(57)【要約】本発明は、対象からなどの試料中の非天然核酸の量を評価するための、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、対象における、移植拒絶反応などの状態のリスクを決定するために、使用し得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、該試料は、非天然核酸および天然核酸を含み、該方法は、
ミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから結果を得ること、および
該結果に基づいて試料中の非天然核酸の量を決定することを含み、ここで、決定することは、該結果を平均して該量を決定すること、および平均することは、中央値を採ることである、
前記方法。
【請求項２】
決定することが、または方法がさらに、ロバストな標準偏差および／またはロバストな変動係数を使用し、結果を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
決定することが、または方法がさらに、不一致な値を使用し、結果を分析することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、該試料は、非天然および天然核酸を含み、該方法は、
ミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから結果を得ること、および
該結果に基づいて試料中の非天然核酸の量を決定することを含み、ここで、決定することは、ロバストな標準偏差および／またはロバストな変動係数を使用し、該結果を分析することを含む、
前記方法。
【請求項５】
決定することが、または方法がさらに、不一致な値を使用し、結果を分析することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法であって、該試料は、非天然および天然核酸を含み、該方法は、
ミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから結果を得ること、および
該結果に基づいて試料中の非天然核酸の量を決定することを含み、ここで、決定することは、不一致な値を使用し、該結果を分析すること
を含む、
前記方法。
【請求項７】
量が、レポートにおいて提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対象からの１つ以上の試料中の非天然核酸の１つ以上の量に基づいて対象におけるリスクを評価する方法であって、該試料（単数または複数）は、非天然および天然核酸を含み、該方法は、
対象からの１つ以上の試料中の非天然核酸の１つ以上の量を得ること、ここで、該量は、１つ以上のミスマッチ増幅に基づく定量アッセイの結果から決定される、および
非天然核酸の量（単数または複数）に基づいてリスクを評価すること
を含む、前記方法。
【請求項９】
量（単数または複数）が、レポートから得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
量（単数または複数）が、天然核酸または全核酸に対する非天然核酸の比または百分率である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
天然または全核酸の量もまた決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
各々のミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイが、
複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）の標的の各々について、少なくとも２つのプライマー対で試料の核酸またはその一部の増幅を実施すること、ここで、各々のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいて、ＳＮＶ標的の１つのアレルと比較して、３’末端から２番目であるミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の別のアレルと比較して、３’の２重ミスマッチを含み、およびＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、および少なくとも２つのプライマー対の別のものは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および
増幅から結果を得ることまたは提供すること
を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２つのプライマー対の別のプライマー対が、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルと比較して３’末端から２番目のミスマッチも含むが、ＳＮＶ標的の１つのアレルと比較して３’二重ミスマッチも含み、およびＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
結果が、増幅の情報提供的な結果である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、増幅アッセイの情報提供的な結果を選択すること含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
増幅の情報提供的な結果が、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型に基づいて選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型を得ることを含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、複数のＳＮＶ標的の各々について少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９０のＳＮＶ標的である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
複数のＳＮＶ標的が、少なくとも９５のＳＮＶ標的である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複数のＳＮＶ標的が、１０５未満のＳＮＶ標的である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数のＳＮＶ標的が、１００未満のＳＮＶ標的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
非天然核酸の遺伝子型が、未知または得られないとき、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、可能性の高い非天然遺伝子型の予測に基づく結果を評価することを含む、請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
評価することが、期待値最大化アルゴリズムによって実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、天然遺伝子型、および可能性の高い非天然遺伝子型の予測に基づく情報提供的な結果を選択することを含む、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
期待値最大化が、可能性の高い非天然遺伝子型を予測するために使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、天然核酸の遺伝子型を得ることを含む、請求項１２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む、請求項１２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイがさらに、複数のＳＮＶ標的の各々について、少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む、請求項１２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
最大尤度が、非天然核酸の量を決定するために使用される、請求項１２〜３０いずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
試料（単数または複数）が、無細胞ＤＮＡ試料を含み、および、量が、非天然無細胞ＤＮＡの量である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
対象が、移植レシピエントであり、および、非天然核酸の量が、ドナー特異的無細胞ＤＮＡの量である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
移植レシピエントが、心臓移植レシピエントである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
移植レシピエントが、小児移植レシピエントである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
増幅が、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲなどの定量的ＰＣＲによる、請求項１２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
量（単数または複数）に基づいてリスクを決定することをさらに含む、請求項１〜７および９〜３６いずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
リスクが、移植に関連するリスクである、請求項８または３７に記載の方法。
【請求項３９】
移植が、心臓移植である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
移植が、小児移植である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
方法がさらに、または評価することが、非天然核酸の量（単数または複数）に基づき、対象への処置を選択することを含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
方法がさらに、または評価することが、非天然核酸の量（単数または複数）に基づいて、対象を処置することを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
方法がさらに、または評価することが、非天然核酸の量（単数または複数）に基づいて、対象への処置について情報を提供することを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
方法がさらに、または評価することが、対象において経時的に非天然核酸の量（単数または複数）のモニタリングをすること、または、該モニタリングを提案することを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
方法がさらに、または評価することが、後続の時点での対象における非天然核酸の量（単数または複数）を得ることを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
方法がさらに、または評価することが、非天然核酸の量（単数または複数）に基づき、対象に投与された処置の効果を評価することを含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
処置が、抗拒絶反応療法である、請求項４１〜４３および４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
処置が、抗感染症療法である、請求項４１〜４３および４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
試料（単数または複数）またはその一部を提供すること、または得ることをさらに含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
試料（単数または複数）から核酸を抽出することをさらに含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
試料（単数または複数）が、血液、血漿または血清を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
試料（単数または複数）が、心臓移植などの移植から１０日以内の対象からのものである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
試料（単数または複数）が、心臓移植などの移植から２４時間以内の対象からのものである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
試料（単数または複数）が、心臓移植などにおけるクロスクランプ除去から２４時間以内の対象からのものである、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の元で、２０１６年１１月２日に出願された米国仮出願第62/416696号および２０１７年８月１７日に出願された米国仮出願第62/546789号の出願日の利益を主張し、この仮出願の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価するための、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、移植拒絶反応などの状態のリスクを決定するために使用し得る。本発明はさらに、非天然無細胞デオキシリボ核酸（ドナー特異的無細胞ＤＮＡなどの非天然無細胞ＤＮＡ）の量を評価するための、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を使用する方法および組成物に関する。
【０００３】
発明の背景
試料中の非天然核酸を検出しおよび定量する能力は、移植拒絶反応などの早期検出の余地を与えることがあるだろう。核酸異種集団の定量的分析のための現在の方法（例えば、天然および非天然核酸の混合物）は、しかしながら限定される。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は少なくとも部分的に、多重／最適化ミスマッチ増幅を用いて対象からの試料中の低頻度の非天然核酸を定量し得るという、驚くべき発見に基づく。多重／最適化ミスマッチ増幅は、特定配列の増幅のために３’末端から２番目のミスマッチを、しかし代替配列に対しては２重ミスマッチを含むことがあるプライマーの設計を包含する。かかるプライマーでの増幅は、核酸異種集団において、非天然核酸の量が例えば１％未満、または０．５％である場合でさえ、試料中の非天然核酸の量の定量的決定を可能にする。
【０００５】
本明細書に提供されるのは、かかる最適化された増幅に関連する方法、組成物、キットおよびレポートである。本方法、組成物、キットおよびレポートはそれぞれ、実施例および図にあるものの任意の１つを含む、本明細書で提供される方法、組成物、キットおよびレポートの任意の１つであることができる。
【０００６】
ある側面において、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価する方法、ここで非天然核酸および天然核酸を含む試料が提供される。本方法は、ミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから結果を得ること、およびその結果に基づき試料中の非天然核酸の量を決定することを含み、ここにおいて決定することは、量を決定するために結果を平均すること、および平均することは中央値を採ることを含む。
【０００７】
別の側面において、対象からの試料中の天然核酸の量を評価する方法で、試料は、非天然および天然核酸を含み、ミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから結果を得ること、および結果に基づき試料中の非天然核酸の量を決定することが、ここにおいて決定することは、ロバストな標準偏差および／またはロバストな変動係数を使用して結果を分析することを含む、前記決定することが提供される。
【０００８】
別の側面において、対象からの試料、非天然および天然核酸を含む試料、における非天然核酸の量を評価する方法は、ミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから結果を得ることを含み、および結果に基づき、試料中の非天然核酸の量を決定することを含み、ここにおいて、決定することは、不一致な値を使用し結果を分析することを含む。
【０００９】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、決定することは、または、方法はさらに、ロバストな標準偏差および／またはロバストな変動係数を使用し結果を分析することを含む。
本明細書において提供される方法の任意の１つのある態様において、決定することまたは方法はさらに、不一致な値を使用し結果を分析することを含む。
【００１０】
別の側面において、対象からの１つ以上の試料中の１つ以上の量の非天然核酸に基づく、対象におけるリスクを評価する方法は、非天然および天然核酸を含む試料、対象からの１つ以上の試料中に、１つ以上の量の天然核酸を得ること、そしてその量が、１つ以上のミスマッチ増幅に基づく定量アッセイから決定され、各々が本明細書に提供されるかかるアッセイの任意の１つにおいて定義され、および非天然核酸の量に基づくリスクを評価することを含む。
【００１１】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、量はレポートから得られ、またはレポートにおいて提供される。
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、量は、天然核酸または全核酸に対する非天然核酸の比率またはパーセンテージである。
本明細書において提供される任意の１つの方法のある態様において、天然または全核酸の量もまた決定される。
【００１２】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイは、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的の各々のため、試料またはその一部などにおける少なくとも１つのプライマー対を用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅を含み、ここにおいて、少なくとも１つのプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここにおいて少なくとも１つのプライマー対は、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）と比較して、３’ミスマッチを伴うプライマー（例えば、末端から２番目であるミスマッチ）、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えば、アレル）と比較して３’２重ミスマッチを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）を特異的に増幅する。
