(57)【要約】  本発明は、がん細胞を標的化するための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、該物質を発現するＴ細胞、該物質を産生するための方法、および該物質を用いてがんを治療する方法に関する。特に、本明細書は、アミノ酸配列ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）を有するＩＧＦ２ＢＰ３−００１などのペプチドを有するＨＬＡクラスＩまたはＩＩ分子に結合する、ＴＣＲおよびそれらの変異型に関する。本明細書は、免疫療法で使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞にさらに関する。特に、本明細書は、がんの免疫療法に関する。本明細書は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激しまたは生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α鎖およびａβ鎖を含んでなるＴＣＲであって、前記α鎖が配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるＴＣＲα可変ドメインを含んでなり；前記β鎖が配列番号１０と少なくとも９０％同一であるＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり；ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【請求項２】
前記ＴＣＲα定常ドメインが、配列番号２のＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７０％同一であり、前記β定常ドメインが、配列番号１０のＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７０％同一である、ＴＣＲα定常ドメインおよびＴＣＲβ定常ドメインをさらに含んでなる、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記α定常ドメインがα膜貫通ドメインＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬ（配列番号１８）を含んでなり、前記β定常ドメインがβ膜貫通ドメインＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号１９）を含んでなる、請求項１または２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲα可変ドメインが配列番号２のアミノ酸配列からなり；前記ＴＣＲβ可変ドメインが配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲα定常ドメインが配列番号２のＴＣＲα定常ドメインからなり、前記ＴＣＲβ定常ドメインが配列番号１０のＴＣＲβ定常ドメインからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
配列番号２からなるα鎖と、配列番号１０からなるβ鎖とを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記ＴＣＲα鎖が配列番号２のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり；および／または前記ＴＣＲβ鎖が配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、請求項１〜６のいずれかに記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記ＴＣＲα鎖が、配列番号２の全ての３つのＣＤＲを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ＴＣＲβ鎖が、配列番号１０の全ての３つのＣＤＲを含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記α鎖およびβ鎖が融合して一本鎖ＴＣＲを形成する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記α鎖および／またはβ鎖が検出可能な標識を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
前記検出可能な標識が、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、請求項１１に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
前記αおよび／またはβ鎖が治療効果のある薬剤にコンジュゲートされている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
前記治療効果のある薬剤が、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される、請求項１３に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
γ鎖およびδ鎖を含んでなるＴＣＲであって、前記γ鎖が配列番号２のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり、および／または前記ＴＣＲδ鎖が配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり；ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【請求項１６】
ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合し、前記ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチドが配列番号１からなり、前記ＭＨＣ分子がＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖、または請求項１５に記載のＴＣＲのγ鎖および／またはδ鎖をコードする核酸。
【請求項１８】
少なくとも１つのプロモーター配列に作動可能に連結された、請求項１７に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体ががん患者から得られる、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が健常ドナーから得られる、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、および／または請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞と；薬学的に許容可能な担体と；任意選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
前記ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下で、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、ＭＨＣ分子によって提示されると、配列番号１のペプチドに特異的に結合するＴＣＲを生成する方法。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞、および／または請求項２３に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法。
【請求項２６】
前記ＴＣＲが宿主細胞の表面で発現される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が自己由来である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が同種異系である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＣＲが治療効果のある薬剤にコンジュゲートされている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療効果のある薬剤が、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１つの化学療法剤を前記対象に投与するステップをさらに含んでなる、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
放射線療法を前記対象に施すステップをさらに含んでなる、請求項３２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするベクターで前記細胞を形質転換し、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）前記形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）前記複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法。
【請求項３６】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするベクターで前記細胞を形質転換し、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）前記形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）前記複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法。
【請求項３８】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ａ）生物学的サンプルを請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲに接触させるステップと、
ｂ）前記生物学的サンプルへのＴＣＲの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプル中のがんを検出する方法。
【請求項４０】
前記ＴＣＲが検出可能な標識を含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記検出可能な標識が、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出が、生体外、生体内または原位置で実施される、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｔ細胞がγ／δＴ細胞である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＴＣＲを発現する有効数のＴ細胞、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の医薬組成物を患者に投与するステップを含んでなる、標的細胞がＩＧＦ２ＢＰ３を異常に発現する患者の標的細胞を死滅させる方法。
【請求項４６】
可溶性ＴＣＲである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項４７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲαであって、前記α鎖が配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＴＣＲα可変ドメインを含んでなり；前記β鎖が配列番号１０と少なくとも９５％同一であるＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり；ＩＧＦ２ＢＰ３−３−ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【請求項４８】
配列番号２に対して前記α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／または配列番号１０に対して前記β鎖に少なくとも１つの変異を有し、同一ペプチドの非変異ＴＣＲの少なくとも２倍である、ＩＧＦ２ＢＰ３−３−００１ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対する結合親和性および／または結合半減期を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項４９】
配列番号２に対して前記α鎖に少なくとも１つの突然変異を有し、および／または配列番号１０に対して前記β鎖に少なくとも１つの突然変異を有し、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載のＴＣＲ。
【請求項５０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９〜２２のいずれかに記載の宿主細胞、または請求項２３に記載の医薬組成物が、少なくとも２４時間隔てられた少なくとも２回の投与で投与される、請求項２５〜３８および４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項２３に記載の医薬組成物が、数日間、数週間または数ヶ月間にわたって前記対象に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項２３に記載の医薬組成物が、局所注入によって投与される、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記局所注入が、注入ポンプおよび／またはカテーテル装置によって投与される、請求項５２に記載のいずれかの方法。
【請求項５４】
前記局所注入が固形腫瘍、固形腫瘍に供給する血管、および／または固形腫瘍を取り囲む領域への注入である、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項２３に記載の医薬組成物が、１用量あたり約１０４〜約１０１０個の細胞の用量で投与される、請求項２５〜３８、４５、および５０〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号２のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および／または配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるＴＣＲであって、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的化する。これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来するペプチドであり得て、それらは各腫瘍細胞内で発現され、同一起源の非改変細胞内と比較して、通常、上方制御される。
【０００２】
