(57)【要約】  イノシシ属（Ｓｕｓ）免疫系をプライミングする方法を開示する。該方法は、有効量のマイコバクテリウム全細胞溶解物を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する工程を含む。
2019522659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシシ属（Ｓｕｓ）の免疫系をプライミングする方法であって
マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）より調製する、請求項１の方法。
【請求項３】
マイコバクテリウム全細胞溶解物が、精製を経ていない、請求項１または請求項２の方法。
【請求項４】
マイコバクテリウム全細胞溶解物が未分画である、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱脂質化されていない、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
【請求項６】
マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱タンパク質化されていない、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
投与が、経口、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、皮内、眼内、肺内、鼻内、経皮、真皮下、局所、粘膜、鼻、皮膚への圧、膣内、子宮内、子宮頸部内、および直腸からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
投与が粘膜である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
投与が鼻内である、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を薬学的に許容されうるキャリアーと合わせる、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、イノシシ属体重キログラムあたり、約０．００００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、イノシシ属体重キログラムあたり、約１〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、イノシシ属体重キログラムあたり、約１〜約２５０μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、イノシシ属体重キログラムあたり、約１〜約１２５μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約０．０００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約３００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回用量として投与する、請求項１〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回単位用量として投与する、請求項１〜１９のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を多数回用量治療計画で投与する、請求項１〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
用量あたりの体積が、用量あたり約０．００１〜約５０ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
用量あたりの体積が、用量あたり約０．０１〜約２５ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
用量あたりの体積が、用量あたり約０．１〜約１０ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項２５】
用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約５ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約２ｍＬである、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、誕生直後から約１時間齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項２８】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１時間〜約２４時間齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項２９】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２４時間〜約１週齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項３０】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１週〜約１ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項３１】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１ヶ月〜約２ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項３２】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２ヶ月〜約３ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項３３】
マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約３ヶ月〜約４ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、請求項１〜２６のいずれか一項の方法。
【請求項３４】
イノシシ属免疫系のプライミングが、白血球プライミングを含む、請求項１〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３５】
イノシシ属免疫系のプライミングが、Ｔ細胞プライミングを含む、請求項１〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３６】
イノシシ属免疫系のプライミングが、単球プライミングを含む、請求項１〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３７】
イノシシ属免疫系のプライミングが、マクロファージプライミングを含む、請求項１〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３８】
イノシシ属免疫系のプライミングが、肺胞マクロファージプライミングを含む、請求項１〜３３のいずれか一項の方法。
【請求項３９】
プライミングされた肺胞マクロファージが、刺激に反応してＴＮＦ−アルファ産生の増進を示す、請求項１〜３８のいずれか一項の方法。
【請求項４０】
イノシシ属がブタである、請求項１〜３９のいずれか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
呼吸器感染は、約１９〜６８日の範囲の育成期（ｎｕｒｓｅｒｙ  ａｇｅ）の仔ブタの死亡の主因であり、養豚産業に多大な経済的損失を生じる１。例えば、ブタ繁殖呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、世界中のブタの慢性ウイルス性疾患である。ＰＲＲＳは、大部分の養豚を行う国々の風土病であり、そして養豚産業に対する大きな経済的損失の原因となっており、概算年間損失は、米国において、６億６４００万ドルである２。ＰＲＲＳの臨床的徴候は、呼吸器および生殖器機能不全を含み、そして原因病原体はＰＲＲＳウイルス（「ＰＲＲＳＶ」）である３。ＰＲＲＳＶは、生後２日という早い時期から、ブタ免疫系を調節することによって疾患を確立し、そして感染後、数週間続く４。
【０００２】
仔ブタのワクチン接種は、呼吸器感染と闘うために一般的に用いられる戦略である；しかし、ワクチン接種アプローチで新生仔保護を達成しようとする試みは、無効と見なされている５。新生仔で免疫化を成功させるためには、新生仔免疫系が未成熟である結果、困難が生じ、こうした未成熟な免疫系は、細胞傷害性Ｔ細胞ならびにＩＦＮ−ガンマ産生Ｔ細胞（すなわちＴヘルパー（Ｔｈ）１細胞）を伴う細胞仲介性免疫反応を生じる能力が限定されていることが知られている。その結果、ウイルスを含む細胞内病原体に対する防御は無効である６。新生仔抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）、リンパ球、および適応免疫の発展に関与する自然免疫系の他の細胞の能力の代表的な報告は、マイトジェンに対する限定された反応、サイトカイン・プロファイルの相違、解剖学的構造の発展の欠如、および適切でそして防御性である適応免疫反応の発展に必要な膜受容体発現の相違を示す７。
【０００３】
ワクチン接種に対する適切な適応免疫反応を可能にするために必要な自然免疫系が新生仔では不適切であることは、量および質両方に関して、ワクチン誘導性抗体反応が損なわれていることによって明らかになる８。この状態は、新生ブタがワクチン接種された週齢に応じた、ブタインフルエンザウイルス（「ＳＩＶ」）に対するワクチン接種への抗体反応の度合いの相違によって立証される。１週齢で最初にワクチン接種された仔ブタは、２回目のワクチン接種後、４または８週齢で最初にワクチン接種されたブタよりも、より低い最大抗体力価を発展させ、そしてより早く血清陰性となる９。同様に、３週齢でブタ・サーコウイルス病（「ＰＣＶＤ」）に対してワクチン接種された仔ブタは、１週齢でワクチン接種されたブタよりもこのウイルスに対してよりよく保護された１０。したがって、新生ブタワクチン学における主な困難の１つは、自然免疫系の未刺激（プライミングされていない）状態が、抗微生物防御免疫を提供するために十分な質および強度の適応免疫反応の発展を可能にするような、Ｔ細胞活性化のための適切なシグナル伝達ならびに最適なサイトカイン環境を提供することができないため、生物製剤が、一生の早い時期に、適切な防御免疫を誘発することが不可能であることである。
【０００４】
新生ブタの免疫系は十分に成熟していないため、ワクチンによって提供される抗原性刺激に対して適切な適応免疫反応を発展させる用意ができるまでには、生後数週間を要する。その結果、新生肺は、空気感染病原体に対する防御のため、自然免疫系に大きく依存する。現在、ブタのウイルスまたは細菌呼吸器感染のための完全に有効なワクチンまたは療法は存在しない。しかし、これらの問題に取り組むため、異なるアプローチが試みられてきている。
【０００５】
これらの問題に取り組もうとする１つのアプローチは、新生仔自然免疫経路の発展を促進することによって、その成熟および機能性を加速させるであろう、該経路を活性化する、非侵害性だが免疫刺激性の物質を投与することである。新生ブタの自然免疫系の発展を促進するために調べられてきた戦略には、酵母細胞壁の構成要素であるベータ−グルカンでの、または異なる植物抽出物での食餌補充が含まれる１１。全身性の免疫刺激効果の刺激を示す結果が報告されてきているが、食餌補充は、その効果のため、気道に存する自然免疫系の細胞において、直接ターゲティングを行わない。
【０００６】
食餌補充に加えて、別のアプローチは、気道に存する自然免疫の細胞を直接プライミングする。例えばマクロファージおよび樹状細胞を含む、自然免疫系の細胞は、防御免疫を仲介する際に、または抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）として、直接的な役割を果たす。ヒトにおいて、生細菌であるカルメット・ゲラン桿菌（「ＢＣＧ」）が、通常、ヒトの誕生時に投与され、強いＴｈ１型免疫反応を誘導可能である。いかなる理論によっても束縛されることなしに、ＢＣＧワクチンの有効性は、この微生物が、ＡＰＣによって発現される多数のｔｏｌｌ様受容体（「ＴＬＲ」）に結合し、その結果、炎症促進性サイトカインを産生し、そしてＴｈ１免疫の発展を促進する能力によると考えられる。
【０００７】
これらの問題に取り組もうとする別のアプローチは、限定されるわけではないが、アクネ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）の熱不活性化またはホルムアルデヒド処理懸濁物、微生物多糖、リポ多糖、タンパク質結合型多糖、ムラミル−ジペプチド、脂質Ａ、ならびに脱タンパク質化および脱脂質化マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）を含む、免疫調節剤として用いられる、微生物産物の注射による投与である。例えば、米国特許第４，７４４，９８４号（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ，  Ｉｎｃ．）は、動物およびヒトにおけるウイルス感染を治療する方法であって、動物またはヒトに、油および水エマルジョン中の脱タンパク質化細菌懸濁物を注射する工程を含み、そして該細菌細胞壁懸濁物が、マイコバクテリウム属種から得られうる、前記方法を開示する。米国特許第５，７５９，５５４号（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ，  Ｉｎｃ．）は、ヒトまたは動物において、免疫系を刺激する方法であって、ヒトまたは動物に、油を含有しない不溶性細菌細胞壁分画の水性懸濁物を投与する工程を含み、そして該不溶性細菌細胞壁分画が、マイコバクテリウム種から調製され、そして分画から脂質を抽出するように処理される、前記方法を開示する。米国特許第６，８９０，５４１号（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）は、新生動物の免疫系を活性化して、動物の産生能を増進するための方法であって、新生動物にマイコバクテリウム属細胞壁抽出物を投与する工程を含む、前記方法を開示する。
【０００８】
しかし、不運なことに、米国特許第４，７４４，９８４号、第５，７５９，５５４号、および第６，８９０，５４１号に開示される方法は、重大な欠点を有する。１つの欠点は、細胞壁懸濁物、細胞壁分画または細胞壁抽出物の投与は、潜在的に、他の戦略ほど有効でないことである。例えば、細胞壁懸濁物、細胞壁分画または細胞壁抽出物の投与は、細胞壁コア構成要素のみに限定され、そしてマイコバクテリウム・エンベロープの外葉に存在するいかなる構造構成要素も含む可能性は低い。細胞壁構造は、マイコバクテリウム・エンベロープのわずかな部分のみである。いかなる理論にも束縛されることなく、マイコバクテリウム・エンベロープの外葉に存在する構造構成要素と組み合わせて、コア細胞壁コア構成要素を投与すると、細胞壁コア構成要素のみを投与する場合に比較して、新生動物の免疫系の刺激に対する相加的でそしておそらく相乗的な効果があると仮定される。