【００１３】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、各々のＳＮＶ標的のために、少なくとも１つ別のプライマー対を伴う核酸増幅を含み、ここにおいて、少なくとも１つ別のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここにおいて、少なくとも１つ別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の１つ別の配列（例えば、アレル）を、特異的に増幅する。
【００１４】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイは、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的の各々に、少なくとも２つのプライマー対に伴う、試料、またはその一部における、ＰＣＲなどの核酸増幅を含み、ここにおいて各々のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここにおいて、少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）と比較して、３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目である、しかしＳＮＶ標的の１つ別の配列（例えば、アレル）と比較して３’二重ミスマッチを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）を特異的に増幅し、および少なくとも２つのプライマー対の１つ別が、ＳＮＶ標的の１つ別の配列（例えば、アレル）を、特異的に増幅する。
【００１５】
本明細書において提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイは、複数のＳＮＶ標的について各々のかかるＳＮＶ標的のための、少なくとも２つのプライマー対などの本明細書において提供される試料の少なくとも１つのプライマー対を用いる試料のＰＣＲなどの核酸増幅を含み、ここにおいて各々のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、天然核酸および／または非天然核酸の遺伝子型に基づく情報提供的な結果を選択する。
【００１６】
本明細書において提供される任意の１つのある態様において、方法は、情報提供的な結果に基づき、試料中の非天然核酸の量を決定することを含んでいてもよい。
本明細書において提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、複数のＳＮＶ標的を同定することを含む。本明細書において提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、非天然核酸の遺伝子型を推論することを含む。
【００１７】
本明細書において提供される方法の任意の１つのある態様において、量を決定することは、中央値を採るなどの平均することを含む。本明細書において提供される方法の任意の１つのある態様において、量は、情報提供的な結果などの結果の中央値などの平均値に基づく。
【００１８】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、決定することは、または方法はさらに、ロバストな統計を使用し結果を分析する方法を含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、ロバストな標準偏差などの標準偏差、および／または、ロバストな変動係数などの変動係数、または％ロバストな変動係数などの％ロバストな変動係により、結果は分析されることがある。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、量は少なくとも部分的にまたは方法はさらに、ロバストな統計を使用する結果の分析を含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、分析は、ロバストな標準偏差などの標準偏差、および／またはロバストな変動係数などの変動係数、または％ロバストな％変動係数などの％変動係数の使用を包含する。
【００１９】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、決定すること、または、方法はさらに、不一致な値を使用し結果を分析することを含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、結果は、不一致な値により分析されることができる。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、量は、少なくとも部分的に、不一致な値を使用する分析に基づき、または方法はさらに、不一致な値を使用する結果の分析を含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、分析は、不一致な値の使用を包含する。
【００２０】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイは、試料またはその一部において実施される、少なくとも２つのプライマー対などの少なくとも１つのプライマー対をもちいる、複数のＳＮＶ標的の各々について、ＰＣＲなどの、核酸増幅を含み、ここにおいて、各々のプライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここにおいて、２つ以上などの１つ以上のうち１つのプライマー対が、ＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）について３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目であるミスマッチ）を、しかしＳＮＶ標的の別の配列（例えば、アレル）について３’二重ミスマッチを含み、およびＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）を特異的に増幅し、および天然遺伝子型および／または可能性の高い非天然遺伝子型の予測に基づく情報提供的な結果を決定することを含む。
【００２１】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、各々のＳＮＶ標的について、少なくとも１つ別のプライマー対を用いるＰＣＲなどの核酸増幅を含む。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、少なくとも１つ別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の１つ別の配列（例えば、アレル）について、少なくとも１つ別の３’ミスマッチ（例えば、末端から２番目である）を、しかしＳＮＶ標的の１つの配列（例えば、アレル）について、３’二重ミスマッチを含み、およびＳＮＶ標的の１つ別の配列（例えばアレル）を、特異的に増幅する。
【００２２】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、増幅結果に基づいて非天然核酸の量を評価することを含む。本明細書で提供される方法の提供される方法の任意の１つのある態様において、結果は情報提供的な結果である。
【００２３】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、ＰＣＲ増幅などの、増幅の情報提供的な結果を選択することを含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、選択された情報提供的な結果は、中央値平均などで平均される。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、ロバストな統計により結果をさらに分析することを含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、結果は、ロバストな標準偏差などの標準偏差により、および／またはロバストな変動係数などの変動係数、または％ロバストな変動係数などの、％変動係数によりさらに分析されることができる。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、不一致な値により結果を分析することを含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、結果は、不一致な値によりさらに分析されることができる。
【００２４】
提供される方法の任意の１つのある態様において、ＰＣＲなどの核酸増幅の情報提供的な結果は、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型に基づいて選択される。
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、非天然核酸および／または天然核酸の遺伝子型を得ることを含む。
【００２５】
本明細書で提供される方法の任意の１つの態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、天然遺伝子型、および可能性の高い非天然遺伝子型の予測に基づく情報提供的な結果を選択することを含む。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、非天然核酸の遺伝子型が、知られないまたは得られないとき、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、可能性の高い非天然遺伝子型の予測に基づく結果を評価することを含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、評価することまたは予測が期待値最大化アルゴリズムをもちいて実施される。提供される方法の任意の１つの態様において期待値最大化は、可能性の高い非天然遺伝子型を予測するために使用される。
【００２６】
提供される方法の任意の１つのある態様において、最大尤度は、非天然核酸の量を計算するために使用される。
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む。
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイはさらに、複数のＳＮＶ標的の各々について、少なくとも２つのプライマー対などの少なくとも１つを得ることを含む。
【００２７】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチ増幅に基づく 定量的アッセイはさらに、結果を得ることまたは提供することを含む。提供される方法の任意の１つのある態様において、結果は情報提供的な結果である。
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、量を得ることまたは量を提供することを含む。
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、結果または量は、レポートにおいて提供される。
【００２８】
１つの側面において、本明細書において提供される任意の１つの方法の結果および／または量を含有するレポートが提供される。提供される任意の１つの方法またはレポートのある態様において、結果は、情報提供的な結果である。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、結果は、レポートから得られる。
提供されるレポートの任意の１つのある態様において、レポートは、電子形式で与えられる。提供されるレポートの任意の１つのある態様において、レポートは、ハード版である。提供されるレポートの任意の１つのある態様において、レポートは、口述で与えられる。
【００２９】
任意の１つの方法のある態様において、ＳＮＶ標的当たり、少なくとも１つのプライマー対、少なくとも２つのプライマー対、少なくとも３つのプライマー対、少なくとも４つのプライマー対またはより多くある。提供される方法の任意の１つのある態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも４５、４８、５０、６０、６５、７０、７５、８５、９０またはより多い。提供される方法の任意の１つのある態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも９０、９５またはより多くの標的である。提供される方法の任意の１つの態様において、複数のＳＮＶ標的は、９０、９５より少ない、またはより多くのものよりも少ない標的である。提供される方法の任意の１つのある態様において、複数のＳＮＶ標的は、１０５または１００標的より少ない。
【００３０】
提供される方法の任意の１つのある態様において、ミスマッチのプライマーは、フォワードプライマーである。任意の１つの方法のある態様において、プライマー対についてのリバースプライマーは、各々のＳＮＶ標的についてと同じである。
【００３１】
提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．００５％である。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．０１％である。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．０３％である。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．０５％である。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．１％である。
【００３２】
提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、少なくとも０．３％である。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、１．５％より少ない。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、１．３％より少ない。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、１％より少ない。提供される方法の任意の１つのある態様において、試料中の非天然核酸の量は、０．５％より少ない。
【００３３】
提供される方法の任意の１つのある態様において、試料は、無細胞ＤＮＡ試料を含み、および量は、非天然無細胞ＤＮＡの量である。
提供される方法の任意の１つのある態様において、対象は、レシピエントであり、および非天然核酸の量は、ドナー特異的無細胞ＤＮＡの量である。
提供される方法の任意の１つのある態様において、レシピエントは、心臓レシピエントである。
提供される方法の任意の１つのある態様において、レシピエントは、小児心臓レシピエントなどの小児レシピエントである。
提供される方法の任意の１つのある態様において、ＰＣＲなどの増幅は、リアルタイムＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅である。
【００３４】
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、試料中の非天然核酸の量に基づく対象におけるリスクを決定することを含む。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、リスクは移植に関連するリスクである。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、移植拒絶反応のリスク、移植片の解剖学的問題または移植片の損傷である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植片に対する損傷は、初期または進行中の損傷である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、損傷の重篤度を示す。
【００３５】
提供される方法の任意の１つのある態様において、閾値より非天然核酸の量が大きい場合、リスクは増加する。本明細書に提供される方法の任意の１つのある態様において、閾値と比較して非天然核酸の量が少ない場合、リスクが低下する。
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、心臓移植レシピエントに関して、かかる閾値は１％である。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、心臓移植レシピエントに関して、閾値は１．３％である。
【００３６】
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、非天然核酸の量に基づく対象への処置を選択することを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、非天然核酸の量に基づく対象を処置することを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、非天然核酸の量に基づく対象への処置についての情報を提供することを含む。
【００３７】
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、モニタリングまたは経時的に対象において、非天然核酸の量をモニタリングすることを示唆することを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、その後の時点において、対象における非天然核酸の量を評価することを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法は、本明細書で提供される方法の任意の１つなどの、その後の時点などで、対象から別の試料を得ること、および試料について試験を実施することをさらに含む。
【００３８】
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、非天然核酸の量に基づく対象に投与された処置の効果を評定することを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、処置は抗拒絶反応療法である。
提供される方法の任意の１つのある態様において、処置は抗感染症療法である。
【００３９】
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、試料またはその一部を提供することまたは得ることを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、試料から核酸を抽出することを含む。
提供される方法の任意の１つのある態様において、試料は血液、血漿、または血清を含む。
【００４０】
