(57)【要約】本開示の態様は、シグナルペプチドと、ＴＧＦ−βに特異的に結合する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、細胞内で発現された場合、ＴＧＦ−βを中和するだけでなく、ＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞活性化を特異的に誘発することもできる。Ｔ細胞活性化によって免疫細胞が免疫賦活性サイトカインを産生し増殖するよう促され、それによりＴＧＦ−βが免疫抑制性シグナルから活性化刺激となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナルペプチドと、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、前記抗原結合ドメインがＴＧＦ−βに特異的に結合する、前記ポリペプチド。
【請求項２】
シグナルペプチドと、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、前記ＶＨ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＨＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＨＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＨＣＤＲ３）とを含み、前記ＶＬ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（ＬＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＬＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（ＬＣＤＲ３）とを含む、前記ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＶＨ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含み、前記ＶＬ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
シグナルペプチドと、ＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、前記ＶＨ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＨＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＨＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（ＨＣＤＲ３）とを含み、前記ＶＬ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（ＬＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（ＬＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ＬＣＤＲ３）とを含む、前記ポリペプチド。
【請求項５】
前記ＶＨ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、前記ＶＬ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
シグナルペプチドと、ＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、前記ＶＨ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１（ＨＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２（ＨＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３（ＨＣＤＲ３）とを含み、前記ＶＬ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４（ＬＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（ＬＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ＬＣＤＲ３）とを含む、前記ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＶＨ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を含み、前記ＶＬ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＶＨ領域とＶＬ領域とがペプチドリンカーによって分離されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、Ｓ−Ｘ−ＰＬ−Ｙ−ＰＳ−Ｔ−ＥまたはＳ−Ｙ−ＰＬ−Ｘ−ＳＰ−Ｔ−Ｅという構造を有し、Ｓは前記シグナルペプチドであり、ＸはＶＨであり、ＰＬはペプチドリンカーであり、ＹはＶＬであり、ＰＳは前記ペプチドスペーサーであり、Ｔは前記膜貫通ドメインであり、及びＥは前記エンドドメインである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
共刺激領域をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記共刺激領域が、前記膜貫通ドメインとエンドドメインの間にある、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記膜貫通ドメインがＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記エンドドメインがＣＤ２８シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドリンカーがグリシン−セリンリンカーである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーが少なくとも４個のアミノ酸である、請求項３〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記エンドドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドスペーサーが５０個未満のアミノ酸を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドスペーサーが５０個超のアミノ酸を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドスペーサーがＩｇＧ分子のヒンジ領域を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドスペーサーがＩｇＧ分子のヒンジ領域とＣＨ２ＣＨ３領域とを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドスペーサーがＩｇＧ分子のヒンジ領域からなる、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
検出ペプチドをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記検出ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、９４、または９５のペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記検出ペプチドがリンカーと隣接している、請求項２２または２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記検出ペプチドがＶＨ領域及びＶＬ領域に対してＮ末端である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記検出ペプチドが前記シグナルペプチドと前記抗原結合ドメインの間にある、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記シグナルペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
癌分子特異的抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記癌分子がＨｅｒ２を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記癌分子がＣＤ１９またはＣＤ２０を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記抗原結合ドメインが可溶性ＴＧＦ−βに特異的に結合する、請求項２〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項３２に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項３４】
癌特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
前記癌特異的ＣＡＲがＨｅｒ２に特異的に結合する、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記癌特異的ＣＡＲがＣＤ１９またはＣＤ２０に特異的に結合する、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
免疫細胞である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
Ｔ細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
ナチュラルキラー細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４１】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項３８に記載の細胞。
【請求項４２】
エクスビボにある、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４３】
請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の細胞をＴＧＦ−βと接触させることを含む、免疫応答を刺激するための方法。
【請求項４４】
免疫応答を刺激することが、免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子の発現及び／または分泌を増加させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子が、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のうちの１つまたは複数である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
免疫応答を刺激することが、免疫細胞の増殖を増加させることを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞が、免疫刺激を必要とする対象のインビボにある、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＴＧＦ−βが、免疫刺激を必要とする前記対象において産生される内因性ＴＧＦ−βである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヒト対象が、癌、線維症、または開放創を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌が黒色腫である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヒト対象がＢ細胞悪性腫瘍を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヒト対象が固体腫瘍を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞をヒト対象に投与することをさらに含む、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ＴＧＦ−βを前記対象に投与することをさらに含む、請求項４７〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
溶液中でＴＧＦ−βを検出するための方法であって、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の細胞を前記溶液に接触させることと、免疫刺激を測定することとを含み、免疫刺激の増加はＴＧＦ−βが存在することを示し、免疫刺激の増加がないことはＴＧＦ−βが存在しないことを示す、前記方法。
【請求項５７】
免疫刺激が、免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子の発現を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子が、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のうちの１つまたは複数である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫刺激が、免疫細胞の増殖の増加を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞がエクスビボにある、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチドを作製するための方法であって、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドを細胞内で発現させることを含む、前記方法。
【請求項６３】
Ｔ細胞をインビトロで増殖させるための方法であって、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のインビトロのＴ細胞を、ＴＧＦ−βを含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項６４】
前記組成物が１〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記組成物がＩＬ−２をさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記組成物が２０〜４００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞をフィーダー細胞と接触させることをさらに含む、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記フィーダー細胞が放射線照射されている、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｔ細胞とフィーダー細胞との接触が除かれている、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記増殖した制御性Ｔ細胞が、１０％未満の非制御性Ｔ細胞を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
患者における疾患または病的状態を治療するための方法であって、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の細胞を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項７３】
前記細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患が自己免疫疾患である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患が癌である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
インビトロの前記細胞とＴＧＦ−βを含む組成物とを接触させることを含む方法によって前記細胞をインビトロで増殖させることをさらに含む、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物が１〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記組成物がＩＬ−２をさらに含む、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記組成物が２０〜４００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞をフィーダー細胞と接触させることをさらに含む、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記フィーダー細胞が放射線照射されている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記Ｔ細胞とフィーダー細胞との接触が除かれている、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項７６〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記増殖した制御性Ｔ細胞が、１０％未満の非制御性Ｔ細胞を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項７４または請求項７６〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記患者へのＴＧＦ−βの投与をさらに含む、請求項７２〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／２４８，６８５号の優先権の恩典を主張するものである。上記に参照した開示の全内容は、権利放棄することなく参照により本明細書に具体的に援用される。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金第ＣＡ１８３５２８号及び同第ＯＤ０１２１３３号に基づき、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
１．  発明の分野
本発明は、概してバイオテクノロジー及び医学の分野に関するものである。詳細には、本発明は、ＴＧＦ−βの存在下で免疫応答を刺激するのに有用なポリペプチドと、該ポリペプチドを含む細胞とに関するものである。
【背景技術】
【０００４】
２．  背景
ＴＧＦ−βは、固体腫瘍、線維症、及び調節不全創傷を含めた種々の病原状態において、高レベルで見られる多面発現性サイトカインである。固体腫瘍の治療計画では、ＴＧＦ−βを腫瘍微小環境で中和することが対象とされてきた。抗ＴＧＦ−β抗体が多種存在しているが、治療剤としての抗体にはいくつかの欠点がある。例えば、抗体は、他の抗原結合分子と比べて大きい可能性があり、また複数遺伝子によりコードされる多重鎖タンパク質である。これらの両方の側面が、高い生産コストを招いてしまう。また、ＴＧＦ−βを阻害する化学物質が特定されてきたが、肝臓での代謝副産物に起因する毒性の問題を伴う場合が多い。
【０００５】
ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体を発現するＴＧＦ−β非感受性Ｔ細胞を用いた養子Ｔ細胞療法の使用戦略が検討されている。しかしながら、ＴＧＦ−βシグナルの中和だけでは十分ではない恐れがあり、ＴＧＦ−βシグナルを免疫抑制から免疫賦活に反転させることによって、さらに有望な治療戦略がもたらされる可能性がある。
【０００６】
したがって、ＴＧＦ−βの作用を中和し、かつ費用対効果の高い産生といった便益も得られるさらに有効な治療法が、当該技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書に記載のポリペプチドは、細胞内で発現された場合に、ＴＧＦ−βを中和するだけでなく、ＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞活性化を特異的に誘発することもできるポリペプチドを提供することで、当該技術分野のニーズを満たすものである。Ｔ細胞活性化によって免疫細胞が免疫賦活性サイトカインを産生し増殖するよう促され、それによりＴＧＦ−βが免疫抑制性シグナルから活性化刺激となる。したがって、本開示の態様は、シグナルペプチドと、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、該抗原結合ドメインがＴＧＦ−βに特異的に結合する、該ポリペプチドに関する。
【０００８】
一部の態様では、本開示は、シグナルペプチドと、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、該ＶＨ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＨＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＨＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＨＣＤＲ３）とを含み、該ＶＬ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（ＬＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＬＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（ＬＣＤＲ３）とを含む、該ポリペプチドに関する。一部の実施形態では、ＶＨはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含み、ＶＬはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む。
【０００９】
一部の態様では、本開示は、シグナルペプチドと、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、該ＶＨ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（ＨＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ＨＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（ＨＣＤＲ３）とを含み、該ＶＬ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（ＬＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（ＬＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６（ＬＣＤＲ３）とを含む、該ポリペプチドに関する。一部の実施形態では、ＶＨはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含み、ＶＬはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む。
【００１０】
