(57)【要約】【課題】新規なバイオセンサシステム等を提供する。【解決手段】熱制御バイオセンサを含むＳＰＲセンサが開示される。さらに、本開示は、周囲温度よりも高い温度までＳＰＲセンサを加熱するステップを含むＳＰＲ技法について述べる。バイオセンサシステムは、導電性金属薄膜が担持された第１の側と第２の側とを有する光学的に透明な基板と、導電性金属薄膜に接触している一対の導電性電極と、上記基板の前記第２の側に隣り合って位置決めされた光学プリズムと、上記基板の前記第１の側に隣り合って位置決めされた、流路を画定しているくぼんだ領域を有するブロックと、上記基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定されたフローセルと、上記基板の前記第２の側を照明するように位置決めされた光源と、上記基板の前記第２の側から反射した光を受けるように位置決めされた検出装置と、一対の導電性電極に接続された直流源とを備える。【選択図】  図３
2019506603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性金属薄膜が担持された第１の側と、第２の側とを有する、光学的に透明な基板と、
前記導電性金属薄膜に接触している一対の導電性電極と、
前記光学的に透明な基板の前記第２の側に隣り合って位置決めされた光学プリズムと、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側に隣り合って位置決めされた、流路を画定しているくぼんだ領域を有するブロックと、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定されたフローセルと、
前記光学プリズムに光を通すことで前記光学的に透明な基板の前記第２の側を照明するように位置決めされた光源と、
前記光学的に透明な基板の前記第２の側から反射した光を受けるように位置決めされた検出装置と、
前記一対の導電性電極に接続された直流源と、
を備える、バイオセンサシステム。
【請求項２】
前記一対の導電性電極が、前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定された前記フローセルの外側で前記導電性金属薄膜に接触している、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項３】
前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定された前記フローセルの温度を監視するように位置決めされた温度センサをさらに備える、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項４】
前記温度センサが、前記フローセル内に位置決めされている、請求項３に記載のバイオセンサシステム。
【請求項５】
前記温度センサが、前記フローセル内の前記導電性金属薄膜に固定されている、請求項３に記載のバイオセンサシステム。
【請求項６】
前記温度センサが、前記ブロックに組み込まれている、請求項３に記載のバイオセンサシステム。
【請求項７】
前記温度センサからの入力を受信し前記一対の導電性電極への電流の出力を調節するように構成された制御装置をさらに備える、請求項３に記載のバイオセンサシステム。
【請求項８】
金属薄膜を支持するガラス基板と、
前記金属薄膜に接触している一対の電極と、
前記ガラス基板又は前記金属薄膜に接触している温度センサと、
を備える、ＳＰＲセンサカセット。
【請求項９】
金属薄膜を支持するガラス基板、
前記金属薄膜に接触している一対の電極、及び、
前記ガラス基板又は前記金属薄膜に接触している温度センサ
を備える、ＳＰＲセンサカセットと、
前記ＳＰＲセンサカセットを受容するように構成されたポート、
前記ＳＰＲセンサカセットが前記ポート内に位置決めされたときに前記ＳＰＲセンサカセットの前記ガラス基板に接触するように位置決めされた光学プリズム、
前記ＳＰＲセンサカセットが前記ポート内に位置決めされたときに前記ＳＰＲセンサカセットの前記ガラス基板に光を向けるように構成された光源、
前記ＳＰＲセンサカセットが前記ポート内に位置決めされたときに前記ＳＰＲセンサカセットの前記ガラス基板から反射する光を受けるように位置決めされた検出器、
前記ＳＰＲセンサカセットが前記ポート内に位置決めされたときに前記一対の電極に電気的に接触する直流電源、及び、
前記ＳＰＲセンサカセットが前記ポート内に位置決めされたときに前記温度センサからのデータを受信するように構成され、前記一対の電極への電流の流れを管理するように構成された、制御装置
