(57)【要約】本発明は、ヒトDR5抗原に特異的に結合する単一特異性または二重特異性抗体分子に関する。本発明は特に、DR5シグナル伝達、アポトーシスおよび細胞死の誘導をもたらす細胞表面抗原結合後のIgG分子のクラスタ化を増強する、Fc領域における変異を有するIgG1アイソタイプのDR5特異的抗体分子に関する。本発明はさらに、DR5上の異なるエピトープに結合する抗体分子の組み合わせに関する。本発明はまた、これらの分子を含有する薬学的組成物およびこれらの組成物を用いたがんの処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンIgGのFc領域とヒトDR5に結合する抗原結合領域とを含む抗体であって、Fc領域が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異を含む、抗体。
【請求項２】
Fc領域が、E430G、E345K、E430S、E430F、E430T、E345Q、E345R、E345Y、S440WまたはS440Yより選択される変異を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
Fc領域が、E430GまたはE345Kより選択される変異を含む、請求項1または2記載の抗体。
【請求項４】
Fc領域が、K439EまたはS440Kより選択される変異をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
抗原結合領域が、SEQ ID NO:46のアミノ酸残基116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするヒトDR5上のエピトープに結合する、前記請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
抗原結合領域が、SEQ ID NO:46のアミノ酸残基79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするヒトDR5上のエピトープに結合する、前記請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
抗原結合領域が、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む、前記請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14;
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、22; または
(e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(d)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。
【請求項８】
抗原結合領域が、以下のアミノ酸配列を有する可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む、前記請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体:
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23;
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23; または
(f) 該(VH)および(VL)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(e)のいずれか1つに定義される(VH)および(VL)。
【請求項９】
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgDまたはIgMアイソタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
IgG1アイソタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
IgG1m(f)、IgG1m(a)、IgG1m(z)、IgG1m(x)アロタイプまたは混合アロタイプである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１２】
Fc領域が、以下の群のアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体:
(a) SEQ ID NO:29;
(b) SEQ ID NO:30;
(c) SEQ ID NO:31;
(d) SEQ ID NO:32; または
(e) 該配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(d)のいずれか1つに定義されるアミノ酸配列。
【請求項１３】
抗体が重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、LCがSEQ ID NO:39の配列を含み、かつHCが以下の配列の1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37;
(f) (HC) SEQ ID NO:38; または
(g) 該(HC)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(f)のいずれか1つに定義される(HC)。
【請求項１４】
抗体が重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、LCがSEQ ID NO:43の配列を含み、かつHCが以下の配列の1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載の抗体:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; 
(c) (HC) SEQ ID NO:42; または
(d) 該(HC)配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(c)のいずれか1つに定義される(HC)。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１６】
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１７】
アゴニストである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１８】
カスパーゼ依存性細胞死などの、標的細胞におけるプログラム細胞死を誘導する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１９】
DR5を発現する標的細胞においてアポトーシスを誘導する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２０】
細胞生存性を低減する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２１】
前記請求項のいずれか一項記載の少なくとも1つの抗体を含む、組成物。
【請求項２２】
前記請求項のいずれか一項記載の1つまたは複数の抗体を含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
前記請求項1〜20のいずれか一項に定義される第1の抗体および第2の抗体を含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２４】
第1の抗体および第2の抗体が、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
ヒトDR5に結合する第1の抗体が、ヒトDR5への第2の抗体の結合をブロックしない、前記請求項23〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6
を含み、かつ
第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14
を含む、または
第1の抗体および第2の抗体が
(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
請求項21〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6
を含み、かつ
第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14
を含む、または
第1の抗体および第2の抗体が
(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
請求項21〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
第1の抗体が以下の6つのCDR配列:
(a) (VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、6
を含み、かつ
第2の抗体が以下の6つのCDR配列:
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14
を含む、または
第1の抗体および第2の抗体が
(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
請求項21〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
第1の抗体および第2の抗体が、1:1のモル比、1:2のモル比、1:3のモル比、1:4のモル比、1:5のモル比、1:6のモル比、1:7のモル比、1:8のモル比、1:9のモル比、1:10のモル比、1:15のモル比、1:20のモル比、1:25のモル比、1:30のモル比、1:35のモル比、1:40のモル比、1:45のモル比、1:50のモル比、50:1のモル比、45:1のモル比、40:1のモル比、35:1のモル比、30:1のモル比、25:1のモル比、20:1のモル比、15:1のモル比、10:1のモル比、9:1のモル比、8:1のモル比、7:1のモル比、6:1のモル比、5:1のモル比、4:1のモル比、3:1のモル比、2:1のモル比などの、1:49〜49:1のモル比で組成物中に存在する、前記請求項23〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
第1の抗体および第2の抗体が、1:1のモル比で組成物中に存在する、前記請求項のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３１】
薬学的組成物である、前記請求項21〜30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
前記請求項1〜14および16〜20のいずれか一項記載の1つまたは複数の抗原結合領域を含む、二重特異性抗体。
【請求項３３】
前記請求項1〜14および16〜20のいずれか一項に定義される第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域を含む、請求項32記載の二重特異性抗体。
【請求項３４】
第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域が、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する、前記請求項32〜33のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項３５】
ヒトDR5に結合する第1の抗原結合領域が、ヒトDR5に結合する第2の抗原結合領域の結合をブロックしない、前記請求項32〜34のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項３６】
第1の抗原結合領域が以下の6つのCDR配列:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6
を含み、かつ
第2の抗原結合領域が以下の6つのCDR配列:
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14
を含む、または
第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域が
(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
前記請求項32〜35のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項３７】
第1の抗原結合領域が以下の6つのCDR配列:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6
を含み、かつ
第2の抗原結合領域が以下の6つのCDR配列:
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14
を含む、または
第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域が
(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
前記請求項32〜35のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項３８】
第1の抗原結合領域が以下の6つのCDR配列:
(a) (VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、22
を含み、かつ
第2の抗原結合領域が以下の6つのCDR配列:
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14
を含む、または
第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域が
(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列
を含む、
前記請求項32〜35のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項３９】
二重特異性抗体が、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含み、該第1の重鎖がヒトIgG1におけるF405Lに対応する変異を含み、かつ該第2の重鎖がヒトIgG1におけるEU付番でのK409Rに対応する変異を含む、前記請求項32〜38のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項４０】
二重特異性抗体が、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含み、該第1の重鎖がヒトIgG1におけるK409Rに対応する変異を含み、かつ該第2の重鎖がヒトIgG1におけるEU付番でのF405Lに対応する変異を含む、前記請求項32〜38のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項４１】
薬学的組成物である、前記請求項32〜40のいずれか一項記載の二重特異性抗体。
【請求項４２】
薬学的担体をさらに含む、前記請求項21〜31または41のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
医薬として使用するための、前記請求項21〜31または41〜42のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４４】
感染性疾患、自己免疫疾患または心血管奇形の処置において使用するための、前記請求項21〜31、または41〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
固形腫瘍および/または血液学的腫瘍の処置において使用するための、前記請求項21〜31または41〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
結腸直腸がん腫および結腸直腸腺がんを含む結腸直腸がん、膀胱がん、骨肉腫、軟骨肉腫、トリプルネガティブ乳がんを含む乳がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系のがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃腺がんを含む胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝細胞がんを含む肝臓がん、NSCLCおよびSCLCを含む肺がん、卵巣がん、膵管がんおよび膵臓腺がんを含む膵臓がん、肉腫、または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚がんを含む皮膚がんなどの、固形腫瘍の処置において使用するための、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
慢性リンパ球性白血病ならびに急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病を含む白血病、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの、血液学的腫瘍の処置において使用するための、請求項45記載の組成物。
【請求項４８】
DR5発現腫瘍の増殖の阻害において使用するための、前記請求項21〜31、42〜43または45〜47のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４９】
DR5発現腫瘍におけるアポトーシスの誘導において使用するための、前記請求項21〜31、42〜43または45〜47のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５０】
表1に示される1つまたは複数の配列をコードする、核酸構築物。
【請求項５１】
請求項1〜20および32〜41のいずれか一項記載の抗体をコードする、核酸構築物。
【請求項５２】
請求項50および51のいずれか一項記載の1つまたは複数の核酸構築物を含む、発現ベクター。
【請求項５３】
請求項51記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５４】
組み換え原核細胞、組み換え真核細胞または組み換え微生物宿主細胞などの、組み換え宿主細胞である、請求項53記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記請求項1〜42のいずれか一項記載の抗体または組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法。
【請求項５６】
さらなる治療剤を投与する段階をさらに含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
さらなる治療剤が、化学療法薬(パクリタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ペメトレキセドを含むが、これらに限定されない)、キナーゼ阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブまたはエベロリムスを含むが、これらに限定されない)、アポトーシス調節物質(組み換えヒトTRAILまたはビリナパントを含むが、これらに限定されない)、RAS阻害剤、プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブを含むが、これに限定されない)、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタットを含むが、これに限定されない)、栄養補助食品、サイトカイン(IFN-γを含むが、これに限定されない)、抗体または抗体模倣体(抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR抗体および抗体模倣体を含むが、これらに限定されない)、抗体-薬物コンジュゲートからなる群より選択される1つまたは複数の抗がん剤である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体または組成物がバイアルなどの1つまたは複数の容器に入っている、前記請求項1〜42のいずれか一項記載の抗体または組成物を含む、要素のキット。
【請求項５９】
前記請求項のいずれか一項記載の抗体または組成物が、治療での同時使用、別個使用または逐次使用のためのものである、請求項58記載の要素のキット。
【請求項６０】
がんの処置のための医薬の製造のための、前記請求項1〜42のいずれか一項記載の抗体または組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトDR5抗原に特異的に結合する単一特異性または二重特異性抗体分子に関する。本発明は特に、細胞表面抗原結合後のIgG分子のクラスタ化を増強する、Fc領域における変異を有するIgG1アイソタイプのDR5特異的抗体分子に関する。本発明はさらに、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する抗体分子の組み合わせに関する。本発明はまた、これらの分子を含有する薬学的組成物ならびにこれらの組成物を用いたがんおよび他の疾患の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
デス受容体5、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10B、TNFRSF10B、TNF関連アポトーシス誘導リガンド受容体2、TRAIL受容体2、TRAIL-R2およびCD262としても知られているDR5は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)に結合し、アポトーシスを媒介する、TNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。DR5は、3つの細胞外システインリッチドメイン(CRD)、膜貫通ドメイン(TM)およびデスドメイン(DD)を含む細胞質ドメインを有する、1回貫通I型膜タンパク質である。リガンドが存在しない場合、DR5は単量体として、またはプレリガンドアセンブリドメイン(PLAD)としても知られる、第1のシステインリッチドメインの相互作用を通して2つまたは3つの受容体のプレアセンブリされた複合体として、細胞膜に存在する(Wassenaar et al., Proteins. 2008 Feb 1;70(2):333-43（非特許文献1）; Valley et al., J Biol Chem. 2012 Jun 15;287(25):21265-78（非特許文献2）; Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99（非特許文献3）)。DR5細胞外ドメインと複合したTRAILの結晶構造から、TRAILが、三量体受容体および三量体リガンドを含む複合体においてDR5の細胞外ドメイン中のCRD2およびCRD3に結合することが示された(Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71（非特許文献4）)。DR5三量体は、脂質マクロドメイン、いわゆる脂質ラフト中の高次受容体凝集体へとさらにクラスタ化することができる(Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99（非特許文献3）)。リガンド結合立体配座において、細胞質デスドメイン含有アダプタータンパク質FADDは、オリゴマー化されたDR5分子の細胞内DD表面と結合し、イニシエーターカスパーゼであるカスパーゼ-8およびカスパーゼ-10と会合して、細胞死誘導シグナル伝達複合体(DISC)を形成する。
【０００３】
TRAIL媒介アポトーシスに対するがん細胞の感受性に基づき、この経路を活性化してがん細胞において選択的にアポトーシスを誘導するための多数の薬剤が開発された。ヒト組み換えTRAIL (hrTRAIL)はドゥラネルミンとして開発されており、一連の従来の(単一特異性、二価)抗DR5抗体が臨床で開発され、試験されている(Ashkenazi et al., Nat Rev Drug Discov. 2008 Dec;7(12):1001-12（非特許文献5）; Trivedi et al., Front Oncol. 2015 Apr 2;5:69（非特許文献6）において概説されている): DR5抗体にはレキサツムマブ(HGS-ETR2)、HGS-TR2J、コナツムマブ(AMG655)、チガツズマブ(CS-1008)、ドロジツマブ(Apomab)およびLBY-135が含まれる。これらの化合物を用いた臨床研究から、DR5抗体が一般的に耐容性は良好であるが、説得力のある有意な臨床的利点を示せないことが実証された。DR5を標的とする抗体の有効性を高める努力は、(i) 併用処置を通してDR5アゴニストに対するがん細胞の感受性を改善すること、(ii) より良好な患者の層別化のためのバイオマーカーを開発すること、および(iii) DR5シグナル伝達およびアポトーシス誘導をより効果的に活性化するDR5標的指向性剤の開発に主に焦点を当てている(Lim et al., Expert Opin Ther Targets. 2015 May 25:1-15（非特許文献7）; Twomey et al., Drug Resist Updat. 2015 Mar;19:13-21（非特許文献8）; Reddy et al., PLoS One. 2015 Sep 17;10(9)（非特許文献9）において概説されている)。DR5活性化を増加させるための様々な治療形式が記載されており、合成DR5結合ペプチドのオリゴマー化、DR5特異的足場の線状融合、rhTRAILまたはコナツムマブのナノ粒子に基づく送達系および多価DR5抗体に基づく形式を含む(Holland et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):185-93（非特許文献10）において概説されている)。APG880および誘導体は、ヒトIgGのFc部分に融合された2つの一本鎖TRAIL受容体結合(scTRAIL-RBD)分子(TRAIL模倣体)で存在する。各scTRAIL-RBDは3つの受容体結合部位を有し、融合タンパク質において6価結合様式を生じる(WO 2010/003766 A2（特許文献1）)。プロトタイプのscTRAIL-RBD (APG350)は、インビボでFcγR非依存性抗腫瘍効力を誘導することが記載されている(Gieffers et al., Mol Cancer Ther, 2013. 12(12): p. 2735-47（非特許文献11）)。抗DR5 scFv断片、ヒト血清アルブミン残留物(residue)およびヒトp53の四量体化ドメインの融合によってアセンブルされた4価抗DR5抗体断片由来構築物は、一価構築物よりも強力にアポトーシスを誘導することが示されている(Liu et al., Biomed Pharmacother. 2015 Mar;70:41-5（非特許文献12）)。ナノボディ分子は、scFvと同様に、多価分子を形成するために連結することができるラクダ科(camelid)重鎖のみの抗体に由来する単一ドメイン抗体断片(VHH)である。前臨床インビトロ試験により、4価抗DR5 Nanobody(登録商標)分子であるTAS266は、より迅速なカスパーゼ活性化動態に起因して、TRAILまたは架橋DR5抗体LBY-135よりも強力であることが示された(Huet et al., MAbs. 2014;6(6):1560-70（非特許文献13）)。TAS266はまた、LBY-135の親マウスmAbよりインビボで強力であった。MultYbody(商標)分子(MultYmab技術)は、ホモ多量体化ペプチドとIgGヘテロ二量体(ノブ・イントゥ・ホール)における1つの重鎖のFcとの融合に基づいており、MultYbody分子を溶液中で本質的に多価にする。抗DR5 MultYbodyはインビトロで強力な死滅化を誘導することが示された。二重親和性再標的指向性(DART)分子は、共有結合したFvに基づくダイアボディである。単一のDR5エピトープ(単エピトープDART)または2つのDR5エピトープ(二エピトープDART)に対する4価性を含む4価DR5標的指向性Fc DARTは、インビトロおよびインビボで細胞傷害性を誘導する際にTRAILおよびコナツムマブ変種よりも強力であることが示された(Li et al., AACR Annual Meeting Apr 20 2015, Poster abstract #2464（非特許文献14）)。あるいは、FcγR非依存性のアビディティー駆動DR5超クラスタ化は、がん細胞上のDR5へのおよび腫瘍微小環境中の線維芽細胞上に発現される線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)への同時結合を通して二重特異性DR5xFAP抗体(RG7386)により媒介されうる(Friess et al., AACR Annual Meeting Apr 19 2015, Presentation abstract #952（非特許文献15）; Wartha et al., Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2014 Apr 5-9; San Diego, CA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2014;74(19 Suppl):Abstract nr 4573. doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4573（非特許文献16）)。最後に、異なるエピトープを認識する2つの抗DR5抗体の特異的組み合わせは、重複エピトープまたは類似エピトープを認識する2つの抗DR5抗体の組み合わせと比較してインビトロおよびインビボでアゴニスト効力の増強を示した(WO 2014/009358（特許文献2）)。
【０００４】
上記のアプローチは、前臨床試験における従来の抗DR5抗体と比べて効力の増強を示すが、しかし臨床データから、DR5アゴニストの改善が依然として必要であることが示される。さらに、抗体に基づく形式では、通常は抗体断片に基づく構築物の場合ではない通常のIgGの薬物動態(PK)および他のFc媒介エフェクター機能を保存することが望ましい。改善された特性を有するさらなるDR5アゴニストを提供する必要性が依然として存在する。
【０００５】
結果として、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、心血管奇形および他の疾患の処置のための改良された抗DR5抗体を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO 2010/003766 A2
【特許文献２】WO 2014/009358
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wassenaar et al., Proteins. 2008 Feb 1;70(2):333-43
【非特許文献２】Valley et al., J Biol Chem. 2012 Jun 15;287(25):21265-78
【非特許文献３】Sessler et al., Pharmacol Ther. 2013 Nov;140(2):186-99
【非特許文献４】Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71
【非特許文献５】Ashkenazi et al., Nat Rev Drug Discov. 2008 Dec;7(12):1001-12
【非特許文献６】Trivedi et al., Front Oncol. 2015 Apr 2;5:69
【非特許文献７】Lim et al., Expert Opin Ther Targets. 2015 May 25:1-15
【非特許文献８】Twomey et al., Drug Resist Updat. 2015 Mar;19:13-21
【非特許文献９】Reddy et al., PLoS One. 2015 Sep 17;10(9)
【非特許文献１０】Holland et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2014 Apr;25(2):185-93
【非特許文献１１】Gieffers et al., Mol Cancer Ther, 2013. 12(12): p. 2735-47
【非特許文献１２】Liu et al., Biomed Pharmacother. 2015 Mar;70:41-5
【非特許文献１３】Huet et al., MAbs. 2014;6(6):1560-70
【非特許文献１４】Li et al., AACR Annual Meeting Apr 20 2015, Poster abstract #2464
【非特許文献１５】Friess et al., AACR Annual Meeting Apr 19 2015, Presentation abstract #952
【非特許文献１６】Wartha et al., Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2014 Apr 5-9; San Diego, CA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2014;74(19 Suppl):Abstract nr 4573. doi:10.1158/1538-7445.AM2014-4573
【発明の概要】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、二次架橋に依存しない細胞表面抗原結合の条件となる抗体クラスタ化を促進する抗DR5抗体のFc領域における特異的な点突然変異の導入が、DR5活性化を引き起こし、アポトーシスおよび細胞死を誘導する際の抗体の効力を有意に増強することを見出した。
【０００９】
本発明の目的は、がんおよび他の疾患の処置に用いるための改善された抗DR5抗体を提供することである。そのような改善された抗体は、Fc領域における変異を含む。本発明のさらなる目的は、本発明による1つまたは複数の抗DR5抗体を含むがんおよび他の疾患の処置のための改善された組成物を提供することであり、例えばここで該抗体はDR5上の異なるエピトープに結合する。本明細書に記載のそのような改善された組成物は、本発明による少なくとも1つの抗DR5抗体を含み、より好ましくは、該組成物は、DR5上の異なる非競合エピトープなどの、DR5上の異なる領域に結合する2つの抗DR5抗体を含む。
【００１０】
本発明は、Fc領域が、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430、E345またはS440位に対応するアミノ酸位置に変異を含む、ヒト免疫グロブリンIgGのFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含む抗DR5抗体を提供する(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242)。
【００１１】
すなわち、本発明者らは、本発明の第1の局面において、Fc領域における変異を含む本発明の抗DR5抗体が、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440位に対応するアミノ酸位置に変異を有しない抗DR5抗体と比べて腫瘍細胞などのDR5陽性細胞のアポトーシスを増加させることを見出した。すなわち、本発明の抗DR5抗体は、DR5陽性腫瘍またはDR5発現腫瘍の処置に適している。
【００１２】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、E430G、E430S、E430FおよびE430Tからなる群より選択される変異を、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430に対応するアミノ酸位置に含む。
【００１３】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒト免疫グロブリンIgGのFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含み、ここでFc領域は、ヒトIgGにおけるEU付番での変異E430G (430位のグルタミン酸をグリシンへ)またはE345K (345位のグルタミン酸をリジンへ)を含む。
【００１４】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒトIgG1のFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含み、ここでFc領域はE430G変異を含む。
【００１５】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yからなる群より選択される変異を、ヒトIgGにおけるEU付番でのE345に対応するアミノ酸位置に含む。
【００１６】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒトIgG1のFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含み、ここでFc領域はE345K変異を含む。
【００１７】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、S440WおよびS440Yからなる群より選択される変異を、ヒトIgGにおけるEU付番でのS440に対応するアミノ酸位置に含む。
【００１８】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒトIgG1のFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含み、ここでFc領域はS440Y変異を含む。
【００１９】
1つの局面において、本発明は、DR5に結合する1つまたは複数の抗体を含む組成物を提供する。1つの態様において、組成物は、DR5上の異なるエピトープに結合する1つまたは複数の抗体を含む。これにより、DR5に結合するために抗体が異なるエピトープに結合するか、またはDR5配列(SEQ ID NO:46)内の異なるアミノ酸を必要とする態様が提供される。1つの態様において、組成物はDR5への結合について競合しない抗DR5抗体を含み、すなわち1つの態様において、抗DR5抗体は非重複エピトープに結合する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、DR5に結合する1つまたは複数の抗原結合領域を含む二重特異性抗体を提供する。
【００２１】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含み、ここで該第1および第2の重鎖は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置に変異を含む。
【００２２】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含み、ここで該第1の重鎖は、F405およびE430位に対応する変異を含み、かつここで該第2の重鎖は、K409およびE430位に対応する変異を含み、ここでアミノ酸位置はEU付番によるヒトIgG1に対応している。
【００２３】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのF405L変異を有する第1の重鎖およびK409R変異を有する第2の重鎖を含むFc領域を含む。本発明の別の態様において、二重特異性抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのK409R変異を有する第1の重鎖およびF405L変異を有する第2の重鎖を含むFc領域を含む。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書に記載の抗体または組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む、疾患を処置する方法を提供する。本発明の1つの態様において、疾患はがんである。
【００２５】
本発明の別の局面において、本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物は、医薬として使用するためのものである。1つの態様において、抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物は、疾患の処置に使用するためのものである。1つの態様において、疾患はがんまたは腫瘍である。
【００２６】
別の局面において、本発明は、抗体または組成物がバイアルなどの1つまたは複数の容器に入っている、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または組成物を含む要素のキットを提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造のための本明細書に記載の抗体または組成物の使用を提供する。1つの態様において、本発明は、がんの処置のための医薬の製造のための本明細書に記載の抗体または組成物の使用を提供する。
【００２８】
本明細書に記載の抗DR5抗体および抗DR5抗体を含む組成物は、ヒトDR5に向けられ、またはヒトDR5に特異的である。本明細書に記載の抗DR5抗体および組成物は、アカゲザルおよびカニクイザルDR5と交差反応する。特に、本発明の1つの態様において、抗DR5抗体および組成物は、ヒトDR5の細胞外ドメインに特異的に結合する。本発明の1つの特定の態様において、該抗体および抗DR5抗体を含む組成物は、非重複エピトープの位置でヒトDR5に結合する。すなわち、1つの態様において、組成物は、本発明による少なくとも1つの抗DR5抗体を含む。1つの態様において、組成物は、本発明による第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含む。すなわち、本明細書に記載の第1の抗DR5抗体は、本明細書に記載の第2の抗DR5抗体の結合をブロックしない。1つの特定の態様において、本明細書に記載の組成物は、ヒトDR5に結合する第1および第2の抗DR5抗体を含み、第1の抗DR5抗体は、ヒトDR5への第2の抗DR5抗体の結合をブロックしない。
【００２９】
本発明の抗DR5抗体および抗DR5抗体を含む組成物、すなわちFc領域におけるアミノ酸変異を含む抗DR5抗体は、一般に、DR5の活性を調節するために用いることができる。1つの態様において、抗DR5抗体または組成物は、DR5によって媒介されるシグナル伝達を誘発、活性化および/または増大もしくは増強しうる。本発明によるFc領域におけるアミノ酸変異を含む抗DR5抗体が、DR5によって媒介されるシグナル伝達を増大または増強しうることは、シグナル伝達が、Fc領域における該変異を有しない同じ抗DR5抗体と比較される場合と理解されるべきである。1つの態様において、抗DR5抗体または組成物はDR5に対するアゴニスト効果を有し、特にDR5の下流効果を誘発または増大する。本発明によるFc領域におけるアミノ酸変異を含む抗DR5抗体が、DR5に対するアゴニスト効果を有しうることは、アゴニスト効果が、DR5リガンドTRAILまたは同じ抗DR5抗体、すなわち同じCDR配列を有するが、本発明によるFc領域における該変異を有しないものと比較される場合と理解されるべきである。すなわち、本発明の抗DR5抗体または組成物は、がん細胞または腫瘍などの、DR5を発現する細胞、腫瘍塊または組織においてアポトーシスまたは細胞死を誘導することができる。
【００３０】
本発明の1つの態様において、本明細書に記載の抗DR5抗体または組成物は、Fc領域における該変異を有しない同じ抗DR5抗体または組成物と比べてがん細胞、腫瘍細胞または腫瘍などの、DR5を発現する細胞または組織におけるアポトーシス、細胞死または増殖停止を誘導、誘発、増大または増強する。1つの態様において、本明細書に記載の抗DR5抗体または組成物は、細胞表面上のDR5に結合することができ、特に、DR5によって媒介されるシグナル伝達が、Fc領域における該変異を有しない同じ抗DR5抗体または組成物と比べて誘導、誘発、増大または増強されるようにDR5に結合することができる。1つの態様において、本明細書に記載の抗体または組成物は、DR5を発現するがんもしくは腫瘍細胞、腫瘍または組織においてアポトーシスまたは細胞死が誘導されるようにDR5に結合することができるようなものでありうる。
【００３１】
1つの態様において、本発明の抗体または組成物は、DR5を発現するがん細胞またはがん組織におけるアポトーシスまたは細胞死を誘導、誘発、増大または増強する。増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露された、または本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞におけるホスファチジルセリンの露出の増大または増強されたレベルによって測定することができる。あるいは、増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露された、または本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞におけるカスパーゼ3またはカスパーゼ7の活性化を測定することによって測定することができる。あるいは、増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、未処理の細胞培養物と比較して、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露されたまたは本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞培養物における生存性の喪失によって測定することができる。カスパーゼ媒介アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤、例えばZVADによるDR5抗体への曝露後の生存性の喪失の阻害を実証することによって評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】4種類の異なるヒトIgG1 Fcアロタイプのアミノ酸アラインメントを示す。IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)、IgG1m(x)のFc配列は、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、および32に明記されている。
【図２】FACS上のフローサイトメトリーによって測定した際の、DR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対するヒト化（hDR5）およびキメラ化（DR5）抗DR5抗体の結合を示す。抗gp120抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した。結合を、MFI（平均蛍光強度）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３】DR5陽性COLO 205細胞に対する、ヘキサマー化増強変異のE430GまたはE345Kを有するおよび有さない抗DR5抗体の結合を示す。ヒト-マウスキメラ抗体のバリアントのIgG1-DR5-01-K409R（A）、IgG1-DR5-05-F405L（B）、および二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L（BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）（C）を、COLO 205細胞に対する結合について、FACS上のフローサイトメトリー分析で試験した。結合を、蛍光強度の幾何平均として表す。抗gp120抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した。エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対する抗DR5抗体の結合を示す。ヒト-マウスキメラ抗体のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを、（A）モックトランスフェクトCHO細胞、（B）ヒトDR5トランスフェクトCHO細胞、および（C）アカゲザル（Rhesus macaque）DR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合について、FACS上のフローサイトメトリー分析において試験した。結合を、蛍光強度の幾何平均として表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】（A）EMBOSS Matcher（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/）；(.) 類似アミノ酸；(:) 同一アミノ酸を用いた、ヒトDR5およびマウスDR5の細胞外ドメインの一部の配列アラインメントを示す。（B）ドメインスワップ型DR5細胞外ドメインのグラフ表示（白色：ヒトDR5配列；黒色：マウスDR5配列）を示す。アミノ酸番号はヒト配列を指し、ドメインスワップは、パネルAに示されたアラインメントに基づいて行った。（C）フローサイトメトリーによって評価した際の、ヒト-マウスキメラDR5分子のパネルに対するIgG1-hDR5-01-F405Lおよびアイソタイプ対照抗体IgG1-b12の結合を示す。各々のドメインスワップ型DR5分子において、x軸上に示されるように、特定のヒトアミノ酸がマウス配列によって置き換えられている。エラーバーは、二連の試料の標準偏差を示す。（D）フローサイトメトリーによって評価した際の、ヒト-マウスキメラDR5分子のパネルに対するIgG1-hDR5-05-F405Lの結合を示す。各々のドメインスワップ型DR5分子において、x軸上に示されるように、特定のヒトアミノ酸がマウス配列によって置き換えられている。IgG1-b12を、アイソタイプ対照抗体に含めた。エラーバーは、二連の試料の標準偏差を示す。
