(57)【要約】  サンプル中の粒子の形態学的特性を求めるホログラフィック顕微鏡法による分析システムおよび方法。ホログラフィック顕微鏡法システムから得られた記録済みホログラムから明視野再構成画像を生じさせる。このシステムによって画像化された粒子の形態学的特性を求めることができる。ホログラムか明視野再構成画像かのいずれか一方またはこれら両方からＨｕモーメントを計算して形態学的特性の指標を得る。
2019534463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子の形態学的特性を求める方法であって、
マイクロフルイディックチャネル内でレーザビーム中に粒子を流通させるステップと、
前記レーザビームおよび前記粒子の干渉パターンを記録するステップと、
レイリー・ゾンマーフェルト解析を利用することによって三次元明視野を再構成するステップと、
前記三次元明視野をデコンボリューションして前記粒子内の散乱中心を求めるステップと、
単一軸線に沿って積分して前記粒子の二次元画像を構成するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記画像についてＨｕモーメントを求めるステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記粒子の前記形態学的特性を識別するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
コンピュータ計算されるホログラムを計算して前記コンピュータ計算されるホログラムを前記記録された干渉パターンと比較するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記コンピュータ計算されるホログラムは、ローレンツ・ミー理論によってコンピュータ計算される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
半径、屈折率、対称性、および均質性のうちの少なくとも１つを求めるステップを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
複数の粒子を前記レーザビーム中に流通させ、複数の粒子について二次元画像を構成する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
粒子の形態学的特性を求める方法であって、
サンプルをマイクロフルイディックチャネル中に流通させるステップと、
レーザビームを前記サンプルと相互作用させるステップと、
前記レーザビームを前記サンプルから散乱させて散乱した部分を生じさせるステップと、
コリメートされたレーザビームの非散乱部分および前記散乱部分から干渉パターンを生じさせるステップと、
前記干渉パターンを対物レンズで拡大するステップと、
次の分析のために前記干渉パターンを記録するステップと、
散乱関数を利用してホログラムを計算するとともに前記記録された干渉パターンを前記計算されたホログラムに当てはめるステップと、
前記当てはめた計算済みホログラムから前記サンプルの屈折率および半径の推定値を求めるステップと、
前記記録された干渉パターンについてＨｕモーメントを求めるステップとを含む、方法。
【請求項９】
レイリー・ゾンマーフェルト解析を利用することによって三次元明視野を再構成し、前記三次元明視野をデコンボリューションして前記粒子内の散乱中心を求め、そして単一軸線に沿って積分して前記粒子の二次元画像を構成することによって明視野画像を生じさせるステップを更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子の前記形態学的特性を識別するステップを更に含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
コンピュータ計算されるホログラムを計算して前記コンピュータ計算されるホログラムを前記記録された干渉パターンと比較するステップを更に含む、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記コンピュータ計算されるホログラムは、ローレンツ・ミー理論によってコンピュータ計算される、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
半径、屈折率、対称性、および均質性のうちの少なくとも１つを求めるステップを更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
複数の粒子を前記レーザビーム中に流通させ、複数の粒子について二次元画像を構成する、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルを流通させる前記ステップは、少なくとも６ｍｍ／秒の速度状態にある、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルに関して剪断力を求めるステップを更に含む、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
前記単一軸線は、前記対物レンズの光軸である、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
粒子の形態学的特性を求めるためのコンピュータ実装機械であって、
プロセッサと、
ホログラフィック顕微鏡法システムと、
複数の粒子を受け取って該粒子を流すサンプルステージと、
前記プロセッサおよび前記ホログラフィック顕微鏡法システムに作動的に連結された有形的コンピュータ可読媒体とを有し、前記有形的コンピュータ可読媒体は、
前記サンプルステージ内のマイクロフルイディックチャネル内において粒子をレーザビーム中に流通させ、
前記レーザビームおよび前記粒子の干渉パターンを記録し、
レイリー・ゾンマーフェルト解析を利用して三次元明視野を再構成し、
前記三次元明視野をデコンボリューションして前記粒子内の散乱中心を求め、
単一軸線に沿って積分して前記粒子の二次元画像を構成するよう定められたコンピュータコードを含む、コンピュータ実装機械。
【請求項１９】
前記サンプルステージは、カルーセルカートリッジから成る、請求項１８記載の機械。
【請求項２０】
前記マイクロフルイディックチャネルは、５０μｍ×１０００μｍである、請求項１８記載の機械。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
シリコーン油は、タンパク質を主成分とする薬剤中のありふれた汚染物であり、かかる汚染物は、注射器の潤滑、ガスケット、またはバイアル中隔に起因している場合がある。シリコーン液滴は、それ自体特に問題ではないが、タンパク質凝集体として誤って識別される場合があり、かかるタンパク質凝集体は、患者に対するリスクとなるとともに薬物の有効性を低くする場合がある。更に、シリコーンエマルション液滴は、タンパク質凝集を引き起こす場合がある。これらの問題に適切に取り組むためには、タンパク質凝集体をシリコーン油エマルション液滴から識別することができなければならない。考慮すべき他の汚染物は、内因性の場合がありまたは外因性の場合がある。内因性汚染物としては、シリコーン油、気泡、調合薬開発の際に安定化のために添加される賦形剤が挙げられるが、これらには限定されない。外因性汚染物としては、ダスト、ガラスシャード、ゴム粒状物、細菌が挙げられるが、これらには限定されない。
【０００２】