提供される方法またはレポートの任意の１つのある態様において、試料は、対象から心臓移植の１０日以内に得られるか、または得られたものである。本明細書で提供される方法またはレポートの任意の１つのある態様において、試料は、対象から手術の１４日以内に得られるか、または得られたものである。本明細書で提供される方法またはレポートの任意の１つのある態様において、試料は、対象から手術の２４時間以内に得られるか、または得られたものである。本明細書で提供される方法またはレポートの任意の１つのある態様において、手術は、移植手術である。本明細書で提供される方法またはレポートの任意の１つのある態様において、試料は、対象からクロスクランプ除去の１４時間以内に得られるか、または得られたものである。本明細書で提供される方法またはレポートの任意の１つのある態様において、試料は、対象からクロスクランプ除去の２４時間以内に得られるか、または得られたものである。
【００４１】
本明細書で提供される方法の任意の１つの態様において、量は経時的に週ごとに決定されるか、または得られる本明細書で提供される方法の任意の１つの態様において、量は経時的に隔週ごとに決定されるか、または得られる。本明細書で提供される方法の任意の１つの態様において、量は経時的に月ごとに決定されるか、または得られる。
【００４２】
ある態様において、本明細書で提供される方法についての態様の任意の１つは、提供されるレポートの任意の１つのある態様であることがある。ある態様において、本明細書で提供されるレポートの態様の任意の１つは、本明細書で提供される任意の１つの方法のある態様であることがある。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
添付の図面は、一定の縮尺で描くことを意図していない。これらの図は例示的なものに過ぎず、開示を可能にするためには必要とされない。
【００４４】
【図１】図１は、ＭＯＭＡプライマーの例示的で非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ Ａを含有する配列の伸長が起こることが予想され、これによりＳＮＶ Ａの検出が行われ、これは続いて定量されることがある。しかしＳＮＶ Ｂの伸長は、二重ミスマッチのために起こることは予想されない。
【図２】図２は、例示的な増幅トレースを提供する。
【図３】図３は、再構成実験からの結果を示し、構想の証明を説明する。
【図４】図４は、移植レシピエント患者からの血漿試料で測定した無細胞ＤＮＡのパーセントを提供する。すべてのデータは、生検を受けた患者からのものである。濃い点は拒絶反応を意味する。
【図５】図５は、血漿試料についての本明細書に提供される方法からのさらなるデータを提供する。移植手術後、ドナーのパーセントレベルは低下する。
【００４５】
【図６】図６は、期待値最大化を用いた、未知の場合の非天然ドナー遺伝子型の予測を示す。黒＝背景、緑＝半情報提供的、赤＝完全情報提供的、破線＝最初の反復、実線＝２回目の反復、最終コール＝１０％。
【図７】図７は、期待値最大化を用いた、未知の場合の非天然ドナー遺伝子型の予測を示す。黒＝背景、緑＝半情報提供的、赤＝完全情報提供的、最終コール＝５％。
【図８】図８は、未知の場合の非天然ドナー遺伝子型を予測する能力を実証する、再構成実験データを提供する。データは、９５個のＳＮＶ標的のセットを用いて生成されている。
【００４６】
【図９】図９は、１０４個のＭＯＭＡ標的の平均バックグラウンドノイズを提供する。
【図１０】図１０は、ＭＯＭＡを使用する方法のバックグラウンドノイズのさらなる例を提供する。
【図１１】図１１は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１２】図１２は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１３】図１３は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１４】図１４は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１５】図１５は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１６】図１６は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１７】図１７は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１８】図１８は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図１９】図１９は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２０】図２０は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２１】図２１は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２２】図２２は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２３】図２３は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２４】図２４は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２５】図２５は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２６】図２６は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２７】図２７は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２８】図２８は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図２９】図２９は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図３０】図３０は、いくつかの態様において、プローブをミスマッチプライマーと同じ鎖に有することの利点を説明する。
【図３１】図３１は、いくつかの態様が動作してもよいコンピュータシステムの例を示す。
【００４７】
発明の詳細な説明
本開示の側面は、試料中の非天然核酸の高感度の検出および／または定量化のための方法に関する。非天然核酸、例えば非天然ＤＮＡは、臓器移植後を含む様々な状況において個体に存在し得る。本開示は、対象から得た試料中の、非天然無細胞ＤＮＡ濃度などの非天然核酸を検出、分析、および／または定量するための技術を提供する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「非天然核酸」は、別の供給源に由来するか、または対象において見出される核酸の突然変異型である特定の配列に関して）、核酸を指す。したがって「天然核酸」は、別の供給源からではなく、対象において見出される核酸の突然変異型ではない（特定の配列に関して）核酸である。いくつかの態様において、非天然核酸は、非天然無細胞ＤＮＡである。「無細胞ＤＮＡ」（またはｃｆ−ＤＮＡ）は、細胞の外、例えば対象の血液、血漿、血清などに存在するＤＮＡである。
【００４９】
いかなる特定の理論またはメカニズムにも束縛されることを望まないが、ｃｆ−ＤＮＡは、例えば細胞のアポトーシスを介して、細胞から放出されると考えられている。非天然核酸の例は、移植レシピエント対象における、移植片のドナーからの核酸である。本明細書で使用する場合、本明細書で提供される組成物および方法は、非天然供給源からの無細胞ＤＮＡ、例えば、ドナー特異的ＤＮＡまたはドナー特異的無細胞ＤＮＡ（例えば、ドナー特異的ｃｆＤＮＡ）の量を決定するために、使用し得る。
【００５０】
本明細書において提供されるのは、配列同一性の違いを有する核酸を測定するために使用し得る、方法および組成物である。いくつかの態様において、配列同一性の違いは、一塩基バリアント（ＳＮＶ）である；しかしながら、ＳＮＶが本明細書で指すされる場合はいつでも、天然核酸と非天然核酸の間の配列同一性のいかなる違いも、適用可能であることが意図される。したがって、本明細書で提供される方法の任意の１つは、配列同一性に違いがある場合に、天然核酸ｖｓ非天然核酸に適用し得る。本明細書で使用する場合、「一塩基バリアント」は、単一ヌクレオチド（single nucleotide）において配列可変性がその中に存在する、核酸配列を指す。いくつかの態様において、ＳＮＶは両アレル（両アレル）ＳＮＶであり、ＳＮＶについて１つのメジャーなアレルおよび１つのマイナーなアレルが存在することを意味する。
【００５１】
いくつかの態様において、ＳＮＶは、集団内などに２つより多くのアレルを有すことができる。いくつかの態様において、ＳＮＶは配列の突然変異バージョンであり、非天然核酸は突然変異バージョンを指し、一方天然核酸は非突然変異バージョン（野生型など）を指す。かかるＳＮＶはこのように対象内で起こりうる突然変異であることができ、これは疾患または状態に関連し得る。一般に「マイナーなアレル」は、遺伝子座について、集団などにおいて頻度が少ないアレルを指し、一方「メジャーなアレル」は、集団などにおいてより頻度が高いアレルを指す。本明細書で提供される方法および組成物は、核酸の混合物内のメジャーおよびマイナーなアレルの核酸を、いくつかの態様において低レベルで存在する場合であっても、定量し得る。
【００５２】
ＳＮＶなどの、配列同一性に可変性が存在する核酸配列は、一般に「標的」と呼ばれる。本明細書で使用する場合、「ＳＮＶ標的」は、個体の集団などにおける、または対象において起こり得て疾患または状態に関連し得る突然変異の結果として生じる、単一ヌクレオチドなどにおいて配列可変性が存在するところの核酸配列を指す。ＳＮＶ標的は１つより多くのアレルを有し、好ましい態様において、ＳＮＶ標的は両アレルである。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ標的は、一塩基多型（ＳＮＰ）標的である。
【００５３】
これらの態様のいくつかにおいて、ＳＮＰ標的は両アレルである。非天然核酸は、極めて低いレベルであっても、ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量的アッセイを本明細書で提供されるようにＳＮＶ標的に特異的なプライマーを用いて実施することにより、定量可能であることが発見されている。いくつかの態様において、非天然核酸の量は、定量的ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量的アッセイを、複数のＳＮＶ標的についてのプライマーを用いて試みることにより、決定される。
【００５４】
「複数のＳＮＶ標的」は、各標的に対して少なくとも２つのアレルが存在する、１より多くのＳＮＶ標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的は両アレルであると予想され、ＳＮＶ標的の各アレルに特異的なプライマー対を使用して、各アレルの核酸を特異的に増幅し、ここで増幅は、特異的アレルの核酸が試料中に存在する場合に起こる。いくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、対象内の複数の配列であって、突然変異し得、そのように突然変異した場合に、対象の疾患または状態を示すことがあるものである。本明細書で使用する場合、１つのアレルは標的配列の突然変異型であってよく、別のアレルは配列の非突然変異型である。
【００５５】
いくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量的アッセイは、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５またはより多くの標的についてのプライマー対を用いて実施される。いくつかの態様において、定量的アッセイは、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８または９７、より少ない標的についてのプライマー対を用いて実施される。いくつかの態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜１０５、４５〜１０５、５０〜１０５、５５〜１０５、６０〜１０５、６５〜１０５、７０〜１０５、７５〜１０５、８０〜１０５、８５〜１０５、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９、または９０〜９５の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。いくつかの態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９０〜９９、９０〜９８、９０〜９７、または９０〜９６の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。
【００５６】
さらなる他の態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜９５、４５〜９５、５０〜９５、５５〜９５、６０〜９５、６５〜９５、７０〜９５、７５〜９５、８０〜９５、８５〜９５、または９０〜９５の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。さらなる他の態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜９０、４５〜９０、５０〜９０、５５〜９０、６０〜９０、６５〜９０、７０〜９０、７５〜９０、８０〜９０、または８５〜９０の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。さらなる他の態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜８５、４５〜８５、５０〜８５、５５〜８５、６０〜８５、６５〜８５、７０〜８５、７５〜８５、または８０〜８５の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。さらなる他の態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜８０、４５〜８０、５０〜８０、５５〜８０、６０〜８０、６５〜８０、７０〜８０、または７５〜８０の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。さらなる他の態様において、十分な情報提供的な結果は、４０〜７５、４５〜７５、５０〜７５、５５〜７５、６０〜７５、６５〜７５、または７０〜７５の間の標的についてのプライマー対を用いて得られる。
【００５７】
本明細書で提供される「情報提供的な結果」とは、試料中の非天然核酸および／または天然核酸のレベルを定量するために使用し得る結果である。一般的に、いくつかの態様において、情報提供的な結果は、天然核酸が特定のＳＮＶ標的についてヘテロ接合性である場合の結果および、「コールなし」または誤ったコール結果を除外する。情報提供的な結果からアレルのパーセントを、標準曲線を使用し、提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において算出し得る。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、非天然核酸および／または天然核酸の量は、それぞれ、非天然核酸および／または天然核酸の情報提供的な結果にわたる平均値を表す。
【００５８】
本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、平均は絶対量として、またはパーセントとして与えられる。好ましくは、本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、この平均は中央値である。本明細書において提供される任意の１つの方法の他の態様において、平均は、刈り込まれた平均（trimmed mean）である。本明細書において使用する場合、「刈り込まれた平均」は、最も低いレポートする標的（２つの最も低いものなど）の、レポートする標的の最も高いもの（２つの最も高いものなど）との組み合わせにおける除去を指す。本明細書において提供される任意の１つの方法のさらなる他の態様において、平均（average）は平均（mean）である。
【００５９】
本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、方法は、ロバストな統計（例えば、ＢＤ  ＦＡＣＤｉｖａＴＭ  ソフトウェア）の使用をさらに含み得る。いくつかのかかる態様において、かかる統計の使用は、終わりに結果の品質チェックとして行われ得る。いくつかのかかる態様において、統計はやり直す必要がある可能性のある試料、または破棄されるべきいくつかの結果を指摘する可能性がある。いくつかの態様において、本明細書において提供される任意の１つの方法は、ロバストな標準偏差（ｒＳＤ）などの標準偏差、および／またはロバストな変動係数（ｒＣＶ）などの変動係数、または％ロバストな変動係数などの％変動係数が、それにより計算されることができるステップを包含し得る。
【００６０】
本明細書において使用されるように、ロバストなＳＤは、個々のデータポイントの集団の中央値に対するに対する偏差に基づく。
それは、
ｒＳＤ=（｛｜Ｘｉ−中央値ｘ｜｝の中央値）×１．４８２６
として計算されることができる。
１．４８２６という値は、結果として生じるロバストな値を、正常な集団分布の等価物へ調節する定数因数である。
よって、正常に分布される集団のためにＳＤおよびｒＳＤは、同等である
【００６１】
類似的に、ロバストなＣＶおよびロバストなＣＶのパーセントは、それぞれ：
ｒＣＶ＝ｒＳＤ／中央値Ｘ  および ％ｒＣＶ＝ｒＳＤ／中央値Ｘ×１００％、
として計算されることができる。
よって、本明細書において提供される任意の１つの方法において、最終量は、ｒＳＤなどの標準偏差、および／またはｒＣＶなどの変動係数、または％ｒＣＶなどの％変動係数を使用する結果の分析において、少なくとも部分的に決定されることができる。
【００６２】
本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、方法はさらに、不一致な値（ｄＱＣ）を含むことができる。例としては、ホモ接合型レシピエントのマイナーなアレル割合の平均値および非情報提供的な標的は、試料の混同および汚染から守るために評定されることができる。それらは、非特異的なアレルのノイズを条件として、理論的に、ほぼゼロパーセントと読めるはずである。もし回収または処理する間に試料の交換が起こった場合、間違った遺伝子型レシピエントが使用され、ｄＱＣは，情報価値のない標的と想定される最大５０または１００％の示度まで直ちに上がることがある。ｄＱＣはまた、試料の汚染および多分遺伝的な不安定性をとらえることができる。一般的に、健康的な試料は、ｄＱＣ０．５以下を有するだろう。
【００６３】
比率またはパーセンテージなどの非天然核酸の量は、天然および／または非天然核酸のメジャーおよびマイナーなアレルの量ならびに遺伝子型を用いて、決定し得る。例えば、天然核酸が特定のＳＮＶ標的についてヘテロ接合性である場合の結果は、天然の遺伝子型の知識を用いて除外し得る。さらに、結果を、非天然の遺伝子型の知識を用いて評価することもできる。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、天然核酸の遺伝子型は既知であるが非天然核酸の遺伝子型は知られていない場合、方法は、可能性のある非天然の遺伝子型を予測すること、または非天然の遺伝子型をシーケンシングによって決定すること、のステップを含む。かかる方法のさらなる詳細は、実施例においてなど本明細書において他の場所に取り込まれる。
