(57)【要約】  新規の抗ＣＬＤＮ抗体及び抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（これらの誘導体を含む）、並びにこれらを使用して増殖性障害を治療する方法が、本明細書において提供される。
2019500335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞毒性剤と操作可能に会合されている抗ＣＬＤＮ抗体を含む抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２】
式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎの抗体薬物コンジュゲート、又は薬学的に許容されるその塩。
（式中、Ｍは、抗ＣＬＤＮ抗体を含み、
Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
Ｄは、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）弾頭を含み、Ｄは、
【化１】
2019500335.tif 000041
からなる群から選択され、
ｎは、１〜２０の整数である）
【請求項３】
モノクローナル抗体である抗ＣＬＤＮ抗体を含む、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項４】
抗ＣＬＤＮ抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片及びＳｃＦｖ断片；又はこれらの免疫反応性断片からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項５】
抗ＣＬＤＮ抗体が、部位特異的抗体である、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項６】
配列番号２１として示される軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３として示される重鎖可変領域（ＶＨ）（ＳＣ２７．１）；又は配列番号２５として示されるＶＬ及び配列番号２７として示されるＶＨ（ＳＣ２７．２２）；又は配列番号４５として示されるＶＬ及び配列番号４７として示されるＶＨ（ＳＣ２７．１０８）；又は配列番号５７として示されるＶＬ及び配列番号５９として示されるＶＨ（ＳＣ２７．２０４）を含む抗体を含む、又はヒトＣＬＤＮタンパク質への結合についてこの抗体と競合する抗ＣＬＤＮ抗体を含む、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項７】
配列番号６１として示される軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号６３として示される重鎖可変領域（ＶＨ）（ｈＳＣ２７．１）；又は配列番号６５として示されるＶＬ及び配列番号６７として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．２２）；又は配列番号６９として示されるＶＬ及び配列番号７１として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．１０８）；又は配列番号７３として示されるＶＬ及び配列番号７５として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．２０４）；又は配列番号７３として示されるＶＬ及び配列番号７７として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２）を含む抗体を含む、又はヒトＣＬＤＮタンパク質への結合についてこの抗体と競合する抗ＣＬＤＮ抗体を含む、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項８】
３つの相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、すなわち、配列番号１０９を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１０を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１１１を有するＣＤＲＬ３を有するＶＬ、並びに３つの相補性決定領域（ＣＤＲＨ）すなわち、配列番号１１２を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１５を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１１４を有するＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む抗体を含む、又はヒトＣＬＤＮタンパク質への結合についてこの抗体と競合する抗ＣＬＤＮ抗体を含む、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項９】
配列番号７８を有する軽鎖及び配列番号７９を有する重鎖（ｈＳＣ２７．１）を含む抗体；又は配列番号８０を有する軽鎖及び配列番号８１を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２２）；又は配列番号８０を有する軽鎖及び配列番号８２を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１）；又は配列番号８３を有する軽鎖及び配列番号８４を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．１０８）、又は配列番号８３を有する軽鎖及び配列番号８５を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１）、又は配列番号８６を有する軽鎖及び配列番号８７を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４）；又は配列番号８６を有する軽鎖及び配列番号８８を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２）；又は配列番号８６を有する軽鎖及び配列番号８９を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１）を含む抗体を含む、又はヒトＣＬＤＮタンパク質への結合についてこの抗体と競合する抗ＣＬＤＮ抗体を含む、請求項１又は２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１０】
がん幹細胞に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＤＣを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項１３】
がんが、子宮内膜がん、卵巣がん、乳がん及び肺がんから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
がんが、漿液性卵巣がんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
がんが、卵巣類内膜癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
がんが、子宮体部子宮内膜癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
がんが、肺扁平上皮癌又は肺腺癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
