(57)【要約】本発明は、同じ酵素の阻害剤、例えば、血液凝固の酵素の阻害剤をアッセイするために用いる汎用キャリブレーション方法に関する。本方法は、生物試料中の酵素の可逆的または不可逆的な阻害剤をアッセイする方法におけるこの汎用キャリブレーションの使用にも関する。本発明は、さらに、酵素の阻害剤のスクリーニングのための方法における汎用キャリブレーションの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の阻害剤をアッセイするための汎用キャリブレーションを得るための方法であって、前記方法は、以下のステップ：
ａ）前記酵素Ｅと、標識化され、前記酵素に特異的な基質Ｓとを含んだ複数の混合物の各々について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  前記酵素に特異的な前記基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  前記混合物の各々において、前記基質は、前記酵素と比較して過剰に存在し、
−  前記混合物は、同じ初期基質濃度［Ｓ］０を含み、
−  前記混合物は、同じ総体積Ｖおよび同じ反応媒体ＭＲを有し、
−  前記混合物は、最高初期酵素濃度が［Ｅ］０である、既知の減少する初期酵素濃度を有するか、または最高初期酵素活性がＡ０である、既知の減少する初期酵素活性を有し、
−  混合物の定常状態における前記残留酵素活性は、以下のステップ：
ａ１）既知の初期酵素濃度の、または既知の初期酵素活性の、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、前記酵素Ｅの溶液と前記基質Ｓの溶液とを混合するステップ、
ａ２）前記標識の前記検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、前記曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、前記プロットするステップ、および
ａ３）ａ２）で得られた前記曲線の前記直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ａ３）で得られた前記勾配は、前記混合物の定常状態における前記残留酵素活性である、
前記残留酵素活性を決定するステップと、
ｂ）ステップａ）の前記混合物の各々について、前記混合物の初期酵素濃度を前記最高初期酵素濃度［Ｅ］０と比較して標準化することによって前記混合物の前記初期酵素濃度をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換するか、または前記混合物の初期酵素活性を前記最高初期酵素活性Ａ０と比較して標準化することによって前記混合物の前記初期酵素活性をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定された前記抗酵素活性をステップａ）で得られた定常状態における前記残留酵素活性の関数として、混合物ごとに、グラフ上に、プロットすることによって汎用キャリブレーション曲線を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記酵素は、ヒドロラーゼ類のクラスに、リアーゼ類のクラスに、またはイソメラーゼ類のクラスに属する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記阻害剤は、可逆的な直接もしくは間接阻害剤、または不可逆的な直接もしくは間接阻害剤である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）では、初期酵素濃度［Ｅ］をもつ混合物について、パーセンテージとして表現された前記抗酵素活性が、式：
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ％＝１−（［Ｅ］／［Ｅ］０）、
によって算出され、初期酵素活性Ａをもつ混合物については、パーセンテージとして表現された前記抗酵素活性が、式：
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ％＝１−（Ａ／Ａ０）
によって算出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項５】
ステップｃ）では、前記キャリブレーション曲線は、式：
【数１】
2019516404.tif 000014
をもつ直線であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、パーセンテージとして表現された前記抗酵素活性であり、
ｖは、定常状態における前記残留酵素活性であり、
１／ｖ０は、前記キャリブレーション曲線の前記勾配であり、ｖ０は、阻害剤の不在下で観測される定常状態における前記残留酵素活性である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項６】
前記酵素Ｅの阻害剤に固有であり、被検試料について決定された前記抗酵素活性を阻害剤の量または濃度へ変換することを可能にする変換チャートを生成することにあるステップｄ）も含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項７】
ステップｄ）は、以下のサブステップ：
ｄ１）各々が、前記阻害剤を既知の初期濃度で、前記酵素Ｅを前記初期濃度［Ｅ］０でまたは前記初期活性Ａ０で、および前記酵素に特異的な標識化された基質Ｓを前記濃度［Ｓ］０で含んだ、少なくとも２つの標準化混合物について定常状態における前記残留酵素活性を決定するサブステップであって、
−  前記標準化混合物の各々において、前記酵素は、前記阻害剤と比較して過剰に存在し、
−  前記標準化混合物は、同じ体積Ｖ’および同じ反応媒体ＭＲを有し、
−  混合物の定常状態における前記残留酵素活性は、以下のステップ：
ｄ１’）阻害剤の既知の初期濃度をもつ標準化混合物を得るために、前記阻害剤を前記酵素Ｅの溶液および前記基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｄ１’’）前記標識の前記検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、前記曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、前記プロットするステップ、および
ｄ１’’’）ｄ１’’）で得られた前記曲線の前記直線部分の前記勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｄ１’’’）で得られた前記勾配は、前記標準化混合物の定常状態における残留酵素活性である、
前記残留酵素活性を決定するサブステップと、
ｄ２）前記混合物の前記抗酵素活性を前記標準化混合物についてステップｄ１’’’）で測定された定常状態における前記残留酵素活性から決定するために、前記標準化混合物の各々について、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた前記汎用キャリブレーション曲線を用いるサブステップと、
ｄ３）各標準化混合物について、前記標準化混合物の阻害剤の初期濃度をステップｄ２）で決定された前記抗酵素活性の関数としてグラフ上にプロットすることによって、標準曲線またはチャートを生成するサブステップと
を含む、請求項６に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項８】
前記体積Ｖ’は、体積Ｖと同一である、請求項７に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項９】
ステップｄ）は、前記標準曲線の式をステップｄ３）で前記グラフ上にプロットされた対（抗酵素活性、阻害剤の濃度）の回帰によって決定することにあるサブステップｄ４）も含む、請求項７または請求項８に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項１０】
−  前記阻害剤が可逆的な直接阻害剤であれば、前記標準曲線の式は、以下の式：
【数２】
2019516404.tif 000015
であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、前記抗酵素活性であり、
［Ｉ］０は、前記被検試料中に存在する阻害剤の濃度であり、
ｉおよびｅは、前記阻害剤に固有の２つの固定された定数であり、
−  前記阻害剤が不可逆的な間接阻害剤であれば、前記標準曲線の式は、以下の式：
［Ｉ］０＝ｅ×ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）
であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、前記被検試料中における前記抗酵素活性であり、
［Ｉ］０は、前記試料中に存在する阻害剤の濃度であり、
ｅは、前記阻害剤に固有の固定された定数である、
請求項７〜９のいずれか一項に記載の汎用キャリブレーションを得るための方法。
【請求項１１】
生物試料中の酵素の阻害剤をアッセイする方法であって、以下のステップ：
１）体積がＶ’’で、前記阻害剤を含む前記生物試料のアリコート、前記酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および前記酵素に特異的な標識化された基質Ｓを初期濃度［Ｓ］０で含んだ、反応媒体ＭＲの被検混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  前記酵素に特異的な前記基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  前記被検混合物の定常状態における前記残留酵素活性は、以下のステップ：
ｉ）初期酵素濃度［Ｅ］０の、または初期酵素活性Ａ０、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、前記生物試料の前記アリコートを前記酵素Ｅの溶液および前記基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｉｉ）前記標識の前記検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、前記曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、前記プロットするステップ、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた前記曲線の前記直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｉｉｉ）で得られた前記勾配は、前記被検混合物の定常状態における前記残留酵素活性である、
前記残留酵素活性を決定するステップと、
２）前記生物試料の抗酵素活性を前記被検混合物について測定された定常状態における前記残留酵素活性から決定するために、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキャリブレーション方法のステップｃ）で得られた前記汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記生物試料は、血液の、血漿の、多血小板血漿の、少血小板血漿の、あるいは血小板もしくは赤血球微粒子または任意のその他の細胞を含んだ血漿の試料である、請求項１１に記載のアッセイする方法。
【請求項１３】
前記生物試料は、少血小板血漿試料である、請求項１２に記載のアッセイする方法。
【請求項１４】
前記酵素は、凝固因子、カリクレインおよびプラスミンから選択され、好ましくは因子ＩＩａ、因子Ｘａおよびプラスミンから選択された血液凝固の酵素である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害剤は、アンチトロンビン、ヘパリンコファクターＩＩ、α２マクログロブリン、ヒルジン、レピルジン、デシルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダビガトラン、ビバリルジン、アルガトロバン、非分画ヘパリン類、低分子量ヘパリン類、五糖類およびダナパロイドナトリウムから選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記体積Ｖ’’は、体積Ｖと同一である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のアッセイする方法。
【請求項１７】
以下のステップ：
３）パーセンテージとして表現され、ステップ２で得られた前記抗酵素活性を請求項６〜１０のいずれか一項に記載のキャリブレーション方法のステップｄ）で得られた前記阻害剤に固有のチャートを用いて阻害剤の濃度へ変換するステップ
をさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のアッセイする方法。
【請求項１８】
前記体積Ｖ’’は、体積Ｖ’と同一である、請求項１７に記載のアッセイする方法。
【請求項１９】
直接経口抗凝血剤で処置された患者における出血リスクを推定するための請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のアッセイする方法の使用。
【請求項２０】
直接経口抗凝血剤で処置された患者における出血リスクを推定するための方法であって、前記方法は、以下のステップ：
−  前記患者からの生物試料中の直接経口抗凝血剤の量または濃度を、本発明のアッセイする方法を用いて、決定するステップと、
−  この量または濃度を所定の閾値と比較するステップと、
−  直接経口抗凝血剤の量または濃度が前記所定の閾値を上回れば、出血リスクがあると結論するステップと
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の直接経口抗凝血剤で処置された患者における出血リスクを推定するための方法であって、以下のステップ：
−  前記患者に投与するための抗阻害剤化合物の量を前記患者からの生物試料中で測定された直接経口抗凝血剤の量または濃度の関数として決定するステップ
をさらに含む、方法。
【請求項２２】
前記直接経口抗凝血剤で処置された患者は、直接経口抗凝血剤の過量投与を受けた疑いがある患者であるか、もしくは処置を抗ビタミンＫ剤から前記直接経口抗凝血剤へ最近変えられた患者であるか、または外科的介入をまさに受けようとしている患者である、請求項１９に記載の使用、あるいは請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酵素の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法であって、以下のステップ：
１）体積がＶ’’’で、試験化合物を初期濃度［Ｃ］で、前記酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および前記酵素に特異的な標識化された基質Ｓを初期濃度［Ｓ］０で含んだ、反応媒体ＭＲの混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  前記酵素に特異的な前記基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  前記酵素は、前記混合物中に前記試験化合物と比較して過剰に存在し、
−  前記混合物の定常状態における前記残留酵素活性は、以下のステップ：
ｉ）初期酵素濃度［Ｅ］０の、または酵素活性Ａ０、初期基質濃度［Ｓ］０および試験化合物の濃度［Ｃ］の混合物を得るために、前記試験化合物を前記酵素Ｅの溶液および前記基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｉｉ）前記標識の前記検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、前記曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、前記プロットするステップ、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた前記曲線の前記直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｉｉｉ）で得られた前記勾配は、被検化合物の定常状態における前記残留酵素活性である、
前記残留酵素活性を決定するステップと、
２）前記試験化合物の抗酵素活性を前記混合物について測定された定常状態における前記残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと、
３）ステップ２）で決定された前記試験化合物の前記抗酵素活性を前記酵素の標準的な阻害剤について濃度［Ｃ］で同じ条件下において決定された前記抗酵素活性と比較するか、またはステップ２）で決定された前記試験化合物の前記抗酵素活性を所定の閾値と比較するステップであって、前記試験化合物は、前記試験化合物の前記抗酵素活性が前記酵素の標準的な阻害剤の前記抗酵素活性より大きいか、または前記試験化合物の前記抗酵素活性が前記所定の閾値より大きければ、前記酵素の阻害剤として同定される、前記比較するステップと
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２４】
前記体積Ｖ’’’は、体積Ｖと同一である、請求項２３に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
前記酵素は、ヒドロラーゼ類のクラスに、またはリアーゼ類のクラスに属する、請求項２３または請求項２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
酵素Ｅの阻害剤を同定するためのキットであって、
−  前記酵素Ｅ、
−  前記酵素に特異的な標識化された基質Ｓ、および
−  請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を実行するための使用説明書
を備える、キット。
【請求項２７】
生物試料中の酵素Ｅの阻害剤の少なくとも１つをアッセイするためのキットであって、
−  前記酵素Ｅ、
−  前記酵素に特異的な標識化された基質Ｓ、
−  前記酵素の少なくとも１つの阻害剤、および
−  請求項１１〜１９のいずれか一項に記載のアッセイする方法を実行するための使用説明書
を備える、キット。
【請求項２８】
