(57)【要約】  Ｈｏｍ−１の発現を阻害する核酸分子を被験体に投与することを含む、被験体において炎症性障害を治療する方法。特に、核酸分子は、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドである。被験体から得られる炎症組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することを含む、被験体において炎症性障害の治療剤を選択するか、又は被験体において炎症性障害の治療剤の有効性をモニタリングする方法を更に開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において炎症性障害を治療する方法であって、Ｈｏｍ−１の発現を阻害する核酸分子を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記核酸分子がＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子がモルホリノオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記モルホリノオリゴヌクレオチドが配列番号３、４、５又は６の配列を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子を局所的に、経口で、直腸に、経鼻的に、静脈内に、関節内に、結膜に、頭蓋内に、腹腔内に、胸膜内に、筋肉内に、髄腔内に又は皮下に投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子をそのまま投与する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体から得られる炎症組織サンプルが、対照レベルと比較してより高レベルのＨｏｍ−１を発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
投与工程の前に、前記被験体から得られる炎症組織サンプルにおいて対照レベルと比較してより高いＨｏｍ−１の発現レベルを検出することを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
投与工程の後に、前記被験体から得られる炎症組織サンプルにおいてＨｏｍ−１又は炎症性サイトカインの発現レベルを検出することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対照レベルが非炎症組織サンプルにおけるＨｏｍ−１の発現レベルに相当する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
炎症性障害を治療するための組成物であって、Ｈｏｍ−１の発現を阻害する核酸分子と薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物。
【請求項１２】
前記核酸分子が配列番号３、４、５又は６の配列を有するモルホリノオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
局所、経口、直腸、経鼻、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内又は皮下投与経路用に配合される、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
炎症性障害の治療剤を同定する方法であって、
炎症組織サンプルと試験治療剤とを接触させることと、
前記組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、
を含み、前記発現レベルが対照レベル以下である場合に、前記試験治療剤を前記炎症性障害の候補治療剤とする、方法。
【請求項１５】
被験体において炎症性障害の治療剤を選択する方法であって、
前記被験体から得られる炎症組織サンプルと治療剤とを接触させることと、
前記組織サンプルにおいて対照レベルと比較してより低いか又は同じＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、
前記治療剤を前記被験体に投与することと、
を含む、方法。
【請求項１６】
被験体において炎症性障害の治療剤の有効性をモニタリングする方法であって、
前記被験体に前記治療剤を投与した後に該被験体から得られる炎症組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、
検出レベルと対照レベルとを比較することと、
前記比較に基づいて治療決定を行うことと、
を含み、前記検出レベルが前記対照レベルよりも高い場合に、前記被験体への前記治療剤又は異なる治療剤の投与を継続する、方法。
【請求項１７】
前記治療剤がステロイド性、非ステロイド性の抗炎症薬、免疫抑制剤である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療剤がＨｏｍ−１阻害剤である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療剤がタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、細胞、抗体若しくはそのフラグメント、小分子化合物、核酸分子、又は植物抽出物である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対照レベルが、非炎症組織サンプル又は治療剤と接触させる前の前記炎症組織サンプルにおけるＨｏｍ−１の発現レベルに相当する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
被験体において炎症性障害を治療する方法であって、
