(57)【要約】【解決手段】核酸ターゲットの等温増幅においてバックグラウンド増幅を除去する方法を提供することを目的とする。溶液及び酵素を含む混合物を用意するステップと、第１及び第２のテンプレートを前記混合物の中に加えるステップとを備える方法であって、前記第１のテンプレートは増幅テンプレートであり、前記第２のテンプレートは漏出吸収テンプレートである。核酸の多重化され、超高感度で、超特異な検出にこのアプローチを使用する方法が示される。【選択図】図１
2019506185.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ターゲットの等温増幅においてバックグラウンド増幅を除去する方法であって、
バッファ及び酵素を含む混合物を用意するステップと、
第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドを前記混合物の中に加えるステップとを備え、
前記第１のオリゴヌクレオチドは増幅オリゴヌクレオチドであり、前記第２のオリゴヌクレオチドは漏出吸収オリゴヌクレオチドであり、前記第３のオリゴヌクレオチドは特定ターゲット変換オリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項２】
前記第１のオリゴヌクレオチドは、ニッキング酵素認識部位を含む部分的な繰り返し構造を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌクレオチドに沿った重合の生成物を結合し、拡張し、非活性化し、ゆっくりリリースすることができ、それにより、閾値効果を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３のオリゴヌクレオチドの３’側は、重合及びニッキングに際してターゲット配列に結合することができ、前記第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの濃度の制御によって調節された閾値を超えた第１のオリゴヌクレオチドを活性化することができる配列を出力する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素は、ポリメラーゼ、ニッキング酵素及びエキソヌクレアーゼのリストから選択され、前記ポリメラーゼ及びニッキング酵素は等温増幅を進行させることができ、前記エキソヌクレアーゼはシステムの飽和を回避することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素と前記オリゴヌクレオチドとの混合物が所定の閾値を超える刺激を受けたときにのみ、信号増幅が開始される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記閾値は第２のオリゴヌクレオチドの濃度の制御によって調節される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のオリゴヌクレオチドの５’出力部及び第２の漏出吸収オリゴヌクレオチドの結合部と比較して、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’端部は、増幅された配列への低減された親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のオリゴヌクレオチドの３’端部は、前記第１オリゴヌクレオチドによって増幅された配列と相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’端部は、非活性化するテールを増幅された配列に付加するためのテンプレートとして役立つ、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
増幅された配列が高い濃度では前記第１のオリゴヌクレオチドの反応が第２のオリゴヌクレオチドの反応より速いが、増幅された配列が低い濃度では前記第２のオリゴヌクレオチドによる反応が第１のオリゴヌクレオチドの反応より速いように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドの濃度が選択され、それにより、刺激閾値を超えないときには効果的に増幅を除去する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ターゲット配列は、バイオマーカーとして使用することができる既知の配列のＲＮＡ鎖又はＤＮＡ鎖であり、その存在又は濃度は、超高感度で、超特異な方法で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複数のターゲット配列は、それらの特異なターゲットを独立して検出し報告することができる直交配列を備えた第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドの複数のセットを使用して、同じ試料内において同時に検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
報告プローブである第４のオリゴヌクレオチドが付加される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記報告プローブは蛍光プローブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記報告プローブは、増幅オリゴヌクレオチドによって増幅された信号鎖を検出する、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記報告プローブは、蛍光色素及び／又は消光剤によって両方の末端で修正される自己相補形構造鎖である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記報告プローブは、ニッキング認識部位を含んでいるループを備える、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
増幅オリゴヌクレオチドは、制限酵素の認識部位を含んでいる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
二重鎖の増幅テンプレートの低下速度は、ニッカーゼ／制限酵素の比を変えることによって制御される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
制限酵素は、好ましくは、エキソヌクレアーゼとともに、付加される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は等温ＤＮＡ増幅におけるバックグラウンド増幅を除去する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸の等温指数関数的増幅には広範囲の潜在的な適用性がある。１つの具体例は、信号の大幅な増幅を提供することができ、簡素かつ高速なので、バイオマーカーの高感度検出のためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づいたプロトコルを交換することである（例えば、非特許文献１〜６参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Qian J, et al. (2012) Sequence dependence of isothermal DNA amplification via EXPAR. Nucleic Acids Research 40(11):e87-e87.
【非特許文献２】Tan E, et al. (2005) Isothermal DNA amplification coupled with DNA nanosphere-based colorimetric detection. Anal Chem 77(24):7984-7992.
【非特許文献３】Zhang K, et al. (2015) Digital quantification of miRNA directly in plasma using integrated comprehensive droplet digital detection. Lab Chip. doi:10.1039/C5LC00650C.
【非特許文献４】Van Ness J, Van Ness L, Galas D (2003) Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. P Natl Acad Sci Usa 100(8):4504-4509.
【非特許文献５】Tan E, et al. (2008) Specific versus nonspecific isothermal DNA amplification through thermophilic polymerase and nicking enzyme activities. Biochemistry 47(38):9987-9999.
【非特許文献６】1. Guatelli, J. C. et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. P Natl Acad Sci USA 87, 7797-1878 (1990).
【非特許文献７】Walker G, Little M, Nadeau J, Shank D (1992) Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. P Natl Acad Sci USA 89(l):392.
【非特許文献８】(Cancel)
【非特許文献９】Ong J, Evans TC, Tanner N (2012) Compositions and Methods Relating to Variant DNA Polymerases and Synthetic DNA Polymerases.(13/823,811).
【非特許文献１０】Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA (2006) DNA detection using recombination proteins. PLOS biology 4(7):e204.
【非特許文献１１】Recombinase polymerase amplification
【非特許文献１２】Tanner N, Evans TC (2013) Compositions and Methods for Reducing Background DNA Amplification.(13/799,463).
【非特許文献１２ｂ】Dang C, Janaseya, SD (1996) Oligonucleotide Inhibitors of TaqDNA Polymerase Facilitate Detection of Low Copy Number Targets by PCR, 264, 268-27863
【非特許文献１３】Tanner N, Evans TC Jr (2012) Reducing Template Independent Primer Extension and Threshold Time for Loop Mediated Isothermal Amplification.(13/671,123).
【非特許文献１４】Fukui, K. & Kuramitsu, S. Simultaneous Use of MutS and RecA for Suppression of Nonspecific Amplification during PCR. Journal of Nucleic Acids 2013,1-5(2013).
【非特許文献１５】Mitani, Y. et al. Rapid SNP diagnostics using asymmetric isothermal amplification and a new mismatch-suppression technology. Nat Meth 4, 257-262(2007).
【非特許文献１６】Padirac, A., Fujii, T. & Rondelez, Y. Quencher-free multiplexed monitoring of DNA reaction circuits. Nucleic Acids Research 40,e118 (2012).
【非特許文献１７】Buh Gasparic, M. et al. Comparison of nine different real-time PCR chemistries for qualitative and quantitative applications in GMO detection. Anal Bioanal Chem 396,2023-2029(2010).
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公報第２００９／０８１６７０号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０６７７２６号公報
【特許文献３】中国特許第１０４６６２１５９号公報
【特許文献４】オーストラリア公報第２０１５２０２４３９号公報
【特許文献５】米国特許公報第２０１３／０１２２５５号公報
【特許文献６】国際公開第２００９／０１２２４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前述の適用は、指数関数的な核酸増幅スキームの一般的傾向によって妨げられ、抑制されないバックグラウンド信号を有することとなる。これは、ターゲット・バイオマーカー（つまり、関係する単鎖又は二本鎖の核酸配列）が完全に不在であっても、テストが、結局、不特定増幅を行い、誤った肯定的な結論を出すかもしれない、ということを意味する。これは、これらの適用に使用される正の増幅ループの避け得ない属性であり、これらの適用では、基礎状態が本来的に不安定で、（ターゲット配列又は別の配列の）ＤＮＡ増幅が起こらざるを得ない。プライマーダイマーはＰＣＲの場合の周知例であるが、多くの等温増幅スキームは、誤った正の増幅すなわちバックグラウンド増幅のこの現象に対して、より敏感でさえある。
【０００６】
例えば、重合及びニッキングイベント（「ポリメラーゼ−ニッカーゼ増幅」として以下参照。）の繰り返しサイクルに基づく等温増幅スキームの重要なものは、当初には、非特許文献７に記載された、制限酵素及び修飾された骨格を備えるＤＮＡテンプレートを使用してニッキングステップを実行するものであった。その後、この技術は、ニッカーゼ（すなわち、ニッキング酵素）と呼ばれる非対称の制限エンドヌクレアーゼの使用まで拡大された。ニッカーゼは、ＤＮＡ二本鎖の特定の結合部位を認識した後にＤＮＡ二本鎖の片側だけを切断し、それにより、修飾されていないＤＮＡテンプレート骨格の使用が可能となる（例えば、非特許文献６〜１０参照。）。これらの技術について、いくつかの特許が取得されている（例えば、特許文献１〜４及び６参照。）。しかしながら、この一群の増幅戦略が（トリガーされない) バックグラウンド増幅、という検出戦略の有用性を制限する事実の傾向があることは明白であった。指数関数的ポリメラーゼ−ニッカーゼ増幅におけるバックグラウンド増幅の現象は詳細（例えば、非特許文献５参照。）に研究されて、２つの異なるメカニズムが働いていることが示されており、第１のメカニズムは、増幅ループの自己着火（つまり、正しい配列の誤った正の増幅）を説明し、第２のメカニズムは、通常はより長い寄生種の緩慢な出現（つまり、予期されたものと異なる配列の増幅）を説明する。これらの問題に対して種々のアプローチが提案されており、他のタイプの等温増幅についてと同様に、ポリメラーゼ−ニッカーゼ増幅においては、２つのラインに沿っている。第１のラインにおいて、１つは、使用される分子の増幅機構の改善によって増幅ループの厳密さの増加を試みている。１つは、例えば、酵素（例えば、非特許文献９）、又は、テンプレート配列（ポリメラーゼ−ニッカーゼ増幅の場合、いくつかの配列が非特許文献１における他のものよりよく作用することが示された後）を改善しようとすることができる。１つは、例えば、塩類の濃度を最適化することによって、いわゆる「ホットスタート」戦略（例えば、非特許文献１０〜１１参照。）を使用することによって、又は、添加物を使用することによって、バッファと実験条件とを改善しようとすることもでき、添加物は、小さな分子（例えば、非特許文献１２参照。）であってよく、オリゴヌクレオチド（例えば、非特許文献１２ｂ参照。）はだめたが、界面活性剤、クラウディングエージェント、単鎖結合タンパク、ＭｕｔＳ（例えば、非特許文献１５参照。）等のミスマッチ結合タンパク（例えば、非特許文献１３〜１４及び特許文献５参照。）でもよい。第２のアプローチは、第１のものと組み合わせて使用することもできるが、詳細に報告された戦略を使用するものであって、信号の生成が、１つの正確な配列が増幅された場合にのみ開始され、そうでない場合には開始されず、それにより、誤った正の生成を、混合物中で副次的反応が起きても、回避することができる。周知の例には、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ、プライムタイムアッセイ、Ｚｅｎ（ＴＭ）プローブ、サイクリングプローブ、分子ビーコンなど（いくつかの例及び詳細は、非特許文献１６〜１７に挙げられる。）が含まれる。ここで、���々は、バックグラウンド増幅の現象を低減して完全に除去する新しい手法を提案する。従前の試みに反して、我々は、分子成分の機能を改善しようとはせず、分子プログラミング及び動力学システムからの概念を使用して、十分な刺激が付与された場合の信号の指数関数的増幅の可能性を保持しつつも、非増幅状態が混合物の可能な長期転帰となることを確実にする。さらに、我々は、この新しいアプローチが、種々の核酸ターゲットに対して、ロバストで、多重化可能で、超高感度で、超特異な等温検出スキームを構築するのに適切なことを示す。
