(57)【要約】  本発明は、一つには、がん患者から得た腫瘍組織を含む試料を採点するためのシステム及び方法に関する。前記スコアは、少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表す。前記方法から得られるスコアは、患者が免疫療法に対して積極的に応答し得る可能性を示す可能性がある。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するためのイメージングシステムであって、
イメージング領域内で前記試料の位置決めをするためのステージと、前記試料に電磁放射線を向けるための電磁放射線源と、及び前記試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器とを備えたイメージング装置と、
コントローラとを含み、前記コントローラは、
オペレータと前記コントローラとの間で情報を交換するためのユーザインターフェースと、
コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路とを備え、前記指示は、前記イメージングシステムの前記コントローラに、
前記検出された電磁放射線についての情報を前記イメージング装置から受信させ、
前記検出された電磁放射線に基づいて画像データを生成させ、
前記画像データを解析して少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する前記少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、前記第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する前記少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせ、そして
前記スコアを記録させ、ここで、前記スコアは、閾値と比較したとき、前記がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、イメージングシステム。
【請求項２】
前記少なくとも１対の細胞間の近接を表す前記スコアが、前記１対の細胞が互いに所定の近接内に存する程度を表す、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記近接が、画素スケールに基づいて評価される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約１画素〜約１００画素までの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約５画素〜約４０画素までの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項７】
前記１対の細胞間の前記所定の近接が、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である、請求項２に記載のシステム。
【請求項８】
前記スコアが、前記１対の細胞の境界線間の近接を獲得することによって計算される、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記スコアが、前記１対の細胞の質量中心間の近接を獲得することによって計算される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記スコアが、前記１対の細胞の選択された第１細胞周囲の外周に基づいて境界線ロジックを用いて計算される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記スコアが、前記１対の細胞の境界線の交点を求めることによって計算される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記スコアが、前記１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記画像データを生成することは、
前記検出された電磁放射線についての前記情報を単純画像データに分けることと、
前記データを複数のデータチャネルから提供することを含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、前記第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記データを解析することは、
前記処理回路の拡張装置を使用して、前記第１データチャネルからの前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、前記第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成することと、
相互作用面積を求めることであって、前記相互作用面積が、前記第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積であり、かつ前記第１バイオマーカーを発現する前記細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている、ことと、
前記処理回路の相互作用計算機を使用して、前記相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至ることと、を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記正規化因子が、前記第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記相互作用面積が、前記拡張された第１バイオマーカーマスクを、前記第２データチャネルの信号から求められた前記第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることによって求められる、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
第３データチャネルが、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルが、前記試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の前記総面積が、前記第３データチャネルからの信号に基づく、前記試料内の全細胞を表す細胞マスクと、前記第４データチャネルからの信号に基づく、前記試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって求められる、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記細胞マスクと前記腫瘍領域マスクとを組み合わせることが、前記腫瘍領域マスクを前記細胞マスクから除去することを含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記処理回路はさらに、前記コントローラに、
前記画像内の前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーの濃度を表す低倍率で画像データを獲得させ、
最も高濃度の前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーを包含する領域を特定させ、
最も高濃度の前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーを包含する所定数の前記領域を選択させ、
イメージング装置へ指示を送って前記所定数の領域に対して高倍率の画像データを獲得させるように設定されており、
その場合、前記高倍率の画像データは、分析のために前記コントローラへ供給され、前記スコアを求めるために使用される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記低倍率が１０倍以下であり、前記高倍率が１０倍超である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記低倍率が１０倍であり、前記高倍率が４０倍である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記低倍率が１０倍であり、前記高倍率が２０倍である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記低倍率が４倍であり、前記高倍率が４０倍である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記低倍率が４倍であり、前記高倍率が２０倍である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記コントローラが、前記スコアを、前記試料の前記画像に関するメタデータと結びつける、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記コントローラが、前記スコアを包含する報告を作成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２８】
前記コントローラが、免疫療法の方針を決定するためにオペレータに前記スコアを提供する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２９】
前記コントローラが、データベースに前記スコアを記録する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３０】
前記コントローラが、前記スコアを患者の医療記録と結びつける、請求項１に記載のシステム。
【請求項３１】
前記電磁放射線源は、白熱ランプ、蛍光ランプ、又はダイオードからなる群から選択されるインコヒーレント電磁放射線源である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３２】
前記電磁放射線源は、コヒーレント電磁放射線源である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３３】
さらに、前記電磁放射線源からの電磁放射線を前記試料に向けるように配置された電磁放射線調整用光学系部品も備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記電磁放射線調整用光学系部品は、異なる電磁放射線波長帯域を用いて前記試料を照らすように設定された、調節可能な分光フィルタ素子を包含する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
さらに、前記試料から発光された電磁放射線を収容して、その発光された電磁放射線を出力電磁放射線として前記検出器へ向けるように設定された、電磁放射線集光光学系部品も備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記電磁放射線集光光学系部品は、前記試料からの前記電磁放射線から特定の電磁放射線波長帯域を選択するように設定された、調節可能な分光フィルタ素子を包含する、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記検出器は、少なくとも１つのＣＣＤセンサを備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３８】
前記検出器は、光電子増倍管を備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３９】
前記検出器は、前記試料からの前記電磁放射線に応じて電気信号を発生して、その電気信号を前記コントローラへ伝えるように設定されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項４０】
前記コントローラはさらに、電気信号を前記ステージ、前記電磁放射線源及び前記検出器のうち１つ以上へ送ることによって、前記ステージ、前記電磁放射線源及び／又は前記検出器のうち少なくとも１つの特性を調節するように設定されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項４１】
さらに、情報を前記オペレータへ表示するためのディスプレイ装置も備えている、請求項１に記載のシステム。
【請求項４２】
前記表示される情報は、前記システムのパラメータ、前記システムの特性及び前記試料の取り込み画像のうち１つである、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記コントローラは、前記ディスプレイ装置に前記スコアを表示する、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４４】
前記イメージング装置からの前記検出された電磁放射線についての前記情報は、複数の分光画像である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４５】
前記複数の分光画像はそれぞれ、前記試料から発光され前記検出器によって検出された様々な波長の電磁放射線に対応する、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記試料によって発光された電磁放射線の波長はそれぞれ、前記試料における特異的な特徴を特定するために前記試料に追加された様々な蛍光色素分子に対応している、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
組織試料を採点する方法であって、
イメージングシステムを使用してがん患者から採取した組織試料についての画像データを得る工程であって、前記イメージングシステムが、前記試料をイメージング領域に位置付けるためのステージと、電磁放射線を前記試料に向けるための電磁放射線源と、電磁放射線出力を収集するための検出器とを備えたハウジングと、メモリと画像処理モジュールを有する処理回路とを備えたコントローラと、を含む、工程と、
１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する前記１対の細胞の第１メンバーと、前記第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する前記１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めるために、前記画像処理モジュールを用いて前記画像データを解析する工程と、
前記スコアを前記メモリに記録する工程と、を含み、スコアが閾値と比較したときに、前記がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す、方法。
【請求項４８】
前記１対の細胞間の近接を表す前記スコアは、前記１対の細胞同士が所定の近接の範囲内に存する程度を表している、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記画像データを解析する工程は、前記近接を画素スケールで評価することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記１対の細胞間の前記所定の近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記１対の細胞間の前記所定の近接は、約５画素〜約４０画素までの範囲である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記１対の細胞間の前記所定の近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記１対の細胞間の前記所定の近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記スコアは、前記１対の細胞の境界線間の近接を獲得することによって計算される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記スコアは、前記１対の細胞の質量中心間の近接を獲得することによって計算される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記スコアは、前記１対の細胞の選択された第１細胞周囲の外周に基づいて境界線ロジックを用いて計算される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
前記スコアは、前記１対の細胞の境界線の交点を求めることによって計算される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記スコアは、前記１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記画像データを生成する工程は、
前記検出された電磁放射線についての前記情報を単純画像データに分ける工程と、
前記データを複数のデータチャネルから提供する工程と、を含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、前記第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する、請求項４７に記載の方法。
【請求項６０】
前記画像データを解析する工程は、
前記処理回路の拡張装置を使用して、前記第１データチャネルからの前記第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、前記第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成する工程と、
相互作用面積を求める工程であって、前記相互作用面積が、前記第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積であり、かつ前記第１バイオマーカーを発現する前記細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている、工程と、
前記処理回路の相互作用計算機を使用して、前記相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至る工程と、を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記正規化因子は、前記第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記相互作用面積を求める工程は、前記拡張された第１バイオマーカーマスクを、前記第２データチャネルの信号から求められた前記第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせる工程を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
第３データチャネルは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルは、前記試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記第３データチャネルからの信号に基づく、前記試料内の全細胞を表す細胞マスクと、前記第４データチャネルからの信号に基づく、前記試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって、前記第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積を求める工程をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞マスクと前記腫瘍領域マスクとを組み合わせる工程は、前記腫瘍領域マスクを前記細胞マスクから除去することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
さらに、前記画像において前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーの濃度を表すデータを低倍率で画像化するために前記イメージングシステムを使用する工程と、
最も高濃度の前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーを包含する領域を特定する工程と、
最も高濃度の前記第１バイオマーカー又は前記第２バイオマーカーを包含する所定数の前記領域を選択する工程と、
イメージング装置へ指示を送って前記所定数の領域に対して高倍率の画像データを獲得する工程と、を含み、
その場合、前記高倍率の画像データは、分析のために前記コントローラへ供給され、前記スコアを求めるために使用される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６７】
前記低倍率は１０倍以下であり、前記高倍率は１０倍超である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記低倍率は４倍であり、前記高倍率は２０倍である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
さらに前記スコアを、前記試料の前記画像に関するメタデータと結びつける工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７０】
さらに前記スコアを包含する報告を作成する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７１】
さらに免疫療法の方針を決定するために専門家に前記スコアを提供する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７２】
さらにデータベースに前記スコアを記録する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７３】
