(57)【要約】ＴＬ１Ａとしても知られる、受容体ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１５（ＴＮＦＳＦ１５）に特異的に結合する抗体が開示される。抗ＴＬ１Ａ抗体を作製および使用する方法もまた記載される。
2019522961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体１０Ａ４と、ヒトＴＬ１Ａ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）への結合について競合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
１以上の残基１０２−１１６（配列番号１６）または１６６−１８０（配列番号１７）を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
１以上の残基１６９ＱＡＧＲ１７２および１以上の残基１１３ＫＮＱＦ１１６を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する、請求項２に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
配列１６９ＱＡＧＲ１７２および／または１１３ＫＮＱＦ１１６を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する、請求項２に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
ＤＲ３へのヒトＴＬ１Ａの結合を実質的に阻害する、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
ヒトおよびカニクイザルＴＬ１Ａの両方に結合する、請求項１−４のいずれか一項に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項７】
抗体１０Ａ４がさらに
ａ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
ｉ）配列番号７の配列を含むＣＤＲＨ１；
ｉ）配列番号８の配列を含むＣＤＲＨ２；および
ｉ）配列番号９の配列を含むＣＤＲＨ３；
および
ｂ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
ｉ）配列番号１２の配列を含むＣＤＲＬ１；
ｉ）配列番号１３の配列を含むＣＤＲＬ２；および
ｉ）配列番号１４の配列を含むＣＤＲＬ３
を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
ａ）重鎖が、配列番号６の配列と少なくとも８０％配列同一性を有する重鎖可変領域を含み；および
ａ）軽鎖が、配列番号１１の配列と少なくとも８０％配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、
１以上の重鎖および１以上の軽鎖を含む、請求項７に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項９】
抗体が、
ａ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
ｉ）配列番号７の配列を含むＣＤＲＨ１；
ｉ）配列番号８の配列を含むＣＤＲＨ２；および
ｉ）配列番号９の配列を含むＣＤＲＨ３；
および
ｂ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
ｉ）配列番号１２の配列を含むＣＤＲＬ１；
ｉ）配列番号１３の配列を含むＣＤＲＬ２；および
ｉ）配列番号１４の配列を含むＣＤＲＬ３、
を含む１０Ａ４であって、
ここで、抗体または断片がＤＲ３へのヒトＴＬ１Ａの結合を実質的に阻害する、
単離抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
ａ）重鎖が、配列番号６の配列と少なくとも８０％配列同一性を有する重鎖可変領域を含み；および
ａ）軽鎖が、配列番号１１の配列と少なくとも８０％配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、
抗体または断片がＤＲ３へのヒトＴＬ１Ａの結合を実質的に阻害する、
１以上の重鎖および１以上の軽鎖を含む、請求項９に記載の単離抗体または抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体が、減少したまたは除去されたエフェクター機能を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃバリアントである、先行する請求項のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれかに記載の抗原結合断片の抗体の重および／または軽鎖可変領域をコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の宿主細胞を、抗体または断片の産生を可能にする条件下で培養すること、および細胞から抗体を精製することを含む、抗ＴＬ１Ａ抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項１６】
抗体またはその抗原結合断片とＴＬ１Ａ間で複合体の形成を可能にする条件下で、試料を請求項１−１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、試料におけるＴＬ１Ａの存在を検出し、複合体の形成を検出する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬ１Ａに対する抗体、ならびにかかる抗体を作製および使用する方法に関する。該抗体は免疫系疾患を治療することにおいて特に有用であると予想される。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に構造的に関連するタンパク質は、総称してＴＮＦスーパーファミリーと呼ばれる。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーであるＴＬ１Ａは、細胞死ドメイン受容体（ＤＲ）３に結合し、活性化リンパ球に共刺激シグナルを提供するＴＮＦ様サイトカインである。この相互作用を介して、ＴＬ１Ａは、ＩＦＮ−ガンマの分泌を誘導し、したがって、Ｔヘルパー１型エフェクター応答の発生に関与し得る。
【０００３】
ＴＬ１ＡはＩＩ型膜貫通タンパク質であり、かつＴＮＦスーパーファミリーメンバー１５（ＴＮＦＳＦ１５）と命名されている。ＴＬ１Ａは、内皮細胞および単球によって主に発現され、その発現はＴＮＦ−ａおよびＩＬ−１ａ（Ｍｉｇｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６：４７９−９２（２００２））により誘導される。ＴＬ１Ａは炎症性サイトカインＴＮＦおよびＩＬ−１によって、また免疫複合体（ＩＣ）によっても、アップレギュレートされる（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９２：２４１−５１（２００４））。
【０００４】
ＴＬ１Ａは、そのコグネイト受容体ＤＲ３（その活性化が死および生存因子両方を誘導することが既知の死受容体）を介してシグナル伝達を媒介する。ＴＬ１Ａはまた、ＴＮＦと同様に、ホモ三量体の可溶型として循環すると推定される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９８（１−２）：１−８（Ｍａｒｃｈ  ２００５））。
【０００５】
ＴＬ１Ａは、ＴＮＦ受容体ファミリーを含有する死ドメインのメンバーである細胞死受容体３（ＤＲ３）に高親和性で結合し、Ｗｓｌ−１、Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、およびＬＡＲＤとも呼ばれ、今やＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５）と命名されている。細胞の状況に依存して、ＴＬ１ＡによるＤＲ３のライゲーションは、２つのシグナル経路の１つ、転写制御因子ＮＦ−ｋＢの活性化またはカスパーゼおよびアポトーシスの活性化を引き起こすことができる。ＴＬ１Ａは、Ｔ細胞共刺激およびＴｈ１極性化において機能する。活性化されたＴ細胞上で、ＴＬ１Ａは、その表面結合受容体ＤＲ３を介して特異的に機能し、細胞生存および炎症性サイトカインの分泌を促進する。腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの可溶性タンパク質である、分泌されたデコイ受容体３（ＤｃＲ３）は、ＴＬ１Ａの作用をブロックする（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ＴＬ１Ａ，ａ  ＴＮＦ−ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２９８：１−８（２００５））。
【０００６】
従って、アレルギー／喘息、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、１型糖尿病および移植片拒絶などの、様々な炎症性および免疫疾患および障害の治療において使用され得る組成物が、当技術分野で依然として必要とされる。ＴＬ１Ａに対するモノクローナル抗体に関する本発明は、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトＴＬ１Ａに特異的に結合し、かつＤＲ３への結合をブロックし、それによってＴＬ１Ａ発現細胞においてそうでなければ生じるであろう免疫刺激シグナルを阻害する、単離抗体およびその抗原結合断片に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、抗体１０Ａ４とヒトＴＬ１Ａへの結合について競合する、単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０００９】
本発明は、１以上の残基１０２−１１６（配列番号１６）または１６６−１８０（配列番号１７）を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１０】
本発明は、１６９ＱＡＧＲ１７２の１以上の残基および１１３ＫＮＱＦ１１６の１以上の残基を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の実施形態は、配列１６９ＱＡＧＲ１７２または１１３ＫＮＱＦ１１６を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の実施形態は、配列１６９ＱＡＧＲ１７２および１１３ＫＮＱＦ１１６を含むエピトープでＴＬ１Ａに結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１１】
本発明は、ＤＲ３へのヒトＴＬ１Ａの結合を実質的に阻害する、単離抗ＴＬ１Ａ抗体またはその抗原結合断片を含む。本発明の実施形態は、ヒトおよびカニクイザルＴＬ１Ａの両方に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１２】
本発明は、配列番号７に示されるＣＤＲＨ１配列；配列番号８に示されるＣＤＲＨ２配列；および配列番号９に示されるＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変ドメインを含むＴＬ１Ａに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１３】
本発明は、配列番号１２に示されるＣＤＲＬ１配列；配列番号１３に示されるＣＤＲＬ２配列；および配列番号１４に示されるＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含むＴＬ１Ａに結合する、単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１４】
本発明の実施形態は、配列番号７に示されるＣＤＲＨ１配列；配列番号８に示されるＣＤＲＨ２配列；および配列番号９に示されるＣＤＲＨ３配列を含む重鎖可変ドメインならびに配列番号１２に示されるＣＤＲＬ１配列；配列番号１３に示されるＣＤＲＬ２配列；および配列番号１４に示されるＣＤＲＬ３配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、ＴＬ１Ａに結合する単離抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１５】
本発明は、１以上の重鎖および１以上の軽鎖を含む単離抗体または抗原結合断片を含み、ここで、重鎖は、配列番号６の配列と少なくとも８０％配列同一性を有する重鎖可変領域を含み；および軽鎖は、配列番号１１の配列と少なくとも８０％配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【００１６】
本発明は、抗体または断片の重および／または軽鎖可変領域をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞を抗体または断片を生産できる条件下で培養し、かつ細胞から抗体を精製することを含む、抗ＴＬ１Ａ抗体またはその抗原結合断片の製造方法を含む。
【００１７】
本発明の実施形態は、試料を抗体、または断片およびＴＬ１Ａ間に複合体の形成を可能にする条件下で本発明のＴＬ１Ａ抗体、または抗原結合断片と接触させることを含む、試料におけるＴＬ１Ａの存在を検出する方法、および複合体の形成を検出する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＴＬ１Ａ  ＣＨＯ細胞上のモノクローナル抗体１０Ａ４．Ｆ７の滴定を示す。ＴＬ１Ａ抗体の希釈液を１時間１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液において１０５  ＴＬ１Ａ  ＣＨＯ細胞とインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＰＥ抗ヒトＧｉｇ（Ｆａｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）での染色により抗体結合を検出し、かつＦＡＣＳにより評価した。ＥＣ５０は０．４０ｎＭである。
【図２】図２は、抗体１０Ａ４．Ｆ７によるｈＤＲ３  ＣＨＯ細胞へのＴＬ１Ａ結合の阻害を示す。２００ｎｇ／ｍｌ（５０μｌ）のＴＬ１Ａ  ＳＨ６を１０Ａ４．Ｆ７（５０μｌ）抗体またはコントロールＩｇＧ１抗体（ＦＡＣＳ緩衝液における全試薬）の希釈液とインキュベートした。混合物を３０分間インキュベートし、次いで、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中の１０５  ｈＤＲ３  ＣＨＯ細胞に加え、１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＰＥ抗６ｘＨｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ系）で細胞を染色することによりＤＲ３  ＣＨＯ細胞へのＴＬ１Ａ結合を検出し、ＦＡＣＳにより評価した。この実験におけるＩＣ５０は、０．５２４ｎＭであった。
【図３】図３は、センサーグラムを示す。プロテインＧ表面上に捕捉された１０Ａ４．Ｆ７とのＨｕ−ＴＬ１Ａ−Ｈｉｓ（２５０、２００、１５０、１００および５０ｎ）
【図４】図４は、結合ダイアグラムを示す。
【図５】図５は、ＤＳＣによる１０Ａ４．Ｆ７の物理的安定性を示す。
【図６】図６は、ＴＬ１Ａ．２−ｇ４Ｐカッパ軽鎖ヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図７】図７は、重鎖ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図８】図８は、１０Ａ４．Ｆ７  ＶＨ１領域ヌクレオチド（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＣＤＲＨ１（配列番号７）、ＣＤＲＨ２（配列番号８）およびＣＤＲＨ３（配列番号９）が示される。
【図９】図９は、１０Ａ４．Ｆ７  ＶＬ１領域ヌクレオチド（配列番号１０）およびアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。ＣＤＲＬ１（配列番号１２）、ＣＤＲＬ２（配列番号１３）およびＣＤＲＬ３（配列番号１４）が示される。
【図１０】図１０は、１０Ａ４のＨＤＸ−ＭＳエピトープマッピングを示す。エピトープ領域は、下線が引かれている。アミノ酸８５−１０１（配列番号１５）、１０２−１１６（配列番号１６）および１６６−１８０（配列番号１７）。
【図１１】図１１は、ＴＬ１Ａのアミノ酸１０２−１１６および１６６−１８０である２つのペプチド領域の代表的なＨＤＸ動態曲線は、１０Ａ４による有意な保護を示したことを示す（青色曲線  対  赤色曲線）。非エピトープ領域７２−８４（配列番号１８）は、一方で、ｍＡｂ結合時の重水素取り込みにおいて変化を示さなかった。
【図１２】図１２は、ＴＬ１Ａ構造上にマッピングされたＨＤＸにより同定されたＴＬ１Ａの２つの領域を示す。
【図１３】図１３は、ＴＬ１Ａにおける非連続的なエピトープが重鎖および軽鎖の両方からの相互作用を必要とするであろうことを示す１０Ａ４  ｍＡｂについてＦＡＢモデル（赤＝Ｈ鎖、ピンク＝Ｌ鎖）でのＴＬ１Ａ三量体を示す。ペプチド領域１（マゼンタ色）およびペプチド領域２（青色）は、溶媒に曝露された非連続的なエピトープを形成する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＴＬ１Ａに特異的に結合し、かつＤＲ３への結合をブロックし、それによってＴＬ１Ａ発現細胞においてそうでなければ生じるであろう免疫刺激シグナルを阻害する、単離抗体、特にモノクローナル抗体、例えばヒトモノクローナル抗体を開示する。単離抗体、かかる抗体の製造方法ならびに抗体または断片を含有するように製剤化された医薬組成物が、本明細書に提供される。免疫抑制のための抗体単独で、または他の免疫抑制剤と組み合わせて使用する方法もまた、本明細書に提供される。従って、本明細書中に記載される抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、例えば、免疫系疾患を治療することを含む広範な治療適用に使用されてもよい。
【００２０】
定義
本明細書中で使用される「抗体」という用語は、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖を含んでもよい。一実施形態では、「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合断片を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。或る天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体では、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。或る天然に存在する抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的散在性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、様々な免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。
【００２１】
抗体は、典型的には、１０−７〜１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）により反映される高親和性でそれらのコグネイト抗原に特異的に結合する。約１０−６Ｍより大きい任意のＫＤは、一般に、非特異的な結合を示すと考えられる。本明細書中で使用されるように、抗原に「特異的に結合する」抗体は、高親和性で抗原および実質的に同一の抗原に結合する抗体を指し、それは１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５ｘ１０−９Ｍ以下、および最も好ましくは１０−８Ｍおよび１０−１０Ｍ間以下のＫＤを有することを意味し、無関係の抗原には高親和性で結合しない。所定の抗原と高度の配列同一性を示す場合、例えば、所定の抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％配列同一性を示す場合、抗原は、所定の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトＴＬ１Ａに特異的に結合する抗体はまた、或る非ヒト霊長類種（例えば、カニクイザル）からのＴＬ１Ａと交差反応してもよいが、他の種からのＴＬ１Ａ、またはＴＬ１Ａ以外の抗原と交差反応しない。
【００２２】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない任意の一般に既知のアイソタイプに由来してもよい。ＩｇＧアイソタイプは、或る種における以下のサブクラスに分けられる：ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ならびにマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１はいくつかのアロタイプの存在し、最大で数個のアミノ酸において互いに異なる。「抗体」は、例として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体；全合成抗体；ならびに一本鎖抗体を含んでもよい。
【００２３】
本明細書中で使用される抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語は、抗原（例えば、ヒトＴＬ１Ａ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分／断片」という用語内に包含される結合断片の例は、以下を含む（ｉ）Ｆａｂ断片−ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片−ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、および（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）。単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、または合成リンカーにより連結された２以上の単離ＣＤＲの組み合わせは、抗原に結合できる場合、抗体の抗原結合ドメインを含んでもよい。
【００２４】
別段の指示がない限り、「抗体または断片」が、「抗体またはその抗原結合断片」と同一の意味を有するように、「断片」という用語は、請求項等で抗体について使用される場合、抗体の抗原結合断片を指す。
【００２５】
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープについて単一の結合特異性および親和性を示す抗体または全ての抗体が特定のエピトープについて単一の結合特異性および親和性を示す抗体の組成物を指す。典型的には、かかるモノクローナル抗体は、単一の細胞または抗体をコードする核酸に由来し、かつ、任意の配列変化を意図的に導入することなく増殖されるだろう。従って、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および任意の定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマより産生され、例えば、トランスジェニックまたは導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）から得られるＢ細胞を不死化細胞に融合することにより得られる。
【００２６】
本明細書中で使用される「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段により調製され、発現され、作製され、または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてのトランスジェニックまたは導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えば、マウス）またはそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体（ｃ）組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段により調製され、発現され、作製され、または単離された抗体、を含む。かかる組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされた特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用する可変および定常領域を含むが、例えば、抗体成熟の間に起こるその後の再編成および変異を含む。当技術分野で知られるように（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１１７−１１２５参照）、可変領域は、抗原結合ドメインを含有し、外来抗原に特異的な抗体を形成するよう再編成する様々な遺伝子によりコードされている。再編成に加えて、可変領域は、外来抗原への抗体の親和性を増加させるために、複数の単一アミノ酸変化（体細胞突然変異または超変異と呼ばれる）によりさらに改変され得る。定常領域は、抗原にさらに応答して変化する（すなわち、アイソタイプスイッチ）。従って、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再編成され、かつ体細胞変異した核酸配列は、最初の生殖系列配列と同一でなくてもよく、代わりに実質的に同一、または類似している（すなわち、少なくとも８０％の同一性を有する）。
