性を実証した以前公表された研究に光を当てた。これらの環境にはおそらくヒドロキシルイオンが存在するにもかかわらず、ことによるとタンパク質、たとえば、アルブミンは偶発的にｉｎ  ｖｉｖｏでＰＢ  ＮＰを保護していたのであろう。これらのデータは、タンパク質コロナが生理的環境においていかにしてＰＢ  ＮＰを保護しているのかの概念実証的説明を例証している。ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を示していた研究は思いがけなくこの方法に頼っていた可能性がある。しかし、以前に述べたように、生理溶液中に存在するタンパク質（たとえば、アルブミン、もっとも豊富な血清タンパク質）を使用してｉｎ  ｖｉｖｏで偶発的にＰＢ  ＮＰを保護するこの方法は予測できず不完全である。したがって、発明者らは、確実で合理的に設計された安定なナノ粒子を作成するためにＰＢ  ＮＰをバイオポリマーで被覆するＬｂＬアプローチを実行した。
【００５３】
ＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰはＰＢＳ中で安定で機能的である  同じ特徴付け技法を使用してＰＢＳ中でのＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰの安定性および機能性を分析した。ＤＬＳは、ＰＢＳ中のＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰが２２０．２ｎｍの平均流体力学的径を有する単分散粒径分布を有することを示している（図４Ａ）。さらに、ＰＢ  ＮＰのＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合に従ったＶｉｓ−ＮＩＲスペクトル上のピークはＰＢＳ中での４８時間後に吸光度のわずか２５％の消失を例示しており（図４Ｂ）、非被覆およびアルブミン被覆ＰＢ  ＮＰよりも改善された安定性を示している。重要なことに、ＰＢＳ中のＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰは、水中のＬｂＬ被覆ＰＢ  ＮＰと水中の非被覆ＰＢ  ＮＰの両方と比べてＰＴＴ後の温度の減少を示さず（１ｍｇ／ｍＬで７６．０℃に到達）、ＬｂＬコーティング後のＰＢ  ＮＰの改善された安定性および機能性を実証した（図４Ｃ）。確かに、ナノ粒子の安定性および機能性を改善するためにはさらなる研究、たとえば、ナノ粒子のサイズを制御する合成条件を最適化する、およびここに記載されるポリマーを用いたコーティングを変化させて（または異なる生体適合性ポリマーを使用して）ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用ごとにナノ粒子分解動態を目的に合わせる、を実施する必要がある。にもかかわらず、これらの研究は、多様な生理条件下で安定しているＰＢ  ＮＰを合成するための設計考慮事項の最初の概念実証としての役に立つ。
【００５４】
上記の研究結果により明らかにされるように、生理的環境（例えば、血液、リンパ液）は多くの場合わずかにアルカリ性であり、おそらく非被覆ＰＢ  ＮＰの分解を引き起すと考えられる。生理溶液、たとえば、ヒト血清（たとえば、アルブミン）に見いだされるタンパク質は、ＰＢ  ＮＰのＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合を遮蔽してそのような環境でのその分解を防ぐのに十分であることもあるが、この保護方法は予測不可能で信頼できないＰＢ  ＮＰ特性をもたらすことがある。臨床応用（撮像、治療、セラノスティック）のためのＰＢ  ＮＰのロバスト設計を保証するため、分解動態はきちんと説明され一貫していなければならない。ＰＢ  ＮＰが生体適合性ポリマーで被覆される合理的に設計されたＬｂＬコーティング法を利用すれば、生理溶液中でヒドロキシルイオン攻撃に対してＰＢ  ＮＰを保護することが可能であり、もっと長期間依然としてＰＢ  ＮＰが確実に安定し機能的であることが可能になる。これらの結果は、合理的に設計されたＬｂＬアプローチを使用して調節可能な分解動態を有するＰＢ  ＮＰに安定性および機能性を与える有用性を例示している。これらの研究は、臨床使用のための優れた性能特質を有するＰＢ  ＮＰベースのナノ粒子を設計するのに重要な工程である。
【００５５】
がんの光熱免疫療法のためのプルシアンブルーナノ粒子およびチェックポイント阻害
ナノ粒子はその多様な治療および撮像能力のせいでがんの処置に広範に使用されてきた。最近、ナノ粒子はがん治療のための免疫療法と組み合わせた調査もされてきた。なぜならば、これらの組合せはより永続性のある応答を提供し免疫を与える可能性を有するからである。本明細書では、発明者らは、一般的で治療困難な小児がんである神経芽細胞腫の「光熱免疫療法」のための抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害と組み合わせたプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）ベースの光熱療法を説明する。光熱免疫療法は、近赤外線レーザーおよび近赤外線光吸収ナノ粒子を使用して腫瘍を破壊する迅速で低侵襲性法として役に立つ。抗ＣＴＬＡ−４は、免疫抑制を逆転させ抗腫瘍応答を誘発する免疫チェックポイント阻害剤である。発明者らのナノ粒子合成計画はｐＨ依存安定性を示すＰＢＮＰを生じ、すなわち、このＰＢＮＰは、腫瘍間質を表すわずかに酸性のｐＨで安定であり血液およびリンパ液を模倣するわずかにアルカリ性の条件下では急速に分解する。マウス神経芽細胞腫モデルにおいて腫瘍内に投与されるＰＢＮＰを使用する光熱療法は腫瘍負荷および成長速度の急速な低減を誘発するが、その応答は不完全で腫瘍は再発する。しかし、ＰＢＮＰ併用抗ＣＴＬＡ−４ベースの光熱免疫療法により神経芽細胞腫保持マウスでは１００日目で５５％生存期間が得られる。これは、（ｉ）抗ＣＴＬＡ−４単独、（ｉｉ）光熱療法単独、および（ｉｉｉ）無処置で処置された動物において１００日目でそれぞれ１２．５％、０％、および０％の生存期間と比べられている。最後に、光熱免疫療法で処置され長期間生存したマウスは、神経芽細胞腫腫瘍再チャレンジに対する保護を示し、これらの腫瘍に対する免疫の発現ががんの処置のための新規の併用療法としての光熱免疫療法の可能性を例証していることが示唆される。
【００５６】
ナノ医療の分野の進歩によりがんを処置するための多機能性治療および撮像（「セラノスティック」）能力を有するナノ粒子がもたらされ、いくつかのナノ粒子はＦＤＡの認可を受けているまたは現在臨床評価を受けているのいずれかである。Ｓｃｈｕｔｚ，Ｃ．Ａ．；Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ−Ｊｅａｎｎｅｒｅｔ，Ｌ．；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｈ．；Ｌｙｎｃｈ，Ｉ．；Ｒｉｅｄｉｋｅｒ，Ｍ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ａｎｄ  ｕｎｄｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）２０１３，８（３），４４９−６７；およびＲｉｎｋ，Ｊ．Ｓ．；Ｐｌｅｂａｎｅｋ，Ｍ．Ｐ．；Ｔｒｉｐａｔｈｙ，Ｓ．；Ｔｈａｘｔｏｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１３，２５（６），６４６−５１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。がんナノ医療での目的の新興領域は、免疫系を特異的に標的にするおよび／または活性化する免疫療法と組み合わせたナノ粒子の使用である。Ｂｅａｒ，Ａ．Ｓ．；Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｌ．Ｃ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．；Ｐｅｒｎａ，Ｓ．Ｋ．；Ｍａｔｔｏｓ  Ａｌｍｅｉｄａ，Ｊ．Ｐ．；Ｌｉｎ，Ａ．Ｙ．；Ｅｃｋｅｌｓ，Ｐ．Ｃ．；Ｄｒｅｚｅｋ，Ｒ．Ａ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌ−ｅｎａｂｌｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３，８（７），ｅ６９０７３；Ｇｕｏ，Ｌ．；Ｙａｎ，Ｄ．Ｄ．；Ｙａｎｇ，Ｄ．；Ｌｉ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｚａｌｅｗｓｋｉ，Ｏ．；Ｙａｎ，Ｂ．；Ｌｕ，Ｗ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｈｏｌｌｏｗ  ｃｏｐｐｅｒ  ｓｕｌｆｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１４，８（６），５６７０−８１；Ｗａｎｇ，Ｃ．；Ｘｕ，Ｌ．；Ｌｉａｎｇ，Ｃ．；Ｘｉａｎｇ，Ｊ．；Ｐｅｎｇ，Ｒ．；Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２０１４，２６（４８），８１５４−６２；およびＺｈａｎｇ，Ｐ．；Ｃｈｉｕ，Ｙ．Ｃ．；Ｔｏｓｔａｎｏｓｋｉ，Ｌ．Ｈ．；Ｊｅｗｅｌｌ，Ｃ．Ｍ．，Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｅｎｔｉｒｅｌｙ  ｆｒｏｍ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎ��ｅ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２０１５，９（６），６４６５−７７を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの組合せ「ナノ免疫療法」は、従来のがん療法（たとえば、化学療法、手術、放射線療法）に対して改善され持続性のある応答の可能性および処置を受けた対象に免疫を与えてがんの再発に対する長期の保護を提供する可能性を与える。本研究では、発明者らは、がんを処置するためにプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）ベースの光熱治療（ＰＴＴ）を抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害と組み合わせる「光熱免疫療法」と名付けられた併用療法を説明する。
【００５７】
ナノ粒子ベースのＰＴＴは、近赤外線（ＮＩＲ）光吸収ナノ粒子および低出力ＮＩＲレーザーを使用して腫瘍負荷を低減するための迅速で低侵襲性の方法として機能する。Ｈｕａｎｇ，Ｘ．；Ｊａｉｎ，Ｐ．Ｋ．；Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｉ．Ｈ．；Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．，Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＰＴＴ）  ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｌａｓｅｒｓ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ２００８，２３（３），２１７−２８；およびＬｏｏ，Ｃ．；Ｌｏｗｅｒｙ，Ａ．；Ｈａｌａｓ，Ｎ．；Ｗｅｓｔ，Ｊ．；Ｄｒｅｚｅｋ，Ｒ．，Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ２００５，５（４），７０９−１１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。いくつかの報告では、動物がんモデル、たとえば、乳がん、扁平上皮癌、および前立腺がんにおいて金ナノシェル、金ナノロッド、金ナノケージ（nanocages）、および炭素ナノチューブを含む多様なナノ粒子を使用するＰＴＴの有効性が実証されている。Ｈｉｒｓｃｈ，Ｌ．Ｒ．；Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｊ．；Ｂａｎｋｓｏｎ，Ｊ．Ａ．；Ｓｅｒｓｈｅｎ，Ｓ．Ｒ．；Ｒｉｖｅｒａ，Ｂ．；Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｅ．；Ｈａｚｌｅ，Ｊ．Ｄ．；Ｈａｌａｓ，Ｎ．Ｊ．；Ｗｅｓｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｎａｎｏｓｈｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｎｄｅｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３，１００（２３），１３５４９−５４；Ｌａｌ，  Ｓ．；Ｃｌａｒｅ，Ｓ．Ｅ．；Ｈａｌａｓ，Ｎ．Ｊ．，Ｎａｎｏｓｈｅｌｌ−ｅｎａｂｌｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｉｍｐｅｎｄｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ．Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  ２００８，４１（１２），１８４２−５１；Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．；Ｄｒｅａｄｅｎ，Ｅ．Ｃ．；Ｈｕａｎｇ，Ｘ．；Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｉ．Ｈ．；Ｃｈｕ，Ｈ．；Ｐｕｓｈｐａｎｋｅｔｈ，Ｓ．；ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｆ．；Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．，Ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＰＴＴ）  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２００８，２６９（１），５７−６６；Ａｕ，Ｌ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｄ．；Ｚｈｏｕ，Ｆ．；Ｌｉ，Ｚ．Ｙ．；Ｌｉ，Ｘ．；Ｘｉａ，Ｙ．，Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｃａｇｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２００８，２（８），１６４５−５２；Ｃｏｂｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．；Ａｕ，Ｌ．；Ｃｈｅｎ，Ｊ．；Ｘｉａ，Ｙ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｃａｇｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒ��ａｌ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ２０１０，７（５），５７７−８７；Ｋａｍ，  Ｎ．  Ｗ．；  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．；Ｗｉｓｄｏｍ，Ｊ．Ａ．；Ｄａｉ，Ｈ．，Ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ａｓ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５，１０２（３３），１１６００−５；Ｙｕ，Ｊ．Ｇ．；Ｊｉａｏ，Ｆ．Ｐ．；Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｑ．；Ｊｉａｎｇ，Ｘ．Ｙ．；Ｐｅｎｇ，Ｚ．Ｇ．；Ｚｅｎｇ，Ｄ．Ｍ．；Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ’  ｕｓｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２０１２，８（３），３４８−５４；Ｂｕｒｋｅ，Ａ．Ｒ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｎ．；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｄ．Ｌ．；Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｃ．；  Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ，Ｒ．Ｂ．，Ｊｒ．；Ａｊａｙａｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｔｏｒｔｉ，Ｆ．Ｍ．；Ｔｏｒｔｉ，Ｓ．Ｖ．，Ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１２，３３（１０），２９６１−７０；Ｈｕａｎｇ，Ｎ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｚｈａｏ，Ｊ．；Ｌｕｉ，Ｈ．；Ｋｏｒｂｅｌｉｋ，Ｍ．；Ｚｅｎｇ，Ｈ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｌｌ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａｎｉｍａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｌａｓｅｒ  Ｓｕｒｇ  Ｍｅｄ  ２０１０，４２（９），６３８−４８；およびＳｔｅｒｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，Ｊ．；Ｋａｂｂａｎｉ，Ｗ．；Ｈｓｉｅｈ，Ｊ．Ｔ．；Ｃａｄｅｄｄｕ，Ｊ．Ａ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌａｓｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ．Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２００８，１７９（２），７４８−５３を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。本明細書では、発明者らは、その光熱特性がごく最近にしか記載されていない、ＰＢＮＰをＰＴＴ剤として利用する。Ｆｕ，Ｇ．；Ｌｉｕ，Ｗ．；Ｆｅｎｇ，Ｓ．；Ｙｕｅ，Ｘ．，Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｐｅｒａｔｅ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１２，４８，１１５６７−１１５６９；およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｈ．Ａ．；Ｃｈａｋａｒｂａｒｔｉ，Ｌ．；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．；Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｄ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．ＲＳＣ  Ａｄｖ  ２０１４，４（５６），２９７２９−２９７３４を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＴＴに使用された一般的な別のナノ粒子と比べて、ＰＢＮＰはいくつかの利点を提供し、すなわち、ワンポット合成計画を使用して単回のスケーラブルな工程で容易に合成され、高価な合成材料を必要とせず、放射性中毒を処置するためのヒト経口使用では既にＦＤＡ認可を受けている。Ｓｈｏｋｏｕｈｉｍｅｈｒ，Ｍ．；Ｓｏｅｈｎｌｅｎ，Ｅ．Ｓ．；Ｈａｏ，Ｊ．；Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，Ｍ．；Ｆｌａｓｋ，Ｃ．；Ｆａｎ，Ｘ．；Ｂａｓｉｌｉｏｎ，Ｊ．Ｐ．；Ｂａｓｕ，Ｓ．；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｄ．，Ｄｕａｌ  ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ＭＲＩ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｇｅｎｔｓ  Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｃｈｅｍ  ２０１０，２０，５２５１−５２５９；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｈ．Ａ．；Ｙｏｏｎ，Ｐ．Ｒ．；Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｌ．Ｓ．；Ｓａｈａ，Ｓ．Ｒ．；Ｐａｇｌｉｏｎｅ，Ｊ．；Ｓｚｅ，Ｒ．Ｗ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．，Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２０１４，２５（１），１２９−１３７；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．；Ｙａｄａｖｉｌｌｉ，Ｓ．；Ｓｚｅ，Ｒ．Ｗ．；Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｊ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．，Ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄ  ２０１４，９，２５８１−９５；Ｖｏｊｔｅｃｈ，Ｊ．Ｍ．；Ｃａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，Ｊ．；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．；Ｓｚｅ，Ｒ．Ｗ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．，Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ２０１５，（９８），ｅ５２６２１；Ｆａｕｓｔｉｎｏ，Ｐ．Ｊ．；Ｙａｎｇ，Ｙ．；Ｐｒｏｇａｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，Ｃ．Ｒ．；Ｓａｄｒｉｅｈ，Ｎ．；Ｍａｙ，Ｊ．Ｃ．；Ｌｅｕｔｚｉｎｇｅｒ，Ｅ．；Ｐｌａｃｅ，Ｄ．Ａ．；Ｄｕｆｆｙ，Ｅ．Ｐ．；Ｈｏｕｎ，Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｓｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｅｒｒｉｃ  ｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ：Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ．Ｊ  ��ｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ａｎａｌ  ２００８，４７（１），１１４−２５；Ｙａｎｇ，Ｙ．；Ｆａｕｓｔｉｎｏ，Ｐ．Ｊ．；Ｐｒｏｇａｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，Ｃ．Ｒ．；Ｓａｄｒｉｅｈ，Ｎ．；Ｍａｙ，Ｊ．Ｃ．；Ｌｅｕｔｚｉｎｇｅｒ，Ｅ．；Ｐｌａｃｅ，Ｄ．Ａ．；Ｄｕｆｆｙ，Ｅ．Ｐ．；Ｙｕ，Ｌ．Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈａｌｌｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｅｒｒｉｃ  ｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ：Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ２００８，３５３（１−２），１８７−９４；およびＦＤＡ：Ｒａｄｉｏｇａｒｄａｓｅ−ｆｅｒｒｉｃ  ｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ（ｉｉ）  ｃａｐｓｕｌｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２００８／０２１６２６ｓ００７ｌｂｌ．ｐｄｆ．（ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｍａｒｃｈ  ７，２０１７）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００５８】
