(57)【要約】本発明は、医学生物学の分野に関し、ＣＴＬＡ４に対する単一ドメイン抗体及びその誘導タンパク質を開示する。特に、本発明は、ＣＴＬＡ４結合タンパク質及びその使用、とりわけＣＴＬＡ４関連疾患、例えば腫瘍を治療及び／又は予防するための使用を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４に特異的に結合することができ、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＣＴＬＡ４結合タンパク質であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、
（１）配列番号１に示されるＣＤＲ１、配列番号２に示されるＣＤＲ２、配列番号３に示されるＣＤＲ３；
（２）配列番号４に示されるＣＤＲ１、配列番号５に示されるＣＤＲ２、配列番号６に示されるＣＤＲ３；
（３）配列番号７に示されるＣＤＲ１、配列番号８に示されるＣＤＲ２、配列番号９に示されるＣＤＲ３；
（４）配列番号１０に示されるＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＣＤＲ２、配列番号１２に示されるＣＤＲ３；
（５）配列番号１３に示されるＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＣＤＲ２、配列番号１５に示されるＣＤＲ３；
（６）配列番号１６に示されるＣＤＲ１、配列番号１７に示されるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるＣＤＲ３；
（７）配列番号１９に示されるＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＣＤＲ２、配列番号２１に示されるＣＤＲ３；
（８）配列番号２２に示されるＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＣＤＲ２、配列番号２４に示されるＣＤＲ３；
（９）配列番号２５に示されるＣＤＲ１、配列番号２６に示されるＣＤＲ２、配列番号２７に示されるＣＤＲ３；
（１０）配列番号２８に示されるＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＣＤＲ２、配列番号３０に示されるＣＤＲ３；
（１１）配列番号３１に示されるＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＣＤＲ２、配列番号３３に示されるＣＤＲ３；
（１２）配列番号３４に示されるＣＤＲ１、配列番号３５に示されるＣＤＲ２、配列番号３６に示されるＣＤＲ３；
（１３）配列番号３７に示されるＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＣＤＲ２、配列番号３９に示されるＣＤＲ３；
（１４）配列番号４０に示されるＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＣＤＲ２、配列番号４２に示されるＣＤＲ３；
（１５）配列番号４３に示されるＣＤＲ１、配列番号４４に示されるＣＤＲ２、配列番号４５に示されるＣＤＲ３；
（１６）配列番号４６に示されるＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＣＤＲ２、配列番号４８に示されるＣＤＲ３；
（１７）配列番号４９に示されるＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＣＤＲ２、配列番号５１に示されるＣＤＲ３；
（１８）配列番号５２に示されるＣＤＲ１、配列番号５３に示されるＣＤＲ２、配列番号５４に示されるＣＤＲ３；
（１９）配列番号５５に示されるＣＤＲ１、配列番号５６に示されるＣＤＲ２、配列番号５７に示されるＣＤＲ３；
（２０）配列番号５８に示されるＣＤＲ１、配列番号５９に示されるＣＤＲ２、配列番号６０に示されるＣＤＲ３；
（２１）配列番号６１に示されるＣＤＲ１、配列番号６２に示されるＣＤＲ２、配列番号６３に示されるＣＤＲ３；
（２２）配列番号６４に示されるＣＤＲ１、配列番号６５に示されるＣＤＲ２、配列番号６６に示されるＣＤＲ３；
（２３）配列番号６７に示されるＣＤＲ１、配列番号６８に示されるＣＤＲ２、配列番号６９に示されるＣＤＲ３；
（２４）配列番号７０に示されるＣＤＲ１、配列番号７１に示されるＣＤＲ２、配列番号７２に示されるＣＤＲ３；及び
（２５）配列番号７３に示されるＣＤＲ１、配列番号７４に示されるＣＤＲ２、配列番号７５に示されるＣＤＲ３
から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、ＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項２】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがＶＨＨである、請求項１に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項３】
前記ＶＨＨがヒト化ＶＨＨである、請求項２に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項４】
前記ＶＨＨが、配列番号７６〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項５】
前記ＶＨＨが、配列番号７６〜１００のいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒト化ＶＨＨが、配列番号１０１〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質の親和性成熟によって得られるＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項８】
２つの前記免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項９】
免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である、請求項９に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列が、配列番号１３２に示されている、請求項１０に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号１１４〜１２８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項１３】
以下の特徴：
（ａ）１×１０−７Ｍ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ４に結合すること；
（ｂ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８０及び／又はＣＤ８６との相互作用をブロックすること；
（ｃ）ＰＢＭＣ及び／又はＴ細胞の活性化を増強すること；
（ｄ）腫瘍増殖を阻害すること
の少なくとも１つを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項１４】
１×１０−７Ｍ未満、好ましくは１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＣＴＬＡ４に結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１６】
発現調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子を含むか、又は請求項１６に記載の発現ベクターで形質転換されており、前記ＣＴＬＡ４結合タンパク質を発現することができる組換え細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれかに一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質を製造する方法であって、
ａ）ＣＴＬＡ４結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１７に記載の組換え細胞を培養するステップ；
ｂ）工程ａ）の培養物から宿主細胞によって発現されたＣＴＬＡ４結合タンパク質を回収する工程；並びに
ｃ）任意選択で、工程ｂ）から得られたＣＴＬＡ４結合タンパク質をさらに精製及び／又は修飾するステップ
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
対象におけるがんを予防及び／又は治療する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質又は請求項１９に記載の医薬組成物の有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
追加の抗腫瘍治療手段を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記追加の抗腫瘍治療手段が、化学療法、放射線療法、腫瘍特異的抗原を標的とする抗体療法、他の腫瘍免疫療法又は腫瘍標的化小分子薬を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記追加の抗腫瘍治療手段が、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ変異抗体、抗ＶＥＧＦａ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、若しくは抗ＣＭＥＴ抗体又はそれらの組み合わせを用いた抗体療法を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記がんが、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頚がん、子宮体癌、骨肉腫からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
対象における感染症を予防及び／又は治療する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質又は請求項１９に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
前記感染症が、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ジアルジア属、マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群から選択される病原体によって引き起こされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
がん又は感染症を予防及び／又は治療するための医薬の調製における、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ４結合タンパク質又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学生物学の分野に関し、ＣＴＬＡ４に対する単一ドメイン抗体及びその誘導タンパク質を開示する。特に、本発明は、ＣＴＬＡ４結合タンパク質及びその使用、とりわけＣＴＬＡ４に関連する疾患、例えば、腫瘍を治療及び／又は予防するための使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
ラクダ又はアルパカのようなラクダ科の動物は、軽鎖が天然に欠損している重鎖抗体を産生することができる。重鎖抗体の分子は、１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）並びに２つの従来のＣＨ２及びＣＨ３領域のみを含有するが、完全な抗原結合機能を有し、人工的に操作された一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）ほどに凝集は容易ではない。さらに重要なことに、組換え的に発現されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体と同等の構造的安定性及び抗原結合活性を有し、ナノボディ又は重鎖単一ドメイン抗体と呼ばれる、標的抗原に結合することができる現在公知である最小単位である。その特別な構造的性質のために、重鎖単一ドメイン抗体は、伝統的な抗体と小分子薬物の両方の利点を有し、長期開発サイクル、低い安定性、及び厳しい貯蔵条件などの伝統的な抗体の欠点を克服し、新世代の抗体療法を開発する方向性を表す。
【０００３】
腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原は、有効な免疫応答を生じさせるための基礎である。しかしながら、抗原が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合されて提示される場合、エフェクターＴ細胞の活性化を促進するために共刺激シグナルが必要とされる。研究は、多数の腫瘍が、部分的には、Ｔ細胞を完全に活性化するための補助刺激シグナルの欠如のために、及びおそらくは調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって誘導される免疫抑制のために、患者自身の免疫系を逃れることができることを示している。Ｔ細胞上のＣＤ２８への、抗原提示細胞上のＣＤ８０又はＣＤ８６の結合は、主要な共刺激シグナルである。ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）は、Ｔ細胞発現の負の調節因子であり、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対してより高い親和性を有する。これは、ＣＤ２８の共刺激シグナルをブロックし、一方、Ｔ細胞の負の調節経路を活性化する。ＣＴＬＡ４の免疫抑制効果は、自己免疫応答の制限において重要な役割を果たす。しかしながら、腫瘍免疫応答において、ＣＴＬＡ４媒介性阻害機構は、多くの場合、腫瘍細胞が免疫系から逃げることができる理由のうちの１つである。したがって、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍応答は、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用をブロックすることによって増強することができる。
【０００４】
高い親和性でＣＴＬＡ４に結合し、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０への結合をブロックすることができる、抗ＣＴＬＡ４抗体、とりわけＣＴＬＡ４に対する重鎖単一ドメイン抗体に対する必要性が当該技術分野において依然として存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ファージディスプレイ技術によるスクリーニングによって、高い特異性、高親和性及び高い安定性を有する抗ＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を得た。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＣＴＬＡ４結合タンパク質を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、ＣＴＬＡ４結合タンパク質をコードする核酸分子、並びに上記核酸分子を含有する発現ベクター及び宿主細胞に関する。
【０００８】
本発明はさらに、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【０００９】
本発明はさらに、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を製造する方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質及び医薬組成物の使用、特にＣＴＬＡ４関連疾患を予防及び／又は治療するための使用及び方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ抗原タンパク質に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体の結合曲線を示す。
【図２】図２は、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４相互作用に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体のブロッキング曲線を示す。
【図３】図３は、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４相互作用に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質のブロッキング曲線を示す。
【図４】図４は、抗体番号Ｃ２７の５つのヒト化変異体（Ａ）及び抗体番号Ｃ１の４つのヒト化変異体（Ｂ）の配列アライメントを示す。
【図５】図５は、ＣＴＬＡ４に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合曲線を示す（ＥＬＩＳＡによる）。
【図６】図６は、ＣＴＬＡ４に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合曲線を示す（ＥＬＩＳＡによる）。
【図７】図７は、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４相互作用に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質のブロッキング曲線を示す（競合ＥＬＩＳＡによる）。
【図８】図８は、ＣＴＬＡ４に対する四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合曲線を示す（競合ＥＬＩＳＡによる）。
【図９】図９は、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４相互作用に対する二価又は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質のブロッキング能を示す（細胞中和実験による）。
【図１０】フローサイトメトリーによって検出されたＣＴＬＡ４タンパク質に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合特異性。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーによって検出されたサルＣＴＬＡ４タンパク質に対する四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の結合を示す。
【図１２】図１２は、ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣの活性化を示す。
【図１３】図１３は、二価及び四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣの活性化の比較を示す。
【図１４】図１４は、ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。
【図１５】図１５は、ＣＴＬＡ４−ヒト化マウスにおけるＭＣ３８腫瘍に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ阻害効果を示す。
【図１６】図１６は、経時的なラットにおける二価及び四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の血漿濃度の変化曲線を示す。
【図１７】図１７は、ラットにおけるＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態パラメーターを示す。
【図１８】図１８は、ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の熱安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
他に指示又は定義がない限り、使用される全ての用語は、当業者には明らかである当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、標準ハンドブック、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第２版）、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０年）、及びＲｏｉｔｔら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第２版）、Ｇｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９年）、並びに本明細書において引用されている一般的な背景技術が参照される。さらに、他に指示がない限り、詳細に具体的に記載されていない全ての方法、ステップ、技術及び操作は、当業者には明らかであるように、それ自体が公知である方法で実施され得て及び実施されている。再度、例えば、標準ハンドブック、上記で言及された一般的な背景技術、及びそこに引用されているさらなる参考文献が参照される。
【００１３】
他に指示がない限り、交換可能な用語である「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書において使用されているかどうかに関わらず、重鎖抗体又は従来の４本鎖抗体を指し、一般的な用語として使用され、フルサイズの抗体、その個々の鎖、並びにそれらの全ての部分、ドメイン又は断片（限定されないが、それぞれ、ＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインなどの抗原結合ドメイン又は断片を含む）が含まれる。さらに、（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「単一可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語で）本明細書で使用される用語「配列」は、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列、並びにそれをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むことが一般的に理解されるべきである。
【００１４】