【００６４】
本明細書に提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、アレルは、対象の天然核酸および／または対象に天然にはない核酸（例えば、それぞれレシピエントおよびドナーのもの）の以前の遺伝子型決定に基づき、決定し得る。遺伝子型決定のための方法は、当技術分野において知られている。かかる方法には、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどのシーケンシング、他の分離技術またはＰＣＲアッセイを含む。本明細書で提供される方法の任意の１つは、かかる遺伝子型を得るステップを含むことができる。
【００６５】
本明細書で使用する場合「得ること」とは、それによってそれぞれの情報または材料を獲得できる任意の方法を指す。したがってそれぞれの情報は、天然の遺伝子型を決定することなどの、実験方法によって獲得し得る。いくつかの態様において、それぞれの材料を、様々な実験的または実験室的方法で作成し、設計し得る。それぞれの情報または材料は、レポートまたは資料などにおいて情報を与えられまたは提供されることによっても、獲得し得る。材料は、いくつかの態様において、商業的手段によって（すなわち、購入によって）与えられるかまたは提供されてもよい。
【００６６】
レポートは、口頭、書面（またはハードコピー）または電子形式において、例えば視覚化または表示し得る形式であってよい。いくつかの態様において、本明細書で提供される各アッセイについての「生の」結果がレポートで提供され、このレポートから、試料中の非天然核酸の量を決定するためのさらなるステップを実施することがある。これらのさらなるステップは、以下のうちの任意の１つ以上を含むことがある：情報提供的な結果を選択すること、天然および／または非天然の遺伝子型を得ること、天然および非天然核酸に関する情報提供的な結果についてのアレルパーセントを算出すること、アレルパーセントを平均化すること、など。
【００６７】
他の態様において、レポートは、試料中の非天然核酸の量を提供する。その量から、いくつかの態様において臨床医は、対象に対する処置の必要性または後の時点での非天然核酸の量など、対象をモニターする必要性を、評価し得る。したがって、本明細書で提供される方法の任意の１つにおいて、方法は、対象中の非核酸の量を１つ別の時点で評価することを含むことがある。かかる評価は、本明細書で提供される方法の任意の１つを用いて実施することがある。
【００６８】
本明細書で提供される増幅に基づく定量的アッセイは、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を利用する。かかるアッセイで使用するためのプライマーを得ることができ、本明細書で提供される方法の任意の１つは、定量的アッセイを実施するための１つ以上のプライマー対を得るステップを含むことがある。一般にプライマーは、核酸の量を定量する際にそれらの使用を容易にする、ユニークな特性を有する。例えば、プライマー対のフォワードプライマーは、３’ヌクレオチド（例えば、末端から２番目の３’ヌクレオチド）でミスマッチであることがある。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいてであるが、ＳＮＶ位置に隣接している。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ位置に対するプライマーのミスマッチ位置は、図１に示される通りである。一般に、かかるフォワードプライマーは３’ミスマッチを有していても、増幅反応において増幅生成物（適切なリバースプライマーと併せて）を生成し、こうしてそれぞれのＳＮＶを有する核酸の増幅およびその結果としての検出を可能にする。
【００６９】
特定のＳＮＶが存在せず、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある場合、増幅産物は一般に産生されない。好ましくは、本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的について、各アレルの特異的増幅が、他のアレルの増幅なしで起こることがあるプライマー対が得られる。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅なしの、またはバックグラウンドもしくはノイズを超える別の核酸配列の増幅なしの、標的の特異的アレルの増幅をいう。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的なアレルの増幅のみをもたらす。
【００７０】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、両アレルである各ＳＮＶ標的について、２つのプライマー対があり、それぞれが２個のアレルのうちの１つに特異的であり、したがって、それが増幅するアレルに関しては１つのミスマッチを有し、増幅しないアレルに関して二重ミスマッチを有する（再度ただしそれらのアレルの核酸が存在する場合に限る）。本明細書で提供される方法または組成物の任意の１つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーはフォワードプライマーである。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的についての２つのプライマー対のリバースプライマーは、同じである。
【００７１】
これらの概念は、本明細書で提供される方法の任意の１つでのプライマー対の設計において使用し得る。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特定の遺伝子座の断片を増幅するために、反対の鎖（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖）に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、任意の適切なサイズの核酸断片を増幅するように設計され得て、例えば本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出する。本明細書で提供される方法の任意の１つは、本明細書に記載の１つ以上のプライマー対を得るための１つ以上のステップを含有し得る。
【００７２】
本明細書に記載のプライマー対は、多重ＰＣＲアッセイに使用されることがあることが理解されるべきである。したがって、本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、プライマー対は、ＰＣＲ反応において他のプライマー対と適合するように設計される。例えばプライマー対は、ＰＣＲ反応における他のプライマー対の少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個等と適合するように設計されてもよい。本明細書で使用する場合、ＰＣＲ反応におけるプライマー対は、それらの標的を同じＰＣＲ反応において増幅し得る場合に、「適合的」である。
【００７３】
いくつかの態様においてプライマー対が適合的であるのは、同じＰＣＲ反応に多重化されている場合に、それらの標的ＤＮＡの増幅が、１％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、または６０％以下阻害されている場合である。プライマー対は多くの理由で適合的でない可能性があり、その理由としては、限定はされないが、プライマー二量体の形成、および他のプライマー対と干渉し得る、鋳型上の標的外部位への結合を含む。したがって、本開示のプライマー対は、他のプライマー対との二量体の形成を妨げるか、または標的外結合部位の数を制限するように、設計されることがある。多重ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当技術分野で知られており、さもなければ本明細書に別途記載される。
【００７４】
いくつかの態様において、本明細書に記載のプライマー対は、非天然核酸の量を定量するために多重ＰＣＲアッセイにおいて使用される。したがって、本明細書に提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、プライマー対は、潜在的に非二倍体であるゲノム領域を検出するように設計されたプライマー対を除いて、二倍体であるゲノム領域を検出するように設計される。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマー対は、反復マスク領域、既知コピー数可変領域、または非二倍体であることがある他のゲノム領域を検出しない。
【００７５】
上の通り、いくつかの態様において、本明細書において提供される任意の１つの方法は、「ミスマッチ増幅方法」または「ミスマッチ増幅増幅に基づく定量的アッセイ」またはその様なものなどの、特異的な無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量についての値を決定するためのステップを包含してもよい。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、「ミスマッチ増幅に基づく定量的アッセイ」は、それにより核酸は本明細書に記載のＭＯＭＡプライマーで増幅され、および核酸の量が決定されることがある任意の定量的アッセイであり、かかる方法は、ＳＮＶ標的からの複数の増幅を含む。
【００７６】
かかる方法は、ＰＣＴ出願番号PCT/US2016/030313の方法を包含し、および本明細書で提供される方法の任意の１つにおいて、ＰＣＴ出願番号PCT/US2016/030313の方法に記載される方法の、任意の１つのいくつかの方法のステップを包含してもよく、およびかかる方法およびステップは、本明細書において参照により組み込まれる。本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、複数増幅のかかる結果は、中央値、ロバストな標準偏差、ロバストな変動係数および不一致な値を包含する、１つ以上の統計方法を使用することにより、非天然核酸の量を決定することに使用されてもよい。
【００７７】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは定量的ＰＣＲアッセイである。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは定量的ＰＣＲアッセイである。定量的ＰＣＲには、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、TAQMAN（商標）などが含まれる。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスがまだ進行している間に反応動態を液相でモニタリングし得る、ＰＣＲ反応を指す。従来のＰＣＲとは対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応においてリアルタイムで同時に検出または定量する能力を提供する。特定の色素からの蛍光強度の増加に基づき、標的の濃度を、増幅がそのプラトーに達する前であっても決定し得る。
【００７８】
複数プローブの使用は、単一プローブリアルタイムＰＣＲの能力を拡大し得る。多重リアルタイムＰＣＲは、各アッセイが固有の蛍光色素で標識された特異的プローブを有し得、各アッセイについて異なる観察色をもたらす、複数のプローブに基づくアッセイを使用する。リアルタイムＰＣＲ装置は、異なる色素から生成される蛍光を区別し得る。異なるプローブは、それぞれ固有の発光スペクトルを有する異なる色素で標識し得る。スペクトル信号は、離散光学系で収集され、一連のフィルタセットを通過し、検出器のアレイによって収集されることがある。色素間のスペクトルの重なりの補正は、純粋な色素スペクトルを用いて行列代数により実験データをデコンボリューションすることにより、実施されてもよい。
【００７９】
プローブは、本開示の方法、特に定量化ステップを含む方法のために有用であることがある。本明細書で提供される方法の任意の１つは、ＰＣＲアッセイの実施におけるプローブの使用を含むことができ、一方で、本明細書において提供されるキットの組成物の任意の１つは、１つ以上のプローブを含むことがある。重要なことに、本明細書に提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、ＰＣＲ定量アッセイの１つ以上または全てにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対鎖上ではない。このようにプローブをＰＣＲ反応に組み込む際に、さらなるアレル特異的識別が提供することがあることが見出されている。これは、図１１〜３０において説明される。
【００８０】
一例として、TaqMan（商標）プローブは、５’末端にＦＡＭ（商標）またはＶＩＣ（登録商標）色素標識を有し、３’末端にマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）を有する、加水分解プローブである。TaqMan（商標）プローブの原理は、一般に、相補的なプローブ結合領域へのハイブリダイゼーション中に二重標識TaqMan（商標）プローブを切断するための、Taq（商標）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、およびフルオロフォアに基づく検出に依存する。TaqMan（商標）プローブは、定量的ＰＣＲ反応の指数関数的段階の間に、定量的測定における検出の特異性を高めることがある。
【００８１】
ＰＣＲシステムは一般に、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存し、そのシグナルは反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増加する。例えば、最も簡単で最も経済的な形式においては、そのレポーターは、二本鎖ＤＮＡ特異的色素SYBR（登録商標）Green（Molecular Probes）であることがある。SYBR Greenは、二本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブに結合する色素である。SYBR Green色素が二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増加する。より多くの二本鎖アンプリコンが産生されると、SYBR Green色素シグナルが増加する。
【００８２】
本明細書で提供される方法の任意の１つにおいて、ＰＣＲはデジタルＰＣＲであってもよい。デジタルＰＣＲは、希釈された増幅産物を複数の個別試験部位に分割して、ほとんどの個別試験部位が、ゼロまたは１つの増幅産物を含むようにすることを含む。次いで増幅産物を分析して、試料中の選択された関心対象のゲノム領域の頻度の表示を提供する。個別試験部位ごとに１つの増幅産物を分析すると、各個別試験部位について２値の「イエスまたはノー」の結果が得られ、選択された関心のあるゲノム領域が定量化され、選択された関心のあるゲノム領域の相互の頻度が決定される。
【００８３】
ある側面において、これに加えて、または代替として、複数の分析を、所定の領域からのゲノム領域に対応する増幅産物を使用して行うことがある。２つ以上の所定の領域の分析結果を用いて、増幅産物の数の相対的な頻度を定量し、決定し得る。２つ以上の所定の領域を使用して試料中の頻度を決定することにより、単一の検出アッセイによっては容易には明らかにされない、増幅効率の変動などを介したバイアスの可能性が低減される。デジタルＰＣＲを使用してＤＮＡを定量する方法は、当技術分野で知られており、例えば米国特許公開番号US20１40242582に記載されている。
【００８４】
本明細書で提供されるＰＣＲ条件は、本明細書に記載の方法の任意の１つに従って機能するように、改変または最適化することができることが、理解されるべきである。典型的には、ＰＣＲ条件は、使用する酵素、標的鋳型、および／またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の１つ以上の成分が改変または最適化される。最適化されることができるＰＣＲ反応の成分の非限定的な例としては、鋳型ＤＮＡ、プライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度、緩衝液、プローブ（例えば、リアルタイムＰＣＲを実施する場合）、緩衝液、および反応容積を含む。
【００８５】
前述の態様のいずれにおいても、任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素）を利用し得、これには熱安定性ポリメラーゼを含む。適切なポリメラーゼ酵素は当業者に知られており、以下を含む：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼ。
【００８６】
例示的なポリメラーゼとしては、限定はされないが、以下を含む：Bacillus stearothermophilus ｐｏｌ Ｉ、Thermus aquaticus（Ｔａｑ）ｐｏｌ Ｉ、Pyrccoccus furiosus（Ｐｆｕ）、Pyrococcus woesei（Ｐｗｏ）、Thermus flavus（Ｔｆｌ）、Thermus thermophilus（Ｔｔｈ）、Thermus litoris(Ｔｌｉ）およびThermotoga maritime（Ｔｍａ）。これらの酵素、これらの酵素の改変型、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含む販売元から市販されている。代表的な酵素としては、以下を含む：PHUSION（登録商標）（New England Biolabs, Ipswich, MA）、Hot MasterTaq（登録商標）（Eppendorf）、PHUSION（登録商標）Mpx（Finnzymes）、PyroStart（登録商標）（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（TAKARA）、およびCS3AC/LA（KlenTaq, University City, MO）。
【００８７】
塩および緩衝液としては、当業者によく知られているものが挙げられ、これには、それぞれＭｇＣｌ２およびＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものが含まれる。典型的には、１．５〜２．０ｎＭのマグネシウムがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに最適であるが、しかし最適なマグネシウム濃度は、鋳型、緩衝液、ＤＮＡおよびｄＮＴＰに依存し得、これはそれぞれがマグネシウムをキレート化する可能性があるからである。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が低すぎると、ＰＣＲ産物が形成されない場合がある。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が高すぎると、望ましくないＰＣＲ産物が見られる場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、０．１ｍＭまたは０．５ｍＭ増分で約５ｍＭまでのマグネシウム濃度を補充することにより、最適化し得る。
