(57)【要約】  本発明は、微生物細胞培養物中のリポペプチドを富化する方法であって、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合して、リポペプチドを含む凝集体の形成を誘発すること；前記細胞培養物を遠心して、上清画分及びペレット画分を得ること；前記ペレット画分を前記上清画分から分離すること；及び前記ペレット画分をポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルと混合することで、前記リポペプチドを前記凝集体から放出させることを含む方法を提供する。微生物細胞培養物からエキソ多糖類を精製する方法であって、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合して、凝集体の形成を誘発すること；前記細胞培養物を遠心して、上清画分及びペレット画分を得ること；前記上清画分を前記ペレット画分から分離すること；アルコールを前記上清画分に加えることで、前記エキソ多糖類を沈殿させること；及び前記沈殿したエキソ多糖類を前記上清画分から取り出すことを含む方法も提供される。【選択図】図８
2019506881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞培養物中のリポペプチドを富化する方法であって、
ａ）両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合して、リポペプチドを含む凝集体の形成を誘発すること；
ｂ）前記細胞培養物を遠心して、上清画分及びペレット画分を得ること；
ｃ）前記ペレット画分を前記上清画分から分離すること；及び
ｄ）前記ペレット画分をポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルと混合することで、前記リポペプチドを前記凝集体から放出させること
を含む方法。
【請求項２】
前記リポペプチドが、イツリン型化合物、フェンギシン型化合物、サーファクチン型化合物、フサリシジン型化合物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポペプチドがフサリシジン型化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フサリシジン型化合物が、フサリシジンＡ、フサリシジンＢ、フサリシジンＣ、フサリシジンＤ、ＬＩ−Ｆ０３、ＬＩ−Ｆ０４、ＬＩ−Ｆ０５、ＬＩ−Ｆ０６、ＬＩ−Ｆ０７、ＬＩ−Ｆ０８、パエニセリン（Ｐａｅｎｉｓｅｒｉｎｅ）Ａ１、パエニセリンＡ２、パエニセリンＡ３、パエニセリンＡ４、パエニセリンＢ１、パエニセリンＢ２、パエニセリンＢ３、パエニセリンＢ４、パエニセリンＣ１、パエニセリンＣ２、パエニセリンＣ３、パエニセリンＣ４、パエニプロリキシン（Ｐａｅｎｉｐｒｏｌｉｘｉｎ）Ａ１、パエニプロリキシンＡ２、パエニプロリキシンＢ１、パエニプロリキシンＢ２、パエニプロリキシンＣ１、パエニプロリキシンＣ２、パエニプロリキシンＤ１、パエニプロリキシンＤ２、パエニプロリキシンＥ１、パエニプロリキシンＥ２、パエニプロリキシンＦ１、パエニプロリキシンＦ２、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
両親媒性スルホネートを細胞培養物と混合し、前記両親媒性スルホネートが、下記式（Ｉ）の化合物である前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【化１】
2019506881.tif 000012
［式中、
Ｒ１及びＲ２は独立に、直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル又は直鎖若しくは分岐のＣ２−２０アルケンであり；
ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋である。］
【請求項６】
Ｒ１及びＲ２が独立に直鎖若しくは分岐のＣ８アルキルである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記スルホネートがジオクチルスルホスクシネート；１，４−ビス（２−エチルヘキソキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−スルホネート；又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
両親媒性サルフェートが細胞培養物と混合され、
当該両親媒性サルフェートがアルキルサルフェートである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルキルサルフェートが、下記式（ＩＩ）の化合物である請求項６に記載の方法。
【化２】
2019506881.tif 000013
［式中、
Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル、又は直鎖若しくは分岐のＣ２−２０アルケンであり；
ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋であり；
ただしＲ１及びＲ２が両方ともＨではない。］
【請求項１０】
Ｒ１及びＲ２が独立に、分岐のＣ３−２０アルキルである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルキルサルフェートが、７−エチル−２−メチル−４−ウンデカニルサルフェート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２は分岐のＣ３−２０アルキルである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記アルキルサルフェートが２−エチルヘキシルサルフェート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
両親媒性スルホネートが細胞培養物と混合され、
前記両親媒性スルホネートが直鎖アルキルベンゼンスルホネート又は分岐のアルキルベンゼンスルホネートである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記両親媒性スルホネートが、下記式（ＩＩＩ）の直鎖アルキルベンゼンスルホネートである請求項１４に記載の方法。
【化３】
2019506881.tif 000014
［式中、
Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ又は直鎖Ｃ１−２０アルキルであり；
ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋であり；
ただしＲ１及びＲ２は両方ともＨであることはない。］
【請求項１６】
Ｒ１及びＲ２がＣ１０−１６アルキル鎖を形成している請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記直鎖アルキルベンゼンスルホネートがドデシルベンゼンスルホネート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルが、ＣｎＨ２ｎ＋１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＨの分子式を有する化合物であり、
ｍが１〜１２０の整数であり；
ｎが１〜２０の整数である前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ｎが８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｎが１２又は１８である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ｍが５〜１００の整数である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ｍが２５である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｍが１００である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
微生物細胞培養物からエキソ多糖類（ＥＰＳ）を精製する方法であって、
ａ）両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合して、凝集体の形成を誘発すること；
ｂ）前記細胞培養物を遠心して、上清画分及びペレット画分を得ること；
ｃ）前記上清画分を前記ペレット画分から分離すること；
ｄ）アルコールを前記上清画分に加えることで、前記ＥＰＳを沈殿させること；及び
ｅ）前記沈殿したＥＰＳを前記上清画分から取り出すこと
を含む方法。
【請求項２５】
ＥＰＳが、グルカン、フルクタン、カードラン、ジェラン、キサンタン、エミュルサン、デキストラン、セルロース、及びこれらの組み合わせから選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
両親媒性スルホネートが細胞培養物と混合され、
前記両親媒性スルホネートが、下記式（Ｉ）の化合物である請求項２４又は２５に記載の方法。
【化４】
2019506881.tif 000015
［式中、
Ｒ１及びＲ２は独立に、直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル又は直鎖若しくは分岐のＣ２−２０アルケンであり；
ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋である。］
【請求項２７】
Ｒ１及びＲ２が独立に直鎖若しくは分岐のＣ８アルキルである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記スルホネートがジオクチルスルホスクシネート；１，４−ビス（２−エチルヘキソキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−スルホネート；又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
両親媒性サルフェートが細胞培養物と混合され、
両親媒性サルフェートがアルキルサルフェートである請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルキルサルフェートが、下記式（ＩＩ）の化合物である請求項２９に記載の方法。
【化５】
2019506881.tif 000016
［式中、
Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル、又は直鎖若しくは分岐のＣ２−２０アルケンであり；
ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋であり；
ただしＲ１及びＲ２が両方ともＨではない。］
【請求項３１】
Ｒ１及びＲ２が独立に、分岐のＣ３−２０アルキルである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルキルサルフェートが、７−エチル−２−メチル−４−ウンデカニルサルフェート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２は分岐のＣ３−２０アルキルである請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記アルキルサルフェートが２−エチルヘキシルサルフェート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
両親媒性スルホネートが細胞培養物と混合され、
前記両親媒性スルホネートが直鎖アルキルベンゼンスルホネート又は分岐のアルキルベンゼンスルホネートである請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記両親媒性スルホネートが、下記式（ＩＩＩ）の直鎖アルキルベンゼンスルホネートである請求項３５に記載の方法。
【化６】
2019506881.tif 000017
［式中、
Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ又は直鎖Ｃ１−２０アルキルであり；
ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋であり；
ただしＲ１及びＲ２は両方ともＨであることはない。］
【請求項３７】
Ｒ１及びＲ２がＣ１０−１６アルキル鎖を形成している請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記直鎖アルキルベンゼンスルホネートがドデシルベンゼンスルホネート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルが、ＣｎＨ２ｎ＋１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＨの分子式を有する化合物であり、
ｍが１〜１２０の整数であり；
ｎが１〜２０の整数である請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ｎが８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ｎが１２である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｎが１８である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ｍが５〜１００の整数である請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ｍが２５である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｍが１００である請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートと混合する前に、前記微生物細胞培養物のｐＨを約４〜約７に調節する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記微生物細胞培養物のｐＨを約６に調節する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
遠心前に、前記微生物細胞培養物に、塩を約０．５％〜約５％の濃度で加える、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
塩化ナトリウム又は塩化カリウムを、前記微生物細胞培養物に約２％の濃度で加える、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記微生物細胞培養物が、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）及び／又はシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の菌株を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記微生物細胞培養物が、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１、及び／又は個々の菌株の全ての識別特性を有するそれらの真菌突然変異株を含む、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年３月３日出願の米国暫定特許出願第６２／３０３，１７１号（参照によって、全体が本明細書に組み込まれる。）に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、微生物細胞培養物を処理して、微生物細胞によって産生されるリポペプチド類及びエキソ多糖類を濃縮又は精製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
殺菌剤には無数の用途があり、例えば作物保護；食品、飼料及び化粧品の保存剤として；及びヒト及び動物の両方の用途用の治療剤としてである。作物収量減少、食物媒介の疾患並びにヒト及び動物の両方の真菌感染は、先進国及び発展途上国の両方において問題となっている。
【０００４】
合成殺虫剤又は殺菌剤は多くの場合で非特異的であることから、他の天然の有益な生物を含む標的生物以外の生物に対して作用し得る。化学性質のため、それらは有害で非生物分解性でもあり得る。世界的に、特に食品における化学物質の残留物に関連する可能な環境問題及び健康問題について消費者の意識が高まっている。そのため、化学（すなわち合成）農薬の使用又は少なくとも量を減らすようにという消費者の圧力が大きくなってきた。従って、効果的な病害生物防除を可能としていながら、食物連鎖上の要件を管理する必要性がある。
【０００５】
合成殺虫剤又は殺菌剤の使用によって生じるさらなる問題は、殺虫剤又は殺菌剤の繰り返し及び独占的施用によって、多くの場合で、抵抗性病原微生物の選択が生じてしまうことである。通常、そのような菌株は、同じ作用機序を有する他の有効成分に対しても交差抵抗性である。これによって、活性化合物による病原体の効果的な防除ができなくなる。しかしながら、新たな作用機序を有する有効成分は開発が困難であるとともに費用のかさむものである。
