(57)【要約】本発明は付加堆積のためのバイオインクを製造する方法に関し、該方法は、５〜４０質量％のゼラチンを含む第１の溶液と、１５〜３５質量％のアルギネートを含む第２の溶液と、１〜１５質量％のフィブリノゲン、および任意的に懸濁液内の生細胞を含む第３の溶液とを用意することと、約３５〜６５体積％の第１の溶液、約１５〜３５体積％の第２の溶液、および約１５〜３５体積％の第３の溶液を含み、これらの割合が合計して１００％となるように選択される混合物を作製することとを含む。バイオインクによって、カルシウムイオンおよびトロンビンを含む溶液によって重合することができる物体の付加堆積が可能になる。物体はインキュベートされて、身体組織の代替体として、例えば（線維芽細胞の添加により）皮膚代替体として、使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
付加堆積のためのバイオインクを製造する方法において、
（ａ）５〜４０質量％（好ましくは６〜３０質量％）のゼラチンと０〜５質量％のＮａＣｌとを含む第１の溶液を用意し、
（ｂ）１〜１２質量％（好ましくは１〜８質量％）のアルギネートと０〜５質量％のＮａＣｌとを含む第２の溶液を用意し、
（ｃ）１〜１５質量％（好ましくは３〜１５質量％）のフィブリノゲンと懸濁液内の生細胞とを含む第３の溶液を用意し、
（ｄ）約３５〜６５体積％の前記第１の溶液、約１５〜３５体積％の前記第２の溶液、および約１５〜３５体積％の前記第３の溶液を含み、これらの割合が合計して１００％となるように選択される混合物を作製し、
該方法において、
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の順序は任意であり、
前記ＮａＣｌの含量は、前記第１の溶液および前記第２の溶液を合わせて、０．２〜５質量％、好ましくは０．２〜３質量％、さらにより好ましくは０．４〜２質量％となるように選択され、
前記生細胞は、あらゆるヒトまたは動物の組織または器官から単離された初代細胞である、方法。
【請求項２】
前記生細胞は、幹細胞（分化全能性、分化多能性、および３重分化能性（ｔｒｉｐｏｔｅｎｔ））または分化細胞（生殖系列細胞もしくは体細胞）、あらゆるヒトまたは動物の組織または器官から単離された初代細胞（例えば生殖系列細胞）、体細胞，幹細胞；結合組織または支持組織（骨、靱帯、軟骨、腱、脂肪組織など）、筋組織（血管壁の平滑筋細胞、心筋、骨格筋など）、神経組織および上皮（血管、ワルトン管、口腔粘膜、舌背、硬口蓋、食道、膵臓、副腎、前立腺、肝臓、甲状腺、胃、腸、小腸、直腸、肛門、胆のう、甲状腺濾胞、リンパ管、皮膚、汗腺、体腔上皮、卵巣、卵管、子宮、子宮内膜、子宮頸部（子宮頸管内膜、子宮頸膣部）、膣、大陰唇、直尿細管（ｔｕｂｕｌｉ  ｒｅｃｔｉ）、精巣網、輸出管、精巣上体、精管、射精管、尿道球腺、精のう、中咽頭、喉頭、声帯、気管、細気管支、角膜、鼻、腎臓の近位尿細管曲部、腎臓の遠位尿細管、腎盂、尿管、膀胱、前立腺部尿道など）に由来する細胞；中胚葉、外胚葉、または内胚葉由来の細胞；リンパ球（特にＢリンパ球、Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＮＫＴリンパ球、制御性Ｔリンパ球、補助リンパ球）、骨髄細胞、顆粒球、好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球、過分葉好中球、単球、マクロファージ、網状赤血球、血小板（ｔｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）、マスト細胞、血小板、巨核球、樹状細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞（ａｄｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ）、クロム親和性細胞、松果体細胞、グリア細胞、グリア芽細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、大細胞性神経分泌細胞（ｍａｇｎｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ）、星状細胞（ｓｔｅｌｌａｒ  ｃｅｌｌ）、ベッチェル細胞；下垂体細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、成長ホルモン分泌細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞（ｌａｃｔｏｔｒｏｐｈ）、肺細胞（特にＩ型肺胞細胞、ＩＩ型肺胞細胞、クララ細胞）；肺胞マクロファージ、心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）、周皮細胞、胃細胞（特に消化細胞（胃主細胞）、壁細胞、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸内分泌細胞、腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞）、肝細胞（特にヘパトサイト、クッパー細胞）、骨細胞（特に骨芽細胞、オステオサイト、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、エナメル芽細胞）、軟骨細胞（特に軟骨芽細胞、コンドロサイト）、毛細胞（特にトリコサイト）、皮膚細胞（特にケラチノサイト、脂肪細胞、線維芽細胞、メラノサイト、母斑細胞）、筋細胞（特にミオサイト、筋芽細胞、筋管）、腱細胞、腎細胞（特にポドサイト、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、緻密斑細胞）、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵母細胞、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生細胞は、結合組織もしくは支持組織、筋組織、神経組織または上皮から単離される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生細胞は、臍帯血細胞、幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、がん幹細胞、前駆細胞、自家細胞、同系移植細胞、同種異系細胞、異種移植細胞、遺伝子改変細胞、誘導前駆細胞、トランスフェクション細胞からなる群から選択される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法によって取得することができるバイオインク。
【請求項６】
身体組織代替体を製造する方法において、
（ｉ）請求項５に記載のバイオインクを用意し、
（ｉｉ）１〜５質量％のカルシウムイオンと、２Ｕ／ｍＬ〜４０Ｕ／ｍＬ（好ましくは５Ｕ／ｍＬ〜４０Ｕ／ｍＬ、さらにより好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬ）のトロンビンとを含む水溶液（「重合溶液」と呼称する）を用意し、
（ｉｉｉ）前記バイオインクをそのゲル化点より高い温度Ｔ１にして、前記バイオインクの前記ゲル化点より低い温度Ｔ２の基質に堆積させ、該基質において、前記バイオインクはゲルとなって「未処理のプリント物体」と呼称される制御された３次元物体を形成し、
（ｉｖ）前記未処理のプリント物体を前記重合溶液で処理して、前記未処理のプリント物体を身体組織代替体へと固定し、
（ｖ）前記身体代替体を細胞培地にてインキュベートする、方法。
【請求項７】
Ｔ１は２７℃〜３２℃であり、Ｔ２は４℃〜２０℃である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記未処理のプリント物体は、Ｔ１よりも高い温度Ｔ３で、好ましくは３５℃〜３８℃で、浸漬することによって前記重合溶液で処理される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記身体組織代替体は皮膚代替体前駆体であり、
前記バイオインクは生線維芽細胞を含む懸濁液であり、
前記インキュベートは３６℃〜３８℃の温度で行われ、８〜４０日継続する第１のインキュベート期と５〜１０日継続する第２のインキュベート期とを含み、ケラチノサイトの水性懸濁液を前記第１のインキュベート期と前記第２のインキュベート期との間において前記皮膚代替体の表面に堆積させる、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記未処理のプリント物体はほぼ平坦な上部面を含み、平坦な上部面のｃｍ２当たり０．２〜１０×１０５（好ましくは０．２〜２×１０５）の線維芽細胞に等しい線維芽細胞が均一に分布する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
線維芽細胞の濃度は、バイオインクのｃｍ３当たり０．６〜１２×１０５の線維芽細胞、好ましくはバイオインクのｃｍ３当たり１〜７×１０５の線維芽細胞、さらにより好ましくはバイオインクのｃｍ３当たり１〜５×１０５の線維芽細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
堆積されるケラチノサイトの量は、平坦な上部面のｃｍ２当たり０．０５〜５０×１０５のケラチノサイト（好ましくは０．２〜２０×１０５、より好ましくは０．５〜１０×１０５のケラチノサイト）である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記身体組織代替体は皮膚代替体であり、前記方法において、
（ｉ）第１のステップにおいて、前駆脂肪細胞および／または成熟脂肪細胞を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオインクを用いて、皮下組織を複数の層状にプリントし、
（ｉｉ）第２のステップにおいて、線維芽細胞を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオインクを用いて、皮下組織を複数の層状にプリントし、
（ｉｉｉ）第３のステップにおいて、ケラチノサイトを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオインクを用いて、１または複数の層をプリントする、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法によって取得することができる身体組織代替体。
【請求項１５】
前記身体組織代替体は、
線維芽細胞を含有する真皮層、
ケラチノサイトを含有する表皮層、
ケラチノサイトを含有する角質層、を含む皮膚代替体である、請求項１４に記載の身体組織代替体。
【請求項１６】
特に修復、美容または形成外科的処置において、ヒト患者または動物患者の身体にインプラントするために使用される、請求項１４または１５に記載の身体組織代替体。
【請求項１７】
