(57)【要約】  本発明は、グリコシル化アポＪのレベルの検出に基づく、虚血または虚血性組織障害を診断する方法、虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を予測する方法、虚血性イベントに罹患した患者の予後を判定する方法、および安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定する方法に関する。本発明は、サンプル中のグリコシル化アポＪを測定する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の虚血または虚血性組織障害を診断する方法であって、前記被験体のサンプル中で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するＮ−アセチルグルコサミン残基を含むアポＪのレベルの低下または参照値に対するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むアポＪのレベルの低下が、患者が虚血または虚血性組織障害に罹患していることの指標となることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記虚血が、心筋虚血または脳虚血である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心筋虚血が、急性心筋虚血または微小血管性狭心症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記脳虚血が、脳卒中である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、虚血性イベントに罹患した疑いがある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定を、疑わしい虚血性イベントの発症後最初の６時間以内に、少なくとも１つの壊死マーカーのレベルが上昇する前に、または前記疑わしい虚血性イベントに対して任意の処置を患者が受け入れる前に実施する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を予測する方法または前記虚血性イベントに罹患した患者の予後を判定する方法であって、前記患者のサンプル中で、グリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するグリコシル化アポＪのレベルの低下が、前記虚血が進行中であるか、または前記患者の予後不良の指標となることを特徴とする、方法
【請求項８】
前記グリコシル化アポＪが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記虚血性イベントが、心筋虚血性イベントである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記心筋虚血性イベントが、ＳＴ上昇心筋梗塞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者の予後が、６ヶ月の再発のリスク、院内死亡のリスクまたは６ヶ月の死亡のリスクとして判定される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定する方法であって、前記患者のサンプル中で、グリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するグリコシル化アポＪのレベルの低下が、前記患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクが高いことを示す指標となることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
前記グリコシル化アポＪが、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定冠動脈疾患に罹患している患者が、該安定冠動脈疾患の前に急性冠動脈症候群に罹患していた、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記再発虚血性イベントが、急性冠動脈症候群、脳卒中または一過性脳虚血性イベントである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルが、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応するか、または前記Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルが、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、生物流体である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物流体が、血漿または血清である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．Ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸から選択されるグリカン残基に特異的に結合するレクチンである第１の試薬と、
ｂ．アポＪポリペプチドに特異的に結合することができる第２の試薬と
を含む、キット。
【請求項２０】
前記レクチンが、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のレクチンまたはＤａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のレクチンまたはそれらの組み合わせ物である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記第２の試薬が、その抗原結合領域を含む抗体またはその断片である、請求項１９または２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記第１の試薬が、固定化されている、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
前記第２の試薬が、標識を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記標識が、その化学的、電気的または磁気的特性の少なくとも１つの変化によって検出され得る、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記第２の試薬に特異的に結合することができる第３の試薬をさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記第３の試薬が、その抗原結合領域を含む抗体またはその断片である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を判定するための、前記虚血性イベントに罹患した患者の予後のための、または前記安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定するための、前記患者の虚血または虚血性組織障害の診断のための、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項２８】
サンプル中のグリコシル化アポＪを測定する方法であって、
（ｉ）前記サンプルを、グリコシル化アポＪ中に存在するグリカン残基に特異的に結合するレクチンと、前記サンプル中のグリコシル化アポＪとレクチンとの間の複合体の形成に適した条件下で接触させるステップと、
（ｉｉ）前記レクチンおよび前記グリコシル化アポＪを含む複合体の量を検出するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｉ）で用いられるレクチンが、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチン、またはＮ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸に特異的に結合するレクチンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチンが、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のレクチンであり、または前記Ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸に特異的に結合するレクチンがＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のレクチンである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記グリカン残基に特異的に結合するレクチンが、固定化されている、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ｉｉ）における複合体が、アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬を用いて検出される、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬が、その抗原結合領域を含む抗体またはその断片である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、検出可能な標識に結合される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標識が、その化学的、電気的または磁気的特性の少なくとも１つの変化によって検出され得る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出が、前記アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬に特異的に結合することができる試薬を用いて実施される、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬に特異的に結合することができる前記第３の試薬が、その抗原結合領域を含む抗体またはその断片である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルまたは前記Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルの測定を、請求項１９〜２６のいずれか一項に定義されるキットまたは請求項２８〜３７のいずれか一項に定義される方法を用いて測定する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋虚血または脳虚血またはそれに関連する組織虚血性障害を有する個体の予後、診断およびリスク層別化のための、ならびに安定冠動脈疾患（ＣＡＤ）を有する個体における再発虚血性イベントを提示するためのバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）および脳血管イベントは、アテローム血栓症の最も頻繁な臨床症状であり、世界中の死亡および障害の主要な原因である。早期の血管再生の重要性から、ならびに死亡および／または生活の質低下のリスクが高いため、早期診断が不可欠である。このような状況において、バイオマーカーは、ＡＣＳの疑いのある患者の診断、トリアージ、リスク層別化、および管理のための臨床評価を補完し、虚血性対出血性脳卒中を区別するための重要なツールとなる。これらのバイオマーカーは、病理学的プロセスに関する情報を提供し、より複雑で高価な診断技術（特に磁気共鳴など）に取って代わるものとなるべきである。
【０００３】
実際に、心臓虚血性イベント（呼吸器または筋肉病変による痛み）と同様の症状の苦しい、非心臓性の問題から、救急救命室に運ばれる率が高い。脳血管疾患の場合、出血性対虚血性脳卒中の判別指標を有することが緊急に必要であり、それにより患者管理が適切かつ迅速に開始され得る。
【０００４】
したがって、虚血の早期に特異的かつ高感度に検出するための新しいバイオマーカーを同定することへの未解決の希求が存在する。これまでは、炎症、心機能および壊死のマーカーが研究されてきた。しかしながら、それらの測定が虚血性症候群の診断および予後に有用かどうかは明らかではない。虚血性臓器障害は、通常、組織壊死に先立ち、時機を得て検出された場合、逆転する可能性がある。虚血の正確で早期の検出のための既存のマーカーのこの欠如は、世界中の不必要な経済コストの上昇を招く。
【０００５】
現在、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の診断および管理は、臨床評価、心電図所見およびトロポニン値（受け入れられたバイオマーカーの唯一の群）に基づいている。このプロトコルの適用にはいくつかの制限が伴うことから、心筋虚血を有する患者を管理するための新しいバイオマーカーの調査が不可欠である。第１の欠点は、心筋トロポニン（ｃＴｎ）が、心筋病変の進行段階である不可逆的な壊死（細胞死）のマーカーであることである。さらに、高感度ｃＴｎアッセイ（ｈｓ−ｃＴｎ）は、ある種の非特異性を明かしている。加えて、現行のガイドラインでは、急性胸痛を有する患者の適切なトリアージを行うために連続的なｈｓ−ｃＴｎ測定を行う必要性が強調されている。
【０００６】
アポリポタンパク質Ｊ（アポＪ）のアイソフォームの分布プロファイルのシフトに基づいて虚血性組織障害を検出する方法は、ＷＯ２０１１０９８６４５号およびＣｕｂｅｄｏ、Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２０１１，１０：２１１−２２０）に記載されている。これらの研究では、アポＪアイソフォームの２つの異なる群であるアポＪ−１５およびアポＪ−２９が、二次元電気泳動とその後の質量分析によって同定されていた。これらのアポＪ形態は、組織傷害、特にＡＭＩによる心臓障害と関連していた。虚血性障害では、虚血性イベントの適時かつ正確な検出が、組織の不可逆的傷害を引き起こし得るその進行を防止するために重要である。このシナリオでは、アポＪ分布プロファイルの変化を測定するための二次元電気泳動とその後の質量分析に基づく方法論は、それらがあまりにも複雑で、時間がかかり、虚血の診断に使用するのに費用がかかるため、臨床診療において使用することができなかった。
【０００７】
したがって、特に、血管障害およびＡＭＩの検出のための改良された方法が当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
第１の態様において、被験体の虚血もしくは虚血性組織障害を診断する方法であって、前記被験体のサンプル中で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することを含む方法、または被験体の虚血または虚血性組織障害を診断する方法であって、前記被験体のサンプル中で、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ（シロバナヨウシュチョウセンアサガオ）レクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルまたはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ（小麦胚芽）レクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することを含む方法に関する。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を予測する方法または虚血性イベントに罹患した患者の予後を判定する方法であって、前記患者のサンプル中で、グリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するグリコシル化アポＪのレベルの低下が、虚血が進行中であるか、または患者の予後不良の指標となる方法に関する
【００１０】
別の態様において、本発明は、安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定する方法であって、前記患者のサンプル中で、グリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するグリコシル化アポＪのレベルの低下が、患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクが高いことを示す指標となる方法に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、
ａ．Ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸から選択されるグリカン残基に特異的に結合するレクチンである第１の試薬と、