タンパク質凝集体とシリコーン油エマルション液滴（および他の汚染物は以下を有することができる）は、ミクロンスケール範囲内のほぼ同じサイズを有し、したがって、多くの粒子特性評価技術、例えば静的光散乱法、動的光散乱法、光オブスキュレーション、およびクールター計数器では識別することが不可能である。タンパク質凝集体をシリコーン油エマルション液滴から識別するために用いられる２つの技術は、マイクロフロー画像化（microflow imaging：ＭＦＩ）および共鳴質量測定法（resonant mass measurement：ＲＭＭ）である。ＭＦＩは、粒子がマイクロフルイディックチャネルを通って流れているときに粒子を画像化することによって働く。これら画像を用いると、アスペクト比およびコントラストのような特性に基づいて粒子を識別することができる。これは、大きな粒子について良好に働くが、回折に起因して直径が数ミクロンに満たない粒子を識別するのが困難である。ＲＭＭもまた、粒子をマイクロフルイディックチャネル中に流通させるが、各粒子がチャネルを通って流れるときに各粒子の浮遊質量を測定する。かくして、シリコーン油液滴のような正に浮遊性（positively buoyant）の粒子を負に浮遊性（negatively buoyant）のタンパク質凝集体から識別することができるが、ＲＭＭは、５μｍ未満の粒子についてのみ役立つ。加うるに、ＲＭＭは、粒子の１つの特性しか測定しない。
【０００３】
ＭＦＩは、直径が５μｍ未満の粒子についてその感度に関して制限がある。図１６Ｂは、ＭＦＩがホログラフィック顕微鏡法によって計数される粒子数よりも少ないＥＴＦＥ粒子を検出することを示している。これら粒子は、ゴムで作られており、かかる粒子は、タンパク質凝集体について良好なプロキシであるよう設計されている。
【発明の概要】
【０００４】
幾つかの実施形態では、Ｈｕモーメントは、サンプル中の物質の識別のためにホログラフィック顕微鏡法と組み合わせて用いられる。
【０００５】
幾つかの実施形態では、デコンボリューション(deconvolution)と結合された３Ｄレイリー・ゾンマーフェルトを利用し、次にホログラフィック顕微鏡法を用いて測定された単一のホログラムから単一軸線に沿って数値積分を用いて非対称および対称粒子を識別することができる。３Ｄレイリー・ゾンマーフェルト再構成の結果として、検査対象の粒子の３Ｄ画像が得られる。レイリー・ゾンマーフェルト理論を用いると、散乱粒子によって作られる３Ｄ明視野を再構成することができる。３Ｄ明視野(3D light field)から、デコンボリューション法を用いて粒子中の散乱中心の全ての位置を求める。散乱中心は、粒子の３Ｄ構造を構成するために用いられる。単一軸線に沿う積分により、サブビジブル（sub-visible）粒子の明視野について可能であるレベルよりも高い解像度で明視野画像(bright field image)の正確な表示である２Ｄ画像が得られる。
【０００６】
別の実施形態は、粒子の形態学的特性を求める方法に関する。本方法は、サンプルをマイクロフルイディックチャネル中に流通させるステップを含む。レーザビームをサンプルと相互作用させる。レーザビームをサンプルから散乱させて散乱した部分を生じさせる。コリメートされたレーザビームの非散乱部分および散乱部分から干渉パターンを生じさせる。干渉パターンを対物レンズで拡大する。次の分析のために干渉パターンを記録する。散乱関数を利用してホログラムを計算するとともに記録された干渉パターンを計算されたホログラムに当てはめる。当てはめた計算済みホログラムからサンプルの屈折率および半径の推定値を求める。記録された干渉パターンについてＨｕモーメントを求める。
【０００７】
別の実施形態は、粒子の形態学的特性を求めるためのコンピュータ実装機械に関する。本機械は、プロセッサと、ホログラフィック顕微鏡法システムと、複数の粒子を受け取ってこれら粒子を流すサンプルステージと、プロセッサおよびホログラフィック顕微鏡法システムに作動的に連結された有形的コンピュータ可読媒体とを有し、有形的コンピュータ可読媒体は、コンピュータコードを含む。コンピュータコードは、サンプルステージ内のマイクロフルイディックチャネル内において粒子をレーザビームに流通させ、レーザビームおよび粒子の干渉パターンを記録し、レイリー・ゾンマーフェルト解析を利用して三次元明視野を再構成し、三次元明視野をデコンボリューションして粒子内の散乱中心を求め、単一軸線に沿って積分して粒子の二次元画像を構成するよう定められている。
【０００８】
上記発明の概要は、例示に過ぎず、本発明を何らかの仕方で限定しようとするものではない。上述の例示の観点、実施形態、および特徴に加えて、別の観点、別の実施形態、および別の特徴は、以下の図面および詳細な説明を参照すると明らかになろう。
【０００９】
本発明の上記特徴および他の特徴は、添付の図面と関連して以下の説明および特許請求の範囲の記載を考慮すると、より完全に明らかになろう。これら図面が本発明の幾つかの実施形態だけを記載しており、したがって本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではないということを理解して、本発明を添付の図面の使用により追加の特殊性および細部を備えた状態で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】タンパク質凝集体のモニタに利用されるホログラフィック顕微鏡法特性評価（holographic microscopy characterization “ＨＭＣ”）の原理の一実施形態を示す図であり、マイクロフルイディックチャネルに沿って流下するコロイド粒子のホログラフィック画像を光散乱のローレンツ・ミー理論の予測と比較して各粒子の直径ｄpおよび屈折率ｎpを得る手法を示し、散布図中の各点が音波処理によって凝集されるヒトのＩｇＧの典型的なサンプルから得られる単一粒子の特性を表わしており、グレースケール画像として示された測定されるとともにコンピュータ計算されたホログラムが指示した特定のデータ点に対応し、色が測定値の相対密度ｐ（ｄp，ｎp）を示し、ピークがｄp＝２．７μｍおよびｎp＝１．３３９のところにある状態を示す図である。
【図１Ｂ】ＨＭＣ器具を示す図である。
【図２Ａ】２種類のタンパク質凝集体のうちの一方についてのホログラフィック特性評価データを示すとともにトリス緩衝液中のポリ（アリルアミンヒドロクロリド）（ＰＡＨ）と複合体を形成したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を示す図である。
【図２Ｂ】２種類のタンパク質凝集体のうちのもう１つに関するホログラフィック特性評価データを示すとともに０．１モルＮａＣｌと凝集されたウシのインシュリンを示す図である。
【図３Ａ−Ｃ】トータル・ホログラフィック・キャラクタリゼーション法（Total Holographic Characterization）によるシリコーン油液滴からのタンパク質凝集体の分別法を示す図であり、図３Ａは、ヒトのＩｇＧの凝集体の特性の分布状態を示す図、図３Ｂは、水中のシリコーン油液滴の特性の分布状態を示す図、図３Ｃは、ＩｇＧ凝集体と油液滴の混合物の特性を示し、２つの亜群に分かれていることが明確にしめされている図である。
【図４Ａ−Ｃ】オキシトシンの凝集体に対するｐＨの影響を示す図であり、図４Ａは、オキシトシンがｐＨ２では測定可能なほど凝集していない状態を示す図、図４Ｂは、ｐＨを９まで増大させた影響が凝集を引き起こす状態を示す図であり、強度バーが測定値ｐ（ｄp，ｎp）の相対密度を示しており、図４Ｃは、ｐＨの関数としてオキシトシン凝集体の数を示す図であり、ｐＨの増大につれて着実な増加を示す図である。