細胞性免疫応答の特異的要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識する、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【背景技術】
【０００３】
ＩＧＦ２ＢＰ３は、ｍＲＮＡ局在化、交代、および翻訳調節に関与するとされる、インスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質ファミリーのメンバーである。対照組織と比較して、多数のがん組織におけるＩＧＦ２ＢＰ３の高い転写物レベルの存在は、ＩＧＦ２ＢＰ３タンパク質が、増殖中の形質転換細胞内で機能的役割を果たしているかもしれないことを示唆する。ＩＧＦ２ＢＰ３発現は、腎明細胞がん（ＲＣＣ）；悪性黒色腫；食道扁平上皮がん；膵臓がん；および尿路上皮腫瘍などのいくつかのがん型において報告されている。したがって、ＩＧＦ２ＢＰ３に由来するエピトープは、抗がん治療薬をＩＧＦ２ＢＰ３発現がんに標的化するのに有用であってもよい。
【０００４】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴ細胞受容体の同定と特性解析は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応において、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンおよび細胞療法をはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がん治療のための分子標的薬の開発が進歩しているものの、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的な分子を特異的に標的化する新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。本明細書は、ペプチドＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（ＩＧＦ２ＢＰ３−００１；配列番号１）およびその変異型などのＩＧＦ２ＢＰ３のエピトープに特異的に結合する新規ＴＣＲ、核酸、ベクター、および宿主細胞と；このような分子をがんの治療において使用する方法とを提供することにより、必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書は、α鎖およびβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。別の実施形態では、本明細書は、γ鎖およびδ鎖を含んでなるＴＣＲ（「γ／δＴＣＲ」）に関する。
【０００８】
本明細書は、ＴＣＲと、個々のＴＣＲサブユニット（単独または組み合わせ）およびそのサブドメインと、例えば、天然ＴＣＲには存在しない定常ドメイン残基の間に少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合を有する可溶性α／β二量体ＴＣＲなどの可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）と、クローン化ＴＣＲと、当該物質を生産する方法ならびに前記ＴＣＲを保有するその他の細胞を生産する方法とにさらに関し、前記ＴＣＲは、自己由来または同種異系Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体細胞に組み込まれる。
【０００９】
本明細書は、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合するＴＣＲにさらに関し、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチドは、ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）を含んでなり、または代案としてはそれからなる。一実施形態では、ＨＬＡ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２である。
【００１０】
本明細書は、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合するＴＣＲにさらに関し、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチドは、配列番号１と少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７７％、およびより好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）ＩＧＦ２ＢＰ３−００１の変異型、またはその薬学的に許容可能な塩を含んでなり、または代案としてはそれからなり、前記変異型は、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合し、および／または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【００１１】
本明細書は、配列番号１、または配列番号１と少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、本明細書のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有する。
【００１２】
本明細書は、表１に示されるＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性を有する、ＴＣＲα可変ドメインと；表１に示されるＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインとを含んでなる、ＴＣＲにさらに関する。
【００１３】
一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表１に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有し；および／またはＴＣＲβ可変ドメインは、表１に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインおよび／またはＴＣＲβ可変ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲαドメインおよび／または非変異ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。
【００１４】
本明細書のＴＣＲα鎖は、表１に示されるＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＴＣＲα定常ドメインをさらに含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲβ鎖は、表１に示されるＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＴＣＲβ定常ドメインをさらに含んでなってもよい。
【００１５】
本明細書のＴＣＲα鎖は、ＴＣＲα膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲα細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲβ鎖は、ＴＣＲβ膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲβ細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。
【００１６】
本明細書は、表１で開示される１つまたは複数のα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるＴＣＲα鎖、および表１に示されるＣＤＲに対して１つ、２つ、３つまたは４つの置換を有するその変異型にさらに関する。表１に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ３、およびＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなるＴＣＲα鎖が、さらに記載される。表１に示されるα鎖ＣＤＲ３を含んでなるＴＣＲα鎖が、さらに記載される。
【００１７】
本明細書は、表１で開示される１つまたは複数のβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるＴＣＲβ鎖、および表１に示されるＣＤＲに対して１つ、２つ、３つまたは４つの置換を有するその変異型にさらに関する。表１に示されるβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ３、およびＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなるＴＣＲβ鎖が、さらに記載される。表１に示されるβ鎖ＣＤＲ３を含んでなるＴＣＲβ鎖が、さらに記載される。
【００１８】
本明細書は、本明細書のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離または組換え核酸にさらに関する。一実施形態では、本明細書の核酸は、表１に示されるように、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖をコードする。
【００１９】
本明細書はさらに、本明細書に記載のＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を含んでなる、組換え発現ベクターに関する。
【００２０】
本明細書は、本明細書に記載のＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を発現する組換え発現ベクターを含んでなる、単離された宿主細胞にさらに関する。
【００２１】
本明細書は、本明細書による組換え発現ベクター単離を含んでなるされた宿主細胞にさらに関し、好ましくはそ細胞は、ヒト細胞、好ましくは末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、より好ましくはＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔリンパ球である。
【００２２】
本明細書は、本明細書の組換え発現ベクターを含んでなる単離されたＰＢＬにさらに関し、ＰＢＬは、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００２３】
本明細書は、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含んでなる細胞の集団にさらに関する。
【００２４】
本明細は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん（例えば、神経膠芽腫、神経芽腫）、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどの増殖性疾患を治療するための、本明細書のＴＣＲおよび宿主細胞にさらに関する。
【００２５】
一態様では、宿主細胞は、本明細書による少なくとも１つのＴＣＲをコードする核酸で形質移入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲは、表１で開示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる。別の態様では、このような宿主細胞は、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん（例えば、神経膠芽腫、神経芽腫）、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんの免疫療法で使用される。
【００２６】
本明細書は、がん細胞を本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクターまたは宿主細胞に接触させるステップを含んでなる、がん細胞を死滅させまたはその数を減少させる方法にさらに関する。本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクターまたは宿主細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法もまた提供される。
【００２７】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲをコードする核酸と、本明細書による核酸を発現できる発現ベクターとにさらに関する。
【００２８】
本明細書は、疾患の治療および医療で、特にがんの治療で使用するための本明細書によるＴＣＲ、本明細書による核酸、または本明細書による発現ベクターにさらに関する。
【００２９】
本明細書は、前述のような本明細書による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【００３０】
本明細書は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本明細書による宿主細胞にさらに関する。
【００３１】
本明細書は、本明細書による宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本明細書によるペプチドを生産する方法にさらに関する。
【００３２】
本明細書は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子上に抗原が負荷され、または抗原／クラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ複合体モノマーを四量体化することで、クラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ四量体上に抗原が負荷される、本明細書による方法にさらに関する。
【００３３】
本明細書は、抗原提示細胞が、配列番号１またはその変異型を含有する前記ペプチドを発現できまたは発現する発現ベクターを含んでなる、本明細書による方法にさらに関する。
【００３４】
本明細書は、本明細書による方法によって生産される活性化Ｔリンパ球にさらに関し、Ｔ細胞は、本明細書によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。
【００３５】
本明細書は、患者においてがんを死滅させおよび／または細胞を抑制する方法にさらに関し、そのがん細胞は、本明細書による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現し、方法は、本明細書によって生産される有効数のＴ細胞を患者に投与するステップを含んでなる。
【００３６】
本明細書は、本明細書による薬剤としてのまたは薬剤の製造における、本明細書に記載の任意のペプチド、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載の発現ベクター、本明細書に記載の細胞、本明細書に記載の活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体、抗体、またはその他のペプチド−および／またはペプチド−ＭＨＣ−結合分子の使用にさらに関する。一態様では、薬剤はがんに対して有効である。