を備える、ＳＰＲ機器と
を具備する、バイオセンサシステム。
【請求項１０】
前記ＳＰＲセンサカセットが前記ポート内に位置決めされたときに前記ＳＰＲセンサカセットの温度を低下させるように構成された冷却システムをさらに備える、請求項９に記載のバイオセンサシステム。
【請求項１１】
耐導電酸化性の導電性金属薄膜が担持された第１の側と、第２の側とを有する、光学的に透明な基板、
前記導電性金属薄膜に接触している一対の導電性電極、
前記光学的に透明な基板の前記第２の側に隣り合って位置決めされた光学プリズム、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側に隣り合って位置決めされた、流路を画定しているくぼんだ領域を有するブロック、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定されたフローセル、
前記光学プリズムに光を通すことで前記光学的に透明な基板の前記第２の側を照明するように位置決めされた光源、
前記光学的に透明な基板の前記第２の側から反射される光を受けるように位置決めされた検出装置、
前記一対の導電性電極に接続された直流電源、及び、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定された前記フローセルの温度を監視するように位置決めされた温度センサプローブ、
を備えた熱制御バイオセンサシステムを用意するステップと、
前記導電性金属薄膜の前記第１の側に表面改質化合物を付着させるステップと、
前記フローセルについての基準温度を確立するステップと、
前記フローセルについての目標温度を確立するステップと、
前記一対の導電性電極と前記導電性金属薄膜に十分な電流を流して前記フローセルの温度を前記基準温度から前記目標温度まで上昇させるステップと、
を含む、ＳＰＲ分析を実行する方法。
【請求項１２】
耐導電酸化性の導電性金属薄膜が担持された第１の側と、第２の側とを有する、光学的に透明な基板、
前記導電性金属薄膜に接触している一対の導電性電極、
前記光学的に透明な基板の前記第２の側に隣り合って位置決めされた光学プリズム、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側に隣り合って位置決めされた、流路を画定しているくぼんだ領域を有するブロック、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定されたフローセル、
前記光学プリズムに光を通すことで前記光学的に透明な基板の前記第２の側を照明するように位置決めされた光源、
前記光学的に透明な基板の前記第２の側から反射される光を受けるように位置決めされた検出装置、
前記一対の導電性電極に接続された直流電源、及び、
前記光学的に透明な基板の前記第１の側と前記ブロックによって画定された前記フローセルの温度を監視するように位置決めされた温度センサプローブ
を備えた熱制御バイオセンサシステムを用意するステップと、
前記導電性金属薄膜の前記第１の側に表面改質化合物を付着させるステップと、
前記フローセルについての基準温度を確立するステップと、
ＳＰＲ応答を監視しながら前記フローセルに分析物を流すステップと、
前記直流電源からの直流電気を前記一対の導電性電極に通すことによって前記フローセルの温度を調節するステップと、
フローセルの温度を調節する前記ステップの間にＳＰＲ応答を監視し続けるステップと
を含む、ＳＰＲ分析を実行する方法。
【請求項１３】
温度を調節する前記ステップが、約１０秒間で５℃の温度上昇を達成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
温度を調節する前記ステップが、約４秒間で５℃の温度上昇を達成する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
温度を調節する前記ステップが、約２秒間で５℃の温度上昇を達成する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１５年１月８日出願の米国仮特許出願第６２／２７６６２５号、及び２０１５年１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／２８７２４９号の利益を主張する。
【政府の資金援助を受けた研究等に関する申告】
【０００２】
