(57)【要約】  本発明は、眼科用リポ酸コリンエステル組成物及び前記組成物の眼用として適した生体適合性を有する配合物を製造するための具体的なプロセスを記載する。
2019534864.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
老視を治療するための物質の、安定性及び生体適合性を有する組成物であって、リポ酸コリンエステルの医薬塩を０．１〜１０％と、シクロデキストリンを１〜３０％と、張度調整剤を０．１〜２％と、増粘剤を０．１〜０．５％と、防腐剤を０．００３〜０．０１０％と、生化学的エネルギー源を０．０５％〜約１．０％と、注射用水と、を含む、組成物。
【請求項２】
０．１〜０．５％の範囲の濃度のヒドロキシプロピルベータシクロデキストリンを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
張度調整剤としてのグリセロールを更に含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
張度調整剤としての塩化ナトリウムを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
メチオニン、システイン、及びヒスチジンからなる群から選択される安定剤を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
防腐剤としての塩化ベンザルコニウムを更に含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
生化学的エネルギー源としてのアラニンを更に含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記リポ酸コリンエステルの前記医薬塩は、塩化物又はヨウ化物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は防腐剤を含まない、請求項１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の安定性及び生体適合性を有する医薬組成物の製造方法であって：
Ａ．前記リポ酸コリンエステルを微粉砕することと、
Ｂ．不活性ガスで５ｐｐｍ未満まで脱酸素化した水に成分を加えることと、
Ｃ．室温下に前記成分の混合物を激しく混合することと、
Ｄ．混合した前記成分を眼科用ボトルに充填することと、
Ｅ．前記充填を行いキャップをした眼科用ボトルを脱酸素剤及び不活性ガスを含むガス不透過性金属箔マイラー小袋に包装することと、
Ｆ．前記包装を２〜８℃で保管することと、
を含む方法。
【請求項１１】
前記成分の混合物のｐＨを４〜５のｐＨ範囲に調整する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記混合は、窒素雰囲気下に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合は、周囲空気下に行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記最終包装は、窒素置換もされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポ酸コリンエステルを、平均サイズが５ｍｍ以下の微粉末に粉砕する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記脱酸素化の水準が、好ましくは２ｐｐｍである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
混合温度は２０〜２５℃である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記成分を８時間混合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記不活性ガスは窒素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記眼科用ボトルは、これらに限定されるものではないが、Ｔｙｐｅ  １医薬品用ガラス、ＨＤＰＥ、ＰＰ、ＬＤＰＥ、ＰＥＴ、及びＰＴＦＥの群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記眼科用ボトルは、成形同時充填された器具である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記眼科用ボトルは、複数回投与用器具である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記金属箔小袋は他のガス不透過性材料製である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記脱酸素剤は、Ｏｘｙ−Ｇｕａｒｄ（商標）又はＳｔａｂｉｌＯｘ（商標）である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、リポ酸コリンエステルを含む医薬品適合性を有する組成物、及び特定の組成物、並びにこの組成物を安定化させ、点眼薬として適用した場合の眼組織への刺激を最小限に抑えるための方法に関する。本明細書における組成物は（これらに限定されるものではないが）、老視、ドライアイ、白内障、及び加齢性黄斑変性症等の眼疾患の療法として意図されたものである。
【背景技術】
【０００２】
リポ酸コリンエステル（ＬＡＣＥ）は、化学的に合成されたＲ−α−リポ酸の誘導体である。
【０００３】
チオクト酸としても知られるリポ酸は、６位及び８位の炭素を結合して１，２−ジチオラン環を形成するジスルフィド結合を有する炭素数８個の脂肪酸である。この酸は、Ｒ−α−リポ酸の異性体のうち最も生物学的活性の高い光学異性体を形成する。
【０００４】
リポ酸コリンエステル（ＬＡＣＥ、化学構造は図１参照）は、カチオン性のコリン頭部を組み込むことによって生体膜を透過するように設計されている。リポ酸は角膜を透過しないが、リポ酸のコリンエステル誘導体は角膜を透過し、角膜のエステラーゼにより加水分解され、生物学的に活性なリポ酸に変換される。ＬＡＣＥは老視治療用の点眼薬として、１日２回適用される点眼液に配合されている。
【０００５】
リポ酸及びコリンからなるプロドラッグであるＬＡＣＥは、老視を治療する独特な分子である。リポ酸（ＬＡ）は有効成分であり、コリン頭部は眼内への透過を助ける役割を果たす。点眼薬を投与した後、ＬＡとコリンとの間の結合は涙膜及び角膜内のエステラーゼにより加水分解される。遊離リポ酸は眼内に侵入し、最終的に水晶体に到達する。ここで内在の酸化還元酵素がこれをジヒドロリポ酸に還元し、次いでジヒドロリポ酸が表層の細長い水晶体細胞内の細胞質タンパク質を加水分解する。こうしてタンパク質が切断されることにより、細胞質ゾルが自由に流動し、加齢による水晶体の硬化に関与する酸化過程が逆戻りする。ＬＡＣＥから調製された点眼液が遠近調節を可能にし、老視、即ち、加齢に伴い遠近調節力が減退した人の近見に焦点を合わせる力を改善することが期待されている。
【０００６】
老視は、加齢に伴い近方の物体に焦点を合わせる力が喪失することである。この状態は、水晶体の微細構造が生理学的に変化することによって起こり、その結果として、視対象に焦点を合わせるように焦点距離及び水晶体の曲率を自動的に調節する柔軟性が失われる。この状態は矯正レンズによって矯正される。リポ酸コリンエステル（「ＬＡＣＥ」）（例えば、米国特許第８，４１０，４６２号明細書参照）が近見視力を回復させることができると報告されている。
【０００７】
この主張は、ヒトのドナーから提供された水晶体においては、タンパク質ジスルフィドの還元剤であるジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いることによって、及びマウスの水晶体においては、リポ酸を用いることによって、水晶体の軟化を薬理学的に誘導できることを実証したｅｘ−ｖｉｖｏ研究によって支持されている。
【０００８】
この作用機序によれば、多くの眼の疾患及び障害の治療を考えることができる。このような障害として、これらに限定されるものではないが、老視、加齢性黄斑変性症、白内障、及びドライアイが挙げられる。
【０００９】
ＬＡＣＥの配合を難しくさせる問題点は、ジチオラン結合が開環することによって分子の活性を損なう酸化化学種が生成し、不安定化する傾向にあった。ＬＡＣＥは室温で速やかに分解して酸化化学種になる（「ＨＰＬＣ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｏｆ  ＬＡＣＥ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」参照、図２参照）。冷蔵温度で保管してさえも、製剤としての分子の有用性を含め、１週間という短期間の保管で急速に酸化が起こる。ＬＡＣＥ点眼液（ＥＶ０６点眼液とも称される）を、製剤としての最大限の能力を発揮させて利用するには、水性配合物を保管及び使用中に安定化させることが不可欠であった。
【００１０】
ＬＡＣＥ点眼液の医薬品としての開発を複雑化させる他の問題点は、ウサギ刺激モデルにおいて眼表面への刺激がｉｎ−ｖｉｖｏで観測されたことにあった。本発明は、眼刺激の一因又は原因となる予期しなかったパラメータと、これらのパラメータを排除又は最小限に抑えるプロセスとについて詳説する。これらのパラメータは、配合物の組成又は原薬の性質、通常は眼刺激と相関関係にあるか又はその原因となる因子とは関係がないものであった。
【００１１】
ここに記載する組成物及び方法は、眼科用ＬＡＣＥ配合物を長期間安定化させるための配合及び方法を説明するものである。
【００１２】
特定のプロセス条件下に配合したＬＡＣＥ配合物の刺激性の原因に関する予期せぬ発見についても記載する。刺激性の原因は、水中でＬＡＣＥ塩分子が、疎水性相互作用の一部として周囲の水分子と相互作用すると共に、対イオンである陰イオン（塩化物イオン又はヨウ化物イオン）とイオン性相互作用することによって凝集することが関係していた。最終的に使用感のよい（ｃｏｍｆｏｒｔａｂｌｅ）ＬＡＣＥ塩化物の点眼液（ＥＶ０６点眼液）を生成させる決定的なプロセスパラメータを重要な因子として特定した。塩化物塩の場合、最終プロセス条件によって、分解化学種の生成が最小限に抑えられると共に、眼刺激の原因となる化学種の生成が最小限に抑えられた。
【００１３】
ＬＡＣＥヨウ化物の場合、単純なプロセスの最適化では使用感のよい溶液は得られなかった。塩形態がヨウ化物であった場合、ＬＡＣＥが凝集した化学種は、ヨウ化物イオンがより大きいことから凝集した化学種が安定化してしまったため、分散させることができなかった。
【００１４】
ヨウ化物塩の場合は、一旦水溶液に溶解すると、一度形成された凝集体を分散させることができず、ＬＡＣＥヨウ化物塩のピークの約３９〜４１％が熱力学的に安定な凝集化学種として沈降した。会合性化学種と眼刺激との間に相関関係が認められた。本発明の第２の態様は、シクロデキストリン中に包接複合体を生成することによるＬＡＣＥヨウ化物製剤の安定化である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ここに提案する発明により、２つの主目的：（ａ）２〜５℃の冷蔵保管温度で少なくとも１年間安定なＬＡＣＥの点眼液を生成すること、及び（ｂ）眼刺激のない配合物（ＬＡＣＥ塩化物及びＬＡＣＥヨウ化物の両方）を生成すること、が達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ＬＡＣＥの化学構造には決まった２つの分解点がある。１つはジオチオラン環の開環であり、他は酸化的及び加水分解的な分解である。上に述べたように、ＬＡＣＥは酸素と相互作用して速やかに酸化化学種を生成する。水中では、ＬＡＣＥのエステル結合も加水分解を受けやすく、リポ酸とコリンを生成する。加水分解が起こる速度と温度には相関関係がある。加水分解は、温度とｐＨがより低い方が起こりにくい。
【００１７】
ＥＶ０６点眼液とも称されるＬＡＣＥ誘導体の点眼液を、ガス透過性を有する透過性ＬＤＰＥ点眼ボトル内に保管して試験を実施した。本明細書においては、本発明者らが開発した、配合後のＬＡＣＥ溶液の保管中における酸化を最小限に抑える方法を記載する。
【００１８】
加えて、ＬＡＣＥに製剤添加物（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を混合した混合物について広範な配合変化試験を行うことにより、安定化因子となる特定の製剤添加物の重要性、水中でＬＡＣＥを加水分解に対し安定化させるためのｐＨの役割に加え、塩化ナトリウムやグリセロール等の重量モル浸透圧濃度調整剤の効果を確認した。最も重要なことであるが、クエン酸塩、リン酸塩、及びホウ酸塩とは異なる、アラニンのＬＡＣＥに対する安定化効果を、ここに提案する発明において記載する。
【００１９】
刺激の原因を模索する際に、ＬＡＣＥを水に溶解すると、両親媒性の性質を持つ化合物に一般的な、ミセル及びミセル状凝集体を形成することを見出した。定義として、ミセル形成性化合物の例としては、ホスファチジルコリン、ＰＥＧ修飾ホスファチジルコリン、ＰＥＧ−ステアリン酸エステル、ソルビトール等が挙げられる。ＬＡＣＥがミセルを形成する現象は、この分子が両親媒性の性質を有するため予想外なことではなかったが、より低い温度でこれらが凝集体を形成することは驚くべきことであった。凝集体の存在は、自社開発のＲＰ−ＨＰＬＣ法によって測定した。測定はＨＰＬＣ−ＵＶ及びＨＰＬＣ−ＥＬＳＤの両方で実施することができた。ＬＡＣＥの塩化物塩及びヨウ化物塩は両方共水溶液中でミセル状凝集体を形成するが、ＬＡＣＥヨウ化物の方が、対イオンであるヨウ化物イオンとカチオン性のＬＡＣＥ分子との相互作用がより強力であるため、水中でより安定性の高い凝集体を形成する。ＬＡＣＥヨウ化物凝集体の平衡濃度はＡＰＩピークの３９〜４１％である。これと比較すると、攪拌しながら分散させた後のＬＡＣＥ塩化物の平衡濃度は＜１％である。
