(57)【要約】  本発明は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を阻害する抗がん剤スクリーニング方法に関するもので、より詳細には、試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階；ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階；試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階；ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階；及び選別された試験物質の抗がん活性を、細胞や動物から確認する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法と、前記の方法で選別された抗がん剤を有効成分として含む抗がん用組成物に関するものである。  本発明は、ＨＳＰ７０が、がんの発生と進行に重要なＡＩＭＰ２−ＤＸ２と直接結合して安定化させる調節因子であることの発見に基づいて、全く新しい作用機構の抗がん剤を開発するために有効に利用することができる。また、本発明の方法に基づいて選別された抗がん剤を有効成分として含むがんの予防又は治療用薬学的組成物は、ＨＳＰ７０の発現を抑制したり、ＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合を抑制してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を下げてがんの進行を効果的に防ぐことができてがん治療剤の開発に有用に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階；
（ｂ）試験物質の存在下又は非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階；
（ｃ）試験物質の存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合と、試験物質非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合とを比較して、試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階；
（ｄ）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階；及び
（ｅ）選別された試験物質の抗がん活性を、細胞又は動物で確認する手順を含む、抗がん剤スクリーニング方法。
【請求項２】
前記抗がん剤スクリーニング方法は、前記（ｄ）と前記（ｅ）との間に、
（１）前記試験物質を、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する細胞に接触させる段階；
（２）前記細胞と前記試験物質とを接触させない対照群細胞から、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を測定する段階；及び
（３）前記対照群細胞と比較して、前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を減少させる試験物質を選別する段階を追加的に含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の断片は、配列番号２で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＳＰ７０は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＳＰ７０の断片は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記段階（ｂ）の結合を測定する方法は、ツーハイブリッド方法、共同免疫沈降方法（co-immunoprecipitation assay）、共同局所化分析（co-localization assay）、閃光近接測定法（scintillation proximity assay：ＳＰＡ）、ＵＶ又は化学的架橋結合方法、異分子相互作用分析（bimolecular interaction analysis：ＢＩＡ）、質量分析法（massspectrometry：ＭＳ）、ＮＭＲ（nuclear magnetic resonance）、蛍光偏光分析法（fluorescence polarization assays，ＦＰＡ）及び試験管内プルダウンアッセイ（in vitro pull-down assay）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の方法により実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記がんは、乳がん、肺がん、結腸がん、肛門がん、星細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、肝臓がん、精巣がん、子宮頸がん、肉腫、血管腫、食道がん、安岩、喉頭がん、経口がん、中皮腫、骨髄腫、口腔がん、直腸がん、咽喉がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、大腸がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がん、皮膚がん、基底細胞がん、黒色腫、扁平上皮がん、口腔扁平上皮がん、大腸直腸がん、橋細胞腫、子宮内膜がん及び悪性脳膠腫からなる群から選ばれたがんであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記抗がん剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒｉｂｏｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマー、ペプチド、天然抽出物、及び化学物質からなる群から選ばれたことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤を有効成分として含むがんの予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
前記抗がん剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒｉｂｏｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマー、ペプチド、天然抽出物、及び化学物質からなる群から選ばれたことを特徴と請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
がんの予防又は治療用製剤を製造するための請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の使用。
【請求項１３】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とするがんの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月７日に出願された韓国特許出願第１０−２０１６−００２７０７７号の優先権を主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である
【０００２】
本発明は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０の結合を阻害する抗がん剤スクリーニング方法に関するもので、より詳細には（ａ）試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階；（ｂ）試験物質の存在下又は非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階；（ｃ）試験物質の存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合と、試験物質非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合とを比較して、試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階；（ｄ）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階；及び（ｅ）選別された試験物質の抗がん活性を、細胞又は動物で確認する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法と、前記の方法で選別された抗がん剤を有効成分として含む抗がん用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
がん特異的マーカーの開発は、がんの診断だけでなく、がん特異的な治療のためにも要求されている。サイトトキシン治療（cytotoxic therapies）は、最初の抗がん治療薬として使用されて以来、５０余年間がんの治療に広く使われてきたが、がん細胞の他に分裂速度が比較的速い他の臓器の細胞に非特異的に作用して強い毒性を示し、深刻な副作用をもたらす問題がある。このような従来の抗がん剤の副作用及び耐性を克服するために、正常細胞のがん化過程で示されるがん特異的マーカー（cancer specific marker）を利用して、腫瘍細胞特異的に作用する治療剤開発の研究が進められた。抗がん剤による毒性を最小化するための方案として浮上する、がんターゲット治療（cancertargeted therapy）の核心は、がん細胞特異的な遺伝子を探し出すことである。
【０００４】
一方、熱衝撃タンパク質（Heat Shock Protein、ＨＳＰ）とは、タンパク質の恒常性維持に核心的な役割をする分子的シャペロンである。ＨＳＰは低酸素症のようなストレス状況で、細胞の生存にとって重要である。ＨＳＰ、特にＨＳＰ９０とＨＳＰ７０は、広範囲の腫瘍［Morano KA、Annals of the New York Academy of Sciences、1113:1-14、2007; Calderwood SK et al、Trends in biochemical sciences、31:164-72、2006］で多く発現される。いくつかのＨＳＰの発現は、いくつかのがんで腫瘍細胞の増殖、分化、アポトーシス（apoptosis）と相関関係があることが明らかにされ、これはＨＳＰが、それ自身が有する細胞保護の役割のために、がん細胞の生存に重要な役割をすることを示している。ＨＳＰ７０の過剰発現は、マウス繊維肉腫細胞の腫瘍形成を誘発し、遺伝子導入されたマウスのＴ−細胞内ＨＳＰ７０が過剰発現されると、そのマウスのＴ細胞リンパ腫の増加を誘発すると報告されている［Jaattela M、International journal of cancer Journal international du cancer、60:689-93、1995; Seo JS et al、Biochemical and biophysical research communications、218:582-7、1996; Volloch VZ et al、Oncogene、18:3648-51、1999;Murphy ME、Carcinogenesis、34:1181-8、2013］。特に、ＨＳＰ７０は、アポトーシスから細胞を保護する重要な役割をすると知られている。それだけでなく、ＨＳＰの発現が増加することは、血管形成、侵襲、転移に関連していることが知られている［Calderwood SK et al、Trends in biochemical sciences、31:164-72、2006; Zhou J et al、The Journal of biological chemistry、279:13506-13、2004; Bruns AF et al、PloS one、7:e48539、2012; Sun J et al、Arteriosclerosis、thrombosis and vascular biology 24:2238-44、2004; Gong W、et al、Oncology reports、2013; Eustace BK et al、Cell cycle、3:1098-100、2004; Eustace BK et al、Nature cell biology、6:507-14、2004］。
【０００５】
ＡＩＭＰ２（ARS-interacting multi-functional protein 2）は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素複合体（Aminoacyl-tRNA synthetase：ＡＲＳｓ）の形成に関連したタンパク質の一つで、ｐ３８／ＪＴＶ−１又はｐ３８とも称される。ＡＩＭＰ２が、新規ながん抑制因子（tumor suppressor）として、Ｓｍａｄ２／３との直接的相互作用を通じてＴＧＦ−βの信号伝達を強化する機能を有することが報告されており、がん細胞株及び組織で、ＡＩＭＰ２のエキソン２が欠損された形態の変異体であるＡＩＭＰ２−ＤＸ２が特異的に発現されることが知られている（韓国登録特許第１０−０７６２９９５号公報）。
【０００６】