さらに、発明者らは、ＰＢＮＰがｐＨ依存的様式で安定であり、このためにナノ粒子は分解することが可能であり、ＰＴＴ用に使用される非分解性ナノ粒子に対する利点となることを明らかにする。
【００５９】
がん治療のためにはナノ粒子ベースのＰＴＴが有望であるにもかかわらず、ＰＴＴ単独ではある特定の治療が困難なまたは進行がんを処置するには効果がないことがある。これらのがんは、改善された成績を達成するには典型的には組み合わせまたは多様式のアプローチを必要とする。この目的のために、発明者らは、抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害免疫療法と組み合わせたＰＢＮＰベースのＰＴＴを調査した。チェックポイント阻害はモノクローナル抗体を使用して、キーとなる重要な免疫チェックポイント、たとえば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を標的にして、免疫抑制を逆転させ、内在性免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞）を活性化することにより強力な抗腫瘍応答の制御を解く。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｈｅ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２，１２（４），２５２−６４；Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−４．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７，１３（１８  Ｐｔ  １），５２３８−４２；およびＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｌ．；Ｍｏｒｇａｎ，Ｃ．；Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｄ２  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ：Ａ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５，１０（６），ｅ０１２９２３７を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。抗ＣＴＬＡ−４（たとえば、イピリムマブ）および抗ＰＤ−１（たとえば、ニボルマブ）を含むチェックポイント阻害剤は、進行がん、たとえば、転移性黒色腫の処置にＦＤＡの認可を受けている。Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．；Ｏ’Ｄａｙ，Ｓ．Ｊ．；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．；Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｗ．；Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．；Ｈａａｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．；Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．；Ｈａｓｓｅｌ，Ｊ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０，３６３（８），７１１−２３；およびＷｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｋｌｕｇｅｒ，Ｈ．；Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｍ．Ｋ．；Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．；Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．；Ｌｅｓｏｋｈｉｎ，Ａ．Ｍ．；Ｓｅｇａｌ，Ｎ．Ｈ．；Ａｒｉｙａｎ，Ｃ．Ｅ．；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ａ．；Ｒｅｅｄ，Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１３，３６９（２），１２２−３３を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。それにもかかわらず、これらのがんでのチェックポイント阻害剤に対する応答は患者の中程度のサブセットに限られており、これにより患者のもっと大きなグルー���で改善された処置成績を誘発することが可能である療法の必要性が示唆されている。Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．；Ｃｈｅｓｎｅｙ，Ｊ．；Ｐａｖｌｉｃｋ，Ａ．Ｃ．；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．；Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｋ．；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．；Ｌｉｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｐ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｎ．；Ｇｉｇｕｅｒｅ，Ｊ．Ｋ．；Ａｇａｒｗａｌａ，Ｓ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ａｎｄ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｖｅｒｓｕｓ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１５，３７２（２１），２００６−１７を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００６０】
本研究では、発明者らは、ＰＢＮＰベースのＰＴＴを使用して腫瘍を局所的に切除し、したがって、腫瘍量を破壊し続いて抗ＣＴＬＡ−４を全身投与する新規の光熱免疫療法アプローチを提示する。具体的には、発明者の併用療法（図９）は、（１）ＰＢＮＰが腫瘍内に投与されＮＩＲレーザーを照射されて、最初の腫瘍切除の目的を果たすＰＴＴのための生分解性ＰＢＮＰ、および（２）ＰＴＴを補完する頑強な抗腫瘍免疫応答を誘発する腹腔内（ｉ．ｐ．）投与による抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤を使用する。光熱免疫療法の有効性は、神経芽細胞腫の治療困難なマウスモデルにおいて試験された。Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｌ．；Ａｂｏｕ−Ａｎｔｏｕｎ，Ｔ．；Ｖｕｋｍａｎｏｖｉｃ，Ｓ．；Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２，２，８２；およびＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｌ．；Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｄ．；Ｌｅｅ，Ｎ．Ｈ．；Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｉｄ２−ＴＧＦｂｅｔａ  Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｔｏ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３，８（１２），ｅ８３５２１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、この２つの療法、ＰＢＮＰベースのＰＴＴおよび抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害のこの新規の組合せは相乗的に作用していずれかのモダリティー単独を用いて得られる成績以上に成績を改善すると考えられると仮定した。我々の生分解性ＰＢＮＰを使用するＰＴＴにより、神経芽細胞腫マウスモデルでは腫瘍進行が遅くなり、腫瘍負荷が減少したが、これらの腫瘍は再発し、長期間生き残ったマウスはいなかった。これとは対照的に、抗ＣＴＬＡ−４免疫療法と併用したＰＢＮＰベースのＰＴＴでは、抗ＣＴＬＡ−４単独（１２．５％）、ＰＴＴ単独（０％）、または非処置のまま（０％）で処置した対照と比べて、マウスの有意に高い比率（５５％）で完全な腫瘍縮小および長期生存期間（＞１００日）が得られた。さらに、光熱免疫療法を用いて処置された長期生存マウスは、神経芽細胞腫腫瘍でチャレンジされた非処置の無感作マウスと比べて神経芽細胞腫腫瘍再チャレンジに対する保護を示し、光熱免疫療法処置マウスにおける免疫の発現が示された。我々の所見は、がんの処置のための新規の併用療法としての抗ＣＴＬＡ−４を併用したＰＢＮＰベースのＰＴＴ光熱免疫療法の有効性を実証している。
【００６１】
結果
ＰＢＮＰはｐＨ依存性分解および安定性を示す
ＰＢＮＰがｐＨ依存的様式で安定し分解するのかどうかを確定するために、発明者らは、可視ＮＩＲ（Ｖｉｓ−ＮＩＲ）分光法および動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、時間の関数としてならびに腫瘍内、すなわち、腫瘍間質および腫瘍リンパ管／脈管構造に投与されたナノ粒子が典型的に遭遇する条件を模倣する種々のｐＨレベルでＰＢＮＰの分解および安定性を測定した。腫瘍間質は少し酸性ｐＨ（約５．５）を示し、血液およびリンパ液はわずかにアルカリ性ｐＨ（約７．４）を示す。Ｍｅｎｇ，Ｆ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．；Ｄｅｎｇ，Ｃ．；Ｚｈｏｎｇ，Ｚ．，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｎａｎｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍａｔｅｒ  Ｔｏｄａｙ  ２０１２，１５，４３６−４４２；およびＳｏｎｇ，Ｃ．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．；Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｊ．，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  ｐＨ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｂ．Ｔ．Ｈ．Ｐ．，Ｅｄ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００６；ｐｐ  ２１−４２を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。発明者らは、７日間にわたり、３つのｐＨ、腫瘍間質ｐＨを表す５．５、中性ｐＨを表す７．０、および血液／リンパ液ｐＨを表す７．４でＰＢＮＰのＶｉｓ−ＮＩＲおよびＤＬＳ特性を測定した。
【００６２】
ＰＢＮＰのＶｉｓ−ＮＩＲスペクトルは、ＰＢＮＰ格子（λｍａｘ＝７０５ｎｍ）のシアン化物架橋を通じたＦｅＩＩとＦｅＩＩＩの間の金属間電荷移動のエネルギーに応じて、６５０〜９００ｎｍのその特徴的吸収帯を示した。分解したＰＢＮＰは無傷のＰＢＮＰと比べて減弱した吸収帯を示すと予想されるので、この特徴的吸収帯を使用してＰＢＮＰの分解を定量化した。ｐＨ５．５（腫瘍間質のｐＨ）でインキュベートしたＰＢＮＰは７日間にわたりそのＶｉｓ−ＮＩＲスペクトルにごくわずかな変化を示し（図１０Ａ）、ＰＢＮＰは７日間にわたりｐＨ５．５でわずかに分解したことを示している。同様に、中性ｐＨの７．０でインキュベートしたＰＢＮＰではわずかな分解特性が観察された（図１０Ｂ）。しかし、溶液のｐＨが７．０（中性）から７．４（血液およびリンパ液を模倣してわずかにアルカリ性）にわずかに増加するに従って、７日間の経過でＶｉｓ−ＮＩＲスペクトルピーク強度の有意な（５１％）低減（図１０Ｃ）が観察され、ｐＨ７．４でのＰＢＮＰの分解が示された。これはおそらく、ヒドロキシルイオンのわずかな過剰によりＰＢＮＰの特徴的なＦｅＩＩ−ＣＮ−ＦｅＩＩＩ結合が攻撃されて引き起こされたのであり、以前観察されたように、もしかすると水酸化物が形成されシアノ鉄酸塩イオンが放出されたのであろう。Ｉｔａｙａ，Ｋ．；Ａｋａｈｏｓｈｉ，Ｈ．；Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ：Ａｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １９８２，１２９（７），１４９８−１５００；およびＫａｒｙａｋｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ  ２００１，１３（１０），８１３−８１９を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＢＮＰ分解についてのこれらの所見は、６８０ｎｍでの光学密度測定およびこの波長でのその測定された質量消散係数を使用して時間とｐＨの関数としてＰＢＮＰ濃度を測定した研究により確証された。Ｖｉｓ−ＮＩＲ所見に類似して、ＰＢＮＰ濃度は７日後、ｐＨ７．４でその開始濃度の約４３％まで減少し、これらの条件下でのナノ粒子の分解を示し、一方で７日間にわたりｐＨ５．５および７．０では本質的に無変化のままであった。ナノ粒子安定性の補完的な尺度として、発明者らは経時的ＤＬＳ研究を実行し、この研究はナノ粒子粒径分布および安定性を評価するのに使用した。ＰＢＮＰはｐＨ５．５および７．０でインキュベートした場合安定であることが観察された（一定の平均流体力学的径；図１０Ｄおよび１０Ｅ）。
【００６３】
これとは対照的に、ＤＬＳはｐＨ７．４で７日間インキュベートした場合、ＰＢＮＰのナノ粒子集団を検出することはできず（図１０Ｆ）、この血液／リンパ液模倣ｐＨでのナノ粒子の攻撃を示している。総合すると、我々の所見は、我々のＰＢＮＰが、腫瘍間質（低いほうのｐＨ）を模倣する条件下では安定しており、血液およびリンパ液を模倣する条件下では分解する固有のｐＨ依存性分解および安定性を示すので腫瘍内投与に適していることを示している。図１０Ｇ〜１０Ｉは、ｐＨ５．５（図１０Ｇ）、ｐＨ７．０（図１０Ｈ）、およびｐＨ７．４（図１０Ｉ）での７日目のＰＢＮＰのＴＥＭ画像を示しており、わずかに酸性（５．５）および中性（７．０）ｐＨで検出可能なＰＢＮＰを、わずかにアルカリ性ｐＨ（７．４）で検出不可能なＰＢＮＰを示している。
【００６４】
ＰＢＮＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも酸性腫瘍ｐＨにおいて改善されたＰＴＴ能力を示す
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（図１１Ａ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（図１１Ｂ）でのそのＰＴＴ能力を評価することにより、ＰＢＮＰのｐＨ依存安定性がＰＴＴ剤としてのその機能に効果を及ぼすのかどうかを確定する研究を行った。発明者らは、ＰＢＮＰのＰＴＴ能力を濃度（０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ）の関数として上記の２つのｐＨ、５．５および７．４で測定した。発明者らは、ＰＢＮＰが５．５対７．４のｐＨでインキュベートした場合にはより高い温度まで熱くなり、これは濃度依存的様式で起こることを観察した（図１１Ａ）。これはおそらく、高いほうのｐＨでは、ＰＢＮＰがこれらの条件下ではその分解のせいでそのＰＴＴ能力の有意な低減を示すという事実に起因しており、我々の以前の知見と一致する。ＰＴＴ能力の低減も濃度依存性であり、ｐＨ７．４でインキュベートした１ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰは、ｐＨ５．５での１ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰと比べて、ＰＴＴ後温度が約１６℃減少を示し、０．１ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰはこれらのｐＨの間でＰＴＴ能力が約７℃減少を示した。
【００６５】
神経芽細胞腫の同系マウスモデルでのＰＢＮＰのＰＴＴ能力を測定した。ＰＢＮＰの分解および安定性特性を考慮すると、本研究の目標は、腫瘍の熱アブレーションに適した温度（すなわち、５０〜５５℃）を達成するのに効果的なＰＢＮＰの腫瘍内用量を決定することであった。ＩＲサーモグラフィーを使用して、１ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰを５０ＲＬ腫瘍内に注射された５ｍｍ腫瘍（約６０ｍｍ３腫瘍量）を保持するマウスは、１．８７５Ｗ／ｃｍ２レーザー出力密度で８０８ｎｍのＮＩＲレーザーを照射されると２〜４分で切除温度まで熱くなれることが確定された（図１１Ｂ）。これらの結果から、ＰＢＮＰが血液およびリンパ液温度と比べて腫瘍内ｐＨでさらに高い温度まで熱くなる場合ｐＨ依存性ＰＴＴ能力を示すことが示される。
【００６６】
ＰＴＴは神経芽細胞腫のマウスモデルにおいて腫瘍負荷を低減し腫瘍がない日数を増やす
次に、ＰＢＮＰベースのＰＴＴ処置が有効かどうかを神経芽細胞腫腫瘍モデルにおいて評価した。これらの研究では、発明者らは、皮下に注射された生物発光Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を使用する神経芽細胞腫のＮｅｕｒｏ２ａ同系マウスモデルを利用したが、このモデルは侵襲性腫瘍モデルであることが明らかにされている。腫瘍保持マウスは、１ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰを５０ＲＬ腫瘍内に注射され８０８ｎｍレーザーを照射される（１０分間１．８７５Ｗ／ｃｍ２）または非処置のままにしておく、のいずれかであった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。腫瘍生物発光は２日毎に測定されて、腫瘍進行および処置の有効性を評価した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。ＰＴＴ処置群のマウスは、非処置対照群のマウスと比べて処置後すぐにほぼ完全な腫瘍根絶を示し（最小測定生物発光；図１２Ａ）、対照群は一貫して腫瘍進行および成長を示した（測定生物発光の漸進的増加；図１２Ｂ）。複数の腫瘍進行研究の集計データによれば、腫瘍保持マウスがＰＴＴで処置されると、その腫瘍は急速に縮み、この群のマウスは腫瘍が再発する前に平均で３日の腫瘍なし日があることが示された（図１２Ｃ）。さらに、腫瘍進行は非処置対照群のマウスと比べてこれらのマウスは遅く、対照群は腫瘍量の顕著な増加による証拠として急速な腫瘍進行を示した。したがって、これらの結果によれば、この高度に侵襲性の神経芽細胞腫モデルにおいて、ＰＢＮＰベースのＰＴＴが腫瘍負荷を急速に低減し、腫瘍なしの日数を増やし腫瘍成長速度を減少することができることが示される。
【００６７】
ＰＴＴにより腫瘍領域へのリンパ球およびＴ細胞の浸潤が増加する  次に、発明者らは、ＰＢＮＰベースのＰＴＴがこの神経芽細胞腫マウスモデルにおいて免疫刺激効果を誘発するかどうかを評価しようと努めた。この目的のため、ＰＴＴ後の腫瘍浸潤リンパ球の相対比率を定量化する研究を行った。これらの研究では、神経芽細胞腫腫瘍保持マウスは、ＰＴＴ処置と非処置対照の２つの群に分けられた。ＰＴＴ後のリンパ球および特にＴ細胞の腫瘍発現レベルを測定するため、マウスは処置の２４および９６時間後に安楽死され、残りの腫瘍組織はいずれも単離された。腫瘍は処理されて単細胞懸濁液を得て、ＣＤ４５（リンパ球）およびＣＤ３（Ｔ細胞）発現についてフローサイトメトリーを使用して分析した。２４時間後、処置対非処置腫瘍においてリンパ球とＴ細胞集団に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、処置９６時間後、ＰＴＴ処置マウスの腫瘍はリンパ球（すなわち、ＣＤ４５＋の平均値；９．７ＰＴＴ処置対４．１％非処置；図１３Ａ〜１３Ｃ）およびＴ細胞（すなわち、ＣＤ３＋の平均値；６．２ＰＴＴ処置対２．２％非処置；図１３Ｄ〜１３Ｆ）浸潤の有意な（ｐ＞０．０５）増加を示した。これらの結果により、適切な時間の尺度が与えられるとＰＴＴ後腫瘍部位へのＴ細胞の動員が増加することが示唆される。発明者らは、ＰＴＴ処置マウスの脾臓Ｔ細胞が腫瘍細胞と共培養された場合、リコール応答（recall response）を示すかどうかを評価することによりＰＴＴがＴ細胞の包括的活性化をもたらしたかどうかも確定した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイはＰＴＴと対照群の間でリコール応答に有意差を示さず、ＰＴＴ単独では、腫瘍根絶の成功にとり重要である強いリコール免疫応答（recall immune response）を誘発することはできないことが示される。総合すると、これらの結果によれば、図１２に示されるように、ＰＴＴ単独でリンパ球およびＴ細胞の腫瘍領域への浸潤を刺激することは可能であるが、これらの効果は治療困難ながんを根絶するほど強くはないことが示唆される。
【００６８】
光熱免疫療法はマウスの腫瘍縮小および長期生存期間をもたらす  我々の神経芽細胞腫モデルで改善された治療成績のために抗腫瘍免疫応答を増やすために、発明者らはＰＢＮＰベースのＰＴＴと組み合わせて抗ＣＴＬＡ−４免疫療法を使用して、内在性免疫細胞の免疫抑制を減少させ強力な抗腫瘍免疫応答を刺激した。神経芽細胞腫腫瘍保持マウスは、１）ＰＴＴ＋抗ＣＴＬＡ−４群（ｎ＝９）：抗腫瘍ＰＴＴおよびｉ．ｐ．抗ＣＴＬＡ−４、２）ＰＴＴ群（ｎ＝６）：抗腫瘍ＰＴＴ、３）抗ＣＴＬＡ−４群（ｎ＝８）：ｉ．ｐ．抗ＣＴＬＡ−４、および４）非処置群（ｎ＝１０）：処置なしの４群に分けた（表１）。マウスの生物発光撮像法を通じた腫瘍進行と長期生存期間がモニターされた。
【００６９】
【表１】
2019512486.tif 000003
【００７０】