【図５Ａ−Ｄ】ヒトのＩｇＧおよびオキシトシンの凝集に対する音波処理の影響を示す図であり、図５Ａは、音波処理の前におけるヒトのＩｇＧの結果を示す図、図５Ｂは、音波処理の前におけるオキシトシンに関する結果を示す図、図５Ｃは、１時間にわたる音波処理後におけるヒトのＩｇＧに関する結果を示す図、図５Ｄは、１時間にわたる音波処理後におけるオキシトシンに関する結果を示す図であり、両方の場合において、音波処理が小さくかつ高密度の凝集体の生成を促進する状態を示す図であって、データ点が測定値の密度によって着色され、明るい色が高い密度を表わしている図である。
【図６】粒子を測定するための器材の一実施形態を示す図である。
【図７】図６の器材に用いられるマイクロフルイディックチップの一実施形態を示す図である。
【図８】迅速な分析のための多サンプルカルーセルカートリッジの一実施形態を示す図である。
【図９】焦平面の上方の高さｚの関数としてマイクロフルイディックチャネル沿いに下っているコロイド粒子の測定速度ｖ（ｚ）を示す図であり、データが高さ５０μｍで１つのチャネルについて、そして１００μｍの高さでもう１つのチャネルについて示されており、圧力駆動式チャネル流に関する予想放物線状プロフィールが明確に示されている図である。
【図１０Ａ−Ｃ】フラクタルコロイド凝集体のホログラフィック特性評価を示す図であり、図１０Ａは、単分散ポリスチレン球で構成されたモデルフラクタル凝集体の有効半径ａ*pおよび有効屈折率ｎ*pの分布状態を示す図、図１０Ｂは、凝集体のこの母集団のフラクタル構造を強調するためにスケール変更し直された同一のデータを示す図であって、傾斜線がフラクタル寸法Ｄ＝１．７について有効球モデルの予想を表わす図、図１０Ｃは、典型的な凝集体の走査型電子顕微鏡画像を示す図であり、スケールバーが１μｍである図である。
【図１１Ａ−Ｂ】ゼロの一次Ｈｕモーメント（図１１Ａ）および非ゼロの一次Ｈｕモーメント（図１１Ｂ）を生じさせる形状の表示を示し、Ｈｕモーメントは、回転、スケールおよび並進に関して不変量であり、ゼロ次Ｈｕモーメントがスケール変更された慣性モーメントを表わし、一次Ｈｕモーメントが画像の円対称性に関連付けられ、非球状タンパク質凝集体が非ゼロの一次Ｈｕモーメントを有するべきであることを示す図である。
【図１２】球対称性のシリコーン油液滴および非対称タンパク質凝集体について測定されたホログラムの２値画像の比較を示す図である。
【図１３】シリコーン油液滴およびタンパク質凝集体からのデータのオーバーラップが存在するシリコーン油液滴とタンパク質凝集体の混合物から成るサンプルについての屈折率（ｎ）とサイズ（ｄ）の関係を表わすプロット図であり、ＨＭＣを用いて求められるサイズおよび屈折率がオーバーラップ領域において２つの種を識別するのに不十分であることを示すとともにプロット中の点の色がホログラムの一次Ｈｕモーメントの大きさを表わし、青色の点がゼロに近いまたはゼロに等しい一次Ｈｕモーメントを有するホログラムで粒子を表わし、橙色および黄色の点がゼロよりも大きい一次Ｈｕモーメントを有するホログラムで粒子を表わしている図である。
【図１４】ヒトのＩｇＧのサンプルについて屈折率（ｎ）とサイズ（ｄ）の関係を表わすプロット図であり、２つの点に関し、粒子のホログラムならびに粒子の二次元画像のホログラフィック流画像化再構成が示されており、小径であって屈折率の高い粒子の画像がより対称性の高い粒子を示し、大径の屈折率の低い粒子の画像が非対称性の高い粒子の構造に関して相当な細部を表わしている図である。
【図１５Ａ】ホログラフィック流画像化再構成から数個のホログラムおよび二次元画像を示す図であり、シリコーン油エマルション液滴のサンプルからのデータを示し、このパネルにおいて、頂部画像がＨＭＣを用いて測定されたホログラムであり、各ホログラムの真下にホログラフィック流画像化（“ＨＦＩ”）を用いてホログラムから再構成された二次元画像が位置し、ＨＦＩ画像の下には、各画像に関して一次Ｈｕモーメントが存在している状態を示す図である。
【図１５Ｂ】ホログラフィック流画像化再構成から数個のホログラムおよび二次元画像を示す図であり、ＩｇＧタンパク質凝集体のサンプルからのデータを記載し、この場合もまた、このパネル中の頂部の画像がＨＭＣを用いて測定されたホログラムであり、各ホログラムの真下にはホログラフィック流画像化を用いて再構成された二次元画像が存在し、ＨＦＩ画像の下には一次Ｈｕモーメントが存在している状態を示す図である。
【図１６Ａ】ＨＭＣを用いて１０3〜１０7粒子個数／ｍＬの濃度で１．５μｍポリスチレンビーズに関する正確な濃度測定を実証するプロット図である。
【図１６Ｂ】ＥＴＦＥで構成されたＮＩＳＴによって開発されたモデルタンパク質凝集体のＭＦＩとＨＭＣ濃度測定値の比較を示す図、ＮＩＳＴモデル粒子がタンパク質凝集体の粒径分布をシミュレートしているサイズ範囲であり、プロットが１〜２μｍ、２〜４μｍ、４〜８μｍおよび８〜１２μｍの瓶の中の粒子のサイズの関数として濃度を表わしており、ＭＦＩおよびＨＭＣ濃度測定値が５μｍを超える粒子について一致している状態を示す図、５μｍ未満のサイズに関し、ＨＭＣがより敏感であり、ＭＦＩよりも多くの粒子を検出することができる状態を示す図である。
【図１７】ＨＦＩ画像を生じさせる一方法を示す図である。
【図１８】２つのホログラムおよびこれらのＨＦＩ画像を示す図であり、左側にはシリコーン油エマルション液滴を示すとともに右側には非球状タンパク質凝集体を示す図である。
【図１９】ある特定の具体化例に用いられるコンピュータシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の詳細な説明において、添付の図面を参照し、かかる添付の図面は、本明細書の一部をなしている。図中、別段の指定がなければ、類似の記号は、代表的には、類似のコンポーネントを示している。詳細な説明、および特許請求の範囲に記載された例示の実施形態は、本発明を限定するものではない。本明細書において提供されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の実施形態を利用することができ、しかも他の変更を行うことができる。容易に理解されるように、一般に本明細書において説明されるとともに図面に示されている本発明の観点を多種多様な形態で配置し、置換し、組み合わせ、そして設計することができ、これら形態の全ては、明示的に想定されるとともに本発明の一部をなしている。
【００１２】
ホログラフィック顕微鏡法による特性評価（ＨＭＣ）は、タンパク質凝集体およびシリコーン油液滴をＭＦＩよりも小さなサイズまで識別することができ、そしてこのＨＭＣは、ＲＭＭよりも多くの情報を戻す。ＨＭＣは、さらに、２０１４年７月発行の米国特許第８，７９１，９８５号明細書（発明の名称：Tracking and Characterizing Particles with Holographic Video microscopy）、２０１４年７月発行の米国特許第８，７６６，１６９号明細書（発明の名称：Sorting Colloidal Particles into Multiple Channels with Optical Forces: Prismatic Optical Fractionation）、２０１３年４月発行の米国特許第８，４３１，８８４号明細書（発明の名称：Holographic Microfabrication and Characterization System for Soft Matter and Biological Systems）、２０１２年１２月発行の米国特許第８，３３１，０１９号明細書（発明の名称：Holographic Microscopy of Holographically Trapped Three-Dimensional Nanorod Structures）、および２０１０年１１月発行のエス・エイチ・リー（S. H. Lee）、ディー・ジー・グリエル（D. G. Grier ）名義の米国特許第７，８３９，５５１号明細書（発明の名称：Holographic microscopy of Holographically Trapped Three-Dimensional Structures）に記載されており、これら米国特許の各々を参照により引用し、その記載内容を本明細書の一部とする。