以上の通り、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２及びＨＳＰ７０それぞれが腫瘍細胞の分化又は生存と関連していることは知られているが、それらの相互関係ががんにどのような関連性があるかについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０７６２９９５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Morano KA、Annals of the New York Academy of Sciences、1113:1-14、2007
【非特許文献２】Calderwood SK et al、Trends in biochemical sciences、31:164-72、2006
【非特許文献３】Jaattela M、International journal of cancer Journal international du cancer、60:689-93、1995
【非特許文献４】Seo JS et al、Biochemical and biophysical research communications、218:582-7、1996
【非特許文献５】Volloch VZ et al、Oncogene、18:3648-51、1999
【非特許文献６】Murphy ME、Carcinogenesis、34:1181-8、2013
【非特許文献７】Zhou J et al、The Journal of biological chemistry、279:13506-13、2004
【非特許文献８】Bruns AF et al、PloS one、7:e48539、2012
【非特許文献９】Sun J et al、Arteriosclerosis、thrombosis and vascular biology 24:2238-44、2004
【非特許文献１０】Gong W、et al、Oncology reports、2013
【非特許文献１１】Eustace BK et al、Cell cycle、3:1098-100、2004
【非特許文献１２】Eustace BK et al、Nature cell biology、6:507-14、2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
そこで、本発明者らはＡＩＭＰ２−ＤＸ２及びＨＳＰ７０の相互作用を研究中、ＨＳＰ７０がＡＩＭＰ２−ＤＸ２に直接結合してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を安定化させ、結果的にがん細胞の生存と分化に決定的な役割をすることを確認した。従って、ＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合を抑制すると、細胞の分裂と増殖を抑制できることに着目して本発明を完成した。
【００１０】
従って、本発明の目的は、
（ａ）試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階；
（ｂ）試験物質の存在下又は非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階；
（ｃ）試験物質の存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合と、試験物質非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合とを比較して、試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階；
（ｄ）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階；及び
（ｅ）選別された試験物質の抗がん活性を、細胞又は動物で確認する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、
前記抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤を有効成分として含むがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１２】
また、本発明の他の目的は、
前記抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤を有効成分として構成されるがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、
前記抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤を有効成分として必須的に構成されるがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、
がんの予防又は治療用製剤を製造するための、前記抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の使用を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、
前記抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とするがんの予防又は治療方法を提供することである。
【００１６】
［技術的解決方法］
前記のような目的を達成するために、本発明は、
（ａ）試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階；
（ｂ）試験物質の存在下又は非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階；
（ｃ）試験物質の存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合と、試験物質非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合とを比較して、試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階；
（ｄ）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階；及び
（ｅ）選別された試験物質の抗がん活性を、細胞又は動物で確認する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、
前記抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤を有効成分として含む抗がん用組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明の他の目的を達成するために本発明は、
有効成分として、前記抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤からなる抗がん用組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明の他の目的を達成するために本発明は、
有効成分として、本質的に、前記抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤からなる抗がん用組成物を提供する。
【００２０】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、
がんの予防又は治療用製剤を製造するための、前記抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の使用を提供する。
【００２１】
本発明の他の目的を達成するために本発明は、
前記抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とするがん治療方法を提供する。
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、
（ａ）試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階；
（ｂ）試験物質の存在下又は非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階；
（ｃ）試験物質の存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合と、試験物質非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合とを比較して、試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階；
（ｄ）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階；及び
（ｅ）選別された試験物質の抗がん活性を、細胞又は動物から確認する段階を含む抗がん剤スクリーニング方法を提供する。
【００２４】
本発明者らはＨＳＰ７０が、元来の機能の他に、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２に結合してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を分解されないように安定化させ、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による腫瘍細胞の分化と成長を促進させる作用を示すことを発見した。ＨＳＰ７０の発現を抑制してＡＩＭＰ２−ＤＸ２と反応することができるＨＳＰ７０の水準を減少させるか、又はＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２の反応を直接阻害することができる因子は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を減少させ、結果的に腫瘍細胞の成長と分化が阻害されるようにする。本発明者らは、このようなＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２の機能的な関係に対する発見に基づいて、ＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合を阻害することができる製剤をスクリーニングして、抗がん剤として選別することができる抗がん剤スクリーニング方法を本明細書で初めて公開する。
【００２５】
前記（ａ）試験物質の存在下又は非存在下で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを接触させる段階である。
【００２６】
本発明で“タンパク質”は“ポリペプチド（polypeptide）”又は“ペプチド（peptide）”と互換性を有して使用され、例えば、自然状態のタンパク質から一般的に発見されるような、アミノ酸残基の重合体を意味する。前記“断片”は、タンパク質の一部分を意味する。また、本発明で“ポリヌクレオチド（polynucleotide）”又は“核酸”は、単一の又は二重鎖の形態をなすデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を意味する。他の制限がない限り、自然に生成されるヌクレオチドと類似した方法で核酸に混成化される自然のヌクレオチドの公知のアナログも含まれる。“ｍＲＮＡ”は、タンパク質合成の過程で、特定の遺伝子の塩基配列の遺伝情報を、ポリペプチドを形成するリボソームに伝達するＲＮＡである。
【００２７】
本発明で、前記“ＡＩＭＰ２−ＤＸ２”は、ＡＩＭＰ２タンパク質配列（３１２ａａ  ｖｅｒｓｉｏｎ：ＡＡＣ５０３９１．１またはＧＩ：１２１５６６９；  ３２０ａａ  ｖｅｒｓｉｏｎ：ＡＡＨ１３６３０．１，ＧＩ：１５４８９０２３，  ＢＣ０１３６３０．１）の中のエキソン２の領域が欠失された変異体として、ＡＩＭＰ２同等物（アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、またはこれらの組み合わせによる変形体として、ＡＩＭＰ２と実質的に同等の活性を有する機能的同等物、または物理化学的性質を増加または減少させる変形を有し、ＡＩＭＰ２と実質的に同等の活性を有する機能的誘導体）からエキソン２の領域が欠失されたタンパク質を含む。本発明で、ＡＩＭＰ２タンパク質配列のうち“エキソン２の領域が欠失”したとは、ＡＩＭＰ２タンパク質からエキソン２領域のアミノ酸配列が部分的に、又は全体的に失われて生じた変異体が、ＡＩＭＰ２タンパク質とヘテロダイマーを形成して、ＡＩＭＰ２の正常的な機能を妨害することを意味する。従って、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、ＡＩＭＰ２タンパク質のエキソン２のアミノ酸配列がすべて欠失されたり、この領域のアミノ酸配列を含むエキソン１、エキソン３、エキソン４、又はこれらの領域の全てから、これらの領域の一部も欠失されたり、エキソン２のアミノ酸配列の一部のみが欠失されたタンパク質を含む。
【００２８】
本発明の方法を実施するためのＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質は、好ましくは、ヒトを含む哺乳類に由来するものでもあって、最も好ましくは、配列番号１で示されるヒトのＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のアミノ酸配列を含むものでもある。
【００２９】