【０００６】
病原体群における抵抗性発達のリスク並びに環境及びヒト健康上の懸念により、植物病害を管理するための合成殺虫剤及び殺菌剤に代わるのを確認することに関心が向けられるようになった。生物防除剤の使用が一つの選択肢である。
【０００７】
フサリシジン類などの非リボソームペプチドが、その抗微生物特性の故に良く認識されており、作物保護の分野で使用されてきた。それが有する作用機序の故に、それは生物薬剤及び他のバイオテクノロジー用途で使用される可能性も有する。フサリシジン類は、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離することができ、１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカノン酸に加えて６個のアミノ酸残基から構成される環構造を有する。パエニバシラス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）から単離されるフサリシジン類には、ＬＩ−Ｆ０３、ＬＩ−Ｆ０４、ＬＩ−Ｆ０５、ＬＩ−Ｆ０７及びＬＩ−Ｆ０８（Ｋｕｒｕｓｕ  Ｋ，  Ｏｈｂａ  Ｋ，  Ａｒａｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｋ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４０：１５０６−１５１４，  １９８７）などがあり、さらに別のフサリシジンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤが報告されている（Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４９：１２９−１３５、１９９６；Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ５０：２２０−２２８，  １９９７）。
【０００８】
ある種のフサリシジン類は、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）及びペニシリウム・トミー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｈｏｍｉｉ）などの植物病原性真菌に対する殺菌活性を有することが知られている。一部のフサリシジン類は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）などのグラム陽性菌に対しても殺菌活性を有する（Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４９：１２９−１３５，  １９９６；Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ５０：２２０−２２８，  １９９７）。さらに、特定のフサリシジン類がアブラナの黒根腐病を引き起こすレプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｍａｃｕｌａｎｓ）に対して抗真菌活性を有することが見出されている（Ｂｅａｔｔｙ  ＰＨ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＥ．，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４８：１５９−１６９，  ２００２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｕｒｕｓｕ  Ｋ，  Ｏｈｂａ  Ｋ，  Ａｒａｉ  Ｔ  ａｎｄ  Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｋ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４０：１５０６−１５１４，  １９８７
【非特許文献２】Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ４９：１２９−１３５、１９９６
【非特許文献３】Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｍ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  ５０：２２０−２２８，  １９９７
【非特許文献４】Ｂｅａｔｔｙ  ＰＨ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ  ＳＥ．，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４８：１５９−１６９，  ２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発酵ブロス中でフサリシジン類などの活性化合物を富化する効率的な方法を確認する必要がある。そのような発酵ブロスが、ブロスの粘度を高めることで富化プロセスをより困難なものとするエキソ多糖類（ＥＰＳ）及び他のバイオポリマーを高レベルで含むことが多いため、これは特に困難なものとなり得る。
【００１１】
ＥＰＳは、糖残基からなり、多くの微生物によって周囲の環境中に分泌される高分子量ポリマーである。微生物は、広いスペクトルの多官能性多糖類、例えば細胞内多糖類、莢膜多糖類及び細胞外多糖類（ＥＰＳ）を合成する。エキソ多糖類は通常、修飾された単糖類並びに、一時的に、いくつかの非炭水化物置換基、例えばアセテート、ピルベート、スクシネート及びホスフェートからなる。
【００１２】
多くのＥＰＳ、例えばグルカン類及びフルクタン類が、それぞれ、主要基質として二糖類であるショ糖を用いるグリコシルトランスフェラーゼまたはフルクトシルトランスフェラーゼの活性によって細胞外で産生され、微生物によって培地中に分泌される。これらの酵素は、第１段階でショ糖を開裂させ、その後に、ブドウ糖又は果糖を、グルカン類又はフルクタン類を形成する成長する糖ポリマーに送る。その後、残った遊離糖モノマーは代謝される。
【００１３】
商業的目的のため、ＥＰＳは現在、アルコール沈殿などの下流プロセスによるバイオマス分離後に発酵ブロスから単離される（Ｄｏｎｏｔ，  Ｆ．，  Ｆｏｎｔａｎａ，  Ａ．，  Ｂａｃｃｏｕ，  Ｊ．Ｃ．，  ＆  Ｓｃｈｏｒｒ−Ｇａｌｉｎｄｏ，  Ｓ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ８７：９５１−９６２，  ２０１２）。発酵ブロス中の活性化合物からＥＰＳを分離する現行の下流処理はコストが高くなり、活性化合物の分解を生じる可能性がある。粘稠バイオポリマーが合成されることで、発酵プロセス（すなわち、攪拌及び酸素化）並びに高度に精製された分子の回収が妨げられる。活性化合物の活性を保存しながら、発酵ブロス中の活性化合物から粘稠バイオポリマーを分離するコスト効果が高い効率的方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、微生物細胞培養物中のリポペプチドを富化する方法であって、ａ）両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合して、リポペプチドを含む凝集体の形成を誘発すること；ｂ）前記細胞培養物を遠心して、上清画分及びペレット画分を得ること；ｃ）前記ペレット画分を前記上清画分から分離すること；及びｄ）前記ペレット画分をポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルと混合することで、前記リポペプチドを前記凝集体から放出させることを含む方法に関するものである。
【００１５】
ある種の態様において、前記リポペプチドは、イツリン型化合物、フェンギシン型化合物、サーファクチン型化合物、フサリシジン型化合物、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。１態様において、前記リポペプチドはフサリシジン型化合物である。
【００１６】
一部の実施形態において、前記フサリシジン型化合物は、フサリシジンＡ、フサリシジンＢ、フサリシジンＣ、フサリシジンＤ、ＬＩ−Ｆ０３、ＬＩ−Ｆ０４、ＬＩ−Ｆ０５、ＬＩ−Ｆ０６、ＬＩ−Ｆ０７、ＬＩ−Ｆ０８、パエニセリン（Ｐａｅｎｉｓｅｒｉｎｅ）Ａ１、パエニセリンＡ２、パエニセリンＡ３、パエニセリンＡ４、パエニセリンＢ１、パエニセリンＢ２、パエニセリンＢ３、パエニセリンＢ４、パエニセリンＣ１、パエニセリンＣ２、パエニセリンＣ３、パエニセリンＣ４、パエニプロリキシン（Ｐａｅｎｉｐｒｏｌｉｘｉｎ）Ａ１、パエニプロリキシンＡ２、パエニプロリキシンＢ１、パエニプロリキシンＢ２、パエニプロリキシンＣ１、パエニプロリキシンＣ２、パエニプロリキシンＤ１、パエニプロリキシンＤ２、パエニプロリキシンＥ１、パエニプロリキシンＥ２、パエニプロリキシンＦ１、パエニプロリキシンＦ２、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１７】
他の実施形態では、両親媒性スルホネートを細胞培養物と混合し、前記両親媒性スルホネートは、下記式（Ｉ）の化合物である。
【化１】
2019506881.tif 000003
【００１８】
式中、Ｒ１及びＲ２は独立に、直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル又は直鎖若しくは分岐のＣ２−２０アルケンであり；ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋である。１態様において、Ｒ１及びＲ２は独立に直鎖若しくは分岐のＣ８アルキルである。別の態様において、前記スルホネートはジオクチルスルホスクシネート；１，４−ビス（２−エチルヘキソキシ）−１，４−ジオキソブタン−２−スルホネート；又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である。
【００１９】
他の実施形態において、両親媒性サルフェートを細胞培養物と混合し、両親媒性サルフェートはアルキルサルフェートである。１実施形態において、前記アルキルサルフェートは、下記式（ＩＩ）の化合物である。
【化２】
2019506881.tif 000004
【００２０】
式中、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ、直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル、又は直鎖若しくは分岐のＣ２−２０アルケンであり；ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋であり；ただしＲ１及びＲ２が両方ともＨではない。１態様において、Ｒ１及びＲ２は独立に、分岐のＣ３−２０アルキルである。別の態様において、前記アルキルサルフェートは、７−エチル−２−メチル−４−ウンデカニルサルフェート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である。さらに別の態様において、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は分岐のＣ３−２０アルキルである。１実施形態において、前記アルキルサルフェートは２−エチルヘキシルサルフェート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である。
【００２１】
他の実施形態において、両親媒性スルホネートを細胞培養物と混合し、前記両親媒性スルホネートは直鎖アルキルベンゼンスルホネート又は分岐のアルキルベンゼンスルホネートである。ある種の実施形態において、前記両親媒性スルホネートは、下記式（ＩＩＩ）の直鎖アルキルベンゼンスルホネートである。
【化３】
2019506881.tif 000005
【００２２】
式中、Ｒ１及びＲ２は独立に、Ｈ又は直鎖Ｃ１−２０アルキルであり；ＭはＨ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋又は（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋であり；ただしＲ１及びＲ２は両方ともＨであることはない。１実施形態において、Ｒ１及びＲ２がＣ１０−１６アルキル鎖を形成している。別の実施形態において、前記直鎖アルキルベンゼンスルホネートはドデシルベンゼンスルホネート又はそのＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋若しくは（Ｃ１−８アルキル）４Ｎ＋塩である。
【００２３】
ある種の態様において、前記ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルは、ＣｎＨ２ｎ＋１（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＨの分子式を有する化合物であり、ｍは１〜１２０の整数であり；ｎは１〜２０の整数である。一部の態様において、ｎは８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０である。１態様において、ｎは１２又は１８である。さらに別の態様において、ｍは５〜１００の整数である。１実施形態において、ｍは２５である。別の実施形態において、ｍは１００である。
【００２４】
さらに別の実施形態において、本発明は、微生物細胞培養物からエキソ多糖類（ＥＰＳ）を精製する方法であって、ａ）両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合して、凝集体の形成を誘発すること；ｂ）前記細胞培養物を遠心して、上清画分及びペレット画分を得ること；ｃ）前記上清画分を前記ペレット画分から分離すること；ｄ）アルコールを前記上清画分に加えることで、前記ＥＰＳを沈殿させること；及びｅ）前記沈殿したＥＰＳを前記上清画分から取り出すことを含む方法に関するものである。
【００２５】
ある種の態様において、ＥＰＳは、グルカン、フルクタン、カードラン、ジェラン、キサンタン、エミュルサン、デキストラン、セルロース、及びこれらの組み合わせから選択される。
【００２６】
さらに別の実施形態において、本発明は、水溶性のバイオポリマーを微生物細胞培養物から精製する方法であって、ａ）両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを前記細胞培養物と混合させて、凝集体の形成を誘発すること；ｂ）前記細胞培養物を遠心することで、上清画分及びペレット画分を得ること；ｃ）前記上清画分を前記ペレット画分から分離すること；ｄ）アルコールを前記上清画分に加えることで、前記バイオポリマーを沈殿させること；及びｅ）前記沈殿バイオポリマーを前記上清画分から取り出すことを含む方法に関するものである。
【００２７】
さらに別の態様において、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートと混合する前に、微生物細胞培養物のｐＨを約４〜約７に調節する。１態様では、微生物細胞培養物のｐＨを約６に調節する。
【００２８】
さらに他の実施形態では、遠心前に、微生物細胞培養物に、塩を約０．５％〜約５％の濃度で加える。１実施形態では、塩化ナトリウム又は塩化カリウムを、微生物細胞培養物に、約２％の濃度で加える。
【００２９】
別の態様では、前記微生物細胞培養物は、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）及び／又はシュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の菌株を含む。１実施形態では、前記微生物細胞培養物は、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１、及び／又は個々の菌株の全ての識別特性を有するそれらの真菌突然変異株を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（ＢＯＴＲＣＩ）を接種した若い植物を用いて測定した抗真菌活性を描いた図である。パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス（「ＷＢ」）並びに２４，７９０×ｇのＲＣＦでの全ブロスの遠心後に形成されるペレット画分（「ペレット」）及び上清画分（「Ｓｕｐ」）の抗真菌活性を、未処理対照（「水」）と比較した。
【図２】「ＷＢ−ＳＤＯＳ」とラベル表示した遠心助剤を用いずに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス、及び「ＷＢ＋ＳＤＯＳ」とラベル表示したＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）と混合して遠心した全ブロスからのペレットの写真を描いた図である。
【図３】比較的高レベルのＥＰＳを産生することが知られている別のパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの、全ブロスの、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いた若しくは用いない１７，０００×ｇのＲＣＦで５分間の遠心後に形成されたペレットを描いた図である。
