(57)【要約】  流体容器内の細胞または粒子を検出する装置であって、流体容器は、流体容器を少なくとも部分的に満たしている流体の少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を規定されたサブボリュームに分配するように構成されたディスペンサーと、ディスペンサーによって少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子をタイムリーに分配するように構成され、流体を注入するとき又は流体に注入した直後に、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を検知するために、規定されたサブボリューム内および／または規定されたサブボリュームの下位の１つまたは複数のサブボリューム内で検出を実行する検出装置と、を含む、装置である。
2019522480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体容器（１０）内の細胞または粒子（１６）を検出するための装置であって、
前記流体容器（１０）は、
前記流体容器（１０）を少なくとも部分的に満たしている前記流体（１２）の規定のサブボリューム（１８）内に閉じ込められている、少なくとも１つの細胞（１６）または少なくとも１つの粒子（１６）を分配するように構成されたディスペンサー（１４）と、
前記ディスペンサー（１４）によって前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を時間的に協調させて分配するように構成され、前記流体（１２）を注入するとき、または前記流体（１２）を注入した直後に、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知するために、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）における検出を実行する検出装置（２２，３２）と、を含む、装置。
【請求項２】
前記検出装置（２２、３２）は、前記流体（１２）を注入してから１０秒以内に前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記規定されたサブボリューム（１８）は、前記流体容器（１０）の注入開口部の領域（Ａ２）よりも小さい領域（Ａ１）を含む、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記ディスペンサ（１４）は、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を前記流体（１２）の表面に分配するように構成されている、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記検出装置（２２、３２）は、前記流体（１２）の表面から５ｍｍ未満の深さを含む前記規定されたサブボリューム（１８）内の少なくとも１つの細胞（１６）または少なくとも１つの粒子（１６）の検知するように構成される、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記検出装置（２２、３２）は、
より深さの大きいサブボリューム（１８ｄ）から開始して、それぞれに深さが減少していく幾つかのサブボリューム（１８〜１８ｄ）で連続的に検出を実行する、または
より深さの小さいサブボリューム（１８）から開始して、それぞれに深さが増大していくいくつかのサブボリューム（１８〜１８ｄ）で連続的に検出を実行するように構成される、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記検出装置（２２、３２）は、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）に焦点を合わせるように構成された画像取り込み装置（３２）を含み、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の前記１つまたは幾つかのサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）の画像を取り込むように構成される、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記流体容器（１０）は透明であり、前記画像取り込み装置（２２、３２）は、前記流体容器（１０）の下に配置されている、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記流体容器（１０）は、縁部を有する側壁を含み、前記流体（１２）が平坦面を含むように前記側壁に対する前記流体の接触角が調整される、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
複数の流体容器（１０）と、前記ディスペンサー（１４）、前記検出装置（２２、３２）および前記複数の流体容器（１０）のそれぞれを互いに相対的に位置決めして、前記流体（１２）を注入したとき、またはこの流体容器（１０）の前記流体（１２）を注入した直後に、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１２）を検知するように構成された位置決め機構を含む、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
流体容器（１０）内の細胞または粒子（１６）を検出する方法であって、
前記方法は、
少なくとも１つの細胞（１６）または少なくとも１つの粒子（１６）が、流体容器（１１０）を少なくとも部分的に満たす流体（１２）の規定されたサブボリューム（１８）に閉じ込められている自由飛翔滴を分配する工程（５０、６０）と、
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を分配すると共に時間的に協調させた方法で、前記流体（１２）を注入するとき、あるいは前記流体（１２）を注入した直後に、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知するために、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）における検知を実施する工程（５２、６２）を含む、方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子を検知する工程は、前記流体（１２）を注入してから１０秒以内に起こる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記規定されたサブボリューム（１８）は、前記流体容器（１０）の注入開口部の領域（Ａ２）よりも小さい領域（Ａ１）を含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）は前記流体（１２）の表面に分配される、請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）の検出は、前記流体（１２）の上表面から５ｍｍ未満の深さの前記規定されサブボリューム（１８）内で実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出は、
