(57)【要約】本発明は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位と、デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続されている検出可能な標識とを含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。一実施形態では、本発明は、メチレンジスルフィドを含む可逆的な保護基、および標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを有するヌクレオチド類似体を企図している。そのような化合物は、合成による配列決定を含むがこれに限定されない将来の配列決定技術に、新たな可能性を提供する。
2019500324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造：
【化７８】
2019500324.tif 000090
［式中、Ｄは、アジド、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、結合基であり；Ｃは、開裂可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり；Ｌａｂｅｌは、標識である］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２】
前記核酸塩基が、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基類似体である、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３】
前記結合基Ａが、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミンおよびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項４】
前記開裂可能な部位のコアが、
【化７９】
2019500324.tif 000091
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である］
からなる群から選択される、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項５】
Ｌ１が、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−および−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘは、０〜１０である］からなる群から選択される、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項６】
Ｌ２が、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ（ＣＨ２）ｚＮＨ−および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘ、ｙおよびｚは、０〜１０からそれぞれ独立して選択される］からなる群から選択される、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項７】
前記標識が、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項８】
前記化合物が、構造：
【化８０】
2019500324.tif 000092
［式中、前記標識は色素である］を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項９】
前記化合物が、構造：
【化８１】
2019500324.tif 000093
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１０】
前記化合物が、構造：
【化８２】
2019500324.tif 000094
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１１】
前記化合物が、構造：
【化８３】
2019500324.tif 000095
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１２】
前記化合物が、構造：
【化８４】
2019500324.tif 000096
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１３】
前記化合物が、構造：
【化８５】
2019500324.tif 000097
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１４】
前記化合物が、構造：
【化８６】
2019500324.tif 000098
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１５】
前記化合物が、構造：
【化８７】
2019500324.tif 000099
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１６】
前記化合物が、構造：
【化８８】
2019500324.tif 000100
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１７】
前記化合物が、構造：
【化８９】
2019500324.tif 000101
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１８】
前記化合物が、構造：
【化９０】
2019500324.tif 000102
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項１９】
前記化合物が、構造：
【化９１】
2019500324.tif 000103
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２０】
前記化合物が、構造：
【化９２】
2019500324.tif 000104
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２１】
前記化合物が、構造：
【化９３】
2019500324.tif 000105
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２２】
前記化合物が、構造：
【化９４】
2019500324.tif 000106
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２３】
前記化合物が、構造：
【化９５】
2019500324.tif 000107
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２４】
前記化合物が、構造：
【化９６】
2019500324.tif 000108
を有する、請求項１に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２５】
下記の構造：
【化９７】
2019500324.tif 000109
［式中、Ｂは、核酸塩基である］
に従う、デオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２６】
下記の構造：
【化９８】
2019500324.tif 000110
［式中、Ｄは、アジド、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基、ジスルフィドアリルおよびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；リンカーは、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有部位のコアを含み、前記開裂可能な部位のコアは、
【化９９】
2019500324.tif 000111
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である）
からなる群から選択され；Ｌａｂｅｌは、標識である］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２７】
前記リンカーが、０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する、請求項２６に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２８】
前記リンカーが、０．１よりも大きいｌｏｇＰ値を有する、請求項２６に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項２９】
前記リンカーが、１．０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する、請求項２６に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３０】
核酸塩基および糖を含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートであって、前記核酸塩基が、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合している検出可能な標識を含み、前記糖が、メチレンジスルフィドを含む開裂可能な保護基によってキャッピングされている３’−Ｏを含む、デオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３１】
前記ヌクレオシドが、ポリメラーゼとの混合物中にある、請求項３０に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３２】
前記ヌクレオシドの前記核酸塩基が、非天然である、請求項３０に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３３】
前記ヌクレオシドの前記非天然核酸塩基が、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンを含む群から選択される、請求項３２に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３４】
前記開裂可能な保護基が、式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ［式中、Ｒは、アルキルおよび置換アルキル基からなる群から選択される］のものである、請求項３０に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３５】
前記混合物が、プライマーをさらに含む、請求項３１に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３６】
前記プライマーが、核酸鋳型にハイブリダイズされている、請求項３５に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項３０に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３８】
前記核酸鋳型が、固定化されている、請求項３６に記載のデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項３９】
下記の構造：
【化１００】
2019500324.tif 000112
［式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒは、アルキルおよび置換アルキル基からなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２は、接続基である］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項４０】
Ｌ１およびＬ２が、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ＝Ｎおよび−Ｎ＝Ｎ−、アルキル、アリール、分枝鎖アルキル、分枝鎖アリールならびにそれらの組合せからなる群から独立して選択される、請求項３９に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項４１】
前記標識が、検出可能な標識である、請求項３９に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項４２】
Ｌ２が、−Ｓ−ではない、請求項４０に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項４３】
前記標識が、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される、請求項３９に記載の標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート。
【請求項４４】
ＤＮＡポリメラーゼと、核酸塩基および糖を含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートとを含むキットであって、前記糖が、３’−Ｏ上に開裂可能な保護基を含み、前記開裂可能な保護基が、メチレンジスルフィドを含み、前記ヌクレオシドが、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して前記ヌクレオシドの前記核酸塩基に結合した検出可能な標識をさらに含む、キット。
【請求項４５】
プライマーがハイブリダイズされている核酸鋳型と、ＤＮＡポリメラーゼと、核酸塩基および糖を含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートとを含む反応混合物であって、前記糖が、３’−Ｏ上に開裂可能な保護基を含み、前記開裂可能な保護基が、メチレンジスルフィドを含み、前記ヌクレオシドが、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して前記ヌクレオシドの前記核酸塩基に結合した検出可能な標識をさらに含む、反応混合物。
【請求項４６】
ＤＮＡ合成反応を実施する方法であって、ａ）プライマーがハイブリダイズされている核酸鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸塩基および糖を含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用意するステップであって、前記糖が、３’−Ｏ上に開裂可能な保護基を含み、前記開裂可能な保護基が、メチレンジスルフィドを含み、前記ヌクレオシドが、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して前記ヌクレオシドの前記核酸塩基に結合した検出可能な標識をさらに含む、ステップと、ｂ）反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップとを含む、方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応が、配列決定反応の一部である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、
ａ）プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成している、プライマーがハイブリダイズされている核酸鋳型を用意するステップと、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと、核酸塩基および糖を含む第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートとを添加するステップであり、前記糖が、３’−Ｏ上に開裂可能な保護基を含み、前記開裂可能な保護基が、メチレンジスルフィドを含み、前記ヌクレオシドが、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して前記ヌクレオシドの前記核酸塩基に結合した第１の検出可能な標識をさらに含む、ステップと、
ｃ）改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体が生じるように、反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップと、
ｄ）前記改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体における前記デオキシヌクレオシドトリホスフェートの前記第１の検出可能な標識を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項４９】
ｅ）前記開裂可能な保護基と、任意選択で前記検出可能な標識とを、前記改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去するステップと、ｆ）ステップｂ）からｅ）を少なくとも１回繰り返すステップとをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ステップｂ）の繰り返し中に第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合している第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能な標識が、前記第１の検出可能な標識とは異なる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーが、０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーが、０．１よりも大きいｌｏｇＰ値を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーが、１．０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの前記核酸塩基が、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの前記核酸塩基とは異なる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵの類似体を表す、少なくとも４つの異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が、ステップｂ）において使用される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも４つの異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が、ステップｂ）において使用され、前記化合物が、構造：
【化１０１】
2019500324.tif 000113
を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
構造：
【化１０２】
2019500324.tif 000114
を有する非標識３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物も、ステップｂ）において使用される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ステップｅ）が、前記改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を、還元剤に曝露することによって実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記還元剤が、ＴＣＥＰである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシド［ここで、前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドは、核酸塩基および糖を含む］、およびｉｉ）メチルチオメチル供与体を用意するステップと、ｂ）前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法。
【請求項６１】
前記メチルチオメチル供与体が、ＤＭＳＯである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記条件が、酸性条件を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドが、前記ヌクレオシドの前記核酸塩基上に保護基を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、カラムクロマトグラフィーで精製する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）ｉ）３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシド、およびｉｉ）Ｒ−ＳＨ［ここで、Ｒは、アルキルまたは置換アルキルを含む］を用意するステップと、ｂ）前記３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法。
【請求項６６】
前記Ｒ−ＳＨが、エタンチオールである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記条件が、塩基性条件を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを用意するステップと、ｂ）前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法。
【請求項６９】
前記条件が、前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドをＮＨ４Ｆに曝露することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドのトリホスフェートを調製する方法であって、ａ）３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを用意するステップと、ｂ）前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドのトリホスフェートが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法。
【請求項７１】
前記条件が、前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを、ＰＯＣｌ３およびＢｕ３Ｎをとともに（ＭｅＯ）３ＰＯに曝露することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ｃ）前記核酸塩基保護基の除去のステップをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記保護基が、Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル保護基を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル保護基を、加溶媒分解によって除去して、５’−Ｏ−（トリホスフェート）−３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５−（アミノプロパルギル）−２’−デオキシヌクレオシドを生成する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
構造が、
【化１０３】
2019500324.tif 000115
である、化合物。
【請求項７６】
構造が、
【化１０４】
2019500324.tif 000116
である、化合物。
【請求項７７】
構造が、
【化１０５】
2019500324.tif 000117
である、化合物。
【請求項７８】
構造が、
【化１０６】
2019500324.tif 000118
である、化合物。
【請求項７９】
構造が、
【化１０７】
2019500324.tif 000119
である、化合物。
【請求項８０】
構造が、
【化１０８】
2019500324.tif 000120
である、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１５年１１月６日に出願された米国仮特許出願第号および２０１６年４月２６日に出願された同第号に対する利益を主張し、これらは本明細書に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位と、デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続されている検出可能な標識とを含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。そのような化合物は、合成による配列決定を含むがこれに限定されない将来の配列決定技術に、新たな可能性を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ配列決定は、現代のバイオテクノロジーにおいて最も重要な分析方法の１つである。現在の配列決定技術についての詳細な総説は、Ｍ．  Ｌ．  Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０年、１１巻、３１頁［１］、およびＣ．  Ｗ．  Ｆｕｌｌｅｒら．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９年、２７巻、１０１３頁［２］において提供されている。
【０００４】
周知の配列決定方法は、合成による配列決定（ＳＢＳ）法である。この方法によれば、ヌクレオシドトリホスフェートは、３’ＯＨ保護基、特にエステルおよびエーテルによって、可逆的にブロックされる。エステルの例は、アセチル、ホスフェートおよびカーボネートのようなアルカン酸エステルである。ヌクレオシドトリホスフェートは、通常、塩基に標識を含む。
【０００５】
可逆的に３’ＯＨブロックされたヌクレオシドトリホスフェートを使用し、段階的様式で所定の配列のポリヌクレオチドを酵素的に合成する方法は、ＨｉａｔｔおよびＲｏｓｅ（米国特許第５，９９０，３００号）［３］によって記述された。彼らは、開裂可能な３’ＯＨ保護基として、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、ホスホルアミド、カーボネート、カルバメート、ボレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェートおよびスルホンの他に、ニトレートも開示している。脱保護は、化学的または酵素的手段によって行われ得る。ニトレート基について開示されている合成手順も脱保護条件および酵素的組み込みデータもない。特許請求されているデブロッキング溶液は、好ましくは、Ｃｏ２＋のような二価カチオンおよびトリスのような生物学的緩衝液を含有する。標識を含有する３’ＯＨブロックされたヌクレオシドトリホスフェートは、開示されていない。
【０００６】
Ｂｕｚｂｙ（ＵＳ２００７−０１１７１０４）［４］は、３’−ヒドロキシル基で可逆的に保護され、塩基において標識を担持する、ＳＢＳのためのヌクレオシドトリホスフェートを開示している。標識は、ジスルフィドリンカーまたは光開裂可能なリンカー等の開裂可能なリンカーを介して接続されている。リンカーは、最大約２５個の原子からなる。３’ＯＨ−保護基は、ヒドロキシルアミン、アルデヒド、アリルアミン、アルケン、アルキン、アルコール、アミン、アリール、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ボレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルファネート、スルフェート、スルホンおよび複素環の他に、ニトレートであってもよい。
【０００７】
核酸配列決定においてより長いリード長さおよびより良好な正確さを実現するために必要とされるのは、開裂後に反応性残基を残さない、開裂可能な保護基および開裂可能なリンカーを有するヌクレオチド類似体である［５］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，９９０，３００号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０１１７１０４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．  Ｌ．  Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０年、１１巻、３１頁
【非特許文献２】Ｃ．  Ｗ．  Ｆｕｌｌｅｒら．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９年、２７巻、１０１３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位と、デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続されている検出可能な標識とを含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。一実施形態では、本発明は、メチレンジスルフィドを含む可逆的な保護基、および標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを有するヌクレオチド類似体を企図している。そのような化合物は、合成による配列決定を含むがこれに限定されない将来の配列決定技術に、新たな可能性を提供する。
【００１１】
混合物の観点から、本発明は、一実施形態では、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー、および緩衝液、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型等を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の追加の配列決定試薬との混合物中に、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位を含む、デオキシヌクレオシドトリホスフェートを企図している。キットの観点から、本発明は、一実施形態では、一緒に配列決定試薬が、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む別個の容器内に（または混合物中に）、（任意選択で）配列決定においてそのような試薬を使用するための説明書と一緒に提供される、配列決定キットを企図している。本発明が、キット内の配列決定試薬の数または性質によって限定されることは意図されていない。一実施形態では、キットは、緩衝液、ポリメラーゼ、プライマー等を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加の配列決定試薬を含む。
【００１２】
本発明が、任意の特定のポリメラーゼに限定されることは意図されていない。本発明は、ヌクレオチド誘導体の組み込みを強化した改変（例えば、突然変異）ポリメラーゼを企図している。例えば、Ｔａｂｏｒ，  Ｓ．およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｃ．Ｃ．  （（１９９５年）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  （ＵＳＡ）  ９２巻：６３３９頁［６］）は、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼにおけるフェニルアラニン６６７のチロシンによる置き換えおよびＤＮＡポリメラーゼによるジデオキシヌクレオチドの識別に対してこれが有する効果について記述している。一実施形態では、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（エキソ−と指定される）を欠くポリメラーゼを企図している。例えば、９Ｎ°ポリメラーゼのエキソ−変異体は、Ｐｅｒｌｅｒら、１９９８年  ＵＳ５７５６３３４［７］によって、およびＳｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９６年  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３巻：５２８１頁［８］によって記述されている。別のポリメラーゼの例は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８６Ｙ変異体である（Ｅｖａｎｓら、２０００年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２８巻：１０５９頁［９］）。別の例は、Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５Ｔ変異体である（Ａｒｅｚｉら、２００２年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２２巻：７１９頁［１０］）。ＷＯ２００５／０２４０１０Ａ１は、モチーフＡ領域の修飾および９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼに関し、参照により本明細書に組み込まれる［１１］。
【００１３】
方法の観点から、本発明は、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー、および開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを合成する方法、ならびに、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位を含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用する方法の両方を企図している。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、（ａ）開裂可能な保護基として（例えば一般式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒの）メチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを有するヌクレオシドトリホスフェート；および（ｂ）それらの標識された類似体に関し、ここで、標識は、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）を介して核酸塩基に結合している（が、リンカーは追加の基を含有してよい）。そのようなヌクレオチドは、核酸の合成による配列決定（ＳＢＳ）技術において使用され得る。一実施形態では、本発明は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィド（例えば−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ）を含む基によってキャッピングされているヌクレオチド３’−Ｏの合成、脱保護条件または酵素的組み込みに関する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー、および開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記ヌクレオシドの核酸塩基は、非天然である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの非天然核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンを含む群から選択される。一実施形態では、メチレンジスルフィドを含む前記基は、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ［ここで、Ｒは、アルキルおよび置換アルキル基を含む群から選択される］である。一実施形態では、前記検出可能な標識は、（例えば式−ＯＣＨ２−ＳＳ−の）開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して前記核酸塩基に結合している。一実施形態では、前記検出可能な標識は、蛍光標識である。一実施形態では、式（−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−Ｒ）中のＲは、アルキルまたはアリルであり得る。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化１】
2019500324.tif 000003
［式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒは、アルキルおよび置換アルキル基を含む群から選択される］に従う、デオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、天然核酸塩基（シトシン、グアニン、アデニン、チミンおよびウラシル）である。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンを含む群から選択される非天然核酸塩基である。類似体の場合、検出可能な標識は、核酸塩基と前記検出可能な標識との間にリンカーセクションも含み得る。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化２】
2019500324.tif 000004
［式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒは、アルキルおよび置換アルキル基を含む群から選択され、Ｌ１およびＬ２は、接続基である］に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、天然核酸塩基類似体である。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンを含む群から選択される非天然核酸塩基類似体である。類似体の場合、検出可能な標識は、核酸塩基と前記検出可能な標識との間にリンカーセクションも含み得る。一実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＮ、および−Ｎ＝Ｎ−、アルキル、アリール、分枝鎖アルキル、分枝鎖アリールまたはそれらの組合せを含む群から独立して選択される。Ｌ２は、「−Ｓ−」ではないことが好ましい。一実施形態では、本発明は、Ｌ１が、塩基上のアミンまたは塩基上のヒドロキシルのいずれかであることを企図している。一実施形態では、前記標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、前記標識は、検出可能な標識である。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化３】
2019500324.tif 000005
［式中、Ｄは、ジスルフィドアリルおよびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、結合基であり；Ｃは、開裂可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり；Ｌａｂｅｌは、標識（例えば、検出可能な部分）である］に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化４】
2019500324.tif 000006
［式中、Ｄは、アジド、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、結合基であり；Ｃは、開裂可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり；Ｌａｂｅｌは、標識である］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基類似体である。一実施形態では、前記結合基Ａは、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミンおよびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である。一実施形態では、前記開裂可能な部位のコアは、
【化５】
2019500324.tif 000007
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である］
からなる群から選択される。一実施形態では、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−および−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘは、０〜１０であるが、より好ましくは、１〜６である］からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｌ２は、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ（ＣＨ２）ｚＮＨ−および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘ、ｙおよびｚは、０〜１０、より好ましくは、１〜６からそれぞれ独立して選択される］からなる群から選択される。一実施形態では、前記標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、化合物は、構造：
【化６】
2019500324.tif 000008
［式中、前記標識は、色素である］
を有する。一実施形態では、化合物は、
【化７】
2019500324.tif 000009
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化８】
2019500324.tif 000010
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化９】
2019500324.tif 000011