【図６】DR5-01抗体およびDR5-05抗体でのクロスブロックELISAを示す。グラフは、ELISAによって測定した際の、競合抗体IgG1-hDR5-01-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430Gの存在下での可溶性DR5ECD-FcHisCtagに対する、コーティングしたIgG1-hDR5-01-E430G（A）またはIgG1-hDR5-05-E430G（B）の結合の阻害を表示する。抗gp120抗体IgG1-b12（b12）を、陰性対照として使用した。DR5-01はIgG1-hDR5-01-E430Gであり；DR5-05はIgG1-hDR5-05-E430Gである。
【図７】DR5-01抗体およびDR5-05抗体のバリアントでの生存率アッセイを示す。E430Gヘキサマー化増強変異の導入は、単独で使用された単一のヒト-マウスキメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lによる、ならびにそれらの組み合わせによる、DR5陽性COLO 205（A）およびHCT 116（B）結腸がん細胞の殺傷の誘導の増強を結果としてもたらす。エラーバーは標準偏差を示す。
【図８】（A）それぞれ、IgG1-chTRA8-F405LとIgG1-DR5-01-K409RまたはIgG1-DR5-05-F405Lとの間のクロスブロックELISAを示す。3日生存率アッセイにおいて判定した際に、2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GとIgG1-DR5-01-K409R-E430Gとの組み合わせ（B）は、HCT 116結腸がん細胞の殺傷の誘導の増強（EC50の低下）を結果としてもたらし、他方、2種類のクロスブロックする抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GとIgG1-DR5-05-F405L-E430Gとの組み合わせ（C）は、もたらさなかった。エラーバーは標準偏差を示す。
【図９】ヘキサマー化増強変異の導入が、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-DR5-05-F405L-E345K + IgG1-CONA-K409R-E430GおよびBsAb IgG1-DR5-05-F405L-E345K x CONA-K409R-E430Gの組み合わせによるHCT 116結腸がん細胞の殺傷の誘導の増強を結果としてもたらすことを示す。（A）IgG1-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405LでのクロスブロックELISA。（B）3日生存率アッセイ。エラーバーは標準偏差を示す。RLU：相対発光単位。
【図１０】IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせが、3日生存率アッセイにおいて判定した際に、様々なヒトがん細胞株の大きなパネルの生存率を低減させることを示す。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（チューキーの多重比較検定での一元配置分散分析）。
【図１１】BxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞株に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト化IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせおよびキメラIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせの効能を示す。グラフは、二連（BxPC-3）または三連（PANC-1）の試料の平均値+/-標準偏差を表示する。
【図１２】（A）HCT 116ヒト結腸がん細胞への結合に対する、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405Lにおいてアミド分解を模倣する効果を研究するための、FACS分析を用いたフローサイトメトリー分析を示す。Asnアミド分解を模倣する変異N55Dの導入は、IgG1-hDR5-01-K409Rの結合の低下を結果としてもたらしたが、IgG1-hDR5-05-F405Lの結合に対しては最小の効果を有していた。（B）HCT 116ヒト結腸がん細胞への結合に対する、ヒト化抗体DR5-01においてアミド分解を阻止する効果を研究するための、フローサイトメトリー分析を示す。IgG1-hDR5-01-E430Gにおけるアミノ酸置換G56Tの導入は、HCT 116細胞への抗体の結合に対していかなる効果も有さなかった。結合を、蛍光強度の幾何平均として表す。（C）BxPC-3膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効能を示す。グラフは、二連の試料の平均値+/-標準偏差を表示する。
【図１３】IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの反発的および相補的なバリアントでの生存率アッセイを示す。両方の抗体における同じ反発変異（K439EまたはS440K）の導入は、BxPC-3膵臓がん細胞（A）およびHCT-15結腸がん細胞（B）の殺傷の誘導の減少を結果としてもたらす。両方の抗体において2種類の変異（K439EおよびS440K）を組み合わせることによって、反発が中和され、殺傷が回復される。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１４】ヘキサマー化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、細胞表面上での受容体クラスタリングおよびアポトーシスの誘導を誘導する能力における、Fc相互作用の関与。BxPC-3ヒトがん細胞に対する3日生存率アッセイにおいて示されるように、アポトーシスの誘導は、Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCTによって阻害される。
【図１５】3日生存率アッセイにおいて判定した際の、接着性BxPC-3ヒトがん細胞に対する、様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせ（DR5-01：DR5-05）の効力を示す。
【図１６】3日生存率アッセイにおいて判定した際の、接着性BxPC-3（A）およびHCT-15（B）ヒトがん細胞に対する、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G（DR5-01：DR5-05）の効力を示す。
【図１７】PANC-1（AおよびB）ならびにBxPC-3（C）膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト化IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G抗体の組み合わせによる、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を示す。01-E430GはIgG1-hDR5-01-E430Gであり；05-E430GはIgG1-hDR5-05-E430Gであり；ZVAD は汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK）である。
【図１８】COLO 205結腸がん細胞に対する抗DR5抗体または抗DR5抗体の組み合わせの結合時の、細胞死誘導を示す。COLO 205細胞を抗体試料と、5時間（A〜C）および24時間（D〜E）インキュベートした。様々な段階の細胞死誘導を、アネキシンV/PI二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。パネルCおよびDは、それぞれ、5時間および24時間でのアネキシンV/PI二重染色を示す。エラーバーは、2種類の二連試料の標準偏差を示す。01はIgG1-DR5-01-K409Rであり、05はIgG1-DR5-05-F405Lであり、01-E430GはIgG1-DR5-01-K409R-E430Gであり、05-E430GはIgG1-DR5-05-F405L-E430Gである。
【図１９】COLO 205結腸がん細胞に対するDR5抗体の結合時の、カスパーゼ-3/7活性化の速度論を示す。COLO 205細胞を抗体と、1、2、5、および24時間インキュベートした。カスパーゼ-3/7活性化を、ホモジニアス発光アッセイにおいて解析した。AU、任意の単位、エラーバーは、二連の試料の標準偏差を示す。
【図２０】接着性COLO 205結腸がん細胞ならびにBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞に対する3日生存率アッセイにおける、抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片によるFc架橋の存在下または非存在下でのIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの効力、ならびに、抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lに対する比較を示す。非標的結合抗体IgG1-b12を、陰性対照として含めた。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（多重比較のためのボンフェローニ事後検定での一元配置分散分析）。
【図２１】BxPC-3膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、ヒト化IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせおよびヒト化IgG1-DR5-01-E430G + IgG1-DR5-05-E430G抗体の組み合わせの効能を示す。グラフは、二連の試料の平均値+/-標準偏差を表示する。
【図２２】COLO 205結腸がん細胞株、BxPC-3膵臓がん細胞株、SNU-5胃がん細胞株、SK-MES-1肺がん細胞株、およびA375皮膚がん細胞株由来の接着性細胞に対する3日生存率アッセイにおいて判定した、様々なヒトがん細胞株に対するキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体の効能を示す。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（多重比較のためのボンフェローニ事後検定での一元配置分散分析）。(01x05)-E430Gは、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gである。
【図２３】接着性BxPC-3膵臓がん細胞およびCOLO 205結腸がん細胞に対する3日生存率アッセイにおける、抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lと比較した、抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片によるFc架橋の存在下または非存在下でのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの効力を示す。非標的結合抗体IgG1-b12を、陰性対照として含めた。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（多重比較のためのボンフェローニ事後検定での一元配置分散分析）。(01x05)-E430Gは、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430Gである。
【図２４】COLO 205結腸がん細胞に対する二重特異性DR5抗体の結合時の、細胞死誘導を示す。COLO 205細胞を1μg/mLの抗体と、5時間（A〜C）および24時間（D〜E）インキュベートした。様々な段階の細胞死誘導を、アネキシンV/PI二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。エラーバーは、2種類の二連試料の標準偏差を示す。01はIgG1-DR5-01-K409Rであり、05はIgG1-DR5-05-F405Lであり、01-E430GはIgG1-DR5-01-K409R-E430Gであり、05-E430GはIgG1-DR5-05-F405L-E430Gであり、01x05はBsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405Lであり、01-E430G x 05-E430GはBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gである。
【図２５】COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、キメラIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G抗体の組み合わせのインビボ効力の評定を示す。示した抗体（5 mg/kg）で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および23日目に（B）示す。（C）には、750 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図２６】皮下COLO 205結腸がん異種移植における、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体用量で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および16日目に（B）示す。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。＊p＜0.05、＊＊＊p＜0.001。
【図２７】BxPC-3ヒト膵臓がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONA-F405Lに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズを、時間において（A、中央腫瘍サイズ）および腫瘍接種後48日目に（B、平均腫瘍サイズおよびSEM）示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（独立t-検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図２８】A375ヒト皮膚がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONA-F405Lに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズを、時間において（A、中央腫瘍サイズ）および腫瘍接種後29日目に（B、平均腫瘍サイズおよびSEM）示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001（マン・ホイットニー検定）。
【図２９】HCT-15ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後17日目に（B）示す。＊＊＊＊p＜0.001（独立t検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図３０】SW480ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後28日目に（B）示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01（独立t-検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図３１】SNU-5ヒト胃がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後23日目に（B）示す。＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001（マン・ホイットニー検定）。（C）には、500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図３２】SK-MES-1ヒト肺がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの抗体の組み合わせのインビボ効力の評定、およびIgG1-CONAに対する比較を示す。示した抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後14日目に（B）示す。（C）には、1.000 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図３３】フローサイトメトリーによって測定した際の、E430G変異を有するおよび有さない抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05による、DR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を示す。抗gp120抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した。結合を、幾何平均蛍光強度（FI）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。7回の実験のうちの代表的な例を示す。
【図３４】直接標識抗体でのフローサイトメトリーによって測定した際の、抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる、DR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を示す。結合を、幾何平均Alexa 647蛍光強度（FI）として表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３５】ヒトDR5およびカニクイザルDR5に対する抗DR5抗体の結合を示す。抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gを、（A）ヒトDR5トランスフェクトCHO細胞および（B）カニクイザルDR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合について、フローサイトメトリーによって試験した。結合を、蛍光強度（FI）の幾何平均として表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３６】COLO 205結腸がん細胞に対する、クロスブロックしない抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05においてE430G変異を導入する効果を示すための、3日生存率アッセイを示す。エラーバーは標準偏差を示す。4回の実験のうちの代表的な例を示す。
【図３７】COLO 205ヒト結腸がん細胞に対する、DR5抗体での生存率アッセイを示す。ヘキサマー化増強変異S440Yの導入は、単一抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05による殺傷の誘導（A）、ならびに抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の効力の増大（B）を結果としてもたらした。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３８】BxPC-3ヒト膵臓がん細胞の殺傷を誘導する、クロスブロックしない抗体IgG1-DR5-CONA-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gの効力を示す。（A）IgG1-DR5-CONA-K409R（CONA）とIgG1-DR5-chTRA8-F405L（chTRA8）との間のクロスブロックELISA。（B）E430Gヘキサマー化増強変異の導入は、3日生存率アッセイにおいて判定した際、IgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gの組み合わせによるBxPC-3細胞の殺傷の誘導の増強を、結果としてもたらした。エラーバーは標準偏差を示す。
【図３９】様々なヒトがん細胞株に対する、133 nMのヒト組み換えTRAILまたは133 nMの抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G（E430G）およびIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05（WT）での3日生存率アッセイを示す。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊＊p＜0.001、＊＊＊＊p＜0.0001（チューキーの多重比較検定での一元配置分散分析）。
【図４０】Horizon, UKの細胞株パネルの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した、（A）抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）および（B）TRAIL療法による阻害のパーセンテージを示す。各々のデータ点は、示したヒトがん適応症の個々の細胞株を表示する。点線は、レスポンダー（70％以上の阻害）およびノンレスポンダー（70％未満の阻害）として細胞株を分類するために設定した70％最大応答閾値を示す。
【図４１】3日生存率アッセイにおいて判定した際の、接着性ヒト（A）BxPC-3膵臓がん細胞および（B）HCT-15結腸がん細胞に対する、組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gにおける様々な抗体比（01-E430G：05-E430Gとして示す）の効力を示す。2回および3回の実験のうちの代表的な例を、それぞれ、HCT-15およびBxPC-3について示す。
【図４２】BxPC-3膵臓がん細胞に対する生存率アッセイにおいて測定した際の、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G抗体の組み合わせ、E430G変異を有さない親WTの組み合わせ、およびTRAILによる、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を示す。ZVADは、汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK）である。
【図４３】E430G変異を有さない親WTの組み合わせ、およびTRAILと比較した、BxPC-3膵臓がん細胞に対する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの結合時の、カスパーゼ-3/7活性化の速度論を示す。BxPC-3細胞を抗体と、1、2、4、および6時間インキュベートした。カスパーゼ-3/7活性化を、ホモジニアス発光アッセイにおいて解析した。RLU、相対発光単位。4回の実験のうちの代表的な例を示す。
【図４４】接着性HCT-15ヒト結腸がん細胞およびBxPC-3膵臓がん細胞に対する3日生存率アッセイにおける、抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片によるFc架橋の存在下または非存在下でのIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせの効力、ならびに、抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびWT抗体IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の組み合わせに対する比較を示す。非標的結合抗体IgG1-b12を、陰性対照として含めた。グラフは、二連の試料由来の平均+/-標準偏差を示す。両方の細胞株について、2回の実験のうちの代表的な例を示す。
【図４５】ヒトDR5（A、C）またはカニクイザルDR5（B、D）をトランスフェクトしたCHO細胞に対する標的細胞結合時に補体活性化を誘導する、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの解析を示す。（A〜B）20％のプールした正常ヒト血清の存在下での、抗体濃度系列でのインビトロCDCアッセイ。CDCの効力を、ヨウ化プロピジウム（PI）陽性細胞のパーセンテージによって決定した溶解パーセンテージとして提示する。（C〜D）C5枯渇血清の存在下での抗体結合時の補体活性化産物の沈着を、蛍光強度の幾何平均として表す。HIV gp120に対するIgG1-b12 mAbを、非結合アイソタイプ対照抗体として使用した。
【図４６】5種類の異なる結腸がん細胞株に対する生存率アッセイにおいて判定した際の、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gを様々な治療物質と併用する効果を示す。様々な治療的分類由来の100種類の化合物の相乗効果スクリーニングから、5種類の例を示す。
【図４７】COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、単一作用物質および組み合わせの両方としての、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ効力の評定を、E430G変異を有さない親抗体と比較して示す。（A）時間において示した際の、示した抗体（0.5 mg/kg）で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）。（B）500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロット。
【図４８】HCT15ヒト結腸がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、ヘキサマー化増強変異E430Gを有するおよび有さない、抗DR5抗体濃度IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のインビボ効力の評定を示す。0.5 mg/kgの抗体で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において（A）および処置開始後21日目に（B）示す。＊＊p＜0.0011（マン・ホイットニー検定）。（C）には、750 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図４９】SK-MES-1ヒト肺がん細胞での皮下異種移植モデルにおける、15 mg/kgパクリタキセルと併用したIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-430G抗体の組み合わせのインビボ効力の評定を示す。（A）示した化合物で処置したマウスにおける腫瘍サイズ（平均およびSEM）を、時間において示す。（B）16日目の処置群あたりの腫瘍体積。（C）500 mm3よりも小さい腫瘍サイズを有するマウスのパーセンテージを、カプラン・マイヤープロットにおいて示す。
【図５０】IgG1-hDR5-01-G56T-E430G、IgG1-hDR5-05-E430G、または2種類の抗体の組み合わせを1 mg/kgでi.v.投与したSCIDマウスにおけるクリアランス速度を、E430G変異を有さない親WT抗体と比較して示す。（A）血清試料中の総ヒトIgGを、ELISAによって決定し、濃度対時間曲線においてプロットした。各データ点は、4種類の連続希釈した試料の平均+/-標準偏差を表示する。（B）抗体の投与後21日までのクリアランスを、式D*1.000/AUC（Dは注射した用量であり、AUCは濃度-時間曲線の曲線下の面積）に従って決定した。
【図５１】付着したCOLO 205ヒト結腸がん細胞に対する、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-CONA-E430Gでの生存率アッセイを示す。ヘキサマー化増強変異E430Gの導入は、殺傷の誘導を結果としてもたらした。データを、抗体なしでインキュベートした試料（殺傷なし）およびスタウロスポリンとインキュベートした試料（最大殺傷）と比べた発光から算出した、生細胞％として提示する。エラーバーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明の態様を記載する際に、明確化のために特定の専門用語が用いられる。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されることを意図するものではなく、各特定の用語は、同様の目的を達成するために同じような方法で動作するすべての技術的等価物を含むものと理解される。
【００３４】
本明細書に記載の場合、驚くべきことに、DR5に結合し、かつヒトIgG1におけるEU付番での位置E430またはE345に対応するFc領域中の六量体化増強変異を含む抗体は、上記の位置の1つにおける変異のないDR5結合抗体と比べて、DR5を発現する腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する上で優れていることが分かった。さらに、DR5上の異なるエピトープに結合する本発明の2つの抗DR5抗体を含む組成物は、変異のない同じ抗DR5抗体を含む組成物よりもインビトロおよびインビボ研究において優れていることが分かった。すなわち、本発明の2つの抗体を有する組成物は、Fc領域における変異のない2つのDR5抗体を含む組成物と比べて、DR5を発現する腫瘍細胞のアポトーシスの誘導および/または細胞増殖の抑制で優れていた。Fc領域における特定の変異を導入することにより、抗体分子は溶液中で単量体のままでありながらも、細胞表面上での標的結合時の六量体化を増強することができる WO2013/004842、WO2014/108198。
【００３５】
定義
本明細書において用いられる「免疫グロブリン」という用語は、4つすべてがジスルフィド結合によって潜在的に相互接続された、1対の低分子量軽(L)鎖および1対の重(H)鎖の2対のポリペプチド鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスをいう。免疫グロブリンの構造は、よく特徴付けられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。簡単に言うと、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域(本明細書においてVHと略記される)および重鎖定常領域から構成される。IgG抗体の重鎖定常領域は、典型的には、3つのドメインCH1、CH2およびCH3から構成される。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」中のジスルフィド結合を介して相互連結されている。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域(本明細書においてVLと略記される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、1つのドメインCLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域によって隔てられた、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる、超可変性の領域(または配列が超可変でありうるおよび/もしくは構造的に規定されたループの形態でありうる超可変領域)にさらに細分されうる。各VHおよびVLは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順に配列される3つのCDRおよび4つのFRから構成される: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)も参照のこと)。他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、本発明におけるアミノ酸位置への言及は、EU付番(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May;63(1):78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242)によるものである。
【００３６】
本明細書において用いられる「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のヒンジ領域は、EU付番でのアミノ酸位置216〜230に対応する。
【００３７】
本明細書において用いられる「CH2領域」または「CH2ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH2領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、EU付番でのアミノ酸位置231〜340に対応する。しかしながら、CH2領域はまた、本明細書に記載の他のアイソタイプまたはアロタイプのいずれかでありうる。
【００３８】
本明細書において用いられる「CH3領域」または「CH3ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のCH3領域をいうように意図される。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、EU付番でのアミノ酸位置341〜447に対応する。しかしながら、CH3領域はまた、本明細書に記載の他のアイソタイプまたはアロタイプのいずれかでありうる。
【００３９】
本明細書において互換的に用いられうる、「断片結晶化可能領域」、「Fc領域」、「Fc断片」または「Fcドメイン」という用語は、アミノ末端からカルボキシ末端に配列された、少なくともヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む抗体領域をいう。IgG1抗体のFc領域は、例えば、パパインを用いたIgG1抗体の消化によって作出することができる。抗体のFc領域は、免疫系の様々な細胞(エフェクター細胞などの)および補体活性化の古典経路における第1成分である、C1qなどの補体系の成分を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
【００４０】
本発明の文脈における「Fab断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域ならびに軽鎖の定常領域および免疫グロブリンの重鎖のCH1領域を含む、免疫グロブリン分子の断片をいう。「CH1領域」は、例えば、EU付番でのアミノ酸位置118〜215に対応するヒトIgG1抗体の領域をいう。したがって、Fab断片は、免疫グロブリンの結合領域を含む。
【００４１】
本明細書において用いられる「抗体」(Ab)という用語は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそのいずれかの誘導体をいう。本発明の抗体は、免疫グロブリンのFc領域と抗原結合領域とを含む。Fc領域は一般に、2つのCH2-CH3領域および接続領域、例えばヒンジ領域を含む。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。本明細書において用いられる「抗体」という用語はまた、他に明記されていないか、文脈によって矛盾がない限り、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体(ヒトモノクローナル抗体などの)、抗体混合物、組み換えポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体をいう。作出される抗体は、任意のクラスまたはアイソタイプを潜在的に保有することができる。
【００４２】
本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体をいう。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異、挿入または欠失)を含みうる。しかしながら、本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの、別の種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むように意図されない。
【００４３】
本明細書において用いられる「キメラ抗体」という用語は、抗体工学の結果として、両方の鎖タイプ、すなわち重鎖および軽鎖がキメラである抗体をいう。キメラ鎖は、ヒト由来の定常領域に連結された外来可変ドメイン(非ヒト種に由来するか、またはヒトを含む任意の種から合成もしくは操作された)を含む鎖である。
【００４４】
本明細書において用いられる「ヒト化抗体」という用語は、両方の鎖タイプが抗体工学の結果としてヒト化されている抗体をいう。ヒト化鎖は、典型的には、可変ドメインの相補性決定領域(CDR)が外来(ヒト以外の種に由来するか、または合成)であり、鎖の残部がヒト由来である鎖である。ヒト化の評価は、得られたアミノ酸配列に基づいており、それ自体が方法論に基づくものではなく、それによって移植以外のプロトコルを用いることが可能とされる。
【００４５】
本明細書において用いられる「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgA2、IgEまたはIgM)をいう。標準的な抗体を産生するために、各重鎖アイソタイプは、カッパ(κ)またはラムダ(λ)軽鎖のいずれかと組み合わせるべきである。
【００４６】
本明細書において用いられる「アロタイプ」という用語は、同じ種における1つのアイソタイプクラス内のアミノ酸変異をいう。抗体アイソタイプの主たるアロタイプは、民族個体間で異なる。重鎖のIgG1アイソタイプ内の既知のアロタイプ変異は、図1に示すように抗体フレーム中の4アミノ酸置換に起因する。1つの態様において、本発明の抗体は、SEQ ID NO 29に定義されるIgG1m(f)アロタイプのものである。本発明の1つの態様において、抗体は、SEQ ID NO 30に定義されるIgG1m(z)アロタイプ、SEQ ID NO 31に定義されるIgG1m(a)アロタイプ、SEQ ID NO 32に定義されるIgG1m(x)アロタイプ、またはIgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)などの、任意のアロタイプの組み合わせのものである(de lange Exp Clin Immunogenet. 1989;6(1):7-17)。
【００４７】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」、「モノクローナルAb」、「モノクローナル抗体組成物」、「mAb」などの用語は、単一分子組成のAb分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示すAbをいう。ヒトmAbは、機能的なヒト抗体を産生するように再編成され、かつ不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子レパートリーおよびヒト軽鎖導入遺伝子レパートリーを含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどの、トランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物から得られたB細胞を含むハイブリドーマによって作出されうる。あるいは、ヒトmAbは組み換えによって作出されうる。
【００４８】
本明細書において用いられる「抗体模倣体」という用語は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合できるが、抗体と構造的に関連しない化合物をいう。それらは、通常、人工ペプチド、タンパク質、核酸または小分子である。
【００４９】
「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なる、典型的には重複しないエピトープに対する特異性を有する抗体をいう。そのようなエピトープは、同じまたは異なる標的上にありうる。Fc領域を含む異なるクラスの二重特異性抗体の例としては、分子の各抗原結合領域が少なくとも2つの異なるエピトープに結合する、非対称二重特異性分子、例えば相補的CH3ドメインを有するIgG様分子および対称二重特異性分子、例えば組み換えIgG様二重標的分子が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５０】
二重特異性分子の例としては、トリオマブ(登録商標) (Trion Pharma/Fresenius Biotech, WO/2002/020039)、ノブ・イントゥ・ホール(Knobs-into-Holes) (Genentech, WO9850431)、CrossMAbs (Roche, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253)、静電的に適合したFcヘテロ二量体分子(Amgen, EP1870459およびWO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304)、LUZ-Y (Genentech)、DIG-body、PIG-bodyおよびTIG-body (Pharmabcine)、鎖交換組み換えドメインボディ(Strand Exchange Engineered Domain body) (SEEDbody) (EMD Serono, WO2007110205)、二重特異性IgG1およびIgG2 (Pfizer/Rinat, WO11143545)、Azymetric足場(Zymeworks/Merck, WO2012058768)、mAb-Fv (Xencor, WO2011028952)、XmAb (Xencor)、二価二重特異性抗体(Roche, WO2009/080254)、二重特異性IgG (Eli Lilly)、DuoBody(登録商標)分子(Genmab A/S, WO 2011/131746)、DuetMab (Medimmune, US2014/0348839)、Biclonics (Merus, WO 2013/157953)、NovImmune (κλBodies, WO 2012/023053)、FcΔAdp (Regeneron, WO 2010/151792)、(DT)-Ig (GSK/Domantis)、ツー・イン・ワン(Two-in-one)抗体または二重作用(Dual Action) Fabs (Genentech, Adimab)、mAb2 (F-Star, WO2008003116)、Zybodies(商標) (Zyngenia)、CovX-body (CovX/Pfizer)、FynomAbs (Covagen/Janssen Cilag)、DutaMab (Dutalys/Roche)、iMab (MedImmune)、二重可変ドメイン(Dual Variable Domain) (DVD)-Ig(商標) (Abbott, US 7,612,18)、二重ドメインダブルヘッド抗体(Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923)、Ts2Ab (MedImmune/AZ), BsAb (Zymogenetics)、HERCULES (Biogen Idec, US007951918)、scFv-融合体(Genentech/Roche, Novartis, Immunomedics, Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246)、TvAb (Roche, WO2012025525, WO2012025530)、ScFv/Fc融合体, SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS)、インターセプター(Interceptor) (Emergent)、二重親和性再標的技術(Dual Affinity Retargeting Technology) (Fc-DART(商標)) (MacroGenics, WO2008/157379, WO2010/080538)、BEAT (Glenmark)、Di-Diabody (Imclone/Eli Lilly)および化学的に架橋されたmAbs (Karmanos Cancer Center)、ならびに共有結合的に融合されたmAbs (AIMM therapeutics)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、「全長抗体」という用語は、そのクラスまたはアイソタイプの野生型抗体に通常見出されるものに対応するすべての重鎖および軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインを含む抗体(例えば、親抗体または変種抗体)をいう。
【００５２】
本明細書において用いられる「オリゴマー」という用語は、少なくとも原則的には、無制限の数の単量体からなる重合体とは対照的に、2以上であるが限られた数の単量体単位(例えば、抗体)からなる分子をいう。例示的なオリゴマーは、二量体、三量体、四量体、五量体および六量体である。ギリシャ語の接頭語は、オリゴマー中の単量体単位の数を指定するために用いられることが多く、例えば四量体は4単位から構成され、六量体は6単位から構成される。同様に、本明細書において用いられる「オリゴマー化」という用語は、分子を有限の重合度に変換するプロセスをいうように意図される。本明細書において、本発明による標的結合領域を含む抗体および/または他の二量体タンパク質は、例えば細胞表面での、標的結合後のFc領域の非共有結合によって、六量体などの、オリゴマーを形成できることが認められる。
【００５３】
本明細書において用いられる「抗原結合領域」、「抗原結合領域」、「結合領域」または抗原結合ドメインという用語は、抗原に結合することができる抗体の領域をいう。この結合領域は、典型的には、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域によって隔てられた、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる、超可変性の領域(または配列が超可変でありうるおよび/もしくは構造的に規定されたループの形態でありうる超可変領域)にさらに細分されうる抗体のVHおよびVLドメインにより規定される。抗原は、例えば細胞、細菌もしくはビリオン上または溶液中に存在する、ポリペプチドなどの、任意の分子であることができる。「抗原」および「標的」という用語は、文脈によって矛盾がない限り、本発明の文脈において互換的に用いられうる。
【００５４】
本明細書において用いられる「標的」という用語は、抗体の抗原結合領域が結合する分子をいう。標的は、産生された抗体が向けられる任意の抗原を含む。「抗原」および「標的」という用語は、抗体に関して、互換的に用いられ、本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を構成しうる。
【００５５】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、かつ通常、特異的な三次元構造的特徴および特異的な電荷的特徴を有する。立体構造エピトープおよび非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基(言い換えると、アミノ酸残基は特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある)を含みうる。
