(57)【要約】  本発明は神経疾患の治療での使用のための組成物に関する。一実施形態において、本発明は、神経障害の治療での使用のためのｘｅｎｉｎまたは胃抑制ポリペプチドのペプチド類似体に関する。神経疾患の治療の方法、および神経障害を治療するための薬物の製造における本発明によるペプチド類似体の使用も開示される。【選択図】図１
2019512471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経障害の治療での使用のためのｘｅｎｉｎペプチド類似体。
【請求項２】
前記ペプチド類似体がｘｅｎｉｎと少なくとも１つのアミノ酸置換または修飾とを含む、請求項１に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項３】
前記少なくとも１つのアミノ酸修飾がＣ−８オクタノイル基、Ｃ−１０デカノイル基、Ｃ−１２ラウロイル基、Ｃ−１４ミリストイル基、Ｃ−１６パルミトイル基、Ｃ−１８ステアロイル基、およびＣ−２０アシル基を含む群から選択される脂肪酸の付加を含む、請求項２に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項４】
前記少なくとも１つのアミノ酸修飾がＣ−１６パルミトイル基の付加を含む、請求項２または３に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項５】
前記または各脂肪酸がリジン残基で結合される、請求項３または４に記載の使用のためのパプチド類似体。
【請求項６】
前記ペプチド類似体がｘｅｎｉｎと前記ペプチド類似体の１３位にてリジン残基で結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項７】
神経障害の治療での使用のための、胃抑制ポリペプチドのペプチド類似体、またはそのフラグメント。
【請求項８】
前記ペプチド類似体が胃抑制ポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸置換または修飾とを含む、請求項７に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアミノ酸修飾がアミノ酸残基のアシル化を含む、請求項８に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアミノ酸修飾が前記ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基のアセチル化を含む、請求項８または９に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１１】
前記ペプチド類似体がＣ−８オクタノイル基、Ｃ−１０デカノイル基、Ｃ−１２ラウロイル基、Ｃ−１４ミリストイル基、Ｃ−１６パルミトイル基、Ｃ−１８ステアロイル基、およびＣ−２０アシル基を含む群から選択される脂肪酸の付加を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含む、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのアミノ酸修飾がＣ−１６パルミトイル基の付加を含む、請求項１１に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１３】
前記または各脂肪酸がリジン基に結合される、請求項１１または１２に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１４】
前記または各脂肪酸がリジン残基のα−アミノ基またはε−アミノ基に結合される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１５】
前記ペプチド類似体が前記ペプチド類似体の３７位でリジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基を含む、請求項１３または１４に記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１６】
前記ペプチド類似体が一般式ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈのポリマー部分の結合を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含み、ｎが１と２２の間の整数である、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのペプチド類似体。
【請求項１７】
神経障害の治療での使用のための組成物であって、ｘｅｎｉｎのペプチド類似体または胃抑制ポリペプチドのペプチド類似体、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項１８】
使用が前記ペプチド類似体または前記組成物の薬学的に有効な量の投与を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド類似体、または請求項１７に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
使用が０．２５〜２５．００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の前記ペプチド類似体または同等の量の前記組成物の投与を含む、請求項１８に記載の使用のためのペプチド類似体または組成物。
【請求項２０】
前記神経障害が認知機能に影響を及ぼす障害；および機能障害性認知過程の群から選択される障害である、請求項１〜１６、１８および１９のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド類似体、または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記神経障害が神経変性疾患である、請求項１〜１６、１８および１９のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド類似体、または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
前記神経障害がアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１〜１６、１８および１９のいずれか１項に記載の使用のためのペプチド類似体、または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、現在、世界的に４４００万人に影響を及ぼす脳の慢性変性疾患であり、３．２秒毎に新しい症例が診断されている。この疾患は、アミロイドβプラークの蓄積、著しい神経炎症、シナプスの構造と機能の劣化と認知機能低下によって特徴づけられる神経変性状態である。疾患および認知症の他の型の発生率は著しく増加し続け、２０５０年までに全世界で約１億の人々が影響を受けると予想される。
【背景技術】
【０００２】
医学雑誌、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙに掲載された最近の研究は、ＡＤを米国における主な死因の第３位に置いており、この疾患のグローバルコストは世界のＧＤＰの１％（６０５０億米ドル）と推定される。
【０００３】
ＡＤの治療法の開発は遅いことで知られており、わずかに５種類の薬物が現在市販されているが、それらは症状緩和をもたらすだけである。ＡＤの治療法は現在これらの５種類の薬物に限定されており、それらは２つの異なるクラス（コリンエステラーゼ阻害薬とＮＭＤＡ受容体拮抗薬）に由来する。ＡＤの複雑な多因子的病態生理は、現在市販されている薬物でさえ限定的で一貫性のない効力を有することを意味する。ドネペジルなどのコリンエステラーゼ阻害薬は症状緩和をもたらすだけであり、軽度認知障害（ＭＣＩ）患者での臨床試験は、コリンエステラーゼ阻害薬がＡＤへの進行を停止することができないことを示した。
【０００４】
アミロイドカスケード仮説の予測に基づく治療法の開発を目標とする臨床試験もほとんど失敗に終わっている。アミロイド−β（Ａβ）免疫化は、Ａβのミクログリア食作用を活性化する、または毒性Ａβオリゴマーを直接中和すると考えられており、前臨床モデルにおいて、アミロイドプラークの成長を低下させるか、または防止する。臨床試験はしかし、能動免疫化または受動免疫化がＡＤ患者における限定された治療効果を有し、および有害な副作用をもたらし得ることも示唆している。
【０００５】
Ａβを取り除くために免疫療法は免疫系を強化する一方で、神経炎症がＡＤの病態生理に寄与することはよく知られている。したがって、免疫系の抑制は、ＡＤの代替治療手段と考えられていた。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用がＡＤを発症する可能性を有意に低下させることが観察されてきたが、しかしＮＳＡＩＤの使用とＡＤリスクとの関係の正確な本質についての議論が進行中であり、観察的かつ縦断的な集団ベースの研究は防御効果を示唆し続けているが、ＡＤ患者における処置としてＮＳＡＩＤを検査するランダム化比較試験はほとんど成功していない。
【０００６】
γセクレターゼの阻害剤は、ＡＤの認知障害マウスモデルにおける記憶機能の修復とともに、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏでＡＰＰプロセシングに影響しかつＡβ産生を減少させることが示されている。しかし、ＡＤ患者においてγセクレターゼ阻害剤を検査するいくつかの臨床試験は、重篤な有害作用のため、示された限定的な有効性のためのいずれか、または両方の理由から停止されている。同様に、βセクレターゼの阻害は前臨床モデルにおいてＡＤ症状の調節因子としての有望性を示すが、βセクレターゼ阻害剤についての臨床試験の成功は比較的まれである。いずれにせよ、βおよびγセクレターゼ酵素は、ＣＮＳの通常の生理的機能に必須であり、およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、多数のセクレターゼ基質のうちのほんの１つであり、これらの酵素がいくつかの重要な生理的役割を有することは明らかである。これは、セクレターゼ阻害剤の臨床試験の期待はずれの結果を説明し得る。これらの臨床試験において示された重篤な有害作用および限られた有効性は、βおよびγセクレターゼ阻害剤が限られた臨床適応を有し得ることを示唆する。Ａβ産生がセクレターゼ酵素の調節を通して中枢神経系で抑制され得ることを示すエビデンスがあるが、βおよびγセクレターゼを阻害することは実行可能な治療手段でないかもしれない。
【０００７】
総合すると、既存の療法は対症療法を提供するだけであり、開発中の有望な薬物は少ない。このように、この破壊的な疾患を防止するために、疾患修飾性能力および差別化された作用機構を有する新しい療法の開発について明らかに満たされていないニーズがある。
【０００８】
生物学的ペプチドは、小分子および／または生物に比べてそれらの数多い利点、例えば、高効力、低毒性、高特異性、臓器蓄積および薬物相互作用の低リスクのために、多数の治療指標について現在開発されている最も魅力的な新進候補の１つである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、神経障害の治療での使用のためのｘｅｎｉｎのペプチド類似体が提供される。
【００１０】
任意選択で、ペプチド類似体は、ヒトｘｅｎｉｎのペプチド類似体である。
【００１１】
任意選択で、ペプチド類似体は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ２３９０７を有するｘｅｎｉｎの類似体である。
【００１２】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＢ２３９０７．１を有するｘｅｎｉｎの類似体である。
【００１３】
任意選択で、ペプチド類似体は、アミノ酸配列ＭＬＴＫＦＥＴＫＳＡＲＶＫＧＬＳＦＨＰＫＲＰＷＩＬを有するｘｅｎｉｎの類似体である。
【００１４】
任意選択で、ペプチド類似体は、ｘｅｎｉｎおよび少なくとも１つのアミノ酸置換または修飾を含む。
【００１５】
任意選択で、ペプチド類似体は、ｘｅｎｉｎおよび少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００１６】
任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、Ｃ−８オクタノイル基、Ｃ−１０デカノイル基、Ｃ−１２ラウロイル基、Ｃ−１４ミリストイル基、Ｃ−１６パルミトイル基、Ｃ−１８ステアロイル基およびＣ−２０アシル基を含む群から選択される脂肪酸の付加を含む。
【００１７】
さらに任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、Ｃ−１６パルミトイル基の付加を含む。
【００１８】
任意選択で、ペプチド類似体は、ｘｅｎｉｎおよびＣ−１６パルミトイル基を含む。
【００１９】
任意選択で、この脂肪酸または各脂肪酸は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基に隣接してもしくはこの残基で結合される、ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸残基に隣接してもしくはこの残基で結合される、またはペプチド類似体のアミノ酸配列の任意の他のアミノ酸残基で結合される。
【００２０】
任意選択で、この脂肪酸または各脂肪酸は、リジン残基で結合される。
【００２１】
さらに任意選択で、この脂肪酸または各脂肪酸は、リジン残基のαアミノ基またはεアミノ基で結合される。
【００２２】
任意選択で、ペプチド類似体はｘｅｎｉｎと、リジン残基で結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。
【００２３】
さらに任意選択で、ペプチド類似体はｘｅｎｉｎと、ペプチド類似体の１３位にてリジン残基で結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。
【００２４】
本発明の第２の態様によれば、神経障害の治療での使用のための、胃抑制ポリペプチドのペプチド類似体、またはそのフラグメントが提供される。
【００２５】
任意選択で、ペプチド類似体は、ヒト胃抑制ポリペプチドのペプチド類似体、またはそのフラグメントである。
【００２６】
任意選択で、ペプチド類似体は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ８８０４３またはそのフラグメントを有する胃抑制ポリペプチドの類似体である。
【００２７】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ８８０４３．１を有する胃抑制ポリペプチドの類似体、またはそのフラグメントである。
【００２８】
任意選択で、ペプチド類似体は、アミノ酸配列ＭＶＡＴＫＴＦＡＬＬＬＬＳＬＦＬＡＶＧＬＧＥＫＫＥＧＨＦＳＡＬＰＳＬＰＶＧＳＨＡＫＶＳＳＰＱＰＲＧＰＲＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱＲＥＡＲＡＬＥＬＡＳＱＡＮＲＫＥＥＥＡＶＥＰＱＳＳＰＡＫＮＰＳＤＥＤＬＬＲＤＬＬＩＱＥＬＬＡＣＬＬＤＱＴＮＬＣＲＬＲＳＲを有する胃抑制ポリペプチドの類似体、またはそのフラグメントである。
【００２９】
任意選択で、ペプチド類似体は、アミノ酸配列ＭＶＡＴＫＴＦＡＬＬＬＬＳＬＦＬＡＶＧＬＧＥＫＫＥＧＨＦＳＡＬＰＳＬＰＶＧＳＨＡＫＶＳＳＰＱＰＲＧＰＲＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱＲＥＡＲＡＬＥＬＡＳＱＡＮＲＫＥＥＥＡＶＥＰＱＳＳＰＡＫＮＰＳＤＥＤＬＬＲＤＬＬＩＱＥＬＬＡＣＬＬＤＱＴＮＬＣＲＬＲＳＲの５２〜９３位でアミノ酸残基を含む胃抑制ポリペプチドのフラグメントの類似体である。
【００３０】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は胃抑制ポリペプチドのフラグメントの類似体であり、フラグメントがアミノ酸配列ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱを含む。
【００３１】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は、アミノ酸配列ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱを有する胃抑制ポリペプチドのＮ末端の最後から少なくとも１２のアミノ酸残基を含む類似体である。
【００３２】
任意選択で、ペプチド類似体は、アミノ酸配列ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱを有する胃抑制ポリペプチドの類似体である。
【００３３】
任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドと、少なくとも１つのアミノ酸置換または修飾とを含む。
【００３４】
任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドと、少なくとも１つのアミノ酸修飾とを含む。
【００３５】
任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸残基のアシル化を含む。
【００３６】
任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、アミノ酸残基のアセチル化を含む。
【００３７】
さらに任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基のアセチル化、ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸残基のアセチル化、またはペプチド類似体のアミノ酸配列の任意の他のアミノ酸残基のアセチル化を含む。
【００３８】
またさらに任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基のアセチル化を含む。
【００３９】
任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドを含み、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基がアセチル化される。
【００４０】
任意選択で、ペプチド類似体は、Ｃ−８オクタノイル基、Ｃ−１０デカノイル基、Ｃ−１２ラウロイル基、Ｃ−１４ミリストイル基、Ｃ−１６パルミトイル基、Ｃ−１８ステアロイル基、およびＣ−２０アシル基を含む群から選択される脂肪酸の付加を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００４１】
さらに任意選択で、少なくとも１つのアミノ酸修飾は、Ｃ−１６パルミトイル基の付加を含む。
【００４２】
任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドと、Ｃ−１６パルミトイル基とを含む。さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基がアセチル化される胃抑制ポリペプチドと、Ｃ−１６パルミトイル基とを含む。
【００４３】
任意選択で、この脂肪酸または各脂肪酸は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸に隣接してもしくはこの残基で結合される、ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸残基に隣接してもしくはこの残基で結合される、またはペプチド類似体のアミノ酸配列の任意の他のアミノ酸残基で結合される。
【００４４】
任意選択で、この脂肪酸または各脂肪酸は、リジン残基に結合される。
【００４５】
さらに任意選択で、この脂肪酸または各脂肪酸は、リジン残基のαアミノ基またはεアミノ基に結合される。
【００４６】
任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドと、リジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基がアセチル化される胃抑制ポリペプチドと、リジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。
【００４７】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドと、ペプチド類似体の３７位でリジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基がアセチル化される胃抑制ポリペプチドと、ペプチド類似体の３７位でリジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。
