(57)【要約】  本発明は、ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子及びその調製方法を開示する。前記脂質ナノ粒子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを膜材料で被覆して調製され、前記ヌクレオチドの配列は５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’又は５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜材料でアンチセンスオリゴヌクレオチドセグメントを被覆して調製され、
前記ヌクレオチドの配列は５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’又は５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’であり、
前記膜材料は、カチオン性脂質、中性リン脂質、コレステロール、トウェイン、ポリエチレングリコール誘導体を含み、それらのモル比は、（２５〜３５）：（４０〜５０）：（１５〜２５）：（１〜５）：（１〜５）である、ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項２】
前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＭＡを含み；
前記中性リン脂質は、Ｅｇｇ  ＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣを含み；
前記トウェインは、トウェイン２０、トウェイン４０、トウェイン６０、トウェイン８０を含み；
前記ポリエチレングリコール誘導体は、ｍＰＥＧ−ＤＰＰＥ、ｍＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＴＰＧＳ、ｍＰＥＧ−コレステロールを含む、請求項１に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール誘導体におけるＰＥＧは、分子量が５５０〜５０００のモノメチルポリエチレングリコールを含む、請求項１又は２に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコール誘導体は、親水性のポリエチレングリコール鎖又はメチル化ポリエチレングリコール鎖が、リン脂質二重層に埋め込み可能な疎水性構造に連接されて形成された物質であり、
前記疎水性構造は、コレステロール、ビタミンＥ、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルグリセリン、又はこれらの構造類似体である、請求項３に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項５】
前記トウェインがトウェイン８０である、請求項２に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’への修飾は、その両端に位置する最初の３つのヌクレオチドを２’−Ｏ−Ｍｅ修飾し、且つ鎖全体をチオリン酸化修飾するか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’の鎖全体をチオリン酸化修飾するものである、請求項１に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項７】
ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子の調製方法であって、前記脂質ナノ粒子の調製方法は、エタノールで段階希釈する方法であり、具体的には：
カチオン性脂質、中性リン脂質、コレステロール、トウェイン、ポリエチレングリコール誘導体を、所定のモル比で８０％のエタノールに溶解して、混合エタノール溶液を得、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＢＳ緩衝液に溶解してアンチセンスオリゴヌクレオチドのＰＢＳ緩衝液を得る工程（１）と、
得られた混合エタノール溶液とアンチセンスオリゴヌクレオチドのＰＢＳ緩衝液とを等体積で混合して、エタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を得る工程（２）と、
更にＰＢＳ緩衝液を用いて、工程（２）で得られたエタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を等体積で希釈し、エタノールの最終濃度が５％未満の製剤混合液を得るまでＰＢＳ緩衝液を用いて最終濃度のエタノールの混合溶液を等体積で繰り返し希釈する工程（３）と、
工程（３）で得られた製剤混合液に高塩濃度溶液を加え、高塩濃度混合液を得る工程（４）と、
限外濾過装置又は透析装置を用いて、工程（４）で得られた混合液からエタノール及び被覆されていない遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去する工程（５）と、
工程（５）で得られた製品を、孔径が０．２２μｍ以下の濾過膜又はフィルタエレメントにより濾過して除菌し、脂質ナノ粒子を得る工程（６）と、
を含む、調製方法。
【請求項８】
前記ＰＢＳ緩衝液は、デオキシリボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼを含有せず、前記工程（１）に用いるＰＢＳ緩衝液の規格は、１ｘｐＨ＝７であり、前記工程（３）に用いるＰＢＳ緩衝液の規格は、１ｘｐＨ＝７．４である、請求項７に記載の脂質ナノ粒子の調製方法。
【請求項９】
前記高塩濃度溶液はＮａＣｌ溶液であり、工程（４）における混合液のＮａＣｌ濃度は、０．１〜１Ｍである、請求項７に記載の脂質ナノ粒子の調製方法。
【請求項１０】
前記混合液のＮａＣｌ濃度は、０．３〜０．４Ｍである、請求項９に記載の脂質ナノ粒子の調製方法。
【請求項１１】
前記限外濾過装置又は透析装置の分画分子量は、１０，０００〜１００，０００ダルトンである、請求項７に記載の脂質ナノ粒子の調製方法。
【請求項１２】
前記膜材料は、モル比で２５：４５：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、ＴＰＧＳを含む、請求項２に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