[0002]本発明は、国立衛生研究所、国立先進トランスレーショナル科学センターより授与されたＳＢＩＲファストトラックアワード番号Ｒ４４ＴＲ０００６１８に基づく連邦政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、分子の相互作用、特に生体分子相互作用、分子の会合速度及び解離速度、親和定数、及び分子の相互作用又は結合事象に関連する他の特性の測定値を調べるために通常使用される分析方法である。表面プラズモン共鳴は、最も簡単に言えば、センサの表面における屈折率の変化を検出する技法である。センサ（１０）は、ガラス基板（１２）と、薄い貴金属コーティング（１４）（例えば、金、銀など）とを含む。図１を参照すると、偏光された光は、その基板を通過して金コーティングに反射する。特定の入射角度において、光エネルギーの一部分は、金コーティングを通って結合し、サンプルと金表面との間の界面に表面プラズモン波（１６）を作り出す。表面プラズモン波を維持するのに必要な入射光の角度は、質量の変化から、表面（１８）における屈折率の変化の影響を非常に受けやすい。これらの屈折率の変化は、生体分子の会合及び解離を監視することに使用される。
【０００４】
[0004]ＳＰＲ効果は、温度の影響を非常に受けやすい。１℃未満の温度変化でも、ＳＰＲ応答に劇的なシフトが引き起こされることがある。したがって、分析における熱パラメータの正確な制御は不可欠である。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]一実施形態では、本開示は、バイオセンサシステムについて述べる。バイオセンサシステムは、導電性金属薄膜が担持された第１の側と、第２の側とを有する、光学的に透明な基板と、導電性金属薄膜に接触している一対の導電性電極と、光学的に透明な基板の第２の側に隣り合って位置決めされる光学プリズムとを備える。さらに、バイオセンサシステムは、流路を画定しているくぼんだ領域を有するブロックを含む。ブロックは、光学的に透明な基板の第１の側に隣り合って位置しており、したがって、ブロックと光学的に透明な基板の第１の側は、フローセルを画定している。またさらに、バイオセンサシステムは、光学的プリズムに光を通すことで光学的に透明な基板の第２の側を照明するように位置決めされた光源と、光学的に透明な基板の第２の側から反射した光を受けるように位置決めされた検出装置とを含む。またさらに、バイオセンサシステムは、一対の導電性電極に電気的に接続された直流電源を含む。
【０００６】
[0006]さらに、本開示は、ＳＰＲセンサカセットについて述べる。センサカセットは、金属薄膜を支持するガラス基板と、金属薄膜に接触している一対の電極と、ガラス基板又は金属薄膜に接触している温度センサとを備える。
【０００７】
[0007]またさらに、本開示は、ＳＰＲ機器へのドッキング又は挿入に適したＳＰＲセンサカセットを備えたバイオセンサシステムについて述べる。ＳＰＲセンサカセットは、金属薄膜を支持するガラス基板と、金属薄膜に接触している一対の電極と、ガラスフィルム基板又は金属薄膜に接触している温度センサとを備える。ＳＰＲ機器は、前記ＳＰＲセンサカセットを受容するように構成されたポートを備える。ＳＰＲ機器は、ＳＰＲセンサがポート内に位置決めされたときにＳＰＲセンサカセットのガラス基板に接触するように位置決めされた光学プリズムをもたらす。さらに、ＳＰＲ機器は、ＳＰＲセンサカセットがポート内に位置決めされたときにＳＰＲセンサカセットのガラス基板に光を向けるように構成された光源と、ＳＰＲセンサカセットがポート内に位置決めされたときにＳＰＲセンサカセットのガラス基板から反射する光を受けるように位置決めされた検出器とを含む。ＳＰＲセンサ機器は、また、ＳＰＲセンサカセットがポート内に位置決めされたときに一対の電極に電気的に接触する直流電源をもたらす。さらに、ＳＰＲセンサ機器は、ＳＰＲセンサカセットがポート内に位置決めされたときに温度センサからのデータを受信するように構成され一対の電極への電流の流れを管理するように構成された、制御装置をもたらす。
【０００８】
[0008]さらに、本開示は、ＳＰＲ分析を実行する方法を提供する。方法は、
耐導電酸化性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）の導電性金属薄膜が担持された第１の側と、第２の側とを有する、光学的に透明な基板、
導電性金属薄膜に接触している一対の導電性電極、
光学的に透明な基板の第２の側に隣り合って位置決めされる光学プリズム、
光学的に透明な基板の第１の側に隣り合って位置決めされる、流路を画定しているくぼんだ領域を有するブロック、
光学的に透明な基板の第１の側とブロックによって画定されたフローセル、
光学プリズムに光を通すことで光学的に透明な基板の第２の側を照明するように位置決めされた光源、
光学的に透明な基板の第２の側から反射される光を受けるように位置決めされた検出装置、