一部の態様では、本開示は、シグナルペプチドと、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を有する抗原結合ドメインと、ペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含むポリペプチドであって、該ＶＨ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１（ＨＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２（ＨＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３（ＨＣＤＲ３）とを含み、該ＶＬ領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４（ＬＣＤＲ１）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（ＬＣＤＲ２）と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（ＬＣＤＲ３）とを含む、該ポリペプチドに関する。一部の実施形態では、ＶＨはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を含み、ＶＬはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含む。
【００１１】
上述した及び本明細書に記載のポリペプチドは、連続した１本鎖のポリペプチドである。
【００１２】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対して特定の割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％、またはその中で得られる任意の範囲）の「配列同一性」または「相同性」を有し、これは、アライメントして、２つの配列を比較した際に、該割合の塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。このアライメント及びパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野で既知のソフトウェアプログラム（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載のプログラムなど）を用いて算出することができる。
【００１３】
本開示のポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列の全てまたは一部に対して、少なくとも、多くとも、または丁度８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性（またはその中で得られる任意の範囲）を有する、領域、ドメイン、リンカー、スペーサーなどを有していてもよい。特定の実施形態では、本開示全体を通して記載されるポリペプチドは単離されており、これは、細胞環境で見出せられるものではないことを意味する。ポリペプチドが精製されている場合もあり、これは、異なるアミノ酸配列及び／または化学式を有するポリペプチドから完全には分離されていない場合には概ね精製されることを意味する。
【００１４】
一部の実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、ペプチドリンカーによって分離されている。ペプチドリンカーは、本開示のポリペプチドにおいて記載された任意のドメイン／領域を分離し得ると考えられる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシン残基とセリン残基のみから構成されるペプチド（グリシン−セリンリンカー）である。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも、多くとも、または丁度４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、もしくは２００個のアミノ酸（またはその中で得られる任意の範囲）である。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは当該技術分野で既知であるか、または本明細書で説明されているものである。
【００１５】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｓ−Ｘ−ＰＬ−Ｙ−ＰＳ−Ｔ−ＥまたはＳ−Ｙ−ＰＬ−Ｘ−ＰＳ−Ｔ−Ｅという構造を有し、Ｓはシグナルペプチドであり、ＸはＶＨであり、ＰＬはペプチドリンカーであり、ＹはＶＬであり、ＰＳはペプチドスペーサーであり、Ｔは膜貫通ドメインであり、及びＥはエンドドメインである。一部の実施形態では、ポリペプチドはＳ−Ｘ−Ｙ−ＰＳ−Ｔ−ＥまたはＳ−Ｙ−Ｘ−ＰＳ−Ｔ−Ｅという構造を有し、Ｓ、Ｘ、Ｙ、ＰＳ、Ｔ、及びＥは上記で定義されている。本明細書でペプチド及びポリペプチドを言及する場合には、配列及び構造は、当該技術分野で標準的な慣例であるＮ末端からＣ末端に向かうものとして記載され解釈される。
【００１６】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、共刺激領域をさらに含む。一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通ドメインとエンドドメインの間にある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも、多くとも、または丁度１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個（またはその中で得られる任意の範囲）の共刺激領域を含む。一部の実施形態では、共刺激領域は当該技術分野で既知であるか、または本明細書で説明されているものである。
【００１７】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、当該技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載の膜貫通ドメインの全てまたは一部である。
【００１８】
一部の実施形態では、エンドドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインもしくはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、またはその両方を含む。一部の実施形態では、エンドドメインは、当該技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載のエンドドメインの全てまたは一部である。一部の実施形態では、エンドドメインはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインである。一部の実施形態では、エンドドメインは、本明細書に記載の適切なエンドドメインのうちの１つまたは複数の部分、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の部分を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジはＩｇＧ分子のヒンジ領域である。一部の実施形態では、ヒンジは当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載のヒンジ領域である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＩｇＧ分子のＣＨ２ＣＨ３領域を含むか、またはさらに含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ロバ、ヤギ、またはウサギ由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、及び／もしくはＣＨ３領域、または他の領域に由来している。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、ＩｇＧ分子のヒンジ領域及びＣＨ２ＣＨ３領域を含む。一部の実施形態では、ＩｇＧ分子のＣＨ２ＣＨ３領域は、Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７ＱまたはＬ２３５Ｄ／Ｎ２９７Ｑの変異をさらに有して、Ｆｃ受容体の結合を妨げている。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーはＩｇＧ分子のヒンジ領域からなる。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、３０個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、または４個未満のアミノ酸である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２２５個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、もしくは７００個のアミノ酸より少ないか、それらより多いか、または丁度それらの値（またはその中で得られる任意の範囲）である。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは５０個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは５０個超のアミノ酸を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ポリペプチドは検出ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、検出ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のペプチドか、ＨＡタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）か、またはｃＭｙｃタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）である。一部の実施形態では、検出ペプチドはリンカーと隣接している。一部の実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載のペプチドリンカー）は検出ペプチドのアミノ部分にある。一部の実施形態では、リンカー（例えば、本明細書に記載のペプチドリンカー）は検出ペプチドのカルボキシ部分にある。一部の実施形態では、リンカーは検出ペプチドのアミノ部分とカルボキシ部分とにある。一部の実施形態では、検出ペプチドはＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ部分にある。一部の実施形態では、検出ペプチドはシグナルペプチドと抗原結合ドメインとの間にある。
【００２１】
一部の実施形態では、シグナルペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは当該技術分野で既知であるか、または本明細書で説明されているものである。
【００２２】
一部の実施形態では、ポリペプチドは癌分子特異的抗原結合ドメインをさらに含む。例えば、ポリペプチドは、二重特異性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよく、該ポリペプチドは、ＴＧＦ−βに対する抗原結合ドメインと、癌分子または癌抗原に対する抗原結合ドメインとを含む。これらの抗原結合ドメインは、ペプチドスペーサーまたはリンカーで分離されていてもよい。一部の実施形態では、癌分子はＨｅｒ２を含む。一部の実施形態では、癌分子はＣＤ１９またはＣＤ２０を含む。一部の実施形態では、癌分子または癌抗原は当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載のものである。
【００２３】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは可溶性ＴＧＦ−βに特異的に結合する。本開示のポリペプチドと類似のポリペプチドが、可溶性抗原に結合し、可溶性抗原に応答してシグナルを伝達できることは、これまで知られていなかったことである。
【００２４】
本明細書に記載のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９５のうちの少なくともまたは多くとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１３１個、１３２個、１３３個、１３４個、１３５個、１３６個、１３７個、１３８個、１３９個、１４０個、１４１個、１４２個、１４３個、１４４個、１４５個、１４６個、１４７個、１４８個、１４９個、１５０個、１５１個、１５２個、１５３個、１５４個、１５５個、１５６個、１５７個、１５８個、１５９個、１６０個、１６１個、１６２個、１６３個、１６４個、１６５個、１６６個、１６７個、１６８個、１６９個、１７０個、１７１個、１７２個、１７３個、１７４個、１７５個、１７６個、１７７個、１７８個、１７９個、１８０個、１８１個、１８２個、１８３個、１８４個、１８５個、１８６個、１８７個、１８８個、１８９個、１９０個、１９１個、１９２個、１９３個、１９４個、１９５個、１９６個、１９７個、１９８個、１９９個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２１個、２２２個、２２３個、２２４個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、３００個、４００個、５００個、５５０個、１０００個、もしくはそれ以上の連続アミノ酸内に、またはその中で得られる任意の範囲内に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３��個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、またはそれ以上の変異型アミノ酸を含んでもよい。
【００２５】
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸に関する。一部の態様では、本開示は本明細書に記載の１つまたは複数のポリペプチドを含む細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は癌特異的ＣＡＲをさらに含む。一部の実施形態では、癌特異的ＣＡＲはＴＧＦ−β  ＣＡＲとは異なるポリペプチドである。一部の実施形態では、癌特異的ＣＡＲはＨｅｒ２に特異的に結合する。一部の実施形態では、癌特異的ＣＡＲはＣＤ１９またはＣＤ２０に特異的に結合する。一部の実施形態では、癌特異的ＣＡＲは、当該技術分野で既知の及び／または本明細書に記載の癌分子または抗原に特異的に結合する。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、細胞は前駆細胞または幹細胞である。一部の実施形態では、前駆細胞または幹細胞は、インビトロで免疫細胞へ分化される。一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞はナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、細胞はエクスビボにある。免疫細胞という用語は、感染症及び異物の両方に対して身体を防御することに関与する免疫系の細胞を含む。免疫細胞として、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞などのリンパ球、ならびに単球が挙げられ得る。Ｔ細胞には、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞、制御性Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞、及びナチュラルキラーＴ細胞が含まれ得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞である。
【００２６】
本開示のさらなる態様は、本開示の細胞（すなわち、本明細書に記載の抗原結合ポリペプチドを含む細胞）をＴＧＦ−βと接触させることを含む、免疫応答を刺激する方法に関する。一部の実施形態では、免疫応答を刺激することは、免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子の発現及び／または分泌を増加させることを含む。一部の実施形態では、サイトカイン及び／または分子は、炎症性サイトカインまたは炎症性分子である。一部の実施形態では、免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、免疫応答を刺激することは、免疫細胞の増殖を増加させることを含む。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βは、免疫刺激を必要とするヒト対象において産生される内因性ＴＧＦ−βである。一部の実施形態では、ヒト対象は、癌、線維症、または開放創を有する。一部の実施形態では、ヒト対象は、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する。一部の実施形態では、ヒト対象は固体腫瘍を有する。固体腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常含まない、組織の異常腫瘤である。固体腫瘍は、良性（癌ではない）であっても、悪性（癌）であってもよい。固体腫瘍の各々の種類は、固体腫瘍を形成する細胞の種類に基づいて命名されている。固体腫瘍の例は、肉腫、癌腫、及びリンパ腫である。一部の実施形態では、方法はある徴候を持つ人を治療するためのものであり、該徴候はＴＧＦ−β発現の病原性レベルにより特徴付けられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及びポリペプチドは、症状の病因が少なくとも部分的にＴＧＦ−βの発現に基づく、癌、調節不全創傷、線維症、開放創、固体腫瘍などを治療するのに使用され得る。一部の実施形態では、細胞（すなわち、抗原結合ポリペプチドを含む本開示の細胞）は、免疫刺激を必要とするヒト対象内にある。一部の実施形態では、方法は、本開示のポリペプチドまたは核酸を含む本明細書に記載の細胞を、ヒト対象に投与することをさらに含む。
【００２７】
さらなる方法の態様は、本開示の細胞を接触させること及び免疫刺激を測定することを含む、溶液中でＴＧＦ−βを検出するための方法に関し、ここで、免疫刺激の増加はＴＧＦ−βが存在することを示し、免疫刺激の増加がないことはＴＧＦ−βが存在しないことを示す。一部の実施形態では、免疫刺激は、免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子の発現を含む。一部の実施形態では、免疫刺激サイトカイン及び／または免疫刺激分子は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態では、免疫刺激は、免疫細胞の増殖の増加を含む。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞はエクスビボにある。
【００２８】
本明細書に記載の発現または増殖の増加は、対照（無病の対照、非ＴＧＦ−βの対照または非抗原結合ポリペプチドの対照）などのベースライン発現レベルに対して、少なくとも、多くとも、または丁度１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、または１０００倍の増加であり得る。
【００２９】
本開示のさらなる態様は、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチドを細胞内で発現させることを含む、該ポリペプチドを作製するための方法に関する。さらなる態様は、本明細書に記載のポリペプチドを含む、培養細胞、凍結細胞、懸濁細胞、または接着細胞に関する。
【００３０】
本開示の態様は、本開示の細胞を患者に投与することを含む、疾患または病的状態を治療するための方法に関する。一部の実施形態では、患者はヒトの患者である。
【００３１】
一部の実施形態では、細胞は、制御性Ｔ細胞（すなわち、本明細書に記載のＴＧＦ−β結合ポリペプチドを含む制御性Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、疾患は自己免疫疾患である。一部の実施形態では、自己免疫疾患は関節リウマチである。一部の実施形態では、自己免疫疾患は本明細書に記載のものである。
【００３２】
方法態様のうちの一部の実施形態では、方法は、ＴＧＦ−βを対象に投与することをさらに含む。
【００３３】