【０００７】
本発明は、核酸のトレースの検出に使用される等温増幅におけるバックグラウンド増幅を除去する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そのために、本発明は、核酸ターゲットの等温増幅においてバックグラウンド増幅を除去する方法であって、バッファ及び酵素を含む混合物を用意するステップと、第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドを前記混合物の中に加えるステップとを備え、前記第１のオリゴヌクレオチドは増幅オリゴヌクレオチドであり、前記第２のオリゴヌクレオチドは漏出吸収オリゴヌクレオチドであり、前記第３のオリゴヌクレオチドは特定ターゲット変換オリゴヌクレオチドである、方法を提供する。
【０００９】
本発明の他の方法においては、前記第１のオリゴヌクレオチドは、ニッキング酵素認識部位を含む部分的な繰り返し構造を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌクレオチドに沿った重合の生成物を結合し、拡張し、非活性化し、ゆっくりリリースすることができ、それにより、閾値効果を誘発する。
【００１０】
本発明の更に他の方法においては、前記第３のオリゴヌクレオチドの３’側は、重合及びニッキングに際してターゲット配列に結合することができ、前記第３のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドの濃度の制御によって調節された閾値を超えた第１のオリゴヌクレオチドを活性化することができる配列を出力する。
【００１１】
本発明の更に他の方法においては、前記酵素は、ポリメラーゼ、ニッキング酵素及びエキソヌクレアーゼのリストから選択され、前記ポリメラーゼ及びニッキング酵素は等温増幅を進行させることができ、前記エキソヌクレアーゼはシステムの飽和を回避することができる。
【００１２】
本発明の更に他の方法においては、前記酵素とオリゴヌクレオチドとの混合物が所定の閾値を超える刺激を受けたときにのみ、信号増幅が開始される。
【００１３】
本発明の更に他の方法においては、前記閾値は第２のオリゴヌクレオチドの濃度の制御によって調節される。
【００１４】
本発明の更に他の方法においては、前記第１のオリゴヌクレオチドの３’端部は、増幅された配列への低減された親和性を有する。
【００１５】
本発明の更に他の方法においては、前記第２のオリゴヌクレオチドの３’端部は、前記第１オリゴヌクレオチドによって増幅された配列と相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’端部は、非活性化するテールを増幅された配列に付加するためのテンプレートとして役立つ。
【００１６】
本発明の更に他の方法においては、増幅された配列が高い濃度では前記第１のオリゴヌクレオチドの反応が第２のオリゴヌクレオチドの反応より速いが、増幅された配列が低い濃度では前記第２のオリゴヌクレオチドによる反応が第１のオリゴヌクレオチドの反応より速いように、前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドの濃度が選択され、それにより、刺激閾値を超えないときには効果的に増幅を除去する。
【００１７】
本発明の更に他の方法においては、ターゲット配列は、バイオマーカーとして使用することができる既知の配列のＲＮＡ鎖又はＤＮＡ鎖であり、その存在又は濃度は超高感度で、超特異な方法で検出される。
【００１８】
本発明の更に他の方法においては、複数のターゲット配列は、それらの特異なターゲットを独立して検出し報告することができる直交配列を備えた第１、第２及び第３のオリゴヌクレオチドの複数のセットを使用して、同じ試料内において同時に検出される。
【００１９】
本発明の更に他の方法においては、報告プローブである第４のオリゴヌクレオチドが付加される。
【００２０】
本発明の更に他の方法においては、前記報告プローブは蛍光プローブである。
【００２１】
本発明の更に他の方法においては、前記報告プローブは、増幅オリゴヌクレオチドによって増幅された信号鎖を検出する。
【００２２】
本発明の更に他の方法においては、前記報告プローブは、蛍光色素及び／又は消光剤によって両方の末端で修正される自己相補的構造鎖である。ここに使用されるように、用語「自己相補的」は、同じ分子の異なる２つが相補的な基部（Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ）によって互いに交雑することができることを意味する。我々のケースでは、単鎖プローブ（３’及び５’部上の少数のヌクレオチド）の２つの末端は互いに交雑し、消光剤による蛍光色素のクエンチングを誘発することができる。
【００２３】
本発明の更に他の方法においては、前記報告プローブは、ニッキング認識部位を含んでいるループを備える。
【００２４】
本発明の更に他の方法においては、増幅オリゴヌクレオチドは、制限酵素の認識部位を含んでいる。この実施の形態では、当該技術分野において周知のいくつかの制限酵素を使用することができる。そのような酵素の例は、ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩである。好ましくは、この実施の形態において使用される制限酵素はＢｓｍＩである。
【００２５】
本発明の更に他の方法においては、二本鎖の増幅テンプレートの低下速度は、ニッカーゼ／制限酵素の比を変えることによって制御される。
【００２６】
本発明の更に他の方法においては、制限酵素は、好ましくは、エキソヌクレアーゼとともに、付加される。
【００２７】
本発明によれば、指数関数的な等温ＤＮＡ増幅におけるバックグラウンド増幅は、効果的に除去される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】核酸ターゲットのバックグラウンドなしの等温増幅の方法を示す模式図である。
【図２】漏出を吸収し、かつ、ＤＮＡ増幅ループからの不特定の増幅を回避する、新しい設計における漏出吸収テンプレートの役割を示す模式図である。
【図３】各種の増幅設計及びトリガーの各種の初期濃度ためのポリメラーゼ／ニッカーゼ反応に基づいたポジティブフィードバックループのための増幅プロフィールを示すグラフである。
【図４】バックグラウンド増幅に対する擬似テンプレートの影響を示すグラフである。
【図５】実施例２における実験条件を示す表である。
【図６】単純な自触媒作用のループに対する単純なおとりの影響を示すグラフである。
【図７】実施例３における実験条件を示す第１の表である。
【図８】バックグラウンド増幅の除去を示すグラフである。
【図９】実施例３における実験条件を示す第２の表である。
【図１０】各種の擬似テンプレート設計の影響を示すグラフである。
【図１１】実施例４における実験条件を示す第１の表である。
【図１２】テンプレート及び擬似テンプレート対を備えたバックグラウンド増幅除去を示すグラフである。
【図１３】実施例４における実験条件を示す第２の表である。
【図１４】実施例４における実験条件を示す第３の表である。
【図１５】実施例４における実験条件を示す第４の表である。
【図１６】実施例４における実験条件を示す第５の表である。
【図１７】低複製数ターゲットの超高感度検出のための一般的原理を示す模式図である。
【図１８】尾のある増幅テンプレートを備えた超高感度マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）検出用の鎖設計及び動作原理を示す模式図である。
【図１９】実施例５における実験条件を示す第１の表である。
【図２０】ｍｉＲ−２１のＤＮＡ類似物の検出を示すグラフである。
【図２１】ブロックされていない増幅テンプレートを備えた超高感度マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）検出用の鎖設計及び動作原理を示す模式図である。
【図２２】実施例５における実験条件を示す第２の表である。
【図２３】検出限界の測定を示すグラフである。
【図２４】１ｆＭでマイクロＲＮＡターゲットｍｉＲ−２１の存在／不在のロバストな識別を示すグラフである。
【図２５】配列に特有の蛍光性報告を備えた検出モジュールの多重化を示す模式図である。
【図２６】実施例６における実験条件を示す表である。
【図２７】ｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ９２ａの検出に関する実験結果を示すグラフである。
【図２８】実施例８における実験条件を示す表である。
【図２９】ミスマッチング類似物と比較して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ターゲットの検出の特異性を示す模式図である。
【図３０】実施例８における実験条件を示す表である。
【図３１】調整可能な閾値の実在をサポートする実験結果を示すグラフである。
【図３２】バックグラウンド増幅を除去する戦略及び対応するＯＤＥ（常微分方程式）の数値積分に基づく、システムの挙動の運動シミュレーションを示す模式図である。
【図３３】マイクロＲＮＡの検出のための合成ＤＮＡ回路の図であって、ａは概要を示す図、ｂはＤＮＡ回路の接続を単純化した図、ｃはある特定のマイクロＲＮＡの検出専用のＤＮＡ回路の模式図である。
【図３４】報告プローブ（ｒＰ）の第一世代であって、ａは固有信号（シアニン染料５）及び非特異性のＥｖａＧｒｅｅｎ信号の測定を示し、ｂは報告プローブＲＰＢｅ−Ｃｙ５（Ｂｉｏｔｅｇ  ＴＴＴ  ＴＧ  ＤＤＱＩＩ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＴＧ  Ｃｙ５）を用いて自動触媒（ＣＢｅ１２−１ＳＵｂｉｏｔｅｇ）によって生成された信号鎖が検出される実験条件を示す図である。
【図３５】ａは自動触媒テンプレートＣＢａ１２ＰＳ４ｂｉｏｔｅｇ（Ｂｉｏｔｅｇ *Ｃ *Ｔ *Ｃ *ＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓｐ）によって生成され、配列Ｂａ１２（ＣＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＧ）の存在を報告する第２の報告プローブ（ＲＰＢａ−Ｈｅｘ：Ｂｉｏｔｉｎ  ＴＴＴＴＧ  ＤＤＱＩＩ  ＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＨＥＸ）の使用を示し、ｂは実験条件を示す図である。
【図３６】報告プローブ（ｒＰ）の特異性の評価であって、ａはｍｉｒ９２ａの配列の検出、ｂはターゲットＬｅｔ７ａの検出、ｃ及びｄは実験条件を示す図である。
【図３７】不可逆対可逆的な報告戦略を示し、ａは不可逆的な報告戦略、ｂは可逆的な報告戦略、ｃは実験条件を示す図である。
【図３８】直交ＤＮＡ回路を備えたマイクロＲＮＡの多重化の検出：溶液中の原理を示す図である。
【図３９】回復メカニズムを備えない及び備える自触媒的システム間の比較を示す図であって、ａは回復メカニズムを備えない自触媒的システム、ｂは回復メカニズムを備える自触媒的システムである。
【図４０】信号鎖の一時的生成を示し、ａは酵素プロセッサが異なる量の制限酵素（ＲＥ（ＢｓｍＩ  ０〜２００ｕ／ｍＬ））で完成する図、ｂは自触媒作用のテンプレートが、自己始動を遅らせるためにここで使用される異なる濃度の擬似テンプレートの存在に入れられる図、ｃは実験条件を示す図である。
【図４１】回復後の汚染物質除去を示し、ａは研究された回路のトポロジー：４ＤＮＡ鎖（変換器、スレッショルダー、アンプ及びリポーターテンプレート）、ｂは２つの試料（制限酵素ＢｓｍＩの有無に関わらず）の増幅曲線、ｃはパネル（ａ及びｂ）において使用される実験条件、ｄはＢｅ１２の初期濃度の機能としてのＣｔ値の標準較正曲線、ｅは先の試料（ＢｓｍＩの有無に関わらず）の部分標本、ｆは試料及び標準の再増幅用実験条件（パネルｄ及びｅ）を示す図である。
【図４２】二重アッセイのための回復機構の重要性を示し、ａは多重アッセイ＋／−ＢｓｍＩ（ＲＥ）  Ｃｂｅ−ｍｉｒ９２ａ−Ｃｙ５  Ｃｂａ−Ｌｅｔ７ａ−ＨＥＸ、ｂは実験条件を示す図である。
【図４３】二重アッセイのための回復機構の重要性を示し、ａはｍｉｒ９２ａとＬｅｔ７ａとの二重の検知、ｂはｍｉｒ９２ａとＬｅｔ７ｃとの二重の検知を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００３０】
図１は核酸ターゲットのバックグラウンドなしの等温増幅の方法を示す模式図である。
【００３１】
本実施の形態においては、核酸ターゲットの指数関数的な増幅に伴うバックグラウンド信号を除去する新しい方法を提案する。この方法は、分子プログラミングの領域に関し、力学系の概念に基づくものであるから、その原理は従来技術とは異なっている。従来技術は、（特定のプローブを使用して）モニタリングの特性を改善すること、又は、反応のロバスト性を精製することによって（その要素の特性を改善すること、又は、添加物を使用することよって）、（等温又は周期的温度変化に基づく）指数関数的な増幅スキームを改善することを試みた。自己トリガーが非常に遅くても、非増幅状態が不安定なので、これらの最適化ステップは、反応の感度を緩やかに改善するだけである。したがって、検出可能なターゲットの濃度に下限値を設定しても、ある時点でトリガーなしのバックグラウンド増幅が生成されることになる。ここでは、その代わりに、我々は、特定の増幅についての増幅状態に移行するシステムの能力を維持しつつ、非増幅状態を漸近的に安定させることによって、完全にバックグラウンドを除去する。このために、我々は、分子プログラミング技法を使用して、システムが指数関数的な増幅を行う能力に質的に影響しない方法で、非増幅状態をダイナミックに安定させる。我々は、低濃度で増幅率が負であるように（そして、それ故に、低い状態が漸近的に安定になるように）、しかし、有限摂動にならないように、増幅混合物での反応の組み合わせを設計する。これは、速い（非増幅状態中の生成より速くあるべきで、そのため、自己トリガーが不可能である）が、飽和可能な（ゆえに、非増幅状態から離脱した増幅より遅くなり、指数関数的な増幅が生じる）連続的非活性化プロセスの使用によって得られる。そうするために、（１）増幅テンプレートが修正され、（２）付加的なＤＮＡテンプレートが混合物に含まれ、（３）酵素が活性な適切な混合物が使用される。この設計は、特定の種類の所定の調節可能な閾値濃度を超えなければ、ＤＮＡシステムが増幅（基底状態に留まる）を開始しないことを保証する。また、我々は、このシステムが核酸の任意に低く、超高感度で、超特異な検出を可能にすることを示す。より一般的には、このアプローチは、酵素のＤＮＡにプログラムされた回路に活性化閾値及び非線形性を挿入するために使用することができる。
【００３２】
ポリメラーゼ／ニッカーゼ増幅スキームでは、増幅は、連続する拡張、及び、ポリメラーゼ及びニッカーゼのニッキングのそれぞれによって、特定のトリガー（短い単鎖の核酸）の増幅を仲介する繰り返し構造を備える複製テンプレートに基づく。このテンプレートは、その入力側がトリガーによって占められると、プライマーとして働き、ポリメラーゼがそれを拡張する。そして、ニッカーゼは、結果として生じる二重鎖にニックして（刻み目を付けて）、出力を解放する。このプロセスの反復によって、出力である複製を多く生成する。出力がトリガーとして作用することができ、繰り返しテンプレートの入力側を準備することができるようにテンプレートが設計されている（入力側及び出力側が部分的に又は完全に同一であることを意味する）場合、（本明細書においてトリガー、又は、「増幅された配列」と呼ばれる）出力の指数関数的な増幅が起こる。図２Ａは、従来技術において使用されたような重合／ニッキングに基づく単純な増幅ネットワークの模式表現を示す。ほとんどの場合、テンプレートの３’端部はテンプレートの自給性によってバックグラウンド増幅を制限しようとして、非拡張可能な３’端部（例えば、アミノリンカー、リン酸エステル）で修正される。このプロセスは、二重繰り返し構造（非特許文献１７ｂ及び１７ｃ）の上流のテンプレート上のプライマーとして、又は、追加テンプレート（それはポリメラーゼ／ニッカーゼステップを通じてターゲットが存在する状態での増幅のトリガーを生成する（非特許文献１７ｄ及び１７ｅ））上のトリガーを生成するステップにおけるプライマーとして、それを直接使用することによって、ターゲットとされた核酸の存在に接続される。これにより、ターゲットは自律的に大量のＤＮＡを生成する増幅ループを始める。この生成は、蛍光を含む、特定又は非特定のリポーター（挿入色素のような）を用いる種々の技術によって検出される。
【００３３】
【非特許文献１７ｂ】Xiaobo Zhang et al.,“Lab on a Single Microbead: an Ultrasensitive Detection Strategy Enabling microRNA Analysis at the Single-Molecule Level,”Chemical Science 6, no. 11(2015):6213-18, doi:10.1039/C5SC02641E.
