(57)【要約】  本発明は、（ａ）ボツリヌス毒素及び（ｂ）非架橋ヒアルロン酸を含む組成物、ならびにジストニア、痙縮、及び／または皺の処置または防止のための当該組成物の使用に関する。さらに本発明は、皺を美容的に滑らかにするまたは防止するための方法であって、本発明の組成物を投与するステップを含む方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ボツリヌス神経毒素、及び
ｂ）平均分子量が２．５ＭＤａ〜４．５ＭＤａである非架橋ヒアルロン酸
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ボツリヌス神経毒素がＡ型ボツリヌス神経毒素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記非架橋ヒアルロン酸の多分散指数が１．１〜４．０である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
１ミリグラムの非架橋ヒアルロン酸当たり２〜４単位のボツリヌス神経毒素または２０〜４０単位のボツリヌス神経毒素を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ｃ）塩、
ｄ）任意選択により神経毒素安定剤、
ｅ）結晶化阻害剤、
ｆ）緩衝液、及び／または
ｇ）ラジカル捕捉剤
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
２５℃において１Ｈｚの発振周波数を用いて決定される場合の動的粘度が１．５〜４Ｐａ・ｓである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
２００〜５００単位のボツリヌス神経毒素が投与される、ジストニアの処置または防止における使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
５００〜１０００単位のボツリヌス神経毒素が投与される、痙縮の処置または防止における使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
４０〜５０単位のボツリヌス神経毒素が投与される、皺の防止または処置における使用のための請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
適用してから最大２４時間投与部位に残存する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ボツリヌス神経毒素が１２時間以内に放出される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
４〜９ヵ月ごとに投与される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳類の皺、好ましくは広範な模倣活動の結果である皺を、美容的に滑らかにするまたは防止するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜６に記載の組成物を投与するステップと、
（ｉｉ）４〜９ヵ月後に前記投与を繰り返すステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
前記組成物が４０〜５０単位のボツリヌス神経毒素を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
皺、好ましくは模倣活動の結果である皺を滑らかにするまたは防止するための請求項１〜６に記載の組成物の美容的使用であって、適用される前記組成物が４０〜５０単位のボツリヌスを含む、美容的使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）ボツリヌス毒素及び（ｂ）非架橋ヒアルロン酸を含む組成物、ならびにジストニア、痙縮、及び／または皺の処置または防止のための当該組成物の使用に関する。さらに本発明は、皺を美容的に滑らかにするまたは防止するための方法であって、本発明の組成物を投与するステップを含む方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
「ボツリヌス神経毒素」（ＢｏＮＴ）は、いくつかの非常に類似した神経毒性タンパク質群を指す一般的用語とみなすことができる。天然に存在するボツリヌス神経毒素は、嫌気性で芽胞を形成する細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍにより産生され、まれに他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．  ｂａｒａｔｉ、及びＣ．  ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｅ）により産生される。現在、８種の異なる血清型の毒素が存在し、それらはＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ型として知られている。これらの型の一部、例えばＡ、Ｂ、Ｅ、及びＦは人類にとって有毒であるが、Ｃ、Ｄ、及びＧ型は、例えば鳥類、ウマ、ウシ、及び霊長類に毒性をもたらすことの方が多い。
【０００３】
ボツリヌス毒素複合体は、２種の成分、すなわち麻痺作用を起こす神経毒素成分及び関連する無毒性細菌タンパク質成分を含む高分子タンパク質複合体の形態で存在し、無毒性細菌タンパク質成分は、ヘマグルチニンタンパク質及び非ヘマグルチニンタンパク質を含むコートタンパク質としてみなすことができる。ボツリヌス毒素複合体の分子量は、Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧのボツリヌス毒素血清型によって様々であり、約３００ｋＤａ〜約９００ｋＤａである。治療応用に関しては、コートタンパク質は、顕著な機能を有さず、神経毒性特性に寄与しないことが報告されている。神経毒素成分は不活性の１本鎖前駆体（非切断ポリペプチド）として発現し、分子量は全ての既知のボツリヌス毒素血清型について約１５０ｋＤａである。この１本鎖前駆体は、タンパク質切断により活性化して、ジスルフィド結合した２本鎖タンパク質を生成する。約５０ｋＤａの軽鎖タンパク質は触媒ドメインを含み、亜鉛を含有するメタロプロテイナーゼであり、また亜鉛−エンドペプチダーゼとして作用する。約１００ｋＤａの重鎖タンパク質は、トランスロケーションドメイン及び受容体結合ドメインを含む。重鎖は、前シナプスコリン作動性神経終末への結合、とりわけ運動終板または神経筋接合部の前シナプス部分への結合や、毒素の細胞内への内部移行を媒介する。
