(57)【要約】  本発明は、細胞におけるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を高スループット方式で評価するための方法に関し、具体的には、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む単離オリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリのインデル頻度から、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法に関する。本発明のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性を解析するための方法は、高スループット方式で、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性をインビボで評価することを可能にし、従って、当該方法は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが適用されるすべての分野において非常に効果的に利用できる。
2019514379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法であって、
（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入された、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリから取得されたＤＮＡを使用して配列解析を実行する段階と、
（ｂ）前記配列解析から取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を検出する段階と
を備える方法。
【請求項２】
前記ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドは、５'末端‐３'末端方向に、または、逆方向に、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、および、標的ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、５'末端‐３'末端方向に、または、逆方向に、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、および、標的ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは更に、ダイレクトリピート配列、ポリＴ配列、バーコード配列、一定配列、プロモーター配列およびスカフォールド配列から成る群から選択されるものを少なくとも１つ含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは、１００から２００のヌクレオチドの配列から成る、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つのオリゴヌクレオチドに存在する前記ガイドＲＮＡは、同一の前記オリゴヌクレオチドに存在する標的ヌクレオチド配列に対してシスに作用する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを導入する段階と、
（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入された前記細胞ライブラリから取得された前記ＤＮＡを使用してディープシーケンシングを実行する段階と、
（ｃ）前記ディープシーケンシングから取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を検出する段階と
を備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、レンサ球菌属、ナイセリア属、パスツレラ属、フランシセラ属、および、カンピロバクター属から成る群から選択される少なくとも１つの微生物に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダタスパセイバクター属、ラクノスピラ属、ブチリビブリオ属、ペレグリニバクテリア属、アシダミノコッカス属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フランシセラ属、カンジダタスメタノプラズマ属、および、ユーバクテリウム属から成る群から選択される少なくとも１つの微生物に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性は、
１）前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列、
２）前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオンターゲット活性、
３）前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオフターゲット活性、または、
から成る群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列解析は、ディープシーケンシングによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２種類の細胞を含む細胞ライブラリであって、各細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む、細胞ライブラリ。
【請求項１６】
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含む単離オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミドベクターから成る群から選択されるいずれか１つである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１９】
少なくとも２種類のベクターを含むベクターライブラリであって、各ベクターは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む、ベクターライブラリ。
【請求項２０】
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも２種類含むオリゴヌクレオチドライブラリ。
【請求項２２】
（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的とする標的ヌクレオチド配列を設定する段階と、
（ｂ）設定された前記標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成する、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を設計する段階と、
（ｃ）前記標的ヌクレオチド配列と、前記標的ヌクレオチド配列を標的とするガイドＲＮＡとを含むオリゴヌクレオチドを設計する段階と、
（ｄ）ステップ（ａ）から（ｃ）を少なくとも１回繰り返す段階と
を備える、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドライブラリを構築するための方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）は、設計されたオリゴヌクレオチドを合成する段階を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、すなわち、ＴＴＴＶまたはＣＴＴＡに隣接する標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成できる配列を含む単離ガイドＲＮＡ。
【請求項２５】
前記単離ガイドＲＮＡと共に使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＣｐｆ１タンパク質である、請求項２４に記載の単離ガイドＲＮＡ。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載の単離ガイドＲＮＡ、または、前記単離ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む、ゲノム編集のための組成物。
【請求項２７】
請求項２４または請求項２５に記載の単離ガイドＲＮＡ、または、前記単離ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質または前記Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸とを含む、哺乳類細胞におけるゲノム編集のためのシステム。
【請求項２８】
請求項２４に記載のガイドＲＮＡ、または、前記ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質、または、前記Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸を順番または同時に単離哺乳類細胞に導入する段階を備える、哺乳類細胞においてＣｐｆ１でゲノム編集するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性をインビボで、具体的には細胞内で、高スループット方式で評価するための方法に関し、より具体的には、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む単離オリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリのインデル頻度から、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩ型ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓおよびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ）の原核生物免疫システムに由来するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ゲノム編集のための手段を提供する。特に、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質を使用して、細胞および臓器のゲノムを編集するための技法に関する研究が活発に行われている（Ｃｅｌｌ，２０１４，１５７：１２６２‐１２７８）。特に、ｓｇＲＮＡ活性の予測のための研究が、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９システムにおいて行われており（ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．，２０１７，Ｆｅｂ  １０；Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１６，６：３０８７０，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３４，１８４‐１９１）、ＰＤ‐１をコードする遺伝子をＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９によって除去し、細胞を注入することによって疾病を治療するためにＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９を使用することに関する研究が中国で行われている（Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３９：４７９）。近年、Ｃｐｆ１タンパク質（プレボテラおよびフランシセラ１に由来するＣＲＩＳＰＲ）が、別のクラス２ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓシステムのヌクレアーゼタンパク質として報告され（Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３：７５９‐７７１）、それにより、ゲノム編集の選択肢の範囲が拡大した。Ｃｐｆ１は、５'末端が突出した形態で切断すること、ガイドＲＮＡの長さがより短いこと、および、シード配列と切断位置との間の距離がより長いことなど、様々な利点を有する。しかしながら、特に、オンターゲットおよびオフターゲット効果に関して、ヒトおよび他の真核細胞におけるＣｐｆ１の特性に関する研究が欠如している。
【０００３】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのゲノム編集への適用において、活性および精度は非常に重要であるが、オンターゲットおよびオフターゲットのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を確認するために、大量の時間および労力が必要である。オンターゲットおよびオフターゲットの活性に関するインシリコでの予測の精度は限定的であり（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，３２：１２６２‐１２６７）、コンピュータ予測モデルを開発するべく、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ活性に関する包括的インビボ実験を通してヌクレアーゼを特性評価することについての需要がある。
【発明の概要】
【０００４】
［技術的問題］
本発明者は、高スループット方式で、インビボ条件で、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価できるシステムの開発に取り組み、その結果、主な構成要素としてガイドＲＮＡと標的配列とのペアを有するペアライブラリシステムを成功裏に開発し、それにより、本発明を完成させた。
【０００５】
［技術的解決策］
本発明の目的は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入された、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリから取得されたＤＮＡを使用して配列解析を実行する段階と、（ｂ）配列解析から取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を検出する段階とを備える方法を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、少なくとも２種類の細胞を含む細胞ライブラリであって、各細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む、細胞ライブラリを提供することである。
【０００７】
本発明の更に別の目的は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含む単離オリゴヌクレオチドを含むベクター、および、ベクターライブラリを提供することである。
【０００８】
本発明の更に別の目的は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含む単離オリゴヌクレオチド、および、オリゴヌクレオチドライブラリを提供することである。
【０００９】
本発明の更に別の目的は、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的とする標的ヌクレオチド配列を設定する段階と、（ｂ）設定された標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成する、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を設計する段階と、（ｃ）標的ヌクレオチド配列と、標的ヌクレオチド配列を標的とするガイドＲＮＡとを含むオリゴヌクレオチドを設計する段階と、（ｄ）（ａ）から（ｃ）のステップを少なくとも１回繰り返す段階とを備える、オリゴヌクレオチドライブラリを構築するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明の更に別の目的は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、すなわち、ＴＴＴＶまたはＣＴＴＡに隣接する標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成できる配列を含む単離ガイドＲＮＡを提供することである。
【００１１】
本発明の更に別の目的は、単離ガイドＲＮＡまたは単離ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む、ゲノム編集のための組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、単離ガイドＲＮＡ、または、単離ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸とを含む、哺乳類細胞におけるゲノム編集のためのシステムを提供することである。
【００１３】
本発明の更に別の目的は、ガイドＲＮＡ、または、ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質、または、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸を順番または同時に単離哺乳類細胞に導入する段階を備える、哺乳類細胞においてＣｐｆ１でゲノム編集するための方法を提供することである。
【００１４】
［有利な効果］
本発明のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法は、高スループット方式で、細胞におけるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価すること（インビボ）を可能にし、従って、当該方法は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが適用されるすべての分野において非常に効果的に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｃｐｆ１の活性を評価するための、標的配列とガイドＲＮＡ配列とのペアを含むオリゴヌクレオチドを図示する模式図を示す。
【００１６】
【図２】ＡｓＣｐｆ１レンチウイルスベクターのマップを図示する模式図を示す。Ｐｓｉ：パッケージングシグナル、ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答配列、ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子、Ｕ６：Ｕ６  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターｃＰＰＴ：セントラルポリプリントラクト、ＥＦＳ：伸長因子１ａショートプロモーター、ＢｌａｓｔＲ：ブラストサイジン耐性遺伝子。
【００１７】
【図３】ＬｂＣｐｆ１レンチウイルスベクターのマップを図示する模式図を示す。Ｐｓｉ：パッケージングシグナル、ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答配列、ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子、Ｕ６：Ｕ６  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、ｃＰＰＴ：セントラルポリプリントラクト、ＥＦＳ：伸長因子１ａショートプロモーター、ＢｌａｓｔＲ：ブラストサイジン耐性遺伝子。