腫瘍特異的生物発光を測定する代表的経時的画像は、光熱免疫療法で処置されたマウスで腫瘍サイズの漸減およびそれに続く腫瘍の消失を示した（図１４Ａ）。さらに、腫瘍進行は、非処置対照と比べた場合、ＰＢＮＰベースのＰＴＴ＋抗ＣＴＬＡ−４群では有意に（ｐ＝０．０００２）遅かった（図１４Ｂ）。もっとも重要なことに、光熱免疫療法が処置マウスの５５．５％において完全腫瘍縮小および長期生存期間をもたらした（図１４Ｃ）。長期腫瘍なし生存期間は、抗ＣＴＬＡ−４単独（１２．５％）、ＰＴＴ（０％）、または非処置のまま（０％）で処置されたマウスについて観測された生存期間よりも有意に高かった（対数順位検定により決定）（ｐ＜０．０００１）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を枯渇させると、治療応答を抑制した（図１４Ｄ）。これらの結果によれば、ＰＴＴは腫瘍負荷の最初の低減を誘発し、これは残留腫瘍細胞を標的にして除去する抗ＣＴＬＡ−４処置により補完され、光熱免疫療法処置マウスで長期の腫瘍のない生存期間を与えたことが示唆される。したがって、我々の結果から、腫瘍保持マウスの有意に高い比率において完全腫瘍寛解および長期生存期間を確保する上での光熱免疫療法の可能性が示唆される。
【００７１】
光熱免疫療法で処置された長期生存マウスは、無感作、非処置マウスと比べて腫瘍再チャレンジに対する保護を示す  理想的な腫瘍療法は、腫瘍を効果的に根絶するだけではなく、身体からの除去に成功した後の再発を防止する療法だと考えられる。したがって、発明者らは次に、光熱免疫療法が、最初の腫瘍細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）で再チャレンジされた長期生存マウスにおいて保護を与えたのかどうかを調べた（図１５Ａ〜１５Ｄ）。我々の研究は２つの群：１）無感作群（ｎ＝３）：マウスは１０６のＮｅｕｒｏ２ａ細胞でチャレンジされたおよび２）再チャレンジ群（ｎ＝３）：前に光熱免疫療法で処置された長期生存マウスは少なくとも９０日の腫瘍なし生存期間の後１０６のＮｅｕｒｏ２ａ細胞で再チャレンジされた、からなっていた。注目すべきことに、長期生存マウスのすべてが腫瘍再チャレンジに対して保護を示した。なぜならば、これらのマウスは、急速な腫瘍進行が観察された対照マウス（図１５Ｂおよび１５Ｄ）と比べると、再チャレンジ腫瘍を急速に除去した（図１５Ａおよび１５Ｃ）からであった。再チャレンジマウスは、チャレンジの１２〜１４日後に高い腫瘍負荷のせいで安楽死させなければならなかった無感作マウスと比べて腫瘍再チャレンジ後９０日よりも長い間生存した。これらのデータによれば、長期生存マウスでの腫瘍免疫および腫瘍再チャレンジ／再発に対する保護を与える光熱免疫療法の可能性が示唆される。
【００７２】
上の結果は、がんの処置のためにＰＢＮＰベースのＰＴＴと抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害を組み合わせる光熱免疫療法（図９）と名付けられた新規の併用療法の有効性を説明している。ＰＢＮＰは固有のｐＨ依存性分解および安定性（図１０）を示し、腫瘍の間質で観察される条件を模倣する酸性ｐＨで安定であり、血液／リンパ液を模倣するもっと高いｐＨでは初発分解および不安定性を示した。周囲の組織に対して腫瘍間質のｐＨ勾配を利用するのは、腫瘍処置を選択的に始動させる／制御する興味深い戦略である。Ｍａｄｈｕｓｕｄｈａｎ，Ａ．；Ｒｅｄｄｙ，Ｇ．Ｂ．；Ｖｅｎｋａｔｅｓｈａｍ，Ｍ．；Ｖｅｅｒａｂｈａｄｒａｍ，Ｇ．；Ｋｕｍａｒ，Ｄ．Ａ．；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｓ．；Ｙａｎｇ，Ｍ．Ｙ．；Ｈｕ，Ａ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｓ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐＨ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃａｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ  ２０１４，１５（５），８２１６−３４；およびＳａｂｏｋｔａｋｉｎ，Ｍ．Ｒ．；Ｔａｂａｔａｂａｉｅ，Ｒ．Ｍ．；Ｍａｈａｒｒａｍｏｖ，Ａ．；Ｒａｍａｚａｎｏｖ，Ｍ．Ａ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ａｎｄ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｂｒａｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２０１１，４９（４），７４７−５１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。腫瘍間質は、成長中の腫瘍で急速に起こる低酸素および乳酸蓄積のせいで、典型的には酸性である。Ｋａｔｏ，Ｙ．；Ｏｚａｗａ，Ｓ．；Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｃ．；Ｍａｅｈａｔａ，Ｙ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．；Ｍａｅｄａ，Ｔ．；Ｂａｂａ，Ｙ．，Ａｃｉｄｉｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ  ２０１３，１３（１），８９を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＢＮＰが環境のｐＨに強く依存している特性を示すことを実証している我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータによれば、腫瘍特異的療法を送達するのに使用するためのその可能性が示唆され、この療法ではＰＢＮＰは腫瘍内で無傷で安定したままであり、血流またはリンパ系に入ると急速に分解し、それによって、最終的な臨床解釈のためのナノ医療の分野での重要な考慮すべき事柄であるｉｎ  ｖｉｖｏでのナノ粒子の長期の残留性に関連する潜在的な毒性を最小限に抑える。ＰＢＮＰのｐＨ依存特性はそのＰＴＴ能力に著しい効果を及ぼし、ＰＴＴ能力は腫瘍内ｐＨと比べて血液／リンパ液ｐＨでは減少した（図１２Ａ）。これにより、我々は、腫瘍アブレーションをもたらすのに十分なナノ粒子が腫瘍内に存在するのを確実にする腫瘍内に投与されるＰＢＮＰの濃度を確立することにした（図１２Ｂ）。ＰＴＴが施される条件が万一変更される場合、類似��る最適化研究を実行しなければならなくなる可能性があり、たとえば、表面対深部腫瘍は異なるナノ粒子用量、レーザー出力密度、および／または照射持続時間を必要とする可能性がある。ＰＢＮＰが観察される結果よりも長い経時的安定性および有意に遅い分解動態を示す必要性が万一生じた場合（特に、静脈内投与を必要とする適用では）、ＰＢＮＰは、前記のように、生体適合性ポリマー、たとえば、ポリエチレングリコールで適切に表面被覆することが可能であることをここで述べておくのは重要である。Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．；Ｇｏｎｇ，Ｈ．；Ｚｈｕ，Ｗ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｌｉｕ，Ｇ．；Ｌｉｕ，Ｚ．，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｃｕｂｅｓ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１４，３５（３７），９８４４−５２を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００７３】
成長速度は遅くなったが、治療困難ガンのマウスモデル（神経芽細胞種の同系Ｎｅｕｒｏ２ａモデル）でのＰＢＮＰベースのＰＴＴは、非処置マウスと比べて腫瘍保持マウスでの不完全な応答を示した（図１３）。前記のように、がん細胞はその上昇した代謝速度のせいで正常組織よりも熱に感受性であるという所見に基づいて、ＰＴＴは、がんの複数の動物モデルにおいて長期の腫瘍なしの生存期間を与える。Ｄｅｗｈｉｒｓｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｊｒ．，Ｒｏｅｍｅｒ  ＲＢ，Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ  ＬＬ，Ｔｅｐｐｅｒ  ＪＥ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；およびＫａｐｐ，Ｄ．，ＧＭＣａｒｌｓｏｎ，ＲＷ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，２０００を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。しかし、侵襲性のがん、たとえば、我々の神経芽細胞種モデルの場合、発明者らは、がん細胞が生物発光により検出不可能である場合でも、ＰＴＴがすべてのがん細胞を除去するわけではないと疑っている。新生がん細胞はおそらく、神経芽細胞種中の潜伏がん集団についての臨床所見に類似して、新しい腫瘍に成長する。Ｌｏｎｄｏｎ，Ｗ．Ｂ．；Ｃａｓｔｅｌ，Ｖ．；Ｍｏｎｃｌａｉｒ，Ｔ．；Ａｍｂｒｏｓ，Ｐ．Ｆ．；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ａ．Ｄ．；Ｃｏｈｎ，Ｓ．Ｌ．；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｆ．；Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．；Ｌａｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｉｅｈａｒａ，Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ：ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１，２９（２４），３２８６−９２を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。残留がん細胞は完全寛解を示す他の腫瘍モデルでさえ残ることがありうる。発明者らは、その場合には、いかなる特定の説明に縛られることなく、残留腫瘍細胞は強い免疫応答により除去される可能性があると推測する。
【００７４】
ＰＢＮＰベースのＰＴＴにより、腫瘍領域へのリンパ球浸潤が増加した（図１３）。腫瘍に見いだされるリンパ球は、腫瘍進行を遅らせるのに効果的であることが明らかにされており、患者予後の改善に対するその潜在的影響が示唆される。Ｂｏｏｎ，Ｔ．；Ｃｏｕｌｉｅ，Ｐ．Ｇ．；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ，Ｂ．，Ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９９７，１８（６），２６７−８；Ｇａｌｏｎ，Ｊ．；Ｃｏｓｔｅｓ，Ａ．；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃａｂｏ，Ｆ．；Ｋｉｒｉｌｏｖｓｋｙ，Ａ．；Ｍｌｅｃｎｉｋ，Ｂ．；Ｌａｇｏｒｃｅ−Ｐａｇｅｓ，Ｃ．；Ｔｏｓｏｌｉｎｉ，Ｍ．；Ｃａｍｕｓ，Ｍ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．；Ｗｉｎｄ，Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｙｐｅ，ｄｅｎｓｉｔｙ，  ａｎｄ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６，３１３（５７９５），１９６０−４；Ｌｅｅ，Ｓ．；Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｋ．，Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｕｒｒ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２０１２，１４（５），４６８−７４；およびＺｈａｎｇ，Ｌ．；Ｃｏｎｅｊｏ−Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｒ．；Ｋａｔｓａｒｏｓ，Ｄ．；Ｇｉｍｏｔｔｙ，Ｐ．Ａ．；Ｍａｓｓｏｂｒｉｏ，Ｍ．；Ｒｅｇｎａｎｉ，Ｇ．；Ｍａｋｒｉｇｉａｎｎａｋｉｓ，Ａ．；Ｇｒａｙ，Ｈ．；Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ，Ｋ．；Ｌｉｅｂｍａｎ，Ｍ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ，  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００３，３４８（３），２０３−１３を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、ＰＴＴ処置マウスの残留腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の増加した集団（図１３Ａ〜１３Ｃ）は腫瘍根絶のためにこれらの細胞を動員する機会を提供する。Ｃｈｅｗ，Ａ．；Ｓａｌａｍａ，Ｐ．；Ｒｏｂｂｓｈａｗ，Ａ．；Ｋｌｏｐｃｉｃ，Ｂ．；Ｚｅｐｓ，Ｎ．；Ｐｌａｔｅｌｌ，Ｃ．；Ｌａｗｒａｎｃｅ，Ｉ．Ｃ．，ＳＰＡＲＣ，ＦＯＸＰ３，ＣＤ８  ａｎｄ  ＣＤ４５  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１，６（７），ｅ２２０４７を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。リンパ球のこれらのサブセット内では、Ｔ細胞も数が増加して存在しており（ＣＤ３＋細胞；図１３Ｄ〜１３Ｆ）、免疫エフェクター細胞のこのサブセットを動員してＴ細胞媒介抗腫瘍応答を生み出す機会を同様に提供する。Ｂｒｏｅｒｅ，Ｆ．，Ｓｅｒｇｉ  ＧＳｉｔｋｏｖｓｋｙ，Ｍｉｃｈａｉｌ  Ｖｖａｎ  Ｅｄｅｎ，Ｗｉｌｌｅｍ，Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｅｄ．；２０１���を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００７５】
抗ＣＴＬＡ−４免疫療法と組み合わせたＰＴＴにより、抗ＣＴＬＡ−４単独で処置されたマウスで観察された、たった１２．５％の生存期間およびＰＴＴ単独で処置された、または非処置のままの両マウスで観察された０％の生存期間と比べて腫瘍保持マウスの５５．５％で完全腫瘍縮小および長期生存期間がもたらされた（図１４）。発明者らは、光熱免疫療法処置マウスでのこの有意に高い長期生存期間の利点は抗ＣＴＬＡ−４によるＴ細胞消耗および免疫抑制の逆転に起因すると考えており、この逆転はＰＴＴによる減量と免疫応答のプライミングにより補完される。Ｎｅｕｒｏ２ａマウスモデルを使用した以前の研究では、本研究で観察されたよりも抗ＣＴＬＡ−４単独を使用して高い長期生存期間が実証されている（約４０〜５０％対我々の研究での１２．５％）。Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｌ．；Ｄｕｎｎ，Ｓ．Ｎ．；Ｊａｍｅｓ，Ｓ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．；Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｃ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｎ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３，１９（１３），３５４５−５５を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの所見間の差は、以前の研究ではマウスが約１ｍｍの腫瘍サイズに達したときまたは腫瘍接種後一定数の日数（典型的には５〜６日）後に抗ＣＴＬＡ−４免疫療法が開始されたが、発明者らは腫瘍が約５ｍｍに達してはじめて治療を開始し、したがって、我々の研究での有意に高い腫瘍負荷および疾患進行を潜在的に反映しているという事実にもしかすると起因する可能性がある。最後に、光熱免疫療法で処置された長期生存マウスは腫瘍再チャレンジに対する保護を示しており、光熱免疫療法処置マウスではこれらの腫瘍に対して免疫が発現していることが示される（図１５）。しかし、これらの保護的応答を誘発する根底にある免疫学的機構を解明するにはさらなる研究が必要である。要約すると、我々の研究は、ＰＢＮＰ（および他のナノ粒子プラットホーム）が来るべき歳月に免疫工学において果たす可能性がある重要な役割を指定しており、そこではナノ粒子が適切な免疫応答を操作するのに使用されて進行がんを処置する。Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｍｍｕｎｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｈｏｗ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ  ２０１５，１６１（２），２０１−４を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００７６】
発明者らは、神経芽細胞腫の治療困難モデルのマウスを処置するための抗ＣＴＬＡ−４免疫療法と組み合わせて使用した生分解性ＰＢＮＰを開示する。これらのＰＢＮＰはｐＨ依存性分解および安定性を示し、このｐＢＮＰは腫瘍内環境を模倣するより低いｐＨでは安定であり、血液／リンパ液を模倣するわずかにアルカリ性のｐＨでは分解する。ＰＴＴ単独では神経芽細胞腫を有するマウスにわずかな生存期間利点しか与えないことが観察され、腫瘍内へリンパ球が強く浸潤したが、腫瘍細胞に対しては不十分なリコール応答であった。最後に、併用ＰＴＴおよびチェックポイント阻害で処置されたマウスは有意に高い完全腫瘍縮小および長期腫瘍免疫を示した。これらの結果は、治療困難がんの処置でのチェックポイント阻害剤と組み合わせたＰＢＮＰベースのＰＴＴが有用であることを明らかにし、臨床解釈に対する概念実証前兆としての役割を果たす。
【００７７】
上記研究を実施するのに使用された方法は以下に記載されている。すべての合成手順は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から入手される１８．２ＭＶ．ｃｍの抵抗力を有する超純水を使用して行った。ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム三水和物（ＭＷ４２２．３９；Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］・３Ｈ２Ｏ）、および鉄（ＩＩＩ）塩化六水和物（ＭＷ２７０．３；Ｆｅ（Ｃｌ）３・６Ｈ２Ｏ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【００７８】
抗体および細胞  抗ＣＴＬＡ−４抗体（９Ｄ９）はＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ  ＬｅＢａｎｏｎ、ＮＨ）から購入した。マウスＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびＣＤ３−ＦＩＴＣ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。マウス神経芽細胞腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２ａは最初、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、推奨条件下で培養した。細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）で培養した。ルシフェラーゼ発現Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をホタルルシフェラーゼ発現レンチウイルス粒子（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で形質導入し、ピューロマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で選択することにより構築された。ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してルミノメーターで生物発光を測定することにより決定した。
【００７９】
動物  生後４〜６週間の雌Ａ／ＪマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。動物は腫瘍接種に先立って３〜４日間順化させた。すべての手順はＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍの施設動物管理使用委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃０００３０４３９）により承認された。
【００８０】
ＰＢＮＰ合成  プルシアンブルーナノ粒子は、前記の計画を使用して合成した。手短に言えば、５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中６．８ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（２．５×１０−５モル）の水溶液を、５ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水中１０．６ｍｇのＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６・３Ｈ２Ｏ（２．５×１０−５モル）を含有する水溶液に激しい撹拌下で添加した。１５分間の撹拌後、沈殿物を遠心分離（５分間２０，０００×ｇ）により単離し、超音波処理（５ｓ、高出力）によりＭｉｌｌｉ−Ｑ水ですすいだ。粒子を超音波処理によりＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再懸濁する前に単離およびすすぎ工程は３回繰り返した。
【００８１】
ＰＢＮＰ安定性および分解研究  すべての粒子のサイズおよびゼータ電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｋ．）を使用して測定した。ＰＢＮＰ懸濁液は、ｐＨ５．５、７．０または７．４で溶液中に再懸濁した。これらの溶液は、所望のｐＨが得られるまで、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に適切な量の緩酸および塩基を使用して作成した。次に、分析は製造業者の仕様書を使用して実施した。種々のｐＨでのナノ粒子のＶｉｓ−ＮＩＲ吸光度スペクトルはＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアを使用してＧｅｎｅｓｙｓ１０Ｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で測定した。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＴＴ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＴＴは、１．８７５Ｗ／ｃｍ２の出力でＬａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）製の８０８ｎｍＮＩＲレーザーを使用して実施した。０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬの濃度でのＰＢＮＰは７．４または５．５のｐＨで再懸濁し、９６ウェルプレートに蒔き、１０分間照射した。経時的な温度測定は熱電対（Ｏｍｅｇａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して行った。