Ｈｏｍ−１阻害剤で処理した、又はＨｏｍ−１阻害剤を発現する発現構築物を含有する改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を準備することであって、該改変マクロファージ、単球又は樹状細胞が対照レベルと比較してより低レベルのＨｏｍ−１を発現することと、
前記改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を前記被験体に有効量投与することと、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記Ｈｏｍ−１阻害剤がＨｏｍ−１の発現を阻害する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｈｏｍ−１阻害剤がＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
準備工程の前に、前記被験体から得られる炎症組織サンプルにおいて対照レベルよりも高いＨｏｍ−１の発現を検出することを更に含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
組織マクロファージが、病原体侵入に対する宿主防御及び免疫恒常性において重要な役割を果たす。可塑性がマクロファージの特徴である。マクロファージは、宿主細胞及び微生物からのシグナルに満ちた微小環境中に存在することで、炎症誘発性（Ｍ１）表現型又は抗炎症性（Ｍ２）表現型を示すように活性化され得る。マクロファージの異常な分化及び活性化が、炎症の発生機序において重要な役割を果たす。例えばＩＢＤ患者では、Ｍ１炎症誘発性表現型を示す粘膜ＣＤ１４＋マクロファージの増加が見られる。先天免疫及び適応免疫の両方の中心的な実行者としてのその役割から、マクロファージが自己免疫性障害及び炎症性障害の制御に理想的な標的とみなされている。しかしながら、マクロファージの可塑性がどのように調節されるかは、依然として完全には理解されておらず、マクロファージ機能を調整するために操作することができる細胞内因子は、殆ど不明のままである。
【発明の概要】
【０００２】
一態様では、被験体において炎症性障害を治療する方法であって、Ｈｏｍ−１の発現を阻害する核酸分子を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法が記載される。
【０００３】
一実施の形態では、上記核酸分子はＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。上記核酸分子を局所的に、経口で、直腸に、経鼻的に、静脈内に、関節内に、結膜に、頭蓋内に、腹腔内に、胸膜内に、筋肉内に、髄腔内に又は皮下に投与することができる。一実施の形態では、上記核酸分子をそのまま投与する。
【０００４】
別の態様では、炎症性障害を治療するための組成物であって、Ｈｏｍ−１の発現を阻害する核酸分子と薬学的に許容可能な担体とを含む、組成物が本明細書に記載される。一実施の形態では、上記核酸分子は配列番号３、４、５又は６の配列を有するモルホリノオリゴヌクレオチドである。上記組成物は局所、経口、直腸、経鼻、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内又は皮下投与経路用に配合することができる。一実施の形態では、核酸分子（例えば、配列番号３、４、５又は６の配列を有するモルホリノオリゴヌクレオチド）は、そのままの核酸分子である。
【０００５】
更に別の態様では、炎症性障害の治療剤を同定する方法が記載される。該方法は、炎症組織サンプルと試験治療剤とを接触させることと、上記組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することとを含む。上記発現レベルが対照レベル以下である場合に、上記試験治療剤を上記炎症性障害の候補治療剤とする。
【０００６】
一態様では、炎症性障害の治療剤を、それを必要とする被験体において選択する方法であって、上記被験体から得られる炎症組織サンプルと治療剤とを接触させることと、上記組織サンプルにおいて対照レベルと比較してより低いか又は同じＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、上記治療剤を上記被験体に投与することとを含む、方法が記載される。
【０００７】
別の態様では、炎症性障害の治療剤の有効性を、それを必要とする被験体においてモニタリングする方法が記載される。該方法は、上記被験体に上記治療剤を投与した後に該被験体から得られる炎症組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、検出レベルと対照レベルとを比較することと、上記比較に基づいて治療決定を行うこととを含み、上記検出レベルが上記対照レベルよりも高い場合に、上記被験体への上記治療剤又は異なる治療剤の投与を継続する。
【０００８】
別の態様では、炎症性障害の治療を必要とする被験体において炎症性障害を治療する方法が記載される。該方法は、Ｈｏｍ−１阻害剤で処理した、又はＨｏｍ−１阻害剤を発現する発現構築物を含有する改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を準備することであって、該改変マクロファージ、単球又は樹状細胞が対照レベルと比較してより低レベルのＨｏｍ−１を発現することと、上記改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を上記被験体に有効量投与することとを含む。一実施の形態では、該方法は、準備工程の前に、上記被験体から得られる炎症組織サンプルにおいて対照レベルよりも高いＨｏｍ−１の発現を検出することを含む。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１つ以上の実施形態の詳細を、以下の詳細な説明に示す。本実施形態のその他の特徴、課題及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１０】