特に身体組織における毒性、治療的もしくは美容的有効性、または貫通性を評価する目的で、医薬品もしくは化粧料活性成分における試験を行うため、または化学製品における試験を行うための、請求項１４または１５に記載の身体組織代替体の使用。
【請求項１８】
前記身体組織代替体は病的細胞を含むバイオインクで作製され、有効成分の一般または個別の治療的有効性を評価することを目的とする、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、より詳細には身体組織代替体、特に皮膚組織の代替体に関する。本発明は、特に、身体へのインプラントを意図した身体代替体（皮膚など）を製造すること、または医薬品または化粧料活性成分における試験を行って身体組織におけるその毒性、その有効性もしくは貫通性を評価することに関する。
【背景技術】
【０００２】
欧州では、化粧料に使用される化学物質は実験動物において試験することはできない。したがって、皮膚代替体は、天然の真皮の特徴により酷似する特徴を得るため、その製造および使用のコストを低減するために、引き続き改善されている。生物工学的材料および基質を製造するための種々の実験方法のなかでも、付加堆積法は過去数年にわたって大きく注目を浴びているものである。
【０００３】
その一部が「ステレオリソグラフィー」または「３Ｄプリンティング」の用語で知られる付加製造法は、当初、プラスチック製のモデル工業用部品（高速プロトタイピング、特許文献１参照）を製造するために設計されたが、過去約１０年の間、数多くの適用分野で研究されている。付加製造法には、一般に、最初の基質において、制御された３次元形状に粉末、ペースト、または液（インク）相を堆積すること、続いてこの堆積相を固化させて、制御された３次元形状を有する物体を取得することを含む。この堆積は通常複数のパスで行われ、そのそれぞれが粉末、ペースト、または液相を制御された３次元形態に堆積させるものである。従来、これらの堆積物はパス毎（層毎）に固化される。該粉末、ペースト、または液相は均質であってもよく（例えば均質な粉末または溶融型熱可塑性ポリマー）、または液相内に分散した固体粒子を含んでいてもよい。その粘性は重要なパラメータであり得、これは、その堆積後に得られるプリフォームが固化を待つ間（この待ち時間は1秒の何分の１かであり得る）に崩れてはならないためである。また、インクの組成に応じて、種々の技術によって固化することができる。また、特に固化する溶融状態の押出しポリマーの場合、またはチキソトロピー性ペーストの場合、または互いに反応する分子を含む組成を有するポリマーの場合に、自発的に起こることもある（特許文献２に記載されている）。
【０００４】
例として、プラスチック部品は、レーザービームの光によって（または吸収によって発生した熱によって）重合可能なインクを堆積することで製造することができ、金属部品は、レーザービームの影響下で（通常は中間的融解によって）凝固する金属粒子または粉末を含むペーストを堆積することで製造することができ（粉末焼結積層造形法（ＳＬＳ（Selective Laser Sintering））として知られている技術）、溶融金属も直接的に堆積することができる。このように、複雑な形状の工業部品を製造することができる。ＦＤＭ（登録商標）（Fused Deposition Modeling、溶融堆積モデリング）、マルチジェットモデリング、およびＦＴＩ（Film Transfer Imaging、フィルム転写イメージング）など、市場において多数の技術（およびその省略形）が存在する。省略形のＳＦＦ（Solid Freeform Fabrication、固体自由形状製造法）は、付加技術を用いてＣＡＤ（Computer-Aided Design、コンピュータ支援設計）ファイルから直接的に３次元構造を製造するために使用できる一連の技術を指すために用いられる。
【０００５】
付加製造技術の使用は、バイオテクノロジー分野の先行技術において既知である。つまり、「生物学的」材料系の３次元構造がプリントされている。より正確には、この場合、使用されるインクは固化可能な生体適合性材料である。これらの材料は生細胞のための足場材として使用することができ、該生細胞は足場材が固化された後に導入される。また、生細胞は、生細胞を含む懸濁液であるインク内に直接的に導入することもでき、これらのインクは「バイオインク」と呼ばれることもある。
【０００６】
この固化は光化学法によって行うことができる。例として、特許文献３は、生細胞がコロニー形成可能な足場材を作製するための、いくつかのタイプの光重合性ヒドロゲル、すなわちＰＥＧ−ＤＡ（＝ポリエチレングリコールジアクリレート）、ＰＥＧ−ＤＡ−ＰＥＡ（ポリエステルアミド）、ＧＭＡ−キトサンおよびアルギネートの使用を記載している。特許文献４は、ＰＰＦ（ポリプロピレンフマレート）系の吸収性足場構造の製造を記載している。特許文献５および特許文献６は、光化学反応によって固化されるポリエチレングリコールヒドロゲルを使用するステレオリソグラフィーの他の実施形態を記載している。しかしながら、光化学による固化は、相当量の光触媒、光開始剤、および／または染色剤を必要とする（例えば２％光開始剤）。これらの添加剤は毒性学的問題をもたらし得る。光触媒に関して、たとえそれ自体に毒性はないとしても、通常、フリーラジカルの生成は、細胞死や、得られる産生物を妨害する危険性を招くものである。これが、バイオテクノロジー用途のために光重合の代替を見出すことが求められる理由である。
【０００７】
また、ヒドロゲルは固化可能なペースト媒体として過去に使用されてきた。特許文献７は、その非常に長いリストを記載している。特許文献８には、メタクリレート系光硬化性ヒドロゲルが記載されている。特許文献９は、熱可逆性ヒドロゲルをより具体的に記載している。特許文献１０は、温度が臨界ゲル化温度未満に低下したときに固化可能な第１のヒドロゲル前駆体と、架橋可能な第２のヒドロゲル前駆体とを含む、生細胞の懸濁液が堆積され、堆積された懸濁液は冷却することで固化されて、硬化剤が添加される方法を記載している。第２前駆体は、アルギネート、ヒアルロン酸、セルロース誘導体、キトサン、キサンタン、フィブリン、ペクチンゲル、またはポリビニルアルコールとすることができる。一般に、細胞培養足場用の固化したヒドロゲルは、「格子」の名称で当業者には知られている。他の固化可能なシステムは、特許文献１１および特許文献１２に記載されている。
【０００８】
また、アルギネート系インクは、細胞培養用足場を製造するために溶液で固化されるとして既知である。そうしたシステムおよび方法は特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５に記載されている。
【０００９】
特許文献１６は、骨細胞、骨芽細胞を堆積させることができる３次元構造を作製するためのヒドロキシアパタイト堆積物を記載している。
【００１０】
バイオテクノロジーでも、細胞培養誘導を促す足場材に生細胞を含むインクを塗布するために３Ｄプリンティングが使用されていた。特許文献１７および特許文献１８は、ヒト細胞を含有するコラーゲン系インク（アルギネートを含み得る）による３Ｄプリンティングを記載している。特許文献１９は、生物学的または合成的支持体に、３Ｄプリンティングによってヒドロゲルに懸濁した平滑筋細胞を堆積することを記載している。
【００１１】
特許文献２０は、３Ｄプリンティングによって多孔性基質（足場材）に４つの異なる細胞型を堆積することを記載しており、それぞれが専用プリントヘッドから発射される懸濁液として堆積されて、組織を再現する複雑な３次元構造を作製する。特許文献２１は、３Ｄプリンティングによって「格子」型生体適合性構造体を製造することを記載しており、該構造体には特定の範囲の組織に特有の生組織が固定され、平滑筋細胞、皮膚線維芽細胞、内皮細胞、肝星細胞、肝細胞、単球、マクロファージを含む。ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０（２００９年）、１５８７〜１５９５ページに掲載されたＷ．Ｌｅｅらによる「３次元自由形状造形によるヒト皮膚線維芽細胞とケラチノサイトとの多層培養（Multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytesthrough three-dimensional freeform fabrication）」と題する刊行物は、同様の方法で堆積される、Ｉ型コラーゲン系ヒドロゲル格子における３Ｄプリンティングによる細胞の堆積を記載している。特に、この刊行物は、いくつかの層が線維芽細胞またはケラチノサイトを組み込んだ多層コラーゲン構造を製造することを記載している。細胞のインキュベート後、該構造体を皮膚モデルとして使用することができる。
【００１２】
ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０５（６）巻、１１７８〜１１８６ページにおいて、２０１０年に掲載されたＷ．Ｌｅｅらによる「流体チャネルを有する多層化ヒドロゲル足場材のオンデマンド３次元自由形状造形（On-Demand Three-Dimensional Freeform Fabrication of Multi-LayeredHydrogel Scaffold With Fluidic Channels）」と題する刊行物は、コラーゲン系ヒドロゲルとゼラチン溶液との交互の層から生体材料を堆積させる方法を記載している。ヒドロゲルは重炭酸ナトリウムで架橋される一方で、ゼラチン溶液は堆積時に冷却することによって固化する。培養される細胞は、コラーゲンヒドロゲルに含まれる。インキュベート時に、ゼラチン溶液は液体になり、リンスすることで除去される。その結果、ゼラチンを喪失することで残るわずかに密な層と交互になる、コラーゲンヒドロゲルの密な層を含む構造が形成される。この生体材料は細胞の培養に使用することができるが、皮膚代替体ではない。
【００１３】
ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃ部、２０（６）（２０１４年）、４７３〜４８４ページに掲載されたＶ．Ｌｅｅらによる「３次元バイオプリンティングによるヒト皮膚の設計と製造（Design and Fabrication of Human Skin by Three-Dimensional Bioprinting）」と題する刊行物には、手動による組み立ておよび３Ｄプリンティングによって得られた多層システムは、細胞培養条件のもとで非常に異なって発生することが示されている。３Ｄプリンティングによって作製されたシステムは成長してその形状を維持する一方で、手動で組み立てられたシステムはしぼんでしまう。
【００１４】
現在のところ、バイオテクノロジーにおける大多数の３Ｄプリント製品は、科学研究のモデルとして使用可能な製品となっている。この方法で、多様な細胞および器官を再現することができる。モデルシステムは、体内条件と同様の条件下で成長および維持した細胞培養物において医薬有効成分を評価するために使用することができる。ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ６（１９１４）、ｄｏｉ：１０．１０８８／１７５８−５０８２／６／３／０３５００１に掲載されたＹ．Ｚｈａｏらによる「インビトロにおける子宮頸癌モデルのためのＨｅｌａ細胞の３次元プリンティング（Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model invitro）」と題する刊行物が例を提示している。
