(57)【要約】免疫遺伝子療法を使用する「インサイチュワクチン接種」は、患者の免疫系によって指向されるポリクローナル抗腫瘍応答を誘導する能力を有する。切除不能のＭＰＭを有する患者は、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター（セレコキシブ）の１４日間コースと同時に、ヒトインターフェロン−α（ｈＩＦＮ−α２ｂ）遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＩＦＮ）の２胸膜内用量を受け、続いて、標準的な第１選択肢または第２選択肢の細胞傷害性化学療法を受けた。４０名の被験体、ＥＣＯＧ  ＰＳ  ０または１を、処置した：１８名は、第１選択肢の白金を伴うペメトレキセドベースの化学療法を受け、２２名は、第２選択肢のペメトレキセドベース（ｎ＝７）またはゲムシタビンベース（ｎ＝１５）のレジメンを伴う化学療法を受けた。全生存率は、第２選択肢群においてヒストリカルコントロールより有意に高かった。
2019507803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者を処置するための方法であって、該方法は、
ａ．該患者においてがんを診断する工程；そして次いで、
ｂ．該患者を、抗葉酸および白金薬剤併用レジメン；抗葉酸および白金薬剤およびベバシズマブ併用レジメン；プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）インヒビター；プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）インヒビター；ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）インヒビターおよびＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１インヒビター併用レジメンからなる群より選択される処置を含む第１選択肢処置レジメンで処置する工程；そして次いで、
ｃ．該患者において、該第１選択肢処置レジメンに抵抗性であるかまたは該第１選択肢処置レジメン後に再発する類上皮がんを診断する工程；そして次いで、
ｄ．該患者を、ヒトにおいてインターフェロン発現を誘導するために有効な量において、インターフェロンの発現を誘導する薬剤で処置する工程；そして次いで、
ｅ．該患者を、ペメトレキセド、ゲムシタビン、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される処置を含む第２選択肢処置レジメンで処置する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記第２選択肢処置レジメンは、ペメトレキセドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２選択肢処置レジメンは、ゲムシタビンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インターフェロンの発現を誘導する薬剤は、抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原は、ウイルス抗原を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス抗原は、抗原性ウイルスを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原性ウイルスは、ヒトインターフェロンをコードする導入遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原性ウイルスは、ｒＡｄ．ＩＦＮを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｒＡｄ．ＩＦＮは、約３×１０１１  ウイルス粒子の用量で提供され、胸膜内に送達される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２選択肢処置レジメンは、ベバシズマブ；プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）インヒビター；プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）インヒビター；および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）インヒビターからなる群より選択される処置をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２選択肢処置レジメンは、セレコキシブでの処置をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／３０４２３３号に基づく優先権を主張しており、その内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府の利益
この研究は、一部国立がん研究所認可番号ＮＣＩ  Ｐ０１  ＣＡ６６７２６によって基金を得た。
【０００３】
研究契約
この研究は、本明細書で使用されるｒＡｄ−ＩＦＮ免疫−遺伝子ベクターの製造者、ＦＫＤ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって支援された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
簡単な説明
免疫遺伝子療法を使用する「インサイチュワクチン接種（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」は、患者の免疫系によって指向されるポリクローナル抗腫瘍応答を誘導する能力を有する。
【０００５】
実験デザイン：    切除不能の悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を有するヒト患者は、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター（セレコキシブ）の１４日間コースと同時に、ヒトインターフェロン−α（ｈＩＦＮ−α２ｂ）遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスベクター（Ａｄ．ＩＦＮ）の２胸膜内用量を受け、続いて、標準的な第１選択肢または第２選択肢の細胞傷害性化学療法を受けた。主要な転帰は、安全性、毒性、および客観的奏功率であった；第２の転帰は、無増悪生存および全生存を含めた。血液および腫瘍に対する生体相関（ｂｉｏ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）を測定した。
【０００６】
結果：    ４０名の被験体、ＥＣＯＧ  ＰＳ  ０または１を、処置した：１８名は、第１選択肢の白金を伴うペメトレキセドベースの化学療法を受け、２２名は、第２選択肢のペメトレキセドベース（ｎ＝７）またはゲムシタビンベース（ｎ＝１５）のレジメンを伴う化学療法を受けた。処置は、十分に寛容され、有害事象は、ヒストリカルコントロールに匹敵した。改訂ＲＥＣＩＳＴを使用すると、全奏功率は２５％であり、病勢コントロール率は、８８％であった。上皮組織構造を有する全患者に関するメジアン全生存（ＭＯＳ）は、２１ヶ月（９５％  ＣＩ［１２，∞］）であった。対して非上皮組織構造を有する患者に関しては７ヶ月（９５％  ＣＩ［６，∞］）であった。第１選択肢化学療法コホートにおけるＭＯＳは、１２．５ヶ月（９５％  ＣＩ［８，２１］）であった。その一方で、第２選択肢化学療法コホートに関するＭＯＳは、２１．５ヶ月（９５％  ＣＩ［９，∞］）であり、患者のうちの３２％は、２年を経て生存していた。活性化血中Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の数、血中の調節性Ｔ細胞の数、血液もしくは胸膜液中のインターフェロン−αのピークレベル、抗腫瘍抗体の誘導、または処置前生検における免疫遺伝子シグネチャーを含めて、応答と相関する生物学的パラメーターは全く見出されなかった。
【０００７】
結論：  胸膜内Ａｄ．ＩＦＮ、セレコキシブ、および全身化学療法の併用は、ＭＰＭを有する患者において安全であると判明した。全生存率は、第２選択肢群においてヒストリカルコントロールより有意に高かった。この研究の結果は、標準的化学療法単独に対して化学−免疫遺伝子療法の多施設無作為化臨床試験に伴う成り行きを裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１は、Ｘ線撮影応答のウォーターフォールプロットにおけるＡｄ．ＩＦＮ＋化学療法への応答（Ａ）、改訂ＲＥＣＩＳＴ測定値から評価した場合の腫瘍サイズのパーセント変化を使用するスパイダープロット（Ｂ）、および血清メソテリン反応性タンパク質（ＳＭＲＰ）における倍数変化を使用するスパイダープロット（Ｃ）を示す。改訂ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用する奏功率は、図１Ａに示される。図１Ｂおよび図１Ｃは、それぞれ、ベースラインと比較した改訂ＲＥＣＩＳＴ測定値および血清メソテリン（ＳＭＲＰ）レベルにおける変化を示す。
