(57)【要約】本明細書では、腎細胞癌細胞によって発現される抗原に結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が開示される。一部の例では、ＴＣＲは、ａ鎖（配列番号２など）およびβ鎖（配列番号３など）を含む。本明細書では、開示するＴＣＲのａ鎖および／またはβ鎖をコードする核酸を含むベクターも開示される。さらに、ＴＣＲを発現する改変されたＴ細胞が開示される。一部の例では、改変されたＴ細胞は、ＴＣＲａ鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含むベクターでＴ細胞を形質導入することによって調製される。一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞の集団を得ること、ＴＣＲａ鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含むベクターでＴ細胞の集団を形質導入すること、ならびに改変されたＴ細胞を含む組成物を被験体に投与することによって、ＲＣＣを有する被験体を処置することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＴ細胞受容体α鎖をコードする核酸分子、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＴ細胞受容体β鎖をコードする核酸分子、または両方を含む、ベクター。
【請求項２】
前記Ｔ細胞受容体α鎖をコードする前記核酸分子が配列番号２の核酸配列を含み、前記Ｔ細胞受容体β鎖をコードする前記核酸分子が配列番号３の核酸配列を含み、または両方である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
配列番号２の核酸配列および配列番号３の核酸配列を含む、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記Ｔ細胞受容体α鎖をコードする前記核酸、前記Ｔ細胞受容体β鎖をコードする前記核酸、または両方が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
細胞内ドメインを欠く末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
レトロウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
ＳＡＭＥＮレトロウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
配列番号６の核酸配列を含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１０】
ウイルスのｇａｇタンパク質、ウイルスのｐｏｌタンパク質、ウイルスのｅｎｖタンパク質、またはこれらの２つまたはそれより多くの組合せをコードする核酸をさらに含む、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ＰＧ１３細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
リンパ球である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含むＴ細胞受容体α鎖をコードする異種核酸および配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含むＴ細胞受容体β鎖をコードする異種核酸分子を含む、改変されたＴ細胞。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞受容体α鎖をコードする前記異種核酸が、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるタンパク質をコードし、前記Ｔ細胞受容体β鎖をコードする前記異種核酸が、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるタンパク質をコードする、請求項１４に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞受容体α鎖をコードする前記異種核酸が、配列番号２の核酸配列を含むまたはそれからなり、前記Ｔ細胞受容体β鎖をコードする前記異種核酸が、配列番号３の核酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１４または請求項１５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項１７】
細胞内ドメインを欠く末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクターで形質導入された改変されたＴ細胞。
【請求項１９】
腎細胞癌を有する被験体に対して自己であるゲノムを含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項２０】
請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
腎細胞癌（ＲＣＣ）を処置または阻害する方法であって、
ＲＣＣを有する被験体からＴ細胞の集団を得ること、
配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むＴ細胞受容体α鎖をコードする核酸および配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むＴ細胞受容体β鎖をコードする核酸を含むベクターで該Ｔ細胞の集団を形質導入することによって、改変されたＴ細胞の集団を産生すること、ならびに
該改変されたＴ細胞を含む組成物を該被験体に投与することによって、該ＲＣＣを処置または阻害すること
を含む、方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞受容体α鎖をコードする前記核酸が、配列番号２の核酸配列を含むまたはそれからなり、前記Ｔ細胞受容体β鎖をコードする前記核酸が、配列番号３の核酸配列を含むまたはそれからなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞受容体α鎖をコードする前記核酸が、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるタンパク質をコードし、前記Ｔ細胞受容体β鎖をコードする前記核酸が、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるタンパク質をコードする、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターが、細胞内ドメインを欠く末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記改変されたＴ細胞の集団が、前記被験体に投与する前に、抗ＣＤ３４抗体を用いる選択によって富化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞の集団が、形質導入の前に活性化される、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
形質導入の前に、ＣＤ４を発現するＴ細胞を前記Ｔ細胞の集団から枯渇させる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記改変されたＴ細胞の集団を、前記被験体に投与する前に増殖させる、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記改変されたＴ細胞の集団を前記被験体に投与する前に、該被験体に免疫抑制療法が施される、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＣＣが明細胞ＲＣＣである、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＣＣが、配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト内在性レトロウイルス−Ｅ（ＨＥＲＶ−Ｅ）タンパク質を発現する、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）血清型ＨＬＡ−Ａ１１について陽性である、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＣＣを有する被験体を選択することをさらに含み、該ＲＣＣが、配列番号１を含むＨＥＲＶ−Ｅタンパク質を発現し、該被験体がＨＬＡ−Ａ１１について陽性である、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
腎細胞癌抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現する改変されたＴ細胞を作製する方法であって、
被験体からリンパ球の集団を得ること、
該リンパ球の集団を抗ＣＤ３抗体およびインターロイキン−２と接触させて、活性化Ｔ細胞の集団を産生すること、
該活性化Ｔ細胞の集団を請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクターで形質導入して、形質導入されたＴ細胞の集団を産生すること、ならびに
該形質導入されたＴ細胞の集団を増殖させることによって、該改変されたＴ細胞を産生すること
を含む、方法。
【請求項３６】
前記形質導入されたＴ細胞の集団を増殖させることが、前記形質導入されたＴ細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５と接触させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記形質導入されたＴ細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５と接触させることが、該細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５と９〜１１日間接触させることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記形質導入されたＴ細胞を抗ＣＤ３４抗体と接触させることによって、前記形質導入されたＴ細胞の集団を富化することをさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンパ球の集団が、腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する被験体から得られる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記リンパ球の集団が、配列番号１を含むタンパク質を発現する腎細胞癌を有する被験体から得られ、該被験体がＨＬＡ−Ａ１１陽性である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＴ細胞受容体α鎖をコードする単離された核酸。
【請求項４２】
配列番号２の核酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるタンパク質をコードする、請求項４１または請求項４２に記載の核酸。
【請求項４４】
配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を含むＴ細胞受容体β鎖をコードする単離された核酸。
【請求項４５】
配列番号３の核酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４４に記載の核酸。
【請求項４６】
配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるタンパク質をコードする、請求項４４または請求項４５に記載の核酸。
【請求項４７】