より深さの大きいサブボリューム（１８ｄ）から開始して、それぞれに深さが減少していく幾つかのサブボリューム（１８〜１８ｃ）において連続的に実行される、または、
より深さの小さいサブボリューム（１８）から開始して、それぞれに深さが増加していく幾つかのサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）において連続的に実行される、請求項１１〜請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出を実施する工程は、
前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）に焦点を合わせる工程、および
前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）の画像を取り込む工程を含む、請求項１１〜請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記流体容器（１０）は透明であり、検出を実施する工程は、前記流体容器（１０）の下に配置された画像取り込み装置（３２）によって行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記流体を注入するとき、またはこの流体容器の前記流体を注入した直後に前記少なくとも１つの細胞または前記少なくとも１つの粒子を検知するために、ディスペンサー（１４）、検出装置（１２）、および幾つかの流体容器のそれぞれを互いに相対的に位置決めする工程を含む、請求項１１〜請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ディスペンサーによって流体容器内に配置された流体の規定のサブボリュームに分配された細胞または粒子を検出するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞または粒子を流体容器に挿入した後、細胞または粒子が実際に流体容器内にあるかどうかを感知することが一般にしばしば必要である。例えば、後に生成物と呼ばれるモノクローナル抗体および他のタンパク質は、いわゆるモノクローナル細胞系によって調製される。これらは単一の細胞に由来する細胞の集団である。これは、集団の全ての細胞がほぼ同じ遺伝子型を含み、したがって可能な限り等しい産物を生成することを最大限に保証する。
【０００３】
モノクローナル細胞株を作製するために、細胞を個々にいわゆるマイクロタイタープレートに移し、そして所望の集団サイズに達するまで制御された方法でそこで増殖させる。マイクロタイタープレートに単一細胞を沈着させることは、フリージェット印刷法によって、または単一細胞をマイクロタイタープレートの単一のボウルまたはキャビティにピペットで入れることによって行われ、それらは以後「ウェル」と呼ばれる。これらのウェルは容器を表している。細胞培養物から治療用製品を製造する場合、規制上の理由から、プロセスの開始時に実際に１つの細胞しかウェルに配置されていないことを実証する必要がある。集団が必要なサイズまで成長することを可能にするために、ウェル底部が十分に大きい、すなわち細胞よりも著しく大きいことが重要である。最終的に、数百から数千の一連のクローン集団の中から、最も安定した方法でそして最も大量に所望の産物を生産するものが製造に移される。（最終的には、数百から数千のクローン集団のシリーズから、最も安定した方法で最大量に目的の製品を生産するものが製造に転送される。）
【０００４】
流体容器、例えばマイクロタイタープレートのウェル中の細胞を感知する方法は先行技術から知られている。
【０００５】
「高解像度細胞イメージングと組み合わせた単一細胞沈着のための細胞選別による１ラウンドのクローニングにおける単クローン性の保証」［（2015年、American Institute of Chemical Engineers（米国化学工学会）、Biotechnol. Prog., vol. 00, No. 00, http://doi.org/10.1002/btpr.2145 （インターネット）］において、K. Evansらは、モノクローナル細胞株を製造するための方法を記載している（例えば、非特許文献１参照。）。細胞をいわゆるFACS装置（FACS＝蛍光活性化細胞選別）によってマイクロタイタープレートのウェルに移す。その後、細胞を底に運搬するために遠心分離する。続いて、典型的にはいわゆるイメージャーを用いて、顕微鏡下で全ウェル底部を検査し、その中で単一の細胞を探索し、それは使用者によって行われる。この場合、大きな観察体積中の単一細胞を認識することは極めて困難である。
【０００６】
フローサイトメトリーは、電圧または光線を通過する細胞を分析するための既知の方法を表す。例えば、米国特許出願公開第３，３８０，５８４号明細書は、制御された方法で液滴流を中断することができずに液滴が連続的に生成されるという欠点を有する、連続ジェットを含む印刷方法が用いられる粒子分離方法を記載する（例えば、特許文献１参照。）。したがって、この技術を用いて細胞または粒子を選択的に選別する際には、内容に応じて液滴を異なる位置に配置する必要がある。これは飛行中の静電偏向によって起こります。位置の数および必要とされる堆積精度（例えば、９６または３８４ウェルプレートにおける）が高いほど、プロセスはより困難で技術的に複雑になる。欧州特許出願公開第０４２１４０６号明細書から、粒子を分配するためにサーマルプリントヘッドが使用される粒子分離装置および方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。粒子はリザーバ内に任意に配置され、飛行中の放出後に光学的に分析される。上記の方法は、細胞を個々に堆積させることを可能にするが、１００％の効率を達成することはできない。したがって、マイクロタイタープレートは、その後、いわゆるイメージャーによって顕微鏡下で検査されなければならない。
【０００７】
米国特許第７，３１０，１４７号明細書、欧州特許出願公開第１，６８６，３６８号明細書、米国特許第８，４１７，０１１号明細書および米国特許第８，７９５，９８１号明細書から、マイクロタイタープレート中の細胞および粒子を感知するための装置および方法が知られている（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６参照。）。
【０００８】
米国特許第７，６４６，４８２号明細書は、例えば顕微鏡下でウェル底の細胞を調べるために、正しい焦点面を自動的に見つけるための方法を記載している（例えば、特許文献７参照。）。この過程で、顕微鏡がプレートの底部を通して焦点を合わせる間、この方法はセンサ信号内のパターンを検出する。