【００８８】
本開示に従って使用される緩衝液は、添加剤、例えば界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、ならびに当業者によく知られた他のものを含んでもよい。ヌクレオチドは一般に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などであり、これらは、標的核酸の増幅についての反応適切量に添加される。いくつかの態様において、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、約１０μＭ〜約５００μＭであり、これはＰＣＲ反応で生成されるＰＣＲ産物の長さおよび数に依存しし得る。
【００８９】
いくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマーは、改変される。プライマーは、それらの意図された標的（例えば、特定のＳＮＶ）のみに、高い特異性で結合し、さらなるヌクレオチド配列の差異に対して高い識別を示すように設計されてよい。プライマーは、特定の算出融解温度（Ｔｍ）、例えば、４６℃〜６４℃の範囲の融解温度を有するように、改変し得る。所望の融解温度を有するプライマーを設計するために、プライマーの長さを変えることができ、および／またはプライマーのＧＣ含量を変えることができる。
【００９０】
典型的には、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを増加させることにより、プライマーのＴｍが増加する。逆に、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを減少させると、プライマーのＴｍが典型的に低下する。特定のＳＮＶ（または配列非同一性の他の形態）を別のものよりも高感度で検出するために、標的に対して意図的にミスマッチ（単数または複数）を組み込むことにより、プライマーを改変できることが理解されるべきである。したがってプライマーは、それらが結合するように設計された特定の配列（例えば、特定のＳＮＶ）に関して、１つ以上のミスマッチを組み込むことにより、改変されることがある。
【００９１】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応において使用されるプライマーの濃度は、改変または最適化されてよい。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応におけるプライマー（例えば、フォワードまたはリバースプライマー）の濃度は、例えば、約０．０５μＭ〜約１μＭであり得る。特定の態様において、各プライマーの濃度は、約１ｎＭ〜約１μＭである。本開示に従ったプライマーは、ＰＣＲ反応において同一または異なる濃度で使用されることがあることが理解されるべきである。例えば、プライマー対のフォワードプライマーを０．５μＭの濃度で使用し、プライマー対のリバースプライマーを０．１μＭで使用し得る。プライマーの濃度は、限定はされないが、プライマー長、ＧＣ含量、純度、標的ＤＮＡとのミスマッチ、またはプライマー二量体を形成する可能性を含む因子に基づき得る。
【００９２】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の熱プロファイルは、改変または最適化される。ＰＣＲ熱プロファイル改変の非限定的な例には、変性温度および持続時間、アニーリング温度および持続時間および伸長時間が含まれる。
【００９３】
ＰＣＲ反応溶液の温度は、所定のサイクル数の間、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で順次循環させることができる。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的に依存性であることができる。任意の所与の反応について、変性状態は、ある態様において約７０℃〜約１００℃の範囲であり得る。さらに、アニーリング温度および時間は、標的核酸内の特定の座位に結合するプライマーの特異性および効率に影響を及ぼすことができ、特定のＰＣＲ反応にとって重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様において約２０℃〜約７５℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約４６℃〜６４℃であり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）で行うことができる。
【００９４】
伸長温度および時間もまた、アレル産物の収量に影響し得る。所与の酵素に対して、伸長状態は、ある態様において約６０℃〜約７５℃の範囲であることができる。
本明細書で提供される定量アッセイからのアレルの量の定量化は、本明細書で提供されるように、または当業者に明らかな他のようにして、実施することがある。一例として、増幅トレースを、一貫性および堅牢な定量化のために分析する。内部標準を使用して、サイクル閾値を入力核酸（例えば、ＤＮＡ）の量に翻訳し得る。アレルの量は、性能（performant）アッセイの平均として算出し得、遺伝子型について調整し得る。広範囲の効果的な増幅は、低濃度核酸の成功した検出を示す。本明細書において提供される方法の任意の１つにおけるパーセントドナー（percent donor）などの本明細書において提供される量は、すべての性能アッセイの刈り込まれた平均として、コンピュータ処理されることがある（例えば、非天然アレルナノグラムに対する天然アレルナノグラムの比率）。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の任意の１つにおけるパーセントドナーなどの本明細書において提供される量は、すべての性能アッセイの中央値として、コンピュータ処理されることができる。量は、遺伝子型に対する調整を伴い決定されされることがある。
【００９５】
本明細書で提供される方法および組成物は、試料中の、非天然核酸などの低レベルの核酸を検出するために使用できることが見出されている。したがって、本明細書で提供される方法は、比較的まれな核酸の検出が必要とされる試料で使用し得る。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法の任意の１つを試料に使用して、試料中で約１．５％より少ない非天然核酸を検出し得る。他の態様において試料中に、１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０５％、０.０３％、または０．０１％の核酸が非天然核酸である場合、本明細書で提供される方法の任意の１つを試料に使用し得る。本明細書で提供される方法の任意の１つの他の態様においてさえも、試料中の少なくとも０．００５％、しかし１．３％、１．２％、１．１％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０５％、０．０３％または０．０１％の核酸は、非天然である。
【００９６】
非天然核酸の量を、低レベルにおいても決定する能力により、本明細書で提供される方法および組成物は、対象、例えば移植レシピエントにおける、リスクを評価するために使用し得る。本明細書で提供される「リスク」とは、対象（移植レシピエントなど）における任意の望ましくない状態の存在または不在、または、例えば移植拒絶反応等のかかる状態の存在または不在の可能性の増加を指す。本明細書で提供される「増加したリスク」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在、または、かかる状態の存在の可能性の増加を指す。本明細書で提供される「リスクの減少」とは、対象における任意の望ましくない状態または進行の不在、または、かかる状態の存在または進行の可能性の低下（または不在の可能性の増加）を指す。
【００９７】
一例として、移植片（例えば、心臓移植片）の移植後の拒絶反応の早期検出は、処置を容易にし、臨床転帰を改善し得る。移植拒絶反応は、移植の失敗および死亡率の主な原因であり続け、一般的には、生涯にわたる監視モニタリングを必要とする。免疫抑制療法による移植拒絶反応の手順は、特に拒絶反応が早期に検出された場合に、処置の成果を改善することが示されている。移植拒絶反応は典型的には、カテーテルベースの心内膜生検（ＥＭＢ）を用いてモニタリングされる。しかしこの侵襲的処置は、患者のリスクおよび不快感を伴い、小児患者にとって特に不利になることがある。
【００９８】
したがって、本明細書において、移植レシピエントなどの対象の監視のための、感度が高く、特異的で、費用効果が高く、非侵襲的な技術が提供される。かかる技術は、初期段階での移植拒絶反応の検出を可能にすることが見出されている。かかる技術はまた、臓器回復のモニタリングおよび、抗拒絶反応処置または抗感染処置などの処置または療法の選択をモニタリングして、患者の回復を改善し、生存率を高めるために使用することもできる。
【００９９】
本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、方法は、早くも移植手術などの、手術の１４または２４時間以内の対象からの１つ以上の試料において実施されることができる。本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、方法は、早くも心臓移植などの、クロスクランプ除去の１４または２４時間以内の対象からの１つ以上の試料において実施されることができる。本明細書において提供される任意の１つの方法において、対象における非天然核酸の量は、移植手術などの手術の１４または２４時間以内の１つ以上の試料について得ることができる。本明細書において提供される、任意の１つの方法において、対象における非天然核酸の量は、心臓移植などのクロスクランプ除去の、１４または２４時間以内に採られた１つ以上の試料について得られることができる。臨床医は次いでこの量を用いて対象の評価をすることができる。
【０１００】
したがって、提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、対象は移植のレシピエントであり、リスクは移植に関連するリスクである。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、移植拒絶反応のリスク、移植片の解剖学的問題または移植片の損傷である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植片に対する損傷は、初期または進行中の損傷である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、急性状態または慢性状態である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、急性状態は、細胞拒絶反応または抗体媒介性拒絶反応を含む、移植拒絶反応である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、慢性状態は、移植脈管症である。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、損傷の重篤度を示す。提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、移植に関連するリスクは、感染のリスクまたは状態である。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、「移植（transplant）」とは、レシピエントの損傷または欠損した臓器を交換する目的での、ドナーからレシピエントへの臓器の移動を指す。移植は、１つの臓器または複数の臓器であってもよい。いくつかの態様において、用語「移植片（transplant）」は、移植された１以上の臓器を指し、かかる意味は、この用語が使用される文脈から明らかであろう。移植可能な臓器の例としては、限定はされないが、心臓、腎臓（単数または複数）、腎臓、肝臓、肺（単数または複数）、膵臓、腸などが含まれる。本明細書で提供される方法の任意の１つは、本明細書で提供される任意の１つ以上の臓器の移植を受けた対象からの試料に、使用されてよい。いくつかの態様において、移植は心臓移植である。
【０１０２】
移植のレシピエントにおけるリスクは例えば、非天然ｃｆ−ＤＮＡの量、例えば移植拒絶反応に関連する細胞損傷のバイオマーカーであるドナー特異的無細胞ＤＮＡ（ＤＳ ｃｆ−ＤＮＡ）の量を評価することによって、決定し得る。ＤＳ ｃｆ−ＤＮＡは、移植された臓器からおそらくは剥がれ落ちたＤＮＡを指し、その配列は、移植された臓器を寄付したドナーの遺伝子型に（全体または一部が）適合するものである。
【０１０３】
移植のレシピエントにおけるリスクは、例えば、本明細書に記載されているように、ドナー特異的無細胞ＤＮＡなどの非天然ｃｆ−ＤＮＡの量を、提供される方法の任意の１つを全無細胞ＤＮＡ量の評価と組み合わせて用いて、例えば血漿中のｎｇ／ｍｌで評価することにより、決定し得る。
【０１０４】
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法の任意の１つは、非天然核酸の増加および／または天然核酸と比較した非天然核酸の比率またはパーセンテージの増加を、移植拒絶反応などの状態のリスクの増加と相関させることを含むことができる。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、相関させることは、非天然核酸のレベル（例えば、濃度、比率またはパーセンテージ）を閾値と比較して、状態のリスクが増加または低下している対象を同定することを含む。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、閾値と比較して増加した量の非天然核酸を有する対象は、状態のリスクが高いと同定される。本明細書に提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、閾値と比較して非天然核酸の量が減少または同程度の対象は、状態のリスクが低下していると同定される。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「量」とは、核酸の測定のための任意の定量値を指し、絶対量または相対量で与えることができる。さらに、量は、総量、頻度、比率、パーセンテージなどであることができる。本明細書で使用する「レベル」という用語は、「量」の代わりに使用し得るが、同じ種類の値を指すことを意図する。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「閾値（threshold）」または「閾値（threshold value）」は、状態の有無またはリスクの有無を示す、任意の所定のレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、様々な形態をとることができる。これは、中央値または平均値などの単一カットオフ値であることができる。これは、１つの定義群のリスクが別の定義群のリスクの２倍の場合などの、比較群に基づいて設定し得る。これは範囲であることができ、例えば、試験される集団を複数の群に等しく（または不等に）分割するか（低リスク群、中リスク群および高リスク群など）、またはクォードラント（quadrant）に分割して、最も低い象限はリスクが最も低い対象で、最も高い象限はリスクが最も高い対象である、などである。
【０１０７】
閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、明らかに健康な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値は、状態またはリスクの存在前または処置経過後のベースライン値から、決定し得る。かかるベースラインは、試験されているリスクまたは状態と相関していない、対象における正常状態または他の状態を示すことができる。いくつかの態様において、閾値は、試験される対象のベースライン値である、または以前の時点などの、１つ別の時点からの値であり得る。したがって、選択された所定の値は、対象が属するカテゴリーを考慮に入れてよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者の通常の実験を用いて選択し得る。
【０１０８】
非天然核酸レベルの変化も、経時的にモニターし得る。例えば、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどの、閾値からの変化は、リスク、例えば移植に関連するリスクの非侵襲的臨床指標として使用し得る。これは、臨床状態における変動の測定を可能にし、および／または正常値またはベースラインレベルの算出を可能にする。臓器移植において、これは、拒絶反応またはそれに関連する状態のリスクについての、個別の非侵襲的スクリーニング検査の基礎を形成し得る。
【０１０９】
一般に、本明細書で提供されるように、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージは、状態に関連するリスク、例えばレシピエントにおける拒絶反応等の移植に関連するリスクなどの、有無を示すことができ、またはさらなる検査または監視の必要性を示すことができる。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、移植拒絶反応、移植片損傷などの状態を評価するための、さらなる試験を含むことができる。
【０１１０】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、心臓移植レシピエントに関して、かかる閾値は０．８％、０．９％、または１％と同等にまたはより多くあり、ここでそれを超えるレベルはそれぞれリスクの増加を示し、１％以下のレベルはリスクの減少を示す。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、心臓移植レシピエントに関して、かかる閾値は１．３％であり、ここで１．３％を超えるレベルはリスクの増加を示し、１．３％以下のレベルはリスクの減少を示す。
【０１１１】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどが閾値を上回ると決定された場合、本明細書で提供される方法の任意の１つはさらに、対象または対象からの試料に、別の試験を実施することを含むことができる。かかる別の試験は、例えば移植レシピエントにおいてリスクの有無を決定するのに有用であることが当業者に知られている、任意の別の試験であることができる。いくつかの態様において、別の試験は、本明細書で提供される方法の任意の１つである。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、対象は移植レシピエントであり、別の試験は、移植レシピエントにおけるＢＮＰおよび／またはトロポニンのレベルの決定である。本明細書で提供される方法の任意の１つの別の態様において、ＢＮＰおよび／またはトロポニンのレベルに追加された、またはその代わりの別の試験は、心エコー検査である。