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１０】
2019500324.tif 000012
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１１】
2019500324.tif 000013
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１２】
2019500324.tif 000014
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１３】
2019500324.tif 000015
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１４】
2019500324.tif 000016
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１５】
2019500324.tif 000017
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１６】
2019500324.tif 000018
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１７】
2019500324.tif 000019
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１８】
2019500324.tif 000020
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１９−１】
2019500324.tif 000021
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１９−２】
2019500324.tif 000022
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１９−３】
2019500324.tif 000023
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化１９−４】
2019500324.tif 000024
の構造を有する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化２０】
2019500324.tif 000025
［式中、Ｂは、核酸塩基である］
に従う、デオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の配列決定試薬（例えばＤＮＡポリメラーゼ）、および、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む、キットに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、天然核酸塩基類似体である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの核酸塩基は、非天然である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの非天然核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンを含む群から選択される。
【００２２】
本発明は、混合物、すなわち、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを、１つまたは複数の追加の試薬（乾燥しているか溶液中であるかにかかわらず）との混合物中に含む、少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートも企図している。一実施形態では、本発明は、プライマーがハイブリダイズされている核酸鋳型と、ＤＮＡポリメラーゼと、核酸塩基、標識および糖を含む少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートと、標識と核酸塩基との間の開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーとを含む反応混合物であって、前記糖が、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを含み、前記ヌクレオシドが、前記ヌクレオシドの核酸塩基と共有結合的に結合している検出可能な標識をさらに含む、反応混合物に関する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ合成反応を実施する方法であって、ａ）プライマーがハイブリダイズされている核酸鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ、標識および核酸塩基の間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、３’−Ｏが開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされた少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む反応混合物を用意するステップと、ｂ）反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップとを含む、方法に関する。これは、少なくとも１つのデオキシヌクレオシドトリホスフェート（標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを有する）の、結合プライマーへの組み込みを可能にする。一実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応は、配列決定反応（例えばＳＢＳ）の一部である。一実施形態では、前記検出可能な標識は、還元剤への曝露によって、前記核酸塩基から除去される。本発明が１種類の還元剤に限定されることは意図されていない。ジスルフィド結合を還元することができる任意の好適な還元剤を、本発明を実践するために使用することができる。一実施形態では、還元剤は、ホスフィン［１２］、例えば、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリヒドロキシメチルホスフィン、トリヒドロキシプロピルホスフィン、トリスカルボエトキシ−ホスフィン（ＴＣＥＰ）［１３、１４］である。一実施形態では、前記還元剤は、ＴＣＥＰである。一実施形態では、前記検出可能な標識および３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｒ基は、ジチオベースのリンカーおよび終端（保護）基の開裂を実施するように、チオール基［１５］を担持する化合物への曝露によって前記核酸塩基から除去され、そのようなチオール含有化合物は、システイン、システアミン、ジチオ−コハク酸、ジチオトレイトール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン［１６］、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン［１７］を含む（がこれらに限定されない）。反応を、セレノールの包含によってさらに触媒することができる［１８］。加えて、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素（およびアスコルビン酸［２０］）をこの目的のために使用することもできる［１９］。加えて、ジスルフィドおよびチオレダクターゼ等、ジスルフィド結合の開裂のための酵素的方法も公知であり、本発明の化合物で使用することができる［２１］。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡ配列を分析するための方法であって、ａ）プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成している、プライマーがハイブリダイズされている核酸鋳型を含む反応混合物を用意するステップと、ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと、標識および核酸塩基の間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、３’−Ｏが開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされた、核酸塩基を含む第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートとを添加するステップと、ｃ）改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体が生じるように、反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップと、ｄ）前記改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体における前記デオキシヌクレオシドトリホスフェートの前記第１の検出可能な標識を検出するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、検出することにより、いずれの種類の類似体（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ）が組み込まれているかを決定することが可能になる。一実施形態では、方法は、ｅ）前記開裂可能な保護基と、任意選択で前記検出可能な標識とを、前記改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から除去するステップと、ｆ）ステップｂ）からｅ）を少なくとも１回繰り返す（および典型的にはこれらのステップを多数回、例えば、１０〜２００回繰り返す）ステップとをさらに含む。一実施形態では、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーは、疎水性であり、０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーは、疎水性であり、０．１よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーは、疎水性であり、１．０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、方法は、ステップｂ）の繰り返し中に第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップをさらに含み、前記第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、第２の検出可能な標識を含み、前記第２の検出可能な標識が、前記第１の検出可能な標識とは異なる。一実施形態では、前記第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの前記核酸塩基は、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの前記核酸塩基とは異なる。一実施形態では、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵの類似体を表す、少なくとも４つの異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が、ステップｂ）において使用される。一実施形態では、構造：
【化２１】
2019500324.tif 000026
を有する少なくとも４つの異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が、ステップｂ）において使用される。一実施形態では、前記混合物は、構造：
【化２２】
2019500324.tif 000027
を有するものなどの非標識３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物をさらに含み、また、ステップｂ）において使用される。一実施形態では、ステップｅ）は、前記改変されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を、還元剤に曝露することによって実施される。一実施形態では、前記還元剤は、ＴＣＥＰである。一実施形態では、前記検出可能な標識は、ジチオベースのリンカーおよび終端（保護）基の開裂を実施するように、チオール基を担持する化合物への曝露によって前記核酸塩基から除去され、そのようなチオール含有化合物として、システイン、システアミン、ジチオ−コハク酸、ジチオトレイトール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネートおよびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジンが挙げられる（がこれらに限定されない）。
【００２５】
本発明が特定の配列決定プラットフォームに限定されることは意図されていない。しかしながら、好ましい機器は、ＱＩＡＧＥＮのＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ  ＤＮＡ配列決定システム（ＧＲ）である。一実施形態では、ＤＮＡ配列は、合成による配列決定（ＳＢＳ）の方法によって決定される。一実施形態では、配列決定の各サイクルは、８つのステップ：伸長１、伸長２、洗浄１、追加のイメージングソリューション、イメージング、洗浄２、開裂する、および洗浄３からなる。イメージングサイクル中に収集されたデータは、誤り率、スループット値および適用された位相補正値を産出する分析ソフトウェアによって加工される。
【００２６】
同じまたは同様の方法により、概して他のＳＢＳプラットフォーム（すなわち、同様の条件下で動作する任意の合成による配列決定方法）、同様に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のＨｉＳｅｑおよびｍｉＳｅｑプラットフォーム；Ｒｏｃｈｅ４５４；Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭおよびＰｒｏｔｏｎプラットフォーム；ならびにＰａｃｉｆｉｃＢｉｏプラットフォーム等の具体的なＳＢＳプラットフォームの性能を改善し得ることが企図されている。
【００２７】
本発明が１種類の配列決定にだけ限定されることは意図されていない。一実施形態では、前記デオキシヌクレオシドトリホスフェート（核酸塩基、標識および糖、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、前記糖は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを含む）を、パイロ配列決定において使用してよい。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、核酸塩基および糖を含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートであって、前記核酸塩基が、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合している検出可能な標識を含み、前記糖が、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィド基を含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを含む、デオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記ヌクレオシドは、ポリメラーゼ（または何らかの他の配列決定試薬）との混合物中にある。一実施形態では、前記ヌクレオシドの核酸塩基は、非天然である。一実施形態では、前記ヌクレオシドの非天然核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンを含む群から選択される。一実施形態では、メチレンジスルフィド基を含む前記群は、式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ［式中、Ｒは、アルキルおよび置換アルキル基を含む群から選択される］のものである。一実施形態では、前記混合物は、プライマーをさらに含む。一実施形態では、前記プライマーは、核酸鋳型にハイブリダイズされている。一実施形態では、前記検出可能な標識は、蛍光標識である。一実施形態では、前記核酸鋳型は、固定化されている（例えば、ウェル、チャネルもしくは他の構造内に、または代替としてビーズ上に）。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシド［ここで、前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドは、核酸塩基および糖を含む］、およびｉｉ）メチルチオメチル供与体を用意するステップと、ｂ）前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。
【００３０】
一実施形態では、前記メチルチオメチル供与体は、ＤＭＳＯである。一実施形態では、前記条件は、酸性条件を含む。一実施形態では、前記５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドは、前記ヌクレオシドの前記核酸塩基上に保護基を含む。
【００３１】
一実施形態では、前記３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、カラムクロマトグラフィーで精製する。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）ｉ）３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシド、およびｉｉ）Ｒ−ＳＨ［ここで、Ｒは、アルキルまたは置換アルキルを含む］を用意するステップと、ｂ）前記３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。
【００３３】
一実施形態では、前記Ｒ−ＳＨは、エタンチオールである。一実施形態では、前記条件は、塩基性条件を含む。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを調製する方法であって、ａ）３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを用意するステップと、ｂ）前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。
【００３５】
一実施形態では、前記条件は、前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドをＮＨ４Ｆに曝露することを含む。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドのトリホスフェートを調製する方法であって、ａ）３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを用意するステップと、ｂ）前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを、３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドのトリホスフェートが生じるような条件下で処理するステップとを含む、方法に関する。一実施形態では、前記条件は、前記３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−２’−デオキシヌクレオシドを、ＰＯＣｌ３およびＢｕ３Ｎをとともに（ＭｅＯ）３ＰＯに曝露することを含む。一実施形態では、前記方法は、ｃ）前記核酸塩基保護基の除去のステップをさらに含む。一実施形態では、前記保護基は、Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル保護基を含む。一実施形態では、前記Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル保護基は、加溶媒分解によって除去されて、５’−Ｏ−（トリホスフェート）−３’−Ｏ−（Ｒ置換ジチオメチル）−５−（アミノプロパルギル）−２’−デオキシヌクレオシドを生成する。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２３】
2019500324.tif 000028
である化合物に関する。  
【００３８】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２４】
2019500324.tif 000029
である化合物に関する。  
【００３９】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２５】
2019500324.tif 000030
である化合物に関する。  
【００４０】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２６】
2019500324.tif 000031
である化合物に関する。  
【００４１】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２７】
2019500324.tif 000032
である化合物に関する。  
【００４２】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２８】
2019500324.tif 000033
である化合物に関する。  
【００４３】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化２９】
2019500324.tif 000034
である化合物に関する。  
【００４４】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３０】
2019500324.tif 000035
である化合物に関する。  
【００４５】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３１】
2019500324.tif 000036
である化合物に関する。  
【００４６】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３２】
2019500324.tif 000037
である化合物に関する。  
【００４７】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３３】
2019500324.tif 000038
である化合物に関する。  
【００４８】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３４】
2019500324.tif 000039
である化合物に関する。  
【００４９】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３５】
2019500324.tif 000040
である化合物に関する。  
【００５０】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３６】
2019500324.tif 000041
である化合物に関する。  
【００５１】
一実施形態では、本発明は、構造が
【化３７】
2019500324.tif 000042
である化合物に関する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化３８】
2019500324.tif 000043
［式中、Ｒは、アルキル、置換アルキル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、結合基であり；Ｃは、開裂可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり、Ｌａｂｅｌは、標識である］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基類似体である。一実施形態では、前記結合基Ａは、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミンおよびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である。一実施形態では、前記開裂可能な部位のコアは、
【化３９】
2019500324.tif 000044
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である］
からなる群から選択される。一実施形態では、式中、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘは、０〜１０であるが、より好ましくは、１〜６である］からなる群から選択される。一実施形態では、式中、Ｌ２は、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘ、ｙおよびｚは、０〜１０、より好ましくは１〜６からそれぞれ独立して選択される］からなる群から選択される。一実施形態では、前記標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、化合物は、構造：
【化４０】
2019500324.tif 000045
［式中、前記標識は、色素であり、Ｒは、アルキル、置換アルキル基、アリル、置換アリルからなる群から選択される］
を有する。一実施形態では、化合物は、構造：
【化４１】
2019500324.tif 000046
［式中、前記標識は、色素である］
を有する。
一実施形態では、化合物は、構造：
【化４２】
2019500324.tif 000047
を有する。一実施形態では、化合物は、構造：
【化４３】
2019500324.tif 000048
を有する。
【００５３】
一実施形態では、化合物は、構造：
【化４４】
2019500324.tif 000049
を有する。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化４５】
2019500324.tif 000050
［式中、Ｄは、アジド（−Ｎ３）、ジスルフィドアルキル（−ＳＳ−Ｒ）、ジスルフィド置換アルキル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、結合基であり；Ｃは、開裂可能な部位のコアであり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり、Ｌａｂｅｌは、標識である］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記核酸塩基は天然の核酸塩基である。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基類似体である。一実施形態では、前記結合基（Ａ）は、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミンおよびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基である。一実施形態では、前記開裂可能な（Ｃ）部位のコアは、
【化４６】
2019500324.tif 000051
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である］
からなる群から選択される。一実施形態では、前記開裂可能な（Ｃ）部位のコアは、
【化４７】
2019500324.tif 000052
［式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である］
からなる群から選択される。一実施形態では、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−および−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘは、０〜１００である］からなる群から選択される。一部の実施形態では、ｘは、０〜１０であるが、より好ましくは、１〜６である。一部の実施形態では、Ｌ２は、
【化４８】
2019500324.tif 000053
、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘＣＯＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｙ（ＣＨ２）ｚＮＨ−および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘ、ｙおよびｚは、０〜１０、より好ましくは、１〜６からそれぞれ独立して選択される］からなる群から選択される。一実施形態では、Ｌ２は、−ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＮＨ−、−Ｃ（Ｍｅ）２（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）ｘＣＯ−、−（ＣＨ２）ｘＯＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｙＯ（ＣＨ２）ｚＮＨ−および−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−［ここで、ｘ、ｙおよびｚは、０〜１００からそれぞれ独立して選択される］からなる群から選択される。一実施形態では、ｘ、ｙおよびｚは、０〜１０、より好ましくは、１〜６からそれぞれ独立して選択される。一実施形態では、前記標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される。一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化４９】
2019500324.tif 000054
【００５５】
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５０】
2019500324.tif 000055
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５１】
2019500324.tif 000056
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５２】
2019500324.tif 000057
【００５６】
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５３】
2019500324.tif 000058
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５４】
2019500324.tif 000059
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５５】
2019500324.tif 000060
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５６】
2019500324.tif 000061
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５７】
2019500324.tif 000062
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５８】
2019500324.tif 000063
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化５９】
2019500324.tif 000064
【００５７】
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化６０】
2019500324.tif 000065
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化６１】
2019500324.tif 000066
【００５８】
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化６２】
2019500324.tif 000067
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化６３】
2019500324.tif 000068
一実施形態では、化合物は、下記の構造を有する（特定の核酸塩基および標識が以下に示されるが、他の類似のヌクレオチド対応物が企図されている、すなわち、本明細書および図における任意の種々の標識が置換されていてもよく、核酸塩基が異なっていてもよい）：
【化６４】
2019500324.tif 000069
【００５９】
一実施形態では、本発明は、非標識化合物を企図している。一実施形態では、化合物は、構造：
【化６５】
2019500324.tif 000070
［式中、Ｒは、アルキル、置換アルキル基、アリル、置換アリルからなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基である］を有する。一実施形態では、化合物は、構造（ここでも、Ｂは、核酸塩基である）：
【化６６】
2019500324.tif 000071
を有する。一実施形態では、化合物は、
【化６７】
2019500324.tif 000072
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化６８】
2019500324.tif 000073
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化６９】
2019500324.tif 000074
の構造を有する。一実施形態では、化合物は、
【化７０】
2019500324.tif 000075
の構造を有する。一実施形態では、前記核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基類似体である。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、図４３において示されている、３’−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオールヌクレオシドを中間体として、ならびにＤＭＴＳＦおよびジメチルジスルフィドを硫黄源として使用して、３’−ＯＣＨ２−ＳＳＭｅヌクレオチド類似体を合成する方法に関する。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、下記の構造：
【化７１】
2019500324.tif 000076
［式中、Ｄは、アジド、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基、ジスルフィドアリルおよびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；リンカーは、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有部位のコアを含む］
に従う、標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェートに関する。一実施形態では、前記開裂可能な部位のコアは、
【化７２】
2019500324.tif 000077
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基である）
からなる群から選択され；Ｌａｂｅｌは、標識である。一実施形態では、前記リンカーは、疎水性である。一実施形態では、前記リンカーは、０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、前記リンカーは、０．１よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、前記リンカーは、０．５よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。一実施形態では、前記リンカーは、１．０よりも大きいｌｏｇＰ値を有する。
【００６２】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下で定義する。本明細書において定義されている用語は、本発明に関連するエリアの当業者に一般に理解されている通りの意味を有する。「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」等の用語は、単数の実体のみを指すことを意図しておらず、その具体例が例証に使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書における術語は、本発明の具体的な実施形態について記述するために使用されるが、それらの用法は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き、本発明の限界を定めるものではない。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「水素」は、−Ｈを意味し；「ヒドロキシ」は、−ＯＨを意味し；「オキソ」は、＝Ｏを意味し；「ハロ」は、独立して、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを意味し；「アミノ」は、−ＮＨ２（用語アミノを含有する基、例えば、アルキルアミノの定義については、以下を参照）を意味し；「ヒドロキシアミノ」は、−ＮＨＯＨを意味し；「ニトロ」は、−ＮＯ２を意味し；「イミノ」は、＝ＮＨ（用語イミノを含有する基、例えば、アルキルアミノの定義については、以下を参照）を意味し；「シアノ」は、−ＣＮを意味し；「アジド」は、−Ｎ３を意味し；「メルカプト」は、−ＳＨを意味し；「チオ」は、＝Ｓを意味し；「スルホンアミド」は、−ＮＨＳ（Ｏ）２−（用語スルホンアミドを含有する基、例えば、アルキルスルホンアミドの定義については、以下を参照）を意味し；「スルホニル」は、−Ｓ（Ｏ）２−（用語スルホニルを含有する基、例えば、アルキルスルホニルの定義については、以下を参照）を意味し；「シリル」は、−ＳｉＨ３（用語シリルを含有する基、例えば、アルキルシリルの定義については、以下を参照）を意味する。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「メチレン」は、炭素原子が２個の水素原子と結合している化学種を意味する。−ＣＨ２−基は、標準的なメチレン基であると考えられている。鎖または環中のメチレン基は、そのサイズおよび親油性に寄与する。この文脈において、ジデオキシは、メチレン基も指す。特に、２，３−ジデオキシ化合物は、２，３−メチレン（２，３−メチレン−グリコシド＝２，３−ジデオキシ−グリコシド）と同じである。
【００６５】
以下の基について、下記の括弧付きの添字は、基をさらに次の通りに定義する：「（Ｃｎ）」は、基中の炭素原子の正確な数（ｎ）を定義し；「（Ｃ≦ｎ）」は、基中にあり得る炭素原子の最大数（ｎ）を定義し；（Ｃｎ〜ｎ’）は、基中の炭素原子の最小（ｎ）および最大数（ｎ’）の両方を定義する。例えば、「アルコキシ（Ｃ≦１０）」は、１から１０個までの炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個、またはその中から導出できる任意の範囲（例えば、３〜１０個の炭素原子））を有するアルコキシ基を指定する。同様に、「アルキル（Ｃ２〜１０）」は、２から１０個までの炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個、またはその中から導出できる任意の範囲（例えば、３〜１０個の炭素原子））を有するアルキル基を指定する。
【００６６】
用語「アルキル」は、「置換」修飾句なしで使用される場合、結合点としての飽和炭素原子、直鎖状または分枝鎖状、シクロ、環式または非環式構造を持ち、炭素−炭素二重または三重結合を有さず、炭素および水素以外の原子を有さない、非芳香族一価の基を指す。基−ＣＨ３（Ｍｅ）、−ＣＨ２ＣＨ３（Ｅｔ）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−Ｐｒ）、−ＣＨ（ＣＨ３）２（イソ−Ｐｒまたはｉ−Ｐｒ）、−ＣＨ（ＣＨ２）２（シクロプロピル）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３（ｎ−Ｂｕ）、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３（ｓｅｃ−ブチルまたはｓｅｃ−Ｂｕ）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（イソ−ブチルまたはｉ−Ｂｕ）、−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチルまたはｔ−Ｂｕ）、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３（ネオ−ペンチル）、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチルは、アルキル基の非限定的な例である。用語「置換アルキル」は、結合点としての飽和炭素原子、直鎖状または分枝鎖状、シクロ、環式または非環式構造を持ち、炭素−炭素二重または三重結合を有さず、Ｎ、Ｏ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個の原子を有する、非芳香族一価の基を指す。下記の基は、置換アルキル基の非限定的な例である：−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｈ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３および−ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３。
【００６７】
