(57)【要約】長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬の投与を伴う癌ワクチンを対象に投与することにより、癌を有する対象を治療するための方法及び組成物が本明細書に提供される。例えば、投与する方法であって、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを、癌を有する対象に投与することを含み、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を約０．７ｍｇ／ｋｇ未満の用量において投与する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
投与する方法であって、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを、癌を有する対象に投与することを含み、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を約０．７ｍｇ／ｋｇ未満の用量において投与する方法。
【請求項２】
癌ワクチンの治療効力を増強する方法であって、癌ワクチンとＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを、癌を有する対象に投与することを含み、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を０．７ｍｇ／ｋｇ未満の用量において投与し、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の前記投与は、前記ワクチンに対する前記対象の応答を改善するために有効である方法。
【請求項３】
対象における癌を治療する方法であって、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを、癌を治療するために有効な量で前記対象に投与することを含み、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を約０．７ｍｇ／ｋｇ未満の用量において投与し、等量の前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとを使用して癌のマウスモデルにおいて評価する場合、前記ワクチンとＩＬ−２作動薬の非長時間作用バージョンとの投与と比べて前記治療の各々についての５０％の最大腫瘍成長間の時間遅延に基づき生存期間を少なくとも１５日だけ延長するために有効である方法。
【請求項４】
癌の治療を受ける対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を阻害する方法であって、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを、癌を治療するために有効な量で前記対象に投与することを含み、等量の前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとを使用して癌のマウスモデルにおいて評価する場合、腫瘍中のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇからなる群から選択される制御性Ｔ細胞の蓄積を、非長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとの投与時に観察されるものと比べて増強される量だけ阻害するために有効である方法。
【請求項５】
前記ワクチンを前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と別個に前記対象に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ワクチンを前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与前に前記対象に投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ワクチンと前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを治療の１日目に両方投与する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ワクチンを治療の１日目に投与し、前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を治療の１〜４日目のいずれか１日に投与する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象がヒトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が固形癌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が悪性黒色腫である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を０．７ｍｇ／ｋｇ未満〜約０．２ｍｇ／ｋｇの範囲の用量において投与する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が、１つの治療サイクル後に評価する場合、少なくとも２５％の固形腫瘍サイズの低下をもたらすために有効である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬がポリエチレングリコールに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬が平均６つのポリエチレングリコールポリマーに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ワクチンが抗原ワクチン、全細胞ワクチン、樹状細胞ワクチン、及びＤＮＡワクチンから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンが同種異系ワクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチンが自家ワクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチンが抗原ワクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原ワクチンが腫瘍特異的抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍特異的抗原が癌精巣抗原、分化抗原、及び広く存在する過剰発現腫瘍関連抗原から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ワクチンが新抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ワクチンを１つ以上のアジュバントを含む組成物の形態で投与する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
癌を有する対象の治療における使用に関する説明書が添付された、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを含むキット。
【請求項２６】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとが前記対象への投与のための単一の組成物中に含まれる、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記組成物が薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとが別個の容器中に提供される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記ワクチンと前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを別個に前記対象に投与するための説明書が添付された、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとの両方が固体形態である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとの各々が薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物内に含まれる、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を含む前記組成物と前記ワクチンを含む前記組成物との両方が５重量パーセント未満の水を含有する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と前記ワクチンとの両方が水性希釈剤中での再構成に好適な固体形態である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもと、２０１６年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４２０，４４２号明細書、及び２０１７年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２，８５２号明細書の優先権の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容は参照により全体として本明細書に援用される。
【０００２】
本願は、（特に）免疫療法の分野、特定の態様において癌免疫療法に関し、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬の投与を伴って癌ワクチンを個体に投与することによる、癌を有する個体の治療を含む。
【背景技術】
【０００３】
治療癌ワクチンは、感染及び疾患と闘う対象の免疫系の能力を刺激し、又は回復させることにより機能する物質のクラスを表す。治療ワクチンは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）又は予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）ワクチンとは対照的に、癌に対する身体の自然免疫応答をブーストすることにより既存の癌を治療するために使用され、免疫療法の１つの種類を表す。癌治療ワクチンは、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させ、それらを特異的種類の癌を認識し、それに対して作用するように指向し、又は癌細胞の表面上の分子に結合する抗体の産生を誘導するように設計される。しかしながら、有効な治療ワクチンの産生は困難な試みであることが証明されている。それというのも、ワクチン介入は、癌を持続するように機能する機序により抑止される身体の免疫系を撲滅しなければならないためである。治療癌ワクチンは、有効であるために、意図される標的に対する特異的免疫応答を刺激しなければならないだけでなく、癌細胞がそれら自体をキラーＴ細胞による攻撃から保護するために利用するバリアを克服するために十分に強力でなければならない。直近の数年間にわたり、様々なプラットフォームを包含する治療ワクチンの開発における多大な試行が存在しているが、１つのワクチンＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）（シプリューカル−Ｔ（ｓｉｐｕｌｅｕｃａｌ−Ｔ）、自家ワクチン）が今日までにＦＤＡ承認を受けたに過ぎない。治療ワクチンは、例えば乳癌、肺癌、黒色腫、膵癌、結腸直腸癌、及び腎癌を有する患者において評価されている（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１４，１１（９），５０９−５２４）。
免疫化抗癌方針を改善するため、アジュバントのような物質をワクチンに添加して強力な抗癌免疫応答を誘導するそれらの能力をブーストすることができるが、改善される応答は部分的及び／又は一過的であり得ることが多い。癌ワクチンのためのアジュバントは、種々の資源、例えば細菌、細菌により産生される物質、タンパク質、及び合成又は天然サイトカインに由来し得る。ワクチン誘導抗腫瘍活性を増強するための様々な物質、例としてサイトカインが調査されてきた。一部のサイトカインが有効なアジュバントとして機能すると考えられる一方、他のものが驚くべきことにワクチン効力のモジュレーションにおいて有効でないことが見出されている。癌治療ワクチンにおいて使用されるサイトカインには、例えばＩＬ−２、インターフェロン−アルファ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２０１４，１１（９），５０９−５２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今日まで様々なプラットフォームを包含する治療ワクチンの開発における多大な試行が存在しているが、新たなより有効な免疫療法ワクチン及び関連治療レジメンを特定及び提供することが依然として必要とされている。従って、本開示はこの及び他の必要性に対処しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様において、本明細書により詳細に記載されるワクチンとＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを、癌を有する対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【０００７】
第２の態様において、癌ワクチンの治療効力を増強する方法であって、治療癌ワクチンとＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを、癌を有する対象に投与することを含み、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、ワクチンに対する対象の応答を改善するために有効である方法が本明細書に提供される。
【０００８】
さらに別の第３の態様において、対象における癌を治療する方法であって、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを、癌を治療するために有効な量で対象に投与することを含み、癌のマウスモデルにおいて評価する場合、ワクチンとＩＬ−２Ｒ作動薬の非長時間作用バージョンとの投与と比べて両方の治療レジメンについての５０％の最大腫瘍成長間の時間遅延に基づき生存期間を少なくとも１５日だけ延長するために有効である方法が本明細書に提供される。
【０００９】
さらに第４の態様において、本開示は、癌の治療を受ける対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を阻害する方法であって、ＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを、癌性腫瘍を治療するために有効な量で対象に投与することを含み、癌のマウスモデルにおいて評価する場合、治療は非長時間作用バージョンのＩＬ−２Ｒ作動薬とワクチンとの投与時に観察されるものと比べて増強される量だけ腫瘍中のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇからなる群から選択される制御性Ｔ細胞の蓄積を阻害するために有効である方法を提供する。
【００１０】
明確にしておくと、投与順序に関して、ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、同時に又は連続的に、並びに任意の順序で、並びに同一及び／又は異なる投与経路により投与することができる。さらに、治療は、単一の治療サイクルを含み得、又は複数のサイクルを含み得る。
【００１１】
本明細書に提供される態様又は実施形態のいずれか１つ以上に関する１つ以上の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、約０．７ｍｇ／ｋｇ以下である用量において投与する。１つ以上の特定の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、約０．７ｍｇ／ｋｇ未満の用量において投与する。
【００１２】
前述の態様のいずれか１つ以上に関する１つ以上の実施形態において、ワクチンは、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と別個に対象に投与する。
【００１３】
さらに１つ以上の別の実施形態において、ワクチンは、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与前に対象に投与する。例えば１つ以上の実施形態において、ワクチンと長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とは治療の１日目に両方投与する。１つ以上の代替実施形態において、ワクチンを治療の１日目に投与し、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を治療の１〜４日目のいずれか１日に投与する。例えば長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、１、２、３、若しくは４日目のいずれか１日に、又はさらに後日投与する。