【０１１２】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどが、移植対象などについて、１％または１．３％または１．５％または２％などの閾値未満であると決定された場合、さらなる試験は、対象に必要でないかまたは推奨されず、および／または、処置は、対象に必要でないかまたは推奨されない。一方で、本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、決定されることができ、かかる対象は、モニタリングが必要である可能性さえもある。しかし本発明の態様は、他の閾値を利用できることが理解されるべきである。いくつかの態様において、方法はさらに、対象に対してさらなる試験、またはさらなる試験を推奨すること、および／または対象を処置すること、または処置を示唆すること、を含むことができる。明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、さらなる試験は、本明細書で提供される方法の任意の１つである。
【０１１３】
本明細書において提供される方法の任意の１つの方法のいくつかの態様において、方法はさらに、量に基づく処置のレジメを決定すること含んでもよい。本明細書において使用する場合、「処置のレジメを決定すること」は、対象の処置のための、行動の方針の決定を指す。本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、処置のレジメを決定することは、適切な治療を決定することまたは適切な治療についての情報を対象に提供することを決定することを包含する。本明細書において提供される任意の１つの方法のいくつかの態様において、決定することは、適切な治療または適切な治療についての情報を、対象に提供することを包含する。本明細書で使用する場合、処置または治療またはモニタリングは、書状または電子形式で提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は書面または電子形式で提供される。いくつかの態様において、情報は、コンピュータで読むことができる使用説明書として提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は口頭で提供される。
【０１１４】
いくつかの態様において、処置することは、拒絶反応の処置または抗感染である。いくつかの態様において、情報は書状または電子形式で提供される。いくつかの態様において、情報はコンピュータで読むことができる説明書として提供されてもよい。
【０１１５】
抗拒絶反応療法には、例えば、免疫抑制剤の移植レシピエントへの投与が含まれる。「投与すること」または「投与」または「投与する」またはその様なものなどは、対象に対して、直接的にまたは間接的に薬理学的に有用なやり方において、材料を提供することを意味する。よって用語は、処方することなど対象または別の者に材料を投与することを指揮することを包含する。処置または治療の投与は、当該技術分野において知られるいかなる方法によって、達成してもよい（例えばHarrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照）。好ましくは、処置または治療の投与は、治療的に有効な量において起こる。違うルートの投与のための組成物は、当該技術分野において知られる（例えば、E.W．MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照）。
【０１１６】
免疫抑制剤としては、限定はされないが、以下を含む：コルチコステロイド（例えばプレドニゾロンまたはヒドロコルチゾン）、グルココルチコイド、細胞分裂停止剤（cytostatics）、アルキル化剤（ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソ尿素、白金化合物、シクロホスファミド（Cytoxan））、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセートなどの葉酸類似体、アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン類似体、ピリミジン類似体、およびタンパク質合成阻害剤）、細胞傷害性抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）、抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２Ｒアルファ、抗Ｔ細胞または抗ＣＤ−３モノクローナルおよびポリクローナル、例えばAtgamおよびThymoglobuline）、イムノフィリンに作用する薬物、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノラート、フィンゴリモドおよびミリオシン。いくつかの態様において、抗拒絶反応療法は、血液輸送（blood transfer）または骨髄移植を含む。
【０１１７】
療法はまた、敗血症などの全身状態を処置するための療法を含むこともある。敗血症の治療には、静脈内液剤、抗生物質、外科的排液、早期目標指向療法（ＥＧＤＴ）、昇圧剤、ステロイド、活性化プロテインＣ、ドロトレコギンα（活性化）、酸素および臓器機能不全に対する適切な支援が含まれる。これには、腎不全の血液透析、肺機能障害の機械的換気、血液製剤の輸血、および循環不全のための薬物および体液治療が含まれることがある。適切な栄養の確保、好ましくは経腸栄養によるが、必要に応じて非経口栄養による確保は、特に長期の病気の際に含めることがある。他の関連する療法には、深部静脈血栓症および胃潰瘍を予防するためのインスリンおよび薬物療法を含むことがある。
【０１１８】
いくつかの態様において、ここで感染が示され、移植のレシピエントを処置するための療法は、細菌、真菌および／またはウイルス感染を処置するための療法も含み得る。かかる療法は抗生物質を含む。他の例は、除草剤、アミノグリコシド、駆虫剤、抗真菌剤、アゾール抗真菌剤、エキノカンジン、ポリエン、ジアリールキノリン、ヒドラジド誘導体、ニコチン酸誘導体、リファマイシン誘導体、ストレプトミセス誘導体、抗ウイルス剤、ケモカイン受容体アンタゴニスト、インテグラーゼ鎖転移阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＮＮＲＴＩ、ＮＳ５Ａ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、プリンヌクレオシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリシルサイクリン、抗らい菌薬、リンコマイシン誘導体、マクロライド誘導体、ケトライド、マクロライド、オキサゾリジノン抗生物質、ペニシリン、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンを含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
他のかかる療法は、当業者に公知である。本明細書で提供される方法の任意の１つは、対象への抗感染処置を投与または示唆すること（いくつかの態様において、対象に処置に関する情報を提供することを含む）を含み得る。いくつかの態様において、抗感染処置は、免疫抑制療法における量または頻度の減少、または対象に投与される免疫抑制療法の変化であり得る。他の療法は当業者に公知である。
【０１２０】
臨床医に特に有用なものは、本明細書において提供される量、結果または他の値を含むレポートであることが見いだされた。したがって、ある側面において、かかるレポートが提供される。レポートは、視覚化または表示し得る形式など、口頭、書面（またはハードコピー）または電子形式でなされることができる。いくつかの態様において、本明細書で提供されるそれぞれのアッセイの「生の」結果はレポートで提供され、このレポートから、非天然核酸（ドナー特異的無細胞ＤＮＡなど）の量（単数または複数）を分析するためにさらなるステップがなされることができる。他の態様において、レポートは、対象についての非天然核酸（ドナー特異的無細胞ＤＮＡなど）の量について複数の値を提供する。いくつかの態様において、臨床医は、対象の処置の必要性、または対象を経時的にモニタリングする必要性を量から評価し得る。
【０１２１】
本明細書で提供される方法の任意の１つは、例えば移植のレシピエントなどの対象から得られた試料から、例えば無細胞ＤＮＡなどの核酸を抽出することを含むことがある。かかる抽出は、当技術分野で知られている任意の方法または本明細書に提供される他の方法を用いて行うことがある（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、最新版またはQIAamp循環核酸キットまたは他の適切な市販キットを参照）。無細胞ＤＮＡを血液から単離するための例示的な方法は、記載されている。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含有する血液を、対象から採取する。
【０１２２】
ｃｆ−ＤＮＡを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する（例えば、遠心分離または濾過によって）。所望の二次分離を行って、任意の残存する細胞を血漿から除去し得る（例えば、第２の遠心分離または濾過ステップ）。その後ｃｆ−ＤＮＡを、当分野で知られている任意の方法、例えばQiagenにより製造されたものなどの市販のキットを用いて、抽出し得る。ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法も、当技術分野で知られている。
【０１２３】
ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法も、当技術分野で知られている（例えば、Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. １000-１007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-52１0；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 5１, p.１3１7-１3１9；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA 分析 for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. １953-１955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 200１;47:１607-１6１3；およびSwinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526を参照）。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、対象からの試料は、生物学的試料であり得る。かかる生物学的試料の例には、全血、血漿、血清などが含まれる。本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準の、試料への添加が行われることができる。
【０１２５】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、初期追加増幅ステップが実施される。例示的なかかる増幅方法は以下の通りであり、かかる方法は、本明細書で提供される方法の任意の１つに含めることができる。１５ｎｇの無細胞血漿ＤＮＡを、約１００個の標的とＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅する；ここでプールされたプライマーは合計で６μＭであった。試料を、約３５サイクルに供する。反応は合計で２５μｌである。増幅後、試料は、AMPUREビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または簡単にExoSAP-IT（商標）またはZymoを含む、いくつかのアプローチを用いて洗浄し得る。かかる増幅ステップは、本明細書において提供されるいくつかの方法において使用された。
【０１２６】
本開示はまた、本明細書で提供される方法の任意の１つにおいて使用するための複数のＳＮＶ標的を決定する方法、またはプライマーの組成物の任意の１つを誘導できる方法を提供する。複数のＳＮＶ標的を決定する方法は、いくつかの態様において、ａ）複数の高度にヘテロ接合性のＳＮＶを個体の集団において同定すること、ｂ）各ＳＮＶにわたる１以上のプライマーを設計すること、ｃ）十分に特異的なプライマーを選択すること、ｄ）プライマーの多重化能力を、共通の融解温度および／または共通の溶液中において評価すること、およびｅ）プライマーまたはそのサブセットで均一に増幅された配列を同定すること、を含む。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「高度にヘテロ接合性のＳＮＶ」とは、集団において十分に高いパーセンテージのマイナーなアレルを有するものである。いくつかの態様において、マイナーなアレルは、集団において少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％または３５％またはそれ以上である。これらの態様の任意の１つにおいて、マイナーなアレルは、集団において５０％、４９％、４５％、または４０％未満である。かかるＳＮＶは、天然核酸と非天然核酸との間で異なる標的を提供する可能性を増加させる。
【０１２８】
プライマーは、一般に７０ｂｐのウィンドウにまたがるように設計されたが、他のウィンドウ、例えば６０ｂｐｓと８０ｂｐｓの間なども、選択し得る。また一般に、ＳＮＶはこのウィンドウの中央付近にあることが望まれることができた。例えば、７０ｂｐのウィンドウの場合、ＳＮＶは塩基２０〜５０の間、例えば塩基３０〜４０の間であった。本明細書で提供されるプライマーは、ＳＮＶに隣接するように設計された。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「十分に特異的なプライマー」とは、意図されたアレルの増幅の、意図されていないアレルの増幅に対する識別を実証したものであった。したがってＰＣＲでは、２つの増幅の間にサイクルギャップが必要であり得る。ある態様において、サイクルギャップは、少なくとも５、６、７または８サイクルのギャップであった。
【０１３０】
さらに、配列は融解温度に基づいて選択され、一般に４５〜５５℃の間の融解温度を有する配列が「中程度範囲の配列」として選択された。他の温度範囲が所望されてもよく、当業者によって決定し得る。「中程度範囲の配列」とは一般に、温度内の多重増幅形式で増幅されることがあるものである。いくつかの態様において、ｇｃ％含量は３０〜７０％、例えば３３〜６６％であった。
【０１３１】
本明細書で提供される方法の任意の１つのある態様において、方法はさらに、困難領域に関連する配列を除外することを含むことがある。「困難領域」とは、標的配列に関する予測を確実に行うことが困難な、または多重増幅に適さないと考えられる、容量または特徴を有する任意の領域である。かかる領域は、症候性領域、低複雑性領域、高ＧＣ含量の領域、または連続タンデム反復を有する領域を含む。他のかかる特徴は、当業者に決定されるか、または他の方法で当業者に知られている。
【０１３２】
本明細書で提供される方法の任意の１つのいくつかの態様において、プライマー対は、本明細書で提供される定量的アッセイでの使用に適合するように設計される。例えば、プライマー対は、プライマー二量体を防止し、および／またはオフターゲット結合部位の数を制限するように設計されることができる。提供される方法、組成物またはキットの任意の１つの複数のプライマー対は、本明細書に記載の方法の任意の１つに従って最適化または設計されることができることが、理解されるべきである。
【０１３３】
本発明の様々な側面は、単独で、組み合わせて、または前述の態様で具体的に論じられていない様々な構成で使用されてもよく、したがって、それらの用途においては、前述の説明または図面に示された構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、ある態様に記載された側面は、他の態様に記載された側面と任意の様式で組み合わせてもよい。
【０１３４】
また、本発明の態様は、その一例が提供されている、１つ以上の方法として実装されてもよい。方法の一部として実行される行為は、任意の適切な手段で順序付けられる。したがって、図示されていない順序で行為が実施される態様が構成されてもよく、これは、例示的な態様において連続的な行為として示されている場合でも、いくつかの行為を同時に実行することを含んでよい。
特許請求の範囲における順序を示す用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの、クレーム要素を修飾するための使用は、それ自体、任意の優先順位、序列、または１つのクレーム要素の他の要素に対する順序、または方法の行為が実施される時間的順序を示さない。かかる用語は、特定の名称を有する１つのクレーム要素を、同じ名称を有する別の要素（但し、順序を示す用語の使用は除く）から区別するための、ラベルとしてのみ使用される。
【０１３５】
本明細書で使用される語法および専門用語は、説明目的のものであり、限定的であると見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目および追加の項目を包含することを意味する。
本発明のいくつかの態様を詳細に説明したので、当業者には様々な改変および改良が容易に思い浮かぶであろう。かかる改変および改良は、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明は単なる例示に過ぎず、限定を意図するものではない。以下の説明は、本明細書で提供される方法の例を提供する。
【０１３６】
例
例１−レシピエントおよびドナーの遺伝子型情報を用いて
ＳＮＶ標的選択
開示による多重化のための標的の同定は、現在記載されているように、以下のステップの１つ以上を含み得る。第１に、既知の困難領域を除いて、いくつかの民族対照集団（Hardy-Weinberg ｐ＞０．２５）で高度にヘテロ接合性のＳＮＰをスクリーニングし得る。困難領域は、患者および染色体の動原体およびテロメアを含む低い複雑性の領域で異常である可能性のある症候性領域を含む。次いで、所望の長さの標的フラグメントをin silicoで設計し得る。具体的には、それぞれのＳＮＰの７０ｂｐウィンドウにわたる２つの２０〜２６ｂｐプライマーを設計し得る。次いで、ＢＬＡＳＴを使用して全ての候補プライマーをＧＣＲｈ３７に照会し得る。
【０１３７】
十分に特異的であることが見出されたプライマーは保持され得、オフターゲットヒット、特にフラグメントの３’末端でモニタリングされることがある。オフターゲット候補のヒットを、サイズ選択を生き延びるペアワイズフラグメント生成について分析し得る。次いで、選択されたプライマーをin silico多重化評価に供し得る。プライマーの計算された融解温度およびグアニン−シトシンパーセンテージ（ＧＣ％）を使用して、中程度の範囲の配列をフィルタリングし得る。反復遺伝子アルゴリズムおよび模擬アニーリングを使用して、４００の標的に適合する候補プライマーを選択し、最終的に８００のプライマーを選択し得る。