用語「開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー」および「開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカー」は、リンカーがオキシメチレンジスルフィド基を含むことを示すことを意味し、オキシメチレンジスルフィド基のみに限定されるのではなくむしろ、例えば図２５の化合物に見られるような、まさにその基だけではないものを含有し得るリンカーであると考えられる。同様に、用語「オキシメチレンジスルフィド部位のコア」および「オキシメチレンジスルフィド含有部位のコア」は、部位のコアが、オキシメチレンジスルフィド基を含むことを示すことを意味し、オキシメチレンジスルフィド基のみに限定されるのではなくむしろ、まさにその基だけではないものを含有し得る部位のコアであると考えられる。
【００６８】
用語「核酸」は、概して、増幅生成物、合成的により生じたＲＮＡの逆転写生成物、または自然発生のいずれであるかにかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡの両方を指す。典型的には、核酸は、一本鎖または二本鎖分子であり、自然発生のヌクレオチドで構成される。二本鎖核酸分子は、３’−または５’−突出を有し得、そのため、その全長にわたって完全に二本鎖であることは要求も想定もされていない。さらに、核酸は、非自然発生のヌクレオチドおよび／または自然発生のヌクレオチドへの修飾で構成され得る。本明細書において収載されている例は、ライゲーションまたはエキソヌクレアーゼ分解／ポリメラーゼ伸長の防止をそれぞれ可能にするための、５’または３’ヌクレオチドのリン酸化；共有結合および共有結合に類似した結合のための、アミノ、チオール、アルキンまたはビオチニル修飾；フルオロフォアおよび消光剤；分解を防止するための、ヌクレオチド間のホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデートおよびホスホトリエステル結合；メチル化；ならびに、デオキシ−イノシン、５−ブロモ−ｄＵ、２’−デオキシ−ウリジン、２−アミノプリン、２’，３’−ジデオキシ−シチジン、５−メチル−ｄＣ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、イソ−ｄＣおよび−ｄＧ塩基、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基ならびにフッ素修飾されたヌクレオシド等の、修飾された塩基またはヌクレオシドであるがこれらに限定されない。
【００６９】
本明細書において企図されている方法の一部において、プライマーは、配列決定される鋳型の少なくとも一部に対して少なくとも部分的に相補的である。用語「相補的」は、概して、適切な温度およびイオン性緩衝液条件で、２つのヌクレオチドの塩基（例えば、ＡとＴ）の間に、好都合な熱力学的安定性および特異的な対合を形成する能力を指す。この対合は、各ヌクレオチドの水素結合特性に依存する。これの最も基本的な例は、チミン／アデニンとシトシン／グアニン塩基との間の水素結合対である。本発明において、標的核酸の増幅のためのプライマーは、その全長にわたって標的核酸分子と完全相補的または「半相補的」の両方であってよく、ここで、プライマーは、標的核酸へのハイブリダイゼーションが最小限にできるまたはできない、追加の非相補的配列を含有する。
【００７０】
用語「ハイブリダイズさせる」は、概して、それらのヌクレオチド配列と一致する、異なる核酸分子間の塩基対合を指す。用語「ハイブリダイズさせる」および「アニールする」は、交換可能に使用され得る。
【００７１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、概して、典型的には一本鎖ＤＮＡかつ長さ７５ヌクレオチド未満となるように設計されている、核酸配列を指す。
【００７２】
用語「プライマー」は、概して、核酸配列にアニールするまたはハイブリダイズさせ、十分条件（緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、一価および二価の塩、温度等）下で、プライマーが相補的である核酸の伸長を可能にすることができる、オリゴヌクレオチドを指す。
【００７３】
用語「鋳型核酸」、「鋳型分子」、「標的核酸」および「標的分子」は、交換可能に使用することができ、その配列情報を導出するために配列決定反応によって任意選択で問い合わせされ得る増幅反応の対象である核酸分子を指す。鋳型核酸は、クローン増幅法によって発生した、固体表面上に固定化、すなわちビーズまたはアレイ上に固定化され得る、核酸であってよい。
【００７４】
用語「ヌクレオシド」は、糖、例えば、リボースまたはデオキシリボースのＣ−１’炭素と連結している塩基からなる化合物を指す。ヌクレオシドの塩基分は、通常、複素環式塩基、例えば、プリンまたはピリミジンである。
【００７５】
用語「ヌクレオチド」は、モノマー単位としての、またはポリヌクレオチド内の、ヌクレオシドのリン酸エステルを指す。「ヌクレオシド５’−トリホスフェート」は、トリホスフェートエステル基が糖５’−炭素位に結合したヌクレオチドを指し、時に、「ＮＴＰ」、「ｄＮＴＰ」（２’−デオキシヌクレオシドトリホスフェートまたはデオキシヌクレオシドトリホスフェート）および「ｄｄＮＴＰ」（２’，３’−ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートまたはジデオキシヌクレオシドトリホスフェート）として表記される。「ヌクレオシド５’−四リン酸」は、四リン酸エステル基が糖５’−炭素位に結合した代替的な活性化ヌクレオチドを指す。ＰＡ−ヌクレオチドは、プロパルギル類似体を指す。
【００７６】
用語「保護基」は、当該用語が本明細書および／または特許請求の範囲において使用される場合、所望の反応のある特定の条件下で官能基を可逆的に非反応性にする基として従来の化学的な意味で使用され、Ｈではないと理解されている。所望の反応後、保護基を除去して、保護された官能基を脱保護することができる。好ましい実施形態では、すべての保護基は、合成されている分子の実質的な割合を分解しない条件下で、除去可能（かつそれ故、不安定）であるべきである。保護基は、「キャッピング基」または「ブロッキング基」または「開裂可能な保護基」とも称され得る。便宜上、保護基によって保護された官能基は、保護基の一部として示されるかまたは称されてもよいことに留意すべきである。本明細書で記述されているヌクレオチド誘導体の文脈において、保護基は、３’位において使用される。本発明が、配列決定において使用される可逆的に終端しているヌクレオチド上のこの保護基の性質または化学によって限定されることは意図されていない。３’−Ｏ−アジドメチルヌクレオチド、３’−Ｏ−アミノキシヌクレオチド、３’−Ｏ−アリルヌクレオチド；およびジスルフィドヌクレオチド、３’−Ｏ−アジドアルキル、３’−Ｏ−ジチオメチルアルキル、３’−Ｏ−ジチオメチルアリール、３’−Ｏ−アセチル、３’−Ｏ−カルバゼート、３’−Ｏ−アルキルエーテル、３’−Ｏ−アルキルエステル、３’−Ｏ−アルドキシム（−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ）、３’−Ｏ−ケトキシム（−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ、Ｒ’））を含むがこれらに限定されない多様な保護基が、この目的のために企図されている。
【００７７】
本発明の一実施形態は、ヌクレオチドの３’−ＯＨ官能基上に、保護基の官能基化を介してマーカーを直接結合させることを企図している。
【００７８】
用語「標識」または「検出可能な標識」は、その最も広い意味で、検出可能である、またはそれに関連しているものの検出を可能にする任意の部分または特性を指す。例えば、標識を含むヌクレオチド、オリゴ−またはポリヌクレオチドは、検出可能である。理想的には、標識されたオリゴ−またはポリヌクレオチドは、特に、標識されたヌクレオチドが、酵素的手段によって、プライマーおよび鋳型核酸のハイブリダイゼーション複合体に組み込まれた後の、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする。標識は、ヌクレオチド、オリゴ−またはポリヌクレオチドに、共有結合的にまたは非共有結合的に結合していてよい。種々の態様では、標識は、代替的にまたは組み合わせて：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第２の標識、例えば、ＦＲＥＴによって提供される検出可能なシグナルを修飾する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、二重鎖形成を安定させる；（ｉｖ）捕捉機能、例えば、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン複合体形成を付与する、あるいは（ｖ）電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解度またはクロマトグラフ挙動等の物理的特性を変化させることができる。標識は、それらの構造およびそれらの作用機序において広く変動する。標識の例は、蛍光標識、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等を含む）等を含むがこれらに限定されない。さらに例証するために、蛍光標識は、フルオレセインファミリーの色素、ローダミンファミリーの色素、シアニンファミリーの色素、もしくはクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎｅ）、オキサジン、ボラジアザインダセンまたはそれらの任意の誘導体を含んでよい。フルオレセインファミリーの色素は、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮおよびＺＯＥを含む。ローダミンファミリーの色素は、例えば、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６ＧおよびＴＡＭＲＡを含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６ＧおよびＴＡＭＲＡは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）から市販されており、テキサスレッドは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）から市販されている。シアニンファミリーの色素は、例えば、ＣＹ２、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ５．５およびＣＹ７を含み、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）から市販されている。
【００７９】
用語「異なって標識された」は、本明細書において使用される場合、標識されたヌクレオシド核酸塩基上の異なる位置に標識が見出されるのではなく、検出可能な標識が異なる標識であることを指す。
【００８０】
用語「Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵの類似体」は、修飾されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物を指し、ここで、前記デオキシヌクレオシドの核酸塩基は、対応するヌクレオシドであるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンおよびチミジンまたはデオキシウリジンに酷似している。検出可能な標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の場合、Ａの類似体またはデオキシアデノシンは、
【化７３】
2019500324.tif 000078
として表され得るが、核酸塩基と標識との間にリンカーがあることが好ましい。検出可能な標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の場合、Ｇの類似体またはデオキシグアノシンは、
【化７４】
2019500324.tif 000079
として表され得るが、核酸塩基と標識との間にリンカーがあることが好ましい。検出可能な標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の場合、Ｃの類似体またはデオキシシチジンは、
【化７５】
2019500324.tif 000080
として表され得るが、核酸塩基と標識との間にリンカーがあることが好ましい。検出可能な標識されたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の場合、ＴもしくはＵの類似体またはチミジンもしくはデオキシウリジンは、
【化７６】
2019500324.tif 000081
として表され得るが、核酸塩基と標識との間にリンカーがあることが好ましい。追加の核酸塩基として、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、２−アミノ−７−デアザアデニンおよび２−アミノアデニンからなる群から選択される非天然核酸塩基が挙げられ得る。類似体の場合、検出可能な標識は、核酸塩基と前記検出可能な標識との間にリンカーセクションを含んでもよい。
【００８１】
用語「ＴＣＥＰ」または「トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）」は、生化学および分子生物学応用において頻繁に使用される還元剤を指す。これは、多くの場合、２８６．６５グラム／ｍｏｌの分子量を有する塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）として調製および使用される。これは、水溶性であり、中性ｐＨで安定化された溶液として利用可能であり、還元剤の除去を容易にするためにアガロース支持体上に固定化されている。本発明が１種類の還元剤に限定されることは意図されていない。ジスルフィド結合を還元することができる任意の好適な還元剤を、本発明を実践するために使用することができる。一実施形態では、還元剤は、ホスフィン［１２］、例えば、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリヒドロキシメチルホスフィン、トリヒドロキシプロピルホスフィン、トリスカルボエトキシ−ホスフィン（ＴＣＥＰ）［１３、１４］である。本発明がＴＣＥＰの使用に限定されることは意図されていない。一実施形態では、前記検出可能な標識および３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｒ基は、ジチオベースのリンカーおよび終端（保護）基の開裂を実施するように、チオール基を担持する化合物への曝露によって前記核酸塩基から除去され、そのようなチオール含有化合物は、システイン、システアミン、ジチオ−コハク酸、ジチオトレイトール、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン［１７］を含む（がこれらに限定されない）。反応を、セレノールの包含によってさらに触媒することができる［１８］。加えて、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素（およびアスコルビン酸［２０］）をこの目的のために使用することもできる［１９］。加えて、ジスルフィドおよびチオレダクターゼ等、ジスルフィド結合の開裂のための酵素的方法も周知であり、本発明の化合物で使用することができる［２１］。
【００８２】
本明細書に組み込まれてその一部を形成する添付図は、本発明のいくつかの実施形態を例証し、記述と一緒に、本発明の原理を説明する役割を果たす。図は、本発明の好ましい実施形態を例証することのみを目的としており、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、メチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを有するヌクレオシドトリホスフェートの例を示し、ここで、Ｒは、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、またはそれらの類似体等のアルキル基を表し、置換基群は、Ｏ、Ｎ、Ｓ等のヘテロ原子を含有する。
【００８４】
【図２】図２は、３’−Ｏメチレンジスルフィド含有保護基を有するヌクレオシドトリホスフェートの標識された類似体を示し、ここで、標識は、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）を介して核酸塩基に結合している。類似体は、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンのものである。
【００８５】
【図３】図３は、ＴＣＥＰ等の還元剤による３’−Ｏ保護基の脱保護の段階的機序を示す。
【００８６】
【図４】図４は、開裂反応生成物である、従来のスルフィド、およびオキシメチレンスルフィドが連結した、標識されたヌクレオチドを示す。
【００８７】
【図５】図５は、開裂可能なリンカーのスペーサーがプロパルギルエーテルリンカーを含む、標識されたヌクレオチドの例を示す。類似体は、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンのものである。
【００８８】
【図６】図６は、開裂可能なリンカーのスペーサーがプロパルギルアミンリンカーを含む、標識されたヌクレオチドの例を示す。類似体は、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンのものである。
【００８９】
【図７】図７は、開裂可能なリンカーのスペーサーが、ピリミジンについては５位において、およびプリンについては７−デアザ炭素において核酸塩基と直接結合しているメチレン（−（ＣＨ２）ｎ−を含む、標識されたヌクレオチドの例を示す。このリンカーは、メチレン（ｎ＝１）またはポリメチレン（ｎ＞１）であってよく、ここで、開裂後、リンカーは、核酸塩基上の結合点において−（ＣＨ２）ｎＯＨ基を発生させ、Ｌ１およびＬ２は、スペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、前述した通りの開裂可能なリンカーに安定性を提供する原子の群である。類似体は、（左上から時計回りに）デオキシアデノシン、チミジンまたはデオキシウリジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンのものである。
【００９０】
【図８】図８は、非標識ｄＴ類似体（化合物５）の合成を示す。
【００９１】
【図９】図９は、３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−ｄＣＴＰ（１０）の合成を示す。
【００９２】
【図１０】図１０は、標識されたｄＴ中間体に特異的な標識されたヌクレオチドの合成経路を示す。
【００９３】
【図１１】図１１は、１，４−ブタンジオール（ｄｕｔａｎｅｄｉｏｌ）から出発する開裂可能なリンカー合成を示す。
【００９４】
【図１２】図１２は、安定化ｇｅｍ−ジメチル基が、開裂可能なリンカーのα−炭素に結合した開裂可能なリンカーの別の変異体を示す。
【００９５】
【図１３】図１３は、ジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基と隣接し、柔軟なエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）に結合した開裂可能なリンカーの合成を示す。リンカーは、カルバメート基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）を介してＰＡ−ヌクレオチドに結合している。そのような場合に得られるヌクレオチド類似体は、化合物３５（ｄＵＴＰ類似体）のようになり得る。
【００９６】
【図１４】図１４は、開裂可能なジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基と隣接し、リンカーが尿素基（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−）を介してＰＡ−ヌクレオチドに結合した、ｄＡＴＰ類似体のための開裂可能なリンカーの合成を示す。他のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰの類似体）は、反応シーケンスの最後のステップにおいて４２を適切なＰＡ−類似体によって同様に置き換えて合成することができる。
【００９７】
【図１５】図１５は、リンカーが尿素官能基を介してＰＡ−ヌクレオチドに繋がれ、ジスルフィドが２つの炭素リンカーによって色素と接続している、開裂可能なリンカー化合物４５の合成を示す。そのような場合に得られるヌクレオチド類似体は、化合物４９（ｄＧＴＰ類似体）のようになり得る。他のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰの類似体）は、反応シーケンスの第３のステップにおいてヌクレオチド４６を適切なＰＡ−ヌクレオチド類似体で置き換えることによって同様に合成することができる。
【００９８】
【図１６】図１６は、標識されたヌクレオチド５０を１０当量のＴＣＥＰに６５°Ｃで曝露した場合に、予測される生成物５１とともに化合物５２を含むいくつかの副産物を発生させたことを示す。
【００９９】
【図１７】図１７は、５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（下）および５２４ｎｍ（上）において抽出された化合物５０のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、ここで、１１．０８分におけるピークは化合物５１に、１０．８８分におけるピークは化合物５２に、他のピークは副産物に対応する。
【０１００】
【図１８】図１８は、１５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（下）および５２４ｎｍ（上）において抽出された化合物５０のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、ここで、１１．３２分におけるピークは化合物５１に、他のピークは副産物に対応する。
【０１０１】
【図１９】図１９は、同一の開裂条件下で、オキシメチレンジスルフィド連結したヌクレオチド３５が、所望の開裂生成物、化合物５３および５４をきれいに生成したことを示す。リンカーのメチレンチオールセグメント（−ＣＨ２ＳＨ）は、ジスルフィド基の開裂時にヌクレオチドから完全に排除された。
【０１０２】
【図２０】図２０は、５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（下）および５２４ｎｍ（上）において抽出された化合物３５のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、ここで、１１．２４分におけるピークは化合物５３に、３４．７０分におけるピークは化合物５４に対応する。
【０１０３】
【図２１】図２１は、１５分間の曝露後に分析した、２９２ｎｍ（下）および５２４ｎｍ（上）において抽出された化合物３５のＴＣＥＰ曝露生成物のＬＣ−ＭＳトレースを示し、ここで、１１．２５分におけるピークは化合物５３に、３４．７０分におけるピークは化合物５４に対応する。
【０１０４】
【図２２】図２２は、３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔのもの（図１０）とは異なる、適切なステップにおけるメタンチオールまたはナトリウムチオメトキシドによるメルカプトエタノール（ＥｔＳＨ）の置き換えによる、３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅ類似体の合成を示す。
【０１０５】
【図２３】図２３は、活性化リンカー３２を使用する、ＰＡ−ヌクレオチド（例えば５７）の、適切な開裂可能な−ＯＣＨ２−ＳＳ−リンカーとの、および最終的に、フルオロフォア色素とのカップリングを示す。
【０１０６】
【図２４】図２４は、異なるリンカーが実現した、化合物６０および６１を有するヌクレオチド類似体を示す。
【０１０７】
【図２５】図２５は、異なるフルオロフォアレポーティング基によって標識された４−ヌクレオチド類似体の構造［式中、Ｒ＝Ｍｅ−またはＥｔ−である］を示す。
【０１０８】
【図２６】図２６は、異なるフルオロフォアレポーティング基によって標識された４−ヌクレオチド類似体の構造［式中、Ｒ＝Ｍｅ−またはＥｔ−基である］を示す。
【０１０９】
【図２７】図２７は、異なるフルオロフォアレポーティング基によって標識された４−ヌクレオチド類似体の構造［式中、Ｒ＝Ｍｅ−またはＥｔ−基である］を示す。
【０１１０】
【図２８】図２８は、本発明の新たな開裂可能なリンカーを含む一般的なユニバーサルビルディングブロック構造を示す。ＰＧ＝保護基、Ｌ１、Ｌ２−リンカー（脂肪族、芳香族、混合極性直鎖または分枝鎖）。ＲＧ＝反応性基。本発明の一実施形態では、そのようなビルディングブロックは、リンカーの一端にＦｍｏｃ保護基を、および他端に反応性ＮＨＳカーボネートまたはカルバメートを担持する。この好ましい組合せは、新たな開裂可能なリンカーを含む修飾されたヌクレオチド合成において特に有用である。保護基は、核酸／ヌクレオチド化学と適合する条件下で除去可能であるべきであり、反応性基は、選択的であるべきである。リンカー上の活性ＮＨＳ基の、アミン終端ヌクレオチドとの反応後、Ｆｍｏｃ基は、ピペリジンまたはアンモニア等の塩基を使用して簡単に除去することができ、したがって、リンカーの末端におけるアミン基を、開裂可能なマーカーの結合のために露出することができる。多様なマーカーを含む化合物のライブラリーを、このようにして非常に迅速に構築することができる。
【０１１１】
【図２９】図２９は、本発明の新規リンカーを介して結合している開裂可能なマーカーを担持するヌクレオチドの一般的な構造を示す。Ｓ＝糖（すなわち、リボース、デオキシリボース）、Ｂ＝核酸塩基、Ｒ＝Ｈまたは可逆的終端基（保護基）。好ましい可逆的終端基は、アジドメチル（−ＣＨ２Ｎ３）、ジチオ−アルキル（−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ）、アミノキシ（−ＯＮＨ２）を含むがこれらに限定されない。
【０１１２】
【図３０】図３０は、本発明の開裂可能なリンカーを介して結合している開裂可能なマーカーを担持するヌクレオチドに対する別の一般的な構造を示す［式中、Ｄは、アジド、ジスルフィドアルキルおよびジスルフィド置換アルキル基を含む群から選択され、Ｂは、核酸塩基であり、Ａは、結合基であり、Ｃは、開裂可能な部位のコアであり、Ｌ１およびＬ２は、接続基であり、Ｌａｂｅｌは、標識である（標識を有する化合物において）］。
【０１１３】
【図３１】図３１は、図３２Ａ〜Ｃにおいて試験される化合物（Ｌ−シリーズ（９６）、Ｂ−シリーズ（９７）、（Ａ−シリーズ（９８）、および（Ｇ−シリーズ（９９）ファミリー）の化学構造を示す。
【０１１４】
【図３２】図３２Ａは、種々のジスルフィドベースの開裂可能なリンカー：Ｌ−シリーズ（９６）、Ｂ−シリーズ（９７）、Ａ−シリーズ（９８）、およびＧ−シリーズ（９９）ファミリーを有する、３’−Ｏ−アジドメチルＡｌｅｘａ４８８標識されたヌクレオチド類似体の組み込みの時間経過を示す。図３２Ｂは、種々のジスルフィドベースの開裂可能なリンカー：Ｌ−シリーズ（９６）、Ｂ−シリーズ（９７）、Ａ−シリーズ（９８）、およびＧ−シリーズ（９９）ファミリーを有する、３’−Ｏ−アジドメチルＡｌｅｘａ４８８標識されたヌクレオチド類似体の組み込みの反応速度を示す。図３２Ｃは、種々のジスルフィドベースの開裂可能なリンカー：Ｌ−シリーズ（９６）、Ｂ−シリーズ（９７）、Ａ−シリーズ（９８）、およびＧ−シリーズ（９９）ファミリーを有する、３’−Ｏ−アジドメチルＡｌｅｘａ４８８標識されたヌクレオチド類似体の組み込みの、ヌクレオチド濃度に対する反応速度を示す。
【０１１５】
【図３３】図３３は、ｄＡ３’−可逆的終端ヌクレオチド：−ＣＨ２−Ｎ３、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅについての組み込み反応速度論を示す。
【０１１６】
【図３４】図３４は、３つの異なるＤＮＡポリメラーゼ：Ｔ９、Ｊ５およびＪ８による、３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ終端基を有するｄＣ３’−可逆的終端ヌクレオチドの組み込み反応速度論を示す。
【０１１７】
【図３５】図３５は、ＧＲシーケンサーでの伸長Ａ反応において使用されるヌクレオチドの最適化された濃度を示す［ｎＭ］。
【０１１８】
【図３６】図３６は、生誤り率によって測定した際のＡ−シリーズ（９８）ヌクレオチドの配列決定性能を示す。
【０１１９】
【図３７】図３７は、完璧な（誤りのない）リードのパーセンテージによって測定した際のＡ−シリーズ（９８）ヌクレオチドの配列決定性能を示す。
【０１２０】
【図３８】図３８は、多様な配列決定マトリックスによって測定した際のＡ−シリーズ（９８）ヌクレオチドの配列決定性能を示す。
【０１２１】
【図３９】図３９は、生誤り率によって測定した際のＧ−シリーズ（９９）ヌクレオチドの配列決定性能を示す。
【０１２２】
【図４０】図４０は、完璧な（誤りのない）リードのパーセンテージによって測定した際のＧ−シリーズ（９９）ヌクレオチドの配列決定性能を示す。
【０１２３】
【図４１】図４１は、ＥｘｔＢにおいてならびにＥｘｔＢおよびＡの両方において３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔヌクレオチドを含有する配列決定実行からの多重バーコードの同定を示す。
【０１２４】
【図４２】図４２は、種々の開裂可能なリンカー：Ｂ＝Ｂ−シリーズ（９７、１１６、１１７および１１８）、Ｇ＝Ｇ−シリーズ（９９、１０３、１０４および１０５）、Ａ＝Ａ−シリーズ（９８、１００、１０１および１０２）、およびＳＳ＝Ｌ−シリーズ（９６、５０、１０６および１１５）を有する、標識された可逆的終端ｄＣの、伸長Ａ緩衝液中における昇温での安定性の比較を示す。
【０１２５】
【図４３】図４３は、化合物６２からの化合物６３〜６７の合成を例証する合成スキームを示す。合成は、実施例３３、実施例３４および実施例３５において記述されている。
【０１２６】
【図４４】図４４は、化合物６８からの化合物６９〜７１および１１９〜１２０の合成を例証する合成スキームを示す。合成は、実施例３６、実施例３７および実施例３８において記述されている。
【０１２７】
【図４５】図４５は、上から下へｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識されたヌクレオチド（Ａ−シリーズ、９８、１００、１０１および１０２）の完全な化学構造を示す。
【０１２８】
【図４６】図４６は、上から下へｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識されたヌクレオチド（Ｇ−シリーズ、９９、１０３、１０４および１０５）の完全な化学構造を示す。
【０１２９】
【図４７】図４７は、上から下へｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識されたヌクレオチド（Ｌ−シリーズ、９６、５０、１０６および１１５）の完全な化学構造を示す。
【０１３０】
【図４８】図４８は、上から下へｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰに対応する４つの標識されたヌクレオチド（Ｂ−シリーズ、９７、１１６、１１７および１１８）の完全な化学構造を示す。
【０１３１】
【図４９】図４９は、いずれもそれらの３’に可逆的終端基として−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを担持する、ＧＲ機器での配列決定において使用されるヌクレオチド（標識された、化合物７２、７４、７６、７８、および非標識の、化合物１２０、１２６、１３２、１３８）の濃度例を示す。
【０１３２】
【図５０】図５０は、いずれも−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを担持する、新規ヌクレオチド（図４９について記述されている通り、標識されたおよび非標識の）を使用するＧＲでの配列決定実行において発生した強度の例を示す。
【０１３３】
【図５１】図５１は、メチレンジスルフィドメチルを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを有するヌクレオシドトリホスフェートの一連の非リンカー例を示す。
【０１３４】
【図５２】図５２は、メチレンジスルフィドメチルを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを有する異なるフルオロフォアレポーティング基によって標識された４−ヌクレオチド類似体の構造を示す。
【０１３５】
【図５３】図５３は、共通リンカーのＮＨＳ活性化形態の合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１３６】
【図５４】図５４は、ＭｅＳＳｄＡＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１３７】
【図５５】図５５は、ＭｅＳＳｄＣＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１３８】
【図５６】図５６は、ＭｅＳＳｄＧＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１３９】
【図５７】図５７は、ＭｅＳＳｄＴＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４０】
【図５８】図５８は、ＭｅＳＳｄＡＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４１】
【図５９】図５９は、７６の合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４２】
【図６０】図６０は、ＭｅＳＳｄＣＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４３】
【図６１】図６１は、７２の合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４４】
【図６２】図６２は、ＭｅＳＳｄＧＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４５】
【図６３】図６３は、ＭｅＳＳｄＧＴＰ−ＡＲＡ−Ｃｙ５の合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４６】
【図６４】図６４は、ＭｅＳＳｄＵＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４７】
【図６５】図６５は、７４の合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１４８】
【図６６】図６６は、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰの構造を示す概略図である。
【０１４９】
【図６７】図６７は、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰからの３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１５０】
【図６８】図６８は、３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰ−ＰＡの合成のための重要な中間体を示す。
【０１５１】
【図６９】図６９は、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰ−ＰＡからの３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰ−ＰＡの合成の一実施形態を示す概略図である。
【０１５２】
【図７０】図７０は、リンカー設置および蛍光色素のコンジュゲーションを示す概略図である。
【０１５３】
【図７１】図７１は、本発明のリンカーおよび終端基を結合させるために使用され得るヒドロキシメチル誘導体核酸塩基誘導体の構造を示す。Ｒ＝可逆的終端基、ＣＬ＝本発明の開裂可能なリンカー。
【０１５４】
【図７２】図７２は、開裂が実施された後の、ヒドロキシメチル誘導体核酸塩基誘導体の構造を示す。
【０１５５】
【図７３】図７３は、本発明のジチオベースのリンカーおよび終端基の開裂を実施するために使用され得るチオール官能基を担持する化合物の例を示す：Ａ）システアミン、Ｂ）ジチオ−コハク酸、Ｃ）システアミン、Ｄ）ジチオトレイトール、Ｅ）２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、Ｆ）ジチオブチルアミン、Ｇ）メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、Ｈ）２−メルカプトエタンスルホネート、Ｉ）Ｎ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジン。
【０１５６】
【図７４】図７４は、リンカーおよび３’−保護基の選択的かつ段階的開裂−化学構造および反応スキームの例を示す。
【０１５７】
【図７５】図７５は、リンカーの選択的かつ段階的開裂−開裂の各ステップに関連するクロマトグラムの例を示す。
【０１５８】
【図７６】図７６は、リンカーの選択的かつ段階的開裂−選択的開裂反応のすべてのステップに対応するピークから抽出した吸収スペクトルの例を示す。
【０１５９】
【図７７】図７７は、３’上にジチオ保護基を保持するヌクレオチドおよびジチオベースのリンカーについての開裂反応スキームを示す。
【０１６０】
【図７８】図７８Ａは、開裂試薬：ジチオコハク酸、Ｌ−システイン、ＤＴＴおよびシステアミンとの１０分間のインキュベーション後に、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析された出発材料および開裂反応混合物のクロマトグラムを示す。図７８Ｂは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した際の、反応混合物の組成を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
本発明は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位と、デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続されている検出可能な標識とを含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。そのような化合物は、合成による配列決定を含むがこれに限定されない将来の配列決定技術に、新たな可能性を提供する。本発明は、物の組成物として、本明細書の本文および図に示す種々の構造を企図している。これらの組成物は、プライマー伸長反応を含むがこれに限定されない反応において使用され得る。これらの組成物は、混合物中にあってよい。例えば、標識されたヌクレオチド（例えば、図２５に示されているもの等）の１つまたは複数は、１つまたは複数の非標識ヌクレオチド（例えば、図５１に示されているもの等）との混合物中にあってよい（および混合物中で使用されてよい）。これらは、他の試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ、プライマー等）とともにキット内にあってよい。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の標識されたヌクレオチドは、合成のいくつかのステップを要し、多様な色素を異なる塩基に連結することを伴う。段階的プロセスよりもモジュラー方式でリンカーおよび色素結合を実施できることが望ましい。モジュラーアプローチは、一端では保護基および他端では活性化基とのリンカー部分のプレビルディング（ｐｒｅ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ）を伴う。次いで、そのようなプレビルトリンカーを使用して、プロパルギルアミン（ａｐｒｏｐａｒｇｙｌａｍｉｎｅ）ヌクレオチドとカップリングし、次いで、マスクされたアミン基を脱保護し、次いで、活性化色素をカップリングすることができる。これは、段階的合成と比較して、ステップがより少なく収率がより高いという利点を有する。
【０１６３】
一実施形態では、本発明の標識されたヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定において使用される。ＤＮＡ配列決定は、生物学において基本的なツールである。これは、基礎研究、生物医学、診断的および法医学的応用において、ならびに基礎および応用研究の多くの他の分野において広く使用される方法である。新世代のＤＮＡ配列決定技術は、生物学における研究が日常的に行われる手法を変更しつつある。今後数年間で、精密医療、コンパニオン診断等の分野において重要な役割を果たす用意ができている。
【０１６４】
合成による配列決定（ＳＢＳ）は、数百万のＤＮＡ分子、単一またはそれらのクラスターを同時に配列決定することができる、革新的な次世代配列決定（ＮＧＳ）技術である。この技術の基礎は、ＤＮＡ配列決定において大規模な並列処理を可能にする固体表面上でのＤＮＡ分子の単一塩基だけの伸長および検出を可能にする、開裂可能なヌクレオチドターミネーターとして公知である修飾されたヌクレオチドの使用である（包括的な総説については：Ｃｈｅｎｇ−Ｙａｏ，  Ｃｈｅｎ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１４年、５巻、１頁［２２］；Ｆｅｉ  Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１３年、１１巻、３４〜４０頁［５］；Ｃ．Ｗ．  Ｆｕｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９年、２７巻、１０１３頁［２］；Ｍ．Ｌ．  Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１０年、１１巻、３１頁［１］）。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