一対の導電性電極に接続された直流電源、及び、
光学的に透明な基板の第１の側とブロックによって画定されたフローセルの温度を監視するように位置決めされた温度センサプローブ
を備えた熱制御バイオセンサシステムを用意するステップと、
導電性金属薄膜の第１の側に表面改質化合物を付着させるステップと、
フローセルについての基準温度を確立するステップと、
ＳＰＲ応答を監視しながらフローセルに分析物を流すステップと、
直流電源からの直流電力を一対の導電性電極に通すことによってフローセルの温度を調節するステップと
フローセルの温度を調節するステップの間、ＳＰＲ応答の監視を続けるステップと
を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】表面プラズモン共鳴（クレッチマン（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ）配置）の簡略化した概略図である。
【図２Ａ】熱制御バイオセンサの一実施形態の基本構成要素の斜視図である。
【図２Ｂ】電極が可変ＤＣ電流源（４）に接続されている、金属フィルム（２）に接触している導電性電極（３）の上からの図である。
【図３】熱制御バイオセンサの図である。
【図４Ａ】薄膜加熱カセットの図である。
【図４Ｂ】薄膜加熱カセットの側面図である。
【図５】増加する電流の印加に応答したＳＰＲ応答及びチップ温度変化を表すグラフである。
【図６】薄膜加熱（ＴＦＨ）手順前後のＣＯＯＨ５センサにおけるタンパク質の予備濃縮を表すグラフである。
【図７Ａ】炭酸脱水酵素ＩＩと１μＭアセタゾールアミドの相互作用を示すグラフである。相互作用は、設定機器分析温度１３．４℃におけるものである。破線は、ＳＰＲ応答曲線であり、実線は、結合及び親和性のデータを計算するための適合モデルである。
【図７Ｂ】炭酸脱水酵素ＩＩと１μＭアセタゾールアミドの相互作用を示すグラフである。相互作用は、ＴＦＨを用いた、上昇した設定機器分析温度３０℃におけるものである。破線は、ＳＰＲ応答曲線であり、実線は、結合及び親和性のデータを計算するための適合モデルである。
【図８Ａ】高速遷移設定を用いた、単回の注入の間のＳＰＲ分析温度の自動ステッピング（ｓｔｅｐｐｉｎｇ）を示すグラフである。ステッピングプロファイルには、いくらかの温度オーバーシュート及び各設定値におけるより強引な温度制御が考慮された。段階同士の間の遷移時間は、約２秒だった。
【図８Ｂ】単回の注入の間の、ＳＰＲ分析温度の自動ステッピングを示すグラフである。ステッピングプロファイルは、温度オーバーシュートを避けるように調節した。この実験では、約１０秒以内で安定した５℃の温度遷移が達成された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[0021]図２Ａ及び図２Ｂは、以下で討論する方法において使用されるバイオセンサチップ（３０）の一実施形態の基本構成要素の図である。これに限定されるわけではないがガラスのような、光学的に透明な基板（１２）は、導電性金属薄膜（１４）でコーティングされている、又はそれを担持している。薄膜は、導電酸化に対する耐性及びＳＰＲ分析における有用性を有する金、銀又は他の金属とすることができる。バイオセンサチップ（３０）には、さらに、金属膜（１４）に接触する導電性電極（３２）を担持する。図２Ｂは、金属膜（１４）に接触している導電性電極（３２）を上から見た図である。電極（３２）と可変ＤＣ電流源（３４）の接続により、電流を金属薄膜（１４）に流す回路が形成される。
【００１１】
[0022]図３には、開示の方法を実践するのに適した熱制御バイオセンサシステム（４０）の簡素化された実施形態が示されている。図３に示されるように、バイオセンサチップ３０は、光学プリズム（４２）とブロック（４３）との間に保持される。ブロック（４３）は、流路を画定するくぼんだ領域を有する。したがって、面（１８）、すなわちバイオセンシング面（５２）及びブロック（４３）は、協働してフローセル（４４）を画定する。光源（４６）は、金属膜（１４）を照明し、反射した光は、検出装置（４８）に当たる。フローセル（４４）は、約１マイクロリットルのおおよその容積を画定する。したがって、金属膜（１４）が加熱されると、フローセル（４４）内での迅速な熱変化が可能になる。面（１８）に生体分子（図示せず）を付着させて、ＳＰＲバイオセンシング面（５２）を形成する。図４Ａに示されるように、温度センサ（５４）は、バイオセンシング面（５２）及びフローセル（４４）内の温度を監視できるように含まれ得る。温度センサ（５４）は、バイオセンサチップ（３０）の面（１８）に取り付けることができる、或いはブロック（４３）、又はフローセル（４４）内若しくはバイオセンシング面（５２）の温度を直接監視することができる任意の他の好都合な場所に固定することができる。温度センサ（５４）は、熱電対、サーミスタ、又は温度を監視しデータを制御装置に提供する他の適当なセンサとすることができる。