【０００９】
米国特許第８，３８３，０４２号明細書には、真空ホルダーを備える撮像装置が記載されている（例えば、特許文献８参照。）。マイクロタイタープレートの底部を平面的に維持するために、真空ホルダーはマイクロタイタープレートを吸い込み、このようにして対物レンズに対するウェル底部の距離の変動を小さくする。
【００１０】
国際公開第２０１１／１５４０４２号から、自由飛翔液滴中に細胞または粒子を分配するための装置および方法が知られている（例えば、特許文献９参照。）。
【００１１】
本発明者らは、個別に堆積するための現在の分配方法は、１００％信頼できるわけではないが、高効率で細胞を検出し堆積することができることを認識した。
【００１２】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第３，３８０，５８４号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０ ４２１ ４０６号明細書
【特許文献３】米国特許第７，３１０，１４７号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第１，６８６，３６８号明細書
【特許文献５】米国特許第８，４１７，０１１号明細書
【特許文献６】米国特許第８，７９５，９８１号明細書
【特許文献７】米国特許第７，６４６，４８２号明細書
【特許文献８】米国特許第８，３８３，０４２号明細書
【特許文献９】国際公開第２０１１／１５４０４２号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】K. Evans氏等著“Assurance of monoclonality in one round of cloning through cell sorting for single cell deposition coupled with high resolution cell imaging", 2015, American Institute of Chemical Engineers, Biotechnol. Prog., vol. 00, No. 00, http://doi.org/10.1002/btpr.2145.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、流体容器内の細胞または粒子を高い信頼性で検出することができる装置および方法を提供することである。
【００１６】
この目的は、請求項１に記載の装置および請求項１１に記載の方法によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の実施形態は、流体容器内の細胞または粒子を検出するための装置を提供し、当該装置は、
流体容器を少なくとも部分的に満たしている流体の規定のサブボリューム内に閉じ込められている、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を分配するように構成されたディスペンサーと、
ディスペンサーによって、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を時間的に協調させて分配するように構成され、流体を注入するとき、または流体を注入した直後に、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を検知するために、規定されたサブボリュームおよび／または規定されたサブボリュームの下位の１つまたは複数のサブボリュームにおける検出を実行する検出装置と、を含む、装置である。
【００１８】
本発明の実施形態は、流体容器内の細胞または粒子を検出する方法を提供し、当該方法は、
少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子が、流体容器を少なくとも部分的に満たす流体の規定されたサブボリュームに閉じ込められている自由飛翔滴を分配する工程と、
少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を分配すると共に時間的に協調させた方法で、流体を注入するとき、あるいは流体を注入した直後に、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を検知するために、規定されたサブボリュームおよび／または規定されたサブボリュームの下位の１つまたは複数のサブボリュームにおける検知を実施する工程を含む、方法である。
【００１９】
本発明の実施形態では、対象物、すなわち単細胞または単一粒子などの細胞または粒子は、ディスペンサー内でも、対象物が分配される自由落下液滴内でも検出されない。したがって、実施形態では、検出は、輸送中、例えばマイクロタイタープレートのウェル内へは行われない。むしろ、細胞または粒子は、流体を注入するとき、または細胞または粒子が検知されるべき流体容器を少なくとも部分的に満たす流体を注入した直後に検知される。したがって、実施形態は、細胞または粒子が流体容器内に行き着き、実際に流体容器内に配置されているという信頼性の高い検証を可能にする。実施形態では、ディスペンサーは、物体、すなわち細胞または粒子が封入されている自由飛翔滴を分配するので、液滴が実際に流体容器に行き着いたことの信頼性のある検証が可能になり、例えば、マイクロタイタープレートのウェルは、そのような実施形態において可能である。
【００２０】
添付の図面を参照しながら、本発明の実施形態を順次詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、流体容器内の細胞または粒子を検出するための装置の概略図を示す。
【図２】図２は、光学センサを備える装置の概略図を示す。
【図３】図３は、流体容器の概略図を示す。
【図４】図４は、流体容器内の細胞または粒子を検出するための方法の一実施形態のフローチャートを示す。
【図５】図５は、本明細書に記載の流体容器内の細胞または粒子を検出する方法の一実施形態と既知の方法との比較を示す。
【図６】図６は、既知の方法で生じる問題を説明するための流体容器の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
実施形態が連続して説明される前に、本発明はこれらの特別な実施形態によって限定されるのではなく、特許請求の範囲の文言によって限定されることに留意されたい。
【００２３】