【０００９】
別の欠点は、米国特許第４，７４４，９８４号、第５，７５９，５５４号、および第６，８９０，５４１号中のいくつかの態様において、細胞壁抽出および分画のプロセス中、細胞壁は脱脂質化され、この場合、エンベロープ外葉に存在し、そして免疫刺激活性を有することが知られるマイコバクテリウム・エンベロープの少なくとも２つの主要構成要素、すなわちＴＤＭおよびＬＡＭが、脱脂質化中に除去される可能性が非常に高いことである１２。脱脂質化後に残る構成要素は、細胞壁コア構造からなり、これは、マイコバクテリウム・エンベロープの重要な分画ではあるが、マクロファージを活性化し、そしてしたがって自然宿主反応、例えば炎症性サイトカインの産生を誘発する能力を有することが知られる、外葉の顕著なマイコバクテリウム構成要素、例えばＴＤＭおよびＬＡＭなどを欠く。
【００１０】
さらなる欠点は、細胞壁コア構成要素のみの投与が不便であることである。例えば、細胞壁コア構成要素を単離するかまたは抽出する工程には時間が掛かり、いくつかの工程を要する可能性もある。さらに別の潜在的な欠点は、細胞壁コア構成要素が水性配合物中で不溶性であり、そして送達のため、脂質または油に基づくエマルジョンを必要とすることである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，７４４，９８４号
【特許文献２】米国特許第５，７５９，５５４号
【特許文献３】米国特許第６，８９０，５４１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
仔ブタ間に大きな死亡率を引き起こす呼吸器感染の問題に関する、上述の問題に取り組むための戦略が利用可能であるが、こうした戦略は不便であり、欠点を有し、そして他の戦略よりもより有効でない可能性がある。したがって、仔ブタにおける呼吸器感染と闘うための代替法に関する必要性が存在する。好ましくは、こうした代替法は、他の戦略よりより有効であり、そして現在のアプローチの１またはそれより多くの不便さおよび欠点を減少させる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、望ましい特性を示し、そして関連する利点もまた提供する、イノシシ属（Ｓｕｓ）の免疫系をプライミングする、有効でそして効率的な方法を提供することによって、上述の問題に取り組む。本開示のいくつかの態様において、方法は、マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する工程を含む。
【００１４】
本開示の別の側面は、イノシシ属免疫系をプライミングする際に使用するためのマイコバクテリウム全細胞溶解物を提供する。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属の免疫系をプライミングする際に使用するためのマイコバクテリウム全細胞溶解物は、マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する工程を含む。
【００１５】
本開示の別の側面は、イノシシ属の免疫系をプライミングする際に使用するための薬剤製造のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物の使用を提供する。本開示のいくつかの態様において、使用は、マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する工程を含む。
【００１６】
本開示は、利用されてきている当該技術分野における他のアプローチに比較して、いくつかの利点を提供する。１つの態様に記載の方法の１つの利点は、マイコバクテリウム全細胞溶解物の投与が、マイコバクテリウム・エンベロープの構造構成要素のすべてではないとしても大部分を含有していることである。したがって、細胞壁コア構成要素だけでなく、マイコバクテリウム・エンベロープの構造構成要素を含むマイコバクテリウム全細胞溶解物の投与は、細胞壁構成要素のみの投与に比較して、イノシシ属免疫系の刺激に対して、相加的で、そしておそらく相乗的な効果を有する。
【００１７】
別の態様に記載の方法の利点は、本開示にしたがって利用されるマイコバクテリウム全細胞溶解物が脱脂質化されないことである。したがって、細胞壁懸濁物、細胞壁分画または細胞壁抽出物を調製する際に使用される脂質抽出法と異なり、本開示のマイコバクテリウム全細胞溶解物において、強力な免疫刺激活性を有する細胞壁コア構成要素は失われないであろう。
【００１８】
別の態様に記載の方法の利点は、マイコバクテリウム全細胞溶解物が、細胞壁懸濁物、細胞壁分画または細胞壁抽出物よりも調製が容易であり、これによって、他のアプローチの不便さおよび非効率性が減少することである。例えば、マイコバクテリウム・エンベロープの構造構成要素のすべてまたは実質的にすべてを含有する、マイコバクテリウム全細胞溶解物の調製は、細胞壁構成要素の単離または抽出よりもより少ない工程およびより短い時間しか必要としない。
【００１９】
別の態様に記載の方法の利点は、マイコバクテリウム全細胞溶解物を調製するために必要なプロセス工程が、細胞壁懸濁物、細胞壁分画または細胞壁抽出物を調製するために必要なプロセス工程とは異なり、伝統的な産業発酵設備および装置と比較して、容易にスケーラブルであることである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
態様の上述の側面は、付随する図と組み合わせて、態様の以下の説明を参照することによって、より明らかとなり、そしてよりよく理解されるであろう。
【図１】図１は、マイコバクテリウム・スメグマティスの未精製全細胞溶解物に比較した、リポ多糖（「ＬＰＳ」）での刺激に対する、肺胞マクロファージのＴＮＦ−アルファ反応を示す。
【図２】図２は、マイコバクテリウム・スメグマティスの未精製全細胞溶解物での刺激に対するブタ肺胞マクロファージのＴＮＦ−アルファ反応の動力学、およびＷＣＬの強度に対する、細菌を増殖させるために用いた培地の影響を示す。３つの異なるタイプの培地、７Ｈ９、ＧＡＳ、またはＮＢを用いて、未精製全細胞溶解物を得るために用いる細菌細胞集団を調製するため、マイコバクテリウムを培養した。
【図３】図３は、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの強度（５０％有効用量によって示されるようなもの）が、ＷＣＬを調製するための細菌細胞集団を調製するため、マイコバクテリウム・スメグマティスを培養するために用いられる増殖培地のタイプに影響を受けうることを示す。
【図４】図４は、（１）マイコバクテリウム・スメグマティス由来のリポアラビノマンナン（「ＬＡＭ−ＭＳ」）の商業的調製物、および（２）マイコバクテリウム・フレイ細胞壁抽出物の商業的調製物と比較した際の、未精製マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの相対強度を示す。
【図５】図５は、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの投与による、ブタにおけるＴＮＦ−アルファ刺激増進効果を示す。
【図６】図６は、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの投与による、ブタにおけるナチュラルキラー下位集団増進効果を示す。
【図７】図７は、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの投与による、ブタにおけるＢ細胞下位集団増進効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に記載する態様は、包括的であることを意図せず、または以下の詳細な説明に開示する正確な型に本発明を限定することを意図しない。むしろ、態様は、他の当業者が本開示の原理および実施を認識し、そして理解しうるように、選択され、そして記載される。
【００２２】
気道は、新生ブタにおいて疾患感受性の主なターゲットであり、そしてマイコバクテリウムの構造構成要素は、自然免疫系のいくつかの経路に関与することが知られるため、本開示は、新生ブタの気道の自然免疫系を直接プライミングし、そして呼吸器病原体進入のこの決定的な入口でその防御機構を増進させるため、マイコバクテリウム全細胞溶解物の送達によって、この問題に取り組む。
【００２３】
マイコバクテリウム・エンベロープの多様な構造構成要素の免疫刺激活性は、しばらく前から認識されてきている１３。マイコバクテリウム細胞エンベロープは複雑であり、そして層状に配置された、脂質、多糖、糖脂質およびミコール酸の厚い蝋様混合物からなる１４。これらの層はまず、典型的な膜二重層を形成する慣用的な極性脂質で構成される内膜（「ＩＭ」）からなり、そしてこれには、非常に重要な構成要素として、ホスファチジルイノシトールマンノシド（「ＰＩＭ」）が含まれる。ＩＭを覆うのは、ペプチドグリカン−アラビノガラクタン（「ＡＧＰ」）複合体であり、該複合体は、多糖アラビナンへの係留を提供するらせん状ガラクタン（ガラクトースのポリマー）が散在する、らせん状ペプチドグリカン（「ＰＧ」）部分のネットワークからなる足場を形成する。ガラクタンおよびアラビナン多糖を合わせた際、合わせた構造は、エンベロープのアラビノガラクタン（「ＡＧ」）構成要素を構成する１５。次に、ＡＧ単位の遠位アラビノース部分は、ミコール酸への共有結合を通じて係留を提供する。細胞壁のこの下部セグメントは、細胞壁コアと名付けられ、すなわちミコリルアラビノガラクタン−ペプチドグリカン（「ｍＡＧＰ」）複合体である１６。マイコバクテリウム・エンベロープは、最終的に、抽出可能な脂質で構成される上層で覆われ、この層は当該技術分野において、上部セグメント、外葉または外膜として知られる。エンベロープのこの外葉における抽出可能脂質は、脂肪酸、リポオリゴ糖（「ＬＯＳ」）、トリアシルリポペプチド、糖ペプチド脂質（「ＧＰＬ」）、トレハロースジミコール酸（「ＴＤＭ」）およびリポグリカン、すなわちリポアラビノマンナン（「ＬＡＭ」）を含む、異なるタイプの脂質で構成される１７。
【００２４】
ＯＭの構成要素は、「遊離」脂質として（すなわち、根底にあるペプチドグリカン−アラビノガラクタン（「ＡＧＰ」）複合体に共有結合していない溶媒抽出可能脂質として）、マイコバクテリウム細胞壁に存在する１８。ＴＤＭおよびＬＡＭの免疫刺激活性は、徹底的に研究されてきている。ＴＤＢは、Ｃ型レクチン、Ｍｉｎｃｌｅ（マクロファージ誘導性Ｃ型レクチン）に結合する１９。ＴＤＢ認識に際して、Ｃ型レクチン、Ｍｉｎｃｌｅは、Ｆｃ受容体共通γ鎖（「ＦｃＲγ」）と相互作用し、これがＳｙｋを通じた細胞内シグナル伝達を誘発し、ＣＡＲＤ９依存性ＮＦ−κＢ活性化を導く。ＬＡＭは、マイコバクテリウム属に限定されたリポグリカンであり、宿主免疫反応の強力な調節剤として作用し、そしてすべてのマイコバクテリウム種、例えば病原性株、結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびらい菌（Ｍ．  ｌｅｐｒａｅ）、ワクチン株、Ｍ．ボビスＢＣＧ（Ｍ．  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）、日和見株、Ｍ．アビウム（Ｍ．  ａｖｉｕｍ）およびＭ．フォーチュイタム（Ｍ．  ｆｏｒｕｉｔｕｍ）、ならびに非病原性株Ｍ．スメグマティスのエンベロープにおいて見られる。ＬＡＭは、その構造に応じて、異なる免疫調節効果を示す。ＰＩＬＡＭは、ホスホイノシトールキャップ化ＬＡＭであり、そして非病原性種（Ｍ．スメグマティス）に見られる炎症促進性分子であり、一方、ＭａｎＬＡＭは、マンノースキャップ化ＬＡＭであり、そして病原性種（結核菌）に見られる抗炎症分子である２０。ＰＩＬＡＭは、ＴＬＲ２依存方式でマクロファージを活性化し、この方式は、他のＴＬＲを伴うがＴＬＲ４は伴わないようである２１。
【００２５】
免疫刺激活性を有するマイコバクテリウム構造構成要素を定義するため、これらの構成要素を個々に研究可能であるように、これらの構成要素を分画し、そして精製するために、多様な技術が使用されてきている。これらの技術は大部分、細菌の機械的分解後の分画遠心分離に基づく。機械的手段によって細菌を破砕した後、生じた構成要素を分画遠心分離によって分離してもよい。低速（３，０００ｘｇ、式中、ｇは強度の重力場である）でのＷＣＬの遠心分離は、懸濁物中に残る細菌のすべての他の構造構成要素とともに、未破壊細胞の排除を生じる。一方、２７，０００ｇの高速でのＷＣＬの遠心分離は、細胞壁の分離を生じ、細胞壁は遠心分離後、ペレットとして沈殿する一方、膜および細胞質ゾル構成要素は、上清中に懸濁されたままである２２。生じた細胞壁ペレットは、ｍＡＧＰ複合体ならびに会合するＬＡＭを含有する２３。このタイプの組成物は、細菌分画法中のどの時点でも意図的に脱脂質化されていないＷＣＬ調製物のみで生じるであろう。そうでなければ、脱脂質化後、外葉を通常構成する抽出可能脂質分子、例えばＴＤＭおよびＬＡＭは、抽出法中に失われる。実際、脱脂質化マイコバクテリウム・スメグマティスは、マイコバクテリウム・エンベロープの外葉に存在する遊離脂質の１つであるマイコバクテリウムＴＤＭを認識するマクロファージ受容体Ｍｉｎｃｌｅ（マクロファージ誘導性Ｃ型レクチン）によって認識されることが不可能であることが示されてきている２４。したがって、マイコバクテリウムの未精製全細胞溶解物は、このタイプの細菌のマイコバクテリウム・エンベロープに存在することが知られる巨大分子のすべてではないとしてもほとんどを有すると予期されるであろう。
【００２６】
マイコバクテリウムの構造構成要素は、最も顕著にはマクロファージおよび樹状細胞を含む骨髄細胞において発現される多くの宿主受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ヌクレオチド結合性オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（「ＮＬＲ」）、ＭｉｎｉｃｌｅのようなＣ型レクチン受容体およびマンノース受容体（「ＣＤ２０７」）、樹状細胞特異的細胞内接着分子−３捕捉非インテグリン（「ＤＣ−ＳＩＧＮ．ＣＤ２０９」）、ならびにデクチン―１によって認識される２５。マイコバクテリウムによって開始される大部分のＴＬＲ依存性シグナルは陽性であり、炎症性および抗微生物自然免疫反応の活性化につながる。例えば、迅速に増殖し、そして非病原性である種、例えばマイコバクテリウム・スメグマティス由来のホスホイノシトールキャップ化ＬＡＭは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファおよびＩＬ−１２のマクロファージによる産生を刺激する、炎症促進性分子である２６。大部分の細菌は、Ｎ−アセチルＭＤＰを産生する一方、マイコバクテリウムは、Ｎ−グリコリルＭＤＰと呼ばれる、ＭＤＰの普通でない修飾型を産生し、該分子は、Ｉ型インターフェロン（「ＩＦＮ」）の非常に強力な誘導因子であり、そしてインフルエンザウイルス感染に対する防御を提供する際に非常に有効であることが示されてきている２７。さらに、上述のように、マイコバクテリウム・エンベロープ外葉は、非常に多様な化学的に異なる脂質および糖脂質を含有し、これらはおそらく、特異的宿主相互作用を仲介し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで真核細胞に対する強力な生物学的活性を所持することが示されてきている２８。
【００２７】
