(57)【要約】  本発明は、試料内の標的核酸配列における突然変異、一塩基多型又は他のバリアントを野生型配列から区別する方法に関する。当該方法は、ビーズ結合プローブが標的核酸の一端とハイブリダイズし且つ表面結合プローブが同じ標的核酸の多端とハイブリダイズするサンドイッチハイブリダイゼーションを介して磁気ビーズを表面結合させるステップと、磁力及び／又は温度によってハイブリダイゼーションに対してストリンジェンシーを適用するステップと、表面に付着されたまま残っている磁気ビーズの量を決定するステップと、表面に付着されたまま残っている磁気ビーズの量を、標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの有無と相関させるステップとを含む。
2019522476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸における突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを検出する方法であって、
ａ）ビーズプローブ及び表面プローブを提供するステップであり、各プローブは、前記標的核酸の配列に相補的な配列を有し、任意的に、前記標的核酸の配列と比較して１つ又は複数の塩基の変化を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、前記ビーズプローブは磁気ビーズに付着され、さらに、前記表面プローブは固体表面に付着される、ステップと、
ｂ）前記標的核酸を含む試料を提供するステップであり、前記標的核酸は、前記標的核酸の野生型配列と比較して１つ又は複数の突然変異及び／又はバリアントを有し得る、ステップと、
ｃ）前記ビーズプローブ及び表面プローブに前記試料を接触させるステップと、
ｄ）前記標的核酸が前記ビーズプローブ及び表面プローブとハイブリダイズするのを可能にして、サンドイッチ構造を形成し、任意的に、前記表面に付着された結合信号の第１の読み取り情報を得るステップと、
ｅ）磁力及び温度によってハイブリダイゼーション結合に対してストリンジェンシーを適用するステップと、
ｆ）前記表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を決定するステップと、
ｇ）任意的に、ステップｅ）及びｆ）を１回以上繰り返すステップと、
ｈ）前記表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を、前記標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在及び／又は数に相関させるステップと、
を含み、
増加する電圧及び上昇する温度が同時に又は順次適用され、前記電圧及び前記温度は、互いに独立して制御される、方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション結合に対してストリンジェンシーを適用するステップは、増加する電圧の磁場を前記試料に印加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記温度を制御することは、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する前記標的核酸の融解温度を超えて前記試料の温度を上昇させることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記温度を制御することは、前記プローブの融点に近い一定温度に前記試料を維持することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を決定するステップは、前記磁気ビーズの光学的検出を含む、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
いくつかの空間的に分離された表面プローブが、同じ固体表面上に同じストリンジェンシー条件下で存在し、各々が、前記標的核酸の特定のバリアント、又は、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントが存在し得る前記標的核酸の特定の領域を検出する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記空間的に分離された表面プローブは、前記野生型配列に対する表面プローブ、及び、前記標的核酸の関心のある特定の突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントに対する１つ又は複数の表面プローブを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記固体表面はカートリッジである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸は、ステップｄ）に先立ち又はその間に増幅ステップを経る、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸は、薬剤耐性に関与する遺伝子から、任意的に病原体から、任意的にウイルス遺伝子から又は細菌遺伝子から又は真菌遺伝子から得られる、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
病原体の異なる株が、前記標的核酸におけるバリアントを検出することによって同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌遺伝子は、結核菌由来の遺伝子である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸は、がんに関与する哺乳類、好ましくはヒトの遺伝子から得られる、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記電圧及び温度を制御することは、前記標的核酸に強く関連した配列を有する核酸の非特異的結合を減少させる、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内の標的核酸配列における突然変異、一塩基多型又は他のバリアントを野生型配列から区別する方法に関する。本発明は、さらに、磁気ビーズの作動及び／又は温度の制御を用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
結合が以下の質量作用の法則：
【０００３】
【化１】
2019522476.tif 000003
に従うと仮定して、速度論的結合の実験が、会合（Ｋｏｎ）及び解離（Ｋｏｆｆ）の速度定数を決定するために使用される。
【０００４】
いかなる所与の時間においても、受容体−リガンドの複合体が形を成す速度は、リガンドの濃度及び依然として非占有の受容体の数に比例する。解離の速度は、受容体−リガンドの複合体の濃度に比例する。
【０００５】
標的核酸配列における突然変異、一塩基多型バリアント（ＳＮＶｓ又はＳＮＰｓ）及び他のバリアントは、通常、受容体及びリガンドが相補的な核酸であるハイブリダイゼーションアッセイにおいて、１つ又は複数の突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有するいかなる所与の標的核酸のＫｏｆｆと、野生型核酸のＫｏｆｆとを識別することによって野生型配列から最もよく区別される。これは、不適正塩基対を有するハイブリダイゼーションに対して、Ｋｏｎにおける差よりもＫｏｆｆにおける差が大きいためである。
【０００６】
Ｋｏｎ間の識別は場合によっては可能であるが、ポイントオブケア設定において提供することが困難である高度に制御された反応条件を要求する（非特許文献１）。さらに、酵素が完全に適合した核酸ハイブリッドにのみ作用する酵素反応が、典型的には、特異性を高めるためにＫｏｎベースの反応に加えられる（非特許文献１）。しかし、酵素の統合は、統合システムにとってさらなる課題を提供し、そのようなアッセイの各々は、酵素が活性に対して完全に適合した核酸ハイブリッドを要求するため、既知の位置にて、１つの予想される突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアント、又は、いくつかのそのような突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの１つの予想される組み合わせのみを決定することができる。
【０００７】
Ｋｏｆｆ間の識別は、通常、表面結合プローブに対するハイブリダイゼーション反応を実施し、続いてハイブリダイゼーション温度から９０〜９５℃まで温度を徐々に上昇させることにより融解曲線を実行し、その間に、ハイブリダイゼーション信号がモニターされることによって行われる（非特許文献２）。高い温度を要求するそのような２段階のプロセスは、同様に、ポイントオブケア設定には理想的ではない。
【０００８】
特許文献１、特許文献２及び非特許文献３が、ＳＮＰ検出の方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１５／０８６６５４  Ａ１