ｂ．アポＪポリペプチドに特異的に結合することができる第２の試薬と
を含むキットに関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を判定するための、虚血性イベントに罹患した患者の予後のための、または安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定するための、患者の虚血または虚血性組織障害の診断のための本発明によるキットに関する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、サンプル中のグリコシル化アポＪを測定する方法であって、
（ｉ）サンプルをグリコシル化アポＪ中に存在するグリカン残基に特異的に結合するレクチンと、サンプル中のグリコシル化アポＪとレクチンとの間の複合体の形成に適した条件下で接触させるステップと、
（ｉｉ）レクチンおよびグリコシル化アポＪを含む複合体の量を検出するステップと
を含む、方法に関する
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アポＪ  ２−ＤＥプロファイル。対照およびＡＭＩ前の虚血（Ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｐｒｅ−ＡＭＩ）血清サンプル由来の２−ＤＥゲル中のアポＪクラスターの代表的パターンを示す図である。血清中のアポＪは、ｐＩ範囲４．５〜５．０および分子量３７．１〜４７．３ｋＤａの１３個のスポットのクラスターとして検出された。アポＪと同定されたスポットは、酸性ｐＨから塩基性ｐＨまでナンバリングした。スポット２は、ＡＭＩ前の虚血患者においてのみ明らかであった。１、３、７、８、１０、１１、１３とマークされたスポットは、ＡＭＩ前の虚血において検出レベルが向上したが、スポット６および９は、対照群と比較して、ＡＭＩ前の虚血ゲルにおいて強度の減少を示した。スポット３、７、８および１１は、アポＪ−２９であり、スポット６および９は、アポＪ−１５である。
【図２】グリコシル化アポＪ形態。（Ａ）健常ドナーおよび（Ｂ）ＡＭＩ前の虚血患者由来のグリコシル化血清画分（コンカバリンＡとＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンの混合物へのその結合により単離された）中のアポＪクラスターの代表的な２−ＤＥ画像を示す図である。ｐＩおよびＭＷについて全血清のそれらに対応する６つのスポット（１、２、４、５、８および１１）が検出された。図１と同様に、スポットは、酸性ｐＨから塩基性ｐＨまでナンバリングした。アポＪスポットの強度は、対照においてよりもＡＭＩ前の虚血患者において低かった。この減少は、スポット４および８においてより明白であった。
【図３】Ｏ−グリコシル化アポＪ形態。Ｏ−グリコシル化血清画分（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ（パラミツ）レクチンへのその結合により単離された）中のアポＪクラスターの代表的な２−ＤＥ画像を示す図である。ｐＩおよびＭＷについて全血清のそれらに対応する９つのスポット（１、３、４、６、７、８、９、１１および１２）が検出された。図１および図２と同様に、スポットは、酸性ｐＨから塩基性ｐＨまでナンバリングした。
【図４】アポＪグリコシル化形態の存在度。新規および元のイムノアフィニティー酵素−グリコシル化アッセイまたはＥＧＡを用いた特異的測定による、ヒト血漿サンプル中の異なるアポＪグリコシル化形態の存在度を示す棒グラフを示す図である。
【図５】診断値。（Ａ）虚血の初期段階（Ｎ＝３８）および健常被験体（Ｎ＝１４４）のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルを示すボックスプロットを示す図である。（Ｂ）曲線下面積（ＡＵＣ）０．９３４（Ｐ＜０．０００１）およびカットオフ値３３２μｇ／ｍＬ（感度９７％および特異度７１％）でアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの心筋虚血の存在についての診断値を示す受信者動作曲線（ＲＯＣ）を示す図である。
【図６】ＳＴＥＭＩ患者の診断値。（Ａ）入院時のＳＴＥＭＩ患者（Ｎ＝２１２）および健常被験体（Ｎ＝１４４）のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルを示すボックスプロットを示す図である。（Ｂ）曲線下面積（ＡＵＣ）０．７１３（Ｐ＜０．０００１）およびカットオフ値４０９μｇ／ｍＬ（感度８０％および特異度５３％）でアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの虚血の存在についての判別値を示す受信者動作曲線（ＲＯＣ）を示す図である。（Ｃ）入院時のＳＴＥＭＩ患者（Ｎ＝３４０）および健常被験体（Ｎ＝１３９）のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルを示すボックスプロットを示す図である。（Ｄ）曲線下面積（ＡＵＣ）０．８３０（Ｐ＜０．０００１）およびカットオフ値３９３μｇ／ｍＬ（感度８１％および特異度７２％）でアポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの虚血の存在についての判別値を示す受信者動作曲線（ＲＯＣ）を示す図である。
【図７】虚血の進行。（Ａ）入院時および虚血時間におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベル間の逆相関および有意相関を示す回帰プロットを示す図である。（Ｂ）入院３日後（ｔ＝７２時間）の８２人のＳＴＥＭＩ患者のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの進行性低下を示すボックスプロットを示す図である。（Ｃ）入院時および虚血時間におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベル間の逆相関および有意相関を示す回帰プロットを示す図である。
【図８】予後診断値。入院時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの有意差を示すＢｏｘ−Ｐｌｏｔを、（Ａ）院内死亡率および６ヶ月の死亡率に直接関係することが知られている最終的なＴＩＭＩフローグレードに対してと、（Ｂ）ＳＴＥＭＩに罹患した後の予後不良に関連する心原性ショック（心原性ショックを有する６５人の患者および無しの患者１４７人）の存在に対する、入院時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの有意差を示すボックスプロットを示す図である。
【図９】リスク層別化。（Ａ）入院時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルとＧＲＡＣＥリスクスコアとの間の逆相関および有意相関を示す回帰プロットを示す図である。（Ｂ）ＧＲＡＣＥリスクスコア最高値とＳＴＥＭＩ患者の入院３日後のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの減少との間の関連性を示すボックスプロットを示す図である。（Ｃ）入院時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルとＧＲＡＣＥリスクスコアとの間の逆相関および有意相関を示す回帰プロットを示す図である。
【図１０】ＳＴＥＭＩ患者の６カ月間の追跡調査における再発イベントおよび死亡率。６ヶ月の追跡調査後の再発虚血性イベントの存在または死亡率に及ぼす入院時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ（Ａ）レベルおよびＴ  トロポニン（Ｂ）レベル；ならびに入院時および死亡時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベル（Ｃ）または６ヶ月間の追跡調査後の再発虚血性イベントと死亡率（Ｄ）の組み合わせの影響を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示す図である。
【図１１】アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルの予測値。（Ａ）安定ＣＡＤ患者のサンプル採取および追跡調査のタイミングを示すスキームを示す図である：患者は、サンプル採取の平均０．６±０．０４年前に急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）に罹患し、２．３±０．３年後に追跡調査した。（Ｂ）再発イベントがなかった患者（Ｎ＝１８）と比較して、追跡調査時に虚血性再発イベントに罹患した慢性ＣＡＤ患者（Ｎ＝１６）におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルを示すボックスプロットを示す図である。（Ｃ）安定ＣＡＤ患者の再発虚血性イベントを提示するためのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの予測値を示す受信者動作曲線（ＲＯＣ）を示す図である。
【図１２】脳虚血におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃの診断値。脳卒中患者（Ｎ＝１７４）および健常被験体（Ｎ＝１６４）におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルを示すボックスプロットを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
虚血組織障害の診断方法
本発明者らは、虚血の初期段階におけるＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪのレベル、またはＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含むアポＪのレベルが、対照被験体において観察されたレベルに対して減少することを観察した。グリコシル化アポＪのレベルと心臓虚血患者との間の相関関係は、既に記載されているが、この研究は、α−マンノース、α−グルコース（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃ残基を含むグリカンに結合することができるレクチンの混合物を用いてグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施された。この方法は、対照被験体からの患者の判別に優先的に寄与するグリコシル化アポＪの形態の同定を可能にしなかった。本発明者らは、対照サンプルからの虚血に罹患している患者からのサンプルの判別に優先的に寄与するアポＪのグリコシル化形態を同定することができた。実際に、これまでの研究で本発明者らは、アポＪ−２９が、ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪまたはＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含むアポＪで起こることに反して、ＡＭＩ前の虚血において増大したことを報告した。さらに、ＡＭＩ前の虚血患者は、α−マンノース、α−グルコース、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃ残基を有する検出されたアポＪの２５％の減少を示したが、ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪまたはＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含むアポＪの特異的検出は、ＡＭＩ前の虚血患者において４５〜５０％の減少をもたらした。したがって、これらのグリコシル化形態のアポＪの測定は、先行技術に記載された方法を用いて測定されたグリコシル化アポＪ形態を用いて実施される診断に対して感度および特異度が増大した虚血の診断を可能にする。
【００１６】
したがって、第１の態様において、本発明は、被験体の虚血または虚血性組織障害を診断する方法（以後、本発明の診断方法）であって、前記被験体のサンプル中で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルまたはＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するＮ−アセチルグルコサミン残基を含むアポＪのレベルの低下または参照値に対するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むアポＪのレベルの低下は、患者が虚血または虚血性組織障害に罹患していることの指標となる、方法に関する。本発明はまた、被験体の虚血もしくは虚血性組織障害を診断する第２の方法であって、前記被験体のサンプル中で、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルまたはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するＤａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルの低下またはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルの低下は、患者が虚血または虚血性組織障害に罹患していることの指標となる、方法に関する。
【００１７】
本発明の診断方法は、関連する臓器または組織の不可逆的な壊死障害の前に（ＡＣＳの場合はトロポニンレベルとは無関係に）急性虚血性イベントの検出を可能にすることから、特に有利である。これは、イベントの発症後最初の６時間以内でさえ、虚血の存在についての診断値を提供する。
【００１８】
本発明の文脈において、「診断」という用語は、本明細書に開示される方法を適用した場合に、心筋虚血または脳虚血またはそれに関連する虚血組織障害を有する患者からのサンプルと、この傷害および／または障害に罹患していない個体のサンプルとを判別する能力に関する。この検出は、当業者に理解されるように、全てのサンプルについて１００％正確であることを意図するものではない。しかしながら、分析された統計的に有意な数のサンプルが正しく分類される必要がある。統計的に有意な量は、限定されるものではないが、例えば、信頼区間、ｐ値測定、スチューデントのｔ検定およびフィッシャー判別関数の測定などの異なる統計ツールを用いることによって、現場の専門家によって設定され得る。好ましくは、信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％未満である。好ましくは、ｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１未満である。好ましくは、本発明は、試験された特定の群または母集団の被験体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％において虚血または虚血性障害を正確に検出することができる。
【００１９】
「虚血」という用語は、本明細書では「虚血性イベント」と同義的に用いられ、組織の器官への血流の減少または中断の結果生じる任意の状況を指す。虚血は、一時的または永続的であり得る。
【００２０】
「虚血性組織障害」、「虚血性組織傷害」、「虚血による組織障害」、「虚血に関連する組織障害」および「虚血の結果としての組織障害」、「虚血に起因する組織障害」および「虚血性障害組織」という表現は、虚血期間の結果としての器官または組織または細胞に対する形態学的、生理学的および／または分子的障害を指す。
【００２１】
１つの実施形態において、虚血に起因する障害は、心臓組織の障害である。さらにより好ましい実施形態において、心臓組織に対する障害は、心筋虚血に起因する。
【００２２】
「心筋虚血」という用語は、冠動脈アテローム性動脈硬化症および／または心筋への酸素供給不足に起因する循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織への不可逆的な虚血性傷害を表す。この傷害は、冠循環における閉塞（例えば血栓性または塞栓性）イベントをもたらし、心筋代謝要求が心筋組織への酸素の供給を超過する環境を作り出す。
【００２３】
さらに別の実施形態において、障害は、微小血管性狭心症に起因する。本明細書で使用される「微小血管性狭心症」という用語は、小さな心臓血管を通る血流が不十分なことから生じる状態を指す。
【００２４】
１つの実施形態において、虚血に起因する障害は、脳組織の障害である。別の実施形態において、脳組織への障害は、虚血性脳卒中に起因する。「虚血性脳卒中」という用語は、脳への閉塞または血管（その結果、脳への酸素が不足することになる）に起因する脳機能の突然の喪失を指し、これは、筋肉制御の喪失、感覚もしくは意識の低下もしくは消失、目眩、不明瞭な発話、または脳障害もしくは脳血管障害とも呼ばれる、脳への障害の程度および重症度によって変化する他の症状を特徴とする。「脳虚血」（または「脳卒中」）という用語はまた、脳への血液供給の欠乏を指し、しばしば脳への酸素不足をもたらす。