【００１３】
ＨＭＣは、一般的に言って、粒子をマイクロフルイディックチャネル沿いに流下させてコヒーレント照明で照明することによって働く。図１Ｂは、ＨＭＣについてのセットアップの一実施形態を示している。コリメートされたレーザビームからの光は、マイクロフルイディックチャネル内のサンプルを照明する。照明された粒子は、この光のうちの何割かを顕微鏡の焦平面に散乱させ、この焦平面において、この光は、ビームの残部と干渉する。顕微鏡は、結果的に生じた干渉パターンを拡大するとともにこれをビデオカメラのセンサに投影し、ビデオカメラは、その強度を記録する。多数の粒子がビデオの同一「フレーム」内にホログラムを生じさせることができる。散乱光は、粒子に関する詳細な情報を含むホログラムを形成する。ホログラムをローレンツ・ミー（Lorenz-Mie）理論で解析して粒子のサイズおよび屈折率を得ることができる。屈折率は、たとえ粒子が同一サイズを有している場合であっても粒子を識別するために使用できる粒子の組成に関する情報を与える。正確なローレンツ・ミー理論の利用により、ＨＭＣは、ＭＦＩよりも小さなサイズまで正確な結果を得ることができる。ＨＭＣは、ＲＭＭによる浮遊質量測定だけと比較して多数の測定次元、各粒子のサイズ、屈折率、および３Ｄ位置を有する。
【００１４】
コロイド球のホログラム、例えば図１の実施例は、同心の明色および暗色の円形リングの形態を取る。不規則な形状の物体、例えばタンパク質凝集体は、半径方向対称性の小さいホログラムを生じさせる。不規則性の程度は、中心が各自動的に検出される特徴部の上に位置するホログラフィック画像のＨｕモーメント不変量をコンピュータ計算することによって定量化できる。関連モーメントは、対称パターンに関してはゼロに近い値を有し、非対称性の極めて強い特徴部については１に近づく。これらモーメントは、タンパク質凝集体を他の特徴、例えばサイズおよび屈折率とは無関係である対称性の高い物体、例えばシリコーン油液滴から識別するために使用されるべきである。
【００１５】
所与の粒子についてホログラフ的に測定されたサイズ、屈折率および画像モーメントの組み合わせを分類体系に対する入力として使用でき、分類体系は、物体をタンパク質凝集体、シリコーン油液滴または他の何らかの汚染物、例えば細菌、ガラスシャードまたは僅かな量のゴムとして識別する。この分類は、懸濁状態にある互いに異なる種の濃度を評価するのに有用であろう。
【００１６】
ホログラムのモーメント解析は、本来的に、下に位置する粒子の形態学的特性を計測するわけではない。しかしながら、これら計測法を形態学的特性に相関させることができるということは可能性が多分にある。近年、不規則に分岐した凝集体のホログラフィック特性評価によって得られた屈折率を有効媒質理論で解釈することができ、それにより凝集体のフラクタル寸法を推定し、したがってこれらの形態学的特性を評価することができるということが実証された。
【００１７】
図１０Ａのデータは、拡散律則クラスタ凝集（diffusion-limited cluster aggregation ：ＤＬＣＡ）により作られたポリスチレンナノスフェアのフラクタルクラスタについて得られた。代表的な凝集体の走査電子顕微鏡写真図が挿絵に示されている。これら不規則な形状の凝集体は、有効球近似下で高速ローレンツ・ミー解析により解析された。これら当てはめから得られた半径ａ*pおよび屈折率ｎ*pは、フラクタル凝集体とその枝部相互間の細孔を満たす低屈折率媒質の両方を包囲した有効球を特性評価するために解釈される。
【００１８】
フラクタル凝集体に関する特性評価データは、一貫して、下方に傾斜した曲線に沿って下がっており、この下方に傾斜した曲線もまた、タンパク質凝集体について観察される。すると、スケールが不変のフラクタルに関する有効球モデルは、有効屈折率が次式、すなわち、
ｌｎＬ（ｎ*ｐ）＝（Ｄ−３）ｌｎ（ａ*ｐ／ａ0）＋ｌｎＬ（ｎ0）
にしたがって見かけのサイズとともにスケール変更することを予測する。
【００１９】
上式において、Ｌ（ｎ）＝（ｎ2−ｎ2ｍ）／（ｎ2＋２ｎ2ｍ）は、屈折率ｎmの媒質中の屈折率ｎの物体に関するローレンツ・ローレンス係数であり、ここで、ａ0およびｎ0は、それぞれ、成分モノマー粒子の半径および屈折率である。図１０において解析された凝集体は、ａ0＝８０ｎｍ、ｎ0＝１．５９を有している。
【００２０】
このスケール変更予測に従ってスケール変更し直すと、図１０Ａからの特性評価データは、勾配がクラスタの特有のフラクタル寸法Ｄを生じさせる直線に沿って下がるはずである。図１０Ｂに示されている結果は、フラクタル寸法Ｄ＝１．７５を生じさせ、これは、ＤＬＣＡについて予期される。
【００２１】
同じ解析をＢＳＡ、ＢＩ、ＩｇＧおよびオキシトシンに関してデータに利用することにより、４つ全ての形式のタンパク質凝集体がフラクタルであるが、フラクタル寸法がかなり異なるということが示唆される。
【００２２】
ＢＳＡ‐ＰＡＨ錯体は、首尾一貫して、Ｄ＝１．１±０．１のフラクタル寸法を有し、このことは、これらが分岐のほとんどないほぼ直線の凝集体であることが示唆する。ウシインシュリンは、首尾一貫して、高いフラクタル寸法Ｄ＝１．５±０．１を表示し、これは、分岐の程度が高いことを示唆している。ＩｇＧについて得られたフラクタル寸法Ｄ＝１．７±０．１は、ポリスチレン凝集体のフラクタル寸法とほぼ同じぐらい大きく、かかるフラクタル寸法は、これらタンパク質クラスタもまた、拡散律則クラスタ凝集により成長したことを示唆している。
【００２３】
規則的ではない粒子を規則的な粒子と混合した状態で標準のホログラフィック顕微鏡法を利用した技術を用いると、代表的には、千当たりの部（part-per-thousand）で表わされた精度および正確度を有する個々の凝集体または汚染物粒子のサイズ、屈折率および多孔度をもたらす。これらのデータを用いて粒子を計数して区別することにより１０3粒子数／ｍＬ〜１０7粒子数／ｍＬの濃度について正確な濃度値が得られる。しかしながら、本実施形態は、この性能を形態学的情報に拡張する。
【００２４】
図６は、ホログラフィック特性評価機器の一実施形態を示す。図６の機器は、マイクロフルイディックチップを利用する。マイクロフルイディックチップの一実施形態を図７に示す。サンプル量を多めにすると、特に現実の不均一サンプルにおいて共鳴質量測定法を混乱させる可能性がある目詰まりおよび汚れの問題が大幅に排除される。大型の共鳴質量測定サンプルセルは、一般的には１０μｍ×１０μｍ未満のチャネルを有するのに対し、一実施形態において、サンプルマイクロフルイディックチップ用に５０μｍ×１０００μｍのチャネルを有する。分析にあたり、サンプルのアリコート１００μＬを左側のリザーバにピペッティングし、次いで機器のサンプル取付台にチップを固定する。リザーバの端のポートを真空にすることによって、マイクロフルイディックチャネルを通じてオンチップ廃液リザーバにサンプルを移動させる。機器の一実施形態は、機器にチップを挿入することによって取り付けられる真空マニホルドを連結することを特徴とする。サンプルはチップから離れないため、交差汚染の可能性は最小限となる。
【００２５】
