(57)【要約】  キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）発現Ｔ細胞は、固形腫瘍のための有望な免疫療法である。老年のドナー由来のＣＡＲ−Ｔ（ｇＣＡＲＴ）細胞は、より若年のドナー由来のＣＡＲ−Ｔ（ｙＣＡＲ−Ｔ）と比較すると機能的に障害があることが本明細書に示される。より高い形質導入効率および向上された細胞増殖が、ｇＣＡＲ−Ｔと比較して、ｙＣＡＲ−Ｔで観察された。ｙＣＡＲ−Ｔは、ｐＥＲＫ、ｐＡＫＴ、ｐＳＴＡＴ３、およびｐＳＴＡＴ５の、有意に増加したレベルの増殖およびシグナリングの活性化を示した。さらに、ｙＣＡＲ−Ｔは、増強された細胞溶解性能を有することが知られるより高い割合のＣＤ４およびＣＤ８エフェクターメモリー細胞（ＥＭ）を含んだ。より多くの数のＣＤ４およびＣＤ８ＥＭによれば、ｙＣＡＲ−Ｔは、ＩＬ１５で処置されたｙＣＡＲ−Ｔ細胞で観察される最大細胞毒性とともに、ｇＣＡＲ−Ｔと比較して、より高レベルのＣＥＡ特異的細胞毒性を示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクスビボで、リンパ球の個体群を形質導入するための方法であって、
前記リンパ球を、そのリンパ球によりα５β１の発現を増加させる薬剤と、エクスビボで接触させることと、
前記リンパ球を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換えＤＮＡ分子を含む組換えウイルス粒子と混合することとを含む、方法。
【請求項２】
前記リンパ球と前記薬剤と接触させることは、前記リンパ球を前記薬剤でインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤は、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ球と前記薬剤とを接触させることは、前記リンパ球を、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ〜７．５ｎｇ／ｍｌ、または４ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦでインキュベートすることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞と前記薬剤とを接触させることは、前記細胞を、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｍ／ｍｌ、または７．５ｎｇ／ｍｌ〜１２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１でインキュベートすることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を前記薬剤と接触させる前に、前記細胞を疾患と診断された対象から得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患は、癌または後天性免疫不全疾患である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌は、肝癌、膵臓癌、白血病、リンパ管癌、脳癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、精巣癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌および皮膚癌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患は、癌または後天性免疫不全疾患である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えウイルス粒子は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いて生成されたＣＡＲ−Ｔを含む組成物を、前記対象に投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法。
【請求項１２】
前記対象は、少なくとも６５歳である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載される内容は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構成物をコードする組換えＤＮＡ分子を内部に持つ組換えウイルスにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、エクスビボで形質導入する効率を高めるための方法に関する。ＰＢＭＣは、癌のような疾患を患う老年対象から採取され、目的とするＣＡＲで形質導入されて、疾患の治療のために、対象に戻すように投与され得る。
【背景技術】
【０００２】
癌は高齢者の疾患で、その中央値年齢は、先進国では７０歳である（非特許文献１）。高齢者は、環境発癌物質に関連してより多くの遺伝的損傷を蓄積し、免疫機能または「免疫増強」を低下させた（非特許文献１）。免疫増強は、抗腫瘍免疫を損なう未感作Ｔ細胞コンパートメントおよびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞機能欠損の収縮を特徴とする（非特許文献２）。したがって、癌免疫療法は、年齢に関連した免疫変化を説明しなければならない。
【０００３】
主にＣＡＲ−Ｔ細胞プラットフォームの開発を通じて、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）の分野において著しい進歩があった。異種Ｔ細胞は、合成キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子を導入することにより、腫瘍抗原に対する絶妙な特異性を付与するタンパク質を発現するように遺伝子工学的に操作することができる。最近のフェーズＩ  ＨＩＴＭ試験および進行中のＨＩＴＭ−ＳＩＲフェーズＩｂ試験では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性が試験されている。ＣＥＡは、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、および肺癌を含むがこれらに限定されないいくつかのタイプの癌において発現される。腫瘍抗原特異的であるＣＡＲ−Ｔ細胞の注入は、宿主内で免疫を発生させようとするワクチンとは対照的に、患者に直ちに非常に特異的な免疫応答を提供する。
【０００４】
高齢の患者では、未感作からメモリーエフェクターＴ細胞個体群への主要な表現型の変化があり、ＡＣＴが若年患者の治療ほど有効ではない可能性がある（非特許文献３）。インターロイキン−２（ＩＬ２）およびインターロイキン−１５（ＩＬ１５）は、共通ガンマ鎖（γｃ）およびＩＬ２β鎖レセプターを介してシグナル伝達することが知られており、Ｔ細胞の増殖および分化の重要な機能的に異なるレギュレーターである。ＩＬ２およびＩＬ１５の両方は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ、ＰＩ３ｋ／ＡｋｔおよびＭｅｋ／Ｅｒｋシグナル伝達経路を活性化することが知られているが（非特許文献４）、それらは異なる免疫療法効果を有する。ＩＬ１５はメモリーおよびエフェクターＴ細胞の生成に優れた効果を有し、したがって、免疫療法のためにＩＬ２の代わりに外因性ＩＬ１５を使用する傾向が高まっている（非特許文献５）。