【図４】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）又は精製ＳＤＯＳを含むペレット及び上清画分中のフサリシジンＡの相対的定量を描く図である。
【図５Ａ】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いて又は用いずに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスから得られたブロス濃縮物及び上清の粒径分析を示す図である。
【図５Ｂ】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いて又は用いずに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスから得られたブロス濃縮物及び上清の粒径分析を示す図である。
【図５Ｃ】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いて又は用いずに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスから得られたブロス濃縮物及び上清の粒径分析を示す図である。
【図５Ｄ】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いて又は用いずに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスから得られたブロス濃縮物及び上清の粒径分析を示す図である。
【図５Ｅ】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いて又は用いずに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスから得られたブロス濃縮物及び上清の粒径分析を示す図である。
【図６】ｐＨ３、６若しくは１０に調節し、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）とともに遠心したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスから形成されたペレットの写真を描く図である。
【図７Ａ】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）以外の他の化合物とのパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスの場合に形成されたペレットの写真を描いた図である。
【図７Ｂ】ＮＩＡＰＲＯＯＦ（登録商標）４（ナトリウム７−エチル−２−メチル−４−ウンデカニルサルフェート）がＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）と同様の効果を生じることを確認する、より規模の大きい実験でのペレット及び上清画分の写真を描いた図である。
【図８】ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を単独で又はポリオキシエチレン（２５）ドデシルエーテル（Ｃ１２ＥＯ２５とも称される）若しくはＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ２３（ポリオキシエチレン（２３）ドデシルエーテル；Ｃ１２ＥＯ２３とも称される）と組み合わせて含む上清画分及びペレット画分中のフサリシジンＡの相対的定量を描いた図である。
【図９】単独で又は放出助剤として作用するいくつかの化合物のうちの一つと組み合わせてＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含むペレット画分中のフサリシジンＡの相対的定量を描いた図である。
【図１０】放出助剤Ｃ１２ＥＯ２５を加えた後のペレット画分の懸濁性を描いた図である。
【図１１】遠心助剤としてＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及び放出助剤としてＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１００（ポリオキシエチレン（１００）オクタデシルエーテル）を用いる、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス及び相当するブロス濃縮物の５個のバッチでのフサリシジンＡの相対的定量を描いた図である。
【図１２】バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１からの粘稠全ブロス（ＷＢ）のＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いた又は用いない１，５００×ｇのＲＣＦでの５分間の遠心後に形成されたペレットを描いた図である。
【図１３】パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２及び他の二つのパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株で、遠心助剤としてＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及び放出助剤としてＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１００（ポリオキシエチレン（１００）オクタデシルエーテル）を用いて得られた全ブロス（「ＷＢ」）及び相当する上清（「Ｓｕｐ」）及びブロス濃縮物（「ＢＣ」）中のフサリシジンＡの相対的定量を描いた図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書で使用される場合、本記述及び特許請求の範囲で使用される「含む」という動詞及びその活用形は、その非限定的意味で、その言葉に続く事項が含まれるが、具体的に言及されていない事項が排除されるわけではないことを意味するのに用いられる。さらに、不定冠詞「ａ（一つの）」又は「ａｎ（一つの）」は、一つ及び一つのみの要素があることが文脈上で明瞭に要求されていない限り、その要素が複数存在している可能性を排除するものではない。従って、不定冠詞「ａ（一つの）」または「ａｎ（一つの）」は、通常、「少なくとも一つ」を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、親水性及び疎水性の両方を有する化合物を説明するものである。
【００３３】
ある種の態様において、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを、約０．０１％〜約１．０％；例えば、約０．０１％〜約１．０％の範囲、例えば約０．０１％〜約０．５％、約０．０５％〜約０．２％、約０．１％〜約０．２％などの濃度（重量／体積％）で細胞培養物と混合する。
【００３４】
他の態様において、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートを、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１０％、少なくとも０．１２％、少なくとも０．１４％、少なくとも０．１６％、少なくとも０．１８％、又は少なくとも０．２０％の濃度（重量／体積％）で細胞培養物と混合する。
【００３５】
ある種の態様では、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルを、約０．０１％〜約１．０％；例えば、約０．０１％〜約１．０％の範囲、例えば約０．０１％〜約０．５％、約０．０５％〜約０．２％、約０．１％〜約０．２％などの濃度（重量／体積％）でペレット画分又は上清画分と混合する。
【００３６】
他の態様では、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルを、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１０％、少なくとも０．１２％、少なくとも０．１４％、少なくとも０．１６％、少なくとも０．１８％、又は少なくとも０．２０％の濃度（重量／体積％）でペレット画分又は上清画分と混合する。
【００３７】
さらに別の態様では、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートの細胞培養物又はそれに由来する画分と混合されるポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルに対する比率（重量比）は、約５０：１〜約１：５０；例えば、約５０：１〜約１：５０の範囲、例えば約４０：１〜約１：４０、約３０：１〜約１：３０、約２５：１〜約１：２５、約２０：１〜約１：２０、約１５：１〜約１：１５、約１０：１〜約１：１０、約５：１〜約１：５、又は約２：１〜約１：２である。
【００３８】
一部の態様において、両親媒性スルホネート及び／又は両親媒性サルフェートの細胞培養物又はそれに由来する画分と混合されるポリオキシエチレングリコールアルキルエーテルに対する比率（重量比）は、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、又は約１：１０である。
【００３９】
一部の実施形態では、細胞培養物を、少なくとも５，０００ＲＣＦ、少なくとも１０，０００ＲＣＦ、少なくとも１５，０００ＲＣＦ、少なくとも２０，０００ＲＣＦ、少なくとも２５，０００ＲＣＦ、少なくとも３０，０００ＲＣＦ、少なくとも３５，０００ＲＣＦ、又は少なくとも４０，０００ＲＣＦの速度で遠心する。
【００４０】
ある種の態様では、ペレット画分を、カルボン酸のソルビタンエステルのポリオキシエチレン誘導体と混合して、凝集体からリポペプチドを放出させる。１実施形態では、カルボン酸のソルビタンエステルのポリオキシエチレン誘導体は、下記式（ＩＶ）の化合物である。
【化４】
2019506881.tif 000006
【００４１】
式中、Ｒ１は、Ｃ６−１８アルキル又はＣ６−１８アルケニルであり、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ＝２０である。１実施形態において、式（ＩＶ）の化合物は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）オキソラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチル（Ｅ）−オクタデカ−９−エノエート；ポリオキシエチレンソルビタンオレエートとも称される）である。
【００４２】
ナトリウムジオクチルスルホスクシネートは、ＧＥＲＯＰＯＮＤＯＳ（登録商標）、ＡＥＲＯＳＯＬ（登録商標）ＯＴ、ＴＥＲＭＵＬ（登録商標）３６６７、ＴＥＲＭＵＬ（登録商標）３６６５、ＬＡＮＫＲＯＰＯＬ（登録商標）ＫＰＨ７０、及びＳＹＮＥＲＧＥＮ（登録商標）Ｗ１０などのいくつかの商業名で市販されている。
【００４３】
リポペプチド類には、各種細菌、例えばバシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、及びストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）から得ることができる両親媒性環状ペプチド類などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
１態様において、微生物細胞培養物は、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌株を含む。別の態様において、微生物細胞培養物は、次のパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種：Ｐ．アガレクセデンス（Ｐ．ａｇａｒｅｘｅｄｅｎｓ）、Ｐ．アガリデボランス（Ｐ．ａｇａｒｉｄｅｖｏｒａｎｓ）、Ｐ．アルギノリチクス（Ｐ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．アルカリテラエ（Ｐ．ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ）、Ｐ．アルベイ（Ｐ．ａｌｖｅｉ）、Ｐ．アミロリチクス（Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．アナエリアカヌス（Ｐ．ａｎａｅｒｉｃａｎｕｓ）、Ｐ．アンタルクチクス（Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、Ｐ．アッサメンシス（Ｐ．ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）、Ｐ．アゾレズセンス（Ｐ．ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、Ｐ．アゾトフィキサンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ）、Ｐ．バルシノネンシス（Ｐ．ｂａｒｃｉｎｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ボレアリス（Ｐ．ｂｏｒｅａｌｉｓ）、Ｐ．ブラシリエンシス（Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ブラッシカエ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、Ｐ．カムピナセンシス（Ｐ．ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）、Ｐ．チンジュエンシス（Ｐ．ｃｈｉｎｊｕｅｎｓｉｓ）、Ｐ．チチノリチクス（Ｐ．ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．コンドロイチヌス（Ｐ．ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ）、Ｐ．シネリス（Ｐ．ｃｉｎｅｒｉｓ）、Ｐ．クッキー（Ｐ．ｃｏｏｋｉｅ）、Ｐ．クルドラノリチクス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．デジェオネンシス（Ｐ．ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．デンドリチホルミス（Ｐ．ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｐ．デュラム（Ｐ．ｄｕｒｕｍ）、Ｐ．エヒメンシス（Ｐ．ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｐ．エルギイ（Ｐ．ｅｌｇｉｉ）、Ｐ．ファビスポルス（Ｐ．ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｐ．グルカノリチクス（Ｐ．ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．グリカニリチクス（Ｐ．ｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．ゴルドナエ（Ｐ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｐ．グラミニス（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｐ．グラニボランス（Ｐ．ｇｒａｎｉｖｏｒａｎｓ）、Ｐ．ホドガエンシス（Ｐ．ｈｏｄｏｇａｙｅｎｓｉｓ）、Ｐ．イリノイセンシス（Ｐ．ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ジャミラエ（Ｐ．ｊａｍｉｌａｅ）、Ｐ．コベンシス（Ｐ．ｋｏｂｅｎｓｉｓ）、Ｐ．コレオボランス（Ｐ．ｋｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、Ｐ．コレエンシス（Ｐ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、Ｐ．クリッベンシス（Ｐ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ラクチス（Ｐ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｐ．ラルバエ（Ｐ．ｌａｒｖａｅ）、Ｐ．ラウツス（Ｐ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｐ．レンチモルブス（Ｐ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、Ｐ．マセランス（Ｐ．ｍａｃｅｒａｎｓ）、Ｐ．マックアリエンシス（Ｐ．ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｐ．マッシリエンシス（Ｐ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｐ．メンデリイ（Ｐ．ｍｅｎｄｅｌｉｉ）、Ｐ．モトブエンシス（Ｐ．ｍｏｔｏｂｕｅｎｓｉｓ）、Ｐ．ナフタレノボランス（Ｐ．ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、Ｐ．ネマトフィルス（Ｐ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｐ．オドリフェル（Ｐ．ｏｄｏｒｉｆｅｒ）、Ｐ．パブリ（Ｐ．ｐａｂｕｌｉ）、���．ペオリアエ（Ｐ．ｐｅｏｒｉａｅ）、Ｐ．フォエニシス（Ｐ．ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、Ｐ．フィロスファエラエ（Ｐ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）、Ｐ．ポリミキサ（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｐ．ポピリアエ（Ｐ．ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、Ｐ．プルビファシエンス（Ｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｐ．リゾスファエラエ（Ｐ．ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、Ｐ．サングイニス（Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、Ｐ．ステリフェル（Ｐ．ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ）、Ｐ．テッラエ（Ｐ．ｔｅｒｒａｅ）、Ｐ．チアミノリチクス（Ｐ．ｔｈｉアミノｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｐ．チモネンシス（Ｐ．ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．チロピリ（Ｐ．ｔｙｌｏｐｉｌｉ）、Ｐ．ツリセンシス（Ｐ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、Ｐ．バリヅス（Ｐ．ｖａｌｉｄｕｓ）、Ｐ．ボルテクス（Ｐ．ｖｏｒｔｅｘ）、Ｐ．ブルネリス（Ｐ．ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、Ｐ．ウィンニイ（Ｐ．ｗｙｎｎｉｉ）、Ｐ．キシラニリチクス（Ｐ．ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）及びこれらの組み合わせのうちのいずれか一つからの菌株を含む。