【００１５】
一方で、ヒト皮膚の分野では未だに、依然として満たされない多くの需要があるため、治療的関心は高い。したがって、特許文献２２には、人体表面の広範囲の領域に、表皮細胞を含む固化可能なヒドロゲルを人工皮膚として堆積させる装置が記載されている。この装置は重度の熱傷の処置のために設計されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】仏国特許出願公開第２５６７６６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６９４２８３０号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／００５２２８５号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１３／０３０４２３３号明細書
【特許文献５】米国特許第７７８０８９７号明細書
【特許文献６】米国特許第８１９７７４３号明細書
【特許文献７】米国特許第７０５１６５４号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１４／００３９３２号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２０１４／００１２４０７号明細書
【特許文献１０】欧州特許出願公開第２６７０６６９Ａｌ号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２０１３／０１６４３３９号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１４／００９９８７０９号明細書
【特許文献１３】米国特許第８６３９４８４号明細書
【特許文献１４】米国特許第８６９１９７４号明細書
【特許文献１５】米国特許第８６９１２７４号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１３／００１７５６４号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００９／０２０８４６６号明細書
【特許文献１８】国際公開第２０１４／０３９４２７号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２０１１／０２５０６８８号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２０１２／００８９２３８号明細書
【特許文献２１】国際公開第２０１３／０４００８７号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１４／００１２２２５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、身体にインプラントすることか、または医薬品もしくは化粧料活性成分の試験を行うことを意図した身体代替体、特に皮膚代替体の分野に関する。本発明者らは、身体代替体、特に皮膚代替体を製造する従来の方法は２つの点で長い時間を要することを認識した。第１に、身体代替体、特に皮膚代替体の製造が複雑な工程であるため、該方法は長い操作時間（工数で表示）を必要とする。第２に、皮膚代替体の製造に必要な多孔性基質（足場材）はそれ自体では使用できず、培養条件下で使用する前にまず数ヶ月（通常約６ヶ月）の時間をおく必要がある。培養期自体には少なくとも６〜７週間かかる。製造時の複雑な操作は、培養物汚染のリスクを意味することにも留意する必要がある。
【００１８】
バイオインクから皮膚代替体を製造する技術は容易に自動化することができ、その再現性は良好であり、したがって標準化した製品を得るために使用可能であり、また、より迅速である。生体材料は、製造する日に細胞と混合されて、バイオインクを構成し、真皮は１０〜１５日で成熟する。
【００１９】
しかしながら結果は良好ではなく、これは、天然の皮膚の実際的モデルとして使用され得る、真皮表面上の層状表皮の培養に使用可能な人工真皮を得られないためである。２０１５年にＪ．  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、１〜１４ページ（ｄｏｉ：１０．１１７７／２２１１０６８２１４５６７１４６）に掲載された、Ｍ．Ｒｉｅｍａｎｎらの「ヒト初代細胞による軟組織モデルの標準化３Ｄバイオプリンティング（Standardized 3D Bioprinting of Soft Tissue Models with Human PrimaryCells）」と題する刊行物には、光重合性バイオインクの連続層（個々の厚さ：０．０５ｍｍ）の付加堆積による皮膚代替体の製造が記載されている。基質層は、線維芽細胞を含む層と交互になっている。この層は直ちに光重合される。バイオインクはＰＥＧ系である。しかしながら、このようにして得られた皮膚代替体は、天然の表皮の層状構造を有さず、多数の穴を含む。
【００２０】
現在のところ、付加技術を用いて、天然の皮膚に構造的および機能的に十分に類似する皮膚代替体を製造することの課題に対する解決法は存在しない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本課題は、異なる３つの手段で固化される天然ゼラチン、アルギネート、およびフィブリノゲンの混合物を含む新規の組成のバイオインクを使用することで、本発明によって解決される。インク堆積時、ゼラチンは冷却によって固化され、堆積インクのビード形状を維持することができる。堆積後、堆積物をカルシウムイオンおよびトロンビンを含む溶液で処理して、カルシウムイオンによってアルギネートを固化するとともにトロンビン作用によりフィブリノゲンを凝固させる。
【００２２】
したがって、本発明の第１の主題は付加堆積のためのバイオインクを製造する方法であって、該方法において、
（ａ）５〜４０質量％（好ましくは６〜３０質量％）のゼラチンと０〜５質量％のＮａＣｌとを含む第１の溶液を用意し、
（ｂ）１〜１２質量％（好ましくは１〜８質量％）のアルギネートと０〜５質量％のＮａＣｌとを含む第２の溶液を用意し、
（ｃ）１〜１５質量％（好ましくは３〜１５質量％）のフィブリノゲンと任意的に懸濁液内の生細胞（線維芽細胞など）とを含む第３の溶液を用意し、
（ｄ）約３５〜６５体積％の第１の溶液、約１５〜３５体積％の第２の溶液、および約１５〜３５体積％の第３の溶液を含み、これらの割合が合計して１００％となるように選択される混合物を作製し、
ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の順序は任意であり、
ＮａＣｌの含量は、第１の溶液および第２の溶液を合わせて、０．２〜５質量％、好ましくは０．２〜３質量％、さらにより好ましくは０．４〜２質量％となるように選択される。
【００２３】
皮膚代替体の調製のために、生細胞は、真皮、表皮、皮下組織、血管およびリンパ管、毛包、皮脂腺、汗腺、毛穴、立毛筋（ｈａｉｒ  ｅｒｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｓｃｌｅｓ）、筋肉、マイスナー小体、パチニ小体、ルフィーニ小体、結合組織、基底膜である異なる皮膚構造に由来してもよい。より具体的には、これらの細胞は、ケラチノサイト、メラノサイト（特にフィッツパトリックスケールによるフォトタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ）、線維芽細胞（乳頭（papillary）および網状（reticular）線維芽細胞を含む）、メルケル細胞、ランゲルハンス細胞、脂腺細胞、真皮樹状細胞、マクロファージ、マスト細胞、毛包の上皮細胞、毛包毛乳頭の線維芽細胞、前駆脂肪細胞、幹細胞（特に、脂肪細胞組織の幹細胞）、感受性ニューロン、筋細胞とすることができる。これらの細胞は健康であるかまたは病的であってもよい。
【００２４】
本発明の他の主題は、この方法を用いて得ることができるバイオインクである。これは、生細胞、特に線維芽細胞を含むことができる。ゼラチンは、典型的には２７℃〜３２℃、好ましくは２８℃〜３０℃の温度の転移点（ゲル化点）でこのバイオインクに粘度を与える。バイオインクはこの温度より高いと流体であり、この温度より低いとゲルになる。このゲル化は、特に、そのゲル化点より高い温度Ｔ１となったバイオインクがこのゲル化点より低い温度Ｔ２に低下したときに起こる。この場合、バイオインクは、場合によっては押出しビードの形状を維持して、完全に広がることなく直ちに固化することができる。このように、バイオインクは付加堆積方法に使用することができる。
【００２５】
本発明の他の主題は、身体組織代替体を製造する方法であって、該方法において、
（ｉ）本発明のバイオインクを用意し、
（ｉｉ）１〜５質量％のカルシウムイオンと、２Ｕ／ｍＬ〜４０Ｕ／ｍＬ（好ましくは５Ｕ／ｍＬ〜４０Ｕ／ｍＬ、さらにより好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜３０Ｕ／ｍＬ）のトロンビンとを含む水溶液（「重合溶液」と呼称する）を用意し、
（ｉｉｉ）バイオインクをそのゲル化点より高い温度Ｔ１にして、バイオインクのゲル化点より低い温度Ｔ２の基質に堆積させ、該基質において、バイオインクはゲルとなって「未処理のプリント物体」と呼称される制御された３次元物体を形成し、
（ｉｖ）未処理のプリント物体を重合溶液で処理して、未処理のプリント物体を身体組織代替体へと固定し、
（ｖ）任意的に、バイオインクが生細胞を含む場合、身体代替体前駆体を細胞培地にてインキュベートする。有利には、このインキュベートは、好ましくは５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で、３６℃〜３８℃の温度で行われる。
【００２６】
この工程は、単一堆積または付加堆積によって行われることができ、単一堆積は、単層または単一のインクのビードを堆積することからなる一方で、付加堆積は、所定の制御された２次元の延出部を有する、または制御された３次元形状を有する物体ですらある未処理のプリント物体を作製するために使用されることができる。特に、この方法は、押出し（例えば、ピストンまたはネジを備えたシリンジを使用する）、インクジェット（通常は、バイオインクが固化するような適切な温度の足場材にバイオインク滴を射出することに関する）、またはレーザー（例えば、バイオインク層を、レーザーからの光を吸収することができる材料から形成された層上に堆積させることに関し、後者の層はレーザーによって局所的に照射され、バイオインクを固化させるように適切な温度に保たれた基質上にインク滴の出射を行う）による堆積（単一または付加）を含むことができる。
【００２７】