がんが、トリプルネガティブ乳がんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの追加の治療成分を対象に投与することをさらに含む、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞集団中のがん幹細胞を減少させる方法であって、がん幹細胞及びがん幹細胞以外の腫瘍細胞を含む腫瘍細胞集団を、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＤＣと接触させることを含み、これによってがん幹細胞の頻度を減少させる、方法。
【請求項２１】
細胞を請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡＤＣと接触させることを含む、細胞毒を細胞に送達する方法。
【請求項２２】
抗ＣＬＤＮ抗体（Ａｂ）に薬物（Ｄ）をコンジュゲートする工程を含む、請求項１又は２に記載のＡＤＣを生成する方法。
【請求項２３】
抗体が部位特異的抗体を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｄが、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）弾頭を含み、
【化２】
2019500335.tif 000042
からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＤＣが、薬物（Ｄ）を含むＰＢＤペイロードを含み、前記ペイロードが、
【化３】
2019500335.tif 000043
2019500335.tif 000044
2019500335.tif 000045
からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１１に記載の医薬組成物を含有する１つ以上の容器、及び
組成物が、がんを有する対象を治療するためのものであることを示す、１つ以上の容器に付随するラベル又は添付文書
を含む、キット。
【請求項２７】
請求項１１に記載の医薬組成物を含有する１つ以上の容器、及び
がんを有する対象に対する投与量レジメンを示す、１つ以上の容器に付随するラベル又は添付文書
を含む、キット。
【請求項２８】
【化４】
2019500335.tif 000046
2019500335.tif 000047
（式中、Ａｂは、抗ＣＬＤＮ抗体又はこの免疫反応性断片を含む）
からなる群から選択される、抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
以下の式の抗体薬物コンジュゲート。
【化５】
2019500335.tif 000048
（式中、Ａｂは、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１（配列番号８６及び８９）を含む）
【請求項３０】
以下の式の抗体薬物コンジュゲート。
【化６】
2019500335.tif 000049
（式中、Ａｂは、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１（配列番号８６及び８９）を含む）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年１２月４日に出願された米国仮出願第６２／２６３，５４２号、２０１６年１１月２８日に出願された米国仮出願第６２／４２７，０２７号の優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１６年１２月１日に作成され、ｓｃ２７０４ＷＯＯ１＿Ｓ６９６９７＿１３３０ＷＯ＿ＳＥＱＬ＿１２０１１６．ｔｘｔと名付けられ、大きさが１１４，４０４バイトである。
【０００３】
発明の分野
本出願は、一般に、がん及びがんの何らかの再発又は転移の治療、診断又は予防のための、新規の抗クローディン（抗ＣＬＤＮ）抗体又はその免疫反応性断片、及びそれを含む抗体薬物コンジュゲートを含む組成物に関する。本発明の選択された実施形態は、腫瘍形成性細胞の頻度の減少を含むがんの治療のための、このような抗ＣＬＤＮ抗体又は抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
クローディンは、例えば上皮細胞シート又は内皮細胞シートにおいて見出されるような、極性細胞タイプにおける最も頂端の細胞−細胞接着結合である密着結合の、主要な構造タンパク質を含む内在性膜タンパク質である。密着結合は、細胞周辺に連続的なシールを形成するネットワーク形成タンパク質の鎖からなり、細胞と細胞との隙間における溶質及び水の輸送に対する物理的であるが、調節可能なバリアをもたらす。ヒトにおけるタンパク質のクローディンファミリーは、２２〜３４ｋＤａのサイズの範囲の少なくとも２３種のメンバーからなる。クローディンは、正常組織の機能及びホメオスタシスに重要であるが、腫瘍細胞は、密着結合機能の異常を示すことが多い。このことは、腫瘍細胞の脱分化の帰結として、又はがん性組織が迅速に成長するために異常な血管形成を伴う腫瘍塊内において栄養を効率的に吸収する必要性があることの帰結としての、クローディンの発現の調節異常及び／又は局在化と結びつき得る（Ｍｏｒｉｎ、２００５年、ＰＭＩＤ：１６２６６９７５）。個々のクローディンファミリーメンバーは、ある特定のがんタイプでは上方制御され得るが、他では下方制御され得る。クローディンはエンドサイトーシスを受けること、一部のクローディンの代謝回転時間は、他の膜タンパク質に比べて短いこと（Ｖａｎ  Ｉｔａｌｌｉｅら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５３６６４２１）、がん細胞においてクローディン発現は異常調節されること、及びがん細胞において腫瘍細胞間の密着結合構造は破壊されることが知られているので、クローディンタンパク質は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に対する特に良好な標的となり得る。これらの特性は、抗体に対し、新生物中のクローディンタンパク質に結合するより多くの機会を与えるが、正常組織中のクローディンタンパク質への結合には機会を与えない場合がある。個々のクローディンに特異的な抗体は有用であり得るが、多反応性クローディン抗体薬物コンジュゲートであれば、一層幅広い患者集団に対して、細胞毒の送達を促進する見込みが一層高まる可能性もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｎ、２００５年、ＰＭＩＤ：１６２６６９７５
【非特許文献２】Ｖａｎ  Ｉｔａｌｌｉｅら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５３６６４２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
化学療法及び放射線治療のような、がんの従来的な治療的処置は、多くの場合に効果がなく、外科的切除は、実現可能な臨床的代替手段を提供しないことがある。現行の標準治療の限界は、第１選択治療を行った後に再発した患者の場合に、特に明白である。このような場合に、不応性腫瘍は、侵襲性で不治であることが多く、頻繁に発生する。したがって、増殖性障害に対してより標的化された効能の高い治療法を開発することが、依然として強く必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
広い態様において、本発明は、ヒトＣＬＤＮ決定因子に特異的に結合する、単離抗体及び対応する抗体薬物コンジュゲート若しくは抗体診断薬コンジュゲート、又はこれらの組成物を提供する。ある特定の実施形態においては、ＣＬＤＮ決定因子は、腫瘍細胞上に発現するＣＬＤＮタンパク質であるが、他の実施形態においては、ＣＬＤＮ決定因子は、腫瘍開始細胞上に発現する。他の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、ＣＬＤＮタンパク質に結合し、ヒトＣＬＤＮタンパク質上のエピトープに結合する抗体と結合について競合する。
【０００８】