【０１３８】
８００のプライマーを生成し、共通の溶解温度で共通の溶液で多重能力を物理的に試験し得る。具体的には、マルチプレックス画面および中程度の読み取り深度ウィンドウにおいて偶数倍の増幅に基づいてプライマーをフィルタリングし得る。最高性能の多重化ＳＮＰを使用してＭＯＭＡについて４８のアッセイを設計し得る。それぞれのＳＮＰは、４つのミスマッチの選択肢でＷＴ／ＭＵＴで設計されたプローブを有していた。アッセイ当たり８つのプローブがあり得る。新しく入れ子になったプライマーを、７０ｂｐの豊富なフラグメント内に設計し得る。最終的に、増幅効率を評価するために、プライマーを実験的に増幅得る（TAQMAN（商標）を使用して、３回で８プローブ×４８アッセイ）。
【０１３９】
各アッセイの推測的遺伝子型決定の情報提供性（informativeness）
例としては、それぞれのアッセイされたＳＮＰでの既知のまたは可能性のある天然および非天然遺伝子型を使用して、情報提供的なアッセイのサブセットを選択した。対象のホモ接合部位を、非天然型が任意の他の遺伝子型である場合に使用されることがあることに留意されたい。さらに、非天然の遺伝子型がわからない場合、それは推論し得る。遺伝子型は、シーケンシング、ＳＮＰマイクロアレイ、または既知の０％（クリーンレシピエント）試料に対するＭＯＭＡアッセイの適用によっても学習し得る。
【０１４０】
多重アッセイ性能の後処理分析
患者特異的ＭＯＭＡプローブバイアスを、実験コホートにわたって推定し得る。反復的な選択を洗練して最終的な非天然型・パーセント・コールを行い得る。
再構成実験
アッセイの感度と精度を、既知の混合比で再構成された血漿試料を使用して評定し得る。特異的には、比率１：１０、１：２０、１：１００、１：２００、および１：１０００を評価し得る。一般的に、９５ＳＮＶ標的についてのプライマーを、本明細書において提供されるいくつかの態様において記載されるように、使用し得る。
【０１４１】
非天然型の情報なしで機能するには、以下の手順を情報提供的なアッセイを推論し、および結晶試料における非天然で特異的な無細胞ＤＮＡの定量化を可能にして実施してもよい。すべてのアッセイを、完全情報提供シナリオにおけるパフォーマンスについて評定することがある。よって、この手順は、各々のアッセイでクリーンＡＡ／ＡＢ／ＢＢ遺伝子型および各々の定量化の偏見のない挙動を推定した。天然遺伝子型で、対象においてホモ接合性であると知られるアッセイを、選択し得る。非天然核酸に汚染があるとし得、およびアッセイ回収物は、非、半、および完全情報提供的なアッセイに対応する３つのクラスターのアッセイを伴う、３モード分布を創造した。十分な数のホモ接合のアッセイレシピエントで、非天然完全情報提供的なアッセイの存在を、推定し得る。
【０１４２】
もし天然遺伝子型を、ホモ接合で知る場合、次いでもし、非天然遺伝子型ではない測定を観察する場合、真に非天然ホモ接合性であるプローブは、最も高いクラスターを有しおよび予想に等しく、ところが非天然ヘテロ接合性であるものは、予想の半分であるだろう。 
確率分布をプロットし得、および期待値の最大化アルゴリズム（ＥＭ）は、非天然遺伝子型を推論するために用い得る。かかることを、本明細書において提供される任意の１つの方法において、非天然遺伝子型頻度を推論するために使用し得る。
【０１４３】
したがって、ＥＭアルゴリズムを、すべてのアッセイされたＳＮＶ標的において、最も可能性の高い非天然遺伝子型を推論するために使用された。推論される非天然遺伝子型を用いて、定量化は、完全情報シナリオにおいてとして進行してもよい。ＥＭは、アッセイで見いだされるマイナーなアレル比率が、すべてのアッセイは対象において「ＡＡ」である条件で、対象と非天然の各々の組み合わせについて１つ（または一般性を失うことなしに、「ＢＢ」から反転する）に続く、という推論と共に始まり得る。すべての非天然遺伝子型が知られずに、いかなるアッセイで、マイナーなアレルをほぼ０表現するのは、非天然ＡＡであり、および最も高いのは非天然ＢＢであるという知識から、ブートストラップすることは可能である。
【０１４４】
すべての非天然遺伝子型についての最初の予想を記録し、および各々のクラスターの平均が計算された。非天然ＢＢアッセイの平均が、非天然ＡＢのその２倍であることを施行することは、検索を制限する。アルゴリズムは、次いでクラスターに基づいて予想される非天然遺伝子型、および内蔵の推測を再度適用する。プロセスは、変化がなくなるまで反復された。最終の結果は、それらの測定されたバックグラウンドからの逸脱において、もっとも可能性の高い非天然遺伝子型の１組である。一般的に、すべての標的はモデルに分類され、結果は最大化の後でグループ間の場合は、繰り上げられるだろう。
【０１４５】
再構成実験の結果は、概念の証拠を証明する。（図３）１つの標的は完全情報提供的であり、ここではホモ接合性ドナーがホモ接合性レシピエント対して存在する（陰影付けしたデータ点）。他の標的は半情報提供的であり、ここではヘテロ接合性ドナーがホモ接合性レシピエントに対して存在する（白抜きのデータ点）。さらに、移植レシピエント患者からの血漿試料をミスマッチ法で分析した（図４）。すべてのデータは、生検を受けた患者からのものである。濃い点は拒絶反応を意味する。図５に示すさらなるデータは、本明細書で提供されるミスマッチ法が、実際の血漿試料で機能したことを実証する。移植手術後、ドナーのパーセントレベルは低下した。一般に、本明細書に記載の９５個のＳＮＶ標的に対するプライマーが使用された。
【０１４６】
例２−レシピエントの遺伝子型情報はあるがドナーの遺伝子型情報はないＭＯＭＡアッセイ
ドナーの遺伝子型情報なしで作業するために、以下の手順を行って情報提供的アッセイを推測し、血漿試料中のドナー特異的無細胞ＤＮＡの定量化を可能にし得る。すべてのアッセイは、完全情報提供シナリオでの性能について評価した。したがってこの手順は、各アッセイでクリーンなＡＡ／ＡＢ／ＢＢ遺伝子型および各定量化のバイアスなしの挙動を仮定した。レシピエントの遺伝子型を用いて、レシピエントにホモ接合性であることが知られているアッセイを選択した。いかなる汚染もドナー核酸に起因し、アッセイの集合は、非、半、および完全に情報提供的アッセイに対応する３つのクラスターのアッセイを持つ３モード分布を作成した。十分な数のレシピエントホモ接合性アッセイを用いて、ドナーの完全情報提供的アッセイの存在を仮定し得る。
【０１４７】
レシピエントの遺伝子型がホモ接合性で既知の場合であって、レシピエントの遺伝子型ではない測定値が観察された場合、真にドナーにホモ接合性であるプローブは最も高いクラスターを有し、推測と等しいであろうが、一方ドナーにヘテロ接合性であるプローブは、推測と半分等しいであろう。確率分布をプロットし得、期待値最大化アルゴリズム（ＥＭ）を用いてドナー遺伝子型を推定し得る。これらを用いて、本明細書で提供される方法の任意の１つにおいてドナー遺伝子型頻度を推測し得る。したがって、ＥＭアルゴリズムを使用して、アッセイされたすべてのＳＮＶ標的において最も有望なドナー遺伝子型を推測した。推測されたドナー遺伝子型を用いて、定量化を全情報シナリオのように進めることがある。ＥＭは、全てのアッセイがレシピエントにおいて「ＡＡ」である（または一般性を失うことなく、「ＢＢ」からはじかれる）ことを前提とすると、アッセイで見いだされたマイナーなアレル比率が、レシピエントとドナーの各組み合わせについて１つずつの３つのモードの分布をとるという仮定から、始めることがある。
【０１４８】
すべてのドナー遺伝子型についての最初の推測を記録し、各クラスターの平均を算出した。ドナーＢＢアッセイの平均がドナーＡＢの２倍であることを強制すると、検索が制限される。次にアルゴリズムは、クラスターおよび組み込みの仮定に基づいて推測されたドナー遺伝子型を、再割り当てする。このプロセスは、これ以上変更が加えられなくなるまで反復的であった。最終結果は、バックグラウンドから測定された発散を考慮した、最も有望なドナー遺伝子型のセットである。一般的に、すべての標的はモデルに分類され、結果は最大化の後、グループ間の場合は、繰り上げられるだろう。
【０１４９】
図６は、このようにして処理された血漿試料からの例示的な結果を示す。ｘ軸は、レシピエントがホモ接合性であると見出された任意のアッセイのドナー％である。点の列は、個々のＰＣＲアッセイ結果を表す。一番下の円の列は、ドナー遺伝子型の最初の推定値、いくつかのＡＡ、いくつかのＡ／ＢおよびいくつかのＢＢを表す。次いで、最初のアッセイを中心とするベータ分布を示す実曲線を描いた；赤色はホモ接合性（完全情報提供的）、および緑色はヘテロ接合性（半情報提供的）で、黒色の曲線は非情報提供的アッセイまたはバックグラウンドノイズの分布を表す。アッセイは、２番目の列において、再割り当てされ更新された推定であった。２番目の列の曲線は破線を使用する。一番上の列は、変化が起きなかったので最終的な推定である。緑色破線の曲線のピークの２倍は最大尤度ドナー％コールに対応して、約１０％、または赤線の曲線の平均に等しい。
【０１５０】
２つの個体のＤＮＡを用いた再構成実験（Recon１）を、１０％、５％、１％、０．５％、０．１％で作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリで増幅し、洗浄し、次いでＭＯＭＡ法を用いて定量的に遺伝子型決定した。分析は、真の遺伝子型を知るために各個体の遺伝子型を特定して行った。情報提供的標的は、メジャーな個体の遺伝子型の事前知識を用いて決定され（ホモ接合部位を探す）、第２の個体が異なる場合、情報提供的標的を用いて画分（パーセンテージ）を算出するために使用された。次いで、画分を算出した（黒で示し、「遺伝子型情報あり」を示す）。
【０１５１】
２つの個体で開始した第２の再構成実験（Recon2）も、メジャーおよびマイナーを１０％、５％、１％、０．５％および０．１％で作成した。全てのミックスを、標的の多重ライブラリで増幅し、洗浄し、次いでＭＯＭＡ法を用いて定量的に遺伝子型決定した。分析は、真の遺伝子型を知るために各個体の遺伝子型を特定して行った。上記の第２の個体の遺伝子型の事前知識を用いて、情報提供的標的を決定した。次いで、画分を算出した（黒で示し、遺伝子型情報ありを示す）。
【０１５２】
これらの再構成は、次の日にも再実行した（Recon3）。
第２の個体（マイナーＤＮＡ寄与者）からの、遺伝子型情報を用いず、しかし第一の個体についての入手可能な遺伝情報（メジャーＤＮＡ寄与者）のみを用いて、同じ再構成試料（Recon １、2、3）を再度分析した。約３８〜４０個の標的を使用し、遺伝子型解析なしの画分（ドナーなしでシミュレート）を計算し、それらを陰影付けした（図８）。レシピエントホモ接合性である各標的が、多分有用であることが見出された。円は最初の予測であり、閾値化（thresholding）され、右側のものは完全に情報提供的であると考えられ、左側のものはそうではないと考えられた。トップに沿った三角形は同じ標的であったが、最終的な情報提供性の決定のために再着色された。期待値最大化は、簡単な閾値化より優れていたことが見出された。
【０１５３】
例３―刈り込まれた平均、中央値、および刈り込まれていない平均による再構築実験
２つのＤＮＡ試料が変化する割合で混合された再構成実験は実施され、ＭＯＭＡアッセイの正確さと精密さをテストした。結果は、刈り込まれた平均、中央値、刈り込まれていない平均の３つのタイプのアウトプット測定値と共に下に表される。
【表１】
2019534017.tif 000003
【０１５４】
チューブ８は、ＤＮＡを有さず、ネガティブ対照試料は、有用な標的の欠如およびドナー％について「ＮＡ」を正確に反映した。刈り込まれた平均は、レポートする標的の最も低いものの２つおよび最も高いものの２値を低下し、外れ値の影響を減少する。中央値は、最も中央に近い値をレポートする。生平均とは、標準的に定義された平均である。最終のコラムは、９４候補の標的から情報提供的な遺伝子型とこの特殊なレシピエント／ドナーのペアの組にし、および、信頼できない値を産出するであろううまく機能しない標的または不十分に増幅される標的もまたフィルターした後の、分析において使用される標的の数である。
【０１５５】
生平均は、個々の外れ値により強く偏ることが見出された。中央値は、絶対値において、「意図されたパーセンテージ」に、１３の試料の７つのうち他の２つの候補の測定値より近かった。生平均は、５つにおいて最も近く、および刈り込まれたものは３つにおいて、最も近かった。全体的に中央値は、より頻繁により正確であった。
別の再構成実験は、上に記載される通り実施された。
【表２】
2019534017.tif 000004
【０１５６】
チューブ３は、意図されていない試料の不全であり、不十分なライブラリ増幅のためだと考えられた。再度、生平均は、個々の外れ標的値により強く偏る。中央値は、再度絶対値で１３の試料の５つにおける、他の２つの候補の測定値よりも「意図されたパーセンテージ」により近かった。生平均は、５つにおいて最も近くおよび刈り込まれたものは４つのうちで、最も近かった。
別の再構成実験は、上に記載されるように実施された。
【表３】
2019534017.tif 000005
再度、生平均は、個々の外れ標的値により強く偏る。中央値は、再度絶対値で１４試料の９における、他の２つの候補の測定値よりも「意図されたパーセンテージ」により近かった。生平均は、７つにおいて最も近く、および刈り込まれたものは、０に最も近かった。全体的に、中央値は、より頻繁により正確であった。
【０１５７】
例４−コンピュータで実施される態様の例
いくつかの態様において、上述の診断技術は、１つ以上のソフトウェアファシリティを実行する１つ以上の計算機器を介して実施され、経時的に対象の試料を分析し、試料中の無細胞核酸（ＤＮＡなど）を測定し、１つ以上の試料に基づく診断結果を生み出すことができる。図３１は、いくつかの態様が動作し得るコンピュータシステムの例を示しているが、態様は図３１に示すタイプのシステムでの動作に限定されないことを理解されたい。
【０１５８】
図３１のコンピュータシステムは、対象８０６から試料８０６を得ることができる対象８０２および臨床医８０４を含む。上記から理解されるように、試料８０６は、対象８０２のための任意の適切な生物学的材料の試料（対象８０２の無細胞核酸（ＤＮＡなど）の存在を測定するために使用され得、血液試料を含む）であり得る。試料８０６は分析装置８０８に提供し得、これは、当業者が前述のことから理解するように、試料８０８を分析して、無細胞核酸（ＤＮＡなど）の試料８０６および／または対象８０２の非天然無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量を決定する（推定を含む）。図示を容易にするために、分析装置８０８は単一の装置として示されているが、分析装置８０８は、任意の適切な形態をとることができ、いくつかの態様において、複数の装置として実施することがあることを理解されたい。
【０１５９】
試料８０６および／または対象８０２における無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量を決定するために、分析装置８０８は、上記の任意の技術を実施し得、特定の分析を実施することに限定されない。分析装置８０８は、他のハードウェアを動作させ、他のハードウェアによって実施されるタスクの結果を受け取るようにプロセッサ（単数または複数）を駆動して、分析の全体的な結果（試料８０６および／または対象８０２の無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量であってもよい）を決定するソフトウェアに実施された分析ファシリティを実行する１つ以上のプロセッサを含むことができる。分析ファシリティは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体（装置８０８のメモリーなど）に保存されることがある。他の態様において、試料を分析するための本明細書に記載の技術は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の専用コンピュータ構成要素、またはソフトウェア実施の代わりになる他の適切な形態のコンピュータ構成要素で部分的または全体的に実行されてもよい。
【０１６０】
いくつかの態様において、臨床医８０４は、試料８０６を分析装置８０８に直接提供し得、対象８０２から試料８０６を得ることに加えて装置８０８を作動させることができ、他の態様において、装置８０８は臨床医８０４および対象８０２から地理的に離れていてもよく、試料８０６は出荷され得、または分析装置８０８に場所へ転送されることがある。いくつかの態様において、試料８０６は、試料８０６が得られた日付および／または時間に関する試料８０６および／または対象８０２、または試料８０６を記載または同定する他の情報の識別子（例えば、任意の適切なインターフェースを介した入力）とともに分析装置８０８に提供される。
【０１６１】
分析装置８０８は、いくつかの態様において、試料８０６に対して実行された分析の結果を、データベースまたは他の適切なデータストアとして実施されることがあるデータストア８１０Ａを含み得る計算機器８１０に提供するように構成されることがある。いくつかの態様において、計算機器８１０は、クラウドサービスプロバイダなどの分散計算プラットフォームの１つ以上の物理的および／または仮想的な機械を含む１つ以上のサーバとして実施されることがある。他の態様において、装置８１０は、デスクトップまたはラップトップパーソナルコンピュータ、スマート携帯電話、タブレットコンピュータ、専用ハードウェア装置、または他の計算機器として実施することがある。
【０１６２】
いくつかの態様において、分析装置８０８は、その分析の結果を、インターネットを含む１つ以上の有線および／または無線、ローカルおよび／またはワイドエリアコンピュータ通信ネットワークを介して装置８１０に通信し得る。分析の結果は、任意の適切なプロトコルを使用して通信されてもよく、試料８０６および／または対象８０２の識別子、または試料８０６が得られた日付および／または時間など、試料８０６を記載または同定する情報とともに通信されることがある。
【０１６３】
計算機器８１０は、本明細書に記載の診断技術を実行するためのプロセッサ（単数または複数）を駆動し得るソフトウェアに実施された診断ファシリティを実行するための１つ以上のプロセッサを含むことができる。診断ファシリティは、装置８１０のメモリなどの１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体に保存し得る。他の態様において、試料を分析するための本明細書に記載された技術は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の専用コンピュータ構成要素、またはソフトウェア実施の代わりになることがある他の任意の適切な形態のコンピュータ構成要素で部分的または全体的に実施することがある。
【０１６４】