「イノシシ属の免疫系をプライミングする」は、イノシシ属の免疫系を刺激し、そして／または活性化することを指し、そしてこれには、イノシシ属免疫系の細胞による免疫反応を引き起こすことが含まれる。「免疫反応」は、刺激に対する、免疫系の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、単球等の反応である。免疫反応はＢ細胞反応であってもよく、これは特異的抗体、例えば抗原特異的中和抗体の産生を生じる。免疫反応はまた、Ｔ細胞反応、例えばＣＤ４＋反応またはＣＤ８＋反応であってもよい。いくつかの場合、反応は、特定の抗原に特異的である（すなわち「抗原特異的反応」）。免疫反応にはまた生得的反応が含まれてもよい。いくつかの態様において、イノシシ属免疫系のプライミングは、マクロファージのプライミングを含む。いくつかの態様において、イノシシ属免疫系のプライミングは、肺胞マクロファージのプライミングを含む。いくつかの態様において、プライミングされた肺胞マクロファージは、刺激に反応してＴＮＦ−α産生の増進を示す。抗原が病原体由来である場合、抗原特異的反応は、「病原体特異的反応」である。「防御性免疫反応」は、病原体の有害な機能または活性を阻害するか、病原体による感染を減少させるか、あるいは病原体による感染から生じる症状（死を含む）を減少させる、免疫反応である。防御性免疫反応は、例えば、プラーク減少アッセイまたはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製またはプラーク形成の阻害によって、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでの病原体曝露に対する耐性の測定によって、測定可能である。いくつかの態様において、免疫反応は局所性である。いくつかの態様において、免疫反応は全身性である。
【００２８】
本開示のいくつかの態様において、「イノシシ属の免疫系をプライミングする」には、「ワクチン接種のため、イノシシ属の免疫系をプライミングする」が含まれる。ワクチン接種は、イノシシ属が感染しうる、任意のタイプのウイルス、細菌、真菌、原生動物、または他の寄生虫に対するものであってもよいことが想定される。ワクチン接種がターゲティングしうるウイルスの限定されないリストには、限定なしに、ＰＲＲＳＶ、ブタインフルエンザウイルス、ブタ・サーコウイルス、ブタ・パルボウイルス（「ＰＰＶ」）、伝染性胃腸炎（「ＴＧＥ」）ウイルス、ブタ伝染性下痢症ウイルス（「ＰＥＤＶ」）、ブタ・ロタウイルス、ブタパラミクソウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス（「ＡＳＦＶ」）、古典的ブタ熱ウイルス（「ＣＳＦ」）、ブタコロナウイルス科、ブタ・トルクテノウイルス、ブタ・ボカウイルス、ブタ・トロウイルス、ブタＥ型肝炎ウイルス、ブタ内因性レトロウイルス、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタ・サポウイルス、ブタ・ペスチウイルス、ニパウイルス、ボンゴワナウイルス、メナングルウイルス、およびデルタコロナウイルスが含まれる。
【００２９】
ワクチン接種がターゲティングしうる細菌の限定されないリストには、限定なしに、マイコプラズマ・スイス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｕｉｓ）；パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）；ヘモフィルス・ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）；ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）；クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）；アナプラズマ（ａｎａｐｌａｓｍａ）；マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）；アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）およびエクウリ（ｅｑｕｕｌｉ）；ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）；ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）；カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、ジェジュナム（ｊｅｊｕｎｕｍ）、ヒオインテスティナリス（ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．  ｃｏｌｉ））；ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）；クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種；ラウソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）；レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）；レプトスピラ・ブラチスラバ／ムエンチェン（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／ｍｕｅｎｃｈｅｎ）；レプトスピラ・イクテロヘモルハギエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（毒素産生性）；パスツレラ・ムルトシダ（非毒素産生性）；サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）；ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・デルビー（ｄｅｒｂｙ）およびその他；ブラキスピラ・ピロシコリ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ）；ブラキスピラ・ヒオディセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）；ブラキスピラ属（弱溶血性種）；エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種；アクチノマイセス（コリネバクテリウム）・ピオゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ）；クラミジア・プシタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）；クロストリジウム・ノビ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ）；クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）；アクチノバクロム（コリネバクテリウム、ユーバクテリウム）・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  ｓｕｉｓ）；エペリスロゾン・スイス（Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎ  ｓｕｉｓ）；エニシペロスリックス・ルシオパシア（Ｅｎｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコバクテリウム・アビウム／イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ／ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）；マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；マイコプラズマ・フロクラレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅ）；マイコプラズマ・ヒオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）；マイコプラズマ・ヒオシノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）；スタフィロコッカス・ヒクス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ）；他のスタフィロコッカス属；１型ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）；２型、１５型ストレプトコッカス・スイス；およびストレプトコッカス属の他のタイプが含まれる。
【００３０】
本明細書において、「イノシシ属」は、生物学的イノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）に属するメンバーである、野生型または家畜の任意の動物を指し、これには、限定なしに、いずれかの性別または任意の年齢の、バビロウサ・バビルッサ（Ｂａｂｙｒｏｕｓａ  ｂａｂｙｒｕｓｓａ）またはゴールデン・バビルサ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂａｂｉｒｕｓａ）、バビロウサ・セレベンシス（Ｂａｂｙｒｏｕｓａ  ｃｅｌｅｂｅｎｓｉｓ）またはスラウェシ・バビルサ（Ｓｕｌａｗｅｓｉ  Ｂａｂｉｒｕｓａ）、バビロウサ・トゲアネンシス（Ｂａｂｙｒｏｕｓａ  ｔｏｇｅａｎｅｎｓｉｓ）またはトギアン・バビルサ（Ｔｏｇｉａｎ  Ｂａｂｉｒｕｓａ）、ヒロコエルス・メイネルツハゲニ（Ｈｙｌｏｃｈｏｅｒｕｓ  ｍｅｉｎｅｒｔｚｈａｇｅｎｉ）またはモリイノシシ（Ｇｉａｎｔ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｈｏｇ）、ファココエルス・エチオピクス（Ｐｈａｃｏｃｈｏｅｒｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｓ）またはケープ、ソマリもしくはサバクイボイノシシ（Ｃａｐｅ、ＳｏｍａｌｉまたはＤｅｓｅｒｔ  Ｗａｒｔｈｏｇ）、ファココエルス・アフリカヌス（Ｐｈａｃｏｃｈｏｅｒｕｓ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）またはコモン・イボイノシシ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｗａｒｔｈｏｇ）、ポルクラ・サルバニア（Ｐｏｒｃｕｌａ  ｓａｌｖａｎｉａ）またはコビトイノシシ（Ｐｙｇｍｙ  Ｈｏｇ）、ポタモコエルス・ラルバツス（Ｐｏｔａｍｏｃｈｏｅｒｕｓ  ｌａｒｖａｔｕｓ）またはカワイノシシ（Ｂｕｓｈｐｉｇ）、ポタモコエルス・ポルクス（Ｐｏｔａｍｏｃｈｏｅｒｕｓ  ｐｏｒｃｕｓ）またはアカカワイノシシ（Ｒｅｄ  Ｒｉｖｅｒ  Ｈｏｇ）、スス・アホエノバルブス（Ｓｕｓ  ａｈｏｅｎｏｂａｒｂｕｓ）またはパラワン・ヒゲイノシシ（Ｐａｌａｗａｎ  Ｂｅａｒｄｅｄ  Ｐｉｇ）、スス・バルバツス（Ｓｕｓ  ｂａｒｂａｔｕｓ）またはヒゲイノシシ（Ｂｅａｒｄｅｄ  Ｐｉｇ）、スス・ブクレンツス（Ｓｕｓ  ｂｕｃｃｕｌｅｎｔｕｓ）またはベトナム・イボイノシシ（Ｖｉｅｔｎａｍｅｓｅ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、スス・セビフロンス（Ｓｕｓ  ｃｅｂｉｆｒｏｎｓ）またはビサヤ・イボイノシシ（Ｖｉｓａｙａｎ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、スス・セレベンシス（Ｓｕｓ  ｃｅｌｅｂｅｎｓｉｓ）またはセレベス・イボイノシシ（Ｃｅｌｅｂｅｓ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、スス・ヘウレニ（Ｓｕｓ  ｈｅｕｒｅｎｉ）またはフローレス・イボイノシシ（Ｆｌｏｒｅｓ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、スス・オリベリ（Ｓｕｓ  ｏｌｉｖｅｒｉ）またはミンドロ・イボイノシシ（Ｍｉｎｄｏｒｏ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、スス・フィリペニス（Ｓｕｓ  ｐｈｉｌｉｐｐｅｎｓｉｓ）またはフィリピン・イボイノシシ（Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、スス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）または野生イノシシ（Ｗｉｌｄ  Ｂｏａｒ）または家畜ブタ、スス・ベルコスス（Ｓｕｓ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓ）またはジャワ・イボイノシシ（Ｊａｖａｎ  Ｗａｒｔｙ  Ｐｉｇ）、および任意の他のイノシシ、雌ブタ（ｓｏｗ）、仔ブタ、ブタ同腹仔（ｆａｒｒｏｗ）、乳離れ直後の仔ブタ（ｓｈｏａｔ）、未経産ブタ（ｇｉｌｔ）、去勢ブタ（ｂａｒｒｏｗ）、成豚（ｈｏｇ）、イノシシ科の動物（ｓｗｉｎｅ）またはブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）が含まれる。
【００３１】
本開示の方法は、マイコバクテリウム全細胞溶解物を利用する。本明細書において、「ＷＣＬ」と一般的に略される、「全細胞溶解物」は、本開示が属する業の一般的な当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。いくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、未精製マイコバクテリウム全細胞溶解物である。いくつかの態様において、未精製マイコバクテリウム全細胞溶解物には、例えば、構造構成要素がまったく除去されていないか、あるいは未破砕細胞を除去する以外、分画に供されておらず、そして物理的または化学的性質いずれかの他の分配、抽出または分離にも供されていない、溶解されたマイコバクテリウム細胞が含まれる。いくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物には、死んでおり、そしてもはや複製不能であるが、あらかじめ溶解された細胞の構成要素のすべてを含有する、溶解された細胞が含まれる。いくつかの態様において、全細胞溶解物は、ＷＣＬの非変性上清である。いくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物はアジュバントである。
【００３２】