【特許文献２】ＵＳ  ２０１０／１７３２９０  Ａ１
【特許文献３】ＵＳ  ２０１０／３１０４２３  Ａ１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｎｅｚ  Ｋ．，Ｓｐａｓｉｃ  Ｄ．，Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｋ．Ｐ．Ｆ．ａｎｄ  Ｌａｍｍｅｒｔｙｎ  Ｊ．（２０１４）  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｓｔ  １３９：３５３−３７０
【非特許文献２】Ｍｅｕｚｅｌａａｒ  Ｌ．Ｓ．，Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｋ．，Ｌｉｅｂａｎａ  Ｅ．ａｎｄ  Ｂｒｏｏｋｅｓ  Ａ．Ｊ．（２００７）  ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ  ｍｅｌｔ−ｃｕｒｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ９（１）：３０−４１
【非特許文献３】Ｎｇｏ  Ｈｏａｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ：“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＳＮＰ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｕｌｔｒａｂｒｉｇｈｔ  ＳＥＲＳ  ｎａｎｏｒａｔｔｌｅｓ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｌａｒｉａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ”，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｖｏｌ．８１，２９  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１６，ｐｐ．８−１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、標的核酸配列における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの簡略化され低コストの効率的且つ柔軟な検出のための、及び、それらを野生型核酸配列から区別するための改善された手段及び方法が必要とされる。
【００１２】
そのような手段及び方法を、高い温度、酵素的工程又は高度に制御された反応条件を要求せずに、ポイントオブケア設定における統合システムにおいて使用することができる場合にさらに有利である。
【００１３】
異なる突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する複数の標的核酸を、同じアッセイにおいて互いに及び野生型核酸から区別することができる場合にさらに有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの懸念のうち１つ又は複数の懸念により良く取り組むために、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて磁気ビーズの作動を、任意の温度制御及び光学的読み取りと共に用いる。当該方法は、１つの検出プローブを固体表面に結合させ、１つの検出プローブを磁気ビーズに結合させたサンドイッチ構造を介した磁気ビーズの表面結合に基づき、上記の検出プローブのいずれも、同じ標的核酸とハイブリダイズする（図１）。
【００１５】
磁気的作動も温度も、本発明の方法において制御することができるため、不適正塩基対をハイブリダイゼーション反応中に検出することができ、その後の融解曲線が不要になる。これにより、アッセイ時間が短縮されるだけでなく、高い温度が不要になり、そして、蒸発及び圧力の問題が減る。さらに、酵素反応は要求されない。これらの反応条件の単純化により、本発明の方法を統合システムに組み込むことが可能になる。そのような統合システムは、例えば、低コストのマイクロ流体カートリッジである。そのようなカートリッジは、本発明を、ポイントオブケアでの使用に対してより便利にする。
【００１６】
本発明は、任意的に野生型核酸標的に対して完全に相補的なプローブ配列と比較して１つ又は複数の不適正塩基対を有する複数の空間的に分離された表面結合プローブのセット（以後、表面プローブと呼ぶ）を同じカートリッジ上に提供することができるため、同じアッセイにおける異なる突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する複数の標的核酸と、野生型核酸とを識別することも可能にする。
【００１７】
異なる突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する複数の標的核酸と、野生型核酸とのこの識別は、本発明の方法において複数のバリアントを制御する選択肢によってより頑強にされる。プローブの融点に近い固定された温度にてハイブリダイゼーションの磁気ストリンジェンシーを変えることによって、ハイブリダイゼーション反応における不適正塩基対の数に応じて表面結合磁気ビーズの量に差が生じる。同様に、磁力を一定に維持することができ、反応温度が変えられてもよい。磁力及び温度の両方の変動を組み合わせることで、さらに優れたアッセイの感度が可能になり得る。或いは、磁力も温度も一定に維持することができる。
【００１８】
さらに、本発明の方法はサンドイッチハイブリダイゼーション反応において２つのプローブを使用するため、より多くの配列を１つの反応でカバーすることができ、アッセイ設計の微調整を可能にし、さらに、１回の反応でいかなる所与の標的核酸の２つの領域における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの検出も可能にしている。
【００１９】
最後に、参照遺伝子測定の追加を用いて、野生型核酸との比較を要求することなく、標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在を決定することができる。
【００２０】
主要な態様において、本発明は、標的核酸における突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを検出する方法を利用し、当該方法は：
ａ）ビーズプローブ及び表面プローブを提供するステップであり、各プローブは、標的核酸の配列に相補的な配列を有し、任意的に、標的核酸の配列と比較して１つ又は複数の塩基の変化を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、ビーズプローブは磁気ビーズに付着され、さらに、表面プローブは固体表面に付着される、ステップと、
ｂ）標的核酸を含む試料を提供するステップであり、標的核酸は、標的核酸の野生型配列と比較して１つ又は複数の突然変異及び／又はバリアントを有し得る、ステップと、
ｃ）ビーズプローブ及び表面プローブに試料を接触させるステップと、
ｄ）標的核酸がビーズプローブ及び表面プローブとハイブリダイズするのを可能にして、サンドイッチ構造を形成し、任意的に、結果として生じる結合信号の第１の読み取り情報を得るステップと、
ｅ）磁力及び温度によってハイブリダイゼーション結合に対してストリンジェンシーを適用するステップと、
ｆ）表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている磁気ビーズの量を決定するステップと、
ｇ）任意的に、ステップｅ）及びｆ）を１回以上繰り返すステップと、
ｈ）表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を、標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在及び／又は数に相関させるステップと、
を含む。
【００２１】
増加する電圧及び上昇する温度が同時に又は順次適用され、上記の電圧及び温度は、互いに独立して制御される。
【００２２】
一実施形態では、ハイブリダイゼーション結合に対してストリンジェンシーを適用するステップは、増加する電圧の磁場を試料に印加することを含む。
【００２３】
別の実施形態では、温度を制御することは、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する標的核酸の融解温度を超えて試料の温度を上昇させることを含む。
【００２４】
別の実施形態では、温度を制御することは、プローブの融点に近い一定温度に試料を維持することを含む。
【００２５】
別の実施形態では、表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号の量を決定するステップは、磁気ビーズの光学的検出を含む。
【００２６】