一部の態様では、方法は、インビトロでＴ細胞を増殖させる及び／またはＴ細胞の増殖を誘導することを含むかまたはさらに含み、該方法は、本開示のインビトロのＴ細胞を、ＴＧＦ−βを含む組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は制御性細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は本明細書に記載のＴ細胞である。一部の実施形態では、増殖した制御性Ｔ細胞は、１０％未満の非制御性Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、増殖した制御性Ｔ細胞は、０．５％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１４％未満、１６％未満、１８％未満、２０％未満、２２％未満、２４％未満、２６％未満、２８％未満、３０％未満、３２％未満、３４％未満、３６％未満、３８％未満、４０％未満、４２％未満、４４％未満、４６％未満、４８％未満、もしくは５０％未満、またはその中で得られる任意の範囲を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、組成物は１〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも、多くとも、または約０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３．５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、４．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、５．５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、６．５ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、７．５ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、８．５ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、３５ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、４５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、６５ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、８５ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、９５ｎｇ／ｍＬ、もしくは１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β（またはその中で得られる任意の範囲）を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、組成物はＩＬ−２をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は２０〜４００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも、多くとも、または約５Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、１５Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、２５Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、３５Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、４５Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、５５Ｕ／ｍＬ、６０Ｕ／ｍＬ、６５Ｕ／ｍＬ、７０Ｕ／ｍＬ、７５Ｕ／ｍＬ、８０Ｕ／ｍＬ、８５Ｕ／ｍＬ、９０Ｕ／ｍＬ、９５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、１０５Ｕ／ｍＬ、１１０Ｕ／ｍＬ、１１５Ｕ／ｍＬ、１２０Ｕ／ｍＬ、１２５Ｕ／ｍＬ、１３０Ｕ／ｍＬ、１３５Ｕ／ｍＬ、１４０Ｕ／ｍＬ、１４５Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、１５５Ｕ／ｍＬ、１６０Ｕ／ｍＬ、１６５Ｕ／ｍＬ、１７０Ｕ／ｍＬ、１７５Ｕ／ｍＬ、１８０Ｕ／ｍＬ、１８５Ｕ／ｍＬ、１９０Ｕ／ｍＬ、１９５Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、２０５Ｕ／ｍＬ、２１０Ｕ／ｍＬ、２１５Ｕ／ｍＬ、２２０Ｕ／ｍＬ、２２５Ｕ／ｍＬ、２３０Ｕ／ｍＬ、２３５Ｕ／ｍＬ、２４０Ｕ／ｍＬ、２４５Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、２５５Ｕ／ｍＬ、２６０Ｕ／ｍＬ、２６５Ｕ／ｍＬ、２７０Ｕ／ｍＬ、２７５Ｕ／ｍＬ、２８０Ｕ／ｍＬ、２８５Ｕ／ｍＬ、２９０Ｕ／ｍＬ、２９５Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、３０５Ｕ／ｍＬ、３１０Ｕ／ｍＬ、３１５Ｕ／ｍＬ、３２０Ｕ／ｍＬ、３２５Ｕ／ｍＬ、３３０Ｕ／ｍＬ、３３５Ｕ／ｍＬ、３４０Ｕ／ｍＬ、３４５Ｕ／ｍＬ、３５０Ｕ／ｍＬ、３５５Ｕ／ｍＬ、３６０Ｕ／ｍＬ、３６５Ｕ／ｍＬ、３７０Ｕ／ｍＬ、３７５Ｕ／ｍＬ、３８０Ｕ／ｍＬ、３８５Ｕ／ｍＬ、３９０Ｕ／ｍＬ、３９５Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、４０５Ｕ／ｍＬ、４１０Ｕ／ｍＬ、４１５Ｕ／ｍＬ、４２０Ｕ／ｍＬ、４２５Ｕ／ｍＬ、４３０Ｕ／ｍＬ、４３５Ｕ／ｍＬ、４４０Ｕ／ｍＬ、４４５Ｕ／ｍＬ、４５０Ｕ／ｍＬ、４５５Ｕ／ｍＬ、４６０Ｕ／ｍＬ、４６５Ｕ／ｍＬ、４７０Ｕ／ｍＬ、４７５Ｕ／ｍＬ、４８０Ｕ／ｍＬ、４８５Ｕ／ｍＬ、４９０Ｕ／ｍＬ、４９５Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、５０５Ｕ／ｍＬ、５１０Ｕ／ｍＬ、５１５Ｕ／ｍＬ、５２０Ｕ／ｍＬ、５２５Ｕ／ｍＬ、５３０Ｕ／ｍＬ、５３５Ｕ／ｍＬ、５４０Ｕ／ｍＬ、５４５Ｕ／ｍＬ、５５０Ｕ／ｍＬ、５５５Ｕ／ｍＬ、５６０Ｕ／ｍＬ、５６５Ｕ／ｍＬ、５７０Ｕ／ｍＬ、５７５Ｕ／ｍＬ、５８０Ｕ／ｍＬ、５８５Ｕ／ｍＬ、５９０Ｕ／ｍＬ、５９５Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（またはその中で得られる任意の範囲）を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、方法は、細胞をフィーダー細胞と接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、フィーダー細胞は放射線照射されている。フィーダー細胞または支持細胞には、例えば、線維芽細胞、マウス胎仔線維芽細胞、ＪＫ１細胞、ＳＮＬ７６／７細胞、ヒト胎児皮膚細胞、ヒト線維芽細胞、及びヒト包皮線維芽細胞が含まれ得る。
【００３７】
一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞をフィーダー細胞と接触させることが除かれている。除外されるフィーダー細胞は、該Ｔ細胞とは異なる動物種由来である場合がある。
【００３８】
本明細書に記載の方法のうちの一実施形態では、対象はヒト対象である。「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で交換可能に用いられ、以下に限定されないが、ネズミ（例えば、ラット、マウス）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含めた哺乳類を意味する。
【００３９】
本発明についてさらに説明する前に理解されるべきことは、本発明は、記載される特定の実施形態に制限されるものではなく、したがって当然に変わり得るということである。また理解されるべきことは、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためのものであり、制限を意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるということである。
【００４０】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間にある各中間の値（文脈で明らかに示されない限り、下限の１０分の１の単位まで）と、その明記された範囲における任意の他の明記された値または中間の値とは、本発明の範囲内に包含されることを理解すべきである。こうした狭い範囲の上限及び下限は、狭い範囲内に独立して含まれていてもよく、本発明の範囲内に包含されるが、明記された範囲内で具体的に除外された任意の制限を受ける。明記された範囲がこれらの限界値の一方または両方を含む場合、含まれた限界値の一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００４１】
本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲の範囲内にある種々の変更及び改変がこの詳細な記載から当業者に明らかになる以上、詳細な記載及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しつつ説明目的のみで提供されることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
以下の図面は本明細書の一部を形成するものであり、本発明の特定の態様をさらに明らかにするために含まれている。本明細書で提示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによって、本発明をさらによく理解することができる。
【００４３】
【図１】ＴＧＦ−β  ｓｃＦｖがヒトＴＧＦ−βを中和することを示す。ＴＧＦ−βと抗ＴＧＦ−β  ｓｃＦｖの指定された量をＨｅｐＧ２細胞の培養液に３０分間加えた。ＴＧＦ−βの中和を、ウエスタンブロットで検出されたリン酸化ＳＭＡＤ２応答の減少により示している。
【図２】ＴＧＦ−β  ＣＡＲが細胞表面上で発現していることを示す。ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、ｓｃＦｖ＃２を用いて作製した。表面染色とフローサイトメトリーとにより、ＴＧＦ−β  ＣＡＲはＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面に現れていることがわかる。受容体の細胞外ドメインは、ＦＬＡＧエピトープを含んでいる。ＥＧＦＲｔは、切断型上皮増殖因子受容体であり、これは細胞の形質導入を示すものである。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＴＧＦ−β  ＣＡＲが、（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞及び（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞において、内因性ＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断することを示す。Ｔ細胞におけるＴＧＦ−β  ＣＡＲの発現により、ＳＭＡＤ経路を介したＴＧＦ−βシグナル伝達が遮断される。指定された受容体を発現するＴ細胞を、ＴＧＦ−βと共に３０分間インキュベートし、リン酸化ＳＭＡＤ２に対してウエスタンブロットによりプローブした。ｓｃＦｖなしは、いかなるリガンド（抗原）結合ｓｃＦｖドメインも持たないＣＡＲを表し、ＥＧＦＲｔはここの他の成分とは無関係の切断型上皮増殖因子受容体を表す。
【図４】（Ａ）ＴＧＦ−β  ＣＡＲとＮＦＡＴレポーター（ＮＦＡＴ誘導性プロモーターから発現したＥＧＦＰ）とを安定して発現するジャーカット細胞では、ＴＧＦ−β濃度の増加に応じて活性化の増大が見られる。（Ｂ、Ｃ）ＴＧＦ−β  ＣＡＲを安定して発現する初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞では、（Ｂ）ＣＤ６９発現と（Ｃ）Ｔｈ１サイトカイン産生とが、ＴＧＦ−β刺激に応じて上方制御される。ＣＤ６９の上方制御を、ＴＧＦ−βを伴うかまたは伴わずに１日インキュベーションをした後、表面染色によりモニタリングした。ＴＧＦ−βを伴うかまたは伴わずに１日インキュベーションをした後に、タンパク質輸送阻害剤のブレフェルジンＡを適用し、細胞内染色を行うことによって、サイトカインの産生を検出した。「モック」は、無関係の構築物で形質導入されたＴ細胞を表す。「ｓｃＦｖなし」は、ｓｃＦｖドメインを持たないことからＴＧＦ−βに結合できないということを除いてＴＧＦ−β  ＣＡＲと同一であるＣＡＲを発現するＴ細胞を表す。「ＤＮＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体であり、これは、細胞質シグナル伝達ドメインを持たない切断型ＴＧＦ−β受容体鎖２である。提示された値は、±１標準偏差（ｓ．ｔ．ｄ．）を示すエラーバー付きの３つ組の平均値である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊  ＊ｐ≦０．０００５。
【図５】ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体がサイトカインの産生を誘発することができないことを示す。ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体もＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することが報告されているが、ＴＮＦ−αの産生などの免疫賦活性作用を誘発するものではない。Ｔβ短及びＴβ長は２種類の異なるＴＧＦ−β  ＣＡＲであり、Ｄｏｍ−ＮｅｇはドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体を表し、ｓｃＦｖなしは、いかなるリガンド結合ｓｃＦｖドメインも持たないＣＡＲを表す。Ｔβ短は、ＩｇＧ４ヒンジ領域のみからなるペプチドスペーサーを有するＴＧＦ−β  ＣＡＲポリペプチドを表す。Ｔβ長は、ＩｇＧ４ヒンジ領域とＣＨ２ＣＨ３領域とを含むペプチドスペーサーを有するＴＧＦ−β  ＣＡＲポリペプチドを表す。
【図６】ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔ細胞がＴＧＦ−βに応じて増殖することを示す。
【図７】マウスＴＧＦ−β／ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害を示す。ｓｃＦｖ及びマウスＴＧＦ−β１の指定された量をＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞に３０分間作用させた。細胞を溶解し、ＳＭＡＤ２リン酸化に対してプローブした。
【図８】ＴＧＦ−β  ＣＡＲとＮＦＡＴレポーター（ＮＦＡＴ誘導性プロモーターから発現したＥＧＦＰ）とを安定して発現するジャーカット細胞では、マウスＴＧＦ−β１の投入量の増加に応じて活性化の増大が見られており、これは、ヒトＴＧＦ−βを認識するように操作されたＴＧＦ−β  ＣＡＲがマウスＴＧＦ−βとも交差反応することを示す。
【図９】ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体に比べて、より高効率に細胞表面に現れる。
【図１０】ＴＧＦ−β  ＣＡＲの機能は共刺激ドメインの選択によって調整され得る。
【図１１】ＴＧＦ−βは、種々のドナー由来の細胞全体にわたって、用量依存的にＴＮＦ−αの産生を一貫して誘発する。
【図１２】ＴＧＦ−β  ＣＡＲのペプチドスペーサー長は誘発閾値を調節している。
【図１３】ＣＡＲシグナル伝達にはリガンド媒介性のＣＡＲの二量体化が必要であるが、リガンドまたはＣＡＲ自体が二量体として予め存在している必要はない。指定されたＣＡＲを保有するジャーカット細胞株でＣＤ６９表面染色を行った。ＧＦＰ  ＣＡＲ＃１及びＧＦＰ  ＣＡＲ＃３の両方は主にホモ二量体として存在しており、これら２種のＣＡＲはＥＧＦＰ上の異なるエピトープに結合し、単量体のＥＧＦＰ分子に同時に結合することができる。ＧＦＰ  ＣＡＲ＃１及びＧＦＰ  ＣＡＲ＃２は、ＥＧＦＰ上の同じエピトープに結合するが、ＣＡＲ＃２はホモ二量体ではなく単量体として存在している。
【図１４】可溶性二量体抗原分子は、異なる細胞上の受容体を連結することによってシグナル伝達を誘発することができる。
【図１５】ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、細胞間接触依存的方法及び非依存的方法で誘発され得る。
【図１６】ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞間接触がない場合でも活性化され得る。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
例示的実施形態の説明
本明細書に記載のポリペプチド、細胞、及び方法を用いて、ＴＧＦ−βを中和し、かつＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞活性化を特異的に誘発することができる。
【００４５】
Ｉ．  定義
本開示のペプチドは、ＣＡＲすなわちキメラ抗原受容体を含むペプチドに関連する。ＣＡＲは操作された受容体であり、任意の特異性を免疫エフェクター細胞に付与する。これらの受容体を使用して、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するのが一般的である。この受容体はキメラと称されるが、これは受容体が異なる供給源由来の部分から構成されているからである。
【００４６】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、遺伝子産物に言及する場合に本明細書で交換可能に用いられる。
【００４７】
「相同性」、「同一性」、または「類似性」は、２つのペプチドまたは２つの核酸分子の間の配列類似度を表す。同一性は、比較の目的でアライメントされ得る各配列のある位置を比較することによって算出することができる。比較された配列におけるある位置が同一の塩基またはアミノ酸で占有されている場合に、分子はその位置で配列同一性を共有していることになる。配列間の同一性の度合いは、配列により共有される一致するまたは相同性のある位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同性の」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性または２５％未満の同一性を共有するものである。
【００４８】
「アミノ部分」、「Ｎ末端」、「アミノ末端」などという用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの領域の順序を言及するのに使用される。さらに、ある領域に対してＮ末端である場合、必ずしも全体のポリペプチドの末端（または端部）にあるとは限らず、単に該領域またはドメインの末端にあるということである。同様に、「カルボキシ部分」、「Ｃ末端」、「カルボキシ末端」などという用語は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドの領域の順序を言及するのに使用され、ある領域に対してＣ末端である場合、必ずしも全体のポリペプチドの末端（または端部）にあるとは限らず、単に該領域またはドメインの末端にあるということである。
【００４９】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体）の重合体型に言及するものである。ポリヌクレオチドは任意の３次元構造を有し、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、またはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及び核酸プライマーがある。ポリヌクレオチドには、修飾ヌクレオチド（メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体など）が含まれ得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリ前またはアセンブリ後に施され得る。ヌクレオチドの配列に、非ヌクレオチド成分が割り込む場合がある。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識成分とコンジュゲートすることにより、さらに修飾され得る。また、該用語は２本鎖分子及び１本鎖分子の両方を意味している。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態には、２本鎖形態と、２本鎖形態を構成するとわかっているかまたは予測されている２つの相補的な１本鎖形態の各々とが包含される。
【００５０】
「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、本明細書で交換可能に用いられ、脊椎動物、例えば、霊長類、哺乳類、または好ましくはヒトを意味する。哺乳類として、以下に限定されないが、ウマ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、競技用動物、及びペットが挙げられる。
【００５１】
「ゼノフリー（ＸＦ）」、「動物成分フリー（ＡＣＦ）」または「動物フリー」という用語は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して用いられる場合、異種動物由来成分を本質的に含まない培地、細胞外マトリックス、または培養条件を意味する。ヒト細胞を培養する場合には、マウスなどの非ヒト動物由来のいかなるタンパク質も異種成分となるはずである。特定の態様では、ゼノフリーマトリックスは、本質的にいかなる非ヒト動物由来成分をも含まず、それ故にマウスフィーダー細胞またはマトリゲル（商標）を除外している。マトリゲル（商標）は、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）マウス肉腫から抽出された可溶性基底膜調製物であり、該肉腫は、細胞外マトリックスタンパク質に富む腫瘍であり、ラミニン（主要成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチン／ナイドジェンを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物または本開示の細胞は、ゼノフリー培地、または動物成分フリー培地、または動物フリー培地で培養されかつ／または調製される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、細胞が、特定の試薬または要素、例えば血清、シグナル伝達阻害剤、動物成分もしくはフィーダー細胞、外来性遺伝要素、またはベクター要素を「実質的に含まない」のは、その要素の１０％未満を有する場合であり、特定の試薬または要素を「本質的に含まない」のは、その要素の１％未満を有する場合である。しかしながら、細胞集団全体の０．５％未満または０．１％未満が外来性遺伝要素またはベクター要素を含む細胞集団がさらに望ましい。
【００５３】
培養液、マトリックス、または培地が特定の試薬または要素（血清、シグナル伝達阻害剤、動物成分もしくはフィーダー細胞）を「実質的に含まない」のは、培養液、マトリックス、または培地に含まれるこれらの試薬のレベルがそれぞれ、当業者に既知の従来の検出方法を用いて検出可能なレベル未満である場合か、またはこれらの試薬が培養液、マトリックス、または培地に外部から添加されていない場合である。無血清培地は、血清を本質的に含んでいなくてもよい。
【００５４】
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適正な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボにて転写され、また任意選択的に遺伝子産物（例えばポリペプチド）に翻訳される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ形態、ゲノムＤＮＡ形態、またはＲＮＡ形態のいずれかで存在し得る。核酸分子がＤＮＡ形態で存在する場合、核酸分子は１本鎖（すなわち、センス鎖）または２本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンと３’（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンとによって確定される。遺伝子として、以下に限定されないが、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物ＤＮＡまたは真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列が挙げられ得る。転写終結配列は、通例、遺伝子配列の３’側に配置されることになる。
【００５５】
用語「細胞」は、本明細書では当該技術分野における広い意味で用いられ、ある生体を意味するが、この生体は、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部から隔離する膜構造によって囲われており、自己複製することができ、遺伝情報とそれを発現する機序とを有するものである。本明細書で用いられる細胞は、天然に存在する細胞であるか、または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変された細胞など）であり得る。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、自己複製することができ、かつ多能性または多分化能を持つ細胞を意味する。典型的には、幹細胞は傷害組織を再生させることができる。本明細書における幹細胞は、以下に限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞、または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも称される）であり得る。
