(57)【要約】本発明の一態様は、ジカウイルスに対する哺乳動物における免疫応答を引き起こすジカ抗原を発現させることが可能な核酸構築物、及びその使用方法に関する。加えて、ＤＮＡプラスミド及び薬学的に許容される賦形剤を含む、ジカウイルスに対する免疫応答を哺乳動物において生じさせることが可能なＤＮＡプラスミドワクチン、ならびにその使用方法がある。ＤＮＡプラスミドは、哺乳動物における免疫応答を引き起こすのに有効な量で、ジカ株に対して交差反応性であるジカ抗原を哺乳動物の細胞内で発現させることが可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、コンセンサスジカ抗原をコードする、前記単離された核酸分子。
【請求項２】
前記コンセンサスジカ抗原のアミノ酸が、配列番号１、配列番号１のフラグメント、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号１、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号１のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記コンセンサスジカ抗原の前記アミノ酸は、配列番号３、配列番号３のフラグメント、配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号３、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号３のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記コンセンサスジカ抗原の前記アミノ酸は、配列番号５、配列番号５のフラグメント、配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号５、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号５のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記コンセンサスジカ抗原の前記アミノ酸は、配列番号７、配列番号７のフラグメント、配列番号７と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号７、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号７のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号７と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記単離された核酸は、配列番号２、配列番号２のフラグメント、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号２、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号２のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記単離された核酸は、配列番号２、配列番号２のフラグメント、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号２、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号２のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記単離された核酸は、配列番号４、配列番号４のフラグメント、配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有する配列、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号４、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号４のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号４と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記単離された核酸は、配列番号６、配列番号６のフラグメント、配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有する配列、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号６、ＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号６のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドをコードする核酸に結合した配列番号６と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される配列を含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記単離された核酸分子は、プラスミドである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
核酸分子を含む組成物であって、前記核酸分子が、コンセンサスジカ抗原をコードする、前記組成物。
【請求項１２】
前記コンセンサスジカ抗原のアミノ酸が、配列番号１、配列番号１のフラグメント、配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号１、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号１のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記コンセンサスジカ抗原の前記アミノ酸は、配列番号３、配列番号３のフラグメント、配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号３、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号３のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号３と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記コンセンサスジカ抗原の前記アミノ酸は、配列番号５、配列番号５のフラグメント、配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号５、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号５のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号５と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記コンセンサスジカ抗原の前記アミノ酸は、配列番号７、配列番号７のフラグメント、配列番号７と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号７、ＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号７のフラグメント、及びＩｇＥシグナルペプチドに結合した配列番号７と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
電気泳動の使用による個体への送達のために製剤化される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２８からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
ジカウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物を個体に、前記個体における免疫応答を誘導するのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
ジカウイルスが診断された個体を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
個体におけるジカウイルス感染を予防する方法であって、予防有効量の請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物を個体に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年２月２５日出願の米国仮出願第６２／３００，０３０号、２０１６年３月８日出願の米国仮出願第６２／３０５，１８３号、２０１６年９月１９日出願の米国仮出願第６２／３９６，７４２号、２０１６年１１月３日出願の米国仮出願第６２／４１７，１００号、及び２０１７年２月２２日出願の米国仮出願第６２／４６２，２４９号に対する優先権が与えられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ジカワクチン、免疫応答を誘導するための、かつジカウイルスに対して個体を予防的及び／または治療的に免疫化する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーのフラビウイルス属に属する小型のエンベロープを持ったプラス鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、Ａ．ａｅｇｙｐｔｉ及びＡ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓなどの日中に活動するＡｅｄｅｓ蚊によって伝染することが既知である。その名は、ウイルスが１９４７年に最初に分離されたウガンダのジカ森林に由来する。
【０００４】
ジカ熱として既知の感染症は、多くの場合、症状を引き起こさないか、または軽症型のデング熱と同様の軽度の症状のみを引き起こす。１９５０年代から、アフリカからアジアの狭い赤道地帯内で生じることが知られている。このウイルスは、２０１３年〜２０１４年にフランス領ポリネシア、ニューカレドニア、クック諸島、及びイースター島、かつ２０１５年にメキシコ、中央アメリカ、カリビアン、及び南アメリカと、太平洋をわたって東に広がり、ジカの発生は、世界的流行のレベルに到達した。２０１６年現在、この病気は、薬物またはワクチンによって防止することができない。２０１６年２月現在、妊婦におけるジカ熱が母子感染によって胎児における脳発達の異常を引き起こす可能性があり、それが流産または小頭症を引き起こす可能性があるということが証明されている。
【０００５】
世界的にますますウイルスが広がること、及びウイルスに対するいかなる治療またはワクチンもないことの組み合わせが、ジカウイルスを世界的な健康問題にしている。
【０００６】
したがって、ジカウイルスに対する幅広い免疫を提供するワクチン、及び好ましくは、経済的かつ全ての血清型に有効であるワクチンを開発する必要性が依然としてある。さらに、予防的または治療的のいずれかで、ＤＮＡワクチンまたはＤＮＡプラスミドワクチンなどのワクチンを哺乳動物に投与して、ジカウイルスに対する免疫化を提供する有効な方法の必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、ジカウイルスに対する哺乳動物における免疫応答を引き起こすポリペプチドを発現させることが可能な核酸構築物を提供する。核酸構築物は、コードヌクレオチド配列及びコードヌクレオチド配列に作動可能に結合されたプロモーターからなる。コードヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現させ、ポリペプチドは、プレ膜エンベロープ（ｐｒＭ＋ＥｎｖまたはｐｒＭＥ）を含むコンセンサスジカ抗原を含む。プロモーターは、哺乳動物におけるポリペプチドの発現を調整する。
【０００８】
本発明の別の態様は、ジカウイルスに対する免疫応答を哺乳動物において生じさせることが可能である、ＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物においてコンセンサスジカ抗原を発現させることが可能なＤＮＡプラスミド及び薬学的に許容される賦形剤からなる。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスジカ抗原をコードするコード配列に作動可能に結合されたプロモーターからなる。コンセンサスジカ抗原は、コンセンサスｐｒＭＥからなる。
【０００９】
本発明の別の態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳動物の組織に送達することであって、ＤＮＡプラスミドを含むＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物の細胞内でジカウイルスのコンセンサス抗原を発現させて、哺乳動物において免疫応答を誘発することが可能である、送達することと、組織の細胞を電気穿孔して、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にすることとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ジカウイルス粒子、ジカＲＮＡゲノム、及びその翻訳された遺伝子の図を表示する。
【図２】ジカ抗原をコードするインサート（発現カセット）のための位置の部位を示す、ジカワクチンのためのプラスミドマップを表示する。
【図３】様々なジカ抗原設計の線形構造を示す図面を表示する。
【図４】ジカ抗原−リーダー配列＋ｐｒＭＥに対する注釈付きアミノ酸配列を表示する。
【図５】様々なジカウイルス株間の遺伝的関係を表示する。図５は、分離株間の遺伝距離を示し、図６は、遺伝学的系統樹を表示する。
【図６】様々なジカウイルス株間の遺伝的関係を表示する。図５は、分離株間の遺伝距離を示し、図６は、遺伝学的系統樹を表示する。
【図７】ジカ−ｐｒＭ＋Ｅｎｖをコードするインサート（発現カセット）のための位置の部位を示す、ジカワクチンのためのプラスミドマップを表示する。
【図８】発現カセットの存在を示すゲル電気泳動画像を表示する。
【図９】ジカ−エンベロープタンパク質を示すウエスタンブロットゲルを表示する。図９Ａは、細胞溶解物中の抗血清への非特異的結合を示し、図９Ｂは、細胞溶解物中の抗ｐａｎ−ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓへの特異的結合を示す。
【図１０】図１０Ａは、ジカ−エンベロープタンパク質の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する。図１０Ｂは、ジカ−エンベロープタンパク質の精製を示すウエスタンブロットゲルを表示する。
【図１１】ｐｒｅ−Ｍ＋エンベロープ抗原を被覆するペプチドプールに対する、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価されたスパイク特異的ＣＤ８  Ｔリンパ球応答を示す棒グラフを表示する。図１１は、個々のマウスの図である。図１２は、群平均である。第３の免疫化の１週間後の各群における平均応答。
【図１２】ｐｒｅ−Ｍ＋エンベロープ抗原を被覆するペプチドプールに対する、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価されたスパイク特異的ＣＤ８  Ｔリンパ球応答を示す棒グラフを表示する。図１１は、個々のマウスの図である。図１２は、群平均である。第３の免疫化の１週間後の各群における平均応答。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、マウスのジカｐｒＭ＋Ｅｎｖワクチン接種が、ジカ−エンベロープ抗原と反応する陽性抗体応答を引き起こすことを示す、試料の結合ＥＬＩＳＡを表すグラフを表示する。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＺＶ−ｐｒＭＥ免疫原が、ジカ−エンベロープ抗原と特異的に反応するかなりの抗体応答を引き起こすことを示す、グラフを表示する。デング熱１、２、３、及び４抗原Ｅｎｖに対するＺｐＭＥ血清の交差反応性が陰性であった一方で、ジカＥｎｖに対しては、強力な結合を示した。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｅは、ＺＶ−ｐｒＭＥワクチン生成血清がデング熱１〜４組み換えＥｎｖと交差反応しないことを示す、分析を表示する。分析は、抗ＣＨＩＫＶワクチン誘導血清がジカＥｎｖと結合しないことも裏付ける。
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｅを含み、ＺＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築を実証する実験結果を示す。図１６Ａは、ＺＩＫＶ分離株とエンベロープ株との間のＺＩＫＶエンベロープ配列のアミノ酸レベルにおける系統樹を示す。コンセンサス設計戦略をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列に対して採用した。スケールバーは、１部位当たりのアミノ酸の距離を示す。ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアを使用して分析を実施した。赤い星は、ジカ−ｐｒＭＥコンセンサスを示す。図１６Ｂは、ｐＶａｘ１哺乳動物発現ベクター、ｐＧＸ０００１へのｐｒＭＥ（ｐｒＭ＋Ｅｎｖ）のクローニングを示す、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンの図表示を示す。ｐｒＭＥ構築物のコドン最適化合成遺伝子は、ＩｇＥリーダー配列を含んだ。全体的な遺伝子構築物を、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＶａｘ１ベクターのＢａｍＨ１及びＸｈｏ１部位に挿入した。図１６Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンのアガロースゲル電気泳動分析を示す。レーン１は、未消化ワクチン構築物を示し、レーン２は、ＢａｍＨ１／Ｘｈｏ１によるプラスミドの制限消化を示し、レーン３は、ＤＮＡ分子サイズマーカーを示す（ｋｂで）。図１６Ｄは、ウエスタンブロット評価及びＩＦＡ検出を使用した、２９３Ｔ細胞内のＺＩＫＶ  ｐｒＭＥタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を示す。２９３Ｔ細胞をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトし、細胞溶解物及び上清を発現に関して分析した。レーン１は、タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）を含み、レーン２は、ｐＶａｘ１対照細胞溶解物を含み、レーン３は、ＺＶ  ｐｒＭＥでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物を含み、レーン４は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでトランスフェクトされた細胞からの上清を含み、レーン５は、組み換えｐｒＭＥ陽性対照を含む。図１６Ｅは、２９３Ｔ細胞内のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現に関する免疫蛍光分析アッセイ（ＩＦＡ）のアッセイを示す。２９３Ｔ細胞を５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、免疫化したマウスからの血清（１：１００）及び抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣを用いて免疫蛍光標識を実施した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ及びｐＶａｘ１で免疫化したマウスからの血清を用いた染色が示される。
【図１６−２】同上。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｃを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いたワクチン接種後のマウスにおける細胞免疫応答の特性化を実証する実験結果を示す。図１７Ａは、脾細胞内のＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５／群）を、２５μｇのｐＶａｘ１またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンのいずれかを用いて３回、筋肉内で免疫化し、続いてインビボＥＰした。細胞免疫応答誘導を示すものとして、ＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。第３の免疫化の７日後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びエンベロープタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果は、積み上げ棒グラフに示される。データは、１００万個の脾細胞当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値は、各群（ｎ＝４）における平均応答±ＳＥＭを表す。図１７Ｂは、第３の免疫化の１週間後のマトリクスペプチドプールを用いた刺激によって決定される、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的ＩＦＮ−γ応答のエピトープ組成物を示す。値は、各群（ｎ＝４）における平均応答±ＳＥＭを表す。実験を少なくとも３回別々に実施し、結果は同様であった。図１７Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥを用いた免疫化が、ＺＩＫＶペプチドによって刺激されたときにより多数のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞を誘導することを示す。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いた最後の免疫化の１週間後、脾細胞をプールされたＺＩＫＶペプチド（５μＭ）または組織培養培地のみの存在下で培養した。ＺＩＫＶペプチド特異的ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞の頻度を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイによって測定した。単一機能ゲートは、陰性対照（未刺激）試料に基づいて設定し、試料にわたって均一に配置した。合計のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の割合が示される。これらのデータは、２つの別々の免疫化実験を表す。
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｄを含み、脾細胞によるＩＦＮ−γ産生のプロファイル、ならびにｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ（ＭＲ７６６）及びｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ（Ｂｒａｚｉｌ）で免疫化されたマウスから採取された血清中の抗体レベルを示す。６週齢Ｃ５７／ＢＬ６マウスを材料及び方法に記載されるように免疫化した。血清及び脾細胞を第３の免疫化の１週間後に採取し、ＺＩＫＶ特異的ｐｒＭＥペプチドでインキュベートし、１００万個の細胞当たりのＩＦＮ−γ  ＳＦＵの数をＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。図１８Ａは、ＭＲ７６６で免疫化されたマウスから採取された血清のＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。図１８Ｂは、Ｂｒａｚｉｌで免疫化されたマウスから採取された血清のＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。血清中の抗ＺＩＫＶ  Ｅｎｖ抗体レベルをＥＬＩＳＡ（Ｃ＆Ｄ）によって測定した。図１８Ｃは、ＭＲ７６６で免疫化されたマウスにおいてＥＬＩＳＡによって測定された血清中の抗ＺＩＫＶ  Ｅｎｖ抗体レベルを示す。図１８Ｄは、Ｂｒａｚｉｌで免疫化されたマウスにおいてＥＬＩＳＡによって測定された血清中の抗ＺＩＫＶ  Ｅｎｖ抗体レベルを示す。
【図１９−１】図１９Ａ〜図１９Ｅを含み、抗ＺＩＫＶ抗体応答がＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチン接種によって誘導されることを実証する実験結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドまたはｐＶａｘ１を用いて、２週間の間隔で３回、筋肉内で免疫化した。エンベロープ抗原への結合を、様々な希釈で免疫化後の異なる時点において、動物からの血清を用いて分析した。ＥＬＩＳＡプレートをワクチン適合組み換えＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質でコーティングした。図１９Ａは、２つの別々の実験のうちの１つからの結果を示す。第２の実験において同様の結果が得られた。図１９Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫原に応答して生成された抗ＺＩＫＶエンドポイント力価の差を、各追加刺激後の免疫化された動物からの血清において分析したことを示す。図１９Ｃは、ＺＩＫＶ−エンベロープ抗原発現のウエスタンブロット分析を示す。様々な濃度での組み換えＺＩＫＶ−Ｅｎｖタンパク質を、１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、示される通り、ｐＶａｘ１またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの血清を用いてウエスタンブロット分析によって分析した。ＺＩＫＶ−Ｅｎｖタンパク質の発現は、矢印によって示される。図２０Ｄは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥまたはｐＶａｘ１で免疫化されたマウスからの血清を用いたインキュベーションに続いて、ＺＩＫＶ−ＭＲ７６６に感染したか、またはモック感染したかのいずれかのＶｅｒｏ細胞の免疫蛍光分析を示す。ｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの血清試料を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染性を中和させる能力に関して、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって試験した。ＰＲＮＴ５０を投入したウイルスの５０％を阻害することができた血清希釈係数として定義した。括弧内の値は、ＰＲＮＴ５０を示す。対照プラスミドｐＺＩＫＶ−カプシド及びｐＶａｘ１血清を陰性対照として使用した。
【図１９−２】同上。
【図２０−１】図２０Ａ〜図２０Ｅを含み、ＮＨＰのＺＩＫＶ＝ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する実験結果を示す。図２０Ａは、アカゲザルを、２つの部位のそれぞれにおいて１ｍｇとして０及び４週目に投与された２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、皮内（ＩＤ）で免疫化し、免疫化の直後に皮内ＥＰしたことを示す。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用して、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対して１００万個のＰＢＭＣ当たり得られたＩＦＮ−γ産生細胞の数は、ワクチン接種群に対してｙ軸上に示される。値は、各群（ｎ＝５）における平均応答±ＳＥＭを表す。図２０Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を示す。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって免疫化前及び６週目に測定した。図２０Ｃは、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ抗体に対するエンドポイントＥＬＩＳＡ力価が、第１及び第２の免疫化後に示されることを示す。図２０Ｄは、６週目のプールされたサルの血清を使用したウエスタンブロット分析が、組み換えエンベロープタンパク質への結合を実証したことを示す。図２０Ｅは、１０ＰＦＵにおいてＺＩＫＶ  ＭＲ７６６に感染させたＶｅｒｏ細胞の免疫蛍光分析を示す。１：１００で６週目のプールされたサルの血清を用いた感染の２４時間後に細胞を調査し、次いで、二次の抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８を用いて検出した。
【図２０−２】同上。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたアカゲザルからの血清のプラーク減少中和活性を実証する実験結果を示す。アカゲザルを材料及び方法に記載されるように免疫化した。図２１Ａは、免疫化前及び６週目の個々のサルからの免疫血清を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染性を中和させる能力に関して、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって試験したことを示す。ＰＲＮＴ５０を投入したウイルスの５０％を阻害することができた血清希釈係数として定義した。計算されたＩＣ５０値は、各サルに対して列挙される。図２１Ｂ及び２１Ｃは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、及びＵ８７ＭＧ細胞内のＺＩＫＶ  ＭＲ７６６及びＰＲ２０９の細胞変性効果を示す。図２１Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞がモック感染したか、またはＭＲ７６６もしくはＰＲ２０９ウイルスに感染したことを示す。図２１Ｃは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧ細胞が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫化されたプールＮＨＰ血清（６週目）の存在下で、０．００１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいてモック感染したか、またはＭＲ７６６に感染したことを示す。シンシチウム形成（ＣＰＥ）の誘導及びｐｒＭＥタンパク質発現を、免疫化されたＮＨＰ血清を使用した間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって感染の４８時間後に分析した。４倍の対物レンズで写真を撮った。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｃを含み、Ｉ型インターフェロンα，β受容体を欠いたマウスにおけるｐＺＩＫＶ  ｐｒＭＥから単離した脾臓細胞による、ＩＦＮ−γ及び抗体産生のプロファイルを実証する実験結果を示す。図２２Ａは、ＩＦＮ  α，β受容体ノックアウトマウス（４〜６匹）を、２５μｇのｐＺＩＫＶ−ｐｒＭＥまたはｐＶａｘ１プラスミドを用いて、２週間の間隔で３回、筋肉内で免疫化したことを示す。脾細胞を最後の免疫化の２週間後に採取し、ｐｒＭＥペプチドでインキュベートし、ＩＦＮ−γ産生細胞の数をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。図２２Ｂは、免疫化された動物におけるＺＩＫＶ  Ｅｎｖタンパク質に特異的な血清抗体を、免疫化後の様々な日数においてＥＬＩＳＡによって測定したことを示す。図２２Ｃは、免疫化後０、１、２、３、４、及び５週目のエンドポイント力価を示す。
【図２３−１】図２３Ａ〜図２３Ｆを含み、ジカウイルス感染後のＩ型インターフェロンα，β受容体を欠いた免疫化されたマウスに対する生存データを実証する実験結果を示す。ジカ感染後のＩＦＮ−α／β受容体ノックアウトマウスの生存。図２３Ａは、マウスを１回免疫化し、２週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を攻撃接種したことを示す。図２３Ｂは、マウスを２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の７日後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を攻撃接種したことを示す。図２３Ｃは、マウスを２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の７日後に２回の１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ  ＰＲ２０９を攻撃接種したことを示す。２つの別々の実験からのデータを使用して、生存曲線を構築した。図２３Ｄは、２回免疫化された動物に関する体重変化を示し、データは、１実験につき１群当たり１０〜１５匹のマウスを用いた２つの別々の実験からの結果を反映する。図２３Ｅは、図２３Ｂの動物に関する臨床スコアを示す。図２３Ｆは、図２３Ｃの動物に関する臨床スコアを示す。臨床スコアに関する表示は以下の通りである。１−疾病なし、２−可動性の低下、３−猫背の姿勢及び可動性の低下、４−後肢指背歩行（部分麻痺）、５−一方の後肢の麻痺、ならびに６−両方の後肢の麻痺。