配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む、単離されたＴ細胞受容体α鎖ポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む、単離されたＴ細胞受容体β鎖ポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４９に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月３０日に出願された米国仮出願第６２／３５７，２６５号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、がん免疫療法に関し、特に、腎細胞癌反応性Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞、ならびにＴ細胞を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
腎細胞癌（ＲＣＣ）は、米国単独で毎年約１２，０００人の死亡の原因である。ほとんどのがんと同様に、早期に検出された場合には外科的介入が非常に効果的である。標的化された阻害剤および免疫チェックポイントの阻害剤（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体など）でのＲＣＣの処置が進歩しているにもかかわらず、転移性ＲＣＣは一般に致死性であり、平均生存期間は１年未満である。したがって、ＲＣＣに対してより効果的な療法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、ＲＣＣ細胞上に発現される抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が開示される。被験体においてＲＣＣを処置または阻害するために、Ｔ細胞にＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα鎖およびβ鎖）をコードする核酸を形質導入し、Ｔ細胞を、ＲＣＣを有する被験体に投与することができる。
【０００５】
本明細書では、ＲＣＣ細胞によって発現されるヒト内在性レトロウイルス−Ｅ（ＨＥＲＶ−Ｅ）抗原（例えば、配列ＡＴＷＬＧＳＫＴＷＫを有するペプチド；配列番号１）に結合することができるＴＣＲが開示される。一部の例では、ＴＣＲは、明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）細胞によって発現されるＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲである。一部の例では、ＴＣＲは、α鎖（配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するα鎖など）およびβ鎖（配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するβ鎖など）を含む。一部の例では、ＴＣＲα鎖は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によってコードされ、ＴＣＲβ鎖は、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸によってコードされる。
【０００６】
本明細書では、例えば、発現制御配列（プロモーターなど）に作動可能に連結された、本開示のＴＣＲα鎖および／またはβ鎖をコードする核酸を含むベクター（ウイルスベクターなど）も開示される。一部の例では、ベクターは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むが細胞内ドメインを欠く、ＣＤ３４タンパク質などの末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸も含む。非限定的な一例では、ベクターは、ＴＣＲα鎖（配列番号２など）、ＴＣＲβ鎖（配列番号３など）、および末端切断型ＣＤ３４をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター（ＳＡＭＥＮベクターなど）である。
【０００７】
さらに、ＴＣＲα鎖（例えば、配列番号２）およびＴＣＲβ鎖（例えば、配列番号３）をコードする核酸などの、ＲＣＣ細胞（ｃｃＲＣＣ細胞など）によって発現されるＨＥＲＶ−Ｅ抗原に結合することができるＴＣＲを発現する改変されたＴ細胞も開示される。一部の例では、改変されたＴ細胞は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖、および必要に応じて末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸を含むベクターをＴ細胞（ＲＣＣを有する被験体またはドナーから得られたＴ細胞など）に形質導入することによって調製される。
【０００８】
一部の実施形態では、方法は、被験体またはドナーからＴ細胞の集団を得ること、ＴＣＲα鎖（配列番号２など）およびＴＣＲβ鎖（配列番号３など）をコードする核酸を含むベクターをＴ細胞の集団に形質導入すること、改変されたＴ細胞の集団を生成すること、ならびに改変されたＴ細胞を含む組成物を被験体に投与することによって、ＲＣＣ（例えば、ｃｃＲＣＣまたは転移性ｃｃＲＣＣ）を有する被験体を処置することを含む。一部の例では、Ｔ細胞の集団は、核酸分子を形質導入する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化される。他の例では、改変されたＴ細胞の集団は、被験体に投与する前に増殖および／または富化される。
【０００９】
本開示の上記のおよび他の特徴は、添付の図面を参照して進める以下の詳細な記載からより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本明細書に記載するＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現用の例示的なレトロウイルスベクターの概略図である。ＣＭＶ、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー；ψ、パッケージングシグナル；ＳＤ、スプライスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＴＣＲα、ＨＥＲＶ−Ｅ抗原特異的ＴＣＲα鎖（例えば、配列番号２）；Ｐ２Ａ、豚テシオウイルスに由来する自己切断性２Ａペプチド；ＴＣＲβ、ＨＥＲＶ−Ｅ抗原特異的ＴＣＲβ鎖（例えば、配列番号３）；Ｔ２Ａ、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスの自己切断性２Ａペプチド；ＣＤ３４ｔ、タンパク質の細胞外および膜貫通領域を有する末端切断型ＣＤ３４；ＬＴＲ、３’ＬＴＲ。
【００１１】
【図２】図２は、ＲＣＣを有する被験体を処置するための改変されたＴ細胞を回収および作製するための例示的なプロトコールの概略図である。
【００１２】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、２人のドナー（図３Ａ）および１人のドナー（図３Ｂ）からのｃｃＲＣＣ細胞に対するＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞の反応性を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、２人のドナー（図３Ａ）および１人のドナー（図３Ｂ）からのｃｃＲＣＣ細胞に対するＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞の反応性を示すグラフである。
【００１３】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ＣＤ３４選択ステップの前および後の形質導入されたＴ細胞におけるＣＤ３４発現（図４Ａ）、ならびにＣＤ３４選択の形質導入されたＴ細胞におけるＣＤ３（図４Ｂ）およびＨＥＲＶ−Ｅテトラマー（図４Ｃ）の発現を示す一連のプロットである。
【００１４】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＣＤ３４＋−ＨＥＲＶ−Ｅテトラマー＋形質導入Ｔ細胞におけるＣＤ８細胞（図５Ａ）およびＣＤ４細胞（図５Ｂ）を示すプロットである。
【００１５】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２人のドナーからのｃｃＲＣＣ細胞に対するＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞のクロム細胞傷害性を示すグラフである。ドナー１からのＴ細胞集団は３９．９％のＣＤ８＋であり（図６Ａ）、ドナー２からのＴ細胞集団は５２．８％のＣＤ８＋であった（図６Ｂ）。
【００１６】
【図７】図７は、２人の異なるドナーからのＲＣＣ細胞またはＬＣＬ細胞に対する、およびＨＬＡ−Ａ１１陰性ドナーからのＴ細胞および活性化Ｔ細胞に対するＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＴ細胞のクロム放出細胞傷害性を示すグラフである。
【００１７】
【図８】図８は、様々な細胞株と接触させたＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入された健常ドナーからのＣＤ８＋ＣＤ３４＋Ｔ細胞を使用したインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）分泌を示すグラフである。各細胞株のＨＥＲＶ−Ｅ／ＨＬＡ−Ａ１１状態は以下の通りである：ＳＡＵＪ：ＨＥＲＶ−Ｅ＋／ＨＬＡ−Ａ１１＋；ＬＹＯ  ＷＴ：ＨＥＲＶ−Ｅ＋／ＨＬＡ−Ａ１１陰性；ＳＮＹ  Ａ１１＋：ＨＥＲＶ−Ｅ陰性／ＨＬＡ−Ａ１１形質導入；ＵＲＢ  Ａ１１＋：ＨＥＲＶ−Ｅ陰性／ＨＬＡ−Ａ１１形質導入；ＷＨＩ  Ａ１１＋：ＨＥＲＶ−Ｅ陰性／ＨＬＡ−Ａ１１形質導入；ＯＲＴ  Ａ１１＋：ＨＥＲＶ−Ｅ陰性／ＨＬＡ−Ａ１１形質導入；ＯＲＴ  ＷＴ：ＨＥＲＶ−Ｅ陰性／ＨＬＡ−Ａ１１陰性；ＳＥＡ  ＷＴ：ＨＥＲＶ−Ｅ陰性／ＨＬＡ−Ａ１１陰性。標準曲線を挿入図に示す。
【００１８】
【図９】図９は、進行性ｃｃＲＣＣを有するＨＬＡ−Ａ１１陽性患者におけるＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入自己Ｔ細胞の安全性および忍容性を決定するための例示的な第Ｉ相臨床試験を示す概略図である。
【００１９】
【図１０】図１０は、ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を用いて転移性ｃｃＲＣＣを有する患者を処置するための例示的なプロトコールを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表
本明細書または添付の配列表に挙げる任意の核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で定義されるヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な略語を使用して示している。少なくとも一部の場合に、各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、示した鎖に対する任意の参照により、相補鎖も包含されるものと理解される。
【００２１】
配列番号１は、ＨＬＡ−Ａ１１  ＲＣＣ特異的ＨＥＲＶ−Ｅ抗原ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号２は、例示的なＲＣＣ  ＨＥＲＶ反応性ＴＣＲアルファ鎖の核酸配列である。
【００２３】
配列番号３は、例示的なＲＣＣ  ＨＥＲＶ反応性ベータ鎖の核酸配列である。
【００２４】
配列番号４は、例示的な  ＲＣＣ  ＨＥＲＶ反応性ＴＣＲアルファ鎖のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号５は、例示的なＲＣＣ  ＨＥＲＶ反応性ベータ鎖のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号６は、ＲＣＣ  ＨＥＲＶ反応性ＴＣＲおよび末端切断型ＣＤ３４の発現用の例示的なＳＡＭＥＮベクターの核酸配列である。