【００３７】
好ましくは、前記薬剤は、細胞療法、ＴＣＲ、可溶性ＴＣＲまたは抗体である。
【００３８】
本明細書はさらに、本明細書による使用に関し、がん細胞は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん（例えば、神経膠芽腫、神経芽腫）、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、好ましくは非小細胞肺がんである。
【００３９】
本明細書は、がん、好ましくは非小細胞肺がんの診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本明細書によるペプチドをベースとするバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的化する免疫療法である、治療の成功確率を予測するために使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。任意選択的に、抗体または可溶性ＴＣＲは、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。
【００４０】
本明細書は、前記標的の少なくとも１つを認識するＴＣＲを同定するための、好ましくはＴ細胞を活性化する前記ＴＣＲを同定するための、これらの新規標的の使用にさらに関する。
【００４１】
本明細書はまた、がん治療の文脈におけるこれらの新規標的の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】健常組織およびがんにおける、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド提示を示す。
【図２】がんおよび健常組織における、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１発現を示す。
【図３】同上
【図４】同上
【図５】ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＨＣ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１四量体またはＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色を示す（表１）。ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１複合体に特異的に結合する１Ｇ４  ＴＣＲのＲＮＡで形質転換されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および模擬形質転換が、対照の役割を果たした。
【図６】ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド（配列番号１）または同種であるが無関係のペプチドＣＬＵＡ−００１（配列番号２６）、ＣＨＣＨＤ６−００１（配列番号２７）、ＣＤＣ４２ＢＰＧ−００１（配列番号２８）、ＰＡＲＰ１４−００２（配列番号２９）、ＳＹＮＥ２−００１（配列番号３０）、ＩＦＴ７−００１（配列番号３１）、ＤＨＲＳ１２−００１（配列番号３２）、ＳＴＸ１２−００１（配列番号３３）、ＥＥＡ−００１（配列番号３４）、ＳＥＮＰ７−００１（配列番号３５）、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号３６）が負荷された標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のαおよびβ鎖ＲＮＡ（表１）で電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を示す。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なるドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図７】ＩＧＦ２ＢＰ３−００１（配列番号１）、または配列番号１の１〜９位における様々なＩＧＦ２ＢＰ３−００１アラニン置換変異型が負荷された標的細胞との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７αおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を示す。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１が負荷された標的細胞とのまたは未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なるドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて得られた。
【図８】それぞれＡ−３７５黒色腫細胞株、Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞株、およびＳＫ−ＢＲ−３乳がん細胞株との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７（表１）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出である。ＲＮＡ電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞単独が、対照の役割を果たした。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書は、α鎖およびβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。ＭＨＣ分子によって提示されるとＴＣＲおよび抗体に結合できる、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のＴＣＲおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞；そしてそれを使用する方法にも関する。
【００４４】
定義
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
【００４５】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲと略記される）という用語は、αポリペプチド鎖（α鎖）およびβポリペプチド鎖（β鎖）を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、ＨＬＡ分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。
【００４６】
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞毒性Ｔ細胞に関して、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然にペプチドを提示する、標的細胞の溶解；ペプチドによって誘導される、好ましくはインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；ペプチドによって誘導される、好ましくはグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
【００４７】
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短くあり得て、１０、１１、または１２以上に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本明細書のペプチドのより長い変異型）の場合、それらは１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上に長くあり得る。
【００４８】
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内で塩ではないので、本明細書によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態がペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。
【００４９】
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープ群が保持されれば、本明細書にとって重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。
【００５０】
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本明細書にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
【００５１】
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本明細書における「免疫原」である）。本明細書では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本明細書では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
【００５２】
クラスＩ  Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ  ＭＨＣ受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
【００５３】
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本明細書のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーとから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。
【００５４】
本明細書の用法では「ペプチドをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【００５５】
本明細書の用法では「ＴＣＲをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用なＴ細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むＴＣＲをコードする、１つまたは複数のヌクレオチド配列を指す。
【００５６】
本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。
【００５７】
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
【００５８】
コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。
【００５９】
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【００６０】
コード配列に言及する場合、「断片」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
【００６１】
「ＤＮＡセグメント」という用語は、別々の断片の形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、セグメントおよびその構成ヌクレオチド配列が、同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このようなセグメントは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。
【００６２】
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３'−ＯＨ末端を提供する。
【００６３】
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
【００６４】
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。一態様では、このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないという点において、依然として単離されている。
【００６５】
本明細書によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図され、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。
【００６６】
本明細書によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本明細書を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性断片」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与されると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列の断片を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性断片」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
【００６７】
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「セグメント」、および「断片」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列はより大型の配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、セグメントまたは断片に相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
【００６８】
本明細書によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
（ｉｖ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
【００６９】
比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
【００７０】
本明細書では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。
【００７１】
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう
【００７２】
