(57)【要約】多価抗体構築物、前記構築物を含む医薬組成物、およびその使用方法が提示される。本発明者らは、様々な新規多価抗体構築物を設計した。これらの多価結合分子の構成は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、および四重特異性構築物の抗原結合部位を一緒に形成するコグネートポリペプチド鎖のハイフィデリティ対形成を駆動する。結合分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳系および哺乳類一過性トランスフェクション系を含む従来の抗体発現系を使用して容易に発現され、ＣＨ１親和性樹脂を用いて単一ステップで精製することができる。ハイフィデリティアセンブリ、高レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現、および単一ステップで可能な発現産物精製により、これらの構築物は、可変領域のライブラリのハイスループットスクリーニングに良く適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合分子であって、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成する、結合分子。
【請求項２】
第３および第４のポリペプチド鎖をさらに含み、
（ａ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、
ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合し；
（ｄ）前記第１および前記第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成する、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記Ｂドメインと前記Ｇドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項１または２のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項４】
前記Ｂドメインと前記Ｇドメインのアミノ酸配列が異なり、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ３配列に含み、ここで前記Ｂドメインは前記Ｇドメインと相互作用し、前記Ｂドメインと前記Ｇドメインのどちらも、前記直交型改変を欠くＣＨ３ドメインと顕著に相互作用しない、請求項１または２のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項５】
前記直交型改変が、ドメインＢとＧとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項４に記載の結合分子。
【請求項６】
操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項５に記載の結合分子。
【請求項７】
前記直交型改変がノブ・イン・ホール変異を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項８】
前記ノブ・イン・ホール変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項７に記載の結合分子。
【請求項９】
前記直交型改変が、電荷対変異を含む、請求項４から８のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記電荷対変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、ならびに他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記ドメインＥがＣＨ３アミノ酸配列を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項２から１１のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１３】
前記ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列が異なる、請求項２から１１のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記異なる配列が、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ３配列に含み、ここで前記Ｅドメインは前記Ｋドメインと相互作用し、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインのどちらも、前記直交型改変を欠くＣＨ３ドメインと顕著に相互作用しない、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記直交型改変が、ドメインＥとＫとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項１４に記載の結合分子。
【請求項１６】
操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記ＥドメインとＫドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項１５に記載の結合分子。
【請求項１７】
前記ＥおよびＫドメインにおける前記直交型改変がノブ・イン・ホール変異を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項１８】
前記ノブ・イン・ホール変異が、前記ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項１７に記載の結合分子。
【請求項１９】
前記直交型改変が、電荷対変異を含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２０】
前記電荷対変異が、前記ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、ならびに他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である、請求項１９に記載の結合分子。
【請求項２１】
前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が、前記第１のポリペプチドと前記第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である、請求項１３に記載の結合分子。
【請求項２２】
２つの異なるアミノ酸配列が、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である、請求項２１に記載の結合分子。
【請求項２３】
ドメインＩがＣＬ配列を有し、ドメインＭがＣＨ１配列を有する、請求項２から２２のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２４】
ドメインＨがＶＬ配列を有し、ドメインＬがＶＨ配列を有する、請求項２から２３のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２５】
ドメインＨがＶＬアミノ酸配列を有し；
ドメインＩがＣＬアミノ酸配列を有し；
ドメインＫがＣＨ３アミノ酸配列を有し；
ドメインＬがＶＨアミノ酸配列を有し；
ドメインＭがＣＨ１アミノ酸配列を有する、請求項２から２４のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２６】
前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する、請求項２から２５のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２７】
第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を含む結合分子であって：
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、
ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｅ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合し；
（ｆ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合し；
（ｇ）前記第１および前記第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する、結合分子。
【請求項２８】
前記ドメインＥがＣＨ３アミノ酸配列を有し；
ドメインＨがＶＬアミノ酸配列を有し；
ドメインＩがＣＬアミノ酸配列を有し；
ドメインＫがＣＨ３アミノ酸配列を有し；
ドメインＬがＶＨアミノ酸配列を有し；
ドメインＭがＣＨ１アミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の結合分子。
【請求項２９】
第５のポリペプチド鎖をさらに含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖がドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＮはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＯはＣＨ３アミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記結合分子が、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、第５のポリペプチド鎖が、ドメインＰおよびドメインＱを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、
ドメインＰはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＱはＣＨ３アミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第１および前記第５のポリペプチドは、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用および前記Ｏドメインと前記Ｑドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する、請求項２から２６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項３０】
（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨのアミノ酸配列がドメインＮおよびＡのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列がドメインＯおよびＢのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬのアミノ酸配列がドメインＰおよびＦのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭのアミノ酸配列がドメインＱおよびＧのアミノ酸配列と異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記ドメインＮおよびドメインＰが、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項２９に記載の結合分子。
【請求項３１】
（ａ）ドメインＮ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＯ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＰ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＱ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列が異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記ドメインＮおよびドメインＰが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項２９に記載の結合分子。
【請求項３２】
第６のポリペプチド鎖をさらに含み、
（ａ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＲはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記結合分子が、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、
ドメインＴはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３および前記第６のポリペプチドは、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用および前記Ｓドメインと前記Ｕドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成する、請求項２から２６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項３３】
（ａ）ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨのアミノ酸配列がドメインＲおよびＡのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列がドメインＳおよびＢのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬのアミノ酸配列がドメインＴおよびＦのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭのアミノ酸配列がドメインＵおよびＧのアミノ酸配列と異なり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記ドメインＲおよびドメインＴが、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項３２に記載の結合分子。
【請求項３４】
（ａ）ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＡのアミノ酸配列がドメインＲおよびＨのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＢのアミノ酸配列がドメインＳおよびＩのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＦのアミノ酸配列がドメインＴおよびＬのアミノ酸配列と異なり、
ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＧのアミノ酸配列がドメインＵおよびＭのアミノ酸配列と異なり、
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記ドメインＲおよびドメインＴが、前記第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項３２に記載の結合分子。
【請求項３５】
（ａ）ドメインＲ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＳ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＴ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列が異なり、
ドメインＵ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列が異なり、
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記ドメインＲおよびドメインＴが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、請求項３２に記載の結合分子。
【請求項３６】
第５および第６のポリペプチド鎖をさらに含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖が、ドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置されており；
（ｂ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置されており；
（ｃ）前記結合分子が、第５および第６のポリペプチド鎖をさらに含み：
前記第５ポリペプチド鎖が、ドメインＰおよびドメインＱを含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、
前記第６ポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；
（ｄ）前記第１および前記第５のポリペプチドは、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用および前記Ｏドメインと前記Ｑドメインとの間の相互作用を介して会合し、
前記第３および前記第６のポリペプチドは、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用および前記Ｓドメインと前記Ｕドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成する、請求項２から２６のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項３７】
（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列が同一であり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記ドメインＮおよびドメインＰが、前記第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する、請求項３６に記載の結合分子。
【請求項３８】
（ａ）ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列が同一であり；
（ｂ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、前記ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用が、前記第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用が、前記第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する、請求項３６に記載の結合分子。
【請求項３９】
前記Ａドメインと前記Ｂドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、ＩＫＲＴＰＲＥＰまたはＩＫＲＴＶＲＥＰである、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４０】
前記Ｆドメインと前記Ｇドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、ＳＳＡＳＰＲＥＰである、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４１】
少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、前記ＣＨ３アミノ酸配列とヒンジアミノ酸配列とを連結するＣ末端トリペプチド挿入物を有し、ここで前記トリペプチド挿入物は、ＰＧＫ、ＫＳＣおよびＧＥＣからなる群から選択される、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４２】
前記配列が、ヒト配列である、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４３】
少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、ＩｇＧ配列である、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４４】
前記ＩｇＧ配列がＩｇＧ１配列である、請求項４３に記載の結合分子。
【請求項４５】
少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、１つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４６】
前記イソアロタイプ変異がＤ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍである、請求項４５に記載の結合分子。
【請求項４７】
前記ＣＬアミノ酸配列がＣカッパ配列である、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。
【請求項４８】
上記請求項のいずれかに記載の結合分子と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項４９】
請求項４８に記載の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）の下、同時係属の２０１７年９月７日出願の米国仮特許出願第６２／５５５，４９８号、２０１７年８月２４日出願の米国仮特許出願第６２／５４９，８９４号、２０１６年１０月１９日出願の米国仮特許出願第６２／４１０，０５４号の利益を主張し、その開示は、本明細書にその全体が参照により援用される。
【０００２】
２．配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１７年Ｘ月Ｘ日に作成され、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、大きさはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
抗体は、医療分野における非常に貴重なツールである。特に、科学研究および医療診断における役割を含むモノクローナル抗体の重要性は、数十年にわたって広く認識されてきた。しかし、抗体の全潜在能力、特に治療剤として使用の成功は、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、およびイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）の治療法の成功によって示されるように、つい最近、実証された。これらの臨床での成功に続き、抗体治療への関心は、おそらく増加する一方であろう。したがって、研究薬物開発およびその下流にある臨床現場の両方で、抗体の効率的な生成および作製が当技術分野で必要とされている。
【０００４】
抗体治療分野で活発な研究の領域は、多重特異性抗体、つまり、複数の標的を認識するように操作された単一抗体の設計および使用である。これらの抗体は、治療的制御をより高める将来的見込みを提供する。例えば、多くの抗体治療、特に抗体に基づく免疫治療の場合に付随するオフターゲット効果を低減するために、標的特異性を改善する必要性が存在する。加えて、多重特異性抗体は、特に免疫治療の状況において、複数の細胞受容体の相乗的ターゲティングなどの新たな治療戦略を提供する。
【０００５】
多重特異性抗体の将来的見込みにもかかわらず、それらの製造および使用は、その実用化を制限する数多くの制約に悩まされてきた。一般的に、全ての多重特異性抗体プラットフォームは、コグネートの重鎖と軽鎖の対の間のハイフィデリティ対形成を確保する問題を解決しなければならない。しかしながら、多くの問題が、様々なプラットフォームにわたって存在している。例えば、抗体鎖工学は、アセンブルされた抗体の乏しい安定性、抗体鎖の乏しい発現およびフォールディング、ならびに／または免疫原性ペプチドの生成に至る可能性がある。他のアプローチには、複雑なｉｎ  ｖｉｔｒｏアセンブリ反応または精製方法などの、実用的でない製造プロセスの問題がある。加えて、いくつかのプラットフォームには、異なる抗体結合ドメインに簡単かつ効率的にプラグインすることができないという問題がある。これらの多重特異性抗体製造に関連する様々な問題は、多くのプラットフォームの適用、特に多くの治療薬のパイプラインのために必要なハイスループットスクリーニングにおけるその使用を制限する。
【０００６】
したがって、高レベル発現および効率的な精製が可能な抗体プラットフォームが必要とされている。特に、研究および治療現場の両方で直接適用性がある多重特異性抗体の製造能力を向上させる多重特異性抗体プラットフォームが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
４．概要
本発明者らは、様々な新規多価抗体構築物を設計した。これらの多価結合分子の構成は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、および四重特異性構築物の抗原結合部位を一緒に形成するコグネートポリペプチド鎖のハイフィデリティ対形成を駆動する。結合分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞翻訳系および哺乳類一過性トランスフェクション系を含む従来の抗体発現系を使用して容易に発現され、ＣＨ１親和性樹脂を用いて単一ステップで精製することができる。ハイフィデリティアセンブリ、高レベルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現、および単一ステップで可能な発現産物精製により、これらの構築物は、可変領域のライブラリのハイスループットスクリーニングに良く適している。またこれらの構築物は長期安定性を示すことから、多重特異性治療剤として良く適している。
【０００８】
したがって、第１の態様では、第１および第２のポリペプチド鎖を含む結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する、結合分子である。
【０００９】
ある特定の態様では、結合分子は、第３および第４のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｄ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【００１０】
ある特定の態様では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は同一であり、ここで配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００１１】