【００２０】
Ａ．水溶液中のＬＡＣＥ塩化物
ＬＡＣＥ塩化物水溶液は冷蔵温度（２〜５℃）でゲル様構造を形成した。これらのミセル状集合体の数及び凝集は、ミセル形成性薬物濃度の増加と共に増加することも予想される。本発明者らは、ＬＡＣＥのミセル状凝集の程度と眼表面刺激とが相関関係にあることを見出したが、不溶性化合物の薬物送達系にミセル状の媒体を使用することが考えられることが多いため、これは予期せぬ驚くべき結果であった。つまり、これは刺激とミセル状凝集体との間に相関関係があることを説明する最初の報告である。このことを見出した後は、使用感と相関させるために、この現象を配合方法を介して最小限に抑えることが必要となった。
【００２１】
ミセル状凝集体の形成は、配合温度と相関関係にあるようであった（図４）。自己集合体の形成は熱力学的現象であり、最小のエネルギー状態に到達するために表面自由エネルギーを効率的に低下させることが関係している。ＬＡＣＥをより低い温度（５℃）で水中で配合すると、ゲル様の粘稠性を有する凝集体を形成した。冷蔵温度で配合した組成物は眼刺激性が極端に高かった。凝集状態はＲＰ−ＨＰＬＣ法（図１２Ａ〜１２Ｂのクロマトグラム参照）により定量化することが可能であった。一連の調査目的の実験において、広範なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて測定したところ、重合体も低重合体も存在しないことが示された。他の調査においては、周囲空気の存在下又は窒素の存在下にプロセスを実施して眼刺激に関する試験を行った。空気又は窒素と刺激性との間に相関関係は見られなかった。室温で配合した場合はどちらも同程度に使用感がよかったが、空気が存在した方が分解物は多かった。ＨＰＬＣ法で定量化したところ、ＬＡＣＥを室温で配合した方がミセルの凝集は少なかった。室温で配合したＬＡＣＥは使用感がよく刺激性のない溶液を生成した。
【００２２】
同じく予期しなかったのは、ミセル凝集体の「もつれが解ける（ｄｉｓｅｎｔａｎｇｌｉｎｇ）」ことであった。ＨＰＬＣで測定したところ、ＬＡＣＥの水性組成物中で生成した凝集体は、溶液が平衡化するように室温で卓上に放置することにより、「もつれを解く」ことができた。更なる実験を行うことにより、激しくかき混ぜることによって脱凝集することが示された。したがって、これらの化学種は共有結合している永続的な化学種ではなく、ＬＡＣＥが自己集合した凝集体であり、５℃よりも室温下の方が濃度が低いようであることが判明した。ＬＡＣＥ水溶液を凍結させると、糸を引く粘稠性が生じた。この溶液を室温に戻して同温度で保管すると、再び均質な溶液になったように見え、したがって、自己集合が温度依存性を示すという概念の信用性が更に高まった。
【００２３】
更に、配合後は、ＬＡＣＥの凝集体を含まない溶液を、酸化的及び加水分解的な分解を最小限に抑えるために冷蔵条件下に保管することができる。安定性試験を通して、ＬＡＣＥの分解現象を最小限に抑えるために理想的な保管温度は２〜５℃であることが確認された。
【００２４】
最も刺激の少ない溶液が得られる理想的な配合条件は、室温（２２〜２５℃）下であると確認され、安定且つ使用感のよいＬＡＣＥの老視用点眼液が得られる理想的な保管条件は２〜５℃と確認された。
【００２５】
ＬＡＣＥから調製された点眼液の安定化を更に支援するために、酸化により誘導される分解を防止するためのＬＤＰＥ製眼科用ボトルと一緒に脱酸素剤の小包を、マイラー（ｍｙｌａｒ）製の不透過性小袋（ｉｍｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｐｏｕｃｈ）に装入した。広範な安定性試験を行うことにより、ＥＶ０６点眼液で１年間の安定性が達成されることが実証された。
【００２６】
ここに提案する発明には、リポソームの水性製剤、薬物の安定化を主目的として配合したエマルション等の他の形態を含む、ＬＡＣＥを安定化させる様々な組成物の実施形態も記載する。
【００２７】
Ｂ．水溶液中のＬＡＣＥヨウ化物
水溶液中のＬＡＣＥヨウ化物はミセル状凝集体を形成（ＬＡＣＥ塩化物と同様に）し、これが眼組織を刺激する原因となる。次に示す実験にミセル化を阻害する幾つかの配合方法を記載する。
【００２８】
塩化ナトリウムを既存のＬＡＣＥヨウ化物配合物に添加するか、又は塩化ナトリウムを含有する溶液を使用してＡＰＩであるＬＡＣＥヨウ化物を溶解した実験において、「会合性化学種」のピークは大きく低下しなかった。
【００２９】
ＡＰＩを懸濁させるために水性媒体に添加する前に、エタノール又はプロピレングリコール等の共溶媒を使用する実験においては、会合性化学種の比率が著しく低下した。既存の配合物に有機溶媒を添加することも、程度は小さいが、会合性化学種のピークを低下させた。
【００３０】
これらの結果は、ＬＡＣＥ分子間の疎水性相互作用を妨げることができる、会合性化学種を制御する手段としての配合戦略を示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、リポ酸コリンエステル（ＬＡＣＥ）の化学構造を示すものである。
【図２】図２は、１、３、及び４時間かき混ぜた配合物ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−２の、８．１分に現れるＬＡＣＥのミセル状化学種のチャートを示すものである。
【図３】図３は、６、８、及び２４時間かき混ぜた配合物ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−２の、８．１分に現れるＬＡＣＥのミセル化学種のチャートを示すものである。
【図４】図４は、冷蔵温度で混合するとＬＡＣＥのミセル状化学種が最大となることを例示するチャートである。
【図５−１】図５：図５Ａは、ミセル状ＬＡＣＥ濃度（ＨＰＬＣ反応追跡における７．９分及び８．５分の間の大きなピークで示される）の高さと、ＬＡＣＥ塩化物の凝集塊との間に相関関係があることを例示するチャートであり、図５Ｂは、ミセル状ＬＡＣＥ濃度がより低いことと、凝集塊化していないＬＡＣＥ塩化物との間に相関関係があることを例示するチャートである。
【図５−２】（上記の通り。）
【図６】図６は、アラニンの効果をｐＨ毎に例示するグラフである。
【図７】図７は、ＢＡＣを含まない配合物及びグリセロールを含まない配合物の安定性を示すグラフである。
【図８】図８は、亜硫酸塩を含む配合物の安定性を示すグラフである。
【図９】図９は、ＢＡＣを含まないＬＡＣＥ組成物の安定性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、グリセリンを含まないＬＡＣＥ組成物の安定性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、緩衝化された組成物がＬＡＣＥの安定性に与える効果を示すグラフである。
【図１２−１】図１２：図１２Ａは、刺激スコア（ウサギ刺激モデルにおける）とＨＰＬＣ−ＵＶにより測定されたＬＡＣＥミセル状化学種（％）との間の相関関係を示すグラフであり、図１２Ｂは、刺激スコア（ウサギ刺激モデルにおける）とＨＰＬＣ−ＥＬＳＤにより測定されたＬＡＣＥミセル状化学種（％）との間の相関関係を示すグラフであり、図１２Ｃはグリセロールの標準曲線を示すものである。
【図１２−２】（上記の通り。）
【図１２−３】（上記の通り。）
【図１３−１】図１３：図１３Ａは、ＮａＣｌ  １．８％を添加した、ＬＡＣＥヨウ化物１．９２％を含むＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−１５（ロット０９２３０９）のＨＰＬＣチャートであり（Ｔ＝０時間）、図１３Ｂは、ＮａＣｌ  １．８％を添加した、ＬＡＣＥヨウ化物１．９２％を含むＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−１５（ロット０９２３０９）のＨＰＬＣチャートであり（Ｔ＝４時間）、図１３Ｃは、ＮａＣｌ  １．８％を含む、ｐＨ４．５の緩衝液に溶解したＬＡＣＥヨウ化物（ロット０１１５１０）のＨＰＬＣチャートである。
【図１３−２】（上記の通り。）
【図１３−３】（上記の通り。）
【図１４】図１４は、７８％エタノールに溶解したＬＡＣＥヨウ化物（ロット０１１５１０）のＨＰＬＣチャートである。
【図１５】図１５は、１０％プロピレングリコールに溶解したＬＡＣＥヨウ化物（ロット０１１５１０）のＨＰＬＣチャートである。
【図１６】図１６は、スルホブチルエーテルシクロデキストリン中で配合したＬＡＣＥヨウ化物のＨＰＬＣチャートである。
【図１７】図１７は、ミセル化を阻害するためにポリプロピレングリコールと一緒に配合したＬＡＣＥヨウ化物のＨＰＬＣチャートである。
【図１８】図１８は、ＬＡＣＥヨウ化物の酸化に対するＨＰ−β−ＣＤの効果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ＬＡＣＥヨウ化物の不純物全体に対するＨＰ−β−ＣＤの効果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、ＬＡＣＥ塩化物の基本配合物とＨＰ−β−ＣＤを含むＬＡＣＥヨウ化物とを比較したグラフである。
【図２１】図２１は、酸化化学種を生成する活性化エネルギーの計算（ＬＡＣＥヨウ化物／ＨＰ−β−ＣＤ含有配合物対ＬＡＣＥ塩化物含有、ＨＰ−β−ＣＤ非含有配合物）を示すものである。
【図２２】図２２は、リポ酸生成の活性化エネルギーの計算（ＬＡＣＥヨウ化物／ＨＰ−β−ＣＤ含有配合物対ＬＡＣＥ塩化物含有、ＨＰ−β−ＣＤ非含有配合物）を示すものである。
【図２３】図２３は、角膜透過性試験に用いたフランツセルを示すものである。
【図２４】図２４は、試験１におけるリポ酸の透過量（角膜１〜３：ＨＰ−β−ＣＤ７．４％を含む、１．９２％ＬＡＣＥ−Ｉ、角膜４〜６：ＨＰ−β−ＣＤを含まない、１．５％ＬＡＣＥ−Ｃｌ）である。
【図２５】図２５は、試験１におけるＬＡＣＥの透過量を示すグラフである。
【図２６】図２６は、試験２におけるＬＡＣＥの透過量を示すグラフである。
【図２７】図２７は、試験２において角膜から抽出されたリポ酸を示すグラフである（角膜１〜３：ＬＡＣＥヨウ化物３．０％配合物；角膜４〜６：ＬＡＣＥヨウ化物４．５％配合物）。
【図２８】図２８は、試験３におけるＬＡＣＥの透過量を示すグラフである。
【図２９】図２９は、試験３において角膜から抽出されたリポ酸を示すグラフである（角膜１〜３：ＬＡＣＥヨウ化物３．０％／ＨＰ−β−ＣＤ配合物；角膜４〜６：ＬＡＣＥヨウ化物４．５％／ＨＰ−β−ＣＤ非含有配合物）。
【図３０】図３０は、試験４におけるＬＡＣＥの透過量を示すグラフである。
【図３１】図３１は、試験４において角膜から抽出されたリポ酸を示すグラフである（角膜１〜３：ＬＡＣＥヨウ化物１．９２％／ＨＰ−β−ＣＤ配合物；角膜４〜６：ＬＡＣＥヨウ化物１．９２％／ＨＰ−β−ＣＤ非含有配合物）。
【図３２】図３２は、配合物中のＨＰ−β−ＣＤの量に応じた会合性化学種の面積百分率の経時変化を示すグラフである［ＬＡＣＥ  １モルに対するモル当量（Ｍ．Ｅ）で表す］。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ａ．用語の定義
「ＥＶ０６」、「ＬＡＣＥ」、又は「リポ酸コリンエステル」という語は、後に図１に示す化学構造を有するものと理解される。
【００３３】
本明細書において用いられるＬＡＣＥ配合物とは、リポ酸コリンエステル配合物を指す。例えば、ＬＡＣＥ塩化物１．５％配合物は、配合物の１．５重量％のリポ酸コリンエステル塩化物を有する配合物を指す。あるいは、ＥＶ０６点眼液、１．５％は、１．５％のリポ酸コリンエステル塩化物塩を含む配合物を指す。ＬＡＣＥヨウ化物３％は、配合物の３重量％のＬＡＣＥヨウ化物を含む溶液を指す。
【００３４】
本明細書において用いられる、リポ酸コリンエステルの「誘導体」は、リポ酸コリンエステルを非水性の医薬製剤添加物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と反応させることにより生成する、リポ酸及びコリン以外の任意の化合物又は化合物の混合物として理解される。
【００３５】
本明細書において用いられる「自己集合」という語は、熱力学的に最も安定なエネルギー状態を達成するために分子が集合することを意味する。自己集合の一例が、水中で、通常、疎水性部分及び親水性部分を有する分子によって形成される、ミセルである。分子の親水性部分はミセルの表面にあり、内部は疎水性部分を含む。ＬＡＣＥの場合、コリン頭部がミセル表面にある。
【００３６】
特に記載がないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書において用いられる「製剤添加物」という語は医薬的に許容される製剤添加物を指す。
【００３７】
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という語は、疾患又は障害に関連する状態、症状、又はパラメータを改善するのに有効な量、方法（ｍａｎｎｅｒ）、又は様式（ｍｏｄｅ）で療法を施すことを指す。
【００３８】
「予防」という語は、統計的に有意な程度まで、又は当業者が検出可能な程度まで、患者が障害を負うことを妨げること、患者をより長い期間障害のない状態のままにすること、又は障害の進行を止めることを指す。
【００３９】
「治療有効量」という語は、対象の眼疾患又は障害（例えば、老視）の症状を予防若しくは発症を遅延若しくは回復させるか、又は所望の生物学的結果、例えば、遠近調節力若しくは疾患の状態を示唆する他の適切なパラメータの改善を達成する、有効成分（例えば、ＬＡＣＥ又はその誘導体）の量を指す。
【００４０】