【００４５】
別の態様では、微生物細胞培養物は、バシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）の菌株を含む。ある種の態様において、微生物細胞培養物は、次のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種のうちのいずれか：Ｂ．アシジセラー（Ｂ．  ａｃｉｄｉｃｅｌｅｒ）、Ｂ．アシジコラ（Ｂ．ａｃｉｄｉｃｏｌａ）、Ｂ．アシジプロヅセンス（Ｂ．ａｃｉｄｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、Ｂ．アエロリウス（Ｂ．ａｅｏｌｉｕｓ）、Ｂ．アエリウス（Ｂ．ａｅｒｉｕｓ）、Ｂ．アエロフィルス（Ｂ．ａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アガラダエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アイジンゲンシス（Ｂ．ａｉｄｉｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルギコラ（Ｂ．ａｌｇｉｃｏｌａ）、Ｂ．アルカリニトリリクス（Ｂ．ａｌｋａｌｉｎｉｔｒｉｌｉｃｕｓ）、Ｂ．アルカリセジミニス（Ｂ．ａｌｋａｌｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、Ｂ．アルカリテルリス（Ｂ．ａｌｋａｌｉｔｅｌｌｕｒｉｓ）、Ｂ．アルチツジニス（Ｂ．ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）、Ｂ．アルベアユエンシス（Ｂ．ａｌｖｅａｙｕｅｎｓｉｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｂ．アクイマリス（Ｂ．ａｑｕｉｍａｒｉｓ）、Ｂ．アルセニクス（Ｂ．ａｒｓｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．アリヤバッタイ（Ｂ．ａｒｙａｂｈａｔｔａｉ）、Ｂ．アサヒイ（Ｂ．ａｓａｈｉｉ）、Ｂ．アトロファエウス（Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、Ｂ．アウランチアクス（Ｂ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、Ｂ．アゾトフォルマンス（Ｂ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｂ．バジウス（Ｂ．ｂａｄｉｕｓ）、Ｂ．バルバリクス（Ｂ．ｂａｒｂａｒｉｃｕｓ）、Ｂ．バタビエンシス（Ｂ．ｂａｔａｖｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ベイジンゲンシス（Ｂ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ベンゾエボランス（Ｂ．ｂｅｎｚｏｅｖｏｒａｎｓ）、Ｂ．ベベリジェイ（Ｂ．ｂｅｖｅｒｉｄｇｅｉ）、Ｂ．ボゴリエンシス（Ｂ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ボロニフィルス（Ｂ．ｂｏｒｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ブタノリボランス（Ｂ．ｂｕｔａｎｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、Ｂ．カナベラリウス（Ｂ．ｃａｎａｖｅｒａｌｉｕｓ）、Ｂ．カルボニフィルス（Ｂ．ｃａｒｂｏｎｉｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．セセンベンシス（Ｂ．ｃｅｃｅｍｂｅｎｓｉｓ）、Ｂ．セルロシリチクス（Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．チャガンノレンシス（Ｂ．ｃｈａｇａｎｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．チュンガンゲンシス（Ｂ．ｃｈｕｎｇａｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｂ．シビ（Ｂ．ｃｉｂｉ）、Ｂ．シルクランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．クラルキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．コアフリレンシス（Ｂ．ｃｏａｈｕｉｌｅｎｓｉｓ）、Ｂ．コーニイ（Ｂ．ｃｏｈｎｉｉ）、Ｂ．デシシフロンジス（Ｂ．ｄｅｃｉｓｉｆｒｏｎｄｉｓ）、Ｂ．デコロラチオニス（Ｂ．ｄｅｃｏｌｏｒａｔｉｏｎｉｓ）、Ｂ．ドレンテンシス（Ｂ．ｄｒｅｎｔｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ファラギニス（Ｂ．ｆａｒｒａｇｉｎｉｓ��、Ｂ．ファスチジオスス（Ｂ．ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ）、Ｂ．フィルムス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．フレクサス（Ｂ．ｆｌｅｘｕｓ）、Ｂ．ホラミニス（Ｂ．ｆｏｒａｍｉｎｉｓ）、Ｂ．フォルジイ（Ｂ．ｆｏｒｄｉｉ）、Ｂ．フォリス（Ｂ．ｆｏｒｉｓ）、Ｂ．フマリオリ（Ｂ．ｆｕｍａｒｉｏｌｉ）、Ｂ．フニクルス（Ｂ．ｆｕｎｉｃｕｌｕｓ）、Ｂ．ガラクトシジリチクス（Ｂ．ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ガリシエンシス（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ゲラチニ（Ｂ．ｇｅｌａｔｉｎｉ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、Ｂ．ギンセンギ（Ｂ．ｇｉｎｓｅｎｇｉ）、Ｂ．ギンセンギフミ（Ｂ．ｇｉｎｓｅｎｇｉｈｕｍｉ）、Ｂ．グラミニス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｂ．ハルマパルス（Ｂ．ｈａｌｍａｐａｌｕｓ）、Ｂ．ハロチャレス（Ｂ．ｈａｌｏｃｈａｒｅｓ）、Ｂ．ハロズランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．ヘミセルロシリチクス（Ｂ．ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ヘルベルツテイネンシス（Ｂ．ｈｅｒｂｅｒｔｓｔｅｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ホリコシ（Ｂ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ）、Ｂ．ホルネキアエ（Ｂ．ｈｏｒｎｅｃｋｉａｅ）、Ｂ．ホルチ（Ｂ．ｈｏｒｔｉ）、Ｂ．フミ（Ｂ．ｈｕｍｉ）、Ｂ．ファジンポエンシス（Ｂ．ｈｗａｊｉｎｐｏｅｎｓｉｓ）、Ｂ．イドリエンシス（Ｂ．ｉｄｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．インジクス（Ｂ．ｉｎｄｉｃｕｓ）、Ｂ．インファンチス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．インフェルヌス（Ｂ．ｉｎｆｅｒｎｕｓ）、Ｂ．イサベリアエ（Ｂ．ｉｓａｂｅｌｉａｅ）、Ｂ．イスロネンシス（Ｂ．ｉｓｒｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ジェオツガリ（Ｂ．ｊｅｏｔｇａｌｉ）、Ｂ．コレエンシス（Ｂ．ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、Ｂ．コルレンシス（Ｂ．ｋｏｒｌｅｎｓｉｓ）、Ｂ．クリッベンシス（Ｂ．ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ）、Ｂ．クルルウィチアエ（Ｂ．ｋｒｕｌｗｉｃｈｉａｅ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．リフェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．リトラリス（Ｂ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｂ．ロシサリス（Ｂ．ｌｏｃｉｓａｌｉｓ）、Ｂ．ルシフェレンシス（Ｂ．ｌｕｃｉｆｅｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ルテオルス（Ｂ．ｌｕｔｅｏｌｕｓ）、Ｂ．マカウエンシス（Ｂ．ｍａｃａｕｅｎｓｉｓ）、Ｂ．マシアエ（Ｂ．ｍａｃｙａｅ）、Ｂ．マンナニリチクス（Ｂ．ｍａｎｎａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．マリフラビ（Ｂ．ｍａｒｉｆｌａｖｉ）、Ｂ．マルマレンシス（Ｂ．ｍａｒｍａｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．マッシリエンシス（Ｂ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．メタノリクス（Ｂ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、Ｂ．メチロトロフィクス（Ｂ．ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、Ｂ．モジャベンシス（Ｂ．ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ムラリス（Ｂ．ｍｕｒａｌｉｓ）、Ｂ．ムリマルチニ（Ｂ．ｍｕｒｉｍａｒｔｉｎｉ）、Ｂ．ミコイデス（Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、Ｂ．ナンハイエンスビス（Ｂ．ｎａｎｈａｉｅｎｓｖｉｓ）、Ｂ．ナンハイイセジミニス（Ｂ．ｎａｎｈａｉｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、Ｂ．ネアルソニイ（Ｂ．ｎｅａｌｓｏｎｉｉ）、Ｂ．ネ��ゾウエンシス（Ｂ．ｎｅｉｚｈｏｕｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ニアベンシス（Ｂ．ｎｉａｂｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ニアシニ（Ｂ．ｎｉａｃｉｎｉ）、Ｂ．ノバリス（Ｂ．ｎｏｖａｌｉｓ）、Ｂ．オセアニセジミニス（Ｂ．ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、Ｂ．オディッセイ（Ｂ．ｏｄｙｓｓｅｙｉ）、Ｂ．オクヘンシス（Ｂ．ｏｋｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．オクヒデンシス（Ｂ．ｏｋｕｈｉｄｅｎｓｉｓ）、Ｂ．オレロニウス（Ｂ．ｏｌｅｒｏｎｉｕｓ）、Ｂ．オシメンシス（Ｂ．ｏｓｈｉｍｅｎｓｉｓ）、Ｂ．パナシテラエ（Ｂ．ｐａｎａｃｉｔｅｒｒａｅ）、Ｂ．パタゴニエンシス（Ｂ．ｐａｔａｇｏｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ペルセポレンシス（Ｂ．ｐｅｒｓｅｐｏｌｅｎｓｉｓ）、Ｂ．プラコルチジス（Ｂ．ｐｌａｋｏｒｔｉｄｉｓ）、Ｂ．ポチェオネンシス（Ｂ．ｐｏｃｈｅｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ポリゴニ（Ｂ．ｐｏｌｙｇｏｎｉ）、Ｂ．シュードアルカリフィルス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．シュードフィルムス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．シュードミコイデス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、Ｂ．サイクロサッカロリチクス（Ｂ．ｐｓｙｃｈｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．キングダオネンシス（Ｂ．ｑｉｎｇｄａｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．リグイ（Ｂ．ｒｉｇｕｉ）、Ｂ．ルリス（Ｂ．ｒｕｒｉｓ）、Ｂ．サフェンシス（Ｂ．ｓａｆｅｎｓｉｓ）、Ｂ．サラリウス（Ｂ．ｓａｌａｒｉｕｓ）、Ｂ．サリフィルス（Ｂ．ｓａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．シュレゲリイ（Ｂ．ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）、Ｂ．セレナタルセナチス（Ｂ．ｓｅｌｅｎａｔａｒｓｅｎａｔｉｓ）、Ｂ．セレニチレズセンス（Ｂ．ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、Ｂ．セオハエアネンシス（Ｂ．ｓｅｏｈａｅａｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．シャクレトニイ（Ｂ．ｓｈａｃｋｌｅｔｏｎｉｉ）、Ｂ．シアメンシス（Ｂ．ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、Ｂ．シンプレクス（Ｂ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、Ｂ．シラリス（Ｂ．ｓｉｒａｌｉｓ）、Ｂ．スミチイ（Ｂ．ｓｍｉｔｈｉｉ）、Ｂ．ソリ（Ｂ．ｓｏｌｉ）、Ｂ．ソリサルシ（Ｂ．ｓｏｌｉｓａｌｓｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．スポロテルモズランス（Ｂ．ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．ストラトスフェリクス（Ｂ．ｓｔｒａｔｏｓｐｈｅｒｉｃｕｓ）、Ｂ．スブテラネウス（Ｂ．ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．タエアンシス（Ｂ．ｔａｅａｎｓｉｓ）、Ｂ．テクイレンシス（Ｂ．ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓ）、Ｂ．テルマンタルクチクス（Ｂ．ｔｈｅｒｍａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、Ｂ．テルモアミロボランス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ）、Ｂ．テルモクロアカエ（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｃｌｏａｃａｅ）、Ｂ．テルモラクチス（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．チオパランス（Ｂ．ｔｈｉｏｐａｒａｎｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．トリポキシリコラ（Ｂ．ｔｒｉｐｏｘｙｌｉｃｏｌａ）、Ｂ．ツスシアエ（Ｂ．ｔｕｓｃｉａｅ）、Ｂ．バリスモルチス（Ｂ．ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ）、Ｂ．ベッデリ（Ｂ．ｖｅｄｄｅｒｉ）、Ｂ．ビエトナメンシス（��．ｖｉｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビレチ（Ｂ．ｖｉｒｅｔｉ）、Ｂ．ワコエンシス（Ｂ．ｗａｋｏｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス（Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ）、Ｂ．キシアオキシエンシス（Ｂ．ｘｉａｏｘｉｅｎｓｉｓ）、及びこれらの組み合わせからの菌株を含む。