ＤＮＡプライマーへの組み込みおよびその後の検出後に化学反応によって除去することができる開裂可能な保護基によって３’−ＯＨ位がブロックされた、修飾されたヌクレオチドは、ＳＢＳ化学の成功への鍵である（Ｊｕら、ＵＳ  ７，８８３，８６９，  ２０１１  ［２３］；  Ｊｕら、ＵＳ  ８，０８８，５７５，  ２０１２  ［２４］；  Ｊｕら、ＵＳ  ８，７９６，４３２，  ２０１４  ［２５］；  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  ＵＳ  ６，８３３，２４６，  ２００４  ［２６］；  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、ＵＳ  ７７８５７９６Ｂ２，  ２０１０  ［２７］；  Ｍｉｌｔｏｎら、ＵＳ  ７，４１４，１１６  Ｂ２，  ２００８  ［２８］；  Ｍｅｔｚｋｅｒ，  Ｍ．  Ｌ．  ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９９４，  ２２：４２５９−４２６７  ［２９］；  Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３  （５２），  １９６３５，  ２００６  ［３０］；  Ｒｕｐａｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０２  （１７），  ５９３２，  ２００５  ［３１］；  Ｂｅｒｇｍａｎｎら、ＵＳ  ２０１５／０１４０５６１  Ａ１  ［３２］；  Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，  ＵＳ  ２００２／００１５９６１  Ａ１  ［３３］）。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
３’−ＯＨは保護されていないが、ＤＮＡ鋳型への単一塩基組み込み後に修飾基がさらなる伸長を防止し、連鎖を終わらせる事象を発生させるような様式で塩基が修飾された、仮想ターミネーターとして公知であるヌクレオチド類似体を開発するための試みもなされてきた（Ａｎｄｒｅｗ  Ｆ．  Ｇａｒｄｎｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ  ４０巻（１５号）、７４０４〜７４１５頁、２０１２年［３４］、Ｌｉｔｏｓｈら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ，  Ｒｅｓ．、２０１１年、３９巻、６号、ｅ３９頁［３５］、Ｂｏｗｅｒｓら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９年、６巻、５９３頁［３６］）。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
隣接する３’−ＯＨ基が鎖伸長反応に関わるのを防止し、それにより、単一塩基伸長後に停止する、除去可能な基によって２’−ＯＨが保護されている、リボ−ヌクレオチド類似体も開示されており（Ｚｈａｏら、ＵＳ８，３９９，１８８Ｂ２、２０１３年［３７］）、参照により組み込まれる。
【０１６８】
他方で、Ｚｏｎは、除去可能な基によって３’−ＯＨがブロックされたヌクレオチドの１つを含有するジヌクレオチドターミネーターの使用を提案しており（Ｇｅｒａｌｄ  Ｚｏｎ、ＵＳ８，０１７，３３８Ｂ２、２０１１年［３８］）、参照により組み込まれる。
【０１６９】
これまで、開裂可能なジスルフィドリンカー（−ＳＳ−）は、ＧｅｎｅＲｅａｄｅｒ配列決定において使用するための標識されたヌクレオチド中の蛍光色素に結合するために使用されてきた。開裂ステップ後に成長中のＤＮＡ株上に取り残された−ＳＨ痕は、より長いリード長さの実現を制限するいくつかの副反応を引き起こすと考えられている。
【０１７０】
−ＳＨ残基は、開裂ステップにおいて使用されるＴＣＥＰの存在下で、フリーラジカル反応を経て望ましくない官能基を生じる可能性があり、潜在的にＤＮＡ分子を損傷し得ることが公知である（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＳ、Ｚｈｏｕｘｉ  Ｗａｎｇら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２０１０年、２４巻（３号）、２６７〜２７５頁［３９］）。
【０１７１】
−ＳＨ痕は、３’ＯＨ保護基を開裂するフローセル内部に入ってくるヌクレオチドと相互作用してさらなる鎖延長を時期尚早に引き起こすこともでき、それにより、シグナル位相の散逸を引き起こし得る。
【０１７２】
−ＳＨの有害な副反応の最終結果は、リード長さの低減および配列決定実行における誤り率の増大である。
発明の詳細な説明
【０１７３】
本発明は、開裂可能な保護基としてメチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位と、デオキシヌクレオシドの核酸塩基に可逆的に接続されている検出可能な標識とを含むデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用する方法、組成物、混合物およびキットを提供する。そのような化合物は、合成による配列決定を含むがこれに限定されない将来の配列決定技術に、新たな可能性を提供する。
【０１７４】
本発明は、一実施形態では、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、保護基としてメチレンジスルフィドを含む３’−Ｏ基を持ち、式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒを有する、標識されたヌクレオシドトリホスフェートの、ＤＮＡ配列決定（例えば、合成による配列決定）における合成および使用に関与し、ここで、Ｒは、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、またはそれらの類似体等のアルキル基を表し、置換基群は、Ｏ、Ｎ、Ｓ等のヘテロ原子含有する（図１を参照）。一実施形態では、Ｒ基は、３’−Ｏキャッピング基の安定性および開裂性を変調し得、一方、ＤＮＡポリメラーゼ酵素に許容される、官能基を含有してよい。
【０１７５】
別の態様では、本発明は、標識と核酸塩基との間に開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを含み、メチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏ位を持ち、ここで、核酸塩基は、天然であっても、ＤＮＡ鋳型の天然核酸塩基との水素結合相互作用によりＤＮＡ二重鎖を形成し得、ｄＧおよびｄＡの７−デアザ類似体ならびに２−アミノ−ｄＡであり得る非天然塩基であってもよい、標識されたヌクレオシドトリホスフェートに関する。ｄＡおよびｄＧの７−デアザ類似体は、７−Ｎ原子の欠如により、ＤＮＡ三次構造の形成を低減させることができる。一実施形態では、そのようなヌクレオシドが、ＤＮＡ鋳型およびポリメラーゼ相互作用を強化することにより、ＤＮＡ配列決定リード長さを潜在的に改善し得ることが想定される。２−アミノ−ｄＡが、その相補的塩基との（天然状態における２つの結合よりも）より安定な３つの水素結合を形成するその能力により、ＤＮＡ二重鎖安定性を増大させることができることも可能な場合があり、したがって、配列決定実行中におけるＤＮＡプライマーを喪失するリスクを低減させることができる（Ａ  Ｊｕｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．、２００２年、５５巻（１号）、５５〜５７頁［４０］；２−ａｍｉｎｏ−ｄＡＴＰ：  Ｉｇｏｒ  Ｖ．  Ｋｕｔｙａｖｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、４７巻（５１号）、１３６６６〜７３頁［４１］）。
【０１７６】
別の実施形態では、前記ヌクレオチドは、開裂可能なリンカーである−ＯＣＨ２ＳＳ−を介して核酸塩基と連結した蛍光色素等の検出可能なレポーター分子を有し得る。−ＯＣＨ２−ＳＳ−基が核酸塩基に直接結合している標識されたヌクレオチドおよび開裂可能なリンカーとしてのその使用は、先行技術において公知ではない。従来の広く使用されているジスルフィドリンカー（−ＳＳ−）とは逆に、このクラスの開裂可能なリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）は、ＤＮＡ分子上に硫黄トレースを残さず、それを、還元的開裂後、得られた中間体−ＯＣＨ２−ＳＨの急速加水分解によって−ＯＨ基にきれいに変換する。このため、そのようなリンカーは、従来のジスルフィドリンカーのより良好な代替物となり得る。従来のジスルフィドベースのリンカー（−ＳＳ−）において、得られたチオール基（−ＳＨ）は、下記の図４に提示される通り、ＴＣＥＰ等の還元試薬によって開裂された場合、副反応を被り得る（参考文献：Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＭＳ、Ｚｈｏｕｘｉ  Ｗａｎｇら、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２０１０年、２４巻（３号）、２６７〜２７５頁［３９］）。
【０１７７】
別の実施形態では、レポーター基は、５−Ｃ位においてピリミジン塩基（ｄＴ、ｄＣ）に、および天然塩基の７−Ｎまたはデアザ類似体の７−Ｃにおいてプリン塩基（ｄＡ、ｄＧ）に結合していてよい。
【０１７８】
別の実施形態では、標識されたヌクレオチドの構造は、図５に示される通りであってよく、ここで、開裂可能なリンカーのスペーサーは、プロパルギルエーテルリンカーを含む。プロパルギルエーテルを有する核酸塩基は、化学合成の先行技術に従って合成することができる。Ｌ１およびＬ２は、化学的スペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、開裂可能なリンカーに対する安定性および開裂性を変調する原子の群である。これらは、水素原子、ジェミナルジメチル、または、メチル、エチル、ｎ−ブチル、フェニル等、任意のアルキル、フェニルもしくは置換アルキル基であってよい。これらは、−Ｏ、＝Ｏ，ＮＨ、−Ｎ＝Ｎ、酸、アミド、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）等を有する炭化水素鎖も含有し得る。ヌクレオチド上の標識は、蛍光色素、エネルギー移動色素、放射性標識、化学発光プローブ、ヘプタン、および化学的または物理的方法による検出を可能にする他の形態の標識であってよい。
【０１７９】
別の実施形態では、標識されたヌクレオチドの構造は、図６に示される通りであってよい。開裂可能なリンカーのスペーサーは、プロパルギルアミンリンカーを含む。ここでも、Ｌ１およびＬ２は、スペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、前述した通り、リンカーの安定性を提供し開裂性を変調する原子の群である。これらは、水素原子、メチル、エチル等のアルキル基、および他の置換されている基またはそれらの塩であってよい。開裂可能なジスルフィドリンカーのα−炭素上のジェミナルジアルキル基（例えば、下記の構造：
【化７７】
2019500324.tif 000082
に従うジェミナルジメチル類似体）は、より良好な安定性をリンカーに提供して、標識されたヌクレオチドのモジュラー合成を可能にする。これは、ジスルフィドベースの有機化合物の間でよく見られる不均化反応をおそらく防止する。また、これは、標識されたヌクレオチド類似体の合成および精製を支援する、より大きい疎水性をリンカーに付加する［４２〜４４］。リンカー中に存在するｇｅｍジメチル官能基は、ジスルフィド結合を電子的に安定させる役割を果たすだけでなく、おそらく立体効果を介して、ジスルフィド交換が分子間および分子内の両方で発生するのを防止すると考えられている。シスタミンの存在下で、ターミネーター上のジスルフィド官能基はジスルフィド交換に関わり、一方、ｇｅｍジメチル基を装備したリンカーは関わらないことが実証されている。図４２におけるリンカー研究は、ｇｅｍジメチル基を有するおよび有さないリンカーを比較する。この研究から分かるように、ｇｅｍジメチル基を有さないリンカーＧおよびＬは、シスタミンと迅速に交換して、生成物の分解を生じる。予想通り、この現象は、本発明者らが選択したリンカーＡでも類似のリンカーＢでも観測されない。加えて、標識されたヌクレオチドは、２つのジスルフィド、ターミネーター上に１つおよび分子のリンカー分上に１つを含有するため、この安定化効果が、色素とターミネーターとの間でスクランブリングが発生するのを防止すると考えられている。この安定性は、配列決定における本発明者らのヌクレオチドの性能にとって重要である。
【０１８０】
別の実施形態では、標識されたヌクレオチドの構造は、図７のようであってよい。開裂可能なリンカーのスペーサーは、ピリミジンについては５位において、およびプリンについては７−デアザ炭素において核酸塩基と直接結合しているメチレン（−（ＣＨ２）ｎ−を含む。このリンカーは、メチレン（ｎ＝１）またはポリメチレン（ｎ＞１）であってよく、ここで、開裂後、リンカーは、核酸塩基上の結合点において−（ＣＨ２）ｎＯＨ基を発生させ、Ｌ１およびＬ２は、スペーサーを表し、置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、前述した通りの開裂可能なリンカーに安定性を提供する原子の群である。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、特許請求されているヌクレオチドの合成方法に関する。キャッピング基およびリンカーは、記述されている先行技術を修正して合成され得る。例えば、非標識ｄＴ類似体（化合物５）は、図８に示される通りに合成することができる。
【０１８２】
一実施形態では、本発明は、（ａ）開裂可能な保護基として（例えば式−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒの）メチレンジスルフィドを含む基によってキャッピングされている３’−Ｏを有するヌクレオシドトリホスフェート（図１を参照）；および（ｂ）それらの標識された類似体（図２を参照）に関与し、ここで、標識は、開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカー（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）を介して核酸塩基に結合している。そのようなヌクレオチドは、核酸の合成による配列決定（ＳＢＳ）技術において使用され得る。特許請求されているヌクレオチドの合成のための一般的方法も記述されている。
【０１８３】
一実施形態では、図１に示される通り、非標識ヌクレオチドの一般的構造は、共通の構造−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒを有するメチレンジスルフィドを含む基によって保護されている３’−Ｏ基を有し、ここで、Ｒは、正規のアルキル、または−Ｍｅ、−Ｅｔ、−ｎＢｕ、−ｔＢｕ、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ等の置換アルキル基であってよく、Ｂは、天然または非天然核酸塩基であってよい。非天然核酸塩基の一部の具体例は、７−デアザｄＧおよびｄＡ、２−アミノ−ｄＡ等である。
【０１８４】
図２において、標識された類似体の一般的構造は、フルオロフォア等の検出可能なレポーター（標識）が一般的構造−Ｌ１−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｌ２−を有する開裂可能なリンカーを介して核酸塩基に結合していることに加えて、図１のようにメチレンジスルフィドを含む基によって保護されている３’−Ｏとともに示されている。Ｌ１は、核酸塩基を開裂可能なリンカーから、一方、Ｌ２は、開裂可能なリンカーと標識との間を分離する分子スペーサーをそれぞれ表す。Ｌ１およびＬ２はいずれも、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ＝Ｎ、−Ｎ＝Ｎ−等のそれぞれの化学実体と接続するための適切な官能基を有し得る。標識は、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチン、ハプテン等であってよい。標識は、異なるヌクレオチド上で複数の塩基を同時に検出するために異なっていても、固体表面上での空間的に分離されたオリゴヌクレオチドまたはそれらの増幅されたクローンの段階的検出のために同じであってもよい。
【０１８５】
一実施形態では、本発明は、−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ基でキャッピングされている３’−Ｏと、一般的構造−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−を有する開裂可能なリンカーを介して核酸塩基に結合した標識とを有する、新たなクラスのヌクレオチドに関する。そのようなキャッピング基およびリンカーは、ＴＣＥＰまたは関連化学物質による単一処理によって同時にきれいに開裂することができ、ＤＮＡ分子上に硫黄トレースを残さない。
【０１８６】
このクラスのヌクレオチドは、熱活性ポリメラーゼによって触媒されるＤＮＡ鋳型へのヌクレオチド組み込みに必要な比較的高い温度（約６５℃）に耐えるために十分安定であり得るが、ＴＣＥＰ等による還元等のＤＮＡ互換条件下で開裂されるために十分不安定であり得る。一部の実施形態では、開裂は、ジチオトレイトールへの曝露によって遂行されてよい。
【０１８７】
ヌクレオチドは、ＴＣＥＰ等の還元剤に曝露されると、図３に示される段階的機序を介して３’−Ｏ保護基を脱キャッピングし、故に、３’−ＯＨ基の天然状態を修復する。ＴＣＥＰおよびその類似体は、ＳＢＳにおける応用の前提条件である生体分子に対して無害であることが公知である。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は、図２８に示される、新たな開裂可能なリンカーを含む一般的なユニバーサルビルディングブロック構造に関する。ＰＧ＝保護基、Ｌ１、Ｌ２−リンカー（脂肪族、芳香族、混合極性直鎖または分枝鎖）。ＲＧ＝反応性基。本発明の一実施形態では、そのようなビルディングブロックは、リンカーの一端にＦｍｏｃ保護基を、および他端に反応性ＮＨＳカーボネートまたはカルバメートを担持する。この好ましい組合せは、新たな開裂可能なリンカーを含む修飾されたヌクレオチド合成において特に有用である。保護基は、核酸／ヌクレオチド化学と適合する条件下で除去可能であるべきであり、反応性基は、選択的であるべきである。リンカー上の活性ＮＨＳ基の、アミン終端ヌクレオチドとの反応後、Ｆｍｏｃ基は、ピペリジンまたはアンモニア等の塩基を使用して簡単に除去することができ、したがって、リンカーの末端におけるアミン基を、開裂可能なマーカーの結合のために露出することができる。多様なマーカーを含む化合物のライブラリーを、このようにして非常に迅速に構築することができる。
【０１８９】
一実施形態では、本発明は、図２９に示される、新規リンカーを介して結合している開裂可能なマーカーを担持するヌクレオチドの一般的な構造に関する。Ｓ＝糖（すなわち、リボース、デオキシリボース）、Ｂ＝核酸塩基、Ｒ＝Ｈまたは可逆的終端基（保護基）。好ましい可逆的終端基は、アジドメチル（−ＣＨ２Ｎ３）、ジチオ−アルキル（−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ）、アミノキシ（−ＯＮＨ２）を含むがこれらに限定されない。
【実施例】
【０１９０】
下記の実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態および態様を実証しさらに例証するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１９１】
（実施例１）
３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシチミジン（２）の合成
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシチミジン（１）（２．０ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬ丸底フラスコ中の、ＤＭＳＯ（１０．５ｍＬ）、酢酸（４．８ｍＬ）および無水酢酸（１５．４ｍＬ）からなる混合物に溶解し、室温で４８時間撹拌した。次いで、ガス状ＣＯ２の放出が止まるまで飽和Ｋ２ＣＯ３溶液を添加することにより、混合物をクエンチした。次いで、分液漏斗を使用して、混合物をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。次いで、合わせた有機抽出物を、分配漏斗中のＮａＨＣＯ３の飽和溶液（２×１５０ｍＬ）で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水した。有機部を回転蒸発によって濃縮した。反応混合物を最後にシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／７：３から１：１）によって精製した、図８を参照。３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシチミジン（２）を白色粉末として７５％収率で得た（１．７５ｇ、Ｒｆ＝０．６、ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．１６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．４６  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７８−３．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１４，  ２．１４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９７  （ｍ，  １Ｈ），  １．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９３  （ｓ，  ９Ｈ）および０．１３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ。
【０１９２】
（実施例２）
３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−２’−デオキシチミジン（４）の合成
高真空下で終夜乾燥させ、２０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した化合物２（１．７５ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）に、Ｅｔ３Ｎ（０．５４ｍＬ、３．８７ｍｍｏｌ）および５．０ｇの分子篩−３Ａを添加し、Ａｒ雰囲気下で３０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に載置して、温度を氷点下にし、ＣＨ２Ｃｌ２（１．８ｍＬ）中の１．８当量の１Ｍ  ＳＯ２Ｃｌ２をゆっくりと添加し、同じ温度で１．０時間撹拌した。次いで、氷浴を除去して、フラスコを室温にし、４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のチオトシル酸カリウム（１．５ｇ）の溶液を添加し、室温で０．５時間撹拌した。
【０１９３】
次いで、２当量のＥｔＳＨ（０．６ｍＬ）を添加し、さらに４０分間撹拌した。次いで、混合物を５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、漏斗中のセライト−Ｓに通して濾過した。試料を適正な量のＣＨ２Ｃｌ２で洗浄して、生成物が濾過除去されたことを確かめた。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２抽出物を濃縮し、シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ／１：１から１：３、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１中でＲｆ＝０．３）によって精製した。次いで、得られた粗生成物を、２０ｍＬのＭｅＯＨ中の２．２ｇのＮＨ４Ｆで処理した。３６時間後、反応物を２０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、分配することによってＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２部をＮａ２ＳＯ４で脱水し、クロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１から１：２）によって精製した、図８を参照。精製された生成物（４）を白色粉末として１８％収率で得た（０．２６８ｇ、Ｒｆ＝０．３、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：２）。
【０１９４】
１Ｈ  ＮＭＲ、ＣＤＣｌ３中：  δＨ  １１．２５  （１Ｈ，  Ｓ），  ７．６５  （１Ｈ，Ｓ），  ６．１  （１Ｈ，  ｍ），  ５．１７  （１Ｈ，  ｍ），  ４．８０  （２Ｈ，  Ｓ），  ４．４８  （１Ｈ，  ｍ），  ３．９６  （１Ｈ，  ｍ），３．６０  （２Ｈ，  ｍ），  ３．２６  （３Ｈ，  ｓ），  ２．８０  （２Ｈ，  ｍ），  ２．２０  （２Ｈ，  ｍ）および１．１４  （３Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。
【０１９５】
（実施例３）
３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−２’−デオキシチミジンのトリホスフェート（５）の合成
２５ｍＬのフラスコ中、化合物４（０．２６８ｇ、０．７６９ｍｍｏｌ）にプロトンスポンジ（２１０ｍｇ）を添加し、ゴム隔膜を装備した。試料を高真空下で終夜乾燥させた。次いで、材料を、アルゴン雰囲気下、２．６ｍＬ（ＭｅＯ）３ＰＯに溶解した。次いで、Ａｒガス供給を装備したフラスコを氷浴に載置し、撹拌して、温度を氷点下にした。次いで、１．５当量のＰＯＣｌ３をシリンジによって一度に添加し、アルゴン雰囲気下、同じ温度で２時間撹拌した。次いで、氷浴を除去し、乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）中のトリブチルアンモニウムピロホスフェート（１．６ｇ）およびＢｕ３Ｎ（１．４５ｍＬ）からなる混合物を調製した。混合物全体を一度に添加し、１０分間撹拌した。次いで、反応混合物をＴＥＡＢ緩衝液（３０ｍＬ、１００ｍＭ）で希釈し、室温でさらに３時間撹拌した。粗生成物を回転蒸発によって濃縮し、Ｃ１８分取ＨＰＬＣ（方法：０から５分１００％Ａ、続いて、７２分間にわたって勾配最大５０％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢおよびＢ＝アセトニトリル）によって精製した。標的画分のフリーズドライ後、半純粋な生成物を、ＰＬ−ＳＡＸ分取カラムを使用するイオン交換ＨＰＬＣ（方法：０から５分１００％Ａ、次いで７０分間にわたって勾配最大７０％Ｂ、ここで、Ａ＝水中１５％アセトニトリル、Ｂ＝１５％アセトニトリル中０．８５Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液）によってさらに精製した。最終精製をＣ１８分取ＨＰＬＣによって上述した通りに行って、約２５％収率の化合物５を得た、図８を参照。
【０１９６】
（実施例４）
Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−２’デオキシシチジン（７）の合成
３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−ｄＣＴＰ（１０）の合成は、図９に従って実現した。Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシシチジン（６）（５０．０ｇ、１１２．２ｍｍｏｌ）を、２Ｌ丸底フラスコ中のＤＭＳＯ（２１０ｍＬ）に溶解した。これに、酢酸（２１０ｍＬ）および無水酢酸（９６ｍＬ）を逐次に添加し、室温で４８時間撹拌した。この期間中に、生成物への完全変換がＴＬＣによって観測された（Ｒｆ＝０．６、生成物についてＥｔＯＡｃ：ｈｅｘ／１０：１）。
【０１９７】
混合物を２つの等しい画分に分離し、それぞれを２０００ｍＬビーカーに移し、ＣＯ２ガス放出が止まるまで飽和Ｋ２ＣＯ３溶液をゆっくりと添加することによって中和した（ｐＨ８）。次いで、混合物を分液漏斗中のＥｔＯＡｃで抽出した。次いで、有機部を、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（２×１Ｌ）で、続いて蒸留水（２×１Ｌ）で洗浄し、次いで、有機部をＮａ２ＳＯ４で脱水した。
【０１９８】
次いで、有機部を回転蒸発によって濃縮した。次いで、生成物を、ピュリフラッシュ（ｐｕｒｉｆｌａｓｈ）カラムを使用するシリカゲルフラッシュ−カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：４から１：９、３カラム実行、１５ｕｍ、ＨＣ３００ｇピュリフラッシュカラムで）によって精製して、Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−２’−デオキシシチジン（７）を灰色粉末として６０％収率で得た（３４．０ｇ、Ｒｆ＝０．６、ＥｔＯＡｃ：ｈｅｘ／９：１）、図９を参照。
【０１９９】
化合物７の１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５４  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．３０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６２  ＆  ４．７０  （２Ｘｄ，  Ｊ  ＝  １１．５９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８４  ＆  ３．９９  （２Ｘｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．５９  ＆  ２．７９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１８  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９９  （ｓ，  ９Ｈ）  および０．１６  （ｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２００】
（実施例５）
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシシチジン（８）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３５ｍＬ）に溶解したＮ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−２’−デオキシシチジン（７）（２．５２６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）に、分子篩−３Ａ（１０ｇ）を添加した。混合物を３０分間撹拌した。次いで、これにＥｔ３Ｎ（５．５ｍｍｏｌ）を添加し、氷塩水浴上で２０分間撹拌した。次いで、これに、シリンジを使用してＣＨ２Ｃｌ２（７．５ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）中の１Ｍ  ＳＯ２Ｃｌ２をゆっくりと添加し、Ｎ２雰囲気下、同じ温度で２時間撹拌した。次いで、８ｍＬの乾燥ＤＭＦ中のベンゼンチオスルホン酸ナトリウム塩（１．６ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。最後に、ＥｔＳＨを添加し（０．７４ｍＬ）、室温でさらに５０分間撹拌した。反応混合物をセライト−Ｓに通して濾過し、生成物をＣＨ２Ｃｌ２で洗い流した。得られたＣＨ２ＣＨ２部を濃縮した後、これを、シリカゲルカラムを使用するフラッシュクロマトグラフィー（１：１から３：７／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物８を５４．４％収率（１．５ｇ）で得た、図９を参照。化合物８の１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５４  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６９  ＆  ４．８５  （２Ｘｄ，  Ｊ  ＝  １１．６０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８４  ＆  ３．９９  （２Ｘｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．５９  ＆  ２．７９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７５  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．２８  （ｍ，  １Ｈ），  １．２６  （ｍ，  ３Ｈ），  ０．９５  （ｓ，  ９Ｈ）  および０．１６  （ｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２０１】
（実施例６）
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−２’−デオキシシチジン（９）
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−（エチルジチオメチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシシチジン（８、１．５０ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのＴＨＦに溶解した。次いで、ＴＨＦ（３．３ｍＬ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦを、窒素雰囲気下、氷冷温度で添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。次いで、１ｍＬのＭｅＯＨを添加することによって反応物をクエンチし、１０分後に回転蒸発によって溶媒を除去した。生成物を、勾配１：１から１：９／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、化合物９を得た（０．７８ｇ、６５％収率、１：９／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ中でＲｆ＝０．６）、図９を参照。化合物９の１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ８．０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８０  ＆  ４．９０  （２Ｘｄ，  Ｊ  ＝  １１．６０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．００  ＆  ３．８５  （２Ｘｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．５９  ＆  ２．７９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４０  （ｍ，  １Ｈ）および１．３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２０２】
最後に、化合物１０の合成を、化合物９から、化合物５の合成において記述されている標準的な合成プロトコールに従って、実現した（図８を参照）。
【０２０３】
（実施例７）
標識されたヌクレオチドの合成は、図１０および図１１において示されている合成経路に従って、実現することができる。図１０は、標識されたｄＴ中間体の合成に特異的であり、他の類似体は同様に合成され得る。
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（１２）の合成
【０２０４】
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１１、２５．０ｇ、５３．４ｍｍｏｌ）を、２口丸底フラスコ中の乾燥ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解した。反応フラスコを、Ａｒガス充填バルーンでフラッシュした。次いで、これに、新しく開けた、真空乾燥したテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６．１６ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（２．３１６ｇ、１２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次に、Ｎ−トリフルオロアセチル−プロパルギルアミン（２３．９９ｇ、１５７．８ｍｍｏｌ、２．９当量）およびＥｔ３Ｎ（１４．７ｍＬ、１０５．５ｍｍｏｌ）を逐次に添加した。混合物を室温で３．０時間撹拌し、反応完了をＴＬＣによって確認した（生成物についてＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ／３：２中でＲｆ＝０．５）。
【０２０５】
次いで、溶媒を回転蒸発によって除去した。得られた粗生成物を５００ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解し、分液漏斗に移した。次いで、有機部を、飽和ＮａＨＣＯ３（２×４００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×４００ｍＬ）溶液でそれぞれ洗浄した。次いで、ＥｔＯＡｃ部を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。Ｎａ２ＳＯ４塩を濾過除去した後、ロータリーエバポレーターを使用して濾液を濃縮した。次いで、これを、３×４０ｇｍシリカゲルと結合した後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（１：１  Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃから２：３  Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ、２００ｇｍ、１５ｕｍ  ＨＰピュリフラッシュカラム、３カラム実行）によって精製して、２１．９９４ｇの１２（８３．８８％収率）を得た、図１０を参照。
【０２０６】
化合物１２の１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＦ−ｄ７）：  δＨ  １１．６５  （ｂｒｓ，  １Ｈ），  １０．１５  （ｂｒｓ，  １Ｈ），  ８．１５  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  Ｈ６），  ６．３７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９９  Ｈｚ，  １Ｈ，  Ｈ１’），  ５．４２  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３７  （ｂｒｓ，  ２Ｈ，  プロパルギルアミン基のＮＨ−ＣＨ２について），  ４．００  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８４−３．９７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３０  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈ２’），  ２．２０  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈ２’），  ０．９７  （ｓ，  ９Ｈ，  ３Ｘ−ＣＨ３，  ＴＢＤＭＳ）および０．１９  （ｓ，  ６Ｈ，  ２Ｘ  ＣＨ３，  ＴＢＤＭＳ）  ｐｐｍ。
【０２０７】
（実施例８）
５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル）−２’−デオキシウリジン（１３）の合成
化合物１２（２１．９９ｇ、４４．７７ｍｍｏｌ）を、１０００ｍＬ丸底フラスコ中のＤＭＳＯ（９０ｍＬ）に溶解した。次いで、これに、ＡｃＯＨ（４０ｍＬ）および無水酢酸（１３２ｍＬ）を逐次に添加し、室温で４８時間撹拌した。反応完了をＴＬＣによって確認した（Ｒｆ＝０．５；生成物についてＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）。
【０２０８】