前記膜材料は、モル比で３０：４５：２０：５：５のＤＯＴＭＡ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、ＴＰＧＳを含む、請求項２に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
前記膜材料は、モル比で３０：５０：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、ＤＳＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、ＴＰＧＳを含む、請求項２に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
前記膜材料は、モル比で３０：４５：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、ｍＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥを含む、請求項２に記載のｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、具体的には、ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは通常、１８〜２２個のヌクレオチドからなり、塩基対合則により標的メッセンジャーＲＮＡと選択的に結合することで、特定のメッセンジャーＲＮＡの機能を遮断又は抑制し、後続の標的遺伝子によるタンパク質の発現を調節する。
【０００３】
ｂｃｌ−２はアポトーシスを抑制する遺伝子で、当該遺伝子は細胞の分裂、増殖、及び分化を促進することができ、殆どの腫瘍細胞の中で比較的発現率が高いため、腫瘍は当該遺伝子への上方調節によって制限なく成長し拡散することができる。Ｇ３１３９は１８個のヌクレチオドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドセグメントであり、その配列が５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’で、塩基対合則によりｂｃｌ−２をコードするメッセンジャーＲＮＡと結合することで、ｂｃｌ−２遺伝子及び下流タンパク質の発現を好適に抑制することができる。しかしながら、関連報告によると、殆どのアンチセンスオリゴヌクレオチドには適切な薬物送達システムが認められず、それ自体の機能では細胞に入って役割を果たすのが困難である。また、標的メッセンジャーＲＮＡとの結合能が比較的弱く、長時間にわたって抑制結合作用を発揮するのが困難で、しかも殆どのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血漿中のヌクレアーゼの作用により分解されて治療効果を失いやすいという。Ｇ３１３９については、長年の臨床試験を行ったところ一定の治療効果が認められたが、その効果は米国ＦＤＡの関連規格を満たさないため使用の承認を受けなかった。
【０００４】
従来の技術による脂質ナノ粒子膜材料においては、トウェイン（Ｔｗｅｅｎ）化合物とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体（例えばＴＰＧＳ）を結合させる例がない。トウェインを単独で使用する場合、トウェインは比較的短いＰＥＧ鎖を有しており、このような短鎖のＰＥＧがナノ粒子間の反発相互作用を強めることで、粒子の凝集による安定性の低下を防止することができる。一方、このようなナノ製剤ではナノ粒子の表面に埋め込まれる長鎖ＰＥＧが存在しないため、全身循環において食細胞に呑み込まれて機能できなくなることが多い。
【０００５】
また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体（例えばＴＰＧＳ）を単独で使用する場合、ＴＰＧＳは比較的長いＰＥＧ鎖を有しており、食作用系により認識され、食細胞に呑み込まれて機能を喪失することをある程度で回避し、長循環時間を延長することができるものの、ＴＰＧＳが多くある場合、立体障害が存在するため、ナノ粒子が標的腫瘍細胞により有効に摂取されるのが困難になる。
【０００６】
Ｇ３１３９のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドについては、従来修飾を行う場合、殆どはチオリン酸（ＰＳ）化する。このような修飾はアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性をある程度で高めることができるものの、メッセンジャーＲＮＡとの結合能、結合強度、及びマッチングの度合いはいずれも大きく低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記従来技術の不備を克服すべく、ナノ粒子自体の安定性を高めることで、腫瘍組織における薬物の放出を促進し分解される可能性を軽減するとともに、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する耐性を高め、メッセンジャーＲＮＡとマッチングする際の正確性及び結合能を高める薬物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために提供する発明は、以下のとおりである。
【０００９】
膜材料でアンチセンスオリゴヌクレオチドセグメントを被覆して調製されるｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子であって、前記ヌクレオチドの配列が５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’（Ｇ３１３９とも称する）又は５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’である。
【００１０】
更に、前記膜材料は、カチオン性脂質、中性リン脂質、コレステロール、トウェイン、ポリエチレングリコール誘導体を含み、それらのモル比は、（２５〜３５）：（４０〜５０）：（１５〜２５）：（１〜５）：（１〜５）である。
【００１１】