前記酵素の少なくとも１つの他の阻害剤をさらに備える、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特許出願
本国際出願は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月１０日出願の仏国出願第１６５４１４８号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、同じ酵素、例えば、血液凝固の酵素の阻害剤をアッセイするために用いる汎用キャリブレーション方法に関する。本発明は、生物試料中の酵素の阻害剤をアッセイするための方法におけるこの汎用キャリブレーションの使用にも関する。汎用キャリブレーションは、阻害剤を互いに比較することも可能にするので、本発明は、酵素を阻害できる化合物をスクリーニングするための方法における汎用キャリブレーションの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固は、いくつかの因子、特に、
−  トロンビン発生の生理活性化物質である、組織因子、および
−  トロンビンの活性化によってフィブリンへ変換される、フィブリノゲン
を伴う複雑な生理現象である。フィブリンの蓄積は、出血を止める血餅の形成につながる。血餅形成は、特に、多くの酵素およびそれらの阻害剤を伴う活性化と阻害との間のバランスによって調節される。活性化と阻害との間のこのバランスをくつがえすと、２つのタイプの疾患：血栓性疾患および出血性疾患、を誘発しかねない。これらの疾患のいずれか１つを診断すること、またはこれらの疾患を処置するために確立された治療法の働きを測定することを目標として、関与する酵素の１つまたはこの酵素の阻害剤の１つをアッセイすることが有益でありうる。
【０００４】
血液凝固の酵素の阻害剤は、従来、その酵素について次のもの：血液試料中に存在する阻害剤と酵素に特異的な基質と、を競合に持ち込むことによってアッセイされる。かかるアッセイは、概して、阻害剤に固有の専用キットを用いて達成され、
−  特に、被検試料の希釈、固有の試薬濃度および精密な測定点を伴う、概して、阻害剤のアッセイに固有の最適化手法、および
−  線形、多項式または対数であってよいキャリブレーション曲線の数学的回帰モデル
に基づく。
【０００５】
阻害剤に固有のこの専用キットは、一般に、
−  キャリブレータ（典型的に、増加する濃度レベルのアッセイされる阻害剤を含んだ血漿）、および
−  一般に、低および高濃度レベルの阻害剤を含んだ品質管理
を備える。
【０００６】
加えて、同じ酵素のいくつかの阻害剤のアッセイを、異なる試料で、並行して実行できることが必要な場合、ユーザは、阻害剤ごとに１つのアッセイキットを有さなければならない。そのうえ、阻害剤ごとに、測定システムを較正することが必要である。
【０００７】
それゆえに、これらの制限のすべてを克服する方法が必要である。特に、実行するのが容易で問題の阻害剤に固有ではない、血液凝固の酵素の阻害剤をアッセイするための方法、すなわち、言い換えれば、汎用のアッセイ方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、実行するのが難しくなく比較的安価であり、酵素阻害剤が可逆的かまたは不可逆的かどうかに係わらず、同じ酵素の複数の阻害剤の並行アッセイを可能にするキャリブレーション方法を提供する。従来のキャリブレーション方法では、アッセイすることが望まれる阻害剤の増加する濃度からキャリブレーション曲線が生成されたのに対して、本発明によるキャリブレーション方法においては、標的酵素の減少する濃度からキャリブレーション曲線が生成される。本発明によるキャリブレーション方法は、酵素のすべての阻害剤に共通の汎用単位である、抗酵素活性のパーセンテージとして表現された結果を得ることを可能にし、それによって、酵素に対するこれらの阻害剤の阻害効果を比較することを可能にする。キャリブレーションは、それゆえに、阻害剤を互いに比較することを可能にするので、本発明は、酵素の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法における汎用キャリブレーションの使用にも関する。本発明によるキャリブレーション方法は、変換チャートを固有の数学的推論に従って作ることによって、試験される試料中に存在する阻害剤の量または濃度を測定することも可能にする。本発明によるキャリブレーション方法を、それゆえに、生物試料中に存在する酵素の阻害剤のアッセイに適用できて、例えば、直接経口抗凝血剤によって処置された患者に由来する生物試料中に存在する直接経口抗凝血剤のアッセイに適用できる。
【０００９】
より具体的には、本発明は、酵素の阻害剤をアッセイするための汎用キャリブレーションを得るための方法に関し、方法は、以下のステップ：
ａ）酵素Ｅと、標識化され、酵素に特異的な基質Ｓとを含んだ複数の混合物の各々について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  酵素に特異的な基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  混合物の各々において、基質は、酵素と比較して過剰に存在し、
−  混合物は、同じ初期基質濃度［Ｓ］０を含み、
−  混合物は、同じ総体積Ｖおよび同じ反応媒体ＭＲを有し、
−  混合物は、最高初期酵素濃度が［Ｅ］０である、既知の減少する初期酵素濃度を有するか、または最高初期酵素活性がＡ０である、既知の減少する初期酵素活性を有し、
−  混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ａ１）既知の初期酵素濃度の、または既知の初期酵素活性の、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、酵素Ｅの溶液と基質Ｓの溶液とを混合するステップ、
ａ２）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ａ３）ａ２）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ａ３）で得られた勾配は、混合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
ｂ）ステップａ）の混合物の各々について、混合物の初期酵素濃度を最高初期酵素濃度［Ｅ］０と比較して標準化することによって混合物の前記初期酵素濃度をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換するか、または混合物の初期酵素活性を最高初期酵素活性Ａ０と比較して標準化することによって混合物の前記初期酵素活性をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定された抗酵素活性をステップａ）で得られた定常状態における残留酵素活性の関数として、混合物ごとに、グラフ上に、プロットすることによって汎用キャリブレーション曲線を生成するステップと
を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、汎用キャリブレーション方法に用いられる酵素は、ヒドロラーゼ類のクラスに、リアーゼ類のクラスに、またはイソメラーゼ類のクラスに属する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、キャリブレーション方法を用いてアッセイすることが望まれる阻害剤は、可逆的な直接もしくは間接阻害剤、または不可逆的な直接もしくは間接阻害剤である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、汎用キャリブレーション方法のステップｂ）では、初期酵素濃度［Ｅ］をもつ混合物について、パーセンテージとして表現された抗酵素活性は、式：
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ％＝１−（［Ｅ］／［Ｅ］０）、
によって算出され、初期酵素活性Ａをもつ混合物については、パーセンテージとして表現された抗酵素活性は、式：
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ％＝１−（Ａ／Ａ０）
によって算出される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）では、キャリブレーション曲線は、式：
【００１４】
【数１】
2019516404.tif 000002
【００１５】
をもつ直線であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、パーセンテージとして表現された抗酵素活性であり、
ｖは、定常状態における残留酵素活性であり、
１／ｖ０は、キャリブレーション曲線の勾配であり、ｖ０は、阻害剤の不在下で観測された定常状態における残留活性である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、汎用キャリブレーション方法は、酵素Ｅの阻害剤に固有であり、被検試料について決定された抗酵素活性を阻害剤の量または濃度へ変換することを可能性にする、変換チャートを生成することにあるステップｄ）も含む。好ましくは、ステップｄ）は、以下のサブステップ：
ｄ１）各々が、阻害剤を既知の初期濃度で、酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および酵素に特異的な標識化された基質Ｓを濃度［Ｓ］０で含んだ、少なくとも２つの標準化混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するサブステップであって、
−  標準化混合物の各々において、酵素は、阻害剤と比較して過剰に存在し、
−  標準化混合物は、同じ体積Ｖ’および同じ反応媒体ＭＲを有し、
−  混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ｄ１’）阻害剤の既知の初期濃度をもつ標準化混合物を得るために、阻害剤を酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｄ１’’）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ｄ１’’’）ｄ１’’）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｄ１’’’）で得られた勾配は、標準化混合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するサブステップと、
ｄ２）標準化混合物の各々について、その混合物の抗酵素活性を標準化混合物についてステップｄ１’’’）で測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるサブステップと、
ｄ３）各標準化混合物について、標準化混合物の阻害剤の初期濃度をステップｄ２）で決定された抗酵素活性の関数としてグラフ上にプロットすることによって、標準曲線またはチャートを生成するサブステップと
を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、体積Ｖ’は、体積Ｖと同一である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ステップｄ）は、標準曲線の式をステップｄ３）でグラフ上にプロットされた対（抗酵素活性、阻害剤の濃度）の回帰によって決定することにあるサブステップｄ４）も含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、
−  阻害剤が可逆的な直接阻害剤であれば、標準曲線の式は、以下の式：
【００２０】
【数２】
2019516404.tif 000003
【００２１】
であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、抗酵素活性であり、
［Ｉ］０は、被検試料中に存在する阻害剤の濃度であり、
ｉおよびｅは、阻害剤に固有の２つの固定された定数であり、
−  阻害剤が不可逆的な間接阻害剤であれば、標準曲線の式は、以下の式：
［Ｉ］０＝ｅ×ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）
であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、被検試料中における抗酵素活性であり、
［Ｉ］０は、試料中に存在する阻害剤の濃度であり、
ｅは、阻害剤に固有の固定された定数である。
【００２２】
本発明は、生物試料中の酵素の阻害剤をアッセイするための方法にも関し、方法は、以下のステップ：
１）体積がＶ’’で、阻害剤を含む生物試料のアリコート、酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および酵素に特異的な標識化された基質Ｓを初期濃度［Ｓ］０で含んだ、反応媒体ＭＲの被検混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  酵素に特異的な基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  被検混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ｉ）初期酵素濃度［Ｅ］０の、または初期酵素活性のＡ０、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、生物試料のアリコートを酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｉｉ）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｉｉｉ）で得られた勾配は、被検混合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
２）生物試料の抗酵素活性を被検混合物について測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、請求項１〜５のいずれか一項に請求されるようなキャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと
を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法に用いられる生物試料は、血液の、血漿の、多血小板血漿の、少血小板血漿の、あるいは血小板もしくは赤血球微粒子またはその他の細胞を含んだ血漿の試料である。いくつかの好ましい実施形態において、生物試料は、少血小板血漿試料である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法に用いられる酵素は、凝固因子、カリクレインおよびプラスミンから選択され、好ましくは、因子ＩＩａ、因子Ｘａおよびプラスミンから選択される血液凝固の酵素である。
【００２５】
酵素が血液凝固の酵素である実施形態において、本発明によるアッセイ方法によってアッセイされる阻害剤は、アンチトロンビン、ヘパリンコファクターＩＩ、α２マクログロブリン、ヒルジン、レピルジン、デシルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダビガトラン、ビバリルジン、アルガトロバン、非分画ヘパリン類、低分子量ヘパリン類、五糖類およびダナパロイドナトリウムから選択されてよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、体積Ｖ’’は、体積Ｖと同一である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法は、以下のステップ：
３）請求項６〜１０のいずれか１つに請求されるようなキャリブレーション方法のステップｄ）で得られた阻害剤に固有のチャートを用いて、パーセンテージとして表現され、ステップ２）で得られた抗酵素活性を阻害剤の濃度へ変換するステップ
も含む。
【００２８】
本発明は、直接経口抗凝血剤で処置された患者における出血リスクを推定するための本方法によるアッセイ方法の使用にも関する。
【００２９】
本発明は、直接経口抗凝血剤で処置された患者における出血リスクを推定するための方法にも関し、方法は、以下のステップ：
−  患者からの生物試料中の直接経口抗凝血剤の量または濃度を、本発明のアッセイ方法を用いて、決定するステップと、
−  この量または濃度を所定の閾値と比較するステップと、
−  直接経口抗凝血剤の量または濃度が所定の閾値を上回れば、出血リスクがあると見做すステップと
を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、直接経口抗凝血剤で処置された患者における出血リスクを推定するための方法は、以下のステップ：
−  患者に投与するための抗阻害剤化合物の量を患者からの生物試料中で測定された直接経口抗凝血剤の量または濃度の関数として決定するステップ
も含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、直接経口抗凝血剤で処置された患者は、直接経口抗凝血剤の過量投与を受けた疑いがある患者であるか、もしくは処置を抗ビタミンＫ剤から直接経口抗凝血剤への最近変えられた患者であるか、または外科的介入をまさに受けようとしている患者である。
【００３２】
本発明は、酵素の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法にも関し、方法は、以下のステップ：
１）体積がＶ’’’で、試験化合物を初期濃度［Ｃ］で、酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および酵素に特異的な標識化された基質Ｓを初期濃度［Ｓ］０で含んだ、反応媒体ＭＲの混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  酵素に特異的な基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  酵素は、混合物中に試験化合物と比較して過剰に存在し、