本明細書で使用される（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りとは独立してその３次構造を保持する能力を有する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインはタンパク質の別々の機能的性質を担い、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残りの機能を失うことなく、他のタンパク質に付加、除去又は転移され得る。
【００１５】
本明細書で使用される「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４本鎖抗体又は重鎖抗体の鎖など）、又はこのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、保存されたジスルフィド結合によって任意に安定化された２つのベータシートに配置された約７つの逆平行ベータ鎖の２層サンドイッチからなる抗体分子の免疫グロブリンフォールド特性を保持することを特徴とする。
【００１６】
本明細書で使用される「免疫グロブリン可変ドメイン」という用語は、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、これらは、当該技術分野において及び本明細書の以下において、それぞれ、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称する；これらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」によって中断され、これらは、当該技術分野において及び本明細書の以下において、それぞれ、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称する。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４のように示すことができる。抗原結合部位を担持することによって、抗原に対して抗体に特異性を付与するのは、免疫グロブリン可変ドメイン（複数可）である。
【００１７】
本明細書で使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、付加的な可変免疫グロブリンドメインと対になることなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味における免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、「ドメイン抗体」であり、例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨ及びＶＬ（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）などが挙げられる。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、本明細書において以下に定義されるラクダ由来の「ＶＨＨドメイン」（又は単に「ＶＨＨ」）である。
【００１８】
「ＶＨＨドメイン」は、重鎖単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、及びＶＨＨ抗体としても公知であり、「重鎖抗体」の抗原結合免疫グロブリン可変ドメイン（すなわち、「軽鎖を欠損した抗体」（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ、Ａｔａｒｈｏｕｃｈ  Ｔ、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｇ、Ｈａｍｅｒｓ  Ｃ、Ｓｏｎｇａ  ＥＢ、Ｂｅｎｄａｈｍａｎ  Ｎ、Ｈａｍｅｒｓ  Ｒ．：「Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｖｏｉｄ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ」；Ｎａｔｕｒｅ  ３６３巻、４４６〜４４８頁（１９９３年））である。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」と称される）及び従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と称される）と区別するために使用されている。ＶＨＨドメインは、付加的な抗原結合ドメインがないエピトープに特異的に結合することができる（エピトープがＶＨドメインとともにＶＬドメインによって認識される場合における、従来の４本鎖抗体のＶＨ又はＶＬドメインとは対照的である）。ＶＨＨドメインは、単一の免疫グロブリンドメインによって形成された、小さく、強固であり、効率的な抗原認識単位である。
【００１９】
本発明の文脈において、重鎖単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、ＶＨＨ抗体、並びに「ナノボディ（登録商標）」及び「ナノボディ（登録商標）ドメイン」という用語（「ナノボディ」は、Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．（Ｇｈｅｎｔ；ベルギー）の商標である）は、互換的に使用される。
【００２０】
ラクダ由来のＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１巻、２５〜３８頁（１９９９年）の図２に示されるように、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１）によって与えられたＶＨドメインの一般的な番号付けに従って番号付される。この番号付けによれば、
ＦＲ１は、１〜３０位にアミノ酸残基を含み、
ＣＤＲ１は、３１〜３５位にアミノ酸残基を含み、
ＦＲ２は、３６〜４９位にアミノ酸を含み、
ＣＤＲ２は、５０〜６５位にアミノ酸残基を含み、
ＦＲ３は、６６〜９４位にアミノ酸残基を含み、
ＣＤＲ３は、９５〜１０２位にアミノ酸残基を含み、及び
ＦＲ４は、１０３〜１１３位にアミノ酸残基を含む。
【００２１】
しかしながら、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野において周知であるように、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変化し得、カバット（Ｋａｂａｔ）の番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数に対応し得ない（すなわち、カバット番号付けによる１つ以上の位置は、実際の配列で占有されない場合があり、又は実際の配列は、カバット番号付けによって許容される数より多くのアミノ酸残基を含有する場合がある）ことに留意するべきである。これは、一般的に、カバットによる番号付けが、実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合もあり、又は対応しない場合もあることを意味する。
【００２２】
ＶＨドメインのアミノ酸残基を番号付ける代替の方法は、当該技術分野において公知であり、この方法はまた、ＶＨＨドメインに類似の方法で適用することができる。しかしながら、本明細書、特許請求の範囲及び図面において、他に指示がない限り、カバットによる、上記されるＶＨＨドメインに適用される番号付けに従う。
【００２３】
ＶＨＨドメイン中のアミノ酸残基の総数は、通常、１１０〜１２０個、しばしば１１２〜１１５個の範囲内である。しかしながら、より小さく、より長い配列がまた、本明細書に記載されている目的に適している場合があることに留意すべきである。
【００２４】
ＶＨＨドメイン及びこれを含有するポリペプチドのさらなる構造的特性及び機能的性質は、以下のように要約することができる：
ＶＨＨドメイン（自然において、軽鎖可変ドメインの存在なしに、及びそれとのいずれもの相互作用なしに抗原に機能的に結合するように「設計され」ている）は、単一の、比較的小さな、機能的な抗原結合構造単位、ドメイン又はポリペプチドとして機能することができる。これは、ＶＨＨドメインを、一般的に、単独では単一の抗原結合性タンパク質又は免疫グロブリン単一可変ドメインとしての実際の適用には適していないが、機能的な抗原結合性単位（例えば、Ｆａｂ断片などの従来の抗体断片；ＶＬドメインに共有結合したＶＨドメインからなるｓｃＦｖのように）を提供するために、ある形態又は他のものと組み合わせる必要のある従来の４本鎖抗体のＶＨ及びＶＬドメインと区別される。
【００２５】
これらの独特の性質のために、単独で又はより大きなポリペプチドの一部としてのＶＨＨドメインの使用は、従来のＶＨ及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ断片又は従来の抗体断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）の使用と比較して、多数の顕著な利点を提供する：
単一のドメインのみが、高い親和性及び高い選択性で抗原に結合するため必要とされ、そのため、２つの別個のドメインが存在する必要もなく、これらの２つのドメインを（ｓｃＦｖと同様に、とりわけ設計されたリンカーの使用を介して）正しい空間的なコンフォメーション及び配置に存在させる必要もない；
ＶＨＨドメインは、単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後の折り畳み又は修飾を必要としない；
ＶＨＨドメインは、容易に、多価及び多重特異性フォーマットに操作できる（フォーマットされる）；
ＶＨＨドメインは、溶解性が高く、凝集する傾向を有しない；
ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対して非常に安定であり、したがって、冷凍設備を使用することなく、調製、貯蔵又は輸送され得、コスト、時間及び環境の救済をもたらす；
ＶＨＨドメインは、生産に必要とされるスケールにおいてさえ、調製が容易であり、比較的安価である；
ＶＨＨドメインは、従来の４本鎖抗体及びこれらの抗原結合性断片と比較して、より小さく（約１５ｋＤａであり、従来のＩｇＧの約１０倍小さい）、したがって、従来の４本鎖抗体及びこれらの抗原結合性断片と比較して、組織内に（より）高い浸透性を示し、より高い用量で投与することができる；
ＶＨＨドメインは、（とりわけ、従来のＶＨドメインと比較して、伸長したＣＤＲ３ループに起因する）いわゆる空孔結合性質を示すことができ、したがって、さらに、従来の４本鎖抗体及びこれらの抗原結合性断片が接近することができない標的及びエピトープに接近することができる。
【００２６】
特定の抗原又はエピトープに結合するＶＨＨドメインを得る方法は、以前に、例えば、国際公開第２００６／０４０１５３号及び国際公開第２００６／１２２７８６号；Ｒ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４０巻（２０００年）１８５〜１９５頁；Ｌｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２８７巻（２０１２年）１３７１３〜１３７２１頁；Ｄｅｆｆａｒら、Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８巻（１２号）、２６４５〜２６５２頁、２００９年６月１７日及び国際公開第９４／０４６７８号に記載されている。
【００２７】
ラクダに由来するＶＨＨドメインは、元のＶＨＨ配列のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒト由来の従来の４本鎖抗体からのＶＨドメインにおける対応する位置（複数可）で生じる１つ以上のアミノ酸残基で置換することによって「ヒト化」することができる（これは「配列最適化」とも呼ばれ、ヒト化に加えて、配列最適化はまた、改善されたＶＨＨ特徴を提供するための１つ以上の突然変異による配列の他の修飾を包含し、例えば、翻訳後の修飾のための潜在的な部位を除くことが挙げられる）。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ以上の完全なヒトフレームワーク領域配列を含有し得、特定の実施形態において、ＩＧＨＶ３ヒトフレームワーク領域配列を含有する。
【００２８】
本明細書中で使用するとき、「ドメイン抗体」は、とりわけ、非ラクダ哺乳動物のＶＨ又はＶＬドメイン、特にヒト４本鎖抗体を指す。エピトープを単一の抗原結合ドメインとして、すなわちＶＬドメイン又はＶＨドメインとそれぞれ対合せずに結合させるために、このような抗原結合性質の特異的選択が必要であり、例えば、ヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーを使用することによる。
【００２９】
ドメイン抗体は、ＶＨＨのように、約１３〜約１６ｋＤａの分子量を有し、完全なヒト配列に由来する場合には、例えば、ヒトにおける治療的使用のために、ヒト化を必要としない。ＶＨＨドメインの場合のように、それらは原核生物の発現系においてもよく発現され、全体の製造コストにおいて有意な低下をもたらす。
【００３０】
「ドメイン抗体」は、例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら：「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」；Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻：５４４〜５４６頁（１９８９年）；Ｈｏｌｔ，Ｌ．Ｊ．ら：「Ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」；ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１巻（１１号）：４８４〜４９０頁（２００３年）に記載されている。
【００３１】
さらに、限定されないが、ヒト足場又は非免疫グロブリン足場を含む、他の「足場」上に上記されるＣＤＲの１つ以上を「移植」することが可能であることはまた、当業者には明らかである。このようなＣＤＲ移植のための適切な足場及び技術は、当該技術分野において公知である。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を指す。抗原決定基は、典型的には、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含有し、典型的には、特異的な三次元構造特性並びに特異的な電荷特性を有する。例えば、エピトープは、典型的には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の連続又は非連続アミノ酸を、固有の空間的なコンフォメーションで含み、このコンフォメーションは、「線状」であってもよいし、又は「立体的」であってもよい。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編集（１９９６年）におけるエピトープ・マッピング・プロトコールを参照されたい。線状エピトープにおいては、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体構造エピトープにおいては、相互作用点は、互いに分離されたタンパク質上のアミノ酸残基にわたって生じる。
【００３３】
所与の抗原のエピトープは、当該技術分野において周知である多数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編集、１９９６年）を参照されたい。例えば、線状エピトープは、例えばタンパク質分子の部分に対応する、固体支持体上の多数のペプチドを同時に合成し、ペプチドがなおも支持体に付着している間に、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。このような技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１巻：３９９８〜４００２頁；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６年）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３巻：７０９〜７１５頁に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴などのアミノ酸の空間的なコンフォメーションを決定することによって同定され得る。例えば、上記のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照されたい。
【００３４】
抗体は、当該技術分野において公知である従来の技術によって、同じエピトープへの競合的結合についてスクリーニングすることができる。例えば、抗原に対する結合について競合又は交差競合する抗体は、競合又は交差競合アッセイによって得ることができる。それらの交差競合に基づいて同じエピトープに結合する抗体を得るためのハイスループットプロセスは、国際特許公開第０３／４８７３１号に記載されている。対応して、ＣＴＬＡ４上の同じエピトープへの結合について本発明の抗体分子と競合する抗体及びそれらの抗原結合断片は、当該技術分野において公知である従来の技術によって得ることができる。
【００３５】
一般的に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインなど）が結合し得る異なるタイプの抗原又はエピトープの数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、その親和性及び／又は結合性（ａｖｉｄｉｔｙ）に基づいて決定することができる。親和性は、抗原と抗原結合タンパク質の解離の平衡定数（ＫＤ）によって表され、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度である：ＫＤの値が小さくなるにつれて、エピトープと抗原結合タンパク質との間の結合強度が強くなる（あるいは、親和性はまた、１／ＫＤである親和性定数（ＫＡ）として表すことができる）。当業者に明らかであるように、親和性は、目的の特異的抗原に依存して、それ自体公知である方法で決定することができる。結合性は、抗原結合タンパク質（例えば、免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメイン又はそれを含有するポリペプチド）と関連抗原との間の結合強度の尺度である。結合性は、エピトープと抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の親和性と、抗原結合タンパク質上に存在する関連結合部位の数の両方に関する。
【００３６】
他に指示がない限り、「ＣＴＬＡ４結合タンパク質」という用語は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合することができる任意のタンパク質を指す。ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、本明細書で定義されるＣＴＬＡ４に対する抗体又は免疫複合体を包含することができる。「ＣＴＬＡ４結合タンパク質」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（ＩｇＳＦ）、又はＣＤＲ移植分子を包含する。
【００３７】
本発明のＣＴＬＡ４結合分子は、ＶＨＨなどの少なくとも１つのＣＴＬＡ４結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含有し得る。一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合分子は、ＶＨＨなどの２つ、３つ、４つ又はそれ以上のＣＴＬＡ４結合免疫グロブリン単一可変ドメインを含有し得る。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４結合免疫グロブリン単一可変ドメインに加えて、エフェクター機能を有するリンカー及び／又は部分を含み得、例えば、アルブミン結合免疫グロブリン単一可変ドメインのような半減期延長部分、及び／又は血清アルブミンのような融合パートナー及び／又はＰＥＧのような結合ポリマー及び／又はＦｃ領域が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、異なる抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを含有する二重特異性抗体を包含する。
【００３８】
典型的には、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、抗原（すなわち、ＣＴＬＡ４）に結合し、解離定数（ＫＤ）は、（Ｂｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ又はＦｏｒｔｉｂｉｏアッセイで測定した場合）好ましくは１０−７〜１０−１０モル／リットル（Ｍ）、より好ましくは１０−８〜１０−１０モル／リットル、さらにより好ましくは１０−９〜１０−１０モル／リットル若しくはそれより小さく、及び／又は結合定数（ＫＡ）は、少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１である。１０−４Ｍより大きい任意のＫＤ値は、一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。抗原又はエピトープへの抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えば、本明細書に記載されているアッセイ、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイなどのそれ自体が公知である任意の適切な方法で決定することができる。
【００３９】