予期せぬことに、組織マクロファージにおけるＨｏｍ−１発現のノックダウンにより、組織炎症が軽減され、粘膜上皮細胞の生存能力が保護され得ることが発見された。
【００１１】
ヒトホメオボックス転写因子であるＨｏｍ−１は、標準Ｗｎｔシグナル伝達のアンタゴニストである。Ｈｏｍ−１の核酸配列（配列番号１）及びＨｏｍ−１がコードするアミノ酸配列（配列番号２）を以下に示す：
acctggccgc catgcgcctc tcctcctccc cacctcgtgg cccgcagcag ctctccagct ttggctccgt ggactggctc tcccagagca gctgctcagg gccgacccac acccccaggc ctgccgactt ctccctgggg agcctccctg gcccaggcca gacatccggc gcccgggagc cccctcaggc cgtcagcatc aaggaggccg ccgggtcctc aaatctgcct gcgccggaga ggaccatggc cgggttgagt aaggagccaa ataccttgcg ggccccccgt gtccgcacag ccttcaccat ggagcaggtc cgcaccttgg agggcgtctt ccagcaccac cagtacctga gccctctgga gcggaagagg ctggccaggg agatgcagct ctcagaggtc cagataaaaa cctggtttca gaatcgccgc atgaaacaca aacggcaaat gcaggacccc cagctgcaca gccccttctc ggggtctctc catgcgcccc cagctttcta ctcaacgtct tctggccttg ccaatggcct gcagctgctg tgcccttggg cacccctgtc cgggccccag gctctgatgc tgccccctgg ctccttctgg ggtctctgcc aagtggcaca agaggccctg gcatctgcgg gagcttcctg ctgcgggcag cctctggcgt cccacccccc taccccaggc cggccttcgc tgggaccagc cctgtccacg gggccccggg gcctgtgtgc tatgccacag acgggggatg cattttgagg aggcacctct gactcccaca ctcgcggtct tgctgatcgc acctggctcc tacctggagg actcagttgt tctgtttaca tcctggtggc acctctcacc ctgacccaca caaaggttct ggagattact ggagaatata tataaatata tatatgtacg tatatatgta aatacacata tacgtatata taaatatata tatacatatg tgtgtgtata tatatatata tttttttttt tttttttttt tttgagacgg agtgttgctc tgtcacccag gctggagtgc aatgacgcaa tctcggctca ctgcaacctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctccagcc tcagcctccc gagtagctgg gattacagac acccgccacc acgcccggct aattttttct atttttagta gaaatggggt ttcaccatgt tagccaggct ggtctcaaac tcctgaccct gtgatccgcc cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc cactgcaccc ggccctgaga atatatttat taaagccacc tcttcactga aagttaccga aagagtcggt ttaggaagga aacgaagggt cagtgaacag agtcaaatgc agaagtgggc ttgtcatggg tagggctttc ggcgtacgat aaaaggatca tttgtttttt aaaaggggtt ggaaaaactg gttttccagt tggaaacagt aaaggttgta agctttgtgt gtacaaaaga aaacagggaa tgcaggtgtg tttatagcgt tgtggttcaa gtccctctta acaagaactc caaagctgga aagcaggagg gaacaaaggt gaacatgaag gcgaggatgc tggggccctg cagtgcgctc taggctgtgc gtgagccggg actgtaccca cagcttgctg agggctgctc ttcttgggcc agggaaagca gggcagccgg gacctgcggc tgtgcctgga ctgaagctgt cccgcaggtc cccaccctcc aacacgtgct cacctgtccc cctcctcgca gcagcctcgg gacaaaacaa tgactcaagg acagcacttc tcgcagaagg tctggaagtg cccagaatgg gaggcacgga agcccctccc ggggaggact cccgcgttga tggaccgttc ttggtgcaga ctcctgactg cgtgcatgaa acctgagaca agtgcaattc cttccatgtc gccccagagt gcccaggagg caggcagtgc ggggtgccca ggcagacggg ttcagcctgc agaactggag gcgacctgtg aaacccaccc gggcacccca acaggaacag aagcgtggtc ctgcggctgc gtccccagcg agtttcactt tccccttgct cgtttctccc ttgttgtaag tgtttacaac tggcatgtgc ttttaaacgt caggtaagag gggaacagct gctgtacatc gtcctggcga gtgacaatgt gacagaagcc tgggcgaggc cctcggaggg cagcagctgg acaggggcta ctgggtttgg cctggacagc actgatttgt ggatgtggat gggggcacgt tgtccgtgat aaaagtacaa gtgcccctca caaaaaaaaa aaaaaaaa（配列番号１、下線：コーディング配列）