更に、前記カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＭＡを含み、前記中性リン脂質は、Ｅｇｇ  ＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣを含み、前記トウェインは、トウェイン２０、トウェイン４０、トウェイン６０、トウェイン８０を含み、前記ポリエチレングリコール誘導体は、ｍＰＥＧ−ＤＰＰＥ、ｍＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＴＰＧＳ、ｍＰＥＧ−コレステロールを含む。
【００１２】
更に、前記ポリエチレングリコール誘導体におけるＰＥＧの分子量は、５５０〜５０００である。
【００１３】
更に、前記ポリエチレングリコール誘導体におけるＰＥＧの分子量は、５５０、７５０、１０００、２０００、３０００、５０００である。
【００１４】
更に、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体は、親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又はメチル化ポリエチレングリコール鎖（ｍＰＥＧ）が、リン脂質二重層に埋め込み可能な疎水性構造に連接されて形成した物質であり、前記疎水性構造は、コレステロール、ビタミンＥ、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジミリストイルグリセリン（ＤＭＧ）又はこれらの構造類似体である。
【００１５】
更に、前記トウェインは、トウェイン８０である。
【００１６】
更に、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’への修飾は、その両端に位置する最初の３つのヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル修飾し、且つ鎖全体をチオリン酸化修飾するか、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’の鎖全体をチオリン酸化修飾するものである。
【００１７】
ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子の調製方法であって、前記脂質ナノ粒子の調製方法はエタノールで段階希釈する方法とし、具体的には、
カチオン性脂質、中性リン脂質、コレステロール、トウェイン、ポリエチレングリコール誘導体を、所定のモル比で８０％のエタノールに溶解して、混合したエタノール溶液を得、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドをＰＢＳ緩衝液に溶解してアンチセンスオリゴヌクレオチドのＰＢＳ緩衝液を得る工程（１）と、
工程（１）で得られた混合したエタノール溶液とアンチセンスオリゴヌクレオチドのＰＢＳ緩衝液とを等体積で混合して、エタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を得る工程（２）と、
更にＰＢＳ緩衝液を用いて、工程（２）で得られたエタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を等体積で希釈し、エタノールの最終濃度が５％未満の製剤混合液を得るまでＰＢＳ緩衝液を用いて最終濃度のエタノールの混合溶液を等体積で繰り返し希釈する工程（３）と、
工程（３）で得られた製剤混合液に高塩濃度溶液を加え、高塩濃度混合液を得る工程（４）と、
限外濾過装置又は透析装置を用いて、工程（４）で得られた混合液からエタノール及び被覆されていない遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去する工程（５）と、
工程（５）で得られた製品を、孔径が０．２２μｍ以下の濾過膜又はフィルタエレメントにより濾過して除菌し、脂質ナノ粒子を得る工程（６）と、を含む。
【００１８】
更に、前記ＰＢＳ緩衝液は、デオキシリボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼを含有せず、前記工程（１）に用いるＰＢＳ緩衝液の規格は、１ＸｐＨ＝７であり、前記工程（３）に用いるＰＢＳ緩衝液の規格は、１ＸｐＨ＝７．４である。
【００１９】
更に、前記高塩濃度溶液は、ＮａＣｌ溶液であり、工程（４）における混合液のＮａＣｌ濃度は、０．１〜１Ｍである。
【００２０】
更に、前記混合液のＮａＣｌ濃度は、０．３〜０．４Ｍであり、好ましくは０．３Ｍである。
【００２１】
更に、前記限外濾過装置又は透析装置の分画分子量は、１０，０００〜１００，０００ダルトンである。
【００２２】
更に、前記膜材料は、モル比で２５：４５：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、及びＴＰＧＳからなる。
【００２３】
更に、前記膜材料は、モル比で３０：４５：２０：５：５のＤＯＴＭＡ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、及びＴＰＧＳからなる。
【００２４】
更に、前記膜材料は、モル比で３０：５０：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、ＤＳＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、及びＴＰＧＳからなる。
【００２５】
更に、前記膜材料は、モル比で３０：４５：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、ｍＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥからなる。
【００２６】
ここで、
ＤＯＴＡＰ：１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化塩
ＤＯＴＭＡ：１，２−ジオキシオクタデセン−３−トリメチルアミノプロパン塩化塩
ＤＤＡＢ：ビスドデシルジメチル臭化アンモニウム
ＤＯＤＭＡ：１，２−ジオキシオクタデセン−３−ジメチルアミノプロパン
Ｅｇｇ  ＰＣ：卵黄ホスファチジルコリン
