(57)【要約】  極端紫外放射線（EUV）及び/又は軟X線の波長を使用して遺伝子を読み取り、画像化し、編集し、検出し、同定し、マッピングし、変化させ、欠失させ、修復し、かつ配列決定する方法、装置、及びプロセスを記載する。DNA、RNA、及びタンパク質配列のハイスループットのゲノムスキャンを可能にするEUVスキャンツールも記載する。また、遺伝子配列の特性を示す吸収スペクトルを記録するデータベースも記載する。【選択図】図１
2019506625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子による吸収を検出するための装置であって：
a. 0.1 nm〜250 nmの波長を有する放射線を送出するように構成された放射線源；
b. 任意に、該放射線を集束させることが可能な1以上の集束構成要素；
c. 該放射線の少なくとも一部を吸収するように構成された高分子；
d. 該高分子によって吸収された放射線を検出することが可能な検出器であって、高分子の配列を検出するために使用される、前記検出器を備える、前記装置。
【請求項２】
前記放射線源が極端紫外線源（EUV）である、請求項1記載の装置。
【請求項３】
前記放射線源が軟X線源である、請求項1記載の装置。
【請求項４】
前記放射線を集束させることが可能な前記1以上の集束構成要素が存在し、かつ前記高分子に該放射線を集束させることが可能な1以上のミラー、レンズ、又は反射鏡、及びそれらの組合わせから選択される、請求項1記載の装置。
【請求項５】
前記高分子に前記放射線を集束させることが可能な1以上のミラーを備える、請求項1記載の装置。
【請求項６】
前記高分子を前記放射線の範囲内で接触させるように構成されたステージを備える、請求項1記載の装置。
【請求項７】
前記ステージが、前記高分子を前記放射線の範囲内で並進させるように構成されている、請求項6記載の装置。
【請求項８】
前記高分子が、ゲノム配列、DNA配列、RNA配列、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、塩基対、一塩基多型、突然変異、コピー数多型、リード、タンパク質配列、アミノ酸、ペプチド、塩基対配列、細菌、対立遺伝子、染色体、又は分子である、請求項1〜7のいずれか1項記載の装置。
【請求項９】
前記高分子がペプチド又はタンパク質である、請求項1〜8のいずれか1項記載の装置。
【請求項１０】
前記高分子が核酸である、請求項1〜9のいずれか1項記載の装置。
【請求項１１】
前記検出器からの吸収スペクトルを前記高分子の配列へと変換するように構成された、構成要素をさらに備える、請求項8記載の装置。
【請求項１２】
高分子の配列を検出するための、請求項1〜11のいずれか1項記載の装置。
【請求項１３】
高分子の配列を読み取るための、請求項1〜12のいずれか1項記載の装置。
【請求項１４】
高分子の配列を編集するための、請求項1〜13のいずれか1項記載の装置。
【請求項１５】
1以上の遺伝子配列を検出し、読み取り、同定し、かつ編集するための装置であって、
―0.1 nm〜250 nmの範囲の波長を有する光を送出するように構成された、EUV又は軟X線光源、
―光スポットサイズを集束させるためのミラー、レンズ、又は反射鏡、
―配列決定するべき生体物質、
―該配列を同定する吸収スペクトルを備える、前記装置。
【請求項１６】
ゲノム配列、DNA配列、RNA配列、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、塩基対、一塩基多型、突然変異、 コピー数多型、リード、タンパク質配列、アミノ酸、ペプチド、塩基対配列、細菌、対立遺伝子、染色体、分子からなる請求項15記載の1以上の生体物質を検出し、読み取り、同定し、かつ編集するための装置。
【請求項１７】
少なくとも6つの投影ミラー及びプラズマ光源を備える投影レンズ系を使用する、請求項15記載の装置。
【請求項１８】
遺伝子型判定に使用する、請求項15記載の装置。
【請求項１９】
ゲノム地図を作成するために使用する、請求項15記載の装置。
【請求項２０】
細胞内でゲノム配列を1以上の次元でマッピングするための、請求項15記載の装置を使用する方法。
【請求項２１】
DNA塩基、RNA塩基、タンパク質、既知の遺伝子配列、物理的座標（これらの任意の組合わせを含む）についての特性EUV又は軟X線吸収スペクトルのデータベース又はライブラリ。
【請求項２２】
ゲノムの3Dマップを形成する、請求項21記載のライブラリ。
【請求項２３】
自己学習アルゴリズム又は予測的配列決定アルゴリズムのための参照を提供する、請求項1記載のライブラリ。
【請求項２４】
強く集束したEUV又は軟X線放射線を標的配列に送達して、該配列中の塩基を切り離す、配列編集機構。
【請求項２５】
複数の固有の標的配列を編集する、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
自己学習アルゴリズム又は予測的配列アルゴリズムを使用して、請求項1記載の装置を使用することから導かれる遺伝子配列の同定。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は2016年2月1日に出願された米国仮特許出願第62/289,897号の恩典を主張し、該仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