さらに、最初に、本明細書で使用される用語のいくつかについて説明する。ディスペンサーは、細胞または粒子を分配するために構成された装置であると理解される。ディスペンサーの例は、自由飛翔液滴の形態で液体量を分配するように構成された液滴発生器であり得る。ドロップオンデマンド印刷技術は、選択された時点でノズルから単一液滴を選択的に発生させることを可能にする印刷技術であると理解される。対照的に、連続ジェット印刷技術は、薄い連続液体ジェットが圧力駆動方式でノズルから分配される印刷技術であると理解される。ノズルに高周波振動を加えることによって、放出後、ジェットは、とりわけ静電的に偏向され得る単一の液滴に分解される。観測容積（観察体積）は、測定または観測（観察）が行われる特定の高さの容積領域（体積領域）であると理解される。観測容積（観察体積）は、特定の高さの定義された二次元グリッドに配置されてもよい。マイクロタイタープレートは、行と列の幾つかの相互に絶縁されたキャビティ（ウェル）を含むプレートであると理解される。多くの場合、マイクロタイタープレートは長方形で、通常はプラスチックで構成されている。撮像装置は、例えば顕微鏡下でマイクロタイタープレート全体を検査することを可能にする自動顕微鏡のような撮像装置であると理解される。この場合、撮像装置は、マイクロタイタープレートの各ウェルを高解像度で個別に撮影するように構成されている。引き続いて、これは使用者がウェル内の単一細胞を見つけることを可能にする。
【００２４】
上記で説明したように、既知のシステムは、細胞または粒子を含む小滴が実際にマイクロタイタープレートのウェルに入ったという確認を欠いている。この目的のために、イメージャーのような二次技術が一般的に使用されてきた。したがって、ユーザは、自分が分配システムを単独で使用している限り、所望の単一細胞が実際にウェルに到達したかどうかが後からでは分からない。
【００２５】
さらに、撮像装置を使用することにはより多くの問題があることも認識された。撮像装置によって撮影される領域は、細胞と比較した場合、約１：１，０００，０００の係数で巨大です。１つの細胞のみがウェル内にあることを確実にするために、ウェル領域全体を走査しなければならない。同時に、細胞が確実にそのように識別され得るように、分解能は十分に高くなければならない。解像度が高いほど、画像フィールドが狭くなり、スキャンにかかる時間が長くなる。さらに、走査は、空間的にオフセットされた方法で幾つかの画像を捕捉し、これらを全体的な画像に組み合わせることを必要とする。細胞がそのような２つの画像の間に正確に配置されていると、カットオフ、または最悪の場合、結合によって細胞の図が消える可能性がある。さらに、光学焦点深度は、高い光学解像度のために制限される。システムが正確にフォーカスされていないと、細胞がぼやけてしまい、最悪の場合、見落とされる可能性がある。全ウェル容積、すなわち液体の底部から表面までの全ての焦点面の走査は、時間およびデータ消費に関して高価であり、したがって、ほとんど実現不可能である。現在の撮像技術を使用すると、９６ウェルプレートを走査するのに約１０時間かかるであろう。結果のデータ量は約４０ＧＢになる。プレートの量とデータを保存しなければならない時間に基づいて、これは不可能である。さらに、走査の前に細胞を焦点面、すなわちウェルの底部に輸送する必要がある。典型的には、これは細胞沈着後の遠心分離によって達成される。この目的のために、細胞が底部に位置するまでプレートを高い遠心力で遠心分離する。加速および減速中に半径方向の遠心力が発生するため、細胞は外側に輸送される可能性がある。それからそれらはしばしばウェルの隅に静止するようになる。そこに、それらを識別することは非常に困難である。マイクロタイタープレートは広範な標準化にもかかわらず製造公差の影響を受ける。ウェル底部の高さは、全体的にもウェル毎にも異なってもよい。これにより、細胞が横たわるレベル、したがって焦点が均一にならない。誤った焦点は、端に向かって対象物体を不鮮明にする可能性がある。
【００２６】
マイクロタイタープレートが射出成形または深絞りによって製造される方法のために、ウェルは通常、離型エッジを含み、そして、底部のコーナーは９０°ではなく常にわずかに丸い。これにより、イメージャーで強い回折効果とシェーディング効果が得られる。従って、隅に静止するようになった細胞は、明白にまたは全く識別されない可能性がある。ウェルの底が端に向かって高くなると、細胞は中央でのみ焦点が合っていて外側では焦点が合っていません。さらに、単一細胞は屈折効果のために二度描かれるかも知れない。細胞のいわゆるゴースト画像は、実際の像のすぐ近くに生じ得る。したがって、これがゴースト画像であるのか、実際に第２の細胞であるのかを確実に判断することはできない。
【００２７】
上記のように、細胞または粒子がマイクロタイタープレートのウェル内に配置されているかどうかを調べるために、マイクロタイタープレートは通常分配システムから撮像システムに運ばれる。遠心分離および装置間でのマイクロタイタープレートの交換の必要な工程によって、並びに、分注による細胞の沈着とウェル内での感知との間の通過時間によっても、ウェル内の細胞は、実際にはウェルの底のどこかに静止するようになるかも知れない。図６の左側には、時間経過による沈降によって細胞１０２が流体容器１００の底部、例えばマイクロタイタープレートのウェルに沈んでいる状態の流体容器１００を示す。図６の中央の図は、輸送による底部の細胞１０２の動きを示す。図６の右側の図は、遠心力による細胞１０２の動きを示しており、例えば遠心力によって生じることがある。これらの観察は、ウェルの中の細胞は実際には、底のどこかに静止するようになるかも知れないが、実際にはそれらはしばしば隅に静止するようになることを示している。
【００２８】
より小さなウェル底領域を含む他の基板に切り替えることは、理論的には、画像を組み合わせるなどの幾つかの問題を解決するであろう。しかしながら、これは他の欠点を有する。シェーディングおよび焦点ぼけが生じる、ウェル底部の平坦面と非平坦縁部領域との間の比は、負にシフトするであろう。細胞が端で静止する可能性が高まる。ウェル底部の面積、またはとりわけ、細胞が増殖するために利用可能なウェルの容積は、かなり小さいであろう。細胞はさらに増殖し、十分に大きな集団を形成することができなかった。これにより、作業プロセス全体がより複雑になる。ウェル容積が小さいため、細胞に十分な期間にわたって栄養分を供給するために培地を交換または充填しなければならないであろう。２次汚染のリスクや母集団の早期の死滅の可能性が高まる。
【００２９】
したがって、本発明者らは、分注技術だけではマイクロタイタープレートのウェルなどの流体容器内の単一細胞の検証には十分ではないことを認識した。さらに、上述の問題のために、この場合、撮像装置もまたその重要性において制限されている。結局のところ、これは、生産のために選択された最適な集団が確実にモノクローナルとして同定され得ず、従って、廃棄されなければならないという事実を導き得る。これは高い経済的リスクと高いコストにつながる。
【００３０】
本発明の実施形態は、上述の問題を解決し、流体容器内の単一の細胞または粒子でさえも信頼性の高い検出を可能にする装置および方法を提供する。
【００３１】
