(57)【要約】  本発明は、重症熱性血小板減少症候群（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＦＴＳ）の病原体である重症熱性血小板減少症候群ウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ、ＳＦＴＳＶ）を効果的に検出または診断し、ＳＦＴＳを治療するために使用されるＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症熱性血小板減少症候群ウイルス（ＳＦＴＳＶ）の外膜糖タンパク質ＧｃまたはＧｎに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号２１、２２、２３、２４及び２５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１、４２、４３、４４及び４５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６１、６２、６３、６４及び６５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号２６、２７、２８、２９及び３０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６、４７、４８、４９及び５０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、並びに配列番号６６、６７、６８、６９及び７０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、配列番号１、２、３、４及び５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号６、７、８、９及び１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含み、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、配列番号１、２、３、４及び５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖、並びに配列番号６、７、８、９及び１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖を含み、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４及び１０５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２１、１２２、１２３、１２４及び１２５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１０６、１０７、１０８、１０９及び１１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１２６、１２７、１２８、１２９及び１３０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、並びに配列番号１４６、１４７、１４８、１４９及び１５０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、配列番号８１、８２、８３、８４及び８５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号８６、８７、８８、８９及び９０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含み、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、配列番号８１、８２、８３、８４及び８５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列を含む軽鎖、並びに配列番号８６、８７、８８、８９及び９０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列を含む重鎖を含み、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１、２、３、４及び５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列、並びに配列番号６、７、８、９及び１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９】
配列番号８１、８２、８３、８４及び８５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列、並びに配列番号８６、８７、８８、８９及び９０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に９５％以上の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の核酸、またはこれら両方を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体を含むＳＦＴＳＶ診断または検出用組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体を含むＳＦＴＳＶ診断または検出用キット。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を用いてＳＦＴＳＶを診断または検出する方法。
【請求項１５】
前記方法は、請求項１に記載の抗体及び磁石ビーズが結合された複合体を用いることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の抗体を用いてＳＦＴＳを予防または治療する方法。
【請求項１８】
ＳＦＴＳＶの診断、予防または治療のための請求項１に記載の抗体の用途。
【請求項１９】
ＳＦＴＳＶ診断用組成物の製造のための請求項１に記載の抗体の用途。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、重症熱性血小板減少症候群（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＦＴＳ）の病原体である重症熱性血小板減少症候群ウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ、ＳＦＴＳＶ）を検出または診断し、ＳＦＴＳを治療するために使用されるＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。
【０００２】
本出願は、２０１６年３月２３日出願の韓国特許出願第１０−２０１６−００３４７２７号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
【０００３】
〔背景技術〕
重症熱性血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）は新種のダニ媒介感染病疾患であり、主にフタトゲチマダニ（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ  ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ）またはタカサゴキララマダニ（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ  ｔｅｓｔｕｄｉｎａｒｉｕｍ）類によって媒介される重症熱性血小板減少症候群ウイルス（ＳＦＴＳＶ）によって発生する。２００９年中国でＳＦＴＳが最初報告され、２０１２年日本及び韓国でも疾患及びウイルスが報告されている。ＳＦＴＳの主な症状は発熱、腹痛、吐逆、嘔吐、血小板減少症または白血球減少症などであり、重度の場合、多発性臓器不全が発生して死亡に至ることもある。ＳＦＴＳは、中国、日本または韓国で毎年発生しているが、致死率が非常に高く、春から夏までの期間に主に発生する。ＳＦＴＳＶの野生宿主としてはセスジネズミが有力であり、中国の主要発病地ではヤギ、牛、犬またはニワトリなどの家畜から血清抗体が高い比率で発見されたことから、家畜が宿主の役割をする可能性もあると推定される。感染者の体液を媒介にしたヒト−ヒト感染が報告されているが、ＳＦＴＳを効果的に治療できると証明された治療剤または予防法は未だない。
【０００４】
ＳＦＴＳ感染如何を確認するため、血液内の抗ＳＦＴＳＶ抗体価を確認する方法がある。このとき、抗ＳＦＴＳＶ抗体価は主にＳＦＴＳＶのＮタンパク質に対する抗体で測定する。前記抗体はＳＦＴＳＶが死滅したときに露出するＳＦＴＳＶ内部タンパク質に対する抗体である。したがって、従来の抗ＳＦＴＳＶ抗体価の確認を通じた診断は、生きて活発に活動するウイルスの存在を正確に把握できないという限界を有する。ＳＦＴＳを診断する他の方法であるＳＦＴＳＶのＲＮＡ配列をヒト由来検体で検出する方法は、高い正確度を有すると知られているが、検体から良質のウイルスＲＮＡを分離し難いという問題がある。