次世代配列決定法（NGS）及びSanger配列決定法などの配列決定技術は、配列遺伝子及びゲノムの塩基対を読み取り、かつ同定するために使用される。ヒトゲノム中にはおよそ32億塩基対が存在するため、大規模で同定し、配列決定するには、ハイスループット配列決定機器が必要となる。次世代配列決定法は蛍光標識ターミネータを使用する合成及び大量の並列処理によって配列決定して、遺伝子構造及び多型の正確な同定を提供するような技術を含む。CRISPRのような技術は遺伝子配列を編集するために使用される。特殊な酵素を使用して遺伝子配列セット内の所与の配列を標的化し、識別した配列を繰り返し除去する。これが最先端の技術である。
【０００３】
上記技術は固有の利点及び欠点を有する。NGS配列決定法には高レベルの部分的切断、大量の並列的複製、再集合、及び遺伝子配列の参照が要求される。CRISPRには対象の遺伝子配列の周囲の少なくとも20対で編集を行う特異的標的プライマーが要求される。これまでのところ、これらの技術のいずれも、動的に読み取り及び編集を行わず、また読み取るべき、及び編集すべき所与の遺伝子配列内部の塩基対の選択を可能にもしない。
【０００４】
光リソグラフィシステムは、例えば集積回路及び14 nm及びそれより小さい物理的特徴を有するデバイスの製造のために一般に使用されている。そのようなシステムの解像力は露光波長に比例する。より波長が短いほど、製造における分解能が向上し得る。極端紫外リソグラフィ（EUVL）では、極端紫外（EUV）波長（およそ124ナノメータ〜0.1ナノメータ）の電磁放射線を使用する。従って、これらの波長の光子はおよそ10エレクトロンボルト（eV）〜12.4 keV（それぞれ124 nm及び0.1 nmに相当する）の範囲のエネルギーを有する。リソグラフィのためのEUV波長の使用は、半導体チップなどのデバイス並びに他の適用、例えばポリマーエレクトロニクス、太陽電池、バイオテクノロジー、及び医療技術における特徴サイズが10 nm以上未満へと低下するという潜在的利点を有している。
【０００５】
これまでのところこれらの技術ではいずれも、同時に読み取り及び編集を行うことができず、また所与の遺伝子配列内の塩基対から無作為に選択したものを動的に読み取らせ、かつ編集させることができない。
【発明の概要】
【０００６】
（概要）
一態様において、本件開示は一般に生物学的細胞の内側又は外側のいずれかで、遺伝子又は遺伝子配列を選択的に検出し、読み取り、同定するバイオテクノロジー適用における極端紫外（EUV）放射線、軟X線放射線の使用に関する。本件開示はさらに、ゲノム配列内の所与の位置で動的に、かつ/又は無作為に、かつ/又は選択的に遺伝子を編集すること、欠失させること、変化させること、かつ/又は修復することに関する。本明細書では、その全てが配列決定法に複雑さ、不正確さ、及び時間をもたらすDNA合成、生体分子タグ付加、蛍光標識、DNA複製、酵素的開裂、並列処理、カバレッジ深度（depth of coverage）、参照ゲノムとのアラインメント、ナノポアチャネル、ショットガン配列決定法、イオン検出、又はヌクレオチド付加を必要とすることなく選択的に、かつ非順次に配列決定する方法を提供する。
【０００７】
別の態様において、本件開示はまた、リアルタイムで遺伝子配列を機械的に読み取り、変化させるための次世代EUVハイスループットツール又は装置の設計に関する。このツール又は装置の構造は、1以上の照明光学系、投影レンズ又はミラー、光集束デバイス、EUV又は軟X線光源、集光光学系、試料ステージのセットを備える。このツールはスキャンモードにおいて使用して、DNA配列を2D又は3Dでスキャンすることができる。極端紫外波長は、プラズマ及びシンクロトロン光源、又は固体標的、又は液体ドロップレット源などのデバイスによって人為的に発生させることができる。一実施態様において、6以上の高開口数の投影ミラー、4以上の照明ミラー、1つの集光器、及び試料ステージを提供する。ミラーは、放物面を有し、非球面であり、又は自由形状とすることができる。ある実施態様において、少なくとも6つの投影ミラーは、1桁分解能での核酸塩基配列決定に十分な空間分解能を達成するのに有用である。また、より強力な光源を用いることは、スキャンの処理量又は1時間当たりに配列決定される塩基対の数を増加させるのに望ましい。
【０００８】
EUVリソグラフィツールなどの光学系又は装置を使用して、光を20 nm以下のスポットサイズへと集束させることができる。極端紫外リソグラフィ（EUVL）では、極端紫外（EUV）波長（およそ124ナノメータ〜0.1ナノメータ）の電磁放射線を使用する。従って、これらの波長の光子はおよそ10エレクトロンボルト（eV）〜12.4 keV（それぞれ124 nm及び0.1 nmに相当する）の範囲のエネルギーを有する。極端紫外波長はプラズマ及びシンクロトロン光源又は固体標的などのデバイスによって人為的に発生させることができる。この光が遺伝子配列へと入射すると、ある比率の光が吸収される。遺伝子配列の各塩基又は塩基対は分離したEUV周波数での特性吸収スペクトルを生成する。そのようなスペクトルを検出し、又は累積的吸収スペクトルセットから分解し、続いてこれを特定の塩基対を同定する一助とすることができる。使用する波長が短いほど集束されるスポットのサイズは小さくなり、画像化分解能がより高くなる。