【０００４】
前述の内容に関して、神経筋接合部に輸送されると、重鎖の受容体結合ドメインはコリン作動性特異性を提供し、毒素を前シナプス受容体に結合させる。次に、神経毒素は受容体が媒介するエンドサイトーシスを介して神経細胞に進入し、神経細胞のエンドサイトーシス小胞内にとどまる。小胞の酸性化に伴い、軽鎖は細胞質内に移動し、分離する。軽鎖タンパク質は、亜鉛−エンドペプチダーゼとして作用し、小胞融合器官の種々のタンパク質を分離することができ、小胞のエキソサイトーシスを防止するサブセクションである。詳細には、軽鎖の毒性部分は、ＢｏＮＴ血清型に応じて、ＳＮＡＲＥタンパク質複合体（ＳＮＡＰ−２５シンタキシン及びＶＡＭＰにより形成される）を形成する１つ以上のタンパク質を切断することができる。通常、ＳＮＡＲＥ複合体は膜と融合し、それによって神経伝達物質アセチルコリンが細胞から離れることが可能となる。神経伝達物質アセチルコリンがシナプス間隙内に放出されることにより、神経インパルスが筋肉に伝達され、それにより筋肉が収縮するように信号が送られる。ＳＮＡＲＥ複合体の形成がタンパク質の切断を通じて実質的に防止されて、例えばＢｏＮＴ／Ａによる当該複合体が形成されると、アセチルコリンの放出が停止する。結果的に神経と筋肉との間の伝達がブロックされ、最終的に麻痺（ボツリヌス症）が生じる。
【０００５】
しかし、この高い毒性にもかかわらず、１９８０年代初め以降、ボツリヌス毒素は承認された活性医薬成分として、とりわけ特定の運動障害（例えば、瞼の攣縮（眼瞼痙攣）または斜頸（痙縮斜頸））の処置で使用されている。さらに、ボツリヌス毒素は美容医学の分野において、例えば審美的処置で使用されている。加えて、眉間の皺の処置は、心理的影響をいっそう及ぼすものと考えられる。とりわけ、この処置は大うつ病性障害に関連する症状を低減することが報告されている。
【０００６】
ボツリヌス神経毒素は本質的に不安定であり、とりわけアルカリ性条件下で不安定である。さらに、熱不安定性であることも報告されている。このため、市販のボツリヌス神経毒素は、真空乾燥または凍結乾燥した材料として保管されることが多く、また、保管やその次に考えられる再構成の間のボツリヌス神経毒素の完全性及び効力を保つために添加される賦形剤をさらに含有することが多い。
【０００７】
上述の医学的及び美容的適用に関して、ボツリヌス神経毒素は通常はおよそ３ヵ月ごとに投与しなければならない。より望ましい投与レジメンを提供するため、ＵＳ２０１２／０１４５３２Ａ１では、皮下位置におけるボツリヌス毒素の滞留時間が増加するとされるデポー製剤を提案している。実施例を参照すると、製剤に使用するヒアルロン酸は、低分子量の非架橋ヒアルロン酸及び架橋剤（例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）から調製された実質的な架橋ヒアルロン酸である。しかし、上記で提案される徐放製剤は、その適用に関し、まだ改善の余地があるように思われる。詳細には、ＵＳ２０１２／０１４５３２の製剤中の充填剤は投与部位に長時間とどまる可能性が考えられる。
【０００８】
そのため、本発明の目的は、上述の欠点を克服することである。詳細には、本発明の目的は、ボツリヌスの持続効果を延ばす、改良されたボツリヌス神経毒素製剤を提供することである。詳細には、次の投与時に前回投与時の残留分が存在しないことを保証する製剤を提供するべきである。さらに、望ましくない副作用は、防止すべきである、または少なくとも顕著に低減すべきである。
【０００９】
本発明の目的は、（ａ）Ａ型ボツリヌス神経毒素及び（ｂ）量平均分子量が２．５ＭＤａ〜４．５ＭＤａの非架橋ヒアルロン酸を含む特定の組成物によって、そして当該組成物の特定の投与レジメンによって、予想外に解決した。
【００１０】
発明者らは、従来型ボツリヌス製剤では、ボツリヌス毒素の用量を単純に増強して上記効果を達成するべく細胞への摂取量を増やすことができないのに対し、本発明の組成物では、予想外に高い量のボツリヌス神経毒素の適用が可能になることを見いだした。これは、ボツリヌス毒素の実質的部分が、リンパ排出を介してまたは直接静脈系を介して、迅速に体循環に到達すると考えられるためである。体循環に到達することにより、ボツリヌスは隣接組織に拡散し、対応する位置で副作用をもたらす可能性がある。例えば、過量の従来型ボツリヌス毒素製剤を眉間の皺に注入すると、瞼下垂が生じる恐れがある。本発明においては、投与部位に何日、何週間、または何か月もとどまるデポー製剤を使用することなく、顕著に高い量のボツリヌス神経毒素を投与することができる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、（ａ）ボツリヌス神経毒素及び（ｂ）非架橋ヒアルロン酸、好ましくは平均分子量が２．５ＭＤａ〜４．５ＭＤａであり、かつ／または固有粘度が２．７〜３．３ｍ３／ｋｇである非架橋ヒアルロン酸を含む組成物を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、ジストニアの処置における使用のために２２０〜５００単位のボツリヌス神経毒素を投与し、痙縮の処置における使用のために５００〜１０００単位のボツリヌス神経毒素を投与し、または皺の処置における使用のために４０〜５０単位のボツリヌス神経毒素を投与する、本発明の組成物を提供する。
【００１３】
加えて、本発明は、哺乳類の皺、好ましくは広範な模倣活動の結果である皺を、美容的に滑らかにするまたは防止するための方法であって、（ｉ）本発明の組成物を投与するステップと、（ｉｉ）４〜９ヵ月後に投与を繰り返すステップと、を含む方法を提供する。
【００１４】
最後に、本発明の主題は、本発明の組成物の、好ましくは模倣活動の結果である皺への美容的使用であって、適用される当該組成物が４０〜５０単位のボツリヌス神経毒素を含む、美容的使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】下記実施例の結果を示す図である。