【００１８】
【図４】プラスミドライブラリを調製するための、バックボーンベクター、ならびに、標的配列およびガイドＲＮＡ配列のペアを含む、レンチウイルスベクターの模式図を示す。Ｐｓｉ：パッケージングシグナル、ＲＲＥ：Ｒｅｖ応答配列、ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節因子、ｃＰＰＴ：セントラルポリプリントラクト、ＤＲ：Ｃｐｆ１のダイレクトリピート、ＧＳ：ガイドＲＮＡのガイド配列、Ｔ：ポリＴ、Ｂ：バーコード、ＴＳ：標的配列、ＨＳ：相同配列、ＥＦ１α：伸長因子１αプロモーター、ＰｕｒｏＲ：ピューロマイシン耐性遺伝子。
【００１９】
【図５】本発明のペアライブラリを使用して高スループット解析システムのプロセス全体を簡潔に図示する模式図を示す。
【００２０】
【図６】オリゴヌクレオチドプール、プラスミドライブラリ、細胞ライブラリにおける各ペアの相対的コピー数を示す。
【００２１】
【図７】オリゴヌクレオチドプールおよびプラスミドライブラリにおける各ペアのコピー数に正規化された、プラスミドライブラリおよび細胞ライブラリの各ペアのコピー数を示す。
【００２２】
【図８】オリゴヌクレオチドプールにおけるコピー数の順序で、プラスミドライブラリおよび細胞ライブラリにおける各ペアの相対的コピー数を示す。
【００２３】
【図９】プラスミドライブラリにおけるコピー数の順序で、細胞ライブラリにおける各ペアの相対的コピー数を示す。
【００２４】
【図１０】ディープシーケンシングで評価されたプラスミドライブラリおよびオリゴヌクレオチドプールの間のペアコピー数の相関を示す。
【００２５】
【図１１】ディープシーケンシングで評価された、細胞ライブラリとオリゴヌクレオチドプールとの間のペアコピー数の相関を示す。
【００２６】
【図１２】ディープシーケンシングで評価された、細胞ライブラリとプラスミドライブラリとの間のペアコピー数の相関を示す。
【００２７】
【図１３】ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１のＰＡＭ配列を確認するためのプロセスの模式図を示す。
【００２８】
【図１４】ＡｓＣｐｆ１のあり得るＰＡＭ配列に従ってインデル頻度を示す。ＡＮＮＮＮ配列は、あり得るＰＡＭ配列として実験された。表記を簡潔にする目的で、「Ａ」は省略された。
【００２９】
【図１５】ＡｓＣｐｆ１の４種類のＴＴＴＮ  ＰＡＭ配列に関するインデル頻度を示す。各エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３０】
【図１６】ＬｂＣｐｆ１のあり得るＰＡＭ配列に従ってインデル頻度を示す。ＡＮＮＮＮ配列は、あり得るＰＡＭ配列として実験された。表記を簡潔にする目的で、「Ａ」は省略された。
【００３１】
【図１７】ＬｂＣｐｆ１の４種類のＴＴＴＮ  ＰＡＭ配列に関するインデル頻度を示す。各エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３２】
【図１８】インビボおよびインビトロ解析によるＰＡＭ配列の比較結果を図示するグラフを示し、ａおよびｂはそれぞれ、（ａ）ＡｓＣｐｆ１のＰＡＭ配列、および、（ｂ）ＬｂＣｐｆ１のＰＡＭ配列のインビトロ解析の結果を表し、ｃおよびｄはそれぞれ、インデル頻度と、（ｃ）ＡｓＣｐｆ１および（ｄ）ＬｂＣｐｆ１のあり得るＰＡＭ配列との間の相関のインビボ解析の結果を表す。
【００３３】
【図１９】ＡｓＣｐｆ１（左）およびＬｂＣｐｆ１（右）の４種類のＮＴＴＴＡ  ＰＡＭ配列に関するインデル頻度を示す。各エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊Ｐ＜０．０５  分散分析後、テューキーのポストホックテスト
【００３４】
【図２０】フォワード標的配列またはリバース標的配列を使用して、ＡｓＣｐｆ１とＳｐＣａｓ９との間のインデル頻度の順序に関する比較結果を示す。ＳｐＣａｓ９およびＡｓＣｐｆ１のフォワード標的配列（左）およびリバース標的配列（右）に関するインデル頻度の順序の相関が示される。赤色で示される５'‐ＧＧＧ‐３'および５'‐ＴＴＴＡ‐３'配列を、それぞれＳｐＣａｓ９およびＡｓＣｐｆ１標的配列のためのＰＡＭ配列として使用した。ＳｐＣａｓ９標的配列に関する活性の順序については、文献（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，３２：１２６２‐１２６７）を参照されたい。
【００３５】
【図２１】最も活性が高い上位２０％のガイドＲＮＡに関する、ＡｓＣｐｆ１標的配列の各位置におけるヌクレオチド選好度を図示するグラフを示す。Ｐ値は、文献（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，  ３２：１２６２‐１２６７）からの１，２５１ペアのガイドＲＮＡおよび標的配列を使用して、ベースライン確率が０．２である二項分布によって計算した。
【００３６】
【図２２】標的配列のＧＣ含有量と、観察されたインデルとの間の関係を図示するグラフを示し、ａ、ｂおよびｃは、統計的に異なるインデル頻度（Ｐ＞０．０５）を有する各群を表し、各エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３７】
【図２３】Ｃｐｆ１発現レンチウイルスベクターを細胞ライブラリへ送達した後の時間に従って、平均インデル頻度を図示するグラフを示し、各エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３８】
【図２４】Ｃｐｆ１を発現するレンチウイルスを細胞ライブラリに形質導入した３日後、５日後、および、３１日後の各標的配列におけるインデル頻度を示す。
【００３９】
【図２５】ガイドＲＮＡコード配列および標的配列におけるヌクレオチドミスマッチに従ってインデル頻度を解析するための実験の設計を図示する模式図を示す。
【００４０】
【図２６】オフターゲット配列におけるヌクレオチドミスマッチの位置に従って、インデル頻度を示す。
【００４１】
【図２７】１つのヌクレオチドミスマッチを有するオフターゲット配列およびオンターゲット配列におけるガイドＲＮＡの長さに従って、オンターゲット配列におけるインデル頻度に正規化されたインデル頻度を図示するグラフを示す。
【００４２】
【図２８】オフターゲット配列におけるヌクレオチドミスマッチの数に従って相対的なインデル頻度を図示するグラフを示す。
【００４３】
【図２９】オンターゲット配列内の領域に従って、Ｃｐｆ１によって誘導されたオフターゲットのインデル頻度におけるミスマッチヌクレオチドの数の効果を図示するグラフを示す。オフターゲットインデル頻度は、オンターゲット配列におけるインデル頻度に正規化された。
【００４４】
【図３０】Ｃｐｆ１によって誘導されたオフターゲットインデル頻度における、オンターゲット配列内の領域のヌクレオチドの複数のミスマッチの効果を図示するグラフを示す。
【００４５】
【図３１】オフターゲット配列のシード領域における、相対的なインデル頻度に関するミスマッチの種類の効果を図示するグラフを示す。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００４６】
【図３２】オフターゲット配列のトランク領域における、相対的なインデル頻度に関するミスマッチの種類の効果を図示するグラフを示す。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００４７】
【図３３】オフターゲット配列のプロミスキャス領域における、相対的なインデル頻度に関するミスマッチの種類の効果を図示するグラフを示す。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００４８】
【図３４】本発明のペアライブラリを使用するインビボの高スループット評価システムの概念を図示する図を示す。従来、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、個々の、および、難しい方法（小規模システム、上）によって測定されてきた。本発明は、高スループット評価（工場システム、下）を可能にし、従って、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの大規模で容易な評価のための新しい方法を提供する。
【００４９】
【図３５】Ｃａｓ９活性を評価するための、標的配列およびガイドＲＮＡ配列のペアを含むオリゴヌクレオチドを図示する模式図を示す。
【００５０】
【図３６】Ｃａｓ９レンチウイルスベクターのマップを図示する模式図を示す。
【００５１】
【図３７】ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用して測定されたガイドＲＮＡ活性の結果を図示するグラフを示す。
【図３８】本発明のペアライブラリを使用して測定されたガイドＲＮＡ活性の結果を図示するグラフを示す。
【００５２】
【図３９】ｃｒＲＮＡヌクレアーゼと、Ｃｐｆ１ＷＥＤドメインにおけるＴｈｒ１６との間の位置１での相互作用を図示する模式図を示す。ＷＥＤドメイン内のＴｈｒ１６残基のヒドロキシ側鎖は、グアニン塩基のＮ２との極性相互作用を示す（赤色の円の中の青色の点線）。異なるヌクレオ塩基の側鎖（例えば、チミンまたはウラシルのＯ２）は、Ｔｈｒ１６残基と同様の極性相互作用を示すことができる。しかしながら、上の部分はアデニンに存在しないので、側鎖は、ｃｒＲＮＡアデニンリボヌクレオ塩基において、ＰＡＭモチーフに隣接する位置にある標的ＤＮＡ鎖の位置１に存在するチミンとの間に不安定な結合を形成する。ｃｒＲＮＡリボヌクレオチド（グアニンが示される）と標的配列ヌクレオチド（位置１におけるシトシンが示される）との間には相補的な相互作用が存在する。この図は、ＰＤＢ  ５Ｂ４３のデータに基づいて調製された。
【００５３】
【図４０】内在性標的位置および対応する導入された合成配列におけるインデル頻度の間の相関を図示するグラフを示し、８２の解析された内在性領域の散布図を示す。
【００５４】
【図４１】内在性標的位置および対応する導入された合成配列におけるインデル頻度の間の相関を図示するグラフを示し、８２の領域の間の上位２５％のＤＮａｓｅ感受性領域についての散布図を示す。
【００５５】
【図４２】内在性標的位置および導入された配列におけるインデル頻度の間の相関を図示するグラフを示し、（ａ）上位２５％から５０％、（ｂ）上位５０％から７５％、（ｃ）７５％から１００％の各ＤＮａｓｅ感受性領域についての散布図を示す。
【００５６】
【図４３】生物学的反復におけるインデル頻度の間の相関を図示するグラフを示す。独立のレンチウイルス生成および形質導入によって、２つの異なるライブラリ（ライブラリＡおよびライブラリＢ）を調製した。２つのライブラリをＣｐｆ１コードプラスミドでトランスフェクトし、４日後、細胞ライブラリにおいてインデル頻度を解析した。
【００５７】
【図４４】２つの異なる送達方法によるＣｐｆ１の送達後のインデル頻度の間の相関を図示するグラフを示す。細胞ライブラリをＣｐｆ１プラスミドでトランスフェクトした、または、Ｃｐｆ１レンチウイルスベクターで形質導入した。４日後（トランスフェクション）または５日後（形質導入）に、細胞ライブラリのインデル頻度を解析した。
【００５８】
【図４５】標的配列におけるＣｐｆ１活性を評価するための、従来の方法と高スループット方式の評価方法との間の費用の比較結果を図示するグラフを示す。材料（左）および労力（右）の費用を比較した。費用はＵＳＤ単位で示し、労力は、当業者が実行できる最大の作業量として示した。１時間を超える中断がある場合（例えば、培養時間）、労力として計算されない。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
プログラマブルヌクレアーゼは、細胞および個々の対象のゲノム編集に広く使用されており、プログラマブルヌクレアーゼを採用する技術は、生命科学、バイオテクノロジーおよび医学分野における様々な目的に使用できる非常に有用な技術である。特に近年、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｒｅｐｅａｔ／ＣＲＩＳＰＲ関連）の原核生物免疫システムに由来するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣａｓ９、および、Ｃｐｆ１などの有用性が注目されている。しかしながら、オンターゲット活性およびオフターゲット活性は、ガイドＲＮＡによって保持される配列に応じて変動し得るので、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを利用するには、これらのヌクレアーゼの標的配列に関して、ガイドＲＮＡを設計することが重要である。これに関して、本発明者は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を高スループット方式で、インビボで評価するための方法を開発することを試みてきた。
【００６０】
本明細書では以下において、本発明の例示的な実施形態を詳細に記載する。一方、本明細書において開示される説明および例示的な実施形態の各々は、それぞれ、他の説明および例示的な実施形態に適用できる。すなわち、本明細書において開示される様々な要素の組み合わせのすべてが本発明の範囲に属する。更に、本発明の範囲は、本明細書において以下で提供される具体的な開示によって限定されるべきでない。
【００６１】
上の目的を実現するべく、本発明の態様は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法であって、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入された、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリから取得されたＤＮＡを使用して配列解析を実行する段階と、（ｂ）配列解析から取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を検出する段階とを備える方法を提供する。本発明者は、上述の方法を「ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリ解析」と命名した。これは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列がペアとして導入される細胞ライブラリを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法を指す。
【００６２】
特に、本発明者は、ペアライブラリを使用して測定されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性が、細胞内の内在性遺伝子に作用するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性と高い相関を有することを確認し、それにより、本発明の、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを評価するための方法が、インビトロで有用であり得るだけでなく、インビボでも有用であり得ることを確認した。
【００６３】
ゲノム編集／遺伝子編集の技術は、標的指向の修飾を、ヒトを含む動物／植物細胞のゲノムのヌクレオチド配列に導入できる技術であり、特定遺伝子をノックアウトもしくはノックインすること、または、タンパク質を生成しない非コードＤＮＡ配列に修飾を導入することもできる。本発明の方法は、上述の高スループット方式のゲノム編集／遺伝子編集の技術において使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオンターゲット活性およびオフターゲット活性を解析でき、この方法は、目標位置だけに対して特異的に作用するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの作製のために効果的に使用できる。
【００６４】
「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書において使用されるとき、標的ゲノム上の特定位置を認識してそれを切断できるヌクレアーゼ、特に、ガイドＲＮＡによる特異性を有するヌクレアーゼを指す。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ（すなわち、微生物免疫システム）、具体的には、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、および、Ｃｐｆ１などに由来するＣａｓ９タンパク質を含み得るが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはこれに限定されない。
【００６５】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ヒト細胞を含む動物／植物細胞のゲノムにおける特定のヌクレオチド配列を認識して二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし得て、切れ目を形成し得る（ニッカーゼ活性）。二本鎖切断は、ＤＮＡの二本鎖を切断することによって、平滑末端および付着末端の両方を生じさせることを含む。ＤＳＢは、細胞内の相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の機構によって効率的に修復され、このプロセス中、研究者が所望する修飾が標的部位に導入され得る。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、人工物であり得る、または、操作された非天然発生物であり得る。
【００６６】
本明細書において使用されるとき、「Ｃａｓタンパク質」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主なタンパク質構成要素であり、活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼとして作用できるタンパク質である。Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と共に複合体を形成し得て、それにより、これらの活性を示す。
【００６７】
Ｃａｓタンパク質またはそれらの遺伝子についての情報は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）などの、知られているデータベースから取得され得る。具体的には、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であり得る。加えて、Ｃａｓタンパク質は、レンサ球菌属、ナイセリア属、パスツレラ属、フランシセラ属、および、カンピロバクター属の微生物に由来し得て、具体的には、化膿レンサ球菌の微生物に由来し、より具体的には、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌の微生物に由来するＣａｓ９タンパク質であり得るが、これに限定されない。しかしながら、本発明は、上述のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を有する限り、上述の例に限定されない。本発明において、Ｃａｓタンパク質は、組み換えタンパク質であり得る。