図１に、細胞または粒子を検出するための装置の一実施形態を示す。装置は流体容器１０を含む。例えば、流体容器は対応するウェルのアレイを含むマイクロタイタープレートのウェル（キャビティ）であり得る。流体容器は、流体容器の容積を制限し、流体容器を少なくとも部分的に流体で満たすことができるようにする底部および側壁を含むことができる。実施形態では、流体容器１０は透明材料からなる。流体容器１０は、液体などの流体１２で少なくとも部分的に満たされている。例えば、液体は細胞培養のための栄養溶液であり得る。以下では、液体１２を参照する。装置は、少なくとも１つの細胞または粒子１６を液体１２の規定されたサブボリューム（小容積）１８に分配するように構成された分配器１４をさらに備える。ディスペンサー１４は、細胞または粒子が封入されている単一液滴をノズル２２から分配するように構成されたドロップオンデマンドディスペンサとすることができる。ディスペンサー１４は、細胞または粒子が画定された小容積１８に分配されるように流体容器１０に対して位置決めされるかまたは位置決めされ得る。したがって、ディスペンサーは、細胞懸濁液または粒子懸濁液から単一液滴を分配するように構成され得る。例えば、国際公開第２０１１／１５４０４２号に記載されているような構造を含んでもよい。
【００３２】
装置は、流体１２に入るとき、または流体１２に入った直後に少なくとも１つの細胞１６を感知するために、規定されたサブボリューム１８および／または規定されたサブボリュームの下位の１つまたは幾つかのサブボリューム内で検出を実行するディスペンサー１４による少なくとも１つの細胞１６（または少なくとも１つの粒子）の分注と時間的に調和した方法で構成された検出装置２２をさらに備える。
【００３３】
例では、流体容器は装置の一部である。例では、流体容器は装置の一部ではなく、装置とは別に提供されてもよい。
【００３４】
規定されたサブボリュームおよびその規定されたサブボリュームの下位に配置された１つまたは複数のサブボリュームの説明に関して、図３を参照すると、それは流体容器１０の概略斜視図を示している。図３では、サブボリュームはスライスとして示されており、規定されたサブボリューム１８は最上部のスライスによって形成されている。例えば、規定されたサブボリューム１８は、流体容器１０内に配置された液体の液面から所定の深さだけ下方に延在することができる。各サブボリュームの深さは、検出装置の焦点面の焦点深度に対応し得る。例えば、同じものが４０μｍから６０μｍの範囲であり得る。図３の図では、簡単化のために、液体が容器１０を完全に満たすと仮定されている。実際には、容器は通常、液体で部分的にしか満たされていない。図３に見られるように、規定されたサブボリューム１８の領域Ａ１は、流体容器１０の領域Ａ２よりもかなり小さい。ここで、領域は液面に平行な領域であると理解される。規定されたサブボリューム１８の下位の１つまたは幾つかのサブボリュームは、深さが増すにつれてサブボリューム１８の下位に配置される。サブボリュームは、液体表面に対して垂直方向に重なり合ってもよい。サブボリューム１８および１８ａ〜１８ｄは、それぞれ、検出装置２２による検出がサブボリューム全体で行われるように構成することができる。例えば、サブボリュームは、撮像センサがそれぞれのサブボリュームの集束画像を生成することができるように寸法決めされている。
【００３５】
ディスペンサー１４および検出装置２２は、ディスペンサーによる細胞または粒子の分注および適時に検出装置２２による検出を調整する制御装置２４に接続することができる。実施形態では、制御装置はディスペンサーまたは検出装置に配置されてもよい。当業者には明らかなように、制御は、例えばそれに応じてプログラムされた計算手段によって、またはユーザ固有の集積回路によって実施することができる。実施形態では、検出装置は、流体、すなわち図示の実施形態では流体１２に入ってから１０秒以内に少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子を感知するように構成することができる。例えば、検出装置は、細胞または粒子がサブボリューム内に位置すると予想されるときに、サブボリュームのうちの１つにおいて検出を実行するように構成されてもよい。検出が液体１２の表面の直下に配置されたサブボリューム１８で行われる場合、感知はディスペンサーによる分配の直後に行われてもよく、例えば、１秒以内またはさらに短い期間内である。本発明の実施形態では、検出装置は、流体容器の底部の上方に配置されたサブボリューム内の細胞または粒子を検知するように構成される。したがって、物体は、それが流体容器の底部に達する前に検知され得る。
【００３６】
図２は、細胞または粒子を検出するための装置の一実施形態を示し、検出装置は光学センサ３２を含む。ディスペンサー（図２には図示せず）は、細胞懸濁液の液滴３４を投与するように構成されており、細胞１６は液滴３４内に配置されている。ディスペンサーは、例えば細胞培地１２が予め充填されているマイクロタイタープレートのウェルの形態で、流体容器１０に液滴を分配する。実施形態では、流体容器の形状は、流体の表面が平坦になるように選択することができる。調節可能な焦点を含む顕微鏡などの光学センサ３２は、透明流体容器１０の下に配置されている。細胞／粒子は、流体容器１０内の流体に入るときに既に光学センサで捕捉されている。光センサは、カメラと光学系を含む。光学センサ３２は、透明流体容器を通してシステムに焦点を合わせる。このために、画像捕捉装置を表す光学センサ３２は、液体１２の表面の真下にある規定されたサブボリュームに焦点を合わせる。例えば、光センサ３２は、液体表面の真下のサブボリューム、または液体１２の表面から５ｍｍ未満の深さのサブボリュームに焦点を合わせることができる。目的は、細胞／粒子が実際に貯留部に行き着いていることを確認することである。細胞／粒子が貯留部の底に沈むまで待つ必要はない。記載された感知において、流体容器の底部のどこで細胞／粒子が最終的に静止するようになるかは重要ではない。
【００３７】
実施形態では、それぞれ約２００μｌの体積を含む単一滴の細胞懸濁液または粒子懸濁液をマイクロタイタープレートのウェルに分配することができる。例えば、ウェルは予め液体で半分まで満たされていてもよいが、光学センサの焦点は常に液体表面の下に保持されていてもよい。したがって、細胞／粒子は、光学顕微鏡であり得る光学センサ３２の焦点面を通して沈降し得る。細胞／粒子を分配することにより時間的に調和した方法で画像を取り込むことは、流体容器中の細胞／粒子の信頼できる検出を可能にする。さらに、実施形態では、細胞／粒子のさらに信頼性の高い検出を可能にするために、規定された部分体積（または幾つかの規定された部分体積）の一連の画像を取り込むことができる。実際の実験は、そのような構造を使用することによって、観察体積（規定されたサブボリューム）内の物体（細胞／粒子）が液体を貫通し、そして連続して、底部に向かって沈降し、することを容易に認識できることを示し、そして、そこで同じことが光学センサによって観察され得る。
【００３８】
代替の実施形態では、検出までの時間を短縮するために、光学センサの焦点面を物体の沈降移動に抗して移動させることができる。言い換えれば、検出装置は、より深い深度のサブボリュームから始めて、それぞれ減少する深度の幾つかのサブボリュームで連続的に検出を実行するように構成され得る。