【００５６】
本明細書において用いられる「結合」という用語は、典型的には、例えばBIAcore 3000機器においてリガンドとして抗原および分析物として抗体またはその逆を用い表面プラズモン共鳴(SPR)技術によって決定される場合、約10-6 Mもしくはそれ以下、例えば10-7 Mもしくはそれ以下、例えば約10-8 Mもしくはそれ以下、例えば約10-9 Mもしくはそれ以下、約10-10 Mもしくはそれ以下、または約10-11 Mもしくはさらにそれ以下のKDに相当する結合親和性での、所定の抗原または標的への抗体の結合をいい、所定の抗原または密接に関連している抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)への結合に対するその親和性よりも少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例えば少なくとも1,000倍低い、例えば少なくとも10,000倍低い、例えば少なくとも100,000倍低いKDに相当する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低い量は、抗体のKDに依存するので、抗体のKDが非常に低い(すなわち、抗体が非常に特異的である)場合、抗原に対する親和性の程度は、非特異的抗原に対する親和性よりも低く、少なくとも10,000倍低い可能性がある。本明細書において用いられる「KD」(M)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数をいい、kdをkaで除して得られる。
【００５７】
本明細書において用いられる「kd」(秒-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度定数をいう。この値は、Koff値または解離速度(off-rate)ともいわれる。
【００５８】
本明細書において用いられる「ka」(M-1×秒-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度定数をいう。この値は、kon値または結合速度(on-rate)ともいわれる。
【００５９】
本明細書において用いられる「KA」(M-1)という用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合平衡定数をいい、kaをkdで除して得られる。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、「親和性」という用語は、抗体の個々の抗原結合部位の抗原への一価結合などの、単一部位での、ある分子、例えば抗体の、別の分子、例えば標的または抗原への結合の強度である。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、「アビディティー」という用語は、標的と同時に相互作用する抗体の複数の抗原結合部位の間などの、2つの構造間の複数の結合部位の複合強度をいう。2つ以上の結合相互作用が存在する場合、2つの構造は、すべての結合部位が解離した場合にのみ解離するため、解離速度は個々の結合部位の場合よりも遅くなり、それによって個々の結合部位の結合の強度(親和性)と比べて高い有効な全結合強度(アビディティー)をもたらすであろう。
【００６２】
本明細書において用いられる「六量体化増強変異」という用語は、EU付番にしたがってヒトIgG1中のE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異をいう。六量体化増強変異は、WO2013/004842; WO2014/108198に記載されているように、抗体分子が溶液中で単量体のままである間に、細胞表面標的に結合した隣接するIgG抗体間のFc-Fc相互作用を強化し、標的結合抗体の六量体形成の増強を引き起こす。
【００６３】
本明細書において用いられる「反発変異」または「自己反発変異」または「六量体化阻害変異」という用語は、Fc-Fc界面でのアミノ酸間の電荷反発を引き起こし、結果的に隣接する2つのFc領域含有ポリペプチド間のFc-Fc相互作用の弱化を引き起こし、かくして六量体化を阻害しうるヒトIgG1のアミノ酸位置の変異をいう。ヒトIgG1におけるそのような反発変異の例は、K439EおよびS440Kである。反発変異の位置での2つの隣接するFc領域含有ポリペプチド間のFc-Fc相互作用における反発は、第1の変異を有する位置と相互作用するアミノ酸位置に第2の変異(相補的変異)を導入することによって中和することができる。この第2の変異は、同じ抗体または第2の抗体のいずれかに存在することができる。第1および第2の変異の組み合わせは、Fc-Fc相互作用、したがって六量体化の反発および回復の中和を引き起こす。そのような第1および第2の変異の例は、K439E (反発変異)およびS440K (K439Eにより反発を中和)であり、逆の場合も同じくS440K (反発変異)およびK439E (S440Kにより反発を中和)である。
【００６４】
本明細書において用いられる「相補的変異」という用語は、2つの隣接Fc領域含有ポリペプチドにおける2つの変異の組み合わせに起因する、相補的変異を含むFc領域含有ポリペプチドと好ましくは相互作用する隣接Fc領域含有ポリペプチドにおける第1の変異に関連したFc領域含有ポリペプチドにおけるアミノ酸位置の変異をいう。相補的変異および関連した第1の変異は、同じ抗体中(分子内)または第2の抗体中(分子間)のいずれかに存在することができる。分子内相補的変異の例は、WO 2011/131746による二重特異性抗体における選択的ヘテロ二量体化を媒介するK409RおよびF405Lの組み合わせである。2つの隣接するFc領域含有ポリペプチド間のFc-Fc相互作用したがって六量体化の反発および回復の中和を引き起こすK439EおよびS440K変異の組み合わせは、分子間にも分子内にもともに適用できる相補的変異の例である。
【００６５】
本明細書において用いられる「アポトーシス」という用語は、細胞内で起こりうるプログラム細胞死(PCD)のプロセスをいう。生化学的事象は、特徴的な細胞変化(形態学)および死に至る。これらの変化には、小疱形成、細胞収縮、ホスファチジルセリンの露出、ミトコンドリア機能の喪失、核断片化、クロマチン凝縮、カスパーゼ活性化、および染色体DNA断片化が含まれる。特定の態様において、1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体によるアポトーシスは、例えば、実施例19、20、25および45に記載のカスパーゼ-3/7活性化アッセイ法または実施例19および25に記載のホスファチジルセリンの露出などの方法を用いて判定することができる。例えば1 μg/mLの一定濃度の抗DR5抗体が接着細胞に添加され、1〜24時間インキュベートされうる。BD PharmingenのPE活性カスパーゼ-3アポトーシスキット(PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit) (カタログ番号550914) (実施例19および25)またはPromegaのカスパーゼ-Glo 3/7 (Caspase-Glo 3/7)アッセイ(カタログ番号G8091) (実施例20および45)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、カスパーゼ-3/7活性化を判定することができる。BD PharmingenのFITCアネキシンVアポトーシス検出キットI (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I) (カタログ番号556547) (実施例19および25)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、ホスファチジルセリンの露出および細胞死を判定することができる。
【００６６】
本明細書において用いられる「プログラム細胞死」または「PCD」という用語は、細胞内シグナル伝達によって媒介される任意の形態での細胞の死、例えばアポトーシス、自食作用またはネクロトーシスをいう。
【００６７】
本明細書において用いられる「アネキシンV」という用語は、細胞表面上のホスファチジルセリン(PS)に結合するアネキシン群のタンパク質をいう。
【００６８】
本明細書において用いられる「カスパーゼ活性化」という用語は、エフェクターカスパーゼへのその変換に至る、イニシエーターカスパーゼによるエフェクターカスパーゼの不活性プロ型の切断をいい、これによって今度は、細胞内のタンパク質基質が切断されてアポトーシスを引き起こす。
【００６９】
本明細書において用いられる「カスパーゼ依存性プログラム細胞死」という用語は、カスパーゼによって媒介されるプログラム細胞死の任意の形態をいう。特定の態様において、1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体によるカスパーゼ依存性プログラム細胞死は、実施例18および44に記載されているようにパン-カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン(Z-VAD-FMK)の存在下および非存在下において細胞培養物の生存性を比較することにより判定することができる。パン-カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMK (5 μMの終濃度)が96ウェル平底プレート中の接着細胞に添加され、37℃で1時間インキュベートされうる。次に、抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから始めて5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)が添加され、37℃で3日間インキュベートされうる。PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて細胞生存性を定量化することができる。
【００７０】
本明細書において用いられる「細胞生存性」という用語は、代謝的に活性な細胞の存在をいう。特定の態様において、1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体とのインキュベーション後の細胞生存性は、実施例8〜18、21〜24、38〜44、46および48に記載されるように、細胞中に存在するATPを定量化することによって判定することができる。抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから始めて5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)が96ウェル平底プレート中の細胞に添加され、培地が陰性対照として用いられ、5 μMのスタウロスポリンが細胞死の誘導のための陽性対照として用いられうる。3日間のインキュベーション後、PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて細胞生存性が定量化されうる。生存細胞の割合は、以下の式を用いて計算することができる: %生存細胞 = [(発光 抗体サンプル - 発光 スタウロスポリンサンプル)/(発光 抗体なしサンプル - 発光 スタウロスポリンサンプル)]＊100。
【００７１】
本明細書において用いられる「DR5」という用語は、3つの細胞外システインリッチドメイン(CRD's)、膜貫通ドメイン(TM)およびデスドメイン(DD)を含む細胞質ドメインを有する1回貫通I型膜タンパク質である、CD262およびTRAILR2としても知られる、デス受容体5をいう。ヒトでは、DR5タンパク質は、SEQ ID NO:46 (ヒトDR5タンパク質: UniprotKB/Swissprot O14763)に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる。
【００７２】
本明細書において互換的に用いられうる「抗体結合DR5」、「抗DR5抗体」、「DR5結合抗体」、「DR5特異的抗体」、「DR5抗体」という用語は、DR5の細胞外部分のエピトープに結合する任意の抗体をいう。
【００７３】
本明細書において用いられる「アゴニスト」という用語は、DR5に結合した場合に細胞内で、プログラム細胞死でありうる応答を引き起こすことができる抗DR5抗体などの分子をいう。抗DR5抗体がアゴニストであるということは、抗体がDR5への抗DR5結合の結果としてDR5を刺激、活性化またはクラスタ化することと理解されるべきである。つまり、DR5に結合した本発明によるFc領域のアミノ酸変異を含むアゴニスト抗DR5抗体は、DR5に結合したTRAILと同じ細胞内シグナル伝達経路のDR5刺激、クラスタ化または活性化をもたらす。特定の態様において、抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)とともに3日間、標的細胞をインキュベートすることによって、1つまたは複数の抗体のアゴニスト活性を判定することができる。抗体は細胞を播種する際に直接添加されてもよく(実施例8、9、10、39に記載)、またあるいは、抗体サンプルを添加する前に細胞をまず初めに、96ウェル平底プレートに接着させる(実施例11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、23、24、38、40、41、42、43、44、46、48に記載)。アゴニスト活性、すなわちアゴニスト効果は、PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて生存細胞の量を測定することにより定量化することができる。
【００７４】
本明細書において用いられる「DR5陽性」および「DR5発現」という用語は、例えばフローサイトメトリーまたは免疫組織化学で、測定できるDR5特異的抗体の結合を示す組織または細胞株をいう。
【００７５】
本発明の「変種」または「抗体変種」は、「親」抗体と比較して1つまたは複数の変異を含む抗体分子である。例示的な親抗体の形式には、非限定的に、野生型抗体、全長抗体もしくはFc含有抗体断片、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００７６】
例示的な変異には、アミノ酸の欠失、挿入、および親アミノ酸配列におけるアミノ酸の置換が含まれる。アミノ酸置換は、野生型タンパク質中に存在する天然アミノ酸を別の天然に存在するアミノ酸に、または天然に存在しないアミノ酸誘導体に交換しうる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的でありうる。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の3つの表のうちの1つまたは複数において反映されるアミノ酸のクラス内での置換によって定義されうる。
【００７７】
保存的置換のためのアミノ酸残基クラス
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【００７８】
代替の保存的アミノ酸残基置換クラス
2019500869.tif 000003
【００７９】
アミノ酸残基の物理的および機能的な代替分類
2019500869.tif 000004
【００８０】
本発明の文脈において、変種における置換は、以下のように示される:
元のアミノ酸 - 位置 - 置換されたアミノ酸;
アミノ酸残基を示すための表記XaaおよびXを含めて、3文字表記または1文字表記が用いられる。したがって、「E345R」または「Glu345Arg」という記法は、変種が、親抗体中の番号345におけるアミノ酸に対応する変種アミノ酸位置にグルタミン酸とアルギニンとの置換を含むことを意味する。そのような位置が抗体に存在しないが、しかし変種がアミノ酸の挿入を含む場合、例えば: 位置 - 置換されたアミノ酸; 記法、例えば「448E」が用いられる。そのような記法は、一連の相同なポリペプチドまたは抗体の改変に関して特に関連する。同様に、置換アミノ酸残基の同一性が重要でない場合: 元のアミノ酸 - 位置; または「E345」。元のアミノ酸および/または置換されたアミノ酸が、すべてではないが2つ以上のアミノ酸を含みうる修飾の場合、位置345におけるアルギニン、リジンまたはトリプトファンに向けてのグルタミン酸の置換: 「Glu345Arg、Lys、Trp」または「E345R、K、W」または「E345R/K/W」または「E345→R、 KもしくはW」が本発明の文脈において互換的に用いられうる。さらに、「置換」という用語は、他の19種の天然アミノ酸のいずれか1つへの、または非天然アミノ酸などの、他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、位置345におけるアミノ酸Eの置換には、以下の置換の各々が含まれる: 345A、345C、345D、345G、345H、345F、345I、345K、345L、345M、345N、345Q、345R、345S、345T、345V、345W、および345Y。それは、ところで、345Xという指定と等価であり、ここでXは任意のアミノ酸を指定する。これらの置換は、E345A、E345Cなど、またはE345A, Cなど、またはE345A/C/などと指定することもできる。同じことが、本明細書において言及されたありとあらゆる位置への類推のため、そのような置換のいずれか1つを具体的に含むように適用される。
【００８１】
本発明の目的のため、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 好ましくはバージョン5.0.0またはそれ以降のNeedleプログラムにおいて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)を用いて判定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ0.5、およびEBLOSUM62 (BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたNeedleの出力(-nobriefオプションを用いて取得される)は、%同一性として用いられ、以下のように計算される:
(同一残基×100)/(アライメントの長さ - アライメントにおけるギャップの総数)。
【００８２】
本発明の目的のため、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、EMBOSSパッケージ(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, 前記), 好ましくはバージョン5.0.0またはそれ以降のNeedleプログラムにおいて実施されるNeedleman-Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, 前記)を用いて判定される。使用されるパラメータは、ギャップオープンペナルティ10、ギャップ伸長ペナルティ0.5、およびEDNAFULL (NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたNeedleの出力(-nobriefオプションを用いて取得される)は、%同一性として用いられ、以下のように計算される:
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アライメントの長さ - アライメントにおけるギャップの総数)。
【００８３】
CDR変種の配列は、抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも5つの変異または置換、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも4つの変異または置換、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも3つの変異または置換、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも2つの変異、例えば抗体結合領域の6つのCDR配列にわたって合計で保存的、物理的または機能的アミノ酸から選択される多くとも1つの変異または置換で大部分は保存的、物理的または機能的アミノ酸置換を通じて親抗体配列のCDRの配列とは異なりうる。保存的、物理的または機能的アミノ酸は、見つかった20種の天然アミノ酸、すなわちArg (R)、His (H)、Lys (K)、Asp (D)、Glu (E)、Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)、Gln (Q)、Cys (C)、Gly (G)、Pro (P)、Ala (A)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)およびVal (V)から選択される。
【００８４】
CDR変種の配列は、大部分は保存的、物理的または機能的アミノ酸置換を通じて親抗体配列のCDRの配列とは異なりうる; 例えば変種における置換の少なくとも約75%、約80%またはそれ以上、約85%またはそれ以上、約90%またはそれ以上(例えば、約92%、93%または94%などの、約75〜95%)は保存的、物理的または機能的アミノ酸残基置換から選択される変異または置換である。保存的、物理的または機能的アミノ酸は、見つかった20種の天然アミノ酸、すなわちArg (R)、His (H)、Lys (K)、Asp (D)、Glu (E)、Ser (S)、Thr (T)、Asn (N)、Gln (Q)、Cys (C)、Gly (G)、Pro (P)、Ala (A)、Ile (I)、Leu (L)、Met (M)、Phe (F)、Trp (W)、Tyr (Y)およびVal (V)から選択される。
【００８５】
別の配列中のアミノ酸またはセグメントに「対応する」1つの配列中のアミノ酸またはセグメントは、典型的にはデフォルト設定で、ALIGN、ClustalWまたは同様のものなどの標準的な配列アライメントプログラムを用いて他のアミノ酸またはセグメントと整列するアミノ酸またはセグメントである。ゆえに、標準的な配列アライメントプログラムを用いて、例えば免疫グロブリン配列中のどのアミノ酸が、例えばヒトIgG1中の特定のアミノ酸に対応するかを同定することができる。さらに、標準的な配列アライメントプログラムを用いて、配列同一性、例えば少なくとも80%、もしくは85%、90%、または少なくとも95%のSEQ ID NO:29に対する配列同一性を同定することができる。例えば、図1に示す配列アライメントを用いて、IgG1 Fc配列の別のアロタイプにおける特定のアミノ酸に対応する1つのIgG1アロタイプのFc領域における任意のアミノ酸を同定することができる。
【００８６】
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、ベクターにライゲーションされた核酸セグメントの転写を誘導することができる核酸分子をいう。1つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは環状の二本鎖DNAループの形態にある。別のタイプのベクターは、核酸セグメントがウイルスゲノムにライゲーションされうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(非エピソーム性哺乳動物ベクターなどの)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製されうる。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)といわれる。一般に、組み換えDNA技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。本明細書において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられうる。しかしながら、本発明は、等価な機能を果たすウイルスベクター(複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど)などの、他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００８７】
本明細書において用いられる「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、発現ベクターが導入された細胞をいうように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫もいうように意図されるものと理解されるべきである。変異または環境の影響のために後に続く世代ではある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。組み換え宿主細胞には、例えば、CHO-S細胞、HEK-293F細胞、Expi293F細胞、PER.C6、NS0細胞およびリンパ球細胞などの、トランスフェクトーマや、大腸菌(E. coli)などの原核細胞ならびに植物細胞および菌類などの他の真核生物宿主も、大腸菌などの原核細胞も含まれる。
【００８８】
本発明の特定の態様
本発明は、少なくとも部分的に、ヒトIgG1におけるEU付番でのアミノ酸位置E430、E345またはS440に対応するFc領域での特定の変異を導入することにより、DR5を発現する標的細胞における細胞死を誘導する抗DR5抗体の能力を大幅に増強できるという発見に基づいている。本発明はさらに、DR5上の第1および第2のエピトープに結合し、かつFc領域における変異を各々が含む2つの抗体の組み合わせが、Fc領域における変異のない2つの抗体の組み合わせと比べて、ヘテロ六量体を形成し、標的細胞において優れた細胞死誘導を示しうるという驚くべき知見に基づいている。
【００８９】
1つの局面において、本発明は、ヒト免疫グロブリンIgGのFc領域とDR5に結合する抗原結合領域とを含む抗DR5抗体に関し、ここでFc領域は、ヒトIgGにおけるEU付番での位置E430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置に変異を含む。
【００９０】
ヒトIgGにおけるEU付番でのE430、E345およびS440に対応する位置は、Fc領域のCH3ドメインに位置する。
【００９１】
本発明による抗DR5抗体は、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含み、ここで本発明によるヒトIgGにおけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置の変異が第1および第2の重鎖の両方に存在するか、またはあまり好ましくないが重鎖の1つにのみ存在する。本発明の文脈において、六量体化増強変異は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置でのアミノ酸変異である。六量体化増強変異は、細胞表面上の対応する標的に結合した場合に変異を含む抗体間のFc-Fc相互作用を強化する。
【００９２】
ヒトIgG1での以下の位置:E430、E345およびS440の少なくとも1つに対応するFc領域における特定の変異を導入することにより、抗体分子は溶液中で単量体のままでありながらも、細胞表面上での標的結合時の六量体化が増強される(WO2013/004842; WO2014/108198)。
【００９３】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YまたはS440Wに対応する変異を含む。したがって、抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wの群から選択される変異を含む。これにより、細胞表面抗原結合の際に抗体の六量体化の増強を可能にする態様が提供される。抗DR5抗体は、第1の重鎖および第2の重鎖を含むFc領域を含み、ここで上記の六量体化増強変異の1つが第1および/または第2の重鎖に存在しうる。
【００９４】
本発明の好ましい態様において、Fc領域は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430GまたはE345Kに対応する変異を含む。したがって、Fc領域は、E430GおよびE345Kから選択される変異を含む。
【００９５】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE430に対応するアミノ酸位置に変異を含み、ここで変異は、E430G、E430S、E430FおよびE430Tからなる群より選択される。
【００９６】
本発明の1つの態様において、Fc領域は、E430Gに対応する変異を含む。したがって、本発明の1つの態様において、Fc領域はE430G変異を含む。
【００９７】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのE345に対応するアミノ酸位置に変異を含み、ここで変異は、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yからなる群より選択される。
【００９８】
本発明の1つの態様において、Fc領域は、E345Kに対応する変異を含む。したがって、本発明の1つの態様において、Fc領域はE345K変異を含む。
【００９９】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、ヒトIgGにおけるEU付番でのS440に対応するアミノ酸位置に変異を含み、ここで変異は、S440WおよびS440Yからなる群より選択される。
【０１００】
本発明の1つの態様において、Fc領域は、S440Yに対応する変異を含む。したがって、本発明の1つの態様において、Fc領域はS440Y変異を含む。
【０１０１】
本発明の1つの態様において、Fc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのK439EまたはS440Kなどの、さらなる六量体化阻害変異を含む。K439EまたはS440Kなどの六量体化阻害変異は、同じ六量体化阻害変異を含む抗体とのFc-Fc相互作用を妨げるが、K439E変異を有する抗体およびS440K変異を有する抗体を組み合わせることによって阻害効果が中和され、Fc-Fc相互作用が回復する。本発明の1つの態様において、抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番での以下の位置S440またはK439の1つに対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含む。本発明の1つの態様において、Fc領域は、S440またはK439に対応する位置にさらなる変異を含むが、ただし、六量体化増強変異がS440にある場合、さらなる変異が位置S440にないことを条件とする。本発明によるE430、E345またはS440に対応する位置における変異およびK439E変異などのK439に対応するアミノ酸位置でのさらなる変異を含む抗体は、K439E変異などのK439に対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成しない。しかしながら、E430、E345またはS440における六量体化増強変異およびK439EなどのK439におけるさらなる変異を含む抗体は、E430またはE345における六量体化増強変異およびS440KなどのS440におけるさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成する。本発明によるE430またはE345に対応する位置における変異およびS440K変異などのS440に対応するアミノ酸位置でのさらなる変異を含む抗体は、S440K変異などのS440に対応するアミノ酸位置にさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成しない。しかしながら、E430またはE345における六量体化増強変異およびS440KなどのS440におけるさらなる変異を含む抗体は、E430またはE345における六量体化増強変異およびK439などのK439におけるさらなる変異を含む抗体とオリゴマーを形成する。本発明の1つの態様において、Fc領域は、E430Gなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の1つの態様において、Fc領域は、E345Kなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の別の態様において、Fc領域は、E430Gなどの六量体化増強変異およびS440Kなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の1つの態様において、Fc領域は、E345Kなどの六量体化増強変異およびS440Kなどの六量体化阻害変異を含む。本発明の1つの態様において、Fc領域は、S440Yなどの六量体化増強変異およびK439Eなどの六量体化阻害変異を含む。これにより、K439E変異を含む抗体およびS440K変異を含む抗体の組み合わせの間で排他的な六量体化を可能にする態様が提供される。
【０１０２】
ヒトDR5分子(Uniprot O14763)は、最初の1〜55位のシグナル伝達ペプチド、それに続く56〜210位の細胞外ドメイン、211〜231位の膜貫通ドメインおよび232〜440位の細胞質ドメインを含む440個のアミノ酸から構成される。細胞外ドメインは155個のアミノ酸の配列から構成される。DR5の短いアイソフォーム(Uniprot O14763-2)は、細胞外ドメインから185〜213を失っている。
【０１０３】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、DR5の細胞外ドメイン内のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。
【０１０４】
本発明の1つの態様において、抗体は、TRAILと同じ結合部位に結合する抗原結合領域またはTRAILの結合部位と重複する結合部位を含む。TRAIL結合モチーフは、DR5外部ドメインと複合体を形成するTRAILの結晶構造に基づいてCRD2およびCRD3に位置する(Hymowitz et al., Mol Cell. 1999 Oct;4(4):563-71)。すなわち、本発明の1つの態様において、抗体は、TRAILと同じDR5上の結合領域に結合する抗原結合領域を含む。したがって、1つの態様において、DR5抗体はDR5上のCRD2および/またはCRD3に結合する。本発明の1つの態様において、抗体は、DR5へのTRAIL結合をブロックする抗原結合領域を含む。本発明の1つの態様において、抗体は、DR5へのTRAIL結合と競合する抗原結合領域を含む。本発明の1つの態様において、抗体は、TRAIL誘導アポトーシスなどのTRAIL誘導を介した死滅化をブロックする。
【０１０５】
本発明の別の態様において、抗体は、TRAILの結合部位とは異なるDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。本発明の1つの態様において、抗体は、TRAILとは異なるDR5上の結合領域に結合する抗原結合領域を含む。本発明の1つの態様において、抗体は、TRAIL誘導アポトーシスなどのTRAIL誘導を介した死滅化をブロックしない。
【０１０６】
本発明の態様において、抗体は、SEQ ID NO:46のアミノ酸残基116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。すなわち、抗原結合領域はDR5への結合のため、位置116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸および位置139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸に結合するまたはそれを必要とする。抗原結合領域が配列中に含まれる1つまたは複数のアミノ酸に結合するということは、抗原結合領域が配列内の1つまたは複数のアミノ酸と接触しているかまたは直接相互作用していると理解されるべきである。抗原結合領域が配列内の1つまたは複数のアミノ酸を必要とするということは、抗原結合領域と配列中の1つまたは複数のアミノ酸との間の接触または直接的相互作用は必要とされないが、1つまたは複数のアミノ酸が、エピトープの三次元構造を保つために必要とされることを意味する。
【０１０７】
本発明の別の好ましい態様において、抗体は、SEQ ID NO:46のアミノ酸残基79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む。
【０１０８】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびに以下のアミノ酸配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14;
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18およびVL) SEQ ID NO:21、GAS、22; または
(e) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を有する上記(a)〜(d)のいずれかに定義される(VH) CDR1、CDR2、CDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域のCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換がなされないが、しかしVL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
【０１０９】
本発明の1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかにおいて定義される抗DR5抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含み、ここで該VH領域および該VL領域は、以下からなる群より選択される6つのCDR配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(b) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6;
(c) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14; ならびに
(d) (VH) SEQ ID NO:16、17、18およびVL) SEQ ID NO:21、GAS、22。
【０１１０】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、以下からなる群の1つより選択されるCDR配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6、または 
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14、または
(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)または(b)のいずれか1つに定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域のCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換がなされないが、しかしVL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
【０１１１】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、以下からなる群の1つより選択されるCDR配列を有するCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変重鎖(VH)領域ならびにCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む可変軽鎖(VL)領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6、または
(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14、または
(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で5つまでの変異を有する上記(a)または(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、合計で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つもしくは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換がなされ、かつVL領域の3つのCDRにわたり変異がなされない。他の態様において、VH領域の3つのCDRにわたり変異、例えば置換はなされないが、VL領域の6つのCDRにわたり5つまでの変異、例えば置換がなされ、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、好ましくはDR5に対する結合親和性を改変しない。
【０１１２】
本発明の1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含み、ここで該VH領域および該VL領域は、以下からなる群より選択されるVHおよびVL配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23; ならびに
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23。
【０１１３】
本発明の1つの態様において、抗体は、以下のアミノ酸配列を有する可変重鎖(VH)領域および可変軽鎖(VL)領域を含む抗原結合領域を含む:
(a) (VH) SEQ ID NO:4および(VL) SEQ ID NO:7;
(b) (VH) SEQ ID NO:9および(VL) SEQ ID NO:7;
(c) (VH) SEQ ID NO:12および(VL) SEQ ID NO:15;
(d) (VH) SEQ ID NO:19および(VL) SEQ ID NO:23;
(e) (VH) SEQ ID NO:20および(VL) SEQ ID NO:23; または
(f) 該(VH)および(VL)配列にわたり全体で1〜10個の変異もしくは置換を有する上記(a)〜(e)のいずれか1つに定義される(VH)および(VL)。すなわち、1つの態様において、VHおよびVL配列により定義されるVHおよびVL領域にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VHまたはVL配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。本発明の1つの態様において、VH配列において10個までの変異または置換がなされ、かつVL配列において変異はなされない。本発明の1つの態様において、VH配列において変異はなされず、かつVL配列において10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、VHおよびVL配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、VHおよびVL配列内での変異、例えば置換を可能にする。
【０１１４】
本発明の1つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の1つの態様において、抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgDまたはIgMアイソタイプのものである。
【０１１５】
本発明の好ましい態様において、抗体はIgG1抗体である。
【０１１６】
本発明の1つの態様において、抗体は、IgG1m(f)、IgG1m(z)、IgG1m(a)もしくはIgG1m(x)アロタイプ、またはIgG1m(z,a)、IgG1m(z,a,x)、IgG1m(f,a)などの、任意のアロタイプの組み合わせである。
【０１１７】
本発明の1つの態様において、抗体は、以下からなる群のアミノ酸配列を含むFc領域を含む:
(a) SEQ ID NO:29;
(b) SEQ ID NO:30;
(c) SEQ ID NO:31;
(d) SEQ ID NO:32; または
(e) 該配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を有する(a)〜(d)のいずれか1つに定義されるアミノ酸配列。すなわち、1つの態様において、Fc領域にわたり、全体で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、Fc領域にわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が許容される。
【０１１８】
本発明の1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38。
【０１１９】
本発明の1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39に記載される少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38。
【０１２０】
本発明による1つの態様において、抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:39の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択される配列の1つを含む:
(a) (HC) SEQ ID NO:33;
(b) (HC) SEQ ID NO:34;
(c) (HC) SEQ ID NO:35;
(d) (HC) SEQ ID NO:36;
(e) (HC) SEQ ID NO:37; および
(f) (HC) SEQ ID NO:38; または
(g) 該(HC)配列にわたり全体で1〜10個の変異を有する上記(a)〜(f)のいずれか1つに定義される(HC)。すなわち、1つの態様において、重鎖配列により定義される重鎖にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、重鎖配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、重鎖配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、重鎖配列内での変異または置換を可能にする。
【０１２１】
本発明の1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; および
(c) (HC) SEQ ID NO:42。
【０１２２】
本発明の1つの態様において、本明細書において開示される態様のいずれかに定義される抗DR5抗体は、重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43に記載される少なくとも75%、80%、85%、90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、かつここでHCは、以下からなる群より選択されるHC配列に記載されるアミノ酸配列を有する:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; および
(c) (HC) SEQ ID NO:42。
【０１２３】
本発明による1つの態様において、抗体は重鎖(HC)および軽鎖(LC)を含み、ここでLCはSEQ ID NO:43の配列を含み、かつここでHCは、以下からなる群より選択される配列の1つを含む:
(a) (HC) SEQ ID NO:40;
(b) (HC) SEQ ID NO:41; 
(c) (HC) SEQ ID NO:42; または
(d) 該(HC)配列にわたり全体で1〜10個の変異、例えば置換を有する上記(a)〜(c)のいずれか1つに定義される(HC)。すなわち、1つの態様において、重鎖配列により定義される重鎖にわたり、全体で10個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、重鎖配列にわたり1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個または10個の変異、例えば置換などの、10個までの変異、例えば置換がなされる。これにより、重鎖配列にわたり10個までの変異、例えば置換を可能にする態様が提供され、ここで変異、例えば置換は保存的であるか、または同様の物理的もしくは機能的特性を有するアミノ酸に関するものであり、それにより抗DR5抗体の結合親和性または機能を改変することなく、重鎖配列内での変異、例えば置換を可能にする。
【０１２４】
1つの態様において、抗体はヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