既存のＨＭＣ機器は、各使い捨てマイクロフルイディックチップを交換するための専門家を必要とし、一般に、手作業である。しかしながら、図８に、迅速な自動サンプル特性評価のための一実施形態を示す。この使い捨てマルチサンプル（一実施形態において２４個のサンプル）カルーセルカートリッジは、放射状に配置されたマイクロフルイディックチャネルを用いる。サンプルを端部近傍のリザーバに充填し、測定用の位置まで回転させる。
【００２６】
一実施形態において、カートリッジは、標準的なコンパクトディスクと同様な寸法を有するため、消費者用途のための、実績のある費用対効果が高い技術を用いて管理・操作できる。回転タレットは、ベータ機器におけるシングルスライドサンプル取付台に取って代わるだろう。標準的な移動機構を用いて、ディスクをタレットに挿入し、処分のために除去する。
【００２７】
ディスクのリザーバは、ロボットサンプルディスペンサにアクセス可能である。カルーセルにおける各リザーバから、図８の、単一サンプルチャネルに類似するマイクロフルイディックチャネルに注入する。この機器の真空マニホルドは、ディスク中央付近の真空ポートに連結しており、一度に１つのサンプルを測定体積まで吸い込む。例えば、一実施形態において、同じ長方形スライド上に複数のパラレルトラックを用いることができる。さらに、他の選択肢としては、単一サンプルを保持する個々のマイクロフルイディックチップの反復ローディングがある。いずれの場合にも、サンプルは、サンプルリザーバからサンプル観察領域を通して吸い込まれる。別の実施形態は、光軸が水平であり、リザーバを観察領域の上にして、サンプルが、水平配置と同様に観察領域を通じて引っ張られるか、または重力単独の力で縦方向に流れるように、９０°回転で顕微鏡を位置決めすることによって顕微鏡光学素子の典型的な位置を変えることである。
【００２８】
図１０は、２つのマイクロフルイディックチャネル（全高は１つが５０μｍであり、もう１つは１００μｍである）において測定された、高さｚの関数としてのコロイド粒子速度ｖ（ｚ）の依存性を示す。どちらの測定も同じシステムで実施した。粒子追跡データは、粒子の特性評価を行うために用いられた同じホログラフィック適合から得られた。粒子はマイクロフルイディックチャネルにおいて流体の速度場のトレーサとして機能し、したがって圧力で駆動されるポアズイユ流れに特徴的な放物線状プロフィールを描く。異なる流れ条件下では異なる剪断力が生じる。剪断力は、ＨＣを用いて得られる速度プロフィールから決定することができる。
【００２９】
図１０に示したような不均一な流れは、タンパク質を変形し、それどころか変性させる場合のある剪断力をかける。剪断量は、歪み速度（у＝ｄｖ／ｄｚ）によって定量化される。タンパク質によっては、у＝１００ｓ-1というような低歪み速度でも剪断誘起変化の徴候を示すものがある。かくして、ホログラフィック特性評価に関する特定の実施形態は、測定前に誘起される剪断力によるタンパク質分布の変化を示す。その他は、１０5ｓ-1を超える歪み速度でも安定であると考えられる。歪み誘起変形は公知の生物学的機能を有し、幾つかの病態に関係している。流れ誘起剪断力の機能的影響は、バイオ医薬品の毛細血管送達に明らかな関連性を有する。それらはまた、本明細書に記載の方法によって得られる結果に影響してもよい。
【００３０】
剪断力は、個々のタンパク質を変形させることによって、そして粒子間衝突の速度および力を増加させることによっても、タンパク質の凝集を促進することができる。逆に、剪断力はタンパク質凝集体を変形させることができ、さらにはそれらを脱凝集させることもできる。これらの要素は、懸濁液中のタンパク質凝集体の濃度、粒度分布および見かけの形態学的特性を変化させることができる可能性がある。これらの変化は、超音波処理によって剪断力を生じさせた、図５のホログラフィック特性評価データにおいて明らかである。
【００３１】
マイクロフルイディックチャネルの特定の実施形態において、生じる最大歪み速度は、チャネル高さＨおよび中立面流速ｖ0（＃・＝４ｖ0／Ｈ）に左右される。５０μｍ〜１００μｍの範囲の計画されたチャネル高さでは、剪断力は、特に１ｍｍｓ-1を実質的に上回る流速では、観察される凝集挙動に影響を与えると考えられる。
【００３２】
モデル系には、コロイド粒子で構成される、タンパク質凝集体の標準セットおよび、良好に特性評価されているフラクタル凝集体が含まれる。したがって、一実施形態において、ホログラフィック特性評価（holographic characterization：ＨＣ）は、ホログラフィック特性評価データの恩恵を受ける活発な研究領域である、タンパク質懸濁液における剪断誘起変形を分析するための強力なツールとして用いることができる。同時に、このモデル系によって、信頼性および再現性を損なうことなく測定速度を最適化するための、ＨＣの操作パラメータの範囲が確定される。
【００３３】
上記のように、従来のホログラフィック顕微鏡分析に問題を生じる、不規則形状を示し、フラクタル形状さえも示す多くの粒子が存在する。一実施形態において、ＨＭＣはさらに、タンパク質凝集体のような不規則物質などの非球状粒子と、規則形状を持つ汚染物質、例えば、限定するものではないが、シリコーン油、気泡および、球に近い対称性を有する他の汚染物質などの球に近い粒子とを区別する能力を提供することができる。一実施形態において、Ｈｕモーメント分析は、システムが球形種と非球形種との自動判別を提供することができるように、客観的かつ定量的な比較を提供する。他の実施形態において、方法およびシステムは、異なる３Ｄ幾何学形状を有する特定の構造を特定するためにＨｕモーメント分析を利用することができる。Ｈｕモーメントは、球形および非球形という範囲を超えた、異なる幾何学形状のこれらの種類の判別を提供してもよい。Ｈｕモーメントの量の大きさは、各用途に特有であり、関与する形状に左右される。加えてこの分析は、水質測定、化学機械研磨スラリーまたは、ナノロッドのような、特定のナノ構造を含むナノ粒子サンプルなどのあらゆる種類のサンプルにおける種々の汚染物質の特定など、タンパク質の範囲を超えた他の分野で用いることができる。ＨＭＣは、粒子ホログラムの画像解析によってこの識別を行う。本明細書においては、タンパク質凝集体の例示の実施形態を不規則物質（すなわち所望の物質、製品など）と呼び、シリコーン油エマルション液滴を規則物質（すなわち混入物質）と呼ぶ。
【００３４】
シリコーン油エマルション液滴は円形になる傾向があり、したがって円対称ホログラムを示す傾向がある。これとは対照的に、タンパク質凝集体は、分岐構造またはフィラメント状構造を有することができる。これらの構造上の違いは、ホログラムにおいて違いをもたらし、それはこれら２つのタイプの粒子の区別に用いることができる。これは、同じ粒度および屈折率を有する、タンパク質凝集体とシリコーン油エマルション液滴とを区別することを可能にするために重要である。大部分のタンパク質凝集体はシリコーン油とは異なる屈折率を有するが、これらの分布にはオーバーラップが存在しうる。例えば超音波処理したヒトＩｇＧタンパク質は、シリコーン油と同じおよそ１．４１の屈折率を有する、１μｍよりわずかに小さいタンパク質凝集体を少量含む。したがって、屈折率は信頼できず、これらの粒子を区別するためには、ホログラム間の違いを用いる別途分析が必要である。
【００３５】
一実施形態において、ＨＭＣのためのシステムおよび方法は、２つを区別するために、タンパク質凝集体およびシリコーン油エマルション液滴のホログラム間の重要な違いを利用する。
【００３６】
