(57)【要約】本発明は、細胞の表面のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する方法を提供する。また、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの細胞の結合を可能および／または増加する方法、移植された細胞の集団におけるホーミングおよび／または血管外遊出を増加させる方法、対象に移植するための、改変された、幹細胞を含む細胞を作製する方法、対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快する方法、および対象における治療標的への細胞の集団のホーミングを誘導および／または強化するための方法も提供される。さらに本発明は、本発明の方法によって作製された細胞の集団を含む医薬組成物、ならびに対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快するための、そのような組成物を含むキットも提供する。
2019516382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の表面のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する方法であって、
前記細胞に、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、
前記グリコシルトランスフェラーゼを発現するために十分な条件下で前記細胞を培養するステップと
を含み、ここで、発現された前記グリコシルトランスフェラーゼは、前記細胞の糖タンパク質に存在する末端シアリル化ラクトサミンを修飾して前記Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する、方法。
【請求項２】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、ＦＴＶＩＩおよびそれらの組合せである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、末端シアリル化ラクトサミンを細胞内で修飾する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの細胞の結合を可能および／または増加する方法であって、
前記細胞に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、
前記細胞による前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で前記細胞を培養するステップと
を含み、ここで、前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質に存在するグリカン鎖を修飾して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを生成し、それによりＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの前記細胞の結合を可能および／または増加する、方法。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、幹細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が、トランスフェクションによって前記細胞に提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が、形質導入によって前記細胞に提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、それらの修飾形、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸が、修飾されたＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾されたＲＮＡが、ｍｏｄＲＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトＦＴＶＩである、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、およびそれらの組合せからなる群から選択される糖タンパク質をフコシル化する、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
対象に移植された細胞の集団におけるホーミングおよび／または血管外遊出を増加させる方法であって、
前記細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、
前記集団内の１つまたは複数の改変された細胞による前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で前記細胞の集団を培養するステップであって、前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、糖タンパク質に存在するグリカン鎖をフコシル化して、Ｅ−セレクチン（selection）および／またはＬ−セレクチンリガンド発現が強制されている改変された細胞を生成する、ステップと、
前記細胞の集団を、前記対象に移植するステップと
を含み、ここで、強制されたＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンド発現を有する前記改変された細胞は、治療的に有用な部位への増加したホーミングおよび／または血管外遊出を示す、方法。
【請求項２０】
前記細胞の集団が、哺乳動物細胞の集団である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞の集団が、ヒト細胞の集団である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞の集団が、幹細胞の集団である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が、トランスフェクションによって前記細胞の集団に提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、形質導入によって前記細胞の集団に提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、それらの修飾形、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が、修飾されたＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾されたＲＮＡが、ｍｏｄＲＮＡである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトＦＴＶＩである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、およびそれらの組合せからなる群から選択される糖タンパク質をフコシル化する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記移植するステップが、静脈内で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記移植するステップが、所望の血管外遊出部位近くで起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
それを必要とする対象に移植するための改変された細胞を作製する方法であって、
改変すべき細胞の集団を得るステップと、
前記細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、
前記集団内の１つまたは複数の改変された細胞による前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で前記細胞の集団を培養するステップと
を含み、ここで、前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、糖タンパク質に存在するグリカン鎖を修飾して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを生成する、方法。
【請求項３６】
前記細胞の集団が、哺乳動物細胞の集団である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞の集団が、ヒト細胞の集団である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞の集団が、幹細胞の集団である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞の集団が、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸が、トランスフェクションによって前記細胞の集団に提供される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記核酸が、形質導入によって前記細胞の集団に提供される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトＦＴＶＩである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、およびそれらの組合せからなる群から選択される糖タンパク質をフコシル化する（fucoylate）、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
対象に移植するための改変された幹細胞を作製する方法であって、
改変すべき幹細胞の集団を得るステップと、
前記幹細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡを提供するステップと、
前記集団内の１つまたは複数の改変された細胞による前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で前記幹細胞の集団を培養するステップと
を含み、ここで、前記発現されたアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、前記１つまたは複数の改変された細胞上または細胞内に存在するＣＤ４４をフコシル化する、方法。
【請求項４７】
前記アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ヒトＦＴＶＩである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記幹細胞が、ヒト幹細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ヒト幹細胞が、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｃＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡが、形質導入によって提供される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記修飾されたＲＮＡが、ｍｏｄＲＮＡである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記幹細胞の表面でＣＤ４４の細胞外フコシル化を実施するステップをさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
それを必要とする対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快する方法であって、
請求項３５〜５３のいずれか一項に記載の方法によって作製された細胞の集団を得るステップと、
有効量の前記細胞の集団を、前記対象に移植するステップと
を含み、前記移植された細胞が、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを発現する部位へ血管外遊出し、それによって前記対象における前記症状、疾患または傷害の作用が処置または軽快する、方法。
【請求項５５】
前記疾患が、炎症性障害、自己免疫疾患、変性疾患、心血管疾患、虚血性疾患、がん、遺伝的疾患、代謝性障害、および特発性障害からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記傷害が、物理学的傷害、薬物副作用、毒性傷害、および医原性状態からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、哺乳動物である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記哺乳動物が、ヒト、霊長類、農業用動物、および飼育動物からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記移植が、静脈内で起こる、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記移植が、所望の血管外遊出部位近傍で起こる、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記所望の血管外遊出部位が、骨髄である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記所望の血管外遊出部位が、傷害または炎症部位である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
請求項３５〜５３のいずれか一項に記載の方法によって作製された細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項６５】
それを必要とする対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快するためのキットであって、請求項６４に記載の組成物を、その使用のための指示書と共にパッケージして含むキット。
【請求項６６】
それを必要とする対象における治療標的への細胞の集団のホーミングを誘導および／または強化するための方法であって、
（ａ）前記細胞の集団に、前記治療標的で受容体に結合するリガンドの一過性発現を強制するポリペプチドをコードする核酸を提供するステップと、
（ｂ）前記細胞の集団に、前記ポリペプチドを発現させるステップと
を含み、ここで、前記ポリペプチドの発現の際に、治療標的への、前記集団における１つまたは複数の細胞のホーミングが誘導および／または強化される、方法。
【請求項６７】
前記細胞の集団が、幹細胞、組織プロジェニター細胞、抗原特異的Ｔ細胞、Ｔ調節性細胞、抗原パルスされた樹状細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および白血球からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞の集団が、Ｔ−リンパ球である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞の集団が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞の集団が、ステップ（ａ）の前に培養により増大されている、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記治療標的が、腫瘍である、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年５月２０日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３３９，７０４号、および２０１６年６月２４日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３５４，３５０号に基づく優先権を主張している。前述の出願の全体の内容は、あたかも本明細書中に完全に復唱されるように、参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、それらの簡便な単離およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅、多系統分化能、組織修復栄養作用、および強力な免疫調節能［Dominici、２００６年；Griffin、２０１３年］により、細胞治療のために非常に有望である。特にＭＳＣは、骨形成骨芽細胞の前駆体であるので、これらの細胞は、骨粗鬆症または骨形成不全などの全身性骨疾患の処置のために大きな関心を集めている。しかしながら、この目標を達成するために、血管内投与されたＭＳＣの骨指向性を最適化することがまず必要である。
【０００３】
骨への循環細胞の動員は、Ｅ−セレクチン受容体／リガンド接着性相互作用に依存する。Ｅ−セレクチンは、骨髄微小血管上で構成的に発現し、炎症部位の微小血管で誘導的に発現されるカルシウム依存性レクチンである［Sipkins、２００５年；Schweitzer、１９９６年；Sackstein、２００９年］。Ｅ−セレクチンは、シアリルＬｅｗｉｓ  Ｘ（ｓＬｅＸ；ＮｅｕＡｃ−α（２，３）−Ｇａｌ−β（１，４）−［Ｆｕｃ−α（１，３）］ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）として公知であるシアロフコシル化末端四糖モチーフに基本的に結合する。ｓＬｅＸは、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３またはＣＤ４４などの特定の細胞表面糖タンパク質を修飾するグリカン鎖の末端に提示され得る。ｓＬｅＸがこれらのタンパク質で提示されるとき、それぞれＥ−セレクチンリガンドＣＬＡ、ＣＤ４３ＥまたはＨＣＥＬＬとして機能することができる［Dimitroff、２００１年；Sackstein、２００８年］。これらの構造は、造血幹細胞およびプロジェニター細胞（ＨＳＰＣ）ならびに他の造血細胞で、高レベルで発現されるが、ＭＳＣには全く存在しない。このＥ−セレクチンリガンドの欠如に部分的に起因して、静脈移植時に注入されたＭＳＣは、ごく一部しか骨にホーミングしない［Schrepfer、２００７年；Lee、２００９年；Ankrum、２０１０年］。
【０００４】
Ｅ−セレクチンリガンドを生成するために必要なグリカン修飾は、段階的に作用する特定のグリコシルトランスフェラーゼによってゴルジで行われる。ヒトＭＳＣは、ＣＤ４４ならびにｓＬｅＸの合成に必要なグリコシルトランスフェラーゼを高レベルで発現するが、注目すべき例外は、アルファ−（１，３）−フコシル化を媒介するフコシルトランスフェラーゼ：ＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩまたはＦＴＶＩＩのいずれの発現も完全に欠如していることである［Sackstein、２００９年］。従って、ＭＳＣは、末端シアリル化ラクトサミン（ＮｅｕＡｃ−α（２，３）−Ｇａｌ−β（１，４）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）でデコレートされたＣＤ４４を細胞表面に発現しており、強力なＥ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬに変換されるためにアルファ−（１，３）−フコースの添加のみを必要とする。以前に、本発明者らは、インタクトの細胞を精製アルファ−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴＶＩおよびそのヌクレオチド糖ドナーＧＤＰ−フコースと共にインキュベートすることによって、ＭＳＣの表面のグリカンを修飾してＥ−セレクチンリガンドを生成する方法を開発した。「グリコシルトランスフェラーゼ媒介立体置換（ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｅｒｅｏｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」（ＧＰＳ）と呼ばれるこの方法は、ＭＳＣ細胞表面でのＥ−セレクチンリガンド（主にＨＣＥＬＬ）の一過性な生成をもたらす。そのようなＭＳＣのＦＴＶＩ駆動エクソフコシル化は、内皮細胞上のＥ−セレクチン媒介性係留およびローリングを頑強に強化することが実証され、前臨床試験ではＭＳＣ骨指向性（すなわち、骨へのホーミング）を生じた［Sackstein、２００８年］。これらの結果に一部基づいて、このアプローチの有効性が、現在、骨粗鬆症の処置のためエクソフコシル化ＭＳＣを使用した臨床試験で検討されている［NCT02566655、clinicaltrials.gov］。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