ある特定の態様では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は異なり、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型改変を欠くＣＨ３ドメインと顕著に相互作用しない。ある特定の態様では、直交型改変は、ドメインＢとＧとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のドメインにおける３４９Ｃである。ある特定の態様では、直交型改変はノブ・イン・ホール（knob-in-hole）変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。ある特定の態様では、直交型改変は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、ならびに他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
【００１２】
ある特定の態様では、ドメインＥはＣＨ３アミノ酸配列を有する。ある特定の態様では、ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、ここで配列は内在性ＣＨ３配列である。
【００１３】
ある特定の態様では、ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列は異なる。ある特定の態様では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型改変を欠くＣＨ３ドメインと顕著に相互作用しない。ある特定の態様では、直交型改変は、ドメインＥとＫとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。ある特定の態様では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＥドメインとＫドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のドメインにおける３４９Ｃである。ある特定の態様では、ＥドメインとＫドメインにおける直交型改変はノブ・イン・ホール変異を含む。ある特定の態様では、ノブ・イン・ホール変異は、ＥドメインとＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。ある特定の態様では、直交型改変は、電荷対変異を含む。ある特定の態様では、電荷対変異は、ＥドメインまたはＫドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、ならびに他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である。
【００１４】
ある特定の態様では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列が、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。ある特定の態様では、２つの異なるアミノ酸配列は、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である。ある特定の態様では、ドメインＩはＣＬ配列を有し、ドメインＭはＣＨ１配列を有する。
【００１５】
ある特定の態様では、ドメインＨはＶＬ配列を有し、ドメインＬはＶＨ配列を有する。
【００１６】
ある特定の態様では、ドメインＨはＶＬアミノ酸配列を有し；ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し；ドメインＫはＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＬはＶＨアミノ酸配列を有し；ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【００１７】
ある特定の態様では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【００１８】
ある特定の態様では、結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＮはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＯはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、第５のポリペプチド鎖が、ドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＱはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【００１９】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列はドメインＮおよびＡのアミノ酸配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＯおよびＢのアミノ酸配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列はドメインＰおよびＦのアミノ酸配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列はドメインＱおよびＧのアミノ酸配列と異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【００２０】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＯ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＰ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＱ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【００２１】
ある特定の態様では、結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【００２２】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列はドメインＲおよびＡのアミノ酸配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＳおよびＢのアミノ酸配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列はドメインＴおよびＦのアミノ酸配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列はドメインＵおよびＧのアミノ酸配列と異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【００２３】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列はドメインＲおよびＨのアミノ酸配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＳおよびＩのアミノ酸配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列はドメインＴおよびＬのアミノ酸配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列はドメインＵおよびＭのアミノ酸配列と異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【００２４】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＲ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＳ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＴ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＵ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【００２５】
ある特定の態様では、結合分子は、さらに第５および第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はさらにドメインＮおよびドメインＯを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され；（ｂ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され；（ｃ）結合分子はさらに第５および第６ポリペプチド鎖を含み、第５ポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、第６ポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；（ｄ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合し、第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【００２６】
ある特定の態様では、（ａ）ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【００２７】
ある特定の態様では、請求項３６に記載の結合分子であって、ここで：（ａ）ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；（ｂ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【００２８】
ある特定の態様では、ＡドメインとＢドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、ＩＫＲＴＰＲＥＰまたはＩＫＲＴＶＲＥＰである。ある特定の態様では、ＦドメインとＧドメインとの間のジャンクションを形成する配列は、ＳＳＡＳＰＲＥＰである。
【００２９】
ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３アミノ酸配列とヒンジアミノ酸配列とを連結するＣ末端トリペプチド挿入物を有し、ここでトリペプチド挿入物は、ＰＧＫ、ＫＳＣおよびＧＥＣからなる群から選択される。
【００３０】
ある特定の態様では、配列はヒト配列である。ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列はＩｇＧ配列である。ある特定の態様では、ＩｇＧ配列はＩｇＧ１配列である。ある特定の態様では、少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列は、１つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する。ある特定の態様では、イソアロタイプ変異はＤ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍである。ある特定の態様では、ＣＬアミノ酸配列はＣカッパ配列である。
【００３１】
また本明細書において、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を含む結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合し、結合分子を形成する、結合分子が開示される。
【００３２】
ある特定の態様では、ドメインＥはＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＨはＶＬアミノ酸配列を有し；ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＫはＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＬはＶＨアミノ酸配列を有し；ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【００３３】
また本明細書において、本明細書に開示されたまたは記載されたいずれかの結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が開示される。
【００３４】
また本明細書において、本明細書に開示されたまたは記載されたいずれかの結合分子と、本明細書に開示されたまたは記載されたいずれかの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与することを含む、処置方法が開示される。
５．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＣＨ１−ＣＬと対になったＣＨ３−ＣＨ３  ＩｇＧ１二量体対のアラインメントを示す。四次構造は、約１．６Å２のＲＭＳＤで整列している。
【００３６】
【図２】図２は、本明細書に記載の様々な結合分子（抗体構築物とも称される）について、それぞれの命名規則と共に、構成の概略図を示す。
【００３７】
【図３】図３は、本明細書に記載の二価１×１抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインのより高解像度の概略図を示す。
【００３８】
【図４】図４は、例示的な二価の単一特異性構築物の構成を示す。
【００３９】
【図５】図５は、実施例１に記載のバイオレイヤー干渉（biolayer  interferometry、ＢＬＩ）実験からのデータを示し、ここでは、図４に示した構成を有する二価の単一特異性結合分子［ポリペプチド１：ＶＬ−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３／ポリペプチド２：ＶＨ−ＣＨ３（ホール）］がアッセイされた。抗原結合部位は、ＴＮＦαに対して特異的であった。結合分子固定化および固定化された構築物へのＴＮＦα結合からのＢＬＩ応答は、抗原への頑強で特異的な二価結合を示す。データは、分子が、ポリペプチド１とポリペプチド２との意図された対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。
【００４０】
【図６】図６は、例示的な二価の１×１二重特異性結合分子「ＢＣ１」の特徴を示す。
【００４１】
【図７】図７Ａは、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂）により、ゲル濾過を介して、＞９８％が非凝集二価タンパク質である単一の単分散ピークが得られることを実証する、「ＢＣ１」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示す。図７Ｂは、ＣｒｏｓｓＭａｂ二価抗体構築物のＳＥＣ解析の比較文献データ［Schaeferら、（Proc  Natl  Acad  Sci  USA.、２０１１年７月５日；１０８巻（２７号）：１１１８７〜９２頁）からのデータ］を示す。
【００４２】
【図８】図８Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図８Ｂは、標準プロテインＡ精製を使用して精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィの溶出プロファイルである。
【００４３】
【図９】図９は、様々な精製段階での「ＢＣ１」の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００４４】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのＣＨ１−親和性精製後の「ＢＣ１」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ａ）を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ｂ）と比較した図である。
【００４５】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、還元条件下の２つの別個の重鎖（図１１Ａ）、および２つの別個の軽鎖（図１１Ｂ）を実証する「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。
【００４６】
【図１２】図１２は、精製後の不完全な対形成の非存在を確認する、非還元条件下で精製された「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。
【００４７】
【図１３】図１３は、２つのＩｇＧ対照抗体と比較した、「ＢＣ１」の４０℃で８週間にわたる安定性を実証する、加速安定性試験データを示す。
【００４８】
【図１４】図１４は、実施例３でさらに説明されている、例示的な二価１×１二重特異性結合分子「ＢＣ６」の特徴を示す。
【００４９】
【図１５】図１５Ａは、単一ステップのＣＨ１親和性精製によって単一の単分散ピークが得られることと非共有結合凝集体が存在しないことを実証する、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ６」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示す。図１５Ｂは、非還元条件下での「ＢＣ６」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００５０】
【図１６】図１６は、実施例４でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「ＢＣ２８」の特徴を示す。
【００５１】
【図１７】図１７は、「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ３１」および「ＢＣ３２」の単一ステップのＣＨ１親和性精製後の非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【００５２】
【図１８】図１８は、それぞれ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ２８」および「ＢＣ３０」のＳＥＣ解析を示す。
【００５３】
【図１９】図１９は、実施例５でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「ＢＣ４４」の特徴を示す。
【００５４】
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ加速安定性試験条件下での、２つの二価結合分子「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」のサイズ排除クロマトグラフィデータを示す。「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」は、異なる可変領域−ＣＨ３ジャンクションを有する。
【００５５】
【図２１】図２１は、本明細書に記載の三価の２×１抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。
【００５６】
【図２２】図２２は、実施例７でさらに説明されている、例示的な三価２×１二重特異性結合分子「ＢＣ１−２×１」の特徴を示す。
【００５７】
【図２３】図２３は、様々な精製段階で、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して発現された「ＢＣ１」および「ＢＣ１−２×１」タンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【００５８】
【図２４】図２４は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を使用して、二価１×１構築物「ＢＣ１」のアビディティを、三価２×１構築物「ＢＣ１−２×１」のアビディティと比較したものである。
【００５９】
【図２５】図２５は、三価２×１構築物「ＴＢ１１１」の顕著な特徴を示す。
【００６０】
【図２６】図２６は、本明細書に記載の三価１×２抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。
【００６１】
【図２７】図２７は、実施例１０にさらに説明されている、例示的な三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の特徴を示す。
【００６２】
【図２８】図２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ここで非還元（「−ＤＴＴ」）および還元（「＋ＤＴＴ」）条件下の三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」構築物を示すレーンを枠で囲っている。
【００６３】
【図２９】図２９は、２つの抗体：二価１×１構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」および三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の間の抗原結合の比較を示す。「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」は、ＣＴＬＡ４に一価的に結合する一方、「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」は、ＣＴＬＡ４に二価的に結合する。
【００６４】
【図３０】図３０は、実施例１１にさらに説明されている、例示的な三価１×２三重特異性構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」の特徴を示す。
【００６５】
【図３１】図３１は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現および単一ステップのＣＨ１親和性樹脂精製後の「ＢＣ２８−１×１×１ａ」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
【００６６】
【図３２】図３２は、実施例１２でさらに説明されるように、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００６７】
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、３つの抗原：ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４へのＯｃｔｅｔ結合分析を示す。実施例１３でさらに説明されるように、図３３Ａは、「ＢＣ１」の、ＰＤ１および抗原「Ａ」への結合を示し；図３３Ｂは、二価二重特異性構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」の、ＣＴＬＡ４、抗原「Ａ」およびＰＤ１への結合を示し；図３３Ｃは、三価三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」の、ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４への結合を示す。
【００６８】
【図３４】図３４は、本明細書に記載の特定の四価２×２構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。
【００６９】
【図３５】図３５は、実施例１４にさらに説明されている、例示的な四価２×２構築物「ＢＣ２２−２×２」の特定の顕著な特徴を示す。
【００７０】
【図３６】図３６は、様々な精製段階で、２×２四価「ＢＣ２２−２×２」構築物を、１×２三価構築物「ＢＣ１２−１×２」および２×１三価構築物「ＢＣ２１−２×１」と比較する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【００７１】
【図３７】図３７は、例示的な四価２×２構築物の構成を示す。
【００７２】
【図３８】図３８は、本明細書に記載の特定の四価構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。
【００７３】
【図３９】図３９は、二重特異性四価構築物の例示的な構成を示す。
【００７４】
【図４０】図４０は、共通軽鎖ストラテジーを利用した三重特異性四価構築物についての例示的な構成を示す。
【００７５】
【図４１】図４１は、図３９に概略化された四価構築物による二重特異性抗原係合を示し、この構築物が同時係合できたことを実証する。Ｂ−Ｂｏｄｙ固定化および固定化された構築物へのＴＮＦα結合からのバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）応答は、分子が、意図された鎖の対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。
【００７６】
【図４２】図４２は、Ｂ−Ｂｏｄｙの細胞表面抗原への結合のフローサイトメトリー解析を示す。網掛けで示すシグナルは、抗原なしの細胞を示し；ドットで示すシグナルは、表面抗原で一過性にトランスフェクトされた細胞を示す。
【００７７】
【図４３】図４３は、三価構築物の例示的な構成を示す。
【００７８】
【図４４】図４４は、三価構築物の例示的な構成を示す。
【００７９】
【図４５】図４５は、実施例１７でさらに説明されているように、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【００８０】
【図４６】図４６は、ジャンクションバリアントの対形成安定性を評価するために測定された「ＢＣ２４ｊｖ」、「ＢＣ２６ｊｖ」および「ＢＣ２８ｊｖ」の熱転移の差異を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
図面は、例示の目的のためのみに、本発明の様々な実施形態を示している。当業者は、本明細書に例示された構造および方法の代替的実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく利用しうることを以下の説明から容易に認識する。
６．詳細な説明
６．１．定義
【００８２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、下記で与えられる意味を有する。
【００８３】
「抗原結合部位」は、所与の抗原またはエピトープを特異的に認識するまたはそれに特異的に結合する結合分子の領域を意味する。
【００８４】
「Ｂ−Ｂｏｄｙ」は、本明細書に記載される結合分子構築物のいずれかを意味する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指し、ここで目的は、多発性硬化症、関節炎またはがんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益または望ましい臨床結果としては、検出可能であろうとまたは検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の範囲の縮減、疾患の安定した（つまり、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患の状態の回復または緩和、および寛解（部分的寛解または完全寛解）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長も意味しうる。処置を必要とする対象には、すでに状態もしくは障害に罹患している対象、ならびに状態もしくは障害を有する傾向にある対象、または状態もしくは障害を予防すべき状態にある対象が含まれる。
【００８６】
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予防または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家庭用動物、農業用動物、ならびに動物園、スポーツまたはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などが含まれる。