さらに前記スコアを患者の医療記録と結び付ける工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７４】
さらに前記スコアをディスプレイ装置に表示する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７５】
組織試料採点システムであって、前記システムが、
がん患者から採取した組織試料の画像データを獲得するイメージング装置と、
前記イメージング装置から画像データを受信して、前記データを解析することによって、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、前記第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する前記少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めるコントローラと、を備えており、
その場合、前記スコアは、閾値と比較したとき、前記がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、システム。
【請求項７６】
前記イメージング装置は、前記試料をイメージング領域に位置付けるためのステージと、電磁放射線を前記試料に向けるための電磁放射線源と、前記試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器と、を備えている、請求項４０に記載のシステム。
【請求項７７】
前記電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項７８】
前記可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項７７に記載のシステム。
【請求項７９】
前記可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項７７に記載のシステム。
【請求項８０】
前記可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項７７に記載のシステム。
【請求項８１】
前記電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される、請求項７５に記載のシステム。
【請求項８２】
前記可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８３】
前記可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８４】
前記可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８５】
前記発光された電磁放射線又は出力電磁放射線は、約４４０ｎｍ〜約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５０５ｎｍ〜約５３５ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約５９５ｎｍ、約５８５ｎｍ〜約６３０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７１０ｎｍの範囲の波長を包含する帯域からなる群からの１つ以上の可視光帯域を含む、請求項３５に記載のシステム。
【請求項８６】
前記発光された電磁放射線又は出力電磁放射線は、約４４０ｎｍ〜約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５０５ｎｍ〜約５３５ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約５９５ｎｍ、約５８５ｎｍ〜約６３０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７１０ｎｍの範囲の波長を包含する帯域からなる群からの１つ以上の可視光帯域を含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項８７】
前記発光された電磁放射線又は出力電磁放射線は、約４４０ｎｍ〜約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５０５ｎｍ〜約５３５ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約５９５ｎｍ、約５８５ｎｍ〜約６３０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７１０ｎｍの範囲の波長を包含する帯域からなる群からの１つ以上の可視光帯域を含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項８８】
前記発光された電磁放射線又は出力電磁放射線は、約４４０ｎｍ〜約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５０５ｎｍ〜約５３５ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約５９５ｎｍ、約５８５ｎｍ〜約６３０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７１０ｎｍの範囲の波長を包含する帯域からなる群からの１つ以上の可視光帯域を含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項８９】
前記電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項９０】
前記可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記方法は、前記第１バイオマーカーの発現の定量化又は前記第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９４】
前記予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される、請求項９３に記載のシステム。
【請求項９５】
前記陽性予測値は、６５％以上である、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
前記陽性予測値は、７０％以上である、請求項９５に記載のシステム。
【請求項９７】
前記陽性予測値は、７５％以上である、請求項９６に記載のシステム。
【請求項９８】
前記陰性予測値は、６５％以上である、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９９】
前記陰性予測値は、８０％以上である、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
前記方法は、前記第１バイオマーカーの発現の定量化又は前記第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する、請求項４７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記陽性予測値は、６５％以上である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記陽性予測値は、７０％以上である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記陽性予測値は、７５％以上である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記陰性予測値は、６５％以上である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記陰性予測値は、８０％以上である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する、請求項７５に記載のシステム。
【請求項１０８】
前記予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される、請求項１０７に記載のシステム。
【請求項１０９】
前記陽性予測値は、６５％以上である、請求項１０８に記載のシステム。
【請求項１１０】
前記陽性予測値は、７０％以上である、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１１】
前記陽性予測値は、７５％以上である、請求項１１０に記載のシステム。
【請求項１１２】
前記陰性予測値は、６５％以上である、請求項１０８に記載のシステム。
【請求項１１３】
前記陰性予測値は、８０％以上である、請求項１１２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本発明は、２０１５年１０月２３日出願の米国仮特許出願番号第６２／２４５，９３３号、２０１５年１１月２４日出願同第６２／２５９，３２６号に基づく優先権を主張するものであり、これらの特許出願の両方は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、一般に、がん治療分野に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第７，５５５，１５０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書には、一態様において、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するためのイメージングシステムであって、イメージング領域内で試料の位置決めをするためのステージと、試料に電磁放射線を向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器とを備えたイメージング装置と、コントローラとを含む、前記イメージングシステムが開示されている。コントローラは、オペレータとコントローラとの間で情報を交換するためのユーザインターフェースと、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路とを備えている。指示は、コントローラに、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報をイメージング装置から受信させ、（ｉｉ）検出された電磁放射線に基づいて画像データを生成させ、（ｉｉｉ）画像データを解析して少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせ、そして（ｉｖ）スコアを記録させるように設定されており、ここで、前記スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである。
【０００５】
いくつかの実施形態において、スコアは、少なくとも１対の細胞間の近接を表すものであって、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内に存する程度を表している。いくつかの実施形態において、近接は、画素スケールに基づいて評価される。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約５画素〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線間の近接を得ることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の質量中心間の近接を得ることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の選択された第１細胞周囲の外周に基づいて境界線ロジックを用いて計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線の交点を求めることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、画像データを生成することは、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報を単純画像データに分けることと、（ｉｉ）前記データを複数のデータチャネルから提供することを含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、データを解析することは、（ｉ）処理回路の拡張装置を使用して、第１データチャネルからの第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成することと、（ｉｉ）相互作用面積を求めることであって、前記相互作用面積が、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積であり、かつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている、ことと、（ｉｉｉ）処理回路の相互作用計算機を使用して、相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至ることを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、正規化因子は、視野内の全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、相互作用面積は、拡張された第１バイオマーカーマスクを、第２データチャネルの信号から求められた第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることによって求められる。いくつかの実施形態において、第３データチャネルは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルは、試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積は、第３データチャネルからの信号に基づく、試料内の全細胞を表す細胞マスクと、第４データチャネルからの信号に基づく、試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって求められる。いくつかの実施形態において、細胞マスクと腫瘍領域マスクとを組み合わせることは、腫瘍領域マスクを細胞マスクから除去することを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、処理回路はさらに、コントローラに、（ｉ）画像内の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの濃度を表す低倍率で画像データを獲得させ、（ｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する領域を特定させ、（ｉｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する所定数の領域を選択させ、（ｉｖ）イメージング装置へ指示を送って所定数の領域に対して高倍率の画像データを獲得させるように設定されており、その場合、高倍率の画像データは、分析のためにコントローラへ供給され、スコアを求めるために使用される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍以下であり、高倍率は、１０倍超である。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍であり、高倍率は、４０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍であり、高倍率は、２０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、４０倍である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、２０倍である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、コントローラは、スコアを、試料の画像に関するメタデータと結びつける。いくつかの実施形態において、コントローラは、スコアを包含する報告を作成する。いくつかの実施形態において、コントローラは、免疫療法の方針を決定するためにオペレータにスコアを提供する。いくつかの実施形態において、コントローラは、データベースにスコアを記録する。いくつかの実施形態において、コントローラは、スコアを患者の医療記録と結び付ける。
【００１３】
いくつかの実施形態において、電磁放射線源は、白熱ランプ、蛍光ランプ、又はダイオードからなる群から選択されるインコヒーレント電磁放射線源である。いくつかの実施形態において、電磁放射線源は、コヒーレント電磁放射線源である。いくつかの実施形態において、システムはさらに、電磁放射線源からの電磁放射線を試料に向けるように配置された電磁放射線調整用光学系部品を備えている。いくつかの実施形態において、電磁放射線調整用光学系部品は、異なる電磁放射線波長帯域を用いて試料を照らすように設定された、調節可能な分光フィルタ素子を包含する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、システムはさらに、試料から発光された電磁放射線を収容して、その発光された電磁放射線を出力電磁放射線として検出器へ向けるように設定された、磁放射線集光光学系部品を備えている。いくつかの実施形態において、電磁放射線集光光学系部品は、試料からの電磁放射線から特定の電磁放射線波長帯域を選択するように設定された、調節可能な分光フィルタ素子を包含する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、検出器は、少なくとも１つのＣＣＤセンサを備えている。いくつかの実施形態において、検出器は、光電子増倍管を備えている。いくつかの実施形態において、検出器は、試料からの電磁放射線に応じて電気信号を発生して、その電気信号をコントローラへ伝えるように設定されている。
【００１６】
いくつかの実施形態において、コントローラはさらに、電気信号をステージ、電磁放射線源及び検出器のうち１つ以上へ送ることによって、ステージ、電磁放射線源及び／又は検出器のうち少なくとも１つの特性を調節するように設定されている。いくつかの実施形態において、システムはさらに、情報をオペレータへ表示するためのディスプレイ装置を備えている。いくつかの実施形態において、表示される情報は、システムのパラメータ、システムの特性及び試料の取り込み画像のうち１つである。いくつかの実施形態において、コントローラは、ディスプレイ装置にスコアを表示する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、イメージング装置からの検出された電磁放射線についての情報は、複数の分光画像である。いくつかの実施形態において、複数の分光画像はそれぞれ、試料から発光され検出器によって検出された様々な波長の電磁放射線に対応する。いくつかの実施形態において、試料によって発光された電磁放射線の波長はそれぞれ、試料における特異的な特徴を特定するために試料に追加された様々な蛍光色素分子に対応している。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本システムは、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【００１９】
別の態様において、本明細書には、（ｉ）イメージングシステムを用いてがん患者から採取した組織試料に対する画像データを獲得することを含む、組織試料を採点する方法が開示されている。イメージングシステムは、試料をイメージング領域に位置付けるためのステージと、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源と、電磁放射線出力を収集するための検出器を備えたハウジングと、メモリと画像処理モジュールを有する処理回路とを含むコントローラを備えている。前記方法はさらに、（ｉｉ）画像処理モジュールを用いて画像データを解析して、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めることと、（ｉｉｉ）スコアをメモリに記録することを含み、ここで、スコアを、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである。
【００２０】
いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞間の近接を表すものであって、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内に存する程度を表している。いくつかの実施形態において、画像データを解析することは、近接を画素スケールで評価することを含む。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約５画素〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、１対の細胞間の所定の近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線間の近接を獲得することによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の質量中心間の近接を獲得することによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の選択された第１細胞周囲の外周に基づいて境界線ロジックを用いて計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の境界線の交点を求めることによって計算される。いくつかの実施形態において、スコアは、１対の細胞の重なり領域を求めることによって計算される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、画像データを生成することは、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報を単純画像データに分けることと、（ｉｉ）前記データを複数のデータチャネルから提供することと、を含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、画像データを解析することは、（ｉ）処理回路の拡張装置を使用して、第１データチャネルからの第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むように選択された所定のマージン単位で拡張することによって、拡張された第１バイオマーカーマスクを生成することと、（ｉｉ）相互作用面積を求めることであって、前記相互作用面積が、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積であり、かつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれている、ことと、（ｉｉｉ）処理回路の相互作用計算機を使用して、相互作用面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間近接スコアに至ることを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、正規化因子は、視野内の全細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、相互作用面積を求めることは、拡張された第１バイオマーカーマスクを、第２データチャネルの信号から求められた第２バイオマーカーを発現する細胞を表すマスクと組み合わせることを含む。いくつかの実施形態において、第３データチャネルは、細胞核に起因する蛍光信号を表現し、また、第４データチャネルは、試料内の腫瘍領域に起因する蛍光信号を表現する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、第３データチャネルからの信号に基づく、試料内の全細胞を表す細胞マスクと、第４データチャネルからの信号に基づく、試料上の腫瘍領域を表す腫瘍領域マスクとを組み合わせることによって、第２バイオマーカーを発現する能力を有する全細胞の総面積を求めることを含む。いくつかの実施形態において、細胞マスクと腫瘍領域マスクとを組み合わせることは、腫瘍領域マスクを細胞マスクから除去することを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、（ｉ）画像において第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーの濃度を表すデータを低倍率で画像化するためにイメージングシステムを使用することと、（ｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する領域を特定することと、（ｉｉｉ）最も高濃度の第１バイオマーカー又は第２バイオマーカーを包含する所定数の領域を選択することと、（ｉｖ）イメージング装置へ指示を送って所定数の領域に対して高倍率の画像データを獲得することを含み、そして（ｉｖ）その場合、高倍率の画像データは、分析のためにコントローラへ供給されて、スコアを求めるために使用される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、低倍率は、１０倍以下であり、高倍率は、１０倍超である。いくつかの実施形態において、低倍率は、４倍であり、高倍率は、２０倍である。
【００２７】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアを、試料の画像に関するメタデータと結びつけることを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアを包含する報告を作成することを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、免疫療法の方針を決定するために専門家にスコアを提供することを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、データベースにスコアを記録することを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアを患者の医療記録と結び付けることを含む。いくつかの実施形態において、本方法はさらに、スコアをディスプレイ装置に表示することを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本方法は、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【００２９】
別の態様において、本明細書には、組織試料採点システムであって、前記システムが、（ｉ）がん患者から採取した組織試料の画像データを獲得するイメージング装置と、（ｉｉ）イメージング装置から画像データを受信して、データを解析することによって、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めるコントローラと、を備えており、そして（ｉｉｉ）その場合、スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである、前記システムが開示されている。
【００３０】
いくつかの実施形態において、イメージング装置は、試料をイメージング領域に位置付けるためのステージと、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器と、を備えている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、発光された電磁放射線又は出力電磁放射線は、約４４０ｎｍ〜約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ〜約５５０ｎｍ、約５０５ｎｍ〜約５３５ｎｍ、約５５０ｎｍ〜約５９５ｎｍ、約５８５ｎｍ〜約６３０ｎｍ、約６００ｎｍ〜約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ〜約７１０ｎｍの範囲の波長を包含する帯域からなる群からの１つ以上の可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、電磁放射線は、可視光及び非可視光からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約４００ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。いくつかの実施形態において、可視光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲の波長を有する可視光帯域を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本システムは、第１バイオマーカーの発現の定量化又は第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】試料の画像データを獲得するためのイメージング装置のブロック図である。
【図２】典型的な実施形態による、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するように設定されたコントローラのブロック図である。
【図３】典型的な実施形態による、腫瘍組織を含む試料を採点するためのプロセスのフローチャートである。
【図４】第２の典型的な実施形態による、腫瘍組織を含む試料を採点するためのプロセスのフローチャートである。
【図５】典型的な実施形態による、腫瘍組織を含む試料を採点するのに使用される画像処理工程の作業工程図である。
【図６】イメージング及び解析のための組織試料の調製に使用される抗体及び検出試薬の概要の非限定例を示す。
【図７ａ】画像内のＤＡＰＩで検出された全ての核の非限定例を示す。
【図７ｂ】図７ａにおける全細胞の拡張されたバイナリマスクの非限定例を示す。
【図８ａ】４８８染料で検出されたＳ１００の画像の非限定例を示す。
【図８ｂ】図８ａにおける全腫瘍領域のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図８ｃ】図８ａにおける全腫瘍細胞のマスクの非限定例を示す。
【図８ｄ】図８ａにおける全非腫瘍細胞のマスクの非限定例を示す。
【図９ａ】Ｃｙ（登録商標）５で検出されたＰＤ−Ｌ１の画像の非限定例を示す。
【図９ｂ】図９ａにおける全ＰＤ−Ｌ１陽性細胞のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図１０ａ】Ｃｙ（登録商標）３．５で検出されたＰＤ−１の画像の非限定例を示す。
【図１０ｂ】図１０ａにおける全ＰＤ−１陽性非腫瘍細胞のバイナリマスクの非限定例を示す。
【図１１ａ】全ＰＤ−Ｌ１陽性細胞とそれと最も近接した細胞の相互作用マスクの非限定例を示す。
【図１１ｂ】ＰＤ−Ｌ１陽性細胞と極接近したＰＤ−１陽性細胞の相互作用区画の非限定例を示す。
【図１２ａ】２６人の黒色腫患者から得た相互作用スコアの非限定例を示す。
【図１２ｂ】図１２ａの２６人の黒色腫患者から得た相互作用スコア最大値の非限定例を示す。
【図１３】強化アルゴリズムの代わりにホールスライドイメージング法に基づいた解析結果を示す。
【図１４】２６人の患者の相互作用スコアと無増悪生存期間との比較を示す。注）＊は未修正ログランク検定を示す。
【図１５】前記患者のＰＤ−Ｌ１発現と無増悪生存期間との比較を示す。
【図１６】免疫療法に対して積極的な応答者におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、全腫瘍細胞（緑）、及び全細胞（青）に対応する蛍光信号のマスクの非限定例を示す。
【図１７】免疫療法に対して消極的な応答者におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、全腫瘍細胞（緑）、及び全細胞（青）に対応する蛍光信号のマスクの非限定例を示す。
【図１８】３８人の非小細胞肺がん患者から得た典型的なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを示す。
【図１９】前記患者の、２３Ｃ３ＦＤＡ認可ＩＨＣアッセイを用いたＰＤ−Ｌ１発現と無増悪生存期間との比較を示す。注）＊は、未修正ログランク検定を用いてｐ値を求めたことを示す。
【図２０ａ】３４人の追加の黒色腫患者から得た相互作用スコアの非限定例を示す。
【図２０ｂ】図２０ａの患者の相互作用スコアと無増悪生存期間との比較を示す。
【図２０ｃ】図１２ａ及び図１２ｂの患者並びに図２０ａの患者から得た相互作用スコアを示す。
【図２０ｄ】図２０ｃの患者の相互作用スコアと無増悪生存期間との比較を示す。注）＊は、未修正ログランク検定を用いてｐ値を求めたことを示す。
【図２０ｅ】図２０ｃの患者の相互作用スコアと全生存期間（ＯＳ）との比較を示す。注）＊は、未修正ログランク検定を用いてｐ値を計算したことを示す。
【図２１】２９人の転移性黒色腫患者から得たＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０相互作用スコアの非限定例を示す。
【図２２】２９人の精巣がん患者から得たＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアの非限定例を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３５】
以降、様々な実施形態について説明する。ここで注目すべきなのは、具体的な実施形態が包括的な記述を目的とするものではなく、又は本明細書において説明される更に広い態様への限定を目的とするものではないことである。具体的な実施形態と併せて説明されるある態様は、前記実施形態に限定すべきではなくかつそれ以外の実施形態と共に実行することが可能である。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「約」は、当業者に理解できるものであり、しかも使用される文脈に応じてある程度の幅がある。当業者に不明な用語が使用されている場合、使用されている文脈を考慮すれば、「約」は特定条件の最大±１０％を意味する。
【００３７】
要素を説明する文脈における（特に、以下の請求項の文脈における）「一つの（ａ、ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で特に指示がない限り又は文脈から明白に矛盾するものでない限り、単数と複数の両方を網羅するものとする。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において特に指示がない限り、単にその範囲内の個々の数値それぞれに独立して言及する簡潔な方法として用いることを目的とするものであり、また、個々の値はそれぞれ、本明細書に独立して列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書において特に指示がない限り又は文脈から明白に矛盾するものではない限り、任意の好適な順序で実行することができる。任意の及びすべての実施例並びに本明細書において規定される典型的な言葉遣い（例えば、「など」）の使用は、単に実施形態をより明確に説明することを目的とするものであって、特に断りのない限り、請求項の範囲に制限するものではない。本明細書中の言葉遣いはいずれも、クレームされていない要素を本質的要素として示すものと解釈されるべきではない。
【００３８】
「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、障害に関する状態、症状若しくはパラメータを改善するか又は障害の進行を遅らせるのに有効な量、様式又はモードで、統計的に有意な程度又は当業者が検出可能な程度まで治療を施すことを意味する。有効な量、様式又はモードは、対象によって変わる可能性があり、また、患者に合わせてもよい。
【００３９】
一態様において、本明細書には、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料の採点方法を実行するためのシステムが提示されている。
【００４０】
図１は、試料の分光分解された多重画像を獲得するためのイメージング装置１００を示す概略図である。電磁放射線（ＥＭＲ）源１０２は、電磁放射線を調整用光学系部品１０４へ供給する。いくつかの実施形態において、電磁放射線は可視光である。ＥＭＲ源１０２は、白熱ランプ、蛍光ランプ、又はダイオードなどのインコヒーレント光源であり得る。ＥＭＲ源１０２は、レーザ光源などのコヒーレント光源でもあり得、また、コヒーレント光源は、連続波（ＣＷ）又はパルス光を提供することができる。ＥＭＲ源１０２は、ある波長域を有する光を発生するための多光源部品（例えば、多重ダイオード）を収容していてよい。光は、連続波（ＣＷ）又は時間ゲート式（すなわち、パルス式）光のいずれであってもよい。さらに、光は、電磁分光の選択された部分に供給されることもある。例えば、光は、紫外線、可視光、赤外線、又は他の分光領域に存する中心波長及び／又は波長分布を有することができる。いくつかの実施形態において、光は、約３８０ｎｍ〜約７２０ｎｍの範囲に存する波長を有する。ＥＭＲ源１０２はさらに、様々な光学部品、例えば、レンズ、鏡、波長板、及び非線形結晶を備えることも可能であり、それらはいずれも、選択された特徴を有する光を発生するために使用できる。一般に、ＥＭＲ源１０２は、所望の分光、空間及び、いくつかの実施形態では時間特性を有する光を提供するように設定された光学部品及び光学素子を備えている。
【００４１】
調整用光学系部品１０４は、可視光などの電磁波を様々な形で変換するように設定され得る。例えば、調整用光学系部品１０４は、光を分光フィルタリングして、選択された分光波長域の出力光を提供することができる。あるいは、又はさらに、調整用光学系部品は、光の空間分布と光の時間特性を調節することができる。入射電磁放射線、すなわち入射光は、ＥＭＲ上の調整用光学系部品１０４の素子の作用によって生成される。
【００４２】
入射光は、照明ステージ１０６に取り付けられた試料１０８に入射するように向けられる。ステージ１０６は、取り付けクリップ又は他の固定装置のように試料１０８を保護する手段を提供することができる。あるいは、ステージ１０６は、複数の試料１０８が取り付けられる可動トラック又はベルトを含むことができる。ドライバー機構は、複数の試料を一つずつステージ１０６上の照明領域からうまく移動させて、そのときに入射光が試料に衝突するようにトラックを動かすように設定され得る。ステージ１０６はさらに、移動軸と、照明ステージ１０６の固定位置に関連して試料１０８を移動させるための機構と、を含むこともできる。移動機構は、手動操作可能である（例えば、ねじ棒）か、又は電動作動によって自動で移動可能である（例えば、電動ドライバー、圧電式アクチュエータ）。
【００４３】
可視光などの入射電磁放射線に応答して、発光された電磁放射線が試料１０８から出現する。発光光は、様々な形で生成され得る。例えば、いくつかの実施形態において、発光光は、試料１０８を通過した入射光の一部に対応している。他の実施形態において、発光光は、試料から反射した入射光の一部に対応している。さらなる実施形態において、入射光は、試料１０８によって吸収される可能性があり、発光光は、入射光に応答して試料１０８から蛍光発光に対応している。なおさらなる実施形態において試料１０８は発光性でもあり得、入射光がなくても発光光を生成する可能性もある。いくつかの実施形態において、発光光としては、前述の機構のうち２つ以上によって生成された光をあげることができる。
【００４４】
集光光学系部品１１０は、試料１０８からの発光光などの発光された電磁放射線を収容するように配置される。集光光学系部品１１０は、例えば、光が発散する場合に、発光光に視準を合わせるように設定することができる。集光光学系部品１１０はまた、発光光を分光フィルタリングするように設定することもできる。フィルタリング操作は、例えば、上述の機構のうち一つから発生する発光光の一部を、他の処理から発生する光から分離するために有用であり得る。さらに、集光光学系部品１１０は、実施形態における特定の目的のために発光光の空間特性及び／又は時間特性を変更するように設定され得る。集光光学系部品１１０は、発光光を、検出器１１２に入射する出力光へ変換する。
【００４５】
調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０は、対象である試料へ入射する光の特性及び対象である試料から発光される光の特性を操作するために様々な光学部品を包含することができる。例えば、調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０はそれぞれ、入射光及び発光光から特定の波長帯域を選択するために分光フィルタ素子を包含することができる。分光フィルタ素子は、例えば、フィルタに取り付けられた干渉フィルタを包含することができる。いくつかの実施形態において、液晶マスクに準拠した調節可能なフィルタ素子を使用することによって、入射光又は発光光の分光特性を変えることができる。液晶系装置は、通信用インターフェース１５２を介してコントローラ１５０によって制御され得る。
【００４６】
調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０はさらに、試料への入射光又は試料からの発光光の空間分布を操作するために空間光マスク、空間光変調器及び光学パルス整形器などの素子も包含することができる。空間光変調器及び他の適応装置もまた、通信用インターフェース１５２を介してコントローラ１５０によって制御され得る。
【００４７】
最後に、調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０は、入射光又は発光光に選択された特徴を付与することを目的として設定された他の一般的な光学素子、例えば、鏡、レンズ、ビームスプリッター、波長板なども包含することができる。
【００４８】
一般に、検出器１１２は、試料によって発光された光を試料の多重画像として検出及び捕獲するように設定された１つ以上の測定装置を包含する。実施形態において、検出器１１２は、光の空間的特性及び／又は時間特性及び／又は分光特性を測定するように設定され得る。検出器１１２は、画像を獲得するためにＣＣＤ配列及び光電子増倍管などの装置をそれらの各コントロールシステムとともに包含することができる。検出器１１２は、出力光に対応する電気信号を発生させてコントローラ１５０に伝達する。検出器１１２内の適した光学装置は、一般に、通信用インターフェース１５２を介してコントローラ１５０によって制御され得る。
【００４９】
コントローラ１５０は、通信用インターフェース１５２及び処理回路１５６を備えている。コントローラ１５０は、検出器１１２によって検出される出力光に対応する信号を受信することに加えて、電気信号を検出器１１２に送ることによって、通信用インターフェース１５２を通じて検出器１１２の様々な特性を調整する。例えば、検出器１１２がＣＣＤセンサを備えている場合、コントローラ１５０は、電気信号を検出器１１２へ送ることによって、ＣＣＤセンサの露光時間、活動領域、利得設定、及び他の特性を制御することができる。
【００５０】