【図２３−２】図２３Ａ〜図２３Ｆを含み、ジカウイルス感染後のＩ型インターフェロンα，β受容体を欠いた免疫化されたマウスに対する生存データを実証する実験結果を示す。ジカ感染後のＩＦＮ−α／β受容体ノックアウトマウスの生存。図２３Ａは、マウスを１回免疫化し、２週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を攻撃接種したことを示す。図２３Ｂは、マウスを２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の７日後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を攻撃接種したことを示す。図２３Ｃは、マウスを２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の７日後に２回の１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ  ＰＲ２０９を攻撃接種したことを示す。２つの別々の実験からのデータを使用して、生存曲線を構築した。図２３Ｄは、２回免疫化された動物に関する体重変化を示し、データは、１実験につき１群当たり１０〜１５匹のマウスを用いた２つの別々の実験からの結果を反映する。図２３Ｅは、図２３Ｂの動物に関する臨床スコアを示す。図２３Ｆは、図２３Ｃの動物に関する臨床スコアを示す。臨床スコアに関する表示は以下の通りである。１−疾病なし、２−可動性の低下、３−猫背の姿勢及び可動性の低下、４−後肢指背歩行（部分麻痺）、５−一方の後肢の麻痺、ならびに６−両方の後肢の麻痺。
【図２４−１】図２４Ａ〜図２４Ｅを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築を実証する実験結果を示す。図２４Ａは、ｐＶａｘ１哺乳動物発現ベクターへのｒＭＥのクローニングを示す、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンの図表示を示す。コンセンサス設計戦略をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列に対して採用した。ｐｒＭＥ構築物のコドン最適化合成遺伝子は、合成ＩｇＥリーダー配列を含んだ。最適化された遺伝子構築物を、ＣＭＶプロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１ベクターのＢａｍＨ１及びＸｈｏ１部位に挿入した。図２４Ｂは、ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のモデル構築が潜在的に関連するエピトープ領域を有するワクチン標的の重複を実証することを示す。ワクチン設計目的のために行われたいくつかの変更は、ドメインＩＩ及びＩＩＩ内に位置する（差し込み図の左中央の破線内に位置する）。これらの領域内のワクチン特異的残基の変化は、Ｅ（エンベロープ）タンパク質二量体のリボンバックボーン表示上にバイオレットＣＰＫ形式で示される（各鎖は、薄緑色及び濃緑色のそれぞれ）。画定されたＥＤＥに対応する領域は青緑色で示され、融合ループは青色で示される。１５０ループの表面上に露出されるものとしてモデル化されたワクチンＥタンパク質の残基Ｉｌｅ１５６（Ｔ１５６Ｉ）は、いくつかの他のＺＩＫＶ株ならびに複数のデングウイルス株中のＮ−結合型グリコシル化モチーフＮＸＳ／Ｔの一部である。図２４Ｃは、ウエスタンブロット分析を使用した、２９３Ｔ細胞内のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を示す。２９３Ｔ細胞をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトし、ｐａｎ−ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓで免疫化された血清を用いたワクチン構築物の発現に関して、細胞溶解物及び上清を分析した。タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物及び上清、ならびにｒＺＩＫＶ−Ｅ陽性対照を示されるように搭載した。図２４Ｄは、ウエスタンブロット分析を使用した、２９３Ｔ細胞内のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現分析を示す。２９３Ｔ細胞をＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトし、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化された血清を用いたワクチン構築物の発現に関して、細胞溶解物及び上清を分析した。タンパク質分子量マーカー（ｋＤａ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物及び上清、ならびにｒＺＩＫＶ−Ｅ陽性対照を示されるように搭載した。図２４Ｅは、２９３Ｔ細胞内のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質発現に関する免疫蛍光分析アッセイ（ＩＦＡ）分析を示す。細胞を５μｇのＺＩＫＶｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化したマウスからの血清（１：１００）の添加、続いて検出のための二次の抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８抗体の添加を用いて、免疫蛍光標識を実施した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ及びｐＶａｘ１で免疫化したマウスからの血清を用いた染色が示される。ＤＡＰＩパネルは、細胞核の対照染色を示す。オーバーレイパネルは、抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８及びＤＡ��Ｉ染色パターンの組み合わせである。ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２４−２】同上。
【図２５−１】図２５Ａ〜図２５Ｄを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いたワクチン接種後のマウスにおける細胞免疫応答の特性化を実証する実験結果を示す。図２５Ａは、研究中に使用したワクチン免疫化及び免疫分析の時系列を示す。図２５Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答する脾細胞内のＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を、２５μｇのｐＶａｘ１またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンのいずれかを用いて３回、筋肉内で免疫化し、続いて電気穿孔した。細胞免疫応答の誘導を示すものとして、ＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。第３の免疫化の１週間後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びエンベロープタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果は、積み上げ棒グラフに示される。データは、１００万個の脾細胞当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値は、それぞれにおける平均応答±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図２５Ｃは、第３の免疫化の１週間後のマトリクスペプチドプールを用いた刺激によって決定される、ＺＩＫＶｐｒＭＥ特異的ＩＦＮ−γ応答のエピトープ組成物を示す。値は、各群における平均応答±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。実験を少なくとも３回別々に実施し、結果は同様であった。図２５Ｄは、Ｔ細胞応答のフローサイトメトリ分析を示す。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥを用いた免疫化が、ＺＩＫＶペプチドによって刺激されたときにより多数のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞を誘導する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いた最後の免疫化の１週間後、脾細胞をプールされたＺＩＫＶペプチド（５μＭ）またはＲ１０のみの存在下で培養した。ＺＩＫＶペプチド特異的ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌細胞の頻度を、フローサイトメトリによって測定した。単一機能ゲートは、陰性対照（未刺激）試料に基づいて設定し、試料にわたって均一に配置した。合計のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の割合が示される。これらのデータは、２つの別々の免疫化実験を表す。ＩＦＮ、インターフェロン；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２５−２】同上。
【図２５−３】同上。
【図２６−１】図２６Ａ〜図２６Ｅを含み、抗ＺＩＫＶ抗体応答がＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種によって誘導されることを実証する実験結果を示す。図２６Ａは、免疫化されたマウスにおける結合抗体産生（ＯＤ４５０値によって測定される）を測定するＥＬＩＳＡ分析を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）を、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドまたはｐＶａｘ１を用いて、２週間の間隔で３回、筋肉内で免疫化した。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、様々な希釈で免疫化後の異なる時点（２１、３５、及び５０日目）において、動物からの血清を用いて分析した。示されるデータは、少なくとも３つの別々の実験を表す。図２６Ｂは、エンドポイント結合力価分析を示す。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫原に応答して生成された抗ＺＩＫＶエンドポイント力価の差を、各追加刺激後の免疫化された動物からの血清において分析した。図２６Ｃは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化によって誘導されたｒＺＩＫＶ−Ｅ特異的抗体のウエスタンブロット分析を示す。ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を、１２．５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからのプールされた血清（３５日目）を用いてウエスタンブロット分析によって分析した。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合は、矢印によって示される。図２６Ｄは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化によって誘導されたＺＩＫＶ特異的抗体の免疫蛍光分析を示す。ＺＩＫＶ−ＭＲ７６６に感染したか、またはモック感染したかのいずれかのＶｅｒｏ細胞を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからのプールされた血清（３５日目）、続いて検出のための抗マウス−ＡＦ４８８二次抗体で染色した。図２６Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化によって誘導された中和抗体のプラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイ分析を示す。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの血清試料を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染性を中和させる能力に関して試験した。ＰＲＮＴ５０を投入したウイルスの５０％を阻害することができた血清希釈係数として定義した。括弧内の値は、ＰＲＮＴ５０を示す。対照ＺＩＫＶ−Ｃａｐ（ＺＩＫＶカプシドタンパク質を発現させるＤＮＡワクチン）及びｐＶａｘ１血清を陰性対照として使用した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２６−２】同上。
【図２６−３】同上。
【図２７−１】図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、非ヒト霊長（ＮＨＰ）類のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する実験結果を示す。図２７Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。アカゲザルを、２つの部位のそれぞれにおいて１ｍｇとして０及び４週目に投与された２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、皮内で免疫化し、免疫化の直後に皮内で電気穿孔した。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用して、「材料及び方法」の節に記載されるように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対して１００万個のＰＢＭＣ当たり得られたＩＦＮ−γ産生細胞の数が示される。値は、各群（ｎ＝５）における平均応答±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図２７Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を示す。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって免疫化前及び６週目に測定した。図２７Ｃは、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ抗体に対するエンドポイントＥＬＩＳＡ力価が、第１及び第２の免疫化後に示されることを示す。図２７Ｄは、６週目のＲＭ免疫血清を使用したウエスタンブロット分析が、組み換えエンベロープタンパク質への結合を実証したことを示す。図２７Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたＲＭからの血清のＰＲＮＴ活性を示す。免疫化前及び６週目の個々のサルからの免疫血清を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染性を中和させる能力に関して、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって試験した。ＰＲＮＴ５０を投入したウイルスの５０％を阻害することができた血清希釈係数として定義した。計算された（ＰＲＮＴ５０）値は、各サルに対して列挙される。ＩＦＮ、インターフェロン；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２７−２】図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、非ヒト霊長（ＮＨＰ）類のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する実験結果を示す。図２７Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。アカゲザルを、２つの部位のそれぞれにおいて１ｍｇとして０及び４週目に投与された２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、皮内で免疫化し、免疫化の直後に皮内で電気穿孔した。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用して、「材料及び方法」の節に記載されるように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対して１００万個のＰＢＭＣ当たり得られたＩＦＮ−γ産生細胞の数が示される。値は、各群（ｎ＝５）における平均応答±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図２７Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を示す。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって免疫化前及び６週目に測定した。図２７Ｃは、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ抗体に対するエンドポイントＥＬＩＳＡ力価が、第１及び第２の免疫化後に示されることを示す。図２７Ｄは、６週目のＲＭ免疫血清を使用したウエスタンブロット分析が、組み換えエンベロープタンパク質への結合を実証したことを示す。図２７Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたＲＭからの血清のＰＲＮＴ活性を示す。免疫化前及び６週目の個々のサルからの免疫血清を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染性を中和させる能力に関して、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって試験した。ＰＲＮＴ５０を投入したウイルスの５０％を阻害することができた血清希釈係数として定義した。計算された（ＰＲＮＴ５０）値は、各サルに対して列挙される。ＩＦＮ、インターフェロン；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２７−３】図２７Ａ〜図２７Ｅを含み、非ヒト霊長（ＮＨＰ）類のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する実験結果を示す。図２７Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のＩＦＮ−γ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。アカゲザルを、２つの部位のそれぞれにおいて１ｍｇとして０及び４週目に投与された２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、皮内で免疫化し、免疫化の直後に皮内で電気穿孔した。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用して、「材料及び方法」の節に記載されるように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮ−γ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対して１００万個のＰＢＭＣ当たり得られたＩＦＮ−γ産生細胞の数が示される。値は、各群（ｎ＝５）における平均応答±ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図２７Ｂは、ＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を示す。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって免疫化前及び６週目に測定した。図２７Ｃは、抗ＺＩＫＶ−エンベロープ抗体に対するエンドポイントＥＬＩＳＡ力価が、第１及び第２の免疫化後に示されることを示す。図２７Ｄは、６週目のＲＭ免疫血清を使用したウエスタンブロット分析が、組み換えエンベロープタンパク質への結合を実証したことを示す。図２７Ｅは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたＲＭからの血清のＰＲＮＴ活性を示す。免疫化前及び６週目の個々のサルからの免疫血清を、それらがインビトロでＺＩＫＶ感染性を中和させる能力に関して、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイによって試験した。ＰＲＮＴ５０を投入したウイルスの５０％を阻害することができた血清希釈係数として定義した。計算された（ＰＲＮＴ５０）値は、各サルに対して列挙される。ＩＦＮ、インターフェロン；ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２８−１】図２８Ａ〜図２８Ｆを含み、ＺＩＫＶ感染後のＩ型インターフェロンα，β受容体を欠いた免疫化されたマウスに対する生存データを実証する実験結果を示す。図２８Ａは、ＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存を示す。マウスを、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いて、２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の１週間後に、１×１０６プラーク形成単位でＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを攻撃接種した。図２８Ｂは、ＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存を示す。マウスを、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いて、２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の１週間後に、２×１０６プラーク形成単位でＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを攻撃接種した。図２８Ｃは、１×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の体重変化を示す。図２８Ｄは、２×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の体重変化を示す。図２８Ｅは、１×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の臨床スコアを示す。図２８Ｆは、２×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の臨床スコアを示す。臨床スコアに関する表示は以下の通りである。１：疾病なし、２：可動性の低下、３：猫背の姿勢及び可動性の低下、４：後肢指背歩行（部分麻痺）、５：一方の後肢の麻痺、ならびに６：両方の後肢の麻痺。データは、１実験につき１群当たり１０匹のマウスを用いた２つの別々の実験からの結果を反映する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２８−２】図２８Ａ〜図２８Ｆを含み、ＺＩＫＶ感染後のＩ型インターフェロンα，β受容体を欠いた免疫化されたマウスに対する生存データを実証する実験結果を示す。図２８Ａは、ＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存を示す。マウスを、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いて、２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の１週間後に、１×１０６プラーク形成単位でＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを攻撃接種した。図２８Ｂは、ＺＩＫＶ感染後のＩＦＮＡＲ−／−マウスの生存を示す。マウスを、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いて、２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の１週間後に、２×１０６プラーク形成単位でＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを攻撃接種した。図２８Ｃは、１×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の体重変化を示す。図２８Ｄは、２×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の体重変化を示す。図２８Ｅは、１×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の臨床スコアを示す。図２８Ｆは、２×１０６プラーク形成単位で免疫化された動物の臨床スコアを示す。臨床スコアに関する表示は以下の通りである。１：疾病なし、２：可動性の低下、３：猫背の姿勢及び可動性の低下、４：後肢指背歩行（部分麻痺）、５：一方の後肢の麻痺、ならびに６：両方の後肢の麻痺。データは、１実験につき１群当たり１０匹のマウスを用いた２つの別々の実験からの結果を反映する。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２８−３】同上。
【図２９−１】図２９Ａ〜図２９Ｄを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いた単回の免疫化が、Ｉ型インターフェロンα，β受容体を欠いたマウスにおいてＺＩＫＶ攻撃接種に対する防御を提供したことを実証する実験結果を示す。マウスを１回免疫化し、単回の免疫化の２週間後に、２×１０６プラーク形成単位のＺＩＫＶ−ＰＲ２０９を攻撃接種した。生存曲線は、１実験につき１群当たり１０匹のマウスを示す。図２９Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンがマウスの脳内のジカによって誘導される神経異常を予防したことを実証する。図２９Ｂは、ｐＶａｘ１及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種された群からの脳切片を攻撃接種の７〜８日後に採取し、組織構造に関してＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオジン）で染色したことを示す。代表的な防御されていないｐＶａｘ１対照動物から採取された切片は、病変を示す。（ｉ）：大脳皮質の神経網内の核フラグメント（差し込み図は、核フラグメントを強調するためにより高い倍率及び矢印を示す）、（ｉｉ）：皮質内の管の血管周囲性単核細胞浸潤、リンパ球浸潤、及び変性細胞、（ｉｉｉ）：血管周囲性単核細胞浸潤、細胞変性、及び大脳皮質の核フラグメント、ならびに（ｉｖ）：海馬内の変性ニューロン（矢印）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種されたマウスからの正常な組織の一例は、正常範囲内にあるように思われた（ｖ及びｖｉ）。図２９Ｃは、感染後の示された日における、ワクチン接種及びウイルス攻撃接種後のマウスからの血漿試料中のＺＩＫＶ  ＲＮＡのレベルを示す。結果は、１ミリリットルの血漿当たりのゲノム当量として示される。図２９Ｄは、脳組織内のＺＩＫＶ−ＲＮＡのレベルを感染後２８日目に分析したことを示す。結果は、１グラムの組織当たりのゲノム当量として示される。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図２９−２】同上。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｂを含み、ＺＩＫＶ攻撃接種後の抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動的移入後の、Ｉ型インターフェロンα，β受容体を欠いたマウスの防御を実証する実験結果を示す。ジカウイルス（１マウス当たり１０６プラーク形成単位）での皮下攻撃接種の１日後に、抗ジカウイルスＩｇＧに対して滴定されたプールＮＨＰ抗ＺＩＫＶ免疫血清をマウスに腹腔内投与した（１５０μＬ／マウス）。対照として、正常なサル血清及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、対照としての同齢のマウスに投与した（１５０μＬ／マウス）。図３０Ａは、感染及び処置の過程中のマウスの体重変化を示す。各点は、各マウスに対して計算されたパーセントでの攻撃接種前（０日目）の体重の平均及び標準誤差を表す。図３０Ｂは、ＮＨＰ免疫血清の投与後のマウスの生存を示す。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ、前駆体膜、及びジカウイルスのエンベロープ。
【図３１−１】図３１Ａ〜図３１Ｄを含み、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  Ｂｒａｚｉｌワクチンの免疫応答の特性化を実証する実験結果を示す。図３１Ａは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−Ｂｒａｚｉｌ  ＤＮＡワクチンのいずれかでのワクチン接種後の、細胞及び抗体応答を測定するＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６を用いて３回、筋肉内で免疫化し、続いてインビボＥＰした。細胞免疫応答誘導を示すものとして、ＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。第３の免疫化の１週間後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びＥタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果は、積み上げ棒グラフに示される。データは、１００万個の脾細胞当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値は、それぞれにおける平均応答±ＳＥＭを表す。図３１Ｂは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−Ｂｒａｚｉｌ  ＤＮＡワクチンのいずれかでのワクチン接種後の、細胞及び抗体応答を測定するＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）を、２５μｇのＺＩＫＶ  ｐｒＭＥ−Ｂｒａｚｉｌを用いて３回、筋肉内で免疫化し、続いてインビボＥＰした。細胞免疫応答誘導を示すものとして、ＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって測定した。第３の免疫化の１週間後に採取した脾細胞を、全ｐｒＭ及びＥタンパク質に及ぶ６つのペプチドプールのうちの１つの存在下でインキュベートした。結果は、積み上げ棒グラフに示される。データは、１００万個の脾細胞当たりのＳＦＵ（スポット形成単位）の平均数を表し、値は、それぞれにおける平均応答±ＳＥＭを表す。図３１Ｃは、免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を示す。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、様々な希釈で免疫化後３５日目に、マウスからの血清を用いて分析した。図３１Ｄは、免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を示す。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、様々な希釈で免疫化後３５日目に、マウスからの血清を用いて分析した。
【図３１−２】同上。