mrlssspprg pqqlssfgsv dwlsqsscsg pthtprpadf slgslpgpgq tsgareppqa vsikeaagss nlpapertma glskepntlr aprvrtaftm eqvrtlegvf qhhqylsple rkrlaremql sevqiktwfq nrrmkhkrqm qdpqlhspfs gslhappafy stssglangl qllcpwapls gpqalmlppg sfwglcqvaq ealasagasc cgqplashpp tpgrpslgpa lstgprglca mpqtgdaf（配列番号２、下線：アミノ酸９１〜１５１／ホメオドメイン）
【００１２】
被験体にＨｏｍ−１阻害剤、例えばＨｏｍ−１の発現を阻害する核酸分子を投与することによって、炎症性障害の治療を必要とする被験体において炎症性障害を治療する方法が本明細書に記載される。
【００１３】
核酸分子は、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドとすることができる。一実施形態では、核酸分子はモルホリノオリゴヌクレオチドである。モルホリノオリゴヌクレオチドは、標準ＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を有するが、塩基はモルホリン環に結合し、ホスホロジアミデート基を介して連結している。抗Ｈｏｍ−１モルホリノオリゴヌクレオチドは、
５’−TACTCAACCCTGACATAGAGGGTAA−３’（配列番号３）、
５’−GAGCCCGGTTTGCATACACGGCTAA−３’（配列番号４）、
５’−GCCCAGATAAGCAGCGCCTAATTGC−３’（配列番号５）、及び、
５’−CTGTAGGAAAAGCAAGATCAGAACA−３’（配列番号６）から選択される配列を有し得る。
【００１４】
「ＲＮＡｉ剤」という用語は、ＲＮＡ干渉を指向するために標的ＲＮＡに対して十分な配列相補性を有するＲＮＡ（又はその類似体）を指す。概して、干渉ＲＮＡ（「ｉＲＮＡ」）は、特定のｍＲＮＡの触媒分解をもたらす二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは通例、標的核酸分子に結合することができる配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその類似体である。
【００１５】
抗Ｈｏｍ−１核酸分子は任意の投与経路、例えば局所、経口、直腸、経鼻、静脈内、関節内、結膜、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内又は皮下投与経路により被験体に投与することができる。経路は、炎症部位に基づいて選択することができる。抗Ｈｏｍ−１核酸分子を含有する医薬組成物は、任意の投与経路用に、例えば注射液、丸薬、カプセル、点眼剤、噴霧剤、吸入剤、局所クリーム若しくはゲル、又はエアロゾルとして配合することができる。
【００１６】
一実施形態では、抗Ｈｏｍ−１核酸分子は、そのまま投与される。言い換えると、リポソーム又はウイルスベクター等の送達ビヒクルが核酸分子と共に使用されない。
【００１７】
任意のＨｏｍ−１阻害剤を被験体に投与する前に、被験体を試験することで、対照レベルと比較してＨｏｍ−１の発現レベルの上昇及び／又は炎症性サイトカインの発現レベルの上昇を有するかを決定することができる。一実施形態では、被験体から得られる炎症組織サンプルにおいて発現レベルを検出する。Ｈｏｍ−１の発現レベルが増大した被験体を、Ｈｏｍ−１阻害剤で治療することができる。対照レベルは非炎症組織、若しくは炎症性障害を有しない被験体におけるＨｏｍ−１発現レベルの代表的なレベル、又は治療対象の被験体の非炎症組織において見られるレベルとすることができる。
【００１８】
「被験体」は、ヒト及び非ヒト動物を指す。「治療する」又は「治療」は障害、障害の症状、障害に伴う病状又は障害に対する素因を治癒する、軽減する、緩和する、矯正する、発症を遅らせる又は改善する目的での障害を有する被験体への化合物又は作用物質の投与を指す。「有効量」は、治療された被験体において医学的に望ましい結果を生じることが可能な化合物の量を指す。治療方法は単独で、又は他の薬物若しくは療法と併せて行うことができる。
【００１９】
炎症性障害の治療剤を同定するスクリーニング方法も本明細書に記載される。該方法は、炎症組織サンプルと試験治療剤とを接触させることと、組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することとを含む。発現レベルが対照レベル以下である場合、試験治療剤が炎症性障害の候補治療剤となる。
【００２０】
炎症性障害の治療剤を、それを必要とする被験体において選択する方法も記載する。該方法は、被験体から得られる炎症組織サンプルと治療剤とを接触させることと、組織サンプルにおいて対照レベルと比較してより低いか又は同じＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、治療剤を被験体に投与することとを含む。
【００２１】