【００６８】
本明細書において使用されるとき、「Ｃｐｆ１」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと区別される、ＣＲＩＳＰＲシステムの新しいヌクレアーゼを指し、近年報告されたばかりである（Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３（３）：７５９‐７１）。Ｃｐｆ１は、単一のＲＮＡによって操作されるヌクレアーゼであるという特徴があり、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、比較的小さいサイズを有する。加えて、Ｃｐｆ１は、チミンリッチのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を利用し、ＤＮＡの二本鎖を切断することによって付着末端を生じさせることが知られている。Ｃｐｆ１は、これらに限定されないが、カンジダタスパセイバクター属、ラクノスピラ属、ブチリビブリオ属、ペレグリニバクテリア属、アシダミノコッカス属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フランシセラ属、カンジダタスメタノプラズマ属、または、ユーバクテリウム属の微生物に由来し得る。しかしながら、本発明は、上述のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を有する限り、上述の例に限定されない。本発明において、Ｃｐｆ１タンパク質は、組み換えタンパク質であり得る。
【００６９】
「組み換え」という上述の用語は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどについて言及している間に使用されるとき、異種の核酸もしくはタンパク質の導入、または、天然の核酸もしくはタンパク質の変更、または、修飾された細胞に由来する細胞によって修飾された、細胞、核酸、タンパク質もしくはベクターを意味する。従って、例えば、組み換えＣａｓ９または組み換えＣｐｆ１タンパク質は、ヒトのコドン表を使用して、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードする配列を再構成することによって調製され得る。
【００７０】
Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質は、タンパク質が核において作用できる形態であり得て、細胞内に容易に導入できる形態であり得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質は、細胞膜透過ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインに連結され得る。タンパク質形質導入ドメインは、ポリアルギニンまたはＨＩＶ由来ＴＡＴタンパク質であり得るが、これらに限定されない。細胞膜透過ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインに関しては、多くの種類が当技術分野において開示されており、従って、当業者であれば、上の例に限定されない様々な種類のものを本発明に適用できる。
【００７１】
加えて、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードする任意の核酸は更に、核移行シグナル（ＮＬＳ）配列を含むことができる。従って、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸を含む任意の発現カセットは、Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質の発現のための制御配列（例えばプロモーター配列など）に加えて、ＮＬＳ配列を含むことができるが、含まれる配列はこれに限定されない。
【００７２】
Ｃａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質は、単離および／または精製に有用なタグに連結され得る。例えば、小さいペプチドタグ（例えばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグなど）、または、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグなどが、目的に従って連結され得るが、タグはこれらに限定されない。
【００７３】
本発明は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性を解析するための方法を提供する。以降では、方法の各ステップを詳細に説明する。一方、上述のように、上述の用語の定義および態様が以下にも適用されることは明らかである。
【００７４】
ステップ（ａ）は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む単離オリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリから取得されたＤＮＡを使用してディープシーケンシングが実行されるステップである。このステップでは、様々なガイドＲＮＡおよび標的配列に対するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの作用を介した、オンターゲットおよびオフターゲットの活性による様々な挿入および欠失（インデル）が発生した細胞集団から、解析に必要なデータが取得される。
【００７５】
具体的には、ステップ（ａ）は、以下を含むように実行され得る。
【００７６】
（１）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列（すなわち、ガイドＲＮＡ配列および標的ヌクレオチド配列のペア）を含むオリゴヌクレオチドライブラリを調製する。
【００７７】
（２）オリゴヌクレオチドライブラリを使用して、ベクターライブラリ、具体的には、ウイルスベクターライブラリを調製する。具体的には、オリゴヌクレオチドライブラリの各オリゴヌクレオチドのためのベクターを調製することによって、ベクターライブラリを調製する。
【００７８】
（３）ベクターライブラリを使用して細胞ライブラリ、具体的にはウイルスベクターライブラリを調製する。具体的には、ベクターライブラリの各ベクターを細胞に導入することによって細胞ライブラリを構築する。
【００７９】
（４）細胞ライブラリから取得されたＤＮＡを使用して配列解析（例えばディープシーケンシング）を実行する。
【００８０】
ステップ（４）においてＤＮＡが取得される細胞ライブラリは、ステップ（３）において構築された細胞ライブラリにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入されたものであり得て、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性は、細胞を培養することによって誘導される。
【００８１】
本明細書において使用されるとき、「ライブラリ」という用語は、特性の異なる同種の物質が２種類またはより多く含まれるプールまたは集団を指す。従って、オリゴヌクレオチドライブラリは、異なるヌクレオチド配列（例えばガイドＲＮＡ配列、ＰＡＭ配列）および／または異なる標的配列を含む、２またはより多くの種類のオリゴヌクレオチドを含むプールであり得て、ベクターライブラリ（例えばウイルスベクターライブラリ）は、異なる配列または構成要素を含む２またはより多くの種類のベクターを含むプールであり得て、例えば、オリゴヌクレオチドライブラリの各オリゴヌクレオチドのためのベクターのプールであり得て、対応するベクターを構成するオリゴヌクレオチドに差異がある２またはより多くのベクターを含むプールであり得る。細胞ライブラリは、特性が異なる２またはより多くの種類の細胞のプールであり得て、具体的には、本発明の目的のための異なるオリゴヌクレオチドの各々を含む細胞のプール、例えば、各々異なる数の導入ベクター、および／または、各々異なる種類の導入ベクターを含む細胞のプール、具体的には、異なる種類のベクターを含む細胞である。本発明は、高スループット方式で、細胞ライブラリを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価することを目的としているので、各ライブラリのオリゴヌクレオチド、ベクター（例えばウイルスベクター）、および細胞の種類は、２またはより多くの種類であり得て、評価方法が正常に運用される限り、各ライブラリの上限は限定されない。
【００８２】
本明細書において使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって連結された物質を指し、本発明の目的のために、オリゴヌクレオチドは二重螺旋ＤＮＡであり得る。本発明において使用されるオリゴヌクレオチドの長さは、２０ｂｐから３００ｂｐであり得て、具体的には、５０ｂｐから２００ｂｐであり得て、より具体的には、１００ｂｐから１８０ｂｐであり得る。本発明において、オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む。加えて、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためにプライマーが結合できる更なる配列を含み得る。
【００８３】
具体的には、単一のオリゴヌクレオチドにおいて、ガイドＲＮＡは、それに隣接して存在する標的ヌクレオチド配列に対してシスに作用し得る。すなわち、ガイドＲＮＡは、隣接する標的ヌクレオチド配列が切断されたかどうかを確認するために設計されたものであり得る。
【００８４】
オリゴヌクレオチドは細胞に導入され、染色体に組み込まれ得る。
【００８５】
本明細書において使用されるとき、「ガイドＲＮＡ」という用語は、標的ＤＮＡに特異的なＲＮＡを指し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的配列を切断するように、標的配列の全部または一部に相補的に結合し得る。
【００８６】
従来、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ））を構成要素として含むデュアルＲＮＡ、または、標的ＤＮＡにおける配列の全部もしくは一部における相補的配列を含む第１領域と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと相互作用する配列を含む第２領域とを含む形態を指すが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的配列における活性を有することができる任意の形態は、本発明の範囲に限定無しで含まれ得る。一実施形態において、ガイドＲＮＡがＣｐｆ１に適用されるとき、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡであり得て、一方、ガイドＲＮＡがＣａｓ、特にＣａｓ９に適用されるとき、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを構成要素として含むデュアルＲＮＡの形態、または、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主な部分が融合された一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形式であり得る。ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列に相補的な配列を有する部分（これは、スペーサー領域、標的ＤＮＡ認識配列、塩基対形成領域などと呼ばれる）と、Ｃａｓ（特にＣａｓ９タンパク質）の結合のためのヘアピン構造とを含み得る。より具体的には、ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列の全部または一部に相補的な配列を有する部分、Ｃａｓ（特にＣａｓ９タンパク質）の結合のためのヘアピン構造、および、ターミネーター配列を含み得る。上述の構造は、５'末端から３'末端への方向に順番に存在するものであり得る。しかしながら、構造はこれに限定されなくてよいが、ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡの主な部分、または、標的ＤＮＡに相補的な全部または一部を含む限り、任意の構造の形態のガイドＲＮＡが本発明において使用され得る。
【００８７】
ガイドＲＮＡ、具体的には、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に全体的または部分的に相補的な配列、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの上流部分、および、具体的には、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの５'末端に対する少なくとも１つの付加ヌクレオチドを含み得る。付加ヌクレオチドはグアニン（Ｇ）であり得るが、ヌクレオチドはこれに限定されない。
【００８８】
加えて、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの付着を助けるスカフォールド配列を含み得る。
【００８９】
本明細書において使用されるとき、「標的ヌクレオチド配列または標的配列」という用語は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的とすることが予想されるヌクレオチド配列を指し、本発明においては更に、本発明のガイドＲＮＡ‐標的ヌクレオチド配列ペアライブラリ解析の方法によって解析される標的配列を含む。本発明において、ガイドＲＮＡおよび標的配列は、オリゴヌクレオチドライブラリおよびベクターライブラリをそれぞれ構成する各オリゴヌクレオチドおよびベクターにおいて、ペアの形式で存在する。従って、１つのオリゴヌクレオチドまたはベクターに存在するガイドＲＮＡは、その標的配列に対応する。
【００９０】
本発明において、オンターゲット活性（またはオンターゲット効果）／オフターゲット活性（またはオフターゲット効果）および標的ヌクレオチド配列は、完全に異なる意味として理解すべきである。 
【００９１】
「オンターゲット活性」という用語は、ガイドＲＮＡの配列の全部または一部に完全に相補的な配列に対して、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが配列を切断し、更に、切断領域上でインデルを生じさせる活性を指す。
【００９２】
「オフターゲット活性」という用語は、ガイドＲＮＡの配列の全部または一部に完全に相補的でなく、配列の一部がミスマッチである配列に対して、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが配列を切断し、更に、切断領域上でインデルを生じさせる活性を指す。すなわち、「オンターゲット活性」および「オフターゲット活性」という用語は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって切断される配列が、ガイドＲＮＡ配列の全部または一部に完全に相補的であるかどうかによって決定される概念に関する。
【００９３】
一方、本明細書において使用されるとき、「標的配列」という用語は、ペアの形態で存在するガイドＲＮＡによって引き起こされるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性が示されるかどうかについて解析される配列を指す。すなわち、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドライブラリを構成する各オリゴヌクレオチドの設計または調製のプロセス中にオペレーターが決定でき、オペレーターは、設計ステップにおける実施形態の目的に従って、ペアガイドＲＮＡに関して、オンターゲット活性が予想される配列と、オフターゲット活性が予想される配列とを選択し、標的配列を設計できる。標的配列は、これに限定されないが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが認識するプロトスペーサ―隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含み得る。
【００９４】
オリゴヌクレオチドの設計は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価する目的で、当業者によって自由に実行され得る。例えば、ペアは、特定のガイドＲＮＡ配列に関してオンターゲット活性を有する配列を含み得て、また、ペアは、ガイドＲＮＡ配列に関してオフターゲット活性を有する配列を含み得る。例えば、ガイドＲＮＡ配列、具体的にはｃｒＲＮＡ配列に完全に相補的な配列が設計される、または、ヌクレオチドの一部がミスマッチであるように、部分的に相補的な配列が設計される。
【００９５】
加えて、当業者であれば、本発明のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリの解析を実行するように、更なる構成要素をオリゴヌクレオチドに含め得る。例えば、オリゴヌクレオチドは更に、ダイレクトリピート配列、ポリＴ配列、バーコード配列、一定領域配列、プロモーター配列、および、スカフォールド配列から成る群から選択される少なくとも１つを含み得るが、構成要素はこれらに限定されない。
【００９６】
上述のように、オリゴヌクレオチドは、１００〜２００ヌクレオチドの配列から成るものであり得るが（オリゴヌクレオチドはこれに限定されない）、使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの種類、解析目的などに従って、当業者によって適宜調節され得る。
【００９７】
一方、オリゴヌクレオチドは、５'末端から３'末端方向に、標的配列およびガイドＲＮＡコード配列を含むように設計され得て、対照的に、５'末端から３'末端方向に、ガイドＲＮＡ配列および標的配列を含むように設計され得る。
【００９８】
例えば、オリゴヌクレオチドは標的配列およびガイドＲＮＡコード配列、具体的には、標的配列、バーコード配列およびガイドＲＮＡコード配列を含み得て、以下の順序で構築され得るが、順序は特にこれに限定されない。
【００９９】
オリゴヌクレオチドは、５'末端から３'末端の方向に、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、および、標的配列を含み得て、具体的には、（ａ）ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、標的配列、（ｂ）ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、標的配列、ＰＡＭ配列、（ｃ）ガイドＲＮＡコード配列、ポリＴ配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、標的配列、（ｄ）ガイドＲＮＡコード配列、ポリＴ配列、バーコード配列、標的配列、ＰＡＭ配列である。
【０１００】