【図２】本発明の組成物により副作用の増加なしでもたらされた延長効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の組成物は、成分として（ａ）ボツリヌス神経毒素を含む。
【００１７】
好ましい実施形態では、成分（ａ）はＢ型ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ｂ）である。Ｂ型ボツリヌス神経毒素は、小胞結合膜タンパク質２（ＶＡＭＰ２）の切断に対する触媒的挙動を示す。
【００１８】
代替的な好ましい実施形態では、成分（ａ）はＥ型ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ｅ）である。Ｅ型ボツリヌス神経毒素は２５ｋＤ（キロダルトン）のシナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ−２５）も切断するが、このタンパク質内の、例えばＡ型ボツリヌス神経毒素と比較して異なるアミノ酸配列を標的とする。Ｅ型ボツリヌス神経毒素は８種のサブタイプＢｏＮＴ／Ｅ１〜ＢｏＮＴ／Ｅ８を含み、組換えボツリヌス神経毒素としても存在し得る。Ｅ型ボツリヌス神経毒素の配列及び調製は、例えばＷＯ２０１４／０６８３１７で開示されている。詳細には、配列番号１、２、及び３に対し言及がなされている。
【００１９】
とりわけ好ましい実施形態では、本発明の組成物は、成分として（ａ）Ａ型ボツリヌス神経毒素を含む。
【００２０】
好ましくは、Ａ型ボツリヌス神経毒素は約１５０ｋＤａの神経毒素成分を含み、当該神経毒素成分は上述の軽鎖（約５０ｋＤａ）及び重鎖（約１００ｋＤａ）鎖、ならびに任意選択により１種以上のコートタンパク質（例えば、ヘマグルチニンまたは非ヘマグルチニン）に分離することができる。好ましい実施形態では、Ａ型ボツリヌス神経毒素複合体の量分子量（ｗｅｉｇｈｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）は、３００ｋＤａ〜９００ｋＤａ、特に３００、６００、または９００ｋＤａとすることができる。代替的に、好ましいＡ型ボツリヌス神経毒素複合体は、神経毒素成分及びさらなるタンパク質（例えばヘマグルチニンまたは非ヘマグルチニンタンパク質）を含む。
【００２１】
Ａ型ボツリヌス神経毒素は、非常に有毒な化合物と考えられる。マウスにおけるＬＤ５０値は、静脈内投与時の約３０ｐｇ／ｋｇから吸入時の３ｎｇ／ｋｇに及ぶ。ボツリヌスの用量は生物学的活性に関連するものであり、生物学的単位（Ｅ）で、それぞれマウス単位（ＭＵ）で測定される（１生物学的単位（Ｅ）は１マウス単位（ＭＵ）に対応する）。１生物学的単位（Ｅ）は腹部に注入する毒素の量に対応し、この量は、体重が１８〜２０グラムのメスのＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス群の５０％を死亡させるのに十分な量である。
【００２２】
上述のように、Ａ型ボツリヌス神経毒素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍの培養物から取得することができる。タンパク質は培養液から沈殿させ、遠心処理、沈殿、及び吸着の数ステップにより精製することができる。精製した毒素は−７０℃で保管し、その後、毒素の有効性を失うことなく解凍することができる。固体毒素と滅菌等張食塩水の溶液は、冷蔵庫に最大４時間、その効力を失うことなく保管することができる。この再構成は、特定の量の０．９％食塩水を特定の量のボツリヌス毒素に添加して、体積当たりの特定の濃度（通常、単位／ｍｌで計量する）のＡ型ボツリヌス神経毒素を取得するように行うことができる。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、野生型ボツリヌス毒素Ａに対し、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、そして最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大１００％の配列同一性を示すボツリヌス毒素のアイソフォーム、ホモログ、オルソログ、及びパラログを包含する。配列同一性は、信頼性の高い結果を得るのに適した任意のアルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｄ．Ｊ．  Ｌｉｐｍａｎ  ＰＮＡＳ  （１９８８）  ８５：２４４４−２４４８）によって計算することができる。配列同一性は、２つのポリペプチドまたは２つのドメイン（例えば、２つのＬＣドメインまたはその断片）を比較することによって計算することができる。修飾された組換えボツリヌス毒素も、本発明の範囲内である。ただし、本発明は、化学的に修飾されたボツリヌス毒素、例えばペグ化、グリコシル化、硫酸化、リン酸化、または任意の他の修飾（とりわけ１つ以上の表面もしくは溶媒曝露アミノ酸の修飾）によって化学的に修飾されたボツリヌス毒素も指している。本発明における使用に好適な修飾された組換えアイソフォーム、ホモログ、オルソログ、パラログ、及び変異体は生物学的に活性であり、すなわち、ニューロンに移動し、ＳＮＡＲＥ複合体（例えば、ＳＮＡＰ２５）のタンパク質を切断して、その筋肉麻痺効果を発揮することができる。
【００２４】
本発明の組成物はさらに、成分（ｂ）としてヒアルロン酸を含む。ヒアルロン酸は、以下の構造式によって表すことができるグリコサミノグリカンである。
【００２５】
【化１】
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【００２６】
したがって、ヒアルロン酸は、２つのブドウ糖誘導体、すなわちＤ−グルクロン酸及びＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンから構成される二糖のポリマーとみなすことができる。この二糖において、グルクロン酸はＮ−アセチルグルコサミンに対しβ（１→３）グリコシド結合し、Ｎ−アセチルグルコサミンは隣のグルクロン酸に対しβ（１→４）グリコシド結合している。
【００２７】
発明者らは、本発明の組成物が特定のグレードのヒアルロン酸を含むべきであることを見いだした。本発明で使用するヒアルロン酸はかなりの高分子量を有するが、この高分子量は架橋によって達成されるのではなく、それぞれの長さを有する直鎖によって達成される。