コントローラ１５０はまた、通信用インターフェース１５２を介してＥＭＲ源１０２、調整用光学系部品１０４、ステージ１０６、及び集光光学系部品１１０ともつながっている。コントロールシステム１１４は、システム１００の各素子へ電気信号を供給することによって、素子の様々な特性を調整する。例えば、光源１０２へ供給される電気信号を用いて、光１２２の強度、波長、繰り返し周波数、又はその他の特性を調整することができる。ＥＭＲ源１０２によって生成される光がパルス式（すなわち、時間ゲート式）である場合、光パルスの様々な特性は、コントローラ１５０から通信用インターフェース１５２を介してＥＭＲ源１０２へ供給されるコントロール信号にしたがって操作され得る。光調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０へ供給される信号としては、例えば、光の空間的特性を調節する装置（例えば、空間光変調器）の特性を設定するための信号、及び分光フィルタ装置の特性を設定するための信号をあげることができる。照明ステージ１０６へ供給される信号は、例えば、ステージ１０６と関連して試料１０８を位置付けるために及び／又は試料をステージ１０６上の照明位置まで移動するために供給することができる。
【００５１】
通信用インターフェース１５２は、様々なシステム、装置又はネットワークとデータ通信を行うために有線インターフェース又は無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバ、ワイヤー端子など）を包含していてもよい。例えば、通信用インターフェース１５２としては、イーサネット系通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカード及びポート、及び／又は無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉ−Ｆｉトランシーバをあげることができる。通信用インターフェース１５２は、ローカルエリアネットワーク又は広域ネットワーク（例えば、インターネット、構築ＷＡＮなど）を介して通信するように設定されてもよく、また、様々な通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用することもできる。
【００５２】
コントローラ１５０もまた、通信用インターフェース１５２を介してユーザインターフェース１５４とつながっていてもよい。ユーザインターフェース１５４は、システム特性及びパラメータを表示するため及び試料１０８の取り込み画像を表示するための表示装置であってよい。ユーザインターフェース１５４は、イメージング装置１００とのオペレータ相互作用を手助けてかつコントロールするために提供される。処理回路１５６は、検出器１１２を使用して取り込んだ画像データを保存するための記憶装置、例えばメモリ１６０を含み、さらには、例えば、上述の及びさらに以降に記載するようなプロセッサ１５８に制御機能を実行させるプロセッサ１５８への指示を組み込むコンピュータソフトウェアも包含する。さらに、ソフトウェアの指示は、検出器１１２によって取り込まれた画像をプロセッサ１５８に数学的に操作させる。画像の処理及び計算については、本明細書にさらに詳細に記載するが、イメージング装置１００のプロセッサ１１６、又は図２に示しかつ以降に説明されるコントローラ２００などのイメージング装置１００と関連する外部のコンピュータシステムのいずれかによって実行される。
【００５３】
多くの実施形態において、システム１００は、試料１０８の多重分光画像を獲得するように設定されている。多重分光画像は、光の様々な選択された波長における試料１０８の照明に対応しており、そして試料１０８を透過する光又は試料１０８によって反射される光の強度を検出することが可能である。あるいは、多重分光画像は、同様の分光特性を有する光によって試料１０８を照明して、試料１０８の多重画像を収集することに対応している可能性もあり、画像はそれぞれ発光光の様々な波長と対応している。調整用光学系部品１０４及び集光光学系部品１１０における分光フィルタ素子は、一般に、分光分解された画像を得るために使用される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、試料１０８の画像は、連続した取り込み画像間で光学系部品（例えば、光学フィルタ）の設定調整を行いながら順番に収集され得る。他の実施形態において、多重画像は、多重試料ビューを検出するように設定された検出システムを使用して同時に取り込むことができる。例えば、検出システムは、検出器、例えばＣＣＤカメラなどの検出器に対する様々な照明又は発光波長に応じて試料の様々なビューを提示するように設定でき、また、多重ビューも同時に取り込むことができる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、調整用光学系部品１０４は、フィルタホイール又は液晶分光フィルタなどの調節可能な分光フィルタ素子を包含する。フィルタ素子は、様々な光波長帯域を使用して試料１０８に照明を施すように設定され得る。ＥＭＲ源１０２は、広い分光波長成分分布を有する光を提供することができる。選択された広い波長分布領域は、調整用光学系部品１０４内のフィルタ素子によって入射光として通過させて、試料１０８へ入射するように向けられる。試料１０８を透過した光の画像は、検出器１１２によって記録される。その後、調整用光学系部品１０４におけるフィルタ通過帯域の波長を変化させて様々な波長の入射光を提供し、そして試料１０８を透過した（かつ入射光の新たな波長に対応する）光の画像が記録される。同様の一連の分光分解画像はまた、様々な波長の光を発生する多重光源素子を有するＥＭＲ源１０２を用いることによって、あるいは様々な供給源素子のスイッチを入れたり切ったりすることによって、様々な波長の入射光を提供することによっても記録され得る。
【００５６】
上述の通り、試料１０８からの発光光はまた、試料１０８から反射される入射光にも対応している。さらに、発光光は、試料が蛍光化学構造を包含する場合、試料１０８からの蛍光発光にも対応している可能性がある。いくつかの試料では、発光光は、多重光源からの寄与因子（すなわち、透過及び蛍光発光）を包含する可能性もあり、また、光調整用光学系部品１１０内の分光フィルタ素子は、これら信号寄与因子を分離するために使用される可能性もある。
【００５７】
一般に、調整用光学系部品１０４と集光光学系部品１１０はいずれも、設定可能な分光フィルタ素子を包含する。したがって、分光分解は、試料１０８の励起面で（例えば、調整用光学系部品１０４を介して）又は試料１０８の発光面で（例えば、集光光学系部品１１０を介して）のいずれか一方あるいは両方で展開され得る。いずれにしても、試料１０８の多重分光分解画像の集光結果は、「画像スタック」であり、ここで、スタック中の各画像は、特定波長に対応する試料の２次元画像である。概念上、画像セットは、３次元マトリクスを形成すると視覚化でき、その場合、マトリクス次元のうちの２つは、各画像の空間長と空間幅であり、また、３つ目のマトリクス次元は、画像が対応する分光波長（発光又は励起）である。したがって、分光分解された画像セットは、画像の「スペクトラルキューブ」と称することができる。本明細書で使用するとき、このような画像セット（又は画像スタック若しくはスペクトラルキューブ）の「画素」は、各画像における一般的な空間的位置を指す。したがって、画像セットの画素は、画素に対応する空間的位置にある各画像に関する値を包含する。
【００５８】
当該分野において既知の分光画像を得るための他の配置が、手元にある試料の要件にしたがって使用されてもよい。
【００５９】
上述の各分光画像は典型的に特定の波長又は波長域（例えば、分光帯域）を意味するが、全般的に、各分光画像は、１つ以上の波長帯域を包含し得る分光指数、又はより複雑な分光分布に対応する可能性がある。例えば、このような画像は、分光くし形フィルタを使用して生成させることができる。一般に、画像キューブは、数個、例えば１０以上の分光画像を包含する。また一方、いくつかの実施形態において、画像キューブは、より少ない、例えば２つ又は３つの分光画像のみを包含する可能性もある。このような例の一つは、赤−緑−青（ＲＧＢ）色画像であって、その場合、各画素は、それぞれ赤色、緑色及び青色の強度に関する値を包含する。このような情報は、別個の画像のセットとしてよりも単色画像として表示され得るが、その情報量は、画像セットと同様であるため、両方の場合を意味する表現「分光画像」を用いるものとする。
【００６０】
イメージング装置１００は、試料の画像を取り込んで、本明細書に記載の後の試料分析アルゴリズム、例えばがん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するための方法及びアルゴリズムに使用される試料の画像データ１３０を生成するための様々な光学系部品及び装置を包含することができる。このようなイメージング装置は、特許文献１（発明の名称「Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ」）で説明されており、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【００６１】
試料のイメージング処理前に、組織試料は、特異的バイオマーカーに対して親和性を持つ複数の蛍光タグを用いて染色されてよい。染色された試料のデジタル画像が取得でき、また、その画像はさらに、蛍光タグの位置に基づいて解析され得る。イメージング装置１００の処理回路１５６は、全画像解析よりもむしろ、コントローラ１５０に視野選択を実行させるソフトウェアを包含してもよい。その場合、視野は、対象である第１バイオマーカーを発現する細胞数に応じて優先順位を決めてよい。所定の数の視野はさらに、蛍光信号についても解析され得る。いくつかの実施形態において、４種の異なる蛍光タグの使用は、対象である第１バイオマーカーに対応する蛍光信号の画像及び対象である第２バイオマーカーに対応する蛍光信号の画像に加えて、全細胞によって発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像及び腫瘍細胞によって発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像も生成する。
【００６２】
本明細書に記載の通り、組織試料を採点するためのイメージング装置１００から得た画像データの操作は、図２に概略的に図示しているコントローラ２００によって実行され得る。コントローラ２００は、通信用インターフェース２０２及び処理回路２０４を備えることが分かる。処理回路２０４は、組織試料を採点するための工程を実行するように設定される。コントローラ２００の素子及び機能は、イメージング装置１００のコントローラ１５０に包含されてもよく、又はイメージング装置１００とは別のコンピュータシステムに含まれていてもよいと想定される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、蛍光信号の画像は、画像内の細胞に対応する１つ以上の蛍光信号のマスクを生じさせるように操作される。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光信号のマスクは、画像内の全細胞のマスク、画像内の全腫瘍細胞のマスク、画像内の非腫瘍細胞全てのマスク、画像内の、対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞のマスク、画像内の、対象である第２バイオマーカーを発現する全細胞のマスク、及び画像内の対象である第１バイオマーカーを発現する全細胞に加えて、対象である第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を表す相互作用マスクからなる群から選択される１つ以上を含む。なおさらなる実施形態において、相互作用マスクは、対象である第１バイオマーカーを発現する細胞に近接していた対象である第２バイオマーカーを発現する全ての選択された視野からの細胞の相互作用区画を生じさせるのに使用される。相互作用区画の総面積は、少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の空間的近接を表すスコアを生成するのに使用されてよい。いくつかの実施形態において、スコアは、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す。いくつかの実施形態において、本システムは、対象である第１バイオマーカーの発現の定量化又は対象である第２バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【００６４】
図３は、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するための方法の一実施形態の工程を表すフローチャートである。工程３０１では、画像データ、例えば画像データ１３０が得られる。画像データは、イメージング装置、例えばイメージング装置１００によって得られてよい。工程３０２では、画像データは純粋であることから、様々な種類の蛍光信号に特異なデータが別個のチャネルに分類される。工程３０３では、第１チャネルからのデータは、第１バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第１バイオマーカーマスク）を生成するのに使用される。全細胞のマスクは次に、拡張されて（工程３０４）、相互作用する細胞（第２バイオマーカーに陽性）がその中に含まれ得る所定の近接を表す拡張されたマスクを生成する。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーマスクは、１画素〜１００画素の間で拡張される。工程３０５では、第２チャネルからのデータは、第２バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第２バイオマーカーマスク）を生成するのに使用される。工程３０６では、第１バイオマーカーマスクと第２バイオマーカーマスクを組み合わせることによって、第１バイオマーカーに陽性を示す細胞の所定の近接範囲内に存する第２バイオマーカーに陽性を示す細胞を同定する相互作用マスクを生成する。工程３０７では、相互作用マスクの面積に基づいて、空間的近接スコアが計算される。
【００６５】
図４は、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するための方法の第２の実施形態の工程を示す、２つ目のフローチャートである。工程４０１では画像データが得られ、また、工程４０２では、その画像データは純粋であることから、様々な種類の蛍光信号に特異なデータが別個のチャネルに分離される。工程４０３では、第１チャネルからのデータを使用して視野内の全細胞のマスクを生成し、また、工程４０４では、第２チャネルからのデータを使用して、視野内の腫瘍面積などのサブセット面積のマスクを生成する。工程４０５では、全細胞のマスクをサブセット面積のマスクと組み合わせることによって、サブセット細胞のマスク及び非サブセット細胞のマスクを生成する。いくつかの実施形態では、サブセット細胞は腫瘍細胞であり、非サブセット細胞は非腫瘍細胞である。工程４０６では、第３チャネルからのデータを用いて、第１バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第１バイオマーカーマスク）を生成する。全陽性細胞のマスクは次に、拡張されて（工程４０７）、相互作用する細胞（すなわち、第２バイオマーカーに陽性の細胞）がその中に含まれ得る所定の近接を表す拡張されたマスクを生成する。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーマスクは、１画素〜１００画素の間で拡張される。工程４０８において、第４チャネルからのデータを用いて、第２バイオマーカーに陽性を示す全細胞のマスク（第２バイオマーカーマスク）を生成する。工程４０９では、拡張された第１バイオマーカーマスクと第２バイオマーカーマスクを組み合わせることによって、第２バイオマーカーに陽性を示しかつ第１バイオマーカーに陽性を示す細胞の所定の近接範囲内に存する細胞を同定する、相互作用マスクを生成する。工程４１０において、空間的近接スコアは、相互作用マスクの面積を、全サブセット細胞又は全細胞の面積（どちらか一方の入力データの使用を表す図１５のフローチャートにおいて点線で示されるようなもの）で割ることによって計算される。いくつかの実施形態において、サブセット細胞は、第２バイオマーカーに陽性を示し得る細胞である。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーに陽性を示し得る細胞は、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、生存細胞及び非生存細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、また、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに包含されない生存細胞からなる。いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、Ｔ細胞及び非Ｔ細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞のサブセット及び細胞の非サブセットはそれぞれ、骨髄性細胞及び非骨髄性細胞に対応し、あるいはその逆であってもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、１対の細胞同士の近接を表す。いくつかの実施形態において、１対の細胞同士の近接は、１対の細胞の境界線間の近接であって、１対の細胞の質量中心間の近接によって求めること、１対の細胞の選択された第１細胞周囲の外周に基づいて境界線ロジックを用いること、１対の細胞の境界における相互作用を求めること、及び／又は１対の細胞の重なり領域を求めることによって求めることができる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、試料の画像と関連したメタデータと関連しており、生成された報告に包含され、免疫療法計画を決定するためにオペレータに提供されて、データベースに記録され、患者の医療記録と関連させ、及び／又はディスプレイ装置に表示される。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本システムは、対象である第１バイオマーカーの発現の定量化又は対象である第２バイオマーカーマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【００７０】
本明細書に記載の方法において、デジタル画像の操作は、例えば、典型的な実施形態に従って図２のブロック図に例示されたコントローラなどのコントローラを備えたコンピュータシステムによって実行されてよい。コントローラ２００は、通信用インターフェース２０２及び処理回路２０４を備えることが分かる。通信用インターフェース２０２は、様々なシステム、装置又はネットワークとデータ通信を行うために有線インターフェース又は無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバ、ワイヤー端子など）を包含していてもよい。例えば、通信用インターフェース２０２は、イーサネット系通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカード及びポート、及び／又は無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉ−Ｆｉトランシーバを包含していてもよい。通信用インターフェース２０２は、ローカルエリアネットワーク又は広域ネットワーク（例えば、インターネット、構築ＷＡＮなど）を介して通信するように設定されてもよく、また、様々な通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用することができる。
【００７１】
通信用インターフェース２０２は、コントローラ２００と様々な外部システム又は外部装置（例えば、イメージング装置１００）との間で電子データ通信を促進するように設定されたネットワークインターフェースであってもよい。例えば、コントローラ２００は、選択された視野に関する画像データをイメージング装置１００から受信して、データを解析して空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算することができる。
【００７２】
さらに図２についていえば、処理回路２０４は、プロセッサ２０６及びメモリ２０８を包含することが分かる。プロセッサ２０６は、汎用のプロセッサ若しくは特定の目的のプロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、処理コンポーネントのグループ、又は他の好適な処理コンポーネントであってもよい。プロセッサ５０６は、メモリ５０８に記憶された又は他のコンピュータ可読媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ、ネットワーク記憶装置、リモートサーバ）から受信された計算機コードを実行するように設定されていてもよい。
【００７３】
メモリ２０８は、本開示において説明される様々な処理を計算及び／又は促進するためのデータ及び／又は計算機コードを記憶するための１つ以上の装置（例えば、記憶装置、メモリ素子、ストレージデバイスなど）を包含してもよい。メモリ２０８は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み込み専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ記憶装置、一時記憶装置、不揮発性メモリ、フラッシュメモリ、光メモリ、又はソフトウェアオブジェクト及び／又はコンピュータ指示を記憶するための任意の他の好適なメモリを包含してもよい。メモリ２０８は、データベースコンポーネント、オブジェクトコードコンポーネント、スクリプトコンポーネント、又は本開示において説明される様々なアクティビティ及び情報構造を支援するための任意の他の種の情報構造を包含してもよい。メモリ５０８は、処理回路２０４を介してプロセッサ２０６と通信可能に接続されていてよく、また、本明細書に記載の１つ以上の処理を実行する（例えば、プロセッサ２０６によって）ためのコンピュータコードを包含してもよい。