次いで、反応混合物を２，０００ｍＬビーカーに移し、ＣＯ２ガスの放出が止むまで飽和Ｋ２ＣＯ３によって中和した（約ｐＨ８．０）。次いで、混合物を分液漏斗に移し、抽出した（２×５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２）。次いで、合わせた有機部を飽和ＮａＨＣＯ３（１×５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。Ｎａ２ＳＯ４を濾過除去した後、有機部を回転蒸発によって濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／７：３から１：１）によって精製して、１２．３８ｇの化合物１３（約５０％収率）を生成した、図１０を参照。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５；Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１、化合物１３の１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δＨ  １１．６９  （ｓ，  １Ｈ），  １０．０１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９３  （ｓ，  １Ｈ，  Ｈ６），  ６．０７  （ｍ，  １Ｈ，  Ｈ１’），  ４．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３８  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０７  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８６  （ｓ，  ９Ｈ）および０．０８  （ｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２０９】
化合物１４、１５および１６の合成は、化合物５および１０について記述されている関連ステップの合成プロトコールに従って、実現することができる。他のＮ−トリフルオロアセチル−アミノプロパルギル核酸塩基の合成は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０１７，３３８号［３８］のように記述されている。アミノプロパルギル核酸塩基を生成するためのＮ−トリフルオロアセチル基の除去は、温和な条件下、加溶媒分解によってもたらすことができる［４５］。
【０２１０】
他方で、開裂可能なリンカー合成は、１，４−ブタンジオールから出発して、図１１において示されている通りに実現することができ、実施例９において記述されている。
【０２１１】
（実施例９）
４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−ブタン−１−Ｏ−（メチルチオメチル）、１８の合成
１Ｌフラスコ中の１００ｍＬの乾燥ピリジンに溶解した１８．３ｇの１，４−ブタンジオール、１７（１８．３ｇ、２０３．１３ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、氷浴上で氷点下温度にした。これに、シリンジでｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（ＴＢＤＰＳＣｌ、１９．３４ｇ、７０．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応フラスコを、氷浴の除去により室温まで加温し、室温で終夜撹拌を続けた。次いで、溶媒を回転蒸発によって除去し、シリカゲルカラムを使用するフラッシュクロマトグラフィー（７：３から１：１／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−ブタン−１−オールを得た（１３．７ｇ、５９．５％収率、１：１／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃでＲｆ＝０．７、１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （４Ｈ，  ｍ），  ７．４０  （４Ｈ，  ｍ），  ３．７５  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．７０  （４Ｈ，  ｍ）および１．０９  （９Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。得られた生成物のうち、６．０７ｇ（１８．５ｍｍｏｌ）を９０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した、図１１を参照。次いで、これに、酢酸（１５ｍＬ）および無水酢酸（５０ｍＬ）を添加した。混合物を室温で２０時間撹拌した。次いで、これを分液漏斗に移し、３００ｍＬの蒸留水で、同じ体積のＥｔＯＡｃと分配することによって洗浄した。次いで、ＥｔＯＡｃ部を１，０００ｍＬビーカーに移し、飽和Ｋ２ＣＯ３溶液で中和した。水性部を分配することによって除去し、次いで、ＥｔＯＡｃ部を蒸留水（３×３００ｍＬ）でさらに洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。次いで、ＥｔＯＡｃ部を濃縮し、シリカゲルカラム上でのフラッシュクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／９７：３から９０：１０）によって精製して、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−１−Ｏ−（メチルチオメチル）−ブタン、１８（５．１５ｇ、７１．７％収率、９：１／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ中でＲｆ＝０．８）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （４Ｈ，  ｍ），  ７．４０  （６Ｈ，  ｍ），  ４．６２  （２Ｈ，  ｓ），  ３．７０  （２Ｈ，  ｍ），  ３．５０  （２Ｈ，  ｍ），  ２．１５  （２Ｈ，  ｓ），  １．７０  （４Ｈ，  ｍ）および１．０８  （９Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。
【０２１２】
実施例１０
化合物１９の合成
化合物１８（２．０ｇ、５．１５ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、１０ｇの分子篩−３Ａおよび０．７８ｍＬのＥｔ３Ｎ（５．６６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、Ｎ２ガス下、室温で３０分間撹拌した。次いで、フラスコを氷浴に載置して、温度を氷点下にした。次いで、これに、７．７ｍＬの１Ｍ  ＳＯ２Ｃｌ２／ＣＨ２Ｃｌ２溶液（７．７ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、Ｎ２下で１時間撹拌した。次いで、氷浴を除去し、８ｍＬのＤＭＦ中のベンゼンチオスルホン酸−Ｎａ塩（１．６ｇ、８．２４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。次いで、７ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の４−メルカプトフェニル酢酸（１．７３ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、２時間撹拌した。次いで、粗試料全体をセライト−Ｓに通して濾過し、生成物をＥｔＯＡｃによって洗い流した。次いで、ＥｔＯＡｃ抽出物を回転蒸発によって濃縮し、シリカゲルカラム（１：１から３：７／Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）上で精製して、１．１９ｇの化合物１９を４３％収率で得た、図１１を参照、Ｒｆ＝０．５Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／３：７。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  ７．６５  （４Ｈ，  ｍ），  ７．５５  （２Ｈ，  ｍ），  ７．４５  （６Ｈ，  ｍ），  ７．２０  （２Ｈ，  ｓ），  ４．８０  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６５  （４Ｈ，  ｍ），  ３．５０  （２Ｈ，  ｍ），  １．６０  （４Ｈ，  ｍ）および１．０９  （９Ｈ，  ｓ）  ｐｐｍ。
【０２１３】
実施例１１
化合物２０の合成
２０ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した化合物１９（０．６ｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＳＣ（０．４２６ｇ、１．５当量）およびＥｔ３Ｎ（０．２３ｍＬ）により室温で処理し、窒素雰囲気下で１．５時間撹拌した。次いで、１１−アジド−３，６，９−トリオキサデカン−１−アミン（２．０当量）およびＥｔ３Ｎ（２．０当量）からなる混合物を、５ｍＬのＤＭＦ中で調製した。溶液全体を反応混合物に一度に添加し、１時間撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去し、勾配０から１０％ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨを使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、化合物２０を３６％収率で得た（０．２９７ｇ、Ｒｆ＝０．８、１０％ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２）、図１１を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＭｅＯＨ−ｄ４）：  δＨ  ７．７０  （４Ｈ，  ｍ），  ７．５５  （２Ｈ，  ｍ），  ７．４０  （６Ｈ，  ｍ），  ７．４５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８５  （２Ｈ，  ｓ），  ３．６５−３．３０  （２２Ｈ，  ｍ），  １．６５  （４Ｈ，  ｍ）および１．０９  （９Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。
【０２１４】
次いで、生成物２０（０．２９７ｇ）をフラスコ中の７ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解し、氷浴に載置して、窒素雰囲気下、氷点下温度にした。次いで、０．６ｍＬのＴＨＦ中１Ｍ  ＴＢＡＦを滴下添加し、氷冷温度で３時間撹拌した。混合物を１ｍＬのＭｅＯＨでクエンチし、揮発物を回転蒸発によって除去し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、１６５ｍｇの生成物２１を得た、図１１を参照、１Ｈ  ＮＭＲ  （ＭｅＯＨ−ｄ４）：  δＨ  ７．５５  （２Ｈ，  ｍ），  ７．２５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．８５  （２Ｈ，  ｓ），  ３．７５−３．３０  （２２Ｈ，  ｍ）および１．５０  （４Ｈ，  ｍ）  ｐｐｍ。この生成物を、クリックケミストリーを使用してアルキン置換色素と、および活性化剤としてＣＤＩを使用してヌクレオチドとカップリングして、化合物２２を得ることができる。
【０２１５】
安定化ｇｅｍ−ジメチル基が開裂可能なリンカーのα−炭素と結合している、開裂可能なリンカーの別の変異体は、図１２に従って実現することができる。
【０２１６】
（実施例１２）
別の態様では、開裂可能なリンカーは、ジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基と隣接し、柔軟なエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）に結合した化合物３０であり得る。リンカーは、カルバメート基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）を介してＰＡ−ヌクレオチド（例えば、化合物３３）に結合している。そのような場合に得られるヌクレオチド類似体は、図１３に従って合成され得る、化合物３５（ｄＵＴＰ類似体）のようになり得る。他のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの類似体）は、反応シーケンスの最後のステップにおいてＰＡ−ヌクレオチド３３を適切なＰＡ−ヌクレオチド類似体で置き換えることによって同様に合成することができる。
【０２１７】
実施例１３
化合物２８の合成
化合物１８（１５．５３ｇ、４０ｍｍｏｌ）（化合物１８の合成については実施例９を参照）を、丸底フラスコ中の４５０ｍＬの乾燥ジクロロメタンに溶解した。分子篩（３Å、８０ｇ）およびトリエチルアミン（５．６ｍＬ）を添加し、反応混合物を、窒素雰囲気下、０℃で０．５時間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中１Ｍ、６４ｍＬ）をシリンジによってゆっくりと添加し、０℃温度で１．０時間撹拌した。次いで、氷水浴を除去し、２０ｍＬの無水ＤＭＦ中のチオトシル酸カリウム（１０．９ｇ、４８．１ｍｍｏｌ）の溶液を一度に添加し、室温で２０分間撹拌した。次いで、反応混合物を、２Ｌ丸底フラスコ中の２０ｍＬのＤＭＦに溶解した３−メルカプト−３−メチルブタン−１−オール（４．４ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）に注ぎ入れた。得られた混合物を室温で０．５時間撹拌し、セライトに通して濾過した。生成物を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を分液漏斗中の蒸留水で洗浄し、続いて、粗生成物を回転蒸発によって濃縮した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを移動相として使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによる精製後、生成物（２８）を２６％収率（５．６ｇ）で得た、図１３を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．６７−７．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３７−７．４７  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．８１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５５，  ２Ｈ），  １．９０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．５８−１．７７  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３４  （ｓ，  ６Ｈ）および１．０７  （ｓ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２１８】
実施例１４
化合物２９の合成
化合物２８（５．１ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）を、５００ｍＬ丸底フラスコ中の１００ｍＬの無水ピリジンに溶解した。この溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３．３６ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応物を、窒素雰囲気下、室温で１．０時間撹拌した。次いで、反応混合物を、２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（７．６ｍＬ、５１．８ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（５０ｍＬ）からなる溶液に注ぎ入れた。混合物を室温で１．０時間撹拌し、揮発物を回転蒸発によって除去した。得られた粗生成物を、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２／９．５：０．５を使用するシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純粋化合物２９（４．４ｇ、６５％収率）を得た、図１３を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．６３−７．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３４−７．４４  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．７６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６０  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．４９−３．５１  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．３１−３．３９  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８８  （ｍ，  ２Ｈ），１．９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．５７−１．７３  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３１  （ｓ，  ６Ｈ）および１．０３  （ｓ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２１９】
実施例１５
化合物３１の合成
化合物２９（０．９４ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解し、窒素雰囲気下、ＴＨＦ（１．６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）中の１Ｍ  ＴＢＡＦにより０℃で処理した。反応混合物を０℃で２．０時間撹拌し、この時間中に、ＬＣ−ＭＳによりＴＢＤＰＳ保護基の完全な除去を確認した。溶媒を回転蒸発によって除去した後、生成物をＣ１８フラッシュカラム上でのフラッシュクロマトグラフィー（勾配：５０分間にわたって０〜１００％Ｂ、ここで、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢおよびＢ＝アセトニトリル）によって精製した。標的画分を合わせ、凍結乾燥して、純粋化合物３０（０．２８４ｇ、４７％収率）を得た、ＭＳ（ＥＳ＋）（Ｍ＋Ｈ）の計算値４２９．２１、観測値ｍ／ｚ４２９．１８。次に、化合物３０（０．２１７ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、１３ｍＬの乾燥アセトニトリルに溶解した。この溶液に、ＤＩＰＥＡ（９７．７ｕＬ、０．５６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−ＮＨＳエステル（２７３．６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を０℃温度で添加し、同じ温度で２．０時間撹拌した。次いで、生成物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー、１：１から１：９／ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ勾配によって精製して、半純粋な生成物が生じ、これを、２〜５％／ＭｅＯＨ−ＣＨ２Ｃｌ２勾配を使用してさらに精製して、化合物３１（０．２４５ｇ、７４％収率）を得た、図１３を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ），  ７．５９  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ），  ７．３２  （２Ｈ，  ｍ），  ７．２４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．６９  （２Ｈ，  ｓ），  ４．３５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．１６  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０９  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６０−３．４５  （１２Ｈ，  ｍ），  ３．３６−３．２６  （４Ｈ，  ｍ），  １．８２  （２Ｈ，  ｍ），  １．６０  （４Ｈ，  ｍ）および１．２２  （６Ｈ，  ｓ）  ｐｐｍ。
【０２２０】
実施例１６
化合物３２の合成
化合物３１（９３ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）を、磁気棒および窒素ガス源を装備した丸底フラスコ中の乾燥アセトニトリル（１２．０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＤＳＣ（５６ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３７．４μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を逐次に添加し、得られた混合物を室温で５．０時間撹拌した。追加のＤＳＣ（４８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（３７．４μＬ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１５．０時間撹拌を続け、この時間中に、ＴＬＣは、活性化ＮＨＳエステルへの完全変換を示した。ヘキサン−酢酸エチル（３：７から１：９）勾配を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー精製の後、生成物３２を濃厚な油として得（５９ｍｇ、５３％収率）、次のステップにおいて使用した、図１３を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５３  Ｈｚ），  ７．５３  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ），  ７．３３  （２Ｈ，  ｍ），  ７．２４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．６９  （２Ｈ，  ｓ），  ４．３４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．２８  （２Ｈ，  ｍ），  ４．１６  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０９  （２Ｈ，  ｍ），  ３．５７−３．４６  （１０Ｈ，  ｍ），  ３．３５−３．２６  （４Ｈ，  ｍ），  ２．７５  （４Ｈ，ｓ），  １．７４  （４Ｈ，  ｍ），  １．６２  （２Ｈ，  ｍ）および１．２３  （６Ｈ，  ｓ）  ｐｐｍ。
【０２２１】
実施例１７
化合物３４の合成
化合物３３（１０μｍｏｌ）（参考文献ＵＳ２０１３／０１３７０９１Ａ１に従って合成したもの）のアリコートを、１５ｍＬ遠心分離チューブ中で凍結乾燥乾固した。次いで、これを、６０μｍｏｌのＤＩＰＥＡを加えた１．０ｍＬの乾燥ＤＭＦに再懸濁した。別個のチューブ中、化合物３２（３０μｍｏｌ、３当量）を３．３３ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、一度にすべて添加した。手で厳密に振とうすることによって反応物をよく混合し、室温で１２時間シェーカーに載置した。次に、ピペリジン（０．３３ｍＬ）を添加し、室温で３０分間振とうを続けた。次いで、生成物を、Ｃ１８カラムを使用するＨＰＬＣ（勾配：４０分間にわたって０〜７０％Ｂ、ここで、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢおよびＢ＝アセトニトリル）によって精製した。標的画分の凍結乾燥後、生成物３４を７３．３％収率（７．３３ｕｍｏｌ）で得た、図１３を参照。
【０２２２】
実施例１８
化合物３５の合成
化合物３４（４．９μｍｏｌ）のアリコートを、１５ｍＬ遠心分離チューブ中の１．０ｍＬの蒸留水および０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（０．４９ｍＬ）に溶解した。別個のチューブ中、１０ｍｇの５−ＣＲ６Ｇ−ＮＨＳエステル（１７．９μｍｏｌ）を０．９ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。次いで、この溶液を反応混合物に一度にすべて添加し、室温で６．０時間撹拌した。次いで、反応混合物を５０ｍＭ  ＴＥＡＢ（２５ｍＬ）で希釈した。生成物をＨＰＬＣ  Ｃ１８（勾配：７０分間にわたって０〜６０％Ｂ）によって精製した。ＨＰＬＣによる標的画分の凍結乾燥後、化合物３５を得（２．１５μｍｏｌ、約９８％純度で４４％収率）、構造をＭＳ（ＥＳ＋）によって確認した：（Ｍ−Ｈ）Ｃ５８Ｈ７６Ｎ１０Ｏ２５Ｐ３Ｓ２−の計算値、１４６９．３６、測定値ｍ／ｚ  １４６９．６７、図１３を参照。
【０２２３】
同様に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの類似体を、化合物３５について記述されている同様の手順に従って合成し、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳによって特徴付けて、Ａ−シリーズのフルセット（９８、１００、１０１および１０２、図４５）を得た。ｄＡＴＰ類似体については、（Ｍ−Ｈ）Ｃ６６Ｈ８３Ｎ１２Ｏ２３Ｐ３Ｓ２の計算値、１，５６８．４３４８、測定値ｍ／ｚ  １，５６８．４４００；ｄＣＴＰ類似体については、（Ｍ−Ｈ）Ｃ５２Ｈ６５Ｎ１１Ｏ３０Ｐ３Ｓ４の計算値、１，５４５．２０７０、測定値ｍ／ｚ  １，５４５．２０８０、およびｄＧＴＰ類似体については、（Ｍ−Ｈ）Ｃ６６Ｈ９３Ｎ１２Ｏ２７Ｐ３Ｓ４の計算値、１，７０６．４３６９、測定値ｍ／ｚ  １，７０６．４４００。別の態様では、本発明は、開裂可能なジスルフィドがｇｅｍ−ジメチル基と隣接し、リンカーが尿素基（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−）を介してＰＡ−ヌクレオチドに結合した、ｄＡＴＰ類似体のための、化合物４３のように開裂可能なリンカーを有するヌクレオチドに関与する。化合物は、図１４（ｄＡＴＰ類似体について）に従って合成することができる。他のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰの類似体）は、反応シーケンスの最後のステップにおいて４２を適切なＰＡ−類似体によって置き換えて同様に合成することができる。
【０２２４】
実施例１９
化合物３７の合成
撹拌子を装備した１Ｌ丸底フラスコ中、５−（ｆｍｏｃ−アミノ）−１−ペンタノール（３６、２０ｇ、６２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２５６ｍＬ）に室温で溶解した。溶液に、ＡｃＯＨ（４３ｍＬ）およびＡｃ２Ｏ（１４５ｍＬ）を逐次に添加した。フラスコをゴム隔膜で閉じ、Ｎ２下に置き、室温で２０時間撹拌した。反応完了をＴＬＣによって確認した。次いで、反応混合物を３Ｌビーカーに移し、フラスコを水で洗浄した。ビーカーを氷浴中で冷却し、反応混合物を５０％飽和Ｋ２ＣＯ３（４００ｍＬ）で３０分間中和した。混合物を分液漏斗に移し、ＥｔＯＡｃ（２×７００ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相を５０％飽和Ｋ２ＣＯ３（２×４００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮した。粗製油をシリカゲルクロマトグラフィー（２０分間にわたって０から２０％Ｂ、Ａ＝Ｈｅｘ、Ｂ＝ＥｔＯＡｃ）によって精製した。画分の収集および濃縮により、化合物３７（１７．７７ｇ、７５％）を白色固体として得た、図１４を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３３，  ２Ｈ），  ７．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８３，  ２Ｈ），  ７．４４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３３，  ２Ｈ），  ７．３５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５８，  ２Ｈ），  ４．８０３  （ｂｓ，  １Ｈ），  ４．６４３  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８２，  ２Ｈ），  ４．２４  （ｔ，  Ｊ＝  ６．８２，  １Ｈ），  ３．５４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３２，  ２Ｈ），  ３．２５１  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１６７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６５７−１．５５０  （ｍ，  ４Ｈ）および１．４４６−１．４４１  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２２５】
実施例２０
化合物３８の合成
化合物３７（２．７７ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を、Ｎ２下、撹拌子および隔膜を装備した２５０ｍＬ丸底フラスコ中のＤＣＭ（６０ｍＬ）に溶解した。フラスコに、トリエチルアミン（３．０ｍＬ、２１．６ｍＬ、３当量）および４Å分子篩（２８ｇ）を添加した。懸濁液を室温で１０分間、続いて、氷浴中で３０分間撹拌した。フラスコにＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中１Ｍ溶液、１４．４ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応混合物を氷浴中で１時間撹拌した。反応進行を、ＴＬＣ（１：１  Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）を介して出発材料の消失によってモニターした。ＳＯ２Ｃｌ２活性化が完了したら、ＤＭＦ（６０ｍＬ）中のチオトシル酸カリウム（２．４５ｇ、１０．８ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を迅速に添加した。反応混合物を室温に１時間ゆっくりと加温させた。次いで、フラスコに３−メルカプト−３−メチルブタノール（１．８ｍＬ、１４．４ｍｍｏｌ、２当量）を投入し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、４０℃にて真空中で濃縮した。ＦＣＣ（３０分間にわたって０から５０％Ｂ、Ａ＝Ｈｅｘ、Ｂ＝ＥｔＯＡｃ）による精製により、３８（４８２ｍｇ、１４％）を黄色油として得た、図１４を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８１，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３２，  ２Ｈ），  ７．４０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３２，  ２Ｈ），  ７．３１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３２，  ２Ｈ），  ４．８７  （ｂｓ，  １Ｈ），  ４．７９  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８４，  ２Ｈ），  ４．２１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８４  １Ｈ），  ３．７８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８４，  ２Ｈ），  ３．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３５，  ２Ｈ），  ３．２０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８８  （ｔ，  Ｊ ＝  ６．８４，  ２Ｈ），  １．６４−１．５０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４２−１．３９  （ｍ，  ２Ｈ）および１．３２  （ｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２２６】
実施例２１
化合物３９の合成
化合物３８（１３５ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬ丸底フラスコ中、真空下で２時間乾かした。真空を除去し、フラスコをＮ２下に置いた。化合物３８をＤＭＦ（３．１ｍＬ）に溶解し、フラスコにＤＩＰＥＡ（９６μＬ、０．５５ｍｍｏｌ、２当量）を投入した。溶液を１０分間撹拌し、次いで、ＤＳＣ（１２０ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ、１．７当量）を固体として１回用量で添加した。反応混合物を２時間撹拌させ、ＴＬＣ（１：１  Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）を介して完了を検証した。次いで、反応物を３５℃にて真空中で濃縮し、高真空下で１時間さらに乾燥させた。粗製油をシリカゲルにロードし、ＦＣＣ（１４分間にわたって０から５０％Ｂ、Ａ＝ｈｅｘ、Ｂ＝ＥｔＯＡｃ）によって精製した。画分をＴＬＣによって検査し、濃縮して、化合物３９（１３３ｍｇ、７６％）を油として得、これは、時間とともに結晶化した、図１４を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５８，  ２Ｈ），  ７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５８，  ２Ｈ），  ７．４２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５８，  ２Ｈ），  ７．３３  （ｔ，  Ｊ＝  ７．５８，  ２Ｈ），  ４．８７  （ｂｓ，  １Ｈ），  ４．８０  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４８  （ｔ，  Ｊ ＝  ７．０７，  ２Ｈ），  ４．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８２，  ２Ｈ），  ４．２４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０７，  １Ｈ），  ３．５８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３２，  ２Ｈ），  ３．２２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８３  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．０８  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６４９−１．５６２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４４３−１．３９０  （ｍ，  ２Ｈ）および１．３６６  （ｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２２７】
実施例２２
化合物４０の合成
２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（９２μＬ、６３５μｍｏｌ、１０当量）およびトリエチルアミン（１７６μＬ、１２７０μｍｏｌ、２０当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦ（２．７ｍＬ）中の６−ＲＯＸ、ＮＨＳエステル（４０ｍｇ、６４ｕｍｏｌ、１当量）の別個の溶液も調製した。６−ＲＯＸ、ＮＨＳエステル溶液を、ジアミンを含有する急速撹拌溶液に滴下添加した。反応物を２時間撹拌し、進行をＣ１８  ＨＰＬＣ−ＭＳ（１０分間にわたって０から１００％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によってモニターした。完了したら、反応物を、分取Ｃ１８−ＨＰＬＣ（５０分間にわたって１０から１００％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）を介して精製した。画分を合わせ、凍結乾燥して、化合物４０（２０ｍｇ、４８％）を紫〜赤色の固体として得た、図１４を参照。ＭＳ（ＥＳ−）（Ｍ−Ｈ）Ｃ３９Ｈ４５Ｎ４Ｏ６の計算値６６４．３３、測定値ｍ／ｚ  ６６４．５６。
【０２２８】
実施例２３
化合物４１の合成
化合物４０（１０ｍｇ、１５μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（８μＬ、４５μｍｏｌ、３当量）を投入した。別個に、化合物３９（２８ｍｇ、４５μｍｏｌ、３当量）をＤＭＦ（０．２１ｍＬ）に溶解した。化合物３９の溶液を、化合物４０を加えた溶液に、迅速に添加した。反応物をシェーカープレートに１．５時間載置し、その時点で、分析的Ｃ１８−ＨＰＬＣ（１０分間にわたって０〜１００％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５．２、Ｂ＝ＭｅＣＮ）は、残りの化合物４０を明らかにした。追加の化合物３９（１３ｍｇ、２１μｍｏｌ、１．４当量）を添加し、反応物をさらに１時間シェーカープレートに載置した。追加の分析なしに、ピペリジン（３００μＬ）を添加し、１０分間反応させた。次いで、反応混合物を分取Ｃ１８−ＨＰＬＣ（５０分間にわたって１０〜１００％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）に直接注入した。画分を収集し、凍結乾燥して、化合物４１（４．７ｍｇ、３４％）を紫〜赤色の固体として得た、図１４を参照。ＭＳ（ＥＳ＋）（Ｍ＋Ｈ）Ｃ５１Ｈ６８Ｎ５Ｏ９Ｓ２＋の計算値９５９．４５、測定値ｍ／ｚ  ９５９．７６。
【０２２９】
実施例２４
化合物４３の合成
５ｍＬ試料バイアルに、アミン４１（２ｍｇ、２μｍｏｌ）、ＤＳＣ（０．８ｍｇ、３μｍｏｌ、１．５当量）、ＤＩＰＥＡ（０．７μＬ、４μｍｏｌ、２当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．７ｍＬ）を投入した。反応混合物を１時間シェーカーに載置した。反応進行をＣ１８−ＨＰＬＣ（１０分間にわたって０から１００％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５．２、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によってモニターした。次に、０．１  Ｎａ２ＨＰＯ４（３．３ｍＬ）中のヌクレオチド４２（６ｕｍｏｌ、３当量、参考文献ＵＳ２０１３／０１３７０９１Ａ１）を添加し、反応混合物を終夜シェーカーに載置した。反応物を次に水で希釈し、分取Ｃ１８−ＨＰＬＣ（７０分間にわたって０から６０％Ｂ、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＭｅＣＮ）によって精製して、表題化合物４３（０．５μｍｏｌ、２５％）を得た、図１４を参照。ＭＳ（ＥＳ−）（Ｍ−Ｈ）Ｃ６７Ｈ８７Ｎ１３Ｏ２２Ｐ３Ｓ２の計算値１５８１．４７、測定値ｍ／ｚ  １５８１．６５。
【０２３０】
（実施例２５）
別の態様では、開裂可能なリンカーは、リンカーが尿素官能基を介してＰＡ−ヌクレオチドに繋がれ、ジスルフィドが２つの炭素リンカーによって色素と接続している、化合物４５であり得る。そのような場合に得られるヌクレオチド類似体は、図１５に従って合成され得る、化合物４９（ｄＧＴＰ類似体）のようになり得る。他のヌクレオチド類似体（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰの類似体）は、反応シーケンスの第３のステップにおいてヌクレオチド４６を適切なＰＡ−ヌクレオチド類似体で置き換えることによって同様に合成することができる。
【０２３１】
実施例２６
化合物４４の合成