より具体的には、オリゴヌクレオチドは、（ａ）ダイレクトリピート配列、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、標的配列、（ｂ）ダイレクトリピート配列、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、標的配列、ＰＡＭ配列、（ｃ）ダイレクトリピート配列、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、標的配列、一定配列、（ｄ）ダイレクトリピート配列、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、標的配列、ＰＡＭ配列、一定配列を含み得るが、配列は特にこれらに限定されない。
【０１０１】
加えて、オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡコード配列に隣接する、かつ、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの結合に役立つスカフォールド配列を更に含み得る。
【０１０２】
例えば、オリゴヌクレオチドは、スカフォールド配列、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、標的配列を含み得るが、構成要素は特にこれらに限定されない。
【０１０３】
加えて、オリゴヌクレオチドは発現のために、５'末端領域にプロモーター配列を含み得る。本発明の一実施形態において、Ｕ６プロモーターが使用された。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドは、５'末端から３'末端の方向に、標的配列、バーコード配列、ガイドＲＮＡコード配列を含み得て、具体的には、標的配列、ＰＡＭ配列、バーコード配列、ガイドＲＮＡコード配列を含み得て、ＰＡＭ配列、標的配列、バーコード配列、ガイドＲＮＡコード配列を含み得て、標的配列、ＰＡＭ配列、バーコード配列、ポリＴ配列、ガイドＲＮＡコード配列を含み得て、ＰＡＭ配列、標的配列、バーコード配列、ポリＴ配列、ガイドＲＮＡコード配列を含み得て、より具体的には、標的配列、ＰＡＭ配列、バーコード配列、ガイドＲＮＡコード配列、ダイレクトリピート配列を含み得て、ＰＡＭ配列、標的配列、バーコード配列、ガイドＲＮＡコード配列、ダイレクトリピート配列を含み得て、標的配列、ＰＡＭ配列、バーコード配列、ポリＴ配列、ガイドＲＮＡコード配列、ダイレクトリピート配列を含み得て、ＰＡＭ配列、標的配列、バーコード配列、ポリＴ配列、ガイドＲＮＡコード配列、ダイレクトリピート配列を含み得て、一定配列、標的配列、ＰＡＭ配列、バーコード配列、ポリＴ配列、ガイドＲＮＡコード配列、ダイレクトリピート配列を含み得て、一定配列、ＰＡＭ配列、標的配列、バーコード配列、ポリＴ配列、ガイドＲＮＡコード配列、ダイレクトリピート配列を含み得るが、構成要素は特にこれらに限定されない。
【０１０５】
加えて、オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡコード配列に隣接する、かつ、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの結合に役立つスカフォールド配列を更に含み得る。
【０１０６】
例えば、オリゴヌクレオチドは、標的配列、ＰＡＭ配列、バーコード配列、ガイドＲＮＡコード配列、スカフォールド配列を含み得るが、構成要素は特にこれらに限定されない。加えて、オリゴヌクレオチドは発現のために、５'末端領域にプロモーター配列を含み得る。
【０１０７】
加えて、上述のように、オリゴヌクレオチドは更に、上述の構成要素に加えて、５'末端および３'末端に、ＰＣＲ増幅のためのプライマー付着配列を含み得るが、構成要素は特にこれらに限定されない。
【０１０８】
標的配列の長さは、１０ｂｐから１００ｂｐであり得て、具体的には、２０ｂｐから５０ｂｐ、より具体的には、２３ｂｐから３４ｂｐであり得るが、長さは特にこれらに限定されない。
【０１０９】
加えて、ガイドＲＮＡコード配列の長さは、１０ｂｐから１００ｂｐであり得て、具体的には、１５ｂｐから５０ｂｐ、より具体的には、２０ｂｐから３０ｂｐであり得るが、長さは特にこれらに限定されない。
【０１１０】
加えて、バーコード配列は、各オリゴヌクレオチドの認識のためのヌクレオチド配列を指す。本発明において、バーコード配列は、２またはより多くのヌクレオチドの繰り返し（すなわち、ＡＡ、ＴＴ、ＣＣおよびＧＧ）を含まないことがあり得るが、バーコード配列は、各オリゴヌクレオチドを認識するように設計されている限り、特に限定されない。複数のオリゴヌクレオチドにおいて、バーコード配列は、各オリゴヌクレオチドを区別するために、少なくとも２つのヌクレオチドが異なるように設計され得る。バーコード配列の長さは、５ｂｐから５０ｂｐであり得るが、長さはこれらに特に限定されない。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態において、アシダミノコッカス由来Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）およびラクノスピラ由来Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）に関して、ペアのオリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡおよび／または標的配列を変動させることによって、それぞれ、８，３２７種、および、３，６３４種から合成され、それにより、合計１１，９６１種のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリが調製された。オリゴヌクレオチドライブラリを構成する各オリゴヌクレオチドの全長は、１２２ｂｐから１３０ｂｐヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡコード配列および標的ヌクレオチド配列の相互に異なるペアを含み、具体的な構成は図１に示される。
【０１１２】
加えて、本発明の別の実施形態において、化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関して、８９，５９２オリゴヌクレオチドが合成され、それにより、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリが調製された。オリゴヌクレオチドは、１２０ヌクレオチドの全長を有し、ガイドＲＮＡコード配列（ガイド配列）および標的配列を含む（図３５）。
【０１１３】
次に、オリゴヌクレオチドライブラリを使用してベクターライブラリ（例えば、ウイルスベクター）を調製できる。
【０１１４】
本発明のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法の利点の１つは、ウイルスを使用してペアが細胞に導入されるという点にある。標的配列に対応するガイドＲＮＡは、ペアの形態で細胞内に導入されるので、オリゴヌクレオチドライブラリ、ベクターライブラリ、および、細胞ライブラリにおけるコピー数の偏差に起因して発生し得る効果を最小限に抑えることでき、ウイルスを介してゲノムＤＮＡに組み込むことができ、一過性発現による分析法とは異なり、時間に従ってオンターゲットおよびオフターゲットの活性の解析を実行することが可能であり、更に、エピジェネティック因子によって引き起こされる効果を比較的最小限に抑えることができる。ベクターがウイルスであるとき、ウイルスライブラリが細胞に導入され、そこからウイルスを生産および取得でき、それを使用して細胞を感染させることができる。このプロセスは、当業者が当技術分野において知られている方法を使用することによって適宜実行できる。
【０１１５】
本発明において、ベクターは、オリゴヌクレオチドを含み得て、各オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターであり得て、ウイルスベクターは、具体的には、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどであり得るが、ベクターはこれらに限定されず、当業者であれば、本発明の目的を達成できる、知られている任意のベクターを自由に使用できる。
【０１１６】
ベクターとは、オリゴヌクレオチドを細胞へ送達できる媒介物、例えば遺伝子構築物を指す。具体的には、ベクターが個々の対象物の細胞内に存在するとき、挿入断片、すなわち、オリゴヌクレオチドを発現できるように必須の制御要素が動作可能に連結されている挿入断片を含み得る。
【０１１７】
ベクターは、標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製および精製され得る。ベクターが標的細胞（例えば、真核生物および原核生物など）において作用できる限り、ベクターの種類は特に限定されなくてよい。ベクターは、プロモーター、開始コドン、および、終止コドンターミネーターを含み得る。更に、ベクターは適宜、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、および／または、エンハンサー配列、および／または、遺伝子の５'末端および３'末端の部位における非翻訳領域、および／または、選択マーカー領域、および／または、反復単位などを含み得る。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドライブラリの各オリゴヌクレオチドをレンチウイルスベクターにクローニングすることによってレンチウイルスベクターライブラリが調製され（図４および図３６）、それが細胞内で発現され、それにより、ウイルスを取得した。
【０１１９】
次のステップは、ベクターを標的細胞に導入することによって細胞ライブラリを調製することである。具体的には、ライブラリの調製のためにベクターを細胞へ送達する方法は、当技術分野において知られている様々な方法によって達成できる。これらの方法は、例えば、当技術分野において知られている、カルシウムリン酸‐ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介トランスフェクション法、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合法、リポフェクタミン（登録商標）およびプロトプラスト融合法などを含み得る。加えて、ウイルスベクターが使用されるとき、標的物（すなわちベクター）は、感染を手段として有するウイルス粒子を使用して送達され得る。加えて、ベクターは、遺伝子ボンバードメントなどによって細胞に導入され得る。
【０１２０】
導入されたベクターは、細胞内において、ベクター自体として存在し得るか、または、染色体に組み込まれ得るが、ベクターの状態は特にこれらに限定されない。
【０１２１】
本発明において調製される細胞ライブラリは、ガイドＲＮＡ‐標的配列を含むオリゴヌクレオチドが導入される細胞集団を指す。特に、各細胞は、ベクターが導入された、具体的には、ウイルスの種類および／または数が異なるようにベクターが導入されたものであり得る。しかしながら、本発明の分析法は、細胞ライブラリの全部を使用して実行され、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的配列は、ペアの形態で導入され、従って、方法は、細胞感染の効率、オリゴヌクレオチドのコピー数の偏差などによって著しく影響され（図６から図１２）、各ペアに応じた解釈が可能である。
【０１２２】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは更に、構築された細胞ライブラリにインデルを誘導するように導入され得る。
【０１２３】
ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアの種類および／または数に従って、活性の程度を異なって示し得る。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターを介して細胞に送達され得て、それ自体でＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質として細胞に送達され得るが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが細胞内で活性を示すことができる限り、導入方法は特に限定されない。一実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、タンパク質形質導入ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質など）に連結された形態で送達され得るが、形態はこれらに限定されない。タンパク質形質導入ドメインとして、知られている様々な種類のものが当技術分野において使用され得て、ポリアルギニンまたはＨＩＶ由来ＴＡＴタンパク質は、上述のように使用され得るが、特にこれに限定されない。
【０１２４】
加えて、ベクターを導入できる細胞の種類は、ベクターの種類、および／または、標的細胞の種類に従って、当業者が適宜選択し得て、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラティフィムリウムなど）、酵母細胞、真菌細胞（例えば、ピキアパストリスなど）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ、ヨトウガ（Ｓｆ９）など）、動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ＢＯＷメラノーマ細胞、ＨＴ‐１０８０、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）など）、または、植物細胞がある。
【０１２５】
細胞ライブラリにおいて、ヌクレアーゼの活性は、導入されたガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって現れ得る。すなわち、導入された標的配列に関して、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が発生し得て、従って、インデルが発生し得る。本明細書において使用されるとき、「インデル」という用語は、ＤＮＡのヌクレオチド配列において、ヌクレオチドの一部が挿入される、または、欠失する修飾をまとめて指す。インデルは、上述のようにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断するとき、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の機構によって修復が実行されるプロセス中に、標的配列に導入されるものであり得る。
【０１２６】
加えて、本発明の方法は、導入されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性が示される細胞からＤＮＡ配列を取得する段階を備え得る。ＤＮＡの取得は、当技術分野において知られている、様々なＤＮＡ単離方法を使用して実行され得る。
【０１２７】
細胞ライブラリを構成する各細胞が、導入された標的配列におけるインデルの発生を経ることが予想されるので、標的配列のヌクレオチドについて配列解析を実行することによって（例えば、ディープシーケンシング、または、ＲＮＡシーケンシング）、関連データを取得できる。
【０１２８】
ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用する本発明の分析法は、インビボで実行されるので、他のインビトロの分析法と比較して、アーチファクト無しで、信頼できる解析結果を取得できる。
【０１２９】
従って、ステップ（ｂ）は、配列解析を介して取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を取得するステップである。
【０１３０】
上述のように、各インデルは、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアに依存する方式で発生し得て、従って、インデル頻度は、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアによるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性の程度として評価され得る。
【０１３１】
各ペアは、オリゴヌクレオチドライブラリを構成する各オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドを区別することができる特定の配列を挿入することによって区別でき、従って、データ解析のステップにおいて区別された配列に基づいて、データを分類することによって、解析を実行できる。本発明の一実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、２またはより多くのヌクレオチドの任意の繰り返し（すなわち、ＡＡ、ＣＣ、ＴＴ、ＧＧ）を含まないバーコード配列を含むように、および、少なくとも２つの相互に異なるヌクレオチドを含むように調製された。
【０１３２】
本発明のペアライブラリは、インビボで内在性遺伝子に作用するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性との高い相関を有することによって、精度および予測可能性が改善されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法を提供する。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態において、ライブラリを介して測定されたプログラマブルヌクレアーゼの活性が、インビボで内在性遺伝子に対して実際に作用するプログラマブルヌクレアーゼの活性と高い相関を有することが確認された。
【０１３４】
加えて、本発明のペアライブラリは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を高精度で評価することを可能にするという利点を有する。
【０１３５】
具体的には、本発明の特定の実施形態において、ペアライブラリの精度は、ヒトＣＤ１５遺伝子およびヒトＭＥＤ１遺伝子のガイドＲＮＡの活性順位を、過去に開示されたガイドＲＮＡの活性順位と比較することによって評価された（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，３２：１２６２‐１２６７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，３４：１８４‐１９１）。その結果、ヒトＣＤ１５およびヒトＭＥＤ１遺伝子のためのガイドＲＮＡは両方とも、高いスピアマン相関係数を示し、従って、これらのガイドＲＮＡが、知られているガイドＲＮＡの活性順位と高い相関を有することが確認された（図３７）。
【０１３６】
加えて、本発明のペアライブラリを使用して取得された、ガイドＲＮＡの活性度と、細胞における標的配列の直接解析によって取得されたガイドＲＮＡの活性度との間の相関が調査され、その結果、高いスピアマン相関係数を示すことが確認され、従って、本発明のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価する方法は高精度を有することが確認された（図３８）。
【０１３７】
本発明において解析されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性には、例えば以下のものが含まれ得る。
【０１３８】
１）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列
【０１３９】
２）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオンターゲット活性、または、