【０００５】
一方、国際公開ＷＯ２０１５／０５３４５５Ａ１公報に、ＳＦＴＳＶに対する抗体の検出方法が開示されているが、具体的に抗体がＳＦＴＳＶのどの抗原に結合するか及びこのような抗体の中和活性については全く開示されていない。
【０００６】
したがって、従来の死滅した状態のＳＦＴＳＶタンパク質量を測定する酵素免疫反応診断方法の不正確なウイルス力価測定方法、または従来の血液内の低純度のウイルスＲＮＡ分離方法の限界を克服して、ＳＦＴＳＶを効果的に検出、分離または精製できる抗体または方法の開発が求められている実情である。
【０００７】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、ＳＦＴＳＶを効果的に検出または診断してＳＦＴＳを治療できる抗体を提供することを目的とする。また、本発明は、ＳＦＴＳＶ、特にＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に特異的に結合する抗体を提供することを他の目的とする。
【０００８】
〔課題を解決するための手段〕
上記の課題を達成するため、本発明は、ＳＦＴＳＶ、特にその外膜糖タンパク質に特異的に結合する新規な抗体を提供する。また、本発明は、前記抗体を使用してＳＦＴＳＶを効果的に検出、分離または精製する方法を提供する。また、本発明は、前記抗体を使用してＳＦＴＳを効果的に予防または治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明者らは従来のＳＦＴＳＶ診断方法の限界を克服するため、鋭意研究に努めた結果、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質、特にＧｃまたはＧｎに特異的に結合する新規な抗体を見つけ、それを用いてＳＦＴＳＶを効果的に検出できることを見出して本発明の完成に至った。
【００１０】
ＳＦＴＳＶはマイナス一本鎖ＲＮＡウイルスであって、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）とフレボウイルス（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）属に属する。前記ウイルスは直径８０〜１００ｎｍの球状ウイルスであり、フタトゲチマダニを媒介体にする。前記ウイルスの遺伝体はｌａｒｇｅ（Ｌ）、Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍ）及びｓｍａｌｌ（Ｓ）セグメントから構成され、これらはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、糖タンパク質前駆体（Ｍ）、糖タンパク質Ｎ（Ｇｎ）、糖タンパク質Ｃ（Ｇｃ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）及び非構造タンパク質（ＮＳｓ）の６つのタンパク質をコーディングする。
【００１１】
本発明において、「抗体」は完全な抗体、及びその任意の抗原結合部分または一本鎖を含むことができる。天然発生「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された、少なくとも２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とに細分化される。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、これらはアミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００１２】
本発明は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質、特にＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質ＧｃまたはＧｎに特異的に結合する抗体を提供する。望ましくは、前記抗体は下記のような特定のアミノ酸配列を含むか、又は、それからなり得る。また、重鎖と軽鎖の定常領域で自明な一部変形の場合、同一または類似の結合特異性を有する範囲で本発明の範疇に含まれる。また、それぞれのこれら抗体はＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に結合できるため、ＶＨ、ＶＬ、全長軽鎖及び全長重鎖配列（アミノ酸配列及び前記アミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列）は混合及びマッチングされて本発明の他のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質結合抗体を産生することができる。
【００１３】
一実施例において、本発明のＧｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体クローン（Ａｂ１〜５）のアミノ酸配列を下記表１〜８に示した。
【００１４】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列
【００１５】
【表１】
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【００１６】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域１（ＬＦＲ１またはＨＦＲ１）のアミノ酸配列
【００１７】
【表２】
2019516348.tif 000004
【００１８】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１またはＨＣＤＲ１）のアミノ酸配列
【００１９】
【表３】
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【００２０】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域２（ＬＦＲ２またはＨＦＲ２）のアミノ酸配列
【００２１】
【表４】
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【００２２】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２またはＨＣＤＲ２）のアミノ酸配列
【００２３】
【表５】
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【００２４】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域３（ＬＦＲ３またはＨＦＲ３）のアミノ酸配列
【００２５】
【表６】
2019516348.tif 000008
【００２６】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３またはＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列
【００２７】
【表７】
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【００２８】
Ｇｃ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域４（ＬＦＲ４またはＨＦＲ４）のアミノ酸配列
【００２９】
【表８】
2019516348.tif 000010
【００３０】
一実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する抗体は、配列番号１、２、３、４及び５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号６、７、８、９及び１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含むことができる。このような特定の配列からなる抗体は、外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的且つ効果的に結合することができ、ＳＦＴＳＶの検出に非常に有用に使用できる。
【００３１】
他の実施形態において、望ましくは、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、並びに配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体として提供できる。
【００３２】