【非特許文献１７ｃ】Li-Ping Ye et al.,“Surface-Enhanced Raman Spectroscopy for Simultaneous Sensitive Detection of Multiple microRNAs in Lung Cancer Cells,” Chemical Communications 50, no. 80 (August 14, 2014): 11883-86, doi:10.1039/C4CC05598E.
【非特許文献１７ｄ】Hongxia Jia et al., “Ultrasensitive Detection of microRNAs by Exponential Isothermal Amplification., ”Angewandte Chemie International Edition 49, no. 32(July 26, 2010): 5498-5501, doi:10.1002/anie.201001375.
【非特許文献１７ｅ】E Tan et al., “Isothermal DNA Amplification with Gold Nanosphere-Based Visual Colorimetric Readout for Herpes Simplex Virus Detection, ”Clinical Chemistry 53, no. 11 (September 21,2007): 2017-20, doi:10.1373/clinchem.2007.091116.
【００３４】
問題は、テンプレート／ポリメラーゼ及びテンプレート／ポリメラーゼ／ニッカーゼ混合物が反応を漏出しがちなこと、及び／又は、スタート混合物が、真性のターゲットより低レートでとはいっても、漏出しやすい生成物を誘発し得るターゲットの類似物を含み得ることである（非特許文献５参照。）。検出がポジティブフィードバックに基づいているので、トリガーの微細な生成さえも必然的に、究極的にはハイレベルになって、最終分析における誤った正の検出、又は、リアルタイムのモニタリングでのバックグラウンド増幅となるような、増幅ループのスタート（開始）となるであろう。この弱点は、何度も報告され（例えば、非特許文献１〜４参照。）、擬似の重合又は不純物による開始が調査された（例えば、非特許文献５参照。）。この「自己始動」現象は、通常は最初の１時間以内に、時にはわずか数分以内に、観察される。自己トリガーが実際には微量のターゲットによるトリガーよりも速いので、このような不特定の漏出反応は検出限界を著しく低下させる。さらに、増幅が結局どうしても起こるので、ターゲットの初期の存在又は不在を推論するために信号（及び信号それ自体だけでない）の幻の時間をモニターする必要があり、分析を微妙にする。しかしながら、「自己始動」はポジティブフィードバックを備えた設計の基本的属性である：その自触媒作用のループが、本質的に不安定な０状態を備える第１次の増幅を生成することは、力学系の理論から周知である。何が起こっても、結局それらは増幅を開始して、誤った正の生成となるであろう。
【００３５】
この問題を解決する本実施の形態のアプローチは、漏出を吸収し、かつ、初期状態を安定させるために不可逆な指数関数的増幅システムを連続的な分子のプロセスに変換することに基づく。それは、バックグラウンド増幅を低減して更に完全に抑制するためにともに作用するプロトコルの少数の修正を必要とする。図２Ｂは設計を示す。図２Ｂに示されるように、多くの修正はバックグラウンド増幅追加を除去するために使用される：混合物へのエキソヌクレアーゼの追加；テンプレートをエキソヌクレアーゼから保護するために、ホスホロチオエート修正（又は、ビオチン−ストレプトアビジン修正又は修正された基礎のような他のエキソヌクレアーゼを閉鎖する可能性）を備えるテンプレートの保護；増幅された配列の親和性が減少し結合反応が可逆的となるような増幅テンプレートの３’端部上の十分な基礎の除去；及び、最も重大なことには、通常のテンプレートより強く増幅された配列を結合するが、単にその３’端部に少数のヌクレオチドを加えて、増幅テンプレート上で更にプライミングをするためにそれを非活性化する（なぜなら、その３’端部は今ミスマッチである）、（擬似テンプレート又は漏出吸収オリゴヌクレオチドと呼ばれる）第２のテンプレートの追加。図２Ｂにおいて、終端に球が付いた矢印記号は拡張不可能な３’端部（３’リン酸エステル変形）を示し、＊＊＊はエキソヌクレアーゼの劣化に対する保護を表わす。
【００３６】
本実施の形態においては、「擬似テンプレート」又は「漏出吸収テンプレート」と呼ばれる第２のテンプレートが導入される。擬似テンプレートは、他のテンプレートのように、入力を結合して伸長するが、結果として生じる重複部位はニックされない。長さが短いので、細長いトリガーは完全には安定せず、ゆっくりと次第になくなる。しかし、その新しい３’テールは、正確に設計されていれば、同種のテンプレート上でのそれ以上のプライミングを禁止する−それは消耗されていた。このゆっくりした非交雑ステップ（ｄｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ）は、擬似テンプレートを回復させ、擬似テンプレートは、連続的かつ触媒現象的に少量のトリガーを消費し、これにより、漏出を吸収する。混合物におけるエキソヌクレアーゼの存在下では、非活性化されたトリガーは結局消化され、擬似テンプレートが漏出を吸収してシステムを基底状態に維持するという役割を連続的に果たし得ることを確実にする。しかし、増幅テンプレートと同様に、劣化から擬似テンプレートを保護する必要がある。これは、その５’端部での少数のホスホロチオエート修正（又は、ビオチン−ストレプトアビジン修正又は修正された基礎のような他のエキソヌクレアーゼを閉鎖する可能性）を使用して行われる。
【００３７】
システムは、（まだ増幅されていない状態であるとき）トリガーが、増幅テンプレート上ではなく擬似テンプレートに優先的に結合するように、設計されている。これは、例えば、入力側の増幅テンプレートを短くすることによって得ることができ、その結果、入力側の融解温度は、出力側より低く、使用温度より低いが、擬似テンプレート上での全長に亘る相補性を維持している。
【００３８】
しかし、他のアプローチは、増幅テンプレート及び擬似テンプレート上のトリガーのそれぞれの結合エネルギーに適応可能であり、例えば、（デオキシイノシン又は脱塩基部位のような）修正された基礎や、増幅テンプレート上の重複部位を不安定化するための（ホスホロチオエートのような）らせん骨格修正を加えたり、逆に、（修正された基礎、ＬＮＡ基礎、ＲＮＡ基礎、蛍光体、スタッキングエージェント、ダングリング基礎、グルーブバインダー等の）擬似テンプレート上の重複部位を安定させる修正を使用したりする。
【００３９】
最後に、エキソヌクレアーゼ酵素が導入されると、この酵素は、システムの中にある保護されていない単一鎖ＤＮＡのうちのいくらかを消化することができ、不特定の生成物、及び、もし未検査で蓄積されると結局システムを開始させるであろう拡張増幅生成物の蓄積を回避する。したがって、システムは、刺激を待ちながら、増幅されない状態に永久に留まることができる。
【００４０】
これらの追加によって、（増幅されていない状態での）低濃度の増幅率は、事実上、負であり、ロー状態を無期限に維持することができる。対応する力学系の安定した定常状態であるという意味で、それは安定している。しかし、（例えば、混合物に十分な濃度のトリガー鎖を加えることによって）十分な特定の刺激が提供されると、擬似テンプレートの漏出吸収能力が飽和し、増幅率が正になって、指数関数的な増幅が起こる。
【００４１】
上術のように、本発明の方法はマルチターゲット配列（多重検出）の同時検出において使用されてもよい。多重検出、すなわち、同一試料中の同時の異なるターゲットの検出は、特に、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）のため、バイオセンシングの応用についての主な関心事項である。実際、ウィルス又は遺伝病の存在が単一の特定のＤＮＡ塩基配列の検出によって確認されているが、マイクロＲＮＡ関連の疾病は、細胞又は組織のマイクロＲＮＡ署名を変更するいくつかのバイオマーカーの調節不全をしばしば含んでいた。したがって、診断は、複数のマイクロＲＮＡターゲット（マイクロＲＮＡパターン）の検出を必要とすることになる。
【００４２】
本発明の１つの実施の形態によれば、２つの自触媒作用のテンプレートが、２つの異なるターゲットの検出を許可する異なる染料とともに、３’修正される。
【００４３】
好ましい実施の形態によれば、自触媒作用のテンプレートによって増幅された信号鎖を検出する（ここでは、報告プローブ又は（ｒＰ）と呼ばれる）リポータープローブが付与された。各ターゲット用に設計された（配列）及び最適化された（長さ）に違いない従来技術で使用された（検出のために使用された）ＰＣＲプローブと比較して、本発明の方法において使用されるリポータープローブは、適切な双安定のモジュール（自触媒＋擬似テンプレート）を介していかなるターゲットにも接続することができることを意味する、モジュール型である。
【００４４】
本発明の方法では、ターゲットは、変換器テンプレートによって、（擬似テンプレート濃度によってセットされた閾値を超えて）信号を増幅する自触媒作用のテンプレートを活性化するトリガーに変換される。この普遍的な信号は、最終的に輝くプローブによって捕らえられる。リポータープローブは、（３’又は５’に取り付けることができる）蛍光体及び消光剤によって、両端で修正される自己相補的構造（ヘアピン）である。３’軸及び／又はループは、信号鎖のうちの８〜１２のヌクレオチド、好ましくは、９〜１１までと相補的である。信号鎖が生成されないとき、リポータープローブは蛍光体と消光剤とが近接しているような、ステムループ構造にある：蛍光体は消され、これにより、弱い蛍光信号を発する。信号鎖が生成されると、それらはプローブに結合するので、ステムが一時的に開口し、蛍光体がアンクエンチングになる。信号鎖構造は、最終的に、高い蛍光性の二重鎖構造の種類を不可逆的に形成するポリメラーゼによって、プローブに沿って拡張される。各リポータープローブは、特定の自触媒作用のテンプレートによって生成された信号鎖に結合するように設計されている。発明者は、このリポータープローブの信号鎖に非常に似た特性を実証した。
【００４５】
本発明の１つの実施の形態においては、信号鎖は、延長後にプローブ（ｒＰ）によって不可逆的に捕らえられる。その結果、信号鎖の一部は自触媒作用のテンプレートにもう利用可能でなくなるので、増幅が遅れるかもしれない。
【００４６】
好ましい実施の形態によれば、リポータープローブでは、少なくとも１つのニッキング認識部位が、プローブのループに含まれている。結果として、一旦信号鎖がポリメラーゼによって延長されれば、信号鎖は、ニッキング酵素によってニックされ得る。この可逆的なメカニズムは、信号鎖がプローブによって可逆的に補足されるだけであって、増幅にはごくわずかに影響することを示唆する。
【００４７】
リポータープローブは、本発明の方法において使用されるニッキング認識部位を備え、いくつかの欠点を克服することができる：ｉ）Ｎ−クエンチングメカニズム又は遠いクエンチング（つまり、ＴａｑＭａｎプローブ）に起因する弱い信号対雑音率、ii）自触媒作用のテンプレートへの染料の直接の接合をリポータープローブが含んでいることによるモジュール性の欠乏、これにより、染料の変更は、対応する自触媒作用のテンプレートの合成を必要とする。
ここに提案された多重検出アッセイは、同じ酵素の混合物において同時に働く複数の分子のプログラムに依存する。各双安定のノード（システム）は、ターゲットに適した変換されたテンプレートの上流に接続され、リポータープローブの下流に接続されるが、各リポータープローブは異なる発光波長を有する。
【００４８】
これらの直交プログラムは独立して作動するべきであるが、それらは同じ触媒リソースを使用する。これは、競争結果及びクロストーク効果を誘発する可能性がある。特に、一旦双安定システムが対応するターゲットによって起動されたならば、それは対応する信号鎖を増幅し始める。１つのノードによる酵素隔離及び信号生成は、他のノードに否定的に影響するかもしれない。このような影響を回避するために、発明者は、信号鎖の構造的な生成の代わりに、各ノードの一時的な活性化に存在する（ここに、回復メカニズムとして示された）戦略を開発した。ここに使用されるように、用語「一時的な活性化」は信号鎖の短命な生成に関係がある。換言すれば、双安定のノードの構造的な活性化は無限の量の信号鎖を生成するのに対し、一時的な活性化は信号鎖の短い過渡パルスを生成する。
【００４９】
その目標に到達するため、制限酵素が酵素プロセッサに加えられる。制限酵素の認識部位を含むように、自触媒作用のテンプレートは、設計されている。その初期状態（トリガーなし）では、自触媒作用のテンプレートは単鎖で、制限を受けない。一旦、入力種（トリガー又は信号鎖）がテンプレートに結合すれば、それは延長され、結果として生じる重複部位は、ニッキング酵素（反応は触媒現象で、テンプレートを再生成する）又は制限酵素（反応は非触媒現象で、テンプレートを消費する）によって切断される。その結果、自触媒作用のテンプレートは、制限酵素によって次第に破壊され、自触媒作用は、短い間だけ信号鎖を生成して、止まる。信号鎖の濃度プロフィールは、同じ基板のために競争するニッキング及び制限酵素の比率に左右される。
【００５０】