ＤＯＰＣ：ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＭＰＣ：ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＥ：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＥ：ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
ＴＰＧＳ：コハク酸エステル
【００２７】
前記チオリン酸化修飾とは、リン酸基における１つの未架橋状態の酸素原子が硫黄原子によって置換されることを指し、下図に示すように、オリゴヌクレオチド鎖全体の構造への影響が比較的小さく、各種ヌクレアーゼへの耐性を大幅に高めることができる。
【化１】
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【発明の効果】
【００２８】
従来技術に比べると、本発明は下記の利点を有する。
１．本発明に係るナノ微粒子膜材料は、初めて２種類のポリエチレングリコール化試薬（トウェイン及びポリエチレングリコール誘導体）が用いられ、ナノ粒子自体の安定性をある程度高め、腫瘍組織における薬物の放出を促進し、分解される可能性を軽減することができる。
【００２９】
ポリエチレングリコール化試薬であるトウェインは、ナノ製剤の調製によく用いられる。トウェインシリーズは短鎖のＰＥＧを有する。トウェインシリーズ（例えばトウェイン２０／４０／６０／８０）はナノ製剤においてナノ粒子間の反発相互作用を強めることで、凝集しにくくすることができるため、ナノ製剤の安定性をある程度で高めることができ、長期保存しても粒径増加の度合いが比較的小さい。
【００３０】
ポリエチレングリコール誘導体、例えばＴＰＧＳは、よく用いられるもう一つのナノ製剤成分で、比較的長いＰＥＧ鎖を有するため、血液中におけるナノ粒子の循環を促進し、細網内皮系細胞又は食細胞からの摂取による機能喪失を回避することができ、免疫系の認識をある程度回避し、長循環時間を延長することができる。また、比較的長いＰＥＧ鎖が細胞からの摂取をある程度で影響する。
【００３１】
本発明はトウェインとポリエチレングリコール誘導体を組み合わせ、即ち比較的長いＰＥＧ鎖と比較的短い鎖を有するトウェインを組み合わせる。本発明者らは、この２種類のポリエチレングリコール化試薬を組み合わせると、血漿中におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドが被覆されたナノ粒子の安定性、長循環時間、標的細胞への放出及び標的細胞中の遺伝子への分解効果を効果的に高めることができることを見出した。
【００３２】
２．本発明において、トウェインシリーズとＴＰＧＳの組成物について安定性試験（周期２７日間、温度４℃）を行う。図１に示すように、１か月の期間にナノ製剤の粒径変化が比較的小さく、トウェインが製剤の全体的安定性を維持できることが明らかになる。
【００３３】
具体的な試験データは、以下のとおりである。
【００３４】
トウェイン８０を使用して安定性試験（周期２７日間、温度４℃）を行うと、ナノ製剤の粒径が１２６ｎｍから１８１ｎｍに変化し、安定性が最も高く、
トウェイン２０を使用して安定性試験（周期２７日間、温度４℃）を行うと、ナノ製剤の粒径が９９．８ｎｍから２７４．２ｎｍに変化し、安定的であり、
トウェイン４０を使用して安定性試験（周期２７日間、温度４℃）を行うと、ナノ製剤の粒径が１３８．５ｎｍから３０５．９ｎｍに変化し、安定的であり、
トウェイン６０を使用して安定性試験（周期２７日間、温度４℃）を行うと、ナノ製剤の粒径が７６．７ｎｍから２１８．６ｎｍに変化し、安定的である。
【００３５】
３．本発明において、脂質ナノ粒子の膜材料はカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール、トウェイン、ポリエチレングリコール誘導体を含み、且つこれらを所定の割合で組み合わせることにより、調製して得られたナノ膜材料はコストが効果的に削減され、安定性に優れており、細胞受容性が高いため、優れたナノ担体である。
【００３６】
４．本発明において、Ｇ３１３９に対して、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）及びチオリン酸（ＰＳ）化という二重化学的修飾を行い、両端に位置する最初の３つのヌクレオチドを２’−Ｏ−Ｍｅ修飾することにより、血漿中におけるＧ３１３９オリゴヌクレオチドの安定性をある程度で高めることができ、また鎖全体をチオリン酸化修飾する。これによりＲＮＡ／ＤＮＡ／ＲＮＡという構造はＲＮaｓe  Ｈの機能を促進し、特定の標的メッセンジャーＲＮＡ配列を分解することができ、ヌクレアーゼに対する耐性をある程度高め、メッセンジャーＲＮＡとマッチングする際の正確性及び結合能を高めることができる。
【００３７】
両端で３つのヌクレオチドを２’−Ｏ−Ｍｅ修飾すると、標的遺伝子に対する認識と分解に影響を与えることなく、Ｇ３１３９アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性を大幅に高めることができる。これに対し、２つ（Ｇ３１３９−ＧＡＰ−ＬＮＰｓ−２）又は４つのヌクレオチド（Ｇ３１３９−ＧＡＰ−ＬＮＰｓ−４）を２’−Ｏ−Ｍｅ修飾した場合、上記の効果は認められない。本発明は修飾効果に優れ、目的部位へ送達しやすく、優れた遮断効果を果たすことができる。
【００３８】
５．本発明に係る脂質ナノ粒子は、腫瘍細胞の成長及び特定の標的遺伝子、とりわけＫＢ子宮頚癌細胞に対して優れた遮断効果を有する。
【００３９】
６．本発明の調製方法で高塩濃度溶液を加えることにより、ナノ粒子の表面に吸着した遊離オリゴヌクレオチドを解離させ、オリゴヌクレオチドの吸着により粒径が大きくなることを軽減することができる。沈降したオリゴヌクレオチドは後続の透析工程で除去することができる。
【００４０】
７．本発明に係る脂質ナノ粒子の調製方法は、エタノールで段階希釈する方法で、従来技術における非等体積でオンライン混合する方法は複雑で、２つのポンプ及び仕様の異なる液体貯蔵タンクを使用する必要があり、大量生産に適しない。反応速度論の観点からすれば、本発明は従来技術と比べて、系間の動バランスに至らせ、後に懸濁系の安定性を高める点で好適である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明に係るトウェインシリーズとＴＰＧＳの組成物について行った安定性試験（周期２７日間、温度４℃）の結果を示す図である。