【００２７】
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書中に記載される抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入される変異）。しかしながら、本明細書中で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体という用語は、同義語として使用される。
【００２８】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００２９】
本明細書中で使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する（例えば、ＴＬ１Ａに特異的に結合する単離抗体は、ＴＬ１Ａ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＴＬ１Ａのエピトープに特異的に結合する単離抗体は、異なる種からの他のＴＬ１Ａタンパク質への交差反応性を有してもよい。
【００３０】
本明細書中で使用されるように、「ＤＲ３へのＴＬ１Ａの結合を阻害する」抗体は、当該分野で認識されている方法、例えば、ＦＡＣＳ−ベースの細胞−結合アッセイで約０．９μｇ／ｍＬ以下、約０．８５μｇ／ｍＬ以下、約０．８μｇ／ｍＬ以下、約０．７５μｇ／ｍＬ以下、約０．７μｇ／ｍＬ以下、約０．６５μｇ／ｍＬ以下、約０．６μｇ／ｍＬ以下、約０．５５μｇ／ｍＬ以下、約０．５μｇ／ｍＬ以下、約０．４５μｇ／ｍＬ以下、約０．４μｇ／ｍＬ以下、約０．３５μｇ／ｍＬ以下、約０．３μｇ／ｍＬ以下、約０．２５μｇ／ｍＬ以下、約０．２μｇ／ｍＬ以下、約０．１５μｇ／ｍＬ以下、または約０．１μｇ／ｍＬ以下などの約１μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０を有する、ヒトＤＲ３へのヒトＴＬ１Ａの結合を阻害する抗体を指す。
【００３１】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＴＬ１Ａ）上の部位を指す。タンパク質抗原内のエピトープは、連続アミノ酸（通常直鎖状エピトープ）またはタンパク質の３次ホールディングにより並置された不連続アミノ酸（通常、立体構造エピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、必ずしもそうであるとは限らないが、変性溶媒への曝露の際に保持され、一方で、３次ホールディングにより形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒での処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的な立体配座における少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。
【００３２】
「エピトープマッピング」という用語は、抗体−抗原認識に関与する抗原上の分子決定基の同定のプロセスを指す。所定の抗体により結合されるエピトープを決定する方法は、当技術分野で周知あり、かつ例えば、イムノブロッティングおよび免疫沈降アッセイ、ここで、オーバーラップまたは連続ペプチド（例えば、ＴＬ１Ａからの）は、所定の抗体（例えば、抗ＴＬ１Ａ抗体）との反応性について試験される；Ｘ線結晶学；２次元核磁気共鳴；酵母ディスプレイ；およびＨＤＸ−ＭＳ（本明細書の実施例８参照）を含む；（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照）。
【００３３】
２以上の抗体に関して「同一のエピトープに結合する」という用語は、所定の方法により決定されるように抗体がアミノ酸残基の同一のセグメントに結合することを意味する。本明細書中に記載される抗体で、抗体が「ＴＬ１Ａ上の同一のエピトープ」に結合するかどうかを決定する技術は、例えば、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のｘ線解析および水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）（本明細書実施例８参照）などのエピトープマッピング方法を含む。他の方法は、抗原断片（例えばタンパク質分解断片）または抗原の変異したバリエーションへの抗体の結合をモニターする、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の改変に起因する結合の喪失はよくエピトープ成分の指標と考えられる、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１）または変異標的配列バリアントの酵母ディスプレイなど。加えて、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法もまた、使用され得る。これらの方法は、組み合わせのファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドをアフィニティー分離する目的の抗体の能力に依存する。ＶＨおよびＶＬと同一のもしくは密接に関する、または同一のＣＤＲ１、２および３配列を有する抗体は、同一のエピトープに結合することが予想される。
【００３４】
「標的への結合について別の抗体と競合する」抗体は、標的への他の抗体の結合を阻害する（部分的にまたは完全に）抗体を指す。２つの抗体が標的への結合について互いに競合するかどうか、すなわち、１の抗体が標的への他の抗体の結合を阻害するかどうか、およびその程度は、既知の競合実験を使用して決定されてもよい。或る実施形態では、抗体は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％まで標的と競合し、かつ標的への別の抗体の結合を阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」（すなわち、標的と最初にインキュベートされるコールド抗体（ｃｏｌｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））であるかに依存して異なってもよい。競合アッセイは、例えば、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．；２００６；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４２７７またはＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ  １９９９による「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」の１１章に記載されるように行われ得る。競合する抗体は、同一のエピトープ、オーバーラップエピトープまたは隣接するエピトープ（例えば、立体障害によって示される）に結合する。
【００３５】
他の競合結合アッセイは、固相直接の、または間接のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接の、または間接の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２参照）；固相直接のビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４参照）；固相直接の標識化アッセイ、固相直接の標識化サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接の標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７参照）；固相直接のビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６）；および直接の標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７）を含む。
【００３６】
本明細書中で使用される「特異的な結合」、「選択的な結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、他の抗原ではなく所定の抗原上のエピトープへの抗体結合を指す。典型的には、抗体は、（ｉ）例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組み換えヒトＴＬ１Ａおよびリガンドとして抗体を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術または抗原陽性細胞への抗体の結合のスキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により決定される場合、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらに低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、かつ（ｉｉ）所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてその親和性より少なくとも２倍大きい親和性で、所定の抗原に結合する。従って、「ヒトＴＬ１Ａに特異的に結合する」抗体は、１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらに低いＫＤで可溶性または細胞結合ヒトＴＬ１Ａに結合する抗体を指す。「カニクイザルＴＬ１Ａと交差反応する」抗体は、１０−７Ｍ以下、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらに低いＫＤでカニクイザルＴＬ１Ａに結合する抗体を指す。
【００３７】
本明細書中で使用される「ｋａｓｓｏｃ」または「ｋａ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度定数を指し、一方で、本明細書中で使用される「ｋｄｉｓ」または「ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指す。本明細書中で使用される「ＫＤ」という用語は、平衡解離定数を指し、ｋｄとｋａの比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫＤ値は、当技術分野で確立した方法を使用して決定され得る。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用して、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴系またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード分析などのバイオセンサー系を使用することによる。
【００３８】
抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロの、またはインビボでのアッセイの文脈における「ＥＣ５０」という用語は、最大応答の５０％、すなわち最大応答およびベースラインの中間である応答を誘導する、抗体またはその抗原結合断片の濃度を指す。
【００３９】
「固定化されたＴＬ１Ａに結合する」という用語は、例えば、細胞の表面に発現された、または固体支持体に結合されたＴＬ１Ａに結合する本明細書中に記載される抗体の能力を指す。
【００４０】
本明細書中で使用される「交差反応」という用語は、異なる種からのＴＬ１Ａに結合する本明細書中に記載される抗体の能力を指す。例えば、ヒトＴＬ１Ａに結合する本明細書中に記載される抗体はまた、別の種からのＴＬ１Ａ（例えば、カニクイザルＴＬ１Ａ）に結合してもよい。本明細書中で使用されるように、交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）において精製された抗原との特異的な反応性を検出する、またはＴＬ１Ａを生理学的に発現する細胞と結合するもしくはそうでなければ機能的に相互作用することにより測定されてもよい。交差反応性を決定する方法は、本明細書中に記載される標準的な結合アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００  ＳＰＲ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析、またはフローサイトメトリー技術を含む。
【００４１】
本明細書中で使用される対象物に適用される「天然に存在する」という用語は、対象物が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）に存在し、実験室で人間により意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００４２】
「ポリペプチド」は、鎖の長さ上限に上限はなく、少なくとも２つの連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖を指す。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合に限定されない改変を含有してもよい。「タンパク質」は、１以上のポリペプチドを含んでもよい。
【００４３】
本明細書中で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよくかつ、ｃＤＮＡであってもよい。
【００４４】
本明細書に提供される抗体配列への「保存的配列改変」、すなわちヌクレオチド配列によりコードされた、またはアミノ酸配列を含有する抗体の抗原への結合を抑制しないヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変もまた提供される。例えば、改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で既知の標準技術により導入され得る。保存的配列改変は、保存的アミノ酸置換を含み、アミノ酸残基は類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、抗ＴＬ１Ａ抗体における予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同一の側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を除去しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）参照）。
【００４５】
あるいは、別の実施形態では、変異は、飽和突然変異誘発などにより抗ＴＬ１Ａ抗体コーディング配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入され得、かつ得られた改変抗ＴＬ１Ａ抗体は、改善された結合活性についてスクリーニングされ得る。
【００４６】
核酸について、「実質的な相同性」という用語は、最適にアラインメントされかつ比較される場合、２つの核酸、またはその指定された配列が、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有し、少なくとも約８０％ヌクレオチド、通常少なくとも約９０％−９５％、およびより好ましくは少なくとも約９８％−９９．５％ヌクレオチドと同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。
【００４７】
ポリペプチドについて、「実質的な相同性」という用語は、最適にアラインメントされかつ比較される場合、２つのポリペプチド、またはその指定された配列が、適切なアミノ酸挿入または欠失を有し、少なくとも約８０％アミノ酸、通常少なくとも約９０％−９５％、およびより好ましくは少なくとも約９８％−９９．５％アミノ酸と同一であることを示す。
【００４８】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して決定された最適なアラインメントで配列が最適にアラインメントされる場合、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の総数ｘ１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントについて導入される必要がある。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、下記の非限定例に記載される数学的なアルゴリズムを使用して達成され得る。
【００４９】
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップ重み４０、５０、６０、７０、または８０および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０重み残差表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用し、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定され得る。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さ重み１、２、３、４、５、または６を使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００５０】
本明細書中に記載される核酸およびタンパク質配列は、公共のデータベースに対する検索を行う、例えば、関連する配列を同定するために「クエリー配列」としてさらに使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２で行われ、本明細書中に記載される核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝３で行われ、本明細書中に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップのアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期状態のパラメータが、使用され得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【００５１】
核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸（例えば、染色体の他の部分）またはタンパク質から、アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知の他のものを含む標準技術によって精製される場合、「単離された」または「実質的に純粋である」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）参照。
【００５２】
核酸、例えばｃＤＮＡは、標準技術に従って、遺伝子配列を提供するために変異してもよい。コーディング配列について、これらの変異は、所望のアミノ酸配列に影響してもよい。特に、ＤＮＡ配列は、本明細書中に記載される天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ）、スイッチおよび他のかかる配列と実質的に相同、またはそれに由来することが意図される。
【００５３】
本明細書中で使用される「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送する能力のある核酸分子を指すことを意図する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、ここで付加的なＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結されてもよい。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製できる（例えば、バクテリアの複製起点を有するバクテリアのベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。かかるベクターは、本明細書では、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれ、一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはよくプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドが最も一般に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に使用されてもよい。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターもまた含まれ、同等の機能を果たす。
【００５４】
本明細書中で使用される「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、細胞に自然に存在しない核酸を含む細胞を指し、組み換え発現ベクターが導入された細胞であってもよいことを意図する。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も意味することを意図すると理解されるべきである。変異または環境の影響のいずれかに起因して後続の世代に起こり得るので、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないが、本明細書中で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。
【００５５】
本明細書中で使用されるように、「抗原」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはハプテンなどの任意の天然のまたは合成の免疫原性物質を指す。抗原は、可溶性タンパク質コンストラクト、または細胞の表面を発現されたものいずれかとして、ＴＬ１Ａまたはその断片であってもよい。
【００５６】
「免疫調節物質（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」または「免疫抑制物質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ）」は、薬剤、例えば免疫応答を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）、調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）、または改変することに関与し得るシグナル経路の成分を指す。免疫応答を「調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、「調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）」、または「改変」することは、免疫系の細胞における、またはかかる細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）の活性における任意の変化を指す。かかる調節は、様々な細胞タイプの数の増加または減少、これらの細胞の活性における増加または減少、または免疫系内で生じ得る任意の他の変化により明らかにされてもよい免疫系の刺激または抑制を含む。「免疫調節標的（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｔａｒｇｅｔ）」または「免疫調節標的（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｔａｒｇｅｔ）」は、結合について標的化されかつその活性が物質、薬剤、部分、化合物または分子の結合により変化する免疫調節物質である。免疫調節標的は、例えば、細胞の表面上の受容体（「免疫調節受容体」）および受容体リガンド（「免疫調節リガンド」）を含む。
【００５７】
本明細書中で使用される「投与する」は、当業者に既知の任意の様々な方法および送達系を使用する対象への治療剤を含む組成物の物理的な導入を指す。本明細書中に記載される抗体についての好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄、または他の非経口的な投与経路、例えば、注射または注入を含む。本明細書中で使用される「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の通常注射による投与様式を意味し、かつ静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、胸腔内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および肋骨内注射および注入、並びにインビボでの電気穿孔を含むが、これらに限定されない。あるいは、本明細書中に記載される抗体は、局所的、表皮、または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所などの非経口的な経路を介して投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回、および／または１つ以上の延長期間にわたり行うことができる。