【００１２】
[0023]ＳＰＲ分析の間、約０．１アンペア〜約１．５アンペアのＤＣ電流が電極（３２）及び金属膜（１４）に制御された方法で流される。電流によって、薄膜の抵抗加熱により金属膜（１４）が加熱される。したがって、ＳＰＲ分析の間、金属膜（１４）が加熱されると、金属膜（１４）のバイオセンシング面（５２）側に付着された生体分子（図示せず）も周囲温度を上回る予め選択した温度まで加熱される。さらに、電流を制御された方法で変化させると、ＳＰＲ分析中の温度を上昇又は下降のどちらにも調節することができる。熱電対プローブ（５４）を使用する場合、熱制御バイオセンサシステム（４０）は、さらに、熱電対プローブ（５４）によって検出される温度の変化に応答して所望の目標温度を維持するように電流を調節することによるバイオセンサチップ（３０）に流れる電流の制御を可能にする。熱電対プローブ（５４）を用いた温度の自動観測及び制御は、制御装置（図示せず）によって達成することができきる。制御装置に、これに制限されるわけではないがＡ／Ｄ変換器を介して温度を読み取り比例積分微分（ＰＩＤ）制御ループと協働して所望の温度を維持又は達成するのに必要な目標出力電流を決定するマイクロコントローラの使用を含む、多種多様なオプションを利用することができる。制御装置は、目標出力電流の決定後、演算増幅器の電力ステージに接続されたＤ／Ａ変換器を用いて所望の電流を設定する。
【００１３】
[0024]熱制御バイオセンサシステム（４０）は、金属膜（１４）のバイオセンシング面（５２）で起こる分子間相互作用の熱制御とＳＰＲ分析を同時に行う。これに限定されるわけではないが（例えば、デキストラン、又は他のポリマー、チオール、活性組織化単分子層（ａｃｔｉｖｅ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）など）生体分子の付着のような、バイオセンシング面（５２）の表面の変更は、バイオセンサチップ（３０）に対する熱制御性に悪影響を及ぼさない。金属薄膜（１４）の使用は、バイオセンシング面（５２）及びフローセル（４４）内での迅速な熱傾斜率（ｔｈｅｒｍａｌ  ｒａｍｐ  ｒａｔｅ）を可能にするので、有益である。大部分の実施形態では、熱制御バイオセンサシステム（４０）の構成において、フローセル（４４）の可能な限り近くに導電性電極（３２）が置かれ、以て、ＳＰＲを受ける領域、すなわちバイオセンシング面（５２）におけるさらなる熱的制御が可能になる。
【００１４】
[0025]上述した熱制御バイオセンサシステム（４０）は、正確に固定された温度でのＳＰＲ分析を実施することができる。さらに、方法は、迅速な調節及びそれに続く固定された温度でのアッセイにおける熱平衡状態の確立を可能にする。さらに、方法は、ＳＰＲ分析中、すなわちフローセル（４４）を通ってバイオセンシング面（５２）の上を分析物が流れる間にリアルタイムで温度を変えることができ、同時に温度を変えながらＳＰＲ応答の観測／測定を行うことができる。方法は、上述したバイオセンサチップ（３０）を利用し、電流を金属膜（１４）に印加してその金属膜（１４）の局所的な加熱効果を生み出す。金属膜（１４）は、それ自体が金層であってもよく、又はＳＰＲ界面、すなわち面（１８）に配置される追加の導電膜（図示せず）であってもよい。薄膜加熱効果は、熱制御バイオセンサシステム（４０）内の原位置で生じ、ＳＰＲアッセイパラメータとして加味され得る。
【００１５】
[0026]上述したように、開示のデバイス及び方法は、金属膜（１４）への電流の印加に直流を利用する。金属膜（１４）は、５０〜１００ｎｍ程度の厚さを有し、以て必要なレベルの電気抵抗が実現する。ＤＣ電流が電極（３２）に印加されると、金属膜（１４）の抵抗の結果、金属膜（１４）が加熱され、ひいては、フローセル（４４）及びバイオセンシング面（５２）に付着された任意の生体分子と共にバイオセンシング面（５２）も含めて、バイオセンサチップ（３０）が周囲条件以上に加熱される。加熱効果の程度は、印加された電流量に直接関係する。したがって、フローセル（４４）内の温度条件は、電流を変えることによって調節することができる。当業者には、バイオセンシング面（５２）及びフローセル（４４）の加熱のために、制御されるＤＣ電流を電極（３２）に印加するのに、多くのオプションを利用することができると理解されよう。ＤＣ電流を送出する機構のいくつかの非限定的な例としては、これらに限定されるわけではないが、演算増幅器の直接接続、専用の電流源、バック変換器のような電圧制御機構又はＰＷＭデューティサイクル調節が挙げられる。