【図１−２】図２は、全被験体（ｎ＝４０）（Ａ）または腫瘍組織構造（非上皮（ｎ＝１０）  対  上皮（ｎ＝３０））によって分離した被験体（Ｂ）、第１選択肢治療とペメトレキセドとを受けた被験体（ｎ＝１８）（Ｃ）、第２選択肢治療を受けた被験体（ｎ＝２２）（Ｄ）、および化学療法のタイプ（ゲムシタビンベース（ｎ＝１５）  対  ペメトレキセドベース（ｎ＝７））によって分離した第２選択肢被験体（Ｅ）の生存に関するカプラン−マイヤープロットを示す。図２Ａは、患者全体の群のカプラン−マイヤー曲線を示す。多くの下位群を分析した。図２Ｂは、非上皮組織構造を有する１０名の患者のＭＯＳ（６．５ヶ月）に対する上皮組織構造を有する３０名の患者のＭＯＳ（１９ヶ月）における有意差（ログランク、ｐ＝．００４）を示す。図２Ｃは、最先端化学療法で処置した処置未経験の１８名の患者は、１２ヶ月のＭＯＳ（９５％  ＣＩ［６，１５］）とともに、６．５ヶ月のメジアンＰＦＳ（９５％  ＣＩ［５．５，１１．５］）を有した。図２Ｄは、第２選択肢治療で処置した２２名の患者における生存を示す。第２選択肢コホートに関するＭＯＳは、１７ヶ月であった（９５％  ＣＩ［６．５，２６］）。図２Ｅは、第２選択肢コホートの下位群分析である。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図１−５】同上。
【図２】補足図２は、ベースラインのアデノウイルスＮａｂ力価の分布を示す。
【図３−１】補足図３Ａは、ベクター注入前（１日目）に測定したインターフェロン−αの血清レベルを示す。
【図３−２】補足図３Ｂは、３８名の患者においてベースラインで測定した胸膜液または胸腔洗浄物中のＩＦＮαのレベルを示す。
【図３−３】補足図３Ｃは、生存時間と血清インターフェロンレベルとの相関を示す。  補足図３Ｄは、生存時間と胸膜インターフェロンレベルとの相関を示す。
【図４】補足図４Ａおよび４Ｂ、ならびに補足図５は、リンパ球（ＣＤ８染色）、マクロファージ（ＣＤ６８染色）浸潤の程度、およびＰＤ−Ｌ１の発現との免疫組織化学相関を示す。
【図５】同上。
【図６】補足図６は、これらの免疫応答関連遺伝子の発現の強度に関してランク付けしたＭＰＭ標本を示す。  表１は、２０１１年３月〜２０１３年１０月の間の治験に登録したＭＰＭを有する４０名の患者に関する患者個体群統計をまとめる。  表２Ａは、重篤な有害事象を示す。  表２Ｂは、研究の化学療法部分の間の有害事象を示す。  表３は、改訂ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用する奏功率を示す。  補足表１は、ペメトレキセドおよびシスプラチン（またはカルボプラチン）の現在の最先端標準治療化学療法レジメンに関するメジアン全生存（ＭＯＳ）を示す。  補足表２は、その後の治療および効果を示す。  補足表３は、良好な応答（平均生存＝２３．５ヶ月）を有する６名の患者におけるＰＢＭＣのフローサイトメトリーを示し、結果を、不十分な応答（平均生存＝７．２ヶ月）を有する６名の患者と比較した。  補足表４は、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）技術を使用して６００の免疫応答関連遺伝子に関してインターロゲートしたＲＮＡを示す。  補足表５は、処置後患者の血清中の抗腫瘍抗体の発現を示す。  補足表６は、ＮＫ活性化レセプターＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫｐ３０の増大、ならびにＣＤ８  Ｔ細胞活性化シグネチャー（ＣＤ３８ｈｉ／ＨＬＡ−ＤＲｈｉおよびｋｉ６７ｈｉ／Ｂｃｌ−２ｌｏｗ）の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、代表的には、標準的な医療レジメンに不十分にしか応答しない、高死亡率の急速に進行する胸部新生物である（１）。現在の最先端標準治療化学療法レジメンは、ペメトレキセドおよびシスプラチン（またはカルボプラチン）であり、１２〜１３ヶ月のメジアン全生存（ＭＯＳ）を生じる（補足表１）。進行性疾患を有する患者は、さらなる薬剤（ゲムシタビンまたはビノレルビンのような薬物が挙げられる）が提供され得るが、ＭＰＭの第２選択肢処置は、顕著な奏功率または生存の改善を示しておらず、この適応症に関してＦＤＡは承認していない（１、２）。第２選択肢化学療法を受けている、ＭＰＭを有する患者に関して、ＭＯＳは、およそ９ヶ月である（補足表１）。
【００１０】
これらの次善の結果を考慮して、本発明者らのグループは、インサイチュ免疫遺伝子療法の使用を探索して、胸膜内投与される第１世代の複製欠損アデノウイルス（Ａｄ）を使用してＭＰＭを処置してきた（３）。本発明者らの近年の研究は、タイプ１インターフェロン遺伝子（最初は、インターフェロン−β、その後、インターフェロン−α）をコードするＡｄベクターに焦点を当てた（４〜６）。タイプ１インターフェロンは、ある種の腫瘍においていくらかは成功裡に使用され（７）、そして胸膜内インターフェロン−γは、初期ステージの中皮腫においていくらかの効力を示した（８）が、高用量が必要であり、関連する全身副作用が、サイトカイン遺伝子の局所送達によって潜在的には克服される問題であるものの、このアプローチの有用性を制限した。
【００１１】
胸膜内注射後に、Ａｄ．ＩＦＮは、良性の中皮細胞および悪性中皮腫細胞の両方を効率的にトランスフェクトし、胸腔および腫瘍内でのインターフェロンの高濃度の生成を生じた（４〜６）。Ａｄ．ＩＦＮでの中皮腫細胞形質導入は、腫瘍細胞死および免疫系への強力な刺激を生じる。なぜならタイプ１インターフェロンは、樹状細胞における腫瘍ネオアンチゲン提示／プロセシングを増強し、ＴＨ１極性化を誘導し、細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞機能を増強し、ＮＫ細胞およびＭ１表現型マクロファージの機能をも増強するからである（７、９）。Ａｄウイルスベクター自体に対する炎症性応答はまた、さらなる「危険シグナル」を誘発し、抗腫瘍免疫応答をさらに強化する（１０）。この多方面からのアプローチは、腫瘍微小環境を変化させ、腫瘍細胞を死滅させ、そして先天性免疫系および適応免疫系を刺激する。
【００１２】
本発明者らは以前に、フェーズＩ胸膜内Ａｄ．ＩＦＮ治験において抗腫瘍体液性および細胞性免疫応答の安全性、実現可能性、および誘導を示した（４〜６）。本発明者らはまた、最大耐量を同定し、３日間の投与間隔で投与した２用量のＡｄ．ＩＦＮ−α２ｂが、毒性の増強なしに増強された遺伝子移入を生じることを示した。いくらかの患者では、このアプローチは、「寛容性をだめにする」ようであった−−さらなる治療なしで数ヶ月にわたる遠隔部位での腫瘍退縮によって特徴づけられる長期持続性の応答（おそらくは免疫学的な）を生じる。膀胱がん患者において膀胱内注入を介するその同じＡｄ．ＩＦＮ−α２ｂベクターを使用する治験はまた、有望な結果を示した（１１）。
【００１３】
促進するものの、本発明者らのフェーズＩ研究における腫瘍応答のパーセンテージおよび程度は、制限された。本発明者らは、シクロオキシゲナーゼ−２阻害を付加する（ＰＧＥ２およびＩＬ−１０生成を減少させることによって、免疫抑制性腫瘍微小環境を緩和する）ことによって（１２）、および化学療法の同時／アジュバント投与（１３）によって、前臨床モデルにおいてアデノウイルス免疫遺伝子療法の効力を増強しようとした。この後者のアプローチは、ある種の形態の化学療法による−他の機構の中でも樹状細胞への腫瘍ネオアンチゲンの曝露および調節性Ｔ細胞の枯渇による−免疫刺激が、治療効力にとって極めて重要であるという新しいコンセンサスとよく合う（１４〜１７）。よって、本発明者らは、胸膜内Ａｄ．ｈＩＦＮ−α２ｂ（高用量セレコキシブと併用して与えられる）の２用量、続いて、標準的な第１選択肢または第２選択肢の化学療法の安全性および活性を評価するために、手術による切除の候補でなかったＭＰＭ患者においてパイロットおよび実現可能性研究をデザインした。
【００１４】
方法
研究デザインおよび患者
この単一施設のオープンラベルの非無作為化パイロットおよび実現可能性治験において、２つの主な転帰尺度は、以下であった：１）安全性および毒性、ならびに２）腫瘍応答（改訂ＲＥＣＩＳＴによる）。第２の転帰は、以下を含んだ：ＰＦＳ、ＯＳ、ならびに臨床応答および複数の免疫パラメーターの生体相関。
【００１５】
この治験において使用されるベクター（そもそもは、ＳＣＨ  ７２１０１５（Ａｄ．ｈＩＦＮ−α２ｂ）といわれる）は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域においてヒトＩＦＮ−α２ｂ遺伝子の挿入を有する臨床グレードの血清タイプ５、Ｅ１／部分的Ｅ３欠失複製不能アデノウイルスである（６）。それは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，  ＮＪ）によって提供された。
