(57)【要約】  本発明は、サンプルが光源（１１）により照光される場合に、イメージセンサ（１６）によって取得されたサンプルの画像（Ｉｏ）又はホログラムに基づいてサンプル（１０）に含有される粒子（１０６）のホログラフィック特徴付けの方法に関する。ホログラムは、再構成面にサンプルによって透過された光波を示す基準複素画像（Ａｒｅｆ）と称される複素画像を得るようにした、ホログラフィック再構成の対象である。ホログラフィック伝播演算子は、光波の伝播（ｚ）軸に沿ってサンプルによって透過された光波の光学的特徴の変化を記述するよう決定されたプロファイルから、いわゆる複数の二次複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）を得るように基準複素画像に適用される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル（１０）に含有される粒子（１０ｂ）を特徴付ける方法であって、前記方法は、
ａ）伝播軸（Ｚ）に沿って前記サンプル（１０）に向かって伝播する入射光波（１２）を発光する光源（１１）を用いて前記サンプルに照光するステップと、
ｂ）イメージセンサ（１６）を用いて、検出面（Ｐ０）に形成された前記サンプル（１０）の画像（Ｉ０）を取得するステップであって、前記サンプルは前記光源（１１）と前記イメージセンサ（１６）との間に配置され、前記画像は前記照光の効果により前記サンプルによって透過される光波（２２）を示すものであるステップと、を含み、
前記方法はまた、
ｃ）ステップｂ）で取得される前記画像（Ｉ０）に伝播演算子（ｈ）を適用し、再構成面（Ｐｚ、Ｐ０）内の前記サンプルを示す、基準画像と称される複素画像（Ａｒｅｆ）を算出するステップと、
ｄ）前記検出面（Ｐ０）に平行な面内の前記粒子の動径位置（ｘ，ｙ）を選択するステップと、
ｅ）ステップｃ）で算出された基準複素画像（Ａｒｅｆ）から、前記検出面（Ｐ０）又は前記再構成面（Ｐｚ）からの複数の距離における前記サンプルによって透過された前記光波（２２）の少なくとも１つの特徴量（Ｍ、φ、ｋ）を決定するステップであって、ステップｅ）は、
伝播演算子（ｈ）を前記基準複素画像（Ａｒｅｆ）に適用し、前記再構成面（Ｐｚ）又は前記検出面（Ｐ０）からの複数の距離に対する二次複素画像と呼ばれるものを算出することと、  前記二次複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）から、前記距離のそれぞれにおける前記サンプル（１０）によって透過された前記光波（２２）の特徴量（Ｍ、φ、ｋ）を決定することを含むステップと、
ｆ）前記伝播軸（Ｚ）に平行で、ステップｄ）で選択された前記動径位置（ｘ，ｙ）を通過する軸に沿ってステップｅ）で決定された前記特徴量の偏差を示すプロファイル（Ｍ（ｚ）、φ（ｚ）、ｋ（ｚ））を作成するステップと、
ｇ）ステップｆ）で作成された前記プロファイルにより前記粒子を特徴付けるステップと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
各特徴量（Ｍ、φ、ｋ）は、二次複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）の係数又は独立変数から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特徴付けはステップｆ）で作成された前記プロファイルと学習フェーズで決定された標準プロファイルを比較することによって実行される、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）では、各粒子の前記動径位置（ｘ，ｙ）は、ステップｂ）で取得された前記画像（Ｉ０）を用いて、又はステップｃ）で前記基準複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）を用いて選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル（１０）と前記イメージセンサ（１６）との間には拡大光学素子が置かれていない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｄ）は１つかつ同一の粒子を示す複数の動径座標を選択することを含み、
ステップｆ）は、選択された動径座標のそれぞれにおいて基本プロファイルと称される複数のプロファイルを作成し、前記粒子を示すプロファイルを作成するように前記プロファイルを組み合わせることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）において、前記基準複素画像の前記算出は、
ｉ）前記イメージセンサにより取得される前記画像（Ｉ０）から、前記検出面において前記サンプルの初期画像（Ａ０ｋ＝０）を規定するサブステップと、
ｉｉ）サブステップｉ）で規定された前記サンプルの前記初期画像（Ａ０ｋ＝１）、又は前記先行する繰り返し（ｋ−１）から生じる前記検出面における前記サンプルの前記画像（Ａ０ｋ−１）に伝播演算子を適用することによって、再構成面（Ｐｚ）において前記サンプルの複素画像（Ａｚｋ）を決定するサブステップと、
ｉｉｉ）サブステップｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａｚｋ）から、前記複素画像（Ａｚｋ）に影響を及ぼす再構成ノイズによりノイズインジケータ（εｋ）を算出する、サブステップと、
ｉｖ）前記画像の画素の位相値（φ０ｋ（ｘ，ｙ））を調整することによって、前記検出面（Ｐ０）における前記サンプルの前記画像（Ａ０ｋ）を更新するサブステップであって、
前記調整は前記位相値に応じてサブステップｉｉｉ）で算出された前記インジケータの偏差に応じて実行されるサブステップと、
ｖ）前記検出面（Ｐ０）又は前記再構成面（Ｐｚ）)における前記サンプル（１０）の複素基準画像を得るように収束基準に達するまでサブステップｉｉ）〜ｉｖ）を繰り返すサブステップと、
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
サブステップｉｉｉ）は、
様々な画素（ｘ，ｙ）について、前記画素に対してサブステップｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａｚｋ）の値、又は前記画素に対する前記複素画像の一次微分の値に応じて、各画素に関連付けられた量（εｋ（ｘ，ｙ））を算出することと、
前記ノイズインジケータ（εｋ）を得るように様々な画素（ｘ，ｙ）と関連付けられた前記量（εｋ（ｘ，ｙ））を組み合わせることと、を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ノイズインジケータ（εｋ）は、各画素に関連付けられた前記量εｋ（ｘ，ｙ）から算出されたオーダー１又はオーダー１以下のノルムである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サブステップｉｉｉ）では、各画素（ｘ，ｙ）に関連付けられた前記量（εｋ（ｘ，ｙ））は、サブステップｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａｚｋ）の前記画素に対する一次微分の係数から算出される、
請求項８及び９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サブステップｉ）では、前記サンプルの前記初期画像（Ａ０ｋ＝１）は、前記光源により発光される前記光波（１２）を示す画像（Ｉ１２）によって前記イメージセンサ（１６）により取得される前記画像（Ｉ０）の正規化によって規定される、
サブステップｉｉｉ）では、各画素に関連付けられた前記量（εｋ（ｘ，ｙ））は、厳密に正の値、特に数字１から減算された、前記画素に対して、サブステップｉｉ）で算出された前記複素画像（Ａｚｋ）の前記値に応じて算出される、
請求項８及び９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サブステップｉｖ）では、各画素の位相の値は、位相ベクトル（φ０ｋ）と称されるベクトルを形成することによって調整され、その各項は、前記検出面（Ｐ０）における前記サンプルの前記画像の画素の前記位相（φ０ｋ（ｘ，ｙ））の前記値に対応し、このベクトルは、前記位相ベクトルの各項に応じた前記ノイズインジケータ（εｋ）の勾配（∇εｋ）に基づいて、各繰り返しにおいてサブステップｉｉｉ）で算出された前記ノイズインジケータ（εｋ）を最小化又は最大化するように更新される
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記粒子は、細胞、微生物、マイクロビーズ、エキソソーム、エマルジョンの液滴、細胞核又は細胞の一つの残骸から選択される、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記特徴付けは、複数の所定の粒子クラスに応じた前記粒子の分類、又は複数の所定の状態に応じた前記粒子の状態の判定、又は前記粒子の幾何学的パラメータの推定、又は前記粒子の光学パラメータの推定である、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルに含有される粒子を特徴付ける装置であって、
前記サンプル（１０）に向けて伝播する入射光波（１２）を発光可能な光源（１１）と、
イメージセンサ（１６）と、
前記光源（１１）とイメージセンサ（１６）との間に前記サンプル（１０）を保持するように構成されたホルダー（１０ｓ）と、
前記イメージセンサ（１６）によって取得される前記サンプルの画像を受信し、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の前記主題である前記方法のうち、ステップｃ）〜ｆ）を実行するように構成されたプロセッサ（２０）と、を備える、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、ホログラフィック再構成による、サンプル、特に、生物サンプルに存在する粒子の特徴付けに関する。
【背景技術】
【０００２】
レンズレスイメージングによるサンプル、特に、生物サンプルの観測は、過去１０年間に大幅に進歩している。この技法は、サンプルとイメージセンサとの間に光学拡大レンズを配置せずに、光源とイメージセンサとの間にサンプルを配置することでサンプルの観測を可能にする。イメージセンサは、このようにサンプルによって透過される光波の画像を収集する。
【０００３】