【０１４０】
３）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオフターゲット活性
【０１４１】
解析されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性は、オリゴヌクレオチドの設計に応じて変動し得て、これは、細胞ライブラリのディープシーケンシングによって取得されるインデル頻度から解釈される結果として最終的に現れる。
【０１４２】
一実施形態において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列が確認される場合、様々なヌクレオチド配列および／またはあり得るＰＡＭ配列（これらのオリゴヌクレオチドの処理中、標的配列の５'末端において、ＰＡＭ配列のヌクレオチドの数は異なる）を有するように、オリゴヌクレオチドを設計することが可能である。従って、対応するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列は、ＰＡＭ配列に従ってインデル頻度を解析することによって確認できる。
【０１４３】
本発明の特定の実施形態において、アシダミノコッカスおよびラクノスピラに由来するＣｐｆ１（それぞれＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１）のＰＡＭ配列は、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用して解析され、その結果、ＴＴＴＮに関して過去に知られていたこととは異なり、ＴＴＴＶ、それに加えて、ＣＴＴＡが、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１の真のＰＡＭ配列であることが確認された（図１３から図１９）。
【０１４４】
本発明の別の実施形態において、オンターゲット活性の特性の解析のために、様々な種類のガイドＲＮＡと、これに対応する標的配列とを設計することによって、または、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを適用するための条件を変動させることによって、解析を実行することが可能である。上述の解析から、ガイドＲＮＡの設計中に標的効果を最大化できる情報を取得することが可能である。
【０１４５】
本発明の特定の実施形態において、オンターゲット活性の特性は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの種類を変動させ、高い活性を有するガイドＲＮＡの位置特性を解析することによって、または、標的配列のＧＣ含有量を解析することによって解析され（図２０から図２２）、本発明の別の特定の実施形態において、レンチウイルスの送達時間を変動させることによってオンターゲット活性が解析された（図２３および図２４）。
【０１４６】
本発明の別の実施形態において、オフターゲット活性の解析のために、ガイドＲＮＡ配列と標的配列との間の配列の一部にミスマッチがあるように、オリゴヌクレオチドを設計することが可能であり、特に、標的配列の位置を具体的に異ならせることによって設計することが可能である。上の解析を通して、標的配列の位置に従って、ヌクレオチドミスマッチの影響を確認することが可能であり、これにより、ガイドＲＮＡの設計中にオフターゲット活性を最小限に抑えることができる情報を取得することを可能にする。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態において、標的配列の位置に対応するガイドＲＮＡにおいてヌクレオチドミスマッチがあるように、オリゴヌクレオチドが設計され、それにより、標的配列の各位置で、ヌクレオチドミスマッチとオフターゲット効果との間の関係が解析された（図２５から図３３）。
【０１４８】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性は、本発明のガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための例示的な一実施形態を提供し、本発明の範囲は、上述の例示的な実施形態に限定されるものとして解釈されるべきでない。本発明の中核技術の特性は、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアを含む細胞ライブラリを使用して、高スループット方式で、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性をインビボで評価することにあり、この目的のために、基本オリゴヌクレオチドの設計方法、および、それらの結果の解釈は、当業者の意図および目的、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの種類などに従って、十分に拡張することができる。
【０１４９】
本発明の別の態様は、少なくとも２種類の細胞を含む細胞ライブラリを提供し、各細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む。
【０１５０】
本発明の更に別の態様では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含む単離オリゴヌクレオチドを含むベクター、および、ベクターライブラリを提供する。
【０１５１】
本発明の更に別の態様では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチド、および、オリゴヌクレオチドライブラリを提供する。
【０１５２】
細胞ライブラリ、ベクター、ベクターライブラリ、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドライブラリは、上述のものと同一である。
【０１５３】
本発明の更に別の態様では、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的とする標的ヌクレオチド配列を設定する段階と、（ｂ）設定された標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成する、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を設計する段階と、（ｃ）標的ヌクレオチド配列と、標的ヌクレオチド配列を標的とするガイドＲＮＡとを含むオリゴヌクレオチドを設計する段階と、（ｄ）（ａ）から（ｃ）のステップを少なくとも１回、具体的には２回繰り返す段階とを備える、オリゴヌクレオチドライブラリを構築するための方法を提供する。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドライブラリの構築のためにオリゴヌクレオチドを設計するプロセスは、上述のものと同一である。
【０１５５】
プロセスは、標的配列を判定後、標的配列についてのガイドＲＮＡの配列が設計される、または、１つのガイドＲＮＡ配列に対して、ＰＡＭ配列を含む標的配列が設計されることであり得る。すなわち、本発明においては、オンターゲット活性およびオフターゲット活性の両方を解析することが可能であり、ガイドＲＮＡ配列の全部または一部は、標的配列に完全に相補的であり得る、または、配列の一部がミスマッチである状態で標的配列に相補的であり得る。それらの設計プロセスは、１つのガイドＲＮＡに関して、配列の長さおよび／またはヌクレオチド配列の点で、ヌクレオチド配列に偏差があるいくつかの標的配列が設計されるものであり得て、プロセスは、１つの標的配列に関して、配列の長さおよび／またはヌクレオチド配列の点で、ヌクレオチド配列に偏差があるいくつかのガイドＲＮＡが設計され得て、プロセスは、２つのプロセスが組み合わされた方式で実現されるものであり得る。
【０１５６】
ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）は、追加的に設計されたオリゴヌクレオチドを合成するステップを含み得る。
【０１５７】
本発明の更に別の態様では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、すなわち、ＴＴＴＶまたはＣＴＴＡに隣接する標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成できる配列を含む単離ガイドＲＮＡを提供する。
【０１５８】
本発明の更に別の態様では、単離ガイドＲＮＡまたは単離ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む、ゲノム編集のための組成物を提供する。
【０１５９】
単離ガイドＲＮＡは、組み合わせて使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼがＣｐｆ１タンパク質であるものであり得る。
【０１６０】
本発明の更に別の態様では、単離ガイドＲＮＡ、または、単離ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸とを含む、哺乳類細胞におけるゲノム編集のためのシステムを提供する。
【０１６１】
本発明の更に別の態様では、ガイドＲＮＡ、または、ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質、または、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸を順番または同時に単離哺乳類細胞に導入する段階を備える、哺乳類細胞においてＣｐｆ１でゲノム編集するための方法を提供する。
【０１６２】
上述のように、本発明においては、Ｃｐｆ１タンパク質のＰＡＭ配列は、ＴＴＴＮであるという過去の考えとは異なり、ＴＴＴＶまたはＣＴＴＡであることが確認され、従って、本発明の確認に基づいて、ＰＡＭ配列としてＴＴＴＶまたはＣＴＴＡを有するガイドＲＮＡをゲノム編集のために効果的に使用できる。
【０１６３】
［発明の形態］
【０１６４】
以降では、以下の例を参照して、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの例は、説明だけを目的とするものであり、本発明の範囲はこれらの例に限定されない。
【０１６５】
［例１：Ｃｐｆ１の活性を評価するためのペアライブラリの調製、および、それらの評価方法］
【０１６６】
［例１‐１：オリゴヌクレオチドの設計］
【０１６７】
様々なガイドＲＮＡに対して、Ｃｐｆ１の活性を高スループット方式で評価するためにプラスミドライブラリを構築するべく、アシダミノコッカスに由来するＣｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）の８，３２７オリゴヌクレオチドと、ラクノスピラに由来するＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）の３，６３４オリゴヌクレオチドとが、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ（登録商標）（ワシントン州ボセル）によって合成された。オリゴヌクレオチドは、ガイドＲＮＡコード配列（ガイド配列）、および、合計長が１２２〜１３０ヌクレオチドである標的配列を含むように設計された（図１）。
【０１６８】
内在性位置および導入位置におけるインデル頻度を比較するべく、ＲＮＡコード配列および標的配列を含む８２のエラーフリーのオリゴヌクレオチドが、Ｃｅｌｌｅｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（登録商標）（韓国、ソウル）によって合成された。
【０１６９】
加えて、ＰＣＲ増幅中にフォワードプライマーおよびリバースプライマーのための結合部位として使用できるように、２７ヌクレオチドの配列（配列識別番号：１）および２２ヌクレオチドの配列（配列識別番号：２）をそれぞれ、上述のオリゴヌクレオチドの両端に含めた。加えて、各オリゴヌクレオチドを認識できるように、１５ヌクレオチドの固有のバーコード配列を各オリゴヌクレオチドの中央に挿入した。バーコード配列は、２またはより多くのヌクレオチドの反復（すなわち、ＡＡ、ＣＣ、ＴＴおよびＧＧ）を含まないように設計され、バーコード配列のすべては、バーコード配列の間に少なくとも２つのヌクレオチドの偏差があるように設計された。各オリゴヌクレオチドにおいて、ガイドＲＮＡ配列および標的配列は、それぞれ、バーコード配列の上流および下流に配置した。
【０１７０】
［例１‐２：ベクタークローニング］
【０１７１】
Ｃｐｆ１発現レンチウイルスベクターを調製するべく、プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）、＃６９９８２、＃６９９８８）に由来するＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐｆ１をコードする配列が、ｌｅｎｔｉＣａｓ９‐Ｂｌａｓｔプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）、＃５２９６２）に複製され、それぞれ、Ｌｅｎｔｉ＿ＡｓＣｐｆ１‐Ｂｌａｓｔ（配列識別番号：３）およびＬｅｎｔｉ＿ＬｂＣｐｆ１‐Ｂｌａｓｔ（配列識別番号：４）と命名された（図２および図３）。
【０１７２】
加えて、プラスミドライブラリを調製するためのバックボーンベクターを取得するべく、ＳｐＣａｓ９スカフォールド領域がｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ‐Ｐｕｒｏベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）、＃５２９６３）から除去され、このベクターは、Ｌｅｎｔｉ‐ｇＲＮＡ‐Ｐｕｒｏベクター（配列識別番号：５）と命名された（図４）。
【０１７３】
［例１‐３：プラスミドライブラリの調製］
【０１７４】
プラスミドライブラリを調製するために、例１において合成されたオリゴヌクレオチド（それぞれ１２２、１３０ヌクレオチド）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲで増幅させ、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ‐ｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））を使用してゲル精製プロセスを実行した。次に、ＮＥＢｕｉｄｌｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ（登録商標））を使用して、Ｌｅｎｔｉ‐ｇＲＮＡ‐Ｐｕｒｏベクターおよび精製されたＰＣＲ産物を組み合わせた。組み合わせた後に、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））を使用して、上述の反応物（２μＬ）を使用して、電気穿孔によってエレクトロコンピテントセル（２５μＬ、Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））を形質導入させた。次に、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に、形質導入された細胞を植え付け、最終的に、ライブラリの３０倍の数に相当するコロニーを取得した。コロニーを採取し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して、コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０１７５】
［例１‐４：レンチウイルスの生成］
【０１７６】
０．０１％のポリ‐Ｌ‐リシン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））でコーティングされた１００ｍｍの培養皿において、８０％〜９０％の程度のコンフルエンシーまで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。例３において調製されたトランスファープラスミドを４：３：１の重量比で、ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇと混合した。次に、製造元の指示に従って、ｉＮ‐ｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））を使用して、１００ｍｍ培養皿における細胞にプラスミド混合物（１８μｇ）を導入した。トランスフェクションの１５時間後に、培地を成長培地（１２ｍＬ）に置き換えた。トランスフェクションの３９（＝１５＋２４）時間後および６３（＝１５＋４８）時間後に、ウイルスを含む上清を採取した。ウイルスを含む培地の第１バッチおよび第２バッチを混合し、４℃、３，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。次に、Ｍｉｌｌｅｘ‐ＨＶ（登録商標）０．４５μｍタンパク質低結合性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を使用して上清を濾過し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１７７】
［例１‐５：細胞ライブラリの調製］
【０１７８】
細胞ライブラリを調製するために、１００ｍｍ培養皿に付着したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．５×１０６〜２．０×１０６）にレンチウイルスベクターをトランスフェクトした。形質導入の３日後、細胞をピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）で３〜５日間処理した。研究の進行中にライブラリを保存するために、ライブラリを含む細胞を３×１０６細胞／１００ｍｍ培養皿の最低密度で維持した。レンチウイルスベクター調節因子（ＷＰＲＥ）のコピー数を、内在性ヒト遺伝子ＡＬＢと比較し、感染多重度（ＭＯＩ）を確認した。ゲノムＤＮＡ試料におけるプロウイルスおよびＡＬＢのコピー数を測定するべく、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｑＰＣＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標））、ＷＰＲＥ、または、ＡＬＢに特異的なプライマーを使用して、リアルタイムｑＰＣＲを実行した。結果は、ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ‐Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）、＃５２９６３）およびｐＡｌｂｕｍｉｎと共に、標準曲線において示されている。プラスミドＤＮＡ形成による定量化バイアスを防止するべく、ＰＣＲを実行する前にすべてのテンプレートをＡｈｄＩで分解した。ｑＰＣＲ解析において、標準プラスミドＤＮＡが使用されるので、ゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの定量化における効率の偏差を是正するべく、バックグラウンドとしてサケ精子ＤＮＡを含めた。ＨＥＫ２９３細胞は、ほぼ三倍体の染色体を有するが、ＡＬＢ遺伝子が位置する染色体番号４は２つのペアを有し、従って、プロウイルスと細胞ＤＮＡとの比率（ＭＯＩ）は、ＷＰＲＥのコピー数／ＡＬＢのコピー数×０．５によって計算した。
【０１７９】
［例１‐６：細胞ライブラリへのＣｐｆ１の形質導入］