さらに他の実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する抗体は、配列番号２１、２２、２３、２４及び２５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１、４２、４３、４４及び４５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６１、６２、６３、６４及び６５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号２６、２７、２８、２９及び３０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６、４７、４８、４９及び５０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、並びに配列番号６６、６７、６８、６９及び７０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含むことができる。
【００３３】
さらに他の実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに特異的に結合する抗体は、配列番号２１の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４１の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６１の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号２６の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号４６の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号６６の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；配列番号２２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４２の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６２の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号２７の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号４７の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号６７の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；配列番号２３の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４３の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６３の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号２８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号４８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号６８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；配列番号２４の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４４の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６４の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号２９の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号４９の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号６９の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；または配列番号２５の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号４５の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号６５の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号３０の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号５０の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号７０の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体として提供できる。
【００３４】
一実施例において、本発明のＧｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体クローン（Ａｂ６〜１０）のアミノ酸配列を下記表９〜１６に示した。
【００３５】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列
【００３６】
【表９】
2019516348.tif 000011
【００３７】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域１（ＬＦＲ１またはＨＦＲ１）のアミノ酸配列
【００３８】
【表１０】
2019516348.tif 000012
【００３９】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１またはＨＣＤＲ１）のアミノ酸配列
【００４０】
【表１１】
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【００４１】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域２（ＬＦＲ２またはＨＦＲ２）のアミノ酸配列
【００４２】
【表１２】
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【００４３】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖の相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２またはＨＣＤＲ２）のアミノ酸配列
【００４４】
【表１３】
2019516348.tif 000015
【００４５】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域３（ＬＦＲ３またはＨＦＲ３）のアミノ酸配列
【００４６】
【表１４】
2019516348.tif 000016
【００４７】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖の相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３またはＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列
【００４８】
【表１５】
2019516348.tif 000017
【００４９】
Ｇｎ外膜糖タンパク質に結合する抗体の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域４（ＬＦＲ４またはＨＦＲ４）のアミノ酸配列
【００５０】
【表１６】
2019516348.tif 000018
【００５１】
一実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する抗体は、配列番号８１、８２、８３、８４及び８５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号８６、８７、８８、８９及び９０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含むことができる。このような特定の配列からなる抗体は、外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的且つ効果的に結合することができ、ＳＦＴＳＶの検出に非常に有用に使用できる。
【００５２】
他の実施形態において、望ましくは、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する抗体は、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、配列番号８４のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体、並びに配列番号８５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体として提供できる。