【００２７】
配列番号７は、例示的な末端切断型ＣＤ３４（ＣＤ３４ｔ）タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２８】
詳細な説明
同種移植後に長期的な腫瘍退縮を示したＲＣＣ患者から同種Ｔ細胞クローンが以前に単離された（Takahashiら、J.  Clin.  Invest.  １１８巻：１０９９〜１１０９頁、２００８年）。このＨＬＡ−Ａ１１拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ１１陽性のｃｃＲＣＣ細胞株に対して高度に細胞傷害性であったが、非悪性細胞を殺滅しなかった（Takahashiら、２００８年）。ｃＤＮＡ発現クローニングを使用して、内在性レトロウイルスＥ型（ＨＥＲＶ−Ｅ）によってコードされる、このクローンによって認識される抗原が同定された（Takahashiら、２００８年）。この抗原はｃｃＲＣＣで発現されていたが、正常組織または他の腫瘍型では観察されず、約８０％のｃｃＲＣＣ腫瘍によって発現される。
【００２９】
本発明者らは、ＲＣＣ患者から単離されたＴ細胞クローンによって発現されるＴ細胞受容体を同定した。本明細書に記載するように、このＴＣＲは、ＲＣＣ患者を処置するための遺伝子移入免疫療法のために使用することができる。Ｔ細胞をＴＣＲα鎖およびβ鎖をコードする遺伝子で形質導入し、Ｔ細胞を、ＲＣＣを有する被験体に投与して被験体由来の正常Ｔ細胞の特異性をＲＣＣ細胞に向け直す。
Ｉ．略語
ｃｃＲＣＣ    明細胞腎細胞癌
ＣＤ３４ｔ    末端切断型ＣＤ３４
ＣＴＬ        細胞傷害性Ｔリンパ球
ＨＥＲＶ      ヒト内在性レトロウイルス
ＨＬＡ        ヒト白血球抗原
ＬＴＲ：      長鎖末端反復
ＭＭＬＶ      モロニーマウス白血病ウイルス
ＰＢＭＣ      末梢血単核細胞
ＲＣＣ        腎細胞癌
ＴＣＲ        Ｔ細胞受容体
【００３０】
ＩＩ．用語
別段の記載がなければ、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学の一般的な用語の定義は、Lewin's  Genes  X、Krebsら編、Jones  and  Bartlett  Publishers、２００９年（ＩＳＢＮ  ０７６３７６６３２１）；Kendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、Blackwell  Publishers刊、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）：Robert  A.  Meyers（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.刊、１９９５年（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；およびGeorge  P.  Redei、Encyclopedic  Dictionary  of  Genetics,  Genomics,  Proteomics  and  Informatics、第３版、Springer、２００８年（ＩＳＢＮ：１４０２０６７５３４）；および他の類似の参考文献に見出すことができる。
【００３１】
別段の説明がなければ、本明細書で使用する全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数の用語は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、「または」という語は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、「および」を包含することを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。
【００３２】
本開示の実施または試験において本明細書に記載するものに類似のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号に関連する配列は、別段の記載がなければ、２０１６年６月３０日時点でＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書に組み込まれる。不一致がある場合は、用語の説明を含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図しない。
【００３３】
本開示の様々な実施形態の再調査を促進するために、特定の用語について以下の説明を提供する。
【００３４】
抗原：被験体において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激できる化合物、組成物、または物質である。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものなどの特定の液性または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、全ての関連する抗原エピトープを包含する。「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。一実施形態では、Ｔ細胞は、エピトープがＭＨＣ分子との組み合わせで提示されたときにエピトープに応答する。エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒に曝露された際に通常保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、変性溶媒で処理した際に通常失われる。エピトープは、典型的に、少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５つ、約９つ、約７〜１１、または約８〜１０のアミノ酸を特有の空間コンホメーションにおいて含む。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析法および二次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００３５】
抗原は、組織特異的抗原または疾患特異的抗原であってよい。組織特異的抗原は疾患特異的抗原であってもよいため、これらの用語は排他的なものではない。組織特異的抗原は、単一の組織などの限られた数の組織で発現される。疾患特異的抗原は、疾患プロセスと同時発生的に発現される。疾患特異的抗原の特定の非限定的な例は、その発現が腫瘍形成、例えばＲＣＣと相関するまたはそれを予測する抗原である。
【００３６】
自己：個体自身の組織から採られた組織、細胞、または核酸を指す。例えば、Ｔ細胞の自己移入または移植ではドナーとレシピエントとが同一の人である。自己（または「自家（autogeneic）」または「自原性（autogenous）」）は自身に関し、または生物体それ自体の内に起源がある。
【００３７】
ＣＤ３４：細胞間接着分子として機能する細胞表面糖タンパク質である。ＣＤ３４は、高度にグリコシル化された細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有する１回膜貫通タンパク質である。ＣＤ３４は造血細胞上に発現され、細胞遊走において役割を果たす。例示的なヒトＣＤ３４配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５１０９およびＮＭ＿００１７７３（核酸配列）、ならびにＮＰ＿００１０２０２８０およびＮＰ＿００１７６４（アミノ酸配列）が挙げられ、これらの全ては、２０１６年６月３０日の時点でＧｅｎＢａｎｋ中に存在するものとして参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
ＨＬＡ−Ａ１１：ＨＬＡのＡ型に含まれるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の血清型である。ＨＬＡ−Ａ１１は、ＨＬＡ−Ａ＊１１対立遺伝子群によってコードされるα鎖およびβ２−ミクログロブリンによってコードされるβ鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子である。ＨＬＡ−Ａ１１などのＭＨＣクラスＩ分子は、典型的に７〜１１アミノ酸長のペプチド（抗原）に結合し、ＴＣＲへの結合を介したＴ細胞への抗原の提示に関与する。
【００３９】
ヒト内在性レトロウイルスＥ（ＨＥＲＶ−Ｅ）：ＨＥＲＶは、ヒトゲノムに組み込まれた古代の外因性レトロウイルスのレムナントである。ＨＥＲＶはヒトゲノムの５〜８％を構成すると推定される。ほとんどのＨＥＲＶは変異を蓄積しておりまたは転写がサイレンシングされており、全長タンパク質を産生しない。しかしながら、一部のＨＥＲＶは、腫瘍などの状況で転写が活性である。ＨＥＲＶ−Ｅはヒト第６ｑ染色体上に位置するＨＥＲＶサブタイプである。ＨＥＲＶ−Ｅからの少なくとも３つの転写物（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ１３７８４６、ＥＵ１３７８４７、およびＪＱ７３３９０５）が同定されており、ＲＣＣ細胞で発現されるが、他の腫瘍または非腫瘍細胞では発現されない（Takahashiら、J.  Clin.  Oncol.  １１８巻：１０９９〜１１０９頁、２００８年）。
【００４０】
作動可能に連結された：第１の核酸が第２の核酸と機能的な関係で配置されているときに、第１の核酸は第２の核酸と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結された核酸は連続し、２つのタンパク質コーディング領域の連結が必要な場合、オープンリーディングフレームが揃えられる。
【００４１】
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの、他の方法で分離した配列のセグメントの人工的な組合せによって作られる配列を有する核酸分子である。この人工的な組合せは、化学合成によって、または遺伝子操作技術によるなどの核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。
【００４２】
同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない核酸配列（ウイルスに由来しない異種配列などを包含する）、または異なる起源の少なくとも２つの配列の人工的な組合せによって作られる核酸配列を有するウイルスである。「組換え」という用語はまた、天然の核酸分子、タンパク質、またはウイルスの一部分の付加、置換、または欠失のみによって変化した核酸、タンパク質、およびウイルスも包含する。
【００４３】
腎細胞癌（ＲＣＣ）：腎臓の細胞を起源とする腫瘍である。ＲＣＣは成人において最もよく見られる種類の腎臓がんである。ＲＣＣには複数の組織学的サブタイプがあり、サブタイプとしては、ＲＣＣの６０〜７０％を占め、近位尿細管の細胞を起源とする明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）が挙げられる。ｃｃＲＣＣ細胞は、腺房または類肉腫の増殖パターンを有する透明な細胞質を呈する。追加のサブタイプとしては、乳頭状ＲＣＣ（これも近位尿細管の細胞を起源とする）、色素嫌性ＲＣＣ（皮質集合管の細胞を起源とする）、腫瘍溶解性ＲＣＣ（皮質集合管の細胞を起源とする良性新生物）、および集合管ＲＣＣ（髄質集合管の細胞を起源とする）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
Ｔ細胞：免疫応答の重要なメディエーターである白血球（リンパ球）である。Ｔ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、その表面に「表面抗原分類４（cluster  of  differentiation  4）」（ＣＤ４）として公知のマーカーを有する免疫細胞である。ヘルパーＴ細胞としても公知のこれらの細胞は、抗体応答およびキラーＴ細胞応答などの免疫応答を統合するのを助ける。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、「表面抗原分類８」（ＣＤ８）マーカーを有する。一実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。別の実施形態では、ＣＤ８＋細胞はサプレッサーＴ細胞である。