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、ＣＨ２Ｃｌ２中の３７（１．００ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）、分子篩およびトリエチルアミン（０．７２ｍＬ、５．１８ｍｍｏｌ）を投入した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、０℃に冷却した。塩化スルフリル（４．４０ｍＬ、４．４０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、結果として生じた混合物を０℃で１時間撹拌した。ヘキサン中２０％酢酸エチルを使用するＴＬＣ分析は、出発材料の消失を示し、Ｎ’，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中のベンゼンチオスルホン（ｂｅｎｚｅｎｅｔｈｉｏｎｏｓｕｌｆｏｎｉｃ）酸ナトリウム塩（６４８ｍｇ、３．８９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で一度に添加し、反応混合物を室温で２０分間撹拌した。次に、Ｎ−（トリフルオロアセトアミド）エタンチオール（８９６ｍｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を一度に添加し、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。分子篩を濾過除去し、溶媒を減圧下で除去し、残留物を、０〜２０％酢酸エチル−ヘキサン勾配を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーを介して精製して、表題化合物４４（５２９ｍｇ、３９％）を黄色がかった油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）、図１５を参照：  δＨ  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．５０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４０−７．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３０−７．２５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．８２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４２  （ｄ，  ２Ｈ），  ４．２１−４．２０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７０−３．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５９−３．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１７−３．１６  （ｍ，  ２Ｈ）および１．６４−１．４０  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２３２】
実施例２７
化合物４５の合成  
磁気撹拌子を装備した２５ｍＬ丸底フラスコに、カルバメート４４（１００ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）および１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジン溶液を室温で投入した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次いで、アセトニトリル（５ｍＬ）で希釈し、０〜３０％アセトニトリル−ＴＥＡＢ緩衝液勾配を使用する逆相分取ＨＰＬＣを介して精製して、表題化合物４５（１１ｍｇ、２０％）を透明油として得た、図１５を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δＨ  ４．９０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．６４−３．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９８−２．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８６−２．８２  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６６−１．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５０−１．４８  （ｍ，  ２Ｈ）および１．３３−１．３０  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２３３】
実施例２８
化合物４７の合成  
５ｍＬ試料バイアルに、アミン４５（０．９６０ｍｇ、３．０μｍｏｌ）、ＤＳＣ（１．１５ｍｇ、４．５μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６０μＬ、６．０μｍｏｌ）を投入し、室温で２時間振とうした。次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、２００μＬ（参考文献ＵＳ２０１３／０１３７０９１Ａ１）中の３当量のヌクレオチド４６からなる溶液を添加した。反応混合物を１２時間シェーカーに載置した。反応物を次にＴＥＡＢ緩衝液で希釈し、０〜３０％アセトニトリル：５０ｍＭ  ＴＥＡＢ緩衝液勾配を使用する分取逆相ＨＰＬＣによって精製して、表題化合物４７を（１４％収率で）得た、図１５を参照。ＭＳ（ＥＳ−）：（Ｍ−Ｈ）Ｃ２６Ｈ３７Ｆ３Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ２−の計算値、９５９．１０、測定値ｍ／ｚ  ９５９．２４。
【０２３４】
実施例２９
化合物４８の合成
ヌクレオチド４７（１μｍｏｌ）をＴＥＡＢ緩衝液（２００μＬの５０ｍＭ水溶液）に溶解し、２００μＬの水酸化アンモニウム（３０％水溶液）により室温で５０分間処理した。次いで、反応物をＴＥＡＢ緩衝液（１ｍＬの１Ｍ溶液）および蒸留水（５ｍＬ）で希釈した。得られた混合物を、Ｃ１８−ＨＰＬＣ、０〜３０％アセトニトリル：５０ｍＭ  ＴＥＡＢ緩衝液勾配を介して精製して、表題化合物４８（０．４０μｍｏｌ、９０％）を得た、図１５を参照。ＭＳ（ＥＳ−）：（Ｍ−Ｈ）Ｃ２４Ｈ３８Ｎ１０Ｏ１５Ｐ３Ｓ２−の計算値、８６３．１２、測定値ｍ／ｚ  ８６３．４５。
【０２３５】
実施例３０
化合物４９の合成
化合物４８（０．０４μｍｏｌ）のアリコートを、３ｍＬエッペンドルフチューブ中の０．１ｍＬの蒸留水および０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（２０μＬ）に溶解した。別個のチューブ中、１ｍｇのＲＯＸ−ＮＨＳエステル（０．１６８μｍｏｌ）を４８μＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。次いで、この溶液を、反応混合物に一度にすべて添加し、室温で６．０時間撹拌した。次いで、反応混合物を５０ｍＭ  ＴＥＡＢ（５ｍＬ）で希釈した。生成物を、（０〜６０％Ｂ勾配、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリル）を使用するＣ１８−ＨＰＬＣによって精製した。標的画分の凍結乾燥後に化合物４９（０．０３μｍｏｌ、３０％収率）を得た、図１５を参照。ＭＳ（ＥＳ−）（Ｍ−Ｈ）、Ｃ５７Ｈ６７Ｎ１２Ｏ１９Ｐ３Ｓ２−の計算値１３８０．３３、測定値１３８０．２５。
【０２３６】
正規のジスルフィド連結したヌクレオチドとの開裂比較
本明細書で開示される、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド（−ＯＣＨ２−ＳＳ−）リンカーを含有するヌクレオチドのこの新たなクラスを、正規のジスルフィド（−ＳＳ−）連結したヌクレオチド（例えば、米国特許出願第２０１３／０１３７０９１号［４６］において記述されているヌクレオチド５０）と、還元ホスフィンベースの開裂条件下で比較した。これらの２つのクラスのヌクレオチドにおいてはっきりとした差異が観測された。標識されたヌクレオチド５０を１０当量のＴＣＥＰに６５℃で曝露すると、ＬＣ−ＭＳによって同定された予測される生成物５１とともに化合物５２を含むいくつかの副産物を発生させた（図１６および図１７、５分曝露）。不要な副産物の割合は、時間とともに増大した（図１８、１５分曝露）。同一の開裂条件下で、オキシメチレンジスルフィド連結したヌクレオチド３５は、所望の開裂生成物、化合物５３および５４をきれいに生成した。リンカーのメチレンチオールセグメント（−ＣＨ２ＳＨ）は、ジスルフィド基の開裂時にヌクレオチドから完全に排除された（図２０および図２１、５分曝露）。加えて、ＴＣＥＰへの長期曝露は、ＬＣ−ＭＳによって明らかにされた通り、さらなる副産物を発生させなかった（図２２、１５分曝露）。したがって、この新たなクラスのヌクレオチドは、図４に示される通りのチオール基の存在に固有の副反応を排除することにより、ＤＮＡの合成による配列決定（ＳＢＳ）の使用において重大な利点を提供し得る。
【０２３７】
実施例３１
化合物５７の合成
別の実施形態では、ヌクレオチドの３’−ＯＨ基を−ＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔまたは−ＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅでキャッピングすることができ、フルオロフォア色素は、前述した開裂可能な−ＯＣＨ２−ＳＳ−リンカーの１つを介して核酸塩基に結合している（例えば、化合物３５、４３および４９のように）。
【０２３８】
３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔおよび−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅを有するＰＡヌクレオチドの合成は、それぞれ図１０および図２２に従って実現することができる。３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅ類似体の合成の、３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔ（図１０）の合成との差異は、図２２に示される通り、適切なステップにおけるメタンチオールまたはナトリウムチオメトキシドによるメルカプトエタノール（ＥｔＳＨ）の置き換えである。−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅ基は、すべての考えられる３’−Ｏ−ＣＨ２−ＳＳ−Ｒ類似体の中で最小の構造である。したがって、３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅキャッピング基を有するヌクレオチド類似体は、酵素的組み込み速度およびＴＣＥＰ等の還元剤による開裂性の観点から、他の類似体のものよりも性能が良好であるはずである。
【０２３９】
次に、結果として生じたＰＡ−ヌクレオチド（例えば５７）を、適切な開裂可能な−ＯＣＨ２−ＳＳ−リンカーと、最後に、フルオロフォア色素と、図２３において示されている通り、活性化リンカー３２を使用してカップリングすることができる。また、異なる色素を有する他のヌクレオチドは、適切なＰＡ−ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰのＰＡ類似体）およびＮＨＳ活性化色素（Ａｌｅｘａ４８８−ＮＨＳ、ＲＯＸ−ＮＨＳ、Ｃｙ５−ＮＨＳエステル等）を使用して同様に合成することができ、異なるフルオロフォアレポーティング基で標識されたヌクレオチド類似体を実現する。
【０２４０】
（実施例３２）
異なるリンカーを有するヌクレオチド類似体は、化合物６０および６１の合成において示されている通りの、記述されているプロトコールに従って実現することができる（図２４）。
【０２４１】
開裂可能なリンカー−ＯＣＨ２−ＳＳ−を有するが鎖長およびα−炭素における置換が異なる３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｅｔおよび３’−ＯＣＨ２−ＳＳ−Ｍｅヌクレオチドの様々なセットを、同様に合成することができる。得られたクラスのヌクレオチドを、図２５、図２６および図２７に示す。図２５に示されるヌクレオチドの中で、開裂可能なリンカーは、柔軟なエチレングリコールリンカーに結合した安定化ｇｅｍ−ジメチル基と隣接し、カルバメート官能基（−ＮＨ−Ｃ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−）を介してＰＡ−核酸塩基に結合しており、一方、図２６において、カルバメート基は、尿素基（−ＮＨ−Ｃ（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）によって置き換えられている。他方、図２７に示されるヌクレオチドの中で、ジスルフィド基は、主炭素鎖に結合し、尿素官能基によってＰＡ−核酸塩基に繋がれている。
【０２４２】
実施例３３
化合物６４の合成：
２５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物６２（３．０ｇ、４．５８ｍｍｏｌ）、２５ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、３−Å分子篩（５．０ｇ）およびシクロヘキセン（０．５５ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を投入した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に載置し、ＳＯ２Ｃｌ２（６．８ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介してゆっくりと添加し、０℃で１時間撹拌した。次に、過剰な０．５当量のＳＯ２Ｃｌ２を添加して、化合物６３への完全変換を確実にした。温度を１０℃近くに保ちながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を２０ｍＬの乾燥ＤＭＦに再懸濁し、窒素雰囲気下に保った。
【０２４３】
別個のフラスコ中、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（２．４５ｇ、１１．４４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、乾燥ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（２７４．５ｍｇ、油中６０％）で処理して、灰色のスラリーを生成した。これに、化合物６３を一度に添加し、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を、漏斗中のｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（２０ｇ）に通して濾過して、生成物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で溶離した。次いで、ＥｔＯＡｃ溶液を蒸留水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。ＥｔＯＡｃ抽出物をＮａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（カラム：１２０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ、勾配：８０％Ｈｅｘから５０Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ）によって精製した。図４３を参照。標的化合物（６４）を白色固体（１．２ｇ、３２％収率、Ｒｆ：０．４、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／３：２）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：    δＨ  ８．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ６．００  （ｓ，  ２Ｈ），    ４．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３１  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．００  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８２−３．６０  （ｍ，  １３Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  １．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７８  （ｍ，  ９Ｈ）および０．０１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２４４】
実施例３４
化合物６５の合成：
化合物６４（１．２ｇ  １．４６ｍｍｏｌ）を、デシケーター内で終夜、Ｐ２Ｏ５とともに高真空下で乾燥させ、磁気撹拌器を装備した１００ｍＬフラスコ中の３０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．６５７ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴に載置した。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、３１６ｍｇ、１．１当量）を添加し、０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３の０．１Ｍ水溶液で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で抽出した。図４３を参照。有機分をＮａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮した。粗生成物を、勾配８０〜５０％Ｈｅｘ−ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルカラム（８０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆゴールド）上で精製して、０．８２ｇの化合物６５（８２％収率、ＲＦ＝０．５、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／３：２）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．１５  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１１  （ｍ，  １Ｈ），    ４．８０−４．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８３−３．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９０  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７８  （ｍ，  ９Ｈ）および０．１０  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２４５】
実施例３５
化合物６６の合成：
磁気撹拌器を装備した丸底フラスコに、化合物６５（０．３０９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および１０．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０．０ｍＬ）を投入し、窒素雰囲気下、氷浴に載置した。ＴＢＡＦ（０．７２ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ、１Ｍ溶液中）を、シリンジを介してゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）でクエンチした。得られた混合物をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。勾配７：３から２：３  Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃを使用する４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆカラム上でのシリカゲルカラムクロマトグラフィー後、生成物６６を白色粉末として７６％収率で得た（１９６ｍｇ、Ｒｆ＝０．３、Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ／１：１）。図４３を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．４０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．９０−８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０５−３．８５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｓ，  ３Ｈ）および２．３１  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２４６】
生成物６７は、標準的なトリホスフェート合成方法（詳細については化合物５の合成を参照および図８を参照）を介して、化合物６６のリン酸化（ＬＣ−ＭＳによって確認  ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）６７のＣ１４Ｈ２３Ｎ４Ｏ１３Ｐ３Ｓ２について６１１．１９）後に得た。これを、図１３、図１４および図１５において提示されている化合物について記述されている手順に従って、さらに色素で標識された生成物に変換した。
【０２４７】
実施例３６
化合物７０の合成：
化合物６８（７．３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）をデシケーター内で終夜乾燥させ、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した乾燥５００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ＤＣＭ（７０ｍＬ）に溶解した。シクロヘキセン（１．５４ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ、１．１当量）および乾燥３−Å分子篩（１６．６ｇ）を反応混合物に添加し、得られた懸濁液を、氷水浴中、０℃で２０分間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中１Ｍ溶液、３２．７ｍＬ、２．３６当量）を添加し、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。反応進行を、ＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ）を介して出発材料の消失によってモニターした。ＳＯ２Ｃｌ２活性化が完了したら、ＤＭＦ（１２０ｍＬ）中の（ＭｅＯ）３ＢｎＳＨ（７．４ｇ、３４．５ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＮａＨ（１．３２ｇ、３３．１２ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）の混合物を調製し、迅速に一度に添加した。反応物を室温にゆっくりと加温させ、１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、４０℃にて真空中で濃縮した。シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（０から６０％酢酸エチル：ヘキサン勾配で１５分間、続いて、６０％酢酸エチル：ヘキサンで４５分間溶離）による精製により、所望の化合物７０（４．２ｇ、４３．７％収率）を透明油として得た。図４４を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．６７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｍ，  １３Ｈ），  ２．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ０．８１  （ｓ，  ９Ｈ）および０．００２  （ｄ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２４８】
実施例３７
化合物７１の合成：
化合物７０（２ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した２００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ＤＣＭ（３８ｍＬ）に溶解し、氷水浴上で冷却した。この混合物に、ジメチルジスルフィド（１．３ｍＬ、１４．３６ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて、ＤＭＴＳＦ（６２０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＣＭ中溶液（２０ｍＬ）として一度に添加した。得られた混合物を室温にゆっくりと加温させ、次いで、さらに４時間撹拌した。反応物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１００ｍＬ）の添加によってクエンチし、ＤＣＭ（１５０ｍＬ×２）およびＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮した。シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（０から６０％酢酸エチル：ヘキサン勾配で１５分間、続いて、６０％酢酸エチル：ヘキサンで４５分間溶離）による精製により、所望の化合物７１（１ｇ、６２％収率）を白色粉末として得た。図４４を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４０  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８１  （ｓ，  ９Ｈ）および０．００  （ｄ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２４９】
実施例３８
化合物７２の合成：
化合物７１（５６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した１００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、氷水浴上で冷却した。次いで、ＴＢＡＦ（１．５ｍＬのＴＨＦ中１Ｍ溶液、１．５当量）を滴下添加し、０℃で２時間撹拌した。反応進行をＴＬＣ（１００％酢酸エチル  化合物７２についてのＲｆ＝０．２０５、化合物７１についてのＲｆ＝０．６２７）によってモニターした。反応完了時に、メタノール（５ｍＬ）を添加し、反応物をロータリー上で濃縮し、残留物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（０から６０％酢酸エチル：ヘキサン勾配で１５分間、続いて、６０％酢酸エチル：ヘキサンで４５分間溶離）を介して精製して、所望の化合物７２（２８０ｍｇ、６２％収率）を白色粉末として得た。図４４を参照。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．７０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４３  （ｓ，  ３Ｈ）および２．４１  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２５０】
次いで、前述した標準的なトリホスフェート合成（図８における化合物５の合成を参照）に従って、化合物７２をトリホスフェート７３に変換した。
【０２５１】
実施例３９
化合物１０８の合成：
撹拌子を装備した１Ｌ丸底フラスコに、１００ｍＬの無水ピリジン中の１，４−ブタンジオール（１８．３ｇ、２０３．１３ｍｍｏｌ）を投入し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。次いで、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（１３．８ｍＬ、７０ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して滴下添加し、反応物を室温に徐々に加温させ、室温で１２時間撹拌を続けた。揮発物を回転蒸発によって除去し、残留物を８０グラムのシリカゲルに吸収させた。ヘキサン中３０から５０％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーを介する精製により、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−ブタン−１−オール、１０８を得た（１３．７ｇ、５９．５％収率、Ｒｆ＝１：１／ヘキサン：酢酸エチルで０．７、１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．４０  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．７５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６５  （２Ｈ，  ｍ），  １．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．０９  （ｍ，  ９Ｈ，）  ｐｐｍ。合成は図５３に例示されている。
【０２５２】
実施例４０
化合物１０９の合成：
磁気撹拌子を装備した２５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物１０８（６．０７ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）および９０ｍＬの無水ＤＭＳＯを投入した。酢酸（１５ｍＬ）および無水酢酸（５０ｍＬ）を逐次に添加し、反応物を室温で２０時間撹拌し、分液漏斗に移し、３００ｍＬの蒸留水と３００ｍＬの酢酸エチルとに分配した。次いで、有機層を１Ｌビーカーに移し、飽和Ｋ２ＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）を使用して中和した。有機層を蒸留水（３×３００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水した。揮発物を減圧下で除去し、残留物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル／９７：３から９０：１０）を介して精製して、４−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−１−Ｏ−（メチルチオメチル）−ブタン、１０９（５．１５ｇ、７１．７％収率、Ｒｆ＝９：１／ヘキサン：酢酸エチル中で０．８）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （ｍ，  ４Ｈ，），  ７．４０  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．６２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５０  （ｍ，  ２Ｈ，），  ２．１５  （ｓ，  ２Ｈ），  １．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．０８  （ｍ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５３に例示されている。
【０２５３】
実施例４１
化合物１１０の合成：
磁気撹拌子を装備した１Ｌ丸底フラスコに、化合物１０９（１５．５ｇ、４０ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（４５０ｍＬ）、３Å分子篩（８０ｇ）およびトリエチルアミン（５．６ｍＬ）を投入し、反応物を、窒素雰囲気下、０℃で３０分間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（６４ｍＬのジクロロメタン中１Ｍ溶液）を、シリンジを介してゆっくりと添加し、０℃で１時間撹拌した。次いで、氷浴を除去し、２０ｍＬの無水ＤＭＦ中のチオトシル酸カリウム（１０．９ｇ、４８．１ｍｍｏｌ）の溶液を一度に添加した。得られた混合物を室温で２０分間撹拌し、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の３−メルカプト−３−メチルブタン−１−オール（４．４ｍＬ、３６ｍｍｏｌ）の溶液を含有する２Ｌ丸底フラスコに一度に添加した。反応物を室温で３０分間撹拌し、次いで、セライト−Ｓに通して濾過した。生成物を、等量の酢酸エチルと水とに分配した。有機抽出物を分液漏斗中の蒸留水で洗浄し、続いて、粗生成物を回転蒸発によって濃縮した。酢酸エチル：ヘキサン勾配を使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製により、表題化合物１１０（５．６ｇ、２６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．６７−７．７０  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３７−７．４７  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．８１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５５，  ２Ｈ），  １．９０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．５８−１．７７  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３４  （ｓ，  ６Ｈ）および１．０７  （ｓ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５３に例示されている。
【０２５４】
実施例４２
化合物１１１の合成：
磁気撹拌子を装備した５００ｍＬ丸底フラスコに、窒素雰囲気下、化合物１１０（５．１ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１００ｍＬ）および１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（３．３６ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）を投入した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、無水ピリジン（５０ｍＬ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（７．６ｍＬ、５１．８ｍｍｏｌ）の溶液に注ぎ入れた。撹拌を１時間続け、揮発物を回転蒸発によって除去した。得られた粗製物を、（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１５％メタノール）を使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製して、化合物１１１（４．４ｇ、６５％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．６３−７．６８  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３４−７．４４  （ｍ，  ６Ｈ），  ４．７６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６０  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．４９−３．５１  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．３１−３．３９  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．８８  （ｍ，  ２Ｈ），１．９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．５７−１．７３  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３１  （ｓ，  ６Ｈ）および１．０３  （ｓ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５３に例示されている。
【０２５５】
実施例４３
化合物１１３の合成：
磁気撹拌子を装備した５０ｍＬ丸底フラスコに、窒素雰囲気下、化合物１１１（０．９４ｇ、１．４２ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）およびＴＢＡＦ（１．６ｍＬのＴＨＦ中１Ｍ溶液、１．６ｍｍｏｌ）を０℃で投入した。反応混合物を０℃で２．０時間撹拌し、この時間中に、ＬＣ−ＭＳはＴＢＤＰＳ保護基の完全な除去を示した。揮発物をロータリー上で除去した後、生成物をシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０〜５％メタノール勾配）を介して精製して、純粋化合物１１２（０．２８４ｇ、４７％収率）を得た、ＭＳ（ＥＳ＋）（Ｍ＋Ｈ）の計算値４２９．２１、観測値ｍ／ｚ  ４２９．１８。
【０２５６】
次に、化合物１１２（０．２１７ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水アセトニトリル（１３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＤＩＰＥＡ（９７．７μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−ＮＨＳエステル（２７３．６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で２時間撹拌した。ヘキサン中５０から９０％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製により、半純粋な生成物を生成し、これを、ＣＨ２Ｃｌ２中２〜５％メタノール勾配を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーを介してさらに精製して、化合物１１３（０．２４５ｇ、７４％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．７０  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ），  ７．５９  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝７．６  Ｈｚ），  ７．３２  （２Ｈ，  ｍ），  ７．２４  （２Ｈ，  ｍ），  ４．６９  （２Ｈ，  ｓ），  ４．３５  （２Ｈ，  ｍ），  ４．１６  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０９  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６０−３．４５  （１２Ｈ，  ｍ），  ３．３６−３．２６  （４Ｈ，  ｍ），  １．８２  （２Ｈ，  ｍ），  １．６０  （４Ｈ，  ｍ）および  １．２２  （６Ｈ，  ｓ）  ｐｐｍ。合成は図５３に例示されている。
【０２５７】
実施例４４
化合物１１４の合成：
磁気撹拌子を装備した５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物７（１７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、無水アセトニトリル（１５ｍＬ）、ＤＳＣ（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＤＰＩＥＡ（６８μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）を投入した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、追加のＤＳＣ（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６８μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１２時間撹拌した。反応進行をＴＬＣ（Ｒｆ＝出発材料について０．４、生成物Ｒｆ＝９：１／酢酸エチル：ヘキサン中で０．８）によって追跡した。揮発物を回転蒸発によって除去し、残った残留物を、ヘキサン−酢酸エチル勾配を使用する３連続シリカゲルカラムを介して精製して、化合物１１４（１２１ｍｇ、５９％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．８１  （ｍ，２Ｈ），  ７．６３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．７８  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．４３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．２５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１８  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６７−３．５５  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．８４  （ｓ，  ４Ｈ），  １．８８  （ｍ，  ４Ｈ），  １．７３  （ｍ，  ４Ｈ）および１．３２  （ｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５３に例示されている。
【０２５８】
実施例４５
化合物１１７の合成：