【００２５】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」という用語には、治療が望まれる任意の被験体、特に哺乳類被験体が含まれる。哺乳類被験体には、ヒト、家畜、農用動物、および動物園またはペット用の動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、ウシなどが含まれる。本発明の好ましい実施形態において、被験体は哺乳類である。本発明のより好ましい実施形態において、被験体はヒトである。
【００２６】
本明細書で使用される「サンプル」または「生物学的サンプル」という用語は、被験体から単離された生物学的物質を指す。生物学的サンプルは、所与のタンパク質、例えばアポＪのグリコシル化形態のレベルを検出するのに適した任意の生物学的物質を含む。サンプルは、例えば、血液、唾液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）または糞便などの任意の適切な組織または生体液から単離することができる。本発明の特定の実施形態において、サンプルは、組織サンプルまたは生物流体である。本発明のより特定の実施形態において、生物流体は、血液、血清または血漿からなる群から選択される。
【００２７】
好ましくは、アポＪの異なるグリコシル化形態のレベルを測定するために使用されるサンプルは、測定が相対的に行われる場合の参照値の測定に使用されるのと同じタイプのサンプルである。一例として、ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪまたはＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むアポＪの測定が血漿サンプル中で実施される場合、血漿サンプルも参照値を測定するために使用される。サンプルが生物流体である場合、参照サンプルも同じタイプの生物流体液、例えば血清、血漿、脳脊髄液中で測定される。
【００２８】
本明細書で使用される「アポＪ」という用語は、「クラステリン」、「テストステロン抑制前立腺メッセージ」、「アポリポタンパク質Ｊ」、「補体関連タンパク質ＳＰ−４０，４０」、「補体細胞溶解阻害剤」、「補体溶菌阻害剤」、「硫酸化糖タンパク質」、「Ｋｕ７０結合タンパク質」、「ＮＡ１／ＮＡ２」、「ＴＲＰＭ−２」、「ＫＵＢ１」、「ＣＬＩ」としても知られているポリペプチドを指す。ヒトアポＪは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（エントリーバージョン１８７、２０１６年３月１６日）の受託番号Ｐ１０９０９で提供されるポリペプチドである。
【００２９】
本明細書中で使用される「ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ」という用語は、少なくとも１つのグリカン鎖中に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ反復を含む任意のアポＪ分子を指すが、アポＪは、典型的には、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミンを各グリカン鎖中に含む。「ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ」には、高マンノースＮ−グリカン、複合型Ｎ−グリカン、ハイブリッド型オリゴ糖Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカン中に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ分子が含まれる。Ｎ−グリカンのタイプに依存して、ＧｌｃＮＡｃは、ポリペプチド鎖に直接的にまたはＮ−グリカンの末端位置に結合して見出され得る。
【００３０】
「ＧｌｃＮＡｃ」または「Ｎ−アセチルグルコサミン」という用語は、酢酸によるグルコサミンのアミド化から得られ、下記の一般構造を有するグルコースの誘導体を指す：
【００３１】
【化１】
2019516966.tif 000002
【００３２】
１つの実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪは、ＧｌｃＮＡｃの２つの残基を含み、本明細書では（ＧｌｃＮＡｃ）２と称される。（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含むアポＪ分子には、（ＧｌｃＮＡｃ）２が高マンノースＮ−グリカン、複合型Ｎ−グリカン、ハイブリッド型オリゴ糖Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカン中に見出される分子が含まれる。Ｎ−グリカンのタイプに依存して、（ＧｌｃＮＡｃ）２は、ポリペプチド鎖に直接的にまたはＮ−グリカンの末端位置に結合して見出され得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、ＧｌｃＮＡｃまたは（ＧｌｃＮａｃ）２残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍreレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルとして定義される。
【００３４】
「特異的結合」という用語は、レクチンがアポＪのグリコシル化形態に結合することを指すために本発明において使用される場合、レクチンが、非特異的結合に対する実質的により高い親和性を有する２つの分子の３次元構造間の相補性の存在によりアポＪのグリコシル化形態に特異的に結合する能力として理解され、ここで、前記レクチンとアポＪのグリコシル化形態との間の結合は、反応混合物中に存在する他の分子に対する前記分子の任意の結合前に好ましくは行われる。この結果、レクチンがアポＪ分子中に存在していても存在していなくてもよい他のグリカンと交差反応しない。調査の対象となっているレクチンの交差反応性は、例えば、従来の条件下で前記レクチンの対象とされるグリカンならびに多かれ少なかれ（構造的および／または機能的に）密接に関連する多数のグリカンへの結合を評価することによって試験することができる。レクチンが対象とされるグリカンに結合するものの、他のグリカンのいずれにも結合しないか、または本質的に結合しない場合にのみ、対象とされるグリカンに特異的であると考えられる。例えば、レクチンとグリコシル化アポＪとの間の結合親和性が、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０―１４Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有する場合に、結合は特異的であるとみなすことができる。
【００３５】
好ましい実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ」は、他のタイプのＮ−結合型またはＯ−結合型の炭水化物を実質的に含まない。１つの実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ」は、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のα−マンノース残基を含まない。別の実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ」は、Ｎ結合型またはＯ結合型のα−グルコース残基を含まない。さらに別の実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪ」は、Ｎ−結合型もしくはＯ−結合型のα−マンノース残基またはＮ−結合型もしくはＯ−結合型のα−グルコース残基を含まない。
【００３６】
本明細書で使用される「ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むアポＪ」という用語は、そのグリカン鎖中に少なくとも１つのＮ−アセチルグルコース反復および少なくとも１つのシアル酸残基反復を含む任意のアポＪ分子を指す。
【００３７】
本明細書で使用される「シアル酸」という用語は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）として知られ、下記の一般構造を有する単糖類を指す：
【００３８】
【化２】
2019516966.tif 000003
【００３９】
１つの実施形態において、アポＪは、ＧｌｃＮＡｃの２つの残基および１つのシアル酸残基を含む（以下、（ＧｌｃＮＡｃ）２−Ｎｅｕ５Ａｃと称される）。別の実施形態において、ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基は、１つ以上の単糖類によって結合される。
【００４０】
１つの実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応する。
【００４１】
好ましい実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むアポＪ」は、他のタイプのＮ−結合型またはＯ−結合型炭水化物を実質的に含まない。１つの実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むアポＪ」は、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のα−マンノース残基を含まない。別の実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むアポＪ」は、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のα−グルコース残基を含まない。さらに別の実施形態において、「ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むアポＪ」は、Ｎ−結合型もしくはＯ−結合型のα−マンノース残基またはＮ−結合型もしくはＯ−結合型のα−グルコース残基を含まない。
【００４２】
好ましい実施形態において、「Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪ」は、少なくとも１つのシアル酸残基または少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪの任意のグリコシル化形態に対応し、これには、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むが、シアル酸残基を含まないアポＪ、（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含むが、シアル酸残基を含まないアポＪ、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むアポＪ、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびシアル酸残基を含むアポＪならびにシアル酸残基を含むが、（ＧｌｃＮＡｃ）または（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含まないアポＪが含まれる。（ＧｌｃＮＡｃ）残基および（ＧｌｃＮＡｃ）２残基は、シアル酸残基と同じグリカン鎖中に見出され得ることが理解されよう。あるいは、シアル酸残基は、（ＧｌｃＮＡｃ）残基または（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含まないグリカン鎖に見出され得る。
【００４３】
好ましい実施形態において、「Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪ」は、少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪの任意のグリコシル化形態に対応し、これには、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むアポＪおよび（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含むアポＪが含まれる。
【００４４】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルに関連した「減少したレベル」または「低レベル」という用語は、参照値よりも低いサンプル中のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むアポＪの任意の発現レベルに関する。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むアポＪの発現レベルは、それが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低い場合に、その参照値よりも減少しているかもしくは低いと見なされる。
【００４５】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルに関連した「レベルの低下」または「低レベル」という用語は、参照値よりも低いサンプル中のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むアポＪの任意の発現レベルに関する。したがって、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むアポＪの発現レベルは、それが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低い場合に、その参照値よりも減少しているかもしくは低いと見なされる。
【００４６】
Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルに関連した「レベルの低下」または「低レベル」という用語は、参照値よりも低いサンプル中のＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪの任意の発現レベルに関する。したがって、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪの発現レベルは、それが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低い場合に、その参照値よりも減少しているかもしくは低いと見なされる。
【００４７】
Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルに関連した「レベルの低下」または「低レベル」という用語は、参照値よりも低いサンプル中のＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪの任意の発現レベルに関する。したがって、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪの発現レベルは、それが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低い場合に、その参照値よりも減少しているかもしくは低いと見なされる。
【００４８】
本発明の診断方法は、研究の対象となっている被験体において得られたレベルを参照値と比較することを含み、それによって、参照値に対するＮ−アセチルグルコサミン残基を含むアポＪのレベルの低下、または参照値に対するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むアポＪのレベルの低下は、患者が虚血または虚血性組織障害に罹患していることの指標となる。あるいは、本発明の診断方法は、研究の対象となっている被験体において得られたレベルを参照値と比較することを含み、それによって、参照値に対するＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができるアポＪのレベルの低下、または参照値に対するＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができるアポＪのレベルの低下は、患者が虚血または虚血性組織障害に罹患していることの指標となる。
【００４９】