別の実施形態では、いくつかの空間的に分離された表面プローブが、同じ固体表面上に同じストリンジェンシー条件下で存在し、各々が、標的核酸の特定のバリアント、又は、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントが存在し得る標的核酸の特定の領域を検出する。一実施形態では、空間的に分離された表面プローブは、野生型配列に対する表面プローブ、及び、標的核酸の関心のある特定の突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントに対する１つ又は複数の表面プローブを含む。一実施形態では、上記の固体表面はカートリッジである。
【００２７】
別の実施形態では、標的核酸は、ステップｄ）に先立ち又はその間に増幅ステップを経る。
【００２８】
別の実施形態では、標的核酸は、薬剤耐性に関与する遺伝子から、任意的に病原体から、任意的にウイルス遺伝子から又は細菌遺伝子から又は真菌遺伝子から得られる。一実施形態では、病原体の異なる株が、上記の薬剤耐性に関与する病原体の遺伝子から得られた標的核酸におけるバリアントを検出することによって同定される。一実施形態では、標的核酸が得られる薬剤耐性に関与する細菌遺伝子は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の遺伝子である。別の実施形態では、ウイルス遺伝子はインフルエンザ遺伝子である。一実施形態では、インフルエンザ遺伝子は、Ｈ／Ｎタイピングに使用することができる。
【００２９】
別の実施形態では、標的核酸は、がんに関与する哺乳類、好ましくはヒトの遺伝子から得られる。
【００３０】
別の実施形態では、電圧及び／又は温度を制御することは、標的核酸に強く関連した配列を有する核酸の非特異的結合を減少させる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】１つの検出プローブが固体表面に結合させられ、１つの検出プローブが磁気ビーズに結合させられたサンドイッチ構造を介した磁気ビーズの表面結合の概略図であり、どちらのプローブも、同じ標的核酸とハイブリダイズしている。
【図２】プローブ（空のボックス）、標的野生型ＤＮＡ（右傾の網掛けを有するボックス）、及び、ＤＮＡの表面側（上部）又はビーズ側（底部）に導入される不適正塩基対を有する標的ＤＮＡ（左傾の網掛けを有する太い枠付きボックス）を示した図である。
【図３】表面側の不適正塩基対に対する上昇した温度及び固定された磁力での様々なプローブに対するビーズ数を示した図である。エラーバーは標準偏差を表している。
【図４】表面側の不適正塩基対に対する固定された温度及び固定された磁力での様々なプローブに対するビーズ数を示した図である。エラーバーは標準偏差を表している。
【図５】ボックスプロットとして表されている、表面側の不適正塩基対に対する固定された温度及び増加した磁力での様々なプローブに対するビーズ数を示した図である。Ｎ＝２である。
【図６】ビーズ側の不適正塩基対に対する上昇した温度及び固定された磁力での様々なプローブに対するビーズ数を示した図である。ブランクレベルを超える全ての測定に対してＮ＝２である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は特定の実施形態に関して記載されるけれども、この記載は、限定的な意味で解釈されることはない。
【００３３】
本発明の例証的な実施形態を詳細に記載する前に、本発明を理解するのに重要な定義が与えられる。
【００３４】
本明細書において及び付随の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の不定冠詞は、その前後で何か他に明確に指示していない限り、それぞれの複数形も含む。
【００３５】
本発明と関連して、「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的に、±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、及び、さらにより好ましくは±５％の示された数値からの偏差を示している。
【００３６】
「含む」という用語は限定的ではないということが理解されたい。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう規定される場合、これは、好ましくはこれらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。
【００３７】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された順序以外の順序で操作できることが理解されたい。
【００３８】
「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語が方法又は使用のステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において以下に定められたように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。
【００３９】
「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、自然発生のヌクレオチドと類似の様式で機能し得る天然ヌクレオチドの既知の類似体も包含する。
【００４０】
「標的核酸」という用語は、突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在又は数が検出されることになる関心のある核酸を意味する。ビーズプローブ及び表面プローブは、標的核酸配列のストレッチに相補的である。標的核酸は、任意的に、突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの検出前に増幅されてもよい。
【００４１】
「突然変異」という用語は、核酸の配列の持続性の変化を意味する。突然変異は、修復されないＤＮＡに対する損傷、複製の過程におけるエラーから、又は、可動遺伝要素によるＤＮＡの断片の挿入又は欠失から生じる。突然変異は、生物の表現型において識別可能な変化を生じさせ得る。突然変異は、進化、がん、免疫系機能及び薬剤耐性を含むが、これらに限定されない正常な生物学的過程においても異常な生物学的過程においても役割を果たす。
【００４２】
「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」という用語は、ゲノム中の特定の位置にて発生する単一のヌクレオチドにおける変異を意味し、各変異は、集団内で認識できる程度で（例えば＞１％等）存在する。これまでに発見されたほとんどのＳＮＰについては、２つの異なる塩基しかその位置にて発生しないが、３つの異なる塩基の変異を有するＳＮＰが記載されてきた。ＳＮＰは、疾患に対する感受性における差の根底にあり；例えば、鎌状赤血球貧血、βサラセミア及び嚢胞性線維症等の広範なヒト疾患がＳＮＰから生じる。病気の重症度及び治療に対する反応性も、遺伝的変異に依存し得る。例えば、ヒトにおいて、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）遺伝子における一塩基変異は、アルツハイマー病のより高いリスクに関連している。「バリアント」という用語は、そのヌクレオチド配列を変える核酸のいかなる変化も意味する。
【００４３】
「オリゴヌクレオチドプローブ」及び「プローブ」という用語は、標的核酸の配列の少なくとも一部に相補的であり、適切な条件下で標的核酸とハイブリダイズする一本鎖の核酸配列を意味する。任意的に、プローブ配列は、標的核酸配列と比較して１つ又は複数の塩基の変化を有する。典型的には、そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、約１０から約１０００ヌクレオチドの、約１０から約８００ヌクレオチドの、約１０から約７００ヌクレオチドの、約１０から約６００ヌクレオチドの、約１０から約５００ヌクレオチドの、約１５から約４００ヌクレオチドの、約１５から約３００ヌクレオチドの、約１５から約２００ヌクレオチドの、約２０から約１５０ヌクレオチドの、約２０から約１００ヌクレオチドの、約２０から約９０ヌクレオチドの、約２０から約８０ヌクレオチドの、約２０から約７０ヌクレオチドの、約２０から約６０ヌクレオチドの、又は、約２０から約５０ヌクレオチドの長さを有することになる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、約２０、３０、４０、５０、６０又は７０ヌクレオチドの長さを有することになる。
【００４４】
「ビーズプローブ」という用語は、磁気ビーズ上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを意味する。
【００４５】
「表面プローブ」という用語は、固体表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブを意味する。
【００４６】