アミノ酸残基は、一般的に公知であり当業界で認められた標準的な３文字又は１文字のアミノ酸コードに従って示される。２つのアミノ酸配列を比較する場合、「アミノ酸の差異」という用語は、第２の配列と比較して、参照配列の位置に指示された数のアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を指す。置換（複数可）の場合、このような置換（複数可）は、好ましくは保存的アミノ酸置換（複数可）であり、これは、保存的アミノ酸置換が、類似した化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味し、ポリペプチドの機能、活性若しくは他の生物学的特性に影響がほとんどない又は本質的にない。このような保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において周知であり、ここで、保存的アミノ酸置換は、以下のグループ（ｉ）〜（ｖ）内の１つのアミノ酸が同じグループ内の別のアミノ酸残基によって置換される置換であることが好ましい：（ｉ）小さい脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；（ｉｉ）極性の、負荷電を持つ残基及びそれらの（無荷電の）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｉｎ；（ｉｉｉ）極性の、正荷電を持つ残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；（ｉｖ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｈｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；並びに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は、以下の通りである：ＡｌａからＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅへ；ＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕへ。
【００４０】
２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列類似性」は、同一である、又は保存的アミノ酸置換を表すいずれかのアミノ酸のパーセンテージを示す。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の配列同一性のレベルを評価する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、配列分析ソフトウェアは、多くの場合、アミノ酸配列の同一性を決定するために使用される。例えば、同一性は、ＮＣＢＩデータベースでＢＬＡＳＴプログラムを使用することによって決定することができる。配列同一性の決定については、例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、パートＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照されたい。
【００４１】
ポリペプチド又は核酸分子は、例えば、それが得られた天然の生物学的供給源及び／又は反応培地若しくは培養培地と比較した場合に、上記供給源又は培地中に通常付随する少なくとも１つの他の構成要素、例えば別のタンパク質／ポリペプチド、別の核酸、別の生物学的構成要素若しくは巨大分子又は少なくとも１つの夾雑物、不純物若しくは微量構成要素から分離されている場合、「本質的に単離されている」と考えられる。特に、ポリペプチド又は核酸分子は、それが少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、及び１０００倍又はそれより高くまで精製されている場合、「本質的に単離されている」と考えられる。「本質的に単離されている形態である」ポリペプチド又は核酸分子は、適切な技術、例えば、適切なクロマトグラフィー技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使用して決定されるように好ましくは本質的に均質である。
【００４２】
「親和性成熟された」抗ＣＴＬＡ４抗体、特にＶＨＨ又はドメイン抗体は、１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有し、その結果、それぞれの親ＣＴＬＡ４結合分子と比較してＣＴＬＡ４に対する親和性が改善されている。本発明の親和性成熟されたＣＴＬＡ４結合分子は、例えば、Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：７７９〜７８３頁、又はＢａｒｂａｓら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１巻：３８０９〜３８１３頁；Ｓｈｉｅｒら、１９９５年、Ｇｅｎｅ  １６９巻：１４７〜１５５頁；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５巻：１９９４〜２００４年；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４巻（７号）：３３１０〜９頁；及びＨａｗｋｉｎｓら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６巻（３号）：８８９〜８９６頁；ＫＳ  Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＲＥ  Ｈａｗｋｉｎｓ、「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６年に記載されているように、当該技術分野において公知である方法によって調製され得る。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「対象」という用語は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトを指す。
【００４４】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質
第１の態様では、本発明は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合することができる少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むＣＴＬＡ４結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、上記ＣＴＬＡ４結合分子は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一部の実施形態では、上記ＣＴＬＡ４結合分子は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する２つ、３つ、４つ又はそれを超える免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一部の実施形態では、上記ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する２つ以上の同一の免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。他の実施形態では、上記ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する２つ以上の異なる免疫グロブリン単一可変ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する上記２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、互いに直接連結される。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する上記２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、リンカーによって互いに連結される。上記リンカーは、１〜２０個又はそれを超えるアミノ酸の長さを有し、２次構造及びそれを超える構造を持たない非機能性アミノ酸配列であり得る。例えば、上記リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＡＰ、（ＧＧＧＧＳ）×３などのフレキシブルなリンカーである。
【００４５】
一部の実施形態では、上記少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、以下から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む：
（１）配列番号１に示されるＣＤＲ１、配列番号２に示されるＣＤＲ２、配列番号３に示されるＣＤＲ３（抗体番号１１６のＣＤＲに対応する）；
（２）配列番号４に示されるＣＤＲ１、配列番号５に示されるＣＤＲ２、配列番号６に示されるＣＤＲ３（抗体番号１１９のＣＤＲに対応する）；
（３）配列番号７に示されるＣＤＲ１、配列番号８に示されるＣＤＲ２、配列番号９に示されるＣＤＲ３（抗体番号１２８のＣＤＲに対応する）；
（４）配列番号１０に示されるＣＤＲ１、配列番号１１に示されるＣＤＲ２、配列番号１２に示されるＣＤＲ３（抗体番号１３８のＣＤＲに対応する）；
（５）配列番号１３に示されるＣＤＲ１、配列番号１４に示されるＣＤＲ２、配列番号１５に示されるＣＤＲ３（抗体番号１４５のＣＤＲに対応する）；
（６）配列番号１６に示されるＣＤＲ１、配列番号１７に示されるＣＤＲ２、配列番号１８に示されるＣＤＲ３（抗体番号１５５のＣＤＲに対応する）；
（７）配列番号１９に示されるＣＤＲ１、配列番号２０に示されるＣＤＲ２、配列番号２１に示されるＣＤＲ３（抗体番号１６５のＣＤＲに対応する）；
（８）配列番号２２に示されるＣＤＲ１、配列番号２３に示されるＣＤＲ２、配列番号２４に示されるＣＤＲ３（抗体番号１８８のＣＤＲに対応する）；
（９）配列番号２５に示されるＣＤＲ１、配列番号２６に示されるＣＤＲ２、配列番号２７に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ１のＣＤＲに対応する）；
（１０）配列番号２８に示されるＣＤＲ１、配列番号２９に示されるＣＤＲ２、配列番号３０に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ２のＣＤＲに対応する）；
（１１）配列番号３１に示されるＣＤＲ１、配列番号３２に示されるＣＤＲ２、配列番号３３に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ１６のＣＤＲに対応する）；
（１２）配列番号３４に示されるＣＤＲ１、配列番号３５に示されるＣＤＲ２、配列番号３６に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ２２のＣＤＲに対応する）；
（１３）配列番号３７に示されるＣＤＲ１、配列番号３８に示されるＣＤＲ２、配列番号３９に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ２７のＣＤＲに対応する）；
（１４）配列番号４０に示されるＣＤＲ１、配列番号４１に示されるＣＤＲ２、配列番号４２に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ２９のＣＤＲに対応する）；
（１５）配列番号４３に示されるＣＤＲ１、配列番号４４に示されるＣＤＲ２、配列番号４５に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｃ３８のＣＤＲに対応する）；
（１６）配列番号４６に示されるＣＤＲ１、配列番号４７に示されるＣＤＲ２、配列番号４８に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ５のＣＤＲに対応する）；
（１７）配列番号４９に示されるＣＤＲ１、配列番号５０に示されるＣＤＲ２、配列番号５１に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ１７のＣＤＲに対応する）；
（１８）配列番号５２に示されるＣＤＲ１、配列番号５３に示されるＣＤＲ２、配列番号５４に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ２９のＣＤＲに対応する）；
（１９）配列番号５５に示されるＣＤＲ１、配列番号５６に示されるＣＤＲ２、配列番号５７に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ３５のＣＤＲに対応する）；
（２０）配列番号５８に示されるＣＤＲ１、配列番号５９に示されるＣＤＲ２、配列番号６０に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ３７のＣＤＲに対応する）；
（２１）配列番号６１に示されるＣＤＲ１、配列番号６２に示されるＣＤＲ２、配列番号６３に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ３８のＣＤＲに対応する）；
（２２）配列番号６４に示されるＣＤＲ１、配列番号６５に示されるＣＤＲ２、配列番号６６に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ３９のＣＤＲに対応する）；
（２３）配列番号６７に示されるＣＤＲ１、配列番号６８に示されるＣＤＲ２、配列番号６９に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ４２のＣＤＲに対応する）；
（２４）配列番号７０に示されるＣＤＲ１、配列番号７１に示されるＣＤＲ２、配列番号７２に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ６９のＣＤＲに対応する）；及び
（２５）配列番号７３に示されるＣＤＲ１、配列番号７４に示されるＣＤＲ２、配列番号７５に示されるＣＤＲ３（抗体番号Ｊ７８のＣＤＲに対応する）。
【００４６】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の上記少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨである。一部の特定の実施形態では、上記ＶＨＨは、配列番号７６〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、上記ＶＨＨは、ヒト化ＶＨＨである。上記ヒト化ＶＨＨは、配列番号７６〜１００のうちのいずれか１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、上記ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列番号７６〜１００のうちのいずれか１つと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換を含有する。例えば、上記ＶＨＨは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の保存的アミノ酸置換を含有する。一部の特定の実施形態では、上記ヒト化ＶＨは、配列番号１０１〜１０９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、親和性成熟によって得られる。親和性成熟によって得られるＣＴＬＡ４結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有し得、このような変更は、親ＣＴＬＡ４結合タンパク質と比較した場合、ＣＴＬＡ４に対する親和性の増加をもたらす。
【００４８】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合することができる少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインに加えて、免疫グロブリンＦｃ領域をさらに含む。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質における免疫グロブリンＦｃ領域の内包により、結合タンパク質は二量体を形成することが可能になり、さらに上記結合タンパク質のインビボ半減期の延長が可能になる。本発明において使用することができるＦｃ領域は、異なるサブタイプの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭから得ることができる。免疫グロブリンＦｃ領域は、一般的には、ヒンジ領域又はヒンジ領域の一部、免疫グロブリン定常領域のＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、突然変異を野生型のＦｃ配列に導入して、Ｆｃにより媒介される関連活性を変更することができる。上記突然変異には、限定されないが、ａ）Ｆｃによって媒介されるＣＤＣ活性を変更する突然変異；ｂ）Ｆｃによって媒介されるＡＤＣＣ活性を変更する突然変異；又はｃ）ＦｃＲｎによって媒介されるインビボ半減期を変更する突然変異が含まれる。このような突然変異は、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｇ  Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８年、２０巻：４６０〜４７０頁；Ｅｓｏｈｅ  Ｅ．Ｉｄｕｓｏｇｉｅら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００年、１６４巻：４１７８〜４１８４頁；ＲＡＰＨＡＥＬ  Ａ．ＣＬＹＮＥＳら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００年、６巻、Ｎｕｍｂｅｒ  ４号：４４３〜４４６頁；Ｐａｕｌ  Ｒ．Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００６年、１７６巻：３４６〜３５６頁に記載されている。例えば、Ｆｃを媒介したＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性は、増加若しくは除去させることができ、又はＦｃＲｎ親和性は、ＣＨ２領域上で１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を突然変異させることによって増大若しくは減弱させることができる。さらに、タンパク質安定性は、ヒンジ領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を突然変異させることによって増加させることができる。
【００５０】
一部の実施形態では、突然変異されたＦｃが、ホモ二量体又はヘテロ二量体をより容易に形成する傾向が高まるように、突然変異がＦｃ配列に導入され得る。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ、Ｐｒｅｓｔａら、１９９６年、及びＣａｒｔｅｒ  ２００１年は、Ｆｃ接触界面にあるアミノ酸側鎖基の空間相互作用のノブ−ホールモデル（ｋｎｏｂ−ｈｏｌｅ  ｍｏｄｅｌ）を使用して、異なるＦｃ突然変異体がヘテロ二量体をより容易に形成できることに言及し；加えて、中国特許出願公開第１０２５５８３５５号又は中国特許出願公開第１０３３８８０１３号は、Ｆｃ接触界面にあるアミノ酸の電荷を変化させ、順に、Ｆｃ接触界面でのイオン相互作用を変化させることによって、異なるＦｃ突然変異体がヘテロ二量体をより容易に形成できる（中国特許出願公開第１０２５５８３５５号）、又は同じ突然変異によりＦｃがホモ二量体をより容易に形成できる（中国特許出願公開第１０３３８８０１３号）ことを開示する。
【００５１】
好ましくは、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１のＦｃ領域である。一部の特定の実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号１３２に記載されている。一部の実施形態では、配列番号１３２のＮ末端ＥＰＫＳＣを欠失させるか、又はＥＰＫＳＳ若しくはＭＤＰＫＳＳに突然変異させることができる。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質において、ＣＴＬＡ４に特異的に結合することができる免疫グロブリン単一可変ドメインは、リンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結される。上記リンカーは、二次構造又はそれを超える構造を持たずに、長さが１〜２０アミノ酸又はそれを超える非機能性アミノ酸配列であり得る。例えば、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＡＰなどのフレキシブルな接続である。
【００５３】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、直接又はリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結される、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、上記免疫グロブリンＦｃ領域により、上記ＣＴＬＡ４結合タンパク質は２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含む二量体分子を形成することができる。このようなＣＴＬＡ４結合タンパク質は、二価ＣＴＬＡ４結合タンパク質とも呼ばれる。一部の実施形態では、二量体はホモ二量体である。
【００５４】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、直接又はリンカーを介して連結される、ＣＴＬＡ４及び免疫グロブリンＦｃ領域に特異的に結合する２つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、上記免疫グロブリンＦｃ領域により、ＣＴＬＡ４結合タンパク質は、４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含む二量体分子を形成することができる。このようなＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、４価ＣＴＬＡ４結合タンパク質とも呼ばれる。一部の実施形態では、二量体はホモ二量体である。
【００５５】
一部の好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域を含む本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、配列番号１１４〜１２８から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５６】
別の態様では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、配列番号７６〜１００のいずれかのうちの１つのアミノ酸配列からなるＶＨＨと同じエピトープに結合する抗ＣＴＬＡ４抗体分子を包含する。
【００５７】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有する：
（ａ）１×１０−７Ｍ未満のＫＤでヒトＣＴＬＡ４に結合する；
（ｂ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８０及び／又はＣＤ８６との相互作用をブロックする；
（ｃ）ＰＢＭＣ及び／又はＴ細胞の活性化を増強する；