【０００５】
老年のドナーから産生されたＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を研究し、ＩＬ２およびＩＬ１５がＣＡＲ−Ｔ表現型に対して、老年および若年のドナーの両方において、異なる効果を有するかどうかを評価するために実験を行った。本開示で提供される結果は、老年のドナーから得られたＴ細胞が、より若年のドナーからの細胞と比較してより低い効率で形質導入され、老年の細胞毒性および老年Ｔ細胞の腫瘍死滅活性の低下をもたらすことを示す。しかしながら、本開示に示されるように、採取された細胞をα５β１の発現を増加させる薬剤で処理することにより、老年Ｔ細胞の形質導入効率を増加させることができる。関連技術の前述の例およびそれに関連する制限は、例示的であり排他的なものではないことが意図されている。関連技術の他の制限は、明細書の読解および図面の検討を行えば、当業者にとって明らかになるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｌｏｅｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，８：５４１−５５２
【非特許文献２】Ｎａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：７４４６−７４５２
【非特許文献３】Ｋｏｖａｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：１３５９−１３６６
【非特許文献４】Ｍａｒｚｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６８：１０８３−１０９１
【非特許文献５】Ｗａｌｄｍａｎｎ，２００６，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：５９５−６０１
【発明の概要】
【０００７】
以下に記載され説明される、以下の態様および実施形態は、例示的かつ説明的であることを意味し、範囲を限定するものではない。
一態様では、エクスビボで、リンパ球の個体群を形質導入するための方法が提供され、方法は、リンパ球を、該リンパ球によりα５β１の発現を増加させる薬剤と、エクスビボで接触させることと、リンパ球を組換えウイルス粒子と混合することとを含み、組換えウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換えＤＮＡ分子を内部に持つ。いくつかの実施形態では、方法は、α５β１の発現を増加させる薬剤と接触させないリンパ球の形質導入の効率と比較して、組換えウイルス粒子によるリンパ球の形質導入の効率を高める。
【０００８】
いくつかの実施形態では、リンパ球の個体群は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および／またはＮＫ細胞を含む。他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、ＮＫＴ細胞および／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、α５β１の発現を増加させる薬剤は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）またはトランスフォーミング成長因子β−１（ＴＧＦβ１）を含む。他の実施形態では、α５β１の発現を増加させる薬剤は、Ｍ−ＣＳＦおよびＴＧＦβ１を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、薬剤は、当該薬剤を形質導入しないリンパ球の同等の個体群によるα５β１の発現の、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のリンパ球の個体群によるα５β１の発現を増加させる。他の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＴＧＦβ１の発現における増加は、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＴＧＦβ１をコードするｍＲＮＡを定量化することにより測定される。さらに他の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＴＧＦβ１の発現の増加は、Ｍ−ＣＳＦおよび／またはＴＧＦβ１のタンパク質レベルを定量化することにより測定される。いくつかの実施形態では、リンパ球の個体群内の１以上の細胞は、内在性Ｍ−ＣＳＦおよびＴＧＦβ１タンパク質を発現しない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、リンパ球と薬剤とを接触させることは、約１ｘ１０５〜１ｘ１０８、１ｘ１０６〜１ｘ１０７、１ｘ１０６〜１ｘ１０８個のリンパ球を、薬剤とインキュベートすることを含む。つまり、いくつかの実施形態では、リンパ球の個体群は、約１ｘ１０５〜１ｘ１０８、１ｘ１０６〜１ｘ１０７、１ｘ１０６〜１ｘ１０８のリンパ球を含む。他の実施形態では、リンパ球と薬剤とを接触させることは、約１ｘ１０５、１ｘ１０６  １ｘ１０７または１ｘ１０８個のリンパ球を、薬剤とインキュベートすることを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、細胞とＭ−ＣＳＦとを接触させることは、細胞を、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ、２．５〜７．５ｎｍ／ｍｌ、または４ｎｇ／ｍｌ〜７ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦとインキュベートすることを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、細胞とＴＧＦβ１とを接触させることは、細胞を、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｍ／ｍｌ、または７．５ｎｇ／ｍｌ〜１２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１とインキュベートすることを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、細胞をＭ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１と接触させる前に、細胞を疾患と診断された対象から得る。他の実施形態では、疾患は癌または免疫不全疾患である。さらに他の実施形態では、癌は、肝癌、膵臓癌、白血病、リンパ管癌、脳癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、精巣癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌および皮膚癌からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、免疫不全疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、組換えウイルス粒子は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に結合するＴ細胞受容体をコードする。他の実施形態では、腫瘍抗原はからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、腫瘍抗原は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００１６】