【図３２−１】図３２Ａ〜図３２Ｄを含み、ＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質の発現、精製、及び特性化を実証する実験結果を示す。図３２Ａは、ｒＺＩＫＶ  Ｅ発現に対するクローニングプラスミドを示す。図３２Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析による組み換えＺＩＫＶ−Ｅ（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）タンパク質の特性化を示す。レーン１−ＢＳＡ対照；レーン２−ｐＥＴ−２８ａベクタープラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物からの溶解物を、ニッケル地金親和性樹脂カラムによって精製し、ＩＰＴＧ誘導後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。レーン３、３７組み換えＺＶ−Ｅ精製タンパク質を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。レーンＭ、タンパク質分子量マーカー。図３２Ｃは、精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質をその抗原性に関して評価したことを示す。ＥＬＩＳＡプレートをｒＺＩＫＶ−Ｅでコーティングし、次いで、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンまたは陽性対照としてのＰａｎ−ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗体で免疫化されたマウスからの様々な希釈の免疫血清を用いてインキュベートした。結合したＩｇＧを、実験例に記載されるように、ペルオキシダーゼ共役抗マウス抗体、続いて、テトラメチルベンジジン基質の添加によって検出した。図３２Ｄは、ＺＩＫＶ  ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの免疫血清を用いた、精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のウエスタンブロット検出を示す。様々な濃度の精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を、記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に搭載した。１：１００の希釈の免疫血清及び１：１５，０００のヤギ抗マウスを室温で１時間使用した。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像装置上で撮像した。Ｏｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量標準を使用した。矢印は、ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質の位置を示す。
【図３２−２】図３２Ａ〜図３２Ｄを含み、ＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質の発現、精製、及び特性化を実証する実験結果を示す。図３２Ａは、ｒＺＩＫＶ  Ｅ発現に対するクローニングプラスミドを示す。図３２Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析による組み換えＺＩＫＶ−Ｅ（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）タンパク質の特性化を示す。レーン１−ＢＳＡ対照；レーン２−ｐＥＴ−２８ａベクタープラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物からの溶解物を、ニッケル地金親和性樹脂カラムによって精製し、ＩＰＴＧ誘導後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。レーン３、３７組み換えＺＶ−Ｅ精製タンパク質を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。レーンＭ、タンパク質分子量マーカー。図３２Ｃは、精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質をその抗原性に関して評価したことを示す。ＥＬＩＳＡプレートをｒＺＩＫＶ−Ｅでコーティングし、次いで、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンまたは陽性対照としてのＰａｎ−ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗体で免疫化されたマウスからの様々な希釈の免疫血清を用いてインキュベートした。結合したＩｇＧを、実験例に記載されるように、ペルオキシダーゼ共役抗マウス抗体、続いて、テトラメチルベンジジン基質の添加によって検出した。図３２Ｄは、ＺＩＫＶ  ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの免疫血清を用いた、精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質のウエスタンブロット検出を示す。様々な濃度の精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を、記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に搭載した。１：１００の希釈の免疫血清及び１：１５，０００のヤギ抗マウスを室温で１時間使用した。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像装置上で撮像した。Ｏｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量標準を使用した。矢印は、ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質の位置を示す。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｃを含み、ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるジカ−ｐｒＭＥの免疫応答の特性化を実証する実験結果を示す。ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥへの細胞及び抗体応答を測定するＥＬＩＳｐｏｔ及びＥＬＩＳＡ分析。マウス（ｎ＝４／群）を、２５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥを用いて３回、筋肉内で免疫化し、続いてインビボＥＰした。図３３Ａは、細胞免疫応答誘導を示すものとして、ＩＦＮ−γ産生をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したことを示す。図３３Ｂは、免疫化されたＩＦＮＡＲ−／−マウスにおける結合抗体産生を測定するＥＬＩＳＡ分析を示す。ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合を、免疫化後の異なる時点においてマウスからの血清を用いて分析した。図３３Ｃは、免疫化されたＩＦＮＡＲ−／−マウスにおいて産生された抗ＺＩＫＶ抗体のエンドポイント力価分析を示す。
【図３４−１】図３４Ａ〜図３４Ｄを含み、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥに対して免疫化されたアカゲザルからの免疫血清の中和活性を実証する実験結果を示す。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧ細胞を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫化されたプールＮＨＰ血清（６週目）の存在下で、０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいてモック感染させたか、またはＭＲ７６６に感染させた。ジカウイルス感染性を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種されたＮＨＰからの血清を使用した間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって感染の４日後に分析した。図３４Ａは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＭＲ７６６及びＰＲ２０９による感染の阻害を実証する、２０倍の対物レンズを用いて撮った染色された組織試料片の写真を示す。図３４Ｂは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧによる感染の阻害を実証する、２０倍の対物レンズを用いて撮った染色された組織試料片の写真を示す。図３４Ｃは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＭＲ７６６及びＰＲ２０９による感染の阻害を実証する、感染された（ＧＦＰ陽性細胞）の割合を示す棒グラフを示す。図３４Ｄは、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧにおけるＺＩＫＶウイルスＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＵ８７ＭＧによる感染の阻害を実証する、感染された（ＧＦＰ陽性細胞）の割合を示す棒グラフを示す。
【図３４−２】同上。
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｄを含み、ＺＩＫＶがＩＦＮＡＲ−／−マウスに対して悪性であることを実証する実験結果を示す。これらのデータは、ＺＩＫＶがＩＦＮＡＲ−／−において悪性であり、罹患及び死亡をもたらすことを確認する。図３５Ａは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを用いて頭蓋内を介して予防接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図３５Ｂは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを用いて静脈内を介して予防接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図３５Ｃは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを用いて腹腔内を介して予防接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図３５Ｄは、１０６ｐｆｕのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを用いて皮下を介して予防接種されたＩＦＮＡＲ−／−マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図３５Ａは、全ての経路に関する感染の過程中のマウスの体重変化を示す。
【図３６−１】図３６Ａ〜図３６Ｃを含み、非ヒト霊長（ＮＨＰ）類のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する実験結果を示す。図３６Ａは、ＮＨＰ免疫化研究の概略図である。図３６Ｂは、単回の免疫化後の結果を示す。図３６Ｃは、２回の免疫化後の結果を示す。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化に応答するＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−ｇ分泌を測定するＥＬＩＳｐｏｔ分析。アカゲザルを、２つの部位のそれぞれにおいて１ｍｇとして０及び４週目に投与された２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、皮内（ｉ．ｄ．）で免疫化し、免疫化の直後に皮内ＥＰした。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用して、材料及び方法に記載されるように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮ−ｇ分泌細胞を検出した。全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対して１００万個のＰＢＭＣ当たり得られたＩＦＮ−ｇ産生細胞の数が示される。値は、各群（ｎ＝５）における平均応答±ＳＥＭを表す。
【図３６−２】同上。
【図３７−１】図３７Ａ及び図３７Ｂを含み、抗ＺＩＫＶ抗体応答が非ヒト霊長（ＮＨＰ）類のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種によって誘導されることを実証する実験結果を示す。図３７Ａは、単回のＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を示す。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって免疫化前及び６週目に測定した。図３７Ｂは、２回のＤＮＡワクチン接種後のＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体応答の検出を示す。抗ＺＩＫＶ  ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡによって免疫化前及び６週目に測定した。
【図３７−２】同上。
【図３８−１】図３８Ａ〜図３８Ｄを含み、ジカ−ｐｒＭＥ免疫化がジカ攻撃接種に対する防御を付与することを実証する実験結果を示す。図３８Ａは、ＮＨＰジカ攻撃接種研究の概略図である。アカゲザルを、ＥＰを使用したＩＤ経路を介して、ｐＺＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡを用いて、０及び４週目に２回ワクチン接種した。８週目に、動物を、ジカ−ＰＲ２０９ウイルス株を用いて皮下攻撃接種した。対照として、５匹の実験に使われていない動物をＺＶ−ＰＲ２０９ウイルスで感染させた。図３８Ｂは、実験に使われていないＮＨＰにおける個々の動物に対する順次的なウイルス負荷決定を示す。図３８Ｃは、１回ワクチン接種されたＮＨＰにおける個々の動物に対する順次的なウイルス負荷決定を示す。図３８Ｄは、２回ワクチン接種されたＮＨＰにおける個々の動物に対する順次的なウイルス負荷決定を示す。パネルは、３つの群に対する標準誤差バーを有する各動物に対するピークウイルス負荷が示される（ウイルスＲＮＡコピー／ｍＬ血漿のログ）ことを示す。
【図３８−２】同上。
【図３９】図３９Ａ及び図３９Ｂを含み、第１相ジカＤＮＡワクチン研究からの実験結果を示す。図３９Ａは、結合ＥＬＩＳＡ研究からの実験結果を示す。図３９Ｂは、受動的移入及び防御を実証する実験結果を示す。
【図４０】図４０Ａ及び図４０Ｂを含み、免疫蛍光分析からの実験結果を示す。
【図４１−１】図４１Ａ及び図４１Ｂを含み、結合レスポンダーの割合の特性化を実証する実験結果を示す。
【図４１−２】同上。
【図４２】２回目の投与後の中和を実証する実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の省略または短縮された定義は、本発明の好ましい実施形態の理解に役立つために示される。本明細書に示される省略された定義は、決して包括的でもなく、それらは、当該技術分野において理解されるような定義または辞書的定義に矛盾もしない。省略された定義は、当該技術分野において既知の定義を捕捉するか、またはより明確に定義するために本明細書に示される。
【００１２】
定義
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド及びアミノ酸に対する配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ならびにＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して決定され得る。簡潔に、ベーシックローカルアラインメントサーチツールを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似性を決定するのに好適である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの基準は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列の間の一致が偶然に起こり得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸を他の核酸と比較した際の最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の核酸に類似していると見なされる。「類似性の割合」は、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して計算され得る。コンセンサス配列の平均類似性は、系統樹における全ての配列と比較して計算される。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「核酸構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列または「コード核酸配列」は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を誘導することが可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナル及び終止シグナルを含むことができる。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必要な調節エレメントを含有する核酸構築物を指す。
【００１５】
「定電流」という用語は、組織または当該組織を画定する細胞が、その組織に送達される電気パルスの持続時間にわたって受ける、または経験する電流を定義するために本明細書で使用される。電気パルスは、本明細書に記載される電気穿孔デバイスから送達される。この電流は、電気バルスの寿命にわたって当該組織内に一定のアンペア数で留まり、それは、本明細書において提供される電気穿孔デバイスが、好ましくは瞬時のフィードバックを有するフィードバック要素を有するためである。フィードバック要素は、パルスの持続時間の全体にわたって組織（または細胞）の抵抗を測定し、同じ組織内の電流が電気パルスの全体にわたって（約数マイクロ秒）、及びパルス毎に一定のままであるように、電気穿孔デバイスにその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができる。幾つかの実施形態において、フィードバック要素は、制御装置を含む。
【００１６】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は、互換的に使用され、提供される電気穿孔デバイスの能動的応答を意味し、これは、電極間の組織内の電流を測定すること、及びそれに応じて、電流を一定レベルに維持するためにＥＰデバイスによって送達されたエネルギー出力を変化させることを含む。この一定レベルは、パルス系列または電気処理を開始する前に、ユーザによって予め設定される。好ましくは、フィートバックは、電気穿孔デバイスの電気穿孔構成要素、例えば制御装置によって達成され得、それは、その中の電気回路が、電極間の組織内の電流を連続的に監視し、その監視された電流（または組織内の電流）を予め設定された電流と比較して、監視された電流を予め設定されたレベルに維持するためにエネルギー出力調整を連続的に行うことが可能であるためである。いくつかの実施形態では、フィードバックループは、アナログ閉ループフィートバックであるために瞬時である。
【００１７】
「電気穿孔」、「電気透過」、または「動電学的強化」（「ＥＰ」）という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、生体膜内の微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電界パルスの使用を指し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、及び／または水などの生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側に通過することを可能にする。
【００１８】
「分散電流」という用語は、本明細書に記載される電気穿孔デバイスの様々な針電極配列から送達される電流のパターンを定義するために本明細書で使用され、そのパターンは、電気穿孔されている組織の任意の領域における電気穿孔関連熱応力の発生を最小限に抑えるか、または好ましくは排除する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「フィードバック機構」という用語は、ソフトウェアまたはハードウェア（またはファームウェア）のいずれかによって実施されるプロセスを指し、このプロセスは、（エネルギーパルスの送達の前、間、及び／または後に）所望の組織のインピーダンスを受信し、現在の値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーのパルスを調整して、予め設定された値を達成する。「インピーダンス」という用語は、フィードバック機構を考察する場合に本明細書で使用され、オームの法則に従って電流値に変換され得、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。好ましい実施形態では、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路によって実施される。
【００２０】
「免疫応答」という用語は、提供されたＤＮＡプラスミドワクチンを介したジカ抗原、例えば、汎用ジカ抗原の導入に応答する宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味するために本明細書で使用される。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【００２１】
「コンセンサス」または「コンセンサス配列」という用語は、ジカ遺伝子の複数の株の整列の分析に基づき構築された、合成核酸配列または対応するポリペプチド配列を意味するために本明細書で使用される。コンセンサス汎用ジカは、ジカウイルスの複数のサブタイプまたは血清型に対する幅広い免疫を誘導するために使用され得る。
【００２２】
「アジュバント」という用語は、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに添加されて、以下に記載されるＤＮＡプラスミド及びコード核酸配列によってコードされるジカ抗原の抗原性を増強する任意の分子を意味するために本明細書で使用される。
【００２３】
「サブタイプ」または「血清型」という用語は、本明細書において互換的にかつウイルス、例えばジカウイルスと関連して使用され、ウイルス抗原の遺伝的変異体を意味し、このため、１つのサブタイプは、異なるサブタイプとは別の免疫系によって認識される。例えば、ジカウイルスサブタイプ１は、ジカウイルスサブタイプ２とは免疫学的に区別可能である。
【００２４】
本発明の一態様は、ジカウイルスに対する哺乳動物における免疫応答を引き起こすポリペプチドを発現させることが可能な核酸構築物を提供する。核酸構築物は、コードヌクレオチド配列及びコードヌクレオチド配列に作動可能に結合されたプロモーターからなる。コードヌクレオチド配列は、ポリペプチドを発現させ、ポリペプチドは、ｐｒＭＥを含むコンセンサスジカ抗原を含む。プロモーターは、哺乳動物におけるポリペプチドの発現を調整する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、コード配列のＮ末端に作動可能に結合し、かつプロモーターに作動可能に結合されたＩｇＥリーダー配列をさらに含むことができる。好ましくは、ＩｇＥリーダーは、配列番号１２の配列を有する。核酸構築物はまた、コード配列のＣ末端に付着したポリアデニル化配列を含むことができる。好ましくは、核酸構築物は、コドン最適化される。
【００２６】
好ましい実施形態では、核酸配列及びアミノ酸配列は、以下から選択されてもよい。
配列番号  説明
１    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥタンパク質
２    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ（構築物１）ＤＮＡ
３    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ（構築物１）タンパク質
４    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１  ＤＮＡ
５    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１タンパク質
６    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドＤＮＡ
７    コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドタンパク質
８    ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ  ＭＲ７６６  ＤＮＡ
９    ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ  ＭＲ７６６タンパク質
１０  ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ  Ｂｒａｚｉｌ  ＤＮＡ
１１  ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ  Ｂｒａｚｉｌタンパク質
１２  ＩｇＥリーダー
１３  コンセンサスジカＩｇＥリーダー−ＮＳ１  ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１１）
１４  コンセンサスジカＩｇＥリーダー−カプシドＤＮＡ（ｐＧＸ７２１２）
１５  ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ  Ｂｒａｚｉｌ  ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１３）
１６  ジカＩｇＥリーダー−ｐｒＭＥ  ＭＲ７６６  ＤＮＡ（ｐＧＸ７２１４）
１７  カプシドＤＮＡなしのジカＰｒｅＥｎｖ（ＭＲ７６６）（ｐＧＸ７２１０）
１８  カプシドタンパク質なしのジカＰｒｅＥｎｖ（ＭＲ７６６）（ｐＧＸ７２１０）
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書のＤＮＡ配列は、５’末端からＩｇＥリーダー配列（配列番号１２をコードするヌクレオチド配列）が除去され得、本明細書のタンパク質配列は、Ｎ末端から配列番号１２のＩｇＥリーダー配列が除去され得る。
【００２８】
本発明の別の態様は、ジカウイルスに対する免疫応答を哺乳動物において生じさせることが可能である、ＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物においてコンセンサスジカ抗原を発現させることが可能なＤＮＡプラスミド及び薬学的に許容される賦形剤からなる。ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスジカ抗原をコードするコード配列に作動可能に結合されたプロモーターからなる。コンセンサスジカ抗原は、コンセンサスｐｒＭＥ、ＮＳ１、カプシド、または上記の抗原のうちの１つ以上の融合からなる。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスジカ抗原をコードする。一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１８のアミノ酸配列を有するコンセンサスジカ抗原をコードする。
【００２９】
一実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７を含むが、これらに限定されない配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ジカ抗原をコードするコード配列からコード配列のＮ末端上のＩｇＥリーダー配列を引いたものを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＮ末端に付着し、かつプロモーターに作動可能に結合されたＩｇＥリーダー配列をさらに含む。好ましくは、ＩｇＥリーダーは、配列番号１２の配列を有する。
【００３１】
ＤＮＡプラスミドは、コード配列のＣ末端に付着したポリアデニル化配列をさらに含むことができる。好ましくは、ＤＮＡプラスミドは、コドン最適化される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントである。好ましくは、アジュバントは、以下からなる群から選択される：ＩＬ−１２及びＩＬ−１５。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤である。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質、及びより好ましくはポリ−Ｌ−グルタミン酸である。好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度である。好ましくは、ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍＬ以上の総ＤＮＡプラスミドの濃度を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、複数の独特なＤＮＡプラスミドを含み、この複数の独特なＤＮＡプラスミドの各々は、コンセンサスｐｒＭＥタンパク質、コンセンサスｐｒＭＥ（構築物１）、コンセンサスＮＳ１  ＤＮＡ、またはコンセンサスカプシドタンパク質を含むポリペプチドをコードする。
【００３４】
ＤＮＡプラスミドワクチンは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１８を含むが、これらに限定されないアミノ酸配列をコードするＤＮＡプラスミドを含むことができる。
【００３５】
一実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７を含むが、これらに限定されない配列を含むＤＮＡプラスミドを含むことができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンが免疫応答をもたらす哺乳動物は、霊長類である。好ましくは、哺乳動物は、霊長類である。免疫応答は、細胞性応答もしくは液性応答のいずれか、及び好ましくは両方であり得る。
【００３７】
本発明の別の態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳動物の組織に送達することであって、ＤＮＡプラスミドを含むＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物の細胞内でジカウイルスのコンセンサス抗原を発現させて、哺乳動物において免疫応答を誘発することが可能である、送達することと、組織の細胞を電気穿孔して、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にすることとを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、免疫応答を誘発する方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、または筋肉組織に注入することを含む送達ステップを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、免疫応答を誘発する方法は、組織に送達されることが望ましい電流を予め設定することと、予め設定された電流に等しい定電流のエネルギーのパルスを用いて組織の細胞を電気穿孔することとをさらに含むことができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、免疫応答を誘発する方法は、電気穿孔された細胞内のインピーダンスを測定することと、測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギーレベルを調節して、電気穿孔された細胞内の定電流を維持することとをさらに含む。測定及び調節ステップは、好ましくは、エネルギーのパルスの寿命内に生じる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、電気穿孔ステップは、分散パターンでエネルギーのパルスを送達するパルス配列パターンに従って、エネルギーのパルスを複数の電極に送達することを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、かつ任意にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＣＤ８６からなる群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌ−α、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏ×４０、Ｏ×４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びこれらの機能性フラグメント。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、またはＭＥＣから選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、以下が挙げられる。免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度でＤＮＡプラスミドワクチンに存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチン中のポリ−Ｌ−グルタミン酸の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物に送達されて免疫応答を誘発することができ、好ましくは、哺乳動物は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、またはフェレットである。より好ましくは、哺乳動物は、ヒト霊長類である。