光の波長2.8 nm及び開口数（NA）0.5に対するスポットサイズはおよそ2.8 nmである。例えば、単一の核酸塩基は0.34 nmの長さを有する。このことは、画像化分解能が9塩基（〜2.8/0.34）であることを意味する。投影ミラーを使用することで、分解能の限界をさらに低下させることができる。これは、式k1×波長/NA（式中、k1はリソグラフィツールによって達成され得る分解能限界を決定する定数計数である）によって支配される。k1係数をおよそ0.25と仮定すると、限界分解能（k1×波長/NA）は1.4 nm、すなわち4〜5塩基である。4×又は8×の拡大係数を使用すると、分解能限界はより小さくすることができ、最大1〜2塩基対とすることができる。スペクトルは分離した周波数の共鳴ピークを有するため、さらに分解し、塩基対情報及び2つの重なった隣接セットからの吸収スペクトル間の差、3つのスペクトルピークで測定された累積的吸収を使用してより高い分解能の配列決定を得ることが可能である。遺伝子の同定は累積的スペクトルの測定及び位相情報から可能となるはずである。13.5 nm以下、具体的には2〜4 nmの範囲（4.3 nm及び2.8 nmを含む）の波長の光は、これらの適用に好適であると期待される。吸収スペクトルは、本件開示における透過スペクトル又は反射スペクトルと等価に交換することができる。検出器は、わずか1×10-4という小ささの吸収シグナルの感度差を測定することができる。これにより、1核酸塩基の累積的差を識別することが可能になる。
【０００９】
一実施態様において、遺伝子配列又は核酸塩基の読み取り、スキャン、又は画像化のプロセスは、その固有の吸収スペクトルを測定し、かつ公知の又はシミュレートされたスペクトルから遺伝子を同定するプロセスを含む。
【００１０】
本件開示の別の態様において、遺伝子配列又は核酸塩基のセットは所与の位置又はアドレスにおいて編集し、変化させ、修復し、又は欠失させることもできる。欠失は、所与の位置の所望の配列に光スポットを集束させ、集束されたスポットに送達される光又はエネルギーの強度を高めて、光吸収により2つの塩基対間の結合を切り離すか、又は塩基を切り離し、かつ再生を妨害することによって起こる。ある実施態様において、配列の部分配列を編集し、又は欠失させる作用は、配列の読み取りに引き続き起こり得る。スポットのサイズ及び光の強度に依存して、1以上の遺伝子セットを任意の所与の位置で欠失させることができる。2以上の集束されたスポットを使用して、複数の同時分解を達成することもできる。
【００１１】
典型的な実施態様において、遺伝子配列は、DNA及びRNA核酸塩基対、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシルのような部分要素を含む。また、本件開示における遺伝子配列には、種に限定されることなく、DNA及びRNAストランドのような生体物質、リード、一塩基多型（SNPs）、塩基、タンパク質、プライマー、アミノ酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチド、コピー数多型、突然変異、バリアント、酵素、エキソーム、分子、ヌクレオチド、対立遺伝子、染色体、テロメアがある。5つの考え得る塩基、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、及びウラシルの各々は、各元素の相対比の異なる炭素、水素、酸素、及び窒素の組合わせである化学構造が異なる。EUV/軟X線吸収はこれらの元素の存在に感受性があるため、各塩基はEUV波長における識別可能かつ固有のシグネチャー吸収スペクトルを有する。1以上の塩基の吸収スペクトルが一度に得られる例においては、吸収スペクトルは先に記載のように、個別の塩基スペクトルへと分解され得る。同定可能な遺伝子配列、核酸塩基、タンパク質、それらの各々の吸収スペクトルシグネチャーを含むRNA及びDNAのデータベース又はライブラリを生成する。
【００１２】
本件開示は、個体ベースで所与のゲノム中の遺伝子配列の同時若しくは動的な読み取り、又は画像化、マッピング、及び編集若しくは欠失を可能とするために、本件開示は既存の最新技術である次世代配列決定法（NGS）技術よりも改良されている。全ゲノムショットガン配列決定法、デ・ノボ配列決定法、又はサンガー配列決定法のような現在の遺伝子配列決定技術では、破壊、複製、及び標準参照ゲノムの参照を行って初めて遺伝子の配列決定が可能となる。本件開示において、遺伝子オントロジーネットワークとしても記載され得るゲノム地図又は遺伝子配列地図を生成する。全体配列を、それぞれの考え得る位置での各核酸塩基、又は各遺伝子の吸収及び位相スペクトルを測定することにより少なくとも一度に順次記録する。各核酸塩基又は核酸塩基のセットの物理的座標を、他の全体及び局所識別子並びに標識構造と一緒にアドレスとして記録する。各遺伝子、その吸収スペクトル、及び遺伝子位置はこのように記録する。一度同定されたら、引き続き特定の遺伝子配列を選択的又は動的に標的化し、再配置し、又は欠失させる必要があるはずであり、それはそれぞれの記録アドレスを使用して強い放射線を送達するために光源スポットの焦点を再配置することによって行うことができる。EUV放射線は、異なる遺伝子配列を物理的かつスペクトルにより識別するのに十分な空間的かつスペクトル上の分解能、及び特定の遺伝子配列を選択的に標的化するための空間的制御を有する。NGS技術においては、読み取りの間にリアルタイムで配列中の特定の位置に動的に戻ったり、又は配列を編集する可能性は存在しない。
