(57)【要約】  本発明は、生体分子の可逆的保護のための試薬に関する。本発明は、特に、アザイサト酸無水物由来の化合物および、生体分子（特に酵素）を保護し、該生体分子の活性を阻害するための該化合物の使用に関する。また、本発明は、上述の方法で保護された生体分子、および該試薬を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2019522058.tif 000048
（式中、
Ｘは、共有結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｙは、求核基であり、好ましくは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｏ、またはＮＨ−ＮＲ４であり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３は、それぞれ互いに独立して、ＮまたはＣを表し、好ましくは、Ｚ３はＣを表し、より好ましくは、Ｚ３はＣであり、かつＲ３はＺ３に位置し、
Ｒ１は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環であり、好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、
Ｒ２は、非耐熱性および／または非耐酸性保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ１２アルキル基（例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、または２，２−ジメチルプロピル基）、置換されたもしくは置換されていないアリール基、置換されたもしくは置換されていないヘテロ環、アシル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル基、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、またはシアノ基である）。
【請求項２】
下記式（ＩＩ）の、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2019522058.tif 000049
【請求項３】
前記非耐熱性および／または非耐酸性基Ｒ２は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基、置換されたもしくは置換されていないフェノキシアセチル基、トリチル基、メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、またはシトラコニル基から選択される、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１がメチル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３がヨウ素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｚ１がＮ、かつＺ２がＣである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
下記構造式の１つに特徴づけられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【化３】
2019522058.tif 000050
【化４】
2019522058.tif 000051
【化５】
2019522058.tif 000052
【請求項８】
保護された生体分子を形成するために、前記生体分子の１つ以上の求核基がアシル化される条件下において、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物を、１つ以上の求核基を含む生体分子と接触するように配置する工程を含む、保護された生体分子の作製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって得られる、保護された生体分子。
【請求項１０】
下記式（ＩＩＩ）の保護された生体分子：
【化６】
2019522058.tif 000053
（式中、
Ｂｉｏｍｏｌは生体分子であり、
Ｗは、前記生体分子の求核基（例えばＮＨ、ＳまたはＯ）であり、
Ｘは、共有結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｙは、求核基であり、好ましくは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｏ、またはＮＨ−ＮＲ４であり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキル基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３は、それぞれ互いに独立して、ＮまたはＣを表し、好ましくは、Ｚ３はＣを表し、より好ましくは、Ｚ３はＣであり、かつＲ３はＺ３に位置し、
Ｒ１は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環であり、好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、
Ｒ２は、Ｈ、または非耐熱性および／または非耐酸性保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ１２アルキル基（例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、または２，２−ジメチルプロピル基）、置換されたもしくは置換されていないアリール基、置換されたもしくは置換されていないヘテロ環、アシル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル基、ハロゲン、またはシアノ基である）。
【請求項１１】
前記Ｂｉｏｍｏｌが、酵素から選択される、請求項９または１０に記載の保護された生体分子。
【請求項１２】
前記Ｂｉｏｍｏｌが、核酸重合反応で使用される酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）である、請求項１１に記載の保護された生体分子。
【請求項１３】
酵素を可逆的に失活させるための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
前記酵素が、核酸重合反応で使用される酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
核酸増幅反応（例えば、ホットスタート法）における、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の保護された生体分子における、求核基の脱保護方法であって、前記非耐熱性および／または非耐酸性基Ｒ２をそれぞれ熱処理および／または酸処理することで開裂させる工程、およびこれに付随する求核基の脱保護を含む、求核基の脱保護方法。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１２に記載の保護された生体分子の使用、
（ｉｉ）（例えば、非耐熱性基Ｒ２が開裂する温度で熱処理することによる）前記生体分子の脱保護のための少なくとも１つの工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において脱保護されたポリメラーゼを用いた核酸重合工程、を含む核酸の重合方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生体分子の可逆的保護のための試薬に関する。本発明は、特に、アザイサト酸無水物由来の化合物、および生体分子（特に、酵素）を保護し、該生体分子の活性を阻害するための該化合物の使用に関する。また、本発明は、上述の方法で保護された生体分子、および該試薬を使用する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
生体サンプルに存在する標的核酸の特異的で迅速な定量のために生体分子技術を用いた、近年のインビトロにおける診断テストでは、特定のプライマーから標的核酸を増幅させることができる、ポリメラーゼ酵素がもっともよく使用される。
【０００３】
いわゆる「ホットスタート」ポリメラーゼは、野生型と比較すると多くの点で優れ、特に診断テストにおいて優れた感度を示すため、開発された。
【０００４】
「ホットスタート」ポリメラーゼの作用原理は、抗体、アプタマー、または化学薬品によって活性を一時的に阻害し、ＰＣＲ増幅の間に温度を急速に上昇させて活性を回復させる。
【０００５】
低コストであるため、化学薬品によって阻害することが特に有利である。リジン残基のアミン官能基のアシル化によるポリメラーゼの失活は、先行技術に記載されている（例えば、Ariel Louwrier, Anne van der Valkによる、Enzyme and Microbial Technology 36 (2005) 947-952, 「Thermally reversible inactivation of Taq polymerase in an organic solvent for implementation in hot start PCR」を参照のこと。）。第１ＰＣＲサイクル中の９５℃での変性工程または、引き上げられた温度での前活性化工程において、保護基が開裂し、酵素活性が回復する。
【０００６】
米国特許ＵＳ５６７７１５２およびＵＳ５７７３２５８は、Ｔａｑポリメラーゼのリジン中のＮＨ２基を一時的に保護するための、水性溶媒におけるシトランコン酸無水物およびその誘導体の使用を開示する。無水物とアミンの反応後に生成されるアミドは、ＰＣＲ反応で用いられるトリス緩衝液の存在下における熱処理後に酸性化した溶媒によって、加水分解される。
【０００７】
また、イサト酸無水物誘導体が、タンパク質上に存在するアミンのような求核基と反応することができることが示されている。１９８２年に、Moorman A. R.らは、イサト酸無水物による、タンパク質、キモトリプシンのアシル化を開示した（Moorman A. R., Abeles R. H. J., Am. Chem. Soc., 1982, 104, 6785-6786）。この反応は、安定なアントラリン誘導体を生成することで、タンパク質を失活させる。より近年、Hookerらは、イサト酸無水物の反応性を用いて、リゾチーム分子のリジン残基を改変し、さらに酸化カップリングを通して機能できるようになるアニリンモチーフを導入する（Hooker J. M., Esser-Kahn A.B., Francis M. B., J. Am. Chem. Soc., 2006, 106, 1558-1559）。このように、リジンの側鎖上に存在するアミン基の、イサト酸無水物によるアシル化により、非常に安定したアミド結合を形成する。
【０００８】
フランス特許出願ＦＲ１２５７５２６は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはキメラ核酸（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を機能化、ラベリング、捕捉、または分離するためのイサト酸無水物由来のアシル化試薬を開示する。より具体的には、アシル化試薬は、これらの生体分子において所望の官能基を修正する目的で記載されている。
【０００９】
本発明は、生体分子の可逆的保護のための新しい試薬、特に、「ホットスタート」酵素（「ホットスタート」酵素とは、熱処理によって簡単に脱保護される酵素を意味する）を作製するための試薬を提供する。該新しい試薬は、好ましくは、１つ以上の以下の優れた点を有する：
高価でない、
安定している、
水性溶媒に溶解する、
反応速度、ならびに脱保護速度が効率的である、
生体分子と反応したときの生成物が安定である、
熱による脱保護のためのトリス緩衝液の使用が不要である、および／または、
不要な副反応が発生しない。
【００１０】
そのため、本願中に記載される試薬は、Ｔａｑポリメラーゼのような核酸の重合に関する酵素、または特定の逆転写酵素、およびインビトロにおける診断技術で使用されるより一般的な酵素を一時的に不活性化するのに、特に適している。
【００１１】
〔概要〕
そのため、本発明は、下記式（Ｉ）の化合物に関する：
【００１２】
【化１】
2019522058.tif 000002
【００１３】
（式中、
Ｘは、共有結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｙは、求核基であり、好ましくは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｏ、またはＮＨ−ＮＲ４であり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３は、それぞれ互いに独立して、ＮまたはＣを表し、好ましくは、Ｚ３はＣを表し、より好ましくは、Ｚ３はＣであり、かつＲ３はＺ３に位置し、
Ｒ１は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環であり、好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、
Ｒ２は、非耐熱性および／または非耐酸性保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ１２アルキル基（例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、または２，２−ジメチルプロピル基）、置換されたもしくは置換されていないアリール基、置換されたもしくは置換されていないヘテロ環、アシル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル基、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、またはシアノ基である）。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明に係る化合物は、下記式（ＩＩ）である：
【００１５】
【化２】
2019522058.tif 000003
【００１６】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ１、Ｚ２、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上述の式（Ｉ）と同一である）。
【００１７】
特定の一実施形態において、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中の前記非耐熱性および／または非耐酸性基Ｒ２は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）基、置換されたもしくは置換されていないフェノキシアセチル基、トリチル基、メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、またはシトラコニル基から選択される。
【００１８】
特定の一実施形態では、先行する実施形態と組み合わせてもよく、Ｒ１はメチル基である。