【００５８】
本明細書中で使用される「阻害する」または「ブロックする」（例えば、ＤＲ３へのＴＬ１Ａの結合の阻害／ブロックを指す）という用語は、互換的に使用され、かつ部分的なおよび完全な阻害／ブロックの両方を包含する。いくつかの実施形態では、抗ＴＬ１Ａ抗体は、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％までＴＬ１ＡへのＤＲ３の結合を阻害する。
【００５９】
本明細書中で使用される「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的徴候の進行、発症、重症度または再発の逆転、緩和、改善、阻害、または減速または予防する目的で任意のタイプの介入またはプロセスを行う、または対象に活性薬剤を投与することを指す。予防は、疾患を有しない対象への投与、疾患の発症を防ぐこと、または疾患が発症するのであれば、その影響を最小化することを指す。
【００６０】
「有効な用量」または「有効量」という用語は、所望の効果を達成するかまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。「治療的に有効な量」または「治療有効量」の薬物または治療剤は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて使用される場合、疾患症状の重症度における減少により証明される疾患退行、疾患症状のない期間の頻度および持続時間における増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防を促進する任意の量の薬物である。「予防的に有効な量」または「予防的有効量」の薬物は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて疾患を発症するリスクのある対象、または疾患の再発を患う対象に投与される場合、疾患の発症または再発を阻害する量の薬物である。疾患退行を促進する、または疾患の発症または再発を阻害する治療上の、または予防的な薬剤の能力は、臨床試験中のヒト対象、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系、またはインビトロのアッセイで薬剤の活性をアッセイすることなどにより様々な当業者に既知の方法を使用して評価され得る。
【００６１】
「患者」および「対象」という用語は、予防的または治療上の治療のいずれかを受ける任意のヒトまたは非ヒト動物を指す。例えば、本明細書中に記載される方法および組成物は、免疫系疾患を治療するために使用され得る。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物を含む。
【００６２】
本明細書中で使用される「免疫系疾患」は、乾癬、ループス（例えばエリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺炎、原発性粘液浮腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例えばインスリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡群、クローン病、炎症性腸疾患、交感性眼炎、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性胆管炎、慢性活動性肝炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患、多発性筋炎、強皮症、および混合性結合組織病を含むが、以下に限定されない。
【００６３】
本明細書中で使用される「リウマチ性疾患」は、関節、骨、軟部組織、または脊髄に影響を及ぼす任意の疾患を意味し（Ｍａｔｈｉｅｓ，Ｈ．１９８３  Ｒｈｅｕｍａ）かつ炎症性リウマチ、変性リウマチ、関節外リウマチ、および膠原病を含む。さらに、リウマチ性疾患は、慢性多発性関節炎、関節症性乾癬、強直性脊椎炎、関節リウマチ、結節性多発動脈炎（ｐａｎａｒｔｅｒｉｉｔｉｓ  ｎｏｄｏｓａ）、全身性エリテマトーデス、進行性全身性強皮症、関節周囲炎（ｐｅｒｉａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｈｕｍｅｒｏｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）、尿酸性関節炎、軟骨石灰症、皮膚筋炎、筋肉リウマチ、筋炎、および筋硬症を含むがこれらに限定されない。いくつかのリウマチ性疾患は、対象の変化した免疫応答により引き起こされる自己免疫疾患であることが知られている。
【００６４】
本明細書中に記載される様々な態様は、以下のサブシェクションでさらに詳細に記載される。
【００６５】
Ｉ．抗ＴＬ１Ａ抗体
本願は、免疫系疾患を治療することにおける治療剤としての使用に望ましい特性を有する完全ヒト抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体を開示する。これらの特性は、高親和性でヒトＴＬ１Ａに結合する能力、カニクイザルＴＬ１Ａに結合する能力およびＤＲ３結合（したがってシグナル伝達）をブロックする能力を含む。
【００６６】
配列により本明細書に開示された抗ＴＬ１Ａ抗体は、実施例８および９に記載のようにして決定されたヒトＴＬ１Ａ上の特異的なエピトープに結合する。従って、同一または密接に関連するエピトープに結合する他の抗体は、これらの望ましい特性を共有する可能性が高い。
【００６７】
加えて、抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８はカニクイザルＴＬ１Ａに結合し、ヒト治療として抗体の使用に対する規制上の承認を支持する毒性試験を実施する必要がある場合に都合がよい。１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８と同一の、または類似のエピトープに結合する他の抗ＴＬ１Ａ抗体は、ｃｙｎｏ  ＴＬ１Ａへの結合のこの有利な性質を共有する可能性が高い。類似のエピトープに結合する抗体は、競合実験を行うことによって、またはそのエピトープを直接的に決定することによって発見され得る。
【００６８】
本明細書に開示された抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体と競合する抗ＴＬ１Ａ抗体
１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８などの、ｈｕＴＬ１Ａへの結合について本発明の抗体と競合する抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、本明細書中に記載されるもの（実施例１）と類似の免疫処置プロトコールを使用して産生されてもよい。本明細書中に記載される抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体と結合について競合する抗体はまた、ヒトＴＬ１Ａまたはその細胞外ドメイン（配列番号１９の残基７２−２５１）を含むコンストラクトでマウスを免疫することにより、または本明細書に開示された抗ＴＬ１Ａ抗体（例えば１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８）により結合されるエピトープを含有するヒトＴＬ１Ａの断片で免疫することにより、生成されてもよい。生じる抗体は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡでＴＬ１Ａの細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃドメインの融合タンパク質への結合をブロックすること、または例えばＦＡＣＳにより表面上でｈｕＴＬ１Ａを発現する細胞に結合する能力をブロックすることによりヒトＴＬ１Ａへの１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８の結合をブロックする能力についてスクリーニングされ得る。様々な実施形態では、試験抗体を、１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８の添加前、同時、または後にＴＬ１Ａ−Ｆｃ融合タンパク質（または表面上でｈｕＴＬ１Ａを発現する細胞）を接触させる。ＴＬ１Ａ（Ｆｃ融合として、または細胞上のいずれか）への１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８の結合を、特におよそ化学量論的な濃度で、減少させる抗体は、同じ、オーバーラップする、または隣接するエピトープに結合する可能性があり、したがって、１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８の望ましい機能的な特性を共有してもよい。
【００６９】
競合する抗体はまた、当技術分野で既知の他の方法を使用して同定され得る。例えば、組み換えヒトＴＬ１Ａタンパク質コンストラクトがプレート上に固定化され、様々な濃度の非標識の第一の抗体が加えられ、プレートが洗浄され、標識化された第二の抗体が加えられ、洗浄され、かつ結合した標識の量が測定される標準ＥＬＩＳＡアッセイまたは競合ＥＬＩＳＡアッセイが使用され得る。非標識の（第一の）抗体（「ブロッキング抗体」としても呼ばれる）の増加性の濃度が標識化（第二の）抗体の結合を阻害する場合、第一の抗体は、プレート上の標的への第二の抗体の結合を阻害すると言うことができ、または第二の抗体の結合と競合すると言うことができる。その上または代わりに、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ解析は、競合する抗体の能力を評価するために使用され得る。本明細書中に記載される抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体のＴＬ１Ａへの結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がＴＬ１Ａへの結合について抗体と競合できることを実証する。
【００７０】
従って、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳにより測定されるように、細胞上のＴＬ１Ａへの本明細書中に記載される抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体の結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％まで阻害する、および／または細胞上のＴＬ１Ａへのその結合が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％まで阻害された抗ＴＬ１Ａ抗体が、本明細書に提供される。
【００７１】
典型的には、同一の実験が逆に行われる、すなわち、第一の抗体が第二の抗体であり、かつ第二の抗体が第一の抗体である。或る実施形態では、１または他の抗体が第一の抗体である場合に阻害が起こるかどうかにかかわらず、抗体は少なくとも部分的に（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）または完全に（１００％）、標的、例えばヒトＴＬ１Ａまたはその断片への他の抗体の結合をブロックする。抗体が互いに両方の方法、すなわち、第一の抗体が最初に加えられる競合実験および第二の抗体が最初に加えられ競合実験で競合する場合、第一および第二の抗体は、標的への互いの結合を「交差ブロックする」。
【００７２】
おおよそ等しい濃度で存在する場合、抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体がヒトＴＬ１Ａへの１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８の結合を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％まで、または１００％まで阻害する場合、抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、本明細書に開示された抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体と競合すると考えられる。
【００７３】
同一のエピトープに結合する抗ＴＬ１Ａ抗体
本明細書に開示された抗体と同一の、または類似のエピトープに結合する抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、本明細書中に記載されるもの（実施例１）と類似の免疫処置プロトコールを使用して産生されてもよい。生じる抗体は、ヒトＴＬ１Ａへの高親和性結合についてスクリーニングされ得る（実施例４）。選択された抗体は、抗体により結合される正確なエピトープを決定するために水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）方法で研究され得る（実施例８）。ヒトＴＬ１Ａ上の、抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８と同一の、または類似のエピトープに結合する抗体は、１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８の望ましい機能的な特性を共有する可能性が高い。
【００７４】
エピトープ決定は、当技術分野で既知の任意の方法によりなされてもよい。本明細書に開示されたエピトープは、実施例８および９に記載され、図１０−１２に示されるようにＨＤＸ−ＭＳおよび計算により決定される。様々な実施形態では、抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は以下の場合；
それらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触されるｈｕＴＬ１Ａの少なくとも１つの領域内の１以上の同一の残基と接触する場合；それらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触されるｈｕＴＬ１Ａの少なくとも１つの領域内の大部分の残基と接触する場合；それらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触されるｈｕＴＬ１Ａの各領域内の大部分の残基と接触する場合；それらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触されるｈｕＴＬ１Ａの全長に沿って接触の大部分と接触する場合；それらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触されるヒトＴＬ１Ａの全ての別個の領域内で接触する場合；それらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触されるヒトＴＬ１Ａ上の任意の１つの領域の全ての残基と接触する場合；またはそれらが１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触される全ての領域の全ての残基と接触する場合
、本明細書に開示された抗ｈｕＴＬ１Ａ  ｍＡｂ、例えば１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８と同一のエピトープに結合すると考えられる。エピトープ「領域」は、例えば配列番号１６および１７で提供される抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８により接触される一次配列に沿った残基のクラスターである。
【００７５】
ＴＬ１Ａにおける１０Ａ４上のＨＤＸ−ＭＳ測定は、１０Ａ４が、ＴＬ１Ａにおける２つのペプチド領域から構成される非連続的なエピトープを有し、領域１が重水素取り込みにおける最も有意な変化を有することを指し示す（図１０および１１）：
ペプチド領域１（１６６−１８０）：ＥＩＲＱＡＧＲＰＮＫＰＤＳＩＴ（配列番号１７）
ペプチド領域２（１０２−１１６）：ＴＶＶＲＱＴＰＴＱＨＦＫＮＱＦ（配列番号１６）。
【００７６】
可能性のあるエピトープ領域を、ＴＬ１Ａにおける１０Ａ４  ＦａｂについてＨＤＸ−ＭＳ測定により交差検証した。ＭＳにおける重水素化されたペプチド断片化の有用性は、エピトープの空間分解能を以下にさらに精密化した：エピトープ１  １６９ＱＡＧＲ１７２およびエピトープ２  １１３ＫＮＱＦ１１６。
【００７７】
本明細書中に記載される抗体で「ＴＬ１Ａ上の同一のエピトープ」に結合する抗体を決定する技術は、抗原：抗体複合体の結晶のX線解析を含み、エピトープの原子分解を提供する。他の方法は、抗原断片または抗原の突然変異した変異体への抗体の結合をモニターする、ここで、抗原配列内アミノ酸残基の改変に起因する結合の喪失は、よくエピトープ成分の指標と考えられる。加えて、エピトープマッピングのためのコンピュータによる組み合わせの方法もまた、使用され得る。方法はまた、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特定の短いペプチド（天然の３次元形態または変性形態のいずれか）をアフィニティー分離する目的の抗体の能力に依存してもよい。そして当該ペプチドは、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードと見なされる。エピトープマッピングについて、立体構造の非連続的なエピトープをマッピングすることが示されているコンピュータによるアルゴリズムも開発されている（実施例９参照）。
【００７８】
エピトープまたはエピトープを含む領域はまた、ＴＬ１Ａに渡る一連のオーバーラップペプチドへの結合についてスクリーニングすることにより同定され得る。あるいは、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９の方法は、本明細書中に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体と同一のエピトープを有する、従って、類似の特性を有する、抗体の選択を導くために使用されてもよい。ファージディスプレイを使用して、まず抗ＴＬ１Ａ抗体の重鎖を軽鎖のレパートリー（好ましくはヒト）と組み合わせてＴＬ１Ａ結合抗体を選択し、新たな軽鎖を重鎖のレパートリー（好ましくはヒト）と組み合わせて、本明細書中に記載される抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体と同一のエピトープまたはエピトープ領域を有する（好ましくはヒト）ＴＬ１Ａ結合抗体を選択する。あるいは本明細書中に記載される抗体のバリアントは、抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発により得られ得る。
【００７９】
ＴＬ１Ａにおけるアミノ酸残基の、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１に記載されたアラニンスキャニング突然変異誘発または点突然変異誘発のいくつかの他の形態はまた、抗ＴＬ１Ａ抗体についての機能的なエピトープを決定するために使用されてもよい。
【００８０】
特定の抗体により結合されたエピトープまたはエピトープ領域（「エピトープ領域」はエピトープを含むまたはエピトープとオーバーラップする領域である）はまた、ＴＬ１Ａの断片を含むペプチドへの抗体の結合を評価することにより決定されてもよい。ＴＬ１Ａ（例えば、ヒトＴＬ１Ａ）の配列を包含する一連のオーバーラップペプチドは、合成され、かつ結合について例えば直接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ（ペプチドはマイクロタイタープレートのウェル上に結合したＴＬ１Ａへの抗体の結合を防ぐその能力について評価される）、またはチップ上でスクリーニングされてもよい。かかるペプチドスクリーニング方法は、いくつかの非連続的な機能的なエピトープ、すなわちＴＬ１Ａポリペプチド鎖の一次配列に沿って連続していないアミノ酸残基を含む、機能的なエピトープを検出できなくてもよい。
【００８１】
エピトープはまた、タンパク質の高速光化学酸化（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＰＯＰ）などのＭＳベースのタンパク質フットプリント法により同定されてもよい。ＦＰＯＰは、例えば、Ｈａｍｂｌｅｙ  ＆  Ｇｒｏｓｓ（２００５）Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  １６：２０５７に記載されるように行われてもよく、該方法は出典明示により具体的に本明細書に組み込まれる。
【００８２】
抗ＴＬ１Ａ抗体により結合されるエピトープはまた、遊離の場合、および目的の抗体と複合体において結合した場合のＴＬ１Ａにおける不安定なアミド水素のＨ−Ｄ交換速度のＮＭＲ決定を含む、Ｘ線結晶構造決定（例えば、ＷＯ２００５／０４４８５３）、分子モデリングおよび核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などの構造上の方法により決定されてもよい（Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１１３３５；Ｚｉｎｎ−Ｊｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：６８８４）。
【００８３】
Ｘ線結晶学に関して、結晶化は、マイクロバッチ（例えばＣｈａｙｅｎ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：１２６９）、ハンギングドロップ蒸気拡散（例えばＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００）、播種および透析を含む（例えばＧｉｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：３３９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１）当技術分野で既知の任意の方法を使用して達成されてもよい。少なくとも約１ｍｇ／ｍＬおよび好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するタンパク質調製物を使用することが望ましい。結晶化は、約１０％〜約３０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲のポリエチレングリコール１０００−２０，０００（ＰＥＧ；約１０００〜約２０，０００Ｄａの範囲の平均分子量）、好ましくは約５０００〜約７０００Ｄａ、より好ましくは約６０００Ｄａを含有する沈殿剤溶液中で、最も達成されてもよい。タンパク質安定化剤、例えば約０．５％〜約２０％の濃度範囲のグリセリンを含むことが望ましいときもある。塩化ナトリウム、塩化リチウムまたはクエン酸ナトリウムなどの適した塩もまた、沈殿剤溶液中で、好ましくは約１ｍＭ〜約１０００ｍＭの濃度で、望ましいときがある。沈殿剤は、ｐＨ約３．０〜約５．０、好ましくは約４．０で好ましくは緩衝される。沈殿剤溶液で有用な特定の緩衝液は、様々であり得、当技術分野で周知である。（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄ．，（１９９４）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。有用な緩衝液の例は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＭＥＳおよび酢酸を含むがこれらに限定されない。結晶は、２℃、４℃、８℃および２６℃を含む広範囲な温度で成長されてもよい。
【００８４】
抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究されてもよく、かつＸ−ＰＬＯＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布されたＹａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２；例えばＢｌｕｎｄｅｌｌ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８５）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１４  ＆  １１５，Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；米国特許出願公開第２００４／００１４１９４）、およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ（１９９３）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ４９：３７−６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６Ａ：３６１−４２３，Ｃａｒｔｅｒ  ＆  Ｓｗｅｅｔ，ｅｄｓ．；Ｒｏｖｅｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５６：１３１３−１３２３）などのコンピュータソフトウェアを使用して精密化されてもよく、それらの開示内容は、その全体が出典明示により組み込まれる。
【００８５】