−  混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ｉ）初期酵素濃度［Ｅ］０の、または酵素活性Ａ０、初期基質濃度［Ｓ］０および試験化合物の濃度［Ｃ］の混合物を得るために、試験化合物を酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｉｉ）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｉｉｉ）で得られた勾配は、被検化合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
２）試験化合物の抗酵素活性を混合物について測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと、
３）ステップ２）で決定された試験化合物の抗酵素活性を酵素の標準的な阻害剤について濃度［Ｃ］で同じ条件下において決定された抗酵素活性と比較するか、またはステップ２）で決定された試験化合物の抗酵素活性を所定の閾値と比較するステップであって、試験化合物は、試験化合物の抗酵素活性が酵素の標準的な阻害剤の抗酵素活性より大きいかまたは試験化合物の抗酵素活性が所定の閾値より大きければ、酵素の阻害剤として同定される比較するステップと
を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、体積Ｖ’’’は、体積Ｖと同一である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本発明によるスクリーニング方法に用いられる酵素は、ヒドロラーゼ類のクラスに、またはリアーゼ類のクラスに属する。
【００３５】
最後に、本発明は、酵素Ｅの阻害剤を同定するための第１のキットであって、
−  酵素Ｅ、
−  酵素に特異的な標識化された基質Ｓ、および
−  本発明によるスクリーニング方法を実行するための使用説明書
を備える第１のキット、ならびに生物試料中の酵素Ｅの阻害剤のうちの少なくとも１つをアッセイするための第２のキットであって、
−  酵素Ｅ、
−  酵素に特異的な標識化された基質Ｓ、
−  酵素の少なくとも１つの阻害剤、および
−  本発明によるアッセイ方法を実行するための使用説明書
を備える第２のキットに関する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、第２のキットは、少なくとも１つの他の阻害剤も備える。
【００３７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態が以下にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】汎用キャリブレーション。グラフは、抗Ｘａ活性（％）を１０個の実験点で観測された対応するＯＤ／分の関数として示す。（Ａ）広い範囲の手法：これらの実験点の線形回帰は、直線の式ｙ＝１．０５３−０．９９９ｘを与え、決定係数は、Ｒ２＝０．９９４である。（Ｂ）狭い範囲の手法：これらの実験点の線形回帰は、直線の式ｙ＝１．０３４−１．０８１ｘを与え、決定係数は、Ｒ２＝０．９９６である。
【図２】変換チャート。これらのチャートは、３つの直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）の各々について測定された抗Ｘａ活性（％）をｎｇ／ｍｌで表現された濃度へ変換することを可能にする。（Ａ）広い範囲の手法：いくつかの実験点における式２の非線形回帰は、それぞれ、リバーロキサバン（●）についてｉ＝０．７３およびｅ＝１６．４３、アピキサバン（▲）についてｉ＝１．３５およびｅ＝１４．６６ならびにエドキサバン（ｎ）についてｉ＝１．１４およびｅ＝１５．６６を与える。（Ｂ）狭い範囲の手法：いくつかの実験点における式２の非線形回帰は、それぞれ、リバーロキサバン（●）についてｉ＝１．４２およびｅ＝１５．３６、アピキサバン（▲）についてｉ＝２．９１およびｅ＝１３．２３ならびにエドキサバン（ｎ）についてｉ＝１．９８およびｅ＝１４．９６を与える。
【図３】リバーロキサバン。（Ａ）広い範囲の手法：本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて２０個の過負荷に関して測定されたリバーロキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝６．９１＋０．９８ｘを与え、決定係数は、Ｒ２＝０．９９８である。（Ｂ）狭い範囲の手法：本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて８個の過負荷に関して測定されたリバーロキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝１．６３＋０．９６ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９５である。
【図４】図４：アピキサバン。（Ａ）広い範囲の手法：本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて２４個の過負荷に関して測定されたアピキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝１０．４１＋０．９７ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９９である。（Ｂ）狭い範囲の手法：本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて１０個の過負荷に関して測定されたアピキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝２．７９＋０．９７ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９９である。
【図５】エドキサバン。（Ａ）広い範囲の手法：本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて２４個の過負荷に関して測定されたエドキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝０．９９ｘ＋０．８３を与え、決定係数Ｒ２＝０．９９６である。（Ｂ）狭い範囲の手法：本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて１０個の過負荷に関して測定されたエドキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝１．００ｘ−０．２４を与え、決定係数Ｒ２＝０．９９７である。
【図６】汎用キャリブレーションの回帰の改良。グラフは、抗Ｘａ活性（％）を狭い範囲の手法を用いて１０個の実験点で観測された対応するＯＤ／分の関数として提示する。（Ａ）線形回帰：これらの実験点の線形回帰は、式：ｙ＝１．０３４−１．０８１ｘをもつ直線を与え、決定係数Ｒ２＝０．９９６３である。（Ｂ）二次多項式を用いた回帰：これらの実験点の回帰は、式ｙ＝０．９７８−０．７８９ｘ−０．２８１ｘ２の多項式を与え、決定係数Ｒ２＝０．９９９８である。
【図７】血漿中における希釈−汎用キャリブレーション。グラフは、抗Ｘａ活性（％）を広い範囲（●）および狭い範囲（▲）の手法を用いて１０個の実験点で観測された対応するＯＤ／分の関数として提示する。（Ａ）緩衝液中の希釈：線形回帰は、広い範囲の手法（●）では、直線の式ｙ＝１．０５３−０．９９９ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９４であり、狭い範囲の手法（▲）では、直線の式ｙ＝１．０３４−１．０８１ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９６である。（Ｂ）血漿中における希釈：線形回帰は、それぞれ、広い範囲の手法（●）では、直線の式ｙ＝１．０２２−１．１７３ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９８であり、狭い範囲の手法（▲）では、直線の式ｙ＝１．０２０−１．１９８ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９８である。
【図８】血漿中における希釈：リバーロキサバン。（Ａ）広い範囲の手法：血漿中における希釈とともに本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて２０個の過負荷に関して測定されたリバーロキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝１．０３＋０．９６ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９９である。（Ｂ）狭い範囲の手法：血漿中における希釈とともに本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて８個の過負荷に関して測定されたリバーロキサバンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝１．１５＋０．９５ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９５である。
【図９】汎用キャリブレーション。グラフは、抗Ｘａ活性（％）を１０個の実験点で観測された対応するＯＤ／分の関数として示す。これらの実験点の線形回帰は、直線の式ｙ＝０．０９４−０．５１８ｘを与え、決定係数Ｒ２＝０．９９６であった。
【図１０】変換チャート。この図に提示されるチャートは、測定された抗Ｘａ活性（％）をＩＵ／ｍｌ単位の濃度へ変換することを可能にし、（Ａ）非分画ヘパリンについて：実験点の線形回帰は、直線の式ｙ＝２．３５４ｘ−０．０２５６９を与え、決定係数Ｒ２＝０．９９２であり、（Ｂ）低分子量ヘパリンについて：これらの実験点の線形回帰は、直線の式ｙ＝１．６２１ｘ−０．０２８２７を与え、決定係数Ｒ２＝０．９７９であった。
【図１１】（Ａ）非分画ヘパリン。汎用キャリブレーション原理を用いて１１個の過負荷に関して測定された非分画ヘパリンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝１．０２５ｘ−０．０１１０７を与え、決定係数Ｒ２＝０．９７９であった。（Ｂ）低分子量ヘパリン。汎用キャリブレーション原理を用いて７個の過負荷に関して測定された低分子量ヘパリンのレベルのアッセイの結果の理論的なレベルとの比較は、直線の式ｙ＝０．９７６４ｘ＋０．０１４８９を与え、決定係数Ｒ２＝０．９８５であった。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
上述のように、本発明は、酵素の阻害剤のためのキャリブレーション方法に関し、ならびに酵素の阻害剤をアッセイするための方法における、および酵素の阻害剤についてスクリーニングするための方法におけるこの汎用キャリブレーションの使用に関する。
【００４０】
Ｉ−汎用キャリブレーション方法
Ａ．酵素阻害剤をアッセイするための従来の方法の基礎をなす原理
酵素の阻害剤をアッセイするための従来の方法は、少なくとも３つの要素を伴い、２つの生化学反応を互いに競合に持ち込む。３つの要素は、酵素（Ｅ）、試験された試料中の量または濃度を測定することが望まれる阻害剤（Ｉ）、および酵素に特異的な基質（Ｓ）であり、この基質が標識化される（一般に、標識化は、酵素反応が標識の放出をもたらし、その検出を可能にするように選ばれる）。２つの競合する生化学反応は、阻害剤による酵素の阻害反応および酵素とその基質との間の酵素反応である。
【００４１】
阻害剤が可逆的な阻害剤であるときに、可逆的な阻害剤による酵素の阻害反応は、次の通りであり、
【００４２】
【数３】
2019516404.tif 000004
【００４３】
ここで、
ＥおよびＩは、先に定義されたような、酵素および阻害剤を示し、
ＥｌＩは、酵素と阻害剤との間で形成された不活性な複合体を示し、
ｋｉ＋は、酵素と可逆的な阻害剤との間の会合定数であり、
ｋｉ−は、酵素と可逆的な阻害剤との間の解離定数である。
【００４４】
阻害剤が不可逆的な阻害剤であるときには、不可逆的な阻害剤による酵素の阻害反応は、次の通りであり、
【００４５】
【数４】
2019516404.tif 000005
【００４６】
ここで、
Ｅ、ＩおよびＥｌＩは、先に定義された通りであり、
ｋａは、酵素と不可逆的な阻害剤との間の会合定数である。
【００４７】
酵素とその基質との間の酵素反応は、次の通りであり、
【００４８】
【数５】
2019516404.tif 000006
【００４９】
ここで、
ＥおよびＳは、先に定義されたように、酵素およびその標識化された基質を示し、
ＥｌＳは、酵素および基質によって形成された不安定な複合体を示し、
Ｐは、酵素による基質の触媒から生じた生成物を示し、
ＫＭは、アンリ・ミカエリス・メンテン定数であり、
ｋｃａｔは、酵素の触媒定数である。
【００５０】
阻害剤が間接的である場合には、アッセイは、第４の要素：阻害剤とともに複合体（ＡｌＩ）を形成する化合物Ａ、を伴い、この複合体が酵素の不可逆的な阻害剤である。したがって、例えば、不可逆的な間接阻害剤の場合には、競合する反応は、以下のスキーム：
【００５１】
【数６】
2019516404.tif 000007
【００５２】
で表され、ここで、
Ｅ、Ｉ、Ｓ、ＫＭ、およびｋｃａｔは、先に定義された通りであり、
Ａは、阻害剤と複合体ＡｌＩを形成する化合物であり、
ｋｏｎは、複合体ＡｌＩの会合定数であり、
ｋｏｆｆは、複合体ＡｌＩの解離定数である。
ｋｉは、酵素および阻害剤の会合定数である。
【００５３】
アッセイ方法では、初めに、基質が酵素と比べて過剰に存在し、酵素は、それ自体が阻害剤と比べて過剰に存在する。測定の間に、阻害剤によって多かれ少なかれ阻害された酵素が基質を開裂して生成物を与える。これが標識の放出をもたらし、標識の出現および蓄積が試験された試料の少なくとも１つの物理的特性における観測可能な変化を誘起する。曲線を構築することによってこの物理的特性における変動を時間の関数として追跡すると、２つの競合する生化学反応の間の平衡の確立を追跡することが可能である。
【００５４】
確かに、ある時間後には、２つの競合する生化学反応が定常状態、すなわち、酵素および阻害剤（または、間接阻害剤については、酵素および複合体ＡｌＩ）が生化学的な平衡状態にあり、酵素の、阻害剤のおよび複合体ＥｌＩの（または、間接阻害剤については、酵素の、複合体ＡｌＩのおよび複合体ＥｌＡｌＩの）濃度が一定である状態、である局所平衡に達するであろう。酵素が初めに過剰であったので、この時点では、残留酵素活性が残っており、試験された試料中に存在する阻害剤の濃度をそれから推測するためにこの残留酵素活性を定量化することができる。確かに、残留酵素活性と阻害剤の初期濃度とは逆比例し、試験された試料中に存在する阻害剤の濃度が高いほど、測定の間に酵素がより多く阻害されて、定常状態の間に基質に対して活性がより低く、逆に、試料中に存在する阻害剤の濃度が低いほど、測定の間に酵素がより少なく阻害されて、定常状態の間に基質に対して活性がより高い。したがって、これら２つの値、定常状態における酵素の残留活性と阻害剤の濃度との間の関係は、全単射であり、それゆえに、試料中に存在する阻害剤の各濃度に対してユニークな等価残留酵素活性がある。定常状態は、物理的特性（標識の放出と関連する）における変動を時間の関数として提示する曲線の直線部分に対応する。この直線部分の勾配が阻害剤の初期濃度に逆比例する酵素の残留活性である。
【００５５】
酵素阻害剤をアッセイするための従来の方法では、キャリブレーションは、阻害剤の既知の濃度を有するｎ個のキャリブレーション試料について、定常状態における残留酵素活性を決定することによって実行される。従来のアッセイ方法のキャリブレーション曲線は、得られたｎ個の対（残留酵素活性、阻害剤の濃度）を、グラフ上に、プロットすることによって生成される。これらｎ個の対の回帰に関する数学的な式が、試験された試料中に存在する阻害剤の濃度を、試験された試料について定常状態で測定された残留酵素活性から、決定することを可能性にする。
【００５６】
Ｂ．汎用キャリブレーション
本発明は、酵素阻害剤を伴わないが、むしろ酵素のすべての阻害剤に共通の単一のキャリブレータ、すなわち、酵素それ自体を伴うキャリブレーション方法を提供する。本発明による汎用キャリブレーションの原理は、酵素の減少する初期濃度を含んだキャリブレーション試料について、定常状態における残留酵素活性を測定し、次に、得られた異なる対（残留酵素活性、初期酵素濃度）をグラフ上にプロットすることによってキャリブレーション曲線を生成することにある。これらの異なる対の回帰に関する式が、試験された試料について定常状態で測定された残留酵素活性を等価な酵素濃度へ変換することを可能にする。結果を等価な酵素濃度として提供するのではなく、むしろ本明細書では、パーセンテージで表現された、等価な抗酵素活性として結果が提供される。
【００５７】
より具体的には、本発明は、酵素の阻害剤をアッセイするための汎用キャリブレーションを得るための方法に関し、方法は、以下のステップ：
ａ）酵素Ｅと、標識化され、酵素に特異的な基質Ｓとを含んだ複数の混合物の各々について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  酵素に特異的な基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  混合物の各々において、基質は、酵素と比較して過剰に存在し、
−  混合物は、同じ初期基質濃度［Ｓ］０を含み、
−  混合物は、同じ総体積Ｖおよび同じ反応媒体ＭＲを有し、
−  混合物は、最高初期酵素濃度が［Ｅ］０である、既知の減少する初期酵素濃度を有するか、または最高初期酵素活性がＡ０である、既知の減少する初期酵素活性を有し、
−  混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ａ１）既知の初期酵素濃度の、または既知の初期酵素活性の、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、酵素Ｅの溶液と基質Ｓの溶液とを混合するステップ、
ａ２）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ａ３）ａ２）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ａ３）で得られた勾配は、混合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