炎症性障害の治療剤の有効性を、それを必要とする被験体においてモニタリングする方法が更に記載される。該方法は、治療剤を被験体に投与した後に被験体から得られる炎症組織サンプルにおいてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することと、検出レベルと対照レベルとを比較することと、比較に基づいて治療決定を行うこととを含む。検出レベルが対照レベルより低い場合、治療剤が被験体における炎症の治療に効果的であることが示される。検出レベルが対照レベル以上である場合、同じ治療剤を与え続けるか、又は異なる治療剤を試みるという決定を下すことができる。
【００２２】
治療剤又は試験治療剤はタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、細胞、抗体若しくはそのフラグメント、小分子化合物、核酸分子又は植物抽出物とすることができる。一実施形態では、治療剤又は試験治療剤はステロイド性、非ステロイド性の抗炎症薬又は免疫抑制剤であり得る。
【００２３】
上記のスクリーニング、選択又はモニタリングの方法では、対照レベルは、非炎症組織におけるＨｏｍ−１の発現レベルの代表的なレベルとすることができる。対照レベルは、治療剤又は試験治療剤と接触させる前の炎症組織サンプルにおけるＨｏｍ−１の発現レベルとすることもできる。当業者であれば好適な対照レベルを決定することが可能である。
【００２４】
一態様では、改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を用いて炎症性障害を治療する方法が記載される。該方法は、Ｈｏｍ−１阻害剤で処理した、又はＨｏｍ−１阻害剤を発現する発現構築物を含有する改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を準備することを含む。改変マクロファージ、単球又は樹状細胞は、対照レベルと比較してより低レベルのＨｏｍ−１を発現する。有効量の改変マクロファージ、単球又は樹状細胞を、炎症性障害を有する被験体に投与する。
【００２５】
Ｈｏｍ−１阻害剤はタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、細胞、抗体若しくはそのフラグメント、小分子化合物、核酸分子又は植物抽出物とすることができる。一実施形態では、阻害剤は、ＲＮＡｉ剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド）である。
【００２６】
改変細胞を被験体に投与する前に、被験体から得られるサンプル（例えば、炎症組織サンプル）におけるＨｏｍ−１の発現レベルを決定することができる。発現レベルが対照レベルよりも高い場合、被験体が治療に好適であるとみなされる。対照レベルは、非炎症組織におけるレベルの代表的なレベル又は治療対象の被験体から得られる非炎症組織サンプルにおいて検出されるレベルとすることができる。この場合も、当業者であれば好適な対照レベルを決定することが可能である。
【００２７】
Ｈｏｍ−１発現レベルは、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルのいずれかで決定することができる。ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルを測定する方法は、当該技術分野で既知である。
【００２８】
本明細書に記載される方法のいずれにおいても、炎症（例えば、炎症の存在又は程度）の指標としてＨｏｍ−１の発現レベルを検出することに加えて又は代替的に、炎症誘発性サイトカインの発現及び／又は分泌、抗炎症性サイトカインの発現及び／又は分泌、Ｍ１又はＭ２マクロファージのマーカーの発現、ＤＣ分化及び活性化のマーカーの発現の検出を用いて炎症を測定することもできる。
【００２９】
炎症性障害は、局所又は全身の急性又は慢性炎症によって特徴付けられる。炎症性障害としては、炎症性皮膚疾患（例えば皮膚炎、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹、壊死性血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、好酸球性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎又は好酸球性筋膜炎）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、急性呼吸促迫症候群、劇症肝炎、膵炎、過敏性肺疾患（例えば過敏性肺炎、好酸球性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患又はＩＬＤ、特発性肺線維症、及び関節リウマチと関連するＩＬＤ）、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年発症性糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫性甲状線炎、強直性脊椎炎、全身性硬化症、多発性硬化症、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アナフィラキシー、全身性アナフィラキシー、過敏性応答、全身炎症状態、薬物アレルギー、昆虫刺傷アレルギー、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、ヒト免疫不全、ウイルス感染、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病、並びに慢性腎疾患、眼炎症性疾患、ブドウ膜炎及び結膜炎、神経炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
当業者であれば、個体が炎症性障害を有するかを決定することが可能である。炎症性障害を有することが疑われる被験体から得られるサンプル（例えば組織、細胞又は体液サンプル）におけるＨｏｍ−１の発現レベルを、診断ツールとしても用いることができる。
【００３１】