「相補的」という用語は、適切なハイブリダイゼーション条件下で水素結合を介してプローブの逆のセンス鎖を有する標的核酸の鎖と塩基対を形成し、その結果、二本鎖の核酸の断片を形成することができる一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブの配列を意味する。本発明の解釈上、相補的なプローブは、（「適合している」とも呼ばれる）完全に相補的であり、すなわち、その塩基の全てが、互いに隣接して直接標的核酸の塩基と対を形成することになると理解されるか、又は、完全に相補的な配列と比較して、その位置の半分まで、「不適正な」塩基に対して塩基の変化を有すると理解されることになる。例えば、２０ヌクレオチド長のプローブは、そのプローブの完全に相補的な配列と比較して、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の塩基の変化を有してもよい。不適正な塩基は、標的核酸における対応する位置の塩基と水素結合することができない。塩基の変化は、プローブ配列内の隣接位置又は非隣接位置、又は、隣接位置と非隣接位置との混合にて位置し得る。
【００４７】
「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」という用語は、一本鎖核酸が相補的な核酸にアニールし、適合したプリンとピリミジンとの間に非共有結合性の水素結合を形成することによって二本鎖核酸又は「ハイブリッド」を形成する現象を意味する。アデニン−チミン又はウラシル−チミンの塩基対は２つの水素結合を形成し、シトシン−グアニン塩基対は３つの水素結合を形成する。
【００４８】
「結合信号」という用語は、サンドイッチ構造を介して表面に結合したビーズから生じる信号を意味する。結合信号は、結合信号の検出に使用される方法に応じて、表面にわたる一般的な信号であり得るか、又は、サンドイッチ構造におけるビーズの特定の量に相関され得る。
【００４９】
「サンドイッチ構造」及び「サンドイッチハイブリダイゼーション」という用語は、標的核酸が、その核酸配列の別の非重複のストレッチにて２つのプローブ（１つは表面プローブであり、１つはビーズプローブである）とハイブリダイズし、その結果２つのプローブ間で「サンドイッチ」される核酸複合体を意味する（図１）。このプロセスを介して、磁気ビーズは、表面プローブが固定化されている表面に結合させられることになる。
【００５０】
本発明の解釈上、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリッドを維持するのをより困難にするますます厳しくなる条件を意味する。ストリンジェンシーは、サンドイッチ構造を介して表面に結合させられた磁気ビーズに作用する磁力の形態で、又は、核酸ハイブリッドの融解温度に近いか又はそれよりも高い上げられた温度の形態で、又は、磁力と上げられた温度との組み合わせの形態で適用され、その結果、適合した塩基間に存在する非共有結合性の水素結合を破壊することができる。これらのストリンジェンシーを適用する方法のいずれも、ストリンジェンシーを減少又は増加させる、すなわち核酸ハイブリッドの維持を促進するか又はより困難にする緩衝液組成物と組み合わせることができる。これによって、ストリンジェンシーレベルの厳格な制御が可能になる。
【００５１】
「融解温度」という用語は、二本鎖ハイブリッドにおける核酸水素結合塩基対形成の５０％の破壊をもたらす、すなわち、ハイブリッドの５０％が一本鎖核酸に変換される温度を意味する。このプロセスは「変性」とも呼ばれる。核酸ハイブリッドの安定性は、グアニン−シトシンの対がウラシル−アデニン又はチミン−アデニンの対よりも１つ多く水素結合を形成するため、その配列に部分的に依存し、従って、そのさらなる水素結合の破壊に対してより多くのエネルギー、すなわちより高い融解温度を要求する。ハイブリッドの長さも、さらなるエネルギーが各塩基対に要求されるので、その融解温度を決定することにおいて役割を果たす。さらに、不適正塩基対の数及び位置も融解温度に影響を与え、いかなる不適正塩基対も融解温度を低下させることになる。ハイブリッド内の中心位置における不適正塩基対は、末端位置における不適正塩基対よりもさらに融解温度を低下させる。隣接する適合した塩基のストレッチの長さが短くなればなるほど、融解温度は低くなる。融解温度は、ＤＮＡの濃度及びイオン強度にも依存する。本発明のサンドイッチ構造では、ハイブリッドの水素結合にさらなる歪みを与える磁力が、ハイブリッドの融解温度を低下させる。
【００５２】
「空間的に分離された」という用語は、表面上の単離されたスポットに固定化された表面プローブ、すなわち、表面プローブが表面に付着していない空間によって分離された１種の表面プローブのみを有する領域を意味する。例えば、マイクロ流体カートリッジは、４つの別のスポットを有してもよく、その各々がカートリッジ表面に付着された異なる種の表面を有する。
【００５３】
「野生型」という用語は、核酸又は遺伝子の自然発生する配列を意味する。核酸又は遺伝子の複数の対立遺伝子が存在する場合、集団における１つの最も優勢なものが、野生型対立遺伝子と考えられる。
【００５４】
「増幅」という用語は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸の増幅に適したいかなる他の方法も使用した、標的核酸又はそのストレッチのさらなるコピーの生成を意味する。
【００５５】
「薬剤耐性」という用語は、疾患又は状態を治癒させることにおける、又は、病原体を死滅させる又は抑制することにおける薬剤の有効性の低下を意味する。そのような薬剤耐性は、例えば、宿主の核酸配列における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの取得、及び／又は、変化した核酸配列の遺伝子産物の発現によって等、多数のプロセスによって与えられ得る。生物又は細胞が２つ以上の薬剤に耐性を有する場合、多剤耐性であると言われる。
【００５６】
「薬剤耐性に関与する遺伝子」という用語は、病原体又は細胞等の生物の薬剤耐性に寄与する任意の遺伝子を意味する。薬剤に対する耐性が示される主な機構は、（１）例えば、酵素の非活性化又は分解等の薬剤の不活性化又は修飾、（２）例えば、薬剤が結合する、又は、薬剤にとって結合部位を近づきづらくするか又は薬剤に結合するための親和性を下げる構造的変化をもたらすタンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の変化又は核酸配列における塩基の変化等、薬剤標的の変化、（３）例えば代替前駆体の使用、薬剤によって阻止された工程を促進することもできる重複酵素の使用、又は、周囲からの経路産物又は中間産物の取り込み及び使用等、薬剤が抑制する代謝経路の変化、（４）例えば、減少する薬剤透過性及び／又は増加する細胞表面を横切る薬剤の能動流出（ポンプアウト）による等、減少した薬剤蓄積、（５）例えば増加した転写及び翻訳による、又は、タンパク質標的をコードする遺伝子のさらなるコピーの取得による等、薬剤のタンパク質標的の過剰発現、及び、（６）薬剤の核酸標的の複数のコピーの取得である。
【００５７】
「病原体」という用語は、例えば宿主に疾患を引き起こすウイルス、細菌、プリオン、真菌、ウイロイド又は寄生生物等の感染病原体を意味するが、これらに限定されない。宿主は、他の病原体を含むヒト、動物、植物、真菌又は微生物であってもよい。
【００５８】
「病原体の株」という用語は、病原体の種の遺伝的に異なるサブタイプを意味する。
【００５９】
「がんに関与する遺伝子」という用語は、がんの素因及び／又はがんの発達及び／又はがんの進行に寄与する任意の遺伝子を意味する。そのような遺伝子には、がんを引き起こす可能性を持つ「癌遺伝子」、及び、がんへの経路の一歩から細胞を保護する「腫瘍抑制遺伝子」が含まれる。癌遺伝子は、細胞増殖を誘導する増殖因子、細胞増殖及び分化に対する信号を伝達する受容体チロシンキナーゼ、細胞増殖、分化、細胞生存及びアポトーシスに対する応答及びその受容体の活性化を媒介する細胞質チロシンキナーゼ、生物発生細胞周期の調節、細胞増殖、分化及び生存及びアポトーシスに関与する細胞質セリン／スレオニンキナーゼ及びその調節サブユニット、細胞増殖を導く主要経路の信号伝達に関与する調節性ＧＴＰアーゼ、及び、細胞増殖を誘導する遺伝子又は他の癌遺伝子の転写を調節する転写因子を含む。典型的には、癌遺伝子は、がんを引き起こすために野生型遺伝子と比較して過剰発現又は突然変異される必要がある。腫瘍抑制遺伝子は、細胞周期進行、ＤＮＡ損傷との細胞周期の連関、すなわち損傷したＤＮＡの存在下での細胞周期の抑制、アポトーシスの開始、細胞接着、接触抑制及びＤＮＡ修復に不可欠な遺伝子の抑制に関与する遺伝子を含む。腫瘍抑制遺伝子は、典型的には、がんが発達するためには突然変異、低発現又は発現抑制させなければならないが、癌遺伝子に対抗して、腫瘍抑制遺伝子の両方の対立遺伝子がそのように影響されなければならない。
【００６０】
「非特異的結合」という用語は、非相補的な一本鎖核酸のハイブリダイゼーションに関する。そのような非特異的結合は、典型的には、より少ない水素結合が形成されるため弱く、磁力若しくは電圧、非特異的ハイブリッドの融解温度を超えるが、特異的ハイブリッドの融解温度よりは低い上げられた温度、又は、その２つの組み合わせの形態でストリンジェンシーを適用することによって減少させる又は除去することができる。