【００１９】
特定の一実施形態では、先行する実施形態と組み合わせてもよく、Ｒ３はヨウ素である。
【００２０】
特定の一実施形態では、先行の実施形態と組み合わせてもよく、Ｚ１はＮ、かつＺ２はＣである。
【００２１】
特に、本発明は、下記構造式を有する化合物のうちの１つに関する。
【００２２】
【化３】
2019522058.tif 000004
【００２３】
また、本発明は、保護された生体分子を形成するために、前記生体分子の１つ以上の求核基がアシル化される条件下において、上述のような本発明の化合物を、１つ以上の求核基を含む生体分子と接触するように配置する工程を含む、保護された生体分子の作製方法に関する。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、生体分子はアミン官能基を含む。特に、生体分子は、求核官能基、特にタンパク質のリジン残基またはアミノ酸末端におけるアミン官能基、セリンにおけるアルコール官能基、および／またはシステインのチオール官能基を含む、タンパク質である。
【００２５】
本発明は、特に、下記式（ＩＩＩ）で表される保護された生体分子に関する：
【００２６】
【化４】
2019522058.tif 000005
【００２７】
（式中、
Ｂｉｏｍｏｌは生体分子であり、
Ｗは、前記生体分子の求核基（好ましくは、ＮＨ、ＳまたはＯ）であり、かつ、
Ｘは、共有結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｙは、求核基であり、好ましくは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｏ、またはＮＨ−ＮＲ４であり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３は、それぞれ互いに独立して、ＮまたはＣを表し、好ましくは、Ｚ３はＣを表し、より好ましくは、Ｚ３はＣであり、かつＲ３はＺ３に位置し、
Ｒ１は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環であり、好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、
Ｒ２は、Ｈ、または非耐熱性および／または非耐酸性保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ１２アルキル基（例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、または２，２−ジメチルプロピル基）、置換されたもしくは置換されていないアリール基、置換されたもしくは置換されていないヘテロ環、アシル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル基、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、またはシアノ基である）。
【００２８】
特定の一実施形態において、Ｂｉｏｍｏｌは、タンパク質、特に酵素から選択される。
【００２９】
特に好ましい実施形態において、Ｂｉｏｍｏｌは、核酸重合反応で使用される酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）である。
【００３０】
また、開示されるのは、本発明に係る化合物によって保護された生体分子における、求核基の脱保護方法であって、該方法は、１つまたは複数の前記非耐熱性および／または非耐酸性基Ｒ２をそれぞれ熱処理および／または酸処理することで開裂させる工程、およびこれに付随する生体分子における求核基の脱保護を含む方法である。
【００３１】
そのため、本発明は、酵素を可逆的に失活させるための、本発明の化合物の使用にも関する。好ましい一実施形態において、本発明の化合物は、核酸重合反応で使用される酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の可逆的失活のために使用される。
【００３２】
本発明は、さらに、本発明に係る化合物によって、失活したポリメラーゼ酵素の使用、および、核酸増幅工程に先行する、１つまたは複数の非耐熱性基Ｒ２が開裂し、求核基を脱保護できるような温度での少なくとも１回の熱処理工程を含む核酸の増幅方法に関する。
【００３３】
＜定義＞
「置換されたもしくは置換されていない」なる用語は、基に存在する１つ以上の水素が、官能基（例えば、以下の群より選択される：アミン、イミン、ニトリル、シアノ、アミド、イミド、ヒドロキシル、アルコキシル、カルボニル、カルボキシル、エステル、チオール、チオエーテル、チオエステル、およびハロゲン化物）によって置換されていてもよいことを意味する。
【００３４】
「Ｃｘ〜Ｃｙアルキル基」は、ｘ〜ｙ個の炭素原子を有する、直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル鎖、またはシクロアルキルを表す。直鎖状のアルキル鎖の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、およびｎ−デシルが挙げられる。分枝鎖状アルキル鎖の例として、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、２，２−ジメチルプロピル、イソオクチル、イソノニル、およびイソデシルが挙げられる。シクロアルキルの例として、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【００３５】
「アリール」なる用語は、環中、ヘテロ原子を含まない芳香族炭化水素を表す。例えば、アリール基は、芳香族環の一部に６〜１４個の炭素原子を含んでいても良い。アリール基の例として、フェニル、ビフェニル、フェナントレニル、ピレニル、クリセニル、アントラセニル、およびナフチルが挙げられる。
【００３６】
「ヘテロ環」なる用語は、飽和または不飽和の少なくとも１つの環を有する官能基を表し、環を形成する原子の少なくとも１つは、ヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ等）である。ヘテロ環は、複数の縮合環から成ってもよい。例えば、ヘテロ環は、環の一部に６〜１４個の原子を含んでもよい。
【００３７】
「アシル」なる用語は、カルボニル基、カルボニルの炭素原子を介して分子と結合している、アシル基を含むグループを表す。また、炭素原子は、置換されたもしくは置換されていないアルキル基、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されていないヘテロ環に属する他の炭素原子に結合する。例えば、アシル基は、２〜１２個の炭素原子を含む。
【００３８】
「アルケニル」なる用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、直鎖状もしくは分枝鎖状アルキル鎖、またはシクロアルキルを表す。アルケニル基の例として、ビニル、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ３）、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）＝ＣＨ２、シクロヘキシニル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニル、ブタジエニル、ペンタジエニル、およびヘキサジエニルが挙げられる。例えばアルケニル基は、２〜１２個の炭素原子を含む。
【００３９】
「求核」または「求核基」なる用語は、適した反応条件下において、結合を形成するのに必要な２つの電子を供給することによって、反応部（求電子）と共有結合を形成することができる基を表す。１つ以上の求核基は、自然に生体分子（例えば、タンパク質または酵素中の、リジンにおけるアミン基、ポリペプチド鎖のアミン末端、セリンのアルコール、またはシステインにおけるチオール基）中に存在し得る。
【００４０】
「保護基」なる用語は、分子の反応性の一部またはすべてを隠すために、化学官能基から分子へ導入される官能基を表す。分子上の化学官能基を隠す（保護する）ことで、その後の反応の選択性が向上する。そのため、「保護」または「保護された」なる用語は、保護基との反応後の分子の状態を表す。「保護された生体分子」は、保護基によって保護された１つ以上の化学官能基を有する生体分子である。酵素において、保護された酵素は失活していてもよい。脱保護は、保護された分子から一部またはすべての保護基を分離し、好ましくは、本発明の化合物による保護以前の当初の状態の分子を得る工程を表す。
【００４１】
「非耐熱性保護基」は、室温（例えば、１５℃〜２５℃）で安定であり、熱処理（加熱工程）によって、結合している分子から開裂、分離、塩析される、保護基を表す。熱処理とは、例えば、５０℃〜１００℃の温度で、特に、生体分子（例えば、酵素）が最適に機能するのに適した緩衝液の存在下での処理である。
【００４２】
非耐熱性保護基は、特に、Koukhareva et al, Anal. Chem., 2009, 81, 4955-4962;またはTrinlink Biotechnologies（ＷＯ２０１２／０９４３４およびＵＳ８，１３３，６６９）に記載の保護基を含む。
【００４３】
非耐熱性保護基の例として、一般的に、アミド、エーテル、エステル、アセタール、カーボネート、チオエーテル、チオエステル、チオアセタール、チオカーボネート、および特に、Koukhareva et al, Anal. Chem., 2009, 81, 4955-4962に記載の保護基、またはモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、および／または置換されたもしくは置換されていないフェノキシ酢酸が挙げられる。
【００４４】
「非耐酸性保護基」なる用語は、中性状態または塩基性状態において安定であり、室温で酸性状態（例えば、ｐＨ６．０または５．０未満での処理）で開裂、分離、または塩析される、保護基を表す。非耐酸性保護基の例として、特に、シトラコニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル、トリチル（Ｔｒｔ）、メトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、またはｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）が挙げられる。その他の非耐酸性保護基の例は、Chem. Rev., 2009, 109 (6), pp 2455-2504に記載される。より具体的には、２４６７頁および２４９３頁に、保護基がヒドロキシル官能基の保護基であるかまたはアミン官能基の保護基である旨が記載されている。
【００４５】
「生体分子」なる用語は、有機生命体によって合成可能なすべてのマクロ分子を含むと、広く理解されたい。特に、「生体分子」は、核酸ポリマー（特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、多糖類、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質（特に、酵素）を含む。
【００４６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は、相互変換可能であり、アミノ酸のポリマーまたはオリゴマーを表す。そのようなポリマーのアミノ酸は、２つのアミノ酸のカルボキシル基とアミン基との間が、ペプチド結合によって結合している。タンパク質は、非共有結合および／またはジスルフィド架橋によって結合した複数のポリペプチドを含み得る。
【００４７】
本発明の意味において、「アミノ酸」なる用語は、自然発生的アミノ酸もしくは非自然発生的アミノ酸、またはこれらの置換された誘導体を含む。
【００４８】
＜生体分子の保護のための試薬＞
生体分子の保護のための本発明の化合物または試薬は、生体分子（例えば、タンパク質）の一時的保護（「可逆的」保護）求核基（アミン等）として有用なイサト酸無水物誘導体である。
【００４９】
本発明の化合物は、生体分子、特に、タンパク質の求核基と反応する。例えば、化合物は、タンパク質（または酵素）中のリジンのアミンεまたはタンパク質（または酵素）中のＮ末端アミン、タンパク質（または酵素）中のセリンのアルコールまたはタンパク質中のシステインのチオールと反応し、それぞれ、アミド結合、エステル結合またはチオエステル結合を形成し得る。タンパク質または酵素中の求核官能基のうち、好ましくは、少なくとも１つが、タンパク質の官能基および／または酵素の官能基の立体配座を維持するのに重要な働きをもつ。そのため、上述の重要な求核官能基（例えば、リジン、セリンまたはシステイン）を保護することで、タンパク質または酵素を失活させる。
【００５０】
有利には、生体分子と本発明の化合物との間で得られるアミド結合、エステル結合、および／またはチオエステル結合は、特に、低温または室温で安定である。生体分子は、例えば、保存または輸送における室温条件下で、本発明の化合物と併せると、失活し得る。より具体的には、以下の原則に沿って、酵素の脱保護のための条件を生じさせることで、酵素の反応開始点を制御することが可能である：
第１工程において、本発明の化合物と酵素の求核基とのアシル化反応により、本発明の化合物を反応させ、保護された酵素を得る工程、
第２工程において、酸処理および／または熱処理によって、本発明の化合物中に存在する非耐熱性および／または非耐酸性保護基を開裂させることで、本発明の化合物の求核官能基を脱保護し、本発明の化合物の前記求核官能基を保護する工程、
第３工程において、酵素の可逆的なアシル化、脱保護、および酵素活性の保存が付随的に可能となる、本発明の化合物中の脱保護された求核官能基と、酵素のアシル化によって得られるアミド、エステル、またはチオエステル中のカルボニルと、の間を環化する工程。
【００５１】
以下の文章中において、明言されない限り、「本発明の化合物」なる用語は、下記式（Ｉ）の化合物、ならびにこれらの特定の下位の式（特に式（ＩＩ）〜（ＶＩ））、これらの化合物の塩、これらの立体異性体（ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む）、互変体、および同位体標識した化合物（重水素置換体および放射性同位体を含む）を表す。
【００５２】
下記式（Ｉ）の本発明の化合物は、特に、
【００５３】
【化５】
2019522058.tif 000006
【００５４】
分子中の求核基をアシル化できる、アザイサト無水物モチーフ、
ひとたび分離すると、アシル化によって生成されたアミド結合を開裂させる、非耐熱性および／または非耐酸性基Ｒ２によって保護された求核官能基Ｙ、
求核官能基の脱保護後の環化を促すよう設計された、イサト酸無水物と求核官能基との間の接続腕Ｘ、
熱処理および／または酸処理工程中、求核官能基Ｙを分離でき、これにより分子間環化する、求核基Ｙ中の非耐熱性および／または非耐酸性保護基Ｒ２、
好ましくは、求核周辺の立体障害および分子間環化運動の促進を引き起こすことができる、立体的に嵩高い基Ｒ３（このような立体障害の存在が、分子間環化運動に非常に有利となり、生体分子中の求核基の脱保護の速度にも非常に有利となることが、偶然にも発見された）、を提供する。
【００５５】