【００１６】
明記される資格：  ［１］病理確認されたＭＰＭ；［２］ＥＣＯＧパフォーマンスステイタスが０または１；および［３］ベクター注入のためのアクセス可能な胸腔。排除基準は、心膜液貯留、不適切な肺機能（ＦＥＶ１＜１リットルまたは＜４０％の推定値（胸腔ドレナージ後））、重大な心臓、肝臓、もしくは腎臓の疾患、または高い中和抗Ａｄ抗体（Ｎａｂｓ）力価（＞１：２０００）を含んだ。
【００１７】
中止基準および用量制限毒性（ＤＬＴ）として働く有害事象の詳細な説明は、補足方法に記載される。非常に簡潔ではあるが、ＤＬＴは、（ＮＩＣ基準を使用して）任意のグレード４の毒性、グレード３の低血圧症またはアレルギー反応、グレード３の７日間を超えて持続する非血液毒性、持続性のサイトカイン放出症候群、またはグレード３の＞７日間にわたって持続する血液毒性によって規定した。
【００１８】
プロトコルは、Ｐｅｎｎ  ＩＲＢ（ＵＰＣＣ  ０２５１０）、ＦＤＡ（ＢＢ−ＩＮＤ  １３８５４）、およびＮＩＨの組換えＤＮＡ諮問委員会によって承認された。書面によるインフォームド・コンセントを、スクリーニング時に患者から得、その研究を、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０１１１９６６４）において登録した。
【００１９】
研究デザイン
適格なＭＰＭ患者は、局所麻酔下でのまたは胸腔鏡下検査を介するトンネル型（ｔｕｎｎｅｌｅｄ）胸腔内カーテル挿入を受けた（６）。研究１日目および４日目に、３×１０１１  ウイルス粒子（ｖｐ）  Ａｄ．ｈＩＦＮ−α２ｂの用量（２５〜５０ｃｃの滅菌通常生理食塩水中で希釈）を、胸腔の中に注入した。患者を、ベクター注入後の少なくとも２４時間にわたって、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＴＲＣ）において観察した。ベクターを、経口セレコキシブの１４日間コース（ベクター注入の３日前に開始して４００ｍｇを１日に２回）と同時に投与した。
【００２０】
ベクターの第１の用量の１４日後に、患者は、２つの処置群のうちの１つにおいて外来化学療法を開始した：処置未経験の患者は、ペメトレキセドおよび白金薬剤（シスプラチンまたはカルボプラチンのいずれか）での標準用量の最先端化学療法を受けた。第２選択肢化学療法を受けている者は、ゲムシタビン＋／−カルボプラチンを主に受けた（表１）。さらに、その第２選択肢コホートは、疾患安定性または応答があった、以前に少なくとも６ヶ月ペメトレキセドベースの化学療法を受けたことがある患者を含んだ。これらの被験体は、医学文献中で報告されているように、ペメトレキセドで再処置した（補足表１）。
【００２１】
患者を、１９０日目までは外来患者として、その後は、電話または電子カルテによってモニターした。患者を、最初の処置後６週間ごとに、胸部ＣＴスキャンを使用して６ヶ月まで、抗腫瘍応答に関して評価した。最初の追跡ＣＴスキャン（ベクター投与のおよそ２ヶ月後）で進行が記録された場合、被験体は、他の治療選択肢を進めたが、追跡し続けた（補足表２）。６ヶ月後、患者を再診して、地域の医師との連携によって、および電話での会話によって、追跡した。死亡および進行の時を記録した；その後の処置および死亡原因を、可能であれば決定した。レントゲン分析を、患者の医療履歴および他の臨床試験結果を隠された認定胸部放射線科医（ＳＫ）が行った。改訂ＲＥＣＩＳＴ測定値を、各検査時に記録した（１８）。
【００２２】
生体相関
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＩＦＮ−α２ｂレベル（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｓ；  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）、および血清メソテリン関連タンパク質（ＳＭＲＰ）レベル（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＰＡ）を測定した。中和アデノウイルス抗体力価（Ｎａｂｓ）を、以前に記載されるように評価した（５）。腫瘍抗原に対して誘導された体液性応答を検出するために、本発明者らは、以前に記載されるように（４〜６）処置前および処置後の血清を使用して、精製メソテリンおよび同種異系中皮腫細胞株の抽出物に対する免疫ブロッティングを行った。詳細については補足方法を参照のこと。
【００２３】
低温貯蔵した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、処置前、Ａｄ．ＩＦＮ注入の２日後（第２の用量の前）、および第１の用量の１５日後（化学療法投与の直前）に集めた。ＰＢＭＣを、治療に応答した６名の患者および処置とともに進行した６名の患者のセットから研究した（補足表３）。ＰＢＭＣを融解し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびＴ細胞の活性化を、補足方法に詳述されるとおりのフロイーサイトメトリーを使用して評価した（参考文献１９もまた参照のこと）。
【００２４】
そもそもの手術時生検または以前の手術からホルマリン固定したパラフィン包埋切片は、１８名の患者から入手可能であり、抗ＣＤ８、抗ＣＤ６８、または抗ＰＤＬ１抗体で染色した。組織切片を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）分析を使用してＲＮＡレベルに関して評価した（詳細については補足方法を参照のこと）。
【００２５】
免疫遺伝子スコア
腫瘍の基底の「免疫活性化」状態を評価するために、本発明者らは、抗がんＭＡＧＥワクチンに対する黒色腫および肺がん患者の免疫応答を推定するために使用された研究に由来する、近年記載された「免疫スコア」を適応させた（２０）。この研究は、応答と相関する８４の遺伝子（大部分は、ＣＤ８  Ｔ細胞およびインターフェロン応答に関連する）を同定した。本発明者らには、我々のナノストリングデータにおいて６１のＰＣＲで検証した遺伝子のうちの２７に関して情報があった（補足表４を参照のこと）。これら２７の遺伝子の各々の強度の合計を決定し、各腫瘍を、最高の発現から最低の発現までランク付けした。
【００２６】
統計分析
本発明者らのそもそものＰｅｎｎ  ＩＲＢ承認は、２つのコホート：第１選択肢および第２選択肢の化学療法の各々において１０〜１５名の患者の登録に関するものであった。処置層において最低１１名の患者を用いて、本発明者らは、＞１９％の有病率で何らかの予期しない毒性を同定する９０％検出力を有した；本発明者らは最終的には、４０名の患者を処置するための十分なベクターを提供したので、本発明者らはその後、総数で４０名の患者を許容する研究の変更についてＩＲＢ承認を受け、本発明者らが１８名の第１選択肢および２２名の第２選択肢の患者を処置することを可能にした。これは、本発明者らに、約１２％の有病率で何らかの予期しない毒性を同定する９０％検出力を提供した。
【００２７】
客観的奏功率ならびに進行および死亡までの時間の分布を評価することによって、効力を決定した。本発明者らは、カプラン−マイヤー曲線によってＰＦＳおよびＯＳの分布をまとめ、ログランク検定によって層間にわたる曲線を比較した。
【００２８】
フローサイトメトリーデータに使用される統計は、補足方法に記載される。
【００２９】
結果
４０名のＭＰＭを有する患者を、２０１１年３月〜２０１３年１０月の間の治験に登録した。患者の個体群統計学を、表１にまとめる。
【００３０】
３２名の患者は、２胸膜内用量のＡｄ．ｈＩＦＮ−α２ｂを受けた。８名の患者は、以下が原因で、１用量のベクターのみを受けた：  １）低血清アルブミン（ｎ＝１）；２）息切れ（ｎ＝２）；３）増大した血清トランスアミナーゼ（ｎ＝１）；４）上室性頻拍症（ｎ＝１）；または５）低下した絶対好中球数（ｎ＝３）。患者が単一用量を受け、反復投与に不適格であった８症例のうちのいくつかにおいて、反復投与を排除した有害効果は、最初のベクター用量に二次的な予測される有害事象に少なくとも一部は原因があるとすることができた。
【００３１】
全４０名の患者は、最初のベクター注入の１４日後、化学療法処置を開始できた。４０名の患者のうちの１８名（４５％）は、第１選択肢化学療法を受けた。２２名の患者（５５％）は、ペメトレキセド（ｎ＝７）単独またはゲムシタビン＋／−カルボプラチン（ｎ＝１５）のいずれかで第２選択肢化学療法を受けた。少なくとも４サイクルの化学療法を４０名の患者のうちの１０名を除いて全員に送達した。化学療法を、１サイクル後（ｎ＝１［第１選択肢］）、２サイクル後の（ｎ＝６［１名は、第１選択肢、５名は第２選択肢］）、または３サイクル後（ｎ＝２［ともに第２選択肢］）の疾患進行に起因して、これらの１０名の患者のうちの９名において中止した。その１０番目の患者において、化学療法は、急性呼吸性代償不全（ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）の発生に起因して、１サイクル後に中止した（その後、このプロトコルには関連しないことが決定された）。