有利には、Ｔ１は２８℃〜３７℃（好ましくは２８℃〜３３℃）であり、Ｔ２は０℃〜２０℃（好ましくは４℃〜１８℃）である。
【００２８】
プリント物体は、重合溶液での処理によって確実に固定される。カルシウムによるアルギネートの凝固は、場合によってカルシウムを喪失することにより少なくとも部分的に可逆的であり得るが、トロンビンによるフィブリノゲンの凝固は不可逆的である。本発明による工程では、この固定は物体の厚さ全体で均質である。
【００２９】
未処理のプリント物体は、好ましくは温度Ｔ１よりも高い温度Ｔ３で、好ましくは３５℃〜３８℃で、浸漬することによって重合溶液で処理することができる。
【００３０】
本発明の特定の一実施形態において、身体組織前駆体は、皮膚代替体前駆体である。この場合、バイオインクは生線維芽細胞を含む懸濁液である。有利には、３６℃〜３８℃の温度、５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で、インキュベートが行われる。該インキュベートは、有利には、１〜４０日継続する第１のインキュベート期と、５〜４０日継続する第２のインキュベート期とを含み、ケラチノサイトの水性懸濁液を第１のインキュベート期と第２のインキュベート期との間において皮膚代替体の表面に堆積させる。ケラチノサイトはまた、特に薄層状に、本発明によるバイオインクを堆積することによって皮膚代替体の表面に堆積させることもできる。
【００３１】
皮膚代替体前駆体は平坦であってもよく、あるいは別の形状を有してもよい。一実施形態では、未処理のプリント物体は、ほぼ平坦な上部面を含み、平坦な上部面のｃｍ２当たり０．２〜１０×１０５（好ましくは０．２〜２×１０５）の線維芽細胞に等しい線維芽細胞が均一に分布している。
【００３２】
別の実施形態では、線維芽細胞の濃度は、バイオインクのｃｍ３当たり０．６〜１２×１０５の線維芽細胞、好ましくはバイオインクのｃｍ３当たり１〜７×１０５の線維芽細胞、さらにより好ましくはバイオインクのｃｍ３当たり１〜５×１０５の線維芽細胞であり、これは好ましい実施形態である。
【００３３】
さらに皮膚代替体を調製する目的で、堆積されるケラチノサイトの量は、有利には、平坦な上部面のｃｍ２当たり０．０５〜５０×１０５のケラチノサイト（好ましくは０．２〜２０×１０５のケラチノサイト）であり、最も好ましい濃度は平坦な上部面のｃｍ２当たり０．５〜１０×１０５のケラチノサイトである。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、本発明の方法によって得られる生体組織代替体、特に皮膚代替体（または皮膚代替体の前駆体）である。
【００３５】
本発明の方法は、多様な身体代替体を製造するために用いることができる。特に、該方法は、特に線維芽細胞を含有する真皮層、特にケラチノサイトおよびメラノサイトを含有する表皮層および角質層を含む皮膚代替体の製造に用いることができる。この構造は十分に層状化かつ分化されている。本発明による皮膚代替体は、化粧料もしくは皮膚科学的有効成分の効果を研究するために、または毒性学的研究のために使用することができる。また該皮膚代替体は、修復、美容または形成外科的処置にも使用することができる。
【００３６】
例えば、病的細胞とともに作製された身体代替体は、有効成分の一般的または個別の有効性を試験するために使用することができる。
【００３７】
図１〜図１７は、本発明の一部の態様を示しているが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
組織学的および免疫組織学的分析は、当業者に既知の技術に基づく。光学顕微鏡写真は、パラフィンに包埋されるとともにホルマリンで固定されて、脱パラフィンおよび再水和後に着色した断層切片（５μｍ）に基づく。ＮＩＳタイプのソフトウェアに接続されたＤＳ−Ｒｉ１タイプのＣＣＤカメラ（Ｎｉｋｏｎ社）を使用して、非圧縮１６ビットフォーマットの画像を生成した（１サンプル当たり６つの代表的な観察結果）。適切な抗体を用いて５μｍの凍結切片に免疫蛍光実験を行い、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査型システム（Ｚｅｉｓｓ）に接続したＯｂｓｅｒｖｅｒ  ＺＩ光学顕微鏡でサンプルを観察して、非圧縮８ビットフォーマットの画像を生成した（１サンプル当たり６つの代表的な観察結果）。透過型電子顕微鏡用のサンプルを２％のグルタルアルデヒドを含有するカコジル酸ナトリウム（０．１Ｍ）の緩衝液（ｐＨ７．５）で４℃で固定し、次いで１％のＯｓＯ４溶液で処理した。サンプルを脱水し、次いでエポキシ樹脂に包埋し、５６℃で３日間重合させた。次いで、切片を酢酸ウラニル（７％）および酢酸鉛の溶液で処理した。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の方法を模式的に示す。
【図２】図２は、実施例２に関するものであり、本発明の皮膚代替体の断面の光学顕微鏡写真を示す。右下の黒色線は長さ５０μｍである。
【図３】図３は、実施例３に関するものであり、ビメンチンによる免疫組織化学的標識を伴う、本発明の皮膚代替体の断面の光学顕微鏡写真を示す。右下の白色線は長さ５０μｍを表す。
【図４】図４は、実施例４ｂ（本発明には含まれない）に関するものであり、本発明に含まれないバイオインクで作製された皮膚代替体の断面の光学顕微鏡写真を示す。該バイオインクはいずれのフィブリノゲンも含まず、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）と結合したＮＩＨ３Ｔ３型線維芽細胞を含有する。図面では、バイオインクがフィブリノゲンを含まない場合、線維芽細胞が３次元に拡散せず、固化したバイオインクに接着せず、最終的に死に至ることを示している。
【図５】図５は、実施例６に関するものである。図５（ａ）は、それぞれ異なる濃度の生細胞を含む３つのインクで作製された皮膚代替体前駆体について、アラマーブルーによる着色後に光吸収度の比として表される細胞の生存性を示す（５７０ｎｍおよび６００ｎｍで吸光度を測定、生細胞の量はこれらの２つの吸光度値の比によって判断される）。図５（ｂ）は、１０００００線維芽細胞／ｍＬを含有するバイオインクを用いて作製された皮膚代替体について７、１０、および１４日間のインキュベート後の細胞の生存性（同様の方法で測定される）を示す。細胞数の増加は細胞増殖を反映している。図５（ｃ）および図５（ｄ）は、生細胞を表す灰色のベールを生じさせるＤＡＰＩ、および死細胞を表す白色染色を生じさせるヨウ化プロピジウムで染色した後の顕微鏡法による断面を示し、図５（ｃ）は１４日間のインキュベート後の身体代替体に関する一方で、図５（ｄ）は、細胞を死滅させるドデシル硫酸ナトリウム（０．５％）で処理した後の同じ身体代替体（コントロール実験）に関する。
【図６】図６において、図６（ａ）は、本発明に記載の方法の一実施形態に関与するステップを模式的に示す。図６（ｂ）および図６（ｃ）は、マルチウェルプレートのウェル（左）および培養ボックス（図６（ｃ））内での、培地に浸漬した最初の７日間のインキュベート時（図６（ｃ））および培地の表面（図６（ｂ））における、サンプルの位置を示す。
【図７（ａ）】図７（ａ）は実施例７に関し、はＨＰＳ（ヘマトキシリン−フロキシン−サフラン）染色をした本発明における皮膚切片の光学顕微鏡法による断面を示す。
【図７（ｂ）−（ｌ）】図７（ｂ）−（ｌ）は実施例７に関し、図７（ｂ）はマッソントリクローム染色をした本発明における皮膚切片の光学顕微鏡法による断面を示し、図７（ｃ）−（ｌ）は特定の免疫組織学的画像（実施例で説明される図７（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）＊、（ｇ）＊、（ｈ）＊、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）＊、および（ｌ）＊、アスタリスクの付いた図は健康なヒトの皮膚に関し、他のものは本発明による真皮代替体に関するものである）を示す。
【図８】図８は実施例７に関し、本発明による真皮代替体の透過型電子顕微鏡画像（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ））を示す。
【図９】図９は実施例７に関する。
【図１０】図１０は実施例７に関し、特定の免疫組織学的画像（実施例で説明される図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）＊、（ｅ）＊、（ｆ）＊、アスタリスクの付いた図は健康なヒトの皮膚に関し、他のものは本発明による真皮代替体に関するものである）を示す。
【図１１】図１１は実施例７に関し、本発明による真皮代替体の透過型電子顕微鏡画像（図１１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ））を示す。
【図１２】図１２は実施例８に関し、本発明の身体代替体のインキュベート後の細胞増殖曲線を示す。
【図１３】図１３は実施例９に関し、本発明の身体代替体のインキュベート後の細胞増殖曲線を示す。
【図１４】図１４は実施例１０に関し、本発明の身体代替体のインキュベート後の細胞増殖曲線を示す。
【図１５】図１５は実施例１１に関し、本発明の身体代替体のインキュベート後の細胞増殖曲線を示す。
【図１６】図１６は実施例１２に関し、それぞれ４つの異なる濃度で調製された本発明による異なる２つのバイオインクの細胞の生存曲線（図１６（ａ）、図１６（ｂ））と、顕微鏡写真（図１６（ｃ）および図１６（ｄ））を示す。一方は脂肪組織幹細胞で調製され（図１６（ａ））、他方は前駆脂肪細胞で調製され（図１６（ｂ））、これらは２つのタイプの脂肪細胞前駆体である。これらの皮下組織代替体は本発明の方法でバイオプリンティングされ、次いで分化因子（当業者に既知である）で分化させると、機能的皮下組織が得られる。これは、細胞が脂肪細胞に典型的な脂肪酸で満たされた脂肪空胞を有するためである。図１６（ｃ）の顕微鏡写真は、脂肪滴表面に典型的に発現するタンパク質であるペリリピンＡの免疫標識を示す。図１６（ｄ）の顕微鏡写真は細胞の脂肪含量の着色を示し、この着色は、脂肪に特異的な染色であるナイルレッドで得られている。
【図１７】図１７は実施例１３に関し、異なる製造段階における、本発明によって製造された身体代替体前駆体の写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、付加堆積（３Ｄプリンティングなど）によって、身体代替体、および特定の同等の真皮を作製するために用いることができる。この新規の製造方法は、時間を節約し、身体代替体（および特に真皮代替体）を製造するための非常に有利かつ簡易で再現性のある方法を提供する。製造および成熟時間は大きく短縮される。特に、この製造方法は、押出し、インクジェット堆積およびレーザー堆積による堆積（単一または付加）である、付加堆積技術を使用することができる。
【００４１】