よって、本発明の目的は、下記式（Ｉ）の化合物である：
【００５６】
【化６】
2019522058.tif 000007
【００５７】
（式中、
Ｘは、共有結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｙは、求核基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３は、それぞれ互いに独立して、ＮまたはＣを表し、好ましくは、Ｚ３はＣを表し、より好ましくは、Ｚ３はＣであり、かつＲ３はＺ３に位置し、
Ｒ１は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環であり、好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、
Ｒ２は、非耐熱性および／または非耐酸性保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ１２アルキル基（例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、または２，２−ジメチルプロピル基）、置換されたもしくは置換されていないアリール基、置換されたもしくは置換されていないヘテロ環、アシル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル基、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、またはシアノ基である）。
【００５８】
好ましくは、前記基Ｚ１、Ｚ２およびＺ３のうち１つだけが、Ｎである。
【００５９】
特定の一実施形態において、Ｘは、置換されていないＣ１〜Ｃ３アルキル（例えば、メチル）である。
【００６０】
一実施形態において、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アルケニル、アリール基またはヘテロ環である。前記アルキル、アルケニル、アリール基またはヘテロ環は、ニトリル、シアノ、アミド、イミド、アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、エステル、チオエーテル、チオエステル、およびハロゲン化物から選択される１つ以上の官能基によって置換され得る。
【００６１】
一実施形態において、Ｒ１は、ニトリル、シアノ、アミド、イミド、アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、エステル、チオエーテル、チオエステルおよびハロゲン化物から選択される１つ以上の官能基によって置換され得るＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
【００６２】
一実施形態において、Ｒ２は、アミド、エーテル、エステル、アセタール、カーボネート、チオエーテル、チオエステル、チオアセタール、チオカーボネート、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、置換され得るフェノキシ酢酸、シトラコニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル、トリチル（Ｔｒｔ）、メトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）またはｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）から選択される保護基である。
【００６３】
一実施形態において、Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、アリール基、ヘテロ環、アシル基、アルケニル基、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）またはシアノである。前記アルキル、アリール、ヘテロ環、またはアルケニル基は、ニトリル、シアノ、アミド、イミド、アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、エステル、チオエーテル、チオエステル、およびハロゲン化物基から選択される１つ以上の官能基によって置換され得る。
【００６４】
一実施形態において、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基またはハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）である。前記アルキル基は、ニトリル、シアノ、アミド、イミド、アルコキシ、カルボニル、カルボキシル、エステル、チオエーテル、チオエステル、およびハロゲン化物基から選択される１つ以上の官能基によって置換され得る。
【００６５】
Ｒ３は、環化運動を促進するように配置される。例えば、一実施形態において、Ｒ３は、好ましくは６番の位置である。
【００６６】
特定の一実施形態において、Ｒ３は、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソプロピル基、シアノ基またはヨウ素原子である。
【００６７】
特定の一実施形態において、ＹはＳ−Ｓ結合とは異なる。特定の他の実施形態において、２価の求核基Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｏ、ＮＨ−ＮＲ４、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＮＲ４、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｏ、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＲ４、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＲ４、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｏ、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｏ、Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＮＲ４、Ｃ（Ｏ）−Ｓから選択され、かつ、Ｒ４は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル基である。
【００６８】
一実施形態において、環Ｒ２に結合している主鎖上の原子の数を意味する、Ｘ＋Ｙの直線原子の数（異なるＨ、またはＲ４置換基は数に入れない）は、２以上（例えば２〜４）である。
【００６９】
好ましくは、Ｙは、Ｏ、Ｓ、およびＮＨから選択される。この場合、Ｘは結合しない。
【００７０】
好ましい他の実施形態において、Ｙは、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ４から選択され、Ｘは結合しない。より好ましい実施形態において、本発明の化合物は、下記式（ＩＩ）の化合物である。
【００７１】
【化７】
2019522058.tif 000008
【００７２】
特定の一実施形態において、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）中の非耐熱性または非耐酸性基Ｒ２は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、置換されたもしくは置換されていないフェノキシアセチル、トリチル、メトキシトリチル、ジメトキシトリチル、またはシトラコニル基から選択される。
【００７３】
フェノキシ酢酸基の非耐熱性特性は、Lebedev A.らによって証明された（Koukhareva I., Lebedev A., Anal. Chem. 2009, 81, 4955-4962）。特定の一実施形態において、保護基Ｒ２は、非耐熱性保護基であり、置換されたもしくは置換されていないフェノキシアセチル、好ましくはハロゲンによって置換されたフェノキシアセチル（例えばフルオロフェノキシアセチル）である。
【００７４】
当業者は、例えば、ＷＯ２０１２／０９４３４３、ＵＳ８，１３３，６６９または下記文献に記載されているため、所望の機能に特に適した他の非耐熱性および／または非耐酸性保護基を特定できるだろう：
Greene's Protective Groups in Organic Synthesis by Peter G. M. Wuts, Publisher: Wiley-Blackwell; Edition: 5th Edition (December 23, 2014)、または、
Protecting Groups by PJ Kocienski, Publisher: Thieme Publishing Group; Edition: 3rd Revised edition (January 1, 2005)。
【００７５】
式（ＩＩ）に係る化合物の特定の一実施形態では、先行する実施形態と組み合わせてもよく、Ｒ１はメチル基である。
【００７６】
式（ＩＩ）に係る化合物の特定の一実施形態では、先行する実施位形態と組み合わせ得、Ｒ３は、ハロゲン（例えば、ヨウ素）である。
【００７７】
式（ＩＩ）に係る化合物の特定の一実施形態では、先行する実施形態と組み合わせてもよく、Ｚ１はＮであり、かつ、Ｚ２はＣである。
【００７８】
特に、本発明は、下記構造式を有する化合物（実施例にも記載されている）のうちの１つに関する：
【００７９】
【化８】
2019522058.tif 000009
【００８０】
【化９】
2019522058.tif 000010
【００８１】
【化１０】
2019522058.tif 000011
【００８２】
＜本発明の化合物の作製方法＞
本発明の化合物は、実施例に記載の方法、または先行技術として公知の他の合成方法に沿って容易に合成され得る。
【００８３】
例えば、式（ＩＩ）に係る本発明の化合物のいくつかは、合成が実施例１に記載されるヒドロキシル化された前駆体化合物６から合成され得る。非耐熱性または非耐酸性基Ｒ２が、前駆体化合物６中のヒドロキシル基と反応することで、前駆体化合物６は改変され得る。従来の化学手法によっても、また、Ｒ１および／またはＲ３基はこれらの前駆体化合物またはこれらの誘導体と反応し得る。式（ＩＩ）に係る本発明の化合物は、例えば、下記実施例１における図式３の工程（ｉ）に記載されるように、求核置換による環化によって最終的に得られ得る。
【００８４】
＜生体分子を保護するための方法＞
本発明の化合物は、酵素、タンパク質および１つ以上の求核基を有するより一般的な生体分子、例えば、１つ以上のアミンを含む生体分子の保護、可逆的改変または失活のために有用である。
【００８５】
本発明は、特に、１つ以上の保護された求核基を含む生体分子を作製するための方法に関する。前記方法は、１つ以上の保護された求核基を含む生体分子（または、本明細書中で「保護された生体分子」とも称する）を形成するために、生体分子中の１つ以上の求核基がアシル化できる条件下で、上述のような本発明の化合物を、前記生体分子と接するように配置する工程を含む。
【００８６】
生体分子の求核基が加わることで、無水物のカルボニル官能基のうちの１つが求核置換され、ＣＯ２が除外されることによってアシル化がおこる。
【００８７】
特に好ましい一実施形態において、生体分子はアミン官能基を含む。特に、生体分子は、リジン残基のε−アミン官能基または末端アミノ酸のアミンを含むタンパク質である。これらの実施形態において、リジン残基のε−アミン官能基または末端アミンのアシル化により、特に、長期保存の条件下（例えば、室温で２４時間超または数日間）において、非常に安定なアミド結合を形成することができる。
【００８８】
説明図として、式（ＩＩ）の好ましい試薬を用いたアシル化反応を下記図式１に記載する（ここで、Ｒ１はメチル基、Ｚ１はＮ、Ｚ２はＣ、Ｒ３はヨウ素原子である）。
【００８９】
【化１１】
2019522058.tif 000012
【００９０】
生体分子が複数の保護された求核基を有する場合、使用される試薬の量を、所望の改変（保護）の度合いに応じて、調整することができる。特に、酵素の場合、所望の改変の度合いは、好ましくは、酵素が失活する閾値以上を意味する。この閾値は、簡単な試験によって経験的に測定可能である。
【００９１】
保護反応に使用される緩衝液は、一般的にｐＨが６〜９、好ましくはｐＨ７〜９、より好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液である。緩衝液の例として、リン酸緩衝液および前記ｐＨの範囲内で作用する非求核緩衝液が挙げられる。前記非求核緩衝液は、最大５０％のＤＭＳＯを含み得る。このような緩衝液は、http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers.htmlに示されるように、当業者にとって公知である。
【００９２】
アシル化反応、特に、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の少なくとも１つとの酵素のアシル化は、好ましくは、例えばｐＨ７．４である、リン酸緩衝液中で行われることが好ましい。
【００９３】
保護工程は、好ましくは、４℃〜４０℃の温度、例えば４℃〜２５℃の温度で行われる。
【００９４】
上述の方法で得ることができる、１つ以上の保護された求核基を有する生体分子もまた、本発明の一部である。特に、酵素は、ポリペプチド配列中に複数のリジンが存在することで保護された複数のアミン基を有していてもよく、またはセリンもしくはシステインが存在することで、それぞれ、ＯＨ基もしくはＳＨ基を有していてもよい。
【００９５】
そのため、本発明は、下記式（ＩＩＩ）によって表される保護された生体分子に関する：
【００９６】
【化１２】
2019522058.tif 000013
【００９７】
（式中、
Ｂｉｏｍｏｌは生体分子であり、
Ｗは、前記生体分子の求核基（好ましくはＮＨ、ＳまたはＯ）であり、
Ｘは、共有結合またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
Ｙは、求核基であり、好ましくは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４、Ｏ−ＮＲ４、ＮＨ−Ｏ、またはＮＨ−ＮＲ４であり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３は、それぞれ互いに独立して、ＮまたはＣを表し、好ましくは、Ｚ３はＣを表し、より好ましくは、Ｚ３はＣであり、かつＲ３はＺ３に位置し、
Ｒ１は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ６アルキル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール基、または置換されたもしくは置換されていないヘテロ環であり、好ましくは、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、
Ｒ２は、Ｈ、または非耐熱性および／または非耐酸性保護基であり、