【００２８】
概して、本発明において成分（ｂ）として使用するヒアルロン酸は、非架橋ヒアルロン酸である。好ましい実施形態では、ヒアルロン酸の平均分子量は、２．５ＭＤａ〜４．５Ｍｄａ、好ましくは２．７〜４．２ＭＤａ、より好ましくは３．０〜４．０ＭＤａ、とりわけ３．３〜３．８ＭＤａである。
【００２９】
ヒアルロン酸の平均分子量は、所定の固有粘度から計算した。そのため、「粘度平均分子量」と呼ぶこともできる。
【００３０】
ヒアルロン酸の固有粘度は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．６．０、２．２．９に従って、Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ毛管粘度計を２０℃で使用し、また溶媒として水を使用して測定した。それぞれの平均分子量Ｍは、マーク−ホウィンクの関係式［η］＝ＫＭａ（式中、ηは固有粘度であり、ｌｏｇ（Ｋ）は切片であり、ａは傾きである）に従って計算した。好ましくは、非架橋ヒアルロン酸について、ａを０．７に設定することができる。
【００３１】
好ましい実施形態では、ヒアルロン酸（ｂ）は、（上述の分子量の代わりに、または上述の分子量に加えて）その固有粘度によって特徴づけることができる。好ましくは、固有粘度は２．７〜３．３ｍ３／ｋｇ、より好ましくは２．８０〜３．２０ｍ３／ｋｇ、さらにより好ましくは２．９０〜３．１５ｍ３／ｋｇ、とりわけ約３．０９ｍ３／ｋｇである。粘度は、上述のように決定される。
【００３２】
本発明において「非架橋ヒアルロン酸」という用語は、その全ての医薬的に許容される塩、水和物、及び／または溶媒和物を含むことに留意されたい。好ましくは、非架橋ヒアルロン酸はナトリウム塩の形態で存在する。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、非架橋ヒアルロンの多分散指数は１．０〜５．０、好ましくは１．１〜４．０、より好ましくは１．２〜３．５、さらにより好ましくは１．３〜３．０、特に１．４〜２．５、とりわけ１．５〜２．０とすることができる。
【００３４】
化学作用に関して、分散度は分子または粒子のサイズにおける異質性の次元としてみなすことができる。均一な収集において、対象物は同じサイズ、形状、または質量を有する。多分散指数（ＰＤＩ）または単に分散指数Ｄは、所与のポリマーサンプルにおける分子質量の分布の尺度であり、以下の式に従って計算される。
ＰＤＩ＝Ｍｗ／Ｍｎ
（式中、
Ｍｗは量平均分子量であり、
Ｍｎは数平均分子量である）
Ｍｗ及びＭｎは共に、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定することができる。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、非架橋ヒアルロン酸１ミリグラム当たり２〜４単位、好ましくは２．２〜３．８単位、より好ましくは２．４〜３．６単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素を含有することができる。
【００３６】
代替的な好ましい実施形態では、本発明の組成物は、非架橋ヒアルロン酸１ミリグラム当たり２０〜４０単位、好ましくは２２〜３８単位、より好ましくは２４〜３６単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素を含有することができる。
【００３７】
本発明の組成物は、様々な他の医薬的に許容される物質、例えば塩、ラジカル捕捉剤、神経毒素安定剤、結晶化阻害剤、糖、アミノ酸、ビタミン、麻酔剤、界面活性剤、浸透圧調節剤などを含むことができる。本明細書で使用する「医薬的に許容される」という用語は、哺乳類、特にヒトの組織との接触に好適な化合物または物質を指す。本明細書で使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、オープンエンドな用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及びクローズドな用語「（から）なる（ｃｏｎｓｉｓｔ  （ｏｆ））」の両方を包含するように意図されている。
【００３８】
一実施形態では、本発明の組成物は好ましくは
ｃ）塩
ｄ）神経毒素安定剤
ｅ）結晶化阻害剤
ｆ）緩衝液及び／または
ｇ）ラジカル捕捉剤
を含む。
【００３９】
塩（ｃ）は、任意の生理学的に許容される塩、好ましくはナトリウム塩、より好ましくは塩化ナトリウムとすることができる。
【００４０】
神経毒素安定剤（ｄ）は、ボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素タンパク質を安定させ、当該タンパク質の分解を防止する化合物としてみなすことができる。例としてはヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）及びゼラチンなどのタンパク質があり、ＨＡＳが好ましい。
【００４１】
代替的な好ましい実施形態では、本発明の組成物はいかなる神経毒素安定剤も含有せず、好ましくはヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）を含まない。  
【００４２】
結晶化阻害剤（ｅ）は、例えば凍結乾燥ステップ中に、神経毒素の結晶化を防止する物質である。結晶化阻害剤の例としては糖、例えばブドウ糖、果糖、ガラクトース、トレハロース、ショ糖、及び麦芽糖がある。ブドウ糖、果糖、及びショ糖が好ましく、とりわけショ糖が好ましい。
【００４３】
緩衝液（ｆ）は、当該組成物が溶液、好ましくは水溶液の形態をとる場合に、特定のｐＨ値を提供して痛みを伴わない適用（例えば、注射）を達成するために使用する物質である。好ましくは、当該組成物が水溶液の形態をとる場合、緩衝液は６．１から７．６の間、好ましくは６．２から７．２の間、より好ましくは６．３から７．１の間、とりわけ６．５から７．０の間のｐＨ値を提供する。緩衝液は、例えばリン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液などとすることができる。
【００４４】
