(57)【要約】  本開示は、概して、腫瘍学、ウイルス学、および免疫療法の分野に関する。本開示は、ポックスウイルス、特に、各々がヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）またはＧＭ−ＣＳＦを発現するようさらに改変されている高度弱毒化改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、およびワクシニアビルレンス因子Ｅ３の欠失を伴う組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａウイルス（ＭＶＡΔＥ３Ｌ）に関する。本開示は、癌免疫療法薬としての上述の組換えウイルスの使用に関する。上述の組換えポックスウイルスは、免疫チェックポイント遮断療法と組み合わせて使用することもできる。
2019506428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性固形腫瘍に罹患した対象の腫瘍細胞に送達すると腫瘍を治療するのに有効な量で、
（ｉ）ヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦｌｔ３Ｌ）を保持するＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ）、および
（ｉｉ）ｈＦｌｔ３Ｌを保持するＭＶＡΔＥ３Ｌ（ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｔｌ３Ｌ）、
からなる群より選択される組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスを含む組成物。
【請求項２】
腫瘍の治療が、以下の１つ以上によって顕在化する、請求項１に記載の組成物：腫瘍に対する免疫応答の対象における誘導、または腫瘍に対して進行中の免疫応答の対象における増強もしくは促進、腫瘍のサイズの低減、腫瘍の根絶、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍の転移の阻害、および転移性腫瘍の低減もしくは根絶。
【請求項３】
免疫応答の誘導、増強、または促進が、以下の１つ以上を含む、請求項１に記載の組成物：
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍におけるＣＤ４５+細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の動員、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+炎症性単球とＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞の前記注射された腫瘍および遠隔腫瘍への流入、前記注射された腫瘍および遠隔腫瘍における、型ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を介した交差提示ＣＤ１０３+樹状細胞の活性化および移動、ならびに
異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞および交差防御の生成。
【請求項４】
組換えＭＶＡが、腫瘍抗原をコードまたは発現する核酸を保持していない、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
１つ以上の賦形剤が、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、ならびに上記のうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
組換えＭＶＡがＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む、請求項１から４に記載の組成物。
【請求項８】
第２の量の、ヒトＦｌｔ３Ｌをコードおよび発現する、チミジンキナーゼの欠失を伴う複製可能である組換え弱毒化ワクシニアウイルスをさらに含み、ここで前記第２の量が、誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する、請求項１から４、および７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
第３の量の不活化ＭＶＡをさらに含み、ここで前記第３の量は、誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する、請求項１から４、７、および８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
悪性固形腫瘍に罹患した対象を治療する方法であって、前記腫瘍の細胞にＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬおよびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌならびにそれらの組み合わせの群より選択される組換えＭＶＡウイルスを送達し、それによって腫瘍を治療することを含む、前記方法。
【請求項１１】
ウイルスの量が以下の１つ以上をもたらすのに有効である、請求項１０に記載の方法：対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するか、または腫瘍に対する免疫系によって進行中の免疫応答を増強もしくは促進する；腫瘍のサイズを低減する；腫瘍を根絶する；腫瘍の増殖を阻害する；腫瘍の転移を阻害する；および転移性腫瘍を低減または根絶する。
【請求項１２】
腫瘍に対する免疫応答が以下の１つ以上を達成する、請求項１１に記載の方法：
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍におけるＣＤ４５+細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の動員、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+炎症性単球とＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞の注射された腫瘍および遠隔腫瘍への流入、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における、型ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を介した交差提示ＣＤ１０３+樹状細胞の活性化および移動、ならびに
異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞および交差防御の生成。
【請求項１３】
ＭＶＡまたはＭＶＡＡＥ３Ｌが、腫瘍抗原をコードまたは発現する核酸を保持していない、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
組換えＭＶＡが、腫瘍内注射もしくは静脈内注射、または、腫瘍内注射と静脈内注射の同時もしくは連続的組み合わせによって送達される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍が黒色腫または結腸癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
組換えＭＶＡの送達が、恩恵が持続する限り、または最大許容用量に達している限り、数週間、数カ月間、もしくは数年間、または無期限に継続する、請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えＭＶＡの送達が、腫瘍内注射による、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
対象がヒトである、請求項１３に記載の方法。 
【請求項１９】
組換えＭＶＡが、約１０6〜１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内の、好ましくは約１０7〜約１０9プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内の、投与当たりの投与量で送達される、請求項１３から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
送達される量が、全ての腫瘍細胞に感染するのに十分である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
送達が、月に１回から週に２回の範囲内の頻度で繰り返される、請求項１３から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
送達が週に１回繰り返される、請求項１３から１９に記載の方法。
【請求項２３】
黒色腫が転移性黒色腫である、請求項１３から１９に記載の方法。
【請求項２４】
組換えＭＶＡがＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌである、請求項１３から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはその両方の組み合わせからなる群より選択される、ある量の組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を対象の腫瘍へと送達することを含み、以下の免疫学的効果のうちの少なくとも１つをもたらすのに有効である、前記方法：
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍におけるＣＤ４５+細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の動員、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+炎症性単球とＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞の前記注射された腫瘍および遠隔腫瘍への流入、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における、型ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を介した交差提示ＣＤ１０３+樹状細胞の活性化および移動、ならびに
異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞および交差防御の生成。
【請求項２６】
対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するか、または腫瘍に対する対象の進行中の免疫応答を増強もしくは促進するのに有効な量で、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはそれらの組み合わせを前記対象の腫瘍細胞へと送達し、それによって以下のうちの１つ以上を達成することを含む前記方法：前記腫瘍のサイズを低減する、前記腫瘍を根絶する、前記腫瘍の増殖を阻害する、前記腫瘍の転移性増殖を阻害する、前記腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する、または前記対象の生存期間を長引かせる。
【請求項２７】
対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するか、または腫瘍に対する対象の進行中の免疫応答を増強もしくは促進するのに有効な量で、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスを前記対象の腫瘍細胞へと送達することと、前記腫瘍内の免疫抑制性メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で、免疫チェックポイント遮断剤または免疫チェックポイントアゴニストを補助的に前記対象に投与することとを含む、前記方法。
【請求項２８】
チェックポイント阻害剤またはチェックポイントアゴニストの投与が非経口経路によるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
送達が腫瘍内注射によるものであり、投与が静脈内経路によるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
送達と投与の両方が、静脈内経路によるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
送達と投与の両方が、腫瘍内注射によるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
免疫チェックポイント遮断剤が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン−３）、Ｂ７−Ｈ３、およびＴＩＧＩＴ（ＩｇとＩＴＩＭドメインをもつＴ細胞免疫受容体）に対する阻害抗体、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤＬ２、Ｂ７−Ｈ４、ＩＩおよびＤＬＢＣＬ阻害剤、ＢＴＬＡ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択され、前記免疫チェックポイントアゴニストが、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）に対するアゴニスト抗体、およびＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が、原発性もしくは転移性の黒色腫であるか、または原発性もしくは転移性の結腸癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスが送達され、免疫チェックポイント遮断剤が投与され、各々が間隔を隔てた時間間隔の独自の投与スケジュールに従う、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
第１の用量のウイルスが最初に送達され、時間経過後に、第１の用量の免疫チェックポイント遮断剤が投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
送達と投与とが、全体的にみれば同一の期間中に並行して行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスと前記免疫チェックポイント遮断剤の１つまたは両方が、恩恵が持続する限り、および最大許容用量に達しない限り、数週間、数カ月間、もしくは数年間、または無期限の期間中、それぞれ送達および投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスと免疫チェックポイント遮断剤が同時に投与される、請求項２７に記載の方法。ウイルスと免疫チェックポイント遮断剤が同一の組成物中で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項３９】
組換えＭＶＡと免疫チェックポイント遮断剤が腫瘍内に送達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
組換えＭＶＡと免疫チェックポイント遮断剤が連続的に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
ヒトＦｌｔ３Ｌをコードおよび発現する、チミジンキナーゼの欠失を伴う複製可能な組換え弱毒化ワクシニアウイルス、もしくは不活化ＭＶＡ、またはその両方を、それぞれ第２および第３の量で対象に投与することをさらに含み、前記第２の量もしくは第３の量、またはその両方が、誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する、請求項１３または２５に記載の方法。
【請求項４２】
１）請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物を含む第１の構成要素と、
２）それぞれ第２および第３の量の、ＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＦｌｔ３Ｌをコードおよび発現する、チミジンキナーゼの欠失を伴う複製可能な組換え弱毒化ワクシニアウイルス、および不活化ＭＶＡの１つまたは両方を含む第２の構成要素であって、前記第２の量もしくは第３の量または第２および第３の量の両方が、対象において誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する前記第２の構成要素、
とを含むキット。
【請求項４３】
対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスによって前記対象があらかじめ治療されるかまたは前記対象が前記ウイルスを投与されており、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍浸潤免疫細胞によって引き起こされる、腫瘍内の免疫抑制性メカニズムの遮断をもたらすのに有効な量の免疫チェックポイント遮断剤を前記対象の前記対象腫瘍細胞に対して送達することを含む、前記方法。
【請求項４４】
対象において悪性腫瘍を治療する方法であって、腫瘍細胞、間質細胞または腫瘍浸潤免疫細胞によって引き起こされる、腫瘍内の免疫抑制性メカニズムの遮断をもたらすのに有効な量の免疫チェックポイント遮断剤によって前記対象があらかじめ治療されるかまたは前記対象が前記チェックポイント遮断剤を投与されており、前記対象の免疫系が前記腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するのに有効な量で前記対象の前記腫瘍細胞に対して送達することを含む、前記方法。
【請求項４５】
免疫チェックポイント遮断剤が、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＩＩ  ＤＬＢＣＬ阻害剤、ＢＴＬＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
免疫チェックポイント遮断剤が、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３、４４、または４５に記載の方法。
【請求項４７】
悪性固形腫瘍に対する免疫療法薬としての使用に好適な、単離されたヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦｌｔ３Ｌ）を発現するよう改変された、ワクシニアビルレンス因子Ｅ３を欠失した組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａウイルス（ＭＶＡΔＥ３Ｌ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この国際出願は、以下の仮出願の優先権を主張する。２０１６年２月２５日に出願された米国仮出願連続番号第６２／３００，０６６号、２０１６年１１月７日に出願された米国仮出願連続番号第６２／４１８，７８６号、および２０１６年１１月８日に出願された米国仮出願連続番号第６２／４１８，７８８号。これらの全ての出願の開示は、参照によりそれらの全体を全ての目的のために本明細書に組み入れる。
政府の助成
本発明は、国立保健研究所によって授与された助成金ＡＩ０７３７３６、ＡＩ０９５６９２、ＣＡ００８７４８、およびＣＡ５６８２１のもとで政府の助成を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。２０１７年２月２３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、１１０００＿００５１５４−ＷＯ２＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２，６８３バイトのサイズである。
技術分野
本開示は、概して、腫瘍学、ウイルス学、および免疫療法の分野に関する。それは、ポックスウイルス、特に、各々がヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）またはＧＭ−ＣＳＦを発現するようさらに改変されている高度弱毒化改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、およびワクシニアビルレンス因子Ｅ３の欠失を伴う組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａウイルス（ＭＶＡΔＥ３Ｌ）に関する。本開示は、癌免疫療法薬としての上述の組換えウイルスの使用に関する。上述の組換えポックスウイルスはまた、免疫チェックポイント遮断療法と組み合わせて使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
免疫系と癌
悪性腫瘍は、本質的に従来の治療法に対して抵抗性であり、重大な治療上の課題を提示する。免疫療法は、発展する研究分野となってきており、ある種の癌の治療のためのさらなる選択肢となってきている。免疫療法のアプローチは、免疫系が刺激されて腫瘍細胞を認識し、それらを破壊のための標的とし得るという基本原理に基づく。
数多くの研究が、癌の進行において、免疫系構成要素の差異的な存在の重要性を裏付ける（１）（Jochems et al., Exp Biol Med, 236(5): 567-579 (2011)）。臨床データは、高密度の腫瘍浸潤リンパ球が改善した臨床成績と相関することを示唆する（２）（Mlecnik et al., Cancer Metastasis Rev.; 30: 5-12, (2011)）。強力なリンパ球浸潤と患者の生存との間の相関は、黒色腫、卵巣癌、頭頸部癌、乳癌、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、胆嚢癌、および食道癌を含む、様々な型の癌において報告されている（３）（Angell et al., Current Opinion in Immunology, 25:1-7, (2013)）。腫瘍免疫浸潤はマクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、単球、好中球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナイーブリンパ球およびメモリーリンパ球、Ｂ細胞、ならびにエフェクターＴ細胞（Ｔリンパ球）を含み、それらは腫瘍細胞が発現する抗原の認識および後続の細胞傷害性Ｔ細胞による腫瘍細胞の破壊を主に担う。
【０００３】
癌細胞による抗原の提示および腫瘍細胞に対して潜在的に応答することができる免疫細胞の存在にもかかわらず、多くの場合、免疫系は活性化されず、または積極的に抑制されている。この現象の鍵は、免疫系の細胞を支配して免疫系の他の細胞を阻害するようにさせることによって、腫瘍がそれら自身を免疫応答から防御する能力である。腫瘍は、抗腫瘍免疫応答を回避するための多くの免疫調節メカニズムを生じさせる。例えば、腫瘍細胞は、免疫阻害性サイトカイン（ＴＧＦ−βなど）を分泌するか、または腫瘍病巣においてＣＤ４+制御性Ｔ細胞およびマクロファージなどの免疫細胞がこれらのサイトカインを分泌するように誘導する。腫瘍はまた、ＣＤ４+Ｔ細胞が制御性の表現型を発現するようなバイアスをもたらす能力をも有する。全体的な結果は、損なわれたＴ細胞応答および損なわれたアポトーシスの誘導またはＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の低減した抗腫瘍免疫能力である。さらに、腫瘍細胞の表面のＭＨＣクラスＩの、腫瘍に関連する変更された発現はそれらを免疫応答に対し「不可視」にする（４）（Garrido et al. Cancer Immunol. Immunother. 59(10), 1601-1606 (2010)）。抗原提示機能および樹状細胞（ＤＣ）の阻害は、抗腫瘍免疫の回避にさらに寄与する（５）（Gerlini et al. Am. J. Pathol. 165(6), 1853-1863 (2004)）。
【０００４】
さらに、腫瘍微小環境の局所的な免疫抑制性の性質は、免疫編集と共に、標的抗原を発現しない癌細胞亜集団の逃避を導き得る。したがって、免疫系の抗腫瘍活性の保持および／または回復を促進するアプローチの発見は、相当な治療上の有益性をもたらすであろう。
【０００５】
免疫チェックポイントは、抗腫瘍免疫の腫瘍媒介性下方制御に関与してきており、治療標的として使用されている。Ｔ細胞の機能不全は、ＣＤ２８ファミリーの受容体のメンバーである阻害性受容体、ＣＴＬＡ−４およびプログラム細胞死１ポリペプチド（ＰＤ−１）の誘導された発現と並行して起きることが実証されている。ＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーであり、それは、ＰＤ−１に加えて、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡを含む。しかしながら、黒色腫の治療における免疫療法の使用に関する有望性が臨床使用によって強調されており、そして抗ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）および抗ＰＤ−１剤（例えば、ペンブロリズマブおよびニボルマブ）の規制当局による承認さえもあるが、これらの免疫療法に対する患者の応答は限定されている。これらのＴ細胞における阻害シグナル（例えばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、およびＰＤ−１のリガンドＰＤ−Ｌ１）の遮断に焦点を当てた最近の臨床治験は、Ｔ細胞の抑制を反転することが、免疫療法の成功にとって極めて重要であることを示している（６、７）（Sharma et al., Science 348(6230), 56-61 (2015)、Topalian et al., Curr Opin Immunol. 24(2), 202-217 (2012)）。これらの観察は、癌に対する免疫系を利用するための新規の治療アプローチの開発の必要性を強調する。
【０００６】
ポックスウイルス
操作されたワクシニアウイルスのようなポックスウイルスは、転移性癌の腫瘍溶解性療法としての最前線にある（８）（Kirn et al., Nature Review Cancer 9, 64-71 (2009)）。ワクシニアウイルスは大きなＤＮＡウイルスであり、速いライフサイクル、および遠隔組織に対する効率的な血行性伝播を有する（９）（Moss, In Fields Virology (Lippincott Williams & Wilkins, 2007), pp.2905-2946）。ポックスウイルスは、癌細胞において複数の導入遺伝子を発現し、これによって治療効果を増強するベクターとして非常に好適である（１０）（Breitbach et al., Current pharmaceutical biotechnology 13, 1768-1772 (2012)）。前臨床試験および臨床治験は、従来の療法に対して難治性の進行癌の治療に対して腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび他のウイルスを用いることの有効性を実証している（１１〜１３）（Park et al., Lacent Oncol 9, 533-542 (2008)、Kirn et al., PLoS Med 4, e353 (2007)、Thorne et al., J Clin Invest 117, 3350-3358 (2007)）。ポックスウイルスに基づく腫瘍溶解性療法は、細胞溶解、アポトーシス、およびネクローシスの組み合わせを通じて癌細胞を殺傷する利点を有する。それはまた、免疫細胞の腫瘍への動員および抗腫瘍適応免疫応答の進行を促進する、自然免疫感知経路を誘導する。現在の、臨床治験における腫瘍溶解性ワクシニア株（例えばＪＸ−５９４）は、複製性の株である。それらは、腫瘍選択性を高めるためのチミジンキナーゼの欠失を伴い、免疫応答を刺激するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような導入遺伝子の発現を伴う野生型ワクシニアを用いる（１０）（Breitbach et al., Curr Pharm Biotechnol 13, 1768-1772 (2012)）。しかしながら、多くの研究は、野生型ワクシニアが抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する免疫抑制効果を有することを示しており（１４〜１７）（Engelmayer et al., J Immunol 163, 6762-6768 (1999)、Jenne et al., Gene therapy 7, 1575-1583 (2000)、P. Li et al., J Immunol 175, 6481-6488 (2005)、Deng et al., J Virol 80, 9977-9987 (2006)）、これにより、腫瘍自体の免疫抑制効果および免疫回避効果が増すことを示している。対照的に、高度弱毒化ワクシニア株である改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、中程度の免疫活性化効果を有する（１８、１９）（Drillien et al., J Gen Virol 85, 2167-75 (2004)、Dai et al., PLoS Pathog 10(4), e1003989 (2014)）が、哺乳動物細胞において不十分に増殖し、腫瘍抗原の発現または腫瘍溶解性の使用において好適ではないと考えられた。しかしながら、本発明者らは、導入遺伝子を保持するＭＶＡが十分な量で供給される場合、大部分の感染細胞が導入遺伝子を発現することを見出した。
【０００７】
改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、感染性疾患および癌のための重要なワクチンベクターである、高度弱毒化ワクシニア株である。ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における５７０代を超える継代を通じてワクシニア株から派生した。ＭＶＡは親ワクシニアゲノムの３１ｋｂの欠失を有し、多くの哺乳動物細胞において非複製性である。ＭＶＡは、ＷＨＯが主催する天然痘ワクチン接種の間に１２０，０００人を超える人々において使用され、ヒトでの使用において非常に安全であると示された。その安全性およびその外来抗原を発現する能力のために、ＭＶＡは、ＨＩＶ、結核、マラリア、インフルエンザ、コロナウイルス、およびＣＭＶ、ならびに癌に対するワクチンベクターとして研究されている（２０〜２５）（Sutter et al., Current drug targets. Infectious disorders 3, 263-271 (2003)、Gomez et al., Curr Gene Ther 8, 97-120 (2008)、Gomez et al., Curr Gene Ther 11, 189-217 (2011)、Goepfert et al., J Infect Dis 203, 610-619 (2011)、Wyatt et al., Virology 372, 260-272 (2008)、Garcia et al., Vaccine 29, 8309-8316 (2011)）。
【０００８】
癌治療としてのＭＶＡの研究は、今までのところ、腫瘍抗原を発現するためのワクチンベクターとしてのその使用に限定されている（２６、２７）（Tagliamonte et al. Hum Vaccin Immunother 10, 3332-3346 (2014)、Verardi et al., Hum Vaccin Immunother 8, 961-970 (2012)）。様々な腫瘍抗原がＭＶＡに基づいたベクターによって発現され、いくつかの組換えウイルスは、臨床治験の様々な段階にある。例えば、ＭＶＡ−ＰＳＡ−ＰＡＰは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）と前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の両方を発現し、転移性前立腺癌の患者のための臨床治験中である。腫瘍抗原ブラキウリとＴ細胞共刺激分子を発現する組換えウイルスＭＶＡ−ブラキウリ−ＴＲＩＣＯＭもまた、転移性癌の患者のための臨床治験中である。ｐ５３腫瘍抑制因子を発現する組換えウイルスＭＶＡ−ｐ５３もまた、臨床治験中であり、安全であると示されている。標的とされている他の腫瘍抗原は、Ｈｅｒ２、ｈＭＵＣ−１、ＴＷＩＳＴなどを含む。
【０００９】
ＭＶＡは、高度に弱毒化され、中程度に免疫刺激性であるが、それは、重要なビルレンス因子であるＥ３を含む、複数の免疫抑制性ウイルス遺伝子を残す。組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡΔＥ３Ｌは、ワクシニアビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）因子Ｅ３の欠失によってさらに弱毒化され、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において複製することが不可能であるが、ベビーハムスター腎臓BHK-21細胞におけるその複製能を残している（２８）（Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)）。ＭＶＡΔＥ３Ｌは、ＣＥＦにおいてウイルスＤＮＡを複製することができ、ウイルスの後期タンパク質合成を欠如している（２８）（Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)）。それはまた、ＣＥＦにおいてアポトーシスを誘導する（２８）（Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)）。ＨｅＬａ細胞のＭＶＡΔＥ３Ｌ感染は、損なわれたウイルス複製、ウイルスの後期遺伝子転写および翻訳を含む同様の効果を有する（２９）（Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)）。ＭＶＡΔＥ３Ｌはまた、ＨｅＬａ細胞において、おそらくはミトコンドリア経路の活性化を通じてアポトーシスを誘導する（２９）（Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)）。中間遺伝子転写中にｄｓＲＮＡが産生され、これは２’−５’−オリゴアデニル酸シンターゼ／ＲＮアーゼＬおよびプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性化を導き得る。ＰＫＲ欠損ＭＥＦにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌは、中間および後期タンパク質の発現能を獲得する（２９）（Ludwig et al., J Virol 79(4), 2584-2596 (2005)）。
【００１０】