（ｄ）腫瘍増殖を阻害する。
【００５８】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、１×１０−７Ｍ未満、好ましくは１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満のＫＤでＣＴＬＡ４に結合し得る。
【００５９】
一部の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０との相互作用並びに／又はＣＴＬＡ４とＣＤ８０及び／若しくはＣＤ８６との相互作用をブロックすることができる。
【００６０】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、腫瘍増殖を少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％まで阻害することができる。
【００６１】
さらに、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、熱処理に耐性である。例えば、４０℃で最大３０日間まで処理した後、有意な凝集及び分解を観察することができない。
【００６２】
最後に、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、カニクイザルにおいてより良好な耐性を示す。例えば、投与量の最大３０ｍｇ／ｋｇまで、薬物関連有害反応を観察することができない。
【００６３】
核酸、ベクター及び宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は、本質的に単離された形態である。
【００６４】
本発明の核酸はまた、例えばプラスミド、コスミド又はＹＡＣなどのベクターの形態であり得、それに存在し得、及び／又はその一部であり得る。ベクターは、特に、発現ベクター、すなわち、インビトロ及び／又はインビボで（すなわち、適切な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系において）ＣＴＬＡ４結合タンパク質の発現を提供することができるベクターであり得る。このような発現ベクターは、一般的に、プロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）などのような１つ以上の適切な調節エレメントに作動可能に連結された本発明の少なくとも１つの核酸を含む。このようなエレメント及び特定の宿主における特定の配列の発現を考慮したそれらの選択は、当業者の常識である。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を発現するために有用であるか又は必要な調節エレメント及び他のエレメントの具体例には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子などが含まれる。
【００６５】
本発明の核酸は、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドについてのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、それ自体が公知である方法（例えば、自動化ＤＮＡ合成及び／又は組換えＤＮＡ技術）によって調製又は取得することができ、及び／又は適切な天然源から単離することができる。
【００６６】
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のＣＴＬＡ４結合タンパク質を発現するか又は発現することができる；及び／又は本発明の核酸を含有する組換え宿主細胞に関する。特に好ましい実施形態によれば、上記宿主細胞は細菌細胞であり；他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞である。
【００６７】
適切な細菌細胞には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌株などのグラム陰性細菌株、並びにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の菌株などのグラム陽性細菌株由来の細胞が含まれる。適切な真菌細胞には、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種由来の細胞が含まれる。
【００６８】
適切な真菌細胞には、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ（ニューロスポラ）、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の種由来の細胞が含まれる。適切な酵母細胞には、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピチア属の種（例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、及びハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の種由来の細胞が含まれる。
【００６９】
適切な哺乳動物細胞には、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などが含まれる。
【００７０】
しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び異種タンパク質の発現のために当該技術分野において使用される任意の他の細胞も同様に使用することができる。
【００７１】
本発明はさらに、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を製造する方法を提供し、このような方法は、一般的に、下記のステップを含む：
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ；及び
宿主細胞によって発現されたＣＴＬＡ４結合タンパク質を培養物から回収するステップ；及び
場合により、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質をさらに精製及び／又は修飾するステップ。
【００７２】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、細胞内（例えば、細胞質ゾル、ペリプラズマ又は封入体中）のいずれかで上記のように細胞内に産生され、次に、宿主細胞から単離され、場合によりさらに精製され得る；又はそれらは細胞外に（例えば、宿主細胞が培養される培地中に）産生され、次に培養培地から単離され、場合によりさらに精製され得る。
【００７３】
特定の適切な発現ベクター、形質転換又はトランスフェクション法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導法、培養条件などのポリペプチドの組換え生成のために使用される方法及び試薬は、当該技術分野において公知である。同様に、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の製造方法に有用なタンパク質の単離及び精製技術は、当業者に周知である。
【００７４】
しかしながら、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、固相合成又は液相合成を含む化学合成などの当該技術分野において公知であるタンパク質の他の製造方法によっても得ることができる。
【００７５】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、医薬として許容される担体とともに製剤化された、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の１つ又は組合せを含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。このような組成物には、１つ又は組合せの（例えば２つ若しくはそれ以上の異なる）本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質が含まれ得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する抗体分子の組合せを含むことができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも１種の他の抗腫瘍剤と組み合わせられた、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を含むことができる。例えば、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、他の腫瘍特異的抗原を標的とする抗体と併用して投与され得る。他の腫瘍特異的抗原を標的とする上記抗体には、限定されないが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ変異抗体、抗ＶＥＧＦａ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、又は抗ＣＭＥＴ抗体が含まれる。上記抗体はモノクローナルであることが好ましい。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、他の腫瘍免疫療法手段又は腫瘍標的化小分子薬と組み合わせて使用することができる。他の腫瘍免疫療法手段には、限定されないが、ＯＸ４０、ＰＤＬ１／ＰＤ１、ＣＤ１３７などの腫瘍免疫調節分子に対する治療抗体、又はＣＡＲ−Ｔ治療手段などが含まれる。
【００７７】
本発明の医薬組成物はまた、放射線療法、化学療法、外科手術などの他の腫瘍治療手段と組み合わせて使用することができ、又は放射線療法、化学療法、若しくは外科手術の前又は後で使用することができる。
【００７８】
本明細書で使用するとき、「医薬として許容される担体」には、生理学的に適合性である任意及びすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、並びに等張化剤及び吸収遅延剤などが含まれる。担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、又は表皮投与（例えば、注射若しくは輸注による）に適していることが好ましい。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、又は免疫複合体は、化合物を不活性化し得る酸の作用及び他の天然の条件から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。
【００７９】
本発明の薬学的化合物には、１つ以上の医薬として許容される塩が含まれ得る。「医薬として許容される塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持し、いずれの望まれない毒物学的作用も与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。このような塩の例には、酸付加塩及び塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、及び亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、並びに、脂肪族のモノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、並びに脂肪族スルホン酸及び芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、及びカルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びに、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、及びプロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが含まれる。
【００８０】
本発明の医薬組成物はまた、医薬として許容される抗酸化剤を含み得る。医薬として許容される抗酸化剤の例には、以下のものが含まれる：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、及びα−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；並びに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、及びリン酸などの金属キレート剤。
【００８１】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有し得る。
【００８２】
微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、並びに様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、及びフェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にすることができる。また、糖及び塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど吸収を遅延させる作用物質を含めることによって実現され得る。
【００８３】
医薬として許容される担体には、無菌の注射可能な溶液又は注射用分散液を用時調製するための、無菌の水溶液又は水性分散液及び無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に取り込むことができる。
【００８４】
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌であり、安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の規則構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合に必要とされる粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【００８５】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分の１つ又は組合せとともに、適切な溶媒中で必要な量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密ろ過することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基本となる分散媒及び上記で列挙したもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から、活性成分及び任意の付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥及びフリーズドライ法（凍結乾燥）である。
【００８６】
単一の剤形を産生するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象及び個々の投与様式に応じて変わる。単一の剤形を産生するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、一般的に、治療的効果をもたらす組成物の量である。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、医薬として許容される担体と組み合わせた、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【００８７】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してよく、いくつかに分割した用量を経時的に投与してよく、又は、治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加させてよい。投与を容易にし、投薬量を均一にするために、単位剤形の非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療されるべき対象に対する単位投薬量として適した物理的に個別の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と共同して所望の治療的効果をもたらすように計算された、所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特性及び実現すべき特定の治療的効果、並びに（ｂ）個体の感受性を治療するためにこのような活性化合物を調剤する技術に特有の制約によって決定され、これらに直接依存する。
【００８８】
抗体分子の投与の場合、投薬量は、対象の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、２０ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重又は１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療計画は、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１カ月に１回、３カ月毎に１回又は３〜６カ月毎に１回の投与を伴い、初期では短い投与間隔（１週間に１回から３週間毎に１回など）、その後に延長された間隔（１カ月に１回から３〜６カ月毎に１回など）を有する。
【００８９】
あるいは、抗体は、徐放製剤として投与することができ、この場合、必要とされる投与頻度は少なくなる。投薬量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般的に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、続いて、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体である。投薬量及び投与頻度は、治療が予防的であるか又は治療的であるかに応じて変化し得る。予防的適用では、比較的少ない投薬量が、長期間に渡って比較的頻度の低い間隔で投与される。一部の患者は、その後一生、治療を受け続ける。治療的適用では、比較的短い間隔で比較的高い投薬量は、時として、疾患の進行が緩和又は終結されるまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は全面的な改善を示すまで、必要とされる。その後、患者は、予防的計画を施されてもよい。
【００９０】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して、患者に有毒とならずに、所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量を得るように変化され得る。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそれらのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康状態、及び以前の病歴、並びに医薬分野において周知である同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存する。
【００９１】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の「治療有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患症状の無い期間の頻度及び持続期間の増大、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害の予防をもたらす。例えば、ＣＴＬＡ４関連腫瘍の治療に関して、「治療有効量」は、好ましくは、未治療の対象に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％まで細胞増殖又は腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測に役立つ動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの性質は、細胞増殖を阻害する化合物の能力を調べることにより評価することができ；このような阻害は、インビトロで当業者に公知であるアッセイによって決定することができる。治療的有効量の治療的化合物は、腫瘍サイズを縮小し得るか、又は他には対象の症状を改善し得、例えば、がん患者の無増悪生存を達成又は延長し、がん患者の全生存期間を延長することができる。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、及び選択される特定の組成物又は投与経路などの因子に基づいてこのような量を決定することができる。さらに、当業者はまた、インビトロでＴ細胞を活性化する能力を調べることにより、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の有効量を決定することができる。
【００９２】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知である１つ以上の様々な方法を用いて、１つ以上の投与経路を介して投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、又は例えば注射若しくは輸注による他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び輸注が含まれる。
【００９３】
あるいは、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、局所、表皮又は粘膜の投与経路など非経口ではない経路を介して、例えば、鼻腔内に、経口的に、腟経由、直腸経由、舌下又は局所的に投与することができる。
【００９４】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤を調製するための多数の方法は、特許付与されているか、又は、一般的に当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ及びＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。
【００９５】