これらの方法の有望性にもかかわらず、細胞治療に必要な頑強な改変、ホーミングおよび生着を提供する、Ｅ−セレクチンリガンドなどの細胞表面タンパク質を操作する改善された方法が継続的に必要とされている。一部において、本発明は、合成的に修飾されたｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）［Levy、２０１３年；Warren、２０１０年］を導入することによってフコシルトランスフェラーゼ酵素を細胞内で生成することができる代替的アプローチを提供する。エクソフコシル化と同様に、得られる効果は一過性であり、ＭＳＣがホーミング後にその天然の状態に戻ることを可能にする。しかしながら、ｍｏｄＲＮＡアプローチは、ＭＳＣ自身の細胞機構を利用し、ＧＤＰ−フコースの細胞内貯蔵にアクセスしてフコシルトランスフェラーゼ酵素を製造するため、明確に区別される。さらに、内因性ＦＴＶＩは膜結合型でゴルジ膜につなぎ留められているが、エクソフコシル化のために使用される精製されたＦＴＶＩは可溶性であり、タンパク質のステムおよび触媒ドメインのみからなる。ｍｏｄＲＮＡアプローチには未解決の生物学的疑問が残っており、それは特に、ゴルジ局在化が、細胞表面のフコシル化にアクセス可能なものとは異なるアクセプターに酵素をアクセス可能とすることによる。そのように、エクソフコシル化によって生成されるＥ−セレクチンリガンドが、細胞内フコシルトランスフェラーゼの作用によって生成されるＥ−セレクチンリガンドと、アイデンティティおよび機能性で類似しているかは不明である。さらに、新たに合成されたＥ−セレクチンリガンドがＭＳＣ表面で提示される（およびその後に消失する）動態は、エクソフコシル化されたＭＳＣの動態と異なっているようである。最も重要なことに、そのような差異が、骨髄にホーミングするこれらの細胞のＥ−セレクチンリガンド媒介性機能能力の相違を導くかどうかは不明である。
【０００６】
これらの問題に対処するために、本発明者らは、そのような酵素を天然に欠くヒト細胞において同じアルファ−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを使用する細胞内および細胞外フコシル化の直接比較を行った。この目的のために、本発明者らは、複数のヒトＭＳＣ初代培養物を使用して、ｍｏｄＲＮＡを利用してヒトＭＳＣでＦＴＶＩタンパク質を一過性に生成し、得られたＥ−セレクチンリガンドとＦＴＶＩエクソフコシル化を介して生成されたＥ−セレクチンリガンドとの生化学的および機能的特性を比較した。さらに、本発明者らは、マウス頭蓋冠に移植されたＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを実施することによって、処置された両方の種類の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏホーミング特性を直接比較した。このＦＴＶＩ媒介性細胞内フコシル化と細胞外フコシル化とを対比する詳細な比較は、細胞遊走のプログラミングにおけるフコシルトランスフェラーゼＶＩの活性および機能に関する重要な情報を提供し、臨床的有用性のための最も適切なフコシル化アプローチに関する重要な洞察を提供する。
【０００７】
したがって、本発明は、細胞の表面のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する方法であって、細胞に、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、グリコシルトランスフェラーゼを発現するために十分な条件下で細胞を培養するステップとを含み、ここで、発現されたグリコシルトランスフェラーゼは、細胞の糖タンパク質に存在する末端シアリル化ラクトサミンを修飾してＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する、方法を提供する。
【０００８】
また本発明は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの細胞の結合を可能および／または増加する方法であって、細胞に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で細胞を培養するステップとを含み、ここで、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質に存在するグリカン鎖を修飾して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを生成し、それによりＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの細胞の結合を可能よび／または増加する、方法を提供する。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、対象に移植された細胞の集団におけるホーミングおよび／または血管外遊出を増加する方法であって、細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、集団内の１つまたは複数の改変された細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で細胞の集団を培養するステップであって、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、糖タンパク質に存在するグリカン鎖をフコシル化して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンド発現が強制されている改変された細胞を生成する、ステップと、細胞の集団を、対象に移植するステップとを含み、ここで、強制されたＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンド発現を有する改変された細胞は、治療的に有用な部位への増加したホーミングおよび／または血管外遊出を示す、方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、それを必要とする対象に移植するための改変された細胞を作製する方法であって、改変すべき細胞の集団を得るステップと、細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、集団内の１つまたは複数の改変された細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で細胞の集団を培養するステップとを含み、ここで、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、糖タンパク質に存在するグリカン鎖を修飾して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを生成する、方法を提供する。
【００１１】
また本発明は、対象に移植するための改変された幹細胞を作製する方法であって、改変すべき幹細胞の集団を得るステップと、幹細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡを提供するステップと、集団内の１つまたは複数の改変された細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で幹細胞の集団を培養するステップとを含み、ここで、発現されたアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、１つまたは複数の改変された細胞上または細胞内に存在するＣＤ４４をフコシル化する、方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、それを必要とする対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快する方法であって、本発明の方法のいずれかによって作製された細胞の集団を得るステップと、有効量の細胞の集団を、対象に移植するステップとを含み、移植された細胞が、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを発現する部位へ血管外遊出し、それによって対象における症状、疾患または傷害の作用が処置または軽快する、方法を提供する。
【００１３】
また本発明は、本発明の方法によって作製された細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００１４】
また本発明は、それを必要とする対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快するためのキットであって、本発明の組成物を、その使用のための指示書と共にパッケージして含むキットも提供する。
【００１５】
また本発明は、それを必要とする対象における治療標的への細胞の集団のホーミングを誘導および／または強化するための方法であって、（ａ）細胞の集団に、治療標的で受容体に結合するリガンドの一過性発現を強制するポリペプチドをコードする核酸を提供するステップと、（ｂ）細胞の集団に、ポリペプチドを発現させるステップとを含み、ここで、ポリペプチドの発現の際に、治療標的への、集団における１つまたは複数の細胞のホーミングが誘導および／または強化される、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜図１ＣはＭＳＣの特性評価を示す。図１Ａは、代表的な初代ＭＳＣ株について測定された細胞表面マーカーのフローサイトメトリーヒストグラムを示す。図１Ｂは、試験した７つの初代ＭＳＣ株の全てについて提示される、パネルＡと同じマーカーについての平均蛍光強度レベルを示す。各ＭＳＣ株は、異なる健常ドナーから単離した。図１Ｃは、骨形成分化条件（左下部パネル）、脂肪形成分化条件（右下部パネル）、またはＭＳＣ維持培地（上部パネル）を受けたＭＳＣの顕微鏡写真を示す。細胞を、石灰化沈着物を検出するアリザリンレッドで、または脂質沈着物を検出するためにオイルレッドＯで染色した（スケールバー＝１００μｍ）。
【００１７】
【図２】図２は、ＭＳＣの細胞内または細胞外フコシル化後のｓＬｅＸ表面発現の動態を示す。未処理ＭＳＣ、細胞外でフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）ＭＳＣ、または細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）ＭＳＣを、２４時間間隔で収集し、ＨＥＣＡ４５２抗体を使用してｓＬｅＸについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＦＩ：平均蛍光強度。
【００１８】
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、複数の初代ヒトＭＳＣ株で細胞内または細胞外フコシル化によって誘導された細胞表面ｓＬｅＸ発現レベルを示す。図３Ａは、０日目に細胞外でフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）ＭＳＣおよび２〜３日目に細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）ＭＳＣが、未処理ＭＳＣと比較して、ＨＥＣＡ４５２のフローサイトメトリー分析またはｃｓＬｅｘ１染色を介して測定される表面ｓＬｅＸにおいて、同様の増加を示すことを示す。図３Ｂは、複数の独立した初代ＭＳＣ株にわたって観察された表面ｓＬｅＸの同様の増加を示す（ｎ＝１１実験、それぞれの色は、使用した５つの初代ＭＳＣ株の１つを表す）。統計上の比較はスチューデントＴ検定を使用して行った。ｎ．ｓ．＝有意でない（すなわち、ｐ＞０．０５）。＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
【００１９】
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、細胞内または細胞外フコシル化の前後のＭＳＣ特性の評価を示す。図４Ａは、トリパンプルー排除によって測定されたフコシル化ＭＳＣの生存率（％）を示す。エラーバー＝ＳＥＭ。図４Ｂは、細胞外（ＦＴＶＩ−エクソ）または細胞内（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）フコシル化の前後の初代ＭＳＣ株についての細胞表面マーカー発現を示す。図４Ｃは、フコシル化（fucoslation）直後に（左パネル）または再び蒔いてその後１継代培養したときに（すなわちさらに５〜１１日）（右パネル）測定した２つの初代ＭＳＣ株についての陽性および陰性マーカーのパネルについての平均蛍光強度の平均（バー）および範囲（エラーバー）を示す。図４Ｄは、ＦＴＶＩエクソフコシル化またはバッファーのみを用いて処理され、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡまたは対照ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトされるか、または未処理のままであり、その後、三重で蒔かれ、骨形成分化が誘導された１つの初代ＭＳＣ株を示す。各培養物で形成された石灰化沈着物の全体的量を評価するために、アリザリンレッド染色の測定を行った。統計上の比較はテューキーのＨＳＤ検定で一元配置分散分析を使用して行った。ｎ．ｓ．＝有意でない（すなわち、ｐ＞０．０５）；＊＊＝ｐ＜０．０１。
【００２０】
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、細胞内または細胞外フコシル化によって生成されたＥ−セレクチンリガンド糖タンパク質のタンパク質のサイズおよび細胞局在の比較を示す。図５Ａは、未処理ＭＳＣ、細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）ＭＳＣ、および細胞外でフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）ＭＳＣが溶解され、マウスＥ−セレクチン−ヒトＦｃ（Ｅ−Ｉｇ）キメラをプローブとしてウェスタンブロットされたことを示す。図５Ａは、細胞溶解およびＥ−Ｉｇウェスタンブロットの前に、ノイラミニダーゼ（ＮＡｓｅ）を用いてまたは用いずに細胞内でまたは細胞外でフコシル化されたインタクトのＭＳＣを処理することによって決定されるＥ−Ｉｇ反応性糖タンパク質の細胞局在を示す。同じブロットのβ−アクチン染色を、ローディング対照として実施した。
【００２１】
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、フコシル化されたＭＳＣにおける約８５ｋＤのＥ−セレクチンリガンドが、Ｅ−セレクチン結合ＣＤ４４グリコフォームであるＨＣＥＬＬであることを示す。図６Ａは、未処理、細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）および細胞外でフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）ＭＳＣ溶解物からのＥ−セレクチンリガンドをＥ−Ｉｇキメラを使用してプルダウンし、ＣＤ４４抗体を用いてウェスタンブロットしたことを示す。図６Ｂは、ＣＤ４４が、未処理、細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）、および細胞外でフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）ＭＳＣ溶解物から免疫沈降され、ｓＬｅＸを認識するｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２を用いてウェスタンブロットされたことを示す。
【００２２】
【図７】図７は、細胞表面ビオチン化にアクセス可能であるＥ−セレクチンリガンド糖タンパク質の分析を示す。未処理ＭＳＣまたは細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）ＭＳＣを、アミン反応性ビオチン化試薬と共にフラスコ内でインキュベートし、次いで未処理ＭＳＣの一部を細胞外フコシル化した（ＦＴＶＩ−エクソ）。未処理、ＦＵＴ６−ｍｏｄおよびＦＴＶＩ−エクソ細胞溶解物を、プルダウン（ビオチン化）および上清（非ビオチン化）画分に分離した。ウェスタンブロットを、Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ、およびローディング対照としてのβ−アクチンを使用して実施した。
【００２３】
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、平行平板型フローチャンバーを使用する剪断条件下でのＥ−セレクチンリガンド媒介性ＭＳＣ−内皮細胞相互作用の分析を示す。（Ａ）細胞外フコシル化（ＦＴＶＩ−エクソ）および細胞内フコシル化（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）の両方が、フロー条件下で、ＴＮＦα活性化ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上におけるＭＳＣ捕捉／係留／ローリングを可能にしたが、抗Ｅ−セレクチン機能遮断ｍＡｂで前処理されたＨＵＶＥＣに対してはそれらを可能にしなかった。エラーバー＝ＳＥＭ。２つの異なる初代ＭＳＣ株を使用したｎ＝４の独立した実験。（Ｂ）細胞外でフコシル化されたおよび細胞内でフコシル化されたＭＳＣは、ＴＮＦα刺激ＨＵＶＥＣに対して同様のローリング速度を示す。エラーバー＝ＳＥＭ、１時点あたりの分析されたｎ＝１５〜１５５の細胞の速度。統計上の比較はスチューデントＴ検定を使用して行った。ｎ．ｓ．＝有意でない。
【００２４】
【図９】図９は、異種移植時のＤｉＤおよびＤｉＩ標識ＭＳＣ混合物のアリコートにおいて確認されたフコシル化の有効性を示す。ＦＴＶＩエクソフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）およびバッファー対照ＭＳＣ、またはＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡ（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）およびｎｄＧＦＰ対照ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトＭＳＣを、ＤｉＩ（青色）またはＤｉＤ（緑色）で標識し、１：１の比率で混合し、マウスに注入した。注入された細胞混合物それぞれのアリコートを、ｓＬｅＸ結合ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２（赤色）で染色し、ガラススライド上で画像化して、ＦＵＴ６−ｍｏｄまたはＦＴＶＩ−エクソ処理の有効性を確認し、正確な開始率を得た。スケールバー＝１００μｍ。