【００６１】
「強く関連した」という用語は、標的核酸と類似しているが同一ではない核酸の配列に関する。類似性は、最も多くの不適正塩基を有するプローブの類似性よりも低い。
【００６２】
主要な態様において、本発明は、標的核酸における突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを検出する方法を利用し、当該方法は：ａ）ビーズプローブ及び表面プローブを提供するステップであり、各プローブは、標的核酸の配列のストレッチに相補的な配列を有し、任意的に、標的核酸の配列と比較して１つ又は複数の塩基の変化を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、ビーズプローブは磁気ビーズに付着され、さらに、表面プローブは固体表面に付着される、ステップと、ｂ）標的核酸を含む試料を提供するステップであり、標的核酸は、標的核酸の野生型配列と比較して１つ又は複数の突然変異及び／又はバリアントを有し得る、ステップと、ｃ）ビーズプローブ及び表面プローブに試料を接触させるステップと、ｄ）標的核酸がビーズプローブ及び表面プローブとハイブリダイズするのを可能にして、サンドイッチ構造を形成し、任意的に、表面に付着された結合信号の第１の読み取り情報を得るステップと、ｅ）任意的に磁力及び温度によってハイブリダイゼーション結合に対してストリンジェンシーを適用するステップと、ｆ）表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を決定するステップと、ｇ）任意的に、ステップｅ）及びｆ）を１回以上繰り返すステップと、ｈ）表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を、標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在及び／又は数に相関させるステップと、を含む。
【００６３】
標的核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。標的核酸は、標的核酸の野生型配列と比較して、１つ又は複数の突然変異を有してもよい。標的核酸は、その野生型であると考えられる標的核酸の優勢な配列と比較して、１つ又は複数のＳＮＰを有してもよい。標的核酸は、標的核酸の野生型配列と比較して、その配列において１つ又は複数の他のバリアントを有してもよい。さらに、標的核酸は、野生型配列と比較して、１つ又は複数の突然変異及び１つ又は複数のＳＮＰを有してもよい。標的核酸はまた、野生型配列と比較して、１つ又は複数の突然変異及び１つ又は複数の他のバリアントを有してもよい。標的核酸は、野生型配列と比較して、１つ又は複数のＳＮＰ及び１つ又は複数の他のバリアントを有してもよい。最後に、標的核酸はまた、標的核酸の野生型配列と比較して、１つ又は複数の突然変異、１つ又は複数のＳＮＰ及び１つ又は複数の他のバリアントを有してもよい。
【００６４】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイ等、多くの重要な分子の用途は、固体支持体に付着された合成オリゴヌクレオチドを利用する。この付着が起こるためには、オリゴヌクレオチドは、固体表面上の反応基への付着を有するために、官能基で修飾されなければならない。オリゴヌクレオチドは、ガラススライド又はポリマー表面等の平坦な二次元表面、並びに、ミクロビーズ及びミクロスフェア等の三次元表面に付着させることができる。本発明では、ビーズプローブは、磁気ビーズ上に固定化され、表面プローブは、固体表面上に固定化される。このための最も利用可能なアプローチは、個々のオリゴヌクレオチドを合成し、続いてそれらを固体表面又はビーズに固定化することである。固体支持体付着に利用可能なより一般的に使用される化学的性質には：ａ）アルデヒド又はエポキシドにより処理された表面に共有結合したヒドラジド修飾オリゴヌクレオチド、ｂ）活性化カルボキシレート基又はサクシニミジルエステルに共有結合したアミン修飾オリゴ、ｃ）アミノフェニル又はアミノプロピル誘導体化ガラス表面に結合したサクシニル化オリゴヌクレオチド、ｄ）メルカプトシラン化ガラス表面に結合したジスルフィド修飾オリゴヌクレオチド、ｅ）ヨードアセトアミド又はマレイミド等のアルキル化剤を介して共有結合したチオール修飾オリゴ、ｆ）ジゴキシゲニンＮＨＳエステル、ｇ）コレステロール−ＴＥＧ、及びｈ）固定化ストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン修飾オリゴが含まれる。ビーズプローブ及び表面プローブはまた、当業者が認識するであろう他の化学的性質を介して付着されてもよい。
【００６５】
標的核酸のストレッチにそれぞれ相補的であるビーズプローブ及び表面プローブは、標的核酸配列の末端又は内部のストレッチに相補的であり得る。ビーズプローブ及び表面プローブは、標的核酸の両側の末端領域に相補的であってもよく、すなわち、ビーズプローブは一端に相補的であってもよく、表面プローブは他端に相補的であってもよい。ビーズプローブは、標的核酸の一端に相補的であってもよく、表面プローブは、標的核酸の両端から離れて位置する標的核酸のストレッチに相補的であってもよい。ビーズプローブは、標的核酸の一端に相補的であってもよく、表面プローブは、ビーズプローブが相補的である配列の近くに位置する標的核酸のストレッチに相補的であってもよい。表面プローブは、標的核酸の一端に相補的であってもよく、ビーズプローブは、標的核酸の両端から離れて位置する標的核酸のストレッチに相補的であってもよい。表面プローブは、標的核酸の一端に相補的であってもよく、ビーズプローブは、表面プローブが相補的である配列の近くに位置する標的核酸のストレッチに相補的であってもよい。表面プローブ及びビーズプローブはいずれも、標的核酸配列の内部のストレッチに相補的であってもよい。表面プローブ及びビーズプローブはいずれも、互いに近くの位置の標的核酸配列の内部のストレッチに相補的であってもよく、標的核酸配列の同じストレッチに相補的でなくてもよく、又は、互いに相補的でなくてもよい。
【００６６】
標的核酸を含む試料と表面プローブとの接触は、表面プローブが固定化されている表面と試料とを接触させることによって行われる。これは、スライド、アレイ、カートリッジ、ウェル又はチューブに試料を添加することによって発生し得る。標的核酸を含む試料とビーズプローブとの接触は、ビーズプローブが固定化された磁気ビーズと試料とを接触させることによって行われる。これは、試料にビーズを、又は、スライド、アレイ、カートリッジ上の又はウェル若しくはチューブ内のビーズに試料を添加することによって発生し得る。これらの工程は、同時に、すなわち、試料を、磁気ビーズも有するウェル、チューブ、チャンバ、又は他のコンパートメントの表面に添加することによって実施されることが好ましい。最も好ましいのは、ミクロ流体カートリッジのコンパートメントへの試料の添加であり、その表面には、表面プローブが固定化され、ビーズプローブがその表面に動態化された磁気ビーズを有する。そのようなミクロ流体カートリッジの例は、特許文献３に記載されているものであり、Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ（商標）カートリッジとも呼ばれている。Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ（商標）カートリッジは、一滴の液体で満たされ、続いてさらなる流体の移動は要求されない使い捨てのカートリッジである。これらのカートリッジ内のアッセイプロセス全体が、カートリッジ内の磁性ナノ粒子の動きを制御するための磁場の外部印加によって行われ、カートリッジには予め磁性ナノ粒子が搭載されてくる。これらの場は、カートリッジの上下に位置した小さな電磁石によって印加される。
【００６７】
ハイブリダイゼーションは、試料が表面プローブ及びビーズプローブの両方と接触させられると発生する。最適な温度、緩衝液及び他の反応条件は、当業者には既知の多くの因子に依存する。最適な温度及び条件の決定に極めて重要なのは、オリゴヌクレオチドプローブの長さ、グアニン及びシトシンの含量、並びに、２つの配列間の不適正塩基対の最大許容数であり、いかなる所与の核酸ハイブリッドに対する融解温度もかなり考慮に入れる。ハイブリダイゼーション反応温度は、水素結合の形成を可能にするために融解温度より低くなる。ビーズプローブ及び表面プローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションのための例証的なプロトコルは、２０ヌクレオチドの長さ及び４０〜５５％のグアニン＋シトシンを有するビーズプローブ及び表面プローブについては以下の通りであり、洗浄磁石がオンにされる初期段階を含む。これにより、表面上にすでに存在するいかなるアーチファクトも検出することができる基準測定が可能になる。この後、表面プローブを有するスポット上にビーズが集中されるＵ字形磁石を使用した短い収集ステップが続く。Ｕ字形磁石を使用したより長い結合ステップが、収集ステップに続き、有り得る不適正塩基対を有する標的を介してビーズが表面に結合するのを可能にしている。