本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、精製を経ていない。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、精製を経ている。本明細書において、「精製」は、マイコバクテリウム全細胞溶解物由来の望ましくない構成要素を除去するプロセスを指す。精製は、マイコバクテリウム全細胞溶解物から、望ましくない構成要素のすべての痕跡を除去することを必要としない。精製技術には、限定なしに、細胞分画、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、およびアフィニティ精製または沈殿が含まれる。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は分画されない。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は脱脂質化されない。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は脱タンパク質化されない。いくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は単独で投与される。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、ブタウイルス性疾患に対する１またはそれより多くの適切なワクチンとともに投与される。
【００３３】
本開示の方法において利用されるマイコバクテリウム全細胞溶解物は、任意のマイコバクテリウムより調製可能である。本明細書において、「マイコバクテリウム」は、マイコバクテリウム科またはマイコバクテリウム属由来の任意の原核生物を指す。本開示の方法において利用可能なマイコバクテリウムの限定されないリストには、限定なしに、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・マイクロッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｔｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉｉ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプラムリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム・パラツベルキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・キセノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム・ケロネイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎｅｉ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・ファルシノゲネス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム・フラブム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、マイコバクテリウム・ヘモフィツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｐｈｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・セネガレンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム・シミエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｍｉａｅ）、マイコバクテリウム・テルモレシスチブル（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔｉｂｌｅ）、マイコバクテリウム・バカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）、マイコバクテリウム・ポルシヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｏｒｃｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・アブセス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕ）、マイコバクテリウム・ペレグリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・アルベイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｌｖｅｉ）およびマイコバクテリウム・キセノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）が含まれる。
【００３４】
本開示の方法において利用されるマイコバクテリウム全細胞溶解物は、一般の当業者によって考慮されるであろう任意の適用可能経路を用いて投与されてもよく、これには、限定なしに、経口、静脈内（「ＩＶ」）、皮下（「ＳＣ」）、筋内（「ＩＭ」）、腹腔内、皮内、眼内、肺内、鼻内、経皮、真皮下、局所、粘膜、鼻、皮膚への圧、膣内、子宮内、子宮頸部内、および直腸が含まれる。本開示のいくつかの態様において、投与の鼻内経路は、鼻内ドロップを含む。本開示のいくつかの態様において、投与の鼻内経路は、鼻内エアロゾル送達を含む。本開示のいくつかの態様において、鼻内エアロゾル送達は、鼻スプレー送達を含む。
【００３５】
本開示の方法を実行する際、マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量をイノシシ属に投与する。用語「有効量」は、投与の背景において、イノシシ属に投与する際、イノシシ属の免疫系をプライミングするために十分である、マイコバクテリウム全細胞溶解物の量を指す。こうした量は、治療されるイノシシ属において、不都合な事象をまったくまたはほとんど生じてはならない。同様に、こうした量は、毒性の影響をまったくまたはほとんど生じてはならない。当該技術分野をよく知るものには理解されるであろうように、マイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、限定なしに、治療されるイノシシ属のタイプ、イノシシ属の年齢、サイズ、重量、および全身の身体状態、ならびに投薬治療計画を含む、多くの要因に応じて多様であろう。
【００３６】
本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に送達すべきマイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量は、イノシシ属体重キログラムあたりのマイコバクテリウム全細胞溶解物のマイクログラムを決定することによって定量化可能である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約０．００００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１〜約６００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１００〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１００〜約３００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１〜約１００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１〜約７５μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１〜約５０μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約１〜約２５μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、イノシシ属体重ｋｇあたり、約２５〜約５０μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。
【００３７】
本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に送達すべきマイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量は、薬学的に許容されうるキャリアーのミリリットルあたりのマイコバクテリウム全細胞溶解物のマイクログラムを決定することによって定量化可能である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約０．０００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約２５〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約４００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約２５０μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約３００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。本開示のいくつかの態様において、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、用量あたりの薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１００〜約４００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である。
【００３８】
本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、投与前に多数回用量バイアル中に含有される。本開示のマイコバクテリウム全細胞溶解物を含有する多数回用量バイアルは、ガラス、プラスチック、または他の材料で作製されうる。いくつかの態様において、多数回用量バイアルには、マイコバクテリウム全細胞溶解物の約１〜約１０００用量が含まれる。いくつかの態様において、多数回用量バイアルには、マイコバクテリウム全細胞溶解物の約１〜約５００用量が含まれる。いくつかの態様において、多数回用量バイアルには、マイコバクテリウム全細胞溶解物の約１〜約２５０用量が含まれる。いくつかの態様において、多数回用量バイアルには、マイコバクテリウム全細胞溶解物の約１〜約１００用量が含まれる。いくつかの態様において、多数回用量バイアルには、マイコバクテリウム全細胞溶解物の約１〜約５０用量が含まれる。いくつかの態様において、多数回用量バイアルには、マイコバクテリウム全細胞溶解物の約１〜約２５用量が含まれる。
【００３９】
本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、多数回用量治療計画として投与される。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ７日間の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ１４日間の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ１ヶ月の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ２ヶ月の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ３ヶ月の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ４ヶ月の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ５ヶ月の期間である。本開示のいくつかの態様において、多数回用量治療計画は、およそ６ヶ月の期間である。
【００４０】
本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、単回用量として投与される。本開示のさらに別の態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、単回単位用量として投与される。本明細書において、用語「単位用量」は、マイコバクテリウム全細胞溶解物のあらかじめ決定された量である。マイコバクテリウム全細胞溶解物の量は、一般的に、イノシシ属に投与されるであろうマイコバクテリウム全細胞溶解物の投薬量、あるいはこうした投薬量の好適な部分、例えばこうした投薬量の半分または３分の１などに等しい。本開示の方法にしたがって、用語「単回用量」および「単回単位用量」には、組成物を単回適用として投与可能である態様および多数回適用として投与可能である態様が含まれる。
【００４１】
本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物は、乾燥粉末または顆粒として提供され、これらは最初の使用前に、水または他の水性媒体で再構成される。いくつかの態様において、水または他の水性媒体での再構成は、水性懸濁物を形成する。いくつかの態様において、水性懸濁物は、本明細書に記載するような多数回用量バイアル中に含有され、そして本明細書に記載するようなマイコバクテリウム全細胞溶解物の任意の数の用量を有する。いくつかの態様において、水性懸濁物は、本明細書に記載するような単回用量として投与される。いくつかの態様において、水性懸濁物は、本明細書に記載するような単回単位用量として投与される。一般の当業者は、本開示が、任意のサイズ、形状、体積等の乾燥粉末または顆粒を利用することを想定することを理解する。薬学産業において用いられ、そして当業者に理解されるような「ボトル中の粉末」プロセスは、その任意の変形を含めて、本開示によって意図される。
【００４２】
本開示のいくつかの態様において、用量あたり、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の体積は多様である。例えば、マイコバクテリウム全細胞溶解物を投与するために用いる投与経路およびデバイスは、用量あたり、イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の体積の変動を引き起こしうる。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約０．００１〜約５０ｍＬである。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約０．０１〜約２５ｍＬである。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約０．１〜約１０ｍＬである。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約０．１〜約５ｍＬである。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約１〜約５ｍＬである。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約１〜約２ｍＬである。本開示のいくつかの態様において、用量あたりの体積は、用量あたり約１ｍＬ未満である。
【００４３】