本発明のバイオインクは、ヒドロゲルを形成可能な生体材料と細胞との混合物からなる。また、本発明のバイオインクは、使用直前に安定的な水溶液から調製することもできる。溶液は、適切な濃度で調製されたら、単に押出しシリンジ内で細胞の懸濁液（目的が皮膚代替体、典型的には線維芽細胞である場合）と慎重に混合する必要があるのみである。次いで、シリンジはバイオプリンタに取り付けられる。有利には、シリンジプッシャーがフローを制御するように設けられている。例えば、シリンジプッシャーは、押し出される液体またはゲルに一定の圧力を加えるウォームネジおよびモータによって制御することができる。このようにヒドロゲル物体がプリントされる。この物体は通常、平坦な物体である。ヒドロゲルは、プリントされると、生体適合性の重合溶液に浸漬する必要があり、該生体適合性の重合溶液は、生体材料が強固なネットワークを形成するとともに、要求される３次元形状を維持することを可能にする。細胞は、その後、「成熟ステップ」とも呼ばれるステップで成長させるために置かれる。このように細胞が３次元ネットワークへ成長するとき、重合ヒドロゲルに含まれるプリント細胞（皮膚代替体の場合は線維芽細胞）は、その細胞外マトリックスを分泌する。ヒドロゲルは次第に吸収され、特定の機能が現れる新合成（ｎｅｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）組織が発生するための空間を残し、これは、生物材料が吸収可能ではない場合もある「足場材」型手法と比較して明らかな利点である。
【００４２】
目的が皮膚代替体である場合、有利には、ケラチノサイトが本発明のバイオインクの堆積によってまたは表面播種によって添加される。このステップの後に適切なインキュベートが行われ、真皮、真皮表皮接合部、表皮、および角質層を含む層状化かつ分化した皮膚代替体が得られる。
【００４３】
本発明の方法を実施するために、バイオインクは、正確かつ既定の順序および割合で調製される必要がある
【００４４】
第１のステップにおいて、アルギネートとゼラチン粉末とを用意し、それらを滅菌および可溶化して２つの原液を得る。第１の溶液は、ＮａＣｌ溶液（好ましくは０．２％ｍ／ｖ〜５％ｍ／ｖ、より好ましくは０．４％ｍ／ｖ〜３％ｍ／ｖ、最も好ましくは０．５％ｍ／ｖ〜１.４％ｍ／ｖの濃度）にゼラチン粉末を溶解して（好ましくは５％ｍ／ｖ〜４０％ｍ／ｖの濃度）得られるゼラチン水溶液であり、第２の溶液は、ＮａＣｌ溶液（好ましくは０．２％ｍ／ｖ〜５％ｍ／ｖ、より好ましくは０．４％ｍ／ｖ〜３％ｍ／ｖ、最も好ましくは０．５％ｍ／ｖ〜１.４％ｍ／ｖの濃度）に１％ｍ／ｖ〜１０％ｍ／ｖ（好ましくは２％ｍ／ｖ〜７％ｍ／ｖ）の濃度でアルギネート粉末を溶解して（好ましくは「極めて低粘度」特性）得られるアルギネート水溶液である。これら２つの溶液は安定しており、保管することができる。
【００４５】
有利には、同じＮａＣｌ溶液を用いてこれら２つの溶液を調製する。
・６％ｍ／ｖ〜３０％ｍ／ｖのゼラチン溶液、１％ｍ／ｖ〜８％ｍ／ｖのアルギネート溶液、０．２％ｍ／ｖ〜３％ｍ／ｖ（好ましくは０．４％ｍ／ｖ〜２％ｍ／ｖ、より好ましくは０．５％ｍ／ｖ〜１．４％ｍ／ｖ）のＮａＣｌ溶液、
・１０％ｍ／ｖ〜３０％ｍ／ｖのゼラチン溶液、２％ｍ／ｖ〜６％ｍ／ｖのアルギネート溶液、０．２％ｍ／ｖ〜３％ｍ／ｖ（好ましくは０．４％ｍ／ｖ〜２％ｍ／ｖ、より好ましくは０．５％ｍ／ｖ〜１．４％ｍ／ｖ）のＮａＣｌ溶液、
・１５％ｍ／ｖ〜２６％ｍ／ｖのゼラチン溶液、２％ｍ／ｖ〜６％ｍ／ｖ（好ましくは３％ｍ／ｖ〜５％ｍ／ｖ）のアルギネート溶液、０．２％ｍ／ｖ〜３％ｍ／ｖ（好ましくは０．４％ｍ／ｖ〜２％ｍ／ｖ、より好ましくは０．５％ｍ／ｖ〜１．４％ｍ／ｖ）のＮａＣｌ溶液、
・１７％ｍ／ｖ〜２４％ｍ／ｖのゼラチン溶液、２％ｍ／ｖ〜６％ｍ／ｖ（好ましくは３％ｍ／ｖ〜５％ｍ／ｖ）のアルギネート溶液、０．４％ｍ／ｖ〜２％ｍ／ｖ（好ましくは０．５％ｍ／ｖ〜１．４％ｍ／ｖ、より好ましくは０．６％ｍ／ｖ〜１．３％ｍ／ｖ）のＮａＣｌ溶液、
である濃度範囲が特に有利である。
【００４６】
これらの溶液におけるＮａＣｌの役割は、バイオインクにおける細胞成長に有利な浸透圧環境を支援し、アルギネートの溶解を促進することである。
【００４７】
アルギネート粉末は市販の粉末であり、「低粘度」特性が好ましく、「極めて低粘度」特性がさらに好ましい。
【００４８】
バイオインクが過剰なアルギネートを含むと、付加堆積技術に使用するには過度に固いものとなり、バイオインクが十分なアルギネートを含まないと、カルシウムイオンによる重合が不十分となり、得られる前駆体が十分に固体でないことがある。
【００４９】
バイオインクが過剰なフィブリノゲンを含むと、付加堆積技術に使用するには過度に固いものとなり、バイオインクが十分なフィブリノゲンを含まないと、細胞はバイオインクに接着せず、拡散せず、最終的に死滅する。これが、バイオインクに０．２質量％濃度のフィブリノゲンが必要である理由であり、好ましくは最少含量は０．３％である。同様に、トロンビン濃度は、フィブリノゲンがフィブリンに転換可能であるように選択される必要がある。
【００５０】
さらに、第３の溶液を調製し、該第３の溶液は、適切な細胞数（典型的には、０．０５〜１００万細胞／ｍＬ（好ましくは、１ｍＬ当たり０．１〜０．６百万）を添加した、好ましくは１％ｍ／ｖ〜１５％ｍ／ｖ（より好ましくは３％ｍ／ｖ〜１２％ｍ／ｖ、さらにより好ましくは５％ｍ／ｖ〜１０％ｍ／ｖ）の濃度のフィブリノゲン水溶液である。例として、皮膚代替体前駆体の堆積試験では、この溶液２ｍＬを調製することができた。細胞は、特に線維芽細胞とする。
【００５１】
バイオインク内の細胞数は、本発明の身体代替体を調製するための方法をなすために重要である。細胞数が過度に少ないと、細胞は標的の天然組織と十分に類似した組織を形成することができない。例として、線維芽細胞の場合、形成される細胞外マトリックスは、バイオインクの成分を置換するには不十分である。ケラチノサイトなどの上皮細胞の場合、細胞は近接せず、最終的に死滅することが観察される。
【００５２】
バイオインク内の細胞数が過度に多いと、構造が成長する代わりに分解され、驚くべきことに、その性状が変化して使用不可能になる（文字どおり「融解する」）ことが観察される。
【００５３】
第３のステップにおいて、バイオインクをこれらの３つの溶液から調製して、合計１００％になるように、第１の溶液（ゼラチン）を約３５％〜６５％（好ましくは約４５％〜５５％、さらにより好ましくは約５０％）、第２の溶液（アルギネート）を約１５％〜３５％（好ましくは２０％〜３０％、さらにより好ましくは約２５％）、および第３の溶液を約１５％〜３５％（好ましくは約２０％〜３０％、より好ましくは約２５％）含有する混合物を得る。これらのパーセンテージは体積％で表される。
【００５４】
第４のステップにおいて、重合溶液である第４の水溶液が調製される。第４の水溶液は、トロンビンが約１０Ｕ／ｍＬの最終濃度で添加された、約１〜５％ｍ／ｖ、好ましくは約３％ｍ／ｖの溶液内のカルシウムを含有する。この重合溶液は、３Ｄプリンティングによって得られる物体を浸漬して均質な重合ゲルを得ることができるように、十分な量を調達する必要がある。この第４のステップは、前の３つのステップの前または後、または前の３つのステップ中に行うことができるが、この第４の溶液の保管時間は限られている。本発明者らは、第４の溶液を使用直前に調製したとき、バイオインクの固化および重合がより均質であることを観察した。
【００５５】
第４の溶液が十分なカルシウムを含有しないと、アルギネートの重合が起こらないか、または十分ではない。第４の溶液が過度のカルシウムを含有すると、カルシウムが細胞傷害性を有し得るため、細胞の生存性が低下する。
【００５６】
第５のステップにおいてプリントが行われる、つまり、インクを足場材に堆積する。これを行う前に、インクの温度Ｔ１を十分に上昇させてゼラチンを融解する。この温度Ｔ１は、インクの正確な組成に対応し、簡易な試験によって決定する必要がある。上述の最も好ましい組成範囲については、約２８℃〜２９℃の温度Ｔ１が適切であり得る。このプリントは、例えばシリンジが軸に沿って移動してキャリッジが軸に直交する方向に移動する、キャリッジに取り付けられたシリンジを用いて、任意の適切な手段によって行うことができる。基質は、テーブルまたはプラットフォームに配置される。高さ軸に沿った移動は、シリンジを支持するキャリッジのために、または基質キャリアテーブルまたはプラットフォームのために行われ得る。
【００５７】
基質は、有利には、ゼラチンが直ちに固化するように冷却される。この基質の温度Ｔ２は、インクの組成および温度Ｔ１、ならびにその堆積速度に対応する。温度Ｔ２は、簡易な試験によって決定可能である。別の実施形態では、プリント組立体は、低温室に、つまり温度Ｔ２で配置され、任意的にシリンジを温度Ｔ１に加熱することができる。堆積されたばかりのインク層を通る熱伝導により、現在堆積されているインク層が十分に迅速に冷却できないようにして、より厚いまたはより複雑な形状の構造が製造可能であるという点で、この実施形態は有利である。
【００５８】
第６のステップにおいて、未処理のプリント物体を、好ましくは全浸漬して、重合溶液（第４溶液）で処理することで固定させる。得られた結果は、いわゆる「固化した物体」となる。未処理のプリント物体と重合溶液との接触時間は、好ましくは少なくとも１５分である。このステップ時において、重合溶液の温度Ｔ３は、好ましくはゼラチンの融解温度よりも高いものである。これは、ゼラチンが水相へと変化することができ、したがってゼラチンの大部分が固化した物体から除かれるということを意味する。得られた結果は、「身体組織前駆体」と呼ばれ、「皮膚組織前駆体」であり得る。温度Ｔ３は約３７℃であってもよい。
【００５９】
ステップ５および６は模式的に図１に示される。
【００６０】
第６のステップにおいて、身体組織前駆体（皮膚代替体前駆体であり得る）をインキュベートして、代替身体組織（例えば皮膚代替体）を得る。このインキュベートは３期で行われる。第１のインキュベート期のとき、皮膚代替体前駆体は、好ましくは約３７℃の温度で、適切な線維芽細胞培地に浸漬される。このインキュベートの期間は、３日〜２０日（ケラチノサイトでは４０日まで）であり得る。８日〜１５日の期間が好ましい。１２日の期間は線維芽細胞にとって最適である。
【００６１】
この第１のインキュベート期の終了時に、皮膚代替体前駆体の表面にケラチノサイトの水性懸濁液が添加される。  １〜５×１０５細胞／ｃｍ２の濃度が適切である。
【００６２】
次に、第２のインキュベート期に、皮膚代替体前駆体を適切な培養液、例えばグリーン培地に浸漬する。栄養素を定期的に（好ましくは毎日）添加する必要がある。この第２のインキュベート期は５日〜１０日間、好ましくは約７日間継続する。温度は３７℃である。
【００６３】
そして最後に、第３のインキュベート期に、皮膚代替体前駆体を分化培地の表面に維持し、１５〜３０日間、好ましくは１８〜２５日間、典型的には２１日間インキュベートする。温度は３７℃である。このようにして皮膚代替体が得られる。分化培地は、典型的には、ＤＭＥＭおよび特定の添加剤を含む。有利な一実施形態において、これらの添加剤は、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、ウシアルブミン（８ｍｇ／ｍＬ）である。
【００６４】