【００１６】
[0027]開示の方法の実施は、熱制御バイオセンサシステム（４０）における薄膜抵抗加熱の初期ステップを含む。方法は、さらに、分子間相互作用分析の間におけるＳＰＲ応答の測定とあわせて、バイオセンサ面の温度の同時制御を行うことができる。
【００１７】
[0028]加熱プロセスの監視は、熱電対プローブ（５４）又は従来からある他の温度監視装置によって行うことができる。周囲温度を上回る約３０°に達するのに必要な総電力は開始（周囲）温度によって決まるが、一般的に、５Ｗ未満である。電流は、やはりまた、上述した範囲の勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）として印加されてもよく、又は段階的に増加若しくは減少するように印加されてもよい。例えば、図５は、約２０分間に０．１アンペアから１．０アンペアまで０．１アンペア刻みでのＤＣ電流の段階的増加を示している。一温度段階に達するのにセンサに必要な総電力レベルは、センサ面タイプ、構造、センサの局所環境及び周囲温度などの要因に従って変わるが、約５℃刻みでの段階的な迅速な温度上昇は、ある安定した温度段階から他の段階に３０秒未満で達成可能である。したがって２５℃から５５℃までの段階的上昇には、約２分〜約３分必要である。
【００１８】
[0029]熱制御バイオセンサの初期温度が最も低い目標ＳＰＲ分析温度を下回っている場合（例えば、開始分析温度１０℃に対して４℃）、上昇及び下降の両方における迅速な遷移が可能である（５℃進めるのに１分未満の遷移時間）。良好に制御される電力供給源（電圧及び電流）を用いれば、温度は、理論上は、設定値で無期限に、又は表面酸化が起きるまで若しくは金属膜が傷つくまで、保持可能である。
【００１９】
[0030]しかし、電気的に引き起こされる酸化に耐性のある金属膜、例えば金膜を用いると、金属膜のＳＰＲ機能性を劣化させる表面酸化は予想されなくなる。したがって、電流の印加により、金属膜（１４）及びバイオセンシング面（５２）の、周辺環境の周囲温度を上回る温度上昇調節を行うことができる。周辺環境温度は、典型的には、二次温度制御装置（図示せず）によって、バイオセンシング面（５２）の所望の動作温度を下回る温度で一定に保持される。二次温度制御装置は、ＳＰＲ分析ユニットへの組み込みに適した従来の任意の冷却システムとすることができる。金属膜（１４）の電流を減少させる又は除去することで、バイオセンサチップ（３０）が周囲温度に戻ろうとすることが可能になるので、バイオセンシング面（５２）の温度を下降調節することができる。
【００２０】
[0031]開示の装置及び方法の有効性を実証するために試験を行った。原位置での熱制御をもたらすことができることを実証するために、薄膜加熱の概念をバイオセンシング面（５２）自体に適用した。この試験は、バイオセンサチップ（３０）の金金属膜（１４）に適用される電流の印加によって、金金属膜（１４）が熱の微調整のための局所的な熱源として機能することができることを示している。さらに、この試験は、金金属膜（１４）への電流の印加が熱制御バイオセンサシステム（４０）の迅速な熱平衡を可能にすることを示している。
【００２１】
[0032]裸金金属膜（１４）及び熱電対プローブ（５４）を用いた初期ベンチトップ試験は、熱制御をもたらすことができることを示した。電流を増加させると、バイオセンサチップ（３０）の温度も上昇した。図４Ａ及び図４Ｂを参照すると、電流増加による応答を特徴付けるために、ＳＰＲ分析用に設計されたガラス基板（１２）上の金の金属薄膜（１４）で構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）センサカセット（５６）は、バイオセンサチップ（３０）の両端の薄箔電極（３２）と、バイオセンサチップ（３０）の縁に接触して位置決めされる細線熱電対プローブ（５４）を含むように修正した。こうして、センサカセット（５６）は、従来のＳＰＲ機器（図示せず）とのドッキングに適した着脱可能なバイオセンサチップ（３０）を実現する。ベンチトップＳＰＲ機器（図示せず）にセンサカセット（５６）をドッキングすると、熱制御バイオセンサシステム（４０）の必要な構成要素すべてが揃う。具体的には、センサカセット（５６）をドッキングすることで電極（３２）に導線が取り付けられることになり、以てＳＰＲ機器としての図３の熱制御バイオセンサシステム（４０）がもたらされ、ブロック（４３）と、光学プリズム（４２）と、光源（４６）と、検出装置（４８）とを含むことになる。