ボツリヌス毒素の分解を防止するまたは遅らせる化合物は、ラジカル捕捉剤（ｇ）とみなすことができる。ラジカル捕捉剤の例としては、ポリオール（例えば、グリセリン）及び糖アルコール（例えば、マンニトール、イノシトール、ラクチトール、イソマルト、キシリトール、エリスリトール、及びソルビトール）がある。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物はマンニトールを含まない。
【００４６】
一実施形態では、本発明の組成物は好ましくは
ａ）２０〜４０単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素
ｂ）２．５〜９ｍｇの非架橋ヒアルロン酸
ｃ）３．６〜２０ｍｇの塩、好ましくは塩化ナトリウム
ｄ）０〜１．５ｍｇまたは０．２〜１．５ｍｇの神経毒素安定剤、好ましくはヒト血清アルブミン
ｅ）０．４〜０．９４ｍｇの結晶化阻害剤
ｆ）０．３〜０．６ｍｇの緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液
ｇ）２０〜４０ｍｇのラジカル捕捉剤
を含有する。
【００４７】
上述の組成物は好ましくは凍結乾燥物の形態をとることができ、それによって組成物はボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素の有効性を失うことなく保管することができる。凍結乾燥したボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素を含む組成物は、当該凍結乾燥物を滅菌食塩水で再構成することによって取得することができる。この再構成は好ましくは、０．９％食塩水を用いて、好ましくは１ｍｌの量で行う。水性組成物の濃度は、好ましくは以下の範囲とすることができる。
ａ）１ｍｌ当たり２０〜４０単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素
ｂ）０．２５〜０．９％  ｗ／ｖのヒアルロン酸
ｃ）０．３６〜２．０％  ｗ／ｖの塩、好ましくは塩化ナトリウム
ｄ）０〜０．１５％  ｗ／ｖまたは０．０２〜０．１５％  ｗ／ｖの神経毒素安定剤、好ましくはヒト血清アルブミン
ｅ）０．０４〜０．０９４％  ｗ／ｖの結晶化阻害剤
ｆ）０．０３〜０．０６％  ｗ／ｖの緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液
ｇ）２．０〜４．０％  ｗ／ｖのラジカル捕捉剤
【００４８】
代替的な実施形態では、本発明の組成物は好ましくは
ａ）２００〜４００単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素
ｂ）２．５〜９ｍｇの非架橋ヒアルロン酸
ｃ）３．６〜２０ｍｇの塩、好ましくは塩化ナトリウム
ｄ）０〜１５ｍｇまたは０．２〜１．５ｍｇの神経毒素安定剤、好ましくはヒト血清アルブミン
ｅ）４〜９．４ｍｇの結晶化阻害剤
ｆ）０．３〜０．６ｍｇの緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液
ｇ）２００〜４００ｍｇのラジカル捕捉剤
を含有することができる。
【００４９】
上の上述の代替組成物は好ましくは凍結乾燥物の形態をとることができ、それによって組成物はボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素の効力を失うことなく保管することができる。ボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素を含む組成物は、当該凍結乾燥物を滅菌食塩水で再構成することによって取得することができる。この再構成は好ましくは、０．９％食塩水を用いて、好ましくは１ｍｌの量で行う。水性組成物の濃度は、好ましくは以下の範囲とすることができる。
ａ）１ｍｌ当たり２００〜４００単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素
ｂ）０．２５〜０．９％  ｗ／ｖのヒアルロン酸
ｃ）０．３６〜２．０％  ｗ／ｖの塩、好ましくは塩化ナトリウム
ｄ）０〜１．５％  ｗ／ｖまたは０．２〜１．５％  ｗ／ｖの神経毒素安定剤、好ましくはヒト血清アルブミン
ｅ）０．４〜０．９４％  ｗ／ｖの結晶化阻害剤
ｆ）０．０３〜０．０６％  ｗ／ｖの緩衝液、好ましくはリン酸緩衝液
ｇ）２０〜４０％  ｗ／ｖのラジカル捕捉剤
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は２つのサブ組成物を含む場合がある。第１のサブ組成物は、好ましくは成分ａ）、ｄ）、ｅ）、及びｇ）を、使用の際に０．９％滅菌食塩水で再構成される凍結乾燥物の形態で含むことができる。代替的な好ましい実施形態では、凍結乾燥物の形態の第１のサブ組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含まない。第２のサブ組成物は、好ましくは成分ｂ）及びｆ）の水溶液を含むことができる。両方のサブ組成物は、好ましくは合わせて、適用前に実際の組成物を取得することができる。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明の組成物はすぐに使用可能な組成物として存在することができ、すなわち本発明の組成物は、直接患者に投与することができる形態で存在することができる。好ましい実施形態では、当該組成物は充填済のガラスまたはシリンジの形態で存在することができ、当該充填済のガラスまたはシリンジは好ましくは、０〜１５℃、より好ましくは２〜１０℃の温度で保管することができる。
【００５２】
再構成された溶液の形態において、本発明の組成物は、２５℃において１Ｈｚの発振周波数を用いて決定する場合、好ましくは、１．５〜４Ｐａ・ｓ、好ましくは１．７〜３．８Ｐａ・ｓ、より好ましくは２．０〜３．０Ｐａ・ｓの動的粘度を有することができる。この溶液の粘度は、例えば２５〜３２ゲージ針を通じての注射による適用を可能にする。
【００５３】
複素粘度は、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ  ３０２レオメーターを用いて決定した。発振周波数の変動は１０Ｈｚ〜０．１Ｈｚであった。１Ｈｚ及び２５℃では、２．３１〜２．４５Ｐａ＊ｓの複素粘度、８．９４８５〜９．５１３５のＧ’、及び１．２７９〜１．２８２のｔａｎ（δ）を測定した。