【００４５】
本発明の一態様は、哺乳動物においてジカウイルスに対する免疫応答を誘発する方法に関する。方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳動物の組織に送達することと、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流のエネルギーのパルスを用いて、組織の細胞を電気穿孔することとを含む。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳動物の細胞内でジカ抗原、好ましくはコンセンサス抗原を発現させて、哺乳動物における免疫応答を誘発することが可能なＤＮＡプラスミドを含む。免疫応答を誘発する方法は、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流のエネルギーのパルスを用いて、組織の細胞を電気穿孔することを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、または筋肉組織に注入することを含む送達ステップを含む。好ましくは、これらの方法は、インビボ電気穿孔デバイスを使用して、組織に送達されることが望ましい電流を予め設定することと、予め設定された電流に等しい定電流のエネルギーのパルスを用いて組織の細胞を電気穿孔することとを含む。いくつかの実施形態では、電気穿孔ステップは、電気穿孔された細胞内のインピーダンスを測定することと、測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギーレベルを調節して、電気穿孔された細胞内の定電流を維持することとをさらに含み、測定及び調節ステップは、エネルギーのパルスの寿命内に生じる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、電気穿孔ステップは、分散パターンでエネルギーのパルスを送達するパルス配列パターンに従って、エネルギーのパルスを複数の電極に送達することを含む。
【００４８】
本発明はまた、ジカ抗原に対する非フラグメントと実質的に同様の哺乳動物における免疫応答を誘発することが可能なポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含む。ＤＮＡフラグメントは、配列番号１をコードするヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号３をコードするヌクレオチド配列、配列番号４、配列番号５をコードするヌクレオチド配列、配列番号６、配列番号７をコードするヌクレオチド配列、配列番号８、配列番号９をコードするヌクレオチド配列、配列番号１０、配列番号１１をコードするヌクレオチド配列、配列番号１７、配列番号１８をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号１４〜１６を含む、本発明の様々なコードヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択され、本明細書に提供される特異的なコード核酸配列に適用するため、以下の記載されるＤＮＡフラグメントのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３２０個以上、３４０個以上、または３６０個以上のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列に対するコード配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡフラグメントは、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３２０個未満、３４０個未満、または３６０個未満のヌクレオチドを含むことができる。
【００４９】
本発明は、コードヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含み、配列番号１、３、５、７、９、１１、１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。本発明はまた、ジカ抗原に対する非フラグメントと実質的に同様の哺乳動物における免疫応答を誘発することが可能であるポリペプチドフラグメントを含む。ポリペプチドフラグメントは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１８を含む本発明の様々なポリペプチド配列のうちの少なくとも１つから選択され、本明細書に提供される特異的なポリペプチド配列に適用するため、以下の記載されるポリペプチドフラグメントのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、１５個以上、３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１００個以上、１１０個以上、または１２０個以上のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、３０個未満、４５個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１００個未満、１１０個未満、または１２０個未満のアミノ酸を含むことができる。
【００５０】
ジカ抗原に対する非フラグメントと実質的に同様の哺乳動物における免疫応答を誘発する機能性フラグメントの決定は、当業者によって容易に行われ得る。フラグメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などの公的に入手可能なデータベースによって提供されるような少なくとも１つ、好ましくはより多くの抗原エピトープを含有するために分析され得る。加えて、免疫応答研究は、以下の実施例に示されるようなマウス及び抗体力価ならびにＥＬＩＳｐｏｔｓ分析を使用して定期的に評価され得る。
【００５１】
ワクチン
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質及びタンパク質をコードする遺伝子構築物を、それらを免疫応答が誘導され得る免疫原として特に有効にするエピトープと共に提供することによって、改善されたワクチンを提供する。それに応じて、ワクチンは、治療または予防免疫応答を誘導するために提供され得る。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明に従ったワクチンは個体に送達されて、個体の免疫系の活性を調節し、それにより免疫応答を強化する。タンパク質をコードする核酸分子が個体の細胞によって取り込まれたとき、ヌクレオチド配列が細胞内で発現し、タンパク質がそれにより個体に送達される。本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上にタンパク質のコード配列を送達する方法を提供する。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によると、個体を予防的及び／または治療的に免疫化する組成物及び方法が提供される。
【００５４】
細胞によって取り込まれたとき、ＤＮＡプラスミドは、別個の遺伝物質として細胞内に留まることができる。あるいは、ＲＮＡが細胞に投与されてもよい。また、セントロメア、テロメア、及び複製起点を含む直鎖状の微小染色体として遺伝子構築物を提供することが企図される。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。エレメントは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含む。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現のために、エンハンサーが多くの場合必要とされる。これらのエレメントが所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に結合され、かつ調節エレメントが投与される個体内で作動可能である必要がある。
【００５５】
開始及び終止コドンは、概して、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされる。しかしながら、これらのエレメントが、核酸構築物が投与される哺乳動物において機能的である必要がある。開始及び終止コドンは、コード配列と共にフレーム内になければならない。
【００５６】
使用されるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。
【００５７】
本発明を実施するために、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されず、他の実施形態では、プロモーターは、天然または合成の筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載され、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本発明を実施するために、特にヒトに対する遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びヒトβ−グロブリンポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが使用され得る。
【００５９】
ＤＮＡ発現に必要とされる調節エレメントに加えて、他のエレメントもまたＤＮＡ分子に含まれ得る。そのような追加のエレメントは、エンハンサーを含む。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ならびにＣＭＶ、ＲＳＶ、及びＥＢＶ由来などのウイルスエンハンサーを含むが、これらに限定されない群から選択されてもよい。
【００６０】
遺伝子構築物は、構築物を染色体外に維持し、細胞内で構築物の複数のコピーを生成するために、哺乳動物の複製起点が提供され得る。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、及びｐＲＥＰ４は、エプスタイン・バールウイルスの複製起点、ならびに組み込みなしで高コピーエピソーム複製を生じる核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含有する。
【００６１】
タンパク質産生を最大化するために、構築物が投与される細胞内の遺伝子発現に十分に適切である調節配列が選択され得る。さらに、宿主細胞内で最も効率的に転写される、当該タンパク質をコードするコドンが選択され得る。当業者は、細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を産生することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質に対するコード配列がＩｇＥリーダーペプチドに結合されるか、またはそのようなＩｇＥリーダーが除去される、核酸構築物が提供されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに結合されるか、またはそのようなＩｇＥリーダーは除去される。
【００６３】
タンパク質が使用されるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技術を使用して、本発明のタンパク質を産生及び単離することができる。タンパク質が使用されるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技術を使用して、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現形で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質の産生のために使用され得る。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）は、例えば、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株における産生のために使用され得る。市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）は、例えば、昆虫細胞における産生のために使用され得る。市販のプラスミドｐｃＤＮＡまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞における産生のために使用され得る。当業者は、これらの市販の発現ベクター及び発現系またはその他を使用して、常用技術及び容易に入手可能な出発物質によってタンパク質を産生することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。したがって、所望のタンパク質は、原核細胞系及び真核細胞系の両方において調製され得、タンパク質の処理形態のスペクトルをもたらすことができる。
【００６４】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び発現系を使用してもよく、または周知の方法及び容易に入手可能な出発物質を使用してベクターを産生してもよい。プロモーター及びポリアデニル化シグナル、ならびに好ましくはエンハンサーなどの必要な制御配列を含有する発現系は、様々な宿主に対して容易に入手可能であり、当該技術分野において既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。遺伝子構築物は、構築物がトランスフェクトされる細胞株または標的組織の細胞内で機能的であるプロモーターに作動可能に結合されたタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０由来のプロモーターが挙げられる。誘導可能なプロモーターの例としてはマウ乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、容易に入手可能な出発物質から、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に産生することができる。タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、適合する宿主を形質転換するために使用され、それは次いで、外来ＤＮＡの発現が行われる条件下で培養及び維持される。
【００６５】
産生されたタンパク質は、細胞を溶解することか、または適切な、かつ当業者に既知の培養培地からのいずれかによって、培養物から回収される。当業者は、周知の技術を使用して、そのような発現系を使用して産生されたタンパク質を単離することができる。上記の特異的タンパク質に特異的に結合する抗体を使用して、天然供給源からタンパク質を精製する方法は、組み換えＤＮＡ方法によって産生されたタンパク質を精製することに同様に適用され得る。
【００６６】
組み換え技術によってタンパク質を産生することに加えて、本質的に純粋な単離タンパク質を産生するために、自動ペプチド合成機もまた用いられ得る。そのような技術は、当業者に周知であり、ＤＮＡによってコードされたタンパク質の産生において置換を有する誘導体が提供されない場合に有用である。
【００６７】
核酸分子は、インビボ電気穿孔を用いる、及び用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、及び組み換えワクシニアなどのリポソーム仲介、ナノ粒子促進組み換えベクターを含む、いくつかの周知の技術のいずれかを使用して送達され得る。好ましくは、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドなどの核酸分子は、ＤＮＡ注入を介して、かつインビボ電気穿孔と共に送達される。
【００６８】
投与経路には、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼球内、及び経口、ならびに局所、経皮、吸入もしくは坐剤、または膣、直腸、尿道、頬、及び舌下組織の洗浄によるなどの粘膜組織が含まれるが、これらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内、及び皮下注入が含まれる。遺伝子構築物は、伝統的なシリンジ、無針注入デバイス装置、「微粒子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法を含むがこれらに限定されない手段によって投与され得る。
【００６９】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進するために好ましい電気穿孔デバイス及び電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものが含まれ、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。また、３５  ＵＳＣ１１９（ｅ）下で、２００６年１０月１７日出願の米国仮出願第６０／８５２，１４９号及び２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対する利益を主張する、２００７年１０月１７日出願の同時係属かつ共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供される、ＤＮＡワクチンの送達を促進するための電気穿孔デバイス及び電気穿孔法が好ましく、それら全ての全体が本明細書に組み込まれる。
【００７０】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム及びそれらの使用について記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御装置から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、及び電源を備える。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。生体分子は、次いで、皮下注射針を介して選択された組織内に送達される。プログラム可能な定電流パルス制御装置が作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞内への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得る電気穿孔デバイスについて記載している。電気穿孔デバイスは、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって特定される動電学的デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御及びパルスパラメータの入力に基づき、アレイの電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの記憶及び取得を可能にする。電気穿孔デバイスはまた、一連の針電極、注入針用の中央注入チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクを備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイ及び方法は、筋肉などの組織だけではなく他の組織または器官へ深く浸透するように適合される。電極アレイの構成のため、注入針（選択した生体分子を送達するための）はまた、標的器官に完全に挿入され、注入は、電極によって事前に線引きされた領域内で標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは２０ｍｍの長さ及び２１ゲージである。
【００７３】
以下は、本発明の方法の一例であり、上記で考察された特許の参考文献中でより詳細に考察されており、電気穿孔デバイスは、ユーザによって予め設定された電流出力と同様の定電流をもたらすエネルギーのパルスを、哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る。電気穿孔デバイスは、電気穿孔構成要素と、電極アセンブリまたはハンドルアセンブリとを備える。電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形ロガー、入力素子、状況報告要素、通信ポート、メモリ構成要素、電源、及び電源スイッチを含む、電気穿孔デバイスの様々な要素のうちの１つ以上を含み、かつ組み込むことができる。電気穿孔構成要素は、電気穿孔デバイスの１つの要素として機能することができ、他の要素は、電気穿孔構成要素と通信している別個の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態では、電気穿孔構成要素は、電気穿孔デバイスの２つ以上の要素として機能することができ、これは、電気穿孔構成要素から離れた電気穿孔デバイスのさらに他の要素と通信していてもよい。本発明は、電気機械的または機械的デバイスの一部として存在する電気穿孔デバイスの要素によって制限されず、これは、要素が、１つの装置として、または互いに通信している別個の要素として機能することができるためである。電気穿孔構成要素は、所望の組織内に定電流をもたらすエネルギーのパルスを送達することが可能であり、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置で複数の電極を有する電極アレイを含み、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からのエネルギーのパルスを受信し、これを、電極を通じて所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔構成要素に通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信することができ、電気穿孔構成要素によって送達されたエネルギーのパルスを調節して、定電流を維持することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、複数の電極が、分散パターンでエネルギーのパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンス下での電極の制御を通して分散パターンでエネルギーのパルスを送達することができ、プログラムされたシーケンスは、ユーザによって電気穿孔構成要素に入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、シーケンスで送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各々のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、後続の複数のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実施される。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実施される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技術によって決定されるように実質的に瞬時）である。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスをフィードバック機構に通信し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調節して、予め設定された電流と同様の値に定電流を維持する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの送達中に定電流を連続的または瞬時に維持する。
【００７６】
薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤などの機能性分子を含むことができ、これらは、一般に既知であり、容易に入手可能である。好ましくは、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントまたはトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤（またはトランスフェクション促進剤）の投与と併せて細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及び１９９４年１月２６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載され、それらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日出願の米国０２１，５７９号に記載され、それは、参照により本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として核酸分子と併せて投与され得るか、または核酸分子の投与と別々、同時、その前、もしくはその後に投与され得る。トランスフェクション促進剤の例としては、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類縁体、ムラミルペプチド、キノン類縁体、ならびにスクアレン及びスクアレンなどの小胞が挙げられ、ヒアルロン酸もまた、遺伝子構築物と併せて投与されて使用され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、ＤＮＡリポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）としてのレクチンリポソームもしくは当該技術分野において既知の他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤などのトランスフェクション促進剤を含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。
【００７７】
いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、タンパク質の遺伝子であるアジュバントと共に送達され、それは、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに強化する。そのような遺伝子の例は、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、かつ任意にＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ−１５などの、他のサイトカイン及びリンホカインをコードする遺伝子である。有用であり得る他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が挙げられる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏ×４０、Ｏ×４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びこれらの機能性フラグメント。
【００７８】
本発明に従ったＤＮＡプラスミドワクチンは、約１ナノグラム〜１０ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡ量を含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明に従ったＤＮＡプラスミドワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡを含有する。
【００７９】
本発明に従ったＤＮＡプラスミドワクチンは、使用される投与様式に従って製剤化される。ＤＮＡプラスミドワクチンが注入可能な組成物である場合、それらは滅菌、及び／または発熱物質無含有、及び／または微粒子無含有である。等張性製剤が好ましくは使用される。概して、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが挙げられ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。いくつかの実施形態では、ＬＧＳまたは他のポリカチオンもしくはポリアニオンなど、製剤が室温または周囲温度で長時間にわたって安定であることを可能にする安定剤が、製剤に添加される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、コンセンサスジカ抗原に対して哺乳動物における免疫応答を誘発する方法は、粘膜免疫応答を誘導する方法を含む。そのような方法は、上記のコンセンサスジカ抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、及びその機能性フラグメントまたはその発現可能なコード配列のうちの１つ以上を、哺乳動物に投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、及びその機能性フラグメントのうちの１つ以上は、本明細書に提供されるＤＮＡプラスミドジカワクチンの投与の前に、それと同時に、またはその後に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、及びその機能フラグメントからなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離された核酸分子が、哺乳動物に投与される。
【実施例】
【００８１】
本発明を、以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示目的のみで提供されることを理解されたい。上述の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び修正を行って様々な用途及び状況に適合させることができる。したがって、本明細書に示され、かつ説明されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲内に入るように意図されている。
【００８２】
好ましくは、本明細書に記載される筋肉または皮膚ＥＰデバイスと共に使用するためのＤＮＡ製剤は、皮膚への送達に最適な少量、好ましくは少ない注入量、理想的には２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に、高いＤＮＡ濃度、好ましくはマイクログラム〜数十ミリグラム量、及び好ましくはミリグラム量のＤＮＡを含む濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬ以上などの高いＤＮＡ濃度（ｍｇ  ＤＮＡ／製剤の容積）を有する。より好ましくは、ＤＮＡ製剤は、２００μＬの配合物中にグラム量のＤＮＡを、より好ましくは１００μＬの配合物中にグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００８３】
本発明のＥＰデバイスと共に使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知のデバイス及び技術の組み合わせを使用して製剤化または製造され得るが、好ましくは、それらは、２００９年１月１日公開の米国公開第２００９０００４７１６号として公開された、米国出願第１２／１２６６１１号に記載される最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究で使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術はまた、米国公開第２００９０００４７１６号に記載されるもの、及び２００７年７月３日発行の米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知の様々なデバイス及びプロトコルを含むか、またはそれらを組み込む。本明細書に記載される皮膚ＥＰデバイス及び送達技術と共に使用される高濃度のプラスミドは、適度に少量でＩＤ／ＳＣ空間にプラスミドを投与することを可能にし、発現及び免疫化効果を増強するのを補助する。公表文献の米国公第２００９０００４７１６号及び米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
実施例１：ジカｐｒＭＥワクチン
ジカワクチンアプローチ
図２に示されるように、ジカ抗原発現構築物をそこに示される骨格を用いて生成した。発現カセットをＣＭＶプロモーターの後方に、かつトレイリングポリアデニル化テールを用いて挿入した。カセットは、ｐｒＭＥ、ＮＳ１、及びカプシドを含む、図３に示される抗原に対するコード配列を含むことができる。