【００５３】
さらに他の実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する抗体は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４及び１０５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２１、１２２、１２３、１２４及び１２５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４及び１４５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１０６、１０７、１０８、１０９及び１１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１２６、１２７、１２８、１２９及び１３０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、並びに配列番号１４６、１４７、１４８、１４９及び１５０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含むことができる。
【００５４】
さらに他の実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｎに特異的に結合する抗体は、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２１の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４１の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１０６の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１２６の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１４６の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；配列番号１０２の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２２の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４２の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１０７の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１２７の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１４７の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；配列番号１０３の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２３の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４３の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１０８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１２８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１４８の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；配列番号１０４の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２４の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４４の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１０９の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１２９の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１４９の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体；または配列番号１０５の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号１２５の軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、配列番号１４５の軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）、配列番号１１０の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１３０の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ２）、及び配列番号１５０の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ３）を含む抗体として提供できる。
【００５５】
一実施形態において、本発明の抗体は、上述した抗体を含めて、上記表１または表９に示された重鎖及び軽鎖を含む抗体と相同性のあるアミノ酸を含む抗体を含むことができる。また、本発明の抗体は、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、並びにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、これらＣＤＲ配列のうち１つ以上は本明細書に記載された抗体またはその保存的変形に基づいた特定アミノ酸配列を有し得る。また、本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質ＧｃまたはＧｎ結合抗体の機能的特性を有する抗体であり得、表１または表９に示された重鎖及び軽鎖を含む抗体と同じエピトープに結合する抗体であり得る。また、本発明の抗体は、変形された抗体を操作するための出発物質として本明細書に記載された１種以上の軽鎖または抗体配列を有する抗体を使用して製造され、出発抗体から一部変更された特性を有する抗体を全て含むことができる。
【００５６】
本発明において、前記抗体は、抗体の特性を改善するために軽鎖または重鎖内のフレームワーク領域が変形されたものを含むことができる。また、前記抗体は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に対し、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１×１０８Ｍ−１、１×１０９Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１または１×１０１１Ｍ−１の親和定数（ＫＡ）を有し得る。
【００５７】
また、本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体であり得る。これはキメラ抗体などと比べると、ヒト対象体に投与したとき、より減少した抗原性を有し得る。ヒト抗体は、抗体の可変領域または全長鎖をヒト胚線（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）兔疫グロブリン遺伝子を使用したシステムから収得した場合、特定胚線配列の産生物であるか、若しくは、それから誘導された重鎖可変領域、軽鎖可変領域、全長重鎖または全長軽鎖を含むことができる。また、本発明の抗体は、抗原性を有する非免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体であり得る。
【００５８】
また、本発明において、抗体は二重特異的または多重特異的抗体であり得る。本発明の抗体またはその抗原−結合断片は、２つ以上の相異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子であり得る。
【００５９】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に特異的に結合する単一クローン抗体であり得る。例えば、本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に特異的に結合するヒトまたはヒト化単一クローン抗体、若しくは、キメラ抗体であり得、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含むことができる。また、本発明の抗体は、一本鎖抗体であり得、Ｆａｂ断片であり得、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）であり得、ＩｇＧアイソタイプであり得るが、ｓｃＦｖであることが望ましい。