【００５４】
さらに、再構成された溶液の形態の場合、本発明の組成物は好ましくは、１リットル当たり２００〜４００ミリオスモル、好ましくは１リットル当たり２５０〜３７０ミリオスモル、とりわけ１リットル当たり２７０〜３２５ミリオスモルのオスモル濃度を有することができる。好ましくは、オスモル濃度は、Ｐｈ．Ｅｕｒ  ６．０、２．２．３５節に従って決定することができる。
【００５５】
本発明のさらなる主題は、好ましくは２００〜５００単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素が投与される、ジストニアの処置における使用のための本発明の組成物である。より好ましくは、２２０〜４８０、２４０〜４６０、２６０〜４４０、２８０〜４２０、３００〜４００、３２０〜３８０、もしくは３４０〜３８０単位、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば２４０〜３８０単位を使用することができる。
【００５６】
ジストニアは、筋肉の緊張の機能不全によって特徴づけられる病理学的状態を説明するものである。ジストニアは、錐体外路の運動過多と考えられる。ジストニアは、（骨格）筋肉の持続的で非自発的な収縮をもたらし得る。この機能不全は、身体の極端な張力及び不整合において表現される。ジストニアは、例えば遺伝的欠損により、独立した疾患パターンとして生じる（原発性ジストニア）場合もあれば、また他の疾患（例えば、パーキンソン病）に伴って生じる（続発性ジストニア）場合もあれば、あるいは脳卒中の結果として生じる場合もある。拡散のグレードに応じて、ジストニアは３つのタイプに分類することができる。
・限局性ジストニア（１箇所の身体部位のみに影響を及ぼす）
・分節性ジストニア（２箇所以上の身体部位に影響を及ぼす）
・全身性ジストニア（全身に影響を及ぼす）
【００５７】
限局性ジストニアの例としては、咽頭ジストニア（発声ジストニア）または頸部ジストニア（頭部／首の不整合）（あるいは頸部ジストニアは分節性ジストニアとも考えられ得る）、眼瞼痙攣（制御されない瞼のまばたき）、顎口腔ジストニア（口腔領域及び／または咀嚼の疾患）、及び痙性ジストニア（声帯の疾患）がある。全身性ジストニアの一例としては、脚の位置の異常によって特徴づけられる瀬川病がある。
【００５８】
一実施形態では、ジストニアの処置における使用のための本発明の組成物は、非経口的に、好ましくは注射の形態で投与される。当該注射は好ましくは、患部内または患部付近で、好ましくは皮下または筋肉内、とりわけ筋肉内で行うことができる。
【００５９】
本発明のさらなる主題は、好ましくは５００〜１０００単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素が投与される、痙縮の処置における使用のための本発明の組成物である。より好ましくは、５５０〜９５０、６００〜９００、６５０〜８５０、もしくは７００〜８００単位、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば６００〜８５０単位を使用することができる。
【００６０】
痙縮は、（骨格）筋肉の内部張力増強として説明することができる。痙縮の原因は、中枢神経系の運動を司る領域の損傷であり、この領域とは脳及び脊髄、詳細には第１の運動ニューロンの錐体路である。痙縮の最も一般的な理由は、脳梗塞による、運動に関する脳領域の低酸素性損傷である。単痙縮（ｍｏｎｏｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）は、１つの筋肉または１つの四肢の痙縮性麻痺である。痙縮性麻痺になり得る筋肉の例としては、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、腕橈骨筋、上腕二頭筋、方形回内筋、円回内筋、長母指屈筋、短母指屈筋、母指対立筋がある。対称性痙縮は、両脚の麻痺によって特徴づけられる。片側痙縮は、半身の四肢の麻痺、または顔の半分の麻痺（片側顔面攣縮）を説明するものである。最後に、四肢痙縮（ｔｅｔｒａｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）は、全ての四肢の痙縮性麻痺に関連し、さらに首及び体幹の筋肉にも影響が及ぶことがある。
【００６１】
一実施形態では、痙縮の処置における使用のための本発明の組成物は、非経口的に、好ましくは注射の形態で投与される。当該注射は好ましくは、患部内または患部付近で、好ましくは皮下または筋肉内、とりわけ筋肉内で行うことができる。
【００６２】
本発明のさらなる主題は、好ましくは４０〜５５単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素が投与される、皺の処置における使用のための本発明の組成物である。より好ましくは、４２〜５２、４３〜４９、４４〜４８、もしくは４５〜４７単位、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば４３〜５０単位を使用することができる。ボツリヌス毒素による皺の処置は、心理的影響を及ぼし得る。詳細には、抑うつ状態にある人は、皺、とりわけ眉間の皺をボツリヌス毒素の注射によって処置された後に抑うつ気分が軽減することが報告されている。
【００６３】
一実施形態では、皺の処置における使用のための本発明の組成物は、非経口的に、好ましくは注射の形態で投与される。当該注射は好ましくは、対応する皺内または皺付近で行うことができ、眉間の皺が好ましい。注射は、皮下が好ましい。
【００６４】
本発明のさらなる主題は、２０〜１５００単位、好ましくは１００〜８００単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素が投与される、筋肉または外分泌腺における過活動性のコリン作動性神経支配に関連する疾患または状態の処置における使用のための本発明の組成物である。
【００６５】