【００４６】
別の態様において、微生物細胞培養物は、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の菌株を含む。ある種の態様において、微生物細胞培養物は、次のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属種：Ｐ．アンタルクチカ（Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、Ｐ．アゾトホルマンス（Ｐ．ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｐ．ブラチフォルダエ（Ｐ．ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄａｅ）、Ｐ．ブラッシカセアルム（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、Ｐ．ブレッネリ（Ｐ．ｂｒｅｎｎｅｒｉ）、Ｐ．セドリナ（Ｐ．ｃｅｄｒｉｎａ）、Ｐ．コルガテ（Ｐ．ｃｏｒｒｕｇａｔｅ）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｐ．ゲッサルジイ（Ｐ．ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）、Ｐ．リバネンシス（Ｐ．ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）、Ｐ．マンデリイ（Ｐ．ｍａｎｄｅｌｉｉ）、Ｐ．マルギナリス（Ｐ．ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、Ｐ．メジテラネア（Ｐ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ）、Ｐ．メリジアン（Ｐ．ｍｅｒｉｄｉａｎ）、Ｐ．ミグラエ（Ｐ．ｍｉｇｕｌａｅ）、Ｐ．ムシドレンス（Ｐ．ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、Ｐ．オリエンタリス（Ｐ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｐ．パナシス（Ｐ．ｐａｎａｃｉｓ）、Ｐ．プロテゲンス（Ｐ．ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ）、Ｐ．プロテオリチカ（Ｐ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐ．ローデシアエ（Ｐ．ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）、Ｐ．シンキサンタ（Ｐ．ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、Ｐ．チベルバレンシス（Ｐ．ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ）、Ｐ．トラアシイ（Ｐ．ｔｏｌａａｓｉｉ）、Ｐ．ベロニイ（Ｐ．ｖｅｒｏｎｉｉ）、及びこれらの組み合わせのいずれか一つからの菌株を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「リポペプチド」という用語は、両親媒性環状ペプチド類及び抗細菌性ペプチド類を指すことができる。
【００４８】
両親媒性環状ペプチド類は通常、β−アミノ又はβ−ヒドロキシ脂肪酸に連結されたいくつかのα−アミノ酸からなり、フェンギシン型化合物、イツリン型化合物、サーファクチン型化合物、フサリシジン類、ビスコシン類、アンフィシン類、トラアシン類、シリンゴマイシン類、及びプチソルビン類などがあるが、これらに限定されるものではない。イツリン型化合物は、いくつかのアミノ酸からなり、β−アミノ脂肪酸に連結されている。ある種のリポペプチド類の脂肪酸鎖の長さは、Ｃ１４〜Ｃ１７で変動する。これらの化合物は、スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びアミロリクエファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の各種属種から得ることができる。イツリン類及びそれらの変異体が、Ｏｎｇｅｎａ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：    Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｗｅａｐｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １６（３）：１１５−１２５，  （２００７）に記載されている。
【００４９】
本発明のイツリン型化合物には、次の化合物：バシロマイシンＤ、バシロマイシンＦ、バシロマイシンＬ、バシロマイシンＬＣ（バシロペプチンとも称される）、マイコスブチリン、イツリンＡ、イツリンＡＬ、及びイツリンＣ（本明細書で言及の後者３化合物は総称して、イツリン類と称される。）のうちの１以上などがある。
【００５０】
フェンギシン型化合物は、Ｃ１４〜Ｃ１８の長さで変動する鎖を有するβ−ヒドロキシ脂肪酸に連結されている１０個のアミノ酸からなる。これらの化合物は、スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アミロリクエファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セレウス（ｃｅｒｅｕｓ）及びチューリンギエンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の各種属種から、及びストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）から得ることができる。フェンギシン型化合物は、上記のＯｎｇｅｎａに記載されている。本明細書に記載の組成物に好適なフェンギシン型化合物には、フェンギシンＡ、フェンギシンＢ、プリパスタチンＡ、プリパスタチンＢ、Ｋｉｍｕｒａ、ｅｔ  ａｌ．，  ″ＳＮＡ  ６０−３６７−Ｎｅｗ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ａｒｏｍａｔａｓｅ，″  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、５０（６）：５２９−５３１，  （１９９７）に記載のストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）からのプリパスタチン類、及び米国特許第６，２９１，４２６号に記載のアグラスタチン類（本明細書で言及された後者４個のリストは総称してプリパスタチン類と称される。）などがある。
【００５１】
サーファクチン型化合物は、Ｃ１３〜Ｃ１６の長さで変動する鎖を有するβ−ヒドロキシ脂肪酸に連結されたいくつかのアミノ酸からなる。これらの化合物は、スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アミロリクエファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）及びリチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などのバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の各種属種から得ることができる。サーファクチンファミリーの化合物が、上記のＯｎｇｅｎａに記載されている。本発明のサーファクチン型化合物には、次の化合物：エスペリン（ｅｓｐｅｒｉｎ）、リケナイシン、プミラシジン及びサーファクチンのうちの１以上などがある。
【００５２】
フサリシジン型化合物は、１５−グアニジノ−３−ヒドロキシペンタデカン酸に連結した６個のアミノ酸からなる。これらの化合物は、ポリミキサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）などのパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から得ることができる。フサリシジンファミリーの化合物は、Ｃｈｏｉ，  Ｓ−Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  “″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｓａｒｉｃｉｄｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ  Ｅ６８１，″  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ３６５：８９−９５，  （２００８）に記載されている。本発明のフサリシジン型化合物には、次の化合物：フサリシジンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ並びにフサリシジンＬＩ−Ｆ０３、ＬＩ−Ｆ０４、ＬＩ−Ｆ０５、ＬＩ−Ｆ０６、ＬＩ−Ｆ０７及びＬＩ−Ｆ０８のうちの１以上などがある。追加のフサリシジン型化合物には、２０１５年９月２４日出願の米国特許出願第６２／２３２，２０５号（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のパエニセリン類及びパエニプロリキシン類などがある。パエニセリン類及びパエニプロリキシン類の例には、パエニセリンＡ１、パエニセリンＡ２、パエニセリンＡ３、パエニセリンＡ４、パエニセリンＢ１、パエニセリンＢ２、パエニセリンＢ３、パエニセリンＢ４、パエニセリンＣ１、パエニセリンＣ２、パエニセリンＣ３、パエニセリンＣ４、パエニプロリキシンＡ１、パエニプロリキシンＡ２、パエニプロリキシンＢ１、パエニプロリキシンＢ２、パエニプロリキシンＣ１、パエニプロリキシンＣ２、パエニプロリキシンＤ１、パエニプロリキシンＤ２、パエニプロリキシンＥ１、パエニプロリキシンＥ２、パエニプロリキシンＦ１、及びパエニプロリキシンＦ２などがある。
【００５３】
ビスコシン類、アンフィシン類、トラアシン類、シリンゴマイシン類、及びプチソルビン類は、Ｒａａｉｊｍａｋｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  １９（７）：６９９−７１０に記載の植物関連シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属種によって産生される。ビスコシン類には、ビスコシン、ビスコシン−アミド、マッセトリドＡ、マッセトリドＤ、ＷＬＩＰ、シュードフォミン（ｐｓｅｕｄｏｐｈｏｍｉｎ）Ａ、及びシュードフォミン（ｐｓｅｕｄｏｐｈｏｍｉｎ）Ｂなどがある。アンフィシン類には、アンフィシン、テンシン、ホリペプチンＡ、ロキシン、及びアルスロファクチン（ａｒｔｈｒｏｆａｃｔｉｎ）などがある。トラアシン類には、トラアシン、ＦＰ−Ｂ．コルペプチンＡ、ＳＰ２２、及びＳＰ２５Ａなどがある。シリンゴマイシン類には、シリンゴマイシン、シリンゴスタチン、シリンゴトキシン（ｓｙｒｉｎｇｏｔｏｘｉｎ）、シュードマイシンＡ、及びコルマイシンＡなどがある。プチソルビン類には、プチソルビンＩ及びプチソルビンＩＩなどがある。
【００５４】
抗微生物性ペプチドが、Ｗａｎｇ  ＆  Ｗａｎｇ  （２００４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：Ｄ５９０−Ｄ５９２に記載されている。その抗微生物性ペプチドは、非リボソーム合成ペプチド又はリボソーム合成ペプチド（ＲＡＭＰ）であることができる。非リボソーム合成ペプチドは、細菌及び真菌で認められる。これらの抗微生物性ペプチドは、リボソームに基づく合成とは対照的にペプチド合成酵素によって構築される。グラミシジン（例えば、グラミシジンＳ、グラミシジンＤ）、バシトラシン、ポリミキシンＢ．メリチン、セクロピン、及びバンコマイシンが、非リボソーム合成抗微生物ペプチドの例である。Ｚｅｉｔｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ８（８）：  ｅ７１６８７。さらなるパントシンＡ、パントシンＢ．ポリオキシン類、ニッコーマイシン類、リゾシチン、バシリシン、ブラストサイジン、及びミルディオマイシンはいずれも、特許請求の組成物又は方法で使用可能な植物病原体に対して活性な抗微生物性ペプチドである。ＰＥＰ６、ＰＡＦ２６、ＢＰＣ１９４、ＰＥＰ３、ＰＥＰ１１、ＢＰ７６、ＣＡＭＥＬ、イセガナン、Ｄ４Ｅ１、ＴＹＰ、ＥＳＦ１２、ＥＳＦ１、ペキシガナン、ＭＳＩ−９９、ＭＢ−３９、Ｐｅｎ４−１、及びＤ３２Ｒはいずれも、特許請求の組成物又は方法で使用可能な植物病原体に対する活性を有する合成抗微生物性ペプチドである。さらに、セクロピンＡ、Ｂ．タキプレシン、ヘリオマイシン（ｈｅｌｉｏｍｉｃｉｎ）／ドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）、サクロトキシン（ｓａｃｒｏｔｏｘｉｎ）ＩＡ、イガイ・ディフェンシン（ｍｕｓｓｅｌ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、マゲイニン、エスクレンチン（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎ）−１、Ｒｓ−ＡＦＰ２、Ａｌｆ−ＡＦＰ、Ｓｐｉ１、ＤＲＲ２３０−ａ、ＢＳＤ１、ＷＴ１、Ｄｍ−ＡＭＰ１、Ｍｊ−ＡＭＰ１、Ｐｎ−ＡＭＰ、ホルドンチオニン（ｈｏｒｄｏｎｔｈｉｏｎｉｎ）、α−チオニン、ＡＦＰ、ＳＢ−３７、Ｓｈｉｖａ−１、ＳＢ３７、ＭＢ−３９、ＭｓｒＡ１、ＭＳＩ−９９、Ｍｙｐ３０、Ｒｅｖ４、及びＤ４Ｅ１はいずれも、病原体に対する少なくとも部分的な抵抗性を与え、本明細書に記載の組成物及び方法で用いることができるトランスジェニック植物で発現されている。Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ  （２００７）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２７０：１−１１。
【００５５】