【００２５】
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｃは、異種移植されたヒトＭＳＣの相対的骨指向性を測定するための頭蓋冠骨髄のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを示す。図１０Ａは、ＤｉＤ−（緑色）およびＤｉＩ−（青色）染色されたＭＳＣの移植後のマウス頭蓋冠領域の三次元再構築を示す。骨の部分が、骨髄の可視化を容易にするために、デジタル的に取り出されている。スケールバー＝１００μｍ。図１０Ｂは、移植後２時間で、フコシル化されたヒトＭＳＣが対照細胞と比較して骨指向性が増加していることを示し、図１０Ｃは、移植後２４時間からのデータを示し、細胞内フコシル化（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）が、細胞外フコシル化（ＦＴＶＩ−エクソ）よりも強い強化をもたらしていることを示す。エラーバー＝標準偏差。１比較あたりｎ＝４のマウスペア。統計上の比較は、テューキーのＨＳＤ検定で一元配置分散分析を使用して行った。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１。
【００２６】
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、骨髄実質へ異種移植されたヒトＭＳＣの血管外遊出を測定するための血管のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを示す。図１１Ａは、Ａｎｇｉｏｓｅｎｓｅを注入して、血管（赤色）ならびにホーミングしたＤｉＩ（青色）およびＤｉＤ（緑色）染色ＭＳＣを可視化した後の頭蓋冠領域の２Ｄマージ画像スタックを示す。スケールバー＝１００μｍ。図１１Ｂは、移植後２４時間で対照細胞（ベースライン）と比較したときに、細胞内でフコシル化された（ＦＵＴ６−ｍｏｄ）ＭＳＣが、細胞外でフコシル化された（ＦＴＶＩ−エクソ）ＭＳＣよりも有意に大きな、骨髄実質へのＭＳＣ血管外遊出を示すことを示す。エラーバー＝標準偏差。１比較あたりｎ＝４のマウスペア。統計上の比較はテューキーのＨＳＤ検定で一元配置分散分析を使用して行った。＊＊＝ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
一部の実施形態では、本発明は、細胞の表面のＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する方法であって、細胞に、グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、グリコシルトランスフェラーゼを発現するために十分な条件下で細胞を培養するステップとを含み、ここで、発現されたグリコシルトランスフェラーゼは、細胞の糖タンパク質に存在する末端シアリル化ラクトサミンを修飾してＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制する、方法を提供する。
【００２８】
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシド連結の形成を触媒してグリコシドを形成する酵素である。これらの酵素は、グリコシルドナーとして「活性化された」糖ホスフェートを利用し、求核性基へのグリコシル基転移を触媒する。グリコシル転移の生成物は、Ｏ−、Ｎ−、Ｓ−またはＣ−グリコシドであり得る；グリコシドは、単糖、オリゴ糖、または多糖の一部であり得る。グリコシルトランスフェラーゼは、９０を超えるファミリーに分類されている。一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである。グリコシルトランスフェラーゼの非限定的な例は、例えば、C.  Bretonら、Structures  and  mechanisms  of  glycosyltransferases、Glycobiology、２００６年、１６巻（２号）：２９Ｒ〜３７Ｒ頁；D.  Liangら、Glycosyltransferases:  mechanisms  and  applications  in  natural  product  development、Chem.  Soc.  Rev.、２０１５年、４４巻、８３５０〜８３７４頁およびTaniguchiら、Handbook  of  Glycosyltransferases  and  Related  Genes、Springer  Science  &  Business  Media、２０１１年に見出すことができる。一部の実施形態では、細胞は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を有する。例えば、２つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、同時にまたは連続的に、延長するコアグリカン構造へ連結に適切な糖をそれぞれ加えることができる。一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、Ｎ連結型グリコシル化を指示する。他の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、Ｏ連結型グリコシル化を指示する。一部の実施形態では、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、ＦＴＶＩＩおよびそれらの組合せである。
【００２９】
一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、末端シアリル化ラクトサミンを細胞内で修飾する。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの細胞の結合を可能および／または増加する方法であって、細胞に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で細胞を培養するステップとを含み、ここで、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質に存在するグリカン鎖を修飾して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを生成し、それによりＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンへの細胞の結合を可能および／または増加する、方法を提供する。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合的に一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。核酸の多くのバリアントが、所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。
【００３２】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖配列の両方の一部を含有してもよい。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、またはハイブリッドを含んでもよく、核酸はデオキシ−およびリボ−ヌクレオチドの組合せを含有してもよく、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有してもよい。核酸は、一本鎖分子として合成されてもよく、または合成遺伝子を使用して細胞で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）発現されてもよい。核酸は、化学合成法または組み換え法によって得てもよい。
【００３３】
核酸は一般的にホスホジエステル結合を含有するが、少なくとも１つの異なる連結、例えば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはＯ−メチルホスホロアミデート（methylphosphoroamidite）連結およびペプチド核酸骨格および連結を有し得る核酸アナログが含まれてもよい。他のアナログ核酸には、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号に開示されるものを含む、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。１つまたは複数の非天然または修飾されたヌクレオチドを含有する核酸も、核酸の定義内に含まれる。修飾されたヌクレオチドアナログは、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置してもよい。ヌクレオチドアナログの代表的な例は、糖または骨格修飾されたリボヌクレオチドから選択され得る。しかしながら、核酸塩基修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然核酸塩基の代わりに非天然核酸塩基、例えば５位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンを含有するリボヌクレオチドも適切であることを留意すべきである。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基によって置き換えられてもよく、ここでＲは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。また修飾されたヌクレオチドには、例えばKrutzfeldtら、Nature（２００５年１０月３０日）、Soutschekら、Nature、４３２巻：１７３〜１７８頁（２００４年）および米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号に開示されるような、ヒドロキシプロリノール連結を介してコレステロールにコンジュゲートされたヌクレオチドも含まれる。修飾されたヌクレオチドおよび核酸は、米国特許出願公開第２００２０１１５０８０号に開示されるようなロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。さらなる修飾されたヌクレオチドおよび核酸は、米国特許出願公開第２００５０１８２００５号に開示されている。リボース−リン酸骨格の修飾は、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるため、細胞膜を横切る拡散を強化するためなどの様々な理由のために行われてよい。天然核酸とアナログとの混合物が作製されてもよく、代替的に、異なる核酸アナログの混合物、および天然核酸とアナログとの混合物が作製されてもよい。
【００３４】
一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。これらの実施形態の一部の好ましい態様では、細胞は、ヒト細胞である。
【００３５】
他の実施形態では、細胞は、幹細胞である。これらの実施形態の一部の好ましい態様では、幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される。これらの実施形態の一部の好ましい態様では、成体幹細胞は、間葉系幹細胞である。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「細胞に核酸を提供すること」および類似の文法形は、任意の従来のものおよび細胞にヌクレオチド配列を導入し、それを発現する方法で発見されるものを包含することが意図される。発現は、長期的または一過性であってよく、誘導性または当業者に公知の従来の方法を使用して制御される他の発現であってもよい。一部の実施形態では、核酸は、トランスフェクションによって細胞に提供される。他の実施形態では、核酸は、形質導入によって細胞に提供される。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」は、標的細胞に核酸を導入する、化学的に媒介された方法である。トランスフェクションの非限定的な例としては、脂質ベースのトランスフェクションおよびリン酸カルシウムベースのトランスフェクションが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「形質導入」は、標的細胞へ核酸を導入する、ウイルス的に媒介された方法である。トランスフェクションおよび形質導入の方法は当業者に公知であり、細胞型などの当業者に公知の因子に基づいて核酸の有効な送達を達成するように選択することができる。
【００３８】
一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、それらの修飾形、およびそれらの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、核酸は、修飾されたＲＮＡであり、より好ましい実施形態では、修飾されたＲＮＡは、ｍｏｄＲＮＡである。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「修飾されたＲＮＡ」は、塩基置換、骨格修飾、５’または３’末端への修飾、およびそれらの組合せを含む。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「ｍｏｄＲＮＡ」は、シチジンおよびウリジンが、５−メチルシチジンおよびプソイドウリジンでそれぞれ置き換えられている修飾されたＲＮＡである。ｍｏｄＲＮＡの非限定的な例および作製方法は、実施例１に示されている。
【００４１】
一部の実施形態では、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ヒトアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼである。好ましい実施形態では、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ヒトＦＴＶＩである。
【００４２】
一部の実施形態では、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、およびそれらの組合せからなる群から選択される糖タンパク質をフコシル化する。
【００４３】
他の実施形態では、本発明は、対象に移植された細胞の集団におけるホーミングおよび／または血管外遊出を増加させる方法であって、細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、集団内の１つまたは複数の改変された細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で細胞の集団を培養するステップであって、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、糖タンパク質に存在するグリカン鎖をフコシル化して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンド発現が強制されている改変された細胞を生成する、ステップと、細胞の集団を、対象に移植するステップとを含み、ここで、強制されたＥ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンド発現を有する改変された細胞は、治療的に有用な部位への増加したホーミングおよび／または血管外遊出を示す、方法を提供する。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制すること」は、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンのためのリガンドとして機能することができるように糖タンパク質のグリカン鎖を、例えばフコシル化によって修飾することを意味する。Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドの発現を強制することは、例えば、細胞内にまたは細胞上に存在する糖タンパク質のグリカン鎖をフコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼ、例えばアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼを提供することによって成し遂げることができる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。ヒトに加えて、本発明の範囲内の哺乳動物のカテゴリーには、例えば、農業用動物、飼育動物、実験動物などが含まれる。農業用動物の一部の例には、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなどが含まれる。飼育動物の一部の例には、イヌ、ネコなどが含まれる。実験動物の一部の例には、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどが含まれる。
【００４６】
一部の実施形態では、細胞の集団は、哺乳動物細胞の集団である。これらの実施形態の一部の好ましい態様では、細胞の集団は、ヒト細胞の集団である。
【００４７】
一部の実施形態では、細胞の集団は、幹細胞の集団である。これらの実施形態の一部の好ましい態様では、幹細胞の集団は、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される。これらの実施形態の一部の好ましい態様では、成体幹細胞は、間葉系幹細胞である。
【００４８】
本発明における「移植」には、治療組成物、例えば、細胞の集団を個体に提供する、全ての従来の方法および発見される方法が含まれる。移植は、対象の自己の細胞の移植または非自己ドナー由来からの移植であってもよい。一部の実施形態では、移植するステップが、静脈内で行われる。他の実施形態では、移植するステップは、所望の血管外遊出部位で行われる。
【００４９】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に移植するための改変された細胞を作製する方法であって、改変すべき細胞の集団を得るステップと、細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供するステップと、集団内の１つまたは複数の改変された細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で細胞の集団を培養するステップとを含み、ここで、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼが、糖タンパク質に存在するグリカン鎖を修飾して、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンリガンドを生成する、方法を提供する。
【００５０】
また本発明は、対象に移植するための改変された幹細胞を作製する方法であって、改変すべき幹細胞の集団を得るステップと、幹細胞の集団に、アルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡを提供するステップと、集団内の１つまたは複数の改変された細胞によるアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼの発現のために十分な条件下で幹細胞の集団を培養するステップとを含み、ここで、発現されたアルファ１，３−フコシルトランスフェラーゼは、１つまたは複数の改変された細胞上または細胞内に存在するＣＤ４４をフコシル化する、方法を提供する。