本明細書で使用する「過活動性のコリン作動性神経支配」という用語はシナプスに関するものであり、異常に高い量のアセチルコリンがシナプス間隙内に放出されることによって特徴づけられる。「異常に高い」とは、例えば、基準活動に対し最大２５％、最大５０％またはそれ以上の増加に関するものであり、この増加は、例えば同じタイプのシナプスであるが過活動状態（筋肉ジストニアは過活動状態を示し得る）ではないシナプスにおける放出と比較することによって取得することができる。「最大２５％」とは、例えば、約１％〜約２５％を意味する。必要とされる測定を実施する方法は、当技術分野で公知である。
【００６６】
筋肉または外分泌腺における過活動性のコリン作動性神経支配に関連する例示的な疾患または状態としては、例えば、フライ症候群、ワニの涙症候群、腋窩多汗症、足底多汗症、頭部及び首の多汗症、全身の多汗症、鼻汁、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、唾液分泌過多、流涎、流涎症、痙縮状態及び口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、硬直、良性筋痙攣、遺伝性の頤振戦、奇異性の顎筋活動、片側咀嚼筋攣縮、肥大性鰓ミオパシー、咬筋肥大症、前脛骨筋肥大症、眼球振とう、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸の手術計画、外転筋声帯麻痺、不応性変異性発声障害、上部食道括約筋機能不全、声帯ひだ肉芽腫、吃音症、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、保護的咽頭閉鎖、咽頭切除後の発話障害、保護的瞼下垂、眼瞼内反、オッディ括約筋機能不全、偽性アカラシア、非アカラシア食道運動障害、腟痙、手術後運動抑止、振戦、膀胱機能不全、片側顔面攣縮、神経再支配ジスキネジア、全身硬直症候群、破傷風、前立腺肥大、肥満症処置、小児脳性麻痺、アカラシア、ならびに裂肛が挙げられる。
【００６７】
一実施形態では、筋肉または外分泌腺における過活動性のコリン作動性神経支配に関連する疾患または状態の処置における使用のための本発明の組成物は好ましくは非経口的に、好ましくは注射の形態で投与することができる。当該注射は好ましくは、対応する身体部位内または身体部位付近で行うことができる。注射は、筋肉内または皮下が好ましい。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、投与してから最大２４時間、投与部位にとどまる。このことは、組成物はひとたび投与されると、２４時間以内に注射部位から除去、分解及び／または代謝されることを意味する。さらに、本発明の組成物は、投与してから少なくとも１０時間投与部位にとどまることが望ましく、すなわち、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、投与してから１０時間以上２４時間以下、好ましくは１１時間以上２２時間以下、より好ましくは１２時間以上２０時間以下、投与部位に存在する。
【００６９】
本発明の組成物の好ましい実施形態では、Ａ型ボツリヌス神経毒素は、投与してから１２時間以内に放出される。本発明の組成物からのＡ型ボツリヌス神経毒素の放出は、１２時間以内に少なくとも５０％、すなわち５０％〜１００％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％である。当該組成物からのＡ型ボツリヌス神経毒素が上記期間内に放出されることで、Ａ型ボツリヌス神経毒素が、毒素の全身的除去による有効性を顕著に失うことなく、対応する神経細胞で利用できるようにすることが保証される。このことは、ＵＳ２０１２／０１４１５３２の教示とは異なり、本発明の組成物が数週間以上投与部位にとどまるデポー製剤ではないことを意味する。その代わりに、本発明は、ボツリヌス神経毒素がＵＳ２０１２／０１４１５３２と比較して相当に短期間内に放出される場合であっても、ボツリヌス神経毒素の効果の延長が得られるというコンセプトに基づいている。
【００７０】
本発明とは対照的に、現在利用可能なボツリヌスの非徐放性組成物は、通常、６〜１２週間ごとに適用される。このように頻繁にボツリヌス毒素を適用することは、概して望ましくなく、例えば、このような頻繁な適用は抵抗性を生み出すことが報告されている。例えば、二次的な非応答者は中和抗体の存在によって生じることが報告されている。
【００７１】
そのため、別の好ましい実施形態では、本発明の組成物はより有利な投与レジメンで投与される。本発明の組成物は好ましくは、４〜９ヵ月ごと、好ましくは５〜７ヵ月、より好ましくは約６ヵ月ごとに投与することができる。ただし、上記の先端技術と比較すると、本発明の組成物は、ボツリヌス神経毒素が持続的に放出されるデポー製剤には基づいていない。その代わりに、上述の通り、ボツリヌスは好ましくは組成物から１２時間以内に放出され、神経細胞によって吸収される。さらに、これも上述のように、約２４時間後、本発明の組成物の残部は分解または全身的排除が始まり、数日以内に本発明の組成物のいかなる部分も投与部位に残存しないようになる。
【００７２】
本発明のさらなる主題は、哺乳類の皺、好ましくは広範な模倣活動の結果である皺を、美容的に滑らかにするまたは防止するための方法であって、
（ｉ）本発明の組成物を投与するステップと、
（ｉｉ）４〜９ヵ月後に投与を繰り返すステップと、
を含む方法である。
【００７３】
皺は、皮膚におけるひだ、うね、または折り目とみなすことができる。広範な模倣活動の結果である皺は、実質的に、対応する哺乳類、好ましくはヒトの顔で視認できる皺を指すことができる。皺の例としては、溝、眉間のライン、カラスの足跡、頬側の継ぎ目、顎の線、口周りの皺、頬のひだ、マリオネットライン、唇のライン、額の皺、眉をひそめたライン、バニーライン、ほうれい線、目の下の皺、及び頤のひだがある。本発明の組成物を投与するステップ（ｉ）は好ましくは、本発明の組成物を注射により投与するステップを含むことができる。注射は好ましくは、注射針で、好ましくは２７〜３５ゲージ、好ましくは３０〜３３ゲージの注射針サイズで行うことができる。本発明の組成物は好ましくは、対応する皺の部位内または部位付近に注射することができる。注射は、皮下または筋肉内、とりわけ皮下とすることができる。好ましくは、本発明の組成物は、眉をひそめたライン、水平ライン、カラスの足跡、口周りのひだ、精神的な終止（ｍｅｎｔａｌ  ｃｅａｓｅｓ）、頤の皺、及び／または広頸筋のたるみに投与される。
【００７４】