本発明のバイオプリンティング工程は、数センチメートルまたはさらにはデシメートルの寸法を有する物体を得るために使用することができる。プリンタは、従来のＦＤＭ（溶融堆積モデリング）３Ｄプリンタに類似するが、シリンジプッシャーがプラスチック押出し機に置き換わっている。
【００６５】
本発明のバイオインクは、
・プリント（押出し）工程時にヒドロゲルの適切なレオロジーを維持し、
・得られた３Ｄ形状を維持する、均質に重合した物体の形成、
・３Ｄで細胞格子の成長を可能にする、という３つの目的を満たすものである。
【００６６】
これらの３つの機能は、以下の生体材料の使用により検証されている。２９℃の相転移温度を有するコラーゲン系ポリマーであるゼラチンは、レオロジー的成分として使用され、バイオインクがプリント後に冷却基質上に残ることを確実にし、その後に本方法の後のステップで除去することができる。カルシウムの存在下でヒドロゲルを構成する性質を有する炭水化物ポリマーであり、構造要素として使用されるアルギネートは、ゼラチンが可溶化されると、プリントされたバイオインクに機械的安定性を与える。トロンビンの作用下でヒドロゲルを構成する能力を有する糖タンパク質であるフィブリノゲンは、その細胞接着成分（ＲＧＤパターン）のために構築要素および成熟要素の両方として使用される。
【００６７】
図６（ａ）は、用いられる方法の手順を模式的に示す。本発明の方法は、正常ヒト真皮線維芽細胞（normal human dermal fibroblasts、ＮＨＤＦ）を含有する皮膚代替体前駆体の堆積を含む。３７℃の培地内における４日間の全浸漬にてインキュベートを行って、細胞外マトリックスの合成を促進する。次のステップは、正常ヒト表皮ケラチノサイト（normal human epidermal keratinocytes、ＮＨＥＫ）を播種して、細胞増殖、遊走および接着を促進するためにさらに３日間インキュベートするように置くことである。インキュベート開始から７日目の後、合計２１日目まで、細胞分化を得るために気相−液相界面でインキュベートを継続する。
【００６８】
インキュベートは、マルチウェルプレートのウェルまたはペトリボックスで行うことができる。図６（ｃ）は、左側のマルチウェルプレート３、右側の培養ボックスにおける、浸漬でのインキュベート条件を模式的に示す（最初の７日間使用）。「マルチウエルプレート」変形では、バイオプリント身体代替体前駆体１は、マルチウエルプレートのウエル３に位置する培養用インサート２に配置される。培地４は、身体代替体前駆体１を覆う。「培養ボックス」変形では、バイオプリント身体代替体前駆体１は、培地４を含むタンク８に配置され、蓋５がタンク８を覆う。
【００６９】
図６（ｂ）は、左側のマルチウェルプレート３、右側の培養ボックスにおける、液浸（emersion）でのインキュベート条件を模式的に示す（８日目から使用開始）。「マルチウエルプレート」変形では、身体代替体１は培養用インサート２に配置され、その底面はマルチウエルプレートのウェル３に位置する培地４の上面に接触する。「培養ボックス」変形では、身体代替体１は、タンク８に含まれる培地４にわずかに浸漬したステンレス鋼格子６上に配置される。格子６の上面は吸取紙で覆われ、蓋５がタンク８を覆う。
【００７０】
本発明には多くの用途がある。本発明の身体組織代替体を製造する方法は、身体組織代替体の種々の形体を製造するために使用することができる。あらゆるタイプの生細胞を本発明のバイオインクに組み込むことができる。例として、他のすべてのタイプの皮膚細胞をバイオインクに組み込むことができる（特にＡＤＳＣ（Adipose-Derived Stem Cell、脂肪由来幹細胞）、脂肪細胞および前駆脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、真皮樹状細胞、ランゲルハンス細胞、メラノサイト、メルケル細胞、脂腺細胞、マクロファージ、マスト細胞、毛包上皮細胞、毛包毛乳頭（hair follicle papilla）の線維芽細胞、誘導多能性幹細胞）。特に、本方法は、種々の身体組織の代替体、特に角膜、口腔粘膜、食道、軟骨、脈管、膣粘膜の代替体を製造するために使用することができる。
【００７１】
一般に、あらゆるタイプの細胞、好ましくは生細胞を本発明の枠組みに組み込むことができる。
【００７２】
細胞は、胚性幹細胞（分化全能性、分化多能性、および３重分化能性（tripotent））または分化細胞（生殖系列細胞もしくは体細胞）、あらゆるヒトまたは動物の組織または器官から単離された初代細胞（例えば、生殖系列細胞（配偶子））、体細胞、ならびに成体幹細胞であってもよい。細胞は、特に、結合組織または支持組織（骨、靱帯、軟骨、腱、脂肪組織など）、筋組織（血管壁の平滑筋細胞、心筋、骨格筋など）、神経組織および上皮（血管、ワルトン管、口腔粘膜、舌背、硬口蓋、食道、膵臓、副腎、前立腺、肝臓、甲状腺、胃、腸、小腸、直腸、肛門、胆のう、甲状腺濾胞、リンパ管、皮膚、汗腺、体腔上皮、卵巣、卵管、子宮、子宮内膜、子宮頸部（子宮頸管内膜、子宮頸膣部）、膣、大陰唇、直尿細管（tubuli recti）、精巣網、輸出管、精巣上体、精管、射精管、尿道球腺、精のう、中咽頭、喉頭、声帯、気管、細気管支、角膜、鼻、腎臓の近位尿細管曲部、腎臓の遠位尿細管、腎盂、尿管、膀胱、前立腺部尿道など）に由来することができる。
【００７３】
細胞は中胚葉、外胚葉、または内胚葉由来の細胞であるとよい。
【００７４】
ヒトまたは動物細胞は、リンパ球（特にＢリンパ球、Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＮＫＴリンパ球、制御性Ｔリンパ球、補助リンパ球）、骨髄細胞、顆粒球、好塩基性顆粒球、好酸性顆粒球、好中性顆粒球、過分葉好中球、単球、マクロファージ、網状赤血球、血小板（trombocyte）、マスト細胞、血小板、巨核球、樹状細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞（ａｄｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ）、クロム親和性細胞、松果体細胞、グリア細胞、グリア芽細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、大細胞性神経分泌細胞（magnocellular neurosecretion cell）、星状細胞（stellarcell）、ベッチェル細胞、下垂体細胞、性腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、成長ホルモン分泌細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞（lactotroph）、肺細胞（Ｉ型肺胞細胞、ＩＩ型肺胞細胞、クララ細胞）、杯細胞、肺胞マクロファージ、心筋細胞（myocardiocyte）、周皮細胞、胃細胞（胃主細胞、壁細胞、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞、腸内分泌細胞、腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞）、肝細胞（ヘパトサイト、クッパー細胞）、骨細胞（骨芽細胞、オステオサイト、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、エナメル芽細胞）、軟骨細胞（軟骨芽細胞、コンドロサイト）、毛細胞（トリコサイト）、皮膚細胞（ケラチノサイト、脂肪細胞、線維芽細胞、メラノサイト、母斑細胞）、筋細胞（ミオサイト、筋芽細胞、筋管）、腱細胞、腎細胞（ポドサイト、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞、糸球体外メサンギウム細胞、緻密斑細胞）、精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵母細胞からなる群から選択されてもよい。
【００７５】
また、細胞は、病気の組織、例えばがんの組織から単離されてもよい。
【００７６】
例として、細胞は、乳がん；胆道がん；膀胱がん；グリオブラストーマおよび髄芽腫を含む脳がん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸がん；子宮内膜がん；食道がん；胃がん；白血病を含む血液腫瘍；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝がん；肺がん；ホジキン病を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮がんを含む口腔がん；上皮細胞、間質細胞、生殖系列および間葉系細胞のがんを含む卵巣がん；膵がん；前立腺がん；直腸がん；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、メルケル細胞がん、カポジ肉腫、基底細胞がん、および扁平上皮がんを含む皮膚がん；セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛がん）などの生殖系列細胞腫瘍、間質腫瘍、および生殖系列細胞腫瘍を含む精巣がん；甲状腺腺がんおよび髄様がんを含む甲状腺がん；腺がんおよびウィルムス腫瘍を含む腎がんである、多くのタイプのがんから単離する、または多くのタイプのがんを由来とすることができる。
【００７７】
細胞は、臍帯血細胞、幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、がん幹細胞、前駆細胞、自家細胞、同系移植細胞、同種異系細胞、異種移植細胞および遺伝子改変細胞とすることができる。細胞は、誘導前駆細胞とすることができる。細胞は、幹細胞に関連する遺伝子をトランスフェクションして細胞に分化多能性を誘導した対象、例えばドナー対象から単離された細胞であってもよい。幹細胞に関連する遺伝子は、Ｏｃｔ３、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−ＭｙｃおよびＮ−Ｍｙｃからなる群から選択することができる。細胞は、幹細胞に関連する遺伝子をトランスフェクションして分化多能性を誘発した対象から単離されて、所定の細胞株に分化した細胞であり得る。
【００７８】
したがって、本発明の身体組織代替体は、化粧料、医薬品および化学製品の試験のための皮膚代替体としてだけでなく、例えば修復および再建手術における臨床用途にも使用することができる。例として、本発明の皮膚代替体は、熱傷を負った人の皮膚として使用することができる。また、本発明の付加堆積による身体組織代替体の製造方法は、複雑な物体を製造するためにも使用することができ、したがって、例えばその身体代替体を使用する患者から採取した細胞を用いて、耳または鼻の代替体を製造するために使用することができる。
【００７９】
一般に、本発明の身体代替体は、患者（ヒトもしくは動物）の身体にインプラントすることができ、関心のある物質を研究する（特に薬理学的もしくは化粧品について、または化学物質を評価する）ためのモデルとして使用することができ、または指導するため（特に実際の作業と手術準備用試験のため）のモデル物体として使用することができる。有利には、本発明の身体代替体は、重度の熱傷を負った人の皮膚および軟骨（耳、鼻）、歯肉のインプラント、人工食道、人工尿道および尿管、角膜の外科用途に使用することができる。