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同様にＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ＊０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化Ｔリンパ球のＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。同様に、ＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ＊０２またはＨＬＡ−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子／ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）複合体と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、Ｔ細胞を活性化する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
【００７３】
これらのＴ細胞は、本明細書の態様で定義されているように、引き続いて細胞と交差反応して、ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）などの同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を死滅させ得る学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的にアンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。一態様では、当業者は、本明細書の教示を所与として、既知のアンカー残基を維持することによって、ＴＣＲのアミノ酸配列を修飾する能力を有し、このようなＴＣＲ変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子／ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）複合体に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本明細書のＴＣＲ変異型は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子／ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）複合体に結合する能力を維持する。本明細書のＴＣＲ変異型を発現するＴ細胞は、引き続いて、ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）などの同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を死滅させ得る。
【００７４】
一態様では、本明細書で開示されるペプチドまたはＴＣＲは、特に明記されない場合、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位での１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、前記ペプチドのアミノ酸鎖の末端に位置する。ＴＣＲでは、好ましくは、これらの置換は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の可変領域に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【００７５】
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基とそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【００７６】
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するが、サイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、過激な置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「過激な」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。
【００７７】
一態様では、このような置換は、一般的なＬ−アミノ酸以外の構造を含んでもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本明細書の抗原性ペプチドに通常見いだされるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用されて、本明細書による免疫原および免疫原性ポリペプチドが生産されてもよい
【００７８】
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つを超える位置が、同時に置換されることはない。
【００７９】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
好ましい実施形態では、本明細書は、表１に示されるＴＣＲα鎖およびその変異型と、表１に示されるＴＣＲβ鎖およびその変異型とを含んでなる、ＴＣＲに関する。一態様では、本明細書に記載のＴＣＲは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス−Ｉ／ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）／複合体またはクラスＩＩ／ＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）／複合体の分子に結合するまたは特異的に結合する能力を有する。
【００８０】
【表１−１】
2019512242.tif 000002
【表１−２】
2019512242.tif 000003
【００８１】
α／βＴＣＲのαおよびβ鎖、そしてγ／δＴＣＲのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ２つの「ドメイン」、すなわち可変および定常ドメインを有すると見なされる。可変ドメインは、可変領域（Ｖ）と接合領域（Ｊ）の連結からなる。可変ドメインはまた、リーダー領域（Ｌ）を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域（Ｄ）を含んでもよい。αおよびβ定常ドメインはまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるＣ末端膜貫通（ＴＭ）ドメインを含んでもよい。
【００８２】
したがって本明細書では、「ＴＣＲα可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲαＶ（ＴＲＡＶ）領域とＴＣＲαＪ（ＴＲＡＪ）領域との連結を指し；「ＴＣＲα定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＡＣ領域、またはＣ末端切断型ＴＲＡＣ配列を指し、任意選択的にα膜貫通ドメイン（ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬ（配列番号１８））を指す。
【００８３】
同様に「ＴＣＲβ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲβＶ（ＴＲＢＶ）領域とＴＣＲβＤ／Ｊ（ＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ）領域との連結を指し；「ＴＣＲβ定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＢＣ領域、またはＣ末端切断型ＴＲＢＣ配列を指し、任意選択的にβ膜貫通ドメイン（ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号１９））を指す。
【００８４】
γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変ドメイン」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＧＣ配列を指す同様に「ＴＣＲδ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し、「ＴＣＲδ定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＤＣ配列を指す。
【００８５】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるＴＣＲα鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα鎖を含んでなり、またはそれからなる。表１に示されるＴＣＲα鎖は、表１で定義されるような、リーダー（Ｌ）セグメント；Ｖ鎖；３つの相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）；接合領域（Ｊ）、および定常領域を含有する。
【００８６】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【００８７】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲα定常ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【００８８】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ３、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表１に示されるα鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表１に示されるα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【００８９】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有するＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、またはそれからなり、表１の同一α可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【００９０】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるＴＣＲβ鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ鎖を含んでなり、またはそれからなる。表１に示されるＴＣＲβ鎖は、表１で定義されるような、リーダー（Ｌ）セグメント；Ｖ鎖；３つの相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）；接合領域（Ｊ）、および定常領域を含有する。
【００９１】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【００９２】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲβ定常ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【００９３】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１に示されるβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ３、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲβ鎖可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、表１に示されるβ鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、表１に示されるβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【００９４】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表１のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、またはそれからなり、表１の同一β可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【００９５】
α鎖可変ドメインは、表１に示される対応するＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のαＣＤＲドメインを含んでなってもよい。同様に、β鎖可変ドメインは、表１に示される対応するβＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のβＣＤＲドメインを含んでなってもよい。
【００９６】
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、融合して一本鎖ＴＣＲを形成してもよい。代案としては、ＴＣＲα鎖およびβ鎖は、ヘテロ二量体に組み立てられ得る、別個のタンパク質として発現されてもよい。
【００９７】
一実施形態では、表１の任意のＴＣＲα鎖は、任意のその他のＴＣＲβ鎖と対になって、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合するＴＣＲを生じる。別の実施形態では、表１の任意のＴＣＲβ鎖は、任意のその他のＴＣＲα鎖と対になって、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合するＴＣＲを生じる。
【００９８】
ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、それぞれ配列番号２および配列番号１０に対応する、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のα鎖および／またはβ鎖を含んでなり、またはそれからなる。
【００９９】
ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のＴＣＲα可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸２２〜１３０を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のＴＣＲα定常ドメインは、配列番号２のアミノ酸１３１〜２７１を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号１０のアミノ酸２６〜１３９を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲβ定常ドメインは、配列番号１０のアミノ酸１４０〜３１８を含んでなり、または代案としてはそれからなる。
【０１００】