別の態様では、それを必要とする対象を治療するための方法が提供され、方法は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて生成されたＣＡＲ−Ｔを含む組成物を対象に投与することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、対象は少なくとも５５歳、６０歳、６５歳、７０歳または７５歳である。
いくつかの実施形態では、対象は癌と診断されている。他の実施形態では、癌は、肝癌、膵臓癌、白血病、リンパ管癌、脳癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、精巣癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巣癌および皮膚癌からなる群から選択される。
【００１８】
本方法および組成物の追加の実施形態などは、以下の説明、図面、実施例、および請求項から明らかになるであろう。前述および以下の説明から理解されるように、本明細書に記載された各特徴、およびそのような特徴の２つ以上の各組み合わせは、本開示の範囲内に含まれ、そのような組み合わせを含む特徴が相互に矛盾しないように提供される。さらに、任意の特徴または特徴の組み合わせは、本発明の任意の実施形態から具体的に除外されてもよい。本発明のさらなる態様および利点は、特に添付の実施例および図面と併せて考慮すると、以下の説明および請求項に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒト対象から単離され、その後ＣＡＲをコードする構成物を内部に持つ組換えウイルスベクターにより形質導入されたＰＢＭＣのゲートされたフローサイトメトリーを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、老年および若年ＰＢＭＣのウイルス形質導入効率のグラフを示す（ｎ＝８；＊ｐ＝０．００２）。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、ＩＬ２またはＩＬ１５の存在下または非存在下での非形質導入（図２Ａ）および形質導入（図２Ｂ）の老年および若年細胞のグラフを示す（＊ｐ＜０．０５  それぞれの治療について老年対若年）。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、ウェスタンブロット分析により、老年または若年細胞における、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、Ｅｒｋ、およびＡｋｔの発現レベルを示す（＊ｐ＜０．０５  それぞれの治療について老年対若年）。
【図３Ｂ】同上。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、ＩＬ２またはＩＬ１５の存在下または非存在下で保持される形質導入（図４Ａ）および非形質導入（図４Ｂ）の老年および若年細胞の存在下における、ＣＥＡ特異的細胞の細胞毒性を示す（＊ｐ＜０．００５  それぞれの治療について老年対若年）。
【図４Ｂ】同上。
【図５Ａ】図５Ａは、腫瘍細胞とインキュベートする前に、ＩＬ２またはＩＬ１５のいずれかで、若年または老年の抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が維持された培地中のグランザイムＢレベルを示す（＊ｐ＜０．００５  それぞれの治療について老年対若年）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、若年または老年の抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、腫瘍細胞とインキュベートする前に、ＩＬ２またはＩＬ１５のいずれかで維持された培養培地中のパーフォリン（ｐｒｅｆｏｒｉｎ）レベルを示す（＊ｐ＜０．０５  それぞれの治療について老年対若年）。（＊ｐ＜０．００５  それぞれの治療について老年対若年）
【図６Ａ】図６Ａは、若年および老年のヒト対象から単離され、その後ＣＡＲをコードする構成物を内部に持つ組換えウイルスベクターにより形質導入されたＰＢＭＣのゲートされたフローサイトメトリーを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂ、図６Ｃ、および図６Ｄは、形質導入された若年および老年ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴ細胞の個体群のグラフを示す。ＣＤ４エフェクターメモリー細胞（図６Ｂ；＊ｐ＜０．０５  それぞれの治療について老年対若年）、ＣＤ４エフェクター細胞の相対的なレベルが示される（図６Ｃ；＊ｐ＜０．０５それぞれの治療について老年対若年）、およびＣＤ８エフェクターメモリー細胞（図６Ｄ；＊ｐ＜０．０５  対  対応する老年ドナー細胞）の相対的レベルが示される。
【図６Ｃ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図７Ａ】７Ａは、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１で処置された若年および老年のヒト対象から単離され、ＣＡＲをコードする構成物を内部に持つ組換えウイルスベクターにより形質導入されたＰＢＭＣのゲートされたフローサイトメトリーを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂ〜図７Ｃは、若年および老年細胞におけるα５β１インテグリン発現（図７Ｂ；＊ｐ＜０．０００５  対  老年）およびＣＡＲ発現（図７Ｃ；＊ｐ＜０．００５  対  老年）のグラフを示す。
【図７Ｃ】同上。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｂは、ＩＬ２（図８Ａ；＊ｐ＜０．０００５  対  老年）またはＩＬ１５（図８Ｂ；＊ｐ＜０．０００５対  老年）において増殖および維持され、その後、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１で処置された若年および老年ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性のグラフを示す。
【図８Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、様々な態様をより詳細に説明する。しかしながら、そのような態様は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が詳細かつ完全であり、その範囲を当業者に十分に伝えるために提供される。
【００２１】
Ｉ．  定義