Ｒ３は、Ｈ、置換されたもしくは置換されていないＣ１〜Ｃ１２アルキル基（例えば、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基、または２，２−ジメチルプロピル基）、置換されたもしくは置換されていないアリール基、置換されたもしくは置換されていないヘテロ環、アシル基、置換されたもしくは置換されていないアルケニル基、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、またはシアノ基である）。
【００９８】
もちろん、生体分子が複数の求核基を有する、例えばいくつかのリジンを含むタンパク質である場合、単一の生体分子は本発明に係る試薬を用いたアシル化によって一部またはすべてが保護された求核基を有してもよい。
【００９９】
特に、式（ＩＩ）の試薬が１つ以上の求核基を有する生体分子と反応する場合、下記式（ＶＩＩ）の保護された生体分子が得られる：
【０１００】
【化１３】
2019522058.tif 000014
【０１０１】
上述の式（ＩＶ）、（Ｖ）および（ＶＩ）の試薬から１つを選択することで、式（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）および（Ｘ）のうち１つに係る保護された生体分子がそれぞれ得られる。
【０１０２】
【化１４】
2019522058.tif 000015
【０１０３】
【化１５】
2019522058.tif 000016
【０１０４】
【化１６】
2019522058.tif 000017
【０１０５】
特定の一実施形態において、生体分子（またはＢｉｏｍｏｌ）は、酵素から選択される。
【０１０６】
前記方法はいずれの種類の酵素にも適用可能である。特定の所望の酵素として、分子生物学技術において、遺伝子設計のためまたは核酸の重合のために使用される酵素、より具体的には、インビトロにおける診断法に使用される酵素が挙げられる。
【０１０７】
図のように、これらの酵素は、リパーゼ、プロテアーゼ、グリコラーゼ、またはヌクレアーゼを含む。
【０１０８】
特に、所望の酵素として、制限酵素、リガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ、またはＤＮＡポリメラーゼα、βもしくはγ等のＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）またはテロメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、プライマーゼまたはＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）が挙げられる。
【０１０９】
より具体的な好ましい一実施形態において、本発明に係る生体分子は、核酸重合反応において使用される酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼである。核酸の重合に適するポリメラーゼは、当業者によく知られている。重合反応は、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の進行における重合反応である。
【０１１０】
一実施形態において、本発明に係る保護方法において使用される所望の酵素は、以下のポリメラーゼから選択される：Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＫｏｒｎｂｅｒｇＤＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｌＤＮＡポリメラーゼ、αＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ。特に、一実施形態において、熱に安定であり、および／またはエクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば３’５’ エクソヌクレアーゼ）は、本発明に係る方法において、保護されたポリメラーゼを作製するために使用される。
【０１１１】
これらの保護されたポリメラーゼは、特に、ホットスタート法に有用である。ポリメラーゼを保護することで、低温でのＤＮＡの非特定の増幅を防ぎ、そのため増幅反応の効率が促進され、高温での酵素が非耐熱性基の開裂によってのみ脱保護される。
【０１１２】
これらの熱に安定なポリメラーゼにおいて、特に、５０℃〜１００℃で酵素の構造が変性し、および／または酵素の活性が失活する傾向がなく、酵素がひとたび脱保護されると、５０℃〜１００℃で酵素の機能が活性化する傾向がある酵素をリスト化する。特に、ポリメラーゼ：ＴＡＱポリメラーゼおよびＫｌｅｎＴＡＱポリメラーゼである。
【０１１３】
他の熱に安定な酵素は、以下の生物体由来であり得る：Thermus antranikianii、Thermus aquaticus、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus filiformis、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps-17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Anaerocellum thermophilum、Bacillus caldotenax、Bacillus stearothermophilus等。
【０１１４】
＜本発明の化合物を使用する方法＞
本発明に係る保護された生体分子は、選択されるＲ２基に依存する簡単な熱処理および／または酸処理によって、有利に脱保護され得る。
【０１１５】
熱処理または酸処理による、式（ＶＩＩ）に係る保護された生体分子（酵素）を用いた脱保護の原理を下記図式２に記載する。式中、Ｒ１はメチル基、Ｚ１はＮ、Ｚ２はＣおよびＲ３はヨウ素原子である：
【０１１６】
【化１７】
2019522058.tif 000018
【０１１７】
熱処理または酸処理は、非耐熱性または非耐酸性基を開裂させることで、本発明の化合物の求核官能基を分離する。上述のように分離された求核官能基は、生体分子の環化および脱保護によってアシル化が逆行する。有利には、脱保護反応によって生成された副生成物は、反応しない。加えて、この保護反応は、トリス緩衝液または酸および高温条件を引き起こす緩衝液を使用する必要はない。特に、脱保護工程は、ｐＨ６．５〜９．５、好ましくはｐＨ８〜９．０、より好ましくはｐＨ８．５〜９．０の条件下での熱処理によって行うことができる。
【０１１８】
そのため、本発明の化合物によって保護された生体分子の求核基の脱保護のための方法もまた記載される。前記方法は、熱処理および／または酸処理によって、それぞれ非耐熱性基および／または非耐酸性基Ｒ２をそれぞれ開裂させる工程を含み、求核基の脱保護が付随する。
【０１１９】
上述の方法の利点の１つは、酵素を失活させることができる点である。「失活」とは、保護以前の適切な活性条件下での触媒活性と比較して、本発明の方法によって保護された酵素の触媒活性が、かなり低減されるかまたは皆無であることを意味すると理解されたい。
【０１２０】
その結果、上述の脱保護方法によって、保護された酵素の酵素活性を回復することができる。
【０１２１】
そのため、本発明は、酵素の可逆的な失活のための本発明の化合物の使用にも関する。好ましい一実施形態において、本発明の化合物は、核酸増幅反応において使用される酵素（例えば、ポリメラーゼ）の可逆的な失活のために使用される。
【０１２２】
本発明は、特に、ホットスタート法の酵素（例えば、核酸増幅反応（「ＰＣＲ」として知られる反応）において使用されるポリメラーゼ）に適している。
【０１２３】
そのため、本発明はまた、核酸を増幅する方法にも関する。前記方法は、（ｉ）本発明の化合物によって保護されているまたは失活されるポリメラーゼ酵素の使用、（ｉｉ）ポリメラーゼの脱保護のための少なくとも１つの工程（例えば、１つまたは複数の非耐熱性基Ｒ２を開裂することができる温度での熱処理）、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において脱保護されたポリメラーゼを使用する核酸増幅工程を含む。
【０１２４】
特定の一実施形態において、増幅方法は、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素のＫｌｅｎｏｗ断片、または上述のようなその他のポリメラーゼを用いて行われる。
【０１２５】
他の一実施形態では、上述の実施形態と組み合わされてもよく、増幅方法は、当業者によく知られる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）である。ＰＣＲプロトコルは、例えば２０〜４０サイクルを有し、それぞれのサイクルが、少なくとも（ｉ）一般的に９０℃〜９５℃の温度での、増幅されるＤＮＡの変性段階、（ｉｉ）一般的に５５℃〜６５℃の温度で増幅される、ＤＮＡとのプライマーのハイブリダイゼーション段階、および（ｉｉｉ）一般的に６８℃〜７５℃の温度での伸長段階を含む。
【０１２６】
この場合、本発明に係る保護されたポリメラーゼは、好ましくは、熱に安定な保護されたポリメラーゼ、例えば、保護されたＴａｑ（Thermus aquaticus）ポリメラーゼ、保護されたＰｆｕ（Pyrococcus furiosus）ポリメラーゼ、保護されたＶｅｎｔまたはＴｌｉ（Thermococcus litoralis）ポリメラーゼ、またはこれらの改良型、特に組み換え型である。好ましくは、保護されたポリメラーゼが、室温において失活または実質的に失活し、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーのアニーリング温度以上の温度で脱保護され得るように、前記ポリメラーゼ中の十分な数のアミンが保護されている。
【０１２７】
本発明の保護された酵素および保護されたポリメラーゼは、ＰＣＲによる核増幅のための種々の方法において有利に使用される。特に、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ（またはｑＰＣＲ）、半定量的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ、「エラープローン」ＰＣＲ、または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【０１２８】
＜キットおよびツールキット＞
また、本発明は、本発明に係る保護された酵素を含むキットまたはツールキットに関する。これらは、試薬、緩衝液、コントロールおよび／または取扱説明書等を含み得る。
【０１２９】
特に、本発明は、ホットスタート核酸増幅のためのキットに関する。前記キットは以下を含む：
ｉ．本発明に係る保護された熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、式（ＩＩＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、または（Ｘ）（前記式中、Ｂｉｏｍｏｌが熱に安定なＤＮＡポリメラーゼである））、
ｉｉ．適切な場合には、核酸検出試薬（例えば、蛍光試薬）、
ｉｉｉ．適切な場合には、緩衝液、ｄＮＴＰ等。
【０１３０】
これらのキットは、特に、上述の増幅方法を実行するために有用である。
【０１３１】
本発明は、後述する実施例および添付の図面によってよりよく理解されるだろう。
【０１３２】
〔図面の説明〕
図１：アザアントラニル酸フェノキシ酢酸誘導体１０の開裂およびフェニルエチルアミンの分離をモニタリングするＨＰＬＣ。
【０１３３】
図２：フルオロアザアントラニル酸フェノキシ酢酸誘導体１４の開裂およびフェニルエチルアミンの分離をモニタリングするＨＰＬＣ。
【０１３４】
図３：ｎ−Ｂｏｃアザアントラニル酸誘導体１９の開裂およびフェニルエチルアミンの分離をモニタリングするＨＰＬＣ。
【０１３５】
図４：異なる濃度で使用される化合物１３による、ヘモグロビンのアシル化。
【０１３６】
図５：熱処理後のヘモグロビンの逆アシル化
上段図（Ａ）：８ＭＧｕＨＣにおけるヘモグロビン
中断図（Ｂ）：化合物１３によってアシル化され、８ＭＧｕＨＣｌに採取されたヘモグロビン
下段図（Ｃ）：化合物１３によってアシル化され、ｐＨ９のトリス緩衝液で９５℃に熱せられ、８ＭＧｕＨＣｌに採取されたヘモグロビン。
【０１３７】
図６：化合物１３によるアシル化によるＴａｑポリメラーゼの失活、およびＰＣＲ条件下において９５℃で１５分間の熱処理後の活性の回復（２回行った実験の平均を示す）。左側の白地にドット：活性無し、右側の濃い網掛け：９５℃での活性化の１５分後。
【０１３８】
〔実施例〕
後述の実施例において、下記の略語を使用する：
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
Ｂｏｃ２Ｏ：ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィ
ＣＤＣｌ３：重水素化クロロホルム
ｄ：ダブレット
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ｄｄ：ダブレットのダブレット
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＭＳＯ−ｄ６：重水素化ジメチルスルホキシド
ミリＱ水：超純水（Millipore, Molsheim, France）
ＥＤＣ：Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ｅｑ：当量
ＰＥ：石油エーテル
Ｅｔ２Ｏ：ジエチルエーテル
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィ
ＬＣＭＳ：質量分析計を備える液体クロマトグラフ機器
ＨＯＢｔ：ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＡ：イサト酸無水物
ｍ：多重状態
ｎｄ：測定不可
ＮＩＳ：Ｎ−ヨードスクシンイミド
ｑ：四重線
Ｙｌｄ：収率
ＲｆまたはＲＴ：保持時間
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ｓ：シングレット
ｔ：トリプレット
ｒｔ：室温
ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン。
【０１３９】
＜一般的条件＞
後述の実施例において使用される化学的化合物の分析および合成のための一般的条件を以下に示す。
【０１４０】
ＨＰＬＣ分析を、ＰＤＡ  ９９６ダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ）、ＺＱ  ２０００質量分析検出器（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｅｍｐｏｗｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２、および３０℃で流速１ｍｌ／分（２６０ｎｍまたは最大プロットにおける検出）で使用される、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ  ＭＳ  Ｃ１８カラム（４．６×３０、２．５μｍ）を備える、ＷＡＴＥＲＳ  ２７９５  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣシステムを用いて行う。ＺＱ  ２０００質量分析は、エレクトロスプレーイオン化源を有する。イオン化を、コーン電圧が２０Ｖおよび毛細管電圧が３．５ｋＶである正のモードで行う。