【００５１】
一部のさらなる実施形態では、本発明の方法は、幹細胞の表面で発現したＣＤ４４の細胞外フコシル化を実施するステップをさらに含む。本明細書で使用されるとき、「細胞外フコシル化」は、例えば、Sacksteinら、「Ex  vivo  glycan  engineering  of  CD44  programs  human  multipotent  mesenchymal  stromal  cell  trafficking  to  bone」、Nature  Medicine、２００８年；１４巻：１８１〜１８７頁およびSacksteinら、「Glycosyltransferase-programmed  stereosubstitution（GPS）to  create  HCELL:  engineering  a  roadmap  for  cell  migration」、Immunol  Rev.、２００９年；２３０巻：５１〜７４頁に開示されるように、外因性フコシルトランスフェラーゼ、例えばＦＴＩＩＩ、ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ、ＦＴＶＩＩまたはそれらの組合せを、細胞、例えば幹細胞に提供することを意味する。
【００５２】
また本発明は、それを必要とする対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快する方法であって、本発明の方法のいずれかによって作製された細胞の集団を得るステップと、有効量の細胞の集団を、対象に移植するステップとを含み、移植された細胞が、Ｅ−セレクチンおよび／またはＬ−セレクチンを発現する部位へ血管外遊出し、それによって対象における症状、疾患または傷害の作用が処置または軽快する、方法を提供する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」およびそれらの文法的変形は、対象、例えば患者において生理学的応答または転帰を得ることが望ましいプロトコール、レジメン、プロセスまたは療法を、個々の対象に施すことを意味する。特に、本発明の方法および組成物は、疾患症状の発達を遅らせ、または疾患もしくは状態の発症を遅延し、または疾患の発達の進行を停止するために使用し得る。但し、処置されるあらゆる対象は、特定の処置プロトコール、レジメン、プロセスまたは療法に応答しないことがあり得るので、処置は、対象または対象集団、例えば患者集団の各々全てで所望の生理学的応答または転帰が達成されることを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団、例えば、患者集団は、処置に応答しないまたは不十分にしか応答しない場合があり得る。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「軽快させる」、「軽快させること」およびその文法的変形は、対象における疾患の症状の重症度を低下させることを意味する。
【００５５】
本発明において、本明細書に開示される本発明の薬剤（本発明の薬剤を含有する医薬組成物を含む）の「有効量」または「治療有効量」は、そのような薬剤または組成物が対象に投与されたときに本明細書に記載される有益なまたは所望の結果を有効にするために十分な量である。有効な投薬形態、投与様式および投薬量は経験的に決定することができ、そのような決定をなすことは当技術分野の技能の範囲内である。投薬量が、投与経路、処置の持続時間、投与される任意の他の薬剤のアイデンティティ、哺乳動物、例えばヒト患者の年齢、サイズおよび種、ならびに医学および獣医学の技術分野で周知の同様の因子によって変動し得ることは、当業者によって理解される。一般に、本発明による薬剤または組成物の適切な量は、所望の効果を生ずるために有効な最も低い量である薬剤または組成物の量である。本発明の薬剤または組成物の有効量は、適切な間隔で別個に投与される２回、３回、４回、５回、６回またはより多くの回数の小用量で投与され得る。
【００５６】
一部の実施形態では、疾患が、炎症性障害、自己免疫疾患、変性疾患、心血管疾患、虚血性疾患、がん、遺伝的疾患、代謝性障害、および特発性障害からなる群から選択される。
【００５７】
一部の実施形態では、傷害は、物理学的傷害、薬物副作用、毒性傷害、および医原性状態からなる群から選択される。
【００５８】
一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の好ましい実施形態では、哺乳動物は、ヒト、霊長類、農業用動物、および飼育動物からなる群から選択される。一部のより好ましい実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００５９】
一部の実施形態では、移植が、静脈内で行われる。他の実施形態では、移植が、所望の血管外遊出部位近くで行われる。一部の好ましい実施形態では、所望の血管外遊出部位が、骨髄である。他の好ましい実施形態では、所望の血管外遊出部位が、傷害または炎症部位である。
【００６０】
他の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって作製された細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００６１】
他の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象における症状、疾患または傷害の作用を処置または軽快するためのキットであって、本発明の組成物を、その使用のための指示書と共にパッケージして含むキットを提供する。
【００６２】
またキットは、対象への医薬組成物の投与に使用するために、医薬組成物およびバッファー、平衡塩類溶液等の他の試薬それぞれのための適切な貯蔵容器、例えばアンプル、バイアル、チューブなどを含んでもよい。医薬組成物および他の試薬は、例えば溶液または粉末形態などの任意の都合のよい形態でキット中に存在し得る。さらにキットは医薬組成物の使用のための指示書を含んでもよい。さらにキットは、医薬組成物および任意選択の他の試薬を収容するための１つまたは複数の区画を任意選択で有するパッケージング容器を含んでもよい。
【００６３】
また本発明は、それを必要とする対象における治療標的への細胞の集団のホーミングを誘導および／または強化するための方法であって、（ａ）細胞の集団に、治療標的で受容体に結合するリガンドの一過性発現を強制するポリペプチドをコードする核酸を提供するステップと、（ｂ）細胞の集団に、ポリペプチドを発現させるステップとを含み、ここで、ポリペプチドの発現の際に、治療標的への、集団における１つまたは複数の細胞のホーミングが誘導および／または強化される、方法を提供する。
【００６４】
一部の実施形態では、細胞の集団は、任意の医学的に関連する集団であり、例えば、細胞の集団は、幹細胞、組織プロジェニター細胞、抗原特異的Ｔ細胞、Ｔ調節性細胞、抗原パルスされた樹状細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および白血球からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞の集団は、Ｔ−リンパ球である。一部の実施形態では、細胞の集団は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞である。
【００６５】
一部の実施形態では、細胞の集団は、ステップ（ａ）の前に培養により増大されている。
【００６６】
一部の実施形態では、治療標的は、任意の医学的に適切な標的、例えば、傷害部位、炎症または腫瘍などであり得る。
【００６７】
本開示に記載される実施形態は、様々な方法で組み合わせることができる。一つの実施形態のために記載される任意の態様または特長は、本開示に言及される任意の他の実施形態に組み込むことができる。本発明の原理の様々な新規特長が、その特定の実施形態に適用されるとして示され、記載され、および指摘されているが、様々な省略、置換および改変が、本開示の精神を逸脱することなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。当業者は、本発明の原理が、例示の目的のためにおよび限定されずに提示される説明された実施形態以外の形態で実施できることを理解する。
【実施例】
【００６８】
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨格系疾患のための細胞治療に大きな有望性を保持しているが、骨髄への血液由来細胞のホーミングを指令するＥ−セレクチンリガンドの発現を欠いている。以前に、本発明者らは、フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴＶＩ）およびそのドナー糖であるＧＤＰ−フコースを用いて細胞をエクソフコシル化し、強力なＥ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬの一過性表面発現を強制して、静脈内に投与された細胞の強化された骨指向性を得ることによって、ＭＳＣ表面のＥ−セレクチンリガンドを操作する方法を記載した。ここで本発明者らは、ＦＴＶＩ−エクソフコシル化を介して生成されたＥ−セレクチンリガンドと、細胞内で発現されたＦＴＶＩによって生成されたＥ−セレクチンリガンドとがアイデンティティおよび機能において区別されるかどうかの決定を求めた。この目的のために、本実施例では、本発明者らは、ＦＴＶＩ（ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡ）をコードする合成的に修飾されたｍＲＮＡをヒトＭＳＣへ導入した。ＦＴＶＩ−エクソフコシル化（すなわち、細胞外フコシル化）およびＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクション（すなわち細胞内フコシル化）は、細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドレベルで同様のピーク増加を生じ、剪断ベースの機能アッセイでは、Ｅ−セレクチンを発現するヒト内皮細胞の係留／ローリングにおいて匹敵する増加を示した。しかしながら、生化学的分析は、細胞内フコシル化が細胞内および細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドの両方を誘導し、細胞外フコシル化と比較してＥ−セレクチンリガンドのより持続的な発現も誘導したことを明らかにした。注目すべきことに、ヒトＭＳＣのマウス頭蓋冠へのホーミングを評価するためのライブイメージング研究は、細胞外でフコシル化された細胞と比較して細胞内でフコシル化された細胞の静脈内投与後の骨指向性がより大きいことを明らかにした。この研究は、ＦＴＶＩ媒介性の細胞内フコシル化対細胞外フコシル化による、ヒトＭＳＣでプログラム化されたＥ−セレクチンリガンド発現の最初の直接分析である。これらの２つの状況で観察されたＦＴＶＩ活性の生物学的効果の差異は、臨床適用におけるヒトＭＳＣの有効性を改善するための新たな戦略をもたらし得る。
（実施例１）
材料と方法
ヒトアルファ１，３フコシルトランスフェラーゼ遺伝子
【００６９】
ヒトタンパク質ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６およびＦＵＴ７の例示的な配列を以下に示す。発現のためのそのようなフコシルトランスフェラーゼをコードする例示的な核酸配列は、全長配列（下記にも示す）または酵素活性を保持するその切断部分をコードしてもよい。
【００７０】
ヒトＦＵＴ３  ｃＤＮＡ配列
【化１】
2019516382.tif 000003
【化２】
2019516382.tif 000004
【化３】
2019516382.tif 000005
【００７１】
ヒトＦＵＴ３  タンパク質配列
【化４】
2019516382.tif 000006
【化５】
2019516382.tif 000007
【００７２】
ヒトＦＵＴ４  ｃＤＮＡ配列
【化６】
2019516382.tif 000008
【化７】
2019516382.tif 000009
【化８】
2019516382.tif 000010
【００７３】
ヒトＦＵＴ４  タンパク質配列
【化９】
2019516382.tif 000011
【００７４】
ヒトＦＵＴ５  ｃＤＮＡ配列
【化１０】
2019516382.tif 000012
【化１１】
2019516382.tif 000013
【化１２】
2019516382.tif 000014
【００７５】
ヒトＦＵＴ５  タンパク質配列
【化１３】
2019516382.tif 000015
【００７６】
ヒトＦＵＴ６  ｃＤＮＡ配列
【化１４】
2019516382.tif 000016
【化１５】
2019516382.tif 000017
【００７７】
ヒトＦＵＴ６  タンパク質配列
【化１６】
2019516382.tif 000018
【化１７】
2019516382.tif 000019
【００７８】
ヒトＦＵＴ７  ｃＤＮＡ配列
【化１８】
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【化１９】
2019516382.tif 000021
【００７９】
ヒトＦＵＴ７  タンパク質配列
【化２０】
2019516382.tif 000022
ヒト間葉系幹細胞の単離および培養
【００８０】
ヒト細胞を、がん医療機関パートナーズ（Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）（（マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ブリガム女性病院（Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびダナ・ファーバー癌研究所（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））のヒト実験および倫理委員会によって承認された手順に従って取得および使用した。廃棄された骨髄フィルターセットを正常なヒトドナーから得た。骨髄細胞を、ＰＢＳ＋１０Ｕ／ｍｌヘパリン（Ｈｏｓｐｉｒａ）を使用してフィルターセットからフラッシュした。単核画分を、密度勾配培地（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １．０７７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して単離し、ＭＳＣ培地（ＤＭＥＭ、１ｇ／Ｌのグルコース、選択されたロットからの１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン）中に２〜５×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。２０ｍｌの細胞懸濁液を、Ｔ−１７５組織培養フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２、＞９５％湿度でインキュベートした。２４時間後、非接着細胞を除去し、フラスコをＰＢＳでリンスし、新鮮なＭＳＣ培地を加えた。その後、ＭＳＣ培地を１週間あたり２回交換した。１〜２週間で、接着ＭＳＣのクラスターが観察された。コンフルエンスが８０％に近づいたとき、細胞を収集し、ＭＳＣ培地中に３〜５倍希釈し、新たなフラスコ中に蒔いた。収集のために、ＭＳＣをＰＢＳで２回リンスし、０．０５％トリプシンおよび０．５ｍＭのＥＤＴＡで浮き上がらせた。遠心分離後、細胞ペレットを、継代するためＭＳＣ培地に再懸濁したかまたは実験的使用のためにＰＢＳで洗浄した。
ＭＳＣ特性評価および分化
【００８１】
ＭＳＣを、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６およびＣＤ１６６を含むマーカーのパネルについてＦＡＣＳ染色によって特性評価した。細胞生存率を、トリパンプルー排除を使用して測定した。骨形成分化を誘導するために、細胞を、ＭＳＣ培地＋１０ｎＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのグリセロホスフェート、および５０μｇ／ｍｌのＬ−アスコルベート−２−ホスフェートの存在下で培養した。４日後、Ｌ−アスコルベート−２−ホスフェートを除去し、培地を３〜４日毎に合計で１４日間交換した。脂肪形成分化を誘導するために、細胞を、３ｕｇ／Ｌのグルコース、３％のＦＢＳ、１μＭのデキサメタゾン、５００μＭのメチルイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、３３μＭのビオチン、５μＭのロシグリタゾン、１００ｎＭのインスリン、および１７μＭのパントテネートを含むＤＭＥＭ中で培養した。４日後、ＩＢＭＸおよびロシグリタゾンを除去し、培地を３〜４日毎に合計で１４日間交換した。陰性対照として、ＭＳＣを、ＭＳＣ培地中で、培地を３〜４日毎に交換しながら、合計で１４日間維持した。骨形成分化を示す石灰化沈着物を可視化するために、細胞を２％アリザリンレッドで染色した。顕微鏡写真を撮影した後、細胞を、１０％塩化セチルピリジニウム一水和物を使用して脱色し、染色された溶出液を、５９５ｎｍで分光光度計を使用して測定した。脂肪形成分化を示す脂質沈着物を可視化するために、細胞を０．３％オイルレッドＯで染色し、顕微鏡写真を撮影した。
修飾されたｍＲＮＡ合成
【００８２】
修飾されたｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を、以前に記載されているように［Mandal、２０１３年］合成した。簡潔に説明すると、ヒトフコシルトランスフェラーゼ６（ＦＵＴ６）をコードするｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーター、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含有するベクターにサブクローニングした。ＰＣＲ反応を実施して、ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型を生成した。ＦＵＴ６  ＯＲＦならびに５’および３’ＵＴＲを含む１．６μｇの精製されたＰＣＲ産物を、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ  ＡＲＣＡキャップアナログ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、アデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸（ＵＳＢ）、５−メチルシチジン三リン酸およびプソイドウリジン三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応のために使用した。ｍｏｄＲＮＡ産物を、ＭＥＧＡｃｌｅａｒスピンカラム（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して精製し、アリコートを将来の使用のために凍結保存した。核不安定化ＥＧＦＰ（ｎｄＧＦＰ）ｍｏｄＲＮＡを陰性対照として同様に調製した。
ｍｏｄＲＮＡトランスフェクション
【００８３】
ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションを、製造業者の指示書に従ってＳｔｅｍｆｅｃｔ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を用いて実施した。チューブに、６０μｌのバッファー中１μｇのｍｏｄＲＮＡと、６０μｌのバッファー中２μｌの試薬を調製し、２つの複合体を一緒に混合して室温で１５分間インキュベートした。混合物を、２ｍｌのＭＳＣ培地中１×１０６のＭＳＣに加えた。ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションに続いて、Ｂ１８Ｒインターフェロン阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を培地補充物として２００ｎｇ／ｍｌで使用した。
ＦＴＶＩ産生および比活性の測定
【００８４】
組換えＦＴＶＩ酵素を、ＦＴＶＩタンパク質配列（配列番号８）のアミノ酸３５−３５９をコードするｃＤＮＡを使用する確立された技術［Borsig、１９９８年］を使用して、ＣＨＯ細胞で産生した；この配列は、ＦＴＶＩの細胞質および膜貫通領域を省き、酵素のステムおよび触媒ドメイン全体を包含している。精製酵素の比活性は、製造業者の指示書に従って、グリコシルトランスフェラーゼ活性キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定した。簡潔に説明すると、０．１μｇの組換えＦＴＶＩ、１μＬのＥＮＴＰＤ３／ＣＤ３９Ｌ３ホスファターゼ、１５ｎｍｏｌのＮ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン（Ｖ−ｌａｂｓ  Ｉｎｃ）、および４ｎｍｏｌのＧＤＰ−フコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０μＬの反応バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．５）中に溶解し、９６ウェルプレート中３７℃で２０分間インキュベートした。組換えＦＴＶＩを除いて同じ成分を含有させた第２の反応を陰性対照として実施した。反応は、３０μＬのマラカイトグリーン試薬Ａおよび１００μＬの水を各ウェルに添加することによって終了させた。３０μＬのマラカイトグリーン試薬Ｂを各ウェルに添加し、次いで穏やかに撹拌して、室温で２０分間インキュベートすることによって、発色させた。プレートは、マルチウェルプレートリーダーを用いて６２０ｎｍで読み取った。ホスフェート標準を使用して較正曲線を作成し、ＦＴＶＩ酵素の比活性を６０ｐｍｏｌ／分／μｇと決定した。
ＦＴＶＩエクソフコシル化
【００８５】
ＭＳＣを収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％のヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＧＤＰ−フコース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）および６０μｇ／ｍｌの精製ＦＴＶＩ酵素をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に含有するＦＴＶＩ反応バッファー中に、細胞を２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。一部の実験について、「バッファーのみ」対照を、同一の形式であるが、ＦＴＶＩ酵素およびＧＤＰ−フコースを反応から除いて実施した。反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、下流の実験のために直ちに使用した。
フローサイトメトリー
【００８６】
２．５μｌのＨＥＣＡ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＣｓＬｅｘ１−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を９６ウェルプレートの個々のウェルに加えた。ＭＳＣを収集し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中に１×１０６／ｍｌで懸濁し、５０μｌの細胞懸濁液を各ウェルに加えた。４℃で３０分間インキュベートした後、プレートを１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳで洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。蛍光強度を、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して決定した。
強制されたｓＬｅＸ発現、その後のＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションおよびＦＴＶＩエクソフコシル化の時間経過
【００８７】
ＭＳＣは、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトされたもの、ＦＴＶＩエクソフコシル化されたもの、または未処理のままのものであり、アリコートを、ｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２を使用したｓＬｅＸの発現についてのフローサイトメトリー分析のために取り出した。残りの細胞は、Ｔ−２５フラスコ（１群あたり６フラスコ）に継代した。２４時間の間隔で、各群から１つのフラスコを収集し、フローサイトメトリーを、ＨＥＣＡ４５２を使用して実施した。細胞表面ｓＬｅＸ発現の時間経過を、１日ごとに各試料のＨＥＣＡ４５２染色の平均蛍光強度を比較することによって得た。
細胞表面ノイラミニダーゼ処理およびウェスタンブロット分析
【００８８】
未処理、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトされたＭＳＣ（３日目）およびエクソフコシル化されたＭＳＣ（０日目）のＭＳＣを、ＨＢＳＳ＋０．１％ＢＳＡ中に１０７細胞／ｍｌで懸濁し、０．１Ｕ／ｍｌのＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｓｉｅｎｓノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）ありまたはなしで、３７℃で４５分間インキュベートした。次いでＭＳＣを洗浄し、計数し、ペレット化し、−８０℃で凍結した。使用前に、溶解物を、１０５細胞あたり３０μｌの２回の還元ＳＤＳ−試料バッファーを加え、１０分間煮沸することによって調製した。次いで試料を７．５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｔｒｉｓ−ＨＳＣ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移写した。膜を５％ミルクで遮断し、次いでマウスＥ−セレクチンヒト−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ラット抗マウスＥ−セレクチン（クローン１０Ｅ９．６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にコンジュゲートしたヤギ抗ラットＩｇＧで連続的に染色した。全ての染色および洗浄は、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋２ｍＭ  ＣａＣｌ２中で行った。ブロットを、製造業者の指示書に従ってＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ）を使用したケミルミネッセンスにより可視化した。その後、ローディングが等しいことを確認するために、膜を、ウサギ抗ヒトベータ−アクチン（ＰｒｏＳｃｉ）、次いでヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）で染色し、記述されているようにケミルミネッセンスにより可視化した。
ＨＣＥＬＬの免疫沈降およびＥ−セレクチン（Ｅ−Ｉｇ）プルダウン
【００８９】
ＭＳＣは、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトされたもの、ＦＴＶＩエクソフコシル化されたもの、または未処理のままのもの（対照）であり、溶解物を２％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０μｇ／ｍＬのＰＭＳＦ、および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）中で調製した。細胞溶解物を、プロテインＧ−アガロースビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め明瞭にした。ＣＤ４４免疫沈降のために、溶解物を、２Ｃ５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆ１０−４４．２（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、５１５およびＧ４４−２６（いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からなるマウス抗ヒトＣＤ４４モノクローナル抗体のカクテルと共にインキュベートした。Ｅ−セレクチンプルダウンのために、溶解物を、２ｍＭのＣａＣｌ２の存在下で、マウスＥ−Ｉｇと共にインキュベートした。ＣＤ４４免疫沈降物およびＥ−ＩｇプルダウンをプロテインＧ−アガロースビーズを用いて採取し、１．５×還元ＳＤＳ−試料バッファー中での煮沸を介して溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でランし、抗ＣＤ４４抗体２Ｃ５、Ｇ４４−２６およびＦ１０−４４．２、または抗ｓＬｅＸ抗体ＨＥＣＡ４５２を用いてウェスタンブロットした。
細胞表面タンパク質単離
【００９０】
ＭＳＣをフラスコ中でビオチン化し、細胞表面タンパク質を、製造業者の指示書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ細胞表面タンパク質単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して単離した。簡潔に説明すると、未処理ＭＳＣまたはＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトされたＭＳＣをプレートに蒔いて３日後にＰＢＳでリンスし、１０ｍｌのアミン反応性ＥＺ−Ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン試薬を各フラスコに加えた。フラスコを穏やかに４℃で３０分間撹拌し、反応をリシンでクエンチした。細胞を収集し、未処理ＭＳＣの一部をＦＴＶＩでエクソフコシル化した。エクソフコシル化反応後、細胞を洗浄し、溶解した。ビオチン化細胞表面タンパク質を、キットに備えられたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅビーズおよびスピンカラムを使用して単離した。フロースルーを非ビオチン化画分として採取し、結合タンパク質を溶出してビオチン化（細胞表面）画分として採取した。これらの画分をゲル上でランし、ウェスタンブロットを、記述されているようにＥ−Ｉｇキメラおよびベータアクチンについて実施した。
【００９１】
平行平板型フローチャンバー試験
平行平板型フロー実験を、Ｂｉｏｆｌｕｘ−２００システムおよび４８ウェル低剪断マイクロ流体プレート（Ｆｌｕｘｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。マイクロ流体チャンバーを２５０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングし、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ、Ｌｏｎｚａ）を播種し、コンフルエントな単層が形成されるまで、ＥＧＭ−２  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（ＥＧＭ−２培地、Ｌｏｎｚａ）から調製した血管内皮成長培地中で培養した。アッセイ前の４時間に、ＨＵＶＥＣを４０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で活性化してＥ−セレクチン発現を誘導した。ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトされたＭＳＣ、ＦＴＶＩエクソフコシル化されたＭＳＣ、または未処理ＭＳＣを、ＥＧＭ−２培地中に１．０〜１．５×１０６／ｍｌで懸濁し、初めに０．５ダイン／ｃｍ２のずり応力を表す流量とし、１分間隔で１、２、４、８および１６ダイン／ｃｍ２へ増加させながら注入した。１フィールドあたりの捕捉されたローリング細胞の数を、各流量で２つの独立した１０秒間隔について計数し、平均化した。細胞数は、開始細胞数について、０．５ダイン／ｃｍ２の初期注入液で１フィールドあたりに見える細胞の合計数を視覚的に決定し、捕捉された細胞数を１．０×１０６細胞／ｍｌでの細胞数に正規化された開始細胞数に対する割合として表すことによって補正した。そのように、データは、１×１０６細胞／ｍｌ注入液に正規化された１ｍｍ２あたりの捕捉されたローリング細胞の数として表される。フコシル化された細胞の結合の特異性を決定するために、陰性対照を、ＴＮＦαで活性化されていないＨＵＶＥＣを使用して、および抗ＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）抗体（クローン６８−５Ｈ１１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で遮断された活性化ＨＵＶＥＣを用いて実施した。遮断抗体を、ＥＧＭ−２培地中に２０μｇ／ｍｌで懸濁し、ＨＵＶＥＣ上に注入し、２０分間インキュベートしてから洗浄し、フコシル化されたＭＳＣを注入した。ローリング速度は、全てのローリング細胞について各１０秒間隔で移動した距離を測定し、各ずり応力で全てのローリング細胞についてμｍ／秒で測定される速度に変換し、平均ローリング速度を報告することによって計算した。
生体色素染色およびヒトＭＳＣのマウスへの静脈内注入
【００９２】
ＭＳＣを収集し、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡまたはｎｄＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトし、Ｂ１８Ｒを用いてＴ−１７５フラスコに蒔いた。未処理のＭＳＣを同時に継代した。２日後、未処理のＭＳＣを収集し、ＦＴＶＩ−エクソフコシル化または「バッファーのみ」の対照群に分割した。ＦＵＴ６およびｎｄＧＦＰトランスフェクトされたＭＳＣを直接収集した。全ての試料のアリコートを、ＨＥＣＡ４５２のフローサイトメトリー分析のために取り出した。４つの処理のそれぞれからのＭＳＣを２つに分割し、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中に１×１０６細胞／ｍｌで懸濁し、１０μＭのＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤまたはＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＩ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で、３７℃で２０分間染色した。細胞を２回洗浄し、１：１の相反混合物（ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトされたＭＳＣとｎｄＧＦＰ対照をトランスフェクトされたＭＳＣとの１：１混合物、ならびにＦＴＶＩ−エクソフコシル化されたＭＳＣとバッファー対照処理ＭＳＣとの１：１混合物）を調製した。免疫担当ＢＬ／６マウスのペアに各細胞の組合せを後眼窩注入し、各ペアのマウス間で膜色素の組合せを交換した。その後、マウスあたり２ｎｍｏｌのＡｎｇｉｏｓｅｎｓｅ７５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を注入して血管の同時可視化を可能にした。各マウスに注入された細胞混合物のアリコートをＨＥＣＡ４５２−ＦＩＴＣで染色し、ガラススライド上で画像化して、ＦＵＴ６−ｍｏｄまたはＦＴＶＩ−エクソ処理の有効性を確認した。最少で２０のそのような画像（平均４５０個の細胞）を計数して、それぞれのマウスについてＤｉＤおよびＤｉＩ標識ＭＳＣの正確な開始率を得た。開始率が１：１から異なる場合には、補正計数を計算し、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像から得られたホーミング率をそれに応じて調整した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点および２−光子蛍光顕微鏡
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ頭蓋冠骨髄へのＭＳＣホーミングを、イソフルラン麻酔下での動物ライブイメージングのために設計された特注ビデオレート・レーザー走査顕微鏡を使用して画像化した。頭髪を剃り、皮弁を手術で開き、頭蓋冠を露出させた。頭蓋冠領域を生理食塩水で濡らし、６０×１．０ＮＡ水浸対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）下に直接配置した。画像スタックを、シグナル対ノイズ比を強化するためにフレーム平均処理を行いながら、１秒あたり３０フレームで取得した。ＤｉＩ標識ＭＳＣ、ＤｉＤ標識ＭＳＣ、およびＡｎｇｉｏｓｅｎｓｅ７５０標識血管を、共焦点検出スキームを使用して画像化した。骨コラーゲンの第二高調波発生は、フェムト秒パルスＭａｉｔａｉレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）からの８４０ｎｍの光を使用して行った。細胞は組織内約２００μｍの深さまで検出することができた。イメージングは、移植後約２時間および約２４時間で実施した。イメージングセッションの間に、頭皮弁を縫って閉じ、マウスを快復させた。研究は、マサチューセッツ総合病院の施設内動物管理使用委員会の承認の下、動物の管理および使用についての米国の国立衛生研究所のガイドラインに従って行った。
【００９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析
頭蓋冠画像を採取し、３次元スタックとして定量した［Mortensen、２０１３年］。定量のために、頭蓋冠の骨髄にわたる２０の代表的イメージング位置におけるＤｉＤおよびＤｉＩ細胞の数を、各マウスについて手動で計数した。分析は盲検で行い、計数事象を約１０μｍの最小直径に対応させて分析から残骸を排除し、シグナルを用いてＤｉＤおよびＤｉＩの両方のチャネルで自己蛍光事象（他のチャネルの強度の約２×未満の一次チャネルの強度を有するそれらの事象）を除外した。血管外遊出した細胞は、Ａｎｇｉｏｓｅｎｓｅ標識血管から完全に区別される細胞（すなわち、細胞の部分が、いずれの血管のいずれの部分とも重複していない）として定義した。各マウスで計数したＤｉＤ対ＤｉＩ染色細胞の比率を計算し、各マウスペアで比較し、同等なホーミングをベースライン率１に割り当てた。したがって、対照ＭＳＣと比較した処理ＭＳＣのホーミングの倍率変化をマウスの各ペアについて計算し、ホーミング効力を相対的に測定した。４つの異なる初代ＭＳＣ株を表す８マウス（４マウスペア）を処置ごとに画像化した。
（実施例２）
ＭＳＣ特性評価
【００９５】