本明細書で使用される「参照値」という用語は、被験体から採取されたサンプルから得られた値またはデータを評価するための参照として使用される所定の基準に関する。参照値または参照レベルは、絶対値；相対値；上限値または下限値を持つ値；値の範囲；平均値；中央値；算術平均値；または特定の対照値またはベースライン値と比較した値であってよい。参照値は、例えば、試験されている被験体からのサンプルから得られた値などの個々のサンプル値に基づくことができるが、より早い時点で得られた値であってもよい。参照値は、実年齢にマッチさせた群の被験体の母集団などの多数のサンプルに基づくか、または試験されるサンプルを含むもしくは除外するサンプルのプールに基づくことができる。１つの実施形態において、参照値は、健常被験体において測定されたＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪのレベル、ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含むアポＪのレベル、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルまたはＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応し、健常被験体とは、ＧｌｃＮＡｃ残基を含むアポＪのレベル、ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含むアポＪのレベル、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルまたはＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルの測定時に虚血性組織障害を示さず、好ましくは虚血性障害の病歴を示さない被験体のことを意味する。
【００５０】
別の実施形態において、参照値は、臨床的な観点から十分に文書で証明されており、病気を示さず、虚血性組織障害に罹患していない、特に虚血性心筋障害または虚血性脳障害に罹患していない患者の群から得られたサンプルのプールから測定された、対応するバイオマーカーの平均レベルまたは算術平均レベルに対応する。前記サンプル中で、発現レベルの測定は、例えば、参照母集団における平均発現レベルの測定によって行うことができる。参照値の測定には、患者の年齢、性別、身体状態または他の特徴などの、サンプルのタイプのいくつかの特徴を考慮する必要がある。例えば、参照サンプルは、母集団が統計的に有意であるように、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００〜１０００を超える個体の同一量の群から得ることができる。
【００５１】
本発明の診断方法による患者の診断のために使用される参照値は、診断において考慮されるマーカーと同じタイプのサンプルおよび同じバイオマーカーから得られた値であると理解されよう。したがって、診断方法が、ＧｌｃＮＡｃまたは（ＧｌｃＮＡｃ）２を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施される場合、診断に使用される参照値は、場合によっては健常被験体または上記で定義されるサンプルのプールから得られたＧｌｃＮＡｃ残基または（ＧｌｃＮＡｃ）２を含むグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、診断方法が、ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施される場合、診断に使用される参照値は、上述のようにして得られるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって診断方法が実施される場合、診断に使用される参照値は、上述のようにして得られるＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合するグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって診断方法が実施される場合、診断に使用される参照値は、上述のようにして得られるＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。
【００５２】
別の実施形態において、心筋組織障害を診断するためにバイオマーカーが測定される場合、参照値は、心筋組織障害を示さず、好ましくは心筋組織障害に罹患している記録を持たない健常被験体からの同じバイオマーカーのレベルになるであろう。参照値が、被験体からのサンプルのプールから得られたのと同じバイオマーカーの平均レベルである場合、サンプルのプールを準備する元となる被験体は、心筋組織障害を示さず、好ましくは心筋組織障害に罹患している記録を持たない被験体である。
【００５３】
別の実施形態において、脳組織障害を診断するためにバイオマーカーが測定される場合、参照値は、脳組織障害を示さず、好ましくは脳組織障害に罹患している記録を持たない健常被験体からの同じバイオマーカーのレベルになるであろう。参照値が、被験体からのサンプルのプールから得られたのと同じバイオマーカーの平均レベルである場合、サンプルプーを得る元となる被験体は、脳組織障害を示さず、好ましくは脳組織障害に罹患している記録がない被験体である。
【００５４】
本発明の診断方法において使用される参照値は、所望の特異度および感度を得るために最適化することができる。
【００５５】
１つの実施形態において、心筋虚血の診断に使用される参照値は、９７％の感度および７１％の特異度が所望される場合、３３２μｇ／ｍｌのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃもしくは３９３μｇ／ｍＬのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃであり、８１％の感度および７２％の特異度が所望される場合、３９３μｇ／ｍｌのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃである（すなわち、本発明による診断方法は、患者が３３２μｇ／ｍｌ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃを示す場合、９７％の感度および７１％の特異度で、または患者が３９３μｇ／ｍｌ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃを示す場合、８１％の感度および７２％の特異度で心筋虚血の診断を可能にする）。
【００５６】
別の実施形態において、脳虚血の診断に使用される参照値は、６６％の感度および５１％の特異度が所望される場合、４２４μｇ／ｍＬのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃである（すなわち、本発明による診断方法は、患者が４２４μｇ／ｍＬ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃを示す場合、６６％の感度および５１％の特異度で脳虚血の診断を可能にする）。
【００５７】
１つの実施形態において、心筋虚血の診断に使用される参照値は、９７％の感度および７１％の特異度が所望される場合、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる３３２μｇ／ｍｌのアポＪであるか、または８１％の感度および７２％の特異度が所望される場合、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができる３９３μｇ／ｍｌのアポＪである（すなわち、本発明による診断方法は、患者がＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる３３２μｇ／ｍｌ未満のアポＪを示す場合、９７％の感度および７１％の特異度で、または患者がＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができる３９３μｇ／ｍｌ未満のアポＪを示す場合、８１％の感度および７２％の特異度で心筋虚血の診断を可能にする）。
【００５８】
別の実施形態において、脳虚血の診断に使用される参照値は、６６％の感度および５１％の特異度が所望される場合、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる４２４μｇ／ｍＬのアポＪである（すなわち、本発明による診断方法は、患者がＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる４２４μｇ／ｍＬ未満のアポＪを示す場合、６６％の感度および５１％の特異度で脳虚血の診断を可能にする）。
【００５９】
好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むグリコシル化アポＪのレベル、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベル、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルまたはＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルは、壊死マーカーの検出可能な増大がサンプル中で検出される前に実施される。好ましい実施形態において、壊死マーカーは、Ｔ−トロポニンまたはＣＫのいずれかである。さらに別の実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むグリコシル化アポＪのレベル、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベル、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルまたはＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルの測定は、虚血障害の症状発症から１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間またはそれ以上の時間内に得られたサンプル中で実施される。好ましい実施形態において、心筋虚血性障害の場合、症状は、通常、胸痛、息切れ、発汗、衰弱、立ち眩み、軽症、悪心、嘔吐および動悸である。１つの実施形態において、患者はＡＭＩ前の患者である。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、脳虚血性障害の場合、虚血性障害の症状は、限定されるものではないが、嗅覚、味覚、聴覚もしくは視覚の変化、眼瞼下垂または眼筋の衰弱、反射の低下：催吐、嚥下、光に対する瞳孔反応性、感覚の低下および顔の筋力低下、バランス問題および眼振、失語症、失行症（随意運動の変化）、視野欠損、口先弁別症、記憶障害、顔面紅潮、混乱した思考、混乱、口先弁別症、記憶障害、顔面紅潮、思考の混乱、錯乱、性欲亢進行動（前頭葉の関与を伴う）、通常は脳卒中に関連した洞察力の欠如、能力障害、歩行運動の変化、運動協調性の変化、眩暈または平衡感覚異常である。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の診断方法によるアポＪのグリコシル化形態のレベルの測定は、虚血を軽減することまたは虚血性組織障害を軽減することを目的とする任意の薬剤が患者に投与される前に得られた患者のサンプル中で実施される。１つの実施形態において、心筋組織障害の場合、アポＪのグリコシル化形態のレベルの測定は、患者がスタチン、抗血小板剤および／または抗凝固剤で治療される前に得られた患者のサンプル中で実施される。
【００６２】
１つの実施形態において、脳組織障害の場合、アポＪのグリコシル化形態のレベルの測定は、患者が組織プラスミノーゲンアクチベーター、抗血小板剤および／または抗凝固剤で治療される前に得られた患者のサンプル中で実施される。
【００６３】
虚血性障害に罹患した患者の予後方法
本発明者らは、意外にも、グリコシル化アポＪのレベルは、進行中の虚血性イベントの検出のためだけでなく、虚血性イベントに罹患した患者の予後についても有用であることも見出した。
【００６４】
したがって、別の態様において、本発明は、虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を予測する方法（以下、本発明の予後診断方法）または虚血性イベントに罹患した患者の予後を判定するための方法であって、前記患者のサンプル中で、グリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するグリコシル化アポＪのレベルの低下は、虚血が進行中であるか、または患者の予後不良の指標となる、方法に関する。
【００６５】
本発明の文脈において、「進行を予測する」という用語は、本明細書に開示される方法を適用した場合に、虚血またはそれに関連する虚血組織障害に罹患した後の疾患の経過を予測する能力に関する。この検出は、当業者に理解されるように、全てのサンプルについて１００％正確であることを意図するものではない。しかしながら、分析された統計的に有意な数のサンプルが正しく分類される必要がある。統計的に有意な量は、以下のものに限定されるものではないが、例えば、信頼区間、ｐ値測定、スチューデントのｔ検定およびフィッシャー判別関数の測定などの異なる統計ツールを用いることによって、現場の専門家によって設定され得る。好ましくは、信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％未満である。好ましくは、ｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１未満である。好ましくは、本発明は、試験された特定の群または母集団の被験体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％において虚血または虚血性障害を正確に検出することができる。
【００６６】
本発明の文脈において、「予後を判定する」という用語は、「予後」と同義的に用いられ、本明細書に開示される方法を適用した場合に、心筋虚血もしくは脳虚血またはそれに関連する虚血組織障害に罹患した後の患者の結果を予測する能力に関する。この検出は、当業者に理解されるように、全てのサンプルに対して１００％正確であることを意図するものではない。しかしながら、分析された統計的に有意な数のサンプルが正しく分類される必要がある。統計的に有意な量は、以下のものに限定されるものではないが、例えば、信頼区間、ｐ値測定、スチューデントのｔ検定およびフィッシャー判別関数の測定などの異なる統計ツールを用いることによって、現場の専門家によって設定され得る。好ましくは、信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％未満である。好ましくは、ｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１未満である。好ましくは、本発明は、試験された特定の群または母集団の被験体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％において虚血または虚血性障害を正確に検出することができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、患者の予後は、６ヶ月の再発のリスクとして判定される。６ヶ月の再発のリスクを判定する場合、再発は、最初の虚血性イベント後の最初の６ヶ月以内に起こる２回目の虚血性イベントを指すと理解されよう。１つの実施形態において、２回目の虚血性イベントは、最初の虚血性イベントと同じタイプであり、すなわち、最初の虚血性イベントは心筋虚血であり、予後は、患者が２回目の心筋虚血性イベントに罹患するリスクとして判定される。別の実施形態において、２回目の虚血性イベントは、最初の虚血性イベントと異なるタイプのものであり、すなわち、最初の虚血性イベントが心筋虚血である場合、予後は、患者が脳虚血性イベントに罹患するリスクとして判定され、逆もまた同様であり、最初の虚血性イベントが脳虚血性イベントである場合、予後は、患者が心筋虚血性イベントに罹患するリスクとして判定される。
【００６８】
別の実施形態において、患者の予後は、院内死亡率のリスクとして判定される。
【００６９】
好ましい実施形態において、患者の予後は、６ヶ月の死亡率のリスクとして判定される。
【００７０】
「アポＪ」、「患者」、「虚血性イベント」および「サンプル」という用語は、本発明の診断方法の文脈において詳細に記載されており、本方法にも等しく適用可能である。
【００７１】
１つの実施形態において、サンプルは、生物流体である。別の実施形態において、生物流体は、血漿または血清である。
【００７２】
１つの実施形態において、虚血性イベントは、心筋虚血性イベントである。さらに別の実施形態において、心筋虚血性イベントは、ＳＴ上昇心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）である。別の実施形態において、虚血性イベントは、脳虚血性イベントである。
【００７３】