１つの研究は、アポトーシス促進性タンパク質であるＮｏｘａが、ＭＶＡΔＥ３Ｌのアポトーシス誘導において役割を果たすことを示唆する（３０）（Fischer et al., Cell Death Differ 13, 109-118 (2006)）。初期の研究は、ＭＶＡΔＥ３ＬがＣＥＦにおいて、ＭＶＡよりも高いレベルのＩ型ＩＦＮを誘導することを示したが、正確なメカニズムは完全に解明されていない（２８）（Hornemann et al., J Virol 77(15), 8394-07 (2003)）。
１つのＭＶＡΔＥ３Ｌが参照により組み入れられる米国特許第７，０４９，１４５号に記載されている。それは感染可能であるが、マウスおよびヒトを含む多くの哺乳動物細胞において非複製性である。
【００１１】
本開示は、抗癌免疫療法薬としてのｈＦｌｔ３Ｌを発現する組換えＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内送達に焦点を当てる。いずれも腫瘍抗原を発現しない非改変ＭＶＡまたは欠失変異ＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内送達、および不活化ＭＶＡの腫瘍内送達は、腫瘍浸潤免疫細胞（例えば、白血球）、腫瘍細胞、および腫瘍関連間質細胞から自然免疫応答を引き起こし、Ｉ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの誘導を導き、腫瘍免疫抑制性微小環境の改変をもたらす。ＷＯ２０１６／１４４５６４およびＷＯ２０１６／１６８８６２を参照のこと。骨髄細胞の増殖を刺激するＩ型膜貫通タンパク質であるヒトＦｌｔ３Ｌ（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド）は、１９９４年にクローニングされた（Lyman et al., 1994）。ｈＦｌｔ３Ｌの用途は、骨髄移植のための製剤における幹細胞移動（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、樹状細胞の増殖のような癌免疫療法、およびワクチンアジュバントを含む様々な前臨床および臨床の場において探索されている。組換えヒトＦｌｔ３Ｌ（ｒｈｕＦｌｔ３Ｌ）は、５００人を超えるヒト対象において試験され、生物活性であり、安全であり、良好な耐容性を示す（Fong et al., 1998、Maraskovsky et al., 2000、Shackleton et al., 2004、He et al., 2014、Anandasabapathy et al., 2015）。ＣＤ８α+／ＣＤ１０３+のＤＣおよびｐＤＣを含む、ＤＣ亜集団の発生における増殖因子Ｆｌｔ３Ｌの極めて重要な役割の理解についての多くの進展が最近なされた（McKenna et al., 2000、Waskow et al., 2008、Liu et al., 2007、2009、Naik et al., 2006、Ginhoux et al., 2009）。
【００１２】
ＣＤ１０３+／ＣＤ８α+のＤＣは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の自発的なクロスプライミングに必要とされることが示されており（Hildner et al., 2008、Ginhoux et al., 2009, Zhang et al., 2015、Sprangeret al., 2015）、Ｂｒｏｚらは、ＣＤ１０３+のＤＣが腫瘍内にまばらに存在し、それらが豊富な腫瘍関連マクロファージと腫瘍抗原について競合することを報告した。ＣＤ１０３+のＤＣは独自にナイーブおよび活性化ＣＤ８+Ｔ細胞を刺激することが可能であり、適応Ｔ細胞療法の成功に極めて重要である（Broz, et al. Cancer Cell, 26(5):638-52, 2014）。Ｓｐｒａｎｇｅｒらは、腫瘍シグナル伝達経路ＷＮＴ／βカテニンの活性化が、腫瘍内のＣＤ１０３+のＤＣおよび抗腫瘍Ｔ細胞の低減を導くことを報告した（Spranger et al., 2015）。Ｆｌｔ３Ｌ培養ＢＭＤＣの腫瘍内送達は、抗ＣＴＬＡ−４と抗ＰＤ−Ｌ１の免疫療法の組み合わせに対する応答性をもたらす（Spranger et al., 2015）。ＣＤ１０３+のＤＣの増殖因子であるＦｌｔ３Ｌの全身投与およびポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）の腫瘍内注射は、腫瘍内においてＣＤ１０３+のＤＣ集団を拡大および活性化し、マウスの黒色腫およびＭＣ３８結腸癌モデルにおける免疫療法への抵抗性を克服したか、またはそれに対する応答性を増強した（Salmon et al., 2016, Sanchez-Paulete et al., 2016）。
様々な固形腫瘍における腫瘍新抗原の最近の発見は、固形腫瘍が通常個体間で異なる独自の新抗原を有することを示す（Castle et al., Cancer Res 72, 1081-1091 (2012)、Schumacher et al., Science 348, 69-74 (2015)）。本明細書に開示される組換えウイルスは、腫瘍抗原を発現することによってそれらの活性を発揮するのではない。本発明の組換えＭＶＡウイルスの腫瘍内送達は、腫瘍新抗原の効果的な交差提示および腫瘍内（および全身に拡張もする）の抗腫瘍適応免疫の発生を可能にし、したがって、腫瘍に対する免疫応答を開始する点において、腫瘍細胞によって発現される腫瘍分化抗原および新抗原を用いる「インサイチュ癌ワクチン接種」を導く。
【００１３】
腫瘍内の体細胞変異によって生成される新抗原の存在にもかかわらず、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の機能はしばしば複数の阻害メカニズムによるチェックで抑えられる（３３）（Mellman et al., Nature 480, 480-489 (2011)）。例えば、活性化Ｔ細胞上の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）の上方制御は、Ｔ細胞共刺激因子ＣＤ２８と競合して樹状細胞（ＤＣ）上のＣＤ８０（Ｂ７１）／ＣＤ８６（Ｂ７．２）と相互作用し、それによって、Ｔ細胞活性化および増殖を阻害する。ＣＴＬＡ−４はまた、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現し、Ｔｒｅｇの阻害性機能の媒介において重要な役割を果たす（３４、３５）（Wing et al., Science 322, 271-275 (2008)、Peggs, et al., J Exp Med 206, 1717-1725 (2009)）。さらに、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ／ＰＤ−Ｌ２の発現は、ＣＤ２８ファミリーの阻害性受容体であるＰＤ−１の活性化を導き、Ｔ細胞枯渇をもたらし得る。ＣＴＬＡ−４およびプログラム細胞死１ポリペプチド（ＰＤ−１）のような阻害性受容体に対する抗体を用いる免疫療法は、動物での研究における顕著な前臨床活性および転移性癌の患者における臨床応答を示しており、転移性黒色腫、非小細胞肺癌、および腎細胞癌の治療に関してＦＤＡによって承認されている（６、３６〜３９）（Leach et al., Science 271, 1734-1746 (1996)、Hodi et al., NEJM 363, 711-723 (2010)、Robert et al., NEJM 364, 2517-2526 (2011)、Topalian et al., Cancer Cell 27, 450-461 (2012)、Sharma et al., Science 348(6230), 56-61 (2015)）。
【００１４】
黒色腫
死亡率が最も高い癌の１つである黒色腫は、米国および世界中において最も急速に増加している癌である。その発生率は、主に太陽への過剰曝露および日焼けベッドの使用により、若い白人の女性において、１９８０年から５０％増加している。アメリカ癌学会によると、２０１５年において米国のおよそ７８，０００人の人々が黒色腫であると診断され、ほぼ１０，０００人の人々（または１時間当たり１人）が、黒色腫により死亡するであろう。多くの場合、進行性黒色腫は、化学療法および放射線療法を含む従来の治療法に抵抗性である。結果として、転移性黒色腫を有する人々は、６〜１０カ月のみの期待余命の非常に悪い予後を有する。約５０％の黒色腫がＢＲＡＦ（重要な腫瘍促進性遺伝子）に変異を有するという発見は、この疾患の標的化療法への扉を開いた。ＢＲＡＦ阻害剤による初期の臨床治験は、ＢＲＡＦ変異を有する黒色腫の患者において、顕著ではあるが、残念なことに持続可能でない応答を示した。したがって、これらの患者および他のＢＲＡＦ変異を有さない黒色腫の患者に対する代替的な治療戦略が喫緊に必要である。
【００１５】
ヒトの病理学的データは、黒色腫病巣内のＴ細胞浸潤の存在が、より長い患者の生存期間と正に相関することを示す（４０）（Oble et al. Cancer Immun. 9, 3 (2009)）。黒色腫に対する防御における免疫系の重要性は、免疫活性因子ＩＦＮ−α２ｂおよびＩＬ−２のような免疫療法の部分的な成功（４１）（Lacy et al. Expert Rev Dermatol 7(1):51-68 (2012)）、ならびに、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の単独または併用療法のいずれかを含む免疫チェックポイント療法に対する転移性黒色腫の患者の前例がない臨床的応答（６、７、３７、４２〜４５）（Sharma and Allison, Science 348(6230), 56-61 (2015)、Hodi et al., NEJM 363(8), 711-723 (2010)、Wolchok et al., Lancet Oncol. 11(6), 155-164 (2010)、Topalian et al., NEJM 366(26), 2443-2454 (2012)、Wolchok et al., NEJM 369(2), 122-133 (2013)、Hamid et al., NEJM 369(2), 134-144 (2013)、Tumeh et al., Nature 515(7528), 568-571 (2014)）によってさらに裏付けられる。しかしながら、多くの患者は、免疫チェックポイント遮断療法単独に応答しない。ウイルス療法の追加が免疫チェックポイント遮断に対する抵抗性を克服する可能性があり、これは動物腫瘍モデルによって裏付けられた（４６）（Zamarin et al., Sci Transl Med 6(226), 2014）。しかしながら、この抵抗性を克服するメカニズムは十分に理解されているとはとても言えない。
【００１６】
腫瘍免疫におけるＩ型ＩＦＮおよび細胞質ＤＮＡ感知経路
Ｉ型ＩＦＮは、宿主抗腫瘍免疫において重要な役割を果たす（４７）（Fuertes et al., Trends Immunol 34, 67-73 (2013)）。ＩＦＮＡＲ１−欠損マウスは、腫瘍細胞の移植後の腫瘍の進行に対しより感受性であり、自発的な腫瘍特異的Ｔ細胞プライミングもまたＩＦＮＡＲ１−欠損マウスにおいて欠如している（４８、４９）（Diamond et al., J Exp Med 208, 1989-2003 (2011)、Fuertes et al., J Exp Med 208, 2005-2016 (2011)）。より最近の研究は、細胞質ＤＮＡ感知経路が、抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞免疫の発生を導く、自然免疫による腫瘍由来ＤＮＡの感知において重要であることを示している（５０）（Woo et al., Immunity 41, 830-842 (2014)）。この経路はまた、放射線誘導抗腫瘍免疫においても役割を果たす（５１）（Deng et al., Immunity 41, 843-852 (2014)）。自発的抗腫瘍Ｔ細胞応答が癌患者において検出されるが、多くの患者において、最終的に、癌が宿主抗腫瘍免疫を克服してしまう。腫瘍免疫抑制性微小環境を改変する新規な戦略は、癌治療にとって有益であろう。
【００１７】
本発明者とその同僚は既に、宿主による腫瘍に対する免疫応答を改善する方向へのいくつかの段階に入っている。不活化ＭＶＡの腫瘍内（または全身性）送達が、Ｉ型ＩＦＮの誘導を含む、自然および適応の、細胞性免疫応答の活性化に起因する抗腫瘍免疫を誘導することと、この活性化が、腫瘍免疫の克服、および固形腫瘍の低減、さらには根絶を導くこととが示されている。参照によりその全体を組み入れる、２０１６年２月２５日出願され、２０１６年９月１５日にＷＯ２０１６／１４４５６４として公開された国際（ＰＣＴ）特許出願を参照のこと。さらに、同一の研究者のグループは、導入遺伝子を発現しないＭＶＡおよび／またはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内または全身の送達がまた、Ｉ型ＩＦＮの誘導を含む、同様の細胞性応答の活性化に起因する抗腫瘍免疫を誘導し、黒色腫のような固形腫瘍の低減、さらには根絶を導くことを示している。参照によりその全体を組み入れる、２０１６年４月１８日出願され、２０１６年１０月２０日にＷＯ２０１６／１６８８６２として公開された国際（ＰＣＴ）特許出願を参照のこと。それにもかかわらず、悪性腫瘍に罹患した対象の免疫系の能力を改善する努力は進行中である。
【発明の概要】
【００１８】
一態様において、本開示は、悪性固形腫瘍に罹患した対象の腫瘍細胞に送達すると腫瘍を治療するのに有効な量で、（ｉ）ヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦｌｔ３Ｌ）を保持するＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈＦｔｌ３Ｌ）、および（ｉｉ）ｈＦｌｔ３Ｌを保持するＭＶＡΔＥ３Ｌ（ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｔｌ３Ｌ）からなる群より選択される組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスを含む組成物に関する。関連する態様において、本開示は、悪性固形腫瘍に対する免疫療法薬としての使用に好適な、単離されたヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦｌｔ３Ｌ）を発現するよう改変された、ワクシニアビルレンス因子Ｅ３を欠失した組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａウイルス（ＭＶＡΔＥ３Ｌ）に関する。
いくつかの実施形態において、腫瘍の治療は、以下のうちの１つ以上によって顕在化する：腫瘍に対する免疫応答の対象における誘導、または腫瘍に対して進行中の免疫応答の対象における増強もしくは促進、腫瘍のサイズの低減、腫瘍の根絶、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍の転移の阻害、および転移性腫瘍の低減もしくは根絶。
【００１９】
より具体的な実施形態において、免疫応答の誘導、増強、または促進は、以下のうちの１つ以上を含む：
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍におけるＣＤ４５+細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の動員、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+炎症性単球とＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞の注射された腫瘍および遠隔腫瘍への流入、ならびに
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における、型ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を介した交差提示ＣＤ１０３+樹状細胞の活性化および移動、
異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞および交差防御の生成。
【００２０】
いくつかの実施形態において、組換えＭＶＡは、腫瘍抗原をコードまたは発現する核酸を保持していない。さらなる実施形態において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の賦形剤は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、ならびに上述のうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される。さらなる実施形態において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む。
一態様において、組成物は、第２の量の、ヒトＦｌｔ３Ｌをコードおよび発現する、チミジンキナーゼの欠失を伴う複製可能である組換え弱毒化ワクシニアウイルスをさらに含み、ここで第２の量は、誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する。別の態様において、組成物は、第３の量の不活化ＭＶＡをさらに含み、ここで第３の量は、誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本開示は、悪性固形腫瘍に罹患した対象を治療する方法に関し、方法は、腫瘍の細胞にＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬおよびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌならびにそれらの組み合わせの群より選択される組換えＭＶＡウイルスを送達し、それによって腫瘍を治療することを含む。一実施形態において、前記ウイルスの量は、以下のうちの１つ以上をもたらすのに有効である：対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するか、または腫瘍に対する免疫系によって進行中の免疫応答を増強もしくは促進する；腫瘍のサイズを低減する；腫瘍を根絶する；腫瘍の増殖を阻害する；腫瘍の転移を阻害する；および転移性腫瘍を低減または根絶する。いくつかの実施形態において、腫瘍に対する免疫応答は以下のうちの１つ以上を達成する。
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍におけるＣＤ４５+細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の動員、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-炎症性単球とＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞の注射された腫瘍および遠隔腫瘍への流入、ならびに
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における、型ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を介した交差提示ＣＤ１０３+樹状細胞の活性化および移動、
異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞および交差防御の生成。
さらなる実施形態において、上記ＭＶＡまたはＭＶＡＡＥ３Ｌは、腫瘍抗原をコードまたは発現する核酸を保持していない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、組換えＭＶＡは、腫瘍内注射もしくは静脈内注射、または、腫瘍内注射と静脈内注射の同時もしくは連続的組み合わせによって送達される。
いくつかの実施形態において、腫瘍は黒色腫または結腸癌または乳癌または前立腺癌である。
いくつかの実施形態において、１つの型の固形腫瘍に罹患した対象のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌによる治療は、無関係な型の腫瘍に対する防御を実証し、本開示の免疫療法薬が異なる起源の腫瘍を標的とする抗腫瘍活性を引き起こすことが実証された。
よりさらなる実施形態において、組換えＭＶＡの送達は、恩恵が持続する限り、または最大許容用量に達している限り、数週間、数カ月間、もしくは数年間、または無期限に継続する。いくつかの実施形態において、組換えＭＶＡの送達は、腫瘍内注射による。
いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
他の実施形態において、組換えＭＶＡは、約１０6〜１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内の、好ましくは約１０7〜約１０9プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内の、投与当たりの投与量で送達される。いくつかの実施形態において、送達される量は、全ての腫瘍細胞に感染するのに十分である。いくつかの実施形態において、送達は、月に１回から週に２回の範囲内の頻度で繰り返される。さらなる実施形態において、送達は週に１回繰り返される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、黒色腫は転移性黒色腫である。
いくつかの実施形態において、組換えＭＶＡは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌである。
別の態様において、本開示は対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはその両方の組み合わせからなる群より選択される、ある量の組換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を対象の腫瘍へと送達することを含み、以下の免疫学的効果のうちの少なくとも１つをもたらすのに有効な方法に関する：ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ４+エフェクターＴ細胞の増殖および活性化、
ＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍におけるＣＤ４５+細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の動員、
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+炎症性単球とＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞の注射された腫瘍および遠隔腫瘍への流入、ならびに
注射された腫瘍および遠隔腫瘍における、型ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を介した交差提示ＣＤ１０３+樹状細胞の活性化および移動、
異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞および交差防御の生成。
【００２４】
別の態様において、本開示は対象において固形悪性腫瘍を治療する方法であって、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するか、または腫瘍に対する上記対象の進行中の免疫応答を増強もしくは促進するのに有効な量で、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはそれらの組み合わせを対象の腫瘍細胞へと送達し、それによって以下のうちの１つ以上を達成することを含む方法に関する：腫瘍のサイズを低減する、腫瘍を根絶する、腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍の転移性増殖を阻害する、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する、または対象の生存期間を長引かせる。
さらに別の態様において、本開示は、対象において悪性腫瘍を治療する方法に関し、方法は、対象の免疫系が腫瘍に対する免疫応答を開始するように誘導するか、または腫瘍に対する上記対象の進行中の免疫応答を増強もしくは促進するのに有効な量で、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるウイルスを対象の腫瘍細胞へと送達することと、ならびに腫瘍内の免疫抑制性メカニズムを遮断するのに有効な第２の量で、免疫チェックポイント遮断剤または免疫チェックポイントアゴニストを補助的に対象に投与することとを含む。
【００２５】
一実施形態において、チェックポイント阻害剤またはチェックポイントアゴニストの投与は非経口経路によるものである。一実施形態において、送達は腫瘍内注射によるものであり、投与は静脈内経路によるものである。別の実施形態において、送達と投与の両方は、静脈内経路によるものである。いくつかの実施形態において、送達と投与の両方は、腫瘍内注射によるものである。
いくつかの実施形態において、補助的な投与はエフェクターＴ細胞応答を増強し、いくつかの実施形態において、補助的な投与はメモリーＴ細胞応答を増強する。いくつかの実施形態において、補助的な投与は顕著に生存期間を増加させ、いずれか単独の治療法と比較して、少なくとも、転移性腫瘍を含む腫瘍の増殖の阻害を達成する。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント遮断剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン−３）、Ｂ７−Ｈ３、およびＴＩＧＩＴ（ＩｇとＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体）に対する阻害抗体からなる群より選択され、免疫チェックポイントアゴニストは、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）に対するアゴニスト抗体、およびＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体からなる群より選択される。
【００２６】
一実施形態において、腫瘍は、原発性もしくは転移性の黒色腫であるか、または原発性もしくは転移性の結腸癌である。別の実施形態において、ウイルスが送達され、免疫チェックポイント遮断剤が投与され、各々が、間隔を隔てた時間間隔のそれ自体の投与スケジュールに従う。
一実施形態において、第１の用量のウイルスが最初に送達され、時間経過後に、第１の用量の免疫チェックポイント遮断剤が投与される。
さらなる実施形態において、送達と投与とが、全体的にみれば同一の期間中に並行して行われる。いくつかの実施形態において、ウイルスと免疫チェックポイント遮断剤の１つまたは両方が、恩恵が持続する限り、および最大許容用量に達しない限り、数週間、数カ月間、もしくは数年間、または無期限の期間中、それぞれ送達および投与される。
いくつかの実施形態において、ウイルスと免疫チェックポイント遮断剤は、同時に投与される。さらなる実施形態において、ウイルスと免疫チェックポイント遮断剤は、同一の組成物中で投与される。
いくつかの実施形態において、組換えＭＶＡと免疫チェックポイント遮断剤は、腫瘍内に送達される。さらなる実施形態において、組換えＭＶＡと免疫チェックポイント遮断剤は、連続的に投与される。
【００２７】
より具体的な実施形態において、方法は、ヒトＦｌｔ３Ｌをコードおよび発現する、チミジンキナーゼの欠失を伴う複製可能な組換え弱毒化ワクシニアウイルス、もしくは不活化ＭＶＡ、またはその両方を、それぞれ第２および第３の量で対象に投与することをさらに含み、上記第２もしくは第３の量、またはその両方は、誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する。
一態様において、本開示は、１）本開示による組成物を含む第１の構成要素と、
２）それぞれ第２および第３の量の、ヒトＦｌｔ３Ｌをコードおよび発現する、チミジンキナーゼの欠失を伴う複製可能な組換え弱毒化ワクシニアウイルス、および不活化ＭＶＡの１つまたは両方を含む第２の構成要素であって、上記第２の量もしくは第３の量または第２および第３の量の両方は、上記対象において誘導または増大または促進された免疫応答を増強するのに寄与する第２の構成要素とを含むキットに関する。
【００２８】
本方法の興味深い結果は、ウイルスの腫瘍内注射が、異なる固形腫瘍に対する抗腫瘍免疫をもたらすということである。
本開示において、本発明者らは、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ株またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ株のどちらかが癌免疫療法薬として使用できるかを探索した。実際、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が、腫瘍の根絶および抗腫瘍免疫の生成において、ＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを観察した。同様に、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が、腫瘍の根絶および抗腫瘍免疫の生成において、ＭＶＡよりも効果的である。したがって、治療選択肢として、改善された治療結果を達成するために、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌまたはその両方によって患者を治療することができる。
【００２９】
本明細書においてみられるＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬとＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの間の類似性の観点から、ｈＦｌｔ３Ｌを欠如するＭＶＡΔＥ３Ｌと比較してＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌについて観察された性質および利点がまた、ＭＶＡ単独と比較したＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌによって示されるということが予想される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プラスミドＤＮＡであるｐＣＢベクターとＭＶＡウイルスゲノムＤＮＡとの間の、チミジンキナーゼ（ＴＫ）座位における相同組換えの概略図である。ｐＣＢプラスミドは、対象の特定の遺伝子（ＳＧ）、この場合マウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）またはヒトＦｌｔ３Ｌ（ｈＦｌｔ３Ｌ）を、ワクシニア合成初期および後期プロモーター（Ｐｓｅ／ｌ）の制御下に挿入するのに使用された。ワクシニアＰ７．５プロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉのキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）が薬剤選択マーカーとして使用された。これら２つの発現カセットは、各々の側でＴＫ遺伝子の部分配列（ＴＫ−ＬおよびＴＫ−Ｒ）によって隣接されていた。ＳＧを欠如するプラスミドＤＮＡは、ベクターコントロールとして使用された。プラスミドＤＮＡと改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）またはＭＶＡΔＥ３Ｌ（Ｅ３Ｌ遺伝子の欠失を伴う）のゲノムＤＮＡとのＴＫ座位において起こる相同組換えは、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３ＬのゲノムＤＮＡのＴＫ座位へのＳＧおよびｇｐｔ発現カセットの挿入をもたらし、ＭＶＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを生成する。組換えウイルスは、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）、キサンチンおよびヒポキサンチンを含むｇｐｔ選択培地の存在下で濃縮され、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの混入していない適切な組換えウイルスが得られるまで薬剤選択培地の存在下で４〜５ラウンド、プラーク精製された。
【図２】組換えウイルスのＰＣＲ解析を示し、ＭＶＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含むＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ組換えウイルスの成功裏の生成を実証する。ウイルスゲノムのＤＮＡは、ＰＣＲによって解析され、導入遺伝子の挿入とＴＫの欠失を検証し、親ウイルス、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの混入がないことを確認した。挿入された導入遺伝子を含むＰＣＲ産物はシーケンシングされ、挿入された遺伝子が正しい配列を有することを確認した。
【図３Ａ】両側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルで、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を根絶する点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＦｌｔ３Ｌ挿入物を有さないＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）両側腫瘍移植モデルの概略図。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍移植の７〜８日後に、右側のより大きな腫瘍に対して２×１０7ｐｆｕのＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルス、またはＰＢＳモック注射コントロールを、腫瘍内注射した。腫瘍サイズが測定され、腫瘍は組換えウイルスまたはＰＢＳを週に２回注射された。マウスの生存をモニターした。
【図３Ｂ】両側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルで、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を根絶する点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＦｌｔ３Ｌ挿入物を有さないＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｂ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを注射後の日数に対する注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の容積。