【０１８０】
ＡｓＣｐｆ１（またはＬｂＣｐｆ１）を発現するレンチウイルスベクターを形質導入するべく、最初に、形質導入の２４時間前に、細胞ライブラリ（２×１０６〜３×１０６個の細胞）を１００ｍｍ培養皿に植え付けた。次に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を含むＤＭＥＭ内の細胞にＡｓＣｐｆ１発現ウイルスベクターを形質導入し、１０％ＦＢＳおよびブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（登録商標））を含むＤＭＥＭにおいて維持した。
【０１８１】
ＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１をコードするプラスミドの形質導入の場合、最初に、形質導入の６時間前に細胞ライブラリ（３×１０６個の細胞）を３つの６０ｍｍ培養皿に植え付けた。次に、Ｌｅｎｔｉ＿ＡｓＣｐｆ１‐ＢｌａｓｔまたはＬｅｎｔｉ＿ＬｂＣｐｆ１‐Ｂｌａｓｔプラスミド（４μｇ）およびリポフェクタミン（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））（８μＬ）を用いて細胞に形質導入した。細胞を一晩培養し、培地を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに置き換えた。次に、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）を含む培養培地において、形質導入の第１日目から４日間、形質導入細胞を培養した。
【０１８２】
［例１‐７：ディープシーケンシング］
【０１８３】
Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を使用して、細胞ライブラリからゲノムＤＮＡを単離した。次に、インデル頻度の解析のために、最初に、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、挿入された標的配列をＰＣＲによって増幅した。細胞ライブラリの１００倍またはより大きいカバレッジを達成するべく、一次ＰＣＲにおいて、１３μｇ／試料の量で、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した（２９３Ｔ細胞（１×１０６）のゲノムＤＮＡを１０μｇと仮定した）。各試料ごとに、反応あたり１μｇのゲノムＤＮＡを使用して、１３回の独立の反応（５０μＬ）を実行し、反応生成物を混合した。
【０１８４】
内在性部位および導入部位におけるインデル頻度を比較するべく、試料あたり１００ｎｇのＤＮＡを、導入標的配列および内在性標的配列のためのＤＮＡとして、ＰＣＲ増幅のために使用した。
【０１８５】
次に、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ‐ｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。二次ＰＣＲにおいて、一次ＰＣＲの精製物（２０ｎｇ）をイルミナ（登録商標）アダプタおよびバーコード配列と共に取り付けた。ＰＣＲ反応において使用されるプライマーを以下の表１Ａ〜表１Ｄに示す。最終産物を分離および精製し、混合し、ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ（イルミナ（登録商標））を使用して解析にかけた。
【０１８６】
［表１］
【表１】
2019514379.tif 000003
【表２】
2019514379.tif 000004
【表３】
2019514379.tif 000005
【表４】
2019514379.tif 000006
【０１８７】
ＦＰ：フォワードプライマー、ＲＰ：リバースプライマー
【０１８８】
［例１‐８：ペアコピー数の解析］
【０１８９】
ライブラリにおける各ペアのコピー数を評価するために、以下の数式を使用してリード数を正規化した。
正規化されたペアあたりのリード数＝（ペアあたりのリード数／試料におけるすべてのペアの合計リード数）×１０６＋１
【０１９０】
［例１‐９：インデル頻度の解析］
【０１９１】
カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用してディープシーケンシングデータを分類および解析した。各ガイドＲＮＡ標的ペアのデータ分類を、１５ｂｐバーコード配列、および、その下流にある４ｂｐ一定配列（すなわち、合計１９ｂｐの配列）に基づいて実行した。予想される切断部位の周囲（すなわち、切断部位の中央における８ｂｐの領域）に位置する挿入または欠失は、Ｃｐｆ１によって誘導された変異と考えられた。単一のヌクレオチドの置換を解析から除外した。Ｃｐｆ１およびガイドＲＮＡの活性に由来する実際のインデル頻度は、観察されたインデル頻度でＣｐｆ１が送達されなかった細胞ライブラリのバックグラウンドインデル頻度を差し引くことによって計算した。バックグラウンドインデル頻度は、主にオリゴヌクレオチドの合成において発生する。解析の精度を向上させるべく、リード数、および、ペアあたりのバックグラウンドインデル頻度に従ってディープシーケンシングデータを分類した（表２）。
【０１９２】
［表２］
【表５】
2019514379.tif 000007
【０１９３】
［例１‐１０：インデル頻度の比較］
【０１９４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４８ウェルディッシュに播種し、ガイドＲＮＡコード配列および標的配列を含む独立のレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。形質導入の３日後、形質導入されなかった細胞を除去するために、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）で細胞を処理した。上述のように、ＡｓＣｐｆ１を発現するレンチウイルスベクターを使用して、Ｃｐｆ１を形質導入細胞に送達した。Ｃｐｆ１導入の５日後、ＤＮＡを細胞から単離し、ディープシーケンシングにかけた。
【０１９５】
［例１‐１１：クロマチンアクセシビリティの計算］
【０１９６】
細胞あたり４コピーが存在する染色体番号１７および２２を除き、４ゲノム領域をランダムに選択した。４領域内のランダムな座位を標的とするように、合計８２のガイドＲＮＡを設計した。ＤＮａｓｅ  Ｉ感受性スコアは、ＤＮＡエレメントの百科事典（ＥＮＣＯＤＥ）から取得されたＤＮａｓｅ‐ｓｅｑ（ＥＮＣＦＦ０００ＳＰＥ）データを使用して計算した。標的領域の各位置にあるＤＮａｓｅ  Ｉ感受性スコアは、対応する位置にあるＤＮａｓｅ‐ｓｅｑシーケンシングリード断片の重複数を最初にカウントすることによって計算した。
【０１９７】
例えば、標的領域の位置５に、シーケンシング重複リードが２つあるとき、上述の位置のスコアが２であると仮定した。ＰＡＭおよび標的配列を含む各領域の長さは２７ｂｐである。従って、各位置における２７のスコアを平均化することによって、標的領域におけるＤＮａｓｅ  Ｉ感受性スコアを取得した。
【０１９８】
ヒトゲノム（ＵＣＳＣゲノムブラウザからのｈｇ１９／ＧＲＣｈ３７）の３２億の位置における８２の標的領域のＤＮａｓｅ  Ｉスコアを順位付けしたとき、スコアは広く分布することが示された（０％〜９９．９９％）。
【０１９９】
［例２：Ｃａｓ９の活性を評価するためのペアライブラリの調製、および、それらの評価方法］
【０２００】
本発明者は、異なる種類のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＳｐＣａｓ９を使用して、本発明のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価する方法を確認した。
【０２０１】
［例２‐１：オリゴヌクレオチドの設計］
【０２０２】
高スループット方式で、様々なガイドＲＮＡに関してＳｐＣａｓ９活性を評価するためのプラスミドライブラリを構築物するべく、本発明者は、上述の例と同様の方法でガイドＲＮＡ標的配列オリゴヌクレオチドを設計した。
【０２０３】
具体的には、化膿レンサ球菌に由来するＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）のために、ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ（登録商標）（ワシントン州ボセル）およびＴｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）（カリフォルニア州サンフランシスコ）によって、８９，５９２のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドは、１２０ヌクレオチドの全長を有し、ガイドＲＮＡコード配列（ガイド配列）および標的配列を含むように設計された（図３５）。加えて、ＰＣＲ増幅中にフォワードプライマーおよびリバースプライマーのための結合部位として使用できるように、２６ヌクレオチドの配列（ＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧ、配列識別番号：２３）および２９ヌクレオチドの配列（ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡ、配列識別番号：２４）をそれぞれ、上述のオリゴヌクレオチドの両端に含めた。加えて、各オリゴヌクレオチドの識別のために、固有の１５ｂｐのバーコード配列が各オリゴヌクレオチドの中央に挿入された。バーコード配列は、２またはより多くのヌクレオチドの反復（すなわち、ＡＡ、ＣＣ、ＴＴおよびＧＧ）を含まないように設計され、バーコード配列のすべては、バーコード配列の間に少なくとも２つのヌクレオチドの偏差があるように設計された。各オリゴヌクレオチドにおいて、標的配列およびガイドＲＮＡはそれぞれ、バーコード配列の上流および下流に配置された。
【０２０４】
［例２‐２：プラスミドライブラリの調製］
【０２０５】
上の例において調製されたオリゴヌクレオチドを含むプラスミドライブラリを調製するべく、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ（登録商標））を使用して、オリゴヌクレオチド（各々１２０ヌクレオチド）をＰＣＲによって増幅させ、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ‐ｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））を使用してゲル精製プロセスを実行した。次に、ＮＥＢｕｉｄｌｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ（登録商標））を使用して、ＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ＿Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）、＃５２９６３）ベクターおよび精製されたＰＣＲ産物を組み合わせた。組み合わせた後に、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））を使用して、上述の反応物（２μＬ）を使用して、電気穿孔によってエレクトロコンピテントセル（２μＬ、Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））を形質導入させた。次に、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に、形質導入された細胞を植え付け、最終的に、ライブラリの１７〜１８倍の数に相当するコロニーを取得した。コロニーを採取し、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用して、コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２０６】
［例２‐３：レンチウイルスの生成］ 
【０２０７】
０．０１％のポリ‐Ｌ‐リシン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））でコーティングされた１００ｍｍの培養皿において、８０％〜９０％の程度のコンフルエンシーまで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。例２‐２において調製されたトランスファープラスミドを４：３：１の重量比で、ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇと混合した。次に、製造元の指示に従って、ｉＮ‐ｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））を使用して、１００ｍｍ培養皿における細胞にプラスミド混合物（１８μｇ）を導入した。トランスフェクションの１５時間後に、培地を成長培地（１２ｍＬ）に置き換えた。トランスフェクションの３９（＝１５＋２４）時間後および６３（＝１５＋４８）時間後に、ウイルスを含む上清を採取した。ウイルスを含む培地の第１バッチおよび第２バッチを混合し、４℃、３，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。次に、Ｍｉｌｌｅｘ‐ＨＶ（登録商標）０．４５μｍタンパク質低結合性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を使用して上清を濾過し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０２０８】
［例２‐４：細胞ライブラリの調製］
【０２０９】
オリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリを調製するべく、上の例において調製されたレンチウイルスベクターを、３つの１５０ｍｍ培養皿に付着したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（７．０×１０６個の細胞／培養皿）にトランスフェクトした。形質導入の３日後、細胞をピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）で３〜５日間処理した。研究の進行中にライブラリを保存するために、ライブラリを含む細胞をある細胞密度（７．０×１０６個の細胞／培養皿）で３つの１５０ｍｍ培養皿に維持した。
【０２１０】
［例２‐５：Ｃａｓ９の細胞ライブラリへの移行］
【０２１１】
ＳｐＣａｓ９発現レンチウイルスベクターの形質導入のために、最初に、形質導入の２４時間前に、上の例において調製された細胞ライブラリ（２．１×１０７個の細胞）を３つの１５０ｍｍ培養皿に植え付けた。
【０２１２】
次に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を含むＤＭＥＭにおける細胞にＳｐＣａｓ９発現ウイルスベクターを形質導入し、１０％ＦＢＳおよびブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（登録商標））を含むＤＭＥＭにおいて維持した。
【０２１３】
［例２‐６：ディープシーケンシング］
【０２１４】
Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を使用して、上の例において調製された細胞ライブラリからゲノムＤＮＡを単離した。
【０２１５】
次に、インデル頻度の解析のために、最初に、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、挿入された標的配列をＰＣＲによって増幅した。細胞ライブラリの１００倍またはより大きいカバレッジを達成するべく、一次ＰＣＲにおいて、１８０μｇ／試料の量で、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した（２９３Ｔ細胞（１×１０６）のゲノムＤＮＡを１０μｇと仮定した）。各試料ごとに、反応あたり２μｇのゲノムＤＮＡを使用して、９０回の独立の反応（５０μＬ）を実行し、反応生成物を混合した。
【０２１６】
次に、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ‐ｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【０２１７】
二次ＰＣＲにおいて、一次ＰＣＲの精製物（２０ｎｇ）をイルミナ（登録商標）アダプタおよびバーコード配列と共に取り付けた。ＰＣＲ反応において使用されるプライマーを以下の表３に示す。最終産物を分離および精製し、混合し、ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ（イルミナ（登録商標））を使用して解析にかけた。
【０２１８】
［表３］
【表６】
2019514379.tif 000008
【０２１９】
本発明者は、上の例において調製されたペアライブラリを使用して、上の例におけるＣｐｆ１活性の評価の場合と同様の方式で、Ｃａｓ９活性の評価を実行した。
【０２２０】
［実験例１：ペアライブラリを使用する、Ｃｐｆ１活性の評価］
【０２２１】
［実験例１‐１：ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリの作製］
【０２２２】
高スループット方式で、様々なガイドＲＮＡと共にＣｐｆ１活性を評価するために、本発明者は、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを調製した。本発明者は、標的配列と、それに対応するガイドＲＮＡ配列とを含む、１１，９６１アレイ‐合成オリゴヌクレオチドのプールをＰＣＲによって増幅させ（図１）、ギブソンアセンブリ（登録商標）を使用して、レンチウイルスプラスミドでクローニングした（図４）。ダイレクトリピート配列（配列識別番号：２０）は、フォワードプライマーが結合する位置であり、ガイド配列は、ｃｒＲＮＡの配列である。標的配列は、ＰＡＭ配列と、一定領域ベクターのアニーリング部位である一定配列（配列識別番号：２１）とを含み、リバースプライマーが結合する位置である。上述のプロセスを通してクローニングされるプラスミドの配列は、配列識別番号：３のヌクレオチド配列を有する。
【０２２３】
ガイドＲＮＡを発現し、ゲノムにおける対応する配列を含む細胞ライブラリを調製するべく、プラスミドライブラリから調製されたレンチウイルスライブラリをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に処理した（図５）。次に、ゲノムに挿入された標的配列に対して、ガイドＲＮＡによる切断、および、インデル形成を誘導するべく、Ｃｐｆ１コードプラスミドを細胞に形質導入し、または、Ｃｐｆ１発現レンチウイルスベクターを細胞に形質導入し、それにより、Ｃｐｆ１を細胞ライブラリへ送達した。
【０２２４】