本明細書において用いられる「保存安定性（ｓｈｅｌｆ−ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」又は「保存安定性を有する」という語は、保管中に組成物又は有効成分（例えば、ＬＡＣＥ又はその誘導体）が実質的に変化しないという特徴を有すること、又はそれを特徴付けることと理解される。このような保存安定性を決定するための方法は公知であり、例えば、保存安定性は、配合物を一定期間保管した後に配合物中に残存しているか又は分解した組成物又は有効成分（例えば、リポ酸コリンエステル）の比率をＨＰＬＣで決定することにより測定することができる。例えば、保存安定性を有する医薬組成物は、医薬品規格（ＩＣＨ）に従い保管した後、ＨＰＬＣ測定により、組成物中に有効成分（例えば、リポ酸コリンエステル）が少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超）存在することを指す。
【００４１】
本明細書において用いられる、化合物の「相対保持時間」又は「ＲＲＴ」という語は、式「ＲＲＴ＝（ｔ２−ｔ０）／（ｔ１−ｔ０）」を用いて求めることができ、それぞれ、ＨＰＬＣにより測定された、ｔ０＝ボイド時間、ｔ１＝リポ酸コリンエステルの保持時間、ｔ２＝化合物の保持時間である。
【００４２】
本明細書において用いられる「対象」という語は、一般に、健康なヒト又は特定の疾患若しくは障害（例えば老視）を有する患者等の動物（例えばペット）又はヒトを指す。
【００４３】
ＬＡＣＥ組成物及び実施形態
本明細書に記載するように、ここに提案する発明は、治療有効量のリポ酸コリンエステル、製剤添加物、緩衝剤を含む医薬組成物の実施形態と、適合性のある条件と、眼科用点眼薬として適した生体適合性（非刺激性）を有する安定な溶液を生成する方法及びプロセスと、を提供する。
【００４４】
医薬組成物中のリポ酸コリンエステル又はその誘導体の濃度は、組成物の重量を基準として、０．０１〜０．１％、０．１％〜１０％（例えば、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）の任意の濃度とすることができる。幾つかの実施形態において、医薬組成物中のリポ酸コリンエステルの濃度は１％である。幾つかの実施形態において、医薬組成物中のリポ酸コリンエステルの濃度は３％である。幾つかの実施形態において、医薬組成物中のリポ酸コリンエステルの濃度は４％である。組成物中のＬＡＣＥの好ましい範囲は１〜３％である。この範囲内で好ましい組成物の範囲は１．５〜５％である。ＬＡＣＥの塩形態は、ヨウ化物又は塩化物のいずれかとすることができる。
【００４５】
他の実施形態において、提案する発明における有効な組成物は、ＬＡＣＥ（塩化物又はヨウ化物）及びアラニンを含有する水性配合物であり、アラニンの濃度は、０．１〜０．５％、０．５％〜１％、１％〜１．５％、１．５％〜３％、１．５〜５％の間にある。この範囲内で好ましい組成は、アラニン０．５％及びＬＡＣＥ１．５％である。他の好ましい実施形態は、アラニン０．５％及びＬＡＣＥヨウ化物又はＬＡＣＥ塩化物１．５〜４％である。
【００４６】
好ましい実施形態において、有効なＬＡＣＥ塩形態及びアラニンを含有する組成物は、防腐剤として、３０〜１５０ｐｐｍの濃度の塩化ベンザルコニウムを含有する。
【００４７】
他の実施形態において、有効なＬＡＣＥ塩形態及びアラニンを含有する製剤組成物は防腐剤を含まない。
【００４８】
他の実施形態においては、ポリクオタニウム、ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）、ｓｏｆＺｉａ等の他の防腐剤が、ＦＤＡによりヒトでの使用が承認されている濃度でＬＡＣＥ水性配合物に防腐剤として含まれる。他の防腐剤として、２−フェニルエタノール、ホウ酸、エデト酸二ナトリウムを用いることができる。
【００４９】
水中に高濃度で溶解したＬＡＣＥ塩の自己集合ミセルの溶液はある程度の刺激作用を示す可能性があるので、生体適合性溶液を得るための方法として、リポソームへの内包を行うことができる。この場合、ＬＡＣＥはリポソームの内部に含有されることになる。リポソームは一般に眼表面と生体適合性を有する。他の例において、ＬＡＣＥ塩は、スルホブチルエーテルシクロデキストリン又はヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン等のシクロデキストリンと複合体を形成することにより内包されている。
【００５０】
他の実施形態においては、医薬組成物は、グリセロールを０．１％〜１０％の濃度で含む。好ましい実施形態において、組成物は、グリセロールを０．１〜５％の濃度で含む。
【００５１】
幾つかの実施形態において、防腐剤は塩化ベンザルコニウムであり、生化学的エネルギー源はアラニンである。幾つかの実施形態において、リポ酸コリンエステルは、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物、硫酸イオン、メタンスルホン酸イオン、硝酸イオン、マレイン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、フマル酸イオン、フマル酸水素イオン、酒石酸イオン（例えば、（＋）酒石酸イオン、（−）酒石酸イオン、又はこれらの混合物）、酒石酸水素イオン、コハク酸イオン、安息香酸イオン、及びグルタミン酸等のアミノ酸の陰イオンからなる群から選択される対イオンを有する。
【００５２】
適切な緩衝剤は、その医薬組成物に所望されるｐＨ（例えば、本明細書に記載するもの）を達成することができる、当該技術分野において知られているもののいずれかとすることができる。非限定的な例としては、リン酸緩衝剤（例えば、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、無水二塩基性リン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、及びＨＢＳＳ（ハンクス液）が挙げられる。緩衝剤の適切な量は、所望のｐＨに基づき容易に算出することができる。本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、緩衝剤の量は眼科用製品として許容される量である。しかしながら、幾つかの実施形態において、医薬組成物は緩衝剤を含まない。幾つかの実施形態において、水溶液又は最終医薬組成物のｐＨは、酸（例えば、塩酸）又は塩基（例えば、水酸化ナトリウム）を用いて所望のｐＨ範囲（例えば、本明細書に記載するもの）に調整される。
【００５３】
他の実施形態において、緩衝系は、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、カルシウム緩衝液、並びにそれらの組合せ及び混合物から選択することができる。好ましい実施形態において、緩衝剤はアミノ酸緩衝液である。他の好ましい実施形態において、アミノ酸緩衝液はアラニンを含む。
【００５４】
幾つかの実施形態において、リポ酸コリンエステルは、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、メタンスルホン酸イオン、硝酸イオン、マレイン酸イオン、酢酸イオン、クエン酸イオン、フマル酸イオン、フマル酸水素イオン、酒石酸イオン（例えば、（＋）酒石酸イオン、（−）酒石酸イオン、又はそれらの混合物）、コハク酸イオン、安息香酸イオン、及びグルタミン酸等のアミノ酸の陰イオンからなる群から選択される対イオンを有する。他の対イオンは、ステアリン酸イオン、プロピオン酸イオン、及びフロ酸イオンである。
【００５５】
幾つかの実施形態において、眼科用配合物のｐＨは４〜８である。幾つかの実施形態において、眼科用配合物のｐＨは４．５である。幾つかの実施形態において、眼科用配合物は、生化学的に許容されるエネルギー源、防腐剤、緩衝剤、等張化剤、界面活性剤、粘度調整剤、及び酸化防止剤からなる群から選択される少なくとも１種の成分を含む。
【００５６】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は酸化防止剤を含む。幾つかの好ましい実施形態において、酸化防止剤はアスコルビン酸塩を含む。他の好ましい実施形態において、酸化防止剤はグルタチオンを含む。好適な酸化防止剤は、当該技術分野において公知のもののいずれかとすることができる。非限定的な例としては、アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、アルファチオグリセリン、エチレンジアミン四酢酸、エリソルビン酸、システイン塩酸塩、Ｎ−アセチルシステイン、Ｌ−カルニチン、クエン酸、酢酸トコフェロール、ジクロロイソシアヌル酸カリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、大豆レシチン、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、天然ビタミンＥ、トコフェロール、アスコルビルパスチミネート（ａｓｃｏｒｂｙｌ  ｐａｓｔｈｙｍｉｎａｔｅ）、ピロ亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、１，３−ブチレングリコール、テトラキス［３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）］プロピオン酸ペンタエリスリチル、没食子酸プロピル、２−メルカプトベンズイミダゾール、及び硫酸オキシキノリンが挙げられる。酸化防止剤の適切な量は、組成物の重量の０．１％〜５％の範囲（例えば、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）とすることができる。本明細書に記載する任意の実施形態において、酸化防止剤の量は眼科的に許容される量である。
【００５７】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、高純度窒素又はアルゴン等の不活性環境下で配合することにより調製される。好ましい実施形態において、医薬組成物は、２ｐｐｍ未満の酸素を含む窒素環境下で配合される。
【００５８】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、２０〜２５℃の温度で配合することにより調製される。
【００５９】
好ましい実施形態において、固体ＬＡＣＥ分子は微粉末に粉砕される。好ましくは、固体ＬＡＣＥ分子は、凝集塊のない粉末に粉砕される。一実施形態において、粒度は５００ミクロン未満となるであろう。他の好ましい実施形態において、粒度は１００ミクロン未満となるであろう。
【００６０】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、最初に水溶液を室温（２０〜２５℃）に維持して脱気し、次いで溶液中に製剤添加物を溶解し、続いて穏やかに窒素散気しながら固体ＬＡＣＥを激しく溶解させながらゆっくりと少量ずつ加えることにより調製される。
【００６１】
一実施形態において、医薬組成物は、４時間〜２４時間激しく攪拌される。好ましい実施形態において、医薬組成物は、４〜８時間激しく攪拌される。他の好ましい実施形態において、医薬組成物は、８時間激しく攪拌される。
【００６２】
いずれかの方法により調製された医薬組成物は、少なくとも３ヶ月間の（例えば、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、又は１年を超える）保存安定性を有することができる。
【００６３】
医薬組成物はまた、５℃で一定期間保管した後の薬物関連分解物が、好ましいプロファイル（例えば、薬物関連不純物の総量、又は特定の薬物関連不純物の量）を示すことができる。配合物中の薬物関連分解物の量を測定するための分析ツール（例えば、ＨＰＬＣ）は公知である。
【００６４】
好適な生化学的に許容されるエネルギー源は、当該技術分野において知られているもののいずれかとすることができる。例えば、生化学的に許容されるエネルギー源は、エネルギー代謝経路、特にグルコース代謝経路の中間体として参加することにより還元を促進できる任意のものとすることができる。好適な生化学的に許容されるエネルギー源の非限定的な例として、アミノ酸又はその誘導体（例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、２−オキソグルタル酸エステル、グルタミン酸エステル、及びグルタミン等）、糖又はその代謝物（例えば、グルコース、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ））、ピルビン酸エステル（例えば、ピルビン酸エチル）、ラクトース、乳酸エステル、又はその誘導体）、脂質（例えば、脂肪酸又はモノ−、ジ−、及びトリグリセリド等のその誘導体並びにリン脂質）、及びそれ以外のもの（例えば、ＮＡＤＨ）が挙げられる。生化学的に許容されるエネルギー源の適切な量は、組成物の重量の０．０１％〜５％の範囲（例えば、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）とすることができる。幾つかの実施形態において、生化学的エネルギー源はピルビン酸エチルである。幾つかの実施形態において、生化学エネルギー源はアラニンである。幾つかの実施形態において、ピルビン酸エチル又はアラニンの量は、組成物の重量の０．０５％〜５％の範囲（例えば、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）にある。幾つかの実施形態において、アラニンの量は、組成物の０．５重量％である。本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、生化学的に許容されるエネルギー源の量は、眼科的に許容される量である。
【００６５】