最大有意差は、画像モーメントにおいて現れる。画像モーメントは、画像の全体にわたって強度の分布を記述する、典型的には特定の加重平均の画像についての要約統計量である。幾つかの実施形態において、並進、スケールおよび回転に関する不変量が構築され、利用される。いわゆる「Ｈｕモーメント」（またはＨｕ不変量モーメント、またはＨｕ不変量）は、回転、並進およびスケールの不変性を有し、したがって、粒子がマイクロフルイディックチャネルを通って流れるとき、異なる粒度および向きが表示されるホログラムを記述するために適している。特に、一次Ｈｕモーメントは、不規則粒子（タンパク質凝集体）および規則粒子（シリコーン油滴）間で異なる。一次Ｈｕモーメントは、完全な円対称のホログラムではゼロであり、したがってシリコーン油滴では非常に小さいが、対称性がより低いタンパク質凝集体では大きくなる傾向がある。（ＨＭＣを用いて）検出された各特徴のＨｕモーメントを計算することによって、関連するモーメントを計算し、例えばシリコーン油滴およびタンパク質を特定するなど、特徴および対応する粒子を特定するために用いることができる。
【００３７】
Ｈｕモーメントの識別能力を最大化するために、ホログラムを最初に２値画像に変換することができる。２値画像はコントラストを著しく向上させ、形状の特定を容易にする。
【００３８】
２値画像を作成するためのロバストなしきい値決定によって、ホログラムの代表的な画像が最適化される。しきい値が低すぎる場合、細部が失われ、画像は主として白色に表示される。同様に、しきい値が高すぎる場合、画像は主として黒色となり、やはり詳細が失われる。
【００３９】
バイラテラルフィルタは、ホログラムを平滑化し、少数の極端なピクセルが結果を偏らせる危険性を低減するために用いることができる。平滑化の後、その最大値に比例して、ホログラムのためのしきい値が決定される。
【００４０】
２値画像において、ノイズは偽の形状情報を生み出す可能性がある。これらのアーチファクトを除くかまたは減少させるために、画像加工中にダイレーションおよびエロージョンが用いられる。エロージョンステップにおいては、任意の孤立した白ピクセルの周りの所定数の白ピクセルが除かれる。ダイレーション中には、任意の孤立した白ピクセルの周りに白ピクセルのエッジが加えられる。画像における非常に小さい孤立した白ピクセルはエロージョンステップにおいて完全に除かれるが、大きな形状のものは平滑化エッジで修復される。
【００４１】
他の重要でより影響を受けやすい量は、画像の中心付近の方位角標準偏差または画像強度変動である。幾つかの実施形態において、方位角標準偏差または画像強度変動が考慮される。シリコーンおよびタンパク質物質の場合は、この量はタンパク質凝集体よりもシリコーン油の方がはるかに小さいが、この量は、画像におけるノイズレベルに影響を受けやすい。ホログラムの特徴を特定するために、そして最終的にサンプルの粒子を特定するために、Ｈｕモーメントおよび方位角標準偏差を単独または組み合わせで用いてもよい。
【００４２】
他の実施形態において、粒子を区別するために、ＨＭＣによって与えられる多次元粒度および屈折率分布を用いるデコンボルーション法が利用される。シリコーン油エマルション液滴は、シリコーン油のバルク屈折率と同等の屈折率を有する。これとは対照的に、タンパク質凝集体は、凝集体の粒度に依存する屈折率を有する。より大きなタンパク質凝集体は、それらの分岐構造が液状媒体で満たされるため、有効屈折率が低下する。測定される屈折率は、タンパク質凝集体の流体およびタンパク質の混合物の有効屈折率であり、これはマクスウェル・ガーネット理論（Maxwell Garnett theory）に記述されている。これらの粒度分布および屈折率分布の互いに異なる形状は、それらがオーバーラップする場合でも、分離することができる。したがって、一実施形態において、それらが混在する場合にデコンボルーションが可能になるように、各分布を別々に記述することができる。
【００４３】
全ホログラフィック特性評価は、実証済みの粒子特性評価技術以上の利点を提供する。これは、本質的に自動較正され、入力としてイメージングレーザーの波長、媒体の屈折率および光学倍率のみを必要とする。そのワークフローは自動化されており、訓練された人材によるサンプル調製を必要とするコールターカウンターおよび蛍光顕微鏡法などの技術とは対照的である。ホログラフィック特性評価は、光学顕微鏡検査、光遮蔽法およびマイクロフローイメージングなどの粒子解像イメージング技術よりも優れた粒径分解能を提供する。一実施形態において、粒子はナノメートル以下で解像することができる。動的光散乱（dynamic light scattering：ＤＬＳ）などのバルク特性評価技術とは異なり、全ホログラフィック特性評価は、不均質な多分散系のサンプルをシームレスに処理し、濃度に依存しない一貫性のある結果をもたらす。汚染物質と凝集体とを区別する際に、全ホログラフィック特性評価は、浮揚性のある塊の兆候によってのみ汚染物質を区別することができる共鳴質量測定法（ＲＭＭ）技術以上の普遍的な利点を有する。全ホログラフィック特性評価の高解像度三次元追跡能力は、個々の物体の流体力学的サイズの補足的測定を提供するナノ粒子追跡分析（nanoparticle tracking analysis：ＮＴＡ）に用いることもできる。
【００４４】
系の内容物を監視し、不規則粒子と規則粒子とを区別する能力は、多くの有用な用途を提供する。図４および図５は、ｐＨの変化および超音波処理によって誘起されるタンパク質の凝集の傾向を監視する全ホログラフィック特性評価の能力を示す。図４に提示した代表的なデータは、オキシトシンの凝集へのｐＨの影響を示す。ｐＨ２．０（図４Ａ）からＰｈ９．０（図４Ｂ）に増加させることによって、肉眼で見えない凝集体は１時間後に１０倍に増加する。この傾向は図４Ｃにまとめられている。これらの実験において、凝集体の数はｐＨによって実質的に変化するが、平均凝集体の粒度ならびに、粒度および屈折率の分布の形状は一定のままである。したがって、ｐＨの変化は、成長形態に大きく影響せずに、この系における凝集速度を変化させると思われる。
【００４５】
図５は、超音波処理が、タンパク質の凝集に質的に異なる影響を与えることを明らかにしている。図５Ａおよび図５Ｂのデータはそれぞれ、凝集を促す条件下で調製したヒトＩｇＧおよびオキシトシンの溶液のホログラフィック特性評価の結果を示す。検出された凝集体は、開放分岐型構造に特徴的な１０μｍに及ぶ直径および低屈折率を有している。次いで、これらのサンプルの各々を標準的な水浴超音波処理装置中で超音波による１時間の機械的撹拌にさらした。いずれの場合も、超音波処理は最大の凝集体を破壊し、かわりに、実質的により高い屈折率を有するより小さい直径のクラスタ集団を促進するように思われた。ヒトＩｇＧについての結果を図５Ｃに示し、オキシトシンについての結果を図５Ｄに示す。屈折率は密度の代用となるため、超音波処理したサンプル中のタンパク質凝集体はよりコンパクトであると考えられる。これらの密度の高い物体は、もとはより大きな開放性凝集体に結合しており、単に超音波処理によって分離しただけである可能性がある。超音波処理が、既存の開放性凝集体を密度の高い構造に再構成する可能性もある。これによって、超音波処理後のオキシトシンにおける小さく密度の高い物体の数の増加を良好に説明することができる。
【００４６】
迅速なサンプル分析のための最適な流速を設定する際に、一実施形態は、ホログラフィック特性評価の測定精度および正確さに影響するカメラの露出時間を利用する。カメラの露出時間中に粒子が実質的に動く場合、コロイド粒子のホログラフィック画像はぶれる。一方、モーションブラーはホログラフィック特性評価の結果に影響しうる。ぶれおよびその関連するアーチファクトは、カメラの露出時間を短くすることによって最小限にすることができる。しかしながら、短い露出時間では信号対雑音比が低くなるため、精度が低下する。流速が高ければ、低い流速では流れから沈降する可能性がある、より高い密度の粒子の測定が可能になる。一実施形態において、ＨＣ測定は、流入量６ｍｍ／秒のサンプル線流速で行われる。一実施形態において、少なくとも６ｍｍ／秒およびカメラ露出時間０．０５ミリ秒で行われる。