治療的組成物は、当該技術分野において公知である医療用デバイスを用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態において、本発明の治療的組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；又は同第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの、針無しの皮下注入デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例には、以下が含まれる：制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能なマイクロ注入ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を介して医薬を投与するための治療用デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号；持続的な薬物送達用の流量可変な埋め込み可能注入装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号；複数のチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬物送達系を開示している米国特許第４，４７５，１９６号。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数の他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールは、当業者に公知である。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの親水性の高い化合物を排除する。（所望の場合は）本発明の治療的化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために、例えばリポソーム中にそれらを製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関しては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；及び同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は臓器中に選択的に輸送され、それによって標的化された薬物送達を向上させる１つ以上の部分を含み得る（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９巻：６８５頁を参照されたい）。例示的な標的部分には、葉酸又はビオチン（例えば、Ｌｏｗらによる米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３巻：１０３８頁）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７巻：１４０頁；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９巻：１８０頁）、サーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３巻：１３４頁）；ｐｌ２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：９０９０頁）が含まれる；また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６巻：１２３頁；ＪＪ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；ＬＪ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４巻：２７３頁を参照されたい。
【００９７】
疾患の予防及び治療
別の態様では、本発明は、ＣＴＬＡ４関連疾患の予防及び／又は治療のための、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質、核酸、宿主細胞、及び医薬組成物の使用、並びに対応する方法を提供する。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を用いて予防及び／又は治療できるＣＴＬＡ４関連疾患は、以下のように詳細に記載される。
【００９８】
がん
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質によりＣＴＬＡ４をブロックすることにより、がん細胞に対する患者の免疫応答を増強することができる。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、単独で使用されて、がん性腫瘍の増殖を阻害し得る。又は、以下に記載されるように本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、他の抗腫瘍療法と組み合わせて、例えば、他の免疫原性物質、標準的ながん治療薬、又は他の抗体分子と組み合わせて使用され得る。
【００９９】
したがって、一実施形態において、本発明は、対象においてがんを予防及び／又は治療する方法であって、本発明の治療有効量のＣＴＬＡ４結合タンパク質を対象に投与するステップを含む、方法を提供し、それにより対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する。
【０１００】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を用いて予防及び／又は治療され得る好ましいがんは、典型的には、免疫療法に反応性を有するがんを含む。治療のための好ましいがんの非限定的な例には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫（例えば、転移性の悪性黒色腫）、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頚部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体癌、骨肉腫が挙げられる。本発明の方法を用いて治療され得る他のがんの例には、骨がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内の悪性黒色腫、子宮がん、肛門領域のがん、精巣がん、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性又は急性の白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎う癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含む環境的に誘導されるがん、及び上記がんの組合せが含まれる。
【０１０１】
任意選択で、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、がん細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び炭水化物分子を含む）、細胞、及び免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞などの免疫原性物質と組み合わせることができる（Ｈｅら（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３巻：４９１９〜２８頁）。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例には、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１、及び／若しくはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、又はサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が含まれる。
【０１０２】
ヒトにおいて、黒色腫などの一部の腫瘍は免疫原性であることが示されている。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質を用いてＣＴＬＡ４ブロックによってＴ細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主における腫瘍応答を活性化し得ることが予想される。ＣＴＬＡ４の遮断は（ＣＴＬＡ４抗体など、例えば本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質）は、ワクチン接種プロトコールと組み合わされた場合に最も効果的である可能性が高い。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０〜６２頁；Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ，２０００年、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００〜３０２頁；Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００年、ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４〜４２８頁；Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００年，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０〜７３８頁；さらにＲｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．及びＳｚｎｏｌ，Ｍ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６１章、３０２３〜３０４３頁、ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ら（編集）、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．第５版を参照されたい）。これらの戦略のうち１つにおいて、ワクチンは、自己由来又は同種異系の腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように腫瘍細胞に形質導入する場合、最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種に対する抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９０巻：３５３９〜４３頁）。
【０１０３】
種々の腫瘍における遺伝子発現及び大規模遺伝子発現パターンの研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義をもたらしている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０巻：２８１〜７ページ）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍及び腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えばメラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、及びＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主中に見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示され得る。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、これらのタンパク質に対する免疫応答を生じさせるために、腫瘍に発現された組換えタンパク質及び／又はペプチドの回収物と組み合わせて使用され得る。これらのタンパク質は、通常、免疫系によって自己抗原と考えられ、したがってそれらに耐性である。腫瘍抗原はまた、染色体のテロメアの合成に必要であり、８５％を超えるヒトがん及びごく限られた数の体細胞組織において発現されるタンパク質テロメラーゼを含み得る（Ｋｉｍ，Ｎら（１９９４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６巻：２０１１〜２０１３頁）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させる体細胞突然変異又は２つの無関係な配列間の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体のｂｃｒ−ａｂｌ）を作製するため、がん細胞において発現される「ネオ抗原」であり得る。
【０１０４】
他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ及びＨＣＶ）並びにカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などのヒトがんに関与するウイルス由来のタンパク質を含み得る。ＣＴＬＡ４の遮断（ＣＴＬＡ４抗体など、例えば本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質）と併用してもよい別の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離され、精製された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するために抗原提示細胞への送達において非常に効率的である（Ｓｕｏｔ，Ｒ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ（１９９５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９巻：１５８５〜１５８８頁；Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８巻：１１７〜１２０頁）。
【０１０５】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的反応をプライミングするために使用することができる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで産生され、様々なタンパク質及びペプチド抗原、並びに腫瘍細胞抽出物で負荷され得る（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４巻：３２８〜３３２頁）。ＤＣはまた、遺伝的手段によって形質導入されて、これらの腫瘍抗原を同様に発現し得る。ＤＣはまた、免疫化の目的で腫瘍細胞に直接融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ，Ａら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６巻：３３２〜３３６頁）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、より強力な抗腫瘍応答を活性化するために、ＣＴＬＡ４の遮断（ＣＴＬＡ４抗体など、例えば本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質）と効果的に組み合わせられ得る。
【０１０６】
ＣＡＲ−Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法）は、腫瘍を治療するための別の細胞療法である。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるために、ＣＤ３−ζ鎖又はＦｃεＲＩγの細胞内部分と結合した特定の腫瘍抗原に対する抗体の抗原結合部分のキメラタンパク質を遺伝的に感染させた患者由来のＴ細胞である。また、同時刺激シグナリング配列は、Ｔ細胞の細胞傷害活性、増殖及び生存を増加させるために、及びサイトカインの放出を促進させるために導入されてもよい。再プログラムした後、患者由来のＴ細胞をインビトロで拡大させて、多数の腫瘍特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を産生させ、次に、腫瘍を治療するために患者に輸注される。ＣＴＬＡ４ブロッキング剤（ＣＴＬＡ４抗体など、例えば、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質）は、より強力な抗腫瘍応答を活性化させるために、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法と組み合わせて使用され得る。
【０１０７】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、標準的ながん治療と組み合わせることができる。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質は、化学療法計画と効果的に組み合わせることができる。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質及び化学療法の併用後の科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞傷害作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加をもたらすべきであるということである。細胞死によりＣＴＬＡ４の遮断との相乗効果をもたらし得る他の併用療法は、放射線、外科手術、及びホルモン欠乏である。これらのプロトコールの各々は、宿主内に腫瘍抗原の供給源を作り出す。血管新生阻害剤はまた、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質と組み合わせることができる。血管新生の阻害は、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給することができる腫瘍細胞死をもたらす。
【０１０８】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、他の腫瘍特異的抗原に対する抗体と組み合わせて使用することができる。他の腫瘍特異的抗原に対する上記抗体には、限定されないが、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ変異抗体、抗ＶＥＧＦａ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、又は抗ＣＭＥＴ抗体が含まれる。上記抗体はモノクローナルであることが好ましい。
【０１０９】
本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質はまた、腫瘍細胞に対してＦｃアルファ又はＦｃガンマ受容体発現エフェクター細胞を標的とする二重特異性抗体と組み合わせて使用することができる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号及び同第５，８３７，２４３号を参照されたい）。二重特異性抗体を用いて、２つの別々の抗原を標的にすることができる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的反応をより効果的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＣＴＬＡ４の遮断の使用によって増強される。あるいは、抗原は、腫瘍抗原及び樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用によって、ＤＣに直接送達され得る。
【０１１０】
腫瘍は、非常に様々な機構によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機構の多くは、腫瘍によって発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらには、とりわけ、ＴＧＦ−ベータ（Ｋｅｈｒｌ，Ｊ．ら（１９８６年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３巻：１０３７〜１０５０頁）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．及びＯ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３巻：１９８〜２００頁）、及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ，Ｍ．ら（１９９６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４巻：１３６３〜１３６５頁）が含まれる。これらの実体の各々に対する抗体は、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進するために、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質と組み合わせて使用され得る。
【０１１１】
宿主免疫応答性を活性化するために使用され得る他の抗体は、抗ＣＴＬＡ４と組み合わせて使用することができる。抗ＣＤ４０抗体は、ヘルパーＴ細胞活性を効果的に置換することができ（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３巻：４７４〜４７８頁）、本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質と併用することができる。ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４巻：２１６０〜２１６９頁）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３巻：６８２〜６８５頁（１９９７年））、及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７巻：２６２〜２６６頁）などのＴ細胞共刺激分子に対する抗体、並びにＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許第５，８１１，０９７号）又はＢＴＬＡ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ら（２００３年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４巻：６７０〜９頁）、Ｂ７−Ｈ４（Ｓｉｃａ，ＧＬら（２００３年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８巻：８４９〜６１頁）などの負の補助刺激分子の活性をブロックする抗体の活性化はまた、増加したレベルのＴ細胞活性化をもたらし得る。
【０１１２】