【図３Ｃ】両側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルで、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を根絶する点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＦｌｔ３Ｌ挿入物を有さないＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｃ）ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＭＶＡΔＥ３Ｌ（ｎ＝９）、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝９）、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝９）で処理された担腫瘍マウスのカプランマイヤー生存曲線（*、ｐ＜０．０５；***、ｐ＜０．００１）。
【図３Ｄ】両側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルで、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を根絶する点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＦｌｔ３Ｌ挿入物を有さないＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｄ）致死用量のＭＣ３８結腸腺癌細胞（１×１０5）を皮下に再負荷されたナイーブマウス（黒丸、ｎ＝５）およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウス（黒い菱形、ｎ＝４）のカプランマイヤー生存曲線。
【図４Ａ−Ｂ】両側黒色腫モデルで、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ８+Ｔ細胞の増殖および活性化を誘導する点においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが効果的であることを実証する、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射後に取得されたデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、または陽性コントロールとしての熱不活化ＭＶＡ（Ｈｅａｔ−ＭＶＡ）によって様々に処理されたマウスの注射された腫瘍（右側プロット）および注射されていない腫瘍（左側プロット）におけるＣＤ８+グランザイムＢ+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｂ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるグランザイムＢを発現するＣＤ８+細胞の一連の代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図４Ｃ−Ｄ】両側黒色腫モデルで、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ８+Ｔ細胞の増殖および活性化を誘導する点においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが効果的であることを実証する、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射後に取得されたデータの一連のグラフ表示である。（Ｃ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって様々に処理されたマウスの注射された腫瘍（右側）および注射されていない腫瘍（左側）におけるＣＤ８+Ｋｉ−６７+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる（**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｄ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＫｉ−６７を発現するＣＤ８+細胞の一連の代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図５Ａ−Ｂ】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖および活性化を誘導する点においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが効果的であることを実証する、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射後に取得されたデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって処理されたマウスの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＣＤ４+グランザイムＢ+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、****、ｐ＜０．０００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｂ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるグランザイムＢを発現するＣＤ４+細胞の一連の代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図５Ｃ−Ｄ】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４+Ｔ細胞の増殖および活性化を誘導する点においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが効果的であることを実証する、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射後に取得されたデータの一連のグラフ表示である。（Ｃ）注射された腫瘍（右側プロット）および注射されていない腫瘍（左側プロット）におけるＣＤ４+Ｋｉ−６７+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる（**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｄ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＫｉ−６７を発現するＣＤ４+細胞の一連の代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図６Ａ−Ｂ】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４+ＦｏｘＰ３+制御性Ｔ細胞の低減を誘導する点においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが効果的であることを示す、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射後に取得されたデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって処理された両側マウスモデルの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＣＤ４+ＦｏｘＰ３+細胞のパーセンテージの２つのプロットからなる（**、ｐ＜０．０１、****、ｐ＜０．０００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｂ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４+細胞の一連の代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図７Ａ−Ｄ】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ４５+細胞およびＣＤ８+細胞の動員の点で効果的であり、ＣＤ８+／Ｔｒｅｇおよび通常型ＣＤ４+／Ｔｒｅｇの比率を増加させることを示す一連の棒グラフである。（Ａ、Ｂ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって処理されたマウスの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍１グラム当たりの腫瘍浸潤のＣＤ４５+細胞およびＣＤ８+細胞のそれぞれの絶対数の２つのプロット（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意でない）。（Ｃ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＣＤ８+／Ｔｒｅｇの比率（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意でない）。（Ｄ）注射された腫瘍および注射されていない腫瘍における通常型ＣＤ４+／Ｔｒｅｇの比率（*、ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意でない）。データは平均±ＳＥＭである（ＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。
【図８】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＦ４／８０+のＴＡＭおよびＣＤ２４+のＤＣのフローサイトメトリーのプロットの一連のグラフ表示である。ＴＡＭおよびＤＣは、ＣＤ４５+ＭＨＣ−ＩＩhiＬｙ６Ｃloである。それらは、ＣＤ２４とＦ４／８０発現パターンによってさらに分けられた。ＴＡＭはＦ４／８０ｈｉＣＤ２４loであり、ＣＤ２４+のＤＣｓは高レベルのＣＤ２４を発現する。
【図９Ａ−Ｂ】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を低減することを示す一連のグラフ表示である。（Ａ、Ｂ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって処理されたＷＴマウス、およびＰＢＳまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−Ｆｌｔ３Ｌによって処理されたＢａｔｆ３-/-マウスの、注射された腫瘍（Ｂ）および注射されていない腫瘍（Ａ）の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＴＡＭ細胞のパーセンテージ（**、ｐ＜０．０１、****、ｐ＜０．０００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＷＴマウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５、Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝２、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。
【図１０】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍におけるＣＤ１０３+のＤＣおよびＣＤ１１ｂ+のＤＣのフローサイトメトリーのプロットの一連のグラフ表示である。腫瘍関連ＣＤ２４+のＤＣは、それらのＣＤ１１ｂおよびＣＤ１０３の発現によってさらに分けることができる。ＣＤ１１ｂ+のＤＣは高レベルのＣＤ１１ｂを発現し、一方でＣＤ１０３+のＤＣは高レベルのＣＤ１０３を発現する。
【図１１Ａ−Ｄ】ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍においてＣＤ２４+、ＣＤ１０３+、およびＣＤ１１ｂ+の樹状細胞の低減、ならびに注射されていない腫瘍において、ＣＤ２４+、ＣＤ１０３+の樹状細胞の低減を導くことを示す、一連のグラフ表示である。（Ａ、Ｂ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって処理されたＷＴマウス、およびＰＢＳまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−Ｆｌｔ３Ｌによって処理されたＢａｔｆ３-/-マウスの、注射された腫瘍（Ｂ）および注射されていない腫瘍（Ａ）の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ２４+のＤＣのパーセンテージ（**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１、****、ｐ＜０．０００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＷＴマウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５、Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝２、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｃ、Ｄ）注射された腫瘍（Ｄ）および注射されていない腫瘍（Ｃ）の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージ（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１、****、ｐ＜０．０００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＷＴマウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５、Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝２、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。（Ｅ、Ｆ）注射された腫瘍（Ｆ）および注射されていない腫瘍（Ｅ）の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１１ｂ+のＤＣのパーセンテージ（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１）。データは平均±ＳＥＭである（ＷＴマウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝３、および各々のウイルス群に対してｎ＝５、Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝２、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。
【図１２】ウイルス処置後の、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍における骨髄細胞集団のフローサイトメトリーのプロットの一連のグラフ表示である。ＣＤ４５+腫瘍浸潤骨髄細胞は、それらのＣＤ１１ｂおよびＬｙ６Ｃの発現によってさらに分けられた。Ｌｙ６Ｃ+細胞は、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+炎症性単球、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞、およびＬｙ６ＣintＣＤ１１ｂ+細胞（おそらく好中球）を含むいくつかの集団にさらに分割することができる。
【図１３Ａ−Ｄ】注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がＬｙ６Ｃ+ＣＤ１１ｂ-細胞およびＬｙ６Ｃ+ＣＤ１１ｂ+細胞の流入を導くことを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ａ、Ｂ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡによって処理されたＷＴマウス、およびＰＢＳまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−Ｆｌｔ３Ｌによって処理されたＢａｔｆ３-/-マウスの、注射された腫瘍（Ｂ）および注射されていない腫瘍（Ａ）の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+細胞のパーセンテージ（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、****、ｐ＜０．０００１）。（Ｃ、Ｄ）注射された腫瘍（Ｂ）および注射されていない腫瘍（Ａ）の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞のパーセンテージ（*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１）。データは平均±ＳＥＭである（ＷＴマウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝４、および各々のウイルス群に対してｎ＝５、Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいてＰＢＳ群に対してｎ＝２、および各々のウイルス群に対してｎ＝５）。
【図１４Ａ】両側ＭＣ３８腫瘍移植モデルで、ウイルス注射された腫瘍および注射されていない（反対側の）腫瘍の両方の増殖を遅延させる点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）両側ＭＣ３８腫瘍移植モデルで、ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを注射後の日数に対する注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の容積の１２のプロットからなる。上述のように、ウイルスは右側のより大きな腫瘍へのみ注射した。
【図１４Ｂ】両側ＭＣ３８腫瘍移植モデルで、ウイルス注射された腫瘍および注射されていない（反対側の）腫瘍の両方の増殖を遅延させる点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｂ）ＰＢＳ（ｎ＝１０）、ＭＶＡΔＥ３Ｌ（ｎ＝１０）、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝１０）で処理された担ＭＣ３８腫瘍マウスのカプランマイヤー生存曲線（**、ｐ＜０．０１；****、ｐ＜０．０００１）。
【図１５Ａ】４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）両側移植モデルにおける、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の一連のグラフ表示を示す。４Ｔ１細胞（２．５×１０5）をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側の剃毛した皮膚へと皮下移植し、左側に（５×１０4）の細胞を移植した。移植後５日目において、右側の腫瘍（直径約３ｍｍ）に、週に２回、ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）を注射した。（Ａ）両側４Ｔ１腫瘍移植モデルにおける、ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスを注射後の日数に対するそれぞれの腫瘍容積（注射されたおよび注射されていない）の一連のグラフである。
【図１５Ｂ−Ｄ】４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）両側移植モデルにおける、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の一連のグラフ表示を示す。４Ｔ１細胞（２．５×１０5）をＢＡＬＢ／ｃマウスの右側の剃毛した皮膚へと皮下移植し、左側に（５×１０4）の細胞を移植した。移植後５日目において、右側の腫瘍（直径約３ｍｍ）に、週に２回、ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）を注射した。（Ｂ、Ｃ）最初の注射後１８日目のそれぞれの腫瘍容積（注射されたおよび注射されていない）のグラフである（ＰＢＳに対してｎ＝５およびＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対してｎ＝１０、****、Ｐ＜０．０００１）。（Ｄ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで処理されたマウスのカプランマイヤー生存曲線。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した（ＰＢＳに対してｎ＝５およびＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対してｎ＝１０、***、Ｐ＜０．００１）。
【図１６Ａ−Ｄ】ＷＴのＣ５７Ｂ／６およびＳＴＩＮＧGt/Gtマウスの前立腺癌ＴＲＡＭＰ−Ｃ２片側移植モデルにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の一連のグラフ表示を示す。（Ａ〜Ｄ）ＷＴまたはＳＴＩＮＧGt/Gtマウスにおける、ＰＢＳまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの注射後の日数に対するそれぞれの腫瘍容積の一連のグラフである。
【図１６Ｅ−Ｆ】ＷＴのＣ５７Ｂ／６およびＳＴＩＮＧGt/Gtマウスの前立腺癌ＴＲＡＭＰ−Ｃ２片側移植モデルにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の一連のグラフ表示を示す。（Ｅ）ウイルスによる最初の注射の日におけるそれぞれの最初の腫瘍容積のグラフである（ＷＴマウスにおいて、ＰＢＳに対してｎ＝１０およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対してｎ＝１０、ＳＴＩＮＧGt/GtマウスにおいてＰＢＳに対してｎ＝７およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対してｎ＝１０、*、Ｐ＜０．０５）。（Ｆ）最初の注射後２４日目のそれぞれの腫瘍容積のグラフである。（ＷＴマウスにおいて、ＰＢＳに対してｎ＝１０およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対してｎ＝１０、ＳＴＩＮＧGt/GtマウスにおいてＰＢＳに対してｎ＝７およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対してｎ＝１０、*、Ｐ＜０．０５、****、Ｐ＜０．０００１）
【図１７Ａ】両側Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫移植モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延させることまたは腫瘍を根絶することに対して、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の組み合わせが効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）両側Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫移植モデルにおける、ＰＢＳ、またはＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを注射後の日数に対する注射された腫瘍および反対側の注射されていない腫瘍の容積。さらに、図１７（Ａ〜Ｃ）は、Ｂ１６−Ｆ１０両側移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達との組み合わせが、全体の応答性および治癒率を上昇させることを示す。
【図１７Ｂ】両側Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫移植モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延させることまたは腫瘍を根絶することに対して、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の組み合わせが効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｂ）両側Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫移植モデルにおける、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の腹腔内送達の存在下でのＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射後の日数に対する注射された腫瘍および反対側の注射されていない腫瘍の容積。さらに、図１７（Ａ〜Ｃ）は、Ｂ１６−Ｆ１０両側移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達との組み合わせが、全体の応答性および治癒率を上昇させることを示す。
【図１７Ｃ】両側Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫移植モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延させることまたは腫瘍を根絶することに対して、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の組み合わせが効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｃ）ＰＢＳ（ｎ＝５）、またはＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝９）で処理された担Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍マウスのカプランマイヤー生存曲線（***、ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ＰＢＳ（ｎ＝５）、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝８）、ＭＶＡＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋アイソタイプコントロール（ｎ＝９）、ＭＶＡＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＣＴＬＡ４抗体（ｎ＝９）、ＭＶＡＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ１抗体（ｎ＝９）、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ｎ＝８）で処理された担腫瘍マウスのカプランマイヤー生存曲線（***、ｐ＜０．００１）。さらに、図１７（Ａ〜Ｃ）は、Ｂ１６−Ｆ１０両側移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達との組み合わせが、全体の応答性および治癒率を上昇させることを示す。
【図１７Ｄ】両側Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫移植モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延させることまたは腫瘍を根絶することに対して、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の組み合わせが効果的であることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ｄ）致死用量のＭＣ３８結腸腺癌細胞（１×１０5）を皮下に再負荷されたナイーブマウス（ｎ＝５）、およびＭＶＡＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＣＴＬＡ４抗体（ｎ＝２）、ＭＶＡＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ１抗体（ｎ＝３）、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ｎ＝４）で処理された生存マウスのカプランマイヤー生存曲線。
【図１８Ａ−Ｂ】ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が自家腫瘍および異種腫瘍に対する抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞免疫の生成を導き、それが抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下で増強されることを示すデータの一連のグラフ表示である。（Ａ）三連でのＥＬＩＳＰＯＴの走査画像である。３つのナイーブマウスの脾臓より単離したプールされたＣＤ８+Ｔ細胞を陰性コントロールとして使用した（ナイーブ）。抗ＣＴＬＡ−４（−Ａｂ）を伴わないＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスの３つの脾臓より単離したプールされたＣＤ８+Ｔ細胞は、放射線照射されたＢ１６−Ｆ１０とＭＣ３８の両方に対して反応性を示した。抗ＣＴＬＡ−４（＋αＣＴ）を伴ったＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスの３つの脾臓より単離したプールされたＣＤ８+Ｔ細胞は、放射線照射されたＢ１６−Ｆ１０とＭＣ３８の両方に対してウイルス処理マウスからのものよりも強い反応性を示した。（Ｂ）（Ａ）に記載される条件下での放射線照射されたＢ１６−Ｆ１０またはＭＣ３８に対する陽性スポットのグラフである。（**、ｐ＜０．０１、****、ｐ＜０．０００１）。
【図１９】両側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルにおいて、熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射が、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、Ｉ型ＩＦＮならびに炎症性サイトカインおよびケモカインのＭＶＡよりも高いレベルの遺伝子発現を誘導することを示すデータの一連のグラフ表示である。ＰＢＳ、ＭＶＡ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡのいずれかで処理された、注射されたＢ１６−Ｆ１０腫瘍および注射されていないＢ１６−Ｆ１０腫瘍におけるＩｆｎｂ、Ｉｌ６、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ９、およびＣｘｃｌ１０遺伝子発現の定量的リアルタイムＰＣＲ解析のグラフがここで示される。
【図２０Ａ】熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射が、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）における抗黒色腫ＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフ表示である。（Ａ）ＰＢＳまたは熱不活化ＭＶＡのいずれかで処理されたＢ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおける腫瘍流入領域リンパ節におけるＴＲＰ−２テトラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞の一連の代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図２０Ｂ】熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射が、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）における抗黒色腫ＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフ表示である。（Ｂ）ＰＢＳまたはＨｅａｔ−ＭＶＡのいずれかで処理されたＢ１６−Ｆ１０黒色腫を有するＷＴおよびＢａｔｆ３-/-マウスにおけるＴＲＰ−２テトラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージのグラフである。各々の試料は、同一の条件で処理された２〜３匹のマウスからプールされたリンパ節に由来した。（*、ｐ＜０．０５）。
【図２１Ａ】片側腫瘍移植モデルにおいて大きく確立されたＢ１６−ＯＶＡ黒色腫の治療においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が効果的であることを示す一連のグラフ表示である。（Ａ）大きく確立されたＢ１６−ＯＶＡモデルを伴う片側腫瘍移植モデルの概略図である。Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞（５×１０5細胞）を、Ｃ５７Ｂ／６マウスの右側に皮下移植した。腫瘍移植の８〜９日後、マウスに、２×１０7ｐｆｕのＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、またはＰＢＳモックコントロールを１週間に２回腫瘍内注射した。腫瘍サイズを測定し、マウスの生存をモニターした。
【図２１Ｂ】片側腫瘍移植モデルにおいて大きく確立されたＢ１６−ＯＶＡ黒色腫の治療においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が効果的であることを示す一連のグラフ表示である。（Ｂ）ＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ、またはポリ（Ｉ：Ｃ）の注射後の日数に対する注射された腫瘍の容積。
【図２１Ｃ−Ｄ】片側腫瘍移植モデルにおいて大きく確立されたＢ１６−ＯＶＡ黒色腫の治療においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が効果的であることを示す一連のグラフ表示である。（Ｃ）ウイルスまたはポリ（Ｉ：Ｃ）を最初に注射した日のそれぞれの最初の腫瘍容積のグラフである（ｎ＝１０）。（Ｄ）腫瘍内でＰＢＳ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ、またはポリ（Ｉ：Ｃ）で処理された担腫瘍マウスのカプランマイヤー生存曲線である（ｎ＝１０、****、ｐ＜０．０００１）。