【００３２】
その研究プロトコルは、概して十分に寛容された。大部分の患者は、サイトカイン放出症候群、悪心、疲労、貧血、リンパ球減少症（グレード３〜４）、および低アルブミン血症を含め、ベクターおよび導入遺伝子発現から予測された軽度の毒性のみを経験した（表２Ａ）。これらの毒性は、代表的には、ベクター投与の完了の２４〜４８時間以内には消散し、大部分は、最初のベクター注入後に起こった。本発明者らは、全身性のインターフェロン効果におそらく起因して、軽度の症状（ベクター注入後数日間にわたる一時的な不定愁訴、食欲不振、悪心、および持続性の低グレードの発熱が挙げられる）を有する１１名の患者を同定した。重篤な有害事象は、胸腔カテーテル感染（ｎ＝２）；低酸素症（ｎ＝２）；上室性頻拍症（ＳＶＴ）（ｎ＝１）；および食道炎（ｎ＝１）を含んだ；ベクターの注入に直接的に原因があるとすることができるものはなかった（表２Ａ）。カテーテル留置に関連する局所的な感染は、研究プロトコルと確かに関連し、ここでは、患者の大部分は、この臨床試験における登録のために、具体的にカテーテル挿入を受けたが、カテーテルからの有害効果は、カテーテルを介する胸腔へのＡｄＩＦＮの投与にも、ｒＡｄＩＦＮベクター自体にも、直接関連しなかった。一時的な低酸素症を有する１名の患者は、ベクター注入に関連した考えられる低血圧症を予測して利尿薬を計画的に差し控えたことに関連して、反復ベクター投与の日に、想定されるうっ血性心不全増悪を経験した。低酸素症は、利尿後に迅速に消散した。ＳＶＴのエピソードは、彼の左房および右房の両方を圧迫する、右半胸郭および縦隔において広範囲に及ぶ腫瘍負荷を有する１名の患者において認められた。食道炎は、彼女の遠位食道を圧迫していた左側の悪性胸膜中皮腫の病巣領域の一時的緩和のために定位放射線治療を要した患者において示された。因果関係を否定できない死亡はなかった。研究の化学療法部分の間の有害事象は、予測され、かつヒストリカルコントロールに匹敵した（表２Ｂ）。
【００３３】
改訂ＲＥＣＩＳＴ１．１を使用する奏功率を、図１Ａおよび表３に示す。両方のコホートの組み合わせに関しては、本発明者らは、患者のうちの６２．５％において症状安定化、および患者のうちの２５％において部分的応答を示した；完全応答は観察されなかった。わずか１２．５％が、サイクル２の後に進行性疾患を有した。全体的な病勢コントロール率（ＤＣＲ）は、８７．５％であった。部分的応答は、９／２５（３６％）のペメトレキセドベースの化学療法を伴う評価可能な患者、および１／１５（７％）のゲムシタビンベースの処置を伴う評価可能な患者において認められた。
【００３４】
図１Ｂおよび図１Ｃは、それぞれベースラインと比較して、改訂ＲＥＣＩＳＴ測定値および血清メソテリン（ＳＭＲＰ）レベルにおける変化を示す。ＳＭＲＰに関しては、２７名の患者のうちの１２名が、ＳＭＲＰレベルにおいて２０％を超える増大を示した（図１Ｃ、上側パネル）。その一方で、２７名の患者のうちの１５名が、ある時点で２０％より大きな減少を示した（図１Ｃ、下側パネル）。改訂ＲＥＣＩＳＴおよびＳＭＲＰ応答の両方が、持続した。
【００３５】
この原稿の提出時に、４０名の患者のうちの６名が、２４ヶ月という最低限の追跡に伴って生きていた。死亡した患者のうちの２名を除いて全員が、進行性疾患で死亡し、１名の患者は、陽子線放射線療法後の食道穿孔状態が原因で死亡し（５ヶ月）、もう１名の患者は、ＢＡＰ−１欠損関連の転移性ぶどう膜黒色腫が原因で死亡した（４０ヶ月）。図２Ａは、群全体のカプラン−マイヤー曲線を示す。そのＭＯＳは、１３ヶ月であった（９５％  ＣＩ［９，１２］）；しかし、本発明者らは、その曲線に顕著な「テール」があることに留意し、長期の生存を有する患者の部分セットを明らかにした。１２ヶ月でのコホート全体の生存は、５５％であり（９５％  ＣＩ：  ０．３８、０．６９）、１８ヶ月では、４０％（９５％  ＣＩ  ０．５５、０．２５）および２４ヶ月では、２５％（９５％  ＣＩ：  ０．３９、０．１３）であった。ＰＦＳは、５．３ヶ月であった。
【００３６】
多くの下位群を分析した。図２Ｂは、非上皮組織構造を有する１０名の患者のＭＯＳ（６．５ヶ月）に対する、上皮組織構造を有する３０名の患者のＭＯＳ（１９ヶ月）における有意差（ログランク、ｐ＝．００４）を示す。最先端化学療法で処置した１８名の処置未経験の患者は、１２ヶ月のＭＯＳ（９５％  ＣＩ［６，１５］）（図２Ｃ）とともに、６．５ヶ月のメジアンＰＦＳ（９５％  ＣＩ［５．５、１１．５］）を有した。図２Ｄは、第２選択肢治療で処置した２２名の患者における生存を示す。第２選択肢コホートのＭＯＳは、１７ヶ月であった（９５％  ＣＩ［６．５、２６］）。図２Ｅは、第２選択肢コホートの下位群分析である。第２選択肢ペメトレキセド群（ｎ＝７）において、そのＭＯＳは、２６ヶ月であり（２４ヶ月生存率は、６２％であり、７名の患者のうちの３名が、なお生存）、メジアンＰＦＳは、８ヶ月（９５％  ＣＩ［３，∞］）であった。第２選択肢ゲムシタビン群（ｎ＝１５）において、そのＭＯＳは、１０ヶ月であり（９５％  ＣＩ［４、２１］）、メジアンＰＦＳは、３．５ヶ月であった（９５％  ＣＩ［１．５、５．５］）。ＭＯＳは、性別または年齢と有意に関連しなかった（データは示さず）。
【００３７】
全ての潜在的な患者を、ベースラインアデノウイルスＮａｂ力価に関してスクリーニングした。スクリーニングした患者のうちの１６％は、本発明者らの所定のカットオフ値１：２０００を上回る力価を有し、従って、不適格であると考えられた。治験に参加した４０名の患者の中で、メジアン力価は、１：１００であった；力価の分布を、補足図２に示す。
【００３８】
生体相関
インターフェロン−αの血清レベルを、ベクター注入前に測定した（１日目）（補足図３Ａ）。血清ＩＦＮは、３９名の患者において検出不能であったかまたはベースラインにあり非常に低かった；１名の被験体は、治療前に高い循環レベルを有した（２１００ｐｇ／ｍｌ）。患者のうちのおよそ半分（ｎ＝２１）が、ベクター注入後２日目に、血清ＩＦＮの検出可能なレベルを有した（１５〜１６０８ｐｇ／ｍｌ）。これらの患者の中で、メジアン値は、４７０ｐｇ／ｍｌであった。胸膜液または胸腔洗浄物中のＩＦＮαのレベルは、３８名の患者においてベースラインにおいて測定された（補足図３Ｂ）。検出可能なベースライン胸膜内ＩＦＮαを有した患者はいなかった。胸腔レベルは、最初の投与後に血清中で認められるより遙かに高かった。本発明者らは、生存時間と、血清（補足図３Ｃ）または胸腔（補足図３Ｄ）のインターフェロンレベルとの相関関係がないことを認めた。
【００３９】
処置後患者の血清中の抗腫瘍抗体の発現は、４０名の患者のうちの３９名において分析のために利用可能であった。１１名の患者では、本発明者らは、抗腫瘍免疫ブロットバンドの数または強度において何の変化も観察せず、１４名では、腫瘍バンドにおいて最小限の変化があり、そして残りの１４名では、抗腫瘍バンドにおいて明らかな増大があった。しかし、これらの群の中で生存に、またはＸ線撮影応答率に、有意差はなかった（補足表５）。
【００４０】
本発明者らは、良好な応答（平均生存＝２３．５ヶ月）を有した６名の患者のＰＢＭＣからフローサイトメトリーを行い、不十分な応答（平均生存＝７．２ヶ月）を有する６名の患者の結果と比較した（補足表３）。以前の研究において、本発明者らは、数名の患者でのＡｄ．ＩＦＮ投与後のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における活性化マーカーＣＤ６９の発現の増大を観察し、これが、ＮＫ細胞の活性化を生じるＩＦＮαの全身放出のマーカーであり得ることを示唆した。本発明者らは、患者の大部分においてＡｄ．ＩＦＮα注入の３日後にＣＤ６９を発現するＮＫ細胞およびＴ細胞のパーセントの増大を観察したが、本発明者らは、臨床応答との有意な相関を検出しなかった（補足表６）。本発明者らは、ＮＫ活性化レセプターＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫｐ３０（これらは、樹状細胞ワクチン治験における応答を推定した（２１））の増大も、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化シグネチャー（ＣＤ３８ｈｉ／ＨＬＡ−ＤＲｈｉおよびｋｉ６７ｈｉ／Ｂｃｌ−２ｌｏｗ）の変化（２２）も観察しなかった。本発明者らはまた、ＣＤ４調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦＯＸＰ３＋細胞）のベースラインレベルにおける差異またはこれら細胞の誘導における変化を示さなかった。ＣＤ４細胞上でのＩＣＯＳの発現の増大は、抗ＣＴＬＡ４抗体で処置した黒色腫患者における応答と関連した（２３）；しかし、本発明者らは、これらのマーカーにおける有意な変化を認めなかった（データは示さず）。
【００４１】