特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号２のＴＣＲα鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα鎖を含んでなる。
【０１０１】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号２のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号２のＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲα定常ドメインを含んでなる。
【０１０３】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号２のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号２のα鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号２のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１０４】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号２のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有するＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、配列番号２のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１０５】
別の特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号１０のＴＣＲβ鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ鎖を含んでなる。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号１０のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号１０のＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲβ定常ドメインを含んでなる。
【０１０８】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１０９】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号１０のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、配列番号１０のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１１０】
α鎖可変ドメインは、配列番号２の対応するＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のαＣＤＲドメインを含んでなってもよい。同様に、β鎖可変ドメインは、配列番号１０の対応するβＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のβＣＤＲドメインを含んでなってもよい。
【０１１１】
さらに好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、ＩＧＦ２ＢＰ３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合し、ＧＦ２ＢＰ３ペプチドはＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）およびその変異型から選択される。一実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ分子からなる群から選択される、クラスＩ  ＭＨＣ分子である。一実施形態では、ＨＬＡ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２である。別の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子である。
【０１１２】
本明細書のＴＣＲは、好ましくは、約２μＭ以下、約３μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で、ＩＧＦ２ＢＰ３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に結合する。より好ましいのは、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下の結合親和性を有する、高親和性ＴＣＲである。本発明のＴＣＲの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ；約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ；約２０ｎＭ〜約３０ｎＭ；約３０ｎＭ〜約４０ｎＭ；約４０ｎＭ〜約５０ｎＭ；約５０ｎＭ〜約６０ｎＭ；約６０ｎＭ〜約７０ｎＭ；約７０ｎＭ〜約８０ｎＭ；約８０ｎＭ〜約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ〜約１００ｎＭが挙げられる。
【０１１３】
本明細書の用法では、本明細書のＴＣＲとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、ＩＧＦ２ＢＰ３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、２μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有するＴＣＲを意味するために使用される。
【０１１４】
本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、それらの定常ドメインの間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいＴＣＲとしては、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを有するものが挙げられるが、ただし、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７は、システイン残基によって置換されており、前記システインは、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。
【０１１５】
上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを有してもよく、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とが、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。
【０１１６】
本明細書のＴＣＲは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。
【０１１７】
一実施形態では、α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／またはβ鎖に少なくとも１つの変異を有する本明細書のＴＣＲは、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する。
【０１１８】
一実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖に少なくとも２つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＩＧＦ２ＢＰ３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲα鎖および／または非変異ＴＣＲβ鎖を含んでなるＴＣＲの少なくとも２倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増強とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく（Ａｌｅｋｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｋｕｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性であるＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られているプロセスにおいて胸腺内で負に選択され（Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｒｕｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）、すなわち、自己抗原に対する低親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のみが残留する。したがって、ＩＧＦ２ＢＰ３に対する本明細書のＴＣＲまたは変異型の親和性は、当技術分野で周知の方法によって高め得る。
【０１１９】
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。
【０１２０】
本明細書の医薬組成物はまた、本明細書のＴＣＲを発現する少なくとも１つの宿主細胞と、薬学的に許容で可能な担体とを含む。
【０１２１】
本明細書の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤もまた含んでもよい。
【０１２２】
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。
【０１２３】
本明細書のさらなる態様は、本明細書のペプチド、ペプチド変異型、ＴＣＲ、およびＴＣＲ変異型をコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、一本鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本明細書のなおもさらなる態様は、本明細書によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
【０１２４】
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡセグメントが連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
【０１２５】
１つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、米国コネチカット州ニューヘイブンのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．をはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。
【０１２６】
本明細書のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限部位を遺伝子操作することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
【０１２７】
一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、本明細書のＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）を形質導入し、それを患者への輸液前に増殖させる。
【０１２８】
別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ  ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＴＣＲ  ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖が再発現される。
【０１２９】
末梢Ｔ細胞に導入されたＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ表面発現に必要であるＣＤ３複合体との結合について、内因性ＴＣＲ鎖と競合してもよい。高レベルのＴＣＲ表面発現は、標的腫瘍抗原を発現する細胞による始動のための適切な感受性を付与するのに必須であることから（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌａｂｒｅｃｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現レベルを増強するストラテジーは、ＴＣＲ遺伝子治療における重要な考慮事項である。
【０１３０】
発現を増加させるために、本明細書のＴＣＲをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β−アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、伸長因子（ＥＦ）−１ａ（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター（Ｊｏｓｅｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）などの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。
【０１３１】
強力なプロモーターに加えて、本明細書のＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。
【０１３２】
本発明のＴＣＲのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【０１３３】
高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方を高レベルで転写する必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の生成を確実にする単一転写物から生じるので、ＴＣＲ−α鎖とＴＣＲ−β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０１３４】
本明細書のＴＣＲをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増加されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現を有意に高めることが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１３５】
さらに、導入ＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は、重大な自己免疫リスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１３６】