【００５７】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期胚由来の多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以来ノックアウトマウスの作製にも適用されてきた。１９９８年に、ヒトＥＳ細胞が樹立され、現在では再生医療に利用できるようになっている。
【００５８】
組織幹細胞は、ＥＳ細胞とは異なり、限られた分化能を有する。組織幹細胞は組織の特定の場所に存在し、未分化型の細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は低いのが一般的である。組織幹細胞では、核／細胞質比が高く、細胞内オルガネラが少ない。組織幹細胞の多くは、低い多能性、長い細胞周期、及び個体の一生以上の増殖力を有する。組織幹細胞は、その細胞が由来する部位に基づいて、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分類される。皮膚系の組織幹細胞には、表皮幹細胞及び毛包幹細胞などが含まれる。消化器系の組織幹細胞には、膵臓（共通）幹細胞及び肝幹細胞などが含まれる。骨髄系の組織幹細胞には、造血幹細胞及び間葉系幹細胞などが含まれる。神経系の組織幹細胞には、神経幹細胞及び網膜幹細胞などが含まれる。
【００５９】
「人工多能性幹細胞」は通例ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略記され、非多能性細胞、一般的には成体体細胞または最終分化細胞（線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、または表皮細胞など）から、再プログラム化因子と称される特定の因子を導入することによって人工的に調製された多能性幹細胞の種類を表す。
【００６０】
「多能性」は、１つ以上の組織もしくは器官を構成するか、または特に３つの胚葉である内胚葉（胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織及び神経系）のうちのいずれかを構成する全ての細胞に分化する可能性を有する幹細胞を意味する。本明細書で用いられる「多能性幹細胞」は、３つの胚葉（例えば、全能細胞または人工多能性細胞の直系子孫）のいずれかに由来する細胞に分化することができる細胞を意味する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「治療」及び「治療する」といった用語は、所望の薬理学的作用及び／または生理学的作用を得ることを意味する。該作用は、疾患もしくは疾患の症候を完全にもしくは部分的に防ぐという点から予防的であってもよく、ならびに／または疾患及び／もしくは該疾患に起因する有害作用を部分的もしくは完全に治癒するという点から治療的であってもよい。本明細書で使用される場合、「治療」は哺乳類（例えば、ヒト）における疾患の任意の治療を含み、「治療」には、（ａ）疾患に感染する可能性があるが疾患に罹患しているとまだ診断されていない対象に該疾患が生じるのを防ぐこと、（ｂ）該疾患を阻害する、すなわちその発症を阻止すること、及び（ｃ）該疾患を緩和する、すなわち、疾患の退行をもたらすことが含まれる。
【００６２】
一部の実施形態では、方法は、固体腫瘍のサイズ及び／または細胞数を減じるのに有用である。一部の実施形態では、本開示の方法は、対象における固体腫瘍などの腫瘍の増殖を阻害するのに有用である。
【００６３】
用語「抗原」は、それに対して免疫系に抗体を産生させるか、またはそれに対してＴ細胞が応答する任意の物質を意味する。一部の実施形態では、抗原は、長さが５個〜５０個のアミノ酸であるペプチドか、または少なくとも、多くとも、もしくは丁度５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２５０個、もしくは３００個のアミノ酸、もしくはその中で得られる任意の範囲である。
【００６４】
用語「抗体」には、ヒト、マウス、ヒト化、キメラに属するかまたは別の種由来であり得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異性抗体、及び抗体断片が含まれる。「モノクローナル抗体」は、ある特異的抗原部位に対する実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である。
【００６５】
「抗体またはその機能性断片は、特定の抗原またはエピトープに特異的に結合するか、またはそれと免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とを含む。抗体という用語には、遺伝子組換えされたか、または改変された免疫グロブリンの形態、例えば、細胞内抗体、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ）が含まれる。機能性抗体断片という用語は、抗体の抗原結合断片を含み、例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、ｒｌｇＧ断片、及びｓｃＦｖ断片を含む。ｓｃＦｖという用語は、慣例的な２本鎖抗体のうちの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとが結合して１本鎖を形成している、１本鎖Ｆｖ抗体を意味する。
【００６６】
１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の使用には特に関心が持たれている。ｓｃＦｖは組換え分子であり、抗原結合ドメインをコードする免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域が１本鎖ポリペプチドに改変されている。通例、ＶＨ配列とＶＬ配列とがリンカー配列により結合されている。例えば、Ａｈｍａｄ（２０１２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９８０２５０を参照されたく、この文献は参照により本明細書に具体的に援用される。
【００６７】
「治療有効量」または「有効量」は、疾患を治療するために哺乳類または他の対象に投与した場合に、該疾患のかかる治療に影響を及ぼすのに十分な作用剤の量または２つの作用剤を合わせた量を意味する。「治療有効量」は、作用剤、疾患及びその重症度、ならびに治療を受ける対象の年齢、体重などによって異なることになる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味してもよい。本明細書の特許請求の範囲にて使用される単語「ａ」または「ａｎ」は、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、１つであるかまたは２つ以上を意味してもよい。
【００６９】
特許請求の範囲における用語「または」は、単に代替物を指すか、またはその代替物が互いに排反することを明確に示していない限り、「及び／または」を意味するのに使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／または」を意味する定義を支持している。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上のものを意味してもよい。
【００７０】
本出願の全体を通して、用語「約」は、ある値が、該値を決定するのに用いられる装置、方法に関する誤差の固有の変動、または試験対象間に存在する変動を含むことを示すのに使用される。
【００７１】
ＩＩ．  ポリペプチド
Ａ．  シグナルペプチド
「シグナルペプチド」は、例えば特定の細胞小器官（小胞体など）及び／または細胞表面などへの細胞内タンパク質の輸送及び局在化を指示するペプチド配列を意味する。シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体内に導く。これは、受容体がグリコシル化され、細胞膜に固定されるべき場合には、必要不可欠である。天然でアミノ末端部分に結合されていることの多いシグナルペプチドを使用する（例えば、軽鎖−リンカー−重鎖という順のｓｃＦｖにおいては、軽鎖の天然シグナルペプチドを使用する）のが一般的である。一部の実施形態では、シグナルペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８である。
【００７２】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）を通過した後に切断されるものであり、すなわち切断可能シグナルペプチドである。一部の実施形態では、制限酵素部位がシグナルペプチドのカルボキシ末端にあり、切断を促す。
【００７３】
Ｂ．  抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、ＴＧＦ−β抗体を基にした１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「１本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」の抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを含み、これらのドメインは１本鎖ポリペプチド内にある。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにしている。
【００７４】
本開示のポリペプチドの抗原結合ドメインの可変領域は、ＶＨ及び／またはＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及び／またはＣＤＲ３領域内で、アミノ酸残基を変異させることによって修飾されて、抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善することができる。用語「ＣＤＲ」は相補性決定領域を意味し、相補性決定領域は、Ｂ細胞及びＴ細胞によりそれぞれ産生される免疫グロブリン（抗体）及びＴ細胞受容体の可変鎖の一部分に基づいており、これらの分子が特異的な抗原に結合する。ＣＤＲでは免疫グロブリン及びＴ細胞受容体に関連する多くの配列多様性が見られ、これらの領域が超可変領域と称される場合もある。変異が部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発によって導入される場合があり、それが抗体結合にまたは他の対象となる機能特性に及ぼす影響を、適正なインビトロアッセイまたはインビボアッセイで評価することができる。好ましい保存的修飾が導入され、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基が変えられるのが典型的である。変異は、アミノ酸の置換、追加、または欠失であり得る。
【００７５】
フレームワーク修飾を抗体に施して、例えば、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」させることによって、免疫原性を低減することができる。
【００７６】
抗原結合ドメインはまた、該抗原結合ドメインを、同一の抗原（多価）または異なる抗原（多特異性）と結合するＶＨ及びＶＬ領域対と多量体化させることによって、多特異性または多価になり得ると考えられる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、２つの作用物質の可逆的結合の平衡定数を意味し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列の抗体の親和性よりも、少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、もしくは少なくとも１０００倍大きい、またはそれ以上（またはその中で得られる任意の範囲）のものであり得る。本明細書で使用される場合、用語「結合活性」は、希釈後における２つ以上の作用物質の複合物の解離に対する抵抗を意味する。「免疫反応性」及び「優先的に結合する」という用語は、抗体及び／または抗原結合断片に関して本明細書で交換可能に用いられる。
【００７８】
用語「結合」は、例えば、共有結合、静電結合、疎水結合、及びイオン結合、ならびに／または水素結合の相互作用（例えば塩橋及び水架橋などの相互作用を含む）による２つの分子間の直接会合を意味する。
【００７９】
Ｃ．  ペプチドスペーサー
スペーサー領域は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインにつなげるものである。この領域は、抗原結合ドメインを、抗原認識を促すべく様々な方向に指向させるのに十分な可撓性を有するべきである。最も基本的な形態は、ＩｇＧ由来のヒンジ領域である。その他には、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域及びＣＤ３の一部が挙げられる。一部の実施形態では、ＣＨ２ＣＨ３領域は、Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ修飾もしくはＬ２３５Ｄ／Ｎ２９７Ｑ修飾を有してもよく、または少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％のＣＨ２ＣＨ３領域のアミノ酸配列同一性を有してもよい。ほとんどのｓｃＦｖ型構築物にはＩｇＧヒンジで十分である。しかしながら、最良のスペーサーを経験的に決定しなければならない場合が多い。一部の実施形態では、スペーサーはＩｇＧ４由来である。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ」は、隣接するポリペプチド領域に構造上の可撓性と間隔とを付与する可撓性ポリペプチドコネクタ領域（「ヒンジ領域」または「スペーサー」とも称される）を意味し、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドからなることができる。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）由来の「ヒンジ」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの区間として定義されるのが一般的である（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１６１−２０６）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、最初と最後のシステイン残基を同一位置で重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成するように配置することによって、ＩｇＧ１配列と整合させることができる。ヒンジ領域は、自然発生的なものであっても非自然発生的なものであってもよく、以下に限定されないが、米国特許第５，６７７，４２５号に記載の改変ヒンジ領域を含む。ヒンジ領域には、ＣＨ１ドメインのクラスまたはサブクラスとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来した完全ヒンジ領域が含まれ得る。用語「ヒンジ」にはまた、ＣＤ８に由来した領域、及び隣接する領域に可撓性と間隔とを付与するのに同様の機能をもたらす他の受容体に由来した領域も含まれ得る。
【００８１】
ペプチドスペーサーは、少なくとも、多くとも、または丁度４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３２５個、３５０個、または４００個のアミノ酸（またはその中で得られる任意の範囲）の長さを有し得る。一部の実施形態では、ペプチドスペーサーは、免疫グロブリン由来のヒンジ領域からなるか、またはそれを含む。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６２；及びＨｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．を参照されたい。
【００８２】
ペプチドスペーサーの長さは、ＴＧＦ−βへの応答及び／または増殖特性に影響を与え得る。一部の実施形態では、５０個未満、４５個未満、４０個未満、３０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、または１０個未満のアミノ酸などの短いスペーサーは、効果的な活性化応答に要するＴＧＦ−βの濃度を減少させるという利点を持ち得る。一部の実施形態では、少なくとも５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、２００個、２０１個、２０２個、２０３個、２０４個、２０５個、２０６個、２０７個、２０８個、２０９個、２１０個、２１１個、２１２個、２１３個、２１４個、２１５個、２１６個、２１７個、２１８個、２１９個、２２０個、２２５個、２２６個、２２７個、２２８個、２２９個、２３０個、２３１個、２３２個、２３３個、２３４個、２３５個、２３６個、２３７個、２３８個、２３９個、２４０個、２４１個、２４２個、２４３個、２４４個、２４５個、２４６個、２４７個、２４８個、２４９個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、または２９０個のアミノ酸のスペーサーなどの長いスペーサーは、インビボまたはインビトロで増殖を増加させるという利点を持ち得る。
【００８３】
非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域には、以下のアミノ酸配列のうちの１つが含まれ得る：
2019500012.tif 000002
一部の実施形態では、ヒンジはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９である。一部の実施形態では、ヒンジはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９である。
【００８４】
ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。ヒンジ領域には、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して１つ以上のアミノ酸置換及び／または挿入及び／または欠失を含み得る。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９はＴｙｒに置換される可能性があり、その結果、ヒンジ領域は配列
2019500012.tif 000003
を含むようになる。
【００８５】
ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８由来のアミノ酸配列を含むことができ、例えば、ヒンジ領域は以下のアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000004
またはその変異体。
【００８６】
Ｄ．  膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性アルファヘリックスである。通例、エンドドメインの最も膜近位の構成要素に由来した膜貫通ドメインが用いられる。膜貫通ドメインが異なると、受容体の安定性が変わることになる。
【００８７】
膜貫通ドメインは、ペプチドスペーサーとエンドドメインとの間に挿入される。一部の実施形態では、膜貫通ドメインはペプチドスペーサーと共刺激領域との間に挿入される。一部の実施形態では、リンカーが膜貫通ドメインと共刺激領域またはエンドドメインとの間にある。
【００８８】
使用に適するのは、ポリペプチドを真核生物（例えば、哺乳類）細胞の細胞膜に挿入させる任意の膜貫通ドメインである。非限定的な例として、膜貫通配列
2019500012.tif 000005
が使用され得る。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ベータ由来の
2019500012.tif 000006
、ＣＤ４由来の
2019500012.tif 000007
、ＣＤ３ゼータ由来の
2019500012.tif 000008
、ＣＤ２８由来の
2019500012.tif 000009
、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）由来の
2019500012.tif 000010
、またはＣＤ７由来の
2019500012.tif 000011
である。
【００８９】
Ｅ．  エンドドメイン
抗原を認識した後、受容体はクラスター化し、シグナルがエンドドメイン及び／または共刺激ドメインを介して細胞に伝達される。一部の実施形態では、本明細書に記載の共刺激ドメインはエンドドメインの一部である。最も一般的に使用されるエンドドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ゼータである。これは、抗原が結合した後に、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３ゼータは完全にコンピテントな活性化シグナルを提供することができずに、さらに共刺激シグナル伝達が必要になる。例えば、キメラＣＤ２８及びＯＸ４０をＣＤ３ゼータと共に用いて増殖／生存シグナルを伝達することができるか、または３つ全てを合わせて用いることができる。
【００９０】
本開示のポリペプチドにおける使用に適したさらなるエンドドメインとして、抗原結合ドメインへの抗原の結合を介した活性化に応じて、特徴的で検出可能なシグナル（例えば、細胞による１つ以上のサイトカインの産生増加、標的遺伝子の転写変化、タンパク質の活性変化、細胞挙動の変化（例えば、細胞死）、細胞増殖、細胞分化、細胞生存、細胞内シグナル伝達応答の調節など）を提供する任意の所望のシグナル伝達ドメインが挙げられる。一部の実施形態では、エンドドメインには少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つなど）の本明細書に記載のＩＴＡＭモチーフが含まれる。一部の実施形態では、エンドドメインには、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖が含まれる。
【００９１】
本開示のポリペプチドにおける使用に適切なエンドドメインとして、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する細胞内シグナル伝達ポリペプチドが含まれる。ＩＴＡＭモチーフは、ＹＸ１Ｘ２（Ｌ／Ｉ）であり、式中、Ｘ１及びＸ２は独立して任意のアミノ酸である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）。エンドドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＩＴＡＭモチーフを含む場合もある。ある場合には、ＩＴＡＭモチーフがエンドドメイン内で２回反復され、ＩＴＡＭモチーフの第１の例及び第２の例は、６個〜８個のアミノ酸により相互に分離され、例えば、（ＹＸ１Ｘ２（Ｌ／Ｉ））（Ｘ３）ｎ（ＹＸ１Ｘ２（Ｌ／Ｉ））となっており、式中、ｎは６〜８の整数であり、６個〜８個のＸ３の各々は任意のアミノ酸であり得る（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）。
【００９２】