高親和性で結合する抗ＴＬ１Ａ抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、本明細書に開示された抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体のように、高親和性でｈｕＴＬ１Ａに結合し、有効な治療剤である可能性を高める。様々な実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、３００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤでｈｕＴＬ１Ａに結合する。他の実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、２ｎＭおよび１００ｐＭ間のＫＤでｈｕＴＬ１Ａに結合する。ｈｕＴＬ１Ａに対する抗体の結合能力を評価する標準アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＳＰＲ解析およびＲＩＡを含む。
【００８６】
抗ＴＬ１Ａ抗体配列バリアント
本明細書に開示された抗体配列におけるいくつかの可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）は、許容され、依然として抗体の望ましい特性を維持してもよい。ＣＤＲ領域はカバットシステムを使用して記載されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。従って、本発明は、本明細書に開示された抗体（例えば１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８）のＣＤＲ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＣＤＲ配列を含む抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体をさらに提供する。本発明はまた、本明細書に開示された抗体（例えば１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８）の重および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の重および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体を提供する。
【００８７】
同一の生殖系列に由来する抗ＴＬ１Ａ抗体
抗原結合特異性が主にＣＤＲによって決定されることを考慮すると、本明細書に開示された抗体（例えば１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８）とＣＤＲ配列を共有する抗体は、それらの望ましい特性を共有する可能性が高い。
【００８８】
或る実施形態では、本発明の抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体は、特定のヒト生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来する重鎖可変領域および／または特定のヒト生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。抗体１０Ａ４は、ヒト生殖系列Ｖ４−３９、Ｄ４−１７およびＪＨ３に由来する重鎖および軽鎖生殖系列ＶＫ１およびＪＫ４を有する。ヒトＴＬ１Ａに結合し、かつこれらの生殖系列配列のいくつかまたは全てに由来する他の抗体は、配列、特に同一のＶ領域遺伝子に由来するものにおいて非常に密接に関連している可能性があり、したがって、同一の望ましい特性を共有することが予想される。
【００８９】
本明細書中で使用されるように、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、ヒト抗体は特定の生殖系列配列「に由来する」重または軽鎖可変領域を含み、かつ抗体配列は任意の他のものよりも所定の生殖系列に由来する可能性が高い生殖系列と十分に関連する。かかる系は、目的の抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫処置することまたは目的の抗原でファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。抗体の配列が「由来する」ヒト生殖系列免疫グロブリン配列は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、かつヒト抗体の配列と配列で最も近い（すなわち、最大の％の同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的変異の意図的な導入に起因して、生殖系列配列と比較してアミノ酸の差異を含有してもよい。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的にはヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によりコードされることアミノ酸配列とアミノ酸配列で少なくとも９０％同一であり、かつ他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウスの生殖系列配列）と比較した場合に、ヒトであるとヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９５％、またはより少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってもよい。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によりコードされるアミノ酸配列と１０以下のアミノ酸差異を示すだろう。特定の場合では、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子（例えばＶ領域）によりコードされるアミノ酸配列と５以下、または４、３、２、または１以下のアミノ酸の差異を示してもよい。
【００９０】
ＩＩ．遺伝子操作された抗体および改変された抗体
ＶＨおよびＶＬ領域
改変された抗体を遺伝子操作するために出発物質として本明細書に開示された１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を使用して調製され得る、遺伝子操作された抗体および改変された抗体もまた提供され、改変された抗体は出発抗体から変化した特性を有してもよい。抗体は、可変領域の１つまたは両方（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内、の１以上の残基を改変することにより遺伝子操作され得る。その上または代わりに、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、抗体は、定常領域内の残基を改変することにより遺伝子操作され得る。
【００９１】
行われ得る可変領域工学の１つのタイプはＣＤＲ移植である。かかる移植は、本明細書に開示された抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体と結合について競合する、および／または本明細書に開示された抗ｈｕＴＬ１Ａ抗体と同一のエピトープに結合する非ヒト抗ＴＬ１Ａ抗体をヒト化する際に特に有用である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を主に介して標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列に移植された特定の参照抗体からＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって特定の参照抗体の特性を模倣する組み換え抗体を発現できる（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９、およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０参照）
【００９２】
かかるフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開文献から得られ得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）、並びにＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）“Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ”  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ａｎｄ  Ｃｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）“Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ”  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６で見出すことができ；これらの各々の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００９３】
本明細書中に記載される抗体における使用についての好ましいフレームワーク配列は、本明細書中に記載される抗体により使用されるフレームワーク配列と構造上類似するものである。ＶＨ  ＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植され得る、またはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して２０までの、好ましくは保存的な、アミノ酸置換を含有するフレームワーク領域に移植され得る。例えば、或る例では、抗体の抗原結合能力を維持する、または増強するためにフレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えばＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０参照）。
【００９４】
本明細書中に記載される遺伝子操作された抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に改変がなされたものを含む。典型的には、かかるフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有してもよい。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することにより同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発により生殖系列配列に「復帰突然変異」され得る。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、包含されることを意図する。
【００９５】
別のタイプのフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去して抗体の潜在的な免疫原性を減少させるために、フレームワーク領域内の、または１以上のＣＤＲ領域内までもの１以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許公開第２００３０１５３０４３にさら詳細に記載されている。
【００９６】
別のタイプの可変領域改変は、目的の抗体の１以上の結合特性（例えば、親和性）を改善するためにＣＤＲ領域内のアミノ酸残基を変異させることである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発は、変異および抗体結合、または目的の他の機能的なに対する効果を導入するために行うことができる。好ましくは、保存的改変が導入される。変異は、アミノ酸付加、欠失、または好ましくは置換であってもよい。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５残基以下が変異される。
【００９７】
抗体のＣＤＲにおけるメチオニン残基は、酸化され、潜在的な化学的分解をもたらし、結果として抗体の効力が低下し得る。従って、酸化的分解を受けないアミノ酸残基で置換された重および／または軽鎖ＣＤＲにおける１以上のメチオニン残基を有する抗ＴＬ１Ａ抗体もまた提供される。
【００９８】
同様に、脱アミド部位は、抗ＴＬ１Ａ抗体、特にＣＤＲから除去されてもよい。
【００９９】
抗原結合ドメイン内の潜在的なグリコシル化部位は、抗原結合を妨害することがあるグリコシル化を防ぐために好ましくは除去される。例えば、米国特許第５，７１４，３５０参照。
【０１００】
Ｆｃｓおよび改変されたＦｃｓ
抗原への抗原結合ドメインの結合から生じる治療用抗体の活性（例えばアンタゴニスト抗体の場合、コグネイトリガンドまたは受容体タンパク質、またはアゴニスト抗体の場合、誘導されたシグナル伝達をブロックする）に加えて、抗体のＦｃ部分は、任意の数の生物学的効果を引き出すために複雑な方法で一般に免疫系と相互作用する。免疫グロブリンのＦｃ領域などのエフェクター機能は、抗原−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、および抗体−依存性細胞介在貪食（ＡＤＣＰ）などの多くの重要な抗体機能に関与し、異なる機構によるものではあるが標的細胞の死滅をもたらす。重鎖定常領域（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）の５つの主要なクラスまたはアイソタイプが存在し、特徴的なエフェクター機能をそれぞれ有する。これらのアイソタイプは、サブクラスにさらに細分することができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４として知られている４つのサブクラスに分かれている。ＩｇＧ分子は、抗体のＩｇＧクラスに特異的な３つのクラスのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）、すなわちＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩと相互作用する。ＦｃγＲ受容体へのＩｇＧの結合についての重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに位置することが報告されている。抗体の血清半減期は、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する抗体の能力により影響される。
【０１０１】
本発明の抗体は、意図した使用についての抗体の生物学的活性（もしあれば）に基づき選択された、異なるＦｃ領域を含む定常ドメインと組み合わせた本発明の可変ドメインを含んでもよい。Ｓａｌｆｅｌｄ（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１３６９。ヒトＩｇＧは、例えば、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類でき、かつこれらの各々は、１以上のＦｃγ受容体（活性化受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２）；ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６）および阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢ）への結合についての、および補体第一成分（Ｃ１ｑ）についての固有の特性を有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、全てのＦｃγ受容体に結合する；ＩｇＧ２は、ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１に結合し、かつＦｃγＲＩＩＡＲ１３１  ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８へはより低い親和性を有し；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、およびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８に結合し；および阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、全ての他のＦｃγ受容体よりＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３についてより低い親和性を有する。Ｂｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：３７１６  Ｉｄ。研究は、ＦｃγＲＩが、ＩｇＧ２に結合せず、およびＦｃγＲＩＩＩＢが、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合しないことが示されている。同著。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３≫ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２。結果として、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなくＩｇＧ１定常ドメインは、ＡＤＣＣが望ましい薬物での使用のために選択されてもよい；ＩｇＧ３は、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現ＮＫ細胞、マクロファージの単球の活性化の場合、選択されてもよい；およびＩｇＧ４は、抗体がアレルギー患者を脱感作するために使用される場合、選択されてもよい。ＩｇＧ４はまた、抗体が全てのエフェクター機能を欠如することが望ましい場合、選択されてもよい。
【０１０２】
従って、本明細書中に記載される抗ＴＬ１Ａ可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃである、に連結されてもよく（例えば、共有結合または融合）、以下の任意のアロタイプまたはイソアロタイプであってもよい、例えば、ＩｇＧ１について：Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１（ａ）、Ｇ１ｍ２（ｘ）、Ｇ１ｍ３（ｆ）、Ｇ１ｍ１７（ｚ）；ＩｇＧ２について：Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３（ｎ）；ＩｇＧ３について：Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１（ｇ１）、Ｇ３ｍ２８（ｇ５）、Ｇ３ｍ１１（ｂ０）、Ｇ３ｍ５（ｂ１）、Ｇ３ｍ１３（ｂ３）、Ｇ３ｍ１４（ｂ４）、Ｇ３ｍ１０（ｂ５）、Ｇ３ｍ１５（ｓ）、Ｇ３ｍ１６（ｔ）、Ｇ３ｍ６（ｃ３）、Ｇ３ｍ２４（ｃ５）、Ｇ３ｍ２６（ｕ）、Ｇ３ｍ２７（ｖ）。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ｍＡｂｓ  １：１）参照。アロタイプの選択は、潜在的な免疫原性の懸念、例えば抗薬物抗体の形成を最小化することなどにより影響されてもよい。
【０１０３】
本明細書中に記載される可変領域は、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原−依存性細胞傷害性などの抗体の１以上の機能的な特性を変化させるために１以上の改変を含むＦｃに結合してもよい。さらに、本明細書中に記載される抗体は、化学的に改変されてもよい（例えば、１以上の化学的な部分は、抗体に結合され得る）または抗体の１以上の機能的な特性を変化させるためにそのグリコシル化を変化させて改変されてもよい。これらの実施形態のそれぞれは、以下にさらに詳細に説明される。Ｆｃ領域における残基のナンバリングは、カバットのＥＵインデックスのものである。本明細書に開示された配列バリアントは、残基番号と、それに続く、天然に存在するアミノ酸の代わりに置換されるアミノ酸に関連し、任意に、その位置の天然に存在する残基が先行して提供される。複数のアミノ酸は、所定の位置に存在し得る場合、例えば配列が天然に存在するアイソタイプ間で異なる場合、または複数の変異がその位置で置換され得る場合、それらはスラッシュで区切られる（例えば「Ｘ／Ｙ／Ｚ」）。
【０１０４】
例えば、親Ｆｃと比較した（ａ）抗体−依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の増加または減少、（ｂ）補体媒介性細胞傷害性（ＣＤＣ）の増加または減少、（ｃ）Ｃ１ｑについての親和性の増加または減少および／または（ｄ）Ｆｃ受容体についての親和性の増加または減少を有するＦｃバリアントを生成するためにＦｃ領域における改変を行ってもよい。かかるＦｃ領域バリアントは、一般に、Ｆｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸改変を含むだろう。アミノ酸改変を組み合わせることは特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、その中に２、３、４、５などの置換を含んでもよい、例えば本明細書で同定された特定のＦｃ領域位置。例示的なＦｃ配列バリアントは本明細書に開示され、かつ米国特許第５，６２４，８２１；６，２７７，３７５；６，７３７，０５６；６，１９４，５５１；７，３１７，０９１；８，１０１，７２０；ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２；ＷＯ０１／５８９５７；ＷＯ０４／０１６７５０；ＷＯ０４／０２９２０７；ＷＯ０４／０３５７５２；ＷＯ０４／０７４４５５；ＷＯ０４／０９９２４９；ＷＯ０４／０６３３５１；ＷＯ０５／０７０９６３；ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０５／０９２９２５およびＷＯ０６／０２０１１４もまた提供される。
【０１０５】
エフェクター機能を低減すること
ＡＤＣＣ活性は、Ｆｃ領域を改変することによって減少されてもよい。或る実施形態では、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位は、除去されてもよい。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するように改変されてもよい。ＡＤＣＣ部位は、当技術分野で知られている；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関してＳａｒｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９参照。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒバリアントは、ＦｃγＲ結合を効率的に除去する。Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６：４２２３およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３９２６。他の実施形態では、ＦｃγＲへの減少した結合を有するＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含んでいた。Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：２８９。
【０１０６】
ＣＤＣ活性もまた、Ｆｃ領域を改変することにより減少してもよい。ＩｇＧ１位置Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１での変異、特にアラニン変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、Ｃ１ｑに結合し、かつ補体を活性化する対応する抗体の能力を有意に減少させる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８；ＷＯ  ９９／５１６４２。ＩｇＧ１の３３１位の改変（例えばＰ３３１Ｓ）は、補体結合を減少させることを示した。Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１およびＣａｎｆｉｅｌｄ  ＆  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３。別の例では、２３１〜２３９位のアミノ酸内の１以上のアミノ酸残基を変化させ、補体固定する抗体の能力を減少させる。ＷＯ９４／２９３５１。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、減少した補体結合を有するＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：２８９。
【０１０８】