それにより、別の実施の形態によれば、増幅オリゴヌクレオチドは、制限酵素の認識部位を含んでいる。認識部位は、本発明の方法において使用されることができる各制限酵素によって認識されてもよい。好ましくは、本発明において使用される制限酵素は、次のものから選ばれる：ＢｓｍＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ１、ＢｓｒＤＩ、ＡｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＰｖｕＩ、より好ましくは、ＢｓｍＩである。好ましくは、制限酵素が加えられ、エキソヌクレアーゼも加えられる。
【００５１】
１つの様相によれば、本発明は、核酸ターゲット、特に、本発明によるバックグラウンド増幅を除去する方法の実施を含むＲＮＡの検出方法にも関する。さらに、この検出方法は、リポータープローブを加えること、及び／又は、本出願に述べられているような増幅テンプレートに制限酵素用の認識部位を含んでいることを更に含む。
【００５２】
本発明のバックグラウンド増幅を除去する方法は、添付された図を参照して、以下の実施例における詳細な方法に識別される。
【００５３】
上に示したように、本発明によるバックグラウンド増幅を除去する方法は、異なるオリゴヌクレオチドを加えることを含む。発明者は、本発明の方法において使用されてもよいいくつかの異なるオリゴヌクレオチドを評価した。
【００５４】
読者の一助となるように、本発明において使用されるすべてのオリゴヌクレオチド（すべてのヌクレオチド配列）を含む表を以下に提供する。
2019506185.tif 000003
2019506185.tif 000004
2019506185.tif 000005
2019506185.tif 000006
修正された配列については、本発明の文脈では、次のシンボルが次のものに関係がある：
「ｂｉｏｔｅｇ」：トリエチレングリコール結合したビオチン
「ｐ」：３’リン酸エステル修正；
「＊」：ホスホロチオエート骨格修正（エキソヌクレアーゼからの保護）；
Ｃｙ３５：シアニン染料３．５蛍光体
ＢＭＮ３：ＢＭＮ３蛍光体
Ｃｙ５：シアニン染料５蛍光体
ビオチン：アミノエトキシ−エトキシエタノールを結合したビオチン；
Ｈｅｘ：ヘキサクロロフルオレセイン蛍光体
ＢＨＱ１  ブラックホール消光剤１
ＢＨＱ２：ブラックホール消光剤２
ＢＭＮＱ５３０：ＢＭＮＱ５３０消光剤
【００５５】
テンプレートの多様なコンビネーションは、上にリストされた配列、及び、ここに記述された実施例に基づいて、本発明のバックグラウンド増幅を除去する方法において使用されてもよい。本明細書の記載及びヌクレオチド設計に関する一般知識から出発する当業者は、本発明の方法を実施するために他のテンプレート及び他の組み合わせを決定することができるであろう。
【００５６】
次に、指数関数的な増幅に使用可能なポリメラーゼ／ニッカーゼシステムにおけるバックグラウンド増幅に関して実施例１が記載されているが、このバックグラウンド増幅は、増幅テンプレートの３’端部を単に短くすることによって、又は、増幅テンプレートの３’端部を短くするとともにエキソヌクレアーゼを加えることによって、減少するが、消失しない。
【００５７】
図３Ａは、各種の増幅設計及び各種の初期濃度又はトリガーのためのポリメラーゼ／ニッカーゼ反応に基づいたポジティブフィードバックループのための増幅プロフィールを示すグラフである。図３Ｂは、実施例１における実験条件を示す表である。
【００５８】
増幅テンプレートを短くすることによって、入力側の融解温度は使用温度よりはるかに低くなる。これは擬似反応によって安定した中間物の生成を回避するのであり、なぜなら、拡大製品（図２Ｂにおける「非活性化されたトリガー」参照。）のニッキングの後に、入力が次第になくなり、別の出力の生成を開始させることができる前に、（同じ又は別のテンプレートの上で）再度交雑するからである。したがって、活性化工程に不可逆ステップはなく、これにより、バックグラウンド増幅率が減少する。テンプレートの入力側のトリガー用の融解温度以上で増幅反応がよく起こるということは、ポリメラーゼがプライマーテンプレートの構造へのより高い親和性を持っていることを示しており、このことは、一時的にであっても形成された基板を捉えて拡張することを可能にする。
【００５９】
このことを示すために、ポリメラーゼＢｓｔ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ、ニッキング酵素Ｎｂ．ＢｓｍＩ、及び、できれば、エキソヌクレアーゼを使用する指数関数的な増幅システムが構築され、その挙動は、（図３に示されるように）種々の量のそのトリガーが存在する状態、又は、トリガーがない状態で、観察された。我々は、混合物におけるＤＮＡの濃度について報告するために挿入色素を使用する。増幅反応は、単一の増幅テンプレートによって駆動されたが、この増幅テンプレートは、ニッキング酵素認識部位を含んでいる１１量体の完全なデュアル繰り返し、又は、入力（３’）側の１つ又は２つの基部によって短くされたものであった。（非特許文献１８に記載のように純化されて格納された）サーマス・サーモフィルスからの好熱性の５’−＞３’エキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪが使用された。それは、次の実施例において、２５ｎＭの最終濃度で一般に使用される。
【００６０】
【非特許文献１８】Yamagata A, Masui R, Kakuta Y, Kuramitsu S, Fukuyama K (2001) Overexpression, purification and characterization of RecJ protein from Thermus thermophilus HB8 and its core domain. Nucleic Acids Research 29(22):4617.
【００６１】
反応混合物は、バッファ内における以下の最終濃度で、構成される（ポリメラーゼ及びニッキング酵素が流通在庫から得られた）（図３Ｂ参照。）。テンプレートは最終混合物において５０ｎＭで使用された。３’リン酸エステル変性は、テンプレートの３’端部の可能な（テンプレートされた又はアンテンプレートされた）拡張を阻むように意図された。他のタイプの変性を同じ目的（実際、いかなる３’端子ＯＨ変性も使用することができるかもしれない）に同様に使用することができるかもしれない：
ＣＢｅ１２ＰＳ３：Ｃ* Ｇ* Ａ* ＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−ＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応）
ＣＢｅ１２−１ＰＳ３：Ｃ* Ｇ* Ａ* ＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−ＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に対応）
ＣＢｅ１２−２ＰＳ３：Ｃ* Ｇ* Ａ* ＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−ＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対応）
培養の最初では、入力（Ｂｅ１２＝ＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対応）は、０ｐＭ（ｍｉｌｌｉＱが代わりに使用された）、８ｐＭ、２００ｐＭ及び１ｎＭ濃度でチューブに導入された。
【００６２】
反応は、氷の上で全容積１０μＬ内に組み立てられ、ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ又はＣＦＸ９６のリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏｒａｄ）内において、４５℃で行われた。ＥｖａＧｒｅｅｎチャンネル内の蛍光は、ＣＦＸ９６サーモサイクラーの第１チャンネルを使用して２分毎にモニターされた。酵素：Ｂｓｔ２．０  ＷａｒｍＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ及びニッキング内ヌクレアーゼＮｂ．ＢｓｍＩ（両方ともＮＥＢからの）は、４Ｕ／ｍＬ及び４００Ｕ／ｍＬ（それぞれ流通在庫共加水分解の０．０５％及び４％の最終稀釈液）でそれぞれ使用され、ｔｔＲｅｃＪは、加えられたときに、２５ｎＭで使用された。図３Ａに示されるように、従来のポリメラーゼ／ニッカーゼ指数関数的増幅システムのために既に報告されていたが、バックグラウンド増幅（トリガーがない状態での増幅）は、３’側のミッシング基部を備えたテンプレートのために、遅れることが見て取れる。しかし、それは、エキソヌクレアーゼが存在する状態でさえ、ある程度の時間の後にまだ観察される。このバックグラウンド増幅は、スプリアス重合（つまり、プライマー又はテンプレートがない状態での重合、例えば、非特許文献２１参照。）、又は、混合物（非特許文献１〜５参照。）内の不純物の存在に起因したが、それは、実際単純な指数関数的（第１次の）核酸増幅システムの真性的属性である。
【００６３】
【非特許文献２１】Ogata N, Miura T (1998) Creation of genetic information by DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Nucleic Acids Research 26(20):4657-4661.
【００６４】
次に、擬似テンプレートを使用するバックグラウンド増幅の除去に関して、実施例２を説明する。
【００６５】
図４はバックグラウンド増幅に対する擬似テンプレートの影響を示すグラフである。図５は実施例２における実験条件を示す表である。
【００６６】
実施例１でのような増幅テンプレートは、擬似テンプレート（漏出吸収テンプレート）と呼ばれる付加的な鎖及びエキソヌクレアーゼと結合されて、同じ混合物に導入される。擬似テンプレートシーケンス（配列）は２つの部分がある。３’側は増幅された配列と相補的である。５’部は、増幅された配列に添付されるテールの配列をコード化する短い拡張である。任意に選ぶことができるが、その位置で増幅テンプレートと同じ配列を回避するべきである（なぜなら、この場合、拡張増幅された配列が非活性化されず、増幅テンプレートへのマイグレーションの後でも拡張され得るからである）。同じ理由で、一旦テールが結合されたならば、効率的に増幅された配列の拡張を阻むように、好ましくは２〜６ヌクレオチド間で、十分に長い必要がある。さらに、そのテール配列の熱力学的特性は、実施例３において示されるように、バックグラウンド増幅を除去する機能における擬似テンプレートの効率に衝撃を及ぼす。エキソヌクレアーゼは連続的に単一鎖の破片を除去するために混合物に含まれている。
【００６７】
本実施例において、増幅システムは、ウォームスタートとして、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ニッキング酵素Ｎｂ．ＢｓｍＩ、テンプレートＣＢｅ１２−２ＰＳ３（配列：Ｃ* Ｇ* Ａ* ＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−ＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡ−Ｐｈｏｓ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対応）及び多様な濃度（０．６ｎＭ、８ｎＭ）の擬似テンプレートｐＴＢｅ１２Ｔ５ＳＰ（配列：Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ−ＣＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対応）を使用して、作成される。そして、これらの混合物は、種々の量の入力（Ｂｅ１２＝ＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対応）でスパイクされる異なるチューブにおいて分離し、挙動は、蛍光による混合物中のＤＮＡ濃度に続いて、挿入色素ＥｖａＧｒｅｅｎを使用することによって観察される。構成は図５の表に示され、結果は、図４において、ＥｖａＧｒｅｅｎ蛍光の時間プロットのグラフとして示される。
【００６８】
擬似テンプレートの十分な濃度で、バックグラウンド増幅が完全に消え、増幅用の閾値が現われることが、図４において観察される。左端グラフ（擬似テンプレートはないが、エキソヌクレアーゼを備える）は、エキソヌクレアーゼの追加だけでは、システムの機能が質的に変化しないことを再び示す。指数関数的増幅は、トリガーが存在する状態で観察され、（トリガー不在中での）自己始動現象がおよそ時間＝１００分で起こる。擬似テンプレートの追加すると、システムは、信号を指数関数的に増幅する能力を維持するが、擬似テンプレートの濃度が所定値（値は中心及び右端のグラフに基づいて、６〜８ｎＭの間にある）を超えると、自己始動現象は完全に消滅し、増幅は、入力濃度が所定の閾値を超えるときのみ起こる。
【００６９】
次に、バックグラウンド増幅除去の機構に関して、実施例３を説明する。
【００７０】
図６は単純な自触媒作用のループに対する単純なおとりの影響を示すグラフである。図７は実施例３における実験条件を示す第１の表である。
【００７１】
擬似テンプレートがバックグラウンド増幅を除去することができるメカニズムは、遮断薬、拮抗阻害剤又は自滅抑制剤の使用とは異なる。これは、ここの働くメカニズムが、修正又は非特定の反応速度の最小化だけでなく、指数関数的成長を経験する種の連続的、活動的、不可逆的及び触媒現象的な修正を含んでいるからである。これは、非特定性の生成が生じても、それがある閾値未満である限り、システムの設計によって連続的に吸収されることを述べている。この閾値を超えると、漏出吸収能力は克服され、指数関数的な増幅がスタートする。したがって、完全にバックグラウンド増幅を除去するために、連続吸収と非活性化の能力がリークレートより高い擬似テンプレートの十分な量の導入が必要である。