【００１３】
本件開示は、配列を開裂させ、又は酵素配列に適合する特異的な標的位置でゲノムを切断するために特殊な酵素配列に依存する、CRISPR干渉技術（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）などの既存の最新の編集技術より改良されている。CRISPRの限界は、いかなる一回にも、かつその標的配列が全ての位置で切断される全ての例において、ゲノム内で反復したとしても、ただ1種類の標的配列しか欠失させられないことである。さらに、配列は、切断された後、繰り返し自己修復を試みる。配列が切断されるだけでなく、標的位置の周囲の最大20塩基対領域も切断される。EUV放射線配列決定法及び欠失法において、別々に指定された配列を有する複数の無作為標的は、一段階で編集することができる。同様に、単一の事例の特異的標的も、最大1〜2塩基対の空間分解能で編集することができる。
【００１４】
配列決定に加え、本件開示ではまた、遺伝子型判定、すなわち個体がどの遺伝的バリアントを保有するかを決定するプロセスの適用における本明細書に記載のEUV放射線及び軟X線の使用、方法及び装置も記載する。一実施態様において、EUV放射線を使用して、ゲノム全体よりもむしろエキソームのような配列の部分を配列決定し、かつSNPsにおける多型及び共通の性質を有する領域を調べることができる。また、プロセスを使用して、生殖系列突然変異又は体細胞突然変異、後成的変化、癌及び遺伝的性質の変化を調べることもできる。また、EUV放射線配列決定法は、発現プロファイリングにも使用することができる。
【００１５】
本明細書に記載の方法及び装置には、ヒト、細菌、動物、植物、酵母、哺乳動物細胞を含む様々な種への適用がある。
【００１６】
大部分の例において、配列決定の前に、DNA、RNA、又は他のストランドを細胞から抽出し、線状化し、平坦化し、かつアラインすることができる。EUV放射線配列決定法を用いると、DNAの部分を細胞内で、かつ3次元的に（3D―1以上の次元）、かつ非線形的にさらに配列決定することができる。典型的に、クロマチンはDNAストランドと一緒に結合し、細胞内配列決定法を困難にしている。本件開示に記載の吸収配列決定法を用いると、クロマチンは分離したDNAのスペクトルとは異なる3つのスペクトルピークを有する吸収スペクトルを有するため、DNA配列から識別することができる。
【００１７】
細胞内で配列を画像化する場合、配列決定が行われる間、細胞を、細胞を適性位置に保持するために使用される2以上のレーザービームによって光学的に捕捉することができる。また、もう1つのレーザーを使用して細胞膜若しくは細胞壁において、又は細胞質を介して挿入路を切り開き、細胞中の他の構成要素によるEUVの吸収を低下させることもできる。細胞中の他の構成要素は、異なるスペクトル吸収曲線によって識別することもできる。
【００１８】
ゲノム配列決定法には、顕著な量のデータ分析及びデータの生物情報工学的後処理が要求される。吸収スペクトル群を分解して計算、測定、及び読み取りの時間を節約するために、自己学習及び予測的アルゴリズム（並びに標識構造遺伝子の位置に関する他の既知の情報）を使用することは、有益である。さらに、より大きなスポットサイズについては、より大きな核酸塩基の群をより低いサンプリング分解能で配列決定することができ、かつ測定を個別に扱うよりもむしろ、参照データベース若しくはライブラリ、又は過去に測定された試料におけるスペクトルのような既知のスペクトルから同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
（図面の簡単な説明）
本件開示は、添付の図面と併せて解釈して、以下の詳細な説明に関してより十分に認識することができる。ここで：
【００２０】
【図１】図1は、本明細書の実施例によって計算されたEUV波長でのDNA核酸塩基C、G、A、Tについて計算された吸収スペクトルを示している。
【００２１】
【図２】図2は、遺伝子配列決定法のためのプラズマ光源及び投影ミラーシステムを有するDNAスキャナシステムを示している。
【００２２】
【図３】図3は、高分子からの反射または吸収放射線を検出する方法を示している。吸収が増加するため、光照明は可能な限り斜入射に近接していることが好ましい。
【００２３】
【図４】図4は、非垂直入射での単一核酸塩基のG、C、A、Tからの透過スペクトルを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本明細書では、高分子を検出し、読み取り、同定し、かつ/又は編集するために有用な装置及び方法を提供する。
【００２５】
（a. 定義）
本明細書で提供する装置及び方法を参照する場合、別途示されない限り、以下の用語は以下の意味を有する。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の用語に対し複数の定義がある場合、別途言及のない限り本節の定義が優先する。
【００２６】
用語「極端紫外線」又は「EUV」は、124 nm〜10 nmの波長に及ぶ電磁スペクトルの一部における電磁放射線を指す。放射線は、10 eVから最大124 eVのエネルギーを有する光子を有する。
【００２７】