【００８３】
マウス神経芽細胞腫モデルの確立  原発腫瘍を確立するためおよび再チャレンジ研究のため、ルシフェラーゼでトランスフェクトした１０６のＮｅｕｒｏ２ａ細胞をＰＢＳに懸濁し、既に剪毛しているマウスそれぞれの背中に皮下注射した。腫瘍成長は、ＩＶＩＳ  ＬｕｍｉｎａＩＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してマウスの腫瘍生物発光を撮像することにより腫瘍接種に続いて隔日でモニターした。この動物撮像装置は経時的な腫瘍量の定量的分析を可能にする。腫瘍量は前に記載したこの撮像装置を使用して計算された。Ｓａｖｏｌｄｏ，Ｂ．；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｍ．；Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ，Ａ．；Ａｂｋｅｎ，Ｈ．；Ｈｏｍｂａｃｈ，Ａ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ａ．Ｅ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；Ｈｅｓｌｏｐ，Ｈ．Ｅ．；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．；Ｄｏｔｔｉ，Ｇ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０ｚｅｔａ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ  ２００７，１１０（７），２６２０−３０を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。任意の次元での１７ｍｍ径の腫瘍サイズはエンドポイントと名付けられ、マウスはその時点で安楽死された。安楽死はＣＯ２麻酔後の頚椎脱臼を通じて達成された。腫瘍が動物の移動性を損ねた、潰瘍化した、もしくは感染したように思われた場合、またはマウスが疾患マウスの姿勢により苦痛の兆候を呈した場合、マウスは安楽死させた。
【００８４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＴＴ  ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＴＴでは、神経芽細胞腫保持マウスは、腫瘍が生物発光測定を使用して測定された少なくとも５ｍｍのサイズ（約６０ｍｍ３体積）に達すると処置された。腫瘍生着の固有の変動のせいで、マウスは同じ日にではなく、むしろ３〜５日の範囲内で処置された。マウスは処置に先立っておよび処置中に２〜５％のイソフルランを使用して麻酔された。マウスは５０ＲＬのＰＢＮＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を腫瘍内注射され、腫瘍領域は１．８７５Ｗ／ｃｍ２で１０分間、８０８ｎｍＮＩＲレーザー（Ｌａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）で照射された。追加の予防措置として、マウスの眼は、レーザーによる眼の損傷を避けるために処置中は不透明な黒いボール紙で覆われた。ＰＴＴ中に到達した温度は、ＦＬＩＲサーマルカメラ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡ）を使用して測定された。
【００８５】
抗ＣＴＬＡ−４注射  抗ＣＴＬＡ−４抗体（マウス１匹あたり１５０Ｒｇ）は、併用（ＰＴＴ＋ａＣＴＬＡ−４）群では１、４、および７日目に、抗ＣＴＬＡ−４のみの群では０、３、および６日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与された。
【００８６】
腫瘍浸潤研究  全腫瘍を実験および対照腫瘍保持マウスから抽出し、刻んで７０Ｒｍフィルターに通した。単細胞懸濁液が得られた後、腫瘍細胞は研究に先立って完全ＤＭＥＭ培地で培養した。腫瘍単離物を使用してフローサイトメトリーにより白血球浸潤物を評価した。細胞はＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートされたＣＤ４５およびＣＤ３抗体で染色し、試料は８０，０００の閾値でＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ血球計数器に流した。フローサイトメトリー結果の分析はＦｌｏｗＪｏ７．６（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）で行い、目的の集団および平均蛍光強度（ＭＦＩ）はアンゲート生試料から決定した。
【００８７】
ＩＦＮγ発現研究  Ｔ細胞は腫瘍保持マウスの脾臓から収穫し、ＣＤ５免疫磁気ビーズ（Ｌｙ−１、ＭｉＬｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．）で単離した。２００，０００マウスＴ細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞と１対１でＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）に含まれており、このアッセイは製造業者のプロトコルに従って行った。脾細胞および単離されたＴ細胞は完全ＲＰＭＩ培地で培養された。
【００８８】
統計分析  群間の統計的有意性はスチューデントｔ検定を使用して決定した。フローサイトメトリーデータの２つの群間の有意差は、カイ二乗検定を使用して決定した。動物研究での群ごとの最小試料サイズを決定するため、発明者らは、α＝０．０５（この帰無仮説のこの検定に関連する第一種過誤可能性）および検出力＝０．８を使用して検定力分析（power analysis）を行った。ｔ検定ごとのσ／δの値を入力後（ＰＳパワーおよび試料サイズソフトウェアを使用して）、発明者らは。これらの試料サイズは文献で公表されている類似の研究中のサイズと一致している。対数順位検定を使用して種々の群間の生存期間における統計的有意差を決定した（α＝０．０５、χ２が検定の臨界値を超える場合は、個々の群間の生存期間に差はないという帰無仮説を棄却する）。生存期間結果はカプラン・マイヤー曲線に従って分析した。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。
【００８９】
併用光熱Ｔ細胞療法のためのＴ細胞上にプルシアンブルーナノ粒子をバックパックする
ナノ粒子はがんにおいて多くの有望な治療および撮像応用を有するが、ナノ粒子は循環から急速に除去され、不十分な体内分布を示し、腫瘍ターゲティング能力が低いので、制限される場合が多い。細胞バックパッキングは、ナノ粒子が免疫細胞に結合されるが、これらの限界を克服する戦略を提供する可能性がある。この概念は図１６の概要図により例示される。
【００９０】
本明細書に記載される結果は、抗原特異的Ｔ細胞上へのプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）のバックパッキングが、腫瘍の光熱療法のために使用されるが、抗原発現細胞まで通行することが可能であることを示している。発明者らは、Ｔ細胞上にＰＢＮＰを頑強にコンジュゲートするための計画を詳細に述べ、こうして得られるバックパックドＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の物理的、表現型的、および機能的特性を示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では、ＰＢＮＰまたはＴ細胞処置単独のいずれかと比べた場合、バックパックドＴｃ構築物では細胞傷害性が改善されていることが実証され、併用光熱免疫療法がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍有効性を改善する可能性が示唆される。
【００９１】
ナノ粒子は、腫瘍血管系を通じて血管外遊出し、結合したリガンドを介して直接腫瘍または細胞を標的にし、撮像モダリティー、たとえば、ＭＲＩ、ＣＴ、または蛍光を使用して腫瘍視覚化を増強し、治療剤を腫瘍領域に送達するので、がん療法としては魅力的である。Ｓｒｉｋａｎｔｈ  Ｍ，Ｋｅｓｓｌｅｒ  ＪＡ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ＣＮＳ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ；８（６）：３０７−１８；Ｖｅｉｓｅｈ  Ｏ，Ｇｕｎｎ  ＪＷ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１０  Ｍａｒ  ８；６２（３）：２８４−３０４；Ｐｒａｂｈａｋａｒ  Ｕ，Ｍａｅｄａ  Ｈ，Ｊａｉｎ  ＲＫ，Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ  ＥＭ，Ｚａｍｂｏｎｉ  Ｗ，Ｆａｒｏｋｈｚａｄ  ＯＣ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｋｅｙ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３  Ａｐｒ  １５；７３（８）：２４１２−７；Ｖｅｉｓｅｈ  Ｍ，Ｇａｂｉｋｉａｎ  Ｐ，Ｂａｈｒａｍｉ  ＳＢ，  Ｖｅｉｓｅｈ  Ｏ，  Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｈａｃｋｍａｎ  ＲＣ，  ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  ｐａｉｎｔ：ａ  ｃｈｌｏｒｏｔｏｘｉｎ：Ｃｙ５．５  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｃｉ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｊｕｌ  １５；６７（１４）：６８８２−８；およびＶｅｉｓｅｈ  Ｏ，Ｓｕｎ  Ｃ，Ｆａｎｇ  Ｃ，Ｂｈａｔｔａｒａｉ  Ｎ，Ｇｕｎｎ  Ｊ，Ｋｉｅｖｉｔ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｏｐｔｉｃａｌ／ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｎａｎｏｐｒｏｂｅ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９  Ａｕｇ  １；６９（１５）：６２００−７を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。これらの利点にもかかわらず、がん療法におけるナノ粒子の臨床解釈は、血流からの急速な除去、不十分な体内分布、および限られた腫瘍取込みにより制限されている。細胞バックパッキングは、ナノ粒子が細胞の表面に「バックパック」されて、がん療法におけるナノ粒子のこれら限界を克服する有無を言わさぬアプローチとして役立つ。なぜならば、ナノ粒子が疾患の部位まで積極的に通行する細胞の生得的な能力を利用するからである。ターゲティングの伝達手段として細胞を使用することに加えて、細胞バックパッキングは、細胞自体の生得の抗腫瘍細胞応答にてこ入れする可能性を有する。したがって、ナノ粒子と細胞の両方がその生得な特性を保持するまたはバックパッキング進行中に組み合わされると追加の特長を提供することが重大な意味を持つ。
【００９２】
ナノ粒子の細胞バックパッキング（ナノシェル、リポソームおよびリポソーム様合成ナノ粒子を含む）は多くの設定で使用されており、有望な結果をもたらしている。Ｃｈｏｉ  ＭＲ，Ｓｔａｎｔｏｎ−Ｍａｘｅｙ  ＫＪ，Ｓｔａｎｌｅｙ  ＪＫ，Ｌｅｖｉｎ  ＣＳ，Ｂａｒｄｈａｎ  Ｒ，Ａｋｉｎ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｒｏｊａｎ  Ｈｏｒｓｅ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  ２００７  Ｄｅｃ；７（１２）：３７５９−６５；およびＳｔｅｐｈａｎ  ＭＴ，Ｍｏｏｎ  ＪＪ，Ｕｍ  ＳＨ，Ｂｅｒｓｈｔｅｙｎ  Ａ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＤＪ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｓｅｐ；１６（９）：１０３５−４１を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。プラットフォームはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を追跡するＭＲＩのように、マクロファージおよびＴ細胞と結合して、および光熱療法（ＰＴＴ）において撮像応用での使用のために利用されてきた。Ｋｉｒｃｈｅｒ  ＭＦ，Ａｌｌｐｏｒｔ  ＪＲ，Ｇｒａｖｅｓ  ＥＥ，Ｌｏｖｅ  Ｖ，Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ  Ｌ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ  ＡＨ，  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ，Ｐ．Ｈ．Ｓ．］．２００３  Ｏｃｔ  １５；６３（２０）：６８３８−４６；およびＦｌｙｎｎ  ＥＲ，Ｂｒｙａｎｔ  ＨＣ，Ｂｅｒｇｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｌａｒｓｏｎ  ＲＳ，Ｌｏｖａｔｏ  Ｄ，Ｓｅｒｇａｔｓｋｏｖ  ＤＡ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ＳＱＵＩＤ  ａｒｒａｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｓｍ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００７  Ａｐｒ；３１１（１）：４２９−３５を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＴＴは、近赤外線（ＮＩＲ）光応答ナノ粒子を使用して腫瘍を熱的に切除するが、魅力的なアプローチである。ＰＴＴは低侵襲性様式で腫瘍を局所的に切除する能力、およびもしかすると内在性免疫応答の刺激を提供する。Ｈｏｆｆｍａｎ  ＨＡ，Ｃｈａｋａｒｂａｒｔｉ  Ｌ，Ｄｕｍｏｎｔ  ＭＦ，Ｓａｎｄｌｅｒ  ＡＤ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｒ．Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１４；４（５６）：２９７２９−３４；Ｂｅａｒ  ＡＳ，Ｋｅｎｎｅｄｙ  ＬＣ，Ｙｏｕｎｇ  Ｊ��，Ｐｅｒｎａ  ＳＫ，Ｍａｔｔｏｓ  Ａｌｍｅｉｄａ  ＪＰ，Ｌｉｎ  ＡＹ，  ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌ−ｅｎａｂｌｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（７）：ｅ６９０７３；およびＷａｎｇ  Ｃ，Ｘｕ  Ｌ，Ｌｉａｎｇ  Ｃ，Ｘｉａｎｇ  Ｊ，Ｐｅｎｇ  Ｒ，Ｌｉｕ  Ｚ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ．２０１４  Ｄｅｃ  ２３；２６（４８）：８１５４−６２を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、発明者らは、免疫細胞上にバックパックされたナノ粒子は、はるかに増強された抗腫瘍応答を生じる可能性を有すると仮定した。不運なことに、このように有望な応用にもかかわらず、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．による先駆的な例の後でこの概念を組織的に調査せる研究はほとんどなかった。Ｃｈｏｉ  ＭＲ，Ｂａｒｄｈａｎ  Ｒ，Ｓｔａｎｔｏｎ−Ｍａｘｅｙ  ＫＪ，Ｂａｄｖｅ  Ｓ，Ｎａｋｓｈａｔｒｉ  Ｈ，Ｓｔａｎｔｚ  ＫＭ，  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｒｏｊａｎ  ｈｏｒｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１２  Ｄｅｃ；３（１−６）：４７−５４を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【００９３】
本明細書で発明者らは、抗原特異的Ｔ細胞上へのプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）、ＰＴＴ用に使用することができるナノ粒子のバックパッキングを説明する概念実証研究を説明している。Ｆｕ  Ｇ，Ｌｉｕ  Ｗ，Ｆｅｎｇ  Ｓ，Ｙｕｅ  Ｘ．Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｐｅｒａｔｅ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１２；４８：１１５６７−９を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＢＮＰは、合成することが可能である混合原子価鉄シアノ金属酸ナノ粒子でありセラノスティック特性を有し、これは同時に治療および診断特性を有することを意味する。以前、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の光熱療法（ＰＴＴ）のためのＰＢＮＰの使用を示していた。別々の研究では、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏ設定の両方でのマルチモーダル造影剤としてのＰＢＮＰの使用を示した。Ｄｕｍｏｎｔ  ＭＦ，Ｈｏｆｆｍａｎ  ＨＡ，Ｙｏｏｎ  ＰＲ，Ｃｏｎｋｌｉｎ  ＬＳ，Ｓａｈａ  ＳＲ，Ｐａｇｌｉｏｎｅ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１４  Ｊａｎ  １５；２５（１）：１２９−３７；Ｖｏｊｔｅｃｈ  ＪＭ，Ｃａｎｏ−Ｍｅｊｉａ  Ｊ，Ｄｕｍｏｎｔ  ＭＦ，Ｓｚｅ  ＲＷ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｒ．Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１５（９８）：ｅ５２６２１；およびＤｕｍｏｎｔ  ＭＦ，Ｙａｄａｖｉｌｌｉ  Ｓ，Ｓｚｅ  ＲＷ，Ｎａｚａｒｉａｎ  Ｊ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｒ．Ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；９：２５８１−９５を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。他のいくつかのグループもがんのためのセラノスティック応用にＰＢＮＰを利用し、さらに他のいくつかのグループは他のナノ粒子を免疫細胞と結合させた。Ｓｗｉｓｔｏｎ  ＡＪ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＪＢ，Ｉｒｖｉｎｅ  ＤＪ，Ｃｏｈｅｎ  ＲＥ，Ｒｕｂｎｅｒ  ＭＦ．Ｆｒｅｅｌｙ  ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  “ｂａｃｋｐａｃｋｓ”  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１０  Ｊｕｌ  １２；１１（７）：１８２６−３２；Ｆｕ  Ｇ，Ｌｉｕ  Ｗ，Ｌｉ  Ｙ，Ｊｉｎ  Ｙ，Ｊｉａｎｇ  Ｌ，Ｌｉａｎｇ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒ���ｅｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｎｄｅｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｎｏｎ−Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖ’ｔ］．２０１４  Ｓｅｐ  １７；２５（９）：１６５５−６３；Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｊａｉｎ  ＰＫ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ＩＨ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ＭＡ．Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＰＴＴ）  ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｌａｓｅｒｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ．［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ，Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｅｘｔｒａｍｕｒａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ］．２００８  Ｊｕｌ；２３（３）：２１７−２８；Ｃｈｏ  ＮＨ，Ｃｈｅｏｎｇ  ＴＣ，Ｍｉｎ  ＪＨ，Ｗｕ  ＪＨ，Ｌｅｅ  ＳＪ，Ｋｉｍ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｏｃｔ；６（１０）：６７５−８２；Ｃｒｕｚ  ＬＪ，Ｔａｃｋｅｎ  ＰＪ，Ｆｏｋｋｉｎｋ  Ｒ，Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ．Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＰＥＧ  ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１  Ｏｃｔ；３２（２８）：６７９１−８０３；Ｔｏｍｕｌｅａｓａ  Ｃ，Ｂｒａｉｃｕ  Ｃ，Ｉｒｉｍｉｅ  Ａ，Ｃｒａｃｉｕｎ  Ｌ，Ｂｅｒｉｎｄａｎ−Ｎｅａｇｏｅ  Ｉ．Ｎａｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；９：３４６５−７９；Ｓｈｅｅｎ  ＭＲ，Ｌｉｚｏｔｔｅ  ＰＨ，Ｔｏｒａｙａ−Ｂｒｏｗｎ  Ｓ，Ｆｉｅｒｉｎｇ  Ｓ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；６（５）：４９６−５０５；およびＢｅｒｃｉａｎｏ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ＭＡ，Ｍｏｎｔｅｓａ−Ｐｉｎｏ  Ａ，Ｃａｓｔａｎｅｄａ−Ｐｅｎａｌｖｏ  Ｇ，Ｍｕｎｏｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｌ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｌｏｒｅｓ  Ｊ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１４；２１（３２）：３７０１−１６を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。しかし、我々の知る限りでは、免疫細胞との細胞バックパッキング状況でＰＢＮＰおよびそれが提供する独特の特性を使用したグループはない。ＰＴＴについて一般に調査されてきた他のナノ粒子（たとえば、金ナノシェル、炭素ナノチューブ、金ナノロッド）と比べた場合、ＰＢＮＰはいくつかの利点を与え、すなわち、ＰＢＮＰはＦＤＡ認可されており（放射性���染の内部排除のため）、ならびにＰＢＮＰは単回工程（ワンポット合成）および低コストで容易に合成され、これらのナノ粒子のスケーラブルな製造を促進するが、こうした点は臨床解釈にとって重要な２つの特長である。ＦＤＡ：．Ｒａｄｉｏｇａｒｄａｓｅ−ｆｅｒｒｉｃ  ｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ（ｉｉ）  ｃａｐｓｕｌｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２００８／０２１６２６ｓ００７ｌｂｌ．ｐｄｆ．［最後にアクセスしたのはＭａｒｃｈ  ７，２０１７］を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。我々の構築物の第２の成分、Ｔ細胞は、ＰＢＮＰを腫瘍環境にまで輸送するビヒクルとして役立つ。等しく重要なのが、これらの免疫細胞が特定の抗原を標的にして抗原特異的応答を生じる能力である。この能力は、がんと日和見感染の両方のための免疫療法としての抗原特異的Ｔ細胞の使用を既に可能にしている。