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリマー」への言及は、単一のポリマーならびに２つ以上の同一または異なるポリマーを含み、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤ならびに２つ以上の同じまたは異なる賦形剤等を含む。
【００２２】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在値およびその記載された範囲内の他の記載または介在値は、開示内に包含されることが意図される。例えば、１μｍ〜８μｍの範囲が記載されている場合、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、および７μｍ、ならびに１μｍ以上の値の範囲および８μｍ以下の値の範囲も明示的に開示されていることが意図される。
【００２３】
本明細書で使用される「マクロファージコロニー刺激因子」または「Ｍ−ＣＳＦ」は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ記録アクセッション番号ＮＰ＿０００７４８に記載されているタンパク質、および任意に、その任意の前駆体、変異体またはアイソフォームをいう。
【００２４】
本明細書で使用される「形質転換成長因子β−１」または「ＴＧＦβ１」は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ記録アクセッション番号ＮＰ＿０００６５１に記載されているタンパク質、および任意に、その任意の前駆体、変異体またはアイソフォームをいう。
【００２５】
本明細書で使用される「老年のドナー」とは、少なくとも５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、または７５歳のヒトをいう。本明細書において使用される「老年Ｔ細胞」は、老年のドナーから得られた、または採取されたＴ細胞を指す。
【００２６】
本明細書で使用される「若年のドナー」とは、５５歳、５０歳または４５歳未満のヒトをいう。本明細書で使用される「若年Ｔ細胞」は、若年のドナーから得られた、または採取されたＴ細胞を指す。
【００２７】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、それぞれは、本明細書に記載の方法に従うことが可能な、あらゆる動物（例えば、マウスおよびラットなどのげっ歯類）、または、インビトロであろうと生体内原位置であろうと、その細胞を指し得る。特定の非限定的な実施形態において、患者、対象、または個体は、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、キメラＴ細胞受容体に関して「特異的に結合する」という表現は、キメラＴ細胞受容体が構造的に異なるタンパク質に対してより高い親和性でその標的タンパク質に結合することを意味する。
【００２９】
ＩＩ．  老年Ｔ細胞対若年Ｔ細胞
癌のリスクが高い老年個体群の状況における、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法の急速な進歩を考えると、潜在的な年齢関連ＣＡＲ−Ｔ細胞欠損に対処するための研究が行われた。老年のドナーから製造されたＣＡＲ−Ｔは、より若年の個人や若年のドナー由来のＣＡＲ−Ｔに対して機能障害を示すと推測された。さらに、老年ＣＡＲ−Ｔ（ｇＣＡＲ−Ｔ）障害およびインビトロまたはインビボでの治療活性を有するｇＣＡＲ−Ｔの生成効率を改善するための戦略についてのメカニズムが仮定された。
【００３０】
ＣＡＲ−Ｔの生成には、通常、癌に罹患しており、癌を治療するための医学的介入を必要とする対象由来の末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）などの細胞を最初に採取することが含まれる。実施例１を含む本明細書に記載された実験により、老年のドナーから得られたＴ細胞は、若年のドナー由来のＴ細胞の形質導入と比較して、ＣＡＲ構成物をコードする内部に組換え核酸分子を有するウイルスベクターによって形質導入が減少していることが判明した。老年と若年のドナーＴ細胞の形質導入効率の差異を調べるために、ＰＢＭＣを若年と老年のドナーの両方から単離し、当該技術分野で標準的な方法を用いて活性化し、その後、ＣＥＡについて特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するためにレトロウイルス形質導入した。細胞質フロー解析を用いて形質導入効率を測定し、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞（若年のドナーからの細胞）と比較して、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞（老年のドナーからのＣＡＲ−Ｔ細胞）が有意に低いことがわかった。老化は、老化により変化する細胞表面マーカーおよびシグナル形質導入の経路の変化のために、リンパ球の増殖能力の低下を引き起こすことが知られている（Ｆｕｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ａｇｉｎｇ，２：３３−５４）。
【００３１】
さらに、非形質導入細胞および形質導入細胞の両方をＩＬ２またはＩＬ１５中に維持して所望のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖および維持を可能にした場合、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、非形質導入ｙＣＡＲ−Ｔ細胞および形質導入ｙＣＡＲ−Ｔ細胞の両方において、有意により高い増殖があった。ＩＬ２／ＩＬ１５ＲβγＣ受容体が、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５のＡｋｔ、ＥｒｋおよびＪａｋ依存性活性化を含む複数の増殖経路を活性化することは、当業者に知られている（Ｃｏｒｎｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，１０８：６００−６０８）。注目すべきことに、Ａｋｔ、Ｅｒｋ、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５のリン酸化は、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してｙＣＡＲ−Ｔ細胞において有意に増加することが示され、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ２およびＩＬ１５のような増殖サイトカインで処置されているにもかかわらず、増殖前シグナリングの障害を有することを示した。
【００３２】