適切な防腐剤は、当該技術分野において公知のもののいずれかとすることができる。非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、セトリモニウム、クロロブタノール、エデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ポリクオタニウム−１（Ｐｏｌｙｑｕａｄ（登録商標））、ポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）、安定化されたオキシクロロ錯体（ＰＵＲＩＴＥ（登録商標））、過ホウ酸ナトリウム、及びＳｏｆＺｉａ（登録商標）が挙げられる。医薬組成物中の防腐剤の適切な量は、組成物の重量の０．００５％〜０．１％の範囲（例えば、０．００５、０．０１、０．０２％、０．０５％、０．１％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）とすることができる。幾つかの実施形態において、防腐剤は塩化ベンザルコニウムである。幾つかの実施形態において、塩化ベンザルコニウムの量は、組成物の重量の０．００３％〜０．１％（例えば、０．００３、０．０１、０．０２％、０．０５％、０．１％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）である。幾つかの実施形態において、塩化ベンザルコニウムの量は、組成物の０．０１重量％である。本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、防腐剤の量は、眼科的に許容される量である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は防腐剤を含まない。
【００６６】
好適な等張化剤は、当該技術分野において公知のもののいずれかとすることができる。非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトール、デキストロース、グリセリン、ポリプロピレングリコール、及びそれらの混合物が挙げられる。医薬組成物中の等張化剤の適切な量は、２００〜４６０ｍＯｓｍ（例えば、２６０〜３６０ｍＯｓｍ、又は２６０〜３２０ｍＯｓｍ）の重量モル浸透圧濃度を達成することができる任意の量である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は等張化組成物である。幾つかの実施形態において、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム）の量は、組成物の重量の０．１％〜５％（例えば、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）である。本明細書に記載する実施形態のいずれかにおいて、等張化剤の量は、眼科的に許容される量である。
【００６７】
好適な界面活性剤は、イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤を含む、当該技術分野において公知のもののいずれかとすることができる。有用な非イオン性界面活性剤の非限定的な例としては、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート８０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレエート］、ポリソルベート６０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノステアレート］、ポリソルベート４０［ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノパルミテート］、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレート、ポリ（オキシエチレン）ソルビタントリオレエート、又はポリソルベート６５［ポリ（オキシエチレン）ソルビタントリステアレート］）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、又はポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（例えば、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８１］、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３］、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５］、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７１］、又はポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール［Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４１］）、ステアリン酸ポリオキシル４０、ショ糖脂肪酸エステル、及びそれらの組合せが挙げられる。幾つかの実施形態において、界面活性剤はポリソルベート８０である。医薬組成物中の界面活性剤の適切な量は、組成物の重量の０．０１％〜５％の範囲（例えば、０．０５、０．１、０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく範囲）とすることができる。幾つかの実施形態において、界面活性剤はポリソルベート８０であり、ポリソルベート８０の量は、組成物の重量の０．０５％〜５％の範囲（例えば、０．０５、０．１、０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）にある。幾つかの実施形態において、ポリソルベート８０の量は組成物の０．５重量％である。本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、界面活性剤の量は眼科的に許容される量である。しかしながら、幾つかの実施形態において、医薬組成物は界面活性剤を含まない。
【００６８】
好適な粘度調整剤は、当該技術分野において公知のもののいずれかとすることができる。非限定的な例として、カーボポールゲル、セルロース系の試剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ポリカルボフィル、ポリビニルアルコール、デキストラン、ゼラチングリセリン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー４０７、ポリビニルアルコール、及びポリビニルピロリドン、並びにそれらの混合物が挙げられる。粘度調整剤の適切な量は、組成物の重量の０．１％〜５％の範囲（例えば、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、又はこれらの特定した数値に基づく任意の範囲）とすることができる。本明細書に記載する実施形態のいずれにおいても、粘度調整剤の量は眼科的に許容される量である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は粘度調整剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の高分子粘度調整剤）を含まない。
【００６９】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、次に示す特徴の１又は２以上を有する：
（ａ）リポ酸コリンエステル塩を、組成物の重量の０．１％〜１０％（例えば、０．１％、１．０％、１．５％、３％、４％、５％、又は特定した数値の間の任意の範囲）の濃度で含む；
（ｂ）防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）を、組成物の重量の０．００３％〜０．１％（例えば、０．０１％）の濃度で含む；
（ｃ）生化学的エネルギー源（例えばアラニン）を、組成物の重量の０．１％〜５％（例えば、０．５％）含む；
（ｄ）グリセロールを、組成物の重量の０．５％〜５％（例えば、２．７％）の濃度で含む；
（ｅ）ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリンを、組成物の重量の１〜２０％の濃度で含む；
（ｆ）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）を、組成物の重量の０．１〜０．５％の濃度で含む。
【００７０】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、グリセリンを１〜３重量％と、アラニンを０．５重量％と、塩化ベンザルコニウムを０．００５〜０．０１重量％と、リポ酸コリンエステルを１〜３重量％と、水と、から本質的になり、医薬組成物のｐＨは４．３〜４．７である。
【００７１】
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、グリセリンを１〜３重量％と、アラニンを０．５重量％と、ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリンを１〜３０％と、塩化ベンザルコニウムを０．００５〜０．０１重量％と、リポ酸コリンエステルの医薬塩を１〜３重量％と、水と、から本質的になり、医薬組成物のｐＨは４．３〜４．７である。
【００７２】
他の実施形態において、リポ酸コリンエステルの医薬塩形態は塩化物である。
【００７３】
他の実施形態において、リポ酸コリンエステルの医薬塩形態はヨウ化物である。
【００７４】
他の実施形態において、リポ酸コリンエステルの医薬塩形態は、これらに限定されるものではないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、リン酸塩、トシラート、ステアリン酸塩、メタンスルホン酸塩の群に含まれる。
【００７５】
他の実施形態において、増粘剤は、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンである。
【００７６】
好ましい実施形態において、好ましい増粘剤は、濃度が０．１〜０．５％のヒドロキシプロピルメチルセルロースである。
【００７７】
他の実施形態においては、ＬＡＣＥを安定化させるために酸化防止剤が添加される。
【００７８】
適切な酸化防止剤は、アスコルビン酸塩、グルタチオン、ヒスチジン、メチオニン、システインとすることができる。
【００７９】
他の実施形態において、組成物のｐＨは４〜５の間にある。
【００８０】
一実施形態において、眼科用組成物は、対象の各眼に１日１回、１日２回、１日３回、及び１日４回投与される。
【００８１】
幾つかの実施形態において、本発明は、水溶液中で水の影響を受けて加水分解しやすい有効成分（例えば、リポ酸コリンエステル又はその誘導体）を水溶液中に含む医薬組成物を保存するための系も提供する。好ましい実施形態において、医薬組成物はＬＤＰＥ眼科用点眼ボトル内に保存され、充填プロセス中に窒素置換（ｏｖｅｒｌａｉｄ）を行い、キャップをした後、脱酸素剤を含むマイラー製ガス不透過性小袋で二次包装する。
【００８２】
他の実施形態において、点眼ボトル又は点眼器具は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）である。他の実施形態において、点眼ボトルは、ガス透過性の低い材料から構成される。
【００８３】
他の実施形態において、点眼ボトル又は点眼器具は、眼内に吐出するためのポリプロピレン製滴下チップを有するガラス製眼科用ボトル（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｂｏｔｔｌｅ）である。
【００８４】
他の実施形態において、点眼ボトルは、ガス透過性の低い任意の材料から構成することができる。他の実施形態において、点眼ボトルは、成形同時充填法によって充填された単位用量とすることができる。
【００８５】
一実施形態において、医薬組成物は、２〜５℃で３ヶ月間〜２年間保存される。
【００８６】
治療方法
リポ酸コリンエステル又はその誘導体を含む医薬組成物（例えば本明細書に記載するもの）は、酸化的損傷に関連する疾患又は障害を治療又は予防するための方法に使用することができる。酸化的損傷に関連する疾患又は障害は知られている。
【００８７】
幾つかの実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における眼疾患の治療方法であって、治療有効量の本明細書に記載する医薬組成物のいずれかを対象の眼に投与することを含む、方法を提供する。
【００８８】
幾つかの実施形態において、眼疾患は、老視、ドライアイ、白内障、黄斑変性症（加齢性黄斑変性症等）、網膜症（糖尿病網膜症等）、緑内障、又は眼炎症である。幾つかの実施形態において、眼疾患は老視である。
【００８９】
本明細書における眼疾患を治療又は予防する方法に用いるための医薬組成物の適切な量は、任意の治療有効量とすることができる。幾つかの実施形態において、この方法は、水晶体の遠近調節力を少なくとも０．１ジオプター（Ｄ）（例えば、０．１、０．２、０．５、１、１．２、１．５、１．８、２、２．５、３、又は５ジオプター）向上させるのに有効な量の医薬組成物を対象の眼に投与することを含む。幾つかの実施形態において、方法は、１〜５滴（１滴当たり約４０μＬ）の医薬組成物を対象の眼に投与することを含む。幾つかの実施形態において、対象の眼は、１、２、３、４、５回、又は５回を超えて、１回当たり１〜５滴（１滴当たり約４０μＬ）の医薬組成物で治療される。幾つかの実施形態において、対象の水晶体又は眼は、毎回１、２、３、４、５滴、又は５滴を超える医薬組成物で治療される。幾つかの実施形態において、対象の眼は、本明細書の医薬組成物を１日２回又は３回、各回１滴又は２滴（１滴当たり約４０μＬ）で治療される。