本明細書で使用される「グリコシル化アポＪ」という用語は、ポリペプチド鎖に結合した少なくとも１つのＮ−結合型またはＯ−結合型オリゴ糖鎖を含むアポＪの任意の形態を指す。「グリコシル化アポＪ」という用語は、Ｎ−結合型およびＯ−結合型のオリゴ糖を含む変異体の両方を含む。この用語はまた、Ｎ結合型複合型オリゴ糖、高マンノース型オリゴ糖またはハイブリッド型オリゴ糖を含むアポＪを含む。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明の予後診断方法で判定されるグリコシル化アポＪは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪである。さらにより好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応する。１つの実施形態において、本発明の予後診断方法で判定されるグリコシル化アポＪは、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪである。
【００７５】
別の実施形態において、本発明の予後診断方法において判定されるグリコシル化アポＪは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪである。さらにより好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応する。１つの実施形態において、本発明の予後診断方法において判定されるグリコシル化アポＪは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪである。
【００７６】
グリコシル化アポＪのレベルに関連した「減少したレベル」または「低レベル」という用語は、参照値よりも低いサンプル中のグリコシル化アポＪの任意の発現レベルに関する。したがって、グリコシル化アポＪのレベルは、それが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低い場合に、その参照値よりも減少しているかもしくは低いと見なされる。好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中に見出されるレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中に見出されるレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中のレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中のレベルよりも低い。
【００７７】
本発明の予後診断方法に言及する場合の「参照値」という用語は、被験体から採取されたサンプルから得られた値またはデータを評価するための参照として使用される所定の基準に関する。参照値または参照レベルは、絶対値；相対値；上限値または下限値を持つ値；値の範囲；平均値；中央値；算術平均値；または特定の対照値またはベースライン値と比較した値であってよい。参照値は、例えば、試験されている被験体からのサンプルから得られた値などの個々のサンプル値に基づくことができるが、より早い時点で得られた値であってもよい。参照値は、実年齢にマッチさせた群の被験体の母集団などの多数のサンプルに基づくか、または試験されるサンプルを含むもしくは除外するサンプルのプールに基づくことができる。１つの実施形態において、参照値は、虚血性イベントに罹患しており、虚血が進行していないか、または良好な進行を有する被験体において測定されたグリコシル化アポＪのレベルに対応する。６カ月の再発のリスクとして判定された進行の場合、参照値は、虚血性イベント時に採取された患者からのサンプル中のグリコシル化アポＪレベルとみなすことができるが、ここで、患者は、最初の虚血性イベントから少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月またはそれ以上経過した後に更なる任意の虚血性イベントに罹患していない。別の実施形態において、進行が院内死亡率のリスクとして判定される場合、参照値は、虚血性イベント時の患者のグリコシル化アポＪのレベルとみなすことができるが、ここで、患者は病院から退院している。６ヶ月の死亡率のリスクとして判定される進行の場合、参照値は、虚血性イベント時に採取された患者のサンプル中のグリコシル化アポＪレベルとみなすことができるが、ここで、患者は、虚血性イベントから少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月後にまだ生存している。
【００７８】
別の実施形態において、参照値は、臨床的な観点から十分に文書で証明されており、虚血性イベントに罹患した後に、前のパラグラフで定義される良好な予後を示す患者の群から得られたサンプルのプールから測定された、対応するバイオマーカーの平均レベルまたは算術平均レベルに対応する。前記サンプル中で、発現レベルの測定は、例えば、参照母集団における平均発現レベルの測定によって行うことができる。参照値の測定には、患者の年齢、性別、身体状態または他の特徴などの、サンプルのタイプのいくつかの特徴を考慮する必要がある。例えば、参照サンプルは、母集団が統計的に有意であるように、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００〜１０００を超える個体の同一量の群から得ることができる。
【００７９】
本発明の予後診断方法による患者の予後のために使用される参照値は、診断において考慮されるマーカーと同じタイプのサンプルおよび同じバイオマーカーから得られた値であると理解されよう。したがって、予後診断方法が、ＧｌｃＮＡｃまたは（ＧｌｃＮＡｃ）２を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施される場合、診断に使用される参照値は、場合によっては健常被験体または上記で定義されるサンプルのプールから得られたＧｌｃＮＡｃ残基または（ＧｌｃＮＡｃ）２を含むグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、予後方法が、ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施される場合、診断に使用される参照値は、上述のようにして得られるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。
【００８０】
Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって予後診断方法が実施される場合、診断に使用される参照値は、上述のようにして得られる健常被験体またはサンプルプールから得られたＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合するグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって予後方法が実施される場合、予後に使用される参照値は、上述のようにして得られるＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。
【００８１】
別の実施形態において、心筋組織障害に罹患した患者の予後を判定するためにバイオマーカーが測定される場合、参照値は、心筋虚血性イベントに罹患した後に、上記で定義される基準（６ヶ月後の虚血性イベントの再発がないこと、６ヶ月後の院内死亡率または死亡率なし）のいずれかに従った良好な予後を示す被験体からの同じバイオマーカーのレベルであろう。参照値が、被験体からのサンプルのプールから得られたのと同じバイオマーカーの平均レベルである場合、サンプルのプールを準備する元となる被験体は、心筋虚血性イベントに罹患した後に、上記で定義される基準（６ヶ月後の虚血性イベントの再発がないこと、６ヶ月後の院内死亡率または死亡率なし）のいずれかに従った良好な予後を示す被験体である。
【００８２】
別の実施形態において、脳組織障害を診断するためにバイオマーカーが測定される場合、参照値は、脳虚血性イベントに罹患した後に、上記で定義される基準（６ヶ月後の虚血性イベントの再発がないこと、６ヶ月後の院内死亡率または死亡率なし）のいずれかに従った良好な予後を示す被験体からの同じバイオマーカーであろう。参照値が、被験体からのサンプルのプールから得られたのと同じバイオマーカーの平均レベルである場合、サンプルのプールを準備する元となる被験体は、脳虚血性イベントに罹患した後に、上記で定義される基準（６ヶ月後の虚血性イベントの再発がないこと、６ヶ月後の院内死亡率または死亡率なし）のいずれかに従った良好な予後を示す被験体である。
【００８３】
本発明の予後診断方法において使用される参照値は、所望の特異度および感度を得るために最適化することができる。
【００８４】
特定の実施形態において、死亡率および再発イベントの予後に使用される参照値は、５８％の感度および５１％の特異度が所望される場合、２８７μｇ／ｍＬのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃである（すなわち、本発明による予後診断方法は、患者が２８７μｇ／ｍＬ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃを示す場合、５８％の感度および６１％の特異度で死亡率および再発イベントの予後を可能にする）。
【００８５】
特定の実施形態において、死亡率および再発イベントの予後に使用される参照値は、５５％の感度および６５％の特異度が所望される場合、３９８μｇ／ｍＬのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃである（すなわち、本発明による予後診断方法は、患者が３９８μｇ／ｍＬ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃを示す場合、５５％の感度および６５％の特異度で死亡率および再発イベントの予後を可能にする）。
【００８６】
特定の実施形態において、死亡率および再発イベントの予後に使用される参照値は、５５％の感度および６５％の特異度が所望される場合、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる３９８μｇ／ｍＬのアポＪである（すなわち、本発明による予後診断方法は、患者がＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる３９８μｇ／ｍＬ未満のアポＪを示す場合、５５％の感度および６５％の特異度で死亡率および再発イベントの予後を可能にする）
【００８７】
特定の実施形態において、死亡率および再発イベントの予後に使用される参照値は、死亡率および再発イベントの予後のために５８％の感度および５１％の特異度が所望される場合、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができる２８７μｇ／ｍｌのアポＪであり、死亡率の予後のために６４％の感度および５０％の特異度が所望される場合、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができる２７３μｇ／ｍｌのアポＪである（すなわち、本発明による予後診断方法は、患者がＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができる２８７μｇ／ｍｌ未満のアポＪを示す場合、５８％の感度および５１％の特異度で死亡率および再発イベントの予後を、または患者がＤ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに結合することができる２７３μｇ／ｍｌ未満のアポＪを示す場合、６４％の感度および５０％の特異度で死亡率の予後の診断を可能にする）。
【００８８】
本発明のリスク層別化方法
本発明者らはまた、グリコシル化アポＪのレベル、特にＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃを含むグリコシル化アポＪのレベルが、安定冠動脈疾患（ＣＡＤ）に罹患した患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定するのに有用なバイオマーカーでもあることを示した。この方法は、患者が虚血性イベントに罹患するリスクに従って患者を層別化することを可能にし、したがって、リスクに応じて患者に特定の予防療法を割り当てるのに有用である。
【００８９】
したがって、別の態様において、本発明は、安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを測定する方法（以下、本発明のリスク層別化方法）であって、前記方法は、前記患者のサンプル中で、グリコシル化アポＪのレベルを測定することを含み、ここで、参照値に対するグリコシル化アポＪのレベルの低下が、患者が再発虚血性イベントに罹患する罹患するリスクが高いことを示す指標となる方法に関する。
【００９０】
本発明の文脈において、「リスクを測定する」または「リスク層別化」という用語は、ａ）心筋虚血もしくは脳虚血またはそれに関連する虚血性組織障害に罹患した後の患者の更なる臨床合併症の罹患、および／またはｂ）本明細書中に開示される方法を適用した場合に、心筋虚血もしくは脳虚血またはそれに関連する虚血性組織障害に対する特定の治療からの恩恵のリスクまたは蓋然性を測定する能力に関する。この検出は、当業者に理解されるように、全てのサンプルに対して１００％正確であることを意図するものではない。しかしながら、分析された統計的に有意な数のサンプルが正しく分類される必要がある。統計的に有意な量は、以下のものに限定されるものではないが、例えば、信頼区間、ｐ値測定、スチューデントのｔ検定およびフィッシャー判別関数の測定などの異なる統計ツールを用いることによって、現場の専門家によって設定され得る。好ましくは、信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または９９％未満である。好ましくは、ｐ値は、０．０５、０．０１、０．００５または０．０００１未満である。好ましくは、本発明は、試験された特定の群または母集団の被験体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％において虚血または虚血性障害を正確に検出することができる。
【００９１】
患者、虚血性イベント、サンプル、アポＪおよびグリコシル化アポＪという用語は、本発明の診断方法および予後診断方法の文脈において詳細に記載されており、本発明のリスク層別化方法にも等しく適用可能である。
【００９２】
１つの実施形態において、再発虚血性イベントは、急性冠動脈症候群、脳卒中または一過性虚血性イベントである。
【００９３】
１つの実施形態において、サンプルは、生物流体である。別の実施形態において、生物流体は、血漿または血清である。
【００９４】
１つの実施形態において、虚血性イベントは、心筋虚血性イベントである。さらに別の実施形態において、心筋虚血性イベントは、ＳＴ上昇心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）である。別の実施形態において、虚血性イベントは、脳虚血性イベントである。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明の予後診断方法で測定されるグリコシル化アポＪは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪである。別の実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応する。
【００９６】
別の実施形態において、本発明の予後診断方法において測定されるグリコシル化アポＪは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪである。別の実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるアポＪのレベルに対応する
【００９７】
「安定冠動脈疾患」および「安定冠動脈心疾患」という用語は、同じ意味を持ち、同義的に用いられる。両方の用語には、病状安定冠動脈疾患（ＳＣＡＤ）が含まれる。「安定心血管疾患」、「安定冠動脈疾患」または「安定冠動脈心疾患」という用語の文脈における「安定」は、急性心血管イベントがない場合の診断された心血管疾患の任意の状態として定義される。したがって、例えば、安定冠動脈疾患は、冠動脈血栓症が臨床的提示（急性冠動脈症候群）を特色づける状況を除いて、冠動脈疾患の異なる進行段階を定義する。ＳＣＡＤに罹患している患者は、以下の状態の１つ以上によって定義される：抗血小板剤、抗凝固剤および／またはスタチンによる治療下で少なくとも３ヶ月間の安定した投与における、陽性ＥＣＧストレス検査または陽性心筋シンチグラフィーによる安定狭心症または冠動脈の５０％超の狭窄、急性冠動脈症候群の病歴、冠動脈血管再生術再建術の病歴。
【００９８】
好ましい実施形態において、安定冠動脈疾患に罹患している患者は、安定冠動脈疾患の前に急性冠動脈症候群に罹患していた。好ましい実施形態において、安定冠動脈疾患に罹患している患者は、安定冠動脈疾患の前に少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、６０ヶ月またはそれ以上、急性冠動脈症候群に罹患していた。