【００３９】
例えば画像取り込み装置によって幾つかの検出を実行することは、少なくとも１つの検出を実行している間、対象物に正確に焦点が合っていることを可能にし、したがって、絶対的に確実に検出され得る。実際の実験は、例えば、１５μｍの直径を含むポリスチレン粒子が対応する手順によって容易に感知され得ることを示した。
【００４０】
例えば、それぞれ減少する深さを含む幾つかのサブボリュームが本願の図３に示されており、それらには参照番号１８ａ〜１８ｄが付されている。例えば、小液滴をディスペンサーで分配した後にサブボリューム１８ｄ内で検出を直ちに開始することができ、検出をそれぞれ減少する深さ、すなわち１８ｃから１８ｂまで、１８ａから１８までを含むサブボリューム内で連続的に実行することができる。これにより、流体収容容器１０内の液体１２に混入した細胞や粒子を高い信頼性で検知することができる。
【００４１】
代替の実施形態では、検出装置は、より浅い深さのサブボリュームから始めて、それぞれ増加する深さを含む幾つかのサブボリュームの検出を連続的に実行するように構成することもできる。
【００４２】
本発明の実施形態では、規定されたサブボリュームは１０ｍｍ2未満の領域を含み得る。例えば、サブボリュームは、検出装置の焦点面の焦点深度に対応する深さで２×２ｍｍの領域を含み得る。実施形態では、検出装置は、細胞または粒子がサブボリュームに落ち着くまでサブボリューム内の一連の画像を取り込むように構成されてもよい。実施形態では、検出装置は、液面の真下に配置されたサブボリューム、または液面の下５ｍｍ未満の深さに配置されたサブボリュームに焦点を合わせるように構成されてもよい。本発明の実施形態では、検出装置は、例えば５０Ｈｚと１５０Ｈｚの間の捕捉率、例えば１００Ｈｚで、それぞれのサブボリュームの幾つかの検出を実行するように構成することができる。実施形態において、検出装置は、１００Ｈｚの撮像レートを有する撮像装置であり得る。実施形態では、限られた側方領域で垂直走査を実行するために、画像取り込み装置の焦点を横切ることができる。実施形態では、例えば、異なる深度で画像を取り込むために画像が取り込まれる間の移動速度は５ｍｍ／ｓであり得る。実施形態では、例えば、流体容器内の液体の体積は１５０μｌであり得、これは細胞培養における典型的な体積である。
【００４３】
実施形態は、実証化された数の粒子を分配するのに使用することができる。特に、本発明の実施形態は、信頼性のある実証化された方法で単一細胞をマイクロタイタープレートのキャビティに分注するために細胞株の製造に使用することができる。本発明の実施形態では、単クローン性を検証するためおよびさらなる処理のために、単一細胞または特定の数の細胞をモノクローナル細胞培養物中にプリントすることができる。特に、実施形態は、単一細胞分析に使用され得る。
【００４４】
したがって、本発明の実施形態は、対象物、すなわち細胞または粒子が、流体容器が少なくとも部分的に充填されている流体の規定されたサブボリュームに分配される方法を提供する（図４のステップ５０）。物体は、流体に入ったとき、または流体に入った直後に検知される。このために、１つまたは複数の検出は（幾つかの検出は）、少なくとも１つの細胞または少なくとも１つの粒子（細胞）を分配することと時間的に調和した方法で、規定されたサブボリュームおよび／または規定されたサブボリュームの下の１つまたは複数のサブボリュームで実行され得る（図４のステップ５２）。物体を検知することは、流体に入ってから１０秒以内に、好ましくは５秒以内に、そしてより好ましくは流体に入ってから１秒以内に起こり得る。実施形態では、規定されたサブボリュームは、流体容器の注入開口部の領域よりも小さい領域を含む。実施形態では、物体は流体の表面に分配される。実施形態では、物体は液体の表面の下の規定された流体容積に分配される。
【００４５】
実施形態では、ディスペンサーは、粒子懸濁液または細胞懸濁液を所定の位置で流体容器に選択的に移送するように構成される。考えられるメカニズムは、次の通りである。ドロップオンデマンド印刷（圧電式または熱駆動式）、蛍光ベースのフロー対称性（ＦＡＣＳ−蛍光活性化細胞選別）、ピペッティング（手動またはピペッティングロボットによる）、投与装置（弁式、ディスプレーサ式、シリンジポンプ式など）。実施形態では、検出装置は、流体容器（リザーバ）の中央の液面の上端に焦点を合わせるように構成されている。これにより、液滴の衝撃の領域、すなわちその中に物体を含む輸送量の領域に自動的に焦点が合ってもよい。あるいは、上記のように、流体容器の中心の液体体積は、液滴がディスペンサーによって分配されると直ぐに下から開始して集中してもよい。これは、物体がランダムな時点で焦点が合っていることを保証する。この目的のために、焦点を見つけるために流体容器の正確な充填レベルを知る必要はない。
【００４６】
リザーバ内の液体のメニスカスをできる限り平坦に保ち、したがって流体容器内で再現可能な液体レベルを得るために、例えば欧州特許第１８８０７６４号明細書に記載されているように、特別な形状を含むリザーバを使用することができる。例えば、平らな段差は、流体容器が正確に既知の液体容積で満たされているときにメニスカスを平らに引き出すのに非常に適している。
【００４７】
本発明の実施形態では、物体は流体容器内の流体の表面に適用されてもよく、または表面の下に流体内に挿入されてもよい。実施形態では、検出は、対応するサブボリュームに焦点を合わせる撮像装置によって行われる。代替実施形態では、異なる検出装置を使用することができる。例えば、検出装置は、それらの間の容量を感知するように構成された、流体容器の壁に形成された電極によって実施することができる。例えば、幾つかの異なる深さで検出を実行するために、幾つかのそのような電極を流体容器の異なる深さに配置することができる。
【００４８】
したがって、本発明の実施形態は、容器容積よりも小さい観察容積が流体容器（リザーバ）内で観察される装置および方法を提供する。実施形態では、流体または液体への物体の進入点のみが観察される。したがって、観察容積を観察するためのセンサと、観察容積内に単独で粒子を選択的に分配するための機構とを設けることができる。したがって、液体中の粒子および細胞を認識する装置および方法は、液体を受容するためのリザーバまたはキャビティ、１つまたは複数の（１つまたは幾つかの）細胞／粒子と共に液体を移送するための機構、および１つまたは複数の（１つまたは幾つかの）粒子または細胞を認識するセンサを含む。実施形態において、リザーバは粒子懸濁液または細胞懸濁液を受けるためのリザーバであり、機構は粒子懸濁液または細胞懸濁液を所定の位置でリザーバに選択的に移動させるための機構であり、そして、センサは、予め定められた位置で細胞培地中の１つまたは複数の（単一または幾つかの）粒子または細胞を認識するためのセンサである。
【００４９】