【００８７】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するために十分な量を意味する。
【００８８】
「治療有効量」は、疾患の症状を改善するために有効な量である。予防が治療と考えることができるように、治療有効量は「予防有効量」であることができる。
６．２．その他の解釈上の規則
【００８９】
別途指定しない限り、本明細書における配列に対する全ての参照は、アミノ酸配列に対するものである。
【００９０】
別途指定しない限り、抗体定常領域残基ナンバリングは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるwww.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs（２０１７年８月２２日にアクセス）およびEdelmanら、Proc.  Natl.  Acad.  USA、６３巻：７８〜８５頁（１９６９年）に記載のＥｕインデックスに従い、本明細書に記載される結合分子の鎖内の残基の物理的な位置にかかわらず、内在性定常領域配列におけるその位置にしたがって残基を識別する。「内在性配列」または「天然配列」は、生物、組織、または細胞に由来し、人工的に改変または変異されていない、核酸およびアミノ酸配列の両方を含む任意の配列を意味する。
【００９１】
この開示において、「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、「含有すること（containing）」、「有すること（having）」、「含む（includes）」、「含むこと（including）」およびその言語的変化形は、米国特許法でそれらが帰する意味を有し、明示的に列挙されている成分以外のさらなる成分の存在を許容する。
【００９２】
本明細書で提供される範囲は、列挙される端点を含む範囲内の全ての値についての省略表現と理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。
【００９３】
特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「または」という用語は、包括的であると理解される。特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、単数または複数であると理解される。
【００９４】
特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野で通常許容される範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。約は、示された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内と理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾されている。
６．３．結合分子
【００９５】
第１の態様では、結合分子が提供される。
【００９６】
図３を参照して、第１の一連の実施形態では、結合分子は、第１および第２のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【００９７】
また図３を参照して、第２の一連の実施形態では、結合分子はさらに、第３および第４のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｄ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【００９８】
様々な実施形態において、第１と第３のポリペプチド鎖は、配列が互いに同一であり、第２と第４のポリペプチドは、配列が互いに同一である。これらの実施形態では、ドメインＥとドメインＫとの間の相互作用を介した第１と第３のポリペプチド鎖の会合（下記セクション６．３．１５を参照）が、下記実施例１に例示される構築物などの二価の単一特異性抗体構築物を形成する。
【００９９】
他の実施形態では、第１と第３のポリペプチド鎖は配列が互いに同一でなく、第２と第４のポリペプチドは配列が互いに同一でない。これらの実施形態では、ドメインＥとドメインＫとの間の相互作用を介した第１と第３のポリペプチド鎖の会合（下記セクション６．３．１５を参照）が、二価の二重特異性抗体構築物を形成することができる。
６．３．１．ドメインＡ（ＶＬ）
【０１００】
本明細書に記載される結合分子において、ドメインＡは、ＶＬアミノ酸配列を有する。本明細書に記載の結合分子において有用なＶＬアミノ酸配列は、抗体軽鎖可変ドメイン配列である。本明細書に記載の天然抗体および抗体構築物の両方における典型的な配列では、特異的ＶＬアミノ酸配列が、特異的ＶＨアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、下記セクション６．３．１．１および６．３．１．２においてさらに詳細に記載されているように、ヒト配列、合成配列、または、ヒト配列、非ヒト哺乳動物配列、哺乳動物配列および／もしくは合成配列の組合せを含む、哺乳動物配列である。
【０１０１】
様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。ある特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖可変ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。
【０１０２】
本明細書に記載の結合分子では、ドメインＡのＣ末端は、ドメインＢのＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＡは、下記セクション６．３．１９．１および実施例６においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＡとドメインＢとの間のジャンクションにおいてそのＣ末端で変異しているＶＬアミノ酸配列を有する。
６．３．１．１．相補性決定領域
【０１０３】
ＶＬアミノ酸配列は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される高度に可変性の配列、典型的に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＤＲは、ヒト配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、特定の抗原またはエピトープに対して抗原結合部位の結合親和性を変化させるように変異された天然に存在する配列である。ある特定の実施形態では、天然に存在するＣＤＲは、親和性成熟および体細胞超変異を介してｉｎ  ｖｉｖｏ宿主で変異されている。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、ＰＣＲ突然変異誘発および化学的突然変異誘発を含むがこれらに限定されない方法を介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで変異されている。様々な実施形態では、ＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない、合成配列である。
６．３．１．２．フレームワーク領域およびＣＤＲグラフト化
【０１０４】
ＶＬアミノ酸配列は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）配列を含む。ＦＲは、一般的に、散在されたＣＤＲの足場として作用する保存配列領域（セクション６．３．１．１．参照）であり、典型的には、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４配置（Ｎ末端からＣ末端へ）である。様々な実施形態では、ＦＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＦＲは、ヒト配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、合理的に設計された配列を含むがそれに限定されない、合成配列である。
【０１０５】
様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは両方が、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来し、ここでＣＤＲはＦＲ足場にグラフト化され、ＣＤＲが特定の抗原に対する特異性を提供している。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは全て、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない、合成配列である。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲおよびＦＲは、同じ種に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲおよびＦＲは、異なる種に由来する。好ましいグラフト化されたＣＤＲ実施形態では、抗体は「ヒト化」されており、ここで、グラフト化されたＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバおよびヤギ配列を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物配列であり、ＦＲはヒト配列である。ヒト化抗体は、教示する全てについてその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０７，２１３号においてより詳細に議論されている。様々な実施形態では、ある種に由来するＦＲの部分または特定の配列は、別の種のＦＲの部分または特定の配列を置き換えるために使用される。
６．３．２．ドメインＢ（ＣＨ３）
【０１０６】
結合分子では、ドメインＢは、ＣＨ３アミノ酸配列である。ＣＨ３アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、抗体重鎖のＣ末端ドメインの配列である。
【０１０７】
様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプに由来し、またはＩｇＥもしくはＩｇＭアイソタイプ由来のＣＨ４配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸２２４−３３０である。様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、内在性ＣＨ３配列のセグメントである。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｃ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９およびＫ３３０を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５ならびにＣ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９およびＫ３３０を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。好ましい実施形態では、結合分子は、ＣＨ３配列を有する複数のドメインを有し、ここで、ＣＨ３配列は、全長内在性ＣＨ３配列、ならびにＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、またはその両方を欠くＣＨ３配列の両方を指すことができる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、１つまたは複数の変異を有する内在性配列である。特定の実施形態では、変異は、下記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてさらに詳細に記載されているように、内在性ＣＨ３配列に導入されて特定のＣＨ３配列の特定の対形成をガイドする、１つまたは複数の直交型変異である。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるSticklerら（Genes  Immun.、２０１１年４月；１２巻（３号）：２１３〜２２１頁）においてより詳細に記載されているように、ＣＨ３配列は、本明細書でイソアロタイプ変異と称される、あるアロタイプの特定のアミノ酸を別のアロタイプのアミノ酸に置き換えることによって、抗体の免疫原性を低減するように操作されている。特定の実施形態では、Ｇ１ｍ１アロタイプの特定のアミノ酸が置き換えられている。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列において、イソアロタイプ変異Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍがなされている。
【０１１１】
好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；およびトリペプチド挿入物４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化：Ｔ３６６Ｋ；およびトリペプチド挿入物４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。さらなる他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化：Ｙ３４９Ｃおよびトリペプチド挿入物４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、ドメインＢは、それらと異なって、内在性ＣＨ３配列に組み込まれた４４７Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。
【０１１３】
本明細書に記載される結合分子では、ドメインＢのＮ末端が、ドメインＡのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．１９．１および実施例６においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＡとドメインＢとの間のジャンクションにおいてそのＮ末端で変異しているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０１１４】
結合分子では、ドメインＢのＣ末端は、ドメインＤのＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．１９．３においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＢとドメインＤとの間のジャンクションにＣ末端で伸長されているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
６．３．３．ドメインＤ（ＣＨ２）
【０１１５】
本明細書に記載される結合分子では、ドメインＤは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ＣＨ２アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、Ｎ末端からＣ末端へ参照して天然抗体重鎖の第３のドメインのＣＨ２アミノ酸配列である。様々な実施形態では、ＣＨ２配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１１１−２２３である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、下記セクション６．３．１９．３においてより詳細が議論されているように、Ｎ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントを、ＣＨ２ドメインへ連結するＮ末端ヒンジ領域ペプチドを有する。
【０１１７】
結合分子では、ドメインＤのＮ末端が、ドメインＢのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．１９．３においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＤとドメインＢとの間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長されているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０１１８】
結合分子では、ドメインＤのＣ末端が、ドメインＥのＮ末端に連結されている。特定の実施形態では、ドメインＤは、下記セクション６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ１アミノ酸配列またはＣＬアミノ酸配列を有するドメインＥのＮ末端に連結されている。
６．３．４．ドメインＥ（定常領域）
【０１１９】
結合分子では、ドメインＥは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。本明細書に記載される場合、定常領域ドメインアミノ酸配列は、抗体の定常領域ドメインの配列である。
【０１２０】
様々な実施形態では、定常領域配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、定常領域配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体軽鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ラムダまたはカッパ軽鎖由来である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体重鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプである抗体重鎖配列である。好ましい実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、上記セクション６．３．２においてさらに詳細に記載されている。
【０１２１】
特定の実施形態では、定常領域配列は、１つまたは複数の直交型変異を含むように変異されている。好ましい実施形態では、ドメインＥは、下記セクション６．３．１４．２においてより詳細に記載されているように、ノブ−ホール（同義的に「ノブ・イン・ホール」、「ＫＩＨ」）直交型変異、ならびに下記セクション６．３．１４．１においてより詳細に記載されているように、直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ノブ−ホール直交型変異は、Ｔ３６６Ｗ変異である。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、ＣＨ１配列である。ＣＨ１配列は、下記セクション６．３．４．１においてさらに詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、下記で６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されている。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＬ配列である。ＣＬ配列は、下記セクション６．３．４．２においてさらに詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、下記で６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されている。
６．３．４．１．ＣＨ１ドメイン
【０１２４】
ＣＨ１アミノ酸配列は、本明細書に記載される場合、Ｎ末端からＣ末端へ参照して抗体重鎖の第２のドメインの配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、ＣＨ１配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１−９８である。
６．３．４．２．ＣＬドメイン
【０１２５】
本明細書に記載される結合分子において有用なＣＬアミノ酸配列は、抗体軽鎖定常ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、ＣＬ配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、ＣＬ配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＬ配列は、ヒト配列である。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖定常ドメイン配列である。特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ラムダ（λ）軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＧ０４である。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトカッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、カッパ軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４である。
６．３．５．ドメインＦ（ＶＨ）
【０１２８】
結合分子では、ドメインＦは、ＶＨアミノ酸配列を有する。本明細書に記載の結合分子におけるＶＨアミノ酸配列は、抗体重鎖可変ドメイン配列である。本明細書に記載の天然および結合分子の両方における典型的な抗体配置では、特定のＶＨアミノ酸配列が、特定のＶＬアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、上記セクション６．３．１．１および６．３．１．２においてさらに詳細に記載されているように、ヒト配列、合成配列、または、非ヒト哺乳動物配列、哺乳動物配列および／もしくは合成配列の組合せを含む、哺乳動物配列である。様々な実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。
６．３．６．ドメインＧ（ＣＨ３）
【０１２９】
結合分子では、ドメインＧは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。ＣＨ３配列は、上記セクション６．３．２においてさらに詳細に記載されている。
【０１３０】
ある特定の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変異変化：Ｓ３５４Ｃ；およびトリペプチド挿入物４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変異変化：Ｓ３５４Ｃ；および４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋトリペプチド挿入物を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変化：Ｌ３５１Ｄ；および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入物を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を有する。
６．３．７．ドメインＨ（可変領域）
【０１３１】
結合分子では、ドメインＨは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。可変領域ドメインアミノ酸配列は、本明細書に記載される場合、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれ上記セクション６．３．１および６．３．５においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．８．ドメインＩ（定常領域）
【０１３２】
本明細書に記載される結合分子では、ドメインＩは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．４においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＩは、セクション６．３．４．２においてより詳細に議論されているように、カッパ軽鎖由来のＣＬである定常領域配列を有する。
６．３．９．ドメインＪ（ＣＨ２）
【０１３３】
結合分子では、ドメインＪは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ＣＨ２アミノ酸配列は、上記セクション６．３．３でさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、下記セクション６．３．１９．４においてより詳細に記載されているように、ドメインＪをドメインＩへ連結するＮ末端ヒンジ領域を有する。
【０１３４】
結合分子では、ドメインＪのＣ末端は、ドメインＫのＮ末端に連結されている。特定の実施形態では、ドメインＪは、下記セクション６．３．１９．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ１アミノ酸配列またはＣＬアミノ酸配列を有するドメインＫのＮ末端に連結されている。
６．３．１０．ドメインＫ（定常領域）
【０１３５】
結合分子では、ドメインＫは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．４においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＫは、下記セクション６．３．１４．２でさらに詳細に記載されているノブ−ホール直交型変異；上記６．３．２においてより詳細に記載されているイソアロタイプ変異；ならびに下記セクション６．３．１４．１においてより詳細に記載されている直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、イソアロタイプ変異と組み合わされたノブ−ホール直交型変異は、以下の変異変化：Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖである。
６．３．１１．ドメインＬ（可変領域）
【０１３６】
結合分子では、ドメインＬは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。可変領域ドメインアミノ酸配列は、本明細書に記載される場合、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれ上記セクション６．３．１および６．３．５においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＬは、ＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．１２．ドメインＭ（定常領域）
【０１３７】
結合分子では、ドメインＭは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．４においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＭは、セクション６．３．４．１においてより詳細に議論されているように、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１である定常領域配列を有する。