また、前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の断片は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２においてＨＳＰ７０との結合に必要な部分を含む断片を意味する。本発明者らは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が、ＨＳＰ７０の基質結合ドメイン部位に結合することを確認した。具体的には、ヒトＨＳＰ７０のアミノ酸配列における３８５乃至５３６番目のアミノ酸を含む断片が、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２と結合できることを明らかにした。従って、本発明を実施するためのＨＳＰ７０の断片は、配列番号３における３８５乃至５３６番目のアミノ酸を含む断片でもある。
【００３０】
本発明で、“ＨＳＰ７０”は、熱衝撃タンパク質７０（Heat Shock Protein，ＨＳＰ）であって、タンパク質の恒常性の維持に核心的な役割をする分子的シャペロンである。ＨＳＰ７０は、低酸素症のようなストレス状況で、細胞の生存にとって重要である。一方、ＨＳＰ７０は、広範囲の腫瘍［Morano KA、Annals of the New York Academy of Sciences、1113:1-14、2007;Calderwood SK et al、Trends in biochemical sciences、31:164-72、2006］で多く発現される。ＨＳＰ７０の発現は、いくつかのがんで腫瘍細胞の増殖、分化、アポトーシス（apoptosis）との相関関係があることが明らかにされており、これはＨＳＰ７０自体が有する細胞保護役割のために、がん細胞の生存に重要な役割を示している。ＨＳＰ７０の過剰発現は、マウス繊維肉腫細胞の腫瘍形成を誘発して、遺伝子導入されたマウスのＴ−細胞内ＨＳＰ７０が過剰発現されると、そのマウスのＴ細胞リンパ腫の増加を誘発すると報告されている［Jaattela M、International journal of cancer Journal international ducancer、60:689-93、1995;Seo JS et al、Biochemical and biophysical research communications、218:582-7、1996;Volloch VZ et al、Oncogene、18:3648-51、1999;Murphy ME、Carcinogenesis、34:1181-8、2013］。
【００３１】
本発明の方法を実施するためのＨＳＰ７０タンパク質は、好ましくは、ヒトを含む哺乳動物に由来するものでもあって、最も好ましくは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むものでもある。
【００３２】
また、前記ＨＳＰ７０の断片は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合に必要な部分を含んでいる断片を意味する。本発明者らは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が、ＨＳＰ７０の基質結合ドメイン（Substrate binding domain）部位に結合することを確認した。具体的には、ヒトのＨＳＰ７０のアミノ酸（配列番号３）配列における３８５乃至５３６番目のアミノ酸（配列番号４）を含む断片が、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２と結合することを明らかにした。従って、本発明を実施するためのＨＳＰ７０の断片は、配列番号３における３８５乃至５３６番目のアミノ酸（配列番号４）配列を含む断片でもある。
【００３３】
また、本発明に係るＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片、さらに、ＨＳＰ７０又はその断片は、これらの機能的同等物を含んでいる。前記“機能的同等物”とは、前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とその断片、さらに、ＨＳＰ７０又はこれらの断片のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の配列相同性（つまり、同一性）を有するポリペプチドを意味するもので、配列番号１で示されるＡＩＭＰ２−ＤＸ２と、配列番号３で示されるＨＳＰ７０のポリペプチドと実質的に同質の生理活性を示すポリペプチドを意味する。ここで“実質的に同質の生理活性”とは、野生型ＡＩＭＰ２−ＤＸ２と野生型ＨＳＰ７０との間の直接的で特異的な結合を再現できることを意味する。つまり、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の断片の機能的同等物は、全体の長さのＨＳＰ７０又はその断片に結合することができる活性を有するものであり、ＨＳＰ７０の断片の機能的同等物とは、全体の長さのＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はＡＩＭＰ２−ＤＸ２におけるＨＳＰ７０に結合する部位に結合できる活性を有するものを意味する。前記機能的同等物は、アミノ酸配列の一部が付加、置換又は欠失された結果、生成されたものでもある。前記でアミノ酸の置換は好ましくは保存的置換である。天然に存在するアミノ酸の保存的置換の例は、以下の通りである；脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ）、疎水性アミノ酸（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）及び硫黄含有アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）、又は前記機能的同等物には、アミノ酸配列上でアミノ酸の一部が欠失された変形体も含まれる。前記アミノ酸の欠失又は置換は、好ましくは、本発明のポリペプチドの生理活性に直接的に関連していない領域に位置している。また、アミノ酸の欠失は好ましくは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はＨＳＰ７０ポリペプチドの生理活性に直接関与していない部分に位置する。従って、前記アミノ酸配列の両末端又は配列内に幾つかのアミノ酸が付加された変形体も含まれる。また、本発明の機能的同等物の範囲には、本発明によるポリペプチドの基本骨格及びその生理活性を維持しながら、ポリペプチドの一部の化学構造が変形されたポリペプチド誘導体も含まれる。例えば、本発明のポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させるための構造変更がこれに含まれる。
【００３４】
本発明の方法で“接触（contacting）”とは、一般的な意味であり、２つ以上の製剤（例えば、２つのポリペプチド）を結合させたり、製剤と細胞（例えば、タンパク質と細胞）を結合させることを意味する。接触は試験管内（in vitro）で起こり得る。例えば、試験管（test tube）又は他のコンテナ（container）で２つ以上の製剤を結合させたり、試験製剤と細胞とを、又は細胞溶解物と試験製剤とをを結合させることである。また、接触は、細胞又はインシチュー（in situ）で起こることもある。例えば、２つのポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを細胞内で共同発現（coexpression）させることで、細胞又は細胞溶解物から２つのポリペプチドを接触させることである。また、テストしようとするタンパク質が固定相の表面に配列されたタンパク質チップ（protein chip）やタンパク質アレイ（protein array）を利用することもできる。
【００３５】
本発明の方法を、細胞内で実施するときには、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０は、細胞内在的に発現されることを利用したり、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２やその断片、ＨＳＰ７０又はその断片をコードする核酸を細胞内に導入して形質転換させることで過発現されるようにして、実施することができる。また、本発明の方法を試験管内又はタンパク質アレイのようなｉｎ  ｓｉｔｕで実施するときには、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片、ＨＳＰ７０又はその断片は、天然から抽出したり、遺伝工学的方法により製作して準備することができる。例えば、通常の方法によって、前記ポリペプチド又はその機能的同等物をコードする核酸と組換えて発現ベクターを作製して、適切な宿主細胞において発現させて得ることができる。また、本発明の方法を実施するために必要な前記ポリペプチドは、当業界において公知である化学的合成方法でも製作することができる。
【００３６】
また、本発明の方法で“試験物質”とは、試験製剤（test agent）又は製剤（agent）と互換可能に使用することができるもので、任意の物質（substance）、分子（molecule）、元素（element）、化合物（compound）、実在物（entity）又はこれらの組み合わせを含む。例えばタンパク質、ポリペプチド、低分子有機化合物（small organic molecule）、多糖類（polysaccharide）、ポリヌクレオチドなどを含む。また、天然産物（natural product）、合成化合物又は化学化合物又は２つ以上の物質の組み合わせでもある。
【００３７】
具体的には、本発明の方法を通じて選別される抗がん剤は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０とのタンパク質結合を阻害したり、ＨＳＰ７０と結合できるＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の発現水準を下げることができるものであれば物質の特性に制限されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒｉｂｏｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマー、ペプチド、天然抽出物、及び化学物質などでもある。好ましくは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現を下げることができるｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は化学物質でもあるがこれに限定されるものではない。
【００３８】
前記（ｂ）段階は、（ａ）段階で試験物質の存在下又は非存在下で接触させたＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階である。
【００３９】
前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定する段階は、二つのタンパク質の結合程度を測定するために、当業界で通常的に使用されるものであれば制限なく選択して使用することができる。例えば、ツーハイブリッド（two hybrid）方法、共免疫沈降方法（co-immunoprecipitation assay、 co-IP）、組織免疫染色と共局所化分析（co-localization assay）、シンチレーション（閃光）近接測定法（scintillation proximity assay，ＳＰＡ）、ＵＶ又は化学的架橋結合方法、二分子相互作用分析（bimolecular interactionan alysis、ＢＩＡ）、質量分析法（mass spectrometry，ＭＳ）、ＮＭＲ（nuclear magnetic resonance）、蛍光偏光分析法（fluorescence polarization assays，ＦＰＡ）及び試験管内プル−ダウンアッセイ（in vitro pull-down assay）、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）、タンパク質チップ（protein chip）又はアレー（array）、Ｖｅｎｕｓ  ＢｉＦＣ（bimolecular fluorescence complementation，ＢｉＦＣ）などから適宜選択して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を測定することができる。
【００４０】
本発明の具体的な実施例では、細胞内にＨＡ、Ｓｔｒｅｐ、放射性同位元素等で適切に標識されたＤＸ２とＨＳＰ７０を過発現させ、ｃｏ−ＩＰ実験を行ったり、ＧＳＴ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ実験を利用して、ＤＸ２に結合しているＨＳＰ７０タンパク質の水準を測定したり、逆にＨＳＰ７０に結合しているＤＸ２のタンパク質の水準を測定した。
【００４１】
前記（ｃ）段階は、（ｂ）で測定した試験物質の存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合と、試験物質非存在下でのＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合とを比較して、試験物質によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準の変化を判断する段階である。
【００４２】