【００１４】
一部の実施形態において、対象はヒト対象である。
【００１５】
１つ以上のさらなる実施形態において、癌は固形癌である。例えば癌は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌からなる群から選択することができる。
【００１６】
さらに１つ以上の別の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ以下の範囲の用量において投与する。さらに１つ以上の別の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．２ｍｇ／ｋｇ未満の範囲の用量において投与する。一部の別の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、約０．７ｍｇ／ｋｇ以下〜約０．３ｍｇ／ｋｇの用量において、又は約０．７ｍｇ／ｋｇ以下〜約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量において投与する。長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬についての例示的な投与量には、例えば０．７ｍｇ／ｋｇ；０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、及び０．２ｍｇ／ｋｇが含まれる。
【００１７】
上記態様のいずれか１つ以上に関する一部の実施形態において、固形癌性腫瘍を治療する場合、本方法は、１つの治療サイクル後に評価する場合、少なくとも約２５％の固形腫瘍サイズの低下をもたらすために有効である。
【００１８】
一部の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、ポリエチレングリコールに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む。さらに一部のさらなる実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、４、５及び６つのポリエチレングリコールポリマーに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む。さらに一部の別の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、平均約６つのポリエチレングリコールポリマーに放出可能に共有結合しているアルデスロイキンを含む。１つ以上のさらなる実施形態において、アルデスロイキンに放出可能に共有結合しているポリエチレングリコールポリマーは、分枝状である。
【００１９】
前述の態様のいずれか１つ以上に関するさらに一部の別の実施形態において、ワクチンは、例えば抗原ワクチン、全細胞ワクチン、樹状細胞ワクチン、及びＤＮＡワクチンから選択される。１つ以上の実施形態において、ワクチンは、同種異系ワクチンである。或いは、一部の実施形態において、ワクチンは、自家ワクチンである。一部の別の特定の実施形態において、ワクチンは、抗原ワクチンである。１つ以上の関連実施形態において、抗原ワクチンは、腫瘍特異的抗原を含む。例えば一部の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、癌精巣抗原、分化抗原、及び広く存在する過剰発現腫瘍関連抗原から選択される。
【００２０】
さらに一部の別の実施形態において、ワクチンは新抗原を含む。
【００２１】
さらに別の態様において、癌を有する対象の治療における使用に関する説明書が添付されたＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとを含むキットが提供される。
【００２２】
キットの１つ以上の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとは対象への投与のための単一の組成物中に含まれ、単一の組成物は場合により、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
【００２３】
キットの一部の代替的実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとは別個の容器中に提供され、キットはワクチンと長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを別個に対象に投与するための説明書を含む。
【００２４】
キットの一部の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとの両方は固体形態である。１つ以上の関連実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとは、水性希釈剤中での再構成に好適な固体形態である。
【００２５】
さらに１つ以上の別の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンとの各々は薬学的に許容可能な賦形剤を各々含む別個の組成物内に含まれる。
【００２６】
さらに一部のさらなる実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を含む組成物とワクチンを含む組成物との両方は５重量パーセント未満の水を含有する。
【００２７】
さらなる態様及び実施形態は以下の詳細な説明及び特許請求の範囲に記載され、本開示はこれに関して限定されるものと見なすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ−Ｈ】図１Ａ〜１Ｈは、実施例２に記載の単一用量のＲＳＬＡＩＬ−２又は５日用量のアルデスロイキンによる治療後のＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおける免疫細胞変化を例示する。示される時点において動物から腫瘍浸潤リンパ球を単離し、免疫細胞集団をフローサイトメトリーにより評価した。各々のデータ点は個々のマウス腫瘍を表し、線は平均値を表す。データを各々の時点における３〜４つのレプリケートを用いる２〜４つの独立試験から組み合わせた。図１Ａは、ビヒクル（白丸）、アルデスロイキン（黒四角）及びＲＳＬＡＩＬ−２（黒三角）の各々による治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中のＣＤ８Ｔ細胞の総割合を示し；図１Ｂは、ビヒクル（白丸）、アルデスロイキン（黒四角）及びＲＳＬＡＩＬ−２（黒三角）の各々による治療後の様々な時点における腫瘍中のメモリーＣＤ８Ｔ細胞の割合を示し；図１Ｃは、ビヒクル（白丸）、アルデスロイキン（黒四角）及びＲＳＬＡＩＬ−２（黒三角）の各々による治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中の活性化ＮＫ細胞の割合を示し；図１Ｄ及び１Ｅは、治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中のＣＤ４Ｔ細胞の割合を示し；図１Ｆは、治療後の様々な時点（５、７、及び１０日目）における腫瘍中のＣＤ４Ｔｒｅｇ細胞の割合を示し；図１Ｇは、治療後の総ＣＤ４細胞のＴｒｅｇ細胞の割合を示し；図１Ｈは、治療後の総ＣＤ８細胞とＴｒｅｇ細胞との比を提供する。
【図２】図２は、実施例３に記載の非修飾ＩＬ−１（アルデスロイキン、黒逆三角）と比較したＲＳＬＡＩＬ−２（黒四角）（及びその放出活性コンジュゲートＩＬ−２形態、黒丸）の腫瘍薬物動態を実証するグラフである。
【図３Ａ−Ｄ】図３Ａ〜３Ｈは、樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、次いで実施例４において詳述される様々な治療群について詳述されるとおりの（ｉ）ＧＰ−１００、例示的なペプチドワクチン；抗ＣＤ４０ｍＡｂ；及びＴＬＲ−７作動薬、Ｒ８４８（レシキモド、イミダゾキノリン）を含有するカクテル製剤単独により、又は（ｉｉ）長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２（ＩＬ−２に基づき０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で、又は（ｉｉｉ）高用量若しくは低用量の非修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）のいずれかとの併用でワクチン接種したマウスにおける治療過程にわたる腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すプロットである。
【図３Ｅ−Ｈ】図３Ａ〜３Ｈは、樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、次いで実施例４において詳述される様々な治療群について詳述されるとおりの（ｉ）ＧＰ−１００、例示的なペプチドワクチン；抗ＣＤ４０ｍＡｂ；及びＴＬＲ−７作動薬、Ｒ８４８（レシキモド、イミダゾキノリン）を含有するカクテル製剤単独により、又は（ｉｉ）長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２（ＩＬ−２に基づき０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で、又は（ｉｉｉ）高用量若しくは低用量の非修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）のいずれかとの併用でワクチン接種したマウスにおける治療過程にわたる腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すプロットである。
【図４】図４は、実施例４に詳述される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける治療過程にわたる平均腫瘍サイズ（ｍｍ２）のグラフである。
【図５】図５は、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞機能に関連するプロットであり、即ち実施例４に詳述される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける治療過程にわたるＩＦＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１の割合として表現）を実証する。プロットは、ＧＰ１００／抗ＣＤ４０／ＴＲＬ−７作動薬／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群についての、ワクチン接種約４０日後まで拡大する９０％超における安定で持続的なＩＧＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１）応答を示し；ワクチン／ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法は、他の治療群と比べて最大割合のＩＦＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１）応答に達し、それを維持した。加えて、ワクチン／ＲＳＡＩＬ−２併用療法誘導ＩＧＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１）応答は他の治療群よりも降下が緩やかであった。
【図６】図６は、実施例４に詳述される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける治療過程にわたる生存パーセントを実証するプロットである。治療過程にわたる腫瘍サイズを示すプロット（図３Ａ〜３Ｈ及び図４）と一致して、ワクチン／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群（群８）についての生存期間は他の治療群と比較して有意に延長された。
【図７】図７は、実施例４に記載される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける治療過程にわたるｐｍｅｌ細胞パーセント（総ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合として表現）を実証するプロットである。ＲＳＬＡＩＬ−２は、ＧＰ−１００ワクチンと併用した場合、ペプチドワクチン療法と合わせた高用量及び低用量ＩＬ−１治療の両方と比較した場合に顕著に上昇したｐｍｅｌ−１応答を呈した。
【図８】図８は、実施例４に記載される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける治療過程にわたるＣＤ４細胞の割合として表現される制御性Ｔ細胞、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を示すプロットである。プロットから見て分かるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２誘導制御性Ｔ細胞の割合は各々の投与サイクルの終了付近で急速に減少する。
【図９】図９は、実施例５に記載される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける５、７、１０及び３０日目の各々における治療過程にわたるＴｈｙ１．１＋ｐｍｅｌ−１細胞の数／１グラムの腫瘍を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、実施例５に記載される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける５、７、１０及び３０日目の各々におけるＴｈｙ１．１＋ｐｍｅｌ−１細胞の数／１グラムの脾臓組織を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、実施例（例えば実施例６〜９）に記載のＣＴ２６マウス腫瘍細胞系からの２０個の新抗原に対応するＮＯＵＳ−０２０挿入配列、配列番号５を提供する。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは、実施例６に記載されるとおり、本明細書に記載されるマウス試験において使用される例示的なマウス新抗原癌ワクチン、ＮＯＵＳ−０２０の免疫原性を例示する。単一突然変異ペプチドに対するＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによりナイーブマウスにおける免疫化３週間後に計測したＴ細胞応答の分析を図１２Ａに示し、細胞内サイトカイン染色による２０個のペプチドのプールに対するものを図１２Ｂ（ペプチドのプール）に示す。５つの免疫原性ペプチド（＃３、１０、１７、１８、１９）に対する応答を示す。エピトープのＩＤは構築物中の抗原の位置に対応し、ＳＦＣはスポット形成細胞を指す。示されるとおり、例示的なマウス新抗原性癌ワクチン、ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄはＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を誘導する。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａは、実施例７に記載される試験におけるＣＤ８及びＣＤ４応答を誘導する新抗原を示す構築物の概略図を提供する。図１３Ｂは、２０個のワクチンコード新抗原のプールに対するＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによりナイーブマウスにおけるＧＡｄ／ＭＶＡ免疫化後に計測したＴ細胞応答の分析を提供する。
