(57)【要約】  本開示は、テネイシン、特にテネイシンのＦＢＧドメインに対する完全抗体及び結合断片に関し、それらは親抗体と比べて免疫原性が低い可能性がある。本開示はまた、該抗体又は結合断片を含む組成物、並びにそれらのいずれか１つの、慢性の炎症に関連する障害などの障害の診断、予後、及び／又は治療のための使用に関する。さらに本開示は、前記抗体を作製する方法を提供する。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２２又は２３に示される配列を含むテネイシン（例えば、Ｔｅｎｓｃｉｎ  Ｃに特異的な）に特異的な抗体又は結合断片。
【請求項２】
配列番号２２に示される配列を含む軽鎖を含むテネイシン（例えば、Ｔｅｎｓｃｉｎ  Ｃに特異的な）に特異的な抗体又は結合断片。
【請求項３】
配列番号３のＣＤＲＨ１、配列番号４のＣＤＲＨ２、及び配列番号５、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、及び３２から独立して選択されるＣＤＲＨ３をもつＶＨ又はそのバリアントをさらに含み、前記ＶＨ及びＶＬの前記ＣＤＲにおいて最大で５個のアミノ酸が変更される請求項１又は２に記載の抗体又は結合断片。
【請求項４】
配列番号６、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５から選択されるＶＨ及びそのバリアントを含み、前記配列の最大で５個のアミノ酸が変更される請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
【請求項５】
配列番号１９のＶＨを含む請求項４に記載の抗体又は結合断片。
【請求項６】
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
【請求項７】
完全長抗体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
【請求項８】
前記軽鎖が配列番号１に示される配列を有する請求項７に記載の抗体又は結合断片。
【請求項９】
前記重鎖が配列番号２に示される配列を有する請求項７又は８に記載の抗体又は結合断片。
【請求項１０】
前記重鎖が配列番号３４に示される配列を有する請求項１〜８に記載の抗体又は結合断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片及び薬理学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片又は請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記使用が炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患の前記治療のためのものである、請求項１２に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１４】
前記炎症性疾患が、例えば、急性播種性脳脊髄炎（ａｄｅｍ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎不全、副腎皮質ホルモン過剰症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、シュトリュンペル・マリー病、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ａｐｓ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、カナール・スミス症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫性多腺性症候群（１型、２型、及び３型）、自己免疫性網膜症（ＡＲ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性／ニューロンニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性耳状炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、食細胞性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡（ＣＰ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症、クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、糖尿病、１型、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮水疱症（ＥＢ）及び後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的自己免疫性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎（非増殖性：限局性分節性糸球体硬化症及び膜性糸球体腎炎、増殖性：ＩｇＡ腎症）、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎（ＧＰＡ）を伴う肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚軸索型ニューロパシー、急性汎自律神経障害、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症（ＩＧＡＮ）、バージャー病、咽頭炎併発糸球体腎炎、ＩｇＡ天疱瘡、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節不妊症、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病、間質性膀胱炎、アイザックス症候群、ニューロミオトニア、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球梗塞性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ皮膚病（ＬＡＤ）、類天疱瘡、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、単クローン性ガンマグロブリン血症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、ニューロミオトニア、アイザックス症候群（後天性、腫瘍随伴性、遺伝性）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、睾丸炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性神経精神障害）、腫瘍随伴性自己免疫性多臓器症候群（ＰＡＭＳ）、腫瘍随伴性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡（ＰＮＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎原発性胆汁性肝硬変、アノー症候群、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性巣状脳炎（ＣＦＥ）、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症（ＲＡＲ）、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群／スティッフマン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファー血管炎、小水疱水疱性皮膚病、並びに白斑ウェゲナー肉芽腫症（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含む群から選択される自己免疫疾患である請求項１３に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１５】
前記炎症性疾患が、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、１型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン・バレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低塩酸症、並びにがん、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓、並びにがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにそれらの転移形態を含む群から選択される請求項１３に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１６】
関節リウマチなどの請求項１４に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１７】
炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患の前記治療用の薬剤の製造のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体、結合断片、又は請求項１１に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
前記炎症性疾患が、例えば、急性播種性脳脊髄炎（ａｄｅｍ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎不全、副腎皮質ホルモン過剰症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、シュトリュンペル・マリー病、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ａｐｓ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、カナール・スミス症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫性多腺性症候群（１型、２型、及び３型）、自己免疫性網膜症（ＡＲ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性／ニューロンニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性耳状炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、食細胞性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡（ＣＰ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症、クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、糖尿病、１型、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮水疱症（ＥＢ）及び後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的自己免疫性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎（非増殖性：限局性分節性糸球体硬化症及び膜性糸球体腎炎、増殖性：ＩｇＡ腎症）、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎（ＧＰＡ）を伴う肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚軸索型ニューロパシー、急性汎自律神経障害、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症（ＩＧＡＮ）、バージャー病、咽頭炎併発糸球体腎炎、ＩｇＡ天疱瘡、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節不妊症、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病、間質性膀胱炎、アイザックス症候群、ニューロミオトニア、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球梗塞性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ皮膚病（ＬＡＤ）、類天疱瘡、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、単クローン性ガンマグロブリン血症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、ニューロミオトニア、アイザックス症候群（後天性、腫瘍随伴性、遺伝性）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、睾丸炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性神経精神障害）、腫瘍随伴性自己免疫性多臓器症候群（ＰＡＭＳ）、腫瘍随伴性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡（ＰＮＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎原発性胆汁性肝硬変、アノー症候群、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性巣状脳炎（ＣＦＥ）、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症（ＲＡＲ）、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群／スティッフマン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファー血管炎、小水疱水疱性皮膚病、並びに白斑ウェゲナー肉芽腫症（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含む群から選択される自己免疫疾患データある請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記炎症性疾患が、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、１型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン・バレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低塩酸症、並びにがん、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓、並びにがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにそれらの転移形態を含む群から選択される請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
関節リウマチなどの請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片又は請求項１１に記載の医薬組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項２２】
前記治療が関節リウマチなどの炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患のためのものである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２５】
請求項２３のポリヌクレオチド又は請求項２４のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テネイシン−Ｃなどのテネイシンのフィブリノゲン様グローブ（ＦＢＧ）ドメインに特異的な抗体又はその結合断片、その抗体を含む組成物、並びにそれらのいずれか１つの、診断、予後の判定、及び／又は障害、例えば慢性炎症に関連する障害の治療における使用、並びに前記抗体を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症は、病原体、組織損傷、刺激物などの有害な刺激に対する組織の複雑な生体反応である。炎症は、有害な刺激を除去し、組織の治癒プロセスを開始するための、組織による防御的な試みである。炎症に関連する異常は、さまざまなヒト疾患（炎症性疾患）を引き起こす広範な無関係の疾患群（a large, unrelated group of disorders）を含む。炎症性の特徴を有する疾患の例としては（限定されないが）、喘息、自己免疫疾患、糸球体腎炎、アレルギー（過敏症）、がん、炎症性腸疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、及び移植拒絶反応が挙げられる。関節リウマチ（ＲＡ）は、慢性炎症疾患の典型的な例である。
【０００３】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ＲＡにおける炎症性メディエーターの産生を促進する上で重要な役割を果たし、ＴＬＲ機能を遮断することは臨床的に大きく利する可能性がある（Brentano (2005)及びO'Neill (2002)に概説されている）。この受容体ファミリーは、免疫系の不可欠な部分を形成する。ＴＬＲは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の両方を認識することによって、感染及び損傷に対する宿主防御を媒介する（Matzinger (2002)）。ＤＡＭＰには、組織損傷時に生成される内在性の炎症誘発性分子であり、損傷又は壊死細胞から放出される細胞内分子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子又は損傷時に上方制御されるＥＣＭ分子の断片が含まれる（Bianchi (2007)及びGordon (2002)に概説されている）。
【０００４】
活性化すると、ＴＬＲは、炎症誘発性サイトカイン及びＭＭＰの発現の刺激を含む自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を促進する（Medzhitov (2002)）。ＴＬＲは、ＲＡ患者の滑膜組織において高いレベルで発現し（Radstake (2004)、Roelofs (2005)、Sacre (2007)、及びSacre, 2008）、ＴＬＲ４の標的欠損又は機能欠失変異を有するマウスは実験的関節炎に罹患しない（Choe (2003)及びLee (2005)）。
【０００５】
テネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）は、組織損傷及び創傷修復に関連するＥＣＭ糖タンパク質である。テネイシン−Ｃは成人健常者の組織では通常発現しないが、成人において急性炎症の間に特異的且つ一過性に上方制御され、慢性炎症では持続的に発現する（Chiquet-Ehrismann (2003)に概説されている）。免疫組織化学的な研究において、正常なヒト関節ではテネイシン−Ｃがほとんど発現しないが、ＲＡ滑膜、炎症及び線維症の領域、具体的には滑膜内層の下方、侵襲性パンヌス内、及び血管周囲でレベルが大きく増加することが示されている（Cutolo (1992)、MacCachren (1992)、及びSalter (1993)）。また、ＲＡ患者（Chevalier (1994)及びHasegawa (2007)）並びにＲＡ軟骨（Salter (1993)及びChevalier (1994)）からの滑液においてテネイシン−Ｃレベルが著しく増加する。
【０００６】
テネイシン−Ｃは１５０万Ｄａの大きい六量体タンパク質である。各鎖は、アセンブリドメイン（ＴＡ）、ＥＧＦ様リピート（ＥＧＦ−Ｌ）、フィブロネクチンＩＩＩ型様リピート（ＴＮＩＩＩ）、及びフィブリノゲン様グローブ（ＦＢＧ）を含むさまざまなドメインを含む（Orend (2005)に概説されている）。テネイシン−Ｃ及びそのドメインの配列を図９に示す。
【０００７】
テネイシン−ＣはＴＬＲ４の内在性活性化因子であることが示されており、破壊的な関節の炎症に必要であることが示されている（国際公開第２０１０／１０３２８９号）。テネイシン−Ｃは、関節の細胞を活性化できることが示され、テネイシン−Ｃの主要な活性ドメインは、分子Ｃ末端の２２７個のアミノ酸の（２６．９ｋＤａ）球状ドメインであるフィブリノゲン様グローブ（ＦＢＧ）にマッピングされている（Siri (1991)）。
【０００８】
ＦＢＧをＲＡ患者に由来する滑膜培養物に加えると、炎症誘発性サイトカインの自然放出が増強された。また、ＴＬＲ４及びＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路の活性化を介して、初代ヒトマクロファージにおけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、及びＩＬ−８の合成並びにＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＩＬ−６の合成が刺激された。
【０００９】
ＬＰＳの場合に見られるように、ＦＢＧによるサイトカイン合成の誘導にはＴＬＲ４の発現が必要であることが示されている。しかし、ＬＰＳと違って、ＴＬＲ−４活性化にはＣＤ１４とＭＤ−２のいずれも必要でないようである。ＣＤ１４は、他のリガンドによるＴＬＲ４の活性化に必要不可欠である。ＴＬＲ４はＭｙＤ８８依存的にリピドＡに応答する必要がなく（Jiang (2005)）、フィブロネクチンＥＤＡ（エクストラドメインＡ）はＣＤ１４の非存在下でもマスト細胞を活性化でき（Gondokaryono (2007)）、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞のヒアルロン酸活性化は、ＴＬＲ４、ＣＤ４４、及びＭＤ−２の複合体を必要とするが、ＣＤ１４を必要としない（Taylor (2007)）。
【００１０】
各ＴＬＲ４リガンドによる異なる受容体複合体の形成は、異なる細胞内アダプター／シグナル伝達分子の動員を促進しうる。これから、我々がＦＢＧ及びＬＰＳで観察した異なる細胞応答を説明することができる。同様に、ＴＬＲ４及びＣＤ４４複合体のヒアルロン酸活性化は、ＬＰＳとは異なるマウス肺胞マクロファージ細胞株における遺伝子発現のパターンを誘導する（Taylor (2007)）。
【００１１】
厳密に制御されたテネイシン−Ｃの発現パターンは、慢性の炎症の治療標的として魅力的である。それは、成人健常者にはたいてい欠けているが、発現は組織損傷に際して特異的に誘導される。急性炎症の間、テネイシン−Ｃは一過性に発現され、誘発がしばしば炎症に先行し、炎症が消散する時点にはｍＲＮＡ及びタンパク質はともに組織に存在しない（Chiquet-Ehrismann (2003）に概説されている）。
【００１２】
今日では、テネイシン−Ｃの持続的な発現は慢性炎症に関連することが示されている。ＲＡのほかに、多発性硬化症（Gutowski (1999)）及びシェーグレン病（sjogrens disease）（Amin (2001)）を含む他の自己免疫疾患、並びに難治性創傷（non-healing wounds）、並びに糖尿病性及び静脈性潰瘍（Loots (1998)）においてテネイシン−Ｃレベルの上昇が観察されている。テネイシン−Ｃのデノボ合成は、口腔粘膜の疾患における炎症の強度とよく相関し、テネイシン−Ｃの血漿レベルは、投薬又は手術前後の炎症性腸疾患の活性の信頼できる指標である（Chiquet-Ehrismann (2003)に概説されている）。
【００１３】