【００９０】
本方法は、あらゆる年齢の患者に実施することができる予防方法を含む。本方法は、あらゆる年齢の患者、特に２０〜７５歳の患者に実施することができる治療方法も含む。
【００９１】
以下の実施例は例示的なものであり、主張する実施形態の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９２】
実施例１
リポ酸コリンエステル塩化物（ＬＡＣＥ）の化学構造及び一般的性状
【化１】
2019534864.tif 000003
【００９３】
【表１】
2019534864.tif 000004
【００９４】
実施例２
ＬＡＣＥ塩化物処理溶液の混合時間と相関させたミセル状化学種の動力学
本項に記載する実験は、ＬＡＣＥ塩化物のミセル状化学種が２５℃で長時間混合することにより安定化及び消滅することを示すものである。その結果から、これらの化学種が、ミセルやミセル状凝集体等の自己集合系に特徴的な可逆的性質を有することが示された。
【００９５】
分子の自発的な自己集合によるミセル状化学種の形成は、平衡状態にある系の全自由エネルギーにより駆動される。この実験から、混合時間が長くなると平衡状態に到達するという動力学が示された。
【００９６】
目的：
〇成長するミセル状化学種が安定化するか否かを確認することにより、処理時間の階層（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｔｉｍｅ  ｂｒａｃｋｅｔ）を確認する。
〇「保持時間（ｈｏｌｄｉｎｇ  ｔｉｍｅ）」を確認する。
【００９７】
手順：
〇媒体に窒素をバブリングして脱酸素化した後、２５℃でＬＡＣＥ塩化物１．５％を含む２００ｇのバッチを２つ調製した。ＬＡＣＥを溶解する間は窒素のバブリングを継続した。
〇一方のバッチは、多量の凝集塊を有するＧＭＰ  Ｂａｔｃｈ  ＃２（Ｇ２−１４ＬＡＣ）をそのまま使用して調製し、もう一方のバッチは、Ｇ２−１４ＬＡＣを乳鉢及び乳棒を用いて微粉末に粉砕した試料を使用して調製した。
〇ＬＡＣＥを溶解してｐＨを調整した後、継続的に窒素置換しながらバッチを２４時間攪拌し、溶存酸素を約１．６ｐｐｍ（ｖｓ．飽和溶解度８．２ｐｐｍ）に維持した。１時間、３時間、４時間、６時間、８時間、９時間、及び２４時間の時間点で約５〜１５ｍＬをシリンジで抜き取り、濾過滅菌して点眼ボトル（５ｍL／ボトル）に装入した。ボトルは窒素置換しなかった（装置がバルクのバッチに使用中であったため）。
〇全ての時間点の試料を１０ｍｇ／ｇに希釈し、バルク溶液から抜き取ってから３０分以内に、ＥＬＳＤ検出を用いてＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行うために注入した。
〇２４時間の時間点が経過した後、バルク溶液を濾過滅菌し、それぞれ約５０ｍＬの２つの部分に分割し、一方の分割分は５℃で保持し、もう一方の５０ｍＬの分割分は２５℃に保持した。分割分は全て、容器内に窒素を吹き込んで窒素置換した。
〇更に２４時間保持した後、各分割分を点眼ボトルに充填し、ボトルを窒素置換した。
【００９８】
溶解の観察
〇Ｇ２−１４ＬＡＣの凝集塊化した部分を配合物ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−１に約５分間かけて加えた。凝集塊の一部は溶解させるのに更に２０分間を要した。
〇粉末化したＧ２−１４ＬＡＣを配合物ＫＷ−ＬＡＣＥ−０１−８６−２に約１５分間かけて加えた。その理由は、スパチュラ一杯を加える毎に材料が凝集して表面に浮遊し、薄い浮遊物の塊となり、即座に分散しなかったためである。したがって、先に加えた分が渦流に吸い込まれるまで次の添加分を追加しなかった。各添加分が溶解するまでの時間は約１０分間と推定され、全過程で約２５分間を要した。
【００９９】
結果
〇最初の採取時点から、両方の配合物においてＲＴ＝８分に明確なピーク（ミセル状化学種と相関）が認められた。
〇８分のピーク（ミセル状化学種）の面積％に関しては、２つのバッチ間に一貫した差は見られなかったが、幾つかの時間点においては、粉末化したＬＡＣＥ塩化物から製造した２番目のバッチの方がミセル状化学種の量が多かった。
〇８分のピークの面積％は、次表に示すように２４時間後に大幅に低下した。
〇どちらのバッチも最終ｐＨは４．５４であった。
【０１００】
【表２】
2019534864.tif 000005
【０１０１】
この結果は、８．１分のＬＡＣＥ塩化物ミセル状化学種が長時間の混合により最小限に抑えられたことを示している。８．１分のピークは長時間混合することにより劇的に小さくなった。
【０１０２】
それぞれの溶液のリポ酸コリンエステルの分解物についても測定した。先に述べたように、ＬＡＣＥの分解機構は酸化的及び加水分解的なものであり、その結果として酸化及び加水分解された化学種が生成する。
【０１０３】
【表３】
2019534864.tif 000006
【０１０４】
このデータは、混合時間が長くなるとＬＡＣＥの分解物が増加することを示している。したがって、ＥＶ０６点眼液を配合するための最終的なプロセス条件は、分解物を最小限に抑えながら非刺激性溶液を得るように、最大８時間という条件を含むものとした。
【０１０５】
ＬＡＣＥヨウ化物を用いて同様の混合実験を行ったところ、溶液の凝集を最小限に抑えることはできなかった。実際、ＬＡＣＥヨウ化物の場合、凝集した化学種は、８時間の混合を終えた後でもＡＰＩの３９％と高かった。
【０１０６】
実施例３
混合温度とＬＡＣＥ塩化物のミセル状化学種の存在との相関関係
図４に示すデータは、アルゴン中及び冷蔵条件下に配合したＬＡＣＥ塩化物の溶液のものである。溶液は眼表面に対する刺激が極めて強かった。ミセル状化学種の比率は、ＡＰＩであるＬＡＣＥの主ピークの８〜１０％（矢印で示した保持時間７．９〜８．１分のミセル状化学種）であり、この濃度は室温で混合した溶液では普通は観測されないものである。
【０１０７】
実施例４
凝集塊とＬＡＣＥミセル状化学種の形成との相関関係
図５Ａは、固体の「凝集塊」を含んでいたＬＡＣＥ塩化物のバッチから調製したＥＶ０６点眼液のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。このロットのＡＰＩ（医薬品有効成分、固体ＬＡＣＥ原薬）から調製した溶液は、ＬＡＣＥミセル状化学種（矢印で示す）の比率が、粉末状ＡＰＩのロットから調製した溶液（図５Ｂ）よりも高かった（１０〜１５％）。
【０１０８】
したがって、溶液は両方共完全に溶解しているように見えたが、凝集塊のないＡＰＩから配合した溶液の方が、ＬＡＣＥミセル状化学種の濃度が低かった（図５Ｂ参照）。これを眼刺激と相関させると、図５Ａに示す溶液の方がウサギモデルにおける刺激スコアが高かった。これに従い、配合前に、粉末状材料にするための凝集塊破砕（ｄｅ−ｃｌｕｍｐｉｎｇ）手順を組み込むことにした。
【０１０９】
実施例５
製剤添加物及びＬＡＣＥの配合変化試験
概要
これらの実験の目的は、配合物組成及び微小環境（ｐＨ等）を体系的に変化させることにより、配合物を不安定化させる可能性のある変数を引き出すことにあった。リポ酸及びリポ酸の任意の誘導体は、熱、光、及び酸素中で分解及び重合しやすく、その結果としてジチオラン環が開環することになる。したがって、酸化に起因する切断によるフリーラジカルの生成（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃｉｓｓｉｏｎ）を誘導する可能性がある製剤添加物の存在は不安定化因子となる可能性がある。配合設計表（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｇｒｉｄ）１及び２により、配合物に既に存在する製剤添加物に関し、不安定化の可能性がある因子としての作用を体系的に調査した。
【０１１０】
これらの実験におけるＬＡＣＥ配合物の組成は、原薬、アラニン、グリセリン、塩化ベンザルコニウムを精製水中に含み、ｐＨを４．４〜４．６に到達させるために１Ｎの水酸化ナトリウム又は１Ｎの塩酸を添加したものであり、重量モル浸透圧濃度は２９０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。本文書に記載する実験は、ＬＡＣＥ点眼液を安定化させることができる製剤添加物を見極めるための配合変化試験である。
【０１１１】
配合設計表１において、次に示す（ａ）〜（ｅ）で与える変数について試験を行った。窒素をフラッシュしたグローブボックス内で配合物を調製し、濾過滅菌した。全ての配合物は５７℃の加速条件下に試験を行い、Ｔ＝０、３．５日後、及び７日後に、分析及び不純物調査のためにＨＰＬＣを行った。設計表１では全部で１９種の配合物を試験した。
（ａ）ｐＨの効果：ｐＨ３．５、４、及び５の配合物を調製し、ｐＨ４．５の対照配合物と比較した。図６に示すように、ＬＡＣＥの分解速度は３．５〜５の全てのｐＨ範囲で同程度であった。
（ｂ）アラニンの効果：配合物中におけるアラニンの役割を基本（ｏｒｉｇｉｎａｌ）配合物（対照）の分解速度と比較することにより推測した。図６に示すように、アラニンの非存在下ではＬＡＣＥの分解速度が速くなるようであった。したがってアラニンは、ＥＶ０６眼科用配合物に必要な製剤添加物である。
（ｃ）塩化ベンザルコニウム及びグリセリンの効果：グリセリンに含有される過酸化物が酸化を触媒する可能性があるという仮説を立てた。同様に、ＢＡＫはフリーラジカルによる開裂に続いて酸化を起こさせるため、原薬を不安定化させる可能性があるという仮説を立てた。図７から分かるように、塩化ベンザルコニウムを含まない配合物は実質的に対照よりも安定であった。グリセリンを含まない試作配合物（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）も同様に、対照よりも安定であった。更に、配合物に加えた塩化ナトリウム（グリセロールの替わりに、重量モル浸透圧濃度調整用として）は、不安定化効果を有するようであった（同じく図７に示す）。グリセリン、塩化ナトリウム、亜硫酸塩、及びｐＨを様々に組み合わせた他の実験において（全ての変形形態は塩化ベンザルコニウムを含まない）、注目すべきは、塩化ベンザルコニウムを含まない配合物が全て対照よりも安定であったことである（図５）。図７及び図９に示す実験から、ＬＡＣＥ中の塩化ベンザルコニウムを除去することが配合物を安定化させるための一つの方法となり得ることが示された。ＥＶ０６眼科用組成物の場合、塩化ベンザルコニウムの含有量を最小限の５０ｐｐｍにすることが主要な安定化因子となる可能性がある。塩化ナトリウムは不安定化作用を有することが示され、したがって、最終ＥＶ０６組成物の等張化剤としては、グリセロールがより適していると考えられた。
（ｄ）亜硫酸塩の効果：亜硫酸塩を使用し、様々な量の亜硫酸塩を組み合わせて様々な実験を行った（図８）。酸化防止剤としての亜硫酸塩を、様々なｐＨ値（４、４．５）及び濃度で配合物に添加した（図８）。亜硫酸塩が存在してもＬＡＣＥの安定性は実質的に向上しないようであった。配合物中の０．１％の亜硫酸塩は対照と同程度であるため、有害な影響があるか否かは不明であった。
（ｅ）グリセリンの効果：グリセリンの効果を、グリセリンを体系的に除去することにより様々な配合の組合せで調査した。図７及び図１０に示すように、グリセリンを含まない組合せは対照よりも安定しているようだった。しかしながら、塩化ナトリウムの不安定化効果が高いので、グリセリンを張度調整のために必要な製剤添加物として選択した。
（ｆ）緩衝剤の効果：様々な緩衝化された組成物について試験を行った。酢酸緩衝液及び酢酸塩＋ホウ酸が配合物を安定化させるようであった。
【０１１２】
実験
ａ）ＨＰＬＣ法の設定：ＨＰＬＣ分析は、（Ａ）０．０５Ｍの一塩基性リン酸ナトリウム、０．００５Ｍの１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩、０．２％ｖ／ｖのトリエチルアミン（リン酸でｐＨ４．５に調整）；及び（Ｂ）アセトニトリルから構成される移動相による５０分間のグラジエント溶出から構成されるものとした。分析カラムとしてＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  ＡＱ（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１２０Å）、Ｐ／Ｎ  ＡＱ１２５０５２５４６ＷＴを使用し、分析用検出波長は２２５ｎｍとする。
【０１１３】
ｂ）配合
ＡＰＩであるＬＡＣＥが確実に酸素や熱に曝されないように注意を払いながら配合物を調製した。不活性Ｎ２雰囲気のグローブバッグ内でＡＰＩを清浄なガラスバイアルに分取し、アルミ箔（ｔｉｎｆｏｉｌ）に包んで使用時まで−２０℃の冷凍庫で保管した。配合物は高純度の製剤添加物及び滅菌されたガラス器具を用いて調製した。製剤添加物は全て原液を調製し、ＡＰＩの添加及び最終ｐＨ調整を行う前に混合した。配合物を附録Ａの表に示す。
【０１１４】
ＩＩ．結果及び考察
図６は、５７℃における％ＡＰＩを時間（Ｔ＝０から、３．５日後、及び７日後まで）に対しプロットしたものであり、ｐＨ３．５、４、４．５（基本配合物）、５で調製した配合物及び対照からアラニンを抜いた配合物を体系的に比較したものである。アラニンを含まない配合物は、Ｔ＝０においてさえ、ＡＰＩ含有量がかなり低下していた。図６から分かるように、配合物はこれらのｐＨ３．５〜５の条件下においては同等である。
【０１１５】
図７は、次に示す変形形態を比較する配合物のプロットである：（ａ）対照（基本配合）  対  対照に０．２５％塩化ナトリウムを加えたもの、対照に０．２５％塩化ナトリウムを加え、グリセリンを抜いたもの、（ｂ）対照（基本配合）  対  対照から塩化ベンザルコニウムを抜いたもの、（ｃ）対照（基本配合）  対  基本配合からグリセリンを抜いたもの。