【０１４１】
ＨＰＬＣ分析における条件は、下記の通りである。
【０１４２】
【表１】
2019522058.tif 000019
【０１４３】
ＮＭＲスペクトルを、Ｊｅｏｌ  Ｌａｍｂｄａ  ４００ＭＨｚ分光計で記録した。化学シフト（δ）は、内部基準として使用される溶液のピーク（ＣＤＣｌ３：７．２６ｐｐｍ；ＤＭＳＯ−ｄ６：２．４９ｐｐｍ）に相対的なｐｐｍで示される。スペクトルを、上記略語（ｓ、ｄ、ｔ、ｑ、ｑｕおよびｍ）を用いて記載する。結合定数（Ｊ）を、ヘルツ（Ｈｚ）で表す。
【０１４４】
カラムクロマトグラフィを、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０、メッシュ０．０６３〜０．２ｍｍ／７０〜２３０、またはＭｅｒｃｋ  ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（登録商標）ＲＰ−１８  ４０〜６３μｍシリカゲルで行った。
【０１４５】
薄層クロマトグラフィによる分析を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＰＯＬＹＧＲＡＭ（登録商標）ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ２５４、０．２０ｍｍ、またはＡＬＵＧＲＡＭ（登録商標）ＲＰ−１８  Ｗ／ＵＶ２５４  ０．１５ｍｍプレートで行った。
【０１４６】
＜実施例１：Ｏ−フェノキシ酢酸非耐熱性保護基を有する本発明のアザイサト酸無水物分子（９）（化合物ＩＶに対応）の合成＞
本実施例において、本発明の化合物の（図式３に係る）合成が記載される。初めの前駆体ヒドロキシル化合物６は、６つの工程のうち最初に合成される。これは、本発明の他の化合物の合成の出発化合物として提供される。それから、化合物６をフェノキシアセチル化し、化合物７を得る。そして、化合物７をヨード化し、化合物８を得る。最後に、化合物８を環化し、タンパク質または他の生体分子と反応し、それらを一時的に保護することができる、所望のアザイサト酸化合物９を得る。
【０１４７】
【化１８】
2019522058.tif 000020
【０１４８】
［実施例１．１：４−クロロ−１−ヒドロキシフルロ［３，４−ｃ］ピリジン−３（１Ｈ）−オン（１）の合成］
【０１４９】
【化１９】
2019522058.tif 000021
【０１５０】
窒素下における５００ｍＬシュレンク管中で、１９．３０ｍＬの２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（１１４．２４ｍｍｏｌ、３当量）を、１５０ｍＬのＴＨＦに溶かす。−１０℃で、６０．１３ｍＬのｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．９Ｍ、１１４．２４ｍｍｏｌ、３当量）を加え、反応混合物を１０分間撹拌する。−８０℃で、６．００ｇの２−クロロニコチン酸（３８．０８ｍｍｏｌ、１当量）を加え、反応物を−５０℃で３時間撹拌する。そして、１７．６９ｍＬのＤＭＦ（２２８．４８ｍｍｏｌ、６当量）を−８０℃で投入し、反応混合物を１時間３０分撹拌する。室温に戻した後、１００ｍＬの水を加え、その溶液を、ＡｃＯＥｔ（３×１５０ｍＬ）を用いて抽出する。その後、水相を、濃縮したＨＣｌ溶液でｐＨ２まで酸性化し、さらに、ＡｃＯＥｔ（３×２００ｍＬ）を用いて抽出する。そして、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、最後に蒸発させる。得られた油を、勾配溶離（ＤＣＭからＤＣＭ／ＡｃＯＥｔ  ８５／１５）によってシリカゲルカラムで精製する。
【０１５１】
最終生成物は、白色粉末として得られ、収率は６９％である（４．８８ｇ、２６．３０ｍｍｏｌ）。
【０１５２】
Mp = 191-193℃;IR (KBr): v, 3100 (OH), 2913, 2766, 1776 (C=O), 1609, 1584, 1408, 1194, 1136, 1093, 1047, 925, 755 cm-1;1H NMR (400MHz , DMSO-d6):δ 6.67 (bs, 1H); 7.79 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz); 8.50 (bs, 1H); 8.74 (d, 1H , 3J = 5.0 Hz);13C NMR (100 MHz, DMSO- d6): δ 96.9; 118.8; 120.4; 147.0; 154.6; 159.3; 164.6。
【０１５３】
［実施例１．２：ｔｅｒｔ−ブチル２−クロロ−４−ホルミルニコチネート（２）の合成］
【０１５４】
【化２０】
2019522058.tif 000022
【０１５５】
２５０ｍＬフラスコに、室温で、３．５ｇの化合物１（１８．８６ｍｍｏｌ、１当量）、３５ｍｌのＤＣＭ、および２．６２ｍｌのＴＥＡ（１８．８６ｍｍｏｌ、１当量）を加える。混合物を室温で１０分間撹拌する。０℃で、８．５４ｍｌのｔ−ＢｕＢｒ（７５．４５ｍｍｏｌ、４当量）および８．７４ｇのＡｇ２Ｏ（３７．７２ｍｍｏｌ、２当量）を少しずつ加える。反応物を室温で２時間撹拌する。前記混合物を、セライトを通して濾過し、蒸発させ、勾配溶離（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ  ９５／５からシクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ  ９０／１０）によって、シリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、白色粉末として得られ、収率は６７％である（３．０７ｇ、１２．７０ｍｍｏｌ）。
【０１５６】
Mp = 97-99℃;IR (KBr): v, 3077, 1732 (C=O), 1708 (C=O), 1578, 1370, 1294, 1261, 1178, 1133, 847 cm-1;1H NMR (400MHz, CDC13): δ 1.64 (s, 9H); 7.65 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz); 8.65 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz); 10.06 (s, 1H);13C NMR (100 MHz, CDC13): δ 27.9 (3C), 85.1; 121.0; 130.1; 140.6; 149.1; 150.9; 163.0; 188.2。
【０１５７】
［実施例１．３：ｔｅｒｔ−ブチル２−クロロ−４−（ヒドロキシメチル）ニコチネート（３）の合成］
【０１５８】
【化２１】
2019522058.tif 000023
【０１５９】
１００ｍＬフラスコ中、３５ｍＬのＥｔＯＨに３．００ｇの化合物２（１２．４１ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。−１０℃で、０．５１ｇのＮａＢＨ４（１３．６５ｍｍｏｌ、１．１当量）を少しずつ加え、その反応混合物を３０分間撹拌する。それから、５０ｍＬの水を加え、その溶液を、ＤＣＭ（３×７５ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＮａＣｌ飽和溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、蒸発させる。
【０１６０】
最終生成物は、白色粉体として得られ、収率は９７％（２．９４ｇ、１２．０６ｍｍｏｌ）である。
【０１６１】
Mp = 122-124℃;IR (KBr): v, 3263 (OH), 3003, 2980, 1717 (C=O), 1592, 1387, 1365, 1299, 1170, 1131, 1080, 1063, 869, 846 cm-1;1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.60 (s, 9H); 2.89 (t, 1H, 3J = 6.3 Hz); 4.69 (d, 2H, 3J = 6.3 Hz); 7.39 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz); 8.37 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 27.9 (3C); 61.3; 84.3; 120.6; 128.6; 147.2; 149.8; 150.8; 164.8。
【０１６２】
［実施例１．４：ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２−クロロニコチネート（４）の合成
【０１６３】
【化２２】
2019522058.tif 000024
【０１６４】
１００ｍＬフラスコに、室温で、２．２５ｇの化合物３（９．２３ｍｍｏｌ、１当量）、３０ｍＬのＤＣＭ、１．８８ｇのイミダゾール（２７．７０ｍｍｏｌ、３当量）、および２．７８ｇのＴＢＤＭＳＣｌ（１８．４７ｍｍｏｌ、２当量）を加える。反応混合物を室温で、４時間撹拌する。それから、５０ｍＬの水を加え、その溶液を、ＤＣＭ（３×７５ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＮａＣｌ飽和溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。そして、粗反応生成物を勾配溶離（ＰＥからＰＥ／Ｅｔ２ＯＨ  ９５／５）によってシリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、無色の油として得られ、収率は９５％（３．１５ｇ、８．８０ｍｍｏｌ）である。
【０１６５】
IR (KBr): v, 2956, 2931, 2859, 1717 (C=O), 1584, 1369, 1291, 1259, 1168, 1127, 840 cm-l;1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.10 (s, 6H); 0.94 (s, 9H), 1.60 (s, 9H); 4.74 (s, 2H); 7.50 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz); 8.39 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -5.6 (2C); 18.2; 25.7 (3C), 27.9 (3C); 61.1; 83.6; 119.7; 127.6; 146.7; 149.7; 151.0; 164.1。
【０１６６】
［実施例１．５：ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２−メチルアミノ）ニコチネート（５）の合成］
【０１６７】
【化２３】
2019522058.tif 000025
【０１６８】
シールド管に、室温で、４．００ｇの化合物４（１１．１７ｍｍｏｌ、１当量）、１５ｍＬのｔ−ＢｕＯＨ、および４．８３ｍＬのＭｅＮＨ２（Ｈ２Ｏ中、４０％ｗ／ｗ、５５．８７ｍｍｏｌ、５当量）を加える。その反応混合物を１００℃で、２４時間撹拌する。蒸発後に、それから５０ｍＬの水を加え、その溶液を、ＤＣＭ（３×７５ｍＬ）を用いて抽出する。そして、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥからＰＥ／Ｅｔ２ＯＨ  ９０／１０）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０１６９】
最終生成物は、無色の油として得られ、収率は７０％（３．１０ｇ、８．７９ｍｍｏｌ）である。
【０１７０】
IR (KBr): v, 3377 (N-H), 2931, 2857, 1732 (C=O), 1584, 1370, 1291, 1259, 1190, 1169, 1127, 1112, 839 cm-1;1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 0.11 (s, 6H); 0.96 (s, 9H); 1.59 (s, 9H); 3.02 (d, 3H, 3J = 4.9 Hz); 4.90 (s, 2H); 6.97 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz); 7.87 (bs, 1H); 8.25 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -5.4 (2C); 18.4; 25.9 (4C), 28.4 (3C); 63.9; 82.2; 104.9; 109.0; 151.8; 154.6; 159.5; 167.8。
【０１７１】
［実施例１．６：ｔｅｒｔ−ブチル４−（ヒドロキシメチル）−２−（メチルアミノ）ニコチネート（６）の合成］
【０１７２】
【化２４】
2019522058.tif 000026
【０１７３】
１００ｍＬフラスコ中、３０ｍＬのＤＣＭに３．００ｇの化合物５（８．５１ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。０．９７ｍＬのＡｃＯＨ（１７．０２ｍｍｏｌ、２当量）および１７．０２ｍＬのＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、１７．０２ｍｍｏｌ、２当量）を同時に加える。その反応物を室温で、１５時間撹拌する。それから、７０ｍＬの水を加え、その溶液を、ＤＣＭ（３×７０ｍＬ）を用いて抽出する。そして、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。それから、粗反応生成物を勾配溶離（ＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ８０／２０からＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ６０／４０）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０１７４】
最終生成物は、白色粉末として得られ、収率は９２％（１．８６ｇ、７．８１ｍｍｏｌ）である。
【０１７５】
IR (KBr): v, 3348 (N-H), 3242 (O-H), 2980, 2944, 1667 (C=O), 1596, 1557, 1530, 1367, 1242, 1165, 1126, 1074, 1061, 805 cm-1;1H NMR (400MHz, CDCl3): δ 1.60 (s, 9H), 3.01 (d, 3H, 3J = 4.9 Hz); 4.73 (s, 2H); 6.73 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz); 7.58 (bs, 1H); 8.22 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz);13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 28.3 (3C); 28.4; 64.0; 83.0; 106.4; 110.7; 151.8; 153.2; 159.2; 167.5。