【００７２】
本実施例において、増幅された配列の破片を積極的に非活性化する擬似テンプレートと、増幅された配列を結合して競争するが、配列を修正しない受動的の競争者との間の差は、実験的に示される。図７の表において示される構成を備えたマスターミックスが作成される。
【００７３】
さらに、２つのおとりバインダー（デコイ１＝Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に対応）、及び、低下から保護されるデコイ２＝Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ａ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に対応）は増幅配列を結合することができるが、その延長に結び付かない）の多様な濃度は導入される。しかし、トリガー（つまり、Ｂａ１２＝ＣＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対応）は導入されず、４５℃の培養に際して、バックグラウンド増幅が起こるまで、混合物は観察される。
【００７４】
図６は、ＣＢａ１２−２ＰＳ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対応）によって媒介した自触媒作用のループに対する単純なおとりの効果を示す。おとりがよりよいバインダーであって、使用された自触媒作用のテンプレート（１００ｎＭ）の量より２倍以上に凝縮された場合でさえ、バックグラウンド増幅が１時間以内に生じて、おとりバインダーデコイ１（図６Ａ参照。）又はデコイ２（図６Ｂ参照。）の追加によってわずかしか影響を受けないことが見てとれる。はるかに低い濃度が使用される場合さえ、これは、効率的にバックグラウンド増幅を除去する擬似テンプレートの影響に対する際立った差異である。これは、遮断薬の使用に似ておらず、非常に異なるメカニズムが作用している、という事実を支持する。
【００７５】
トリガーと相補的な単純な配列（つまり、基板の変換を含まない「受動的な」競合的バインダー）が混合物に含まれている場合、おとり競争者のためのトリガーの親和力が増幅テンプレートのためよりもはるかに大きい場合でさえ、増幅されていない状態の安定は検出されず、このおとり競争者は非常に高い濃度で（バックグラウンド増幅を完全に消失するのに十分な擬似テンプレートが８ｎＭだけの実施例２と比較して）存在していることが、図６に見られる。これは、我々のアプローチの新規な点である、非活性化（ｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に帰着するような、基板の触媒現象的、連続的な化学修飾が、結果を得るのに必要であることを示している。
【００７６】
次に、バックグラウンド増幅除去の最適化に関して、実施例４を説明する。
【００７７】
図８は擬似テンプレート及びｔｔＲｅｃＪを使用するバックグラウンド増幅の除去、並びに、テンプレート及び擬似テンプレートの設計の最適化を示す。蛍光時間トレースはそれぞれ独立した実験を表わす。図８Ａは、擬似テンプレートの濃度の増加によるバックグラウンド除去を示す（増幅テンプレート＝ＣＢａ１２−１ＰＳ４：Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴ−Ｐｈｏｓ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に対応）、擬似テンプレート＝ｐＴＢａ１２Ａ４ＳＰ：Ａ* Ａ* Ａ* ＡＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に対応）。擬似テンプレート濃度の機能として１／Ｃｔをプロットすることは、ある場合には線形相関を示す。これらの場合では、線形回帰は、（［ｐＴ］ｔｈｒ（つまり、バックグラウンド増幅が消える濃度）に注意）重大な擬似テンプレート濃度の決定を可能にする。図８Ｂは擬似テンプレート設計の効果を示す。増幅テンプレートＣＢａ１２−２ＰＳ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対応）は各種の擬似テンプレートの異なる濃度で培養され、自己始動への時間が測定された。使用されたすべての擬似テンプレートは、５’端部でのテーリング基部（ｔａｉｌｉｎｇ  ｂａｓｅｓ）を除いて、同じ配列を有する。図８Ｃは増幅テンプレートのデザインの効果を示す。（上部パネルにおいて図式化された）各種の増幅テンプレートは、所定の擬似テンプレートの濃度が変化して存在する下で、培養された。
【００７８】
図９の表において示される構成を備えたマスターミックスが作成される。
【００７９】
さらに、０から２５ｎＭまで分布する各種濃度の擬似テンプレートｐＴＢａ１２Ａ４ＳＰ（配列：Ａ* Ａ* Ａ* Ａ* ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に対応）が導入される。しかし、トリガー（つまり、Ｂａ１２＝ＣＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対応）は導入されず、４５℃の培養に際して、バックグラウンド増幅が起こるまで、混合物の蛍光は観察される。
【００８０】
図８Ａは、混合物における擬似テンプレートの濃度の関数として、バックグラウンド増幅時間の発展の評価を示す。バックグラウンド増幅時間の逆数が擬似テンプレートの関数としてプロットされる場合、ラインはＸ軸と交差する。これは、擬似テンプレートの小さく有限の集約を使用し、バックグラウンド増幅時間が時間を大げさに増加するように遅れさせられることを確認する。これは双安定の体制への分岐点のサインである。これは、ここで示されるようなバックグラウンド除去の作動原理が、特定の運動の割合対不特定の運動の割合の改良にではなく、運動系の非平衡に由来することを証明している。
【００８１】
さらに、システムの挙動をコード化するために使用される２つの核酸要素の最良の設計の評価を試みた：増幅テンプレート及び擬似テンプレート。
【００８２】
第１には、擬似テンプレートについては、上記のように同じ混合物が集められるが、ここでは、３’テーリング末端において異なる種々の設計（ｐｔＢａ１２Ｔ５ＳＰ＝Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ−ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に対応）、ｐｔＢａ１２Ｔ４Ｓ３Ｐ＝Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ−ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に対応）、ｐｔＢａ１２Ｔ３Ｓ３Ｐ＝Ｔ* Ｔ* Ｔ* −ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に対応）；ｐｔＢａ１２Ｔ２Ｓ３Ｐ＝Ｔ* Ｔ* Ｃ* ＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に対応）；ｐｔＢａ１２Ｔ１Ｓ３Ｐ＝Ｔ−* Ｃ* Ｔ* ＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ、−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に対応）を備えた擬似テンプレートが、追加された種々の濃度（０〜２０ｎＭ）で、集められる。これらすべての実験は、増幅テンプレートとして、ＣＢａ１２−２ＰＳ４（配列：Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧ−ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡ−Ｐｈｏｓ、−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対応））を使用する。図８Ｂでは、最適設計法規則が見つかる：擬似テンプレートは、効率的にバックグラウンド増幅を排除するために少なくとも２つの基部テールを必要とする；この長さに優先して、短いテールを備える擬似テンプレート設計はより効率的である（より多くの実験が図１０に示される）。これは、擬似テンプレートからの拡張トリガーの非交雑率に関連付けられたそれらの交代がより速いからであって、その結果、これらのより短い擬似テンプレートはより効率的である。
【００８３】
第２には、テンプレートの設計は、入力側の０、１、２又は３つの基部を撤去し、テンプレート（トリガーテンプレートされた拡張による）の再延長を回避するために３’リン酸エステル修正をすることによって、考察される。反応は、種々のテンプレート（ＣＢａ１２ＰＳ４＝Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ；−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に対応）、ＣＢａ１２−１ＰＳ４＝Ｃ* Ｔ* Ｃ* ＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴ−Ｐｈｏｓ；−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に対応）、ＣＢａ１２−２ＰＳ４＝Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡ−−−Ｐｈｏｓ；−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に対応）、ＣＢａ１２−３ＰＳ４＝Ｃ* Ｔ* Ｃ* Ｇ* ＴＣＡＧＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＡ−−−−Ｐｈｏｓ；−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に対応）、そして「−−」は除去された基部を強調するために使用される。）とともに、上記のように集められ、各場合に、種々の濃度の効率的な擬似テンプレート（ｐｔＢａ１２Ａ４ＳＰ＝Ａ* Ａ* Ａ* Ａ* ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓ、−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に対応）が加えられる。図８Ｃは、擬似テンプレートによって完全なバックグラウンド除去効果を観察するために、テンプレートから少なくとも１つの基部を除去することが必要であることを示す。これは、擬似テンプレートを備えた効果的な第１次の率が、増幅テンプレートを備えたものより高い必要がある、という事実によって、合理的に説明することができる。２つの基部の除去は、正確な増幅率を維持している間に自己始動をなくすことができるシステムも提供する。しかし、増幅テンプレート上の３つの基部の除去は増幅割合を過度に減少させる。
【００８４】
次に、バックグラウンド増幅除去のメカニズムの一般法則に関して、実施例５を説明する。
【００８５】
図１０は各種の擬似テンプレート設計の影響を示すグラフである。図１１は実施例５における実験条件を示す第１の表である。図１２はテンプレート及び擬似テンプレート対を備えたバックグラウンド増幅除去を示すグラフである。図１３は実施例４における実験条件を示す第２の表である。図１４は実施例４における実験条件を示す第３の表である。図１５は実施例４における実験条件を示す第４の表である。図１６は実施例５における実験条件を示す第５の表である。
【００８６】
本実施例において、結果が、増幅プロセスにおいて使用される酵素の特別の特性に左右されないことを示す。最初に、我々は、増幅プロセス（Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）を駆動するために別のニッキング酵素をテストし、我々は、擬似テンプレートがバックグラウンド増幅をまだ除去することができることをチェックする。我々は、さらに、アプローチが、ニッキング構成要素としてＮｔ．ＢｓｔＮＢＩを使用する増幅システムに有効なことを示す。
【００８７】
認識及び分裂部位の相対的な配置は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩとＮｂ．ＢｓｍＩ（Ｎｂ．ＢｓｍＩは実施例１〜４において使用されるニッカーゼである。）との間で異なる。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩについては、ニッカーゼの認識部位は、入力の配列内に完全に含まれ、ニッキング位置は、認識部位の下流の４つのヌクレオチドである。結果として、擬似テンプレート配列上で認識部位を非活性化しなければならない（そうでなければ、擬似テンプレート上の拡張製品は、オリジナルのトリガー長さにニックバック（ｎｉｃｋｅｄ  ｂａｃｋ）され得る。）。認識配列の底部（テンプレート、ニックされなかった）の鎖上でのｄＴ−＞ｄＵの突然変異によってこれが得られることが示され、したがって、すべての擬似テンプレートはこの変異した配列（非特許文献１８ｂ）で設計された。
【００８８】
【非特許文献１８ｂ】Alexandre Baccouche et al., “Dynamic DNA-Toolbox Reaction Circuits: a Walkthrough, ”Methods, February 2014, doi:10.1016/j.ymeth.2014.01.015.