【図２２Ａ】熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射と免疫チェックポイント抗体の全身性送達との組み合わせが、大きく確立された黒色腫片側移植モデルにおける抗腫瘍効果を改善することを示す一連のグラフ表示である。（Ａ）大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０モデルを伴う片側腫瘍移植モデルの概略図である。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０5細胞）を、Ｃ５７Ｂ／６マウスの右側に皮下移植した。腫瘍移植の８〜９日後、マウスに、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の腹腔内送達の存在下または非存在下で、２×１０7ｐｆｕのＨｅａｔ−ＭＶＡを１週間に２回腫瘍内注射した。腫瘍サイズを測定し、マウスの生存をモニターした。
【図２２Ｂ】熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射と免疫チェックポイント抗体の全身性送達との組み合わせが、大きく確立された黒色腫片側移植モデルにおける抗腫瘍効果を改善することを示す一連のグラフ表示である。（Ｂ）アイソタイプコントロール、または抗ＣＴＬＡ−４、または抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１の存在下でのＰＢＳ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡの注射後の日数に対する注射された腫瘍の容積。
【図２２Ｃ−Ｄ】熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射と免疫チェックポイント抗体の全身性送達との組み合わせが、大きく確立された黒色腫片側移植モデルにおける抗腫瘍効果を改善することを示す一連のグラフ表示である。（Ｃ）第１の処理の前のそれぞれの最初の腫瘍容積のグラフである。（ｎ＝１０）（Ｄ）アイソタイプコントロール、または抗ＣＴＬＡ−４、または抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１の存在下でＰＢＳ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡで処理された担腫瘍マウスのカプランマイヤー生存曲線である（ｎ＝１０、*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、****、ｐ＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本発明で使用されるとき、以下の用語は、文脈が他を明確に示さない限り、以下のそれらに帰属する意味を有するものとする。
「癌」は、制御不能な細胞増殖を特徴とするヒトおよび動物の疾患のクラスを指す。他に明示的に示されない限り、用語「癌」は、用語「腫瘍」、「悪性腫瘍」、「過剰増殖」、および「新生物」と交換可能に本明細書で使用することができ、用語「癌細胞」は、用語「腫瘍細胞」、「悪性腫瘍細胞」、「過剰増殖細胞」、および「新生物細胞」と交換可能である。
「黒色腫」は、メラニンを産生可能な細胞を起源とする悪性新生物を指す。用語、黒色腫は、「悪性黒色腫」と同義である。黒色腫は、患者のリンパ節、皮膚、肝臓、肺、および脳の組織を含む広範囲に転移する。
【００３２】
「固形腫瘍」は、全ての新生物細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指し、リンパ腫、白血病、および多発性骨髄腫のような血液癌を除く。固形腫瘍の例は、軟部組織の肉腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍および他の骨腫瘍（例えば、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、脳／中枢神経腫瘍（例えば、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、小児腫瘍、例えば非定型奇形腫様／横紋筋様腫瘍、胚細胞腫瘍、胚芽腫、上衣腫）、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫を含むがこれらに限定されない。本開示の組成物および方法が有用であろう最も一般的な固形腫瘍のいくつかは、頭頸部癌、直腸腺癌、神経膠腫、髄芽腫、尿路上皮癌、膵臓腺癌、子宮の癌（例えば、子宮内膜癌、卵管癌）、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺腺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌および腺癌）、小細胞肺癌、黒色腫、乳癌、非浸潤性乳管癌、腎細胞癌、および肝細胞癌、副腎腫瘍（例えば、副腎皮質癌）、食道腫瘍、眼腫瘍（例えば、黒色腫、網膜芽腫）、胆嚢腫瘍、胃腸腫瘍、ウィルムス腫瘍、心臓腫瘍、頭頚部腫瘍、喉頭および下咽頭腫瘍、口腔腫瘍（例えば、口唇腫瘍、口腔腫瘍、唾液腺腫瘍）、鼻咽頭腫瘍、神経芽細胞腫、腹膜腫瘍、下垂体部腫瘍、カポジ肉腫、小腸腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、甲状腺腫瘍、副甲状腺腫瘍、膣腫瘍、ならびに上記の任意のものの転移を含む。
【００３３】
「転移」は、癌の原発部位から生体内の隣接する組織または遠位の位置への拡散を指す。癌細胞（癌幹細胞を含む）は、原発腫瘍から分離して、リンパ管および血管へと浸透し、血流を介して循環して、生体内のどこかの正常組織内で増殖することができる。転移は、原発腫瘍から分離し、血流またはリンパ液を介して移動し、遠位部位でとどまる、癌細胞（または癌幹細胞）に付随する連続的なプロセスである。別の部位にあるとき、癌細胞は血管またはリンパ壁を通って再浸透し、増殖を続け、最終的に新しい腫瘍（転移性腫瘍）を形成する。いくつかの実施形態において、この新しい腫瘍は、転移性（または二次）腫瘍と呼ぶ。
【００３４】
「免疫応答」は、癌性細胞、転移性腫瘍細胞などへの選択的障害、それらの破壊、またはそれらのヒト体内からの排除を生じる、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上述の細胞または肝臓によって産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）のうちの１つ以上の作用を指す。免疫応答は、例えば、細胞、すなわちＴ細胞の機能の改変（調節、例えば顕著な増強、刺激、活性化、減衰、または阻害）である、Ｔ細胞応答を含んでもよい。Ｔ細胞応答は、特定の型のＴ細胞、またはＴ細胞の亜集団、例えば、エフェクターＣＤ４+、ＣＤ４+ヘルパー、エフェクター、ＣＤ８+、ＣＤ８+細胞傷害性、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の、生成、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）もしくは増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、または刺激を含んでもよい。そのようなＴ細胞亜集団は、細胞受容体または細胞表面分子（例えば、ＣＤ、または分化抗原群分子）の１つ以上を検出することによって同定できる。Ｔ細胞応答はまた、他の細胞の分化または増殖に影響を及ぼす可溶性メディエーターなどの細胞因子（例えばサイトカイン、リンホカイン、サイトカイン結合タンパク質、またはインターロイキン）の変更された発現（統計学的に有意な増加または低減）をも含んでもよい。例えば、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α／β）は、自然免疫の極めて重要な調節因子である（５２）（Huber et al. Immunology 132(4):466-474 (2011)）。動物およびヒトの研究は、抗原認識および抗腫瘍免疫応答の初期段階の間におけるＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方の運命に直接影響をもたらすＩＦＮ−α／βの役割を示している。Ｉ型ＩＦＮは、樹状細胞の活性化に対する応答において誘導され、この樹状細胞は自然免疫系の番人である。免疫応答はまた、体液性（抗体）応答をも含んでもよい。
【００３５】
「腫瘍免疫」は、それにより腫瘍が免疫系による認識および排除を回避する１つ以上のプロセスを指す。したがって、治療の構想として、そのような回避が弱められるかまたは排除され、腫瘍が免疫系によって認識され攻撃されるとき（後者は本明細書において「抗腫瘍免疫」と呼ぶ）、腫瘍免疫は「治療」される。腫瘍認識の例は、腫瘍結合であり、腫瘍攻撃の例は腫瘍低減（数、サイズまたはその両方）および腫瘍排除である。
「Ｔ細胞」は、様々な細胞媒介性適応免疫応答に参加する胸腺由来リンパ球を指す。
「ヘルパーＴ細胞」は、ＣＤ４+Ｔ細胞を指し、ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子へと結合した抗原を認識する。少なくとも２つの型のヘルパーＴＥ細胞、Ｔｈ１およびＴｈ２が存在し、それらは異なるサイトカインを産生する。
【００３６】
「細胞傷害性Ｔ細胞」は、その表面に通常ＣＤ８分子マーカーを有し（ＣＤ８+）し、その表面に特異的抗原分子を有する標的細胞を破壊することによって、細胞媒介性免疫において機能するＴ細胞を指す。細胞傷害性Ｔ細胞はまた、パーフォリンが形成した孔を介して標的細胞に侵入してアポトーシス（細胞死）を誘導することができるセリンプロテアーゼであるグランザイムを放出する。グランザイムは、細胞傷害性表現型のマーカーとしての役割を果たす。細胞傷害性Ｔ細胞の他の名称は、ＣＴＬ、細胞溶解性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔリンパ球、キラーＴ細胞、またはキラーＴリンパ球を含む。細胞傷害性Ｔ細胞の標的はまた、ウイルス感染細胞、細菌もしくは原虫寄生虫の感染細胞、または癌細胞を含み得る。多くの細胞傷害性Ｔ細胞は、それらの細胞表面に存在するタンパク質ＣＤ８を有する。ＣＤ８はクラスＩ  ＭＨＣ分子の一部に引きつけられる。典型的には、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８+細胞である。
「腫瘍浸潤白血球」は、循環（血液またはリンパ液）に存在するか、またはさもなくばそこを去った、および腫瘍に移動した、癌（黒色腫など）に罹患した対象の白血球を指す。
【００３７】
「免疫チェックポイント阻害剤」、または「免疫チェックポイント遮断剤」、または「免疫チェックポイント遮断阻害剤」は、チェックポイントタンパク質の１つ以上の活性を、完全にまたは部分的に、低減、阻害、干渉、または調節する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化または機能を調節する。チェックポイントタンパク質は、ＣＤ２８受容体ファミリーメンバー、ＣＴＬＡ−４ならびにそのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６、ＰＤ−１ならびにそのリガンドＰＤＬ１およびＰＤＬ２、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＩＩ  ＤＬＢＣＬ、ＢＴＬＡ、または上述のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない（５３）。本明細書における使用が意図される非限定的な例は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８０、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
治療物質または組成物の投与の文脈において使用するとき、「非経口」は、消化管を介する投与以外の任意の投与経路を含む。本明細書に開示される方法に特に関連するのは、静脈内（例えば肝臓送達のための関門脈を介するものを含む）、腫瘍内または髄腔内投与である。
【００３８】
「抗体」は、抗原に結合する免疫グロブリン分子、またはそのような分子の抗原結合フラグメントを指す。したがって、抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、および無傷の免疫グロブリンの免疫反応性（抗原結合）フラグメントまたは一部であり得る。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト組換え抗体、ならびに二重特異性および三重特異性抗体を含む様々な形態で存在してよい。
【００３９】
「腫瘍溶解性ウイルス」は、癌細胞に優先的に感染し、そのような細胞内で複製し、その複製プロセスを通じて癌細胞の溶解を誘導するウイルスを指す。天然に発生する腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例は、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ならびに腫瘍選択的であるよう操作された、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、および単純ヘルペスウイルスのようなウイルスを含む（例えばNemunaitis, J. Invest New Drugs. 17(4):375-86 (1999); Kirn, DH et al. Nat Rev Cancer. 9(1):64-71(2009); Kirn et al. Nat. Med. 7:781 (2001); Coffey et al. Science 282:1332(1998)を参照）（８、５４〜５６）。ワクシニアウイルスは多くの型の細胞に感染するが、腫瘍細胞が複製に助力する代謝産物を有し、また複製に助力するある経路の活性化を示し、またウイルス複製を助力する自然免疫系を回避する環境を作り出すという事実によって、腫瘍細胞内で優先的に複製する。本開示の文脈において、ＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌは、それらが元来、腫瘍細胞内部で複製してアポトーシスを引き起こすことによって、抗腫瘍効果をもたらさないので、腫瘍溶解性ウイルスの定義に合致しない。（それらのウイルスが腫瘍抗原を発現しないので、ワクチンの古典的な定義にも合致しない。しかしながら、それらが腫瘍に対する宿主の免疫応答を促進および増強する役割を果たすので、それらはアジュバントに類似する免疫刺激性分子として作用するといえる。）
【００４０】
「ＭＶＡ」は、「改変ワクシニアＡｎｋａｒａ」を意味し、Ａｎｋａｒａ株に由来し、ワクチンおよびワクチンアジュバントとしての使用のために開発されたワクシニアの高度弱毒化株を指す。元のＭＶＡは、ニワトリ胚細胞を介した連続的継代によって野生型Ａｎｋａｒａ株から単離され、このように処理されることによって、霊長類（ヒトを含む）細胞において効率的に複製するその能力を含む、約１５％の野生型ワクシニアゲノムを欠失する（５７）（Mayr et al., Zentralbl Bakteriol B 167, 375-390 (1978)）。天然痘ワクチン接種株ＭＶＡ：マーカー、遺伝的構造、衰弱した防御機構を有する生物内での非経口ワクチン接種および挙動によって得られた経験。ＭＶＡは、感染性疾患または腫瘍に対する遺伝子またはワクチン接種の送達のための組換えベクターとしての開発の適切な候補と考えられている（５８）（Verheust et al., Vaccine 30(16), 2623-2632 (2012)）。ＭＶＡは、長さ１７８ｋｂのゲノムを有し、配列は（５９）（Antoine et al., Virol. 244(2): 365-396 (1998)）において最初に開示された。配列はまた、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕ９４８４８．１にも開示される。医療グレードのＭＶＡは、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ  Ａ／Ｓ  Ｋｖｉｓｔｇａａｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋより商業的および公的に入手可能である。さらに、ＭＶＡは、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤおよびＣＭＣＮ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅｓ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅからも入手可能である。
「ＭＶＡΔＥ３Ｌ」は、機能性Ｅ３Ｌ遺伝子を欠失し、感染性であるが複製性でなく、宿主の免疫系を回避する能力をさらに損なっている、ＭＶＡの欠失変異体を意味する。それは、腫瘍またはウイルスの抗原を移入するためのワクチンベクター（またはその他によって）として使用されている。この変異ＭＶＡ  Ｅ３Ｌノックアウトおよびその調製は、例えば米国特許第７，０４９，１４５号に記載されている。
【００４１】
「対象」とは、癌に罹患し得える、そしてそのように罹患した場合に治療の必要がある、任意の動物（哺乳動物、ヒトまたはその他）の患者を意味する。
本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、動物またはヒトに投与されるとき、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応をもたらさない物質および組成物を指す。本明細書において使用されるとき、用語は、本発明の治療物質と不適切で良くない様式で反応しない限り、全ての不活性、非毒性、液体または固体の充填剤または希釈剤、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、保存剤など、例えば、液体医薬的担体、例えば、滅菌水、生理食塩水、糖溶液、Ｔｒｉｓバッファー、エタノールおよび／または特定の油を含む。
【００４２】
「治療有効量」または「有効量」は、１回以上の投与でかつ十分な期間投与された場合に、疾患の軽減、治癒、または緩和において所望の生物学的結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。本開示において、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌのそれぞれの有効量は、（好適な期間および好適な頻度で投与され、）癌細胞の数を低減するか、または腫瘍サイズを低減するかもしくは腫瘍を根絶するか、または末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、遅延もしくは停止する）するか、転移性増殖を阻害（すなわち、遅延もしくは停止する）するか、腫瘍増殖を阻害（安定化もしくは止める）するか、腫瘍の治療を可能にするか、および／または腫瘍に対する免疫応答を誘導および促進する量である。任意の個別の場合における適切な治療量は、当業者によって本開示に照らして日常的な実験を用いて決定され得る。そのような決定は、インビトロで効果的であると見出された量および動物で効果的であると見出された量から開始するであろう。治療有効量は、培養中の細胞に恩恵を与えることが見出された濃度または複数の濃度に基づいて最初に決定されるであろう。有効量は、細胞培養におけるデータから推定でき、本明細書に詳述されるような要因に基づいて上方または下方に調整できる。ウイルス構築物の有効量は一般的に、約１０5〜約１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲内であるが、より少ないかまたはより多い用量も投与され得る。好ましい実施形態において、投与量は約１０6〜１０9ｐｆｕである。典型的には、単位用量は、１〜１０ｍｌの範囲内の容量で投与される。ウイルス粒子に対するｐｆｕの同等量は、用いる特定のｐｆｕ力価測定法に従って変動し得る。一般的にｐｆｕは、約５〜１００ウイルス粒子と同等量である。ｈＦｌｔ３Ｌ導入遺伝子を保持するウイルスの治療有効量を、１つ以上の用量に分割して、所定の期間、所定の投与頻度で投与できる。例えば、本開示によるｈＦｌｔ３Ｌを保持するウイルスの治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重、および全般的状態、ならびに特定の対象において特定の癌に対する所望の免疫応答を引き起こすウイルス構築物の能力に従って変動し得る。
【００４３】
本明細書に開示されるウイルスに基づく免疫刺激剤を特に参照して、「治療有効量」または「有効量」は、腫瘍細胞増殖を低減、阻害、または廃止して、それによって腫瘍を低減または根絶するのに十分な、またはインビトロ、エクスビボ、または対象においてのいずれかで、転移性拡散を阻害、低減、または廃止するのに十分な、または場合によっては転移性拡散の低減、阻害および／もしくは廃止のうちの１つ以上を最終的にもたらす腫瘍に対する免疫応答を引き起こすおよび促進するのに十分な、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む組成物の量を指す。腫瘍細胞増殖の低減、阻害、または根絶は、ネクローシス、アポトーシス、もしくは免疫応答、または上述のうちの２つ以上の組み合わせの結果であり得る（しかしながら、アポトーシスの促進は、例えば、腫瘍溶解性ウイルスで観察されるものと同一の因子によるものでなくてよい）。治療有効である量は、組成物において使用される特定のウイルス、治療される対象の年齢および状態、腫瘍形成の度合い、他の治療法の有無などのような要因に応じて変動し得る。同様に、投与される組成物の投与量およびその投与頻度は、活性成分の能力、投与されたときのその活性の継続期間、投与経路、対象のサイズ、年齢、性別、および体調、副作用のリスク、ならびに医師の判断のような様々な要因に依存するであろう。組成物は、注射可能な溶液などの様々な剤形で投与される。
【００４４】
免疫チェックポイント阻害剤との併用療法を特に参照して、免疫チェックポイント遮断剤の「治療有効量」は、腫瘍微小環境における免疫抑制を反転または低減し、治療される対象の宿主免疫を活性化または増強するのに十分な免疫チェックポイント遮断剤の量を意味するものとする。ＣＤ２８阻害剤に対する阻害抗体、例えば、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）（例えばイピリムマブ）、抗ＰＤ−１（プログラム細胞死１）阻害抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ランブロリズマブ）、および抗ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）阻害抗体（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＳＢ００１０７１８０）、ならびにＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）に対する阻害抗体、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン−３）、Ｂ７−Ｈ３、およびＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）に対する阻害抗体を含む、承認されるか、臨床治験中であるか、または他の未だ開発中であるいくつかの免疫チェックポイント遮断剤が存在する。上述の投与量範囲は、いくつかの投与臨床治験が完了しており、当業者の間で知られているかまたは容易であり、他の剤への推測を可能にしている。
【００４５】
好ましくは、腫瘍は特定のチェックポイントを発現するが、本発明の文脈において、免疫チェックポイント遮断剤が腫瘍内で腫瘍細胞、間質細胞、および腫瘍浸潤免疫細胞によって引き起こされる免疫抑制メカニズムをより一般的に遮断するのでこれは厳密に必要ではない。
例えば、ＣＴＬＡ４阻害剤イピリムマブは、黒色腫の手術後にアジュバント療法として投与されるとき、３週間ごとに全部で４回の投与のために、３ｍｇ／ｋｇの総輸液量で９０分間にわたって１〜２ｍｇ／ｍＬで投与される。この療法はしばしば、重篤で生命を脅かしさえする、免疫媒介性副作用を伴い、これは投与できる許容用量および累積量を制限する。ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを補助的に投与するとき、イピリムマブの用量および／または累積量を低減することができるであることは理解される。特に、以下に叙述される実験結果に照らして、上述のＭＶＡウイルスの１つまたは両方と共に補助的に腫瘍に対して直接的に投与される場合、ＣＴＬＡ４阻害剤の用量をさらに低減できるであろうことは理解される。したがって、イピリムマブに関して上に提示される量は、補助的投与について患者にもたらされるべき特定の投与量および累積量を決定するための開始点となるであろうが、最適量を決定するための投与研究は必要であろう。
【００４６】
ペンブロリズマブは、２５ｍｇ／ｍＬに希釈された黒色腫におけるアジュバント療法としての投与のために処方される。ペンブロリズマブは、３週間ごとに３０分間にわたり２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。同様に、これは、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌとの補助的投与における投与量および投与を決定するための開始点となるであろう。
ニボルマブは、２週間ごとの６０分間にわたる静脈内注入として３ｍｇ／ｋｇでの投与のために処方され、同様に、ＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌのウイルスおよびウイルス構築物と概して同一の範囲内の量での本明細書に記載されるＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの補助的である、またはＨｅａｔ−ＭＶＡ（不活化ＭＶＡ、不活化は熱導入またはＵＶ照射導入であり得る）の補助的である、これと他のチェックポイント阻害剤の投与量および投与レジメンを決定する開始点を提示する。
アゴニスト抗体のような免疫刺激剤は、癌のための免疫療法としても探索されている。例えば、抗ＩＣＯＳ抗体は、ＩＣＯＳの細胞外ドメインに結合し、ＩＣＯＳシグナル伝達およびＴ細胞の活性化をもたらす。抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０に結合し、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を増強してＴ細胞活性化、増殖、および生存をもたらす。他の例は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体を含む。これらの剤の全ては臨床治験の様々な段階にある。
免疫刺激アゴニスト抗体は、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（または不活化ＭＶＡ）の腫瘍内注射と組み合わせて全身性で使用できる。代替的に、免疫刺激アゴニスト抗体は、同時または連続的のいずれかでの腫瘍内送達を介してＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌと補助的に使用できる。
【００４７】
「薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤」または「薬学的に許容可能な賦形剤」は、限定なしに、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。生物学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。賦形剤のさらなる詳細は以下に提示される。抗菌剤、例えば抗真菌剤のような補助的な活性成分もまた組成物に組み入れることができる。
「送達する」は、これが腫瘍に対する（腫瘍内）局所投与であっても、例えば静脈内経路によってであっても、本開示のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（または、特に大きく確立された腫瘍に対して免疫チェックポイント遮断阻害剤との補助的投与におけるＨｅａｔ−ＭＶＡ）を腫瘍微小環境に配置することに関連して使用される。用語は、腫瘍自体へと到達するＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに焦点を当てる。
【００４８】
本明細書における「補助的投与」は、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌと組み合わせる第２の治療様式、例えば、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌと時間的に近接して投与される免疫チェックポイント遮断剤を指す。例えば、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１阻害剤、および／またはＣＴＬＡ４阻害剤（より具体的な実施形態において、抗体）を、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌと同時に（ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが、上述されるように腫瘍内または全身に投与されるとき、静脈内または腫瘍内注射によって）、またはＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ投与の前後において、投与することができる。ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ投与と免疫チェックポイント遮断剤が１〜７日の間隔で、または最大３週間もの間隔で投与される場合、これはなお本明細書に述べられる「時間的に近接して」の範囲内であり、したがって、そのような投与は「補助的」として的確であろう。
【００４９】
「ベクター」は、適切な制御因子が伴うとき複製可能であり、細胞間で遺伝子配列を移すことができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝的因子を含む。したがって、本用語は、クローニング、発現ビヒクル、およびウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置するベクターを意図する。「プロモーター」は、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入され、遺伝子の特異的な転写の開始に必要とされるＤＮＡ配列を指す。語句「作動可能に位置する」、「作動可能に連結する」、「制御下にある」、または「転写制御下にある」は、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御する核酸に関連して、プロモーターが正しい位置および方向にあることを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、配列をコードする核酸の一部または全部が転写することができる核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を意味する。いくつかの実施形態において、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または阻害性ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を産生するための核酸の転写を含む。
本開示において、本発明者らは、Ｆｌｔ３Ｌを腫瘍微小環境に送達してＣＤ１０３+／ＣＤ８α樹状細胞（ＤＣ）を含む免疫細胞の動員、分化、および機能を促進することを目的として、ヒトＦｌｔ３Ｌを発現する組換えＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌウイルスを作製した。以下に記載される特定の実験において、導入遺伝子が、ＴＫ遺伝子を分割してそれを抹消してＴＫ座位に挿入されたが、非複製性ウイルスの場合、これは厳密に必要ではなく、当業者の技術の範囲内で別の好適な組み込み座位を選択できる。したがって、標識ＴＫ-を省略している。
【００５０】
Ｊｅｎｎｅｒｅｘは、以前に、ワクシニアウイルスが顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする導入遺伝子を発現するよう操作され、腫瘍選択性を増加させるためのワクシニアＴＫ遺伝子の欠失を伴う、ＪＸ−５９４を開発した。ＧＭ−ＣＳＦは、末梢非リンパ組織においてＤＣホメオスタシスに重要な別の増殖因子である（King et al., 2010、Greter et al., 2012）。ＧＭ−ＣＳＦを分泌する致死的に放射線照射された同種黒色腫細胞からなる黒色腫ワクチン（ＧＶＡＸ）は、いくらかの臨床的利益を示している（Dranoff et al., 2003）。例えば、ＣｕｒｒａｎおよびＡｌｌｉｓｏｎは、黒色腫細胞株由来ワクチンＢ１６−ＧＭＣＳＦ（ＧＶＡＸ）またはワクチンＢ１６−Ｆｌｔ３Ｌ（Ｆｌ３ＶＡＸ）とＣＴＬＡ−４遮断剤との組み合わせが、ワクチンが腫瘍から遠位の部位に投与された場合に、マウスの約６０％において確立された黒色腫を根絶することを示した（Curran and Allison, 2009）。しかしながら、ワクチンがＣＴＬＡ−４遮断剤と組み合わせて腫瘍に投与されたとき、ＧＶＡＸは、ヒトにおける腫瘍根絶に効果的でなく、一方でＦＩ３ＶＡＸ処理は、７５％の腫瘍がないマウスをもたらした（ヒトのデータ示さず）。１つの可能性がある説明は、腫瘍に対するＧＭ−ＣＳＦ投与が腫瘍内に骨髄抑制細胞生成を誘導するかも知れないというものである（Serafini et al., 2004）。腫瘍に対するＧＭ−ＣＳＦの投与が免疫寛容を誘導するかも知れないという関心により、本開示の発明者らは、３つの組換えウイルスの一対一の比較を実施した：両側Ｂ１０−Ｆ１０黒色腫モデルを用いる確立されたＢ１６黒色腫の根絶に対するＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（例２、図３Ａおよび３Ｂ）。本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが、腫瘍増殖の根絶または遅延において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＭＶＡΔＥ３Ｌより効果的であることを発見した。例２に記載されるように、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が、反対側の腫瘍の増殖の遅延および生存期間の延長の点でＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦよりも効果的であることを示した。このＭＶＡΔＥ３Ｌ-−ｈＦｌｔ３Ｌの全身性効果は、注射されていない腫瘍の治療に対してのみでなく、転移性疾患の治療に対してもまた重要である。
【００５１】
本開示の発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、再負荷の際に異なる腫瘍型に対しても全身性免疫をもたらすことを示した。最初に黒色腫に罹患した生存動物（例２）を用いて、本発明者らは、動物を異なる腫瘍型で再負荷した（結腸癌細胞、例３）。結腸癌細胞またはウイルスにまったく曝露されていなかった動物は、腫瘍を発生し、死亡したが、以前にＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで処理された動物は、注射された結腸癌細胞を拒絶した。