【０１２５】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体はアゴニストである。抗体がアゴニストであるということは、抗体がDR5をクラスタ化、刺激または活性化することと理解されるべきである。1つの態様において、DR5に結合した本発明のアゴニスト抗DR5抗体は、DR5に結合したTRAILと同じ細胞内経路を活性化する。抗体濃度希釈系列(例えば20,000 ng/mLから5倍希釈で0.05 ng/mLの終濃度まで)とともに3日間、標的細胞をインキュベートすることによって、1つまたは複数の抗体のアゴニスト活性を判定することができる。抗体は細胞を播種する際に直接添加されてもよく(実施例8、9、10、39に記載)、またあるいは、抗体サンプルを添加する前に細胞をまず初めに、96ウェル平底プレートに接着させる(実施例11、12、13、14、15、16、17、18、21、22、23、24、38、40、41、42、43、44、46、48に記載)。アゴニスト活性、すなわちアゴニスト効果は、PromegaのCellTiter-Glo発光細胞生存性アッセイ(カタログ番号G7571)などの、この目的のための特別なキットを用いて生存細胞の量を測定することにより定量化することができる。
【０１２６】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は増強されたアゴニスト活性を有する。抗DR5抗体が活性を有することは、抗体がDR5をクラスタ化できるか、またはDR5に結合したTRAILと少なくとも同じ細胞内経路を活性化できると理解されるべきである。すなわち、増強されたアゴニスト活性を有する抗DR5抗体は、TRAILまたはDR5に対する野生型IgG1抗体と比較して、DR5を発現する細胞または組織において増加したレベルのアポトーシスまたはプログラム細胞死を誘導することができる。
【０１２７】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、標的細胞においてプログラム細胞死を誘導する。本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、カスパーゼ依存性細胞死を誘導する。カスパーゼ依存性細胞死は、カスパーゼ-3および/またはカスパーゼ-7の活性化によって誘導されうる。本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、カスパーゼ-3および/またはカスパーゼ-7依存性細胞死を誘導する。本発明の1つの態様において、抗体はアポトーシスを誘導する。1つまたは複数のアゴニスト抗DR5抗体によるアポトーシスは、例えば、実施例19、20、25および45に記載のカスパーゼ-3/7活性化アッセイ法または実施例19および25に記載のホスファチジルセリンの露出などの方法を用いて判定することができる。例えば1 μg/mLの一定濃度の抗DR5抗体が接着細胞に添加され、1〜24時間インキュベートされうる。BD PharmingenのPE活性カスパーゼ-3アポトーシスキット(PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit) (カタログ番号550914) (実施例19および25)またはPromegaのカスパーゼ-Glo 3/7 (Caspase-Glo 3/7)アッセイ(カタログ番号G8091) (実施例20および45)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、カスパーゼ-3/7活性化を判定することができる。BD PharmingenのFITCアネキシンVアポトーシス検出キットI (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I) (カタログ番号556547) (実施例19および25)などの、この目的のための特別なキットを用いることによって、ホスファチジルセリンの露出および細胞死を判定することができる。
【０１２８】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、アネキシン-V結合によって測定できるホスファチジルセリン(PS)の露出を誘導する。本発明の1つの態様において、抗DR5は、標的細胞の細胞表面へのPSの転位置を誘導する。それゆえ、アネキシン-V結合は、プログラム細胞死と相関し、プログラム細胞死に至る細胞事象を誘導する抗DR5抗体の能力を測定するために用いることができる。
【０１２９】
本発明の好ましい態様において、抗DR5抗体は腫瘍細胞などの、DR5を発現する標的細胞においてアポトーシスを誘導する。
【０１３０】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は細胞生存性を低減する。
【０１３１】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体はDR5クラスタ化を誘導する。抗体がクラスタ化を誘導し、クラスタ化をさらに増強しうるということは、DR5に結合したTRAILと少なくとも同じ細胞内シグナル伝達経路の活性化に至る。
【０１３２】
1つの態様において、本発明の抗体または組成物は、DR5を発現するがん細胞またはがん組織におけるアポトーシスまたは細胞死を誘導、誘発、増大または増強する。増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露された、または本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞におけるホスファチジルセリンの露出の増大または増強されたレベルによって測定することができる。あるいは、増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露された、または本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞におけるカスパーゼ3またはカスパーゼ7の活性化を測定することによって測定することができる。あるいは、増大または増強されたアポトーシスまたは細胞死は、未処理の細胞培養物と比較して、本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体に曝露されたまたは本発明の1つもしくは複数の抗DR5抗体で処理された細胞培養物における生存性の喪失によって測定することができる。カスパーゼ媒介アポトーシスの誘導は、カスパーゼ阻害剤、例えばZVADによるDR5抗体への曝露後の生存性の喪失の阻害を実証することによって評価することができる。
【０１３３】
本発明の1つの態様において、抗DR5抗体は、DR5を発現する標的細胞上での抗体の六量体化などのオリゴマー化に関与する。六量体化などのオリゴマー化は、Fc-Fc相互作用を通じて媒介される。これを判定するための1つの方法は、抗体がオリゴマー化する、例えば六量体化することを示すFc-Fc相互作用を阻害することによるものである。Fc-Fc相互作用は、実施例15に記載されるようにDCAWHLGELVWCTなどのFc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチに結合するペプチドによって阻害することができる。
【０１３４】
二重特異性抗体
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも1つの抗原結合領域を含む二重特異性抗体を含む。
【０１３５】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の1つまたは複数の抗原結合領域を含む二重特異性抗体を含む。
【０１３６】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、本明細書において定義される第1の抗原結合領域および第2の抗原結合領域を含む。
【０１３７】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１３８】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここでヒトDR5に結合する該第1の抗原結合領域はヒトDR5に結合する該第2の抗原結合領域の結合をブロックしない。
【０１３９】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第1および/または第2のFc領域は、本発明によるヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異を含む。本発明の1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第1および第2のFc領域は、ヒトIgG1,におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異を含む。本発明の1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第1のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異を含む。本発明の1つの態様において、二重特異性抗DR5抗体は、第1および第2のFc領域を含み、ここで第2のFc領域は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異を含む。
【０１４０】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する上記(a)または(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換などの5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個などの、5個までの変異または置換が見出される。
【０１４１】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列を含み、(a) 該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(b) それぞれ各第1および第2の抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換などの5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個などの、5個までの変異、例えば置換が見出される。
【０１４２】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(c) 該6つのCDR配列それぞれにわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する上記(a)または(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換などの5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個などの、5個までの変異または置換が見出される。
【０１４３】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(b) それぞれ各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5つまでの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
【０１４４】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、またはここで該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異または置換を有する上記(a)または(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5つまでの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異または置換などの5つまでの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つなどの、5つまでの変異または置換が見出される。
【０１４５】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで、(a) 該第1の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列(VH) SEQ ID NO:16、17、18および(VL) SEQ ID NO:21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の6つのCDR配列(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含む、または(b) 該第1の抗原結合領域および該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、各抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力などの第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異、例えば置換などの、5つまでの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1つ、2つ、3つ、4つまたは5つなどの、5つまでの変異、例えば置換が見出される。
【０１４６】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の配列:(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:8、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6、または（b) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含み、かつここで該第2の抗原結合領域は以下の配列:(c) (VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14または(d) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(c)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
【０１４７】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:8、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14を含み、または（b) 該第1の抗原結合領域もしくは該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を含む。
【０１４８】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の配列:(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6または(b) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含み、かつここで該第2の抗原結合領域は以下の配列:(c) (VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14または(d) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(c)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
【０１４９】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:1、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:3および(VL) CDR1 SEQ ID NO:5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO:6を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14を含み、または(b) 該第1の抗原結合領域もしくは該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を含む。
【０１５０】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで該第1の抗原結合領域は以下の配列:(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:17、CDR3 SEQ ID NO:18および(VL) CDR1 SEQ ID NO:21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO:22または(b) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(a)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含み、かつここで該第2の抗原結合領域は以下の配列:(c) (VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14または(d) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を有する上記(c)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
【０１５１】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、第1および第2の抗原結合領域を含み、ここで(a) 該第1の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:16、CDR2 SEQ ID NO:17、CDR3 SEQ ID NO:18および(VL) CDR1 SEQ ID NO:21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO:22を含み、かつ該第2の抗原結合領域は以下の配列:(VH) CDR1 SEQ ID NO:10、CDR2 SEQ ID NO:2、CDR3 SEQ ID NO:11および(VL) CDR1 SEQ ID NO:13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO:14を含み、または(b) 該第1の抗原結合領域もしくは該第2の抗原結合領域は、各抗原結合領域の該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異を含む。
【０１５２】
抗体が、第1および第2の重鎖を含むFc領域を含む二重特異性抗体である場合、本発明による変異、すなわちIgG1のEU付番でのE430、E345またはS440に対応する位置における変異は原則として、重鎖の1つにのみ; すなわち第1または第2の重鎖のいずれかに存在しうるが、本発明による好ましい態様において、変異は二重特異性抗体の第1および第2の重鎖の両方に存在する。
【０１５３】
特定の態様において、抗体は、参照により本明細書に組み入れられるWO 11/131746に記載されたヘテロ二量体タンパク質などの二重特異性抗体でありうる。
【０１５４】
1つの態様において、抗体は、免疫グロブリンの第1のFc領域と第1の抗原結合領域とを含む第1の重鎖、および免疫グロブリンの第2のFc領域と第2の抗原結合領域とを含む第2の重鎖を含む二重特異性抗体であり、ここで第1および第2の抗原結合領域は、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープに結合する。
【０１５５】
さらなる態様において、第1のFc領域を含む第1の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み; かつここで第2のFc領域を含む第2の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含み、かつここで第1のFc領域を含む第1の重鎖における該さらなるアミノ酸置換は、第2のFc領域を含む第2の重鎖における該さらなるアミノ酸置換とは異なる。
【０１５６】
さらなる態様において、第1のFc領域を含む第1の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのK409に対応する位置にアミノ酸置換を含み; かつ第2のFc領域を含む第2の重鎖は、ヒトIgG1重鎖のFc領域でのF405に対応する位置にアミノ酸置換を含む。
【０１５７】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域においてE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436、およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基での変異を含む第1および第2のFc領域を導入することを含み、ただしS440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする。
【０１５８】
さらなる態様において、S440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436、およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基での第1および第2のFc領域における変異は、同じアミノ酸残基の位置または異なる位置にありうる。さらなる態様において、それは第1および第2のFc領域における同じアミノ酸残基の位置での同じまたは異なる変異でありうる。
【０１５９】
別の態様において、二重特異性抗体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436、およびK447に対応するものから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基での変異を含む第1または第2のCH2-CH3領域を含み、ただしS440における変異はS440YまたはS440Wであることを条件とする。
【０１６０】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は第1および第2の重鎖を含み、ここで該第1の重鎖は、EU付番でのヒトIgG1におけるF405Lに対応する変異を含み、かつ該第2の重鎖は、EU付番でのIgG1におけるK409Rに対応する変異を含む。
【０１６１】
本発明の1つの態様において、二重特異性抗体は薬学的組成物に含まれる。
【０１６２】
抗DR5抗体組成物
本発明のいずれかの局面または態様によるモノクローナル抗体または二重特異性抗体などの抗DR5抗体は、薬学的組成物、診断組成物または任意の他の組成物などの、組成物に含まれうる。
【０１６３】
1つの局面において、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれか1つによる少なくとも1つの抗DR5抗体を含む組成物に関する。
【０１６４】
1つの局面において、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれか1つによる1つまたは複数の抗DR5抗体を含む組成物に関する。この組成物は、2つの異なるモノクローナル抗DR5抗体の組み合わせなどの、同一ではない本明細書に記載の本発明による1つ、2つまたはそれ以上の抗DR5抗体を含みうる。
【０１６５】
本発明の1つの態様において、組成物は、本明細書に記載の第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含む。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は、本明細書に記載の第1の抗体および本明細書に記載の第2の抗体を含み、ここで第1および第2の抗体は同一ではない。
【０１６６】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む第1の抗DR5抗体およびヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１６７】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む第1の抗DR5抗体およびヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗体はDR5への第2の抗体の結合をブロックしない。
【０１６８】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む第1および第2の抗DR5抗体を含み、そのような変異は、E430G、E430SおよびE430Tからなる群より選択されうる。
【０１６９】
本発明の1つの態様において、組成物は、E430Gを含む第1の抗DR5抗体およびE430G変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2抗体はDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１７０】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列]:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、E430に対応する位置における変異を含む。
【０１７１】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む。
【０１７２】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE430G変異を含む。
【０１７３】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE430G変異を含む。
【０１７４】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、E430に対応する位置における変異を含む。
【０１７５】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE430に対応する位置における変異を含む。
【０１７６】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE430G変異を含む。
【０１７７】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE430G変異を含む。
【０１７８】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置における変異を含む第1の抗DR5抗体およびヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置における変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１７９】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置における変異を含む第1の抗DR5抗体およびヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置における変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗体はDR5への第2の抗体の結合をブロックしない。
【０１８０】
本発明の1つの態様において、組成物は、E345に対応する位置における変異を含む第1および第2の抗DR5抗体を含み、そのような変異は、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yからなる群より選択されうる。
【０１８１】
本発明の1つの態様において、組成物は、E345Kを含む第1の抗DR5抗体およびE345K変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2抗体はDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１８２】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、E345に対応する位置における変異を含む。
【０１８３】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置における変異を含む。
【０１８４】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE345K変異を含む。
【０１８５】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE345K変異を含む。
【０１８６】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、E345に対応する位置における変異を含む。
【０１８７】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのE345に対応する位置における変異を含む。
【０１８８】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE345K変異を含む。
【０１８９】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるE345K変異を含む。
【０１９０】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む第1の抗DR5抗体およびヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2の抗体がDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１９１】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む第1の抗DR5抗体およびヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗体はDR5への第2の抗体の結合をブロックしない。
【０１９２】
本発明の1つの態様において、組成物は、S440Yを含む第1の抗DR5抗体およびS440Y変異を含む第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2抗体はDR5上の異なるエピトープに結合する。
【０１９３】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む第1および第2の抗DR5抗体を含み、そのような変異は、S440WおよびS440Yからなる群より選択されうる。
【０１９４】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、S440に対応する位置における変異を含む。
【０１９５】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む。
【０１９６】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6:を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14:を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるS440Y変異を含む。
【０１９７】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、2、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるS440Y変異を含む。
【０１９８】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6:を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14:を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、S440に対応する位置における変異を含む。
【０１９９】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、ヒトIgG1におけるEU付番でのS440に対応する位置における変異を含む。
【０２００】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるS440Y変異を含む。
【０２０１】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:1、8、3および(VL) SEQ ID NO:5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗DR5抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO:10、2、11および(VL) SEQ ID NO:13、RTS、14を含み、かつここで該第1の抗DR5抗体および該第2の抗DR5抗体は、Fc領域におけるS440Y変異を含む。
【０２０２】
本発明の1つの態様において、組成物は、第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2の抗体はヒトIgG1 EU付番でのK439EまたはS440Kに対応するさらなる六量体化阻害変異を含む。本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1および第2の抗DR5抗体はヒトIgG1におけるEU付番でのE430、E345もしくはS440に対応するアミノ酸位置での六量体化増強変異を含み、かつここで第1の抗体が、K439に対応するアミノ酸位置でのさらなる変異を含み、またはかつここで第2の抗体が、S440に対応するアミノ酸位置でのさらなる変異を含み、ただしさらなる変異がS440にある場合には六量体化増強変異はS440にないことを条件とする。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体はE430GおよびK439Eなどの六量体化増強変異を含み、かつここで第2の抗DR5抗体はE430GおよびS440Kなどの六量体化増強変異を含む。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで第1の抗DR5抗体はE345KおよびK439Eなどの六量体化増強変異を含み、かつここで第2の抗DR5抗体はE345KおよびS440Kなどの六量体化増強変異を含む。これにより、K439E変異を含む抗体およびS440K変異を含む抗体の組み合わせの間で六量体化が排他的に行われる組成物を可能にする態様が提供される。
【０２０３】
本発明の1つの態様において、組成物は、ヒトDR5上の異なるエピトープに結合する第1の抗DR5抗体および第2の抗DR5抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、SEQ ID NO 46のアミノ酸残基番号116〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基およびアミノ酸残基番号139〜166内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む第1の抗DR5抗体ならびにSEQ ID NO 46のアミノ酸残基番号79〜138内に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基を含むまたは必要とするDR5上のエピトープに結合する抗原結合領域を含む第2の抗DR5抗体を含む。
【０２０４】
本発明の1つの態様において、組成物は、DR5への第2の抗DR5抗体の結合をブロックしないDR5に結合する第1の抗DR5抗体を含む。すなわち、本発明の1つの態様において、組成物は、第1および第2の抗DR5抗体がDR5への結合について競合しない、DR5に結合する第1の抗DR5抗体およびDR5に結合する第2の抗DR5抗体を含む。したがって、本発明の文脈において、第2の抗DR5抗体の結合をブロックしない第1の抗DR5抗体は、第2の抗DR5抗体と競合しない第1の抗DR5抗体と同じものでありうることが理解されるべきである。
【０２０５】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し; かつ該第2の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２０６】
その1つの態様において、第1の抗体および第2の抗体の全体で6つのCDR配列の配列同一性は、少なくとも85%、90%、95%、97%、または99%である。
【０２０７】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで該第1の抗体および該第2の抗体は(c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換のような5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個のような、5個までの変異または置換が見出される。
【０２０８】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、2、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される各抗体の6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換のような5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個のような、5個までの変異、例えば置換が見出される。
【０２０９】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FASと少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し; かつ該第2の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。その1つの態様において、第1の抗体および第2の抗体の全体で6つのCDR配列の配列同一性は、少なくとも85%、90%、95%、97%、または99%である。
【０２１０】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで該第1の抗体および該第2の抗体は(c) それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換のような5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個のような、5個までの変異または置換が見出される。
【０２１１】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 1、8、3および(VL) SEQ ID NO: 5、FAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される各抗体の6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換のような5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個のような、5個までの変異、例えば置換が見出される。
【０２１２】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (a) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し; かつ該第2の抗体は、6つのCDR配列を含むVH領域およびVL領域を含み、ここで全体で6つのCDR配列が、以下に記載されるCDR配列: (b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する。その1つの態様において、第1の抗体および第2の抗体の全体で6つのCDR配列の配列同一性は、少なくとも85%、90%、95%、97%、または99%である。
【０２１３】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(a) (VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(b) (VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで該第1の抗体および該第2の抗体は(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異または置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換のような5個までの変異または置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異または置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個のような、5個までの変異または置換が見出される。
【０２１４】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで(a) 該第1の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 16、17、18および(VL) SEQ ID NO: 21、GAS、6を含み、かつ該第2の抗体は以下の6つのCDR配列:(VH) SEQ ID NO: 10、2、11および(VL) SEQ ID NO: 13、RTS、14を含み、またはここで(b) 該第1の抗体および該第2の抗体は、それぞれ該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む(a)に定義される各抗体の6つのCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。すなわち、1つの態様において、抗原結合領域を含む6つのCDRにわたり、全体で5個までの変異、例えば置換が許容される。本発明のいくつかの態様において、VH領域の3つのCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個の変異または置換のような5個までの変異、例えば置換が作出され、かつVL領域のCDRにわたり変異が作出されない。他の態様において、VH領域のCDRにわたり変異、例えば置換が作出されないが、VL領域のCDRにわたり1個、2個、3個、4個または5個のような、5個までの変異、例えば置換が見出される。
【０２１５】
本発明の1つの態様において、組成物は、上記態様のいずれかに定義される第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は、ヒトIgG1, EU付番でのK439またはS440位に対応するFc領域における変異をさらに含む。本発明の1つの態様において、組成物は、K439EのようなK439に対応する変異を含む第1の抗体およびS440KのようなS440に対応する変異を含む第2の抗体を含む。本発明の1つの態様において、組成物は、S440KのようなS440に対応する変異を含む第1の抗体およびK439EのようなK439に対応する変異を含む第2の抗体を含む。これにより、組成物が、E430GおよびK439Eのような少なくとも2つの変異を含む第1の抗体ならびにE430GおよびS440Kのような少なくとも2つの変異を含む第2の抗体を含む態様が提供される。本発明の別の態様において、組成物は、E345KおよびK439Eのような少なくとも2つの変異を含む第1の抗体ならびにE345KおよびS440Kのような少なくとも2つの変異を含む第2の抗体を含む。これにより、異なる特異性を有する抗体の六量体化を可能にする態様が提供される。
【０２１６】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の配列(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5, CDR2 FAS, CDR3 SEQ ID NO 6を含み、かつ該第2の抗体は以下の配列(b) (VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
【０２１７】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は以下のCDR配列を含み、(a) 該第1の抗体は以下のCDR配列(VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 8、CDR3 SEQ ID NO 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6を含み、かつ該第2の抗体は以下のCDR配列(VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(b) 各抗体について該CDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む各抗体について(a)に記述されるCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
【０２１８】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の配列(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 2、CDR3 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 6を含み、かつ該第2の抗体は以下の配列(b) (VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 2、CDR3 11および(VL) SEQ ID NO CDR1 13、CDR2 RTS、CDR3 14または(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
【０２１９】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は以下のCDR配列を含み、(a) 該第1の抗体は以下のCDR配列(VH) CDR1 SEQ ID NO 1、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 3および(VL) CDR1 SEQ ID NO 5、CDR2 FAS、CDR3 SEQ ID NO 6を含み、かつ該第2の抗体は以下のCDR配列(VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(b) 各抗体について該CDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む各抗体について(a)に記述されるCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
【０２２０】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体は以下の配列(a) (VH) CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO 18および(VL) CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22を含み、かつ該第2の抗体は以下の配列(b) (VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(c) 該6つのCDR配列にわたり全体で1〜5個の変異もしくは置換を有する上記(a)もしくは(b)に定義される(VH) CDR1、CDR2およびCDR3ならびに(VL) CDR1、CDR2およびCDR3を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異または置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