この画像は、ホログラムとも呼ばれ、光源により発光され、サンプルにより透過される光波と、光源により発光される光波の、サンプルによる回折から生じる回折波との間の干渉パターンから形成される。これらの干渉パターンは、用語「回折パターン」を使用して呼ばれる場合もある。
【０００４】
ＷＯ２００８０９０３３０には、レンズレスイメージングによって生物粒子、この例では、細胞、の観測を可能にする装置が記載されている。この装置は、干渉パターンと各セルとの関連付けを可能にし、干渉パターンのモフォロジは細胞の種類の識別を可能にする。したがって、レンズレスイメージングは従来の顕微鏡に代わる簡単で安価なものであるように見える。また、その観測の範囲は顕微鏡のあり得る範囲よりも著しく大きい。この技術に関する応用の展望は非常に大きいものと理解されている。
【０００５】
ＷＯ２０１５０１１０９６には、ホログラムに基づいて細胞の状態の推定を可能にする方法が記載されている。この出願では、例えば、生細胞を死細胞と区別することができる。
【０００６】
Langehanenberg P.による刊行物 "Autofocusing in digital holographic microscopy", 3D Research, vol. 2 No. March 1, 2011, 及びPoher Vによる刊行物 "Lensfree in-line holographic detection of bacteria", SPIE vol. 8086 May 22, 2011には、デジタルフォーカスアルゴリズムの適用に基づいて粒子を配置する方法が記載されている。Ning W.による刊行物 "Three-dimensional identification of microorganisms using a digital holographic microscope", Computational and Mathematical Methods in Medicine, vol. 220, No. 4598, January 1, 2013には、再構成された粒子画像に適用された３次元フィルタに基づいた粒子の識別を可能にする方法が記載されている。
【０００７】
一般に、イメージセンサにより取得されたホログラムは、ホログラフィック再構成アルゴリズムによって処理され、サンプルの光学的特性、例えば、透過因子又は位相を推定することができる。このようなアルゴリズムはホログラフィックの再構成の分野で周知である。このため、サンプルとイメージセンサとの距離が知られていると、この距離、並びに光源により発光される光波の波長を考慮して伝播アルゴリズムが適用される。そしてサンプルの光学的特性の画像を再構成するのが可能になる。再構成された画像は、特に、サンプルにより透過された光波の複素画像であってもよく、それはサンプルの光吸収又は位相−偏差特性に関する情報を含むことができる。ホログラフィック再構成アルゴリズムの例が、刊行物Ryle et al. "Digital in-line holography of biological specimens", Proc. Of SPIE Vol.6311 (2006)に記載されている。
【０００８】
しかし、ホログラフィック再構成アルゴリズムは、「二重像」という用語で言及される、再構成画像における再構成ノイズをもたらす恐れがある。これは主にイメージセンサに形成される画像がこのセンサに達する光波の位相に関連する情報を含まないことに起因するものである。したがって、ホログラフィック再構成は、イメージセンサで集光された光波の強度に単に基づく部分的光学情報に基づいて生成される。ホログラフィック再構成の品質改善はかなり多くの研究の目的であり、それは、いわゆる「位相検索」アルゴリズムを実装し、イメージセンサに露光される光波の位相の推定を可能にするものである。
【０００９】
ＵＳ２０１２／０２１８３７９には、例えば、サンプルの複素画像の再構成を可能にする方法であって、複素画像が振幅及び位相情報を含むものが記載されている。このような画像は、細胞の識別を可能にする特定の種類の情報を取得するのを可能にする。ＵＳ２０１２／０１４８１４１では、ＵＳ２０１２／０２１８３７９に記載された方法を適用して、精子の複素画像を再構成し、その移動度、向き、又は特定の幾何学的パラメータ、例えば、鞭毛のサイズを特徴付ける。また、ＷＯ２０１４／０１２０３１には、細胞の、この例では精子の複素画像を再構成する方法の適用も記載されている。この文献にはまた、連続するホログラムの取得も記載され、各ホログラムはホログラフィック再構成されて、精子の軌道の３次元トラッキングを取得することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／０９０３３０号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０１１０９６号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０２１８３７９号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１４／０１２０３１号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Langehanenberg P.著、"Autofocusing in digital holographic microscopy", 3D Research, vol. 2 No. March 1, 2011
【非特許文献２】Poher V著, “"Lensfree in-line holographic detection of bacteria", SPIE vol. 8086 May 22, 2011
【非特許文献３】Ning W.著，"Three-dimensional identification of microorganisms using a digital holographic microscope", Computational and Mathematical Methods in Medicine, vol. 220, No. 4598, January 1, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明者らは、ホログラムに基づくホログラフィック再構成によって得られた複素画像を使用すると、特にサンプルが媒体内に分散した粒子を含む場合は、サンプルを十分に特徴付けることはできないと考えている。本発明はこの問題を解決し、粒子を正確に特徴付けることを可能にし、単一の取得画像に基づいて実施され得るものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一主題は、サンプルに含有される粒子を特徴付ける方法であって、
ａ）伝播軸に沿って前記サンプルに向かって伝播する入射光波を発光する光源を用いて前記サンプルを照光するステップと、
ｂ）イメージセンサを用いて、検出面に形成された前記サンプルの画像を取得することであって、前記サンプルは前記光源と前記イメージセンサとの間に配置され、各画像は前記照光の効果により前記サンプルにより透過される光波を示すものであるステップと、を含み、
前記方法はまた、
ｃ）ステップｂ）で取得される前記画像に伝播演算子を適用して、再構成面内の前記サンプルを示す基準画像と称される複素画像を算出するステップと、
ｄ）前記検出面に平行な面内の前記粒子の動径位置を選択するステップと、
ｅ）ステップｃ）で算出された前記複素画像から、前記検出面又は前記再構成面からの複数の距離における前記サンプルにより透過される前記光波の少なくとも１つの特徴量を決定するステップと、
ｆ）前記伝播軸に平行で、かつステップｄ）で選択された前記動径位置を通過する軸に沿って、ステップｅ）で決定された前記特徴量の前記偏差を示すプロファイルを作成するステップと、
ｇ）ステップｆ）で作成された前記プロファイルにより前記粒子を特徴付けるステップと、を含むことを特徴とする。
【００１４】
好ましくは、ステップｅ）は、
伝播演算子を前記基準複素画像に適用して、前記再構成面又は前記検出面から複数の距離の二次複素画像と呼ばれるものを算出すること、
前記二次複素画像から前記距離のそれぞれにおいて、前記イメージセンサが露光される前記光波、すなわち前記サンプルにより透過される前記光波の特徴量を決定することと、を含む。
【００１５】
各特徴量は、ステップｅ）で算出された二次複素画像の前記係数又は前記独立変数を決定することで決定してもよい。
【００１６】
語「ｏｎｅ」又は「ａ」は「少なくとも１つ」を意味するものと理解される。
【００１７】
一実施形態によれば、前記特徴付けはステップｆ）で作成された前記プロファイルを学習フェーズで決定された標準プロファイルと比較することで行われる。この学習フェーズは特徴付けるサンプルの代わりに標準サンプルを用いることでステップａ）〜ｆ）を実施することにある。
【００１８】
ステップｄ）では、ステップｂ）で取得される前記画像を用いて、又はステップｃ）で算出された前記基準複素画像を用いて、各粒子の前記動径位置を選択することができる。
【００１９】
一実施形態によれば、前記サンプルと前記イメージセンサとの間には拡大光学素子が置かれていない。
【００２０】
好ましくは、前記基準画像が算出される前記再構成面は、前記サンプルが延在している面であり、前記サンプルの面と称される。
【００２１】
前記光源はレーザダイオード又は発光ダイオードとすることができる。
【００２２】
一実施形態によれば、ステップｃ）において、前記基準複素画像の前記算出は、
ｉ）前記イメージセンサにより取得される前記画像から、前記検出面において、前記サンプルの初期画像を規定するサブステップと、
ｉｉ）サブステップｉ）で規定された前記サンプルの前記初期画像又は前記先行する繰り返しから生じる前記検出面における前記サンプルの前記画像に伝播演算子を適用することで、再構成面において前記サンプルの複素画像を決定するサブステップと、
iii)サブステップｉｉ）で決定された前記複素画像からノイズインジケータを算出することであって、このノイズインジケータは、好ましくは増加又は減少関数に応じて、前記複素画像に影響を及ぼす再構成ノイズに依存するものであるサブステップと、
ｉｖ）前記画像の前記画素の位相値を調整することによって前記検出面における前記サンプルの前記画像を更新し、前記調整は、前記位相値に応じて、サブステップｉｉｉ）で算出された前記インジケータの偏差に応じて行われるサブステップと、
ｖ）前記検出面、又は前記再構成面において前記サンプルの複素基準画像を得るように収束基準に達するまで、サブステップｉｉ）〜ｉｖ）を繰り返すサブステップと、を含む。
【００２３】
一実施形態によれば、サブステップｉｉｉ）は、