初代骨髄由来ＭＳＣを、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６およびＣＤ１６６を含むマーカーのパネルについて評価した。ＭＳＣは、ＭＳＣマーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について一様に陽性であり、ＣＤ１０６について微かであり、内皮細胞マーカーＣＤ３１ならびに造血マーカーＣＤ３４およびＣＤ４５について陰性であった（図１Ａ）。このマーカー発現プロファイルは、試験した７つの初代ＭＳＣ株全てにわたって一貫していた（図１Ｂ）。２つの初代ＭＳＣ株を、脂肪形成および骨形成系統へ分化する能力について試験した（代表的画像を図１Ｃに示す）。
（実施例３）
ｓＬｅＸ表面発現は、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクション後２〜３日でピークとなり、ＦＴＶＩエクソフコシル化の場合よりもゆっくりと低下する。
【００９６】
細胞表面Ｅ−セレクチンリガンド発現についての最適な時間点を決定するために、本発明者らは、ＭＳＣのＦＴＶＩエクソフコシル化とＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションとの間のフローサイトメトリーによるｓＬｅＸ表面発現の動態を比較した。予想されるように、エクソフコシル化された細胞は、処理後すぐに最大表面ｓＬｅＸに達し、２４時間までに４０％へ低下し、４８時間までにほぼゼロのベースラインレベル（すなわち本来のＭＳＣ反応性と同様）に戻った。対照的にＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション２日後に最大細胞表面ｓＬｅＸ発現に達し、３日目まで高レベルを維持し、その後徐々に減少した（図２）。誘導されたｓＬｅＸ発現のこれらの動態に基づいて、エクソフコシル化された細胞を用いた全ての実験は処理後すぐに実施し、一方でＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡ−トランスフェクトされた細胞を用いた実験はトランスフェクション後２〜３日で実施した。
（実施例４）
細胞内および細胞外ＦＴＶＩフコシル化によって誘導されるｓＬｅＸ表面発現は複数の初代ＭＳＣ株にわたって同様で一貫しており、ＭＳＣ特性を変化させない
【００９７】
両方の方法を使用した細胞表面グリカンのフコシル化の全体的な程度を評価するために、本発明者らは、フローサイトメトリーにより総細胞表面ｓＬｅＸレベルを分析した。この分析は、細胞内および細胞外フコシル化細胞の両方で表面ｓＬｅＸ発現のおよそ２ログの増加を明らかにし（図３Ａ）、この結果は、クローン特異的バイアスを除外する第２の抗ｓＬｅＸ  ｍＡｂクローンを使用して確認された（図３Ａ）。ＭＳＣ初代培養物間でいくらかの変動が観察されたが、平均で細胞表面ｓＬｅＸにおける増加は５つの独立した初代ＭＳＣ株を試験したときに両方の方法について同様であった（図３Ｂ）。ＦＴＶＩフコシル化のいずれかの方法がＭＳＣ生物学的特徴に影響を与えたかどうかを決定するために、本発明者らは、フコシル化前後のいくつかの重要な特性を調べた（図４Ａ〜図４Ｄ）。本発明者らは、ＭＳＣ生存率が、細胞内または細胞外フコシル化によって有意に減少しなかったこと（図４Ａ）、ならびにＭＳＣマーカーのパネルが、フコシル化直後に測定したとき（図４Ｂ、図４Ｃ）またはさらなる継代を培養したとき（すなわち５〜１１日）（図４Ｃ）のいずれも変化しなかったことを観察した。最後に、本発明者らは、処理された細胞を骨芽細胞系統または脂肪形成系統に向けて分化させたが、分化における視覚的差異は観察できなかった。骨芽細胞分化の定量は、細胞内および細胞外でフコシル化されたＭＳＣとそれらのそれぞれの対照との間に有意差がないこと、ならびに未処理ＭＳＣと比較して減少がないこと（図４Ｄ）を明らかにした。
（実施例５）
細胞内および細胞外フコシル化によって生成されたＥ−セレクチンリガンド糖タンパク質の比較分析
【００９８】
ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションおよびＦＴＶＩ−エクソフコシル化によって生成されたＥ−セレクチンリガンド糖タンパク質のアイデンティティおよび細胞局在を分析するために、本発明者らは、Ｅ−セレクチン−Ｉｇキメラ（Ｅ−Ｉｇ）をプローブとして使用してウェスタンブロットを実施した。細胞外でフコシル化されたＭＳＣからの溶解物は、主にＨＣＥＬＬに対応するサイズの約８５ｋＤ［Sackstein、２００９８］、および現状未特定の糖タンパク質の約６０ｋＤにＥ−Ｉｇ反応バンドを示した（図５Ａ）。約８５ｋＤのバンドが実際にＨＣＥＬＬであるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＣＤ４４を免疫沈降させ、ＨＥＣＡ４５２でブロットし、逆にＥ−Ｉｇを使用してＥ−セレクチンリガンドを単離し、ＣＤ４４でブロットした（図６Ａ〜図６Ｂ）。ＨＣＥＬＬと約６０ｋＤのバンドの両方が、細胞内でフコシル化されたＭＳＣの溶解物に同様に存在したが、より大きな分子量のＥ−Ｉｇ反応性バンドも、これらの溶解物で非常に大きな強度で観察され、ＦＴＶＩがその天然の細胞内状況で存在するとき、さらなる糖タンパク質基質がフコシル化にアクセス可能であることを示唆する（図５Ａ）。Ｅ−Ｉｇ反応性タンパク質の細胞局在を決定するために、インタクト細胞のノイラミニダーゼ処理を実施して全ての細胞表面糖タンパク質からｓＬｅＸを除去した。予想されるように、細胞外でフコシル化された細胞のノイラミニダーゼ処理後にＥ−Ｉｇ反応性糖タンパク質は残らず、全てが細胞外に局在したことが示された。細胞内でフコシル化された細胞（３日目）では、約６０ｋＤおよび約８５ｋＤの検出可能なＥ−Ｉｇ反応性タンパク質の全てが細胞外であったが、より大きなＥ−Ｉｇ反応性タンパク質の一部はノイラミニダーゼ処理後も依然として存在しており、細胞内局在を示唆した（図５Ｂ）。この傾向は、約６０ｋＤおよび約８５ｋＤのバンドが、より大きなＥ−Ｉｇ反応性タンパク質と比較して、アクセス可能な細胞表面タンパク質で大きな比率を占めることを明らかにした細胞表面ビオチン化実験（図７）によって裏づけられた。
（実施例６）
細胞内および細胞外フコシル化は、流体剪断条件下で、Ｅ−セレクチンリガンド媒介性ＭＳＣ捕捉、係留およびローリングを同様に可能にする
【００９９】
ｓＬｅＸはＥ−セレクチンにとって重要な結合決定因子であるので、ＨＥＣＡ４５２およびｃｓＬｅｘ１反応性の劇的な増加は、細胞内および細胞外フコシル化の両方が、処理されたＭＳＣに対する機能的Ｅ−セレクチン結合活性を可能にすることを示唆する。Ｅ−セレクチン結合活性を直接評価するために、本発明者らは、フコシル化されたＭＳＣおよび未処理ＭＳＣが、ＴＮＦαを用いた処理によってＥ−セレクチンを発現するように刺激されたＨＵＶＥＣ単層上において流体剪断条件下で捕捉、係留およびローリングを起こす能力を調べた。未処理のＭＳＣは、いかなるずり応力のレベルでも、刺激されたＨＵＶＥＣとほとんどまたは全く相互作用を示さず、Ｅ−セレクチンリガンド発現の欠如と一致していた。対照的に、細胞内でおよび細胞外でフコシル化されたＭＳＣの両方は、４ダイン／ｃｍ２までのずり応力レベルで、ＴＮＦα刺激ＨＵＶＥＣ単層上において捕捉、係留およびローリングを起こす能力が大きく強化された（図８Ａ）。細胞外でフコシル化されたＭＳＣと細胞外でフコシル化されたＭＳＣとの間でローリング細胞の数（図８Ａ）またはローリング速度（図８Ｂ）に有意差は観察されず、ＦＡＣＳによって観察された表面ｓＬｅＸの同様な増加レベルは、処理されたＭＳＣで得られるＥ−セレクチンリガンド活性に相応する機能的改善を正しく予測していることが示唆された。非刺激のＨＵＶＥＣまたは抗Ｅ−セレクチン遮断モノクローナル抗体で処理されたＨＵＶＥＣでは、フコシル化されたＭＳＣとの捕捉、係留またはローリング相互作用は支持されず、これらの相互作用がＥ−セレクチン単独に媒介されたものであることが確認された。
（実施例７）
細胞内でおよび細胞外でフコシル化されたＭＳＣの両方が、未処理のＭＳＣよりも効率的に頭蓋冠骨髄に蓄積する
【０１００】
ＦＡＣＳによって観察された細胞表面ｓＬｅＸ、ウェスタンブロットによって観察されたＥ−Ｉｇ反応性ならびにＴＮＦα刺激ＨＵＶＥＣで観察された捕捉／係留およびローリングの劇的な増加は、集約的に細胞内および細胞外フコシル化の両方がＭＳＣで作動性のＥ−セレクチンリガンドを生成できることを示す。Ｅ−セレクチンリガンドにおけるこれらの差異がｉｎ  ｖｉｖｏで機能的に関連するかどうかを決定するために、本発明者らは、マウス宿主の頭蓋冠における細胞トラッキングのための生体内共焦点多光子顕微鏡を使用して、それらのｉｎ  ｖｉｖｏの骨髄ホーミング特性を調べた［Levy、２０１３年；Mortensen、２０１３年］。細胞内または細胞外でフコシル化されたＭＳＣを、対応する非フコシル化対照細胞と共に、それぞれ細胞表面色素ＤｉＤまたはＤｉＩで染色し、１：１の相反細胞混合物（処理対対照）を調製した。マウスのペアに各細胞の組合せを移植し、各ペアのマウス間で膜色素の組合せを交換した。各マウスに注入された細胞混合物のアリコートをＨＥＣＡ４５２で染色し、ガラススライド上で画像化して、フコシル化の有効性を確認し、正確な開始率を得た（図９）。移植後およそ２時間および再度２４時間で、頭蓋冠を画像化し（図１０Ａ）、ＤｉＤおよびＤｉＩ事象を計数した。対照ＭＳＣと比較して、細胞内および細胞外でフコシル化されたＭＳＣの両方が、移植後２時間で、骨指向性（すなわち骨における蓄積）の有意な増加を実証した（図１０Ｂ）。同じマウスを移植後２４時間で画像化したとき、同様の傾向が観察され、細胞内でフコシル化されたＭＳＣと比較して細胞内でフコシル化されたＭＳＣでさらに有意な細胞数の増加が観察された（図１０Ｃ）。
（実施例８）
細胞内でフコシル化されたＭＳＣは、移植後２４時間で頭蓋冠血管から骨髄実質への有意に大きな血管外遊出を実証する
【０１０１】
移植された細胞の骨髄実質への血管外遊出は、生着のための前提条件である。血管外遊出の程度を評価するために、本発明者らは、近赤外血管色素（Ａｎｇｉｏｓｅｎｓｅ７５０）を注入してマウス血管を可視化し、マルチスタックイメージングを実施した。本発明者らは、移植後２４時間の頭蓋冠を画像化して、血管から周囲の骨髄空間へ明確に血管外遊出したＤｉＩおよびＤｉＤ染色細胞を同定し（図１１Ａ）、対照ＭＳＣと比較して細胞内および細胞外でフコシル化されたＭＳＣの両方が骨髄実質への有意に高まった浸透を示すことを見出した（図１１Ｂ）。さらに血管外遊出における明確な差異が２つの処置間で観察され、移植後２４時間で、細胞内でフコシル化されたＭＳＣは、細胞外でフコシル化されたＭＳＣより２倍多く血管外遊出されるようである（図１１Ｂ）。これらの知見は、ＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡ形質導入のＥ−セレクチンリガンドの持続的（すなわち２日目より長い）存在（図２）がｉｎ  ｖｉｖｏの状況で細胞ホーミングおよび血管外遊出の機能的改善を生じることを示唆する。
（実施例９）
考察と結論
考察
【０１０２】
ＭＳＣは、臨床的影響の大きな可能性を持つ細胞治療の道筋である。世界的に５００を超える過去および現在の登録された臨床試験において、ＭＳＣが、骨疾患（例えば、骨粗鬆症、骨形成不全）、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、多発性硬化症）、および炎症性疾患（例えば、心筋梗塞、潰瘍性大腸炎）［clinicaltrials.gov、２０１５年１２月にアクセス］を含む広範囲の症状を処置するための試みにおいて利用されている。しかしながら、ＭＳＣ移植は十分に耐用性があるが、臨床的転帰は一般的に期待外れである［Griffin、２０１３年；Galipeau、２０１３年］。ＭＳＣの臨床的有効性を制限する未解決の主要な課題は、その意図する標的部位（単数または複数）に、移植されたＭＳＣを有効に送達することである。傷害／疾患器官へのＭＳＣの直接注入はいくつかの適応症で可能であるが、このアプローチは侵襲性で、付随的な組織損傷をもたらす可能性がある。さらに、特定の器官または多焦点もしくは全身症状に対して、局所注入は実行困難であり、有効な部位特異的局在化を可能にするために、細胞の血管送達を最適化するための戦略が必要である。
【０１０３】
ＭＳＣホーミングを制限する主要な欠点の１つは、Ｅ−セレクチンリガンド発現の欠如である。Ｅ−セレクチンリガンドを用いてＭＳＣを操作する試みにおいて、様々なアプローチ、例えば、細胞膜への共有結合性ペプチドの連結［Cheng、２０１２年］、およびＥ−セレクチンリガンド融合タンパク質［Lo、２０１６年］またはｓＬｅＸ被覆ポリマービーズ［Sarkar、２０１１年］の非共有結合性カップリングなどが利用されてきた。しかしおそらく最も生理学的に妥当なアプローチは、末端シアリル化ラクトサミンを正規のセレクチン結合決定基であるｓＬｅＸに変換する能力が本来的に強力かつ特異的なヒトアルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ酵素の力を利用することである。本発明者らは、以前に、ＭＳＣの細胞表面をエクソフコシル化し、そのようにＥ−セレクチンリガンドＨＣＥＬＬを生成し、骨へのホーミングを改善するための精製されたＦＴＶＩの使用を記載した［Sackstein、２００９年］。エクソフコシル化は、臍帯造血細胞［Xia、２００４年；Wan、２０１３年；Popat、２０１５年］、調節性Ｔ細胞［Parmar、２０１５年］および神経幹細胞［Merzaban、２０１５年］を含む他の細胞型のセレクチン媒介性ホーミングおよび生着を強化するためにも採用されている。対照的に、ＭＳＣにおいて細胞内でフコシルトランスフェラーゼを生成するためのｍｏｄＲＮＡの使用は新しく、比較的未開拓である。今日までの唯一の研究では、ヒトＭＳＣが、ＦＴＶＩＩ、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）および抗炎症性サイトカインインターロイキン１０（ＩＬ−１０）をコードするｍｏｄＲＮＡを同時トランスフェクトされた。これらの三重にトランスフェクトされた細胞をマウスに異種移植したとき、骨髄ホーミングのわずかな強化が、皮膚炎症モデル［Levy、２０１３年］および実験的自己免疫性脳脊髄炎モデル［Liao、２０１６年］における適度な改善と共に報告されている。しかし、実験設計の性質（すなわち３つの遺伝子を同時発現するためにｍｏｄＲＮＡを同時トランスフェクトしている）、ならびに方法論の差異（異なるフコシルトランスフェラーゼ、異なる前臨床モデル）により、結果を、エクソフコシル化を採用する他の試験からの結果と比較することは困難である。特に、ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションによって生成されるＥ−セレクチンリガンドが細胞外フコシルトランスフェラーゼの作用によって生成されるＥ−セレクチンリガンドとアイデンティティおよび機能において類似しているかどうか、および得られるホーミング効率において何らかの差異が明らかにされるかどうかをこれらの試験から決定することはできなかった。
【０１０４】
本明細書における本発明者らの結果は、ｓＬｅＸレベルによって測定されるように（すなわちｍＡｂ  ＨＥＣＡ４５２に対する反応性によって評価されるように）、および熱力学的剪断条件下でのサイトカイン刺激ＨＵＶＥＣに対するＥ−セレクチン媒介性捕捉／係留／ローリング活性を評価することによって確認されるように、複数のヒトＭＳＣの初代培養物にわたって、細胞内および細胞外フコシル化方法が、細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドの生成について同様に強力であることを示す。産生されるある特定のＥ−セレクチンリガンド糖タンパク質の量および細胞局在は、２つの方法間でわずかに異なっており、細胞内フコシル化は、細胞内および細胞外の両方に存在するいくらかのさらなるＥ−セレクチン結合糖タンパク質をもたらす。さらなる細胞内タンパク質が、細胞内に通常は局在する新規なｓＬｅＸ保持糖タンパク質であるか、または細胞表面提示の輸送のための前駆体（すなわち、さらに翻訳後修飾を受けるか、顆粒に保存されるかもしくは細胞表面に往復されるプロセスにあるタンパク質）であるかは、まだ決定されていない。２つの方法間の最も顕著な相違は、細胞表面におけるＥ−セレクチンリガンド提示の動態であった。ピークのｓＬｅＸは、細胞外フコシル化の直後に観察され、１〜２日で急速に低下したが、細胞内フコシル化では、ｓＬｅＸは４８時間でピークに達し、その後、より緩やかに低下した。さらに、両方の方法が、対照ＭＳＣと比較して骨指向性を有意に増加させたが、全体的な骨髄ホーミング、特に遊出におけるより大きな増加が、移植後２４時間のｉｎ  ｖｉｖｏの細胞内でフコシル化された細胞について観察された。エクソフコシル化直後またはｍｏｄＲＮＡトランスフェクション後２日目に注入された事実を考慮すると、細胞表面に残るＥ−セレクチンリガンドの顕著に異なるレベルが２４時間後にこれらの差異に寄与している可能性がある。この作用の分子的根拠を決定するためにさらなる研究が正当化されるが、ゴルジにおけるグリカンアクセプターのアクセス可能性および／または細胞内グリコシル化産物の膜分布の差異を高めることも関連し得る。
【０１０５】
本発明者らの知見は、ヒトＭＳＣおよび他の目的の細胞（例えば、幹細胞、組織プロジェニター細胞または白血球の他の種類）を使用する将来の臨床適用に情報を与えるために重要である。ＦＴＶＩエクソフコシル化およびＦＵＴ６−ｍｏｄＲＮＡトランスフェクションの両方がシンプルで、一過性で、かつ非組み込み性であることから、理想的な糖操作戦略である。本明細書に記載の細胞内グリコシル化後のＥ−セレクチンリガンド発現のより長い期間ならびに関連するホーミングおよび遊出特性における改善に加えて、このアプローチの実用的な利点は、ＦＴＶＩ酵素およびＧＤＰ−フコースが細胞産物であり、したがって可溶性組換え酵素の精製およびＧＤＰ−フコースの合成に関連する労力および費用がないことである。さらに、ＦＴＶＩ酵素は、その天然の細胞状況に局在している（すなわち、ゴルジ膜に埋め込まれている）ので、さらなるアクセプター基質がフコシル化のためにアクセス可能である。一方、細胞外フコシル化の実用的利点は、処置の迅速性（したがって細胞のさらなる培養の回避）、ゴルジグリコシル化ネットワークの潜在的な破壊の回避、ならびに核酸を細胞に導入することに伴うリスク、例えば限定されないが細胞の抗ウイルス防御機構の活性化などのリスクがないことが挙げられる。さらに、他の（すなわち非ＭＳＣの）臨床的に適切な細胞のフコシル化を考慮するとき、エクソフコシル化は、その細胞表面にシアリル化ラクトサミンを保持する任意の細胞型に容易に適用可能であり、このことは、細胞表面ｓＬｅＸ発現を強制するために必要なフコシルトランスフェラーゼ（単数または複数）をコードする核酸（ｍｏｄＲＮＡなど）を容易にトランスフェクト可能な細胞型または細胞表面ｓＬｅＸ発現を強制するために必要な関連するフコシルトランスフェラーゼ（単数または複数）をコードする核酸が他の手段（例えば、ウイルスベクターを介した形質導入）によって導入することができる細胞型に限定される細胞内フコシル化（または他の細胞内グリコシルトランスフェラーゼ修飾）とは対照的である。しかしながら、トランスフェクトまたは形質導入され得るこれらの細胞において、細胞表面ｓＬｅＸ発現を強制するために必要なグリコシルトランスフェラーゼ（単数または複数）をコードする関連する核酸配列の導入は、細胞表面ｓＬｅＸ発現を生じるおよび／または増強するための細胞表面（細胞外）フコシル化と組み合わせることができる。そのようなコンビナトリアル戦略は、本発明の範囲内に包含される。
【０１０６】