６．３．１３．ドメインＡおよびＦの対形成
【０１３８】
結合分子では、ドメインＡ  ＶＬアミノ酸配列およびドメインＦ  ＶＨアミノ酸配列は会合して、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ａ：Ｆ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＡＢＳによる抗原結合は、下記セクション６．３．１３．１においてさらに詳細に記載されている。
【０１３９】
様々な多価の実施形態では、ドメインＡおよびＦ（Ａ：Ｆ）によって形成されるＡＢＳは、結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳと配列が同一であり、したがって、結合分子内の１つまたは複数の他の配列同一ＡＢＳと同じ認識特異性を有する。
【０１４０】
様々な多価の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳと配列が非同一である。ある特定の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、結合分子における１つまたは複数の他の配列非同一ＡＢＳと異なる認識特異性を有する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、結合分子における少なくとも１つの他の配列非同一ＡＢＳによって認識される抗原と異なる抗原を認識する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ  ＡＢＳは、結合分子における少なくとも１つの他の配列非同一ＡＢＳによっても認識される抗原の、異なるエピトープを認識する。この実施形態では、ドメインＡおよびＦによって形成されるＡＢＳは、抗原のエピトープを認識し、ここで、結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳは、同じ抗原を認識するが、同じエピトープは認識しない。
６．３．１３．１．ＡＢＳによる抗原の結合
【０１４１】
ＡＢＳおよびそのようなＡＢＳを含む結合分子は、ＡＢＳが特異的に結合するエピトープ（またはより全体的には抗原）を「認識する」と言われ、エピトープ（またはより全体的には抗原）は、ＡＢＳの「認識特異性」または「結合特異性」と言われる。
【０１４２】
ＡＢＳは、特定の親和性で、その特定の抗原またはエピトープに結合すると言われる。
【０１４３】
本明細書で記載される場合、「親和性」は、１個の分子と別の分子との間の非共有結合性分子間力相互作用の強度を指す。親和性、つまり相互作用の強度は、解離平衡定数（ＫＤ）として表すことができ、ここでＫＤ値は低いほど、分子間の相互作用が強力であることを示す。抗体構築物のＫＤ値は、当技術分野で周知の方法によって測定することができ、例えば、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））、および細胞結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の目的のために、親和性は、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）を使用してバイオレイヤー干渉法によって測定された解離平衡定数である。
【０１４４】
「特異的結合」は、本明細書で使用される場合、ＡＢＳとそのコグネート抗原またはエピトープとの間の親和性を指し、ここでＫＤ値は、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満である。
【０１４５】
本明細書に記載される結合分子におけるＡＢＳの数は、結合分子の「価」を定義する。図２に概略化されるように、単一のＡＢＳを有する結合分子は「一価」である。複数のＡＢＳを有する結合分子は、「多価」であると言われる。２つのＡＢＳを有する多価結合分子は「二価」である。３つのＡＢＳを有する多価結合分子は「三価」である。４つのＡＢＳを有する多価結合分子は「四価」である。
【０１４６】
様々な多価の実施形態では、複数のＡＢＳは全て同じ認識特異性を有する。図２に概略化されているように、そのような結合分子は、「単一特異性」「多価」結合構築物である。他の多価の実施形態では、複数のＡＢＳの少なくとも２つが、異なる認識特異性を有する。そのような結合分子は、多価および「多重特異性」である。ＡＢＳが集約的に２つの認識特異性を有する多価の実施形態では、結合分子は二重特異性である。ＡＢＳが集約的に３つの認識特異性を有する多価の実施形態では、結合分子は三重特異性である。
【０１４７】
ＡＢＳが、集約的に、同じ抗原に存在する異なるエピトープに対して複数の認識特異性を有する多価の実施形態では、結合分子は、「多重パラトピック（multiparatopic）」である。ＡＢＳが、集約的に、同じ抗原の２つのエピトープを認識する多価の実施形態では、結合分子は、「二重パラトピック（biparatopic）」である。
【０１４８】
様々な多価の実施形態では、結合分子の多価性は、特定の標的に対する結合分子のアビディティを向上させる。本明細書で記載される場合、「アビディティ」は、２つまたはそれより多くの分子、例えば特定の標的に対する多価結合分子間の全体的な相互作用の強度を指し、ここで、アビディティは、複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。アビディティは、上記で説明されているような、親和性を決定するために使用される方法と同じ方法によって測定することができる。ある特定の実施形態では、特定の標的に対する結合分子のアビディティは、相互作用が特異的結合相互作用であり、ここで２つの分子間のアビディティは、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満のＫＤ値を有する。ある特定の実施形態では、特定の標的に対する結合分子のアビディティが、相互作用が特異的結合相互作用であるＫＤ値であり、ここで個々のＡＢＳの１つまたは複数の親和性は、それらの各抗原またはエピトープ自体への特異的結合として十分なＫＤ値を有していない。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の特定の標的または複合体の別個の抗原、例えば個々の細胞で見出される別個の抗原に対する複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の個々の抗原の別個のエピトープに対する複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。
６．３．１４．ドメインＢおよびＧの対形成
【０１４９】
本明細書に記載の結合分子では、ドメインＢのＣＨ３アミノ酸配列とドメインＧのＣＨ３アミノ酸配列とが会合している。ＣＨ３配列は、上記セクション６．３．２においてさらに詳細に記載されている。
【０１５０】
様々な実施形態では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は、同一である。これらの実施形態のいくつかでは、配列は、内在性ＣＨ３配列である。
【０１５１】
様々な実施形態では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は異なっており、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型改変を欠くＣＨ３ドメインと顕著に相互作用しない。
【０１５２】
本明細書に記載される「直交型改変」または同義的に「直交型変異」は、直交型改変を有する第１のドメインの、相補的な直交型改変を有する第２のドメインに対する結合の親和性を増加させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異である。ある特定の実施形態では、直交型改変は、直交型改変を有するドメインの、相補的な直交型改変を欠くドメインに対する親和性を減少させる。ある特定の実施形態では、直交型改変は、内在性抗体ドメイン配列における変異である。様々な実施形態では、直交型改変は、アミノ酸の付加または欠失を含むがこれらに限定されない、内在性抗体ドメイン配列のＮ末端またはＣ末端の改変である。特定の実施形態では、直交型改変には、下記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてさらに詳細に記載されている操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型改変には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異から選択される直交型改変の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型改変は、上記セクション６．３．２においてさらに詳細に記載されているイソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
６．３．１４．１．直交型操作されたジスルフィド架橋
【０１５３】
様々な実施形態では、直交型改変は、第１のドメインと第２のドメインとの間の操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。本明細書に記載される場合、「操作されたジスルフィド架橋」は、２つまたはそれより多いドメインが会合するとき非天然ジスルフィド結合を形成するように、２つまたはそれより多いドメインに非内在性システインアミノ酸を提供する変異である。操作されたジスルフィド架橋は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMerchantら（Nature  Biotech（１９９８年）１６巻：６７７〜６８１頁）においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの一方におけるＫ３９２Ｃ変異、ならびに他方のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｃである。好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃである。別の好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣＨ３ドメインのＣ末端の伸長によって提供される第１および第２のＣＨ３ドメインの両方における４４７Ｃ変異である。
６．３．１４．２．直交型ノブ−ホール変異
【０１５４】
様々な実施形態では、直交型改変は、ノブ−ホール（同義的にノブ・イン・ホール）変異を含む。本明細書で記載される場合、ノブ−ホール変異は、第１のドメインが、相補的立体変異のないドメインとの会合と比較して、相補的立体変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、第１のドメインの表面の立体的特徴を変化させる変異である。ノブ−ホール変異は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号および米国特許第８，２１６，８０５号において、より詳細に記載されている。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるMerchantら（Nature  Biotech（１９９８年）１６巻：６７７〜６８１頁））においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋と組み合わされる。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異が組み合わされる。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ４０７Ｔ変異である。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＦ４０５Ａ、ならびに第２のドメインにおけるＴ３９４Ｗである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異およびＦ４０５Ａであり、第２のドメインにおけるＴ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ４０７Ａである。ある特定の実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異および操作されたジスルフィド変異は、第１のドメインにおけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。好ましい実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異は、第１のドメインにおけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
６．３．１４．３．直交型電荷対変異
【０１５６】
様々な実施形態では、直交型改変は、電荷対変異である。本明細書で使用される場合、電荷対変異は、ドメインが、相補的電荷対変異の無いドメインとの会合と比較して、相補的電荷対変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、ドメインの表面のアミノ酸の電荷に影響を与える変異である。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。電荷対変異は、それぞれ教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５９２，５６２号、米国特許第９，２４８，１８２号、および米国特許第９，３５８，２８６号においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の安定性を改善させる。好ましい実施形態では、電荷対変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｋ変異、および他のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
６．３．１５．ドメインＥおよびＫの対形成
【０１５７】
様々な実施形態では、Ｅドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０１５８】
様々な実施形態では、Ｋドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０１５９】
様々な実施形態では、ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は、内在性ＣＨ３配列である。
【０１６０】
様々な実施形態では、ＥドメインとＫドメインの配列は異なる。様々な実施形態では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型改変を欠くＣＨ３ドメインと顕著に相互作用しない。ある特定の実施形態では、直交型改変には、上記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型改変には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異、および電荷対変異から選択される直交型改変の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型改変は、イソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
【０１６１】
様々な実施形態では、ＥドメインおよびＫドメインのアミノ酸配列は、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である。様々な実施形態では、２つの異なるアミノ酸配列は、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である。ＣＨ１配列およびＣＬ配列は、それぞれ上記セクション６．３．４．１および６．３．４．２においてさらに詳細に記載されている。特定の重鎖の会合を促進するために重鎖のＣ末端にＣＨ１およびＣＬ配列を使用することが、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４２，２４７号に記載されている。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は両方とも内在性配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は、それぞれ別個に直交型改変を内在性ＣＨ１配列およびＣＬ配列に含む。特定の実施形態では、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，０５３，５６２号および米国特許第９，５２７，９２７号においてナンバリングされ、より詳細が議論されているように、内在性ＣＨ１およびＣＬ配列における直交型改変は、ＣＨ１配列における１３８位およびＣＬ配列における１１６位、ＣＨ１配列における１２８位およびＣＬ配列における１１９位、またはＣＨ１配列における１２９位およびＣＬ配列における２１０位の操作されたシステインから選択される、操作されたジスルフィド架橋である。好ましい実施形態では、操作されたシステインは、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＨ１配列における１２８位およびＣＬカッパ配列における１１８位である。
６．３．１６．ドメインＩおよびＭの対形成およびドメインＨおよびＬの対形成
【０１６２】
様々な実施形態では、ドメインＩは、ＣＬ配列を有し、ドメインＭは、ＣＨ１配列を有する。様々な実施形態では、ドメインＨは、ＶＬ配列を有し、ドメインＬは、ＶＨ配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し、およびドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有し、ドメインＫは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。
【０１６３】
様々な実施形態では、ＩドメインおよびＭドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型改変を内在性配列に含み、ここでＩドメインはＭドメインと相互作用し、ＩドメインとＭドメインのどちらも、直交型改変を欠くドメインと顕著に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｉドメインにおける直交型変異はＣＬ配列にあり、Ｍドメインにおける直交型変異はＣＨ１配列にある。直交型変異は、上記セクション６．３．１４．１−６．３．１４．３においてより詳細に記載されている。様々な実施形態では、ＣＬ配列およびＣＨ１配列における直交型変異は、電荷対変異である。特定の実施形態では、電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるBonischら（Protein  Engineering、Design  &  Selection、２０１７年、１〜１２頁）においてさらに詳細に記載されているように、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＬ配列におけるＦ１１８Ｓ、Ｆ１１８ＡまたはＦ１１８Ｖ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ、またはＣＬ配列におけるＴ１２９Ｒ変異と対応するＣＨ１配列におけるＫ１４７Ｄである。一連の好ましい実施形態では、電荷対変異は、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異と対応するＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｄ、またはＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異と対応するＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｋである。
【０１６４】
様々な実施形態では、ＣＬ配列およびＣＨ１配列における直交型変異は、操作されたジスルフィド架橋を生成する。一連の好ましい実施形態では、非内在性システインアミノ酸を提供する変異は、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｃ、またはＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ、またはＣＬ配列におけるＳ１６２Ｃ変異と対応するＣＨ１配列におけるＰ１７１Ｃ変異である。
【０１６５】
様々な実施形態では、ＨドメインおよびＬドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型改変を内在性配列に含み、ここでＨドメインはＬドメインと相互作用し、ＨドメインとＬドメインのどちらも、直交型改変を欠くドメインと顕著に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｈドメインにおける直交型変異はＶＬ配列にあり、Ｌドメインにおける直交型変異はＶＨ配列にある。特定の実施形態では、直交型変異は、ＶＨ／ＶＬ境界での電荷対変異である。好ましい実施形態では、ＶＨ／ＶＬ境界での電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるIgawaら（Protein  Eng.  Des.  Sel.、２０１０年、２３巻、６６７〜６７７頁）においてより詳細に記載されているように、ＶＨにおけるＱ３９Ｅと対応するＶＬにおけるＱ３８Ｋ、またはＶＨにおけるＱ３９Ｋと対応するＶＬにおけるＱ３８Ｅである。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．三価結合分子
【０１６７】
別の一連の実施形態において、結合分子は、３つの抗原結合部位を有し、したがって「三価」と称される。
【０１６８】
図２１を参照して、様々な三価の実施形態では、結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＮはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＯはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）結合分子は、第５のポリペプチド鎖をさらに含み、第５のポリペプチド鎖が、ドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＱはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。図２に概略化されているように、これらの三価の実施形態は、「２×１」三価構築物と称される。
【０１６９】
図２６を参照して、さらなる一連の三価の実施形態では、結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。図２に概略化されているように、これらの三価の実施形態は、「１×２」三価構築物と称される。
【０１７０】
様々な実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結される。様々な実施形態では、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結される。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結するかまたはドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、セクション６．３．１９．６においてより詳細に記載されている６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．１７．１．三価２×１二重特異性構築物［２（Ａ−Ａ）×１（Ｂ）］
【０１７１】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列はドメインＮおよびＡのアミノ酸配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＯおよびＢのアミノ酸配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列はドメインＰおよびＦのアミノ酸配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列はドメインＱおよびＧのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．２．三価２×１二重特異性構築物［２（Ａ−Ｂ）×１（Ａ）］
【０１７２】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列はドメインＮおよびＨのアミノ酸配列と異なり、ドメインＯおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＯおよびＩのアミノ酸配列と異なり、ドメインＰおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列はドメインＰおよびＬのアミノ酸配列と異なり、ドメインＱおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列はドメインＱおよびＭのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．３．三価２×１三重特異性構築物［２（Ａ−Ｂ）×１（Ｃ）］
【０１７３】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＯ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＰ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＱ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、セクション６．３．４．１および６．３．４．２においてより詳細に記載されているように、ドメインＯは、カッパ軽鎖由来のＣＬである定常領域配列を有し、ドメインＱは、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１である定常領域配列を有する。好ましい実施形態では、上記セクション６．３．１４においてより詳細が議論されているように、ドメインＯおよびドメインＱは、互いに特異的に会合するようにＣＨ３配列を有する。
６．３．１７．４．三価２×１単一特異性構築物
【０１７５】
図２１を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０１７６】
図２１を参照して、別の一連の実施形態において、ドメインＮ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．５．三価１×２二重特異性構築物［１（Ａ）×２（Ｂ−Ａ）］
【０１７７】