骨髄移植は、現在、造血起源の様々な腫瘍を治療するために使用されている。移植片対宿主疾患はこの処置の結果であるが、移植片対腫瘍応答から治療上の利益を得ることができる。ＣＴＬＡ４の遮断は、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を増加させるために使用することができる。また、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のために、抗原特異的なＴ細胞のエクスビボでの活性化及び拡大、並びにレシピエントへのこれらの細胞の養子移入を伴ういくつかの実験的処理プロトコールがある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．及びＲｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５巻：５４６〜５１頁）。これらの方法はまた、ＣＭＶなどの感染性因子に対するＴ細胞反応を活性化するために使用され得る。本発明のＣＴＬＡ４結合タンパク質の存在下におけるエクスビボでの活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度及び活性を増加させることが期待され得る。
【０１１３】
感染症
本発明の他の方法は、特定の毒素又は病原体に曝露された患者を治療するために使用される。したがって、本発明の別の態様は、対象における感染症を予防又は治療する方法であって、対象に本発明のＣＴＬＡ４結合性タンパク質を投与することを含む、方法を提供し、それにより、対象は感染症のために治療される。
【０１１４】
上記で検討した腫瘍へのその適用と同様に、ＣＴＬＡ４の遮断は、単独で又はアジュバントとして、ワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例としては、現在有効なワクチンが存在しない病原体、又は従来のワクチンが完全には有効でない病原体が挙げられる。これらには、限定されないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、及びＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が含まれる。ＣＴＬＡ４の遮断は、感染の過程で変化した抗原を提示するＨＩＶなどの、薬剤によって確立された感染に対して特に有用である。これらの新規なエピトープは、抗ヒトＣＴＬＡ４投与の時点で異物として認識され、したがって、ＣＴＬＡ４を介した負のシグナルによって弱くならない強いＴ細胞反応を引き起こす。
【０１１５】
発明の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性ウイルスの例の中には、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟体動物ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルス性脳炎ウイルスが含まれる。
【０１１６】
本発明の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性細菌の例の中には、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ症、及びライム病の細菌が含まれる。
【０１１７】
本発明の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性真菌の例の中には、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラタ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（フミガタス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニガー（ｎｉｇｅｒ）など）、ムコラエ属（ムコル（ｍｕｃｏｒ）、アビシジア（ａｂｓｉｄｉａ）、リゾフス（ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ））、スポロトリックス・スケンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）及びヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）が含まれる。
【０１１８】
本発明の方法によって治療可能な感染を引き起こす病原性寄生虫の例の中には、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ）、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ属種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア・ドノバン（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉ）、ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。
【０１１９】
上記の方法の全てにおいて、ＣＴＬＡ４の遮断は、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）、又は腫瘍抗原の提示の増強を提供する二重特異性抗体療法（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２巻：１１２１〜１１２３頁を参照されたい）などの他の形態の免疫療法と組み合わせることができる。
【実施例】
【０１２０】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、本発明の範囲は、いずれにせよ特定の実施例に限定されるべきではない。
【０１２１】
実施例１：ＣＴＬＡ４に対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
１．１  ライブラリー構築及びスクリーニング
免疫化のためのＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１２９）をＨＥＫ２９３細胞（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）により発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。１頭のフタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）を免疫化のために選んだ。４回の免疫化後、リンパ球を１００ｍｌのラクダ末梢血から単離し、総ＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）により抽出した。抽出されたＲＮＡは、指示書に従ってＳｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＦＩＲＳＴ  ＳＴＲＡＮＤＳＵＰＥＲＭＩＸキットを用いてｃＤＮＡに逆転写された。重鎖抗体をコードする核酸断片を入れ子ＰＣＲによって増幅した：
第１ラウンドのＰＣＲ：
上流プライマー：ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＣ（配列番号１１０）；
下流プライマー：ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ（配列番号１１１）。
【０１２２】
第２ラウンドのＰＣＲ：
鋳型としての第１ラウンドのＰＣＲからのＰＣＲ産物、
上流プライマー：ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＲＧＧＡＧＧ（配列番号１１２）；
下流プライマー：ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ（配列番号１１３）。
【０１２３】
標的重鎖単一ドメイン抗体核酸断片を回収し、エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ由来）を用いてファージディスプレイベクターｐＣＤｉｓｐｌａｙ−３（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ：ＶＰＴ４０２３）にクローニングした。次に、生成物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞ＴＧ１に電気穿孔し、ＣＴＬＡ４に対する重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリーを構築し、確認した。連続希釈をプレーティングすることにより、ライブラリー容量は約１０８と決定された。ライブラリーの挿入率を決定するために、５０クローンをコロニーＰＣＲ用にランダムに選択した。結果は、挿入率が９９％以上であることを示した。
【０１２４】
１．２  ＣＴＬＡ４に対する重鎖単一ドメイン抗体のパニング
マルチウェルプレートは、５μｇ／ウェルでＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質及びＦｃタンパク質を用いて、４℃で一晩、コーティングされた。翌日、室温で２時間、１％スキムミルクでブロックした後、１００μｌのファージ（８×１０１１ｔｆｕ、１．１で構築されたラクダ重鎖単一ドメイン抗体のファージディスプレイライブラリー由来）を室温で１時間添加した。その後、Ｆｃ非結合ファージは、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて室温で１時間洗浄することにより、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質でコーティングされたウェルに再度移された。ＣＴＬＡ４に特異的に結合したファージをトリエチルアンモニウム（１００ｍＭ）で解離させ、大腸菌ＴＧ１を対数期で感染させてファージを生成し、次にこれを次のラウンドスクリーニング用に精製した。同じスクリーニングを３〜４回繰り返した。これにより、陽性クローンが濃縮され、ファージディスプレイ技術によって抗体ライブラリーからＣＴＬＡ４特異的抗体を選択する目的を達成した。
【０１２５】
１．３  ファージ酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）による個々の陽性クローンの特異的選択
３ラウンドのパンニング後に得られたＣＴＬＡ４結合陽性ファージを用いて、空の大腸菌を感染させ、播種した。９６個の単一コロニーを培養のためにランダムに選択し、ファージをそれぞれ産生させ、精製した。プレートを４℃で一晩、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質でコーティングした；得られた試料ファージを添加し（対照としてブランクファージ）、室温で１時間、インキュベートした。一次抗体であるマウス抗ＨＡタグ抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｓｈｉｊｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ．）を洗浄後に加え、反応のために室温で１時間、インキュベートした。二次抗体であるヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体（Ａｍｙｊｅｃｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ．）を洗浄後に添加し、反応のために室温で１時間、インキュベートした。アルカリホスファターゼ発色溶液を洗浄後に添加し、吸収値を４０５ｎｍの波長で読み取った。試料ウェルのＯＤが対照ウェルのＯＤと比較して３倍である場合、試料は陽性として決定される。陽性ウェルの細菌は、プラスミド抽出及びその後の配列決定のために、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢ液体培地に移して培養された。
【０１２６】
各クローンのタンパク質配列は、配列アラインメントソフトウェアであるＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩに従って分析された。同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有するクローンは同じ抗体であると考えられ、一方、異なるＣＤＲ配列を有するクローンは異なる抗体であると考えられ、これらの早期終了配列は除外された。最終的には、計３４種の異なる抗体が得られた。
【０１２７】
実施例２  ＣＴＬＡ４に対する重鎖単一ドメイン抗体の予備評価
２．１  大腸菌における重鎖単一ドメイン抗体の発現及びそれらの精製
配列決定分析により得られた３４個の重鎖単一ドメイン抗体のコード配列を発現ベクターＰＥＴ３２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、製品番号：６９０１６−３）にサブクローニングし、正しい組換えプラスミドを発現宿主株ＢＬ１（ＤＥ３）（Ｔｉａｎｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＣＢ１０５−０２）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ固体培地上に３７℃で一晩、播種した。単一コロニーを接種し、一晩培養し、翌日、移し、振とうして３７℃で増殖させた。培養物が０．６−１のＯＤ値に達したとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、２８℃で一晩、振とうしながら誘導した。翌日、遠心分離により細菌を回収し、溶解して抗体の粗抽出物を得た。次に、ニッケルイオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗体タンパク質を精製し、純度が９０％を超える抗体タンパク質を得た。
【０１２８】
２．２  ヒトＣＴＬＡ４タンパク質への候補ＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体の特異的結合
プレートをＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質で一晩、４℃でコーティングし、実施例２．１で得られた１０ｎｇの重鎖単一ドメイン抗体を各ウェルに添加し（対照はＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質に結合しない単一ドメイン抗体である）、室温で１時間反応させた。洗浄後、一次抗体である抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加し、１時間、室温で反応させた。洗浄後、二次ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（Ｙｉｑｉａｏ  Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、カタログ：ＳＳＡ００７２００）を添加し、１時間、室温で反応させた。洗浄後、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１２９】
プレートをＦｃタンパク質で一晩、４℃でコーティングし、実施例２．１で得られた１０ｎｇ重鎖単一ドメイン抗体を各ウェルに添加し（対照は他の無関係の標的に対する単一ドメイン抗体である）、室温で１時間反応させた。洗浄後、ウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕ  Ｘｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加し、１時間、室温で反応させた。洗浄後、ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｕ  Ｘｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１３０】
ＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質についてのＯＤ値をブランク対照についてのＯＤ値で割った比が４を超えるか又は４に等しい場合、候補抗体はＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質に結合するものと考えられる；同時に、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ抗原タンパク質に結合することができる上記抗体は、ＣＴＬＡ４−Ｆｃへの結合についてのＯＤ値をＦｃタンパク質への結合についてＯＤ値で割った比が＞＝５である場合、Ｆｃ部分よりむしろＣＴＬＡ４部分に特異的に結合するものと考えられる。
【０１３１】
結果は、３４個の抗体のうち２５個（太字中の太字）がＦｃに結合することなくＣＴＬＡ４に特異的に結合できることを示した。結果を以下の表１に示す。
【０１３２】
【表１】
2019522489.tif 000002
【０１３３】
２．３  競合ＥＬＩＳＡによるＣＤ８０とＣＴＬＡ４の相互作用に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体のブロッキング効果の検討
ＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質及びＣＤ８０−Ｆｃタンパク質（配列番号１３０）は、ＨＥＫ２９３細胞（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）における発現によって得られた。ビオチン化タンパク質であるＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチンは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットを用いて得られた。
【０１３４】
プレートを０．５μｇ／ウェルでＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて一晩、４℃でコーティングし、続いて、実施例２．２で確認されたＣＴＬＡ４に特異的に結合する５００ｎｇの重鎖単一ドメイン抗体（対照は他の無関係の標的に対する単一ドメイン抗体又は単なる緩衝液である）、及び２５ｎｇのＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチン（抗体又はタンパク質をブランク群に添加せず、等容量の緩衝液だけを添加した）を各ウェルに添加し、１時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。対照ＯＤ値に対する試料ＯＤ値が０．８未満である場合、抗体はブロッキング効果を有すると考えられる。
【０１３５】
表２に示されるように、抗体番号Ｃ１、Ｃ１６、Ｃ２７、Ｊ３７、Ｊ４２、１２８、１４５、１５５、１６５は、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４相互作用に対するブロッキング効果を示した。
【０１３６】
【表２】
2019522489.tif 000003
【０１３７】
２．４  マウスＣＴＬＡ４タンパク質に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体の結合
マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質（配列番号１３１）は、ＨＥＫ２９３細胞（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）における発現によって得られた。ビオチン化タンパク質であるｍＣＴＬＡ４−Ｆｃ−ビオチンは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットを使用して得られた。
【０１３８】
プレートは、０．５μｇ／ウェルで、実施例２．１で得られた重鎖単一ドメイン抗体（対照群は、他の無関係の標的に対する単一ドメイン抗体である）、すなわち、実施例２．３の結果に従って選択されたより良好なブロッキング効果を有する４つの抗体１４５、１５５、Ｃ１及びＣ２７を用いて一晩、４℃でコーティングされ、１００μｇのマウスＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を各ウェルに添加し、１．５時間、室温で反応させた。その後、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａより購入した）を添加し、混合物を室温で１．５時間反応させた。洗浄後、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。結果を表３に示す。
【０１３９】
【表３】
2019522489.tif 000004
【０１４０】
本発明のヒトＣＴＬＡ４の重鎖単一ドメイン抗体は、マウスＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質に結合しないことが見てとることができる。
【０１４１】
２．５  ＣＴＬＡ４−Ｆｃ抗原タンパク質に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体の結合曲線
プレートは、０．５μｇ／ウェルで、得られたＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体を用いて一晩、４℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を添加し、１時間、室温で反応させた。洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（ｌａｋｅｐｈａｒｍａ）を添加し、１時間、室温で反応させた。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼｃ発色溶液を添加し、吸光度を波長４０５ｎｍで読み取った。ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４をデータ処理及びマッピング分析に用いて、ＣＴＬＡ４に対する抗体の結合曲線を得て、及び４パラメーター適合によりＥＣ５０値（抗体番号１４については約５０ｎｇ／ｍｌ；抗体番号１５５については約１３ｎｇ／ｍｌ；抗体番号Ｃ１については約１２３ｎｇ／ｍｌ、抗体番号Ｃ２７については約９３ｎｇ／ｍｌ）を得た。１４５及び１５５の結果を図１Ａに示し、Ｃ１及びＣ２７の結果を図１Ｂに示す。
【０１４２】
２．６  ＣＤ８０とＣＴＬＡ４の相互作用に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体のブロッキング曲線