【０１１６】
図７から分かるように、基本配合に塩化ナトリウムを添加すると配合物が安定化しなくなった。
【０１１７】
図８は、５７℃におけるＬＡＣＥの安定性に対する亜硫酸塩の効果を示すものである。亜硫酸塩含有配合物を、亜硫酸塩０．０５％及び亜硫酸塩０．１％の濃度で、ｐＨ４及び４．５で調製した。亜硫酸塩を添加しても基本配合物は安定化しなかった。
【０１１８】
図９は、塩化ベンザルコニウムを抜くことによる安定化効果の可能性を更に模索したものである。塩化ベンザルコニウムを含まない変形配合物は、対照である基本配合物（ｐＨ４．５）よりも優れていた。変形配合物は、ＢＡＣ非含有組成物（ｐＨ４、４．５）、グリセリン非含有／ＢＡＣ非含有＋０．９％塩化ナトリウム、ＢＡＣ非含有＋０．０５％亜硫酸塩（ｐＨ４及び４．５）とした。
【０１１９】
図７及び図１０は、ｐＨ、亜硫酸塩、及び塩化ナトリウムを変化させた様々な組成物におけるグリセリンの効果を比較するものである。塩化ナトリウム及び亜硫酸塩が存在する、グリセリン非含有、ＢＡＣ非含有配合物、並びにグリセリン非含有、ＢＡＣ含有配合物は基本配合物よりも優れていた。
【０１２０】
図１１は、緩衝化した様々な組成物の使用をＬＡＣＥの安定性に関し調査したものである。基本配合物（ｐＨ４．５）を、酢酸緩衝組成物及びホウ酸塩（ｐＨ７．５）と比較した。酸化防止剤として添加したエデト酸ナトリウムは配合物を安定化させなかった。酢酸緩衝液及び酢酸緩衝液＋ホウ酸は対照配合物よりも優れているようであった。
【０１２１】
総括すると、塩化ベンザルコニウムを除くことにより一貫して安定性が向上するようであった。グリセロールを除くことも同様に好ましい手続きとなる可能性がある。グリセロールにはＡＰＩを分解することもあるホルムアルデヒドが残存していることが知られている。興味深いことに、エデト酸塩又は亜硫酸塩を添加しても好ましい効果は見られなかった。アスコルビン酸ナトリウム等の他の酸化防止剤が好ましい効果を示す可能性がある。
【０１２２】
【表４】
2019534864.tif 000007
【０１２３】
【表５】
2019534864.tif 000008
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
【表７】
2019534864.tif 000010
【０１２６】
【表８】
2019534864.tif 000011
【０１２７】
実施例６：
眼刺激とＬＡＣＥミセル状化学種の比率との相関関係
図１２Ａ及び図１２Ｂは、全体として、配合した複数種のバッチにおける刺激とＬＡＣＥミセル状化学種との相関関係の全体像を示すものである。
【０１２８】
実施例７
グリセロールによる重量モル浸透圧濃度の調整方法
○薬物含有配合物及び偽薬に要求される重量モル浸透圧濃度範囲は２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましくは、全てのＬＡＣＥ配合物を２９０〜３１０ｍＯｓｍ／Ｋｇとすることが必要である。
○ＬＡＣＥは重量モル浸透圧濃度に寄与するので、各配合物毎に要求される重量モル浸透圧濃度を達成するためにグリセロール濃度を変化させることになる。
【０１２９】
Ｉ．総括：最終調整した組成物
【０１３０】
【表９】
2019534864.tif 000012
【０１３１】
ＩＩ．実験の詳細：
Ａ．グリセロール含有偽薬
一連の偽薬を調製した。偽薬及び続いて調製したＬＡＣＥ含有溶液は全て、様々な量のグリセロールと一緒に、次に示すものを含む：
・アラニン０．５％（５ｍｇ／ｇ）
・塩化ベンザルコニウム０．００５％（０．０５ｍｇ／ｇ）
・ｐＨを４．５に調整するための少量の１Ｎ  水酸化ナトリウム、１Ｎ  塩酸
・吸入用水（Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）（最終重量にするために添加）
【０１３２】
【表１０】
2019534864.tif 000013
【０１３３】
Ｂ．ＬＡＣＥ含有配合物
図１２Ｃに示す標準曲線と、ＬＡＣＥ１％当たり４４〜５５ｍＯｓｍ／ｋｇ（平均４８ｍＯｓｍ／ｋｇ）の増加を示した配合データとに基づき、ＬＡＣＥの実際の浸透圧への寄与を確認するために一連の溶液を調製した。標的の全体の重量モル浸透圧濃度を３００ｍＯｓｍ／ｋｇとした。
【０１３４】
【表１１】
2019534864.tif 000014
【０１３５】
これらのデータは、重量モル浸透圧濃度に対するＬＡＣＥの効果が予想よりも幾分高く、１％当たり５７〜６０ｍＯｓｍ／ｋｇ程度であったことを示している。これに従い、ＬＡＣＥを含まない溶液の標的重量モル浸透圧濃度を僅かに変化させ、つまり標的グリセロール含有量を変化させることにより網羅的な（ｆｕｌｌ）一連の溶液を調製した。全ての溶液は、偽薬に使用したものと同一のアラニン／塩化ベンザルコニウム（ｐＨ４．５）の原液を使用して調製し、したがって、最終組成物は全て次に示すものを含んでいた：
○アラニン０．５％（５ｍｇ／ｇ）
○塩化ベンザルコニウム０．００５％（０．０５ｍｇ／ｇ）
○ｐＨを４．５に調整するための少量の１Ｎ水酸化ナトリウム、１Ｎ塩酸
○吸入用水（各配合物の最終重量が５．０ｇになるように添加）
【０１３６】
【表１２】
2019534864.tif 000015
【０１３７】
Ｃ．滅菌調製物
これらの実験結果に基づき、次に示す標的組成を有する配合物の濾過滅菌した１０．０ｇのバッチをそれぞれ調製し、滅菌済の点眼ボトルに包装した（ボトル当たり２ｍＬ）：
【０１３８】
【表１３】
2019534864.tif 000016
【０１３９】
実施例８
ＬＡＣＥ塩化物の医薬組成物の調製方法
ＬＡＣＥ医薬組成物の調製方法を次に示す：
○室温でバッチの重量の８０％の注射用水（Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＷＦＩ）をガラス製配合容器に加える。酸素が≦１０ｐｐｍ（：Ｓ１０ｐｐｍ）になるように水中に窒素を通気する。
○アラニン、グリセリン、及びＢＡＫを段階的に加え、溶解するまで混合する。
○ＨＣｌ又はＮａＯＨでｐＨを４．４〜４．６に調整する。
○窒素中、ＬＡＣＥを乳鉢及び乳棒で粉砕することにより凝集塊をなくし、かき混ぜながらゆっくりと加える。
〇脱酸素処理した注射用水をバッチの最終標的重量に到達するまで加える。
〇確実に完全に分散及び溶解させるためにバッチを合計８時間かき混ぜる。
〇必要であれば、ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨを４．４〜４．６に調整することができる。
〇必要であれば、グリセロールで重量モル浸透圧濃度を２９０〜３１０に調整することができる。
〇８時間混合した後、ＥＶ０６のバルク製剤の溶液を、ｃａｐｓｕｌｅ  ＳＨＣ  ０．５／０．２μｍ滅菌用フィルタで濾過滅菌し、保存バッグに移す。
〇保存バッグ内のバルク製剤溶液を冷蔵又は氷浴内で５℃に維持する。
〇フィルタの完全性を確認するために濾過膜バブルポイント試験を行う。
〇濾過滅菌したバルク溶液をクラス１００のルームに無菌的に移送し、滅菌済ボトルに充填する。
〇窒素置換して滅菌済チップ及びキャップをボトルに取り付ける。
〇密閉したボトルをトレイに移し、窒素通気したバッグに収容し、５℃の保管場所に速やかに移送する。
【０１４０】
実施例９
ＬＡＣＥ塩化物配合物の安定性試験
先の試作配合物はエデト酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムを０．０１％含むものであった。これらの製剤添加物を含む及び含まない場合の安定性試験を実施したところ、エデト酸ナトリウムはＬＡＣＥを安定化させないことが示された。過剰の塩化ベンザルコニウムが存在することにより薬物が僅かに不安定化した。したがって、最終配合物はエデト酸ナトリウムを含まず、塩化ベンザルコニウム０．００５％を含むものとした。微生物試験を行ったところ、現行の配合物組成における０．００４％塩化ベンザルコニウムは製剤の防腐剤として有効であることが示された。
【０１４１】
薬物配合物を更に安定化させるための試みにおいて、ボトルに詰めたＥＶ０６点眼液を、ジップロック式の水蒸気不透過性金属箔製小袋（ｆｏｉｌ  ｐｏｕｃｈ）に入れた脱酸素剤小包の存在下及び非存在下に、中規模のＲ＆Ｄバッチにて体系的な安定性試験（５℃、２５℃、及び４０℃）を実施した。製品のボトルを、繰り返し開閉可能な金属箔製小袋内に脱酸素剤小包と一緒に入れて密閉し、５℃で保管したところ、１２ヵ月間安定であることが示された。
【０１４２】
環境中酸素への曝露及び非冷蔵条件に起因する劣化に対し最終配合物を安定化させるための開発プロセスを通して更なる対策を実施した。原薬の取扱いは窒素下（酸素を排除し、水分を最小限に抑える）に行い、酸素への曝露を最小限に抑えるために窒素雰囲気下（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｌａｎｋｅｔ）で配合を実施した。配合後、製品を水蒸気不透過性の保存バッグに充填し、その後、ボトル詰めが行われるまで冷蔵条件下に保管した。バルク溶液を含む保存バッグは充填時は低温に維持する。酸素曝露を最小限に抑えるため、各ボトルの薬物溶液上に窒素雰囲気を導入する。
【０１４３】
【表１４】
2019534864.tif 000017
【０１４４】
実施例１０
ＬＡＣＥヨウ化物のミセル化を阻害するための配合試験
実験概要：
塩化ナトリウムを既存のＬＡＣＥヨウ化物配合物に添加するか又は塩化ナトリウムを含む溶液を用いてＡＰＩであるＬＡＣＥヨウ化物を溶解するかのどちらの実験においても、「会合性化学種」のピークは大きく低下しなかった。
【０１４５】
水性媒体を添加する前にＡＰＩを懸濁させるためにエタノール又はプロピレングリコール等の共溶媒を使用する実験において、会合性化学種の比率がかなり低下した。有機溶媒を既存の配合物に添加した場合も、程度は小さいが、会合性化学種のピークが低下した。
【０１４６】
この結果は、会合性化学種を制御する手段として、ＬＡＣＥ分子間の疎水性相互作用を邪魔することができる配合戦略を示すものである。
【０１４７】
背景
ＬＡＣＥヨウ化物を用いて調製した様々な配合のバッチにおいて本発明者らがＲＰ−ＨＰＬＣによって観測した、ＡＰＩのうち高比率を占める「会合性化学種」は、ミセル状凝集体であると考えられている。その根拠の一部は、ＬＡＣＥ分子が界面活性剤様構造を有することと、ＬＡＣＥ塩化物の場合は、この化学種が希釈又は更なる攪拌によって消散させることが可能であることとにある。
【０１４８】
塩化ナトリウムはミセルを崩壊させることが文献から知られている。したがって、塩化ナトリウムを添加するか、又は他の機構（例えば、疎水性相互作用）によって会合性化学種を崩壊させることが期待される他の成分を添加することにより、この「会合性化学種」を消散させることができるか否かについて一連の実験を行った。
【０１４９】
結果
この仮説に関する最初の試験として、大きな「会合性化学種」のピークを示すことが知られている既存の配合物（バッチＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−１５）を、様々な量の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む溶液と混合した。最終的な希釈されたＬＡＣＥ濃度は、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に適した水準になるようにした（ＬＡＣＥヨウ化物１２．８ｍｇ／ｍＬ）。
【０１５０】
表１０に、この一連の実験の重要な結果を示すが、塩（ＮａＣｌ）の量が、眼内で許容でき得る量をはるかに超えてさえも（重量モル浸透圧濃度が非常に高いことによる）、会合性化学種の量は時間が経過しても大きく変化しなかった。
【０１５１】
配合物をアセトニトリルで同じ最終ＬＡＣＥヨウ化物濃度まで希釈し、アセトニトリルを全体の約３３％にすると、会合性化学種の量がある程度低下し、３６〜４０％の範囲から４時間で２６％になった。
【０１５２】
【表１５】
2019534864.tif 000018
【０１５３】
次の一連の実験において、ＡＰＩであるＬＡＣＥヨウ化物を様々な方法で溶解し、これらの条件が初期の会合性化学種の生成を阻止することができ、したがって、化学種を時間と共に更に成長させる種を消滅させることができるか否かを確認した。試験を行った条件を次に示す。
【０１５４】
ＮａＣｌ  １．８％を含むｐＨ４．５の緩衝液（アラニン０．５％、ＢＡＫ  ０．００５％）中に溶解。
【０１５５】
エタノールに溶解。ＡＰＩは未希釈のエタノールには溶解せず、懸濁液が生成した。約２２体積％の水性緩衝液（ｐＨ４．５）を加えると、若干加熱して３７℃にすることによりＡＰＩがほぼ完全に溶解した。
【０１５６】
プロピレングリコールに溶解／懸濁させた後、水性緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解。最初にプロピレングリコールを加え、最終溶液の１０重量％を占めるようにした。
【０１５７】
ＮａＣｌ  ０．６％及びプロピレングリコール（ＰＧ）１．５％を含むｐＨ４．５の緩衝液に溶解。この目的は、電荷−電荷相互作用の崩壊（ＮａＣｌによる）及び疎水性相互作用の崩壊（ＰＧによる）が相乗効果を示すか否かを、それぞれの濃度を重量モル浸透圧濃度という観点で妥当であろう濃度として試験することにあった。
【０１５８】
表１０に示すように、他の溶解実験と比較して、エタノール及びプロピレングリコールを用いた実験では、Ｔ＝０において存在する会合性化学種を消滅させるか又は大幅に低下させることに成功した。ＡＰＩを溶液に添加する配合操作ではなく、溶液をＡＰＩ粉末に添加したことが、これらの幾つかの場合においてＴ＝０が高かったことの説明となり得るが、配合したバッチを調製した当日ではなかったことに留意されたい。