【０２２１】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1および第2の抗体は以下のCDR配列を含み、(a) 該第1の抗体は以下のCDR配列(VH) CDR1 SEQ ID NO 16、CDR2 SEQ ID NO 17、CDR3 SEQ ID NO 18および(VL) CDR1 SEQ ID NO 21、CDR2 GAS、CDR3 SEQ ID NO 22を含み、かつ該第2の抗体は以下のCDR配列(VH) CDR1 SEQ ID NO 10、CDR2 SEQ ID NO 2、CDR3 SEQ ID NO 11および(VL) CDR1 SEQ ID NO 13、CDR2 RTS、CDR3 SEQ ID NO 14または(b) 各抗体について該CDR配列にわたり全体で1〜5個の変異、例えば置換を含む各抗体について(a)に記述されるCDR配列を含む。すなわち、抗原結合領域の6つのCDR配列にわたる1つまたは複数の変異、例えば置換は、DR5を発現する標的細胞においてアゴニスト特性、DR5エピトープ結合および/またはアポトーシスを誘導する能力のような第1または第2の抗体の結合特性を変化させない。
【０２２２】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は1:1のモル比、1:2のモル比、1:3のモル比、1:4のモル比、1:5のモル比、1:6のモル比、1:7のモル比、1:8のモル比、1:9のモル比、1:10のモル比、1:15のモル比、1:20のモル比、1:25のモル比、1:30のモル比、1:35のモル比、1:40のモル比、1:45のモル比、1:50のモル比、50:1のモル比、45:1のモル比、40:1のモル比、35:1のモル比、30:1のモル比、25:1のモル比、20:1のモル比、15:1のモル比、10:1のモル比、9:1のモル比、8:1のモル比、7:1のモル比、6:1のモル比、5:1のモル比、4:1のモル比、3:1のモル比、2:1のモル比のような、1:49〜49:1のモル比で組成物中に存在する。
【０２２３】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は1:9〜9:1のモル比で組成物中に存在する。
【０２２４】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体はおよそ1:1のモル比で組成物中に存在する。
【０２２５】
本発明の1つの態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体および該第2の抗体は1:1のモル比で組成物中に存在する。
【０２２６】
本発明の好ましい態様において、組成物は第1および第2の抗DR5抗体を含み、ここで該第1の抗体および第2の抗体ならびに/または任意のさらなる抗体は、等モル比で組成物中に存在する。
【０２２７】
本発明の1つの態様において、組成物は薬学的組成物である。
【０２２８】
本発明の薬学的組成物は、本発明の任意の局面または態様によるモノクローナル抗体または二重特異性抗体のような抗体を含みうる。
【０２２９】
薬学的組成物は、(Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2012 June, ISBN 9780857110275)に開示されているものなどの従来の技法にしたがって、薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の既知の補助剤および賦形剤とともに製剤化されうる。
【０２３０】
薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに任意の他の既知の補助剤および賦形剤は、本発明の抗体または二重特異性抗体および選択の投与様式に適しているべきである。薬学的組成物の担体および他の構成要素に対する適当性を、本発明の選択化合物または薬学的組成物の所望の生物学的特性に及ぼす顕著な負の影響の欠如(例えば、抗原結合に及ぼす実質的な影響に満たない(10%またはそれ以下の相対阻害、5％またはそれ以下の相対阻害など))に基づいて決定する。
【０２３１】
本発明の薬学的組成物はまた、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、界面活性剤(例えば、Tween-20もしくはTween-80のような、非イオン性界面活性剤)、安定化剤(例えば、糖もしくは無タンパク質アミノ酸)、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、および/または薬学的組成物に含めるのに適した他の材料を含みうる。
【０２３２】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者にとって毒性がない状態で、特定の患者、組成物、および投与の様式について所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変えられうる。選択される投薬レベルは、利用される本発明の特定の組成物、またはそのアミドの活性、投与の経路、投与の時間、利用されている特定の化合物の排出の速度、処置の継続期間、利用される特定の組成物と組み合わせて用いられるその他の薬物、化合物、および/または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康および以前の病歴、ならびに医療技術分野において周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態学的因子に依存するであろう。
【０２３３】
薬学的組成物は任意の適当な経路および様式によって投与されうる。インビボおよびインビトロで本発明の化合物を投与する適当な経路は、当技術分野において周知であり、かつ当業者によって選択されうる。
【０２３４】
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、非経口的に投与される。
【０２３５】
本明細書において用いられる「非経口投与」および「非経口的に投与される」という用語は、通常は注射による、腸内および局所への投与以外の投与の様式をいい、ならびに上皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入を含む。
【０２３６】
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は静脈内または皮下の注射または注入によって投与される。
【０２３７】
本発明の1つの態様において、薬学的組成物は薬学的担体とともに、モノクローナル抗体または二重特異性抗体のような本発明による1つまたは複数の抗体を含む。
【０２３８】
薬学的に許容される担体は、本発明の化合物と生理学的に適合する任意のおよびすべての適当な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤(isotonicity agent)、酸化防止剤ならびに吸収遅延剤などを含む。
【０２３９】
本発明の薬学的組成物において利用されうる適当な水性および非水性の担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびその適当な混合物、オリーブ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、および胡麻油のような、植物油、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、トラガカントゴム、およびオレイン酸エチルのような、注射可能な有機エステル、ならびに/または様々な緩衝液が挙げられる。他の担体は薬学の技術分野において周知である。
【０２４０】
薬学的に許容される担体には、滅菌注射可能水溶液または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【０２４１】
適切な流動性は、例えば、レシチンのような、コーティング材料の使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および表面活性物質の使用によって維持されうる。
【０２４２】
本発明の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤、例えば(1) アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどのような、水溶性酸化防止剤; (2) パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、プロピルガレート、アルファ-トコフェロールなどのような、油溶性酸化防止剤；および(3) クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような、金属キレート剤を含みうる。
【０２４３】
本発明の薬学的組成物はまた、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、グリセロールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含みうる。
【０２４４】
本発明の薬学的組成物はまた、薬学的組成物の貯蔵寿命または有効性を増強しうる保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、保存剤または緩衝液のような、選択の投与経路に適した1つまたは複数の補助剤を含有しうる。本発明の化合物は、例えばインプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤のような、化合物を迅速な放出から保護する担体を用いて調製されうる。そのような担体は、ゼラチン、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、生分解性生体適合性重合体、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を単独でもしくはワックスとともに、または当技術分野において周知の他の材料を含みうる。そのような製剤の調製のための方法は一般に、当業者には公知である。
【０２４５】
1つの態様において、本発明の化合物は、インビボでの適正な分布を確実にするように製剤化されうる。非経口投与用の薬学的に許容される担体には、滅菌水性溶液または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来の媒質または薬剤は活性化合物と不適合でない限り、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。他の活性化合物または治療用化合物も組成物に組み入れられうる。
【０２４６】
注射または注入用の薬学的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化されうる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような)、およびそれらの適当な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含有する水性または非水性の溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および表面活性物質の使用によって維持されうる。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされうる。滅菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、例えば、必要に応じて上に列挙したような成分の1つまたは組み合わせと共に組み入れ、その後に滅菌精密ろ過を行うことによって調製されうる。一般に、分散液は、基礎分散媒と必要な他の成分、例えば上に列挙したものからの成分とを含有する滅菌媒体に、活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、活性成分と所望する任意の追加成分との粉末を前もって滅菌ろ過したその溶液から与える真空乾燥および冷凍乾燥(凍結乾燥)である。
【０２４７】
滅菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙したような成分の1つまたは組み合わせと共に組み入れ、その後に滅菌精密ろ過を行うことによって調製されうる。一般に、分散液は、基礎分散媒と上に列挙したものからの必要な他の成分とを含有する滅菌媒体に、活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法の例は、活性成分と所望する任意の追加成分との粉末を前もって滅菌ろ過したその溶液から与える真空乾燥および冷凍乾燥(凍結乾燥)である。
【０２４８】
本発明の薬学的組成物は、本発明の1つもしくは複数のモノクローナル抗体または1つもしくは複数の二重特異性抗体、本発明による抗体または二重特異性抗体と別の治療用化合物との組み合わせ、あるいは本発明の化合物の組み合わせを含有しうる。
【０２４９】
治療用途
本発明の任意の局面または態様によるモノクローナル抗体、二重特異性抗体または組成物のような抗体は、薬物として、すなわち治療用途のために用いられうる。
【０２５０】
本発明の1つの態様において、組成物は、薬物として用いるためのモノクローナル抗体または二重特異性抗体のような、本発明による1つまたは複数の抗体を含む。
【０２５１】
別の局面において、本発明は、対象においてDR5を発現する細胞に関わる障害を処置または予防するための方法であって、本発明の抗DR5抗体、二重特異性抗体または1つもしくは複数の抗体を含む組成物の治療的有効量の、それを必要とする対象への投与を含む該方法を提供する。本方法は、典型的には、障害を処置または予防するのに有効な量の本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を伴う。
【０２５２】
本発明の抗DR5抗体は、DR5を発現する細胞に関連する障害の処置または予防において用いることができる。例えば、抗体は、DR5発現細胞に関わる障害を処置または予防するために、ヒト対象に、例えばインビボに、投与されうる。本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は、典型的には、抗DR5抗体または二重特異性抗体が投与されるヒトである。対象は、例えば、DR5機能を調節することにより、またはDR5発現細胞を直接的もしくは間接的に死滅させることにより、是正または改善されうる障害を有するヒト患者を含みうる。
【０２５３】
1つの局面において、本発明は、DR5を発現する細胞に関連する疾患または障害の症状の処置または改善で用いるための、本明細書の任意の局面または態様において定義される抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物に関する。
【０２５４】
本発明の1つの態様において、感染性疾患、自己免疫疾患または心血管奇形の処置で用いるための、本明細書において開示される任意の局面または態様による抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物。
【０２５５】
1つの局面において、本発明は、がんおよび/または腫瘍の症状の処置または改善で用いるための、本明細書の任意の局面または態様において定義される抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物に関する。
【０２５６】
本発明の1つの態様において、本発明の任意の局面または態様による抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、がんおよび/または腫瘍の処置において用いるためのものである。
【０２５７】
「がん」という用語は、典型的には未調節の増殖によって特徴付けられるヒトのような哺乳動物における生理学的状態をいい、または記述する。大部分のがんは、2つのより大きな群のがん、すなわち固形腫瘍および血液学的腫瘍の1つに属する。
【０２５８】
特定の局面において、抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物は、がんを発症するリスクを低減させ、がん進行における事象の発症を遅延させ、またはがんが寛解したおよび/もしくは原発腫瘍が外科的に除去された場合に再発のリスクを低減させるために予防的に投与される。後者の場合、抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物は、例えば、手術に関連して(すなわち、手術前、手術中または手術後に)投与されうる。予防的投与は、他の生物学的要因のために存在すると考えられる腫瘍の位置を特定することが困難な患者においても有用でありうる。
【０２５９】
1つの態様において、本発明の1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、固形腫瘍および/または血液学的腫瘍の処置において用いるためのものである。
【０２６０】
1つの態様において、本発明の1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、結腸直腸がんおよび結腸直腸腺がんを含む結腸直腸がん、膀胱がん、骨肉腫、軟骨肉腫、トリプルネガティブ乳がんを含む乳がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経線維肉腫、神経内分泌腫瘍を含む中枢神経系のがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、胃腺がんを含む胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、肝細胞がんを含む肝臓がん、非小細胞肺がん(NSCLC)および小細胞肺がん(SCLC)を含む肺がん、卵巣がん、膵管がんおよび膵臓腺がんを含む膵臓がん、肉腫、または悪性黒色腫および非黒色腫皮膚がんを含む皮膚がんなどの、固形腫瘍の処置において用いるためのものである。
【０２６１】
本発明の1つの態様において、1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、白血病、慢性リンパ球性白血病および骨髄性白血病など、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病など、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫などまたは多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫など、および骨髄異形成症候群などの、血液学的腫瘍の処置において用いるためのものである。
【０２６２】
本発明の特定の態様において、1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、以下のがん群から選択されるがんの処置において用いるためのものである; 膀胱がん、骨がん、結腸直腸がん、肉腫、子宮内膜がん、線維芽細胞がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、筋肉がん、神経組織がん、卵巣がん、膵臓がんおよび皮膚がん。
【０２６３】
本発明の1つの態様において、1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、DR5陽性またはDR5発現腫瘍またはがんの増殖の阻害において用いるためのものである。
【０２６４】
本発明において、DR5陽性腫瘍またはがんは、細胞表面上にDR5を発現する腫瘍細胞および/またはがん細胞と理解されるべきである。そのようなDR5発現は、免疫組織化学、フローサイトメトリー、画像化または他の適当な診断方法によって検出されうる。
【０２６５】
本発明の1つの態様において、1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、DR5発現腫瘍またはがんの増殖の阻害において用いるためのものである。DR5の異種発現を示す腫瘍およびがん組織も、DR5陽性腫瘍およびがんとみなされる。
【０２６６】
腫瘍および/またはがんは、DR5発現を示すいくつかの腫瘍および/またはがん細胞および/または組織にてDR5を発現することがあり、いくつかの腫瘍および/またはがんは、DR5の過剰発現または異常発現を示すことがあり、その一方で他の腫瘍および/またはがんがDR5の異種発現を示す。そのような腫瘍および/またはがんはすべて、抗DR5抗体、二重特異性抗体および本発明によるそのような抗体を含む組成物を用いた処置に適した標的でありうる。
【０２６７】
本発明の1つの態様において、1つまたは複数の抗DR5抗体または二重特異性抗体を含む組成物は、DR5発現腫瘍におけるアポトーシスの誘導において用いるためのものである。
【０２６８】
本発明の別の局面は、本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法を含む。
【０２６９】
本発明の1つの態様において、本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法は、該個体にさらなる治療剤を投与する段階をさらに含む。
【０２７０】
本発明の1つの態様において、さらなる治療剤は、化学療法薬(パクリタキセル、テモゾロミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、イリノテカン、ドキソルビシン、ゲムシタビン、5-フルオロウラシル、ペメトレキセドを含むが、これらに限定されない)、キナーゼ阻害剤(ソラフェニブ、スニチニブまたはエベロリムスを含むが、これらに限定されない)、アポトーシス調節物質(組み換えヒトTRAILまたはビリナパントを含むが、これらに限定されない)、RAS阻害剤、プロテアソーム阻害剤(ボルテゾミブを含むが、これに限定されない)、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(ボリノスタットを含むが、これに限定されない)、栄養補助食品、サイトカイン(IFN-γを含むが、これに限定されない)、抗体または抗体模倣体(抗TF、抗AXL、抗EGFR、抗IGF-1R、抗VEGF、抗CD20、抗CD38、抗HER2、抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD40、抗CD137、抗GITR、抗VISTA (もしくは他の免疫調節標的)抗体および抗体模倣体を含むが、これらに限定されない)、ならびにブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、HuMax-TF-ADCまたはHuMax-AXL-ADCのような抗体-薬物コンジュゲートの群より選択される単一の薬剤または薬剤もしくはレジメンを含む薬剤の組み合わせである。
【０２７１】
さらなる局面において、本発明は、本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物を含む要素のキットを含み、該抗体、二重特異性抗体または組成物は、1つまたは複数のバイアルのような1つまたは複数の容器中にある。
【０２７２】
本発明の1つの態様において、本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物を含む要素のキットは、治療での同時使用、別個使用または逐次使用のためのものである。
【０２７３】
さらなる態様において、本発明は、がんの処置のための薬物の製造のための本発明による抗DR5抗体、二重特異性抗体または組成物の使用のためのものである。
【０２７４】
本発明の態様を記述する際に、すべての可能な態様の組み合わせおよび入れ替えは明示的に記述されていない。それにもかかわらず、ある種の手段が相互に異なる従属請求項に記載されているか、または異なる態様に記述されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを有利に使用できないことを示すものではない。本発明は、記述された態様のすべての可能な組み合わせおよび入れ替えを想定する。
【０２７５】
本発明の別の局面において、本発明は、表1に示されるアミノ酸配列による抗体をコードする核酸構築物を含む。すなわち1つの態様において、本発明は、SEQ ID No: 1〜23または29〜43に示されるアミノ酸配列に対応する抗体をコードする核酸構築物を含む。本発明の1つの態様において、核酸構築物は、本明細書において開示されるいずれかの態様による抗体をコードする。
【０２７６】
さらなる局面において、本発明は、Fc領域が、ヒトIgG1, EU付番でのE430、E345またはS440に対応するアミノ酸位置の変異を含む、本発明による抗体をコードする核酸に関する。本発明による抗体をコードする核酸は、本明細書において記述される特定のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むことがさらに企図される。したがって、1つの態様において、核酸は、SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42または43による配列を有する抗体をコードする。
【０２７７】
別の局面において、本発明は、本発明において用いるためのヒト抗DR5抗体、ヒト化抗DR5抗体またはキメラ抗DR5抗体の配列をコードする核酸に関し、そのような抗体の配列をコードする発現ベクターに関し、そのような発現ベクターを含む宿主細胞に関し、そのような抗体を産生するハイブリドーマに関し、およびそのような宿主細胞またはハイブリドーマを、抗体が産生され、任意で、回収される適切な条件の下で培養することによりそのような抗体を産生する方法に関する。ヒト化抗DR5抗体は、「huDR5」とも表示されうる。
【０２７８】
1つの態様において、本発明は、SEQ ID No: 33〜43によるアミノ酸配列の1つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。
【０２７９】
1つの態様において、本発明は、SEQ ID NO: 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42および43、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO: 3および11から選択されるVH CDR3アミノ酸配列のいずれか1つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO: 4、9および12から選択されるVHアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、SEQ ID NO: 7および15から選択されるVLアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、発現ベクターは、ヒト抗体軽鎖の、ヒト抗体重鎖の、または両方の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、SEQ ID NO:58、59、60、61、62、63、64、65、66、67および68からなる群より選択されるヒト抗体重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【０２８０】
特定の態様において、発現ベクターは、上記アミノ酸配列の1つまたは複数の変種をコードするヌクレオチド配列を含み、該変種は、多くとも25個のアミノ酸改変、例えば多くとも20個、例えば多くとも15、14、13、12、もしくは11個のアミノ酸改変、例えば10、9、8、7、6、5、4、3、2、もしくは1個のアミノ酸改変、例えば欠失もしくは挿入、好ましくは置換、例えば保存的置換、または該配列のいずれかと少なくとも80%の同一性、例えば上記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも85%の同一性もしくは90%の同一性もしくは95%の同一性、例えば96%の同一性もしくは97%の同一性もしくは98%の同一性もしくは99%の同一性を有する。
【０２８１】
本発明の文脈における発現ベクターは、染色体ベクター、非染色体ベクター、および合成核酸ベクター(適当な発現制御要素のセットを含む核酸配列)を含む、任意の適当なベクターでありうる。そのようなベクターの例としては、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組み合わせ由来のベクター、ならびにウイルス核酸(RNAまたはDNA)ベクターが挙げられる。1つの態様において、ヒト化CD3抗体をコードする核酸は、例えば線状発現要素(例えばSykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355 59 (1997)に記述されているような)、コンパクト核酸ベクター(例えばUS 6,077,835および/もしくはWO 00/70087に記述されているような)、pBR322、pUC 19/18、もしくはpUC 118/119のようなプラスミドベクター、「midge」最小サイズ核酸ベクター(例えばSchakowski et al., Mol Ther 3, 793 800 (2001)に記述されているような)を含め、裸のDNAもしくはRNAベクター中に、またはCaPO4-沈殿された構築物のような、沈殿された核酸ベクター構築物(例えばWO 00/46147、Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551 55 (1986)、Wigler et al., Cell 14, 725 (1978)、およびCoraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)に記述されているような)として含まれる。そのような核酸ベクターおよびその使用法は、当技術分野において周知である(例えばUS 5,589,466およびUS 5,973,972を参照のこと)。1つの態様において、ベクターは、細菌細胞におけるヒト化抗DR5抗体の発現に適している。そのようなベクターの例としては、BlueScript (Stratagene)、pINベクター(Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503 5509 (1989))、pETベクター(Novagen, Madison WI)などのような発現ベクターが挙げられる。
【０２８２】
発現ベクターは、同様にまたはあるいは、酵母系における発現に適したベクターでありうる。酵母系における発現に適した任意のベクターが利用されうる。適当なベクターには、例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびPGHのような構成性または誘導性プロモーターを含むベクターが含まれる(F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)、およびGrant et al., Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987)において概説されている)。
【０２８３】
核酸および/またはベクターはまた、新生ポリペプチド鎖のような、ポリペプチドをペリプラズム空間へまたは細胞培地中へ向けることができる分泌/局在化配列をコードする核酸配列を含みうる。そのような配列は当技術分野において公知であり、分泌リーダーまたはシグナルペプチド、オルガネラ標的指向性配列(例えば、核局在化配列、ER保持シグナル、ミトコンドリア輸送配列、葉緑体輸送配列)、膜局在化/アンカー配列(例えば、輸送停止配列、GPIアンカー配列)などを含む。
【０２８４】
本発明の発現ベクターにおいて、抗DR5抗体をコードする核酸ならびに第1および第2のポリペプチド核酸は、任意の適当なプロモーター、エンハンサー、および他の発現促進要素を含みまたは伴いうる。そのような要素の例としては、強力な発現プロモーター(例えば、ヒトCMV IEプロモーター/エンハンサーならびにRSV、SV40、SL3-3、MMTVおよびHIV LTRプロモーター)、有効なポリ(A)終結配列、大腸菌におけるプラスミド産物のための複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および/または好都合なクローニング部位(例えば、ポリリンカー)が挙げられる。核酸はまた、CMV IEのような構成性プロモーターとは対照的に誘導性プロモーターを含みうる(当業者は、そのような用語が実際には、ある種の条件下でのある程度の遺伝子発現の記述子であることを認識するであろう)。
【０２８５】
1つの態様において、抗DR5抗体をコードする発現物は、ウイルスベクターを介して宿主細胞もしくは宿主動物中に配置され、および/または宿主細胞もしくは宿主動物に送達される。
【０２８６】
そのような発現ベクターは、抗DR5抗体の組み換え産生のために用いられうる。1つの局面において、本明細書において記述されるいずれかの局面または態様の抗DR5抗体は、抗体を産生する組み換え真核または原核宿主細胞の使用によって提供される。したがって、本発明は、本明細書において定義される抗DR5抗体を産生する、トランスフェクトーマのような、組み換え真核または原核宿主細胞を提供する。宿主細胞の例としては、CHOまたはHEK-293細胞のような、酵母、細菌および哺乳動物の細胞が挙げられる。例えば、1つの態様において、宿主細胞は、本明細書において記述される抗DR5抗体の発現をコードする配列を含む、細胞ゲノムへ安定に組み込まれた核酸を含む。1つの態様において、宿主細胞は、本明細書において記述される第1または第2のポリペプチドの発現をコードする配列を含む、細胞ゲノムへ安定に組み込まれた核酸を含む。別の態様において、宿主細胞は、本明細書において記述される抗DR5抗体、第1または第2のポリペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線状発現要素のような、非組み込み核酸を含む。
【０２８７】
本明細書において用いられる「組み換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という用語は、発現ベクターが導入された細胞をいうように意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫もいうように意図されることが理解されるべきである。変異または環境の影響のために後続の世代ではある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお、本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組み換え宿主細胞には、例えば、CHO細胞、HEK-293細胞、PER.C6、NS0細胞、およびリンパ球細胞のようなトランスフェクトーマ、ならびに大腸菌のような原核細胞や植物細胞および真菌のような他の真核生物宿主が含まれる。
【０２８８】
本明細書において用いられる「トランスフェクトーマ」という用語は、CHO細胞、PER.C6、NS0細胞、HEK-293細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌のような、抗体または標的抗原を発現する組み換え真核生物宿主細胞を含む。
【０２８９】
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体を産生するための方法であって、
(a) 上記の本明細書において記述される本発明のハイブリドーマまたは宿主細胞を培養する段階、ならびに
(b) 培地から本発明の抗体を回収および/または精製する段階
を含む、該方法に関する。
【０２９０】
さらなる局面において、抗体の配列をコードするヌクレオチド配列は、治療用ポリペプチドのような、第2の部分をさらにコードする。例示的な治療用抗体は、本明細書の他の箇所に記述されている。1つの態様において、本発明は、抗体融合タンパク質を産生するための方法であって、
(a) そのようなヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する段階、ならびに
(b) 培地から抗体融合タンパク質を回収および/または精製する段階
を含む、該方法に関する。
【０２９１】
本発明の1つの局面において、本発明は、本明細書において開示されるいずれかの態様による抗体をコードする1つまたは複数の核酸構築物を含む発現ベクターを含む。
【０２９２】
本発明のさらなる局面において、本発明は、発現ベクターを含む宿主細胞を含む。
【０２９３】
本発明の1つの態様において、宿主細胞は、組み換え原核細胞、組み換え真核細胞または組み換え微生物宿主細胞のような、組み換え宿主細胞である。
【０２９４】
配列の表1
2019500869.tif 000005
2019500869.tif 000006
2019500869.tif 000007
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2019500869.tif 000018
2019500869.tif 000019
2019500869.tif 000020
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【実施例】
【０２９５】
実施例1：抗体構築物および抗原構築物
DR5のための発現構築物
ヒトの完全長DR5タンパク質（SEQ ID NO 46）、アカゲザルの完全長DR5タンパク質（SEQ ID NO 25）、およびマウスの完全長DR5タンパク質（SEQ ID NO 26）の発現のためのコドン最適化構築物を、利用可能な配列：ヒト（Homo sapiens）DR5（Genbankアクセッション番号NP_003833、UniprotKB/Swiss-Prot O14763-1）、アカゲザル（Macaca mulatta）DR5（Genbankアクセッション番号EHH28346）、マウス（Mus musculus）DR5（UniprotKB/Swiss-Prot Q9QZM4）に基づいて生成した。DR5抗体の結合領域のマッピング（実施例6に記載されている通り）のために、以下のキメラヒト／マウスDR5構築物；それぞれ、対応するマウスDR5配列によって以下の一部が置き換えられたヒトDR5（数字はヒト配列を指す）を作製した：構築物A aa 56〜68、構築物B aa 56〜78、構築物C aa 69〜78、構築物D aa 79〜115、構築物E 79〜138、構築物F aa 97〜138、構築物G aa 139〜166、構築物H aa 139〜182、構築物I aa 167〜182、構築物J 167〜210、構築物K aa 183〜210。機能喪失変異K415Nを、ヒトDR5デスドメイン中に導入した（SEQ ID NO 44）。加えて、C末端Hisタグを有するヒトDR5の細胞外ドメイン（ECD）のためのコドン最適化構築物：DR5ECD-FcHistag（SEQ ID NO 27）およびDR5ECDdelHis（SEQ ID NO 28）を生成した。すべての構築物は、クローニングに適している制限部位および最適コザック（GCCGCCACC）配列を含有していた。構築物を、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.3（Invitrogen）にクローニングした。
【０２９６】
抗体のための発現構築物
抗体発現のために、キメラヒト／マウスDR5抗体DR5-01およびDR5-05（EP2684896A1に基づく）ならびにそれらのヒト化バリアントhDR5-01およびhDR5-05（WO2014/009358に基づく）の、以前に記載されているようなVHおよびVL配列を、関連性のある定常HCおよびLC領域を含有する発現ベクター（pcDNA3.3）にクローニングした。所望の変異を、遺伝子合成または部位特異的変異誘発のいずれかによって導入した。
【０２９７】
実施例のいくつかにおいて、事前に記載されている、DR5に対する参照抗体を使用した。IgG1-CONA（US7521048 B2およびWO2010/138725に基づく）ならびにIgG1-chTRA8（EP1506285B1およびUS7244429B2に基づく）を、上記のような関連性のある抗体発現ベクターにクローニングした。
【０２９８】
実施例のいくつかにおいて、gp120特異的抗体であるヒトIgG1抗体IgG1-b12を、陰性対照として使用した（Barbas et al., J Mol Biol. 1993 Apr 5;230(3):812-23）。
【０２９９】
一過性発現
抗体を、IgG1、κとして発現させた。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、本質的にVink et al. (Vink et al., Methods, 65 (1), 5-10 2014)により記載されているように、293 fectin（Life technologies）を用いてExpi293F細胞（Life technologies, USA）に一過性にトランスフェクトした。
【０３００】
膜タンパク質を、freestyle Max試薬を用いて、製造業者により記載されているように、Freestyle CHO-S細胞（Life technologies）において発現させた。
【０３０１】
タンパク質の精製および分析
抗体を、固定化プロテインGクロマトグラフィーによって精製した。Hisタグ付加組み換えタンパク質を、固定化金属親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質バッチを、SDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー、およびエンドトキシンレベルの測定を含む複数の生物分析アッセイによって分析した。
【０３０２】
二重特異性抗体の生成
二重特異性IgG1抗体を、制御された還元条件下でのFabアーム交換によって生成した。この方法の基礎は、WO2011/131746に記載されているような特定のアッセイ条件下でヘテロダイマーの形成を促進する、相補的CH3ドメインの使用である。F405LおよびK409R（EU付番）変異を、抗DR5 IgG1抗体に導入して、相補的CH3ドメインとの抗体ペアを作製した。F405L変異を、IgG1-DR5-05およびIgG1-DR5-05-E430Gに導入し；K409R変異を、IgG1-DR5-01およびIgG1-DR5-01-E430Gに導入した。二重特異性抗体を生成するために、各々の抗体の最終濃度が0.5 mg/mLの2種類の親相補的抗体を、75 mM 2-メルカプトエチルアミン-HCl（2-MEA）と100μL TEの総体積において31℃で5時間インキュベートした。スピンカラム（Microcon遠心フィルター、30k、Millipore）を用いて製造業者のプロトコルに従い、還元剤2-MEAを除去することによって、還元反応を停止した。このように、二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R x IgG1-DR5-05-F405L（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）およびIgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430G（BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G）を生成した。
【０３０３】
K409R変異および／またはF405L変異は、抗体の対応する抗原への結合に対していかなる効果も有さない。すなわち、K409R変異および／またはF405L変異は、抗DR5抗体のDR5への結合についていかなる効果も有さない。
【０３０４】
実施例2：様々なヒトがん細胞株上のDR5発現レベル
細胞あたりのDR5密度を、マウスモノクローナル抗体B-K29（Diaclone、カタログ番号854.860.000）と共にQIFIKIT（DAKO、カタログ番号K0078）を用いた間接免疫蛍光によって、様々なヒトがん細胞株について定量した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、PBSで洗浄し、2×106細胞/mLの濃度で再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。50μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり100,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号650101）に播種した。細胞を、300×gで3分間の遠心分離によって沈殿させ、10μg/mLの飽和濃度の50μLの抗体試料またはマウスIgG1アイソタイプ対照試料（BD/Pharmingen、カタログ番号555746）に再懸濁した。4℃で30分のインキュベーション後、細胞を沈殿させ、150μL FACS緩衝液（PBS＋0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）＋0.02％（w/v）アジ化ナトリウム）に再懸濁した。設定ビーズおよび較正ビーズを、製造業者の説明書に従ってプレートに添加した。細胞およびビーズを並行して、150μL FACS緩衝液でさらに2回洗浄し、50μL FITCコンジュゲートヤギ抗マウスIgG（1/50；DAKO、カタログ番号F0479）に再懸濁した。二次抗体を、4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞およびビーズを、150μL FACS緩衝液で2回洗浄して、150μL FACS緩衝液に再懸濁した。免疫蛍光を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で、生細胞の集団内の10,000イベントを記録することによって測定した。較正ビーズの蛍光強度の幾何平均を使用して、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いてゼロ強度およびゼロ濃度を通るようにさせた較正曲線を算出した。各細胞株について、形質膜上に発現しているDR5分子の数の推定値である抗体結合能力（ABC）を、較正曲線の方程式に基づいて、DR5抗体染色した細胞の幾何平均蛍光強度を用いて算出した（GraphPad Softwareを用いた、標準曲線からの未知のものの内挿）。概して、DR5細胞表面発現は、ここで評価した細胞株上で低度から中等度であった。これらのデータに基づいて、細胞株を、低いDR5発現（ABC＜10,000）および中等度のDR5発現（ABC＞10,000）に従って分類した。HCT-15（ATCC, CCL-225）、HT-29（ATCC, HTB-38）およびSW480（ATCC, CCL-228）結腸がん、BxPC-3（ATCC, CRL-1687）、HPAF-II（ATCC, CRL-1997）およびPANC-1（ATCC, CRL-1469）膵臓がん、ならびにA549（ATCC, CCL-185）およびSK-MES-1（ATCC, HTB-58）肺がん細胞株は、低いDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲3,081〜8,411）。COLO 205（ATCC CCL-222（商標））およびHCT 116（ATCC CCL-247）結腸がん、A375（ATCC, CRL-1619）皮膚がん、ならびにSNU-5（ATCC, CRL-5973）胃がん細胞株は、中等度のDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲10,777〜21,262）。
【０３０５】
実施例3：ヒト化DR5-01およびDR5-05抗体のHCT 116細胞に対する結合
ヒト化抗体hDR5-01およびhDR5-05は、特許出願WO2014/009398に記載されている。精製したIgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405LのDR5陽性HCT 116ヒト結腸がん細胞に対する結合を、FACS分析によって分析し、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの結合と比較した。単一細胞懸濁液を調製するために、接着性HCT 116細胞を、PBS（B.Braun；カタログ番号3623140）で2回洗浄し、その後、トリプシン1×/EDTA 0.05％と37℃で2分間インキュベートした。10 mLの培地［L-グルタミンおよびHEPESを含むマッコイ5A培地（Lonza；カタログ番号BE12-168F）＋10％ Donor Bovine Serum with Iron（Life Technologies；カタログ番号10371-029）＋100単位ペニシリン/100単位ストレプトマイシン（Lonzaカタログ番号DE17-603E）］を添加し、その後、細胞を、1200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させた。細胞を、10 mL培地に再懸濁し、1200 rpmで5分間の遠心分離によって再び沈殿させ、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。100μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり100,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-One；カタログ番号650101）に播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0〜10μg/mLの範囲）の100μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。細胞を、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させ、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-フィコエリトリン（R-PE）コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、150μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で10,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