【図１４Ａ−Ｆ】図１４Ａ〜１４Ｆは、実施例８に記載されるとおりの非治療、ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチン単独による治療、ＲＳＬＡＩＬ−２単独による治療、又はＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチン及びＲＳＬＡＩＬ−２の併用による治療のいずれかを受容したＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＣＴ２６腫瘍成長のプロットである。図１４Ａは、対照群（非治療）についての結果を提供し；図１４Ｂは、ＧＡｄワクチン単独により治療したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍の容積を実証し；図１４Ｃ及び１４Ｄは、ＲＳＬＡＩＬ−２（それぞれ０又は７日目のいずれかに投与）並びに０日目におけるＲＳＬＡＩＬ−２及びＧＡｄの同時投与（図１４Ｅ）又は連続投与（図１４Ｆ）により治療したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍の容積をそれぞれ実証する。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａは、ＲＳＡＩＬ−２単独により治療した樹立腫瘍を有する個々のマウスにおける腫瘍容積のプロットであり；図１５Ｂは、実施例９に記載されるとおりのＮＯＵＳ−０２０ワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２との併用により治療した樹立腫瘍を有する個々のマウスにおける腫瘍容積のプロットである。ＣＲ＝完全奏効  ＰＲ＝部分奏効（＞４０％の腫瘍縮小）。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ及び１６Ｂは、それぞれ実施例９に記載されるとおりの（ｉ）ＲＳＬＡＩＬ−２のみ、及び（ｉｉ）ＮＯＵＳ−０２０及びＲＳＬＡＩＬ−２による治療に応答するマウスの脾臓中で計測した５４日目における免疫応答の分析を提供する。ワクチンによりコードされる上位５つの免疫原性新抗原のプールに対する及び残り１５個の新抗原に対するＴ細胞応答をＩＣＳにより定量した。点線及び実線は、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞についての陽性応答についての閾値をそれぞれ表す。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａは、実施例１０に記載される試験群の各々についての樹立ＣＴ２６腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける平均腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すグラフである。図１７Ｂは、実施例１０に詳述される試験群の各々についての樹立皮下ＣＴ２６腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける治療過程にわたる生存パーセントを実証するプロットである。プロットと一致して、ＡＨ１ワクチン／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群についての生存期間は他の治療群と比較して有意に延長された。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａは、樹立皮下ＣＴ２６腫瘍を担持し、実施例１０の試験群の各々について記載のとおり治療したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける脾臓組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇとの比を示す棒グラフである。図１８Ｂは、樹立皮下ＣＴ２６腫瘍を担持し、実施例１０の試験群の各々について記載のとおり治療したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇとの比を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
用語
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象が含まれる。
【００３０】
本開示のある特徴を記載し、及び特許請求するにあたり、特に記載のない限り以下に記載する定義に従い以下の用語を使用する。
【００３１】
語「〜を含む」を用いて本明細書に記載されるどの態様についても、「〜からなる」及び／又は「本質的に〜からなる」に関して記載される他の類似の態様も提供されることを理解すべきである。
【００３２】
「水溶性非ペプチドポリマー」は、室温で水に対して少なくとも３５％（重量基準）可溶であるポリマーを指す。しかしながら、好ましい水溶性非ペプチドポリマーは、好ましくは、水に対して７０％超（重量基準）、より好ましくは９５％超（重量基準）可溶である。典型的には、「水溶性」ポリマーの未ろ過水溶液調製物は、ろ過後の同じ溶液により透過される光の量の少なくとも７５％を透過する。好ましくは、このような未ろ過水溶液調製物は、ろ過後の同じ溶液により透過される光の量の少なくとも９５％を透過する。水に対して少なくとも９５％（重量基準）可溶であるか又は水に対して完全に可溶である水溶性ポリマーが最も好ましい。「非ペプチド性」であることに関して、ポリマーは、それが有するアミノ酸残基が３５％未満（重量基準）含有するとき非ペプチド性である。
【００３３】
用語「単量体」、「単量体サブユニット」及び「単量体ユニット」は、本明細書では同義的に使用され、ポリマーの基本構造単位の１つを指す。ホモポリマーの場合、単一の繰り返し構造単位がポリマーを形成する。コポリマーの場合、２つ以上の構造単位が−あるパターンで又はランダムに−繰り返すことでポリマーを形成する。本発明との関連において使用される好ましいポリマーはホモポリマーである。水溶性非ペプチドポリマーは、連続的に結合された１つ以上の単量体を含んで単量体の鎖を形成する。
【００３４】
「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」は、本明細書で使用されるとき、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することが意図される。特に指示されない限り、「ＰＥＧポリマー」又はポリエチレングリコールは、実質的に全ての（好ましくは全ての）単量体サブユニットがエチレンオキシドサブユニットであるものであり、しかしながらポリマーは、例えばコンジュゲーション用に、個別のエンドキャッピング部分又は官能基を含有してもよい。本発明で使用されるＰＥＧポリマーは、１つ以上の末端酸素が例えば合成変換中に置換されたか否かに応じて、以下の２つの構造のうちの一方を含み得る：「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」又は「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２−」。前述のとおり、ＰＥＧポリマーについては、変量（ｎ）は約３〜４０００の範囲であり、末端基及びＰＥＧ全体の構造は様々であり得る。
【００３５】
ポリマーの幾何学的配置又は全体構造に関して「分枝状」は、分岐点又は中央構造特徴部から延在する２つ以上のポリマー「アーム」又は「鎖」を有するポリマーを指す。
【００３６】
水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに関する分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれかとして表現することができる。特に示されない限り、本明細書の分子量への全ての言及は重量平均分子量を指す。分子量決定の両方、数平均及び重量平均は、ゲル浸透クロマトグラフィー又は他の液体クロマトグラフィー技術を使用して計測することができる。分子量値を計測する他の方法、例えば数平均分子量を決定するための末端基分析の使用若しくは束一性特性（例えば凝固点降下、沸点上昇、又は浸透圧）の計測又は重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心、若しくは粘度測定を使用することもできる。ＰＥＧポリマーは、典型的には、多分散性（即ちポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は等しくない）であり、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、いっそうより好ましくは約１．１０未満、さらによりいっそうより好ましくは約１．０５未満、最も好ましくは約１．０３未満の低多分散性値を有する。
【００３７】
「生理学的に切断可能な」又は「加水分解性の」又は「分解性の」結合とは、生理学的条件下で水と反応する（即ち加水分解される）比較的不安定な結合である。結合が水中で加水分解する傾向は、所与の分子内で２つの原子をつなぐ一般的な種類の結合に依存するのみならず、それらの原子に結合した置換基にもまた依存し得る。加水分解に不安定な又は弱い適切な結合としては、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド、オリゴヌクレオチド、チオエステル、及びカーボネートが挙げられる。
【００３８】
「酵素分解性の結合」は、１つ以上の酵素により分解を受ける結合を意味する。
【００３９】
「安定な」結合（ｌｉｎｋａｇｅ）又は結合（ｂｏｎｄ）は、水中で実質的に安定な化学結合、即ち、長期間にわたり生理学的条件下でいかなる認め得る程度の加水分解も受けない結合を指す。加水分解に安定な結合の例としては、限定はされないが、一般的に以下が挙げられ得る：炭素−炭素結合（例えば脂肪族鎖中の）、エーテル類、アミド類、アミン類など。概して、安定な結合は、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解速度を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、多くの標準的な化学テキストブックを参照することができる。
【００４０】
例えば活性部分、例えばインターロイキン−２に共有結合しているポリエチレングリコールの文脈における「放出可能な」共有結合は、生理学的条件下で、任意の好適な放出機序により、活性部分、例えばインターロイキン−２からポリエチレングリコールポリマー部分を放出し、又は脱離させるものである。
【００４１】
本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬への言及は、その薬学的に許容可能な塩形態を包含することを意味する。
【００４２】
「実質的に」又は「本質的に」とは、ほぼ全体的に又は完全に、例えばある所与の分量の９５％以上を意味する。
【００４３】
同様に、「約」又は「ほぼ」は、本明細書で使用されるとき、所与の分量のプラス又はマイナス５％を意味する。
【００４４】
「薬学的に許容可能な賦形剤」又は「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書に記載される組成物中に含まれ得る成分であって、対象に重大な有害毒性効果を引き起こさない成分を指す。
【００４５】
用語「患者」、又は「対象」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に提供されるとおりの化合物又は組成物又は併用の投与により予防又は治療することのできる病態、例えば癌に罹患している又はそれに罹り易い生物を指し、ヒト及び動物の両方が含まれる。対象には、限定されるものではないが、哺乳動物（例えばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、好ましくはヒトである。
【００４６】
「投与」は、当業者に公知の様々な方法及び送達系のいずれかを使用する対象への治療剤の導入を指す。例示的な投与経路には、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄又は、例えば注射若しくは点滴による他の非経口投与経路が含まれる。語句「非経口投与」は、本明細書で使用されるとき、通常、注射による腸内及び局所投与以外の投与方式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ管内、病変内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴が含まれる。治療剤は、非経口でない経路、又は経口経路により投与することもできる。他の非経口でない経路には、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば鼻腔内、経膣、経直腸、舌下又は局所投与経路が含まれる。
【００４７】
治療剤の「治療有効量」又は「治療有効投与量」は、単独で、又は別の治療剤との併用で使用する場合、（ｉ）疾患の発症から対象を保護する、又は（ｉｉ）病状の重症度の減少、無症状期間の頻度及び持続期間の増加、若しくは疾患の苦痛に起因する障害若しくは不能の予防により証明される疾患退縮を促進する薬剤の任意の量である。例えば疾患退縮を促進する治療剤の能力は、例えばヒト対象における、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系における当業者に公知の種々の方法を使用して、又はインビトロアッセイにおける薬剤の活性をアッセイすることにより評価することができる。
【００４８】
腫瘍の治療例として、薬剤又は薬剤の併用の治療有効量は、細胞成長又は腫瘍成長を、非治療対象と比べて少なくとも約１０％だけ、少なくとも約２０％だけ、少なくとも約３０％だけ、少なくとも約４０％だけ、少なくとも約５０％だけ、少なくとも約６０％だけ、少なくとも約７０％だけ、又は少なくとも約８０％だけ、少なくとも約９０％だけ、少なくとも約９５％だけ、又は少なくとも約１００％だけ阻害する量である。好ましくは、治療有効量は、細胞成長又は腫瘍成長を少なくとも約３０％だけ阻害する量である。
【００４９】
概要
現在の抗癌ワクチン方針に関連する欠点、例えば弱い免疫応答などの少なくとも一部に対処するための試行において、ワクチン及びＩＬ−２Ｒβ活性化量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を、癌を有する対象に投与することを含む方法が本明細書に提供される。癌ワクチンに対する抗腫瘍応答を改善するためにサイトカイン、例えばＩＬ−２、並びに他のアジュバントが探索されている一方、持続的で再現性のある有効なワクチンベース癌療法を提供するためにさらなる増強が必要とされている。従って、本開示は、少なくとも一部には、癌ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒ作動薬、より具体的には、ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を含む特に有益な療法薬併用の発見に基づく。
【００５０】
Ｉｌ−２は、アルファ（ＩＬ２Ｒα、ＣＤ２５）、ベータ（ＩＬ２Ｒβ、ＣＤ１２２）及び共通のガンマ鎖受容体（γｃ’ＣＤ１３２）を含有する受容体シグナリング複合体を通じて免疫細胞増殖及び活性化を刺激する。高用量において、ＩＬ２はヘテロ二量体ＩＬ２Ｒβγ受容体に結合し、腫瘍殺傷ＣＤ８＋メモリーエフェクターＴ（ＣＤ８Ｔ）細胞の所望の拡大をもたらす。しかしながら、ＩＬ２はそのヘテロ三量体受容体ＩＬ２Ｒαβγにもより大きな親和性で結合し、それが免疫抑制ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大し、それが癌免疫療法についての不所望な効果をもたらし得る。従って、ＩＬ−２増強抗癌ワクチン接種方針に関連する１つ以上の欠点を克服するための試みにおいて、治療癌ワクチン接種と、ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、特に長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬の投与とを併用する治療モダリティが本明細書に提供される。理論により拘束されるものではないが、本出願人らは、免疫抑制Ｔｒｅｇの活性化を担うＩＬ２Ｒαサブユニットと相互作用する領域をマスクする（即ちその活性を抑制し、又は減衰させる）長時間作用型ＩＬ−２化合物、即ち長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬を利用することにより、ワクチン接種誘導Ｔ細胞応答を選択的に拡大して優れた治療有効性を達成することができることを発見し、それは本開示及び裏付けの実施例から明らかになる。
【００５１】
ワクチン
本明細書に提供される治療方法は、ワクチン、即ち癌特異的免疫応答、例えば自然及び適応免疫応答を刺激するためのワクチンを、癌に対する宿主免疫を生成するために投与することを含む。本明細書に提供される組成物及び方法は、特に臨床及び研究用途の両方において使用される。様々な癌免疫原を本明細書に記載される方法に従って投与することができ、本発明はこれに関して限定されるものではない。良好なワクチン接種アウトカムは、ＩＬ−２経路により（即ちワクチンとの長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬の共投与により）達成して癌ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬の補完性に起因して所望のＴ細胞応答を刺激することができることが本出願人らの見地である。即ち、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬とワクチン接種との併用の投与を用いて以下のいずれか１つを達成することができる：（ｉ）複数のクラスのワクチンの有効性及び有用性の大きな増強、（ｉｉ）強力なＴ細胞応答の促進、並びに（ｉｉｉ）高、中程度及び低親和性抗原に対する免疫活性の増加。裏付けの実施例はこのアプローチの有用性を例示する。より特定すると、本明細書に例示されるとおり、長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、即ちＲＳＬＡＩＬ−２と癌特異的免疫応答を刺激するためのワクチン接種との併用は、以下の１つ以上を提供するために有効である：単一投与される場合のワクチン接種又は長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬のいずれか（即ち単独）と比べた抗腫瘍効果の有意な増強、生存期間の改善、及び腫瘍組織中のｐｍｅｌ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖拡大。