【図２】ＫＢ癌細胞における遺伝子レベル（ｂｃｌ−２）のＧ３１３９調節試験の結果を示す図である。
【図３】Ａ５４９肺癌細胞における遺伝子レベル（ｂｃｌ−２）のＧ３１３９調節試験の結果を示す図である。
【図４】ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞における遺伝子レベル（ｂｃｌ−２）のＧ３１３９調節試験の結果を示す図である。
【図５】癌抑制率試験の結果を示す図である。
【図６】生存試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明及びその実施形態を例示的に説明するが、下記説明の内容に限定されるものではない。図面に示すのは本発明の実施形態の一つに過ぎず、これだけに限定されない。よって、当業者はここから示唆を受けて、本発明の趣旨から逸脱せず、鋭意工夫をすることなく作り出した当該発明に類似する構造形態及び実施例等は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるものとする。
【実施例】
【００４３】
実施例１
ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子の調製方法であって、具体的には、
モル比で２５：４５：２０：５：５のＤＯＴＡＰ、Ｅｇｇ  ＰＣ、コレステロール、トウェイン８０、ＴＰＧＳを８０％のエタノールに溶解して、混合したエタノール溶液を得、鎖全体がチオリン酸化修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’をＰＢＳ緩衝液（１Ｘ  ｐＨ＝７）に溶解して、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（ＰＢＳ緩衝液）を得る工程（１）と、
工程（１）で得られた混合したエタノール溶液とアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液とを等体積で混合して、エタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を得る工程（２）と、
更にＰＢＳ緩衝液を用いて、工程（２）で得られたエタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を等体積で希釈し、エタノールの最終濃度が５％未満の製剤混合液を得るまでＰＢＳ緩衝液（１Ｘ  ｐＨ＝７．４）を用いて最終濃度のエタノールの混合溶液を等体積で繰り返し希釈する工程（３）と、
工程（３）で得られた製剤混合液に高塩濃度溶液を加え、濃度が０．１Ｍの混合液を得ることで、ナノ粒子の表面に結合した遊離オリゴヌクレオチドを解離する工程（４）と、
分画分子量が１０，０００ダルトンの限外濾過装置を用いて、工程（４）で得られた混合液からエタノール及び遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去する工程（５）と、
工程（５）で得られた製品を、孔径が０．２２μｍの濾過膜又はフィルタエレメントにより濾過して除菌し、脂質ナノ粒子を得る工程（６）と、を含む。
【００４４】
実施例２
ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子の調製方法であって、具体的には、
モル比で３５：４０：１５：１：１のＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＣ、コレステロール、トウェイン４０、ｍＰＥＧ５５０−ＤＰＰＥを８０％のエタノールに溶解して、混合したエタノール溶液を得、鎖全体がチオリン酸化修飾された、且つ両端が２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’をＰＢＳ緩衝液（１Ｘ  ｐＨ＝７）に溶解して、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（ＰＢＳ緩衝液）を得る工程（１）と、
工程（１）で得られた混合したエタノール溶液とアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液とを等体積で混合して、エタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を得る工程（２）と、
更にＰＢＳ緩衝液を用いて、工程（２）で得られたエタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を等体積で希釈し、エタノールの最終濃度が５％未満の製剤混合液を得るまでＰＢＳ緩衝液（１Ｘ  ｐＨ＝７．４）を用いて最終濃度のエタノールの混合溶液を等体積で繰り返し希釈する工程（３）と、
工程（３）で得られた製剤混合液に高塩濃度溶液を加え、最終濃度が０．３Ｍの高塩濃度混合液を得る工程（４）と、
分画分子量が５０，０００ダルトンの限外濾過装置を用いて、工程（４）で得られた混合液からエタノール及び遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去する工程（５）と、
工程（５）で得られた製品を、孔径が０．２２μｍの濾過膜又はフィルタエレメントにより濾過して除菌し、脂質ナノ粒子を得る工程（６）と、を含む。
【００４５】
実施例３
ｂｃｌ−２を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脂質ナノ粒子の調製方法であって、具体的には、
モル比で３０：５０：２５：３：３のＤＤＡＢ、ＤＳＰＣ、コレステロール、トウェイン６０、ｍＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥを８０％のエタノールに溶解して、混合したエタノール溶液を得、鎖全体がチオリン酸化修飾された、且つ両端が２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド５’  ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ３’をＰＢＳ緩衝液（１Ｘ  ｐＨ＝７）に溶解して、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（ＰＢＳ緩衝液）を得る工程（１）と、