用語「軟X線」は、10 nm〜0.1 nmの波長に及ぶ電磁スペクトルの一部における電磁放射線を指す。放射線は、0.1 eVから最大10 eVのエネルギーを有する光子を有する。極端紫外線、EUV及び軟X線は、本件開示において互換的に使用され、0.1 nm〜124 nmの全範囲を表す。
【００２８】
用語「高分子」は、少なくとも1000 Daを有する高分子量の分子を指す。有用な高分子には、モノマーの繰り返すポリマーを含む。例としては、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ウイルス、及びオリゴ糖がある。
【００２９】
用語「スポットサイズ」は、標的と相互作用することが可能な放射線ビームの直径を指す。放射線ビームが支持体に接触する実施態様において、スポットサイズは支持体を横断する放射線ビーム又はビーム最収束部（beam waist）の直径である。スポットは、レンズ又はミラーシステムによって、エアリーディスクによって画定され、放射線ビームの波長に依存する最小のスポットサイズへと集束され、又は平行化された放射線ビームとし得る。実際、最小スポットサイズの半径は、1.22λf（ここでfはレンズのf数である）、すなわちエアリーパターンの第1の暗い円によって定義される。リソグラフィシステムにおいて、所与の分解能は投影ミラーのセットからの全拡大率及びシステムの開口数（NA）によって達成される。分解能、すなわち最小スポットサイズはk1λ/NAとして定義される（ここで、k1は分解能係数であり、k1はおよそ0.25である）。今日のリソグラフィシステムは既に4×の拡大率及び0.5 NAを達成している。2.8 nmの波長に対し、これは0.7 nm又は2塩基対の分解能である。より高い拡大率は、投影ミラーの数を増加させてより小さいスポットサイズへと集束させること及びシステム開口数をより大きくすることにより達成することができる。8×の拡大率に対しては、単一塩基対の分解能が可能となる。
【００３０】
（a. 装置）
本明細書では、高分子を検出し、読み取り、同定し、かつ/又は編集するために有用な装置を提供する。装置は一般に、放射線源、放射線の少なくとも一部を吸収するように構成された1以上の高分子、透過放射線及び/又は吸収放射線を検出することの可能な検出器を備える。
【００３１】
ある実施態様において、放射線源は0.1 nm〜250 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は極端紫外放射線及び/又は軟X線放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、極端紫外放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、軟X線放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、0.1 nm〜10 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、1 nm〜10 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、1 nm〜250 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、10 nm〜250 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、10 nm〜200 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、10 nm〜150 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、10 nm〜124 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。ある実施態様において、放射線源は、0.1 nm〜124 nmの波長を有する放射線を送出することが可能である。
【００３２】
放射線源は、当業者が有用であると考える任意の放射線源とすることができる。有用な放射線源は、商業的に利用可能である。有用な例には、プラズマ及びシンクロトロン光源又は固体標的がある。EUV光源には、高次調和X線発生源、EUVビーム線シンクロトロン、EUV固体標的、及びプラズマベース源がある。例えば、ニッケル様スズは11.9 nmのEUV放射線を生成し、ニッケル様銀は、13.9 nmのEUV放射線を生成し、スズドロップレットは、13.5 nmのEUV放射線を生成する。光源は、レーザーによって駆動される、例えばレーザーによって生成されるプラズマ、又は電気的に駆動される、例えば電気的に放電されるプラズマであり、かつ連続的又はパルス放射され得る。無電極Zピンチ源、例えば2〜4 nmの範囲の波長を有し、窒素を用いて2.8 nmで400 mWのエネルギーを送達するEnergetiq EQ-10SXRを使用することもできる。液体ジェット、スズ又はキセノンのプラズマも使用する。例えば、スズのプラズマ源は、8〜19 nmの範囲のEUVを有し、キセノンのプラズマ源は8〜19 nmの範囲のEUVスペクトルを有し、11〜15 nmの範囲のより高い強度を伴う。固体標的では、所与の標的に衝撃を与え、X線を生成するために電子が使用される。
【００３３】