【００５２】
例示的なワクチンには、限定されるものではないが、例えば抗原ワクチン、全細胞ワクチン、樹状細胞ワクチン、及びＤＮＡワクチンが含まれる。さらに、特定の種類のワクチンに応じて、ワクチン組成物は、ワクチンに対する対象の免疫応答を増強させることが公知の１つ以上の好適なアジュバントを含み得る。ワクチンは、例えば細胞ベースであり得、即ち、患者自身の癌細胞からの細胞を使用して作出して抗原を同定し、得ることができる。例示的なワクチンには、対象からの活性化免疫細胞を他のタンパク質と共に同じ対象に再度送達してそれらの腫瘍抗原によりプライミングされる免疫細胞の免疫活性化をさらに容易にする腫瘍細胞ベース及び樹状細胞ベースワクチンが含まれる。腫瘍細胞ベースワクチンには、全腫瘍細胞及び遺伝子改変腫瘍細胞が含まれる。全腫瘍細胞ワクチンは、場合により、例えば腫瘍細胞又は腫瘍溶解物のいずれかの放射線照射により抗原提示を増強するように処理することができる）。ワクチン投与には、用いられるワクチンの種類に応じて、アジュバント、例えばバチルスカルメットゲラン（ＢＣＧ）又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）も伴い得る。プラスミドＤＮＡワクチンも使用することができ、直接注射又は粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）により投与することができる。ペプチドワクチン、ウイルス遺伝子導入ベクターワクチン、及び抗原改変樹状細胞（ＤＣ）も使用に企図される。
【００５３】
一部の実施形態において、ワクチンは治療癌ペプチドベースワクチンである。ペプチドワクチンは、既知配列を使用して、又は（１つ以上の）対象自身の腫瘍からの単離抗原から作出することができ、新抗原及び改変抗原が含まれる。例示的な抗原ベースワクチンには、抗原が腫瘍特異的抗原であるものが含まれる。例えば腫瘍特異的抗原は、特に癌精巣抗原、分化抗原、及び広く存在する過剰発現腫瘍関連抗原から選択することができる。組換えペプチドワクチンは、腫瘍関連抗原からのペプチドをベースとし、本方法において使用する場合、アジュバント又は免疫モジュレーターと投与又は製剤化することができる。ペプチドベースワクチンにおいて使用される例示的な抗原には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる。それというのも、このリストは純粋に例示であることを意味するためである。例えばペプチドワクチンは、成体組織中で通常はサイレンシングされるが、腫瘍細胞中で転写的に再活性化される遺伝子によりコードされる癌精巣抗原、例えばＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２を含み得る。或いは、ペプチドワクチンは、組織分化関連抗原、即ち正常組織起源で正常及び腫瘍性組織の両方により共有される抗原を含み得る。例えばワクチンは、黒色腫関連抗原、例えばｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｍａｒｔ−１、ＭＡＧＥ−３、若しくはチロシナーゼを含み得；又は前立腺癌抗原、例えばＰＳＡ若しくはＰＡＰを含み得る。ワクチンは、乳癌関連抗原、例えばマンマグロビン−Ａを含み得る。本方法において使用されるワクチン中に含まれ得る他の腫瘍抗原には、例えばＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ１／Ｎｕｅ、ｈＴＥＲＴ、ｒａｓ、及びＢ−ｒａｆが含まれる。ワクチン中で使用することができる他の好適な抗原には、癌幹細胞又はＥＭＴプロセスに関連するＳＯＸ−２及びＯＣＴ−４が含まれる。
【００５４】
抗原ワクチンには、多抗原及び単一抗原ワクチンが含まれる。例示的な癌抗原には、約５〜約３０個のアミノ酸、又は約６〜２５個のアミノ酸、又は約８〜２０個のアミノ酸を有するペプチドが含まれ得る。
【００５５】
上記のとおり、免疫刺激アジュバント（ＲＳＬＡＩＬ−２と異なる）をワクチン中で、特に腫瘍関連抗原ベースワクチン中で使用して有効な免疫応答の生成を支援することができる。例えばワクチンは、病原菌関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を取り込んで免疫の改善を支援し得る。さらなる好適なアジュバントには、モノホスホリルリピドＡ、又は他のリポ多糖；トル様受容体（ＴＬＲ）作動薬、例えばイミキモド、レシキモド（Ｒ−８４８）、ＴＬＲ３、ＩＭＯ−８４００、及びリンタトリモドなどが含まれる。使用に好適なさらなるアジュバントには、熱ショックタンパク質が含まれる。
【００５６】
遺伝子ワクチンも、本明細書に提供される方法における使用に好適である。遺伝子ワクチンは、典型的には、発現カセットを担持するウイルス又はプラスミドＤＮＡベクターを使用する。それらは投与時に体細胞又は樹状細胞に炎症応答の一部として形質移入し、それによりクロスプライミング又は直接的な抗原提示をもたらす。一部の実施形態において、遺伝子ワクチンは１回の免疫化において複数の抗原の送達を提供するものである。遺伝子ワクチンには、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン及びウイルスベースワクチンが含まれる。
【００５７】
本方法において使用されるＤＮＡワクチンは、腫瘍抗原を送達及び発現するために構築される細菌プラスミドである。ＤＮＡワクチンは、任意の好適な投与方式、例えば皮下又は皮内注射により投与することができるが、リンパ節中に直接注射することもできる。さらなる送達方式には、例えば遺伝子銃、エレクトロポレーション、超音波、レーザー、リポソーム、微粒子及びナノ粒子が含まれる。
【００５８】
より特定すると、一部の実施形態において、ワクチンは新抗原、又は複数の新抗原を含む。即ち、一部の実施形態において、ワクチンは新抗原ベースワクチンである。このアプローチは、マウス癌モデルを使用して本明細書の実施例６〜９に例示される。例えば一部の実施形態において、新抗原ベースワクチン（ＮＢＶ）組成物は、複数の癌新抗原をタンデムでコードし得、各々の新抗原は癌細胞中で突然変異しているタンパク質に由来するポリペプチド断片である。例えば新抗原ワクチンは、複数の免疫原性ポリペプチド断片（癌細胞中で突然変異しているタンパク質の各々）をコードする核酸構築物を含む第１のベクターを含み得、各々の免疫原性ポリペプチド断片が元のタンパク質からの様々な数の野生型アミノ酸によりフランキングされる１つ以上の突然変異アミノ酸を含み、各々のポリペプチド断片が頭尾連結して免疫原性ポリペプチドを形成する。免疫原性ポリペプチドを形成する免疫原性ポリペプチド断片の各々の長さは異なり得る。
【００５９】
ウイルス遺伝子導入ベクターワクチンも使用することができ；このようなワクチンにおいて、組換え遺伝子操作ウイルス、酵母、細菌などを使用して癌特異的タンパク質を患者の免疫細胞に導入する。腫瘍溶解又は非腫瘍溶解性であり得るベクターベースアプローチにおいて、ベクターは例えばその固有の免疫刺激特性に起因してワクチンの効率を増加させ得る。例示的なウイルスベースベクターには、ポックスウイルス科、例えばワクシニア、改変ワクシニア株アンカラ及びアビポックスウイルスからのものが含まれる。複製コンピテントワクシニアプライミングベクター及び複製インコンピテントフォウルボックス（ｆｏｗｌｂｏｘ）ブーストベクターを含有する癌ワクチン、ＰＲＯＳＴＶＡＣも使用に好適である。各々のベクターは、ＰＳＡについてのトランス遺伝子並びにまとめてＴＲＩＣＯＭと称される３つの共刺激分子、ＣＤ８０、ＣＤ５４及びＣＤ５８を含有する。他の好適なベクターベース癌ワクチンには、Ｔｒｏｖａｘ及びＴＧ４０１０（ＭＵＣ１抗原及びＩＬ−２をコードする）が含まれる。
【００６０】
使用されるさらなるワクチンには、細菌及び酵母ベースワクチン、例えば組換えリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）が含まれる。
【００６１】
上記のとおり、前述のワクチンは、アジュバント及び他の免疫ブースターと併用及び／又は製剤化して有効性を増加させることができる。さらに、特定のワクチンに応じて、投与は腫瘍内又は非腫瘍内（即ち全身）のいずれでもよい。一部の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と投与されるワクチンは、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）ワクチンでない。一部の他の実施形態において、ワクチンは、抗ＣＤ４０作動薬及びＴＬＲ７作動薬を含む製剤カクテルの成分として投与されるｇｐ１００ワクチンでない。
【００６２】
癌ワクチンは、本明細書に記載される任意の好適な投与経路、例えば皮内、静脈内、皮下、節内、リンパ管内、腫瘍内投与などにより投与することができる。
【００６３】
長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬
本明細書に記載される方法、製剤、キットなどは、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与を含む。これに関連して、本開示は、その作動薬が同じインビトロモデルにおけるＩＬ−２Ｒαβへの結合親和性よりも少なくとも５倍高い（より好ましくは少なくとも１０倍高い）ＩＬ−２Ｒβへのインビトロ結合親和性を呈し、ＩＬ−２よりも少なくとも１０倍有効なインビボ半減期（ＩＬ−２のインビボ消失に基づく半減期）を有する限り、いかなる特定の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬にも限定されない。例として、ＩＬ−２に対する親和性を基準として計測することが可能である。これに関連して、本明細書中の実施例１に言及されるＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２と比べてＩＬ−２Ｒαβへの親和性の約６０倍の低下を呈するが、ＩＬ−２Ｒβへの親和性はＩＬ−２と比べて約５倍の低下に過ぎない。
【００６４】
長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の非限定的な例が国際公開第２０１２／０６５０８６号パンフレット及び国際公開第２０１５／１２５１５９号パンフレットに記載されている。例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は本願の実施例１に言及されるＲＳＬＡＩＬ−２であり、放出可能ＰＥＧは下記のとおりの２，７，９置換フルオレンをベースとし、ポリ（エチレングリコール）鎖は、フルオレン環上の２及び７位からアミド結合（フルオレン−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）、及びフルオレン環の９位にメチレン基（−ＣＨ２−）により結合しているカルバメート窒素原子への結合によるＩＬ−２への放出可能な共有結合により延在している。これに関連して、ＲＳＬＡＩＬ−２は、以下の式：
【化１】
2019534308.tif 000002
［式中、ＩＬ−２はＩＬ−２の残基であり、及び「ｎ」は約３〜約４０００の整数である］に包含される化合物、及びその薬学的に許容可能な塩を含む組成物である。上記式に示されるとおり、ＩＬ−２分子は、好ましくは、それに共有結合している上記のとおりの４、５、又は６つの分枝状ポリエチレングリコール部分を有する。１つ以上の実施形態において、この組成物は、以下の式：
【化２】
2019534308.tif 000003
［式中、ＩＬ−２はＩＬ−２の残基であり、（ｎ）（ＩＬ−２に結合しているポリエチレングリコール部分の数を指す）は１、２、３、７及び＞７からなる群から選択される整数である］に包含される化合物、及びその薬学的に許容可能な塩を１０％以下（モル量基準）、好ましくは５％以下（モル量基準）含有する。一部の実施形態において、ＲＳＬＡＩＬ−２はＩＬ−２に結合している平均約６つのポリエチレングリコール部分を有する。
【００６５】
組成物、例えば本明細書に記載されるＲＳＬＡＩＬ−２組成物についての平均ＰＥＧ化度を決定するため、典型的には、タンパク質をビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイのような方法により又はＵＶ分析により定量して試料中のタンパク質のモル数を決定する。次にＰＥＧ部分を放出させる条件に試料を曝露してＰＥＧ部分を放出させ、次に放出されたＰＥＧを定量し（例えばＢＣＡ又はＵＶによる）、タンパク質モル数と相関させて平均ＰＥＧ化度を決定する。
【００６６】
一部の別の実施形態において、ＲＳＬＡＩＬ−２は、一般に、不活性プロドラッグ、即ち投与時に不活性であると見なされ、インビボでのポリエチレングリコール部分の徐放により、腫瘍部位における持続濃度を達成するために有効なインターロイキン−２の活性コンジュゲート形態を提供する。実施例２に提供されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２は、ＣＤ−１２２（ＩＬ−２Ｒβとしても公知）作動薬、即ちＣＤ−１２２（ＩＬ−２Ｒβ）を活性化させ又は刺激し得る分子であると見なすことができる。さらに、ＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒαβγと比べてＩＬ−２Ｒβγに選択的に結合し、それを活性化させるＣＤ−１２２作動薬であると見なすことができる。
【００６７】
ＲＳＬＡＩＬ−２のさらなる例示的な組成物は、分子の全てのポリマー部分が約２５０ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する上記の式に係る化合物を含む。さらなる好適な範囲としては、約１，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンから選択される範囲、約５，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約５５，０００ダルトンの範囲、約１５，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの範囲、及び約２０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。
【００６８】
ポリエチレングリコールポリマー部分のさらなる例示的な重量平均分子量としては、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。一部の実施形態において、ポリエチレングリコールポリマーの重量平均分子量は約２０，０００ダルトンである。
【００６９】
上記のとおり、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。典型的には、かかる塩は薬学的に許容可能な酸又は酸等価物との反応によって形成される。これに関連して用語「薬学的に許容可能な塩」は、概して、比較的非毒性の無機酸及び有機酸付加塩を指し得る。これらの塩は、投与媒体又は剤形製造過程においてインサイチューで、又は別途本明細書に記載されるとおりの長時間作用型インターロイキン−２を好適な有機酸又は無機酸と反応させて、そのようにして形成された塩を単離することにより調製し得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、シュウ酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）「薬学的塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ）」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。従って、記載されるとおりの塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来してもよく；又は酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎｉｃ）などの有機酸から調製されてもよい。
【００７０】
前述のＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬に関して、用語「ＩＬ−２」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ−２活性を有する部分を指す。用語、「残基」は、ＩＬ−２の残基の文脈では、上記の式に示されるとおり、ＩＬ−２分子のうち１つ以上の共有結合部位においてポリエチレングリコールなどのポリマー剤との共有結合後に残る部分を意味する。非修飾ＩＬ−２がポリエチレングリコールなどのポリマーに結合すると、その１つ以上のポリマーとの連結に付随する１つ以上の共有結合の存在によってＩＬ−２は僅かに変化することが理解されるであろう。この僅かに変化した形態の、別の分子に結合したＩＬ−２が、ＩＬ−２の「残基」と称される。