国際公開第２０１０／１０３２８９号は、テネイシン−Ｃの生物学的活性を調節する、慢性炎症反応を調節するための薬剤の使用、並びに慢性炎症に関連する疾患の治療におけるその使用を記載している。
【００１４】
Clark et al. (1997) (52)は、「リンパ球ローリング」を妨害するＦＢＧドメインに特異的なマウス抗体を記載している。後者は、細胞遊走の尺度であり、細胞活性化及び炎症性サイトカインの産生とは無関係であると考えられている。
【００１５】
本発明者らは、テネイシン−Ｃのフィブリノゲン様グローブ（ＦＢＧ）ドメインに対して非常に高い親和性を有し、ＦＢＧの生物学的活性を中和する、治療での使用に適した性質を有する抗体及びその断片、特にヒト抗体を設計した。これらの高親和性抗体は、テネイシン−Ｃ関連障害、特に関節リウマ（ＲＡ）を含む慢性炎症に関連する障害の診断又は治療に抗ＦＢＧ抗体分子を使用する方法などのさまざまな治療方法において有用である。また、抗体は、関連する診断方法及び予後予測方法（prognostic methods）においても有用である。抗体は国際公開第２０１６／０２０７０２号に開示されており、該公開出願は本明細書に参考により組み込まれる。本出願は、抗体１６５＿１２＿Ｃ３（本明細書ではＣ３と呼ぶ）が由来する抗体Ｂ１２を開示する。
【発明の概要】
【００１６】
本開示は、潜在的なＴ細胞エピトープが軽鎖フレームワークから取り除かれて免疫原性が減少したＣ３＊と呼ばれる改変抗体又はその結合断片、及び前記改変を軽鎖に含むＢ１２抗体のバリアントに関する。したがって、以下が提供される。
【００１７】
１．配列番号２２又は２３、特に配列番号２２に示される配列を含むテネイシン（例えばＴｅｎｓｃｉｎ  Ｃに特異的な）に特異的な抗体又は結合断片。
２．配列番号３のＣＤＲＨ１、配列番号４のＣＤＲＨ２、及び配列番号５、１２、１４、１６、１８、２４、２６、２８、３０、及び３２から独立して選択されるＣＤＲＨ３をもつＶＨ又はそのバリアントをさらに含み、最大で５個のアミノ酸がＶＨ及びＶＬのＣＤＲにおいて変更される第１項に記載の抗体又は結合断片。
３．配列番号６、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、及びそのバリアントから選択されるＶＨを含み、その配列の最大で５個のアミノ酸が変更される第１項又は第２項に記載の抗体又は結合断片。
４．Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である第１項〜第３項のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
５．完全長抗体である第１項〜第３項のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
６．重鎖が配列番号１に示される配列を有する第５項に記載の抗体又は結合断片。
７．重鎖が配列番号２に示される配列を有する第５項又は第６項に記載の抗体又は結合断片。
８．第１項〜第７項のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片を含む医薬組成物。
９．治療に使用するための、第１項〜第７項のいずれか一項に記載の抗体若しくは結合断片又は第８項に記載の医薬組成物。
１０．使用が、炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患、例えば、関節リウマチなどの本明細書に開示の障害の治療のためである第９項に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
１１．慢性炎症反応、例えば、関節リウマチなどの本明細書に開示に障害の治療用の薬剤の製造に使用するための第１項〜第７項のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片又は第８項に記載の医薬組成物。
１２．第１項〜第７項のいずれか一項に記載の抗体若しくは結合断片又は第８項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む治療の方法。
１３．治療が、炎症性疾患、例えば、関節リウマチなどの慢性炎症性疾患のためである第１２項に記載の方法。
１４．第１項〜第７項のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片をコードするポリヌクレオチド。
１５．第１３項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
１６．第１２項のポリヌクレオチド又は第１３項のベクターを含む宿主細胞（例えば哺乳類細胞）。
１７．第１６項で定められる宿主細胞を培養して、前記抗体又は結合断片を発現させるステップを含む本開示による抗体又は結合断片を製造する（作製する）方法。
【００１８】
したがって、配列番号１に示される軽鎖配列を含む、テネイシンに特異的な（例えば、Ｔｅｎｓｃｉｎ  Ｃに特異的な）抗体又は結合断片が提供される。
【００１９】
【化１】
2019507744.tif 000003
【００２０】
本開示の抗体又は結合断片は、配列番号３のＣＤＲＨ１、配列番号４のＣＤＲＨ２、並びに配列番号５、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、及び３２から独立して選択されるＣＤＲＨ３を含むＶＨ又はそのバリアントをさらに含み、最大で５個のアミノ酸がＶＨ及びＶＬのＣＤＲにおいて変更される（特にそこにおいて、ヒトテネイシンＣに対する結合親和力は、「親／出発」抗体の結合親和力と類似した値に維持される）。
【００２１】
１つの実施形態では、本開示の抗体又は結合断片のＶＨは、配列番号６、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、及びそのバリアントから独立して選択され、その配列の最大で５個のアミノ酸が変更される。
【００２２】
１つの実施形態では、ＶＨは、配列番号２に示される重鎖にある。
【００２３】
【化２】
2019507744.tif 000004
【００２４】
したがって１つの実施形態では、本開示の抗体は、完全長抗体、又は完全長抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４などのＩｇＧを含む分子である。
【００２５】
１つの実施形態では、抗体又はその結合断片は、ＦＢＧドメイン、特にテネイシン−ＣのＦＢＧドメインに特異的である。
【００２６】
１つの実施形態では、本開示による抗体又は結合断片が、ヒトテネイシン−Ｃに対する親和力が１００ｎＭ以上であり、例えば５０ｎＭ以上など、具体的には、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０．５ｎＭ（当然ながら親和力はより低い数値を有する）以上である。
【００２７】
本開示による抗体及び結合断片は、対応する親抗体と比べて免疫原性が低い可能性がある。
【００２８】
１つの実施形態では、本開示による抗体又は結合断片はペイロードに結合される。
【００２９】
本開示による抗体及び結合断片は、対応する親抗体よりも良好に発現することができ、例えば、１．５、２、２．５、又は３倍良好に発現することができる。
【００３０】
本開示による抗体及び結合断片は、親和性などの特性が対応する親抗体と同等である。しかし、場合によっては、本明細書の抗体又は結合断片は、対応する親抗体よりも特性又は活性が向上しうる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書で使用される「抗体」としては、実質的に完全な抗体分子、並びにキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体（少なくとも１つのアミノ酸が天然に存在するヒト抗体に対して変異している）、単鎖抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖及び／又は軽鎖のホモ二量体及びヘテロ二量体、並びにそれらの抗原結合断片及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
「抗原結合断片」によって、テネイシン−ＣのＦＢＧドメインに結合できる抗体の機能的断片を意味する。
【００３３】
抗体結合断片及び抗原結合断片は、文脈がそうでないことを示さない限り、本明細書において互換可能に用いられる。
【００３４】
抗体結合断片の例としては、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217を参照されたい）。これらの抗体断片を作り出し、製造する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Verma et al, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照されたい）。本発明で用いる他の抗体断片としては、国際特許出願である国際公開第２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号、及び国際公開第２００５／００３１７１号に記載のＦａｂ及びＦａｂ’断片が挙げられる。
【００３５】
完全長抗体を含む多重特異性抗体の例としては、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、及びＩｇＧ−Ｖが挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用されるＩｇＧ−ｓｃＦｖは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端にｓｃＦｖを有する完全長抗体である。
【００３７】
本明細書で使用されるｓｃＦｖ−ＩｇＧは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ末端にｓｃＦｖを有する完全長抗体である。
【００３８】
本明細書で使用されるＶ−ＩｇＧは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ末端に可変領域を有する完全長抗体である。
【００３９】
本明細書で使用されるＩｇＧ−Ｖは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端に可変領域を有する完全長抗体である。
【００４０】
ＤＶＤ−Ｉｇ（二重ＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、４つのさらなる可変領域を、各重鎖と各軽鎖のＮ末端に１つずつ有する完全長抗体である。
【００４１】
１つの実施形態では、抗体結合断片は、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’断片であるか、又はそれを含む。Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む抗体結合断片としては、Ｆａｂｄａｂ、Ｆａｂ’ｄａｂ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ’−（ｓｃＦｖ）２、ＤｉＦａｂ、ＤｉＦａｂ’が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用されるＦａｂｄａｂは、随意にリンカーを介して、その重鎖又は軽鎖に付加されたドメイン抗体を有するＦａｂ断片を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるＦａｂ’ｄａｂは、随意にリンカーを介して、その重鎖又は軽鎖に付加されたドメイン抗体を有するＦａｂ’断片を指す。
【００４４】
本明細書で使用されるＦａｂＦｖは、以下：重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬのそれぞれのＣ末端にさらなる可変領域が付加されたＦａｂ断片を指す。例えば、国際公開第２００９／０４０５６２号を参照されたい。このフォーマットは、そのペグ化型として提供されてもよく、例えば、国際公開第２０１１／０６１４９２号を参照されたい。
【００４５】
本明細書で使用されるＦａｂ’ＦｖはＦａｂＦｖに類似し、Ｆａｂ部分がＦａｂ’に置換されている。このフォーマットは、そのペグ化型として提供されてもよい。
【００４６】
本明細書で使用されるＦａｂｄｓＦｖは、Ｆｖ内ジスルフィド結合が付加されたＣ末端可変領域を安定化するＦａｂＦｖを指す。例えば、国際公開第２０１０／０３５０１２号を参照されたい。このフォーマットは、そのペグ化型として提供されてもよい。
【００４７】
本明細書で使用されるＦａｂ−ｓｃＦｖ（バイボディとも呼ばれる）は、随意にリンカーを介して、ｓｃＦｖが軽鎖又は重鎖のＣ末端に付加されたＦａｂ分子である。
【００４８】
本明細書で使用されるＦａｂ’−ｓｃＦｖは、随意にリンカーを介して、ｓｃＦｖが軽鎖又は重鎖のＣ末端に付加されたＦａｂ’分子である。
【００４９】
本明細書で使用されるＤｉＦａｂは、それらの重鎖のＣ末端を介して連結された２つのＦａｂ分子を指す。
【００５０】
本明細書で使用されるＤｉＦａｂ’は、それらのヒンジ領域の１つ以上のジスルフィド結合を介して連結された２つのＦａｂ’分子を指す。
【００５１】
ＤｉＦａｂ及びＤｉＦａｂ’分子はそれらの化学的に結合した形態を含む。
【００５２】
リンカーの例は、配列番号４５〜８６で配列表に開示されており、さらに配列ＰＰＰ及び配列番号３６〜４４に開示されるヒンジ配列が含む。
【００５３】
本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、例えばテネイシン−Ｃの生物学的活性を下方制御しうる。
【００５４】
本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、例えばテネイシン−Ｃの転写の阻害剤でありうる。
【００５５】
本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、例えばテネイシン−Ｃの翻訳の阻害剤でありうる。
【００５６】
したがって１つの実施形態では、本開示による抗体、又はその結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、テネイシン−Ｃなどのテネイシンの発現を、特に生体内で下方制御しうる。
【００５７】
本発明の第１の態様の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、テネイシン−Ｃの結合性の阻害剤でありうる。例えば、抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、テネイシン−Ｃのコンフォメーションを変えて、その結果テネイシン−Ｃがその１つの受容体又は複数の受容体にもはや結合することができない（特に、テネイシン−ＣのＦＢＧドメインの結合及び／又は活性が阻害される）。
【００５８】
本開示の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、テネイシン−Ｃの競合結合阻害剤でありうる。抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、テネイシン−Ｃ受容体機能を、直接的に（テネイシン−Ｃ受容体アンタゴニストとして作用することによって）又は間接的に（媒介分子又は補助分子に結合することによって）遮断することによって（テネイシン−Ｃなどの）テネイシンの生物学的活性も阻害できることが当業者に理解されよう。
【００５９】
本発明の第１の態様の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、ＴＬＲ−４受容体のアンタゴニストでありうる。ＴＬＲ４のアンタゴニストによって、間接的な拮抗作用が含まれる。抗原結合断片、その誘導体、又はバリアントは、ＴＬＲ４又は他の受容体のテネイシン−Ｃ活性化を防止しうる。
【００６０】
本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントによるテネイシン（テネイシン−Ｃなど、特にそのＦＢＧドメイン）の生物学的活性の阻害が全体的でも部分的でもありうることは当業者に理解されよう。例えば、抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、テネイシン（テネイシン−Ｃなど、特にそのＦＢＧドメイン）の生物学的活性を、抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントに曝露されていない炎症細胞のテネイシン（テネイシン−Ｃなど）の生物学的活性に比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、例えば１００％阻害する。
【００６１】
１つの実施形態では、抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、モノクローナルである。
【００６２】
１つの実施形態では、本開示による抗体又は結合断片をコードするポリヌクレオチドが提供され、例えば、抗体又は結合断片の重鎖及び軽鎖は、同一又は異なるポリヌクレオチド鎖上にコードされる可能性がある。したがって、本明細書で使用される場合、「コードするポリヌクレオチド」は、重鎖及び軽鎖の両方をコードする１つのポリヌクレオチド、又は１つが重鎖をコードし、１つが軽鎖をコードする２つの別々のポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
１つの態様では、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００６４】
ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者に周知である。これに関して、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照されたい。
【００６５】
別の態様では、上記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞が提供される。いずれの好適な宿主細胞／ベクター系も、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物による系を使用してもよく、真核生物、例えば哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、骨髄腫、又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【００６６】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現を導くのに適した条件下で本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含有する宿主細胞を培養すること、並びに抗体分子を単離することを含む本発明による抗体分子を作製するための方法を提供する。
【００６７】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含むことがあり、その場合、重鎖又は軽鎖ポリペプチドをコードする配列のみを、宿主細胞をトランスフェクトするのに使用すればよい。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の作製では、細胞株は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターでトランスフェクトすることができる。代替的に、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
【００６８】
１つの実施形態では、抗体又は結合断片は、１つ又は複数の賦形剤、希釈剤、及び／又は担体を含む医薬製剤として提供される。したがって、上記の抗体又は結合断片を含む医薬組成物が提供される。
【００６９】
本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントが一般に、意図された投与経路及び標準的な製薬実務に関して選択された好適な医薬賦形剤希釈剤又は担体と混合して投与されることになることは当業者に理解されよう（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995, Ed. Alfonso Gennaro, Mack Publishing Company、ペンシルベニア州、アメリカ合衆国を参照されたい）。
【００７０】
例えば、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、香味剤又は着色剤を含有しうる、即放、遅延放出、又は徐放用途のための錠剤、カプセル、膣座薬、エリキシル剤、溶液、又は懸濁液の形態で、経口で、口腔内に、又は舌下に投与することができる。
【００７１】
そのような錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、及びグリシンなどの賦形剤、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及びある特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシ−プロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、及びアラビアゴム（acacia）などの造粒結合剤を含有してよい。くわえて、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルクなどの滑沢剤が含まれてもよい。
【００７２】
類似のタイプの固体組成物もまた、ゼラチンカプセルの充填剤として用いることができる。これに関する好適な賦形剤としては、ラクトース（lactose）、デンプン、セルロース、乳糖（milk sugar）、又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤に関して、本発明の化合物は、さまざまな甘味剤又は香味剤、着色剤、又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁剤と、並びに水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、及びそれらの組み合わせなどの希釈剤と混ぜ合わせることができる。代替的に、カプセルは液体製剤で充填されてもよい。
【００７３】
本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントはまた、非経口で、例えば、静脈内、関節内、動脈内、腹膜内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、若しくは皮下、海綿体内注射によって投与することができ、又は注入法によって投与することができる。それらは、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有しうる滅菌水溶液の形態で最もよく使用される。必要に応じて、水溶液は適切に（好ましくは３〜９のｐＨに）ｐＨ調節されるべきである。無菌条件下での適切な非経口製剤の調節は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。
【００７４】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、及び意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有しうる水性及び非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位投与容器又は多回投与容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提供することができ、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば注射用水を加えればよい凍結乾燥（freeze-dried）（凍結乾燥（lyophilised））状態で保存することができる。用事注射液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【００７５】