【００８９】
さらに、ニッキング酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩは効率的に鈍い認識部位を処理することができないことに注意すべきである。少なくとも１つの閉鎖されたＧＣ又ＣＧペアがＧＡＧＴＣ認識部位の必要とされた５’であることが分かる（開放終端ＡＴペアの場合には、付加的に誤って組み合わせられるか又はニッキングレートを修正するために案内されたダングリングＡによってダングル（ｄａｎｇｌｅ）エネルギーがもたらされることが分かる。）。この強制は、ニッキングレートに影響せずに、テンプレートの入力側から除去することができる基部の数を制限する。ここで、２つの基部が１２−基部繰り返し配列から除去され、そのため、追加の閉鎖ペアが存在する。
【００９０】
図１１の表に示される構成を備えたマスターミックスが作成される。
【００９１】
この混合物は種々の設計を備えた異なる濃度の擬似テンプレートで補足される（順番に、ドレインδ１〜８：ｐＴｋ１２Ｔ５Ｓ４Ｐ＝Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ* Ｔ−ＣＡＡＴＧＡＣＵＣＣＴＧ−Ｐ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に対応）；ＡｐＴｋ１２Ａ１ＳＵＰ＝Ａ* Ｃ* Ａ* ＡＴＧＡＣＵＣＣＴＧ−Ａ−Ｐ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に対応）；ＡｐＴｋ１２Ａ２ＳＵＰ＝Ａ* Ａ* Ｃ* ＡＡＴＧＡＣＵＣＣＴＧ−Ａ−Ｐ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対応）；ＡｐＴｋ１２Ａ３ＰＳ＝Ａ* Ａ* Ａ* −Ｃ* ＡＡＴＧＡＣＵＣＣＴＧ−Ａ−Ｐ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に対応）；ＡｐＴｋ１２Ａ４ＳＵＰ＝Ａ* Ａ* Ａ* ＡＣＡＡＴＧＡＣＵＣＣＴＧ  Ａ−Ｐ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に対応）；ＡｐＴｋ１２Ａ５ＳＵＰ＝Ａ* Ａ* Ａ* ＡＡＣＡＡＴＧＡＣ８ＣＣＴＧ  Ａ−Ｐ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に対応）；ＡｐＴｋ１２Ａ６ＳＵＰ＝Ａ* Ａ* Ａ* ＡＡＡ  ＣＡＡＴＧＡＣＵＣＣＴＧ  Ａ−Ｐ−、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に対応））。増幅は、特定の挿入色素ＥｖａＧｒｅｅｎを含む二本鎖とともに、リアルタイムでモニターされ、トリガーは初期反応ミックスに導入されない。
【００９２】
図１０はニッキング酵素としてＮｔ．ＢｓｔＮＢＩを使用した実験の結果を説明する。擬似テンプレートがない状態、及び、エキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪの存在下であっても、Ｎｂ．ＢｓｍＩの上で作動するシステムの場合に非常に似ていて、バックグラウンド増幅は常に観察される（曲線が、ある程度の時間高い状態にあった後に、ベースラインの方へ戻るという事実は、利用可能なｄＮＴＰｓの消耗によるものである：とても少ないｄＮＴＰｓだけが混合物において利用可能、又は、利用可能なｄＮＴＰｓがもはやない場合、新しいトリガーの生成は止まり、エキソヌクレアーゼによる既存のトリガーの消化がトリガーの濃度を減少させて蛍光性の信号が減少し始める。プラトーで費やされる時間の長さは、混合物でのｄＮＴＰの初期の濃度の調節によって、いかなる希望時間にも簡単に合わせることができる。）。しかし、十分に大量である場合、各種の擬似テンプレートは０状態を安定させることができる。Ｎｂ．ＢｓｍＩの場合との比較によって、同じ濃度の増幅テンプレートにとっては、より大きな濃度の擬似テンプレートが、バックグラウンド増幅の完全な除去のために、典型的に必要である。
【００９３】
第２に、他のいくつかのポリメラーゼ、例えば、Ｂｓｔフルレングス及びＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）がこれらの異なる２つのニッカーゼと結合してテストされた。実験条件は図１３〜１６の表において与えられ、結果は図１２に示される。すべての場合において、バックグラウンド増幅をなくして非増幅状態を安定させることができる擬似テンプレートの濃度があることが分かる。予想通りに、それらの分子の詳細が漏出率及び擬似テンプレートの効率に影響するので、この濃度は、使用される酵素の詳細、並びに、増幅テンプレート及び擬似テンプレートの設計又は修正に左右される。
【００９４】
種々のニッカーゼ、種々のポリメラーゼ、増幅された種のための種々の配列、並びに、増幅テンプレート及び擬似テンプレートの種々の設計を使用することができるという事実は、本アプローチの一般化を証明する。それは、例えば、高性能、高い特異性又は高純度のような、合成物の特定の化学的性質にリンクされないが、力学系の原則を使用して、バックグラウンド増幅を遅らせて完全に除去さえする、新しく一般的な原則であることを示している。我々は、必ず増幅を開始するような、増幅のみの指数関数的な増幅システムから、２つの選択肢状態のうちのいずれか一方に無期限に留まることができるが、一方から他方へ切り替えることもできるような、双安定システムの方へ進展する。
【００９５】
図１２は、ポリメラーゼ及びニッキング酵素の種々のコンビネーションを使用するテンプレート及び擬似テンプレート対を備えたバックグラウンド増幅除去を実証する。図１２Ａは、ＤＮＡポリメラーゼＢｓｔフルレングス及びニッカーゼＮｂ．ＢｓｍＩを使用する場合を示している。図１２Ｂ及び１２Ｃは、ＤＮＡポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）及びニッカーゼＮｂ．ＢｓｍＩを使用する場合を示している。図１２Ｄは、ＤＮＡポリメラーゼＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）及びニッカーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩを使用する場合を示している。図１２Ａ〜１２Ｄの各々において、左端は、異なる濃度の擬似テンプレートを含んでいる各試料の時間トレースを示し、２番目は、擬似テンプレート濃度と１／Ｃｔとの間の線形相関を示し、３番目は、使用されるテンプレート及び擬似テンプレートを示し、右端は、使用されるポリメラーゼ及びニッカーゼを示している。
【００９６】
次に、擬似テンプレート手法を使用するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ターゲット又は類似物の過敏な検出に関して、実施例６を説明する。
【００９７】
図１７は、低複製数ターゲットの超高感度検出のためのバックグラウンドのない増幅ループの使用のための一般的原理を示す模式図である。基本的な考え方は、閾値を超えた増幅ループを余儀なくさせるために低複製数ターゲットが使用され、これにより、増幅をトリガーする、ということである。ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＰＡ、ＲＣＡ、ＮＡＳＢＡ等のような種々の他の方法との比較において、低複製数ターゲットそれ自体は増幅されない。この実施例において、我々は、増幅ループにその閾値を超えさせるために低複製数ターゲットを使用するための２つのアプローチを提案する。図１８は尾のある増幅テンプレートを備えた過超高感度マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）検出用の鎖設計及び動作原理を示す模式図である。図１９は実施例６における実験条件を示す第１の表である。図２０はｍｉＲ−２１のＤＮＡ類似物の超高感度検出を示すグラフである。図２１はブロックされていない増幅テンプレートを備えた超高感度過敏マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）検出用の鎖設計及び動作原理を示す模式図である。図２２は実施例６における実験条件を示す第２の表である。図２３は検出限界の評価を示すグラフである。図２４は１ｆＭでマイクロＲＮＡターゲットｍｉＲ−２１の存在／不在のロバストな識別を示すグラフである。
【００９８】
核酸のロバストで高感度の検出のための潜在的な応用を示すために、我々は、上述のバックグラウンドなしの指数関数的ループが、任意の（実験者によって決定された）配列を感知するために設計された変換テンプレートに連結され得ることを、ここで示す。本開示に記述したバックグラウンド増幅なしのシステムを使用する、低複製数ターゲットの超高感度検出用の一般的な原理が、図１７に示される。アッセイが新しいターゲットに対して再目的化されると、変換テンプレートだけを適応させる必要があるので、この設計は総括的でモジュール的である。例として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）、又は、そのＤＮＡ類似物は、ターゲットとしてここで選択されているが、同じ設計を使用して、他の多くの興味のある配列（特に、他のマイクロＲＮＡ、ＲＮＡ配列、又は、ＤＮＡ配列）を検出し得ることが理解される。
【００９９】
１つの典型的なアッセイ設計（設計１）は以下のように進行する：増幅ループ（増幅配列：Ｂｅ１２＝ＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧ、−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対応）のための配列が選択され、（入力側の削除された基部を備える）増幅テンプレート及び対応する擬似テンプレートが設計され、それから、小さなテールは増幅テンプレートの３’側に加えられる。このテールは、いくつかの配列に、増幅配列より高い親和力を結合するために使用される。さらに、変換テンプレートが作成され、その入力側はターゲット配列（ここでは興味のあるマイクロＲＮＡ）に対応し、その出力配列は、二重繰り返し構造の一部でない３’テールを含む増幅テンプレートの入力側に相補的である。設計は、図１８に図式化されている。図１９の表において示される構成を備えた混合物が用意される。
【０１００】
変換テンプレートは低濃度で混合物に挿入され、この鎖により、漏出しやすい製品の生成を回避する。混合物は（擬似テンプレートの有無に関わらず）、２本のチューブにおいて分離され、０（純粋なｍｉｌｌｉＱ水）又は１ｐＭのターゲット種（ｍｉＲ−２１配列に対応するＤＮＡ鎖：Ｄ２１DNA ＝ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に対応）は、培養の直前に混合物内でスパイクされる。図２０に結果が示されているが、この結果においては、ターゲットポジティブチューブがｔ＝〜４００分から始まる検出信号を供給するので、擬似テンプレートが存在する状態で、１ｐＭ濃度はバックグラウンド増幅と容易に識別されるが、一方で、ネガティブコントロールは７００分よりも前に増幅しない。ロバストで高感度なターゲット／ターゲットなしの識別のために擬似テンプレートが必要であるならば、擬似テンプレートが存在しない状態では、ターゲットを備えたチューブ又はターゲットのないチューブは、ほとんど同時に増幅する。ターゲットとされたマイクロＲＮＡすなわち配列に相補的であるように変換テンプレートの入力配列を変更することで十分であるから、このようなアッセイは、非常に容易に他のマイクロＲＮＡ又は興味のある核酸の方へ再設計され得ることは、明らかである。閾値化増幅モジュールの修正は必要でない。多くのポリメラーゼはＤＮＡ又はＲＮＡ配列をプライマーとして公平に使用し得ることも周知であるから、この結果は、ＤＮＡ類似物を除く、本当のマイクロＲＮＡの検出に有用である。このことは、実際、次の実験において実証される。
【０１０１】
同様の原理に基づいた他のアッセイ設計（設計２）は、削除とともにブロックされていない増幅テンプレート（つまり、３’リン酸エステルなしか、他の３’変性で）を使用する。これらのテンプレートは、変換テンプレートによって発せられた信号を効率的に捕らえるように拡張することができる。このアプローチは図２１に図式化されている。図２２の表において示される構成を備えた混合物が用意される。
【０１０２】
このアプローチの検出限界を評価するために、混合物は、１ｎＭから１ｆＭまでの種々の濃度のｍｉＲ−２１（Ｄ２１DNA ＝ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡ−、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に対応）のＤＮＡ類似物で、スパイクされる。
【０１０３】
推定された検出限界が、１０μＬ試験管内における１つ未満のターゲット分子を意味する約１０ｚＭで得られることは、注目すべきである。したがって、試験管内の唯一の分子を検出することが理論上実現可能に見える。
【０１０４】
そして、同様の実験は、真実の生物学のターゲットである合成のオリゴリボヌクレオチドｍｉＲ−２１を検出するために行われる。実験条件は上記と同じである。システムは、ｍｉＲ−２１（配列ｍｉＲ−２１＝ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に対応）の０又は１ｆＭで開始される。図２４は２つの試料の各々を記録した時間トレースを表わす。このシステムが、非常にわずかな濃度であっても、ＲＮＡターゲットを含んでいる試料を、対照試料（ターゲットなし）と容易に識別することを明白に実証している。両実験においては、混合物内に変換テンプレートを包含することが自己始動（バックグラウンド増幅）をある程度を回復させるが、これが非常に遅く起こるので、実際上は、感度を制限しないことに、注意すべきである。例えば図２３において、線形回帰は、１０ｚＭ、つまり、１ミリリッター当たり６つのターゲット分子、と推定されるアッセイの感度の限界を評価するために、使用することができる。この現象は、変換テンプレートの構造に依存するようにも見え、以下で説明する（過敏で、超特異な）実施例は、変換テンプレートが検出可能なバックグラウンド増幅を生成しない場合を示す。
【０１０５】
次に、特定の蛍光性報告を使用して、バックグラウンドなしの検出モジュールを多重化することに関して、実施例７を説明する。
【０１０６】
図２５は配列に特有の蛍光性報告を備えた検知モジュールの多重化を示す模式図である。図２６は実施例７における実験条件を示す表である。
【０１０７】
単一チューブにおいて多重検出を行うことは、準備時間及びアッセイの試薬費用を減少させることを可能にし、分析的なＰＣＲ（量的ＰＣＲ）において一般に用いられている技術である。しかし、多重化の可能性は等温増幅の場合にはよりまれである。特に、恐らく、トリガーされない増幅を示す強い傾向があるので、ポリメラーゼ／ニッカーゼ指数関数的増幅スキームについては報告されていない。それにもかかわらず、ＥＸＰＡＲによるＬｅｔ−７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に対応）及びｍｉｒ２１−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に対応）の同時検出のための並列化アッセイは報告されているが、それは実際には２つの単一アッセイを使用する（試料が分離され、各ターゲットの検出が分離された試験管において実施されることを意味する。）（非特許文献２０参照。）。上述のバックグラウンドなしの増幅モジュールを使用して、単一の試料内の２つのターゲットを同時に検出するため、我々は、２つの独立したテンプレート／擬似テンプレートシステムの混合物に基づいた二重化システムの構築をテストした（図２５参照。）。２つのトリガー及び２つの増幅テンプレートの配列は、クロスバインディングを回避するように設計され、擬似テンプレートは上記で導入された規則に従って構築される。相対濃度は従来の結果から推定され、酵素荷重を緩和するために自触媒作用テンプレートの総濃度を一定に保つだけである（例えば、非特許文献１９参照。）。さらに、種特有の蛍光性報告を（技術水準を利用して）生成するために、増幅テンプレートにＮ−クエンチング（Ｎ−ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）リポーター（例えば、非特許文献１６参照。）として２つの蛍光染料が添付される。図２６の表に示される構成を備える混合物が組み立てられる。
【０１０８】
【非特許文献１９】van Roekel HWH, et al. (2014) Automated Design of Programmable Enzyme-Driven DNA Circuits. ACS Synth Biol:141110070157007.
【非特許文献２０】Zhang Y, Zhang CY, Sensitive Detection of microRNA with Isothermal Amplification and a Single-Quantum-Dot-Based Nanosensor, Anal. Chem (2012).