つまり、（ｂ）段階で導出された試験物質の存在下又は非存在下で接触させたＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０とのタンパク質の結合水準の差を把握して、試験物質がＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合に及ぼす影響を判断する段階である。
【００４３】
前記（ｄ）段階は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる試験物質を選別する段階である。
【００４４】
本発明者らは、具体的な実施例で、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０とは細胞内で特異的に直接結合し、ＨＳＰ７０との結合を通じてＡＩＭＰ２−ＤＸ２は分解されないように安定化され、結果的にＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞の増殖と分化が維持されることを確認した。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の安定化は、ＨＳＰ７０タンパク質との直接的な結合を通じて行われるもので、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質がＨＳＰ７０タンパク質から解離されると、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質が不安定になり、分解されてその水準が減少するようになり、結果的にＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞の増殖と分化が阻害される。このような効果は、ＨＳＰ７０の発現を抑制するｓｉＲＮＡ又はＨＳＰ７０阻害剤を利用して確認することができた。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との間の結合を抑制することにより、非正常的に細胞分裂するがん細胞の発生と増殖を抑制できることが分かった。
【００４５】
また、他の実施例では、腫瘍発生関連細胞実験と異種移植（xenograft）の動物実験を通じて、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との間の結合を抑制すると、がん細胞の増殖、腫瘍の形成と成長が抑制されることを確認した。
【００４６】
以上の本発明者らの発見を通じて、当業者は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との間の結合を抑制又は結合水準を減少させる物質が、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を不安定にしてがん細胞の増殖と分化を抑制できることが分かる。前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる物質は、代表的には、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合自体を阻害する物質、又はＡＩＭＰ２−ＤＸ２と結合可能なＨＳＰ７０タンパク質の量を減少させる物質でもある。本発明の抗がん剤スクリーニング方法によって選別された抗がん剤に対する具体的な例は、本発明によるがんの予防又は治療用薬学的組成物に対する説明に記述されている。
【００４７】
前記（ｅ）段階は、（ｄ）段階で選別された物質の抗がん活性を細胞又は動物で確認する段階である。
【００４８】
（ｅ）段階は、（ｄ）段階でＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させるものに選別された試験物質が、具体的にがん又は腫瘍モデルの細胞又は動物からＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の不安定化と予測される抗がん活性を有するかを確認する段階である。前記抗がん活性は、非正常的な細胞分裂の増加、正常細胞のがん細胞への転換、がん細胞の細胞分裂と増殖、腫瘍の発生と成長などを抑制することを意味する。
【００４９】
前記がん又は腫瘍モデルの細胞又は動物は、当業界で通常的に使用されるものであれば適宜選択して、（ｄ）段階で選別された物質の抗がん活性を確認することができる。本発明の具体的な実施例では、ヒトのがん細胞株をマウスに注入する異種移植を利用して、体内腫瘍の発生と形成過程を観察している。
【００５０】
本発明に係る抗がん剤スクリーニング方法は、前記（ｄ）と（ｅ）段階の間に追加的に
（１）試験物質を、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する細胞に接触させる段階；
（２）前記細胞と試験物質とを接触しない対照群細胞でＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を測定する段階；及び
（３）対照群細胞と比較してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を減少させる試験物質を選別する段階を実施することができる。
【００５１】
本発明によれば、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が分解されないように安定化するにはＨＳＰ７０との直接的な結合が必要なため、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準が減少すると、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のタンパク質水準が減少することを理解できる。前記（１）乃至（３）の段階は、（ｄ）段階でＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させるものに選別された試験物質が、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を減少させるか否かをさらに確認することである。前記の追加的な段階は、（ｄ）段階でＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる製剤として選別されたが、偽陰性（false-positive）である場合、又はＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を阻害する水準がＡＩＭＰ２−ＤＸ２の不安定化を引き起こすことに不足した場合を判断して除去するために、実施することができる。
【００５２】
前記（１）段階は、（ｄ）段階で選別された試験物質をＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する細胞に接触させる段階である。
【００５３】
前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する細胞は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を内在的に発現する細胞でもあって、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに形質転換されてＡＩＭＰ２−ＤＸ２を過剰発現する細胞でもある。例えば、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を発現する多様ながん細胞株の中から適宜選択して、試験物質のＡＩＭＰ２−ＤＸ２不安定化効果を検証することができる。前記“接触”の意味は先に説明した通りである。
【００５４】
前記（２）段階は、（１）段階で試験物質と接触した細胞と試験物質を接触していない対照群細胞からＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準を測定する段階である。
【００５５】
前記ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を測定するために、当業界で通常に使用されるタンパク質検出方法を制限なく選択して使用することができ、例えば、ウェスタンウェスタンブロット（western blotting）、ドットブロッティング（dot blotting）、酵素結合免疫吸着分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ＥＬＩＳＡ）、放射免疫分析法（ＲＩＡ）、放射免疫拡散法、オウクテロニ免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈降法（immunoprecipitation）、補体固定分析法、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）又はタンパク質チップ（chip）方法などを使用することができる。
【００５６】
前記（ｃ）段階は、対照群の細胞と比較してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を減少させる試験物質を選別する段階である。
【００５７】
前記（ｃ）段階は、先に（ｂ）のステップで測定した試験物質を接触した細胞と接触していない対照群細胞とで測定したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を比較し、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質水準が実際に減少したことが示された試験物質をさらに選別することになる。
【００５８】
本発明では、前記がんは乳がん、肺がん、結腸がん、肛門がん、星状細胞腫、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、肝臓がん、睾丸がん、子宮頸部がん、肉腫、血管腫、食道がん、眼がん、喉頭がん、経口がん、中皮腫、骨髄腫、口腔がん、直腸がん、咽喉がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、大腸がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がん、皮膚がん、基底細胞がん、黒色腫、扁平上皮がん腫、口腔扁平上皮がん腫、大腸直腸がん、膠芽腫（膠細胞腫）、子宮内膜がん及び悪性脳膠腫からなる群から選ばれ得るがこれらに限定されるものではない。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明に係る抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤を有効成分として含むがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００６０】
また、本発明は、有効成分として、本発明に係る抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤からなるがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００６１】
また、本発明は、有効成分として、本質的に、本発明に係る抗がん剤スクリーニングの方法で選別された抗がん剤からなるがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００６２】
本発明の方法により選別された抗がん剤は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させ、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を不安定化してがん細胞の増殖と分化を抑制できるものであれば物質の特性に特別な制限はないが、作用機作によって代表的にＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０二つのタンパク質の結合自体を阻害する物質又はＨＳＰ７０の発現を抑制してＨＳＰ７０と結合可能なＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準をさげる物質を考えてみる。
【００６３】
本発明の方法で選別された抗がん剤は具体的にはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマー、ペプチド、天然抽出物及び化学物質からなる群から選ばれたものでもある。
【００６４】
本発明者らはＨＳＰ７０に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＨＳＰ７０）、又はＨＳＰ７０阻害剤を使用して、がん細胞から、ＨＳＰ７０の発現を抑制するとＨＳＰ７０に結合したＡＩＭＰ２−ＤＸ２の水準が減少してＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質が分解して減少し、結果的にＡＩＭＰ２−ＤＸ２によるがん細胞の増殖と分化が抑制されることを確認した。
【００６５】
これは、ｓｉＲＮＡ又はＨＳＰ７０阻害剤などＨＳＰ７０の発現を抑制できる製剤は、がん疾患の予防又は治療に効果的に利用できることを示した。
【００６６】
従って、本発明に係る抗がん剤スクリーニングで選別された抗がん剤は、ＨＳＰ７０特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はＨＳＰ７０阻害剤でもある。前記ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ＨＳＰ７０ｍＲＮＡに特異的に結合してｍＲＮＡの分解を誘導することができる１０乃至３０個の塩基配列からなり、当業界において公知の方法により通常の技術者が容易に製作することができる。