様々な画素について、前記画素に対してサブステップｉｉ）で決定された前記複素画像の前記値に応じて、又は前記画素に対する前記複素画像の一次微分（a dimensional derivative）の値に応じて、各画素に関連付けられた量を算出することと、
様々な画素に対する前記算出された量を合算して、ノイズインジケータを得ることと、を含む。
【００２４】
ノイズインジケータは各画素に関連付けられた前記量から算出されたオーダー１又はオーダー１以下のノルムとすることができる。ノイズインジケータは前記複素画像に影響を及ぼす前記再構成ノイズを定量化する。
【００２５】
各画素に関連付けられた前記量はサブステップｉｉ）で決定された前記複素画像の、前記画素に対する、一次微分の前記係数から算出されてもよい。
【００２６】
それは、前記複素画像の一次微分から得ることができ、この微分は前記画像の複数の画素で、あるいは、前記画像の各画素でも算出されるものである。それは前記画像の複数の画素における、あるいは前記画像の各画素における前記複素画像の前記値から得ることもできる。
【００２７】
一実施形態によれば、
サブステップｉ）では、前記サンプルの前記初期画像は、前記光源により発光された前記光波を示す画像により、前記イメージセンサにより取得される前記画像の正規化により規定される。
サブステップｉｉｉ）では、各画素に関連付けられた前記量は、前記画素に対してサブステップｉｉ）で決定され、厳密に正の値、例えば数１から減算された前記複素画像の前記値に応じて算出される。
【００２８】
本方法は、単独で又は組み合わせて取得した以下の特徴のいずれか１つを含むことができる。
−サブステップｉｉｉ）では、前記インジケータは、サブステップｉｉ）で決定された前記複素画像の各画素に関連付けられた前記量の合計、任意選択的に加重和であり、
−サブステップｉｖ）では、各画素の前記位相の前記値は位相ベクトルと称されるベクトルを形成することで調整され、その各項は前記検出面における前記サンプルの前記画像の前記画素の前記位相の前記値に対応し、このベクトルは、各繰り返しにおいて、更新され、前記位相ベクトルの各項に応じる前記ノイズインジケータの勾配に基づいてサブステップｉｉｉ）で算出された前記ノイズインジケータを最小化又は最大化する。
【００２９】
一実施形態によれば、ステップｄ）では、１つのかつ同一の粒子を示す複数の動径座標が選択され、ステップｆ）では、選択された座標の数と等しいいくつかのプロファイルが作成される。その後、ステップｆ）は、これらのプロファイルの組み合わせ、例えばこれらのプロファイルの平均を含むことができる。
【００３０】
前記粒子は細胞、微生物、マイクロビーズ、エキソソーム又はエマルジョンの液滴であってもよい。それはまた細胞核、細胞の一つの残骸又は細胞小器官であってもよい。用語「特徴付け」は特に以下のことを意味すると理解される。
−粒子の性質の特性、すなわち、１つ又は複数の所定のクラスに応じたこの粒子の分類の決定、
−１つ又は複数の所定の状態に応じた前記粒子の状態の決定、
−粒子サイズ、その形状、その体積又は任意の他の幾何学的パラメータの推定、
−１つ又は複数の粒子の光学的特性、例えば屈折率又は光透過特性の推定、
−これらの特徴付けに応じた前記粒子のカウント。
【００３１】
本発明の別の主題は、サンプルを観測する装置であって、
−前記サンプルに向かって伝播する入射光波を発光可能な光源と、
−前記光源とイメージセンサとの間に前記サンプルを保持するように構成されたホルダーと、
−前記イメージセンサにより取得される前記サンプルの画像を受信し、本願に記載の方法、より詳細には、上述のステップｃ）〜ｆ）又はステップｃ）〜ｇ）を実施するように構成されたプロセッサと、を備える装置である。
【００３２】
他の利点及び特徴は、非制限例によって与えられ、かつ、次の添付図面に示される、本発明の特別な実施形態の以下の説明からより明確となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は本発明にかかる例示的な装置を示す。
【図２】図２（Ａ）は再構成面におけるサンプルの複素画像の計算を可能にする方法の主要ステップを図示する。  図２（Ｂ）はイメージセンサによって取得されるホログラムを示す。  図２（Ｃ）は図２（Ａ）に示す方法の１回目の繰り返しにおける再構成面に再構成された画像を示す。  図２（Ｄ）は図２（Ｃ）に示す画像の各画素に関連付けられた量を示す画像を示す。  図２（Ｅ）は基準複素画像と呼ばれる、図２（Ａ）に示す方法の複数回の繰り返し後に再構成された画像の表示を示す。  図２（Ｆ）は基準複素画像から形成された二次複素画像に基づいて得られたプロファイルを示す。
【図３】図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は再構成ノイズを有する、及び再構成ノイズを有しない、ホログラフィック再構成によって得られた複素画像の係数又は位相の動径プロファイルを概略的に示す。
【図４】図４は本発明を実施する方法の動作をまとめたものである。
【図５】図５（Ａ）はサンプルが水溶液内に散乱した細胞を含む場合の、イメージセンサにより取得されるホログラムである。図５（Ｂ）及び図５（Ｃ）は基準画像と呼ばれる、再構成面内に形成されている複素画像の係数及び位相をそれぞれ示す。図５（Ｄ）及び図５（Ｅ）は第１の細胞を通過する伝播軸に沿った、イメージセンサに露光される光波の係数の偏差及び位相の偏差をそれぞれ示すプロファイルである。図５（Ｆ）及び図５（Ｇ）は第２の細胞を通過する伝播軸に沿ったイメージセンサに露光される光波の係数の偏差及び位相の偏差をそれぞれ示すプロファイルである。図５（Ｈ）は観測されたサンプルの顕微鏡画像である。
【図６】図６（Ａ）はサンプルが水溶液に散乱した赤血球を含む場合の、イメージセンサにより取得されるホログラムである。図６（Ｂ）及び図６（Ｃ）は基準画像と呼ばれる、再構成面内に形成されている複素画像の係数及び位相をそれぞれ示す。図６（Ｄ）及び図６（Ｅ）は赤血球を通過する伝播軸に沿ったイメージセンサに露光される光波の係数及び位相の偏差をそれぞれ示すプロファイルである。
【図７】図７（Ａ）はサンプルが水溶液に散乱した赤血球を含む場合の、イメージセンサにより取得されるホログラムである。図７（Ｂ）及び図７（Ｃ）は基準画像と呼ばれる、再構成面内に形成されている複素画像の係数及び位相を示すものである。図７（Ｄ）及び図７（Ｅ）は赤血球を通過する伝播軸に沿った、イメージセンサに露光される光波の係数の偏差及び位相の偏差をそれぞれ示すプロファイルである。
【図８】図８（Ａ）はサンプルが水溶液に散乱した油の液滴を含むエマルジョンである場合の、イメージセンサにより取得されるホログラムである。図８（Ｂ）及び図８（Ｃ）は基準画像と呼ばれる、再構成面内に形成されている複素画像の係数及び位相をそれぞれ示す。図８（Ｄ）及び図８（Ｆ）は液滴を通過する伝播軸に沿ったイメージセンサにより露光される光波の係数の偏差及び位相の偏差をそれぞれ示すプロファイルであり、これらのプロファイルは伝播演算子を図８（Ａ）のホログラムに適用することによって算出された二次複素画像から直接得られるものである。図８（Ｅ）及び図８（Ｇ）は液滴を通過する伝播軸に沿った、イメージセンサにより露光される光波の係数の偏差及び位相の偏差をそれぞれ示すプロファイルであり、これらのプロファイルは図８（Ｂ）及び図８（Ｃ）に示される基準複素画像、係数及び位相に伝播演算子を適用することにより算出された二次複素画像から得られるものである。
【図９】図９（Ａ）は液体中に懸濁した様々な体積のラテックスのビードの複素画像を示す。図９（Ｂ）及び図９（Ｃ）は図９（Ａ）に示すビードを通過する複素振幅の係数及び位相のプロファイルをそれぞれ示す。図９（Ｄ）は液体中に懸濁した様々な体積のラテックスのビードの複素画像を示す。図９（Ｅ）及び図９（Ｆ）は、図９（Ｄ）に示すビードを通過する複素振幅の係数及び位相のプロファイルをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図１は本発明に係る例示的な装置を示す。光源１１は、入射光波と称される、伝播軸Ｚに沿ってサンプル１０の方向に伝播する光波１２を発光することができる。光波はスペクトル帯域Δλで発光され、波長λを含むものである。この波長はスペクトル帯域の中心波長とすることができる。
【００３５】
サンプル１０は、特徴付けたいサンプルである。特に、サンプルは粒子１０ｂを含む媒体１０ａであってもよい。粒子１０ｂは血液粒子、例えば赤血球であってもよい。粒子はまた、細胞、寄生虫、微生物、例えばバクテリア若しくは酵母菌、微細藻類、液体媒体内のマイクロビーズ若しくは不溶性の液滴、例えば脂質ナノ粒子であってもよい。粒子はまた、細胞核、小器官又は細胞の残骸であってもよい。好ましくは、粒子１０ｂは直径を有し、あるいは１ｍｍ未満、好ましくは１００μｍ未満の直径に内接される。粒子は、微粒子（直径１ｍｍ未満）又はナノ粒子（直径１μｍ未満）である。媒体１０ａは、粒子が浮遊し、液体媒体、例えば、体液、培養基であってもよいし、環境又は工業プロセスにより得られる液体であってもよい。それは、固形培地であってもよいし、整合性のあるゲル状、例えば、バクテリアの群体の成長に好適な寒天状物質であってもよい。また、それは、気化、硬化又は凍結サンプルであってもよい。
【００３６】
本実施例では、サンプル１０は、流体チャンバ１５内に含有される。流体チャンバ１５は、例えば、ポイント・オブ・ケア装置に通常使用される、例えば毛管作用によりサンプル２０が浸透するミクロキュベットである。伝播軸に沿ったサンプル１０の厚さｅは、通常は、１０μｍ〜１ｃｍの間で変わり、好ましくは、２０μｍ〜５００μｍの間にあり、例えば１５０μｍである。
【００３７】
サンプルは伝播軸に垂直なサンプル面と称される面Ｐ１０に沿って延在する。サンプルはホルダー１０ｓ上に保持されている。
【００３８】
光源１１とサンプル１０との間の距離Ｄは、好ましくは１ｃｍよりも大きい。好ましくは、２〜３０ｃｍの間である。好ましくは、サンプルによって見られる光源は点のようなものと考えてもよい。これは、その直径（又はその対角線）は、サンプルと光源との間の距離の１／１０よりも小さいことが好ましくは、１／１００より小さいことがよりよい、ということを意味する。このように、光は平面波、又はそのようなものと考えられ得る波の形態で、サンプルに到達することが好ましい。
【００３９】
光源１１はレーザダイオード又は発光ダイオードであってもよい。光源はダイヤフラム１８又は空間フィルタと関連付けられてもよい。ダイヤフラムの開口は通常は５μｍ〜１ｍｍの間にあり、好ましくは５０μｍ〜５００μｍにある。本実施例では、ダイヤフラムは基準Ｐ１５０Ｓ下でＴｈｏｒｌａｂｓにより提供され、直径は１５０μｍである。ダイヤフラムは光ファイバで置換でき、その第１の端部は光源１１に対向して置かれており、その第２の端部はサンプル１０に対向して置かれている。