【００４５】
活性化Ｔ細胞は、細胞増殖および／または１つもしくは複数のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、もしくはＴＮＦαなど）の発現もしくは分泌の増加によって検出することができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、抗原に応答した細胞溶解活性の増加によっても検出することができる。
【００４６】
一部の例では、「改変されたＴ細胞」は、異種核酸（本明細書に開示する核酸もしくはベクターの１つもしくは複数など）で形質導入されたか、または１つもしくは複数の異種タンパク質を発現するＴ細胞である。「改変されたＴ細胞」および「形質導入されたＴ細胞」という用語は、本明細書の一部の例では交換可能に使用される。
【００４７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）：抗原（例えば抗原提示細胞上の、ＭＨＣ分子に結合した抗原など）に結合するＴ細胞の表面上のヘテロダイマータンパク質である。ＴＣＲは、それぞれが膜貫通糖タンパク質であるα鎖およびβ鎖を含む。各鎖は、免疫グロブリンの可変ドメインおよび定常ドメインに対して相同性を有する可変領域および定常領域、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質尾部を有する。免疫グロブリンに類似して、ＴＣＲ遺伝子セグメントは発生の間に再構成して、完全な可変ドメインを生成する。
【００４８】
Ｔ細胞は、ＴＣＲへの抗原の結合および共刺激シグナルによって活性化される。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞上の特定のＨＬＡ分子によって提示されたときに特定のエピトープを認識するＴ細胞受容体を有する。抗原提示細胞によって刺激されて細胞傷害性Ｔリンパ球となるＣＴＬ前駆体がそのようなＨＬＡ−ペプチド複合体を有する細胞に接触したときに、ＣＴＬは細胞とコンジュゲートを形成し、それを破壊する。
【００４９】
形質導入する：宿主細胞への異種核酸の移入など、細胞に核酸を移入することである。本明細書で使用する場合、形質導入する（またはトランスフェクトするまたは形質転換する）という用語は、核酸を細胞に導入する全ての技術を包含し、該技術としては、プラスミドベクターでの形質転換、ウイルスベクターの感染、およびエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、または粒子銃加速によるネイキッドＤＮＡの導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「異種」核酸またはタンパク質は、異なる遺伝的供給源を起源とする核酸またはタンパク質を指す。例えば、細胞に対して異種の核酸またはタンパク質は、それが発現される細胞以外の生物体または個体を起源とする。他の例では、異種核酸またはタンパク質は、それが発現される細胞以外の細胞型を起源とする。
【００５１】
ベクター：ベクターが複製するおよび／または宿主細胞に組み込まれる能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能とする核酸分子である。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞中でその複製を可能とする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝子エレメントも含み得る。発現ベクターは、１つまたは複数の挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能とする必要な調節配列を含有するベクターである。一部の非限定的な例では、ベクターは、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【００５２】
ＩＩＩ．Ｔ細胞受容体、ベクター、および宿主細胞
ＲＣＣ  ＨＥＲＶ−Ｅ反応性Ｔ細胞株からクローニングされたＴ細胞受容体（例えば、ＴＣＲα鎖およびβ鎖）が本明細書に開示される。開示するＴＣＲを含むベクター（発現ベクターなど）ならびに開示するＴＣＲα鎖および／またはβ鎖をコードする少なくとも１つの異種核酸を含む宿主細胞も開示される。
【００５３】
Ａ．ＴＣＲ
一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＡＴＷＬＧＳＫＴＷＫ（配列番号１）などのＲＣＣ細胞上に発現されるＨＥＲＶ−Ｅペプチドを認識する。ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の核酸またはポリペプチドを含む。
【００５４】
一部の例では、ＴＣＲα鎖は、配列番号２の核酸配列を含むまたはそれからなる核酸によってコードされる。一部の例では、ＴＣＲβ鎖は、配列番号３の核酸配列を含むまたはそれからなる核酸によってコードされる。一部の例では、ＴＣＲα鎖のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。一部の例では、ＴＣＲβ鎖のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００５５】
一部の実施形態では、本明細書に開示するＴＣＲをコードする核酸は、配列番号２または配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、１００％など）同一の配列を有する。他の実施形態では、本明細書に開示するＴＣＲポリペプチドは、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％（少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％など）同一のアミノ酸配列を有する。例示的な配列は、インターネット上で容易に利用可能なコンピュータープログラムならびに本明細書に記載する核酸配列およびアミノ酸配列を使用して得ることができる。一例では、ポリペプチドは、例えばＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方の状況でＴ細胞によって発現されたときに、ＲＣＣ特異的抗原エピトープ（例えば、配列番号１）への結合性など、開示するＴＣＲポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。
【００５６】
ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖をコードする核酸配列または一次アミノ酸配列の軽微な改変は、本明細書に記載する未改変の対応するポリペプチドと比べて実質的に同等の活性を有するポリペプチドを生じることがある。そのような改変は、部位特異的変異導入によるもののように故意のものであってもよいし、または自発的なものであってもよい。これらの改変によって生成されたポリペプチドの全てが本明細書に包含される。したがって、ＴＣＲα鎖またはβ鎖のポリペプチドの特定の非限定的な例は、ＴＣＲα鎖またはβ鎖のポリペプチドの保存的バリアントである（単一の保存的アミノ酸置換など、例えば、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、例えば、１〜１０の保存的置換、２〜５の保存的置換、４〜９の保存的置換、例えば、１、２、５、または１０の保存的置換）。保存的置換の表を本明細書で提供する（表１）。配列番号４および５に示すアミノ酸配列の置換は、この表に基づいて行うことができる。しかしながら、ポリペプチドの活性を著しく変化させることなく非保存的アミノ酸置換を行うこともできることが理解されるべきである。当業者は、配列アライメントおよび他の利用可能な配列解析ツールに基づいて、置換できるアミノ酸を選択することができる。
【表１】
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【００５７】
Ｂ．ベクター
【００５８】
ＨＥＲＶ−Ｅ反応性ＴＣＲをコードする核酸を含むベクターも本明細書に開示される。ベクターは、１つまたは複数の発現制御エレメントに作動可能に連結された開示するＴＣＲのα鎖およびβ鎖の一方または両方をコードする核酸（配列番号２および／または配列番号３に対して少なくとも９０％同一の核酸など）を含む。特定の実施形態では、ベクターは、ＴＣＲα鎖（例えば、配列番号４をコードする核酸、配列番号２など）およびＴＣＲβ鎖（例えば、配列番号５をコードする核酸、配列番号３など）の両方をコードする核酸を含む。しかしながら、他の例では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、別々のベクターから発現されてもよい。発現制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、リーダー配列、転写ターミネーター、開始および／または終止コドン、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシングシグナル、ならびにポリアデニル化シグナルなどの、核酸の転写および／または翻訳を制御または調節する配列である。ベクターは、複製起点および選択マーカーなどの、ベクターの移入およびその後の複製のための追加のエレメントも含有してもよい。
【００５９】
一部の例では、ベクターは、開示するＴＣＲα鎖およびβ鎖の少なくとも１つをコードする核酸（配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含むウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。Ｔ細胞への遺伝子送達に好適な追加のウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、および鶏痘ウイルスベクターが挙げられる。他の例では、ベクターは、プラスミドまたはバキュロウイルスベクターである。当業者は、例えば本明細書に記載するＴＣＲでＴ細胞を安定的にまたは一過的に形質導入するために、適切なベクターを選択することができる。
【００６０】
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に開示するＴＣＲα鎖およびβ鎖のポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターである。特定の例では、ベクターは、ウイルスにコードされたタンパク質が（例えば、複製コンピテントウイルスの産生を防止するため、望まれない免疫原性を低下させるため、および／または目的の遺伝子（複数可）の挿入を受容するために）削除された改変レトロウイルスベクターである。例示的なレトロウイルス骨格は、ＬＸＳＮおよびＳＡＭＥＮベクターなどのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくものが挙げられる（Clayら、Pathol.  Oncol.  Res.  ５巻：３〜１５頁、１９９９年）。したがって、一例では、ベクターは、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする核酸（配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含むＳＡＭＥＮレトロウイルスベクターである。別の例では、ベクターは、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする核酸（配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含むＳＡＭＥＮレトロウイルスベクターである。さらに別の例では、ベクターは、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする核酸（配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）および配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする核酸（配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含むＳＡＭＥＮレトロウイルスベクターである。非限定的な一例では、ベクターは、配列番号４のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする核酸（配列番号２の核酸配列など）および配列番号５のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする核酸（配列番号３の核酸配列など）を含むＳＡＭＥＮレトロウイルスベクターである。ＴＣＲα鎖核酸およびＴＣＲβ鎖核酸の両方が存在するベクターにおいて、α鎖核酸とβ鎖核酸は、α鎖核酸およびβ鎖核酸の両方が転写および／または翻訳されるように、ＩＲＥＳまたはプロモーターによって分離されていてもよい。他の例では、α鎖核酸とβ鎖核酸とは、ウイルス２Ａペプチド、例えば、豚テシオウイルス−１  ２ＡまたはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス自己切断性ペプチドなどのペプチド切断部位または「自己切断性」ペプチドをコードする核酸によって分離されている（例えば、Kimら、PLoS  One  ６巻：ｅ１８５５６、２０１１年を参照）。