【００４８】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドと、ペプチド類似体の位３７でリジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基がアセチル化される胃抑制ポリペプチドと、アミノ酸配列ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱを有するペプチド類似体の３７位でリジン残基に結合されるＣ−１６パルミトイル基とを含む。
【００４９】
任意選択で、ペプチド類似体は、一般式ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈ（式中、ｎは１と２２の間の整数である）のポリマー部分の結合を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００５０】
さらに任意選択で、ペプチド類似体は、ｘｅｎｉｎと、少なくとも１つのアミノ酸の置換または修飾とを含み、およびペプチド類似体は、一般式ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈ（式中、ｎは１と２２の間の整数である）のポリマー部分の結合を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００５１】
あるいは、ペプチド類似体は、胃抑制ポリペプチドまたはそのフラグメントと、少なくとも１つのアミノ酸の置換または修飾とを含み、およびペプチド類似体は、一般式ＨＯ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）ｎ−Ｈ（式中、ｎは１と２２の間の整数である）のポリマー部分の結合を含む少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含む。
【００５２】
任意選択で、ｎは１と約１０の間の整数である。
【００５３】
さらに任意選択で、ｎは約２と約５の間の整数である。
【００５４】
任意選択で、ポリマー部分は枝分れ構造を有する。枝分れ構造は、線形構造の少なくとも２つのポリマー部分の結合を含み得る。
【００５５】
あるいは、分岐点は各ポリマー部分の構造内に位置することもある。
【００５６】
あるいは、ポリマー部分は線形構造を有する。
【００５７】
任意選択で、このポリマー部分または各ポリマー部分は、ペプチド類似体のＮ末端アミノ酸残基に隣接してもしくはこの残基で結合される、ペプチド類似体のＣ末端アミノ酸残基に隣接してもしくはこの残基で結合される、またはペプチド類似体のアミノ酸配列の任意の他のアミノ酸残基で結合される。
【００５８】
任意選択で、このポリマー部分または各ポリマー部分は、Ｃ末端アミノ酸残基に隣接してもしくはこの残基で結合される。
【００５９】
さらに任意選択で、このポリマー部分または各ポリマー部分は、Ｃ末端アミノ酸残基で結合される。
【００６０】
任意選択で、このポリマー部分または各ポリマー部分は、リジン残基で結合される。
【００６１】
さらに任意選択で、このポリマー部分または各ポリマー部分は、リジン残基のαアミノ基もしくはεアミノ基で結合される。
【００６２】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００６３】
任意選択で、組成物は、本発明の第１または第２の態様による薬学的に有効量のペプチド類似体と、薬学的に許容される担体とを含む。
【００６４】
任意選択で、使用は、本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体または本発明の第３の態様による組成物の投与を含む。
【００６５】
さらに任意選択で、使用は、対象への本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体または本発明の第３の態様による組成物の投与を含む。
【００６６】
さらに任意選択で、使用は、神経障害を患う対象への本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体または本発明の第３の態様による組成物の投与を含む。
【００６７】
さらに任意選択で、使用は、本発明の第１または第２の態様による薬学的に有効量のペプチド類似体または本発明の第３の態様による組成物の投与を含む。
【００６８】
またさらに任意選択で、使用は、本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体の０．２５〜２５．００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の、または本発明の第３の態様による組成物の同等量の投与を含む。
【００６９】
またさらに任意選択で、使用は、本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体の２．５０〜２５．００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の、または本発明の第３の態様による組成物の同等量の投与を含む。
【００７０】
またさらに任意選択で、使用は、本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体の２５．００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の、または本発明の第３の態様による組成物の同等量の投与を含む。
【００７１】
本発明の第４の態様によれば、神経障害を治療するための方法が提供され、方法は本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体または本発明の第３の態様による組成物を投与することを含む。
【００７２】
本発明の第５の態様によれば、神経障害を治療するための薬物の製造における本発明の第１または第２の態様によるペプチド類似体の使用が提供される。
【００７３】
任意選択で、神経障害は、認知機能に影響を及ぼす障害、および機能障害性認知過程の群から選択される障害である。
【００７４】
任意選択で、認知機能に負に影響を及ぼす障害としては、認知症、脳卒中、統合失調症、双極性障害、および神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
任意選択で、認知機能に正に影響を及ぼす障害としては、心的外傷後ストレス障害、てんかん、トゥレット症候群、および幻覚が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
任意選択で、神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ハンチントン病、およびパーキンソン病から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
任意選択で、機能障害性認知過程としては、注意集中、計算、記憶、判断、洞察、学習、および推論が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
任意選択で、神経障害はアルツハイマー病である。
【００７９】
任意選択で、ペプチド類似体は、認知機能を改善することにおける使用のためである。
【００８０】
任意選択でまたは追加的に、ペプチド類似体は、記憶を改善することにおける使用のためである。さらに任意選択でまたは追加的に、ペプチド類似体は、認識または空間記憶を改善することにおける使用のためである。
【００８１】
任意選択で、ペプチド類似体は、アミロイドβを減少させることにおける使用のため、任意選択で、アミロイドβ高密度コアプラーク数を減少させることにおける使用のためである。
【００８２】
任意選択で、ペプチド類似体は、炎症を軽減させることにおける使用のためである。さらに任意選択で、ペプチド類似体は、脳内炎症を軽減させることにおける使用のためである。
【００８３】
任意選択で、ペプチド類似体は、シナプス密度または数を増加させることにおける使用のためである。
【００８４】
任意選択で、ペプチド類似体は、神経発生を増加させることにおける使用のためである。
【００８５】
ここで、本発明の各実施形態を添付する図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてシナプス密度がＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］およびリラグルチドによって部分的に維持されることを示すグラフである。シナプトフィジンレベルは、一日１回１０週間、生理食塩水、リラグルチドおよびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて測定された。多形層（Ａ）、顆粒層（Ｂ）、分子層（Ｃ）、放線状層（Ｄ）、錐体細胞層（Ｅ）、多形細胞層（Ｆ）、皮質内層（Ｇ）および皮質外層（Ｈ）の数量化を図示する。データは、群当たりｎ＝６マウスについて、８〜１２切片の平均値±ＳＥＭを表す。＊＊／＊＊＊ｐ＜０．０１〜ｐ＜０．０００１  ＡＰＰ／ＰＳ１マウスのすべての群と比較した。Δｐ＜０．０５、ΔΔｐ＜０．０１、ΔΔΔ＜０．００１およびΔΔΔΔｐ＜０．０００１生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較した。Ψ＜０．０５およびΨΨｐ＜０．０１Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスと比較した。
【図２】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてシナプス密度がＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびリラグルチドによって部分的に維持されることを示すグラフである。シナプトフィジンレベルは、一日１回、１０週間、生理食塩水、リラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて測定された。多形層（Ａ）、顆粒層（Ｂ）、分子層（Ｃ）、放線状層（Ｄ）、錐体細胞層（Ｅ）、多形細胞層（Ｆ）、皮質内層（Ｇ）および皮質外層（Ｈ）の数量化を図示する。データは、群当たりｎ＝６マウスについて、８〜１２切片の平均値±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１対すべてのＡＰＰ／ＰＳ１群。Δｐ＜０．０５、ΔΔｐ＜０．０１、およびΔΔΔΔｐ＜０．０００１生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較した。
【図３】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおける重要なバイオマーカーに対するＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の保護効果を示すグラフである。生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｃ）におけるβアミロイドプラーク負荷の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｄ）。生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡ／ＰＳ１マウス（Ｇ）の高密度コアコンゴーレッドプラーク負荷の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｈ）。生理食塩水（Ｉ）、リラグルチド（Ｊ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｋ）におけるＩＢＡ−１染色の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｌ）。生理食塩水（Ｍ）、リラグルチド（Ｎ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｏ）におけるダブルコルチン染色（神経発生のマーカー）の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｐ）。データは、群当たりｎ＝６マウスについて、８〜１２切片の平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。ΔΔｐ＜０．００１、ΔΔΔｐ＜０．００１およびΔΔΔΔｐ＜０．０００１対リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。
【図４】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおける重要なバイオマーカーに対するＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］の保護効果を示すグラフである。生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｃ）におけるβアミロイドプラーク負荷の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｄ）。生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡ／ＰＳ１マウス（Ｇ）の高密度コアコンゴーレッドプラーク負荷の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｈ）。生理食塩水（Ｉ）、リラグルチド（Ｊ）およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｋ）におけるダブルコルチン染色（神経発生のマーカー）の代表的な画像、ならびに群当たりｎ＝６動物での数量化（Ｌ）。データは、群当たりｎ＝６マウスについて、８〜１２切片の平均値±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５と＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。ΔΔｐ＜０．００１、ΔΔΔｐ＜０．００１、Δｐ＜０．０５対リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。
【図５】可溶性オリゴマーレベルにおける減少を示すグラフである。生理食塩水、リラグルチドまたはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による１０週間の処置後、総脳ＡＰＰ（Ａ）、凝集βアミロイドオリゴマー（Ｂ）、Ａβ１−４０（Ｃ）、Ａβ１−４２（Ｄ）およびＡβ４２／４０の比率（Ｅ）をＥＬＩＳＡで測定した。値は、群当たりｎ＝６の脳についての平均値±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１対生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。Δ＜０．０５、ΔΔｐ＜０．０１およびΔΔΔｐ＜０．００１対リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。
【図６】βアミロイドオリゴマーレベルにおける減少を示すグラフである。生理食塩水、リラグルチドまたはＮＡｃＧＩＰ（Ｌｙｓ３７ＰＡＬ）による１０週間の処置後、総脳ＡＰＰ（Ａ）、凝集βアミロイドオリゴマー（Ｂ）、Ａβ１−４０（Ｃ）、Ａβ１−４２（Ｄ）およびＡβ４２／４０の比率（Ｅ）をＥＬＩＳＡで測定した。値は、群当たりｎ＝６の脳についての平均値±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１対生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。Δ＜０．０５、ΔΔｐ＜０．０１およびΔΔΔｐ＜０．００１対リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス。
【図７】高頻度刺激後ベースラインの分析であり、生理食塩水で処置されたマウスと比較すると、０．２５、２．５および２５ｎｍｏｌ／ｋｇ（群当たりｎ＝８）で一日１回３週間注射されたリラグルチド（Ａ）はＣ５７Ｂ１／６マウスにおいて海馬のＣＡ１でＬＴＰ（長期増強）の誘導と維持を増強し、低用量で優れた効果が観察され、Ｎ−ＡｃＧＩＰ（Ｌｙｓ３７ＰＡＬ）（Ｂ）は２．５および２５ｎｍｏｌ／ｋｇでＬＴＰの誘導と維持を増強したが、それは０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇでＬＴＰの誘導を阻害し、ｘｅｎｉｎ２５（Ｌｙｓ１３ＰＡＬ）は２５ｎｍｏｌ／ｋｇでＬＴＰの誘導と維持を増強したが、それは２．５および０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇでＬＴＰの誘導を阻害したことを示す。
【図８】野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の急性投与後の、オープンフィールド課題でのベースライン動作を示すグラフである。オープンフィールド課題では、野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてそれぞれの処置の各々の急性注射後、経路長（Ａ）、ラインクロス（Ｂ）、速度（Ｃ）、立ち上がり（Ｄ）、毛づくろい（Ｅ）、糞塊（Ｆ）、およびアリーナ中央での滞在時間（Ｇ）を３０分間測定した。Δｐ＜０．０５対野生型生理食塩水、＊ｐ＜０．０５対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水、ｏｐ＜０．０５、ｏｏｐ＜０．０１、ｏｏｏｐ＜０．００１、ｏｏｏｏｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１リラグルチド。データは、群当たり１１〜１３匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図９】野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の急性投与後の、新規物体認識課題の習得段階におけるベースライン動作を示すグラフである。オープンフィールドアリーナへの曝露から２４時間後、上記のそれぞれの処置の注射を野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスに施して３０分後、新規物体認識課題を同じアリーナを使用して行った。１０分間の習得段階において、野生型マウス（Ａ）またはＡＰＰ／ＰＳ１（Ｂ）マウスのいずれかを２つの同じ物体、白いボールまたは赤い立方体のいずれかに曝した。データは、群当たり１１〜１３匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１０】野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の急性投与後の、新規物体認識記憶のベースラインを示すグラフである。新規物体認識課題の試験段階は、習得段階の３時間後に行われた。試験段階において、習得段階からの物体の１つを、これまでに出会わなかった新規物体と置き換えた。それぞれの処置の急性投与後の試験段階での野生型マウス（Ａ）およびＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｂ）における新規物体と比較した、見慣れた物体についての認識指数を図示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対新規物体。データは、群当たり１１〜１３匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１１】野生型マウスにおける空間学習に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。モリス水迷路訓練は、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による５６日間の処置後、開始した。習得段階は、４日連続して１日当たり４種の訓練セッションを含んだ。訓練日当たりの平均逃避潜時（Ａ）、経路長（Ｂ）および遊泳速度（Ｃ）を図示する。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１２】野生型マウスにおける空間記憶に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。空間記憶の尺度としてモリス水迷路の最終訓練セッションから２４時間後の５日目にプローブ試験を行った。それぞれの薬物の各々による６０日間の処置の後、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスによるプローブ試験中の各象限での滞在時間を上に示す。＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１、＋＋＋ｐ＜０．００１および＋＋＋＋ｐ＜０．０００１対目標象限。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１３】野生型マウスにおけるリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置後の空間視力を示すグラフである。それぞれの薬物による６０日間の処置の後の野生型マウスにおける空間視力の指標として、最終モリス水迷路訓練セッションから２４時間後に行ったプローブ試験中の、逃避プラットフォームの以前の位置から半径１ｃｍ以内での滞在時間の長さを上に示す。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１４】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける空間学習に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。モリス水迷路訓練は、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による５６日間の処置後に開始した。習得段階は、４日連続して１日当たり４種の訓練セッションを含んだ。それぞれの薬物による長期処置後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの、訓練日当たりの平均逃避潜時（Ａ）、逃避プラットフォームへの経路長（Ｂ）、および遊泳速度（Ｃ）を示す。＊ｐ＜０．０５対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水、＋ｐ＜０．０５対ＡＰＰ／ＰＳ１  Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１５】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける空間記憶に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。空間記憶の尺度としてモリス水迷路の最終訓練セッションから２４時間後にプローブ試験を行った。６０日間の処置の後、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによる各象限での滞在時間の長さを上に示す。＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１対目標象限。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１６】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける空間視力に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。それぞれの薬物による６０日間の処置の後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける空間視力の指標として、最終モリス水迷路訓練セッションから２４時間後に行ったプローブ試験中の、逃避プラットフォームの以前の位置から半径１ｃｍ以内での滞在時間の長さを上に示す。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１７】野生型マウスにおける逆転学習に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。逆転水迷路訓練は、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による６１日間の処置後に開始した。習得段階は、４日連続して１日当たり４種の訓練セッションを含んだ。訓練日当たりの平均逃避潜時（Ａ）、経路長（Ｂ）、および遊泳速度（Ｃ）を示す。Δｐ＜０．０５、ΔΔｐ＜０．０１およびΔΔΔΔｐ＜０．０００１対野生型生理食塩水。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１８】野生型マウスにおける逆転記憶に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。逆転記憶の尺度として逆転水迷路の最終訓練セッションから２４時間後に逆転プローブ試験を行った。それぞれの薬物の各々による６５日間の処置の後、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスによる逆転プローブ試験中の各象限での滞在時間を上に示す。＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１、＋＋＋ｐ＜０．００１および＋＋＋＋ｐ＜０．０００１対目標象限。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１９】野生型マウスにおける逆転空間視力に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。それぞれの薬物による６５日間の処置の後の野生型マウスにおける空間視力の指標として、最終逆転水迷路訓練セッションから２４時間後に行ったプローブ試験中の、逃避プラットフォームの以前の位置から半径１ｃｍ以内での滞在時間の長さを上に示す。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２０】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける逆転学習に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。逆転水迷路訓練は、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による６１日間の処置後に開始した。習得段階は、４日連続して１日当たり４種の訓練セッションを含んだ。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの訓練日当たりの平均逃避潜時（Ａ）、経路長（Ｂ）、および遊泳速度（Ｃ）を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水。Ψｐ＜０．０５対ＡＰＰ／ＰＳ１  ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２１】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける逆転記憶に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。逆転記憶の尺度として逆転水迷路の最終訓練セッションから２４時間後に逆転プローブ試験を行った。それぞれの薬物の各々による６５日間の処置の後、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによる逆転プローブ試験中の各象限での滞在時間を上に示す。＋ｐ＜０．０５、＋＋ｐ＜０．０１および＋＋＋＋ｐ＜０．０００１対目標象限。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２２】リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１の空間視力が逆転水迷路プローブ試験で改善されることを示すグラフである。それぞれの薬物による６５日間の処置後のＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける空間視力の指標として、最終逆転水迷路訓練セッションから２４時間後に行ったプローブ試験中の、逃避プラットフォームの以前の位置から半径１ｃｍ以内での滞在時間の長さを上に示す。＊ｐ＜０．０５対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２３】野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるオープンフィールド行動に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。オープンフィールド課題において、自発行動に対する各処置の慢性効果を評価するために、野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてそれぞれの処置の各々の６６日間の投与後に、経路長（Ａ）、ラインクロス（Ｂ）、速度（Ｃ）、立ち上がり（Ｄ）、毛づくろい（Ｅ）、糞塊（Ｆ）、およびアリーナ中央での滞在時間を測定した。Ψｐ＜０．０５、ΨΨｐ＜０．０１およびΨΨΨｐ＜０．００１対ＡＰＰ／ＰＳ１  ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２４】野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける認識記憶に対するリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置の効果を示すグラフである。新規物体認識課題の試験段階は、最初の１０分の習得段階から３時間後に行った。試験段階において、習得段階からの同一の物体の１つを、これまでに出会わなかった新規物体と置き換えた。それぞれの処置の６７日間の投与後の試験段階で野生型マウス（Ａ）およびＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｂ）における見慣れた物体と比較した、新規物体の認識指数を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１対新規物体。データは、群当たり１１〜１２匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２５】リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のＡβプラーク負荷を示すグラフである。それぞれの薬物による１０週間の処置後に生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質中のＡβ沈着を表す代表的な画像を示す。各処置群のＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｅ）の皮質中のＡβ免疫陽性の全数量化も示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水。データは、群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２６】リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中の高密度コアコンゴーレッド親和性プラーク負荷を示すグラフである。それぞれの薬物による１０週間の処置後に生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質中のコンゴーレッド陽性高密度コアＡβプラークを表す代表的な画像を示す。各処置群のＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｅ）の皮質中のコンゴーレッド親和性プラーク負荷の全数量化も示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水。データは、群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図２７】薬物処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質中のミクログリアを示す代表的な顕微鏡写真である。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスならびに生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｇ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｈ）を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質中のＩｂａ１染色を表す代表的な画像を示す。
【図２８】薬物処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中のミクログリアを示す代表的な顕微鏡写真である。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスならびに生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｇ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｈ）を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中のＩｂａ１染色を表す代表的な画像を示す。
【図２９】リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のミクログリアのレベルを示すグラフである。１０週の間一日１回、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］）で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質（Ａ）および歯状回（Ｂ）中のＩｂａ１免疫陽性の全数量化を上に示す。ＸＸＸＸｐ＜０．０００１対すべてのＡＰＰ／ＰＳ１群、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水、ｏｐ＜０．０５、ｏｏｐ＜０．０１、ｏｏｏｏｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１リラグルチド、ΨΨΨΨｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１  ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］。データは、群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図３０】薬物処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質中のアストロサイトを示す代表的な顕微鏡写真である。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスならびに生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｇ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｈ）を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質中のＧＦＡＰ染色を表す代表的な画像を示す。
【図３１】薬物処置された野生型マウスおおびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中のアストロサイトを示す代表的な顕微鏡写真である。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスならびに生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｇ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｈ）を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中のＧＦＡＰ染色を表す代表的な画像を示す。
【図３２】リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のアストロサイトのレベルを示すグラフである。１０週の間一日１回、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質（Ａ）および歯状回（Ｂ）中のＧＦＡＰ免疫陽性の全数量化を上に示す。Ｘ／ＸＸＸ／ＸＸＸＸｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０００１対すべてのＡＰＰ／ＰＳ１群、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水、ｏｐ＜０．０５対ＡＰＰ／ＰＳ１  リラグルチド、＋＋＋ｐ＜０．００１、＋＋＋＋ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１  Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］。データは、群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図３３】リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回における神経発生を表す。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ）、リラグルチド（Ｂ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｃ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｄ）で処置された野生型マウスならびに生理食塩水（Ｅ）、リラグルチド（Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（Ｇ）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｈ）を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中のダブルコルチン染色の代表的な画像を上に示す。
【図３４】Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］が野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて神経発生を促進することを示すグラフである。１０週の間一日１回、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中のダブルコルチン−陽性細胞数量化を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水。ΔΔｐ＜０．０１、ΔΔΔｐ＜０．００１、ΔΔΔΔｐ＜０．０００１対野生型生理食塩水、ｏｐ＜０．０５、ｏｏｐ＜０．０１およびｏｏｏｏｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１リラグルチド、Ψｐ＜０．０５およびΨΨΨΨｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１  ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］。データは、群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図３５】野生型マウスにおけるシナプス密度を示す代表的な顕微鏡写真である。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ〜Ｃ）、リラグルチド（Ｄ〜Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｊ〜Ｌ）で処置された野生型マウス脳中のシナプトフィジン染色の代表的な画像である。Ａ、Ｄ、ＧおよびＪは、歯状回の多形層、顆粒層および分子層を表す。Ｂ、Ｅ、ＨおよびＫは、海馬の放線状層、錐体細胞層および多形細胞層を表し、Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬは、大脳皮質の内層および外層を表す。
【図３６】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるシナプス密度を示す代表的な顕微鏡写真である。１０週の間一日１回、生理食塩水（Ａ〜Ｃ）、リラグルチド（Ｄ〜Ｆ）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（Ｊ〜Ｌ）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳中のシナプトフィジン染色の代表的な画像である。Ａ、Ｄ、ＧおよびＪは、歯状回の多形層、顆粒層および分子層を表す。Ｂ、Ｅ、ＨおよびＫは、海馬の放線状層、錐体細胞層および多形細胞層を表し、Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬは、大脳皮質の内層および外層を表す。