実施形態によれば、センサは光学センサまたは画像センサであり得る。撮像センサは、調節可能な焦点を含み得、観察容積を通して焦点を合わせるように構成され得る。言い換えれば、撮像センサは、観察体積を垂直方向に走査するように構成されてもよい。実施形態では、これは流体容器の下から行われるので、焦点の調整は深さ方向に行われる。実施形態では、粒子懸濁液または細胞懸濁液を流体容器内の流体に移動させることは、自由に飛ぶ液滴の形態で接触することなく行われる。実施形態では、自由飛翔滴は最大１００ｎｌの体積を含む。実施形態では、流体容器は液体で事前充填されている。実施形態では、細胞／粒子を含む液体が流体容器に挿入される。実施形態では、流体容器は、その中に配置された液体が平坦面（メニスカス）を含むように構成されている。実施形態では、このために、流体容器は特定の深さの縁部を含み、流体容器内の液体の体積は、液体が縁部まで達するように適合されている。実施形態では、流体容器は少なくとも１００μｌの容積を含む。
【００５０】
実施形態では、続いて細胞／粒子を幾つかの流体容器、例えばマイクロタイタープレートのウェルに挿入するために、流体容器、ディスペンサーおよび検出装置を互いに向かって移動させることができる機構が提供される。例えば、そのような機構は、幾つかの流体容器、例えばマイクロタイタープレートをディスペンサーおよび検出装置に対して移動させるように、またはディスペンサーおよび検出装置を幾つかの流体容器に対して移動させるように構成することができる。このようにして、その後細胞／粒子を幾つかの流体容器に挿入し、細胞／粒子が各流体容器に入ったかどうかを直ちに確実に検知することが可能である。
【００５１】
本明細書に記載の技術は、既知の方法に対して重要な利点を提供する。
【００５２】
撮像装置と組み合わされた既知の分配技術の重大な欠点は、分配、すなわち流体容器（ウェル）への細胞輸送とウェルの撮像との間の時間および必要な処理工程である。ここで、単一細胞を最初にマイクロタイタープレートのウェルに入れ、次にマイクロタイタープレートをディスペンサーから取り出し、次にプレートを遠心分離し、次にプレートを撮像装置に挿入し、そして撮像装置による検知が行われた。加えて、ウェルの製造関連の幾何学的形状のために、ウェルの底部を画像化する際の悪い状態もある。これらの欠点は、本明細書に記載の技術によって補償される。感知は、細胞を堆積させること、すなわち分配することと直接行われる。細胞が予め定められた位置、例えば中央でウェルに到達するように、そして正確に堆積することができ、ウェル内の液体の入り口点（注入地点）で既に細胞を直接走査することができる。これによって、プレートを動かす必要がなく、および／または細胞をウェル底まで遠心分離する必要がない。これによって、プレートをディスペンサーから取り出し、プレートを遠心分離し、プレートを撮像装置に挿入するステップを省略することができる。さらに、感知（走査）は、細胞が流体容器（ウェル）内に入る位置でのフォーカスシフトを使用してボトムアップから単独で行われてもよい。これは非常に早く起こるかもしれず、細胞は自動的に常に画像の中にあるかも知れない。
【００５３】
したがって、本発明の実施形態は、分注および検出が直接連続して行われ、プレートを移動させることによって容器内の細胞を制御不能な方法で移動させることが発生しないという点で有利である。分配と検出の間に中間ステップはない。さらに、センシングはウェルの底部ではなく自由液体中で行われる。したがって、シェーディング効果や屈折効果、および細胞のゴースト画像はない。さらに、ウェルの底部での検知を損なう可能性がある他の欠点、例えば、引っ掻き傷、指紋（底部／外側）、（静電気的に）塵埃（底部／外側）または汚れ（破片）が上部／内側から付着したものを回避することができ、そしてそれは、例えば細胞と共にウェルの底部で遠心分離される。本発明の実施形態では、水平走査の代わりに垂直走査が使用されるので、焦点の問題および画像を組み合わせる必要性は存在しない。走査される体積は、全ウェルの体積よりもかなり小さい。水平走査とは対照的に、プレートを横切ることは省略され、これは、より速い検知を可能にする。最後に、感知は細胞／粒子が自由液体中にある間に行われるので、画像品質は流体容器、例えばマイクロタイタープレート基板またはそれらの底部の品質にもはや依存しない。
【００５４】
図５は、本明細書に記載の実施形態と既知の方法との比較を示しており、時間軸は上から下にプロットされている。いずれの場合も、細胞懸濁液が基材として使用される。本明細書に記載の方法では、細胞懸濁液を所定の位置でリザーバに移す（ステップ６０）。同時に、顕微鏡による所定の位置の直接検査が行われる（ステップ６２）。ステップ６０および６２の結果として、リザーバ当たりの細胞数についての情報が提供される。
【００５５】
対照的に、既知の方法では、細胞懸濁液をリザーバに移し（ステップ７０）、リザーバを遠心分離し（ステップ７２）、リザーバの底全体を顕微鏡で調べることが行われる（ステップ７４）。従って、既知の方法は著しく高い時間消費を含み、図５における単一のプロセスブロックの高さは対応する工程の期間と相関している。本明細書に記載の方法によって、プロセス全体の単純化および加速が達成されることが見出された。
【００５６】
したがって、本発明の実施形態は、全プロセスが単純化されかつ加速される一方で、細胞分離における単一細胞の改善された検証を可能にする。同時に、その後の培養（細胞の増殖）を可能にするのに十分に大きな容量に細胞を分注できることが前提条件として残っている。実施形態は、その中の細胞を検出した後の流体容器内での細胞培養の対応するステップを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月4日(2018.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体容器（１０）内の細胞または粒子（１６）を検出するための装置であって、
前記装置は、
少なくとも部分的に液体（１２）で満たされている液体容器（１２）と、
少なくとも１つの細胞（１６）または少なくとも１つの粒子（１６）が、前記液体容器（１０）を少なくとも部分的に満たしている前記液体（１２）の規定のサブボリューム（１８）内に閉じ込められている、自由飛翔液滴を分配するように構成されたディスペンサー（１４）と、
前記液体容器（１０）を少なくとも部分的に満たしている前記液体（１２）の前記規定されたサブボリューム（１８）、および／または、前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）内の、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知するように構成された検出装置（２２，３２）と、
前記液体容器（１０）を少なくとも部分的に満たす前記液体（１２）を注入するとき、または前記液体容器（１０）を少なくとも部分的に満たす前記液体（１２）を注入した直後、前記液体の注入から５秒以内に、前記ディスペンサーによる前記細胞または粒子の分配と、前記検出装置による検出とをタイムリーに調整して前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知するように構成された制御装置と、を含み、