本発明の選択された態様は、１つ以上のクローディン（ＣＬＤＮ）ファミリーのタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を対象とする。ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＣは、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎを含み、式中、Ｍは、抗ＣＬＤＮ抗体を含み、Ｌは、任意選択のリンカーを含み、Ｄは、
【０００９】
【化１】
2019500335.tif 000003
からなる群から選択されるピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）弾頭（ｗａｒｈｅａｄ）を含み、
ｎは、１〜２０の整数を含む。
【００１０】
ある特定の態様において、本発明のＡＤＣは、モノクローナル抗体である抗ＣＬＤＮ抗体を含む。さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣを含む抗ＣＬＤＮ抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片及びＳｃＦｖ断片；又はこれらの免疫反応性断片からなる群から選択される。別の実施形態において、ＡＤＣは、内在化抗体である抗ＣＬＤＮ抗体からなる。さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、がん幹細胞に結合する。
【００１１】
ある特定の態様において、本発明のＡＤＣは、配列番号２１として示される軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３として示される重鎖可変領域（ＶＨ）（ＳＣ２７．１）；又は配列番号２５として示されるＶＬ及び配列番号２７として示されるＶＨ（ＳＣ２７．２２）；又は配列番号２９として示されるＶＬ及び配列番号３１として示されるＶＨ（ＳＣ２７．１０３）；又は配列番号３３として示されるＶＬ及び配列番号３５（ＳＣ２７．１０４）として示されるＶＨ；又は配列番号３７として示されるＶＬ及び配列番号３９として示されるＶＨ（ＳＣ２７．１０５）；又は配列番号４１として示されるＶＬ及び配列番号４３として示されるＶＨ（ＳＣ２７．１０６）；又は配列番号４５として示されるＶＬ及び配列番号４７として示されるＶＨ（ＳＣ２７．１０８）；又は配列番号４９として示されるＶＬ及び配列番号５１として示されるＶＨ（ＳＣ２７．２０１）；又は配列番号５３として示されるＶＬ及び配列番号５５として示されるＶＨ（ＳＣ２７．２０３）；又は配列番号５７として示されるＶＬ及び配列番号５９として示されるＶＨ（ＳＣ２７．２０４）を含む抗体を含むか、又はこの抗体とヒトＣＬＤＮタンパク質への結合について競合する、抗ＣＬＤＮ抗体を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明のＡＤＣは、配列番号６１として示される軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号６３として示される重鎖可変領域（ＶＨ）（ｈＳＣ２７．１）；又は配列番号６５として示されるＶＬ及び配列番号６７として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．２２）；又は配列番号６９として示されるＶＬ及び配列番号７１として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．１０８）；又は配列番号７３として示されるＶＬ及び配列番号７５として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．２０４）；又は配列番号７３として示されるＶＬ及び配列番号７７として示されるＶＨ（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２）を含む抗体を含むか、又はこの抗体とヒトＣＬＤＮタンパク質への結合について競合する、抗ＣＬＤＮ抗体を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲＬ）：配列番号１０９を有するＣＤＲＬ１、配列番号１１０を有するＣＤＲＬ２及び配列番号１１１を有するＣＤＲＬ３を有するＶＬ、並びに３つの相補性決定領域（ＣＤＲＨ）：配列番号１１２を有するＣＤＲＨ１、配列番号１１５を有するＣＤＲＨ２及び配列番号１１４を有するＣＤＲＨ３を有するＶＨを含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２）を含むか、又はこの抗体とヒトＣＬＤＮタンパク質への結合について競合する、抗ＣＬＤＮ抗体を含む。
【００１４】
他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、配列番号７８を有する軽鎖及び配列番号７９を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．１）；又は配列番号８０を有する軽鎖及び配列番号８１を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２２）；又は配列番号８０を有する軽鎖及び配列番号８２を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１）；又は配列番号８３を有する軽鎖及び配列番号８４を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．１０８）、又は配列番号８３を有する軽鎖及び配列番号８５を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１）、又は配列番号８６を有する軽鎖及び配列番号８７を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４）；又は配列番号８６を有する軽鎖及び配列番号８８を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２）；又は配列番号８６を有する軽鎖及び配列番号８９を有する重鎖を含む抗体（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１）を含む抗体を含むか、又はこの抗体とヒトＣＬＤＮタンパク質への結合について競合する、抗ＣＬＤＮ抗体を含む。
【００１５】
本発明のある特定の実施形態は、本明細書において開示されているＡＤＣを含む医薬組成物を含む。本発明の他の実施形態は、がん、例えば、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣癌又は卵巣類内膜癌）又は肺がん（例えば、肺扁平上皮癌）又は子宮内膜がん（例えば、子宮体部子宮内膜癌）を治療する方法であって、本発明のＡＤＣのいずれかを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。本発明の別の実施形態は、本発明のＡＤＣの１つ及び少なくとも１つの追加の治療成分により、がんを治療する方法である。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍細胞集団中のがん幹細胞を減少させる方法であって、がん幹細胞及びがん幹細胞以外の腫瘍細胞を含む腫瘍細胞集団を、本発明の抗ＣＬＤＮＡＤＣと接触させることを含み、これによってがん幹細胞の頻度を減少させる、方法を含む。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、細胞毒を細胞に送達する方法であって、細胞を本発明のＡＤＣのいずれかと接触させることを含む、方法を含む。
【００１８】