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫におけるＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射の効果が評価され、細胞傷害性ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の活性化および増殖、ならびに免疫抑制性制御性Ｔ細胞の低減を含む腫瘍微小環境における免疫学的変化が見出された（例４）。
【００５２】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、新生物形質転換、腫瘍免疫回避、およびその後の転移性カスケードを促進する。本開示において、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬがＴＡＭの枯渇に効果的であることを示した。ＴＡＭ低減のメカニズムのさらなる研究のために、本発明者らはＢａｔｆ３欠損マウスを使用した。Ｂａｔｆ３は、ウイルスおよび腫瘍抗原の交差提示に重要な役割を果たすＣＤ１０３+／ＣＤ８α+系統のＤＣの発生に極めて重要な転写因子である。例５に示されるように、Ｂａｔｆ３-/-の腫瘍におけるＴＡＭの数は顕著に低減し、ＴＡＭの生成が、ＣＤ８+Ｔ細胞の腫瘍内浸潤と関連する可能性があることを示唆する。
さらに、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに対する応答における腫瘍樹状細胞集団における変化をモニターした（例６）。例６に示されるように、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、ＣＤ２４+ＤＣ、ＣＤ１０３+ＤＣにおける低減、およびＣＤ１１ｂ+ＤＣにおける減少によって明らかにされるように、樹状細胞集団に動的な変化をもたらす。
【００５３】
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+細胞は、Ｃ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ２）を発現する炎症性単球であり、損傷または感染の部位へと動員される。本開示の発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+細胞およびＬｙ６Ｃ+ＣＤ１１ｂ-細胞の流入をもたらすことを観察した（例７）。
黒色腫におけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの治療効果を試験すること、およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ注射に起因して起こる免疫学的変化を描写することに加えて、本発明者らは、他の腫瘍型において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬがＭＶＡΔＥ３Ｌと比べて優れた効果を示すかどうかを決定することを追求した。例８に示されるように（図１４Ａおよび１４Ｂ）、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、反対側の結腸腫瘍の増殖の遅延および生存期間の延長の点でＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的である。まとめると、黒色腫および結腸癌において観察された結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが、様々な固形腫瘍の治療において使用できることを示唆する。
【００５４】
本開示の発明者らはまた、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、黒色腫瘍増殖の根絶または遅延、および全身性抗腫瘍免疫の生成において効果的であることを示した。したがって、本発明者らは、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬとＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの両方について、治療性能の、同等のパターンを観察した。
さらに、本発明者らは、本開示の組成物の腫瘍内送達および方法が、免疫チェックポイント遮断剤に対する抵抗性を克服することを示した。例１０に示されるように、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達と抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達との組み合わせは、両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫移植モデルにおいて全身性抗腫瘍効果をもたらす。さらに、本発明者らは、免疫チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）の全身性送達を伴うＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射で処理された生存マウスが、異なる腫瘍型の再負荷に対して免疫を発生させたことを実証している（例１１）。まとめると、これらの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが、単独でも、または免疫チェックポイント遮断剤と組み合わせても、固形腫瘍患者（結腸癌および黒色腫を含むがこれらに限定されない）の治療に対して、成功し、確かにより優れた選択肢を提供できることを最初に示す。
【００５５】
本開示において、本発明者らは、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのどちらかが癌免疫療法薬として使用できるかを探索した。実際、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が、腫瘍の根絶および抗腫瘍免疫の生成において、ＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを観察した。同様に、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が、腫瘍の根絶および抗腫瘍免疫の生成において、ＭＶＡよりも効果的である。したがって、治療選択肢として、改善された治療結果を達成するために、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌまたはその両方によって患者を治療することができる。
一実施形態において、本開示は、腫瘍を有する対象において抗腫瘍免疫応答を引き起こすおよび促進する方法であって、腫瘍に対して、有効量のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌまたはその両方を送達することを含む方法に関する。免疫系の刺激は、以下の免疫学的効果のうちの１つ以上によって顕在化され得る。
本発明者らによって作製されたＦＡＣＳデータは、ｈＦｌｔ３を保持する本発明の組換えウイルスによる治療が、不活化ＭＶＡまたは、ｈＦＬＴ３Ｌを伴わないＭＶＡもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌについて以前に報告されたものと質的に同一の免疫学的効果を有することを示す：ＣＤ８+Ｔ細胞の増加、ＣＤ４+Ｔ細胞の増加、制御性Ｔ細胞の低減。これらの結果に基づくと、免疫応答活性化のメカニズムは以前の実験に見られるもの、つまり；Ｉ型ＩＦＮの誘導および他の炎症誘発性サイトカインの誘導、樹状細胞成熟の誘導、腫瘍関連マクロファージの低減と非常に類似したものであろうことが理解される。
上述の１つ以上の免疫学的効果は、対象の治療に対する応答の初期の指標としての機能を果たすことができ、そしてその継続する効果のモニターとして機能を果たすことができる。
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬとＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの間で見られる類似性（例２と９）の観点から、ｈＦｌｔ３Ｌを欠如するＭＶＡΔＥ３Ｌと比較してＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌについて観察された性質および利点がまた、ＭＶＡ単独と比較したＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌによって示されるということが予想される。
【００５６】
一実施形態において、本開示は、腫瘍に罹患した対象において抗腫瘍免疫応答を引き起こすおよび促進する方法であって、腫瘍に対して、有効量のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを送達することを含む方法に関する。免疫系の刺激は、以下の免疫学的効果のうちの１つ以上によって顕在化され得る：
・腫瘍内の抗腫瘍細胞傷害性ＣＤ８+（おそらくＩ型インターフェロン関連）およびエフェクターＣＤ４+Ｔ細胞の増加、
・上記腫瘍に浸潤する樹状細胞の成熟の誘導（不活化ＭＶＡで、ならびに導入遺伝子を有していないＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌで以前の研究において観察されるように、これもまた、おそらくＩ型ＩＦＮの誘導に起因する）、
・対象における活性化抗腫瘍エフェクターＴ細胞の誘導、
・腫瘍内の免疫抑制性（制御性）ＣＤ４+Ｔ細胞の低減、
・細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞対制御性Ｔ細胞の比率、および通常型Ｔ細胞対制御性Ｔ細胞の比率の増加、
・免疫抑制性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の低減、
・ＣＤ２４+、ＣＤ１０３+、およびＣＤ１１ｂ+の低減、ならびに
・炎症性Ｌｙ６hiＣＤ１１ｂ+単球とＬｙ６hiＣＤ１１ｂ-骨髄細胞腫瘍への流入。
【００５７】
上述の１つ以上の免疫学的効果は、対象の治療に対する応答の初期の指標としての機能を果たすことができ、そしてその継続する効果のモニターとして機能を果たすことができる。
これらの効果の観察は、本発明のウイルスが腫瘍を治療する様式が、腫瘍抗原を保持するワクチンベクターのもの（腫瘍内に送達されず、筋肉内、皮下、またはまれに静脈内経路によって送達される）とは異なり、腫瘍溶解性ウイルスのもの（腫瘍細胞内のウイルス複製に主に起因する細胞障害を引き起こす）とも異なることを示す。アポトーシスが本発明の治療に準じた結果をもたらす場合、それは、これらと異なる作用様式によって生じるかまたは生じ得るアポトーシスと同一のメカニズムに起因するのではない。
一実施形態において、本開示は、固形腫瘍と診断された対象を治療する方法であって、腫瘍に対して、治療有効量のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌおよびそのいずれかまたは両方を含む組成物を送達することを含む方法を提供する。
【００５８】
一実施形態において、本開示は、癌と診断された対象において、抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、対象に、治療有効量のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを投与することを含む方法を提供する。本開示の方法は、（未治療または従来の治療を受けた対象と比べて）腫瘍のサイズを低減するか、腫瘍を根絶するか、腫瘍の増殖を阻害するか、転移を阻害するかもしくは、腫瘍の転移性増殖を低減するか、もしくは腫瘍の転移性増殖を根絶するか、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するか、または対象の生存期間を延長することができる抗腫瘍免疫を誘導することを含む。
別の実施形態において、本開示は、固形悪性腫瘍と診断された対象において、Ｔ細胞応答のような自然免疫応答および／または適応免疫応答を含み得る抗腫瘍免疫応答を、治療有効量のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌに腫瘍を曝露することによって増強する、刺激する、または引き起こす方法を提供する。
【００５９】
具体的な実施形態において、本開示は、腫瘍細胞に対するＴ細胞傷害性の点と、やはり腫瘍細胞に対するエフェクターＴ細胞を引き起こす点の両方の、適応免疫応答を媒介する免疫応答を引き起こす方法を提供する。本方法は、固形腫瘍に罹患した対象に、腫瘍内（本発明者らが期待するように）または静脈内にＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む組成物を投与することを含み、上記組成物の投与は、腫瘍に対する腫瘍特異的免疫応答をもたらし、そして最終的に腫瘍増殖の低減、阻害、または根絶、転移性増殖の阻害、腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または対象の生存期間の延長をもたらす。実際、本発明者らは、癌細胞が殺傷されること、および転移を伴う場合に免疫応答が遠隔地に移行できることを示している。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本開示は、腫瘍細胞に対するＴ細胞傷害性の点と、やはり腫瘍細胞に対するエフェクターＴ細胞を引き起こす点の両方の、適応免疫応答を媒介する免疫応答を引き起こす方法を提供する。方法は、対象に、非経口でＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む組成物を投与することを含み、上記組成物の投与は、腫瘍に対する腫瘍特異的免疫応答をもたらし、そして最終的に、従来の療法を受けたか治療を受けていない対象と比べて、腫瘍増殖の低減、阻害、もしくは根絶、および／または転移性増殖の阻害低減もしくは排除、腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または治療された対象の生存期間の延長をもたらす。腹腔内転移に対し、ウイルスを腹腔内注射できる。
実際、本発明者らは、癌細胞が殺傷されること、および転移を伴う場合に免疫応答が遠隔地に移行でき、そして抗腫瘍効果をまだ発揮できることを示している。
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬおよびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦＬＴ３Ｌが多くの哺乳動物細胞において実質的に非複製性であるので、それは、免疫系に対して、複製可能なワクチンまたはベクターと同一の方法によってその効果を発揮するのではない。したがって、免疫系の刺激は、腫瘍溶解の効果にとって障壁であると考えられている（８）（Kirn et al., Nat Rev Cancer. (1), 64-71 (2009)）、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦＬＴ３Ｌは、自然免疫系を利用して、腫瘍に対する細胞傷害性の点とより広範な腫瘍に対するエフェクターＴ細胞の活性化の点の両方の、適応免疫を刺激することができる。
したがって、本開示は、固形悪性腫瘍を治療する方法であって、固形腫瘍と診断された対象において腫瘍に対する免疫応答を誘導するのに有効なＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの量を対象の腫瘍に対して送達することを含む方法を提供する。
【００６１】
本開示はまた、固形悪性腫瘍に罹患した対象において、抗腫瘍全身免疫を生成する方法であって、上記対象の注射されていない腫瘍の拒絶と腫瘍転移の阻害の１つまたは両方をもたらすのに有効なＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの量を対象の腫瘍に対して送達することを含む方法（これは本発明者らが腫瘍再負荷によって試験した）を提供する。
本開示の組成物による治療の効果を増加させるために、本開示の組成物および方法を、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて使用してもよい。腫瘍溶解性ウイルスの好適な例は、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、および単純ヘルペスウイルスを含む。ワクシニアウイルスは多くの型の細胞に感染するが、腫瘍細胞が複製に助力する代謝産物を有し、同様に複製に助力するある経路の活性化を示し、同様にウイルス複製を助力する自然免疫系を回避する環境を作り出すので、腫瘍細胞内で優先的に複製する。本開示の組成物および方法と組み合わせて使用できる複製可能なウイルスの具体例は、導入遺伝子を含むか、または含まない、ＴＫ欠損のワクシニアに基づいたウイルスである、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＥ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む。
【００６２】
本発明者らによる以前に研究において、ＭＶＡが、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧによって媒介される細胞質ＤＮＡ感知経路を介して、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）においてＩ型ＩＦＮ誘導を誘導した。Ｃ５７Ｂ／６マウスにおけるＭＶＡの静脈内送達は、野生型マウスにおいてＩ型ＩＦＮを誘導するが、ＳＴＩＮＧまたはＩＲＦ３を欠くマウスにおいては誘導しなかった。本発明者らはまた、ＭＶＡΔＥ３ＬがｃＤＣにおいて、ＭＶＡよりも高いレベルのＩ型ＩＦＮ遺伝子発現およびＩＲＦ３のリン酸化を誘導したことを示した。ＭＶＡΔＥ３Ｌは、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧに媒介される細胞質ＤＮＡ感知経路とＭＤＡ５／ＭＡＶＳによって媒介されるｄｓＲＮＡ感知経路との両方によって検出される。さらに、Ｂ１６黒色腫細胞およびＭＣ３８結腸腺癌細胞のＭＶＡΔＥ３Ｌ感染がＩ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン、ならびにＩＲＦ３のリン酸化の活性化を誘導した。ＭＶＡとＭＶＡΔＥ３Ｌの両方は、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ−３の切断によって実証されるように、Ｂ１６およびＭＣ３８の細胞においてアポトーシスを誘導する。本発明者らは、この研究の、ＭＶＡまたはＭＶＡΔ３Ｌウイルスを直接的な抗癌療法として使用した。マウスＢ１６黒色腫モデルにおけるＭＶＡまたはＭＶＡΔ３Ｌの腫瘍内注射は、アポトーシス、延長した生存期間、および腫瘍根絶、ならびに全身性抗腫瘍免疫の生成をもたらした。腫瘍内と全身性の両方における細胞免疫応答の動的変化（例４〜７）を含む、本明細書に記載される発見により、ＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌウイルスに関する本発明者らの以前の発見と関連したメカニズムは、本明細書においても同様に機能すると考えられる。
【００６３】
したがって、現在の文献に基づいて、しかし理論に拘束されることは望まないが、以下のメカニズムは、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの抗腫瘍効果に寄与すると考えられる。（ｉ）通常型樹状細胞およびマクロファージを含む免疫細胞におけるＩ型ＩＦＮ応答の誘導、（ｉｉ）癌細胞におけるＩ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの誘導、（ｉｉｉ）癌細胞におけるアポトーシスの誘導、および（ｉｖ）腫瘍免疫抑制性環境から免疫活性化環境への変化。
本開示は、各々がヒトＦｌｔ３Ｌを発現するようさらに改変されたＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌを含む組成物をさらに含む。例１に示されるように、本発明者らは、図１に図示される戦略を用いて、ヒトＦｌｔ３Ｌを発現し、ＴＫ遺伝子の中央部分に欠失を含む組換えＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌを作製した。したがって、ウイルスおよび構築物はＴＫ-と標識することができる。
【００６４】
改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）
改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルソポックスウイルス属のメンバーである。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株（ＣＶＡ）のニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）におけるおよそ５７０代の連続継代によって作製された（６０）（Mayr et al., Infection 3, 6-14 (1975)）。これらの長期間の継代の結果として、生じたＭＶＡウイルスは、広範囲のゲノム欠失を含み、鳥類細胞に対する高い宿主細胞制限を有する（６１）（Meyer et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)）。生じたＭＶＡが非常に無毒であることが様々な動物モデルにおいて示された（５７）（Mayr et al., Dev. Biol. Stand. 41, 225-34 (1978)）。
ＭＶＡの安全性および免疫原性は、臨床治験において、特にヒトの天然痘に対して、広範に試験され、報告されている。これらの研究は、１２０，０００人を超える個人を含み、ヒトにおいて優れた有効性と安全性を実証してきている。さらに、他のワクシニアに基づいたワクチンと比べて、ＭＶＡは、弱められた毒性（感染性）を有するが、それは良好な特定の免疫応答を引き起こす。したがって、ＭＶＡは、特定の免疫応答を誘導する能力を有する安全なワクチンベクターとして確立されている。
上述の特徴のために、ＭＶＡは、組換え遺伝子発現およびワクチンとして使用される操作されたＭＶＡベクターの開発のための魅力的な候補となった。ワクチンベクターとして、ＭＶＡは、ＨＩＶ、結核およびマラリア、ならびに癌を含む多数の病的状態に対して調べられている（２０、２１）（Sutter et al., Curr Drug Targets Infect Disord 3: 263-271(2003)、Gomez et al., Curr Gene Ther 8: 97-120 (2008)）。
【００６５】
ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）のＭＶＡ感染が、共刺激性分子の上方制御および炎症誘発性サイトカインの分泌を特徴とするＤＣ活性化を引き起こすことが実証されている（１８）（Drillien et al., J Gen Virol 85: 2167-2175 (2004)）。この点において、ＭＶＡは、ＤＣを活性化しない標準的な野生型ワクシニアウイルス（ＷＴ−ＶＡＣ）と異なる。樹状細胞は、通常型樹状細胞（ｃＤＣ）および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の２つの主要なサブタイプに分類できる。前者、特にＣＤ１０３+／ＣＤ８α+サブタイプは、Ｔ細胞に対する抗原の交差提示に特に適応しており、後者は、強力なＩ型ＩＦＮ産生細胞である。
ヒト細胞のウイルス感染は、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロン−アルファ（α）によって媒介される自然免疫応答の活性化（第１の防衛線）をもたらす。これは通常、活性化Ｔ細胞（ＣＴＬとヘルパーの両方）の動員および増殖を伴い、最終的に抗体産生を伴う免疫学的「カスケード」の活性化を導く。しかしながら、ウイルスは宿主の免疫応答を抑制する因子を発現する。ＭＶＡは、ＷＴ−ＶＡＣよりも良好な免疫原であり、哺乳動物細胞において不十分に複製する。（例えば、Brandler et al., J. Virol. 84, 5314-5328 (2010)を参照）（６２）。
【００６６】
しかしながら、ＭＶＡは、完全に非複製性ではなく、本発明者らが示すように、いくつかの残存する免疫抑制活性を含む。それにもかかわらず、本明細書に示されるように、ＭＶＡは、処理された対象の生存期間を有意に延長した。これらの発見の意味は、ＭＶＡ（またはＭＶＡΔＥ３Ｌ）の腫瘍への注射または全身性送達によって、その応答が生得的なものであっても、またはチェックポイント阻害剤のような別の免疫療法薬によって誘導もしくは増強されるものであっても、宿主の自然免疫応答および適応免疫応答を増強し、それによって、腫瘍の免疫応答を回避する能力を克服すること、ならびに宿主の腫瘍に対する免疫応答を開始する能力を回復することを可能にするということである。
Ｅ３の欠失を伴う改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡΔＥ３Ｌ）
直前の節に記載されるＭＶＡの抗腫瘍効果はまた、ＭＶＡΔＥ３Ｌにおいても観察される。後者は、ＭＶＡよりも免疫抑制性ではなく、多くの哺乳動物細胞において、より複製性ではなく、その観点から好ましい。さらに、本明細書に記載される実験において見られるように、ＭＶＡΔＥ３Ｌの効果は、ＭＶＡのものよりも一般的に質的に良好であった。
【００６７】
免疫応答
特定の免疫系の活性（例えば抗体および／またはサイトカイン産生、または細胞媒介性免疫の活性化）の上方制御による免疫応答の誘導に加えて、免疫応答はまた、ホメオスタシスの再確立および宿主自身の器官および組織への過剰な損傷の防御のための、検出可能な免疫の抑制、減衰または任意の他の下方制御を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法によって誘導される免疫応答は、腫瘍細胞の直接的もしくは間接的な死、または増殖する能力の消失をもたらすことができる、エフェクターＣＤ８+（抗腫瘍細胞傷害性ＣＤ８+）Ｔ細胞、または活性化Ｔヘルパー細胞、またはその両方を生成する。
本開示の組成物および方法による免疫応答の誘導は、様々なよく知られている免疫学的パラメーターの任意のものを検出することによって決定することができる（６３、６４）（Takaoka et al., Cancer Sci. 94:405-11 (2003); Nagorsen et al., Crit. Rev. Immunol. 22:449-62 (2002)）。したがって、免疫応答の誘導は免疫学的アッセイを含む、数多くのよく知られているアッセイの任意のものによって確認することができ、そのようなアッセイは、可溶性免疫グロブリンまたは抗体、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などの可溶性メディエーター、および他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドならびに／または脂質メディエーターのインビボ、エクスビボ、またはインビトロ測定、免疫系の細胞の機能的または構造的特性の変化によって決定される細胞の活性化状態の変化、例えば、細胞増殖、変化した運動性、変化した細胞内カチオン勾配もしくは濃度（例えばカルシウム）、細胞ポリペプチドのリン酸化もしくは脱リン酸化、変化した表面抗原発現プロファイルを含む、特定の遺伝子発現のような特殊な活性の誘導、免疫系の細胞による細胞分化、またはアポトーシス（プログラム細胞死）の発生、または免疫応答の存在を検出することができる任意の他の基準を含むがこれらに限定されない。例えば、免疫細胞型を区別することができる細胞表面マーカーは、ＣＤ４+、ＣＤ８+、またはＮＫ細胞に結合する特定の抗体によって検出することができる。検出することができる他のマーカーおよび細胞成分は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６、およびＣＣＬ５を含むがこれらに限定されない。免疫応答を検出するための一般的な方法は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学を含むがこれらに限定されない。これらのアッセイおよび同様のアッセイを実施するための手順は広く知られ、例えばＬｅｔｋｏｖｉｔｓ（Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998）に見出すことができる。
【００６８】
医薬組成物および調製
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む医薬組成物は、担体または希釈剤を含んでもよく、それは例えば、水、生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファー、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの保存剤によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウム、および緩衝剤を含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物における、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、または担体分子の使用によってもたらすことができる。他の賦形剤は、湿潤剤または乳化剤を含んでもよい。一般的に注射可能な調製物に好適な賦形剤は、当業者に明らかなように含まれ得る。
【００６９】
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを含む医薬組成物または調製物は、混用的な混合、溶解、造粒化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造できる。薬学的ウイルス組成物は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボの使用に好適なウイルス調製物の形成を促進する生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、または助剤の１つ以上を用いて慣用的様式によって製剤化できる。本組成物は、１つ以上の追加の生物学的に活性な剤と組み合わせることができ（例えば、ＧＭ−ＣＳＦの並行投与）、非経口または腫瘍内投与に好適な本開示の薬学的（生物学的を含む）または獣医学的組成物を生成するために薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に製剤化できる。
【００７０】
当業者に理解されるように、多くの型の製剤が可能である。当該技術分野においてよく認識されるように、選択される特定の型は、選択される投与経路に依存する。例えば、全身製剤は、一般的に注射、例えば、静脈内注射による投与のために設計され、および腫瘍内送達のために設計されるものであろう。好ましくは、全身性または腫瘍内製剤は、滅菌されている。
滅菌されている注射可能な溶液は、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを、本明細書に列挙される様々な他の成分と共に必要量の適切な溶媒に混合し、必要とされるとき、その後の好適な滅菌手段によって調製される。一般的に、分散液は様々な滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、ウイルス＋以前に滅菌ろ過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本開示のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ組成物は、水性溶液において、または生理学的に適合する溶液もしくはバッファー、例えばハンクス溶液、リンガー溶液、マンニトール溶液、または生理食塩水バッファーにおいて製剤化され得る。ある実施形態において、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ組成物の任意のものは、懸濁剤、安定剤、浸透剤または分散剤のような調合剤、ポリエチレングリコール、ポリソルベート８０、１−ドデシルヘキサヒドロ−２Ｈ−アゼピン−２−オン（ラウロカプラム（ｌａｕｒｏｃａｐｒａｎ））、オレイン酸、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、デキストロース、プロピレングリコール、マンニトール、ポリソルベートポリエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）、ミリスチン酸イソプロピル、ベンジルアルコール、イソプロピルアルコール、エタノール、スクロース、トレハロースのようなバッファー、凍結保護剤、または保存剤を含んでもよく、他の当該技術分野において一般的に知られるそのようなものを、本開示の組成物の任意のものにおいて使用してもよい。（Pramanick et al., Pharma Times 45(3), 65-76 (2013)）（６５）。
【００７２】
本開示の生物学的または医薬組成物は、その中に含有されるウイルスが、対象への組成物の投与の際に腫瘍細胞への感染に利用可能になるよう製剤化できる。投与後の、血清、腫瘍、および所望する場合、他の組織におけるウイルスのレベルは、抗体に基づくアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学など）のよく確立された様々な技法によってモニターすることができる。
本発明の組換えウイルスは、約１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．７中に製剤化され、３．５×１０7ＰＦＵ／ｍｌの力価を有して、−８０℃において保存することができる。ワクチンのショットの調製のために、例えば１０2〜１０8、または１０2〜１０9のウイルス粒子を、アンプル内、好ましくはガラスアンプル内で、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥することができる。代替的に、注射可能な調製物は、製剤中の組換えウイルスの段階的凍結乾燥によって製造することができる。この製剤は、インビボの投与に好適である、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、もしくはポリビニルピロリドンのようなさらなる添加物、または抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）のような他の添加物を含むことができる。次いで、ガラスアンプルを密閉して、４℃〜室温で数か月間保存できる。しかしながら、アンプルは、好ましくは−２０℃以下で保存する。
【００７３】
治療のために、凍結乾燥物を、生理食塩水またはＴｒｉｓバッファーのような水性溶液中に溶解して、全身的にまたは腫瘍内のいずれかに投与することができる。投与様式、投与の用量および回数は、当業者によって公知の様式で最適化することができ、以下に詳述する。