【００４０】
装置は散乱体１７を含むことができ、それは光源１１とダイヤフラム１８との間に配置される。このような散乱体を使用することでダイヤフラム１８の開口に対して光源１１をセンタリングする制約を回避することができる。このような散乱体の機能は円錐角αで基本光源１１ｉ（１≦ｉ≦３）により生成された光ビームを分散させることである。好ましくは、散乱角αは１０°から８０°の間で異なる。
【００４１】
好ましくは、入射光波１２のスペクトル発光帯域Δλの幅は１００ｎｍ未満である。「スペクトル帯域幅」という用語は、スペクトル帯域の半波高全幅値を意味するものと理解される。
【００４２】
サンプル１０は光源１１とイメージセンサ１６との間に置かれている。イメージセンサはサンプルが延在する面に平行又は実質的に平行に延在していることが好ましい。「実質的に平行」という用語は、２つの要素が厳密に平行でなくてもよく、２０°又は１０°未満は許容できるといった、数度の角度公差があることを意味するものである。
【００４３】
イメージセンサ１６は検出面Ｐ０に画像を形成することができる。図示する例では、イメージセンサは、ＣＣＤ型又はＣＭＯＳの画素のマトリクスアレイを含むイメージセンサである。ＣＭＯＳセンサは、画素のサイズが小さくなるので好ましく、これにより、空間分解能がより好ましい画像を取得することができる。検出面Ｐ０は入射光波１２の伝播軸Ｚに垂直に延在することが好ましい。
【００４４】
サンプル１０とイメージセンサ１６の画素のマトリクスアレイとの間の距離ｄは、好ましくは、５０μｍから２ｃｍであり、１００μｍから２ｍｍの間であることが好ましい。
【００４５】
イメージセンサ１６とサンプル１０との間には、拡大光学素子がないことに留意されたい。これは、イメージセンサ１６の各画素でのフォーカスマイクロレンズが存在する可能性を除外するものではなく、これらのマイクロレンズがイメージセンサにより取得される画像を拡大する機能を有することを除外するものではない。
【００４６】
入射光波１２の効果により、サンプル１０は検出面Ｐ０において、発生しやすい回析波を生成することができ、特に、サンプルにより透過される入射光波１２の一部に対して干渉を生じさせる場合がある。更に、サンプルは入射光波１２の一部を吸収する場合がある。このようにして、サンプルに透過され、イメージセンサ２０により露光される光波２２は、サンプルによる入射光波１２の回折から生じる成分と、サンプルによる入射光波１２の吸収から生じる成分と、を含むことができる。この成分はサンプルにより吸収されない入射光波１２の一部に相当する。
【００４７】
光波２２はまた、「露光光波」と称される場合もある。プロセッサ２０、例えばマイクロプロセッサはイメージセンサ１６により取得される各画像を処理することができる。特に、プロセッサは画像処理を行うために、かつ本明細書に記載の動作を計算するための指令のシーケンスが記憶されたプログラマブルメモリ２２に接続されたマイクロプロセッサである。プロセッサはイメージセンサ１６により取得される、又はプロセッサ２０により算出される画像を表示できるようにする画面２４に連結されていてもよい。
【００４８】
ホログラムとも称される、イメージセンサ１６に取得される画像は、観測されたサンプルを十分正確に表現することはできない。先行技術で説明したように、サンプル１０により透過され、イメージセンサ１６が露光される光波２２を示す量を算出するために、イメージセンサにより取得される各画像に対して、伝播演算子ｈを適用することができる。「ホログラフィック再構成」という用語で称される、このような方法はこの光波２２の係数又は位相の画像を検出面Ｐ０に平行な再構成面、特にサンプルが延在する面Ｐ１０に再構成することができる。これを実現するために、伝播演算子ｈによる、イメージセンサ１６により取得される画像Ｉ０の畳み込み積が決定される。空間座標（ｘ，ｙ，ｚ）の任意の点、特に、イメージセンサ１６から距離｜ｚ｜に配置される、潜在的にサンプルの面Ｐ１０である再構成面Ｐｚに光波２２の複素表現Ａを再構成することができる。複素表現Ａは複素量であり、その独立変数及び係数は、それぞれイメージセンサ１６が露光される光波２２の位相及び強度を示す。伝播演算子ｈによる画像Ｉ０の畳み込み積は、検出面Ｐ０の座標ｚに延在する、再構成面Ｐｚと称される、平面内の複素表現Ａの空間分布を表す複素画像Ａｚの取得を可能にする。本例では、検出面Ｐ０の式はｚ＝０である。この複素画像は再構成面Ｐｚ内のサンプルの複素画像に対応する。それはイメージセンサ１６が露光される波２２の光学的特性の二次元空間分布も表す。
【００４９】
伝播演算子ｈの役割は、座標（ｘ，ｙ，ｚ）の点から距離｜ｚ｜に配置された、イメージセンサ１６と座標（ｘ，ｙ，ｚ）の点との間の光の伝播を記述することである。再構成距離と呼ばれる、この距離｜ｚ｜での光波２２の係数Ｍ（ｘ，ｙ，ｚ）及び／又は位相φ（ｘ，ｙ，ｚ）を決定することができる。
【数１】
2019516108.tif 000003
・・・(1)
【数２】
2019516108.tif 000004
・・・(2)
【００５０】
演算子ａｂｓ及び演算子ａｒｇはそれぞれ係数及び独立変数を示す。
【００５１】
別の方法で述べると、空間における座標（ｘ，ｙ，ｚ）の任意の点での光波２２の複素表現Ａは次のようである。
【数３】
2019516108.tif 000005
・・・(3)
【００５２】
先行技術により提供される参考文献により明らかなように、特に、粒子特徴付けにおいて、伝播演算子をホログラムに適用することでサンプルの複素画像Ａｚを得るという慣習は先行技術から既知である。
【００５３】
しかし、発明者らは、粒子を含むサンプルの複素画像では、この粒子の特徴付けを十分な信頼性を持って行うことができないと考えている。本発明の重要な点は、粒子は複素画像によって特徴付けられるのではなく、その伝播軸Ｚに沿った光波２２の光学特性のプロファイルによって特徴付けられることである。「プロファイル」という用語は軸に沿った、特に、Ｚ軸に沿ったプロファイルが言及される、伝播軸に沿った量の偏差を意味することを理解されたい。光学特性は位相、振幅又は位相及び振幅の組み合わせとすることができる。一般に、光学特性は上記で規定したような複素表現Ａから得られる。
【００５４】
しかし、このような再構成は、再構成ノイズが伴う場合があり、再構成ノイズは、伝播が位相に関連する情報を含まないホログラムＩ０に基づいて行われるということに起因して、実質的なものとなり得る。したがって、プロファイルが確立される前に、イメージセンサ１６により露光される光波２２の位相に関連する情報を得ることが好ましい。この位相関連情報は、イメージセンサの面Ｐ０、又はイメージセンサから距離｜ｚ｜に配置される再構成面Ｐｚに、光波２２の振幅及び位相の推定を得るべく、先行技術に記載の方法を用いてサンプル１０の複素画像Ａｚを再構成することによって得ることができる。しかし、発明者らは基準複素画像の算出に基づいた方法（図２Ａを参照して記載する）を開発した。本方法は以下の段階を含むものである。
−画像Ｉ０をイメージセンサ１６で取得し、この画像がホログラムを形成する（ステップ１００）。
−再構成面Ｐｚ又は検出面Ｐ０内のサンプル１０の基準画像Ａｒｅｆと呼ばれる、複素画像を算出し、この基準複素画像はイメージセンサ１６が露光される光波２２の位相及び振幅についての情報を含み、このステップは上記した伝播演算子ｈを取得される画像Ｉ０に適用することで行われる（ステップ１１０からステップ１７０）。この画像は、基準画像と言われる。それは、粒子が特徴付けられる基となるプロファイルの形成がそれを基準とするからである。
−基準複素画像又はホログラムのいずれかを用いて、検出面の粒子の動径位置（ｘ，ｙ）を選択する（ステップ１８０）。
−伝播演算子ｈを基準複素画像Ａｒｅｆに適用し、伝播軸Ｚに沿った、二次画像と呼ばれる複素画像Ａｒｅｆ，ｚを算出する（ステップ１８５）。
−それぞれの二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚに基づいて、事前に選択された粒子の動径位置（ｘ，ｙ）における、及び再構成面からの（又は検出面からの）複数の距離における、光波２２の特徴量を推定し、その後、伝播軸Ｚに沿った前記特徴量の偏差を表すプロファイルを作成する（ステップ１９０）。
−このプロファイルにより粒子を特徴付ける。この特徴付けは、取得したプロファイルを、標準サンプルを用いて較正フェーズで得られた標準プロファイルと比較することにより、達成することができる。特徴付けは、取得したプロファイルと標準プロファイルとの比較、あるいは標準プロファイルに関連付けられたクラスに応じた、取得したプロファイルの分類を可能にする基準（metric）に基づいてもよい（ステップ２００）。
【００５５】
以下に、図２（Ａ）に提示するアルゴリズムを詳述し、特定のステップで得られる結果を図２（Ｂ）〜図２（Ｆ）に図示する。ステップ１１０〜１７０はＡｒｅｆで示される基準複素画像を得る好ましい方法であり、この画像は再構成面Ｐｚ内の波２２の複素表現の空間分布を表すものである。当業者はこのような複素画像の再構成を可能にする他のアルゴリズム、及び例えば先行技術を参照して言及したアルゴリズム（例えば、ＵＳ２０１２／０２１８３７９のページ１０〜１２に記載されるアルゴリズム）も想定され得ることを理解するであろう。
（ステップ１００：画像取得）
【００５６】
このステップでは、イメージセンサ１６はサンプル１６の画像Ｉ０、及びサンプルにより透過され、イメージセンサが露光される光波２２の画像をより正確に取得する。このような画像、すなわちホログラムを図２Ｂに示す。
【００５７】
この画像は、塩類の緩衝液に浸漬したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むサンプル１０を用いて生成したものであり、サンプルはＣＭＯＳセンサから１５００μｍの距離ｄに配置した厚さ１００μｍの流体チャンバに含有した。サンプルは発光ダイオード１１で照光し、そのスペクトル発光帯域は４５０ｎｍの波長でセンタリングし、サンプルから距離Ｄ＝８ｃｍに配置した。
（ステップ１１０：初期化）
【００５８】
2019516108.tif 000006
【００５９】
初期画像Ａ０ｋ＝０の位相φ０ｋ＝０は各画素（ｘ，ｙ）においてゼロであるとみなされるか、あるいは任意の値に予め設定されている。具体的には、初期画像Ａ０ｋ＝０は、イメージセンサ１６により取得される画像Ｉ０から直接生じる。しかし、後者はサンプル１０により透過される光波２２の位相に関連するいかなる情報も含まず、イメージセンサ１６はこの光波の強度にのみ反応するものである。
（ステップ  １２０：伝播）
【００６０】