同様に、本発明は、がんのようなＣＬＤＮ関連障害の診断、監視又は治療に有用であるキット又は装置及び関連する方法も提供する。この目的を達成するために、本発明は、好ましくは、ＣＬＤＮ  ＡＤＣを含むレセプタクル及びＣＬＤＮ関連障害を治療、監視、若しくは診断するか、又は前記ＣＬＤＮ  ＡＤＣの投与レジメンを提示するために、前記ＣＬＤＮ  ＡＤＣを使用するための取扱説明資料を含む、ＣＬＤＮ関連障害を検出、診断又は治療するのに有用な製品を提供する。選択された実施形態において、装置及び関連する方法は、少なくとも１つの循環する腫瘍細胞を接触させることを含む。他の実施形態において、開示されたキットは、キット又は装置が、ＣＬＤＮに関連するがんの診断、監視若しくは治療のために用いられるか、又はこの投与レジメンを提示することを示す、取扱説明書、ラベル、添付文書、読本などを含む。
【００１９】
上記は概要であり、したがって、必要により、単純化、一般化及び詳細の省略を含む。結果として、当業者は、概要が例示にすぎず、決して限定を意図していないことを理解する。本明細書に記載の方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の主題の他の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載の教示から明らかになる。概要は、以下で詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を紹介するために提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ＣＬＤＮタンパク質間の配列関係を示す図である。図１Ａは、２３のヒトＣＬＤＮ遺伝子に由来するアラインメントアルゴリズム及びタンパク質配列を使用して生成された樹状図であり、ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ９との間に類似した配列関係があることを示している。
【図１Ｂ】ＣＬＤＮタンパク質間の配列関係を示す図である。図１Ｂは、ＣＬＤＮ６タンパク質とＣＬＤＮ９タンパク質とのアミノ酸配列アラインメントであり、同一性が保存されている残基（縦ハッシュ（ｈａｓｈ））及びトポロジカルドメインの重なり（細胞質残基、小文字；膜貫通ヘリックス、四角い枠及び大文字；細胞外残基、太字の大文字）を示す。
【図２Ａ−１】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜７７、奇数）を示す。
【図２Ａ−２】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜７７、奇数）を示す。
【図２Ｂ−１】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜７７、奇数）を示す。
【図２Ｂ−２】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号２１〜７７、奇数）を示す。
【図２Ｃ−１】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。このような例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの同一軽鎖及び重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜７６、偶数）を示す図である。
【図２Ｃ−２】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。このような例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの同一軽鎖及び重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜７６、偶数）を示す図である。
【図２Ｃ−３】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。このような例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの同一軽鎖及び重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜７６、偶数）を示す図である。
【図２Ｃ−４】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。このような例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの同一軽鎖及び重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜７６、偶数）を示す図である。
【図２Ｃ−５】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。このような例示マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体、並びにｈＳＣ２７．２０４のバリアントの同一軽鎖及び重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２０〜７６、偶数）を示す図である。
【図２Ｄ−１】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。ヒト化抗体ヒト化抗体ｈＳＣ２７．１、ｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８及びｈＳＣ２７．２０４、並びにｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８及びｈＳＣ２７．２０４のバリアントの完全長軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号７８〜８９）を示している。
【図２Ｄ−２】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。ヒト化抗体ヒト化抗体ｈＳＣ２７．１、ｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８及びｈＳＣ２７．２０４、並びにｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８及びｈＳＣ２７．２０４のバリアントの完全長軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列（配列番号７８〜８９）を示している。
【図２Ｅ】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。抗ＣＬＤＮ抗体であるＳＣ２７．１の軽鎖及び重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列を示しており、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法を使用して示されている。
【図２Ｆ】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。抗ＣＬＤＮ抗体であるＳＣ２７．２２の軽鎖及び重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列を示しており、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法を使用して示されている。
【図２Ｇ】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。抗ＣＬＤＮ抗体であるＳＣ２７．１０８の軽鎖及び重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列を示しており、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法を使用して示されている。
【図２Ｈ】マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体のアミノ酸及び核酸配列を提示している図である。抗ＣＬＤＮ抗体であるＳＣ２７．２０４の軽鎖及び重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列を示しており、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法を使用して示されている。