好適なエンドドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含有するポリペプチド由来のＩＴＡＭモチーフ含有部分であってもよい。例えば、好適なエンドドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質由来のＩＴＡＭモチーフ含有ドメインである可能性がある。したがって、好適なエンドドメインは、それが由来する全タンパク質の全配列を含有する必要はない。好適なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例として、以下に限定されないが、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）、及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）が挙げられる。
【００９３】
エンドドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質、ＫＡＲＡＰ、ＰＬＯＳＬ、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２、ＫＡＲ関連タンパク質、ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質、キラー活性化受容体関連タンパク質、キラー活性化受容体関連タンパク質などとしても知られる）に由来している場合もある。例えば、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000012
に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００９４】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000013
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００９５】
一部の実施形態では、エンドドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ、Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、ｆｃイプシロンＲｌガンマ、ｆｃＲガンマ、ｆｃｅＲＩガンマ、高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ、免疫グロブリンＥ受容体の高親和性ガンマ鎖などとしても知られる）に由来している。例えば、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000014
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００９６】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000015
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００９７】
一部の実施形態では、エンドドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３−ＤＥＬＴＡ、Ｔ３Ｄ、ＣＤ３抗原のデルタサブユニット、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３ｄ抗原のデルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）、ＯＫＴ３のデルタ鎖、Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖などとしても知られる）に由来している。例えば、好適なエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（２つのアイソフォーム）のいずれかのうちの約１００個のアミノ酸〜約１１０個のアミノ酸（ａａ）、約１１０個のａａ〜約１１５個のａａ、約１１５個のａａ〜約１２０個のａａ、約１２０個のａａ〜約１３０個のａａ、約１３０個のａａ〜約１４０個のａａ、約１４０個のａａ〜約１５０個のａａ、または約１５０個のａａ〜約１７０個のａａの連続区間に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000016
。
【００９８】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３デルタアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000017
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００９９】
一部の実施形態では、エンドドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ−４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅなどとしても知られる）に由来している。例えば、好適なエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの約１００個のアミノ酸〜約１１０個のアミノ酸（ａａ）、約１１０個のａａ〜約１１５個のａａ、約１１５個のａａ〜約１２０個のａａ、約１２０個のａａ〜約１３０個のａａ、約１３０個のａａ〜約１４０個のａａ、約１４０個のａａ〜約１５０個のａａ、または約１５０個のａａ〜約２０５個のａａの連続区間に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000018
。
【０１００】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３イプシロンアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000019
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１０１】
一部の実施形態では、エンドドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３−ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）などとしても知られる）に由来している。例えば、好適なエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちの約１００個のアミノ酸〜約１１０個のアミノ酸（ａａ）、約１１０個のａａ〜約１１５個のａａ、約１１５個のａａ〜約１２０個のａａ、約１２０個のａａ〜約１３０個のａａ、約１３０個のａａ〜約１４０個のａａ、約１４０個のａａ〜約１５０個のａａ、または約１５０個のａａ〜約１８０個のａａの連続区間に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000020
。
【０１０２】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３ガンマアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、
2019500012.tif 000021
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１０３】
一部の実施形態では、エンドドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺなどとしても知られる）に由来している。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（２つのアイソフォーム）のいずれかのうちの約１００個のアミノ酸〜約１１０個のアミノ酸（ａａ）、約１１０個のａａ〜約１１５個のａａ、約１１５個のａａ〜約１２０個のａａ、約１２０個のａａ〜約１３０個のａａ、約１３０個のａａ〜約１４０個のａａ、約１４０個のａａ〜約１５０個のａａ、または約１５０個のａａ〜約１６０個のａａの連続区間に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000022
。
【０１０４】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ３ゼータアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列のうちのいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000023
。
【０１０５】
一部の実施形態では、エンドドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖、ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファ）、ＭＢ−１膜糖タンパク質、ｉｇアルファ、膜結合免疫グロブリン関連タンパク質、表面ＩｇＭ関連タンパク質などとしても知られる）に由来している。例えば、好適なエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列（２つのアイソフォーム）のいずれかのうちの約１００個のアミノ酸〜約１１０個のアミノ酸（ａａ）、約１１０個のａａ〜約１１５個のａａ、約１１５個のａａ〜約１２０個のａａ、約１２０個のａａ〜約１３０個のａａ、約１３０個のａａ〜約１５０個のａａ、約１５０個のａａ〜約２００個のａａ、または約２００個のａａ〜約２２０個のａａの連続区間に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000024
。
【０１０６】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインポリペプチドは、完全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、好適なエンドドメインポリペプチドは、以下のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る：
2019500012.tif 000025
。
【０１０７】
一部の実施形態では、好適なエンドドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含み得る。ＤＡＰ１０シグナル伝達鎖の一例は、アミノ酸配列：
2019500012.tif 000026
である。一部の実施形態では、好適なエンドドメインは、アミノ酸配列
2019500012.tif 000027
の全長に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる。
【０１０８】
ＣＤ２８シグナル伝達鎖の一例は、アミノ酸配列
2019500012.tif 000028
である。一部の実施形態では、好適なエンドドメインは、アミノ酸配列
2019500012.tif 000029
の全長に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる。
【０１０９】
本開示のポリペプチドにおける使用に適したさらなるエンドドメインには、ＺＡＰ７０ポリペプチド、例えば、以下のアミノ酸配列のうちの約３００個のアミノ酸〜約４００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸〜約５００個のアミノ酸、または約５００個のアミノ酸〜約６１９個のアミノ酸の連続区間に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる：
2019500012.tif 000030
。
【０１１０】
Ｆ．  検出ペプチド
好適な検出ペプチドには、赤血球凝集素（ＨＡ、例えば
2019500012.tif 000031
）、ＦＬＡＧ（例えば、
2019500012.tif 000032
）、ｃ−ｍｙｃ（例えば、
2019500012.tif 000033
）などが含まれる。他の好適な検出ペプチドは当該技術分野で知られている。
【０１１１】
Ｇ．  ペプチドリンカー
一部の実施形態では、本開示のポリペプチドには、ペプチドリンカー（リンカーと称される場合もある）が含まれる。ペプチドリンカーは、本明細書に記載のペプチドドメイン／領域のいずれかを分離していてもよい。一例として、リンカーは、シグナルペプチドと抗原結合ドメインとの間、抗原結合ドメインのＶＨとＶＬとの間、抗原結合ドメインとペプチドスペーサーとの間、ペプチドスペーサーと膜貫通ドメイン（共刺激領域に隣接しているか、もしくは共刺激領域のＮ領域またはＣ領域にある）との間、及び／または膜貫通ドメインとエンドドメインとの間にあってもよい。ペプチドリンカーは、種々のアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。ドメインと領域とは、一般に可撓性の性質を有するペプチドリンカーによって結合され得るが、他の化学結合を除外しない。リンカーは、長さ約６個〜約４０個のアミノ酸のペプチドか、または長さ約６個〜約２５個のアミノ酸のペプチドであってもよい。これらのリンカーは、リンカーをコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて産生されて、タンパク質を連結することができる。
【０１１２】
ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーを用いることができる。ペプチドリンカーは、好適なペプチドリンカーが一般に可撓性ペプチドをもたらす配列を持つことに留意すれば、実質的に任意のアミノ酸配列を持つことができる。グリシン及びアラニンなどの小さいアミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを作製するのに有用である。こうした配列の作製は、当業者には日常的である。
【０１１３】
好適なリンカーは容易に選択することができ、１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０個のアミノ酸、２個のアミノ酸〜１５個のアミノ酸、３個のアミノ酸〜１２個のアミノ酸（例えば、４個のアミノ酸〜１０個のアミノ酸、５個のアミノ酸〜９個のアミノ酸、６個のアミノ酸〜８個のアミノ酸、または７個のアミノ酸〜８個のアミノ酸）などの様々な長さのうちの好適なもののいずれかを有することができ、及び１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のアミノ酸であってもよい。
【０１１４】
可撓性リンカーの例として、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）が含まれ、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン−セリンポリマーを使用することができ、Ｇｌｙ及びＳｅｒは相対的に不定形であることから、構成要素間の中性のつなぎ鎖としての機能を果たし得る。グリシンポリマーを使用することができ、グリシンは同等のアラニンよりも有意にｐｈｉ−ｐｓｉ空間にアクセスし、長い側鎖を有する残基に比べてはるかに制限され難いものである。スペーサーの例には、以下に限定されないが、
2019500012.tif 000034
などを含めたアミノ酸配列が含まれ得る。
【０１１５】
Ｈ．  共刺激領域
好適な共刺激領域の非限定的な例として、以下に限定されないが、４−ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、及びＨＶＥＭに由来するポリペプチドが挙げられる。
【０１１６】
共刺激領域は、少なくとも、多くとも、または丁度２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、もしくは３００個のアミノ酸またはその中で得られる任意の範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ１３７、４−１ＢＢ、ＣＤｗｌ３７、ＩＬＡなどとしても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000035
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＣＤ２８（Ｔｐ４４としても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000036
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１１８】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＩＣＯＳ（ＡＩＬＩＭ、ＣＤ２７８、及びＣＶＩＤ１としても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000037
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＯＸ−４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５−９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＯＸ４０、ＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000038
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２０】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＢＴＬＡ（ＢＴＬＡ１及びＣＤ２７２としても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000039
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７、及びＴｐ５５としても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000040
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２２】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ、及びＫｉ−１としても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000041
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＰ５−９０２Ｐ８．２、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、及びＧＩＴＲ−Ｄとしても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000042
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２４】
一部の実施形態では、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＲＰ３−３９５Ｍ２０．６、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７０、ＨＶＥＡ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ、及びＴＲ２としても知られる）の細胞内部分に由来している。例えば、好適な共刺激領域は、
2019500012.tif 000043
に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２５】
Ｉ．  付加的な修飾
本開示のポリペプチドは、さらに化学修飾され得る。ポリペプチドのグリコシル化は、例えば、ポリペプチド配列内の１つ以上のグリコシル化部位を修飾することによって改変され、抗原に対するポリペプチドの親和性を向上させ得る（米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号）。
【０１２６】
ポリペプチドを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とまたはＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基がポリペプチドに結合するようになる条件下で反応させることによって、本発明のポリペプチドをペグ化して、生物学的半減期を増加させることができる。ポリペプチドのペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われ得る。本明細書で使用される場合、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するのに用いられてきたＰＥＧの形態、例えばモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコールマレイミドのいずれをも包含することを意図している。タンパク質をペグ化する方法は当該技術分野で既知であり、本発明のポリペプチドに適用することができる（欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号）。
【０１２７】
さらに、ポリペプチドをヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質にコンジュゲートまたは融合させることによってポリペプチドを化学修飾して、得られた分子の半減期を増加させることができる。こうしたアプローチは、例えば欧州特許第０３２２０９４号及び同第０４８６５２５号に記載されている。
【０１２８】
本開示のポリペプチドは、診断剤または治療剤にコンジュゲートされかつ診断上使用されることで、例えば、疾患の発症または進行をモニタリングし、所与の治療レジメンの有効性を判定することができる。ポリペプチドはまた、治療剤にコンジュゲートされて、ポリペプチドの免疫賦活性効果と併用した療法を提供することができる。診断剤の例として、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放出断層撮影法用の陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンなどが挙げられる。検出可能な物質は、当該技術分野で既知の技術を用いて、ポリペプチドに直接的にまたはリンカーを介して間接的に連結されるかまたはコンジュゲートされ得る。好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例として、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる。好適な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム１１１、ルテチウム１７１、ビスマス２１２、ビスマス２１３、アスタチン２１１、銅６２、銅６４、銅６７、イットリウム９０、ヨード１２５、ヨード１３１、リン３２、リン３３、スカンジウム４７、銀１１１、ガリウム６７、プラセオジム１４２、サマリウム１５３、テルビウム１６１、ジスプロシウム１６６、ホルミウム１６６、レニウム１８６、レニウム１８８、レニウム１８９、鉛２１２、ラジウム２２３、アクチニウム２２５、鉄５９、セレン７５、ヒ素７７、ストロンチウム８９、モリブデン９９、ロジウム１１０５、パラジウム１０９、プラセオジム１４３、プロメチウム１４９、エルビウム１６９、イリジウム１９４、金１９８、金１９９、及び鉛２１１が挙げられる。キレート剤が、アミン（ａｍｉｔｉｅｓ）（Ｍｅａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：６８−７８）、アミノ酸残基のスルフヒドラル基（Ｋｏｙａｍａ  １９９４  Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１２０：２１７２６２ｔ）、及び糖質基（Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８３：２６３２−２６３６；Ｑｕａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２０：５５９−５７０）を介して結合され得る。