例となる方法：１）バッファーや界面活性剤（通常はツイーン）などの賦形剤を加えて水性製剤の凝集を阻害する、２）適切な賦形剤とともに凍結乾燥して、粉末の塊（cake）を大きくし、安定させ、且つ見た目に訴えるものにする（cosmetic appeal）、３）トレハロースなどの化合物を用いたガラス状の糖の生成。
【００７６】
ヒト患者への経口投与及び非経口投与、又は他の投与経路では、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントの１日投与量レベルは、通常、成人一人あたり１μｇ〜１０００ｍｇ（すなわち約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）が単回投与又は分割投与で与えられることになる。
【００７７】
一例として、投与量レベルは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであることができ、投与レジメンは週に２回又は３回であることができ、投与は静脈内であることができる。別の実施形態では、投与レジメンは、１週間に１回〜１ヶ月に１回の範囲で、静脈内又は皮下注射によって送達することができる。
【００７８】
本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントはまた、鼻腔内又は吸入によって投与することができ、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２‐テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３）、若しくは１，１，１，２，３，３，３―ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）などのハイドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は他の好適なガスなどの好適な噴射剤を使用して、例えば、乾燥粉末吸入器、ポンプ、スプレー、又はネブライザー、加圧容器からのエアロゾルスプレー形の形式で簡便に送達されうる。加圧式エアロゾルの場合、投与量単位は定量を送達するための弁を設けることによって決定されうる。加圧容器、ポンプ、噴霧器、又はネブライザーは、活性がある抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントの溶液又は懸濁液を含有でき、例えば、エタノールと噴射剤の混合物を溶媒として用い、さらにソルビタントリオレエートなどの滑沢剤を含有しうる。吸入器又は注入器で用いるカプセル剤及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明の抗体又は結合断片と、ラクトース及びデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
【００７９】
エアロゾル又は乾燥粉末製剤は、各投与量（又は定量又は「１噴霧（puff）」）が、患者への送達のために、少なくとも１μｇの本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントを含むように好適に準備される。エアロゾルを用いた全体の一日投与量は、患者によって異なることになり、単回投与又はより通常には１日を通して分割投与で与えられうることが理解されよう。
【００８０】
代替的に、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、坐剤又はペッサリーの形態で投与することができ、又はローション、溶液、クリーム、軟膏、若しくは粉剤（dusting powder）の形態で局所的に適用することができる。本発明の化合物はまた、例えば皮膚パッチの使用によって経皮投与することもできる。本発明の化合物は、眼の経路によって投与されてもよい。
【００８１】
眼への使用では、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、等張性のｐＨ調整された滅菌食塩水中の微粒子化懸濁液として、又は好適には、等張性のｐＨ調整された滅菌食塩水中の溶液として、随意にベンジルアルコニウムクロライドなどの防腐剤と組み合わせて製剤化することができる。代替的に、これらは、ワセリン（petrolatum）などの軟膏に製剤化されてもよい。
【００８２】
皮膚への局所適用では、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、例えば、以下のうちの１つ又は複数との混合物中に懸濁又は溶解された活性化合物を含有する好適な軟膏として製剤化することができる：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水。代替的に、それらは、例えば、以下のうちの１つ又は複数との混合物中に懸濁又は溶解された好適なローション又はクリームとして製剤化することができる：鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水。
【００８３】
口内局所投与に適した製剤としては、香味基剤（flavoured basis）、通常はスクロース及びアラビアゴム又はトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ、及び好適な液体担体中に活性成分を含む口内洗浄剤が挙げられる。
【００８４】
１つの実施形態では、マイクロスフェアなどの徐放薬物送達系が使用される。これらは特に注射回数を減らすように設計されている。そのような系の例は、ひとたび注射すると、持続期間にわたってゆっくりと組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を放出する、生分解性マイクロスフェア中にｒｈＧＨをカプセル封入するNutropin Depotである。
【００８５】
代替的に、本発明の抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、例えば必要な部位に薬物を直接放出する外科的に移植される装置によって投与することができる。
【００８６】
エレクトロポレーション治療（ＥＰＴ）システムも、抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントの投与に使用することができる。パルス電界を細胞に送達する装置は、細胞膜の薬物に対する透過性を増加させ、細胞内薬物送達の著しい増強をもたらす。
【００８７】
抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、エレクトロインコーポレイション（electroincorporation）（ＥＩ）によっても送達することができる。ＥＩは、皮膚の表面の直径が３０ミクロンまでの小さい粒子が、エレクトロポレーションにおいて使用されるものと同一又は類似の電気パルスを受けた場合に生じる。ＥＩでは、これらの粒子は角質層を通って皮膚のより深い層に運ばれる。粒子は、薬剤若しくは遺伝子で充填若しくはコーティングすることができ、又は薬物が入ることができる細孔を皮膚に生じさせる「弾丸（bullets）」として単に作用しうる。
【００８８】
抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントの送達の代替方法は、熱感受性ＲｅＧｅｌ注射剤である。ＲｅＧｅｌは、体温未満では注射可能な液体であるが、体温では直ちにゲルリザーバー（gel reservoir）を形成し、ゆっくりと浸食されて既知の安全な生分解性ポリマーに溶解する。活性薬物は、生体高分子が溶解するにつれて時間とともに送達される。
【００８９】
抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント医薬は、経口で送達することもできる。１つのそのような系は、体のビタミンＢ１２の経口摂取のための自然なプロセスを用いてタンパク質及びポリペプチドを共送達する。ビタミンＢ１２取り込み系を利用することにより、タンパク質又はポリペプチドは腸壁を通過することができる。複合体は、ビタミンＢ１２アナログと薬物との間で生成され、複合体のビタミンＢ１２部分の内在性因子（ＩＦ）に対するかなり高い親和性と、複合体の「抗体」部分の顕著な生物活性の両方を保持する。
【００９０】
本開示の組成物は、少なくとも１つの他の薬剤をさらに含みうる。そのようなさらなる薬剤は抗炎症剤でありうる。抗炎症剤としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、スタチン（シンバスタチンＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を含む）、生物学的薬剤（生物製剤）、ステロイド、免疫抑制剤、サリチラート、及び／又は殺菌薬が挙げられるが、これらに限定されない。非ステロイド性抗炎症薬としては、代謝拮抗物質（メトトレキサートなど）及び抗炎症性の金剤（オーラノフィンなどの金チオリンゴ酸ナトリウム、金チオリンゴ酸塩、又は金塩を含む）が挙げられる。生物製剤としては、抗ＴＮＦ剤（アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、抗ＩＬ−１試薬、抗ＩＬ−６試薬、抗Ｂ細胞試薬（retoximab）、抗Ｔ細胞試薬（抗ＣＤ４抗体）、抗ＩＬ−１５試薬、抗ＣＬＴＡ４試薬、抗−ＲＡＧＥ試薬を含む）、抗体、可溶性受容体、受容体結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、機能が改変若しくは弱められた変異タンパク質、ＲＮＡｉ、ポリヌクレオチドアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はオメガ３脂肪酸が挙げられる。ステロイド（コルチコステロイドとしても知られる）としては、コルチゾン、プレドニゾロン、又はデキサメタゾンが挙げられ、本開示による抗体又は結合断片との併用療法にも用いられうる。本開示による併用療法で用いる免疫抑制剤としては、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸が挙げられる。前記併用療法で用いるサリチラートとしては、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリン、及びサリチル酸マグネシウムが挙げられる。殺菌薬としてはキニーネ及びクロロキンが挙げられる。例えば、抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアントは、本開示による抗体又は結合断片を含む治療レジメンにおいて、１つ又は複数のＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、又は免疫抑制剤と組み合わせて投与されうる。
【００９１】
１つの実施形態では、治療での使用に画定された本開示の抗体若しくは抗原結合断片、又はその誘導体若しくはバリアント若しくは組成物が提供される。
【００９２】
１つの実施形態では、本開示の抗体若しくは抗原結合断片、又はその誘導体若しくはバリアント若しくは組成物は、炎症性疾患／障害及び／又は自己免疫疾患、例えば慢性炎症性疾患、特に関節リウマチなどの病態の治療に使用される。
【００９３】
本発明の１つの態様では、本明細書に開示の病態、例えば慢性炎症性疾患の治療及び／又は診断のための薬剤の製造における、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物の使用が提供される。
【００９４】
１つの実施形態では、治療有効量の本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物を対象に投与することを含む、慢性炎症性疾患などの本明細書に開示の病態を治療する方法が提供される。
【００９５】
病態又は障害は、例えば、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、１型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン・バレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低塩酸症、並びにがん、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓、並びにがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにそれらの転移形態を含む群又はそれらからなる群から選択されうる。
【００９６】
１つの実施形態では、自己免疫疾患は、以下を含む群又はそれらからなる群から選択される。急性播種性脳脊髄炎（ａｄｅｍ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎不全、副腎皮質ホルモン過剰症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、シュトリュンペル・マリー（Strumpell-marie）病、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ａｐｓ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、カナール・スミス症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫性多腺性症候群（１型、２型、及び３型）、自己免疫性網膜症（ＡＲ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性／ニューロンニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性耳状炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、食細胞性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡（ＣＰ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症、クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、糖尿病１型、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮剥離（epidermolysis）
【００９７】
水疱症（bullosa）（ＥＢ）及び後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的自己免疫性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎（非増殖性：限局性分節性糸球体硬化症及び膜性糸球体腎炎、増殖性：ＩｇＡ腎症）、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎（ＧＰＡ）を伴う肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚軸索型ニューロパシー、急性汎自律神経障害、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症（ＩＧＡＮ）、バージャー病、咽頭炎併発糸球体腎炎、ＩｇＡ天疱瘡、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節不妊症（immune-regulated infertility）、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病、間質性膀胱炎、アイザックス症候群、ニューロミオトニア、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球梗塞性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ皮膚病（ＬＡＤ）、類天疱瘡、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、単クローン性ガンマグロブリン血症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、ニューロミオトニア、アイザックス症候群（後天性、腫瘍随伴性、遺伝性）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、睾丸炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性神経精神障害）、腫瘍随伴性自己免疫性多臓器症候群（ＰＡＭＳ）、腫瘍随伴性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡（ＰＮＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎原発性胆汁性肝硬変、アノー症候群、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性巣状脳炎（ＣＦＥ）、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症（ＲＡＲ）、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群／スティッフマン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血���炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファー血管炎（golfer's vasculitis）、小水疱水疱性皮膚病、並びに白斑ウェゲナー（Vitiligowegener）肉芽腫症（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）。
【００９８】
１つの実施形態では、自己免疫疾患は、ＡＮＣＡ血管炎、ＩｇＡ腎症（バージャー病）、尋常性天疱瘡／水疱性類天疱瘡、ＩＴＰ、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性甲状腺炎（グレーブス病）、橋本病、ループス腎炎、膜性糸球体腎炎（又は膜性腎症）、ＡＰＳ、重症筋無力症、視神経脊髄炎、原発性シェーグレン、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性膵炎、皮膚筋炎（dermatosmyositis）、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性網膜症、ベーチェット病、ＩＰＦ、全身性強皮症、肝線維症、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎、白斑、グッドパスチャー症候群、肺胞タンパク症、慢性自己免疫性蕁麻疹、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、軸性脊椎関節炎、移植（ＧｖＨＤを含む）、喘息、ＣＯＰＤ、巨細胞性動脈炎、難治性自己免疫性血球減少症、エヴァンズ症候群（自己免疫性溶血性貧血）、１型糖尿病、サルコイドーシス、多発性筋炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、ワルデンストレ−ムマクログロブリン血症、巣状分節性糸球体硬化症、慢性ライム病（ライムボレリア症）、扁平苔癬、スティッフパーソン症候群、拡張型心筋症、自己免疫性（リンパ性）卵巣炎、後天性表皮水疱症、自己免疫性萎縮性胃炎、悪性貧血、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、ラスムッセン脳炎、ギラン・バレー症候群、後天性神経性筋強直症、脳卒中を含む群又はそれらからなる群から選択される。
【００９９】
１つの実施形態では、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、組成物は、不適切な炎症に関連する慢性炎症性疾患の治療に使用される。そのような疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、難治性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン病、糖尿病、紅斑性狼瘡（lupus erythrematosus）（全身性エリテマトーデスを含む）、喘息、線維性疾患（肝硬変を含む）、肺線維症、ＵＶによる損傷、及び乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
慢性炎症は、上記疾患の多くに関連する衰弱性の重篤な疾患であり、感染若しくは損傷部位における持続性炎症又は未知の起源の持続性炎症によって又は自己免疫疾患などの変化した免疫応答と関連して特徴付けられる。
【０１０１】
したがって１つの実施形態では、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、組成物、又は方法は、慢性炎症性疾患の治療に用いられ、その疾患は不適切な炎症に関連するいずれかの疾患に関連する。そのような疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、難治性創傷、多発性硬化症、がん、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン病、糖尿病、紅斑性狼瘡（全身性エリテマトーデスを含む）、喘息、線維性疾患（肝硬変を含む）、肺線維症、ＵＶによる損傷、及び乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
１つの実施形態では、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、組成物、又は方法は、体軸性脊椎関節炎、原発性胆汁性胆管炎、及びアレルギーから選択される疾患の治療に用いられる。
【０１０３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、決して唯一のものではないが、慢性炎症性疾患の典型的な例である。ＲＡは、炎症誘発性サイトカイン及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の持続する合成によって媒介される関節軟骨及び骨の滑膜炎症及び破壊を特徴とする。
【０１０４】
１つの実施形態では、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物は、例えば、以下のうちの１つ又は複数に使用されうる。対象の慢性炎症性疾患状態を診断すること、対象が慢性炎症性疾患を発症する可能性を評価すること、慢性炎症性疾患をもつ対象の予後を判定すること、慢性炎症性疾患の疾患進行をモニターすること、及び／又は慢性炎症性疾患の治療に対する有効性若しくは対象の反応をモニターすること。
【０１０５】
１つの実施形態では、慢性炎症性疾患の診断及び／又は慢性炎症性疾患をもつ患者の予後の判定に使用するための、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物が提供される。
【０１０６】
１つの実施形態では、本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物を用いてテネイシン−ＣのＦＢＧドメインの存在又は非存在又は量を検出することを含む、慢性炎症性疾患を診断する方法及び／又は慢性炎症性疾患をもつ患者の予後を判定する方法が提供される。
【０１０７】