【００６８】
磁気ビーズを表面に効果的に結合させる１つの表面プローブ、１つの標的核酸及び１つのビーズプローブから成るサンドイッチ構造の形成に続いて、第１の短い洗浄工程においてストリンジェンシーがハイブリッド構造に適用され、その後で、別の収集及び結合工程が実施され、さらに、第２のより長い洗浄工程が、ビーズと表面との結合の強度を評価するために実施される。一実施形態では、ハイブリダイゼーション結合にストリンジェンシーを適用することは、増加する電圧の磁場を試料に印加することを含む。ハイブリッドの融解をもたらすのに要求される磁場の範囲は、プローブの長さ、すなわちハイブリダイズされる配列の長さ、グアニン及びシトシンの残基の含量、及び核酸ハイブリッド内の不適正塩基対の数に依存するということを当業者は認識するであろう。２０ヌクレオチドの長さ、５４℃で５０〜５５％のグアニン＋シトシン、及び、ゼロ、１つ又は２つの不適正塩基対を有するビーズプローブ及び表面プローブに対する、ビーズプローブ及び表面プローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを増大させるための例証的な磁場強度の範囲は、完全に適合したプローブとの標的核酸のハイブリッドの融解温度に近い温度で、それぞれ３０秒続く０．１Ｖの増加で、０から１Ｖ、より好ましくは０．２から１Ｖ、最も好ましくは０．４から０．８Ｖである（実施例４を参照されたい）。磁石の周波数及びデューティサイクル等の他の変数はこの期間中変えられない。
【００６９】
別の実施形態では、ストリンジェンシーは、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する標的核酸の融解温度を超えて試料の温度を上昇させることによって適用される。２０ヌクレオチドの長さ、５４℃で４０〜５５％のグアニン＋シトシン、及び、ゼロから１０の不適正塩基対を有するビーズプローブ及び表面プローブに対する、ビーズプローブ及び表面プローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを増大させる例証的な温度の範囲は、４５から６０℃、より好ましくは４８から５８℃、最も好ましくは５１から５７℃である（実施例２を参照されたい）。
【００７０】
別の実施形態では、ストリンジェンシーは、プローブの融点に近い一定温度、好ましくは、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する標的核酸の融解温度を超える一定温度に試料を維持することによって適用される。２０ヌクレオチドの長さ、５０〜５５％のグアニン＋シトシン、及び、０から２つの不適正塩基対を有するビーズプローブ及び表面プローブに対する、ビーズプローブ及び表面プローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを増大させる例証的な一定温度は、５７℃である（実施例３を参照されたい）。
【００７１】
別の実施形態では、増加する電圧及び上昇する温度が同時に又は順次適用され、上記の電圧及び温度は、互いに独立して制御される。２０ヌクレオチドの長さ、５４℃で４０〜５５％のグアニン＋シトシン、及び、０から１０の不適正塩基対を有するビーズプローブ及び表面プローブに対する、ビーズプローブ及び表面プローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションにおけるストリンジェンシーを増大させる例証的な磁場強度の範囲は、それぞれ３０秒続く０．１Ｖの増加で、０から１Ｖ、より好ましくは０．２から１Ｖ、最も好ましくは０．４から０．８Ｖである。磁石の周波数及びデューティサイクル等の他の変数はこの期間中変えられない。例証的な温度の範囲は、４５から６０℃、より好ましくは４８から５８℃、最も好ましくは５１から５７℃である。
【００７２】
一実施形態では、非特異的なハイブリッドが、標的核酸において少数の突然変異、ＳＮＰ又は他のバリアントを有する特異的なハイブリッドよりも多数の不適正塩基対を有することになり、従って、より低い融解温度、及び、核酸の鎖を引き離す磁力によって引っ張られることになる結合をより少なく有することになるため、電圧及び／又は温度の制御は、標的核酸に強く関連した配列を有する核酸の非特異的結合を減らす効果も有する。
【００７３】
ストリンジェンシーがハイブリダイゼーションに適用された後で、依然としてサンドイッチ構造を介して表面に結合させられた結合信号が決定される。同様に、ストリンジェンシーが適用される前にハイブリダイゼーション工程の後で、結合信号の任意の第１の読み取りを行うことができる。一実施形態では、表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を決定することは、磁気ビーズの光学的検出を含む。Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ（商標）カートリッジ等、簡便且つ低コストのミクロ流体カートリッジと共に使用することができる、例えば、目視により光の中のビーズを計数する、位相コントラスト又は電子顕微鏡画像によって、又は、内部全反射（ＦＴＩＲ）によって等、当技術分野において既知のいかなる方法によって光学的検出は発生してもよい。ＦＴＩＲでは、光は全反射の角度で試料内に結合させられる。ビーズが試料表面の近くに存在しない場合、光は完全に反射される。しかし、磁気ビーズが表面に結合させられている場合、全反射の条件に違反し、光の一部が試料内に散乱し、従って、表面によって反射される光の量が減少する。光検出器で反射光の強度を測定することにより、表面に結合させられた磁気ビーズの量を推定することが可能である。これは、試料内に存在する関心のある特定の分子の量の推定を可能にする。
【００７４】
任意的に、ストリンジェンシーを適用する工程及び表面に結合させられた結合信号を決定する工程は、例えば１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回等、数回から１０００回まで繰り返される。非特異的な結合又は弱い結合はより徹底的に排除されることになるため、各反復は、標的核酸におけるバリアントのより正確な決定をもたらすはずである。さらに、非常に類似したハイブリダイゼーションエネルギーを有するバリアントは、何回かの反復にわたって表面に結合したままのビーズの数を比較することによって見分けることができる。
【００７５】
表面プローブ又はビーズプローブのいずれかと標的核酸との間の不適正塩基対が少ないほど、ストリンジェントな条件下で表面に依然として結合させられるビーズの数は多くなるため、表面に結合させられた結合信号が決定されると、標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在及び／又は数に相関させられる。ある範囲のストリンジェンシーが適用される場合、完全に相補的な配列は、不適正塩基対を有する相補的な配列よりも高いストリンジェンシーのポイントまで表面上のビーズを保持することになる。任意的に、もはや増えない又は減少した数のビーズが表面に結合させられるストリンジェンシーの条件を、野生型配列又は参照配列と比較することができる。
【００７６】
一実施形態では、いくつかの空間的に分離された表面プローブが同じ固体表面上に同じストリンジェンシー条件下で存在し、各々が、標的核酸の特定のバリアント、又は、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントが存在し得る標的核酸の特定の領域を検出する。空間的分離は、例えば、別の液滴、ウェル、スロット、切りこみ、チャンバ又は印刷されたグリッドの形態で、又は、スライド、アレイ、プレート、カートリッジ、チップ又は当業者には既知の他の表面上の当業者には既知の他の手段によって達成することができる。好ましい実施形態では、いくつかの空間的に分離されたプローブが付着された固体表面はカートリッジである。より好ましい実施形態では、カートリッジはミクロ流体カートリッジである。特に好ましい実施形態では、ミクロ流体カートリッジは、Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ（商標）カートリッジである。
【００７７】
別の実施形態では、空間的に分離された表面プローブは、野生型配列に対する表面プローブと、標的核酸の関心のある特定の突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントに対する１つ又は複数の表面プローブとを含む。野生型配列は、核酸ハイブリッドを融解するのに要求されるストリンジェンシー条件に対する基準として役立ち得る。関心のある突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントは、疾患又は疾患の素因を引き起こすとして既知の、又は、薬剤耐性若しくは薬物耐性又は当業者が構想することができるいかなる他の関心のある特徴を引き起こすとして既知のものであってもよい。