ＣＤ３活性化をともなうＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、複雑なシグナル伝達カスケードを誘発し、未感作なＴ細胞増加および特定のエフェクター細胞への分化を導く（Ｂｒｏｗｎｌｉｅ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｙｓｋａ，２０１３，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３：２５７−２６９）。この分化は、サイトカイン環境、並びに抗原、抗原提示細胞型および共刺激分子を含むが、これに限定されない他の因子に依存する。研究は、腫瘍細胞を認識し破壊することが知られているメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の持続性の重要性を示している（Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，２００５，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７：１９５−２０１）。また、メモリーＴ細胞表現型の存在は、腫瘍再発の予防に役立つ（Ｓｔｒａｅｔｅｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２３：３９６−４０６）。ＣＤ４およびＣＤ８  ＣＡＲ−Ｔ間の表現型の差を、若年と老年の間で調べた。表現型プロファイリングは、未感作細胞についてはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、セントラルメモリー細胞についてはＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ＋、エフェクターメモリー細胞についてはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、および、エフェクター細胞についてはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−を用いることにより行われた（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２：７４５−７６３）。すべての細胞集団をＣＤ３＋ＣＡＲ＋としてゲートし、次いでＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかをゲートした。データは、ｙＣＡＲ−Ｔが、ＣＤ４エフェクター細胞（ＥＣ）、ＣＤ４エフェクターメモリー（ＥＭ）細胞およびＣＤ８エフェクターメモリーセル（ＥＭ）のより高い割合を含むことを示した。ＩＬ２およびＩＬ１５処理細胞間の表現型において有意差は観察されなかった。活性化されたＴ細胞は増殖し、ＣＭおよびＥＣに分化する。ＥＣおよびＣＭはさらにＥＭ細胞に分化することができる。未感作、エフェクター、ＣＭ、ＥＭはＥＬからＬＮを出す。（Ｏｂｈａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，１７６：４０５１−４０５８）ＥＭは周辺チャレンジからの即時保護を提供し、一方、ＴＣＭは全身チャレンジからの保護を提供し、エフェクター細胞を生成する（Ｂｏｕｎｅａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１：５７９−５９０）。ヒトＣＤ８ＴＥＭは、エクスビボでその溶菌活性を直接的に示し、グランザイムおよびパーフォリンを恒常的に発現し、したがってエフェクター細胞に由来する可能性が高い（Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７９：３６−４０）。
【００３３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＥＡ（ＣＥＡ＋）を発現するマウス結腸癌腫細胞、または、陰性対照として使用されるＣＥＡ−であるＭＣ３８細胞と共にインキュベートして細胞毒性アッセイを行い、活性がＣＡＲ−Ｔレセプタータンパク質によって結合された標的ＣＥＡ分子に特異的であることを示した。ＩＬ２またはＩＬ１５のいずれかで増殖および維持されたｇＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＥＡ特異的細胞毒性が有意に低かったが、ＩＬ２またはＩＬ１５において増殖および維持された非形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞に差はなかった。細胞傷害性Ｔ細胞は、この場合、標的細胞をグランザイム／パーフォリンを介して腫瘍細胞を溶解する（Ｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，６１：１６７１−１６８２）。続いて、本研究において、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞個体群は、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞個体群と比較してＣＤ４＋エフェクター細胞の数が増加していることが測定された。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋細胞の数または相対数を増強または増加させるために処理されるｇＣＡＲ−Ｔ細胞個体群が、本明細書に開示されており、処理されたｇＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞の数または相対数を増加させるように処理されなかった匹敵するｇＣＡＲ−Ｔ細胞よりも高い細胞毒性レベルを有する。重要なことに、細胞毒性がｇＣＡＲ−Ｔ細胞についてより低い形質導入効率について正規化された場合、その値はｙＣＡＲ−Ｔ細胞と有意に異ならなかった。したがって、本明細書では、例えば、対象から得られたＴ細胞のような、細胞の形質導入効率を高めるための方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象は、老年患者である。
【００３４】
ＩＩＩ．  老年Ｔ細胞の救援
インテグリンは、細胞接着を媒介する細胞表面接着分子ファミリーに属し、細胞−細胞接着および細胞移動を担う（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１２４：１１８３−１１９３）。α５β１インテグリンは、Ｔ細胞のレトロネクチンベースの形質導入において重要な役割を果たす（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１５：５０８−５１６）。組換えヒトフィブロネクチン断片であるレトロネクチンは、主に細胞のα５β１インテグリンと相互作用することによって結合する細胞結合ドメインを含み、それによって細胞とウイルス粒子との共局在化を助ける。以下の実施例３に示すように、α５β１インテグリンの著しく高い発現が、老年ドナーＴ細胞と比較して若年ドナーＴ細胞で観察された。この増加した発現は、より低いｇＣＡＲ−Ｔ形質導入効率と相関する。Ｍ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−β１は、α５β１インテグリン発現を上方制御し、細胞接着および移動を促進することが知られている（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２７４：５１９−５２５，Ｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２：５１７９−５１８３）。それらは、多くの異なる細胞型（軟骨細胞、乳癌細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、結腸癌など）上のいくつかの異なるインテグリン、例えばα１、α２、α３、α５およびβ１を調節することも知られている（Ｈｙｎｅｓ，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０：６７３−６８７）。したがって、老年Ｔ細胞におけるα５β１インテグリン発現レベルの発現を増加させるための研究が行われた（例えば、実施例３）。老年のドナーから単離したＰＢＭＣを、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１のいずれかで処置した。その結果、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１のいずれかで処置した老年細胞におけるα５β１インテグリン発現の顕著な増加が観察された。さらに、老年細胞におけるα５β１の発現は、若年Ｔ細胞のそれに匹敵した。