【０３０６】
図2は、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405Lが、それぞれ、その対応するキメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RまたはIgG1-DR5-05-F405Lと類似した結合曲線を示したことを示す。ヒト化は、DR5抗体の結合に対していかなる効果も有さなかった。
【０３０７】
実施例4：ヘキサマー化増強変異の導入は、キメラDR5-01およびDR5-05抗体ならびに二重特異性抗体DR5-01xDR5-05のDR5陽性ヒト結腸がん細胞に対する結合に影響を及ぼさない
ヘキサマー化増強変異（E430GまたはE345K）を有するおよび有さない、IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L、および二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409RxIgG1-DR5-05-F405L（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）の精製した抗体バリアントの、ヒト結腸がん細胞COLO 205に対する結合を、FACS分析によって分析した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性COLO 205細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、1,200 rpmで5分間、遠心分離し、10 mLの培養培地［25mM HepesおよびL-グルタミンを含むRPMI 1640（Lonzaカタログ番号BE12-115F）＋10％ Donor Bovine Serum with Iron（Life Technologiesカタログ番号10371-029）＋50単位ペニシリン/50単位ストレプトマイシン（Lonzaカタログ番号DE17-603E）］に再懸濁した。細胞を、計数し、再び遠心分離して、0.3×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。100μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり30,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0〜10μg/mLの最終濃度の範囲）の50μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。プレートを、300×gで3分間、4℃で遠心分離して、細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で5,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
【０３０８】
図3Aは、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R-E345Kが、IgG1-DR5-01-K409Rと類似した、ヒト結腸がん細胞COLO 205に対する用量依存性結合を示したことを示す。図3Bは、抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E345Kが、IgG1-DR5-05-F405Lと類似した、COLO 205細胞に対する用量依存性結合を示したことを示す。図3Cは、BsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430GおよびBsAb DR5-01-K409R-E345K x DR5-05-F405L-E345Kが、BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405Lと類似した、COLO 205細胞に対する用量依存性結合を示したことを示す。これらのデータにより、ヘキサマー化増強変異E430GまたはE345Kの導入は、IgG1-DR5-01-K409R、IgG1-DR5-05-F405L、およびBsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405LのDR5陽性COLO 205細胞に対する結合に影響を及ぼさなかったことが示される。
【０３０９】
実施例5：キメラDR5-01およびDR5-05抗体のアカゲザルDR5に対する結合
精製したIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、アカゲザルDR5またはヒトDR5を発現するCHO細胞（実施例1に記載）に対する結合を、FACS分析によって分析した。FACS分析の1日前に、CHO細胞に、アカゲザルDR5、ヒトDR5をコードするベクター、または非コードベクター（モック）を一過性にトランスフェクトした。単一細胞懸濁液を調製するために、細胞を、PBSで洗浄し、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。次の工程を、4℃で行った。75μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり75,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル丸底プレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。細胞を、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、10〜0μg/mLの範囲）の50μL試料に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。プレートを、300×gで3分間、4℃で遠心分離して、細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、FACS Canto II（BD Biosciences）上で100,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。図4は、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、CHO細胞上に発現しているアカゲザルDR5に対して用量依存性結合を示したことを示す。ヒトDR5をトランスフェクトしたCHO細胞およびモックトランスフェクトCHO細胞に対する結合を、それぞれ、陽性対照および陰性対照として試験した。IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方について、ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対する結合のEC50値は、同じ範囲であり（それぞれ、［0.014〜0.023μg/mL］および［0.051〜0.066μg/mL］）、IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、ヒトDR5およびアカゲザルDR5に対して同等の結合を示すことが示された。
【０３１０】
実施例6：ドメインスワップ型DR5分子を用いた、ヒトDR5上のDR5-01およびDR5-05抗体の結合領域のマッピング
ヒトDR5およびマウスDR5の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、限定された相同性を示し（図5A）、ヒト化抗体IgG1-hDR5-01-F405LおよびIgG1-hDR5-05-F405Lは、マウスDR5に結合しない（図5C、D）。抗体結合に関与するヒトDR5細胞外ドメイン中のアミノ酸ストレッチを特定する目的で、本発明者らは、図5Bに視覚化されているように、特定のヒトDR5ドメインがマウスアナログによって置き換えられている、11種類のヒト-マウスキメラDR5分子（実施例1に記載されているドメインスワップ型DR5分子）を開発した。ドメインスワップ型DR5バリアントを、CHO細胞上で一過性に発現させた。ドメインスワップ型DR5分子に対するDR5抗体の結合の喪失により、ヒトDR5のスワップされたドメインが、結合にとって非常に重要である1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。逆に、ドメインスワップ型DR5分子に対するDR5抗体の結合の保持により、ヒトDR5のスワップされたドメインが、結合にとって非常に重要であるアミノ酸を含有しないことが示される。結合アッセイのために、3×106個のトランスフェクト細胞を、洗浄して、3 mL FACS緩衝液に再懸濁した。100μLの細胞懸濁液を、96ウェル丸底プレート（Greiner Bio-one；カタログ番号650101）のウェルあたりに添加した（ウェルあたり100.000細胞）。次の工程を、4℃で行った。細胞を、沈殿させ、50μLのDR5抗体試料に再懸濁して（10μg/mLの最終濃度）、4℃で30分間インキュベートした。細胞を、2回洗浄し、50μLの二次抗体R-PE-コンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）において4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、2回洗浄し、120μL FACS緩衝液に再懸濁して、FACS Canto II（BD Biosciences）上で分析した。生存PE陽性細胞のパーセンテージを、GraphPad Prism ソフトウェアを用いてプロットした。表面発現は、様々なエピトープに対するDR5抗体のパネルを用いて、各ドメインスワップ型DR5分子について確認した（示されていない）。gp120に対する非標的結合抗体IgG1-b12を、結合についての陰性対照として含めた。図5Cは、IgG1-hDR5-01-F405Lが、構築物E（79〜138）、F（97〜138）、G（139〜166）、およびH（139〜182）に対して結合の喪失を示し、他方、構築物A〜D（ヒトDR5配列56〜115をカバーする）およびI〜K（ヒトDR5配列167〜210をカバーする）に対する結合は保持されていたことを示す。合わせて、これらのデータにより、アミノ酸領域116〜138および139〜166は、各々、IgG1-hDR5-01-F405LのヒトDR5に対する結合に必要とされる1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。図5Dは、IgG1-hDR5-05-F405Lが、構築物D（79〜115）、E（79〜138）、およびF（97〜138）に対して結合の喪失を示し、他方、構築物A〜C（ヒトDR5配列56〜78をカバーする）およびG〜K（ヒトDR5配列139〜210をカバーする）に対する結合は保持されていたことを示す。合わせて、これらのデータにより、アミノ酸領域79〜138は、IgG1-hDR5-05-F405LのヒトDR5に対する結合に必要とされる1つまたは複数のアミノ酸を含有することが示される。
【０３１１】
実施例7：DR5-01抗体およびDR5-05抗体でのクロスブロックELISA
DR5の細胞外ドメインに対する結合についてのヒト化DR5-01抗体とヒト化DR5-05抗体との間の競合を、本実施例に記載されているようなサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）におけるサンドイッチ結合アッセイによって、およびForteBio Octet（登録商標）HTXシステムを用いたバイオレイヤー干渉法（BLI）によって（データは示していない）測定した。ELISAのために、96ウェル平底ELISAプレート（Greiner bio-one；カタログ番号655092）を、100μL PBS中の2μg/mL DR5抗体（IgG1-hDR5-01-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430G）で、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、200μL PBSA［PBS/1％ウシ血清アルブミン（BSA；Rocheカタログ番号10735086001）］を添加することによってブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。ウェルを、PBST［PBS/0.05％ Tween-20（Sigma-Aldrich；カタログ番号63158）］で3回洗浄した。次に、DR5ECD-FcHistag（SEQ ID NO 27）（0.2μg/mLの最終濃度）および競合抗体（1μg/mLの最終濃度）を、100μL PBSTA（PBST/0.2％ BSA）の総体積において添加して、室温で1時間、振盪しながらインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ウェルを、100μLのPBSTA中ビオチニル化抗Hisタグ抗体（R&D Systems；カタログ番号BAM050；1:2.000）と室温で1時間、ELISA振盪機上でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ウェルを、PBSTA中のストレプトアビジン標識ポリHRP（Sanquin；カタログ番号M2032；1:10.000）と室温で20分間、ELISA振盪機上でインキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、100μLの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸［ABTS（Roche；カタログ番号11112597001）］とのRTで30分間の、光から保護したインキュベーションを通して、反応を視覚化した。等体積の2％シュウ酸を添加することによって、基質反応を停止した。405 nmでの蛍光を、ELISAリーダー（BioTek ELx808 Absorbance Microplate Reader）上で測定した。図6は、競合抗体の非存在下でのDR5ECD-FcHisCtagの結合と比べた、競合抗体の存在下でのコーティングした抗体に対するDR5ECD-FcHisCtag結合の阻害パーセンテージとして表した、結合競合を示す（阻害％＝100−［（競合抗体の存在下での結合／競合抗体の非存在下での結合）］*100）。コーティングしたIgG1-hDR5-01-E430Gに対するDR5ECD-FcHistagの結合は、可溶性IgG1-hDR5-05-E430Gの存在下で阻害されなかった。逆に、コーティングしたIgG1-hDR5-05-E430Gに対するDR5ECD-FcHistagの結合もまた、可溶性IgG1-hDR5-01-E430Gの存在下で阻害されなかった。これらのデータにより、IgG1-hDR5-01-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gは、DR5ECD-FcHisCtagの結合について互いに競合しなかったことが示され、それらが、ヒトDR5の細胞外ドメイン中の別個のエピトープを認識することが示唆された。これらのデータは、古典的なサンドイッチアッセイを用いたBLIによって確認され、そこでは、IgG1-hDR5-01-F405LまたはIgG1-hDR5-05-F405L（10 mM酢酸ナトリウムpH 6.0、ForteBioカタログ番号18-1070中、20μg/ml）を、アミン反応性第2世代バイオセンサー（FoteBioカタログ番号18-5092）上に固定化した。続いて、バイオセンサーを、DR5ECDdelHis（SEQ ID NO 28）（試料希釈液、ForteBioカタログ番号18-1048中、100 nM）とインキュベートして、競合抗体（試料希釈液中、5μg/mL）の結合を分析した（データは示していない）。
【０３１２】
実施例8：ヘキサマー化増強変異の導入は、DR5-01抗体およびDR5-05抗体ならびにそれらの組み合わせによる細胞死誘導の効力を改善する
ヒト結腸がん細胞COLO 205およびHCT 116を殺傷する抗体の能力に対する、IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lにおけるヘキサマー化増強変異E430Gの効果を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体を、単一作用物質として、ならびに、DR5-01抗体およびDR5-05抗体の組み合わせとして試験した。COLO 205細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。HCT 116細胞は、トリプシン処理によって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種した。50μLの連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0.05〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。2種類の抗体の組み合わせで処置した試料において、アッセイにおける総抗体濃度は、単一抗体で処置した試料におけるものと同じであった。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。培養細胞の生存率を、代謝的に活性を有する細胞の指標である、存在するATPを定量する、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ（Promega、カタログ番号G7571）において決定した。キットから、20μLのルシフェリン溶液試薬をウェルあたりに添加して、500 rpmで2分間、プレートを振盪することによって混合した。次に、プレートを、37℃で1.5時間インキュベートした。100μLの上清を白色OptiPlate-96（Perkin Elmer、カタログ番号6005299）に移して、発光を、EnVision Multilabel Reader（PerkinElmer）上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析し、プロットした。図7は、以下の式を用いて算出した際の、生細胞のパーセンテージを示す：生細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）／（抗体なし試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］*100。
【０３１３】
図7は、E430G変異の導入が、COLO 205（A）およびHCT 116（B）細胞の両方において、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの効能を増強したことを示す。IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせは、いずれかの抗体単独よりも強力であり、かつ、E430G変異を有さない抗体の組み合わせよりも強力であった。IgG1-DR5-01-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405Lの組み合わせは、いずれかの抗体単独よりも強力であった。これらのデータにより、ヘキサマー化増強変異E430Gの導入は、単一抗体としておよび組み合わせでの両方で、キメラDR5抗体01および05の結合時の細胞殺傷の誘導の増強を結果としてもたらし、組み合わせがより強力であったことが示される。
【０３１４】
実施例9：ヘキサマー化増強変異を有する2種類のクロスブロックしないDR5抗体を組み合わせることは、標的細胞殺傷の増強を結果としてもたらす
実施例8において、ヘキサマー化増強変異を有する2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを組み合わせることが、単一抗体の効力と比較して、がん細胞株に対する殺傷の増強を結果としてもたらしたことが示される。ここで、本発明者らは、2種類のクロスブロックしない抗DR5抗体対2種類のクロスブロックする抗DR5抗体の効力を比較する。抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430Gの、クロスブロックしない抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430Gまたはクロスブロックする抗体IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのいずれかとの組み合わせの、単一抗体と比較してHCT 116結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体IgG1-chTRA8-F405LおよびIgG1-DR5-05-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行い、Octet（登録商標）HTXシステム上でのサンドイッチ結合アッセイによって確認した（データは示されていない）。HCT 116細胞に対する生存率アッセイを、5倍希釈において、0.00005〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で、実施例8に記載されているように行った。図8は、HCT 116細胞の殺傷における単一抗体の効力が、2種類のクロスブロックしない抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R-E430Gを組み合わせることによって増強され（図8B）、2種類のクロスブロックする抗体IgG1-chTRA8-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを組み合わせることによっては増強されなかった（図8C）ことを示す。
【０３１５】
実施例10：ヘキサマー化増強変異を有する、クロスブロックしない抗体の組み合わせDR5-05 + CONAおよび二重特異性抗体DR5-05xCONAの、標的細胞殺傷を誘導する能力
2種類のクロスブロックしない抗体の別の組み合わせ（IgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345K）およびその二重特異性誘導体BsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345Kの、それぞれ、ヘキサマー化増強変異を有さない抗体の組み合わせおよび二重特異性抗体と比較した、HCT 116結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。抗体IgG1-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-05-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行い、Octet（登録商標）HTXシステム上でのサンドイッチ結合アッセイによって確認した（データは示していない）。HCT 116細胞に対する生存率アッセイを、5倍希釈において、0.01〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で、実施例8に記載されているように行った。図9は、ヘキサマー化増強変異を有する、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-CONA-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E345KおよびBsAb IgG1-CONA-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E345Kが、ヘキサマー化増強変異E430GまたはE345Kを有さないこれらの抗体と比較して、HCT 116細胞の殺傷において効力の増強を示したことを示す。
【０３１６】
実施例11：E430Gヘキサマー化増強変異を有するDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせの、様々ながん細胞株において標的細胞殺傷を誘導する能力
ヘキサマー化増強変異E430Gを有するおよび有さない、ヒト-マウスキメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの、COLO 205、HCT-15、HCT 116、HT-29、およびSW480結腸がん、BxPC-3、HPAF-II、およびPANC-1膵臓がん、SNU-5胃がん、A549およびSK-MES-1肺がん、ならびにA375皮膚がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。接着性細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した［COLO 205、HCT-15、SW480、およびBxPC-3：25mM HepesおよびL-グルタミンを含むRPMI 1640（Lonzaカタログ番号BE12-115F）＋10％ DBSI（Life Technologiesカタログ番号10371-029）＋Pen/Strep（Lonzaカタログ番号DE17-603E）；HCT 116およびHT-29： L-グルタミンおよびHepesを含むマッコイ5A培地（Lonza、カタログ番号BE12-168F）＋10％ DBSI＋Pen/Strep；HPAF-IIおよびSK-MES-1：イーグル最小必須培地（EMEM、ATCCカタログ番号30-2003）＋10％ DBSI＋Pen/Strep；PANC-1およびA375：L-Glnを含まず、HEPESを含むDMEM 4.5 g/L グルコース（Lonzaカタログ番号LO BE12-709F）＋10％ DBSI＋1 mM L-グルタミン（Lonzaカタログ番号BE17-605E）＋Pen/Strep；SNU-5：IMDM (Lonzaカタログ番号BE12-722F)＋10％ DBSI＋Pen/Strep；A549：F-12K培地（ATCCカタログ番号30-2004）＋10％ DBSI＋1 mM L-グルタミン＋Pen/Strep］。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、150μLの抗体試料（最終濃度10μg/mL）によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。すべての試験した細胞株について、生細胞のパーセンテージは、10μg/mLの抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーション後に、非標的結合陰性対照抗体IgG1-b12とのインキュベーション後よりも有意に低かった（図10）。試験した細胞株のうちの2種類を除いたすべてにおいて、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの効力は、ヘキサマー化増強変異を有さない組み合わせIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lについてよりも有意に良好であった。これらのデータにより、ヘキサマー化増強変異を有するキメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、二次的架橋物質の必要なく、結腸がん、膵臓がん、胃がん、肺がん、および皮膚がんを含む様々な起源のがん標的細胞の殺傷において非常に有効であったことが示される。IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの殺傷効力とDR5標的発現レベル（実施例2に記載）との間には、いかなる相関もなかった。
【０３１７】
実施例12：E430Gヘキサマー化増強変異を有するヒト化DR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせの、標的細胞殺傷を誘導する能力
キメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、インビトロでBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞の殺傷を誘導する効能を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの効能と比較するために、生存率アッセイを行った。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、連続希釈抗体調製物系列の150μL抗体試料によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。ヘキサマー化増強変異を有するヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gは、対応するキメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gと類似した用量応答曲線を示した（図11）。
【０３１８】
実施例13：抗体IgG1-hDR5-01-E430Gの最適化
アミノ酸配列N55-G56を、IgG1-hDR5-01およびIgG1-hDR5-05の重鎖のCDR2領域（SEQ ID NO:2）における潜在的なアスパラギン（Asn）アミド分解モチーフとして特定した。標的結合に対するアミド分解の効果を試験するために、この位置でのアミド分解を、IgG1-hDR5-01-K409RおよびIgG1-hDR5-05-F405LにおけるN55D変異の導入によって模倣した。IgG1-hDR5-01-N55D-K409RおよびIgG1-hDR5-05-N55D-F405Lを、HCT 116細胞に対する結合について、実施例3に記載されているようなFACS分析によって試験した。図12Aは、N55D変異の導入によるアミド分解の模倣が、HCT 116細胞上のIgG1-hDR5-01-K409Rの結合の強い減少を結果としてもたらしたことを示す。対照的に、IgG1-hDR5-05-F405LおよびIgG1-hDR5-05-N55D-F405Lは、同等の結合曲線を示した。DR5-01抗体におけるAsnアミド分解のリスクを低減させるために、G56T変異をIgG1-hDR5-01-E430Gに導入し、この抗体バリアントを、HCT 116細胞に対する結合について、実施例3に記載されているようなFACS分析によって試験した。図12Bは、変異が、HCT 116細胞へのIgG1-hDR5-01-E430Gの結合に対していかなる効果も有さなかったことを示す。
【０３１９】
ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの能力と比較するために、生存率アッセイを行った。生存率を、実施例11に記載されているように、ウェルあたり1,000細胞、および、200μLの総体積における、4倍希釈において0.0001〜10,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる抗体濃度系列で評価した。図12Cは、IgG1-hDR5-01-E430GにおけるG56T変異の導入が、IgG1-hDR5-05-E430Gとの組み合わせでの抗体の殺傷効力に対していかなる効果も有さなかったことを示す。
【０３２０】
実施例14：ヒト化抗体の組み合わせhDR5-01-G56T-E430GおよびhDR5-05-E430Gによる細胞死誘導は、ヘキサマーを形成するためのFc：Fc相互作用を必要とする
細胞死を誘導するための、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる抗体ヘキサマー形成の必要性を解析するために、本発明者らは、自己反発変異K439EおよびS440Kを使用した（Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3）。1つのIgG1抗体における、または抗体の組み合わせにおける、K439EまたはS440Kのいずれかの存在によって導入される抗体間のFc反発は、E345KまたはE430Gなどのヘキサマー化増強変異の存在下でさえも、ヘキサマー化の阻害を結果としてもたらす（WO2013/0044842）。K439EおよびS440K変異による反発は、一方またはもう一方の変異を各々保有する2種類の抗体の混合物において両方の変異を組み合わせることによって中和され、Fc：Fc相互作用およびヘキサマー化の回復を結果としてもたらす。IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方について、K439EまたはS440K変異のいずれかを有するバリアントを生成し、すべての異なる組み合わせで試験した。生存率アッセイを、実施例11に記載されているように、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞に対して、4倍希釈において0.3〜20,000 ng/mLの総濃度の範囲にわたる連続希釈抗体調製物系列で行った。
【０３２１】
図13は、同じ反発変異（K439EまたはS440K）を両方が保有するIgG1-hDR5-01-G56T-E430GバリアントおよびIgG1-hDR5-05-E430Gバリアントの組み合わせが、BxPC-3細胞（A）およびHCT-15細胞（B）において強く減少した殺傷効力を示したことを示す。殺傷効力は、相補的な変異K439EまたはS440Kのうちの1つを各々有する2種類の抗体を組み合わせることによって反発が中和された場合に、回復された。これらのデータにより、Fc-Fc相互作用によるヘキサマー化が、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gによる細胞死の誘導のために必要とされることが示される。
【０３２２】
実施例15：抗体Fc-Fc相互作用は、ヘキサマー化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430GによるDR5クラスタリングおよびアポトーシスの誘導に関与している
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gによる細胞死の誘導におけるFc-Fc媒介性抗体ヘキサマー化の関与を試験するために、本発明者らは、Fc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチ中のコアアミノ酸を含有する領域においてFcに結合する（Diebolder et al., Science. 2014 Mar 14;343(6176):1260-3）、13残基ペプチドDCAWHLGELVWCT（DeLano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456):1279-83）を使用した。BxPC-3細胞に対する生存率アッセイを、DCAWHLGELVWCTペプチドの存在下または非存在下で、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて、実施例11に記載されているように行った。簡潔に言うと、細胞の37℃での一晩インキュベーションの後、培養培地を除去して、希釈系列（0〜100μg/mLの範囲）のFc結合DCAWHLGELVWCTペプチド、非特異的対照ペプチドGWTVFQKRLDGSVを含有する、またはペプチドなしの、100μL培養培地によって置き換えた。次に、50μLの抗体試料（833 ng/mLの最終濃度）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、BxPC-3細胞の殺傷を誘導する能力は、100μg/mLのFc結合DCAWHLGELVWCTペプチドによって強く阻害された（図14）。これらのデータにより、ヘキサマー化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、がん細胞の細胞表面上でのDR5クラスタリングおよびアポトーシスの誘導を誘導する能力における、Fc：Fc相互作用の関与が示される。
【０３２３】
実施例16：E430Gヘキサマー化増強変異を有するキメラ抗体の組み合わせDR5-01およびDR5-05抗体の、様々な組み合わせ比でがん細胞殺傷を誘導する能力
抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gで組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。様々な比のIgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gを有する50μLの抗体試料（5倍希釈において、0.06〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈系列で、100：0、90：10、80：20、70：30、60：40、50：50、40：60、30：70、20：80、10：90、および0：100のDR5-01：DR5-05の比として示す）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。20μg/mLおよび4μg/mLの総抗体濃度で、殺傷は、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方を含有するすべての試験した抗体比で同等に有効であった。0.8μg/mLおよび0.16μg/mLの総抗体濃度で、抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430Gの両方を含有するすべての試験した抗体比は、殺傷を誘導した（図15）。
【０３２４】
実施例17：E430Gヘキサマー化増強変異を有するヒト化抗体DR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの、様々な組み合わせ比での、がん細胞殺傷を誘導する能力
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な抗体比で組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。概して、実験は、実施例16に記載されているように行った。簡潔に言うと、あらかじめ付着させた細胞（ウェルあたり5,000細胞）を、BxPC-3については10μg/mLおよびHCT-15については20μg/mLの最終抗体濃度の、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G（100：0、98：2、96：4、94：6、92：8、90：10、50：50、10：90、8：92、6：94、4：96、2：98、および0：100のDR5-01：DR5-05の比として図16に示す）と、ポリスチレン96ウェル平底プレート中150μLにおいて、37℃で3日間インキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。殺傷は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方を含有するすべての試験した抗体比で同等に有効であった（図16）。
【０３２５】
実施例18：E430Gヘキサマー化増強変異を有するヒト化DR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせは、カスパーゼ依存性細胞傷害を誘導する
カスパーゼ阻害剤の存在下および非存在下で、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの細胞傷害を比較するために、生存率アッセイを行った。PANC-1およびBxPC3膵臓がん細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。25μLの汎カスパーゼ阻害剤Z-Val-Ala-DL-Asp-フルオロメチルケトン（Z-VAD-FMK、150μLにおいて5μMの終末濃度、Bachem、カタログ番号4026865.0005）を細胞培養物に添加して、37℃で1時間インキュベートし、その後、連続希釈抗体調製物系列（4倍希釈において、1〜20μg/mLの最終濃度の範囲）の25μL抗体試料を添加して、37℃で3日間、さらにインキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。組み換えヒトTRAIL/APO-2L（eBioscience、カタログ番号BMS356）を、6μg/mLの最終濃度で使用した。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。ヘキサマー化増強変異を有するヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKの存在下で、PANC-1およびBxPC3膵臓がん細胞の生存率を低減させることができず、IgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせが、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導したことが示された（図17）。これはまた、天然のDR5リガンドTRAILについても示された。
【０３２６】
実施例19：アネキシンV/ヨウ化プロピジウムおよび活性カスパーゼ-3染色によって評価した際の、COLO 205結腸がん細胞に対するキメラDR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの結合時の細胞死誘導
細胞死誘導の速度論を、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。アネキシン-Vは、プログラム細胞死の開始後に細胞表面上に露出されるホスファチジルセリンに結合し、これは可逆的プロセスである。PIは、細胞に入った場合に二本鎖DNAおよびRNAの中にインターカレートする色素である。PIは、無傷の形質膜および核膜を通過できないため、生きている細胞を染色することはないが、膜の完全性が低下している瀕死の細胞にのみ入って染色する。これらの特徴のために、アネキシンV/PI二重染色は、開始プログラム細胞死（アネキシンV陽性/PI陰性）と不可逆的プログラム細胞死（アネキシンV陽性/PI陽性）との間を区別するために適用することができる。カスパーゼ-3は、外因性のデス受容体誘導性細胞死経路および内因性のミトコンドリア細胞死経路の両方によって活性化される。したがって、活性カスパーゼ-3はまた、死カスケードの開始についてのマーカーでもある。IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの結合時の細胞死の誘導を、DR5陽性COLO 205結腸がん細胞において解析した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、0.2×106細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。500μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり100,000細胞）を、24ウェル平底培養プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号662160）に播種して、37℃で16時間インキュベートした。500μLの抗体試料を添加し（1μgの抗体最終濃度）、37℃で5時間または24時間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞を、250μLの1×PBSで1回洗浄した。接着性細胞を、100μLの0.05％トリプシンと37℃で10分間インキュベートすることによって収集した。200μLの培地を、トリプシン処理した細胞に添加し、細胞を、96ウェル丸底FACSプレート（Greiner Bio-One、カタログ番号650101）に移して、非接着性細胞とプールした。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、200μLの氷冷PBSに再懸濁して、それぞれ、アネキシンV/PI染色および活性カスパーゼ-3染色のために、96ウェル丸底FACSプレートにおいて100μLの2種類の試料に分けた。
【０３２７】
アネキシンV/PI二重染色は、FITCアネキシンVアポトーシス染色キットI（BD Pharmingen、カタログ番号556547）を用いて行った。細胞を、氷冷PBSで1回洗浄し、50μLのアネキシンV/PI染色溶液（アネキシンV-FITC 1：00およびPI 1：25）において4℃で15分間インキュベートした。細胞を、100μLの結合緩衝液で洗浄し、20μLの結合緩衝液に再懸濁して、1時間以内にiQue Screener（IntelliCyt）上で蛍光を測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析し、プロットした。
【０３２８】
活性カスパーゼ-3染色は、PE活性カスパーゼ-3アポトーシスキット（BD Pharmingen、カタログ番号550914）を用いて行った。細胞を、氷冷PBSで1回洗浄し、100μLのCytofix/Cytoperm固定化および透過処理溶液に再懸濁して、氷上で20分間インキュベートした。細胞を、室温で沈殿させ、100μLの1×透過処理（Perm）/洗浄緩衝液で2回洗浄し、室温で30分のインキュベーションのために、100μLのPEウサギ抗活性カスパーゼ-3（1：10）に再懸濁した。細胞を、室温で沈殿させ、100μLの1×透過処理/洗浄緩衝液で1回洗浄し、20μLの1×透過処理/洗浄緩衝液に再懸濁した。蛍光を、iQue Screener上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析し、プロットした。
【０３２９】
図18は、5時間のインキュベーション後に、キメラ抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、アネキシンV陽性/PI陰性（A）および活性カスパーゼ-3陽性細胞（B）のパーセンテージの増加によって示されるように、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して効率的に細胞死の初期段階を誘導したことを示す。アネキシンV陽性/PI陰性および活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせで処置した細胞において、E430G変異を有さないDR5抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L）または単一抗体のいずれかと比較して、より高かった。5時間の時点で、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージは、すべての試料においてバックグラウンドレベルと同様であった（C）。
【０３３０】
24時間のインキュベーション後に、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージ（D）は、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gで処置した試料において増強されており、細胞が細胞死の不可逆的段階に入ったことが示された。また、この段階で、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせの効果は、E430G変異を有さないDR5抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405L）または単一抗体のいずれかで処置した試料においてよりも強かった（アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージがより大きく増加（E））。同じ時点で、活性カスパーゼ3陽性細胞のパーセンテージは、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gで処置した細胞において最も高かった。
【０３３１】
これらのデータにより、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせは、COLO 205結腸がん細胞において細胞死の初期段階および後期段階の両方を誘導し、E430Gヘキサマー化増強変異を有さない抗体の組み合わせよりも有効に、そのようにすることが示される。
【０３３２】
実施例20：ヘキサマー化増強変異を有するキメラDR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせのCOLO 205結腸がん細胞に対する結合時の、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7の活性化