【０１７６】
［実施例１．７：ｔｅｒｔ−ブチル２−（メチルアミノ）−４−（（２−フェノキシアセトキシ）メチル）ニコチネート（７）］
【０１７７】
【化２５】
2019522058.tif 000027
【０１７８】
５０ｍＬフラスコ中、５ｍＬのＤＣＭに２０４μＬのフェノキシアセチルクロライド（１．４７ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。１９８ｍｇのＨＯＢｔ（１．４７ｍｍｏｌ、１当量）を加え、その反応混合物を室温で撹拌する。１０分後、３５０ｍｇの化合物６（１．４７ｍｍｏｌ、１当量）を加え、その反応物を、室温で２４時間撹拌する。それから、４０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（４×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥからＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ８／２）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０１７９】
最終生成物は、白色粉末として得られ、収率は７０％（３８５ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）である。
【０１８０】
Mp = 149-151℃;IR (KBr): v, 3365, 2970, 1760, 1668, 1583, 1192, 752;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.59 (s, 9H); 3.01 (d, 3H, 3J = 4.9 Hz); 4.75 (s, 2H); 5.45 (s, 2H); 6.53 (d, 1H, 3J = 5.1 Hz); 6.94 (m, 2H); 7.01 (t, 1H, 3J = 7.3 Hz); 7.30 (m, 2H); 7.89 (d, 1H, 3J = 4.2 Hz); 8.18 (d, 1H, 3J = 5.12 Hz);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.3 (4C); 65.2; 65.4; 83.1; 105.6; 108.9; 114.6 (2C); 121.8; 129.6 (2C); 147.4; 152.0; 157.6; 159.6; 167.1; 168.6。
【０１８１】
［実施例１．８：ｔｅｒｔ−ブチル５−ヨード−２−（メチルアミノ）−４−（（２−フェノキシアセトキシ）メチル）ニコチネート（８）
【０１８２】
【化２６】
2019522058.tif 000028
【０１８３】
２５ｍＬフラスコに、２８０ｍｇの化合物７（０．７５ｍｍｏｌ、１当量）、５ｍＬのＤＣＭ、２５３ｍｇのＮＩＳ（１．１２ｍｍｏｌ、１．５当量）、および５００μＬの酢酸を加える。その反応混合物を、室温で３時間撹拌する。それから、前記反応混合物を、２０ｍＬのチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液で２０ｍＬに採取する。そして、Ｅｔ２Ｏ（４×３０ｍＬ）を用いて抽出する。有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥからＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ９／１）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０１８４】
最終生成物は、黄色の粉末として得られ、収率は９１％（３４０ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）である。
【０１８５】
Mp= 127-129℃;IR (KBr) v, 3424, 2934, 1755, 1704, 1576, 1193, 752;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.56 (s, 9H); 2.97 (d, 3H, 3J = 4.6 Hz); 4.64 (s, 2H); 5.4 (s, 2H); 6.90 (d, 2H, 3J = 7.8 Hz); 6.99 (t, 1H, 3J = 7.3 Hz); 7.27 (m, 2H); 8.50 (s, 1H);Ｎ−Ｈシグナルは見当たらない;13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.1 (3C); 28.4; 65.0; 68.7; 82.5; 83.7; 112.7; 114.6 (2C); 121.8; 129.5 (2C); 144.6; 157.5; 157.7; 158.3; 166.5; 168.3。
【０１８６】
［実施例１．９：（６−ヨード−１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）メチル２−フェノキシ酢酸（９）
【０１８７】
【化２７】
2019522058.tif 000029
【０１８８】
窒素下における５０ｍＬフラスコ中、１０ｍＬのＤＣＭに３００ｍｇの化合物８（０．６０ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。９５１μＬのホスゲン（トルエン中２０％、１．８０ｍｍｏｌ、３当量）および２５１μＬのＴＥＡ（１．８０ｍｍｏｌ、３当量）を同時に加え、その反応物を、室温で撹拌する。これを３回繰り返し、すべての原材料を変化させる。それから、４０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（５×５０ｍＬ）を用いて抽出する。有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、そのまま、勾配溶離（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ  ９５／５からＨ２Ｏ／ＡＣＮ  ５／９５）によって、Ｃ１８−グラフテッドシリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、白色粉末として得られ、収率は９０％（２５５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）である。
【０１８９】
Mp = 162-164℃;IR (KBr) v (cm-1): 3439, 2935, 1787, 1757, 1728, 1450, 1176, 756;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 3.65 (s, 3H); 4.65 (s, 2H); 5.79 (s, 2H); 6.86 (d, 2H, 3J = 8.5 Hz); 6.96 (t, 1H, 3J = 7.5 Hz); 7.27 (m, 2H); 9.00 (s, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 31.2; 64.8; 66.7; 94.7; 107.7; 114.6 (2C); 121.8; 129.5 (2C); 146.8; 150.0; 153.3; 155.1; 157.5; 162.7; 168.2。
【０１９０】
＜実施例２．Ｏ−フルオロ−フェノキシ酢酸非耐熱性保護基を有する本発明のアザイサト酸無水物分子１３の１種（化合物Ｖに対応）の合成＞
ここでは、（図式４に係る）本発明の他の例示的な化合物の合成が記載される。前駆体化合物６は、フルオロ−フェノキシアセチル（より非耐熱性であり得る基）であり、これから化合物１１を得る。前記化合物１１をヨード化することで、化合物１２を得る。最後に、前記化合物１２を環化することで、アザイサト酸化合物１３を得る。
【０１９１】
【化２８】
2019522058.tif 000030
【０１９２】
［実施例２．１：ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（４−フルオロフェノキシ）アセトキシ）メチル）−２−（メチルアミノ）ニコチネート（１１）
【０１９３】
【化２９】
2019522058.tif 000031
【０１９４】
５０ｍＬフラスコに、１４９ｍｇの４−フルオロフェノキシ酢酸（０．８８ｍｍｏｌ、１．０５当量）、５ｍＬのＤＣＭ、１６９ｍｇのＥＤＣ（０．８８ｍｍｏｌ、１．０５当量）、および１１９ｍｇのＨＯＢｔ（０．８８ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加える。室温で５分間経過後、２００ｍｇの化合物６（０．８４ｍｍｏｌ、１当量）を加え、その反応物を、室温で３時間撹拌する。それから、３０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（３×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ９／１からＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ８／２）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０１９５】
最終生成物は、黄色の粉末として得られ、収率は５７％（１９０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）である。
【０１９６】
Mp = 151-153℃; IR (KBr) v, (cm-1): 3376, 2977, 2935, 1758 (CO), 1683 (CO), 1586, 1189, 831;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.60 (s, 9H); 3.02 (d, 3H, 3J = 4.6 Hz); 4.71 (s, 2H); 5.45 (s, 2H); 6.54 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz); 6.88 (m, 2H); 6.99 (t, 2H, 3J = 8.3 Hz); 7.88 (S, 1H); 8.20 (d, 1H, 3J = 5.2 Hz);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.1; 28.3 (3C); 65.4; 65.9; 83.1; 105.6; 109.0; 115.9 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 116.0 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 147.3; 152.0; 153.8 (d, 4JC-F = 2Hz, 1C); 157.8 (d, 1JC-F = 239 Hz, 1C); 159.5; 167.1; 168.4。
【０１９７】
［実施例２．２：（６−ヨード−１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）メチル２−（４−フルオロフェノキシ）酢酸（１２）
【０１９８】
【化３０】
2019522058.tif 000032
【０１９９】
２５ｍＬフラスコ中、３ｍＬのＤＣＭに２００ｍｇの化合物１１（０．５１ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。１７２ｍｇのＮＩＳ（０．７７ｍｍｏｌ、１．５当量）および１５０μＬの酢酸を加え、その反応溶媒を２時間撹拌する。その反応混合物を、２０ｍＬのチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、ＮａＨＣＯ３飽和溶液２０ｍＬに採取する。そして、Ｅｔ２Ｏ（４×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥからＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ９／１）によって、シリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、黄色の油として得られ、収率は６８％（１８０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）である。
【０２００】
IR (KBr): v, 3413, 2926, 1763, 1688, 1506, 1183, 828;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.56 (s, 9H); 2.97 (d, 3H, 3J = 4.64 Hz); 4.60 (s, 2H); 5.37 (s, 2H); 6.85 (m, 2H); 6.96 (m, 2H); 8.50 (s, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.1 (3C); 28.4; 65.7; 68.7; 82.4; 83.7; 112.7; 115.9 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 116.0 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 144.5; 153.7; 157.7; 157.8 (d, 1JC-F = 239 Hz, 1C); 158.3; 166.4; 168.2。
【０２０１】
［実施例２．３：（６−ヨード−１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）メチル２−（４−フルオロフェノキシ）酢酸（１３）
【０２０２】
【化３１】
2019522058.tif 000033
【０２０３】
窒素下における５０ｍＬフラスコ中、３ｍＬのＤＣＭに１６０ｍｇの化合物１２（０．３１ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。４８９μＬのホスゲン（ＴＨＦ中２０％、０．９８ｍｍｏｌ、９当量）および１２９μＬのＴＥＡ（０．９８ｍｍｏｌ、９当量）を同時に加え、その反応物を３０分間撹拌する。それから、３０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（３×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その反応混合物を、乾燥するまで蒸発させ、そのまま、勾配溶離（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ  ９５／５からＨ２Ｏ／ＡＣＮ  ５／９５）によって、Ｃ１８−グラフテッドシリカゲルカラムで精製する。