このステップでは、サンプルの面で得られた画像Ａ０ｋ−１は、以上説明したような伝播演算子を適用することによって再構成面Ｐｚに伝播され、再構成面Ｐｚ内にサンプルを示す複素画像Ａｚｋが得られる。「複素画像」という用語は、この画像の各項が複素量であることを言及するものである。伝播は、次式のように、画像Ａ０ｋ−１を伝播演算子ｈ−ｚで畳み込むことで行われる。
【数４】
2019516108.tif 000007
・・・(5),
シンボル*は畳み込み積を表す。添字−ｚは、伝播が伝播軸Ｚの方向とは反対方向に行われるということを表している。逆伝播と言われる。
【００６１】
伝播演算子は、例えば、次のようなフレネル−ヘルムホルツ関数である。
【数５】
2019516108.tif 000008
・・・(6)
【００６２】
畳み込みは一般に周波数領域内で行われ、あるいは積に低減され、この場合、この演算子のフーリエ変換が使用され、後者は、
【数６】
2019516108.tif 000009
・・・(6')
λは光源１１のスペクトル発光帯域の中心波長を示す。
【００６３】
したがって
【数７】
2019516108.tif 000010
・・・(7)
ｒ及びｒ’はそれぞれ動径座標、すなわち再構成面Ｐｚ内の位置座標、及び検出面Ｐ０内の位置座標を示す。
【００６４】
１回目の繰り返し（ｋ＝１）では、Ａ０ｋ＝０はステップ１１０で決定された初期画像である。後続の繰り返しでは、Ａ０ｋ−０は、先行する繰り返しで更新された検出面Ｐ０の複素画像である。
【００６５】
再構成面Ｐｚは、検出面Ｐ０から離れた面、好ましくは検出面に平行な面である。好ましくは、再構成面Ｐｚは、サンプル１０が置かれた面Ｐ１０である。具体的には、この面に再構成された画像は一般的に高い空間分解能の取得を可能にする。検出面からゼロではない距離に配置され、好ましくは検出面に平行な別の平面、例えばイメージセンサ１６とサンプル１０との間にある平面であってもよい。
【００６６】
図２（Ｃ）は、上記に規定した伝播演算子を図２（Ｂ）のホログラムに適用することによって検出面Ｐ０から１４４０μｍの距離に再構成された画像Ａｚｋ＝１の係数を示す。この画像は１回目の繰り返しで確立された再構成面内の複素画像である。
（ステップ１３０：複素画像Ａｚｋの複数の画素の量の算出）
【００６７】
このステップでは、複素画像Ａｚｋの複数の画素（ｘ，ｙ）の各画素に関連付けられた量εｋ（ｘ，ｙ）を、好ましくは、これらの画素のそれぞれにおいて算出する。この量は、量が算出された画素（ｘ，ｙ）における画像Ａｚｋの、又はその係数の値Ａｚｋ（ｘ，ｙ）に依存する。それはまた、この画素内の画像の一次微分、例えば、この画像の一次微分の係数にも依存する。
【００６８】
本例では、各画素（ｘ，ｙ）に関連付けられた量は一次微分の係数に基づくものである。
【数８】
2019516108.tif 000011
・・・(8)
【００６９】
画像は画素に離散化されるので、微分演算子は次のようなSobel演算子に置き換えてもよい。
【数９】
2019516108.tif 000012
・・・(9)
ここで、-( )*は複素共役演算子であり、 
−Ｓｘ及びＳｙは再構成面Ｐｚの２つの直交軸Ｘ及びＹに沿ったSobel演算子である。
本例では、
【数１０】
2019516108.tif 000013
・・・(10)
であり、ＳｙはＳｘの転置行列である。
【００７０】
図２（Ｄ）は画像の形態における、図２（Ｃ）に示す画像Ａｚｋ＝１の各画素における量εｋ（ｘ，ｙ）の値を示す。
（ステップ１４０：画像Ａｚｋに関連付けられたノイズインジケータの確立）
【００７１】
2019516108.tif 000014
【００７２】
2019516108.tif 000015
【００７３】
本ケースでは、オーダー１のノルム、換言すればｐ＝１を用いる。具体的には、発明者らはオーダー１のノルム、又はオーダー１以下のノルムは特にこのアルゴリズムに好適であると推定している。その理由は、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）と併せて後述する。
【００７４】
本ステップでは、複素画像の各画素（ｘ，ｙ）において、複素画像Ａｚｋから算出された量εｋ（ｘ，ｙ）は合計され、複素画像Ａｚｋに関連付けられたノイズインジケータεｋが形成される。
【００７５】
故に、次式で与えられる。
【数１１】
2019516108.tif 000016
・・・(15)
【００７６】
このノイズインジケータεｋは複素画像Ａｚｋにおける合計偏差のノルムに相当する。
【００７７】
図２（Ｄ）の例を参照して、ノイズインジケータεｋ＝１は、１回目の繰り返しにおいて、この画像の画素の値を合計することで得られる。
【００７８】
オーダー１のノルムの代わりに、量εｋ（ｘ，ｙ）の加重和、又は別の演算の組み合わせを想定することもできる。
【００７９】
オーダー１のノルム、又はオーダー１以下のノルムを使用するので、ノイズインジケータεｋの値は、複素画像Ａｚｋがサンプルをより表すようになるにつれて、減少する。具体的には、１回目の繰り返しでは、画像Ａ０ｋの各画素（ｘ，ｙ）における位相の値φ０ｋ（ｘ，ｙ）は、低く（poorly）推定される。検出面Ｐ０から再構成面Ｐｚまでのサンプルの画像の伝播は、その後、先行技術に関して言及したように大幅な再構成ノイズを伴う。この再構成ノイズは再構成画像の変動の形態をとるものである。これらの変動により、再構成画像における再構成ノイズの寄与が増大するにつれて、上記で規定したノイズインジケータεｋは、値が増加する。具体的には、再構成ノイズに起因する変動はこのインジケータの値を増大させる傾向がある。
【００８０】
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）はそれぞれ、かなりの量の再構成ノイズ及びわずかな再構成ノイズにより影響される再構成画像の係数（又は位相）の動径プロファイルを模式的に示す。ここでは、透明で均質な媒体１０ａ内の粒子１０ｂの散乱を含むサンプルとする。概略プロファイルは、２つの大幅な変動を含み、それぞれ粒子１０ｂを示すものである。図３（Ａ）のプロファイルはまた、再構成ノイズを示す振幅の小さい、高周波の変動も含むものである。図３（Ａ）の上記に規定したノイズインジケータεｋは、図３（Ｂ）より大きい。オーダー１より大きいノルムに基づいたインジケータεｋの使用も好適であり得るが、このようなノルムは、サンプルを示す大きな変動に対する再構成ノイズを示す振幅の小さい変動を減衰させる傾向がある。一方で、オーダー１又は、オーダー１より小さいノルムは、大きな変動に対して小さな変動を減衰させない。このため、発明者らには、オーダー１以下のノルムに基づいた再構成ノイズインジケータεｋの方が好ましい。
【００８１】
本ステップの重要な態様は検出面Ｐ０において、サンプルの画像Ａ０ｋの各画素に対する位相値φ０ｋ（ｘ，ｙ）を決定することにあり、これにより、後続の繰り返しにおいて、そのインジケータεｋ＋１がインジケータεｋより小さい再構成画像Ａｚｋ＋１を得ることが可能になる。
【００８２】
１回目の繰り返しでは、以上のように、関連情報は、光波２２の強度についてのみ利用でき、その位相については利用できない。したがって、再構成面Ｐｚに再構成された第１の画像は、検出面Ｐ０内の光波２２の位相に関する関連情報がないので、かなりの量の再構成ノイズにより影響される。したがって、インジケータεｋ＝１は高い。後続の繰り返しでは、アルゴリズムは、インジケータεｋを漸次最小化するように検出面Ｐ０内で位相φ０ｋ（ｘ，ｙ）の漸次調整を行う。
【００８３】
検出面の画像Ａ０ｋは、光波の強度及びその位相の両方の観点から検出面Ｐ０内の光波２２を示している。ステップ１２０〜１６０は、繰り返し、画像Ａ０ｋの各画素に対して、インジケータεｋを最小化する位相の値φ０ｋ（ｘ，ｙ）を確立することを目的とし、後者は、画像Ａ０ｋ−１を再構成面Ｐｚに伝播することによって得られる画像Ａｚｋから得られるものである。
【００８４】
最小化アルゴリズムは勾配降下アルゴリズムであってもよいし、後述する共役勾配降下アルゴリズムであってもよい。
（ステップ１５０：検出面内の位相の値の調整）
【００８５】
ステップ１５０は、複素画像Ａ０ｋの各画素の位相φ０ｋ（ｘ，ｙ）の値を決定することを目的とし、後続の繰り返しｋ＋１で、複素画像Ａ０ｋの伝播から再構成面Ｐｚに生じるインジケータεｋ＋１が最小化される。
【００８６】
2019516108.tif 000017
【００８７】
この式は以下のベクトル形式で表現してもよい。
【数１２】
2019516108.tif 000018
・・・(16')
【００８８】
2019516108.tif 000019
【００８９】
2019516108.tif 000020
【００９０】
スケールファクタβｋは以下の式で表すことができるスカラー値である。
【数１３】
2019516108.tif 000021
・・・(19)
ここでは、スカラー積を示す。
【００９１】
ステップサイズαｋは繰り返しの回により、例えば１回目の繰り返しにおける０．０３から、最後の繰り返しにおける０．０００５まで、変動し得る。
【００９２】
更新式は、ベクトルφ０ｋの調整を可能とし、これにより複素画像Ａ０ｋの各画素における位相φ０ｋ（ｘ，ｙ）が繰り返し更新される。検出面における、この複素画像Ａ０ｋは、その後、各画素に関連付けられた位相のこれらの新しい値で更新される。なお、複素画像Ａ０ｋの係数は修正されず、これは、イメージセンサにより取得される画像から決定され、下式で表される。
【数１４】
2019516108.tif 000022
（ステップ１６０：アルゴリズムの繰り返し又は終了）
【００９３】
収束基準に到達しない限り、ステップ１６０では、ステップ１５０で更新された複素画像Ａ０ｋに基づいて、ステップ１２０〜１６０の新しい繰り返しでアルゴリズムの繰り返しを行う。
【００９４】
収束基準は、所定の繰り返し回数ｋであってもよいし、インジケータの勾配∇εｋの最小値であってもよいし、あるいは２つの連続する位相ベクトルφ０ｋ−１、φ０ｋの無視可能な差分であってもよい。収束基準に到達したとき、推定は、検出面Ｐ０又は再構成面Ｐｚにおけるサンプルの複素画像の正確な推定であるとみなされる。
（ステップ１７０：基準複素画像の取得。）
【００９５】
最後の繰り返しの終わりに、この方法は、最後の繰り返しから生じる複素画像Ａ０ｋを再構成面Ｐｚに伝播し、基準複素画像Ａｒｅｆ＝Ａｚｋを取得することを含んでもよい。代替案としては、基準複素画像Ａｒｅｆは検出面Ｐ０における最後の繰り返しから生じる複素画像Ａ０ｋである。ただし、粒子の密度が高いときは、この代替案は不利である。これは特に、再構成面Ｐｚが、サンプルが置かれた面Ｐ１０に対応するときは、検出面Ｐ０における空間分解能は再構成面Ｐｚにおける空間分解能より小さいためである。
【００９６】