【００６１】
追加の実施形態では、ベクターは、ベクターで形質導入された細胞の同定および／または富化を可能とする選択マーカーをコードする核酸をさらに含む。例示的な選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性など）、チミジンキナーゼ、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質など）、またはβ−ガラクトシダーゼを含む。他の例では、選択マーカーは、（例えば、フローサイトメトリーまたは免疫磁気分離を使用して）形質導入された細胞を同定するために使用できる細胞表面発現タンパク質を含む。非限定的な一例では、本明細書に開示するベクターは、細胞内シグナル伝達ドメインを欠いた末端切断型ＣＤ３４タンパク質（ＣＤ３４ｔ）をコードする核酸を含む。ＣＤ３４ｔタンパク質は、ＣＤ３４の細胞外および膜貫通領域を含み、結果として、細胞表面上に発現されるが、末端切断型タンパク質を発現する細胞の活性に影響を及ぼさない（Norellら、Cancer  Immunol.  Immunother.  ５９巻：８５１〜８６２頁、２０１０年）。ＣＤ３４ｔを発現する細胞は、抗ＣＤ３４抗体を用いて同定することができ、また、フローサイトメトリーまたは免疫磁気的方法を使用して単離することができる。
【００６２】
一例では、ＣＤ３４ｔをコードする核酸は、配列番号６のヌクレオチド４０２８〜４９７５の配列または配列番号６のヌクレオチド４０２８〜４９７５と少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い）配列同一性を有する配列を含むまたはそれからなる。特定の例では、ＣＤ３４ｔタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％（少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％など）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００６３】
開示するＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現するための例示的なレトロウイルスベクター（ＳＡＭＥＮベクターなど）を図１に示す。ベクターは、プロモーター／エンハンサー（ＭＭＬＶ  ５’ＬＴＲに融合されたヒトサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーなど）を含む５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（ψ）、ＴＣＲα鎖をコードする核酸（例えば、配列番号２）、第１の自己切断性２Ａペプチド（豚テシオウイルス自己切断性２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドなど）、ＴＣＲβ鎖をコードする核酸（例えば、配列番号３）、第２の自己切断性２Ａペプチド（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ自己切断性２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドなど）、末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする核酸、および３’ＬＴＲを含む。
【００６４】
一部の例では、ベクターは、配列番号６の核酸配列を含むまたはそれからなる。他の例では、ベクターは、配列番号６の核酸配列と少なくとも９５％（少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％など）の配列同一性を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。本明細書で提供する例示的なベクターにおいて、ＴＣＲα鎖は配列番号６のヌクレオチド２１６５〜２９７１によってコードされ、Ｐ２Ａペプチドは配列番号６のヌクレオチド２９７２〜３０３７によってコードされ、ＴＣＲβ鎖は配列番号６のヌクレオチド３０３８〜３９５８によってコードされ、Ｔ２Ａペプチドは配列番号６のヌクレオチド３９５９〜４０２７によってコードされ、ＣＤ３４ｔ受容体は配列番号６のヌクレオチド４０２８〜４９７５によってコードされる。
【００６５】
Ｃ．宿主細胞
ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、または両方をコードするベクターなどの、開示するＴＣＲα鎖および／または開示するＴＣＲβ鎖をコードする核酸を含む宿主細胞も本明細書に開示される。一部の例では、宿主細胞は、ベクターを含む組換えウイルスを産生できる細胞（例えば、プロデューサー細胞）である。他の例では、宿主細胞はリンパ球（例えば、Ｔ細胞）である。宿主細胞にベクターを導入する方法は当業者に公知であり、（例えばプラスミドベクターでの）形質転換、（例えばウイルスベクターの）感染、およびエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、または粒子銃加速（例えば、ネイキッドＤＮＡ）が挙げられる。
【００６６】
ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖がレトロウイルスベクター（開示するＳＡＭＥＮベクターなど）から発現される例では、組換えウイルスの産生は、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株から発現されるウイルスタンパク質を必要とする。したがって、一部の例では、本明細書に開示するウイルスベクターは、ウイルスタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖなど）を発現するヘルパーウイルスを用いて宿主細胞（２９３細胞株など）に導入される。他の例では、本明細書に開示するウイルスベクターは、ウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖタンパク質を安定に発現するパッケージング細胞株に形質導入される。例示的なパッケージング細胞株としては、ＧＰ＆Ｅ  ８６、ＰＧ１３、およびＰＡ３１７細胞株などのＮＩＨ−３Ｔ３細胞株（Markowitzら、J.  Virol.  ６２巻：１１２０〜１１２４頁、１９８８年；Millerら、J.  Virol.  ６５巻：２２２０〜２２２４頁、１９９１年；Millerら、Mol.  Cell  Biol.  ６巻：２８９５〜２９０２頁、１９８６年）、または２９３ＧＰＧ細胞、ＧＰ２−２９３細胞などの２９３細胞株が挙げられる。したがって、一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載するウイルスベクターで形質導入されたパッケージング細胞株などのプロデューサー細胞である。非限定的な一例では、ウイルスベクターは、ＨＥＲＶ−Ｅ特異的なＴＣＲα鎖およびβ鎖ならびに末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードするＳＡＭＥＮベクター（配列番号６の核酸を有するベクターなど）である。一部の例では、プロデューサー細胞株はＧＭＰ認証されたものである。一例では、プロデューサー細胞株は、ＨＥＲＶ−Ｅ特異的なＴＣＲα鎖およびβ鎖ならびに末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードするＳＡＭＥＮベクター（配列番号６の核酸を有するベクターなど）を含むＰＧ１３パッケージング細胞株である。
【００６７】
一部の例では、宿主細胞は、Ｔ細胞などのリンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球は、開示するＴＣＲα鎖およびβ鎖の少なくとも１つをコードする異種核酸を含むＴ細胞（富化または増殖されたＴ細胞の集団など）である。一部の例では、リンパ球は、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする異種核酸（配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含む。別の例では、リンパ球は、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする異種核酸（配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含む。さらに別の例では、リンパ球は、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする異種核酸（配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）および配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする核酸（配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸など）を含む。非限定的な一例では、リンパ球は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする異種核酸（配列番号２の核酸配列など）および配列番号５のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする核酸（配列番号３の核酸配列など）を含む。追加の例では、リンパ球は、末端切断型ＣＤ３４タンパク質（例えば、細胞内ドメインまたはシグナル伝達ドメインを欠いたＣＤ３４タンパク質）をコードする異種核酸も含む。
【００６８】
一部の実施形態では、本明細書に開示するベクターでリンパ球（リンパ球の集団など）が形質導入される。形質導入後、標識化抗体を使用するフローサイトメトリーまたは同種（cognate）ペプチド（配列番号１など）への反応性の検出などの当業者に公知の方法によって、ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖の発現を決定することができる。一部の例では、ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖がＣＤ３４ｔと共発現される場合、形質導入された細胞は、例えば、フローサイトメトリーまたは免疫磁気技術（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ３４試薬システム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡまたはＩｓｏｌｅｘ（登録商標）３００磁気細胞選択システム、Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を利用し、抗ＣＤ３４抗体を使用して検出および／または富化することもできる。