【００７８】
一実施形態では、標的核酸は、ステップｄ）に先立ち又はその間に増幅ステップを経て、標的核酸又はそのストレッチのさらなるコピーが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法（ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、核酸配列ベース増幅、鎖置換増幅、多置換増幅、又は、核酸の増幅に適したいかなる他の方法も使用して生成される。当業者は、本発明の特定の用途に最も適した方法を構想することができるであろう。
【００７９】
一実施形態では、標的核酸は、薬剤耐性に関与する遺伝子から、任意的に病原体から、任意的にウイルス遺伝子から又は細菌遺伝子から又は真菌遺伝子から得られる。そのような病原体は、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、多剤耐性細菌、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＣ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含むが、これらに限定されない。薬剤耐性に関与する遺伝子は、典型的には、薬剤が結合するものである。突然変異は、薬剤標的への薬剤の結合の変化をもたらす恐れがあり、例えば、薬剤が結合する核酸配列における塩基の変化又はタンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の変化等であり、薬剤と薬剤標的との化学的相互作用を減少させるか、又は、薬剤にとって結合部位を近づきづらくするか又は薬剤に結合するための親和性を下げる構造的変化をもたらす。そのような遺伝子におけるあらゆる突然変異の存在を決定するために、遺伝子全体又はある核酸の領域をカバーする野生型配列に完全に相補的なプローブが、同じ表面上で空間的に分離して印刷される。プローブのいずれかが、ストリンジェントな条件下でより低いビーズを表面に結合したまま保持する程度を示す場合、これは、不適正塩基対の存在を示し、従って、その特定のプローブによってカバーされる遺伝子又は領域の一部における突然変異を示す。有利に、これは、いかなるあり得る突然変異の存在も検出することになり、当技術分野においては既知の特定の突然変異の設計に限定されない。
【００８０】
別の実施形態では、病原体の異なる株が、薬剤耐性に関与する上記の病原体の遺伝子から得られる標的核酸におけるバリアントを検出することによって同定される。そのような病原体及び遺伝子には、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、Ｃ．ディフィシル及びそれらの遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。バリアントを有する標的の区別は、プロトコルの終わりに生じてもよく、最初は、比較的低レベルのストリンジェンシーにて、病原体の全ての株が、関心のある又は参照の特定の株由来の配列に完全に相補的なプローブに結合することになり、標的核酸含有試料が得られた試料中の特定の病原体の存在を決定し、ストリンジェンシーのレベルがさらに増加すると、バリアントは、核酸ハイブリッドにおける不適正塩基対によるプローブへのそれらの差次的な結合によって検出されることになり、関心のある株又は参照の株と比較して塩基のバリアントを有する病原体の新たな又は既知の株の存在を決定する。これは、例えば、インフルエンザ及びプラスモジウム等の非常に変化する株を有する病原体の検出に関連している。
【００８１】
一実施形態では、標的核酸が得られる薬剤耐性に関与する細菌遺伝子は、結核菌由来の遺伝子である。そのような遺伝子には、例えば、リファンピシン、イソニアジド、エチオナミド、イソニアジド−エチオナミド、ストレプトマイシン、フルオロキノロン、ピラジナミド、エタンブトールに対する耐性に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
別の実施形態では、標的核酸は、がんに関与する哺乳類の遺伝子から得られる。好ましい実施形態では、哺乳類の遺伝子はヒト遺伝子である。そのような遺伝子は、癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子であってもよい。例えば、そのような遺伝子は、増殖因子、受容体チロシンキナーゼ、細胞質チロシンキナーゼ、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ、調節性ＧＴＰアーゼ、細胞周期進行遺伝子の抑制に関与する遺伝子、又は、細胞周期をＤＮＡ損傷に結合する遺伝子であってもよい。標的核酸野生型、及び、がんに関与することが既知の特定の標的核酸バリアントに正確に一致するプローブが、同じ表面上で空間的に分離して印刷され得る。バリアント用プローブが、ストリンジェントな条件下で野生型用プローブよりも多くの量のビーズを表面に結合したまま保持する場合、バリアントが存在する。これは、がんにおける突然変異遺伝子の検出に特に関連し、ＫＲＡＳ又はＢＲＡＦにおいて等、ある特定の発癌性バリアントの存在が、治療の選択に影響を及ぼす。
【００８３】
実施例
本発明の標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントを検出する方法は、以下の実施例を参照することによって支持及び例示される。これらの実施例は決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが強調されなければならない。
【実施例１】
【００８４】
１．プローブ配列の設計
配列のハイブリダイズする部分において、不適正塩基対の量を増やしてプローブ−標的の組合せを設計することによって、上記の配列間の差を検出することができた。理想的には、全ての不適正塩基対の配列が、完全に適合するプローブよりも少ないビーズ数をもたらすはずである。実際には、適合するプローブと、端に１つの不適正塩基対を有するプローブとの差が検出可能であることはほとんどあり得ない。従って、不適正塩基対を検出するために使用されるプローブは、不適正塩基対がプローブの中央付近のどこかに現れるように設計されるべきである。
【００８５】
各アッセイが２つのプローブ、すなわち１つのビーズプローブと１つの表面プローブを有するため、不適正塩基対は、標的の両側に導入されている（図２）。全ての配列に対する配列番号が、以下の表に列挙されている。
【００８６】
【表１】
2019522476.tif 000004
【実施例２】
【００８７】
２．表面プローブにおける不適正塩基対に対する、固定された磁力にて温度を変えることによるストリンジェンシーの適用
表面プローブに結合する配列において不適正塩基対の量を増やしたＤＮＡ標的を、４５℃にて固定された作動プロトコルを用いて、ミクロ流体カートリッジにおいて、表面及びビーズプローブを担持するビーズにハイブリダイズさせた。次に、結合させたビーズを、温度を上げて０．４Ｖにて洗浄磁石を活性化することによって洗い流した。使用される作動プロトコルは、洗浄磁石がオンにされる初期段階を含む。これにより、表面上にすでに存在するあらゆるアーチファクトを検出することができる基準測定が可能になる。この後、表面プローブを有するスポットにわたってビーズが集中されるＵ字形磁石を使用した短い収集ステップが続く。Ｕ字形磁石を使用したより長い結合ステップが、収集ステップに続き、有り得る不適正塩基対を有する標的を介してビーズが表面に結合するのを可能にしている。短い洗浄ステップが続き、その後、別の収集及び結合ステップが実行される。最後に、ビーズと表面との結合の強度を評価するためにより長い洗浄ステップが行われ、その間に６０℃までそれぞれ３０秒間続いて摂氏１度ずつ温度が上げられる。
【００８８】
不適正塩基対を有する全ての標的が、５４℃にて参照よりも少ないビーズ数を示している。１つの不適正塩基対を有する標的（標的１１及び１２）又は２つの不適正塩基対を有する標的（１３及び１４）が、依然として５４℃にてビーズ数を示している。１つ又は複数の不適正塩基対を含有する標的に対する全てのビーズ数は、この温度での野生型標的のビーズ数とは有意に異なる（図３）。
【実施例３】
【００８９】
３．表面プローブにおける不適正塩基対に対する、固定された磁力にて固定された温度のストリンジェンシーの適用
表面プローブに結合する配列において不適正塩基対の量を増やしたＤＮＡ標的を、４５℃にて固定された作動プロトコルを用いて、同じミクロ流体カートリッジにおいて、互いに空間的に分離して表面に及びビーズプローブを担持するビーズにハイブリダイズさせた。次に、結合させたビーズを、作動によって洗い流した（図４）。使用される作動プロトコルは、０．４Ｖにて洗浄磁石がオンにされる初期段階を含む。これにより、表面上にすでに存在するあらゆるアーチファクトを検出することができる基準測定が可能になる。この後、表面プローブを有するスポットにわたってビーズが集中されるＵ字形磁石を使用した短い収集ステップが続く。Ｕ字形磁石を使用したより長い結合ステップが、収集ステップに続き、有り得る不適正塩基対を有する標的を介してビーズが表面に結合するのを可能にしている。短い洗浄ステップが続き、その後、別の収集及び結合ステップが実行される。最後に、５７℃の固定された温度にて、ビーズと表面との結合の強度を評価するためにより長い洗浄ステップが行われる。