本発明者らは、フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸（例えば、ｍｏｄＲＮＡ）の導入を介する細胞内フコシル化を、フコシルトランスフェラーゼ媒介性エクソフコシル化プロセスと組み合わせると、細胞におけるＥ−セレクチンリガンド活性の実質的により高い（およびより延長された）発現がもたらされ得ることに気づく。多くの場合に、細胞表面ｓＬｅＸの発現を強制するためにグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸の導入は、例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞、および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む臨床的に関連する細胞型の多様な集団に有用であり得る。成体幹細胞としては、骨髄、臍帯血、脂肪組織、胎盤組織、皮膚、筋肉、肝臓、膵臓、神経組織、目の組織からを含む任意の臨床的に関連する部位から得られる幹細胞、および実際に、外胚葉、内胚葉または間葉細胞系統から誘導される任意の細胞型からの幹細胞が挙げられる。したがって特定の臨床適用（単数または複数）に依存して、細胞内または細胞外フコシル化アプローチの有用性が好まれ得る。
【０１０７】
フコシル化を介するＥ−セレクチン相互作用を最大化することが、骨指向性を改善するための有効な戦略であり、炎症性障害（例えば、糖尿病および関節リウマチなどの自己免疫疾患）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症）、心血管疾患、虚血症状およびがんを含むがそれらに限定されない幅広い医学的障害を処置するために有用であり得ることは、今や明らかである。しかしながら、ＭＳＣおよび目的の他の細胞（例えば、他の種類の幹細胞、組織プロジェニターまたは白血球）は、ホーミングおよび／または関連する細胞型への分化をさらに改善するために他の方法で改変されてもよい。例えば、ＭＳＣへアレンドロネートを固定すること［Yao、２０１３年］、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ４など）の発現を上方調節することにより組織への細胞遊走を改善すること［Wynn、２００４年；Shi、２００７年；Jones、２０１２年］、およびインテグリンのレベルまたは活性を増加させることにより骨への強固な接着および分化を改善すること［Kumar、２００７年；Srouji、２０１２年；Hamidouche、２００９年］によって、ＭＳＣの骨表面保持を改善する試みがなされてきた。ホーミング、生着および分化プロセスの各段階でＭＳＣまたは他の関連する細胞の関与を強化するために、将来のトランスレーショナルな試みが、特定のおよび段階的形式で複数のホーミングおよび分化アプローチを組み合わせようとすることは合理的であると思われる。このように、フコシル化は、全ての細胞ベースの治療の臨床的有用性を最大化するためのコンビナトリアルなアプローチの重要な一態様として使用することができる。
【０１０８】
本発明者らは、さらにフコシル化、特に、ｍｏｄＲＮＡプロセスまたは関連するα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を導入する他の手段を介してＥ−セレクチン相互作用を最大化することが、直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、リンパ腫等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、移植片対宿主病、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患、紅斑性狼蒼、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、アルツハイマー病等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性状態（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等）によって開始されるものを含むがこれらに限定されない多数の医学的障害を処置または改善するためにおそらく有効な戦略であると考える。
【０１０９】
本開示はさらに、フコシル化を介して、特にｍｏｄＲＮＡプロセスを使用してＥ−セレクチン相互作用を最大化することによる、Ｅ−セレクチンが罹患組織の内皮ベッドにおいて発現されおよび／またはＬ−セレクチン発現白血球が罹患組織において浸潤／蓄積している疾患、障害または病状の処置を対象とする。前述のとおり、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンは、シアル化、フコシル化炭水化物にそれぞれ結合し、細胞表面上のこれらのシアロフコシル化グリカン構造の強制的な発現は、これらのセレクチンに対する結合をプログラムするのに役立つ。したがって、本開示は、投与された細胞上のＥ−セレクチンリガンドの発現を増大させることにより標的組織へのホーミングを増大する方法について記述し；さらに、投与された細胞上の強力なＥ−セレクチンおよびＬ−セレクチンリガンド（ＨＣＥＬＬなど）の発現を増大して、血管内皮細胞上のＥ−セレクチンへのおよび／または罹患組織内の組織浸潤白血球上のＬ−セレクチンへの附着を促進する方法について記述し、本開示は、生物学的効果が意図される関連する組織微環境内の細胞の定着／付着を増大させる手段を提供する。一般に、本明細書に記述される方法は、免疫療法適用（例えば、がんまたは感染性疾患適用のために培養により増大された抗原特異性Ｔ細胞および／もしくは培養により増大されたＮＫ細胞の投与、培養により増大されたキメラ抗原受容体［ＣＡＲ］Ｔ細胞の投与、抗原パルスされた樹状細胞の投与等）、免疫調節性／免疫抑制性治療適用（例えば、培養により増大された調節性Ｔ細胞［Ｔｒｅｇ］の投与、抗原パルスされた樹状細胞の投与、間葉系幹細胞の投与、培養により増大されたＮＫＴ細胞の投与等）、または組織修復／再生医学適用（例えば、組織再生／回復のための幹および／または前駆細胞または他の組織修復細胞の使用；組織再生／回復のための培養により増大された幹細胞および／または培養により増大された前駆細胞の使用）においても、細胞ベースの任意の治療的手法の転帰を改善する有用性を有する。再生医学適用における有用性に伴い、投与された細胞は、組織特異的細胞を生じる長期の生着（付随して増殖／分化を伴う）によって標的組織を再生するのにそれ自体寄与することができ（例えば、血液細胞産生のための造血幹細胞の移植においてなど）、および／または長期の生着もしくは分化なしに組織常在細胞に組織回復／修復効果をもたらすことができる（例えば、常在幹／前駆細胞を刺激して損傷組織を修復する栄養作用をもたらすことによっておよび／または傷害を促進し、修復を妨げる炎症過程を弱めることによって）ものと理解される。本明細書に記述される全ての適応に対する全ての適用は、単独でまたは促進剤（例えば、成長因子、組織骨格等）と組み合わせて使用され得る。直接的な組織傷害（例えば、熱傷、外傷、骨折、骨奇形、褥瘡性潰瘍等）、虚血／血管事象（例えば、心筋梗塞、脳卒中、ショック、出血、凝血障害等）、感染症（例えば、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、膀胱炎、敗血症、ＳＩＲＳ等）、異常増殖（例えば、乳がん、肺がん、前立腺がん、腎細胞がん、リンパ腫、白血病等）、免疫学的／自己免疫症状（例えば、急性または慢性ＧＶＨＤ、多発性硬化症、糖尿病、炎症性大腸疾患［例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎］、関節リウマチ、乾癬等）、変性疾患（例えば、骨粗鬆症、変形関節炎、椎間板変性、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症等）、先天的／遺伝的疾患（例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ハンチントン舞踏病等）、薬物副作用（例えば、化学療法により誘導される組織／臓器毒性、放射線療法毒性、薬物により誘導される肝炎、薬物により誘導される心傷害等）、毒性傷害（例えば、放射線被曝、化学的曝露、アルコール性肝炎、アルコール性膵炎、アルコール性心筋症、コカイン心筋症等）、代謝異常（例えば、尿毒症性心膜炎、代謝性アシドーシス等）、医原性症状（例えば、放射線により誘導される組織傷害、手術関連合併症等）および／または特発性の過程（例えば、筋萎縮側索硬化、パーソネイジ−ターナー症候群等）によって開始されるものを含むがこれに限定されない付随する炎症（例えば、急性および／または慢性）を有する疾患、障害もしくは病状、組織傷害／損傷または新生物症状の全ては、本明細書に記述される方法により処置され得る。本明細書に記述される方法によって処置され得る他の一般的なおよび特定の疾患、障害または病状には、これに限らないが、以下がある：
急性白血病（例えば、急性二形質性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性未分化白血病）；
骨髄異形成症候群、例えば、アミロイドーシス慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、難治性貧血（ＲＡ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ−Ｔ）および環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）；
骨髄増殖症候群、例えば、急性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生（骨髄線維症）、本態性血小板血症、慢性骨髄性白血病および真性多血症；
食細胞障害、例えば、チェディアック−東症候群、慢性肉芽腫症、白血球接着不全症、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、好中球アクチン欠損症および細網異形成症；
リソソーム蓄積症、例えば、副腎白質ジストロフィー、アルファマンノシドーシス、ゴーシェ病、ハンター症候群（ＭＰＳ−ＩＩ）、ハーラー症候群（ＭＰＳ−ＩＨ）、クラッベ病、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ−ＶＩ）、異染性白質異栄養、モルキオ症候群（ＭＰＳ−ＩＶ）、ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ細胞病）、ムコ多糖蓄積症（ＭＰＳ）、ニーマンピック病、サンフィリポ症候群（ＭＰＳ−ＩＩＩ）、シャイ症候群（ＭＰＳ−ＩＳ）、スライ症候群、ベータ−グルクロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ−ＶＩＩ）およびウォールマン病；
遺伝的赤血球異常、例えば、ベータ地中海貧血、ブラックファンダイヤモンド貧血、赤芽球癆および鎌状赤血球症；
遺伝的血小板異常、例えば無巨核球症／先天性血小板減少、灰色血小板症候群；
実質器官悪性腫瘍、例えば、脳腫瘍、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、腎細胞癌、肺がん、乳がん、胃がん、食道がん、皮膚がん、口腔がん、内分泌がん、肝臓がん、胆管系がん、膵臓がん、前立腺がんおよび精巣がん；
他の適用、例えば、骨髄移植、心疾患（心筋梗塞）、肝疾患、筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、椎間板疾患／変性、骨疾患、骨折、脳卒中、末梢血管疾患、頭部外傷、水疱性疾患、ミトコンドリア病、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ増大させた幹および前駆細胞集団、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精適用および増大、造血救出事態（Hematopoietic  Rescue  Situations）（強い化学／放射線）、様々な組織起源から得られる幹細胞および前駆細胞、ヒトおよび動物における適用、ならびに四肢再生、再建外科手順／適応、単独または促進剤との組み合わせ；
慢性白血病、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＪＣＭＬ）および若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、
幹細胞障害、例えば、無形成性貧血（重度）、先天性血球減少、先天性角化不全、ファンコニ貧血および発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；
リンパ増殖性疾患、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫および前リンパ球性白血病；
組織球障害、例えば、家族性赤血球食細胞性リンパ組織球症、血球貪食、血球貪食リンパ組織球症、ヒスチオサイトーシスＸ、およびランゲルハンス細胞組織球症；
先天性（遺伝性）免疫系障害、例えば、ＴおよびＢ細胞の非存在、Ｔ細胞の非存在、正常Ｂ細胞ＳＣＩＤ、毛細管拡張性運動失調症、裸リンパ球症候群、分類不能型免疫不全症、ディジョージ症候群、コストマン症候群、白血球接着不全症、オーメン症候群、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏を伴うＳＣＩＤ、ヴィスコットアルドリッチ症候群およびＸ連鎖リンパ増殖性疾患；
他の遺伝性疾患、例えば、軟骨毛髪低形成、セロイドリポフスチン症、先天性造血性ポルフィリン症、家族性地中海熱、グランツマン血小板無力症、レッシュナイハン症候群、大理石骨病およびサンドホフ病；
形質細胞疾患、例えば、多発性骨髄腫、形質細胞白血病およびワルデンストレームマクログロブリン血症；
自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、強直性脊椎炎、真性糖尿病および炎症性大腸疾患。
関節および骨疾患／症状、例えば、椎間板変性、滑膜疾患、軟骨変性、軟骨外傷、軟骨裂傷、関節炎、骨折、骨奇形、骨再建、骨形成不全症、先天性骨疾患／症状、遺伝的骨疾患／症状、骨粗鬆症。大理石骨病、低ホスファターゼ血症、代謝性骨疾患等。
水疱性疾患、乾癬、湿疹、表皮水疱症、潰瘍性皮膚症状、軟部組織奇形（術後皮膚および軟部組織奇形を含む）、形成外科／再建手術適応等などの皮膚／軟部組織疾患および症状。
【０１１０】
一般に、付随する炎症症候には、発熱、疼痛、水腫、充血、紅斑、挫傷、圧痛、硬直、膨れ、悪寒、呼吸窮迫、血圧低下、高血圧、鼻詰まり、頭重感、呼吸障害、体液貯留、凝血塊、食欲不振、体重減少、多尿、夜間多尿、無尿、呼吸困難、運動性呼吸困難、筋力低下、知覚変化、心拍数増加、心拍数低下、不整脈、多飲、肉芽腫の形成、線維素性、膿、非粘稠性漿液、または潰瘍、があるがこれに限定されない。急性および／または慢性炎症に関連する実際の症候は周知であり、炎症の位置、炎症の原因、炎症の重症度、罹患した組織または器官、および関連障害を含むがそれに限定されない因子を考慮することにより当業者によって決定され得る。
【０１１１】
急性および／または慢性炎症の特定のパターンは、炎症が上皮表面において起こるか、または化膿菌が含まれるなどの場合に、身体に生じる特定の状況の間に見られる。例えば、肉芽腫性炎症は、結核、ライ病、サルコイドーシスおよび梅毒を含むがこれに限定されない、限定されているが多数の疾患から生じる肉芽腫の形成に起因する炎症である。化膿性炎症は、多量の膿をもたらす炎症であり、膿は、好中球、死細胞および体液からなる。ブドウ球菌属などの化膿菌による感染症は、この種の炎症に特徴的である。漿液性炎症は、一般に漿膜の中皮細胞により産生されるが、血漿から得ることができる非粘稠性漿液の大量の滲出に起因する炎症である。皮膚水疱は、このパターンの炎症を例証する。
【０１１２】
潰瘍性炎症は、上皮表面からの組織の壊死性消失に起因し、下層を曝露し、潰瘍を形成する炎症である。
【０１１３】
急性および／または慢性炎症症候は、様々な疾患および障害の根底にある障害の大きく、無関係な群と関連し得る。免疫系は、アレルギー反応、関節炎症状といくつかのミオパチーの両方において実証される急性および／または慢性炎症性障害、異常な炎症をもたらす多くの免疫系障害としばしば関係している。急性および／または慢性炎症過程に病因論の起源がある非免疫性疾患には、がん、アテローム性動脈硬化症および虚血性心疾患がある。症候として急性および／または慢性炎症を呈示する障害の非限定的な例には、ざ瘡、酸逆流／胸やけ、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、アレルギー、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化、貧血、虫垂炎、動脈炎、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫不全、亀頭炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、水疱性天疱瘡、熱傷、滑液包炎、がん、心停止、心炎、セリアック病、蜂巣炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、絨毛羊膜炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（および／またはその急性増悪）、肝硬変、大腸炎、うっ血性心不全、結膜炎、薬物により誘導される組織傷害（例えば、シクロホスファミドにより誘導される膀胱炎）、嚢胞性線維症、膀胱炎、感冒、涙腺炎、褥瘡性潰瘍、認知症、皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー、糖尿病潰瘍、消化器疾患、湿疹、気腫、脳炎、心内膜炎、内分泌障害、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、線維筋痛、線維形成、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、糸球体腎炎、舌炎、心疾患、心臓弁機能不全、肝炎、化膿性汗腺炎、ハンチントン舞踏病、高脂血症膵臓炎、高血圧、回腸炎、感染症、炎症性大腸疾患、炎症性心臓肥大症、炎症性神経病変、インスリン抵抗性、間質性膀胱炎、間質性腎炎、虹彩炎、虚血、虚血性心疾患、角膜炎、角結膜炎、喉頭炎、狼瘡性腎炎、黄斑変性、乳腺炎、乳様突起炎、髄膜炎、代謝症候群（症候群Ｘ）、片頭痛、粘膜炎、多発性硬化症、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、ニューロン炎、非アルコール性脂肪肝、肥満、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨軟骨炎、骨減少、骨髄炎、骨粗鬆症、骨炎、耳炎、膵炎、パーキンソン病、耳下腺炎、骨盤炎症性疾患、尋常性天疱瘡（pemphigus  vularis）、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、胸膜炎、肺炎、多嚢胞腎炎、直腸炎、前立腺炎、乾癬、歯髄炎、腎盂腎炎、門脈炎、放射線により誘導される傷害、腎不全、再灌流傷害、網膜炎、リウマチ熱、鼻炎、卵管炎、サルコイドーシス、唾液腺炎、副鼻腔炎、直腸痙攣、鬱血性皮膚炎、狭窄、口内炎、脳卒中、外科合併症、滑膜炎、腱炎、腱症、滑液鞘炎、血栓性静脈炎、甲状腺炎、扁桃炎、外傷、外傷性脳傷害、移植拒絶反応、三角炎、結核、腫瘍、潰瘍、尿道炎、ウルシティス（ursitis）、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎および陰門炎があるがこれに限定され
ない。
【０１１４】