【図３７】リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のシナプス密度を示すグラフである。歯状回の多形層（Ａ）、顆粒層（Ｂ）と分子層（Ｃ）、海馬の放線状層（Ｄ）、錐体細胞層（Ｅ）と多形細胞層（Ｆ）、および大脳皮質の内層（Ｇ）と外層（Ｈ）におけるシナプトフィジンの光学密度の全数量化を示す。Ｘ／ＸＸＸＸｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０００１対すべての群のＡＰＰ／ＰＳ１マウス、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水、Λｐ＜０．０５およびΛΛｐ＜０．０１対野生型Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］。データは、群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【図３８】１０週間、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳中の可溶性Ａβを示すグラフである。１０週の間一日１回、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス脳由来の、総脳ＡＰＰ（Ａ）、凝集Ａβオリゴマー（Ｂ）、Ａβ１−４０（Ｃ）、Ａβ１−４２（Ｄ）およびＡβ４２／４０の比率（Ｅ）の数量化、総タンパク質含有量に対する正規化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＡＰＰ／ＰＳ１生理食塩水、ｏｐ＜０．０５およびｏｏｐ＜０．０１対ＡＰＰ／ＰＳ１リラグルチド。データは、処置群当たり６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭを表す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
実施例
ここで、本発明の実施形態を非限定例として述べる。
【００８８】
材料および方法
動物
Ｃ５７ＢＩ／６背景をもつＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ΔＥ９マウスをＵｌｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの動物ユニットで飼育した。ヘテロ接合体オスを地元（Ｈａｒｌａｎ，ＵＫ）で購入した野生型Ｃ５７／ＢＩ６メスとともに飼育した。仔マウスを耳パンチし、ＡＰＰ配列（順方向“ＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧＧ”、逆方向“ＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＡＣＡ”）に特異的なプライマーでのＰＣＲを用いて遺伝子型を同定した。導入遺伝子を発現しないマウスを野生型対照として使用した。オスマウスをすべての試験で用いた。マウスを個別にケージに入れ、恒温室（温度：２１．５±１℃）で、１２／１２明暗サイクル（０８：００時に電灯をつけ、２０：００時に消灯）で維持した。飼料と水は、自由に摂取できた。本試験の開始前の２週間、マウスを毎日慣らした。処置開始時に、ＡＰＰ／ＰＳ１および野生型マウスは７月齢であった。マウスをランダム化し、一日１回（１５：００時に）それらの指定処置、リラグルチド（２．５ｎｍ／ｋｇ体重）、Ｎ−ＡｃＧＩＰ（Ｌｙｓ３７ＰＡＬ３７）、ｘｅｎｉｎ２５（ＬＹｓ１３ＰＡＬ）または生理食塩水（０．９重量／体積％）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。処置群は、ｎ＝１２〜１４であった。すべての実験は、１９８６年の動物（科学的処置）法に従って、英国内務省によって認可された。
【００８９】
ペプチド
Ｎ−ＡｃＧＩＰ（Ｌｙｓ３７ＰＡＬ）、ｘｅｎｉｎ２５（Ｌｙｓ１３ＰＡＬ）およびリラグルチドは、ＥＺ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）から購入した。ペプチドの純度は逆相ＨＰＬＣによって分析し、次いでマトリックスによって援助されるレーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて特徴づけ、純度が＞９９％であった。ペプチドをポリプロピレンチューブ中で１ｍｇ／ｍＬの濃度にｕｌｔｒａｐｕｒｅ（登録商標）水で再構成しアリコートで凍結して、注射のために必要な用量を新たに調製できるようにした。
【００９０】
実験計画および処置
処置開始時に、ＡＰＰ／ＰＳ１および野生型マウスは７月齢であった。合計８群になるように、マウスをランダム化し、遺伝子型当たり４処置群に割り当てた。野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１マウスを、８〜１０週間の間リラグルチド（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）または生理食塩水（０．９％重量／体積）のいずれかを一日１回（１５：００時に）腹腔内に投与される４群にそれぞれ分けた。処置群は、ｎ＝１２〜１４であった。リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］は、ＥＺ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）から購入した。ペプチドの純度は、逆相ＨＰＬＣによって分析し、次いでマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を用いて特徴づけ、純度が＞９９％であった。ペプチドをポリプロピレンチューブ中で１ｍｇ／ｍＬの濃度にｕｌｔｒａｐｕｒｅ（登録商標）水で再構成しアリコートで凍結して、注射のために必要な用量を新たに調製できるようにした。ペプチドを次いで、１０ｍＬ／ｋｇの量で投与する前に０．９％ＮａＣｌ中で調製した。
【００９１】
オープンフィールド課題
マウスを、不安と自発運動活性を評価するために、オープンフィールド課題（ＯＦＴ）にかけた。手短に言えば、マウスを円形アリーナ（直径５８ｃｍ、高さ３１ｃｍ）に入れ、５分間自由に探索させておいた。カメラ位置に直接隣接して、アリーナの２ｍ上に配置した６０Ｗ電球により、アリーナを照らした。コンピュータ化追跡システム（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を使用してマウスの動きを記録し、これを用いてＯＦＴ動作も分析した。不安のレベルを示すために、毛づくろいイベント、立ち上がりイベントおよび排便を手動で記録した。毛づくろいは、マウスが走るのをやめて自身の毛をなめる、噛む、または掻き始めた行為と定義した。立ち上がりは、マウスが走るのをやめて自身の両前足を床から持ち上げ、後ろ足で立った行為と定義した。排便は、各試験の後でアリーナ内の糞塊の数を計数することにより測定した。経路長、速度および直線性を自発運動活性の表示として、デジタル記録した。マウスを装置に順応させかつ不慣れな環境が引き起こし得る自然のストレスおよび不安を減少させるために、ＯＦＴを新規物体認識課題の２４時間前に行った。アリーナは、嗅覚キューの集積を妨げるために、各マウスの間をエタノール（７０％）で十分に清浄した。
【００９２】
新規物体認識課題
９日後（１群）、２５日後（２群）、８週間後（３群）または１９週間後（４群）に、マウスを新規物体認識課題（ＯＲＴ）で評価した。この課題は、新規性についての齧歯動物の自然な選好を利用し、およびマウスにおける作業記憶の尺度として使用される。手短に言えば、マウスを、２つの同一の物体；Ｂｌｕタックを用いて、壁から１５ｃｍ離してアリーナの床に固定された２つの赤い立方体（幅１．８ｃｍ）または２つの白いボール（幅２ｃｍ）のいずれか、とともに、最初の馴化段階のためのアリーナに入れた。アリーナを、アリーナの２ｍ上に配置した６０Ｗ電球で薄暗く照らした。マウスを１０分間、見慣れた物体があるアリーナを探索させておいた。マウスの行動を頭上のカメラで記録し、物体の２ｃｍ半径内で２つの見慣れた物体を探索して費やされた時間をＴｒａｃｋｅｒソフトウェア（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を使用して算出した。マウスを次いで取り出して、それらのホームケージに３時間戻した。インターバル後に、マウスを次いで、馴化段階からの１つの見慣れた物体と１つの新規の物体（赤い立方体または白いボールのいずれか）と共に、試験段階のためにアリーナに戻した。使用された見慣れた物体および新規の物体（左側または右側）の位置をランダム化して、いかなる交絡要因の影響も減らした。これまでの試験では、物体または場所の嗜好性のいずれも赤い立方体および白いボールの使用により明白でないことを示している。再度、マウスを１０分間自由に探索させ、それらの行動を記録した。アリーナを、潜在的に混同させる嗅覚キューを取り除くために、各試験の間に７０％エタノールで清浄した。データを、習得段階と試験段階の両方で各物体について算出される認識指数（Ｒｌ）として表す。ＲＩは、物体ＡまたはＢを探索するのに費やした合計時間を両物体の探索で費やした合計時間で割って、１００を掛けたもの（ｔＡまたはｔＢ／（ｔＡ＋ｔＢ）×１００）と定義される。
【００９３】
モリス水迷路
１０日後（１群）、２６日後（２群）、８週間後（３群）または１９週間後（４群）にマウスをモリス水迷路（ＭＷＭ）で評価した。迷路は高さ４０ｃｍ、直径１２０ｃｍであり、２５±１℃で維持される水で満たした。小さな逃避プラットフォーム（１０×６．５×２１．５ｃｍ）を端から２５ｃｍ、水面下１ｃｍに隠して、象限の１つの中央に配置した。視覚キューは、部屋の壁に配置した。ＭＷＭの習得訓練段階は、４日間連続して１日当たり４回の９０秒間の試験で構成した。水を満たしたタンクにマウスを入れ、自由に泳がせておいた。各マウスをプールに入れた時点は、全試験にわたりランダム化した。余分の迷路視覚キューを使用して、マウスは、プールの南西の象限の中央の水面下１ｃｍに隠された逃避プラットフォームの位置を学ばなければならなかった。マウスが９０秒以内にプラットフォームを探せなかった場合、マウスはそこに誘導され、２０秒間そこに留まるように促された。マウスを次いで、試験と試験の間の２０分、それらのホームケージに戻した。最終訓練日の２４時間後に、単一プローブ試験のために逃避プラットフォームを取り外して、マウスを水に戻した。マウスを９０秒間自由に泳がせておき、以前に逃避プラットフォームを含んだ象限に滞在した時間を、作業記憶の機能の表示として測定した。逃避プラットフォームの正確な位置での滞在時間を、空間視力の尺度として記録した。
【００９４】
逆転水迷路
１５日後（１群）、３１日後（２群）、９．５週間後（３群）または２０．５週間後（４群）にマウスを、逃避プラットフォームを南西の象限から北西の象限に移動させた、逆転水迷路（ＲＷＭ）にかけた。この変更は、認知の柔軟性、すなわちプラットフォームの新しい位置を再学習する能力を評価するように設計される。３〜４日連続して１日当たり４試験を行い、続いて最終逆転プローブ試験を行った。
【００９５】
海馬領域ＣＡ１での手術およびＬＴＰ（長期増強）記録
長期増強を評価するために、マウスをｉｎ  ｖｉｖｏでの電気生理学実験のために用いた。すべての実験の間、マウスにウレタン（エチルカルバメート、１．８ｇ／ｋｇを腹腔内に）で麻酔をかけた。頭蓋骨を露出し、直径０．８ｍｍの３つの穴を穿孔した。電極（テフロン被覆タングステン、Ｂｉｌａｎｅｙ，Ｋｅｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を、記録電極用に正中線の１．５ｍｍ後方で１．０ｍｍ側方に、および刺激電極用にブレグマの２．０ｍｍ後方と正中線の１．５ｍｍ側方に挿入した。電極を、皮質と海馬の上層を通して、約１０ミリ秒の潜時を有する陰性偏向する興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）が出現するまでＣＡ１領域中へゆっくり下げた。興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）の記録を、Ｓｃｈａｆｆｅｒ側枝／交連神経路の刺激に応答して右海馬半球のＣＡ１領域中の放線状層から行った。ｆＥＰＳＰを、トリガー閾値の調節が可能な、コンピュータ処理される刺激および記録ユニット（ＰｏｗｅｒＬａｂ，  ＡＤＩ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で記録した。トリガーされたユニットは、定電流刺激単離ユニット（Ｎｅｕｒｏｌｏｇ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を活性化した。データ収集システムを同時にトリガーして、すべてのイベントを記録した。ｆＥＰＳＰ記録のサンプリング速度は、２０ｋＨｚであった。興奮性を評価し高周波刺激および記録のための適当な電圧を決定するために、増加する電圧への各マウスの応答を２．０Ｖから最大５Ｖまで（または最大反応が誘導されるまで）０．２５Ｖの間隔で入力／出力曲線で測定した。刺激電圧を次いで調節して最大ｆＥＰＳＰのおよそ６０％を生じさせ、この値でベースラインの記録を測定した。ＬＴＰを誘導するための高周波刺激プロトコルは、５ミリ秒（２００Ｈｚ）の刺激時間間隔と２秒の１連の間の間隔を有する４連の１００刺激からなった。このＬＴＰ誘導プロトコルは、ＬＴＰの飽和を防止するため、したがってＬＴＰの促進を検出することを可能にするために選択された。ＬＴＰは、高周波刺激を適用する前に、１５分間にわたり記録されたベースラインｆＥＰＳＰ勾配のパーセンテージとして測定された。この値を興奮性シナプス後電位勾配の１００％とし、記録したすべての値をこのベースライン値に対して正規化した。高頻度刺激後ＬＴＰデータを次いで、対象間要因として処置群および対象内要因として時間を用いる二元配置反復測定分散分析法によって分析した。
【００９６】
組織学
動物を、ＰＢＳ緩衝液に続いて、ＰＢＳ中の氷冷４％パラホルムアルデヒドで経心的に灌流した。頭脳を摘出し、脳半球を切り離した。片方の半球をプロセシングまで４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定し、もう片方を液体窒素中で急速凍結し、今後の分析のために−８０℃で保管した。半脳を次いで、凍結時に氷結晶が形成されるのを防止するために、ＰＦＡから３０％スクロースに移し、少なくとも２４時間浸漬した。脳を次いで、凍結スプレー（Ｅｎｖｉｒｏｔｅｃｈ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｓｐｒａｙ，  Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ；カタログ番号６７６９０３８）で固化し、−２５℃に設定したクリオスタット（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）内のホルダーに入れた。脳を次いで、Ｌｅｉｃａクリオスタットを用いて、−２〜−３ブレグマの深さで４０μｍの冠状切片に切断し、試料収集を、海馬の出現（ブレグマまで−０．９４μｍ）で開始しブレグマに対して約３．２８μｍまで行った。立体解析学的目的のために、保持する最初の切片をランダムに選択し、２４ウェルプレートに入れ、７切片おきに１切片を順に収集し、各１０〜１３切片を含む７組が各マウス脳から収集されるようにした。必要になるまで、プレートを―２０℃で保管した。
【００９７】
立体解析学的規則に従って切片を選択し、第１の切片をランダムに、その後６切片おきに取った。β−アミロイドプラークについて、およびコンゴーレッド親和性の高密度コアアミロイドプラークについて染色を行った。シナプスの数を決定するために、シナプトフィジンについての染色、および神経発生の尺度として、未熟ニューロンのマーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）についての染色も行った。アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ、ミクログリアのマーカーであるＩｂａ１、酸化ストレスのマーカーである８−オキソグアニン、ＩＲＳ−１  ｐＳｅｒ６１６、およびシナプス密度を決定するために使用したシナプトフィジンについて染色を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするためにすべての切片を０．０８％〜５％のＨ２Ｏ２中でインキュベートし、０．０１％〜０．０３％のＴｒｉｔｏｎＸを使用して透過処理した。
【００９８】
抗原認識を強化するために、Ｉｂａ１プロトコルは、０．０５Ｍのクエン酸三ナトリウム（ｐＨ９）中９０℃で３０分間、切片のインキュベーションを必要とした。非特異的結合を次いで５％〜１０％正常血清を用いてブロックしてから、マウス、抗ＧＦＡＰ（１：２５０、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ含有ＰＢＳ中、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｆｅｌｔｈａｍ，ＵＫ；カタログ番号ＭＡＢ３４０２）ポリクローナル、ウサギ抗Ｉｂａ１（２％ヤギ血清と０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ含有ＰＢＳ中、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｎｅｕｓｓ，  Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号０１９−１９７９１）、ポリクローナル、ウサギ抗Ａβ抗体（１：２００、ＴＢＳ中、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ；カタログ番号７１−５８００）、ヤギ抗マウスダブルコルチン（１：２００、２％ウサギ血清含有ＰＢＳ中、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．  Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｓｃ−８０６６）またはシナプトフィジン（１：２００、Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；カタログ番号ａｂ７８３７）と４℃で終夜インキュベートした。非特異的抗体結合を防止するために切片を５％正常血清中でブロックしてから、切片をウサギポリクロナール抗アミロイドβペプチド（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＫ，  ７１−５８００）またはヤギポリクローナル抗ダブルコルチン（１：２００、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，  ＵＳＡ，  ｓｃ−７１０）、またはウサギ抗シナプトフィジン（１：２００、Ａｂｅａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ，  ７８３７−５００）とインキュベートした。４℃での終夜のインキュベ−ション後、切片をそれぞれの二次抗体中でインキュベートした。翌日、切片をそれぞれの二次抗体とインキュベートし、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＥｌｉｔｅとＳＧ基質（Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ  ＡＱ，  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ，  Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ；カタログ番号Ｈ５５０１）を用いて可視化を行った。高密度コアアミロイドプラークを、コンゴーレッドを使用して検出した。切片をＰＢＳで洗浄し、次いで塩処理したスライドに乗せ、風乾させ、蒸留水に３０秒間浸漬し次いで飽和塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液に２０分間浸漬した。スライドの付加の前に、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を飽和塩化ナトリウムに加えた。スライドを次いでＮａＣｌ溶液から、飽和ＮａＣｌ溶液中で希釈した０．２％アルカリ化コンゴーレッド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号６０９１０）に３０分間移した。スライドを次いで、段階的エタノール脱水し、キシレン中での５分間の浸漬を３回行ってから、永久封入剤Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ；カタログ番号Ｈ−５０００）を使用してカバースライドを乗せた。染色した切片の画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｏ顕微鏡（ＡｘｉｏスコープＡ１、Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して取得し、各画像（切片当たり２画像、マウス当たり約８〜１０画像、計１６〜２０画像）中の染色面積パーセンテージを、ＩｍａｇｅＪ（ＩｍａｇｅＪ，  Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡ）内の複数閾値プラグインを使用して定量化した。染色面積パーセンテージの分析を、ＯＤ（光学濃度）の分析を行ったシナプトフィジン以外の、すべてのマーカーについて行った。画像をグレイスケールに変換し、閾値を設定し、陽染された面積の平均パーセンテージを各脳について算出した。すべての免疫組織化学分析を盲検法で行い、それによりコードは本試験に関与しない同僚によって顕微鏡スライドに適用された。コードは分析の完了時に初めて明らかにされた。