【００６９】
一部の実施形態では、開示するＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現する改変（例えば、形質導入）されたＴ細胞は、例えばアフェレーシスによって、被験体からリンパ球の集団（ＰＢＭＣ集団など）を得ることによって作製される。リンパ球の集団中のナイーブまたは休止したＴ細胞は、例えば、リンパ球を１つまたは複数のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２３の１つまたは複数など）と接触させることによって形質導入前に活性化される。一部の例では、リンパ球を抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２と１〜４日間（１日、約２日、約３日、または約４日など）接触させて活性化Ｔ細胞を産生させる。一部の例では、リンパ球を３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と２または３日間接触させる。
【００７０】
例えば、感染によって（ウイルスベクターの場合）またはトランスフェクションもしくは形質転換によって（プラスミドもしくはネイキッドＤＮＡベクターの場合）、本明細書に開示するベクターで活性化Ｔ細胞を形質導入する。一部の例では、形質導入されたＴ細胞を、富化および／または増殖させる。例えば、ベクターが、末端切断型ＣＤ３４分子をコードする核酸を含む場合、形質導入されたＴ細胞は、例えば形質導入の約２〜４日後に、形質導入されたＴ細胞の集団を抗ＣＤ３４抗体と接触させ、（例えば、フローサイトメトリーまたは免疫磁気ビーズを使用して）ＣＤ３４発現細胞を精製することによって選択または富化することができる。また、形質導入されたＴ細胞は、形質導入されたＴ細胞を抗ＣＤ３（例えば、約３０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８（例えば、約３０ｎｇ／ｍｌ）、および／またはＩＬ−２（例えば、約３００ＩＵ／ｍｌ）とある期間（約７〜１４日間または９〜１１日間など）培養することによって増殖させることができる。一部の例では、放射線照射ＰＢＭＣ細胞上での培養によって、形質導入されたＴ細胞を増殖させる。
【００７１】
ＩＶ．腎細胞癌を処置または阻害する方法
ＲＣＣ細胞によって発現される抗原またはエピトープに結合するＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα鎖およびβ鎖）を発現するＴ細胞（またはＴ細胞の集団）を被験体に投与することによって、被験体においてＲＣＣを処置または阻害する方法が本明細書に開示される。一部の例では、方法は、本明細書に記載する改変されたＴ細胞をＲＣＣ（ｃｃＲＣＣ、進行性ｃｃＲＣＣ、または転移性ｃｃＲＣＣなど）を有する被験体に投与することを含む。特定の例では、被験体は、ＨＬＡ−Ａ１１陽性であり、ｃｃＲＣＣを有する。
【００７２】
本明細書に記載する改変されたリンパ球（例えば、改変または形質導入されたＴ細胞）は、医薬組成物に組み込むことができる。一部の例では、組成物は、約１０４〜１０１２個の改変されたＴ細胞（例えば、約１０４〜１０７個の細胞、約１０６〜１０９個の細胞、または約１０８〜１０１２個の細胞）を含む。例えば、約５×１０６〜５×１０８個の改変されたＴ細胞／ｋｇが被験体に投与されるように組成物を調製することができる。そのような組成物は、典型的に、改変されたＴ細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」は、医薬品の投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。そのような担体または希釈剤の例としては、水、食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルを使用することもできる。補助活性化合物を組成物に組み込んでもよい。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に公知または明らかであり、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、The  University  of  the  Sciences  in  Philadelphia、Lippincott,  Williams,  &  Wilkins編、Philadelphia、PA、第２１版（２００５年）などの刊行物により詳細に記載されている。
【００７３】
被験体のｉｎ  ｖｉｖｏ処置は、本明細書に開示する改変されたＴ細胞の投与によって開始される。投与は、典型的に、静脈内または腹腔内注入によって為されるが、固形腫瘍または他のそのような限局性病変への直接の注射を使用することもできる。処置の有効性は、一般に、（例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準を使用して）病変の減少／クリアランスによって評価される。病変のサイズおよび数は、イメージング（ＭＲＩ、ＰＥＴ、および／またはＣＴイメージングなど）によって評価することができる。一部の例では、病期診断は毎月、３ヶ月毎、または６ヶ月毎に行われる。一部の例では、被験体からの血液試料も注入後の１つまたは複数の時点で分析されて、（例えば、ＣＤ３４ｔを発現する改変されたＴ細胞の場合、ＣＤ３４を発現するＣＤ３＋細胞の絶対数および／またはパーセンテージを評価することによって）存在する改変されたＴ細胞の数が定量される。
【００７４】
改変されたＴ細胞の集団の複数回用量を投与することができる。例えば、改変されたＴ細胞の集団は、毎日、１日おき、週に２回、毎週、２週毎、３週毎、毎月、またはより少ない頻度で投与することができる。特定の一例では、改変されたＴ細胞の単回注入が投与されるが、熟練した臨床医は、被験体、処置されている状態、以前の処置歴、および他の要因に基づいて、代替的なスケジュールを選択することができる。
【００７５】
一部の実施形態では、被験体は、ｃｃＲＣＣなどのＲＣＣを有する。ＲＣＣまたはｃｃＲＣＣを有する被験体を同定する方法は当業者に公知であり、ＲＣＣの放射線写真による証拠（例えば、超音波、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、もしくはＰＥＴスキャンによるイメージング）および／またはＲＣＣの存在を確認する生検（細針吸引もしくは針コア生検など）が挙げられる。一部の例では、被験体は転移性ＲＣＣを有する。さらなる例では、ＲＣＣを有する被験体はまた、ＨＬＡ  Ａ１１＋であり、腫瘍はＨＥＲＶ−Ｅプロウイルスを発現する（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を発現する）。一部の実施形態では、方法は、改変されたＴ細胞を用いる処置のために、ＨＬＡ  Ａ１１＋であり、その腫瘍が配列番号１を含むタンパク質を発現するＲＣＣ（ｃｃＲＣＣなど）を有する患者を選択することを含む。
【００７６】
特定の実施形態では、方法は、ＲＣＣを有する被験体（ＨＬＡ  Ａ１１＋であり、その腫瘍が配列番号１を含むタンパク質などのＨＥＲＶ−Ｅプロウイルスを発現するｃｃＲＣＣを有する被験体など）からリンパ球を含む細胞の集団を得ることを含む。他の例では、リンパ球を含む細胞の集団は、処置される被験体（ＨＬＡ  Ａ１１＋であり、その腫瘍が配列番号１を含むタンパク質などのＨＥＲＶ−Ｅプロウイルスを発現するｃｃＲＣＣを有する被験体など）に対してＨＬＡが適合したドナーから得られる。
【００７７】
被験体からＴ細胞を回収し、Ｔ細胞を形質導入するための例示的なプロトコールを図に示す。リンパ球（ＰＢＭＣなど）を含む細胞の集団は、アフェレーシスを含むがこれに限定されない任意の方法によって得ることができる。細胞の集団の全てもしくは一部分を直ちに利用してもよいし、または細胞の全てもしくは一部分を将来的な使用のために凍結保存してもよい。使用の準備ができたときに、細胞の集団の全てまたは一部分を解凍し（以前に凍結保存した場合）、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３など）とのインキュベーションによってＴ細胞を活性化する。一部の例では、約１０７〜１０９個のＰＢＭＣを抗ＣＤ３モノクローナル抗体（例えば、約３０ｎｇ／ｍｌ）ならびに必要に応じてさらにＩＬ−２（例えば、約３００ＩＵ／ｍｌ）および／またはＩＬ−１５（約１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートする。特定の一例では、約６×１０８個のＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３およびＩＬ−２と約１〜５日間（約１日、約２日、約３日、約４日、または約５日など）インキュベートする。別の特定の例では、約６×１０８個のＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５と約１〜５日間（約１日、約２日、約３日、約４日、または約５日など）インキュベートする。
【００７８】
一部の例では、Ｔ細胞の活性化後に、必要に応じて細胞からＣＤ４＋細胞を枯渇させる。一部の例では、ＣＤ４＋細胞は、例えばフローサイトメトリーまたは免疫磁気技術（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ４試薬システム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を利用し、抗ＣＤ４抗体を使用して、または抗ＣＤ４抗体が結合したＣＤ４＋Ｔ細胞の赤血球リセッティングを使用して除去されて、ＣＤ４枯渇細胞集団が作製される。他の例では、ＣＤ４の枯渇は、形質導入後または形質導入されたＴ細胞の増殖後に実行することができる。一部の例では、ＣＤ４枯渇細胞集団は、Ｔ細胞のＣＤ８＋集団（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多いＴ細胞の集団などの、実質的にＣＤ８＋Ｔ細胞であるＴ細胞の集団）である。
【００７９】
Ｔ細胞の活性化（および必要に応じたＣＤ４＋細胞の枯渇）後に、ＨＥＲＶ−Ｅ反応性のＴＣＲα鎖、Ｔ細胞β鎖、または両方をコードする異種核酸を含むベクター（上記セクションＩＩＩＢに記載する１つまたは複数のベクターなど）で細胞を形質導入する。特定の例では、約１０７〜１０９個の細胞が形質導入される（例えば、約１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、または１×１０９個の細胞）。非限定的な一例では、約２×１０８個の細胞が形質導入される。一部の例では、ベクターは、末端切断型ＣＤ３４タンパク質をコードする異種核酸も含む。したがって、一部の例では、形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ３４特異的抗体（フローサイトメトリーまたは免疫磁気精製など）を使用して濃縮される。
【００８０】
形質導入されたＴ細胞（または必要に応じて、ＣＤ３４富化の形質導入されたＴ細胞および／もしくはＣＤ３４富化、ＣＤ４枯渇の形質導入されたＴ細胞）を、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、増殖後に適切な投与量（例えば、約１０６〜１０１２個の細胞）で凍結保存することができる。特定の一例では、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、および３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を含有する培地中、放射線照射された同種ＰＢＭＣフィーダー細胞（２５０，０００個のＴ細胞あたり４０００万個の細胞）上で形質導入されたＴ細胞を増殖させる。増殖は、所望の数のＴ細胞を得るのに十分な時間、例えば約４〜１４日（４〜９日、７〜１０日、８〜１２日、９〜１４日、９〜１１日など）であってよい。一部の例では、Ｔ細胞に、５日目、８日目、および１１日目に新鮮なＩＬ−２を追加する。一部の非限定的な例では、増殖は、必要に応じて、１〜５日間など増殖の少なくとも一部分の間、例えば増殖プロトコールの９〜１４日目に、ＷＡＶＥバイオリアクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）中で実行することができる。当業者は、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴ細胞を増殖させるための他の方法を特定することができ、それを本明細書に記載する形質導入されたＴ細胞で使用することもできる（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８２７，６４２号ならびにRiddellおよびGreenberg、J.  Immunol.  Meth.  １２８巻：１８９〜２０１頁、１９９０年を参照）。