急性および／または慢性炎症をもたらし得るさもなければ原因になり得る疾患、障害および外傷の一般的な区分には、遺伝的疾患、異常増殖、直接組織傷害、自己免疫疾患、感染性疾患、血管疾患／合併症（例えば、虚血／再灌流傷害）、医原性の原因（例えば薬物有害作用、放射線傷害等）およびアレルギー性徴候があるが、これに限定されない。
【０１１５】
一実施形態において、急性および／または慢性炎症は組織炎症を含む。一般に、組織炎症は、特定の組織もしくは器官に限定される急性および／または慢性炎症である。したがって、例えば、組織炎症は、皮膚の炎症、筋肉の炎症、腱の炎症、靭帯の炎症、骨の炎症、軟骨／関節の炎症、肺の炎症、心臓の炎症、肝臓の炎症、胆嚢の炎症、膵臓の炎症、腎臓の炎症、膀胱の炎症、歯肉の炎症、食道の炎症、胃の炎症、腸の炎症、肛門の炎症、直腸の炎症、血管の炎症、腟の炎症、子宮の炎症、精巣の炎症、陰茎の炎症、外陰の炎症、ニューロンの炎症、口腔の炎症、眼の炎症、耳の炎症、脳の炎症、心室／髄膜（meningial）の炎症および／または中枢もしくは末梢神経系細胞／エレメントを含む炎症を含み得
る。
【０１１６】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、全身性炎症を含む。組織炎症と同一でなくても含まれる過程は類似しているが、全身性炎症は、特定の組織に限られず、むしろ上皮、内皮、神経組織、漿膜表面および器官系を含めた身体の複数部位を含む。それが感染症による場合、用語敗血症は、細菌敗血症に特異的に適用される菌血症およびウイルス敗血症に特異的なウイルス血症で使用され得る。血管拡張および器官機能不全は、敗血症性ショックおよび死亡に至る場合がある広範囲にわたる感染と関連する深刻な問題である。
【０１１７】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は関節炎により誘導される。関節炎は、例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎の様な脊椎関節症、反応性関節炎（ライター症候群）、乾癬性関節炎、炎症性大腸疾患と関連する腸炎性関節炎、ウィップル病およびベーチェット病、化膿性関節炎、痛風（痛風関節炎、結晶性滑膜炎、代謝性関節炎とも一般に呼ばれる）、偽痛風（ピロリン酸カルシウム沈着症）、およびスティル病を含めた滑膜の炎症による、身体の関節への損傷を含む症状の一群を含む。関節炎は、単一の関節（単関節炎）、２〜４つの関節（少数関節炎）または５つもしくはより多くの関節（多発関節炎）に罹患することがあり、自己免疫疾患または非自己免疫疾患のいずれかであることができる。
【０１１８】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、自己免疫不全により誘導される。自己免疫疾患は、各疾患の主要な臨床病理的特徴に応じて、全身性および器官特異性自己免疫不全に大まかに分割され得る。全身性自己免疫疾患には、例えば、全身性紅斑性狼蒼（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチおよび多発筋炎がある。局所自己免疫疾患には、内分泌性（１型真性糖尿病、橋本病、アジソン病等）、皮膚病学的（尋常天疱瘡）、血液学的（自己免疫溶血性貧血）、神経性（多発性硬化症）があり、または体組織の任意の限局性の塊を実質的に含み得る。自己免疫障害の型には、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、アレルギーまたは過敏症、筋萎縮側索硬化（ＡＬＳ）、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、関節炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性膵炎、水疱性天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（その急性増悪を含む）、１型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、子宮内膜症、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）、間質性膀胱炎、狼瘡（円板状エリテマトーデス、薬物により誘導される紅斑性狼蒼。狼瘡性腎炎、新生児狼瘡、亜急性皮膚エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスを含める）、限局性強皮症、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、ミオパチー、ナルコレプシー、神経性筋強直、尋常天疱瘡、悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、再発性播種性脳脊髄炎（多相性播種性脳脊髄炎）、リウマチ熱、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、滑液鞘炎、血管炎および白斑があるがこれに限定されない。特定の一実施形態において、急性および／または慢性炎症は、対象の糖尿病に起因する、さもなければそれにより引き起こされる。別の特定の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、対象の多発性硬化症に起因する、さもなければそれにより引き起こされる。
【０１１９】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、ミオパチーにより誘導される。一般に、ミオパチーは、免疫系が筋肉の構成要素を不適切に攻撃する場合に引き起こされ、筋肉に炎症をもたらす。ミオパチーには、例えば、炎症性ミオパチーおよび自己免疫性ミオパチーがある。ミオパチーには、例えば、皮膚筋炎、封入体筋炎および多発筋炎がある。
【０１２０】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、血管炎により誘導される。血管炎は、白血球遊走ならびにその結果として生じる損傷による、静脈（静脈炎）、動脈（動脈炎）および毛細管の様なリンパ管および血管を含めた血管壁の炎症を特徴とする様々な群の障害である。炎症は、身体の任意の場所の、任意のサイズの血管に罹患し得る。それは、動脈および／または静脈のいずれにも罹患し得る。炎症は、血管内の単一の位置に罹患することを意味する巣状であることができ、または炎症は、特定の器官もしくは組織全体に点在する炎症の領域で広範囲にわたることができ、または身体の２つ以上の器官系に罹患することもできる。血管炎には、バーガー病（閉塞性血栓性血管炎）、脳血管炎（中枢神経系血管炎）、ＡＮＣＡ関連血管炎、チャーグストラウス動脈炎、クリオグロブリン血症、本態性クリオグロブリン血症性血管炎、巨大細胞（側頭）動脈炎、ゴルファーの血管炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、過敏性血管炎（アレルギー性血管炎）、川崎病、顕微鏡的多発性動脈炎／多発血管炎、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛（ＰＭＲ）、リウマトイド血管炎、高安動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、再発性多発性軟骨炎、ベーチェット病の様な結合組織障害、または他の結合組織障害に伴う血管炎、ウイルス感染症に伴う血管炎があるがこれに限定されない。
【０１２１】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、皮膚障害により誘導される。皮膚障害には、例えば、尋常性ざ瘡を含めたざ瘡、水疱性類天疱瘡（bullous  phemigoid）、アトピー性皮膚炎ならびに急性および／または慢性光線性皮膚炎を含めた皮膚炎、湿疹様アトピー性湿疹、接触湿疹、乾燥性湿疹、脂漏性皮膚炎、発汗異常症、貨幣状湿疹、静脈湿疹、皮膚炎、疱疹状皮膚炎、神経皮膚炎、および自己湿疹化、および鬱血性皮膚炎、糖尿病性皮膚合併症、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、尋常性乾癬（plaqure  psoriasis）、爪乾癬、滴状乾癬、頭皮乾癬、倒置乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症（erythrodermis  psoriasis）および乾癬性関節炎を含めた乾癬、酒さおよび限局性強皮症を含めた強皮症、潰瘍がある。
【０１２２】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、消化管障害により誘導される。消化管障害には、例えば、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病および潰瘍性大腸炎の様な潰瘍性直腸炎を含めた炎症性大腸疾患、左側結腸炎、全結腸炎ならびに劇症大腸炎がある。
【０１２３】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、心血管疾患により誘導される。ＬＤＬコレステロールが、動脈壁に埋め込まれると、それは免疫応答を呼び起こし得る。急性および／または慢性炎症は、動脈を最終的に損傷する場合があり、それは動脈を破裂させる場合がある。一般に、心血管疾患は、心臓自体ならびに／または血管系、特に心臓へおよび心臓から通じる静脈および動脈に罹患する多くの特異的疾患のうちのいずれかである。例えば、高血圧、心内膜炎、心筋炎、心臓弁機能不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、糖尿病性心臓症状、動脈炎、静脈炎、血管炎の様な血管炎症；動脈硬化および狭窄の様な動脈閉塞疾患、炎症性心臓肥大症、末梢動脈疾患；動脈瘤；塞栓；解剖；偽動脈瘤；血管奇形；血管母斑；血栓症；血栓性静脈炎；拡張蛇行静脈；脳卒中を含めて６０個を超える型の心臓血管障害がある。心臓に罹患する心臓血管障害の症候には、胸痛、または胸部不快感（狭心症）、一方もしくは両腕、左肩、頸部、顎もしくは背中の疼痛、息切れ、眩暈、速い鼓動、悪心、異常な鼓動、疲労感があるがこれに限定されない。脳に罹患する心臓血管障害の症候には、顔面、腕もしくは脚、特に身体の片側における突然の麻痺または脱力、突然の発話もしくは会話の理解の混乱または問題、突然の一方もしくは両眼の視力の問題、突然の眩暈、歩行困難またはバランスもしくは協調の消失、原因不明の突然の激しい頭痛があるがこれに限定されない。脚、骨盤および／または腕に罹患する心臓血管障害の症候には、筋肉の疼痛、痛みまたは痙攣である跛行および特に夜間の足もしくはつま先における冷えまたは麻痺感があるがこれに限定されない。
【０１２４】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、がんにより誘導される。一般に、炎症は、腫瘍の周りの微環境を組織化し、増殖、生存および遊走を助長する。例えば、線維素性炎は、フィブリンが血管を通ることを可能にする血管透過性の大きな増加に起因する。がん細胞など適当な凝血促進性刺激が存在する場合、線維性滲出液は沈着する。沈着は、漿膜間で瘢痕への線維性滲出液の変換が起こり得る漿膜腔において一般に見られ、漿膜の機能を制限する。別の例において、がんは、ＮＦ−κＢ駆動炎症性がんの様な炎症性癌である。
【０１２５】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、薬理学的に誘導される炎症である。重要なビタミンおよびミネラルの欠乏を含めた特定の薬物または外因性化合物が、炎症をもたらすことは公知である。例えば、ビタミンＡ欠乏症は、炎症性応答の増加を引き起こし、ビタミンＣ欠乏症は、結合組織疾患を引き起こし、およびビタミンＤ欠乏症は、骨粗鬆症をもたらす。特定の薬理学的薬剤は、炎症性合併症、例えば、薬物により誘導される肝炎を誘導する可能性がある。コカインおよびエクスタシーなどの特定の違法薬物は、炎症と密接に関連する転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）を活性化することにより、いくつかの有害作用を及ぼし得る。放射線療法は、曝露および投薬の部位によって、肺毒性、熱傷、心筋炎、粘膜炎および他の組織傷害を誘導する可能性がある。
【０１２６】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、感染症により誘導される。感染性生物は、身体の他の部分に伝染することができる場合、循環系またはリンパ系を介して隣接する組織の境界に逃れることができる。生物が、急性炎症の作用に含有されない場合、近傍のリンパ管を経てリンパ系に接近することができる。リンパ管の感染症は、リンパ管炎として公知であり、リンパ節の感染症は、リンパ腺炎として公知である。病原体は、循環系へのリンパ排液によって血流に接近することができる。感染症には、細菌性膀胱炎、細菌脳炎、汎発性インフルエンザ、ウイルス脳炎およびウイルス性肝炎（Ａ、ＢおよびＣ）があるがこれに限定されない。
【０１２７】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、組織または器官傷害により誘導される。組織または器官傷害には、熱傷、裂傷、創傷、穿刺または外傷があるがこれに限定されない。
【０１２８】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、移植拒絶反応により誘導される。レシピエントの免疫系が移植器官または組織を攻撃するので、移植器官または組織が移植レシピエントの身体に受け入れられない場合に移植拒絶反応は起こる。適応免疫応答、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介と体液免疫（抗体）機序の両方によって媒介される。移植拒絶反応は、超急性拒絶反応、急性拒絶反応または慢性拒絶反応に分類することができる。移植器官または組織の急性および／もしくは慢性拒絶反応は、拒絶反応が、よく理解されていない急性および／もしくは慢性炎症性であり、移植組織に対する免疫応答によるところである。移植拒絶反応としては、急性または慢性ＧＶＨＤいずれかの移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）も挙げられる。ＧＶＨＤは、移植された髄において機能的免疫細胞が、レシピエントを「外来である」と認識し、免疫学的攻撃を開始する同種骨髄移植の一般的な合併症である。それは、特定の状況下で輸血において起こる可能性もある。ＧＶＨＤは、急性および慢性形態に分けられる。急性および慢性ＧＶＨＤは、異なる免疫細胞サブセット、異なるサイトカインプロファイル、幾分異なる宿主標的を含むように見え、処置に対して異なる応答を示す。別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、Ｔｈ１媒介性炎症性疾患により誘導される。
【０１２９】
正しく機能している免疫系において、免疫応答により免疫誘起を行うのに適するバランスのとれた炎症誘発性Ｔｈ１応答および抗炎症性Ｔｈ２応答が得られるはずである。一般的に言って、炎症誘発性Ｔｈ１応答が一旦開始されると、身体は、Ｔｈ２応答により呼び起こされる抗炎症性応答を利用して、このＴｈ１応答を打ち消す。この反作用の応答は、アトピーにおけるＩｇＥおよび好酸性応答の促進と関連する、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３、さらに抗炎症性応答を有するＩＬ−１０などのＴｈ２型サイトカインの放出を含む。Ｔｈ１媒介性炎症性疾患は、急性および／または慢性炎症をもたらすＴｈ１細胞により生じる過剰な炎症誘発性応答を含む。Ｔｈ１媒介性疾患は、ウイルス的、細菌的または化学的（例えば、環境的）に誘導され得る。例えば、Ｔｈ１媒介性疾患を引き起こすウイルスは、慢性または急性感染症を引き起こす可能性があり、呼吸器障害またはインフルエンザを引き起こし得る。
【０１３０】
別の実施形態において、急性および／または慢性炎症は、急性および／または慢性神経原性炎症を含む。急性および／または慢性神経原性炎症とは、末梢知覚神経終末から放出されるＳＰもしくはＣＧＲＰの様な炎症性分子の放出によって開始および／または維持される炎症応答（すなわち、これら神経における脊髄への正常な求心性シグナル伝達と対照的に、遠心性機能）のことを指す。急性および／または慢性神経原性炎症には、一次炎症および二次神経原性炎症の両方がある。一次神経原性炎症とは、一次知覚神経終末（ＣおよびＡ−デルタ線維など）からの物質の放出により開始される、またはそれに起因する組織炎症（炎症症候）のことを指す。二次神経原性炎症とは、知覚神経終末を刺激し、神経からの炎症メディエータの放出を引き起こすペプチドまたはサイトカインなど、非ニューロン起源の炎症メディエータ（例えば、肥満細胞または免疫細胞など間質から得られる血管ベッドもしくは組織由来の溢出物）により開始される組織炎症のことを指す。急性および／または慢性神経原性炎症の両方の形態（一次および二次）の正味の作用は、末梢知覚神経線維の感作により維持される炎症状態を有し得る。得られた急性および／または慢性神経原性炎症の生理的結末は、例えば、皮膚痛覚（アロディニア、痛覚過敏）、関節疼痛および／または関節炎、内臓疼痛および機能不全、肺機能不全（喘息、ＣＯＰＤ）ならびに膀胱機能障害（疼痛、過活動膀胱）などを生じる問題とする組織によって決まる。
結論
【０１３１】
本明細書において、本発明者らは、複数の初代ヒトＭＳＣ株を使用して、細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドの一過性の増加、および骨へのＭＳＣホーミングに対するそれらの影響についての、アルファ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ６を使用する２つの別個のアプローチの機能的および生化学的評価を報告する。この研究は、臨床的に関連する実験モデルで同じ酵素を使用する細胞内および細胞外フコシル化の間の最初の直接比較である。未処理のＭＳＣと比較して、細胞内および細胞外フコシル化の両方が、試験した初代ＭＳＣ株の全てにおいて、細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドを顕著に増加させ、骨指向性を改善し、これらのアプローチが複数のＭＳＣドナーにわたって一貫し、妥当なものであることを示している。注目すべきことに、移植後２４時間で、全体的骨指向性および血管外遊出のレベルは、細胞外フコシル化よりも細胞内フコシル化で有意に高かった。この知見は、細胞外でフコシル化されたＭＳＣと対比して細胞内でフコシル化されたＭＳＣの細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドのより持続的な発現と増加した多様性をおそらく反映している。まとめると、これらの結果は、フコシル化を強制するためのこのシンプルで非永続的な戦略が、移植されたＭＳＣのホーミングの増強に使用し得るものであることを示している。
引用された文献
【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【０１３２】
本出願で引用された全ての文献は、本明細書で再度完全に引用されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
本発明の例示的な実施形態を本明細書に記載してきたが、本発明は、記載されている実施形態に限定されず、様々な他の変更または修飾が、本発明の範囲または精神から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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