予後を決めるのは、例えば、慢性炎症性疾患の悪化でありうる。代替的に、予後は、慢性炎症性疾患の減少（すなわち改善）でありうるか、又は予後は、慢性炎症性疾患が同じままである（すなわち、悪化若しくは改善することなく一定の状態のままである）ことでありうる。
【０１０８】
１つの実施形態では、診断の方法はインビトロでの方法である。
【０１０９】
したがって１つの実施形態では、本開示による抗体又は結合断片は、標識、例えば、放射標識又は蛍光標識などの検出、定量及び／又はモニタリングできる標識に結合される。
【０１１０】
好適な治療は、有効量の本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、又は組成物を、以下のうちの１つ以上と随意に組み合わせて投与することを含むことができる。ＤＭＡＲＤＳ（メトトレキサートなど）、抗ＴＮＦ薬物、抗ＩＬ１７治療、Ｔ細胞共刺激モジュレーター（Orencia（商標）−アバタセプトなど）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）阻害剤（Actemra（商標）−トシリズマブなど）、抗ＣＤ２０抗体（Rituxan（商標）−リツキシマブ（rituxumab）など）、Ｂ細胞活性化因子（抗ＢＡＦＦなど）、ヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の阻害剤（Tofacitinib（商標）など）、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤（Fostamatinib（商標）など）、抗ＴＮＣ抗体若しくはシトルリン化テネイシン−Ｃドメインに対する抗体、並びに／又はシトルリン化及び／若しくは非シトルリン化テネイシン−Ｃの生物学的活性を調節する薬剤。
【０１１１】
特定の実施形態では、本開示による好適な治療は、テネイシン−ＣのＦＢＧドメインを標的とする。
【０１１２】
１つの実施形態では、診断の方法又は適切な治療を決定する方法は、次のうちの１つ以上を行うことを含む。免疫アッセイ、分光法、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロット若しくはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗体マイクロアレイ、免疫組織染色、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フルオロイムノアッセイ、及び／又はアビジン−ビオチン若しくはストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイ。
【０１１３】
１つの態様では、
（ｉ）本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物
（ｉｉ）投与手段
（ｉｉｉ）それらを使用するための説明書
を含む部品のキットが提供される。
【０１１４】
１つの実施形態では、キットはさらに、
（ｉｖ）少なくとも１つの他の薬剤
を随意に含む。
【０１１５】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）本開示による抗体、又はその抗原結合断片、誘導体、若しくはバリアント、若しくは組成物、及び
（ｉｉ）使用のための説明書
を含む、対象の慢性炎症性疾患状態を決定するのに使用するための部品のキットが提供される。
【０１１６】
さらなる定義
本明細書で使用される「アミノ酸変化」は、アミノ酸の置換又は欠失を指し、特にアミノ酸の置換は、配列中のアミノ酸を異なる（代替）アミノ酸で置換することを指す。
【０１１７】
本明細書で使用される「炎症」は、組織傷害、感染、又は局所免疫応答によって開始される体液、血漿タンパク質、及び白血球の局所的蓄積を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される「急性炎症」は、炎症の初期段階（開始）及び損傷、感染、又は局所免疫応答の直後の短期間の一過性炎症反応を指す。典型的には、急性炎症は急速に回復し、炎症が続くのはほんの数分から長くても２〜３日である。
【０１１９】
本明細書で使用される「慢性炎症」は、持続性及び／又は難治性（non-resolved）の炎症を指す。その炎症は健康な組織の不適切な破壊に関連していることが多い。この炎症は進行性であり、数週間又はそれ以上続くことがある。慢性炎症は、典型的には、持続性の感染や、自己免疫疾患を含むがこれに限定されない疾患に関連する。
【０１２０】
本明細書で使用される「慢性関節炎症」とは、ヒト疾患で観察されるように、数週間から数か月にわたって進行し、且つ寛解がなく、罹患した関節の変形並びに軟骨破壊及び骨破壊のＸ線像による証拠をもたらす持続性炎症をいう（Kelly, Harris, Ruddy and Sledge, Textbook of Rheumatology 4th Edition）。
【０１２１】
実験的マウスモデルでは、慢性関節炎症は、比較的短い期間でさえも和らぐことがなく、不適切な組織破壊を引き起こす炎症を特徴とする。これは、滑膜腔及び関節腔内の炎症細胞の長期存在、軟骨細胞死、並びに軟骨侵食及び骨侵食によって組織学的に特徴付けられる（及び同定することができる）。
【０１２２】
本明細書で使用される「慢性炎症性疾患状態」は、慢性炎症状態の有無にかかわらず、対象の診断、予後判定、及び／又は適切な治療の決定を含む。
【０１２３】
本明細書で使用される「断片」は、少なくとも４つのアミノ酸、例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個のアミノ酸を指す。
【０１２４】
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータープログラム、例えばウィスコンシン大学遺伝コンピューティンググループ（Genetic Computing Group）のＧＡＰプログラムを使用して決定でき、その配列が最適にアラインメントされたポリヌクレオチドについて同一性パーセントが計算されることが理解されよう。
【０１２５】
代替的に、アラインメントは、クラスタルダブルプログラム（Thompson et al, 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680に記載）を使用して行うこともできる。
【０１２６】
使用パラメーターは以下の通りでありうる：ファーストペアワイズアラインメントのパラメーター：ｋタプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップ対角線（top diagonal）の数；５。スコアリング法：ｘパーセント。
【０１２７】
マルチプルアライメントのパラメーター：ギャップ開始ペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。スコア行列：ＢＬＯＳＵＭ。代替的に、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して局所配列アライメントを決定してもよい。
【０１２８】
「対象」又は「個体」という用語は、ヒトを含むすべての動物を意味する。対象の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、及びブタが挙げられる。「患者」という用語は、治療を必要とする障害を有する対象又は個体を意味する。一般に、対象及び／又は患者はヒトであることになる。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「医薬製剤」は本開示による治療上有効な製剤を指す。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」又は「有効量」又は「治療上有効」とは、所与の疾患及び投与レジメンについて治療効果をもたらす量をいう。これは、必要とされる添加剤及び希釈剤、すなわち担体又は投与媒体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性物質である。さらに、それは、宿主／患者の活動、機能、及び反応における臨床的に重大な障害を軽減及び／又は予防するのに十分な量を意味することを意図する。代替的に、治療有効量は、宿主／患者において臨床的に重大な疾患の改善を引き起こすのに十分である。当業者に理解されるように、活性薬剤（本開示による抗体又は結合断片など）の量は、その比活性に応じて変動しうる。好適な投与量は、必要とされる希釈剤と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性組成物を含有しうる。本発明の組成物の製造のための方法及び使用において、治療有効量の活性成分が提供される。治療有効量は、当該技術分野において周知であるように、年齢、体重、性別、疾患、合併症、その他の疾患などの患者の特性に基づいて、医療または獣医療の当業者によって決定することができる。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、ペイロードという用語には、例えば、生物学的に活性があるタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸、及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子、並びにＮＭＲ又はＥＳＲ分光法によって検出されうる蛍光組成物又は蛍光化合物などのレポーター基が含まれる。
【０１３２】
他のペイロードとしては、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕｌ７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２、及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種、又は限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ抑制剤、タキソイド、及びスラミンなどの薬物が挙げられうる。
【０１３３】
他のペイロードとしては、タンパク質、ペプチド、酵素が挙げられる。対象となる酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。対象となるタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドとしては、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤若しくは抗血管新生剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、若しくは他の成長因子などの生物学的応答調節物質、及び免疫グロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
他のペイロードには、例えば診断に有用な検出可能な物質が含まれうる。検出可能な物質の例としては、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、（陽電子放射断層撮影法で用いる）陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体に結合できる金属イオンについては、一般には、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、及びフィコエリスリンが挙げられ、好適な発光物質としては、ルミノールが挙げられ、好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びイクオリンが挙げられ、好適な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが挙げられる。
【０１３５】
別の例では、ペイロードは、生体内での抗体の半減期を延ばし、且つ／又は抗体の抗原性を低下させ、且つ／又は上皮性関門を横切る抗体の免疫系への送達を増強しうる。このタイプの好適なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又は国際公開第０５／１１７９８４号に記載のものなどのアルブミン結合化合物が含まれる。
【０１３６】
エフェクター分子がポリマーである場合、エフェクター分子は一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば随意に置換された直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝多糖若しくは非分枝多糖類、例えばホモ多糖若しくはヘテロ多糖でありうる。
【０１３７】
上記合成ポリマー上に存在しうる具体的な任意選択置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基が含まれる。
【０１３８】
合成ポリマーの具体例としては、随意に置換された直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）などの随意に置換されたポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
【０１３９】
具体例な天然に存在するポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はその誘導体が挙げられる。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール選択的反応基を含むことが意図される。反応基は、直接的にポリマーに結合していてもよく、又はリンカーセグメントを介して結合していてもよい。そのような基の残基は、場合によっては、抗体断片とポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されよう。
【０１４１】
ポリマーのサイズは、所望に応じて変えることができるが、一般に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａなどの５０００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲にあることになる。ポリマーサイズは特に、生成物の使用目的、例えば、腫瘍などのある特定の組織に局在できること又は循環半減期を延ばせることに基づいて選択することができる（総説については、Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545を参照されたい）。
【０１４２】
したがて、例えば生成物が、例えば腫瘍の治療に使用するために、循環を離れて組織に浸透することが意図されている場合、例えば約５０００Ｄａの分子量をもつ、分子量が小さいポリマーを使用することが有利でありうる。生成物が循環中に留まる用途では、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する分子量がより高いポリマーを使用することが有利でありうる。
【０１４３】
好適なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体などの、特に分子量が約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲のポリアルキレンポリマーが挙げられる。
【０１４４】
１つの例では、本発明で用いる抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合される。１つの具体的な例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、又はカルボキシル基を通して結合されうる。そのようなアミノ酸は、抗体断片に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片に操作してもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、国際公開第９８／２５９７１号、国際公開第２００８／０３８０２４号を参照されたい）。１つの例では、本発明の抗体分子は改変Ｆａｂ断片であり、その改変は、エフェクター分子の結合を可能にする、抗体分子の重鎖のＣ端末側終端における１つ又は複数のアミノ酸付加である。好適には、付加アミノ酸は、エフェクター分子が結合されうる１つ又は複数のシステイン残基を含有する改変ヒンジ領域を形成する。複数の部位を用いて、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。
【０１４５】
好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通して共有結合する。改変抗体断片に結合した各ポリマー分子は、その断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は一般に、ジスルフィド結合、又は特に硫黄−炭素結合であることになる。結合する場所としてチオール基が用いられる場合、適切に活性化されるエフェクター分子、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択性誘導体を用いることができる。活性化されたポリマーは、上記のポリマー改変抗体断片の調製において出発材料として使用されうる。活性化ポリマーは、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドなどのα−ハロカルボン酸又はエステルなどのチオール反応基を含有するいずれのポリマーであってもよい。そのような出発材料は、商業的に（例えば、Nektar、旧Shearwater Polymers Inc.、ハンツビル、アラバマ州、アメリカ合衆国から）入手することができ、又は市販の出発材料から従来の化学手順を用いて調製することができる。具体的なＰＥＧ分子としては、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Nektar、旧Shearwater、Rapp Polymere、及びSunBioから入手可能）並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Nektar、旧Shearwaterから入手可能）が挙げられる。
【０１４６】
１つの実施形態では、抗体は、例えば欧州特許第０９４８５４４号又は欧州特許第１０９００３７号に開示の方法に従って、ＰＥＧ化された、すなわち、それに共有結合しているＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾Ｆａｂ断片又はｄｉＦａｂである（"Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York、"Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC、及び"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545も参照されたい）。１つの例では、ＰＥＧはヒンジ領域のシステインに結合している。１つの例では、ＰＥＧ改変Ｆａｂ断片は、改変ヒンジ領域の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基はマレイミド基に共有結合しうる。リシン残基上のアミン基の各々には、分子量が約２０，０００Ｄａのメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合しうる。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの総分子量は約４０，０００Ｄａでありうる。
【０１４７】
具体的なＰＥＧ分子としては、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Nektar、旧Shearwaterから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ  ２０，０００）改変リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミド（2-[3-(N-maleimido)propionamido]ethyl amide of N,N'-bis(methoxypoly(ethylene glycol) MW 20,000) modified lysine）が挙げられる。
【０１４８】
ＰＥＧリンカーの代替供給元としてはNOF社が挙げられ、ＧＬ２−４００ＭＡ２（以下の構造中のｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍは２である）を供給する。ｎは約４５０である。
【０１４９】
【化３】
2019507744.tif 000005
【０１５０】
すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。以下のタイプのさらなる代替ＰＥＧエフェクター分子：
【０１５１】
【化４】
2019507744.tif 000006
がDr Reddy、NOF、及びJenkemから入手可能である。
【０１５２】
１つの実施形態では、鎖のアミノ酸２２６位又は２２６位付近、例えば重鎖のアミノ酸２２６位（連番ナンバリングよる）のシステインアミノ酸残基を通して（例えば本明細書に記載のＰＥＧで）ペグ化された抗体が提供される。
【０１５３】
本明細書の文脈において、「含む（comprising）」は「含む（including）」と解釈されるべきである。
【０１５４】
ある特定の要素を含む本発明の態様はまた、関連要素「からなる（consisting）」又は「から本質的になる（consisting essentially）」代替的な実施形態に及ぶことを意図している。
【０１５５】
技術的に適切な場合、本発明の実施形態は組み合わせることができる。
【０１５６】
特許及び出願のような技術的参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に具体的に、且つ、明示的に詳述されたいずれの実施形態は、単独で、又は１つ以上のさらなる実施形態と組み合わせて、免責事項（disclaimer）の基礎を形成することができる。
【０１５７】
本開示の態様は配列及び図に記載され、修正の基礎を成しうる。図及び配列の開示は、本開示の教示に関して一般的に適用され、単に非常に特殊な組み合わせとみなされることを意図するものではない。
【０１５８】
次に、以下の図面を参照して、本発明の態様を具体化する実施例を単に例示として説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１Ａ】図１（Ａ）ＴＬＲ４及びＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧのインビトロ結合アッセイの結果を示すグラフ。（Ｂ）モノクローナルＡｂ  Ｃ３がインビトロでＦＢＧとＴＬＲ４との結合を破壊する能力を示すための実験の結果を示すグラフ。
【図１Ｂ】同上。
【図２Ａ】図２（Ａ）ＭＡｂ  Ｃ３とのインキュベーション後に組換えヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したヒトＭ２マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン放出に対する効果を示すグラフ。（Ｂ）ＭＡｂ  Ｃ３とのインキュベーション後に組換えネズミＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したヒトＭ２マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン放出に対する効果を示すグラフ。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図３Ａ】図３（Ａ）ＭＡｂ  Ｂ１２とのインキュベーション後に組換えヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したヒトＭ２マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン放出に対する効果を示すグラフ。（Ｂ）実験室規模／より大きい規模でＭＡｂ  Ｂ１２とインキュベートした後に組換えヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したヒトＭ２マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン放出に対する効果を示すグラフ。