磁気撹拌子を装備した５００ｍＬ丸底フラスコに、化合物６８（７．３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、デシケーター内で終夜予め乾燥させたもの）、無水ジクロロメタン（７０ｍＬ）、シクロヘキセン（１．５４ｍＬ、１５．２ｍｍｏｌ）および３−Å分子篩（１６．６ｇ）を投入し、得られた懸濁液を、窒素雰囲気下、０℃で２０分間撹拌した。次に、ＳＯ２Ｃｌ２（ジクロロメタン中１Ｍ溶液、３２．７ｍＬ、２．３６当量）を添加し、得られた混合物を０℃で１時間撹拌した。反応進行を、ＴＬＣを介して出発材料（１００％酢酸エチル）の消失についてモニターした。ＳＯ２Ｃｌ２活性化が完了したら、ＤＭＦ（１２０ｍＬ）中の（ＭｅＯ）３ＢｎＳＨ（７．４ｇ、３４．５ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＮａＨ（１．３２ｇ、３３．１２ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）の混合物を調製し、迅速に一度に添加した。反応物を室温にゆっくりと加温させ、１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、４０℃にて真空中で濃縮した。ヘキサン中０から６０％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製により、所望の化合物７０（４．２ｇ、４３．７％収率）を透明油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ６．０３  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．６７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｍ，  １３Ｈ），  ２．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ０．８１  （ｓ，  ９Ｈ）および０．００２  （ｄ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５４に例示されている。
【０２５９】
実施例４６
化合物７１の合成：
磁気撹拌子を装備した２００ｍＬ丸底フラスコに、Ｎ２雰囲気下、化合物１１７（２．０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（３８ｍＬ）を投入し、氷水浴上で冷却した。この混合物に、ジメチルジスルフィド（１．３ｍＬ、１４．３６ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて、ＤＭＴＳＦ（６２０ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ、１．１当量）をジクロロメタン中溶液（２０ｍＬ）として添加した。得られた混合物を室温にゆっくりと加温させ、さらに４時間撹拌した。次いで、反応物をＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１００ｍＬ）の添加によってクエンチし、ジクロロメタン（１５０ｍＬ×２）および酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮した。シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０から６０％酢酸エチル勾配で溶離）による精製により、所望の化合物７１（１．０ｇ、６２％）を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４０  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８１  （ｓ，  ９Ｈ）および０．００  （ｄ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５４に例示されている。
【０２６０】
実施例４７
化合物１１９の合成：
化合物７１（５６２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した丸底フラスコ中の無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、氷水浴上で冷却した。次いで、ＴＢＡＦ（１．５ｍＬのＴＨＦ中１Ｍ溶液、１．５当量）を滴下添加し、０℃で２時間撹拌した。反応進行をＴＬＣ（１００％酢酸エチル  化合物１１９についてのＲｆ＝０．２、化合物７１についてのＲｆ＝０．６）によってモニターした。反応完了時に、メタノール（５ｍＬ）を添加し、反応物をロータリー上で濃縮し、残留物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（０から６０％酢酸エチル：ヘキサン勾配で１５分間、続いて、ヘキサン中６０％酢酸エチルで４５分間溶離）を介して精製して、所望の化合物１１９（２８０ｍｇ、６２％収率）を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．７０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４３  （ｓ，  ３Ｈ）および２．４１  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ。
【０２６１】
次いで、１０％ＮＨ４ＯＨにより室温で５時間処理することによって脱保護を行って−ＳＳＭｅ開裂を最小化したことを除き、化合物１１９を、標準的なトリホスフェート合成方法（下記参照）を使用して、トリホスフェート１２０に変換した。収率２５％；ＨＲＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ１２Ｈ２０Ｎ５Ｏ１２Ｐ３Ｓ２の計算値、５８２．９７６、観測値ｍ／ｚ  ５８２．９７５合成は図５４に例示されている。
【０２６２】
実施例４８
化合物１２３の合成：
化合物１２１（２．５ｇ、４．９４ｍｍｏｌ）をデシケーター内で終夜乾燥させ、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した乾燥丸底フラスコ中の無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した。シクロヘキセン（０．５５ｍＬ、１．１当量）および乾燥３−Å分子篩（６．０ｇ）を反応混合物に添加し、得られた懸濁液を室温で２０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷塩水浴に載置して、温度を氷点下にし、ＳＯ２Ｃｌ２（７．４ｍＬ、ジクロロメタン中１Ｍ溶液）をシリンジでゆっくりと添加した。得られた混合物を０℃で１時間撹拌し、続いて、０．５当量のＳＯ２Ｃｌ２を添加して、反応を完了させた。反応進行を、ＴＬＣを介して出発材料の消失によってモニターした。次に、ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の（ＭｅＯ）３ＢｎＳＨ（２．６５ｇ、１２．３５ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＮａＨ（０．４７２ｇ、１１．８５ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）の懸濁液を、別個のフラスコ中で調製した。反応混合物を合わせ、室温にゆっくり加温し、１時間撹拌した。次いで、反応混合物をガラス焼結漏斗に通して濾過して、ＭＳを除去し、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４水溶液（５０ｍＬ）の添加によって濾液をクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機物をＮａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮した。ヘキサン：酢酸エチル勾配を使用するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによる精製により、所望の化合物１２３（１．４ｇ、４２．２％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．２９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ５．９９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３２  （ｍ，  １Ｈ），  ４．００  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６９  （ｍ，  ９Ｈ），  ２．５２  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ０．８０  （ｍ，  ９Ｈ）および０．０１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５５に例示されている。
【０２６３】
実施例４９
化合物１２４の合成：
化合物１２３（１．４ｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した２００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ジクロロメタン（４２ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。この混合物に、ジメチルジスルフィド（０．９３ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、続いて、ＤＭＴＳＦ（４５０ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。得られた混合物を０℃で２時間撹拌した。５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）の添加によって反応物をクエンチし、ジクロロメタン（１００ｍＬ×２）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮した。生成物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０から３０％酢酸エチル勾配で溶離）によって精製して、所望の化合物１２４（０．９３ｇ、８３．１％）を白色粉末として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．４８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｍ，  １Ｈ），７．３７  （ｍ，  ２Ｈ）  ６．００  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３３  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７６  （ｍ，  ９Ｈ）および０．０１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５５に例示されている。
【０２６４】
実施例５０
化合物１２５の合成：
化合物１２４（９３０ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、撹拌子およびゴム隔膜を装備した１００ｍＬ丸底フラスコ中の無水ＴＨＦ（５２ｍＬ）に溶解し、氷水浴上で０℃に冷却した。次いで、ＴＢＡＦ（３．５ｍＬのＴＨＦ中１Ｍ溶液、１．５当量）を滴下添加し、０℃で４時間撹拌した。反応完了時に、メタノール（５ｍＬ）を添加して反応物をクエンチし、揮発物を減圧下で除去し、残留物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中０から７５％酢酸エチル勾配）を介して精製して、所望の化合物１２５（４２５ｍｇ、５８％収率）を白色粉末として得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．２４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５１−７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．０９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４０  （ｍ，  ３Ｈ）および２．４１  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５５に例示されている。
【０２６５】
実施例５１
化合物１２６の合成：
次いで、化合物１２５を、標準的なトリホスフェート合成手順（下記参照）を使用して、トリホスフェート１２６に変換し、最終脱保護ステップを１０％ＮＨ４ＯＨにより室温で２時間処理することによって行って−ＳＳＭｅ開裂を最小化した。３０％収率、ＨＲ  ＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ１１Ｈ２０Ｎ３Ｏ１３Ｐ３Ｓ２の計算値、５５８．９６５；観測値ｍ／ｚ  ５５８．９６４。合成は図５５に例示されている。
【０２６６】
実施例５２
化合物１３０の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、１２７（２．０ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を投入し、高真空下、デシケーター内、Ｐ２Ｏ５上で１２時間乾燥させた。ジクロロメタン（４０ｍＬ）をＮ２下で添加し、得られた溶液を、塩氷浴上で１５分間冷却した。シクロヘキセン（０．３４ｍＬ、３．４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ＳＯ２Ｃｌ２（３．４ｍＬ、ジクロロメタン中１Ｍ溶液、３．４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。得られた混合物を３０分間撹拌し、反応進行をＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン／１：１、１２７  Ｒｆ＝０．５、１２８  Ｒｆ＝−ＣＨ２Ｃｌ分解産物について０．１５）によってモニターした。追加のＳＯ２Ｃｌ２（３．１ｍＬ、ジクロロメタン中１Ｍ溶液、３．１ｍｍｏｌ）を滴下添加し、反応混合物をもう４０分間撹拌して、化合物１２８への完全変換を確実にした。次いで、この混合物を、高真空下、０℃で濃縮した。
【０２６７】
次いで、無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）を、Ｎ２下で残留物に添加し、すべての固体が溶解するまで、混合物を０℃で撹拌した。ＤＭＦ（８ｍＬ）中のｐ−トルエンチオスルホン酸カリウム（０．９６ｇ、４２５ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、得られた反応混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物を、最初は減圧下、０℃で、次いで室温で濃縮した。残留物を、ヘキサン中０から１００％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲルカラム上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１３０をクリーム色固体（１．１ｇ、５１％；ＴＬＣ  Ｒｆ：０．３５、酢酸エチル：ヘキサン  ２：１）として得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：７３３［Ｍ＋１＋］。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３， ４００  ＭＨｚ）：  δＨ  ８．０２  （ｂｒ．ｓ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｄ，  Ｊ＝８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４５  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３８  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．０１  （ｔ，  Ｊ＝６．６  Ｈｚ  １Ｈ），  ５．４６  ＆  ５．３８  （ＡＢ，  ＪＡＢ＝１２．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｄｄ，  Ｊ＝１２．５，  ２．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５５  （ｄｄ，  Ｊ＝１２．５，  ２．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．１７  （ｍ，  １Ｈ），  １．２６  （ｄ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ，  ３Ｈ），  １．２５  （ｄ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５６に例示されている。
【０２６８】
実施例５３
化合物１３１の合成：
氷水浴中で冷却したジクロロメタン（無水物、４０ｍＬ）中の１３０（１．１ｇ  １．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジメチルジスルフィド（０．６６ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）をＮ２下で添加した。得られた混合物を１５分間撹拌し、ＮａＳＭｅ（０．２３ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた反応混合物を０℃で４時間撹拌した（反応進行をＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン／２：１、１３０  Ｒｆ＝０．３５、１３１  Ｒｆ＝０．４５）によってモニターした）。混合物をセライト−Ｓに通して濾過し、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラム上で精製し、ヘキサン中酢酸エチル（０〜１００％）で溶離して、化合物１３１を白色固体（０．６８ｇ、７５％；ＴＬＣ  Ｒｆ：０．４５、酢酸エチル／ヘキサン／２：１）として得た。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ：６２５［Ｍ＋１＋］。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．００  （ｂｒ．  ｓ，  １Ｈ），  ７．４５  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２８  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．２４  （ｔ，  Ｊ＝６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．９９  ＆  ４．９４  （ＡＢ，  ＪＡＢ＝１１．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．２７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９９  （ｄｄ，  Ｊ＝１２．５，  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８６  （ｄｄ，  Ｊ＝１２．５，  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．５０  （ｍ，  １Ｈ），  １．３０  （ｄ，  Ｊ＝６．６  Ｈｚ，  ３Ｈ）および１．２９  （ｍ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図５６に例示されている。
【０２６９】
実施例５４
化合物１３２の合成：
次いで、化合物１３１を、標準的な方法のセクションにおいて記述されている標準的なトリホスフェート合成方法を介して、トリホスフェート１３２に変換した。２５％収率；ＨＲＭＳ−ＥＳ＋：Ｃ１２Ｈ２０Ｎ５Ｏ１３Ｐ３Ｓ２の計算値、５９８．９７１、観測値ｍ／ｚ  ５９８．９７０。合成は図５６に例示されている。
【０２７０】
５５
実施例
化合物１３４の合成：
化合物１３３（４．４７ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）および（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（ＴＭＰＭ−ＳＨ）を高真空下で２時間乾燥させ、次いで、Ｐ２Ｏ５とともに１２時間デシケーターに入れた。化合物１３３を無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０．０ｍＬ）に溶解し、シクロヘキセン（１０ｍＬ、９６．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、−１０℃で１５分間撹拌した。次に、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ  ＳＯ２Ｃｌ２の新しく調製した溶液（２５ｍＬ、２６．７５ｍｍｏｌ）を、添加漏斗を介して滴下添加し、得られた混合物を−１０℃で１時間撹拌した。浴温度を１０℃に保ちながら、揮発物を真空中で除去した。次いで、残留物を無水ＤＭＦ（５２ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下に保った。
【０２７１】
別個のフラスコ中、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（４ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（４８ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。次いで、ＮａＨ（１．１ｇ、２６．８ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を添加し、得られた灰色のスラリーを０℃で１５分間撹拌した。これを先の溶液に一度に添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗（１５０：３００ｍＬ／ブライン：酢酸エチル）中で分配した。次いで、有機層をブライン（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。水性層を逆抽出した（４×５０ｍＬの酢酸エチル）。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を除去し、生成物をシリカゲルカラム上でのフラッシュクロマトグラフィー（カラム：１２０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ−ＩＳＣＯ、勾配ヘキサン中０〜１００％酢酸エチル）によって精製した。標的化合物１３４を白色固体として２２％収率（１．３５ｇ）で得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：    δＨ  ８．１７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｄ，  １Ｈ），  ６．３０  （ｍ，  １Ｈ），  ６．１２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．７１  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ４．４３  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０４  （ｍ，  １Ｈ），    ３．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８３  （ｍ，  ９Ｈ），  ３．７４（ｄｄ，  １Ｈ），  ２．７４  （ｄｄｄ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｄｄｄ，  １Ｈ），  １．９３  （ｍ，  ２Ｈ）  １．５３  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９３  （ｍ，  ９Ｈ），  ０．１１（ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ−Ｈ＋］観測値５８１、Ｒｆ＝０．５９（４：６／ヘキサン−酢酸エチル）。また、化合物１３５も副産物として２２．５％収率（１．１３ｇ）で単離された。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：    δＨ  ８．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４１  （ｍ，  １Ｈ），  ６．１２  （Ｍ，  ３Ｈ），  ４．７６  （ｄｄ  ，  ２Ｈ），  ４．４７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０１  （ｍ，  １Ｈ），    ３．９０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８２  （ｍ，  ９Ｈ），  ３．７５（ｍ，  １Ｈ），  ２．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．０４  （ｓ，  ３Ｈ）および１．９１  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ−Ｈ＋］観測値４６７。合成を図５７において例証する。
【０２７２】
実施例５６
化合物１３６の合成：
１００ｍＬ丸底フラスコ中の化合物１３４（３．６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を、高真空下で２時間乾燥させ、次いで、Ｐ２Ｏ５とともに１２時間真空デシケーターに入れた。無水ＣＨ２Ｃｌ２（９６ｍＬ）およびジメチルジスルフィド（２．８ｍＬ、３０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃に冷却した。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、１．３４ｇ、６．８２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で１時間撹拌した。次に、反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、９０ｍＬのＮａＨＣＯ３の０．１Ｍ水溶液で中和し、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、ロータリー上で濃縮した。残留物を、ヘキサン中３０〜５０％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲルカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。標的化合物１３６を白色固体（２．１ｇ、７７％収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．９９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｄ，  １Ｈ），  ６．２９（ｄｄ，  １Ｈ），  ４．８７  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ４．４９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８８  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４７  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．４５  （ｄｄ，  １Ｈ），  ２．０４  （ｄｄ，  １Ｈ）および１．５４  （ｓ，  ２Ｈ）  ，  ０．９３  （ｍ，  ９Ｈ）および０．１３  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）［Ｍ−Ｈ＋］観測値４４７．０。合成は図５７に例示されている。
【０２７３】
実施例５７
化合物１３７の合成：
高真空下で２時間乾燥させた１００ｍＬ丸底フラスコ中の化合物１３６（２．１６ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解し、続いて、酢酸（１．２ｍＬ）およびＴＨＦ中ＴＢＡＦ（６．７ｍＬの１Ｍ溶液、６．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、０℃で１時間、次いで、室温でさらに２時間撹拌した。揮発物を真空中で除去し、残留物を、ジクロロメタン中０〜８％メタノール勾配を使用する４０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆゴールドカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーを介して精製した。標的化合物１３７を白色固体（１．４５ｇ、９０％収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．１２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３６  （ｄ，  １Ｈ），  ６．１１（ｔ，  １Ｈ），  ４．８７  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ４．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１４  （ｑ，  １Ｈ），  ３．９４  （ｄｄ，  １Ｈ），  ３．８３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．４（ｍ，  ２Ｈ），  １．９３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ；  ＬＣＭＳ  （ＥＳＩ）  ［Ｍ−Ｈ＋］測定値３３３。合成は図５７に例示されている。
【０２７４】
実施例５８
化合物１３８の合成：
生成物１３８は、標準的なトリホスフェート合成方法（下記参照）を使用する化合物１３７のリン酸化後に得た。４０％収率、ＨＲ  ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１２Ｈ２１Ｎ２Ｏ１４Ｐ３Ｓ２の計算値、５７３．９６５；観測値ｍ／ｚ  ５７３．９６４。合成は図５７に例示されている。
【０２７５】
実施例５９
化合物１４１の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１３９（２．２３ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）、３−Å分子篩（３．５ｇ）およびシクロヘキセン（０．６０ｍＬ）を投入した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で２０分間撹拌した。反応物を０℃に冷却し、ＳＯ２Ｃｌ２（５．４ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介してゆっくりと添加した。反応物を０℃で１．５時間撹拌し、さらに１．８ｍＬのＳＯ２Ｃｌ２（ジクロロメタン中１Ｍ溶液）を添加し、０℃で４０分間撹拌を続けて、化合物１４０への完全変換を確実にした。浴温度を１０℃近くに保ちながら、揮発物を減圧下で除去した。得られた固体を２０ｍＬの無水ＤＭＦに再懸濁し、窒素雰囲気下に保った。
【０２７６】
別個のフラスコ中、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（１．９８ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（２４７ｍｇ、鉱油中６０％、６．１７ｍＭ）で処理して、暗灰色のスラリーを生成した。次に、化合物１４０溶液を一度に添加し、反応物を室温で１時間撹拌した。次いで、反応混合物を、蒸留水（１５０ｍＬ）と酢酸エチル（１５０ｍＬ）とに分配した。有機層を蒸留水（２×１５０ｍＬ）でさらに洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。揮発物を減圧下で除去し、残留物を、ヘキサン中８０から１００％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲルカラム上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。標的化合物１４１を白色固体（７９８ｍｇ、２８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：    δＨ  ８．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ６．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．００  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．４４  （ｍ，  １Ｈ），    ４．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８０−３．６０  （ｍ，  １１Ｈ），  ３．１０  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．３６  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２４  （ｍ，  １Ｈ），  ０．８０  （ｍ，  ９Ｈ）および０．０１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。ＬＣ−ＭＳによってさらに確認：（Ｍ−Ｈ）について観測値ｍ／ｚ  ７９５．２５。合成は図５８に例示されている。
【０２７７】
実施例６０
化合物１４２の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１４１（０．７７９ｇｍ、０．９８ｍｍｏｌ、Ｐ２Ｏ５上で１２時間真空乾燥させたもの）および乾燥ＴＨＦ（２０．０ｍＬ）を投入し、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。ＴＢＡＦ（１．１７ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液、１．１７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介してゆっくりと添加し、反応混合物を０℃で１．５時間撹拌した。次に、追加のＴＢＡＦ（１ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液、１ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で３時間反応させた。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、メタノール（５ｍＬ）の添加によってクエンチし、蒸留水（１００ｍＬ）を添加し、反応物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機物をＮａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮した。ヘキサン中８０〜１００％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲル上での残留物のカラムクロマトグラフィーにより、化合物１４２を白色粉末（５２５ｍｇ、７９％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （メタノール−ｄ４）：  δＨ  ８．３３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１９  （ｍ，  １Ｈ），  ６．０６（ｍ，  ２Ｈ），  ６．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．５７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７５  （ｍ，  ９Ｈ），  ３．１６  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．８０  （ｍ，  １Ｈ）および２．２８  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ；  ＬＣ−ＭＳ：  Ｍ−Ｈ測定値ｍ／ｚ  ６８０．０。合成は図５８に例示されている。
【０２７８】
実施例６１
化合物１４３の合成：
化合物１４３は、化合物１４２から、標準的な方法のセクションにおいて記述されている標準的なトリホスフェート合成手順を介して合成した。収率６５％、ＬＲＭＳ−ＥＳ−：Ｃ２５Ｈ３３Ｎ５Ｏ１５Ｐ３Ｓ−の計算値、７６８．０９；観測値ｍ／ｚ  ７６８．５４（Ｍ−Ｈ）。合成は図５８に例示されている。
【０２７９】
実施例６２
化合物１４４の合成：
５０ｍＬコニカルチューブに、化合物１４３（３．８０ｍＬのＨＰＬＣグレード水中５．２５ｍＭ溶液、２０μｍｏｌ）およびｐＨ４．６５酢酸塩緩衝液（４．７５ｍＬ）を投入し、９．０ｍＬの新しく調製したｐＨ４．６５酢酸塩緩衝液中ＤＭＴＳＦ（８０ｍＭ）溶液と迅速に合わせた。得られた混合物を室温で２時間振とうし、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（２ｍＬ）の添加によってクエンチした。生成物を分取ＨＰＬＣ（カラム：３０×２５０ｍｍ  Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅ、方法：０から２．０分間１００％Ａ、続いて、７０分間にわたって５０％Ｂ、流量：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリル）で直ちに精製した。ＨＰＬＣグレード水に溶解した後、適切な画分を凍結乾燥し、合わせて、２３．４ｕｍｏｌの化合物１４４（７３％収率）を得た。ＬＲＭＳ−ＥＳ−：（Ｍ−Ｈ）についてＣ１６Ｈ２３Ｎ５Ｏ１２Ｐ３Ｓ２−の計算値、６３４．００、ｍ／ｚ観測値６３４．４２。合成は図５８に例示されている。
【０２８０】
化合物１４４を、標準的な方法のセクションにおいて記述されている手順に従って、色素で標識された生成物（７６）に変換した（図５９）。化合物１４６は、２ステップにて７５％収率で得た、ＬＲＭＳ−ＥＳ＋：（Ｍ＋Ｈ）についてＣ３４Ｈ５９Ｎ７Ｏ１９Ｐ３Ｓ４の計算値、１０９０．２０、ｍ／ｚ観測値１０９０．２４。化合物７６は、１４６から５０〜７０％収率で得た、ＨＲＭＳ−ＥＳ−：（Ｍ−Ｈ）についてＣ６７Ｈ８６Ｎ９Ｏ２３Ｐ３Ｓ４の計算値１６０５．３９３；観測値ｍ／ｚ１６０５．３８０。
【０２８１】
実施例６３
化合物１５０の合成：
２５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物１４８（３．０ｇ、４．５８ｍｍｏｌ）、２５ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、３−Å分子篩（５．０ｇ）およびシクロヘキセン（０．５５ｍＬ、５．４ｍｍｏｌ）を投入した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に載置し、ＳＯ２Ｃｌ２（６．８ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介してゆっくりと添加し、反応物を０℃で１時間撹拌した。次に、過剰な０．５当量のＳＯ２Ｃｌ２を添加して、化合物１４９への完全変換を確実にした。温度を１０℃近くに保ちながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を２０ｍＬの乾燥ＤＭＦに再懸濁し、窒素雰囲気下に保った。
【０２８２】
別個のフラスコ中、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（２．４５ｇ、１１．４４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（２７４．５ｍｇ、シリコン油中６０％）で処理して、灰色のスラリーを生成した。これに、化合物１４９を一度に添加し、反応物を、窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した。次いで、反応混合物をｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓに通して濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル溶液を蒸留水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮し、ヘキサン中２０から５０％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲルカラム上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製した。標的化合物１５０を白色固体（１．２ｇ、３２％収率、Ｒｆ：０．４、ヘキサン：酢酸エチル／３：２）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：    δＨ  ８．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ６．００  （ｓ，  ２Ｈ），    ４．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３１  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．００  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８２−３．６０  （ｍ，  １３Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  １．８４  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７８  （ｍ，  ９Ｈ）および０．０１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図６０に例示されている。
【０２８３】
実施例６４