【００９４】
本報告では、発明者らは、ナノ粒子と免疫細胞の両方の追加の撮像および治療機能は将来の研究に組み込まれるまたは利用することが可能であることに注目しつつ、抗原特異的Ｔ細胞上にバックパックされたＰＢＮＰのＰＴＴ能力を探求する。発明者らは、最初に、抗原特異的Ｔ細胞の表面にＰＢＮＰを頑強に結合させ、得られたＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物を視覚化するのに使用される手軽なコンジュゲーション計画を説明する。次に、発明者らは、サイズ、Ｖｉｓ−ＮＩＲ光吸収特性を測定し、ＰＴＴにとって重要な特性である、Ｔ細胞に結合した場合のＰＢＮＰの光熱変換効率を計算する。続いて、発明者らは、ＰＢＮＰのバックパッキング後の抗原特異的Ｔ細胞の表現型的および機能的評価を実施する。最後に、発明者らは、得られた腫瘍生存率を評価することによりバックパックドＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の抗腫瘍効果を測定する。これらＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＢＮＰ媒介ＰＴＴの切除効果と抗原特異的Ｔ細胞の標的抗腫瘍効果を組み合わせる。これらの結果がタンデムＰＢＮＰ−Ｔｃ細胞構築物の実現可能性および機能性についての洞察を与え、悪性腫瘍の処置のためのこの光熱免疫療法（ＰＴＩ）の抗腫瘍有効性を改善する将来の研究への道を開くことが我々の希望である。
【００９５】
以下の方法および材料が用いられた。
【００９６】
化学物質および細胞培養補給物  化学物質は、他の方法で明記されていなければ、すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。研究で使用した超純水は、≧１８．２ＭΩｃｍの抵抗力を有するＭｉｌｌｉ−Ｑｓｙｓｔｅｍ（ＭＱ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から入手した。
【００９７】
ナノ粒子合成およびバイオコンジュゲーション  ＰＢＮＰは前記の通り室温で合成された。Ｖｏｌｚ  ＨＧ．Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；２００６を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。手短に言えば、５ｍＬのＭＱ中１０．６ｍｇのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］・３Ｈ２Ｏ（２．５×１０−５モル）を含有する水溶液を、１０ｍＬのＭＱ中６．８ｍｇのＦｅ（Ｃｌ）３・６Ｈ２Ｏ（２．５×１０−５モル）を含有する激しく撹拌される水溶液に添加した。ＰＢＮＰを含有する得られた青の沈殿物はすすいで、遠心分離および超音波処理により非反応成分を取り除いた。ＰＢＮＰは、静電気的自己組織化を介して１ｍｇのＰＢＮＰあたり０．１ｍｇのアビジンの比率で、濾過された非蛍光−またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートアビジン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で被覆された。Ｊａｉｓｗａｌ  ＪＫ，Ｍａｔｔｏｕｓｓｉ  Ｈ，  Ｍａｕｒｏ  ＪＭ，Ｓｉｍｏｎ  ＳＭ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｌｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｊａｎ；２１（１）：４７−５１を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。この混合物は光から保護され、フルオロフォアコンジュゲートアビジンは、４℃、オービタルシェイカーで３時間にわたりＰＢＮＰを被覆させておいた。
【００９８】
ナノ粒子特徴付け  製作に続いて、ＰＢＮＰまたはアビジン被覆ＰＢＮＰのサイズおよびゼータ電位が、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ．）を使用して決定された。５００〜１１００ｎｍの範囲でのＰＢＮＰおよびＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物のＶｉｓ−ＮＩＲスペクトルはＶＩＳＩＯＮｌｉｔｅソフトウェアを使用してＧｅｎｅｓｙｓ１０Ｓ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で測定した。
【００９９】
細胞源  ジャーカット細胞  ヒトジャーカットＴ細胞はＡＴＣＣ（ジャーカットクローンＥ６−１、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）から入手し、一般的なＴ細胞部分を用いた細胞バックパッキングの実現可能性を調べるために使用した。ジャーカット細胞は、１０％のウシ胎仔血清および１％のＧｌｕｔａＭａｘを有するＲＰＭＩ１６４０で維持した。
【０１００】
一次細胞ＰＢＭＣ  ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍおよびベイラー医科大学の施設内審査委員会承認プロトコル下で、告知に基づく同意を得た健康なボランティアまたは未確認の破棄血液製剤から入手した。全血は無菌ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で洗浄し、ＰＢＭＣはフィコール密度勾配分離により単離した。赤血球は溶解し（ＡＣＫ溶解バッファー）、残りのＰＢＭＣは、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  ＴＭ−１およびウシ胎仔血清を補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＰＢＭＣを使用して、ＰＨＡ芽細胞、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）、および抗原特異的Ｔ細胞株を作成した。
【０１０１】
ＣＭＶ  Ｔ細胞  ＣＭＶ特異的Ｔ細胞では、ＰＢＭＣは、前記の通り、ＣＭＶｐｐ６５タンパク質にまたがる重複ペプチドライブラリーでパルスした自家抗原提示細胞を用いて刺激することにより拡大させた。細胞増殖および共培養での使用に先立って、細胞は、ＩＬ２（１００Ｕ／ｍＬ）の存在下で同じ重複ペプチド混合物でパルスされた照射ＰＨＡ芽細胞（３０Ｇｙ）で凍結アリコートから再刺激された。ＰＨＡ芽細胞は、植物性血液凝集素（５μｇ／ｍＬ）およびＩＬ２（１００Ｕ／ｍＬ）での刺激によりＰＢＭＣから作成された。Ｔ細胞は４５％クリック培地（Click's medium）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  ＴＭ−１、および５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＶＡ）を補充されたＲＰＭＩ１６４０で維持された。
【０１０２】
ＥＢＶ  Ｔ細胞  ＥＢＶ特異的Ｔ細胞では、ＰＢＭＣは、前記の通り、ＥＢＶ  ＢＺＬＦ１、ＬＭＰ２、およびＥＢＮＡ１タンパク質にまたがる重複ペプチドライブラリーでパルスした自家抗原提示細胞、または自家照射ＬＣＬのいずれかを用いて刺激することにより拡大させた。細胞増殖および共培養での使用に先立って、細胞は、照射自家リンパ芽球様細胞株で凍結アリコートから再刺激された。ＬＣＬは先ずシクロスポリン（１μｇ／ｍＬ）の存在下でＥＢＶ  Ｂ９５−８ウイルスでの感染により成長させ、４週間にわたり拡大させた。Ｔ細胞は４５％クリック培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＧｌｕｔａＭＡＸ  ＴＭ−１、および５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ  ＶＡ）を補充されたＲＰＭＩ１６４０で維持された。
【０１０３】
Ｔ細胞上へのＰＢＮＰのバックパッキング  ジャーカットＴｃ、ＥＢＶ  Ｔｃ、またはＣＭＶ  Ｔｃは、以前記載された通りに（Ｊａｉｓｗａｌ  ２００３）、４℃、オービタルシェイカー上で１ｍｇ／ｍＬのビオチン化試薬（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）と共インキュベートすることによりビオチン化した。ビオチン化試薬のスルホＮＨＳ基は細胞表面タンパク質の遊離のアミンに共有結合する。次に、ビオチン化Ｔ細胞は蛍光性アビジン被覆ＰＢＮＰの溶液（１０−７〜１０−８ｍｇ  ＰＢＮＰ／Ｔ細胞）に添加した。混合物は光から保護し、オービタルシェイカー上４℃で０．５〜１時間アビジン−ビオチン相互作用を生じさせておいた。次に、細胞はすすいで、遠心分離により非結合ナノ粒子を取り除いた。これに続いて、ＰＢＮＰをＴ細胞上に効果的に「バックパック」し、構築物はＰＢＮＰ−Ｔｃと同定された。バックパッキングの効率は、共焦点顕微鏡、およびフローサイトメトリーを使用して評価した。
【０１０４】
撮像に先立って、Ｔ細胞は製造業者の仕様書通りにバイアビリティー色素（ＤＡＰＩ、ＣＦＳＥ、カルセインブルーＡＭまたはカルセインレッド／オレンジ）で染色した。画像は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ／Ｇｅｏｒｇｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  ＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙのＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６１、Ｚｅｉｓｓ  Ａｐｏｔｏｍｅ、およびＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１００共焦点顕微鏡で入手し、スケールバーは２０μｍを示している。
【０１０５】
フローサイトメトリー  裸のおよびバックパックドＴ細胞の表現型は、Ｔ細胞マーカー、たとえば、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（Ｇｋ１．５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、およびＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、またはＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコンジュゲートされたＰＤ−１（ＣＤ２７９、ＲＭＰ１−３０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のパネルに対する抗体で染色することにより特徴付けをした。上記の通りに、Ｔ細胞をカルセインブルーバイアビリティー色素またはＣＤ３抗体で染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−アビジン被覆ＰＢＮＰに結合させた後、Ｔ細胞バックパッキングの試験を実施した。ゲートは非染色細胞に基づいて設定した。試料はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＢＤ  Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター上で取得し、結果はＦｌｏｗ  Ｊｏ７．６．５（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。
【０１０６】
光熱療法  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＴＴ有効性を評価するため、ＰＢＮＰまたはＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物を標的細胞と共培養した。共培養物は９６ウェルプレートで確立され、個々のウェルは、２．５Ｗ／ｃｍ２で１０分間、ＮＩＲレーザー（８０８ｎｍ  Ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ  Ｄｉｏｄｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＴＴを受けさせた。ＰＴＴ中のそれぞれのウェルの温度は熱電対またはＦＬＩＲ熱画像システム（ＦＬＩＲ、Ｂｉｌｌｅｒｃａ、ＭＡ）を使用してモニターした。それぞれの実験条件の光熱変換効率は、以前記載された方法論（Ｒｏｐｅｒ  ２００７，Ｈｏｆｆｍａｎ  ２０１４）を使用して決定した。光熱変換効率のこの定式決定は、細胞および細胞培養培地成分の存在下でＰＢＮＰまたはＰＢＮＰ−Ｔｃの効果的な光熱変換効率を測定した。
【０１０７】
細胞増殖  Ｔ細胞の増殖能力を確定するため、細胞は製造業者のプロトコルに従ってＣＦＳＥで標識し、その対応する標的で刺激した。増殖は２４時間後に測定した。
【０１０８】
ＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮγ分泌  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＨＴＳフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、４℃で４時間または一晩１０μｇ／ｍＬの濃度でＩＦＮ−ｇ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）で被覆した。プレートはＰＢＳで洗浄し、３７℃で１時間遮断した。次に、細胞は１×１０６／ｍＬの濃度で蒔き、アクチン、ＣＭＶ抗原、またはＥＢＶ抗原を含有するペプチド標的に曝露した。発現のため、プレートはＰＢＳ／．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄し、３７℃で２時間ビオチン化ＩＦＮ−ｇ検出抗体（．５μｇ／ｍＬ；Ｍａｂｔｅｃｈ）と一緒にインキュベートし、続いて室温で１時間ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒にインキュベートし、スポットは、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（Ｓｉｇｍａ）溶液と一緒にインキュベートすることにより発現させた。スポット形成細胞（ＳＦＣ）は計数し、自動プレート読取りシステム（Ｋａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用してＺｅｌｌｎｅｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇにより評価した。
【０１０９】
共培養実験  標的細胞に対するその有効性を評価するため、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物は２対１の比率で標的細胞（ＬＣＬまたはＰＨＡ芽細胞）に添加し、４〜８時間ＲＰＭＩ培地で培養し、その時点の後ＰＴＴは上記の通りに投与された。標的細胞は、アッセイに含める前に製造業者のプロトコルに従ってＣＦＳＥ／Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄで標識した。共培養および／またはＰＴＴの完了に続いて、フローサイトメトリーを使用して標的細胞上のＣＦＳＥ／Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ発現を調べて細胞生存率を決定した。結果は、ＤＭＳＯにより人為的に死滅させた標的細胞単独の負の対照、照射標的細胞、および標的細胞の正の対照と比べた。実験群は；（ｉ）標的細胞単独、（ｉｉ）照射標的細胞（３０Ｇｙ）、（ｉｉｉ）無関係な細胞株（ＥｏｌまたはＰｈｘ）と一緒の標的細胞、（ｉｖ）ＤＭＳＯと一緒の標的細胞、（ｖ）Ｔｃと一緒の標的細胞、（ｖｉ）ＰＢＮＰと一緒の標的細胞、（ｖｉｉ）ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物と一緒の標的細胞、（ｖｉｉｉ）レーザーと一緒の標的細胞、（ｉｘ）Ｔｃおよびレーザーと一緒の標的細胞、（ｘ）ＰＢＮＰおよびレーザーと一緒の標的細胞、ならびに（ｘｉ）ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物およびレーザーと一緒の標的細胞、の通りであった。Ｔ細胞の特異性および活性化を評価するため、ＥＢＶ  Ｔｃ（裸のまたはＰＢＮＰでバックパックされた）は２対１の比率で照射ＬＣＬ細胞で刺激され、ＣＭＶ  Ｔｃ（裸のまたはＰＢＮＰでバックパックされた）は２対１の比率で抗原負荷ＰＨＡ芽細胞で２４時間刺激され、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイは製造業者のプロトコル（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）通りに実施した。
【０１１０】
統計値  統計分析はＰｒｉｓｍ  Ｖ５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行った。統計的有意性は両側スチューデントｔ検定から決定し、ｐ＜０．０５を有する値は統計的に有意である資格があり、２つの特定の群間の比較を示すアステリスク（＊）または他のすべての群との比較を示すポンド記号（＃）で示される。
【０１１１】
ＰＢＮＰは抗原特異的Ｔ細胞上に頑強にバックパックすることが可能である
ＰＢＮＰは合成され、合成されたままで（裸で）またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲートしてもしくは非蛍光性アビジンで被覆される、のいずれかで使用された。動的光散乱を使用して、得られた非被覆またはアビジン被覆ＰＢＮＰの流体力学的径および表面電荷（ゼータ電位）を測定した。発明者らは、裸とアビジン被覆ＰＢＮＰの両方について単分散粒径分布（０．３０８対アビジン付きの０．３８７；データは示されず）およびゼータ電位約−４０ｍＶを実証した。ジャーカットＴ細胞は、ＰＢＮＰを用いたバックパッキング一般Ｔ細胞の実行可能性を確かめるためのこれらの実験に使用した。ＰＢＮＰは、示された計画（図１７Ａ）に従ってアビジン−ビオチン相互作用（Ｋｄ約１０−１５）を介してＴｃ上にバックパックされ、結果としてのＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物を作り出した。共焦点蛍光顕微鏡は、裸のＴｃ（図１７Ｂ、左）と比べてこのプロトコルを使用してＴｃ上へのＰＢＮＰのバックパッキングの成功（図１７Ｂ、右）を示していた。ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物はフローサイトメトリーによっても同定可能であり、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８についても陽性であったＣＤ３＋細胞上でのゲーティングは、３日間までのＴｃへのＰＢＮＰの安定なコンジュゲーションを示していた（図１７Ｃ、１７Ｄ）。
【０１１２】
ＰＢＮＰは、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物中にある間その機能特性を保持する  前述のように、細胞バックパッキングの主要な目標の１つが、Ｔ細胞療法とナノ医療の両方から提供される利点を利用することである。したがって、我々の構築物の重要な設計考慮事項は、ナノ粒子と細胞の両方がバックパッキング後その特性を保持していることである。発明者らはＰＢＮＰを主に光熱療法の薬剤として使用しているので、近赤外線光を吸収し周囲の組織を切除するその能力に関係するＰＢＮＰの特性を評価する。発明者らは、Ｖｉｓ−ＮＩＲスペクトル、光熱加熱および冷却動態、ならびにＰＢＮＰ単独と比べたＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の光熱変換効率を測定した。ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物のＶｉｓ−ＮＩＲ分光学は、遊離のＰＢＮＰについて観察された特徴的吸収ピークに類似して６５０〜７５０ｎｍの間にピークを示し、Ｔｃ単独ではこれらの波長ではピーク吸収を示さなかった（図１８Ａ）。光熱加熱および冷却動態に対するバックパッキングの効果を研究するため、遊離のＰＢＮＰ、ＰＢＮＰ−Ｔｃ、およびＴｃの試料を９６ウェルプレートで培養し、前記のように、８０８ｎｍ  ＮＩＲレーザーで照射した。１０分間の照射続いて室温での１０分間に続いて、ＰＢＮＰおよびＰＢＮＰ−Ｔｃ試料は類似する加熱（約６０℃まで）および冷却動態を示したが、群間には有意差はなかった（ｐ＝０．２７５；図１８Ｂ）。到達した最高温度は、ＰＴＴを受けたＴｃ単独の対照試料が到達した温度、またはＮＩＲレーザー照射なしのＴｃもしくはＰＢＮＰ単独いずれか（ｐ＜０．０００１）よりも有意に高かった（ｐ＝０．０００２）。温度は照射中およびこれに続いてモニターし、冷却動態は、前記の通りに、遊離のおよびバックパックドナノ粒子の光熱変換効率を計算するのに利用された。発明者らは、遊離のＰＢＮＰと比べた場合、ＰＢＮＰ−Ｔｃの匹敵する光熱変換効率を見た（５．６％対４．９％、図１８Ｃ）。我々の結果は、ＰＢＮＰがＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物においてＰＴＴの薬剤として機能するその能力を保持することを示している。
【０１１３】
ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物はＣＭＶおよびＥＢＶ抗原発現標的に対する機能性を維持し、併用光熱免疫療法において最適な機能をする
ＰＢＮＰがバックパッキング後その機能特性を保持することを実証したので、発明者らは次に、抗原特異的Ｔ細胞の機能性がナノ粒子バックパックの存在により損なわれるのかどうか確定しようと努めた。一次Ｔ細胞でのプラットフォームの適応性を確定するため、発明者らは：ｐｐ６５抗原にまたがる１５アミノ酸ペプチドでパルスされた細胞に対して試験されたＣＭＶ特異的Ｔ細胞、およびＥＢＶ抗原をＴ細胞に天然に提示する照射ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株に対して試験されたＥＢＶ特異的Ｔ細胞という抗原特異的Ｔ細胞の２つのモデルを選んだ。
【０１１４】