【００２２】
[0033]熱電対プローブ（５４）は、バイオセンサチップ（３０）の温度変化を監視することができる。ドッキング構成でセンサカセット（５６）を用いる場合、熱電対プローブ（５４）は、典型的には、ベンチトップＳＰＲ分析システムの一部となり、熱制御バイオセンサシステム（４０）のブロック（４３）部分に組み込まれる、又は、任意選択で、フローセル（４４）内若しくは金属膜（１４）に接触するように位置決めされることになる。バイオセンサチップ（３０）に対する電流を調節したときのＳＰＲ応答及びチップ温度を監視した。図５のグラフを参照されたい。分析チャンバにおける周囲温度は、１０℃に保った。図５の第１の領域に表されているように、電流を０．１Ａから１Ａまで緩やかに段階的に増加させた結果、ＳＰＲ応答の対応した変化とともに温度がゆっくりと段階的に上昇した。「電源オフ」によって示される電流の除去の結果、冷却システムの二次制御装置が動作することで、ＳＰＲ応答が周囲条件へと戻った。図５の第２の部分は、０．８Ａまでの電流の単回の増加、及びそれに対応したＳＰＲ応答の変化を反映している。
【００２３】
[0034]観測の結果、時間と共に温度が上昇するにつれてＳＰＲ応答単位（ＲＵ）が減少することは、ＳＰＲ分析システムで先に観測された温度／ＲＵ関係と一致した。さらに、チップの縁における測定温度の変化は、ＳＰＲ応答における変化と相関関係にあった。ＳＰＲディップ（ｄｉｐ）特性には違いがみられず、ＳＰＲ応答の変化は、単に、金膜の抵抗加熱によるものと考えられる。これらの結果は、センサ周囲温度を上回る約２５℃までの温度上昇を示している。しかし、実験を継続したところ、周囲の２０℃の温度を超えて７５℃よりも高い温度に成功裏に達した。
【００２４】
[0035]以下の例は、機能上の薄膜加熱を示している。これらの試験は、上述され図３、図４Ａ及び図４Ｂに示されるバイオセンサチップ（３０）を用いて行った。この例では、ＳＰＲセンサの金表面には、標準的なＣＯＯＨ５の化学成分を担持した。予め較正してある細線熱電対プローブを、熱電対接合部がバイオセンサチップの縁に直接接触できるように位置決めした。光学膜を、組立体の上に置き、ポリイミドテープを用いて箔電極を絶縁し、組立完成体を作製した。熱制御バイオセンサチップ（３０）を、ベンチトップＳＰＲ分析機器にドッキングして熱制御バイオセンサシステム（４０）を用意し、配線接続を完成させ、システムを１０℃の分析温度で平衡状態に置いた。しかし、ドッキングしたバイオセンサチップの縁に接触するように置いた熱電対プローブからの示度は、１３．４℃の温度を示した。したがって、以下に記載の実験についての基準温度には１３．４℃を用いる。すべての実験についての流動緩衝液は、１０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（標準ｄＨＢＳ）を含んでいた。
【００２５】
[0036]初期試験は、界面化学における薄膜加熱の効果を判定するために実施した。５０μｇ／ｍＬの炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡ−ＩＩ）が入った１０ｍＭのアセテート緩衝液（ｐＨ５．０）を、１分間、注入によってセンサチップ上で予備濃縮した。次いで、センサチップを、５分間、電流１アンペア（約１．５Ｖ、総電力約１．５Ｗ）を使用して３９．１℃まで加熱した。電流を中断すると、センサは、１３．４℃に戻って平衡状態になることができた。ＣＡ−ＩＩ注入を繰り返し、予備濃縮シグナルを測定した。
【００２６】
[0037]続いて、標準的なアミン結合の手順を用いて、酵素炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡ−ＩＩ）をバイオセンサチップ（３０）のバイオセンシング面（５２）上に固定化した。約２５００応答単位（ＲＵ）の酵素を固定化した。初期試験は、基準温度１３．４℃で１分間、流量３０μＬ／分で１μＭのアセタゾールアミドをフローセル（４４）の中に注入することで実施した。続いて、電流を７５０ｍＡまで増加させると、シグナルは１０分間で平衡状態になることができた。アセタゾールアミド試験を、表面温度を上昇させて繰り返した。各温度におけるアセタゾールアミドの結合データを、標準的な分析手順に従って処理し、運動速度定数及び平衡解離定数を求めた。運動速度定数及び平衡解離定数から、フローセル内の温度の上昇によって、アセタゾールアミドとＣＡ−ＩＩの結合の相互作用において予想される効果があったことが示された。前述した予想される効果とは、温度の増加と共に、解離速度定数及び平衡解離定数が著しく増加することである。