【００３５】
α５β１発現の増加が形質導入効率の増加と相関することを示すために、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１で処理した老年および若年ドナーＴ細胞の両方の形質導入を、同等の形質導入効率で形質導入した（実施例３）。さらに、細胞毒性アッセイを用いて処理したｇＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効率を評価することにより、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞をＭ−ＣＳＦまたはＴＧＦ−β１で処理することにより、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞個体群の細胞致死活性が増加することが示された。
【００３６】
結論として、この研究は、ｇＣＡＲ−Ｔ間のＣＡＲ発現の障害が、老年癌患者の免疫療法において大きな障害を引き起こし得るＣＥＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を妨げる可能性があることを示唆している。我々の前臨床インビトロデータは、この表現型が、これらの感染細胞の抗腫瘍活性を救援するために、老年Ｔ細胞をＭ−ＣＳＦまたはＴＧＦ−β１で処理することによって逆転され得ることを示唆する。臨床応用の前に、インビボ試験に加えて他のＣＡＲ−Ｔ製品におけるこれらの知見の確認が必要である。この研究は、年齢に関連するＣＡＲ−Ｔ欠損が可逆的であることを示唆しているため、翻訳の影響がある。要入力（１００に達したら、ＡＬＴ＋２を使い始める）。
【００３７】
ＩＶ．  実施例
以下の実施例は本質的に例示的なものであり、決して限定するものではない。
実施例１：抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製
老年  Ｔ細胞と若年ドナーＴ細胞の形質導入効率の差を調べるために、６５歳以上の８人の老年患者（ｇＣＡＲ−Ｔ群）および１８〜４５歳の範囲の８人の非老年患者（ｙＣＡＲ−Ｔ群）から得られた全血からＰＢＭＣを単離した。各群からのＰＢＭＣをＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で４８時間活性化し、細胞を２ｘ１０６／ｍｌの濃度に維持した。ＰＭＢＣは、ハイブリッドＣＤ２８／ＣＤ３分子を有するＭＦＧレトロウイルスバックボーン中のＩｇＴＣＲ（ＩｇＣＥＡ）のｈＭＮ１４ｓＦｖ−ＣＤ８ヒンジセグメントの分子融合により生成されたタンデム分子を含有するレトロウイルス送達システムを用いて、３回形質導入された（Ｅｍｔａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１４：８１１２−８１２２の方法に従って生成される）。形質導入効率は、表面発現抗ＣＥＡ  ＣＡＲ構築物によって特異的に結合されたＣＥＡ−Ｉｇ融合タンパク質を用いて形質導入の４８時間後に測定した。ＣＥＡ−Ｉｇ融合タンパク質の形質導入による細胞の結合を、フローサイトメトリーを用いて検出した。ＣＤ３およびキメラ抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔを発現する生存可能な単一細胞を同定するために、標準ゲーティング戦略を用いた。結果は、図１Ａに示すように、ｇＣＡＲ−Ｔ群（２１．３％）から得られた細胞では、ｎ＝８、ｐ＝０．００２のｙＣＡＲ−Ｔ群（３６．９％）から得られた細胞よりウイルス形質導入効率が有意に低かったことを示す（図１Ｂ）。
【００３８】
ＩＬ２（３０００ＩＵ／ｍｌ）またはＩＬ１５（５ｎｇ／ｍｌ）中で、２つの群のそれぞれからの非形質導入および形質導入細胞を２０日間維持し、増殖曲線を測定した。ＩＬ２およびＩＬ１５の両方についてのｇＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖と比較して、非形質導入（図２Ａ）および形質導入（図２Ｂ）ｙＣＡＲ−Ｔ細胞の両方の有意に高い増殖があった。形質導入されていないｙＣＡＲ−Ｔ細胞および形質導入されたｙＣＡＲ−Ｔ細胞の両方の増殖は、形質導入されていないｇＣＡＲ−Ｔ細胞および形質導入されたｇＣＡＲ−Ｔ細胞より約２．５倍高かった（図２Ａおよび２Ｂ）。結果を平均±ＳＥＭ（＊ｐ＜０．０５）として示す。
【００３９】
実施例２：ｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞の分子プロファイル  
ＩＬ２／ＩＬ１５ＲβγＣ受容体は、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５のＡｋｔ、ＥｒｋおよびＪａｋ依存性活性化を含む複数の増殖経路を活性化する（Ｃｏｒｎｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，１０８：６００−６０８）。ｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞と機能との間の相違をさらに理解するために、抗ＣＥＡ  ＣＡＲを発現するｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＳｔａｔ３、Ｓｔａｔ５、ＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化を測定する実験を行った。全タンパク質を、実施例１に記載のように生成および維持されるｇＣＡＲ−ＴおよびｙＣＡＲ−Ｔ細胞から２０日目に単離し、ＩＬ２またはＩＬ１５で処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、１ｍＭ  ＮａＶＯ４、および１ｍＭ  ＮａＦを補充したＲＩＰＡ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１０９：１００２４−１００２９）に記載されているように溶解した。溶解物を１０，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、上清を回収し、ＢＳＡを標準としてＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク質定量を行った。