図２６を参照して、様々な実施形態では、ドメインＲおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨのアミノ酸配列はドメインＲおよびＡのアミノ酸配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＳおよびＢのアミノ酸配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬのアミノ酸配列はドメインＴおよびＦのアミノ酸配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭのアミノ酸配列はドメインＵおよびＧのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．６．三価１×２二重特異性構築物［１（Ａ）×２（Ｂ−Ｂ）］
【０１７８】
図２６を参照して、様々な実施形態では、ドメインＲおよびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＡのアミノ酸配列はドメインＲおよびＨのアミノ酸配列と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＳおよびＩのアミノ酸配列と異なり、ドメインＴおよびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＦのアミノ酸配列はドメインＴおよびＬのアミノ酸配列と異なり、ドメインＵおよびドメインＭのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＧのアミノ酸配列はドメインＵおよびＭのアミノ酸配列と異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１７．７．三価１×２三重特異性構築物［１（Ａ）×２（Ｂ−Ｃ）］
【０１７９】
図２６を参照して、様々な実施形態では、ドメインＲ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は異なり、ドメインＳ、ドメインＢ、およびドメインＩのアミノ酸配列は異なり、ドメインＴ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は異なり、ドメインＵ、ドメインＧ、およびドメインＭのアミノ酸配列は異なり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、セクション６．３．４．１および６．３．４．２においてより詳細が議論されているように、ドメインＳは、カッパ軽鎖由来のＣＬである定常領域配列を有し、ドメインＵは、ＩｇＧ１アイソタイプ由来のＣＨ１である定常領域配列を有する。好ましい実施形態では、上記セクション６．３．１４においてより詳細が議論されているように、ドメインＳおよびドメインＵは、互いに特異的に会合するようにＣＨ３配列を有する。
６．３．１７．８．三価１×２単一特異性構築物
【０１８１】
図２６を参照して、様々な実施形態では、ドメインＲ、ドメインＡ、およびドメインＨのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＴ、ドメインＦ、およびドメインＬのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＵおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ドメインＲおよびドメインＴが、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
６．３．１８．四価２×２結合分子
【０１８２】
様々な実施形態では、結合分子は、４つの抗原結合部位を有し、したがって「四価」と称される。
【０１８３】
図３４を参照して、さらなる一連の実施形態では、結合分子は、さらに第５および第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はさらにドメインＮおよびドメインＯを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され；（ｂ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され；（ｃ）結合分子はさらに第５および第６ポリペプチド鎖を含み、第５ポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、第６ポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；（ｄ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合し、第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【０１８４】
様々な実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結され、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結される。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結し、ドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、セクション６．３．１９．６においてより詳細に記載されているように、６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．１８．１．四価２×２二重特異性構築物
【０１８５】
図３４を参照して、一連の四価２×２二重特異性結合分子では、ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【０１８６】
図３４を参照して、別の一連の四価２×２二重特異性結合分子では、ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
６．３．１８．２．四価２×２単一特異性構築物
【０１８７】
図３４を参照して、様々な実施形態では、ドメインＮ、ドメインＡ、ドメインＨ、およびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰ、ドメインＦ、ドメインＬ、およびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、およびＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
【０１８８】
図３４を参照して、別の一連の四価２×２単一特異性実施形態では、ドメインＮ、ドメインＡ、ドメインＨ、およびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰ、ドメインＦ、ドメインＬ、およびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、およびＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
６．３．１９．ドメインジャンクション
６．３．１９．１．ＶＬとＣＨ３ドメインとを連結するジャンクション
【０１８９】
様々な実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸は、ＶＬドメインのＣ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端とを連結しているジャンクションは、下記のセクション６．１２．６の表２に記載されている配列の１つである。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で、欠失または付加されている。特定の実施形態では、Ｐ３４３は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＬドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方で欠失または付加されている。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されており、Ｐ３４３が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されている。別の好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失され、ＣＨ３ドメインのＮ末端が、Ｐ３４３Ｖ変異を有する。
６．３．１９．２．ＶＨとＣＨ３ドメインとを連結するジャンクション
【０１９０】
様々な実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端を連結するジャンクションは、下記のセクション６．１２．６の表３に記載されている配列の１つである。特定の実施形態では、Ｋ１７７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３、Ｒ３４４およびＥ３４５が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方で欠失または付加されている。好ましい実施形態では、Ｔ１６６、Ｋ１７７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失されている。
６．３．１９．３．ＣＨ３のＣ末端をＣＨ２のＮ末端に連結しているジャンクション（ヒンジ）
【０１９１】
本明細書に記載の結合分子では、ＣＨ２ドメインのＮ末端は、「ヒンジ」領域アミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域は、抗体のＮ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントと抗体のＣＨ２ドメインとを連結している抗体重鎖の配列である。加えて、ヒンジ領域は、典型的に、Ｎ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントとＣＨ２ドメインとの間のフレキシビリティ、ならびに重鎖間のジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフ（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）の両方を提供する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号５６である。
【０１９２】
様々な実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とＣＨ２ドメインのＮ末端との間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長されている。ある特定の実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とヒンジ領域との間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長され、次いでＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。好ましい実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＰＧＫトリペプチド配列の挿入、続いてＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフの挿入によって伸長されている。
【０１９３】
特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端における伸長は、別のＣＨ３ドメインの直交型Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸配列を組み込んでいる。好ましい実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端における伸長は、ＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んでおり、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフは、カッパ軽鎖のＧＥＣモチーフを組み込んでいる別のＣＨ３ドメインの直交型Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成する。
６．３．１９．４．ＣＬのＣ末端とＣＨ２のＮ末端とを連結するジャンクション（ヒンジ）
【０１９４】
様々な実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、そのＣ末端を介してヒンジ領域に連結され、次いで、ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される。ヒンジ領域配列は、上記セクション６．３．１９．３においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号５６である。
６．３．１９．５．ＣＨ２のＣ末端を定常領域ドメインに連結するジャンクション
【０１９５】
様々な実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、そのＣ末端を介して、定常領域ドメインのＮ末端に連結されている。定常領域は、上記セクション６．３．４においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、その内在性配列を介してＣＨ３配列に連結されている。他の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＣＨ１またはＣＬ配列に連結されている。ＣＨ２配列のＣＨ１またはＣＬ配列への連結を議論する例が、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４２，２４７号においてより詳細に記載されている。
６．３．１９．６．三価および四価分子においてドメインＯをドメインＡにまたはドメインＳをドメインＨに連結するジャンクション
【０１９６】
様々な実施形態では、抗体の重鎖（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）が、追加のＡＢＳを提供する追加のドメインを含むようにそのＮ末端で伸長される。図２１、図２６および図３４を参照して、ある特定の実施形態では、ドメインＯおよび／またはドメインＳの定常領域ドメインアミノ酸配列のＣ末端は、それぞれ、ドメインＡおよび／またはドメインＨの可変領域ドメインアミノ酸配列のＮ末端に連結されている。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＬアミノ酸配列である。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＬアミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＬアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ペプチドリンカーを介して可変領域ドメインに連結されている。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
【０１９７】
様々な実施形態では、抗体の軽鎖（例えば、第２および第４のポリペプチド鎖）が、抗体の追加の可変ドメイン−定常ドメインセグメントを含むようにそのＮ末端で伸長される。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ１アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＨアミノ酸配列である。
６．４．特定の二価結合分子
【０１９８】
さらなる態様では、二価結合分子が提供される。
【０１９９】
図３を参照して、第１の一連の実施形態では、結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を含み、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。
【０２００】
好ましい実施形態では、ドメインＥは、ＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し；ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＫは、ＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し；ドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有する。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、結合分子は、二重特異性二価結合分子である。ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、結合分子は、単一特異性二価結合分子である。
６．４．１．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」
【０２０２】
図３および図６を参照して、一連の実施形態では、結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＬ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１  ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【０２０３】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号８の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号９の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．２．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」
【０２０４】
図３および図１４を参照して、一連の実施形態では、結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、ＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１  ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
６．４．３．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」
【０２０５】
図３および図１６を参照して、一連の実施形態では、結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１  ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【０２０６】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．４．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」
【０２０７】
図３および図１９を参照して、一連の実施形態では、結合分子は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有し、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異、Ｐ３４３Ｖ変異、およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４Ｃ変異およびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１  ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
【０２０８】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号３２の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．５．特定の三価結合分子
６．５．１．三価１×２二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８−１×２」
【０２０９】
セクション６．４．３および図２６を参照して、一連の実施形態では、結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは、Ｙ３４９Ｃ変異、およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くドメインＳをドメインＨに連結するＧＳＧＳＧＳリンカーペプチドを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）結合分子が、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｄ）ドメインＲおよびドメインＴが第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０２１０】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号３７の配列を有し、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有し、および第６のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有する。
６．５．２．三価１×２三重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８−１×１×１ａ」
【０２１１】
セクション６．４．３ならびに図２６および図３０を参照して、一連の実施形態では、結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは第３のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くドメインＳをドメインＨに連結するＧＳＧＳＧＳリンカーペプチドを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）結合分子が、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは第３のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵはＬ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｄ）ドメインＲおよびドメインＴが第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。
【０２１２】
好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号４５の配列を有し、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有し、および第６のポリペプチド鎖は、配列番号５３の配列を有する。
６．６．抗原特異性
【０２１３】
本明細書に記載の結合分子の抗原結合部位は、多種多様な分子標的に特異的に結合するように選択しうる。例えば、抗原結合部位（単数または複数）は、Ｅ−Ｃａｄ、ＣＬＤＮ７、ＦＧＦＲ２ｂ、Ｎ−Ｃａｄ、Ｃａｄ−１１、ＦＧＦＲ２ｃ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＯＬＲ１、ＩＧＦ−Ｉｒａ、ＧＬＰ１Ｒ、ＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ＥＰＨＢ６、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、インテグリン−ａｖｂ３、ＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、アネキシン、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦα、ＣＤ１３７、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、ＢＡＦＦ、ベータアミロイド、Ｃ５、ＣＡ−１２５、ＣＤ１４７、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＬＡ−２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＧＤ２ガングリオシド、ＧＤＦ−８、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２２２１、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＭＵＣ１、Ｎｏｔｃｈ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦβ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦｃ、ヘマトポエチン（４ヘリックスバンドル）（ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＩＬ−２（Ｔ細胞増殖因子）、ＩＬ−３（マルチコロニーＣＳＦ）、ＩＬ−４（ＢＣＧＦ−１、ＢＳＦ−１）、ＩＬ−５（ＢＣＧＦ−２）、ＩＬ−６  ＩＬ−４（ＩＦＮ−β２、ＢＳＦ−２、ＢＣＤＦ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３（Ｐ６００）、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５（Ｔ細胞増殖因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＯＳＭ（ＯＭ、オンコスタチンＭ）、およびＬＩＦ（白血病阻止因子）など）；インターフェロン（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βなど）；免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６）など）；ＴＮＦファミリー（ＴＮＦ−α（カケクチン）、ＴＮＦ−β（リンホトキシン、ＬＴ、ＬＴ−α）、ＬＴ−β、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、および４−１ＢＢＬなど）；ならびに特定のファミリーに分類されないもの（ＴＧＦ−β、ＩＬ  １α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１  ＲＡ、ＩＬ−１０（サイトカイン合成阻害因子Ｆ）、ＩＬ−１２（ＮＫ細胞刺激因子）、ＭＩＦ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（ｍＣＴＬＡ−８）、および／またはＩＬ−１８（ＩＧＩＦ、インターフェロン−γ誘導因子）など）に特異的に結合しうる；二重特異性抗体に関する実施形態では、抗体は、例えば、これらの標的のうちの２つに結合しうる。さらに、標的マスト細胞および好塩基球を標的とするためのＩｇＥ抗体のＦｃ部分の使用など、Ｆｃ受容体発現細胞を標的とするために、抗体の重鎖のＦｃ部分を使用してもよい。
【０２１４】