本開示の方法は、イノシシ属の免疫系をプライミングするため、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内の、マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量のイノシシ属への投与を利用する。本明細書において、用語「有効な期間」は、望ましいプライミング結果を得るため、望ましい投与を提供するために十分に長い期間を意味する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、誕生直後から約１時間齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１時間〜約２４時間齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２４時間〜約１週齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１週〜約１ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１ヶ月〜約２ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２ヶ月〜約３ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約３ヶ月〜約４ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約４ヶ月〜約８ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約８ヶ月〜約１２ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１２ヶ月〜約２４ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２４ヶ月〜約３６ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。本開示のいくつかの態様において、マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約３６ヶ月〜約４８ヶ月齢までにイノシシ属に投与する。
【００４４】
いくつかの態様において、本開示の方法を、表１に示す用量にしたがって、イノシシ属に鼻内投与してもよい。
表１
【００４５】
【表１】
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【００４６】
週：イノシシ属の週齢
体重：イノシシ属の体重
μｇ：マイコバクテリウムＷＣＬのμｇ
μｇ／ｋｇ：イノシシ属体重ｋｇあたりのマイコバクテリウムＷＣＬのμｇ
μｇ／ｍＬ：薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたりのマイコバクテリウムＷＣＬのμｇ
本開示の方法において利用されるマイコバクテリウム全細胞溶解物を、任意に、１またはそれより多い薬学的に許容されうるキャリアーと組み合わせてもよい。本開示の方法において利用されうる薬学的に許容されうるキャリアーの限定されないリストには、限定なしに、水または生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、油、希釈剤、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル、合成ポリマー、エマルジョン、脂質で作製された固形粒子等が含まれる。当業者が理解するであろうように、本開示にしたがって、当該技術分野に知られる任意の希釈剤を利用してもよい。本開示のいくつかの態様において、希釈剤は水溶性である。本開示のいくつかの態様において、希釈剤は水不溶性である。本明細書において、用語「希釈剤」には、限定なしに、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノール、緩衝酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウム溶液等、およびその組み合わせが含まれる。
【００４７】
以下の態様もまた意図される：
１．  イノシシ属の免疫系をプライミングする方法であって
マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する
工程を含む、前記方法。
【００４８】
２．  マイコバクテリウム属全細胞溶解物を、マイコバクテリウム・スメグマティスより調製する、第１項の方法。
３．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が、精製を経ていない、第１項または第２項の方法。
【００４９】
４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が未分画である、第１〜３項のいずれか一項の方法。
５．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱脂質化されていない、第１〜４項のいずれか一項の方法。
【００５０】
６．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱タンパク質化されていない、第１〜５項のいずれか一項の方法。
７．  投与が、経口、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、皮内、眼内、肺内、鼻内、経皮、真皮下、局所、粘膜、鼻、皮膚への圧、膣内、子宮内、子宮頸部内、および直腸からなる群より選択される、第１〜６項のいずれか一項の方法。
【００５１】
８．  投与が粘膜である、第１〜７項のいずれか一項の方法。
９．  投与が鼻内である、第１〜８項のいずれか一項の方法。
１０．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約０．０００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第１〜９項のいずれか一項の方法。
【００５２】
１１．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第１〜１０項のいずれか一項の方法。
【００５３】
１２．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１００〜約４００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第１〜１１項のいずれか一項の方法。
【００５４】
１３．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回用量として投与する、第１〜１２項のいずれか一項の方法。
１４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回単位用量として投与する、第１〜１３項のいずれか一項の方法。
【００５５】
１５．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を多数回用量治療計画で投与する、第１〜１２項のいずれか一項の方法。
１６．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．００１〜約５０ｍＬである、第１〜９項のいずれか一項の方法。
【００５６】
１７．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．０１〜約２５ｍＬである、第１〜９項のいずれか一項の方法。
１８．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．１〜約１０ｍＬである、第１〜９項のいずれか一項の方法。
【００５７】
１９．  用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約５ｍＬである、第１〜９項のいずれか一項の方法。
２０．  用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約２ｍＬである、第１〜９項のいずれか一項の方法。
【００５８】
２１．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、誕生直後から約１時間齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
２２．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１時間〜約２４時間齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
【００５９】
２３．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２４時間〜約１週齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
２４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１週〜約１ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
【００６０】
２５．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１ヶ月〜約２ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
２６．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２ヶ月〜約３ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
【００６１】
２７．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約３ヶ月〜約４ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第１〜２０項のいずれか一項の方法。
２８．  イノシシ属免疫系のプライミングが、白血球プライミングを含む、第１〜２７項のいずれか一項の方法。
【００６２】
２９．  イノシシ属免疫系のプライミングが、Ｔ細胞プライミングを含む、第１〜２７項のいずれか一項の方法。
３０．  イノシシ属免疫系のプライミングが、単球プライミングを含む、第１〜２７項のいずれか一項の方法。
【００６３】
３１．  イノシシ属免疫系のプライミングが、マクロファージプライミングを含む、第１〜２７項のいずれか一項の方法。
３２．  イノシシ属免疫系のプライミングが、肺胞マクロファージプライミングを含む、第１〜２７項のいずれか一項の方法。
【００６４】
３３．  プライミングされた白血球が、刺激に反応してインターフェロン・ガンマ産生の増進を示す、第１〜２８項のいずれか一項の方法。
３４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を薬学的に許容されうるキャリアーと合わせる、第１〜９項のいずれか一項の方法。
【００６５】
３５．  イノシシ属がブタである、第１〜３４項のいずれか一項の方法。
３６．  マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する工程を含む、イノシシ属の免疫系をプライミングする際に使用するための、マイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００６６】
３７．  マイコバクテリウム属全細胞溶解物を、マイコバクテリウム・スメグマティスより調製する、第３６項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
３８．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が、精製を経ていない、第３６項または第３７項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００６７】
３９．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が未分画である、第３６〜３８項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
４０．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱脂質化されていない、第３６〜３９項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００６８】
４１．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱タンパク質化されていない、第３６〜４０項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
４２．  投与が、経口、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、皮内、眼内、肺内、経皮、真皮下、局所、粘膜、鼻、および皮膚への圧からなる群より選択される、第３６〜４１項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００６９】
４３．  投与が粘膜である、第３６〜４２項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
４４．  投与が鼻内である、第３６〜４３項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７０】
４５．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約０．０００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第３６〜４４項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７１】
４６．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第３６〜４５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７２】
４７．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１００〜約４００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第３６〜４６項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７３】
４８．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回用量として投与する、第３６〜４７項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
４９．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回単位用量として投与する、第３６〜４８項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７４】