【００８０】
さらに、本発明の身体皮膚代替体は、身体組織における種々の化学物質の毒性、有効性、および貫通性を評価するために使用することができる。また、身体皮膚代替体は、アレルゲン試験にも使用することができる。
【００８１】
本発明は、いうまでもなく、ヒト細胞、および他の動物細胞、特に他の哺乳動物細胞に、隔てなく適用可能である。
【実施例】
【００８２】
以下の実施例は、本発明の一部の態様を示すものであり、その範囲を限定しない。
【００８３】
［実施例１：細胞の培養と採取］
この実施例は、本発明の皮膚代替体の製造に使用可能な細胞（線維芽細胞およびケラチノサイト）を増幅し採取する方法を示す。
【００８４】
真皮ケラチノサイトと線維芽細胞とをヒト包皮から単離した。
【００８５】
ケラチノサイトは、ヒト上皮成長因子（１０ｎｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）、５μｇ／ｍＬ）、２×１０−９Ｍトリヨード−Ｌ−チロニン（５μｇ／ｍＬ）、１０−１０Ｍイソプロテレノール、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、および１０％ウシ胎仔血清とともに、アデニン（２４．３μｇ／ｍＬ）を添加した、ＤＭＥＭとハムＦ１２と（３：１の比）を含む「グリーン培地」として既知の培地を用いて、当業者に周知の技術を用いて照射したヒト線維芽細胞において培養した。２、３および４継代の間に採取したケラチノサイトを使用した。
【００８６】
線維芽細胞は、ＤＭＥＭ、２０％ウシ新生仔血清、および抗生物質を含む適切な培地において、５％ＣＯ２を含む雰囲気内で３７℃にて培養した。５、６、７および８継代の間に採取した線維芽細胞を使用した。
【００８７】
［実施例２：付加技術による堆積（本発明の方法）］
ゼラチンの第１の水溶液は、０．９％ｍ／ｖのＮａＣｌ溶液に２０％ｍ／ｖのゼラチン粉末を溶解することにより調製した。アルギネートの第２の水溶液は、０．９％ｍ／ｖのＮａＣｌ溶液に４％ｍ／ｖのアルギネート粉末（極めて低粘度）を溶解することによって調製した。フィブリノゲンの第３の水溶液は、８％ｍ／ｖで調製し、２百万細胞／ｍＬの細胞数で（実施例１で得られた）懸濁液の線維芽細胞を加えた。
【００８８】
これら３つの溶液を混合して、５０体積％の第１の溶液（ゼラチン）、２５体積％の第２の溶液（アルギネート）、および２５体積％の第３の溶液（線維芽細胞はフィブリノゲン内で回収）を含有する混合物（「バイオインク」と呼称）を得た。
【００８９】
３％ｍ／ｖカルシウムと２０Ｕ／ｍＬの最終濃度のトロンビンとを含有する重合水溶液を調製した。
【００９０】
このバイオインクは、２９℃で粘性転移をする。バイオインクを約３０℃の温度に加熱し、フローを制御できるようにシリンジプッシャーに嵌合したシリンジによって、既知のタイプの堆積技術による付加堆積にこの温度で使用した。基質は約４℃の温度であり、結果として堆積したインクは直ちに固化した。直径３００μｍのビードから開始して、いくつかの層を約１０ｍｍの総厚さで約数平方センチメートルの面積にわたって堆積した。得られた結果は、ｃｍ２当たり２．５×１０５線維芽細胞の密度で線維芽細胞が均質に分布した平坦な物体であった。
【００９１】
このようにして堆積した未処理のプリント物体のそれぞれを重合溶液に浸漬するとともに、３７℃の温度に維持したフィブリノゲンを架橋および凝固させて、アルギネートを重合させるとともに、フィブリノゲンを凝固させた。このようにして得られた平坦な物体は、「皮膚代替体前駆体」と呼称される。
【００９２】
［実施例３：皮膚代替体前駆体の成熟（本発明の方法）］
皮膚代替体前駆体を、１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸を含有する線維芽細胞培地で１２日間インキュベートした。皮膚代替体前駆体に毎日栄養を与えた。１２日後、皮膚代替体前駆体の表面にケラチノサイトをｃｍ２当たり２．５×１０５細胞の濃度で適用した。
【００９３】
皮膚代替体前駆体を、１ｍＭ濃度のアスコルビン酸２−リン酸と抗生物質とを含む上述のグリーン培地に浸漬して、最初の７日間のインキュベート期間インキュベートした。皮膚代替体前駆体に毎日栄養を与えた。
【００９４】
次いで、皮膚代替前駆体を、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸２−リン酸、および抗生物質とともにＤＭＥＭを含有する分化培地内の液体の表面に維持して、第２の２１日間のインキュベート期間、インキュベートした。分化培地は８ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有していた。
【００９５】
このようにして皮膚代替体を得た。皮膚代替体は、化粧料または化学製品の試験を行うために使用することができる。
【００９６】
図２はそうした皮膚代替体の断面を示す。表皮は、真の角質層をその外面に含み、ケラチノサイトを含むことが分かる。真皮表皮接合部ははっきりと認められる。真皮は線維芽細胞を含む（図２において黒い線で囲まれた核のみが認められる）。真皮には孔が認められる。これらの孔は、次第に、線維芽細胞によって分泌される細胞外マトリックスで充填される。
【００９７】
図３は、真皮代替体における線維芽細胞の細胞骨格の中間径フィラメントを示す（ビメンチンによる免疫組織化学的標識）。健康な天然の真皮に見受けられるものと類似した３次元形態の細胞骨格が認められる。
【００９８】
［実施例４：良好ではない種々の試験］
この実施例は、良好ではない現状技術または新規の方法を用いた真皮代替体を製造する試みを含む。
【００９９】
［実施例４ａ：光重合性のＰＥＧジアクリレート系インク］
皮膚代替体前駆体は、本発明に関して記載したものと同様の方法を用いて、光重合性ＰＥＧ−ＤＡ（ポリエチレングリコールジアクリレート）系バイオインクを使用して調製した。光開始剤は、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）８１９（ＣＩＢＡによるビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）−フェニルホスフィンオキシド）であった。インキュベート後、２日後に１００％の細胞死滅率が観察された。この理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、これは細胞毒性である光開始剤自体ではなく、光開始剤によって生成が促進されるフリーラジカルであると考えている。
【０１００】
［実施例４ｂ：フィブリノゲンを含まない本発明のインク］
ＮＩＨ３Ｔ３株の蛍光マウス線維芽細胞を用いて、他のすべての成分について本発明に沿って、フィブリノゲンを含まないバイオインクを作製した。本発明の方法のステップを用いて、このバイオインクから皮膚代替体前駆体を調製した。この場合において、ゲルが良好に保持されるにもかかわらず、ゲル内の細胞接着パターンの欠如のために、細胞はインキュベート時に十分に成長しなかった。図４から分かるように、細胞は拡散せずに最終的に死滅する。ゆえに、この皮膚代替体は、化粧料、医薬品および化学製品の試験には使用できない。
【０１０１】
［実施例４ｃ：過度に流体であるインク］
「極めて低粘度」の代わりに「低粘度」および「高粘度」である粘度によって特に区別される異なるタイプのアルギネートを用いて、本発明の方法を使用した。「高粘度」インクでは良好に押し出されないことが分かる。本方法は、「低粘度」インクを用いて未処理のプリント物体を得るように調整することができるが、その実施形態は、押出しの安定性を低下させ、好ましくない。
【０１０２】
［実施例４ｄ：他の不良の原因］
・適用後のバイオインクと重合溶液との接触時間が過度に短い（約１５分未満）、
・重合時のバイオインク堆積物の全浸漬の不良、
・時間が経過した重合溶液、の場合に、不良（不十分な形態および／または特性を有する皮膚代替体前駆体の形成）が観察された。
【０１０３】
［実施例５：３つの皮膚層（皮下組織、真皮、および表皮）を有する全皮膚の製造（本発明の方法）］
３つの皮膚層は、同じ方法を用いるが、バイオインクおよび異なる細胞を含有する３つの異なるシリンジで、プリント可能である。
第１のシリンジは、バイオインクに希釈した前駆脂肪細胞および／または成熟脂肪細胞を含む。この皮下組織は複数の層状にプリントされ、最初に皮膚の最も深い層を形成するためにプリントされる。
第２のシリンジは、本方法において記載するようにバイオインクに線維芽細胞を含む。真皮のこの部分は、以前にプリントした皮下組織の表面上に複数の層状にプリントされる。
第３のシリンジは、わずかに異なるバイオインクに希釈されたケラチノサイトを含有する。この表皮は、真皮層の表面上に１または複数の層状にプリントされる。１／１０〜１／２の割合のメラノサイトを任意の時点でケラチノサイト懸濁液に添加して、色素性皮膚を得ることができる。
【０１０４】
［実施例６：細胞含量を変えた本発明のバイオインク］
本発明の３つのバイオインクを調製したが、それらの間の唯一の違いは、バイオインク１ｍＬ当たり５０，０００細胞、バイオインク１ｍＬ当たり１００，０００細胞、およびバイオインクｍＬ当たり２００，０００細胞である、生細胞（ヒト線維芽細胞）の含量であった。真皮代替体前駆体は、本発明の方法を用いてこれらのバイオインクで作製した。プリントした真皮代替体前駆体を、５体積％ＣＯ２のもとで、３７℃において４日間インキュベートするために置いた。生細胞のフラクションをアラマーブルー試験（５７０ｎｍおよび６００ｎｍでの吸光度の測定、生細胞の量は、これらの２つの吸光度値の比率の結果である）で測定した。バイオインクは、真皮代替体における線維芽細胞の生存を可能にすること、真皮代替体前駆体におけるこれらの生細胞の濃度は、バイオインク内の生細胞の濃度に比例することが観察される（図５ａ参照）。
【０１０５】
所定の細胞密度（実際には１００，０００）について、生細胞の量を、上述のインキュベート条件下における培養の７、１０および１４日後に測定した。結果を図５（ｂ）に示す。これらの細胞は皮膚代替体内で経時的に増殖することが分かる。
【０１０６】
１４日後、ＤＡＰＩ（生細胞の核を染色する）とヨウ化プロピジウム（死細胞の核を染色する）とによって皮膚代替体の染色が行われた。図５（ｃ）は、光学顕微鏡法による断面における、ＤＡＰＩ染色（灰色のベール）とヨウ化プロピジウムで染色されたいくつかの領域（白色のスポット）を示す。図５（ｄ）は、同じサンプルについてのコンロール実験を示す。該コンロール実験において、細胞は、ドデシル硫酸ナトリウム（０．５％）での処理により死滅した。白色のヨウ化プロピジウム染色が認められる。
【０１０７】
［実施例７：本発明の皮膚代替体の調製］