診断ファシリティは、分析の結果および試料８０６を記載または同定する情報を受け取り、その情報をデータストア８１０Ａに保存し得る。情報は、対象８０２の以前の試料に関する情報が診断ファシリティによって以前に受信され、保存されている場合など、対象８０２の他の情報に関連して、データストア８１０Ａに保存されてもよい。複数の試料に関する情報は、対象８０２の識別子などの共通の識別子を使用して関連付けることができる。いくつかの場合において、データストア８１０Ａは、複数の異なる対象について情報を含むことがある。
【０１６５】
診断ファシリティはまた、対象８０２の診断を決定するために、ユーザ入力によって特定された特定の対象８０２に対する１つ以上の試料８０６の分析の結果を分析するように動作されてもよい。診断は、対象８０２が特定の状態を有している、有し得る、または将来的に発症することがあるというリスクの結論であってもよい。診断ファシリティは、特定の試料８０６について決定された無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量を１つ以上の閾値と比較すること、または試料８０６について経時的に決定された無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量の経時的な変化を１つ以上の閾値と比較することを含む、上記の様々な例のいずれかを使用して診断を決定し得る。例えば、診断ファシリティは、同じ試料（単数または複数）について非天然核酸（ＤＮＡなど）の量を別の閾値と比較することによって、ある状態の対象８０２に対するリスクを決定し得る。閾値との比較に基づいて、診断ファシリティは、ある状態の対象８０２に対するリスクを示す出力を生成することがある。
【０１６６】
前述から理解されるように、いくつかの態様において、無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量を比較し得る異なる閾値で診断ファシリティを構成することがある。異なる閾値は、例えば、異なる人口統計学的群（年齢、性別、人種、経済的クラス、病歴における特定の処置／状態／他の有無、または他の人口統計学的分類）、異なる状態、および／または他のパラメータまたはパラメータの組み合わせに対応する。かかる態様において、診断ファシリティは、計算機器８１０のメモリに保存された異なる閾値を用いて、無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量と比較される閾値を選択するように構成することがある。
【０１６７】
したがって、選択は、人口統計学的群に基づいて閾値が異なる態様における対象８０２の人口統計学的情報に基づき、これらの場合、対象８０２の人口統計学的情報は、診断ファシリティに提供されるか、または対象８０２の識別子を使用する診断ファシリティによって（別の計算機器、またはデータストア８１０Ａと同じかまたは異なるデータストア、または任意の他の適切な供給源から）回収される。選択は、追加的または代替的に、リスクが決定されるべき条件に基づいてもよく、診断ファシリティは、リスク受信を入力として条件を決定する前に、リスクの決定の基礎となる閾値を選択する条件を使用し得る。診断ファシリティは、複数の閾値がサポートされる態様において、任意の特定の方法で閾値を選択することに限定されないことを理解されたい。
【０１６８】
いくつかの態様において、診断ファシリティは、リスクの診断および／または対象８０２の診断のための基礎を含むユーザインターフェースをユーザに提示するために出力するように構成されてもよい。診断の基礎は、例えば、対象８０２について１つ以上の試料８０６に検出された無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量を含み得る。いくつかの態様において、ユーザインターフェースは、上述の結果、値、量、グラフなどの任意の例を含み得る。それらは経時的な結果、値、量などを含み得る。いくつかの場合、グラフには、グラフに表示されたデータの分析から生成されることがある異なる診断に、グラフの異なる領域がどのように対応しているかをユーザに示すために注釈を付けることができる。例えば、グラフ化データと比較して分析を決定し得る閾値をグラフ（単数または複数）に課すことがある。これは、グラフに線を追加すること、グラフを区画に分けることなどを包含してもよい。いくつかの態様において、区画は、追加にまたは代わりに異なる透明性および／または色彩の影などを用いて、影がつけられてもよい。診断ファシリティが２つより多くの閾値を評定する態様においては、線および／または影より大きい面積を指摘してもよい。
【０１６９】
特に線および／または影を有するグラフを含むユーザインターフェースは、無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量に基づいて対象８０２のリスクを決定するための、他のユーザインターフェースを介して提供されることができるものよりも、より直感的で迅速なレビューインタフェースをユーザに提供することができる。そのため、本明細書において提供されるような、ユーザインターフェースに対する特異的および実質的な利点があり得るだろう。ユーザインターフェース、特に線および／または影を有するものはまた、ユーザに無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量に基づく８０２の対象のリスクを決定する、他のユーザインターフェースを通して提供されることがあるだろうものより、はるかにより直感的で迅速なレビューインタフェースをユーザに提供するであろう。しかしながら、態様は、任意の特定のユーザインターフェースで実施されることに限定されないことを理解されたい。
【０１７０】
いくつかの態様において、診断ファシリティは、対象８０２および／または臨床医８０４または別の臨床医であり得る臨床医によって操作されることがある１つ以上の他の計算機器８１４（装置８１４Ａ、８１４Ｂを含む）に診断またはユーザインターフェースをアウトプットし得る。診断ファシリティは、ネットワーク（単数または複数）８１２を介して診断および／またはユーザインターフェースをデバイス８１４に送信することができる。
【０１７１】
本明細書で説明される原理に従って動作する技術は、任意の適切な方法で実施されてもよい。上記の議論には、無細胞核酸（ＤＮＡなど）の量の分析に基づく状態のリスクを決定する様々なプロセスのステップおよび動作を示す一連のフローチャートが含まれている。上述の処理ブロックおよび決定ブロックは、これらの様々なプロセスを実行するアルゴリズムに含まれ得るステップおよび動作を表す。これらのプロセスから導出されたアルゴリズムは、１つ以上の単一または多目的プロセッサの動作に統合され、その動作を指示するソフトウェアとして実施されてもよく、デジタル信号処理（ＤＳＰ）回路または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの機能的に等価な回路として実施されてもよく、あるいは他の適切な方法で実施することがある。態様は、任意の特定の回路または任意の特定のプログラミング言語またはプログラミング言語のタイプの任意の特定の構文または動作に限定されないことを理解されたい。むしろ、当業者であれば、上記の説明を使用して回路を製作するか、または本明細書で説明したタイプの技術を実行する特定の装置の処理を実行するコンピュータソフトウェアアルゴリズムを実施することがある。本明細書で別段の指示がない限り、上述のステップおよび／または動作の特定のシーケンスは、本明細書に記載された原理の実施および態様において実施され、変更されることがあるアルゴリズムの単なる例示であることも理解されたい。
【０１７２】
したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の技術は、アプリケーションソフトウェア、システムソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、埋め込みコード、または任意の他の適切なタイプのコンピュータコードを含む、ソフトウェアとして実施されるコンピュータ実行可能命令で実行し得る。かかるコンピュータ実行可能命令は、任意の多数の適切なプログラミング言語および／またはプログラミングツールまたはスクリプトツールを使用して記述し得、フレームワークまたは仮想機械上で実行される実行可能な機械言語コードまたは中間コードとしてコンパイルすることもある。
【０１７３】
本明細書で説明される技術がコンピュータ実行可能命令として実行されるとき、これらのコンピュータ実行可能命令は、これらの技術に従って動作するアルゴリズムの実行を完了する１つ以上の動作をそれぞれ提供する多数の機能的ファシリティを含む任意の適切な方法で実施されることがある。「機能的ファシリティ」は、例えば、１つ以上のコンピュータと統合され、実行されると、１つ以上のコンピュータに特定の動作上の役割を実施させるコンピュータシステムの構造的な構成要素である。機能的ファシリティは、ソフトウェア要素の一部または全部であってもよい。例えば、機能的ファシリティは、プロセスの機能として、または個別プロセスとして、または任意の他の適切な処理のユニットとして実施されてもよい。本明細書に記載された技術が複数の機能ファシリティとして実施される場合、それぞれの機能ファシリティはそれ自身の方法で実施されてもよく、すべて同じ方法で実施する必要はない。さらに、これらの機能的ファシリティは、必要に応じて並列および／または直列に実行し得、それらが実行しているコンピュータ（単数または複数）上の共有メモリを使用して、メッセージパッシングプロトコルまたは他の適切な方法を使用して、互いに情報を渡すことがある。
【０１７４】
一般に、機能的ファシリティは、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データタイプを実施するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。典型的には、機能的ファシリティの機能性は、それらが動作するシステムにおいて所望に応じて組み合わされ、または分散されてもよい。いくつかの実施において、本明細書で技術を実行する１つ以上の機能的ファシリティは一緒になって完全なソフトウェアパッケージを形成し得る。これらの機能的ファシリティは、代替的な態様において、ソフトウェアプログラムアプリケーションを実施するために、他の無関係の機能的ファシリティおよび／またはプロセスと相互作用するように適合されてもよい。
【０１７５】
１つ以上のタスクを実行するために、いくつかの例示的な機能的ファシリティが本明細書で説明されている。しかし、説明された機能的ファシリティおよびタスクの分割は、本明細書に記載された例示的技術を実施することがある機能的ファシリティのタイプの単なる例示であり、態様は、機能的ファシリティの任意の特定の数、分割またはタイプで実施されることに限定されないことを理解されたい。いくつかの実施において、すべての機能性が単一の機能的ファシリティで実施されてもよい。いくつかの実施において、本明細書で説明される機能的ファシリティのいくつかは他のものと一緒にまたは別々に（すなわち、単一のユニットまたは別個のユニットとして）実施されることがあるか、またはこれらの機能的ファシリティのいくつかが実施され得ないことを理解されたい。
【０１７６】
本明細書で説明される技術を（１つ以上の機能的ファシリティとして実施されるとき、または他の任意の方法で）実施するコンピュータ実行可能命令は、いくつかの態様において、１つ以上のコンピュータ可読媒体上にコードされ、媒体に機能性を提供し得る。コンピュータ可読媒体は、ハードディスクドライブなどの磁気媒体、コンパクトディスク（ＣＤ）またはデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）などの光媒体、永続的または非永続的なソリッドステートメモリ（例えば、フラッシュメモリ、磁気ＲＡＭなど）、または任意の他の適切な記憶媒体を含む。かかるコンピュータ可読媒体は、計算機器の一部またはスタンドアロンの別個の記憶媒体を含む、任意の適切な方法で実施することがある。本明細書で使用する場合、「コンピュータ可読媒体」（「コンピュータ可読記憶媒体」とも呼ばれる）は、有形の記憶媒体を指す。有形の記憶媒体は、非一時的であり、少なくとも１つの物理的な構造的構成要素を有する。本明細書で使用する場合、「コンピュータ可読媒体」において、少なくとも１つの物理的構造的構成要素は、埋め込まれた情報を有する媒体を作成するプロセス、それに情報を記録するプロセス、または情報で媒体をコードする任意の他のプロセスの間に何らかの形で変更されることがある少なくとも１つの物理的特性を有する。例えば、コンピュータ可読媒体の物理的構造の一部の磁化状態は、記録プロセスの間に変更されてもよい。
【０１７７】
技術がコンピュータ実行可能命令として実施されることがあるいくつかの（すべてではない）実施において、これらの命令は、図３１の例示的なコンピュータシステムを含む任意の適切なコンピュータシステムで動作する１つ以上の適切な計算機器（単数または複数）上で実効され得、または、または１つ以上の計算機器（または１つ以上の計算機器の１つ以上のプロセッサ）は、コンピュータ実行可能命令を実行するようにプログラムされてもよい。計算機器またはプロセッサは、命令が、データストア（例えば、オンチップキャッシュまたは命令レジスタ、バスを介してアクセス可能なコンピュータ可読記憶媒体など）など、計算機器またはプロセッサにアクセス可能な方法で保存されているときに命令を実行するようにプログラムされることがある。これらのコンピュータ実行可能命令を含む機能的ファシリティは、単一の多目的プログラム可能デジタル計算機器、処理能力を共有し本明細書に記載の技術を共同して実行する２以上の多目的計算機器の調整されたシステム、本明細書に記載された技術を実行するための（共同配置または地理的に分散された）単一の計算機器または計算機器の調整されたシステム、本明細書に記載の技術を実行するための１つ以上のフィールドプログラム可能ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または任意の他の適切なシステムと統合し、それを指示し得る。
【０１７８】
技術が回路および／またはコンピュータ実行可能命令で実施される態様を説明した。いくつかの態様において、少なくとも１つの例が提供された方法の形態であってもよいことを理解されたい。方法の一部として実施される行為は、任意の適切な方法で順序付けられ得る。したがって、例示的な態様では連続的な動作として示されていても、いくつかの動作を同時に実行することを含み得る、示されていない順序で動作が行われる態様が構築されてもよい。上述のデバイス、システム、態様、方法、技術、アルゴリズム、媒体、ハードウェア、ソフトウェア、インターフェース、プロセッサ、ディスプレイ、ネットワーク、入力、出力、またはそれらの任意の組合せを含む、上記の任意の１つが、他の側面において本明細書で提供される。
【０１７９】
例５−例示的アッセイ
遺伝子型決定
多重化された、アレルに特異的な定量的ＰＣＲに基づくアッセイは、ドナー画分（ＤＦ）をｃｆ−ＤＮＡのパーセンテージとして計算するために、使用されることがある。高い頻度のＳＮＰのパネルは、アレルの間を確実に区別する能力のために選択される。手短に言えば、全ｃｆ−ＤＮＡの１５ｎｇを、多重化されるライブラリマスター混合物に、各々の試料の中にスパイクされた外因性標準（４．５Ｅ＋０３コピー）ともに追加し、および０．００５ＵＱ５（ＮＥＢ）ＤＮＡ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、３μＭの９６標的のフォワードプライマープール、３μＭの９６標的のリバースプライマープールを含有し、ＭｇＣｌ２最終濃度２ｍＭの２５μｌである反応において、３５サイクルのＰＣＲにより増幅された。
【０１８０】
サイクルの条件は、９８℃を３０秒間、次いで９８℃のサイクルを１０秒間、５５℃を４０秒間、および７２℃を３０秒間であり得る。これはそして２分の７２℃における培養により収量され得、および次いで４℃において保存されることがある。１０マイクロリットルの最終反応は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（Thermo Fisher Scientific）で、３７℃で１５分、続いて８０℃で１５分の培養により、清掃される。ライブラリは、次いで保存緩衝液により希釈され、そして遺伝子型決定のためにプロセスされるかまたは−８０℃において保存されるかのいずれかである。定量的遺伝子型決定（ｑＧＴ）は、１：１００に希釈され保存されるライブラリの１：１００希釈の３．８μｌから始めて実施され、および適切な対照とカリブレーター（calibrator）を共に３μｌの反応の２重複複製により、Roche Light
Cycler 480 platform (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)において、実行される。手順は、各々の標的の遺伝座（言い換えれば、ホモ接合のＡＡ、へトロ接合のＡＢおよびホモ接合のＢＢ）で、またはドナーで３つの可能性のある遺伝子型の１つをもつレシピエントまたはドナーのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を割り当てることに使用される。
【０１８１】
ドナー画分（特異的な）分析
ヘテロ接合性のＤＮＡソースの標準曲線を使用し、各々の標的でアレルを定量する。品質管理手順を、各々の標準曲線および試料増幅を評定することに使用することがある。計量可能な標的は、解釈することを進行することがある。容認性のクライテリアは、記録に残る増幅の形状、２番目のアレル、シグナルに対するノイズ、傾き、標準曲線の組のｒ平方、対照の増幅、およびネガティブ対照による汚染についてのアレルに特異的なＰＣＲアッセイの特異性を包含し得る。
【０１８２】
各々の標的（例えば、ホモ接合のＡＡ、へトロ接合のＡＢ、およびホモ接合のＢＢ）におけるレシピエントおよび／またはドナーの可能性のある遺伝子型のラベルを用いて、情報提供的な標的を、レシピエントがホモ接合性と知られおよびドナーが異なる遺伝子型を有するものとして定義し得る。ドナーがホモ接合性でありおよびレシピエントから異なる場合、標的は、完全情報提供型として言及され、それは観察されるＢアレル比率は、およそ全体的にＤＦレベルだからである。ドナーがへトロ接合性である場合、標的を半情報提供的であると呼び、それは貢献がＡおよびＢアレル両方に対するからであり、および測定された貢献が２倍となるからである。情報提供的でおよび品質管理合格のアレル比率の中央値を計算し、および全ｃｆ−ＤＮＡのＤＦ（％）としてレポートする。
【０１８３】
各々の遺伝子型決定プロセスは、２つの品質管理測定、ｒＣＶおよびｄＱＣを産出することがある。規則化されたロバストな変動係数を、情報提供的なおよび計量可能な標的の分布を使用し、コンピュータ処理する。第一に、ロバストな標準偏差を、マイナーな種の割合の中央値からの中央値の絶対的な相違としてコンピュータ処理する。ｒＳＤを、それを規則化した後、中央値で割ることにより変動係数に変換する。ｒＣＶは、アッセイされた標的の中央値の周りの広がりおよび精密さまたは試料の質の基準として機能することがある。ｄＱＣは、レシピエントホモ接合型および非情報提供的な標的のマイナーなアレル割合平均値の評定などの不一致性品質のチェックである（汚染からの保護として実施されることがある）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
2019534017.tif 000037
2019534017.tif 000038