最後に、本発明者らは、「腫瘍微小環境の免疫原性」が、１８名の患者において入手可能な処置前生検に由来する病理学材料を使用して、免疫療法に対する応答を推定し得るか否かを調査した（２０、２４、２５）。免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、本発明者らは、リンパ球（ＣＤ８染色）、またはマクロファージ（ＣＤ６８染色）の浸潤の程度とも、生存を伴うＰＤ−Ｌ１の発現とも、いずれも有意な相関がないことを示した（補足図４Ａおよび４Ｂ、ならびに５）。スライドもまた、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）技術を使用して、６００の免疫応答関連遺伝子に関してインターロゲートされるＲＮＡを生成するために使用した。本発明者らには、近年発表された免疫応答遺伝子シグネチャーから、６１のＰＣＲ検証された遺伝子のうちの２７に関する情報があった（２０）。これらのマーカーは、主にＴ細胞およびインターフェロン誘導性遺伝子である（補足表４を参照のこと）。ＭＰＭ標本を、これらの遺伝子の発現の強度に関してランク付けした場合、生存との有意な相関はなかった（補足図６）。
【００４２】
考察：
この治験の原理的説明は、「インサイチュワクチン接種」といわれるアプローチ（腫瘍部位自体が標的として使用され、抗原供給源となるストラテジー）を使用して、抗腫瘍免疫応答を誘導することであった。本発明者らは、活性化導入遺伝子（インターフェロン−α）を発現して、免疫原性細胞死滅を誘導しかつ免疫刺激状態に向かって腫瘍微小環境を変化させるアデノウイルスベクターの強い免疫強化活性を使用した。さらに、本発明者らは、ＣＯＸ−２インヒビターであるセレコキシブを投与することによる強い免疫抑制分子ＰＧＥ２（２６）を阻害することによって、腫瘍微小環境をさらに変化させようと試みた。しかし、大部分のがんワクチンは、最適な効力のために抗原の複数回の投与（「ブースト」）を要する（２７、２８）。中和Ａｄ抗体の誘導は、本発明者らがベクターの、間隔の近い２より多くの用量を与えることを妨げたので、本発明者らは、化学療法のある種のタイプが免疫原性の状況において細胞死を引き起こし得、従って、感作された抗腫瘍応答を刺激するという観察を利用することによって本発明者らの「ブースト」を提供した（１４〜１７）。これは、従って、インサイチュ遺伝子免疫療法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）および化学療法の組み合わせを正式に使用する初めての臨床試験のうちの１つである。
【００４３】
本発明者らの多方面からの併用アプローチは、登録された患者のうちの大部分において実現可能でありかつ安全であると判明した。本発明者らの研究において、３２／４０の患者が、重篤な有害事象の証拠なしにこの併用療法を寛容し；ベクター投与に関連する有害事象のうちの大部分が、最初の用量に原因があるとすることができた；そして最初の投与後に重篤な有害事象を有した８名の患者のうちの７名は、セレコキシブおよび化学療法のコースを安全に完了することができた。１名の患者のみが、さらなる化学療法投与に進まなかった。これは、先に記載されるように、放射線療法に関連する食道炎が原因であった。
【００４４】
タイプＩインターフェロン遺伝子を発現する組換えＡｄベクター（ＡｄＩＦＮβおよびＡｄＩＦＮα）の反復胸郭内投与を含む本発明者らの以前の臨床試験（４〜６）に基づけば、観察された毒性のうちの大部分は、最初のベクター用量に二次的なサイトカイン放出症候群に関連した。本研究では、主な転帰尺度のうちの１つは、ｒＡｄＩＦＮ／セレコキシブおよび化学療法での逐次的治療の安全性であった。本発明者らは、１用量のｒＡｄＩＦＮおよび化学療法の併用と、２用量のものとの間に実質的な差異があるとは考えなかった。本発明者らは、以前のフェーズＩ臨床試験において単一用量のＡｄＩＦＮでＸ線撮影応答を認めた（４〜６）ので、最初のｒＡｄＩＦＮ用量のみの後に患者が研究に進むことを許容することは、安全性および効率の両方の観点から合理的であった。
【００４５】
第１選択肢の患者における臨床上の効力に関して、本発明者らの奏功率、メジアンＰＦＳ、ＭＯＳ、および１年生存は、併用化学療法単独で文献中で以前に報告されたものに類似であった（補足表１を参照のこと）。しかし、本発明者らの病勢コントロール率は、化学療法で報告されたものより高く、ＫＭ曲線に、長期の生存を有する患者の部分セットを表す「テール」があった。これは、本発明者らの第１選択肢コホートにおける１８名の患者のうちの１１名のみ（６１％）が、より都合の良い上皮組織構造を有したという事実（報告された治験のうちのいずれよりも低い割合（補足表１））にも拘わらず観察された。数は少ないものの、上皮、最先端群におけるＭＯＳは、非上皮患者においてわずか８ヶ月であったのに対して、１５ヶ月であった（ｐ＜０．０５）。
【００４６】
本発明者らは、ヒストリカルコントロールと比較して、最先端のＰｅｍ／ｐｌａｔ／ｒＡｄＩＦＮ群において認められるＭＯＳの改善がないことが、以下を含むいくつかの要因に起因したと考える：非類上皮腫瘍のより高いパーセンテージ；手術および／または緩和的放射線療法での予備処置；ならびに中皮腫を有するより初期のステージの患者が、本発明者らの団体での根治的胸膜切除術および光線力学療法の同時の治験へと変わったので、より後期のステージの患者を選択したこと。中皮腫の手術は、２００３年において、Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ研究の発表時にはほとんど確立されていなかったので、その治験において化学療法を受けている患者のうちの多くは、現時点での手術的介入を考慮したと思われた。
【００４７】
第２選択肢の患者における奏功率およびメジアンＰＦＳは、以前に報告された治験のものに類似であったが、ＤＣＲおよびＭＯＳは、類似の第２選択肢の化学療法治験において報告されたもののほぼ２倍であった（補足表１）。最先端の患者と同様に、本発明者らは、ＫＭプロット上で「生存のテール」を見出した。ゲムシタビンベースの化学療法を受けている第２選択肢患者のうちのおよそ２０％が、２４ヶ月を経て生存していた。これは、長期の免疫学的現象を示唆する。しかし、特に興味深いのは、その７名のペメトレキセドでの再処置を受けている第２選択肢の患者が、特に印象的な１００％のＤＣＲ、２８％の奏功率、８ヶ月のＰＦＳ、および２５ヶ月より長いＭＯＳを有するという所見であった。この具体的な患者集団との比較のために、本発明者らは、ペメトレキセドに以前応答したことがある患者において第２選択肢治療としてペメトレキセドを投与した３回の臨床試験（これは、合計１０３名の患者を含んだ）からのデータを見出すことができた（補足表１）。この群は、特に良好な応答特徴を明らかに有する（報告された平均は、１８％の奏功率、５．１ヶ月のＰＦＳ、および１１．７ヶ月のＭＯＳ）が、この治験における患者は、遙かにより印象的な程度まで応答した（上記を参照のこと）。
【００４８】
長期の生存を生じる持続する症状安定化または緩慢な進行性疾患を有する患者の存在は、他の免疫療法治験において観察されてきた（２９）。例えば、抗ＣＴＬＡ抗体を使用する近年の研究は、黒色腫および中皮腫においてこのパターンを示した（３０、３１）。このパターンは、免疫療法の効果が頻繁に遅れ、応答の混合パターンを示し得、そして増大したＰＦＳまたはＭＯＳを生じない可能性があると同時に、改善された長期の生存率をなお生じるという観察と一致する（２９、３２）。Ｘ線撮影測定値およびＳＭＲＰレベル、ならびに本発明者らの患者のうちの多くにおいて認められる長期の「症状安定化」を使用する本発明者らの長期応答データは、他の免疫療法治験に類似である。
【００４９】
本発明者らの広範囲な調査にも拘わらず、本発明者らは、予後情報および／または機械論的情報を提供し得る潜在的生体マーカーを同定することができなかった。これは、循環する細胞または因子が腫瘍内のプロセスを不十分にしか反映していない可能性があるという事実に起因し得る（含意は、最も有用な生体マーカーは、腫瘍生検標本から見出される必要があるというということである）。これは、既知の特定の抗原に対する応答が血液中で測定され得るワクチンと比較して、未知の抗原に対するポリクローナル応答を生じる免疫療法（例えば、本発明者らのもの）のタイプに特に当てはまり得る。
【００５０】
Ａｄ．ＩＦＮ治療が、チェックポイント阻害性遮断（中皮腫において有望であることを示すアプローチ）とどのように調和し得るかを推測することは、興味深い（３１）。抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体でのチェックポイント遮断治療とは対照的に、ＰＤ−Ｌ１の発現および腫瘍の既存の免疫シグネチャーは、Ａｄ．ＩＦＮへの応答を推測しなかった。インサイチュワクチン接種が、存在する内因性の免疫を単純に増幅するよりむしろ、免疫応答を誘導することによっておそらく機能するとすれば、Ａｄ．ＩＦＮは、最小限の内因性免疫応答またはＰＤ−Ｌ１の低発現を有するそれら患者において特に有用であり得、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ１抗体と併用した場合に、さらにより効果的であり得る。これらの仮説を検証する前臨床試験は、進行中である。
【００５１】