【００７１】
例えば、国際公開第２０１２／０６５０８６号パンフレットに記載される配列番号１〜４のいずれか一つに対応するアミノ酸配列を有するタンパク質が、それらと実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドと同様に、例示的ＩＬ−２タンパク質である。これらの配列も本明細書に提供される。用語の実質的に相同とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が１つ以上の置換、欠失、又は付加だけ参照配列と異なるが、その正味の効果は参照配列と対象配列との間に有害な機能的相違をもたらさないものであることを意味する。本明細書の目的上、９５パーセントより高い相同性、等価な生物学的活性（必須ではないが等価な生物学的活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同と見なされる。相同性を決定する目的上、成熟配列のトランケーションは無視しなければならない。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−２」には、例えば部位特異的突然変異誘発によるとおり意図的に修飾されるか、又は突然変異を通じて偶発的に修飾されたタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、１〜６つのさらなるグリコシル化部位を有する類似体、タンパク質のカルボキシ端側末端に少なくとも１つのさらなるアミノ酸を有する類似体であって、そのさらなる１つ以上のアミノ酸が少なくとも１つのグリコシル化部位を含む類似体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え生成された部分の両方が含まれる。加えて、ＩＬ−２は、ヒト供給源、動物供給源、及び植物供給源に由来し得る。一つの例示的ＩＬ−２は、アルデスロイキンと称される組換えＩＬ−２である（配列番号３）。
【００７２】
化合物の放射標識、そのインビボ投与、及びそのクリアランスの決定が関わるものなどの従来手法を用いて、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬であると提案される化合物が「長時間作用型」であるかどうかを決定することができる。本明細書における目的上、ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の性質は、典型的には、マウスにおいて評価しようとする作動薬の投与後の様々な時点でフローサイトメトリーを用いてリンパ球のＳＴＡＴ５リン酸化を計測することにより決定される。参考として、ＩＬ−２では約２４時間までにシグナルが失われるが、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬についてはそれより長い期間持続する。例示として、ＲＳＬＡＩＬ−２の組成物についてシグナルは数日間持続する。
【００７３】
ここで本明細書に記載される長時間作用型作動薬のＩＬ−２Ｒβバイアスを考慮して、実施例２は、ＲＳＬＡＩＬ−２の例示的組成物についての受容体バイアスに関連するインビトロ及びインビボデータの両方を提供する。実施例２に記載されるとおり、マウス黒色腫腫瘍モデルにおいて、ＩＬ−２と比較した場合のＲＳＬＡＩＬ−２についてのＣＤ８／制御性Ｔ細胞の比は、ＩＬ２受容体アルファと比べたＩＬ−２受容体ベータの優先的な活性化を裏付ける。例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２は、例えばＴｒｅｇと比べてエフェクターＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を優先的に活性化させ、拡大するために有効である。
【００７４】
さらに、代表的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２と比べて増加した腫瘍曝露、好ましくは有意に増強された腫瘍曝露、例えばＩＬ−２の等価物について正規化した場合、少なくとも５０倍増加した曝露、又は少なくとも１００倍増加した曝露、又は少なくとも２００倍増加した曝露、又は少なくとも３００倍増加した曝露、又は少なくとも４００倍増加した曝露、又は少なくとも５００倍増加した曝露を提供する。例示として、マウス黒色腫腫瘍モデルにおけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を実施例３に記載する。それに記載されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２は、例えばＩＬ−２と比べて５００倍（ＩＬ−２等価物に基づき正規化）、有意に増強された腫瘍曝露を提供することが見出された。
【００７５】
本明細書に記載される長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の特徴の少なくとも１つ以上に基づき、免疫抑制Ｔｒｅｇの活性化を担うＩＬ２Ｒαサブユニットと相互作用する領域をマスクする長時間作用型ＩＬ−２化合物を投与することにより、癌患者におけるワクチン接種誘導Ｔ細胞応答を選択的に拡大してそれにより優れた治療有効性を達成するために有効な方法が本明細書に提供される。
【００７６】
本明細書に記載される方法、組成物、及びキットによれば、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬はＩＬ−２Ｒβ活性化量で提供される。当業者は、どのくらいの所与の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬がＩＬ−２Ｒβにおける臨床的に有意味なアゴニスト活性をもたらすのに十分であるかを決定することができる。例えば、当業者は文献を参照してもよく、及び／又は一連の漸増量の長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬を投与して、どの１つ以上の量がＩＬ−２Ｒβの臨床的に有意味なアゴニスト活性をもたらすかを決定してもよい。或いは、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の活性化量を、上記に記載されるインビボＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて決定する（投与後にインビボで決定する）ことができ、ここではピーク時点でＮＫ細胞の１０％を上回るＳＴＡＴ５リン酸化を誘導するのに十分な量が活性化量と見なされる。
【００７７】
しかしながら、１つ以上の例において、ＩＬ−２Ｒβ活性化量は、タンパク質の量で表現される以下の範囲の１つ以上により包含される量である：約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ；約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ；約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ；約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ；約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ。一部の実施形態において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、０．７ｍｇ／ｋｇ以下の用量において投与する。特定の例示的な投与量範囲には、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ又は約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約０．７ｍｇ／ｋｇ未満が含まれる。
【００７８】
確認のために言えば、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬に関して、活性化の量及び程度は大きく異なり得、治療癌ワクチンの投与と合わせた場合になおも有効であり得る。即ち、ＩＬ−２Ｒβでごく最小限の作動薬活性を十分に長期間にわたり呈する長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の量は、癌ワクチンと投与する場合、本明細書に記載される方法、組成物、及びキットが臨床的に意味のある応答を可能とする限り、なおも長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬であり得る。一部の例において、（例えば）相乗的相互作用及び応答に起因して、抗癌ワクチン接種を伴う場合、ＩＬ−２Ｒβの作動薬活性は最小限だけ要求され得る。
【００７９】
本明細書に記載される治療方法は、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効であると見なす限り継続され得る。治療方法が有効であることの指標となる非限定的パラメータには、以下のいずれか１つ以上が含まれる：腫瘍縮小（重量及び／又は容積の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；及び無進行生存。腫瘍サイズの変化は、任意の好適な方法、例えばイメージングにより決定することができる。様々な診断イメージングモダリティ、例えばコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、二重エネルギーＣＤＴ、陽電子放出断層撮影及びＭＲＩを用いることができる。
【００８０】
ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の実際の用量、並びに本明細書に記載される方法、組成物、及びキットに関連する投与レジメンは、対象の年齢、体重、及び全身状態並びに治療下の癌の種類及び進行、医療専門家の判断、並びに投与すべき特定のワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬に応じて異なる。
【００８１】
ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与頻度及びスケジュールに関して、当業者は適切な頻度を決定することが可能であろう。例えば臨床医は、治療サイクルにおいて、ワクチンを例えば単一用量として又は例えば数日間若しくは数週間の過程にわたる一連の用量のいずれかで投与することを決定することができる）。長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、ワクチンと同時に、又はワクチン接種前、又は癌ワクチン投与後のいずれかで投与する。例えば一部の治療モダリティにおいて、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、ワクチン投与の７日以内に（例えば１、２、３、４、５、６、又は７日目のいずれか１日に）投与する。一部の例において、長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、ワクチン接種の４日以内、例えば１、２、３、又は４日目のいずれか１日に投与する。ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の長時間作用性質に基づき、このような化合物は、典型的には、比較的低頻度で（例えば３週間に１回、２週間に１回、８〜１０日に１回、週に１回など）投与する。
【００８２】
治療過程に関連する例示的な時間の長さには、約１週間；約２週間；約３週間；約４週間；約５週間；約６週間；約７週間；約８週間；約９週間；約１０週間；約１１週間；約１２週間；約１３週間；約１４週間；約１５週間；約１６週間；約１７週間；約１８週間；約１９週間；約２０週間；約２１週間；約２２週間；約２３週間；約２４週間；約７ヵ月；約８ヵ月；約９ヵ月；約１０ヵ月；約１１ヵ月；約１２ヵ月；約１３ヵ月；約１４ヵ月；約１５ヵ月；約１６ヵ月；約１７ヵ月；約１８ヵ月；約１９ヵ月；約２０ヵ月；約２１ヵ月；約２２ヵ月；約２３ヵ月；約２４ヵ月；約３０ヵ月；約３年；約４年；約５年が含まれる。
【００８３】
本明細書に記載される治療方法は、典型的には、患者ケアを監督する臨床医がその治療方法を有効である、即ち患者が治療に応答していると見なす限り継続される。治療方法が有効であることの指標となる非限定的なパラメータには、以下の１つ以上が含まれ得る：腫瘍縮小（重量及び／又は容積及び／又は外観の点で）；個別の腫瘍コロニーの数の減少；腫瘍消失；無進行生存；好適な腫瘍マーカーによる適切な応答（該当する場合）、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞数の増加、Ｔ細胞数の増加、メモリーＴ細胞数の増加、セントラルメモリーＴ細胞数の増加、制御性Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数の低下。
【００８４】
本明細書に提供される方法は、（特に）癌に罹患している患者の治療に有用である。例えば患者はワクチン単独、並びに長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬との併用に応答性であり得るが、その併用により応答性である。別の例として、患者はワクチン又は長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬のいずれかに対して非応答性であり得るが、その併用に対して応答性である。さらに別の例として、患者はワクチン又は長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬単独のいずれかに対して非応答性であり得るが、その併用に対して応答性である。
【００８５】
例えばワクチン及び／又は長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与は、典型的には注射によるものである。肺内、鼻内、頬側、直腸、舌下及び経皮など、他の投与方法もまた企図される。本明細書で使用されるとき、用語「非経口」には、皮下、静脈内、動脈内、腫瘍内、リンパ管内、腹腔内、心臓内、くも膜下腔内、及び筋肉内注射、並びに点滴注射が含まれる。上記のとおり、ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬は、別個に投与することができる。或いは、初回用量として、又は治療過程全体にわたり、又は投与レジメンの様々な段階においてワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の投与が同時であることが所望される場合（及びワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬が互いに及び所与の製剤中で適合する）、単一剤形／製剤の投与（例えば両方の免疫学的成分を含有する静脈内製剤の静脈内投与）により同時投与を実現することができる。当業者はルーチンの試験を通じて、２つのそのような成分が互いに及び所与の製剤中で適合するかどうかを決定することができる。例えば患者への投与は、ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬と希釈剤とを含む組成物を注射することにより達成することができる。加えて、患者への投与は、癌ワクチン及び希釈剤の注射により達成することができる。さらに、投与は、ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とワクチンと希釈剤とを含む組成物を注射することにより達成することができる。可能な希釈剤に関して、希釈剤は、注射用静菌水、水中デキストロース５％、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、乳酸加リンゲル溶液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びこれらの組み合わせからなる群から選択することができる。当業者は、２つの所与の薬理成分が所与の製剤中で共に適合するかどうかをルーチンの試験で決定することができる。
【００８６】
本明細書に記載される療法薬併用、即ち長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬及びワクチンは、キットの形態で提供することができる。上記のとおり、成分は、単一の組成物中に、場合により、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を伴って含めることができ、又は別個の容器中で提供することができ、キットは、典型的には、使用説明書を含む。好適な薬学的に許容可能な賦形剤には、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，７ｔｈｅｄ．，Ｒｏｗｅ，Ｒ．Ｃ．，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２に記載のものが含まれる。キット成分、例えばワクチンと長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬とを含む組成物は、液体又は固体形態のいずれかであり得る。ある好ましい実施形態において、ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬の両方は、固体形態である。好ましい固体形態は、例えば５重量パーセント未満の水、又は好ましくは２重量パーセント未満の水を含有する固体乾燥形態であるものである。固体形態は、一般に水性希釈剤中での再構成に好適である。