次に、ＰＣＲによって標的配列を増幅し、インデル頻度を評価するために、ディープシーケンシングを利用した解析を実行した。その結果、オリゴヌクレオチドのプールにおいて、各ペアの相対的コピー数が変動することが、ディープシーケンシングを通して確認された。すなわち、コピー数に基づくと、コピー数は、最も多いコピー数を有するオリゴヌクレオチドの上位０．５％、および、最も少ないコピー数を有するオリゴヌクレオチドの下位０．５％を除く９９％のオリゴヌクレオチドにおいて、最大１３０倍までの偏差を示した（図６）。プラスミドおよび細胞ライブラリは、オリゴヌクレオチドプールと比較して、コピー数の偏差のレベルがわずかに高いことを示した。従って、プラスミドおよび細胞ライブラリのペアコピー数はそれぞれ、オリゴヌクレオチドおよびプラスミドのペアコピー数に対して正規化された。その結果、オリゴヌクレオチドプールのコピー数の偏差と比較して、低いレベルの偏差が示されることを確認した（図７）。プラスミドライブラリおよび細胞ライブラリを形成するプロセス中に、大部分のコピー数において追加的に発生する偏差はそれぞれ、オリゴヌクレオチドおよびプラスミドライブラリのペアコピー数の偏差の範囲内にあることが示された（図８および図９）。オリゴヌクレオチドプール、プラスミドライブラリ、および、細胞ライブラリにおける各ペアのコピー数は、非常に高い相関を示した（図１０から図１２）。まとめると、これらの偏差は、細胞ライブラリを調製するプロセス（すなわち、ギブソンアセンブリ（登録商標）、形質転換、レンチウイルスベクターの調製、形質導入など）の進行と共に増加し、細胞ライブラリにおける各ペアのコピー数の偏差は、オリゴヌクレオチドのコピー数の偏差によって主に引き起こされる。一方、細胞ライブラリにおけるＭＯＩは、約７．０であることが示された。
【０２２５】
以下の表４Ａおよび表４Ｂは、解析の目的のためのオリゴヌクレオチドの設計およびフィルタリングの条件の要約を提供する。
【０２２６】
［表４］
【表７】
2019514379.tif 000009
【表８】
2019514379.tif 000010
【０２２７】
以下の表５は、オリゴヌクレオチドプールおよび細胞ライブラリにおけるペアの数がまとめられた表を示す。
【０２２８】
［表５］
【表９】
2019514379.tif 000011
【０２２９】
［実験例１‐２：内在性標的位置および導入位置におけるインデル頻度の比較］
【０２３０】
本発明者は、内在性ゲノム部位、および、対応するレンチウイルスによる導入合成部位に位置する特定の標的配列でのインデル頻度には、強い相関があることを確認した（図４０）。そのような高い相関は、ペアを形成しないライブラリが使用されたときと比較して、高いレベルを示した。
【０２３１】
Ｃａｓ９媒介インデル形成の効率に影響するクロマチンアクセシビリティは、内在性領域に応じて変動するが、レンチウイルスは、活性転写領域において、より多く組み込まれ、従って、クロマチンアクセシビリティは、導入領域においてより高くなることが予想される。内在性領域におけるクロマチンアクセシビリティの偏差に起因するインデル頻度の変化を低減するべく、本発明者は、内在性領域のサブセットと、同様のクロマチンアクセシビリティを有する導入領域との間で、インデル頻度の相関を比較した。
【０２３２】
この目的のために、ＤＮＡエレメントの百科事典（ＥＮＣＯＤＥ）から取得されたＤＮａｓｅ‐ｓｅｑ値から取得されたＤＮａｓｅ  Ｉ感受性データを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のクロマチンアクセシビリティを計算した。
【０２３３】
その結果、同様のクロマチンアクセシビリティスコアを有する標的領域サブセットにおいて、相関がより高いこと、特に、高いクロマチンアクセシビリティを有するサブセットにおいて、更に高いことが確認された（図４１および図４２）。大部分の標的配列において、導入配列におけるインデル頻度は、内在性標的領域より高く、特に、低いクロマチンアクセシビリティを有する領域において高かった。
【０２３４】
加えて、各構成要素のコピー数に関して、細胞ライブラリは、過去の研究において使用されたライブラリと同様のボラティリティを示した（図６から図１１）。
【０２３５】
一方、細胞ライブラリの平均ＭＯＩは、約７．０であり、２つの生物学的反復の間には強い相関があった。２つの異なる細胞ライブラリに関するＣｐｆ１の送達は、同様のインデル頻度を生じさせた（図４３）。
【０２３６】
加えて、本発明者は、Ｃｐｆ１が２つの異なる方法（すなわち、Ｃｐｆ１コードプラスミドの一過性トランスフェクション、および、Ｃｐｆ１をコードするレンチウイルスベクターの形質導入）によって送達されるとき、インデル頻度に明確な相関があることを確認した（図４４）。
【０２３７】
解析された標的配列の大部分において、Ｃｐｆ１をコードするレンチウイルスベクターの形質導入後に、インデル頻度がより高くなることが確認された（図４４）。
【０２３８】
従って、本発明者は、レンチウイルスベクターを介するＣｐｆ１形質導入を用いて実験を実行した。ただし、ＬｂＣｐｆ１  ＰＡＭを判定する実験は、一過性プラスミドトランスフェクションによって実行された。
【０２３９】
［実験例１‐３：哺乳類細胞におけるＰＡＭ配列の確認］
【０２４０】
本発明者は、本発明のインビボシステムによって、アシダミノコッカス（Ａｓ）、または、ラクノスピラ（Ｌｂ）由来のＣｐｆ１によって利用されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を確認することを試みた。今日まで、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼによって使用されるＰＡＭ配列は、インビトロ条件、または、哺乳類細胞ではない細菌システムのみにおいて確認されてきた。インビトロ条件においてＡｓおよびＬｂに由来するＣｐｆ１を解析したとき、ＴＴＴＮは、最も頻繁に使用されるＰＡＭ配列であるという点、および、ＡｓＣｐｆ１の構造は、あり得るＰＡＭ配列としてＴＴＴＮをサポートするという点を考慮して、１８（Ａｓ）または１６（Ｌｂ）ガイド配列に関して、７０（すなわち、４３（ＡＮＮＮＡとして示される）＋３（ＡＴＴＴＢとして示される）＋３（ＢＴＴＴＡ）として示される）の相互に異なるＰＡＭ配列を調製した（ＡｓＣｐｆ１の場合は合計１，２６０（７０×１８）の標的配列、ＬｂＣｐｆ１の場合は合計１，１２０（７０×１６）の標的配列、図１３）。その結果、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＴＴＴＴを除けば、ＴＴＴＡ、ＴＴＴＣまたはＴＴＴＧがＰＡＭ配列として使用されたとき、ＡｓＣｐｆ１（図１４および図１５）およびＬｂＣｐｆ１（図１６および図１７）の両方において、最高のインデル頻度が示された。これらの結果は、ＴＴＴＮではなく、ＴＴＴＶが、哺乳類細胞において上述の２つの酵素によって最も頻繁に使用されるＰＡＭ配列であることを示唆している。加えて、ＴＴＴＶを除けば、ＣＴＴＡが、ＡｓおよびＬｂに由来するＣｐｆ１について最高のインデル頻度を示したことから、二次的なＰＡＭ配列であると考えることができる。インビトロ条件および哺乳類細胞条件において使用されるＰＡＭ配列の偏差（図１８）は、２つのシステム間のゲノム編集効率の偏差と符合し、哺乳類ゲノムを編集するための効率的方法を確立するには、インビトロではなく、哺乳類細胞におけるＰＡＭ配列を検証することが非常に重要であることが示唆される。
【０２４１】
ＡｓＣｐｆ１、ｃｒＲＮＡおよび標的ＤＮＡの共結晶構造は、ＰＡＭ配列の第４のヌクレオチドを含まない、最初の３つのヌクレオチド（５'‐ＴＴＴ‐３'）が、Ｃｐｆ１タンパク質と相互作用することを表し、ＰＡＭ配列として「５'‐ＴＴＴＮ‐３'」をサポートする。本発明者のインビボの検証研究は、哺乳類細胞において、ＴＴＴＮからＴＴＴＶまで、ＰＡＭの選好度を理解する上で役立つ。
【０２４２】
加えて、ＡｓＣｐｆ１のインデル頻度（ＬｂＣｐｆ１のインデル頻度ではない）に関して、ＴＴＴＡがＰＡＭ配列として使用されるとき、低いレベルで有意に高いことが確認された。このことは、他のあり得るＰＡＭ配列と比べて、ＡｓＣｐｆ１のＰＡＭ配列として、ＴＴＴＡがわずかに高い選好度を有することを示唆している。
【０２４３】
次に、本発明者は、ＴＴＴＡ  ＰＡＭの５'末端に近いヌクレオチドの修飾がゲノム編集の効率に影響し得るかどうかを評価した。その結果、ａＴＴＴＡ、ｔＴＴＴＡ、ｃＴＴＴＡ、ｇＴＴＴＡの間では、インデル頻度の変化が無いこと（図１９および図３９のａ）、一方で、ＬｂＣｐｆ１のインデル頻度は、ｃＴＴＴＡがＰＡＭ配列として使用されたとき、ａＴＴＴＡまたはｔＴＴＴＡと比較して、低いレベルで有意に高いことを示す（図３９のｂ）ことが確認された。
【０２４４】
［実験例１‐４：オンターゲット活性の高スループットプロファイリング］
【０２４５】
次に、本発明者は、ガイドＲＮＡの効率に関して、標的配列の特性を確認することを試みた。複数のガイドＲＮＡのスクリーニングは、ゲノム編集における必須の初期段階であることを考慮すると、標的配列の特性の検証により、ゲノム編集技術の発展を促進させることができるであろう。
【０２４６】
最初に、本発明者は、ＡｓＣｐｆ１および化膿レンサ球菌由来Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）が同一の標的配列と同様の活性を有するかどうかを評価した。本発明者は、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１のＰＡＭ配列の位置の間の差異を考慮して、元の標的配列および逆標的配列の両方を標的とするＣａｓ９およびＣｐｆ１の活性順位を比較した（図２０）。その結果、すべての場合において、Ｃａｓ９とＣｐｆ１との間には相関が無いことが確認された。
【０２４７】
次に、活性が最も高い２０％のガイドＲＮＡについて、各位置における、ＡｓＣｐｆ１標的配列のヌクレオチドの選好度を調査した。最も目立つ差異は、位置１において観察された。これは、ＰＡＭ配列のすぐ隣にあるヌクレオチドである。高い活性を有するガイドＲＮＡにおいて、チミンが位置１で著しく減少した（図２１）。配列特異的な特性の偏差があるが、ＰＡＭのすぐ隣の位置は、ＳｐＣａｓ９においても非常に重要である。
【０２４８】
本発明者は、位置１におけるチミンの選好度の欠如が、Ｃｐｆ１タンパク質と、標的ヌクレオチドの位置１に結合するｃｒＲＮＡリボヌクレオチドとの間の相互作用の不安定性に起因すると判断した。ＤＮＡに結合するＡｓＣｐｆ１（ＰＤＢ  ５Ｂ４３）の構造に基づくと、ＷＥＤドメイン内におけるＴｈｒ１６のヒドロキシ側鎖は、グアニン塩基のＮ２と安定した極性相互作用を形成し、また、ウラシルおよびチミンのＯ２との間にも、安定した極性相互作用を形成する（図３９）。
【０２４９】
しかしながら、アデニンには、Ｔｈｒ１６のヒドロキシ側鎖と相互作用できる、対応する部分が無いので、ｃｒＲＮＡアデニンリボヌクレオチドの位置が不安定である。従って、標的ＤＮＡ鎖の位置１におけるチミンは、好ましくない。
【０２５０】
最終的に本発明者は、ＡｓＣｐｆ１が、４０％から６０％のＧＣ含有量を有する標的配列に関して、最高の活性を示すことを確認した（図２２）。この結果は、ＳｐＣａｓ９に関する過去の結果と同様である。
【０２５１】
インデル頻度はまた、細胞におけるＣａｓ９およびガイドＲＮＡの発現の時間の長さに影響される。過去の研究の報告によると、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの形質導入後、細胞を長期間培養（例えば、６〜１１日）にかける場合、インデル頻度およびノックアウト効率が時間依存的な方式で増加する。しかしながら、これらの過去の研究は、ごく少ない数（１、５または６）のガイドＲＮＡに関して、比較的短い期間（１４日間まで）にわたって試験されたものであるので、長期間の培養が、ガイドＲＮＡの効率に関して、順位による限界を克服するのに十分なインデル頻度を引き起こし得るかどうかは明示的に確認されなかった。インデル頻度がスクリーニング効率に著しく影響する、ゲノムレベルのスクリーニング研究において、主なヌクレアーゼ（すなわち、Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡはレンチウイルスベクターに送達されるので、これは非常に重要な問題である。従って、本発明者は、１か月間（３１日間）までに発現された２２０のガイドＲＮＡについて、インデル頻度を解析することによって、上記の問題を説明することを試みた。ＡｓＣｐｆ１がレンチウイルスベクターに送達されたとき、培養期間を５日間に増やすことによって、平均および各インデル頻度は両方とも著しく増加した（図２３および図２４）。この結果は、ＳｐＣａｓ９に関する過去の結果と同様である。しかしながら、形質導入後の５日目、１０日目、３１日目では、インデル頻度に差異は無かった。これらの結果は、５日間以上にわたって培養しても、主に標的配列およびガイドＲＮＡ配列によって決定される特定のレベルを超えてインデル頻度を増加させることができないことを示唆する。
【０２５２】
［実験例１‐４：オフターゲット活性の高スループットプロファイリング］
【０２５３】
次に、本発明者は、Ｃｐｆ１のオフターゲット活性プロファイルを評価することを試み、第１ステップとして、高い標的切断効率を有するガイドＲＮＡ配列のミスマッチ効果を確認することを試みた。これに関して、ＡｓＣｐｆ１のための４つのガイドＲＮＡ、および、これに対応する４つの標的配列を設計し、これらの標的インデル頻度は、形質導入後の５日目にそれぞれ、５３％、３４％、３２％、１５％であることが示された。これらの中で、標的切断効率が最も高い３つのガイドＲＮＡをオフターゲット効果プロファイリングのために選択し、ガイドＲＮＡの各位置で、標的配列とのそれらのミスマッチ効果を解析した（図２５）。その結果、１から６の位置において、１ｂｐのミスマッチがインデル頻度を著しく減少させることを確認した（図２６）。これらの結果は、上の位置がシード領域であることを示唆する。上述のように、本発明のインビボ条件において検証された、ＡｓＣｐｆ１のガイドＲＮＡのシード領域は、フランシセラノビサイダ由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）に関するガイドＲＮＡのシード領域が最初の５つの位置の中に存在することが予想された従来のインビトロ実験の結果と同様である。一方、位置１９から２３に１つのヌクレオチド配列のミスマッチがある場合において、インデル頻度はわずかに減少することが示された（図２６）。従って、本発明者は、この領域をプロミスキャス領域と命名した。
【０２５４】
更に、位置７から１８において、１つのヌクレオチド配列のミスマッチがある場合、インデル頻度がわずかに減少することが示された（図２６）。従って、本発明者は、この領域をトランク領域と命名した。
【０２５５】
上の結果から、本発明者は、ＡｓＣｐｆ１において、ガイドＲＮＡのシード領域における、および、トランク領域の１８ヌクレオチド（ｎｔ）内のヌクレオチド配列のミスマッチは許容されず、一方、プロミスキャス領域におけるヌクレオチド配列のミスマッチは許容されると判断した。これらの結果は、ＦｎＣｐｆ１のインビトロＤＮＡ切断において、ガイドＲＮＡの３'末端における６ｎｔを切断したり、または、ガイド配列の１８ｎｔを保存したりしても、十分に効率的であるという過去の研究の結果と一致する。加えて、Ｃａｓ９に関しても、ＰＡＭ配列から遠くに位置するガイドＲＮＡ領域は重要でないことが過去に報告されている。
【０２５６】
従って、本発明者は次に、切断されたガイドＲＮＡを使用して、オンターゲットおよびオフターゲット効果を解析した。その結果、ガイドＲＮＡの３'末端が４ｎｔのサイズにまで切断されたとき、または、ガイドＲＮＡの長さが最小１９ｎｔまで短縮されたとき、オンターゲットのインデル頻度が維持され、オフターゲットインデル頻度がゆっくり減少することが確認された（図２７）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９において観察された効果と同様に、切断されたガイドＲＮＡを使用して、オンターゲット効果を減少させることなくオフターゲット効果を減少させることができることを示す。
【０２５７】
［実験例１‐５：内在性標的位置のインデル頻度と高い相関を有するＣｐｆ１活性のライブラリベースの評価］ 
【０２５８】
本発明者は、ヌクレオチドミスマッチの数とオフターゲット効果との間の相関を解析した。その結果、潜在的なオフターゲット位置におけるヌクレオチドミスマッチの数が増加するにつれて、オフターゲット効果が減少することが確認された（図２８）。
【０２５９】
更に、本発明者は、シード領域と、シードがトランクに接続される領域と、トランク領域と、トランクがプロミスキャス領域に接続される領域と、プロミスキャス領域とから成る５つの領域におけるヌクレオチドミスマッチの数の効果を評価した。その結果、ヌクレオチドミスマッチの数が増加するにつれて、領域のすべてにおいて、インデル頻度が低くなったことが確認された。しかしながら、４〜５個のミスマッチがあるときでも著しいインデル頻度が示されたプロミスキャス領域において、この傾向は明示的に示されなかった（図２９および図３０）。加えて、シード領域、または、シードがトランクに接続される領域において、３またはより多くのヌクレオチドのミスマッチがインデル形成を完全に阻害した。
【０２６０】
次に、本発明者は、ミスマッチの形成がオフターゲット効果に影響し得るかどうかを調査した。シード領域およびトランク領域において、非ゆらぎトランジション（ｎｏｎ‐ｗｏｂｂｌｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）またはトランスバージョンミスマッチ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）と比較して、ゆらぎトランジション（ｗｏｂｂｌｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）ミスマッチが高いインデル頻度と相関することが確認された（図３１から図３３）。これらの結果は、ＳｐＣａｓ９のオフターゲット効果に関して非偏向（ｕｎｂｉａｓｅｄ）の解析結果と一致する。しかしながら、そのような現象は、すべての種類のミスマッチがインデル頻度をごくわずかに減少させるプロミスキャス領域においては観察されなかった。
【０２６１】
［実験例２：ペアライブラリを使用したＣａｓ９活性の評価］
【０２６２】
［実験例２‐１：Ｃａｓ９活性を評価するためのペアライブラリの調製］
【０２６３】
高スループット方式で、様々なガイドＲＮＡと共にＣａｓ９の活性を評価するために、本発明者は、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを調製した。本発明者は、標的配列と、それに対応するガイドＲＮＡ配列とを含む、８９，５９２アレイ‐合成オリゴヌクレオチドのプールをＰＣＲによって増幅させ（図３５）、ギブソンアセンブリ（登録商標）を使用して、レンチウイルスプラスミドでクローニングした（図３６）。
【０２６４】
ガイドＲＮＡを発現し、ゲノムにおける対応する配列を含む細胞ライブラリを調製するべく、プラスミドライブラリから調製されたレンチウイルスライブラリをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に処理した（図５）。
【０２６５】
次に、ゲノムに挿入された標的配列に対するガイドＲＮＡによる切断、および、インデル形成を誘導するべく、Ｃａｓ９を発現するレンチウイルスベクターを細胞に形質導入し、それにより、Ｃａｓ９を細胞ライブラリに送達した。次に、ＰＣＲによって標的配列を増幅し、インデル頻度を評価するために、ディープシーケンシングを利用した解析を実行した。
【０２６６】
［実験例２‐２：ヒトＣＤ１５遺伝子およびヒトＭＥＤ１遺伝子のガイドＲＮＡに関するＣａｓ９活性の評価］
【０２６７】
上の例において調製されたペアライブラリを使用して、ヒトＣＤ１５遺伝子およびヒトＭＥＤ１遺伝子のガイドＲＮＡに関してＣａｓ９活性を評価した。
【０２６８】