本発明者らの研究は、比較的小規模であり、非無作為化であり、単一施設で行われたので、その結果の解釈にいくつかの潜在的な限界があることを認識することは重要である。中皮腫の臨床過程には、実質的に不均一性が存在する。患者ＭＭの生存を詳述する近年発表されたレジストリ研究は、ＭＭ集団が２群：一方は、短い生存時間（９〜１２ヶ月）を有し、もう一方は、かなり長く生存する小さな群に分けられ得ることを肯定的に仮定した（３３）。任意の初期ステージ臨床試験（例えば、本発明者らのもの）は、考えられる選択バイアス（良好なＥＣＯＧ  ＰＳおよびＡｄ．ＩＦＮベクターの胸膜内送達のために胸腔へのアクセスを許容するために十分な臨床状態に向かうバイアスを含む）の影響下にある。重要なことには、本発明者らの患者のうちの多くは、最終的な生存に対して不確定の影響を伴うその後の治療を受けた［補足表２を参照のこと］。
【００５２】
本発明者らの治験は、非無作為化であったので、本発明者らの結果は、より小さな第２選択肢の治験が、本発明らの治験と同じ種類の患者集団および類似のバイアスを有していたと推定して、以前に発表された研究の状況の中で解釈され得るに過ぎない。この正直なところ不完全な比較器（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）を使用すると、本発明者らの研究における特に興味深い所見は、中皮腫を有する第２選択肢化学療法（特に、第２選択肢ペメトレキセド）を受けた患者が、Ａｄ．ＩＦＮインサイチュワクチン接種を介する免疫遺伝子療法という感作プロトコル＋セレコキシブの付随した投与による免疫抑制の標的化遮断の後に化学療法を与えた場合に、極めてうまくいくことであった。第２選択肢ペメトレキセド患者に関して、この群が、ＭＯＳに関して第２選択肢ゲムシタビンコホートよりうまく（および、皮肉なことに、第１選択肢ペメトレキセドレシピエントよりさらにうまく）事が運んだことは明らかである。本発明者らは、彼らが疾患進行前にペメトレキセドに対して持続性の（少なくとも６ヶ月の）最初の応答を有したと仮定すると、より都合のよい腫瘍生物学を有する患者を選択した可能性が高い。さらに、ｐｅｍ／ｐｌａｔｉｎに応答せず、次いでゲムシタビンを受けたそれらの患者は、第１選択肢コホートにおける処置未経験の患者より悪い全体的な腫瘍生物学を有した可能性がある。従って、治験の第２選択肢アームにおいて両方向に選択バイアスが存在した。おそらく最も重要なことには、これらの同じバイアスは、中皮腫におけるあらゆる第２選択肢化学療法治験に存在し、第２選択肢において本発明者らが報告した全生存率は、ペメトレキセドでの、およびゲムシタビンでの再処置の以前の報告より優れている（補足表１を参照のこと）。
【００５３】
これらの結果は、いくつかの興味深いが、未だ答えがない疑問を生じさせる：  １）第２選択肢の患者は、第１選択肢レシピエントより遙かに良好に応答したのはなぜか？；  ２）ペメトレキセドの反復コースを受ける患者が、第２選択肢ゲムシタビンに際するより良好に機能するのはなぜか？  ３）ペメトレキセドに最初に応答し、次いで、再処置した患者が、長期の症状安定化として予め選択されたことはあり得るか？；および４）生存における差異が免疫応答のためであるとするのであれば、この転帰と相関する免疫応答のマーカーが存在しないのはなぜなのか？  治療後の生検は、免疫応答の腫瘍内マーカーを決定することに役立ったと思われるが、この臨床プロトコルでは含めなかった。上手くいけば、これらの疑問のうちのいくつかは、将来の研究で答えが出され得る。
【００５４】
本発明者らは、中皮腫において「免疫学的感作」に最適な化学療法レジメンを未だ解っていない。免疫療法との併用における化学療法の潜在的役割は、多種多様であり、以下が挙げられる：樹状細胞への腫瘍ネオアンチゲンの提示を生じる腫瘍細胞死；骨髄由来免疫抑制細胞および調節性Ｔ細胞の数の減少；腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞に関して存在するＴ細胞レパートリーの増大した空間を可能にする全体的なＴ細胞枯渇；ならびに腫瘍微小環境へと往き来するＴ細胞の増大（１４〜１７）。本発明者らの研究室は、悪性中皮腫の同系の免疫応答を起こし得るマウスモデルにおいてペメトレキセドおよびゲムシタビンの両方のこれらの特徴を評価することにかなりの努力を費やしており、両方の化学療法剤とｒＡｄＩＦＮのマウスバージョンとの有意な相乗効果を示した。本発明者らは、大きくは、中皮腫における最先端治療に関する標準治療の化学療法剤としてのその受容された役割が原因で、この臨床試験における第１選択肢治療にペメトレキセドを選択した；ゲムシタビンは、中皮腫に関して十分に受容された第２選択肢薬剤である。しかし、ゲムシタビンが、ペメトレキセドより、ｒＡｄＩＦＮとの最先端治療における使用により有効な薬剤であり得るということは起こり得るので、本発明者らは、将来のヒト臨床試験においてこの疑問に答えが出ることを期待する。
【００５５】
結論として、本発明者らの研究は、胸膜内Ａｄ．ＩＦＮ−α２ｂベクター、セレコキシブ、および全身化学療法の併用が、ＭＰＭ患者において安全であり、実現可能であり、十分に寛容されると判明したことを示す。この研究において、特に第２選択肢治療において観察された病勢コントロール率および生存率は、ヒストリカルデータと好都合に匹敵した。明らかなことには、本発明者らのアプローチの価値は、より大規模な多施設無作為化臨床試験で検証される必要がある。このような研究は、治療が中皮腫を有する患者において生存を増強することがまだ示されていなかった第２選択肢の設定において計画されている最中である。
【００５６】
補足方法
用量制限毒性の定義
臨床試験の主要エンドポイントは、ＭＰＭのための標準治療化学療法との併用での胸膜内ＡｄＩＦＮの２用量の新たな毒性および安全性を同定することであった。登録した被験体を、セレコキシブおよび第１の用量のＡｄ．ＩＦＮの開始から、第１ラウンドの化学療法の１４日後（およそ３０日目）まで、用量制限毒性（ＤＬＴ）に関して評価した。用量制限毒性（ＤＬＴ）を、米国国立がん研究所が採用した有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ  ｖ．３．０）に従って、以下の因果関係を否定できない有害事象（ＡＥ）のうちのいずれかとして定義した：
・任意のグレード４毒性（ＡｄＩＦＮの最後の用量後≦７日間継続する孤発性グレード４リンパ球減少症）。
・グレード３低血圧症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）またはアレルギー反応／過敏症。
・ＡｄＩＦＮ投与後６〜４８時間以内にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を除いて＞７日間持続するグレード３非血液毒性
・投与の４８〜７２時間以内に始まりかつＡｄＩＦＮの最後の用量後に１０日間まで持続する、持続性ＣＲＳ。
・最後のベクター用量後に＞７日間持続するグレード３血液毒性（孤発性リンパ球減少症を除く）。
【００５７】
ＤＬＴが注入の間に起こった場合、ＡｄＩＦＮ投与を中止し、さらなる試験薬は投与されないことになっていた。ＤＬＴが１日目〜３日目の間に行った場合、試験薬の第２の用量は、投与されなかったと思われる。
【００５８】
プロトコル中止規定は、２件（２）のＤＬＴが第１の処置群内で起これば、研究の登録をデータの検討、ならびに段階的縮小に関するＦＤＡおよびＩＲＢとの審議の係属を中断することになっていたことを明記する。
【００５９】
さらに、そのプロトコルは、事象の中でも、被験体がＤＬＴもしくは重篤な有害事象を経験すれば、または化学療法サイクルが、毒性の解決がないことに起因して、予定されたサイクルから３週間を超えて遅れていれば、予測される完了の前に、被験体がその研究から撤退し得ることを明記した。
【００６０】
手順
イムノブロッティング
腫瘍抗原に対して誘導された体液性応答を検出するために、本発明者らは、精製メソテリンおよび同種異系中皮腫細胞株からの抽出物に対するイムノブロッティングを行った。精製メソテリンを、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）から購入した。細胞株を、以前の臨床試験からの患者胸膜液から得、以前に記載される（Ｓｔｅｒｍａｎ  ＤＨ，  Ｒｅｉｃｏ  Ａ，  Ｈａａｓ  ＡＲら，  Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ．    Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０；  １８  ：  ８５２−６０）ように培養して増殖させた。細胞からの抽出物または精製タンパク質を調製し、以前に記載される（Ｓｔｅｒｍａｎら，  ２０１０）ように、処置前および処置の６週間後の時点に由来する患者血清（１：１５００に希釈）でイムノブロットを行った。複数の曝露物を得、比較を、その曝露物に対して行ったところ、ここで処置前のブロットで検出された主要バンドは、処置後ブロットにおいて強度が等しかった
【００６１】