【００８１】
形質導入（改変）されたＴ細胞を、被験体に投与する前に解凍する（以前に凍結された場合）。被験体は、改変されたＴ細胞を投与する前に免疫抑制レジメン（例えば、リンパ球枯渇）を受けてもよい。一例では、被験体は、改変されたＴ細胞を投与する前にシクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを投与される。非限定的な一例では、被験体は、−５日目および−４日目にシクロホスファミド（例えば、６０ｍｇ／ｋｇ）、ならびに／または−５日目から−１日目にフルダラビン（例えば、２５ｍｇ／ｍ２）を投与される（０日目が改変されたＴ細胞の投与である）。別の非限定的な例では、被験体は、−５日目にシクロホスファミド（１，０００ｍｇ／ｍ２  ＩＶ）、および−５日目から−３日目にフルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２）を投与される（０日目が改変されたＴ細胞の投与である）。改変されたＴ細胞は、例えば注入によって、被験体に投与される。一部の例では、Ｔ細胞は、約１０４〜１０１２個の改変されたＴ細胞（例えば、約１０４〜１０７個の細胞、約１０６〜１０９個の細胞、または約１０８〜１０１２個の細胞、または約１×１０６〜１×１０９個の改変されたＴ細胞／ｋｇ（約１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、または１×１０９個の細胞／ｋｇなど）の用量で投与される。例えば、改変されたＴ細胞の被験体中での増殖を促進するためおよび／または好中球の回復を支援するために、免疫系支持療法も被験体に施してもよい。非限定的な一例では、被験体は、１０日間のＩＬ−２（例えば、８時間毎の７２，０００ｉｕ／ｋｇ  ｉｖ）および／または絶対好中球数が５００より多くなるまで＋１日目から毎日Ｇ−ＣＳＦ（例えば、３００〜４８０μｇ  ｓｃ）を投与される。別の例では、免疫系支持療法は、改変されたＴ細胞の投与後に１２時間毎に７日間２×１０６ｉ．ｕ．／ｍ２を投与することを含む。
【００８２】
処置有効性は、腫瘍サイズ、病変の数、腫瘍の病期、奏効率、または当業者に公知の他の基準などの標準的な方法によってモニターされる。一部の例では、（例えば、標準的なＲＥＣＩＳＴまたはｉｒＲＥＣＩＳＴ基準によって定義される）原発性腫瘍または転移のサイズの減少は、被験体におけるＲＣＣの阻害を示す。例えば、両方が参照により本明細書に組み込まれる、Eisenhauerら、Eur.  J.  Cancer  ４５巻：２２８〜２４７頁、２００９年；Wolchockら、Clin.  Cancer  Res.  １５巻：７４１２〜７４２０頁、２００９年を参照されたい。他の例では、無増悪生存および／または全生存期間（例えば、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１２ヶ月間、１８ヶ月間、２年間、またはそれより長い、例えば、１〜１２ヶ月間、６〜１８ヶ月間、１〜２年間、またはそれより長い）は、被験体におけるＲＣＣの阻害を示す。他の例では、循環ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入ＣＤ３４＋またはＣＤ８＋／ＣＤ３４＋Ｔ細胞の持続性、免疫細胞サブセットの変化、およびＴ細胞の活性化状態のうちの１つまたは複数、ならびに他の免疫学的決定因子が、臨床アウトカムと共に、ベースライン、処置の間の異なる時点、および疾患進行の時点に評価される。
【００８３】
一部の例では、被験体は、形質導入されたＴ細胞での処置の前に、並行して、または後に、１つもしくは複数の治療剤、外科的切除、および／または放射線療法などの１つまたは複数の追加の処置も施される。当業者は、本明細書に開示する改変されたＴ細胞と組み合わせてＲＣＣを有する被験体に投与するための治療剤を選択することができる。そのような薬剤としては、抗ＶＥＧＦ剤（パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、カボザンチニブ、ソラフェニブ、レンバチニブ、および／もしくはベバシズマブなど）、ｍＴＯＲ阻害剤（テムシロリムスおよび／もしくはエベロリムスなど）、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブなど）、ならびに／またはサイトカイン療法（ＩＦＮαおよび／もしくはＩＬ−２など）が挙げられる。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、ある特定の具体的な特徴および／または実施形態を説明するために提供するものである。これらの実施例は、記載する具体的な特徴または実施形態に本開示を限定するものと解してはならない。
【００８５】
（実施例１）
ＨＥＲＶ−Ｅ  ＣＴ−ＲＣＣ１反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＴ細胞受容体のクローニング
ＣＤ８＋ＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＲＣＣ反応性Ｔ細胞クローンは以前に同定された（Takahashiら、J.  Clin.  Invest.  １１８巻：１０９９〜１１０９頁、２００８年）。このＲＣＣ反応性ＣＴＬは、ＨＥＲＶ−ＥペプチドＡＴＷＬＧＳＫＴＷＫ（配列番号１）（Takahashiら、２００８年）を認識する。ｃｃＲＣＣ細胞のＨＬＡ−Ａ１１拘束性認識を有するＴ細胞クローンからトータルＲＮＡを抽出し、５’ＲＡＣＥによって全長ＴＣＲ鎖を同定した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖をコードする核酸はそれぞれ配列番号２および３として本明細書に開示されている。ＴＣＲα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４および５として本明細書に開示されている。
【００８６】
β鎖に連結された末端切断型ＣＤ３４分子を含むレトロウイルスコンストラクトにＴＣＲα鎖およびβ鎖をコードする核酸（配列番号２および３）をクローニングした（図１）。末端切断型ＣＤ３４カセットは細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むが、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くため、細胞中で機能しないが、その発現はＣＤ３４のそれらの表面発現に基づく形質導入されたＴ細胞の富化を可能とする。ベクターの配列を配列番号６として提供する。
【００８７】
（実施例２）
ｃｃＲＣＣ細胞に対するＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＴＣＲで形質導入したＴ細胞の反応性
２人の健常ドナーからのＰＢＭＣを実施例１に記載のベクターで形質導入した。形質導入されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ１１＋およびＨＥＲＶ−Ｅ＋  ｃｃＲＣＣ細胞を特異的に殺滅した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＣＴ−ＲＣＣ−１ペプチド（配列番号１）の追加は、予想した通り、ＨＥＲＶ−Ｅ陰性細胞およびＨＥＲＶ−Ｅ陽性細胞の両方に対する反応性を増加させた（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００８８】
（実施例３）
プロデューサークローンの開発
実施例１に記載のこのＴＣＲを含有するレトロウイルスベクターをＰＧ１３パッケージング細胞株に導入し、臨床用途のために高力価のレトロウイルスプロデューサークローンを単離した。ＰＧ１３プロデューサー細胞株を限界希釈でクローニングして高力価のクローンを生成した。次いで、ヒトＴ細胞に効率的に抗ＨＥＲＶ−Ｅ反応性を形質導入および移入する能力についてクローンをスクリーニングした。さらなる試験のために２つのクローンを選択した（７Ｇ１および２７Ａ７）。
【００８９】
この目的のために、各クローンからレトロウイルスを調製し、２つの別々のフルスケールの検証手順を行った。２人の健常ドナーからのＴ細胞をクローン７Ｇ１または２７Ａ７からのレトロウイルスで形質導入した。それらは、それぞれ６３．２％および６７．５％
【化１】
2019522984.tif 000003
または６５．２％および６１．６％
【化２】
2019522984.tif 000004
のＣＤ３４＋であり、両方のクローンが等しい効率でＴ細胞を形質導入したことを示す。免疫磁気ビーズを使用した、形質導入された細胞のＣＤ３４精製後、培養物は、それぞれ９９．３％および９８．４％
【化３】
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または９９．４％および９９．７％
【化４】
2019522984.tif 000006
のＣＤ３４＋であり、純粋なＴＣＲ形質導入Ｔ細胞培養物であったことを示す。
【００９０】
バイアルあたり５×１０６個の細胞のマスターセルバンクを両方のクローンについて生成した（７Ｇ１について２１２バイアルおよび２７Ａ７について２２０バイアル）。ウイルスの大きい３リットルのバッチを７Ｇ１クローンから調製し、７Ｇ１クローンおよび７Ｇ１ウイルスの両方をＧＭＰ認証のためにインディアナ大学のＶｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙに送付した。
【００９１】
（実施例４）
ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の評価
ＰＧ１３レトロウイルスプロデューサークローン７Ｇ１からの上清を正常ＰＢＬ由来Ｔ細胞を形質導入するために使用した。形質導入の３日後、細胞を、抗ＣＤ３４をコーティングした免疫磁性粒子とインキュベートし、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用して精製し、ＣＤ３４発現について染色した。選択前に６３．２％の細胞がＣＤ３４を発現し、これは選択後に９９．３％に増加した（図４Ａ）。ＣＤ３４＋細胞はＣＤ３を発現し（図４Ｂ）、ＨＥＲＶ−Ｅテトラマーの染色が陽性であった（図４Ｃ）。ＣＤ３４選択細胞は主にＣＤ８＋細胞であり（図５Ａ）、ＣＤ４＋細胞の割合はごくわずかであった（図５Ｂ）。
【００９２】
実施例２に記載の形質導入されたＴ細胞を評価した。クロム放出細胞傷害性による決定で、形質導入されたＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ１１＋およびＨＥＲＶ−Ｅ＋ｃｃＲＣＣ細胞を特異的に殺滅した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＣＴ−ＲＣＣ−１ペプチド（配列番号１）の追加は、ＨＥＲＶ−Ｅ陰性細胞に対する反応性を増加させた（図６Ａおよび６Ｂ）。ドナー１からのＴ細胞集団は３９．９％のＣＤ８＋であり（図６Ａ）、ドナー２からのＴ細胞集団は５２．８％のＣＤ８＋であった（図６Ｂ）。
【００９３】