本明細書で開示の方法で精製可能であるＥＰＳ類の例には、アセタン（アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ））；アルギン酸類（アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ））；セルロース（アセトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ））；キトサン（ケカビ属種（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ  ｓｐｐ．））；カードラン（アルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）変種ミキソゲネス（ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ））；シクロソフォラン類（ｃｙｃｌｏｓｏｐｈｏｒａｎｓ）（アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、リゾビウム属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びキサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．））；デキストラン（ロイコノストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストク・デキストラニクム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）及びラクトバチルス・ヒルガルジイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ））；エミュルサン（アシネトバクター・カルコアセチクス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ））；ガラクトグルコ多糖類（ｇａｌａｃｔｏｇｌｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）（アクロモバクター属種（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス・マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、リゾビウム属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びズーグレア属種（Ｚｏｏｇｌｅａ  ｓｐｐ．））；ガラクトサミノガラクタン（ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ）（アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））；ジェラン（オーレオモナス・エロデア（Ａｕｒｅｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）及びスフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ））；グルクロナン（シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ））；Ｎ−アセチルグルコサミン（スタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））；Ｎ−アセチル−ヘパロサン（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））；ヒアルロン酸（ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ））；インジカン（ベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ））；ケフィラン（ラクトバチルス・ヒルガルジイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ））；レンチナン（レンチヌス・エロデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｌｏｄｅｓ））；レバン（アルカリゲネス・ビスコスス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；プルラン（アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））；スクレログルカン（スクレ���チウム・ロルフシイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、スクレロチウム・デルフィニイ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｄｅｌｆｉｎｉｉ）及びスクレロチウム・グルカニクム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｇｌｕｃａｎｉｃｕｍ））；シゾフィラン（スキゾフィルム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ））；ステワルタン（ｓｔｅｗａｒｔａｎ）（パントエア・ステワルチイ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）下位属種ステワルチイ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ））；スクシノグリカン（アルカリゲネス・フェーカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）変種ミキソゲネス（ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ）、シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ））；キサンタン（キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））；及びウェラン（アルカリゲネス属種（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐｐ．））などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
開示の方法は、当業界で公知の方法に従って微生物株（例えば、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１、又はそれ由来の真菌突然変異体（株））を培養することで得られる組成物とともに用いることができる。従来の大規模微生物培養プロセスには、液内発酵、固体発酵又は液体表面培養などがある。発酵終了に向かって、栄養分が枯渇してくると、細胞は増殖期から胞子形成期への移行を開始することで、発酵の最終産物は、かなりの部分が胞子、代謝物及び残留発酵培地である。胞子形成は、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の自然なライフサイクルの一部であり、栄養制限に応じて細胞によって開始される。発酵は、高レベルの胞子形成のコロニー形成単位を得て、胞子形成を促進するように構成される。発酵によって得られる細菌細分、胞子及び代謝物を、直接用いることができるか、工業的方法、例えば遠心、接線流濾過、深層濾過、及び留去によって濃縮することができる。
【００５７】
そのような組成物は、発酵産生物を含む。一部の実施形態において、濃縮した発酵ブロスを、例えばダイアフィルトレーション法によって洗浄して、残留発酵ブロス及び代謝物を除去する。本明細書で使用される「ブロス濃縮液」という用語は、本明細書に記載の工業的方法によって濃縮されているが、液体形態のままである全ブロス（発酵ブロス）を指す。本明細書で使用される「発酵固体」という用語は、発酵ブロスを乾燥させた後の残る固体材料を指す。本明細書で使用される「発酵産物」という用語は、全ブロス、ブロス濃縮液及び／又は発酵固体を指す。本発明の方法を用いて、発酵産物を含む組成物を作ることができる。
【００５８】
発酵ブロス又はブロス濃縮液は、噴霧乾燥、凍結乾燥、箱型乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥又は留去などの従来の乾燥プロセス又は方法を用い、担体を加えて又は加えずに濃縮物を乾燥することができる。
【００５９】
得られた乾燥生成物を、製粉又は造粒などよってさらに処理して、特定の粒径又は物理形態を得ることができる。下記で記載の担体は、乾燥後に加えることもできる。
【００６０】
発酵ブロスの抽出、遠心及び／又は濾過などの当業界で公知の手段によって、本発明の菌株の発酵ブロスの無細胞調製物を得ることができる。いわゆる無細胞調製物が、細胞を持たないのではなく、細胞を除去するのに使用される技術に応じて（例えば、遠心速度）、ほぼ無細胞又は実質的に無細胞であることができることは、当業者であれば明らかであろう。得られた無細胞調製物を乾燥し、及び／又は植物若しくは植物成長培地に施用するのを助ける成分とともに製剤することができる。発酵ブロスについて上記で記載の濃縮方法及び乾燥技術を、無細胞調製物に適用することもできる。
【００６１】
一部の実施形態において、開示の方法は、液体製剤である組成物を製造するものである。液体製剤の例には、懸濁剤及び油分散液などがあるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態において、本発明の組成物は、固体製剤である。液体製剤の例には、凍結乾燥粉末及び噴霧乾燥粉末などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明の方法で製造される組成物は、効力、安定性及び有用性を改善し、及び／又は処理、包装及び最終用途使用を容易にするために細胞、無細胞調製物又は代謝物を含む組成物に加えられる製剤不活性成分を含むことができる。そのような製剤不活性成分及び製剤成分には、担体、安定剤、栄養素又は物理特性調節剤などがあり得るものであり、それは個別に又は組み合わせて加えることができる。一部の実施形態において、担体には、水、オイル及び他の有機若しくは無機溶媒などの液体材料、並びにミネラル類、ポリマー類若しくは生物的に若しくは化学合成によって誘導されるポリマー複合体などの固体材料などがあり得る。一部の実施形態において、担体は、種子若しくは根などの植物部分への組成物の付着を促進する結合剤又は接着剤である。例えば、Ｔａｙｌｏｒ，  Ａ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ″Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｓｅｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ″，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．  ２８：３２１−３３９（１９９０）を参照する。安定化剤には、凝固阻止剤、酸化防止剤、乾燥剤、保護剤又は保存剤などがあり得る。栄養素には、炭素源、窒素源及びリン源、例えば糖類、多糖類、オイル、タンパク質、アミノ酸、脂肪酸及びリン酸塩などがあり得る。物理特性調節剤には、増量剤、湿展剤、増粘剤、ｐＨ調節剤、レオロジー調節剤、分散剤、佐剤、界面活性剤、凍結防止剤又は着色剤などがあり得る。一部の実施形態において、発酵によって産生される細胞、無細胞調製物又は代謝物を含む組成物を、他の製剤調製物を用いずに、希釈剤としての水を用い又は用いずに直接用いることができる。一部の実施形態において、製剤不活性物質を、発酵ブロス濃縮後、及び乾燥時及び／又は乾燥後に加える。
【００６３】
寄託情報
本発明のパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株のサンプルは、２０１４年８月２８日にブダペスト条約下に、米国農務省農業研究局国立農業利用研究センター（ＮＲＲＬ）［１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｐｅｏｒｉａ，  ＩＬ６１６０４，  Ｕ．Ｓ．Ａ．］にあるｔｈｅ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託しており、次の受託番号：ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２を割り当てられている。本発明のバチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のサンプルは、１９９７年５月７日にブダペスト条件下にＮＲＲＬに寄託しており、次の受託番号：ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１を割り当てられている。
【００６４】
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株及びバチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株は、培養物へのアクセスが、本特許出願の係属中に、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４及び３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２下に資格を有すると特許商標庁が決定した者に入手可能となるようにする条件下で寄託されている。その寄託物は、寄託されたパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株の実質的に純粋な培養物を代表するものである。寄託物は、該当する出願の対応物又はその子孫が提出されている国における外国特許法による要求に応じて入手可能である。しかしながら、理解すべき点として、寄託物を入手できても、それが、行政措置によって付与された特許権から逸脱した該当する発明を実施する許可を構成するものではない。
【００６５】
以下の実施例は、純粋に例示を目的として提供されるものであり、本発明を限定するためのものではない。
【００６６】
実施例
実施例１．パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の全ブロスからのペレット及び上清画分におけるフサリシジンＡレベル及び殺菌活性
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２を大豆系培地で増殖させて、全ブロス培養物を得た。次に、全ブロス培養物の一部を相対遠心力（ＲＣＦ）２４，７９０×ｇで１０分間遠心して、ペレット画分（すなわち、ブロス濃縮液）及び上清を得た。この速度での遠心は、少量（約３０ｍＬ）についてのみ可能であり、柔らかいペレット画分及び相対的に濁った上清が得られた。ペレット画分は元の体積の１／４〜１／３を占め、上清画分が残りの部分を占めていた。ペレット画分及び上清画分は、それ以上の希釈や濃縮を行わずにその体積で分析した。
【００６７】
最大遠心速度がＲＣＦ１７，０００×ｇに制限された更に大きい体積（約１０００ｍＬ）では、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス培養物が粘稠であって、ペレット画分を上清画分から分離することはできなかった。パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス培養物の大規模遠心には、より低い遠心速度でペレット画分及び上清画分を分離することができるように全ブロス培養物を調整する必要があることは明らかであった。
【００６８】
超高速液体クロマトグラフィー／質量分析三重飛行時間（ＵＰＬＣ／ＭＳ  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ）を用いるクロマトグラフィー法を用いて、画分中の公知の殺菌剤化合物、フサリシジンＡの相対量を評価した［カラム：ＺＯＲＢＡＸ（商標名）Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ、２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ；水（０．１％ＦＡ）及びアセトニトリル（０．１％ＦＡ）；勾配（％Ｂ）：０−５分１０−９５％；洗浄］。フサリシジンＡの同定は、その固有の保持時間及び質量によって行った。スペクトラムにおけるフサリシジンピークの相対シグナル強度を表１に示してあり、各強度は全ブロススペクトラムに存在するものに対して正規化されている。フサリシジンＡはペレット画分中に集中しており、上清画分中には少量が残っていた。
【００６９】
各画分中に存在するコロニー形成単位も、全ブロス培養物、上清画分及びペレット画分の連続希釈を行い、固体培地上にその希釈液を蒔くことによっても定量した。得られたコロニーをカウントし、記録した（表１参照）。予想通り、大部分の細胞が、遠心によってペレット画分に移動した。
【００７０】
表１．パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２のコロニー形成単位（ＣＦＵ）及び全ブロス培養液中のフサリシジンＡの相対量
【表１】
2019506881.tif 000007
【００７１】
画分の殺菌活性を、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（ＢＯＴＲＣＩ）を用いるイン・ビボアッセイでも測定した。パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス並びに相当する上清及びペレット画分をそれぞれ水で希釈して、同等の最終体積とした。その希釈した全ブロス、上清画分、及びペレット画分を若い植物に施用し、次にその植物を、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（ＢＯＴＲＣＩ）の接種物に曝露した。植物病原体の接種物への曝露から数日後に、各植物について、未処理対照植物と比較した病原体の防除パーセントを評点した。各処理とも、数連で評価した。
【００７２】
図１に示した結果は、最大殺菌活性が全ブロス（「ＷＢ」）及びペレット画分（「ペレット」）にあるが、上清画分（「Ｓｕｐ」）では、未処理対照（「水」）と比較してほとんど観察できないほどの殺菌活性が得られたことを示している。
【００７３】
これらの実験データは、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス中の殺菌剤化合物が、全ブロスの遠心及び得られたペレットからの上清の除去によって富化又は濃縮され得ることを示している。
【００７４】
実施例２．パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス用の遠心処理補助剤の確認