化合物１５１の合成：
化合物１５０（１．２ｇ  １．４６ｍｍｏｌ）を、Ｐ２Ｏ５とともに高真空下、デシケーター内で終夜乾燥させ、磁気撹拌子を装備した１００ｍＬフラスコ中の３０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．６５７ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴に載置した。ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、３１６ｍｇ、１．１当量）を添加し、０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３の０．１Ｍ水溶液で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮した。粗生成物を、ヘキサン中８０〜５０％酢酸エチル勾配を使用するシリカゲルカラム上で精製して、０．８２ｇの化合物１５１（８２％収率、ＲＦ＝０．５、ヘキサン：酢酸エチル／３：２）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．１５  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１１  （ｍ，  １Ｈ），    ４．８０−４．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８３−３．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９０  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７８  （ｍ，  ９Ｈ）および０．１０  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図６０に例示されている。
【０２８４】
実施例６５
化合物１５２の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１５１（０．３０９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および１０．０ｍＬの乾燥ＴＨＦ（１０．０ｍＬ）を投入し、窒素雰囲気下で氷浴に載置した。ＴＢＡＦ（０．７２ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液、０．７２ｍｍｏｌ）を、シリンジを介してゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、ＮａＨＣＯ３の０．５Ｍ水溶液（５０ｍＬ）でクエンチした。次いで、得られた混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。勾配７：３から２：３のヘキサン：酢酸エチルを使用するシリカゲルカラム上でのシリカゲルカラムクロマトグラフィー後、生成物１５２を白色粉末として７６％収率で得た（１９６ｍｇ、Ｒｆ＝０．３、ヘキサン：酢酸エチル／１：１）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ８．４０  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．９０−８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．６５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０５−３．８５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｓ，  ３Ｈ）および２．３１  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図６０に例示されている。
【０２８５】
実施例６６
化合物１５３の合成：
化合物１５３は、標準的なトリホスフェート合成方法（下記参照）を使用して、化合物１５２のリン酸化後に３０％収率で得た（ＬＣ−ＭＳ：Ｃ１４Ｈ２３Ｎ４Ｏ１３Ｐ３Ｓ２の計算値、６１０．９８；観測値ｍ／ｚ  ６１１．１１（Ｍ−Ｈ）。これを、標準的な方法のセクションにおいて記述されている手順に従って、色素で標識された生成物（７２）にさらに変換した（図６１）。化合物１５５は、２ステップにて４９％収率、化合物７２は６０〜８５％収率で得た、ＨＲＭＳ−ＥＳ−：Ｃ５３Ｈ６８Ｎ８Ｏ３０Ｐ３Ｓ６−の計算値、１５８１．１５６（Ｍ−Ｈ）；測定値ｍ／ｚ  １５８２．１６０。
【０２８６】
実施例６７
化合物１５９＆１６０の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１５７（２．０４ｇ、２．３９ｍｍｏｌ）を投入し、高真空で１２時間にわたって乾燥させた。反応槽をアルゴンでフラッシュした後、１３ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２およびシクロヘキサネセン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｓｅｎｅ）（０．３０ｍＬ、２．８６ｍｍｏｌ）を逐次に添加した。次いで、反応フラスコを氷水塩浴に載置し、１０分間撹拌して、混合物を０℃未満にした。ＳＯ２Ｃｌ２（４．０ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ、４．０ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して２分間にわたって滴下添加し、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。さらに０．８当量のＳＯ２Ｃｌ２（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を１分間にわたって滴下添加し、反応物を０℃でさらに１／２時間撹拌した。次に、浴温度を約１０℃に保ちながら、揮発物を真空中で除去した。得られた固体を１５ｍＬの乾燥ＤＭＦに再懸濁し、アルゴン雰囲気下に保った。
【０２８７】
別個の１００ｍＬフラスコ中、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（ＴＭＰＭ−ＳＨ、１．２７ｇ、６．０ｍｍｏｌ、終夜真空乾燥させたもの）を、アルゴン雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（１６ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（１９５ｍｇ、油中６０％、４．８８ｍｍｏｌ）で処理して、灰色のスラリーＴＭＰＭＴ−ＳＮａ塩を生成した。ガス形成が治まるまで（約１０分）混合物を撹拌した。これに、ＴＭＰＭＴ−ＳＮａ塩を一度に添加し、混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で、ＴＬＣ（マイクロワークアップ：ジクロロメタン／水；溶媒：ヘキサン：酢酸エチル／１：１）により完全変換を確認するまで（１時間）、撹拌した。次いで、反応混合物を、濾過漏斗中のｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（１０ｇ）に通して濾過して、生成物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で溶離した。次いで、ジクロロメタン溶液を水（３×１００ｍＬ）で洗浄した。水性層を３×１００ｍＬのジクロロメタンで抽出した。合わせたジクロロメタン抽出物をＮａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮した。次いで、これを、フラッシュクロマトグラフィー（カラム：１００ｇ、勾配：２５％〜５０％ヘキサン：酢酸エチル５ＣＶ、次いで、５０％ＥＥ  １０ＣＶ）によって精製した。
【０２８８】
標的化合物１６０を白色泡状物（１．２２ｇ、５１％収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δＨ  １０．６３  （ｓ，  １Ｈ），  １０．１５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３−７．５  （ｍ，  ８Ｈ），  ７．２０−７．３  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ６．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｄｄ，  １Ｈ），  ４．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８１  （ｍ，  １１Ｈ），  ３．３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７  （ｍ，  １Ｈ），  １．０５  （ｍ，  ８Ｈ），  ０．８  （ｍ，  ９Ｈ）および０．１１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。ＬＣＭＳ：  １０１９．３７１  Ｄａ。合成は図６２に例示されている。
【０２８９】
加えて、ＴＢＤＭＳ脱保護生成物１５９を副産物として２５％収率（０．４８ｇ）で得た。Ｒｆ＝０．２／ヘキサン：酢酸エチル／１：１。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δＨ  １０．６３  （ｓ，  １Ｈ），  １０．１５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３−７．５  （ｍ，  ８Ｈ），  ７．２０−７．３  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ６．１５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．５０  （ｄｄ，  １Ｈ），  ４．３０  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８１  （ｍ，  １１Ｈ），  ３．５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．３  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７  （ｍ，  １Ｈ），および１．０４  （ｍ，  ８Ｈ）  ｐｐｍ。ＬＣＭＳ：  ９０５．２８６  Ｄａ。
【０２９０】
実施例６８
化合物１６１の合成：
磁気撹拌子およびゴム隔膜を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１６０（０．３６ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を投入し、高真空で１２時間乾燥させた。アルゴンでフラッシュした後、７ｍＬの乾燥ジクロロメタンおよびジメチルジスルフィド（０．１６ｍＬ、１．７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応フラスコを氷浴に載置し、１０分間撹拌して、混合物を０℃にした。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、８０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をＴＬＣ（マイクロワークアップ：ジクロロメタン／水；溶媒：ヘキサン：酢酸エチル／１：１）まで０℃で撹拌した。反応混合物を２５０ｍＬ分液漏斗に移し、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３の０．１Ｍ水溶液で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラム（カラム：２５ｇ、勾配：１０％〜５０％ヘキサン：酢酸エチル３ＣＶ、次いで、５０％酢酸エチル５ＣＶ）上で精製した。標的化合物１６１を黄色泡状物（０．２３ｇ、７４％収率）として得た。合成は図６２に例示されている。
【０２９１】
実施例６９
化合物１６２の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、７．０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した化合物１６１（０．１８ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を投入し、アルゴン雰囲気下で氷浴に載置した。混合物を１０分間撹拌して、これを０℃にし、０．２８ｍＬの酢酸を添加した。ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．４７ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して１分間にわたって滴下添加した。反応混合物を、０℃で０．５時間、次いで、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル／１：１）は、依然として出発材料を示した。追加のＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．４７ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して１分間にわたって滴下添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。次に、混合物を２ｍＬのメタノールでクエンチし、室温で１０分間撹拌した。溶媒を回転蒸発によって除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム：１０ｇ、ヘキサン：２ＣＶかけて酢酸エチル／１：１から１００％、次いで、２０ＣＶかけて１００％酢酸エチル）によって精製して、化合物１６２を白色泡状物（９６ｍｇ、６２％）として得た。合成は図６２に例示されている。
【０２９２】
実施例７０
化合物１６３の合成：
化合物１６３は、脱保護ステップにおいてＡＭＡまたはメタノール性アンモニアを水酸化アンモニウムの代わりに使用したことを除き、標準的なトリホスフェート合成方法（下記参照）を使用する化合物１６２のリン酸化後に得た。これを、以下の標準的な手順に従って、色素で標識された生成物７８にさらに変換した。化合物７８は、化合物１６５から９７％収率で得た。ＨＲＭＳ−ＥＳ−計算値Ｃ６７Ｈ９６Ｎ９Ｏ２７Ｐ３Ｓ６（Ｍ−Ｈ）１７４３．３９５、測定値１７４３．３９０。合成は図６２に例示されている。
【０２９３】
実施例７１
化合物１６９の合成：
１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１６７（３．１２０ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）、３０．０ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２、３−Å分子篩（５．０ｇ）およびシクロヘキサネセン（０．７０ｍＬ、６．９ｍｍｏｌ）を投入した。得られた混合物を、窒素雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。次いで、反応フラスコを氷浴に載置した。これに、ＳＯ２Ｃｌ２（８．５ｍＬ、ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ、１．５当量）を、シリンジを介してゆっくりと添加し、０℃で１時間撹拌した。次に、さらに４．０ｍＬの１Ｍ  ＳＯ２Ｃｌ２を添加し、４０分間撹拌して、化合物１６８への完全変換を確実にした。温度を１０℃近くに保ちながら、揮発物を真空下で除去した。得られた固体を２０ｍＬの乾燥ＤＭＦに再懸濁し、窒素雰囲気下に保った。
【０２９４】
別個のフラスコ中、（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタンチオール（３．０２８ｇ、１４．１５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で乾燥ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨ（５６６ｍｇ、油中６０％、１４．１５ｍＭ）で処理して、灰色のスラリーを生成した。これに、化合物１６８溶液を一度に添加し、窒素雰囲気下、室温で２．５時間撹拌した。次いで、反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）とともにｃｅｌｉｔｅ（登録商標）−Ｓ（２０ｇ）に通して濾過した。次いで、酢酸エチル溶液を蒸留水（３×２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮し、１２０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆＧｏｌｄ上でのフラッシュクロマトグラフィー、勾配：ヘキサン：酢酸エチル（７：３から３：７）によって精製した。標的化合物（１６９）を白色固体（１．４３ｇ、３５．５％収率、Ｒｆ：０．５、ヘキサン：酢酸エチル／１：１）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：    δＨ  ７．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ６．０９  （ｍ，  １Ｈ），  ６．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．６７−４．５１  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３０  （ｍ，  １Ｈ），    ４．２２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．００  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８０−３−６０  （ｍ，  １１Ｈ），  ２．３１  （ｍ，  １Ｈ），  １．８３  （ｍ，  １Ｈ），  ０．８０  （ｍ，  ９Ｈ）および０．０１  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図６４に例示されている。
【０２９５】
実施例７２
化合物１７０の合成：
化合物１６９（１．４３ｇ  １．９９ｍｍｏｌ）を、高真空下、Ｐ２Ｏ５上で１２時間乾燥させ、磁気撹拌子および窒素ガス源を装備したフラスコ中の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。これに、ジメチルジスルフィド（０．８９ｍＬ、９．８８ｍｍｏｌ）を添加し、反応フラスコを氷浴上で撹拌した。次いで、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＳＦ、４３０ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１．０時間撹拌した。反応混合物を５００ｍＬ分液漏斗に移し、１００ｍＬのＮａＨＣＯ３の５０ｍＭ水溶液でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（２×１５０ｍＬ）で抽出した。有機分をＮａ２ＳＯ４で脱水し、回転蒸発によって濃縮した。粗生成物を、ヘキサン−酢酸エチル（８：２から３：７）勾配を使用するシリカゲルカラム（８０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆゴールド）上で精製して、０．６２２ｇｍの化合物１７０（５４％収率、ＲＦ＝０．６、ヘキサン：酢酸エチル／１：１）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δＨ  ７．９９  （ｂｒｓ，  １Ｈ，  ＮＨ），  ７．９８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６９  （ｍ，  ２Ｈ），    ４．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３３  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８８  （ｍ，  １Ｈ），  ０．７８  （ｍ，  ９Ｈ）および０．１０  （ｍ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ。合成は図６４に例示されている。
【０２９６】
実施例７３
化合物１７１の合成：
磁気撹拌子を装備した１００ｍＬ丸底フラスコに、化合物１７０（０．６２３ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、Ｐ２Ｏ５上で１２時間真空乾燥させたもの）および無水ＴＨＦ（２０．０ｍＬ）を投入し、窒素雰囲気下で氷浴に載置した。ＴＢＡＦ（１．２７ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液、１．２７ｍｍｏｌ）を、シリンジを介してゆっくりと添加した。反応混合物を０℃で１．５時間撹拌し、さらに０．９ｍＬのＴＨＦ中１Ｍ  ＴＢＡＦ溶液を添加し、０℃で合計４時間撹拌した。次いで、反応混合物を分液漏斗に移し、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）でクエンチした。得られた混合物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。勾配ヘキサン中７：３から３：７酢酸エチルを使用する８０ｇのＲｅｄｉＳｅｐＲｆカラム上でのシリカゲルカラムクロマトグラフィー後、生成物１７１を白色粉末として６３％収率（３１１ｍｇ）で得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （メタノール−ｄ４）：  δＨ  ８．１６  （ｓ，  １Ｈ），  ６．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７９  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．６９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．３６  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．３２  （ｍ，  １Ｈ）および２．０８  （ｍ，  １Ｈ）  ｐｐｍ，    ＬＲＭＳ−ＥＳ−：  Ｍ−Ｈ測定値ｍ／ｚ  ４６８．０  Ｄａ。合成は図６４に例示されている。
【０２９７】
実施例７４
化合物１７２の合成：
生成物１７２は、標準的なトリホスフェート合成方法を使用する化合物１７１のリン酸化後、５８％収率で得た。ＬＲＭＳ計算値Ｃ１４Ｈ２１Ｎ３Ｏ１４Ｐ３Ｓ２−（Ｍ−Ｈ）、６１１．９７、測定値６１２．１５。化合物１７１を、標準的な方法のセクション（下記参照）において記述されている標準的な手順に従って、色素で標識された生成物（７４）にさらに精巧化した（図６５）。化合物１７４は、２ステップにて７４％収率で得た（ＨＲＭＳ−ＥＳ−計算値Ｃ３２Ｈ５５Ｎ５Ｏ２１Ｐ３Ｓ４−（Ｍ−Ｈ）１０６６．１５、測定値１０６６．４２）。化合物７４は、６２％収率で得た（ＨＲＭＳ−ＥＳ−計算値Ｃ５９Ｈ８０Ｎ７Ｏ２５Ｐ３Ｓ４−（Ｍ−Ｈ）、１５０７．３３０、測定値１５０７．３２５）。
【０２９８】
実施例７５
トリホスフェート合成のための標準的方法：
高真空下、Ｐ２Ｏ５上で予め乾燥させたヌクレオシド（１６０μｍｏｌ）およびプロトンスポンジ（１．５当量）を、Ｎ２雰囲気下、２５ｍＬ梨型フラスコ中のトリメチルホスフェート（０．８ｍＬ）に溶解し、すべての固体が完全に溶解するまで、２０分間撹拌した。次いで、フラスコを氷水浴に載置して、反応物を（−５から０℃）にした。次いで、ＰＯＣｌ３（１．５当量）を、シリンジを介して一度に添加し、反応物を１時間撹拌した。
【０２９９】
ｎ−ブチルアンモニウムピロホスフェート（０．３６ｇ）、ｎ−Ｂｕ３Ｎ（０．３６ｍＬ）および無水ＤＭＦ（１．３ｍＬ）の混合物を、１５ｍＬコニカルチューブ中で調製して、濃厚なスラリーを生成した。完全に溶解したら、これを、激しく撹拌した混合物に迅速に一度に添加し、室温で１５分間撹拌した。
【０３００】
次いで、反応混合物を、２５０ｍＬ丸底フラスコ中の１００ｍＬの０．１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液に注ぎ入れ、室温で３時間撹拌した。次いで、これを、真空中で２５ｍＬまで濃縮し、２５ｍＬの水酸化アンモニウム（２８〜３０％ＮＨ３含有量）で室温で８時間処理した。揮発物のほとんどを減圧下で除去した後、反応粗製物を０．１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液（３０ｍＬ）に再懸濁し、Ｃ１８分取−ＨＰＬＣ（３０×２５０ｍｍ、Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅカラム、方法：０から２分１００％Ａ、続いて、７０分間にわたって５０％Ｂ、流量２５ｍＬ／分；Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝ＡＣＮ）によって精製した。ＨＰＬＣグレード水（２０ｍＬ）に溶解した後、標的画分を凍結乾燥し、合わせた。この半純粋な生成物を、ＰＬ−ＳＡＸ分取カラム上でのイオン交換ＨＰＬＣ（方法：０から５分１００％Ａ、次いで、線形勾配７０分間にわたって最大７０％Ｂ、ここで、Ａ＝水中１５％アセトニトリル、Ｂ＝１５％アセトニトリル中０．８５Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液）によってさらに精製した。最終精製は、Ｃ１８分取ＨＰＬＣによって上述した通りに行った。ヌクレオシドトリホスフェートは、凍結乾燥後に２０〜６５％収率で得た。
【０３０１】
（実施例７６）
ＤＭＴＳＦを使用する３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰの３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰへの変換のための標準的な方法：
５０ｍＬコニカルチューブに、３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰ（３．８０ｍＬのＨＰＬＣグレード水中５．２５ミリモル濃度溶液、２０μｍｏｌ）およびｐＨ＝４．６５酢酸塩緩衝液（５．２０ｍＬ）を投入し、９．０ｍＬのＤＭＴＳＦ（ｐＨ＝４．６５酢酸塩緩衝液中８０ミリモル濃度溶液）と迅速に合わせた。得られた混合物を室温で２時間振とうし、反応物を２．０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液によってクエンチし、３０×２５０ｍｍ  Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅカラム上での分取ＨＰＬＣ、方法：０から２．０分１００％Ａ、続いて、線形勾配７０分間にわたって最大５０％Ｂ、流量：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリルによって直ちに精製した。ＨＰＬＣグレード水に溶解した後、標的画分を凍結乾燥し、合わせて、ヌクレオチドに応じて５０〜７５％収率の３’−（ＯＣＨ２ＳＳＭｅ）−ｄＮＴＰを得た。３’−ＯＣＨ２Ｓ−（２，４，６−トリメトキシフェニル）メタン−ｄＮＴＰの構造例を図６６において例証する。
【０３０２】
（実施例７７）
ＮＨＳ活性化リンカーのコンジュゲーションのための標準的な方法：
ＨＰＬＣグレード水（２ｍＬ）に溶解したＭｅＳＳｄＮＴＰ−ＰＡ（１０ｕｍｍｏｌ）を、Ｎａ２ＨＰＯ４の新しく調製した０．５Ｍ水溶液（１ｍＬ）で希釈した。コニカルチューブ中、ＮＨＳ活性化リンカー（ＮＨＳ−Ａ−Ｆｍｏｃ、１１４、３５ｍｇ、２．５当量）を無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。次いで、これを、ＭｅＳＳｄＮＴＰ−ＰＡ／Ｎａ２ＨＰＯ４溶液に一度に添加し、室温で８時間撹拌した。
【０３０３】
次いで、反応物を０．１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液（２．０ｍＬ）で希釈し、ピペリジン（０．６ｍＬ）で処理した。混合物を室温で１時間撹拌し、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）でさらに希釈し、３０×２５０ｍｍ  Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅカラム上での分取ＨＰＬＣ、方法：０から２．０分１００％Ａ、続いて、線形勾配７０分間にわたって最大５０％Ｂ、流量：２５ｍＬ／分、Ａ＝５０ｍＭ  ＴＥＡＢ、Ｂ＝アセトニトリルによって迅速に精製した。ＨＰＬＣグレード水に溶解した後、標的画分を凍結乾燥し、合わせて、４５〜７５％収率のＭｅＳＳｄＮＴＰ−Ａ−ＮＨ２を得た。
【０３０４】
（実施例７８）
ＮＨＳ色素で標識するための標準的な方法：
２．０ｍＬのＨＰＬＣグレード水中のＭｅＳＳｄＮＴＰ−Ａ−ＮＨ２（４．５５μｍｏｌ）を、１５ｍＬコニカルチューブ中のＮａ２ＨＰＯ４（０．８ｍＬの０．５モル濃度水溶液）で希釈し、１．４ｍＬの無水ＤＭＦ中のＮＨＳ活性化色素（２．５当量）と合わせた。反応混合物を室温で８時間撹拌し、０．１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液（４０ｍＬ）で希釈し、３０×２５０ｍｍ  Ｃ１８  Ｓｕｎｆｉｒｅカラム上での分取ＨＰＬＣ、方法：０から５分１００％Ａ、続いて、線形勾配７０分間にわたって最大５０％Ｂ、流速２５ｍＬ／分によって精製した。ＨＰＬＣグレード水に溶解した後、標的画分を凍結乾燥し、合わせて、５０〜８０％収率の標識された生成物を得た。
【０３０５】
（実施例７９）
開裂可能なリンカーおよびマーカーの核酸塩基との結合
開裂可能なリンカーを結合させるために使用される好ましい部分の１つは、プロパルギルベースまたはアリルベースである。開裂可能なリンカーおよび色素を結合させる他の手段も企図されている。特に、色素開裂後に残留リンカーのほとんどまたは全くない結果となる塩基部分との結合が特に好ましい。開裂後に残留リンカーが電荷を担持しない結果となる塩基との結合も好ましい。これらの特色は、ヌクレオチドが、酵素によって、標識／色素の開裂後に核酸の成長鎖に効率的な様式で組み込まれることを確実にするために重要である。本発明によって企図される１つの特定の実施形態は、開裂可能な色素に結合するためのヒドロキシメチル修飾された塩基部分の使用を含む。そのような化合物の例を、図７１に示す。図７２は、色素および３’−Ｏ保護基の開裂後のヒドロキシメチル誘導体の構造を示す。
【０３０６】
（実施例８０）
開裂可能なリンカーおよび３’−Ｏ保護基の開裂
多様な開裂剤を使用して、本発明のリンカーおよび保護基を開裂することができる。例えば、多様なチオール担持化合物が、（「Ｔｈｉｏｌ−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ」、Ｓｉｎｇｈ，  Ｒ．およびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，  Ｇ．Ｍ．、Ｓｕｌｆｕｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐｓ；  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓ、Ｐａｔａｉ，  Ｓ．編、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｌｔｄ．、１９９３年、６３３〜６５８頁）において記述されている通りに使用され得る［１５］。特に、還元されたチオール基ｐＫａを有する化合物、例えばジチオブチルアミン、ＤＴＢＡを使用して、脂肪および効率的な開裂収率を実現することができる（Ｌｕｋｅｓｈら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、２０１２年、１３４巻（９号）、４０５７〜４０５９頁［１６］）。本発明の開裂を実施するために使用され得るチオール保持化合物の例を、図７３に示す。
【０３０７】
本発明のジチオ終端基およびリンカーを開裂するために好適な化合物の別のクラスは、ホスフィンである（Ｈａｒｐｐら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９６８年、９０巻（１５号）４１８１〜４１８２頁［１２］、Ｂｕｒｎｓら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９９１年、５６巻、２６４８〜２６５０頁［１３］、Ｇｅｔｚら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３巻、７３〜８０頁（１９９９年）［１４］）。本発明のジチオベースの保護基およびリンカーを開裂するために有用なホスフィンの例は、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリス−ヒドロキシメチル−ホスフィン（ＴＨＭＰ）、トリス−ヒドロキシプロピル−ホスフィン（ＴＨＰＰ）、トリス−カルボエトキシ−ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む。ある特定の場合、リンカーまたは３’−保護基のいずれかを選択的に開裂できることが所望され得る。これは、保護基およびリンカーならびに開裂試薬の選択を設計することによって実現することができる。例えば、３’−アジドメチルエーテル保護基とジスルフィドリンカー保持ヌクレオチドとの組合せを、この目的のために使用することができる。この場合、ジスルフィド架橋の選択的開裂は、チオールベースの開裂試薬を使用することによって遂行することができ、３’−アジドメチルエーテル保護基の除去は、ＴＣＥＰ等のホスフィンを使用することによって実現することができる。そのような手順の例を、図７４、図７５および図７６において例証する。図７４は、化学反応が起こるスキームおよび形成された化合物の構造を示し、図７５は、各段階において収集されたＨＰＬＣクロマトグラムを、図７６は、各ピークから抽出された吸収スペクトルを示す。ステップＡ）標識された３’−Ｏ−保護ヌクレオチドは、両方のヌクレオチド（２８０ｎｍ；プロパルギル化合物についての最大は２８０〜２９０ｎｍに向かってシフトすることに留意されたい）ならびに色素（５７５ｎｍ）において、１つのピーク（１）および吸収を示す。ステップＢ）ＤＴＴによる処理は、色素の吸収ピーク（５７５ｎｍ）を持ち、より遅く移動する（より疎水性）ピーク２、ならびに（２７８ｎｍ）吸収およびより親水性の特徴によるより速い移動を有するピーク３を生成する。ステップＣ）ＴＣＥＰによる追加の処理は、２７８の吸収最大を持ち、３’−ＯＨ保護基の喪失と一致するさらに低い保持時間で色素のないピーク４を生成する。開裂された色素は追加のピーク（５、６）に分割するが、両方のピークが同一の吸収を有する。
【０３０８】
開裂の別の例を、図７７および図７８に示す。図７７は、３’末端におけるヌクレオチド担持ジチオベースの保護基およびジチオベースのリンカーを使用する開裂反応のためのスキームを示す。この図が示すように、開裂反応は、１ステップまたは２ステッププロセスとして実施され得る。図７８は、多様な開裂剤：ジチオコハク酸、Ｌ−システイン、ＤＴＴおよびシステアミンを使用して実施された開裂実験の結果を示す。図７８（Ａ）は、出発材料ならびに開裂剤ジチオコハク酸、Ｌ−システイン、ＤＴＴおよびシステアミンとのインキュベーション後の反応混合物について発生したＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７８（Ｂ）は、Ｌ−システイン、ＤＴＴおよびシステアミンの場合、リンカーおよび３’−保護基の両方の完全開裂、ならびにジチオコハク酸の場合、３’−Ｏ−保護基の選択的開裂を示す、反応混合物の同定された組成物を示す。これは、選択性が、リンカーの構造、保護基、および開裂剤の性質を選択することによって（すなわち、ＳＨ基のｐＫａおよび立体障害の程度を変動させることで）実現できることを示している。これらに加えて、ビス（２−メルカプトエチル）スルホン（ＢＭＳ）およびＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン（ＤＭＨ）等の多様な好適な開裂剤を使用することができる（Ｓｉｎｇｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、２２巻、１０９〜１１５頁（１９９４年）［１７］）。反応を、セレノールの包含によってさらに触媒することができる（Ｓｉｎｇｈら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９５年１１月２０日；２３２巻（１号）：８６〜９１頁［１８］）。水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ素（Ｓｔａｈｌら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、１９５７年、２９巻（１号）、１５４〜１５５頁［１９］）およびアスコルビン酸（Ｎａｒｄａｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻、８８２５〜８８２８頁（２００１年）［２０］）をこの目的のために使用することもできる。加えて、ジスルフィドおよびチオレダクターゼ等、ジスルフィド結合の開裂のための酵素的方法も周知であり、本発明の化合物で使用することができる（Ｈｏｌｍｇｒｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２５２巻、１９９５年、１９９〜２０８頁［２１］）。
【０３０９】
（実施例８１）
スカベンジャー
使用される開裂剤に従って、当業者は、開裂反応が完了した後に開裂剤の超過分を除去すると予想されるスカベンジャー剤を選択する必要がある。例えば、チオール保持開裂剤については、遊離ＳＨ基と反応することができるスカベンジャーが使用され得る。例えば、ヨードアセトアミドまたはマレイミド誘導体等のアルキル化剤が使用され得る（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６２３，５９８号［４７］）。水素化ホウ素には、当業者は、ケトン保持化合物、例えばレブリン酸または同様の化合物を使用し得る。最後に、超過の開裂剤を非反応性種に酸化させるための酸化試薬、例えば過ヨウ素酸塩を使用してもよい（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００７年、１２巻（３号）、６９４〜７０２頁［４８］）。
【０３１０】
（実施例８２）
モジュラー合成
本発明の標識されたヌクレオチドは、合成のいくつかのステップを要し、多様な色素を異なる塩基に連結することを伴う。段階的プロセスよりもモジュラー方式でリンカーおよび色素結合を実施できることが望ましい。モジュラーアプローチは、一端では保護基および他端では活性化基とのリンカー部分のプレビルディングを伴う。次いで、そのようなプレビルトリンカーを使用して、プロパルギルアミンヌクレオチドとカップリングし、マスクされたアミン基を脱保護し、次いで、活性化色素をカップリングすることができる。これは、段階的合成と比較して、より少ないステップおよびより高い収率という利点を有する。例えば、図１３における化合物３２は、活性化反応性基（炭酸ジスクシンイミジル）およびマスクされた／保護されたアミン（Ｆｍｏｃ）を有する、開裂可能な官能基を含む予め活性化したリンカーの例である。プロパルギルアミン（ｐｒｏｐａｒｇｙｌａａｍｉｎｅ）ヌクレオチド上の遊離アミンとカップリングした後、保護基は、例えば塩基（アンモニア水溶液、ピペリジン）による処理によって好都合に除去され得、活性化（ＮＨＳ）色素分子とカップリングすることができる。
【０３１１】
（実施例８３）
本発明のリンカーを試験して、それらの疎水性を測定した。化合物のｌｏｇＰ値は、ｎ−オクタノールおよび水ログの間のその分配係数の対数（ｃｏｃｔａｎｏｌ／ｃｗａｔｅｒ）であり、化合物の親水性（またはその欠如）の十分に確立された尺度である［４９］。低い親水性およびしたがって高いｌｏｇＰ値は、乏しい吸収または浸透を引き起こす。この場合、ｌｏｇＰ値は予測ソフトウェアを使用して算出され、以下の表は、リンカー（図２５におけるもの等）が疎水性リンカーであり、一方、一部の商業的に使用されているリンカーが親水性であることを示す結果を示す。
【表１】
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【０３１２】
これらの好ましい実施形態を参照して本発明について記述してきたが、他の実施形態でも同じ結果を実現することができる。本発明の変形および修正は、当業者には明白となり、添付の特許請求の範囲において、すべてのそのような修正および同等物を網羅することが意図されている。上記で引用したすべての出願、特許および刊行物の、ならびに対応する出願の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
【数１−１】
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【数１−２】
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【数１−３】
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【数１−４】
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【数１−５】
2019500324.tif 000088
【数１−６】
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【図１】
2019500324.tif 000121
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【国際調査報告】
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