実施例19において、キメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーションが、COLO 205結腸がん細胞においてカスパーゼ-3の活性化を誘導したことが記載された。活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、抗体の組み合わせとのインキュベーションの24時間後よりも5時間後に、より高かった。本実施例においては、カスパーゼ-3/7認識モチーフDEVDを有する基質が、切断時に、ルシフェラーゼの基質であるアミノルシフェリンを放出する、カスパーゼ-Glo 3/7アッセイ（Promega、カタログ番号G8091）を用いて、カスパーゼ-3/7の活性化を時間において測定した。細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性COLO 205を含有する培養上清をプールすることによって収集した。細胞を、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、0.8×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。25μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり2,000細胞）を、384ウェル培養プレート（Perkin Elmer、カタログ番号6007680）に播種し、37℃で16時間インキュベートした。25μLの抗体試料を添加し（1μgの抗体最終濃度）、37℃で1、2、5、および24時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温まで温度を低下させた。細胞を、300 gで3分間の遠心分離によって沈殿させた。25μLの上清を除去し、25μLのカスパーゼ-Glo 3/7基質によって置き換えた。500 rpmで1分間振盪することによって混合した後、プレートを、室温で1時間インキュベートした。発光を、EnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）上で測定した。
【０３３３】
図19は、1、2〜5時間の時間経過において、カスパーゼ-3/7の活性化が、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GおよびIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lによって、ならびに二重特異性DR5抗体BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gについて誘導されたことを示す。24時間後に、カスパーゼ-3/7の活性化は、すべての試験したDR5抗体についてほぼベースラインレベルに低減した。1時間後、カスパーゼ-3/7の活性化は、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gで処置していた細胞において既に観察され、他方、ヘキサマー化増強変異を有さないIgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの組み合わせで処置していた細胞においては、いかなるカスパーゼ-3/7活性化も観察されなかった。同様に、2時間および5時間で、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gによって誘導されたカスパーゼ-3/7の活性化は、IgG1-DR5-01-K409R + IgG1-DR5-05-F405Lの組み合わせについてよりも強かった。これらのデータにより、ヘキサマー化増強変異を有するキメラDR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、ヘキサマー化増強変異を有さない抗体の組み合わせよりも迅速な、かつより強力なカスパーゼ-3/7の活性化を誘導したことが示される。
【０３３４】
実施例21：E430Gヘキサマー化増強変異を有するキメラDR5-01およびDR5-05の抗体の組み合わせの効能は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係である
二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下での抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、COLO 205大腸がん細胞ならびにBxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を比較するために、生存率アッセイを行った。比較のために、二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知である2種類のDR5抗体IgG1-CONAおよびIgG1-chTRA8-F405Lを、同じ設定で試験した。細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させた。細胞を、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させ、0.5×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。接着性細胞の上清を、ヤギ抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片（1/150；Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-006-098）の非存在下または存在下の、150μLの抗体試料（最終濃度10μg/mL）によって置き換え、37℃で3日間インキュベートした。細胞殺傷の陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、Fc架橋剤の存在下または非存在下の両方で、COLO 205、BxPC-3、およびPANC-1がん細胞の、陰性対照と比較して有意な殺傷を誘導した（図20）。対照的に、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、Fc架橋剤の非存在下で標的細胞殺傷を誘導しなかった。Fc架橋は、COLO 205およびBxPC-3細胞において、IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lによる殺傷を誘導したが、架橋剤の存在下または非存在下での抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gよりも、有意に低い効能であった。これらのデータにより、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GによるCOLO 205、BxPC-3、およびPANC-1がん細胞の殺傷は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係であること、ならびに、この架橋剤と無関係の殺傷は、Fc架橋されたIgG1-DR5-CONA およびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lについてよりも効率的であることが示される。
【０３３５】
実施例22：IgG1-hDR5-01-430GにおけるK409R変異の導入およびIgG1-hDR5-05-E430GにおけるF405L変異の導入は、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効能に対していかなる効果も有さない
本出願に記載されている実験の多くにおいて、抗DR5抗体IgG1-01およびIgG1-05は、IgG Fcドメイン中に、それぞれ、K409RおよびF405L（EU付番インデックス）変異を含有する。これらの変異により、WO2011/131746に記載されているような制御された還元条件下で、IgG1-01-K409RとIgG1-05-F405Lとの間のFabアーム交換反応によるDR5二重特異性抗体の生成が可能になる。Fabアーム交換がないと、K409RおよびF405L変異をもつヒトIgG1抗体は、野生型ヒトIgG1と同じ機能的特徴を示すと考えられている（Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50）。ここで、本発明者らは、K409RまたはF405L変異の存在が、親IgG1-01およびIgG1-05抗体の組み合わせの、インビトロでDR5陽性腫瘍細胞において細胞死を誘導する能力に対していかなる効果も有さないことを示す。ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの能力と比較するために、生存率アッセイを行った。BxPC-3に対する生存率アッセイを、実施例11に記載されているように、4倍希釈において、0.001〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲にわたる連続希釈した抗体系列で行った。BxPC-3膵臓がん細胞株は、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gとのインキュベーション後に、ヒト化抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと類似した生存率曲線を示した（図21）。これらのデータにより、K409RおよびF405L変異は、E430Gヘキサマー化増強変異を有するヒト化DR5-01およびDR5-05抗体の組み合わせの効能に対していかなる効果も有さなかったことが示される。
【０３３６】
実施例23：キメラ二重特異性抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、DR5陽性腫瘍細胞の殺傷を誘導する
2種類の異なるDR5エピトープを標的とする二重特異性抗体を、実施例1に記載されているように、キメラ抗体IgG1-DR5-01-K409R-E430GとIgG1-DR5-05-F405L-E430Gとの間のFabアーム交換によって生成した。10μg/mLのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの、様々な組織起源のがん細胞（COLO 205大腸がん、A375皮膚がん、SK-MES-1肺がん、BxPC-3膵臓がん、およびSNU-5胃がん細胞株）の殺傷を誘導する能力を試験するために、生存率アッセイを、実施例11に記載されているように行った。すべての試験した細胞株について、生細胞のパーセンテージは、10μg/mLのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G抗体とインキュベートした場合に、非標的結合陰性対照抗体IgG1-b12と比較して有意に低かった（図22）。これらのデータにより、ヘキサマー増強変異E430Gを有する二重特異性抗DR5xDR5'抗体は、結腸がん、膵臓がん、胃がん、肺がん、および皮膚がんを含む様々な起源のがん細胞の殺傷を、二次的架橋剤の必要なく誘導したことが示される。
【０３３７】
実施例24：キメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの効能は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係である
二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下でのキメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの、BxPC-3膵臓がん細胞およびCOLO 205結腸がん細胞の殺傷を誘導する効能を比較するために、生存率アッセイを、実施例21に記載されているように行った。比較のために、二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知である2種類のDR5抗体IgG1-CONAおよびIgG1-chTRA8-F405Lを、同じ設定で試験した。キメラBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、Fc架橋剤の存在下または非存在下の両方で、COLO 205およびBxPC-3がん細胞の、陰性対照と比較して有意な殺傷を示した（図23）。対照的に、DR5抗体IgG1-DR5-CONAおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、Fc架橋剤の存在下で殺傷を誘導しただけであった。
【０３３８】
実施例25：アネキシンV/ヨウ化プロピジウムおよび活性カスパーゼ-3染色によって評価した際の、COLO 205結腸がん細胞に対するBsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gの結合時の細胞死誘導
COLO 205細胞に対する1μg/mL BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gによる細胞死誘導の速度論を、実施例19に記載されているように、アネキシンV/ヨウ化プロピジウム（PI）二重染色および活性カスパーゼ-3染色によって解析した。
【０３３９】
図24は、5時間のインキュベーション後に、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gが、アネキシンV陽性/PI陰性（A）および活性カスパーゼ-3陽性細胞（B）のパーセンテージの増加によって示されるように、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して効率的に細胞死の初期段階を誘導したことを示す。アネキシンV陽性/PI陰性および活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセンテージは、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gで処置していた細胞において、E430G変異を有さない二重特異性抗体（BsAb IgG1-DR5-01-K409RxDR5-05-F405L）または単一特異性抗体のいずれかと比較して、より高かった。5時間の時点で、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージは、すべての試料においてバックグラウンドレベルと同等であった（C）。24時間のインキュベーション後に、アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージ（D）は、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gで処置した試料において増強されており、細胞が細胞死の不可逆的段階に入ったことが示された。また、この段階で、BsAb IgG1-DR5-01-K409R-E430GxDR5-05-F405L-E430Gの効果は、E430G変異を有さない二重特異性抗体（BsAb IgG1-DR5-01-K409R x DR5-05-F405L）で処置した試料においてよりも強かった（アネキシンV/PI二重陽性細胞のパーセンテージがより大きく増加（E））。同じ時点で、活性カスパーゼ3陽性細胞のパーセンテージは、BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gで処置した細胞において最も高かった。
【０３４０】
これらのデータにより、BsAB IgG1-DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430Gは、COLO 205結腸がん細胞において細胞死の初期段階および後期段階の両方を誘導し、E430Gヘキサマー化増強変異を有さない二重特異性抗体よりも有効に、そのようにすることが示される。
【０３４１】
実施例26：皮下COLO 205結腸がん異種移植モデルにおける、ヘキサマー化増強変異を有するおよび有さないDR5-01およびDR5-05抗体バリアンドのインビボ効力
ヘキサマー化増強変異を有する、様々な抗DR5抗体およびDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせのインビボ抗腫瘍効力を、COLO 205ヒト結腸がん細胞での皮下モデルにおいて評定した。0日目に、細胞を、非接着性細胞およびトリプシン処理した接着性細胞を含有する培養上清をプールすることによって収集した。3×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、200μL PBSの体積において注射した。すべての実験および動物の取扱いは、地方自治体によって承認され、すべての適用可能な国際的な、国家の、および地方の法律および指針に従って実施した。腫瘍の発生を、少なくとも週に2回、0.52×（長さ）×（幅）2としてカリパス（PLEXX）測定値によってモニターした。腫瘍を、1,500 mm3の終点腫瘍体積まで、腫瘍が潰瘍形成を示すまで、重篤な臨床徴候が観察されるまで、または腫瘍成長がマウスの動きを阻止するまで測定した。6日目に、平均腫瘍体積は約200 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表2）。マウスを、6および13日目に、200μL PBS中の100μg抗体の腹腔内（i.p.）注射によって処置した（用量あたり5 mg/kg）。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、最初の投薬の3日後にIgG血清決定のために取得した。3匹の個々のマウスは、検出可能なヒトIgG血漿レベルを有さず、統計分析から排除した（下記の表2を参照されたい）。他のマウスについて、ヒト抗体血漿濃度は、Vcen＝50 mL/kg、Vs＝100 mL/kgの2コンパートメントモデルならびに11.6日の排出半減期を仮定した場合に、期待値に従っていた（データは示していない）。腫瘍を、腫瘍接種の16週間後まで測定した。
【０３４２】
（表２）処置群および投薬
2019500869.tif 000028
【０３４３】
図25Aは、時間における処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。図25Bは、すべての群がまだ無傷であった時である腫瘍接種後23日目の、平均腫瘍体積を表示する。すべての抗DR5抗体試料は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、腫瘍成長を有意に阻害した（23日目の、ノンパラメトリック分散分析の解析（クラスカル・ワリス）およびその後のダンの多重比較検定：p＜0.0001）。完全な腫瘍の抑止が、ヘキサマー化増強変異を有するDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G）について、ヘキサマー化増強変異を有するおよび有さない二重特異性抗体（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405LおよびBsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G）について、ならびにヘキサマー化増強変異を有する抗DR5抗体（IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430G）について観察された。ヘキサマー化増強変異を有さないIgG1-CONAおよびIgG1-DR5-05-F405Lは、IgG1-b12と比較して腫瘍成長を強く阻害したが、完全な腫瘍の抑止は結果としてもたらさなかった。
【０３４４】
図25Cは、750 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。陰性対照抗体IgG1-b12で処置したマウスと比較して、腫瘍増生は、抗DR5抗体で処置したすべての群において有意に遅延していた（腫瘍サイズカットオフ750 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。研究の終末（112日目）に、ヘキサマー化増強変異を有するDR5-01 + DR5-05抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G）で処置したマウスの群は、コナツムマブ群よりも有意に少ない、腫瘍増生を伴うマウスを示した（フィッシャーの正確偶然性検定p＜0.01）。
【０３４５】
これらのデータにより、IgG1-DR5-05-F405LにおけるE430Gヘキサマー化増強変異の導入は、ヘキサマー化増強変異を有さないIgG1-DR5-05-F405Lと比較して、皮下COLO 205結腸がん腫瘍モデルにおいて腫瘍阻害の増強を結果としてもたらしたことが示される。ヘキサマー化増強変異を有するDR5-01抗体およびDR5-05抗体の両方（IgG1-DR5-01-K409R-E430GおよびIgG1-DR5-05-F405L-E430G）、ヘキサマー化増強変異を有するおよび有さない二重特異性抗体（BsAb DR5-01-K409R x DR5-05-F405LおよびBsAb DR5-01-K409R-E430G x DR5-05-F405L-E430G）、ならびにヘキサマー化増強変異を有する抗体の組み合わせ（IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430G）は、ヘキサマー化増強変異を有さないIgG1-CONAおよびIgG1-DR5-05-F405Lよりも良好な腫瘍阻害を示した。
【０３４６】
実施例27：皮下COLO 205結腸がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下COLO 205ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。10日目に、平均腫瘍体積は約400 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表3）。マウスを、10日目に、100μL PBS中の40μg（2 mg/kg）、10μg（0.5 mg/kg）、または2μg（0.1 mg/kg）の抗体の静脈内（i.v.）注射によって処置した。対照群におけるマウスは、40μg（2 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍を、腫瘍接種の17週間後まで測定した。
【０３４７】
（表３）処置群および投薬
2019500869.tif 000029
【０３４８】
図26Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。単一用量の0.5 mg/kgまたは2 mg/kgの抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gでの処置は、研究を126日目にやめるまで、完全な腫瘍退縮を結果としてもたらした。0.5 mg/kgおよび2 mg/kgのIgG1-CONAでの処置もまた、腫瘍退縮を誘導したが、退縮は不完全であり、腫瘍増生の再発が、それぞれ、すべてのマウスまたはほぼすべて（7/8）のマウスにおいてあった。0.1 mg/kgでは、IgG1-CONAも、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせも、抗腫瘍活性を示さなかった。図26Bは、腫瘍接種後16日目に、2 mg/kgおよび0.5 mg/kgのIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gによる腫瘍阻害が、等価用量のIgG1-CONAと比較して有意に良好であったことを示す（独立t検定）。
【０３４９】
図26Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。0.5 mg/kgおよび2 mg/kgの用量で、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GおよびIgG1-CONAは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（p＜0.001の、腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析）。0.5 mg/kgの用量で、腫瘍成長進行の阻害は、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gについて、等価用量のIgG1-CONAに対して有意に良好であった。
【０３５０】
これらのデータにより、2 mg/kgで投薬された組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、IgG1-CONAと比較して16日目に腫瘍負荷を有意に低減させ、0.5 mg/kgでは、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせが、IgG1-CONAと比較して、16日目に腫瘍負荷を有意に低減させ、かつ進行のない生存時間を延長させた（腫瘍サイズカットオフ500 mm3）ため、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gが、IgG1-CONAと比較してより強い抗腫瘍効力を有していたことが示される。
【０３５１】
実施例28：皮下BxPC-3膵臓がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下BxPC-3ヒト膵臓がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONA-F405Lと比較した。0日目に、接着性細胞をトリプシン処理によって収集した。5×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。10日目に、平均腫瘍体積は約250 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表4）。マウスを、20および28日目に、200μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって処置した。対照群におけるマウスは、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、投薬の1週間後にIgG血清決定のために取得した。腫瘍を、腫瘍接種の10週間後まで測定した。
【０３５２】
（表４）処置群および投薬
2019500869.tif 000030
【０３５３】
図27Aは、処置群あたりの中央腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのすべての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害し、他方、IgG1-CONA-F405L処置群は阻害しなかった。図27Bは、腫瘍接種後48日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、等価用量のIgG1-CONA-F405Lよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、p＜0.05）。
【０３５４】
図27Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、およびIgG1-CONA-F405Lと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。
【０３５５】
これらのデータにより、インビボBxPC-3ヒト膵臓がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONA-F405Lについてよりも有意に良好であったことが示される。
【０３５６】
実施例29：皮下A375皮膚がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下A375ヒト皮膚がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONA-F405Lと比較した。0日目に、接着性細胞をトリプシン処理によって収集した。5×106細胞を、6〜11週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例26に記載されているように行った。19日目に、平均腫瘍体積は約250 mm3であり、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した（下記の表5）。マウスを、19および26日目に、200μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって処置した。対照群におけるマウスは、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。適正な抗体投与を確認するため、血液試料を、投薬の1週間後にIgG血清決定のために取得した。腫瘍体積を、腫瘍接種の7週間後まで解析した。
【０３５７】
（表５）処置群および投薬
2019500869.tif 000031
【０３５８】
図28Aは、処置群あたりの中央腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのすべての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害し、他方、IgG1-CONA-F405L処置群は阻害しなかった。図28Bは、腫瘍接種後29日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズが、IgG1-b12で処置したマウスにおいてよりも小さかった（すべての用量レベルについてp＜0.05、多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置分散分析）こと、および、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせが、等価用量でIgG1-CONA-F405Lよりも有意に強力であった（マン・ホイットニー検定、p＜0.05）ことを示す。
【０３５９】
これらのデータにより、インビボA375ヒト皮膚がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONA-F405Lについてよりも有意に良好であったことが示される。
【０３６０】
実施例30：皮下HCT-15結腸がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下HCT-15ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清を補給したRPMI-1640培地における単層培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、6〜8週齢の雌BALB/cヌードマウス（Shanghai Laboratory Animal Center）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。研究中の動物の世話および使用は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）の規則に従って実施した。腫瘍体積を、毎週2回、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式：V＝0.5 a×b2（式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である）を用いてmm3で表した。腫瘍接種の11日後に、平均腫瘍サイズは186 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
【０３６１】
（表６）処置群および投薬、実施例30
2019500869.tif 000032
【０３６２】
図29Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのすべての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害し、他方、IgG1-CONAは阻害しなかった。図29Bは、処置の開始後17日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、p＜0.05）。
【０３６３】
図29Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、および等価用量のIgG1-CONAと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。
【０３６４】
これらのデータにより、HCT-15ヒト結腸がん細胞でのインビボ異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に良好であったことが示される。
【０３６５】
実施例31：皮下SW480結腸がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SW480ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清を補給したL-15培地における単層培養として、37℃で100％空気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。1×107細胞を、6〜8週齢の雌NOD/SCIDマウス（Beijing HFK Bioscience）の側腹部中に、マトリゲル（1：1）と共に200μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の10日後に、平均腫瘍サイズは175 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
【０３６６】
（表７）処置群および投薬、実施例31
2019500869.tif 000033
【０３６７】
図30Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのすべての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害した（10 mg/kg p＜0.0001；2 mg/kg p＜0.001；0.5 mg/kg p＜0.05）。IgG1-CONA処置群は、最高の用量でIgG1-b12よりも良好であっただけであった（10 mg/kgおよび2 mg/kg p＜0.01）が、0.5 mg/kgでは良好でなかった。図30Bは、処置開始後28日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、10 mg/kgおよび0.5 mg/kgで等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、p＜0.05）。
【０３６８】
図30Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。10 mg/kgで投薬した組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、および等価用量のIgG1-CONAと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.001）。
【０３６９】
これらのデータにより、インビボSW480ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、ならびに、10 mg/kgおよび0.5 mg/kgの用量についての抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に良好であったことが示される。
【０３７０】
実施例32：皮下SNU-5胃がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SNU-5ヒト胃がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、20％胎児ウシ血清を補給したIMDM培地における浮遊培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の細胞を収集し、1×107細胞を、6〜8週齢の雌CB17/SCIDマウス（Beijing HFK Bioscience）の側腹部中に、マトリゲル（1：1）と共に200μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の8日後に、平均腫瘍サイズは169 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
【０３７１】
（表８）処置群および投薬、実施例32
2019500869.tif 000034
【０３７２】
図31Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのすべての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を阻害した。2 mg/kgおよび10 mg/kgの用量で、抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、完全な研究時間（処置開始後7週間）にわたって続いた完全な腫瘍退縮を結果としてもたらした。図31Bは、処置開始後23日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（マン・ホイットニー検定、p＜0.05）。
【０３７３】
図31Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して、および等価用量のIgG1-CONAと比較して、腫瘍成長進行を有意に阻害した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.05）。
【０３７４】
これらのデータにより、インビボSNU-5ヒト胃がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、および、抗腫瘍効力は、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に良好であったことが示される。
【０３７５】
実施例33：皮下SK-MES-1肺がん異種移植モデルにおける、様々な用量の抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ効力
様々な用量のIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいて評定し、等価投薬のIgG1-CONAと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清および0.01 mM NEAAを補給したMEM培地における単層培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。0日目に、指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、6〜8週齢の雌BALB/cマウス（Shanghai Laboratory Animal Center）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。マウスの取扱いおよび腫瘍体積の測定は、実施例30に記載されているように行った。腫瘍接種の21日後に、平均腫瘍サイズは161 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBS中の200μg（10 mg/kg）、40μg（2 mg/kg）、または10μg（0.5 mg/kg）の抗体のi.v.注射によって2回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、200μg（10 mg/kg）IgG1-b12で処置した。腫瘍接種後に、動物の福祉を毎日確認し、腫瘍体積を毎週2回測定した。
【０３７６】
（表９）処置群および投薬、実施例33
2019500869.tif 000035
【０３７７】
図32Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gのすべての試験した用量は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍成長を有意に阻害し（p＜0.0001）、他方、IgG1-CONAは、10 mg/kg（p＜0.01）および2 mg/kg（p＜0.05）でIgG1-b12と比較して有意な効果を有しただけであったが、0.5 mg/kgでは効果を有さなかった（一元配置分散分析およびその後のダネットの多重比較検定）。図32Bは、処置開始後14日目に、IgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gの組み合わせによる腫瘍成長阻害が、2 mg/kgおよび0.5 mg/kgで等価用量のIgG1-CONAよりも有意に良好であったことを示す（独立t検定、それぞれ、p＜0.05およびp＜0.01）。
【０３７８】
図32Cは、1.000 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して（腫瘍サイズカットオフ1.000 mm3でのマンテル・コックス分析：p≦0.001）、ならびに2 mg/kgおよび0.5 mg/kgで等価用量IgG1-CONAと比較して（腫瘍サイズカットオフ1.000 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.05）、腫瘍成長進行を有意に阻害した。
【０３７９】
これらのデータにより、インビボSK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいて、組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430Gは、様々な用量（0.5 mg/kg、2 mg/kg、および10 mg/kg）で腫瘍成長を阻害したこと、ならびに、抗腫瘍効力は、0.5 mg/kgおよび2 mg/kgで、等価用量のIgG1-CONAについてよりも有意に良好であったことが示される。
【０３８０】
実施例34：様々なヒトがん細胞株上のDR5発現レベル
細胞あたりのDR5密度を、実施例2に記載されているように、マウスモノクローナル抗体B-K29と共にQIFIKITを用いた間接免疫蛍光によって、様々なヒトがん細胞株について定量した。細胞株を、低いDR5発現（ABC＜10,000）および中等度のDR5発現（ABC＞10,000）に従って分類した。ヒトがん細胞株SK-MEL-5（ATCC, HTB-070）悪性黒色腫、Jurkat（ATCC, TIB-152）急性T細胞白血病、およびDaudi（ATCC, CCL-231）バーキットリンパ腫は、低いDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲3,500〜6,500）。ヒト大腸がん細胞株SNU-C2B（ATCC, CCL-250）、LS411N（ATCC, CRL-2159）、およびDLD-1（ATCC, CCL-221）は、中等度のDR5発現を有することが見出された（QIFIKIT ABC範囲12,000〜44,500）。
【０３８１】
実施例35：ヘキサマー化増強変異の導入は、IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05抗体のDR5陽性ヒト結腸がん細胞に対する結合に影響を及ぼさない
ヒト結腸がん細胞HCT 116に対する結合を、E430G変異を有するおよび有さないIgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の精製した抗体バリアントについてフローサイトメトリーによって分析した。単一細胞懸濁液を調製して、実施例3に記載されているように、連続希釈抗体調製物系列（4倍希釈において、0.0006〜10μg/mLの最終濃度の範囲）について、結合を分析した。二次抗体とのインキュベーション後に、細胞を2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器（BD Biosciences）上で分析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
【０３８２】
図33は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gが、E430G変異を有さないそれらの対応する抗体と類似した、HCT 116細胞に対する用量依存性結合を示したことを示す。E430G変異の導入は、DR5抗体の結合に対していかなる効果も有さなかった。EC50値は、6回の反復実験から、IgG1-hDR5-01-G56T-E430Gについて74.4 (+/- 58.4) ng/mL、およびIgG1-hDR5-05-E430Gについて101.2 (+/- 52.6) ng/mLと算出された。 
【０３８３】
実施例36：単一抗体としておよび組み合わせとしてのIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、DR5陽性ヒトがん細胞に対する結合
中等度のDR5発現を有するHCT 116ヒトがん細胞に対する抗体結合を、単一作用物質としておよび2種類の抗体の組み合わせとしての両方で、Alexa 647標識IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびAlexa 647標識IgG1-hDR5-05-E430Gの精製した試料についてフローサイトメトリーによって分析した。1 mg/mLのIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gを、3の標識度に到達するように、0.1 M NaHCO3コンジュゲーション緩衝液において、5モル過剰量のAlexa Fluor（登録商標）647カルボン酸スクシンイミジルエステル（Molecular Probes；カタログ番号A-20006）で1時間、室温で標識した。遊離の過剰量のAlexa 647を、PD 10カラム（Amersham Bioscience、カタログ番号17-0851-01）上で除去した。単一細胞懸濁液を調製して、実施例3に記載されているように、連続希釈抗体調製物系列（5倍希釈において、0.0019〜30μg/mLの最終濃度の範囲）について結合を分析した。抗体インキュベーション後に、細胞を2回洗浄し、100μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器（BD Biosciences）上で分析した。結合曲線を、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
【０３８４】
図34は、クロスブロックしない抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの単一抗体および組み合わせの両方が、HCT 116ヒトがん細胞に対して用量依存性結合を示したことを示す。
【０３８５】
実施例37：抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430GのカニクイザルDR5に対する結合
精製したIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、ヒトDR5またはカニクイザルDR5の短いアイソフォームを発現するCHO細胞に対する結合を、フローサイトメトリーによって分析した。デスドメインの機能喪失変異K386Nを有する短いアイソフォームのヒトDR5タンパク質（SEQ ID NO 47、Uniprot番号O14763-2に基づく）、ならびに、アミノ酸185〜213の欠失およびデスドメインの機能喪失変異K420Nを有するカニクイザルDR5タンパク質（SEQ ID NO 50；NCBIアクセッション番号XP_005562887.1に基づく）の発現のためのコドン最適化構築物を、実施例1に記載されているように生成した。DR5トランスフェクトCHO細胞に対する結合を、概して実施例5に記載されているように分析した。トランスフェクト細胞を、液体窒素中に保存し、37℃で素早く融解して、10 mL培地に懸濁した。細胞を、PBSで洗浄し、1.0×106細胞/mLの濃度でFACS緩衝液に再懸濁した。100μLの細胞懸濁液試料（ウェルあたり100,000細胞）を、96ウェルプレートに播種し、300×gで3分間、4℃での遠心分離によって沈殿させた。25μLの連続希釈抗体調製物系列（6倍希釈において、最終濃度0〜20μg/mL）を添加し、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞を、洗浄して、50μLの二次抗体R-PEコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG F(ab')2（Jackson ImmunoResearch；カタログ番号109-116-098；1/100）と4℃で30分間、光から保護してインキュベートした。細胞を、150μL FACS緩衝液で2回洗浄し、50μL FACS緩衝液に再懸濁して、抗体結合を、BD LRSFFortessa細胞分析器（BD Biosciences）上で10,000イベントを記録することによって分析した。結合曲線を、GraphPad Prism ソフトウェアを用いた非線形回帰分析（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析した。