【００９０】
ビーズ数における有意差が、１つ又は複数の不適正塩基対を有する各アッセイされた標的と野生型標的との間で得られ、完全に相補的な標的（参照）と、１つの不適正塩基対を有する標的（標的１１及び１２）又は複数の不適正塩基対を有する標的（標的１３）とを区別するのを可能にしている。
【実施例４】
【００９１】
４．表面プローブにおける不適正塩基対に対する、固定された温度にて磁力を変えることによるストリンジェンシーの適用
表面プローブに結合する配列において不適正塩基対の量を増やしたＤＮＡ標的を、４５℃にて固定された作動プロトコルを用いて、ミクロ流体カートリッジにおいて、表面及びビーズプローブを担持するビーズにハイブリダイズさせた。使用される作動プロトコルは、洗浄磁石がオンにされる初期段階を含む。これにより、表面上にすでに存在するあらゆるアーチファクトを検出することができる基準測定が可能になる。この後、表面プローブを有するスポットにわたってビーズが集中されるＵ字形磁石を使用した短い収集ステップが続く。Ｕ字形磁石を使用したより長い結合ステップが、収集ステップに続き、有り得る不適正塩基対を有する標的を介してビーズが表面に結合するのを可能にしている。短い洗浄ステップが続き、その後、別の収集及び結合ステップが実行される。最後に、ビーズと表面との結合の強度を評価するためにより長い洗浄ステップが行われる。洗浄磁石の電圧は、反応温度を５４℃にて固定したまま、それぞれ３０秒間続いて０．２Ｖずつ、０．４から０．６Ｖから０．８Ｖまで上げられる。磁石の周波数及びデューティサイクル等の他の変数はこの期間中変えられない。
【００９２】
測定されたビーズ数は、全ての測定された標的において減少したが、不適正塩基対の数がより多い標的においてより減少し、ハイブリッド配列の中央に不適正塩基対を有する標的においてより減少した（図５）。
【実施例５】
【００９３】
５．ビーズプローブにおける不適正塩基対に対する、固定された磁力にて温度を変えることによるストリンジェンシーの適用
ビーズプローブに結合する配列において不適正塩基対の量を増やしたＤＮＡ標的を、４５℃にて固定された作動プロトコルを用いて、ミクロ流体カートリッジにおいて、表面プローブを介して表面及びビーズにハイブリダイズさせた。次に、結合させたビーズを、温度を上げて０．４Ｖにて洗浄磁石を活性化することによって洗い流した。使用される作動プロトコルは、洗浄磁石がオンにされる初期段階を含む。これにより、表面上にすでに存在するあらゆるアーチファクトを検出することができる基準測定が可能になる。この後、表面プローブを有するスポットにわたってビーズが集中されるＵ字形磁石を使用した短い収集ステップが続く。Ｕ字形磁石を使用したより長い結合ステップが、収集ステップに続き、有り得る不適正塩基対を有する標的を介してビーズが表面に結合するのを可能にしている。短い洗浄ステップが続き、その後、別の収集及び結合ステップが実行される。最後に、ビーズと表面との結合の強度を評価するためにより長い洗浄ステップが行われ、その間に６０℃までそれぞれ３０秒間続いて摂氏１度ずつ温度が上げられる。
【００９４】
ビーズプローブに結合する標的核酸の側への不適正塩基対の導入は、表面プローブに結合する標的核酸の側への不適正塩基対の導入と非常に類似の結果をもたらし、不適正塩基対を標的の両側で検出することができるということを示している（図６）。
【図１】
2019522476.tif 000005
【図２】
2019522476.tif 000006
【図３】
2019522476.tif 000007
【図４】
2019522476.tif 000008
【図５】
2019522476.tif 000009
【図６】
2019522476.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月25日(2018.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸における突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを検出する方法であって、
ａ）ビーズプローブ及び表面プローブを提供するステップであり、各プローブは、前記標的核酸の配列に相補的な配列を有し、任意的に、前記標的核酸の配列と比較して１つ又は複数の塩基の変化を有するオリゴヌクレオチドプローブであり、前記ビーズプローブは磁気ビーズに付着され、さらに、前記表面プローブは固体表面に付着される、ステップと、
ｂ）前記標的核酸を含む試料を提供するステップであり、前記標的核酸は、前記標的核酸の野生型配列と比較して１つ又は複数の突然変異及び／又はバリアントを有し得る、ステップと、
ｃ）前記ビーズプローブ及び表面プローブに前記試料を接触させるステップと、
ｄ）前記標的核酸が前記ビーズプローブ及び表面プローブとハイブリダイズするのを可能にして、サンドイッチ構造を形成し、任意的に、前記表面に付着された結合信号の第１の読み取り情報を得るステップと、
ｅ）磁力及び温度によってハイブリダイゼーション結合に対してストリンジェンシーを適用するステップと、
ｆ）前記表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を決定するステップと、
ｇ）任意的に、ステップｅ）及びｆ）を１回以上繰り返すステップと、
ｈ）前記表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を、前記標的核酸における突然変異、ＳＮＰバリアント又は他のバリアントの存在及び／又は数に相関させるステップと、
を含み、
増加する電圧の磁場及び上昇する温度が同時に又は順次適用され、前記電圧及び前記温度は、互いに独立して制御される、方法。
【請求項２】
前記温度を制御することは、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントを有する前記標的核酸の融解温度を超えて前記試料の温度を上昇させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面に付着されたサンドイッチ構造に残っている結合信号を決定するステップは、前記磁気ビーズの光学的検出を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
いくつかの空間的に分離された表面プローブが、同じ固体表面上に同じストリンジェンシー条件下で存在し、各々が、前記標的核酸の特定のバリアント、又は、突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントが存在し得る前記標的核酸の特定の領域を検出する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記空間的に分離された表面プローブは、前記野生型配列に対する表面プローブ、及び、前記標的核酸の関心のある特定の突然変異又はＳＮＰバリアント又は他のバリアントに対する１つ又は複数の表面プローブを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固体表面はカートリッジである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的核酸は、ステップｄ）に先立ち又はその間に増幅ステップを経る、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸は、薬剤耐性に関与する遺伝子から、任意的に病原体から、任意的にウイルス遺伝子から又は細菌遺伝子から又は真菌遺伝子から得られる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
病原体の異なる株が、前記標的核酸におけるバリアントを検出することによって同定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌遺伝子は、結核菌由来の遺伝子である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸は、がんに関与する哺乳類、好ましくはヒトの遺伝子から得られる、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記電圧及び温度を制御することは、前記標的核酸に強く関連した配列を有する核酸の非特異的結合を減少させる、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
増加する電圧の磁場及び上昇する温度が同時に又は順次適用され、上記の電圧及び温度は、互いに独立して制御される。
【国際調査報告】
2019522476.tif 000011
2019522476.tif 000012
2019522476.tif 000013