【００８５】
系統発生分析及びジカｐｒＭＥのワクチン設計
図５及び６に示されるように系統発生分析を行った。星は、コンセンサスｐｒＭＥ配列の配列番号３の位置を示す。このコンセンサスｐｒＭＥは、図７に従った発現ベクター中のクローニング部位に挿入されることが示される。
図９Ａ及び９Ｂに示されるように発現したタンパク質をウエスタンブロット分析によって特性化し、それは、抗フラビウイルス抗体への特異的結合を示す。
次いで、図１０Ａ及び１０Ｂに示されるようにタンパク質を精製した。
【００８６】
マウス免疫化
動物−Ｂａｌｂ／Ｃマウス（８匹の群）
プラスミド−ジカ−ｐｒＭＥ（配列番号２を含むコード配列）
デバイス−３Ｐ電気穿孔デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）
免疫化スケジュール：
マウスを０日目に１回（第１）、ならびに１４及び２８日目に追加刺激の合計３回、ＤＮＡで免疫化した。ＤＮＡの第３の免疫化の１週間後、免疫分析を実施した。
注入方法−筋肉内
出血スケジュール−出血前ならびに１４、２８、及び３５日目
出血方法−眼窩後
群及び動物−１０匹の動物／群×３群＝３０
１）ｐＶａｘ１
２）ｐＶａｘ−１ジカｐｒｅＭＥ（配列番号２）
【００８７】
ジカｐｒＭＥワクチンによって誘発される細胞免疫応答
ｐｒＭＥ抗原を覆うペプチドプールに対して、ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによってスパイク特異的ＣＤ８  Ｔ−リンパ球応答を評価した。図１１及び１２を参照されたい。各群における平均応答は、第３の免疫化の１週間後である。エラーバーは、標準誤差を示す。ｐＶａｘ対照への応答が示される。
【００８８】
マウスにおける抗体の誘導
マウスのジカｐｒＭＥワクチン接種は、ジカ−エンベロープ抗原と反応する陽性抗体応答を引き起こした。図１３及び１４を参照されたい。
【００８９】
ジカｐｒＭＥワクチンは、組み換えタンパク質Ｅ抗原への結合に基づき、マウスにおいて免疫原性であることが分かった。ウエスタンブロット分析及びＥＬＩＳＡによって、免疫化された動物においてセロコンバージョンが観察された。
【００９０】
実施例２：ジカウイルスｐｒＭＥに対する新規のＤＮＡワクチンは、インビボで防御免疫を誘導する。
ジカウイルスのプレ膜＋エンベロープタンパク質を標的とする新規の合成ＤＮＡコンセンサスベースのワクチンが、本明細書に記載される。構築物発現の確認後、電気穿孔を通してマウス及び非ヒト霊長類を免疫化し、ワクチン接種された動物における中和活性と共に、細胞性免疫及び液性免疫の両方の誘導を示す。ＩＦＮ−α／β  Ｒ−／−マウスにおいて、単回または２回のいずれかの注入免疫化が、この致死的な攻撃接種モデルにおける体重減少または死亡に対して１００％防御性であった。これは、人体試験に承認された最初のジカウイルスワクチンを表す。
【００９１】
ここで、材料及び方法を説明する。
【００９２】
細胞、ウイルス、及び動物
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）＃ＣＲＬ−Ｎ２６８，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及びＶｅｒｏ  ＣＣＬ−８１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−８１）細胞を維持し、コンフルエンス後に継代した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したイーグル最小必須培地（ＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ−ｃｅｌｌｇｒｏ）中で、神経細胞性腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１）及びＵ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）を維持し、コンフルエンス後に継代した。ジカウイルス株ＭＲ７６６（Ｄｒ．Ｓｕｓａｎ  Ｗｅｉｓｓより寄贈）及びＰＲ２０９（Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ）の両方がＶｅｒｏ細胞内で増幅し、ストックをＶｅｒｏ細胞に対する標準的なプラークアッセイによって滴定した。
【００９３】
Ｃ５７／ＢＬ６及びＩＦＮＡＲ−／−マウスならびにアカゲザルの処置をケタミン麻酔下で実施した。湿度、温度、及び光（１２時間の明／１２時間の暗サイクル）の制御された条件下で、社会的相互作用を可能にした隣接する個々の霊長類ケージに動物を収容した。食物及び水は、自由に摂取させた。動物を１日２回監視し、市販のサル用チュー、トリート、及び果物を１日２回供給した。
【００９４】
ＤＮＡワクチン構築物及び合成
ジカ−ｐｒＭ＋ＥｎｖプラスミドＤＮＡ構築物は、膜（ｐｒＭ）及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質の全長前駆体をコードする。コンセンサス戦略を使用し、現在のジカｐｒＭ＋Ｅタンパク質配列の整列によってコンセンサス配列を決定した。ヒトにおける発現の強化のためにワクチンインサートを遺伝的に最適化し（すなわち、コドン及びＲＮＡ最適化）、発現を促進するためにＩｇＥリーダー配列を付加した。構築物を商業的に合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）、次いで、以前に記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローン化した。最終構築物は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンと名付けられ、対照プラスミド骨格は、ｐＶａｘ１である。加えて、ＭＲ７６６及び２０１６  Ｂｒａｚｉｌｉｎ発生株由来のｐｒＭ及びＥｎｖ遺伝子をコードする多くの他の一致したＤＮＡ構築物もまた、さらなる評価のために設計した。Ｉｎｏｖｉｏ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）によってＤＮＡ構築物の大規模増幅を実施し、精製したプラスミドＤＮＡを免疫化のために水中で製剤化した。アガロースゲル電気泳動を介して、ＤＮＡインサートのサイズを確認した。ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアを使用したＣｌｕｓｔａｌＷを用いた多重整列（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）によって、系統発生分析を実施した。
【００９５】
ＤＮＡ免疫化及び電気穿孔
マウス免疫原性研究：インビボＥＰ送達を用いて前脛骨筋に送達される全容積２０〜３０μＬの水中２５μｇのＤＮＡで、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）及びＩＦＮＡＲ−／−マウス（５〜７週齢）を免疫化した（ｎ＝４）。免疫化の直後に、同じ部位にＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応定電流ＥＰデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＰＡ）を用いてインビボＥＰを送達した。三つ又ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ低侵襲デバイスを筋肉に約２ｍｍ挿入した。２６ゲージの固体ステンレス鋼電極からなる三角形３電極アレイを通じて方形波パルスを送達し、１秒の遅延によって分離した５２マイクロ秒／パルスにわたって、２つの０．１アンペア定電流パルスを送達した。ＥＰの使用に関するさらなるプロトコルは、すでに詳述されている。マウスを２週間の間隔で３回免疫化し、最終免疫化の１週間後に屠殺した。細胞性及び液免疫応答の分析のために各免疫化後に血液を採取した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。アカゲザル免疫原性研究：５匹のアカゲザルを２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いて、４週間置いて２回、２つの部位においてＩＤ免疫化した。マウス免疫化に関して記載される同じデバイスを使用して、ＥＰをすぐに送達した。
【００９６】
ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおける攻撃接種研究
ＩＦＮＡＲ−／−マウスを３つの群に分けた。マウスの第１の群を１回免疫化し、免疫化の２週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ  ＰＲ２０９を用いて攻撃接種した。マウスの第２の群を２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の１週間後に１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ  ＰＲ２０９を用いて攻撃接種した。マウスの第３の群を２週間の間隔で２回免疫化し、第２の免疫化の１週間後に２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ  ＰＲ２０９を用いて攻撃接種した。攻撃接種後、動物を計量し、皮下に位置する温度チップによって体温を毎日測定した。加えて、１日２回、疾病の臨床兆候（可動性の低下、猫背の姿勢、後肢指背歩行（部分麻痺）、一方の後肢または両方の後肢の麻痺）に関して動物を観察した。愛護に基づく安楽死の基準は、２０％の体重減少または任意の異常な臨床兆候の観察からなった。
【００９７】
ウエスタンブロット及び免疫蛍光アッセイ
インビトロ発現研究のために、製造業者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従ってＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ試薬を使用して、トランスフェクションを実施した。簡潔に、３５ｍｍ皿において細胞を５０％コンフルエンスまで成長させ、１ｕｇのジカｐｒＭＥワクチンを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解した。すでに記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、ウエスタンブロットを使用して、採取した細胞溶解物からのジカｐｒｅＭ＋Ｅｎｖタンパク質の発現を検証した。
【００９８】
ウエスタンブロット分析を使用して、マウス及びＲＭ免疫血清の特異性を確認した。３〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、５μｇまたは１ｕｇのＺＩＫＶ  Ｅｎｖ組み換えタンパク質及びＯｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量マーカー（製品番号９２８−４００００）を搭載した。ＭＯＰＳ緩衝液中で５０分間、２００Ｖでゲルを実行した。ｉＢｌｏｔ  ２  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した。膜を室温で１時間、ＰＢＳ  Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遮断した。抗フラビウイルス型抗原（ＭＡＢ１０２１６−Ｃｌｏｎｅ  Ｄ１−４Ｇ２−４−１５）抗体を１：５００に希釈して、ワクチン発現を検出し、マウス及びＲＭからの免疫血清を、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を有するＯｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液中で１：５０に希釈し、４℃で一晩膜を用いてインキュベートした。膜をＰＢＳＴで洗浄し、次いで、室温で１時間、マウス血清に対して１：１５，０００の希釈で、適切な二次抗体［マウス血清及びフラビウイルス抗体に対してヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＣＷ（ＬＩＣＯＲ）、ならびにＲＭ血清に対してヤギ抗ヒトＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩＣＯＲ）］を用いてインキュベートした。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像装置（ＬＩ−ＣＯＲ）上で撮像した。
【００９９】
免疫蛍光アッセイに関して、ＨｅＬａまたはＶｅｒｏ細胞をカバースリップ上で成長させ、５μｇのジカｐｒｅＭ＋Ｅｎｖワクチンでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を４％  ＰＦＡで１５分間固定した。次いで、室温で１時間、ＰＢＳ中で希釈した正常ヤギ血清を用いて、非特異的結合を遮断した。次いで、スライドをＰＢＳ中で５分間洗浄し、続いて４℃で一晩、１：１００の希釈で、免疫化されたマウスまたはＲＭからの血清を用いてインキュベートした。上記のようにスライドを洗浄し、室温で１時間、１：２００の希釈で、適切な二次抗体［マウス血清に対してヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８（Ｓｉｇｍａ）、及びＲＭ血清に対してヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８］を用いてインキュベートした。洗浄後、ＤＡＰＩを有するＦｌｏｕｒｏｓｈｉｅｌｄ封入培地（Ａｂｃａｍ）を添加して、全ての細胞核を染色した。その後、カバースリップを載置し、スライドを顕微鏡（ＥＶＯＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下で観察した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。加えて、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、またはＵ８７−ＭＢ細胞を、４チャンバ組織培養処理ガラススライド（Ｆａｌｃｏｎ  ｃａｔ＃３５４１１４）上で成長させ、４〜６日間０．０１のＭＯＩでＭＲ７６６  ＺＶを用いて感染させ、次いで上記のように染色した。
【０１００】
脾細胞及びＰＢＭＣ単離
脾細胞の単細胞懸濁液を全てのマウスから調製した。簡潔に、１０％  ＦＢＳ（Ｒ１０）を補充した５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中で、マウスからの脾臓を個々に採取し、次いで、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  ８０パドルブレンダー（Ａ．Ｊ．Ｓｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて高速で３０秒間処理した。処理した脾臓試料を、４５ｍｍナイロンフィルタを通して濾過し、次いで、４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、室温で５分間、５ｍＬのＡＣＫ（アンモニウム−塩化物−カリウム）溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、次いで、ＰＢＳを添加して反応を停止した。試料を４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで再び遠心分離した。細胞ペレットを、１×１０７細胞／ｍＬの濃度で、Ｒ１０中で再懸濁させ、次いでＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びフローサイトメトリ分析で使用する前に４５ｍｍナイロンフィルタに通した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。ＲＭに関して、血液（各時点において２０ｍＬ）をＥＤＴＡ管中で採取し、Ａｃｃｕｓｐｉｎ管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、標準的なフィコール−ハイパック手順を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
【０１０１】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
簡潔に、９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗マウスＩＦＮ−γ捕捉Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で覆い、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％  ＢＳＡで２時間遮断した。ｐＺＶ−ｐｒＭ＋Ｅｎｖで免疫化されたマウスからの２０万個の脾細胞を各ウェルに添加し、培地単独（陰性対照）、ＰＭＡ／イオノマイシンを有する培地（陽性対照）、または９個のアミノ酸による１５ｍｅｒ重複からなり、ジカエンベロープタンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の長さに及ぶペプチドプール（１μｇ／ｍＬ）を有する培地の存在下で、５％  ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、次いで、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ  Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、次いで、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、５−ブロモ−４−クロロ−３′−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩及びニトロブルーテトラゾリウムクロリド（色原体呈色試薬、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。最後に、プレートを蒸留水で洗い流し、室温で乾燥させ、スポット形成単位を自動ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り装置（ＣＴＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって定量化し、未処理の値を１００万個の脾細胞当たりのＳＦＵに正規化した。ＲＭ試料に関して、サルＩＦＮ−γ用のＥＬＩＳＰＯＴＰＲＯ（ＭＡＢＴＥＣＨ）を製造業者によって説明されるように使用し、２０万個のＰＢＭＣをペプチドプールで刺激し、プレートを洗浄し、以前に記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２；Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１２０１１，ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ  ５：ｅ９２８）、スポットを発現させ、計数した。
【０１０２】
液性免疫応答：抗体結合ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、すでに記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、マウス及びＲＭ血清の力価を決定した。簡潔に、１μｇ／ｍＬの精製ジカエンベロープタンパク質を使用して、４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を覆った。少なくとも１時間ＰＢＳ中１０％  ＦＢＳで遮断した後、プレートを０．０５％  ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。免疫化されたマウス及びＲＭからの血清試料を１％  ＦＢＳ、０．２％  ＰＢＳＴ中で順次に希釈し、プレートに添加し、次いで、室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％  ＰＢＳＴ中で再び４回洗浄し、次いで、室温で１時間、マウス血清に対して１：３５０００の希釈で、ＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。ＲＭ血清に関して、抗サルＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を室温で１時間、１：５０００の希釈で使用した。製造業者の使用説明書（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）錠を添加することによって、結合した酵素を検出した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、１５分後に反応を停止した。次いで、プレートを４５０ｎｍの光学濃度で読み取った。全てのマウス血清及びＲＭ血清試料を二つ組で分析した。Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌによって記載される方法（Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２１：３５−４１）を使用して、エンドポイント力価を決定した。
【０１０３】
中和（ＰＲＮＴ５０）アッセイ
ＭＲ７６６及びＶｅｒｏ細胞を含むプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）は、すでに記載されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９３：１６５８−６５）。簡潔に、マウスまたはＲＭ血清を血清無含有ＤＭＥＭ中で順次に希釈し（１：１０〜１：１２８０）、３７℃で２時間、等容積のＭＲ７６６ジカウイルス（１００ｐｆｕ）でインキュベートした。混合物をＶｅｒｏ細胞の融合層に添加し、２時間吸着のために３７℃でそのままにした。２×ＤＭＥＭ培地：軟寒天（１：１）重層を細胞上に添加し、プレートを３７℃で５日間インキュベートした。寒天重層をウェルから除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、１×ＰＢＳで洗浄し、プレートを乾燥させた。２４ウェルプレート内で行われたアッセイにおけるプラークを手動で計数した。９６ウェルプレート内で行われたアッセイにおけるプラークを自動Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ読み取り装置（ＣＴＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）でスキャンし、試料ウェル中のプラークならびに陰性対照（ＤＭＥＭのみ）及び陽性対照（１００ｐｆｕのＭＲ７６６ジカウイルスのみ）中のプラークを、ＥＬＩＳｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒが備わった自動ソフトウェアを使用して計数した。プラーク減少のパーセントを以下のように計算した。％減少＝１００×［１−（各希釈に対するプラークの平均数／陽性対照ウェル中のプラークの平均数）］。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、％プラーク減少対各個々の血清希釈のログ変換の非線形回帰分析を実施して、ワクチン接種応答後のピークにおける実際の５０％  ＰＲＮＴ力価の線形補間を促進した。５０％中和における中央値及び四分位範囲を各中和標的に対して、全体的にかつワクチン処置群によって計算し、幾何平均力価も計算した。力価は、プラーク数の５０％減少をもたらす最高希釈の逆数を表す。
【０１０４】
フローサイトメトリ及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
脾細胞を９６ウェルプレート（２×１０６／ウェル）に添加し、タンパク質輸送阻害剤カクテル（ブレフェルジンＡ及びモネンシン）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で、３７℃／５％  ＣＯ２で５時間、ジカｐｒｅＭ及びエンベロープでプールされたペプチドを用いて刺激した。細胞刺激カクテル（加えてタンパク質輸送阻害剤）（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びモネンシン）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を陽性対照として、及びＲ１０培地を陰性対照として使用した。次いで、製造業者の使用説明書（ＢＤ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって記載されるように、全ての細胞を表面及び細胞内タンパク質に対して染色した。簡潔に、蛍光色素共役抗体を用いた表面染色の前に、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のアジ化ナトリウム及び１％  ＦＣＳを含有するＰＢＳ）中で細胞を洗浄した。製造業者のプロトコルに従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｔｙｏｐｅｒｍ  ＴＭ（ＢＤ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、固定し、かつ透過化し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色のために使用した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ４５０；クローン１Ｄ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ；クローンＲＭ４−５；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７；クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ４４（ＢＶ７１１；クローンＩＭ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞内染色のために、以下の抗体を使用した。ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α（ＰＥ；クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１４５−２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＩＬ−２（ＰｅＣｙ７；クローンＪＥＳ６−ＳＨ４；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して全てのデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。
【０１０５】
統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ，Ｐｒｉｓｍ  ４（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を統計分析のために利用した。Ｌｏｇ１０変換をエンドポイント結合ＥＬＩＳＡ力価及び全ウイルスＰＲＮＴ５０力価に適用した。
【０１０６】
これらの実験の結果をここで説明する。
【０１０７】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築
ジカｐｒＭ（前駆体膜）及びＥ（エンベロープ）遺伝子（ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ）のコンセンサス配列を、ヒトにおける感染を引き起こした、１９５２〜２０１５年の間に単離された様々なジカからのｐｒＭ及びＥ配列を使用して生成した（図１６Ａ）。追加の修飾後、ジカ−ｐｒＭＥコンセンサス配列をｐＶａｘ１ベクターにクローン化し、効率の高い免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダーペプチド配列の付加を含む最適化を行って、そのインビボ発現を改善した（図１６Ｂ）。エンドヌクレアーゼ制限消化及び遺伝子配列決定を使用して、最終ワクチンプラスミドを検証した（図１６Ｃ）。８４トランスフェクションの４８時間後、ワクチンでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から、ウエスタン分析及び間接免疫蛍光アッセイを実施することによって、プラスミドからのジカ−ｐｒＭＥタンパク質の発現を確認した（図１６Ｄ及び１６Ｅ）。
【０１０８】
ジカ−ｐＭＥ  ＤＮＡワクチンは、マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞または機能的液性応答を誘導する。
ジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンが細胞免疫応答を誘導する能力を評価した。記載されるように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、筋肉内注入、続いて、９２の送達部位における電気穿孔（ＥＰ）によって、２週間の間隔で３回、対照プラスミド骨格（ｐＶａｘ１）またはジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンのいずれかを用いて、５匹のＣ５７／ＢＬ６マウスの群を免疫化した。第３の注入の１週間後に動物を屠殺し、各動物から採取したバルク脾細胞を、それらがジカ−Ｅｎｖを包含するペプチドプールへのエクスビボ曝露後にインターフェロン−γを分泌する能力に関して、標準的な酵素結合ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアッセイで評価した。アッセイの結果は、ジカ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの脾細胞が、複数のジカ−Ｅｎｖペプチドプールでの刺激後に明確な細胞免疫応答をもたらしたことを示す（図１７Ａ）。全ジカ−ｐｒＭＥタンパク質に及ぶ１５ｍｅｒ（１１個のアミノ酸による重複）からなる２２個のペプチドプールを使用した、マトリクス形式でのマッピング分析ＥＬＩＳｐｏｔによって、最も強力な細胞性応答（複数可）を誘発したジカ−Ｅｎｖの領域（複数可）を評価した。図１７Ｂに見られるように、いくつかのプールは、高いＴ細胞応答を誘導したが、ペプチドプール１５は、１０６応答当たり最高のＳＦＵを誘導した。マッピングデータは、配列に対する１つの優性ｐｒＭＥエピトープ『ＩＲＣＩＧＶＳＮＲＤＦＶＥＧＭ（配列番号１８）』を明らかにした。免疫エピトープデータベース分析リソースＩＤＥＰコンセンサスツールを使用して、列挙された優性ペプチドが１つのＨ２−Ｄｂ制限エピトープを含有することを確認し、この抗原の効果的な処理を示唆する。
【０１０９】
ジカ−ｐｒＭＥワクチンの細胞免疫原性のさらなる評価は、最終免疫化の１週間後に採取したＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能特性の決定を伴った。結果は、ジカ−ｐｒＭＥワクチンが腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びＩＦＮ−γを発現させる二機能性ワクチン特異的Ｔ細胞の割合を増加させたことを示す（図１７Ｃ）。重要なことには、ジカ−ｐｒＭＥワクチン接種は、Ｔ細胞機能性を拡張する強力な能力を呈した。比較研究のために近年特定されたブラジルジカ株または元のＭＲ７６６ジカ株のいずれかのｐｒＭＥ配列をコードするプラスミド１１５を用いて、さらなるワクチン研究を実施した。図１７Ａで使用された同じジカ−ｐｒｅＭＥペプチドプールを用いた脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって、第３の注入の一週間後に、いずれかのプラスミドで免疫化されたマウスにおける細胞免疫応答の誘導を測定した。結果は、新規のコンセンサスジカ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン構築物によって誘導されるＴ細胞応答及び抗体応答が、これらの２つの非コンセンサスプラスミドワクチンのいずれかによって生成された応答よりも少なくとも２倍高かったことを示す（図１８Ａ及び１８Ｂ）。ブラジルワクチンまたはＭＲ７６６  ｐｒＭＥワクチンのいずれかによって誘導された細胞性応答の詳細なマッピング分析は、両方が、コンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドに対して図１７Ｂで特定された優性Ｅｎｖ特異的ＣＴＬエピトープに対して、それらの最も有意な細胞性応答も誘導したことを明らかにした（データは図示せず）。全体的に、コンセンサス免疫原は、これらのアッセイにおいて一貫してより堅固であるように思われ、さらに研究した。
【０１１０】