【００４７】
全ホログラフィック特性評価から得られる三次元追跡データは、観察体積内で粒子の位置を見つけ、連続ビデオフレーム内でその粒子を特定するために用いることができる。得られた粒子位置のシーケンスは、連結して単一粒子の軌跡を得ることができる。観察体積内の粒子の軌跡上の各点は、粒子のサイズおよび屈折率の独立した推定値と関連付けられている。これらは、正確さおよび精度を改善するために組み合わせることができる。この提案で示したすべての特性評価データは追跡を用いて得られた。
【００４８】
粒子追跡はまた、たとえ粒子が互いに不明確になるほど近くを通過する場合であっても、観察体積を通過するすべての粒子を確実に検出し分析することに役立つ。たとえ粒子をその移動中に個々に特定することができなくても、追跡アルゴリズムは、衝突を特定し、補正することができる。追跡は、正確な濃度測定に必要となる、正確な粒子数測定を行うために必須である。しかしながら、流速を上げることによって、観察体積内に各粒子が存在する時間が減少する。多数のビデオフレームによる各粒子の追跡には、カメラのフレームレートを増加させる必要があり、それにより機器の製造コストが増加する可能性がある。
【００４９】
一実施形態において、ホログラフィック特性評価の迅速化に関して予測される問題を、ホログラフィック顕微鏡の倍率を下げ、それによって視野を広げることによって軽減してもよい。粒子は、より大きなこの観察体積を通過するためにより多くの時間を使い、したがってより多くのフレームで記録され、より高いフレームレートで記録するという必要条件が緩和される。より大きな横寸法は、測定時間中に観察し、特性評価する粒子数をさらに増加させる。倍率の低下はまた、機器の製造コストを低下させる。
【００５０】
しかしながら、倍率の低い対物レンズへの切り替えにおける難題は、記録されるホログラムの空間分解能の低下である。より小さなホログラムは、より迅速に解析することができるが、空間分解能が損なわれると、ローレンツ・ミー散乱理論（Lorenz-Mie scattering theory）における数値適合の信頼性が低下する可能性がある。低倍率のレンズもまた、開口数を低下させる傾向があり、これはさらにホログラムをぶれさせ、分析を妨げる可能性がある。一実施形態において、正確さを維持しながら、分析速度を上げ、機器のコストを下げるために、対物レンズの倍率を例えば１００倍から４０倍に低下させる。
【００５１】
ＨＭＣに関する前述のホログラムおよび技術は、ともに有用なデータを提供し、視覚像、すなわちホログラムを提供するが、より見慣れた、一般人の既知の経験によく類似する視覚像を得ることが望まれる。したがって、一実施形態において、ホログラムを用いた明視野表示であるホログラフィック流画像が基本的に作成される。例えば図１４に見られるようなこれらのホログラフィック流画像は、大部分の一般人が見慣れた明視野写真に類似した性質のものである。図１５Ａおよび図１５Ｂは、シリコーン液滴（１５Ａ）およびタンパク質凝集体粒子（１５Ｂ）のＨＦＩ画像間で比較した場合の、より容易に識別できる違いを明らかにしている。
【００５２】
幾つかの実施形態において、粒子の明視野表示を行うために、１つまたは複数のホログラムが用いられる。図１７は、一実施形態を示したものであり、特性決定をもたらすＨＭＣ間の相互作用（一括してステップ１７１０）および、ＨＦＩを作成し（１７５０）、Ｈｕモーメントにより粒子形態学的特性を識別する（１７３０）プロセスを説明している。レイリー・ゾンマーフェルト理論（Rayleigh-Sommerfeld theory）は、ＨＭＣ（１７１０）によって捕捉されたホログラムから、散乱粒子によって生成される３Ｄ光照射野を再構成（１７５１）するために用いることができる。３Ｄ光照射野から、デコンボルーション法（１７５２）を用いて、粒子内の散乱中心のすべての位置が決定される。散乱中心は、粒子の３Ｄ構造の構築に用いられる。光軸に沿った数値積分法によって、明視野像の正確な表示である２Ｄ画像が作成される（１７５３）。図１８において、一番上の列に、２つの異なる形状を有する粒子を表す２つのホログラムがある。２列目に示した３Ｄ構造を決定するために、Ｒ‐Ｓ再構成およびデコンボルーションが用いられる。光軸に沿って積分することにより、一番下の列に示した２Ｄ  ＨＦＩ画像が得られる。３Ｄ構造の任意の他の軸に沿って積分しても、ＨＦＩ画像を計算することができる。光軸に沿った積分が、明視野観察によって取得されるデータと最も類似している。
【００５３】
デコンボルーションを用いる３Ｄ再構成と、それに続く１つの軸に沿った積分によって、肉眼で見えない粒子についての従来の明視野像よりも高解像度の画像が得られる。一実施形態において、ホログラフィック特性評価は、開口数が高く被写界深度が浅いイメージング光学素子を用いる。しかしながら、ＨＣは粒子のホログラムを測定するが、それは粒子が焦点面に存在することを必要としない。実際、高解像度を維持しながら、焦点面から大きな距離にわたって位置する粒子が測定される。実際に、粒子が焦点面から数百μｍ離れていても高解像度を維持することができる。これとは対照的に、明視野観察において、粒子は、焦点面の被写界深度内に位置しなければならない。実際に、もし粒子が焦点面からわずかな距離（数μｍ）でも離れていれば、粒子はピンぼけになるであろう。明視野観察において、もし粒子が被写界深度に対して大きければ、その全体画像は同時には焦点が合わないだろう。これとは対照的に、ＨＣホログラムから構築されたＨＦＩ画像において、被写界深度より大きい粒子は完全に焦点が合うであろう。なぜなら、ホログラムは焦点面において測定されるのではないからである。一例として、開口数０．７５は、ＨＦＩ画像または明視野像において０．３５μｍの解像度を提供する。ＨＦＩが数百μｍの有効被写界深度を有するのに対し、明視野観察が有する被写界深度は、約１μｍである。
【００５４】
ＨＦＩからの画像は、Ｈｕモーメント分析（１７３１）を用いて形状を決定し、球形対称からの粒子のずれを定量的に測定することによって、すなわち粒子形態学的特性（１７３２）を識別することによって定量化することができる。Ｈｕモーメントの定量化は、ホログラム（ステップ１７１２）および／または明視野像（ステップ１７５３）によって行うことができる。
【００５５】
従来の明視野観察は、肉眼で見えない粒子の画像を捕捉するための高い倍率に依拠すると同時に、被写界深度という代償を払って行われる。このような明視野像は非常に浅い被写界深度を有する。これとは対照的に、ＨＦＩは、深い被写界深度で迅速かつ正確に行われる。浅い被写界深度は、明視野像で捕捉できる詳細の量を限定する。現在のマイクロフローイメージング技術は、ＨＦＩでは可能な高解像度画像を提供できない、低倍率および低開口数を用いる。小さな被写界深度による解像度の限定は、特に小粒子のマイクロフローイメージングの検出感度を低下させる。正確な粒子数測定には、濃度の正確な測定を行うことが必要である。検出感度の低下は、より小さな粒子の濃度の不正確性をもたらす。ＨＣおよび、ＨＣの延長としてのＨＦＩは、より小さな粒子の検出により高い感度を有し、より小さな粒子についてのより正確な濃度測定をもたらす（図１６Ａ参照）。
【００５６】
ＨＦＩによって捕捉されるホログラムは、粒子が焦点面になくても、詳細な明視画像を生成するようにデジタル再構成した３Ｄ情報を符号化する。実際、ＨＭＣによって測定されるホログラムは、測定の焦点面におけるものではない。
【００５７】