【００７４】
さらに図２についていえば、コントローラ２００は、イメージング装置１００から入力を受信することが分かる。イメージング装置は、画像データをすべて取得して、それを説明するメタデータの全てとともにそれを記録する。イメージング装置は、その後、コントローラ２００によって読み出すことができるストリームにデータをシリアル化する。データストリームは、任意のバイナリデータストリームタイプ、例えば、ファイルシステム、ＲＤＢＭ又はダイレクトＴＣＰ／ＩＰ通信などに対応し得る。データストリームを使用する場合、コントローラ２００は、分光分離装置２１０を包含することが分かる。分光分離装置２１０は、画像データをイメージング装置１００から受信することができ、そこで分光分離を行って、各波長帯域に対して独立した個別のチャネルに様々な波長を表す画像を分離する。例えば、画像データは、組織試料において対象である細胞又はタンパク質を同定するのに使用される様々な蛍光色素分子ごとに別個のチャネルへ「分離」されてよい。蛍光色素分子は、ほんの一例として、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８染料、５５５染料、５９４染料、及びＴｅｘａｓＲｅｄからなる群のうちの１つ以上であってよい。ある例では、チャネルのうちの１つは、画像中の核を同定するように、波長４６１ｎｍ（ＤＡＰＩに関する最高発光波長）周囲の所定の帯域内に存する画像データを包含していてもよい。その他のチャネルは、様々な波長に対する画像データを包含して、様々な蛍光色素分子を使用して組織試料の様々な部分を同定してもよい。
【００７５】
コントローラ２００は、様々なマスカー、例えば細胞マスカー２１２、サブセット領域マスカー２１６、第１バイオマーカーマスカー２２、及び第２バイオマーカーマスカー２２４などを包含することも分かっている。他の実施形態においてコントローラ２００に包含され得るこれらマスカー又は他のマスカーを使用して単純信号を分光分離装置２１０から受信して、組織試料において対象である特定の特徴を同定するのに使用される蛍光色素分子に応じて、対象である特定の細胞又は領域に対してマスクを作成する。マスクを作成するために、マスカー（例えば、細胞マスカー２１２、サブセット領域マスカー２１６、第１バイオマーカーマスカー２２、及び第２バイオマーカーマスカー２２４など）は、視野に内の各画素の強度に関連した画像データを受信する。画素強度は、試料によって発光される蛍光発光の量に正比例しており、その結果、（蛍光色素分子を使用して特有のバイオマーカーを同定する場合、）試料中のタンパク質バイオマーカーの量と正比例する。絶対閾値は、画像画素に認められる値に基づいて設定されてよい。閾値以上の画素はすべて、１．０又は「オン」にマッピングされ、また、それ以外の画素はすべて、０．０又は「オフ」にマッピングされる。この方法において、バイナリマスクは、視野内の対象である細胞部分又は組織部分を同定するために作成される。他の実施形態において、マスクは、下界を用いて作成され、その場合、下界以上の整数を有する画素はすべて認められて、マスクにおいて画素値として使用される。強度が下界未満の場合、画素値は０．０又は「オフ」に設定される。
【００７６】
図５に示すマスキングのための作業工程図例において、核領域及び腫瘍領域を特定する蛍光信号に関するチャネル（例えば、それぞれＤＡＰＩ及び４８８染料チャネル）は、下界プロトコル（工程５１０、５１２、５２０、５２２）を使用するが、バイオマーカーを同定するためのチャネル（例えば、それぞれＣｙ５およびＣｙ３．５チャネル）は、マスク出力を提供するために閾値プロトコル（工程５３０、５４０）を使用することが示される。下界プロトコルと関連して、下界を求めるためのヒストグラム工程もある。具体的には、ヒストグラムの閾値（工程５１２、５２２）は、入力画像の閾値をもたらすが、閾値化が生じるポイントを求めるためにスライディングスケールを使用する。入力データは、現在の画像とユーザが確定した閾値パーセンテージである。後者は、閾値レベルを設定すべき合計強度のパーセントを求めるのに使用される。先ず、各画素の強度を合計して合計強度とする。閾値パーセンテージにこの合計強度を掛けると、カットオフ合計が得られる。最後に、画素全てを、（ヒストグラム中の）強度で分類して、カットオフ合計に至るまで（ｂｉｎごとに）あらゆる前記強度を合計する。処理中に達した最後の最高画素強度が、現在の画像における閾値である。その値よりも大きな強度を有する全ての画素は、最大値に設定し、一方、それ以外はすべて最小値に設定される。
【００７７】
図５において工程５１４、５１６、５２４、５２６、５２８、５３２、５３４、５３６、５４２、５４４として特定される工程は、初期マスカー、例えば細胞マスカー２１２、サブセット領域マスカー２１６、第１バイオマーカーマスカー２２２及び第２バイオマーカーマスカー２２４中で生じる中間工程を表す。これら工程は、次のように定義される。
【００７８】
拡張は、画像中の最高輝度の領域の面積を拡大する。拡張には、２つの入力データが必要である。１つ目は、計算上の現在の画像であり、２つ目は、拡張反復回数である。１つ目の入力データには二値画像のみが使用されると考えられる。この手順は、連続画像で操作するが、出力は有効な拡張ではない。拡張処理は、先ず、画像中の最大画素強度を見つけることによって開始する。その後、画像中の各画素を一度試験する。調査中の画素が最大強度と等しい強度を有する場合、その画素が、反復半径を有しかつ元の画素を中心とした円として出力画像に書き込まれる。円内の画素はすべて、最大強度と等しい強度を有する。それ以外の画素はすべて、変更せずに出力画像へ複写される。
【００７９】
穴埋め手順は、画像の「空」領域を最高強度の画素で埋めるものである。これら空領域は、最小強度を有する領域であり、また、その画素領域（サイズ）はユーザによって指定される。現在の画像とサイズは、必要な２つの入力データである。拡張と同様に、この手順は、二値画像にのみ適用されるべきである。
【００８０】
エロ―ジョン処理は、拡張と同じ方法で画像形成する。第１工程が画像の最小強度を測定して、最低強度と合致する画素のみを変更して、獲得した最小強度の強度をブルームするのに使用した円を最低強度値で埋めること以外は、機能性はすべて拡張と同様である。拡張と同様に、この手順は、二値画像に適用されるのみのはずである。
【００８１】
オブジェクトの削除。２つの入力データ、すなわち、現在の画像とオブジェクトサイズが期待される。オブジェクトの削除は、穴埋め手順とは逆のものである。入力データであるオブジェクトサイズよりも小さな面積を埋める最大強度を有する画素のみを含む任意の領域は、最小強度と設定され、したがって「削除される」。この手順は二値画像にのみ適用されるべきであり、連続画像への適用は、予想外の結果をもたらす可能性がある。
【００８２】
最終工程５１８、５２９、５３８及び５４６における出力はそれぞれ、結果として得られた細胞マスク、サブセット領域マスク（又は、この特定の例では、腫瘍領域マスク）、バイオマーカー１細胞マスク、及びバイオマーカー２細胞マスクである。図５はさらに、空間的近接スコアを計算するための得られたマスクの組み合わせを示している。これらの組み合わせを、図２に示すコントローラ２００の組み合わせマスカーを参照して、以下に説明する。
【００８３】
コントローラ２００は、組み合わせマスカー、例えばサブセット細胞マスカー２１８、非サブセット細胞マスカー２２０、及び相互作用マスカー２３０を包含することも分かっている。サブセット細胞マスカーは、図５の工程５５２に示すようなａｎｄ演算を実行して、細胞マスカー２１２（画像中の全細胞を表す）の出力をサブセット領域マスカー２１６の出力と組み合わせる。したがって、サブセット細胞マスカーは、画像中の全サブセット細胞のマスクを生成する。いくつかの実施形態において、サブセット細胞は、腫瘍細胞である。これと同じ組み合わせは、図５の工程５５４で示されるような非サブセット細胞マスカー２２０によって実行されるｏｕｔ演算を用いて、試料画像中に非サブセット細胞全てのマスクを生成する。いくつかの実施形態において、非サブセット細胞は、非腫瘍細胞である。
【００８４】
別のマスクと組み合わせる前に、第１バイオマーカーマスク（第１バイオマーカーマスカー２２２から得たもの）を、拡張装置２２６で拡張する。拡張されたマスクは、第２バイオマーカーを発現する細胞が第１バイオマーカーを発現する細胞と相互作用するのに適した近接な範囲内に存する空間を特定するために、第１バイオマーカーを発現する前記細胞を取り囲む面積を表す。これは、図５の工程５５６及び５５８で表される。図５のフローチャートは、２つの工程５５６及び５５８において生じる拡張を表している。これは、各工程において最大反復回数に制限がある場合に必要とされる可能性がある。例えば、反復回数は最大１０回（１０画素増加に相当）であってよく、つまり、２０画素増加する必要がある場合は、拡張を２つの後続工程に分ける必要がある。
【００８５】
第２バイオマーカーマスカー２２４内では、バイオマーカーマスクを、図５の工程５６０に示すように、ａｎｄ演算を使用して前記非サブセット細胞マスクと組み合わせて、第１バイオマーカーに陽性を示す非サブセット細胞全てのマスクを生成することができる。このマスクは、その後、相互作用マスカー２３０において、拡張装置２２６からの拡張されたマスクと組み合わせて（工程５６２）、相互作用マスクを生成する。相互作用マスクは、第２バイオマーカーに陽性を示しかつ相互作用面積内にも存するか又は拡張されたマスクと重なる、非腫瘍細胞を特定した。前記特定された細胞は、その後、第１バイオマーカーに陽性を示す細胞と相互作用する細胞を表すため、さらに大きな治療反応をもたらす。
【００８６】
空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算するために、相互作用マスクの面積を面積評価装置２３２において画素で求める。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーを発現できる全細胞の面積は、面積評価装置２３４において画素で求められる。第２バイオマーカーを発現できる細胞は、腫瘍細胞又は非腫瘍細胞であってよい。いくつかの実施形態において、視野内の全細胞の面積は、面積評価装置２３４において画素で求められる。相互作用スコア、すなわち空間的近接スコアは、相互作用計算機２３６において、面積評価装置２３２から得た面積を面積評価装置２３４から得た面積で割り、それに所定の係数を掛けることによって求められる。先に説明したように、一実施形態において、相互作用計算機２３６で実行される式は次の通りである。
【００８７】
【数１】
2019500583.tif 000003
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた細胞の総面積）であり、また、Ａｃは、正規化因子である。ここで、正規化因子は、第２特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である。いくつかの実施形態において、正規化因子は、全腫瘍細胞又は非腫瘍細胞全ての総面積である。いくつかの実施形態において、正規化因子は、全細胞の総面積である。
【００８８】
ＡＮＤ手順は、２進ａｎｄ演算を手本にしているが、有意手段が異なる。ＡＮＤ手順は、現在の画像及びユーザ選択結果を受け入れる。出力は、２つの入力画像からの画素と合致する正規化強度を掛け合わせることによって生じた画像である。いくつかの応用では、画像強度データは、すでに正規化されている。したがって、ＡＮＤ手順は、単に、２つの画像の画素的な掛け算である。ＯＵＴ手順に必要な２つの入力データは、現在の画像とユーザ選択結果である。ＯＵＴ手順は、式：Ａ×（１−Ｂ／Ｂｍａｘ）に従って第１の画像から第２の画像を削除するものであり、ここで、Ａは、現在の画像であり、Ｂは、削除すべきユーザ選択画像であり、また、Ｂｍａｘは、Ｂの最大強度である。ここで留意すべきは、ＢのＢｍａｘによる割り算がＢを正規化することである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本明細書には、がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点するためのイメージングシステムであって、イメージング領域内で試料の位置決めをするためのステージと、試料に電磁放射線を向けるための電磁放射線源と、試料からの電磁放射線を検出するように設定された検出器とを備えたイメージング装置と、コントローラと、を備える、前記イメージングシステムが提示されている。コントローラは、オペレータと電子制御システムとの間で情報を交換するためのユーザインターフェースと、コンピュータ可読媒体に記憶された指示を実行するように設定された処理回路とを備えている。指示は、画像システムの電子制御システムに、（ｉ）イメージング装置からの検出された電磁放射線についての情報を受信させ、（ｉｉ）検出された電磁放射線に基づいて画像データを生成させ、（ｉｉｉ）画像データを解析して少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めさせ、そして（ｉｖ）スコアを記録させるものであるが、前記スコアは、閾値と比較したとき、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示すものである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の近接を表すスコアは、１対の細胞同士が所定の近接の範囲内にあるという程度を表している。
【００９１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、非腫瘍細胞は、間質細胞である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバー及び第２メンバーは、免疫細胞を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞、骨髄性細胞、又は間質細胞は、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、免疫細胞は、ＰＤ−１を発現する。
【００９４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、腫瘍細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、骨髄性細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、間質細胞を含み、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーはＰＤ−Ｌ１を発現し、また、免疫細胞はＰＤ−１を発現する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ−１、ＧＩＴＲＬ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第１バイオマーカーを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される第２バイオマーカーを発現する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ１を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＣＴＬＡ−４を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＰＤ−Ｌ２を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＰＤ−１を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＣＴＬＡ−４を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ８６を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＬＡＧ−３を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＨＬＡ−ＤＲを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＴＩＭ−３を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、４１ＢＢを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、４．１ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＯＸ４０を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＯＸ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＣＤ４０を発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＣＤ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＩＣＯＳを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＩＣＯＳＬを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＧＩＴＲを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＧＩＴＲＬを発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーは、ＨＬＡ−ＤＲを発現し、また、少なくとも１対の細胞の第２メンバーは、ＴＣＲを発現する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーによって発現される第１バイオマーカーと少なくとも１対の細胞の第２メンバーによって発現される第２バイオマーカーは、互いに相互作用する。いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞の第１メンバーによって発現される第１バイオマーカーと少なくとも１対の細胞の第２メンバーによって発現される第２バイオマーカーは、互いに相互作用しない。
【００９８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の空間的近接は、約０．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約４５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約４０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約３５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約３０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約２５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約２．５μｍ〜約１５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約５０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約４５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約４０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約３５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約３０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約２５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約２０μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ〜約１５μｍまでの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、約２０μｍ、約２１μｍ、約２２μｍ、約２３μｍ、約２４μｍ、約２５μｍ、約２６μｍ、約２７μｍ、約２８μｍ、約２９μｍ、約３０μｍ、約３１μｍ、約３２μｍ、約３３μｍ、約３４μｍ、約３５μｍ、約３６μｍ、約３７μｍ、約３８μｍ、約３９μｍ、約４０μｍ、約４１μｍ、約４２μｍ、約４３μｍ、約４４μｍ、約４５μｍ、約４６μｍ、約４７μｍ、約４８μｍ、約４９μｍ、又は約５０μｍである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１対の細胞間の空間的近接は、約１画素〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約５〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１０〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、空間的近接は、約１画素、約２画素、約３画素、約４画素、約５画素、約６画素、約７画素、約８画素、約９画素、約１０画素、約１１画素、約１２画素、約１３画素、約１４画素、約１５画素、約１６画素、約１７画素、約１８画素、約１９画素、約２０画素、約２１画素、約２２画素、約２３画素、約２４画素、約２５画素、約２６画素、約２７画素、約２８画素、約２９画素、約３０画素、約３１画素、約３２画素、約３３画素、約３４画素、約３５画素、約３６画素、約３７画素、約３８画素、約３９画素、約４０画素、約４１画素、約４２画素、約４３画素、約４４画素、約４５画素、約４６画素、約４７画素、約４８画素、約４９画素、約５０画素、約５１画素、約５２画素、約５３画素、約５４画素、約５５画素、約５６画素、約５７画素、約５８画素、約５９画素、約６０画素、約６１画素、約６２画素、約６３画素、約６４画素、約６５画素、約６６画素、約６７画素、約６８画素、約６９画素、約７０画素、約７１画素、約７２画素、約７３画素、約７４画素、約７５画素、約７６画素、約７７画素、約７８画素、約７９画素、約８０画素、約８１画素、約８２画素、約８３画素、約８４画素、約８５画素、約８６画素、約８７画素、約８８画素、約８９画素、約９０画素、約９１画素、約９２画素、約９３画素、約９４画素、約９５画素、約９６画素、約９７画素、約９８画素、約９９画素、又は約１００画素である。