ライセートをβ−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて変性させ、７０℃で１０分間加熱し、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸ４−１５％ゲル（Ｂｉｏｒａｄ）で電気泳動し、ＴｒａｎｓＢｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ）に転写し、リン酸化および総Ｅｒｋ、Ａｋｔ、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５タンパク質に対する一次抗体でイムノブロットした。一次抗体の結合は、化学発光基質としてＨＲＰ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｔｓｅｒ  Ｂｌｏｔ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。イムノブロットをＧＡＰＤＨに対する抗体で再プローブして、等しい負荷を制御した。トリプリケート試料を各処理群についてロードし、信号をデンストモトリック分析によって定量し、それぞれの全タンパク質に対して正規化した。Ａｋｔ、Ｅｒｋ、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ５のそれぞれのリン酸化は、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞（図３Ａおよび３Ｂ）と比較して、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞において有意に増加し、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞が増殖サイトカイン、例えばＩＬ２およびＩＬ１５で処理されているにもかかわらず、増殖促進シグナリングの障害を有することが示された。
【００４０】
実施例３：ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロ抗腫瘍活性
抗ＣＥＡ若年および老年ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍効果を調べるために、実施例１に記載の抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＭＣ３８（ネズミ結腸癌細胞株）標的細胞とインキュベートした細胞毒性アッセイを実施した。実施例１に記載のようにＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）またはＩＬ１５（５ｎｇ／ｍｌ）でｙ−ＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞（エフェクター細胞（Ｅ））を処理し、次いで１：１、１：１０および１：２０標的対エフェクター細胞比でＭＣ３８ＣＥＡ＋（標的細胞（Ｔ））細胞とインキュベートした。ＭＣ３８細胞は、ヒトＣＥＡをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされ、ＭＣ３８ＣＥＡ＋細胞を生成する。ＭＣ３８ＣＥＡ−細胞を陰性対照として使用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＥＡ特異的細胞毒性を示した。細胞溶解（細胞毒性）は、細胞培養上清中へのＬＤＨ（ラクトースデヒドロゲナーゼ）の放出を測定することによって決定した。図４Ａおよび図４Ｂに示すように、ＩＬ２およびＩＬ１５処置ｇＣＡＲ−Ｔの両方についてのｇＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ２およびＩＬ１５処置ｙＣＡＲ−Ｔ細胞より有意に低いＣＥＡ特異的細胞毒性を有し（ｙＣＡＲ−Ｔより約２倍低い、ｐ＜０．００５）、非形質導入ＣＡＲ−Ｔ細胞に差はなかった。ＩＬ２またはＩＬ１５処理したｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞によるパーフォリンおよびグランザイムＢの分泌も測定した。図５Ａおよび５Ｂに示すように、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞によるグランザイムＢ（図５Ａ）およびパーフォリン（図５Ｂ）の分泌は、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞による分泌よりも有意に高かった。結果を平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５。ＩＬ２およびＩＬ１５処置の両方についてｇＣＡＲ−Ｔと比較して、ｙＣＡＲ−Ｔによる腫瘍殺傷の増強は、パーフォリン（１．３±０．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１）およびグランザイムＢ（０．４±０．０３ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０２）のレベルの増加と相関した。ｇＣＡＲ−Ｔ細胞についてより低い形質導入効率について細胞毒性が正規化された場合、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞とｙＣＡＲ−Ｔ細胞との間で値に有意な差はなかった（データ示さず）。
【００４１】
ゲーティング戦略を用いて、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７発現（ｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞のそれぞれについてｎ＝８）に基づいて、ＣＤ４またはＣＤ８メモリーおよびエフェクターＴ細胞表現型分析を行った。ＣＥＡ特異的ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、エフェクター、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリー細胞について表現型を調べた。ｙＣＡＲ−Ｔ細胞とｇＣＡＲ−Ｔ細胞との間のＣＤ４およびＣＤ８のＣＡＲ−Ｔ間の表現型の相違を調べた。表現型プロファイリングは、未感作細胞についてはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋、セントラルメモリー細胞についてはＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ＋、エフェクターメモリー細胞についてはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−、および、エフェクター細胞についてはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−を用いることにより行われた（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２：７４５−７６３）。すべての個体群を、図６Ａに示すようにＣＤ３＋ＣＡＲ＋としてゲートし、次いでＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかをゲートした。また、図６Ｂ、６Ｃおよび６Ｄは、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞がより高い比率のＣＤ４エフェクターメモリー（ＥＭ）細胞（４３．２±６．８％、ｐ＝０．００２）、ＣＤ４エフェクター細胞（ＥＣ）（６４．３±７．６％、ｐ＝０．００３）、およびＣＤ８エフェクターメモリー細胞（ＥＭ）（１６．５±３．６％、ｐ＝０．００２）を含有することを示す。結果を平均±ＳＥＭとして示す。各群（ＩＬ２またはＩＬ１５）についての＊ｐ＜０．０５対老年ドナーＴ細胞。ＩＬ２処理細胞とＩＬ１５処理細胞との間の表現型に有意差は観察されなかった。