【０１５９】
【表１６】
2019534864.tif 000019
【０１６０】
実施例１１
ＬＡＣＥヨウ化物のミセル化を崩壊させるためのシクロデキストリンを用いた配合試験
仮説
ＬＡＣＥ分子間の疎水性相互作用を邪魔する製剤添加物を含有させることにより会合性化学種を軽減することができる。
【０１６１】
ポリプロピレングリコール、Ｄｅｘｏｌｖｅ−７（スルホブチルエーテル−ベータ−シクロデキストリン）、又はヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを含む配合物を調製し、会合性化学種及び関連物質を分析した。
【０１６２】
【表１７】
2019534864.tif 000020
【０１６３】
実施例１２
ＨＰ−β−ＣＤ／Ｌａｃｅヨウ化物配合物中における安定性の向上
これらの実験は、ＨＰ−β−ＣＤ／Ｌａｃｅヨウ化物配合物により達成される安定性の向上をＨＰ−β−ＣＤ非含有／Ｌａｃｅヨウ化物配合物と比較して示すものである。
【０１６４】
実験番号１
ＬＡＣＥヨウ化物を３％含み、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）を含む（ＨＰβＣＤ１６．１％）か又は含まないいずれかの配合物を１０ｇ程度調製した。両方の配合物はアラニン０．５％、ｐＨ４．５、塩化ベンザルコニウム５０ｐｐｍ、及び重量モル浸透圧濃度調整用のグリセロールを含むものとし、全ての溶液をｐＨ４．２〜４．５とした。ＨＰ−β−ＣＤを含む配合物においては、シクロデキストリンをＬＡＣＥ濃度に対し１．５：１のモル比で存在させた。配合物を０．２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過し、各配合物５ｍＬを１０ｍＬ容のＬＤＰＥ製点眼ボトルに充填した後、窒素雰囲気下に滴下ノズルを挿入し、ボトルをキャップで閉じた。充填時に点眼ボトルを不透過性小袋に装入しなかった。
【０１６５】
２種類の配合物を含む点眼ボトルを２５℃の恒温インキュベーター内で保管し、各時間点で関連物質分析（ＨＰＬＣによる）用に０．５ｍＬ（約１０滴）を採取した。窒素雰囲気の補充は行わなかったので、採取を行う度にある程度の空気がボトルに流入した。この実験は、酸素から保護せずに連続的に試料採取を行った場合の室温（２５±０．１℃）下における安定性に関する初期調査であった。
【０１６６】
図１８は、２５℃で２０日間試料採取を繰り返す間に酸化されたＬＡＣＥ化学種が増加する時間経過を示すものである（正方形：ＬＡＣＥ−Ｉ  ３％配合物、ＨＰ−β−ＣＤ  １６．１％；菱形：ＬＡＣＥ−Ｉ  ３％配合物、ＨＰ−β−ＣＤ非含有）。試料を採取する時間点はＴ＝０、１日後、２日後、８日後、１２日後、及び１７日後とした。）
【０１６７】
これらのデータ（図１８及び図１９）は、シクロデキストリンが、ＬＡＣＥを酸化に対し、初期（その結果として、調製時点で酸化されたＡＰＩの量がより少なくなる）及び加速的ストレス条件下（存在する酸素の量が増加する）の両方において保護したことを示している。ＨＰ−β−ＣＤを含む配合物は、これらの条件下で１７日間を通して不純物の合計量（リポ酸を含まない）が規格である≦２．０％を維持していた。２０日後のリポ酸の濃度は約０．２０％であった。
【０１６８】
実施例１３
ＬＡＣＥ塩化物の臨床用配合物及びＬＡＣＥヨウ化物ＨＰ−β−ＣＤの比較試験
臨床用ＬＡＣＥ塩化物及び試作品であるＬＡＣＥヨウ化物配合物（ＨＰ−β−ＣＤ対ＬＡＣＥのモル比１：１）の両方の安定性試験を行うために、配合物を濾過し、ＬＤＰＥ点眼ボトルに充填し、窒素雰囲気にした後、脱酸素剤を含む不透過性金属箔製小袋に装入した。開始時点ではある程度の酸素が依然として小袋内に存在していると思われる。しかしながら、Ｔ＝０の後の最初の時間点以降は、酸化されたＬＡＣＥ化学種の増加は高温下でさえも停止した。これは残存酸素が枯渇したためと考えられる（図２０）。酸化したＬＡＣＥ塩化物の化学種の増加速度は２５℃の方が５℃よりも僅かに高かったが、大きな差ではない。
【０１６９】
ＨＰ−β−ＣＤを含む試作品であるＬＡＣＥヨウ化物配合物は、ＡＰＩ溶解時に窒素雰囲気にしなかったにも拘わらず、開始時点における酸化ＬＡＣＥの量がより少なかった（ＬＡＣＥヨウ化物では約０．１１％、これに対しＬＡＣＥ塩化物では０．３％）。臨床用ＬＡＣＥ塩化物配合物の場合は、溶液を脱酸素処理し、溶解時も窒素雰囲気を維持した。
【０１７０】
更に、試作品であるＬＡＣＥヨウ化物配合物を窒素雰囲気下に小袋に装入すると、酸化ＬＡＣＥ全体の比率の上昇が非常に小さくなり、横這いになった。どちらの配合物も初期の上昇の度合いは温度に依存していた。したがって、各配合物の活性化エネルギーを、アレニウスモデルを用いて概算することができる。ＨＰ−β−ＣＤを含む試作品ＬＡＣＥヨウ化物配合物の活性化エネルギーは、基本となるＬＡＣＥ−Ｃｌ配合物の３倍を超え（図２１）、ＨＰ−β−ＣＤがＬＡＣＥを酸化に対し安定化させていることを更に示唆している。
【０１７１】
【表１８】
2019534864.tif 000021
【０１７２】
ＬＡＣＥを分解させる加水分解機構（その結果としてリポ酸が成長する）の活性化エネルギーも、安定性のデータから算出することができた（図２２）。酸化機構とは異なり、ＬＡＣＥ−Ｃｌ配合物及びＬＡＣＥ−Ｉ配合物の加水分解の活性化エネルギーは同程度であり（それぞれ６５．６ｋＪ／ｍｏｌ及び６９．４ｋＪ／ｍｏｌ）（図２１）、シクロデキストリンが加水分解に大きな影響を与えないことを示唆している。
【０１７３】
実施例１４
ＬＡＣＥ塩化物及びＬＡＣＥヨウ化物の角膜透過性試験
重大な疑問は、ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）と一緒に配合した薬物が、角膜組織を十分に透過し、角膜エステラーゼに到達して有効薬物であるリポ酸を放出することができるかどうかであった。先に述べたように、リポ酸はこの適応症：即ち老視に有効な薬物である。
【０１７４】
次に示す実験により：（ａ）異なる濃度のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）を含むＬＡＣＥヨウ化物配合物を用いた、仔ウシ角膜に対するリポ酸コリンエステル（ＬＡＣＥ）の透過性、及び（ｂ）ＬＡＣＥ塩化物対ＬＡＣＥヨウ化物の相対的な透過性、を試験した。実験は図２３に示すフランツ拡散セル装置を用いて実施した。
【０１７５】
これらの配合物からＬＡＣＥを２種類の塩：ＬＡＣＥ塩化物及びＬＡＣＥヨウ化物の一方として送達する。ＬＡＣＥはプロドラッグであり、角膜バリアを通過して輸送された後、眼内エステラーゼの作用及び生理学的条件下における薬物化合物の受動的（ｐａｓｓｉｖｅ）加水分解によって有効薬物であるリポ酸に加水分解される。したがって、透過性を評価するために、ＬＡＣＥ及びリポ酸の両方の濃度を各時間点で分析した。
【０１７６】
【表１９】
2019534864.tif 000022
【０１７７】
手順：
ａ．無菌のクリーンベンチ内で仔ウシの眼球６個を切開する。
ｂ．眼球から角膜を摘出し、無菌２回蒸留水で手短に濯ぎ、無菌培養皿内で、グルタチオン緩衝液（０．１％グルタチオン、酸化型、６ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７、濾過滅菌済）３ｍＬに浸す。
ｃ．角膜を５℃に維持し、切除後２４時間以内に使用する。
ｄ．６個の５ｍＬ容の垂直型フランツ拡散セルを蒸留水及びイソプロパノールで洗浄し、組み立てる前にクリーンベンチ内で風乾させる。
ｅ．小型のスターラーバーをレセプター液チャンバ内に装入する。レセプター液（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、濾過滅菌済）用のボトルを化学天秤で風袋を秤量し、４．５ｍＬを各フランツセルに加える。開始時のレセプター液の正確な重量を記録する。
ｆ．角膜からグルタチオン緩衝液をレセプター液で丁寧に洗い流し、ドナー側の台座（ｐｅｄｅｓｔａｌ）に載せる。ドナー側チャンバを角膜に載せ、組立体全体を金属クリップで台座に固定する。この時点で試料採取用アームからレセプター液０．５ｍＬを、流体の高さがアームの黒い目印の線に到達するまで追加する。この追加分の重量も記録する。
ｇ．フランツ拡散装置を加熱装置に接続し、温度を３７℃に昇温する。この温度に到達したら、配合物（「ドナー液」）をドナー側チャンバに加える。
ｈ．ドナー液０．２ｍＬを加える。ドナー側チャンバ及び試料採取用アームは、使用しないときは蒸発を防ぐために両方共パラフィルムで覆っておく。
ｉ．試料採取はＤｒｕｍｍｏｎｄピペットを介して試料採取アームのみから行う。各時間点において各セルからレセプター液を２００〜３００μＬ採取する。
ｊ．試料を０．３ｍＬのガラス製インサートを有する褐色ガラス製ＨＰＬＣバイアル瓶に加えて秤量する。試料採取アームから抜き取った分を新たなレセプター液で補充する。
ｋ．試料を採取する際は、レセプター側チャンバに気泡が混入しないよう、液面の高さが試料採取アームの付け根よりも低くならないようにした。２回の時間点の間に液が大量に蒸発したら、試料採取前に継ぎ足してそれを記録し、試料採取は通常通り行った。
ｌ．試料はＨＰＬＣ分析を行うまで５℃で保管した。
ｍ．角膜をビーズミルでホモジナイズすることにより抽出した。
【０１７８】
試験１：この試験の目的は、ＬＡＣＥの角膜通過に対するＨＰ−β−ＣＤの効果を評価するために、ＬＡＣＥヨウ化物１．９２％を含むＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３３の透過性を、ＥＣＶ−２３Ａｐｒｉｌ１５−１１２−０８，Ｄｅｍｏ  ＃６（Ｆｒｏｎｔａｇｅ、ＬＡＣＥ塩化物１．５％）と比較することにある。ＬＡＣＥ−Ｉ及びＬＡＣＥ−Ｃｌの分子量の差を考慮し、ＬＡＣＥ濃度を等しくした。したがって、ＬＡＣＥ塩化物１．５％配合物はＬＡＣＥヨウ化物１．９２％配合物に相当する。この実験にエステラーゼ阻害剤は使用しなかった。
【０１７９】
試験１の結果（図２４及び図２５）は、透過した製剤の大部分は、回収時点よりも前に、角膜通過中又はレセプター液中でＬＡＣＥが加水分解されて生成したリポ酸であったことを示している。ＬＡＣＥヨウ化物配合物の場合、透過した化学種はほとんど全てがリポ酸であり、ＬＡＣＥ塩化物配合物の場合は若干多めの分解していないＬＡＣＥが透過した。これはある程度予測されていたことであり、その理由は、ＬＡＣＥヨウ化物分子のイオンサイズ及び分子量がＬＡＣＥ塩化物分子よりも大きいため、角膜中の滞留時間がより長くなる可能性があり、リポ酸に加水分解される程度がより高くなることにある。透過液はそれぞれ試料採取時に回収した直後に分析した。透過した薬物全体の比率はＬＡＣＥ−Ｉ含有配合物及びＬＡＣＥ−Ｃｌ含有配合物間で同程度であり、５〜７％（ＬＡＣＥ−Ｉの場合の極端に透過性が高かったものを除く）であった。
【０１８０】
試験２：この試験の目的は、ＬＡＣＥ−Ｉ濃度の異なる２種類のＬＡＣＥ−Ｉ配合物の透過性を評価することにあった：ＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３６（ＬＡＣＥヨウ化物３％／ＨＰ−β−ＣＤ  １０．７％）及びＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３９（Ｌａｃｅヨウ化物４．５％／ＨＰ−β−ＣＤ１６．１％）（図２６及び図２７）。
【０１８１】
試験２の結果は、レセプター液中に存在していた透過した薬物のほとんどはそのリポ酸形態であったが、先の試験よりも薬物濃度が高かったにも拘わらず、リポ酸濃度が低かったことを示している。薬物のかなりの部分が角膜組織内に含まれており、これは、この試験に利用したウシ角膜切片の厚みがより厚かった（試験２は約１．５〜１．８ｍｍ、試験１は約０．６〜０．８ｍｍ）ことに起因する。リポ酸の総量の１〜５％の範囲が角膜組織から抽出され、ＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３６（ＬＡＣＥ−Ｉ  ３．０％／ＨＰ−β−ＣＤ  １０．７％）に曝された角膜から平均３．４％、ＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３９（ＬＡＣＥ−Ｉ  ４．５％／ＨＰ−β−ＣＤ  １６．１％）に曝された角膜から平均２．５％が抽出された。
【０１８２】
試験３：この試験では、ＨＰ−β−ＣＤを含むＬＡＣＥヨウ化物配合物及びＨＰ−β−ＣＤを含まないＬＡＣＥ塩化物配合物の透過性を調査した。この試験の目的は、先の試験２で得られたデータをベースとし、角膜層の透過にＬＡＣＥ濃度が支障を来すか否かを更に見極めるために、ＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３９（ＬＡＣＥ−Ｉ  ４．５％／ＨＰ−β−ＣＤ  １６．１％）及びＥＣＶ−２３Ａｐｒｉｌ１５−１１２−０８（ＬＡＣＥ−Ｃｌ  １．５％、ＨＰ−β−ＣＤなし）のＬＡＣＥ角膜透過性の差を検証することにあった。
【０１８３】
接触していた角膜切片からのＬＡＣＥ／ＬＡの抽出はビーズミルによるホモジナイゼーションにより行った。試験の結論としては、ＡＣ−ＬＡＣＥ−０３−３９（ＬＡＣＥ−Ｉ  ４．５％／ＨＰ−β−ＣＤ  １６．１％）に曝された角膜組織中に認められたリポ酸の質量の方が多いことが分かったが、送達されたＡＰＩ濃度の増加と比較して、角膜内の濃度の増加ははるかに小さかった（図２８及び図２９）。したがって、最も高い投与量である４．５％のＬＡＣＥ−Ｉは薬物の透過という観点では大きな利点をもたらさない可能性がある。
【０１８４】
試験４：この試験は、ＬＡＣＥ塩を一定に維持したまま、ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリンが透過性に与える影響を比較するものである。この試験においては、試験対象（ｃｏｈｏｒｔ）を両方共ＬＡＣＥヨウ化物とした。