【００６７】
本発明の具体的な実施例では、下記化学式１の化合物がＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を濃度依存的に阻害し、結果的にＡＩＭＰ２−ＤＸ２が不安定化してその発現が阻害されることによりがん細胞の増殖と分化が抑制されることを確認した。
【００６８】
【化１】
2019512693.tif 000003
【００６９】
本発明に係るがんの予防又は治療用薬学的組成物は、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口的投与方法は、これに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、境膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与でもあって、好ましくは血管内投与でもある。
【００７０】
また、本発明に係るがん疾患の予防又は治療用組成物は、薬学的に許容される担体と共に、当業界において公知の方法で、投与経路により多様に剤形化することができる。“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容されてヒトに投与されるとき、活性成分の作用を阻害しない、通常的に胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさない非毒性の組成物を意味する。前記担体には全ての種類の溶媒、分散媒質、水中油又は油中水エマルジョン、水性組成物、リポソーム、マイクロビーズ及びマイクロソームが含まれる。
【００７１】
本発明の薬学的組成物を非経口的に投与する場合、本発明の組成物は、適切な非経口用担体と共に、注射剤、経皮投与剤及び鼻腔吸込剤の形態で、当該技術分野で公知の方法により製剤化することができる。前記注射剤の場合には、必ず滅菌しなければならず、バクテリア、真菌のような微生物の汚染から保護されるべきである。注射剤の場合、適切な担体の例としては、これに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質でもある。より好ましくは、適切な担体としては、ハンクス溶液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（phosphate buffered saline；リン酸緩衝生理食塩水）又は注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストローズのような等張溶液などを使用することができる。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、ティーメロサルなどのような多様な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含むことができる。また、前記注射剤は、殆どの場合、糖又は塩化ナトリウムのような等張化剤をさらに含むことができる。
【００７２】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロゾル剤などの形態が含まれる。前記で“経皮投与”とは、本発明の組成物を局所的に皮膚に投与して組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。例えば、本発明の組成物を注射型剤形で製造してこれを３０ゲージの細い注射針で皮膚を軽く淡刺（prick；プリック）又は皮膚に直接的に塗布する方法で投与することができる。これらの剤形は、製薬化学において一般的に公知である処方の文献（Remington’s Pharmaceutical Science、15th Edition、1975、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania）に記述されている。
【００７３】
吸込投与剤の場合、本発明に係る組成物は、適切な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な基体を使用して、加圧パック又は煙霧器からエアロゾルスプレーの形態で伝達すことができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は計量された量を伝達するバルブを提供して決定することができる。例えば、吸込器又は吹込器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又は澱粉のような適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
【００７４】
その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されていることを参考にすることができる（Remington’s Pharmaceutical Sciences、19thed.、Mack Publishing Company、Easton、PA、1995）。
【００７５】
また、本発明に係る薬学的組成物は、一つ以上の緩衝剤（例えば、食塩水またはＰＢＳ）、カーボハイドレート（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、アルミニウムヒドロキシサイド）、懸濁剤、濃厚剤及び／又は保存剤をさらに含むことができる。
【００７６】
また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速化、遅速化又は遅延化された放出を提供することができるように、当業界に公知の方法を使用して、多様に剤形化することができる。本発明の組成物は、また、がん疾患を予防又は治療する効果がある公知の化合物と併用して投与することができる。
【００７７】
本発明は、がんの予防又は治療用製剤を製造するための、前記抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の使用を提供する。
【００７８】
本発明は、前記抗がん剤スクリーニング方法で選別された抗がん剤の有効量を、これを必要とする個体に投与することを特徴とするがん治療方法を提供する。
【００７９】
本発明の前記“有効量”とは、個体に投与したとき、がんの改善、治療、予防、検出、診断、又はがん転移抑制又は減少効果を示す量を意味し、前記“個体”とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物に由来する細胞、組織、器官等でもある。前記個体は、前記の効果が必要な患者（patient）でもある。
【００８０】
本発明の前記“治療”とは、がん又はがん関連疾患の症状を改善させることを包括的に指して、これはこれらの疾患を治癒したり、実質的に予防するか、又は状態を改善させることを含むことができ、がん又はがん関連疾患から始まった一つの症状又は殆どの症状を緩和させたり、癒したり、予防することを含むが、これに制限されるものではない。
【００８１】
本発明の用語“〜を含む（comprising）”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同じく使用され、組成物又は方法において、記載されていない追加的な成分、要素又は方法段階などを排除しない。用語“〜からなる（consisting of）”とは別に記載されていない追加的な要素、段階又は成分などを除外することを意味する。用語“本質的に〜からなる（essentially consisting of）”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された成分の要素又は段階と共に、これの基本的な特性に実質的に影響を与えない成分要素又は段階などを含むことを意味する。
【発明の効果】
【００８２】
［有利な効果］
従って、本発明は、ＨＳＰ７０が、がん発生の主な原因タンパク質の一つであるＡＩＭＰ２−ＤＸ２と直接結合して安定化させるという発見に基づいて、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを利用して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２と、ＨＳＰ７０との結合水準を減少させる物質を抗がん剤として選別する抗がん剤スクリーニング方法と、前記方法で選別された抗がん剤を有効成分として含むがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供する。本発明に係るＨＳＰ７０の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの製剤、ＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合を抑制する化合物などは、がんにおけるＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を下げて、がんの発生と進行を抑制する効果が優れている。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
各図面に記載されたＤＸ２はＡＩＭＰ２−ＤＸ２の略称である。
【００８４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＡＩＭＰ２との相互関係をマススペクトロメトリー（mass spectrometry）技法で分析した模式図及び結果を示した図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はＡＩＭＰ２に、いくつかのＨＳＰ７０アイソフォームが結合する様相を質量分析（mass analysis）で検出した結果である（赤棒：ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、青棒：ＡＩＭＰ２）。
【図２Ａ】図２Ａは、ＥＧＦの処理により内在性（endogenous）ＨＳＰ７０のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質との結合が増加することを免疫沈降法（immune-precipitation，ＩＰ）及びウェスタンブロットを通じて確認した結果である（ＷＣＬ：whole cell lysate；全細胞可溶化物）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＥＧＦの処理により内在性（endogenous）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のＨＳＰ７０タンパク質との結合が増加することを免疫沈降法とウェスタンブロットを通じて確認した結果である（ＷＣＬ：whole cell lysate）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＲＦＰ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＧＦＰ−ＨＳＰ７０が一緒に過剰発現された２９３Ｔ細胞をＥＧＦで３０分間処理した後、ＲＦＰ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＧＦＰ−ＨＳＰ７０との結合が増加することを共焦点顕微鏡（confocal microscopy）で確認した結果である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合ＫＤ値をＳＰＲ（surface plasmon resonance；表面プラズモン共鳴）装備を利用して評価した結果である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の断片及びその略語を示した模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、いくつかのＨＳＰ７０アイソフォーム（ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ９、ＨＳＰＤ１）がＡＩＭＰ２−ＤＸ２各断片に結合する程度を測定した結果である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２各断片がＨＳＰ７０と結合する程度をウェスタンブロットを通じて確認した結果である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０とが結合する各タンパク質内の位置を示した模式図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＨＳＰ７０タンパク質の断片及びその略語を示した模式図である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＨＳＰ７０タンパク質のいくつかの断片の中でＡＩＭＰ２−ＤＸ２と結合する断片をウェスタンブロットを通じて確認した結果である（ＷＣＬ：whole cell lysate）。