【０１０９】
４つのオリゴヌクレオチドがチューブ内で組み合わせられるとき、蛍光信号は、ターゲットのない状態では、１０００分まで、増幅が起こらないことを示す。しかし、ターゲット（Ｂｃ１２＝ＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧ；−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に対応）、Ｂｅ１２＝ＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に対応））の１つ又は両方が混合物に２０ｎＭで挿入されると、それらは、別のモジュールに影響せずに、対応するバックグラウンド自由増幅モジュールによってはっきりと検出されて増幅される（図２５参照）。図２５Ａは、図示されるような２つの独立した検出モジュールを組み合わせることによって、二重の検出アッセイが構築され、テンプレートに付けられた２つの蛍光染料でモニターされ得ることを示す。図２５Ｂは、２つのターゲット（トリガーなし；Ｂｃ１２のみ；Ｂｅ１２のみ；Ｂｃ１２及びＢｅ１２）の４つの可能な組み合わせを注入した後の、ＢＭＮ３及びＣｙ３．５蛍光の時間変化を示す。１つのモジュールが高い状態に切り替わるときでさえ、第２の増幅ループの擬似テンプレートは、摂動を緩和して低い状態にそのモジュールを維持することができることに注目すべきである。
【０１１０】
これは、本開示を使用して、同じ混合物内での多重検出を同時に行って、多重のアッセイを構築することが可能であることを示している。
【０１１１】
次に、低濃度の種々の検出核酸ターゲットを検出するアプローチの普遍性、及び、その超高感度で超特異な性質に関して、実施例８を説明する。
【０１１２】
図２７はｍｉＲＮＡ  ｍｉＲ９２ａの検出に関する実験結果を示すグラフである。図２９はミスマッチング類似物と比較して、ｍｉＲＮＡターゲットの検出の特異性を示す模式図である。図２８及び３０の各々は、実施例８における実験条件を示す表である。
【０１１３】
図２７は、ＲＮＡターゲットｍｉＲ９２ａを検出するためにセットアップされた実験を示している（実験条件については図２８参照。）。実施例６の第２の設計（図２１）に示したものと同じ設計を使用し、次の要素を備える：ｉ）３’部分の３つのヌクレオチドによって短くされたリン酸塩処理されていない自触媒作用のテンプレート、ニッカーゼＮｂ．ＢｓｍＩ（配列は後述される）を使用するＣＢｅ１２−３ｎｏＰＳ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ii）同系統の疑似テンプレートＡｐｔＢｅ１２Ａ３Ｓ３Ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、iii)ニッカーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩを使用する変換テンプレート９２ａｔｏＦ５ＴＢｅ１２ＰＳ０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）。３−構成要素のシステムは、４つの酵素プロセッサ（ポリメラーゼ穴（ｅｘｏ−）、ニッカーゼＮｂ．ＢｓｔＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ及びエキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪ）と接触し、１０ａＭから１０ｎＭまで（プラスのネガティブコントロール）の濃度のＲＮＡターゲットｍｉＲ９２ａとともに培養される。図２７ＡはＥｖａＧｒｅｅｎで記録された各試料の時間トレースを表わす。図２７Ｂはターゲットの濃度の関数として、対応するＣｔｓのプロットを示す。対照試料（ターゲットのない）は実験継続時間中は離れているが、不特定のバックグラウンド増幅の完全な除去を証明し、ターゲットを含んでいる試料は、線形の関係を備えたｍｉＲ９２ａ濃度に応じて、連続して切り替えられる。この実験のセットは、１０ａＭ濃度のターゲットが、ネガティブコントロールと比較して、非常にロバストに検出され得ることを示しており、これは、変換テンプレートが存在する状態でさえ、バックグラウンド増幅が完全に除去されることを実証している。はるかに低い濃度でも検出され得ることも示唆する。この結果は、このアプローチの普遍性及び臨床的に関連する種々のＲＮＡターゲットの検出の効率をサポートする。
【０１１４】
検出スキームを設計する場合、アッセイの感度だけでなく、その特異性、すなわち、同様の化合物のバックグラウンドからターゲットを分離する能力もチェックする必要がある。ここで、我々は、親密な類似物から所定のターゲットを分離するシステムの能力に注目する。我々は、選択制が非常によく、１つの不適合について少なくとも１００００倍の感度の差があることを示す。図２９はｍｉＲＮＡ  Ｌｅｔ７ａの特異性検出の実験結果を示す模式図である（実験条件については図３０参照。）。実施例６の設計１（図１８）の１つに類似する３−鎖アッセイ設計を含んでいる：短くされた自触媒作用のテンプレートＣＢａ１２−２ＡＵＬＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、擬似テンプレートＡｐＴＢａ１２Ａ３Ｓ３Ｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）及び変換テンプレートＬｅｔ７ａｔｏＦ５ＴＢａ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）。３つのＤＮＡ鎖は、４−酵素プロセッサ（ポリメラーゼ穴（ｅｘｏ−）、ニッカーゼＮｂ．ＢｓｔＢｓｍＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ及びエキソヌクレアーゼｔｔＲｅｃＪ）と接触し、同系統のターゲットＬｅｔ７ａ（配列＝ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）又はミスマッチング  マイクロＲＮＡ類似物Ｌｅｔ７ｃ（配列＝ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）及び、それぞれ１及び２ミスマッチを有する、Ｌｅｔ７ｂ（配列＝ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）とともに培養される。図２９Ａ及び図２９Ｂは、時間トレース、及び、濃度が増加する正確なターゲットＬｅｔ７ａを含んでいる各試料のＣｔｓのプロットを表わす。図２７のように、実験は、増幅（Ｃｔ）の時間とターゲットの濃度との間の線形相関を、ネガティブコントロールが増幅を生成しない１０ａＭ  ｐｆターゲットまでの範囲で示している。図２９Ｃは、マッチングターゲットＬｅｔ７ａ、又は、ミスマッチング類似物Ｌｅｔ７ｂ若しくはＬｅｔ７ｃ（１ｆＭ、１００ｆＭ及び１０ｐＭ）のいずれかを含む独立した試料の時間トレースを示している。比較すると、Ｌｅｔ７ａを含んでいる試料は、Ｌｅｔ７ｂ又はＬｅｔ７ｃで誘発された試料より、後者が高濃度で存在していても、ずっと前に増幅する。アッセイの高い特異性の証拠として、１ｆＭのＬｅｔ７ａを備えた試料についてのＣｔはおよそ５００分であるが、一方、１０ｐＭ（すなわち、１００００倍以上）の類似種Ｌｅｔ７ｃ（単一のミスマッチを有する）は、７００分未満であるが、２００分遅れている。図２９Ｄは、アッセイの非常に高い特異性を強調し、種々のｍｉＲＮＡについての増幅時間（Ｃｔ）を表示する。結論として、本実施の形態は、正確なターゲットと単一及び二重ミスマッチ類似物とを効率的に区別することができる。
【０１１５】
次に、増幅を始めるのに必要なトリガーの限界濃度の調節に関して、実施例９を説明する。
【０１１６】
図３１は調整可能な閾値の実在をサポートする実験結果を示すグラフである。
【０１１７】
双安定状態にある所定のテンプレート／擬似テンプレート対について、我々は、システムを高い状態に切り替えるのに必要なトリガーの濃度が擬似テンプレートの濃度とともに増加することを示す（図３１参照。）。図３１は、増幅割合を犠牲にして、擬似テンプレートで調整可能な閾値を実施することが可能なことを示している。図３１において：５０ｎＭの自触媒作用のテンプレートβｔｏβが、２０、２５又は３０ｎＭの擬似テンプレートβ及び種々の濃度のトリガーβとともに、培養される；ハッシュドバーは、システムを高い状態に切り替えるのに必要な閾値トリガー濃度を見付けることができる範囲を示す；青いドットは最大の増幅割合を示す。同時に、擬似テンプレート濃度がポジティブフィードバックループより重要になり始めるので、最大の増幅割合は増加する擬似テンプレート濃度とともに減少する。換言すると、より低い閾値を備えたシステムはより反応がよい。
【０１１８】
次に、バックグラウンド増幅を排除するためにここで示されたテンプレート／擬似テンプレートアプローチを可能にする原理のコンピュータによる分析を説明する。
【０１１９】
図３２は、バックグラウンド増幅を除去する戦略及び、対応するＯＤＥ（常微分方程式）の数値積分（非特許文献１８ｂ参照。）に基づく、システムの挙動の運動シミュレーションを示す模式図である。
【０１２０】
図３２Ａは、バックグラウンド増幅を除去し、非増幅状態を安定させる戦略を示す。アプローチは「擬似テンプレート」に基づき、通常のＤＮＡツールボックステンプレートのように入力を非常に長くするが、ニッキングすることができない。引き延ばされた入力は、ゆっくりと消散するが、新しい３’テールは、正確に設計された場合、同系統のテンプレート上でそれ以上のプライミングを禁止し、それは消耗した。また、このゆっくりした非交雑ステップは、擬似テンプレートを回復し、したがって、それは基板ではなく触媒として作用する。酵素が線形な形態にあると仮定すると、擬似テンプレート経路に関連した第１次の割合は、擬似テンプレート濃度及び二重型形成によって、したがって、増幅テンプレートの結合親和力に相関する擬似テンプレートの結合親和力によって、制御される。上述のように、これは、例えば、テンプレートの結合部位上の少数の基部の除去によって、調節することができる。続いて、擬似テンプレートによる最大の非活性化率は、ゆっくりした非交雑ステップに依存し、したがって、擬似テンプレートに沿った入力のテーリングによってもたらされた安定性増加により、制御される。それにより、生産と擬似テンプレート（Δbind）との間の熱力学的結合の差、及び、擬似テンプレート（Δext ）上の拡張に関連した安定性の増加の２つの設計パラメータが当然に定義される。
【０１２１】
ＤＮＡツールボックスに含まれる酵素及びＤＮＡ交雑反応のセットはよく認められるので、これらの２つのエネルギー差を自由なパラメータとして維持する完全な、量子論的力学モデルを構築することが可能である（非特許文献１８ｂにおいて開示された方法による。）。このＯＤＥモデルは１５の変数を含み、１つは各ＤＮＡ鎖又はＤＮＡ複合体用である。双安定性の数値探索は、非増幅状態においてシステムにわずかな摂動を付与することによって、次の結論をもたらす。第１に、Δbindが極小値以上であるとすると、双安定  性はΔbind／Δext スペースの広範囲に亘って得ることができ、十分な擬似テンプレー  トが含まれる（図３２Ｂ）。第２に、より低いΔext を備えた擬似テンプレートはより効率的である。しかし、擬似テンプレートの交代が速すぎる（つまり、低いΔext ）と、トリガーの速い捕獲の要求は、擬似テンプレートの濃度を極小化することになり、これは増幅率に否定的に影響するかもしれない。
【０１２２】
これらの数値的な結論は、実施例１〜５で説明した実験の結果に正確に沿っている。擬似テンプレートがない状態で、繰り返しテンプレートによって誘発された図２８Ａに示される単純な自触媒的なループは、本質的に不安定な０状態を備える第１次の増幅を生成する：実施例１において既に報告（例えば、非特許文献５参照。）して示したように、トリガーが不在であっても、Δbind値及びエキソヌクレアーゼの存在に関係なく、指数関数的な増幅が可能なシステムは、スプリアス重合又は不純物によって始動され、自己始動する。しかし、十分な量の擬似テンプレートがシステムに組み入れられると、０状態が安定するようになったことが観察し得る（例えば、実施例２における図４又は実施例３における図８参照。）。同時に、わずかな濃度のトリガー鎖によるトリガーの後に、増幅をすぐに観察し得る。Ｃｔ対擬似テンプレートの濃度の実験的プロットは、数値シミュレーションにおいて観察されるサドルノード分岐の典型的なものであり（図３２Ｃ）、双安定性が擬似テンプレートの限界濃度以上で突然に観察される。
【０１２３】
異なるΔbind／Δext 値を備えた設計の代案がテストされ、期待値とのかなりよい一致が見つかった；擬似テンプレートは、効率的にトリガーを非活性化するために少なくとも２つ基部のテールを必要とする；この長さ以上で、より低いΔext を備えた擬似テンプレートの設計はより効率的である、つまり、より低い濃度を備えた双安定性を得ることになる（実施例３における図８Ｂ参照。）。予測に従って、Δbindの極小値が、合理的な擬似テンプレート濃度を備えた双安定な挙動にとって必要に見えるが、それらが双安定状態に非常に容易にもたらされても、自触媒作的なテンプレートの過度の不安定化は反応がないシステムを産出する（具体例３におけるで図８Ｃ参照。）。
【０１２４】
これらの数値シミュレーションは、それ故に、実験結果と一致し、バックグラウンド増幅の縮小及び完全な除去が単安定な指数関数的増幅システムから双安定なシステムへの推移による、という事実をサポートする。さらに、この推移が、例えば、増幅テンプレート、擬似テンプレート又はそれぞれの濃度のような、配列実験のパラメータによって制御されるので、実施例６、７、８及び１２において示されたように、バックグラウンド増幅を欠き、かつ、超高感度、超特異性があり、多重化された核酸の検出に適したシステムを得ることは可能である。
【０１２５】
報告プローブを使用する本発明によるバックグラウンドなしの増幅方法によるマイクロＲＮＡの多重検出アッセイを、以下の実施例１０で説明し、得られた結果を図３３〜３７に示す。
【０１２６】
図３３は、報告ブローブを使用する本発明によるマイクロＲＮＡの検出のための合成ＤＮＡ回路の一般的な説明を示している。自触媒的テンプレート（これは信号鎖の指数関数的な増幅を促進する）及び擬似テンプレート（これは漏出反応によって生成された信号鎖を非活性化する）から成る双安定性のスイッチは、変換テンプレート（これはターゲットに結合して、自触媒的テンプレートのためのトリガーを順番に発生する）の上流に接続され、報告プローブ（これは特定の蛍光信号を生成する）の下流に接続される。
【０１２７】
最初に、発明者は報告プローブの生成（図３４）を実証した。この実験では、発明者は、報告プローブＲＰＢｅ−Ｃｙ５（Ｂｉｏｔｅｇ  ＴＴＴ  ＴＧ  ＤＤＱＩＩ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＴＧ  Ｃｙ５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８に対応）を備えた自動触媒（ＣＢｅ１２−１Ｓ４ｂｉｏｔｅｇ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に対応）によって生成された信号鎖の検出を実証した。トリガーは初期条件で付与されず、不特定の反応によって短い遅れの後に自触媒作用が開始された。信号特異信号（シアニン染料５）が非特異性のＥｖａＧｒｅｅｎ信号（これは二重鎖の総量を報告する）に関連することが観察された。信号対雑音比は、プローブの濃度によって影響を受けないが、クエンチング効率、蛍光体の量子収量及び他の物理化学的要件にむしろ依存することに注意すべきである。