コンセンサスジカ−ｐｒＭＥワクチンがマウスにおける液性免疫応答を誘導する能力を評価した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの群を、２５μｇの空の対照プラスミドまたはコンセンサスジカｐｒＭＥワクチンプラスミドのいずれかを用いて、２週間の間隔で３回、筋肉内注入によって免疫化し、続いてＥＰした。０日目（第１の免疫化前）、１４日目（第１の免疫化の２週間後）、２１日目（第２の免疫化の１週間後）、及び３５日目（第３の免疫化の１週間後）に、注入した各マウスから血清を得た。捕捉抗原として固定化ｒＺＩＫＡ−Ｅｎｖを使用して、ＥＬＩＳＡによって、採取した各血清をジカ特異的ＩｇＧ応答に関して試験した。抗ジカ特異的ＩｇＧの有意な増加が２１日目に観察され、血清ＩｇＧレベルにおけるさらなる追加刺激が３５日目の血清に見られた（図１９Ａ）。ワクチン接種された動物からの１３８  ６０日目の血清は、３５日目に見られる高い抗体応答が最終追加刺激後に長期間維持されたことを示す。最も重要なことには、ワクチン接種されたマウスからの血清が、エンドポイント力価によって示されるように非常に高いレベルの抗体を含有した（図１９Ｂ）。ウエスタン分析によってｒＺＩＫＡ−Ｅを検出する能力（図１９Ｃ）、及び免疫蛍光アッセイによってジカ感染細胞を染色する能力（図１９Ｄ）に関して、３５日目のプールされた血清をスクリーニングすることによって、ワクチンによって誘導された抗体の特異性の追加の評価を実施した。これらの分析の両方からの結果が特異性を確認した。
【０１１１】
さらに、上記のように、ブラジル株及びＭＲ７６６株からのｐｒＭＥ配列をコードするプラスミドを用いて免疫化されたマウスにおいて、ジカ特異的結合抗体応答もまた評価した。偽免疫化またはワクチンで免疫化されたマウスからの３５日目の血清を、ｒＺＩＫＡ−Ｅへの結合に関してＥＬＩＳＡで分析した。この分析は、両方のプラスミドが有意な抗体結合を誘導したこと（図１８Ｃ及び１８Ｄ）、ならびにコンセンサスジカ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いた免疫化が、異種ジカエンベロープへの親和性が増加した良好な液性応答をもたらすことを示す。
【０１１２】
ＤＶ、ＷＮＶ、及び他のフラビウイルスを分析するためのすでに記載されている技術から適応された方法を使用して、空のｐＶａｘ１、コンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチン、またはコンセンサスジカ−カプシドプラスミドワクチンのいずれかを用いて、３回免疫化したマウスからの３５日目のプールされた血清に対して、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイを実施した。図１９Ｅに示されるように、第３のワクチン接種後の抗ジカ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価は、ジカ−カプシドＤＮＡワクチンまたは対照ＤＮＡ  ｐＶａｘ１を受けたマウスよりも、１６０がジカ−ｐｒＭＥワクチンを受けたマウスにおいて有意に高かった。本実験で使用したジカ−ｐｒＭＥワクチンによって誘導された中和抗体は、ＰＲＮＴ５０力価＝４５６を有した。ウイルスプラークの代表的な写真は、１：１００の希釈の血清に関して下部に示される。
【０１１３】
非ヒト霊長類におけるジカ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンによって誘発される細胞性及び液性応答
皮内（ＩＤ）免疫化によってＮＨＰを免疫化し、続いて電気穿孔し、これは、この方法がＤＮＡワクチンによって抗原特異的液性免疫応答を増強し得ることを示す以前の研究に基づく。アカゲザル（ＲＭ；ｎ＝５／群）に、ＥＰで２．０ｍｇのワクチンプラスミドＩＤを投与し、０日目（第１の免疫化前の免疫化前）、２週目（第１の免疫化の２週間後）、６週目（第２の免疫化の２週間後）にＲＭから血清及びＰＢＭＣを採取した。ワクチンによって誘導された細胞免疫応答を測定するために、図１７Ａで使用したジカ−Ｅペプチドプールを用いてエクスビボで刺激された６週目のＰＢＭＣに、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を実施した。結果は、ジカｐｒＭＥ免疫化が全てのＲＭにおいて抗ジカＴ細胞応答を追加刺激し、免疫前血清における応答と比較してそれらの抗原認識を広げたことを示す（図２０Ａ）。
【０１１４】
ＩＤ＋ＥＰでワクチン接種されたＲＭからの血清１８１における特異的抗ジカウイルス抗体応答をＥＬＩＳＡによって評価した。一次ワクチン接種後、ジカ−Ｅｎｖ特異的結合抗体は、第１の免疫化の２週間後にＲＭにおいて検出可能であり、後続の免疫化でさらに追加刺激した（図２０Ｂ）。同じ免疫化後の時点からのワクチン接種されたＲＭからの血清を希釈して、エンドポイント力価を研究し、ｒＺＩＫＡ−Ｅｎｖを再び分析した（図２０Ｃ）。ワクチン接種された群からのプールされたＲＭ血清を使用して、ＥＬＩＳＡ結果をウエスタン分析によって確認した（図２０Ｄ）。さらに、免疫化されたＲＭからの血清もまた、免疫蛍光アッセイにおいてジカ−ＭＲ７６６に感染したＶｅｒｏ細胞を認識することが可能であった（図２０Ｅ）。次に、ジカで免疫化されたＲＭからの血清における中和抗体（ｎＡｂ）応答を検出することが試みられた。ＰＲＮＴ５０（対照ジカ感染の５０％が阻害された血清希釈の逆数）をＮＡｂ活性に関して試験するために使用し、各個々の免疫化された動物に対して実施した。アッセイの検出の限界であった１０未満の抗体力価を有する試料を、動物の各群に割り当てた。興味深いことに、ジカ−ｐｒＭＥで免疫化されたサルは、１６１〜１３８０に及ぶ力価を有した（平均５０１±２２４）（図２１Ａ）。
【０１１５】
ＮＨＰ免疫血清がジカに感染した神経芽腫細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）及び神経前駆細胞（Ｕ−８７ＭＧ）における感染を遮断する能力は重要である。対照またはワクチン血清によるＭＲ７６６またはＰＲ２０９を有する細胞株を感染に関して、２４時間後に分析した。ワクチン接種されたＲＭからの血清は、感染後に両方の細胞株においていずれのウイルスも阻害した（１．０の感染多重度）（図２１Ｂ及び２１Ｃ）。これらのデータは、ジカ感染を阻害するジカ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡをワクチン接種されたＲＭからの血清の有効性を裏付ける。
【０１１６】
ジカｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンで免疫化された、Ｉ型インターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ）を欠いたマウスにおけるジカ特異的機能的免疫応答及びジカウイルスに対する防御
ジカで誘導された疾病及び免疫の機構は、はっきりと定義されず、ジカ感染に対する免疫応答の仮説的な病原性に対する防御は、今のところ不明瞭である。マウスのほとんどの株は、ジカ感染に耐性を示すが、ＩＦＮ−α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を欠いたマウスは、感染及び疾病にかかりやすく、６〜７日間の攻撃接種１６以内に最も死亡したことが分かった。コンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンがこのマウス株において細胞性及び液性免疫応答を誘導する能力を調査した。空の対照プラスミドを用いて、またはコンセンサスジカ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、２週間の間隔で３回、ＥＰによってＩＦＮＡＲマウスの群を免疫化した。０、１４、２１、及び３５日目に、免疫化されたマウスから血清を採取し、最終免疫化の１週間後に、脾細胞をマウスから採取した。ワクチンで免疫化されたＩＦＮＡＲマウスからの脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける１０６個の細胞当たりのＳＦＵレベルによって示されるように、明確な細胞免疫応答をもたらした（図２２Ａ）。ｒＺＩＫＡ−Ｅｎｖを捕捉抗原として使用するＥＬＩＳＡからの結果は、動物が１４日目までに検出可能な抗ジカ血清ＩｇＧを有したことを示し、これらのレベルを後続の採取時間において追加刺激した（図２２Ｂ）。ワクチン接種されたマウスからの血清は、エンドポイント力価によって示されるように、有意なレベルの抗体を含有した（図２２Ｂ）。結果は、コンセンサスジカ−ｐｒＭＥワクチンで免疫化されたＩＦＮＡＲマウスが、抗ジカ細胞性及び液性免疫応答を可能にすることを示し、この潜在的な攻撃接種モデルにおけるワクチン防御に関するさらなる研究を支持する。
【０１１７】
予備的研究において、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｖ）、頭蓋内（ｉ．ｃ．）、及び静脈内（ｉ．ｖ）投与された１×１０６ＰＦＵのＰＲ２０９分離株を用いて、ＩＦＮＡＲマウスに攻撃接種した。攻撃接種後、全ての動物を、毎日の体重、体温測定の記録、ならびに後肢虚弱及び麻痺などの瀕死状態の他の兆候を含む臨床兆候に関して監視した。接種後の最初の２日間、マウスの全身外観の変化は観察されなかった。しかしながら、３日目以降、４つ全ての感染経路が、活性の低下、可動性の低下、猫背の姿勢を示し、後肢虚弱、水分摂取の低下、及び明らかな体重減少を伴った。攻撃接種部位に関わらず、動物は６日目〜８日目の間に感染で死亡し、この攻撃接種用量を後続の研究で利用した。
【０１１８】
ワクチン接種された動物の２つの群（１群当たり１０匹）またはｐＶａｘ１で免疫化された対照の２つの組に、０日目に１×、及び１４日目に１×をワクチン接種し、１×１０６ＰＦＵまたは２×１０６ＰＦＵのＰＲ２０９のいずれかを用いて、２１日目に攻撃接種した（図２３Ｂ及び２３Ｃ）。ワクチン接種された動物の１００％が生存した一方で、１×１０６ＰＦＵを攻撃接種された対照のわずか３０％、または２×１０６ＰＦＵを攻撃接種された対照のわずか１０％が生存した。次に、動物の群を１×で免疫化し、免疫化後の１４日目に、それらに攻撃接種した。これらの動物の１００％が生存した一方で、対照動物の１０％が生存した。ジカ−ｐｒＭＥを１回ワクチン接種され、次いでジカウイルスを用いて攻撃接種された全てのマウスが、致死的な攻撃接種から防御された（図２３Ａ）。全ての攻撃接種において、ワクチン接種された動物はまた、疾病の兆候を呈さず、体重減少から防御された（図２３Ｄ）。ジカウイルスを用いた対照マウスの感染は、多くの場合、可動性の低下、猫背の姿勢、後肢指背歩行、及び／または有意な死亡率を伴う両方の後肢の麻痺と組み合わせて、著しい体重減少をもたらした（図２３Ｅ及び２３Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＺＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン媒介免疫応答がジカ攻撃接種に対してマウスを防御することを示す。
【０１１９】
本研究において、ｐｒＭＥをＤＮＡベースのワクチンから産生された抗原として使用し、加えて電気穿孔した液性及び細胞性応答が、齧歯動物及び非ヒト霊長類において立証された。ＥＰ送達アプローチによる強化されたＤＮＡワクチン技術の最適化は、堅固かつ幅広い免疫応答の刺激において有効であり、単回の免疫化は、ＩＦＮＡＲマウスにおける疾病及び死亡に対して防御性であった免疫を誘導した。この研究は、この深刻な新しいウイルス感染に対する柔軟かつ迅速に臨床的に実行可能なＤＮＡワクチン接種戦略を使用して、防御免疫が生成され得ることを裏付ける。
【０１２０】
実施例３：受動的抗体移入を通したＺＩＫＶ感染及び病因に対するインビボ防御、ならびにｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡワクチンを用いた活性免疫化
本研究において、ＺＩＫＶのプレ膜＋エンベロープタンパク質（ｐｒＭＥｎｖ）を標的とする新規の合成ＤＮＡワクチンを生成し、インビボ有効性に関して評価した。プラスミド構築物の初期のインビトロ発生及び評価研究後に、電気穿孔を介した強化ＤＮＡ送達を通して、このｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡベースの免疫原を用いて、マウス及び非ヒト霊長類を免疫化した。ワクチン接種された動物は、抗原特異的細胞性及び液性免疫ならびに中和活性をもたらすことが分かった。インターフェロン（ＩＦＮ）−α／β受容体を欠いたマウス（指定されたＩＦＮＡＲ−／−）において、このＤＮＡワクチンを用いた免疫化は、インビボウイルス攻撃接種後に、脳組織内のウイルス病理を予防することに加えて、感染に関連した体重減少または死亡に対して１００％の防御を誘導した。加えて、非ヒト霊長類抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動的移入は、後続のウイルス攻撃接種に対してＩＦＮＡＲ−／−マウスを防御した。病原性マウスモデルにおけるこのＺＩＫＶワクチンのこの初期研究は、ＺＩＫＶ感染におけるｐｒＭＥを標的とする免疫応答の重要性を裏付け、このワクチンアプローチに対する追加の研究が、ヒトにおけるＺＩＫＶ対照に関連性があり得ることを示唆する。
【０１２１】
ここで、材料及び方法を説明する。
【０１２２】
細胞、ウイルス、及び動物
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１％ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；Ｇｉｂｃｏ−Ｑ３  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ヒト胚腎臓２９３Ｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）＃ＣＲＬ−Ｎ２６８，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）及びＶｅｒｏ  ＣＣＬ−８１（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−８１）細胞を維持し、コンフルエンス後に継代した。ジカウイルス株ＭＲ７６６（Ｄｒ  Ｓｕｓａｎ  Ｗｅｉｓｓより寄贈）及びＰＲ２０９（Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ）の両方がＶｅｒｏ細胞内で増幅し、ストックをＶｅｒｏ細胞に対する標準的なプラークアッセイによって滴定した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｗｉｓｔａｒ及びＰｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ  ＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに従って、５〜６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＩＦＮＡＲ−／−（ＭＭＲＲＣリポジトリ−Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスを収容し、温度制御された光サイクルの施設で処理／ワクチン接種した。
【０１２３】
Ｂｉｏｑｕａｌ，ＭＤ，ＵＳＡにおいて、ＲＭを収容し、処理／ワクチン接種した。Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＩＨ，ｔｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅに記載される勧告に厳密に従って、この研究を実施した。全ての動物免疫化作業は、Ｂｉｏｑｕａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。Ｂｉｏｑｕａｌは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって認定されている。獣医従事者の監督下で、訓練を受けた者によってケタミン麻酔下で全ての手順を実施し、『Ｗｅａｔｈｅｒａｌｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ』の勧告に従って、動物愛護を保護し、動物の苦痛を最小限に抑えるためにあらゆる努力をした。湿度、温度、及び光（１２時間の明／１２時間の暗サイクル）の制御された条件下で、社会的相互作用を可能にした隣接する個々の霊長類ケージに動物を収容した。食物及び水は、自由に摂取させた。訓練を受けた者によって、動物を１日２回監視し、市販のサル用チュー、トリート、及び果物を１日２回供給した。
【０１２４】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンの構築
膜（ｐｒＭ）＋エンベロープ（Ｅ）及びカプシドタンパク質の全長前駆体をコードするＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドＤＮＡ構築物を合成した。コンセンサス戦略を使用し、現在のＺＩＫＶ  ｐｒＭＥタンパク質配列の整列によってコンセンサス配列を決定した。ヒトにおける発現の強化のためにワクチンインサートを遺伝的に最適化し（すなわち、コドン及びＲＮＡ最適化）、発現を促進するためにＩｇＥリーダー配列を付加した。構築物を商業的に合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ，ＵＳＡ）、次いで、以前に記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下で修飾ｐＶａｘ１発現ベクターにサブクローン化した。最終構築物は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンと名付けられ、対照プラスミド骨格は、ｐＶａｘ１である。加えて、ＭＲ７６６（ＤＱ８５９０５９．１）及び２０１６  Ｂｒａｚｉｌｉｎ（ＡＭＡ１２０８４．１）発生株由来のｐｒＭ及びＥ遺伝子をコードする多くの他の一致したＤＮＡ構築物もまた、さらなる評価のために設計した。Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）によってＤＮＡ構築物の大規模増幅を実施し、精製したプラスミドＤＮＡを免疫化のために水中で製剤化した。アガロースゲル電気泳動を介して、ＤＮＡインサートのサイズを確認した。ＭＥＧＡバージョン５ソフトウェアを使用したＣｌｕｓｔａｌＷを用いた多重整列（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）によって、系統発生分析を実施した。
【０１２５】
ＤＮＡ免疫化及び電気穿孔を介した送達強化
インビボ電気穿孔送達を用いて前脛骨筋に送達される全容積２０〜３０μＬの水中２５μｇのＤＮＡで、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）及びＩＦＮＡＲ−／−マウス（５〜６週齢）を免疫化した。ＤＮＡ注入の直後に、同じ部位にＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応定電流電気穿孔デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いてインビボ電気穿孔を送達した。三つ又ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ低侵襲デバイスを筋肉に約２ｍｍ挿入した。２６ゲージの固体ステンレス鋼電極からなる三角形３電極アレイを通じて方形波パルスを送達し、１秒の遅延によって分離した５２μｓ／パルスにわたって、２つの０．１アンペア定電流パルスを送達した。電気穿孔の使用に関するさらなるプロトコルは、すでに詳述されている（Ｆｌｉｎｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ５：１２６１６）。マウスを２週間の間隔で３回免疫化し、最終免疫化の１週間後に屠殺した。細胞性及び液免疫応答の分析のために各免疫化後に血液を採取した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。アカゲザル免疫原性研究：５匹のアカゲザルを２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いて、５週間の間隔で２回、２つの部位において皮内で免疫化した。マウス免疫化に関して記載される同じデバイスを使用して、電気穿孔をすぐに送達した。
【０１２６】
ウエスタンブロット分析
インビトロ発現研究のために、製造業者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ）に従ってＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ試薬を使用して、トランスフェクションを実施した。簡潔に、３５ｍｍ皿において細胞を５０％コンフルエンスまで成長させ、１μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解した。すでに記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、ウエスタンブロットを使用して、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種されたマウスからの抗フラビウイルスまたは免疫血清のいずれかを使用して、採取した細胞溶解物からのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の発現ならびにマウス及びＲＭ血清の免疫特異性を検証した。簡潔に、３〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、５μｇまたは１μｇのＺＩＫＶエンベロープ組み換えタンパク質（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）；トランスフェクトされた細胞溶解物または上清、及びＯｄｙｓｓｅｙタンパク質分子量マーカー（製品番号９２８−４００００）を搭載した。ＭＯＰＳ緩衝液中で５０分間、２００Ｖでゲルを実行した。ｉＢｌｏｔ  ２  Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した。膜を室温で１時間、ＰＢＳ  Ｏｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で遮断した。ワクチン発現を検出するために、抗フラビウイルス型抗原（ＭＡＢ１０２１６−Ｃｌｏｎｅ  Ｄ１−４Ｇ２−４−１５）抗体を１：５００に希釈し、マウス及びＲＭからの免疫血清を、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を有するＯｄｙｓｓｅｙ遮断緩衝液中で１：５０に希釈し、４℃で一晩膜を用いてインキュベートした。膜をＰＢＳＴで洗浄し、次いで、室温で１時間、マウス血清に対して１：１５，０００の希釈で、マウス血清及びフラビウイルス抗体に対して適切な二次抗体（ヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ６８０ＣＷ；ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＲＭ血清に対してヤギ抗ヒトＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてインキュベートした。洗浄後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像装置（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で撮像した。
【０１２７】
免疫蛍光アッセイ
免疫蛍光アッセイに関して、細胞をカバースリップ上で成長させ、５μｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。次いで、室温で１時間、ＰＢＳ中で希釈した正常ヤギ血清を用いて、非特異的結合を遮断した。次いで、スライドをＰＢＳ中で５分間洗浄し、続いて４℃で一晩、１：１００の希釈で、免疫化されたマウスまたはＲＭからの血清を用いてインキュベートした。上記のようにスライドを洗浄し、室温で１時間、１：２００の希釈で、適切な二次抗体（マウス血清に対してヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８、及びＲＭ血清に対してヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８；Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。洗浄後、ＤＡＰＩを有するＦｌｏｕｒｏｓｈｉｅｌｄ封入培地（Ａｂｃａｍ）を添加して、全ての細胞核を染色した。その後、カバースリップを載置し、スライドを顕微鏡（ＥＶＯＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）下で観察した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。加えて、Ｖｅｒｏ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、またはＵ８７−ＭＢ細胞を、４チャンバ組織培養処理ガラススライド上で成長させ、０．０１のＭＯＩで、ＲＭ免疫血清（１：２００）を用いて／用いずに予めインキュベートしたＺＩＫＶ−ＭＲ７６６またはＰＲ２０９を用いて感染させ、記載されるように（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｊ  Ｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ９４：１３６２−９）、ｐａｎ  ｆｌａｖｉｒｕｓ抗体を使用して、ＺＩＫＶ感染後４日目に染色した。
【０１２８】
病理組織学的分析
病理組織学のために、ホルマリン固定パラフィン包埋された脳組織を厚さ５μｍの矢状断面に分割し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に配置し、３７℃で一晩支持した。２回のキシレン変化を使用して切片を脱パラフィンし、１００％、９０％、次いで７０％エタノール中に浸漬することによって再水和した。切片を、２分間ハリスヘマトキシリン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して核構造に対して染色し、続いて、１％酸アルコール（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）中で分化し、２分間Ｓｃｏｔｔ’ｓ  ｔａｐ  ｗａｔｅｒで処理した。続いて、切片を、２分間エオシン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して細胞質構造に対して対比染色した。スライドを７０％、９０％、及び１００％エタノールで脱水し、キシレン中で除去し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して載置した。
【０１２９】
脾細胞及びＰＢＭＣ単離
脾細胞の単細胞懸濁液を全てのマウスから調製した。簡潔に、１０％  ＦＢＳ（Ｒ１０）を補充した５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０中で、マウスからの脾臓を個々に採取し、次いで、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  ８０パドルブレンダー（Ａ．Ｊ．Ｓｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて高速で３０秒間処理した。処理した脾臓試料を、４５ｍｍナイロンフィルタを通して濾過し、次いで、４℃で１０分間、１５００ｇで遠心分離した。細胞ペレットを、室温で５分間、５ｍＬのＡＣＫ（アンモニウム−塩化物−カリウム）溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、次いで、ＰＢＳを添加して反応を停止した。試料を４℃で１０分間、１５００ｇで再び遠心分離した。細胞ペレットを、Ｒ１０中で再懸濁させ、次いでＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及びフローサイトメトリ分析で使用する前に４５ｍｍナイロンフィルタに通した（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。ＲＭに関して、血液（各時点において２０ｍＬ）をＥＤＴＡ管中で採取し、Ａｃｃｕｓｐｉｎ管（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて、標準的なフィコール−ハイパック手順を使用して、ＰＢＭＣを単離した。５ミリリットルの血液も、血清単離のために各時点において血清管に採取した。
【０１３０】
フローサイトメトリ及び細胞内サイトカイン染色アッセイ
脾細胞を９６ウェルプレート（２×１０６／ウェル）に添加し、タンパク質輸送阻害剤カクテル（ブレフェルジンＡ及びモネンシン；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で、３７℃／５％  ＣＯ２で５時間、ＺＩＫＶ−ｐｒｅＭでプールされたペプチドを用いて刺激した。細胞刺激カクテル（加えてタンパク質輸送阻害剤；ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びモネンシン；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を陽性対照として、及びＲ１０培地を陰性対照として使用した。次いで、製造業者の使用説明書（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって記載されるように、全ての細胞を表面及び細胞内タンパク質に対して染色した。簡潔に、蛍光色素共役抗体を用いた表面染色の前に、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のアジ化ナトリウム及び１％  ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中で細胞を洗浄した。製造業者のプロトコルに従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｔｙｏｐｅｒｍ  ＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、固定し、かつ透過化し、続いて細胞内染色を行った。以下の抗体を表面染色のために使用した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ４５０；クローン１Ｄ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ；クローンＲＭ４−５；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７；クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ４４（ＢＶ７１１；クローンＩＭ７；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。細胞内染色のために、以下の抗体を使用した。ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α（ＰＥ；クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１４５−２Ｃ１１；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＩＬ−２（ＰｅＣｙ７；クローンＪＥＳ６−ＳＨ４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。ＬＳＲＩＩフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して全てのデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０１３１】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