【図４】図４は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合関係で、各タンパク質の内、いずれかの位置で結合が行われるかを示す模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＳＰ７０タンパク質で細胞を処理したとき、又はｓｉ−ＨＳＰ７０で処理してＨＳＰ７０の発現を阻害したときのそれぞれについて、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現変化をタンパク質水準及び遺伝子水準で観察した結果である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｈ４６０細胞を、ＨＳＰ７０阻害剤であるＰＥＳ（ピフィスリン−ｕ）、ＶＥＲ（ＶＥＲ１５５００８）で処理したとき、又はＨＳＰ９０阻害剤であるＧｅｌ（Geldanamycin；ゲルダナマイシン）、ＰＵ（ＰＵＨ７１）で処理したときのＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現変化を、タンパク質及び遺伝子水準で観察した結果である（ＷＢ：  ウェスタンブロット、  ＲＴ：  ＲＴ−ＰＣＲ）。
【図６Ａ】図６Ａは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が過剰発現されている２９３Ｔ細胞をＨＳＰ７０阻害剤であるＰＥＳ（ピフィスリン−ｕ）、ＶＥＲ（ＶＥＲ１５５００８）で処理したとき、又はＨＳＰ９０阻害剤であるＧｅｌ（Geldanamycin）、ＰＵ（ＰＵＨ７１）で処理したとき、細胞の成長が阻害されるか否かを確認した結果である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｓｉ−ＨＳＰ７０によってＨＳＰ７０の発現が阻害された細胞から細胞の成長を観察した結果である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ｓｉ−ＲＮＡの技法を通じてＨＳＰ７０の発現を減少させた後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞成長の結果物であるＤＮＡ合成をＥｄＵアッセイを通じて観察した結果である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を減少させる化合物を探索するためのＡＩＭＰ２−ＤＸ２モニタリングアッセイの模式図を示したものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２モニタリングアッセイを通じて選別されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０の結合阻害剤であるＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物の構造式を示した図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物の処理によってＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合が阻害されるか否かをウェスタンブロットを通じて確認した結果である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はＡＩＭＰ２が過剰発現された細胞に、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物を、各濃度別に処理した後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はＡＩＭＰ２の発現の変化をルシフェラーゼアッセイを通じて確認した結果である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ｂの結果を数値化して各タンパク質の発現を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を計算した結果である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物をＨ４６０細胞に濃度別（２．５、５、１０μＭ）に１２時間処理した後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、Ａｃｔｉｎ（アクチン）タンパク質発現と、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現を、ウェスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲで観察した結果である。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物でＨ４６０細胞を濃度別（２．５、５、１０μＭ）に１２時間処理した後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、Ａｃｔｉｎタンパク質発現と、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現を、ウェスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲで観察した結果である。
【図９Ａ】図９Ａは、肺がん細胞のＡ５４９細胞株と正常肺細胞のＷＩ−２６をＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度依存的に処理した後、細胞の生存率を評価した結果である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）によってＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現を誘導できる肺がん細胞であるＡ５４９を、ドキシサイクリン（０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞の成長を誘導し、７日目に、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５（４０μＭ）で処理して、９６時間、細胞成長抑制及び死滅を確認した結果である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現量が多様な２つの肺の正常細胞（ＷＩ−２６，  ＷＩ−３８）と７つの肺がん細胞（ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＨＣＣ−１３９９、ＨＣＣ−９５、ＨＣＣ−３６６、ＨＣＣ−１５８８、ＮＩＣ−Ｈ４６０）を、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度別に処理した後、ＭＴＴアッセイを行い、ＧＩ５０を計算した結果である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現が高いＨ４６０細胞をマウスに移植（xenograft）した後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物又はＴａｘｏｌを投与した後、腫瘍の大きさの変化を観察した結果である（腫瘍の肉眼観察写真）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現が高いＨ４６０細胞をマウスに移植（xenograft）した後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物又はＴａｘｏｌを投与した後、腫瘍の大きさの変化を観察した結果である（腫瘍の体積変化）。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現が高いＨ４６０細胞をマウスに移植（xenograft）した後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物又はＴａｘｏｌを投与した後、腫瘍の大きさの変化を観察した結果である（腫瘍の重量変化）。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現が高いＨ４６０細胞をマウスに移植（xenograft）した後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物又はＴａｘｏｌを投与した後、腫瘍の大きさの変化を観察した結果である（動物の体重変化）。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００８６】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するのみのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００８７】
＜実施例１＞
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２及びＨＳＰ７０の結合関係分析
Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２  ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２をそれぞれ発現させた２９３Ｔ細胞のｌｙｓａｔｅを、ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して免疫沈降（immunoprecipitation，ＩＰ）した後、カラムによって沈降されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離されたタンパク質は、ｔｒｙｓｉｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を利用して、ゲル内消化（in-gel digestion）方法でペプチドの水準に分解し、このペプチドをＬＣ−マススペクトロメトリー（Ｔｈｅｒｍｏ）装備を通じて分析した（図１Ａ）。
【００８８】
２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから供給を受けて使用し、Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２  ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２はＤＸ２、ＡＩＭＰ２配列をそれぞれｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ５ベクターにクローニングして入れた後、２９３Ｔ細胞にＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）と称される遺伝子導入試薬（transfection reagent）を利用して過剰発現した。
【００８９】
細胞の溶解（lysis）は、適量の溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｉｓ（ＰＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＢＳ）を入れて３０分間、４°Ｃでインキュベーションすることによって行い、溶解させた細胞可溶化物（cell lysate）を１３２００  ｒｐｍで１５分間、遠心分離した後、細胞可溶化物から分離された上澄み液のみを採った後、上澄み液をｓｔｒｅｐ−ｔａｇカラム（ｔｈｅｒｍｏ）に通過させた。上澄み液を通過させた後、提供される溶出バッファーを利用して、カラムに結合されているタンパク質を溶出して集めた後、集められたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００９０】
図１Ａに示した通り、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＡＩＭＰ２の相互作用をマススペクトロメトリー技法で分析した結果、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の結合タンパク質１０７個、ＡＩＭＰ２の結合タンパク質１４８個を確認できた。その中で４５個の結合タンパク質が重なることを確認した。
【００９１】
一方、図１Ｂに示した通り、ＡＩＭＰ２と比較してＡＩＭＰ２−ＤＸ２にＨＳＰ７０タンパク質が優勢で結合することが確認できた。
【００９２】
より具体的には、図１Ｂの赤色のグラフは、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、青色のグラフは、ＡＩＭＰ２の結合タンパク質を示すグラフである。ｍａｓｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ（質量分析）で多く検出するほどグラフの横軸の左側に表示されるようなり、検出された頻度が縦軸に表示される。図１Ｂの赤色のグラフでＡＩＭＰ２−ＤＸ２結合タンパク質で示されたＨＳＰＡ８、ＨＳＰＤ１、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ９、ＨＳＰＨ１、ＨＳＰＡ２、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡ１Ａは全てＨＳＰ７０のアイソフォームである。一方、青色のグラフのＡＩＭＰ２の場合には、ＨＳＰ７０のアイソフォーム（ＨＳＰＡ４）が一つだけ検出されることを確認した。のみならず、ＡＩＭＰ２の場合には、ＤＸ２では観察されなかったＨＳＰ９０のアイソフォームであるＨＳＰ９０Ｂ１が検出されることを確認した。以上の結果の通り、ＨＳＰ７０がＡＩＭＰ２−ＤＸ２に優勢して結合する結論を得ることができた。
【００９３】
＜実施例２＞
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０の結合関係の確認