ＴＮＦ受容体ファミリー、例えば、ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａおよびＴＮＦＲＳＦ１Ａとしても公知）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴβＲとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０およびＣＤ１３４としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳおよびＣＤ９５としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤＣＲ３としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬＲ１、ＤＲ４、およびＣＤ２６としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２、ＤＲ５、およびＣＤ２６２としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬＲ３、ＤＣＲ１、ＣＤ２６３としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬＲ４、ＤＣＲ２、およびＣＤ２６４としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫおよびＣＤ２６５としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＦＮ１４、ＴＷＥＡＫＲ、およびＣＤ２６６としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩおよびＣＤ２６７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦＲ、ＢＲ３、およびＣＤ２６８としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭおよびＣＤ２７０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ、ｐ７５ＮＴＲ、およびＣＤ２７１としても公知）、またはＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡおよびＣＤ２６９としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲおよびＣＤ３５７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ、ＴＡＪ、およびＴＲＡＤＥとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＣＤ３５８としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ２５（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＬＡＲＤ、またはＷＳ−１としても公知）、ＥＤＡ２Ｒ（ＸＥＤＡＲとしても公知）を含むがこれらに限定されないＴＮＦ受容体ファミリーに特異的に結合する抗原結合部位（単数または複数）を選択してもよい。
【０２１５】
がん免疫療法（immune-oncology）標的、例えば、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＢＹ５５およびＣＧＥＮ−１５０４９などのチェックポイント阻害剤標的を含むがこれらに限定されない標的に特異的に結合する抗原結合部位（単数または複数）を選択してもよい。
【０２１６】
一連の実施形態では、腫瘍−会合細胞を特異的に標的とする抗原結合部位（単数または複数）が選択されうる。様々な実施形態では、抗原結合部位（単数または複数）は、腫瘍会合免疫細胞を特異的に標的とする。ある特定の実施形態では、抗原結合部位（単数または複数）は、腫瘍会合制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に標的とする。特定の実施形態では、結合分子は、結合分子が腫瘍会合制御性Ｔ細胞を特異的に標的とするように、ＣＤ２５、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４およびＮＲＰ１の１つまたは複数から選択される抗原に特異的な抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、結合分子は、結合分子が腫瘍会合制御性Ｔ細胞を特異的に標的とするように、ＣＤ２５およびＯＸ４０、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５およびＮＲＰ１、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０およびＮＲＰ１、またはＣＴＬＡ−４およびＮＲＰ１に特異的に結合する抗原結合部位を有する。好ましい実施形態では、二重特異性二価結合分子は、結合分子が腫瘍会合制御性Ｔ細胞を特異的に標的とするように、ＣＤ２５およびＯＸ４０、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５およびＮＲＰ１、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０およびＮＲＰ１、またはＣＴＬＡ−４およびＮＲＰ１に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、腫瘍会合制御性Ｔ細胞の特異的標的化は、制御性Ｔ細胞の枯渇（例えば、殺傷）に至る。好ましい実施形態では、制御性Ｔ細胞の枯渇は、下記セクション６．７．１においてより詳細に検討されているように、毒素へコンジュゲートされた抗体などの、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）改変によって媒介される。
【０２１７】
一連の実施形態では、結合分子は、ＣＤ３、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２の１つまたは複数から選択される抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、二重特異性二価は、ＣＤ３およびＲＯＲ１に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、二重特異性二価は、ＣＤ３およびＲＯＲ２に特異的に結合する抗原結合部位を有する。特定の実施形態では、三重特異性三価は、ＣＤ３、ＲＯＲ１およびＲＯＲ２に特異的に結合する抗原結合部位を有する。
６．７．さらなる改変
【０２１８】
さらなる一連の実施形態では、結合分子は追加的改変を有する。
６．７．１．結合分子−薬物コンジュゲート
【０２１９】
様々な実施形態では、結合分子は、治療剤（つまり、薬物）にコンジュゲートされて、結合分子−薬物コンジュゲートを形成する。治療剤には、化学治療剤、画像化剤（例えば、放射性同位体）、免疫調節剤（例えば、サイトカイン、ケモカイン、またはチェックポイント阻害剤）、および毒素（例えば、細胞毒性剤）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、治療剤は、下記セクション６．７．３においてより詳細に議論されているように、リンカーペプチドを介して結合分子に連結されている。薬物を本明細書に開示される結合分子にコンジュゲートするために適合しうる抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製方法は、例えば、それぞれ教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２４，００３号（ポット法）、米国特許第８，１６３，８８８号（ワンステップ法）、米国特許第５，２０８，０２０号（ツーステップ法）、米国特許第８，３３７，８５６号、米国特許第５，７７３，００１号、米国特許第７，８２９，５３１号、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第７，７４５，３９４号、ＷＯ２０１７／１３６６２３、ＷＯ２０１７／０１５５０２、ＷＯ２０１７／０１５４９６、ＷＯ２０１７／０１５４９５、ＷＯ２００４／０１０９５７、ＷＯ２００５／０７７０９０、ＷＯ２００５／０８２０２３、ＷＯ２００６／０６５５３３、ＷＯ２００７／０３０６４２、ＷＯ２００７／１０３２８８、ＷＯ２０１３／１７３３３７、ＷＯ２０１５／０５７６９９、ＷＯ２０１５／０９５７５５、ＷＯ２０１５／１２３６７９、ＷＯ２０１５／１５７２８６、ＷＯ２０１７／１６５８５１、ＷＯ２００９／０７３４４５、ＷＯ２０１０／０６８７５９、ＷＯ２０１０／１３８７１９、ＷＯ２０１２／１７１０２０、ＷＯ２０１４／００８３７５、ＷＯ２０１４／０９３３９４、ＷＯ２０１４／０９３６４０、ＷＯ２０１４／１６０３６０、ＷＯ２０１５／０５４６５９、ＷＯ２０１５／１９５９２５、ＷＯ２０１７／１６０７５４、Storz（MAbs.、２０１５年１１−１２月；７巻（６号）：９８９〜１００９頁）、Lambertら（Adv  Ther、２０１７年３４巻：１０１５頁）、Diamantisら（British  Journal  of  Cancer、２０１６年、１１４巻、３６２〜３６７頁）、Carricoら（Nat  Chem  Biol、２００７年、３巻：３２１〜２頁）、Weら（Proc  Natl  Acad  Sci  USA、２００９年、１０６巻：３０００〜５頁）、Rabukaら（Curr  Opin  Chem  Biol.、２０１１年、１４巻：７９０〜６頁）、Hudakら（Angew  Chem  Int  Ed  Engl.、２０１２年：４１６１〜５頁）、Rabukaら（Nat  Protoc.、２０１２年、７巻：１０５２〜６７頁）、Agarwalら（Proc  Natl  Acad  Sci  USA.、２０１３年、１１０巻：４６〜５１頁）、Agarwalら（Bioconjugate  Chem.、２０１３年、２４巻：８４６〜８５１頁）、Barfieldら（Drug  Dev.  and  D.、２０１４年、１４巻：３４〜４１頁）、Drakeら（Bioconjugate  Chem.、２０１４年、２５巻：１３３１〜４１頁）、Liangら（J  Am  Chem  Soc.、２０１４年、１３６巻：１０８５０〜３頁）、Drakeら（Curr  Opin  Chem  Biol.、２０１５年、２８巻：１７４〜８０頁）およびYorkら（BMC  Biotechnology、２０１６年、１６巻（１号）：２３頁）に記載されている。
６．７．２．さらなる結合部分構造
【０２２０】
様々な実施形態では、結合分子は、１つまたは複数の追加の結合部分構造を含む改変を有する。ある特定の実施形態では、結合部分構造は、例えば、全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂ、ミニボディ、カメリドＶＨＨ、および当業者に公知の他の抗体断片もしくはフォーマットを含むがこれらに限定されない抗体断片または抗体フォーマットである。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるBrinkmannら（MABS、２０１７年、９巻、２号、１８２〜２１２頁）において詳細に記載されている。
【０２２１】
特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１または第３のポリペプチド鎖のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１および第３のポリペプチド鎖の両方のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１および第３のポリペプチド鎖の両方のＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造の個々の部分が、官能性結合部分構造を形成するように、第１および第３のポリペプチド鎖のＣ末端に別個に連結されている。
【０２２２】
特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、ポリペプチド鎖のいずれか（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、または第６のポリペプチド鎖）のＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、追加の結合部分構造の個々の部分が、官能性結合部分構造を形成するように、異なるポリペプチド鎖のＮ末端に別個に連結されている。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、結合分子内のＡＢＳの異なる抗原またはエピトープに特異的である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、結合分子内のＡＢＳの同じ抗原またはエピトープに特異的である。改変が２つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、同じ抗原またはエピトープに特異的である。改変が２つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、異なる抗原またはエピトープに特異的である。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、下記セクション６．７．３においてより詳細が議論されているように、例えば、反応性化学および親和性タグシステムを含むがこれらに限定されないｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を使用して結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、Ｆｃ媒介結合（例えば、プロテインＡ／Ｇ）を介して結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、例えば、結合分子と追加の結合部分構造との融合産物のヌクレオチド配列を同じ発現ベクター（例えば、プラスミド）にコード化するなどの組換えＤＮＡ技術を使用して、結合分子に連結される。
６．７．３．官能基／反応基
【０２２５】
様々な実施形態では、結合分子は、例えば追加の部分構造（例えば、上記セクション６．７．１および６．７．２においてより詳細が議論されている薬物コンジュゲートおよび追加の結合部分構造）の連結などの下流プロセスおよび下流精製プロセスにおいて使用することができる、官能基または化学的反応性基を含む改変を有する。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、改変は、例えば、反応性チオール（例えば、マレイミド系反応性基）、反応性アミン（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド系反応性基）、「クリック化学」基（例えば、反応性アルキン基）、およびホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）を保持するアルデヒド類を含むがこれらに限定されない化学的反応性基である。ある特定の実施形態では、改変は、親和性ペプチド配列（例えば、ＨＡ、ＨＩＳ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、ＭＢＰおよびＳｔｒｅｐシステムなど）を含むがこれらに限定されない官能基である。ある特定の実施形態では、官能基または化学的反応性基は、開裂可能なペプチド配列を有する。特定の実施形態では、開裂可能なペプチドは、光開裂、化学開裂、プロテアーゼ開裂、還元条件、およびｐＨ条件を含むがこれらに限定されない手段によって開裂される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞内プロテアーゼによって実施される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞外または膜会合プロテアーゼによって実施される。プロテアーゼ開裂を採用するＡＤＣ治療は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるChoiら（Theranostics、２０１２年；２巻（２号）：１５６〜１７８頁）においてより詳細に記載されている。
６．８．医薬組成物
【０２２７】
別の態様では、本明細書に記載される結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。典型的な実施形態では、医薬組成物は滅菌される。
【０２２８】
様々な実施形態では、医薬組成物は、結合分子を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、結合分子を、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、結合分子を、１０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含む。ある特定の実施形態では、結合分子は、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、またはさらには５０ｍｇ／ｍｌもしくはそれより高い濃度で存在する。特定の実施形態では、結合分子は、５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で存在する。
【０２２９】
様々な実施形態では、医薬組成物は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９６１，９６４号、米国特許第８，９４５，８６５号、米国特許第８，４２０，０８１号、米国特許第６，６８５，９４０号、米国特許第６，１７１，５８６号、米国特許第８，８２１，８６５号、米国特許第９，２１６，２１９号、米国特許出願第１０／８１３，４８３号、ＷＯ２０１４／０６６４６８、ＷＯ２０１１／１０４３８１およびＷＯ２０１６／１８０９４１においてより詳細に記載されている。
６．９．製造法
【０２３０】
本明細書に記載の結合分子は、抗体製造のために現在使用されている標準的な無細胞翻訳、一過性トランスフェクションおよび安定なトランスフェクションアプローチを使用して、発現によって容易に製造することができる。特定の実施形態では、結合分子の製造のために、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのプロトコールおよび試薬、例えばＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ、または教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるFangら（Biological  Procedures  Online、２０１７年、１９巻：１１頁）に詳細に記載されているようにポリエチレンイミンなどの当業者に公知の他の試薬を用いて、使用することができる。
【０２３１】
下記の実施例でさらに説明されているように、発現タンパク質は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＣＨ１樹脂などのＣＨ１親和性樹脂、およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから提供されているプロトコールを使用して、容易に精製することができる。さらなる精製は、当技術分野で常套的に使用されているイオン交換クロマトグラフィを使用して行ってもよい。
６．１０．処置方法
【０２３２】
別の態様では、患者に、本明細書に記載される結合分子を、患者を処置するために有効な量で投与することを含む、処置方法が提供される。
【０２３３】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、がんを処置するために使用されうる。がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮のがんでありうる。一部の実施形態では、がんは、新生物、悪性疾患；癌腫；未分化癌腫；巨細胞紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ腫；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌・胆管細胞癌；小柱腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺腫性家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド悪性腫瘍；細気管支肺胞腺癌（branchiolo-alveolar  adenocarcinoma）；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌（acidophil  carcinoma）；好酸性腺癌；好塩基球腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化性癌（nonencapsulating  sclerosing  carcinoma）；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；ダクト癌浸潤；髄様癌；小葉癌；炎症性腫；乳腺パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性男性細胞腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性エキストラ乳腺傍神経節腫；褐色細胞腫；糸球体肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏メラノーマ；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫（malig  melanoma）；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎児性癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉系軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星細胞腫；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星芽腫；神経膠芽腫；乏突起；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；顆粒球肉腫；および有毛細胞白血病でありうる。
【０２３４】
本開示の抗体は、例えば、がん、自己免疫、移植拒絶反応、外傷後の免疫応答、移植片対宿主病、虚血、脳卒中、および感染症の処置のために、例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０などのウイルス抗原を標的とすることにより、それ自体または医薬組成物の形態で、対象に投与することができる。
６．１１．さらなる態様および実施形態
【０２３５】
他の態様および実施形態を、番号を付した以下の項目で示す。
１．ＶＨ−ＣＨ３で構成される重鎖（ＨＣ）およびＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３を含む軽鎖（ＬＣ）を含むドメイン交換抗体であって、ＨＣのＶＨ−ＣＨ３は、ＬＣのＶＬ−ＣＨ３と二量体化して、ＣＨ３ＬＣ／ＣＨ３ＨＣドメイン対を含む第１のドメイン交換ＬＣ／ＨＣ二量体を形成する、ドメイン交換抗体。
２．軽鎖はＶＬ−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３としてさらに定義され、重鎖はＶＨ−ＣＨ３（ホール）としてさらに定義される、項目１に記載の抗体。
３．軽鎖はＶＬ−ＣＨ３（ホール）−ＣＨ２−ＣＨ３としてさらに定義され、重鎖はＶＨ−ＣＨ３（ノブ）としてさらに定義される、項目１に記載の抗体。
４．軽鎖が、第２のＬＣ／ＨＣ二量体をさらに含み、ここで軽鎖はＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＸ１−ＣＨＸとしてさらに定義され、軽鎖はＶＸ２−ＣＨＸ２とさらに二量体化している、項目１〜３のいずれかに記載の抗体。
５．ＶＸ１が第２のＶＨ領域であり、ＶＸ２が第２のＶＬ領域である、項目４に記載の抗体。
６．ＶＸ１が第２のＶＬ領域であり、ＶＸ２が第２のＶＨ領域である、項目４に記載の抗体。
７．ＣＨＸおよびＣＨＸ２が、ＣＨ３／ＣＨ３二量体を形成する、項目４〜６のいずれかに記載の抗体。
８．ＣＨＸおよびＣＨＸ２が、ＣＨ１／ＣＬ二量体を形成する、項目４〜６のいずれかに記載の抗体。
９．軽鎖が、ＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ１−ＣＨ１としてさらに定義され、ＶＸ２−ＣＨＸ２がＶＬ１−ＣＬである、項目４に記載の抗体。
１０．抗体が、２つの軽鎖を含み、第１の軽鎖がＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ１−ＣＨ１としてさらに定義され、第２の軽鎖がＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ１−ＣＬとしてさらに定義され、ＶＨ１−ＣＨ１がＶＬ１−ＣＬと二量体化している、項目１〜３のいずれかに記載の抗体。
１１．抗体が、２つの軽鎖を含み、第１の軽鎖がＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨ１−ＣＨ３としてさらに定義され、第２の軽鎖がＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＬ１−ＣＨ３としてさらに定義され、ＶＨ１−ＣＨ３がＶＬ１−ＣＨ３と二量体化している、項目１〜３のいずれかに記載の抗体。
１２．ＶＬ１−ＣＨ３が、ＶＬ１−ＣＨ３（ノブ）としてさらに定義され、ＶＨ１−ＣＨ３が、ＶＨ１−ＣＨ３（ホール）としてさらに定義される、項目１１に記載の抗体。
１３．重鎖が、第２のＬＣ／ＨＣ二量体をさらに含み、重鎖がＶＸ１−ＣＨＸ−ＶＨ−ＣＨ３としてさらに定義され、重鎖がＶＸ２−ＣＨＸ２とさらに二量体化している、項目１〜３のいずれかに記載の抗体。
１４．ＶＸ１が第２のＶＨ領域であり、ＶＸ２が第２のＶＬ領域である、項目１３に記載の抗体。
１５．ＶＸ１が第２のＶＬ領域であり、ＶＸ２が第２のＶＨ領域である、項目１３に記載の抗体。
１６．ＣＨＸおよびＣＨＸ２が、ＣＨ３／ＣＨ３二量体を形成する、項目１３〜１５のいずれかに記載の抗体。
１７．ＣＨＸおよびＣＨＸ２が、ＣＨ１／ＣＬ二量体を形成する、項目１３〜１５のいずれかに記載の抗体。
１８．重鎖が、ＶＨ１−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ３としてさらに定義され、ＶＸ２−ＣＨＸ２がＶＬ１−ＣＬである、項目４に記載の抗体。
１９．第１のＬＣ／ＨＣ二量体が、第１のエピトープを認識する第１の結合部位を含み、第２のＬＣ／ＨＣ二量体が、第１のエピトープと異なるかまたは異なる抗原に由来する第２のエピトープを認識する第２の結合部位を含み、ここで第１のＬＣ／ＨＣ二量体または第２のＬＣ／ＨＣ二量体のいずれかはドメイン交換されている、項目４〜１８のいずれかに記載の抗体。
２０．２つの第１のＬＣ／ＨＣ二量体と単一の第２のＬＣ／ＨＣ二量体とを含む二重特異性抗体である、項目１９に記載の抗体。
２１．２つの第１のＬＣ／ＨＣ二量体と２つの第２のＬＣ／ＨＣ二量体とを含む二重特異性抗体である、項目１９に記載の抗体。
２２．ＨＣまたはＬＣが、下記の表Ａに示す変異を含む、項目１〜２１のいずれかに記載の抗体。
【表Ａ】