プレートは、０．５μｇ／ウェルのＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、一晩、４℃でコーティングされ、続いて、実施例２．１で得られた、ウェルあたり１００ｕＬの勾配希釈系列（２５０ｎｇ／ｍＬのＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチンを含有する）の１００μＬのＣＴＬＡ４ブロッキング単一ドメイン抗体／ウェルを添加し、１時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。
【０１４３】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４をデータ処理及びグラフ分析に用いて、４パラメーター適合によるＣＤ８０／ＣＴＬＡ４に対する抗体番号Ｃ１、Ｃ２７、１４５、１５５のブロッキング曲線及びＩＣ５０値を得た（抗体番号Ｃ１のＩＣ５０は８５２ｎｇ／ｍＬであり、抗体番号Ｃ２７については約７３１ｎｇ／ｍｌであり、抗体番号１４５については約１．９４７μｇ／ｍｌであり、抗体番号１５５については約４．６９０μｇ／ｍｌである）。１４５及び１５５の結果を図２Ａに示し、Ｃ１及びＣ２７の結果を図２Ｂに示す。
【０１４４】
２．７  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の調製
ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域（配列番号１３２）のアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔ（Ｐ０１８５７）からのヒト免疫グロブリンガンマ１（ＩｇＧ１）の定常領域アミノ酸配列に基づいて得られた。ヒトＩｇＧ１−Ｆｃをコードする核酸断片は、ヒトＰＢＭＣ総ＲＮＡから逆転写ＰＣＲにより得られ、上記実施例で得られたＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体とＦｃの融合タンパク質をコードする核酸断片は、オーバーラップＰＣＲにより得られ、次に、ベクターｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）にサブクローニングされた。
【０１４５】
組換え単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質プラスミドは、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地で希釈し、形質転換のためにＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に添加した。各プラスミド／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞懸濁液に添加し、３７℃及び１０％ＣＯ２で９０ｒｐｍにてインキュベートした。同時に、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を添加した。４時間後、ＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン及び５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を補足し、１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを添加した。５〜６日間培養した後、一過性の発現上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製して、標的ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質を得た。
【０１４６】
抗体番号Ｃ１、Ｃ２７、１４５、１５５のＦｃ融合タンパク質の配列をそれぞれ配列番号１１４〜１１７に示す。
【０１４７】
２．８  ＣＤ８０とＣＴＬＡ４の相互作用に対するＣＴＬＡ４重鎖単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質のブロッキング曲線
プレートは、０．５μｇ／ウェルのＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を用いて、一晩、４℃でコーティングされ、続いて、実施例２．７で得られた、ウェルあたり１００μＬの勾配希釈系列（２５０ｎｇ／ｍＬのＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチンを含有する）のＣＴＬＡ４ブロッキング単一ドメイン抗体を添加し、１．５時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１．５時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。
【０１４８】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４をデータ処理及びグラフ分析に用いて、４パラメーター適合によるＣＤ８０／ＣＴＬＡ４に対する抗体番号１４５、１５５のブロッキング曲線及びＩＣ５０値を得た（抗体番号１４５のＩＣ５０は約３３９ｎｇ／ｍｌであり、抗体番号１５５については約２６１ｎｇ／ｍｌである）。結果を図３に示す。
【０１４９】
実施例３  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体のヒト化
ヒト化は、タンパク質表面アミノ酸ヒト化方法（再表面化）及びＶＨＨヒト化のための普遍的なフレームワークグラフト法（普遍的なフレームワークへのＣＤＲグラフト化）によって実施される。
【０１５０】
ヒト化のステップは以下の通りである：抗体番号Ｃ２７及びＣ１の相同モデリングは、モデリングソフトウェアＭｏｄｅｌｌｅｒ９を用いて行われた。参照相同配列は、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３抗体（ＰＤＢコード：１ＸＦＰ）であり、アミノ酸の相対的溶媒接近可能性は、タンパク質の三次元構造に従って計算される。抗体番号Ｃ２７及びＣ１のアミノ酸の１つが溶媒に曝露された場合、全ての置換が完了するまで、参照ヒト抗体ＤＰ−４７配列の同じ位置でのアミノ酸と置換された。
【０１５１】
抗体番号Ｃ２７をヒト化し、抗体番号Ｃ２７の５種のヒト化変異体を得た；抗体番号Ｃ１をヒト化し、抗体番号Ｃ１の４種のヒト化変異体を得た。表４は、これらのヒト化変異体の配列番号及びその中のアミノ酸変化を、カバット番号付け後のアミノ酸残基番号とともに列挙する。図４ａはＣ２７ヒト化配列のアラインメントを示し、図４ｂはＣ１ヒト化配列のアラインメントを示す。
【０１５２】
【表４】
2019522489.tif 000005
【０１５３】
実施例４  哺乳動物細胞を用いたＣＴＬＡ４ブロッキング抗体タンパク質の調製
４．１  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の調製
ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域のアミノ酸配列（配列番号１３２）は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔ（Ｐ０１８５７）からのヒト免疫グロブリンガンマ１（ＩｇＧ１）の定常領域アミノ酸配列に基づいて得られた。ヒトＩｇＧ１−Ｆｃをコードする核酸断片は、ヒトＰＢＭＣ総ＲＮＡから逆転写ＰＣＲにより得られ、上記実施例で得られたＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体とＦｃの融合タンパク質をコードする核酸断片は、オーバーラップＰＣＲにより得られ、次に、ベクターｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）にサブクローニングされた。
【０１５４】
組換え単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質プラスミドは、抗体発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地で希釈し、形質転換のためにＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に添加した。各プラスミド／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞懸濁液に添加し、３７℃及び１０％ＣＯ２で９０ｒｐｍにてインキュベートした。同時に、５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を添加した。４時間後、ＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン及び５０μｇ／ＬのＩＧＦ−１を補足し、１３５ｒｐｍで培養した。２４時間後、３．８ｍＭのＶＰＡを添加した。５〜６日間培養した後、一過性の発現上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製して、標的ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質を得た。
【０１５５】
得られたＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質の配列をそれぞれ配列番号１１４〜１２６に示し、ここで、配列番号１１８〜１２６はヒト化ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質である。これらの融合タンパク質は、１つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含み、それぞれが２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むホモダイマーを形成し、そのため、これらの融合タンパク質はまた、２価のＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質とも呼ばれる。
【０１５６】
４．２  ＢＭＳからのＣＴＬＡ４抗体の調製
ＢＭＳ  Ｉｎｃ．からの抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブの遺伝子は、米国特許出願公開第２００２／００８６０４１号の抗体１０Ｄ１の方法によりクローニングされ、ベクターｐＣＤＮＡ４にクローニングされた。
【０１５７】
組換えプラスミドは、実施例４．１と同じ方法によりＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトされ、得られたＢＭＳの抗ＣＴＬＡ４抗体を１０Ｄ１と改名した。
【０１５８】
４．３  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質及び公知のＣＴＬＡ４抗体の発現の比較
同じ発現システム及び一過性トランスフェクション条件を用いると、本発明のＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルは４００ｍｇ／Ｌより高かったが、一方、抗体１０Ｄ１の発現レベルは約１５０ｍｇ／Ｌであった。この結果は、本発明のＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質が構造においてより安定であり、公知のＣＴＬＡ４抗体よりも高い発現レベルをもたらすことができることを示す。
【０１５９】
４．４  四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の調製
２つのタンデムＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体と１つのＦｃ領域の融合タンパク質をコードする核酸断片は、オーバーラップＰＣＲにより得られ、次に、ベクターｐＣＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）にサブクローニングされた。構築された組換えプラスミドを用いて、４．１に記載されているのと同じ方法により、一過性発現のためにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。２つのタンデムなＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体と１つのＦｃの融合タンパク質が得られ、これは、４価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質とも呼ばれる、４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含む二量体分子を形成することができた。
【０１６０】
四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の平均的な一過性発現レベルは、約４００ｍｇ／Ｌであり、二価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質のそれに匹敵する。
【０１６１】
実施例５  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の特徴付け
５．１  ＣＴＬＡ４に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合能力（ＥＬＩＳＡによる）
プレートは、実施例２．７及び４．１により得られた０．５μｇ／ウェルのＣＴＬＡ４単一ドメインＦｃ融合タンパク質、及び例４．２により得られた１０Ｄ１タンパク質で一晩、４℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のＣＴＬＡ４−Ｆｃ−ビオチンを添加し、１時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１．５時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。
【０１６２】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４は、データ処理及びグラフ分析に用いられた。４パラメーター適合により、ＣＴＬＡ４に対する抗体の結合曲線及びＥＣ５０値（全ての試験抗体のＥＣ５０値は約６０〜７０ｎｇ／ｍＬである）が得られ、ＣＴＬＡ４に対する親和性を反映した。
【０１６３】
結果を図５に示す。この場合、縦軸はＯＤ４０５であり、横軸はＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質（又は１０Ｄ１タンパク質）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）である；抗体番号Ｃ２７のＦｃ融合タンパク質の４種の異なるヒト化形態は、ｈｕＣ２７ｖ１−ＬｄＦｃ（配列番号１１８）、ｈｕＣ２７ｖ２−ＬｄＦｃ（配列番号１１９）、ｈｕＣ２７ｖ３−ＬｄＦｃ（配列番号１２０）、ｈｕＣ２７ｖ４−ＬｄＦｃ（配列番号１２１）として標識された。４つのタンパク質は、ＣＴＬＡ４に匹敵する親和性を有し、ＢＭＳの非ヒト化Ｃ２７−ＬｄＦｃ及び公知のＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ１に匹敵する。
【０１６４】
５．２  ＣＴＬＡ４に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合能力（ＥＬＩＳＡによる）
プレートは、実施例２．７及び４．１により得られた０．５μｇ／ウェルのＣＴＬＡ４単一ドメインＦｃ融合タンパク質を用いて一晩、４℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のＣＴＬＡ４−Ｆｃ−ビオチンを添加し、１時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１．５時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。
【０１６５】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４は、データ処理及びグラフ分析に使用された。４パラメーター適合により、ＣＴＬＡ４に対する抗体の結合曲線及びＥＣ５０値（全ての試験抗体のＥＣ５０値は約２５〜３５ｎｇ／ｍＬである）が得られ、ＣＴＬＡ４に対する親和性を反映した。
【０１６６】
結果を図６に示す。この場合、縦軸はＯＤ４０５であり、横軸はＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）である；三角は、抗体番号Ｃ２７のヒト化形態Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ２７ｖ３−ＬｄＦｃ（配列番号１２０）を表し、四角は、抗体番号Ｃ１のヒト化形態Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−Ｌｄ−Ｆｃ（配列番号１２６）を表し、円は、抗体番号Ｃ１のＦｃ融合タンパク質であるＣ１−ｌｄ−Ｆｃを表す。Ｃ１−ｌｄ−Ｆｃは、長い反応時間のために他の２つよりもはるかに高い着色度を有し、したがって、良好なＥＣ５０を示す。しかしながら、ＣＴＬＡ４に対する３種のタンパク質の親和性において実際には差がない。
【０１６７】
５．２  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質のＣＴＬＡ４−ＣＤ８０相互作用に対するブロッキング効果（競合ＥＬＩＳＡによる）
プレートは、０．５μｇ／ウェルのＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質で一晩、４℃でコーティングされ、続いて、ウェルあたり、実施例４．１によって得られたＣＴＬＡ４単一ドメインＦｃ融合タンパク質又は実施例４．２によって得られた１０Ｄ１タンパク質の勾配希釈系列（２５０ｎｇ／ｍＬのＣＤ８０−Ｆｃ−ビオチンを含有する）を１００ｕＬ添加し、１時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。
【０１６８】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４は、データ処理及びグラフ分析に使用された。４パラメーター適合により、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０に対する抗体のブロッキング曲線及びＩＣ５０値が得られた。結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。２種の異なる単一ドメイン抗体Ｃ２７及びＣ１は、ヒト化配列又は元の配列であるかどうかにかかわらず、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０相互作用をブロックする同等の能力を有し、ＢＭＳの既に市販されている抗体（１０Ｄ１と標識されている）よりも優れていることが見てとれる。
【０１６９】
５．３  ＣＴＬＡ４に対する四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合能力（ＥＬＩＳＡによる）
プレートは、実施例４．１により得られたＣＴＬＡ４単一ドメインＦｃ融合タンパク質及び実施例４．４により得られた四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質を０．５μｇ／ウェルで一晩、４℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のＣＴＬＡ４−Ｆｃ−ビオチンを添加し、１時間、室温で反応させた。ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、１．５時間、室温で反応させた。発色溶液を添加した後、吸光度を４０５ｎｍの波長で読み取った。
【０１７０】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４は、データ処理及びグラフ分析に使用された。４パラメーター適合により、ＣＴＬＡ４に対する抗体の結合曲線及びＥＣ５０値（全ての試験抗体のＥＣ５０値は約２５〜３５ｎｇ／ｍＬである）が得られ、ＣＴＬＡ４に対する親和性を反映した。
【０１７１】
結果を図８に示す。この場合、縦軸はＯＤ４０５であり、横軸はＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）である；三角は、四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃ（配列番号１２８）を表し；四角は、抗体番号Ｃ１のヒト化形態Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−Ｆｃを表し；円は、ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体番号Ｃ１のＦｃ融合タンパク質であるＣ１−ｌｄ−Ｆｃを表す。３つのタンパク質のＥＣ５０はわずかに異なるが、四価タンパク質の分子量が２価分子の約５／４であることを考慮すると、モル濃度に変換した場合の３つのタンパク質のＣＴＬＡ４に対する親和性に差はない。
【０１７２】
５．４  ＣＴＬＡ４に対する二価及び四価のＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合能力の同定及び比較（ＳＰＲ法）
組換えヒトＣＴＬＡ４に対する、上記の実施例において得られたＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合反応速度論は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００装置を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）法により測定された。組換えラクダ抗ヒトＦｃ抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに結合させて、約１０００反応単位（ＲＵ）を得た。反応速度論測定について、抗体をＨＢＳ−ＥＰ＋１×緩衝液（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ−１００６−６９）を用いて一定濃度（１．３７〜１０００ｎｍ）に希釈し、２５℃で１２０秒間注入して、ＣＴＬＡ４及びマウスＦｃの融合タンパク質について連続して３倍希釈し、２５℃で１２０秒間注入して、解離時間を３０分とし、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で１２０秒間再生した。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、単純な１対１のＬａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて計算された。平衡解離定数（ｋＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。