【００９９】
本発明の予後診断法におけるグリコシル化アポＪのレベルに関連した「レベルの低下」または「低レベル」という用語は、参照値よりも低いサンプル中のグリコシル化アポＪの任意の発現レベルに関する。したがって、グリコシル化アポＪのレベルは、それが参照値よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれよりも低い場合に、その参照値よりも減少しているかもしくは低いと見なされる。好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中に見出されるレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中に見出されるレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸基残基を含むグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中のレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中に見出されるレベルよりも低い。別の実施形態において、Ｄ．ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルは、参照サンプル中のレベルよりも低い。
【０１００】
本発明のリスク層別化方法に言及する場合の「参照値」という用語は、被験体から採取されたサンプルから得られた値またはデータを評価するための参照として使用される所定の基準に関する。参照値または参照レベルは、絶対値；相対値；上限値または下限値を持つ値；値の範囲；平均値；中央値；算術平均値；または特定の対照値またはベースライン値と比較した値であってよい。参照値は、例えば、試験されている被験体からのサンプルから得られた値などの個々のサンプル値に基づくことができるが、より早い時点で得られた値であってもよい。参照値は、実年齢にマッチさせた群の被験体の母集団などの多数のサンプルに基づくか、または試験されるサンプルを含むもしくは除外するサンプルのプールに基づくことができる。１つの実施形態において、参照値は、安定冠動脈疾患に罹患しているが、任意の再発虚血性イベントに罹患していない被験体において測定されたグリコシル化アポＪのレベルに対応する。参照値を測定することができる適切な患者は、安定冠動脈疾患に罹患しており、安定冠動脈疾患の発症後、少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月またはそれ以上の期間にわたって虚血性再発イベントに罹患していない患者である。
【０１０１】
別の実施形態において、参照値は、臨床的な観点から十分に文書で証明されており、安定冠動脈疾患に罹患しているが、安定冠動脈疾患の発症後、少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月またはそれ以上の期間にわたって再発虚血性イベントに罹患していない患者の群から得られたサンプルのプールから測定された、対応するバイオマーカーの平均レベルまたは算術平均レベルに対応する。前記サンプル中で、発現レベルの測定は、例えば、参照母集団における平均発現レベルの測定によって行うことができる。参照値の測定には、患者の年齢、性別、身体状態または他の特徴などの、サンプルのタイプのいくつかの特徴を考慮する必要がある。例えば、参照サンプルは、母集団が統計的に有意であるように、少なくとも２、少なくとも１０、少なくとも１００〜１０００を超える個体の同一量の群から得ることができる。
【０１０２】
本発明のリスク層別化による患者のリスク層別化診断のために使用される参照値は、診断において考慮されるマーカーと同じタイプのサンプルおよび同じバイオマーカーから得られた値であると理解されよう。したがって、リスク層別化方法が、ＧｌｃＮＡｃまたは（ＧｌｃＮＡｃ）２を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施される場合、リスク層別化に使用される参照値は、場合によっては健常被験体または上記で定義されるサンプルのプールから得られたＧｌｃＮＡｃ残基または（ＧｌｃＮＡｃ）２を含むグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、リスク層別化方法が、ＧｌｃＮＡｃおよびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪのレベルを測定することによって実施される場合、リスク層別化に使用される参照値は、上述のようにして得られるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸残基を含むグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。
【０１０３】
別の実施形態において、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することによってリスク層別化方法が実施される場合、リスク層別化に使用される参照値は、上述のようにして得られるＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに特異的に結合するグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。別の実施形態において、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪのレベルを測定することによってリスク層別化方法が実施される場合、リスク層別化に使用される参照値は、上述のようにして得られるＤａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍレクチンに特異的に結合することができるグリコシル化アポＪの発現レベルでもある。
【０１０４】
本発明のリスク層別化において使用される参照値は、所望の特異度および感度を得るために最適化することができる。特定の実施形態において、リスク層別化に使用される参照値は、９４％の感度および６４％の特異度が所望される場合、４８５μｇ／ｍｌのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃである（すなわち、本発明によるリスク層別化方法は、患者が４８５μｇ／ｍｌ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃを示す場合、９４％の感度および６４％の特異度でＣＡＤに罹患している患者の再発イベントの予測を可能にする）。
【０１０５】
別の実施形態において、リスク層別化に使用される参照値は、９４％の感度および６４％の特異度が所望される場合、Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる４８５μｇ／ｍｌのアポＪである（すなわち、本発明によるリスク層別化方法は、患者がＴ．ｖｕｌｇａｒｉｓレクチンに結合することができる４８５μｇ／ｍｌ未満のアポＪを示す場合、９４％の感度および６４％の特異度でＣＡＤに罹患している患者のイベントの予測を可能にする）。
【０１０６】
本発明によるバイオマーカーの測定のためのキット
本発明者らはまた、本明細書に記載される疾患のほかに、グリコシル化アポＪが関与する他の疾患の診断にも適したグリコシル化アポＪの検出を可能にするキットを得た。
【０１０７】
したがって、別の態様において、本発明は、
ａ．Ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸から選択されるグリカン残基に特異的に結合するレクチンである第１の試薬と、
ｂ．アポＪポリペプチドに特異的に結合することができる第２の試薬と
を含むキットに関する。
【０１０８】
本発明で用いられる「Ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸から選択されるグリカン残基に特異的に結合するレクチン」という用語は、任意の生物に由来する糖に結合する能力を有する抗体とは異なる任意のタンパク質のほかに、組換え方法で得られた、糖タンパク質中の糖残基への結合能力を維持するそれらの変異体を指す。本発明における使用に適したレクチンの例には、以下のものに限定されるものではないが、Ｃｏｎａｖａｌｉａ  ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａ、Ｔｒｉｔｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ、Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ、Ｅｒｙｔｈｔｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ、  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｌｌｏｍｙｒｉｎａ  ｄｉｃｈｏｔｏｍａ、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ、Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ、Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓおよびＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓから単離されたレクチンが含まれる。
【０１０９】
本発明における使用に適したレクチンの例には、表１に示されるレクチン（この表は、レクチンの一般的な名称、それが由来する生物、および前記レクチンに特異的に結合する糖を示す）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
【表１】
2019516966.tif 000004
【０１１１】
好ましい実施形態において、レクチンは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のレクチン、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のレクチンまたはそれらの組み合わせである。
【０１１２】
好ましい実施形態において、第２の試薬は、抗アポＪ抗体またはその抗原結合領域を含むその断片である。
【０１１３】
本発明の文脈において、「アポＪ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子およびその免疫学的に活性な部分、すなわち、本明細書で定義されグリコシル化アポＪに特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。本発明による使用に適した抗体には、結合がＮ−結合型またはＯ−結合型の炭水化物の存在によって影響されない限り、グリコシル化アポＪのポリペプチド部分に位置する１つ以上のエピトープを認識する抗体が含まれる。これらの抗体は、アポＪのグリコシル化形態およびその非グリコシル化形態の両方に結合することができる。
【０１１４】
免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の部分の例には、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって生成することができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ‘）２が含まれる。抗体は、ポリクローナル（典型的には、異なる決定基またはエピトープに対して指向される異なる抗体を含む）またはモノクローナル抗体（抗原上の単一の決定基に対して指向される）であり得る。抗体はまた、組換え、キメラ、ヒト化、合成または上記のいずれかの組み合わせ物であってもよい。
【０１１５】
１つの実施形態において、レクチンは固定化されている。固定化は、通常、支持体への結合によって達成される。本発明において使用される「支持体」という用語は、本発明の成分が物理的に結合され、したがって固定化される任意の固体材料を指す。本発明におけるそれらの使用に適した固体支持体には、以下のものに限定されるものではないが、シリコーン、ガラス、石英、ポリイミド、アクリレート、ポリメチルメタクリレート、セラミック、ニトロセルロース、金属、アモルファスシリコンカーバイド、ポリスチレンのほかに、マイクロ製造またはマイクロリソグラフィーに適した任意の他の材料が含まれる。
【０１１６】
レクチンは、共有結合または水素結合、疎水性相互作用もしくはイオン結合などの非共有結合によって支持体に固定化されることができる。適切なマイクロアレイおよび支持体の一般的な概説は、Ｓｈａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：６３９−６４５（１９９６））、ＬｅＧｅｎｄｒｅ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ９：７８８−８０５（１９９０））、米国特許第６１９７５９９号明細書および米国特許第６１４００４５明細書に記載されている。あるいは、エポキシ基、ビニルスルホン酸基、活性エステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イソチオシアネート基などによって活性化された支持体を使用することもできる。支持体がエポキシ基によって活性化されている場合、これらの基には、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＴＭＳ）、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランなどが含まれる。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明によるキットの成分は、標識を含む。原則的に、本発明は、キットの成分ｂへの共有結合が可能であり、それが前記成分のその後の検出を可能にする限り、任意の標識の使用を意図する。好ましい実施形態において、標識は、その化学的、電気的または磁気的特性の少なくとも１つの変化によって検出することができる
【０１１８】
したがって、本発明は、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは２１３Ｂのタイプの放射性同位体でタンパク質を修飾する可能性を意図する。放射性同位体を用いた標識化は、典型的には、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡおよびＴＥＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）などの金属イオンを錯化することができるキレートリガンドを用いて実施される。
【０１１９】
それにもかかわらず、好ましい実施形態において、成分ａは、蛍光基で標識される。本発明において使用するための適切な蛍光化合物には、以下のものに限定されるものではないが、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオール（ＴＲＩＴ）、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、ＨＥＸ（６−カルボキシ−４−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオロセイン）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、ＪＯＥ、（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオロセイン）、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオロセイン、５−カルボキシローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン（Ｔａｍｒａ）、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン（Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｐｒｉｎｃｅｓｔｏｎ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＤＡＢＣＹＬ、エオシン、エリスロシン、臭化エチジウム、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその類縁体、半導体ナノ結晶をベースとする無機蛍光標識（量子ドット）、Ｅｕ３＋およびＳｍ３＋などのランタニドをベースとする蛍光標識が含まれる。
【０１２０】