ｂ）ステップａ）の混合物の各々について、混合物の初期酵素濃度を最高初期酵素濃度［Ｅ］０と比較して標準化することによって混合物の前記初期酵素濃度をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換するか、または混合物の初期酵素活性を最高初期酵素活性Ａ０と比較して標準化することによって混合物の前記初期酵素活性をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換するステップと、
ｃ）ステップｂ）で決定された抗酵素活性をステップａ）で得られた定常状態における残留酵素活性の関数として、混合物ごとに、グラフ上に、プロットすることによって汎用キャリブレーション曲線を生成するステップと
を含む。
【００５８】
汎用キャリブレーション方法のステップａ）
本発明による汎用キャリブレーション方法のステップａ）は、キャリブレーションされる酵素と酵素に特異的な基質とを反応媒体ＭＲ中に含んだ複数のキャリブレーション混合物の各々について定常状態における残留酵素活性を決定することにある。「複数の混合物」は、少なくとも２個の異なる混合物、好ましくは少なくとも４個の異なる混合物、例えば４、５、６、７、８もしくは９個の異なる混合物、あるいは少なくとも１０個の異なる混合物、例えば、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５個の異なる混合物、または１５個より多い異なるキャリブレーション混合物を意味することが意図される。
【００５９】
酵素
酵素は、触媒特性をもつタンパク質または糖タンパク質である。本明細書に記載される汎用キャリブレーション方法は、その特異的な基質とともに、以下のタイプの酵素反応：
【００６０】
【数７】
2019516404.tif 000008
【００６１】
に関与する任意の酵素に適用されてよく、ここでＥ、Ｓ、ＥｌＳ、Ｐ、ＫＭ、ｋｃａｔは、先に定義された通りである。
【００６２】
より一般的に言えば、本発明によるキャリブレーション方法が適用されてよい酵素は、基質との酵素反応がそのためにいずれの補酵素も伴わない酵素である。かかる酵素は、当分野で知られ、以下のクラス：ヒドロラーゼ類、リアーゼ類およびイソメラーゼ類に属する。したがって、本発明による汎用キャリブレーション方法に用いられる酵素は、ヒドロラーゼ類のクラスに、リアーゼ類のクラスに、またはイソメラーゼ類のクラスに属する。好ましくは、キャリブレーション方法に用いられる酵素は、ヒドロラーゼ類のクラスに、またはリアーゼ類のクラスに属する。
【００６３】
ヒドロラーゼ類は、加水分解反応を触媒する酵素のクラスを構成し、このクラスは、エステル類を加水分解するエステラーゼ類、オリゴ糖類または多糖類を加水分解するペプチダーゼ類、およびリン系生成物を加水分解するホスファターゼ類を含む。ペプチダーゼ類（またはプロテアーゼ類）のうちでも、（Ｎ末端アミノ酸を順次に放出する）アミノペプチダーゼ類、（Ｃ末端アミノ酸を順次に放出する）カルボキシペプチダーゼ類、（ジペプチドを加水分解する）ジペプチダーゼ類、および（タンパク質を加水分解する）プロテイナーゼ類の間で区別がなされる。本文書に提示する実施例では、本発明者は、プロテアーゼであり、それゆえに、ヒドロラーゼ類のクラスに属する酵素として因子Ｘａを用いた。
【００６４】
リアーゼ類は、加水分解または酸化以外の手段による種々の化学結合の切断を触媒し、新しい二重結合または新しい環をしばしば形成する酵素のクラスを構成する。このクラスの酵素は、以下には限定されないが、炭素−炭素結合を切断するデカルボキシラーゼ類、アルドラーゼ類およびオキソ酸リアーゼ類のようなリアーゼ類、炭素−酸素結合を切断するデヒドラターゼ類のようなリアーゼ類、炭素−窒素結合を切断するフェニルアラニンアンモニアリアーゼのようなリアーゼ類、炭素−硫黄結合を切断するリアーゼ類などを含む。
【００６５】
イソメラーゼ類は、しばしば官能基の再配置および分子のその異性体のうちの１つへの変換によって、分子内の変化を触媒する酵素のクラスを構成する。このクラスの酵素は、以下には限定されないが、ラセマーゼ類、エピメラーゼ類、シス−トランスイソメラーゼ類、分子内オキシドレダクターゼ類、分子内トランスフェラーゼ類、分子内リアーゼ類およびトポイソメラーゼ類を含む。
【００６６】
本発明によるキャリブレーション方法に用いられる酵素は、細菌、ウィルス、真菌または植物由来の酵素であってもよく、哺乳動物酵素（ヒトまたは動物）であってもよい。特に、本発明による汎用キャリブレーション方法は、例えば、ヒトまたは動物治療用阻害剤を開発することを目標として、阻害剤を同定することが有益な任意の酵素に適用されてもよく、あるいは生物試料中の阻害剤の存在、例えば、治療用阻害剤によって処置された患者に由来する生物試料中の治療用阻害剤の存在を定量化することが望ましい任意の酵素に適用されてもよい。
【００６７】
酵素に特異的な標識化された基質
化学反応を触媒することが可能である前に、酵素は、初めにそれらの基質に結合しなければならない。「基質」および「酵素基質」という用語は、本明細書では同義で用いられる。それらの用語は、当分野で知られる意味を有し、酵素の作用を受けることが可能な任意の分子を示す。当業者は、キャリブレーション方法に用いられる基質がキャリブレーションの対象である酵素に特異的な基質でなければならないことを認識するであろう。当業者は、酵素の特異性が広いとき、すなわち、それがいくつかの基質を許容するときには、理想的な基質の選択が実際には酵素に対するこの基質の（測定の正確さを担う）特異性と、測定の感度および実用性に関連する解析上の制約との間の折衷であることも知っている。
【００６８】
本発明によるキャリブレーション方法に用いられる基質は、検出可能な物理的特性を有する標識化された基質である。基質は、好ましくは、酵素と基質との間の酵素反応が標識の放出をもたらし、それによって、この標識を検出することを可能にするように標識化される。
【００６９】
したがって、「標識化された基質」は、検出可能な標識を含む、もしくはそれと（例えば、非共有結合的に）会合するか、またはそれに（例えば、共有）結合した基質を示すことが意図される。
【００７０】
種々のタイプの標識化および標識が当業者にはよく知られ、発色性、蛍光性、化学発光性、電気化学的または放射性標識などを含めて、本発明の文脈内でこれらを用いてよい。本文書に提示される実施例では、本発明者は、酵素Ｆ．Ｘａ（ウシ因子Ｘａ）および発色性基質ＭＡＰＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いた、ここではペプチド配列ＭＡＰＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（４−Ｍｅｔｈｙｌ−２−Ａｍｉｎｏ−［Ｍｅｔｈｏｘｙ−（Ｅｔｈｏｘｙ）−Ｃａｒｂａｍａｔｅ］−Ｐｅｎｔａｎｏｙｌ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）がパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ：ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ）に共有結合される。酵素反応がｐＮＡを放出し、混合物におけるその光学濃度（または吸光度）を４００ｎｍと５００ｎｍとの間の波長、典型的に４０５ｎｍでモニターできる。
【００７１】
キャリブレーション混合物の特性
本発明による方法に用いられるキャリブレーション混合物は、最高初期酵素濃度が［Ｅ］０である、既知の減少する初期酵素濃度を有する。代わりに、キャリブレーション混合物は、最高初期酵素活性がＡ０である、既知の減少する初期酵素活性を有する。
【００７２】
キャリブレーションのために用いられる最高初期酵素濃度［Ｅ］０、および初期酵素濃度の範囲がキャリブレーション曲線の意図される用途（例えば、オペレータが試験化合物の初期濃度をそのために確定するスクリーニング方法における用途、または治療用阻害剤の濃度が所定の閾値と比較して非常に低いかまたは非常に高いことが知られている患者からの生物試料中の治療用阻害剤をアッセイするための方法における用途）に応じて選択されることを当業者は認識するであろう。しかしながら、［Ｅ］０および初期酵素濃度の範囲は、生物試料中に（またはスクリーニング試料中に）、酵素が阻害剤と比較して常に過剰に存在するように選ばれなければならない。この過剰は、ゼロでない残留酵素活性の測定を保証する。「阻害剤と比較して過剰に存在する酵素」は、初期酵素濃度が、アッセイすることが望まれる阻害剤の濃度より（または試験することが望まれる試験化合物の濃度より）少なくとも１．２５倍より高い、好ましくは少なくとも１．３３倍より高い、より好ましくは少なくとも１．５倍よりさらに高いことを意味することが意図される。したがって、キャリブレーション混合物中の初期酵素濃度は、この条件を満たす任意の濃度であってよい。同様に、キャリブレーション混合物のうちの１つにおける最高初期酵素活性Ａ０は、キャリブレーション曲線の意図される用途に応じて選ばれる。
【００７３】
本発明によるキャリブレーション方法に用いられるキャリブレーション混合物は、それらの初期酵素濃度を除いて、同一である。特に、それらは、同じ初期基質濃度［Ｓ］０を含む。そのうえ、すべてのキャリブレーション混合物において、基質は、酵素と比較して過剰に存在する。この過剰は、定常状態の間に極めて少ししか変動しない基質濃度を有することを可能にする。「酵素と比較して過剰に存在する基質」は、初期酵素濃度より少なくとも１０倍より高い、好ましくは初期酵素濃度より少なくとも１００倍より高い、より好ましくは初期酵素濃度よりも少なくとも１０００倍より高いか、または少なくとも１００００倍より高い初期基質濃度を意味することが意図される。言い換えれば、初期酵素濃度［Ｅ］ｎを有するキャリブレーション混合物において、［Ｅ］ｎ／［Ｓ］０比が１０以上、好ましくは１００以上、より好ましくは１０００または１００００以上であれば、酵素が基質と比較して過剰に存在する。
【００７４】
すべてのキャリブレーション混合物が同じ総体積Ｖも有する。キャリブレーション方法は、任意の総体積Ｖを有するキャリブレーション混合物を用いて実行されてよい。明白なのは、コストの理由から、解析体積を最小限に抑えることが常に望ましいことである。したがって、例えば、体積Ｖは、数ミリリットル（例えば、１ｍｌまたは２ｍｌ）と数１００マイクロリットル（例えば５００μｌ、４００μｌ、３００μｌまたは３００μｌ未満）との間であってよい。
【００７５】
キャリブレーション混合物は、すべてが同じ反応媒体ＭＲも有する。「反応媒体」は、阻害反応と酵素反応とがその中で競合に持ち込まれる溶媒を意味することが意図される。反応媒体は、かかる反応に適した任意の反応媒体であってよい。反応媒体が酵素反応に対して有しうる影響を所与として、当業者は、キャリブレーションおよびアッセイ（またはキャリブレーションおよびスクリーニング）が同じ反応媒体または実質的に同じ反応媒体中で実行されなければならないことを理解するであろう。したがって、例えば、目標が酵素の阻害剤によって処置された患者に由来する生物試料中に存在する阻害剤をアッセイすることであるときには、キャリブレーション混合物の反応媒体は、健康な患者からの生物試料（すなわち、阻害剤を含まない生物試料−以下を参照）のアリコートを含む。
【００７６】
本文書の終わりに記載される実施例では、キャリブレーションは、３５０μｌの総体積Ｖに対して５０μｌの健康な血漿、１５０μｌの基質溶液および１５０μｌの酵素溶液を含んだキャリブレーション混合物で実行された。かかるキャリブレーションを用いて、アッセイは、３５０μｌの総体積Ｖに対して、酵素の阻害剤によって処置された患者から得られた５０μｌの血漿、１５０μｌの基質溶液および１５０μｌの酵素溶液を含んだ被検混合物で、またはより一般的に、酵素の阻害剤によって処置された患者から得られた血漿、基質溶液、および酵素溶液を１：３：３の体積比で含んだ被検混合物で実行されてよい。
【００７７】
キャリブレーション混合物の調製
各キャリブレーション混合物は、初期基質濃度［Ｓ］０および既知の初期酵素濃度または既知の初期酵素活性をもつ混合物を得るために、基質溶液と酵素溶液とを混合することによって調製される。例えば、既知の濃度の酵素の同じ貯蔵濃度の系列希釈によって混合物を得ることが可能である。系列希釈液には、緩衝液または血漿（以下を参照）が用いられてよい。
【００７８】
健康な生物試料のアリコートが用いられる実施形態では、キャリブレーション混合物は、既知の初期酵素濃度、または既知の初期活性、および基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、健康な生物試料のアリコート（希釈ありまたはなし）を酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合することによって調製される。当業者は、酵素溶液のおよび基質溶液の健康な生物試料への添加の順序が直接阻害剤の場合には重要でないことを知っている。確かに、被検混合物は、
−  初めに健康な生物試料を酵素溶液と混合し、次に、標識化された基質溶液を添加することによる（インキュベーションは、基質溶液の添加前に実行されてよい）か、
−  または、初めに健康な生物試料を標識化された基質溶液と混合し、次に、酵素溶液を添加することによるか（インキュベーションは、酵素溶液の添加前に実行されてよい）
のいずれかで得られてよい。しかしながら、間接阻害剤の場合には、健康な生物試料が初めに過剰な酵素の溶液と混合されて、反応の平衡相（すなわち、すべての複合体ＡｌＩが酵素に固定された相）に達することを可能にするために混合物が十分な時間インキュベートされる。次に、インキュベーション期間の終わりに基質溶液が添加されて（実施例２を参照）、酵素反応を開始する。
【００７９】
実験条件
阻害反応および酵素反応は、任意の適切な物理化学的実験条件（ｐＨ、温度、イオン強度など）下で実行されてよい。しかしながら、当業者は、すべてのキャリブレーション混合物の反応が（同じか、または実質的に同じ反応媒体中で実行されるのに加えて）同じ実験条件下で実行されなければならないことを認識するであろう。
【００８０】
酵素反応の最適な実験条件は、当分野で知られるか、または当業者によって容易に決定されてよい。本明細書に提示される実施例では、本発明者は、３５℃と４０℃との間の温度、ならびにＯｗｒｅｎ  Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液（ｐＨ７．３５）および／または血漿を含んだ反応媒体を用いた。
【００８１】
定常状態における残留酵素活性の決定
先に示されたように、標識の検出可能な物理的特性における変化を時間の関数としてモニターすることが平衡状態の確立をモニターすることを可能にする。モニタリングは、標識の検出可能な物理的特性の値を時間の関数として測定することによって実行される。物理的特性を測定するために用いられる技術を標識の性質が決定する。したがって、標識が発色性標識であれば、物理的特性は、分光光度法によって測定されてよい光学濃度（または吸光度）であり、標識が蛍光性標識であれば、物理的特性は、分光蛍光法によって測定されるなどである。
【００８２】
標識の検出可能な物理的特性における変化は、定常平衡に達してそれを観測するのに十分に長い期間にわたって、あるいは（例えば、かかる平衡に達する時間が既知か、または予め決定されたときには）定常平衡の期間のみにわたってモニターされる。より具体的には、物理的特性の値を時間の関数としてグラフ上にプロットすることによって得られた曲線は、ある時間後に直線部分を有し、この部分が定常状態に対応する。当業者は、それゆえに、標識の物理的特性における変化をモニターするために最適な期間をどのように決定すべきかを知っている。直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）に係わる以下に提示される実施例では、本発明者は、ＤＯＡを含んだ試料を基質溶液と混合して、得られた混合物を２４０秒間インキュベートし、次に、酵素反応を開始する酵素溶液を添加した。標識ｐＮＡの光学濃度を酵素反応開始の５０秒後に始めて３０秒間、すなわち、５０秒と８０秒との間の継続時間にわたって経時的に４０５ｎｍで測定することによって反応をモニターした。ヘパリン類に係わる以下に提示される実施例では、本発明者は、ヘパリンを含んだ試料を酵素溶液と混合して、得られた混合物を１１．５分間インキュベートし、次に、酵素反応を開始する基質溶液を添加した。標識ｐＮＡの光学濃度を酵素反応開始の２０秒後に始めて３０秒間にわたって４０５ｎｍで測定することによって反応をモニターした。
【００８３】
標識化を時間の関数としてモニターするための曲線がキャリブレーション混合物ごとに得られる。
【００８４】
本発明によるキャリブレーション方法は、その後に、標識の検出可能な物理的特性における変化の時間の関数としての曲線の直線部分の勾配を、混合物ごとに、算出することにあるステップを含む。所与のキャリブレーション混合物について、すなわち、所与の初期酵素濃度について、定常状態における残留酵素活性は、その混合物について生成された曲線の直線部分の勾配である。
【００８５】
汎用キャリブレーション方法のステップｂ）
本発明による汎用キャリブレーション方法のステップｂ）は、キャリブレーション混合物の各々について、混合物の初期酵素濃度を最高初期酵素濃度［Ｅ］０と比較して標準化することによって混合物の前記初期酵素濃度をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換することか、または混合物の初期酵素活性を最高初期酵素活性Ａ０と比較して標準化することによって混合物の前記初期酵素活性をパーセンテージとして表現された抗酵素活性へ変換することにある。
【００８６】
標準化は、任意の方法によって実行されてよい。しかしながら、好ましくは、初期酵素濃度［Ｅ］または初期酵素活性Ａを有する混合物について、この混合物についてパーセンテージとして表現された抗酵素活性ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、以下の式：
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）＝１−（［Ｅ］／［Ｅ］０）、またはＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）＝１−（Ａ／Ａ０）
のうちの１つによって算出される。したがって、最高初期酵素濃度［Ｅ］０または最高初期活性Ａ０を有する試料については、抗酵素活性ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）がゼロである。
【００８７】