ボツリヌス毒素は、処置と同じ日に、または処置の次の日に投与することができる。例えば、第１の処置セッション中に、用量の第１の画分を投与することができる。第１の画分は好ましくは準最適な画分、すなわち、完全には皺または皮膚のラインを除去しない画分である。１回以上の処置セッション中に、総用量の残りの画分を投与することができる。
【００７５】
４〜９ヵ月後に投与を繰り返すステップ（ｉｉ）は好ましくは、上述と同じ条件／デバイスを適用して本発明の組成物を投与するステップを含むことができる。本発明の組成物の投与を繰り返すことにより、さらなる用量のボツリヌスが細胞で利用できるようになり、対応する皮膚が好ましくは美容的に滑らかな状態を保つ。代替的な実施形態では、投与は５〜７ヵ月後または５〜８ヵ月後に繰り返される。
【００７６】
本発明の方法の好ましい実施形態では、投与する本発明の組成物は、４０〜５５単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型ボツリヌス神経毒素を含む。より好ましくは、４２〜５２、４３〜４９、４４〜４８、もしくは４５〜４７単位、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば４３〜５０単位を使用することができる。当技術分野で一般的な、皺を滑らかにするまたは防止するための方法は、約２０単位の神経毒素を投与するステップを含む。高い用量の神経毒素を含有する組成物の使用は、下垂（例えば、瞼下垂）のような望ましくない副作用のリスクを顕著に増強することが報告されている。しかし、本発明の方法では、このような負の副作用は観察されない可能性が考えられ、高い用量の神経毒素が細胞で利用できるようになり、それによって有効性の延長がもたらされる。上の説明と同様に、本発明の美容方法では、ボツリヌス神経毒素Ａは好ましくは、本発明の組成物から１２時間以内に放出される。
【００７７】
本発明のさらなる主題は、皺、好ましくは模倣活動の結果である皺を滑らかにするまたは防止するための本発明の組成物の美容的使用であって、適用される本発明の組成物が４０〜５５単位のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型神経毒素を含む、美容的使用である。より好ましくは、４２〜５２、４３〜４９、４４〜４８、もしくは４５〜４７単位、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば４３〜５０単位を使用することができる。
【００７８】
上に示すように、従来技術の組成物は、皺を滑らかにするまたは防止するために美容的に使用する場合において、約２０単位のボツリヌス神経毒素を含有することが報告されている。適用される当該組成物に含まれる４０〜５５単位という高い量のボツリヌス神経毒素、好ましくはＡ型神経毒素によって、より多くの単位のボツリヌスが対応する細胞で利用できるようになり、皺を滑らかにするまたは防止するための本発明の組成物の使用によって、本発明の組成物で適用される神経毒素の効果の延長が保証される。
本発明は、以下の実施例によって示すことができる。
【実施例】
【００７９】
１．組成物の調製
実施例１
組成物の２つのサブユニットを調製した。
【００８０】
サブユニット１：５０単位のＡ型ボツリヌス神経毒素、２５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、及び１．１８ｍｇのショ糖を含有する凍結乾燥物を、１ｍｌの０．９％食塩水で再構成した。
【００８１】
サブユニット２：１ｍｌの水、平均分子量が約３．８ｋＤの１４ｍｇの非架橋ヒアルロン酸、３４ｍｇのマンニトール、３．０ｍｇのグリセリン、０．６ｍｇのリン酸緩衝液を含有する溶液を用意した。
【００８２】
得られる水性組成物１ｍｌがそれぞれ以下を含有するようにサブユニットを混合した。
Ａ型ボツリヌス神経毒素  ２５単位
非架橋ヒアルロン酸  ７ｍｇ
ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）  ０．１２５ｍｇ
ショ糖  ０．５９ｍｇ
マンニトール  １７．０ｍｇ
グリセリン  １．５ｍｇ
リン酸緩衝液  ０．３ｍｇ
塩化ナトリウム  ４．５ｍｇ
【００８３】
参照実施例
参照組成物を以下のようにして取得する。５０単位のＡ型ボツリヌス神経毒素、２５ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、及び１．１８ｍｇのショ糖を含有する凍結乾燥物を、１ｍｌの０．９％食塩水で再構成した。
【００８４】
したがって、得られた水性組成物はそれぞれ以下を含有した。
Ａ型ボツリヌス神経毒素  ５０単位
ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）  ０．２５ｍｇ
ショ糖  １．１８ｍｇ
塩化ナトリウム  ０．９ｍｇ
【００８５】
２．有効性の比較
２．１  １０匹のマウスの群２群に対し、各々の右腓腹筋に、参照実施例の組成物０．８ｍｌまたは実施例１の組成物１．６ｍｌ（両実施例とも４０単位のＡ型ボツリヌス神経毒素を含有）を注射した。いずれの群においても死亡は観察されなかった。軽微な全身毒性の徴候が、２〜１０日目に同じ程度で両群に生じた。
【００８６】
図１から分かるように最大スコアは４（ＤＡＳスコア）であり、これは後肢の完全な麻痺を示すものである。麻痺の発生から最大の麻痺までの時間は１日であった。マウスにおいてＥＣ５０レベル（ＤＡＳスコア２）に達する麻痺の持続時間は、参照組成物の場合が約１２日であり、本発明の組成物の場合が約３０日であった。したがって、本発明の組成物により、副作用の増加なしでの予想外の延長効果がもたらされる。
【００８７】
２．２  上の項目２．１に従った比較を繰り返し、本発明の組成物で処置するマウスに対し、２．５ｍｌの実施例１の組成物、すなわち６２．５単位のＡ型ボツリヌス神経毒素を注射した。いずれの群においても死亡は観察されなかった。軽微な全身毒性の徴候が、２〜１０日目に同じ程度で両群に生じた。
【００８８】
図２は、本発明の組成物により副作用の増加なしでもたらされた延長効果を示すものである。
【図１】
2019507118.tif 000003
【図２】
2019507118.tif 000004
【国際調査報告】
2019507118.tif 000005
2019507118.tif 000006