エフェクター機能が完全に回避される使用について、例えば抗原結合のみが望ましい治療効果を生み出すために十分であり、かつエフェクター機能が、望ましくない副作用を導く（またはそのリスクを増大させる）だけである場合、ＩｇＧ４抗体が使用されてもよく、またはＦｃ領域またはその実質的な部分を欠く抗体または断片が考案され得、またはＦｃがグリコシル化を完全に除去するように変異されてもよい（例えばＮ２９７Ａ）。あるいは、エフェクター機能を欠き、ＦｃγＲに結合する能力を欠き（ＩｇＧ２のような）かつ補体を活性化できない（ＩｇＧ４のような）、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域）およびヒトＩｇＧ４（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）のハイブリッドコンストラクトが作製されている。Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：１２５６。Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：４４１；Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７９（エフェクター機能を一般的に減少させるＦｃ改変を考察する）も参照されたい。
【０１０９】
他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体の全てのエフェクター機能を減少させるために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって変更される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸は、抗体が、エフェクターリガンドについての減少した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が変化されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体（残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７）または補体のＣ１成分（残基２９７、３１８、３２０、３２２）であり得る。両方ともＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第５，６２４，８２１および５，６４８，２６０。
【０１１０】
１つの初期の特許出願はＡＤＣＣを減少させるためにＦｃγＲＩへの結合を減少させるＩｇＧ  Ｆｃ領域における改変（２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ）またはＣＤＣを除去するために補体成分Ｃ１ｑへの結合をブロックする改変（Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ）を提案した。ＷＯ８８／００７０８９。Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３；Ｃｈａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８：９０３６；およびＳｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７（ＦｃγＲＩＩＩ結合へのこれらの変異の効果を考察する）も参照。
【０１１１】
エフェクター機能を低減させるＦｃ改変はまた２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、および３２８Ｒなどの、２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５、および３２８位での置換、挿入、および欠失を含む。Ｆｃバリアントは、２３６Ｒ／３２８Ｒを含んでもよい。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減する他の改変は、２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、および２３４Ｖ置換を含む。これらおよび他の改変は、Ｓｔｒｏｈｌ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：６８５−６９１で概説される。新生児ＦｃＲ結合を維持（半減期維持）しながら、エフェクター機能（ＡＤＣＣおよび補体活性化の両方）は、ＩｇＧ１におけるＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、任意にＧ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４におけるＥ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、任意にＧ２３６Δ；およびＩｇＧ２におけるＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓなどの、１以上の２３３−２３６および３２７−３３１位でＩｇＧ残基を突然変異させることによって減少され得る。Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３；ＷＯ９９／５８５７２参照。エフェクター機能を減少させる他の変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７）；ＩｇＧ２におけるＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３；米国特許第５，８３４，５９７も参照されたい）；およびＩｇＧ４についてのＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５）を含む。ヒトＩｇＧ１におけるエフェクター機能を低減する別の変異の組み合わせは、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓを含む。Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４：７００。一般にＬａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ｇａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４７９を参照されたい。Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質（アバタセプト）との関連でエフェクター機能を減少させることが見出された付加的な変異はＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ（ＥＵ残基ナンバリング）である。Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ．３４：２２０４。
【０１１２】
減少したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有する他のＦｃバリアントは、以下に開示される；Ｇｌａｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２６：２８７（ＩｇＧ４におけるＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを減少させるＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：１１９８０（ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ）；Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＭＡｂｓ  １：５７２および米国特許公開第２００７／０１４８１６７（ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）；ＭｃＥａｒｃｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：１１８５（ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ）；Ｖａｆａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：１１４（ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）。
【０１１３】
或る実施形態では、本質的にエフェクター機能を有さない、すなわち、ＦｃγＲへの減少した結合および減少した補体結合を有するＦｃが選択される。例示的なＦｃ、例えば、エフェクターレスであるＩｇＧ１  Ｆｃは、以下の５つの変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５：２８９。これらの５つの置換はまた、グリコシル化を除去するためにＮ２９７Ａと併用されてもよい。
【０１１４】
ＩＩＩ．抗体の物理的な特性
本明細書中に記載される抗体は、軽または重鎖可変領域のいずれかにおける１以上のグリコシル化部位を含有できる。かかるグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性または変化した抗原結合に起因する抗体のｐＫの変化をもたらしてもよい（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２；Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４；Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７；Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含有するモチーフで起こることが知られている。いくつかの例では、可変領域グリコシル化を含有しない抗ＴＬ１Ａ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域におけるグリコシル化モチーフを含有しない抗体を選択することによる、またはグリコシル化領域内の残基を突然変異させることによる、いずれかで達成され得る。
【０１１５】
或る実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。アスパラギンの脱アミドはＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で起こってもよく、かつ、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を減少させるイソアスパラギン酸残基の生成をもたらす（イソアスパラギン酸効果）。
【０１１６】
各抗体は、固有の等電点（ｐＩ）を有し、一般にｐＨ６から９．５間の範囲にあたる。ＩｇＧ４抗体についてのｐＩは典型的には、６−８のｐＨ範囲内にある。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、インビボでの条件下でいくらかのアンフォールディングおよび不安定性を有してもよいという推測がある。したがって、正常範囲にあたるｐＩ値を含有する抗ＴＬ１Ａ抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲におけるｐＩを有する抗体を選択することによって、または荷電した表面残基を変異させることによってのいずれかで達成され得る。
【０１１７】
各抗体は、特徴的な融解温度を有し、より高い融解温度はインビボでより大きい全体の安定性を示す（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｍ  Ｃ（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１）。一般に、ＴＭ１（初期のアンフォールディングの温度）は６０℃より大きく、好ましくは６５℃より大きく、さらにより好ましくは７０℃より大きいことが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．６８：４７−５２）または円偏光二色性（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．４０：３４３−９）を使用して測定され得る（図５を参照されたい）。
【０１１８】
好ましい実施形態では、急速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して測定され得る（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ａ  Ｊ  ａｎｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｄ  Ｅ（１９９５）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．６７：３６２６−３２）。
【０１１９】
別の好ましい実施形態では、最小の凝集効果を有する抗体が選択され、凝集効果は望ましくない免疫応答の誘発および／または変化したまたは好ましくない薬物動態学的特性を引き起こし得る。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集で許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および光散乱を含むいくつかの技術により測定され得る。
【０１２０】
ヒト−ＩｇＧ４アイソタイプ（１０Ａ４−ＩｇＧ４）としてフォーマットされた抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ  １０Ａ４は、いくつかの標準生物物理学的な技術により特徴付けられ、かつ純粋で、単量体でかつ安定なモノクローナル抗体に典型的な生物物理学的な特性を有することが示された。例えば、マルチアングル光散乱検出器（ＭＡＬＳ）に結合されたサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）は、抗体の試料は純度９０％以上であり、主要種は〜１４０ｋＤａのＭＡＬＳ測定質量を有していたことを示した。動的光散乱は５．３ｎｍの流体力学的半径を決定し、また、溶液における単量体抗体について予想されるものと一致する。示差走査熱量測定データはまた、１０Ａ４−ＩｇＧ４が、高い熱安定性を有し、７０．７５℃、８４．６９８℃および８８．５０℃の転移中点（Ｔｍ）値を有する３つの異なる熱転移を有することを示した。
【０１２１】
ＩＶ．核酸分子  
本明細書中に記載される別の態様は、本明細書中に記載される抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および他の当技術分野で周知のものを含む標準技術により、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然の単離されたＤＮＡに結合している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から精製される場合、「単離された」または「実質的に純粋である」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。本明細書中に記載される核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、かつイントロン配列を含有しても、しなくてもよい。或る実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１２２】
本明細書中に記載される核酸は、標準分子生物学技術を使用して得られ得る。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに詳細に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体について、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得られ得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を使用する）から得られる抗体について、抗体をコードする核酸は、ライブラリーから回収され得る。
【０１２３】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準組み換えＤＮＡ技術によりさらに操作され得る、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子へ、Ｆａｂ断片遺伝子へ、またはｓｃＦｖ遺伝子へ変換する。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈において使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味することを意図する。
【０１２４】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長重鎖遺伝子へ変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており（例えば、以下Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｌ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）かつこれらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅により得られ得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【０１２５】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）へ変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）、かつこれらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅により得られ得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１２６】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬ配列が可動性リンカーに連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有して連続した一本鎖タンパク質として発現されるように、ＶＨ−およびＶＬをコードするＤＮＡ断片が可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結され得る（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４参照）。
【０１２７】
Ｖ．抗体産生
本発明の様々な抗体、例えば本明細書に開示された抗ヒトＴＬ１Ａ抗体と同一のエピトープと、競合または結合する抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）に記載された標準体細胞ハイブリダイゼーション技術などの様々な既知の技術を使用して産生され得る。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原理上、モノクローナル抗体を産生する他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージディスプレイ技術もまた、利用され得る。
【０１２８】
ハイブリドーマを調製する好ましい動物系として、マウス系がある。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常に確立された手順である。免疫処置プロトコールおよび融合のための免疫処置された脾臓細胞の単離のための技術は、当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウスの骨髄腫細胞）および融合手順もまた、知られている。
【０１２９】
本明細書中に記載されるキメラの、またはヒト化抗体は、上記に記載されたように調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。標準分子生物学技術を使用して、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的のマウスのハイブリドーマから得ることができ、かつ非マウスの（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよう遺伝子操作できる。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウスの可変領域は、当技術分野で既知の方法を使用してヒト定常領域に結合され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７  Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．参照）。ヒト化抗体を作製するために、マウスのＣＤＲ領域は、当技術分野で既知の方法を使用してヒトフレームワークに挿入され得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９、およびＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０参照）。
【０１３０】
一実施形態では、本明細書中に記載される抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＴＬ１Ａに対するかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくむしろヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾームマウスを使用して生成され得る。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾームマウスは、それぞれ本明細書中でＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスとして呼ばれるマウスを含み、本明細書中でまとめて「ヒトＩｇマウス」として呼ばれる。
【０１３１】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異とともに、再編成されていないヒト重（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９参照）。従って、マウスはマウスＩｇＭまたはκの減少した発現を示し、かつ免疫処置に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成するよう、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ｓｕｐｒａ；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３，ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６に概説される）。ＨｕＭａｂマウスの調製および使用、およびかかるマウス保有されるゲノム改変は、以下にさらに記載され：Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；ａｎｄ  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１、その全体が出典明示により具体的に本明細書に組み込まれる。さらに、米国特許第５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，７８９，６５０；５，８７７，３９７；５，６６１，０１６；５，８１４，３１８；５，８７４，２９９；および５，７７０，４２９；全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙ；Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，５４５，８０７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙ；およびＫｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照。
【０１３２】
或る実施形態では、本明細書中に記載される抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を有するマウスなどの、導入遺伝子およびトランス染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを使用して産生される。本明細書中で「ＫＭマウス」として呼ばれるかかるマウスは、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌのＰＣＴ公開ＷＯ０２／４３４７８で詳細に記載される。
【０１３３】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替トランスジェニック動物系は、当技術分野で入手可能であり、かつ、本明細書中に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体を産生するために使用され得る。例えば、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）として呼ばれる代替のトランスジェニック系が使用され得；かかるマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，９３９，５９８；６，０７５，１８１；６，１１４，５９８；６、１５０，５８４および６，１６２，９６３に記載される。