具体的には、ペアライブラリを使用したガイドＲＮＡの活性順位と、文献（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，３２：１２６２‐１２６７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，３４：１８４‐１９１）に開示されたガイドＲＮＡの活性順位とを比較することによって、ペアライブラリの精度を評価した。
【０２６９】
結果として、ヒトＣＤ１５遺伝子に関するガイドＲＮＡは、Ｒ＝０．６３４のスピアマン相関係数を示し、一方、ヒトＭＥＤ１遺伝子（エクソン全体の長さの上位８０％内で設計された）に関するガイドＲＮＡは、Ｒ＝０．５８２のスピアマン相関係数を示し、従って、２つのペアライブラリは、知られているガイドＲＮＡの活性順位と高い相関を有することが確認された（図３７）。
【０２７０】
［実験例２‐３：細胞内標的配列についてのガイドＲＮＡ活性と、ペアライブラリのガイドＲＮＡ活性との比較］
【０２７１】
本発明者は、ペアライブラリ方法を使用して取得されたガイドＲＮＡの活性の程度と、細胞に存在する標的配列の直接解析によって取得されたガイドＲＮＡの活性の程度との間の相関を比較することを試みた。
【０２７２】
具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４８ウェルディッシュに植え付け、ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアを含むレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入の３日後、細胞をピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）で処理し、形質導入細胞のみを選択した。
【０２７３】
次に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を含むＤＭＥＭにおける細胞にＳｐＣａｓ９発現ウイルスベクターを形質導入し、１０％ＦＢＳおよびブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍＬ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（登録商標））を含むＤＭＥＭにおいて維持した。ＳｐＣａｓ９発現ウイルスの形質導入の６日後、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））を使用して、細胞ライブラリからゲノムＤＮＡを単離した。次に、インデル頻度の解析のために、まず、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、レンチウイルスに挿入された標的配列、および、細胞に存在する標的配列をＰＣＲによって増幅した。各試料について、反応あたり１００ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、反応（２０μＬ）を実行した。次に、ＭＥＧＡｑｕｉｃｋ‐ｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。
【０２７４】
二次ＰＣＲにおいて、一次ＰＣＲの精製物（２０ｎｇ）をイルミナ（登録商標）アダプタおよびバーコード配列と共に取り付けた。ＰＣＲ反応において使用されるプライマーを以下の表３に示す。最終産物を分離および精製し、混合し、ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ（イルミナ（登録商標））を使用して解析にかけた。
【０２７５】
その結果、細胞内標的配列についてのガイドＲＮＡ活性、および、ペアライブラリのガイドＲＮＡ活性が高い相関（Ｒ＝０．５４６）を示すことが確認された。
【０２７６】
上の結果から、本発明のＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアライブラリを使用して、高スループット方式で実行される評価は高精度を有することが確認された（図３８）。
【０２７７】
［実験例３：標的配列におけるＣｐｆ１活性を評価する従来の方法との比較］
【０２７８】
活性を評価するための、本発明の高スループット方法を既存の個々の評価方法と比較した。
【０２７９】
具体的には、費用の単位はＵＳＤであり、労力の単位は、１時間に当業者が達成することができる作業の最大量を表す。 インキュベーション時間など、１時間より長い中断がある場合、労力としてカウントされない。
【０２８０】
結果を以下の表６で示す。
【０２８１】
［表６］
【表１０】
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【０２８２】
上の結果をまとめると、本発明は、哺乳類細胞における特定の標的配列に関する、ガイドＲＮＡの活性の高スループット評価のための方法を提供する。ゲノムの特定領域に対するゲノム編集、または、特定遺伝子のノックアウトのために、ガイドＲＮＡを設計でき、インデル頻度は、特に一過性トランスフェクションなどの単純な送達手段によって確認できることが確認された。しかしながら、インデル頻度は、ガイドＲＮＡ自体の効率だけでなく、トランスフェクション効率の影響も受ける。従って、インデル頻度を識別するためのそのような方法は、トランスフェクションまたは送達効率の偏差に起因して、最適なガイドＲＮＡ配列を安定的に確認することができないことがあり得る。本発明において、細胞集団に関する単一のバッチの形質導入および／またはトランスフェクションに起因して、１０，０００またはより多くのガイドＲＮＡの効率を１回の試行で確認し、異なるバッチ間の送達の偏差によって、引き起こされ得る誤差を最小限に抑えた。形質導入またはトランスフェクションのわずかに低い効率は、試験されるガイドＲＮＡの全部の効率を低減することが可能であり得るが、しかしながら、ガイドＲＮＡの活性順位および「相対的な」活性は維持され、従って、試験されたものの中で、最高の活性を有するガイドＲＮＡを選択することが可能である。異なる送達効率に起因して生じ得る誤差を最小限に抑えるための方法の１つは、繰り返し実験を実行することであるが、これには、労力および費用が必要である。更に、本発明のペアライブラリを使用する方法は、細胞の状態および種類に従って様々に現れるエピジェネティック因子によってほとんど影響されない。レンチウイルスベクターは、主に転写活性領域に挿入されるので、レンチウイルスベクターを使用してペアライブラリを細胞集団に送達すとき、エピジェネティク状態によって引き起こされ得る、インデル頻度の偏差を最小限に抑えることができる。送達効率、細胞状態、および、細胞種類の偏差は、ガイドＲＮＡの効率の比較における最も深刻な問題の１つとして挙げられてきた。しかしながら、本発明のペアライブラリは、配列に基づいて、ガイドＲＮＡ効率の安定的な評価を可能にし、送達またはエピジェネティク状態の偏差が効率に影響し得る可能性を低減する。
【０２８３】
約１，４００のガイドＲＮＡコードプラスミドの細胞へのコトランスフェクションによって、ガイドＲＮＡの活性に影響し得る、ヌクレオチド配列およびエピジェネティク状態などのパラメーターを確認できる、中サイズの非ペアダブルライブラリのアプローチ方法の場合、各細胞において、複数のガイドＲＮＡライブラリがコトランスフェクトされるので、オフターゲット効果を解析することは困難であり、従って、確認されたインデルがどのガイドＲＮＡによって形成されたかを判断することが困難であるという短所がある。更に、ガイドＲＮＡのコピー数は、切断効率に著しく影響し、この場合、ライブラリ内のコピー数に著しい偏差があり、従って、各ガイドＲＮＡの活性を予測することが困難になる。本発明のライブラリはまた、既存のライブラリと同様に、コピー数に偏差がある。しかしながら、本発明において、ガイドＲＮＡおよび標的配列は、ペアの形式で使用され、いくつかのペアが細胞に送達されるとき、合成標的配列と、配列に反応しないガイドＲＮＡとの間の反応は無視することができる。更に、特定のガイドＲＮＡ、および、これに対応する合成標的配列をコードするＤＮＡは、単一のコピーとして、ほとんどすべての細胞に存在するので、コピー数に関連する偏差を防止できる。オフターゲットの評価のために同様のオンターゲット配列が使用されるときでも、ガイドＲＮＡ配列の多様性より多くのコピー数が導入されるので、異なるペアのガイドＲＮＡおよび標的配列の間の反応は、著しいレベルで見られないことがあり得ので、オフターゲット効果を評価できる。更に、導入されるコピー数は、レンチウイルスベクターを希釈することによって調節できる。
【０２８４】
本発明は、ＲＮＡにガイドされるゲノムの操作に影響し得るパラメーターの決定を可能にする。すなわち、標的配列、エフェクターヌクレアーゼオーソログの種類、ガイドＲＮＡの構造領域、標的ＤＮＡのエピジェネティク状態、ガイドＲＮＡおよびエフェクターヌクレアーゼにさらされる濃度および期間、ガイドＲＮＡおよびエフェクターヌクレアーゼの送達効率など、様々な要素によって、オンターゲットおよびオフターゲット位置においてインデル頻度を確認できる。本発明のペアライブラリを介して、様々な標的配列における各パラメーターの効果を高スループット方式で試験できることが予想される。
【０２８５】
上の結果をまとめると、本発明は、オフターゲット効果を検出するための新しい方法を提供する。オフターゲット効果は、同様にガイド配列の類似性に基づくインシリコのアプローチを通して予想でき、実験的に測定できる。ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ，Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ、ＢＬＥＳＳ、ＩＤＬＶキャプチャ、ＨＴＧＴＳなどの非偏向実験方法が導入されてきたが、これらは、完全には敏感または精巧でない。
【０２８６】
本研究は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ分野における「産業革命」と見なされ得る。今後、本発明に起因して、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を、従来の困難な個々の測定システム（コテージシステム）に依存する代わりに、ライブラリに基づいて高スループット方式（工場のシステム）でインビボで測定できる（図３４）。
【０２８７】
上述より、本発明に関連する当技術分野における当業者であれば、本発明の技術的概念または必須の特性を変更することなく、本発明が他の特定の形式で具現化され得ることを理解することができるであろう。これに関して、本明細書において開示された例示的な実施形態は、説明のみを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、例示的な実施形態だけでなく、様々な代替形態、修正形態、均等物、および、添付の請求項によって定義される本発明の思想および範囲内に含まれ得る他の実施形態も包含することが意図されている。
【０２８８】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月7日(2019.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性を評価するための方法であって、
（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入された、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリから取得されたＤＮＡを使用して配列解析を実行する段階と、
（ｂ）前記配列解析から取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を検出する段階と
を備える方法。
【請求項２】
前記ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドは、５'末端‐３'末端方向に、または、逆方向に、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、および、標的ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、５'末端‐３'末端方向に、または、逆方向に、ガイドＲＮＡコード配列、バーコード配列、ＰＡＭ配列、および、標的ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは更に、ダイレクトリピート配列、ポリＴ配列、バーコード配列、一定配列、プロモーター配列およびスカフォールド配列から成る群から選択されるものを少なくとも１つ含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは、１００から２００のヌクレオチドの配列から成る、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つのオリゴヌクレオチドに存在する前記ガイドＲＮＡは、同一の前記オリゴヌクレオチドに存在する標的ヌクレオチド配列に対してシスに作用する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含む細胞ライブラリにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを導入する段階と、
（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが導入された前記細胞ライブラリから取得された前記ＤＮＡを使用してディープシーケンシングを実行する段階と、
（ｃ）前記ディープシーケンシングから取得されたデータから、各ガイドＲＮＡ‐標的配列ペアのインデル頻度を検出する段階と
を備える、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９タンパク質は、レンサ球菌属、ナイセリア属、パスツレラ属、フランシセラ属、および、カンピロバクター属から成る群から選択される少なくとも１つの微生物に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃｐｆ１タンパク質は、カンジダタスパセイバクター属、ラクノスピラ属、ブチリビブリオ属、ペレグリニバクテリア属、アシダミノコッカス属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フランシセラ属、カンジダタスメタノプラズマ属、および、ユーバクテリウム属から成る群から選択される少なくとも１つの微生物に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特性は、
１）前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのＰＡＭ配列、
２）前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオンターゲット活性、
３）前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのオフターゲット活性、または、
から成る群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列解析は、ディープシーケンシングによって実行される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２種類の細胞を含む細胞ライブラリであって、各細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む、細胞ライブラリ。
【請求項１６】
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含む単離オリゴヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１７】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミドベクターから成る群から選択されるいずれか１つである、請求項１６または１７に記載のベクター。
【請求項１９】
少なくとも２種類のベクターを含むベクターライブラリであって、各ベクターは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、前記ガイドＲＮＡが標的とする標的ヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む、ベクターライブラリ。
【請求項２０】
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列および標的ヌクレオチド配列を含む単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも２種類含むオリゴヌクレオチドライブラリ。
【請求項２２】
（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが標的とする標的ヌクレオチド配列を設定する段階と、
（ｂ）設定された前記標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成する、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を設計する段階と、
（ｃ）前記標的ヌクレオチド配列と、前記標的ヌクレオチド配列を標的とするガイドＲＮＡとを含むオリゴヌクレオチドを設計する段階と、
（ｄ）ステップ（ａ）から（ｃ）を少なくとも１回繰り返す段階と
を備える、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチドライブラリを構築するための方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）は、設計されたオリゴヌクレオチドを合成する段階を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、すなわち、ＴＴＴＶまたはＣＴＴＡに隣接する標的ヌクレオチド配列の相補鎖と塩基対を形成できる配列を含む単離ガイドＲＮＡ。
【請求項２５】
前記単離ガイドＲＮＡと共に使用されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはＣｐｆ１タンパク質である、請求項２４に記載の単離ガイドＲＮＡ。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載の単離ガイドＲＮＡ、または、前記単離ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む、ゲノム編集のための組成物。
【請求項２７】
請求項２４または請求項２５に記載の単離ガイドＲＮＡ、または、前記単離ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質または前記Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸とを含む、哺乳類細胞におけるゲノム編集のためのシステム。
【請求項２８】
請求項２４に記載の単離ガイドＲＮＡ、または、前記単離ガイドＲＮＡをコードする核酸と、Ｃｐｆ１タンパク質、または、前記Ｃｐｆ１タンパク質をコードする核酸を順番または同時に単離哺乳類細胞に導入する段階を備える、哺乳類細胞においてＣｐｆ１でゲノム編集するための方法。
【国際調査報告】
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