【０１２９】
ポリペプチドはまた、治療剤にコンジュゲートされて、ポリペプチドの免疫賦活性効果と併用した療法を提供することができる。
【０１３０】
さらなる好適なコンジュゲート分子として、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、アンチセンス核酸、抑制ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ分子など）、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、３本鎖形成分子、及び外部ガイド配列が挙げられる。アプタマーは、確定された２次構造及び３次構造（ステムループまたはＧカルテットなど）にフォールディングする長さ１５〜５０塩基の範囲の小さい核酸であり、逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大きい分子と同様に、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｉｌｉｎｅ）（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小さい分子にも結合することができる。リボザイムは、分子内でまたは分子間で化学反応に触媒作用を及ぼすことができる核酸分子である。リボザイムは、通例、標的基質の認識及び結合によって切断を生じさせて、核酸基質を切断する。３本鎖形成機能性核酸分子は、３本鎖を形成することによって２本鎖核酸または１本鎖核酸と相互作用することができ、該３本鎖では、ＤＮＡの３つの鎖がワトソン−クリック型及びフーグスティーン型対合に基づいて複合体を形成している。３本鎖分子は、高い親和性及び特異性で標的領域と結合することができる。
【０１３１】
機能性核酸分子は、標的分子が持つ特異的活性のエフェクター、阻害剤、調節剤、及び刺激剤として作用することができるか、または他の任意の分子とは無関係に新規の活性を持つことができる。
【０１３２】
Ｊ．  癌特異的キメラ抗原受容体
一部の実施形態では、細胞には、癌特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）がさらに含まれ得る。ＣＡＲの文脈における用語「癌特異的」は、癌特異的抗原などの癌特異的分子に対して抗原結合特異性を有するＣＡＲを意味する。一部の実施形態では、癌特異的ＣＡＲは、ＴＧＦ−β  ＣＡＲを有する細胞内にある。一部の実施形態では、癌特異的ＣＡＲ及びＴＧＦ−β  ＣＡＲは、別々のポリペプチド上にある。一部の実施形態では、ＣＡＲは、癌特異的分子とＴＧＦ−βとに対して抗原結合を有する二重特異性ＣＡＲである。例えば、二重特異性ＣＡＲは、シグナル伝達ペプチド、癌分子特異的ｓｃＦｖ、任意選択的にペプチドリンカー／スペーサーを有し、続いてＴＧＦ−β  ｓｃＦｖ、さらに続いてスペーサー、膜貫通ドメイン、及び共刺激ドメインを有していてもよい。一部の実施形態では、二重特異性ＣＡＲには、本明細書に記載の１つまたは複数の付加的なペプチドセグメントが含まれる。
【０１３３】
一部の実施形態では、本開示のポリペプチドはＣＤ２０  ｓｃＦｖを含み得る。ＣＤ２０  ｓｃＦｖの一例として、以下の配列が含まれる。
2019500012.tif 000044
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示のポリペプチドはＣＤ１９  ｓｃＦｖを含み得る。ＣＤ１９  ｓｃＦｖの一例として、以下の配列が含まれる。
2019500012.tif 000045
【０１３５】
他の癌特異的分子（ＣＤ１９及びＣＤ２０に加えて）として、ＣＡＩＸ、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３、ｅｒｂ−Ｂ４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ｋ−軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄリガンド、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｍＡｂ  ＩｇＥの標的とされるＴＡＡ、ＴＡＧ−７２、及びＶＥＧＦ−Ｒ２が挙げられ得る。一部の実施形態では、癌特異的分子はＨｅｒ２を含む。
【０１３６】
ＩＩＩ．  細胞
特定の実施形態は、本開示のポリペプチドまたは核酸を含む細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞またはＴ細胞である。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びガンマデルタＴ細胞を含めたＣＤ３を発現する免疫細胞の全種類が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球が含まれ、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することができる。
【０１３７】
好適な哺乳類細胞には、初代細胞及び不死化細胞株が含まれる。好適な哺乳類細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、及びネズミ（例えば、マウス、ラット）細胞株などが含まれる。好適な哺乳類細胞株として、以下に限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、ベロ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴＩ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ−７８、ジャーカット、ＨＬ−６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、及びＹＴＳ）などが挙げられる。
【０１３８】
細胞が不死化細胞株ではなく、その代わりに個体から得られた細胞（例えば、初代細胞）である場合もある。例えば、ある場合には、細胞は個体から得られた免疫細胞である。一例として、細胞は個体から得られたＴリンパ球である。別の例では、細胞は個体から得られた細胞傷害性細胞である。また別の例では、細胞は個体から得られた幹細胞または前駆細胞である。
【０１３９】
ＩＶ．  方法
本開示の態様は、免疫応答を刺激する方法に関する。免疫応答刺激は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで行われ得る。一部の実施形態では、方法は、ＴＧＦ−βの存在下で免疫応答を刺激することができる細胞に関する。方法は、通例、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターもしくはＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ＲＮＡ）を用いて哺乳類細胞を遺伝子改変することか、または該ポリペプチドを細胞に直接移入することに関与する。細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）、幹細胞、前駆細胞などであり得る。一部の実施形態では、細胞は本明細書に記載の細胞である。
【０１４０】
一部の実施形態では、遺伝子改変はエクスビボで行われる。例えば、Ｔリンパ球、幹細胞、またはＮＫ細胞（または本明細書に記載の細胞）は個体から得られ、その個体から得られた細胞は遺伝子改変されて、本開示のポリペプチドを発現する。ある場合には、遺伝子改変された細胞は、エクスビボで活性化される（すなわち、ＴＧＦ−βを細胞とエクスビボで接触させる）。他の場合には、遺伝子改変された細胞は、個体（例えば、細胞を採取した個体）に導入され、その遺伝子改変細胞はインビボで（すなわち内因的に産生したＴＧＦ−βによって）活性化される。
【０１４１】
一部の実施形態では、方法は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）などの付加的な治療剤の投与をさらに含む。こうした治療剤は、ペプチド形態で患者に投与されても、ＴＧＦ−β  ＣＡＲを含む細胞などの本開示の細胞内で発現されてもよい。ＢＩＴＥは、当該技術分野で既知の及び／または本明細書に記載の癌抗原／癌分子に対する抗原特異性を有し得、またＣＤ３などのＴ細胞分子に対する抗原特異性をも有し得る。
【０１４２】
一部の実施形態では、方法は、癌を治療するかまたは癌を有する者に投与するための、本明細書に記載の細胞またはペプチドの投与に関する。一部の実施形態では、癌は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、小児または成人における脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌及び下咽頭癌、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞性肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔または中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌、肉腫、基底皮膚癌、扁平細胞皮膚癌、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍である。
【０１４３】
実施形態を用いて、免疫介在性、炎症性、または自己免疫性炎症性の疾患（例えば、過敏症、喘息、糖尿病（例えば、１型糖尿病）、移植片拒絶など）の多くを治療または寛解することができる。こうした疾患または障害の例として、以下に限定されないが、関節炎（関節リウマチ、例えば、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風または痛風関節炎、急性痛風関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、脊椎関節炎、及び若年発症全身関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、変形関節炎、原発性慢性多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｉｍａｒｉａ）、反応性関節炎、ならびに強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、乾癬（例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、及び爪の乾癬）、アトピー（例えば、枯草熱及びヨブ症候群などのアトピー性疾患）、皮膚炎（例えば、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎）、Ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹（例えば、慢性アレルギー性蕁麻疹、及び慢性自己免疫性蕁麻疹を含めた慢性特発性蕁麻疹）、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、硬化症（例えば、全身性硬化症、多発性硬化症（ＭＳ）（視神経脊髄型（ｓｐｉｎｏ−ｏｐｔｉｃａｌ）ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、及び再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）など）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、大腸炎（潰瘍性大腸炎、潰瘍性結腸炎、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ性大腸炎、壊死性全腸炎、及び全層性大腸炎）、及び自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、呼吸窮迫症候群（例えば、成人または急性の呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ））、髄膜炎、ブドウ膜の全体または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎などの場合の脳神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症（ｐｒｕｒｉｔｉｓ  ｓｃｒｏｔｉ）、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫状態に起因する突発性難聴、ＩｇＥ媒介性疾患（例えば、アナフィラキシーならびにアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎）、脳炎（例えば、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系及び／または脳幹脳炎）、ブドウ膜炎（例えば、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎）、ネフローゼ症候群を伴うまたは伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）（例えば、原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮもしくは特��性膜性腎症、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜もしくは膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、ならびに急速進行性ＧＮを含めた慢性または急性糸球体腎炎）、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、亀頭炎（例えば、形質細胞限局性亀頭炎）、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前癌性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー状態及び応答、アレルギー反応、湿疹（例えば、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、及び水疱性掌蹠湿疹）、喘息（例えば、気管支喘息（ａｓｔｈｍａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｅ）、気管支喘息（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ａｓｔｈｍａ）、及び自己免疫性喘息）、Ｔ細胞の浸潤を伴う状態及び慢性炎症反応、妊娠中の胎児Ａ−Ｂ−Ｏ血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス（例えば、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス及び円板状エリテマトーデス、脱毛症ループス、皮膚ＳＬＥまたは亜急性皮膚ＳＬＥなどの全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、ならびに播種性エリテマトーデス）、若年発症（Ｉ型）糖尿病（例えば、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ））及び成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、ならびに自己免疫性糖尿病が挙げられる。さらに考慮されるのは、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅延型過敏症と関連する免疫応答、サルコイドーシス、肉芽腫症（例えば、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症）、無顆粒球症、脈管炎（例えば、血管炎、大型血管炎（リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発動脈炎、免疫性血管炎、ＣＮＳ血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、壊死性血管炎（例えば、全身性壊死性血管炎）、ならびにＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、チャーグ・ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）及びＡＮＣＡ関連小血管血管炎））、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、溶血性貧血または免疫性溶血性貧血（例えば、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ））、アジソン病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多臓器損傷症候群（例えば、敗血症、外傷、または出血に続発するもの）、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡（例えば、水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡）、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｍｕｃｕｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、及び紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体障害（例えば、免疫複合体腎炎）、抗体媒介性腎炎、多発ニューロパチー、慢性神経障害（例えば、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性神経障害）、自己免疫性または免疫媒介性の血小板減少症（例えば、慢性または急性ＩＴＰを含めた特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ））、強膜炎（例えば、特発性角強膜炎、上強膜炎）、精巣及び卵巣の自己免疫疾患（例えば、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎）、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性内分泌疾患（例えば、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、
または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎）、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性症候群（例えば、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群））、腫瘍随伴症候群（例えば、ランバート・イートン筋無力症症候群またはイートン・ランバート症候群、スティッフマンまたはスティッフパーソン症候群などの神経性腫瘍随伴症候群）、脳脊髄炎（例えば、アレルギー性脳脊髄炎または脳脊髄炎性アレルギー、及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎）、重症筋無力症（例えば、胸腺腫関連重症筋無力症）、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、ならびに感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球性間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギランバレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、肝硬変（例えば、原発性胆汁性肝硬変及び肺硬変）、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック（Ｃｅｌｉａｃ）またはセリアック（Ｃｏｅｌｉａｃ）病、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患（例えば、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性難聴）、多発性軟骨炎（例えば、難治性または再発もしくは再発性多発性軟骨炎）、肺胞タンパク症、コーガン症候群／非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、酒さ性自己免疫、帯状疱疹関連痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症及び意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ））を含む原発性リンパ球増加症、末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病（例えば、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、聴覚消失、視覚消失、周期性四肢麻痺、及びＣＮＳのチャネル病）、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状もしくは分節状または巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認認知症、脱髄疾患（例えば、自己免疫性脱髄疾患及び慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー）、ドレスラー症候群、円形脱毛症、完全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強指症、及び毛細血管拡張症）、男性及び女性の自己免疫性不妊症（例えば抗精子抗体に起因）、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、鳥飼病、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎（例えば、アレルギー性肺胞炎及び線維化性肺胞炎）、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、寄生虫病（例えば、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症）、サムター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎（例えば、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性または慢性）、またはフックス毛様体炎）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒素血症、膵炎、甲状腺中毒症、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、予防接