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスは、エキソ多糖類（ＥＰＳ）などの粘稠性バイオポリマーを含むことから、遠心によってコンパクトなペレット分画を作るのが困難となる。このことは、図２で「ＷＢ−ＳＤＯＳ」とラベル表示された処理助剤を加えずに遠心した全ブロスからのペレットの写真でわかる。各種化学薬剤が遠心時にコンパクトなペレット画分の形成を誘発する能力を調べたところ、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ナトリウムジオクチルスルホスクシネート；ＳＤＯＳとも称される）が確認された。
【００７５】
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を、０．１％〜０．５％（重量／体積）の濃度でパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス（「ＷＢ」）に加えた場合、混合物を遠心することで、コンパクトなペレット画分及び粒子状材料を比較的含まない上清が得られた。このことは、図２で「ＷＢ＋ＳＤＯＳ」とラベル表示されたＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）と混合した遠心全ブロスの写真からわかる。
【００７６】
実施例３．別のパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの全ブロスでの遠心処理助剤の効果
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）が他のＥＰＳ産生株との遠心時にコンパクトなペレット画分の形成を誘発するか否かを調べるため、比較的高レベルのＥＰＳを産生することが知られている別のパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株を大豆系培地で増殖させた。全ブロスのいくつかの調製物を、０．１％〜０．５％（重量／体積）の濃度でＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）の非存在下及び存在下に、ＲＣＦ１７，０００×ｇで５分間遠心した。
【００７７】
図３に示したように、ＥＰＳ産生性パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの全ブロスにＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を加えることで、コンパクトなペレット画分及び透明な上清画分が常に得られた。対照的に、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）の非存在下での同じ全ブロスの遠心では、概して、拡散したペレット画分及び濁った上清画分が得られた。
【００７８】
実施例４．ＳＤＯＳがコンパクトなペレット画分の形成を誘発することの確認並びにペレット及び上清画分中のフサリシジンＡの測定
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）は、Ｓｏｌｖａｙ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手可能な市販品である。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）中のＳＤＯＳが遠心効果を起こすものであり、前記市販品中の別の化学成分ではないことを確認するため、ＳＤＯＳの精製調製物を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を全ブロスに最終濃度０．１％まで加え、又は精製したＳＤＯＳを最終濃度０．１％又は０．５％まで加えて、実施例２に記載の実験を繰り返した。コンパクトなペレット画分を、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）又は精製ＳＤＯＳを用いて得た。
【００７９】
次に、実施例１に記載の分析方法を用いて、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）若しくは精製ＳＤＯＳを含む全ブロス並びにペレット及び上清画分中のフサリシジンＡの相対レベルを求めた。等体積の全ブロス、ペレット画分及び上清画分を、フサリシジンＡレベルについて分析し、それを全ブロス中のフサリシジンＡによって生じたシグナルに正規化した。フサリシジンＡの大半がペレット画分中に分離され、上清画分中にはごくわずかしか残っていなかった（図４参照）。
【００８０】
これらの実験でのペレット画分は元の体積の１／４〜１／３に相当し、上清画分は実施例１で認められた残留体積を占めていた。ペレット画分は全ブロスの濃縮型を表すことから、ペレット画分中のフサリシジンＡの相対量が全ブロスで検出される量よりかなり高いと予想されたであろう（例えば、表１中の全ブロス及びペレット画分におけるフサリシジンＡレベルを参照）。しかしながら、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）で形成されたペレット画分では、これは当てはまらなかった（図４中の全ブロス及びペレット画分におけるフサリシジンＡレベルを比較する）。これらの結果は、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）が比較的低い遠心速度での全ブロスからのコンパクトなペレット画分の形成を促進するが、それによって、実施例１に記載のクロマトグラフィー法で検出可能なフサリシジンＡの量も低下させることを示唆していた。この分析方法は、クロマトグラフィーカラムがフサリシジンＡを他の化合物から分離する能力によるものであり、大きい不溶性凝集体で結合したフサリシジンＡを検出しないものと考えられる。
【００８１】
実施例５．ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む及びそれを含まないパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２培養ブロスにおける粒径の分析
実験結果は、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）がパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスでの胞子、フサリシジンＡ、及び他の材料の大きい凝集体の形成を誘発し、これらの凝集体が比較的低速度での遠心時にコンパクトなペレット画分を与えたことを示唆していた。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）で凝集が生じているか否かを調べるため、粒径分析（ＰＳＡ）を行った。
【００８２】
ＰＳＡは、懸濁液サンプルにおける粒径分布を測定するものである。レーザー光を液体粒子懸濁液に通す。レーザー光がそのサンプルを通る時に、散乱光の強度における角度変化を記録する。この角度強度依存性を用いて、粒径分布を得る。得られたデータ曲線は、その粒径の粒子の群の関数としての粒径を表す。
【００８３】
ＰＳＡを、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む若しくは含まないブロス濃縮液、並びにＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む若しくは含まないパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスからの上清画分で行った。ブロス濃縮液は、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含まない高速遠心後、又はペレットからの除去が困難であった少量の上清でのＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む低速遠心後のパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスからのペレット画分から構成されていた。得られたデータ曲線を、図５Ａ〜５Ｅに示してある。各グラフにおける二つの曲線は、各サンプルで得た二つの測定値を表す。
【００８４】
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含むブロス濃縮液についてのＰＳＡデータ曲線は、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含まないブロス濃縮液で認められたものより大きい直径を有する粒子の群を確認するものであった。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含むブロス濃縮液からの粒子の大半が、６μｍ以上の直径を示した。対照的に、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含まないブロス濃縮液からの粒子のほとんどが６μｍ未満の直径を示した（図５Ｂ及び図５Ｃを比較する）。これらの結果は、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）が大きい凝集体の形成を誘発するという仮説を裏付けるものであった。
【００８５】
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む及び含まない上清画分の分析も、この仮説を裏付けるものであった。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む全ブロスからの上清画分中の粒子の大半が０．４μｍ未満の直径を示したが、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含まない全ブロスからの上清画分中の粒子のほとんどが０．４μｍより大きい直径を有していた（図５Ｄ及び図５Ｅを比較する）。これらのデータは、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）をパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスに加えることで、大きい凝集体の形成が誘発され、それが遠心時に上清画分から効果的に除去され、ペレット画分とともに沈殿することを示唆している。
【００８６】
実施例６．ペレット形成及びフサリシジンＡレベルに対するｐＨ及び塩濃度の効果
フサリシジンＡなどの殺菌剤化合物は多くの場合、それらが溶解している溶液のｐＨによって影響を受けるイオン性基を有する。これらのイオン性基の電荷は、その殺菌剤化合物が溶液中で他の化合物とどのように相互作用するかに影響を与える。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）がパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス中での凝集体の形成を誘発する能力を改善するｐＨを確認するため、遠心前に塩酸及び水酸化ナトリウムを加えることで、全ブロスのｐＨを３〜１０に調節した。
【００８７】
ｐＨ３、６若しくは１０でのＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む全ブロスでの低速遠心後のペレット画分の観察で、ｐＨ６でコンパクトなペレット画分と透明上清が生じることが示された（図６参照）。この実験を、ｐＨ３、４、５、６、７、８、９若しくは１０に調節したＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含むパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスで繰り返した。遠心後、ペレット画分を上清画分から分離し、ペレット画分中での相対フサリシジンＡレベルを実施例１に記載の方法で求めた。４〜７のｐＨでの全ブロスからのペレット画分で、最高フサリシジンＡレベルが検出された。
【００８８】
塩濃度が、溶液のイオン強度に影響する。高い塩濃度は、双極子相互作用を遮断し、極性化合物の水和を減らすことで、溶液からのこれら化合物の「塩析」を可能と得る。各種濃度の塩（例えば、塩化ナトリウム又は塩化カリウム）を、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２に加えて、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む低速遠心後のコンパクトなペレット画分形成に対するそれらの効果を確認した。約２％〜約１０％の塩濃度が、コンパクトなペレット画分の形成を促進した。
【００８９】
実施例７．パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスを用いる別の遠心処理助剤の確認
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を確認した後、追加の化学剤について、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスで同様の効果を生じる能力を評価した。５０ｍＬ円錐バイアル中、各化学剤を０．１％〜０．５％（重量／体積）の濃度で全ブロスと混合し、ＲＣＦ３，０００×ｇを生じる比較的低遠心速度で５分間遠心した。
【００９０】
次に、各種化学剤と混合した遠心全ブロスを、化学剤を全く含まない遠心全ブロスと比較した（すなわち、図７Ａ中の最も左の円錐バイアル）。いくつかの化学剤が、低速遠心（すなわち、ＲＣＦ３，０００×ｇ）後に透明上清を生じ、それらについてさらに調べた。実施例１に示したように、これらの化学剤の非存在下で識別可能なペレット画分を形成するのに、ＲＣＦ２４，７９０×ｇでの遠心が必要であった。
【００９１】
全ブロスからのペレット画分の充填を改善する化学剤を、より大きい体積で調べて、この効果を確認した。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を、陽性対照としてこれらの確認実験に含めた。図７Ｂは、ＮＩＡＰＲＯＯＦ（登録商標）４（ナトリウム７−エチル−２−メチル−４−ウンデカニルサルフェート）がＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）で認められる効果と同様の効果を生じることを確認する一つのそのような実験からのペレット及び上清画分の写真を示す図である。
【００９２】
ＮＩＡＰＲＯＯＦ（登録商標）４（ナトリウム７−エチル−２−メチル−４−ウンデカニルサルフェート）；ＮＩＡＰＲＯＯＦ（登録商標）８（ナトリウム２−エチルヘキシルサルフェート）；及び直鎖アルキルベンゼンスルホネート、ナトリウムドデシルベンゼンスルホネートによって、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスの低速遠心後にコンパクトなペレット画分の形成が可能となった。
【００９３】
実施例８．パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２ペレット画分中の殺菌剤化合物の放出助剤の確認
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む又は含まないブロス濃縮液及び上清画分のＰＳＡ分析は、遠心助剤（例えば、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ））の添加が遠心時にコンパクトなペレット画分をより容易に形成する凝集体の形成を誘発することを示した（図５Ａ〜５Ｅを参照）。結果的に、遠心及びペレット画分の単離後に加えた放出助剤が凝集体を乱し、殺菌剤化合物の生物学的利用能及び得られる発酵産生物の効力を高める可能性がある。
【００９４】
いくつかの化合物について、ペレット画分で、放出助剤として作用する能力を調べた。放出助剤としての化合物の効力を評価するため、実施例２に記載の方法に従って、全ブロスから、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を用いてペレット画分を形成した。次に、ペレット画分の部分をその各種化合物と混合し、各サンプル中に存在するフサリシジンＡの量を、実施例１に記載の分析方法を用いて求めた。フサリシジンＡの全ての測定値を、出発材料全ブロス中に存在する量に正規化した。ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）のみを含むペレット画分を対照として含めた。
【００９５】
いくつかのポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル化合物が、ペレット画分中に存在するフサリシジンＡの相対量を増加させることが認められた。これらの化合物には、ポリオキシエチレン（２５）ドデシルエーテル（Ｃ１２ＥＯ２５とも称される）及びＢＲＩＪ（登録商標）Ｌ２３（ポリオキシエチレン（２３）ドデシルエーテル；Ｃ１２ＥＯ２３とも称される）などがあった（図８を参照）。さらなる実験によって、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル化合物Ｃ１２ＥＯ６（ポリオキシエチレン（６）ドデシルエーテル）及びＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１００（ポリオキシエチレン（１００）オクタデシルエーテル）も、ペレット画分中に存在するフサリシジンＡの相対量を増やすことが示された（図９参照）。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）オキソラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチル（Ｅ）−オクタデカ−９−エノエート；ポリオキシエチレンソルビタンオレエートとも称される）も、放出助剤として機能することが認められた（図９参照）。