【００６０】
本発明において、単一クローン抗体は通常の単一クローン抗体方法によって産生でき、合成された抗体遺伝子を抗体発現用ベクター、望ましくはｐｃＤＮＡ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶまたはｐＣＥＰ４などに挿入して発現及び精製することができる。また、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を用いることができ、マウスシステムを用いて製造されたマウス単一クローン抗体の配列に基づいて製造することができる。例えば、標準分子生物学技術を用いて、重鎖及び軽鎖兔疫グロブリンをコーディングするＤＮＡをマウスハイブリドーマから得て、それと共に非マウス兔疫グロブリン配列を含むようにすることができる。
【００６１】
一実施形態において、本発明は、アミノ酸がそれぞれのヒトＶＨまたはＶＬ胚線配列からの抗体フレームワークに置換されたフレームワークを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６２】
他の実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３、４及び５からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖を含むポリペプチド、並びに配列番号６、７、８、９及び１０からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖を含むポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。一具現例において、前記核酸は、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９及び１７０からなる群より選択されたいずれか１つの核酸配列であり得、これを下記表１７に示した（表において、太字で示した部分は軽鎖可変領域（ＶＬ）であり、下線で示した部分は重鎖可変領域（ＶＨ）である）。
【００６３】
【表１７】
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2019516348.tif 000020
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【００６４】
さらに他の実施形態において、本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に対する抗体特異性が維持される範囲内で、上記表１〜表１６に示されたアミノ酸配列のうちいずれか１つと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、本発明の前記抗体を発現可能な核酸は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に対する抗体特異性が維持される範囲内で、上記表１７に示された核酸配列のうちいずれか１つと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むことができる。
【００６５】
また、本発明は、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、前記ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質Ｇｃに結合する抗体のアミノ酸配列をコーディングする核酸、またはＧｎに結合する抗体のアミノ酸をコーディングする核酸を含むことができる。または、本発明のベクターは、上記の２種の核酸を全て含むことで、二重特異的抗体を発現することができる。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、（１）本発明の抗体の重鎖をコーディングする第１組換えＤＮＡ切片、及び（２）本発明の抗体の軽鎖をコーディングする第２組換えＤＮＡ切片を含む宿主細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖それぞれをコーディングする組換えＤＮＡ切片を含む宿主細胞を提供する。一部実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト単一クローン抗体またはその抗原結合断片である。
【００６７】
本発明のＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質結合抗体をコーディングするポリヌクレオチドを発現させるため、多様な発現ベクターを使用することができる。哺乳動物宿主細胞から抗体を産生するため、ウイルス由来及び／または非ウイルス発現ベクターを使用できる。例えば、ｐｃＤＮＡ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶまたはｐＣＥＰ４などのベクターと、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣＨＯ−ＤＧ４４などの宿主細胞を使用することができる。
【００６８】
本発明の抗体を保有して発現する宿主細胞は、原核または真核細胞であり得る。例えば、前記宿主細胞はＥ．Ｃｏｌｉ、望ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８．ＨＢ２１５１、ＢＬ２１などであり得、これらは本発明のポリヌクレオチドをクローニングして発現させるのに有用であり得る。また、他の微生物宿主として、バチルス、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、または他の腸内細菌、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、若しくは多様なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を使用できる。本発明の抗体を発現させるため、他の微生物、例えば酵母を使用でき、バキュロウイルスベクターと結合された昆虫細胞も使用できる。
【００６９】
望ましい一実施形態において、本発明のＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質結合ポリペプチドを発現させて製造するとき、哺乳動物宿主細胞を使用することができる。例えば、内因性兔疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株または外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株が挙げられる。また、任意の動物またはヒト細胞であって、例えば、ＣＨＯ細胞株、Ｃｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、ＨＥＫ細胞株、形質転換されたＢ−細胞及びハイブリドーマを含む。また、兔疫グロブリンを分泌可能な多くの好適な宿主細胞株を使用でき、望ましくはＨＥＫ２９３、ＣＨＯまたはＣＨＯ−ＤＧ４４を使用することができる。
【００７０】
また、本発明は、本発明の１種以上のＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質結合分子（例えば、ＧｃまたはＧｎ結合抗体またはその抗原結合断片）を含むＳＦＴＳＶ診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物は、ＳＦＴＳＶの検出、分離または精製に有用に使用することができる。また、前記組成物は、ＳＦＴＳＶの診断に適した１種以上の他の製剤をさらに含むことができる。また、本発明は、本発明の抗体を使用してＳＦＴＳＶを診断する方法を提供する。前記方法は、ＳＦＴＳＶの定量的／定性的検出または診断に使用することができる。具体的に、前記診断方法は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞または組織）から、若しくは、ＳＦＴＳが発生したか又は発生する危険のある対象から、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質及び／または核酸発現及びＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質機能を決定する診断検定を含むことができる。本発明において、検出は定量及び／または定性分析を含み、存在／不存在の検出及びウイルス量（ｔｉｔｅｒ）の検出を含むものである。このような方法は当業界で公知であり、当業者であれば本願の実施のために適切な方法を選択することができる。
【００７１】
本発明において、ＳＦＴＳＶの検出または診断は、抗原−抗体の複合体を検出する放射免疫分析、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）または免疫蛍光分析などを通じて行うことができる。本発明において、抗原は放射能物質、酵素または蛍光物質などで標識することができる。