工程（１）で得られた混合したエタノール溶液とアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液とを等体積で混合して、エタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を得る工程（２）と、
更にＰＢＳ緩衝液を用いて、工程（２）で得られたエタノールの最終濃度が４０％の混合溶液を等体積で希釈し、エタノールの最終濃度が５％未満の製剤混合液を得るまでＰＢＳ緩衝液（１Ｘ  ｐＨ＝７．４）を用いて最終濃度のエタノールの混合溶液を等体積で繰り返し希釈する工程（３）と、
工程（３）で得られた製剤混合液に高塩濃度溶液を加え、最終濃度が１Ｍの高塩濃度混合液を得る工程（４）と、
分画分子量が１００，０００ダルトンの限外濾過装置を用いて、工程（４）で得られた混合液からエタノール及び遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドを除去する工程（５）と、
工程（５）で得られた製品を、孔径が０．２２μｍの濾過膜又はフィルタエレメントにより濾過して除菌し、脂質ナノ粒子を得る工程（６）と、を含む。
【００４６】
実施例４：
（１）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：５０：２０：５：５
（２）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：５０：２０：５：５
（３）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３５：５０：２０：５：５
【００４７】
【表１】
2019535808.tif 000004
【００４８】
カチオン性脂質ＤＯＴＡＰのモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤１は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤１を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００４９】
（１）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４０：２０：５：５
（２）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：５
（３）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：５０：２０：５：５
【００５０】
【表２】
2019535808.tif 000005
【００５１】
中性リン脂質Ｅｇｇ  ＰＣのモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤２は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤２を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００５２】
（１）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：１５：５：５
（２）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：５
（３）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２５：５：５
【００５３】
【表３】
2019535808.tif 000006
【００５４】
コレステロールのモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤２は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤２を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００５５】
（１）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：１：５
（２）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：３：５
（３）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：５
【００５６】
【表４】
2019535808.tif 000007
【００５７】
トウェイン８０のモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤３は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤３を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００５８】
（１）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：１
（２）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：３
（３）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：５
【００５９】
【表５】
2019535808.tif 000008
【００６０】
ＴＰＧＳのモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤３は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤３を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００６１】
（１）ＤＯＴＭＡ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：５
（２）ＤＯＴＭＡ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：４５：２０：５：５
（３）ＤＯＴＭＡ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３５：４５：２０：５：５