本開示による医薬組成物は、さらなるアジュバントを含んでもよい。本明細書において使用されるとき、「アジュバント」は、腫瘍抗原に対する宿主の免疫応答を増強、増大、または強化する物質を指す。典型的なアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、Ｑｕｉｌ  Ａ、細菌細胞壁ペプチドグリカン、ウイルス様粒子、多糖、ｔｏｌｌ様受容体、ナノビーズなどであり得る（Aguilar et al. (2007), Vaccine 25: 3752-3762）。
【００７４】
組換えＭＶＡウイルスを含むキット
本開示は、本明細書に記載される組換えＭＶＡのうちの１つ以上を含む１つ以上の組成物を含むキットの供給を意図する。キットは、組換えＭＶＡの治療すべき対象への投与のための説明書と共に組換えＭＶＡの１つまたは複数の容器またはバイアルを含むことができる。説明書は、以下に提供される組成物または複数の組成物を投与するための投与レジメンを示し得る。
いくつかの実施形態において、キットはまた、組換えＭＶＡ組成物との補助的な投与のためのチェックポイント阻害剤を含むさらなる組成物を含んでもよい。
【００７５】
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの有効量および投与量
一般的に、対象は、約１０6〜約１０10プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲のＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの投与量を投与されるが、より少ないかまたはより多い用量も投与され得る。好ましい実施形態において、投与量は約１０7〜１０9ｐｆｕである。ウイルス粒子に対するｐｆｕの同等量は、用いる特定のｐｆｕ力価測定法に従って変動し得る。一般的に、ｐｆｕは、約５〜１００ウイルス粒子と同等量であり、０．６９ＰＦＵは約１ＴＣＩＤ５０である。ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの治療有効量を、１つ以上の用量に分割して、所定の期間、所定の投与頻度で投与できる。
【００７６】
例えば、当業者に明らかであるように、本開示によるＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、体重、および全身状態、ならびに特定の対象における所望の免疫応答を引き起こすＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの能力（対象の療法に対する応答性）に従って変動し得る。ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの対象への送達において、投与量もまた、全身の医学的状態、以前の病歴、疾患の型および進行、腫瘍量、腫瘍における腫瘍浸潤免疫細胞の有無などのような要因に応じて変動するであろう。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物を、投与が簡単でありかつ投与量の均一である単位投与剤形に製剤化することは有利である。「本明細書において使用されるとき、単位投与剤形」は治療される哺乳動物対象に対する単位用量として好適な物理的に分離した単位を指し、各々の単位が必要とされる薬学的または獣医学的に許容可能な担体と会合して、所望の治療効果をもたらすよう計算された所定の量の活性物質を含む。
【００７７】
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの投与および治療レジメン
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬおよびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌは、非経口、例えば、腫瘍内または静脈内の投与を含む１つ以上の経路を用いて達成することができる。一実施形態において、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌは、直接的な局所応答が望まれる場合、例えば腫瘍内注射によって腫瘍内へと直接投与される。さらに、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの投与経路は、例えば、最初の投与が腫瘍内注射を用い、続く投与が静脈内注射を介するか、またはそれらの任意の組み合わせのように変動し得る。ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ注射の治療有効量を、所定の期間、所定の投与頻度で投与できる。ある実施形態において、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを、他の治療処置と組み合わせて使用できる。例えば、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを、巨大原発性腫瘍に罹患した患者のために、ネオアジュバント（術前）またはアジュバント（術後）環境において投与できる。そのような最適化治療レジメンが、手術のような一次療法の前後に、腫瘍に対する免疫応答を誘導し、患者の腫瘍量を低減するであろうことは理解される。さらに、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを、化学療法または放射線照射のような他の治療処置と組み合わせて投与できる。
ある実施形態において、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのウイルスは、週または月に少なくとも１回投与されるが、必要な場合より頻繁に、例えば恩恵が持続する限り、数週間、数カ月間、数年間、またはさらに無期限の期間中、週に２回投与できる。耐容される場合、およびそれらが持続するかまたは増加する恩恵を生じる場合、より頻繁な投与が意図される。本方法の恩恵は、以下を含むが、これらに限定されない：癌細胞の数の低減、腫瘍サイズの低減、腫瘍の根絶、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害、転移性増殖の阻害または安定化または根絶、腫瘍増殖の阻害または安定化、および生活の質の安定化または改善。さらに、恩恵は、腫瘍に対する免疫応答の誘導、エフェクターＣＤ４+Ｔ細胞の活性化、エフェクターＣＤ８+Ｔ細胞の増加、または制御性ＣＤ４+細胞の低減を含み得る。例えば、黒色腫の文脈において、恩恵は、最初の黒色腫の診断の１、２、３、４、５またはそれ以上の年における、再発または転移がないことであり得る。結腸癌および他の固形腫瘍についても同様の評価をなし得る。
ある他の実施形態において、腫瘍塊または腫瘍細胞は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロでＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌによって治療される。
【００７８】
ベクター
以下に詳述される実験において、ｐＣＢプラスミドに基づいたベクターは、特定の目的の遺伝子（ＳＧ）、この場合マウスＧＭ−ＣＳＦ（ｍＧＭ−ＣＳＦ）またはヒトＦｌｔ３Ｌ（ｈＦｌｔ３Ｌ）を、ワクシニア合成初期および後期プロモーター（Ｐｓｅ／ｌ）の制御下に挿入するのに使用された。ベクター構築の方法論は、M. Puhlmann, C. K. Brown, M. Gnant, J. Huang, S. K. Libutti, H. R. Alexander, D. L. Bartlettに記載されている。ワクシニアは、腫瘍指向性遺伝子療法のためのベクターである：Biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant. Cancer Gene Therapy, 7(1), 66-73 (2000)。ワクシニアＰ７．５プロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉのキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）が薬剤選択マーカーとして使用された。これら２つの発現カセットは、各々の側でＴＫ遺伝子の部分配列によって隣接されていた。ＴＫ遺伝子の選択は、利便性の問題からであり、ウイルス内の他の好適な座位が使用できた。プラスミドＤＮＡと改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）またはＭＶＡΔＥ３ＬのゲノムＤＮＡとのＴＫ座位において起こる相同組換えは、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３ＬのゲノムＤＮＡのＴＫ座位へのＳＧおよびｇｐｔ発現カセットの挿入をもたらし、ＭＶＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを生成する。組換えウイルスは、ＭＰＡ、キサンチンおよびヒポキサンチンを含むｇｐｔ選択培地の存在下で濃縮され、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの混入していない適切な組換えウイルスが得られるまで薬剤選択培地の存在下で４〜５ラウンド、プラーク精製された。
【００７９】
しかしながら、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌゲノムへの組み込みに好適な任意の他の発現ベクター、および代替的なプロモーター、制御因子、選択マーカー、切断部位、ＭＶＡの非必須の挿入領域を使用できたことは理解できるであろう。ＭＶＡは、リンカーゲノムの末端に、Ｃ１１、Ｃ７、Ｋ３、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ４、Ｆ６、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１１、Ｆ１４．５、Ｊ２、Ａ４６、Ｃ１６を含む多くの免疫調節性遺伝子をコードする。これらの遺伝子は、ウイルスの免疫活性化特性を増強する可能性のために除去し得、導入遺伝子の挿入を可能にし得る。
【実施例】
【００８０】
材料および方法  ウイルスおよび細胞株
ＭＶＡおよびＭＶＡΔＥ３Ｌウイルスは、Ｇｅｒｄ  Ｓｕｔｔｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｎｉｃｈ）によって親切に提供され、ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）細胞において増殖させた。ＭＶＡは、商業的および／または公的に入手可能である。ＭＶＡΔＥ３Ｌウイルスの生成方法は、記載された（２８）（Hornemann et al., J Virol 77, 8394-8407 (2003)）。ウイルスは、３６％スクロースクッションを通じて精製した。ＢＨＫ−２１を、１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、および５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むイーグル最小必須培地（イーグルＭＥＭは  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入可能である、Ｃａｔ＃  １１０９５−０８０）において培養した。マウス黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０は、当初はＩ．Ｆｉｄｌｅｒ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）より得た。Ｂ１６−Ｆ１０細胞は、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ＭＣ３８結腸腺癌細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において維持した。マウストリプルネガティブ乳癌細胞株４Ｔ１は、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で培養した。ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるトランスジェニック腺癌マウス前立腺モデル（ＴＲＡＭＰ）に由来する。ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞は、同質遺伝子的なＣ５７ＢＬ／６マウスに移植されるとき、腫瘍形成性である。ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞はＡＴＣＣより入手可能である。それらは、５％のＮｕ−Ｓｅｒｕｍ  ＩＶ、５％のＦＢＳ、ウシインシュリン、およびＤＨＴを含むＤＭＥＭにおいて培養する。全ての細胞は３７℃で、５％ＣＯ2インキュベーターで増殖した。
本明細書において使用される細胞および細胞株は、他が示されない限り、商業的または公的に入手可能である。
【００８１】
マウス
６〜８週齢の間のメスのＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入し、インビボ腫瘍移植および処理実験に使用した。これらのマウスは、Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設で維持した。全ての手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に厳格に従って実施した。プロトコールはＳｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓによって承認された。
Ｂａｔｆ３-/-およびＳＴＩＮＧGt/Gtマウスは、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂａｔｆ３-/-）、およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｖａｎｃｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＳＴＩＮＧGt/Gt）において作られた。これらのマウスは、Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設で繁殖し、維持した。
【００８２】
両側腫瘍移植モデル、およびｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＦｌｔ３Ｌを発現する組換えＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌウイルスの腫瘍内注射
簡単に言うと、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍移植の８日後、右側のより大きな腫瘍は、週に２回、マウスが麻酔下にあったときに、２×１０7ｐｆｕのＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、または熱不活化ＭＶＡを腫瘍内注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍容積は、次の式：ｌ（長さ）×ｗ（幅）×ｈ（高さ）／２によって計算した。マウスは、苦痛の兆候を見せたとき、または腫瘍の直径が１０ｍｍに達したとき、安楽死させた。
【００８３】
いくつかの実験において、ＭＣ３８結腸腺癌細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍を７〜８日間増殖するようにし、その後、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳコントロールを週に２回より大きな腫瘍に注射した。腫瘍サイズを測定し、マウスの生存をモニターした。
いくつかの実験において、４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に２．５×１０5、および左側に５×１０4）。腫瘍移植の５日後、右側のより大きな腫瘍に、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれか（２×１０7ｐｆｕ）を週に２回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。マウスの生存をモニターした。
【００８４】
両側腫瘍移植モデル、および免疫チェックポイント遮断の全身性または腫瘍内投与の存在下または非存在下でのウイルスの腫瘍内注射
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍移植の８日後、両側腫瘍を有するマウスを、右側のより大きな腫瘍に対するＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射、および抗ＣＴＬＡ−４（マウス１匹当たり１００μｇ）、抗ＰＤ−１（マウス１匹当たり２５０μｇ）、抗ＰＤ−Ｌ１（マウス１匹当たり２５０μｇ）、またはアイソタイプコントロール（マウス１匹当たり１００μｇ）を含む免疫チェックポイント遮断抗体の腹腔内送達で週２回処理した。腫瘍サイズが測定され、腫瘍は週に２回注射された。マウスの生存をモニターした。
いくつかの実験において、ＳＴＩＮＧGt/Gt、Ｂａｔｆ３-/-マウスおよびＷＴの年齢一致させたコントロールを両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫移植に使用し、マウス右側のより大きな腫瘍に対してＰＢＳまたはＨｅａｔ−ＭＶＡで処理した。
【００８５】
片側皮下腫瘍移植およびウイルスの腫瘍内注射
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫（５０μｌの容量中の５×１０5細胞）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚に皮下移植した。移植の８〜９日後、腫瘍サイズを測定し、直径５〜６ｍｍの腫瘍に、週に２回、マウスが麻酔下にあったときに、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（５０μｌの容量中２×１０7ｐｆｕのＭＶＡ）、またはＨｅａｔ−ＭＶＡ、またはポリ（Ｉ：Ｃ）（マウス１匹当たり５０μｇ）またはＰＢＳを注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。腫瘍容積は、次の式：ｌ（長さ）×ｗ（幅）×ｈ（高さ）／２によって計算した。マウスは、苦痛の兆候を見せたとき、または腫瘍の直径が１５ｍｍに達したとき、安楽死させた。
いくつかの実験において、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫（５０μｌの容量中の５×１０5細胞）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚に皮下移植した。移植の８〜９日後、腫瘍サイズを測定し、直径５〜６ｍｍの腫瘍に、腹腔内送達されたアイソタイプコントロール、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１の存在下でＰＢＳ、またはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌを注射した。腫瘍サイズが測定され、腫瘍は週に２回注射された。マウスの生存をモニターした。マウスは、苦痛の兆候を見せたとき、または腫瘍の直径が１５ｍｍに達したとき、安楽死させた。
いくつかの実験において、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞を、ＳＴＩＮＧGt/Gtマウスおよび年齢を一致させたＷＴのＣ５７Ｂ／６コントロールの剃毛した右側に皮下移植した（１匹のマウス当たり、５０μｌのＰＢＳ中の１×１０6細胞）。腫瘍移植の１７日後、右側の腫瘍（直径およそ３〜４ｍｍ）に、ＰＢＳまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれか（２×１０7ｐｆｕ）を週に２回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。マウスの生存をモニターした。
【００８６】
腫瘍細胞懸濁液の調製、ＲＮＡ単離、およびリアルタイムＰＣＲ
簡単に言うと、６〜８週齢のＣ５７Ｂ／６マウスに対し、２．５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を左側に、５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を右側に皮下移植した。移植後７日で、ＭＶＡ（２×１０7ｐｆｕ）もしくはＨｅａｔ−ＭＶＡ、またはＰＢＳを右側のより大きな腫瘍に注射した。注射は３日後に繰り返した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を、最初の注射後７日で採取し、細胞懸濁液を作製した。
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって全細胞溶解物より抽出し、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）によって逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲは、遺伝子特的プライマーを用いて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲ装置（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって三連で実施した。相対発現は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベルに対して正規化した。
【００８７】
フローサイトメトリー
腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節内の免疫細胞の表現型および特徴を分析するために、本発明者らは次のプロトコールに従ってＦＡＣＳ解析前に細胞懸濁液を作製した（Zamarin et al., Science Translational Medicine 6, 226-232 (2014)）。最初に、ＭＶＡまたはＰＢＳで処理後３日で、鉗子および外科用ハサミを用いて腫瘍を単離した。次いで、腫瘍を秤量した。腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節を切り刻み、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（１．６７Ｗｕｎｓｃｈ  Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（０．２ｍｇ／ｍｌ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。繰り返しピペッティングして細胞懸濁液を作製し、７０μｍナイロンフィルターを通してろ過し、次いで完全ＲＰＭＩによって洗浄し、その後Ｆｉｃｏｌ精製をして死細胞を除去した。細胞は、抗ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、およびＣＤ８抗体によって表面標識の処理をした。生細胞は、固定性色素ｅＦｌｕｏｒ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて死細胞と区別する。それらはさらにＦｏｘＰ３固定および透過キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて透過処理し、Ｋｉ−６７、ＦｏｘＰ３、およびグランザイムＢに対して染色した。骨髄細胞集団の染色のために、ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｌｙ−６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）に対する蛍光色素結合抗体をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入した。全ての抗体は、それらの対応するアイソタイプコントロールと共に試験した。データをＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて解析した。
【００８８】
ＥＬＩＳＰＯＴ
ナイーブまたは処理されたマウスからのマウス脾臓を採取し、機械的に破壊し、ＲＢＳを溶解した。ＣＤ８+Ｔ細胞を、マグネチック抗ＣＤ８+ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とのインキュベーションによってポジティブ選択した。ＢＤマウスＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴセットを製造者の取扱説明書に従って用いた。簡単に言うと、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＰＢＳ中の１００μｌの抗マウスＩＦＮ−γ抗体によってコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄して非結合の抗体を除去し、７％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地によって２時間室温でブロッキングした。１×１０5の精製ＣＤ８+Ｔ細胞を同数の放射線処理したＢ１６またはＭＣ３８細胞と混合し、各々のウェルに播種した。プレートを３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎによって広範囲に洗浄し、１００μ／ウェルのマウスＩＦＮ−γに対するビオチン化検出抗体と共にインキュベートした。洗浄後に酵素コンジュゲート（ストレプトアビジン−ＨＲＰ）を添加し、その後にスポット発色のための最終基質溶液を添加した。スポットをＫＳソフトウェアを含むＡｕｔｏｍａｔｅｄ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）によって計数した。
【００８９】
ＴＲＰ−２テトラマー染色
腫瘍流入領域リンパ節を単離し、切り刻み、その後Ｌｉｂｅｒａｓｅ（１．６７Ｗｕｎｓｃｈ  Ｕ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（０．２ｍｇ／ｍｌ）と共に３０分間３７℃でインキュベートした。繰り返しピペッティングして細胞懸濁液を作製し、７０μｍナイロンフィルターを通してろ過し、次いで完全ＲＰＭＩによって洗浄した。リンパ節細胞懸濁液を、抗ＦｃγＲＩＩ（２．４Ｇ２）抗体および１０μＬのＰＥ−Ｈ−２Ｋｂ  ＴＲＰ２（チロシナーゼ関連タンパク質−２）（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）テトラマー（ＭＢＬ）と共に３０分間室温でインキュベートし、その後に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体によって３０分間４℃で染色した。細胞をＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で洗浄し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いてＢＤ  ＬＳＲＩＩによって解析した。
【００９０】
試薬
試薬の商業的供給源は以下の通りであった：治療用抗ＣＴＬＡ４（クローン９Ｈ１０および９Ｄ９）、抗ＰＤ１（クローンＲＭＰ１−１４）、抗ＰＤ−Ｌ１（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）はＢｉｏＸｃｅｌｌより購入し、フローサイトメトリーで使用した抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＤ４５．２  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、ＣＤ３  ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４  ＡＰＣ−ｅｆｌｕｏｒ７８０、ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ−ｅｆｌｕｏｒ７１０）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＤ４  ＱＤｏｔ  ６０５、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＡＰＣ）より購入した。ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｌｙ−６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＭＨＣ  ＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）に対する蛍光色素結合抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入した。
【００９１】
統計
研究における２つの群の比較のために、両側独立スチューデントのｔ検定を使用した。生存データは、ログランク（コックス・マンテル）検定によって分析した。有意であるとみなされるｐ値は、次の図によって示す：*、ｐ＜０．０５、**、ｐ＜０．０１、***、ｐ＜０．００１、****、ｐ＜０．０００１。試験に含まれる動物の数は各々の図の凡例で考察する。
【００９２】
（例１）
ｍＧＭ−ＣＳＦまたはｈＦｌｔ３Ｌを発現する組換えＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌウイルスの作製
本開示において、本発明者らは、標準的な組換えウイルス技術を用いて、ＴＫの欠失を含み、ワクシニア合成初期／後期プロモーター（Ｐｓｅ／ｌ）のもとでのヒトＦｌｔ３ＬまたはマウスＧＭ−ＣＳＦの発現を伴うかまたは伴わない組換えＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌを作製した。最初に、本発明者らは、ワクシニアＰｓｅ／ｌの制御下の特定の目的の遺伝子（ＳＧ）、およびワクシニアＰ７．５プロモーターの制御下の大腸菌のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）を、両側にチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を隣接させて含むプラスミドを構築した。
ＢＨＫ２１細胞を０．０５のＭＯＩでＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌで１時間感染させ、次いで、上述のプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。感染細胞を４８時間で回収した。ＭＰＡ、キサンチンおよびヒポキサンチンを含むｇｐｔ選択培地中でさらに培養して組換えウイルスを選択し、プラーク精製した（Ｌｏｒｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。ＰＣＲ解析を実施して、ＴＫ遺伝子の一部を欠失し、かつマウスＧＭ−ＣＳＦまたはヒトＦｌｔ３Ｌを含むおよび含まない組換えウイルスを同定した（図２）。
ＰＣＲを用いて、組換えウイルスＭＶＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ、およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌにおける正しい挿入を検証した。プライマー対ｍＧＭ−ＣＳＦ−Ｆ１／Ｒ１は、組換えウイルスＭＶＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦに挿入されたｍＧＭ−ＣＳＦからの３１０ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅するのに使用した。ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬおよびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬにおけるｈＦｌｔ３Ｌ遺伝子挿入は、プライマー対ｈＦｌｔ３Ｌ−Ｆ４／Ｒ４によって検証し、それは３１６ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅できる。プライマー対ＴＫ−Ｆ４／ＴＫ−Ｒ４は、ＴＫ座位の特異的な遺伝子挿入を検証するのに使用した。ＴＫ−Ｆ４／Ｒ４は、ＭＶＡまたはＭＶＡΔＥ３Ｌから３０４ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅できるが、ＴＫ−Ｒ４プライマー座位の欠失により、ＭＶＡ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌにおいては増幅できなかった。
【００９３】
プライマー配列：ＴＫ−Ｆ２（配列番号１）：ＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＣ；ＴＫ−Ｆ４（配列番号２）：ＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡ；
ＴＫ−Ｒ４（配列番号３）：ＴＣＣＴＴＣＧＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＣＴ；
ＴＫ−Ｆ５（配列番号４）：ＧＡＡＣＧＧＧＡＣＴＡＴＧＧＡＣＧＣＡＴ；
ＴＫ−Ｒ５（配列番号５）：ＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣＧ；
ｐＣＢ−Ｒ３（配列番号６）：ＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＧＧＣＧ；
ｍＧＭＣＳＦ−Ｆ１（配列番号７）：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴ；
ｍＧＭＣＳＦ−Ｒ１（配列番号８）：ＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＧ；
ｈＦｌｔ３Ｌ−Ｆ１（配列番号９）：ＡＡＣＧＡＣＣＴＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣ；
ｈＦｌｔ３Ｌ−Ｒ１（配列番号１０）：ＧＧＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＣＡＴＴＴＧＧ。
【００９４】
（例２）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、両側Ｂ１０−Ｆ１０黒色腫モデルにおいて、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方の根絶または増殖の遅延において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であった