【０１２８】
次に、発明者は、自触媒的テンプレートＣＢａ１２ＰＳ４ｂｉｏｔｅｇ（Ｂｉｏｔｅｇ *Ｃ* Ｔ* Ｃ* ＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−ＣＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＧ−Ｐｈｏｓｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に対応）によって生成されて、配列Ｂａ１２（ＣＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に対応）の存在を報告する第２の報告プローブ（ＲＰＢａ−Ｈｅｘ：Ｂｉｏｔｉｎ  ＴＴＴＴＧ  ＤＤＱＩＩ  ＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＨＥＸ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に対応）を設計した。増幅曲線は、ＥｖａＧｒｅｅｎ（非特異性）及びＨｅｘ（特異）を使用して記録され、発色団は、Ｂａ１２（図３５）の生産を報告するプローブの効能を実証する。
【０１２９】
報告プローブ（ｒＰ）の特異性も評価された（図３６）。その目標へ向けて、２つの分子プログラムが別々に組み立てられる：ａ．信号鎖Ｂｅ１２（９２ａｔｏＦ５ＴＢｅ１２Ｓ０Ｐ／ＣＢｅ１２−３ｎｏＰＳ３／ｐＴＢｅ１２Ｔ５ＳＰ又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５：それぞれ）を増幅するｍｉｒ９２ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の配列の検出用の１つ；ｂ．信号Ｂａ１２（Ｌｅｔ７ａｔｏＦ５ＴＢａ１２Ｓ０Ｐ／ＣＢａ１２−３ｎｏＰＳ３／ｐＴＢａ１２Ｔ５ＳＰ又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を増幅するターゲットＬｅｔ７ａの検出用の１つ。各システムは、両方の報告プローブ（ＲＰＢｅ−Ｃｙ５、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）及びＲＰＢａ−Ｈｅｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、酵素プロセッサ及び０又は１ｐＭの同系統のターゲットが存在する状態で分離されたチューブに入れられる。両方の場合で、観察された：ｉ）ネガティブコントロールが検出可能ないかなるポジティブ信号をも生じない間、ターゲットが存在する状態のみにおける信号増幅、ii）両方の報告プローブの特異な報告：ＲＰＢｅ−Ｃｙ５及びＲＰＢａ−Ｈｅｘは、（ｍｉｒ９２ａの存在によってトリガーされた）Ｂｅ１２及び（Ｌｅｔ７ａの存在によってトリガーされた）Ｂａ１２の存在を排他的にそれぞれ報告する。
【０１３０】
更なる開発では、発明者は２つのタイプの報告戦略（不可逆・可逆的な報告戦略）を比較した。得られた結果は図３７に示される。
【０１３１】
従来の設計では、信号鎖は、重合（図３７ａに示される安定した重複部位の形成）によるプローブによって不可逆的に捕らえられる。
【０１３２】
本発明による他の好ましい開発においては、プローブは、信号鎖が重合された後、ニッキング認識部位を示すように設計されている。その結果、重複部位は力学の可逆的な報告戦略に結び付くニッキング酵素（例えば、Ｎｂ．ＢｓｍＩ）によってカットすることができる。
【０１３３】
得られた結果は、非ニック可能プローブが信号鎖を消耗し、それにより、非自触媒的擬似テンプレートとして作用することを示している。したがって、増幅における重要な遅れが観察された。これに反して、可逆的なプローブは、ニッキングによって再生成される信号鎖を単に一時的に消耗する。したがって、増幅における遅れはあまり重要ではない。
【０１３４】
以下の実施例１１において、発明者は、独立して動作する直交プログラムが同じ触媒現象の資源を使用する多重検出アッセイにおいて他のノードに否定的に影響するかもしれない１つのノードによる酵素隔離及び信号生成を両方回避する「回復機構」と呼ばれる機構を実証した。発明者によって開発された戦略は、信号鎖の構造的生成の代わりに各ノードの一時的な活性化にある。その目標へ向けて、制限酵素が酵素プロセッサに加えられる。
【０１３５】
溶液中における直交ＤＮＡ回路を備えたマイクロＲＮＡの多重検出の原理が、図３８に示されている。
【０１３６】
図３９は回復メカニズムを備えない及び備える自触媒的システムで得られた結果を示す。
【０１３７】
図３９ａに示されるように、自触媒的システムが回復メカニズムを備えずに作動するとき、指数関数的増幅ループによって信号鎖が蓄積される。シンクとして作用するエキソヌクレアーゼの存在において、信号鎖の濃度が安定水準に達する（生成が分解と釣り合う）ところで、システムは定常状態に達する。
【０１３８】
図３９ｂに示されるように、自触媒的システムが回復メカニズムを備えて作動するとき、ニッカーゼ（Ｎｂ．ＢｓｍＩ）に加えて、制限酵素（ＢｓｍＩ）が酵素プロセッサに加えられる。両方とも基板、つまり、二重鎖の自触媒的テンプレートを有する。トリガーの重合後、結果として生じる重複部位は、ニッカーゼ又は制限酵素によってカットすることができる。したがって、指数関数的な増幅がまだ持続している一方で、テンプレートは制限酵素によって徐々に分解されるが、分解速度はニッカーゼ／制限酵素の比に依存する。自触媒的ループは最終的に停止し、信号鎖は、エキソヌクレアーゼによって解重合され、もはや蓄積しない。
【０１３９】
信号鎖の一時的な生成は、図４０に実験的に示されている。実験条件は図４０ｃに示されている。１００ｎＭの自触媒的テンプレートが、酵素の混合物が存在する状態に入れられる。酵素プロセッサは、種々の量の制限酵素（ＢｓｍＩ、０〜２００ｕ／ｍＬ）で完成する。制限酵素（ＲＥ）が存在せず、エキソヌクレアーゼが存在する状態における自触媒的作用は、信号鎖の一定の生産が分解と釣り合う定常状態となるようにシステムを駆動する。ＲＥが導入されると、それは次第にアクティブテンプレート（つまり、入力鎖に結合して重合を駆動したテンプレート）を破壊し、その結果、生成は最終的に停止し、信号鎖の濃度は０にまで戻る。信号鎖の一時的な生成の鋭さ及び大きさは、ニッカーゼ／制限酵素の比に依存する（図４０ａ）。
【０１４０】
自触媒的テンプレートは、自己始動を遅らせるためにここで使用される種々の濃度の擬似テンプレートの存在に入れられる。実験は、制限酵素の存在が増幅を防止しないことを最初に示す。次に、回復の効率は、１０００分間の培養（図４０ｂ）の後でさえも、時間に沿って同じままである。
【０１４１】
回復メカニズムの効率を証明するために、発明者は、十分な検出システムとともに増幅した後に、増幅されたトリガー（生成が増幅器ＣＢｅ１２−３ｎｏＰＳ３によって促進されるＢｅ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３））の濃度を測定した（図４１ａ）。最初に、ＤＮＡ回路及び酵素組織（ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ニッカーゼ）を含んでいる２本のチューブが、制限酵素ＢｓｍＩが存在する状態（２００ｕ／ｍＬ）又は存在しない状態で１ｎＭのＢｅ１２によってトリガーされた。２つの複製された試料は、反応が停止される（チューブは、４℃に置かれた、図４１ｂ）前に、３５０分間反応を続けた。それから、これらの試料のアリコート（１／１００）は、１００ｎＭのテンプレートＣｂｅ１２−３ｎｏＰＳ３及び４ｎＭの擬似テンプレートｐＴＢｅ１２Ｔ５ＳＰ‘ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）が存在する状態で再増幅された。そして、ＥｖａＧｒｅｅｎの蛍光は、Ｃｔ（増幅時間）を決定するために５０℃でモニターされ、それから、１セットの既知の濃度の標準のＢｅ１２溶液を使用して得られたＣｔ値と比較された（図４１ｄ）。制限酵素がない状態で、高濃度（＞２０ｎＭ）のＢｅ１２は３５０分後に試料の中にあるが、制限酵素（［Ｂｅ１２］＜＜３ｎＭ）が生成の停止を媒介した場合、この量はもっと低い（図４１ｅ）。
【０１４２】
得られた結果は、ＲＥがない状態で、ＥｖａＧｒｅｅｎ信号が安定水準に達することを示している（図４１ａ）。ＲＥが導入される場合、ＥｖａＧｒｅｅｎ信号は、報告プローブがプローブの劈開によって高い蛍光信号を保持する一方で、初期蛍光状態に戻る前に、短いスパイクを記録した（図４１ｂ）。その反応は再増幅の３５０分前に停止される。パネルにおいて使用される実験条件は、図４１ｃに示される。図４１ｄは、初期濃度のＢｅ１２の機能として、Ｃｔ値の標準校正曲線である。図４１ｄは、制限酵素が存在する状態で、Ｂｅ２１の濃度は、ＲＥのない試料と比較して、大幅に低下する（そして、それにより、多量の汚染分子を蓄積した）ことを示している。試料及び標準の再増幅の実験条件（パネルｄ及びｅは図４１ｆに示される）。
【０１４３】
実施例１２において、発明者は、同じ試料とは異なったマイクロＲＮＡの多重検出の実現可能性を調査した。その目標へ向けて、マイクロＲＮＡ  ｍｉｒ９２ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）又はＬｅｔ７ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を検出するために、異なるＤＮＡ回路が組み立てられた。報告プローブは、それぞれ、シアニン染料５及びＨｅｘで機能的なものにされる。図４２においては、２つのプログラムは、制限酵素ＢｓｍＩを含む酵素プロセッサ又は含まない酵素プロセッサとともに貯留される。各シリーズについて、試料は、ターゲットなし、２つのターゲットのうちの１つ、又は、両方のターゲットのいずれかでスパイクされる。制限酵素がない状態で、一旦双安定のモジュールがＯＮ（同系統のターゲットによって誘発された）に切り替わると、第２の双安定のモジュールの特異でない増幅に最終的に結び付く（第２のターゲットが不在でも）ことに注目することは重要である。このことは、上述されたクロストークメカニズムによって説明することができる。制限酵素が導入されると、対応する双安定性のスイッチだけがＯＮになり、回復メカニズムの多重化適用の効能及び重要性を実証する。したがって、２つのプログラム間の結合メカニズムによって、ＢｓｍＩがない状態では、適性な特異性を得ることができないことが実証された。しかし、回復メカニズムは、２つのプログラムの結合解除及びこれによる両方のターゲットの特異的検出を可能にする。
【０１４４】
同じアッセイを使用して、発明者は、さらに、信号の等温指数関数的増幅に基づくこのアッセイを使用する多重検出のためのエキソヌクレアーゼの重要性を実証した。２つの独立したＤＮＡ回路が、同じ試料から２つのターゲットの存在を評価するために使用される：１）ｍｉｒ９２ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）及びＬｅｔ７ａ‘ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の二重検出（図４３ａ）、並びに、２）ｍｉｒ９２ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）及びＬｅｔ７ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）の二重検出（図４３ｂ）。このアッセイの実験条件は、図４３ｃに示される。
【０１４５】
図４３は、エキソヌクレアーゼがない状態では、１つのノードの増幅が第２のノードに干渉して、最終的にその増幅を推進する信号鎖の蓄積となることを示す。エキソヌクレアーゼが存在する状態では、一旦増幅が回復メカニズムによって停止されると、信号鎖は破壊される。シンクとして作用し、エキソヌクレアーゼは、増幅を調整して信号鎖の濃度を０にまで低下させる。信号鎖のこの一時的な鋭い生成は、リポータープローブ上で輝くのに十分であるが、ＤＮＡ回路の独立を保護して、第２のノードに干渉するのには十分ではない。したがって、発明者は、同じ試料内に貯留された２つのＤＮＡ回路を使用する２つのターゲットの特異的検出をここで実証した。
【０１４６】
上述のように、本実施の形態では、等温増幅中のバックグラウンド信号を低減して除去する、新しい方法が提案されている。原理は、低濃度のトリガーでは増幅率が減少し恐らくネガティブであることを確実にすることであり、それにより、より高い濃度のトリガーでは低い状態は安定するがまだ速く、有限の摂動に続いて増幅が起こる。これは、速いが飽和可能な連続的な非活性化プロセスの使用によって得られる。ここで説明した設計は、（１）修正された増幅テンプレート、（２）わずかな濃度の非活性化された擬似テンプレート、及び、（３）重合酵素及び解重合酵素の混合物を使用し、所定の調節可能な閾値を超えなければ、ＤＮＡシステムが増幅を開始しないことを保証する。この閾値は、超高感度検出のために任意に低く設定することができ、高い特異性及び多重化能力を提供する。より一般的には、このアプローチは、酵素のＤＮＡプログラム化回路に活性化閾値及び非線形性を挿入するために使用することができる。本記載は、また、本発明によるバックグラウンド増幅を除去する方法が、特にマイクロＲＮＡ検出のための、多重検出方法において、効率的に使用されるかもしれないことを実証する。本発明の方法において使用される他のテンプレートへの報告プローブの付加、及び、上述の回復メカニズムの使用は、迅速で、特異的な、あまり高価でない検出を得ることを可能にする。
【０１４７】
この詳細な説明中の開示は、上記実施の形態に限定されるものでなく、様々に修正され、変更されてもよい。このように、修正及び変更は、ここに添付された特許請求の範囲の保護範囲から除外されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明は、等温ＤＮＡ増幅におけるバックグラウンド増幅を除去し、種々の核酸ターゲットのロバストに多重化され、超特異的で、超高感度な検出を得る一般的な方法に適用可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３５ａ】
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【図３５ｂ】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019506185.tif 000073
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