【００８７】
ここに記載した方法、キット及び関連組成物は、本明細書に記載される方法により治癒又は予防し得る任意の病態、例えば癌に罹患している患者の治療に使用することができる。癌は、体内の異常細胞の無制御成長により特徴付けされる様々な疾患の広いグループを指し、癌又は癌組織には腫瘍が含まれ得る。例示的病態は、癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、脳癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、脳癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び白血病である。一部の特定の実施形態において、治療すべき癌は、固形癌、例えば乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、骨癌、結腸直腸癌、胃癌、リンパ腫、悪性黒色腫、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、甲状腺癌、腎癌、胆管癌、脳癌、子宮頸癌、上顎洞癌、膀胱癌、食道癌、ホジキン病及び副腎皮質癌などである。
【００８８】
本方法、キット及び組成物は、例えばワクチンに対する対象の応答を改善することによる癌ワクチンの治療効力の増強に有用である。増強された応答は、治療の間、単一の治療ラウンド後、２〜３つの治療サイクル後など任意の好適な時点において、及び多数の好適な方法のいずれか、例として、腫瘍の縮小（部分奏効）、即ち腫瘍サイズ又は容積の評価、腫瘍の消失、疾患進行の低下（癌は進行していない）、及び１つ以上の腫瘍試験マーカーの分析により適宜評価することができる。一部の例において、治療有効性の指標は、ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬による治療と、対応するＩＬ−２の非長時間作用バージョンと投与される（例えば同等数のＩＬ−２等価物を達成するように投与される）ワクチンによる治療とを比較する場合、５０％の最大腫瘍成長間の時間遅延に関して計測することができる。比較は、ヒト患者において、又は好適な動物モデル、例えば好適なマウス癌モデルにおいて実施することができる。特に有効な治療は、５０％の最大腫瘍成長において評価する場合）、少なくとも５日、又は少なくとも１０日、又は少なくとも１２日、又は少なくとも１５日だけ、又は少なくとも２０日だけ、又は少なくとも３０日以上だけ生存期間を延長する。
【００８９】
本明細書に提供される方法、キット、組成物などは、治療を受ける対象における腫瘍成長又はサイズ（又は容積）の低下にも有用である。治療有効量の癌ワクチン及び長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えば本明細書に提供されるものを、樹立腫瘍を有する対象に投与することによる治療は、１つ以上の実施形態において、対象における腫瘍成長又はサイズを低下させるために有効である。例えば一部の実施形態において、１つ以上の治療サイクルは、腫瘍サイズを治療前の腫瘍サイズと比較する場合に約２５％だけ、又は約３０％だけ、又は約４０％だけ、又は約５０％だけ、又はさらには約６０％だけ、又は約７０％以上だけ低下させるために有効である。
【００９０】
さらに一部の別の実施形態において、本明細書に提供される方法、キット、組成物などは、癌の治療を受ける対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を阻害するために有効である。一部の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、腫瘍中のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ、及びＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇからなる群から選択される制御性Ｔ細胞（即ち前述の細胞型のいずれか１つ）の蓄積を、非長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えばＩＬ−２及びワクチンの投与時に観察されるものと比べて増強される量だけ阻害するために有効である。例えば対象Ｔｒｅｇ（単一で又はＴｒｅｇの考えられる併用のいずれか１つとして計測する）は、ワクチン及びＩＬ−２による治療と比較する場合、１．５倍以上、又は２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上だけ阻害することができる。治療は、一部の実施形態において、対象における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の蓄積を、非治療対象と比較する場合、少なくとも２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上、又は５倍以上、又は６倍以上だけ阻害するために有効であり得る。
【００９１】
さらに一部の別の実施形態において、本明細書に提供される方法、キット、組成物などは、対象におけるＴ細胞及び／又はＮＫ細胞活性及び／又は増殖を刺激するために有効である。一部の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、対象におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加に有効である。さらに一部の他の実施形態において、本方法は、例えば対応する癌の癌マウスモデルにおいて評価する場合、対象におけるＮＫ細胞数を増加させるために有効である。例えば対象のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ワクチン及び非修飾ＩＬ−２による治療と比較する場合、１．５倍以上、又は２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上だけ増加させることができる。治療は、一部の実施形態において、対象のＣＤ８＋Ｔ細胞を、非治療対象と比較する場合、少なくとも２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上、又は５倍以上、又は６倍以上だけ増加させるために有効であり得る。同様に、対象のＮＫ細胞は、ワクチン及び非修飾ＩＬ−２による治療と比較する場合、１．５倍以上、又は２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上だけ増加させることができる。治療は、一部の実施形態において、対象のＮＫ細胞数を、非治療対象と比較する場合、少なくとも２倍以上、又は３倍以上、又はさらには４倍以上、又は５倍以上、又は６倍以上だけ増加させるために有効であり得る。
【００９２】
実施例について見ると、少なくとも実施例４及び５は、例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２の投与を伴う例示的な治療ワクチンの投与から生じる相乗作用の別の指標を提供する。例えば図３Ａ〜３Ｈ及び図４における結果を考慮すると、ＲＳＬＡＩＬ−２、例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬はワクチン接種後に投与した場合、用いられたマウスモデルにおける腫瘍成長を有意に遅延させ、それによりワクチン接種単独又は高用量ＩＬ−２若しくは低用量ＩＬ−２のいずれかの投与を伴うワクチン接種と比較した場合に顕著に改善した応答を達成するために有効であったことが見て分かる。図４について見ると、例えば治療のほぼ３８日後、ワクチン接種／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群における平均腫瘍サイズはほぼ２５ｍｍ２であった一方、最も近い治療群（腫瘍成長の減速の効力に関して）のワクチン接種／ＩＬ−２低用量における平均腫瘍サイズはほぼ１２５ｍｍ２であり、ほぼ５倍の差であったことが見て分かる。これらの結果は、ワクチン療法を伴う場合の長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２の、治療応答を改善する優れた能力を強調する。
【００９３】
例示的なＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２の投与を伴う抗癌ワクチン接種についての顕著な治療結果をさらに実証するにあたり、図６は様々な治療群の各々についての生存パーセントのプロットを提供する。最も重要なことに、ペプチドワクチン／長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬治療群における対象の１００％が約５７日まで生存し、ほぼ６２日において５０％の生存率であり；治療法に対する陽性応答に関して次に最も近い治療群、即ちペプチドワクチン／低用量ＩＬ−２治療群について、ほぼ３２日までの１００％の生存率が観察され、約４８日において５０％の生存率であり、ほぼ１５日の増加であった。
【００９４】
実施例４及び５に記載される対象の治療方法の免疫刺激又は免疫減衰効果について見ると、ＲＳＬＡＩＬ−２が、腫瘍組織中でＩＬ−２よりも有意に高く安定なＰｍｅｌ−１応答を誘導するために有効であることが見て分かる。さらに、高用量ＩＬ−２又はＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかの投与を伴うワクチン治療を腫瘍微小環境と類似の様式で比較する場合、ＲＳＬＡＩＬ−２は、脾臓中でＩＬ−２よりも有意に高く安定なＰｍｅｌ−１応答を誘導するために有効である。ＲＳＬＡＩＬ−２は、７日目における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の低下を有効に媒介し、少なくとも３０日目まで拡大する腫瘍中で最小のＴｒｅｇ数を維持した。治療過程にわたる様々な免疫細胞型（Ｔｒｅｇ及び非Ｔｒｅｇ）の評価に基づき、ペプチドワクチンは、ＲＳＬＡＩＬ−２と併用した場合、腫瘍及び脾臓中の高いＰｍｅｌとＴｒｅｇとの比を産生したが、ＩＬ−２と併用した場合には産生しなかった。少なくともこれらのデータに基づき、例示的なＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２が腫瘍組織中のより長い期間にわたる多数のＰｍｅｌ−１細胞及び少数のＴｒｅｇの安定的維持においてＩＬ−２よりも顕著に良好であることが考えられる。さらに、ＲＳＬＡＩＬ−２は、腫瘍に対するＴｒｅｇの蓄積を特異的に阻害し、治療の３０日目まで腫瘍組織中のＰｍｅｌとＴｒｅｇとの高い比の維持を促進する。
【００９５】
実施例６〜９は、特に新抗原ベースワクチン組成物単独の投与と比較した場合、ＲＳＬＡＩＬ−２との併用が、より多数のワクチンコード新抗原に対する免疫応答並びにワクチンコード新抗原と反応性のＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の増加数を提供するために有効であることを例示する。さらに、本明細書に記載される併用により治療したマウス中の腫瘍は、ワクチンコード新抗原に対して反応性のＴ細胞が高度に濃縮した。即ち、代表的な新抗原ベースワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２との併用は有意な抗腫瘍効果をもたらし、強力な新抗原特異的免疫応答を誘導した。
【００９６】
図１０に示されるとおり、例示的なＡＨ−１単一抗原ペプチドワクチンは、ＲＳＬＡＩＬ−２との併用で投与した場合、単独で投与される場合のＡＨ−１ワクチン及びＲＳＬＡＩＬ−２の各々と比較した場合、腫瘍成長を顕著に遅延させ、生存期間を改善した。従って、ＲＳＬＡＩＬ−２はペプチドベース癌ワクチンと併用した場合、腫瘍成長を遅延させ、生存期間を改善するために有効であった。加えて、併用は、癌を有する対象に投与する場合に顕著な抗腫瘍効果を提供するその能力の別の証拠として、腫瘍組織中で多数のＰｍｅｌ−１細胞及び少数のＴｒｅｇを産生するために有効であった。
【００９７】
本明細書において参照される全ての論文、書籍、特許、特許公報及び他の刊行物は、全体として参照により援用される。本明細書の教示と参照によって援用される技術との間に不一致が生じた場合、その教示の意味及び本明細書の定義が（特に本明細書に添付される特許請求の範囲で用いられる用語に関して）優先するものとする。例えば、本願及び参照によって援用される刊行物が同じ用語を別様に定義する場合、定義が載せられている文書の教示の範囲内でその用語の定義が維持されるものとする。
【実施例】
【００９８】
前述の説明並びに以下の例は例示を意図するもので、本明細書で提供される本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明が関係する技術分野の当業者には、本発明の範囲内の他の態様、利点及び変形例が明らかであろう。
【００９９】
材料及び方法
アルデスロイキンのものと同一のアミノ酸配列（配列番号３）を有する組換えヒトＩＬ−２をクローニングし、発現させ、使用して本明細書でＲＳＬＡＩＬ−２と称される例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬を調製した。
【０１００】
ＲＳＬＡＩＬ−２は、国際公開第２０１５／１２５１５９号パンフレットの実施例１の手順に従うと得ることが可能な組成物を指し、概してマルチＰＥＧ化形態のＩＬ−２を含む組成物であって、ここでコンジュゲートの形成に用いられるＰＥＧ試薬の結合は投与後に遊離可能である。
【０１０１】
ＮＯＵＳ−０２０新抗原ワクチン：ＮＯＵＳ−０２０構築物は、ＣＴ−２６マウス腫瘍細胞系からの２０個の非同義単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）を含有する。ＮＯＵＳ−０２０ワクチンは、類人猿由来アデノウイルスと、本明細書に記載されるマウスモデル試験において使用されるＣＴ２６マウス腫瘍細胞系からの２０個の新抗原をコードするＭＶＡワクチンとをベースとする。ＮＯＵＳ−０２０挿入配列を図１１に示す。各々の突然変異のため、アミノ酸変化を野生型タンパク質配列中に埋め込み、新抗原について全長２５個のアミノ酸について上流及び下流の両方で１２個のアミノ酸によりフランキングさせる。組換え人工タンパク質の発現をモニタリングする目的のため、異なる新抗原からのタンパク質断片の配列を頭尾結合させてＨＡペプチド配列が下流で融合している人工抗原を形成する。
【０１０２】
実施例１
ＭＰＥＧ２−Ｃ２−ＦＭＯＣ−２０ＫＤ−ＮＨＳによるＲＩＬ−２のＰＥＧ化
１．４４ｍｇ／ｍｌの精製ｒＩＬ−２（１０６．４ｍＬ）を第１の容器に入れ、続いて５３．６ｍＬの製剤化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、５％トレハロース）を加えた。ｐＨを測ると４．６２であり、温度を測ると２１．２℃であった。ＰＥＧ試薬のＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ−２０Ｋ（国際公開第２００６／１３８５７２号パンフレットに記載されるとおり利用可能）（１３．１ｇ）を第２の容器に入れ、続いて７３．３ｍＬの２ｍＭ  ＨＣｌを加えた。得られた溶液を手動で２５分間かき混ぜた。第１の容器にホウ酸ナトリウム（０．５Ｍ、ｐＨ９．８）を加えてｐＨを約９．１に上昇させ、次にＰＥＧ試薬が入った第２の容器の内容物を１〜２分間かけて第１の容器に加えた。次に８．１ｍＬの２ｍＭ  ＨＣｌを第２の容器に入れることによってリンスステップを行い、第１の容器に内容物を加えた。コンジュゲーション反応では、最終的なｒＩＬ−２濃度は０．６ｍｇ／ｍＬであり、ホウ酸ナトリウム濃度は１２０ｍＭであり、ｐＨは９．１±０．２であり、温度は２０〜２２℃であった。試薬の活性（置換レベル）を調整した後のＰＥＧ試薬とｒＩＬ−２とのモル比は３５：１であった。コンジュゲーション反応を３０分間進行させ、７５ｍＬの２Ｎ酢酸の添加による酸性化反応（ｐＨをほぼ４に降下させる）により停止させた。生成物を上記のとおりイオン交換クロマトグラフィーにより精製して主として４ｍｅｒ、５ｍｅｒ及び６ｍｅｒ（ｒ−ＩＬ−２に放出可能に共有結合しているＰＥＧ試薬の数を指す（８ｍｅｒ及びそれより高度なＰＥＧ化は、クロマトグラフィーに関連する洗浄ステップの間に取り除かれた）の組成物を提供した。この組成物は、本明細書で「ＲＳＬＡＩＬ−２」と称する。
【０１０３】
実施例２
ＲＳＬＡＩＬ−２の受容体バイアス及び関連免疫療法特性