誤対合を減少させるために、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性ＴＣＲと対形成する能力が低下するように、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域を修飾してもよい。これらのストラテジーは、ヒトＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換すること；導入ＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することによって、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を生成すること（システイン修飾）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖のＣ末端領域内の相互作用残基を交換すること（「ノブ・イン・ホール」）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させること（ＣＤ３ζ融合）を含んでもよい。  （Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０１３７】
次に、ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）が適切な宿主において発現され、本明細書のペプチドまたは変異型を含んでなるポリペプチドが生産されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本明細書のペプチドまたは変異型をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本明細書のポリペプチドの発現および生産のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０１３８】
本発明明細書の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
【０１３９】
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
【０１４０】
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
【０１４１】
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。
【０１４２】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【０１４３】
一実施形態では、宿主細胞は、本細書のＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはＴ細胞前駆体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α／βＴＣＲを発現するように形質転換されたγ／δＴ細胞である。
【０１４４】
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部を有するＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター、およびネオマイシンなどの耐性マーカーを含んでなる。一例は、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
【０１４５】
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内で、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。ＣＭＶベクターは、例えば、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞と共に使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
【０１４６】
別の実施形態では、本明細書の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトと同様）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ  ＩとＭＨＣ  ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。
【０１４７】
本明細書はまた、本明細書のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、米国メリーランド州ベセスダのＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒトの線維芽細胞株および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  ＢａｌｂａｓおよびＡｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書、"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ｐａｒｔ  Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２６２−９、および当業者に知られているその他の文献にある。
【０１４８】
本明細書のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに依存する周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、米国郵便番号２０８７７メリーランド州ゲイザースバーグのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０１４９】
成功裏に形質転換細胞、すなわち本明細書のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。
【０１５０】
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞が、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子中に負荷されてもよいように、本明細書のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本明細書は、本明細書による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【０１５１】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１５２】
本明細書のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、ペプチドまたはその変異型を生産する方法を提供する。
【０１５３】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲ、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ、ｉ．ｄ、ｉ．ｐ、ｉ．ｍ、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ、ｉ．ｍ、ｓ．ｃ、ｉ．ｐ、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１５４】
活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
【０１５５】
本明細書は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい）は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。
【０１５６】
細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。
【０１５７】
ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。
【０１５８】
さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。
【０１５９】
アプタマーは、診断および治療目的で有用である。一態様では、少なくとも１つまたはそれ以上のアプタマーが腫瘍細胞に取り込まれ、したがってｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の腫瘍細胞への標的化送達のための分子ビヒクルとして機能し得る。
【０１６０】
アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本明細書による配列番号１４〜配列番号１５のいずれかに記載の配列とＭＨＣ分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体またはＴＣＲなどに対して、選択され得る。
【０１６１】
一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなＴＣＲを製造する方法を提供し、方法は、ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下でＴＣＲを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。
【０１６２】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ＩＧＦ２ＢＰ３モノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０１６３】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０１６４】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０１６５】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをＩＧＦ２ＢＰ３−００１で免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０１６６】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをｐ２８６−１Ｙ２Ｌで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０１６７】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０１６８】
本明細書は、Ｔ細胞が、本明細書によるＡ  ＴＣＲを発現できる発現ベクターを含んでなる、本明細書による方法にさらに関する。
【０１６９】
本明細書は、本明細書による有効数のＴＣＲ、可溶性ＴＣＲおよび／またはＴ細胞を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞がＩＧＦ２ＢＰ３を異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【０１７０】
本明細書は、記載される任意のＴＣＲ、本明細書による核酸、本明細書による発現ベクター、本明細書による細胞、または本明細書による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本明細書は、薬剤ががんに対して有効である、本明細書による使用にさらに関する。
【０１７１】
本明細書はさらに、本明細書による使用に関し、前記がん細胞は、非小細胞肺がん細胞であり、または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどのその他の固形または血液学的腫瘍細胞である。
【０１７２】
本発明は、がん細胞を本明細書の宿主細胞と接触させるステップを含んでなる、がん細胞を死滅させる方法にさらに関する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書のＴＣＲを発現する。一実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。一実施形態では、好ましい実施形態では、がん細胞は、非小細胞肺がん細胞；または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどのその他の固形たは血液学的腫瘍細胞から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、治療効果のある薬剤にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、治療効果のある薬剤は、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される。
【０１７３】
本発明は、本発明の宿主細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にさらに関する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書のＴＣＲを発現する。一実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。１つの実施形態では、宿主細胞は、治療される対象にとって自己由来である。別の実施形態では、宿主細胞は、処置される対象に対して同種異系である。好ましい実施形態では、がん細胞は、非小細胞肺がん細胞；または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどのその他の固形たは血液学的腫瘍細胞から選択される。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、治療効果のある薬剤にコンジュゲートされる。本明細書の用法では、「治療効果のある薬剤」という用語は、疾患または望ましくない医学的状態を治療または予防するために使用される化合物を意味する。一実施形態では、治療効果のある薬剤を使用して、がんが治療または予防される。特定の実施形態では、治療効果のある薬剤は、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される。
【０１７５】
本明細書のＴＣＲ、核酸、および宿主細胞、そしてその医薬組成物は、当該技術分野で公知であり、治療されるがん型次第で変動してもよい経路によって、それを必要とする対象に投与されてもよい。投与経路としては、例えば、局所投与（腫瘍内など）と、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、門脈内および肝臓内などの非経口投与とが挙げられる。好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲ、核酸または宿主細胞、またはその医薬組成物は、例えば、点滴ポンプおよび／またはカテーテル装置を用いた、固形腫瘍などの治療される部位への局所注入によって、対象に投与される。一実施形態では、本明細書の組成物は、固形腫瘍、固形腫瘍に供給する血管、および／または固形腫瘍を取り囲む領域に注入される。