【０２０４】
最終生成物は、白色粉末として得られ、収率は７７％（１１５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）である。
【０２０５】
Mp = 150-152℃;IR (KBr) v (cm-1): 3454, 3078, 2934, 1787, 1745, 1504, 1194, 825;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 3.66 (s, 3H); 4.62 (s, 2H); 5.78 (s, 2H); 6.83 (m, 2H); 6.95 (m, 2H); 9.01 (s, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 31.2; 65.6; 66.8; 94.7; 107.7; 115.9 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 115.9 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 146.7; 150.0; 153.4; 153.7 (d, 4JC-F = 2Hz, 1C); 155.2; 157.8 (d, 1JC-F = 239 Hz, 1C); 162.8; 168.1。
【０２０６】
＜実施例３．Ｎ−Ｂｏｃ非耐酸性／非耐熱性保護基を有する本発明のアザイサト酸無水物分子１８の一種の合成（化合物ＶＩに対応）＞
ここでは、（図式５に係る）本発明の他の例示的な化合物の合成を記載する。まず、前駆体化合物６をアミン化合物の前駆体であるアジド化合物１５に変化させる。前記化合物１５はアミン化合物の前駆物質であり、アミン官能基をＢＯＣ保護基と結合させ、化合物１６を得る。前記化合物１６のヨウ素化反応によって化合物１７が得られる。最終的に、前記化合物１７を環化することで、アザイサト酸化合物１８が得られる。
【０２０７】
【化３２】
2019522058.tif 000034
【０２０８】
［実施例３．ｔｅｒｔ−ブチル４−（アジドメチル）−２−（メチルアミノ）ニコチネート（１５）］
【０２０９】
【化３３】
2019522058.tif 000035
【０２１０】
窒素下における１００ｍＬのフラスコ中、２０ｍＬのＤＭＦに１．４０ｇの化合物６（５．８８ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。０℃で、０．９１ｍＬのＭｅＳＯ２Ｃｌ（１１．７６ｍｍｏｌ、２当量）および４．０８ｍｌのＴＥＡ（２９．３ｍｍｏｌ、５当量）を同時に加える。その反応混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣ（ＰＥ／Ｅｔ２Ｏ  １／１）によってモニタリングする。対応するメシラート誘導体が完全に形成された後、１．１５ｇのＮａＮ３（１７．６４ｍｍｏｌ、３当量）を加え、その混合物を、室温で３時間撹拌する。それから、５０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（３×６０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥ／Ｅｔ２Ｏ  ９／１からＰＥ／Ｅｔ２Ｏ  ８／２）によって、シリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、黄色の油として得られ、収率は７３％（１．１３ｇ、４．２９ｍｍｏｌ）である。
【０２１１】
IR (KBr) v, 3374, 2978, 2104 (N3), 1679, 1586, 1425, 1125, 847, 655;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.60 (s, 9H); 3.01 (d, 3H, 3J = 5.0 Hz); 4.58 (s, 2H); 6.61 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz); 7.73 (s, 1H); 8.24 (d, 1H, 3J = 5.0 Hz);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.3 (3C); 53.9; 77.0; 83.1; 106.7; 111.5; 146.8; 152.0; 159.5; 167.1。
【０２１２】
［実施例３．１：ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−２−（メチルアミノ）ニコチネート（１６）
【０２１３】
【化３４】
2019522058.tif 000036
【０２１４】
２５ｍＬフラスコ中、５ｍＬのＴＨＦに、１８０ｍｇの化合物１５（０．６８ｍｍｏｌ、１当量）および４４７ｍｇのＢｏｃ２Ｏ（２．０５ｍｍｏｌ、３当量）を溶かす。７５０μＬのＮａＯＨ水溶液（０．７５ｍｍｏｌ、１．１当量、Ｈ２Ｏ中１Ｍ）および２３０ｍｇのＰＣｙ３を続けて加える。その反応物を、室温で２時間撹拌する。それから、３０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（３×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥ／  ＡｃＯＥｔ  ９／１からＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ８／２）によって、シリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、黄色の油として得られ、収率は５９％（１３５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）である。
【０２１５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.44 (s, 9H); 1.60 (s, 9H); 3.01 (d, 3H, 3J = 4.6 Hz); 4.40 (d, 2H, 3J = 6.1 Hz); 5.02 (sl, 1H); 6.57 (d, 1H, 3J = 5.1 Hz); 7.52 (sl, 1H); 8.18 (d, 1H, 3J = 5.1 Hz);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.4 (6C); 28.5; 43.9; 79.6; 83.0; 107.6; 111.6; 150.5; 151.5; 155.7; 159.2; 167.4。
【０２１６】
［実施例３．２：ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）−５−ヨード−２−（メチルアミノ）ニコチネート（１７）
【０２１７】
【化３５】
2019522058.tif 000037
【０２１８】
２５ｍＬフラスコ中、４ｍＬのＤＣＭに１３０ｍｇの化合物１６（０．３９ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。２２５ｍｇのＮＩＳ（０．５８ｍｍｏｌ、１．５当量）および２００μＬの酢酸を加え、その反応混合物を１２時間撹拌する。それから、前記反応混合液を、１０ｍＬのチオ硫酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、ＮａＨＣＯ３で１０ｍＬに採取する。そして、Ｅｔ２Ｏ（４×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥからＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ９／１）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０２１９】
最終生成物は、黄色の粉末として得られ、収率は６７％（１２１ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）である。
【０２２０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.44 (s, 9H); 1.60 (s, 9H); 2.95 (d, 3H, 3J = 4.6 Hz); 4.39 (d, 2H, 3J = 5.2 Hz); 4.82 (sl, 1H); 6.67 (sl, 1H); 8.48 (s, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.1 (3C); 28.3 (4C); 47.6; 79.5; 82.9; 83.9; 113.1; 147.7; 154.9; 157.5; 158.3; 166.7。
【０２２１】
［実施例３．４：ｔｅｒｔ−ブチル（６−ヨード−１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［１，３］オキサジン−５−イル）メチルカルバミン酸（１８）
【０２２２】
【化３６】
2019522058.tif 000038
【０２２３】
窒素下における２５ｍＬフラスコ中、３ｍＬのＤＣＭに１００ｍｇの化合物１７（０．２２ｍｍｏｌ、１当量）を溶かす。３４２μＬのホスゲン（０．６５ｍｍｏｌ、トルエン中２０％、３当量）および９０μＬのＴＥＡ（０．６５ｍｍｏｌ、３当量）を同時に加え、その反応物を、室温で３０分間撹拌する。この操作を３回繰り返し、すべての原材料を変化させる。それから、３０ｍＬの水を加え、その溶液を、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。こうして得られるアザト酸無水物１８を、さらなる精製工程を行うことなく、そのまま反応させる。
【０２２４】
＜実施例４：本発明のアザイサト酸無水物由来の分子の、アミン化合物との反応＞
本実施例では、実施例１〜３において合成された分子（それぞれ分子９、１３および１８）が、フェニルエチルアミンのようなアミン化合物と反応することを実証している。
【０２２５】
【化３７】
2019522058.tif 000039
【０２２６】
［実施例４．１：（５−ヨード−２−（メチルアミノ）−３−（フェネチルカルバモイル）ピリジン−４−イル）メチル２−フェノキシ酢酸（１０）
【０２２７】
【化３８】
2019522058.tif 000040
【０２２８】
１０ｍＬフラスコに、６５ｍｇの化合物９（０．１３ｍｍｏｌ、１当量）、１ｍＬのＤＣＭ、および１７．４μＬのフェニルエチルアミン（０．１３ｍｍｏｌ、１当量）を加える。その反応混合物を、室温で１時間撹拌する。それから、１５ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（５×２０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ９／１からＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ７／３）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０２２９】
最終生成物は、黄色みがかった粉末として得られ、収率は７１％（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）である。
【０２３０】
Mp = 164-166℃;IR (KBr) v (cm-1): 3428, 3296, 2924, 1761, 1627, 1433, 1170, 754;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.86 (s, 3H); 2.88 (d, 2H, 3J = 7.1 Hz); 3.69 (m, 2H); 4.57 (s, 2H); 4.98 (s, 2H); 5.58 (d, 1H, 3J = 4.5 Hz); 6.54 (t, 1H, 3J = 5.6 Hz); 6.88 (d, 2H, 3J = 8.8 Hz); 7.00 (t, 1H, 3J = 7.6 Hz); 7.21 (m, 2H); 7.28 (m, 5H); 8.40 (s, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.4; 35.2; 40.6; 64.9; 67.3; 80.3; 114.6 (2C); 118.6; 122.0; 126.8; 128.6 (2C); 128.7 (2C); 129.7 (2C); 138.1; 140.7; 156.3; 156.8; 157.5; 166.5; 168.3。
【０２３１】
［実施例４．２：（５−ヨード−２−（メチルアミノ）−３−（フェネチルカルバモイル）ピリジン−４−イル）メチル２−（４−フルオロフェノキシ）酢酸（１４）
【０２３２】
【化３９】
2019522058.tif 000041
【０２３３】
１０ｍＬフラスコに、５０ｍｇの化合物１３（０．１０ｍｍｏｌ、１当量）、１ｍＬのＤＣＭ、および１２．９μＬのフェニルエチルアミン（０．１０ｍｍｏｌ、１当量）を加える。その反応物を、室温で１時間撹拌する。それから、１０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（５×１５ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ７／３からＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ６／４）によって、シリカゲルカラムで精製する。最終生成物は、黄色みがかった粉末として得られ、収率は８７％（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）である。
【０２３４】
Mp = 165-167℃;IR (KBr): v, 3388, 3376, 2924, 1742, 1661, 1577, 1504, 1191, 824;1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.86 (d, 3H, 3J = 4.64 Hz); 2.89 (t, 2H, 3J = 6.84 Hz); 3.72 (m, 2H); 4.51 (s, 2H); 4.99 (s, 2H); 5.55 (d, 1H, 3J = 4.6 Hz); 6.51 (t, 1H, 3J = 8.0 Hz); 6.83 (m, 2H); 6.97 (m, 2H); 7.21 (m, 3H); 7.30 (m, 2H); 8.40 (s, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.4; 35.1; 40.5; 65.6; 67.3; 80.2; 115.9 (d, 3JC-F = 8 Hz, 2C); 116.1 (d, 2JC-F = 23 Hz, 2C); 118.6; 126.8; 128.6 (2C); 128.7 (2C); 138.1; 140.7; 153.6 (d, 4JC-F = 2Hz, 1C); 156.3; 156.8; 157.9 (d, 1JC-F = 222 Hz, 1C); 166.5; 168.1。