ＩＬ−２受容体に対する結合親和性及び免疫刺激プロファイルに関連する受容体バイアス：ＲＳＬＡＩＬ−２のＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒβへの親和性を表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００）により直接計測し、臨床的に利用可能なＩＬ−２（アルデスロイキン）と比較した。ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を使用して抗ヒト抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＣＭ−５センサーチップの表面に結合させた。次にヒトＩＬ−２Ｒα−Ｆｃ又はＩＬ−２Ｒβ−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかをこの表面にわたって捕捉リガンドとして使用した。酢酸塩緩衝液ｐＨ４．５に、５ｍＭから始まるＲＳＡＩＬ−２及びその活性ＩＬ−２コンジュゲート代謝産物（１−ＰＥＧ及び２−ＰＥＧ−ＩＬ−２）の段階希釈物を作成した。これらの希釈物をリガンドに５分間結合させて、結合した反応単位（ＲＵ）を濃度に対してプロットし、ＥＣ５０値を決定した。各ＩＬ−２受容体サブタイプに対する各アイソフォームの親和性をＩＬ−２と比べた倍数変化として計算した。
【０１０４】
ＲＳＬＡＩＬ−２のインビトロ結合及び活性化プロファイルは、ＰＥＧ化がアルデスロイキンと比べてＩＬ２とＩＬ２Ｒαとの相互作用を妨害することを示唆し；これらの効果がインビボで免疫細胞サブタイプのプロファイルをバイアスするかどうかを決定するための調査を実施した。ＲＳＬＡＩＬ−２又はＩＬ２のいずれかの投与後の腫瘍中のＣＤ８Ｔ及びＴｒｅｇ細胞の数は、ＩＬ２の多面的効果がＩＬ２／ＩＬ２Ｒα界面におけるポリ（エチレングリコール）（ＲＳＬＡＩＬ−２中として）へのＩＬ２のコンジュゲーションに起因してシフトしたかどうかの重要な尺度である。この課題に対処するため、皮下Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫腫瘍を担持するマウスを単一用量のＲＳＬＡＩＬ−２又は５回用量のアルデスロイキンにより治療し、腫瘍微小環境中の免疫細胞をフローサイトメトリーにより定量した。結果を図１Ａ〜１Ｇに示す。
【０１０５】
アルデスロイキン治療マウスの腫瘍中で総及びメモリーＣＤ８細胞は腫瘍浸潤リンパ球の割合として増加し；しかしながら、これらの効果は一過的であり、ビヒクルと比べて５日目に有意性を達成した。対照的に、有意な（Ｐ＜０．０５）及び持続される総及びメモリーＣＤ８Ｔ細胞刺激は単一ＲＳＬＡＩＬ−２投与後に達成され、メモリーＣＤ８（７日目）及び総ＣＤ８（７及び１０日目）の割合がアルデスロイキンと比べて優れていた。ＲＳＬＡＩＬ−２及びアルデスロイキン治療の両方は、治療開始５及び７日後に増加した活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をもたらしたが、この効果は１０日目までに縮小した。腫瘍浸潤リンパ球のＣＤ４細胞の割合は、５日目にビヒクルと比べてＲＳＬＡＩＬ−２治療後に縮小した。１０日目、ＲＳＬＡＩＬ−２は、ビヒクル及びアルデスロイキンと比較して少数のＣＤ４細胞割合をもたらした。ＣＤ４細胞集団を、Ｔｒｅｇ集団を定義するＦｏｘＰ３＋サブセットについてさらに分析した。ＲＳＬＡＩＬ−２投与は全ての時点においてＴｒｅｇの割合を低下させ、ＰＥＧ鎖から生じるＩＬ２Ｒαサブユニットへの接近の低下と一致した。対照的に、アルデスロイキンによるＴｒｅｇ低下は穏やかであり、５日目に有意性を達成した。ＣＤ８Ｔ細胞の増加及びＴｒｅｇの低下は、７日目までに腫瘍中のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の顕著な上昇をもたらした。ＲＳＬＡＩＬ−２、アルデスロイキン、及びビヒクルについてのＣＤ８／Ｔｒｅｇの比はそれぞれ４４９、１８、及び４であり、ＲＳＬＡＩＬ−２についてのＩＬ２受容体アルファと比べたＩＬ２受容体ベータの優先的な活性化を裏付けた。
【０１０６】
免疫組織化学染色を実施し、ＣＤ８Ｔ細胞は数が増加しただけでなく、腫瘍細胞が散在したことを裏付けた。これらの結果は、ＲＳＬＡＩＬ−２が、腫瘍中のＴｒｅｇの等しい刺激なしで非修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）について見られるものよりもロバストなインビボメモリーエフェクターＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導するために有効であることを示し、インビトロＩＬ２Ｒβ選択的結合プロファイルと一致する。即ち、ＲＳＬＡＩＬ−２はＴｒｅｇと比べてエフェクターＣＤ８＋Ｔ及びＮＫ細胞を優先的に活性化させ、拡大するために有効である。
【０１０７】
実施例３
ＲＳＬＡＩＬ−２の腫瘍曝露
本試験の目的は、アルデスロイキンと比較した場合の、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍活性を評価することであった。
【０１０８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞（１匹の動物当たり１×１０６個）を右脇腹中に皮下移植した。移植７日後、２００ｍｍ３の腫瘍が計測された場合、動物にＲＳＬＡＩＬ−２（２ｍｇ／ｋｇ×１）又はアルデスロイキン（３ｍｇ／ｋｇ、毎日×５）を投与した。腫瘍を回収し（観察時間当たりｎ＝４）、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及び０．２５％酢酸を含有する氷冷ＰＢＳ中で均一化し、遠心分離して上清を得た。腫瘍組織中のＲＳＬＡＩＬ−２レベルを定量するため、上清をｐＨ９緩衝液中で３７℃において一晩インキュベートすることによりＰＥＧをＩＬ２から放出させた。ヒトＩＬ２に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡによりＩＬ２を計測した。ＡＵＣを計算するため、ノンコンパートメントモデルを使用してデータをＰｈｅｏｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎＬｉｎによりフィットさせた。１日目のＡＵＣに基づき５を乗算してアルデスロイキン後のＡＵＣを推定した。
【０１０９】
図２に示されるとおり、腫瘍アルデスロイキンレベルはＣｍａｘに急速に達し、次に急速に降下し、各々の投与２４時間後の＜４ｎｇ／ｇの濃度及び０．０９±０．０２μｇ／時間／ｇの１日ＡＵＣをもたらした。対照的に、ＲＳＬＡＩＬ−２は、単一投与８日後まで腫瘍中で検出可能であり、３０±６．９μｇ／時間／ｇのＡＵＣを達成した。ＡＵＣに基づき、ＲＳＬＡＩＬ−２を使用して７．５倍少量のＩＬ２等価物を投与した場合であっても（３ｍｇ／ｋｇ  毎日×５＝１５ｍｇ／ｋｇ対２ｍｇ／ｋｇ）、ＲＳＬＡＩＬ−２の単一用量は５日用量のアルデスロイキンと比較して６７倍高い曝露をもたらした。従って、ＩＬ２等価物に基づき曝露を正規化すると、ＲＳＬＡＩＬ−２はアルデスロイキンと比べて５００倍の曝露増加を達成した。ＲＳＬＡＩＬ−２の活性コンジュゲートＩＬ−２形態（２−ＰＥＧ−ＩＬ２及び１−ＰＥＧ−ＩＬ２の全体）も定量し、５日目まで腫瘍中で検出可能のままであり、２３±４．４μｇ／ｇのＡＵＣを生じさせた。従って、活性コンジュゲートＩＬ２への曝露はアルデスロイキンと比較して５０倍高く、換言すると等価用量のアルデスロイキンと比べて３８０倍の曝露増加であった。従って、ＲＳＬＡＩＬ−２の腫瘍曝露は、アルデスロイキンについての２つの５日サイクルについての１日２回と比較してマウスにおける９日に１回の投与を可能とした。
【０１１０】
実施例４
マウスＢ１６黒色腫モデルにおける例示的なワクチンＧＰ１００に対する応答の改善におけるＲＳＬＡＩＬ−２の効力の評価
マウスＢ１６黒色腫モデルを使用してＲＳＬＡＩＬ−２がワクチン接種誘導腫瘍特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大及び機能を有効に促進し得るかどうかを決定するための試験を実施した。本試験は、例示的なペプチドワクチンの治療有効性を増強するＲＳＬＡＩＬ−２及び非修飾ＩＬ−２の両方の能力を比較した。
【０１１１】
本試験の開始は、３００，０００個のＢ１６野生型細胞／部位の接種７日後の開始とした。本試験において、ナイーブｇｐ１００特異的ＴＣＲトランスジェニックｐｍｅｌ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞を、樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウス中に養子移植し、次に（ｉ）ＧＰ−１００（糖タンパク質１００）ペプチドワクチン（５０μｇ／マウス）、抗ＣＤ４０ｍＡｂ（５０μｇ／マウス）、及びＴＬＲ−７作動薬、Ｒ８４８（レシキモド、イミダゾキノリン、５匹のマウス／パック）を含有するワクチン製剤単独により、又は（ｉｉ）ＲＳＬＡＩＬ−２（ＩＬ−２に基づき０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で、又は（ｉｉｉ）高用量若しくは低用量の非修飾ＩＬ−２（アルデスロイキン）のいずれかとの併用でワクチン接種した。次にマウスは、単一用量のＲＳＬＡＩＬ−２又はＩＬ−２（高用量）を８日ごとに受容した。治療群は以下のとおりであった：
【０１１２】
【表１】
2019534308.tif 000004
【０１１３】
腫瘍成長、生存期間及び血中のＴ細胞応答をモニタリングし、腫瘍及び脾臓中のエフェクターｐｍｅｌ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの局在化を分析した。Ｔ細胞応答を５日目、７日目、１２日目、１５日目及び２０日目並びに治療過程全体にわたり計測した。図３Ａ〜３Ｈは、群１〜８の各々についての治療過程にわたる腫瘍サイズ（ｍｍ２）をそれぞれ示すプロットである。図３Ｈに示されるとおり、カクテルとして製剤化されたＲＳＬＡＩＬ−２と例示的なペプチドワクチンとの併用は、他の治療群と比較した場合、腫瘍成長の遅延において特に有効であった。図４は、容易な比較のため試験群の各々についての治療過程にわたる平均腫瘍サイズ（ｍｍ２）を示すグラフである。図４に示されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２、例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬はワクチン接種後に投与した場合、用いられたマウスモデルにおける腫瘍成長を有意に遅延させるために有効であり、ワクチン接種単独又は高用量ＩＬ−２若しくは低用量ＩＬ−２のいずれかの投与を伴うワクチン接種と比較した場合に顕著に改善された応答を達成した。図４について見ると、例えば治療のほぼ３８日後にワクチン接種／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群における平均腫瘍サイズはほぼ２５ｍｍ２であった一方、最も近い治療群（腫瘍成長の減速における効力に関して）、ワクチン接種／ＩＬ−２低用量における平均腫瘍サイズはほぼ１２５ｍｍ２であったことが見て分かり、著しい差は、ワクチン療法を伴う場合に治療応答を改善するＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、例えばＲＳＬＡＩＬ−２の優れた能力を例示する。
【０１１４】
図５は、ｇｐ１００特異的Ｔ細胞機能に関連するプロットであり、即ち上記の様々な治療群についての治療過程にわたるＩＦＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１の割合として表現）を実証する。プロットは、ＧＰ１００／抗ＣＤ４０／ＴＲＬ−７作動薬／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群についての、ワクチン接種約４０日後まで拡大する９０％超における安定で持続的なＩＧＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１）応答を示し；ワクチン／ＲＳＬＡＩＬ−２併用療法は、他の治療群と比べて最大割合のＩＦＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１）応答に達し、それを維持した。加えて、ワクチン／ＲＳＡＩＬ−２併用療法誘導ＩＧＮ−ｇ＋Ｔ細胞（ｐｍｅｌ−１）応答は他の治療群よりも降下が緩やかであった。
【０１１５】
図６は、治療群の各々についての生存パーセントを実証するプロットである。治療過程にわたる腫瘍サイズを示すプロット（図３Ａ〜３Ｈ及び図４）と一致して、ワクチン／ＲＳＬＡＩＬ−２治療群（群８）についての生存期間は他の治療群と比較して有意に増強された。ペプチドワクチン／長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬治療群における対象の１００％が約５７日まで生存し、ほぼ６２日において５０％の生存率であり；治療法に対する陽性応答に関して次に近い治療群、即ちペプチドワクチン／低用量ＩＬ−２群について、１００％の生存率がほぼ３２日まで観察され、約４８日において５０％の生存率であった。
【０１１６】
図７は、治療過程にわたる治療群の各々についてのｐｍｅｌ細胞パーセント（総ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合として表現）を実証するプロットである。ＲＳＬＡＩＬ−２は、ＧＰ−１００ワクチンと併用した場合、ペプチドワクチン療法と合わせた高用量及び低用量ＩＬ−１治療の両方と比較した場合に顕著に上昇したｐｍｅｌ−１応答を呈した。
【０１１７】
図８は、実施例４に記載される試験群の各々についての樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスにおける治療過程にわたるＣＤ４細胞の割合として表現される制御性Ｔ細胞、即ちＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を示すプロットである。プロットから見て分かるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２誘導制御性Ｔ細胞の割合は各々の投与サイクルの終了付近で急速に減少する。
【０１１８】
ＲＳＬＡＩＬ−２、例示的な長時間作用型ＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬は、ワクチン接種単独又は高用量及び低用量治療モダリティの両方で投与される非修飾（即ち非長時間作用型）ＩＬ−２の投与を伴うワクチン接種と比較した場合、腫瘍成長を強力に抑制し、マウスの生存期間を有意に改善するワクチン接種との顕著な相乗作用を実証した。ＲＳＬＡＩＬ−２は、腫瘍中のｐｍｅｌ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞数をさらに増強し、免疫抑制Ｔｒｅｇ数を減少させた。ＲＳＬＡＩＬ−２は、３０日間にわたり腫瘍中のｐｍｅｌ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇとの高い比を安定的に維持するために有効であった。極めて強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び抗腫瘍活性の誘導にかかわらず、大きな毒性は観察されなかった。
【０１１９】
実施例５
マウスＢ１６黒色腫モデルにおける例示的なワクチン、ＧＰ１００に対する応答の改善におけるＲＳＬＡＩＬ−２の効力の別の評価−腫瘍、脾臓及び血液中のｐｍｅｌ及びＴｒｅｇの分析
上記実施例４に記載されるとおりのマウスＢ１６黒色腫モデルを使用して腫瘍及び脾臓に対するエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇの局在化に対する、例示的なペプチドワクチンと併用して投与した場合のＲＳＬＡＩＬ−２の影響を調査するための試験を実施した。
【０１２０】
本試験において、ナイーブｇｐ１００特異的ＴＣＲトランスジェニックｐｍｅｌ−１ＣＤ８＋Ｔ細胞を、樹立皮下Ｂ１６腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウス中に養子移植し、次に（ｉ）ＧＰ−１００、糖タンパク質−１００ペプチドワクチン（５０μｇ／マウス）、抗ＣＤ４０ｍＡｂ（５０μｇ／マウス）、及びＴＬＲ−７作動薬、Ｒ８４８（レシキモド、イミダゾキノリン、５匹のマウス／パック）を含有するカクテル単独により、又は（ｉｉ）ＲＳＬＡＩＬ−２（ＩＬ−２に基づき０．２ｍｇ／ｋｇ）との併用で、又は（ｉｉｉ）高用量ＩＬ−２（アルデスロイキン）との併用でワクチン接種した。次にマウスは、単一用量のＲＳＬＡＩＬ−２又はＩＬ−２（高用量）を８日ごとに受容した。治療群は以下のとおりであった：
【０１２１】
【表２】
2019534308.tif 000005
【０１２２】