【０１７３】
抗ＣＴＬＡ４抗体の測定された結合親和性を表５に示す。結果は、四価分子の親和性がおそらく特定の立体障害のために二価分子の親和性よりわずかに低いことを示す。
【０１７４】
【表５】
2019522489.tif 000006
【０１７５】
５．４  ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０相互作用に対する二価及び四価ＣＴＬＡ４単一ドメインＦｃ融合タンパク質のブロッキング能（細胞中和実験による）
９６ウェルプレートは、抗ヒトＣＤ３（５０ｎｇ／ｍＬ）を補足した１．５×１０５個のＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（中国科学アカデミーの上海細胞バンク）を接種され、３７℃で１５分間インキュベートした。次に、二価又は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質（３０ｎｇ／ｍｌ〜０．９４ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌのＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質を希釈液に添加した）及び等密度のＲａｊｉ細胞（中国科学アカデミーの上海細胞バンク）を添加した。培養２４時間後、ＩＬ−２発現の検出のために上清を回収した。データをＳｏｆｔ  Ｍａｘで処理して、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質の中和を介した、二価又は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＩＬ−２の阻害効果を計算した。ＥＣ５０を用いて効果を比較した。
【０１７６】
結果を図９に示す。二価及び四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質（それぞれ正方形及び三角で表す）は、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０の阻害において同等であり、既に市販されているＢＭＳのＣＴＬＡ４抗体よりも優れていた（１０Ｄ１として標識され、円で示される）。
【０１７７】
５．５  ＣＴＬＡ４タンパク質に対するＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の結合特異性
ヒトＨＥＫ２９３細胞は、全長ヒトＢ７ファミリータンパク質遺伝子を有するプラスミド（ｐＣＤＮＡ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＶ８６２２０）の一過性トランスフェクションにより、膜上にヒトＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＰＤ１タンパク質を一過性に発現する。このプラスミドはまた、標的タンパク質のＣ末端がＥＧＦＰタンパク質に融合されるのを可能にし、それにより、膜上に発現されるＢ７ファミリータンパク質のレベルは緑色蛍光強度によって検査され得るようにする。構築された一過性にトランスフェクトされた細胞株には、２９３−ＣＴＬＡ４−ＥＧＦＰ、２９３−ＰＤ１−ＥＧＦＰ、２９３−ＣＤ２８−ＥＧＦＰが含まれる。
【０１７８】
構築された細胞を０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、ｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃ抗体を添加した。同時に、他の無関係の標的に対する、２μｇの単一ドメイン抗体の陰性対照を設定し、氷上で２０分間インキュベートした。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ二次抗体である抗ｈＩｇ−ＰＥを氷上で２０分間添加した。洗浄後、細胞を５００μｌの０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーにより検出した。
【０１７９】
結果を図１０に示す。上段は対照群を示し、下段は試料群を示す。ｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−ＦｃはヒトＣＴＬＡ４タンパク質のみに特異的に結合し、他のＢ７ファミリータンパク質には結合しないことは明らかである。
【０１８０】
５．６  サルＣＴＬＡ４タンパク質への四価ＣＴＬＡ４単一ドメインＦｃ融合タンパク質の結合
サルＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質をＹｉｑｉａｏ  Ｓｈｅｎｚｈｏｕから購入した。ビオチン化タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃ−ビオチンは、実施例４．４において得られた四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質を用いて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｂｉｏｔｉｎｌｙｔｉｏｎキットの使用により得られた。
【０１８１】
プレートは、０．５μｇ／ウェルのサルＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質又はヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質で一晩、４℃でコーティングされ、続いて、勾配希釈系列のｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃ−ビオチンを添加し、１時間、室温で反応させた。次に、ＳＡ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａから購入した）を添加し、室温で１．５時間反応させた。次に、発色剤を添加し、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。
【０１８２】
ＳｏｔｆＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４は、データ処理とグラフ分析に使用された。４パラメーター適合により、サルＣＴＬＡ４又はヒトＣＴＬＡ４に対する抗体のブロッキング曲線及びＥＣ５０値が得られた。
【０１８３】
結果を図１１に示す。縦軸はＯＤ４０５であり、横軸は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の濃度（ｎｇ／ｍＬ）である；三角は、サルＣＴＬＡ４との結合を表し、四角及び円は、ヒトＣＴＬＡ４との結合を表す。四価のＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、サルＣＴＬＡ４タンパク質に効率的に結合することができることが見てとれる。
【０１８４】
５．７  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣの活性化
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常ドナーの末梢血から、ヒトリンパ球（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）用の単離溶液を用いた密度勾配遠心分離によって単離された。
【０１８５】
プレートは、０．３μｇ／ウェルの抗ＣＤ３抗体で一晩、４℃でコーティングされた。翌日、１×１０５個のＰＢＭＣを各ウェルに添加し、同時に１０μｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−Ｆｃ、ｈｕＣ２７−Ｆｃ又はＢＭＳ  ＣＴＬＡ４抗体（１０Ｄ１と命名される）をそれぞれ、各ウェルに添加した。５日間培養した後、上清を採取し、上清中のＩＦＮ−γレベルをＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により検出した。
【０１８６】
結果を図１２に示す。１０μｇ／ｍＬの濃度で、抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＢＭＣ細胞によるγ−インターフェロンの分泌を増強することができ、すなわち、ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＢＭＣ細胞の活性化を増強することが見てとれる。さらに、ｈｕＣ１ｖ４−Ｌｄ−ＦｃとｈｕＣ２７ｖ３−Ｌｄ−Ｆｃの両方は、ＢＭＳ抗ＣＴＬＡ４抗体よりも良好な活性を示した。
【０１８７】
５．８  二価及び四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣの活性化
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常ドナーの末梢血から、ヒトリンパ球（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）用の単離溶液を用いた密度勾配遠心分離によって単離された。
【０１８８】
プレートは、０．３μｇ／ウェルの抗ＣＤ３抗体で一晩、４℃でコーティングされた。翌日、１×１０５個のＰＢＭＣを各ウェルに添加し、同時に０．０３ｕｇ／ｍＬの二価又は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−ＬＤ−Ｆｃ（図中、Ｌｄとして標識される）、ｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃ（図中、ｔｅｔとして標識される）又はＢＭＳ  ＣＴＬＡ４抗体（１０Ｄ１と命名される）をそれぞれ、各ウェルに添加した。５日間培養した後、上清を採取し、上清中のＩＦＮ−γレベルをＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により検出した。
【０１８９】
結果を図１３に示す。０．０３μｇ／ｍＬの低用量濃度で、抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質（二価又は四価の両方）は、ＰＢＭＣ細胞によるγ−インターフェロンの分泌を増強することができ、すなわち、二価又は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、０．０３μｇ／ｍＬの低用量濃度で、ＰＢＭＣ細胞の活性化を有意に増強することが見てとれる。さらに、４価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質であるｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃは、ＢＭＳ抗ＣＴＬＡ４抗体よりも良好な活性を示した。
【０１９０】
５．９  樹状細胞−Ｔ細胞混合リンパ球反応におけるＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、健常ドナー由来の末梢血の白血球から、ヒトリンパ球（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）用の単離溶液を用いた密度勾配遠心分離によって単離された。次に、それらを無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地とともに１〜２時間インキュベートして、非付着性細胞を除去し、細胞を１０％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ中で培養した。５〜６日間培養した後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを添加し、２４時間インキュベートして、成熟樹状細胞を得た。
【０１９１】
この方法で得られた樹状細胞を２×１０５／ｍｌのＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した。次に、ウェルあたり５０μｌを９６ウェルのＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ：３７９９）に添加し、インキュベーター中で培養した。
【０１９２】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、磁気ビーズ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：１３０−０９６−５３３）を用いて、製造業者の指示書に従って、別のドナーのＰＢＭＣから単離された。
【０１９３】
上記の方法で得られた１×１０４個の樹状細胞及び１×１０５個のＣＤ４＋Ｔ細胞を混合し、ＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、９６ウェル培養プレートに添加し、５０μｌの細胞混合物を各ウェルに添加した。ＲＰＭＩ完全培地に希釈された、ウェルあたり１００μｌのｈｕＣ１ｖ４−Ｌｄ−Ｆｃを０．１μｇ／ｍｌ又は０．０１μｇ／ｍｌの最終抗体濃度に添加した。上清を培養５〜７日後に回収し、上清中のＩＦＮ−γレベルをＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により検出した。
【０１９４】
結果を図１４に示す。ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、混合リンパ球反応においてＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を増強することができることが見てとれる。すなわち、ＣＴＬＡ４ブロッキング単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔ細胞活性化を増強する。さらに、この生物学的活性は濃度依存性であり、Ｔ細胞の有意な活性化が低用量濃度（０．０１μｇ／ｍｌ）で観察された。
【０１９５】
５．１０  ヒト化マウスにおける四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の抗腫瘍効果
ＣＴＬＡ４ヒト化マウス（すなわち、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質を発現するマウス）に５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞を接種した。
【０１９６】
接種後の７、１０、１３、及び１６日目に、１００μｇの試験試料又は同量のヒト免疫グロブリン（対照群として）を腹腔内投与した。腫瘍サイズは、接種後５日目から２０日目まで、２日ごとに測定された。検査した試料は、４価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質（図中のＴｅｔ）、及びＢＭＳによって市販されているＣＴＬＡ４モノクローナル抗体であるイピリムマブを含んだ。
【０１９７】
以下の図に示される結果から、ＣＴＬＡ４ヒト化マウスにおける４価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の抗腫瘍効果は、約５ｍｇ／ｋｇの用量でＢＭＳイピリムマブの効果に匹敵した。
【０１９８】
実施例６：ラットにおけるＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態
ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質をＳＤラットに単回静脈内（ＩＶ）投与し、血液試料を様々な時点で回収し、Ｅｌｉｓａアッセイを用いて、試験物質の投与後、ラットの血漿中の試験物質の濃度を決定した。薬物動態パラメーターを計算した。
【０１９９】
動物の選択：６〜８週齢及び体重２００〜３００ｇのＳＤラットを選択した。それらをランダムに２群に分け、各群は８匹であり、半分が雄であり、半分が雌であった。
【０２００】
投与：１０ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内（ＩＶ）投与。
【０２０１】
採血：投与前、投与直後、投与後の様々な時点で、約０．５ｍｌの血液は、各ラットの頸静脈から毎回を回収された。回収された血液を迅速に遠心分離して血清を分離し、分析するまで−８０℃で保存した。
【０２０２】
血液薬物濃度の検出：血清中のＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の含量をサンドイッチＥＬＩＳＡによって検出した。プレートは、ＣＴＬＡ４特異的抗体を捕捉するために、組換えヒトＣＴＬＡ４タンパク質でコーティングされ、Ｆｃ領域は、完全なＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の検出を確認するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）で検出された。
【０２０３】
データ処理：関連する薬物動態パラメーターは、ＡＵＣ（０−ｔ）、ＡＵＣ（０−∞）、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｔ１／２、Ｖｓｓ、ＭＲＴなどを含む血中薬物濃度対時間の曲線を用いて計算された。
【０２０４】
ラットにおける二価及び四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の血中薬物濃度対時間の曲線を図１６に示す（ａは二価抗体ｈｕＣ１ｖ４−Ｌｄ−Ｆｃであり、ｂは四価抗体ｈｕＣ１ｖ４−ｔｅｔ−Ｆｃである）。薬物動態パラメーターを図１７に示す。この結果は、二価又は四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の両方が、ラットにおいてより長いインビボ半減期（５日を超える）を有し、良好なインビボ安定性を指示することを示した。同時に、最も高い血中濃度を維持する場合、四価抗体は２倍となるインビボ半減期（１１日を超える）を有していた。このように、インビボでの四価抗体の有効血中濃度の維持はより長いと結論付けら、臨床投与はより長い間隔を有し得ることが期待される。
【０２０５】
実施例７：ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質のドラッガビリティー（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）の評価
７．１  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の物理化学的性質
ヒト２９３ＨＥＫ細胞により発現され、アフィニティー精製された四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、実施例４．４に記載される方法によって得られた。次に、そのドラッガビリティーは、ＳＥ−ＨＰＬＣ、還元性条件下でのＣＥ、ＣＥ、ＷＣＸ、非還元条件下でのＤＳＣによる予備的な物理的及び化学的性質分析によって評価された。具体的な値を以下の表に記載する。これらのデータから、四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、良好な物理的及び化学的性質を有し、工業的規模の生産に適していることが予め決定され得る。
【０２０６】
【表６】
2019522489.tif 000007
【０２０７】
７．２  ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の熱破壊試験
ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質をＵＦ／ＤＦによって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液に交換して２０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。熱破壊試験は、４０℃に上昇させて、３０日間行われた。０日目、１０日目、２０日目、及び３０日目の試料は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって純度について試験され、変化の傾向を以下の図に示す。４０℃では、調製物を最適化することはなく、主ピークの純度はわずかに低下したが、凝集及び分解の明確な傾向は観察されなかったことが見てとれる。同時に、そのより高いＴｍ値を考慮すると、タンパク質が良好な熱安定性を有することが決定され得る。
【０２０８】
実施例８：ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質の予備毒性の評価
４匹のカニクイザルをランダムに２群に分け、さらに各群を２つに分け、半分が雄であり、半分が雌であり、それぞれ低用量群及び高用量群（それぞれ７．５及び３０ｍｇ／ｋｇ）とした。四価ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、後肢静脈ボーラスを介して１回投与された。投与前（Ｄ−１）、投与後のＤ１５及びＤ２９に、体重、血球数、血液凝固能、血液生化学及び免疫原性の指標を検出した。
【０２０９】
試験中、４匹の動物は死亡及び瀕死を示さなかった。単回投薬７．５〜３０ｍｐｋのカニクイザルに関して、血液学的指標のリンパ、Ｅｏｓ、Ｂａｓｏ、Ｍｏｎｏの有意な増加が観察された。他の動物群の臨床観察、体重、凝固能、血液生化学的指標は、毒性学的有意性を伴う変化を示さなかった。
【０２１０】
したがって、７．５及び３０ｍｐｋでのカニクイザルへの単回静脈内注射は、有意な毒性を示さず、ＮＯＡＥＬは３０ｍｇ／ｋｇ以上であった。ＢＭＳのイピリムマブについて報告された非臨床ＮＯＡＥＬは約１０ｍｇ／ｋｇである。ＣＴＬＡ４単一ドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質は、イピリムマブよりも毒性の副作用が低いものと判断することができる。
【図１】
2019522489.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
2019522489000001.app
【国際調査報告】
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