本発明者らは、マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫両側移植モデルを用いて、転移性増殖に対するＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射の効果を調べた。簡単に言えば、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞は、Ｃ５７Ｂ／６マウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に５×１０5、および左側に１×１０5）。腫瘍移植の７〜８日後、本発明者らは、週に２回、右側のより大きな腫瘍に対し、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、およびＭＶＡΔＥ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳを腫瘍内注射した。腫瘍サイズを測定し、マウスの生存をモニターした（図３Ａ）。ＰＢＳ処理マウスが、その後の７〜１４日で腫瘍増殖の増加を伴い急速に死亡した（図１３５ＢＡおよびＣＢ）一方で、ＭＶＡΔＥ３Ｌで処理したマウスは注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方の遅延された腫瘍増殖の遅延を示し、これは、ＰＢＳ群における１１日の平均生存期間からＭＶＡΔＥ３Ｌ処理群における２５日までの平均生存期間の延長をもたらした（図３ＢおよびＣ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ（ｎ＝９）対ＰＢＳ（ｎ＝５）に対して***、Ｐ＜０．００１）。さらに、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ処理マウスはまた、２５日の生存期間中央値を有し、１／９のマウスが、黒色腫を治癒した。さらに、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスは７０日の生存期間中央値を有し、４／９のマウスは治癒した（図３ＢおよびＣ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝９）対ＭＶＡΔＥ３Ｌ（ｎ＝９）に対して***、Ｐ＜０．００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝９）対ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ（ｎ＝９）に対して*、Ｐ＜０．０５）。まとめると、これらの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、患者における転移性の状況を模倣する両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおいて、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方の根絶または増殖の遅延において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦまたはＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であった。
【００９５】
（例３）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、再負荷の際に異なる腫瘍型に対する全身性免疫をもたらす
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の後の生存マウス（ｎ＝４）が異なる腫瘍型に対して免疫を生じさせるかどうかを評価するために、皮下移植によって致死用量のＭＣ３８（１×１０5）を再負荷した。上記腫瘍またはウイルスに対してそれまでに曝露していないナイーブマウス（ｎ＝５）をコントロールとして使用した。全てのナイーブマウスが腫瘍を発生し、２９日の生存期間中央値を有して腫瘍移植の２６〜３１日後で死亡したが、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理の生存マウスの全ては、ＭＣ３８腫瘍負荷を拒絶した（図３Ｄ）。マウスはそれまでにＭＣ３８腫瘍に対して曝露していなかったことを考慮すると、これは非常に注目に値する。これらの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫とＭＣ３８結腸癌と間の共通の抗原の認識、および異なる型の腫瘍に対する抗腫瘍免疫の発生を可能にすることを示唆する。
【００９６】
（例４）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の増殖および活性化、ならびに制御性Ｔ細胞の低減の点で効果的である。
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫における、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射がＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞の活性化および増殖をもたらすかどうかを評価するために、６〜８週齢のＣ５７Ｂ／６マウスに対し、２．５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を左側に、５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を右側に皮下移植した。移植後７日で、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、もしくはＨｅａｔ−ＭＶＡまたはＰＢＳを右側のより大きな腫瘍に注射した。注射は３日後に繰り返した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を、最初の注射後７日で採取し、細胞懸濁液を作製した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍に浸潤した生免疫細胞をＦＡＣＳにより解析した。ＰＢＳ処理された腫瘍における５８．９％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理された腫瘍における９７％までの、注射された腫瘍におけるグランザイムＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞の劇的な増加があった（ｐ＜０．０００１、図４Ａ、４Ｂ）。注射されていない腫瘍においても、ＰＢＳ処理されたマウスにおける６１．９％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理されたマウスにおける９１．６％およびＭＶＡΔＥ３Ｌ処理されたマウスにおける８３％までの、グランザイムＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞の増加があった（ｐ＜０．００１、図４Ａ、４Ｂ）。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬとＭＶＡΔＥ３Ｌとで処理されたマウス間のグランザイムＢを発現するＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージの違いは、統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５、図４Ａ、４Ｂ）。
【００９７】
注射された腫瘍において、Ｋｉ−６７+ＣＤ８+Ｔ細胞は、ＰＢＳで処理された腫瘍における５８．３％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで処理された腫瘍における８３．２％まで増加した（ｐ＜０．０１、図４Ｃ、４Ｄ）。注射されていない腫瘍においても、ＰＢＳ処理されたマウスにおける５８．７％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理されたマウスにおける７５．４％までの、Ｋｉ−６７を発現するＣＤ８+Ｔ細胞の増加があった（ｐ＜０．０１、図４Ｃ、４Ｄ）。
【００９８】
ＰＢＳ処理されたマウスと比較してウイルス処理されたマウスからの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍において、同様の変化がＣＤ４+Ｔ細胞について観察され、グランザイムＢ+ＣＤ４+Ｔ細胞が、ＰＢＳ処理された腫瘍における２０％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理された腫瘍における９８．４％まで上昇した（Ｐ＝０．０００２、図５Ａ、５Ｂ）。注射されていない腫瘍においても、ＰＢＳ処理されたマウスにおける１８．７％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理されたマウスにおける６７．８％およびＭＶＡΔＥ３Ｌ処理されたマウスにおける４５．２％までの、グランザイムＢを発現するＣＤ４+Ｔ細胞の増加があった（ｐ＜０．０００１、ＰＢＳ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ｐ＜０．０１、ＰＢＳ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、図５Ａ、５Ｂ）。
【００９９】
さらに、ＰＢＳ処理された腫瘍における４０％からＭＶＡΔＥ３Ｌ処理された腫瘍における５９．６％およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理された腫瘍における６６．６％までの、Ｋｉ−６７+ＣＤ４+Ｔ細胞の増加があった（ｐ＜０．００１、ＰＢＳ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、ｐ＜０．０１、ＰＢＳ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、図５Ｃ、Ｄ）。注射されていない腫瘍においても、ＰＢＳ処理されたマウスにおける４０％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理されたマウスにおける６１．２％およびＭＶＡΔＥ３Ｌ処理されたマウスにおける５２．２％までの、Ｋｉ−６を発現するＣＤ４+Ｔ細胞の増加があった（ｐ＜０．０１、ＰＢＳ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ｐ＜０．０５、ＰＢＳ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、図５Ｃ、５Ｄ）。
注射された腫瘍において、ＣＤ４+Ｆｏｘｐ３+Ｔ細胞は、ＰＢＳで処理された腫瘍における４５．１％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで処理された腫瘍における２６．６％まで減少した（ｐ＜０．００１、図６Ａ、６Ｂ）。注射されていない腫瘍において、ＣＤ４+Ｆｏｘｐ３+Ｔ細胞は、ＰＢＳで処理されたマウスにおける５１．６％からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで処理された腫瘍における３７．１％まで減少した（ｐ＜０．０１、図６Ａ、６Ｂ）。
【０１００】
本発明者らは、ウイルス処理後の注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＣＤ４５+細胞、ＣＤ８+細胞の絶対数を測定した。注射された腫瘍において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ４５+細胞を、３．８×１０6／ｇから、それぞれ１．６×１０7／ｇまたは１．３×１０7／ｇまで増加させたことを見出した（Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ａ）。注射されていない腫瘍において、反対側の腫瘍におけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ４５+細胞を、３．３×１０6／ｇから、それぞれ９．５×１０7／ｇまたは５．４×１０7／ｇまで増加させたことを見出した（Ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、Ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ａ）。
本発明者らはまた、注射された腫瘍において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ８+細胞を、２．９×１０5／ｇから、それぞれ２．９×１０6／ｇまたは２．０×１０6／ｇまで増加させたことを見出した（Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ｂ）。注射されていない腫瘍において、反対側の腫瘍におけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ８+細胞を、２．８×１０5／ｇから、それぞれ１．６×１０6／ｇまたは１．１×１０6／ｇまで増加させた（Ｐ＜０．００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ｂ）。
【０１０１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４+ＦｏｘＰ３+細胞として定義される）に対するＣＤ８+Ｔ細胞の比率、およびＴｒｅｇに対するＴｃｏｎｖ（ＣＤ４+ＦｏｘＰ３-細胞）の比率もまた評価した。注射された腫瘍において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ８+／Ｔｒｅｇの比率を２．８から１８．６または１２．５まで増加させたことを観察した（Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、図７Ｃ）。本発明者らはまた、注射されていない腫瘍において、反対側の腫瘍におけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ８+／Ｔｒｅｇの比率を３．４から１１または７．８まで増加させたことを見出した（Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ｃ）。
【０１０２】
本発明者らは、注射された腫瘍において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、エフェクターＣＤ４+／Ｔｒｅｇの比率を０．６５から４．１または３．２まで増加させたことを観察した（Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ｄ）。注射されていない腫瘍において、反対側の腫瘍におけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌの腫瘍内注射が、エフェクターＣＤ４+／Ｔｒｅｇの比率を０．７から３．３または２．９まで増加させたことも出した（Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図７Ｄ）。
これらの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が腫瘍微小環境における免疫学的変化を引き起こし、それは、細胞傷害性ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の増殖および活性化、ならびにＣＤ８+／ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇの比率の増加として顕在化することを示す。
【０１０３】
（例５）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、腫瘍関連マクロファージを枯渇させる点において効果的である
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、以下の表面マーカー、ＣＤ４５+ＭＨＣ−ＩＩ+Ｆ４／８０hiＣＤ２４loを発現する腫瘍浸潤骨髄細胞である（Broz, et al. Cancer Cell, 26(5):638-52, 2014）。本発明者らは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＣＤ４５＋細胞のうちのＴＡＭのパーセンテージを分析した。本発明者らはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、ＣＤ４５+細胞のうちのＴＡＭのパーセンテージを、注射された腫瘍において２１．４％から０．７％まで（Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図８、９Ｂ）、注射されていない腫瘍において２２％から３．２％まで（Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図８、９Ａ）低減したことを観察した。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌは、注射されていない腫瘍においてＴＡＭを低減する点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的である（Ｐ＜０．０５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＭＶＡΔＥ３Ｌ、図８、９Ａ）。Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいて、ＰＢＳ処理マウスにおけるＣＤ４５+細胞のうちのＴＡＭのパーセンテージは、注射された腫瘍において５．４％であり、注射されていない腫瘍において７．２％であった（Ｐ＜０．０１、注射された腫瘍のＷＴのＰＢＳ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図８、９Ｂ、Ｐ＜０．０５、注射されていな腫瘍のＷＴのＰＢＳ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図８、９Ｂ）。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、注射された腫瘍において０．５％まで、注射されていない腫瘍において１．５％まで、ＣＤ４５+細胞のうちのＴＡＭのパーセンテージをさらに低減した（Ｐ＜０．０００１、注射された腫瘍のＢａｔｆ３-/-のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図８、９Ｂ、Ｐ＜０．０５、注射されていな腫瘍のＢａｔｆ３-/-のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図８、９Ａ）。Ｂａｔｆ３-/-の腫瘍において顕著に低減したＴＡＭの数は、ＴＡＭの生成が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍内浸潤と関連する可能性があることを示唆する。ＴＡＭは、腫瘍進行および転移を促進することが示されている。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射による注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方からのＴＡＭの効果的な枯渇は、この療法の効果に寄与する可能性がある。
【０１０４】
（例６）
注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が樹状細胞集団の動的な変化をもたらす
本発明者らは次に、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において樹状細胞（ＤＣ）の集団を解析した。腫瘍浸潤ＤＣは、ＣＤ４５+Ｌｙ６Ｃ−ＭＨＣ−ＩＩ+ＣＤ２４hiＦ４／８０lo細胞を特徴とする（Broz et al., Cancer Cell, 2014）。ＣＤ２４hiのＤＣのうち、ＣＤ１１ｂ+のＤＣとＣＤ１０３+のＤＣの２つのＤＣ集団が存在する。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ２４hiのＤＣ（ＣＤ２４+）のパーセンテージを調べた。ＷＴマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射されていない腫瘍において３％から１．３％までの（Ｐ＝０．００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図９Ａ）、注射された腫瘍において２．４％から０．２％までの（Ｐ＝０．０００４、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図９Ｂ）、ＣＤ２４+のＤＣの低減をもたらしたことを見出した。Ｂａｔｆ３-/-マウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がまた、注射されていない腫瘍において３．４％から０．８％までの（Ｐ＝０．０５、Ｂａｔｆ３-/-のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図９Ａ）、注射された腫瘍において２．６％から０．３％までの（Ｐ＜０．０００１、Ｂａｔｆ３-/-のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図９Ｂ）、ＣＤ２４+のＤＣの低減をもたらしたことを見出した。これらの発見は樹状細胞の活性化と一致する。
【０１０５】
ＣＤ１０３+のＤＣは、末梢ＤＣの亜集団であり、抗原の交差提示に専門化している。Ｂａｔｆ３は、ＣＤ１０３+のＤＣの分化に重要な転写因子である。ＣＤ１０３+のＤＣは、宿主抗腫瘍免疫において重要な役割を果たす。本開示の発明者らは、以前に、Ｂａｔｆ３依存性のＣＤ１０３+のＤＣが不活化ＭＶＡ媒介抗腫瘍効果に必要であることを示している（ＷＯ２０１６／１６８８６２）。ここで、本発明者らは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１０３+のＤＣのパーセンテージを調べた。ＷＴマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射されていない腫瘍において１．０％から０．３％までの（Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１０、１１Ａ）、注射された腫瘍において０．９％から０．０５％までの（Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１０、１１Ｂ）、ＣＤ１０３+のＤＣの低減をもたらしたことを見出した。予想通り、ＣＤ１０３+のＤＣは、ＷＴマウスと比べてＢａｔｆ３-/-マウスにおいて大きく低減していた（Ｐ＜０．０００１、ＷＴのＰＢＳ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図１０、１１Ａ、１１Ｂ）。これらの結果は、ＣＤ１０３+のＤＣがウイルスの腫瘍内注射の後に動的な変化を経ることを示す。
【０１０６】
注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方におけるＣＤ４５+細胞のうちのＣＤ１１ｂ+のＤＣのパーセンテージもまた調べた。ＷＴマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍において０．９％から０．０６％までの（Ｐ＜０．０１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１０、１１Ｄ）、注射されていない腫瘍において１．０％から０．８％までの（Ｐ＝０．５４、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１０、１１Ｃ）、ＣＤ１０３+のＤＣの低減をもたらしたことを見出した。予想通り、ＣＤ１１ｂ+のＤＣは、ＷＴマウスと比べてＢａｔｆ３-/-マウスにおいて影響を受けなかった（図１０、１１Ｃ、および１１Ｄ）。これらの結果は、ＣＤ１１ｂ+のＤＣがウイルスの腫瘍内注射の後に、注射された腫瘍において動的な変化を経ることもできることを示す。ＣＤ１１ｂ+のＤＣは、注射されていない腫瘍において、ＣＤ１０３+のＤＣよりも移動性が低い。
【０１０７】
（例７）
注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+細胞およびＬｙ６Ｃ+ＣＤ１１ｂ-細胞の流入をもたらす
Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+細胞は、Ｃ−Ｃケモカイン受容体（ＣＣＲ２）を発現する炎症性単球であり、Ｃ−Ｃケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）によって損傷または感染の部位へと動員される。これらの細胞は、ＴＮＦおよびｉＮＯＳ産生樹状細胞（ＴｉｐＤＣ）および他の炎症性細胞亜集団を発生させ、組織損傷または微生物殺傷をもたらす。本発明者らは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＣＤ４５+細胞のうちのＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+の単球のパーセンテージを調べた。ＷＴマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍において１１．７％から３７％までの（Ｐ＝０．００１１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１２、１３Ｂ）、注射されていない腫瘍において１３．５％から２６％までの（Ｐ＝０．０１０２、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１２、１３Ａ）、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+の単球の増加 をもたらしたことを見出した。予想通り、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+の単球は、ＷＴマウスと比べてＢａｔｆ３-/-マウスにおいて影響を受けなかった（図１２、１３Ａ、および１３Ｂ）。興味深いことに、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射は、注射された腫瘍において１１．７％から２５．７％までの（Ｐ＝０．００１１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１２、１３Ｂ）、注射されていない腫瘍において１３．５％から３５．６％までの（Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ対ＰＢＳ、図１２、１３Ａ）、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+の単球の増加をもたらした。これらの結果は、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ+の単球が、ウイルス処理の後、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において動員されることを示す。
【０１０８】
本発明者らは、ウイルス処理マウスにおける注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞の劇的な増加も観察した。ＷＴマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍において１６．５％から３２．７％までの（Ｐ＝０．００４７、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１２、１３Ｄ）、注射されていない腫瘍において１５．３％から３２．７％までの（Ｐ＝０．００４５、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、図１２、１３Ｃ）、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞の増加をもたらした。ＰＢＳ処理マウスにおけるＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞は、Ｂａｔｆ３-/-マウスにおいて、ＷＴマウスと比べて低減していた（ＷＴマウスにおける１６．５％対Ｂａｔｆ３-/-マウスにおける４．９％、図１２、１３Ｃ、および１３Ｄ）。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、注射された腫瘍において４．９％から１３．３％までの（Ｐ＝０．０１１７、Ｂａｔｆ３-/-のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対Ｂａｔｆ３-/-のＰＢＳ、図１２、１３Ｄ）、注射されていない腫瘍において６．３％から１３．９％までの（Ｐ＜０．０５、Ｂａｔｆ３-/-のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対Ｂａｔｆ３-/-ＰＢＳ、図１２、１３Ｃ）、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞の増加をもたらした。これらの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｍＧＭ−ＣＳＦ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ、またはＨｅａｔ−ＭＶＡ処理のような免疫刺激ウイルス処理の後に、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞が動員されることを示す。抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞と抗ウイルスＣＤ８+Ｔ細胞が、腫瘍部位へのＬｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞の動員に重要かも知れないということがあり得る。
【０１０９】
（例８）
両側ＭＣ３８腫瘍移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的である
異なる固形腫瘍モデルにおいてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＭＶＡΔＥ３Ｌの抗腫瘍効果を比較するために、本発明者らは、Ｃ５７Ｂ／６マウスの右側に、５×１０5ＭＣ３８結腸癌細胞を左側に１×１０5細胞を皮下移植した。腫瘍を７〜８日間増殖するようにし、その後、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）またはＰＢＳコントロールを週に２回より大きな腫瘍に注射した。全てのＰＢＳコントロールマウスが、ＰＢＳモック処理後７〜１４日（１０日の生存期間中央値）で腫瘍増殖により死亡した（図１４Ａおよび１４Ｂ）が、一方で、ＭＶＡΔＥ３Ｌによる腫瘍内注射は、生存期間中央値をＰＢＳ群における１０日からＭＶＡΔＥ３Ｌ群における２１日まで延長した（****、ＭＶＡΔＥ３Ｌ（ｎ＝１０）対ＰＢＳ（ｎ＝１０）に対してＰ＜０．０００１）。
【０１１０】
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、生存期間中央値を２３日までさらに延長した（**、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝１０）対ＭＶＡΔＥ３Ｌ（ｎ＝１０）に対してＰ＜０．００３）。これらの結果は、両側ＭＣ３８腫瘍移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬがＭＶＡΔＥ３Ｌよりも効果的であることを示す。
【０１１１】
（例９）
ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射はまた、マウストリプルネガティブ乳癌４Ｔ１両側移植モデルにおいて効果的である
Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫およびＭＣ３８結腸腺癌モデルに加えて、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）４Ｔ１両側腫瘍移植モデルの治療において効果を有するかどうかを調べた。簡単に言うと、４Ｔ１マウストリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの左右の側面へと皮下移植された（右側に２．５×１０5、および左側に５×１０4）。腫瘍移植の５日後、右側のより大きな腫瘍に、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれか（２×１０7ｐｆｕ）を週に２回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。マウスの生存をモニターした。ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、ＰＢＳ処理腫瘍と比べて注射された腫瘍の腫瘍容積の劇的な減少を導いた（図１５Ａ）。処理後１８日の注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の腫瘍容積を示した（図１５、Ｂ、Ｃ、Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。より重要なことに、マウスの平均生存期間は、ＰＢＳ処理マウスにおける１８日からＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスにおける２１日まで延長した（図１５Ｄ、Ｐ＝０．０００１、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。これらの結果は、両側４Ｔ１乳癌モデルにおけるＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、腫瘍増殖の遅延および処理マウスの延長した生存期間の点において効果的であるということを示す。本明細書に含まれる結果に基づいて、この両側４Ｔ１移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌと抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体のような免疫チェックポイント遮断との組み合わせがもまた、ウイルス療法単独よりも効果的であろうと予想する。
【０１１２】
（例１０）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、ＳＴＩＮＧを必要とするマウス前立腺癌ＴＲＡＭＰ−Ｃ２片側腫瘍移植モデルにおいて効果的である