【０３８６】
図35は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gが、CHO細胞上に発現しているヒトDR5およびカニクイザルDR5に対して用量依存性結合を示したことを示す。IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方について、ヒトDR5およびカニクイザルDR5に対する結合のEC50値は、4回の反復実験に基づいて同じ範囲にあった（表10）。
【０３８７】
（表１０）ヒトDR5およびカニクイザルDR5に対するIgG1-hDR5-01-G56T-E430G およびIgG1-hDR5-05-E430Gの結合のEC50値。4回の実験に基づく。
2019500869.tif 000036
【０３８８】
実施例38：E430G変異の導入は、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05による細胞死誘導の効力を改善する
ヒト結腸がん細胞COLO 205を殺傷する抗体の能力に対する、IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05におけるヘキサマー化増強変異E430Gの効果を研究するために、生存率アッセイを行った。E430G変異を有するおよび有さない抗体を、単一作用物質として、および2種類のクロスブロックしない抗体の組み合わせとして試験した。COLO 205細胞を、実施例8に記載されているように収集した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、ポリスチレン96ウェル平底プレート（Greiner Bio-One、カタログ番号655182）に播種し、37℃で一晩接着させた。続いて、抗体濃度系列（4倍希釈において、0.3〜20,000 ng/mLの最終濃度の範囲）の50μL試料を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリン（Sigma Aldrich、カタログ番号S6942）とインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。
【０３８９】
図36は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせが、いずれかの抗体単独よりも強力であり、かつ、E430G変異を有さない抗体の組み合わせよりも強力であったことを示す。これらのデータにより、ヘキサマー化増強変異E430G変異の導入は、クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの接着性COLO 205結腸がん細胞に対する結合時に、細胞殺傷の誘導の増強を結果としてもたらしたことが示される。細胞を播種した時に抗体を直接添加した実験設定（実施例8）と対照的に、単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gは、試料を添加する前に細胞を96ウェル平底プレートに最初に接着させたこの実験において、COLO 205細胞に対する効力を示さなかった。
【０３９０】
実施例39：ヘキサマー化増強変異S440Yの導入は、ヒト結腸がん細胞に対して細胞死を誘導する抗DR5抗体の効力を改善する
IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の単一抗体および組み合わせの、COLO 205ヒト結腸がん細胞を殺傷する能力に対する、ヘキサマー化増強変異S440Yの効果を、生存率アッセイにおいて研究した。細胞を収集して、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、実施例8に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を96ウェルプレートに播種し、同時に、50μLの連続希釈抗体調製物系列（4倍希釈において、0.0003〜20μg/mLの最終濃度の範囲）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。
【０３９１】
図37Aは、細胞を播種した時に抗体を直接添加した実験設定において、ヘキサマー化増強変異S440Yの導入は、単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-S440YおよびIgG1-hDR5-05-S440Yによる用量依存性殺傷を結果としてもたらし、他方、親の野生型抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05は、COLO 205結腸がん細胞を殺傷できなかったことを示す。また、IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の組み合わせの効力も、両方の抗体においてS440Y変異の導入によって改善され、EC50の低下によって表示された（図37B）。
【０３９２】
実施例40：ヘキサマー化増強変異E430Gの導入は、抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA + IgG1-DR5-chTRA8による細胞死誘導の効力を改善する
抗体IgG1-DR5-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405LについてのクロスブロックELISAを、実施例7に記載されているように行った。K409R変異およびF405L変異は、ここでは関連性がなく、E430G変異を有する抗体の効能に対していかなる効果も有さないことが事前に示された（実施例22）。図38Aは、競合抗体の非存在下でのDR5ECD-FcHisCtagの結合と比べた、競合抗体の存在下でのコーティングした抗体に対するDR5ECD-FcHisCtag結合の阻害パーセンテージとして表した、結合競合を示す（阻害％＝100−［(競合抗体の存在下での結合／競合抗体の非存在下での結合)］*100）。コーティングしたIgG1-DR5-CONA-K409Rに対するDR5ECD-FcHisCtagの結合は、可溶性IgG1-DR5-chTRA8-F405Lの存在下で阻害されなかった。逆に、コーティングしたIgG1-DR5-chTRA8-F405Lに対するDR5ECD-FcHistagの結合もまた、可溶性IgG1-DR5-CONA-K409Rの存在下で阻害されなかった。これらのデータにより、IgG1-DR5-CONA-K409RおよびIgG1-DR5-chTRA8-F405Lは、DR5ECD-FcHisCtagの結合について互いに競合しなかったことが示される。
【０３９３】
次に、クロスブロックしない抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA-C49W + IgG1-DR5-chTRA-8の、付着したBxPC-3ヒト膵臓がん細胞を殺傷する能力に対するヘキサマー化増強変異E430Gの効果を、実施例11に記載されているような生存率アッセイにおいて研究した。図38Bは、ヘキサマー化増強変異を有する抗体の組み合わせIgG1-DR5-CONA-C49W-E430G + IgG1-DR5-chTRA8-E430Gが、E430Gヘキサマー化増強変異を有さない親抗体の組み合わせと比較して、BxPC-3細胞の用量依存性殺傷の増加を示したことを示す。
【０３９４】
実施例41：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、様々ながん細胞株において標的細胞殺傷を誘導する能力
クロスブロックしない抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、殺傷を誘導する効力を、様々なヒトがん細胞株について解析し、E430G変異を有さない親抗体の組み合わせおよびTRAILと比較した。HCT-15、HCT 116、HT-29、およびSW480結腸がん、BxPC-3、HPAF-II、およびPANC-1膵臓がん、SNU-5胃がん、A549およびSK-MES-1肺がん、ならびにA375皮膚がん細胞に対する生存率アッセイを、本質的に実施例11に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。50μLの抗体試料（133 nMの最終濃度）またはヒト組み換えTRAIL/APO-2L（eBioscience、カタログ番号BMS356；133 nMの最終濃度）を添加して、37℃で3日間インキュベートした。
【０３９５】
TRAILおよび抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは両方とも、様々な適応症を起源とするヒトがん標的細胞株の殺傷を示す（図39）。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの殺傷は、11種類の試験した細胞株のうち6種類において、対照抗体IgG1-b12と比較して有意であった。これらの応答する細胞株について、生細胞のパーセンテージは、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gとのインキュベーション後に、E430G変異を有さない抗体の組み合わせとのインキュベーション後よりも有意に低かった。IgG1-hDR5-01-K409R-E430G + IgG1-hDR5-05-F405L-E430Gの殺傷効力とDR5標的発現レベル（実施例2に記載）との間には、いかなる相関もなかった。
【０３９６】
実施例42：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの細胞傷害効力についてのヒトがん細胞株パネルのスクリーニング
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの活性を、14種類の腫瘍系統：腎臓がん、神経組織がん、大腸がん、胃がん、乳がん（主にトリプルネガティブ乳がん（TNBC））、非小細胞肺がん（NSCLC）、膀胱がん、膵臓がん、卵巣がん、黒色腫、肝臓がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、および小細胞肺がん（SCLC）に相当する235細胞株のパネルにおいて試験し、TRAILの活性と比較した。成長阻害解析を伴う72時間ATPliteアッセイ（120時間アッセイを行ったDLD-1およびHCT 116細胞株を除く）を、Horizon Discovery Ltd, UKで、2つの部分において行った。試料は、384ウェルアッセイプレートにおいて四連として試験した。0.072μMの最終濃度から開始した抗体の連続希釈系列を、すべての試験した細胞株について使用した。TRAIL（Invitrogen；カタログ番号PHC1634）については、第1の部分において試験した細胞株については0.01μMの最終濃度、およびスクリーニングの第2の部分において試験した細胞株については0.17μMの最終濃度から開始した連続希釈系列を使用した。阻害パーセンテージは、以下の式を用いて算出した：T≧V(0)の場合、阻害パーセンテージ＝100*［1−（T−V(0)）／（V−V(0)）］；T＜V(0)の場合、阻害パーセンテージは100％、式中、T＝試験試料の発光、V(0)＝0日目の培地対照試料の発光、およびV＝3日目の培地対照試料の発光。レスポンダー細胞株およびノンレスポンダー細胞株を、70％以上の阻害を示す細胞株をレスポンダーとして、および69％以下の阻害を示す細胞株をノンレスポンダーとして分類する、最大応答閾値によってグループ化した（図40；表11）。抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL単独療法の両方についてのレスポンダー細胞株を、小細胞肺がん（SCLC）を除いて、すべての試験した腫瘍適応症について見出した。
【０３９７】
表１１：様々なヒトがん適応症：腎臓がん（A）、神経組織がん（B）、大腸がん（C）、胃がん（D）、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）（E）、非小細胞肺がん（NSCLC）（F）、膀胱がん（G）、膵臓がん（H）、卵巣がん（I）、黒色腫（J）、肝臓がん（K）、子宮内膜がん（L）、頭頸部がん（M）、および小細胞肺がん（SCLC）（N）に相当する細胞株のパネルについて、Horizon Discovery Ltd, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL単独療法の結果。IC50値および最大阻害のパーセンテージを表にしている。
【０３９８】
（表１１Ａ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の腎臓がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000037
【０３９９】
（表１１Ｂ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の神経組織がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000038
【０４００】
（表１１Ｃ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の大腸がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000039
【０４０１】
（表１１Ｄ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の胃がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000040
【０４０２】
（表１１Ｅ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の乳がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000041
【０４０３】
（表１１Ｆ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000042
【０４０４】
（表１１Ｇ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の膀胱がん細胞株スクリーニングの結果
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【０４０５】
（表１１Ｈ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の膵臓がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000044
【０４０６】
（表１１Ｉ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の卵巣がん細胞株スクリーニングの結果
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【０４０７】
（表１１Ｊ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の黒色腫細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000046
【０４０８】
（表１１Ｋ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の肝臓がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000047
【０４０９】
（表１１Ｌ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の子宮内膜がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000048
【０４１０】
（表１１Ｍ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の頭頸部がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000049
【０４１１】
（表１１Ｎ）Horizon, UKでの3日生存率アッセイスクリーニングにおいて決定した際の、抗体（IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）およびTRAIL療法の小細胞肺がん（SCLC）がん細胞株スクリーニングの結果
2019500869.tif 000050
【０４１２】
実施例43：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な組み合わせ比でがん細胞殺傷を誘導する能力
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、様々な比のIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gで組み合わせた場合の、BxPC-3膵臓がん細胞およびHCT-15結腸がん細胞の殺傷を誘導する能力を研究するために、生存率アッセイを行った。連続希釈系列（5倍希釈において、0.006〜20μg/mLの最終濃度の範囲にわたる）の、1：0、9：1、3：1、1：1、1：3、1：9、および0：1の抗体比を、実施例16に記載されているようにCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて試験した。
【０４１３】
20μg/mL、4μg/mL、および0.8μg/mLの総抗体濃度で、BxPC-3（図41A）およびHCT-15（図41B）細胞の殺傷は、抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの両方を含有するすべての試験した抗体比で同等に有効であった。対照的に、単一抗体（1：0および0：1の比）は、殺傷を誘導しなかった。0.16μg/mLの総抗体濃度で、試験したIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの組み合わせは、より高い抗体濃度よりも小さい程度であったが、殺傷を誘導し、効力は、使用する様々な比によって影響を受ける。
【０４１４】
実施例44：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導する
カスパーゼ阻害剤の存在下および非存在下で、ヘキサマー化増強変異E430Gを有するおよび有さないIgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05の抗体バリアントの組み合わせの細胞傷害を比較するために、生存率アッセイを行った。抗体またはTRAIL試料の連続希釈系列（4倍希釈において、0.002〜133 nMの最終濃度の範囲）でのCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイを、実施例18に記載されているように行った。
【０４１５】
BxPC-3細胞の殺傷は、TRAILならびに抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05およびIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKの存在下で阻害された（図42）。これらのデータにより、TRAILと同様に、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05およびIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、カスパーゼ依存性プログラム細胞死を誘導したことが示される。
【０４１６】
実施例45：ヒトがん細胞に対する抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの結合時の、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7の活性化
カスパーゼ-3/7の活性化を、本質的に実施例20に記載されているように、カスパーゼ-Glo 3/7アッセイを用いて時間において測定した。簡潔に言うと、細胞を、トリプシン処理によって収集し、セルストレーナーを通過させ、1,200 rpmで5分間の遠心分離によって沈殿させて、1.6×105細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁した。25μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり4,000細胞）を、384ウェル培養プレート（Perkin Elmer、カタログ番号6007680）に播種し、37℃で一晩インキュベートした。25μLの試料を添加し（26.6 nMの最終濃度）、37℃で1、2、4 、および6時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温まで温度を低下させた。細胞を、300 gで3分間の遠心分離によって沈殿させた。25μLの上清を除去し、25μLのカスパーゼ-Glo 3/7基質によって置き換えた。500 rpmで1分間振盪することによって混合した後、プレートを、室温で1時間インキュベートした。発光を、EnVision Multilabel Reader（Perkin Elmer）上で測定した。
【０４１７】
1、2、4〜6時間の時間経過において、TRAILおよび抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは両方とも、ヘキサマー化増強変異を有さないWT抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05と比較して、BxPC-3細胞に対してより迅速な、かつより強力なカスパーゼ-3/7の活性化を誘導した（図43）。
【０４１８】
実施例46：抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビトロの効能は、二次的Fc架橋剤の存在を必要としない
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの、二次的抗体架橋剤の非存在下および存在下でヒトHCT-15結腸がん細胞およびBxPC-3膵臓がん細胞の殺傷を誘導する能力を比較するために、生存率アッセイを行った。二次的抗体架橋剤の存在下で殺傷の増強を示すことが公知であるIgG1-DR5-CONAを、比較のために同じアッセイにおいて試験した。二次的架橋剤の非存在下および存在下での生存率アッセイを、本質的に実施例21に記載されているように行った。簡潔に言うと、100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、96ウェルプレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。ヤギ抗ヒトIgG抗体のF(ab')2断片の非存在下または存在下の、50μLの抗体試料（最終濃度4μg/mL）と、37℃で3日間インキュベートした。細胞殺傷の陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリンとインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。
【０４１９】
組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、BxPC-3およびHCT15細胞において強力な殺傷を誘導し、細胞傷害は、二次的架橋剤の存在下でさらには増強されなかった（図44）。対照的に、IgG1-DR5-CONAおよび野生型抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05の効力は、BxPC-3およびHCT15の両方において、二次的架橋剤の存在によって増強された。これらのデータにより、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430GによるBxPC-3およびHCT15がん細胞の殺傷は、二次的Fc架橋剤の存在とは無関係であることが示される。
【０４２０】
実施例47：ヒトDR5またはカニクイザルDR5のいずれかを一過性にトランスフェクトしたCHO細胞に対するIgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの結合時の、補体活性化
抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、補体を活性化する能力を解析するために、ヒトDR5またはサルDR5のいずれかの短いアイソフォームを一過性にトランスフェクトしたCHO細胞に対してインビトロ補体依存性細胞傷害（CDC）アッセイを行い、補体成分C3cの沈着を測定した。DR5構築物は、アゴニスト抗体の結合時のアポトーシスの誘導による殺傷を阻止するために、それらのデスドメイン中にK386N（ヒト）またはK420N（カニクイザル）の変異を保有していた。ヒトDR5またはサル（カニクイザル（Macaca fascicularis））DR5でのCHO細胞の一過性トランスフェクションは、実施例1に記載されているように行った。
【０４２１】
CDCアッセイのために、0.1×106細胞を、ポリスチレン丸底96ウェルプレート（Greiner bio-one、カタログ番号650101）において精製抗体の濃度系列と、80μLの総体積中で15分間、振盪機上、RTでプレインキュベートした。次に、20μLの正常ヒト血清（NHS；カタログ番号M0008 Sanquin, Amsterdam, The Netherlands）を、補体の供給源として添加し、37℃インキュベーターにおいて45分間インキュベートした（20％の最終NHS濃度；3倍希釈において、0.003〜10.0μg/mLの最終抗体濃度）。プレートを氷上に置くことによって反応を停止し、その後、遠心分離によって細胞を沈殿させて、上清を30μLの2μg/mLヨウ化プロピジウム溶液（PI；Sigma Aldrich, Zwijnaarde, The Netherlands）によって置き換えた。PI陽性細胞のパーセンテージを、Intellicyt iQue（商標）スクリーナー（Westburg）上でフローサイトメトリーによって決定した。データを、GraphPad PRISM 5において対数変換された濃度を用いた非線形用量応答適合の最良適合値を用いて分析した。
【０４２２】
C3b沈着の解析のために、0.1×106細胞を、丸底96ウェルプレートにおいて精製抗体の濃度系列（3倍希釈において、0.003〜10.0μg/mLの最終抗体濃度）と、80μLの総体積中で15分間、振盪機上、RTでプレインキュベートした。次に、20μLのC5枯渇血清（Quidel；カタログ番号A501）を、補体の供給源として添加し、37℃インキュベーターにおいて45分間インキュベートした（20％の最終NHS濃度）。細胞を沈殿させ、続いて、50μLのFITC標識ポリクローナルウサギ抗ヒトC3c補体（Dako；カタログ番号F0201；2μg/mL）とFACS緩衝液において30分間、4℃でインキュベートした。細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄し、30μL FACS緩衝液に再懸濁した。細胞上へのC3b沈着を、Intellicyt iQue（商標）スクリーナー（Westburg）上でフローサイトメトリーによって決定した。データを、GraphPad PRISM 5において対数変換された濃度を用いた非線形用量応答適合の最良適合値を用いて分析した。
【０４２３】
DR5トランスフェクトCHO細胞に対する補体依存性殺傷（図45A〜B）およびC3b沈着（図45C〜D）の両方が、IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gについて、両方の単一抗体および組み合わせについて用量応用曲線で観察された。これらのデータにより、IgG1抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの、細胞表面上の標的結合時に補体活性化を誘導する内因性能力が、両方の単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430G、ならびに組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gについて保存されていたことが示される。
【０４２４】
実施例48：ヒト結腸がん細胞株に対する、化合物のパネルでの抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効力増強についての、薬物併用スクリーニング解析
抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用して相乗的な阻害効果を提示する臨床的に関連性のある化合物を特定するために、様々な治療的分類に相当する100種類の化合物を、結腸がん細胞株における潜在的な相乗効果についてスクリーニングした。成長阻害分析を伴う、72時間（LS-411N, SNU-C2B、およびSW480について）または120時間（DLD-1およびHCT 116について）のATPliteアッセイを、Horizon Discovery Ltd, UKで、384ウェルアッセイプレートにおいて6×6の最適化された組み合わせマトリックスで行った。すべての試料は、四連で試験した。成長阻害パーセンテージは、以下の式を用いて算出した：T≧V(0)の場合、成長阻害パーセンテージ＝100*［1−（T−V(0)）／（V−V(0)）］；T＜V(0)の場合、 成長阻害パーセンテージ＝100*［1−（T-V(0)）／V(0)］、式中、T＝試験試料の発光、V(0)＝0日目の培地対照試料の発光、およびV＝3日目の培地対照試料の発光。相乗効果を特定するために、平均自己クロス活性を、代表的な化合物を用いて各々の治療的分類について決定した。Loewe相加性を超過する併用効果を測定するため、Horizon Discovery Ltdは、相乗効果スコアと呼ばれる相乗的相互作用の強さを特徴決定するためのスカラー測定を考案した。相乗効果スコア方程式は、相加性についてのLoeweモデルを用いた、成分作用物質の活性に数値的に由来するモデル表面を超過する、マトリックスにおける各点での実験的に観察された活性体積を積分する。相乗効果スコア方程式における追加的な用語は、個々の作用物質について使用される種々の希釈係数について正規化するため、および実験全体にわたる相乗効果スコアの比較を可能にするために使用される。陽性阻害ゲーティングまたはIデータ乗数を含めることにより、ゼロ効果レベル近くのノイズを除去し、高い活性レベルで起こる相乗的相互作用についての結果に偏らせる。相乗効果スコア（S）は、以下の式を用いて算出した： S＝log fX log fY Σ max（0,Iデータ）（Iデータ−ILoewe）、式中、fx,y ＝各々の単一作用物質について使用される希釈係数。平均自己クロス＋3σよりも大きい相乗効果スコアを、99％信頼レベルで候補相乗効果と考えた。
【０４２５】
表12は、100種類の試験した化合物すべてについての相乗効果スコアを示す。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gとの相乗効果は、化学療法剤（細胞骨格調節因子およびDNA/RNA損傷物質を含む）、キナーゼ阻害剤、PI3K経路阻害剤、RAS阻害剤、アポトーシス調節物質、プロテアソーム阻害剤、エピジェネティック修飾因子（HDAC阻害剤を含む）、および他のものを含む、様々な治療的分類由来の化合物で、1つまたは複数の細胞株について観察された。図46は、抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用した試験化合物の成長阻害効果の、5種類の例を示す。ビリナパント（図46C）、オキサリプラチン（図46A）、イリノテカン（図46B）、およびパクリタキセル（図46E）は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの効果を増強した例であり、他方、バリシチニブ（図46D）は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gの活性に対していかなる効果も示さなかった例である。
【０４２６】
（表１２）結腸がん細胞株LS-411N、SNU-C2B、SW480、DLD-1、およびHCT 116に対する生存率アッセイにおいてIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gと併用して試験した、様々な治療的分類の100種類の化合物についての相乗効果スコア。相乗効果（相乗効果スコア＞平均自己クロス＋3σ）を灰色で示す。
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【０４２７】
実施例49：皮下COLO 205結腸がん異種移植モデルにおける、抗DR5抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ効力
抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、皮下COLO 205ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、単一抗体および両方の抗体の組み合わせについて評定し、E430G変異を有さない親抗体と比較した。腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、本質的に実施例26に記載されているように行った。3×106細胞を、5〜8週齢の雌SCIDマウス（C.B-17/IcrHan（登録商標）Hsd-Prkdcscid；Harlan）の側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。9日目に、平均腫瘍体積を測定し、マウスを、同等の腫瘍サイズ分散を有する群に選別した。マウスを、9日目に、200μL PBS中の10μg（0.5 mg/kg）抗体の静脈内（i.v.）注射によって処置した。対照群におけるマウスは、10μg（0.5 mg/kg）IgG1-b12で処置した。
【０４２８】
（表１３）処置群および投薬
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【０４２９】
図47Aは、時間における処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。単一抗体IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430GにおけるE430G変異の導入は、E430G変異を有さない親抗体と比較して、腫瘍成長の阻害の増強を結果としてもたらした。抗体の組み合わせでの処置は、IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430GおよびE430G変異を有さない親抗体の組み合わせの両方について、完全な腫瘍退縮を誘導した。19日目に、DR5抗体で処置したすべての群における平均腫瘍サイズは、陰性対照抗体IgG1-b12で処置した動物におけるものよりも有意に小さかった（マン・ホイットニー検定（P＜0.001））（データは示していない）。図47Bは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。陰性対照抗体IgG1-b12で処置したマウスと比較して、腫瘍増生は、抗DR5抗体で処置したすべての群において有意に遅延していた（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.0001）。ヘキサマー化増強変異E430Gを有さない単一抗体IgG1-hDR5-01-G56TおよびIgG1-hDR5-05で処置したマウスは、他の試験した抗DR5抗体で処置したマウスと比較して有意に早期に、腫瘍増生を示した（腫瘍サイズカットオフ500 mm3でのマンテル・コックス分析：p＜0.0001）。
【０４３０】
実施例50：皮下HCT15結腸がん異種移植モデルにおける抗DR5抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のインビボ効力に対する、ヘキサマー化増強変異の効果
抗DR5抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下HCT15ヒト結腸がん異種移植モデルにおいて、E430Gヘキサマー化増強変異を有さないIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05のものと比較した。細胞を、インビトロで、10％胎児ウシ血清を補給したRPMI-1640培地における単層培養として、37℃で空気中5％ CO2の雰囲気において維持した。指数増殖期の接着性細胞を、トリプシン-EDTA処理によって収集した。5×106細胞を、7〜9週齢の雌BALB/cヌードマウスの側腹部中に、100μL PBSの体積において注射した。研究中の動物の世話および使用は、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care（AAALAC）の規則に従って実施した。腫瘍体積を、毎週2回、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式：V＝0.5 a×b2（式中、aおよびbは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である）を用いてmm3で表した。平均腫瘍サイズが161 mm3に達した時に、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当て、処置を開始した（群あたり8匹のマウス）。マウスを、Q7Dレジメンに従って、0.5 mg/kgの抗体（組み合わせにおいては0.25 mg/kgの各抗体）のi.v.注射によって3回処置した。対照群におけるマウスを、並行して、0.5 mg/kg IgG1-b12で処置した。
【０４３１】
図48Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体の組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gは、IgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05よりも良好な腫瘍成長阻害を示した。21日目に、組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gで処置したマウスにおける平均腫瘍サイズは、等価用量のIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05で処置したマウスにおいてよりも有意に小さかった（マン・ホイットニー検定：P＜0.0011）（図48B）。図48Cは、750 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。組み合わせIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gで処置したマウスにおける腫瘍増生は、等価用量のIgG1-hDR5-01-G56T + IgG1-hDR5-05で処置したマウスにおいてよりも有意に後であった。
【０４３２】
これらのデータにより、抗DR5抗体の組み合わせIgG1-DR5-01-K409R-E430G + IgG1-DR5-05-F405L-E430GにおけるE430Gヘキサマー化増強変異の導入は、HCT15ヒト結腸がん細胞でのインビボ異種移植モデルにおいて、腫瘍成長阻害の増強を結果としてもたらしたことが示される。
【０４３３】
実施例51：皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおける、パクリタキセルと併用したIgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ効力
IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430Gのインビボ抗腫瘍効力を、CrownBiosciences, Taicang, Chinaで、皮下SK-MES-1ヒト肺がん異種移植モデルにおいてパクリタキセルと併用して評定した。細胞培養、腫瘍細胞接種、マウスの取扱い、腫瘍増生の測定、および終点決定は、実施例33に記載されているように行った。腫瘍接種の21日後に、平均腫瘍サイズは167 mm3に達し、マウスを、乱塊法を用いて群に割り当てて、処置を開始した。表14に示したように、マウスを、Q7Dレジメンに従って、g体重あたり、10μL PBSにおいて両方を投薬した2 mg/kg抗体および15 mg/kgパクリタキセルのi.v.注射によって2回処置した。
【０４３４】
（表１４）処置群および投薬、実施例53
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【０４３５】
図49Aは、処置群あたりの平均腫瘍体積を示す。抗体処置単独（2 mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G）、または15 mg/kgパクリタキセルと併用した2 mg/kg抗体処置、または15 mg/kgパクリタキセル単独はすべて、IgG1-b12と比較して抗腫瘍効力を実証した。図49Bは、16日目の処置群あたりの腫瘍体積を示す。すべての処置群において、腫瘍負荷は、IgG1-b12と比較して有意に低かった（マン・ホイットニー検定、p＜0.01）。図49Cは、500 mm3よりも大きい腫瘍体積でのカットオフ設定を伴う、腫瘍進行のカプラン・マイヤープロットを示す。15 mg/kgパクリタキセルと2 mg/kg IgG1-hDR5-01-G56T-E430G + IgG1-hDR5-05-E430G抗体との併用は、パクリタキセルまたは抗体単独と比較して、進行のない生存を有意に延長させた（ゲーハン・ブレスロー・ウィルコクソン検定、腫瘍サイズカットオフ500 mm3：p＜0.05）。
【０４３６】
実施例52：IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gの薬物動態（PK）解析
IgG1-hDR5-01-G56T-E430GおよびIgG1-hDR5-05-E430Gのクリアランス速度を、E430G変異を有さない親抗体と比較して、単一化合物についておよび2種類の抗体の組み合わせについて、SCIDマウスにおけるPK実験において研究した。
【０４３７】
7〜10週齢の雌SCID（C.B-17/IcrHan@Hsd-Prkdc<scid, Harlan）マウス（群あたり3匹のマウス）に、200μLの注射体積において20μgの抗体（1 mg/kg）を静脈内注射した。50〜100μLの血液試料を、抗体投与後10分、4時間、1日、2日、7日、14日、および21日に、伏在静脈から採集した。血液を、ヘパリン含有バイアル中に採集し、10,000 gで5分間、遠心分離した。血漿試料を、4種類の最初の時点については1：20（285μL PBSA（0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）を補給したPBS）中、15μL試料）で、最後の2種類の時点については1：10（270μL PBSA中、30μL試料）で希釈して、抗体濃度の決定まで-20℃で保存した。
【０４３８】
総ヒトIgG濃度を、サンドイッチELISAを用いて決定した。マウス抗ヒトIgG-κmAbクローンMH16（CLB Sanquin、カタログ番号M1268）を、捕捉抗体として使用し、100μLにおいて4℃で一晩、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）にPBS中2μg/mLの濃度でコーティングした。プレートを、プレート振盪機上で1時間、RTでPBSAとインキュベートすることによってブロッキングした。洗浄後、100μLの連続希釈した血漿試料（3倍希釈において、0.037〜1μg/mLの範囲）を添加して、プレート振盪機上で1時間、RTでインキュベートした。プレートを、300μL PBST（0.05％ Tween 20を補給したPBS）で3回洗浄し、続いて、プレート振盪機上で1時間、RTで100μLのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（番号109-035-098, Jackson, West Grace, PA；0.2％ BSAを補給したPBSTにおいて1：10.000）とインキュベートした。プレートを再び、300μL PBSTで3回洗浄し、その後、15分間、RTでの100μLの基質2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)［ABTS；Roche、カタログ番号11112 422001；50 mL ABTS緩衝液（Roche、カタログ番号11112 597001)中、1錠］と、光から保護してインキュベートした。100μLの2％シュウ酸の添加およびRTで10分間のインキュベーションによって、反応を停止した。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）において405 nmで測定した。参照曲線として注入した物質を用いることによって、濃度を算出した。プレート対照として、精製ヒトIgG1（The binding site、カタログ番号BP078）を含めた。ヒトIgG濃度（μg/mLにおける）をプロットし（図50A）、曲線下の面積（AUC）を、Graphpad prism 6.0を用いて算出した。血液試料採取の最後の日（21日目）までのクリアランスを、式D*1.000/AUC（式中、Dは注射の用量（1 mg/kg）である）によって決定した（図50B）。
【０４３９】
IgG1-hDR5-01-G56T-E430GまたはIgG1-hDR5-05-E430Gと、E430G変異を有さないそれらの親抗体との間には、単一作用物質として注射した時またはそれらの組み合わせとして注射した時の両方で、血漿クリアランス速度においていかなる差も観察されなかった（図50）。
【０４４０】
実施例53：ヘキサマー化増強変異E430Gを有する抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAは、ヒト結腸がん細胞を殺傷することができる
本研究は、ヘキサマー化増強変異E430Gを有する抗DR5抗体IgG1-DR5-CONAの、付着したヒト結腸がん細胞COLO 205を殺傷する能力を例証する。COLO 205細胞を、実施例8に記載されているように収集した。100μLの単一細胞懸濁液（ウェルあたり5,000細胞）を、96ウェル平底プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートした。抗体濃度系列（4倍希釈において、0.04〜10μg/mLの最終濃度の範囲）の50μL試料を添加して、37℃で3日間インキュベートした。陽性対照として、細胞を、5μMスタウロスポリンとインキュベートした。細胞培養物の生存率を、実施例8に記載されているように、CellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイにおいて決定した。発光を、EnVision Multilabel Reader（PerkinElmer）上で測定した。データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いた非線形回帰（可変の傾きを有するシグモイド用量応答）を用いて分析し、プロットした。生細胞パーセンテージは、以下の式を用いて算出した：生細胞％＝［（抗体試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）／（抗体なし試料の発光−スタウロスポリン試料の発光）］*100。
【０４４１】
図51は、ヘキサマー化増強変異E430Gの導入が、IgG1-DR5-CONA-E430Gによる用量依存性殺傷を結果としてもたらし、他方、親の野生型抗体 IgG1-DR5-CONAは、付着したCOLO 205結腸がん細胞を殺傷できなかったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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