前記検出装置（２２、３２）は、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）に焦点を合わせて、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の前記１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）の画像を取り込むように構成された画像取り込み装置（３２）を含む、装置。
【請求項２】
前記検出装置（２２、３２）は、前記液体（１２）を注入してから１秒以内に前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記装置は前記液体容器（１０）を含み、前記規定されたサブボリューム（１８）は前記液体容器（１０）の注入開口部の領域（Ａ２）よりも小さい領域（Ａ１）を含む、請求項１または請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記検出装置（２２、３２）は、
より深さの大きいサブボリューム（１８ｄ）から開始して、それぞれに深さが減少していく幾つかのサブボリューム（１８〜１８ｄ）で連続的に検出を実行する、または
より深さの小さいサブボリューム（１８）から開始して、それぞれに深さが増大していく幾つかのサブボリューム（１８〜１８ｄ）で連続的に検出を実行するように構成される、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記液体容器（１０）は透明であり、前記画像取り込み装置（２２、３２）は前記液体容器（１０）の下に配置されている、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
複数の液体容器（１０）と、前記ディスペンサー（１４）、前記検出装置（２２、３２）および前記複数の液体容器（１０）のそれぞれを互いに相対的に位置決めして、前記液体（１２）を注入したとき、またはこの液体容器（１０）の前記液体（１２）を注入した直後、前記液体の注入から５秒以内に、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１２）を検知するように構成された位置決め機構を含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
液体容器（１０）内の細胞または粒子（１６）を検出する方法であって、
前記方法は、
少なくとも１つの細胞（１６）または少なくとも１つの粒子（１６）が、液体容器（１１０）を少なくとも部分的に満たす液体（１２）の規定されたサブボリューム（１８）に閉じ込められている自由飛翔液滴を分配する工程（５０、６０）と、
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を分散させるのと時間的に協調させて、前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）における検出を実行する工程によって、前記液体（１２）を注入するとき、または前記液体（１２）を注入した直後、前記液体の注入から５秒以内に、前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）を検知する工程と、を含み、
前記検出を実行する工程は、
前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の１つまたは幾つかのサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）に画像取り込み装置（３２）焦点を合わせる工程と、
前記規定されたサブボリューム（１８）および／または前記規定されたサブボリューム（１８）の下位の前記１つまたは複数のサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）の画像を取り込む工程と、を含む、方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子を感知する工程は、前記液体（１２）を注入してから１０秒以内に起こる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記規定されたサブボリューム（１８）は、前記液体容器（１０）の注入開口部の領域（Ａ２）よりも小さい領域（Ａ１）を含む、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）は前記液体（１２）の表面に分配される、請求項７〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの細胞（１６）または前記少なくとも１つの粒子（１６）の検出は、前記液体（１２）の上表面から５ｍｍ未満の深さの前記規定されサブボリューム（１８）内で実行される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
検出は、
より深さの大きいサブボリューム（１８ｄ）から開始して、それぞれに深さが減少していく幾つかのサブボリューム（１８〜１８ｃ）において連続的に実行される、または、
より深さの小さいサブボリューム（１８）から開始して、それぞれに深さが増加していく幾つかのサブボリューム（１８ａ〜１８ｄ）において連続的に実行される、請求項７〜請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体容器（１０）は透明であり、検出を実施する工程は、前記液体容器（１０）の下に配置された画像取り込み装置（３２）によって行われる、請求項７〜請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体を注入するとき、またはこの液体容器の前記液体を注入した直後、前記液体の注入から５秒以内に前記少なくとも１つの細胞または前記少なくとも１つの粒子を感知するために、ディスペンサー（１４）、検出装置（１２）、および幾つかの液体容器のそれぞれを互いに相対的に位置決めする工程を含む、請求項７〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体容器（１０）を使用する工程を含み、前記液体容器（１０）は、縁部を有する側壁を含み、前記液体（１２）の接触角は、前記液体（１２）が平坦面を含むように、前記側壁に対して調整される、請求項７〜請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2019522480.tif 000009
2019522480.tif 000010
2019522480.tif 000011