５０．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を多数回用量治療計画で投与する、第３６〜４７項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
５１．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．００１〜約５０ｍＬである、第３６〜４４項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７５】
５２．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．０１〜約２５ｍＬである、第３６〜４４項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
５３．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．１〜約１０ｍＬである、第３６〜４４項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７６】
５４．  用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約５ｍＬである、第３６〜４４項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
５５．  用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約２ｍＬである、第３６〜４４項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７７】
５６．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、誕生直後から約１時間齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７８】
５７．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１時間〜約２４時間齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００７９】
５８．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２４時間〜約１週齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８０】
５９．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１週〜約１ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８１】
６０．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１ヶ月〜約２ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８２】
６１．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２ヶ月〜約３ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８３】
６２．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約３ヶ月〜約４ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第３６〜５５項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８４】
６３．  イノシシ属免疫系のプライミングが、白血球プライミングを含む、第３６〜６２項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
６４．  イノシシ属免疫系のプライミングが、Ｔ細胞プライミングを含む、第３６〜６２項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８５】
６５．  イノシシ属免疫系のプライミングが、単球プライミングを含む、第３６〜６２項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
６６．  イノシシ属免疫系のプライミングが、マクロファージプライミングを含む、第３６〜６２項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８６】
６７．  イノシシ属免疫系のプライミングが、肺胞マクロファージプライミングを含む、第３６〜６２項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
６８．  プライミングされた白血球が、刺激に反応してインターフェロン・ガンマ産生の増進を示す、第３６〜６３項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８７】
６９．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を薬学的に許容されうるキャリアーと合わせる、第３６〜４４項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
【００８８】
７０．  イノシシ属がブタである、第３６〜６９項のいずれか一項記載の使用のためのマイコバクテリウム全細胞溶解物。
７１．  マイコバクテリウム全細胞溶解物の有効量を、イノシシ属が生まれた後、有効な期間内に、イノシシ属に投与する工程を含む、イノシシ属の免疫系をプライミングする際の使用のための薬剤製造のための、マイコバクテリウム全細胞溶解物の使用。
【００８９】
７２．  マイコバクテリウム属全細胞溶解物を、マイコバクテリウム・スメグマティスより調製する、第７１項の使用。
７３．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が、精製を経ていない、第７１項または第７２項の使用。
【００９０】
７４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が未分画である、第７１〜７３項のいずれか一項の使用。
７５．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱脂質化されていない、第７１〜７４項のいずれか一項の使用。
【００９１】
７６．  マイコバクテリウム全細胞溶解物が脱タンパク質化されていない、第７１〜７５項のいずれか一項の方法。
７７．  投与が、経口、静脈内、皮下、筋内、腹腔内、皮内、眼内、肺内、経皮、真皮下、局所、粘膜、鼻、および皮膚への圧からなる群より選択される、第７１〜７６項のいずれか一項の使用。
【００９２】
７８．  投与が粘膜である、第７１〜７７項のいずれか一項の使用。
７９．  投与が鼻内である、第７１〜７８項のいずれか一項の使用。
８０．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約０．０００１〜約１０００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
【００９３】
８１．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約５０〜約５００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第７１〜８０項のいずれか一項の使用。
【００９４】
８２．  イノシシ属に投与されるマイコバクテリウム全細胞溶解物の量が、用量あたり薬学的に許容されうるキャリアーのｍＬあたり、約１００〜約４００μｇのマイコバクテリウム全細胞溶解物である、第７１〜８１項のいずれか一項の使用。
【００９５】
８３．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回用量として投与する、第７１〜８２項のいずれか一項の使用。
８４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を単回単位用量として投与する、第７１〜８３項のいずれか一項の使用。
【００９６】
８５．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を多数回用量治療計画で投与する、第７１〜８２項のいずれか一項の使用。
８６．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．００１〜約５０ｍＬである、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
【００９７】
８７．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．０１〜約２５ｍＬである、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
８８．  用量あたりの体積が、用量あたり約０．１〜約１０ｍＬである、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
【００９８】
８９．  用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約５ｍＬである、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
９０．  用量あたりの体積が、用量あたり約１〜約２ｍＬである、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
【００９９】
９１．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、誕生直後から約１時間齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
９２．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１時間〜約２４時間齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
【０１００】
９３．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２４時間〜約１週齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
９４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１週〜約１ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
【０１０１】
９５．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約１ヶ月〜約２ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
９６．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約２ヶ月〜約３ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
【０１０２】
９７．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を、約３ヶ月〜約４ヶ月齢までにイノシシ属に投与する、第７１〜９０項のいずれか一項の使用。
９８．  イノシシ属免疫系のプライミングが、白血球プライミングを含む、第７１〜９７項のいずれか一項の使用。
【０１０３】
９９．  イノシシ属免疫系のプライミングが、Ｔ細胞プライミングを含む、第７１〜９７項のいずれか一項の使用。
１００．  イノシシ属免疫系のプライミングが、単球プライミングを含む、第７１〜９７項のいずれか一項の使用。
【０１０４】
１０１．  イノシシ属免疫系のプライミングが、マクロファージプライミングを含む、第７１〜９７項のいずれか一項の使用。
１０２．  イノシシ属免疫系のプライミングが、肺胞マクロファージプライミングを含む、第７１〜９７項のいずれか一項の使用。
【０１０５】
１０３．  プライミングされた白血球が、刺激に反応してインターフェロン・ガンマ産生の増進を示す、第７１〜９８項のいずれか一項の使用。
１０４．  マイコバクテリウム全細胞溶解物を薬学的に許容されうるキャリアーと合わせる、第７１〜７９項のいずれか一項の使用。
【０１０６】
１０５．  イノシシ属がブタである、第７１〜１０４項のいずれか一項の使用。
マイコバクテリウム全細胞溶解物およびマイコバクテリウム全細胞溶解物を作製するプロセスの例を提供する。シードストックは、マイコバクテリウム・スメグマティス株、名称ｍｃ２１５５（第一世代）を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロスおよびＯＡＤＣ（７Ｈ９＋ＯＡＤＣ）培地中で増殖させて、さらなるプロセシング、例えば培地の将来の接種のための凍結シードストックを保存するため、５０〜１００シードストックを生成することによって、生成する。マイコバクテリウム・スメグマティスｍｃ２１５５の商業的に入手可能な供給源は、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｔｒｅｖｉｓａｎ）ＬｅｈｍａｎｎおよびＮｅｕｍａｎｎ（ＡＴＣＣ（登録商標）７０００８４ＴＭ）である。本開示に適したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロスの商業的に入手可能な供給源は、ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）ＤｉｆｃｏＴＭ  Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロスである。
【０１０７】
一般の当業者が知っているように、ＯＡＤＣは、マイコバクテリウム種のための培地中で用いられる、オレイン酸、アルブミン、デキストロース、およびカタラーゼの略である。ＯＡＤＣ補足剤には、表２に同定する量の構成要素が含まれる。
【０１０８】
表２
【０１０９】
【表２】
2019522659.tif 000004
【０１１０】
ＯＡＤＣ補足剤は、表２に提供する構成要素の量に基づいて、適切なサイズの容器中、まず、水にＮａＣｌを溶解させることによって調製される。ＢＳＡをゆっくりと添加し、そしてＢＳＡが溶解するまで、組み合わせを撹拌するが、これは最大１時間掛かりうる。Ｄ異性体グルコース（「Ｄ−グルコース」）を組み合わせに添加する。適切な量のＮａＯＨを添加することによって、組み合わせのｐＨを７に調節する。第二の容器中で、オレイン酸ナトリウムを調製し、そしてその構成要素には、２４０ｍＬの水、４．８ｍＬの６Ｍ  ＮａＯＨ、および４．８ｍＬのオレイン酸が含まれる。構成要素を５６℃に温め、そして構成要素が透明溶液になるまで旋回させる。オレイン酸ナトリウム溶液をＯＡＤＣ補足剤に添加する。フード中で、組み合わせを無菌ボトル内に濾過する。ボトルをアルミニウムホイルで覆い、そして４℃で保存する。
【０１１１】