放射線源は、当業者に公知の技術を使用して、所望の放射線波長を送出するように構成することができる。放射線源を調整する主な方法には、帯域内周波数のみを反射し、他の周波数を吸収することにより例えば、13〜14 nmの帯域内放射線を選択するモリブデンケイ素（Mo/Si）多層のようなミラーシステムが必要である。同様に、カーボンチタン（Carbon Titanium）多層を2.8 nmで使用して、放射線帯域を選択することができる。
【００３４】
装置内で、放射線源は1以上の高分子と接触する放射線を送出するように構成される。高分子は、少なくとも一部の放射線を吸収するように構成される。当業者であれば、高分子が放射線の一部を透過もし得ることを認識されよう。
【００３５】
高分子を放射線と接触させるために、装置は放射線を集束させて高分子と接触させることが可能な1以上の集束構成要素をさらに備え得る。集束構成要素は、源から送出される放射線を集束させることが可能な任意の構成要素とすることができる。ある実施態様において、集束構成要素は1以上のミラーである。ある実施態様において、集束構成要素は1以上のレンズである。ある実施態様において、集束構成要素は1以上の反射鏡である。ある実施態様において、集束構成要素は1以上のミラー、レンズ、及び/又は反射鏡の組合わせである。集束構成要素の例示的構成を、実施例及び図2において提供する。ある実施態様において、装置は少なくとも6つの高開口数投影ミラー及び少なくとも4つの照明ミラーを備える。ミラーは、放物面を有し、非球面であり、又は自由形状とすることができる。ある実施態様において、少なくとも6つの投影ミラーは1桁の分解能の核酸塩基配列決定に十分な空間分解能を提供する。分解能をより高くするため、より多くのミラー、又はより小さなスポットサイズへと集束させるより高い開口数のシステムを使用することができる。6つの投影ミラーは4×の拡大率を達成することができる。8×の拡大率又は単一塩基対の分解能には、8〜12個のミラーが必要となり得る。
【００３６】
反射鏡としても知られるミラーは、多層コーティングを含み得る。軟X線領域における多層の例には、Ti/Ni、Ca/Co、Sc/Ni、Mg/Ni、Be/Ni、B4C/Ru、C/Fe、及びSc/Wc、Ba/Co、Ca/Co、C/Coがある。また、ミラーは単一ベース物質、例えばNi又はCo又はMoのナノスケールの化合物とすることもでき、かつ2又は3次元で物質の他のナノスケールの化合物を含むこともできる。ミラーの物理的サイズはツール及び捕捉領域のサイズに応じ、小さくは1〜10 cmの直径から最大1 m以上の直径の範囲である。ミラーは基板＋コーティングからなり、基板はケイ素、シリカ、又はBeとし得る。
【００３７】
ある実施態様において、放射線スポットサイズは0.1〜100 nmである。ある実施態様において、放射線スポットサイズは、1〜100 nmである。ある実施態様において、放射線スポットサイズは、10〜75 nmである。ある実施態様において、放射線スポットサイズは、10〜50 nmである。ある実施態様において、放射線スポットサイズは、10〜25 nmである。ある実施態様において、放射線スポットサイズは、10〜230 nmである。
【００３８】
装置は、放射線の少なくとも一部を吸収するように構成された1以上の高分子をさらに含む。有用な高分子を、以下に詳細に記載する。各高分子は標準技術及び構成要素を使用して、放射線を吸収するように構成され得る。高分子は、溶液中、又は固体支持体上で、又は当業者が好適であると考える任意の他の形態で放射線に提示され得る。溶液中の高分子はキュベット、マイクロタイターウェル、微小流体デバイス又はチャネル中で、スライド上で、又は任意の他の好適な媒体中又はその上で提示することができる。
【００３９】
ある実施態様において、高分子を固体支持体上で提供する。固体支持体は高分子を支持するのに好適な任意の物質とすることができる。有用な支持体材料には、ガラス、セラミック、シリカ、ポリカーボネート、PDMS、及びケイ素がある。反射モードのシステムか、又は透過モードのシステムか、いずれを使用するかに応じて、透過用膜支持体又は超研磨された若しくは平坦な基板のいずれかを、高分子を保持するために使用することができる。有用な固体支持体の例としては、顕微鏡又はスライド、シリコンウェーハ、グラフェンフィルム、画像化又は記録グリッドがある。膜支持体には、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、多孔性フィルム、カーボングリッド、又は有孔グリッドがある。支持体は、商業的供給業者から取得することができ、又は標準技術によって製造することができる。
【００４０】
支持体は、任意の数の高分子を含むことができる。ある実施態様において、各支持体は単一の高分子を提供する。有利なことに、本明細書で提供する特定の装置及び方法により、単一高分子の配列決定が容易になる。さらなる実施態様において、各支持体は、複数の高分子を提供する。また、本明細書で提供する装置及び方法により、多数の高分子の配列決定が容易になる。ある実施態様において、複数の高分子を、並行して配列決定し得る。ある実施態様において、複数の高分子を、同時に配列決定し得る。
【００４１】
支持体が複数の高分子を提供する場合、高分子の密度を、本明細書に記載の方法に好適な任意の密度とすることができる。アプローチは、高分子の単一ユニットを識別するように模索する。