【００９９】
ヒトＡＰＰ  ＥＬＩＳＡ脳抽出
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１０％グリセロール、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸で構成される細胞抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＦＮＮ００１１）に、５ｍＬ当たり２５０μＬのプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｐ８３４０）を、使用直前に補充した。液体窒素下でホモジナイズされた脳組織１００ｍｇ当たり４ｍＬの細胞抽出緩衝液を加えた。試料を氷上で３０分間溶解し、１０分間隔でボルテックスしてから、４℃で１０分間１３，０００ｒｐｍにて遠心した。生じた上清を新たなエッペンドルフに等分し、直後のＡＰＰレベルの分析のために氷上で静置した。
【０１００】
ヒトＡＰＰ  ＥＬＩＳＡ脳抽出
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１０％グリセロール、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸で構成される細胞抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＦＮＮ００１１）に、５ｍＬ当たり２５０μＬのプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｐ８３４０）を、使用直前に補充した。液体窒素下でホモジナイズされた脳組織１００ｍｇ当たり４ｍＬの細胞抽出緩衝液を加えた。試料を氷上で３０分間溶解し、１０分間隔でボルテックスしてから、４℃で１０分間１３，０００ｒｐｍにて遠心した。生じた上清を新たなエッペンドルフに等分し、直後のＡＰＰレベルの分析のために氷上で静置した。
【０１０１】
凝集ＡβオリゴマーサンドイッチＥＬＩＳＡ
各試験試料を、凝集Ａβ  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）により供給される標準希釈緩衝液中で１：１０に希釈した。凝集Ａβ標準液は、標準希釈緩衝液で希釈して、５．７ｎｇ／ｍＬ〜０．０１９５ｎｇ／ｍＬで、ヒト凝集Ａβ標準溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）から二つ組で調製した。標準試料および試験試料（１００μＬ）を、９６ウェルプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）を使用して、ＡβのＮ末端に特異的なモノクローナル抗体で被覆したウェル中にピペットで移した。色素原ブランクとして最初の２つのウェルを空のままにし、一方１００μＬの標準希釈緩衝液をゼロウェルに加えた。ウェルを接着プレートカバーで覆い、試料を室温で２時間インキュベートした。Ｍｕｌｔｉｗａｓｈ  ＩＩＩ  Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ洗浄機（Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ，  Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ウェルを事前に蒸留水で１：２５に希釈した洗浄緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，  ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）で４回洗浄した。洗浄後、１００μＬのビオチン化検出抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）を色素原ブランクウェル以外の各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で４回洗浄した後、色素原ブランクウェル以外のウェルを、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＳＡＶ−ＨＲＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）と室温で３０分間インキュベートした。過剰ＳＡＶ−ＨＲＰを除去し、ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。各ウェルを次いで１００μＬの安定化色素原（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）と、青色が発色するまで暗所で室温にて２０〜３０分間インキュベートした。最終的に、１００μＬの停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４９１）を加え、溶液中の青色が黄色に変化するのを誘導した。プレートを、停止液を加えて直ちに分光光度計（Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ３  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入した。各ウェルの吸光度を、色素原ブランクに対してプレートリーダーをブランクにして、４５０ｎｍで測定した。標準の吸光度測定値を標準濃度に対してプロットし、作成したヒト凝集Ａβ標準曲線を用いて各試料中の凝集Ａβ濃度を決定した。各試験試料の凝集Ａβ濃度を次いで、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定される、対応する脳タンパク質濃度で割った。
【０１０２】
Ａβー１−４０およびＡβ１−４２ＥＬＩＳＡ脳抽出
すでに液体窒素下でホモジナイズされた脳組織を、８容量の氷冷グアニジン緩衝液（５．０ＭグアニジンＨＣＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｇ３２７２）／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｔ５９４１、ｐＨ８．０）と４℃で終夜混合した。ホモジネートを次いでさらに、５ｍＬ当たり２５０μＬのプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ  ＵＳＡ；カタログ番号Ｐ８３４０）を補充した、氷冷反応緩衝液ＢＳＡＴ−ＤＰＢＳ（５％ＢＳＡと０．０３％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｐ９４１６）を含むダルベッコＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ；カタログ番号Ｄ１４０８））で希釈した（１：１０）。試料を次いで、４℃で２０分間遠心分離した。上清を新たなエッペンドルフに移し、使用まで氷上で保管した。
【０１０３】
Ａβ１−４０サンドイッチＥＬＩＳＡ
各試験試料を、Ａβ１−４０ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４８１）により供給される標準希釈緩衝液中で１：３に希釈した。Ａβ１ー４０標準液は、標準希釈緩衝液で希釈して、０．５ｎｇ／ｍＬ〜０．００７８１ｎｇ／ｍＬで、ヒトＡβ１−４０標準溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４８１）から二つ組で調製した。標準試料および試験試料（５０μＬ）を、９６ウェルプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４８１）を使用して、Ａβ１−４０のＮ末端に特異的なモノクローナル抗体で被覆したウェルにピペットで移した。色素原ブランクとして最初の２つのウェルを空のままにし、一方５０μＬの標準希釈緩衝液をゼロウェルに加えた。１−４０Ａβ配列のＣ末端を認識するウサギ検出抗体（５０μＬ）を次いで、色素原ブランクを除いて、各ウェルに加えた。ウェルを次いで接着プレートカバーで覆い、試料を振盪しながら室温で３時間インキュベートした。Ｍｕｌｔｉｗａｓｈ  ＩＩＩ  Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ洗浄機（Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ，  Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ウェルを事前に蒸留水で１：２５に希釈した洗浄緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４８１）で４回洗浄した。洗浄後、１００μＬの抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰを、色素原ブランクを除いて、各ウェルに加えた。ウェルをプレートカバーで覆い、試料を室温で３０分間インキュベートした。過剰抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰを除去し、ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。各ウェルを次いで１００μＬの安定化色素原（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４８１）と、青色が発色するまで暗所で室温にて２０〜３０分間インキュベートした。最終的に、１００μＬの停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４８１）を加え、溶液中の青色が黄色に変化するのを誘導した。プレートを、停止液を加えて直ちに分光光度計（Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ３  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入した。各ウェルの吸光度を、色素原ブランクに対してプレートリーダーをブランクにして、４５０ｎｍで測定した。標準の吸光度測定値を標準濃度に対してプロットし、作成したヒトＡβ１−４０標準曲線を用いて各試料中のＡβ１−４０濃度を決定した。各試験試料のＡβ１−４０濃度を次いで、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定される、対応する脳タンパク質濃度で割った。
【０１０４】
Ａβ  １−４２サンドイッチＥＬＩＳＡ
各試験試料を、Ａβ１−４２ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４４１）により供給される標準希釈緩衝液中で１：３に希釈した。Ａβ１−４２標準液は、標準希釈緩衝液で希釈して、１ｎｇ／ｍＬ〜０．０１５６３ｎｇ／ｍＬで、ヒトＡβ１−４２標準溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４４１）から二つ組で調製した。標準試料および試験試料（５０μＬ）を、９６ウェルプレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４４１）を使用して、ＡβのＮ末端に特異的なモノクローナル抗体で被覆したウェルにピペットで移した。色素原ブランクとして最初の２つのウェルを空のままにし、一方５０μＬの標準希釈緩衝液をゼロウェルに加えた。１−４２Ａβ配列のＣ末端を認識するウサギ検出抗体（５０μＬ）を次いで、色素原ブランクを除いて、各ウェルに加えた。ウェルを次いで接着プレートカバーで覆い、試料を振盪しながら室温で３時間インキュベートした。Ｍｕｌｔｉｗａｓｈ  ＩＩＩ  Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ洗浄機（Ｔｒｉｃｏｎｔｉｎｅｎｔ，  Ｇｒａｓｓ  Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ウェルを事前に蒸留水で１：２５に希釈した洗浄緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４４１）で４回洗浄した。洗浄後、１００μＬの抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰを、色素原ブランクを除いて、各ウェルに加えた。ウェルをプレートカバーで覆い、試料を室温で３０分間インキュベートした。過剰抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰを除去し、ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。各ウェルを次いで１００μＬの安定化色素原（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４４１）と、青色が発色するまで暗所で室温にて２０〜３０分間インキュベートした。最終的に、１００μＬの停止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号ＫＨＢ３４４１）を加え、溶液中の青色が黄色に変化するのを誘導した。プレートを、停止液を加えて直ちに分光光度計（Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ３  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に挿入した。各ウェルの吸光度を、色素原ブランクに対してプレートリーダーをブランクにして、４５０ｎｍで測定した。標準の吸光度測定値を標準濃度に対してプロットし、作成したヒトＡβ１−４２標準曲線を用いて各試料中のＡβ１−４２濃度を決定した。各試験試料のＡβ１−４２濃度を次いで、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイで決定される、対応する脳タンパク質濃度で割った。
【０１０５】
統計
データを、確率のレベルを９５％に設定し、プログラムＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して分析した。結果を平均値±ＳＥＭとして表す。データを、一元配置または二元配置分散分析に続いてポストホック検定またはスチューデントｔ検定によって分析した。
【０１０６】
実施例１
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける初期の認知機能低下に対する本発明のペプチド類似体の効果を確立するｉｎ  ｖｉｖｏ試験
【０１０７】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに生理食塩水、リラグルチドまたは本発明のペプチド類似体（Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］）のいずれかを一日１回、１０週間注射した。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］およびリラグルチドを、シナプス密度のマーカーであるシナプトフィジン（前シナプス小胞タンパク質）のレベルを維持するそれらの能力について評価した。シナプス消失は、認知機能低下と関連する。したがって、シナプスを維持する能力は神経保護特性を示し、シナプス統合性の増加は認知機能の改善と関連する。
【０１０８】
図１（Ａ〜Ｆ）に示すように、シナプトフィジンの発現レベルの数量化は、野生型マウスのすべての群が生理食塩水、リラグルチドまたはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも海馬での発現レベルが有意に高いことを示している。野生型マウスのすべての群においてシナプトフィジン染色は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質内層（Ｇ）と皮質外層（Ｈ）よりも有意に大きかった。リラグルチドおよびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるシナプトフィジン染色レベルは、皮質内層（Ｇ）において野生型マウスのすべての群と同等であったが、染色レベルは、皮質外層（Ｈ）においてＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスと比較して、リラグルチド（ｐ＜０．０１）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１群において有意に減少された。
【０１０９】
リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも多形層（Ａ、ｐ＜０．００１）、分子層（Ｃ、ｐ＜０．０５）、錐体細胞層（Ｅ、ｐ＜０．０００１）および皮質内層（Ｇ、ｐ＜０．０００１）と皮質外層（Ｈ、ｐ＜０．０００１）においてシナプトフィジンレベルが有意に高かった。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも多形層（Ａ、ｐ＜０．０１）、錐体細胞層（Ｅ、ｐ＜０．０１）、皮質内層（Ｇ、ｐ＜０．０００１）および皮質外層（Ｈ、ｐ＜０．０００１）においてシナプトフィジンレベルが有意に高く、シナプス数に対するリラグルチドおよびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の両方の保護能力を示している。シナプス消失は、アルツハイマー病の進行と関連する。
【０１１０】
これらのデータは、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］およびリラグルチドが海馬と皮質（両方とも、学習および記憶との関連で重要な脳領域である）においてシナプスを維持することを示し、神経障害を治療する上でのそれらの使用をさらに実証する。
【０１１１】
実施例２
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける本発明のペプチド類似体による処置に続くシナプス密度の分析
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに生理食塩水、リラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］を一日１回、１０週間注射し、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびリラグルチドを、シナプトフィジンのレベルを維持するそれらの能力について評価した。
【０１１２】
図２に示すように、シナプトフィジンレベルは処置にかかわりなく野生型マウスにおいて同等であることが観察されたが、シナプス密度はＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてリラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］の両処置によって部分的に維持されており、両薬物による処置がシナプス消失を防止することに影響を与え得ることを示唆している。
【０１１３】
具体的には、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも多形層（Ａ、ｐ＜０．０００１）、錐体細胞層（Ｅ、ｐ＜０．０００１）、多形細胞層（Ｆ、ｐ＜０．０５）および皮質内層（Ｇ、ｐ＜０．０００１）と皮質外層（Ｈ、ｐ＜０．０００１）において発現レベルが有意に高く、シナプス数に対するＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］の保護能力を示している。効果は、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて観察された効果と同等だった。学習および記憶に関連して重要な脳領域である海馬および皮質におけるＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびリラグルチドによるシナプスの維持は、神経障害を治療する上での使用をさらに実証する。