【０２３５】
［実施例４．３：ｔｅｒｔ−ブチル（（５−ヨード−２−（メチルアミノ）−３−（フェネチルカルバモイル）ピリジン−４−イル）メチル）カルバミン酸（１９）
【０２３６】
【化４０】
2019522058.tif 000042
【０２３７】
１０ｍＬフラスコ中、１ｍＬのＤＣＭにアザイサト酸無水物１８を溶かす。それから、２７．６μＬのフェニルエチルアミン（０．２２ｍｍｏｌ、１当量）を加え、その反応混合物を、室温で１時間撹拌する。それから、１０ｍＬの水を加え、その溶液を、Ｅｔ２Ｏ（４×２０ｍＬ）を用いて抽出する。それから、有機相を混合し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させる。その後、粗反応生成物を、勾配溶離（ＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ７／３からＰＥ／ＡｃＯＥｔ  ４／６）によって、シリカゲルカラムで精製する。
【０２３８】
最終生成物は、黄色みがかった粉末として得られ、収率は５４％（６１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）である。
【０２３９】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.34 (s, 9H); 2.79 (d, 3H, 3J = 4.6 Hz); 2.88 (t, 2H, 3J = 7.1 Hz); 3.67 (m, 2H); 3.87 (d, 2H, 3J = 6.5 Hz); 5.47 (sl, 1H); 5.72 (sl, 1H); 7.18 (m, 5H); 8.27 (s, 1H); 8.98 (sl, 1H);13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 28.3 (3C); 28.4; 30.0; 40.6; 44.9; 80.0; 80.6; 118.9; 126.4; 128.4 (2C); 128.7 (2C); 138.8, 143.1; 156.1; 156.2; 156.7; 166.7。
【０２４０】
＜実施例５：ホットスタートＰＣＲ条件下での、アザアントラニル酸化合物の脱保護およびフェニルエチルアミンの分離の方法＞
ここでは、実施例３で合成した誘導体１０，１４および１９を、ホットスタートＰＣＲ条件において開裂でき、タンパク質によく似たフェニルエチルアミンを分離できることを実証する。
【０２４１】
＜基本手順＞
２．５ｍＭアミド（誘導体１０，１４または１９）のＤＭＳＯ溶液２０μＬおよび遺伝物質増幅反応に従来から使用される緩衝液（６０ｍＭ  トリス（ｐＨ９）、５０ｍＭ  ＫＯ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１８０μＬを１．５ｍＬチューブに加える。それから、９５℃にて熱混合器で混合物を撹拌する。ＬＣＭＳモニタリングをｔ＝１５分、３０分および１時間にて行う。
【０２４２】
［実施例５．１：アザアントラニルフェノキシ酢酸誘導体１０の９５℃での開裂の評価］
【０２４３】
【化４１】
2019522058.tif 000043
【０２４４】
フェノキシ酢酸基の熱脱保護により、対応するベンジルアルコールの形成が起こる（図式７を参照のこと）。それから、アミド結合に関与しているカルボニルに対するアルコールの求核攻撃により、対応するラクトンが生成されることで、溶媒へのフェニルエチルアミンの分離が起こる。
【０２４５】
この反応カスケードは図１のＨＰＬＣクロマトグラムに示される。
【０２４６】
９５℃での１５分間の後、脱保護されたアルコール、および、フェニルエチルアミンの分離を示す生じ得るラクトンの形成に気付くであろう。この結果は、対応するアルコールの形成により生じるフェノキシ酢酸基の非耐熱性を明確に実証している。環化後、生じ得るラクトンの存在に気付く。これは、アミド結合の開裂、およびこれによりフェニルエチルアミンが溶媒に分離されたことを実証している。９５℃での１時間の後、最初のアミドおよびアルコールの集まりはラクトンに代わってほぼ完全に消えていた。
【０２４７】
この結果は、分子間環化系によって９５℃でのアミド結合の開裂が起こり得ることを実証している。
【０２４８】
［実施例５．２：フルオロアザアントラニル酸フェノキシ酢酸誘導体１４の９５℃での開裂の評価］
【０２４９】
【化４２】
2019522058.tif 000044
【０２５０】
また、フルオロフェノキシ酢酸誘導体１４を用いて、脱保護方法が行われた。９５℃での１５分間の後、アミドの集まりはかなり減る。特に、誘導体１０で観察された結果よりも少ない（図２を参照のこと）。フッ素原子の存在により、フェノキシ酢酸基の開裂が促進される。それゆえ、３０分後、アルコール、および、フェニルエチルアミンの分離を示す多量のラクトンの代わりに、このアミドの集まりはほぼ完全に消滅した。
【０２５１】
［実施例５．３：Ｎ−Ｂｏｃアザアントラニル酸誘導体１９の９５℃での開裂の評価］
【０２５２】
【化４３】
2019522058.tif 000045
【０２５３】
この場合は、Ｎ−ｂｏｃ基の脱保護により、ベンジルアミン中間体誘導体が生じる。
【０２５４】
それから、この誘導体は環化され、溶媒へのフェニルエチルアミンの分離により対応するラクトンが形成され得る（上記の図式９）。種々の中間体を示すＨＰＬＣモニタリングが図３に示される。
【０２５５】
この誘導体では、非環式の脱保護型（中間体アミン）は検出されない。従って、この実施例は、脱保護後のＮ−ｂｏｃ基の迅速な環化、これによるフェニルエチルアミンの形成を実証している。これにより、速い環化には、アルコール官能基に比べて、５番の位置のアミノ官能基が好都合であることが確認される。それゆえ、当業者は、即座の環化およびフェニルエチルアミンの分離の結果、十分に速い脱保護を起こすために適切な、芳香環の５番の位置のＮＨ２官能基の保護基を見つけ得る。
【０２５６】
［実施例６：本発明に記載されているような、アザイサト酸化合物１３によるヘモグロビンの可逆的保護］
ここでは、フルオロフェノキシ非耐熱性基を有するアザイサト酸誘導体１３が、穏やかな条件下、水性溶媒中において、タンパク質と反応でき、タンパク質−フルオロフェノキシアザアントラニル酸誘導体を形成することを実証する。
【０２５７】
９５℃での熱処理後の保護基の除去により、天然タンパク質を再生成することができる。
【０２５８】
＜プロトコル＞
以下のように混合物を作製する。ＡＬ  ６００  １ｘ〜ＡＬ  ６００  ０．２５ｘを実験する。ＡＬ  ６００  １ｘ〜ＡＬ  ６００  ０．２５ｘはそれぞれ、ＤＭＳＯとｐＨ７．４のＰＢＳとの混合物中で、濃度を上げたアザイサト酸化合物に反応させたヘモグロビン３３μｇに対応する（ＰＢＳ＝タブレットを溶解させることにより得られたリン酸緩衝生理食塩水、参照：Ｓｉｇｍａ  Ｐ４４１７、２００ｍＬの水（ｐＨ７．４）中）。Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ｃ４  ３００カラム（Milford, USA）にＨＰＬＣ分析用のアリコートを回収する前に、混合物を室温で２時間インキュベートし、１２０分後において、１０ｍＭトリフルオロ酢酸溶液中、２０〜７２％の勾配のアセトニトリルを得る。
【０２５９】
【表２】
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【０２６０】
図４において、ＡＬ  ６０２  ＣＴＲＬ  ０．２５ｘのクロマトグラムは、コントロールのヘモグロビンは化合物１３と反応していないことを示す。タンパク質部分のヘム並びにアルファおよびベータの２つのサブユニットを理解できる。以下の３つのクロマトグラム（ＡＬ  ６００  ０．２５ｘ〜１ｘ）は、アザイサト酸化合物１３によりアシル化されたアルファサブユニットおよびベータサブユニットに対応する右側への大規模な移動に対応して、タンパク質部分が消滅していることを示す。ピークの広がりは、タンパク質の反応部のランダムなアシル化に対応している。
【０２６１】
このように、記載されているような本発明のアザイサト酸化合物はタンパク質と反応できることを実証している。
【０２６２】
反応溶媒ＡＬ  ６００  １ｘが、ＰＣＲバッファ（主にトリス（ｐＨ９）からなる）中での９５℃で１５分間の熱処理に供される時、ベンジルアミド部分の加水分解が観察され、これにより、天然ヘモグロビンのクロマトグラフの特徴が戻る。これは、図５において明らかである。図５では、上段図のクロマトグラム（Ａ）が、８ＭのＧｕＨＣｌに採取された天然のヘモグロビンを示し、中段図のクロマトグラム（Ｂ）が、化合物１３によりアシル化され、８ＭのＧｕＨＣｌに採取されたヘモグロビンを示し、下段図のクロマトグラム（Ｃ）が、化合物１３によりアシル化され、その後、トリス緩衝液（ｐＨ８）中で加熱され、８ＭのＧｕＨＣｌに採取されたヘモグロビンを示す。すでに述べたように、ヘモグロビンのアシル化により多量のアシル化タンパク質が形成され、その後、天然のタンパク質を再生するための熱処理後に多量のアシル化タンパク質は消滅することが明確に理解できる。
【０２６３】
なお、熱処理中に沈殿し得るタンパク質部分の溶解度を高めるため、反応後に、反応溶媒を８ＭのＧｕＨＣｌに移した。この実施例は、本発明に記載されるような化合物１３によるモデルタンパク質の可逆的アシル化を実証している。
【０２６４】
［実施例７：本発明に記載されているアザイサト酸化合物１３による、Ｔａｑポリメラーゼの可逆的アシル化の実証］
ここでは、非耐熱性フルオロフェノキシ基を有するアザイサト酸誘導体１３が、穏やかな条件下、水性溶媒中において、熱に安定なポリメラーゼ（Ｔａｑ）と反応でき、Ｔａｑ−アザアントラニル酸フルオロフェノキシ誘導体が形成されることを実証する。ＰＣＲ条件下での９５℃の熱処理後の保護基の除去により、ポリメラーゼの活性を回復させることができる。これは、活性を測定することにより実証される。
【０２６５】
このように、ポリメラーゼの活性を一時的に隠して、熱処理後にはポリメラーゼの活性を回復させるため、うまく改変されたアザイサト酸無水物を用いる、という構想が明示される。
【０２６６】
＜プロトコル＞
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｔａｑ（２５００ｕ／１００μＬ  ＲＥＦ  Ｅ０００１２）を用いたが、この酵素の求核の形跡をすべて取り除くため、あらかじめＡｍｉｃｏｎ  １０  ＫＤ  ｍｉｃｒｏｃｏｎ（ｎｏ．４２４０７）を通過させることにより、緩衝液を変更した。こうして、酵素懸濁液をｍｉｃｒｏｃｏｎに沈殿させ、緩衝液がなくなるまで遠心分離した。１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄を行い、その後、チューブを反転させることにより、最下層の残渣を回収し、ＰＢＳとともにＱＳＰ２０μＬに加え、１２５ｕ／μＬの懸濁液を得た。このように、この方法によってかなり満足のいくやり方でトリスおよびグリセロールが除去されることを実証した。
【０２６７】
それから、表２に記載される混合物を作製する。ＡＬ  ６０４  ０．２５ｘ〜ＡＬ  ６０４  ０．３７５ｘを実験する。ＡＬ  ６０４  ０．２５ｘ〜ＡＬ  ６０４  ０．３７５ｘはそれぞれ、ＤＭＳＯとｐＨ７．４のＰＢＳとの混合物中で、濃度を上げたアザイサト酸化合物に反応させたＴａｑポリメラーゼ６２５ユニットに対応する（ＰＢＳ＝タブレットを溶解させることにより得られたリン酸緩衝生理食塩水、参照：Ｓｉｇｍａ  Ｐ４４１７、２００ｍＬ水（ｐＨ７．４）中）。ホットスタートＰＣＲ条件での酵素活性を評価する前に、軽くボルテックスで混合することにより、混合物を室温で３時間インキュベートする。
【０２６８】
【表３】
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【０２６９】
［化合物１３により改変されたＴＡＱのポリメラーゼ活性の測定］
「ヘアピン」構造で末端処理された４５塩基のオリゴヌクレオチドプローブを用いてＴＡＱポリメラーゼの重合活性を測定する。構造の先端に蛍光消光剤が、プローブ配列の末端に蛍光標識が存在することを特徴とする。これにより、消光剤がフルオロフォアに空間的に近く、この構造において蛍光シグナルが測定できないようにしている。ポリメラーゼ活性の作用により、前記プローブの先端に相補的な１９塩基のオリゴヌクレオチドを用いてこのプローブを伸長する。伸長作用により、プローブのヘアピン構造を開き、フルオロフォアを放出でき、それから蛍光が測定できる。酵素の活性に必要な試薬（ｄＮＴＰ、ＭｇＣ１２および塩基性緩衝液（ｐＨ９．５））の存在下で６０℃の温度で２０分間この蛍光測定を行う。
【０２７０】
測定の開始時において蛍光の増加は線形的であり、伸長の時間（分）につき発される蛍光の量に対応した初速度を計算できる。既知の活性を有する特定のポリメラーゼの種々の濃度に対して初速度（Ｕ／μＬ）を測定することにより、未知の活性を有する同様の酵素の活性の測定を可能とする校正曲線を作製することができる。
【０２７１】
失活を目的とした、ポリメラーゼの化学改変は、この方法により測定される。酵素の改変後の残りの活性レベルの測定により、所定の位置での保護の効果を調べることができる。化学改変により完全に失活したポリメラーゼは、９０℃を超える温度での熱による活性化を行わない限り、活性を引き起こすことは全くできないに違いない。
【０２７２】
９５℃で１５分間加熱した後の酵素の活性の回復能力は、例えば、同じ方法によって容易に測定可能である。
【０２７３】
このように、図６は、選択されたアシル化試薬の濃度に依存して、Ｔａｑのポリメラーゼ活性を完全に失活させることができ、ホットスタートＰＣＲ条件下で９５℃で１５分間処理した後に回復させることができることを示す（ＡＬ  ６０４  ０．３７５ｘに対応する棒グラフを参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】図１：アザアントラニル酸フェノキシ酢酸誘導体１０の開裂およびフェニルエチルアミンの分離をモニタリングするＨＰＬＣ。
【図２】図２：フルオロアザアントラニル酸フェノキシ酢酸誘導体１４の開裂およびフェニルエチルアミンの分離をモニタリングするＨＰＬＣ。
【図３】図３：ｎ−Ｂｏｃアザアントラニル酸誘導体１９の開裂およびフェニルエチルアミンの分離をモニタリングするＨＰＬＣ。
【図４】図４：異なる濃度で使用される化合物１３による、ヘモグロビンのアシル化。
【図５】図５：熱処理後のヘモグロビンの逆アシル化  上段図（Ａ）：８ＭＧｕＨＣにおけるヘモグロビン  中断図（Ｂ）：化合物１３によってアシル化され、８ＭＧｕＨＣｌに採取されたヘモグロビン  下段図（Ｃ）：化合物１３によってアシル化され、ｐＨ９のトリス緩衝液で９５℃に熱せられ、８ＭＧｕＨＣｌに採取されたヘモグロビン。
【図６】図６：化合物１３によるアシル化によるＴａｑポリメラーゼの失活、およびＰＣＲ条件下において９５℃で１５分間の熱処理後の活性の回復（２回行った実験の平均を示す）。左側の白地にドット：活性無し、右側の濃い網掛け：９５℃での活性化の１５分後。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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