本発明の皮膚代替体を、より具体的には図６に示す方法を用いて、調製した。図７（ａ）は、本発明の方法を用いて得られた真皮基質の断面を示す。この図は、ＨＰＳ（ヘマトロキシリン−フロキシン−サフラン）染色を用いて得た。図７（ｂ）は同じ真皮代替体の断面（厚さ５μ）を示す。マッソントリクロームを用いて染色を行った。線維芽細胞核（Ｎ）および線維芽細胞によって新合成された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が、バイオプリントした真皮に見受けられる。図７（ｃ）、図７（ｄ）および図７（ｅ）は、本発明にしたがってバイオプリントした真皮における（表皮および真皮に重なる領域）、コラーゲンＩ（図７（ｃ））、コラーゲンＶ（図７（ｄ））およびフィブリリン（図７（ｅ））に特異的な免疫組織学的標識を示す一方で、図７（ｆ）、図７（ｇ）および図７（ｈ）は、比較のためにヒトの皮膚において同じ条件下で得られた対応する画像を示す（これら６つの図の一部の線は、より見やすくするように破線で引き直されている）。
【０１０８】
ビメンチンおよびエラスチンも検出された（図示せず）。
【０１０９】
図７（ｉ）および図７（ｊ）は、本発明にしたがってバイオプリントした真皮における（表皮および真皮に重なる他の領域）、ラミニン３３２（図７（ｉ））およびコラーゲンＶＩＩ（図７（ｊ））に特異的な免疫組織学的標識を示す一方で、図７（ｋ）および図７（ｌ）は、比較のために同じ条件下で得られた、ヒトの皮膚の対応する画像を示す。
【０１１０】
図８（ａ）および図８（ｂ）は、図７（ｃ）のバイオプリントした真皮の領域の拡大図、すなわち線維芽細胞（図８（ａ））（Ｎ、ＲｅおよびＲｂの記号は核、細網（reticulum）およびリボソームをそれぞれ示す）と、新合成コラーゲンを（図８（ｂ））とを示す。図８（ａ）において、左側の黒色線は０．５μｍの長さを表し、図８（ｂ）では２００ｎｍの長さを表す。
【０１１１】
図８（ｃ）および図８（ｄ）は、図８（ｂ）の詳細、すなわち線条コラーゲン（図８（ｃ））および可溶性エラスチンの沈着（図８（ｄ））を示す。
【０１１２】
図９は、本発明のバイオプリントした真皮の画像を示す。数字の符号は、微細構造の特徴、すなわちサイトケラチンの中間径フィラメント１０、ヘミデスモソーム１１、透明帯１２、緻密層１３、アンカーフィブリラ（anchor fibrilla）１４、コラーゲン線維１５を示す。を示す。右下の垂直線は０．２μｍの長さを表す。
【０１１３】
図１０（ａ）、図１０（ｂ）および図１０（ｃ）は、本発明にしたがってバイオプリントした真皮における（表皮および真皮に重なる他の領域）、サイトケラチン１０（図１０（ａ））、フィラグリン（図１０（ｂ））およびロリクリン（図１０（ｃ））に特異的な免疫組織学的標識を示す一方で、図１０（ｄ）、図１０（ｅ）および図１０（ｆ）は、比較のためにヒトの皮膚において同じ条件でヒトに得られた対応する画像を示す。
【０１１４】
図１１（ａ）は、本発明の真皮代替体の他の微細構造画像を示す。この領域は角質層を示す。図１１（ｂ）、図１１（ｃ）、図１１（ｄ）、および図１１（ｅ）はｄ詳細、すなわちコルネオデスモソーム（図１１（ｂ））、デスモソーム（図１１（ｃ））、ケラトヒアリン顆粒（図１１（ｄ））、オドランド層板体（Odland lamellar bodies）（図１１（ｅ））を示す。
【０１１５】
この実施例において、本発明の方法を用いて得られた真皮代替体は、健康なヒトの皮膚と形態学的に類似しているだけでなく、表皮分化および増殖に関連するすべてのバイオマーカー（例えば、サイトケラチン１０、フィラグリン）を発現し、機能性バリアーとして作用可能であり（特にロリクリンの発現を参照）、通常は細胞外マトリックスに見受けられるタンパク質を発現する（特にコラーゲンＩ、コラーゲンＶ、フィブリリン、ビメンチン、エラスチン）ことが示される。これは、本発明の真皮代替体とヒト真皮との、形態学的、組織学的、および機能的に近い類似を示すものである。
【０１１６】
［実施例８：ヒト内皮細胞を伴う本発明の身体代替体］
本発明にしたがって２つのバイオインクを調製し、一方は１ミリリットル当たり２００，０００のヒト真皮内皮細胞を含み、他方は１ミリリットル当たり４００，０００のヒト真皮内皮細胞を含むものであった。身体代替体前駆体を堆積し、上述のアラマーブルー試験でインキュベートの４、８および１４日後に細胞の生存性を測定した。図１２は、初期細胞密度の関数として、プリントした内皮細胞の増殖を示す。
【０１１７】
［実施例９：ヒト角膜線維芽細胞を伴う本発明の身体代替体］
本発明にしたがって２つのバイオインクを調製し、一方は１ミリリットル当たり１５０，０００のヒト角膜線維芽細胞を含み、他方は１ミリリットル当たり２００，０００のヒト角膜線維芽細胞を含むものであった。身体代替体前駆体を堆積し、上述のアラマーブルー試験でインキュベートの４および８日後に細胞の生存性を測定した。図１３は、初期細胞密度の関数として、プリントした細胞の増殖を示す。
【０１１８】
［実施例１０：ヒト口腔粘膜線維芽細胞を伴う本発明の身体代替体］
本発明にしたがって２つのバイオインクを調製し、一方は１５０，０００のヒト口腔粘膜線維芽細胞を含み、他方は２００，０００のヒト口腔粘膜線維芽細胞を含むものであった。身体代替体前駆体を堆積し、上述のアラマーブルー試験でインキュベートの４および８日後に細胞の生存性を測定した。図１４は、初期細胞密度の関数として、プリントした細胞の増殖を示す。
【０１１９】
［実施例１１：ヒト毛包真皮乳頭線維芽細胞を伴う本発明の身体代替体］
本発明にしたがって２つのバイオインクを調製し、一方は１５０，０００のヒト毛包真皮乳頭線維芽細胞を含み、他方は２００，０００のヒト毛包真皮乳頭線維芽細胞を含むものであった。身体代替体前駆体を堆積し、上述のアラマーブルー試験でインキュベートの４および８日後に細胞の生存性を測定した。図１５は、初期細胞密度の関数として、プリントした細胞の増殖を示す。
【０１２０】
［実施例１２：種々の生細胞のバイオインク］
本発明にしたがって４つのバイオインクを調製し、実施例６に記載のものと同様に、１つはバイオインク１ミリリットル当たり１００，０００の脂肪幹細胞を含み、他はバイオインク１ミリリットル当たり２００，０００、４００，０００、および６００，０００の脂肪幹細胞を含むものであり、身体代替体前駆体を調製した。バイオインクは身体代替体前駆体内における脂肪幹細胞の生存を可能にすることと、該前駆体におけるこれら生細胞の濃度は、バイオインク内の生細胞の濃度に比例するということとが観察される（図１６ａ参照）。
【０１２１】
同様に、本発明にしたがって４つのバイオインクを調製し、１つはバイオインク１ミリリットル当たり１００，０００の前駆脂肪細胞を含み、他はバイオインク１ミリリットル当たり２００，０００、４００，０００、および６００，０００の前駆脂肪細胞を含むものであり、身体代替体前駆体を調製した。バイオインクは身体代替体前駆体内における前駆脂肪細胞性幹細胞の生存を可能にすることと、該前駆体におけるこれら生細胞の濃度は、バイオインク内の生細胞の濃度に比例するということとが観察される（図１６ｂ参照）。図１６（ｃ）および図１６（ｄ）については（図面の項に）上述されている。
【０１２２】
［実施例１３：耳代替体前駆体の製造］
本発明の方法の使用において、約８ｃｍの最大サイズを有するヒトの耳代替体の前駆体を調製した。このバイオインクは、１０％（ｗ／ｖ）のウシゼラチン（ＣＡＳ番号９０００−７０−８）（Sigma Aldrich（仏国）から供給）、０．５％（ｗ／ｖ）のアルギネート(極めて低粘度、ＣＡＳ番号９００５−３８−３)（Aesar（仏国）から供給）、２％（ｗ／ｖ）のフィブリノゲン（ＣＡＳ番号９００１−３２−５）（Sigma Aldrich（仏国）から供給）を用いて３７℃の温度で調製した。新たにトリプシン処理した細胞を、３Ｄプリンティングの直前に、バイオインク１ミリリットル当たり１×１０６細胞の含量で添加した。均質化したバイオインクをシリンジに移した。この充填したシリンジを１５℃〜３７℃で保管して、必要なレオロジー特性を得た。マイクロピペットの直径は２００μｍであった。基質を周囲温度とした。未処理のプリント物体（図１７、画像１）を、トロンビン（２０Ｕ／ｍＬ、ＣＡＳ番号９００２−０４−４）の存在下において、ＣａＣｌ２の溶液（１００ｍＭ）内で３０分間処理した。図１７が参照される（画像ＢおよびＣ）。
【０１２３】
［実施例１４：付加堆積方法のレオロジー］
本発明のバイオインクについて、円錐／平板幾何学的形状（２５ｍｍ）を有する回転粘度計（ＡＲ２０００、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、せん断速度走査モード（０．１〜１００ｓ−１）を用いて２８℃で粘度を評価した。この温度は付加堆積時の温度を表す。せん断速度は、
【数１】
2019500904.tif 000002
の式を用いて計算し、該式においてτｗ［Ｐａ］、
【数２】
2019500904.tif 000003
[s-1]、およびη［Ｐａ．ｓ］はそれぞれ、せん断応力、押出しノズルの壁部ｗのせん断速度、バイオインクの粘度を示す。
【０１２４】
せん断速度は、Ｑ＝０．１８３ｍｍ３．ｓ−１である固定バイオインクフローに対してポアズイユの式を用いて、
【数３】
2019500904.tif 000004
の式にしたがって計算した。
【０１２５】
ノズル入口（ｔ）の後とノズル出口（ｂ）とのせん断応力（τｗ）は、半径（Ｒ）、せん断速度
【数４】
2019500904.tif 000005
および、粘度（η）から開始して、測定した。
【０１２６】
表１は、Ｑ＝０．１８３ｍｍ３．ｓ−１のフローを有する円錐台形ノズル（長さ１５ｍｍ）による、本発明のバイオインク押出し方法のレオロジー特性を示す。
【表１】
2019500904.tif 000006
【０１２７】
本発明のバイオインクでは、実際的な作業条件下で、せん断応力は約５０Ｐａであることが分かる。細胞の生存性は、約５０００Ｐａのせん断応力が細胞に加えられたときに多くのタイプの細胞において減少するということが現状技術において報告されていることから、これは、先の実施例で観察された優れた細胞の生存性を説明するものである。したがって、本発明のバイオインクは、市販のシリンジおよびオリフィスを使用して、特に押出し技術によって、付加堆積技術を用いて２次元または３次元の物体を製造する方法に使用することができる。
【０１２８】
［実施例１５：薬理試験のため、病的細胞を含むバイオインクで作製した身体組織代替体］
本発明の方法の使用において、病的細胞、すなわち、アトピー性皮膚炎に罹患した患者から採取した線維芽細胞およびケラチノサイトを含有する皮膚組織代替体が作製される。この皮膚組織代替体は、この疾患の分子機構を研究し、特に局所的形態（活性成分を含有するクリーム）または全身的形態（活性成分が培地の溶液内に存在する）における様々な医薬品および化粧料調製物の効果を研究するための調査モデルとして用いられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）−（ｌ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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