例えば、最高酵素濃度［Ｅ］０が１０ｎＭであれば、関連する抗酵素活性は、０％である。４つの測定が実行される場合に、３つの残りの測定結果が７．５ｎＭ、５ｎＭおよび２．５ｎＭの濃度について得られてよく、先に示されたように算出される、それらに関連する抗酵素活性は、それぞれ、０．２５（すなわち、２５％）、０．５（すなわち、５０％）および０．７５（すなわち、２５％）である。
【００８８】
汎用キャリブレーション方法のステップｃ）
本発明による汎用キャリブレーション方法のステップｃ）は、ステップｂ）で算出された抗酵素活性をステップａ）で得られた定常状態における残留酵素活性の関数として、キャリブレーション混合物ごとに、グラフ上に、プロットすることによってキャリブレーション曲線を生成することにある。
【００８９】
キャリブレーション曲線の式は、グラフ上にプロットされた対（抗酵素活性、定常状態における残留酵素活性）の回帰によって算出されてよい。回帰は、線形または多項式回帰であってよい。回帰が線形である場合には、キャリブレーション曲線の式は、形式：
【００９０】
【数８】
2019516404.tif 000009
【００９１】
の「式１」であり、ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、パーセンテージとして表現された抗酵素活性であり、
ｖは、定常状態で測定された残留酵素活性であり、
１／ｖ０は、キャリブレーション曲線の勾配であり、ｖ０は、試料中に存在する阻害剤の濃度がゼロであるときに観測される、定常状態で測定された残留酵素活性（すなわち、最大残留酵素活性）に対応する。
【００９２】
結果は、パーセンテージとして表現され、したがって、単位が酵素のすべての阻害剤に共通であり、それらの阻害作用を互いに比較することを可能にする。
【００９３】
チャート
先に示されたように、キャリブレーション方法は、酵素の阻害剤のアッセイに用いることが意図されてよい。「酵素の阻害剤」または「酵素阻害剤」は、酵素に結合してその活性を減少させる任意の分子を示す。阻害剤は、可逆的または不可逆的であってよい。「可逆的な阻害剤」は、（例えば、水素結合、疎水性相互作用および／またはイオン結合を介して）酵素と非共有結合的に会合し、酵素を非永続的に不活性化する阻害剤を意味することが意図される。本明細書では、阻害剤Ｉが酵素と直接的に会合する場合に「可逆的な直接阻害剤」が言及され、阻害剤と生物試料中に存在する化合物との複合体ＡｌＩが酵素と会合する場合に「可逆的な間接阻害剤」が言及される。酵素の「不可逆的な阻害剤」は、少なくとも１つの共有結合を介して酵素と会合し、したがって、酵素と安定な複合体を形成し、それによって酵素を永続的に不活性化する阻害剤を意味することが意図される。阻害剤Ｉが酵素と直接的に会合する場合に「可逆的な直接阻害剤」が言及され、阻害剤と生物試料中に存在する酵素の自然阻害剤との複合体ＡｌＩが酵素と会合する場合に「可逆的な間接阻害剤」が言及される。
【００９４】
パーセンテージとして表現された抗酵素活性の観点からではないが、厳密な定量的単位に相当する、阻害剤の量または濃度の形で（例えばｎｇ／ｍｌで）表現されたアッセイの結果を提供することを目標として、本発明によるキャリブレーション方法は、チャートを生成する追加のステップも含んでよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明によるキャリブレーション方法は、酵素Ｅの阻害剤に固有であり、被検試料について決定された抗酵素活性を阻害剤の量または濃度へ（例えば、ｎｇ／ｍｌで表現された濃度として）変換することを可能にする、変換チャートを生成することにあるステップｄ）も含む。
【００９５】
好ましくは、本発明によるキャリブレーション方法は、酵素Ｅの阻害剤に固有の少なくとも１つのチャートを生成することにあるステップｄ）も含み、ステップｄ）は、以下のステップ：
ｄ１）各々が、阻害剤を既知の初期濃度で、酵素Ｅを濃度［Ｅ］０で、および酵素に特異的な標識化された基質Ｓを濃度［Ｓ］０で含んだ、少なくとも２つの標準化混合物について、定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  標準化混合物の各々において、酵素は、阻害剤と比較して過剰に存在し、
−  標準化混合物は、同じ体積Ｖ’および同じ反応媒体ＭＲを有し、
−  混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ｄ１’）阻害剤の既知の初期濃度をもつ標準化混合物を得るために、阻害剤を酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｄ１’’）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ｄ１’’’）ｄ１’’）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｄ１’’’）で得られた勾配は、標準化混合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
ｄ２）標準化混合物の各々について、その混合物の抗酵素活性を標準化混合物についてステップｄ１’’’）で測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと、
ｄ３）各標準化混合物について、標準化混合物の阻害剤の初期濃度をステップｄ２）で決定された抗酵素活性の関数としてグラフ上にプロットすることによって、標準曲線またはチャートを生成するステップと
を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、方法は、標準曲線の式をグラフ上にプロットされた対（抗酵素活性、阻害剤の濃度）の回帰によって決定することにある追加のステップｄ４）も含んでよい。回帰は、線形、多項式または他の回帰であってよい。
【００９７】
キャリブレーション方法のステップｄ１）
本発明によるキャリブレーション方法のステップｄ１）は、各々が、既知の濃度の阻害剤を含み、酵素Ｅを濃度［Ｅ］０（すなわち、キャリブレーション方法のステップａ）〜ｄ）で用いられる最高初期酵素濃度と同一の濃度）で、または初期活性Ａ０（すなわち、キャリブレーション方法のステップａ）〜ｄ）で用いられる初期酵素活性と同一の活性）で、および基質Ｓを濃度［Ｓ］０（すなわち、キャリブレーション方法のステップａ）〜ｄ）で用いられる初期基質濃度と同一の濃度）で含む、少なくとも２つの標準化混合物について定常状態における残留酵素活性を決定することにある。標準化混合物中には、酵素が阻害剤と比較して過剰に存在する（上記を参照）。
【００９８】
例えば、チャートを生成するために用いられる標準化混合物は、典型的に０および６００ｎｇ／ｍｌの間の、阻害剤の増加する初期濃度を有してよい。例えば、用いられる標準化混合物は、０、１００、２００、３００、４００および任意選択で５００ｎｇ／ｍｌに等しい初期濃度を有してよい。代わりに、０および２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度を有する標準化混合物が用いられてもよい。典型的に、前記濃度は、０、３０、６５および１００ｎｇ／ｍｌ、あるいは０、５０、１００および１５０ｎｇ／ｍｌに等しくてよい。
【００９９】
キャリブレーション方法のステップｄ）で用いられる標準化混合物は、キャリブレーション方法のａ）〜ｃ）で用いられる混合物の体積Ｖと同一であってもなくてもよい同じ体積Ｖ’を有する。好ましくは、体積Ｖ’は、体積Ｖと同一である。標準化試料の反応媒体ＭＲは、キャリブレーション方法のステップａ）〜ｃ）で用いられる試料の反応媒体と好ましくは同一かまたは実質的に同一である。
【０１００】
一般的に言って、チャートの生成のために、阻害反応と酵素反応とが汎用キャリブレーション方法に用いられるのと同一の、任意の適切な物理化学的実験条件（ｐＨ、温度、イオン強度など）下で競合に持ち込まれる。
【０１０１】
汎用キャリブレーションのステップａ）について記載された操作条件は、特に混合の順序に関して（上記を参照）、ステップｄ１）に適用可能である。混合する前に、阻害剤は、好ましくは、既知の濃度の阻害剤の溶液の形態にある（例えば、阻害剤が健康な生物試料に添加される）。ステップｄ１’’）（標識の検出可能な物理的特性の値を時間の関数として測定し、直線部分を有する曲線を生成するステップ）およびステップｄ１’’’）（定常状態における残留酵素活性を得るために、この曲線の直線部分の勾配を算出するステップ）は、キャリブレーション方法のステップａ２）およびａ３）のように実行される。
【０１０２】
キャリブレーション方法のステップｄ２）
本発明によるキャリブレーション方法のステップｄ２）は、標準化混合物の各々について、その混合物の抗酵素活性を標準化混合物について測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いることにある。これは、標準化混合物について測定された定常状態における残留酵素活性をグラフ上にプロットすることによって、および関連する抗酵素活性を決定することによって手作業で決定されてよい。代わりに、キャリブレーション曲線が直線であれば、標準化混合物の抗酵素活性は、キャリブレーション曲線の式、例えば、式１を用いて算出されてもよい。
【０１０３】
キャリブレーション方法のステップｄ３）およびｄ４）
本発明によるキャリブレーション方法のステップｄ３）は、各標準化混合物について、標準化混合物の阻害剤の初期濃度をステップｄ２）で決定された抗酵素活性の関数としてグラフ上にプロットすることによって、標準曲線またはチャートを生成することにある。
【０１０４】
本発明によるキャリブレーション方法は、ステップｄ３）でグラフ上にプロットされた対（抗酵素活性、阻害剤の濃度）の回帰によって標準曲線の式を決定することにある追加のステップｄ４）も含んでよい。回帰は、線形、多項式または他の回帰であってよい。当業者は、標準曲線の式をどのように決定すべきかを知っている。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態において、阻害剤が可逆的な直接阻害剤であれば、チャートは、対（抗酵素活性、阻害剤の濃度）が決定された標準化試料に関して以下の式（式２）の非線形回帰を実行することによって得られ、
【０１０６】
【数９】
2019516404.tif 000010
【０１０７】
ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、抗酵素活性であり、
［Ｉ］０は、試料中に存在する阻害剤の濃度であり、
ｉおよびｅは、各阻害剤に固有の２つの固定された定数である。
代わりのモデリング、例えば、多項式が用いられてもよい。
【０１０８】
本発明の他の実施形態において、阻害剤が生物試料中に存在する化合物Ａと複合体ＡｌＩを形成する不可逆的な間接阻害剤であれば、チャートは、
対（抗酵素活性、阻害剤の濃度）が決定された標準化試料に関して以下の式（「式３」）の線形回帰
を実行することによって得られ、
［Ｉ］０＝ｅ×ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）
ここで、
ＡｎｔｉＥｎｚｙｍｅ（％）は、抗酵素活性であり、
［Ｉ］０は、試料中に存在する阻害剤の濃度であり、
ｅは、各阻害剤に固有の固定された定数であり、
式３は、阻害剤の初期濃度が各々の標準化混合物における複合体Ａの初期濃度以下である場合にのみ有効である。代わりのモデリング、例えば、多項式が用いられてもよい。
【０１０９】
キャリブレーション方法のステップｄ）が固有のチャートを有することが望まれる酵素の任意の阻害剤について繰り返されてよい。
【０１１０】
Ｃ．自動化
いくつかの実施形態において、本発明による汎用キャリブレーション方法（およびさらにアッセイまたはスクリーニング方法）のいくつかのステップは、自動化診断デバイス上で実行される。好ましくは、本発明による汎用キャリブレーション方法（およびさらにアッセイまたはスクリーニング方法）のすべてのステップがかかる自動化デバイス上で実行される。例えば、本明細書に提示される実施例に記載されるように、本発明による汎用キャリブレーション方法およびアッセイまたはスクリーニング方法は、Ｓｔａｇｏ社からのＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ自動化デバイス上で実行される。かかる自動化デバイスは、試料を同時にロードし、混合およびインキュベーションを実行して、光学濃度を測定することを可能にする。これは、迅速で信頼性および再現性のあるキャリブレーションまたはアッセイ方法をもたらす。
【０１１１】
本発明による方法は、遠隔バイオデバイスまたは患者のベッドにおけるポータブルデバイス上で用いられてもよい。
【０１１２】
ＩＩ−汎用キャリブレーション方法の使用
先に示されたように、本発明による汎用キャリブレーション方法によって得られるキャリブレーション曲線は、酵素に固有であり、生物試料中の酵素の阻害剤をアッセイするため、およびスクリーニング方法において酵素を阻害できる化合物を同定するために用いられてよい。
【０１１３】
Ａ．生物試料中の酵素阻害剤をアッセイするための方法
生物試料中の酵素の阻害剤をアッセイするための方法は、以下のステップ：
１）体積がＶ’’で、阻害剤を含む生物試料のアリコート、酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および酵素に特異的な標識化された基質Ｓを初期濃度［Ｓ］０で含んだ、反応媒体ＭＲの被検混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  酵素に特異的な基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  被検混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ｉ）初期酵素濃度［Ｅ］０の、または初期酵素活性のＡ０、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、生物試料のアリコートを酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｉｉ）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｉｉｉ）で得られた勾配は、被検混合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
２）生物試料の抗酵素活性を被検混合物について測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと
を含む。
【０１１４】
好ましくは、本発明によるアッセイ方法は、パーセンテージとして表現され、ステップ２）で得られた抗酵素活性を、汎用キャリブレーション方法のステップｄ）で得られた、阻害剤に固有のチャート（または標準曲線）を用いて阻害剤の濃度へ変換することにあるステップ３）も含む。確かに、本発明によるアッセイ方法は、阻害剤を
−  パーセンテージとして表現された活性の形、これは、所与の酵素に関して、異なる阻害剤の作用を互いに比較することを可能にする汎用単位に相当する、か、
−  あるいは、量または濃度の形（例えば、ｎｇ／ｍｌ）、これは、厳密な定量的単位に相当する、で、
アッセイすることを可能にする。
【０１１５】
アッセイ方法のステップ１）
本発明によるアッセイ方法のステップ１）は、被検生物試料のアリコート、キャリブレーション方法に用いられるものと同じ酵素Ｅ、およびキャリブレーション方法に用いられるものと同じ標識化された特異的な基質Ｓを含んだ混合物について定常状態における残留酵素活性を決定することにある。被検混合物では、初期基質濃度が［Ｓ］０、すなわち、キャリブレーション方法に用いられるものと同じ濃度であり、初期酵素濃度が［Ｅ］０、すなわち、キャリブレーション方法に用いられる最高初期酵素濃度であるか、または初期酵素活性がＡ０、すなわち、キャリブレーション方法に用いられる最高初期酵素活性である。被検混合物では、基質が酵素と比較して過剰に存在し、酵素は、アッセイされる阻害剤と比べてそれ自体が過剰に存在する。
【０１１６】
被検試料の体積Ｖ’’は、キャリブレーション方法のステップａ）〜ｃ）で用いられる混合物の体積Ｖと同一であってもなくてもよく、キャリブレーション方法のステップｄ）で用いられる標準化混合物の体積Ｖ’と同一であってもなくてもよい。好ましくは、体積Ｖ’’は、体積Ｖおよび体積Ｖ’と同一である。被検混合物の反応媒体は、キャリブレーション試料のおよび標準化試料の反応媒体と好ましくは同一かまたは実質的に同一である。
【０１１７】
酵素および阻害剤
先に示されたように、本発明は、阻害剤の存在、例えば、治療用阻害剤によって処置された患者に由来する生物試料中のその治療用阻害剤の存在を定量化することが望ましい（先に定義されたような）任意の酵素に適用されてよい。
【０１１８】
本発明のいくつかの実施形態において、アッセイ方法に用いられる酵素は、血液凝固の酵素である。「血液凝固の酵素」は、例えば、凝固因子、カリクレインまたはプラスミンのような、血液の凝固に関与する任意の酵素を意味することが意図される。血液凝固の酵素は、好ましくは哺乳動物酵素、好ましくはウシまたはヒト酵素である。酵素は、組み換え型または血漿由来であってよく、精製されていてもいなくてもよい。いくつかの実施形態において、血液凝固の酵素は、因子ＩＩａ、因子Ｘａおよびプラスミンから選択される。
【０１１９】
本発明による方法によってアッセイされてよい血液凝固の酵素の不可逆的な直接阻害剤は、アンチトロンビン、ヘパリンコファクターＩＩ、α２マクログロブリン、ヒルジン、レピルジンおよびデシルジンから選択されてよい。本発明による方法によってアッセイされてよい血液凝固の酵素の可逆的な直接阻害剤は、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダビガトラン、ビバリルジンおよびアルガトロバンから選択されてよい。本発明による方法によってアッセイされてよい血液凝固の酵素の不可逆的な間接阻害剤は、非分画ヘパリン類、低分子量ヘパリン類、フォンダパリヌクスのような五糖類およびダナパロイドナトリウムから選択されてよい。
【０１２０】