さらに別の実施形態において、キットは、成分ｂに特異的に結合することができる第３の成分（成分ｃ）を含む。この場合、レクチンによる支持体に捕捉されたアポＪの検出は、成分ｂを直接検出することによって実施されるのではなく、成分ａに結合された後に成分ｃを検出することによって実施される。
【０１２１】
成分ｂに特異的に結合することができる限り、任意の分子をキットの第３の成分として使用することができる。１つの実施形態において、成分ｂは、結合対の第１のメンバーで修飾され、成分ｃは、結合対の第２のメンバーで修飾される。
【０１２２】
「結合対」という用語は、以下のものに限定されるものではないが、生化学的、生理学的および／または化学的な相互作用を含む任意のタイプの分子間相互作用によって特異的に結合する能力を有する一対の分子（結合対の第１および第２のメンバーを指す）を指す。結合対には、抗原／抗体、抗原／抗体断片、ハプテン／抗ハプテンなどの免疫型の相互作用のほかに、アビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン化分子、葉酸／葉酸結合タンパク質、ホルモン／ホルモン受容体、レクチン炭水化物、レクチン／炭水化物で修飾された分子、酵素／酵素基質、酵素／酵素阻害剤、タンパク質Ａ／抗体、タンパク質Ｇ／抗体、相補的核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）の配列を含む）、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質などの相互作用の任意のタイプが含まれる。
【０１２３】
結合対の「第１」および「第２」のメンバーという用語は、相対的なものであり、前述のメンバーのそれぞれは、結合対の第１または第２のメンバーとなり得ることが理解されよう。
【０１２４】
本発明によるキットの成分ｂが抗体である、さらに好ましい実施形態において、第３の成分は、前記成分ｂに特異的に結合することができる抗体である。この場合、第２の抗体は、標識を含む。キットの第３成分のための適切な標識は、キットの成分ｂのための上記のものと同じである。キットの第３成分のための適切な標識は、キットの成分ｂのための上記のものと同じである。キットの第３の成分の標識は、蛍光基、発光基または酵素であり得る。検出可能な化合物が酵素である場合、この酵素は、例えば活性化剤、基質、増幅剤などを添加した後に検出可能なシグナルを生成することができなければならない。
【０１２５】
本発明の検出可能なタグとして適切な酵素および対応する基質には、以下のものが含まれる：
・  アルカリホスファターゼ：
・  発色基質：ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、ファーストレッド／ナフトールホスフェート−ＡＳ−ＴＳをベースとする基質
・  蛍光基質：４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）、２−（５’−クロロ−２’−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン（ＣＰＰＣＱ）、３，６−フルオレセインジホスフェート（３，６−ＦＤＰ）、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＢ、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲ、またはＦａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢのジアゾニウム塩が挙げられる。
・ペルオキシダーゼ：
・  ２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＴ）、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）および３−メチル−２−ベンゾチアジンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）テトラヒドロクロライドをベースとする発色基質
・  蛍光基質：４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元フェノキサジン、還元ベンゾチアジン（Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬、Ａｍｐｌｅｘ  ＵｌｔｒａＲｅｄ試薬および還元ジヒドロキサンテンを含む）
・  グリコシダーゼ：
・  発色基質：β−Ｄ−ガラクトシダーゼのためのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｏ−ＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）
・  蛍光基質：レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド、４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド。
・  オキシドレダクターゼ（ルシフェラーゼ）：
・  発光基質：ルシフェリン。
【０１２６】
酵素標識の場合、キットは、追加の成分として酵素の１つ以上の基質を含有してもよい。
【０１２７】
さらにより好ましい実施形態において、結合対の第２のメンバーに結合される検出可能な化合物は、蛍光化合物である。本発明で使用される「蛍光化合物」という用語は、測定された波長または波長範囲で光を吸収し、異なる波長または波長範囲で光を放出する全ての化合物を指す。本発明において使用するための適切な蛍光化合物には、以下のものに限定されるものではないが、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオール（ＴＲＩＴ）、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、ＨＥＸ（６−カルボキシ−４−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオロセイン）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、ＪＯＥ、（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオロセイン）、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオロセイン、５−カルボキシローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン（Ｔａｍｒａ）、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン（Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｐｒｉｎｃｅｓｔｏｎ  Ｒｅｄ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＤＡＢＣＹＬ、エオシン、エリスロシン、臭化エチジウム、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその類縁体、半導体ナノ結晶をベースとする無機蛍光標識（量子ドット）、Ｅｕ３＋およびＳｍ３＋などのランタニドをベースとする蛍光標識が含まれる。
【０１２８】
任意に、更なる実施形態において、キットは、異なる濃度のグリコシル化アポＪを含むバックグラウンド対照および／または標準曲線としてのブランクをさらに含む。
【０１２９】
更なる態様において、本発明は、虚血性イベントに罹患した患者の虚血の進行を判定するための、虚血性イベントに罹患した患者の予後のための、または安定冠動脈疾患に罹患している患者が再発虚血性イベントに罹患するリスクを判定するための、被験体の虚血または虚血性組織障害の診断方法において上記で定義される本発明によるキットの使用に関する。
【０１３０】
サンプル中のグリコシル化アポＪを測定する方法
別の態様において、本発明は、サンプル中のグリコシル化アポＪを測定する方法であって、
（ｉ）サンプルを、グリコシル化アポＪ中に存在するグリカン残基に特異的に結合するレクチンと、サンプル中のグリコシル化アポＪとレクチンとの間の複合体の形成に適した条件下で接触させるステップと、
（ｉｉ）レクチンおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を含むグリコシル化アポＪを含む複合体の量を検出するステップと
を含む、方法。
【０１３１】
「グリコシル化アポＪ」、「サンプル」および「グリコシル化アポＪ中に存在するグリカン残基に特異的に結合するレクチン」という用語は、本発明の診断方法および予後診断方法の文脈のほかに本発明によるキットの文脈において詳細に記載されており、本発明によるグリコシル化アポＪの測定方法にも等しく適用可能である。
【０１３２】
ステップ（ｉ）において、グリコシル化アポＪの測定方法は、サンプルを、グリコシル化アポＪ中に存在するグリカン残基に特異的に結合するレクチンと、サンプル中のグリコシル化アポＪとレクチンとの間の複合体の形成に適した条件下で接触させるステップを含む。
【０１３３】
前記複合体の形成に適した条件は、当業者によって測定されることができ、適切な温度、インキュベーション時間、およびｐＨを含む。特定の実施形態において、温度は、４〜４０℃、特に１０〜３５℃、より具体的には１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃（室温）の範囲である。特定の実施形態において、ｐＨは、ｐＨ２〜ｐＨ１０、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ１０の範囲である。特定の実施形態において、ステップ（ｉ）は、少なくとも１分間、好ましくは少なくとも５分間、より好ましくは少なくとも３０分間、さらにより好ましくは少なくとも６０分間にわたって行うことが可能である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、サンプルは、レクチンとの接触前に希釈される。サンプルの適切な希釈の範囲は、１：１０〜１：１０００００、好ましくは１：１００〜１：１０００であり、より好ましくは、血漿サンプルの希釈は、１：２００または１：１５００である
【０１３５】
１つの実施形態において、ステップ（ｉ）で使用されるレクチンは、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチンまたはＮ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸に特異的に結合するレクチンである。より好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミンに特異的に結合するレクチンは、Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ由来のレクチンであるか、またはＮ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸またはシアル酸に特異的に結合するレクチンは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のレクチンである。
【０１３６】
さらに別の実施形態において、グリカン残基に特異的に結合するレクチンは固定化される。適切な支持体は、本発明のキットに記載されたものと同じである。
【０１３７】
ステップ（ｉ）が、レクチンとサンプル中に存在するグリコシル化アポＪとの間の複合体の形成を可能にするのに十分な時間にわたって行われた後に、ステップ（ｉｉ）が実施される。ステップ（ｉｉ）において、グリコシル化アポＪの測定方法は、レクチンおよびグリコシル化アポＪを含む複合体の量を検出するステップを含む。
【０１３８】
１つの実施形態において、ステップ（ｉ）で得られた複合体は、非特異的結合を介して支持体に結合したであろう任意のアポＪを除去するために、ステップ（ｉｉ）の開始前に洗浄される。ステップ（ｉ）後の洗浄は、洗浄液を用いて実施される。特定の実施形態において、洗浄溶液は、１種以上の塩を含有する。好ましくは、洗浄溶液に含まれる塩は、トリス緩衝液（ＴＢＳ）またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に含まれるＮａＣｌである。それに加えるかまたは代えて、洗浄液は、少なくとも１種の界面活性剤を含有する。好ましくは、界面活性剤は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなる群から選択される。
【０１３９】
レクチンおよびグリコシル化アポＪを含む複合体の量の検出は、通常、アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬を用いて実施される。好ましい実施形態において、アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬は、抗体またはその抗原結合領域を含むその断片である。
【０１４０】
グリコシル化アポＪを検出するための方法のステップ（ｉｉ）での使用に適した抗体は、本発明によるキットの文脈において定義されており、本明細書においても同様に適用可能である。１つの実施形態において、抗体は、検出可能な標識にカップリングされる。抗アポＪ抗体のための適切な標識は、本発明のキットの文脈において上記で定義されている。好ましい実施形態において、その化学的、電気的または磁気的特性の少なくとも１つの変化によって標識を検出することができる。
【０１４１】
別の実施形態において、レクチンおよびグリコシル化アポＪを含む複合体の量の検出は、アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬に特異的に結合することができる試薬を用いて実施される。別の実施形態において、アポＪポリペプチドに特異的に結合する試薬に特異的に結合することができる第３の試薬は、抗体またはその抗原結合領域を含むその断片であり、この場合、複合体の検出は、アポＪに特異的に結合する試薬に結合した抗体の検出によって行われる。これは、検出可能な標識を含む抗体を用いて行われる。抗体における使用のための適切な標識は、本発明によるキットの文脈において上記で定義される。標識は、蛍光標識または酵素標識であり得る。
【実施例】
【０１４２】
本発明を、以下の実施例によって説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１４３】
実施例１
心臓虚血におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃおよびアポＪ−ＧｌｃＮＡｃの診断値
心臓虚血患者におけるアポＪプロテオミックプロファイルは、二次元電気泳動（２−ＤＥ）とその後の質量分析同定を用いて以前に特徴付けられていた（Ｃｕｂｅｄｏ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，２０１１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：２１１−２２０）。その研究では、イベント発症後最初の６時間以内に特定のアポＪ型が増大（アポＪ−２９）または減少（アポＪ−１５）したことが示されていた（図１）。これらの基準を適用することにより、特定のアポＪ型（アポＪ−１５およびアポＪ−２９）が急性心筋梗塞（ＡＭＩ）によって誘導される組織障害のマーカーとすることが提案されていた。同じ研究において、アポＪ−１５およびアポＪ−２９において検出された変化が、アポＪのグリコシル化プロファイルの変化によるものであり得るのかを分析した。具体的には、Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ  ＡとＴｒｉｔｉｃｕｍ  ｖｕｌｇａｒｉｓのレクチンの混合物（α−マンノース、α−グルコース、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃ残基とのタンパク質に結合する）で血清糖タンパク質を単離した。単離されたタンパク質は、２−ＤＥ分析とその後の質量分析同定によって分析した。この分析（図２）では、スポット１、２、４、５、８および１１のみがα−マンノース、α−グルコース、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃ残基を含み、スポット３、６、７、９、１０、１２および１３はこれらの残基を有していないことが判明した。α−マンノース、α−グルコース、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃ残基によるグリコシル化アポＪスポットの強度は、対照よりもＡＭＩ前の虚血患者において低かった。この減少は、形態４および８でより明白であった。虚血の初期段階でα−マンノース、α−グルコース、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃグリコシル化アポＪ強度が計２５％減少した。対照的に、虚血の初期段階では、これらの残基（３、６、７、１０、１２および１３）がないアポＪ型が増大した。