【図３Ｂ】同上。
【図４】図４  グラフは、ＭＡｂ  Ｃ３とのインキュベーション後に組換えＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したＲＡ滑膜線維芽細胞による前炎症性サイトカイン放出に対する効果を示す。
【図５】図５  ＥＬＩＳＡで測定したラットの足からの滑液のウォッシュアウトにおけるテネイシンＣレベルと、対する臨床スコアを示す散布図。
【図６】図６  さまざまな投与量のＣ３  ＭＡｂによる治療後の経時的なラットの臨床スコアを示すグラフ。
【図７】図７  さまざまな投与量のＣ３  ＭＡｂによる治療後の経時的なラットの後肢容積を示すグラフ。
【図８】図８  使用したプライマー配列を示す表。
【図９】図９（Ａ）テネイシン−Ｃドメイン構造を示す模式図。（Ｂ）凡例。
【実施例】
【０１６０】
実施例１  抗原及びアッセイ試薬としての精製テネイシン−ｃ  ＦＢＧの作製
テネイシン−ＣのＦＢＧドメインを含む精製可溶性タンパク質（ＴＮＣ  ＦＢＧ）を、抗体選択における抗原として、並びにその後のスクリーニング及び特性解析アッセイにおける試薬として使用するために生成した。複数の哺乳動物種のテネイシン−Ｃに結合する抗体を単離するための選択方法を可能にするために、ヒト、マウス、ラット、又はイヌのいずれかのＴＮＣ  ＦＢＧドメインを組み込んださまざまなＤＮＡ発現コンストラクトを合成した。また、ヒトテネイシン−Ｒ  ＦＢＧコンストラクトも、このホモログへの望ましくない結合を示す抗体を同定するために調製した。以下に記載するように、Ｃ末端又はＮ末端ＦＢＧドメインのいずれかに結合したラットＣＤ４又はヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグのいずれかを有する６Ｈｉｓタグタンパク質としてコンストラクトを作製した。
【０１６１】
タンパク質発現コンストラクト
抗原発現用の合成ＤＮＡコンストラクトはすべて合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ピスカタウェイ、アメリカ合衆国）によって配列を確認した。発現ドメインを、ラットＣｄ４（ドメイン３及び４）タグ（Chappie et al, 2006）又はヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ（Falk et al, 2012）のいずれかとそれぞれ融合させる哺乳動物発現ベクターｐＢＩＯＣＡＭ４又はＢＩＯＣＡＭ５にＦＢＧドメインをクローニングした。発現させたタンパク質の分泌を分泌させるために、ベクターを、マウスＶＨ鎖に由来する小胞体（ＥＲ）シグナル配列を含むｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲプラスミド（インビトロジェン）（Falk et al, 2012）から改変した。Ｎ末端ＦＢＧ（例えば、ＦＢＧ−Ｆｃ−Ｈｉｓ又はＦＢＧ−ｒＣｄ４−Ｈｉｓ）を生じるコンストラクトの場合はすべて、消化したＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ切断ｐＢＩＯＣＡＭ４又はｐＢＩＯＣＡＭ５ベクターと連結した。Ｃ末端ＦＢＧ（例えば、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ又はｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）を生じるコンストラクトの場合はすべて、消化したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＢＩＯＣＡＭ４又はｐＢＩＯＣＡＭ５ベクターと連結した。ＦＢＧドメインを増幅するために使用したプライマーを図３に載せる。コンストラクトはすべて配列を確認した。ＥＬＩＳＡスクリーニングを容易にするために、Ｈｉｓタグをコードするインサート（プライマー２５７４及び２５７５）を、ＦＢＧ−Ｘ（Ｎ末端ＦＢＧ）融合を含む発現プラスミドのＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に（Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグを置換して）クローニングした。全長テネイシンＣを、ＢｓｔＸＩ及びＢａｍＨＩによる消化によってＧｅｎｓｃｒｉｐｔｐＵＣ５７プラスミドから直接クローニングし、ＢｓｔＸＩ／ＢａｍＨＩ切断発現ベクターｐＦＢＧ−Ｆｃ−Ｈｉｓ６にクローニングした。Ｈｉｓ−ＦＢＧコンストラクトを作り出すために、プライマーをｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ発現プラスミドからＰＣＲを設計し、Ｈｉｓ−ＦＢＧをコードするＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＩＯＣＡＭ５にクローニングした。
【０１６２】
タンパク質発現及び細胞培養
Machery Nagel Nucleobond Xtra Midiキット（７４０４１０．５０、フィッシャーサイエンティフィック、英国）を使用して、トランスフェクション品質のプラスミドＤＮＡを調製した。抗原及び抗体発現用のＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞及びＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地、ＲＰＭＩ培地はライフテクノロジーズ（Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）から入手した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションを以前に記載されているように行った（Chappie et al, 2006）。
【０１６３】
タンパク質精製及びＱＣ
タンパク質アフィニティー精製には、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース又は固定化組換えプロテインＡ樹脂のいずれかを使用した。Ｈｉｓタグタンパク質の精製では、培養上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（１０１８２４０、キアゲン、クローリー、英国）と１時間混合し、樹脂を遠心分離（２００×ｇ、２分）のためにProteus１ステップミディスピンカラム（Generon、英国）に移した。非結合タンパク質を、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）を補ったリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流した。結合したタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ８）中の３００ｍＭイミダゾールを加え、カラム遠心分離（２００×ｇ、２分）することによって分画して溶出させた。プールした溶出タンパク質含有画分を、Gebaflex Midi透析チューブ（Generon  Ｄ０１０、分子量カットオフ３．５ｋＤａ）に入れ、ＰＢＳに対して透析した。
【０１６４】
Ｆｃタグタンパク質及びヒトＩｇＧ４として発現される抗体を、プロテインＡセファロース（ＰＣ−Ａ２５、Generon、メイデンヘッド、英国）を用いて精製した。培養上清を遠心分離（２５００×ｇ、１５分）で清澄化し、プロテインＡセファロースと４℃で一晩混合した後、樹脂をProteus１ステップミディスピンカラム（Generon、英国）に移した。カラムを遠心分離し（２００×ｇ、２分）、ＰＢＳで洗浄して非結合タンパク質を除去した。Ｆｃタグタンパク質又はＩｇＧ４タンパク質を、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中の０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を用いてカラム遠心分離（２００×ｇ、２分）することによってプロテインＡからに分画して溶出させた。溶出画分をプールし、Gebaflex Maxi透析チューブ（Generon  Ｄ０４５、分子量カットオフ８ｋＤａ）でＰＢＳに対して透析した。
【０１６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ゲル）及び分光光度法（理論吸光係数を使用したＯＤ２８０）によってタンパク質の純度及び濃度を分析した。精製タンパク質を細胞ベースのアッセイに使用した場合には、最初にエンドトキシン含有量をリムルスアメーバ細胞溶解産物発色エンドトキシンアッセイ（ピアス）によって決定した。エンドトキシンレベルが１ミリグラム当たり１エンドトキシン単位（すなわち１ＥＵ／ｍｇ）を超えた場合は、タンパク質を使用しなかった。
【０１６６】
実施例２  一次抗ＦＢＧ抗体の単離
抗体ファージディスプレイ
４３名のヒトリンパ球ドナーから単離されたＤＮＡを用いて構築したIontas Ltd専有ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用いて、テネイシン−Ｃ  ＦＢＧドメインに対する抗体を単離した。選択、ファージレスキュー、及びｐＳＡＮＧｌＯ（Martin et al, 2006）へのサブクローニングはすべて、当該技術分野で周知の技術を用いて以前に記載されているように実施した（Schofield et al, 2007）。
【０１６７】
融合パートナーのＮ末端（例えば、ＦＢＧ−Ｆｃ、ＦＢＧ−ｒＣｄ４）又はＣ末端（Ｆｃ−ＦＢＧ、ｒＣｄ４−ＦＢＧ）のいずれかにおいてヒトＩｇＧ１  Ｆｃ又はｒＣｄ４に融合したＴＮＣ  ＦＢＧを固定化し、その上で２回のラウンドのパンニング選択を行った。定常軽鎖（ＣＬ）カッパ（κ）又はラムダ（λ）鎖のいずれかを含有するＦａｂ発現ベクターへの後続のサブクローニングを容易にするために、カッパ（κ）又はラムダ（λ）可変軽鎖（ＶＬ）のいずれかを含有するファージ抗体ライブラリーを別々にパンニングした。
【０１６８】
ポリクローナルファージ集団を選択した集団から調製し、ＴＮＣ  ＦＢＧ抗原又は適切な融合パートナー（Ｆｃ又はｒＣｄ４）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いてＥＬＩＳＡ（ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ）で試験した。ファージとインキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したファージをペルオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体を用いて検出した。選択の１ラウンド目と２ラウンド目の間の抗原特異的な結合体の富化、及び２ラウンド目の産物集団における、抗Ｆｃ又は抗ｒＣｄ４ファージと比較した場合の、ＦＢＧ結合体のより大きな集団。これは選択が成功したことを示している。
【０１６９】
交差反応性アッセイ及びＥＬＩＳＡによるｓｃＦｖの抗原への結合の確認
ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて抗原認識を確認するために、２ラウンド目の選択産物を個々のｓｃＦｖクローンとして発現させた。産物集団を細菌発現ベクターｐＳＡＮＧ１０（Martin et al, 2006）にサブクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、個々の形質転換体を以前に記載されているように９６ウェルプレートで誘導した（Schofield et al, 2007）。大腸菌上清を集め、ユウロピウム標識抗ＦＬＡＧ検出抗体を用いたＤＥＬＦＩＡベースのＥＬＩＳＡを用いて、ｓｃＦｖのＴＮＣ  ＦＢＧへの結合についてアッセイした。
【０１７０】
λライブラリーを用いた最も成功した選択は、抗原ｒＣｄ４−ＦＢＧ及びＦｃ−ＦＢＧ（選択１４７及び１４８）に対するパニングに基づいた。κライブラリーでは、最も成功した選択は、抗原ＦＢＧ−ｒＣｄ４（１５０）、ｒＣｄ４−ＦＢＧ（１５２）、及びＦｃ−ＦＢＧ（１５３）で得られた。このＥＬＩＳＡスクリーニングの７９個の陽性クローンをさらなる分析に向けて選択した。
【０１７１】
交差反応性ＥＬＩＳＡによって、抗ヒトＦＢＧ  ｓｃＦｖの６７／７９（８５％）がマウスＴＮＣ  ＦＢＧに対して交差反応性があることが示された。抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列解析は優れた配列多様性を示した。例えば、ＶＬλライブラリーからの選択１４７及び１４８は、９２％のユニークな可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含み、ＶＬκライブラリーからの選択１５０、１５２、及び１５３は、それぞれ、６７％、９１％、及び１００％ユニークな可変ＶＨ  ＣＤＲ３配列を含んだ。
【０１７２】
最も効果的な選択から単離したさらなる１４２５個のクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、これによって、ＦＢＧ結合特異性をもつさらなる４０１個のｓｃＦｖが結果として同定された。これらのクローンは、最初のＥＬＩＳＡで同定した７９個のｓｃＦｖと一緒に、さらなる評価に向けて選ばれた。
【０１７３】
１４２５個のクローンを特異性ＥＬＩＳＡでさらに試験し、各ｓｃＦｖをヒトテネイシンＲ  ＦＢＧ並びにヒト、マウス、ラット、及びイヌＴＮＣ  ＦＢＧに対する結合について試験した。テネイシンＲ  ＦＢＧ結合のシグナルで除した、テネイシンＣへの結合について得られたＥＬＩＳＡシグナルに従ってクローンをランク付けした。比が５０を超える上位２５０個のクローンをサブクローニング及びさらなる分析のために選んだ。
【０１７４】
実施例３  機能アッセイにおける一次抗ＦＢＧ抗体のスクリーニング
全細胞アッセイ系におけるＦＢＧ誘発シグナル伝達の阻害剤としての抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖの活性を評価するために、抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖを二価ｓｃＦｖ−Ｆｃ又は単量体Ｆａｂにいずれかとしてフォーマット（reformat）した。
【０１７５】
選択１４７、１４８、１５０、１５２、及び１５３のそれぞれについて、一次ＥＬＩＳＡシグナルによってランク付した上位５０個の抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖを、個々の選択集団として哺乳動物発現プラスミドｐＢＩＯＣＡＭ５（Falk et al, 2012）にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクションによって発現させた（Chappie et al, 2006）。Ｆａｂ発現では、Iontas Ltd専有プロトコールを使用して、プールしたλ又はκ  ｓｃＦｖ可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）インサートを二重プロモーターＦａｂ発現ベクター（軽鎖生殖系列に応じてｐＦａｂ−ｄｕａｌ−κ  又はｐＦａｂ−ｄｕａｌ−λ）にクローニングした。培養上清をＴＨＰ−１細胞アッセイにおける活性についてスクリーニングし、選択したｓｃＦＶ−Ｆｃ及びＦａｂヒット（hits）を再アッセイ及び阻害活性の確認のためにアフィニティー精製した。
【０１７６】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）リポーター細胞アッセイ
テネイシン−Ｃは、ＦＢＧドメインと細胞ＴＬＲ４との相互作用によって、炎症細胞及び線維芽細胞におけるサイトカインの産生を誘発することが示されている（Midwood et al, 2009）。ＴＮＦａ、ＩＬ−８、及びＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生を導く受容体シグナル伝達カスケードは、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を伴う。このプロセスは、容易に測定されるタンパク質シグナルの生成を伴うＮＦ−κΒ活性化に応答するように改変された「レポーター」細胞系において研究することができる。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞株（インビボジェン、トゥールーズ、フランス）は、ヒトＴＨＰ−１単球細胞株に由来し、ＮＦ−κΒ誘導性分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターコンストラクトを安定に発現する。さらにこれらの細胞は細胞表面ＴＬＲ４を恒常的に発現し、それによって、ＴＮＣ  ＦＢＧ融合タンパク質のシグナル伝達活性を、ミディアムスループット〜ハイスループットのアッセイ法で培養上清中のＳＥＡＰの比色定量又は蛍光定量を用いて容易に測定することができる。
【０１７７】
低ＦＢＧ濃度での活性は、どのスクリーニングアッセイの成功にとっても非常に重要である。レポータータンパク質の力強い増加を生じるのに必要なＦＢＧの濃度が高すぎる場合、いかなるそのようなシグナルを完全に阻害するのに必要なｓｃＦｖ、Ｆｃ−ＳｃＦｖ、又はＦａｂコンストラクトの発現レベル及び濃度はスクリーニングにおいて容認できないものとなるであろう。Ｆｃ−ＦＢＧは、この細胞アッセイにおいて低いｎＭレベルで強いＳＥＡＰシグナルを生じる（ＣＤ４−ＦＢＧはこの濃度範囲で応答を生じなかった）。
【０１７８】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は、細胞を超低付着性Ｔ７５フラスコで培養したことを除いて、供給業者のプロトコール（http://www.invivogen.com/PDF/THP1_Blue_NF_kB_TDS.pdf）に従って補充ＲＰＭＩ培地で培養し継代した。アッセイでは、ＲＰＭＩ培地にＦｃ−ＦＢＧ（３又は１０ｎＭ）が総体積１７０μｌで入った９６ウェル組織培養プレートにＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞を加えた（１００，０００細胞／ウェル）。発現させたｓｃＦｖ−Ｆｃ若しくはＦａｂ又はアフィニティー精製抗体をＰＢＳ中に含む培養上清を３０μｌの容積で加え、細胞を３７℃で１８時間インキュベーションした。上清を採取し、ＳＥＡＰについてはAttophosＡＰ蛍光定量システム（Ｓ１０００、プロメガ）を用いて、又はＩＬ−８含有量についてはDuoSet  ＥＬＩＳＡ開発システム（ＤＹ２０８、Ｒ＆Ｄシステム、英国）を用いて供給業者の指示に従ってアッセイした。データをプロットし、プリズムソフトウェア（グラフパッド）を用いて曲線の当てはめを行った。
【０１７９】
ＨＥＫ２９３Ｆ培養上清としての抗ＦＢＧ抗体のスクリーニングは、ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）細胞におけるＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘発シグナル伝達の推定阻害剤を明らかにし、そのうちの９個が再アッセイの際に精製された精製ｓｃＦｖ−Ｆｃ又はＦａｂとして確認された。Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧは、効力のあるアッセイを機能させる上で重要である。単量体ＦＢＧは、ＴＨＰ−１  Ｂｌｕｅ及びヒト細胞においていかなるサイトカイン応答も誘発しない。
【０１８０】
実施例４  一次抗ＦＢＧ抗体の機能特性解析
ＥＬＩＳＡ交差反応性アッセイ
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）機能アッセイで同定した９個のヒトＦＢＧシグナル伝達阻害剤のパネルを、ラット、マウス、及びイヌＦＢＧに対する交差反応性についてＥＬＩＳＡで評価した。また、ヒトテネイシン−Ｒ  ＦＢＧホモログに対する結合も決定した。アッセイウェルをヒト、ラット、マウス、及びイヌＴＮＣ  ＦＢＧ−ｒＣＤ４、又はヒトＴＮＲ  ＦＢＧ−ｒＣｄ４融合タンパク質でコーティングし、Ｆａｂの結合を、抗カッパ又は抗ラムダｍＡｂ、続いてユウロピウム結合抗マウスｍＡｂを用いて検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、Ｃ３抗体がヒトＴＮＦ−ＦＢＧの他の哺乳類ホモログに対して良好な交差反応性を示し、ヒトＴＮＦ−ＦＢＧに対する見かけの結合がより低いことを明らかにした。これらが以下であった。
【０１８１】
表面プラズモン共鳴による結合親和力の測定
ヒト、ラット、及びマウスのＴＮＣ  ＦＢＧ並びにヒトＴＮＲ  ＦＢＧとの結合についての、選択したＦａｂの親和性並びに結合及び解離動態を、２５℃にて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した。
実験は、Human Fab Capture Kit（ＧＥ、２８−９５８３−２５）で提供されたプロトコールに従ってＣＭ５センサーチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置を用いて行った。さまざまな濃度のｒＣｄ４−ＦＢＧを、固定化Ｆａｂを含むフローセル及びリファレンスフローセルに注入した。リファレンスシグナルを差し引いた後、データを、Ｔ１００  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いてグローバル１：１フィットに当てはめた。
【０１８２】
計算した速度定数を表３に示す。ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対するＦａｂの親和性の順序はＢ１２（１１０ｐＭ）＞であった。Ｆａｂはすべて、げっ歯類ＴＮＣ  ＦＢＧに対して低いナノモル親和性を示し、典型的には、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対する親和性はヒトＴＮＲ  ＦＢＧよりも６０倍を超えて低かった。
阻害効力アッセイ
【０１８３】
ＴＬＲ４媒介分泌型アルカリホスファターゼ及びＩＬ−８サイトカイン産生の測定を用いて、ｈｕＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ活性の中和のための精製Ｆａｂの効力をＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）アッセイで測定した。プリズムソフトウェア（グラフパッド）を用いたＩＣ５０値の計算を可能にするために、精製Ｆａｂを濃度範囲（０．３〜１００ｎＭ）でアッセイウェルに添加したことを除いて、実施例２に記載したようにアッセイを行った。
【０１８４】
本開示のＣ３抗体は、Ｂ１２と呼ばれる抗体に由来する。
【０１８５】
【表１】
2019507744.tif 000007
表１  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法によって測定した抗ＦＢＧ  Ｆａｂ結合動態データ。ＫＤ、平衡解離定数；Ｋａ、結合定数；Ｋｄ、解離定数
【０１８６】
実施例５  ｈｕＴＮＣＦＢＧドメインに対する最適化抗体の作製及び単離
標的化ＣＤＲ変異導入による親和性成熟