【００４２】
ある実施態様において、支持体を1以上の高分子を移動させることが可能なステージ上に提供する。例えば、ステージは高分子を放射線に対して任意の方向へと並進させることを可能とし得る。ある実施態様において、ステージは、高分子の第1のモノマーが放射線と接触するように、高分子を移動させることが可能である。第1のモノマーは、高分子中の任意のモノマー―末端モノマー又は中間モノマーとし得る。ある実施態様において、ステージは、高分子の第2のモノマーが放射線と接触するように、高分子を移動させることが可能である。ある実施態様において、第2のモノマーは、第1のモノマーに隣接する。ある実施態様において、ステージは、移動の度に不連続な1つのモノマー分の距離だけ高分子を移動させることが可能である。そのような実施態様において、ステージは、放射線を通過した高分子を一度に1つのモノマー分だけ移動させることが可能である。例えば、第1の位置において、高分子のモノマーnからmを放射線と接触させることができる。第2の位置への移動後、モノマーn＋1からm＋1が放射線と接触することとなる。距離m-nは様々であり、高分子への放射線ビーム入射のスポットサイズに応じて決まる。
【００４３】
先の構成要素のために有用なステージは、当業者に公知である。例としては、ナノポジショナ、圧電ステージ、ナノ位置決めステージ、エンコーダがある。これらのステージは、0.1 nmの分解能で3次元に並進及び回転することができる。1つの塩基はおよそ0.34 nmの距離を有するため、これは単一の塩基にわたって分解し、又は並進するのに十分である。
【００４４】
高分子成分の検出は、反射モード又は透過モードにおいて行うことができる。反射率モードにおける場合、反射性スペクトルを入射角の平面から記録し、特定の波長のスペクトルピークは吸収を示す。透過モードにおける場合、吸収スペクトルにおけるスペクトルの降下は吸収シグネチャーを特定する。このことを図3に示す。
【００４５】
（高分子）
高分子は、当業者が好適であると考える任意の高分子とすることができる。ある実施態様において、高分子はポリマーである。ある実施態様において、高分子はポリペプチドである。ある実施態様において、高分子はペプチド又はタンパク質である。ある実施態様において、高分子はポリヌクレオチドである。ある実施態様において、高分子はDNAである。ある実施態様において、高分子はRNAである。ある実施態様において、高分子はオリゴ糖である。
【００４６】
高分子は、当業者が好適であると考える任意の方法により調製することができる。また、高分子は当業者が好適であると考える任意の供給源から取得できる。ある実施態様において、高分子は合成されたものである。ある実施態様において、高分子は細胞を起源とする。ある実施態様において、高分子は細胞から単離する。ある実施態様において、高分子は細胞内にある。
【００４７】
一般に、高分子は先に記載のように支持体表面に提示される。高分子は支持体表面で静止させることができる。ある実施態様において、高分子を支持体表面に固定化する。高分子は、好適であると考えられる任意の技術により支持体表面に固定化することができる。ある実施態様において、高分子を非共有結合性相互作用を介して支持体と連結させる。非共有結合性相互作用の例には、静電相互作用及び疎水性相互作用がある。ある実施態様において、高分子を1以上の共有結合を介して支持体に連結させる。ある実施態様において、高分子との連結のために支持体を誘導体化する。ガラス支持体は、例えばアミノ又はエポキシド又はメルカプト基でシラン化することにより誘導体化することができる。アミノ、スクシニル、又は硫黄基に連結された高分子を、標準技術によってそのような誘導体化されたものに共有結合により固定化することができる。ある実施態様において、標準技術を介して支持体をビオチンで誘導体化し、高分子をアビジンに連結する。ある実施態様において、標準技術を介して支持体をアビジンで誘導体化し、高分子をビオチンに連結する。そのような実施態様において、固定化結合はアビジン及びビオチンの相互作用によって形成される。
【００４８】
従って、支持体と結合した高分子を放射線との接触のために構成する。ある実施態様において、放射線中で支持体を移動させ、高分子又はその一部を位置決めする。放射線が高分子と接触するように、放射線源、任意の光学系、及び支持体を構成する。検出器を、高分子によって吸収され、かつ/又は透過され、かつ/又は再放出された放射線を検出するように構成する。
【００４９】
（方法）
本明細書で提供する方法において、放射線源は放射線を生成する。放射線は、放射線の少なくとも一部を吸収する高分子と接触する。高分子によって吸収され、かつ/又は透過された放射線を検出器によって検出する。
【００５０】
ポリヌクレオチド配列決定法において、ポリヌクレオチドの各塩基又は塩基対は、分離したEUV周波数での特性吸収スペクトルを提供する。例示的な吸収スペクトルを本明細書の図及び実施例において提供する。単一塩基又は塩基対が吸収に寄与する場合、その塩基対を吸収スペクトルから同定できる。複数の塩基又は塩基対が吸収に寄与する場合、吸収スペクトルを分解することにより寄与する塩基又は塩基対を同定することができる。ある実施態様において、ステージを放射線スポットサイズの全体にわたって移動させる。異なる波長での複合吸収スペクトルの変化は、どの塩基又は塩基対が放射線スポットの外へ移動したか、及びどの塩基又は塩基対が放射線スポット中に移動したかを示す。これらの変化から、方法は放射線スポットの外へ移動した塩基又は塩基対及び放射線スポット中に移動した塩基又は塩基対を識別することができる。これらの識別された塩基又は塩基対は高分子の配列情報を提供する。従って、本明細書では高分子の配列を同定するための方法を提供する。