本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がマウス前立腺癌ＴＲＡＭＰ−Ｃ２片側腫瘍移植モデルの治療において効果を有しているかどうかを調べた。簡単には、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞を、ＳＴＩＮＧGt/Gtマウスおよび年齢を一致させたＷＴのＣ５７Ｂ／６コントロールの剃毛した右側に皮下移植した（１匹のマウス当たり、５０μｌのＰＢＳ中の１×１０6細胞）。腫瘍移植の１７日後、右側の腫瘍（直径およそ３〜４ｍｍ）に、ＰＢＳまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌのいずれか（２×１０7ｐｆｕ）を週に２回注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した。マウスの生存をモニターした。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、ＷＴマウスにおいて、ＰＢＳ処理腫瘍と比べて、注射された腫瘍の腫瘍容積を劇的な減少をもたらしたが、ＳＴＩＮＧ欠損マウスにおいて有効性がより低かった（図１６、Ａ〜Ｄ）。最初の腫瘍容積および注射後２４日の腫瘍容積を、それぞれ図１６ＥおよびＦに示した。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ注射腫瘍の平均容積は、ＷＴマウスにおいて１１８ｍｍ3であり、ＳＴＩＮＧGt/Gtマウスにおいて２８２ｍｍ3であったが、一方で、ＰＢＳ注射腫瘍の平均容積は、ＷＴマウスにおいて３３８ｍｍ3であり、ＳＴＩＮＧGt/Gtマウスにおいて４３３ｍｍ3であった（図１６Ｆ、Ｐ＜０．０００１、ＷＴマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ、Ｐ＜０．０００１、ＳＴＩＮＧGt/GtマウスにおけるＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。これらの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが、ＷＴおよびＳＴＩＮＧGt/Gtマウスの両方において抗腫瘍効果を有するが、ＷＴマウスにおいて、ＳＴＩＮＧGt/Gtマウスにおけるものよりも効果的であった（図１６Ｆ、Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで処理されたＳＴＩＮＧGt/Gt対ＷＴマウス）。この実験は、ＰＣＴ出願時にまだ進行している。生存期間のデータは、実験の最後に利用可能であろう。これらの結果は、ＳＴＩＮＧ依存的細胞質ＤＮＡ感知経路が、この片側マウス前立腺癌モデルにおいてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの抗腫瘍効果を媒介する点において重要な役割を果たすことを示す。本発明者らは、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおいて、ＳＴＩＮＧ依存的細胞質ＤＮＡ感知経路が、熱不活化ＭＶＡ媒介抗腫瘍効果にとって重要であることを以前に報告した（国際特許出願ＷＯ／２０１６／１４４５６４を参照）。Ｈｅａｔ−ＭＶＡと同様に、ＭＶＡΔＥ３Ｌは、大部分は細胞質ＤＮＡ感知経路を介してＢＭＤＣにおいてＩ型ＩＦＮを誘導する（ＭＶＡΔＥ３Ｌ特許仮出願を参照）。本明細書において、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が前立腺癌モデルにおいてＳＴＩＮＧによって媒介される抗腫瘍効果を誘導することを確認した。
【０１１３】
（例１１）
両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫移植モデルにおいて、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射もまた効果的である
ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、両側Ｂ１６−Ｆ１０移植モデルにおいて抗腫瘍効果を発揮するかどうかを試験するために、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３ＬもしくはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＰＢＳを、週に２回より大きい腫瘍に注射し、腫瘍サイズと生存をモニターした。本発明者らは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が腫瘍を根絶するか、または腫瘍増殖を遅延させ、ＰＢＳ群における１１日の生存期間中央値をＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ群における２８日にまで延長することを見出した（***、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌ（ｎ＝８）対ＰＢＳに対して（ｎ＝５）Ｐ＝０．０００８）（図１７Ａおよび１７Ｃ）。この結果は、ＭＶＡ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射がまた、両側腫瘍移植モデルにおいて腫瘍に対して効果的であることを示す。
【０１１４】
（例１２）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と免疫チェックポイントの全身性送達との組み合わせが、両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫移植モデルにおいて、相乗的抗腫瘍効果を有する
本発明者らは、両側Ｂ１６−Ｆ１０およびＭＣ３８腫瘍移植モデルにおいて、不活化ＭＶＡの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断の全身性送達が、いずれかの剤単独と比べて増強した効果をもたらすことを以前に示した。本開示において、本発明者らは、両側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断の全身性送達がまた、ウイルス療法単独と比べてより良好な腫瘍殺傷および改善された生存期間をもたらすかどうかを試験した。腫瘍移植の８日後、週に２回、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスを右側のより大きな腫瘍に注射した。４つのマウスの群がＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌによって処理され、各々の群は、アイソタイプコントロール、または抗ＣＴＬＡ−４、または抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかの腹腔内送達を受けた（図１７Ａ、Ｂ）。ＰＢＳ処理マウスがＰＢＳモック処理の６〜１４日後に腫瘍増殖の増加によって急速に死亡した一方で、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋アイソタイプコントロールで処理したマウスが、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を排除し、またはその増殖を遅延させた（図１７Ａ、Ｂ）。結果として、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋アイソタイプ（ｎ＝９）は、それらの生存期間をＰＢＳ群（ｎ＝５）と比べて有意に延長した（図１７Ｃ、**、Ｐ＝０．００１１）。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体の全身性送達との組み合わせは、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を根絶する、またはその増殖を遅延させる点において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ単独の腫瘍内注射よりも効果的であった。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＣＴＬＡ−４で処理したマウスの２／９、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ−１で処理したマウスの３／９、およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１で処理したマウスの４／８が、処理後１１２日で腫瘍がないものとなったが、一方で、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋アイソタイプで処理したマウスの２／９が腫瘍がないものとなった。（図１７、Ａ〜Ｃ）。抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１の腹腔内送達単独は、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおいて最小の治療上の有益性を有した。これらの結果は、転移性Ｂ１６黒色腫モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達が免疫チェックポイント遮断に対する処理抵抗性を克服し、改善された抗腫瘍効果をもたらすことを示す。
【０１１５】
（例１３）
免疫チェックポイントの全身性送達と組み合わせたＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射で処理された生存マウスは、異なる腫瘍型の負荷に対する免疫を生じさせる
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の後の生存マウスが異なる腫瘍型に対して免疫を生じさせるかどうかを評価するために、皮下移植によって致死用量のＭＣ３８（１×１０5）を再負荷した。上記腫瘍またはウイルスに対してそれまでに曝露していないナイーブマウス（ｎ＝４）をコントロールとして使用した。この実験において、全てのナイーブマウスが腫瘍を発生し、３４日の生存期間中央値を有して腫瘍移植の３４〜４２日後で死亡したが、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋免疫チェックポイント遮断で処理した生存マウスの全ては、ＭＣ３８腫瘍負荷を拒絶した（図１７Ｄ）。これらはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＣＴＬＡ−４群からの２匹の生存マウス、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ−１群からの３匹のマウス、およびＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＰＤ−Ｌ１群からの４匹のマウスを含む。これらの結果は、免疫チェックポイント遮断の存在下でのＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫とＭＣ３８結腸癌との共通の抗原の効果的な認識、および異なる腫瘍に対する抗腫瘍免疫の発生を可能にすることを示唆する。
【０１１６】
（例１４）
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、抗腫瘍ＣＤ８+Ｔ細胞免疫の生成をもたらし、これは抗ＣＴＬＡ−４抗体の存在下で増強される
本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射単独または抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内送達の存在下のＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の処理後に、生存マウスがＢ１６−Ｆ１０およびＭＣ３８結腸癌に対する抗腫瘍メモリーＴ細胞免疫を生じさせるかどうかを、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳｐｏｔ）を用いることによって試験した。簡単に言うと、ＣＤ８+Ｔ細胞を脾細胞より単離し、１×１０5細胞を、抗ＩＦＮ−γコーティングされたＢＤ  ＥＬＩＳＰＯＴプレートマイクロウェル中にて３７℃で一晩培養した。ＣＤ８+Ｔ細胞を、γ線照射器によって放射線照射したＢ１６−Ｆ１０またはＭＣ３８細胞のいずれかで刺激し、サイトカイン分泌を抗ＩＦＮ−γ抗体によって検出した。ナイーブマウスからのＣＤ８+Ｔ細胞は、Ｂ１６−Ｆ１０またはＭＣ３８細胞のいずれに対してもまったく反応性を示さなかったが、一方でＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスからのＣＤ８+Ｔ細胞は、Ｂ１６−Ｆ１０とＭＣ３８細胞の両方に対する反応性を示した（図１８、ＡおよびＢ）。マウスにＢ１６−Ｆ１０を移植して、続けてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌで腫瘍内処理したがＭＣ３８細胞に決して曝露していない別の実験において、ＭＣ３８細胞に対する同様の反応性も観察した（データ示さず）。これらの結果は、Ｂ１６−Ｆ１０の治療のためのＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射が、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫に対してのみではなく、無関係な腫瘍型、この場合には、ＭＣ３８結腸腺癌に対する抗腫瘍免疫の発生をもたらすことを示す。これは、Ｂ１６−Ｆ１０に対してＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌによって処理された生存マウスがまた、致死用量のＭＣ３８の負荷を成功裏に拒絶するというインビボの発見（例３、図３Ｄ）を裏付ける。交差防御はまた、ＭＶＡΔＥ３Ｌもしくは熱不活化ＭＶＡまたは熱不活化ワクシニアが腫瘍内送達されたときにも観察された（データ示さず）。交差防御の効果は、Ｅ３ＬΔ８３Ｎ−ＴＫ-−ｈＦｌｔ３Ｌのような複製腫瘍溶解性ウイルスを使用したときにより弱かった（データ示さず）。免疫原性ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌまたは熱不活化ワクシニアの感染が、Ｂ１６−Ｆ１０とＭＣ３８の癌細胞の両方に存在する腫瘍抗原の効果的な交差提示をもたらし、これが、異種腫瘍の交差防御の発生をもたらすことがありえる。
【０１１７】
ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射と抗ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内送達との組み合わせが、ウイルス単独で処理したものよりもかなり強い抗Ｂ１６−Ｆ１０と抗ＭＣ３８のＣＤ８+Ｔ細胞の応答を生じさせた（図１８、ＡおよびＢ、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ単独対ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ＋抗ＣＴＬＡ−４によって誘導された抗Ｂ１６−Ｆ１０または抗ＭＣ３８のＣＤ８+Ｔ細胞応答に対し、**、Ｐ＜０．０１、****、Ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、ウイルス療法と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせが、エフェクターＴ細胞の応答のみでなく、メモリーＴ細胞の応答をも増強することを示す。
【０１１８】
（例１５）
熱不活化ＭＶＡによる腫瘍内注射は、両側Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍移植モデルにおいて注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、Ｉ型ＩＦＮならびに炎症性サイトカインおよびケモカインを誘導する
本発明者らは、インビトロでの腫瘍細胞または樹状細胞の、熱不活化ＭＶＡ（Ｈｅａｔ−ＭＶＡ）またはＭＶＡΔＥ３Ｌのいずれかによる感染が、Ｉ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン産生をもたらすことを以前に示した（国際特許出願ＷＯ／２０１６／１４４５６４およびＷＯ／２０１６／１６８８２を参照）。インビボにおいてＨｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射がＩ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインを誘導することができるかどうかを試験するために、本発明者らは以下の実験を実施した。簡単に言うと、６〜８週齢のＣ５７Ｂ／６マウスに対し、２．５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を左側に、５×１０5のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を右側に皮下移植した。移植後７日で、ＭＶＡ（２×１０7ｐｆｕ）もしくはＨｅａｔ−ＭＶＡ、またはＰＢＳを右側のより大きな腫瘍に注射した。注射は３日後に繰り返した。注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方を、最初の注射後７日で採取し、細胞懸濁液を作製した。ＲＮＡを細胞より抽出し、定量的リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。結果は、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射が、ＭＶＡよりも非常に高いレベルのＩｆｎｂ、Ｉｌ６、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ９、およびＣｘｃｌ１０を含む遺伝子の誘導を誘導したことを示した（図１９）。これはおそらくは、Ｈｅａｔ−ＭＶＡのＭＶＡより高い、免疫および注射された腫瘍における腫瘍細胞の両方においてｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ媒介細胞質ＤＮＡ感知メカニズムを活性化する能力によるものである。注射されていない腫瘍において、Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射が広範囲のサイトカインおよびケモカイン産生を誘導できたという観察は興味深い。これは、腫瘍特異的ＣＤ８+とＣＤ４+との両方のＴ細胞が、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍に動員されて活性化されて、これが腫瘍細胞の殺傷をもたらすという事実によって説明できる。腫瘍ＤＮＡの放出は、樹状細胞、マクロファージ、および単球を含む免疫細胞におけるｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ細胞質ＤＮＡ感知経路によって感知でき、これがＩｆｎｂ、Ｉｌ６、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ９、およびＣｘｃｌ１０の遺伝子発現の誘導をもたらす。
【０１１９】
Ｅ３は、免疫回避ビルレンス因子であるので、免疫細胞と腫瘍細胞との両方において、ＭＶＡΔＥ３Ｌは、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ依存性細胞質ＤＮＡ感知経路とＭＤＡ５／ＭＡＶＳ依存性細胞質ｄｓＲＮＡ感知経路の両方の活性化を介して、ＭＶＡよりも高いレベルのＩ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインを誘導する。本明細書における結果に照らして、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３ＬまたはＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、インビボの注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方においてＭＶＡよりも高いレベルのＩ型ＩＦＮならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインを誘導するであろうと予想する。ＳＴＩＮＧまたはＢａｔｆ３の非存在下で、Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射によって誘導される抗腫瘍Ｔ細胞応答は、有意に弱められる（参照によりその全体を組み入れるＷＯ／２０１６／１４４５６４）。さらに、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、ＷＴマウス内の注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方に対する、Ｌｙ６ＣhiＣＤ１１ｂ-細胞の流入を誘導するが、この細胞型の流入は、Ｂａｔｆ３−／−マウスにおいて有意に低減した（例７、図１３ＣおよびＤ）。本発明者らはまた、注射された腫瘍および注射されていない腫瘍の両方において、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが誘導したＩｆｎｂ、Ｉｌ６、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ９、およびＣｘｃｌ１０の遺伝子発現が、ＳＴＩＮＧまたはＢａｔｆ３欠損マウスにおいて低減するであろうと予想する。
【０１２０】
（例１６）
熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射が、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）における抗黒色腫ＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導する
Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内送達がＴＤＬＮにおいて活性化ＣＤ８+Ｔ細胞の誘導をもたらすことが示されているが、それらが抗腫瘍Ｔ細胞であるか抗ウイルスＴ細胞であるかは不明である（参照によりその全体を組み入れるＷＯ／２０１６／１４４５６４）。Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射が活性化腫瘍特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の誘導をもたらすかどうかを試験するために、本発明者らは、メラニン形成細胞抗原ＴＲＰ−２免疫原ペプチドと反応するＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためのＴＲＰ−２テトラマーアッセイを用いた。簡単に言うと、ＷＴのＣ５７Ｂ／６およびＢａｔｆ３-/-のマウスにＢ１６−Ｆ１０を皮下移植した。腫瘍が直径４ｍｍになったとき、それらを、３日の間隔で２回、Ｈｅａｔ−ＭＶＡの皮下注射で処理した。最初の注射の７日後、ＴＤＬＮをインキュベートし、細胞懸濁液を調製し、抗ＦｃγＲＩＩ（２．４Ｇ２）およびＰＥ−Ｈ−２Ｋｂ  ＴＲＰ２（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）テトラマー（ＭＢＬ）と共に室温で３０分間インキュベートし、その後に抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体で染色した。細胞をＦＡＣＳによって解析した。Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射が、ＰＢＳコントロールと比べてＴＤＬＮ内のＴＲＰ−テトラマー陽性ＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージの増加をもたらすことを観察した（図２０、ＡおよびＢ、*、Ｐ＜０．０５、Ｈｅａｔ−ＭＶＡにおける９％対ＰＢＳ処理マウスにおける１．６％）。この誘導は、Ｂａｔｆ３欠損マウスにおいて低減した（図２０、ＡおよびＢ、*、Ｐ＜０．０５、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ処理ＷＴマウスにおける９％対Ｈｅａｔ−ＭＶＡ処理Ｂａｔｆ３-/-マウスにおける１．１％）。これらの結果は、Ｈｅａｔ−ＭＶＡによる腫瘍内注射が、抗腫瘍特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の応答をもたらし、これがＢａｔｆ３依存性ＤＣを必要とすることを示す。本明細書における実験的証拠に照らして、本発明者らは、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌウイルスによっても同様の結果が得られるであろうと予想する。
【０１２１】
（例１７）
片側腫瘍移植モデルにおいて大きく確立されたＢ１６−ＯＶＡ黒色腫の治療においてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は効果的である
本発明者らは、大きく確立されたＢ１６−ＯＶＡ片側腫瘍移植モデルにおいて、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射の抗腫瘍効果を熱不活化ＭＶＡ（Ｈｅａｔ−ＭＶＡ）またはポリ（Ｉ：Ｃ）と比較した。この実験において、恒常的にオボアルブミン（ＯＶＡ）を発現するＢ１６−ＯＶＡ黒色腫（５０μｌの容量中の５×１０5細胞）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚に皮下移植した。移植の９日後、腫瘍サイズを測定し、直径５〜６ｍｍの腫瘍に、週に２回、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ（２×１０7ｐｆｕ）、またはＨｅａｔ−ｉＭＶＡ（ＭＶＡの２×１０7ｐｆｕに相当）、またはポリ（Ｉ：Ｃ）またはＰＢＳを注射した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した（図２１Ａ）。ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内注射は、処理されたマウスの全てにおいて、腫瘍増殖を遅延させる点において効果的であった（図２１Ｂ）。それはまた、ＰＢＳ処理マウスにおける９日からＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ処理マウスにおける２３日まで生存期間中央値を延長した（図２１Ｄ、Ｐ＜０．０００１、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ対ＰＢＳ）。注射時の最初の腫瘍容積は、各々の実験群において同様の４５ｍｍ3の平均腫瘍容積で開始した（図２１Ｃ）。大きく確立された腫瘍におけるＨｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射はまた、有効であり、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ処理マウスの生存期間中央値は２６．５日に延長した（図２１Ｄ、Ｐ＜０．０００１、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ対ＰＢＳ）。合成ｄｓＲＮＡであるポリ（Ｉ：Ｃ）は、自然免疫アゴニストである。細胞外ポリ（Ｉ：Ｃ）はエンドソーム局在化Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）を活性化でき、一方で、細胞内ポリ（Ｉ：Ｃ）は、細胞質ｄｓＲＮＡセンサーである、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）を活性化できる。腫瘍微小環境におけるＣＤ１０３+ＤＣおよび腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＤ８□+ＤＣは、高レベルのＴＬＲ３を発現しているので、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、交差提示ＤＣの効果的な免疫調節因子となり得る（Salmon et al., Immunity 2016）。週２回のポリＩ：Ｃの腫瘍内注射（マウス１匹当たり５０μｇ）はまた、この大きく確立された片側Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫モデルにおいて腫瘍収縮をもたらした（図２１Ｂ）。それまたは、ＰＢＳ処理マウスにおける９日からポリ（Ｉ：Ｃ）処理マウスにおける１７日まで生存期間中央値を延長した（図２１Ｄ、Ｐ＜０．０００１、ポリ（Ｉ：Ｃ）対ＰＢＳ）。ポリ（Ｉ：Ｃ）はＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＨｅａｔ−ＭＶＡよりも強力ではないように見えたが、その差は統計学的に有意ではなかった（図２１Ｄ）。さらに、ポリ（Ｉ：Ｃ）処理マウスは、疲労や衰弱を含む全身的な病気を呈した。おそらく、腫瘍内送達されたポリ（Ｉ：Ｃ）が全身循環へと漏れ出し、免疫関連副作用を引き起こした。この実験からの結果は、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３ＬまたはＨｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射が、片側移植モデルにおいて大きく確立された非常に悪性であるＢ１６−ＯＶＡを治療する点で効果的であることを示した。
【０１２２】
（例１８）
熱不活化ＭＶＡの腫瘍内注射と免疫チェックポイント抗体の全身性送達との組み合わせが、大きく確立された黒色腫片側移植モデルにおける抗腫瘍効果を改善する
本発明者らは、熱不活化ＭＶＡ（Ｈｅａｔ−ＭＶＡ）の腫瘍内注射と抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体のような免疫チェックポイント遮断の全身性送達との組み合わせが、片側腫瘍移植モデルにおける大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０の根絶における増強された能力を有するかどうかをさらに試験した。簡単に言うと、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（５×１０5細胞）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側の剃毛した皮膚に皮下移植した。移植の９日後、直径５〜６ｍｍの腫瘍にＨｅａｔ−ＭＶＡ（ＭＶＡの２×１０7ｐｆｕに相当）またはＰＢＳを注射した。マウスはまた、週に２回、抗ＣＴＬＡ−４抗体（マウス１匹当たり１００μｇ）、抗ＰＤ−１抗体（マウス１匹当たり２５０μｇ）、または抗ＰＤ−Ｌ１（マウス１匹当たり２００μｇ）の腹腔内送達で処理した。マウスを毎日モニターし、腫瘍サイズを週に２回測定した（図２２Ａ）。Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射は、処理されたマウスの全てにおいて腫瘍増殖を遅延させる点、および処理されたマウスの１０分の１において腫瘍を根絶する点において効果的であった（図２２Ｂ）。それはまた、ＰＢＳ処理マウスにおける６日から熱処理マウスにおける２７日まで生存期間中央値を延長した（図２２Ｄ、****、Ｐ＜０．０００１、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ対ＰＢＳ）。注射時の最初の平均初期腫瘍容積は、ＰＢＳ群において７６ｍｍ3で、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ＋アイソタイプ群において５５ｍｍ3で開始した（図２２Ｃ、*、Ｐ＜０．０５、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ対ＰＢＳ）。免疫チェックポイント遮断抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１の存在下でのＨｅａｔ−ＭＶＡ腫瘍内注射は、１０匹の処理マウスのうち４匹を治癒した（図２２Ｄ）が、Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射と抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせは、大きく確立された腫瘍の８０％の治癒をもたらした（図２２Ｄ、*、Ｐ＜０．０５、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ＋抗ＰＤ−Ｌ１対Ｈｅａｔ−ＭＶＡ＋抗ＣＴＬＡ−４またはＨｅａｔ−ＭＶＡ＋抗ＰＤ−１、**、Ｐ＜０．０１、Ｈｅａｔ−ＭＶＡ＋抗ＰＤ−Ｌ１対Ｈｅａｔ−ＭＶＡ＋アイソタイプ）。これらの結果は、片側移植モデルにおける不十分な免疫原性の大きく確立されたＢ１６−Ｆ１０の処理の点で、Ｈｅａｔ−ＭＶＡの腫瘍内注射と免疫チェックポイント遮断の組み合わせが、ウイルス療法単独よりも効果的であることを示した。Ｈｅａｔ−ＭＶＡと抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせは、試験された全ての組み合わせのうち最も強力であるように見える。この大きく確立された腫瘍モデルにおいてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌが、Ｈｅａｔ−ＭＶＡと類似の能力を有した（例１８、図２１）ので、ＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌの腫瘍内送達と免疫チェックポイント遮断の組み合わせが、黒色腫および他の固形腫瘍モデルにおいてＭＶＡΔＥ３Ｌ−ｈＦｌｔ３Ｌ単独よりも増強した抗腫瘍効果を有することを予想する。
【０１２３】
上の明細書、例、およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全な説明を提供する。しかしながら、これらは例示であり、非限定的である。本発明の範囲は特許請求の範囲にある。
本明細書において引用される全ての特許および文献は、参照によりその全体を全ての目的に対して組み入れられる。本明細書に開示されるいかなる実施形態または特許請求の範囲の特徴も、出願人の裁量により除外することができる。
【０１２４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−Ｄ】
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【図１６Ａ−Ｄ】
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【図１６Ｅ−Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ−Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ−Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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