以下の特定の実施例は単なる例示と解釈され、それ以外の開示を何ら限定するものではない。更に詳述しなくても、当業者であれば本明細書における説明に基づき、最大限に本開示を使用することができると思われる。
【実施例】
【００３２】
マクロファージは、先天免疫及び適応免疫の両方の主要調節因子である。マクロファージの可塑性が細胞内因子によってどのように調節されるかは、完全には理解されていない。下記のデータから、ヒトホメオボックス転写因子Ｈｏｍ−１が、Ｍ１表現型へのマクロファージ極性化の指向において極めて重要な役割を果たすことが実証される。Ｈｏｍ−１発現は、ＩＢＤ患者の炎症粘膜から単離された組織マクロファージにおいて異常に上昇している。ｅｎ  ｂｌｏｃ培養モデルを用いることで、モルホリノオリゴヌクレオチドによる組織マクロファージにおけるＨｏｍ−１発現のノックダウンにより組織炎症が軽減され、粘膜上皮細胞の生存能力が保護され得ることが示された。まとめると、本発明者らのデータから、Ｈｏｍ−１を炎症性障害の管理のための新規の標的とすることができることが示唆される。
【００３３】
Ｈｏｍ−１発現は、炎症胃腸粘膜から単離されたマクロファージにおいて上方調節される
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球由来マクロファージモデルを用いることで、Ｈｏｍ−１が単球からマクロファージへの分化及び炎症誘発性活性化を制御することが示された。組織マクロファージの分化及び活性化におけるＨｏｍ−１の潜在的役割を検証するために、ＩＢＤ患者の粘膜から単離された粘膜マクロファージにおけるＨｏｍ−１発現を検査した。Ｈｏｍ−１発現が、炎症粘膜から単離されたマクロファージにおいて、同じ患者の正常粘膜から単離された対照マクロファージと比較して顕著に上昇していることが見出された。ＦＡＣＡＳ及びＥＬＩＳＡ分析を用いることで、Ｈｏｍ−１の発現の上昇と同時にＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６等のＭ１表面マーカーの発現、並びにＭ１炎症誘発性サイトカインの発現及び分泌が、炎症粘膜から単離されたマクロファージにおいて上昇していることが見出された。加えて、炎症粘膜から単離されたマクロファージにおいて活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）の発現も上昇していることが見出された。
【００３４】
Ｈｏｍ−１は、粘膜マクロファージの可塑性を調節し、粘膜マクロファージをＭ１表現型へと極性化する
可塑性がマクロファージの特徴である。環境信号に応答して、マクロファージは、古典的炎症誘発性Ｍ１表現型から顕著な特徴を有する様々なＭ２表現型に及ぶ幅広い表現型を示す。コルチコステロイドは、炎症性障害を管理するために広く使用されており、マクロファージのＭ２表現型を誘導することが示されている。Ｈｏｍ−１が粘膜マクロファージの可塑性の調節において役割を果たすかを決定するために、Ｈｏｍ−１の発現に対するコルチコステロイドの影響を検査した。粘膜ＣＤ１４マクロファージとプレドニゾロン（predinisolone）とのインキュベーションにより、Ｈｏｍ−１発現レベルの顕著な低減及びＭ１サイトカインＩＬ１２分泌の特徴的な低減がもたらされたが、Ｍ２サイトカインＩＬ１０の分泌は増大した。マクロファージ可塑性の調節におけるＨｏｍ−１の潜在的役割と一致して、ＧＦＰ−Ｈｏｍ−１をトランスフェクトした粘膜マクロファージではなく、ＧＦＰをトランスフェクトした粘膜マクロファージの形態を、ＰＤにより特徴的なラウンドアップ（roundup）表現型を示すように誘導することができることが見出された。ＧＰＦ又はＧＦＰ−Ｈｏｍ−１を発現するマクロファージの培養培地におけるＣＤ８０の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析及びＩＬ１２分泌のＥＬＩＳＡ分析から、Ｈｏｍ−１がマクロファージをＰＤにより誘導されるＣＤ８０の低減及びＩＬ１２の分泌に抵抗性を示すようにすることが示された。Ｈｏｍ−１がマクロファージの極性化を調節するかを更に検証するために、Ｍ２からＭ１へのスイッチの誘導時のＨｏｍ−１発現を、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏマクロファージ分化モデルを用いて検査した。Ｈｏｍ−１発現がＭ２からＭ１への極性化の誘導時に上昇することが見出された。マクロファージの極性化におけるＨｏｍ−１の主要な調節的役割を明確にするために、ＬＰＳにより誘導されるＭ２からＭ１への表現型スイッチにおけるＨｏｍ−１のノックダウンの影響を検査した。Ｈｏｍ−１の下方調節により、マクロファージがＬＰＳにより誘導されるＭ１極性化に抵抗性を示すようになることが見出され、その過程におけるＨｏｍ−１の主要な調節的役割が示唆される。マクロファージ極性化におけるＨｏｍ−１の機能を更に明確にするために、Ｍ２マクロファージにおけるＨｏｍ−１の異所性発現の影響を検証したが、Ｈｏｍ−１の過剰発現によりＭ１マーカーＣＤ８０の表面発現の顕著な増大、並びにＭ１サイトカインＩＬ１ｂ、ＩＬ１２及びＴＮＦａの分泌の上昇がもたらされることが見出された。まとめると、データから、Ｈｏｍ−１がマクロファージの可塑性の調節において重要な役割を果たし、マクロファージをＭ１表現型へと極性化することが示唆された。
【００３５】
Ｈｏｍ−１は、Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子の発現を差次的に調節する
Ｈｏｍ−１により調節されるマクロファージの極性化の潜在的機構を検証するために、Ｍ１遺伝子及びＭ２遺伝子の特徴的発現に対するＨｏｍ−１の異所性発現の影響を検査した。Ｈｏｍ−１発現がＩＬ１、ＩＬ１２及びＴＮＦａ等のＭ１遺伝子の発現を促進するが、ＩＬ１０及びＴＧＦｂ等のＭ２遺伝子の発現を抑制することが見出された。Ｈｏｍ−１発現が試験したＭ２遺伝子の発現ではなく、Ｍ１遺伝子の発現に必要とされるという本発明者らの以前の所見と合わせると、本発明者らのデータにより、Ｈｏｍ−１がＭ１遺伝子及びＭ２遺伝子の発現を極性化することによってマクロファージの可塑性を調節することが示唆された。