【図３Ａ】フローサイトメトリによって検出された、ヒトＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合する抗ＣＬＤＮ抗体ＳＣ２７．１及びＳＣ２７．２２の能力を示す図であり、結果は、平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）及びヒストグラムの変化として示されており、黒い実線は、１を引いた蛍光（ＦＭＯ）アイソタイプ−対照（灰色）と比べた、記載のＣＬＤＮタンパク質を過剰発現した細胞に対する記載の抗体の結合を示している。
【図３Ｂ】フローサイトメトリにより検出した、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に結合する抗ＣＬＤＮ抗体の能力を示す図であり、結果は、各細胞株に結合している各抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示されている。
【図３Ｃ】目的の抗原を発現する細胞の固定数に対して抗体数を力価測定することによって決定した、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９に対する例示的な抗ＣＬＤＮ抗体の見かけの結合親和性を示す図である。
【図４Ａ】抗ＣＬＤＮ抗体ＳＣ２７．１及びＳＣ２７．２２は、ヒトＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９を過剰発現する細胞に内在化することができ、サポリン細胞毒の送達を媒介することを示している。
【図４Ｂ】ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９に対する様々な抗体の見かけのＩＣ５０を示す。
【図５Ａ】インビボでの卵巣の腫瘍体積を縮小する抗ＣＬＤＮＡＤＣの能力を示す図である。
【図５Ｂ】インビボでの肺の腫瘍体積を縮小する抗ＣＬＤＮＡＤＣの能力を示す図である。
【図６Ａ】非腫瘍形成性（破線）卵巣、膵臓及び肺の腫瘍細胞集団及びＦＭＯアイソタイプ対照（灰色）と比べた、ヒトＣＳＣにおけるＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９タンパク質の発現（黒色の実線）を示す図である。
【図６Ｂ】ＣＬＤＮ＋（黒丸）又はＣＬＤＮ−（白丸）卵巣腫瘍細胞を移植されたマウスにおける、腫瘍の成長を示す図であり、ＣＬＤＮ＋腫瘍細胞は、ＣＬＤＮ−卵巣腫瘍細胞に比べて、腫瘍形成性が向上していることを示している。
【図７】限界希釈アッセイの結果を示す図である。抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣであるＳＣ２７．２２ＰＢＤ１により処理された腫瘍は、対照のＡＤＣであるＩｇＧ１ＰＢＤ１により処理された腫瘍に比べて、腫瘍開始細胞が約４倍、低下したことを示した。
【図８Ａ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓに由来する一連の腫瘍及び正常組織に対するＣＬＤＮ６の相対ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図８Ｂ】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓに由来する一連の腫瘍及び正常組織に対するＣＬＤＮ９の相対ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図８Ｃ】腫瘍期によって細分化した、子宮体部子宮内膜癌におけるＣＬＤＮファミリーメンバーの相対ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図８Ｄ】ＩＩＩ期及びＩＶ期の子宮体部子宮内膜癌における、ホルモン受容体発現に対するＣＬＤＮ６の相対ｍＲＮＡ発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、多くの様々な形態で具現化され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、構成上の目的だけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
【００２２】
ＣＬＤＮ発現は、いくつかの腫瘍タイプの生物マーカーとなることが、驚くべきことに、見出され、この関連性は、こうした腫瘍の治療に利用され得る。さらに、ＣＬＤＮ発現が腫瘍形成性細胞に関連すること、したがって、このような細胞の阻害又は除去に効果的に利用し得ることが、予想外に見出された。腫瘍形成性細胞は、下記にさらに詳細に記載されるが、従来の多くの治療に耐性を示すことが知られている。先行技術の教唆とは対照的に、開示された化合物及び方法は、この固有の耐性を有効に克服する。
【００２３】
したがって、本明細書において開示されているもののようなＣＬＤＮコンジュゲートは、選択された増殖性（例えば、新生物）障害又はその進行若しくは再発の治療及び／又は予防に有利に使用され得ることが、特に注目すべきである。とりわけ特定のドメイン、領域若しくはエピトープに関して、又は神経内分泌機能を含むがん幹細胞若しくは腫瘍及びそれらの開示された抗体薬物コンジュゲートとの相互作用に関連して、本発明の好ましい実施形態を下記に詳細に議論するが、本発明の範囲がこのような例示的実施形態によって限定されないことを当業者が理解することが、理解される。むしろ、本発明の最も広範囲の実施形態及び添付の特許請求の範囲は、いかなる特定の作用機序又は特に標的とされる腫瘍、細胞若しくは分子成分にもかかわらず、本明細書において開示されているものを含めた抗ＣＬＤＮ抗体及びコンジュゲート、並びに新生物障害又は細胞増殖性障害を含めた、様々なＣＬＤＮ関連又は媒介障害の治療及び／又は予防におけるこれらの使用を、広く及び明示的に対象とする。
【００２４】
Ｉ．クローディン（ＣＬＤＮ）生理学的機能
クローディンは、上皮細胞シート又は内皮細胞シートにおいて見出されるような、極性細胞タイプにおける最も頂端の細胞−細胞接着結合である密着結合の、主要な構造タンパク質を含む、内在性膜タンパク質である。密着結合は、細胞周辺に連続的なシールを形成するネットワーク形成タンパク質の鎖からなり、細胞と細胞との隙間における溶質及び水の輸送に対する、物理的であるが調節可能なバリアをもたらす。ヒトにおけるタンパク質のクローディンファミリーは、２２〜３４ｋＤａのサイズの範囲の少なくとも２３種のメンバーからなる。全てのクローディンは、タンパク質末端の両方が、膜の細胞内表面に位置しているテトラスパニントポロジー（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ）を有しており、これにより、２種の細胞外（ＥＣ）ループであるＥＣ１及びＥＣ２の形成をもたらす。ＥＣループは、ヘッドトゥーヘッド同種相互作用を媒介し、ある特定のクローディンの組合せの場合、密着結合の形成をもたらすヘッドトゥーヘッド異種相互作用を媒介する。特定のクローディン−クローディン相互作用及びクローディンＥＣ配列は、イオン選択性及び密着結合の強度の重要な決定因子である（例えば、Ｎａｋａｎｏら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６９６８８５を参照）。通常、ＥＣ１は、約５０〜６０アミノ酸のサイズであり、より大きなＷ−Ｘ（１７−２２）−Ｗ−Ｘ（２）−Ｃ−Ｘ（８−１０）−Ｃモチーフ内部に保存されたジスルフィド結合、及びイオンチャネル形成に関与する多数の帯電残基を含有する（Ｔｕｒｋｓｅｎ及びＴｒｏｙ、２００４年、ＰＭＩＤ：１５１５９４４９）。ＥＣ２は、ＥＣ１より小さく、約２５アミノ酸である。このヘリックスターンヘリックス立体構造により、ＥＣ２は、反対側の細胞膜上におけるクローディンの二量体又は多量体の形成に寄与することが示唆されているが、両ループにおける変異は複合体の形成を撹乱し得る。クローディン−クローディン複合体は、インビトロにおいて、関与する具体的なクローディンに応じて、二量体から六量体のサイズの範囲となり得る（Ｋｒａｕｓｅら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８０３６３３６）。個々のクローディンは、ＰＣＲ解析により決定すると、組織特異的発現パターンの範囲、及び発生学的に調節された発現を示す（Ｋｒａｕｓｅら、２００８年、ＰＭＩＤ：１８０３６３３６；Ｔｕｒｋｓｅｎ、２０１１年、ＰＭＩＤ：２１５２６４１７）。