2019534277.tif 000002
２３．ＩｇＧ抗体である、項目１〜２２のいずれかに記載の抗体。
２４．ＬＣが、ＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３からなり、任意選択で１つまたは複数のリンカー／ジャンクションまたはヒンジ領域をさらに含む、項目１〜２３のいずれかに記載の抗体。
２５．第１のＬＣ／ＨＣ二量体が、ＣＨ３（ノブ）／ＣＨ３（ホール）二量体、ＣＨ３Ｈｃ／ＣＨ３Ｈｃ二量体によって特徴付けられるか、またはＣＨ３ＬＣ／ＣＨ３ＨＣドメインのコグネート対を生ずることができる操作されたＣＨ３ドメインを含んでおり；軽鎖が、ＣＨ２−ＣＨ３を含むＦｃ鎖とさらに二量体化され、それによってＦｃ領域を形成する、項目１〜２４のいずれかに記載の抗体。
２６．軽鎖が、ＣＨ２−ＣＨ３を含むＦｃ鎖とさらに二量体化され、それによってＦｃ領域を形成し；Ｆｃ領域が、ＣＨ３（ノブ）／ＣＨ３（ホール）二量体、ＣＨ３Ｈｃ／ＣＨ３Ｈｃ二量体によって特徴付けられるか、またはＣＨ３ＬＣ／ＣＨ３ＨＣドメインのコグネート対を生ずることができる操作されたＣＨ３ドメインを含んでいる、項目１〜２５のいずれかに記載の抗体。
２７．操作されたＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３のアミノ酸配列またはヒトＩｇＧ１のＣＨ３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的バリアントを含み、操作されたＣＨ３ドメインは、以下：
ａ）１つもしくは複数のノブもしくはホール変異、好ましくはＴ３６６Ｙ／Ｙ４０７Ｔ、Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ／Ｔ３９４’Ｗ：Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ４０７’ＡおよびＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９’Ｃ：Ｔ３６６’Ｓ：Ｌ３６８’Ａ：Ｙ４０７Ｖのいずれかのノブもしくはホール変異；
ｂ）他のコグネートＣＨ３ドメインのシステイン残基と共有結合的に連結し、それによりドメイン間ジスルフィド架橋を導入し、好ましくは両方のＣＨ３ドメインのＣ末端を連結する、システイン残基；
ｃ）ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互のセグメントで構成されるＳＥＥＤ  ＣＨ３ヘテロ二量体；および／または
ｄ）反発する電荷がヘテロ二量体形成を抑制する１つもしくは複数の変異、好ましくは、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９’Ｒ、Ｋ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’ＫもしくはＫ４０９Ｄ：Ｋ３９２Ｄ：Ｋ３７０Ｄ／Ｄ３９９’Ｋ：Ｅ３５６’Ｋ：Ｅ３５７’Ｋのいずれかである１つもしくは複数の変異；および／または
ｅ）ヘテロ二量体形成および／もしくは熱安定性のために選択された１つもしくは複数の変異、好ましくは、Ｔ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｌ：Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３５０Ｖ：Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ：Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ：Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｋ３９２Ｍ：Ｔ３９４Ｗ、もしくはＦ４０５Ａ：Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３６６Ｌ：Ｔ３９４Ｗのいずれかである１つもしくは複数の変異
の１つまたは複数を含み、ここでナンバリングはＥｕインデックスに従う、項目２５〜２６のいずれかに記載の抗体。
２８．ＶＨまたはＶＬドメインのいずれかとＣＨ３ドメインとの間のジャンクションがアミノ酸配列を含み、ここでアミノ酸配列は、
ａ）ヒトＩｇＧ抗体のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部であるか、および／または
ｂ）ヒトＩｇＧ抗体のＶＬドメインとＣＬドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部であるか；および／または
ｃ）ヒトＩｇＧ抗体のＶＨドメインとＣＨ１ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部であるか；および／または
ｄ）５〜２０アミノ酸長、好ましくは８〜１５アミノ酸長を有する人工連結配列である、項目１〜２５のいずれかに記載の抗体。
２９．  ａ）ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインのいずれかに位置するＦｃガンマ受容体結合部位および／もしくはＣ１ｑ結合部位を含むエフェクター機能競合抗体；
ｂ）Ｆｃガンマ受容体および／もしくはＣ１ｑへの結合が欠損しているＦｃ領域を含むエフェクター陰性抗体
であるか、または
ｃ）ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインのいずれかに位置するｐＨ依存性ＦｃＲｎ結合部位を含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載の抗体。
３０．抗体が、標的を認識する結合部位を組み込んだ一対の重鎖および軽鎖を含む一価の結合部位によって第１の標的を特異的に認識し、ここで軽鎖は、定常領域で構成される別の軽鎖に結合され、それによってＦｃ領域を形成する、項目１〜２９のいずれかに記載の抗体。
３１．抗体が、第２の標的を特異的に認識する二重特異性抗体であり、ここで第１の標的はＴＮＦ−α、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ４７またはＰＤ−１であり、第２の標的はＥＧＦＲ、ＲＯＲ１またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３、Ｌａｇ−３である、項目３０に記載の抗体。
３２．抗体の定常ドメインが、ヒト起源であるか、ヒト化されたものであるか、または各ヒトＩｇＧ１抗体ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的に活性なバリアントである、項目１〜３１のいずれかに記載の抗体。
３３．項目１〜３２のいずれかに記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【実施例】
【０２３６】
６．１２．実施例
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、限定するものではない。
６．１２．１．
（実施例１）
二価単一特異性構築物および二価の二重特異性構築物
【０２３７】
ＴＮＦａを認識する二価単一特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを、標準的な分子生物学的手法を使用して、以下の構成（ＶＬ（セルトリズマブ）−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３／ＶＨ（セルトリズマブ）−ＣＨ３（ホール））で構築した。この構築物において、
第１のポリペプチド鎖（配列番号１）
ドメインＡ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＢ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）（ノブ：Ｓ３５４Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ）
ドメインＤ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＥ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
第２のポリペプチド鎖（配列番号２）
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）（ホール：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第３のポリペプチド鎖：
第１のポリペプチド鎖と同一
第４のポリペプチド鎖：
第２のポリペプチド鎖と同一。
【０２３８】
ドメインおよびポリペプチド鎖の参照は、図３に従う。構築物の全体の構成を図４に示す。「（ＶＬ）」と略記して特定されているドメインＡを有する第１のポリペプチド鎖の配列は、配列番号１で提供される。「（ＶＨ）」と略記して特定されているドメインＦを有する第２のポリペプチド鎖の配列は、配列番号２で提供される。
【０２３９】
全長構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ無細胞タンパク質合成発現系で、約１８時間、２６℃で穏やかに撹拌しながら発現させた。発現後、無細胞抽出物を遠心分離して、不溶性物質をペレット化し、上清を、１０×カイネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）で２倍希釈して、バイオレイヤー干渉のための検体として使用した。
【０２４０】
ビオチン化ＴＮＦαを、ストレプトアビジンセンサーに固定化し、約１．５ｎｍのウェーブシフト応答に付した。１０×カイネティックバッファーでベースラインを確立した後、センサーを、抗体構築物検体溶液中に浸漬した。構築物は、セルトリズマブの従来のＩｇＧフォーマットに匹敵する約３ｎｍの応答を与え、機能性の全長抗体へと組み立てられる二価単一特異性構築物の能力を実証した。結果を図５に示す。
【０２４１】
本発明者らはまた、以下のドメイン構成を有する二価の二重特異性抗体を構築した：
第１のポリペプチド鎖：ＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ）
第２のポリペプチド鎖：ＶＨ−ＣＨ３
第３のポリペプチド鎖：ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール）
第４のポリペプチド鎖  ＶＨ−ＣＨ１。
【０２４２】
配列（可変領域配列を除く）を、配列番号３（第１のポリペプチド鎖）、配列番号４（第２のポリペプチド鎖）、配列番号５（第３のポリペプチド鎖）、配列番号６（第４のポリペプチド鎖）でそれぞれ示す。
６．１２．２．
（実施例２）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」
【０２４３】
本発明者らは、ＰＤ１および第２の抗原「抗原Ａ」に特異的な「ＢＣ１」と称する二価の二重特異性構築物を構築した。「ＢＣ１」構成の顕著な特徴を、図６に示す。
【０２４４】
さらに詳細に、図３に従ってドメインおよびポリペプチド鎖の参照を示し、天然の配列からの改変を括弧内に示すと、構成は、以下の通りであった：
第１のポリペプチド鎖（配列番号８）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃトリペプチド挿入物）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（配列番号９）：
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ；４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入物）
第３のポリペプチド鎖（配列番号１０）：
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（配列番号１１）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
【０２４５】
Ａドメイン（配列番号１２）およびＦドメイン（配列番号１６）は、「抗原Ａ」に特異的な抗原結合部位（Ａ：Ｆ）を形成する。Ｈドメインは、ニボルマブ由来のＶＨ配列を有し、Ｌドメインは、ニボルマブ由来のＶＬ配列を有し；ＨおよびＬは会合して、ヒトＰＤ１に特異的な抗原結合部位（Ｈ：Ｌ）を形成する。
【０２４６】
Ｂドメイン（配列番号１３）は、いくつかの変異、つまりＴ３６６Ｋ、４４５Ｋ、４４６Ｓおよび４４７Ｃ挿入物を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。Ｔ３６６Ｋ変異は、ドメインＧにおけるＬ３５１Ｄ残基の電荷対コグネートである。ドメインＢにおける「４４７Ｃ」残基は、Ｃ末端ＫＳＣトリペプチド挿入物に由来するものである。
【０２４７】
ドメインＤ（配列番号１４）は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２の配列を有する。
【０２４８】
ドメインＥ（配列番号１５）は、変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。３６６Ｗは、「ノブ」変異である。３５４Ｃは、ドメインＫにおけるコグネート３４９Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。
【０２４９】
ドメインＧ（配列番号１７）は、以下の変異：Ｌ３５１Ｄ、および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入物を有する、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。Ｌ３５１Ｄ変異は、ドメインＢ  Ｔ３６６Ｋ変異に対する電荷対コグネートを導入する。ドメインＧの「４４７Ｃ」残基は、Ｃ末端ＧＥＣトリペプチド挿入物に由来する。
【０２５０】
ドメインＩ（配列番号１９）は、ヒトＣカッパ軽鎖（Ｃκ）の配列を有する。
【０２５１】
ドメインＪ［配列番号２０］は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインの配列を有し、ドメインＤの配列と同一である。
【０２５２】
ドメインＫ［配列番号２１］は、以下の変化：Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ３の配列を有する。３４９Ｃ変異は、ドメインＥのコグネート３５４Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。３５６ＥおよびＬ３５８Ｍは、免疫原性を減少させるイソアロタイプアミノ酸を導入する。３６６Ｓ、３６８Ａおよび４０７Ｖは、「ホール」変異である。
【０２５３】
ドメインＭ［配列番号２３］は、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１領域の配列を有する。
【０２５４】
「ＢＣ１」は、哺乳動物発現を使用して１００μｇ／ｍｌを超える濃度で、高レベルで容易に発現することができる。
【０２５５】
本発明者らは、二価の二重特異性「ＢＣ１」タンパク質が、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＣＨ１特異的ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性樹脂を使用して単一ステップで容易に精製することができることを見出した。
【０２５６】
図７Ａに示すように、ＳＥＣ解析は、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップにより、ゲル濾過を介して、＞９８％がモノマーである単一の単分散ピークが得られることを実証する。図７Ｂは、ＣｒｏｓｓＭａｂ二価抗体構築物のＳＥＣ解析の比較文献データを示す。
【０２５７】
図８Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図８Ｂは、標準的なプロテインＡ精製を使用して精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであり、不完全な組み立て産物の同時精製と一致する追加的な溶出ピークを示す。
【０２５８】
図９は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン３でみられるように、ＣＨ１親和性樹脂を用いた「ＢＣ１」の単一ステップの精製により、ほぼ均一な単一バンドが得られる。レーン４は、続いて陽イオン交換仕上げ工程で最小の追加的な精製を行ったものを示す。レーン７は、比較による、標準的なプロテインＡ精製を使用した軽度の精製を示し、レーン８〜１０は、陽イオン交換クロマトグラフィを使用した、プロテインＡ精製物質のさらなる精製を示す。
【０２５９】
図１０は、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのＣＨ１−親和性精製後の「ＢＣ１」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＡ）を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＢ）と比較した図である。
【０２６０】
図１１は、還元条件下の２つの別個の重鎖（図１１Ａ）、および２つの別個の軽鎖（図１１Ｂ）を実証する「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。図１２における質量分析データは、精製後の不完全対形成の非存在を確認する。
【０２６１】
加速安定性試験を実行して、「ＢＣ１」Ｂ−Ｂｏｄｙ設計の長期安定性を評価した。精製されたＢ−ＢｏｄｙをＰＢＳバッファー中８．６ｍｇ／ｍｌに濃縮して４０℃でインキュベートした。構造的完全性をＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０３カラムを備えた分析的サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して毎週測定した。構造的完全性を、凝集物の形成と関連させて、無傷のモノマーのパーセンテージ（％モノマー）を測定することによって決定した。データを図１３に示す。ＩｇＧ対照１は、良好な安定性特性を有する陽性対照である。ＩｇＧ対照２は、インキュベーション条件下で凝集することが公知の陰性対照である。「ＢＣ１」Ｂ−Ｂｏｄｙは、分析的ＳＥＣで決定されるように、構造的完全性を何ら失うことなく、８週間、インキュベートされた。
【０２６２】
また、二価構築物のＴＭは約７２℃であり、本発明者らは、「ＢＣ１」が高い耐熱性を有すると決定した。
【０２６３】
表１は、重要な開発性特徴について、「ＢＣ１」とＣｒｏｓｓＭａｂとを比較する。
【表１】
2019534277.tif 000003
６．１２．３．
（実施例３）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」
【０２６４】
本発明者らは、「ＢＣ６」と称する二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを構築した。「ＢＣ６」は、「ＢＣ１」と同様であるが、ドメインＢの残基３６６およびドメインＧの残基３５１で野生型残基を保持していることを除いてＢＣ１と同一であった。したがって「ＢＣ６」は、「ＢＣ１」のドメインＢとドメインＧにおける正しい対形成を容易にするように設計された電荷対コグネートＴ３６６ＫおよびＬ３５１Ｄを欠く。「ＢＣ６」構成の顕著な特徴を図１４に示す。
【０２６５】
「ＢＣ１」に存在する電荷対残基の非存在にもかかわらず、ＣＨ１親和性樹脂を使用した「ＢＣ６」の単一ステップの精製は、高度に均質な試料をもたらすことが分かった。図１５Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ６」のＳＥＣ解析を示す。データは、単一のステップＣＨ１親和性精製によって、「ＢＣ１」での観察と同様に、単一の単分散ピークが得られることを実証し、ポリペプチド鎖１とポリペプチド鎖２との間およびポリペプチド鎖３とポリペプチド鎖４との間のジスルフィド結合が無傷のままであることを実証する。またクロマトグラムは、非共有結合性の凝集物が存在しないことも示す。
【０２６６】
図１５Ｂは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、レーン１は単一ステップのＣＨ１親和性精製後の「ＢＣ６」の第１のロットをローディングしたものであり、レーン２は、単一ステップのＣＨ１親和性精製後の「ＢＣ６」の第２のロットをローディングしたものである。レーン３および４は、ＣＨ１親和性精製に続けてイオン交換クロマトグラフィを用いて達成しうるさらなる精製を実証する。
６．１２．４．
（実施例４）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ３１」
【０２６７】
本発明者らは、ドメインＢおよびＧのＣＨ３境界内の操作されたジスルフィドを「ＢＣ１」および「ＢＣ６」に存在するＣ末端ジスルフィドに対する代替的Ｓ−Ｓ連結として有する二価１×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」および「ＢＣ３１」を構築した。文献は、ＣＨ３境界のジスルフィド結合が、Ｆｃ  ＣＨ３ドメインの状況で直交性を行使するには不十分であることを示している。これらのＢ−Ｂｏｄｙ構築物の全体の構成を図１６に概略化し、「ＢＣ２８」の顕著な特徴を下記に示す：
ポリペプチド鎖１：「ＢＣ２８」鎖１（配列番号２４）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｋ３６６Ｗ）
ポリペプチド鎖２：「ＢＣ２８」鎖２（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
ポリペプチド鎖３：「ＢＣ１」鎖３（配列番号１０）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
ポリペプチド鎖４：「ＢＣ１」鎖４（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
【０２６８】
「ＢＣ２８」Ａ：Ｆ抗原結合部位は、「抗原Ａ」に特異的である。「ＢＣ２８」Ｈ：Ｌ抗原結合部位は、ＰＤ１（ニボルマブ配列）に特異的である。「ＢＣ２８」ドメインＢは、野生型ＣＨ３と比較して以下の変化：Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物を有する。「ＢＣ２８」ドメインＥは、野生型ＣＨ３と比較して以下の変化：Ｓ３５４Ｃ、Ｋ３６６Ｗを有する。「ＢＣ２８」ドメインＧは、野生型と比較して以下の変化：Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物を有する。
【０２６９】
したがって、「ＢＣ２８」は、ドメインＢの残基３４９Ｃに操作されたシステイン、およびドメインＧの残基３５４Ｃに操作されたシステインを有する（「３４９Ｃ−３５４Ｃ」）。
【０２７０】
「ＢＣ２９」は、ドメインＢの残基３５１ＣおよびドメインＧの３５１Ｃに、操作されたシステインを有する（「３５１Ｃ−３５１Ｃ」）。「ＢＣ３０」は、ドメインＢの残基３５４ＣおよびドメインＧの３４９Ｃに操作されたシステインを有する（「３５４Ｃ−３４９Ｃ」）。ＢＣ３１は、残基３９４Ｃに操作されたシステイン、およびドメインＧの３９４Ｃに操作されたシステイン（「３９４Ｃ−３９４Ｃ」）を有する。ＢＣ３２は、ドメインＢの残基４０７ＣおよびドメインＧの４０７Ｃに操作されたシステインを有する（「４０７Ｃ−４０７Ｃ」）。
【０２７１】
図１７は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１および３は、無傷の「ＢＣ２８」（レーン１）および「ＢＣ３０」（レーン３）の高レベルの発現および実質的な均一性を示す。レーン２は、ＢＣ２９のオリゴマー化を示す。レーン４および５は、ＢＣ３１およびＢＣ３２の乏しい発現をそれぞれ示し、ＢＣ３２の連結が不十分であることを示す。別の構築物ＢＣ９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって報告された、ドメインＢの残基３９２およびドメインＧの３９９に導入されたシステインを有し（「３９２Ｃ−３９９Ｃ」）、ジスルフィド対を形成する構築物）は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥでオリゴマー化を示した（データは示さず）。
【０２７２】
図１８は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ２８」および「ＢＣ３０」のＳＥＣ解析を示す。さらに本発明者らは、「ＢＣ２８」が、プロテインＡ樹脂を使用した単一ステップの精製を使用して容易に精製することができることを実証した（結果は示さず）。
６．１２．５．
（実施例５）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」
【０２７３】
図１９は、本発明者らの現行の好ましい二価の二重特異性１×１構築物である二価の二重特異性１×１Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」の一般的構成を示す。
第１のポリペプチド鎖（「ＢＣ４４」鎖１）（配列番号３２）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
ドメインＥ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｋ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」ポリペプチド鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
第３のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」ポリペプチド鎖３）（配列番号１０）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」ポリペプチド鎖４）（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
６．１２．６．
（実施例６）
可変−ＣＨ３ジャンクション操作
【０２７４】
本発明者らは、ドメインＡとＢとの間のＶＬ−ＣＨ３ジャンクション、ならびにドメインＦとＧとの間のＶＨ−ＣＨ３ジャンクションを変異させた一連のバリアントを作製し、二価１×１  Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物の発現レベル、組み立て、および安定性を評価した。多くの解決策がありうるが、本発明者らは、Ｔ細胞エピトープの導入を減少させるために、ＶＬ、ＶＨおよびＣＨ３ドメイン内で天然に見出される残基のみを使用することを選択した。ドメイン構成の構造的評価は、好ましい配列組合せをさらに限定する。下記表２および表３は、「ＢＣ１」および他の二価構築物に基づくいくつかのジャンクションバリアントについてのジャンクションを示す。
【表２】
2019534277.tif 000004
【表３】
2019534277.tif 000005
【０２７５】
図２０は、４０℃での加速安定性試験プロトコールにおける示された週数での「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」試料のサイズ排除クロマトグラフィを示す。「ＢＣ１５」は安定なままであった；「ＢＣ１６」は、経時的に不安定となることが分かった。