【０１７６】
好ましい実施形態では、本明細書の組成物は、少なくとも２４時間隔てられた少なくとも２回の投与の投与レジメンを用いて対象に投与される。本明細書の組成物を投与するのに適した投与レジメンとしては、例えば、１日１回、２日に１回、３日に１回などが挙げられる。より好ましい投与レジメンとしては、週１回、週２回、隔週１回、月１回、および月２回が挙げられる。特定の実施形態では、用量漸増レジメンが使用され、一連の増加用量が、数日間、数週間または数ヶ月間に対象に投与される。
【０１７７】
本発明のＴＣＲを発現する宿主細胞の有効用量としては、例えば、１用量当たり少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、および少なくとも１０１０個の宿主細胞が挙げられる。一実施形態では、本明細書の宿主細胞は、１用量当たり約１０４〜約１０１０個の細胞の用量、好ましくは１用量当たり１０５〜約１０９個の細胞の用量で投与される。好ましい実施形態では、用量は、少なくとも２回またはそれ以上の投与サイクルにわたって、投与レジメンで投与される。
【０１７８】
本発明はまた、少なくとも１つの化学療法剤および／または放射線療法と組み合わせて、本明細書のＴＣＲ、核酸、または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にも関する。
【０１７９】
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）本明細書のＴＣＲをコードする少なくとも１つのベクターで細胞を形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
【０１８０】
ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）本明細書のＴＣＲをコードするベクターで細胞を形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
【０１８１】
ａ）生物学的サンプルを本明細書のＴＣＲに接触させるステップと；
ｂ）生物学的サンプルへのＴＣＲの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプルにおいてがんを検出する方法もまた提供される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、がんを検出する方法は、生体外、生体内または原位置で実施される。
【０１８３】
本明細書は、小細胞肺がんの診断および／または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本明細書によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本明細書はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
【０１８４】
特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を生産する方法を提供することもまた、本明細書のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的化する変異誘発によって増加され得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、または抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。別の態様では、それは養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞内で発現される。例えば、その内容全体が参照により援用される、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレット、国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレット、および国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットを参照されたい。
【０１８５】
さらに本明細書のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。
【０１８６】
抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体またはＴＣＲは、腫瘍が位置確認され得るように、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらの断片は、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
【０１８７】
診断用の抗体またはＴＣＲは、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の２つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体および／またはＴＣＲは、前記プローブで、直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体および／またはＴＣＲへの付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体またはＴＣＲへの組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
【実施例】
【０１８８】
アロ反応性設定を使用して自己免疫寛容を回避し、自己由来設定、すなわち、患者に由来するＴ細胞と比較してより高い結合活性を有する、Ｔ細胞もをたらし得る。このような設定の例としては、アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｄｏｖｎｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｗｉｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、およびヒトＭＨＣまたはヒトＴＣＲについて遺伝子組換えであるマウスの免疫化（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）が挙げられる。
【０１８９】
実施例１：アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）
告知に基づく同意を得た後、ＨＬＡ−Ａ＊０２陽性およびＨＬＡ−Ａ＊０２陰性の健常ドナーからのＰＢＭＣを使用した。組換えビオチン化ＨＬＡ−Ａ２クラスＩモノマーと、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１を含有するＡ２蛍光性四量体をＭＢＬＩ（マサチューセッツ州ウーバン）から得た。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗ＣＤ２０ＳＡと共に、ＰＢＭＣを室温で１時間培養し、洗浄して、ビオチン化Ａ２／ＩＩＧＦ２ＢＰ３−００１モノマーと共に室温で３０分間培養し、洗浄して、２４ウェルプレート内の００１％ヒトＡＢ血清添加ＲＰＭＩに、３×１０６細胞／ウェルで播種した。インターロイキン７（ＩＬ−７；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を１日目に１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ＩＬ−２（英国ヘアフィールドのＣｈｉｒｏｎ）を４日目に１０Ｕ／ｍＬで添加した。５週間にわたり、細胞を新鮮なＰＢＭＣで毎週再刺激し、応答性細胞と１：１の比で混合して、２４ウェルプレートに３×１０６／ウェルで播種した。
【０１９０】
高結合活性Ｔ細胞を得るために、およそ１０６のＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ２／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１四量体フィコエリトリン（ＰＥ）（ＭＢＬＩから得た）と共に、３７°Ｃで００１分間培養し、それに続いて抗ＣＤ８イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と共に４°Ｃで２０分間培養し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析がそれに続いた。選別は、ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ（英国オックスフォード市カウリーのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。ウェル当たり、２×１０５の選別された細胞、フィーダーとしての２×１０６照射Ａ２陰性ＰＢＭＣ、２×１０４のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ／ｍＬ（ノルウェイ国オスロのＤｙｎａｌ）、およびＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）を使用して、選別された四量体陽性細胞を２４ウェルプレート内で増殖させた。次に、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用して、単細胞５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）などの当該技術分野で公知の技術を用いてＴＣＲを同定し単離した。次に、非重複ＴＣＲ  ＤＮＡをアミノ酸／ＤＮＡ配列決定について分析し、当該技術分野で周知の方法を用いて発現ベクターにクローニングした。
【０１９１】
実施例２：ＴＣＲのクローニング
ＴＣＲのクローニング法は、例えば、前記方法に関してその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１００号明細書に記載されるように、当該技術分野で公知である。制限部位ＮｄｅＩをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドＡ１（ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇａｇｔｃａａｃａａｇｇａｇａａｇａａｇａｔｃｃ配列番号２２）、細菌における発現の効率的な開始のために導入されたメチオニン、および制限部位ＳａｌＩをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドＡ２（ｔｔｇｔｃａｇｔｃｇａｃｔｔａｇａｇｔｃｔｃｔｃａｇｃｔｇｇｔａｃａｃｇ配列番号２３）を使用して、α鎖可変領域を増幅した。β鎖の場合、制限部位ＮｄｅＩをコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドＢ１（ｔｃｔｃｔｃａｔａｔｇｇａｔｇｇｔｇｇａａｔｔａｃｔｃａａｔｃｃｃｃａａ配列番号２４）、細菌における発現の効率的な開始のために導入されたメチオニン、および制限部位ＡｇｅＩをコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドＢ２（ｔａｇａａａｃｃｇｇｔｇｇｃｃａｇｇｃａｃａｃｃａｇｔｇｔｇｇｃ配列番号２５）を使用して、β鎖可変領域を増幅した。
【０１９２】
ＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＧＭＴ７＋Ｃαベクターにライゲートし、それをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断した。ＴＣＲβ鎖をコードするＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで切断し、別個のｐＧＭＴ７＋Ｃβベクターにライゲートし、それもまたＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで切断した。ライゲートされたプラスミドをコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ／寒天プレート上に播種する。３７℃で一晩インキュベートした後、単一コロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬＢ中で一晩３７℃で振盪しながら増殖させる。クローン化プラスミドをＭｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、挿入断片を自動ＤＮＡ配列決定装置（Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定する。
【０１９３】
腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖をコードするＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７を健常ドナーのＴ細胞から単離し増幅した。健常ドナー由来の細胞は、Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２００３に記載の方法に従って、生体外刺激した。標的特異的細胞は、引き続くＴＣＲ単離のために、標的特異的多量体を使用して単細胞ソートした。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されるように、標準法によって５’ＲＡＣＥを通じてＴＣＲ配列を単離した。ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７は、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから単離した。ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、Ｒ７Ｐ１Ｄ５、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２のαおよびβ可変領域を配列決定した。
【０１９４】
Ｒ１０Ｐ１Ａ７  ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号２の残基２２〜１３０に対応するアミノ酸配列を有することが見いだされた。Ｒ１０Ｐ１Ａ７  ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号１０の残基２６〜１３９に対応するアミノ酸配列を有することが見いだされた。
【０１９５】
ファージディスプレイを用いてＴＣＲ変異型のライブラリーを作成し、高親和性変異体を同定し得た。表１に記載のＴＣＲから選択された参照ＴＣＲに、（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（３）：３４９−３５４）に記載されるＴＣＲファージディスプレイおよびスクリーニングを適用し得る。
【０１９６】