【００５１】
ある実施態様において、本明細書で提供する方法を、多数のポリヌクレオチドに適用する。これらのポリヌクレオチドの吸収スペクトルをポリヌクレオチドの塩基又は塩基対配列とともに保存する。これらの方法において、スペクトル及び対応する配列のライブラリを発達させる。このライブラリにより新たなポリヌクレオチドの配列の同定が容易となる。ある実施態様において、本明細書ではスペクトル及びそれらの対応する配列の機械学習の方法を提供する。本装置の構成要素がますますスペクトル及び配列を蓄積させるにつれ、それらは新たなスペクトルから配列を同定するのにより熟練するようになる。
【００５２】
この実施態様において、遺伝子配列又は核酸塩基を読み取り、スキャンし、又は画像化するプロセスには、その固有の吸収スペクトルを測定し、かつ/又は公知の若しくはシミュレートされたスペクトルから遺伝子を同定するプロセスがある。
【００５３】
本件開示の別の態様において、遺伝子配列又は核酸塩基のセットは所与の位置又はアドレスにおいて編集し、変化させ、修復し、又は欠失させることもできる。欠失は、所与の位置の所望の配列に光スポットを集束させ、集束されたスポットに送達される光又はエネルギーの強度を高めて、光吸収により2つの塩基対間の結合を切り離すか、又は塩基を切り離し、かつ再生を妨害することによって起こる。ある実施態様において、配列の部分配列を編集し、又は欠失させる作用は、配列の読み取りに引き続き起こり得る。スポットのサイズ及び光の強度に依存して、1以上の遺伝子セットを任意の所与の位置で欠失させることができる。2以上の集束されたスポットを使用して、複数の同時分解を達成することもできる。
【００５４】
ある実施態様において、本明細書では高分子を切断するための方法を提供する。先の構成のいずれかにおいて、高分子への放射線の強度を高分子の1以上の結合を切断するのに十分な高い強度へと増加させることができる。ある実施態様において、高分子の特定の配列を、先に記載のように同定する。装置中で配列が同定された場合、放射線の強度を調整して高分子を切断する。そのような実施態様では、高分子中の標的配列の配列特異的切断が提供される。これらの実施態様において、高分子はペプチド又はタンパク質とすることができ、高分子はDNA又はRNAなどのポリヌクレオチドとすることができる。
【００５５】
ある実施態様において、遺伝子オントロジー又は高分子の3Dマップ又はネットワークを形成することができる。これは、各遺伝子の物理的及び配列位置の記録データベースを含む。各配列をマッピングした後、所与の配列の位置を特定の位置で動的にアドレス指定し、かつ編集し、又は修復することができる。
【実施例】
【００５６】
（実施例）
（実施例1）
分子スペクトルの評価において、各核酸塩基を0 nm〜5.0 nmの波長のEUV放射線と接触させる。各核酸塩基の吸収スペクトルを計算して図1で提供し、透過スペクトルを図4で提供する。C、G、A、及びTはそれらの固有の分子組合わせ及び密度のために固有のスペクトルを有する。いくつかの事例において、スペクトルシグネチャーは2.2 nm（酸素）、2.8 nm（窒素）、及び4.3 nm（炭素及び水素）の波長で図4の3つのスペクトル降下（グアニン）からなり、いくつかのそのような事例においてスペクトルシグネチャーは2.8 nm及び4.3 nmの波長での2つのスペクトル降下（アデニン）からなる。さらに、各々のスペクトル降下の相対的スペクトル強度は、高分子の各核酸塩基中に存在する酸素原子（2.3 nmの波長）、窒素原子（2.8 nmの波長）、及び炭素原子（4.3 nmの波長）の数に比例する。H原子は相対的に透過性である。このように、有機分子、ペプチド、アミノ酸を同定し、それらの既知の構造と相互に関連付けることができる。さらに、既知の対合構造に関する情報及び空間情報は、高分子成分をさらに識別する一助となる。
【００５７】
（実施例2）
いくつかの事例において、高分子は識別子原子、例えば塩素原子を有する。この事例において追加のスペクトル降下がもう1つの波長、例えば6.5 nmで観察される。EUV及び軟X線のプラズマ源は、そのスペクトル範囲が広いため、固有の原子を有する一部の高分子成分は容易に同定できる。
【００５８】
本明細書中で引用された全ての刊行物及び特許、出願は、各々の個別の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。特許請求の範囲に記載の主題は様々な実施態様の観点から記載される一方、当業者であれば様々な改変、置換、省略、及び変化をその趣旨から逸脱することなく加えることができることを認識するであろう。従って、主題の範囲はその等価物を含む以下の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることを意図するものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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