ＨＦＩは、粒子の全３Ｄ構造を表す高解像度２Ｄ画像を数値的に生成するためにホログラムという単一の画像を必要とするが、明視野顕微鏡画像は、明視野顕微鏡の焦点面における狭い領域にある粒子のスライスのみを捕捉する。高解像度のＨＦＩ画像は、粒子の対称性のＨｕモーメント分析を容易にする。
【００５８】
ＨＦＩおよび画像解析の用途は、単独でも一緒でも適用でき、限定するものではないが、タンパク質凝集体、研磨スラリー凝集物、ナノ粒子混合物中の大粒子汚染物質および、流体中に浮遊する任意の種類の非球形汚染物質を含む。
【００５９】
ＨＦＩおよびＨｕモーメント分析の速度および定量的側面は、単独でも一緒でも適用できるが、品質管理、品質保証および製造プロセス制御に適用可能である。製造において、凝集体生成機構は凝集を防止するために重要になりうる。粒子形態学的特性は、凝集機構についての重要な情報源になりうる。製剤化において、凝集の防止は重要な目標である。したがって、ＨＦＩおよび／またはＨｕモーメント分析から粒子形態学的特性を知ることによって、凝集を防止する製剤を製造するために役立つ機構の決定結果を通知することができる。
【００６０】
図１９に示されているように、コンピュータアクセス可能媒体１２０（例えば、本明細書で説明されているストレージデバイス、例えばハードディクス、フロッピーディスク、メモリスティック、ＣＤ‐ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、などまたはこれらの集合体）を用意する（例えば、処理装置１１０と連絡関係をなして）のが良い。コンピュータアクセス可能媒体１２０は、非一過性コンピュータアクセス可能媒体であるのが良い。コンピュータアクセス可能媒体１２０には実行可能な命令１３０が格納されているのが良い。追加的にまたは代替的に、記憶装置１４０がコンピュータアクセス可能媒体１２０とは別個に設けられるのが良く、この記憶装置は、命令を処理装置１１０に提供して処理装置がある特定の例えば本明細書において説明する例示の手技、プロセスおよび方法を実行するよう構成するのが良い。命令は、多くの組をなす命令を含むのが良い。例えば、幾つかの具体化例では、命令は、高周波エネルギーを複数のシーケンスブロックで解析部に適用するための命令を含むのが良く、この場合、シーケンスブロックの各々は、少なくとも第１のステージを含む。命令は、シーケンスブロックの各々の始まりのところでの磁化が安定するまで第１のステージを連続的に繰り返す命令、複数のシーケンスブロックに対応した複数の画像化セグメントを連結して単一の連続した画像化セグメントの状態にする命令、および少なくとも１つの緩和パラメータを符号化して単一の連続画像化セグメントの状態にする命令を更に含むのが良い。
【００６１】
システム１００は、ディスプレイまたは出力装置、入力装置、例えばキーボード、マウス、タッチスクリーンまたは他の入力装置を更に含むのが良く、かかるシステムは、論理ネットワークを介して追加のシステムに接続されるのが良い。本明細書で説明する実施形態のうちの多くのものは、プロセッサを搭載した１つまたは２つ以上のリモートコンピュータへの論理接続方式を用いてネットワーク化された環境で具体化できる。論理接続方式は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）およびワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含むのが良く、かかるＬＡＮおよびＷＡＮは、例示として本明細書において与えられており、本発明を限定するものではない。かかるネットワーク化環境は、オフィス規模または企業規模のコンピュータネットワーク、イントラネットおよびインターネットでは常套的であり、かかるネットワーク化環境は、多種多様な通信プロトコルを用いることができる。当業者であれば理解できるように、かかるネットワークコンピューティング環境は、代表的には、多くの形式のコンピュータシステム形態を含むことができ、かかる形態としては、パーソナルコンピュータ、手持ち型装置、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサ利用またはプログラム可能コンシューマエレクトロニクス、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータなどが挙げられる。本発明の実施形態は、分散型コンピューティング環境でも実施でき、かかる分散型コンピューティング環境では、タスクは、通信ネットワークを介して互いにリンクされた（ハードワイヤードリンク、ワイヤレスリンク、またはハードワイヤードもしくはワイヤレスリンクの組み合わせかのいずれかによって）ローカルおよびリモート処理装置によって実施できる。分散型コンピューティング環境では、プログラムモジュールは、ローカルメモリストレージデバイスおよびリモートメモリストレージデバイスの両方に設置可能である。
【００６２】
種々の実施形態が方法ステップとの一般的関係において説明されており、これら方法ステップは、プログラム製品によって一実施形態で具体化でき、かかるプログラム製品としては、ネットワーク化環境内のコンピュータによって実行可能なコンピュータ実行可能命令、例えばプログラムコードが挙げられる。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実行しまたは特定の抽象データ型を実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。コンピュータ実行可能命令、関連データ構造、およびプログラムモジュールは、本明細書において開示する方法のステップを実施するプログラムコードの例を表わしている。かかる実行可能命令または関連データ構造の特定のシーケンスは、かかるステップで記載された機能を実行するための関連行為の例を表わしている。
【００６３】
本発明のソフトウェアおよびウェブ具体化例は、ルールに基づいた論理または他の論理で標準プログラミング技術により達成でき、それにより種々のデータベース検索ステップ、相関ステップ、比較ステップおよび決定ステップを達成することができる。また、注目されるべきこととして、本明細書および特許請求の範囲で用いられる「コンポーネント」および「モジュール」という用語は、１行または２行以上のソフトウェアコード、および／またはハードウェア具体化例、および／または手動入力を受け取る機器用いた具体化例を含むものである。
【００６４】
本明細書における実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関し、当業者であれば、文脈および／または用途に対して妥当である場合、複数形から単数形にかつ／あるいは単数形から複数形に変換することができる。種々の単数形／複数形の組み合わせは、分かりやすくするために本明細書において明示的に記載されている場合がある。
【００６５】
例示の実施形態の上記説明は、例示および説明目的で与えられている。これは、網羅的ではなくまたは開示した形態素のもののみに対する限定であることを意図しておらず、上記教示に照らして改造および変形が可能であり、または改造および変形が開示した実施形態の実施から得られる場合がある。したがって、上記実施形態は、本発明の範囲を限定するものと解されてはならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図５Ａ−Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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