本発明の他の実施形態では、酵素は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ：ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）である。ＡＣＥは、カルボキシペプチダーゼ類のファミリーに属する金属酵素である。ＡＣＥは、アンジオテンシンＩの開裂を触媒して、効力のある血管収縮薬アンジオテンシンＩＩを与える。ＡＣＥは、効力のある血管拡張薬ブラジキニンの不活性化にも関与する。この酵素の阻害剤は、独自の治療クラスを構成する。それらは、動脈高血圧、心不全および糖尿病性腎症の処置に重要な役割を果たす最近の治療群を形成する。臨床的に用いられ、本発明による方法によってアッセイされてよいＡＣＥ阻害剤の例は、以下には限定されないが、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、モノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリルおよびトラドラプリルを含む。ＡＣＥは、ヒップリル−ヒスチジル−ロイシン（ＨＨＬ：ｈｉｐｐｕｒｙｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）または３−（２−フリルアクリロイル）−Ｌ−フェニルアラニル−グリシル−グリシン（ＦＡＰＧＧ：３−（２−ｆｕｒｙｌａｃｒｙｌｏｙｌ）−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｇｌｙｃｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ）のような人工基質を用いてキャリブレーションされる。後者の場合には、３４０ｎｍにおける吸光度の減少が加水分解された基質の量に比例する。
【０１２１】
生物試料
酵素阻害剤をアッセイするための方法は、生物試料、特に、患者に由来する生物試料に対して実行される。
【０１２２】
本明細書に用いられる「患者」という用語は、ヒトを示す。「患者」という用語は、特定の年齢を示さず、それゆえに、小児、青年および成人を包含する。一般的に言って、本発明によるアッセイ方法において、患者は、生物試料中の量を決定することが望まれる酵素阻害剤に基づく処置を受けている被検者である。本発明の文脈では、酵素阻害剤、または酵素阻害剤によって阻害される酵素に（活性化のまたは阻害の）効果を有しうるその他の薬を患者が投与されていないときに、「正常な患者」または「健康な患者」が言及される。血液凝固の酵素の阻害薬をアッセイするための方法の場合には、健康な患者は、凝血促進剤または抗凝血剤の処置を受けていない患者である。
【０１２３】
「生物試料」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で用いられる。生物試料は、阻害剤がその中に存在し、アッセイされてよい任意の生体液であってよい。本発明によるアッセイ方法に用いられてよい生体液の例は、以下には限定されないが、血液、血清、血漿、尿、唾液、胃液、汗などを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるアッセイ方法は、患者からの単なる血液生物試料を用いる。血液生物試料は、血液の、血漿の、多血小板血漿の、少血小板血漿の、血小板もしくは赤血球微粒子またはその他の細胞を含んだ血漿の試料であってよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明によるアッセイ方法は、全血試料（すなわち、そのすべての成分をもつ血液）に対して実行される。クエン酸塩加の全血であってもよい。この場合、血液サンプリングによって取られた全血がクエン酸塩チューブ中に採取される。
【０１２５】
他の実施形態では、本発明によるアッセイ方法は、血液試料から得られた血漿試料に対して実行される。ヒト血液から血漿を得るための方法は、当分野で知られる。好ましくは、生物試料は、少血小板血漿（ＰＰＰ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）試料である。この場合、試料は、特に、患者の血液試料を含むクエン酸塩チューブを１８℃と２２℃との間の温度の恒温遠心分離器において、２０００〜２５００ｇの速度で１５分間遠心分離することによって得られてよい。ＰＰＰ試料が保存されなければならない場合には、次のプロトコルを用いることが可能であり、このプロトコルは、
−  血漿を迅速にデカントし、白血球および血小板の細胞層の上におよそ０．５ｃｍの血漿を残すステップと、
−  溶血チューブまたはプラスチックチューブ中に血漿を回収するステップと、
−  このチューブを再び１８℃と２２℃との間の温度の恒温遠心分離器において、２０００〜２５００ｇの速度で１５分間遠心分離するステップと、
−  （細胞破片を含む）チューブの底部を取ることなく０．５〜１ｍＬの部分に等分するステップと、
−  −７０℃と−９０℃との間、好ましくは−８０℃で迅速に凍結させるステップと
にある。
【０１２６】
本発明によるアッセイを任意の適切な体積の生物試料に対して実行できる。一般に、本発明に用いられる生物試料のアリコートは、小体積である。したがって、生物試料は、２μｌと５００μｌとの間、好ましくは３μｌと４００μｌとの間、または３μｌと１００μｌとの間、あるいは５μｌと５０μｌとの間の体積を有してよい。生物試料のかかる体積は、実際、日常的な装置上の解析にとって十分であるが、遠隔バイオデバイス上では削減されてよい。この生物試料は、基質Ｓの溶液のおよび酵素Ｅの溶液の添加前に、特に、緩衝液（例えば、Ｏｗｒｅｎ  Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液）中または血漿中に希釈されてよい。
【０１２７】
この文書の終わりに提示される実施例では、定型的に、生物試料が、基質Ｓの溶液のおよび酵素Ｅの溶液の添加前に、３５０μｌの総体積Ｖを有する被検混合物のおよそ１．８体積％に相当する、最終体積の１２．５体積％（すなわち、５０μｌの最終体積中の６．２５μｌの試料）か、あるいは３５０μｌの総体積を有する被検混合物のおよそ７．１体積％に相当する、最終体積の５０体積％（すなわち、５０μｌの最終体積中の２５μｌの試料）を表すように希釈された。
【０１２８】
被検試料の調製および競合反応条件
被検混合物は、初期酵素濃度［Ｅ］０の、または初期活性Ａ０、および初期基質濃度［Ｓ］０の混合物を得るために、阻害薬の性質に応じて決定される順序（上記を参照）で生物試料のアリコート（希釈ありまたはなし）を酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合することによって調製される。一般的に言って、汎用キャリブレーション方法に用いられるものと同一の任意の適切な物理化学的実験条件（ｐＨ、温度、イオン強度など）下で阻害反応と酵素反応とが競合に持ち込まれる。
【０１２９】
ステップｉｉ）（標識の検出可能な物理的特性の値を時間の関数として測定し、直線部分を有する曲線を生成するステップ）およびステップｉｉｉ）（定常状態における残留酵素活性を得るために、この曲線の直線部分の勾配を算出するステップ）は、キャリブレーション方法のステップａ２）およびａ３）のように実行される。
【０１３０】
アッセイ方法のステップ２）
本発明によるアッセイ方法のステップ２）は、生物試料の抗酵素活性を被検混合物について測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いることにあり、チャートを生成するための方法のステップｄ２）のように実行される。
【０１３１】
アッセイ方法のステップ３）
アッセイ結果を阻害剤の量またはその濃度の形で得ることが望ましい場合には、アッセイ方法は、追加のステップ３）を含み、このステップは、パーセンテージとして表現され、ステップ２）で得られた抗酵素活性を、汎用キャリブレーション方法のステップｄ）で得られた、阻害剤に固有のチャート（または標準曲線）を用いて阻害剤の濃度へ変換することにある。
【０１３２】
これは、被検混合物について測定された抗酵素活性をグラフ上にプロットすることによって、および阻害剤の対応する量または濃度を決定することによって手作業で決定されてよい。代わりに、阻害剤の濃度が標準曲線の式を用いて算出されてもよい。例えば、阻害剤が可逆的な直接阻害剤であれば、被検混合物中の阻害剤の濃度は、式２（またはその他の適切な式）によって算出されてよく、阻害剤が不可逆的な間接阻害剤であれば、被検混合物中の阻害剤の濃度は、式３（またはその他の適切な式）によって算出されてよい。
【０１３３】
したがって、本発明のアッセイ方法のステップ３）の終わりには、試験された生物試料、例えば、酵素阻害剤によって処置された患者からの生物試料中に存在する阻害剤の濃度を決定することが可能である。
【０１３４】
臨床使用
直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）の分野では、本発明によるキャリブレーション／アッセイ方法は、過量投与を診断することを目標として、例えば、患者がそれらの薬用量を超過した場合、薬物相互作用の場合、処置を抗ビタミンＫ剤（ＶＫＡ：ａｎｔｉｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）から直接経口抗凝血剤へ変えた場合に、あるいは、外科的介入または侵襲的手技の前に、ＤＯＡによって処置された患者からの生物試料中のＤＯＡをアッセイするために用いられてよい。確かに、例えば、ＤＯＡの投与を停止した後に、ＤＯＡのレベルが依然として高ければ、外科手術中の患者には出血のリスクがあり、その時にはＤＯＡのレベルが減少するのを待つか、または解毒剤のアプローチを用いて、阻害剤の不利な点を打ち消すために患者に抗阻害剤化合物を投与するかのいずれかが必要である。
【０１３５】
したがって、本発明の対象は、ＤＯＡによって処置された患者における出血リスクを推定するための本発明によるアッセイ方法の使用である。特に、本発明の対象は、ＤＯＡによって処置された患者における過量投与を診断するための本発明によるアッセイ方法の使用である。本発明の別の対象は、ＤＯＡによって処置された患者における出血リスクを外科的介入の前に決定するための本発明によるアッセイ方法の使用である。
【０１３６】
本発明は、直接経口抗凝血剤（例えば、因子Ｘａ阻害剤または因子ＩＩａ阻害剤）によって処置された患者における出血リスクを推定するための方法にも関し、方法は、以下のステップ：
−  患者からの生物試料中の直接経口抗凝血剤の量または濃度を、本発明のアッセイ方法を用いて、決定するステップと、
−  この量または濃度を所定の閾値と比較するステップと、
−  直接経口抗凝血剤の量または濃度が所定の閾値を上回れば、出血リスクがあると見做すステップと、
−  任意選択で、患者からの生物試料中で測定された直接経口抗凝血剤の量または濃度に応じて患者に投与するための抗阻害剤化合物の量を決定するステップと
を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、ＤＯＡによって処置された患者は、ＤＯＡの過量投与を受けた疑いがある。他の実施形態では、ＤＯＡによって処置された患者は、処置を抗ビタミンＫ剤（ＶＫＡ）から直接経口抗凝血剤へ最近変えられている。さらに他の実施形態では、ＤＯＡによって処置された患者は、外科的介入をまさに受けしようとしている。
【０１３８】
「所定の閾値」とは、当分野で知られる阻害剤の量または濃度か、または所与の状況（例えば、切迫した外科的介入があるとき）にある患者には阻害剤がそれを超えると過剰である量または濃度に相当すると判断された阻害剤の量または濃度を意味することが本明細書では意図される。かかる閾値は、臨床的に用いられるＤＯＡごとに科学および／または医学界によって確定され、各ＤＯＡの臨床使用でより多くの経験が得られるにつれてよく再定義される。したがって、例えば、直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）処置を受けている患者に外科的介入を許容するための判定閾値は、（リバーロキサバンについての最小値として、Ｐｅｒｎｏｄら，Ａｎｎａｌｅｓ  ｆｒａｎｃａｉｓｅｓ  ｄａｎｅｓｔｈｅｓｉｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｒｅａｎｉｍａｔｉｏｎ，２０１３，３２（１０）：６９１−７００）３０ｎｇ／ｍｌ以下のレベルである。
【０１３９】
本発明による方法において、出血リスクを伴うＤＯＡを服用している患者に投与されてよい抗阻害剤化合物は、止血剤を含む。
【０１４０】
Ｂ．酵素阻害剤をスクリーニングするための方法
先に示されたように、本発明によるキャリブレーション方法は、キャリブレーションされる酵素のすべての阻害剤に共通の汎用単位である、抗酵素活性のパーセンテージとして表現された結果を得ることを可能にし、それによって酵素に対するこれらの阻害剤の阻害効果を比較することを可能にする。本発明によるキャリブレーション方法は、それゆえに、酵素の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法に用いられてよい。
【０１４１】
一般的に言って、本発明によるスクリーニング方法は、試験化合物の所与の濃度について測定された抗酵素活性を決定するステップと、この抗酵素活性を酵素の既知の阻害剤の同じ濃度について同じ条件下で測定された抗酵素活性と比較するステップとを含む。
【０１４２】
本発明は、それゆえに、酵素の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法にも関し、方法は、以下のステップ：
１）総体積がＶ’’’で、試験化合物を初期濃度［Ｃ］で、酵素Ｅを初期濃度［Ｅ］０でまたは初期活性Ａ０で、および酵素に特異的に標識化された基質Ｓを初期濃度［Ｓ］０で含んだ、反応媒体ＭＲの混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップであって、
−  酵素に特異的な基質は、検出可能な物理的特性を有する標識で標識化され、
−  酵素は、混合物中に試験化合物と比較して過剰に存在し、
−  混合物の定常状態における残留酵素活性は、以下のステップ：
ｉ）初期酵素濃度［Ｅ］０の、または酵素活性Ａ０の、初期基質濃度［Ｓ］０のおよび試験化合物の濃度［Ｃ］の混合物を得るために、試験化合物を酵素Ｅの溶液および基質Ｓの溶液と混合するステップ、
ｉｉ）標識の検出可能な物理的特性の値を測定し、曲線を得るために、この物理的特性の値を時間の関数として、グラフ上に、プロットするステップであって、曲線は、定常状態に対応する直線部分を有する、プロットするステップ、および
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で得られた曲線の直線部分の勾配を算出するステップ
によって決定され、ステップｉｉｉ）で得られた勾配は、被検化合物の定常状態における残留酵素活性である、
残留酵素活性を決定するステップと、
２）試験化合物の抗酵素活性を混合物について測定された定常状態における残留酵素活性から決定するために、汎用キャリブレーション方法のステップｃ）で得られた汎用キャリブレーション曲線を用いるステップと、
３）ステップ２）で決定された試験化合物の抗酵素活性を酵素の標準的な阻害剤について濃度［Ｃ］で同じ条件下において決定された抗酵素活性と比較するか、またはステップ２）で決定された試験化合物の抗酵素活性を所定の閾値と比較するステップであって、試験化合物は、試験化合物の抗酵素活性が酵素の標準的な阻害剤の抗酵素活性より大きいかまたは試験化合物の抗酵素活性が所定の閾値より大きければ、酵素の阻害剤として同定される、比較するステップと
を含む。
【０１４３】
スクリーニング方法のステップ１）
本発明によるスクリーニング方法のステップ１）は、試験化合物、同じ酵素Ｅおよび酵素に特異的な標識化された基質Ｓを含む混合物について定常状態における残留酵素活性を決定するステップにあり、アッセイ方法のステップ１）と同様に実行される。
【０１４４】
試験化合物を含んだ混合物の体積Ｖ’’’は、キャリブレーション方法のステップａ）〜ｃ）で用いられる混合物の体積Ｖと同一であってもなくてもよく、キャリブレーション方法のステップｄ）で用いられる標準混合物の体積Ｖ’と同一であってもなくてもよい。好ましくは、体積Ｖ’’’は、体積Ｖおよび体積Ｖ’と同一である。試験化合物を含んだ混合物の反応媒体ＭＲは、キャリブレーション試料のおよび標準化試料の反応媒体と好ましくは同一かまたは実質的に同一である。
【０１４５】
酵素
すでに示されたように、本発明は、例えば、ヒトまたは動物治療用阻害剤を開発することを目標として、阻害剤を同定することが有益な（先に定義されたような）任意の酵素に適用されてよい。したがって、本発明によるキャリブレーション／スクリーニング方法において、酵素は、同定された治療標的である。より具体的には、本発明によるキャリブレーション／スクリーニング方法において、酵素は、ヒドロラーゼ類の、リアーゼ類のまたはイソメラーゼ類のクラスに属し、治療標的として同定された任意の酵素であってよい。
【０１４６】
治療標的として同定されたリアーゼ類の例は、以下には限定されないが、ドパ脱炭酸酵素（または芳香族Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵素、酵素、その既知の臨床用阻害剤は、パーキンソン病の状況で用いられるカルビドパおよびベンセラジド、ならびに妊娠性高血圧の処置に用いられるメチルドパを含む）；炭酸脱水酵素（赤血球の細胞内原形質膜表面に存在する酵素、その臨床的阻害剤は、抗緑内障薬、利尿剤、反てんかん薬として用いられ、胃十二指腸潰瘍、神経障害または骨粗鬆症の処置にも用いられる）；ヒスチジン脱炭酸酵素（その既知の臨床用阻害剤であるカテキンおよびトリトカリンなどは、抗ヒスタミン剤として用いられる）；ならびにオルニチン脱炭酸酵素（その既知の臨床用阻害剤であるエフロルニチンは、がん処置に用いられる）を含む。
【０１４７】
治療標的として同定されたヒドロラーゼ類の例は、以下には限定されないが、ウィルスアスパルチルプロテアーゼ類（またはアスパラギン酸プロテアーゼ類）（それらの既知の臨床用阻害剤は、以下には限定されないが、ＨＩＶ感染の処置に用いられるサキナビルおよびインジナビル、ならびにＣ型肝炎の処置に用いられるテラプレビルおよびバセプレビルを含む）；セリンプロテアーゼ類、例えば、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼなどの膵臓消化酵素を含むヒトセリンプロテアーゼ類（それらの阻害剤は、気腫、嚢胞性線維症またはがんの発生および進行など重篤な疾患の処置に用いられてよい）、血液凝固に関与する酵素、例えば、トロンビン、カリクレイン、因子Ｘａ（上記を参照）、およびプラスミンなどの線維素溶解に関与する酵素類；ヒトアンジオテンシン変換酵素（上記を参照）、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ（その既知の臨床用阻害剤は、血中コレステロール値を下げるための薬物として用いられるスタチンを含む）、ヒトエンケファリナーゼ（その阻害剤は、鎮痛剤、抗うつ薬、鎮静剤、および止痢薬として用いられる）を含むが、それらには限定されない、メタロプロテアーゼ類；ならびに、例えば、エステラーゼ類、ウィルスグリコシダーゼ類、ヒトグリコシダーゼ類、リパーゼ類、ホスファターゼ類およびホスホリラーゼ類などの他のヒドロラーゼ類を含む。