腫瘍及び脾臓細胞試料を回収し、最初に固定可能な生存指示薬により処理し、次に生存免疫細胞について染色した。試料の各々について生存免疫細胞の総量を計数し、対象細胞型についてのゲーティング／総イベントの回収に使用した。フローサイトメーター読取値のまとめた未加工データからプライマリー細胞数を導き、分析した。図９は、治療群２、３及び４についての５、７、１０及び３０日目の各々におけるＴｈｙ１．１＋ｐｍｅｌ−１細胞数／１グラムの腫瘍を示す棒グラフである。見て分かるとおり、高用量ＩＬ−２又はＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかの投与を伴うワクチン治療を比較した場合、ＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２よりも有意に高く安定な腫瘍組織中のＰｍｅｌ−１応答を誘導するために有効である。図１０は、治療群２、３及び４についての５、７、１０及び３０日目の各々におけるＴｈｙ１．１＋ｐｍｅｌ−１細胞数／１グラムの脾臓を示す棒グラフである。見て分かるとおり、高用量ＩＬ−２又はＲＳＬＡＩＬ−２のいずれかの投与を伴うワクチン治療を腫瘍微小環境と類似の様式で比較する場合、ＲＳＬＡＩＬ−２は、ＩＬ−２よりも脾臓中の有意に高く安定的なＰｍｅｌ−１応答を誘導するために有効である。上記実施例４に記載される結果と同様に、ＲＳＬＡＩＬ−２は、７日目における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の低下を有効に媒介し、少なくとも３０日目まで拡大する腫瘍中で最小のＴｒｅｇ数を維持した。治療過程にわたる様々な免疫細胞型（Ｔｒｅｇ及び非Ｔｒｅｇ）の評価に基づき、ペプチドワクチンは、ＲＳＬＡＩＬ−２と併用した場合、腫瘍及び脾臓中の高いＰｍｅｌとＴｒｅｇとの比を産生したが、ＩＬ−２と併用した場合には産生しなかった。要約すると、これらのデータに基づき、例示的なＩＬ−２Ｒαβバイアス作動薬、ＲＳＬＡＩＬ−２は、腫瘍組織中のより長い期間にわたる多数のＰｍｅｌ−１細胞及び少数のＴｒｅｇの安定的維持においてＩＬ−２よりも顕著に良好であることが考えられる。さらに、ＲＳＬＡＩＬ−２は、腫瘍に対するＴｒｅｇの蓄積を特異的に阻害し、治療の３０日目まで腫瘍組織中の高いＰｍｅｌとＴｒｅｇとの比の維持を促進した。
【０１２３】
実施例６
ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンの免疫原性
ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンの免疫原性は、５×１０８個のウイルス粒子（ｖｐ）の用量における単一筋肉内免疫化後のＢＡＬＢ／ｃ同系交配マウスにおいて評価した。免疫化３週間後に脾細胞を回収し、コードされる各々の新抗原ワクチンに対応する合成ペプチドの存在下で細胞を刺激することによりＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔにより試験した。陰性対照培養物は、ペプチド希釈剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で培養培地単独により刺激した細胞を含んだ。免疫応答（１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞数）を関連図に示す。抗原ウェルの平均が１５個のＳＦＣ／１０６個のＰＢＭＣよりも大きく、ＤＭＳＯウェルのバックグラウンド値を３倍だけ超過した場合に応答を陽性と見なした。Ｔ細胞応答（ＣＤ４及びＣＤ８）の質は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて免疫原性である５つの新抗原のプールを用いて細胞内ＩＦＮ−γサイトカイン染色により計測した。免疫応答（１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞数）を図１２Ａ及び１２Ｂに示す。見て分かるとおり、ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンはＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を誘導する。
【０１２４】
実施例７
ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄ−ＭＶＡワクチンの免疫原性
ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄ−ＭＶＡワクチンの免疫原性をプライムブースト試験において評価した。ＢＡＬＢ／ｃ同系交配マウスをＧＡｄ（５×１０８個のウイルス粒子の用量）によりプライミングし、次に４週目においてＭＶＡ（１０７ｐｆｕ）によりブーストした。ワクチン誘導応答は、２０個のワクチンコード新抗原のプールを用いて脾臓細胞を刺激するＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによるブースト１週間後に計測した。陰性対照培養物は、ペプチド希釈剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で培養培地単独により刺激した細胞を含んだ。
【０１２５】
免疫応答（１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞数）を図１３Ｂ及び１３Ｃに示す。抗原ウェルの平均が１５個のＳＦＣ／１０６個のＰＢＭＣより大きく、ＤＭＳＯウェルのバックグラウンド値を３倍だけ超過した場合に応答を陽性と見なした。Ｔ細胞応答（ＣＤ４及びＣＤ８）の質は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについて免疫原性であることが得られた５つの新抗原のプールを用いて細胞内ＩＦＮ−γサイトカイン染色により計測した。Ｔ細胞応答の質（ＣＤ４及びＣＤ８）は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイについて免疫原性であることが得られた上位５つの新抗原のプールを用いて細胞内ＩＦＮ−γサイトカイン染色により計測した。示されるとおり、新抗原ワクチンはＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞についての応答を誘導した。図１３Ａは、ＣＤ８及びＣＤ４応答を誘導する新抗原を示す構築物の模式図を提供する。図１３Ｂは、２０個のワクチンコード新抗原のプールに対するＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔによりナイーブマウスにおけるＧＡｄ／ＭＶＡ免疫化後に計測したＴ細胞応答の分析を提供する。
【０１２６】
実施例８
マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄ−ＣＴ２６新抗原ワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２とを用いる併用治療（早期治療環境）
ＮＯＵＳ−０２０ワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２との同時投与（０日目におけるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチン及びＲＳＬＡＩＬ−２）及び後続の投与（ＧＡｄ  ０日目、及びＲＳＬＡＩＬ−２、７日目）の治療有効性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６腫瘍成長に対して評価した。
【０１２７】
−３日目にＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６結腸癌腫細胞を注射した。３日後（０日目）、マウスを（ｉ）ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチン単独（筋肉内、５×１０８個のウイルス粒子の用量）、（ｉｉ）ＲＳＬＡＩＬ−２単独（静脈内、０．８ｍｇ／ｋｇ、ｑ９×３）、又は（ｉｉｉ）０日目に同時に投与されるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２との併用により、若しくは（ｉｖ）０日目に投与されるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンと７日目に投与されるＲＳＬＡＩＬ−２とによる連続投与レジメンにより治療した。
【０１２８】
腫瘍容積を各治療群について経時的に記録した。結果を図１４Ａ〜１４Ｆに示す。図１４Ａは対照群（非治療）についての結果を提供し；図１４ＢはＧＡｄワクチン単独より治療したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍の容積を実証し；図１４Ｃ及び１４ＤはＲＳＬＡＩＬ−２（それぞれ０又は７日目のいずれかに投与）並びにＲＳＬＡＩＬ−２及びＧＡｄの０日目における同時投与（図１４Ｅ）又は連続投与（図１４Ｆ）により治療したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍の容積をそれぞれ実証する。
【０１２９】
図面から見て分かるとおり、７日目のＲＳＬＡＩＬ−２の投与は、早期治療環境（即ち大型腫瘍塊の成長前）におけるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンの有効性を顕著に改善した。
【０１３０】
ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２との併用を投与するための様々な治療レジメンをさらに探索するため、異なる治療間隔を探索した。
【０１３１】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍細胞をチャレンジし、チャレンジ３日後（０日目）、それらは、ＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄワクチン（０日目、５×１０８個のウイルス粒子）又は０日目に投与されるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄと３、５、若しくは７日目のいずれかに投与されるＲＳＬＡＩＬ−２との併用を受容した。腫瘍成長を経時的に様々な治療群においてモニタリングした。以下の表３は、各治療モダリティについての試験終了時における腫瘍排除マウスの割合を示す。
【０１３２】
【表３】
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【０１３３】
表３のデータに基づき、ＧＡｄワクチン接種とＲＳＡＩＬ−２の単一用量投与との間隔が相乗的活性に影響を与えることが考えられる。上記のデータに基づき、ＲＳＡＩＬ−２を最初にワクチン接種５日後より後に、例えばワクチン接種６日後、又は７日後、又は８日後、又は９日後又は１０日後又はそれより後に投与するのが好ましいことが考えられる。
【０１３４】
実施例９
マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＮＯＵＳ−０２０ＧＡｄ−ＭＶＡ  ＣＴ２６新抗原ワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２とによる樹立腫瘍の併用治療
ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６細胞をチャレンジした。１週間後、１００ｍｍ３の腫瘍塊を有するマウスを２つの群にランダム化し（０日目）、一方の群はＲＳＬＡＩＬ−２単独を受容し、第２の群は、それぞれ０日目（５×１０８個のウイルス粒子）及び６日目（静脈内、０．８ｍｇ／ｋｇ）に投与されるＮＯＵＳ−０２０とＲＳＬＡＩＬ−２との併用を受容した。ＲＳＡＩＬ−２の投与を１４日目、２２日目、３６日目、４３日目、及び４６日目に繰り返した。併用治療を受容する群についてＭＶＡによるブーストを２８日目に実施し、ＭＶＡを１０７ｐｆｕの用量において筋肉内注射した。腫瘍容積を経時的にモニタリングした。結果を図１５Ａ（ＲＳＡＩＬ−２のみ）及び１５Ｂ（ＮＯＵＳ−０２０及びＲＳＡＩＬ−２）に示す。ＲＳＬＡＩＬ−２単独を投与した群は４４％の奏効率を有し、２匹の完全奏功及び２匹の部分奏功を示した（部分奏効＝４０％超の腫瘍縮小を示すが、腫瘍の完全消失を示さない）。対照的に、上記のとおりのＮＯＵＳ−０２０とＲＳＬＡＩＬ−２との併用を投与した群は８９％の治療応答を有し、４匹の完全奏功及び４匹の部分奏功を示した。
【０１３５】
これらの結果は、例示的なマウス新抗原ＮＯＵＳ−０２０癌ワクチンとＲＳＬＡＩＬ−２とによる併用療法が樹立腫瘍を有するマウスの治療において有効であることを実証する。
【０１３６】
併用群ＮＯＵＳ−０２０及びＲＳＬＡＩＬ−２又はＲＳＬＡＩＬ−２のみからの応答マウスを５４日目に屠殺した。抗原特異的Ｔ細胞応答の評価を、２つの別個のペプチドプール：上位５つの免疫原性新ペプチドのプール及び残り１５個のワクチンコード新ペプチドを含有する第２のプールの存在下で刺激した脾臓細胞に対する細胞内ＩＦＮ−γ染色により実施した。結果を図１６Ａ（ＲＳＬＡＩＬ−２のみ）及び１６Ｂ（ＮＯＵＳ−０２０及びＲＳＬＡＩＬ−２）に示す。
【０１３７】
実施例１０
マウスＣ２６結腸癌腫モデルにおけるワクチン接種と併用するＲＳＬＡＩＬ−２の抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹のマウス）のＣ２６結腸癌腫モデルにおける、ＲＳＬＡＩＬ−２の投与と併用する例示的な単一抗原ペプチドワクチン（ＡＨ１ペプチド）を使用してワクチン接種に対する抗腫瘍免疫応答を調査するための試験を実施した。
【０１３８】
試験の開始（０日目）は、１匹のマウス当たり１×１０６個のＣＴ２６野生型細胞の接種４日後の開始とした。試験群は以下のとおりであった：
群１（非治療）：
群２：ＲＳＬＡＩＬ−２のみ、０．８ｍｇ／ｋｇ、８日ごとに投与；
群３：ＡＨ１ワクチン製剤のみ。ワクチンは、５日目及び１３日目に投与されるＡＨ１ペプチド（ＣＴ２６中で発現されるｇｐ７０（４２３〜４３１）に由来する免疫優勢ＣＤ８エピトープ、アミノ酸ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（Ｈｕａｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９３，９７３０−９７３５（１９９６）、２５μｇ／マウス））、抗αＣＤ−４０ｍＡＢ（５０μｇ／マウス）、及びトル様受容体７作動薬、イミキモド、５匹のマウス／パック）を含み；
群４：ＡＨ１ワクチン（ＡＨ１ペプチド、ｇｐ７０（４２３〜４３１）、２５μｇ／マウス／抗αＣＤ−４０ｍＡＢ（５０μｇ／マウス）／イミキモド、５匹のマウス／パック）及びＲＳＬＡＩＬ−２（０．８ｍｇ／ｋｇ）、４日目及び１２日目に投与。
【０１３９】
腫瘍容積を経時的にモニタリングした。結果を図１７Ａ及び１７Ｂに示す。図面に示されるとおり、ＡＨ−１ワクチン及びＲＳＬＡＩＬ−２の両方は、単独で投与した場合に腫瘍成長を遅延させたが、併用投与した場合、有意な抗腫瘍効果が観察された（２０％の生存率）。
【０１４０】
結果：結腸癌のマウスモデルにおいて、例示的なＡＨ−１単一抗原ペプチドワクチンは、ＲＳＬＡＩＬ−２と併用投与した場合、単独投与した場合のＡＨ−１ワクチン及びＲＳＬＡＩＬ−２の各々と比較した場合に腫瘍成長を顕著に遅延させ、生存期間を改善した。
【０１４１】
上記のとおりのＡＨ１ペプチドワクチン、ＲＳＬＡＩＬ−２、又はその両方の併用のいずれかにより治療したＣＴ２６−腫瘍処理マウスの腫瘍及び脾臓中の腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇの局在化を決定するための別個の試験を実施した。７日目に腫瘍及び脾臓細胞試料を回収し、最初に固定可能な生存指示薬により処理し、次に生存免疫細胞について染色した。生存免疫細胞の総量を試料の各々について計数し、対象細胞型についてのゲーティング／総イベントの回収に使用した。プライマリー細胞数をフローサイトメーター読取値のまとめた未加工データから導き、分析した。結果を図１８Ａ及び１８Ｂに示す。
【０１４２】
結果：図面に提供されるとおり、ＲＳＬＡＩＬ−２の投与と合わせたワクチン接種は、脾臓と比較した場合に腫瘍中の有意に高いＣＤ８Ｔ細胞とＴｒｅｇとの比をもたらした。従って、ＲＳＬＡＩＬ−２の投与は、ワクチン接種と併用する場合、ワクチン単独又はＲＳＬＡＩＬ−２単独の投与のいずれかよりも腫瘍組織中の有意に高く安定なＰｍｅｌ−１応答を誘導するために有効である。
【０１４３】
【化３】
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【化４】
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【図１Ａ−Ｈ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｆ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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