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、画像データを生成することは、（ｉ）検出された電磁放射線についての情報を単純画像データに分けることと、（ｉｉ）前記データを複数のデータチャネルから提供することを含み、その場合、第１データチャネル内の単純画像データは、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現し、また、第２データチャネル内の単純画像データは、第２バイオマーカーに起因する蛍光信号を表現する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択は、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むのに十分なマージン単位で拡張することと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割り、その結果得られた商に所定の係数を掛けることによって空間的近接スコアに至ることと、を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張して、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍ内に取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数を掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むために約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張することと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号で取り囲まれている前記全細胞に関して、画素単位で測定される第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、データを解析することには、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を約１画素〜約１００画素の範囲のマージン単位で拡張して、第２バイオマーカーを発現する細胞を第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれている前記全細胞に関して、画素単位で測定される第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商に所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって求められる。
【０１０６】
【数２】
2019500583.tif 000004
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、Ａｃは、第２特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積（正規化因子）である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、次の式にしたがって求められる。
【０１０８】
【数３】
2019500583.tif 000005
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＮＴは、非腫瘍細胞の総面積である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって求められる。
【０１１０】
【数４】
2019500583.tif 000006
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＴは、全細胞の総面積である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、４つの蛍光タグは、それぞれ異なるバイオマーカーに特異のものであり、測定工程で使用される。さらなる実施形態において、第１蛍光タグは第１バイオマーカーと関連しており、第２蛍光タグは第２バイオマーカーと関連しており、第３蛍光タグは第３バイオマーカーと関連しており、また、第４蛍光タグは第４バイオマーカーと関連している。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーは、腫瘍及び非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、第２バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーは、腫瘍及び非腫瘍マーカーを含み、また、第２バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態において、第３バイオマーカーは、全細胞によって発現される。いくつかの実施形態において、第４バイオマーカーは、腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、第３バイオマーカーは全細胞によって発現され、また、第４バイオマーカーは腫瘍細胞でのみ発現される。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカー又は別の抗体に対して結合親和性を示す抗体と共役した蛍光色素分子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対して親和性を示す蛍光色素分子である。
【０１１２】
蛍光色素分子の例としては、フルオレセイン、６ーＦＡＭ、ローダミン、ＴｅｘａｓＲｅｄ、カリフォルニアレッド、ｉＦｏｕｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｆ、カルボキシロードル、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ−クローム、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）３５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４０５、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）４８８、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）５４９、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）５９４、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６３３、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６４９、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ（登録商標）８００、フィコエリトリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィル−プロテインａ）、ＰｅｒＣＰーＣｙ５．５、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’、５’−ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５−（及び−６−）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、ＨＥＸ、ルシファーイエロー、マリーナブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＯＰＡＬ（商標）５２０、ＯＰＡＬ（商標）５４０、ＯＰＡＬ（商標）５７０、ＯＰＡＬ（商標）６２０、ＯＰＡＬ（商標）６５０、ＯＰＡＬ（商標）６９０、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、蛍光色素分子は、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３．５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）７、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８染料、５５５染料、５９４染料、ＴｅｘａｓＲｅｄ、及びクマリンから成る群から選択される。４８８染料の例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８及びＣＦ（商標）４８８Ａが挙げられるが、これらに限定されない。５５５染料の例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５が挙げられるが、これに限定されない。５９４染料の例としては、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４が挙げられるが、これに限定されない。
【０１１３】
本明細書で使用するとき、「視野」は、組織試料のホールスライドデジタルイメージの一部分を意味する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、２〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、３０〜２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜１５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜１００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０〜４０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態において、ホールスライドイメージは、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００（増分を含む）の所定の視野を有する。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号は、約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張される。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約５〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約１００画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約９０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約８０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約７０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約６０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約５０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約４０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１０〜約３０画素までの範囲である。いくつかの実施形態において、マージンは、約１画素、約２画素、約３画素、約４画素、約５画素、約６画素、約７画素、約８画素、約９画素、約１０画素、約１１画素、約１２画素、約１３画素、約１４画素、約１５画素、約１６画素、約１７画素、約１８画素、約１９画素、約２０画素、約２１画素、約２２画素、約２３画素、約２４画素、約２５画素、約２６画素、約２７画素、約２８画素、約２９画素、約３０画素、約３１画素、約３２画素、約３３画素、約３４画素、約３５画素、約３６画素、約３７画素、約３８画素、約３９画素、約４０画素、約４１画素、約４２画素、約４３画素、約４４画素、約４５画素、約４６画素、約４７画素、約４８画素、約４９画素、約５０画素、約５１画素、約５２画素、約５３画素、約５４画素、約５５画素、約５６画素、約５７画素、約５８画素、約５９画素、約６０画素、約６１画素、約６２画素、約６３画素、約６４画素、約６５画素、約６６画素、約６７画素、約６８画素、約６９画素、約７０画素、約７１画素、約７２画素、約７３画素、約７４画素、約７５画素、約７６画素、約７７画素、約７８画素、約７９画素、約８０画素、約８１画素、約８２画素、約８３画素、約８４画素、約８５画素、約８６画素、約８７画素、約８８画素、約８９画素、約９０画素、約９１画素、約９２画素、約９３画素、約９４画素、約９５画素、約９６画素、約９７画素、約９８画素、約９９画素、又は約１００画素である。いくつかの実施形態において、画素は、幅０．５μｍである。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約４５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約４０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約３５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約３０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約２５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約２０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約２．５μｍ〜約１５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約４５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の約５μｍ〜約４０μｍの細胞膜で第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の約５μｍ〜約３５μｍの細胞膜で第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、��１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約３０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の約５μｍ〜約２５μｍの細胞膜で第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約２０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ〜約１５μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号の拡張は、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約１６μｍ、約１７μｍ、約１８μｍ、約１９μｍ、約２０μｍ、約２１μｍ、約２２μｍ、約２３μｍ、約２４μｍ、約２５μｍ、約２６μｍ、約２７μｍ、約２８μｍ、約２９μｍ、約３０μｍ、約３１μｍ、約３２μｍ、約３３μｍ、約３４μｍ、約３５μｍ、約３６μｍ、約３７μｍ、約３８μｍ、約３９μｍ、約４０μｍ、約４１μｍ、約４２μｍ、約４３μｍ、約４４μｍ、約４５μｍ、約４６μｍ、約４７μｍ、約４８μｍ、約４９μｍ、又は約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する近接する細胞を取り囲んでいる。いくつかの実施形態において、近接する細胞に関する第２バイオマーカーは、第１バイオマーカーと直接接触している。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、選択された各視野からの、第２バイオマーカーを発現する全細胞の第１総面積は、画素単位で測定される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、選択された各視野からの非腫瘍細胞全ての第２総面積である。いくつかの実施形態において、第２総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１総面積と第２総面積はともに画素単位で測定される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、第２バイオマーカーを発現する能力を有する選択された各視野からの全細胞の第２総面積である。いくつかの実施形態において、第２総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１総面積と第２総面積はともに画素単位で測定される。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、正規化因子は、選択された各視野からの全細胞の第２総面積である。いくつかの実施形態において、第２総面積は、画素単位で測定される。いくつかの実施形態において、第１総面積と第２総面積はともに画素単位で測定される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約５０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約４５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約４０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約３５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約３０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約２５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約２０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約１５００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００〜約１０００である。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、又は約５０００であり、それぞれの増分も包含する。いくつかの実施形態において、閾値スコアは、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、約２４００、約２５００、約２６００、約２７００、約２８００、約２９００、約３０００、約３１００、約３２００、約３３００、約３４００、約３５００、約３６００、約３７００、約３８００、約３９００、約４０００、約４１００、約４２００、約４３００、約４４００、約４５００、約４６００、約４７００、約４８００、約４９００、又は約５０００であり、それぞれの増分も包含し、±１００である。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０２〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０３〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０４〜約１０５である。いくつかの実施形態において、所定の係数は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約５５００、約６０００、約６５００、約７０００、約７５００、約８０００、約８５００、約９０００、約９５００、約１００００、約２００００、約３００００、約４００００、約５００００、約６００００、約７００００、約８００００、約９００００、又は約１０５であり、それぞれの増分も含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、予測力は、陽性予測値、陰性予測値、又はそれらの組み合わせとして定量される。陽性予測値は、閾値を超えるスコアで治療に反応する患者の人数を、治療に反応する患者の総人数で割ることによって計算される。陰性予測値は、閾値未満のスコアで治療に反応しない患者の人数を、治療に反応しない患者の総人数で割ることによって計算される。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６０％超である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、８０％以上である。いくつかの実施形態において、陽性予測値は、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％であり、それぞれの増分も包含する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６０％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、６５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、７５％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、８０％以上である。いくつかの実施形態において、陰性予測値は、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％であり、それぞれの増分も包含する。