抗ＦＢＧ抗体Ｂ１２を親和性成熟のために選択した。標的化ＣＤＲ変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ変異導入を用いて６個のアミノ酸のブロックにおけるＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲ３残基をランダム化することによって行った（Fellouse and Sidhu, 2007; Kunkel et al., 1987; Sidhu and Weiss, 2004）。所与のクローンにおいてＶＨ  ＣＤＲ３は長いため（１０〜１６残基）、３つの重複ブロックにおいてランダム化を行い、ＶＬ  ＣＤＲ３（９残基）は２つの重複ブロックにおいてランダム化を行った。ランダム化は、３２個のコドン組み合わせから所定の位置に２０個のアミノ酸のいずれか（及び単一のアンバー終止コドンのみ）をコードしうるＮＮＳ（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔ及びＳ＝Ｇ／Ｃ）縮重プライマーを用いて行った。以下のライブラリーを作り出した。
【０１８７】
【表２】
2019507744.tif 000008
表２  ＣＤＲ３ランダム化ライブラリーの推定サイズ
【０１８８】
高ストリンジェンシーファージディスプレイ選択
ストレプトアビジンダイナビーズでのファージ−抗体選択は、以前に記載されているように行った（Dyson et al, 2011）。複数ラウンドの溶液相選択をビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対して行って、親和性が向上したクローンを富化させた。各ラウンドの至適抗原濃度は、さまざまな抗原濃度に対して選択すること及び成果物の数を非抗原対照と比較することによって経験的に決定した。選択のストリンジェンシーは、各ラウンドで使用する抗原の量を減らすことによって増加させた。選択ウィンドウ（selection window）（選択産物と非抗原対照との間のファージ力価の倍数差（fold difference））が１０を下回った後は、さらなるラウンドの選択は行わなかった。したがって、３ラウンド目で観察された選択ウィンドウが大きかったために４ラウンド目の選択に供したＢ１２を除く全てのライブラリーについて、３ラウンドの選択をビオチン化ヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対して行った。全てのライブラリーを、各選択ラウンドにおいてストレプトアビジンビーズおよびテネイシン−Ｒ（１〜３ラウンド目は１００ｎＭ、４ラウンド目は１ｎＭ）に対する除外の対象として、ストレプトアビジンまたはテネイシン−Ｒに対する望まれない交差反応性を回避した。くわえて、ヒト抗原およびマウス抗原を選択ラウンド間で交代させたハイブリッド選択戦略をＢ１２ランダム化ライブラリーのみに対して行った。Ｂ１２ライブラリーに対してこの追加選択を行った理由は、ヒトおよびマウスｒＣｄ４−ｈｉｓ−ＦＢＧに結合するＢ１２親抗体において観察された、親和性の大きな違いのためであった。さらに、優れたオフレートをもつ抗体クローンを選択するために、追加ラウンドの選択を行った。オフレート選択では、ファージをビオチン化抗原（この場合１ｎＭ）に結合させ、その後、大過剰な非ビオチン化抗原（５００ｎＭ）を反応に加え、２０時間または４０時間インキュベーションした。非ビオチン化抗原は、競合物としての役目を果たし、ビオチン化抗原から解離したファージ抗体を捕捉し、すなわち、より長いオフレートをもつ抗体のみが選択の終わりに回収されることになる（Hawkins et al., 1992; Zahnd et al., 2010）。各選択ラウンドの結果のファージ力価を、計算した選択ウィンドウと共に、下記表３〜５に示す。
【０１８９】
【表３】
2019507744.tif 000009
表３  選択産物力価
１ラウンド目選択
ファージ産物力価は、Schofield et al, 2007に記載されているように決定した。
【０１９０】
【表４】
2019507744.tif 000010
表４  選択産物力価
２ラウンド目選択
ファージ産物力価は、以前に記載されているように決定した（Schofield et al, 2007）。
【０１９１】
【表５】
2019507744.tif 000011
表５  選択産物力価
３ラウンド目選択
ファージ産物力価は、以前に記載されているように決定した（Schofield et al, 2007）。
【０１９２】
ＥＬＩＳＡスクリーニング
抗ＦＬＡＧ捕捉ＥＬＩＳＡを行って、親抗体と比較してマウスＦＢＧ結合について親和性が向上したクローンをスクリーニングした。
【０１９３】
ｓｃＦｖ  ｐＳＡＮＧｌＯ発現プラスミドをもつ大腸菌クローンを、以前に記載されているように自己誘導培地を用いて９６ウェルプレートで誘導した（Schofield et al, 2007）。大腸菌上清をＥＬＩＳＡアッセイ用に採取した。ＥＬＩＳＡは、ユウロピウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ、アルドリッチ、英国）とＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（dissociation-enhanced lanthanide fluorometric immunoassay））システムを使用した。黒色免疫吸着（immunosorb）プレート（ヌンク）は、２％ミルクパウダー、ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｍ、１ウェルあたり３００μｌ）を加えることによってブロックしたウェルに、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ、Ｆ３１６５、ＰＢＳ中５ｕｇ／ｍｌ、１ウェルあたり５０μｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％ツイーン２０）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した後、発現したｓｃＦｖをＰＢＳ−Ｍ中に含有する９６ウェル自動誘導培養上清の１：２希釈物を加えた（１ウェルあたり５０μｌ）。プレートを１時間インキュベーションし、上記のように洗浄し、ビオチン化マウス又はヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（ＰＢＳ−Ｍ中５μｇ／ｍｌ、５０μｌ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに１時間インキュベーションし、洗浄し、ストレプトアビジン−Ｅｕ（パーキンエルマー、１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ−Ｍ、５０μｌ）を加え、３０分間インキュベーションし、洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（５０μｌ）を加え、パーキンエルマーヌンクFusionプレートリーダー（励起＝３２０ｎｍ、発光＝６２０ｎｍ）で読み取った。
【０１９４】
このアッセイでは、自動誘導培養におけるｓｃＦｖの発現レベルが抗ＦＬＡＧでコーティングされたウェルで飽和状態になるので、ｓｃＦｖ発現レベルの違いを正規化する。したがって、アッセイで得られたシグナルは、洗浄後に結合しているビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧの量を反映し、マウス又はヒトＦＢＧに対するそのクローンのオフレートの関数であることになる。Ｂ１２サブライブラリーからの選択産物のＥＬＩＳＡスクリーニングによって、マウスＴＮＣ  ＦＢＧへの結合が向上したクローンが明らかになった。
【０１９５】
ＨＴＲＦスクリーニング
ＨＴＲＦに基づく競合アッセイを開発し、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの結合が向上した抗体バリアントをスクリーニングした。
【０１９６】
すべての試料及び試薬は、記載の濃度の４倍でアッセイバッファー（５０ｍＭ  ＮａＰＣ、０．１％ＢＳＡ、０．４Ｍ  ＫＦ、ｐＨ７．０）で調製した。その後、５μｌの各試薬を、低容量３８４ウェルアッセイプレート（グライナー、７８４０７５）に加えて、２０μｌの最終反応ボリュームを得た。ＩｇＧ抗体を、製造業者の指示に従ってｄ２標識キット（シスバイオ（CisBio）、６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を用いて標識した。ストレプトアビジンユウロピウムクリプテート（シスバイオ、６１０ＳＡＫＬＡ、ロット番号２５Ｃ）を、製造業者に推奨されるように２０μｌ反応あたり１．８ｎｇの活性部分（ＳＡ）の最終濃度で使用した。ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧを、EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin試薬（サーモサイエンティフィック、２１３２７）を用いて調製した。ビオチンの程度はビオチン化蛍光定量キット（サーモサイエンティフィック、４６６１０）を用いて定量した。必要に応じて、ｓｃＦｖを含有する上清（ＥＬＩＳＡアッセイ用に上記のように調製した）を、３８４ウェルアッセイプレートに最終希釈１／２０で加えた（すなわち、アッセイバッファー中１／５希釈、続いて５μｌ希釈試料を２０μｌのＦＲＥＴアッセイに添加）。スクリーニングに使用したｄ２標識Ｂ１２  ＩｇＧの濃度は１．２５ｎＭであった。別段の規定がない限り、ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（ビオチン：タンパク質比＝１．８：１）は、２．２ｎＭ（２Ａ５  ＩｇＧ抗体を用いたアッセイ）又は１ｎＭ（Ｂ１２  ＩｇＧを用いた実験）のいずれかで存在した。試料を室温で約１時間インキュベーションし、ＦＲＥＴシグナルをBMG Pherastar装置を用いて測定した。励起＝３２０ｎｍ、発光＝６２０ｎｍ及び６６５ｎｍ、積分開始時間＝６０μ秒、積分時間＝５００μ秒、１ウェル当たり１００回フラッシュ。培養上清を含有する競合アッセイでは、ビオチニル化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ抗原をストレプトアビジンユウロピウムクリプテートと４５分間プレインキュベーションした後に、アッセイプレートに試薬を加えた。ＦＲＥＴシグナルはすべて、ΔＲと表され、ここで、Ｒ＝（Ｅ６６５／Ｅ６２０×１０４）及びΔＲ＝（Ｒ試料−Ｒバックグラウンド蛍光）である。
【０１９７】
親和性選択変異体ライブラリー由来の非標識ｓｃＦｖクローンを含有する培養上清を、ＦＢＧとフルオロフォア標識親ＩｇＧ抗体との間の相互作用の阻害について試験した。両アッセイにおいて有用な範囲内のＦＲＥＴシグナルを示すクローンの相対ランキングは、広範に変化しておらず、それらが類似のエピトープに対して競合していたことを示した。したがって、親和性成熟選択由来のすべてのＢ１２  ｓｃＦｖバリアントを、Ｂ１２  ＩｇＧ分子のヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの結合を阻害する能力についてスクリーニングした。親和性成熟クローンと並行してｓｃＦｖとして発現させた親クローンをベンチマークとして使用した。
【０１９８】
ＳｃＦｖを配列決定し、ユニークなＶＨ又はＶＬ  ＣＤＲ３配列をもつクローンのパネルを、それぞれＥＬＩＳＡ及びＨＴＲＦアッセイにおけるマウス及びヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対するその結合に基づいて、ヒトＩｇＧ４フォーマットでのさらなる研究のために選択した。
【０１９９】
【表６】
2019507744.tif 000012
表６  ヒトｒＣＤ４−ＦＢＧに対する親和性が向上したクローンのＨＴＲＦスクリーニング
【０２００】
抗体Ｂ１２のバリアントは、マウスＦＢＧ結合について≧４倍の向上を示し、ＨＴＲＦシグナルの≧９１％阻害を示した。ユニークなＣＤＲ３配列をもち、これらの基準に適合する合計で３１個のクローンを以下に同定した。
【０２０１】
【表７】
2019507744.tif 000013
表７  マウス及びヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの向上した結合で同定され、さらなる研究用のヒトＩｇＧフォーマットへの変換のために選択されたクローンの重鎖又は軽鎖ＣＤＲ３配列。
【０２０２】
これらは、ヒト及びマウスのＴＮＣ  ＦＢＧに結合する抗体クローンの重鎖又は軽鎖の配列であり、したがって、本発明の方法、使用、組成物、及び化合物において潜在的有用性を有する。例えば、これらのＣＤＲ３配列を有するＴＮＦ  ＦＢＧに結合する抗体は、ＴＮＣ又はＴＮＣ  ＦＢＧの同定、機能の阻害、検出、及び精製に有用でありうる。
【０２０３】
ＩｇＧ４フォーマットへの変換と結合動態の決定
３１個の対象となるｓｃＦｖを、ヒンジ安定化突然変異（Ｓ２４１Ｐ、Angal et al, 1993）をもつヒトＩｇＧ４としての抗体の生成のために、ヒトＩｇＧ４発現ベクターにサブクローニングした。ＩｇＧ４抗体をＨＥＫ−２９３Ｆ細胞中で一過性で発現させ、ヒト及びマウスのＴＮＣ  ＦＢＧ並びにヒトＴＮＲ  ＦＢＧへの結合に関するそれらのオフレートをランク付けするために、培養上清を表面プラズモン共鳴分光法を用いてスクリーニングした。簡潔に説明すると、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験は、BIAcore T100装置を用いて行い、ヒト抗体捕捉キットプロトコール（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９）によるプロトコールに従った。オフレートスクリーニングでは、１０，０００レスポンスユニット（ＲＵ）の抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９）を、アミンカップリングキットプロトコール（ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）に従ってＥＤＣ／ＮＨＳ架橋結合化学を用いて、Ｓｅｒｉｅｓ５  ＣＭ５デキストランセンサーチップ（ＢＲ−１００５−３０）のフローセル（ＦＣ１及びＦＣ２）に固定化した。発現したＩｇＧ４を含有する培養上清を２×ＰＢＳ−Ｔで１：２に希釈し、ＦＣ２（流速５μｌ／分、６０秒添加時間）に注入して２５℃での抗体捕捉を可能にした。抗体捕捉レベルは、上清中の抗体の発現レベルに依存して３０８〜１９７５ＲＵの範囲であった。
【０２０４】
一定濃度の抗原（１５ｎＭのヒトおよびマウスＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ並びに１００ｎＭのヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）を、ＦＣ１（リファレンスフローセル）およびＦＣ２（抗体捕捉フローセル）を介した流路を用いて３０μｌ／分の流速で注入し、結合領域及び解離領域をそれぞれ１分間および５分間にわたって測定した。結合表面の再生は３０秒の添加時間で３Ｍ  ＭｇＣｌ２を使用した。オフレートは、BIAevaluationソフトウェア（ＧＥ、ＢＲ−１００５−９７）を用いて１：１の相互作用を仮定して、リファレンスセルの差し引き及びセンサーグラム実験データの適合によって決定した。オフレートスクリーニングの結果を下記表８にまとめる。
【０２０５】
【表８】
2019507744.tif 000014
表８  ヒトＩｇＧ４抗ＦＢＧオフレートのランク付けのための表面プラズモン共鳴スクリーニング
【０２０６】
クローンを、ヒト及びマウスのＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧについては低いオフレートに、且つ、ヒトＴＮＲについてはｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧの高いオフレートに従ってランク付けした。各ライブラリーからのランクが高い上位３つの抗体を、精製ＩｇＧ４としてのより詳細な動態分析に優先させた。これらのクローンを下記表９に示す。
【０２０７】
【表９】
2019507744.tif 000015
表９  向上したＦＢＧ結合オフレートの特徴をもつＢ１２変異体の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（太字下線はＢ１２親において変更されたアミノ酸を示す）。
【０２０８】
９個の優先ＩｇＧ４抗体について詳細な動態パラメーターを評価した。ヒト、ラット、及びイヌＴＮＣ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ並びにヒトＴＮＲ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧとの相互作用について結合特性を測定した。動態アッセイは、上記のオフレートの決定と本質的に同じプロトコールに従い、以下のようないくつかの改変を伴った。動態パラメーター測定の精度を向上するために、抗ヒトＦｃ  ＩｇＧをより低いレベル（２２２９ＲＵ）で固定化し、捕捉される抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４の量における対応する減少を得た。精製抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４をＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ツイーン２０中で３．５ｎＭの濃度に希釈し、１０μｌ／分の流速、６０秒の添加時間でＦＣ２に注入した。これによって、典型的には、平均８０ＲＵ（範囲：５５ＲＵ〜９０ＲＵ）の捕捉抗体が得られた。抗原は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ツイーン２０で倍希釈することによって調製した（７ｎＭであったマウスｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧを除いて最高濃度１００ｎＭ）。アッセイは、３７℃（３０μｌ／分、１２０秒添加時間；マウスｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧＦＢＧ、１０μＬ／分、６０秒添加時間）で、フローセル及び注入チャンバーが共にこの温度に平衡化された状態で行った。前述のとおり、動態パラメーターは、BIAevaluationソフトウェア（ＧＥ、ＢＲ−１００５−９７）を用いて、リファレンスセルを差し引き、１：１の相互作用を仮定してセンサーグラム実験データをあてはめることよって決定した。９個すべての抗体が、親和性成熟されなかった親クローンと比較して、マウスＴＮＣ  ＦＢＧドメインに対する向上した結合を示し、抗体１６５＿１３＿Ｂ１、１６５＿１３＿Ｃ３、及び１６０＿０１＿Ａ４は、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対する結合についてｎＭ以下のＫＤ値を示し、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧアナログに対して＞７０倍低い親和性を示した。
【０２０９】
【表１０】
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表１０  ３７℃での表面プラズモン共鳴によって測定された抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４結合動態データ
【０２１０】
実施例７  シトルリン化ＦＢＧに結合する抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４
シトルリン化ＦＢＧに対する抗体Ｂ１２の結合親和力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。Ｂ１２を、ＱＭＣＦ発現技術（Icosagen、エストニア）を用いて、ヒンジ安定化するＳ２４１Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４として発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（MabSelect Sure、ＧＥヘルスケア）で精製した。
【０２１１】
ヒトＴＮＣ  ＦＢＧのシトルリン化
供給業者の取扱説明書に従って、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ２（ＰＡＤ２；ＭＱ−１６．２０１−２．５、Modiquest、オランダ）又はペプチジルアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４；ＭＱ−１６．２０３−２．５、Modiquest、オランダ）のいずれかを用いて、精製ヒトＨｉｓ−ＦＢＧをシトルリン化した。簡潔に説明すると、Ｈｉｓ−ＦＢＧを、供給された脱イミノ化バッファー（０．１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール）中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２５０μｌを１２５ｍＵのＰＡＤ２又はＰＡＤ４酵素と混ぜた後に３７℃で２時間インキュベーションした。シトルリン化は、酵素処理した試料のアミノ酸分析によって確認した。非シトルリン化対照タンパク質として使用するために、脱イミノ化バッファー中のＨｉｓ−ＦＢＧの分割量をＰＡＤ酵素の非存在下において３７℃で２時間インキュベーションした。シトルリン化Ｈｉｓ−ＦＢＧタンパク質及び非修飾Ｈｉｓ−ＦＢＧタンパク質を以下に記載するようにＳＰＲ実験に使用した。
【０２１２】
表面プラズモン共鳴
ＳＰＲ実験はBIAcore 3000装置で行った。抗ヒトＩｇＧ（ＧＥヘルスケア）をアミノカップリング化学を用いてＣＭ５センサーチップの表面に共有結合させた。ＲＵ単位で表した結合抗ヒトＩｇＧの量は６５００〜７０００（６．５〜７．０ｎｇ／ｍｍ２）の間で変動した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．００５％ツイーン２０）中で２５℃にて、Ｂ１２−ｈＩｇＧ４（１〜１３ｎＭ）を固定化した抗ヒトＩｇＧに結合させた。Ｈｉｓ−ＦＢＧバリアントの固定化Ｂ１２−ｈＩｇＧ４への結合もまた、２５℃でＨＢＳ−ＥＰバッファー中で測定した。流速は、固定化実験では５μｌ／分であり、動態解析では２０μｌ／分であった。センサーチップ表面は３Ｍ  ＭｇＣｌ２を用いて再生した。BIAevaluationプログラム４．１（ＧＥヘルスケア）を用いてデータを解析した。
【０２１３】
シトルリン化Ｈｉｓ−ＦＢＧに対するＢ１２−ＩｇＧ４結合の解析によって、非修飾Ｈｉｓ−ＦＢＧに対する結合について得られた値と比較した場合に、動態パラメーターは本質的に変化しなかったことが明らかになった。これらの結果は、Ｂ１２系統の抗ＦＢＧ抗体が、治療用途又は診断用途において、シトルリン化と非シトルリン化の両方の形態のＴＮＣ  ＦＢＧに結合すると予想されることを示す。
【０２１４】
【表１１】
2019507744.tif 000017
表１１  Ｂ１２−ｈＩｇＧ４とＨｉｓ−ＦＢＧバリアントの相互作用の動態パラメーター
各動態パラメーターは、３回の独立した測定の平均値±ｓ．ｄ．を表す。
【０２１５】
実施例８  免疫組織化学を用いたヒトＲＡ組織におけるＴＮＣＦＢＧの検出