第１のアプローチはＣＭＶ特異的Ｔ細胞を使用し、発明者らはＰＢＮＰでのバックパッキングに続くその表現型および機能を評価した。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞増殖は１２時間にわたるＣＦＳＥ希釈により測定し、その時点の後細胞はフローサイトメトリーにより分析した。発明者らは、Ｔ細胞単独およびＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の増殖能力は、ｐｐ６５負荷ＰＨＡ芽細胞により刺激されて、匹敵しており、両群とも非刺激Ｔ細胞対照よりも有意に増殖する（ｐ＝０．００２、ｎ＝３；図１９Ａ、１９Ｂ）ことを観察した。さらに、フローサイトメトリーによる表現型分析では、ＰＢＮＰ−Ｔｃと比べた場合、Ｔ細胞中のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットに変化がないことが示された（図１９Ｃ）。次に、Ｔ細胞およびＰＢＮＰ−Ｔｃは、アクチン（非特異的）、ＰＨＡ（汎特異的）、またはｐｐ６５（ＣＭＶ特異的）で刺激され、ＥＬＩＳｐｏｔを実施して刺激の２４時間後Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）分泌を定量化した（図１９Ｄ）。発明者らは、Ｔ細胞単独群と比べてＰＢＮＰ−Ｔｃ群中の減少したＩＦＮγ分泌細胞を同定し、サイトカイン放出に対するＰＢＮＰバックパックのありそうな効果が示唆された。この所見にもかかわらず、発明者らは、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物に含まれるＴ細胞がそれでも機能的であることを見出した。なぜならば、Ｔ細胞はｐｐ６５負荷標的細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞溶解性機能を示し、表現型分析ではエフェクターおよび記憶Ｔ細胞のサブセットが維持され、バックパックド構築物でのＴ細胞消耗マーカーの発現が減少していることが明らかにされたからであった。
【０１１５】
発明者らは次に、ＰＢＮＰ−Ｔｃは相乗効果を示し、いずれかの処置モダリティー単独と比べた場合、特定の標的の死滅が改善されていると仮定した。ＰＨＡ芽細胞（ｐｐ６５パルス標的）はＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄバイアビリティー色素で染色され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞、ＰＢＮＰ、またはＰＢＮＰ−Ｔｃと１対２の比率で共培養された。４〜８時間の培養に続いて、試料の半分は０．９８Ｗの出力で１０分間ＰＴＴを受けた。個々のウェル由来の標的細胞蛍光のフローサイトメトリー分析により、腫瘍生存率の顕著な減少が示された（図１９Ｅ、１９Ｆ）。具体的に、発明者らは、負の対照（標的細胞単独）と比べて、標的細胞生存率はＴ細胞単独で４４．９％減少し（＋／−０．４５％）（ｐ＜０．０００１）、ＰＢＮＰおよびレーザーベースのＰＴＴで８５＋／−６．１％減少し（ｐ＜０．０００１）、ＰＢＮＰ−Ｔｃ群では両方の処置の組合せで９３．７＋／−１．４％減少した（ｐ＜０．０００１）ことを見出した。とりわけ、我々の結果では、いずれかの療法単独と比べた場合、ＰＢＮＰバックパックドＴ細胞を使用するタンデム療法群での腫瘍生存率の優勢な減少が示された（ｐ＝０．０００２、図１９Ｆ）。
【０１１６】
ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物はＥＢＶ抗原発現標的に対する機能性を維持し、併用光熱免疫療法において最適な機能をする
Ｔ細胞機能性の維持の成功およびＣＭＶ特異的ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物を用いた改善された治療可能性を実証したので、発明者らは、この機構がさらに適切な抗原プロセッシング系において有効かどうかを確定しようと努めた。発明者らは、健康なドナー由来のＥＢＶ特異的Ｔ細胞を作成し、ＰＢＮＰを用いたバックパッキングに続いてその表現型および機能を評価した。前に実行した通りに、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞増殖は１２時間にわたるＣＦＳＥ希釈により測定し、その時点の後細胞はフローサイトメトリーにより分析した。発明者らは、Ｔｃ単独およびＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の増殖能力は、ＬＣＬにより刺激されて、匹敵しており、両群とも非刺激ＣＴＬ対照よりも有意に増殖する（ｐ＜０．０００１、ｎ＝３；図２０Ａ、２０Ｂ）ことを見出した。ＰＢＮＰバックパックドＴ細胞の表現型分析では、予想通り、ＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい集団が明らかにされ、これは非バックパックド対照と比べた場合、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物において変化していないように思われた（図２０Ｃ）。次に、Ｔ細胞およびＰＢＮＰ−Ｔｃは、アクチン（非特異的）、ＰＨＡ（汎特異的）、または照射ＬＣＬ細胞（ＥＢＶ特異的）で刺激され、ＥＬＩＳｐｏｔを実施して２４時間の刺激に続くＩＦＮγ分泌を確定した（図１９Ｄ）。上と類似して、パルスペプチドモデルでは、発明者らはＰＢＮＰ−ＴｃにおいてＩＦＮγ分泌の減少を観察し、これらの細胞ではサイトカインプロファイルが損なわれている可能性が示唆された。ＩＦＮγの減少にもかかわらず、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物中のＥＢＶ特異的Ｔ細胞がそれでも機能的であることが確定され、Ｔ細胞はＬＣＬ標的細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では機能を示し、さらなる表現型分析では、エフェクターおよび記憶Ｔ細胞のサブセットが維持され、バックパックド構築物でのＴ細胞消耗のマーカーが維持されたまたは減少したことが明らかにされた。
【０１１７】
次に、発明者らは、Ｔ細胞療法（ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を用いて）または光熱療法（ＰＢＮＰおよびレーザーを用いて）単独のいずれかと比べて、特定の標的の死滅に関してＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の相乗効果の可能性を調べることに努めた。ＬＣＬ細胞（標的細胞、ＥＢＶ特異的）はＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄバイアビリティー色素で染色され、Ｔ細胞、ＰＢＮＰ、またはＰＢＮＰ−Ｔｃと１対２の比率で共培養され、４〜８時間後指示されたウェルでＰＴＴを実施し、試料は上記の通りフローサイトメトリーにより分析した。標的細胞蛍光の分析により、腫瘍生存率の減少に成功したことが示された（図２０Ｅ、２０Ｆ）。標的細胞単独の負の対照と比べて、生存率はＴ細胞で２５．４＋／−０．９％減少し（ｐ＝０．００７）、ＰＢＮＰおよびレーザーベースのＰＴＴで５０．５＋／−０．８％減少し（ｐ＝０．００７）、ＥＢＶ特異的ＰＢＮＰ−Ｔｃ群での組合せで７９．８＋／−０．３％減少した（ｐ＜０．０００１）。これらの結果では、いずれかのモダリティー単独と比べた場合、ＰＢＮＰ−Ｔｃを使用する併用光熱免疫療法では標的細胞生存率の有意な減少が示された（ｐ＝０．００３、図２０Ｆ）。
【０１１８】
アビジン−ビオチンコンジュゲーションはＣＴＬ上へのＰＢＮＰの結合を成功させることができた
ＰＢＮＰをＴ細胞に結合させるため、発明者らは、アビジン被覆ＰＢＮＰをビオチン化Ｔ細胞に接触させることにより頑強なアビジン−ビオチン相互作用の利点を利用した（図１７Ａ）。動的光拡散を使用して、非被覆またはアビジン被覆ＰＢＮＰの流体力学的径および表面電荷（ゼータ電位）を測定した。我々の合成およびコーティング計画から、ナノ粒子の単分散粒径分布、言い換えると、平均流体力学的径約８０〜９０ｎｍが得られ、非被覆とアビジン被覆ＰＢＮＰの両方について多分散インデックス約０．２およびゼータ電位約−４０ｍＶであった。発明者らはジャーカットＴ細胞を利用して、Ｔ細胞にＰＢＮＰをコンジュゲートさせる実現可能性を確かめて、指示された計画に従ってＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物を作り出した（図１７Ａ）。共焦点蛍光顕微鏡により、コンジュゲーション後直ちに（１日目）評価した非被覆Ｔ細胞と比べて（図１７Ｂ、左）このプロトコルを使用してＴ細胞上へのＰＢＮＰの結合が成功したことが確かめられた（図１７Ｂ、右）。ＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物はフローサイトメトリーでも同定し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８に対しても陽性であったＣＤ３＋Ｔ細胞のゲーティング、それにより３日までの間ＣＴＬ上へのＰＢＮＰのコンジュゲーションの成功が確かめられた（図１７Ｃ＆１７Ｄ）。ＣＴＬに結合したＰＢＮＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は３日間にわたり有意でなく減少し、細胞１個あたりのナノ粒子の量はおそらく経時的に減少することが示された。これらの所見は５日間にわたって実行された共焦点顕微鏡で実証され、これにより細胞１個当たりのＰＢＮＰの数が３日目までに減少したことが示された。表面結合ナノ粒子のこの「希釈」はもしかすると、ＣＴＬの増大および／または細胞によるＰＢＮＰの内部移行に起因する可能性がある。所見により、アビジン−ビオチン親和性に基づいてＣＴＬに結合したＰＢＮＰの細胞−ナノ粒子コンジュゲーション計画の実現可能性が例証された。ＣＴＬ表現型＆機能はＰＢＮＰコンジュゲーションによる影響を受けない。細胞上へのナノ粒子の安定なコンジュゲーションを達成した後の重要な設計考慮事項は、ナノ粒子とＴ細胞の両方がハイブリッド構築物への組込み後にその特性を保持していることを保証することである。したがって、発明者らは、抗原特異的Ｔ細胞の表現型および機能性がナノ粒子コーティングの存在によって損なわれるのかどうかを確定しようと努めた。発明者らは、ＣＴＬ単独およびＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物の増殖能力が、ＥＢＶペプチド負荷ＰＨＡ芽細胞により刺激されると、匹敵し、両方の群が非刺激ＣＴＬ群よりも有意に増殖したことを観察した（ｐ＝０．００２、ｎ＝７；図２１Ａ＆２１Ｂ）。フローサイトメトリーによる表現型分析では、ＣＴＬ：ＰＢＮＰと比べた場合、ＣＴＬ単独中のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットに変化がないことが示された（図２１Ｃ＆２１Ｄ）。他のサブセット、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ、ならびに消耗のマーカー、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＰＤ１の追加の分析により、ＣＴＬとＣＴＬ：ＰＢＮＰの間には有意差がないことが示された。非被覆およびＰＢＮＰ被覆ＣＴＬの機能的能力を評価するため、発明者らは、ＣＴＬをＥＢＶ陽性標的細胞と共���養し、上澄みのサイトカイン濃度ならびに標的細胞の生存率を測定した。刺激されたＣＴＬ対変動する濃度のＰＢＮＰにコンジュゲートされたＣＴＬによるサイトカイン産生の試験により、サイトカイン産生には顕著な効果がなかったことが示された（図２１Ｅ）。指示された条件内での標的細胞蛍光のフローサイトメトリー分析により、ＥＢＶ特異的ＣＴＬを用いた処置に続くＥＢＶ抗原パルス標的細胞の生存率の顕著な減少が示され、この生存率はＰＢＮＰ被覆ＥＢＶ−ＣＴＬでは維持された（ｐ＝０．１５、図２１Ｆ）。したがって、我々の結果は、ＥＢＶ特異的ＣＴＬがＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物内でナノ粒子にコンジュゲートされている間はその表現型ならびに抗原依存性増殖および機能的能力を維持することを示している。ＣＴＬ上にコンジュゲートされたＰＢＮＰはＰＴＴの薬剤として機能的である。本研究では、ＰＢＮＰはＰＴＴの薬剤として主に利用される。したがって、ＰＢＮＰの基本的特性（すなわち、近赤外線（ＮＩＲ）光を吸収し周囲の組織を切除するその能力）がＣＴＬ上への結合後損なわれないよう保証することが必要不可欠であった。発明者らは先ず、ＣＴＬ、ＰＢＮＰおよびＣＴＬ：ＰＢＮＰの可視ＮＩＲ吸収スペクトルを５００〜１１００ｎｍ波長範囲で調べて、ＰＢＮＰがＣＴＬへのコンジュゲーション後６５０〜７５０ｎｍの範囲でその特徴的な吸収ピークを保持したかどうかを試験した。発明者らは、ＰＢＮＰがＣＴＬへのコンジュゲーション後でもその可視ＮＩＲ吸収特徴を保持することを見出した（図２２Ａ）。次に、発明者らは、光熱加熱および冷却動態を評価して、ＰＢＮＰ単独と比べた場合のＣＴＬ：ＰＢＮＰの光熱変換効率を評価した。加熱および冷却プロファイルでは、この効率はＮＩＲレーザーで直接照射された標的細胞およびＣＴＬと共培養されその後ＮＩＲレーザーを受けた標的細胞と比べた（図２２Ｂ）。我々の所見では、ＰＢＮＰがＣＴＬへのコンジュゲーション後でもその光熱変換能力を保持することが示されている。最後に、発明者らは、ＣＴＬ上へのＰＢＮＰのコンジュゲーションが一次標的細胞を切除する能力に影響を及ぼすかどうかを確定した。細胞生存率（ＥＢＶペプチドでパルスされた蛍光標識された一次ＰＨＡ芽細胞）のフローサイトメトリー分析では、ＣＴＬ：ＰＢＮＰプラスＮＩＲレーザーを用いた処置に続いて標的細胞の生存率の減少が示された（すなわち、標的細胞＋ＣＴＬ：ＰＢＮＰ＋レーザー群；図２１Ｃ＆２１Ｄ）。これとは対照的に、ＮＩＲレーザー単独またはＰＢＮＰ単独のいずれかで処置された標的細胞の負の対照は標的細胞生存率に影響を与えなかった。標的細胞単独および標的細胞＋ＤＭＳＯの内部標準を使用して、細胞傷害性アッセイの精度を保証した。とりわけ、我々の結果は、「標的細胞＋ＣＴＬ：ＰＢＮＰ」と「標的細胞＋ＰＢＮＰ＋レーザー」群の両方と比べて「標的細胞＋ＣＴＬ：ＰＢＮＰ＋レーザー」群では標的細胞生存率が有意に減少していた（両比較でｐ＜０．０５）ことを示しており、これはおそらく、いずれかの死滅モダリティー単独と比べて、ＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物に保持されているＰＢＮＰの切除能力を構築物中のＣＴＬそれ自体の細胞傷害能力を組み合わせた有利な効果に起因する。���合すると、我々の結果は、ＰＢＮＰがＣＴＬへのコンジュゲーション後でもその固有の吸収特性、光熱加熱／冷却プロファイルおよびＰＴＴ能力を保持していることを実証している。
【０１１９】
ナノ粒子は、薬物カプセル封入および送達の方法として医薬ではかなりの関心がもたれてきたが、免疫療法のためのその適応性はまだ十分には探求されていない。本研究では、発明者らは、ＰＢＮＰの媒体として抗原特異的Ｔ細胞を使用してバイオハイブリッドナノ免疫療法を生み出すための決定的に重大な最初の工程を提供する。発明者らは、一次ＥＢＶ抗原特異的ＣＴＬ上にＰＢＮＰをコンジュゲートする頑強な方法を記載し、個々の成分、ならびに最終ＣＴＬ：ＰＢＮＰ構築物を特徴付けた。重要なことに、発明者らは、コンジュゲーション方法がＰＢＮＰとＣＴＬの両方の個々の機能を維持することを実証した。
【０１２０】
本実施例は、抗原特異的Ｔ細胞上にプルシアンブルーナノ粒子を結合させる実現可能性を実証する概念実証研究として役に立つ。ＰＢＮＰとＣＴＬの両方がＣＴＬ：ＰＢＮＰ内でその固有の物理的、表現型的および機能的特性を維持した。本研究は、新しいＣＴＬ：ＰＢＮＰナノ免疫療法がウイルス関連悪性腫瘍、たとえば、ＥＢＶ＋がんを処置するのに効果的であることを実証した。発明者らは、バイオ機能付与技法（静電気的自己組織化および細胞表面ビオチン化）およびアビジン−ビオチン相互作用を伴う一般化可能計画を使用してドナー由来ＥＢＶ抗原特異的ＣＴＬ上へのＰＢＮＰのコンジュゲーションに成功したことを実証した（図１７）。重要なことに、ＣＴＬとＰＢＮＰの両方が細胞−ナノ粒子構築物中でその固有の特性を保持していた。具体的に、ＰＢＮＰ被覆ＣＴＬは、非被覆ＣＴＬと比べて、Ｔ細胞特異的マーカーのその発現および増殖し、サイトカインを発現し、ＥＢＶ抗原発現標的細胞（ＰＨＡ芽細胞）を溶解するその能力を保持していた（図２１）。ＰＢＮＰはその特徴的Ｖｉｓ−ＮＩＲ吸収ピーク、その光熱変換能力、および一次標的細胞のＰＴＴのために使用されるその能力を保持していた（図２２）。これらの研究により、がんの処置のためのならびに感染症の処置のための治療薬としての我々のバイオハイブリッドＣＴＬ：ＰＢＮＰの潜在的使用が示唆される。
【０１２１】
ナノ粒子は、薬物カプセル封入および送達の方法として医薬ではかなりの関心がもたれてきたが、免疫療法のためのその適応性はまだ十分には探求されていない。発明者らは、ＰＢＮＰの媒体として抗原特異的Ｔ細胞を使用するための方法を開示し、Ｔ細胞上にプルシアンブルーナノ粒子をカップリングする方法を強化し、ＰＢＮＰ−Ｔｃ構築物の個々の成分ならびに併用新生成物を特徴付けた。バックパッキング方法はＰＢＮＰおよびＴ細胞の個々の機能を維持する。これは光熱免疫療法には価値がある。なぜならば、光熱免疫療法はナノ粒子とＴ細胞の両方の既存の確立したエフェクター特性を頼りにしており、いずれの大きな変更も利益にならないからである。
【０１２２】
発明者らは、増殖しその標的を特異的に死滅させるＴ細胞の能力に対して細胞バックパッキングの効果がないことを示したが、試験された細胞は確かにサイトカイン産生の減少を示し、これは、環境への種々の表面受容体およびリガンドの関与を排除する表面ナノ粒子の存在に帰すことができると考えられる。
【０１２３】
要約すると、発明者らは、免疫療法の長所とナノ医療の長所を組み合わせる臨床プラットフォームのさらなる発展の基礎を提供するＰＢＮＰバックパックドＴ細胞構築物を作成する実現可能性を実証してきた。
【０１２４】
光熱療法は神経線維腫症１型関連悪性末梢神経鞘腫瘍においてＭＥＫ阻害剤の有効性を改善する
悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）は生存率が低い侵襲性腫瘍であり、４０歳未満の神経線維腫症１型（ＮＦ１）患者の死亡の主な原因である。外科的切除がＭＰＮＳＴの標準治療であるが、不完全であることが多く、機能喪失を生じることがあり、この患者集団のためには新規の処置方法の開発を必要とする。本明細書では、発明者らは、ＭＰＮＳＴのためのＭＥＫ阻害およびナノ粒子ベースの光熱療法（ＰＴＴ）を含む新規の併用療法を説明している。ＭＥＫ阻害剤は、ＮＦ１関連ＭＰＮＳＴにおいて構成的に活性化されている発がん遺伝子である、Ｒａｓにより駆動される活性を遮断し、ＰＴＴは、がん細胞を切除する低浸潤法として役に立つ。ＭＰＮＳＴのためにこれら一見共通点のない技法を組み合わせる我々の理論的根拠は、局所的ＰＴＴを用いた全身化学療法の有効性を実証するいくつかの報告に基づいている。発明者らは、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−０３２５９０１（ＰＤ９０１）をＰＴＴ剤としてプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）と組み合わせて、ＭＥＫ活性を遮断し同時にＭＰＮＳＴを切除した。これらのデータはＰＤ９０１とＰＢＮＰベースのＰＴＴを組み合わせる相乗効果を示しており、この効果はＲａｓ経路に集中してアポトーシス、ネクローシス、および増殖の減少を生じ、それによって腫瘍成長を軽減し、ＭＰＮＳＴ保持動物の生存期間を増加する。これらの結果により、ＭＰＮＳＴを有する患者の処置のためのこの新規の局所的−全身的併用「ナノ化学療法」の可能性が示唆される。
【０１２５】
神経線維腫症１型（ＮＦ１）は、世界中で約３，５００人に１人の個人が発症する神経系の障害である。Ｒｉｃｃａｒｄｉ，Ｖ．Ｍ．＆Ｓｍｉｒｎｉｏｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ，ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ＆Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５１，６５８（１９９２）；およびＫａｔｚ，Ｄ．，Ｌａｚａｒ，Ａ．＆Ｌｅｖ，Ｄ．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｕｒ（ＭＰＮＳＴ）：ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１，ｅ３０，ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６２３９９４０９００１２２７（２００９）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。この障害は、良性の神経線維腫の発症、そのうちのかなりの部分の悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）への進行、低５年生存率の侵襲性腫瘍（＜５０％）および４０歳未満のＮＦ１患者の死亡の主な原因であることを特徴とする。Ｅｖａｎｓ，Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  １．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９，３１１−３１４（２００２）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
外科的切除はＭＰＮＳＴの標準治療である。Ｇｒｏｂｍｙｅｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｒｅｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｈａｈｌａｅｅ，Ａ．，Ｂｕｓｈ，Ｃ．Ｈ．＆Ｈｏｃｈｗａｌｄ，Ｓ．Ｎ．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ９７，３４０−３４９（２００８）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。しかし、手術は侵襲性で、消耗性で、不完全であり、機能の喪失をもたらすことがある。Ｆｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｅ．＆Ｇｕｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｈ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  １．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，１５７３−１５７７（２００２）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。このせいで、ＭＰＮＳＴの管理のための新規の方法の開発が必要とされる。
【０１２７】