簡潔に、９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗マウスＩＦＮ−γ捕捉Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で覆い、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ＋１％  ＢＳＡで２時間遮断した。免疫化されたマウスからの２０万個の脾細胞を各ウェルに添加し、培地単独（陰性対照）、ＰＭＡ／イオノマイシンを有する培地（陽性対照）、または９個のアミノ酸による１５ｍｅｒ重複からなり、ＺＩＫＶ  ｐｒＭＥタンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の長さに及ぶペプチドプール（１μｇ／ｍＬ）を有する培地の存在下で、５％  ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、細胞を洗浄し、次いで、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ  Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに添加し、次いで、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、５−ブロモ−４−クロロ−３′−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩及びニトロブルーテトラゾリウムクロリド（色原体呈色試薬、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。最後に、プレートを蒸留水で洗い流し、室温で乾燥させ、ＳＦＵを自動ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り装置（ＣＴＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって定量化し、未処理の値を１００万個の脾細胞当たりのＳＦＵに正規化した。ＲＭ試料に関して、サルＩＦＮ−γ用のＥＬＩＳＰＯＴＰＲＯキット（ＭＡＢＴＥＣＨ）を製造業者によって説明されるように使用し、２０万個のＰＢＭＣをペプチドプールで刺激し、プレートを洗浄し、以前に記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、スポットを発現させ、計数した。
【０１３２】
液性免疫応答：抗体結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用して、すでに記載されているように（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）、マウス及びＲＭ血清の力価を決定した。簡潔に、１μｇの精製ｒＺＩＫＶ−Ｅタンパク質を使用して、４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を覆った。少なくとも１時間ＰＢＳ中１０％  ＦＢＳで遮断した後、プレートを０．０５％  ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。免疫化されたマウス及びＲＭからの血清試料を１％  ＦＢＳ中で順次に希釈し、プレートに添加し、次いで、室温で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％  ＰＢＳＴ中で再び４回洗浄し、次いで、室温で１時間、マウス血清に対して１：３５，０００の希釈で、ＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いてインキュベートした。ＲＭ血清に関して、抗サルＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を室温で１時間、１：５，０００の希釈で使用した。製造業者の使用説明書（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）基質溶液を添加することによって、結合した酵素を検出した。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、１５分後に反応を停止した。４５０ｎｍの光学濃度をＳｙｎｅｒｇｙプレートリーダー上で読み取った。全てのマウス及びＲＭ血清試料を二つ組で分析した。すでに記載されている方法（Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１：３５−４１）を使用して、エンドポイント力価を決定した。
【０１３３】
中和（ＰＲＮＴ５０）アッセイ
ＭＲ７６６及びＶｅｒｏ細胞を含むＰＲＮＴは、すでに記載されている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９３：１６５８−６５）。簡潔に、熱不活性化マウスまたはＲＭ血清を血清無含有ＤＭＥＭ中で順次に希釈し（１：１０〜１：１２８０）、３７℃で２時間、等容積のＺＩＫＶ  ＭＲ７６６（１００ＰＦＵ）でインキュベートした。混合物をＶｅｒｏ細胞の融合層に添加し、２時間吸着のために３７℃でそのままにした。２×ＤＭＥＭ培地：軟寒天（１：１）重層を細胞上に添加し、プレートを３７℃で５日間インキュベートした。寒天重層を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１×ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液で染色し、１×ＰＢＳで洗浄し、プレートを乾燥させた。２４ウェルプレート内で行われたアッセイにおけるプラークを自動Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ読み取り装置（ＣＴＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）でスキャンし、試料ウェル中ならびに陰性対照（ＤＭＥＭのみ）及び陽性対照（１００ＰＦＵ  ＭＲ７６６  ＺＩＫＶウイルスのみ）ウェル中のプラークを、ＥＬＩＳｐｏｔリーダーが備わった自動ソフトウェアを使用して計数した。プラーク減少の割合を以下のように計算した。％減少＝１００×｛１−（各希釈に対するプラークの平均数／陽性対照ウェル中のプラークの平均数）｝。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、％プラーク減少対各個々の血清希釈のログ変換の非線形回帰分析を実施して、ワクチン接種応答後のピークにおける実際の５０％  ＰＲＮＴ力価の線形補間を促進した。５０％中和における中央値及び四分位範囲を各中和標的に対して、全体的にかつワクチン処置群によって計算し、幾何平均力価も計算した。力価は、プラーク数の５０％減少をもたらす最高希釈の逆数を表す。
【０１３４】
ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ攻撃接種研究
ジカ攻撃接種研究のために、ＩＦＮＡＲ−／−マウス（ｎ＝１０／群）を、ジカ−ｐｒＭＥワクチンまたはｐＶａｘ１を用いて１回または２回免疫化した。マウスは、１５日目（単一の免疫化群）、または第２の免疫化の１週間後の２１日目（２つの免疫化群）に、１×１０６ＰＦＵまたは２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスのいずれかを有した。また、ＩＦＮＡＲ−／−マウス（ｎ＝１０／群）の追加の群を１回免疫化し、１５日目に２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを用いて攻撃接種した。攻撃接種後、動物を計量し、皮下に位置する温度チップによって体温を毎日測定した。加えて、１日２回、疾病の臨床兆候（可動性の低下、猫背の姿勢、後肢指背歩行（部分麻痺）、一方の後肢または両方の後肢の麻痺）に関して動物を観察し、ウイルス負荷決定のために採血した。愛護に基づく屠殺の基準は、２０％の体重減少または一方もしくは両方の後肢の麻痺からなった。
【０１３５】
ＺＩＫＶ負荷の測定のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
処理されたマウスからの脳を４℃で１週間ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中に浸漬し、次いで−８０℃で保管した。次いで、脳組織を計量し、ステンレス鋼ビーズを有するＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、３０サイクル／秒で６分間、２ｍＬクライオバイアル中６００μＬのＲＬＴ緩衝液中で均質化した。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、血液からウイルスＲＮＡも単離した。ＺＩＫＶ特異的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを、対象の動物からのウイルスＲＮＡの検出のために利用した。ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｖｉｒｕｓ  １−Ｓｔｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を有するプライマーＺＩＫＶ  ８３５及びＺＩＫＶ  ９１１ｃならびにプローブＺＩＫＶ  ８６０ＦＡＭを使用して、ＲＮＡを逆転写及び増幅した。各プレートに対して標準曲線を並行して生成し、ウイルスゲノムコピー数の定量化のために使用した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）ソフトウェアバージョン２．３を使用して、サイクル閾値（Ｃｔ）の値を計算し、複製のうちの少なくとも１つに対するＣｔ値≦３８を、すでに記載されているように（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １４：１２３２−９）、陽性と見なした。出血前は、このアッセイにおいて陰性であった。
【０１３６】
統計分析
抗体力価の倍の増加の差を、マン−ホイットニー分析を使用して比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、統計分析を実施した。全ての分析に対して、Ｐ＜０．０５を有意と見なした。Ｌｏｇ１０変換をエンドポイント結合ＥＬＩＳＡ力価及び全ウイルスＰＲＮＴ５０力価に適用した。
【０１３７】
これらの実験の結果をここで説明する。
【０１３８】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサスＤＮＡワクチンの構築
ＺＩＫＶ  ｐｒＭ（前駆体膜）及びＥｎｖ（エンベロープ）遺伝子（ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ）のコンセンサス配列を、ヒトにおける感染を引き起こした、１９５２〜２０１５年の間に単離された様々なＺＩＫＶからのｐｒＭ及びＥｎｖ配列を使用して生成した。追加の修飾後、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス配列をｐＶａｘ１ベクターにクローン化し、効率の高い免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダーペプチド配列の付加を含む最適化を行って、そのインビボ発現を改善した（図２４Ａ）。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５上の相同モデル及び可視化を使用して、ＺＩＫＶ−エンベロープ配列の最適整列を実施した。参照モデルは、ＰＤＢ  ５ＪＨＭ及びＰＤＢ  ５ＩＺ７を含んだ。ｐｒＭＥ抗原上の特異的領域に対応する整列した残基を、可視化目的でモデルにおいて標識化した（図２４Ｂ）。最適化されたコンセンサスワクチン選択は、概して、本研究において分析された複数のＺＩＫＶ株に対して保存的または半保存的である。ＥＤＥ特異的中和抗体の構造研究は、これらの認識決定基がエンベロープ−ダイマー表面における血清型不変部位に見られ、それが、融合ループの露出した主鎖ならびに２つの保存グリカン鎖（Ｎ６７及びＮ１５３結合グリカン）を含むことを明らかにした（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  ５２０：１０９−１３）。これらの２つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスにおいて高度に保存されない。さらに、ＺＩＫＶは、Ｎ６７結合グリコシル化部位を有さず、Ｎ１５４結合グリコシル化部位（デングのＮ１５３結合グリコシル化部位と同等）は、単離されたＺＩＫＶ株のうちのいくつかにおいて存在しない。したがって、コンセンサス設計の一部として、このグリコシル化部位を除外して構築物を設計した。この部位におけるグリコシル化の欠如は、ＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質へのＥＤＥ１型広域中和抗体（ｂｎＡｂ）の改善された結合と関連付けられている（Ｒｏｕｖｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  ５２０：１０９−１３）。
【０１３９】
構築に続いて、ウエスタンブロット分析及び間接免疫蛍光アッセイによって、プラスミドからのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質の発現を確認した。ｐａｎｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗体（図２４Ｃ）、及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスから採取した血清（図２４Ｄ）を使用したウエスタンブロットによって、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで一時的にトランスフェクトされた細胞から調製されたタンパク質抽出物を、発現に関して分析した。抗ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ特異的抗体を用いたトランスフェクションの４８時間後、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の染色によって、ＩＦＡによってＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ発現をさらに検出した（図２４Ｅ）。
【０１４０】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡワクチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞を誘導する。
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドワクチンが細胞免疫応答を誘導する能力を評価した。筋肉内（ｉ．ｍ．）注入、続いて、送達部位における電気穿孔を通して、２週間の間隔で３回、対照プラスミド骨格（ｐＶａｘ１）またはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンのいずれかを用いて、４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を免疫化した（図２５Ａ）。第３の注入の１週間後に動物を屠殺し、各動物から採取したバルク脾細胞を、それらがＺＩＫＶ−ｐｒＭＥを包含するペプチドプールへのエクスビボ曝露後にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌する能力に関して、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで評価した。アッセイの結果は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたマウスからの脾細胞が、複数のＺＩＫＶ−Ｅペプチドプールでの刺激後に細胞免疫応答をもたらしたことを示す（図２５Ｂ）。全ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥタンパク質に及ぶ１５ｍｅｒ（１１個のアミノ酸による重複）からなる２２個のペプチドプールを使用した、マトリクス形式でのＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、最も強力な細胞性応答（複数可）を誘発したＺＩＫＶＥｎｖの領域（複数可）を評価した。いくつかのプールは、高いＴ細胞応答を示したが、ペプチドプール１５は、スポット形成単位（ＳＦＵ）の最高値を呈した（図２５Ｃ）。このマトリクスマッピング分析は、優性ｐｒＭＥエピトープ『ＩＲＣＩＧＶＳＮＲＤＦＶＥＧＭ（配列番号１７）』を明らかにした（ａａ１６７−１８１）。免疫エピトープデータベース分析リソースツールを利用した分析を通して、このペプチドがＨ２−Ｄｂ制限エピトープを含有することを確認し、このハプロタイプにおいて、抗原が効果的に処理されることを裏付ける。
【０１４１】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンの細胞免疫原性のさらなる評価は、最終免疫化の１週間後に採取したＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能特性の決定を伴った。結果は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種がＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）及びＩＦＮ−γを発現させる二機能性ワクチン特異的Ｔ細胞の割合を増加させたことを示す。重要なことには、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチン接種は、Ｔ細胞機能性を拡張する強力な能力を呈した（図２５Ｄ）。
【０１４２】
加えて、近年特定されたブラジルＺＩＫＶ株または元のＭＲ７６６  ＺＩＫＶ株のいずれかのｐｒＭＥｎｖ配列をコードする最適化プラスミドを用いて、比較免疫研究を実施した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖペプチドプールを用いた脾細胞の刺激後、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析を通して、第３のワクチン接種の一週間後に、いずれかのプラスミドで免疫化されたマウスにおける細胞免疫応答の誘導を測定した。結果は、コンセンサスＺＩＫＶｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン構築物によって誘導されるＴ細胞応答が、これらの２つの非コンセンサスプラスミドワクチンのいずれかによって生成された応答よりも一貫して高かったことを示す（図３１Ａ及び３１Ｂ）。ブラジルまたはＭＲ７６６  ｐｒＭＥワクチンのいずれかによって誘導された細胞性応答の詳細なマッピング分析は、両方のワクチンが、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドに対して図２５Ｂ及び図２５Ｃで特定された優性Ｅｎｖ特異的ＣＴＬエピトープに対して、有意な細胞性応答を誘導したことを明らかにした（データは図示せず）。コンセンサス免疫原は、同じ用量において、これらのＴ細胞アッセイにおいてより堅固な応答を一貫して誘導し、追加のアッセイにおいてさらに評価した。
【０１４３】
ＺＩＫＶ組み換えエンベロープタンパク質の生成
これらの研究の開始時に、特異的抗ＺＩＫＶ免疫応答を評価するために使用可能な市販の試薬はなかった。したがって、必要に迫られて、組み換えＺＩＫＶ−エンベロープタンパク質（ｒＺＩＫＶ−Ｅ）を生成して、本研究で実施されるアッセイを支持した。この試薬を生成するために、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンコンセンサス抗原に基づくコンセンサスＺＩＫＶ−エンベロープ配列を、ｐＥＴ３０ａ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化した（図３２Ａ）。ｒＺＩＫＶ−Ｅ抗原をＥ．ｃｏｌｉ培養物中で産生し、ニッケルカラムクロマトグラフィを使用して精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析し、それは、抗Ｈｉｓ  ｔａｇ抗体を使用したウエスタン分析によって検出され得る、ｒＺＩＫＶ−Ｅでトランスフェクトされた細菌からの溶解物中に、予測されたサイズの過剰発現されたタンパク質を示した（図３２Ｂ）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンで免疫化されたマウスからの血清は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ；図３２Ｃ）において捕捉抗原として使用したｒＺＩＫＶ−Ｅｎｖに結合した。複数のフラビウイルスのエンベロープタンパク質に反応する市販の抗体（指定されたｐａｎｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）もまた、ｒＺＩＫＶ−Ｅに結合した。ウエスタン分析は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖで免疫化されたマウスからの免疫血清が、ｒＺＩＫＶ−Ｅを特異的に認識したことを実証した（図３２Ｄ）。これらのデータは、生成されたｒＺＩＫＶ−Ｅが、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖをワクチン接種されたマウスからの免疫血清と特異的に反応したことを示し、したがって、この組み換えタンパク質をさらなる免疫原性研究のために使用した。
【０１４４】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンによるＣ５７ＢＬ／６マウスにおける機能的液性応答の誘導
コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンがマウスにおける液性免疫応答を誘導する能力を評価した。２５μｇの空の対照ｐＶａｘ１またはコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンプラスミドのいずれかを用いて、２週間の間隔で３回、電気穿孔を介した送達を通して、４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を筋肉内（ｉ．ｍ．）で免疫化した。免疫化された各マウスから血清を得て、捕捉抗原として固定化ｒＺＩＫＶ−Ｅを使用して、ＥＬＩＳＡによって、ＺＩＫＶ特異的ＩｇＧ応答に関して試験した。抗ＺＩＫＶ特異的ＩｇＧの有意な増加が２１日目に観察され、血清ＩｇＧレベルにおけるさらなる追加刺激が３５日目に認められた（図２６Ａ）。ワクチン接種された動物からの６０日目の血清は、高いＺＩＫＶ特異的抗体応答が最終追加刺激後に長期間維持されたことを示す。最も重要なことには、ワクチン接種されたマウスからの血清が、エンドポイント力価によって示されるように非常に高いレベルのｒＺＩＫＶ−Ｅ特異的抗体を含有した（図２６Ｂ）。ウエスタン分析によってｒＺＩＫＶ−Ｅ（エンベロープ）を検出する能力（図２６Ｃ）、及び免疫蛍光アッセイによってＺＩＫＶ（ＭＲ７６６株）感染細胞を染色する能力（図２６Ｄ）に関して、ＺＩＫＶｐｒＭＥｎｖプラスミドを接種されたマウスからのプールされた血清をスクリーニングすることによって、ワクチンによって誘導された抗体の特異性の追加の評価を実施した。これらの分析の両方からの結果は、ワクチンによって誘導された液性応答の特異性を確認した。
【０１４５】
さらに、上記のように、ブラジル株及びＭＲ７６６株からのｐｒＭＥｎｖ配列をコードするプラスミドを用いて免疫化されたマウスにおいて、ＺＩＫＶ特異的結合抗体応答もまた評価した。ｐＶａｘ１及び両方の非コンセンサスワクチンで免疫化されたマウスからの３５日目（第３の免疫化の１週間後）の血清を、ｒＺＩＫＶ−Ｅへの結合に関してＥＬＩＳＡによって分析した。この分析は、ＭＲ７６６及びＢｒａｚｉｌワクチンプラスミドの両方が有意な抗体結合を誘導したこと、ならびにコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いた免疫化が、ｒＺＩＫＶ−Ｅに対して有効な液性応答をもたらすことを示す（図３１Ｃ及び図３１Ｄ）。
【０１４６】
対照ｐＶａｘ１プラスミド、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖプラスミドワクチン、またはコンセンサスＺＩＫＶ−Ｃ（カプシド）プラスミドワクチンのいずれかを用いて、（３回）免疫化したマウスからの３５日目のプールされた血清に対して、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイを実施した。使用したＰＲＮＴアッセイは、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、及び他のフラビウイルスを分析するためにすでに記載されている技術から応用された方法であった（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：４０４０−７）。図２６Ｅに示されるように、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種が、４５６±５の抗ＺＩＫＶ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価（対照ＺＩＫＶ感染の５０％が阻害された血清希釈の逆数）を伴い、有意な中和応答をもたらした一方で、ＺＩＫＶ−Ｃａｐ  ＤＮＡワクチンをワクチン接種されたマウスは、ｐＶａｘ１対照プラスミドをワクチン接種された動物（力価＝１５±２）を最小限にのみ上回った力価（３３±６）を示した。
【０１４７】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いた免疫化後の、Ｉ型インターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ−／−）を欠いたマウスにおけるＺＩＫＶに対する免疫応答及び防御
ＺＩＫＶで誘導された疾病及び免疫の機構は、はっきりと定義されず、ＺＩＫＶ感染に対する免疫応答の仮説的な病原性に対する防御は、今のところ不明瞭である（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｊ  Ｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ９４：１３６２−９）。マウスのほとんどの株は、ＺＩＫＶ感染に耐性を示すが、ＩＦＮ−α／β受容体（ＩＦＮＡＲ−／−）を欠いたマウスは、感染及び疾病にかかりやすく、攻撃接種後６〜７日以内に最も死亡したことが分かった（Ｌａｚｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １９：７２０−３０）。コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドワクチンがこのマウス株において細胞性及び液性免疫応答を誘導する能力を調査した。対照ｐＶａｘ１プラスミドまたはＺＩＫＶ  ｐｒＭＥワクチンプラスミドワクチンのいずれかを用いて、２週間の間隔で３回、電気穿孔を介した送達で、５〜６週齢の雌ＩＦＮＡＲ−／−マウス（ｎ＝４）をｉ．ｍ．で免疫化した。０、１４、２１、及び３５日目に、免疫化されたマウスから血清を採取し、最終免疫化の１週間後（３５日目）に、脾細胞をマウスから採取した。ワクチンで免疫化されたマウスからの脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおける１０６個の細胞当たりのＳＦＵレベルによって示されるように、明確な細胞免疫応答をもたらした（図３３Ａ）。ｒＺＩＫＶ−Ｅを捕捉抗原として使用するＥＬＩＳＡ分析からの結果は、１４日目までの検出可能な抗ＺＩＫＶ血清ＩｇＧ（約１：１，０００の力価）を示し、これらのレベルを後続のワクチン接種で追加刺激し、結合抗体力価は、少なくとも１：１００，０００に達した（図３３Ｂ及び３３Ｃ）。比較すると、免疫化後３５日目の試料に対するＰＲＮＴ５０力価は、１：６０であった。結果は、コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンで免疫化されたＩＦＮＡＲ−／−マウスが、抗ＺＩＫＶ細胞性及び液性免疫応答を生成することが可能であることを示し、この病原性攻撃接種における推定的ワクチン効果のこのモデルにおけるさらなる研究を支持する。
【０１４８】
非ヒト霊長類におけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ  ＤＮＡワクチンによって誘発されるＺＩＫＶ特異的機能的細胞性及び液性応答
より低い電圧の皮内形式での強力な免疫応答を示す近年の研究（Ｈｕｔｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ  ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２３：９４３−５０；Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １：ｅ１１）に基づき、皮内電気穿孔を使用して、ＮＨＰを皮内免疫化によって免疫化した。アカゲザル（ＲＭ；ｎ＝５／群）に、電気穿孔を用いて２．０ｍｇのワクチンプラスミドを皮内投与し、各動物に４週間置いて２回ワクチン接種した。血清及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、０日目（免疫化前）及び６週目（第２の免疫化の２週間後）に採取した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖペプチドプールを用いてエクスビボで刺激された免疫化前及び６週目のＰＢＭＣのＥＬＩＳｐｏｔ分析は、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖ免疫化がＲＭにおいて堅固な抗ＺＩＫＶ  Ｔ細胞応答を誘導したことを示した（図２７Ａ）。
【０１４９】
ワクチン接種されたＲＭからの血清における特異的な抗ＺＩＫＶ抗体応答を、ＥＬＩＳＡによって評価した。６週目に、ｒＺＩＫＶ−Ｅｎｖ特異的結合抗体が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖをワクチン接種された動物において検出可能であった（図２７Ｂ）。２週目（第１の免疫化後）及び６週目（第２の免疫化後；図２７Ｃ）に、各動物に対してエンドポイント力価を決定した。個々のワクチン接種された動物からのＲＭ血清を使用して、ウエスタンブロット分析によってＥＬＩＳＡ結果を確認した（図２７Ｄ）。６週目にＲＭにおいて生成された抗体の中和活性を、ＰＲＮＴ５０アッセイによって評価した。全てのワクチン接種されたサルが、有意な中和活性を有し、抗ＺＩＫＶ逆数ＰＲＮＴ５０希釈力価は、１６１〜１３８０に及ぶ（平均５０１±２２４の標準誤差；図２７Ｅ）。ＰＲＮＴ力価は、ＥＬＩＳＡ力価（データは図示せず）と直接相関しなかった。
【０１５０】
ＮＨＰワクチン免疫血清がインビトロでＶｅｒｏ細胞、神経芽腫（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）または神経前駆（Ｕ−８７ＭＧ）細胞のＺＩＫＶ感染を遮断する能力を、ＩＦＡによって検査した。ＺＩＫＶ  Ｑ２株（ＭＲ７６６またはＰＲ２０９）を血清またはＮＨＰ−免疫血清の希釈液中で予めインキュベートし、各細胞型の単層に添加した。感染の４日後、ｐａｎ  ｆｌａｖｉｒｕｓ抗体を使用して、ＩＦＡによってＺＩＫＶ陽性細胞を同定し（図３４Ａ〜３４Ｃ）、ＺＩＫＶ陽性細胞を定量化した（図３４Ｂ〜３４Ｄ）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種されたＲＭからの血清は、各細胞型においてＺＩＫＶ感染を阻害した。
【０１５１】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫化後のＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ感染及び疾病に対する防御
予備的研究において、５〜６週齢のＩＦＮＡＲ（−／−）マウス（ｎ＝１０）を、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、頭蓋内、または静脈内（ｉ．ｖ．）経路のいずれかによって投与される１×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＶ−ＰＲ２０９分離株を用いて攻撃接種した。攻撃接種後、全ての動物を、体重の日常測定、ならびに後肢虚弱及び麻痺などの瀕死状態の他の兆候の検査を含んだ、感染の臨床兆候に関して監視した。接種後の最初の４日間、マウスの全身外観の変化は観察されなかった。しかしながら、４日目以降、群の各々におけるマウスは、全体的な活性の低下、可動性の低下、及び猫背の姿勢を示し、多くの場合、後肢虚弱、水分摂取の低下、及び明らかな体重減少を伴った。ウイルス攻撃接種経路に関わらず、動物は６日目〜８日目の間に感染で死亡した（図３５Ａ〜３５Ｅ）。これらのデータに基づき、このモデルにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥを介した防御を評価するための後続の研究は、攻撃接種のためにｓ．ｃ．経路を使用した。
【０１５２】