【０１１４】
実施例３
ＡＤの重要なバイオマーカーに対する本発明のペプチド類似体の効果
βアミロイドおよび高密度コアコンゴーレッド親和性プラーク負荷ならびに神経新生と炎症に対し、リラグルチドおよび生理食塩水対照と比較してＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の慢性効果を評価するためにＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおいて試験を行った。組織学的マーカーを１０週間の処置の後に分析した。
【０１１５】
図３（Ａ〜Ｄ）に示すように、βアミロイドプラーク負荷は、生理食塩水で処置した対照と比較して、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置したマウスにおいて３０％減少した（ｐ＜０．０００１）。βアミロイドにおける減少と一致して、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置された対照と比較して、高密度コアコンゴーレッド親和性プラーク負荷において有意に大きな減少（５５％、ｐ＜０．０００１）を示した。高密度コアプラークにおけるＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］に誘導されたこの減少は、リラグルチド処置によって誘導された３６％減少よりも有意に大きかった（ｐ＜０．００１、図３Ｅ〜Ｈを参照されたい）。そのような調査結果は、本発明のペプチド類似体が、神経細胞の消失および進行したアルツハイマー病の症状に密接に関連する、高密度コアプラークの形成を減少させるその能力においてリラグルチドより優れていることを示唆している。
【０１１６】
炎症に対するその効果を評価すると、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］のＩＢＡ−１レベルは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと同等だった（図３Ｉ〜Ｌを参照されたい）。
【０１１７】
βアミロイドおよび高密度コアプラーク負荷に対するその効果に加えて、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて神経発生を有意に増加させる能力を示した（図３Ｍ〜Ｐ）。手短に言うと、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも１２２％多く（ｐ＜０．０００１）ダブルコルチン陽性ニューロンを有し、およびリラグルチドで処置されたマウスよりも有意に多く（ｐ＜０．０１）、本発明のペプチド類似体がアルツハイマー病のＡＰＰ／ＰＳ１モデルにおいてリラグルチドよりも効果的に神経発生を刺激することを示す。
【０１１８】
実施例４
ＡＤの重要なバイマーカーに対する本発明のペプチド類似体の効果
βアミロイドおよび高密度コアコンゴーレッド親和性プラーク負荷、炎症と神経新生に対し、リラグルチドおよび生理食塩水対照と比較してＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］の効果を評価するためにＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおいて試験を行った。
【０１１９】
図４（Ａ〜Ｄ）に示すように、βアミロイドプラーク負荷は、生理食塩水で処置された対照と比較するとＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（２７％の減少）によって有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。βアミロイドプラーク負荷における減少と一致して、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスも、高密度コアコンゴーレッド親和性プラーク負荷において有意な減少（４５％）を示した（ｐ＜０．０００１、図４Ｅ〜Ｈ）。βアミロイドプラーク負荷における有意差は、リラグルチドとＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたマウスの間で観察されなかった。
【０１２０】
炎症に対するその効果を評価すると、ＮＡｃＧＩＰ（Ｌｙｓ３７ＰＡＬ）で処置されたマウスのＩＢＡ−１レベルは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと同等だった（図４Ｉ〜Ｌを参照されたい）。
【０１２１】
加えて、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］は、処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて神経発生を部分的に回復させる能力を示した（図４Ｍ〜Ｐ）。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもダブルコルチン陽性ニューロンが有意に多かった（＋４６％）（ｐ＜０．０５）。リラグルチドおよび生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたマウスとの間に有意差はなかった。各薬物で処置された群を生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較するｔ検定において、リラグルチド（ｐ＜０．０５）で処置されたマウスおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたマウス（ｐ＜０．０１）の双方は、それらの無処置ＡＰＰ／ＰＳ１対照同腹仔よりもダブルコルチンニューロンが有意に多く、両薬物が神経発生を増加させることを示唆している。
【０１２２】
実施例５
本発明のペプチド類似体は、可溶性オリゴマーのレベルを減少させる
図５に示すように、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］およびリラグルチドは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて総ＡＰＰレベル（５Ａ）またはＡβ１−４２レベル（５Ｄ）を変化させなかった。リラグルチド処置は、生理食塩水およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して増加されたＡβ１−４０レベル（５Ｃ）および有意に減少されたＡβ４２／４０の比率（５Ｅ）と関連した。
【０１２３】
Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、凝集βアミロイドオリゴマーにおいて有意に大きな８０％減少をもたらした（５Ｂ、ｐ＜０．００１）。これは、対照と比較して、リラグルチドで処置されたマウスで観察された５４％の減少よりも大きかった（５Ｂ、ｐ＜０．０１）。そのような有意な減少は、ｉｎ  ｖｉｖｏでニューロンコミュニケーションを改善すると予想される。
【０１２４】
実施例６
本発明のペプチド類似体は、可溶性オリゴマーのレベルを減少させる
図６に示すように、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびリラグルチドは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて総ＡＰＰ（６Ａ）もしくはＡβ１−４０（６Ｃ）もしくはＡβ１−４２のレベルを有意に変化させなかった。リラグルチド処置は、生理食塩水およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、Ａβ４２／４０の比率（６Ｅ）の有意な減少と関連した。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］処置は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、凝集βアミロイドオリゴマーにおいて有意に大きな７８％減少をもたらした（６Ｂ、ｐ＜０．００１）。これは、対照と比較してリラグルチドで処置されたマウスで観察された５４％の減少よりも大きかった（６Ｂ、ｐ＜０．０１）。βアミロイドオリゴマーは学習および記憶に対して有害効果を有すると報告されているため、観察された減少は物体認識課題における能力の改善を説明できる（実施例７および図７を参照されたい）。
【０１２５】
実施例７
用量反応試験
オスＣ５７ＢＩ／６マウスは、Ｕｌｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで飼育され、処置開始の前に、８〜１０週齢であった。マウスを個別にケージに入れ、恒温室（温度：２１．５±１℃）で、１２／１２明暗サイクル（０８：００時に電灯をつけ、２０：００時に消灯）で維持した。飼料と水は、自由に摂取できた。マウスに、リラグルチド、Ｎ−ＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］を０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇ、２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ、および２５ｎｍｏｌ／ｋｇの３用量で注射した。別の群には、対照として生理食塩水を注射した。マウスは、それぞれの処置注射を一日１回（１５：００時に）、２１日間施されてから、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＴＰを受けた。すべての実験は、１９８６年の動物（科学的処置）法にしたがって、英国内務省によって認可された。
【０１２６】
弱い刺激プロトコルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで海馬におけるＬＴＰの誘導能を試験すると、生理食塩水で処置された野生型マウスは弱いＬＴＰを誘導した（図７Ａ〜Ｃを参照されたい）。
【０１２７】
高頻度刺激後ベースラインを分析すると、リラグルチド処置は低濃度でのＬＴＰの増強と関連した（図７Ａ）。二元配置分散分析において、時間の有意な影響はなかった（ｐ＞０．９９９）。しかし、０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇでのペプチド類似体投与は、生理食塩水で処置されたマウスと比較して、ＬＴＰの誘導の増加と関連した（Ｐ＝０．００６８）。２．５ｎｍｏｌ／ｋｇでは、経時的効果はなかった（ｐ＞０．９９９）が、しかしペプチド類似体投与と関連するＬＴＰにおいて有意に大きな増加があった（ｐ＜０．０００１）。２５ｎｍｏｌ／ｋｇでは、時間の有意な影響はなかった（ｐ＞０．９９９）。しかし、ペプチド類似体処置は、ＬＴＰの誘導能を有意に増加させた（ｐ＝０．００１）。
【０１２８】
高周波刺激後ベースラインを分析すると、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］処置は、高濃度でＬＴＰの増強と関連した（図７Ｂ）。二元配置分散分析において、時間の有意な影響はなかった（ｐ＝０．８２４）。しかし、０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇでの本発明のペプチド類似体の投与は、生理食塩水で処置されたマウスと比較して、ＬＴＰの誘導の減少と関連した（Ｐ＜０．０００１）。２．５ｎｍｏｌ／ｋｇおよび２５ｎｍｏｌ／ｋｇでは、時間の有意な影響はなかった（ｐ＞０．９９９）。しかし、ペプチド類似体処置は、両濃度でＬＴＰの誘導能を有意に増加させ（Ｐ＝０．０００１）、２．５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でわずかに優れた効果が観察された。
【０１２９】
高周波刺激後ベースラインを分析すると、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ処置は、高濃度でＬＴＰの増強と関連した（図７Ｃ）。二元配置分散分析において、生理食塩水で処置されたマウスと比較して、時間の有意な影響はなく（ｐ＞０．９９９）または０．２５ｎｍｏｌ／ｋｇでのペプチド類似体の有意な効果はなかった（ｐ＝０．３９５）。２．５ｎｍｏｌ／ｋｇでは、時間の有意な影響はなかった（ｐ＞０．９９９）。しかし、本発明のペプチド類似体による処置は、ＬＴＰの誘導能を有意に増加させ（Ｐ＝０．０００８）、一方で２５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量による処置は有意な経時的効果（ｐ＝０．００５５）、およびペプチド類似体（ｐ＜０．０００１）と関連した。
【０１３０】
実施例８
運動機能および不安に対する処置の急性効果
自発運動行動および不安に対する薬物の急性効果を評価するために、野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスに、オープンフィールドアリーナに導入される３０分前に、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］を注射した。経路長（図８Ａ）、ラインクロス（図８Ｂ）および速度（図８Ｃ）は、処置群と無処置群との間でほとんど同様であったが、ＡＰＰ／ＰＳ１  Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたマウスは例外的に、生理食塩水で処置された野生型マウスと比較して経路長、ラインクロスおよび速度で有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスも、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりラインクロスが有意に多かった（ｐ＜０．０５）。リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの立ち上がり行動（図８Ｄ）は、リラグルチドで処置された野生型群を除くすべてと比較して、有意に減少した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０００１）。さらに、リラグルチドで処置された野生型マウスにおける立ち上がり行動は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１群と比較して、有意に減少した（ｐ＜０．０５）。毛づくろいイベント数（図８Ｅ）および５分間に排出された糞塊数（図８Ｆ）は、遺伝子型または処置群にわたり有意差がなかった。しかし、アリーナ中央での滞在時間は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスでは有意に減少しており（ｐ＜０．０５）、ＡＰＰ／ＰＳ１モデルにおける急性リラグルチド投与後の不安レベルの増加を示唆する（図８Ｇ）。
【０１３１】
実施例９
認識記憶に対する処置の急性効果
図９に示すように、場所選好は野生型（Ａ）またはＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Ｂ）のいずれでも明瞭でなかった。場所選好は、物体認識課題の習得段階中の、同じ物体の探索で費やした時間に基づいて算出される。場所選好の評価によって、物体に対する選好が装置内のそれらの位置によって影響を受けることを除外できる。生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の急性投与に応答する物体認識記憶を、図１０に示す。野生型マウスのすべての群（図１０Ａ）は、完全な認識記憶を示し、見慣れた物体よりも新規の物体を優先的に探索した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０００１）。対照的に、ＡＰＰ／ＰＳ１群（図１０Ｂ）のいずれも新規物体と見慣れた物体とを識別できず、ＡＰＰ／ＰＳ１モデルにおいて処置開示時点で明らかに認識記憶が損なわれていることを示している。
【０１３２】
実施例１０
空間学習および記憶に対する処置の慢性効果
モリス水迷路訓練を、８週間の処置の後に開始した。動物は、行動に関する試験の間、処置を続けて受けた。動作に対する急性薬物影響の可能性を排除するために、訓練は毎日０９：００時に始まり、薬物は１５：００時に投与された。モリス水迷路課題の習得段階の間に、動物は４日連続して１日当たり４試験を完了した。野生型マウスの平均の一日の動作を図１１に示す。二元配置反復測定分散分析は、生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスにおいて習得段階で有意差がないことを示した。逃避潜時（図１１Ａ）は予想どおり、経時的に有意に低下した（ｐ＜０．０００１）が、しかし薬物は、観察された逃避潜時に影響を及ぼさなかった（ｐ＝０．４４６３）。逃避潜時に一致して、経路長（図１１Ｂ）は野生型マウスの処置群間で有意差がなかった（ｐ＝０．２４）が、しかし経路長は経時的に低下した（ｐ＜０．０００１）。速度（図１１Ｃ）は、薬物処置によって有意に変わらなかった（ｐ＝０．７１）が、しかし速度は経時的に不定であった（ｐ＝０．００２２）。
【０１３３】
空間記憶を、最終訓練セッションの２４時間後に、５日目にプローブ試験で評価した（図１２）。生理食塩水で処置された野生型マウスにおいて、一元配置分散分析は、象限間に有意差があることを示した（ｐ＜０．０００１）。ダネットの多重比較事後検定は、生理食塩水で処置された野生型マウスが反時計回り象限（ＣＣＷ；ｐ＜０．００１）、向かい側の象限（ＯＰＰ；ｐ＜０．０００１）および時計回り象限（ＣＷ；ｐ＜０．０５）よりも目標象限での滞在時間が有意に長かったことを示し、完全な空間記憶を示す。リラグルチドで処置された野生型マウスは、象限間で有意差を示した（ｐ＝０．００１８）。事後分析は、リラグルチドで処置されたマウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．０５）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．０１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．０１）よりも有意に長い時間を目標象限で滞在したことを示した。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスは、象限間で有意差を示した（ｐ＝０．０００８）。ダネットの多重比較事後検定は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．０１）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．０５）およびＣＷ象限（ｐ＜０．００１）よりも有意に長い時間、目標象限に滞在したことを示した。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型のマウスも、象限間で有意差を示した（ｐ＝０．０００５）。ダネットの事後検定は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．０５）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．００１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．０１）よりも有意に長い時間、目標象限に滞在したことを示した。合わせてこれは、モリス水迷路における野生型マウスの空間記憶が、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］での長期処置によって影響を受けないことを示している。
【０１３４】
空間視力を、訓練の間に逃避プラットフォームが位置していた正確な位置での遊泳に費やされた時間の長さを測定することによって評価した（図１３）。野生型処置群の間で有意差は観察されなかった。
【０１３５】