【００３６】
組織炎症の発生機序におけるＨｏｍ−１により調節されるマクロファージ可塑性の標的化
Ｈｏｍ−１により調節されるマクロファージを標的化し、組織炎症を軽減することができるかを更に決定するために、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の炎症又は正常粘膜から得られる組織のｅｎ  ｂｌｏｃ培養物を使用した。臨床所見と一致して、ＴＮＦａ、ＩＬ１β及び硝酸塩等の炎症性サイトカインの分泌が炎症組織の培養物中で顕著に上昇していることが見出された。次いで、抗Ｈｏｍ−１モルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯ）を組織培養物に添加し、それが粘膜マクロファージにおけるＨｏｍ−１の発現を下方調節することができるかを検査した。Ｈｏｍ−１  Ｍｏがｅｎ  ｂｌｏｃ組織培養物中でマクロファージにおけるＨｏｍ−１発現を効率的に阻害することが見出された。組織炎症に対するＨｏｍ−１  ＭＯの影響を更に検証するために、ｅｎ  ｂｌｏｃ組織とＨｏｍ−１とのインキュベーション時のＴＮＦａの濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検査した。Ｈｏｍ−１  ＭＯにより培養物中のＴＮＦａの量が用量依存的に低減することが見出された。他の炎症誘発性サイトカインの分泌に対するＨｏｍ−１  ＭＯの影響を更に検証するために、ＩＬ１及び硝酸塩の分泌に対するＨｏｍ−１  ＭＯの影響を検査したが、ＴＮＦａと同様に、Ｈｏｍ−１  ＭＯがｅｎ  ｂｌｏｃ培養系においてこれらの炎症誘発性サイトカインの強い阻害をもたらすことが見出された。ｅｘ  ｖｉｖｏでのｅｎ  ｂｌｏｃ培養物がｉｎ  ｖｉｖｏでの組織微小環境を反映し得るため、本発明者らのデータから、組織炎症を軽減するためにＨｏｍ−１  ＭＯにより組織マクロファージを標的化することができることが示唆された。
【００３７】
Ｈｏｍ−１  ＭＯは、炎症組織の炎症における上皮細胞の生存能力を奪回する
粘膜潰瘍を引き起こす上皮細胞のアポトーシスがＩＢＤの特徴である。組織炎症は、粘膜上皮細胞のアポトーシスの大きな要因であると考えられていた。ｅｎ  ｂｌｏｃ組織培養物を用いることで、炎症粘膜から単離された組織において、正常対照組織の上皮細胞のアポトーシス率と比較して、より高い粘膜上皮細胞のアポトーシス率が見られることが見出された。Ｈｏｍ−１  ＭＯをｅｎ  ｂｌｏｃ組織培養物に添加した場合、対照ＭＯではなくＨｏｍ−１  ＭＯが組織培養物中の上皮細胞のアポトーシスに対して強い阻害効果を及ぼすことが見出された。Ｈｏｍ−１  ＭＯが組織炎症を軽減し得るという本発明者らの所見と合わせると、データから、Ｈｏｍ−１  ＭＯが炎症を管理する作用物質として機能し得ることが示唆された。
【００３８】
単球の単離及び培養
ボストン小児病院での健常な成人ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ヒト物質を用いた実験は、ブリガムアンドウィメンズ病院の施設内審査委員会により認可されたガイドラインに従って行った。ＣＤ１４＋単球を、抗ＣＤ１４コーティングマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いてＰＢＭＣから精製した。新たに単離したＣＤ１４＋単球の純度は、フローサイトメトリーにより分析したところ９５％超であった。単球を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて１２ウェルプレートにおいて１×１０６細胞／ｍｌで培養した。Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ３はPeproTechから購入し、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで使用した。サイトカインを、２日又は３日に１回培養物に添加した。
【００３９】
ＲＮＡ干渉
ヒト初代単球を、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Lonza）を用い、製造業者の取扱説明書に従ってトランスフェクトした。簡潔に述べると、５×１０６個の単球を、Ｈｏｍ−１  ｓｉＲＮＡ（フォワード：５’−UUCAGAAUCGCCGCAUGAAACACAAACGG−３’（配列番号７）；リバース：５’−CCGUUUGUGUUUCAUGCGGCGAUUCUGAA−３’（配列番号８））又は非有効ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（フォワード：５’−UGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGC−３’（配列番号９）；５’−リバース：GCACUGCACGCCGUAGGUCAGGGUGGUCA−３’（配列番号１０））のいずれか０．５ｎｍｏｌを含む１００μｌのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に再懸濁した後、ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ  Ｄｅｖｉｃｅ（Lonza）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を装置から即座に取り出し、２ｍＭグルタミン及び１０％ＦＢＳを含有する１ｍｌの予め温めたＨｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｍｅｄｉｕｍと共に一晩インキュベートした。次いで、細胞を完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、適切なサイトカインで処理して、マクロファージへの分化を誘導した。同様に、単球に由来するマクロファージを、Ｈｕｍａｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Lonza）を用い、製造業者の取扱説明書に従ってトランスフェクトした。