【００７２】
一態様において、本発明の診断方法は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に対する抗体を磁石ビーズに結合させた複合体を用いることができる。具体的に、前記方法は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質ＧｃまたはＧｎに特異的な抗体を磁石ビーズに結合させた複合体を用いて、ＳＦＴＳＶをより効果的に検出、分離または精製することができる。前記ＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質に対する抗体−磁石ビーズ複合体は、抗体の特性を用いて検体内に存在するＳＦＴＳＶと結合するようになり、このとき磁力で磁石ビーズを引っ張れば、ウイルスと検体内の他の物質とを分離してウイルスを効果的に精製することができる。このようにして精製されたウイルスは不純物が除去されて、相対的にＲＮＡ分離が容易であり、それによって良質の精製結果データが得られる。また、磁石ビーズに吸着している状態のウイルスに他の抗体を用いた免疫化学反応をさらに行うことができ、それによって検体内に存在するＳＦＴＳＶを迅速に確認することができる。図４にこのような診断方法を概略的に示した。
【００７３】
また、本発明は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質に結合する抗体を含むＳＦＴＳＶ診断用キットを提供する。前記キットは、上述した抗体のいずれか１つ以上及び抗原−抗体複合体検出用試薬を含むことができる。前記抗原−抗体複合体検出用試薬は、放射免疫分析、ＥＬＩＳＡまたは免疫蛍光分析などで使用される試薬であり得る。
【００７４】
例えば、前記免疫反応を検出するため、検出試薬は直接的またはサンドイッチ方式で間接的に標識することができる。直接的標識方法の場合、アレイなどに使用される血清試料はＣｙ３またはＣｙ５のような蛍光標識で標識される。サンドイッチ方式の場合、標識されていない血清試料を先に検出試薬が付着されたアレイと反応させて結合させた後、標的タンパク質を標識された検出抗体と結合させて検出する。サンドイッチ方式の場合、敏感度と特異性を高めることができ、ｐｇ／ｍＬレベルまで検出可能である。その外に、放射能物質、発色物質、磁性粒子または高密度電子粒子などを標識物質として使用することができる。蛍光光度計は走査型共焦点顕微鏡を使用でき、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．またはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃなどから入手できる。
【００７５】
本発明のキットは、結合分析に必要な１つ以上の付加成分をさらに含むことができ、例えば結合バッファー、試料準備に必要な試薬、血液採取用注射器または陰性及び／または陽性対照群をさらに含むことができる。このような多様な検出試薬を含むことができる本願のキットは、分析形態によってＥＬＩＳＡ分析用、ディップスティックラピッドキット（ｄｉｐ  ｓｔｉｃｋ  ｒａｐｉｄ  ｋｉｔ）分析用、マイクロアレイ用、遺伝子増幅用、または免疫分析用などで提供され、分析形態に合わせて適切な検出試薬を選別することができる。
【００７６】
また、本発明は、本発明のＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質に結合する抗体を含む薬学的組成物を提供する。望ましくは、前記薬学的組成物は、ＳＦＴＳの予防用または治療用で使用可能である。本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶを中和してウイルスの増殖を遮断することで、ＳＦＴＳを効果的に予防または治療することができる。
【００７７】
本発明において、前記組成物は、ＳＦＴＳＶ関連疾患の治療または予防に適した１種以上の他の製剤をさらに含むことができる。薬学的組成物に使用可能な担体は組成物の効果を向上させるか、組成物を安定化させるか、または組成物の製造を容易にすることができる。薬学的に許容される担体は、生理的に許容可能な溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、等張化剤または吸収遅延剤などを含むことができる。
【００７８】
本発明において、前記薬学的組成物は当業界で公知の多様な方法で投与でき、投与経路及び／または方式は所望の結果によって変わり得る。前記薬学的組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、腹膜内または皮下注射などの投与方式で投与することができる。投与経路によっては、活性化合物である抗体を酸の作用及び化合物を不活性化する他の自然条件から保護する物質でコーティングすることができる。
【００７９】
本発明において、前記薬学的組成物は滅菌した流体であり得る。流体組成物の適当な流動性を維持するため、例えばレシチンのようなコーティング剤または界面活性剤などを使用できる。また、前記薬学的組成物は、等張化剤（例えば、糖、ポリアルコール、マンニトール、ソルビトール及び塩化ナトリウムなど）または吸収遅延剤（アルミニウムモノステアレートまたはゼラチンなど）を含むことができる。
【００８０】
本発明において、前記薬学的組成物は、当業界で公知の通常実施される方法で製造でき、望ましくはＧＭＰ条件下で製造することができる。前記薬学的組成物は、ＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質結合抗体の治療有効用量または効能用量を含むことができる。また、前記薬学的組成物のうち活性成分の投与量レベルは、患者に毒性を示さず、目的とする治療効果を達成するのに十分な量であり得る。
【００８１】
本発明において、治療投与量は安全性及び効能が最適化されるように滴定することができる。本発明の抗体を全身投与する場合、投与量範囲は宿主体重１ｋｇ当り約０．０００１〜１００ｍｇ、より一般的は０．０１〜１５ｍｇの範囲であり得る。例示的な治療法は、２週に１回、または１ヶ月に１回、または３ヶ月〜６ヶ月毎に１回の全身投与を伴う。全身投与の一方法において、投与量は１〜１０００μｇ／ｍＬ、一部方法では２５〜５００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度に達するように調整できる。または、頻度を減らして投与することが求められる場合は、徐放製剤を通じて抗体を投与することができる。投与量及び頻度は患者の抗体半減期によって変わり得る。予防的用途では、相対的に少ない投与量を長期にわたって相対的に間隔を空けて投与することができる。
【００８２】
また、本発明は、前記薬学的組成物を使用してＳＦＴＳを予防または治療する方法を提供する。前記予防または治療方法は、本発明の抗体を含む組成物の治療学的に有効な量の投与を含むことができる。「治療学的に有効な量」とは、ＳＦＴＳ疾患の予防または治療に有効な本発明の抗体またはこれを含む組成物の量を意味する。
【００８３】
また、本発明は、ＳＦＴＳＶ診断用組成物を製造するためのＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質結合抗体の用途を提供する。前記診断用組成物を製造するため、本発明の抗体またはそれを含む組成物は許容される担体などの追加成分を含むことができる。
【００８４】
また、本発明は、ＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質結合抗体の用途を提供する。ＳＦＴＳＶに特異的に結合する本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶ診断用で使用でき、ＳＦＴＳ疾患が発生したか又は発生する危険のある対象から、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質及び／または核酸発現、及び前記タンパク質の機能を決定する診断用途で使用できる。また、本発明の抗体は、ＳＦＴＳが発生する危険があるか又は発生した対象に、ＳＦＴＳＶによって発病するＳＦＴＳの予防または治療用途で使用できる。
【００８５】
〔発明の効果〕
本発明の抗体は、ＳＦＴＳＶの外膜糖タンパク質ＧｃまたはＧｎに特異的に結合可能であるため、本発明の抗体を使用することでＳＦＴＳＶを効果的に検出または診断でき、ＳＦＴＳを治療することができる。
【００８６】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕抗体クローンＡｂ１〜Ａｂ１０のアミノ酸配列を示した図である。
【００８７】
〔図２〕ＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質Ｇｃ及びＧｎに対し、精製されたｓｃＦｖ切片抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示した図である。これらデータは３回反復サンプルの平均±Ｓ．Ｄを示す。