【０１４８】
治療標的として同定されたイソメラーゼ類の例は、以下には限定されないが、アラニンイソメラーゼを含む（この酵素は、とりわけ細菌中に存在し、そのことがこの酵素を抗菌薬の開発にとって好都合な標的にする）。
【０１４９】
試験化合物
本発明によるスクリーニング方法においては、任意のタイプの化合物が試験されてよい。したがって、試験化合物は、天然産物または合成品であってよく、単一分子かあるいは異なる分子の混合物または複合体であってもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、化学ライブラリ（すなわち、分子のライブラリ）に属する。化学ライブラリは、何千万個もの化合物を含みうる。細菌もしくは真菌抽出物の形態のまたは植物抽出物の形態の天然化合物の化学ライブラリは、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ボセル，ワシントン州）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ダーラム，ノースカロライナ州）から入手可能である。合成化合物の化学ライブラリも、例えば、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（プリンストン，ニュージャージー州）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（メリマック，ニューハンプシャー州）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ニューミルフォード，コネチカット州）およびＡｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー，ウィスコンシン州）から、またはＭｅｒｃｋ、Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｃｏｍｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｍｏｎｓａｎｔｏ／Ｓｅａｒｌｅ、およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＵｐＪｏｈｎなどの大手の化学会社から市販されている。
【０１５１】
試験化合物は、任意の分子クラス、例えば、タンパク質類、ペプチド類、ペプチド模倣薬、ペプトイド類、サッカリド類、ステロイド類などに属してよい。試験化合物は、小分子、または概しておよそ５０およびおよそ２５００ダルトンの間、例えば、５００および７００ダルトンの間、ならびに３５０ダルトン未満などの低分子量の分子であってもよい。
【０１５２】
操作条件
汎用キャリブレーションのステップａ）についてまたはアッセイ方法のステップ１）について記載された操作条件は、スクリーニング方法のステップ１）に適用可能である。
【０１５３】
いくつかの手順では、単一の化合物が本発明の同定方法によって試験される。他の手順では、いくつかの化合物が並行して試験される。この場合、酵素反応は、いくつかの試験を同時に行うことを可能にするマルチウェルプレートの上で実行されてよい。典型的な支持体のうちには、取り扱いが容易なマイクロタイトレーションプレート、より詳しくは１２、２４、４８、９６、もしくは３８４（またはそれ以上の）ウェルプレートがある。
【０１５４】
化合物は、単一濃度で試験されてもよい。代わりに、化合物は、いくつかの濃度、例えば、対照として用いられる酵素の既知の阻害剤が活性である濃度の範囲内の濃度で試験されてもよい。
【０１５５】
酵素を阻害する化合物の同定
本発明によるスクリーニング方法において、試験化合物は、試験化合物の抗酵素活性が酵素の標準的な阻害剤について同じ条件下で測定された抗酵素活性より大きいか、または試験化合物の抗酵素活性が所定の閾値より大きければ、酵素の阻害剤として同定される。
【０１５６】
「酵素の標準的な阻害剤」は、本明細書では酵素の既知の阻害剤を示す。当業者は、臨床的な関心を担う試験化合物を同定するために標準的な阻害剤をどのように選択すべきかを知っている。例えば、標準的な阻害剤は、臨床的に用いられる酵素阻害剤であってよい。
【０１５７】
「所定の閾値」は、試験される濃度において、試験化合物がそれを超えると臨床的な関心を担う酵素の阻害剤であると考えられてよい抗酵素活性の値として同定された、阻害剤の量または濃度を意味することが本明細書では意図される。
【０１５８】
治療用阻害剤の開発
本発明によるスクリーニングプロセスの目標は、酵素を阻害し、臨床的な関心を担う化合物を同定することである。本発明によるスクリーニング試験は、その後に他の試験、例えば、酵素の他の既知の阻害剤と、および／または同じクラスに属する他の酵素と比較して実行される本発明による１つ以上のスクリーニング試験が続いてもよい。代わりにまたは加えて、本発明によるスクリーニング試験は、その後に細胞モデルまたは動物モデルに関するｉｎ  ｖｉｖｏ毒性研究が続いてもよい。試験化合物が酵素に対して阻害活性を有するとして同定されたときには、同定された試験化合物と比較して改善された特性を有する新しい基礎をなす阻害剤構造を同定することを目標として、構造−活性関連性研究が行われてもよい。
【０１５９】
ＩＩＩ−キット
本発明は、本発明による方法を実行するために用いる装置を備えるキットも対象とする。特に、本発明は、酵素の阻害剤をアッセイするためのキットおよび酵素を阻害することが可能な化合物のスクリーニングのためのキットに関する。キットは、概して、所与の酵素について設計される。しかしながら、１つのキットが、１つより多い酵素について設計されてもよい。例えば、キットは、共有される生物学的機序に関与する少なくとも２つの酵素について、特に、血液凝固の少なくとも２つの酵素について設計されてもよい。キットは、アッセイ方法に用いることが意図されるときには、酵素の単一の阻害剤の場合に用いられるように設計されてもよい。代わりに、キットは、酵素のいくつかの異なる阻害剤（例えば、２つの異なる阻害剤または２つより多い異なる阻害剤）をアッセイするために設計されてもよい。そのうえ、キットは、阻害剤をアッセイするための方法に用いることが意図されるときには、単一のアッセイを可能にするようにも設計されてよい。あるいは、キットは、有限数のアッセイ、例えば、２回のアッセイまたは５回のアッセイまたは１０回のアッセイまたは２０回のアッセイまたは５０回のアッセイなどを行うように設計されてもよい。
【０１６０】
一般的に言って、本発明によるキットは、酵素および特異的な基質を備える。いくつかの実施形態において、キットに含まれる特異的な基質は、標識化される。他の実施形態では、キットに含まれる特異的な基質は、標識化されないが、キットは、その標識化のために必要とされる少なくとも１つの試薬を備える。酵素および基質は、キャリブレーションおよび予想される数のアッセイを行うために適切な量で提供される。
【０１６１】
キットは、酵素の阻害剤をアッセイするための方法に用いることが意図されるときには、阻害剤の標準化のための１つ以上の試料を備えてよい。キットは、酵素の異なる阻害剤をアッセイするために用いることが意図されるときには、酵素の異なる阻害剤の各々の標準化のための１つ以上の試料を備えてよい。
【０１６２】
キットは、酵素の阻害剤を同定するためのスクリーニング方法に用いることが意図されるときには、酵素の少なくとも１つの標準的な阻害剤を備えてよい。
【０１６３】
本発明によるキットは、本発明によるキャリブレーション／アッセイ方法またはキャリブレーション／スクリーニング方法を実行するための試薬または溶液、例えば、生物試料を希釈するための試薬または溶液なども備えてよい。特に、キットは、生物試料を希釈するための緩衝液、例えば、ＯＫＢ緩衝液を備えてよい。これらの試薬および／または溶液を用いるためのプロトコルもキットに含まれてよい。
【０１６４】
本発明によるキットは、品質管理も備えてよい。
【０１６５】
キットの異なる成分は、固体形態（例えば、凍結乾燥形態で）または液体形態で提供されてよい。キットは、任意選択で、試薬もしくは溶液の各々を含んだ容器、および／または本発明のキャリブレーション／アッセイ方法もしくはキャリブレーション／スクリーニング方法のいくつかのステップを実行するための容器を備えてよい。
【０１６６】
一般的に言って、本発明によるキットは、本発明によるキャリブレーション／アッセイ方法もしくはキャリブレーション／スクリーニング方法を実行するための使用説明書も備える。
【０１６７】
本発明によるキットは、バイオ製品の調製、販売および使用を規制する行政機関によって要求される形式の使用説明書も備えてよい。
【０１６８】
本明細書に用いられるすべての技術および科学用語は、特段の記載がない限り、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。同様に、本明細書に挙げられるすべての刊行物、特許出願、すべての特許、すべての他の参考文献は、参照により組み込まれる。
【０１６９】
以下の実施例および図は、本発明のいくつかの実施形態を記載する。しかしながら、実施例は、説明のために提示されるに過ぎず、本発明の範囲を決して限定しないことが認識されよう。
【実施例】
【０１７０】
実施例１：可逆的な直接阻害剤
ビタミンＫ拮抗薬（ＶＫＡ：ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）は、経口で投与される抗凝血剤の歴史的に最初で唯一のクラスである。多くの食品および薬物相互作用を加えられ得る、このタイプの処置に対する患者の反応における大きな変動性は、多くの血液試料を患者から採取することを伴う、処置の定期的なｉｎ  ｖｉｔｒｏモニタリングを必要とする。この所見は、理論的には、定期的なモニタリングを必要とせず、比較的少ない食品および薬物相互作用のみを有する、直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）と呼ばれる抗凝血薬の新しいファミリーを製薬業界が開発することにつながった。抗凝血剤のこのファミリーは、２つのクラスに分けられる：
−  抗Ｘａ、因子Ｘａの直接阻害剤、および
−  抗ＩＩａ、トロンビンの直接阻害剤。
【０１７１】
先に示されたように、例えば、緊急の外科的介入の前、過量投与が疑われる場合、または原因不明の出血の場合になど、直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）をアッセイすることが有用ないくつかの状況がある。本明細書に提示される研究は、抗Ｘａのファミリーに焦点を合わせ、その主な分子は、以下の通りである：
−  リバーロキサバン、Ｘａｒｅｌｔｏ（登録商標）の名称でＢａｙｅｒ／Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社が販売；
−  アピキサバン、Ｅｌｉｑｕｉｓ（登録商標）の名称でＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ｐｆｉｚｅｒ社が販売；および
−  エドキサバン、Ｓａｖａｙｓａ（登録商標）またはＬｉｘｉａｎａ（登録商標）の名称でＤａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ社が販売。
【０１７２】
Ｉ．実験プロトコル
１．材料
血漿試料（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ，ラ・プレンヌ・サン・ドニ，フランス）は、凝血促進剤または抗凝血剤処置に従っていない健康な患者に由来した。２０１１年／０１月、２０１２年／０３月、２０１４年／０４月、２０１４年／１１月および２０１５年／０２月付けの血漿の異なるプールを実験に用いた。血漿バッグからプールを作る前に、プロトロンビンレベル（ＰＴ：ｐｒｏｔｈｏｒｏｍｂｉｎ  ｌｅｖｅｌ）の値、活性化物質によるセファリン時間（ＣＴＡ：ｃｅｐｈａｌｉｎ  ｔｉｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、およびさらに凝血因子の濃度に一貫性があったことを検証するために試験を実行した。血漿バッグをその後に３７℃で５０分間解凍し、室温で３０分間放置して安定化した。プールを作り、血漿を分割する前に１５３回転／分で３５分間撹拌した。フラクションをおよそ−７０℃で保存した。使用前に、それらを３７℃で５分間解凍した。
【０１７３】
抗凝血剤の過負荷を４００μｇ／ｍｌに濃縮したアピキサバン（Ｅｌｉｑｕｉｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社，ニューヨーク，米国）の溶液、５００μｇ／ｍｌに濃縮したエドキサバントシラート（Ｌｉｘｉａｎａ，Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ社，東京，日本）の溶液、および３９３μｇ／ｍｌに濃縮したリバーロキサバン（Ｘａｒｅｌｔｏ，Ｂａｙｅｒ社、レーヴァークーゼン，ドイツ）の溶液から作った。
【０１７４】
市販キットＳＴＡ（登録商標）−Ｌｉｑｕｉｄ  Ａｎｔｉ−Ｘａ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社，アニエール・シュル・セーヌ，フランス）からの試薬、Ｆ．Ｘａ（ウシ由来の因子Ｘａ）および基質（ＭＡＰＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）を用いた。これらの市販試薬およびさらに正常ヒト血漿のプールＰｏｏｌ  Ｎｏｒｍ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社，アニエール・シュル・セーヌ，フランス）、Ｏｗｒｅｎ  Ｋｏｌｌｅｒ緩衝液（ＯＫＢ：Ｏｗｒｅｎ  Ｋｏｌｌｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．３５，ＳＴＡ（登録商標）−Ｏｗｒｅｎ−Ｋｏｌｌｅｒ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社，アニエール・シュル・セーヌ，フランス）、ならびに脱着溶液（ＤＵ：ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ＳＴＡ（登録商標）−Ｄｅｓｏｒｂ  Ｕ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社，アニエール・シュル・セーヌ，フランス）を、製造業者によって推奨されるように、室温で３０分間再生した。
【０１７５】
脱ミネラル水中で５％に希釈したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ社，ヴァル・ド・ルイユ，フランス）を実験に用いた。
【０１７６】
すべての測定をＳＴＡ（登録商標）自動化デバイス（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社，アニエール・シュル・セーヌ，フランス）ＡＵＴ００４６０（ヘースティング番号）上で実行した。これらの実験に用いた自動化デバイスのためのソフトウェアバージョンは、バージョンｖ３．０４．０５であった。
【０１７７】
２．方法
抗Ｘａ酵素アッセイ。比色分析によってカイネティクスを４０５ｎｍでモニターし、パラニトロアニリド（ｐＮＡ：ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）の放出を検出した。光学濃度（ＯＤ）を２秒ごとに測定した。３つの直接経口抗Ｘａ抗凝血剤をアッセイするために、２つの手法：広い範囲の手法および狭い範囲の手法を最適化した。これは、広い範囲の手法が所望の範囲全体にわたって抗凝血剤をアッセイすることを可能にするためであるが、しかし、これらの抗凝血剤の低濃度の測定が高精度を必要とするので、狭い範囲の手法もそれゆえに開発した。
【０１７８】
広い範囲では、６．２５μｌの生物試料（血漿）をＯＫＢで５０μｌの最終体積に希釈した。１５０μｌの基質の存在下でマイクロキュベットを３７℃で２４０秒間インキュベートした。予め３７℃でインキュベートした１５０μｌのＦ．Ｘａの添加によって反応を開始した。狭い範囲では、２５μｌの試料を２５μｌのＯＫＢで希釈した。基質および酵素の添加のための実験条件は、広い範囲の手法と同じである。勾配を５０秒と８０秒との間で決定した。
【０１７９】
汎用キャリブレーション。キャリブレーションを、９０％〜０％に及ぶ抗Ｘａ活性に対応する１０％〜１００％のＦ．Ｘａに及ぶ、１０点からなるＦ．Ｘａの範囲から実行した。この範囲をキットＳＴＡ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ  Ａｎｔｉ−Ｘａからの試薬から生成した。Ｆ．Ｘａ（２ｍｌ，１．８ｍｌ，・・・，０．２ｍｌ）を２ｍｌの最終体積に向けてＯＫＢ（０ｍｌ，０．２ｍｌ，・・・，１．８ｍｌ）中に希釈した。２０１４年／０４月付けの健康な血漿のプールをこの実験に用いた。５％のＤＭＳＯを血漿中で２０分の１に希釈した。結果（５０秒と８０秒との間のＯＤ／分の測定結果）を２回の反復試験で決定した。
【０１８０】
１０個のキャリブレーション点について測定したカイネティクスの勾配が抗Ｘａ活性（％）のグラフをＯＤ／分の関数としてプロットすることを可能にする。試験された試料のＯＤ／分をパーセンテージとしての抗Ｘａ活性へ変換するために得た線の式を用いる。線の式は、１次のまたは２次の多項式回帰によって与える。
【０１８１】
変換チャートの生成。両方の手法（広い範囲の手法および狭い範囲の手法）について、各直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）に固有のチャートのパラメータを少数の実験点上の式２の非線形回帰によって決定した。広い範囲では、０、１００、２００、３００および４００ｎｇ／ｍｌのＤＯＡで過負荷を与えた試料を用いてリバーロキサバンと関連するチャートを生成した。０、１００、２００、３００、４００および５００ｎｇ／ｍｌで過負荷を与えた試料を用いてアピキサバンと、およびエドキサバンと関連するチャートを生成した。狭い範囲では、０、３０、６５、および１００ｎｇ／ｍｌのＤＯＡで過負荷を与えた試料を用いてリバーロキサバンと関連するチャートを生成した。０、５０、１００、および１５０ｎｇ／ｍｌのＤＯＡで過負荷を与えた試料を用いてアピキサバンと、およびエドキサバンと関連するチャートを生成した。試料ごとにＯＤ／分を５０秒と８０秒との間で測定した。