２名の独立した盲検化した観察者が、各ブロットを視覚的にスキャンして、処置後血清において顕著に増大したように見える新たなバンドを検出し、コンセンサススコアにした。そのブロットを、以下のとおり、半定量的にスコア付けした：  ０＝いかなるバンドにおいても変化なし；  １＝最小限の変化（すなわち、１本または２本のバンドの強度が増大）；  ２＝＞２本のバンドにおける明確な増大または新たなバンドの出現。各スコア付けカテゴリーを示すサンプルを、補足図１に示す。
【００６２】
フローサイトメトリー
処置前、Ａｄ．ＩＮＦ注入の２日後（第２の用量の前）および第１のベクターの用量後１５日目（化学療法の前）に集めて低温保存した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を融解し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびＴ細胞部分セット、ならびにそれらの活性化状態を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｋｉ６７、Ｂｃｌ２、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、およびＮＫｐ３０に対するｍＡｂで評価した。全てのｍＡｂは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）およびＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）のものであった。その治療に応答した６名の患者および応答しなかった６名の患者のセットからのＰＢＭＣを、研究した（補足表２）。
【００６３】
細胞調製および染色の詳細は、以前に発表した（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＪＰ，  Ｋｉｎｄｌｅｒ  ＨＬ，  Ｐａｐａｓａｖｖａｓ  Ｅら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  （ＴＧＦ−ｂｅｔａ）  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＧＣ１００８  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  （ＭＰＭ）．  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１３；  ８  ：ｅ２６２１８）。１００，０００個の生存リンパ球（ＦＳＣおよびＳＳＣにおいてサイズおよび粒状によって定義）を集めることによって分析を行った。死細胞を、ＦＳＣ／ＳＳＣにおける手動でのゲート制御によって排除した。検出閾値を、アイソタイプをマッチさせた陰性コントロールに従って設定した。結果を、平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびリンパ球、ＮＫ細胞（Ｌｉｎ３−ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋またはＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセント（％）として表した。データ分析を、ＦｌｏＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，  Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，  ＣＡ）を使用して行った。
【００６４】
免疫組織化学
そもそもの手術時生検または以前の手術からのホルマリン固定したパラフィン包埋切片を、１８名の患者から入手した。脱パラフィン化および抗原賦活化の後に、これらを、Ｔ細胞に関して（抗ＣＤ８抗体を使用して）およびマクロファージに関して（抗ＣＤ６８抗体を使用して）、Ｐｅｎｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅが染色した。切片をまた、Ｍｅｒｃｋが独占抗体（クローン２２Ｃ３）を使用して抗ＰＤ−Ｌ１に関して染色した。切片を、病理学者が盲検化様式において０〜５のスケールでＰＤ−Ｌ１発現の量に関してスコア付けした：０＝陰性、１＝微量／希、２＝低い、３＝中程度、４＝高い、および５＝非常に高い。
【００６５】
組織切片をまた、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を使用するＲＮＡ分析のために使用した。細胞溶解物を作製するかまたはＲＮＡを単離する前に、組織切片を、キシレン中で３×５分間にわたって脱パラフィン化し、次いで、１００％  エタノール中に２×２分間、９５％  エタノール中に２分間、７０％  エタノール中に２分間、連続的に浸漬することによって再水和し、次いで、ｄＨ２Ｏ中に処理する準備ができるまで浸漬した。組織を、１０〜５０μｌのＰＫＤ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７３５０４）を添加することによってスライド上で溶解した。組織をそのスライドから掻き取り、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。プロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｒｏｔ−Ｋカタログ番号０３１１５８３６００１）をわずか１０％  最終容積で添加し、そのＲＮＡ溶解物を、１５分間５５℃において、次いで、１５分間８０℃においてインキュベートした。そのＲＮＡ溶解物または全ＲＮＡを、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒＴＭシステムを使用して遺伝子発現プロファイリングを行うまで−８０℃で貯蔵した。１サンプルあたり５０ｎｇの細胞溶解物または全ＲＮＡ（最終容積５μｌ中）を、と混合した。
【００６６】
フローサイトメトリー統計
データを、メジアン、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルとして記載した。各時点での応答者（ｎ＝６）と非応答者（ｎ＝６）との間の比較を、ウィルコクソン・クラスカル−ウォリス検定（順位和）を使用して行った。全患者（ｎ＝１２）に関して時点間の差異を、データ分布に依存して、ウィルコクソンの符合順位検定または対応のあるｔ検定を使用して検定した。その一方で、応答者（ｎ＝６）における、および非応答者（ｎ＝６）における時点間の差異を、ウィルコクソンの符合順位検定を使用して検定した。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意と見做した。全ての統計は、ＪＭＰ  Ｐｒｏ１１（登録商標）を使用した。
まとめ
【００６７】
本発明者らの具体的開示を考慮すれば、当業者は、代わりの反復を容易に考案し得る。例えば、本発明者らは、ｒＡｄ−ＩＦＮを使用するが、他の薬剤がインターフェロンを誘導することは公知である。同様に、本発明者らは、セレコキシブを使用するが、当該分野は、均等なＣＯＸ−２酵素インヒビターを教示する。本発明者らは、従って、本発明者らの特許の範囲が、ここで教示される本発明者らの具体例によってではなく、本発明者らの添付の法的な請求項およびこれらに対する許容された均等物によって定義されることを意図する。
【００６８】
添付の法的な請求項において、本発明者らは、用語「類上皮」を使用して、純粋に類上皮組織構造を有し、少なくとも約９０％  類上皮組織構造を有する二相性組織構造を有するがんを記載する。
参考文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月6日(2018.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者を処置するための、インターフェロンの発現を誘導する薬剤を含む組成物であって、該組成物は、ヒトにおいてインターフェロン発現を誘導するために有効な量で該患者に投与されることを特徴とし、ここで、
ａ．該患者においてがんが診断されており；そして次いで、
ｂ．該患者は、第１選択肢処置レジメンで処置されており；そして次いで、
ｃ．該患者において、該第１選択肢処置レジメンに抵抗性であるかまたは該第１選択肢処置レジメン後に再発するがんが診断されており、