実施例１に記載のベクターで形質導入された健常ドナーからのＰＢＭＣもＲＣＣ細胞およびＴ細胞の特異的殺滅について試験した。ＨＬＡ−Ａ１１＋およびＨＥＲＶ−Ｅ発現ＳＡＵＪ−ＲＣＣ細胞は特異的に殺滅されたが、ＨＬＡ−Ａ１１−ＨＥＲＶ−Ｅ陰性細胞（ＳＡＵＪ−ＬＣＬ）はそうでなかった（図７）。ＨＥＲＶ−Ｅを発現しても（ＬＹＯ−ＲＣＣ）しなくても（ＬＹＯ−ＬＣＬ）、ＨＬＡ−Ａ１１−細胞も殺滅されなかった。最後に、ＨＬＡ−Ａ１１＋ドナーからのＴ細胞は殺滅されなかった（図７）。
【００９４】
標的として一連のｃｃＲＣＣ細胞株を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりインターフェロン−ｙ（ＩＮＦ−γ）分泌を測定することによってＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の抗原特異性を評価した。図８は、ＨＬＡ−Ａ１１陽性でＣＴ−ＲＣＣ  ＨＥＲＶ−Ｅを発現するｃｃＲＣＣ細胞と共培養したときのみ、形質導入されたＴ細胞はＩＮＦ−γを産生することを示す（バックグラウンドの２倍より多く、１ｎｇ／ｍｌより多い）。
【００９５】
（実施例５）
ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の安全性および忍容性の決定
本実施例は、ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞でのｃｃＲＣＣの処置の安全性および忍容性を決定するために使用できる方法を記載する。しかしながら、これらの特定の方法から逸脱する方法を使用してＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の安全性および忍容性を成功裡に決定できることも当業者であれば理解する。
【００９６】
図９は、（例えば臨床的実施の前に）ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の安全性および忍容性を決定するための例示的なプロトコールを示す概略図である。
【００９７】
完全な外科的切除に適さず、臨床的にまたは放射線写真により二次元的に評価可能な進行性であり、ＨＬＡ−Ａ１１陽性である転移性のＨＥＲＶ−Ｅ陽性ｃｃＲＣＣを有する被験体をこの試験のために選択する。被験体は１５〜２０リットルの白血球アフェレーシスを受け、１×１０１０個のＰＢＭＣを回収する（必要に応じて凍結保存する）。その後、ＰＢＭＣ（６×１０８〜２×１０９個の細胞）を解凍し、抗ＣＤ３（例えば、５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３）およびＩＬ−２（例えば、３００ＩＵ／ｍｌ）（および必要に応じてＩＬ−１５、例えば１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で２〜３日間活性化させた後、免疫磁気的方法を使用してＣＤ４発現細胞を枯渇させる。ＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲおよびＣＤ３４ｔ（例えば、実施例１に記載したもの）をコードするレトロウイルスで約２００×１０６個のＴ細胞の形質導入を行う。形質導入後、ＣＤ３４＋免疫磁気ビーズ選択を使用して０．５〜１×１０６個の形質導入されたＴ細胞／ｋｇを富化した後、（３人の健常ドナーからプールした）放射線照射した同種ＰＢＭＣフィーダー細胞を使用してＩＬ−２／ＩＬ−１５含有培地（例えば、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２および１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５）中で９〜１１日間ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる。
【００９８】
プロトコールの一部の実施形態では、陽性選択されたＣＤ３４＋Ｔ細胞をＲＥＰに入れて、注入に必要とされる細胞数を迅速に生成させる。ＲＥＰに入れる形質導入された細胞の数は、患者の体重および注入コホートによって決定される。ＲＥＰを開始するために、３０ｎｇ／ｍＬの可溶性抗ｈＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を有する１５０ｍｌの完全サイトカイン培地（ｒｈＩＬ２／ｒｈＩＬ１５）を含有する直立のＴ１７５ｃｍ２フラスコ中で１×１０６個のＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入細胞を２００×１０６個のフィーダー細胞と合わせる。フィーダー細胞は、最低３人の別々の正常ドナーからのＰＢＭＣを一緒にし、５０００ＲＡＤの放射線を照射したＰＢＭＣからなる。加湿５％ＣＯ２インキュベーター中に５〜６日間、フラスコを直立にして置く。フラスコをインキュベーターから取り出し、細胞を回収し、計数し、３００ＩＵ／ｍＬ−ＩＬ２および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５を含有する新鮮な培地中に再懸濁する。さらなる増殖のために細胞懸濁液をＷａｖｅバイオリアクターバッグ（複数可）に移す。Ｗａｖｅバイオリアクター灌流システムを利用することによって、サイトカインを含有する新鮮な培地を培養培地に毎日補充する。
【００９９】
形質導入および増殖されたＴ細胞を、免疫抑制化学療法での処置後の個々の被験体へのその後の注入のために適切な用量レベル（下記を参照）で凍結保存する。
【０１００】
４つの異なるＴ細胞用量段階増加コホート（５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ、５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ、１×１０７個のＴ細胞／ｋｇ、または５×１０７個のＴ細胞／ｋｇ）のそれぞれに３人の被験体を順次登録する。被験体は、ＩＶでの１，０００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミド（−５日目）および毎日３０分の３日間のｉ．ｖ．での３０ｍｇ／ｍ２のフルダラビン（−５日目から−３日目）による非骨髄破壊的な免疫抑制コンディショニングレジメンを受けた後、０日目にＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の注入により標的とするＴ細胞用量を送達される。注入前に、Ｔ細胞に対して最終の細胞計数を行い、生存能力および無菌性の評価を行う。Ｔ細胞注入後、注入関連毒性の徴候について被験体を最大４時間モニターする。Ｔ細胞注入前の準備投薬は、アセトアミノフェンおよびｉ．ｖ．のベナドリルである。Ｔ細胞注入後、被験体に、７日間（０日目から＋６日目）の２，０００，０００ＩＵ／ｍ２の用量の１２時間のｉ．ｖ．によるＩＬ−２および好中球回復（ＡＮＣ＞５００）が起こるまで１日目から毎日の３００μｇのＧ−ＣＳＦを与える。被験体は好中球回復後に診療センターを退院し、６〜８週間毎週通院し、身体検査および体重などの標準的な評価、ならびにルーチンの臨床検査（血液学および電解質）を受ける。ＲＥＣＩＳＴ基準を使用してＰＥＴおよびＣＴイメージングを使用した再病期診断をＴ細胞注入の３０日後、次いで、最初の年は３ヶ月毎、次いでそれ以後は腫瘍進行のエビデンスが生じるまで６ヶ月毎に行う。
【０１０１】
試験における段階的増加、段階的縮小、または用量の段階的増加の保留の決定は、表２に概説する規則に従う。
【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
養子Ｔ細胞移入に関連する有害事象は一般にＴ細胞注入後２１日以内に起こるので、コホートの次の被験体または次のコホートの最初の被験体を処置する前に、各被験体をＴ細胞注入後２１日間観察する。したがって、登録された次の患者がコンディショニング化学療法を開始する前に、各患者に対するＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の注入の間に最低２１日間がある。用量制限毒性（ＤＬＴ）は、Ｔ細胞注入の中止に繋がるあらゆる有害事象として、ならびに／または下記を除いて、ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋／ＣＤ３４＋Ｔ細胞の注入に恐らくまたは確実に関連すると判断される全てのグレード３および４の毒性として定義される：
【０１０４】
・リンパ球減少、好中球減少、および血小板減少として定義される骨髄抑制
・ＩＬ−２の予測毒性（セクション１４．３に記載されている）
・フルダラビンおよびシクロホスファミドの予測毒性
・標準的な支持治療による細胞投与の２４時間以内にグレード２またはそれ未満のグレードに戻ることができる、細胞注入の２時間以内に起こる（細胞注入に関する）即時型過敏反応（症候性気管支痙攣およびグレード４の低血圧を除く）
・グレード３の発熱
・１０日以内にグレード２未満またはグレード２の自己免疫毒性まで解消するグレード３の自己免疫
・７日以内にグレード２まで解消する顕著な臨床的後遺症を伴わないグレード３の代謝検査異常
【０１０５】
Ｔ細胞注入後の複数の時点において血液試料を採取し、循環ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を評価し、その細胞は、ＣＤ３４を発現するＣＤ３＋細胞のパーセンテージおよび絶対数を定量することによって分析される。容易に生検に適する腫瘍を有する患者は、上記と同じ方法論を使用してＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を評価するために、転移性腫瘍病変の随意の細針吸引も受けてもよい。被験体を最大５年間追跡し、疾患進行が記録されたときに試験から外す。
【０１０６】
（実施例６）
ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を用いる腎細胞癌の処置
本実施例は、ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を用いる、ＲＣＣを有する被験体に対して使用できる方法を記載する。しかしながら、これらの特定の方法から逸脱する方法を使用して、ＨＥＲＶ−Ｅ  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞によりＲＣＣを有する被験体を成功裡に処置できることを当業者は理解する。
【０１０７】
図１０は、ＲＣＣを有する被験体を処置するための例示的なプロトコールを示す概略図である。
【０１０８】
ＨＬＡ−Ａ１１陽性でありＨＥＲＶ−Ｅ陽性であるＲＣＣ（転移性ｃｃＲＣＣなど）を有する被験体に対してアフェレーシスを行い、Ｔリンパ球を回収する。３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体および３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を用いてＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで２日間活性化させる。本明細書に記載するＨＥＲＶ−Ｅ特異的ＴＣＲを含むレトロウイルスベクター（例えば、配列番号６）をＴ細胞に形質導入する。３０ｍｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および３０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８を用いてリンパ球を７〜１４日間増殖させる。被験体に対して、（例えば、実施例３に記載するように）化学療法誘発性のリンパ球枯渇を行い、形質導入されたＴ細胞をＩＬ−２支持と共に（例えば、実施例５に記載するように決定される）ＭＴＤで注入する。
【０１０９】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すれば、説明した実施形態は例に過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神に含まれる全てを本発明者らの発明として主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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