【０１３４】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスクロモゾーム動物系は、当技術分野で入手可能であり、かつ本明細書中に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体を産生するために使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」として呼ばれるヒト重鎖トランス染色体およびヒト軽鎖トランス染色体の両方を有するマウスが使用され得；かかるマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を有するウシは、当技術分野で記載され（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）、かつ本明細書中に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体を産生するために使用され得る。
【０１３５】
ヒト抗体、例えば、ヒト抗ＴＬ１Ａ抗体を作製するための当技術分野において記載されるさらなるマウス系として、（ｉ）内因性マウス重鎖および軽鎖可変領域が、相同組換えによって、内因性マウス定常領域に作動可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域と置換されており、その結果、マウスにおいてキメラ抗体（ヒトＶ／マウスＣ）が作製され、次いで、その後、標準組換えＤＮＡ技術を使用して完全ヒト抗体に変換される、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）ならびに（ｉｉ）マウスが再編成されていないヒト重鎖可変領域、しかし単一の再変性されたヒト共通軽鎖可変領域を含有するＭｅＭｏ（登録商標）マウス（Ｍｅｒｕｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。このようなマウスおよび抗体を作製するためのその使用は、例えば、ＷＯ２００９／１５７７７、ＵＳ２０１０／００６９６１４、ＷＯ２０１１／０７２２０４、ＷＯ２０１１／０９７６０３、ＷＯ２０１１／１６３３１１、ＷＯ２０１１／１６３３１４、ＷＯ２０１２／１４８８７３、ＵＳ２０１２／００７０８６１およびＵＳ２０１２／００７３００４に記載されている。
【０１３６】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製できる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２２３，４０９号；同５，４０３，４８４号；および同５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４２７，９０８号および同５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，９６９，１０８号および同６，１７２，１９７号；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８８５，７９３号；同６，５２１，４０４号；同６，５４４，７３１号；同６，５５５，３１３号；同６，５８２，９１５号および同６，５９３，０８１号を参照のこと。
【０１３７】
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体はまた、免疫処置の際にヒト抗体応答が生じ得るようヒト免疫細胞が再編成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製できる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，４７６，９９６号および同５，６９８，７６７号に記載されている。
【０１３８】
免疫処置
ヒトＴＬ１Ａに対する完全ヒト抗体を作製するために、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１およびＷＯ９８／２４８８４によって、その他の抗原について記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウス（例えば、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ７またはＫＭマウス）を、ＴＬ１Ａ抗原および／またはＴＬ１Ａを発現する細胞の精製または濃縮された調製物を用いて免疫処置できる。あるいは、マウスをヒトＴＬ１ＡをコードするＤＮＡを用いて免疫処置できる。好ましくは、マウスは、第１の注入の際に６〜１６週齢とする。例えば、ＨｕＭＡｂマウスを腹膜内に免疫処置するために、組換えＴＬ１Ａ抗原の精製または濃縮された調製物（５〜５０μｇ）を使用できる。ＴＬ１Ａ抗原の精製または濃縮された調製物を使用する免疫処置が抗体をもたらさない事象では、ＴＬ１Ａを発現する細胞、例えば、細胞系統を用いてマウスを免疫処置して、免疫応答を促進することもできる。例示的細胞系統として、ＴＬ１Ａ過剰発現性安定ＣＨＯおよびＲａｊｉ細胞系統が挙げられる。
【０１３９】
種々の抗原を用いる累積的経験は、ＨｕＭＡｂトランスジェニックマウスは、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる最初に腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）免疫処置と、それに続く、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原を用いる隔週でのＩＰ／ＳＣ免疫処置（最大合計１０）の際に最良に応答することを示した。免疫応答は、後眼窩出血によって得られている血漿試料を用いて、免疫処置プロトコールの過程にわたってモニタリングできる。血漿は、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってスクリーニングでき（以下に記載されるように）、抗ＴＬ１Ａヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために使用できる。マウスを、抗原を用いて静脈内に追加免疫し、３日後に、屠殺し、脾臓およびリンパ節を採取できる。各免疫処置のために２〜３回の融合が実施されることが必要であり得ると予測される。各抗原について、６から２４匹の間のマウスが、通常免疫処置される。普通、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＫＭ系統が使用される。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は両方とも、２種の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）単一マウスに一緒に育種され得る。
【０１４０】
ＴＬ１Ａに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本明細書に記載されるヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫処置されたマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合できる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングできる。例えば、５０％  ＰＥＧを用いて、免疫処置マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、Ｓｐ２／０非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８１）と融合できる。細胞を、およそ２×１０５で平底マイクロタイタープレートにプレーティングし、続いて、１０％胎児クローン血清、１８％「６５３」コンディショニング培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１Ｘ  ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する選択培地で２週間インキュベートする。およそ２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと置換されている培地で培養できる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングできる。広範なハイブリドーマ成長が起こると、１０〜１４日後に普通に培地を観察できる。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再度スクリーニングでき、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合に、制限希釈によってモノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングできる。次いで、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性決定のために組織培養培地において少量の抗体を作製できる。
【０１４１】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを、２リットルのスピナーフラスコ中で成長させることができる。プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
【０１４２】
ＶＩ．抗体製造
ＴＬ１Ａに対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
配列が提供される特異的抗体およびその他の関連抗ＴＬ１Ａ抗体の両方を含めた、本発明の抗体を、当技術分野で周知であるように、例えば、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。
【０１４３】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または対象の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、遺伝子が、転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入することができる。これに関連して、用語「作動可能に連結された」は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすよう、抗体遺伝子がベクター中にライゲーションされることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクター中に挿入されてもよく、または両遺伝子は、同一発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位およびベクターの連結または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって、発現ベクター（単数または複数）中に挿入される。本明細書に記載される抗体の軽鎖および重鎖可変領域を使用し、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数または複数）と作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントと作動可能に連結されるように、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクター中に挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製できる。さらに、またはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１４４】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子に加えて、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保持し得る。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））に記載されている。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得る当業者には明らかである。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有する、ＳＲαプロモーター系などの異なる供給源に由来する配列からなる（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【０１４５】
組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製の起点）などのさらなる配列および選択マーカー遺伝子を保持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、すべてＡｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，３９９，２１６号、同４，６３４，６６５号および同５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子として、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するための）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のための）が挙げられる。
【０１４６】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（単数または複数）を、標準技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の種々の形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のためによく使用されるさまざまな技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて本明細書に記載される抗体を発現させることは理論上可能であるが、真核細胞、最も好ましくは、哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましいが、これは、このような真核細胞、特に、哺乳動物細胞は、適切にフォールディングされ、免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、活性な抗体の高効率の産生にとっては有効ではないと報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。本発明の抗体はまた、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の糖鎖操作された株においても産生できる。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０。
【０１４７】
本明細書に記載される組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるように、ＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するためには、別の好ましい発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に開示されるＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞中に導入され、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
【０１４８】
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、よく観察される翻訳後修飾によって予測される配列とは異なることもある。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖から失われていることが多い。Ｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１００：１１３２。Ｎ末端グルタミン残基およびより少ない程度であるが、グルタミン酸残基は、治療用抗体の軽鎖および重鎖の両方でピログルタミン酸残基に変換されることが頻繁にある。Ｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：５４４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＪＢＣ  ２８６１１２１１；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１１２１１。
【０１４９】
ＶＩＩ．アッセイ
本明細書に記載される抗体は、ＴＬ１Ａとの結合について、例えば、標準ＥＬＩＳＡによって試験できる。手短には、マイクロタイタープレートを精製されたＴＬ１Ａを、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍＬで用いてコーティングし、次いで、ＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングする。各ウェルに抗体の希釈物（例えば、ＴＬ１Ａ免疫処置マウスから得た血漿の希釈物）を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次試薬（例えば、ヒト抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄した後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、ｐｒｏｄｕｃｔ：ＡＢＴＳ−１０００）を用いて発色させ、ＯＤ４１５〜４９５で分光光度計によって分析する。次いで、免疫処置されたマウスから得た血清を、ＴＬ１Ａを発現しないコントロール細胞株とではなく、ヒトＴＬ１Ａを発現する細胞株との結合についてフローサイトメトリーによってさらにスクリーニングする。手短には、抗ＴＬ１Ａ抗体の結合を、ＴＬ１Ａ発現性ＣＨＯ細胞を１：２０希釈の抗ＴＬ１Ａ抗体とともにインキュベートすることによって評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを用いて検出する。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施する。最高の力価を発生するマウスが、融合に使用されることが好ましい。
【０１５０】
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体、ひいては、ＴＬ１Ａ免疫原と陽性の反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングできる。好ましくは、高親和性でＴＬ１Ａと結合する抗体を産生するハイブリドーマを、サブクローニングし、さらに特性決定できる。細胞バンクを作製するために、抗体精製のために、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによって）各ハイブリドーマから１つのクローンを選択できる。
【０１５１】
抗ＴＬ１Ａ抗体を精製するために、モノクローナル抗体精製のために２リットルのスピナーフラスコ中で選択されたハイブリドーマを成長させることができる。プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたＩｇＧを、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーによって調べ、純度を確実にすることができる。バッファー溶液は、ＰＢＳに交換でき、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０によって濃度を決定できる。モノクローナル抗体をアリコートにし、−８０℃で保存できる。
【０１５２】
選択された抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体が独特のエピトープと結合するか否かを調べるために、市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して各抗体をビオチン化できる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン標識されたプローブを用いて検出できる。上記のように、ＴＬ１ＡコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用して、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究を実施できる。
【０１５３】
精製された抗体のアイソタイプを調べるために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を使用してアイソタイプＥＬＩＳＡを実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを調べるために、１μｇ／ｍＬの抗ヒト免疫グロブリンを用いてマイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩コーティングできる。１％  ＢＳＡを用いてブロッキングした後、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプコントロールと周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼがコンジュゲートしているプローブのいずれかと反応させる。プレートを上記のように発色させ、分析する。
【０１５４】
モノクローナル抗体の、ＴＬ１Ａを発現する生存細胞との結合を調べるために、実施例１７に記載されるようにフローサイトメトリーを使用できる。手短には、膜結合性ＴＬ１Ａを発現する細胞株（標準成長条件下で成長させた）を、０．１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃で１時間混合する。洗浄した後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下でフィコエリトリン（ＰＥ）標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。試料を光および側方散乱特性を使用するＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析して、単細胞でゲート開閉し、標識された抗体の結合を調べる。フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、または代わりに）、蛍光顕微鏡を使用する代替アッセイを使用してもよい。上記のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡によって調べることができる。この方法によって、個々の細胞の可視化が可能となるが、抗原の密度に応じて減少した感受性を有し得る。
【０１５５】
抗ＴＬ１Ａ抗体は、ウエスタンブロッティングによってＴＬ１Ａ抗原との反応性についてさらに試験できる。手短には、ＴＬ１Ａを発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロースメンブランにトランスファーし、２０％マウス血清を用いてブロッキングし、試験されるべきモノクローナル抗体を用いてプロービングする。抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを使用してＩｇＧ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤を用いて発色させることができる（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１５６】
種々の抗ＴＬ１Ａ抗体の結合親和性、交差反応性および結合速度論を解析する方法は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００ＳＰＲ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を含む。
【０１５７】
一実施形態では、抗体は、ヒトＴＬ１Ａの細胞外領域と特異的に結合する。抗体は、ＴＬ１Ａの細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能的ドメイン）と特異的に結合し得る。特定の実施形態では、抗体は、ＤＲ３が結合するＴＬ１Ａ上の部位と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＬ１Ａの細胞外領域およびカニクイザルＴＬ１Ａの細胞外領域と特異的に結合する。好ましくは、抗体は、高親和性でヒトＴＬ１Ａと結合する。
【０１５８】
ＶＩＩＩ．組成物
容される担体と一緒に製剤化された、本明細書に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体またはその抗原結合断片（単数または複数）の１つまたは組み合わせを含有する組成物、例えば、医薬組成物がさらに提供される。