【０１８５】
配合物はＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−３２（ＬＡＣＥ−Ｉ  １．９２％、ＨＰ−β−ＣＤなし）及びＡＣ−ＬＡＣＥ−０５−２１Ｂ（ＬＡＣＥ−Ｉ  １．９２％、１モル当量のＨＰ−β−ＣＤ（７．４％））とした。この試験の目的は２通りあった。第１の目的は濃度の等しい２種類のＬＡＣＥ−Ｉ溶液を直接比較し、ＨＰ−β−ＣＤの透過性への影響を直接検証することにあった。第２の目的は、角膜組織内における製剤の保持にＨＰ−β−ＣＤが与える影響を検証することにあった。
【０１８６】
この試験のデータは、ＨＰ−β−ＣＤが薬物の角膜内保持に影響を与えないことを示唆しており、両方の配合物で、合計して平均７％のＬＡ（リポ酸）が角膜切片から抽出された（図３０及び図３１）。
【０１８７】
角膜層を超えて透過するという観点では、ＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−３２に使用した３種の角膜全てにおいて、４〜６時間で透過が進行したが、一方、ＡＣ−ＬＡＣＥ−０５−２１Ｂに使用した角膜は１種のみが４時間の時点で透過を開始した。しかしながら、２８時間後の製剤の平均透過量は同程度であり、ＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−３２ではＬＡの合計量が１２．６７±５．６２％であり、ＡＣ−ＬＡＣＥ−５−２１ＢではＬＡの合計量が１１．２７±９．７８％であった。角膜から抽出された濃度が同程度であったのみならず、２８時間後の平均透過量が同程度であったことは、角膜組織へのＬＡＣＥ−Ｉの侵入にＨＰ−β−ＣＤが支障を来さないことを示している。
【０１８８】
全てのデータを総合して分析すると、ＬＡＣＥヨウ化物を、分子サイズがより大きいことや送達系（ＨＰ−β−ＣＤ）に起因して輸送が妨げられることなく、眼表面に投与することが可能であることを示している。更に、試験結果は、調査を行った全ての濃度において角膜を通じてＬＡＣＥの輸送が効率的に行われることを示している。更に、ＬＡＣＥヨウ化物／ＨＰ−β−ＣＤ濃度の割にレセプター液中のリポ酸濃度が高いことは、角膜エステラーゼによりＬＡＣＥがリポ酸に変換されたことを示している。これとは対照的に、ＬＡＣＥ塩化物は、リポ酸及びＬＡＣＥの混合物がより多く、これは分子量がより低いことに起因する可能性がある。
【０１８９】
実施例１５
ＬＡＣＥ−Ｉ：ＨＰ−β−ＣＤのモル比に応じた会合性化学種
先の実験は、ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）が、水溶液中におけるＬＡＣＥ−Ｉのミセル化を阻害することができることを示していた。これらの実験から、ＬＡＣＥヨウ化物対ヒドロキシプロピルベータシクロデキストリンのモル比（熱力学的に安定な包接複合体を生成するのに必要なＨＰ−β−ＣＤを決定する。
【化２】
2019534864.tif 000023
【０１９０】
この手法は、ＨＰ−β−ＣＤ内にＬＡＣＥヨウ化物の完全な包接複合体を生成し、それによってＬＡＣＥ分子が凝集する機会を阻止するものである。ＬＡＣＥヨウ化物対ＨＰ−β−ＣＤのモル比を変化させて数種の配合物のバッチを調製し、凝集性化学種の経時的な成長を分析した。配合物は５℃で保管した。逆相ＨＰＬＣにより会合性化学種の生成を測定し、次いで主ＬＡＣＥピーク面積に対する面積百分率を記録した。
【０１９１】
ＬＡＣＥ−Ｉ及びＨＰ−β−ＣＤの濃度が少なくとも１対１モル当量であった場合（図３２に示すように）、会合性化学種の生成を阻止することができたという結果が確認された。
【０１９２】
実施例１６
凝集性化学種及びＩｎ−Ｖｉｖｏ眼刺激の相関関係
実施例１６ではｉｎ−ｖｉｖｏモデル（ウサギＤｒａｉｚｅモデル）において会合性化学種の濃度と眼刺激との相関関係を確認した。データはＬＡＣＥヨウ化物：ＨＰ−β−ＣＤのモル当量の比が１：１又は１：１．５であった場合に、刺激スコアの平均が０〜０．５を達成することができたことを示している。
【０１９３】
【表２０】
2019534864.tif 000024
【０１９４】
【表２１】
2019534864.tif 000025
【０１９５】
【表２２】
2019534864.tif 000026
【０１９６】
・試料採取を繰り返したため、及び／又は保管条件（脱酸素剤を含む金属箔製小袋不使用）のため、この配合物はある程度の酸化的分解が起こった。
・会合性化学種が増加したため（５℃で１ヵ月間）、重量モル浸透圧濃度は低下した。
【０１９７】
【表２３】
2019534864.tif 000027
【０１９８】
補足
・繰り返しの操作にも拘わらず、このロットでは関連物質は増加しなかった。
・これは、同時に同一保管条件下で安定性試験にも付したＦＫ−ＬＡＣＥ−０２−３２バッチ（シクロデキストリンなし）と好都合に比較され、酸化したＬＡＣＥ不純物は５℃及び２５℃の両方でより多く増加したことを示している。
・この比較はシクロデキストリンがＬＡＣＥ分子を酸化からある程度保護する可能性を示唆している。
【０１９９】
【表２４】
2019534864.tif 000028
【０２００】
【表２５】
2019534864.tif 000029
【０２０１】
【表２６】
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【０２０２】
【表２７】
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【０２０３】
【表２８】
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【０２０４】
【表２９】
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【０２０５】
【表３０】
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【０２０６】
【表３１】
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【０２０７】
【表３２】
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【０２０８】
【表３３】
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【０２０９】
【表３４】
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【０２１０】
【表３５】
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【０２１１】
【表３６】
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【０２１２】
【表３７】
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【０２１３】
【表３８】
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【０２１４】
【表３９】
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【０２１５】
【表４０】
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【０２１６】
【表４１】
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【０２１７】
実施例１９
ＬＡＣＥヨウ化物製剤溶液を配合する方法
一般的なプロセス手順
ＬＡＣＥ−Ｉ／ＨＰｂＣＤ（ＨＰＭＣなし）
１．ビーカーに、順に：ＷＦＩ、アラニン、グリセロール、ＨＰ−β−ＣＤ、及び塩化ベンザルコニウム溶液（ＷＦＩ中ＢＡＫ０．００５ｇ／ｍＬ）を加える。
２．ビーカーにマグネチックスターラーを装入し、製剤添加物を合一する。
３．１ＮのＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ４．５に調整する。
４．ビーカーを、２５℃に設定された加熱／冷却水循環装置に接続されたジャケット付き槽内に装入する（熱を伝導するために蒸留水をジャケット付き槽に加える）。Ｓｃｉｌｏｇｉｘ攪拌翼を沈めて約５００ＲＰＭで攪拌する。
５．攪拌しながらＡＰＩを少量ずつ加える。ＡＰＩの添加が終了したら、配合物を４５〜６０分間攪拌して確実に完全に溶解させる。
６．ビーカーを混合装置から取り出して秤量する。蒸発分を補うためにＷＦＩを加える。
７．配合物を濾過する（０．２μＭ  ＰＶＤＦ）。
【０２１８】
ＬＡＣＥ−Ｉ及び０．２３％  ＨＰＭＣ（２種類の溶解プロセス）
Ａ．溶液１：ヒプロメロース２９１０  １．１６％（ｗ／ｗ）のＷＦＩ溶液
１．ビーカーにＷＦＩを加える。
２．ビーカーを９０℃に設定された加熱／冷却水循環装置に接続されたジャケット付き槽内に装入する（熱を伝導するために蒸留水をジャケット付き槽に加える）。Ｓｃｉｌｏｇｉｘ攪拌翼を沈めて約４００ＲＰＭで攪拌する。
３．ＷＦＩが≧（２：）７０℃に到達したら、ヒプロメロース２９１０の添加を開始して分散させる。攪拌速度を６５０ＲＰＭに上昇する。
４．ＨＰＭＣを全て添加したら、加熱／冷却水循環装置の温度を１０℃に低下し、攪拌を継続する。
５．溶液が冷却され、透明かつ粘性を示すようになったら、ビーカーを攪拌装置から取り出して秤量する。蒸発分を補うためにＷＦＩを加える。
【０２１９】
Ｂ．溶液２：ＬＡＣＥ配合物（ＨＰＭＣなし）
１．ビーカーに、順に：ＷＦＩ、アラニン、グリセロール、ＨＰ−β−ＣＤを加える。
２．ビーカーを、２５℃に設定された加熱／冷却水循環装置に接続されたジャケット付き槽内に装入する（熱を伝導するために蒸留水をジャケット付き槽に加える）。Ｓｃｉｌｏｇｉｘ攪拌翼を沈めて約５００ＲＰＭで攪拌する。
３．ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで４．１８に調整する。
４．攪拌しながらＡＰＩを少量ずつ加える。ＡＰＩの添加が終了したら、配合物を４５〜６０分間攪拌して確実に完全に溶解させる。
５．ＢＡＫ溶液（ＷＦＩ中ＢＡＫ０．００５ｇ／ｍＬ）を加える。
６．ビーカーを攪拌装置から取り出して秤量する。蒸発分を補うためにＷＦＩを加える。
７．必要であればｐＨを調整する。
【０２２０】
Ｃ．溶液１及び２の合一
１．指定量の溶液１をビーカーに秤り取る。
２．ビーカーを、２５℃に設定された加熱／冷却水循環装置に接続されたジャケット付き槽内に装入する（熱を伝導するために蒸留水をジャケット付き槽に加える）。Ｓｃｉｌｏｇｉｘ攪拌翼を沈めて約１３０ＲＰＭで攪拌する。
３．攪拌しながら溶液２を溶液１に加える。
４．ビーカーを攪拌装置から取り出す。
５．０．２μＭ  ＰＶＤＦフィルタを使用して濾過滅菌する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
2019534864.tif 000050
【図５−２】
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【図６】
2019534864.tif 000052
【図７】
2019534864.tif 000053
【図８】
2019534864.tif 000054
【図９】
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【図１０】
2019534864.tif 000056
【図１１】
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【図１２−１】
2019534864.tif 000058
【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
2019534864.tif 000061
【図１３−２】
2019534864.tif 000062
【図１３−３】
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【図１４】
2019534864.tif 000064
【図１５】
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【図１６】
2019534864.tif 000066
【図１７】
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【図１８】
2019534864.tif 000068
【図１９】
2019534864.tif 000069
【図２０】
2019534864.tif 000070
【図２１】
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【図２２】
2019534864.tif 000072
【図２３】
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【図２４】
2019534864.tif 000074
【図２５】
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【図２６】
2019534864.tif 000076
【図２７】
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【図２８】
2019534864.tif 000078
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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