抗ＦＢＧ抗体が、ヒト組織におけるヒトＴＮＣ  ＦＢＧタンパク質の内在性形態を効果的に認識するかどうかを決定するために、免疫組織化学研究を行った。テネイシン−Ｃは慢性炎症の部位で発現し、関節リウマチをもつ個人の炎症を起こした関節滑膜内に局在することは、市販の抗体を用いた免疫組織化学によって以前に示されている（Goh et al, 2010、Salter DM, 1993）。Ｂ１２抗体を、ＱＭＣＦ発現技術（Icosagen、エストニア）を用いてマウスＩｇＧ２ａフォーマットとして発現させ、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーで精製し、続いてSuperdex 200ゲルろ過を行った。完全長ヒトテネイシン−ＣのＥＧＦドメインを認識する対照マウスＩｇＧ１抗テネイシン−Ｃ抗体（クローン４Ｆ１０ＴＴ；タカラクローンテック）を陽性対照コンパレーター（comparator）として使用した。関連がない細菌抗原に対するマウスＩｇＧ１（ダコ  Ｘ０９３１）又はＩｇＧ２ａ（ダコ  Ｘ０９４３）を対照一次抗体として使用して、これらのアイソタイプによる非特異的バックグラウンド染色のレベルを測定した。診断が確定したＲＡをもつドナーからのヒト膝関節滑膜の凍結切片（Asterand、英国）を室温に平衡化し、１：１体積／体積のアセトン／メタノール中で固定し（１０分間）、洗浄バッファーに移した。免疫染色は、製造者のプロトコールに従ってDako AutostainerをEnvision Flex試薬（ダコ  Ｋ８０１０）と共に用いて行った。簡潔に説明すると、固定した組織スライドを自動染色装置上に置き、ブロック（ペルオキシダーゼブロック、５分間；タンパク質ブロック、１０分間、ダコ  Ｘ０９０９）した後に、一次抗体（Ｂ１２又はクローン４Ｆ１０ＴＴ；１、２、又は４μｇ／  ｍｌ）を３０分間加えた。いくつかの対照では、スライドを一次抗体に曝露しなかった。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え（２０分）、スライドを再度洗浄した後、ＤＡＢ＋クロモゲンを１０分間加えた。スライドを洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、染色を顕微鏡での可視化のためにカバーガラスを被せた。
【０２１６】
アセトン／メタノールを用いて固定したＲＡ滑膜の凍結切片において、抗ＴＮＣ  ＦＢＧ  Ｂ１２マウスＩｇＧ２ａは、陽性対照抗体であるクローン４Ｆ１０ＴＴで得られたものと非常に類似した染色パターンを示した。滑膜、線維膜、血管系、及び間質内に特異的な免疫染色が観察された。リンパ球凝集体内には染色はなかった。いくつかの非特異的免疫染色が非免疫対照治療組織に存在した。これらの結果は、ＲＡ滑膜内のテネイシン−Ｃ発現に関する以前の報告を確認及び拡張するものであり、Ｂ１２が炎症部位における内在性テネイシン−Ｃに結合する有効な作用物質であることを示し、さらにＦＢＧがＲＡにおいてアクセス可能な標的であることを示す。
【０２１７】
実施例９  抗体配列
ＶＨ及びＶＬ配列のＣＤＲを囲み枠で示した。
【０２１８】
抗体Ｂ１２
【０２１９】
【化５】
2019507744.tif 000018
【０２２０】
抗体Ｂ１２＊
【０２２１】
【化６】
2019507744.tif 000019
【０２２２】
抗体  １６５  １３  Ｂ１＊（Ｂ１２由来）
【０２２３】
【化７】
2019507744.tif 000020
【０２２４】
抗体  １６５  １３  Ｂ６＊（Ｂ１２由来）
【０２２５】
【化８】
2019507744.tif 000021
【０２２６】
抗体  １６５  １３  Ｄ１（Ｂ１２由来）
【０２２７】
【化９】
2019507744.tif 000022
【０２２８】
抗体  １６５  １３  Ｃ３（Ｂ１２由来）
【０２２９】
【化１０】
2019507744.tif 000023
【０２３０】
抗体  １６５  １３  Ｃ３＊（Ｂ１２由来）
【０２３１】
【化１１】
2019507744.tif 000024
【０２３２】
抗体  １６５  １３  Ｄ４＊（Ｂ１２由来）
【０２３３】
【化１２】
2019507744.tif 000025
【０２３４】
抗体  １６５  １３  Ａ４＊（Ｂ１２由来）
【０２３５】
【化１３】
2019507744.tif 000026
【０２３６】
抗体  １６５  １３  Ｂ３＊（Ｂ１２由来）
【０２３７】
【化１４】
2019507744.tif 000027
【０２３８】
抗体  １６５  １３  Ｅ１＊（Ｂ１２由来）
【０２３９】
【化１５】
2019507744.tif 000028
【０２４０】
抗体  １８０  １１  Ｆ５＊（Ｂ１２由来）
【０２４１】
【化１６】
2019507744.tif 000029
【０２４２】
ＩｇＧ４  １６５  １３  Ｃ３（Angal 1993に記載のヒンジ改変をもつ定常領域）
【０２４３】
【化１７】
2019507744.tif 000030
【０２４４】
抗体Ｂ１２
【０２４５】
【化１８】
2019507744.tif 000031
【０２４６】
実施例１３  インビトロでのＣ３抗体の活性
モノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）が、ＴＮＣ−ＦＢＧのその受容体ＴＬＲ４への結合を乱すことによって作用することを確認するために、まずインビトロ結合アッセイをＴＬＲ４及びＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧについて開発し、次にＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧとＣ３とのをプレインキュベーションの効果を決定した。
【０２４７】
ＰＢＳ中の組換えヒトＴＬＲ４（Ｒ＆Ｄシステムズ）（１ｕｇ／ｍｌ（１４．６ｎＭ））（又はＰＢＳ単独）を９６ウェルプレートに結合させた。ブロッキング（１０％ＢＳＡ）した後、示された濃度のヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧを加えた。検出は、１ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ１  ＭＡｂ（AbD Serotec、クローン２Ｃ１１）、１ｕｇ／ｍｌの抗マウスＨＲＰ結合二次抗体（AbD Serotec、ＳＴＡＲ１３Ｂ）、及びＴＭＢ基質とインキュベーションすることによって行った。結果を図１Ａに示す。ｎ＝４の平均値及びＳＥＭが示されている。この実験は、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧがインビトロでＴＬＲ４に用量依存的に結合することを示す。
【０２４８】
図１Ｂに示されるように、モノクローナルＡｂ  Ｃ３はインビトロでＦＢＧとＴＬＲ４の結合を乱す。
【０２４９】
リン酸緩衝食塩水中の組換えヒトＴＬＲ４（又はリン酸緩衝食塩水単独）を９６ウェルプレートに結合させ、ブロッキングした後に、Ｃ３  Ｍａｂ又はアイソタイプ対照抗体とプレインキュベーションした組換えヒトＦｃ−Ｈｉｓ−ＴＮＣ−ＦＢＧ（１００ｎＭ）を加えた。検出は、タンパク質のＦｃ部分に対する抗体、抗マウスＨＲＰ結合二次抗体、及びＴＭＢ基質の一連のインキュベーションによって行った。Ｃ３とプレインキュベーションした試料の％阻害率を、アイソタイプ対照試料（ＩＣ５０＝４４．５ｎＭ）と比較して計算した。ｎ＝４。
【０２５０】
実施例１４  抗体Ｂ１２及びＣ３の抗炎症効果
抗ＴＮＣ−ＦＢＧ抗体Ｂ１２及びＣ３（１６５＿１３＿Ｃ３）は、生体系において抗炎症効果を有することが確認された。これを行うために、ヒト単球をフィコール勾配及び向流遠心分離によって末梢血（London blood bank）から単離した。次いで単球を１００ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ（ペプロテック）で５日間分化させてＭ２マクロファージを得た。
【０２５１】
図２Ａの結果に示されるように、組換えヒトＦｃ−ＴＮＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）又はＬＰＳ（Enzo）（１ｎｇ  ／ｍｌ）を室温で３０分間、ＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２、及び０．０４ｕＭ）又はアイソタイプ対照（Eureka）ＭＡｂ（１ｕＭ）とプレインキュベーションした後に、ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で加えた。２４時間後に上清を採取し、ＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＴＮＦサイトカインＥＬＩＳＡ（ＢＤバイオサイエンス）に供した。ｎ＝３。これらの結果は、１ｕＭ  Ｃ３がＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したヒトＭ２マクロファージによる炎症誘発性サイトカイン放出を大きく減少させることを示し、この減少はＩＬ−８及びＴＮＦの両方において統計的に有意である。予想通り、Ｃ３はＬＰＳ誘導サイトカイン放出に影響を及ぼさない。
【０２５２】
図２Ｂは、組換えマウスＦｃ−ＴＮＣ  ＦＢＧ（１ｕＭ）を室温で３０分間、ＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２、及び０．０４ｕＭ）又はアイソタイプ対照（Eureka）ＭＡｂ（１ｕＭ）とプレインキュベーションした後に、ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で加えた実験の結果を示す。２４時間後に上清を採取し、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ｎ＝３以上、平均値及びＳＥＭが示される。やはり、１ｕＭのＣ３は、マクロファージによるマウスＦｃ−ＴＮＣ−ＦＢＧ誘導サイトカイン放出を大きく減少させた。この減少は抗体の良好な異種間反応性を示している。
【０２５３】
ＦＢＧ誘導サイトカイン放出がタンパク質のＦｃ部分よりもむしろＦＢＧによって誘導されたことを確認するために、Ｆｃ部分が不活性になるように変異したタンパク質（Ｆｃ−Ｍｕｔ−ＦＢＧ）を用いた。抗ＴＮＣ−ＦＢＧ抗体、Ｂ１２、Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）、及びＡ４（１６０＿０１＿Ａ４）も、この分子に対する活性について試験した。Ｆｃ−Ｍｕｔ−ＦＢＧ（１ｕＭ）及びＣ３、Ａ４又はＢ１２（１ｕＭ）をＲＴで３０分間プレインキュベートした後に、ヒトＭ２マクロファージ培養物に加えた。２４時間後に上清を採取し、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ｎ＝３、平均値及びＳＥＭが示される。結果を図２Ｃに示す。この実験によって、Ｆｃ−Ｈｉｓ−ＦＢＧ誘導サイトカイン合成は、Ｆｃ受容体を通したＦｃ部分のシグナル伝達によるものではないことが裏付けられた。さらに、関連する抗体Ｂ１２及びＡ４並びにＣ３のプレインキュベーションは、ヒトＭ２マクロファージによるＦＢＧ誘導サイトカイン放出を大きく減少させることが示される。
【０２５４】
図３Ａは、モノクローナル抗体Ｂ１２が、ヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激された初代ヒトマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生を減少させることを示す。この実験では、組換えヒトテネイシン−Ｃ  ＦＢＧ（１ｕＭ）を、ＭＡｂ  Ｂ１２（１、０．１、０．０１  、又は０．００１ｕＭ）又はアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と室温で３０分間プレインキュベートした後に、ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で加えた。２４時間後に上清を採取し、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ｎ＝１。ここでもやはり、Ｂ１２抗体プレインキュベーションはＦＢＧ誘導サイトカイン放出を減少させることがわかり、このドナーではＩＬ−８によって最小の応答が得られる。
【０２５５】
図３Ｂは、実験室規模又はそれより大きい規模で作られたモノクローナル抗体Ｃ３が、初代ヒトマクロファージによるＦＢＧ誘導サイトカイン合成の遮断において同じレベルの有効性を示すことを示す。
【０２５６】
Ｃ３抗体を動物実験に取り入れるため、ＩｇＧ４  Ｂ１２  １６５−１３−Ｃ３産物を、大手受託製造組織（leading contract manufacturing organisation）において商業的ＧＳ−ＣＨＯ発現を利用してクローニング、発現、及び精製した。重鎖及び軽鎖の可変領域のｃＤＮＡをＣＨＯ発現用に最適化し、ライフテクノロジーズで（市販のシグナル配列を用いて）合成した後に、発現ベクターにクローニングした。ＣＨＯ細胞をプールとしてトランスフェクションし、発現が最も高いプールを大規模振とうフラスコ生産（２２Ｌ−１１×５Ｌ振盪フラスコ中で２Ｌ）に進めた。専有のフィードを４日目及び８日目に与えた後、１２日目に培養物を回収した。材料を遠心分離した後、深層ろ過及びろ過滅菌した。タンジェンシャルフローろ過（３０ｋＤａ分子量カットオフ）を用いて材料の約５．５倍の濃縮を実施し、得られた濃縮物を再度ろ過滅菌した後にMabSelect SuRe精製を行った。生成物を溶出し、生成物を中和し、次いで２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で約１１ｍｇ／ｍＬに濃縮／透析ろ過した。サイズ排除ＨＰＬＣを伴った還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、純度が高く、単量体が９８％を超える物質を示した。エンドトキシンは１ｍｇあたりＯ．１Ｅｕ未満であった。
【０２５７】
この実験では、より大きな規模の抗体バッチの効力を、現在のより小さい規模のバッチと比較した。組換えヒトテネイシン−Ｃ  ＦＢＧ（１ｕＭ）を室温で３０分間、ＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２、及び０．０４ｕＭ）又はアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）とプレインキュベーションした後に、ヒトＭ２マクロファージ培養物に３連で加えた。２４時間後に上清を採取し、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ｎ＝１、Ｉｃｏ＝実験室規模  Ｌｏｎ＝より大きな規模の材料。この実験は、抗体の両バッチがＦＢＧ誘導サイトカイン合成の減少において同等の効力を示すことを示し、すなわち結果は生産量に関係なく一貫している。
【０２５８】
実施例１５  モノクローナル抗体Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）は、ヒトＴＮＣ−ＦＢＧで刺激したＲＡ滑膜線維芽細胞による炎症誘発性サイトカインの産生を減少させる
滑膜線維芽細胞は、ＲＡにおいて炎症誘発性サイトカイン放出の重要な源でありうることが報告されている（R Bucala et al. (1991) Constitutive Production of Mitogenic and Inflammatory Cytokines by Rheumatoid Synovial Fibroblasts. J. Exp. Med. 173:569-574）ので、Ｃ３抗体がやはり、ＦＢＧ誘導サイトカイン放出に対してマクロファージにおける効果と同様の効果を示すかどうかを試験した。
【０２５９】
ヒトＲＡ線維芽細胞は、０．５ｍｇ／ｍｌリベラーゼ（Liberase）（ロシュ）及び０．２ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（ロシュ）を含むＲＰＭＩ（ロンザ）中で組織を消化し、３７℃で１〜１．５時間インキュベートすることによってドナーＲＡ滑膜組織から生じさせた。結果として得られた組織をピペットで２００μｍのナイロンメッシュに通し、メッシュを通過しなかった材料を、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ）を含むＲＰＭＩを含有するペトリ皿に入れ、３７℃で５日間ンキュベーションした。５日後、滑膜線維芽細胞が組織から生じ、残った組織をＲＡ滑膜線維芽細胞（ＲＡＳＦ）培養から取り除いた後、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ロンザ）中で維持した。この実験に向けてＲＡＳＦを１×１０４細胞／ウェルで播いた。組換えヒトＴＮＣ−ＦＢＧ（１ｕＭ）を、ＭＡｂ  Ｃ３（１、０．２、及び０．０４ｕＭ）又はアイソタイプ対照ＭＡｂ（１ｕＭ）と室温で３０分間プレインキュベーションした後に、滑膜線維芽細胞培養に３連で加えた。２４時間後に上清を採取し、サイトカインＥＬＩＳＡに供した。ｎ＝１、平均値及びＳＥＭが示される（図４を参照されたい）。
【０２６０】
これらの結果は、Ｃ３が、ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＦＢＧ誘導炎症誘発性サイトカイン放出（ＩＬ−８及びＩＬ−６の両方）を減少させるように作用することを示し、この作用が、炎症を起こしたＲＡ関節に見られる複数の細胞型における有望な機構であることを示している。
【０２６１】
実施例１６  ラットモデルにおけるテネイシン−Ｃのレベル
マウスＣＩＡ（コラーゲン誘導関節炎）モデル及びラットＣＩＡモデルの両方におけるテネイシン−Ｃの発現が確認され、疾患活性が臨床スコアと相関することが示された。
【０２６２】
図５は、２回の別個のＣＩＡ試験（ＫＷＳ）の終了時に、ラットの足からの滑液ウォッシュアウト中のテネイシンＣのレベルを測定する実験の結果を示す。テネイシン−ＣレベルはＥＬＩＳＡ（IBL、ｌａｒｇｅ（ＦＮ  ＩＩＩ−Ｂ）キット）によって測定した。測定したＴＮＣレベルを、ＫＷＳで指定されたその足と関連する臨床スコアと相関付けた。この実験は、足の臨床スコアが高いほど、その足からの滑液に見られるＴＮＣのレベルが高いことを示す。これは、ラットＣＩＡモデルがＣ３抗体を試験するのに良いモデルであることを示す。
【０２６３】
実施例１７  コラーゲン誘導関節炎のラットモデルにおけるＣ３抗体の評価
ＩｇＧ４  Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）を標準的なラットコラーゲン誘導関節炎モデルにおける治療活性（therapeutic activity）について試験した。成体雄Ｌｅｗｉｓラットを無作為に実験群に割り当て、１週間順化させた。０日目に、動物に下背部での皮内注射によって、不完全フロイントアジュバント（ＣＩＩ／ＩＦＡ）中のＩＩ型ウシコラーゲンの１ｍｇ／ｍｌエマルションを５００μｌ投与した。７日目に、動物はＣＩＩ／ＩＦＡの２回目の注射を受けた。注射はガス（イソフルラン）麻酔下で行った。表１２で下記に示す投与スケジュールに従って治療を施した。
【０２６４】
【表１２】
2019507744.tif 000032
【０２６５】
７日目から実験終了まで、週に３回、治療の内容を知らされていない実験者が関節炎の臨床徴候について動物を点数化した。０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目には、治療の内容を知らされていない実験者が、プレチスモメーターを用いて足容積を測定した。
結果
【０２６６】
非特異的な臨床所見
０日目から実験終了まで、毎日、異常な姿勢（背中を丸くして前かがみになった姿勢）、異常な被毛の状態（立毛）、及び異常な活動レベル（活動の減少又は増加）を含む非特異的な臨床徴候について動物をチェックした。第６群の１匹の動物（ＩＤ＃６．９、抗体１０ｍｇ／ｋｇ治療）は、２１日目のイソフルラン麻酔から回復しなかった。動物は、異常な姿勢、異常な被毛の状態、及び異常な活動レベルなどのいかなる非特異的な臨床徴候も示さなかった。関節炎の臨床症状が重症であったために、第１群の１匹の動物（ＩＤ＃１．１０、媒体治療）を実験終了に先立ち、２２日目に処分した。
【０２６７】
臨床スコア
７日目から実験終了まで、週に３回、前肢及び後肢の腫脹を含む関節炎の臨床徴候について動物を点数化した。
実験者には治療の内容をわからないようにした。各肢を５段階で点数化した：（０）腫脹がない、（１）わずかな腫脹及び／又は紅斑、（２）軽度の腫脹、（３）中等度の腫脹、並びに（４）重度の腫脹及び／又は関節硬直。各肢のスコアを足すことによって各動物の臨床的スコアを計算した。図６に示されるデータをグラフ化し（各実験群の平均±ＳＥＭ）、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて実験群間の多重比較のためのダネットの事後検定により分析した。媒体治療動物＃１．１０の最後に記録したスコアは２２日目の後に使用した。動物＃６．９から記録したデータは解析から除外した。媒体治療群の臨床スコアは、７日目に測定した臨床スコアと比較して、１７日目から２８日目の実験終了まで、有意に増加した（ｐ＜０．０００１）。対照ＩｇＧ４及びＩｇＧ４  Ｃ３  １ｍｇ／ｍＬ投与群は、７日目と２８日目の実験終了の間、媒体治療群と比較した場合に、いかなる有意差も誘導しなかった。３ｍｇ／ｋｇで投与したＩｇＧ４  Ｃ３は、２４日目において、媒体治療群と比較した場合に、臨床スコアの有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０１）。１０ｍｇ／ｋｇで投与したＩｇＧ４  Ｃ３は、２２日目から２８日目の実験終了まで、媒体治療群と比較した場合に、臨床スコアの有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０１）。
【０２６８】
足容積
０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に、プレチスモメーター（水置換装置）を用いて後肢容積を測定した。測定はガス（イソフルラン）麻酔下で行った。
実験者には治療の内容をわからないようにした。各実験日の各動物の右及び左後肢容積を平均した。図７はグラフ化したデータを示す（各実験群の平均±ＳＥＭ）。データを、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて実験群間の多重比較のためのダネットの事後検定によって分析した。媒体治療動物＃１．１０の最後に記録した値は２８日目に使用した。動物＃６．９から記録したデータは分析から除外した。媒体治療群で測定された足容積は、０日目に測定された足容積と比較して、１４日目から２８日目の実験終了まで、有意に増加した（１４日目でｐ＜０．０１、２１日目及び２８日目でｐ＜０．０００１）。対照ＩｇＧ４及び１ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧ４  Ｃ３投与群は、０日目と２８日目の間、媒体治療群と比較した場合に、後肢容積にいかなる有意差も誘導しなかった。３ｍｇ／ｋｇで投与したＩｇＧ４  Ｃ３は、２８日目において、媒体治療群と比較した場合に、後肢容積の有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０１）。１０ｍｇ／ｋｇで投与したＩｇＧ４  Ｃ３は、２１日目（ｐ＜０．０５）及び２８日目（ｐ＜０．０１）において、媒体治療群と比較した場合に、後肢体積の有意な減少を引き起こした。
【０２６９】
結論
試験抗体、ＩｇＧ４  Ｃ３（１６５＿１３＿Ｃ３）は、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで投与した場合に、臨床徴候の重症度を有意に減少させた。
【０２７０】
実施例１８  インビボ試験のためのプロトコール