該患者が、該組成物の投与の後に、ペメトレキセド、ゲムシタビン、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される処置を含む第２選択肢処置レジメンでさらに処置されることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記第２選択肢処置レジメンは、ペメトレキセドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第２選択肢処置レジメンは、ゲムシタビンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記インターフェロンの発現を誘導する薬剤は、抗原を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原は、ウイルス抗原を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウイルス抗原は、抗原性ウイルスを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原性ウイルスは、ヒトインターフェロンをコードする導入遺伝子を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原性ウイルスは、ｒＡｄ．ＩＦＮを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｒＡｄ．ＩＦＮは、約３×１０１１  ウイルス粒子の用量で提供され、胸膜内に送達されることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第２選択肢処置レジメンは、ベバシズマブ；プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）インヒビター；プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）インヒビター；および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）インヒビターからなる群より選択される処置をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第２選択肢処置レジメンは、セレコキシブでの処置をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１選択肢処置レジメンに抵抗性であるかまたは前記第１選択肢処置レジメン後に再発する前記がんが類上皮がんを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第１選択肢処置レジメンに抵抗性であるかまたは前記第１選択肢処置レジメン後に再発する前記類上皮がんが、悪性胸膜中皮腫、非小細胞肺がんおよび膀胱がんからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒト患者を処置するための、インターフェロンの発現を誘導する薬剤を含む組成物であって、該組成物は、ヒトにおいてインターフェロン発現を誘導するために有効な量で該患者に投与されることを特徴とし、ここで、
ａ．該患者においてがんが診断されており；そして次いで、
ｂ．該患者は、第１選択肢がん処置レジメンで処置されており；そして次いで、
ｃ．該患者において、該第１がん選択肢処置レジメンに抵抗性であるかまたは該第１選択肢がん処置レジメン後に再発するがんが診断されており、
該患者が、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する薬剤で処置されることを特徴とする、組成物。
【請求項１５】
前記がんが、膀胱がん、非小細胞肺がんおよび中皮腫からなる群から選択されるがんを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記がんが、膀胱がんを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記患者が、ペメトレキセド、ゲムシタビンおよび白金ベースの細胞傷害剤からなる群から選択される細胞傷害剤でさらに処置されることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞傷害剤がペメトレキセドを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞傷害剤が白金ベースの細胞傷害剤を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する前記薬剤が、ペムブロリズマブ、ニボルマブおよびイピリムマブからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
ヒト患者を処置するための、インターフェロンの発現を誘導する薬剤を含む組成物であって、該組成物は、ヒトにおいてインターフェロン発現を誘導するために有効な量で該患者に投与されることを特徴とし、ここで、該患者においてがんが診断されており、該患者が、阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する薬剤でさらに処置されることを特徴とする、組成物。
【請求項２２】
阻害性ヒト免疫系チェックポイントを阻害する前記薬剤が、ペムブロリズマブ、ニボルマブおよびイピリムマブからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
結論：  胸膜内Ａｄ．ＩＦＮ、セレコキシブ、および全身化学療法の併用は、ＭＰＭを有する患者において安全であると判明した。全生存率は、第２選択肢群においてヒストリカルコントロールより有意に高かった。この研究の結果は、標準的化学療法単独に対して化学−免疫遺伝子療法の多施設無作為化臨床試験に伴う成り行きを裏付ける。
例えば、本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
ヒト患者を処置するための方法であって、該方法は、
ａ．該患者においてがんを診断する工程；そして次いで、
ｂ．該患者を、抗葉酸および白金薬剤併用レジメン；抗葉酸および白金薬剤およびベバシズマブ併用レジメン；プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）インヒビター；プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）インヒビター；ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）インヒビターおよびＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１インヒビター併用レジメンからなる群より選択される処置を含む第１選択肢処置レジメンで処置する工程；そして次いで、
ｃ．該患者において、該第１選択肢処置レジメンに抵抗性であるかまたは該第１選択肢処置レジメン後に再発する類上皮がんを診断する工程；そして次いで、
ｄ．該患者を、ヒトにおいてインターフェロン発現を誘導するために有効な量において、インターフェロンの発現を誘導する薬剤で処置する工程；そして次いで、
ｅ．該患者を、ペメトレキセド、ゲムシタビン、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される処置を含む第２選択肢処置レジメンで処置する工程、
を包含する方法。
（項目２）
前記第２選択肢処置レジメンは、ペメトレキセドを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第２選択肢処置レジメンは、ゲムシタビンを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記インターフェロンの発現を誘導する薬剤は、抗原を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗原は、ウイルス抗原を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ウイルス抗原は、抗原性ウイルスを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記抗原性ウイルスは、ヒトインターフェロンをコードする導入遺伝子を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記抗原性ウイルスは、ｒＡｄ．ＩＦＮを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ｒＡｄ．ＩＦＮは、約３×１０１１  ウイルス粒子の用量で提供され、胸膜内に送達される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第２選択肢処置レジメンは、ベバシズマブ；プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）インヒビター；プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）インヒビター；および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）インヒビターからなる群より選択される処置をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記第２選択肢処置レジメンは、セレコキシブでの処置をさらに含む、項目１に記載の方法。
【国際調査報告】
2019507803.tif 000032