【００６２】
【表６】
2019535808.tif 000009
【００６３】
この他に、他の関係し得るリン脂質についてもスクリーニングを行った。カチオン性脂質ＤＯＴＭＡのモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤２は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤２を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００６４】
（１）ＤＯＴＡＰ／ＤＳＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：４０：２０：５：５
（２）ＤＯＴＡＰ／ＤＳＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：４５：２０：５：５
（３）ＤＯＴＡＰ／ＤＳＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：５０：２０：５：５
【００６５】
【表７】
2019535808.tif 000010
【００６６】
リン脂質ＤＳＰＣのモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤３は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。このため、製剤３を最良な配合として選択し、次のとおりスクリーニングを行った。
【００６７】
（１）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００＝３０：４５：２０：５：１
（２）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００＝３０：４５：２０：５：３
（３）ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００＝３０：４５：２０：５：５
【００６８】
【表８】
2019535808.tif 000011
【００６９】
ＤＰＰＥ−ｍＰＥＧ２０００のモル比を調整して１因子試験を行ったところ、他の成分が変わらない条件において、電位がほぼ同一でありながら、製剤３は粒径及び被覆率がいずれも他の２製剤より明らかに優れている。
【００７０】
上記のとおり、各配合及びその割合についてスクリーニングすることにより、下記の結論を得ている。
（１）「ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝２５：４５：２０：５：５」という配合と割合が、粒径が比較的小さく、被覆率が安定しており、正電位が好適である。
（２）他の配合については、「ＤＯＴＭＡ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：４５：２０：５：５」、「ＤＯＴＡＰ／ＤＳＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ＴＰＧＳ＝３０：５０：２０：５：５」及び「ＤＯＴＡＰ／Ｅｇｇ  ＰＣ／コレステロール／トウェイン８０／ｍＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ＝３０：４５：２０：５：５」という配合と割合が、粒径、電位、被覆率、及び安定性において比較的好適である。よって、更にこれらの配合と割合について試験を行い、分析した。
【００７１】
以下、実施例１についての試験である。
下表では、遊離２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９及び２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９脂質ナノ粒子は、鎖全体がチオリン酸化修飾された、且つ最初の３つのヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ修飾されたＧ３１３９（５’  ―ＵＣＵ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＵ  ―３’）を意味し、
遊離Ｇ３１３９及びＧ３１３９脂質ナノ粒子は、鎖全体がチオリン酸化修飾されたＧ３１３９（５’−ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ−３’）を意味し、
空白ナノ粒子は、膜材料により被覆されて形成した、内容物のない脂質ナノ粒子を意味する。
【００７２】
１．Ａ５４９肺癌細胞毒性試験
（１）Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに播種し、コロニー形成率が６０〜７０％になるように、ＲＰＭＩ１６４０培養液（ウシ胎児血清１０％含有）を用いて細胞を一晩培養した。
（２）翌日、各濃度群に対してタキソール（ＰＴＸ）濃度勾配（１ｎｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌ）と各種アンチセンスオリゴヌクレオチド（濃度が同じく１０μｍｏｌ／Ｌ）を用いる毒性試験を複数回行い、３７℃で二酸化炭素５％の環境下で培養した。
（３）２４ｈ、４８ｈ、７２ｈにＭＴＳ試薬（新規なテトラゾール化合物）２０μＬを加え、波長４９０ｎｍにて検出し、結果を下表に示す。
【００７３】
【表９】
2019535808.tif 000012
【００７４】
本試験で、各試験群はいずれも異なる濃度のタキソール（ＰＴＸ）を用いて治療し、化学感作効果を示すように、各アンチセンスオリゴヌクレオチド群の濃度を同じく１０μｍｏｌ／Ｌとした。治療後４８ｈに、Ｇ３１３９脂質ナノ粒子と２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９脂質ナノ粒子は癌細胞に対し一定の化学感作効果を果たしており、タキソールを併用すると癌細胞の死滅効果が大幅に高まることが確認された。当該結果には統計学的有意性が認められた。
【００７５】
２．遺伝子レベル（ｂｃｌ−２）のＧ３１３９調節試験