【００２５】
配列解析は、クローディンファミリーメンバーの系統樹を構築するために使用することができ、タンパク質配列の関係、及びその関連度合いを示すものである（図１Ａ）。例えば、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９タンパク質は近縁であることが認められ得、このことは、染色体位置１６ｐ３．３において、これらの遺伝子が隣接するヘッドツゥーヘッド位にあることを考慮すると、祖先遺伝子が複製されていること示唆している。これらの類似性は、異型的に相互作用するこれらのファミリーメンバーの能力を説明することができる可能性が高い。同様に、ＣＬＤＮ３タンパク質及びＣＬＤＮ４タンパク質は、配列解析により近縁であり、これらの遺伝子は、染色体位置７ｒ１１．２３において、タンデムで見出すことができる。ある特定のファミリーメンバー間のＥＣ１ループ又はＥＣ２ループの高度な相同性（例えば、図１Ｂ）により、多様なクローディンファミリーメンバーと多重反応性である抗体を開発する機会がもたらされる。
【００２６】
スカリン（ｓｋｕｌｌｉｎ）としても知られているＣＬＤＮ６は、発生学的に調節されているクローディンである。ＣＬＤＮ６タンパク質の代表的なオルソログは、ヒト（ＮＰ＿０６７０１８）、チンパンジー（ＸＰ＿５２３２７６）、アカゲザル（ＮＰ＿００１１８０７６２）、マウス（ＮＰ＿０６１２４７）及びラット（ＮＰ＿００１０９５８３４）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトにおいて、ＣＬＤＮ６遺伝子は、染色体位置１６ｐ１３．３における、約３．５ｋＢｐにわたる２つのエクソンからなる。ＣＬＤＮ６遺伝子座の転写は、２１９アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿０６１２４７）をコードする、１．４ｋＢの成熟ｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿０２１１９５）をもたらす。ＣＬＤＮ６は、上皮運命にコミットしたＥＳ細胞誘導体内（Ｔｕｒｋｓｅｎ及びＴｒｏｙ、２００１年、ＰＭＩＤ：１１６６８６０６）、胎児表皮内（Ｍｏｒｉｔａら、２００２年、ＰＭＩＤ：１２０６０４０５）、及び表皮の基底上のレベル（Ｔｕｒｋｓｏｎ及びＴｒｏｙ、２００２年、ＰＭＩＤ：１１９２３２１２）において発現する。ＣＬＤＮ６はまた、発生中のマウスの腎臓においても発現する（Ａｂｕａｚｚａら、２００６年、ＰＭＩＤ：１６７７４９０６）が、発現は、成体腎臓では検出されない（Ｒｅｙｅｓら、２００２年、ＰＭＩＤ：１２１１０００８）。ＣＬＤＮ６はまた、ＣＬＤＮ１及びＣＬＤＮ９と共に、Ｃ型肝炎ウイルスの共受容体でもある（Ｚｈｅｎｇら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７８０４４９０）。
【００２７】
ＣＬＤＮ９は、ＣＬＤＮ６と最も近縁のファミリーメンバーである。ＣＬＤＮ９タンパク質の代表的なオルソログは、ヒト（ＮＰ＿０６６１９２）、チンパンジー（ＸＰ＿００３３１４９８９）、アカゲザル（ＮＰ＿００１１８０７５８）、マウス（ＮＰ＿０６４６８９）及びラット（ＮＰ＿００１０１１８８９）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトにおいて、ＣＬＤＮ９遺伝子は、染色体遺伝子座１６ｐ１３．３における、約２．１ｋＢｐにわたる単一のエクソンからなる。イントロンを含まないＣＬＤＮ９遺伝子座の転写は、２１７アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００６６１９２）をコードする、２．１ｋＢのｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿０２０９８２）をもたらす。ＣＬＤＮ９は、内耳（Ｋｉｔａｒｊｉｒｉら、２００４年、ＰＭＩＤ：１４６９８０８４；Ｎａｎｋａｎｏら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６９６８８５）、角膜（Ｂａｎら、２００３年、ＰＭＩＤ：１２７４２３４８）、肝臓（Ｚｈｅｎｇら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７８０４４９０）、及び発生中の腎臓（Ａｂｕａｚｚａら、２００６年、ＰＭＩＤ：１６７７４９０６）の、多様な構造において発現する。蝸牛におけるＣＬＤＮ９タンパク質の発現と一致して、ミスセンス変異を伴うＣＬＤＮ９タンパク質を発現する動物は、おそらく傍細胞のＫ＋の透過性の変化のために、聴覚障害を示し、この結果として、音声の検出に関与する有毛細胞の脱分極に重要なイオン電流の撹乱がもたらされる。内耳の細胞におけるＣＬＤＮ９の発現が、他のクローディンにより形成される、より頂端部の密着結合鎖の下方のサブドメインに特異的に局在化されており、正常組織における全てのクローディンが、最頂端部の接触可能な密着結合において見出されるわけではないことを示している（Ｎａｎｋａｎｏら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６９６８８５）。蝸牛における結果と対照的に、ミスセンスＣＬＤＮ９を発現するマウスは、肝異常又は腎異常の徴候を示さなかった（Ｎａｎｋａｎｏら、２００９年、ＰＭＩＤ：１９６９６８８５）。
【００２８】
ＣＬＤＮ４は、食中毒及び他の消化器疾病の一因となるクロストリジウム・ペリフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）エンテロトキシンへの高い親和性結合のために、エンテロトキシン受容体としてもまた公知である。ＣＬＤＮ４タンパク質の代表的なオルソログは、ヒト（ＮＰ＿００１２９６）、チンパンジー（ＸＰ＿５１９１４２）、アカゲザル（ＮＰ＿００１１８１４９３）、マウス（ＮＰ＿０３４０３３）及びラット（ＮＰ＿００１０１２０２２）が含まれるが、これらに限定されない。ヒトにおいて、イントロンを含まないＣＬＤＮ４遺伝子は、染色体位置１７ｑ１１．２３において、約１．８２ｋＢｐにわたる。ＣＬＤＮ４遺伝子座の転写は、２０９アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００１２９６）をコードする、１．８２ｋＢのｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００１３０５）をもたらす。消化器病原体により産生される毒素に結合するＣＬＤＮ４の能力と一致して、ＣＤＬＮ４の発現は、ＧＩ管全体、並びに前立腺、膀胱、乳房及び肺において検出され得る（Ｒａｈｎｅｒら、２００１年、ＰＭＩＤ：１１１５９８８２；Ｔａｍａｇａｗａら、２００３年、ＰＭＩＤ：１２８６１０４４；Ｗａｎｇら、２００３年、ＰＭＩＤ：１２６００８２８；Ｎｉｃｈｏｌｓら、２００４年、ＰＭＩＤ：１４９８３９３６）。
【００２９】