【００４２】
活性化されたＴ細胞は増殖し、ＣＭＴ細胞およびＥＣに分化する。ＥＣ細胞およびＣＭ細胞はさらにＥＭ細胞に分化することができる。未感作、エフェクター、ＣＭ、およびＥＭ細胞は、ＥＬ細胞からＬＮ細胞を出す。（１２）ＥＭ細胞は、周辺チャレンジからの即時保護を提供するが、ＴＣＭは、全身チャレンジからの保護を提供し、エフェクター細胞を生成する（Ｂｏｕｎｅａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１：５７９−５９０）。ヒトＣＤ８ＴＥＭは直接的なインビボでの溶解活性を示し、グランザイムおよびパーフォリンを恒常的に発現し、従ってエフェクター細胞に由来する可能性が高い（Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７９：３６−４０）。
【００４３】
このように、さらなる実験は、ｇＣＡＲ−Ｔ形質導入の救援に焦点を合わせた。細胞傷害性Ｔ細胞は、グランザイム／パーフォリンを介して、標的細胞、この場合、腫瘍細胞を溶解する。本発明者らは、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞にＣＤ４＋エフェクター細胞の数が増加し、おそらく、このことが、この群で観察された細胞毒性の増加を引き起こしたことを見出した。
【００４４】
実施例４：ｇＣＡＲ−Ｔ細胞の救援
老年Ｔ細胞における減少したα５β１インテグリン発現レベルを救援し、それによりウイルス形質導入を増加させるために、老年のドナーから単離したＰＢＭＣを、Ｍ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで処置し、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるα５β１インテグリン発現に対する処置の効果を測定した。フローサイトメトリー分析を実施し（図７Ａ）、Ｍ−ＣＳＦおよびＴＧＦβ１で処置した活性化老年Ｔ細胞におけるα５β１インテグリンの相対的発現を、８人のドナーすべてで定量し、未処置のｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔ細胞（各群についてｎ＝８）と比較した。ｇＣＡＲ−Ｔ細胞におけるα５β１インテグリン発現の有意な増加がＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦβ１処置の両方で観察された。図７Ｂに示すｇＣＡＲ−Ｔ細胞におけるα５β１インテグリン発現は、ｙＣＡＲ−Ｔ細胞における（ｇＣＡＲ−Ｔ細胞＋Ｍ−ＣＳＦ：４１．０＋１．０、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞±ＴＧＦβ１：３１．８±１．４、ｙＴ細胞４４．４１±４．２、ｐ＜０．０００５）α５β１インテグリン発現と同等であった。次いで、処理した細胞を、実施例１で行った抗ＣＥＡ  ＣＡＲ−Ｔ構築物を含むレトロウイルスで形質導入し、形質導入効率をＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦβ１処理ｇＣＡＲ−Ｔ細胞で増加させた（ｙＣＡＲ−Ｔ３６．９±４．３、ｇＣＡＲ−Ｔ２９．９±１．０、ｇＣＡＲ−Ｔ＋Ｍ−ＣＳＦ４１．４±１．０、ｇＣＡＲ−Ｔ±ＴＧＦβ１４０．１±２．０、ｐ＜０．００２対ｇＣＡＲ−Ｔ（図７Ｃ）。
【００４５】
次いで、処理したｇＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍細胞傷害活性を実施例２と同様に評価した。ＩＬ２（図８Ａ）またはＩＬ１５（図８Ｂ）のいずれかで処理したｙＣＡＲ−Ｔ細胞およびｇＣＡＲ−Ｔ細胞とＭＣ３８ＣＥＡ＋細胞をインキュベートすることによって、細胞毒性アッセイを行った。ｙＣＡＲ−ＴおよびｇＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞は、標的とエフェクター細胞の比が１：１、１：１０および１：２０のＭＣ３８ＣＥＡ＋標的細胞とそれらをインキュベートすることによって評価した。ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＥＡ特異性を示す陰性対照としてＭＣ３８ＣＥＡ細胞を用いて対照実験も行った。データの分析後、結果は、ＩＬ２およびＩＬ１５処理細胞の両方について、ｇＣＡＲ−Ｔ細胞のＭ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１による処理が、細胞毒性に関してｇＣＡＲ−Ｔ細胞を救援したようであることを示した。具体的には、いずれかのＭ−ＣＳＦで処理したｇＣＡＲ−Ｔ細胞（図８Ａ、結果は平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．００５、対  非処理ｇＣＡＲ−Ｔ細胞）、またはＴＧＦβ１（図８Ｂ、結果は平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０００５、対  非処理ｇＣＡＲ−Ｔ細胞）、Ｍ−ＣＳＦまたはＴＧＦβ１のいずれかで未処置のｇＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して有意に増加した細胞傷害活性を有した。
【００４６】
いくつかの例示的な態様および実施形態が上記で議論されてきたが、当業者は、それらの特定の変更、置換、追加およびこれらのサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および今後導入される特許請求の範囲は、その真の精神および範囲内にあるそのようなすべての変更、置換、追加およびサブコンビネーションを含むと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
2019500881.tif 000002
【図１Ｂ】
2019500881.tif 000003
【図２Ａ】
2019500881.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2019500881.tif 000010
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2019500881.tif 000015
【図７Ａ】
2019500881.tif 000016
【図７Ｂ】
2019500881.tif 000017
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2019500881.tif 000019
【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
2019500881.tif 000021
2019500881.tif 000022