様々な試料群を設計して、各種癌細胞（Ａ５４９癌細胞、ＫＢ癌細胞及びＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を含む）に対する各種Ｇ３１３９剤型のｂｃｌ−２レベルの調節効果について測定し、薬物の調節作用により変化しないβ−アクチンを参照遺伝子として用い、目標遺伝子ｂｃｌ−２への上下調節作用について観察することで薬物が効いたか否かを確認した。
【００７６】
（１）癌細胞、例えばＡ５４９癌細胞、ＫＢ癌細胞、及びＬＮＣａＰ前立腺癌細胞を６ウェルプレートに播種し、コロニー形成率が８０％になるように、ＲＰＭＩ１６４０培養液（ウシ胎児血清１０％含有）を用いて細胞を一晩培養した。
（２）最終濃度が１μＭのＧ３１３９製剤を腫瘍細胞培養液に加え、当該製剤は２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９脂質ナノ粒子、Ｇ３１３９脂質ナノ粒子、遊離Ｇ３１３９、遊離２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９、空白脂質ナノ粒子及び培養液対照群の６群に分けた。
（３）３７℃で二酸化炭素５％の環境下で４ｈ培養した後、細胞を新鮮な培養液に移し、引き続き４８ｈ培養した。標準な方法で細胞を収集し、分解させ、ＲＮＡを抽出した。
（４）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ技術を用いて各群のｂｃｌ−２メッセンジャーＲＮＡのレベルを分析し、試薬供給者から提供された標準な方法により、各群治療後のｂｃｌ−２の発現状況について測定することができる。
【００７７】
１）ＫＢ癌細胞
様々な試料群を設計して、ＫＢ癌細胞中のｂｃｌ−２レベルを調節し、試験結果を下表及び図２に示す。薬物の調節作用により変化しないβ−アクチンを参照遺伝子として用い、目標遺伝子ｂｃｌ−２への上下調節作用について観察することで薬物が効いたか否かを確認した。
【００７８】
【表１０】
2019535808.tif 000013
【００７９】
上表及び図２から分かるように、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾された脂質ナノ粒子群では、ｂｃｌ−２遺伝子レベルが６７．７１％と他の試験群よりも大幅に下方調節され、遊離薬物群（３、４）では薬物送達システムがないため細胞に入ることができず、わずかな下方調節作用しか認められず（それぞれ４．６９％及び１０．９６％）、空白ナノ粒子群では薬物を投与しなかったため、下方調節作用が認められなかった。
【００８０】
２）Ａ５４９肺癌細胞
試験結果を下表及び図３に示す。
【表１１】
2019535808.tif 000014
【００８１】
上表及び図３から分かるように、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾された脂質ナノ粒子群では、ｂｃｌ−２遺伝子レベルが７１．８７％と他の試験群よりも大幅に下方調節され、遊離薬物群（３、４）では薬物送達システムがないため細胞に入ることができず、わずかな下方調節作用しか認められず（それぞれ１１．２５％及び６．７１％）、空白ナノ粒子群では薬物を投与しなかったため、下方調節作用が認められなかった。
【００８２】
３）ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞
試験結果を下表及び図４に示す。
【表１２】
2019535808.tif 000015
【００８３】
上表及び図４から分かるように、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾された脂質ナノ粒子群では、ｂｃｌ−２遺伝子レベルが７８．７８％と他の試験群よりも大幅に下方調節され、遊離薬物群（３、４）では薬物送達システムがないため細胞に入ることができず、わずかな下方調節作用しか認められず（それぞれ６．８５％及び５．１１％）、空白ナノ粒子群では薬物を投与しなかったため、下方調節作用が認められなかった。
【００８４】
３．ＫＢ細胞異所性接種マウスｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルの薬力学及び生存曲線試験
（１）５×１０６のＫＢ癌細胞をヌードマウスの背部の右側に接種し、平均１５０ｍｍ３の可視腫瘍になるように１〜２週間成長させた。
（２）腫瘍が所定の大きさになったら、各群の担癌マウスに、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９脂質ナノ粒子、Ｇ３１３９脂質ナノ粒子、遊離Ｇ３１３９、遊離２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９、タキソール注射液、及び生理食塩液をそれぞれ尾静脈投与した。３日に１回投与し３週間連続投与した。治療群は６群とし、１群あたり担癌マウス１０匹とした。
（３）ノギスを用いて腫瘍の長さ及び幅を測定し、下式により腫瘍の体積を求めた。
腫瘍体積＝（π／６）×長さ（ｍｍ）×（幅）２
（４）腫瘍の大きさが１５００ｍｍ３になったら、治療群から取り出し、二酸化炭素で窒息させることにより安楽死を施行した。
治療期間が終了した後の各群の腫瘍体積が、抗腫瘍活性を示すことができる。
【００８５】
図５及び図６はそれぞれ、癌抑制率試験及び生存試験の結果を示す図である。
【００８６】
図５及び図６から分かるように、ＫＢ癌細胞異所性接種ヌードマウスについての薬力学及び生存曲線に示すように、２’−Ｏ−Ｍｅ修飾Ｇ３１３９脂質ナノ粒子とタキソールを併用すると優れた癌抑制効果を有し、担癌マウスが長い間生存する。これは、脂質ナノ粒子が大きな毒性と副作用を伴わないで、薬効を高めることができることを示している。
【図１】
2019535808.tif 000016
【図２】
2019535808.tif 000017
【図３】
2019535808.tif 000018
【図４】
2019535808.tif 000019
【図５】
2019535808.tif 000020
【図６】
2019535808.tif 000021
【配列表】
2019535808000001.xml
【国際調査報告】
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2019535808.tif 000025
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