この必要性に応えて、発明者らは、ＭＰＮＳＴを処置するための全身的（経口的）に投与されるＭＥＫ阻害剤と局所的（腫瘍内）に投与されるナノ粒子ベースの光熱療法（ＰＴＴ）の新規の併用療法を説明している。ＭＥＫ阻害とＰＴＴを組み合わせる理論的根拠は、多様ながんを処置するための化学療法をＰＴＴと組み合わせる有効性が改善されたことを実証した文献の前例に基づいている。Ｈａｕｃｋ，Ｔ．Ｓ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｙａｔｓｅｎｋｏ，Ｔ．，Ｋｕｍａｒａｄａｓ，Ｊ．Ｃ．＆Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０，３８３２−３８３８（２００８）；Ｙｏｕ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｇ．＆Ｌｉ，Ｃ．Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｈｉｇｈ  ｐａｙｌｏａｄ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｈｏｌｌｏｗ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｌｉｇｈｔ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ４，１０３３−１０４１，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｎ９０１１８１ｃ（２０１０）；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏ−ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３２，８５５５−８５６１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１．０７．０７１（２０１１）；Ｍｅｈｔａｌａ，Ｊ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ｏｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）  ９，１９３９−１９５５，ｄｏｉ：１０．２２１７／ｎｎｍ．１３．２０９（２０１４）；Ｌｉ，Ｘ．，Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｙｕｂａ，Ｅ．，Ｈａｒａｄａ，Ａ．＆Ｋｏｎｏ，Ｋ．ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＰＡＭＡＭ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｒｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ−ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，６５７６−６５８４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１４．０４．０４３（２０１４）；Ｔａｏ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３５，６６４６−６６５６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１４．０４．０７３（２０１４）；Ｗｕ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｌｉｕ，Ｘ．＆Ｌｉｕ，Ｊ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｌｏ���ｄｉｎｇ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｃａｇｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ／ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ５，３０９７０−３０９８０（２０１５）；Ｆａｙ，Ｂ．Ｌ．，Ｍｅｌａｍｅｄ，Ｊ．Ｒ．＆Ｄａｙ，Ｅ．Ｓ．Ｎａｎｏｓｈｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０，  ６９３１−６９４１，ｄｏｉ：１０．２１４７／ＩＪＮ．Ｓ９３０３１（２０１５）；およびＸｕｅ，Ｐ．，Ｂａｏ  Ｊ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．＆Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ５，２８４０１−２８４０９（２０１５）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。研究はＰＴＴ用の薬剤としてグラフェンオキシド、金ナノロッド、およびナノシェルを使用して、がん、たとえば、炎症性乳がんおよび肝細胞癌における化学療法の有効性を改善することに成功してきた。ＰＴＴが化学療法の有効性を改善する１つの機構は、標的腫瘍細胞の膜透過性を増加して、化学療法剤の取込みを増やすことによる。反対に、ＰＴＴも化学療法から利益を得ており、化学療法は全身作用を誘発してＰＴＴの固有の局所的効果を補完する。これら以前の所見が動機となって、発明者らは、ＮＦ１関連ＭＰＮＳＴという文脈でこれら相補的効果を利用しようと努めた。具体的には、発明者らは、ＭＥＫ阻害剤、ＰＤ−０３２５９０１（ＰＤ９０１）とＰＴＴ剤としてのプルシアンブルーナノ粒子（ＰＢＮＰ）を組み合わせて、ＭＥＫ活性を遮断し、同時に近赤外線（ＮＩＲ）レーザーを照射するとＭＰＮＳＴを切除した。本研究は、ＮＦ１関連ＭＰＮＳＴの処置のためのＰＴＴと化学療法間の相乗作用を利用する最初の試みを表している。ＭＥＫ阻害剤は、Ｒａｓシグナル伝達経路を標的にする小分子阻害剤である。ＮＦ１およびＮＦ１関連ＭＰＮＳＴ患者は特徴的に、発がん性Ｒａｓシグナル伝達の負の制御因子であるニューロフィブロミンを欠く。ニューロフィブロミンタンパク質機能がなければ、Ｒａｓは構成的活性化を与えられる。Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄ，Ｏ．Ｎ．，Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌ，Ｄ．Ｈ．＆Ｃｏｕｌｄｗｅｌｌ，Ｗ．Ｔ．Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  Ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｆｏｃｕｓ  ２８，Ｅ８，ｄｏｉ：１０．３１７１／２００９．１１．ＦＯＣＵＳ０９２２１（２０１０）；およびＲａｄ，Ｅ．＆Ｔｅｅ，Ａ．Ｒ．Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  １：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｉｎｓｉ��ｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ５２，３９−４６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１６．０２．００７（２０１６）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。Ｒａｓシグナル伝達経路は、ＲＡＦ、ＭＥＫ、およびＥＲＫを通じてリン酸化カスケードを生み出し、このＥＲＫはそのリン酸化された形態で（ｐ−ＥＲＫ）で、無制御細胞増殖およびがん進行の増加に関連する遺伝子の転写に影響を及ぼす。Ｔａｎｏｕｅ，Ｔ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．＆Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｅ．Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，１１０−１１６，ｄｏｉ：１０．１０３８／３５００００６５  （２０００）；およびＦａｒａｓｓａｔｉ，Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７３，１８６１−１８７２，ｄｏｉ：１０．２３５３／ａｊｐａｔｈ．２００８．０８０３７６（２００８）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。調査によれば、ＭＰＮＳＴにおいてＲａｓ活性を遮断するのにＭＥＫ阻害剤を使用する可能性が示唆されるが、これらの研究は、細胞株または動物モデルのいずれかにおいて行われ、ＭＰＮＳＴの処置ではあまり重要ではない結果が得られた。Ｖａｒｉｎ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｄｕａｌ  ｍＴＯＲＣ１／２  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ＮＦ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌｅｘｉｆｏｒｍ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．７０９９（２０１６）；Ｄｏｄｄ，Ｒ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．ＮＦ１  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２，１９０６−１９１７，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３５−７１６３．ＭＣＴ−１３−０１８９（２０１３）；Ｅｎｄｏ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＡＫＴ／ｍＴＯＲ  ａｎｄ  ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍＴＯＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ＮＦ１−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９，４��０−４６１，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１２−１０６７（２０１３）；Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ７，８９０−８９６，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３５−７１６３．ＭＣＴ−０７−０５１８（２００８）；およびＪｅｓｓｅｎ，Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２３，３４０−３４７，ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ６０５７８（２０１３）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。化学療法とＰＴＴを組み合わせる有効性が改善されたことに基づいて、発明者らは、ＭＰＮＳＴを処置するためにＰＢＮＰベースのＰＴＴと組み合わされるとＭＥＫ阻害剤ＰＤ９０１の効果がさらに強力になることを期待した。ＰＴＴは光活性化ナノ粒子および低出力ＮＩＲレーザーを使用して腫瘍を破壊するための低浸潤的方法である。Ｌｏｏ，Ｃ．，Ｌｏｗｅｒｙ，Ａ．，Ｈａｌａｓ，Ｎ．，Ｗｅｓｔ，Ｊ．＆Ｄｒｅｚｅｋ，Ｒ．Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎａｎｏｓｈｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５，７０９−７１１（２００５）；およびＨｕａｎｇ，Ｘ．，Ｊａｉｎ，Ｐ．Ｋ．，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｉ．Ｈ．＆Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ（ＰＰＴＴ）  ｕｓｉｎｇ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｌａｓｅｒｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３，２１７−２２８（２００８）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。本研究では、発明者ら
がＭＰＮＳＴのＰＴＴ用にＰＢＮＰを使用し、これは発明者らが以前、皮下神経芽細胞腫の切除のために使用していた。Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５，１２９−１３７，ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｃ４００４２６６（２０１４）；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｙａｄａｖｉｌｌｉ，Ｓ．，Ｓｚｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｎａｚａｒｉａｎ，Ｊ．＆Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．Ｍａｎｇａｎｅｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，２５８１−２５９５，ｄｏｉ：１０．２１４７／ＩＪＮ．Ｓ６３４７２（２０１４）；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｈ．Ａ．，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｌ．，Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｄ．＆Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ４，２９７２９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ４ｒａ０５２０９ａ（２０１４）；およびＶｏｊｔｅｃｈ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｎｏ−Ｍｅｊｉａ，Ｊ．，Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｓｚｅ，Ｒ．Ｗ．＆Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．Ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ｅ５２６２１，ｄｏｉ：１０．３７９１／５２６２１（２０１５）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。ＰＴＴ用に使用される代わりのナノ粒子と比べて、ＰＢＮＰはいくつかの利点を提供する。すなわち、ＰＢＮＰは単一のスケーラブルな工程において低コストで容易に合成することが可能であり、ヒト経口消費（放射性中毒の処置のために）では既にＦＤＡの認可を受けており、ＰＴＴ剤として使用するためのその潜在的安全性が示唆される。Ｆａｕｓｔｉｎｏ，Ｐ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｓｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｅｒｒｉｃ  ｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ：Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ４７，１１４−１２５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｂａ．２００７．１１．０４９（２００８）；およびＹａｎｇ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈａｌｌｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｅｒｒｉｃ  ｈｅｘａｃｙａｎｏｆｅｒｒａｔｅ：Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３５３，１８７−１９４，ｄｏｉ��１０．１０１６／ｊ．ｉｊｐｈａｒｍ．２００７．１１．０３１（２００８）を参照されたい。前記文献はそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
ＰＢＮＰベースのＰＴＴと併用したＰＤ９０１がＭＰＮＳＴに対して処置成績の改善をもたらすかどうかを確定するため、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウスＭ２  ＭＰＮＳＴ細胞、およびｉｎ  ｖｉｖｏでＭＰＮＳＴの同系皮下マウスモデルを使用した。Ａｎｔｏｓｚｃｚｙｋ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６，１０５７−１０６６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎｅｕｏｎｃ／ｎｏｔ３１７（２０１４）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。第一に、発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＰＮＳＴ細胞を処置する際のＰＤ９０１およびＰＢＮＰベースのＰＴＴの有効性を個別に評価した。具体的には、ＭＰＮＳＴ細胞生存率に対する個々の療法の効果および療法により誘導される細胞死の機構を発明者らは評価した。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＰＮＳＴ細胞の処置でのＰＤ９０１／ＰＴＴ組合せの有効性およびＰＤ９０１とＰＴＴのこの組合せが相乗的かどうか（用量応答および薬物相互作用計算を使用して）を評価した。最後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍進行および動物生存期間に対するＰＤ９０１／ＰＴＴ組合せの効果を確定した。これらの研究の所見によれば、最終的臨床解釈への重要な前触れである、ＭＰＮＳＴを前臨床的に処置するための新規種類のナノ化学療法の実現可能性が実証されている。
【０１２９】
ＰＤ９０１は、ＥＲＫ活性化を遮断することによりｉｎ  ｖｉｖｏでＭＰＮＳＴを効果的に処置する  Ｍ２細胞におけるＰＤ９０１の作用の推定される抗ＭＥＫ機構を確認するため、発明者らは、Ｒａｓシグナル伝達経路でＭＥＫの下流に位置している、ＥＲＫの活性化に対するその効果を測定した。Ｍ２細胞は溶媒（ＤＭＳＯ）または１μＭのＰＤ９０１で４または８時間処置し、次に収穫して、溶解して、ローディングコントロールとしてアクチンを使用してリン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）および全ＥＲＫについて探索した。１μＭのＰＤ９０１は４時間でも８時間でもＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）の活性化を効果的に遮断したが、これは溶媒処置レーンで観察された明瞭なｐ−ＥＲＫバンドと比べて、ＰＤ９０１処置レーンでのウェスタンブロット上に目に見えるｐ−ＥＲＫバンドがないことにより実証された（図２３ａ）。Ｍ２細胞におけるｐ−ＥＲＫ発現が減少したという我々の所見は、公表されている文献の所見と一致しており、ＰＤ９０１処置の数時間後にはＥＲＫ活性化が減少したことが確かめられる。Ｈｅｎｎｉｇ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＤ０３２５９０１  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，１２１８−１２２５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２３４７０（２０１０）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
ＭＰＮＳＴ生存率に対するＭＥＫ阻害の効果を確定するため、発明者らはＭ２細胞を変動する用量のＰＤ９０１で処置し、細胞生存率を測定した。ＰＤ９０１はＭ２細胞生存率を濃度依存的様式で減少させ、ＩＣ５０はおおよそ１μＭであった（図２３ｂ）。これらの結果は、他の細胞株でＭＥＫ阻害剤を使用する以前の研究と一致している。Ｄｅ  Ｒａｅｄｔ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．ＰＲＣ２  ｌｏｓｓ  ａｍｐｌｉｆｉｅｓ  Ｒａｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ＢＲＤ４−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１４，２４７−２５１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５６１（２０１４）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
Ｍ２生存率の減少を引き起こす機構を確定するため、細胞死の機構（アポトーシス対後期アポトーシス／ネクローシス）およびＭ２細胞周期に対するＰＤ９０１処置の効果を分析した。ＰＤ９０１は、試験されたすべての濃度でアポトーシス（ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ−）と後期アポトーシス／ネクローシス（７ＡＡＤ＋）の両方によりＭ２生存率を減少させることが見出された（図２３ｃ）。さらに、ＰＤ９０１は濃度依存的様式でＭ２細胞のＧ０／Ｇ１期での著しい停止を引き起こし（図２３ｄ）、処置後の増殖の減少が示された。Ｍ２細胞を用いたこれらの結果により、ＰＤ９０１を使用するＭＥＫ阻害が、ＥＲＫ活性化の遮断により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＰＮＳＴを処置するための実現可能なモダリティーであることが示唆されており、ＥＲＫの活性化はさもなければ細胞増殖および分裂を増加させると考えられる；Ｋａｔｚ，Ｄ．，Ｌａｚａｒ，Ａ．＆Ｌｅｖ，Ｄ．Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｕｒ（ＭＰＮＳＴ）：ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１，ｅ３０，ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６２３９９４０９００１２２７（２００９）。
【０１３２】
ＰＢＮＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＰＮＳＴのＰＴＴのための効果的な薬剤として機能する  ＰＢＮＰがＭＰＮＳＴのＰＴＴのための効果的な薬剤として機能するかどうかを確定するため、研究はＭ２細胞を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われた。第一に、動的光散乱により測定される場合単分散粒径分布（平均流体力学的径６８．１ｎｍ）を有し、透過型電子顕微鏡で観察した場合その特徴的立方体構造を有するＰＢＮＰが合成された（図２４ａ）。合成されたＰＢＮＰは、１．５Ｗ／ｃｍ２レーザー出力密度の８０８ｎｍＮＩＲレーザーで１０分間照射されると濃度依存的様式で熱くなった（図２４ｂ）。重要なことに、この増加性加熱は、ＰＢＮＰがＮＩＲレーザーで同じように照射されるとＭ２細胞の生存率の減少を一貫してもたらした（図２４ｃ）。約４５℃およびそれよりも高い温度はＭ２細胞の生存率を類似する程度に減少させるように思われた（おおよそ１５〜２５％生存可能）。興味深いことに、ＰＢＮＰベースのＰＴＴは、Ｍ２細胞においてそれが加熱される温度範囲に応じて異なるレベルのアポトーシスおよび／または後期アポトーシス／ネクローシスを始動させた。レーザー出力もレーザー照射持続時間もこれらの研究では一定に保たれていたので、この温度範囲は、今度は、ＰＴＴのために使用されるＰＢＮＰの濃度に依存していた。４５〜５０℃温度範囲まで加熱されたＭ２細胞は主にアポトーシスを通じて細胞死を始動させ、１．５Ｗ／ｃｍ２で１０分間照射後４６．８℃の平均温度を達成した０．０３ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰで処置されたＭ２細胞は細胞の７２．２％でアポトーシスが生じた。これとは対照的に、＞５０℃まで加熱されたＭ２細胞は主に後期アポトーシス／ネクローシスを通じて細胞死を始動させ、１．５Ｗ／ｃｍ２で１０分間照射後５１．３℃の平均温度を達成した０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰで処置されたＭ２細胞は細胞の７３．２％で後期アポトーシス／ネクローシスが生じた（図２４ｄ）。アポトーシスまたはネクローシスのいずれかにより細胞死を優先的に始動させる温度範囲についてのこの所見は、腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで切除するのに金ナノロッドを使用する以前の研究により確証される。Ｐａｔｔａｎｉ，Ｖ．Ｐ．，Ｓｈａｈ，Ｊ．，Ａｔａｌｉｓ，Ａ．，Ｓｈａｒｍａ，Ａ．＆Ｔｕｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｗ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７，１−１１，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０５１−０１４−２８２２−３（２０１５）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。したがって、ＰＢＮＰはＭＰＮＳＴのＰＴＴのための効果的な薬剤として機能し、これらの細胞の生存率をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させる。さらに重要なことに、我々のデータによれば、ＰＢＮＰベースのＰＴＴを使用して細胞死を誘導する潜在的に調節可能な機構（アポトーシス対ネクローシス）が示唆され、これはｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＰＮＳＴに対する処置成績を改善するためにそれに続く研究で��用することが可能である。
【０１３３】
ＰＤ９０１とＰＴＴは相乗的に組み合わされてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＰＮＳＴに対して改善された処置成績をもたらす  Ｍ２細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置する際のＰＤ９０１とＰＢＮＰベースのＰＴＴ両方の個々の有効性を確定した後、発明者らは次に処置を組み合わせる潜在的な利点を調べようと努めた。細胞生存率研究では、２つの処置をｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み合わせると、Ｍ２細胞の生存率を施された処置のいずれかの単独よりも多く有意に減少させることができることが示された（図２５ａ）。低用量（０．１２５μＭのＰＤ９０１、「低ＰＤ９０１」；０．００５ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰベースのＰＴＴ、「低ＰＴＴ」）でも高用量（１μＭのＰＤ９０１、「高ＰＤ９０１」；０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＢＮＰベースのＰＴＴ、「高ＰＴＴ」）でも、併用処置により、同一条件下で施された個々の処置よりも細胞生存率を有意に減少させた。さらに、ＰＤ９０１＋ＰＴＴ（「高コンボ」）は機能してＭ２細胞においてｐ−ＥＲＫ発現を効果的に遮断し、ＰＤ９０１処置単独の効果を写し出していた（図２５ｂ）。ＰＤ９０１単独でも高コンボ処置でも類似するウェスタンブロット読み出し情報がもたらされたが、これらの効果が２つの処置群で経時的に維持されるかどうかを解明するにはさらなる研究が必要であることを心に留めておくのが重要である。以前の研究では、ＭＥＫ阻害後の経時的なｐ−ＥＲＫ発現の救済が示されている。したがって、ｐ−ＥＲＫ発現の持続性の減少をもたらす療法は、ＭＰＮＳＴにおいて処置成績を改善するには重要である可能性がある。
【０１３４】
興味深いことに、ＰＴＴ単独でｐ−ＥＲＫ発現を減らすことができ（図２５ｂ）、これはそのシグナル伝達経路に沿った点でのＲａｓシグナル伝達に対してＰＴＴが潜在的に影響を及ぼすことを示している。この所見により、ＰＤ９０１とＰＴＴはＭ２細胞生存率を減少させるのに機能の仕方が異なる（それぞれ、細胞周期停止対アブレーション）が、これらの効果はＲａｓシグナル伝達経路に沿って集中している。ＰＴＴを使用してがんにおいて際立ったシグナル伝達経路を変化させることは以前調査されたことがない。ＮＦ１関連ＭＰＮＳＴという文脈でのＲａｓシグナル伝達に対するＰＴＴの効果を確定するためのさらに深い機構的研究が進行中である。
【０１３５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＤ９０１／ＰＴＴ組合せの効果を評価する研究の別の構成要素として、発明者らは、Ｍ２細胞生存率の減少に対するＰＤ９０１とＰＴＴの効果が相乗的かどうかを確定しようと努めた。個々の処置またはＰＤ９０１／ＰＴＴ組合せのいずれかの増加濃度に応答したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭ２細胞の生存率を測定する用量応答曲線によれば、ＰＤ９０１とＰＴＴは相乗的に組み合されてＭ２生存率を減らすことが示された（図２５ｃ）。試験された用量の３つ（用量２、３、および４）の薬物相互作用係数（ＣＤＩ）は０．７未満であると計算され、ＰＤ９０１とＰＴＴの間の有意な薬物相乗作用を示している。Ｘｕ，Ｓ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｐａｅｏｎｏｌ  ａｎｄ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｏｎ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ａｃｔａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ２８，８６９−８７８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７４５−７２５４．２００７．００５６４．ｘ（２００７）を参照されたい。前記文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
ＰＤ９０１とＰＴＴは組み合わされてｉｎ  ｖｉｖｏでＭＰＮＳＴ進行を減らし生存期間を増やす  我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ所見が動機となって、発明者らは以前の文献に基づいてＢ６１２９ＳＦ１／ＪマウスでＭ２細胞株を使用してＭＰＮＳＴの同系マウスモデルを作成して、新規併用療法のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を試験した。マウスにはＭ２細胞を皮下に注射した。マウスが確立した腫瘍（径で約１０ｍｍ）を示すと、ＭＰＮＳＴ保持マウスは４つの群に分け、１）非処置（ｎ＝５）、２）ＰＤ９０１で処置（ｎ＝５）、３）ＰＴＴで処置（ｎ＝５）、または４）ＰＤ９０１とＰＴＴの両方で処置（ｎ＝５）であった。腫瘍進行は毎日に測定しマウス生存期間は処置後モニターした。非処置群の腫瘍はもっとも速い速度で進行し（図２６ａ、黒色線）、この群のマウスは１４日またはそれ未満後に高い腫瘍負荷に屈した（生存期間中央値＝１３日；図２６ｂ）。これとは対照的に、ＰＤ９０１とＰＴＴで処置したマウスは、その腫瘍進行曲線の勾配が減少していることにより示されるように、他のすべての群と比べて腫瘍成長が遅いことを示した（図２６ａ、紫色線）。この腫瘍成長が遅いことは、ＰＤ９０１処置およびＰＴＴ処置マウスでそれぞれ生存期間中央値１８日と１５日が観察された、他のすべての処置群のマウスと比べてＰＤ９０１とＰＴＴの両方で処置したマウスでは生存期間が有意に増加したと言い換えられた（生存期間中央値２９日）（図２６ｂ；ｐ＜０．０５）。処置の８時間後ＭＰＮＳＴ保持マウスから抽出された腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により、併用処置後の腫瘍細胞死の増加というこれらの所見が確かめられた（図２５ａ）。処置成績の改善は、ＰＢＮＰベースのＰＴＴの単回局所投与およびＰＤ９０１の毎日経口投与を使用して観察されたことに注目するべきである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたこれら２つの療法の収束性の生物学的効果をテコ入れするこの併用療法のさらなる最適化により、潜在的な利点、たとえば、ＭＥＫ阻害剤のより少ない服用回数を与えることに加えて、現在観察される成績よりもＭＰＮＳＴでの処置成績がさらに改善される可能性がある。
【０１３７】
総合すると、我々の所見により、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＰＮＳＴについての処置成績の改善を達成するためにＰＢＮＰベースのＰＴＴと併用してＰＤ９０１を使用する実現可能性が実証される。
【０１３８】
要約すると、発明者らは、２つの異なるが相乗的な処置、すなわち、小分子阻害剤ＰＤ９０１を使用するＭＥＫ阻害およびＰＢＮＰベースのＰＴＴを含む新しい併用療法を開示する。発明者らは、２つの処置戦略がＲａｓシグナル伝達経路に収束していることを示しており、これによりＥＲＫ活性化が減少した。これらの効果は、ＰＴＴを介した光熱アブレーションの効果と組み合わされると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもＭＰＮＳＴの成長を減少させた。我々のグループでの進行中の研究は、これらのデータを頼りにして、ＰＤ９０１およびＰＴＴの組合せ効果をさらに機構的に説明し、ＮＦ１関連ＭＰＮＳＴを臨床的に処置する際のこの併用ナノ化学療法の相乗作用をもっとよく利用する。
【０１３９】
以下の方法および材料が用いられた。
【０１４０】
化学物質およびＰＢＮＰ合成  ＰＤお３２５９０１（＃ＰＺ０１６２；ＰＤ９０１）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＰＢＮＰは以前記載された通りにＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入したその構成塩から合成した；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｈ．Ａ．，Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｌ．，Ｄｕｍｏｎｔ，Ｍ．Ｆ．，Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｄ．＆Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｒ．Ｐｒｕｓｓｉａｎ  ｂｌｕｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ４，２９７２９，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ４ｒａ０５２０９ａ（２０１４）。
【０１４１】
ＭＰＮＳＴ細胞  Ｍ２マウスＭＰＮＳＴ細胞株は、Ｄｒ．Ｓａｍｕｅｌ  Ａ．Ｒａｂｋｉｎから寄贈され（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ；Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；Ａｎｔｏｓｚｃｚｙｋ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ．  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６，１０５７−１０６６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎｅｕｏｎｃ／ｎｏｔ３１７（２０１４））、最初はＬＦ  Ｐａｒａｄａ研究所から入手されたＮｆ１／Ｔｒｐ５３ヘテロ接合体マウスにおいて自然に生じた腫瘍から単離された。Ｍ２細胞は、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトアビジンを有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で培養された。
【０１４２】
ウェスタンブロット  処置されたＭ２細胞は１×ＲＩＰＡ緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）］に溶解された。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上に移された。次に、ブロットはＴＢＳＴ中５％の脱脂乳で遮断され、続いて４℃で一晩一次抗体のインキュベーションを行った。洗浄後、ブロットは室温で１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体でインキュベートされた。シグナルはＥＣＬまたはＥＣＬプラス（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用し続いてフィルム現像により検出された。使用された一次抗体は以下の通りである：ｐ−ＥＲＫ（１対１，０００、ウサギ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、ＥＲＫ（１対２，０００、ウサギ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、およびβ−アクチン（１対１０，０００、マウス、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１４３】
細胞生存率アッセイ  Ｍ２細胞は９６ウェル細胞培養プレートに一晩、１つのウェルあたり５０，０００細胞で播種した。処置後、細胞はＡＴＰベースのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して生存率について分析した。
【０１４４】
発光はＥｎＳｐｉｒｅ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）上で読み取った。
【０１４５】
フローサイトメトリー  適切な処置後、Ｍ２細胞はＰＥ−ＡｎｎｅｘｉｎＶ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ）および７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ）で染色した。細胞周期分析では、Ｍ２細胞は処置後ヨウ化プロピジウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で染色した。フローサイトメトリーはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ上で実施し、ＦｌｏｗＪｏ７．６ソフトウェアで分析した。
【０１４６】
動的光散乱  ＰＢＮＰの流体力学的径（１０μｇ／ｍＬ）は、製造業者の仕様書によりＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で動的光散乱より測定した。
【０１４７】
透過型電子顕微鏡  ＰＢＮＰは１００メッシュの標準ホルムバール格子（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）上に落とし、ＪＥＭ−２１００  ＦＥＧ高解像度透過型電子顕微鏡上、２００ｋＶで透過型電子顕微鏡により可視化した。
【０１４８】
光熱療法  １．５Ｗ／ｃｍ２の８０８ｎｍＮＩＲレーザー（Ｌａｓｅｒｇｌｏｗ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）はすべてのＰＴＴ研究用に使用された。ＰＢＮＰは種々の濃度で９６ウェルプレートに添加され、１０分間照射された。熱電対（Ｏｍｅｇａ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して１分間隔でウェルの温度を測定した。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＤ９０１とＰＢＮＰベースのＰＴＴの相互作用の分析  薬物相互作用係数（ＣＤＩ）を使用して、以前３６に記載された通りに、Ｍ２細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置する際のＰＤ９０１とＰＢＮＰベースのＰＴＴの間の相互作用を分析した。手短に言えば、Ｍ２細胞を変化する用量のＰＤ９０１、ＰＢＮＰベースのＰＴＴ、または併用ＰＤ９０１／ＰＴＴに受けさせた。使用したＰＤ９０１の用量は０．１２５〜１００μＭであり；ＰＢＮＰベースのＰＴＴの用量はＮＩＲレーザーで１０分間照射される０．００５〜０．１ｍｇ／ｍＬであった。ＰＤ９０１＋ＰＴＴ併用の用量は個々の処置ごとに使用された併用用量であった。それぞれの用量でのＭ２細胞の生存率は、ＡＴＰベースのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して測定した。所与の用量のＰＤ９０１、ＰＢＮＰベースのＰＴＴ、または併用ＰＤ９０１／ＰＴＴについてのＣＤＩは式：ＣＤＩ＝（ＰＤ９０１／ＰＴＴに応答したＭ２生存率）／（ＰＤ９０１に応答したＭ２生存率×ＰＴＴに応答したＭ２生存率）を使用して計算した。ＣＤＩ＜１の値は薬物相乗性を示しており、ＣＤＩ＜０．７は有意な薬物相乗性を示しており、ＣＤＩ＝１は加算性を示しており、ＣＤＩ＞１は薬物拮抗性を示した。
【０１５０】
動物  すべての動物研究はＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍの施設動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃０００３０５７１）の承認を受けた。研究は承認されたＩＡＣＵＣガイドラインに従って行った。生後４〜６週間の雌Ｂ６１２９ＳＦ１／ＪマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。マウスは毒性の症状（たとえば、病気のマウスの不自然な姿勢、感染、損なわれた移動性、体重減少、自傷行為、出血）について毎日モニターした。毒性症状のせいで安楽死させたマウスはおらず、測定可能な体重減少は記録されなかった。動物は腫瘍接種に先立って３〜４日間気候順化させた。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究  １００万のＭ２細胞を１００μＬの５０％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）／５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊマウスの背中に注射した。腫瘍が径で１０ｍｍに到達すると処置を開始した。動物は４つの群で処置した：（１）非処置（ｎ＝５）：動物は処置を受けなかった、（２）ＰＴＴ処置（ｎ＝５）：動物は５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＮＰを腫瘍内に注射され、１．５Ｗ／ｃｍ２ＮＩＲレーザーを１０分間照射された、（３）ＰＤ９０１処置（ｎ＝５）：動物は０．５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ８０中経口胃管栄養法により毎日５ｍｇ／ｋｇのＰＤ９０１を与えられた、および（４）ＰＤ９０１とＰＴＴコンボ処置（ｎ＝５）：動物は上に収載されたＰＴＴとＰＤ９０１処置の両方を与えられた。動物は、腫瘍が径で＞２０ｍｍに到達した場合、その腫瘍が潰瘍化した場合、または動物が苦痛の兆候を示した場合、安楽死させた。腫瘍は毎日、キャリパーで測定された。処置の効果の組織学的分析では、腫瘍は処置の８時間後に収穫され（上記の処置；ｎ＝群あたり２〜３）、処理され、それに続く顕微鏡検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。
【０１５２】
統計分析  統計分析はＰｒｉｓｍＶ５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行った。プロットでの群間の統計的有意性は両側スチューデントｔ検定を使用して決定し、ｐ＜０．０５を有する値は統計的に有意であるとみなし、アスタリスク（＊）を付けて２つの特定の群間の比較を示した。＊＊はｐ値＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。ｐ値＞０．０５は統計的に有意でないとみなした。群ごとの試料サイズ（ｎ）は、各群３以上であるか、または研究ごとに明示した。動物生存期間研究では、対数順位検定を使用して種々の群間の生存期間の統計的有意差を決定した（α＝０．０５、χ２が検定の臨界値を超える場合は帰無仮説を棄却した）。生存期間結果はカプラン・マイヤープロットを作成することにより分析した。本分析では、ｐ値＜０．０５は統計的に有意であるとみなした。
【０１５３】
前述の開示は本発明の例となる態様を説明しているだけである。当業者であれば理解するように、本発明はその精神または本質的特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、本発明の開示は例を示すことを意図しているが、本発明の範囲ならびに他の特許請求の範囲を限定するものではない。本開示は、本明細書の教えの容易に識別できるいかなる変異形も含み、一部、前述の特許請求の範囲を規定する。
【０１５４】
本明細書で言及される全ての出版物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることを明確に個別に示されている場合と同じ程度に参照によりその全体を本明細書に組み込まれ、参照による組込みが現れる明細書の同じ文章、段落、頁または節に現われる開示が特に参照される。
【図１】
2019512486.tif 000004
【図２】
2019512486.tif 000005
【図３】
2019512486.tif 000006
【図４】
2019512486.tif 000007
【図５】
2019512486.tif 000008
【図６】
2019512486.tif 000009
【図７】
2019512486.tif 000010
【図８】
2019512486.tif 000011
【図９】
2019512486.tif 000012
【図１０】
2019512486.tif 000013
【図１１】
2019512486.tif 000014
【図１２】
2019512486.tif 000015
【図１３】
2019512486.tif 000016
【図１４】
2019512486.tif 000017
【図１５】
2019512486.tif 000018
【図１６】
2019512486.tif 000019
【図１７】
2019512486.tif 000020
【図１８】
2019512486.tif 000021
【図１９】
2019512486.tif 000022
【図２０】
2019512486.tif 000023
【図２１−１】
2019512486.tif 000024
【図２１−２】
2019512486.tif 000025
【図２２】
2019512486.tif 000026
【図２３】
2019512486.tif 000027
【図２４】
2019512486.tif 000028
【図２５】
2019512486.tif 000029
【図２６】
2019512486.tif 000030
【国際調査報告】
2019512486.tif 000031
2019512486.tif 000032
2019512486.tif 000033