【００９６】
実施例９．放出助剤を加えた後のペレット画分の懸濁性上昇
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）単独を含む、又はＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５の両方を含むペレット画分の物理特性を調べた。調べた物理特性のうちの一つは、濃縮ペレット画分の懸濁性であった。
【００９７】
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２を大豆系培地で培養し、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含んだ低速遠心を行って、ペレット画分を得た。そのペレット画分を二つの画分に分離し、Ｃ１２ＥＯ２５をその画分の一方と混合した。両方の画分からの小分けサンプルを１５ｍＬ円錐バイアル中にて水と混合して、１０倍希釈液を作った。希釈されたペレット画分を、数分間にわたり室温で平衡化した。
【００９８】
平衡化後、Ｃ１２ＥＯ２５を含まないペレット画分を二つの層に分離し、上層が透明層であり、下層が濁った層であった（図１０中の左の円錐バイアルを参照）。対照的に、Ｃ１２ＥＯ２５を含むペレット画分は、平衡化後に単一懸濁液のままであった（図８中の右の円錐バイアルを参照）。これらの結果は、Ｃ１２ＥＯ２５が水で希釈した場合にパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２ブロス濃縮液の懸濁性を上昇させることを示していた。
【００９９】
実施例１０．遠心助剤及び放出剤を加えることによる、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスの殺菌活性上昇
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２を大豆系培地で培養して全ブロスを得た。０．１％ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及び２％ＫＣｌを全ブロスの一部に加え、ｐＨを６に調節した。全ブロスのこの部分を遠心してペレット画分（すなわち、ブロス濃縮液）を得て、上清画分は除去した。次に、ペレット画分の一部を放出助剤であるＣ１２ＥＯ２５と混合した。
【０１００】
全ブロス、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）のみを含むペレット画分、並びにＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５の両方を含むペレット画分を水で希釈して、濃度１０％、５％、２．５％、及び１．２５％とした。希釈した全ブロスを若い植物に施用し、次に、それらの植物をアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）（ＡＬＴＥＳＯ）又はボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（ＢＯＴＲＣＩ）の接種物に曝露させた。植物病原体の接種物への曝露から数日後に、各植物について、未処理対照（ＵＴＣ）植物と比較した病原体の防除パーセントを評点した。各処理とも、３連で評価し、平均防除パーセントを報告した（表２〜３参照）。
【０１０１】
各アッセイにおいて、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）のみを含むペレット画分は、全ブロスより大きい殺菌活性を有しており、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５の両方を含むペレット画分が最大殺菌活性を有していた。これらの実験データは、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスへのＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）の添加が低速濃縮時のペレット画分における殺菌剤化合物の富化又は濃縮を可能とし、Ｃ１２ＥＯ２５の添加が、このペレット画分の殺菌活性を高めることを示している。
【０１０２】
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５も、ペレット画分での場合と同様の最終施用量で若い植物にそれぞれ施用した。その後、その若い植物に真菌病原体を接種し、各植物について、ＵＴＣ植物と比較した病原体の防除パーセントを評点した。これらの対照処理は、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５が、ＵＴＣ植物との比較後に確認され得る固有の殺菌活性を持たないことを示した。
【０１０３】
表２．１０％、５％、２．５％及び１．２５％の希釈率でのパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む再懸濁ペレット画分、及びＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５を含む再懸濁ペレット画分によって達成されたアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）（ＡＬＴＥＳＯ）の防除
【表２】
2019506881.tif 000008
【０１０４】
表３．１０％、５％、２．５％、及び１．２５％の希釈率でのパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む再懸濁ペレット画分、及びＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５を含む再懸濁ペレット画分で達成されたボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）（ＢＯＴＲＣＩ）の防除
【表３】
2019506881.tif 000009
【０１０５】
実施例１１．遠心助剤及び放出助剤を用いるパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２ブロス濃縮液の大規模調製でのフサリシジンＡレベル
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスからのブロス濃縮液の五つの大きいバッチを、遠心助剤としてＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及び放出助剤としてＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１００（ポリオキシエチレン（１００）オクタデシルエーテル）を用いて、実施例１０に記載の方法に従って調製した。各バッチは、数リットルの材料からなるものであった。各バッチからの全ブロス及び得られたブロス濃縮液におけるフサリシジンレベルを、実施例１に記載の方法に従って定量した。結果は全て、−８０℃で保存したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス（すなわち、「ＷＢ標準」）中のフサリシジンＡレベルに対して正規化した。
【０１０６】
図１１は、フサリシジンＡ測定値における９５％信頼区間を示すグラフ上のエラーバーとともに結果を表す図である。ブロス濃縮液中のフサリシジンＡレベルは、相当する全ブロスで検出される値の３．５倍であった。
【０１０７】
実施例１２．バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１全ブロスでの遠心処理助剤の効果
バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１を、大豆系培地で増殖させた。得られた粘稠全ブロスを、０．１％〜０．５％（重量／体積）の濃度でのＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）とともに又はそれを含まずにＲＣＦ１，５００×ｇで５分間遠心した。
【０１０８】
ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）のバチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＮＲＲＬ  Ｂ−２１６６１全ブロスへの添加によって、よりコンパクトなペレット画分及びより透明な上清画分が得られた（図１２参照）。対照的に、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含まない同じ全ブロスの遠心によって、相対的に拡散性の画分及び濁った上清画分が得られた。
【０１０９】
実施例１３．遠心助剤及び放出助剤を含むパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスの殺菌活性上昇及び用量応答の確認
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスを、実施例１０に記載の方法に従って調製及び処理した。得られた全ブロス、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）のみを含むペレット画分、並びにＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５の両方を含むペレット画分を連続希釈して、出発材料の１倍、０．５倍、０．２５倍及び０．１２５倍濃度を有するサンプルを調製した。次に、連続希釈サンプルを、０．６２５％の施用量で若い植物に施用した。その植物に、真菌病原体アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）を接種し、次に、ＵＴＣ植物と比較した疾病防除について評価した。報告の疾病防除値は、独立の３連の試験の平均である。
【０１１０】
表４に示したように、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）のみを含むペレット画分は、全ブロスより高い殺菌活性を有しており、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５の両方を含むペレット画分が最大の殺菌活性を有していた。さらに、明らかな用量応答が各サンプル横断的に認められ、１倍サンプルで最高活性が認められ、０．１２５倍サンプルで最小活性が認められた。
【０１１１】
表４．各サンプルの１倍、０．５倍、０．２５倍及び０．１２５倍連続希釈液でのパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス、ＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）を含む再懸濁ペレット画分、並びにＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及びＣ１２ＥＯ２５を含む再懸濁ペレット画分で達成されたアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）（ＡＬＴＥＳＯ）の防除。サンプルはいずれも、０．６２５％の施用量で植物に施用した。
【表４】
2019506881.tif 000010
【０１１２】
実施例１４．三つの異なるパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの全ブロス、ブロス濃縮液及び上清におけるフサリシジンＡレベル
パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロスからの、そして二つの別のパエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）株からの全ブロスからのブロス濃縮液を、遠心助剤としてＧＥＲＯＰＯＮ（登録商標）（ＳＤＯＳ）及び放出助剤としてＢＲＩＪ（登録商標）Ｓ１００（ポリオキシエチレン（１００）オクタデシルエーテル）を用いて、実施例１０に記載の方法に従って調製した。各全ブロス並びにブロス濃縮液の製造時に除去した上清のサンプルを分析用に保存した。各菌株からの全ブロス並びに得られたブロス濃縮液及び上清中のフサリシジンレベルを、実施例１に記載の方法に従って定量した。結果は全て、−８０℃で保存したパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２全ブロス中のフサリシジンＡレベルに正規化した。
【０１１３】
図１３は、フサリシジンＡ測定値における９５％信頼区間を示すグラフ上のエラーバーとともに結果を表す図である。全ブロスからブロス濃縮液に行くフサリシジンＡの有効濃度が３種類全ての株横断的に認められ、ブロス濃縮液中での濃度は、相当する全ブロス中で検出されたレベルの７倍の高さになった。いずれの上清においても、検出可能なフサリシジンＡは認められなかった。
【０１１４】
全ブロス、ブロス濃縮液及び上清について、実施例１０に記載の方法に従って、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）に対する殺菌活性を分析した。ＢＲＡＶＯ（登録商標）（クロロタロニル）による処理を、陽性対照として含めた。表５で提供の結果は、殺菌活性が全ブロス及びブロス濃縮液で認められ、上清では検出可能な殺菌活性はほとんど認められなかったことを示している。
【０１１５】
別段の定義がない限り、本明細書における全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する業界の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様若しくは等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、本明細書においては、好ましい方法及び材料を記載している。引用されている全ての刊行物、特許及び特許公開は、参照によって、あらゆる点に関してその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
本明細書で記述の刊行物は、単に本願の出願日以前のそれらの開示内容のために提供されるものである。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が、先行発明により、そのような刊行物に先行する資格を持たないとの承認と解釈すべきではない。
【０１１７】
開示の発明が、変動可能であると記載されている特定の方法、プロトコール及び材料に限定されないことは明らかである。本明細書で使用される用語が、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも明らかである。
【０１１８】
当業者であれば、通常の実験のみを用いて、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するであろうし、又は確認することが可能であろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものである。
【０１１９】
表５．希釈率５％、２．５％及び１．２５％でのパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株Ａ、及びパエニバシラス属種（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）株Ｂからの全ブロス、ブロス濃縮液、及び上清によって達成されたアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ）（ＡＬＴＥＳＯ）の防除
【表５】
2019506881.tif 000011
【図１】
2019506881.tif 000018
【図２】
2019506881.tif 000019
【図３】
2019506881.tif 000020
【図４】
2019506881.tif 000021
【図５Ａ】
2019506881.tif 000022
【図５Ｂ】
2019506881.tif 000023
【図５Ｃ】
2019506881.tif 000024
【図５Ｄ】
2019506881.tif 000025
【図５Ｅ】
2019506881.tif 000026
【図６】
2019506881.tif 000027
【図７Ａ】
2019506881.tif 000028
【図７Ｂ】
2019506881.tif 000029
【図８】
2019506881.tif 000030
【図９】
2019506881.tif 000031
【図１０】
2019506881.tif 000032
【図１１】
2019506881.tif 000033
【図１２】
2019506881.tif 000034
【図１３】
2019506881.tif 000035
【国際調査報告】
2019506881.tif 000036
2019506881.tif 000037
2019506881.tif 000038