【００８８】
〔図３〕ＳＦＴＳＶ感染の免疫蛍光分析結果（Ａ）、及び蛍光強度測定結果（Ｂ）である。免疫蛍光分析結果から、ＳＦＴＳＶ感染されたＶｅｒｏ細胞がＧｎに対する抗体と反応することが見られ、Ａｂ１０は投与量依存的にウイルス感染を抑制することが見られた。Ａｂ１０はＭＡｂ４−５に比べてウイルス侵入に対する抑制能力が著しく優れた。
【００８９】
〔図４〕抗体−磁石ビーズ複合体を用いてＳＦＴＳＶを検出する方法を概略的に示した図である。
【００９０】
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明の理解を助けるために実施例などを挙げて詳しく説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形でき、本発明の範囲が後述される実施例によって限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００９１】
実施例１：細胞の準備
アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏ細胞を韓国細胞株銀行から購入し、２％熱不活性化されたウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ））−１６４０培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で５％二酸化炭素雰囲気、３７℃で培養した。
【００９２】
実施例２：ウイルス菌株の準備
本実験で使用されたＳＦＴＳウイルスは、ソウル大学病院に入院して２０１２年に死亡した６３歳女性患者の血清サンプルから分離したＫＦ３５８６９１である［Ｋｉｍ  ＫＨ、Ｙｉ  Ｊ、Ｋｉｍ  Ｇ、Ｃｈｏｉ  ＳＪ、Ｊｕｎ  ＫＩ、Ｋｉｍ  ＮＨ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ、２０１２．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３；１９（１１）：１８９２−４．］。分離したウイルスをＶｅｒｏ細胞の単一層に接種して５％二酸化炭素雰囲気、３７℃で培養した。ウイルスをＶｅｒｏ細胞で増殖させ、すべての実験はウイルス培養第三継代数（ｖｉｒａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）で行われた。Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法を用いてＶｅｒｏ細胞で５０％組織培養物感染投与量（ＴＣＩＤ５０）を滴定した。
【００９３】
実施例３：組換えＳＦＴＳウイルス糖タンパク質及び単鎖可変切片抗体融合タンパク質の準備
本実験で使用されたＳＦＴＳウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列は既に報告されている［Ｋｉｍ  ＫＨ、Ｙｉ  Ｊ、Ｋｉｍ  Ｇ、Ｃｈｏｉ  ＳＪ、Ｊｕｎ  ＫＩ、Ｋｉｍ  ＮＨ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｖｅｒｅ  ｆｅｖｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ、２０１２．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２０１３；１９（１１）：１８９２−４．］。ＳＦＴＳウイルス糖タンパク質をコーディングするＤＮＡ鎖を得るため、配列番号１７１のＳＦＴＳウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＧＴ９８５０６、Ｇｎ糖タンパク質に対してアミノ酸２０−４５２、Ｇｃ糖タンパク質に対してアミノ酸５６３−１０３５）に相応するヒトコドン最適化されたＤＮＡ配列を合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。
【００９４】
ヒト兔疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃ領域（Ｇｃ−Ｆｃ、Ｇｎ−Ｆｃ）又はヒトＩｇｋ−鎖定常領域（Ｇｃ−Ｃｋ、Ｇｎ−Ｃｋ）に融合した組換えＳＦＴＳウイルス糖タンパク質Ｇｃ及びＧｎを過剰発現させるため、ＳＦＴＳ糖タンパク質コーディング遺伝子を［Ｐａｒｋ  Ｓ、Ｌｅｅ  ＤＨ、Ｐａｒｋ  ＪＧ、Ｌｅｅ  ＹＴ、Ｃｈｕｎｇ  Ｊ．Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｃｏｔｉｎｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｓｍｏｋｅｒｓ．Ｃｌｉｎｉｃａ  ｃｈｉｍｉｃａ  ａｃｔａ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１０；４１１（１７−１８）：１２３８−４２．］、［Ｌｅｅ  Ｙ、Ｋｉｍ  Ｈ、Ｃｈｕｎｇ  Ｊ．Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｌｙ６３−Ｌｙｓ６８  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＆  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；４６：ｅ１１４．］に開示された方法によって準備した。
【００９５】
まず、ヒト骨髄由来のｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から２種のプライマー（５’−ＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’）及び（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧ−３’）を用いて、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を増幅させて得たＤＮＡ配列または合成されたヒトＩｇｋ−鎖の定常領域（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４．１）を、追加される遺伝子配列のＤＮＡ３’側に位置するように変形した。追加される遺伝子配列はＳｆｉＩ制限酵素を通じて遺伝子追加可能に変形されたｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００９６】
抗体クローンは、各クローンのｓｃＦｖコーディングＤＮＡを使用して単鎖可変切片−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域融合タンパク質（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の形態で生産された。その後、前記ベクターをポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質注入させ、形質注入された細胞を１００Ｕ／Ｌペニシリン−ストレプトマイシンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３発現培地に培養した。過剰発現された組換えＳＦＴＳウイルス糖タンパク質融合タンパク質を、タンパク質Ａ／ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム及びＡＫＴＡピュアークロマトグラフィーシステムを使用した親和性クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じて精製した。
【００９７】