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞性多発筋痛、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小病変症、良性家族性及び虚血再灌流障害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、精子形成欠如（ａｓｐｅｒｎｉｏｇｅｎｅｓｅ）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュプュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、癩性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲症候群、リウマチ性熱、ハンマン・リッチ病、感音難聴、発作性ヘモグロビン尿症、性腺機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少症、伝染性単核球症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑症、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う状態、白血球接着不全症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発型過敏症と関連する免疫応答、白血球漏出を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、多腺性自己免疫症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎または蝶形骨洞炎、好酸球関連障害（例えば、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、レフレル症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症）、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多内分泌性自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルートン症候群、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病と関連する自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、リンパ節炎、血圧応答の低下、血管機能不全、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、及び血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏性障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流傷害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を有する皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎またはその他の中枢神経系炎症性障害、眼球及び眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発毒性、ナルコレプシー、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息性気道過敏症、ならびに子宮内膜症である。
【０１４４】
Ｖ．  医薬組成物
本開示は、免疫応答を必要とする対象において免疫応答を調節するための方法を含む。本開示には、免疫応答を誘導または改変するために使用可能な医薬組成物の形態であり得る細胞が含まれる。
【０１４５】
本開示による組成物は、任意の一般的な経路を介して投与されるのが一般的である。この経路には、以下に限定されないが、非経口注射、同所注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、または静脈内注射が含まれる。
【０１４６】
本発明の組成物は、通例、投与製剤に適合する方法を用いて、治療上有効でありかつ免疫改変するような量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存する。
【０１４７】
適用方法は広範囲に様々であり得る。細胞成分を含む医薬組成物を投与する従来方法のいずれをも適用することができる。医薬組成物の投与量は投与経路に依存し、対象のサイズ及び健康状態によって様々になる。
【０１４８】
数多くの例では、多くともまたは少なくとも約３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の複数回投与を行うのが望ましい。投与は、２日〜１２週の間隔であってもよく、１週〜２週の間隔であるのがより一般的である。投与した後に、アロ反応性免疫応答及びＴ細胞活性についてのアッセイを行ってもよい。
【０１４９】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与された場合に、副作用、アレルギー反応、または他の有害な反応を生じさせることのない分子実体及び組成物を意味する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、ならびに等張剤及び吸収遅延剤などを含む。こうした培地及び作用剤を薬学的活性物質に使用することは、当該技術分野で周知である。任意の通常用いられる培地または作用剤が活性成分に不適合であるという場合を除いて、培地または作用剤を免疫原性組成物及び治療用組成物に使用することが考慮される。本開示の医薬組成物は薬学的に許容される組成物である。
【０１５０】
本開示の組成物は、非経口投与用に製剤化され、例えば、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、または腹腔内経路を経由した注射用に製剤化され得る。こうした組成物は、通例、注射剤として、すなわち液体溶液または懸濁液として調製可能であり、注射に先立って液体を添加する際に溶液または懸濁液の調製用に適した固体形態も調製可能であり、また調製物を乳化することもできる。
【０１５１】
注射に使用するのに適した薬剤形態として、滅菌水溶液または分散液と、ゴマ油、ラッカセイ油、またはプロピレングリコール水溶液を含めた製剤とが挙げられる。また、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌類などの微生物による汚染作用から保護されなければならない。
【０１５２】
滅菌注射用溶液は、活性成分（すなわち、本開示の細胞）の所要量を、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と合わせて適切な溶媒に混合することによって調製され、続いて濾過滅菌される。分散液は、種々の滅菌された活性成分を、滅菌媒体に混合することによって調製され、該滅菌媒体は、基本分散媒と、上記に列挙した成分とは別の必要成分とを含む。
【０１５３】
組成物の有効量は、意図する目標に基づいて決定される。「単位用量」または「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に個別の単位を意味しており、各単位は組成物の所定量を含有し、該所定量は投与（すなわち、適正な経路及びレジメン）に関連して本明細書で論じる所望の応答を得るように算出されるものである。投与される量は、治療剤の数及び単位用量に応じて、所望される結果及び／または防護に依存する。また、該組成物の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に固有の量である。用量に影響を及ぼす因子として、対象の身体的状態及び臨床状態、投与経路、意図する治療目標（症候の軽減対治癒）、ならびに、特定の組成物の効力、安定性、及び毒性が挙げられる。製剤化されると、溶液は、投与製剤に適合する方法で、かつ治療上または予防上有効であるような量で投与される。製剤は、上述した注射溶液型などの種々の投与形態で容易に投与される。
【０１５４】
ＶＩ．  配列
本開示の抗原結合ドメインには、以下のＶＨ（重鎖可変）及びＶＬ（軽鎖可変）領域が含まれる。
2019500012.tif 000046
【０１５５】
ｓｃＦｖ＃１のＶＨ領域及びＶＬ領域の対応するＣＤＲは、以下のアミノ酸配列である：
2019500012.tif 000047
。
【０１５６】
ｓｃＦｖ＃２のＶＨ領域及びＶＬ領域の対応するＣＤＲは、以下のアミノ酸配列である：
2019500012.tif 000048
。
【０１５７】
ｓｃＦｖ＃３のＶＨ領域及びＶＬ領域の対応するＣＤＲは、以下のアミノ酸配列である：
2019500012.tif 000049
。
【０１５８】
本開示の検出ペプチドには、例えば、
2019500012.tif 000050
が含まれ得る。
【０１５９】
例示的なシグナルペプチドには、
2019500012.tif 000051
が含まれる。他の例示的なシグナルペプチドには、
2019500012.tif 000052
が含まれる。
【０１６０】
例示的なペプチドスペーサーヒンジ領域には、
2019500012.tif 000053
が含まれる。
【０１６１】
例示的なペプチドリンカーには、例えば、
2019500012.tif 000054
が含まれる。
【０１６２】
例示的な膜貫通ドメインには、
2019500012.tif 000055
、ＣＤ８ベータ由来の
2019500012.tif 000056
、ＣＤ４由来の
2019500012.tif 000057
、ＣＤ３ゼータ由来の
2019500012.tif 000058
、ＣＤ２８由来の
2019500012.tif 000059
、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）由来の
2019500012.tif 000060
、及びＣＤ７由来の
2019500012.tif 000061
が含まれる。
【０１６３】
例示的な共刺激領域には、
2019500012.tif 000062
が含まれる。
【０１６４】
一部の実施形態では、エンドドメインはＩＴＡＭモチーフを含む。ＩＴＡＭモチーフは、ＹＸ１Ｘ２（Ｌ／Ｉ）であり、式中、Ｘ１及びＸ２は独立して任意のアミノ酸である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）。ある場合には、ＩＴＡＭモチーフがエンドドメイン内で２回反復され、ＩＴＡＭモチーフの第１の例及び第２の例は、６個〜８個のアミノ酸により相互に分離され、例えば、（ＹＸ１Ｘ２（Ｌ／Ｉ））（Ｘ３）ｎ（ＹＸ１Ｘ２（Ｌ／Ｉ））となっており、式中、ｎは６〜８の整数であり、６個〜８個のＸ３の各々は任意のアミノ酸であり得る（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）。
【０１６５】
例示的なエンドドメインには、
2019500012.tif 000063
2019500012.tif 000064
2019500012.tif 000065
またはそれらの部分からのポリペプチドが含まれる。
【実施例】
【０１６６】
ＶＩＩ．  実施例
本発明の実施形態を実証するために以下の実施例が包含される。以下の実施例で開示される技術は、本発明者らにより見出された技術が本発明の実施において十分に機能を果たすことを表しており、それ故に実施の好ましい形態を構成すると見なすことができると、当業者は理解すべきである。一方、本開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において数多くの変更がなされる可能性があるが、なおも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができると、当業者は理解すべきである。
【０１６７】
実施例１
本開示は、ヒト及びマウスのＴＧＦ−βを中和する１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、ヒト及びマウスのＴＧＦ−βに応答性を持つキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とについて説明する。哺乳類全体にわたるＴＧＦ−βの保存レベルから、記載されるｓｃＦｖ及びＣＡＲを用いてほとんどの哺乳類のＴＧＦ−βを結合可能であることが示唆される。抗ＴＧＦ−β抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを、最終的にＮ末端−ＶＨ−（Ｇ４Ｓ）３−ＶＬ−Ｃ末端という順になるように（Ｇ４Ｓ）３リンカーを用いて結合することによって、２種のｓｃＦｖが構築される。これらのｓｃＦｖは、以下の表に示すｓｃＦｖアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を用いて真核生物細胞に形質移入することで産生され得る。
2019500012.tif 000066
【０１６８】
各ｓｃＦｖをマウスカッパ軽鎖由来のリーダー（すなわち、シグナル）ペプチドでタグ付けすることができ、その結果、分泌されたｓｃＦｖを、産生細胞を培養する培地から直接採集することができる。またｓｃＦｖを、Ｎ末端（リーダーペプチドの後方であるがＶＨ配列の前方）において、ＧＧＳリンカーと隣接するＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）エピトープ、ＨＡタグ、またはｃＭｙｃタグなどのマーカーでタグ付けすることもできる。各ｓｃＦｖは、ヒトまたはマウスのＴＧＦ−βを中和するように直接投与される。ｓｃＦｖ＃１及びｓｃＦｖ＃２は、ｓｃＦｖ＃３よりも優れている（図１及び図７）。さらに、各ｓｃＦｖを用いて、ＴＧＦ−β応答性のＣＡＲを構築することが可能である。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域（その数は固有のＣＡＲ設計によって様々である）、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン／エンドドメインから構成される融合タンパク質である。ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、上述のｓｃＦｖを細胞外抗原結合ドメインとして用いて構築され得る。Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含めた免疫細胞を操作して、ウイルス形質導入、ＤＮＡヌクレオフェクション、及びＲＮＡヌクレオフェクションなどの種々の方法によって、ＴＧＦ−β  ＣＡＲを発現させることができる。ＴＧＦ−β  ＣＡＲに結合したＴＧＦ−βは、ヒトＴ細胞を活性化し、それによってＴＧＦ−βシグナル伝達を免疫抑制応答から免疫賦活応答に変えることができる。また、ＴＧＦ−β  ＣＡＲを補助受容体として使用することで、腫瘍浸潤リンパ球、Ｔ細胞受容体操作、または他のＣＡＲに基づくか否かに関わらず、あらゆる養子Ｔ細胞療法において免疫抑制に対抗しかつＴ細胞媒介応答を高めることができる。
【０１６９】
図２に示すように、ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、初代ヒトＴ細胞の表面上で効率的に発現する。ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、ｓｃＦｖ＃２を用いて作製した。表面染色とフローサイトメトリーとにより、ＴＧＦ−β  ＣＡＲは初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に現れていることがわかる。受容体の細胞外ドメインは、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープを含んでいる。ＥＧＦＲｔは、切断型上皮増殖因子受容体であり、これは細胞の形質導入を示すものである。ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体よりも高効率に細胞表面に現れることをさらに見出した（図９）。細胞内シグナル伝達ドメインを持たない切断型ＴＧＦ−β受容体鎖ＩＩを含むドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体（ＤＮＲ）は、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害し、Ｔ細胞エフェクターの機能を改善することが報告されている。しかしながら、ＤＮＲは、ＴＧＦ−β  ＣＡＲとは異なり、細胞表面上で効率的に発現されていない。図９に示すデータは、ＦＬＡＧタグ付きＴＧＦ−β  ＣＡＲ、またはＦＬＡＧタグ付きＤＮＲのどちらかをコードするレンチウイルスを用いた初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の形質導入から得られたものである。各受容体はＴ２Ａ切断ペプチドを介して切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）にタグ付けされ、そのため、形質導入された細胞がＥＧＦＲｔ染色によって特定できる一方、受容体表面発現がＦＬＡＧ染色によって特定できる。図９の結果から、ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、ＤＮＲよりもＴ細胞表面上で極めて高効率に発現されていることがわかる。
【０１７０】
図３は、ＴＧＦ−β  ＣＡＲが内因性ＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断することを示している。初代ヒトＴ細胞におけるＴＧＦ−β  ＣＡＲの発現は、ＳＭＡＤ経路を介したＴＧＦ−βシグナル伝達を遮断する。指定された受容体を発現するＴ細胞を、指定された濃度のＴＧＦ−βと共に３０分間インキュベートし、ウエスタンブロットによりリン酸化ＳＭＡＤ２に対してプローブした。ＥＧＦＲｔは、切断型上皮増殖因子受容体を発現するＴ細胞を表し、「ＣＡＲなし」の対照として作用するのに対して、ｓｃＦｖなしは、いかなるリガンド結合ｓｃＦｖドメインも持たないが、それ以外はＴＧＦ−β  ＣＡＲ長と同一であるＣＡＲを発現するＴ細胞を表す。ＴＧＦ−β  ＣＡＲの後ろに付く「長」及び「短」というラベルは、その細胞外ペプチドスペーサーの長さを表している。図６に示すように、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔ細胞がＴＧＦ−βに応じて増殖する。ＴＧＦ−β  ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＴＧＦ−βを増殖抑制サイトカインから増殖促進サイトカインに変える。
【０１７１】
さらに、ＴＧＦ−β  ＣＡＲはＴ細胞を活性化し、サイトカイン産生を誘発することもわかった（図４）。図４に示すように、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ６９活性化マーカーの発現を上方制御し、ＴＧＦ−β曝露に応じて免疫賦活性サイトカインＩＦＮ−γとＴＮＦ−αとを産生する。ＴＧＦ−βを伴うかまたは伴わずに２４時間インキュベーションをした後、表面染色によりＣＤ６９の上方制御をモニタリングした。ＴＧＦ−βを伴うかまたは伴わずに２４時間インキュベーションをした後に、タンパク質輸送阻害剤のブレフェルジンＡを適用し、細胞内染色を行うことによってサイトカインの産生を検出した。「ｓｃＦｖなし」は、いかなるリガンド結合ｓｃＦｖドメインも持たないＣＡＲを表す。
【０１７２】
ＴＧＦ−β  ＣＡＲとは異なり、ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体は、サイトカイン産生を誘発することはできない。ドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体もＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することが報告されているが、ＴＮＦ−αの産生などの免疫賦活性作用を誘発するものではない（図５）。「Ｔβ短」及び「Ｔβ長」は２種類の異なるＴＧＦ−β  ＣＡＲであり、「Ｄｏｍ−Ｎｅｇ」はドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体を表し、「ｓｃＦｖなし」はいかなるリガンド結合ｓｃＦｖドメインも持たないＣＡＲを表す。
【０１７３】
ＴＧＦ−β  ＣＡＲの機能は共刺激ドメインの選択によって調整され得ることをさらに見出した。図１０に示すように、ＣＤ２８共刺激ドメインと４−１ＢＢ共刺激ドメインとを切り替えることで、ＴＧＦ−βに応じたサイトカイン産生レベルが変わる。さらに、ＴＧＦ−βは、種々のドナー由来のＴＧＦ−β  ＣＡＲを有する細胞全体にわたって、用量依存的にＴＮＦ−α産生を一貫して誘発することを見出した。これは、ＣＡＲの性能が臨床適用に対して信頼するに足るロバスト性を有することを示唆している（図１１）。
【０１７４】
また、ＴＧＦ−β  ＣＡＲのスペーサー長が誘発閾値を調節していることを見出した。細胞外スペーサーの長さを増加させることにより、ＣＡＲ誘発のＴＧＦ−β閾値が上がる（図１２）。これは、リガンド結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の結合を変えることにより、適用上の要求に対するＣＡＲ応答性をカスタマイズできることを示唆する。「短いスペーサー」は、ヒトＩｇＧ４のヒンジ部分を含み、「長いスペーサー」はＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。
【０１７５】
次に、可溶性リガンド媒介性のＣＡＲの二量体化によってＣＡＲシグナル伝達が誘発されることを見出した。指定されたＣＡＲを保有するジャーカット細胞株を図１３に示す。ＧＦＰ  ＣＡＲ＃１とＧＦＰ  ＣＡＲ＃３の両方は主にホモ二量体形態で存在しており、これら２種のＣＡＲは、ＥＧＦＰ上の異なるエピトープに結合し、個々のＥＧＦＰ分子に同時に結合することができる。ＧＦＰ  ＣＡＲ＃１及びＧＦＰ  ＣＡＲ＃２は、ＥＧＦＰ上の同じエピトープに結合するが、ＣＡＲ＃２はホモ二量体ではなく単量体として存在している。結果から明らかになるのは、ＣＡＲシグナル伝達はリガンド媒介性のＣＡＲの二量体化により促進され得るが、リガンドまたはＣＡＲ自体が二量体として予め存在している必要はないということである（図１３）。可溶性リガンドがＣＡＲシグナル伝達を誘発させ得る１つの考えられる機序は、２つの異なる細胞上の受容体を連結することによって、免疫シナプスを形成することである。この機序は、単一種のＧＦＰ  ＣＡＲを発現するジャーカット細胞が二量体ＥＧＦＰによっては活性化され得るが、単量体ＥＧＦＰによっては活性化されないという観測結果とも整合している。また、それぞれ異なるＧＦＰ  ＣＡＲを発現する２種のジャーカット細胞株の混合物が、二量体ＥＧＦＰと単量体ＥＧＦＰの両方によって活性化され得るという観測結果とも整合している。この例では、単量体ＥＧＦＰも細胞間の連結を誘発することができるが、これは、２種のジャーカット細胞株におけるＣＡＲが同一ＥＧＦＰ分子上の２つの異なるエピトープに結合するからである（図１４）。
【０１７６】
ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、細胞間接触依存的方法及び非依存的方法で誘発され得ることを見出した。細胞間接触は、ＥＧＦＰ及びＴＧＦ−βなどの可溶性リガンドがＣＡＲシグナル伝達を誘発させ得る１つの考えられる機序であるが、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、細胞間接触がない場合でも可溶性リガンドにより誘発され得る。図１５では、ＴＧＦ−β  ＣＡＲとＮＦＡＴプロモーターから発現されるＥＧＦＰレポーターとを安定して発現するジャーカット細胞を、様々な細胞密度で播種し、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βの存在下または非存在下でインキュベートしている。細胞が主に分離した単一細胞として存在するような極めて低い密度であっても、ＥＧＦＰシグナルがＴＧＦ−βの存在下で明瞭に観測されている。さらに、１０倍の範囲の細胞密度（５００〜５０００個の細胞／ｃｍ＾２）に対して、細胞密度に応じたＥＧＦＰ産生量の増加は見られていない（図１５）。これらの結果から、可溶性ＴＧＦ−βは、細胞間接触とは無関係にＴ細胞活性化を誘発することができることがわかる。しかしながら、ＥＧＦＰ産生量は、閾値となる細胞密度を超えると有意に増加し、これは、細胞密度レベルが高い場合には細胞間接触が寄与することを明らかにしている。この現象をさらに評価するため、ＴＧＦ−β  ＣＡＲを発現する初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をカルシウム指示薬のＦｌｕｏ−４−ＡＭでラベル化し、蛍光顕微鏡でイメージングした。細胞間接触がない場合にＴＧＦ−βを添加した後に観測されたＦｌｕｏ−４−ＡＭシグナルにより、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔ細胞が細胞間連結なしに可溶性リガンドによって活性化され得ることが裏付けられている（図１６）。
【０１７７】
ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、腫瘍微小環境における免疫抑制駆動体としてのＴＧＦ−βの役割を中和するための免疫細胞の必要性に対処する。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍に対して注目すべき臨床結果を得ているが、固体腫瘍に対する効力はまだ著しく制限されている。固体腫瘍は、ＴＧＦ−β及び他のサイトカインの過剰産生によって免疫抑制性の高い微小環境をもたらし、その結果として最終的にＴ細胞が不活性化されることが知られている。ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、内因性ＴＧＦ−β経路を介したシグナル伝達を低減させることによって免疫抑制に対抗する能力だけではなく、ＴＧＦ−βの存在下でＴ細胞活性化を特異的に誘発する能力もＴ細胞に付与する。Ｔ細胞活性化によって免疫細胞が免疫賦活性サイトカインを産生し増殖するよう促され、それによりＴＧＦ−βが、免疫抑制性シグナルから、抗腫瘍免疫応答を活性化する活性化刺激となる。
【０１７８】
実施例２：自己免疫疾患のための多機能性制御性Ｔ細胞療法の設計
本実施例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を操作するのに用いることができる方法について説明しており、該ＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）によって活性化されて選択的にエクスビボで増殖し、ロバストな抑制性機能をインビボで維持し、抗インターロイキン６受容体アルファ（ＩＬ−６Ｒα）１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を分泌することで、関節リウマチ（ＲＡ）のマウスモデルにおいて効果的に炎症を低減させることができる。当該技術分野で既知の及び／または本明細書に記載の自己免疫疾患などの他の自己免疫疾患も、本実施例及び本開示に記載の方法によって治療され得ることが考慮される。
【０１７９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する従来型のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）を用いる養子Ｔ細胞療法により、難治性癌、特にＢ細胞悪性腫瘍に対する顕著な臨床的有効性が得られている。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を自己免疫疾患の治療に適用することは、まだ揺籃期にある。
【０１８０】
Ｔｒｅｇは、多数の機序によってＴｃｏｎｖの機能を抑制し、その機序のうちの１つがＴＧＦ−βという、エフェクターＴ細胞の機能とナチュラルキラー細胞の機能の両方を阻害する強力な免疫抑制サイトカインの分泌である。本発明者らは、ＴＧＦ−βの存在下でＴｃｏｎｖを特異的に活性化するＴＧＦ−β  ＣＡＲの開発を行っており（図４）、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔ細胞が可溶形態と固定形態の両方のＴＧＦ−βに応答することを確認してきた。ＴＧＦ−β  ＣＡＲを発現するヒトＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ及びＣＤ８＋Ｔｃｏｎｖは、ＴＧＦ−βが通常、免疫抑制性の高い作用物質であるという事実にも関わらず、ＴＧＦ−βの存在下でロバストなＮＦＡＴシグナル伝達を誘発し、Ｔｈ２サイトカインを産生する（図４）。
【０１８１】
ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、以下の理由によりＴｒｅｇ療法に一義的に適していると考えられる：１）ＴＧＦ−βは、Ｔｒｅｇの分化を促進することが知られており、したがって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＴＧＦ−β媒介性増殖が、混入しているＴｃｏｎｖの増殖を防ぎつつ、Ｔｒｅｇを選択的に増殖させる方法を提示する。本発明者らは、放射線照射されたフィーダー細胞の存在下でのみ、ＴＧＦ−βが、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ発現Ｔｃｏｎｖのロバストな増殖を駆動することを確認した。フィーダー細胞が存在しない場合には、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｃｏｎｖの増殖はＴＧＦ−βの存在により特異的に阻害され、その阻害は、改変されていないＴｃｏｎｖまたは非ＴＧＦ−β  ＣＡＲを発現するＴｃｏｎｖと比較して、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｃｏｎｖに対して有意に強くなっている。本発明者の実験結果によると、天然のホモ二量体として存在するＴＧＦ−βによって、その両方がＴＧＦ−β  ＣＡＲを発現する２つのＴ細胞間の接合が生じ得ることを示唆している。この細胞間接合の結果、Ｔｃｏｎｖ間に同胞殺生毒性が生じる場合がある。この毒性は、ＣＡＲシグナル伝達に起因する増殖応答によって十二分に相殺され得るが、放射線照射フィーダー細胞の補助がある場合のみである。Ｔｃｏｎｖとは異なり、Ｔｒｅｇはグランザイム媒介性細胞傷害性を呈することはなく、また内因性ＴＧＦ−βシグナル伝達により抑制されない。したがって、フィーダー細胞の補助がない場合には、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ発現Ｔｒｅｇは、ＴＧＦ−β駆動性エクスビボ増殖プロトコルにおいて混入しているＴｃｏｎｖよりも選択的に増殖されることにより、治療用Ｔｒｅｇを産生するのに抱える大きな障害のうちの１つに対処することができると考えられる。２）活性化されたＴｒｅｇはＴＧＦ−βを自然産生するため、インビトロ及びインビボにおけるＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの持続的活性化のための機序を付与する。抗原特異的Ｔｒｅｇは、免疫抑制においてポリクローナルＴｒｅｇよりもさらに効果的であることがわかっていた。一方、Ｔｒｅｇは一旦活性化されると、抗原非特異的な方法でサプレッサー機能を発揮することができることもわかっていた。さらに、予め活性化されたポリクローナルＴｒｅｇが、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎を阻害することが明らかにされていた。総合すると、これらの結果から、抗原特異的Ｔｒｅｇは、非抗原特異的Ｔｒｅｇよりも活性化される可能性があることからより効果的であり得ること、また標的細胞に対する特異性が、おそらく有利ではあるものの、治療上の機能には必須ではないことが示唆される。天然の抗原特異的Ｔｒｅｇは、単離すること、及び治療に応用するのに十分多い量まで増殖することが困難である。形質転換Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の導入は魅力的な代替手段を提供するが、各疾患にはそれ自体の特異的ＴＣＲと、適切な抗原標的の利用可能性とが必要であり、そのうちの後者はＴ細胞療法の開発における主なボトルネックとして認識されてきた。ＴＧＦ−βの産生はＴＣＲの特異性とは無関係なＴｒｅｇの自然産物であるため、ＴＧＦ−β  ＣＡＲは、持続性のあるＴｒｅｇ活性化を可能にする一般化された戦略を提示しており、疾患特異的受容体を必要とすることなしに、広範な疾患標的に対するＴｒｅｇ媒介性抑制をサポートすることができるであろう。
【０１８２】
本実施例は、初期研究の疾患モデルとしてＲＡを用いて、自己免疫疾患に対する細胞免疫療法のための新規な方法論と特異的Ｔｒｅｇ産物とを提供するものである。全体としての目的は、持続した治療機能を有する治療用Ｔｒｅｇを作製するための一般化されたアプローチを確立することと、マウスのコラーゲン誘発関節炎モデルにおける操作されたＴｒｅｇの効用を明らかにすることである。
【０１８３】
Ａ．  ロバストなＴｒｅｇ増殖のためのＴＧＦ−β媒介性エクスビボ増殖プロトコルの開発
初代ヒトＴｒｅｇを、健康なドナーの血液サンプルから、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットの後に、磁気ビーズに基づくＣＤ１２７−細胞とＣＤ２５＋細胞の濃縮を用いて、単離することができる。単離された細胞をＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化し、３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充した完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％熱不活化ウシ胎仔血清）中で２日間培養した後に、レンチウイルス形質導入を行うことができる。切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）で（Ｔ２Ａ切断ペプチドを介して）タグ付けされたＴＧＦ−β  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを予め構築し、初代ヒトＴｃｏｎｖに形質導入することによって検証を行った。ＣＡＲ発現細胞を磁気ビーズに基づくＥＧＦＲｔ＋細胞のソーティングによって単離することができる。このソーティングスキームにより、ＣＡＲに直接抗体を結合させる必要性がなくなり、非生産的にＴ細胞が活性化する可能性が低減される。ソーティングされたＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、以下の種々の培養条件下で９６ウェルプレートにて増殖させることができる。（ａ）３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２のみ、（ｂ）濃度勾配（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）のあるＴＧＦ−βのみ、（ｃ）ＩＬ−２（５０〜３００Ｕ／ｍｌ）及びＴＧＦ−β（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）の勾配、（ｄ）ＩＬ−２及びＴＧＦ−βの濃度勾配に加え、Ｔ細胞：放射線照射フィーダー細胞（ＴＭ−ＬＣＬ）の比が１：７の放射線照射フィーダー細胞（ＴＭ−ＬＣＬ）。生細胞数を３週間にわたってフローサイトメトリーにより定量することができる。さらに、新たに単離したＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７−細胞から始める細胞調製プロセスの間にわたって、Ｆｏｘｐ３発現レベルを細胞内染色により定量することができる。ＴＧＦ−β結合ｓｃＦｖドメインを持たないことを除いてＴＧＦ−β  ＣＡＲと同一である「ｓｃＦｖなし」ＣＡＲを構築し、陰性対照として含めることができる。
【０１８４】
本実施例に記載の検討を通して、以下のことを明らかにすることができる：（１）ＴＧＦ−β  ＣＡＲ発現によって、ＴＧＦ−βの添加に応じて特異的に増殖する能力を持つＴｒｅｇが得られるか否か、（２）高効率（高倍の増殖により定義される）及び高純度（混入Ｔｃｏｎｖの最少限の存在により定義される）のエクスビボＴｒｅｇ増殖のためのＩＬ−２、ＴＧＦ−β、及び／またはフィーダー細胞の至適な組み合わせの特定。本発明者らは、異なる構造特性を有する複数のＴＧＦ−β  ＣＡＲを開発し、ＴＧＦ−βに応じたこれらのＣＡＲの個々のシグナル伝達閾値を観測した。２種の異なるＴＧＦ−β  ＣＡＲ、すなわち、一方は短い（１２個のアミノ酸）細胞外スペーサーを持ち、他方は長い（２２９個のアミノ酸）細胞外スペーサーを持つＴＧＦ−β  ＣＡＲを評価して、Ｔｒｅｇの適用に至適な構築物を特定することができる。
【０１８５】
Ｂ．  インビトロ及びインビボでのＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇのサプレッサー機能の至適化
ＴＧＦ−β  ＣＡＲを安定して発現するＴｒｅｇのサプレッサー機能をさらに調べることができる。Ｔｒｅｇを単離し、形質導入して、上述のようにソーティングする。長いスペーサーのＴＧＦ−β  ＣＡＲと短いスペーサーのＴＧＦ−β  ＣＡＲの両方を評価することができる。陰性対照として、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ１２７−／ＣＤ２５＋表現型の濃縮前）の一部を形質導入しソーティングすることで、操作されたＴｒｅｇに対するＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｃｏｎｖの比較を提供することができる。第２の陰性対照として、上述のｓｃＦｖなしＣＡＲで形質導入したＴｒｅｇをこの検討に含めることができる。ソーティングされたＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充した完全培地中で増殖することができるが、このＩＬ−２の濃度は、エクスビボでのＴｒｅｇの生存と増殖とをサポートすると報告されており、発表された研究で報告されている濃度のうちの中間の濃度である。増殖手順を、至適なＴｒｅｇ増殖をサポートするとわかっている条件に変えていくことができる。Ｔｃｏｎｖは、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５とを補充した完全培地中で増殖されることになる。
【０１８６】
ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇのサプレッサー機能を、標的Ｔｃｏｎｖとの共培養で評価することができる。標的Ｔｃｏｎｖは、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するようにレンチウイルスで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｔｒｅｇ機能を評価するために、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、ＣＦＳＥ標識ＣＤ１９  ＣＡＲ−ＴｃｏｎｖとＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞の両方と共に可溶性ＴＧＦ−βの存在下または非存在下で共インキュベートすることができる。ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔｃｏｎｖの増殖を、ＣＦＳＥ希釈によって、ならびにフローサイトメトリーによる生細胞数カウントによって評価することができる。この共培養状況でＴｒｅｇ増殖とＴｃｏｎｖ増殖とを明確に区別するために、ＣＦＳＥに基づく増殖アッセイを、より広範に使用される３Ｈ−チミジン取り込みアッセイの代わりに実施することができる。ＣＦＳＥ標識細胞をフローサイトメトリーにより初期の時点から正確に定量することができる一方で、ＣＦＳＥ希釈ピークは７日間にわたる細胞分裂動力学を表すことになる。陰性対照として、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−ＴｃｏｎｖまたはｓｃＦｖなしＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、共インキュベーションサンプルにおいてＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇと入れ替えることができる。ｓｃＦｖなしＣＡＲ−Ｔｒｅｇは多少の抑制機能を示すが、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、ＴＧＦ−βの産生及びそれに続くＴＧＦ−β  ＣＡＲを介したオートクリンＴｒｅｇ活性化のために抑制が増強されることが予測される。その上、外来性ＴＧＦ−βの添加によりＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇのサプレッサー機能がさらに強まり、その結果、ＣＤ１９＋標的細胞の存在にも関わらず、ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔｃｏｎｖの増殖が最少化することが予想される。
【０１８７】
インビトロでのＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇのサプレッサー機能を検証すると、操作されたＴｒｅｇのインビボでのサプレッサー機能の実行能力を見積もることができる。動物の検討に関しては、マウスＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、磁気ビーズに基づく細胞ソーティングによりＤＢＡ／１マウスのリンパ節及び脾臓から単離することになる。ヒトＴｒｅｇに関して前述したとおり、ＴＧＦ−β  ＣＡＲの発現のために、ソーティングされた細胞をマウスＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化し、形質導入し、増殖し、及びソーティングすることができる。ＴＧＦ−β  ＣＡＲはヒトＴＧＦ−βを標的とするｓｃＦｖで構築されているが、本発明者らは、この受容体がマウスＴＧＦ−βと高効率に交差反応することを確認した（図８）。コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）を誘発するために、ＤＢＡ／１マウスの尾部の付け根に、ＰＢＳに溶解した２ｍｇ／ｍｌのニワトリＩＩ型コラーゲンと０．１Ｍの酢酸とを１：１で混合した、完全フロインドアジュバントを含有する乳濁液１００μｌを注射することができる。ＣＩＡ免疫化の１日前かまたはＣＩＡ免疫の２週間後に、異なる疾患進行段階でのＴｒｅｇの性能を評価するため、１００万個のＴｒｅｇを尾静脈注射を介して投与することができる。関節炎を予防または寛解させる能力に関して、ＴＧＦ−β  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、ｓｃＦｖなしＣＡＲ−Ｔｒｅｇ及び「Ｔｒｅｇなし」対照（すなわち、ＣＩＡ免疫化後にＴｒｅｇが投与されていない対照）に対して比較することができる。Ｋｅｌｃｈｔｅｒｍａｎｓ，  Ｈ．らが以前に説明したとおり、マウスを４点尺度に基づいて足の臨床関節炎に関して評価することができる（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ７，  Ｒ４０２−４１５  （２００５））。１０匹の動物を各テスト条件に含めることができる（全４０匹の動物）。ｎ＝１０のサンプルサイズは、両側ｔ検定でα＝０．０５にてスコアリングする関節炎において、１．５標準偏差の差異を検出するように９２％の検出力を提供するものである。入手できる文献から、ｓｃＦｖなしＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、ＣＩＡモデルにおいて関節炎症候の顕著な抑制を達成すると予想される。一方で、ＴＧＦ−β  ＣＡＲの添加により、Ｔｒｅｇの機能性が増強され、さらなるＣＩＡの効果的な阻害をもたらすと予想される。長いスペーサーのＣＡＲか短いスペーサーのＣＡＲのどちらがＣＩＡモデルにおいて優れたインビボ機能性を呈するかについては今後の検討事項である。
【０１８８】
本明細書で開示及び請求される方法の全ては、本開示を考慮して、必要以上の実験を行うことなく実施かつ実行され得る。本発明の組成物及び方法は好ましい実施形態という点から記載されてきた一方で、本発明の概念、趣旨及び範囲を逸脱することなく、該方法に対して、及び本明細書に記載の方法の工程または工程の順序において、変更がなされてもよいことが当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連付けられる特定の作用剤が、本明細書に記載の作用剤に置き換えられ得るが、同一のまたは類似の結果が達成されるようになることが明らかであろう。当業者に自明のこうした類似の置換及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内にあると見なされる。全ての参考文献、引用文献、特許公報、及びに列挙された任意のＧｅｎｂａｎｋ受託番号に関連した配列は、あらゆる目的に対してその全体が参照により本明細書に具体的に援用される。
【０１８９】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補う例示的手順または他の詳細を提供する範囲内において、参照により本明細書に具体的に援用される。
2019500012.tif 000067
2019500012.tif 000068
2019500012.tif 000069
【図１】
2019500012.tif 000070
【図２】
2019500012.tif 000071
【図３】
2019500012.tif 000072
【図４】
2019500012.tif 000073
【図５】
2019500012.tif 000074
【図６】
2019500012.tif 000075
【図７】
2019500012.tif 000076
【図８】
2019500012.tif 000077
【図９】
2019500012.tif 000078
【図１０】
2019500012.tif 000079
【図１１】
2019500012.tif 000080
【図１２】
2019500012.tif 000081
【図１３】
2019500012.tif 000082
【図１４】
2019500012.tif 000083
【図１５】
2019500012.tif 000084
【図１６】
2019500012.tif 000085
【配列表】
2019500012000001.app
【国際調査報告】
2019500012.tif 000086
2019500012.tif 000087
2019500012.tif 000088
2019500012.tif 000089
2019500012.tif 000090