【０１５９】
或る実施形態では、組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌの濃度で、または１〜３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００〜３００ｍｇ／ｍｌで抗ＴＬ１Ａ抗体を含む。
【０１６０】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、その他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、併用療法は、少なくとも１種のその他の免疫抑制剤と組み合わせた、本明細書に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体を含み得る。
【０１６１】
本明細書において、「医薬上許容される担体」として、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、化合物を、酸および化合物を不活性化し得るその他の天然条件作用から保護するために、材料において、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子をコーティングしてもよい。
【０１６２】
本明細書に記載される医薬化合物は、１種または複数の医薬上許容される塩を含み得る。「医薬上許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、何らかの望ましくない毒物学的影響を付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などといった非毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などといった非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどといったアルカリ土類金属に由来するものならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどといった非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【０１６３】
本明細書に記載される医薬組成物はまた、医薬上許容される抗酸化物質を含み得る。医薬上許容される抗酸化物質の例として、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどといった水溶性抗酸化物質、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどといった油溶性抗酸化物質および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などといった金属キレート化剤が挙げられる。
【０１６４】
本明細書に記載される医薬組成物において使用され得る、適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどといった）およびそれらの適した混合物、オリーブオイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
【０１６５】
これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在の防止は、滅菌法手順、前掲によって、また種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にできる。糖、塩化ナトリウムなどといった等張剤を組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤を含めることによって、注射用医薬品形態の長期の吸収を引き起こすことができる。
【０１６６】
医薬上許容される担体として、滅菌水溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除いて、本明細書に記載される医薬組成物におけるその使用が考慮される。補足活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１６７】
治療用組成物は、通常、製造および貯蔵の条件下で無菌で、安定でなくてはならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の秩序構造として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含めることが好ましいであろう。組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射用組成物の長期吸収を引き起こすことができる。
【０１６８】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み込むことと、それに続く、滅菌精密濾過によって調製できる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製の好ましい方法として、その前もって滅菌濾過された溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）がある。
【０１６９】
単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与様式に応じて変わる。単一投与形を生産するための担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、一般に、治療効果を生産する組成物の量となる。一般に、医薬上許容される担体との組合せにおいて、この量は、１００パーセントのうち、有効成分の約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは、約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、有効成分の約１パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
【０１７０】
投与計画は、最適の所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するよう調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急事態によって示されるように、用量を比例的に低減または増大してもよい。投与の容易性および投与形の均一性のための投与単位形に非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において、投与単位形とは、治療されている対象の単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生産するよう算出された所定の量の活性化合物を含有する。本明細書に記載される投与単位形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためのこのような活性化合物の配合の技術分野に固有の制限によって決定され、それらに直接左右される。
【０１７１】
抗体の投与のために、投与量は、約１〜１００ｍｇ／宿主体重１ｋｇ、より通常は、１〜５０ｍｇ／宿主体重１ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、４０ｍｇ／体重１ｋｇ、３０ｍｇ／体重１ｋｇ、２０ｍｇ／体重１ｋｇ、１５ｍｇ／体重１ｋｇ、１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは５ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的治療計画は、週に１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。
【０１７２】
抗体は、持続放出製剤として投与でき、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与の投与量および頻度は、治療が維持的であるか、治療的であるかに応じて変わり得る。維持的適用では、比較的少ない投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。一部の患者は、生涯治療を受け続ける。治療的適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全寛解を示すまで、比較的短い間隔の比較的多い投与量が時には必要である。その後、患者は、投与計画を投与されることがある。
【０１７３】
本明細書に記載される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るよう変えてもよい。選択される投与量レベルは、使用される本明細書に記載される特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用されている特定の化合物の排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物および／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および先の病歴および医薬の技術分野において周知の同様の因子を含めた種々の薬物動態因子に応じて変わる。
【０１７４】
本明細書中に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体の「治療有効量」は、好ましくは疾患症状の重症度における減少、疾患症状のない期間の頻度および持続時間における増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防をもたらす。
【０１７５】
本明細書に記載される組成物は、当技術分野で公知の１種または複数の種々の方法を使用して、１種または複数の投与経路によって投与できる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、所望の結果に応じて変わる。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路として、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路が挙げられる。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【０１７６】
あるいは、本明細書中に記載される抗体は、局所的な、表皮、または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所などの非経口的な経路を介して投与され得る。
【０１７７】
留置用剤、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた徐放性製剤など、活性化合物を、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製できる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を調製するための多数の方法が、特許権をとられているか、または一般的に、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０１７８】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態では、本明細書に記載される治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同５，３８３，８５１号；同５，３１２，３３５号；同５，０６４，４１３号；同４，９４１，８８０号；同４，７９０，８２４号；または同４，５９６，５５６号に開示される装置などの注射針無し皮下注射装置を用いて投与できる。本明細書に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体とともに使用するための周知の留置用剤およびモジュールの例として、制御された速度で医薬を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号が挙げられる。；皮膚を通って医薬を投与するための治療用装置を開示する同４，４８６，１９４号；正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する同４，４４７，２３３号；連続薬物送達のための可変流動埋め込み可能注入器具を開示する同４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達システムを開示する同４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達システムを開示する同４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多数のその他のこのような留置用剤、送達系およびモジュールが、当業者に公知である。
【０１７９】
ＩＸ．使用および方法
本明細書に記載される抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＴＬ１Ａシグナル伝達をブロックすることによる免疫応答の抑制またはＴＬ１Ａの検出に絡む多数のインビトロおよびインビボ有用性を有する。好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体である。例えば、本明細書に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体は、インビトロもしくはエキソビボで培養細胞に、または種々の疾患において免疫性を抑制するために、例えば、インビボでヒト対象に投与できる。したがって、対象において免疫応答が改変されるように、対象に、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象において免疫応答を改変する方法が、本明細書において提供される。好ましくは、応答は、阻害され、抑制され、または減少する。
【０１８０】
また、試料およびコントロール試料を、ヒトＴＬ１Ａと特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、抗体または断片とヒトＴＬ１Ａとの複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、試料におけるヒトＴＬ１Ａ抗原の存在を検出するか、またはヒトＴＬ１Ａ抗原の量を測定するための方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、これでは、コントロール試料と比較した、試料間の複合体形成の相違が、試料におけるヒトＴＬ１Ａ抗原の存在を示す。さらに、本明細書に記載される抗ＴＬ１Ａ抗体は、イムノアフィニティー精製によってヒトＴＬ１Ａを精製するために使用できる。
【実施例１】
【０１８１】
実施例１
ＴＬ１Ａ免疫処置および融合
ＫＭ免疫処置：
ＴＬ１Ａへの完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、ＫＭマウスＴＭを精製された組み換えＴＬ１Ａ抗原（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  １３１９−ＴＬ／ＣＦ）で免疫処置した（表１）。
【表１】
2019522961.tif 000003
【０１８２】
Ｒｉｂｉアジュバントにおける１５ｕｇの天然抗原、および５ｕｇのＴＮＰ改変抗原の混合物を０、５、８、１１、１５および１８日にホックプラス複数部位の皮下（ＳＣ）に注射し、その後に２２日に脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の融合をした。ＴＮＰ改変ＴＬ１Ａを、５μｌのピクリルスルホン酸（Ｓｉｇｍａ  ９２８２２）を１ｍｇのＴＬ１Ａと４時間、４℃で混合することにより作製し、その後ＰＢＳで一晩透析した。
【０１８３】
ＢＴＬＡへのヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生：
ＫＭマウスＴＭから単離されたリンパ球を電気融合によりマウス骨髄腫細胞株と融合した。電気融合は、ＣｙｔｏｐｌｕｓｅＴＭ融合キュベット中の電極間にリンパ球および骨髄腫細胞を整列させるよう電流を使用し、かつ細胞膜を横切る電位を短時間上昇させることにより達成した。電流の短いパルスは、隣接する細胞間の孔を開く膜を不安定化させる。このプロセスの間に、隣接する細胞の膜は融合し、ハイブリッド骨髄腫：リンパ球（ｈｙｄｂｒｉｄｏｍａ）細胞をもたらす。
【０１８４】
免疫処置マウスからのリンパ球の単一の細胞懸濁液を、電気融合により同数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）と融合した。細胞を平底マイクロタイタープレートに約２．５ｘ１０４で播種し、その後に１０％ＦＢＳ、３−５％Ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、ＯＰＩ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｏ  ５００３：１．１ｘ１０−３Ｍオキサロ酢酸、４．５ｘ１０−４Ｍピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、および１ＸＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ０２６２）を含有する選択培地でのインキュベーションが続く。約１週間後、細胞をＨＡＴをＨＴ（Ｓｉｇｍａ  Ｈ０１３７）で置換した培地で培養した。次いで、個々のウェルを自動均質アッセイによってスクリーニングして、ヒトＩｇＧカッパ抗体を産生するウェルを選択した。引き続いて、これらのヒトＩｇＧ陽性ウェルをＴＬ１Ａ抗原被覆プレート上でＥＬＩＳＡによりスクリーニングして、ＴＬ１Ａ特異的なヒトＩｇＧカッパ抗体を分泌するハイブリドーマを選択した。抗体分泌ハイブリドーマを２４ウェルプレートへ再播種し、再度スクリーニングし、それらがＴＬ１Ａに特異的な抗体を依然として産生する場合、細胞を−８０℃または液体窒素（ＬＮ２）下で凍結して保存した。抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも２回サブクローニングした。安定なサブクローンをインビトロで培養し、さらなる特性評価のために組織培養培地で少量の抗体を生成した。サブクローンの凍結アリコートをＬＮ２で凍結させることにより保存した。
【０１８５】
このハイブリドーマ：ＴＬ１Ａ  ２５９６．１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８について使用される命名プロトコールは以下の通りである。抗体は、ＴＬ１Ａに特異的であり、かつ融合２５９６に由来する。親クローンはプレート１０ウェルＡ４から単離された。１０Ａ４．Ｆ７は、親クローン１０Ａ４のサブクローンであり、かつ１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８は、１０Ａ４．Ｆ７のサブクローンである。
【０１８６】
抗原への抗体結合の特性評価
本開示の抗体は、例えば、標準ＥＬＩＳＡによりＴＬ１Ａへの結合について試験され得る。簡潔には、マイクロタイタープレートはＰＢＳ中で１．０μｇ／ｍｌの精製されたＴＬ１Ａでコーティングされ、ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ中で１％ウシ血清アルブミンでブロックされる。抗体の希釈液（例えば、ＴＬ１Ａ−免疫処置マウスからの血漿、または細胞培養上清の希釈液）は、各ウェルに加えられ、周囲温度で１−２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次試薬（例えば、ヒト抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）と周囲温度で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ）−６−スルホン酸）基質（Ｍｏｓｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ、１．４６ｍｍｏｌ／Ｌ）で発色し、ＯＤ４０５で解析した。
【０１８７】
上記に記載されたＥＬＩＳＡアッセイはまた、ＴＬ１Ａ免疫原と陽性反応性を示すハイブリドーマについてスクリーニングするために使用され得る。ＴＬ１Ａに高い結合活性で結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特性評価する。親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによる）各ハイブリドーマからの１つのクローンは、−１４０℃で保存された５−１０のバイアル細胞バンクを作製するため、および抗体精製のために選択され得る。
【０１８８】
抗ＴＬ１Ａ抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製のために組織培養フラスコ中で１−２Ｌの容積まで増殖され得る。上清はプロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いるアフィニティークロマトグラフィー前に濾過され、かつ濃縮され得る。溶出されたＩｇＧは、純度を保証するためにゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより確認される。緩衝液は、ＰＢＳに交換することができ、濃度は、１．４３吸光係数を使用してＯＤ２８０により決定され得る。モノクローナル抗体は分注され、−８０℃で保存され得る。
【０１８９】
選択された抗ＴＬ１Ａモノクローナル抗体が、固有のエピトープに結合するかを決定するために、各抗体は、商業的に入手可能な試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してビオチン化され得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を使用する競合研究は、上記に記載されるようにＴＬ１Ａ被覆−ＥＬＩＳＡプレートを使用して行われ得る。ビオチン化ｍＡｂ結合は、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼプローブで検出され得る。その上、類似の競合研究は、ＴＬ１Ａ−ＣＨＯ細胞のＦＡＣＳによりなされ得る。細胞へのＴＬ１Ａ抗体の結合は、抗ヒトＩｇ−フィコエリトリンプローブを用いて検出され得る。
【０１９０】
精製された抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡは、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して行われ得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルは、１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで一晩、４℃でコートされ得る。１％ＢＳＡでブロッキングした後、プレートを１から２時間周囲温度で１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプコントロールと反応させる。ウェルは、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ−特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ−抱合型プローブのいずれかと反応され得る。上記に記載されたように、プレートを発色し、解析する。
【０１９１】
ＦＡＣＳアッセイを、本開示の抗体が細胞上で発現される天然ＴＬ１Ａに結合することを検証するために使用した。簡潔には、ＰＢＳ１％ＢＳＡプラス０．５％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）中の抗体の希釈液をＴＬ１Ａを発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞（１０５細胞）と４℃で３０−６０分間インキュベートした。細胞を、遠心分離、上清の吸引、および新鮮なＦＡＣＳ緩衝液の添加により、２回洗浄した。細胞上のＴＬ１Ａへの抗体結合を、４℃で３０分間ＰＥ（フィコエリトリン）標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体中で細胞をインキュベートし、上記のように２回（２ｘ）細胞を洗浄し、かつＦＡＣＳで解析することにより検出した（図１）。
【０１９２】
ＤＲ３へのＴＬ１Ａ結合をブロックする抗ＴＬ１Ａ抗体の同定はまた、ＣＨＯ細胞上で発現されるｈＤＲ３（ＤＲ３  ＣＨＯ）への可溶性ＴＬ１Ａ−ＳＨ６タンパク質（ｈｉｓでタグされた）結合を使用することによるＦＡＣＳにより行われた。抗ＴＬ１Ａまたはコントロール抗体をＦＡＣＳ緩衝液中で３０分間０．１−０．５ｕｇ／ｍｌでＴＬ１Ａ  ＳＨ６抗原とインキュベートし、次いでｈＤＲ３  ＣＨＯ細胞を抗体ＴＬ１Ａ混合物に加え、３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ｈＤＲ３  ＣＨＯ細胞へのＴＬ１Ａ結合をＰＥ抗Ｈｉｓ抗体および、その後のＦＡＣＳで検出した。ブロッキング抗体は、ＴＬ１Ａ  ＳＨ６がｈＤＲ３  ＣＨＯ細胞に結合することを防ぐ（図２）。