【０１２５】
本明細書に開示の方法において、がん患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。さらなる実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ又はウマである。
【０１２６】
本明細書に開示の方法において、腫瘍組織は、がん患者から採取される。がんの種類としては、限定されるものではないが、循環器系のがん、例えば、心臓のがん（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫）、縦隔及び胸膜、並びに他の胸腔内蔵器のがん、血管腫瘍及び腫瘍が関連する維管束組織；気道のがん、例えば鼻腔及び中耳、副鼻腔、咽頭、気管、気管支、及び肺のがん、例えば小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、気管支がん（扁平上皮がん、未分化小細胞がん、未分化大細胞がん、腺がん）、細気管支肺胞上皮（細気管支）がん、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；消化器系のがん、例えば、食道がん（扁平上皮がん、腺がん、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃がん（細胞腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃がん、すい臓がん（導管腺がん、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸がん（腺がん、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸がん（腺がん、管状腺腫、絨毛構造、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路、例えば、腎臓がん（腺がん、腎芽細胞腫［腎芽腫］）、リンパ腫、白血病）、胆のうがん及び／又は尿道がん（扁平上皮がん、移行上皮がん、腺がん）、前立腺がん（腺がん、肉腫）、精巣がん（セミノーマ、奇形腫、胎生期がん、奇形がん、絨毛腫、肉腫、間質細胞腫、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、リンパ腫）；肝臓がん、例えば、肝がん（肝細胞がん）、胆管がん、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵内分泌腫瘍（褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ペプチド腫瘍、島細胞腫及びグルカゴン産生腫瘍など）；骨のがん、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性骨巨細胞腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ、ｏｓｔｅｏｃａｒｔｉｌａｇｉｎｏｕｓ  ｅｘｏｓｔｏｓｅｓ）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系のがん、例えば、中枢神経系の腫瘍（ＣＮＣ）、原発性中枢神経系リンパ腫、頭蓋骨のがん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜のがん（髄膜腫、血管肉腫、神経膠腫症）、脳のがん（星状細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、グリノーマ、肉腫）；生殖器系のがん、例えば、婦人科がん、子宮がん（子宮内膜がん）、頸部がん（子宮頸がん、前腫瘍性子宮頸部異形成）、卵巣がん（卵巣がん［漿液性嚢胞腺がん、ムチン性嚢胞腺がん、分類不能大腸炎］、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部のがん（扁平上皮癌、上皮内がん、腺がん、線維肉腫、黒色腫）、膣がん（澄明細胞汗腺腫、扁平上皮がん、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管がん（上皮性悪性腫瘍）及び女性生殖器に関する他の部位のがん；胎盤、ペニス、前立腺、睾丸、及び男性生殖器に関する他の部位のがん；血液学的系統のがん、例えば���血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔のがん、例えば、唇、舌、歯茎、口腔底部、口蓋、及び口の他の部位、耳下腺、及び唾液腺の他の部位、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状陥凹、下咽頭、並びに唇、口腔及び咽頭の他の部位のがん；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞がん、扁平上皮がん、カポジ肉腫、異形成母斑、リンパ腫、血管腫、皮膚線維腫、及びケロイド；副腎のがん；神経芽細胞腫；また、結合組織及び軟組織、後腹膜及び腹膜、目を包含する他の組織のがん、眼球内黒色腫、及び付属器、胸部、頭及び／又は首、肛門部、甲状腺、副甲状腺、副腎並びに他の内分泌腺及び関連構造のがん、リンパ節の続発性及び詳細不明の悪性腫、呼吸器系及び消化器官の続発性悪性新生物並びに他の部位の続発性悪性新生物、又はそれらの１つ以上の組み合わせがあげられる。
【０１２７】
免疫療法の例としては、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブ又はトラスツズマブ）、抱合型モノクローナル抗体（例えば、イブリツモマブ・チウキセタン、ブレンツキシマブ・ベドチン、又はトラスツズマブ・エムタンシン）、二重特異性モノクローナル抗体（ブリナツモマブ）、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ又はデュルバルマブ）、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、及びイミキモド、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。
【０１２８】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接を表すスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張して、第２特異的バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号で取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１２９】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接を表すスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張して、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれた前記全細胞に関する第１の総面積を、正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３０】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接を表すスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料は複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を、約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張して、第２バイオマーカーを発現する近接した細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれからの全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内に取り囲まれている前記全細胞に関して、画素単位で測定される第１の総面積を、正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３１】
別の態様において、本明細書には、イメージング装置と、腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野に含まれる複数の細胞から選択される少なくとも１対の細胞間の空間的近接を表すスコアを求めるためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されており、ここで、前記試料は、がん患者から採取されたものであり、前記方法は、（ｉ）がん患者から採取した腫瘍組織を含む試料から入手可能な所定数の視野を選択することであって、前記試料が複数の蛍光タグで染色されており、選択が、他の視野に比べて第１バイオマーカーを発現する細胞の数をより多く含有する視野を選択することに偏っている、ことと、（ｉｉ）選択された視野それぞれにおいて、第１バイオマーカーに起因する蛍光信号を約１〜約１００画素までの範囲のマージン単位で拡張して、第１バイオマーカーを発現する細胞の細胞膜の約０．５μｍ〜約５０μｍの範囲内に第２バイオマーカーを発現する細胞を取り囲むことと、（ｉｉｉ）選択された視野それぞれから全細胞であって、第２バイオマーカーを発現しかつ第１バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張された蛍光信号内で取り囲まれている前記細胞に関して、画素単位で測定される第１の総面積を正規化因子で割って、その結果得られる商を所定の係数と掛け合わせて空間的近接スコアに至ることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、次の式にしたがって求められる。
【０１３３】
【数５】
2019500583.tif 000007
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＮＴは、非腫瘍細胞の総面積である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式にしたがって求められる。
【０１３５】
【数６】
2019500583.tif 000008
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、Ａｃは、第２特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、空間的近接スコアは、次の式によって求められる。
【０１３７】
【数７】
2019500583.tif 000009
前記式中、ＡＩは、相互作用総面積（第２特異的バイオマーカーを発現しかつ第１特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因した拡張された蛍光信号に取り囲まれた、細胞の総面積）であり、また、ＡＴは、全細胞の総面積である。
【０１３８】
別の態様において、イメージング装置と、がん患者から得た腫瘍組織を含む試料を採点するためのコントローラであって、患者のがんを治療する方法に使用される前記コントローラとを備えたシステムを利用する方法が開示されている。いくつかの実施形態において、がん患者から得た腫瘍組織を含む試料を採点する方法は、免疫療法を施す前に実行される。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、本明細書には、イメージング装置と、治療する必要のある患者のがんを治療するためのコントローラとを備えたシステムを利用する方法であって、（ａ）患者から採取した腫瘍組織を含む試料を採点することであって、（ｉ）患者から採取した腫瘍組織を含む試料を使用して、少なくとも１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の空間的近接を表すスコアを求めることと、（ｉｉ）スコアを記録することを含む、ことと、（ｂ）スコアを閾値と比較することと、（ｂ）閾値と比較したときにスコアが、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す場合に、患者に免疫療法を施すことを含む、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、測定工程は、本明細書に説明した通りである。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本明細書には、組織試料を採点する方法であって、（ｉ）イメージングシステムを使用してがん患者から採取した組織試料についての画像データを得る工程であって、イメージングシステムが、試料をイメージング領域に位置付けるためのステージと、電磁放射線を試料に向けるための電磁放射線源と、電磁放射線出力を収集するための検出器を備えたハウジングと、メモリと画像処理モジュールを有する処理回路とを備えた電子制御システムを含む、工程と、（ｉｉ）画像処理モジュールを用いて画像データを解析して、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求める工程と、（ｉｉｉ）スコアをメモリに記録する工程と、を含み、スコアが閾値と比較したときに、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す、前記方法が開示されている。いくつかの実施形態において、本方法は、第１特異的バイオマーカーの発現の定量化又は第２特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予測力を提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本明細書には、がん患者から採取した組織試料の画像データを獲得するイメージング装置と、イメージング装置から画像データを受信してデータを解析することによって、１対の細胞と、第１バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第１メンバーと、第１バイオマーカーとは異なる第２バイオマーカーを発現する少なくとも１対の細胞の第２メンバーとの間の近接を表すスコアを求めるコントローラと、を備えた組織試料採点システムであって、その場合、閾値と比較したときにスコアが、がん患者が免疫療法に積極的に応答する可能性を示す、前記システムが開示されている。
【実施例】
【０１４２】
［実施例１］
ヒト患者から得た黒色腫組織試料についての試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１４３】
試料の調製：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂した。次に、スライドは、キシレンからアルコールまでの一連の洗浄を経て再水和してから、蒸留水中でインキュベートした。その後、加熱抗原賦活化法を、高圧高温条件を用いて行い、冷却させて、トリス緩衝生理食塩水へ移した。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、内在性ペルオキシダーゼを遮断した後、タンパク質ブロッキング溶液でインキュベートして非特異性抗体染色を抑えた。次にスライドを、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色した。スライドをその後洗浄してから、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−１染色を、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。次に、残留ＨＲＰをすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、４８８染料と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で直接標識化した抗ウサギＨＲＰ二次抗体とマウス抗Ｓ１００の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＰＤ−１染色を、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。抗体と検出試薬の概略図を図６に示す。別法として、スライドは、抗ＰＤ１一次抗体の代わりに抗ＣＤ８一次抗体で染色した。
【０１４４】
試料イメージング及び解析：次に、Ｖｅｃｔｒａソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ２．０．８（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用したＶｅｃｔｒａ２  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて蛍光画像を得た。先ず、スライドの白黒イメージングは、ＤＡＰＩを用いて４倍で行った。自動化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて組織を含むスライドの領域を特定した。
【０１４５】
組織を含むと特定されたスライドの領域を、ＤＡＰＩ（青）、ＦＩＴＣ（緑）及びＣｙ（登録商標）５（赤）に関するチャネルにおいて４倍で画像化してＲＧＢ画像を作成した。これらの４倍画像は、自動化強化アルゴリズム（ｉｎＦｏｒｍを使用して開発されたもの）を用いて視野選択装置１０１で処理することによって、Ｃｙ（登録商標）５最高発現に従って、考えられる２０倍視野を特定して順位付けした。
【０１４６】
上位４０の視野を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、及びＣｙ（登録商標）５の波長全域において２０倍で画像化した。現画像の利用可能性について再調査して、ピンぼけ、腫瘍細胞不在、壊死が非常に進んでいるか、又は予測される抗体局在に関係のない高濃度の蛍光信号（すなわち、背景染色）を含む画像は、解析前に不採用とした。容認された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて処理し、その場合、蛍光色素分子はそれぞれ、分光分離装置２１０によって個別のチャネルへ分光分離して、別ファイルとして保存した。
【０１４７】
処理後のファイルをさらに、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて又はＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いた全自動処理によって解析した。以下に詳細を記す。
【０１４８】
ＤＡＰＩ画像はそれぞれ細胞マスカー２１２で処理して、画像内の全細胞核を特定し（図７ａ）、また、その後、３画素ずつ拡張して細胞全体のおおよそのサイズを表した。この結果得られたマスクは、画像内の全細胞を表していた（図７ｂ）。
【０１４９】
４８８染料で検出されたＳ１００（黒色腫に対する腫瘍細胞マスカー）（図８ａ）は、腫瘍マスカー２１６で処理して、画像内の全腫瘍面積のバイナリマスクを作成した（図８ｂ）。前記バイナリマスクと全細胞のマスクとの重なりが、腫瘍細胞マスカー２１８を用いて腫瘍細胞に対する新たなマスクを作成した（図８ｃ）。
【０１５０】
同様に、非腫瘍細胞に対する新たなマスクを作成した核全てのマスクとの組み合わせに腫瘍細胞マーカーを含まないもの（図８ｄ）も、非腫瘍細胞マスカー２２０を用いて行った。
【０１５１】
各Ｃｙ（登録商標）５画像（図９ａ）は、第１バイオマーカーマスカー２２２によって処理し、全細胞のマスクと重ねて、ＰＤ−Ｌ１陽性の全細胞のバイナリマスクを作成した（図９ｂ）。バイオマーカーマスクと全細胞のマスクとを重ねることによって、バイオマーカー陽性細胞としてマスク内で偽って特定される可能性のあるノイズ画素を消去した。
【０１５２】
各Ｃｙ（登録商標）３．５画像（図１０ａ）は、第２バイオマーカーマスカー２２４によって処理してＰＤ−１陽性細胞に対するバイナリマスクを作成して、非腫瘍細胞全てのマスクと重ねて、ＰＤ−Ｌ１陽性の非腫瘍細胞全てのバイナリマスクを作成した（図１０ｂ）。バイオマーカーマスクと非腫瘍細胞全てのマスクとを重ねることによって、バイオマーカー陽性細胞としてマスク内で偽って特定される可能性のあるノイズ画素を消去した。
【０１５３】
ＰＤ−Ｌ１陽性細胞全てのバイナリマスクは、第２拡張装置２２６を用いて拡張して、近接した細胞（例えば、ＰＤ−１を有する細胞）を取り囲む相互作用マスクを作成した（図１１ａ）。この相互作用マスクは、相互作用マスカー２３０を用いてＰＤ−１陽性非腫瘍細胞全てのバイナリマスクと、組み合わせることによって、ＰＤ−１がＰＤ−Ｌ１と相互作用し得るほど十分にＰＤ−Ｌ１陽性細胞と近接させてＰＤ−１陽性細胞の相互作用区画を作成した（図１１ｂ）。
【０１５４】