図２Ｅは、３０回の繰り返しの後に再構成面Ｐｚで得られた基準複素画像Ａｚｋ＝３０の各画素の係数Ｍｚｋ＝３０の画像を示す。この画像を、１回目の繰り返しで得られた同様の画像Ａｚｋ＝１を示す図２Ｃと比較することができる。特に各粒子間に、再構成ノイズが明らかに減少したことが観測される。また、この画像の空間分解能では、各粒子の動径座標（ｘ，ｙ）の同定を改善することができる。これらの結論は、基準画像Ａｒｅｆ＝Ａｚｋ＝３０の各画素の位相画像φｚｋ＝３０にも関連するものである。
（ステップ１８０：粒子の動径座標の選択）
【００９７】
本ステップでは、粒子の動径座標（ｘ，ｙ）が基準画像Ａｒｅｆ＝Ａｚｋ＝３０から、例えば、その係数Ｍｒｅｆ＝Ｍｚｋ＝３０の画像、又はその位相φｒｅｆ＝φｚｋ＝３０の画像から選択される。上述したように、動径座標という表現は、検出面又は再構成面の座標を指すものである。最後の繰り返しの後で、検出面で得られたホログラムＩ０、又は複素画像Ａ０ｋに基づいて、この選択を実行することも想定することができる。しかし、粒子の数が増加する場合、再構成面に形成された画像の選択を実行することが好ましい。これは、特に再構成面Ｐｚがサンプルの面Ｐ１０に対応するときは、空間分解能がよくなるからである。
【００９８】
図２Ｅでは、点線で囲まれた粒子の選択が示されている。
（ステップ１８５：伝播演算子の適用）
【００９９】
このステップ１８５では、上記したような伝播演算子ｈを用いて基準複素画像Ａｒｅｆが複数の再構成距離に伝播され、検出面Ｐ０又は再構成面Ｐｚからの種々の距離で再構成された複数の二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚと呼ばれる複素画像が得られる。このように、このステップは、下記の式で表される複数の複素画像Ａｒｅｆ，ｚを決定することを含む。
【数１５】
2019516108.tif 000023
・・・(20)
この場合、
【数１６】
2019516108.tif 000024
【０１００】
値ｚｍｉｎ及び値ｚｍａｘは、基準複素画像が伝播される軸Ｚに沿った最小座標と最大座標である。好ましくは、複素画像はサンプル１０とイメージセンサ１６との間の複数の座標ｚで再構成される。複素画像はサンプル１０の一方の側で形成されてもよい。
【０１０１】
これらの二次複素画像はホログラフィック再構成演算子ｈを基準画像Ａｒｅｆに単に適用することで確立される。これは、ステップ１２０〜１６０の繰り返しに続いてイメージセンサが露光される光波２２、特にその位相を正確に表す複素画像である。したがって、二次画像Ａｒｅｆ，ｚは伝播軸Ｚに沿った光波２２の伝播の良い記述子を形成する。これらは、基準複素画像から非常に容易に得られる。したがって、基準複素画像から、いくつかの再構成画像を容易に得ることができ、これは、基準複素画像の伝播演算子の直接的な適用は時間がほとんどかからない演算であるので迅速に行うことができる。
（ステップ１９０：プロファイルの作成）
【０１０２】
このステップでは、各二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚから、光波２２の特徴量が決定され、伝播軸Ｚに沿った前記特徴量の偏差を表すプロファイルを規定する。特徴量は、下記とすることができる。
−係数、この場合、プロファイルは、事前に選択された動径位置（ｘ，ｙ）において各二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚ（ｘ，ｙ）の係数Ｍｒｅｆ，ｚ（ｘ，ｙ）から作成される。その後、プロファイルＭ（ｚ）が得られる。
−位相、この場合、プロファイルは、事前に選択された動径位置（ｘ，ｙ）における各二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚ（ｘ，ｙ）の位相φｒｅｆ，ｚ（ｘ，ｙ）から作成される。その後、プロファイルφ（ｚ）が得られる。
各画像の係数及び位相の組み合わせ、例えば、比の形式
【数１７】
2019516108.tif 000025
である。その後、プロファイルｋ（ｚ）が得られる。
【０１０３】
図２（Ｆ）は伝播軸Ｚに沿った光波２２の位相φ（ｚ）の偏差を示す。
（ステップ２００：特徴付け）
【０１０４】
その後、粒子を、上記ステップで作成されたプロファイルから特徴付けることができる。好ましくは、既知の標準サンプルを用いて学習フェーズで作成された標準プロファイルのデータベースを利用することができる。その後、標準プロファイルに基づいて、作成されたプロファイルを比較又は分類することによって特徴付けが実行される。
【０１０５】
記載されている例では、ステップ１３０で実施される各画素に関連付けられた量εｋ（ｘ，ｙ）は、画像Ａｚｋの各画素（ｘ，ｙの一次微分に基づくものである。１つの変形例によれば、初期画像Ａｚｋ＝０は、以上説明したように、入射光波１２を示すスカラー値又は画像によって正規化される。このようにして、各画素において、検出面又は再構成面におけるサンプルの画像の係数は、１以下である。ステップ１３０では、各画素に関連付けられた量εｋ（ｘ，ｙ）は、各画素における画像Ａｚｋの差分の係数であり、値１である。このような量は下記式を用いて得ることができる。
【数１８】
2019516108.tif 000026
・・・(20)
ステップ１４０では、
【数１９】
2019516108.tif 000027
・・・(21)
それは、非離散化形式では、
【数２０】
2019516108.tif 000028
・・・(22)
に相当し、ｒは再構成面における動径座標を示す。
【０１０６】
2019516108.tif 000029
【０１０７】
位相ベクトルに対するこのノイズインジケータεｋの勾配は下記のようであると示すことができる。
【数２１】
2019516108.tif 000030
・・・(23)
ｒ’は、検出面における動径座標を示す。
【０１０８】
式（１５）と合わせて上記したような合計偏差型のノルムのように、このようなインジケータの使用は、均質な媒体１０ａに散乱した粒子１０ｂを含むサンプルに好適である。勾配降下アルゴリズムでは、このインジケータは１と等しくない係数を有する画素数をサンプルの画像内の離散的に分散した区域まで低減させる傾向にあり、これらの区域はサンプルの粒子１０ｂに相当するものである。
【０１０９】
別の変形例によれば、ステップ１３０では、ノルムは次式で与えられる。
【数２２】
2019516108.tif 000031
・・・(25) 
であり、ステップ１４０では、
【数２３】
2019516108.tif 000032
・・・(26)
であり、非離散化形式で、
【数２４】
2019516108.tif 000033
・・・(27)
に相当する。
【０１１０】
上記実施形態のように、ステップ１３０は、複素画像Ａｚｋの係数に基づいて各画素に関連付けられた量εｋ（ｘ，ｙ）を算出し、その後、ノルムに基づいた複素画像Ａｚｋに関連付けられたノイズインジケータを算出することを、含む。この変形例によれば、ノルムはオーダー２である。
【０１１１】
位相ベクトルに対する、このインジケータの勾配は下記のようであると示すことができる。
【数２５】
2019516108.tif 000034
・・・(28)
【０１１２】
別の変形例によれば、ステップ１３０では、各画素に関連付けられた量は下式で与えられる。
【数２６】
2019516108.tif 000035
・・・(30)
ステップ１４０では、
【数２７】
2019516108.tif 000036
・・・(31)
であり、それは、非離散化形式で、
【数２８】
2019516108.tif 000037
・・・(32)
に相当する。各画素に関連付けられた量は上記変形例（式（２５）参照）と同一であるが、画像に関連付けられたノイズインジケータはオーダー１のノルムに応じて算出される。
【０１１３】
別の変形例によれば、ステップ１３０では、各画素に関連付けられた量は次式で与えられる。
【数２９】
2019516108.tif 000038
・・・(35)
ステップ１４０では、
【数３０】
2019516108.tif 000039
・・・(36)
であり、それは、非離散化形式で、
【数３１】
2019516108.tif 000040
・・・(37)
に相当する。
【０１１４】
こうして、実施形態にかかわらず、複素画像Ａｚｋに関連付けられたノイズインジケータεｋは、
−画像の値、画像の係数、又は画像の一次微分に基づいて画像の複数の画素の量を算出し、
−ノルムの形式、好ましくはオーダー１未満でのノルムで前記量を合算する
ことにより得ることができる。
【０１１５】
図４は、上記したアルゴリズムの主要ステップをまとめたものであり、イメージセンサ１６により取得される画像Ｉ０から、初期画像Ａ０ｋ＝０が形成される。各繰り返しｋでは、再構成面Ｐｚ内に光波２２を示す複素画像Ａｚｋは検出面Ｐ０内の光波２２を表す画像Ａ０ｋのデジタル伝播により確立される。ノイズインジケータεｋは画像Ａｚｋに関連付けられている。検出面Ｐ０における光波２２の位相φ０ｋに応じた、その勾配∇εｋは、検出面における光波２２の前記位相のどれかが更新されることに基づいて算出される。この更新は、新しい繰り返しが実行され得ることに基づいて、検出面Ｐ０における新しい複素画像Ａ０ｋ＋１を形成することを可能にする。収束基準に到達後、基準画像Ａｒｅｆが得られ、それは、本例では、サンプルの面Ｐ１０内で最後の繰り返しで得られた、画像Ａ０ｋの伝播により得られた画像である（ステップ１７０）。この基準画像は検査される粒子の動径位置（ｘ，ｙ）を選択するのを可能にする（ステップ１８０）。伝播演算子ｈをそれに適用して、伝播軸Ｚに沿った複数の座標において、複数の二次複素画像Ａｒｅｆ,zを作成する（ステップ１８５）。選択された動径位置における様々な二次画像Ａｒｅｆ,zの値に基づいて、伝播軸に沿った光波２２の特徴量のプロファイルが得られる（ステップ１９０）。
【０１１６】
上記の実施形態では、インジケータεｋは、再構成ノイズとともに増大する関数を示す。別の方法で述べると、再構成ノイズの量がより大幅に増えると、インジケータεｋは大きくなる。したがって、最適化アルゴリズムは、特にその勾配∇εｋに基づいて、このインジケータを最小化する傾向がある。もちろん本発明は、再構成ノイズとともに減少する関数を示すインジケータを用いて適用してもよく、インジケータは再構成ノイズが増加するにつれて、小さくなる。その後、最適化アルゴリズムは、特に、その勾配に基づいてこのインジケータを最大化する傾向がある。一般に、ノイズインジケータにとって、複素画像内の再構成ノイズの累積振幅の単調関数に従うことが好ましい。
【０１１７】