表３に示す量の構成要素を用いることによって、７Ｈ９＋ＯＡＤＣ培地を調製する。まず、オートクレーブした三角フラスコに、グリセロール、培地、および水を添加し、そして構成要素を混合することによって、７Ｈ９培地を調製する。ＯＡＤＣ補足剤を組み合わせに添加し、そして組み合わせを混合する。フード中で、培地を無菌ボトル内に濾過する。ボトルをアルミニウムホイルで覆い、そして４℃で保存する。
【０１１２】
表３
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
マイコバクテリウム・スメグマティスｍｃ２１５５の培養物は、マイコバクテリウム・スメグマティスｍｃ２１５５の第一世代ストックを用いて、７Ｈ９＋ＯＡＤＣ培地またはＧＡＳ培地上で増殖可能である。第一の工程は、用いようとする増殖培地（７Ｈ９またはＧＡＳ）を調製し、そして１０ｍＬ〜５０ｍＬで試験管内にアリコットすることによって、培養を開始することである。マイコバクテリウム・スメグマティス・シード培養物を迅速融解し、そして１ｍＬ凍結ストックから１０ｍＬ培地に無菌的にトランスファーすることによって、出発培養物を接種する。マイコバクテリウム増殖が明らかになり、そしてロバストになるまで、培養試験管を３７℃で２４〜７２時間インキュベーションする。
【０１１５】
次の工程は継代培養である。凍結ストックから開始した後、増殖中のマイコバクテリウム培養物を取り、そして総最終体積の１０％で、新鮮な増殖培地に添加することによって、培養を拡大する。例えば、１０ｍＬの増殖中のシードを、１００ｍＬの新鮮培地に添加する。新規に接種した培養物を戻して、３７℃で２４〜７２時間インキュベーションする。
【０１１６】
次の工程は最終培養である。継代培養法の後に、マイコバクテリウム培養物の最終総体積を達成したら、通気および混合しながら、産生発酵容器を３７℃で接種後７２時間インキュベーションする。
【０１１７】
次の工程は採取である。マイコバクテリウムを含有する培地を発酵容器から取り除き、そして３，０００ｒｐｍ（２，０００ｘｇ）で１５分間遠心分離して、細胞をペレットにする。あるいは、培養物を乱さずに１０〜１５分間置いて、より重いマイコバクテリウムを収集容器の底に定着させてもよい。定着／遠心分離したペレットから、液体を注ぎ出すかまたはその上から液体を吸引することによってのいずれかで、上清液体を除去する。リン酸緩衝生理食塩水を定着／遠心分離したペレットに添加して、マイコバクテリウムを洗浄する。定着させる／遠心分離することによってＰＢＳを再び除去し、そして凍結／溶解の前に、ペレットを全部で３回洗浄する。
【０１１８】
次の工程は、凍結／溶解である。収集し、そして洗浄したペレットを、さらにプロセシングするまで凍結してもよいし、または凍結なしに、ペレットを直ちにプロセシングしてもよい。ペレットを溶解緩衝液（８ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）、プロテイナーゼ阻害剤、２５０μｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼおよび２５０μｇ／ｍＬ  ＲＮアーゼ中に、溶解緩衝液ｍＬあたり、２グラム（湿重量）マイコバクテリウムを含有するように懸濁する。物理的剪断力、例えば超音波処理、高圧ホモジナイズまたはジルコニアビーズを用いた実験室スケールのホモジナイズを用いて、マイコバクテリウム細胞を破壊する。細胞調製物を等体積のジルコニア／シリカビーズ（０．１ｍＭ）に添加し、そして最長３０分間混合する。
【０１１９】
次の工程は清澄化である。マイコバクテリウム細胞を溶解した後、より大きいビーズおよび破壊されていない細胞構成要素が容器中で定着することを可能にすることによって、材料を再び清澄化する。遠心分離もまた用いて、沈降を高速化してもよい。清澄化後、０．２２ミクロンフィルターを通じて、生じた材料をろ過し、そしてアリコットを−２０℃またはそれ未満で保存する。
【０１２０】
最後の工程は分析試験である。最終凍結材料を、内毒素、ＴＮＦ−アルファ刺激能、総タンパク質、および無菌性に関して試験する。
本開示は、以下の限定されない実施例によってさらに記載される。肺胞マクロファージ（ＡＭΦ）は、気道において、免疫ホメオスタシスを維持する自然免疫系細胞の主なタイプである。いかなる理論によっても束縛されることなく、微生物産物に反応して、ＡＭΦによって生成される炎症促進性環境は、呼吸器ウイルス感染に対する適応免疫反応の発展に非常に重要であると考えらえる。マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬがＡＭΦにおいて炎症促進性反応を刺激する能力を試験するため、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬ曝露に対するブタＡＭΦの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ（「ＴＮＦ−α」）反応を測定する研究を行ってもよい。このタイプの細胞の代表的なサンプリングは、ブタＡＭΦ  ＺＭＡＣ細胞からなる。
【０１２１】
ＴＮＦアルファは主に、マクロファージ由来サイトカインである。ＴＮＦアルファは、自然宿主防御を仲介する際に関与する多くのサイトカイン遺伝子のトランス活性化のための「マスター・スイッチ」として作用する、ＮＦ−κＢのシグナル伝達、活性化、および転位置を誘導する。ＩＮＦガンマおよびＩＬ−１２などの他の炎症促進性サイトカインとともに、ＴＮＦアルファは、マクロファージおよび好中球の活性化、プロフェッショナル貪食細胞依存性機能の増大、ならびに細胞仲介性免疫の指示に関与する。
【０１２２】
ブタ肺胞マクロファージ
ブタＡＭΦ細胞株、ＺＭＡＣ−４は、ブタ胎児の肺から得ることが可能であり、そしてＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１６３、およびＣＤ１７２を含む、ＡＭΦに特徴的ないくつかの表面マーカーを発現する貪食細胞からなる。ＺＭＡＣ細胞は、ＰＲＲＳＶの増殖を効率的に支持することが示されてきている。ＺＭＡＣ細胞は、ｌ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国バージニア州ハーンドンを含む多くの供給源から商業的に入手可能）を含有し、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサムより商業的に入手可能）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１ｘ非必須アミノ酸（他の供給源の中でも、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈより商業的に入手可能）が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養可能であり、そして５％ＣＯ２大気中、３７℃で維持可能である。ＺＭＡＣ細胞の維持はまた、ミリリットルあたり１０ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）の組換えマウス・マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．ＴＭ、米国ペンシルバニア州ワーウィックより商業的に入手可能）の包含も必要とする。
【０１２３】
ブタＡＭΦの刺激
ＺＭＡＣ細胞を、４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、米国ニューヨーク州）の各個々のウェル中、ミリリットルあたり５ｘ１０＾５細胞（細胞／ｍＬ）で培養し、そして続いて、偽培地、１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖（「ＬＰＳ」）あるいは５、１．６７または０．５６ｍｃｇ／ｍＬのいずれかのマイコバクテリウム・スメグマティス由来のリポアラビノマンナン（ＬＡＭ−ＭＳ；ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）あるいは１０、５、１．６７または０．５６ｍｃｇ／ｍＬのいずれかの未精製マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬのいずれかに曝露し、そして６、１２または２４時間のいずれかで培養した。これらの時点の１つで、培養上清を採取し、そして試験するまで−２０℃で保存した。
【０１２４】
ＴＮＦ−αの定量化
偽処理されたかあるいはＬＰＳ、精製ＬＡＭまたは未精製マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬで処理されたブタ肺胞マクロファージを培養するために用いた培地を、特異的酵素連結免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）を用いることによって、ＴＮＦ−アルファの存在に関してアッセイする。ＴＮＦ−αの検出のため、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の５０マイクロリットル（μｌ）のマイクロリットルあたり３２マイクログラム（μｇ／ｍＬ）のブタＴＮＦ−アルファＭＡｂ（クローン１０３３０４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリスより商業的に入手可能）で４℃で１６時間コーティングした、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸ  ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の個々のウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、そしてブロッキング溶液（ＰＢＳ−Ｔ中の１％ＢＳＡ）とＲＴで１時間インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、５０μｌの培養上清およびＲＰＭＩ完全培地中で希釈したＴＮＦ−α標準（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２つ組ウェルに添加し、そしてＲＴで２時間放置した。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、各ウェルを、２．５μｇ／ｍＬビオチン標識ブタＴＮＦ−アルファＭＡｂ（クローン１０３３０２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより商業的に入手可能）および０．５％ＢＳＡブロッキング溶液を含有する５０μｌ  ＰＢＳ−Ｔと、ＲＴで１．５時間インキュベーションする。ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、各ウェルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃより商業的に入手可能なＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンを２０ｎｇ／ｍＬ含有する５０μｌ  ＰＢＳ−Ｔと、ＲＴで２０分間インキュベーションし、そして次いで再び、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄する。ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質（ＫＰＬ、米国マサチューセッツ州ガイザーズバーグより商業的に入手可能）を添加して、ＲＴで発色を開始し、そして１００μｌの１Ｍリン酸で停止した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓマイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サニーベールより商業的に入手可能）を用いて、４５０ｎｍで光学密度を決定する。結果を平均し、そして既知の量のＴＮＦ−αで得た値から生成した標準曲線に比較することによって、ＴＮＦ−αの量を決定する。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬで刺激したブタＡＭΦによるＴＮＦ−アルファの有意な産生
ＺＭＡＣ細胞がＬＰＳに反応してＴＮＦ−アルファを産生する能力が、以前の研究で立証されてきている。マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの免疫刺激活性を試験するため、ＺＭＡＣ細胞を、マイコバクテリウム培養のために最適化した７Ｈ９ブロス中で増殖させたマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬに曝露する。高濃度の１０μｇ／ｍＬのマイコバクテリウム・スメグマティスを最初に用いて、１２時間および２４時間細胞を刺激する。図１に例示するように、結果は、ブタ肺胞マクロファージ（ＡＭΦ）ＺＭＡＣを、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ産生の強力な刺激剤である細菌産物リポ多糖（ＬＰＳ）に曝露した際のＴＮＦ−アルファのより低い産生に比較して、ブタＡＭΦ  ＺＭＡＣをマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬに曝露した際に、ＴＮＦ−アルファが一気に産生されたことを示す。
【０１２６】
実施例２
マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬに反応したＡＭΦによるＴＮＦ−アルファの産生の大部分は、刺激後の最初の６時間に起こる
以前の実験からのデータは、ＴＮＦ−アルファの有意な量が刺激後１２時間までに産生されることを示しているが、１２時間〜２４時間の期間中に、このサイトカインのさらなる産生はないようである。この観察によって、本開示の発明者らは、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬに対するＴＮＦ−アルファの反応は、通常、刺激後４〜６時間以内にピークとなる、ＬＰＳ刺激に反応したこのサイトカインに関して観察されているものと類似の発現動力学を有するかどうか疑問を持った。したがって、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの刺激に反応したＴＮＦ−アルファ産生の動力学を確立するため、時間的分析をセットアップする。この実験において、本開示の発明者らはまた、同じマイコバクテリウム・スメグマティスであるが、異なるブロスタイプ中で培養したものから調製した２つの他のＷＣＬもまた含める。図２に例示するように、この時間的分析からの結果は、ＴＮＦ−アルファ発現活性の大部分が、刺激後６時間以内に起こり、そしてこの発現動力学が、すべての３つの試験したマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬ調製物に対する反応において類似であることを立証する。ＷＣＬの３つの異なる調製物に対するマクロファージのＴＮＦ−アルファ反応の類似の動力学および強度は、類似であり、そしてこれらの結果は、３つの調製物すべてが、マクロファージにＴＮＦ−アルファを産生させるように刺激する能力に関して、類似の組成を有することを示唆する。
【０１２７】
実施例３
マイコバクテリウム・スメグマティスを増殖させるために用いる培地は、ＷＣＬのＴＮＦ−アルファ誘導能に影響を及ぼす