相互作用区画に対する容認された領域（最大４０の視野）に由来する総面積と非腫瘍細胞の総面積をそれぞれ、面積評価装置２３２、２３４で計算した。相互作用区画に対する容認された視野全てに由来する総面積を非腫瘍細胞の総面積で割り、相互作用計算機２３６を用いて計数１０，０００を掛けることによって、試料ごとの相互作用スコアを表す整数がもたらされた。ＰＤ−Ｌ１測定値及びＰＤ−１測定値は、再現性が高かった（それぞれＲ２＝０．９８及び０．９７）。広域のＰＤ−Ｌ１発現及びＰＤ−１発現並びに相互作用スコアは、保存臨床標本（ｎ＝５３）で観察された。ニボルマブ（ｎ＝５）又はペンブロリズマブ（ｎ＝２１）で処置した進行性黒色腫患者２６人のコホートでは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアからは、応答者と非応答者を容易に識別できる（ｐ＝０．０１）が、ＰＤ−Ｌ１単独（ｐ＝０．０７）又はＣＤ８単独（ｐ＝０．２３）ではできないことが分かった。さらに、高いＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを発現する患者は、優れた奏効率を示した（８２％対２０％、ｐ＝０．０１）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアの高い患者は、より大きな無増悪期間中央値（ｐ＝０．０５９）が認められ、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアの低い患者と比べて死亡率も低かった（２２％対５８％）。これらの結果から、組織試料を採点してＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを得る本方法は、ＰＤ−Ｌ１発現単独と比べて優れた予測力を提供する（８２％陽性予測値、８０％陰性予測値）ことが分かる。
【０１５５】
患者２６人からの典型的なスコアを図１２ａに示す。データに応じて、閾値８００〜９００を選択して処置への応答の可能性を示した。
【０１５６】
別法として、個々の視野についての相互作用スコアを計算し、その患者ごとのスコア最大値を図１２ｂに示す。スコア最大値に応じて、閾値１９００を選択して処置への応答の可能性を示した。
【０１５７】
相互作用スコアに対する強化アルゴリズムの効果を評価するために、前記手順を、強化アルゴリズムの代わりにホールスライドイメージイング法を用いて行った（図１３参照）。ホールスライドイメージ解析を行ったときに、抗ＰＤ１治療に反応した患者と反応しなかった患者との間に統計学的有意差はもはや無かった。そのため、この解析では閾値を求めることができなかった。
【０１５８】
相互作用スコアを患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）と比較した（図１４）。少なくとも８０３の相互作用スコアが生存期間とうまく相関していた。特に、ＰＤ−Ｌ１発現は、ＰＦＳの向上と相関を示さなかった（図１５）。
【０１５９】
図１６及び図１７は、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−Ｌ陽性細胞（黄）、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑）、及び全細胞（ＤＡＰＩ、青）を示すオーバーレイマスクの代表的な例を示している。免疫療法に対して陽性応答者の場合、図１６のマスクは、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）、ＰＤ−１陽性細胞（黄）、及び全腫瘍細胞（緑）の存在を簡単に示している。一方、免疫療法に対して陰性応答者の場合、図１７のマスクは、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑）及び全細胞（ＤＡＰＩ、青）の存在を示すが、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（赤）又はＰＤ−１陽性細胞（黄）にはほとんどないし全く示さない。図１６は、２１７６の相互作用スコアを表している（免疫療法に対して完全反応）。図１７は、８つの相互作用スコアを表している（免疫療法に無反応）。
【０１６０】
組織試料をさらにＦＤＡ承認方法を用いて評価して、現在は黒色腫組織試料に使用されていない抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン２２Ｃ３を用いて非小細胞肺がんにおけるＰＤ−Ｌ１を測定した。ＰＤ−Ｌ１発現を、患者のＰＦＳと比較し、これを図１９に示す。この方法は、相互作用スコアを使用する本明細書に記載の方法と比べると、統計学的に関連性のある診断値を示さない。
【０１６１】
さらに３４人の転移性黒色腫患者の照合コホートを検査して、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアを獲得した（図２０ａ参照）。相互作用スコアはまた、患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）とも比較した（図２０ｂ）。統計的に有意ではないが（ｐ＝０．１９）、この比較からは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコアが高い患者ほどＰＦＳが長いという傾向が分かる。統計的有意性は、クリニックでのこの治療が比較的最近であったために制限されており、そのため、前記患者の追跡期間が制限されている可能性がある。
【０１６２】
患者２６人からなる初期コホートと患者３４人からなる検証コホートとの組み合わせにおけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用スコア並びに前記スコアと患者のＰＦＳ又は患者の全生存期間（ＯＳ）との比較を、図２０ｃ〜図２０ｅに示す。複合解析からは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の高い患者が抗ＰＤ−１治療に対して改善された反応を示すことがはっきりと分かる。
［実施例２］
ヒト患者から得た非小細胞肺がん組織試料についての試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１６３】
上皮性腫瘍細胞に関し、４８８染料で直接標識化したマウス抗Ｓ１００を４８８染料で直接標識化したマウス抗パンサイトケラチンと置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。３８の試料についての相互作用スコアを図１８に示す。
［実施例３］
ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞及びＣＤ８０を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１６４】
試料の調製；ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を脱脂し、再水和して、高温条件で抗原修復を行った。次いで、染色を行ったが、そこでは、以降の工程を実行した。先ず、組織は、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して１ｋｂのＣＲＬＡ−４ｍＲＮＡに及ぶ２０個のハイブリッド形成プローブ対を用いてＣＴＬＡ−４発現検出に付した。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成は、ＴＳＡ−Ｃｙ（登録商標）３を用いて視覚化した。スライドを洗浄し、残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、マウス抗ＣＤ８０一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ８０染色を、ＴＳＡーＣｙ（登録商標）５（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。残留ＨＲＰはすべて、新たなベンズヒドラジド１００ｍＭと過酸化水素５０ｍＭの２回の洗浄を用いてクエンチした。スライドを再度洗浄してから、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’、６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ３染色を、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）５（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。スライドをもう一度洗浄してから、封入剤を用いてカバーグラスで覆って、室温で一晩乾燥させた。
【０１６５】
実施例１と類似のイメージング及び解析手順を行ってＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３及びＣｙ（登録商標）５の波長全域を画像化した。ＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０の発現を用いて、２０倍画像獲得用強化アルゴリズムを展開した。解析を実行して、ＣＤ８０陽性細胞の近接範囲内にあるＣＴｌＡ−４陽性細胞及びＣＤ３陽性細胞の総面積（画素単位）を測定し、それをＣＤ３陽性細胞の総面積（画素単位）で割り、計数１０，０００を掛け合わせることにより、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０相互作用スコアを求めた。結果を図２１に示す。
［実施例４］
ＣＴＬＡ−４を発現する細胞及びＣＤ８０を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１６６】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＴＬＡ−４及びＣＤ８０の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例５］
ＰＤ−Ｌ２を発現する細胞及びＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１６７】
ＰＤ−Ｌ１の染色及び解析をＰＤ−Ｌ２の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例６］
ＣＴＬＡ−４を発現する細胞及びＣＤ８６を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１６８】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＴＬＡ−４及びＣＤ８６の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例７］
ＬＡＧ−３を発現する細胞及びＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１６９】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＬＡＧ−３及びＨＬＡ−ＤＲの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例８］
ＴＩＭ−３を発現する細胞及びＧａｌｅｃｔｉｎ９を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７０】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＴＩＭ−３及びＧａｌｅｃｔｉｎ９の染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例９］
４１ＢＢを発現する細胞及び４．１ＢＢＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７１】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析を４１ＢＢ及び４．１ＢＢＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例１０］
ＯＸ４０を発現する細胞及びＯＸ４０Ｌを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７２】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＯＸ４０及びＯＸ４０Ｌの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例１１］
ＣＤ４０を発現する細胞及びＣＤ４０Ｌを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７３】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例１２］
ＩＣＯＳを発現する細胞及びＩＣＯＳＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７４】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＩＣＯＳ及びＩＣＯＳＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例１３］
ＧＩＴＲを発現する細胞及びＧＩＴＲＬを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７５】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＧＩＴＲ及びＧＩＴＲＬの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例１４］
ＨＬＡーＤＲを発現する細胞及びＴＣＲを発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７６】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の染色及び解析をＨＬＡ−ＤＲ及びＴＣＲの染色及び解析と置き換えて、実施例１と同様の手順を行った。
［実施例１５］
ＰＤ−１を発現する細胞、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞及びＣＤ３を発現する細胞を含む組織試料における、試料の調製、イメージング、及びイメージングの解析
【０１７７】
実施例１と同様の手順を、マウス抗Ｓ１００抗体を用いずに行った。その代わりに、ＰＤ−Ｌ１検出後、一次抗体及び二次抗体をマイクロ波で除去した。次に、スライドを、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合液でインキュベートした。スライドを洗浄した後、ＣＤ３染色は、ＴＳＡ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。イメージング及び解析は、実施例１と同様であったが、空間的近接（例えば、相互作用スコア）は、画素単位で測定したＰＤ−Ｌ１陽性領域内のＰＤ−１陽性細胞の面積を、画素単位で測定した全有核細胞の面積で割って、計数１０，０００を掛け合わせることにより計算した。２９の試料についての相互作用スコアを図２２に示す。
【０１７８】
特定の実施形態について例示しかつ説明してきたが、当該技術分野における通常の知識により、以下の請求項で定義された広義の態様の技術から逸脱することなく、変更及び修正が可能であると解されるべきである。
【０１７９】
本明細書において例示的に説明される実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない要素や限定を除外して、好適に実施することができる。したがって、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（包含する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」などの用語は、広義に解釈されるべきであって、限定されるものではない。その上、本明細書で使用される用語及び表現は、説明用語として使用されたものであって、限定用語として使用されたものではなく、しかも図示及び説明された特徴と同等のもの又はその一部以外のこのような用語及び表現の使用を意図するものではないが、請求項に記載の技術範囲内では様々な変更が可能であると考えられる。また、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」という言い回しには、具体的に列挙された要素と請求項に記載の技術の基本的な新規特徴に実質上影響を及ぼさない追加要素とが包含されることが分かるであろう。「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」という言い回しは、特定されていない要素を除外する。
【０１８０】
本開示内容は、本出願に記載の特定の実施形態について限定されるものではない。当業者には明白なように、その趣旨及び範囲を逸脱することなく多くの修正及び変更を行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本開示内容の範疇に含まれる機能的に同等の方法及び組成物も、前述の説明から当業者には明白であろう。このような修正及び変更は、添付の請求項の範疇にあるものとする。本開示内容は、添付の請求項が権利を受ける均等物のあらゆる範囲とともに、添付の請求項に関してのみ限定されるものである。本開示内容は、特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生体系に限定されず、当然変更できるものと解されるべきである。また、本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的としており、これらに限定されるものではないと解されるべきである。
【０１８１】
その上、本開示内容の特徴又は態様がマーカッシュグループについて説明している場合、当業者には、本開示内容がそれによってマーカッシュグループの各構成員又は構成員のサブグループについても説明していることが分かるであろう。
【０１８２】
当業者には分かるように、ありとあらゆる目的のために、書面で説明するという観点からみれば、本明細書に開示された全範囲は、ありとあらゆる考えられる部分範囲及びその部分範囲の組み合わせをも網羅する。記載した範囲は、少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などまで分解された同様の範囲を十分に説明しかつ有効にするものと容易に認識することができる。非限定例として、本明細書に記載の範囲はそれぞれ、下側三分の一、中央三分の一そして上側三分の一などに容易に分けることも可能である。当業者にも分かるように、「ｕｐ  ｔｏ（最大で）」、「ａｔ  ｌｅａｓｔ（少なくとも）」、「ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ（を超える）」、「ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ（未満）」などのような言葉はいずれも、記載した数を包含し、しかも上述のように部分範囲に実質上分けることが可能な範囲を意味する。最後に、範囲が個別のメンバーをそれぞれ包含することも当業者には自明であろう。
【０１８３】
本明細書中で引用された刊行物、特許出願、発行された特許及び他の書類はいずれも、それぞれの刊行物、特許出願、発行された特許又は他の書類はその全体が参照として組み込まれるように明確にかつ独立して表示されているかのように、本明細書に参照として組み込まれる。参照として組み込まれた原文に含まれる定義は、本開示内容における定義と矛盾する限りにおいて除外される。
【０１８４】
上記以外の実施形態は以下の請求項に明記する。
【図１】
2019500583.tif 000010
【図２】
2019500583.tif 000011
【図３】
2019500583.tif 000012
【図４】
2019500583.tif 000013
【図５】
2019500583.tif 000014
【図６】
2019500583.tif 000015
【図７ａ】
2019500583.tif 000016
【図７ｂ】
2019500583.tif 000017
【図８ａ】
2019500583.tif 000018
【図８ｂ】
2019500583.tif 000019
【図８ｃ】
2019500583.tif 000020
【図８ｄ】
2019500583.tif 000021
【図９ａ】
2019500583.tif 000022
【図９ｂ】
2019500583.tif 000023
【図１０ａ】
2019500583.tif 000024
【図１０ｂ】
2019500583.tif 000025
【図１１ａ】
2019500583.tif 000026
【図１１ｂ】
2019500583.tif 000027
【図１２ａ】
2019500583.tif 000028
【図１２ｂ】
2019500583.tif 000029
【図１３】
2019500583.tif 000030
【図１４】
2019500583.tif 000031
【図１５】
2019500583.tif 000032
【図１６】
2019500583.tif 000033
【図１７】
2019500583.tif 000034
【図１８】
2019500583.tif 000035
【図１９】
2019500583.tif 000036
【図２０ａ】
2019500583.tif 000037
【図２０ｂ】
2019500583.tif 000038
【図２０ｃ】
2019500583.tif 000039
【図２０ｄ】
2019500583.tif 000040
【図２０ｅ】
2019500583.tif 000041
【図２１】
2019500583.tif 000042
【図２２】
2019500583.tif 000043
【国際調査報告】
2019500583.tif 000044