本発明を合計偏差のノルムを用いて、ＣＤＣＨＯ培養基（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に浸漬されたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に実施した。サンプルを厚さ１００μｍの流体チャンバに置き、発光ダイオードからの距離８ｃｍに配置し、そのスペクトル帯域を４５０ｎｍにセンタリングした。サンプルを２７４８ｘ３８４０画素からなるＣＭＯＳイメージセンサから１５００μｍの距離に置いた。空間フィルタ１８の開口の直径は１５０μｍであった。
【０１１８】
図５（Ａ）はイメージセンサ１６により取得される画像Ｉ０を示す。図５（Ｂ）及び図５（Ｃ）にそれぞれ、サンプルの面Ｐ１０における基準複素画像Ａｒｅｆの係数及び位相の画像を示す。これらの画像を１００回の繰り返しで取得した。各細胞の階調表現の均一性は再構成の品質を裏付けるものである。上記したような伝播演算子ｈをこの基準画像に適用し、伝播軸Ｚに沿った複数の二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚを取得した。また、基準画像の、係数の画像又は位相の画像では、２つの細胞を同定し、図５（Ｂ）及び図５（Ｃ）において黒い破線（細胞１０ｂ−１）及び黒い点線（細胞１０ｂ−２）でそれぞれ囲った。これらの２つの細胞の動径座標（ｘ，ｙ）を抽出した。各細胞について、イメージセンサ１６に到達する光波２２の、係数を示すプロファイルＭ（ｚ）及び位相を示すプロファイルφ（ｚ）を作成した。プロファイルの各点の値は、前記動径座標（ｘ，ｙ）における各二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚの係数及び位相を決定することによって得られる。
【０１１９】
図５（Ｄ）及び図５（Ｅ）はそれぞれ、細胞１０ｂ−１の係数及び位相のプロファイルを示す。図５（Ｆ）及び図５（Ｇ）はそれぞれ細胞１０ｂ−２の係数及び位相のプロファイルを示す。各プロファイルを座標ｚｍｉｎ＝５５２μｍとｚｍａｘ＝２１５２μｍとの間で４０μｍのｚ方向のステップサイズで決定した。再構成面は検出面から１３５２μｍ離して配置している。
【０１２０】
また、これらの再構成の後、細胞をトリパンブルーで処理し、その後、１０倍の倍率の顕微鏡を用いて観測した。トリパンブルーは細胞の生存能力を判定するのに通常用いられる染料である。得られた画像を図５（Ｈ）に示す。細胞１０ｂ−１は生細胞であるが、細胞１０ｂ−２は死細胞であるように見える。
【０１２１】
図５（Ｄ）及び図５（Ｅ）の係数又は位相のプロファイルは生ＣＨＯ細胞を示すものとみなすことができるが、図５（Ｆ）及び図５（Ｇ）は死ＣＨＯ細胞を示すものとみなすことができる。ＣＨＯ細胞はこのようなプロファイルに基づいて特徴付けることができる。
【０１２２】
図６（Ａ）〜図６（Ｅ）に別の例を提示する。これらの例では、サンプルは１／４００に希釈したリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）バッファを含む水溶液内に希釈した赤血球を含む。サンプル１０を１００μｍの厚さの流体チャンバ１５内に置いて、そのチャンバを上記した発光ダイオードから８ｃｍの距離に置いて、そのスペクトル帯域を４５０ｎｍにセンタリングした。サンプルを上記のＣＭＯＳイメージセンサから１．５ｍｍの距離に配置した。空間フィルタ１８の開口のサイズは１５０μｍであった。
【０１２３】
図６（Ａ）はイメージセンサにより取得される画像Ｉ０を示す。図６（Ｂ）及び図６（Ｃ）にそれぞれサンプルの面Ｐ１０において再構成された複素画像Ａｚｋ＝８の係数及び位相の画像を示す。これらの画像は８回の繰り返しで取得した。
【０１２４】
画像Ａｚｋ＝８は、上記した伝播演算子ｈを適用した基準画像Ａｒｅｆを形成し、伝播軸Ｚに沿った複数の二次複素画像Ａｒｅｆ，ｚが得られる。また、基準画像の、係数の画像又は位相の画像において、赤血球を同定し、赤血球をこれらの画像のそれぞれの点線で囲んだ。この赤血球の動径座標（ｘ，ｙ）を抽出した。二次画像Ａｒｅｆ，ｚから、イメージセンサ１６に到達する光波２２の係数を示すプロファイルＭ（ｚ）及び位相を示すプロファイルφ（ｚ）を作成した。プロファイルの各点の値は、前記動径座標での各二次画像の係数及び位相を決定することによって得られる。図６（Ｄ）及び図６（Ｅ）はそれぞれ、このように選択された赤血球の係数及び位相のプロファイルを示す。プロファイルを座標ｚｍｉｎ＝１０００μｍとｚｍａｘ＝２０００μｍとの間で５μｍのｚ方向のステップサイズで決定した。再構成面は検出面から１３８０μｍ離して配置し、これは、図６（Ｄ）及び図６（Ｅ）での横座標７６に対応する。
【０１２５】
この試験を図７（Ａ）に示す別のホログラムＩ０に基づいて繰り返した。図７（Ｂ）及び図７（Ｃ）はそれぞれ８回の繰り返し後にサンプルの面Ｐ１０に再構成された複素画像Ａｚｋ＝８の係数及び位相の画像を示す。赤血球の動径座標（ｘ，ｙ）をこれらの画像から取り出した。複素画像Ａｚｋを伝播軸Ｚに沿った様々な座標で伝播して、イメージセンサ１６に到達する光波２２のモジュールを示すプロファイルＭ（ｚ）（図７（Ｄ））及び位相を示すプロファイルφ（ｚ）（図７（Ｅ））が作成された同じ数の二次画像Ａｒｅｆ，ｚが得られた。
【０１２６】
図８（Ａ）はイメージセンサにより取得される画像Ｉ０を示し、観測されたサンプルは屈折率整合オイルの小滴からなるエマルジョンであり、その屈折率は１．３８に等しくＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファに懸濁されている（Ｃａｒｇｉｌｌｅ  Ｌａｂｓにより作成された基準シリーズＡＡＡｎ＝１．３８００±０．０００２）。これらの画像に示す液滴のサイズは５〜９μｍである。サンプルは１００μｍの厚みを有する流体チャンバ１５内に、直径１５０μｍを有する空間フィルタから８ｃｍ離して４５０ｎｍ付近にセンタリングされたスペクトル帯域で発光する発光ダイオードの下流に配置した。サンプルと検出器との間の距離は１．５ｍｍである。図８（Ｂ）及び図８（Ｃ）に、サンプルの面Ｐ１０において、ホログラムＩ０に基づいた、再構成された複素画像Ａｚｋ＝８の係数及び位相の画像をそれぞれ示す。これらの画像を８回の繰り返しで取得した。これらの画像のそれぞれでは、液滴を同定し、点線で囲んだ。この液滴の動径座標（ｘ，ｙ）を取り出した。液滴を通過し、イメージセンサ１６に到達する光波２２の、係数を示すプロファイルＭ（ｚ）及び位相を示すプロファイルφ（ｚ）を作成した。プロファイルの各点の値は、前記動径座標における各二次画像の係数及び位相を決定することで得られた。図８（Ｅ）及び図８（Ｇ）はイメージセンサ１６に到達する光波２２の係数のプロファイル及び位相のプロファイルをそれぞれ示す。
【０１２７】
さらに、イメージセンサにより取得される画像Ｉ０、すなわち、ホログラムを基準複素画像として用いた。この画像は複数の座標ｚに沿ってデジタル伝播を受けて、各二次複素画像の係数及び位相のプロファイルが得られた二次複素画像が得られる。図８（Ｄ）及び図８（Ｆ）はこのように得られた係数及び位相のプロファイルをそれぞれ示す。
【０１２８】
座標ｚｍｉｎ＝１０００μｍとｚｍａｘ＝２０００μｍとの間で５μｍのｚ方向のステップサイズを用いてプロファイルを決定した。再構成面を検出面から１３８０μｍに配置し、これは、図８（Ｄ）〜図８（Ｇ）の横座標７６に対応する。
【０１２９】
このように、図８（Ｄ）及び図８（Ｆ）は検出器１６により取得されるホログラムＩ０に直接伝播演算子ｈを適用することで得られたプロファイルであり、図８（Ｅ）及び図８（Ｇ）は前記ホログラムＩ０に基づいて上記した方法を実施する基準Ａｒｅｆ複素画像に伝播演算子を適用することで得られるプロファイルである。基準画像の伝播に基づいて作成されたプロファイル（図８（Ｅ）及び図８（Ｇ））はホログラムの伝播に基づいて得られるプロファイル（図８（Ｄ）及び図８（Ｆ））より大きなダイナミックレンジを呈するように見え、位相に関する情報は後者にはない。
【０１３０】
また、粒子の特徴付けにより、その体積を推定することができ、これは特に、球状粒子についての場合である。図９（Ａ）はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した直径３μｍ及び５μｍのラテックスのビードを含むサンプルから得られた基準複素画像の係数を示す。ラテックスのビードは基準４２０５Ａ（直径５μｍ）及び基準４２０３Ａ（直径３μｍ）の基でＤＵＫＥにより供給されたビードである。サンプルは１９個の３μｍビード及び５５個の５μｍビードを含む。サンプルの厚さは１００μｍである。サンプルを上記のように４５０ｎｍにセンタリングされた青色スペクトル帯域で照光する。各粒子について、伝播演算子を基準複素画像に適用し、いくつかの再構成画像が得られた。次に、各複素画像の係数及び位相のプロファイルを決定し、プロファイルは、図９（Ａ）に見えるように各粒子の中心を通過している。図９（Ｂ）及び図９（Ｃ）はそれぞれ様々な粒子に対して得られた係数及び位相のプロファイルを示す。黒で示したプロファイル及びグレーで示したプロファイルはそれぞれ直径５μｍ及び３μｍのビードに対応する。プロファイルが各ビードの体積のシグネチャを形成することを示すことができる。具体的には、同一の体積の粒子に対応するプロファイルは軸Ｚに沿った１つの、かつ同一偏差を示している。プロファイルに適用される判別基準に応じて各プロファイルを特徴付けることができ、その体積に応じてビードを判別することができ、それはまた、同一体積のビードをカウントすることもできる。この判別基準は、プロファイルの最大値とプロファイルの最小値との差、半波高全幅値の基準、又はプロファイルの最大値とプロファイルの最小値との間の高さの基準であってもよい。
【０１３１】
この方法の再現性を評価するために、他のラテックスのビード、本例では、１５個の３μｍビード及び３０個の５μｍビードを用いて別の試験を行った。サンプルは５４０ｎｍにセンタリングした緑色スペクトル帯域で照光した。図９（Ｄ）は基準複素画像の係数を示す。図９（Ｅ）及び図９（Ｆ）はそれぞれ同一のカラーコードを用いて、様々な粒子に対して得られた係数及び位相のプロファイルを示す。また、体積に応じたビードの分類が振幅又は位相プロファイルに基づいて行われ得ることを示すことができる。
【０１３２】
実施形態にかかわらず、方法は１つの、かつ同一の粒子を示す複数の動径座標、例えば、１つの同一の粒子に対応する隣接動径座標の選択を含むものである。二次複素画像に基づいて、方法は選択された動径座標のそれぞれにおける特徴量の決定を含むものである。このように、軸Ｚに沿った、作成されたプロファイルの数は選択された座標の数と同一である。基本プロファイルと称される、これらのプロファイルは、粒子を示すプロファイルを作成するために、例えば、平均して組み合わせることができる。