６．１２．７．
（実施例７）
三価２×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物（「ＢＣ１−２×１」）
【０２７６】
本発明者らは、「ＢＣ１」に基づいて三価２×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１−２×１」を構築した。構成の顕著な特徴を図２２に示す。
【０２７７】
より詳細には、図２１に要約されているドメインおよびポリペプチド鎖の参照を使用して、
第１のポリペプチド鎖
ドメインＮ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＯ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、４４７Ｃ）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、４７７Ｃ）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（ノブ、３５４Ｃ）
第５のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖２）
ドメインＰ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＱ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４７Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖２）
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４７Ｃ）
第３のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖３）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（ホール、３４９Ｃ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
【０２７８】
図２３は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して発現されたタンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０２７９】
レーン１は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の三価２×１「ＢＣ１−２×１」タンパク質の溶離液を示す。レーン２は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の、より分子量が低く、移動が速い、二価「ＢＣ１」タンパク質を示す。レーン３〜５は、プロテインＡを使用した「ＢＣ１−２×１」の精製を示す。レーン６および７は、ＣＨ１親和性樹脂を使用した「ＢＣ１−２×１」の精製を示す。
【０２８０】
図２４は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）解析を使用して、二価「ＢＣ１」構築物のアビディティを、三価２×１「ＢＣ１−２×１」構築物のアビディティと比較したものである。ビオチン化抗原「Ａ」を表面に固定化し、その表面上を、結合解析のために、抗体構築物に通過させる。
６．１２．８．
（実施例８）
三価２×１三重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物（「ＴＢ１１１」）
【０２８１】
本発明者らは、図２５に概略化された構成を有する三価２×１三重特異性分子「ＴＢ１１１」を設計した。図２１に示すドメイン命名規則を参照して、ＴＢ１１１は、以下の構成を有する（「Ａｄａ」は、アダリムマブ由来のＶ領域を示す）：
ポリペプチド鎖１
ドメインＮ：ＶＨ（「Ａｄａ」）
ドメインＯ：ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、３９４Ｃ）
ドメインＡ：ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ：ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、３４９Ｃ）
ドメインＤ：ＣＨ２
ドメインＥ：ＣＨ３（ノブ、３５４Ｃ）
ポリペプチド鎖５
ドメインＰ：ＶＬ（「Ａｄａ」）
ドメインＱ：ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、３９４Ｃ）
ポリペプチド鎖２
ドメインＦ：ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ：ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、３５１Ｃ）
ポリペプチド鎖３
ドメインＨ：ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ：ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ：ＣＨ２
ドメインＫ：ＣＨ３（ホール、３４９Ｃ）
ポリペプチド鎖４（＝「ＢＣ１」鎖４）
ドメインＬ：ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ：ＣＨ１
この構築物は、発現しなかった。
６．１２．９．
（実施例９）
三価１×２二重特異性構築物（「ＢＣ２８−１×２」）
【０２８２】
本発明者らは、以下のドメイン構造を有する三価１×２二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを構築した：
第１のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖１）（配列番号２４）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｋ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
第３のポリペプチド鎖（配列番号３７）
ドメインＲ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＳ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
リンカー＝ＧＳＧＳＧＳ
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）（配列番号１１）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
第６のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＴ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＵ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
【０２８３】
Ｈ：Ｌ結合抗原結合部位と同様に、Ａ：Ｆ抗原結合部位は「抗原Ａ」に特異的である。Ｒ：Ｔ抗原結合部位は、ＰＤに対して特異的である。この構築物の特異性は、したがって抗原「Ａ」×（ＰＤ１−抗原「Ａ」）である。
６．１２．１０．
（実施例１０）
三価１×２二重特異性構築物（「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」）
【０２８４】
本発明者らは、図２７に概略化した一般構造を有する、三価１×２二重特異性分子（「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」）を構築した。ドメインの命名法を図２６に示す。
【０２８５】
図２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ここで非還元および還元条件下の「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」構築物を示すレーンを枠で囲っている。
【０２８６】
図２９は、２つの抗体「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」および「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の抗原結合を比較している。「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」は、ＣＴＬＡ４に一価的に結合する一方、「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」は、ＣＴＬＡ４に二価的に結合する。
６．１２．１１．
（実施例１１）
三価１×２三重特異性構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」
【０２８７】
本発明者らは、図３０に概略化した一般構造を有する三価１×２三重特異性分子を構築した。図２６に示すドメインの命名法を参照して、
第１のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖１）［配列番号２４］
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｋ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入物）
第３のポリペプチド鎖（配列番号４５）
ドメインＲ＝ＶＬ（ＣＴＬＡ４−４）
ドメインＳ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃ挿入物）
リンカー＝ＧＳＧＳＧＳ
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
第６のポリペプチド鎖（＝ｈＣＴＬＡ４−４鎖２）（配列番号５３）
ドメインＴ＝ＶＨ（ＣＴＬＡ４）
ドメインＵ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃ挿入物）
【０２８８】
この三重特異性構築物の抗原結合部位は、以下の通りであった：
抗原結合部位Ａ：Ｆは、「抗原Ａ」に特異的であった；
抗原結合部位Ｈ：Ｌは、ＰＤ１（ニボルマブ配列）に特異的であった；
抗原結合部位Ｒ：Ｔは、ＣＴＬＡ４に特異的であった。
【０２８９】
図３１は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ２８−１×１×１ａ」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
６．１２．１２．
（実施例１２）
二価および三価構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
【０２９０】
図３２は、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０２９１】
レーン１（非還元条件）およびレーン２（還元条件、＋ＤＴＴ）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ１」である。レーン３（非還元）およびレーン４（還元）は、三価の二重特異性２×１構築物「ＢＣ１−２×１」である（実施例７参照）。レーン５（非還元）およびレーン６（還元）は、三価１×２二重特異性構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」である（実施例１０参照）。レーン７（非還元）およびレーン８（還元）は、実施例１１に記載の三価１×２三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」構築物である。
【０２９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
６．１２．１３．
（実施例１３）
結合解析
【０２９３】
図３３は、３つの抗原：ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ−４へのＯｃｔｅｔ結合解析を示す。それぞれの場合において、抗原が固定化され、Ｂ−Ｂｏｄｙが検体である。参照のために、１×１二重特異性の「ＢＣ１」と「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」も比較すると、１×１  Ｂ−Ｂｏｄｙが、抗原結合部位が選択される抗原のみに特異的に結合することが実証された。
【０２９４】
図３３Ａは、「ＢＣ１」がＰＤ１および抗原「Ａ」に結合するが、ＣＴＬＡ４に結合しないことを示す。図３３Ｂは、二価の二重特異性１×１構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」がＣＴＬＡ４に結合するが、抗原「Ａ」またはＰＤ１に結合しないことを示す。図３３Ｃは、三価三重特異性１×２構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」がＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４に結合することを示す。
６．１２．１４．
（実施例１４）
四価構築物
【０２９５】
図３５は、２×２四価二重特異性構築物「ＢＣ２２−２×２」の全体の構成を示す。２×２四価二重特異性は、それぞれの可変ドメイン−定常ドメインセグメントを複製することによって「ＢＣ１」足場で構築した。ドメインの命名法を図３４に概略化する。
【０２９６】
図３６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン７〜９は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後（「ＣＨ１溶離液」）、およびさらにイオン交換クロマトグラフィ精製した後（レーン８、「ＩＥＸ後のｐｋ１」；レーン９、「ＩＥＸ後のｐｋ２」）の「ＢＣ２２−２×２」四価構築物をそれぞれ示す。レーン１〜３は、ＣＨ１親和性精製した後（レーン１）、レーン２および３はさらにイオン交換クロマトグラフィした後の三価２×１構築物「ＢＣ２１−２×１」である。レーン４〜６は、１×２三価構築物「ＢＣ１２−１×２」である。
【０２９７】
図３７は、２×２四価構築物全体の構成を示す。
【０２９８】
図３９および４０は、代替的な構成を有する四価構築物の概略図である。ドメインの命名法を図３８に示す。
６．１２．１５．
（実施例１５）
Ｂ−Ｂｏｄｙによる二重特異性抗原係合
【０２９９】
四価二重特異性２×２  Ｂ−Ｂｏｄｙ「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」を構築した。より詳細には、図３８にまとめたドメインおよびポリペプチド鎖の参照を使用して、
第１のポリペプチド鎖
ドメインＡ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＢ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ノブ）
ドメインＤ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＥ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
ドメインＷ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＸ＝ＣＨ１（ＩｇＧ１）
第３のポリペプチド鎖（第１のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＨ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＩ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ノブ）
ドメインＪ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＫ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
ドメインＷＷ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＸＸ＝ＣＨ１（ＩｇＧ１）
第２のポリペプチド鎖
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ホール）
第４のポリペプチド鎖（第３のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ホール）
第７のポリペプチド鎖
ドメインＹ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＺ＝ＣＬカッパ
第８のポリペプチド鎖（第７のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＹＹ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＺＺ＝ＣＬカッパ。
【０３００】
これを、実施例１に記載されるようにクローニングし、発現させた。ここで、ＢＬＩ実験は、ビオチン化抗原「Ａ」のストレプトアビジンセンサー上への固定化、その後の１０×カイネティックバッファーを用いたベースラインの確立で構成した。次いで、センサーを、無細胞発現された「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」中に浸漬し、次いで、新たなベースラインを確立した。最終的に、センサーを、第２の結合事象が観察された１００ｎＭ  ＴＮＦαに浸漬し、単一の「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」構築物による両方の抗原の二重特異性結合を確認した。結果を図４１に示す。
６．１２．１６．
（実施例１６）
「ＢＢ−ＩｇＧ  ２×２」の抗原特異的細胞結合
【０３０１】
Ｅｘｐｉ−２９３細胞を、Ｅｘｐｉ−２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｍｏｃｋトランスフェクトするかまたは抗原「Ｂ」で一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、Ｅｘｐｉ−２９３細胞を回収し、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定化した。細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄した。２００，０００抗原ＢまたはＭｏｃｋトランスフェクトされたＥｘｐｉ−２９３細胞を、Ｖ底９６ウェルプレート内の１００ｕＬのＰＢＳ中に入れた。細胞を、３ｕｇ／ｍＬの濃度の「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ  ２×２」と１．５時間、室温でインキュベートした。細胞を、３００×Ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、８μｇ／ｍＬの濃度の１００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト第２抗体と室温で１時間インキュベートした。細胞を３００×Ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、細胞結合をＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅを使用してフローサイトメトリーによって確認した。結果を図４２に示す。
６．１２．１７．
（実施例１７）
二価および三価構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
【０３０２】
図４５は、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０３０３】
レーン１（非還元条件）およびレーン２（還元条件、＋ＤＴＴ）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ１」である。レーン３（非還元）およびレーン４（還元）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ２８」である（実施例４参照）。レーン５（非還元）およびレーン６（還元）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ４４」である（実施例５参照）。レーン７（非還元）およびレーン８（還元）は、三価１×２二重特異性「ＢＣ２８−１×２」構築物である（実施例９参照）。レーン９（非還元）およびレーン１０（還元）は、実施例１１に記載の三価１×２三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」構築物である。
【０３０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
６．１２．１８．
（実施例１８）
可変−ＣＨ３ジャンクション操作の安定性解析
【０３０５】
様々なジャンクションバリアントの組合せ間の対形成安定性を評価した。示差走査蛍光定量を行って、鎖１のＶＬ−ＣＨ３ポリペプチド（ドメインＡおよびＢ）と鎖２のＶＨ−ＣＨ３ポリペプチド（ドメインＦおよびＧ）との間の様々なジャンクションバリアント対形成の融点を決定した。ジャンクションバリアント「ＢＣ６ｊｖ」、「ＢＣ２８ｊｖ」、「ＢＣ３０ｊｖ」、「ＢＣ４４ｊｖ」および「ＢＣ４５ｊｖ」（それぞれ、上記表２および表３でみられる「ＢＣ６」、「ＢＣ２８」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ４４」および「ＢＣ４５」の対応するジャンクション配列を有する）は、７６〜７７度の範囲のＴｍを有し、対形成安定性の増加を実証する（表４参照）。図４６は、「ＢＣ２４ｊｖ」、「ＢＣ２６ｊｖ」および「ＢＣ２８ｊｖ」の熱転移の差異を示し、「ＢＣ２８ｊｖ」が３つの中で安定性が最も大きいことを実証している。図のｘ軸は温度であり、ｙ軸は温度変化で割った蛍光変化（−ｄＦｌｕｏｒ／ｄＴｅｍｐ）である。実験は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるNiesenら（Nature  Protocols、（２００７年）２巻、２２１２〜２２２１頁）に記載されているように行った。
【表４】
2019534277.tif 000006
６．１３．配列
【化１】
2019534277.tif 000007
【化２】
2019534277.tif 000008
【化３】
2019534277.tif 000009
【化４】
2019534277.tif 000010
【化５】
2019534277.tif 000011
【化６】
2019534277.tif 000012
【化７】
2019534277.tif 000013
【化８】
2019534277.tif 000014
【化９】
2019534277.tif 000015
【化１０】
2019534277.tif 000016
【化１１】
2019534277.tif 000017
【化１２】
2019534277.tif 000018
【化１３】
2019534277.tif 000019
【化１４】
2019534277.tif 000020
他の配列：
＞ヒンジ：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ［配列番号５６］
＞ＢＣ１−ポリペプチド１  ドメインジャンクション：ＩＫＲＴＰＲＥＰ［配列番号５７］
＞ＢＣ１５−ポリペプチド１  ドメインジャンクション：ＩＫＲＴＶＲＥＰ［配列番号５８］
＞ＢＣ１６−ポリペプチド１  ドメインジャンクション：ＩＫＲＴＲＥＰ［配列番号５９］
＞ＢＣ１７−ポリペプチド１  ドメインジャンクション：ＩＫＲＴＶＰＲＥＰ［配列番号６０］
＞ＢＣ２６−ポリペプチド１  ドメインジャンクション：ＩＫＲＴＶＡＥＰ［配列番号６１］
＞ＢＣ２７−ポリペプチド１  ドメインジャンクション：ＩＫＲＴＶＡＰＲＥＰ［配列番号６２］
＞ＢＣ１−ポリペプチド２  ドメインジャンクション：ＳＳＡＳＰＲＥＰ［配列番号６３］
＞ＢＣ１３−ポリペプチド２  ドメインジャンクション：ＳＳＡＳＴＲＥＰ［配列番号６４］
＞ＢＣ１４−ポリペプチド２  ドメインジャンクション：ＳＳＡＳＴＰＲＥＰ［配列番号６５］
＞ＢＣ２４−ポリペプチド２  ドメインジャンクション：ＳＳＡＳＴＫＧＥＰ［配列番号６６］
＞ＢＣ２５−ポリペプチド２  ドメインジャンクション：ＳＳＡＳＴＫＧＲＥＰ［配列番号６７］
７．参照による組み込み
【０３０６】
本出願で引用された全ての公開文献、特許、特許出願および他の文献は、あたかも個別の公開文献、特許、特許出願または他の文献が、あらゆる目的のために参照により個別に示されて組み込まれているのと同程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
８．均等物
【０３０７】
様々な特定の実施形態を例証および記載してきたが、上記明細書は限定的なものではない。様々な変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われうることが理解される。多くの変形が、本明細書を検討すると、当業者には明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2019534277.tif 000034
【図１５】
2019534277.tif 000035
【図１６】
2019534277.tif 000036
【図１７】
2019534277.tif 000037
【図１８】
2019534277.tif 000038
【図１９】
2019534277.tif 000039
【図２０】
2019534277.tif 000040
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2019534277.tif 000045
【図２６】
2019534277.tif 000046
【図２７】
2019534277.tif 000047
【図２８】
2019534277.tif 000048
【図２９】
2019534277.tif 000049
【図３０】
2019534277.tif 000050
【図３１】
2019534277.tif 000051
【図３２】
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【図３３】
2019534277.tif 000053
【図３４】
2019534277.tif 000054
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
2019534277.tif 000057
【図３８】
2019534277.tif 000058
【図３９】
2019534277.tif 000059
【図４０】
2019534277.tif 000060
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
2019534277.tif 000066
【配列表】
2019534277000001.app
【国際調査報告】
2019534277.tif 000067
2019534277.tif 000068
2019534277.tif 000069
2019534277.tif 000070
2019534277.tif 000071