クローディンは、正常組織の機能及びホメオスタシスに重要であるが、腫瘍細胞は、密着結合機能の異常を示すことが多い。これは、腫瘍細胞の脱分化、又はがん性組織が迅速に成長するために異常な血管形成を伴う腫瘍塊内において栄養を効率的に吸収する必要性があることの帰結としての、クローディンの発現の調節異常及び／又は局在化と結びつき得る（Ｍｏｒｉｎ、２００５年、ＰＭＩＤ：１６２６６９７５）。個々のクローディンファミリーメンバーは、ある特定のがんタイプでは上方制御され得るが、他では下方制御され得る。例えば、ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４の発現は、ある特定の膵がん、乳がん及び卵巣がんにおいて向上するが、他の乳（例えば、「低クローディン」）癌では低下することがある。クローディンはエンドサイトーシスを受けること、一部のクローディンの代謝回転時間は他の膜タンパク質に比べて短いこと（Ｖａｎ  Ｉｔａｌｌｉｅら、２００４年、ＰＭＩＤ：１５３６６４２１）、がん細胞においてクローディン発現は異常調節されること、及びがん細胞において腫瘍細胞間の密着結合構造は破壊されることが知られているので、クローディンタンパク質は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に対する特に良好な標的となり得る。これらの特性は、新生物中のクローディンタンパク質には結合するが、正常組織中のクローディンタンパク質には結合しないという、より多くの機会をも抗体にもたらすことができる。個々のクローディンに特異的な抗体は有用となり得るが、多反応性クローディン抗体であれば、一層幅広い患者集団に対して、ペイロードの送達を促進する見込みが一層高まる可能性もある。具体的に、多反応性クローディン抗体は、凝集抗原密度がより高いために、複数のクローディンタンパク質を発現する細胞をより効果的に標的化することを可能にすることができ、任意の個々のクローディンの抗原発現レベルが低い腫瘍細胞を回避できる可能性を低減し、下記の発現例において認められる通り、単一ＡＤＣについての治療適応数を拡張する。
【００３０】
ＩＩ．がん幹細胞
現行のモデルによれば、腫瘍は、非腫瘍形成性細胞及び腫瘍形成性細胞を含む。非腫瘍形成性細胞は、自己再生能力を有さず、免疫無防備状態マウスに過剰な細胞数で移植された場合でも腫瘍を再現的に形成することができない。本明細書において「腫瘍開始細胞」（ＴＩＣ）とも称される腫瘍形成性細胞は、０．０１〜１０％の腫瘍の細胞集団率を構成し、腫瘍を形成する能力を有する。造血性悪性腫瘍の場合、ＴＩＣは、特に、急性骨髄性悪性腫瘍（ＡＭＬ）においては１：１０４〜１：１０７と非常に稀少な範囲となる場合があり、又は例えば、Ｂ系細胞のリンパ腫においては非常に豊富となる場合もある。腫瘍形成性細胞は、がん幹細胞（ＣＳＣ）とも交換可能に称される腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）と、腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）との両方を包含している。
【００３１】
正常組織の細胞ヒエラルキーを支持する正常幹細胞と同様に、ＣＳＣは、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。これに関して、ＣＳＣは、腫瘍形成性後代と非腫瘍形成性後代の両方を生成することができ、連続的単離及び少数の単離ＣＳＣの免疫無防備状態マウスへの移植によって実証されるように、親腫瘍の異種性細胞組成物を完全に再現することができる。これらの「種細胞」が除去された腫瘍でない限り、腫瘍が転位し又は再発して疾患の再発及び最終的な進行をもたらす可能性がはるかにより高いことが、証拠により示されている。
【００３２】
ＴＰｒｏｇは、ＣＳＣと同様に、一次移植片における腫瘍成長を促進する能力を有する。しかしながら、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは、親腫瘍の細胞異種性を再現することができず、後続の移植片において腫瘍形成性を再開するには効率性が低い。なぜなら、ＴＰｒｏｇは、少数の高精製ＴＰｒｏｇの免疫無防備状態マウスへの連続移植により実証されるように、一般に、限定された数の細胞分裂しかできないからである。ＴＰｒｏｇはさらに、初期ＴＰｒｏｇと後期ＴＰｒｏｇとに分けることができ、これらは、表現型（例えば、細胞表面マーカー）及び腫瘍細胞構造を再現する能力の差異によって区別され得る。いずれもＣＳＣと同程度に腫瘍を再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇの方が、後期ＴＰｒｏｇよりも、親腫瘍の特徴を再現する能力が高い。前述の区別にかかわらず、一部のＴＰｒｏｇ集団は稀に、ＣＳＣに通常属する性質である自己再生能力を獲得し、それ自体がＣＳＣになることができる。
【００３３】
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期及び後期ＴＰｒｏｇの両方）並びに（ｉｉ）非腫瘍形成性細胞、例えば、最終分化腫瘍細胞及び腫瘍−浸潤性細胞、例えば、ＣＳＣから誘導され、通常バルクの腫瘍を含む、線維芽細胞／間質、内皮及び造血性細胞よりも、高い腫瘍形成性を示し、且つ多くの場合、比較的より静止状態にある。従来の治療及びレジメンが、大部分は、腫瘍を縮小させ、急速に増殖する細胞を攻撃するように設計されていることを考慮すると、ＣＳＣは、したがって、より急速に増殖するＴＰｒｏｇ及び他の嵩の大きい腫瘍細胞集団、例えば非腫瘍形成性細胞よりも、従来の治療及びレジメンに対して耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療に対して相対的に化学療法耐性にし得る他の特徴は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズム及び抗アポトーシス遺伝子発現の向上である。このようなＣＳＣの特性は、進行した病期の新生物を有する患者に持続的な応答をもたらすための標準治療レジメンの失敗を示唆している。なぜなら、標準的化学療法では、継続的な腫瘍成長及び再発を実際に促進しているＣＳＣが、有効に標的とされていないためである。
【００３４】
驚くべきことに、ＣＬＤＮ発現が、様々な腫瘍形成性細胞小集団を本明細書に記載される治療に対して感受性にする形で、これらの細胞小集団と関連していることがわかった。本発明は、特に腫瘍形成性細胞を標的化するために有用であり、腫瘍形成性細胞を鎮静する、敏感にする、中和する、頻度を減少させる、ブロックする、破棄する、干渉する、減少させる、妨害する、抑制する、制御する、枯渇させる、和らげる、介在する、縮小させる、再プログラムする、消去する、殺傷する又は他の方法で阻害する（集約して、「阻害する」）ために使用することができ、したがって増殖性障害（例えば、がん）の治療、管理及び／又は予防を容易にする抗ＣＬＤＮ抗体を提供する。有利なことに、本発明の抗ＣＬＤＮ抗体は、対象に投与した際に、ＣＬＤＮの決定因子の型（例えば、表現型又は遺伝子型）にかかわらず、腫瘍形成性細胞の頻度又は腫瘍形成性を好ましくは低減させるように選択されてもよい。腫瘍形成性細胞の頻度の減少は、（ｉ）腫瘍形成性細胞の阻害若しくは根絶、（ｉｉ）腫瘍形成性細胞の成長、拡大若しくは再発の制御、（ｉｉｉ）腫瘍形成性細胞の開始、伝播、維持又は増殖の中断又は（ｉｖ）これら以外の腫瘍形成性細胞の生存、再生及び／若しくは転移を妨げることの結果として生じ得る。いくつかの実施形態において、腫瘍形成性細胞の阻害は、１つ以上の生理学的経路の変化の結果として生じ得る。経路の変化は、腫瘍形成性細胞の阻害又は除去、腫瘍形成性細胞の能力の改変（例えば、分化若しくはニッチ破壊の誘導による）又は腫瘍形成性細胞が腫瘍環境若しくは他の細胞に影響する能力の他の方法での干渉のいずれによるものであっても、腫瘍形成性、腫瘍の維持及び／又は転移並びに再発の阻害により、より有効にＣＬＤＮ関連障害を治療することを可能にする。開示抗体のこの特徴は、標準治療レジメンに耐性又は不応性であることが立証されている再発性腫瘍の治療において、抗体を特に有効にすることがさらに理解される。
【００３５】
腫瘍形成性細胞の頻度の減少を評価するために使用され得る方法としては、限定されないが、細胞数測定又は免疫組織化学的分析、好ましくはインビトロ又はインビボ限界希釈分析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２及びＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）が挙げられる。