【０１３３】
実施形態にかかわらず、検出面Ｐ０とサンプルの面Ｐ１０との間の距離の推定は、特に、基準複素画像がサンプルの面Ｐ１０に作成されている場合に、必要となり得る。この距離は幾何学的に知られている場合もあるし、ホログラフィック再構成の分野で一般的なオートフォーカスアルゴリズムを実施することで推定される場合もある。
【０１３４】
本発明は、ホログラフィック再構成によるサンプルの観測に適用してもよく、ホログラムはレンズレスイメージングか、あるいはデフォーカスイメージングのいずれかにより得られる。この場合、ホログラムはイメージセンサに結合された光学系の焦点面以外の面において、イメージセンサにより取得される画像である。
【０１３５】
本発明は、バイオテクノロジー又は診断学の分野、並びに食料及び農業又は環境若しくは工業プロセスから入手されるサンプルの分析の分野におけるサンプルの特徴付けに適用され得る。
【図１】
2019516108.tif 000041
【図２】
2019516108.tif 000042
【図３】
2019516108.tif 000043
【図４】
2019516108.tif 000044
【図５】
2019516108.tif 000045
【図６】
2019516108.tif 000046
【図７】
2019516108.tif 000047
【図８】
2019516108.tif 000048
【図９】
2019516108.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月22日(2018.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル（１０）に含有される粒子（１０ｂ）を特徴付ける方法であって、前記方法は、
ａ）伝播軸（Ｚ）に沿って前記サンプル（１０）に向かって伝播する入射光波（１２）を発光する光源（１１）を用いて前記サンプルに照光するステップと、
ｂ）イメージセンサ（１６）を用いて、検出面（Ｐ０）に形成された前記サンプル（１０）の画像（Ｉ０）を取得するステップであって、前記サンプルは前記光源（１１）と前記イメージセンサ（１６）との間に配置され、前記画像は前記照光の効果により前記サンプルによって透過される光波（２２）を示すものであるステップと、を含み、
前記方法はまた、
ｃ）ステップｂ）で取得される前記画像（Ｉ０）に伝播演算子（ｈ）を適用し、再構成面（Ｐｚ、Ｐ０）内の前記サンプルを示す、複素画像である基準複素画像（Ａｒｅｆ）を算出するステップと、
ｄ）前記検出面（Ｐ０）に平行な面内の前記粒子の動径位置（ｘ，ｙ）を選択するステップと、
ｅ）ステップｃ）で算出された基準複素画像（Ａｒｅｆ）から、前記検出面（Ｐ０）又は前記再構成面（Ｐｚ）からの複数の距離における前記サンプルによって透過された前記光波（２２）の少なくとも１つの特徴量（Ｍ、φ、ｋ）を決定するステップであって、ステップｅ）は、
伝播演算子（ｈ）を前記基準複素画像（Ａｒｅｆ）に適用し、前記再構成面（Ｐｚ）又は前記検出面（Ｐ０）からの複数の距離に対する二次複素画像を算出することと、  前記二次複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）から、前記距離のそれぞれにおける前記サンプル（１０）によって透過された前記光波（２２）の特徴量（Ｍ、φ、ｋ）を決定することを含むステップと、
ｆ）前記伝播軸（Ｚ）に平行で、ステップｄ）で選択された前記動径位置（ｘ，ｙ）を通過する軸に沿ってステップｅ）で決定された前記特徴量の偏差を示すプロファイル（Ｍ（ｚ）、φ（ｚ）、ｋ（ｚ））を作成するステップと、
ｇ）ステップｆ）で作成された前記プロファイルを用いて前記粒子を特徴付けるステップと、を含む、方法。
【請求項２】
特徴量（Ｍ、φ、ｋ）は、二次複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）の係数又は独立変数から決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特徴付けはステップｆ）で作成された前記プロファイルと学習フェーズで決定された標準プロファイルを比較することによって実行される、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）では、粒子の前記動径位置（ｘ，ｙ）は、ステップｂ）で取得された前記画像（Ｉ０）を用いて、又はステップｃ）で前記基準複素画像（Ａｒｅｆ，ｚ）を用いて選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル（１０）と前記イメージセンサ（１６）との間には拡大光学素子が置かれていない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｄ）は１つかつ同一の粒子を示す複数の動径座標を選択することを含み、
ステップｆ）は、選択された動径座標のそれぞれにおいて複数の基本プロファイルを作成し、前記粒子を示すプロファイルを作成するように前記プロファイルを組み合わせることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）において、前記基準複素画像の前記算出は、
ｉ）前記イメージセンサにより取得される前記画像（Ｉ０）から、前記検出面において前記サンプルの初期画像（Ａ０ｋ＝０）を規定するサブステップと、
ｉｉ）サブステップｉ）で規定された前記サンプルの前記初期画像（Ａ０ｋ＝１）、又は前記先行する繰り返し（ｋ−１）から生じる前記検出面における前記サンプルの前記画像（Ａ０ｋ−１）に伝播演算子を適用することによって、再構成面（Ｐｚ）において前記サンプルの複素画像（Ａｚｋ）を決定するサブステップと、
ｉｉｉ）サブステップｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａｚｋ）から、前記複素画像（Ａｚｋ）に影響を及ぼす再構成ノイズによりノイズインジケータ（εｋ）を算出する、サブステップと、
ｉｖ）前記画像の画素の位相値（φ０ｋ（ｘ，ｙ））を調整することによって、前記検出面（Ｐ０）における前記サンプルの前記画像（Ａ０ｋ）を更新するサブステップであって、
前記調整は前記位相値に応じてサブステップｉｉｉ）で算出された前記インジケータの偏差に応じて実行されるサブステップと、
ｖ）前記検出面（Ｐ０）又は前記再構成面（Ｐｚ）)における前記サンプル（１０）の複素基準画像を得るように収束基準に達するまでサブステップｉｉ）〜ｉｖ）を繰り返すサブステップと、
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
サブステップｉｉｉ）は、
様々な画素（ｘ，ｙ）について、前記画素に対してサブステップｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａｚｋ）の値、又は前記画素に対する前記複素画像の一次微分の値に応じて、各画素に関連付けられた量（εｋ（ｘ，ｙ））を算出することと、
前記ノイズインジケータ（εｋ）を得るように様々な画素（ｘ，ｙ）と関連付けられた前記量（εｋ（ｘ，ｙ））を組み合わせることと、を含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ノイズインジケータ（εｋ）は、各画素に関連付けられた前記量εｋ（ｘ，ｙ）から算出されたオーダー１又はオーダー１以下のノルムである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サブステップｉｉｉ）では、各画素（ｘ，ｙ）に関連付けられた前記量（εｋ（ｘ，ｙ））は、サブステップｉｉ）で決定された前記複素画像（Ａｚｋ）の前記画素に対する一次微分の係数から算出される、
請求項８及び９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サブステップｉ）では、前記サンプルの前記初期画像（Ａ０ｋ＝１）は、前記光源により発光される前記光波（１２）を示す画像（Ｉ１２）によって前記イメージセンサ（１６）により取得される前記画像（Ｉ０）の正規化によって規定される、
サブステップｉｉｉ）では、各画素に関連付けられた前記量（εｋ（ｘ，ｙ））は、厳密に正の値、特に数字１から減算された、前記画素に対して、サブステップｉｉ）で算出された前記複素画像（Ａｚｋ）の前記値に応じて算出される、
請求項８及び９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サブステップｉｖ）では、各画素の位相の値は、位相ベクトル（φ０ｋ）と称されるベクトルを形成することによって調整され、その各項は、前記検出面（Ｐ０）における前記サンプルの前記画像の画素の前記位相（φ０ｋ（ｘ，ｙ））の前記値に対応し、このベクトルは、前記位相ベクトルの各項に応じた前記ノイズインジケータ（εｋ）の勾配（∇εｋ）に基づいて、各繰り返しにおいてサブステップｉｉｉ）で算出された前記ノイズインジケータ（εｋ）を最小化又は最大化するように更新される
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記粒子は、細胞、又は微生物、又はマイクロビーズ、又はエキソソーム、又はエマルジョンの液滴、又は細胞核又は細胞の一つの残骸から選択される、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記特徴付けは、複数の所定の粒子クラスに応じた前記粒子の分類、又は複数の所定の状態に応じた前記粒子の状態の判定、又は前記粒子の幾何学的パラメータの推定、又は前記粒子の光学パラメータの推定である、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルに含有される粒子を特徴付ける装置であって、
前記サンプル（１０）に向けて伝播する入射光波（１２）を発光するように構成された光源（１１）と、
イメージセンサ（１６）と、
前記光源（１１）と前記イメージセンサ（１６）との間に前記サンプル（１０）を保持するように構成されたホルダー（１０ｓ）と、
前記イメージセンサ（１６）によって取得される前記サンプルの画像を受信し、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の前記方法のうち、ステップｃ）〜ｆ）を実行するように構成されたプロセッサ（２０）と、を備える、装置。
【国際調査報告】
2019516108.tif 000050
2019516108.tif 000051
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