Ｈ４６０細胞に内皮成長因子（endothelial growth factor，ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を３０分間処理した後、ＩＰバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＢＳ）で３０分間、４℃で細胞を溶解させた。細胞の可溶化物をＨＳＰ７０抗体（Ａｂｃａｍ）を利用してＩＰした。ＩＰ後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットを通じて、ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、ＨＳＰ７０タンパク質を確認した。Ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）は、添加対照（loading control）を意味し、ＷＣＬは、全細胞可溶化物（whole cell lysate）を意味する。
【００９４】
図２Ａに示した通り、ＥＧＦ処理により内在性（endogeneous）ＨＳＰ７０のＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質との結合が増加することを確認し、この時、ＡＩＭＰ２はＨＳＰ７０と結合していないことが分かった。
【００９５】
Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２が過剰発現された２９３Ｔ細胞をＥＧＦで３０分間処理した。前記実験方法と同様に細胞を溶解させた後、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇカラム（ＧＥ  Ｈｅｌａｔｈｃａｒｅ）を利用してＩＰを進行した。ＩＰ後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを行い、Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０の量を確認する。先のタンパク質は、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｃｌａｓｓｉｃ−ＨＲＰ（ＩＢＡ）、ＨＳＰ７０特異的抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＨＳＰ９０特異的抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を利用して確認した。
【００９６】
図２Ｂに示した通り、ＥＧＦ処理により外来性（exogeneous）ＡＩＭＰ２−ＤＸ２のＨＳＰ７０タンパク質との結合が増加することを確認し、この時、ＨＳＰ９０は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合が極めて弱く、ＥＧＦにより結合が増加しないことが分かった。
【００９７】
ＲＦＰ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＧＦＰ−ＨＳＰ７０が共に過剰発現された２９３Ｔ細胞にＥＧＦを３０分間処理した。ＥＧＦ処理後、冷たいＰＢＳを利用して３回洗浄した後、冷たいメタノールを使用して、細胞を１０分間固定した。固定後、冷たいＰＢＳで再び３回洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液を利用して核を染色した。染色が終わった後、共焦点顕微鏡を利用して各蛍光を観察した。
【００９８】
図２Ｃに示した通り、ＥＧＦ処理によりＲＦＰ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＧＦＰ−ＨＳＰ７０の結合が増加することを共焦点顕微鏡で確認できた。
【００９９】
ＨＳＰ７０タンパク質とＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質との間の結合をＳＰＲ装備（surface plasmon resonance（ＧＥ））を通じて分析した。ＨＳＰ７０タンパク質を固定させた後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を濃度別に流して各タンパク質の結合、分離値を得た後、ＫＤ値を計算した。
【０１００】
図２Ｄに示した通り、精製されたＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＨＳＰ７０タンパク質が、ＫＤ値４．７９×１０−１０水準に直接結合することを、ＳＰＲアッセイを通じて観察した。
【０１０１】
＜実施例３＞
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０の結合構造分析
ＧＳＴ−ｔａｇが融合したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のいくつかの断片（ＤＭ１乃至ＤＭ５）と、２９３Ｔ細胞可溶化物とを混合した。混合した後、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して、各ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質をプルダウン（pull down）した。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質と一緒にプルダウンされたいくつかのＨＳＰ７０タンパク質の量は、マススペクトロメトリー技法を利用して確認した。実験に使用したＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質断片のアミノ酸位置を図３Ａに示した。
【０１０２】
図３Ｂに示した通り、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の断片のうち、配列番号２のアミノ酸配列を有するＤＭ１（配列番号１のアミノ酸配列のうち１−８７番目のアミノ酸に対応する断片）にいくつかのＨＳＰ７０ファミリーが優勢して結合することをマススペクトロメトリー技法を通じて確認することができた。
【０１０３】
次に、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合構造をより具体的に確認するための実験を行った。
【０１０４】
ＧＳＴ−ＥＶ、ＧＳＴ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２  ｆｕｌｌ、ＧＳＴ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２断片（ＤＭ１−ＤＭ５）をＧＦＰ−ＨＳＰ７０が過剰発現された２９３Ｔ細胞可溶化物と混合した。混合した後、ＧＳＴタンパク質をｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを利用してプルダウンし、プルダウンされたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットを通じて分析した。ＧＦＰタンパク質は、ＧＦＰ特異的抗体を利用して確認し、ＧＳＴタンパク質はクーマシー染色（coomassie staining）を通じて確認した。
【０１０５】
図３Ｃ及び図３Ｄに示した通り、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質断片のうち、１−８７アミノ酸を含む配列番号２のアミノ酸配列を有するＤＭ１断片が、ＨＳＰ７０に結合することが分かった。
【０１０６】
一方、ＨＳＰ７０タンパク質内でＡＩＭＰ２−ＤＸ２に結合する部分を確認するための実験を行った。
【０１０７】
Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２と共に、ＧＦＰ−ＨＳＰ７０  ｆｕｌｌ、ＧＦＰ−ＨＳＰ７０断片（ＡＤ、ＳＢ、Ｌｉｄ）を２９３Ｔ細胞に過剰発現させた後、２９３Ｔ細胞の可溶化物をｓｔｒｅｐ−ｔａｇカラムを利用してＩＰた。Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＩＰされたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分離され、各ＧＦＰタンパク質の結合は、ＧＦＰ特異的抗体を利用してウェスタンブロットを通じて確認した。ＨＳＰ７０タンパク質内で実験に使用されたそれぞれの断片（ＡＤ、ＳＢ、Ｌｉｄ）のアミノ酸位置を図３Ｅに示した。
【０１０８】
図３Ｆ及び図４に示した通り、ＨＳＰ７０タンパク質断片のうち、配列番号４のアミノ酸配列を有するＳＢ（substrate binding domain）部分を含む断片だけがＡＩＭＰ２−ＤＸ２と結合することが分かった。
【０１０９】
＜実施例４＞
ＨＳＰ７０によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２の安定化増加
Ｈ４６０細胞にＧＦＰ−ＥＶ、ＧＦＰ−ＨＳＰ７０を遺伝子導入（transfection）を通じて過剰発現させた。また、ＨＳＰ７０に特異的なｓｉ−ＲＮＡ（ｓｉ−ＨＳＰ７０，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を利用して、ＨＳＰ７０の発現を減少させ、この時、対照群としてｓｉ−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＨＳＰ７０の発現を増加、減少させたＨ４６０細胞のタンパク質発現量は、ウェスタンブロット、ｍＲＮＡ発現量は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。ＨＳＰ７０特異的プライマー配列には  Ｆ：ＧＣＧ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  Ｃ、Ｒ：ＧＣＧ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  Ｃを利用した。
【０１１０】
図５Ａに示した通り、ＨＳＰ７０過剰発現によってＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質が増加し、ｓｉ−ＲＮＡ技法を通じたＨＳＰ７０の減少によりＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質が減少することを確認した。この時、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の転写には影響がないことにより、ＨＳＰ７０によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２の調節は、転写後に調節、つまりタンパク質水準での調節であることが分かった。
【０１１１】
一方、Ｈ４６０細胞にＨＳＰ７０阻害剤であるピフィスリン−μ（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＶＥＲ１５５００８（Ｓｉｇｍａ）とＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシン（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＰＵＨ７１（Ｔｏｃｒｉｓ）を処理した後、ウェスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ技法を通じてタンパク質、ｍＲＮＡ発現量を確認した。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の発現量は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２特異的抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を利用して確認した。
【０１１２】
図５Ｂに示した通り、ＨＳＰ７０阻害剤であるＰＥＳ（ピフィスリン−μ）、ＶＥＲ（ＶＥＲ１５５００８）処理によってＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の発現が減少することが分かった。ＨＳＰ９０阻害剤Ｇｅｌ（Geldanamycin）、ＰＵ（ＰＵＨ７１）処理によっては、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の発現に影響がないことを確認し、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０阻害剤によってＡＩＭＰ２の発現は影響がないことが分かった。のみならず、各抑制剤処理によりＡＩＭＰ２−ＤＸ２の転写には影響がないことにより、ＨＳＰ７０抑制剤処理によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２の調節は、転写後の調節、つまりタンパク質水準での調節であることが分かった。
【０１１３】
以上の結果を通じて、ＨＳＰ７０は、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質を特異的に安定化するものと判断された。
【０１１４】
＜実施例５＞
ＤＸ２を経由したＨＳＰ７０の細胞分裂調節
Ｓｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を過剰発現した２９３Ｔ細胞と過剰発現していない２９３Ｔ細胞を、ＨＳＰ７０阻害剤であるピフィスリン−μ（ＰＥＳ）、ＶＥＲ１５５００８（ＶＥＲ）及びＨＳＰ９０阻害剤であるゲルダナマイシン（Ｇｅｌ）、ＰＵＨ７１（Ｐｕ）で１２時間処理した後、ＭＴＴ（Ａｍｒｅｓｃｏ）アッセイを行った。各実験は３回独立的に行い、ＨＳＰ７０に特異的なｓｉ−ＲＮＡ（ｓｉ−ＨＳＰ７０）を利用してＨＳＰ７０の発現を減少させた２９３Ｔ細胞にＳｔｒｅｐ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を過剰発現した後、ＭＴＴアッセイを行った。各実験は３回独立的に行った。
【０１１５】
これに対する結果を図６Ａ及び６Ｂに示した。
【０１１６】
図６Ａに示した通り、ＨＳＰ７０抑制剤ＰＥＳ、ＶＥＲ、ＨＳＰ９０抑制剤Ｇｅｌ、Ｐｕを処理した後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２によって増加する細胞の成長を観察した結果、ＨＳＰ７０抑制剤を処理した場合、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞成長の増加が観察されなかった。また、図６Ｂに示した通り、ｓｉ−ＲＮＡ技法を通じてＨＰＳ７０の発現を減少させた結果、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞成長が観察されなかった。これらの結果を通じてＨＳＰ７０がＤＸ２を通じて細胞の成長を調節していることが分かった。
【０１１７】
一方、ｓｉ−ＲＮＡの技法を通じてＨＳＰ７０の発現を減少させた後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞成長の結果物のＤＮＡ合成をＥｄＵアッセイを通じて観察した結果、ＨＳＰ７０の発現が減少したとき、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２について、発現を通じて増加されるＤＮＡ合成が観察されないことが分かる（図６Ｃ）。
【０１１８】
＜実施例６＞
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０の結合阻害剤の探索
図７Ａに示した通り、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２モニタリングアッセイを作成した後、本発明に係る化合物ライブラリに存在するいくつかの化合物で処理して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２を減少させる化合物を一次に選別した。一次に選別された化合物の中で、ＡＩＭＰ２は減少させず、ＭＴＴアッセイを通じて細胞生存率を測定して正常細胞に影響を与えずにがん細胞にのみ影響を与える化合物を最終的に選別した。
【０１１９】
選別された化合物をＢＣ−ＤＸＩ−４９５と命名し、その構造を図７Ｂに示した。
【０１２０】
＜実施例７＞
ＢＣ−ＤＸＩ−４９５のＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０の結合阻害能及びＤＸ２発現阻害能
前記実施例６を通じて選別されたＢＣ−ＤＸＩ−４９５がＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合を阻害できるか否かを評価した。Ｓｔｒｅｐ−ＤＸ２が過剰発現された２９３Ｔ細胞を、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で、濃度別（２．５、５、１０μＭ）に１２時間処理した後、細胞を１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）が含まれたＰＢＳで溶解した。可溶化物を１３２００ｒｐｍの速度で遠心分離した後、分離された浮遊物と沈殿物からウェスタンブロットを通じてＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２のタンパク質発現量を確認した。ＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現は、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｃｌａｓｓｉｃ−ＨＲＰ（ＩＢＡ）を利用して確認した。
【０１２１】
これに対する結果を図８Ａに示した。
【０１２２】
図８Ａに示した通り、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度依存的に処理する場合、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合が濃度依存的に減少することを確認した。
【０１２３】
ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物によるＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２の減少を確認するために、Ａ５４９細胞にｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＡＩＭＰ２をそれぞれ過剰発現した後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物を濃度依存的（２．５、５、１０、２０、４０μＭ）に４時間処理した。処理後、細胞内にあるＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２タンパク質の量をルシフェラーゼアッセイ（ｃａｔ＃）を通じて確認した。各濃度でのルシフェラーゼ阻害程度を測定して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２を５０％減少させる化合物の濃度を計算し、これをＩＣ５０で示した。また、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物でＨ４６０細胞を濃度別（２．５、５、１０μＭ）に１２時間処理した後、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、Ａｃｔｉｎタンパク質発現と、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２、ＡＩＭＰ２、Ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ発現をウェスタンブロットとＲＴ−ＰＣＲで観察した。
【０１２４】
その結果、図８Ｂ及び８Ｃに示した通り、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物はＡＩＭＰ２発現に影響を与えず（ＩＣ５０  ＞  １００μＭ）、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現のみを特異的に減少させることが確認され（ＩＣ５０：  ４．２μＭ）、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度依存的に処理する場合、ＡＩＭＰ２に影響を与えずＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質のみを特異的に減少させることが確認された（図８Ｄ）。また、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度依存的に処理する場合、ｓｏｌｕｂｌｅ  ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質（浮遊層分画）が減少して、ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質（沈殿物分画）が増加することが分かった（図８Ｅ）。
【０１２５】
＜実施例８＞
ＢＣ−ＤＸＩ−４９５の抗がん効能評価
＜８−１＞ＢＣ−ＤＸＩ−４９５の細胞毒性
ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物により肺がん、正常肺細胞の細胞活性がどのように変化するかを確認するために、Ａ５４９（肺がん細胞）、ＷＩ−２６（正常肺細胞）を、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度依存的（２．５、５、１０、２０、４０μＭ）に処理した。処理後、ＭＴＴアッセイを行い、各細胞の活性を測定した。細胞の活性を５０％減少させる化合物濃度を計算し、これをＧＩ５０で示した。
【０１２６】
図９Ａに示した通り、肺がん細胞であるＡ５４９と正常肺細胞であるＷＩ−２６を、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度依存的に処理した結果、正常細胞には影響せず、肺がん細胞にのみ細胞死滅を誘導することが分かった。
【０１２７】
また、ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）によってＡＩＭＰ２−ＤＸ２の発現を誘導することができる肺がん細胞のＡ５４９を、ドキシサイクリン（０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２による細胞の成長を誘導した。４８時間毎にドキシサイクリンで処理し、７日目にＢＣ−ＤＸＩ−４９５（４０μＭ）を処理して、９６時間、細胞成長抑制及び死滅を確認した。
【０１２８】
図９Ｂに示した通り、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の発現を誘導する場合（ピンクグラフ）、そうでない場合に比べて、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物による細胞毒性がより大きく誘導されることが分かった。
【０１２９】
また、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現量が多様な二つの肺正常細胞（ＷＩ−２６、ＷＩ−３８）と、７つの肺がん細胞（ＮＣＩ−Ｈ２０８７、ＨＣＣ−１３５９、ＨＣＣ−９５、ＨＣＣ−３６６、ＨＣＣ−１４３８、ＨＣＣ−１５８８、ＮＣＩ−Ｈ４６０）を、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物で濃度別に処理した後、ＭＴＴアッセイを行い、ＧＩ５０を計算した。各細胞のＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現量は、ウェスタンブロットを通じて確認した。
【０１３０】
図９Ｃに示した通り、内在性ＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質発現程度に応じ肺がん細胞を３群（Ｌｏｗ（低）、Ｍｅｄｉａｎ（中）、Ｈｉｇｈ（高））に分けた後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５で処理して、細胞毒性程度（ＧＩ５０）を測定した結果、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現が高い細胞において化合物による細胞死滅効果が優れていることが分かった。
【０１３１】
＜８−２＞  ＢＣ−ＤＸＩ−４９５のｉｎ  ｖｉｖｏ抗がん効果の評価
Ｈ４６０細胞５×１０６個を８週齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスなどの表皮に注射して腫瘍を形成させた後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物を５０ｍｇ／ｋｇの濃度で週５回注射して計１０回注射し、陽性対照物質であるｔａｘｏｌは１５ｍｇ／ｋｇの濃度で週２回合計５回注射した。実験終了後、腫瘍を分離して重量を測定した。実験動物の体重及び腫瘍の大きさは週２回測定した。
【０１３２】
ＡＩＭＰ２−ＤＸ２発現が高いＨ４６０細胞をマウスに移植（xenograft）した後、ＢＣ−ＤＸＩ−４９５化合物を５０ｍｇ／ｋｇで投与した結果、対照群であるＴａｘｏｌ（１５ｍｐｋ）と類似する程度にがん細胞の成長を抑制することが分かった。一方、このような腫瘍抑制効果は、腫瘍の重量からも同じく確認された（図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃ）。実験の進行過程の間にマウスの体重には影響がなかった（図１０Ｄ）。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、ＨＳＰ７０ががんの発生の主な原因タンパク質の一つであるＡＩＭＰ２−ＤＸ２と直接結合して安定化させるとの発見に基づいて、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２又はその断片と、ＨＳＰ７０又はその断片とを利用して、ＡＩＭＰ２−ＤＸ２とＨＳＰ７０との結合水準を減少させる物質を抗がん剤として選別する抗がん剤スクリーニング方法と、前記の方法で選別された抗がん剤を有効成分として含むがんの予防又は治療用薬学的組成物を提供する。本発明に係るＨＳＰ７０の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの製剤、さらに、ＨＳＰ７０とＡＩＭＰ２−ＤＸ２との結合を抑制する化合物などは、がんにおいてＡＩＭＰ２−ＤＸ２タンパク質の水準を下げて、がんの発生と進行を抑制する効果が優れて産業上の利用可能性が極めて優れている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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