発現動力学がマイコバクテリウム・スメグマティスの増殖条件とは独立であるにもかかわらず、最大ＴＮＦ−アルファ反応は、図２に示すような溶解物調製とは異なることが注目される。これらの結果は、マイコバクテリウム・スメグマティスを増殖させるために用いられる培地が、ＡＭΦ細胞のＴＮＦ−アルファ反応を誘導する際のＷＣＬの強度に影響を与えうることを示唆する。この理論を試験するため、各ＷＣＬの用量反応曲線を強度分析において確立する。図３に示すように、結果は、３つの溶解物すべてがＡＭΦの優れたＴＮＦ−アルファ反応を誘導可能であることを示すが、産生されるＴＮＦ−アルファの総量がわずかしか異ならないために、強度の解釈は複雑である。本研究において、例えば、図３は、ＮＢブロス中で増殖したマイコバクテリウム・スメグマティスから調製される溶解物が、最も低い半有効用量（ｅｃ５０＝１．２μｇ／ｍＬ）を生じることを示し、この溶解物の強度がより大きいことを示唆する。しかし、この溶解物による最大反応は、７Ｈ９またはＧＡＳブロス中で増殖したマイコバクテリウム・スメグマティスから調製されたＷＣＬによって誘導される反応の約８０％であることが認識されうる。
【０１２８】
強度の複雑な解釈は、ＮＢブロスから調製される溶解物を排除することによって取り除かれる。この分析から、７Ｈ９培地中で増殖したマイコバクテリウム・スメグマティスから調製される溶解物が、ＧＡＳ培地中で増殖した細菌から調製されるものよりもわずかにより強力であると結論付けることは合理的である。したがって、図３に例示するように、本研究は、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬ抽出物の強度（５０％有効用量によって示されるようなもの）が、ＷＣＬを調製する細菌細胞集団を調製するため、マイコバクテリウム・スメグマティスを培養するために用いられるタイプの増殖培地によって影響を受けうることを立証する。試験した３つの異なる培地のうち、ＧＡＳ培地が４．７９ｍｃｇ／ｍＬの５０％有効用量で最も優れているようであり、３．１９ｍｃｇ／ｍＬ培地の５０％有効用量で７Ｈ９培地が続き、そして１．２ｍｃｇ／ｍＬの５０％有効用量のＮＢ培地が続く。
【０１２９】
実施例４
マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬは、精製マイコバクテリウム細胞壁構成要素ＬＡＭ−ＭＳよりも有意により高いＴＮＦ−アルファ反応を誘導する
マイコバクテリウム細胞壁のいくつかの構成要素は、免疫刺激活性を有することが知られており、これには例えば、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、トレハロースジミコール酸（「ＴＤＭ」）およびマイコバクテリウム細胞壁リポアラビノマンナン（「ＬＡＭ」）が含まれる。すべてのマイコバクテリウム種によって発現されるマイコバクテリウム由来ＬＡＭは、マイコバクテリウム細胞に存在するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−２に結合することによって、マクロファージを活性化することが知られる。
【０１３０】
ＬＡＭは、ＴＬＲ２経路を通じて、ＴＮＦ−アルファを含む炎症促進性サイトカイン産生を誘導することが知られる、最も特徴付けられているマイコバクテリウム細胞壁構成要素である。本研究は、マイコバクテリウム・スメグマティスから生成されるＬＡＭ（「ＬＡＭ−ＭＳ」）での刺激に対して、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬでの刺激に反応したＺＭＡＣ細胞のＴＮＦ−アルファ反応を比較する。
【０１３１】
マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬおよびマイコバクテリウムＬＡＭ−ＭＳの同じ刺激濃度で、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬでの刺激に反応したＺＭＡＣ細胞によって産生されるＴＮＦ−アルファの観察される量は、商業的に入手可能なＬＡＭ−ＭＳ（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ）での刺激に反応して同じ細胞によって産生されるＴＮＦ−アルファの量よりも約４倍高く、これを図４に例示する。マイコバクテリウム・スメグマティスのＬＡＭは、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの一部に過ぎないため、これらの結果は、ＬＡＭに加えてマイコバクテリウム・スメグマティスの他の構成要素が、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬに存在する構成要素の複雑な混合物間の相加的で、そしておそらく相乗的な機構によって、ＴＮＦ−アルファ産生に寄与する可能性があることを示唆する。
【０１３２】
実施例５
マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬは、脱タンパク質化および脱脂質化マイコバクテリウム細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）に比較して、有意により高いＴＮＦ−アルファ反応を誘導する
マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬでの刺激に反応したＺＭＡＣ細胞のＴＮＦ−アルファ反応を、米国獣医学認可第２８９号を有する、Ｂｉｏｎｉｃｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ＵＳＡ，  Ｉｎｃ．（ジョージア州アセンズ）から入手可能な商業的製品、Ｅｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．での刺激に比較する。Ｅｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．製品はまた、失効した米国特許第４，７４４，９８４号によっても含まれる。Ｅｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．は、マイコバクテリウム・フレイから抽出されている精製マイコバクテリウム細胞壁のエマルジョンである。該商業的製品中で細胞壁抽出物の濃度は全く示されていないため、ＺＭＡＣ細胞によるＴＮＦ−アルファ産生を刺激する能力に関して、一連の希釈を試験する。この実験の結果を図４に例示する。Ｅｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．製品中の細菌抽出物の量が未知であるため、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬに対するＥｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．の強度に関する直接比較は不可能であるが、マイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬのわずか１．６７μｇ／ｍＬは、Ｅｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．よりもより強いＴＮＦ−アルファ反応を刺激したことが明らかである。したがって、これらの結果は、マイコバクテリウム・エンベロープの構造構成要素を含むマイコバクテリウム全細胞溶解物を投与すると、おそらく細胞壁構成要素しか持たないＥｑｕｉｍｕｎｅ  Ｉ．Ｖ．の投与に比較して、ＺＭＡＣ細胞に相加的でそしておそらく相乗的な効果を有することを示す。
【０１３３】
実施例６
ブタへのマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの投与は、ブタ免疫系の刺激を生じる
概念研究の証明を行い、ブタに対するマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬの免疫学的効果を評価する。基本研究設計を表４に示す。
【０１３４】
表４
【０１３５】
【表４】
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【０１３６】
基本設計プロトコル
１６頭のブタを、８頭のブタの２群にランダムに割り当て、そしてイヤータグで同定する。ブタは、１つの囲いに混じりあって入れられるか、または同じ生産施設に位置する２より多くない囲いに入れられるかいずれかである。ブタを表４に記載するように処理する。研究期間全体で、ブタを生産施設で飼育する。すべてのブタ研究を生産施設で行う。ブタをルーチンの最終肥育（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）のため、群れに戻し、そして研究終了時に通常通りにプロセシングする。処理後の１２〜１８時間の間および処理の３日後の日の朝に、血液を収集する。
【０１３７】
提唱する計画は以下の通りである。第０日の朝、研究のためにブタをランダムに選択し、タグ付けし、そして血液採取する（ｂｌｅｅｄ）。血液を収集したら直ちに、イリノイ州シャンペーンのＡｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。血液を周囲温度で保存する。第０日の午後、研究群ＡおよびＢにブタをランダムに割り当てるためのイヤータグ番号をＡｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。２つの囲いを用いる場合、ブタを２つの囲いにランダムに分ける。第０日の午後、処理ＡおよびＢを、群の割り当てあたり各８頭のブタに投与する（３〜５ＰＭの間に処理が終わることを目標とする）。第１日の早朝、処理の１２〜１８時間後となるように、できる限り早い時間にすべてのブタから血液採取する。すべての血液試料を、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送り、そして周囲温度で保存する。第３日の朝、すべてのブタから血液採取し、そして可能な限り速やかに、周囲温度で、血液をＡｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。
【０１３８】
分析試験プロトコル
凝血を防止するため、ヘパリン含有試験管内に収集する全血試料１ｘ１０ｍＬを、各ブタから収集し、そしてイヤータグ番号および日付で同定する。ヘパリン処理血液を収集し、そして（１）ＴＮＦ−アルファ刺激；（２）ナチュラルキラー下位集団；および（３）Ｂ細胞下位集団に関して分析する。試験試料を、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送り、そして直ちにプロセシングする。
【０１３９】
活動スケジュール
第０日の朝、１６頭のブタにユニークな番号のタグでタグ付けして、研究に登録する。不健康な動物は用いない。動物にタグ付けする間、１０ｍＬの血液試料をヘパリン試験管（緑の蓋）に収集する。各試験管に動物番号および試料収集日を示す。血液試料を、アイスパックをまったく入れないクーラー中で（光を遮断して周囲温度に維持し）、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。
【０１４０】
第０日の午後、群ＡまたはＢへのブタのランダムな割り当てごとに、ブタを１ｍＬの治療で鼻内処理する。すべての動物を同じ囲いに入れるか、または２つの囲いに分ける場合、各群から４頭の処理動物を２つの囲いの一方にランダムに割り当てる。血液試料を、アイスパックをまったく入れないクーラー中で（光を遮断して周囲温度に維持し）、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。
【０１４１】
第１日の朝、処理の１２〜１８時間後をねらって、研究中のブタの全身健康状態を観察し、そして検出された場合、いかなる異常な観察も記録する。１０ｍＬの血液試料をヘパリン試験管（緑の蓋）に収集する。各試験管に動物番号および試料収集日を示す。血液試料を、アイスパックをまったく入れないクーラー中で（光を遮断して周囲温度に維持し）、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。
【０１４２】
第３日の朝、研究中のブタの全身健康状態を観察し、そして検出された場合、いかなる異常な観察も記録する。１０ｍＬの血液試料をヘパリン試験管（緑の蓋）に収集する。各試験管に動物番号および試料収集日を示す。血液試料を、アイスパックをまったく入れないクーラー中で（光を遮断して周囲温度に維持し）、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．に送る。
【０１４３】
結果／分析
ＴＮＦ−アルファ刺激のデータおよび結果を表５および図５に示す。データをＴＮＦ−アルファのナノグラム／ｍＬで示す。
【０１４４】
表５
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
群Ａに比較して、群Ｂにおいて、ＴＮＦ−アルファ刺激の増加が観察される。結果は、群Ｂのマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬ構成要素が、曝露されたブタにおいて、ＴＮＦ−アルファの算出に影響を及ぼしたことを示す。
【０１４７】
ナチュラルキラー下位集団のデータおよび結果を表６および図６に示す。データを、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団のパーセント（％）で示す。
表６
【０１４８】
【表６】
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【０１４９】
群Ｂのナチュラルキラー下位集団の増加が第１日に観察される。いかなる理論によって束縛されることも望ましくないが、群Ｂのマイコバクテリウム・スメグマティスＷＣＬ構成要素の接種に反応して、全身免疫刺激効果が生じたと仮定される。
【０１５０】
Ｂ細胞下位集団のデータおよび結果を表７および図７に示す。データを、ＰＢＭＣ集団のパーセント（％）で示す。
表７
【０１５１】
【表７】
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【０１５２】
群Ａに比較した群ＢのＢ細胞下位集団の増加が第１日に観察される。
態様を上記に開示しているが、本発明は、開示された態様に限定されない。その代わり、本出願は、その一般的な原理を用いた、本発明のいかなる変形、使用または適応も含むよう意図される。さらに、本出願は、本発明が関連し、そして付随する請求項の限定内に属する、当該技術分野の既知のまたは習慣的な実施の範囲内にあるような、本開示からのこうした逸脱も含むよう意図される。
【０１５３】
参考文献
【０１５４】
【化１−１】
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【０１５５】
【化１−２】
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【０１５６】
【化１−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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