【０１９３】
実施例２
抗ＴＬ１Ａ抗体精製
ハイブリドーマからの元の抗ＴＬ１Ａ抗体、１４９０−２５９６−１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８は、ＣＨＯ細胞中で組み換えタンパク質として発現され、ＴＬ１Ａ．２と呼ばれる。このタンパク質は、Ｇ４Ｐ  Ｆｃバージョン並びにＧ１．１  ｆ  Ｆｃバージョンとして発現される。ＣＨＯ細胞から得られる上清はＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅプロテインＡカラムで精製した。簡潔には、ＣＨＯ上清をＰＢＳ（リン酸緩衝液生理食塩水）、ｐＨ７．４で予め平衡化したプロテインＡカラムにかけた。サンプルローディング後にＰＢＳで広範にカラムを洗浄し、その後０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０を使用して結合タンパク質を溶出した。溶出したタンパク質を、適切な量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液の添加により直ちに中性ｐＨにした。次いで、試料を広範な透析によりＰＢＳへ緩衝液を交換した。
【０１９４】
精製された抗体の濃度は、２８０ｎｍでタンパク質の吸光度を測定することにより決定された。２８０ｎｍでの１．４の吸光度は、１ｍｇ／ｍＬの抗体と等しいと考えられる。抗体の純度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ並びにＣＥ−ＳＤＳ方法により確認した。精製された試料中での内毒素レベルをＬＡＬ動態法により測定した。
【０１９５】
凝集レベルは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ並びにＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ法により決定した。抗体の同一性は、エドマン配列決定により抗体の軽および重鎖のＮ−末端アミノ酸配列を決定することにより確認した。抗体の軽および重鎖の質量はＬＣ−ＭＳ法により決定した。抗体の不均一性は、ＴＳＫ  Ｅｔｈｅｒ  ５ＰＷ  カラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーにより評価した。抗体のオリゴ糖特性は、ＰＮＧＡｓｅ  Ｆ酵素を使用して抗体からグリカン構造を除去し、オリゴを蛍光標識化し、かつキャピラリー電気泳動法によるさらなる解析により決定した。
【０１９６】
実施例３
ベクター構築および発現
１０Ａ４  ＶＫを、鋳型としてＶＫクローンＭＰ．１＿０６１３２０１２−Ａ０６を利用するＰＣＲにより増幅し、かつオステオネクチンシグナル配列およびヒトカッパ定常領域を含有するベクターｐＩＣＯＦＳＣｎｅｏＫにクローン化し、プラスミドｐＩＣＯＦＳＣｎｅｏＫ（ＴＬ１Ａ．１０Ａ４）を生成した。
【０１９７】
１０Ａ４  ＶＨを、鋳型としてＶＨクローンＭＰ．１＿０６１３２０１２−Ｅ０２を利用するＰＣＲにより増幅し、かつオステオネクチンシグナル配列およびヒトＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ定常領域を含有するベクターｐＩＣＯＦＳＣｐｕｒＧ４Ｐにクローン化し、プラスミドｐＩＣＯＦＳＣｐｕｒＧ４Ｐ（ＴＬ１Ａ．１０Ａ４）を生成した。プラスミドｐＩＣＯＦＳＣｐｕｒＧ４Ｐ（ＴＬ１Ａ．１０Ａ４）およびｐＩＣＯＦＳＣｎｅｏＫ（ＴＬ１Ａ．１０Ａ４）をＣＨＯ−Ｓ細胞に同時トランスフェクトし、かつ研究使用のためＴＬ１Ａ．２−ｇ４Ｐの発現について安定なプールを選択し、かつスケールアップした。
【０１９８】
実施例４
親和性測定についてのプロトコール
プロテインＧチップ（ＣＭ５）を、それを酢酸緩衝液（ｐＨ２．９）を使用して〜４００Ｒｕｓでコーティングすることにより作製した。１０Ａ４．Ｆ７  ｍａｂ（７．５ｕｇ／ｍＬ、１２ｕＬ）をプロテインＧ表面上で１０ｕＬ／分の流速で捕捉した。複数の濃度（２５０、２００、１５０、１００＆５０ｎ）でのＨｕ−ＴＬ１Ａ−Ｈｉｓ抗原（Ｌｏｔ＃５０１８２ＡＳ１５１）を、捕捉されたｍａｂ上に２５μｌ／分で５分間流し、かつ、７．５分間解離させた。プロテインＧ表面を１００ｕＬ／分の流速で１０ｕＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨおよび５ｕＬの２５ｍＭ  ＨＣＬで再生した。データはＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１を使用することにより解析した。（図３）
【０１９９】
実施例５
エピトープ結合についてのプロトコール
１０Ａ４．Ａ７（４．６ＫＲＵｓ）、１７Ｈ１１．Ｃ２（６．３ＫＲＵｓ）および１０Ａ６．Ｂ６（９．６ＫＲＵｓ）をＣＭ５チップ上でコーティングした。Ｍａｂを３０ｕｇ／ｍＬから滴定し（１：３）、〜２時間２５ｎ  Ｈｕ−ＴＬ１Ａ−Ｈｉｓ抗原でインキュベートした。ｍａｂ上に注入された抗体−抗原複合体が２．５分間表面を覆った。表面を２５ｍＭ  ＮａＯＨで再生した。プロットをｌｏｇ［Ａｂ］対応答を使用して生成し、ここで、抗体−抗原複合体シグナルの減少は、同一のエピトープビンを示す。（図４）
【０２００】
実施例６
ＤＳＣによる１０Ａ４．７の物理的安定性
１０Ａ４．７の物理的安定性をＤＳＣにより行った。図５。
【０２０１】
実施例７
可変領域シーケンシング
総ＲＮＡをハイブリドーマクローン１４９０．２５９６．１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８から調製し、かつＶＨおよびＶＫ  ｃＤＮＡを２通り調製した。抗体の可変領域を、５’ＲＡＣＥユニバーサルプライマーミックスと対の３’ヒト−特異的な定常領域プライマーを使用してｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）手法により増幅した。可変領域を含有する得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ベクターにクローニングした。Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ試料をＴＯＰＯクローンから調製し、かつＤＮＡシーケンシングに供した。得られたＤＮＡ配列をインフレームの再編成および他の抗体特性について解析した。クローンＭＰ．１＿０６１３２０１２−Ｅ０２からのＶＨ配列（図７および８）およびクローンＭＰ．１＿０６１３２０１２−Ａ０６からのＶＫ配列（図６および９）を代表的な配列として選択した。
【０２０２】
実施例８
ＨＤＸ−ＭＳによるＴＬ１Ａ／１０Ａ４エピトープマッピング
水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）方法は、主鎖アミド水素原子の重水素交換の速度および程度をモニターすることによって溶液でのタンパク質立体配座および立体配座動態を調べる。ＨＤＸのレベルは、主鎖アミド水素原子の溶媒接触性およびタンパク質水素結合に依存する。ＨＤＸのタンパク質の質量増加は、ＭＳによって正確に測定することができる。この技術を酵素消化と組み合わせると、ペプチドレベルでの構造特徴を解明することができ、内部に折りたたまれたペプチドと表面露出ペプチドを区別できる。典型的には、重水素標識およびその後のクエンチング実験が行われ、その後にオンラインペプシン消化、ペプチド分離およびＭＳ解析が行われる。
【０２０３】
エピトープマッピングを、抗ＴＬ１Ａ  ｍＡｂ（１０Ａ４）でＴＬ１Ａ三量体および１０Ａ４  ＦａｂでＴＬ１Ａ三量体で行った。エピトープマッピング実験の前に、非重水素化実験を行って、組み換え全長ヒトＴＬ１Ａ三量体（４μＭ）と１０Ａ４を有するＴＬ１Ａ三量体または１０Ａ４  Ｆａｂを有するＴＬ１Ａ三量体（１：３モル比）のタンパク質複合体についての一般的な消化ペプチドのリストを生成し、ＴＬ１Ａにつき８０％配列カバレッジを達成した。ＨＤＸ−ＭＳ実験では、５μｌの各試料（ｍＡｂ／ＦａｂでのＴＬ１ＡまたはＴＬ１Ａ）を５５μｌのＤ２Ｏ緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、Ｄ２Ｏ、ｐＤ７．０）に希釈し、標識反応を開始した。３０秒、５分、２０分、６０分および２４０分の異なる時間で反応を行った。各標識反応期間の終わりに、反応を、クエンチング緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液、４Ｍ  ＧｄｎＣｌ、ｐＨ２．５、１：１、ｖ／ｖ）を添加することによってクエンチし、かつ５０μｌのクエンチした試料を解析のためにＷａｔｅｒｓ  ＨＤＸ−ＭＳ系に注入した。一般的な消化ペプチドの重水素取り込みレベルを、１０Ａ４または１０Ａ４  Ｆａｂの非存在／存在下でモニターした。（図１０）
【０２０４】
実施例９
コンピュータモデリングによるＴＬ１Ａ／１０Ａ４エピトープマッピング
ＴＬ１Ａ三量体の構造を用いて、コンピュータ解析を行った。ＴＮＦ様リガンド１Ａ（ＴＬ１Ａ）は、そのコグネイト受容体ＤＲ３およびデコイ受容体ＤｃＲ３に結合する。ＴＬ１Ａは、従来のＴＮＦリガンドファミリーに属し、現在は、８つの他のメンバー：ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴβ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬおよびＣＤ４０Ｌを含む。
【０２０５】
ヒトＴＬ１Ａは、２５１アミノ酸からなり、３５個は細胞質ドメイン、２４個は膜貫通領域、１９２個は細胞外ドメインである。ＴＬ１Ａアミノ酸配列中に２つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位、１３３および２２９位のＡｓｎ残基が存在する。ＴＬ１Ａ構造は、ＴＮＦスーパーファミリーに典型的なゼリーロールフォールドを示す。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、ＴＮＦファミリーに典型的な、Ａ’ＡＨＣＦおよびＢ’ＢＧＤＥ鎖からなる内側および外側βシートをそれぞれ有するゼリーロールフォールドを採用する非共有ホモ三量体を形成するＩＩ型膜貫通タンパク質である。密に充填された三量体はＴＮＦスーパーファミリーの典型である。三量体集合体中に埋め込まれた各単量体の溶媒接触可能表面面積は１９７７Å２であり、他の安定な三量体ＴＮＦリガンド中で観察されたもの（ＴＮＦα、２４１２Å２；ＴＲＡＩＬ、２２６１Å２；ＣＤ４０Ｌ、２０９１Å２）に匹敵する。他の従来のＴＮＦリガンドと同様に、ＴＬ１Ａのサブユニット界面は、１つの単量体（ＥおよびＦ鎖）におけるβ−サンドイッチの端および隣接単量体（Ａ、Ｈ、ＣおよびＦ鎖）の内部シート間の相互作用により形成される。この界面の中央領域は、主に、三量体の疎水性コアへ寄与するように位置する各単量体からのＦ８１、Ｙ１４６、Ｆ１８２およびＬ１８４を有する疎水性の残基からなる。他の従来のＴＮＦリガンドにおけるこれらの４つの位置での対応する残基は、一般に保存され、最も一般的なドメイン間疎水性接触を形成する。
【０２０６】
ＨＤＸにより同定されるＴＬ１Ａの２つの領域をＴＬ１Ａ構造にマッピングした。図１２。個々の単量体主鎖リボンは、灰色、緑色および黄色に着色している。ペプチド領域１（マゼンタ色）およびペプチド領域２（青色）は、溶媒へ曝露された非連続的なエピトープを形成する。図１３は、１０Ａ４  ｍＡｂについてのＦＡＢモデル（赤＝Ｈ鎖、ピンク＝Ｌ鎖）でＴＬ１Ａ三量体を示し、ＴＬ１Ａにおける非連続的なエピトープが、重鎖および軽鎖の両方からの相互作用を必要とするであろうことを示す。タンパク質複合体の計算評価は、タンパク質界面に位置する選択された残基がタンパク質−タンパク質相互作用エネルギーに有意に寄与し得ることを示す。タンパク質相互作用に有意に寄与することが示されている残基は、芳香族アミノ酸（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）および極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）を含む。
【０２０７】
表２および３は、ペプチド領域１および２に対応する露出アミノ酸の計算評価を含有する。これらの表は、これらのペプチド領域における機能的な残基についての接近可能性を評価するために使用することができる側鎖曝露および側鎖曝露パーセントを示す。ペプチド領域１、表２について、Ｅ１６６、Ｒ１６８、Ｑ１６９、Ｒ１７２，およびＫ１７５は、極度に曝露された（５０−９７％）機能性アミノ酸側鎖を有する注目することは興味深い。興味深いことに、９７％で最も曝露された残基Ｑ１６９を有する領域１  １６９ＱＡＧＲ１７２についてのペプチド断片化ＭＳ空間エピトープからのデータとの良好な相関がある。Ｒ１６８およびＲ１７２の両方がＴＬ１Ａ構造におけるＱ１６９に近接しており、モデリング、三次元構造およびＨＤＸ実験の相関を示している。
【０２０８】
表２  ペプチド領域１に対応する露出アミノ酸の計算評価
【表２】
2019522961.tif 000004
【０２０９】
ペプチド領域２について、最も曝露された機能的な残基はＨ１１１、Ｆ１１２、Ｋ１１３、およびＮ１１４である。これらの機能的なアミノ酸も非常に曝露され（６２−９３％）、かつ非連続的なエピトープの第二のバルクを形成する。モデリングにより同定される機能的な残基は、断片化ＭＳ  １１３ＫＮＱＦ１１６により同定される領域２についてのＭＳ空間エピトープと相関する。
【０２１０】
表３  ペプチド領域２に対応する露出アミノ酸の計算評価
【表３】
2019522961.tif 000005
【０２１１】
まとめると、構造モデリングおよびＨＤＸデータは、１０Ａ４  ｍＡｂパラトープと接触しているＴＬ１Ａの表面上の非連続的なエピトープを定義する。
【０２１２】
実施例１０
Ｔ細胞増殖アッセイ
１μｇ／ｍｌ−０．２１９μｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｋｉｔ（１９０５２）富化ＣＤ４＋ヒトＴ細胞を加える前に３７℃で３０分間、５％  ＣＯ２で抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ３００３１４）とインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２でのインキュベーションの４日の後、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を最後の１８−２０時間添加した。プレートをＰａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用してＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃプレート（Ｐａｃｋａｒｄ  ５００７１８５）上に回収し、乾燥させた。５０μｌ／ウェル  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔを加え、プレートをＰａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンターで計数した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２１３】
表４  抗ＣＤ３駆動Ｔ細胞増殖アッセイ（Ｈｕ  ＣＤ４＋Ｔ細胞）（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表４】
2019522961.tif 000006
【０２１４】
実施例１１
ヒトＰＢＭＣ  ＩＦＮｇ阻害アッセイ（可溶性のＴＬ１Ａ  ｓｔｉｍ）
３ｕｇ／ｍｌ−０．３ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を、ヒト全血から単離されたＰＢＭＣを有する９６ウェル丸底プレート中で５０ｎｇ／ｍｌヒトＴＬ１Ａ（社内）プラス０．２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で一晩のインキュベートした後、上清を回収し、ＩＦＮｇレベルをマッチペアサンドイッチＥＬＩＳＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で試験した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２１５】
表５  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  ＰＢＭＣ）（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表５】
2019522961.tif 000007
【０２１６】
表６  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  ＰＢＭＣｓ）（５．９ｍｇ／ｍｌ）
【表６】
2019522961.tif 000008
【０２１７】
実施例１２
ヒトＰＢＭＣ  ＩＦＮｇ阻害アッセイ（ＴＬ１Ａ発現ＣＨＯ細胞  ｓｔｉｍ）
３ｕｇ／ｍｌ−０．３ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を、ヒト全血から単離されたＰＢＭＣを有する９６ウェル丸底プレート中で照射ＴＬ１Ａ発現ＣＨＯ細胞プラス０．２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした後、上清を回収し、ＩＦＮｇレベルをマッチペアサンドイッチＥＬＩＳＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で試験した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２１８】
表７  ＴＬ１Ａ発現ＣＨＯ細胞＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  ＰＢＭＣ）（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表７】
2019522961.tif 000009
【０２１９】
実施例１３
ヒトＴ細胞ＩＦＮｇ阻害アッセイ
３ｕｇ／ｍｌ−０．３ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（１９０５１）富化ヒトＴ細胞を有する９６ウェル丸底プレート中で５０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＬ１Ａ（社内の）プラス０．５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした後、上清を回収し、ＩＦＮｇレベルをマッチペアサンドイッチＥＬＩＳＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で試験した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２２０】
表８  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  Ｔ細胞）（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表８】
2019522961.tif 000010
【０２２１】
表９  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  Ｔ細胞）（５．９ｍｇ／ｍｌ）
【表９】
2019522961.tif 000011
【０２２２】
表１０  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  Ｔ細胞）（４．８ｍｇ／ｍｌ）
【表１０】
2019522961.tif 000012
【０２２３】
実施例１４
ヒトＮＫ細胞ＩＦＮｇ阻害アッセイ
３ｕｇ／ｍｌ−０．３ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（１９０５５）富化ヒトＮＫ細胞を有する９６ウェル丸底プレート中で５０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＴＬ１Ａ（社内の）プラス０．５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした後、上清を回収し、ＩＦＮｇレベルをマッチペアサンドイッチＥＬＩＳＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で試験した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２２４】
表１１  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  ＮＫ細胞）（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表１１】
2019522961.tif 000013
【０２２５】
実施例１５
ヒト全血ＩＦＮｇ阻害アッセイ
３ｕｇ／ｍｌ−０．３ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を、ヘパリン処置ヒト全血を有する９６ウェル丸底プレート中で５０ｎｇ／ｍｌヒトＴＬ１Ａ（社内の）プラス０．５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした後、プレートを１０分間、１９００ｒｐｍで遠心分離し、血漿を回収し、かつＩＦＮｇレベルをマッチペアサンドイッチＥＬＩＳＡ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で試験した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２２６】
表１２  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｈｕ  ＷＢ）（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表１２】
2019522961.tif 000014
【０２２７】
実施例１６
カニクイザルＰＢＭＣ  ＩＦＮｇ阻害アッセイ
【０２２８】
３ｕｇ／ｍｌ−０．３ｎｇ／ｍｌのＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を、カニクイザル全血から単離されたＰＢＭＣを有する９６ウェル丸底プレート中で５０ｎｇ／ｍｌカニクイザルＴＬ１Ａ（社内の）プラス  ２ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした後、上清を回収し、ＩＦＮｇレベルを霊長類ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で試験した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して最大マイナスバックグラウンドのパーセントをプロットすることにより計算した。
【０２２９】
表１３  ＴＬ１Ａ＋ＩＬ−１２＋ＩＬ−１８駆動ＩＦＮｇ（Ｃｙｎｏ  ＰＢＭＣｓ）（２．４５ｍｇ．ｍｌ）
【表１３】
2019522961.tif 000015
【０２３０】
実施例１７
ヒトｐＮＦｋＢ阻害アッセイ
ＴＬ１Ａ抗体１０Ａ４．Ｆ７．２Ｅ８  ｈｕＩｇＧ４の用量応答曲線を０．５ｕｇ／ｍｌヒトＴＬ１Ａ（社内の）と３７℃で１５分間；５％  ＣＯ２、９６ウェルディープウェルプレートにおいてヘパリン処置ヒト全血でインキュベートした。刺激後、細胞を溶解／固定し、透過処理し、抗体の適切なパネルで染色した。測定はフローサイトメーターで行い、かつ解析はＴｒｅｅＳｔａｒのＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアで行った。ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【０２３１】
表１４  Ｈｕ全血におけるＴＬ１Ａ駆動ホスホ−ＮＦｋＢ（２．４５ｍｇ／ｍｌ）
【表１４】
2019522961.tif 000016
【図１】
2019522961.tif 000017
【図２】
2019522961.tif 000018
【図３】
2019522961.tif 000019
【図４】
2019522961.tif 000020
【図５】
2019522961.tif 000021
【図６−１】
2019522961.tif 000022
【図６−２】
2019522961.tif 000023
【図７−１】
2019522961.tif 000024
【図７−２】
2019522961.tif 000025
【図７−３】
2019522961.tif 000026
【図７−４】
2019522961.tif 000027
【図８】
2019522961.tif 000028
【図９】
2019522961.tif 000029
【図１０】
2019522961.tif 000030
【図１１】
2019522961.tif 000031
【図１２】
2019522961.tif 000032
【図１３】
2019522961.tif 000033
【配列表】
2019522961000001.app
【国際調査報告】
2019522961.tif 000034
2019522961.tif 000035
2019522961.tif 000036
2019522961.tif 000037