モリス水迷路課題の習得段階でのＡＰＰ／ＰＳ１マウスの平均の一日の動作を図１４に示す。全体的な二元配置反復測定分散分析は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて逃避潜時（図１４Ａ）が薬物治療によって有意に影響を受け（ｐ＝０．０２８０）、経時的に有意に減少する（ｐ＜０．０００１）ことを示した。テューキーの多重比較検定は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスまたはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたマウスにおいて観察される相違はなく、生理食塩水で処置された群と、リラグルチドで処置された群との間の逃避潜時における全体的な相違（ｐ＜０．０５）を強調した。全体的な二元配置反復測定分散分析は、経路長が薬物（ｐ＝０．０２５２）および時間（ｐ＜０．０００１）によって有意に影響を受けたことを示した。テューキーの多重比較事後検定は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス全体と比較すると、経路長がリラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて有意に減少したことを示した（図１４Ｂ、ｐ＜０．０５）。遊泳速度の分析に関して、全体的な二元配置反復測定分散分析は、薬物処置（ｐ＝０．０２７７）および時間（ｐ＝０．０００８）がＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて有意に影響したことを示した。テューキーの多重比較検定は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの遊泳速度における全体的な違いを示した（ｐ＜０．０５）。毎日の分析は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたマウスが３日目に、生理食塩水で処置されたマウスよりも遊泳が有意に遅く、およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスが４日目に、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、遊泳が有意に遅かったことを示した（図１４Ｃ、ｐ＜０．０１）。
【０１３６】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの空間記憶を、最終訓練セッションの２４時間後の５日目に行ったプローブ試験で評価した。逃避プラットフォームを除去し、空間記憶を、目標象限内で遊泳に費やされた時間のパーセンテージを用いて評価した（図１５）。生理食塩水で処置された（図１５Ａ、ｐ＝０．２９３４）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された（図１５Ｃ、ｐ＝０．４４７０）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された（図１５Ｄ、ｐ＝０．１４９２）ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、一元配置分散分析は、プローブ試験中の各象限での滞在時間の間に統計的に有意差がないことを示し、空間記憶の機能障害を示している。リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、プローブ試験中の各象限での滞在時間の間で有意な相違を示した（ｐ＝０．００３６）。ダネットの事後の分析は、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．０５）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．０１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．０５）よりも有意に長い時間、目標象限に滞在したことを示し、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて空間記憶が長期にわたるリラグルチド処置によって回復したことを示す。正確な目標領域での滞在時間の長さは、空間視力においてＡＰＰ／ＰＳ１群のいずれの間でも有意差がないことを示した（図１６）。
【０１３７】
実施例１１
逆転学習および記憶に対する処置の慢性効果
逆転水迷路課題の習得段階の間の野生型マウスの平均の一日の動作を、図１７に示す。モリス水迷路とは異なり、逆転訓練段階における逃避潜時は、薬物処置によって有意に影響を受けた（ｐ＝０．００１）。テューキーの多重比較検定は、生理食塩水で処置された野生型マウスと、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスとの間の逃避潜時において全体的に有意な違いがあることを示した。二元配置反復測定分散分析は、予想どおり、逃避潜時（図１７Ａ）が経時的に有意に低下したことを示した（ｐ＜０．０００１）。逃避潜時と一致して、経路長（図１７Ｂ）は野生型処置群間で全体的に有意に異なっており（ｐ＝０．０００４）、予想どおり、経時的に低下した（ｐ＜０．０００１）。ダネットの多重比較事後検定は、リラグルチドで処置された野生型マウス（ｐ＜０．０１）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７０ＰＡＬ］で処置された野生型マウス（ｐ＜０．０００１）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウス（ｐ＜０．０５）の逃避プラットフォームへの経路長が生理食塩水で処置された野生型マウスと比較して、有意に減少したことを明らかにした。全体として、速度も薬物処置によって有意に変化した（ｐ＝０．０２６３）が、訓練日による影響を受けなかった（ｐ＝０．１２７６）。ダネットの多重比較試験は、生理食塩水で処置された野生型マウスと、リラグルチドで処置された野生型マウスとの遊泳速度の有意差を明らかにした（図１７Ｃ）。
【０１３８】
空間記憶は、５日目の最後の訓練セッションから２４時間後に行われた逆転プローブ試験で評価された（図１８）。生理食塩水で処置された野生型マウスにおいて、一元配置分散分析は、象限間に有意差があることを示した（ｐ＜０．００３７）。ダネットの多重比較事後検定は、生理食塩水で処置された野生型マウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．０５）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．０１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．０１）よりも目標象限に有意に長い時間、滞在したことを示し、完全な逆転記憶を示した。リラグルチドで処置された野生型マウスは、象限間で有意差を示した（ｐ＝０．０００８）。事後分析は、リラグルチドで処置された野生型マウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．０１）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．００１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．０５）よりも目標象限に有意に長い時間、滞在したことを示した。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスも、象限間で有意差を示した（ｐ＜０．０００１）。ダネットの事後検定は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．００１）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．０００１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．０１）よりも目標象限に有意に長い時間、滞在したことを示した。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスも、象限間で有意差を示した（ｐ＝０．００１７）。ダネットの多重比較事後検定は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスがＯＰＰ象限よりも目標象限に有意に長い時間、滞在したことを示した（ｐ＜０．００１）。合わせてこれは、野生型マウスの空間記憶がリラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］での長期処置によって明らかに最小限の影響を受けることを示している。
【０１３９】
空間視力を、逃避プラットフォームが位置していた正確な位置での遊泳に費やされた時間の長さを測定することによって評価した（図１９）。野生型処置群の間で有意差は観察されなかった。
【０１４０】
逆転水迷路課題の習得段階の間のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの平均の一日の動作を、図２０に示す。全体的な二元配置反復測定分散分析は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける逃避潜時（図２０Ａ）が薬物処置によって有意に影響を受け（ｐ＜０．０００１）、ならびに経時的に有意に減少する（ｐ＜０．０００１）ことを示した。ダネットの多重比較検定は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスと比較したとき、リラグルチドで処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０００１）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置したＡＰＰ／ＰＡ１マウス（ｐ＜０．０５）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．００１）間の逃避潜時における全体的な相違を強調した。経路長の全体的な二元配置反復測定分散分析は、有意差が薬物（ｐ＝０．０３６４）および時間（ｐ＜０．０００１）と関連したことを示した。テューキーの多重比較検定は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスと比較して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたマウス、またはＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたマウスにおいて有意差がないことを示した。リラグルチドで処置されたマウスと、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたマウスとの間で有意差を特定した。遊泳速度の分析では、全体的な二元配置反復測定分散分析は、処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて逆転水迷路訓練での遊泳速度に対する薬物処置の有意な影響があり（ｐ＝０．００９８）、かつ遊泳速度が数日にわたり有意に異なった（ｐ＝０．０４９７）ことを示した。テチューキーの多重比較検定は、生理食塩水で処置されたマウスと比較して、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたマウスの遊泳速度における全体的な相違を示した（図２０Ｃ；ｐ＜０．０５）。プローブ試験において、各象限において費やされた遊泳時間を用いて、空間記憶を決定した。生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、一元配置分散分析は各象限に滞在した時間の間に有意差がないことを示し（ｐ＝０．２２９２）、空間記憶が損なわれたことを示した。リラグルチドで処置されたマウスは、各象限間で有意差を示した（ｐ＜０．０００１）。テューキーの事後分析は、リラグルチドで処置されたマウスがＣＣＷ象限（ｐ＜０．００１）、ＯＰＰ象限（ｐ＜０．０００１）およびＣＷ象限（ｐ＜０．００１）象限よりも目標象限に有意に長い時間、滞在したことを示した。一元配置分散分析は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによるそれぞれの象限での滞在時間における有意な変動を示した（ｐ＝０．０１９４）。テューキーの多重比較事後検定は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスがＣＣＷ象限よりも目標象限で有意に長い時間、滞在したことを示した（ｐ＜０．０５）。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスも、各象限間で有意差を示した（ｐ＝０．００７３）。ダネットの多重比較事後検定は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスがＣＷ象限よりもＣＣＷ象限において滞在時間が有意に短いことを示した（ｐ＜０．０５）。合わせてこれは、逆転水迷路課題においてリラグルチド処置は逆転学習および記憶の改善と関連するが、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］は学習を改善するが記憶を改善しないことを示している。正確な目標領域での滞在時間の長さの分析は、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスが生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスよりも正確なプラットフォーム位置で有意に多い時間（ｐ＜０．０５）を費やしたことを示した（図２１）。
【０１４１】
実施例１２
運動機能および不安に対する処置の慢性効果
経路長（図２２Ａ）およびラインクロス（図２２Ｂ）は、大部分は処置群と無処置群との間で同様であったが、例外はＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスであり、それらは生理食塩水で処置された野生型マウス（ｐ＜０．０５）、リラグルチドで処置された野生型マウス（ｐ＜０．０５）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウス（ｐ＜０．０１）とＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウス（ｐ＜０．００１）、および生理食塩水で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０５）と比較して経路長の有意な増加を示した。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによるラインクロスは、野生型マウスのすべての群と比較して、有意に増加した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０１）。速度（図２２Ｃ）、立ち上がり行動（図２２Ｄ）、毛づくろい回数（図２２Ｅ）、５分間に排出された糞塊数（図２２Ｆ）、および中心／周辺比率（図２２Ｇ）は、遺伝子型または投与群にわたり有意差がなかった。
【０１４２】
実施例１３
認識記憶に対する処置の慢性効果
生理食塩水、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の長期投与に対する反応での物体認識記憶を図２３に示す。各薬物の急性投与後、野生型マウス（Ａ）のすべての群は、ベースラインで観察されたのと同様に、完全な認識記憶を示し新規物体を優先して探索した（ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．００１）（図１０Ａ）。しかし、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるリラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］での長期処置は、ベースラインで損なわれていた物体認識記憶を回復させた（図１０Ｂ）。リラグルチドで処置されたマウス（ｐ＜０．００１）およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたマウス（ｐ＜０．０５）は双方とも、見慣れた物体よりも新規の物体の探索に有意に多くの時間を費やした。生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、新規物体の探究に多くの時間を費やさなかった。
【０１４３】
実施例１４
免疫組織化学
Ａβプラーク負荷
図２５に示すように、Ａβプラーク負荷についてのクラスカル・ウォリス分析は、群間の有意差を示した（ｐ＜０．０００１）。ダネットの多重比較事後検定は、プラーク負荷が、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図２５Ａ、ｐ＜０．０００１）と比較して、リラグルチド処置（図２５Ｂ、３９％減少）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］処置（図２５Ｃ、２７％減少）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置（図２５Ｄ、２９％減少）によって有意に減少したことを明らかにした。リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスも、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、プラーク負荷を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）。コンゴーレッド染色およびその後の数量化の代表的な画像を図２６に示す。Ａβプラーク負荷における有意な減少と一致して、高密度コアコンゴーレッド親和性プラークも、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図２６Ａ、ｐ＜０．０００１）と比較すると、リラグルチド処置（図２６Ｂ、４３％減少）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］処置（図２６Ｃ、４５％減少）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置（図２６Ｄ、５７％減少）によって有意に大きく減少した。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置は、高密度コアコンゴーレッド親和性プラーク負荷の減少においてリラグルチドより有意に高い有効性を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１４４】
ミクログリア
処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質（図２７）および歯状回（図２８）におけるＩｂａ１染色を示す代表的な顕微鏡写真を示す。数量化（図２９）は、生理食塩水で処置された野生型と比較して、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質においてＩｂａ１染色が有意に増加した（図２９Ａ、ｐ＜０．０００１）のに対して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図２９Ｅ）と比較して、皮質におけるＩｂａ１染色が有意に減少した（図２９Ｆ、ｐ＜０．０００１）ことを示した。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質では、Ｉｂａ１染色は、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、有意に増加した（図２９Ｇ、ｐ＜０．０００１）。生理食塩水で処置された野生型対照マウス（図２９Ａ）と比較して、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回においてＩｂａ１レベルが有意に増加した（図２９Ｅ；ｐ＜０．０００１）。生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスと比較して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回においてＩｂａ１レベルが有意に低下した（図２９Ｆ；ｐ＜０．０１）。生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスと比較して、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回においてＩｂａ１免疫陽性が、有意に増加した（図３０Ｇ、ｐ＜０．０００１）。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による１０週間の処置は、いずれの脳領域においてもＩｂａ１レベルに対する有意な効果がなく（図２９）、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］  処置がＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質（図２７Ｈ）または歯状回（図２８Ｈ）においてミクログリアのレベルに対して効果がなかったことを示している。
【０１４５】
アストロサイト