【００２７】
[0038]頻繁なＳＰＲ分析には、温度の段階的増加が必要となる。図６に報告するデータは、ＳＰＲ分析中の温度の迅速な段階的上昇をもたらす、開示の装置及び方法の能力を示している。図２〜図４Ｂの装置を使用した熱制御バイオセンサシステム（４０）によって制御される外部プログラム可能電力供給源（図示せず）が、導電性電極（３２）に流される電流、したがって金属膜（１４）への電流の印加を管理した。一実施形態では、電力供給源は、ベンチトップＳＰＲユニットに組み込まれそれによって制御される構成要素とすることができる。したがって、ベンチトップＳＰＲユニット内にセンサカセット（５６）をドッキングすることによって、ＳＰＲセンシングゾーンへの分析物又は他の流体の注入の間に所定の温度刻み及び所定の時間間隔で段階的に温度を上昇させるように構成される熱制御バイオセンサシステム（４０）が実現する。目標温度での段階的な温度変化及び時間間隔の管理に必要なＳＰＲ機器への温度フィードバックは、マイクロ流体流路外部のセンサ面に直接接触できるようにフローセル面に取り付けられた細線熱電対によって行った。
【００２８】
[0039]図６に示されるデータは、ＴＦＨ前後での類似したタンパク質予備濃縮特性によって示されるように、１アンペアの電流の印加がバイオセンシング面（５２）でのタンパク質の予備濃縮可能性に悪影響を与えないことを示している。ＣＡ−ＩＩは、次いで、対象となる相互作用における電流の印加を試験するために固定化した。アセタゾールアミド試験からの結果は、図７Ａ及び図７Ｂに示されている。
【００２９】
[0040]図７Ａ及び図７Ｂは、アセタゾールアミドとＣＡ−ＩＩの結合の相互作用における表面温度上昇の影響を示している。この分析では、機器分析モジュール基準温度は、１３．４℃に保ち、バイオセンサチップ（３０）への電流の印加によるＴＦＨを用いてフローセル（４４）の温度を３０℃まで上昇させた。上昇した温度３０℃についての図７Ｂでは、解離速度が明確に増加しており、定量的効果としては、図７Ａに示される１３．４℃の場合の解離速度定数に対して５倍の増加に等しいことが示されている。この試験は、ＳＰＲ分析中のＴＦＨの原理及び有用性を示すのに役立った。
【００３０】
[0041]図８Ａ及び図８Ｂは、フローセル（４４）への分析物の連続的な注入の間の自動的な段階的温度上昇の影響を示している。これらの試験では、流量を５０μｌ／分に設定し、センサ温度変化に関連する、センサ表面の温度及びＳＰＲ応答の変化の両方を監視した。図８Ａは、各段階における限定的な温度設定値のオーバーシューティングを考えに入れた、激しい（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）傾斜プロファイルを使用した機器設定を示している。激しいステッピングプロファイルは、電力変調事象がより高いことから、分析に対していくらかのノイズを引き起こすもととなる。しかし、図８Ａは、バイオセンシング面（５２）及びフローセル（４４）における５℃の温度段階は、２秒以内に達成可能であり、約４秒で安定した温度目標に達したことを示している。図８Ｂは、温度オーバーシュートのないより緩やかな遷移をもたらす、さほど激しくない階段状プロファイルを示している。結果的に、図８Ｂのグラフのプロファイルは、温度制御事象に由来するノイズがより少ない。これらのステッピングパラメータを用いて、比較的よりきれいなシグナルをもたらしつつ、１０秒以内での安定した５℃の温度遷移を達成することができる。図８Ａ及び図８Ｂのグラフは、フローセル（４４）に分析物を注入する間に迅速な温度遷移が可能であることを明確に示している。
【００３１】
[0042]当業者には、本発明の他の実施形態が明らかであろう。したがって、先述した説明は、単に、本発明の一般的な使用及び方法を可能にし、述べているに過ぎない。したがって、以下にある特許請求の範囲において本発明の真の範囲が定義される。
【図１】
2019506603.tif 000003
【図２Ａ】
2019506603.tif 000004
【図２Ｂ】
2019506603.tif 000005
【図３】
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【図４Ａ】
2019506603.tif 000007
【図４Ｂ】
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【図５】
2019506603.tif 000009
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
2019506603.tif 000015