【００４０】
ＦＡＣＳ分析
単球／マクロファージの表現型分析を、蛍光染料コンジュゲート抗体による細胞の免疫標識後にフローサイトメトリーを用いて行った。以下の抗体を使用した：ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ７１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＴＬＲ４、ＩＬ１−β及びＴＮＦ−α、並びにＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４０、ＣＤ３６（eBioscience）；ＦＩＴＣコンジュゲート抗マンノース受容体（ＭＲ）、並びに非コンジュゲートマウス抗ＭＣＳＦＲ（R&D Systems）。同位体対照標識を並行して行った。抗体は、供給業者によって推奨されるように希釈した。ＰＥコンジュゲートウサギ抗マウス（rabbit against mouse）ＩｇＧ抗体を、二次Ｍ−ＣＳＦＲ染色に使用した。標識細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（BD Bioscience）でＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。結果は陽性細胞のパーセンテージ、及び／又はアイソタイプ対照抗体を用いて得られたＭＦＩを減算した平均蛍光強度（ＭＦＩ）値として表す。
【００４１】
ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬によって単離し、等量のＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）による第一鎖ｃＤＮＡ合成に、製造業者のプロトコルに従って使用した。Ｈｏｍ−１  ｃＤＮＡを従来のＰＣＲにより増幅するために、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ系（Invitrogen）を製造業者の取扱説明書に従って使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを用いたＨｏｍ−１及びサイトカイン  ｃＤＮＡの定量的測定を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ；Roche）で行った。
【００４２】
サイトカイン測定
大腸菌（E. coli）のＬＰＳ（Sigma）及びＩＦＮ−γ（PeproTech）で処理したマクロファージ又はＬＰＳで処理したＵ９３７細胞の上清中のＩＬ−１β及びＴＮＦ−α及びＩＬ１２ｐ７０のレベルを、eBiosciencesから入手したＥＬＩＳＡキットを用いて定量化した。分析は製造業者の取扱説明書に従って行った。
【００４３】
活性酸素種（ＲＯＳ）及び一酸化窒素（ＮＯ）の検出
活性化マクロファージにおけるＲＯＳレベルを、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ（商標）  ＬＩＶＥ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Invitrogen）を用い、結果を蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーの両方で分析した以外は、基本的に製造業者の取扱説明書に従って検出した。ＮＯレベルを、Ｇｒｉｅｓｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｎｉｔｒｉｔｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（Invitrogen）により、製造業者によって提示されるプロトコルに従って決定した。
【００４４】
細胞染色（Cytostaining）
ライトギムザ染色のために、Sigma製の染色キットを製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【００４５】
統計分析
データを、対応のあるスチューデントのｔ検定（両側）及びウィルコクソンの順位和検定を用いて分析した。ｐ値が０．０５未満の差を統計的に有意であるとみなした。
【００４６】
その他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴は、あらゆる組み合わせで組み合わされてよい。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的にかなう代替となる特徴によって置き換えられてよい。このように、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴のうちの単なる一例である。
【００４７】
上記詳細な説明から、当業者であれば、記載される実施形態の本質的な特性を容易に特定することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な使用法及び条件に適合するために上記実施形態の様々な変更及び修正を行うことができる。このように、その他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【配列表】
2019512018000001.app
【国際調査報告】
2019512018.tif 000002
2019512018.tif 000003
2019512018.tif 000004
2019512018.tif 000005