処置された野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの大脳皮質（図３０）および歯状回（図３１）におけるＧＦＡＰ染色を示す代表的な顕微鏡写真を示す。数量化（図３２）は、生理食塩水で処置された野生型と比較して、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの皮質においてＧＦＡＰ染色が有意に増加した（図３２Ａ、ｐ＜０．０００１）のに対して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、生理食塩水を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図３０Ｅ）と比較して、皮質においてＧＦＡＰレベルが有意に低下した（図３２Ｆ、ｐ＜０．０００１）ことを明らかにした。歯状回における（図３１Ｂ）ＧＦＡＰ免疫陽性の数量化は、生理食塩水で処置された野生型（図３１Ａ）マウスと比較して、生理食塩水を投与されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスがＧＦＡＰ染色を有意に増加させた（図３１Ｅ、ｐ＜０．０５）ことを示した。歯状回でのＧＦＡＰ染色は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図３２）においていずれの処置によっても有意に影響されなかった。
【０１４６】
神経発生
生理食塩水で処置された野生型マウス（図３３Ａ、ｐ＜０．００１）とＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図３３Ｅ、ｐ＜０．０００１）、およびリラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図３３Ｆ、ｐ＜０．０００１）、およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］  で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図３３Ｇ、ｐ＜０．０００１）と比較して、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型マウス（図３３Ｄ）において神経発生のレベルが有意に増強された。リラグルチドで処置された野生型マウス（図３３Ｂ）は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．００１）、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０１）およびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０５）と比較して、神経発生が増強された。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された野生型マウスは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０１）およびリラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０５）と比較して、神経発生の増強を示した。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ）で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（図３３Ｈ）は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０１）およびリラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０５）と比較して、神経発生の増強を示した。
【０１４７】
シナプス密度
野生型群（図３５）およびＡＰＰ／ＰＳ１群（図３６）におけるシナプトフィジン染色の代表的な顕微鏡写真を示す。シナプトフィジン（図３７）のレベルの数量化は、野生型マウスは海馬のすべての層においてＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもシナプトフィジンの光学密度が有意に上昇したことを示す（図３７Ａ〜Ｆ、ｐ＜０．０５〜ｐ＜０．０００１）。野生型マウスのすべての群においてシナプトフィジン染色は、皮質内層（Ｇ）および皮質外層（Ｈ）において、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも有意に大きかったが、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたマウスでのレベルは野生型対照マウスと同等であった。リラグルチドで処置されたマウスは、多形層（Ａ、ｐ＜０．０１）、分子層（Ｃ、ｐ＜０．０５）、錐体細胞層（Ｅ、ｐ＜０．０００１）および皮質内層（Ｇ、ｐ＜０．０００１）と皮質外層（Ｈ、ｐ＜０．０００１）において、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもシナプトフィジンレベルが有意に高かった。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、多形層（Ａ、ｐ＜０．０００１）、錐体細胞層（Ｅ、ｐ＜０．０００１）および皮質内層（Ｇ、ｐ＜０．０００１）と皮質外層（Ｈ、ｐ＜０．０００１）において、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりも発現レベルが有意に高かった。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、多形層（Ａ、ｐ＜０．０５）、錐体細胞層（Ｅ、ｐ＜０．０１）および皮質内層（Ｇ、ｐ＜０．０００１）と皮質外層（Ｈ、ｐ＜０．０００１）において、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスよりもシナプトフィジン発現レベルが有意に高かった。
【０１４８】
可溶性Ａβ
図３８Ａに示すように、総脳ＡＰＰレベルは、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスと比較したとき、一元配置分散分析（ｐ＝０．３９８１）によって分析して、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の１０週間の投与によって変化しなかった。これとは反対に、一元配置分散分析は、可溶性Ａβオリゴマーのレベルにおいて、処置群間の高い有意差を明らかにした（図３８Ｂ、ｐ＝＜０．０００１）。テューキーの多重比較検定は、Ａβオリゴマーレベルが、生理食塩水で処置された対照と比較してリラグルチド（ｐ＜０．０５）、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（ｐ＜０．０００１）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（ｐ＜０．０００１）処置によって有意に減少したことを示した。さらに、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］（ｐ＜０．０５）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］（ｐ＜０．０５）処置は、リラグルチド処置に対する応答で観察されたものと比較して、可溶性オリゴマーレベルの減少が優れていたことと関連した。Ａβ１−４０の脳レベル（図３８Ｃ）も、処置に応答して有意に変わり（ｐ＝０．００１２）、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析によって示された。ダネットの多重比較事後検定は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０１）およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウス（ｐ＜０．０１）と比較して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡβ１−４０レベルの有意な増加を明らかにした。通常の一元配置分散分析は、処置に応答してＡβ１−４２（図３８Ｄ）のレベルに有意差がないことを示した（ｐ＝０．２４１９）。アミロイド−β（Ａβ）４２／４０の比率は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの処置によって、有意に影響を受けた（ｐ＝０．００５６、クラスカル・ウォリス共分散分析）。ダネットの多重比較検定は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１対照マウスと比較して、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける有意な減少を明らかにした（ｐ＜０．０１）。
【０１４９】
本開示は、アルツハイマー病のＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおける、それぞれ消化管ホルモングルカゴン様ペプチド−１の長時間作用型性類似体、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドおよびｘｅｎｉｎ−２５である、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による８〜１０週間の処置の効果を示す。認知機能は、新規物体認識およびモリス水迷路課題を使用して測定した。可溶性および不溶性アミロイド−β負荷、炎症、シナプス密度および神経発生に対する処置の効果は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび野生型マウスの脳内で評価した。リラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて認知能力を改善し、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］と共に、脳中のアミロイド−β負荷を減少させた。リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による１０週間の処置の後、リラグルチドは脳中の炎症を寛解させシナプス密度をＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬と皮質において回復させた。さらに、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置は野生型マウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回中でダブルコルチン陽性ニューロンの数を増加させ、このペプチドが神経発生を増強したことを示唆した。これらの結果は、リラグルチドの神経保護作用を強調し、さらにＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］が神経保護特性を有するという新規エビデンスを示す。
【０１５０】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける長期にわたるリラグルチド処置はモリス水迷路の習得段階での空間学習を改善し、空間記憶もまたリラグルチド処置の後で回復された。リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による長期処置は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて逆転学習も回復させたのに対して、逆転記憶の回復はリラグルチドによってのみ改善された。認知機能に対するこれらの有益な効果は、シナプス可塑性に対するリラグルチドのプラス効果に関連があるように見える。リラグルチドが学習と記憶を改善するという発見は、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスによる逆転水迷路課題において動作が増強されたことを示す、本明細書に記載する結果によりさらに裏づけられる。加えて、逆転プローブ試験における正確な目標領域での滞在時間、すなわち空間視力の測定は、リラグルチドで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて有意に上昇し、認知動作に対するリラグルチドの確固とした効果を強調している。本開示は、逆転学習が、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて改善されたことも示す。
【０１５１】
本開示は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］はＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、わずかではあるが、プラス効果も有するというさらなるエビデンスを示す。本明細書で例示するデータは、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］が認知障害ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて逆転学習を増強したことを示す。Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］はＮＴＲ１を介してその効果を発揮するので、本明細書に記載の逆転学習の改善はおそらく、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による中心的ＮＴＲ１の活性化を表す。逆転水迷路の良好な学習が必要とする認知柔軟性は、脳のいくつかの領域、例えば嗅内皮質、海馬および前頭前皮質、ＮＴＲ１が発現される領域内の活性に依存する。海馬および皮質分野におけるＮＴＲ１の調節は、本明細書に例示する逆転学習の増強を説明し得る。認識記憶障害は、生理食塩水で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて明らかであり、リラグルチドによる長期処置の後で回復された。同様に、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］処置も、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて認識記憶を回復した。
【０１５２】
１０週間のリラグルチド処置は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいてＡβ免疫陽性および高密度コアプラークの数を減少させた。Ａβ沈着およびプラーク数の有意な減少は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置された、およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて検出された。本開示に記載の結果は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］による脳中のニューロンのＮＴＲ１の活性化、細胞内カルシウムの上昇およびホスホリパーゼＣとＡ２の刺激、ＰＫＣの活性化、αセクレターゼＡＰＰ切断の促進およびそれに続くＡβ産生と沈着の減少によって開始される一連のイベントの結果を表し得る。
【０１５３】
上記の免疫組織化学データは、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７） ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中の可溶性Ａβオリゴマーの減少を示す、生化学データによって裏づけられる。さらに、リラグルチドによる処置は、Ａβ４２／４０の比率を低下させた。Ａβ４２レベルは各処置群間で差がなかったので、変化したＡβ４２／４０の比率は、リラグルチドで処置された動物における非毒性Ａβ４０の相対的増加による可能性が最も高い。合わせて、これは、リラグルチド処置がＡＰＰプロセシングを修正することによってＡβオリゴマーおよびプラーク沈着を減少させたのに対して、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置は代替機構を介してアミロイド負荷を減少させたことを示唆する。１つの可能性は、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］がＡβクリアランスと分解を増強したことであり、これは、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳中のミクログリアが増加したという調査結果によって裏づけられる１つの説である。ミクログリアは活発にＡβを貪食し分解すると知られていることを考慮に入れると、本明細書に示すＡβ沈着および可溶性オリゴマー負荷の減少が貪食ミクログリアの活性化と動員の増加によると提案することは、不合理ではない。
【０１５４】
神経発生は、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置された野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回で増加した。本開示において、リラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］は、歯状回におけるダブルコルチン陽性ニューロンの数を適度に増やしたが、しかし、生理食塩水で処置された対照と比較すると、差は有意ではなかった。これは、リラグルチドおよびＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］が歯状回において未熟ニューロンの数を増加させたが、海馬の神経発生は、野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］の処置後に着実に増えたことを示す。これは以前に未報告の発見である。
【０１５５】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて明白だった海馬および皮質シナプス密度の減少は、リラグルチド、ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬の多形層と錐体細胞層において、および大脳皮質において改善された。
【０１５６】
本開示は１０週間の間７月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを処置し、これは多形層、分子層および錐体細胞層、ならびに大脳皮質においてシナプトフィシン染色を増加させ、脳のこれらの特定の領域がリラグルチドによってより容易に修正されるシナプスを含むことを示唆する。処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスの顆粒層、放線状層および多形細胞層においてシナプトフィジンレベルは低いままであり、これらの結果は、Ａβ症状に関連したシナプス毒性効果に対して、これらの領域でのシナプスの脆弱性の増加を反映し得る。本開示のＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］処置は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの多形層、錐体細胞層および皮質においてシナプス密度を増加させた。本開示は、初めて、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］処置が多形層、錐体細胞層および大脳皮質においてシナプトフィジン染色を増加させたことも示す。本開示の結果は、初めて、Ｘｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］が認知機能を改善し、神経発生とシナプス密度を増強し、かつＡＤのＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおけるＡβ症状を寛解させることを示す。本開示は、リラグルチドがＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて認知障害および神経病理を着実に寛解させることを示した。ＮＡｃＧＩＰ［Ｌｙｓ（３７）ＰＡＬ］およびＸｅｎｉｎ−２５［Ｌｙｓ（１３）ＰＡＬ］も、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて可溶性および不溶性アミロイド負荷を軽減しかつ適度に認知機能を改善したことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月31日(2018.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019512471.tif 000043
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