【０１８２】
血漿過負荷。２０１４年／０４月付けの血漿のプールを用いて過負荷を作った。直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）の貯蔵溶液をＤＭＳＯ％中に希釈した。種々の過負荷用の希釈範囲を作るために１０μｇ／ｍｌの中間溶液を用いた。血漿中におけるＤＯＡの希釈は、２０分の１であった。過負荷の濃度は、リバーロキサバンについて０、１０、２０、３０、４０、５０、６５、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ｎｇ／ｍｌ、ならびにアピキサバンおよびエドキサバンについて０、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００ｎｇ／ｍｌであった。過負荷の最終体積は、１ｍｌであった。エドキサバンを含んだ溶液を暗所に保存した。結果（５０秒と８０秒との間のＯＤ／分の測定結果）を過負荷ごとに３回の反復試験で決定した。
【０１８３】
汎用キャリブレーションのための試験の構成。広い範囲および狭い範囲の手法のための試験構成をＦ．Ｘａの希釈によって生成した。実験条件は、「抗Ｘａ酵素アッセイ」の節に記載したものと同じである。
【０１８４】
チャートの生成のための試験の構成。上記のように、「抗Ｘａ酵素アッセイ」の節に記載した広い範囲および狭い範囲の手法に従って異なる測定結果を得た。
【０１８５】
血漿過負荷のための試験の構成。「抗Ｘａ酵素アッセイ」の節に記載した広い範囲および狭い範囲の手法に従ってＤＯＡで過負荷を与えた血漿に関する測定を実行した。
【０１８６】
ブランク上限の決定。ブランク上限（ＬｏＢ：ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｂｌａｎｌｋ）を標準的な手順に従って決定した。用いた５つの異なる血漿は、２０１１年／０１月、２０１２年／０３月、２０１４年／０４月、２０１４年／１１月および２０１５年／０２月付けのものであった。毎日４つの反復試験を３日にわたって同じ自動化デバイス上で実行した。広い範囲および狭い範囲の手法について試験を実行した。
【０１８７】
検出限界の決定。検出限界（ＬｏＤ：ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を標準的な手順に従って決定した。低アナライト血漿を調製した。過負荷を２０分の１まで実行した。２０１４年／０４月付けの血漿を用いた。汎用キャリブレーションの回帰が一次多項式であったときに、広い範囲におけるアナライトの濃度は、リバーロキサバンのおよびアピキサバンの１０ｎｇ／ｍｌ、ならびにエドキサバンについては１５ｎｇ／ｍｌであった。狭い範囲では、過負荷の濃度は、３つの抗凝血剤について５ｎｇ／ｍｌであった。９００μｌの最終体積に向けて５つの過負荷を作った。汎用キャリブレーションの回帰が二次多項式であったときに、広い範囲におけるおよび狭い範囲におけるアナライトの濃度は、３つの直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）について２ｎｇ／ｍｌであった。過負荷の最終体積は、１０００μｌであった。各過負荷を３つのチューブに分離した。試料をそれらの使用まで−７０℃で凍結させた。１日当たり過負荷ごとに４つの分析反復試験を伴う分析を３日にわたって同じ自動化デバイス上で実行した。
【０１８８】
血漿中における希釈を用いた抗Ｘａ酵素アッセイ。希釈を緩衝液中ではなく血漿中で実行したという事実を除いて、実験条件は、前節に記載したものと同一である。用いた希釈剤は、Ｐｏｏｌ  Ｎｏｒｍであった。とはいえ、汎用キャリブレーションは、Ｆ．ＸａをＯＫＢ中に希釈することによって「汎用キャリブレーション」の節に記載したものと同じ条件下で得た。
【０１８９】
ＩＩ．結果
１．汎用キャリブレーション
図１は、それぞれ広い範囲および狭い範囲の手法で得た本発明による汎用キャリブレーションの例を提示し、結果を測定したＯＤ／分の関数として抗Ｘａ活性（％）で表現する。異なる実験点の線形回帰は、以下の式：
ｙ＝１．０５３−０．９９９ｘ（Ｒ２＝０．９９４）、およびｙ＝１．０３４−１．０８１ｘ（Ｒ２＝０．９９６）
を与える。
【０１９０】
これらの汎用キャリブレーションの理論式は、発明を実施するための形態において先に記載したように式１の直線が与え、本明細書で得た結果は、この表現と完全に一致する、すなわち、１に非常に近い決定係数と１に近いインターセプトポイントとを有する線形回帰を得る。これら２つの直線の式が異なることに注目すると興味深い。試料の希釈が２つの手法の間で異なり（広い範囲の手法について１／８、および狭い範囲の手法について１／２）、マトリクス効果が観測されるという事実がこれを説明する。
【０１９１】
２．変換チャート
図２は、３つの直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）の各々について測定した抗Ｘａ活性（％）をｎｇ／ｍｌで表現した濃度へ変換することを可能にするチャートを示す。対（抗Ｘａ活性、抗凝血剤の濃度）が既知の試料に関して式２の非線形回帰を実行することによって、これらのチャートを生成した。広い範囲の手法では、これらの非線形回帰は、それぞれ、リバーロキサバンについて０．９９７、アピキサバンについて０．９９５、およびエドキサバンについて０．９９３の決定係数Ｒ２を有する。狭い範囲の手法では、これらの非線形回帰は、それぞれ、リバーロキサバンについて０．９９３、アピキサバンについて０．９９７、およびエドキサバンについて０．９９２の決定係数Ｒ２を有する。これらすべての決定係数値が、開発した数学的モデルの妥当性を際立たせる。加えて、等しい濃度では、リバーロキサバンが最も高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗Ｘａ活性を有するのに対して、エドキサバンは、最も低い抗Ｘａ活性を有し、これは、ｎｇ／ｍｌで表現した濃度が抗ＸａＤＯＡをアッセイするための汎用単位ではないことを確認する。
【０１９２】
３．直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）で過負荷を与えた血漿のアッセイ
この節では、ＤＯＡ（リバーロキサバン、アピキサバンおよびエドキサバン）で過負荷を与えた血漿のレベルのアッセイの結果を本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて得て、理論的なレベルと比較した。結果は、線形回帰の勾配が０．９と１．１との間にあるとき、および決定係数Ｒ２が０．９５以上であるときに満足するものであると考えられる。
【０１９３】
リバーロキサバン。図３は、汎用キャリブレーション原理を用いて広い範囲の手法（２０個の過負荷）および狭い範囲の手法（８個の過負荷）で測定し、理論的なレベルと比較したリバーロキサバンのレベルのアッセイの比較の結果を提示する。これらの比較により、それぞれ、０．９８および０．９６の勾配ならびに０．９９８および０．９９５の決定係数が得られ、それによって、結果を検証した。
【０１９４】
アピキサバン。図４は、汎用キャリブレーション原理を用いて広い範囲の手法（２４個の過負荷）および狭い範囲の手法（１０個の過負荷）で測定し、理論的なレベルと比較したアピキサバンのレベルのアッセイの比較の結果を提示する。これらの比較により、それぞれ、０．９７および０．９７の勾配ならびに０．９９９および０．９９９の決定係数が得られ、それによって、結果を検証した。
【０１９５】
エドキサバン。図５は、汎用キャリブレーション原理を用いて広い範囲の手法（２４個の過負荷）および狭い範囲の手法（１０個の過負荷）で測定し、理論的なレベルと比較したエドキサバンのレベルのアッセイの比較の結果を提示する。これらの比較により、それぞれ、０．９９および１．００の勾配ならびに０．９９６および０．９９７の決定係数が得られ、それによって、結果を検証する。
【０１９６】
４．ブランク上限および検出限界
この節では、ブランク上限（ＬｏＢ）および測定検出限界（ＬｏＤ）を汎用キャリブレーション原理を用いて広い範囲および狭い範囲の手法で得た。そのうえ、これらの値を狭い範囲の手法で改善するための方法を提案する。心覚えに、直接経口抗凝血剤（ＤＯＡ）の処置を受けている患者に外科的介入を許容するための判定閾値は、（リバーロキサバンについての最小値として、Ｐｅｒｎｏｄら，Ａｎｎａｌｅｓ  ｆｒａｎｃａｉｓｅｓ  ｄａｎｅｓｔｈｅｓｉｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｒｅａｎｉｍａｔｉｏｎ，２０１３，３２（１０）：６９１−７００）３０ｎｇ／ｍｌ以下のレベルである。
【０１９７】
広い範囲の手法。以下の表１は、本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて広い範囲の手法で得たブランク上限および検出限界を示す。観測したＬｏＤ値は、それぞれ、リバーロキサバンについて２１．５ｎｇ／ｍｌ、アピキサバンについて２１．８ｎｇ／ｍｌ、およびエドキサバンについて２８．８ｎｇ／ｍｌであった。これらの結果が示すのは、低レベルの抗ＸａＤＯＡを緊急の外科的介入の状況で要求される精度で測定することを広い範囲の手法は可能にしないということである。
【０１９８】
【表１】
2019516404.tif 000011
【０１９９】
狭い範囲の手法。以下の表２は、本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて狭い範囲の手法で得たブランク上限および検出限界を示す。観測したＬｏＤ値は、それぞれ、リバーロキサバンについて６．９ｎｇ／ｍｌ、アピキサバンについて６．９ｎｇ／ｍｌ、およびエドキサバンについて８．７ｎｇ／ｍｌであった。これらの結果は、狭い範囲の手法が、非常に低レベルの抗ＸａＤＯＡを正確に測定するのに十分に良好な性能を有することを実証する。
【０２００】
【表２】
2019516404.tif 000012
【０２０１】
狭い範囲の手法における最適化。汎用キャリブレーションは、式１が与える直線に従うことを実証し、実験的に検証した。しかしながら、経験的に、二次多項式による汎用キャリブレーションの回帰は、実験点を線形回帰よりも良好に表現するはずである。このことを実験的に確認した−図６を参照。二次多項式による汎用キャリブレーションの回帰は、ＬｏＢおよびＬｏＤを狭い範囲の手法で改善することを可能にする（以下の表３を参照）が、測定レベルと理論的なレベルとの比較の品質には影響を与えない（結果は示さない）。
【０２０２】
【表３】
2019516404.tif 000013
【０２０３】
５．血漿中における希釈
広い範囲の手法（希釈＝１／８）と狭い範囲の手法（希釈＝１／２）との間の試料希釈値の差がマトリクス効果を誘起する。これを克服するための方法をここで提案する。このために、汎用キャリブレーションでは、試料をもはや緩衝液（ＯＫＢ）中には希釈しないが、希釈係数を変えないまま血漿（Ｐｏｏｌ  Ｎｏｒｍ）中に希釈する。図７は、試料を緩衝液中に希釈したときの汎用キャリブレーションの外観と試料を血漿中に希釈したときの汎用キャリブレーションの外観とを比較する。広い範囲の手法および狭い範囲の手法における実験点の線形回帰は、それぞれ、試料を緩衝液中に希釈したときに、直線の式：
ｙ＝１．０５３−０．９９９ｘ、および
ｙ＝１．０３４−１．０８１ｘ＋
を与え、ならびに試料を血漿中に希釈したときには、直線の式：
ｙ＝１．０２２−１．１７３ｘ、および
ｙ＝１．０２０−１．１９８ｘ
を与える。
【０２０４】
これらの結果は、試料を血漿中に希釈したときに、汎用キャリブレーションの２つの直線の式が互いに重なることを示す。この構成において必要なのは、もはや２つのキャリブレーションを実行することではなく、２つの手法（広い範囲の手法および狭い範囲の手法）に共通する１つのキャリブレーションを単に実行することである。同様に強調すべきは、リバーロキサバンの理論的なレベルと、試料の血漿中における希釈とともに、汎用キャリブレーション原理を用いて過負荷を与えた血漿中で測定したレベルとの比較により、広い範囲の手法では０．９６の勾配および０．９９９の決定係数が得られ、狭い範囲の手法では０．９５の勾配と０．９９５の決定係数が得られることである。図８を参照。これらの結果は、血漿中に希釈した試料における直接経口抗凝血剤のレベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することが可能なことを実証する。
【０２０５】
実施例２：不可逆的な間接阻害剤
Ｉ．実験プロトコル
１．材料
実施例２における血漿試料（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ，ラ・プレンヌ・サン・ドニ，フランス）および試薬は、実施例１に用いたものと同じである。
【０２０６】
ヘパリンの過負荷を５０００ＩＵ／０．２ｍｌに濃縮したヘパリンカルシウム（Ｃａｒｉ−ｐａｒｉｎｅ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，パリ，フランス）、および１００００ＩＵ／０．５ｍｌに濃縮したチンザパリンナトリウム（Ｉｎｎｏｈｅｐ（登録商標），Ｌｅｏ  Ｐｈａｒｍａ，バレルプ，デンマーク）の溶液から作った。
【０２０７】
２．方法
抗Ｘａ酵素アッセイ。実施例１におけるようにカイネティクスをモニターした。非分画ヘパリンおよび低分子量ヘパリンのアッセイのために手法を最適化した。二（２）μｌの血漿をＯＫＢ中で１００ｍｌの最終体積に希釈した。１００ｍｌのＦ．Ｘａの存在下でマイクロキュベットを３７℃で６９０秒間インキュベートした。予め３７℃でインキュベートした、１００ｍｌの基質の添加によって測定フェーズをトリガーした。勾配を２０秒と５０秒との間で決定した。
【０２０８】
汎用キャリブレーション。測定を２０秒と５０秒との間で実行したという事実を除いて、キャリブレーションを実施例１におけるように実行した。
【０２０９】
変換チャートの生成。各ヘパリンに固有のチャートのパラメータを少数の実験点上の式３の線形回帰によって決定した。０、０．３、０．６、および１．０ＩＵ／ｍｌで過負荷を与えた試料を用いてヘパリンカルシウムと関連するチャートを生成した。０、０．２、０．４、および０．６ＩＵ／ｍｌで過負荷を与えた試料を用いてチンザパリンナトリウムと関連するチャートを生成した。試料ごとにＯＤ／分を２０秒と５０秒との間で測定した。
【０２１０】
血漿過負荷。過負荷を作るために血漿のプールを用いた。ヘパリンの貯蔵溶液を生理的血清中に希釈した。過負荷の濃度は、ヘパリンカルシウムについて０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、および１．０ＩＵ／ｍｌ、ならびにチンザパリンナトリウムについて０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、および０．６ＩＵ／ｍｌであった。過負荷の最終体積は、０．５ｍｌであった。結果（２０秒と５０秒との間のＯＤ／分の測定結果）を過負荷ごとに３回の反復試験で決定した。
【０２１１】
汎用キャリブレーションのための試験の構成、チャートを生成するための試験の構成、および血漿過負荷のための試験の構成。実験条件は、「抗Ｘａ酵素アッセイ」の節に記載したものと同じである。
【０２１２】
ＩＩ．結果
１．汎用キャリブレーション
図９は、結果を、測定したＯＤ／分の関数として抗Ｘａ活性（％）で表現する汎用キャリブレーションを示す。異なる実験点の線形回帰は、式ｙ＝０．９９４−０．５１８ｘ＝（Ｒ２＝０．９９６）を与える。このキャリブレーションの理論式を式１の直線が与える。得られた結果は、この式、すなわち、１に非常に近い決定係数と１に近いインターセプトポイントとをもつ線形回帰と完全に一致する。
【０２１３】
２．変換チャート
図１０は、ヘパリンの２つのファミリーの各々について、測定した抗Ｘａ活性（％）をＩＵ§／ｍｌ単位の濃度へ変換するために生成したチャートを提示する。対（抗Ｘａ活性、抗凝血剤の濃度）が既知の試料に関して線形回帰を実行することによって、これらのチャートを生成した。実験点の線形回帰は、非分画ヘパリンについて直線の式ｙ＝２．３５４ｘ−０．０１５６９を与え、低分子量ヘパリンについて直線の式ｙ＝１．６２１ｘ−０．０２８２４７を与えた。これらの式は、（ゼロに近いインターセプトをもつ直線であり）式２と完全に一致している。そのうえ、式３は、ヘパリン濃度がアンチトロンビン濃度以下であるときに理論的に妥当である。反対の場合に、ヘパリンが血漿アンチトロンビンを完全に飽和させるならば、ヘパリンは、もはや測定可能でない。図１０のチャートでこの挙動を見ることができる。確かに、線形回帰は、非分画ヘパリンについて５２．７５％以下、および低分子量ヘパリンについて５２．８５％以下の抗Ｘａ活性にのみ当て嵌まる。これらの値は、独立して決定したとはいえ、極めて一貫性がある。したがって、得られたすべての結果が本明細書において開発した数学的モデルの妥当性を確認する。
【０２１４】
３．ヘパリンで過負荷を与えた血漿のアッセイ
本発明による汎用キャリブレーション原理を用いて得た、非分画ヘパリンでおよび低分子量ヘパリンで過負荷を与えた血漿のレベルのアッセイの結果をここでは理論的なレベルとの比較によって提示する。結果は、線形回帰の勾配が０．９と１．１との間にあるとき、および決定係数Ｒ２が０．９５以上であるときには満足するものであると考えられる。
【０２１５】
非分画ヘパリン。図１１（Ａ）は、１１個の非分画ヘパリン過負荷を用いて得られた結果を提示する。汎用キャリブレーション原理を用いて測定したレベルの理論的なレベルとの比較により、結果を検証する１．０２５の勾配および０．９８７の決定係数を得た。
【０２１６】
低分子量ヘパリン。図１１（Ｂ）は、７個の低分子量ヘパリン過負荷を用いて得られた結果を提示する。汎用キャリブレーション原理を用いて測定したレベルの理論的なレベルとの比較により、結果を検証する０．９７６４の勾配および０．９８５の決定係数を得た。
【図１】
2019516404.tif 000016
【図２】
2019516404.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019516404.tif 000024
【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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