【０１４４】
しかしながら、上記のアッセイで使用されたレクチンの多重特異性に基づき、これらのアッセイは、アポＪの異なるグリコシル化形態（α−マンノースを含む形態、α−グルコースを含む形態、（ＧｌｃＮＡｃ）２および／またはＮｅｕ５Ａｃ残基を含む形態）のいずれが、実際に、虚血性障害に関連するバイオマーカーであるのかを判別することはできなかった。さらに、タンパク質をα−ガラクトースおよびＯ−グリカン中にのみ見出されるＧａｌＮＡｃ残基と結合するＡｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａアレクチンを用いることにより、スポット１、３、４、６、７、８、９、１１および１２のみがα−ガラクトースおよびＧａｌＮＡｃ残基を含み、スポット２、５、１０および１３はこれらの残基を有していないことが判明した。したがって、以前に報告されたスポット１，２、４、５、８および１１の減少は、α−マンノース、α−グルコース、（ＧｌｃＮＡｃ）２およびＮｅｕ５Ａｃ残基を含む形態の減少を示す指標になるだけではない。なぜなら、これらのスポットのいくつかも、Ｏ−グリコシル化残基、より具体的にはα−ガラクトースおよびＧａｌＮＡｃ残基を含むからである。
【０１４５】
アポＪ中の異なるタイプの残基の存在を判別するために、別個の方法論が使用されている。この方法論（以下、イムノアフィニティー酵素−グリコシル化アッセイまたはＥＧＡとして知られる）は、異なるグリコシル化アポＪ型の特異的検出および定量化を可能にする。このＥＧＡは、１）タンパク質が特定のグリコシル化残基（表１）への結合によって固定化される第１のステップ、２）アポＪがアポＪタンパク質配列に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体で検出される第２のステップ、および３）特異的に固定化されたグリコシル化アポＪ形態の量が、レポーターシステムまたは分子によってさらに検出および定量化される最終ステップに基づいている。このレポーターシステムは、ａ）ビオチン−ストレプトアビジン−ＨＲＰなどのレポーターシステムと一緒の二次抗体などの比色系；またはｂ）該システムにおける物理化学的変化（すなわち、化学的、電気的または磁気的変化）で構成され得る。
【０１４６】
【表２】
2019516966.tif 000005
【０１４７】
異なるレクチンを用いたこの方法論を使用して、グリコシル化アポＪは、以下のグリカン残基を有することができると判明した：ａ）（ＧｌｃＮＡｃ）２＋Ｎｅｕ５Ａｃ；ｂ）αＮｅｕ５Ａｃ（２→６）ｇａｌ＋ＧａｌＮＡｃ；ｃ）α−Ｌ−フコース；ｄ）ＧａｌＮＡｃのみ；およびｅ）（ＧｌｃＮＡｃ）２単独（図４）。
【０１４８】
３８人のＡＭＩ前の虚血患者および１４４人の健常対照の血漿サンプル中の（ＧｌｃＮＡｃ）２＋Ｎｅｕ５Ａｃ残基（アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ）でアポＪを特異的に測定するためにＥＧＡを適用した。ＡＭＩ前の虚血患者は、対照と比較した場合、虚血の初期段階でアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋ＡｐｕＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルについて４５％の減少を示すことが判明した（ＡＭＩ前の虚血：２６４±１８対Ｃ：４７３±６μｇ／ｍＬ；Ｐ＜０．０００１；図５Ａ）。ＡＭＩ前の虚血患者のサンプルを、胸痛の発症後および壊死マーカー（Ｔ−トロポニンおよびＣＫ）の上昇前の最初の６時間以内に入院時（ｔ＝０）に採取した。この時点で、患者は、イベント発症のために治療を一切受けていなかった。Ｃ−統計分析から明らかになったことは、ＥＧＡによるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの測定が、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９３４（Ｐ＜０．０００１）およびカットオフ値３３２μｇ／ｍＬ（感度９７％および特異度７１％）で心筋虚血の存在についての高い判別値を示すことである（図５Ｂおよび表２）。したがって、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの測定は、虚血の診断のためのバイオマーカーとして使用することができた。
【０１４９】
ＥＧＡ方法論による２１２人のＳＴＥＭＩ患者におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルをさらに分析した。入院時のＴ−トロポニン陽性患者（壊死を有する患者の群）を含む虚血性疼痛の進行の異なる時間（１時間〜６０時間）を有するＳＴＥＭＩ患者（新生および二次イベントを含む）から入院時にサンプルを採取した。ＳＴＥＭＩ患者は、対照群（ＳＴＥＭＩ：４０２±８対Ｃ：４７３±６μｇ／ｍＬ；Ｐ＜０．０００１；図６Ａ）と比較した場合、入院時のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルについて１５％の減少を示した。Ｃ−統計分析から明らかになったことは、ＥＧＡによるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの測定が、曲線下面積（ＡＵＣ）０．７１３（Ｐ＜０．０００１）およびカットオフ値４０９μｇ／ｍＬ（感度８０％および特異度５３％）で心筋虚血の存在についての高い判別値を示すことである（図６Ｂ）。
【０１５０】
次いで、ＥＧＡを、３４０人のＳＴＥＭＩ患者および１３９人の健常対照においてレクチンＤａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍを用いて（ＧｌｃＮＡｃ）２残基を有するアポＪ（アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に測定するために適用すると、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルついて３５％の減少が入院時のＳＴＥＭＩ患者において見出された（ＳＴＥＭＩ：３２８±７対Ｃ：５０６±１２μｇ／ｍＬ；Ｐ＜０．０００１；図６Ｃ）。Ｃ−統計分析から明らかになったことは、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの測定が、曲線下面積（ＡＵＣ）０．８３０（Ｐ＜０．０００１）およびカットオフ値３９３μｇ／ｍＬ（感度８１％および特異度７２％）で心筋虚血の存在についてのより高い判別値を示すことである（図６Ｄ）。
【０１５１】
【表３】
2019516966.tif 000006
【０１５２】
実施例２
アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃおよびアポＪ−ＧｌｃＮＡｃの予後診断値
第２段階で、特定の定量グリコシル化アポＪ型が予後診断値を有し得るのかを評価した。アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルは、虚血時間（症状の発症と入院との間の経過時間；Ｒ＝−０．２５９  Ｐ＝０．０００３；図７Ａ）と有意相関および逆相関した。さらに、入院３日後の８２人のＳＴＥＭＩ患者におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの測定からは、入院時（ｔ＝７２時間：３３１±１０対ｔ＝０：４０２±８μｇ／ｍＬ；Ｐ＜０．０００１；図７Ｂ）と比較した場合、漸進的な減少が明らかになった。アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルのみを分析した場合、虚血時間との有意相関および逆相関もあった（Ｒ＝−０．１１３  Ｐ＝０．０４８；図７Ｃ）。これらの結果は、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃおよびアポＪ−ＧｌｃＮＡｃが虚血進行の新規のバイオマーカーであることを強調している。
【０１５３】
さらに、院内死亡率および６ヶ月の死亡率の増大による予後の悪化に関連する、最終的なＴＩＭＩフローグレードが０または１であるＳＴＥＭＩ患者は、最終的なＴＩＭＩフローが２以上であるＳＴＥＭＩ患者と比較した場合（図８Ａ）、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルが有意に低いことを示した。さらに、ＳＴＥＭＩに罹患した後の予後不良と関連する、心原性ショックに罹患した患者は、心原性ショックを有していない患者と比較した場合（図８Ｂ）、入院時にアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルが１２％低いことを示した。
【０１５４】
さらに、死亡率に関連する（Ｒ＝−０．２５７  Ｐ＝０．０００２；図９Ａ）、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルとＧＲＡＣＥリスクスコアとの間に逆相関および有意相関があった。さらに、８２人のＳＴＥＭＩ患者の追跡調査におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃレベルの変化を見ると、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルが入院時よりもイベント３日後でさえもより一層低い患者がより高いＧＲＡＣＥリスクスコアを示すことが観察された（Ｐ＝０．００２；図９Ｂ）。同様に、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルも、ＧＲＡＣＥリスクスコアと逆相関および有意相関していた（Ｒ＝−０．１８４  Ｐ＝０．０００６；図９Ｃ）。これらの全ての結果は、虚血性イベントの関わりにおけるリスク層別化マーカーとしてアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃおよびアポＪ−ＧｌｃＮＡｃが予想外の役割を果たすことを指摘している。
【０１５５】
さらに、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析により明らかになったことは、入院時のＳＴＥＭＩ群の中央値よりもアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ値が低い患者が、６ヵ月の追跡調査後に再発虚血性イベントの出現および死亡率について有意差を示すことである（Ｐ＝０．００８；図１０Ａ）。この効果は、同じ分析をＴ−トロポニンを用いて行った場合には見られなかった（Ｐ＝０．３６３；図１０Ｂ）。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析により、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルが入院時の最低四分位内にあるＳＴＥＭＩ患者（＜２３６．８μｇ／ｍＬ）が６カ月の追跡調査で生存率の有意な低下を示すことが明らかになったように（Ｐ＝０．０１５；図１０Ｃ）、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルも予後診断値を有する。６ヶ月の追跡調査後の再発虚血性イベントおよび死亡率の両方の出現を、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルが入院時の最低四分位内にあるＳＴＥＭＩ患者と、入院時により高いアポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルを示すＳＴＥＭＩ患者（Ｐ＝０．０３１；図１０Ｄ）との間のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析におけるエンドポイントとした場合、有意差も観察された。したがって、結果は、虚血提示後の予後診断マーカーとしてのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃおよびアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ血漿レベルの役割を指摘する。
【０１５６】
実施例３
安定冠動脈疾患（ＣＡＤ）の関わりにおける再発虚血性イベント（心臓または脳のいずれか）を提示するための予測値アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ
本研究は、安定冠動脈疾患（ＣＡＤ）の関わりおける再発虚血性イベント（心臓または脳）を提示するための予測値である、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ測定の別の予想外の特性を示した。サンプル採取から平均０．６±０．０４年前に急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）に罹患しており、その後２．３±０．３年にわたって追跡調査した慢性ＣＡＤ患者（Ｎ＝３４）の群におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルを分析した（図１１Ａ）。２つの患者群から血漿サンプルを得た：追跡調査時に急性虚血性イベント（任意の急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、脳卒中または一過性脳虚血性イベント（ＴＩＡ））に罹患した患者（Ｎ＝１６）と、追跡期間中に急性虚血性イベント（Ｎ＝１８）を有さなかった患者。両群の間で、年齢、糖尿病および高血圧の発生、ならびにコレステロールパラメータついて有意差はなかった。含まれた患者のいずれも喫煙者ではなく、患者の全てがサンプル採取時に抗血小板療法の下にあった。再発イベントに罹患した患者は、追跡調査時に何らのイベントもなかった患者よりも、イベントに罹患する前にアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルが２８％低いことを示した（図１１Ｂ）。実際、受信者動作曲線（ＲＯＣ）は、安定ＣＡＤ患者における再発虚血性イベントを提示するためのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの予測値を示した（図１１Ｃ）。具体的に、本研究では、４８５μｇ／ｍＬ未満のアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルは、安定ＣＡＤ患者において感度９４％および特異度６４％で再発虚血性イベントの提示を予測することができた（表２）。したがって、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃは、安定ＣＡＤを有する患者における再発急性虚血性イベントの提示に先立つ「隠れた」虚血プロセスのマーカーとしての追加の価値を示す。
【０１５７】
実施例４
脳虚血におけるバイオマーカーとしてのアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃの役割
さらに、１７４人の脳卒中患者におけるアポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃレベルの測定により、１６４人の健常対照（脳卒中：４１８±７対Ｃ：４５３±７μｇ／ｍＬ；Ｐ＝０．０００８；図１２）と比較した場合、８％の減少を明らかとなり、アポＪ−ＧｌｃＮＡｃ＋Ｎｅｕ５Ａｃ＋アポＪ−ＧｌｃＮＡｃも脳虚血のバイオマーカーであることが強調される。
【図１】
2019516966.tif 000007
【図２】
2019516966.tif 000008
【図３】
2019516966.tif 000009
【図４】
2019516966.tif 000010
【図５】
2019516966.tif 000011
【図６ＡＢ】
2019516966.tif 000012
【図６ＣＤ】
2019516966.tif 000013
【図７ＡＢ】
2019516966.tif 000014
【図７Ｃ】
2019516966.tif 000015
【図８】
2019516966.tif 000016
【図９ＡＢ】
2019516966.tif 000017
【図９Ｃ】
2019516966.tif 000018
【図１０ＡＢ】
2019516966.tif 000019
【図１０ＣＤ】
2019516966.tif 000020
【図１１】
2019516966.tif 000021
【図１２】
2019516966.tif 000022
【国際調査報告】
2019516966.tif 000023
2019516966.tif 000024
2019516966.tif 000025