次に、このＩＦＮＡＲ−／−マウスモデルにおいて、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖワクチンの防御効果を評価した。マウスの２つの群（ｎ＝１０）を、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンを用いた電気穿孔を介した送達を通して、ｉ．ｍ．経路によって免疫化した（２５μｇのワクチン）。また、１０匹のマウスの２つの群を、対照ｐＶａｘ１ベクターを用いた電気穿孔を介した送達を通して、ｉ．ｍ．経路によって免疫化した。免疫化を２週間置いて２回実施し、全ての動物を２１日目（第２の免疫化の１週間後）に攻撃接種した。対照及びワクチン接種されたマウスの一方の組は、１×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９をｓ．ｃ．経路によって投与され、各群のもう一方の組は、合計２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９をｓ．ｃ．経路によって攻撃接種された。攻撃接種後の３週間目に、全てのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種された動物の１００％が生存した一方で、単回用量を攻撃接種された対照のわずか３０％及び２倍用量を攻撃接種された対照のわずか１０％が生存した（図２８Ａ及び２８Ｂ）。全ての攻撃接種において、ワクチン接種された動物は、体重減少のエビデンスもなく疾病の兆候がなかった（図２８Ｃ及び２８Ｄ）。ＺＩＫＶ−ＰＲ２０９ウイルスを用いた対照マウスの感染は、可動性の低下、猫背の姿勢、後肢指背歩行、及び／または一方もしくは両方の後肢の麻痺と共に、著しい体重減少をもたらした（図２８Ｅ及び２８Ｆ）。
【０１５３】
ＺＩＫＶｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いた単回の免疫化がＺＩＫＶ攻撃接種からＩＦＮＡＲ−／−マウスを防御する潜在的な能力を評価した。１０匹のマウスの群を、対照プラスミドまたはＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンのいずれかで１回、電気穿孔を用いてｉ．ｍ．で免疫化し、２週間後に、２倍の総用量２×１０６ＰＦＵのＺＩＫＶ−ＰＲ２０９投与を用いて攻撃接種した。攻撃接種の３週間目に、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種された動物の１００％が生存した一方で、対照動物のわずか１０％が生存した（図２９Ａ）。肉眼的な組織病理学的変化を決定するために、脳組織を厚さ５μｍの矢状断面に分割し、核構造に対して染色し、エオシンを使用して細胞質構造に対して対比染色した（図２９Ｂ）。組織学及びウイルス負荷の分析のために、攻撃接種の後７または８日目にマウスを屠殺した。ＺＩＫＶ感染は、マウスにおいていくつかの脳の病変を引き起こした。ワクチン接種されなかった対照（ｐＶａｘ１）マウスの脳切片は、好中球内の核フラグメント（図２９Ｂ）、皮質内の管の血管周囲性単核細胞浸潤、リンパ球浸潤、及び大脳皮質の変性細胞（図２９Ｂ）、ならびに海馬内の変性ニューロン（図２９Ｂ）を示した。しかしながら、対照的に、ＺＩＫＶ  ｐｒＭＥをワクチン接種された動物は、脳組織内の正常な病理組織を示し（図２９Ｂ）、合成ジカ−ｐｒＭＥワクチンを用いた免疫化によって誘導された防御抗体が、脳内のウイルスによって誘導される疾病を制限し得ることを裏付けた。この観察は、ワクチン接種がこのモデルにおける脳を防御する可能性を実証する。ＺＩＫＶ攻撃接種後のワクチン接種されたマウスにおける体重減少及び運動障害の改善と一致して、高い（２×１０６ＰＦＵ）用量の攻撃接種群におけるウイルス攻撃接種された、ｐＶａｘ１をワクチン接種された動物と比較して、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥをワクチン接種された動物の血中液（図２９Ｃ）及び脳内（図２９Ｄ）において、有意により低いウイルス負荷が認められた。まとめると、これらのデータは、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン媒介免疫応答がＺＩＫＶ攻撃接種に対してマウスを防御することができることを示す。
【０１５４】
抗ＺＩＫＶ免疫血清の受動的移入がＺＩＫＶ感染に対してマウスを防御する
次に、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥｎｖをワクチン接種されたＲＭからの免疫血清の移入がＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ媒介病因を予防するかどうかを試験した。この目的で、６週目のＲＭからの１５０μｇ当量のＩｇＧ（ＰＲＮＴ５０≒１／１６０）を、ＺＩＫＶウイルス攻撃接種の１日後に、ＩＦＮＡＲ−／−マウスに養子導入した。対照マウスの２つの群を含み、一方の群は、ＲＭからの免疫前血清が投与され、もう一方の群は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が投与された。ＰＢＳまたは対照血清が投与されたマウスは、感染の過程中に元の体重の１５〜２５％が減少し、全てが感染の６〜８日後に死亡した。ＲＭからのワクチン免疫血清を感染しやすいマウスに移入したとき、動物は、３及び４日目に体重が減少したが、その後、５日目に体重が戻り始め、最終的に８０％が感染性の攻撃接種を生き延び（図３０Ａ）、ＮＨＰ血清移入がウイルス攻撃接種後のＺＩＫＶ感染の臨床症状に対する防御を付与する能力を実証する（図３０Ｂ）。ＺＩＫＶを用いた攻撃接種に対する防御に対する免疫血清移入の効果を評価するために実施された反復実験において、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ免疫血清レシピエント間の生存は、８０〜１００％に及んだ。これらの研究は、抗ＺＩＫＶワクチン免疫血清が、必要とされる適応性抗ＺＩＫＶ免疫応答の非存在下で、ＺＩＫＶ感染に対する有意な防御を付与する能力を有したことを示す。
【０１５５】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス構築物を用いたワクチン接種
近年のＺＩＫＶの蔓延及びヒトにおけるその関連した病因によって、深刻な問題が生じている。現在、この新しい感染性病原体に対する認可されたワクチンまたは治療薬は存在していない。ごく最近、実験用ＺＩＫＶワクチンの採取が非病原性動物感染モデルにおいて攻撃接種後のウイルス負荷を低下させることが示されている（Ｌａｒｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  ５３６：４７４−８；Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５３：１１９２−３２）。これらのデータは期待が持てる。この点で、追加のモデルにおいてジカを標的とする追加の新規のワクチンアプローチを検査することが重要である。ここで、新規のコンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭ及びＥ抗原を発現させるために設計された合成ＤＮＡワクチンを、マウス及び非ヒト霊長類における電気穿孔によって強化された免疫化後の免疫原性に関して評価した。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチン接種が、マウス及びＮＨＰに両方において免疫原性であり、抗原特異的Ｔ細胞ならびに結合抗体及び中和抗体を生成したことが観察された。独自に、近年記載されているように（Ｔｒｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  ３８６：２０７８−８８）、ＮＨＰを皮内経路による電気穿孔を通してＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化し、それは、ｉ．ｍ．電気穿孔よりも低い電圧及び小さいトランスフェクション領域を使用する。そのようなアプローチのさらなる研究は、臨床状況において利点を提供し得る。
【０１５６】
ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥコンセンサス構築物は、推定グリコシル化部位を除去する潜在的なＮＸＳ／Ｔモチーフの設計された変化を含む。この部位におけるグリコシル化部位の欠失は、ＺＩＫＶ−Ｅタンパク質へのＥＤＥ１型ｂｎＡｂ（広域中和抗体）の改善された結合と関連付けられている（Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７：３０１ｒａ１３２）。コンセンサスＺＩＫＶ−ｐｒＭＥによって誘導された抗体応答は、堅固であるように思われ、場合によっては、同様に開発されたＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−ＭＲ７６６及びＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ−Ｂｒａｚｉｌワクチンによって誘発されるものよりも大きさが優れているように思われる。これらの構築物は、元のＺＩＫＶ−ＭＲ７６６分離株または近年流通しているブラジルからのＺＩＫＶ株のそれぞれと配列が一致していた。裏付けになる一方で、さらなる研究は、誘導された免疫応答に対するそのような組み込まれた設計された変化の効果に関するさらなる洞察を提供するであろう。
【０１５７】
ＺＩＫＶに対する病原性攻撃接種モデルがほとんど存在しないため、Ｃ５７ＢＬ／６及びＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチンの免疫応答の推定的防御性を比較した。両方のマウスの株が、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥで免疫化されたときに堅固な液性免疫応答に応答した。Ｔ細胞応答もまた誘導されたが、ＩＦＮＡＲ−／−動物において誘導されたものと比較して、野生型Ｃ５７ＢＬ／６においてより堅固であるように思われ、マウスにおけるノックアウト表現型のために予測されるような固有の適応性免疫移入の部分的欠陥を裏付ける。しかしながら、抗原特異的免疫の誘導に基づき、モデルは、感染及び病因の両方に対するワクチンの影響の評価のために有用であった。ＩＦＮＡＲ−／−マウスにおけるＺＩＫＶ−ｐｒＭＥでの単回のワクチン接種は、神経病因の防御を含む、このモデルにおける疾病及び死亡に対して防御性であった。Ｅｎｖ抗原に対するフラビウイルス中和抗体は、疾病に対する防御において重要な役割を果たすと考えられ、アイデアは、動物モデルにおける受動的抗体移入によって直接、及び蚊媒介性ウイルス感染を起こしやすい地理的領域におけるプロスペクティブ研究からの疫学データによって間接的に裏付けられる（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  １３０：６９−８０；Ｒｏａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  ３８７：８４３；Ｓａｍａｒａｓｅｋｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  ３８７：５２１−４）。ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡワクチンを用いたＩＦＮＡＲ−／−マウスの免疫化ならびに免疫化されたＮＨＰからの血清移入がこのマウスモデルにおいて防御性であったが、血清移入されたマウスとは対照的にワクチン接種されたＩＦＮＡＲ−／−は、病因の制御の指標として、体重減少の制御の改善を呈した。追加の研究が必要とされるが、この結果は、このモデルにおけるこの防御の側面におけるＴ細胞応答の役割を潜在的に示唆する。加えて、攻撃接種から回復した対照ＩＦＮＡＲ−／−マウスが、少なくとも数週間ＰＣＲによってウイルス陽性のままであることが観察され、ワクチン接種のさらなる利点を示唆する。この研究は、ワクチン接種、この場合、この合成ＤＮＡワクチン接種が感受性宿主における疾病の予防に影響を及ぼす潜在力を裏付ける。
【０１５８】
実施例４：ジカウイルスｐｒＭＥに対するＤＮＡワクチンは、非ヒト霊長類における防御免疫を誘導する
アカゲザルを、２つの部位のそれぞれにおいて１ｍｇとして０及び４週目に投与された２ｍｇのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥプラスミドを用いて、皮内（ｉ．ｄ．）で免疫化し、免疫化の直後に皮内電気穿孔（ＥＰ）した。ＰＢＭＣを免疫化前及び６週目に単離し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用して、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥペプチドを用いた刺激に応答するＩＦＮ−ｇ分泌細胞を検出した（図３６Ａ）。１回の免疫化を受けたＮＨＰ及び２回の免疫化を受けたＮＨＰは、全ｐｒＭＥタンパク質を包含する６つのペプチドプールに対して１００万個のＰＢＭＣ当たり得られたＩＦＮ−ｇ産生細胞の増加を示し（図３６Ｂ及び図３６Ｃ）、ＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種後のＺＩＫＶ特異的細胞免疫応答の誘導を実証する。図３７に示されるように、抗ＺＩＫＶ抗体応答は、ＮＨＰのＺＩＫＶ−ｐｒＭＥワクチン接種によって誘導される。
【０１５９】
アカゲザルを、ＥＰを使用したＩＤ経路を介して、ｐＺＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡを用いて、０及び４週目に２回ワクチン接種した。８週目に、動物を、ジカ−ＰＲ２０９ウイルス株を用いて皮下攻撃接種した。対照として、５匹の実験に使われていない動物をＺＶ−ＰＲ２０９ウイルスで感染させた（図３８Ａ）。ＺＶ−ＰＲ２０９に感染した実験に使われていないＮＨＰは各々、有意なウイルス負荷を呈した（図３８Ｂ）。ｐＺＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡで１回または２回免疫化されたＮＨＰは、検出可能なウイルス負荷を有しなかった（図３７Ｃ及び図３８Ｄ）。これらの研究は、ジカ−ｐｒＭＥ免疫化がジカ攻撃接種に対する防御を付与することを実証する。
【０１６０】
実施例５：第１相  ジカＤＮＡワクチン研究ＩＤ−ＥＰ中間分析
ジカ−００１臨床プロトコル
最初の第１相試験は、デングウイルス未投与成人においてＩＤ投与、続いてＥＰされたＧＬＳ−５７００の安全性、耐性、及び免疫原性を評価するための非盲検、投与量決定試験であり、米国及びカナダの３つの現場で実施した。
【０１６１】
研究の第一目的は、健康なデングウイルス未投与成人対象においてＩＤ注入、続いてＥＰによって投与されたときのＧＬＳ−５７００の安全性及び耐性を、最終ワクチン投与から１４日目まで評価することであった。
【０１６２】
本研究における一次安全性エンドポイントは、（１）器官別大分類（ＳＯＣ）、基本語（ＰＴ）重症度、及びワクチン接種後１４日目までの試験処置及びスケジュールとの関係によって分類される有害事象の発生、（２）投与（注入）部位反応（頻度及び重症度判定によって記載される）、及び最終ワクチン接種後１４日目までの投与部位の疼痛、ならびに（３）頻度及び重症度判定によって記載される安全性の検査パラメータの変化（例えば、肝臓パネル試験及びバイタルサイン）を含む。
【０１６３】
二次的目的は、（１）デングウイルス未投与成人におけるＧＬＳ−５７００のワクチン接種の１年後までの安全性を評価すること、ならびに（２）デングウイルス未投与成人においてＩＤ、続いてＥＰで送達されたときのＧＬＳ−５７００の細胞性及び液性応答を評価することを含む。
【０１６４】
二次免疫学的エンドポイントは、（１）ＥＬＩＳＡによって測定されるジカエンベロープ（Ｅ）タンパク質に対する結合抗体力価、（２）ウイルス中和アッセイで測定されるジカウイルスに対する中和抗体力価、ならびに（３）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔ及び／または細胞内染色（ＩＣＳ）アッセイによって決定されるジカウイルスに対する抗原特異的細胞免疫応答を含む。
【０１６５】
この第１相臨床試験は、ＩＤ注入、続いて電気穿孔（ＥＰ）を介して投与されたＧＬＳ−５７００がデングウイルス未投与の参加者において安全、耐性、かつジカウイルスに対する免疫応答を生成することが可能であるかどうか、及び免疫反応が用量依存性であるかどうかを評価する。三角筋に注入し、直後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−３Ｐデバイスを用いてＥＰする。
【０１６６】
ＧＬＳ−５７００は、ジカウイルスのプレ膜（ｐｒＭ）及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質のコンセンサス配列をコードするプラスミドｐＧＸ７２０１を含有する。
【０１６７】
現在、ジカウイルスに対する承認された治療または予防ワクチンは存在していない。また、ジカウイルスに対するいかなるワクチン候補も人体試験に進出していない。
【０１６８】
ＧＬＳ−５７００のＩＤ投与の評価：
ジカ−００１の２つの群がある（表１）。参加者（１群当たりｎ＝２０）に、２つの用量レベル：１ｍｇまたは２ｍｇのＤＮＡ／用量のうちの１つで、ＧＬＳ−５７００を投与する。０．１ｍＬのＩＤ注入としてワクチンを投与し、続いてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−３Ｐデバイスを用いてＥＰする。参加者は、０、４、及び１２週目に三角筋部に１回または２回の注入を受ける（３回のワクチン接種の連続）。
【表１】
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【０１６９】
安全性を評価するために、「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  Ｅｎｒｏｌｌｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ（付属書Ｂ）」を利用して、参加者を有害事象に関して監視し、検査は、現場の正常値に従って評価される。ＥＰの直後、及びＥＰの３０分後に疼痛を評価する。検査安全性評価を、第１のワクチン接種の１週間後ならびに第２及び第３のワクチン接種の２週間後にスクリーニングにおいて得る。有害事象を、最終ワクチン接種後１２か月にわたって監視するが、これは注入部位反応の評価を含む。
【０１７０】
研究対象集団の選択基準は、以下の通りである。
ａ．年齢１８〜６５歳；
ｂ．参加に同意することができ、同意説明文書（ＩＣＦ）に署名している；
ｃ．全ての研究手順に従うことが可能であり、かつその意思がある；
ｄ．妊娠の可能性がある女性は、医学的に有効な避妊法（経口避妊、バリア法、殺精子剤など）を使用すること、または登録から最後の注入後３か月間無精子のパートナーを有すること、もしくは妊娠を引き起こすことが医学的に不可能なパートナーを有することに同意する。
ｅ．性的に繁殖力があると見なされる性的に活発な男性は、研究中にいずれかのバリア式避妊法を使用することに同意しなければならず、かつ最後の注入後少なくとも３か月使用し続けるか、または永久的に不妊であるか、もしくは妊娠することが医学的に不可能なパートナーを有することに同意する；
ｆ．  正常なスクリーニングＥＣＧまたは臨床的に有意な所見がないスクリーニングＥＣＧ；
ｇ．スクリーニング検査は、正常限度内であるか、またはグレード０〜１の所見のみを有しなければならない；
ｈ．臨床的に有意な免疫抑制疾患または自己免疫疾患の既往歴なし。
ｉ．デングウイルスワクチン接種または病気の既往歴なし、または黄熱ワクチン接種の既往歴なし。
ｊ．スクリーニング検査評価によるベースラインにおいてデング血清陰性
ｋ．現在、またはこの４週間以内、免疫抑制剤（コルチコステロイド、低用量のメトトレキサート、または１０ｍｇ／日未満の用量もしくはステロイド用量当量のプレドニゾンを含有する吸入、局所皮膚、及び／または点眼薬を除外する）を服用していない。
【０１７１】
研究対象集団の除外基準は、以下の通りである。
ａ．現在、または第１の投与の３０日以内のいずれかの治験化合物の投与；
ｂ．参加者がプラセボを投与されたことが検証されている場合を除き、ジカウイルスの治療または予防のための治験製品を以前に投与されている；
ｃ．第１の投与の４週間以内のいずれかのワクチンの投与；
ｄ．第１の投与の４週間以内のいずれかのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の投与
ｅ．第１の投与の３か月以内のいずれかの血液製剤の投与；
ｆ．研究の過程中の妊娠または授乳または妊娠の計画；
ｇ．デングウイルスに対する陽性の血清学的結果（任意の血清型）、または過去のいずれかの時点におけるデングウイルスもしくは黄熱ウイルスワクチン接種のいずれかの投与の既往歴；
ｈ．ＨＩＶ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、または治験責任医師もしくはメディカルモニターによって決定される潜在的に伝染性の感染病に対する陽性の血清学的試験；
ｉ．Ｃ型肝炎に対する陽性の血清学的試験（除外：持続的ウイルス学的応答の確認を伴う治療の成功）；
ｊ．１．５を超えるクレアチニンによって測定される腎疾患のベースラインエビデンス（慢性腎疾患ステージＩＩ以上）；
ｋ．グレード２クレアチニンを除く、グレード２以上の異常を伴うベースラインスクリーニング検査（複数可）；
ｌ．慢性肝疾患または肝硬変；
ｍ．血液学的悪性腫瘍を含む免疫抑制疾患、固形臓器または骨髄移植の既往歴；
ｎ．進行中の、または予想される付随する免疫抑制療法（コルチコステロイド、低用量のメトトレキサート、または１０ｍｇ／日以上の用量もしくはステロイド用量当量のプレドニゾンを含有する吸入、局所皮膚、及び／または点眼薬を除外する）；
ｏ．インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプトなどのＴＮＦ−α阻害剤を用いた進行中の、または予想される治療；
ｐ．群割り当ての４週間以内の事前の大手術または任意の放射線療法；
ｑ．任意の早期興奮症候群、例えば、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群；
ｒ．心臓ペースメーカーまたは自動植え込み式除細動器（ＡＩＣＤ）の存在
ｓ．計画された注入部位（複数可）の２０ｃｍ以内の金属インプラント；
ｔ．計画された注入部位（複数可）における臨床的に有意な医学的状態としてのケロイド瘢痕形成または肥厚性瘢痕の存在。
ｕ．刑事被告人または身体的もしくは精神的疾患のいずれかの治療のために強制的に拘留（強制収監）される参加者；
ｖ．治験責任医師の意見によって、研究要件の順守または免疫学的エンドポイントの評価を妨げる積極的な薬物またはアルコールの摂取または依存；あるいは
ｗ．ジカウイルス関連研究のための試料の保管及び将来の使用を認める意思がない
ｘ．治験責任医師の意見によって、参加者の安全または任意の研究エンドポイントの評価に影響を及ぼす可能性がある任意の病気または状態。
【０１７２】
ジカ−００２臨床プロトコル
第２の第１相試験は、プエルトリコのデング血清陽性成人においてＩＤ投与、続いて電気穿孔されたＧＬＳ−５７００の安全性、耐性、及び免疫原性を評価するためのプラセボ対照、二重盲検研究であった。研究の第一目的は、デング血清陽性の健康な成人対象においてＩＤ注入、続いてＥＰによって投与されたときのＧＬＳ−５７００の安全性及び耐性を、最終ワクチン投与から１２週目まで評価することであった。
【０１７３】
本研究における一次安全性エンドポイントは、（１）器官別大分類（ＳＯＣ）、基本語（ＰＴ）重症度、及びワクチン接種後１２週目までの試験処置及びスケジュールとの関係によって分類される有害事象の発生、（２）投与（注入）部位反応（頻度及び重症度判定によって記載される）、及び最終ワクチン接種後１２週目までの投与部位の疼痛、ならびに（３）頻度及び重症度判定によって記載される安全性の検査パラメータの変化（例えば、肝臓パネル試験及びバイタルサイン）を含む。本研究における二次安全性エンドポイントは、（１）デングウイルス血清陽性成人における最終ワクチン接種後１年を通じてＧＬＳ−５７００の安全性を評価すること、ならびに（２）デングウイルス血清陽性成人においてＩＤ、続いてＥＰで送達されたＧＬＳ−５７００の細胞性及び液性応答を評価することを含む。
【０１７４】
二次免疫学的エンドポイントは、（１）ＥＬＩＳＡによって測定されるジカエンベロープ（Ｅ）に対する結合抗体力価、（２）中和アッセイで測定されるジカウイルスに対する中和抗体、ならびに（３）インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔ及び／または細胞内染色（ＩＣＳ）アッセイによって決定されるジカウイルスに対する抗原特異的細胞免疫応答を含む。
【０１７５】
この第Ｉ相臨床試験は、ＩＤ注入、続いて電気穿孔（ＥＰ）を介して投与されたＧＬＳ−５７００がデングウイルス血清陽性成人において安全、耐性、かつジカウイルスに対する免疫応答を生成することが可能であるかどうかを評価する。三角筋に皮内注入し、直後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−３Ｐデバイスを用いてＥＰする。
【０１７６】
ＧＬＳ−５７００は、ジカウイルスのプレ膜（ｐｒＭ）及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質のコンセンサス配列をコードするプラスミドｐＧＸ７２０１を含有する。
【０１７７】
現在、ジカウイルスに対する承認された治療または予防ワクチンは存在していない。また、ジカウイルスに対するワクチン候補は、人体試験に進出していない。
【０１７８】
ＧＬＳ−５７００のＩＤ投与の評価：
対象（１群当たりｎ＝８０）を無作為化して、２ｍｇのＤＮＡ／用量のＧＬＳ−５７００（ＧＬＳ−５７００は、ＳＳＣ中で製剤化される）またはプラセボ（ＳＳＣ、ＧＬＳ−５７００のための組成緩衝液）のうちのいずれかを投与する。２回の０．１ｍＬのＩＤ注入としてワクチンまたはプラセボを投与し、続いてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−３Ｐデバイスを用いてＥＰする。対象は、０、４、及び１２週目に三角筋部にワクチン接種を受ける（３回のワクチン接種の連続、表２）。
【表２】
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【０１７９】
安全性を評価するために、「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  Ｅｎｒｏｌｌｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ（付属書Ｂ）」を利用して、対象を有害事象に関して監視し、検査は、現場の正常値に従って評価される。ＥＰの３０分後に疼痛を評価する。検査安全性評価を、該当する場合、第１のワクチン接種の１週間後ならびに第２及び第３のワクチン接種の２週間後にスクリーニングにおいて得る。注入部位反応の評価を含む有害事象を、最終ワクチン接種後１２か月にわたって監視する。
【０１８０】
研究対象集団の選択基準は、以下の通りである。
ａ．年齢１８〜６５歳；
ｂ．参加に同意することができ、同意説明文書（ＩＣＦ）に署名している；
ｃ．全ての研究手順に従うことが可能であり、かつその意思がある；
ｄ．妊娠の可能性がある女性は、医学的に有効な避妊法（経口避妊、バリア法、殺精子剤など）を使用すること、または登録から最後の注入後３か月間無精子のパートナーを有すること、もしくは妊娠を引き起こすことが医学的に不可能なパートナーを有することに同意する。
ｅ．性的に繁殖力があると見なされる性的に活発な男性は、研究中にいずれかのバリア式避妊法を使用することに同意しなければならず、かつ最後の注入後少なくとも３か月使用し続けるか、または永久的に不妊であるか、もしくは妊娠することが医学的に不可能なパートナーを有することに同意する；
ｆ．スクリーニングにおいてデングウイルス血清陽性；
ｇ．正常なスクリーニングＥＣＧまたは臨床的に有意な所見がないスクリーニングＥＣＧ；
ｈ．スクリーニング検査は、正常限度内であるか、またはグレード０〜１の所見のみを有しなければならない；
ｉ．臨床的に有意な免疫抑制疾患または自己免疫疾患の既往歴なし。
ｊ．デングウイルスワクチン接種の既往歴なし、または黄熱ワクチン接種の既往歴なし。
ｋ．現在、またはこの４週間以内、免疫抑制剤（コルチコステロイド、低用量のメトトレキサート、または１０ｍｇ／日未満の用量もしくはステロイド用量当量のプレドニゾンを含有する吸入、局所皮膚、及び／または点眼薬を除外する）を服用していない。
【０１８１】
研究対象集団の除外基準は、以下の通りである。
ａ．現在、または第１の投与の３０日以内のいずれかの治験化合物の投与；
ｂ．対象がプラセボを投与されたことが検証されている場合を除き、ジカウイルスの治療または予防のための治験製品を以前に投与されている；
ｃ．第１の投与の４週間以内のいずれかのワクチンの投与；
ｄ．第１の投与の４週間以内のいずれかのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の投与
ｅ．第１の投与の３か月以内のいずれかの血液製剤の投与；
ｆ．研究の過程中の妊娠または授乳または妊娠の計画；
ｇ．デングウイルスに対する陰性の血清学的結果
ｈ．過去のいずれかの時点におけるデングウイルスまたは黄熱ウイルスワクチン接種のいずれかの投与の既往歴；
ｉ．ＨＩＶ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、または治験責任医師もしくはメディカルモニターによって決定される潜在的に伝染性の感染病に対する陽性の血清学的試験の既往歴；
ｊ．Ｃ型肝炎に対する陽性の血清学的試験（除外：持続的ウイルス学的応答の確認を伴う治療の成功）；
ｋ．１．５を超えるクレアチニンによって測定される腎疾患のベースラインエビデンス（慢性腎疾患ステージＩＩ以上）；
ｌ．グレード２クレアチニンを除く、グレード２以上の異常を伴うベースラインスクリーニング検査（複数可）；
ｍ．慢性肝疾患または肝硬変；
ｎ．血液学的悪性腫瘍を含む免疫抑制疾患、固形臓器または骨髄移植の既往歴；
ｏ．進行中の、または予想される付随する免疫抑制療法（コルチコステロイド、低用量のメトトレキサート、または１０ｍｇ／日以上の用量もしくはステロイド用量当量のプレドニゾンを含有する吸入、局所皮膚、及び／または点眼薬を除外する）；
ｐ．インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプトなどのＴＮＦ−α阻害剤を用いた進行中の、または予想される治療；
ｑ．群割り当ての４週間以内の事前の大手術または任意の放射線療法；
ｒ．任意の早期興奮症候群、例えば、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群；
ｓ．心臓ペースメーカーまたは自動植え込み式除細動器（ＡＩＣＤ）の存在
ｔ．計画された注入部位（複数可）の２０ｃｍ以内の金属インプラント；
ｕ．計画された注入部位（複数可）における臨床的に有意な医学的状態としてのケロイド瘢痕形成または肥厚性瘢痕の存在。
ｖ．刑事被告人または身体的もしくは精神的疾患のいずれかの治療のために強制的に拘留（強制収監）される対象；
ｗ．治験責任医師の意見によって、研究要件の順守または免疫学的エンドポイントの評価を妨げる積極的な薬物またはアルコールの摂取または依存；あるいは
ｘ．ジカウイルス関連研究のための試料の保管及び将来の使用を認める意思がない
ｙ．治験責任医師の意見によって、対象の安全または任意の研究エンドポイントの評価に影響を及ぼす可能性がある任意の病気または状態。
【０１８２】
臨床結果
０日目及び４週目にｐＺＶ−ｐｒＭＥ  ＤＮＡで患者を免疫化した（図３９〜４２）。結合レスポンダーの割合を決定するために、ジカエンベロープタンパク質で覆われたプレート内で指示された希釈において血清をインキュベートし、二次抗体は、全ＩｇＧ応答を検出した。
【０１８３】
Ｖｅｒｏ細胞は、ジカウイルスに感染し、３日後、細胞を固定し、次いで、０日目及び６週目からの１：１００希釈の血清でインキュベートする。
【０１８４】
患者の血清のＩＣ５０（Ｖｅｒｏ細胞のＺＩＫＶ  ＰＲ２０９感染を５０％中和する血清の希釈）を決定することによって、中和研究を実施した。
【０１８５】
図３９Ａは、結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を提供する。図３９Ｂは、受動的移入及び防御を実証する実験結果を提供する。
【０１８６】
図４０は、２回目の投与後の抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８染色の増加を示す例示的な免疫蛍光データを提供する。
【０１８７】
図４１は、結合レスポンダーの特性化を実証するデータを提供する。
【０１８８】
図４２は、２回目の投与後に中和の増加があったことを実証するデータを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
2019506175.tif 000048
【図３１−１】
2019506175.tif 000049
【図３１−２】
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【図３２−１】
2019506175.tif 000051
【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
2019506175.tif 000056
【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月29日(2018.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019506175000001.app
【国際調査報告】
2019506175.tif 000068
2019506175.tif 000069