実施例４：抗体ライブラリ構成及びバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＦＴＳから回復した患者の末梢血単核細胞を収集した。全体ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して分離し、オリゴ（ｄＴ）プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）と共に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全体ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを使用して、ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクター使用してヒト単鎖可変切片（ｓｃＦｖ）抗体のファージディスプレイライブラリを製作した。そして［Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ、Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ、Ｓｃｏｔｔ  ＪＫ、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＧＪ．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ：ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ；２００４．］に記載されたように、ライブラリからｓｃＦｖクローンを選択するために４ラウンドのバイオパニングを行った。バイオパニングの各ラウンド毎に、組換えＳＦＴＳウイルス糖タンパク質ＧｃまたはＧｎヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域融合タンパク質（Ｇｃ−Ｆｃ、Ｇｎ−Ｆｃ）３μｇを、メーカーの指示に従って５×１０６個の磁気性ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ−２７０エポキシビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のコーティングに使用した。そして、タンパク質と結合されたビーズはバイオパニング手順で使用した。
【００９８】
実施例５：ＳＦＴＳウイルスに対する単鎖可変切片抗体のスクリーニング
ＳＦＴＳウイルス糖タンパク質に結合する個別的な抗体クローンを選択するため、バイオパニングの最後のラウンドからファージクローンを選択し、ファージ酵素免疫分析法のためにｓｃＦｖ−ディスプレイファージを製造した。マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を一晩中４℃でウェル当り１００ｎｇの組換えＧｃ、ＧｎヒトＩｇｋ鎖定常領域融合タンパク質（Ｇｃ−Ｃｋ、Ｇｎ−Ｃｋ）でコーティングした。前記ウェルを３７℃で１時間、１００μｌのＰＢＳ内３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで遮断し、３７℃で２時間ファージを含む５０μｌの培養物上清液で培養して、１５０μｌのＰＢＳ内０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。その後、遮断バッファー（１：５０００）に希釈された５０ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合された抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間培養した。１５０μｌの０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した後、５０μｌの２，２−アジノ−ビス−３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加して室温で３０分間培養した。その後、各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して４０５ｎｍで測定した。
【００９９】
実施例６：中和分析
ＳＦＴＳウイルス特異的ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合抗体（１００μｌ／ｍｌ）を系列希釈して０．０１μｌ／ｍｌまで１０倍ずつ減少させた。各濃度のｓｃＦｖｓを１００  ＴＣＩＤ５０  ＳＦＴＳウイルス（菌株ＫＦ３５８６９１）の同じ体積に混合し、３７℃で１時間培養した。その後、前記ウイルス−抗体混合物を８−ウェル共焦点顕微鏡チャンバ内のＶｅｒｏ細胞の単一層に移し、３７℃で１時間培養した。ウイルス−抗体混合物を除去した後、サンプルを５％二酸化炭素雰囲気、３７℃で、２％ＦＢＳ及び抗生剤が含まれたＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。８−ウェル共焦点顕微鏡チャンバ内のＶｅｒｏ細胞は免疫蛍光分析（ＩＦＡ）のために使われた。すべての実験は３回行われ、相対的な中和効果は陽性対照群としてＭＡｂ４−５［Ｘｉｌｉｎｇ  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ＳＦＴＳ  ｖｉｒｕｓ、ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ、２０１３．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；２０（９）：１４２６−３２）．］及び陰性対照群として抗ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）抗体と比べてそれぞれ測定した。
【０１００】
実施例７：免疫蛍光分析（ＩＦＡ）及び蛍光強度測定
相対的な中和効果は免疫蛍光分析（ＩＦＡ）を使用して測定した。Ａｂ１０、ＭＡｂ４−５（陽性対照群）、抗ＮＤＶ（陰性対照群）があるか又はないウイルス−抗体混合物で処理されたか又は処理されていない細胞を２日間培養した。前記細胞を室温で１時間リン酸塩バッファー食塩水（ＰＢＳ）で４％パラホルムアルデヒドで固定させた。スライドを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内の０．１％トリトンＸ−１００で遮断及び透過させた後、一晩中４℃で抗ＳＦＴＳウイルス糖タンパク質ＧｎクローンＡｂ６抗体（５μｌ／ｍｌ）とともに培養した。細胞を洗浄してフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合された抗ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）で室温で１時間培養した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）は核を染色するのに使用した。サンプルを共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）で実験した。蛍光信号強度はコンピューター補助Ｌｅｉｃａ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｕｉｔｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＬＡＳ  ＡＦ）を使用して測定した。顕微鏡写真は×１０／０．３レンズを使用して各スライドの５ヶ所領域で撮影し、分析のために３つの中間値を使用した。４０５ｎｍ青色ダイオードレーザーでＤＡＰＩ信号を設定し、アルゴンイオンレーザーでＡｌｅｘａ  ４８８を調整した。
【０１０１】
実施例８：ＳＦＴＳウイルスに対するｓｃＦｖ抗体の産生
ヒトｓｃＦｖライブラリを組換えＳＦＴＳウイルス糖タンパク質に対してバイオパニングした。４ラウンドのパニングの後、抗体クローンを酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を通じてスクリーニングした。１０個のクローン（Ｇｃに対してＡｂ１〜５及びＧｎに対してＡｂ６〜１０）がＥＬＩＳＡを通じてＳＦＴＳウイルスを認識することが示された。前記ＥＬＩＳＡ分析の結果を図２に示し、各抗体クローンのアミノ酸配列を図１に示した。
【０１０２】
実施例９：ＳＦＴＳウイルスに対する抗体の中和活性
ＳＦＴＳウイルスに対して精製されたｓｃＦｖ−ｈＦｃ抗体の中和活性は、Ｖｅｒｏ細胞で実験した。実験した１０個のクローン（Ａｂ１〜Ａｂ１０）のうち、Ａｂ１０が最も強い中和活性を見せた。Ａｂ１０  ｓｃＦｖ−ｈＦｃ抗体（１００μｌ／ｍｌ）を０．０１μｌ／ｍｌで１０倍ずつ希釈し、１００  ＴＣＩＤ５０  ＳＦＴＳウイルス（ＫＦ３５８６９１菌株）に対して滴定した。ＳＦＴＳＶ感染の免疫蛍光分析結果及び蛍光強度測定結果を図３に示した。
【０１０３】
免疫蛍光分析（ＩＦＡ）において、Ａｂ１０（１００μｌ／ｍｌ）で処理された細胞は最も少ないウイルス感染を見せ、中和活性は投与量依存的であった。すなわち、処理されるＭＡｂ  １０の量が多いほどＳＦＴＳウイルスに感染された細胞の数が少なかった。ＭＡｂ  ４〜５（陽性対照群）に比べて、Ａｂ１０は著しく高い中和活性を見せた。陰性対照群抗体は中和活性を全く見せなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】抗体クローンＡｂ１〜Ａｂ１０のアミノ酸配列を示した図である。
【図２】ＳＦＴＳＶ外膜糖タンパク質Ｇｃ及びＧｎに対し、精製されたｓｃＦｖ切片抗体のＥＬＩＳＡ分析結果を示した図である。
【図３】ＳＦＴＳＶ感染の免疫蛍光分析結果（Ａ）、及び蛍光強度測定結果（Ｂ）である。
【図４】抗体−磁石ビーズ複合体を用いてＳＦＴＳＶを検出する方法を概略的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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