無作為に実験群に割り当て、１週間順化させた成体雄Ｌｅｗｉｓラットを使用する。０日目に、動物に下背部での皮内注射によって、不完全フロイントアジュバント（ＣＩＩ／ＩＦＡ）中のＩＩ型ウシコラーゲンの１ｍｇ／ｍｌエマルションを５００μｌ投与する。７日目に、動物はＣＩＩ／ＩＦＡの２回目の注射を受ける。注射はガス（イソフルラン）麻酔下で行う。下記の投与スケジュールに従って治療を施す。０日目から実験の終了まで、週に３回、動物を体重測定することになる。７日目から実験の終了まで、週に３回、治療の内容を知らされていない実験者が関節炎の臨床徴候について動物を点数化する。０日目、１４日目、２１日目、及び２８日目には、治療の内容を知らされていない実験者がプレチスモメーターを用いて足容積を測定する。
【０２７１】
治療群及び投与量
治療群及び投与量を表１３にまとめる。試験化合物用媒体は０．９％塩化ナトリウム溶液（生理食塩水）であった。静脈内注射の投与量は５ｍｌ／ｋｇであった。群はすべてｎ＝１０である。
【０２７２】
【表１３】
2019507744.tif 000033
【０２７３】
臨床スコア
７日目から実験終了まで、週に３回、前肢及び後肢の腫脹を含む関節炎の臨床徴候について動物を点数化する。
実験者には治療の内容をわからないようにする。各肢を５段階で点数化する：（０）腫脹がない、（１）わずかな腫脹及び／又は紅斑、（２）軽度の腫脹、（３）中等度の腫脹、並びに（４）重度の腫脹及び／又は関節硬直。各肢のスコアを足すことによって各動物の臨床的スコアを計算する。
【０２７４】
このモデルにおいて、対照であるメトトレキセートは臨床系減少させる。Ｃ３抗体は臨床系を減少させ、Ｃ３＊抗体はこのモデルでＣ３と同じ又はそれより大きい活性を示す。
【０２７５】
実施例１９  Ｃ３及びＣ３＊抗体ヒト及びマウスＴＮＣＦＢＧ並びにヒトＴＮＲ  ＦＢＧのビアコア分析
動態アッセイ：ヒト及びマウスＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ並びにヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧのＮＳＣＴ抗体に対する結合の特性評価
【０２７６】
１６５＿１３＿Ｃ３＊になされた生殖系列変化が１６５＿１３＿Ｃ３の親和性又は特異性を保持しているかどうかを試験するためにＳＰＲ実験を行った。ＳＰＲ実験は、ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９）のプロトコールに従って、BIAcore T200装置（ＧＥヘルスケア）を用いて行った。
【０２７７】
動態アッセイでは、〜１，５００〜１，９００レスポンスユニット（ＲＵ）の抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９）を、アミンカップリングキットプロトコール（ＧＥ、ＢＲ−１０００−５０）に従ってＥＤＣ／ＮＨＳ架橋結合化学を用いて、Series  S CM5センサーチップ（ＢＲ−１００５−３０）上のすべてのフローセル（ＦＣｌ−４）に固定化した。精製ＮＳＣＴ抗体を３．５ｎＭの濃度にＨＢＳ−Ｐ＋（Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）ランニングバッファーで希釈し、ＦＣ２及びＦＣ４に（１０μＬ／分の流速及び１１５秒の添加時間で）２５℃にて注入した。抗体捕捉レベルは、典型的には７０ＲＵ（ＴＮＲ相互作用の場合）から９０ＲＵ（ＴＮＣ相互作用の場合）の範囲であった。
【０２７８】
ＨＢＳ−Ｐ＋中の１：１希釈系列の抗原（３０ｎＭのヒト及びマウスＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ並びに４８０ｎＭのヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）を、リファレンスフローセル（それぞれＦＣ１及びＦＣ３）及び抗体捕捉フローセル（それぞれＦＣ２及びＦＣ４）を介した流路を用いて３０μｌ／分の流速で注入した。結合領域及び解離領域は、ヒト及びマウスのＴＮＣ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧについてはそれぞれ３．５及び３０分間にわたって、ヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧについては２及び８分間にわたって測定した。ヒト及びマウスＴＮＣ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧとの相互作用解析では、３μＭのＭｇＣｌ２を６０秒間注入することによって、各抗原注入後の遊離捕獲抗体表面を再生させ、各試料注入ごとに新鮮なＮＳＣＴ抗体を捕捉した。各注入の前の５０％ＤＭＳＯを用いた追加の針洗浄工程によって、抗原のキャリーオーバーを妨げた。より生理学的に関連した温度である３７℃にて実験を実施した。
【０２７９】
動態パラメーターは、BIAcore T200 Evaluationソフトウェア  バージョン２．０を使用して、リファレンスセルの差し引きをすること及びセンサーグラム実験データを１：１相互作用モデルに当てはめることによって決定した。結論：１６５＿１３＿Ｃ３及び１６５＿１３＿Ｃ３＊は、試験したＴＮＣ  ＦＢＧ及びＴＮＲ  ＦＢＧタンパク質に対して同等の結合を示す。
【０２８０】
【表１４】
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表１４  ３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法よって測定した最初のタンパク質試料の動態結合データ
ＫＤ、平衡定数（Ｍ）；Ｔ  Ｒｍａｘ、レスポンスユニット（ＲＵ）におけるリガンドの理論的最大結合レベル；ＳＡ、パーセント（％）単位の界面活性（surface activity）；ｋａ、結合定数（１／Ｍｓ）；ｋｄ、解離定数（１／ｓ）；Ｃｈｉ２、値はあてはまりの近さ（closeness of fit）の統計的尺度である（典型的には＜２）。Ｕ値はパラメーターの有意性のさらなる指標である。これは、選択された変数間の相関性のある変化に対するあてはめの依存性を検定することによって決定される、計算された速度定数とＲｍａｘの一意性を表すパラメーターである。値が低いほど、結果の信頼度が高いことを示す。高い値（約１０超）は、報告された動態定数が有用な情報を含まないことを示す。
【０２８１】
実施例２０  ＣＨＯプール振とう（pool shake）フラスコ生産における１６５＿１３＿Ｃ３及び１６５＿１３＿Ｃ３＊の発現
１６５＿１３＿Ｃ３及び１６５＿１３＿Ｃ３＊を、ヒンジ改変ＩｇＧ４重鎖定常領域をもつＧＳ−ＣＨＯ発現ベクターにクローニングした。
実施例１４に記載したように、細胞株を生成し、材料を発現させ、精製した。濃縮及びアフィニティー精製前の細胞培養上清の抗体価データを表１５に示す。ＩｇＧ４  １６５＿１３＿Ｃ３＊の発現は、ＩｇＧ４  １６５＿１３＿Ｃ３と比べて３倍を超えて高かった。
【０２８２】
【表１５】
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表１５：生産終了時の細胞培養上清の力価
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月31日(2018.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２３に示されるＶＬ配列を含むテネイシンＣのＦＢＧドメインに特異的なヒト抗体又は結合断片であって、前記抗体が、配列番号３のＣＤＲＨ１、配列番号４のＣＤＲＨ２、並びに配列番号５、１２、１４、１６、１８、２０、２４、２６、２８、３０、及び３２のＣＤＲＨ３をもつＶＨを含むヒト抗体又は結合断片。
【請求項２】
軽鎖が配列番号２２に示される配列を含み、配列番号３のＣＤＲＨ１、配列番号４のＣＤＲＨ２、及び配列番号１８のＣＤＲＨ３をもつＶＨを含む請求項１に記載のテネイシンに特異的な（例えばテネイシンＣに特異的な）抗体又は結合断片。
【請求項３】
配列番号６、１３、１５、１７、１９、２１、２５、２７、２９、３１、３３、又は３５から選択されるＶＨ及びそのバリアントを含み、前記配列の最大で５個のアミノ酸が変更される請求項１に記載の抗体又は結合断片。
【請求項４】
配列番号１９のＶＨを含む請求項３に記載の抗体又は結合断片。
【請求項５】
Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
【請求項６】
完全長抗体である請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片。
【請求項７】
前記軽鎖が配列番号１に示される配列を有する請求項６に記載の抗体又は結合断片。
【請求項８】
前記重鎖が配列番号２に示される配列を有する請求項６又は７に記載の抗体又は結合断片。
【請求項９】
前記重鎖が配列番号３４に示される配列を有する請求項１〜７に記載の抗体又は結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片及び薬理学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、又は担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
治療に使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記使用が、炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患の前記治療のためのものである請求項１１に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１３】
前記炎症性疾患が、例えば、急性播種性脳脊髄炎（ａｄｅｍ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎不全、副腎皮質ホルモン過剰症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、シュトリュンペル・マリー病、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ａｐｓ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、カナール・スミス症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫性多腺性症候群（１型、２型、及び３型）、自己免疫性網膜症（ＡＲ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性／ニューロンニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性耳状炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、食細胞性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡（ＣＰ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症、クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、糖尿病、１型、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮水疱症（ＥＢ）及び後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的自己免疫性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎（非増殖性：限局性分節性糸球体硬化症及び膜性糸球体腎炎、増殖性：ＩｇＡ腎症）、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎（ＧＰＡ）を伴う肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚軸索型ニューロパシー、急性汎自律神経障害、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症（ＩＧＡＮ）、バージャー病、咽頭炎併発糸球体腎炎、ＩｇＡ天疱瘡、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節不妊症、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病、間質性膀胱炎、アイザックス症候群、ニューロミオトニア、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球梗塞性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ皮膚病（ＬＡＤ）、類天疱瘡、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、単クローン性ガンマグロブリン血症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、ニューロミオトニア、アイザックス症候群（後天性、腫瘍随伴性、遺伝性）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、睾丸炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性神経精神障害）、腫瘍随伴性自己免疫性多臓器症候群（ＰＡＭＳ）、腫瘍随伴性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡（ＰＮＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎原発性胆汁性肝硬変、アノー症候群、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性巣状脳炎（ＣＦＥ）、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症（ＲＡＲ）、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群／スティッフマン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファー血管炎、小水疱水疱性皮膚病、並びに白斑ウェゲナー肉芽腫症（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含む群から選択される自己免疫疾患である請求項１２に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１４】
前記炎症性疾患が、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、１型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン・バレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低塩酸症、並びにがん、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、並びにがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにそれらの転移形態を含む群から選択される請求項１２に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１５】
前記炎症性疾患が関節リウマチである請求項１３に記載の使用のための抗体、結合断片、又は組成物。
【請求項１６】
炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患の前記治療用の薬剤の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体、結合断片又は請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記炎症性疾患は、例えば、急性播種性脳脊髄炎（ａｄｅｍ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、副腎不全、副腎皮質ホルモン過剰症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、脊椎関節炎、シュトリュンペル・マリー病、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ａｐｓ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、カナール・スミス症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、自己免疫性多腺性症候群（１型、２型、及び３型）、自己免疫性網膜症（ＡＲ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性／ニューロンニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性耳状炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、食細胞性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡（ＣＰ）、クローン病、炎症性腸疾患、大腸炎、腸炎、回腸炎、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症、クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、デューリング病、皮膚筋炎、糖尿病、１型、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、ドレスラー症候群、子宮内膜症、表皮水疱症（ＥＢ）及び後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、好酸球性胃腸炎、食道炎、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、結節性紅斑、実験的自己免疫性脳脊髄炎、エヴァンズ症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎（非増殖性：限局性分節性糸球体硬化症及び膜性糸球体腎炎、増殖性：ＩｇＡ腎症）、グッドパスチャー症候群、多発性血管炎（ＧＰＡ）を伴う肉芽腫症（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、急性運動性軸索型ニューロパシー、急性運動感覚軸索型ニューロパシー、急性汎自律神経障害、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症（ＩＧＡＮ）、バージャー病、咽頭炎併発糸球体腎炎、ＩｇＡ天疱瘡、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節不妊症、封入体筋炎、インスリン依存型糖尿病、間質性膀胱炎、アイザックス症候群、ニューロミオトニア、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球梗塞性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ皮膚病（ＬＡＤ）、類天疱瘡、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、単クローン性ガンマグロブリン血症、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、ニューロミオトニア、アイザックス症候群（後天性、腫瘍随伴性、遺伝性）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、卵巣炎、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、睾丸炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性神経精神障害）、腫瘍随伴性自己免疫性多臓器症候群（ＰＡＭＳ）、腫瘍随伴性小脳変性症、腫瘍随伴性天疱瘡（ＰＮＰ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、落葉状天疱瘡（ＰＦ）、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎原発性胆汁性肝硬変、アノー症候群、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、慢性巣状脳炎（ＣＦＥ）、レイノー現象、反応性関節炎、ライター症候群、リカバリン関連網膜症（ＲＡＲ）、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、全身性強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群／スティッフマン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎、バージャー病、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ・ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファー血管炎、小水疱水疱性皮膚病、並びに白斑ウェゲナー肉芽腫症（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含む群から選択される自己免疫疾患である請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記炎症性疾患が、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、１型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン・バレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋梗塞及びアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎、低塩酸症、並びにがん、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎臓がん、並びにがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、黒色腫、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤絨毛がん、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにそれらの転移形態を含む群から選択される請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記炎症性疾患が関節リウマチである請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
治療有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体若しくは結合断片又は請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含む治療方法。
【請求項２１】
前記治療が関節リウマチなどの炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患のためのものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体又は結合断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４】
請求項２２のポリヌクレオチド又は請求項２３のベクターを含む宿主細胞。
【国際調査報告】
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