例えば、配列番号２のα鎖配列の全ての３つのＣＤＲ領域；配列番号１０のβ鎖配列の全ての３つのＣＤＲ領域を変異誘発によって標的化し得て、各ＣＤＲライブラリーは別々にパンニングおよびスリーニングする。
【０１９７】
したがって、参照ＴＣＲの少なくとも２倍の（したがって、天然ＴＣＲの少なくとも２倍であることが暗示される）親和性および／または結合半減期を有するＴＣＲが同定され得る。
【０１９８】
定常領域に導入されたシステインをはじめとする方法を用いて、ＴＣＲヘテロ二量体を再折りたたみし、人工鎖間ジスルフィド結合を提供する。このようにして、  （ａ）変異α鎖と共に参照ＴＣＲβ鎖；（ｂ）変異β鎖と共に参照ＴＣＲα鎖；および（ｃ）変異可変ドメインを含むβ鎖およびα鎖の様々な組み合わせからなるＴＣＲを調製する。
【０１９９】
高親和性の可溶性ジスルフィド結合ＴＣＲと、ＴＣＲ変異型、および天然ペプチドＫＩＱＥＩＬＴＱＶ（配列番号１）ＨＬＡ−Ａ複合体との間の相互作用は、ＢＩＡｃｏｒｅ法を用いて分析し得る。
【０２００】
高親和性ＴＣＲ変異型はまた、酵母、またはＴ細胞ディスプレイによって、ＣＤＲ変異体のライブラリーから選択され得る（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。したがって、候補ＴＣＲ変異型は、ＴＣＲのＣＤＲの変異をデザインして、高結合活性のＴＣＲ変異型を得るための指針を提供する（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｚｏｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０２０１】
実施例３：自己Ｔ細胞の遺伝子操作
Ｔ細胞は、高結合活性ＴＣＲ（いわゆるＴＣＲ療法）、またはＭＨＣＩ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１複合体またはＭＨＣＩＩ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１複合体に対する抗原特異性が増強されたタンパク質融合由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、遺伝子操作し得る。一態様では、このアプローチは、中枢および末梢寛容に関連するいくつかの制限を克服し、患者における新生Ｔ細胞活性化の必要なしに、腫瘍の標的化においてより効率的なＴ細胞を生じる。
【０２０２】
一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、実施例１〜２に記載されるように同定され単離された腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸を、γ−レトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化する。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）を形質導入し、それを患者への輸液前に増殖させる。
【０２０３】
別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ  ＲＮＡが合成された。次に生体外で合成されたＴＣＲ  ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖が再発現された。
【０２０４】
外因性ＴＣＲが形質転換Ｔ細胞の細胞表面で機能的に発現しているかどうかを試験するために、四量体染色技術を用いてＭＨＣ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１結合Ｔ細胞を検出した。図５および表２に示されるように、ＭＨＣ／無関係のペプチド（例えばＮＹＥＳＯ１−００１）四量体（例えば１．５３％）によるよりも、または模擬対照（例えば１．７３％）によるよりも、蛍光標識ＭＨＣ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１四量体染色によって、ＣＤ３陽性特異的Ｔ細胞集団のより高い百分率、すなわち６．７８％が、ＴＣＲ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞内で観察された。対照として、ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１複合体と特異的に結合することが知られている対照ＴＣＲである１Ｇ４  ＴＣＲで形質転換された初代ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体によって容易に検出され、すなわち、１７．６９％であった。これらの結果は、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７がＴ細胞表面で発現され、ＭＨＣ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１複合体と特異的に結合し得ることを示唆する。ＴＣＲ１Ｇ４のα鎖およびβ鎖は、それぞれ配列番号２０および２１で示される。
１Ｇ４α鎖（配列番号２０）：METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
１Ｇ４β鎖（配列番号２１）：MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
ＴＣＲの特異性および親和性を判定するために、形質転換されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１が負荷された標的細胞と、または同種であるが無関係のペプチドＣＬＵＡ−００１（配列番号２６）、ＣＨＣＨＤ６−００１（配列番号２７）、ＣＤＣ４２ＢＰＧ−００１（配列番号２８）、ＰＡＲＰ１４−００２（配列番号２９）、ＳＹＮＥ２−００１（配列番号３０）、ＩＦＴ７−００１（配列番号３１）、ＤＨＲＳ１２−００１（配列番号３２）、ＳＴＸ１２−００１（配列番号３３）、ＥＥＡ−００１（配列番号３４）、ＳＥＮＰ７−００１（配列番号３５）、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号３６）が負荷された標的細胞と同時インキュベートし、ＩＦＮ−γ放出アッセイがそれに続いた。未負荷標的細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞単独が、対照の役割を果たした。ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、細胞毒性活性を有するＴ細胞活性化の指標となる。
【０２０５】
【表２】
2019512242.tif 000004
【０２０６】
図６に示されるように、本開示のＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７をコードするＲＮＡで電気穿孔された初代ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１が負荷された標的細胞との同時インキュベーション後に、対照ペプチドが負荷された標的細胞よって刺激されたもの、および対照よりも、はるかに高レベルのＩＦＮ−γを放出した。標的ペプチド滴定分析は、約１ｎＭのＥＣ５０を示した（表２）。これらの結果は、本発明のＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７が、ＭＨＣ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１複合体との特異的相互作用を通じて、例えばＩＦＮ−γ放出などの細胞毒性Ｔ細胞活性を活性化し得ることを示唆する。
【０２０７】
ＭＨＣ／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１複合体に対するＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７の結合モチーフを判定するために、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチドの９個のアミノ酸のそれぞれでポジショナルアラニンスキャニング分析を実施した。アラニン置換ＩＧＦ２ＢＰ３−００１ペプチドは、表３に示される。
【０２０８】
【表３】
2019512242.tif 000005
【０２０９】
簡潔に述べると、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７で形質転換されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１−Ａ１〜ＩＧＦ２ＢＰ３−００１−Ａ９、または対照照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドが負荷された標的細胞と同時インキュベートし、上記のようなＩＦＮγ放出アッセイがそれに続いた。
【０２１０】
ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のポジショナルアラニンスキャニング分析の結果は図７に示され、表４に要約される。
【０２１１】
【表４】
2019512242.tif 000006
【０２１２】
同一モチーフを有するＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７に対するＡ＊０２結合ペプチドのゲノムワイドスクリーニングは、潜在的に交差反応性のペプチドがないことを明らかにした。これらの結果は、本明細書に記載されるＴＣＲが、オフターゲット効果のリスクが低下した、非常に特異的な認識パターンを示すことを示唆する。
【０２１３】
本明細書に記載のＴＣＲを発現するＴ細胞の有効性を判定するために、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７のＲＮＡで電気穿孔された初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を、例えば、ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＩＧＦ２ＢＰ３−００１（標的）陽性のＡ−３７５（ヒト黒色腫細胞）およびＴ９８Ｇ（ヒト神経膠芽腫細胞株）などの異なるヒトがん細胞株、そしてＨＬＡ−Ａ２陰性およびＩＧＦ２ＢＰ３−００１陰性のＳＫ−ＢＲ−３（ヒト乳がん細胞株）と同時インキュベートし、ＩＦＮγ放出アッセイがそれに続いた。
【０２１４】
図８に示されるように、ＩＦＮγ放出は、ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＩＧＦ２ＢＰ３−００１陽性のＡ−３７５およびＴ９８Ｇ細胞の双方で観察されたが、エフェクター細胞単独対照と同等の基礎レベルのＩＦＮγ放出を有するＳＫ−ＢＲ−３細胞では観察されなかった。これらの結果は、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ１Ａ７を発現するＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２／ＩＧＦ２ＢＰ３−００１特異的様式で、がん細胞を標的化する細胞毒性活性を特異的に誘導し得ることを示唆する。
【０２１５】
本明細書は、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１を過剰にまたは排他的に提示する、がん／腫瘍、好ましくは黒色腫および神経膠芽腫を治療するのに有用なＴＣＲを提供する。
【０２１６】
実施例５：同種異系Ｔ細胞の遺伝子操作
病原体に対する防御の第一線に関与する非従来的なＴリンパ球エフェクターであるガンマデルタ（γδ）Τ細胞は、受容体、特に、ＴＣＲ−γおよびＴＣＲ−δ鎖を活性化することで、ＭＨＣ非依存的様式で腫瘍細胞と相互作用して、腫瘍細胞を根絶し得る。これらのγδＴ細胞は、活性化に際して、迅速なサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）および強力な細胞毒性応答細胞傷害性応を可能にする前活性化表現型を示す。これらのＴ細胞は多くのがんに対して抗腫瘍活性を有し、γδＴ細胞媒介免疫療法が実行可能であり、客観的な腫瘍応答を誘導し得ることが示唆される。（Ｂｒａｚａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０２１７】
固定化抗原、作動性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、腫瘍由来人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、または活性化ｍＡｂとａＡＰＣの組み合わせを用いる近年の進歩は、オリゴクローナルまたはポリクローナルＴＣＲレパートリーありまたはなしで、γδＴ細胞を増殖させるのに成功している。例えば、固定化主要組織適合性複合体クラスＩ鎖関連Ａは、ＴＣＲδ１アイソタイプを発現するγδＴ細胞に対する刺激であり、プレート結合活性化抗体は、生体外でＶδ１およびＶδ２細胞を増殖させた。臨床的に十分な量のＴＣＲδ１、ＴＣＲδ２、およびＴＣＲδ１ｎｅｇＴＣＲδ２ｎｅｇは、ａＡＰＣ上での同時培養に続いて生成し、これらのサブセットは、記憶表現型および生体外および生体内での腫瘍に対する反応性の差異を示した。（Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【０２１８】
さらに、γδＴ細胞は、ＴＣＲ−α鎖およびＴＣＲ−β鎖の導入によって証明されるように、遺伝子修飾に適している。（Ｈｉａｓａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。本明細書の別の態様は、ＩＧＦ２ＢＰ３−００１に結合するＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βを発現するγδＴ細胞の生成に関する。これを行うために、γδＴ細胞をＤｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４によって記載される方法によって増殖させ、（実施例３に記載されるような）ＩＧＦ２ＢＰ３−００１に結合するＴＣＲを発現する組換えウイルスを、増殖させたγδＴ細胞に形質導入することがそれに続いた。次に、ウイルス形質導入γδＴ細胞を患者に輸液する。
【０２１９】
実施例６：レンチウイルスコンストラクトおよび発現分析
簡潔に述べると、２つの試験コンストラクト（「Ｒ１０」）を作製した。次に、これらのコンストラクトを用いて、良好な力価および生産性を有するレンチウイルス上清を生成した。次にレンチウイルス上清を使用して、初代Ｔ細胞（２人のドナー）を形質導入し、フローサイトメトリーによる四量体結合に基づくＴＣＲの表面発現が後続した。
【０２２０】
【表５Ａ−１】
2019512242.tif 000007
【表５Ａ−２】
2019512242.tif 000008
【０２２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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