【００３６】
インビトロ限界希釈分析は、断片化又は非断片化腫瘍細胞（例えば、それぞれ処理又は未処理細胞）を固体培地で培養してコロニーを形成させ、成長したコロニーをカウントし、特徴付けることにより行ってもよい。又は腫瘍細胞を、液体培地を含有するウェルを有するプレート上に段階希釈し、各ウェルを、接種後、好ましくは接種から１０日より後の任意の時点において、コロニー形成について陽性であるか陰性であるかでスコア化してもよい。
【００３７】
インビボ限界希釈分析は、未処理対照又は選択した治療剤に曝露した腫瘍のいずれかからの腫瘍細胞を、免疫無防備状態マウスに段階希釈で移植し、この後、各マウスの腫瘍形成について陽性であるか陰性であるかをスコア化することによって実施される。スコア化は、移植した腫瘍が検出可能となった後の任意の時点で行ってよいが、好ましくは移植から６０日以上経過した後で行う。腫瘍形成性細胞の頻度を決定するための限界希釈実験の結果の解析は、好ましくは、ポアソン分布統計を使用して又は腫瘍がインビボで生成されるか否かの能力のような予め定義された確定事象の頻度を評価することにより（Ｆａｚｅｋａｓら、１９８２、ＰＭＩＤ：７０４０５４８）、行われる。
【００３８】
フローサイトメトリ及び免疫組織化学も、腫瘍形成性細胞の頻度を決定するために使用され得る。両方の技術とも、腫瘍形成性細胞を濃縮することが知られている、当該技術分野で認識されている細胞表面タンパク質又はマーカーに結合する１つ以上の抗体又は試薬を、利用する（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当該技術分野で公知であるように、フローサイトメトリ（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ））は、腫瘍形成性細胞を含む様々な細胞集団を特徴付け、単離、精製、濃縮又は分類するためにも使用され得る。フローサイトメトリは、細胞の混合集団が浮遊している流体の流れを、秒あたり最大何千もの粒子の物理的及び／又は化学的特徴を測定できる電子的検出装置を通して通過させることによって、腫瘍形成性細胞のレベルを測定する。免疫組織化学は、腫瘍形成性細胞マーカーに結合する標識化抗体又は試薬で組織試料を染色することにより、インサイチュ（例えば、組織切片内）で腫瘍形成性細胞の視覚化を可能にするという点で、さらなる情報を提供する。
【００３９】
したがって、本発明の抗体は、例えば、フローサイトメトリ、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、レーザー媒介の薄片化又はＦＡＣＳなどの方法による、腫瘍形成性細胞の同定、特徴付け、監視、単離、薄片化又は集団若しくは小集団の富化に有用であり得る。ＦＡＣＳは、特異的な細胞表面マーカーに基づいて９９．５％を超える純度で細胞小集団を単離するために使用される信頼性のある方法である。ＣＳＣを含む腫瘍形成性細胞の特徴付け及び操作のための他の適合技術は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１２／６８６，３５９、１２／６６９，１３６及び１２／７５７，６４９において見ることができる。
【００４０】
下記に列挙するのは、ＣＳＣ集団に関連し、ＣＳＣを単離又は特徴付けるために使用されてきたマーカーである：ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＬＤＨ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＮＡＮＯＧ、ＮＢ８４、ＮＥＳ、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、ＯＳＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＭＡＲＣＡ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＦＲＣ、ＴＲＫＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１及びＣＴＮＮＢ１。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６３２，６７８並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４、２００８／０１７５８７０、２０１０／０２７５２８０、２０１０／０１６２４１６及び２０１１／００２０２２１参照。
【００４１】
同様に、特定の腫瘍型のＣＳＣに関連する細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋並びに当該技術分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇら、２０１０、前掲、Ｖｉｓｖａｄｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８７８４６５８及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００８／０１３８３１３参照。固形腫瘍におけるＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型、及び白血病におけるＣＤ３４＋ＣＤ３８−を含むＣＳＣの調製物が、本発明に関連して、特に興味深い。
【００４２】
「正」、「低」及び「負」の発現レベルがマーカー又はマーカー表現型に適用されるとき、以下のように定義される。負（つまり、「−」）の発現を有する細胞は、本明細書において、蛍光チャネル中のアイソタイプ対照抗体を、別の蛍光チャネルの目的の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で観察した発現の９５パーセンタイル以下で発現する細胞として定義される。当業者は、この負の事象を定義するための手法が、「１を除いた蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）」又は「ＦＭＯ」染色として参照されることを認識する。上記で述べたＦＭＯ染色手法を用いてアイソタイプ対照抗体で観察された発現の９５パーセンタイルを上回る発現を有する細胞は、「正」（つまり「＋」）と定義される。本明細書で定義するとき、様々な細胞集団が広範に「正」と定義される。抗原の平均発現観測値が、上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色を用いて決定された９５パーセンタイルを上回る場合、細胞は正として定義される。正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回るが、９５パーセンタイルの１標準偏差以内である場合、「低発現」（つまり、「ｌｏ」）の細胞と称され得る。代替的に、正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回り、９５パーセンタイルを上回る１標準偏差より大きい場合、「高発現」（つまり、「ｈｉ」）の細胞と称され得る。他の実施形態において、９９パーセンタイルは、好ましくは、負と正のＦＭＯ染色の間の分界点として使用することができ、いくつかの実施形態において、パーセンタイルは９９％より大きくなり得る。
【００４３】
ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−マーカー表現型及びすぐ上に例示された表現型は、標準的フローサイトメトリ解析並びにさらなる解析のためにＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団を、特徴付け、単離、精製又は濃縮する細胞選別技術と組み合わせて使用され得る。
【００４４】
したがって、腫瘍形成性細胞の頻度を減少させる本発明の抗体の能力は、上記に記載の技術及びマーカーを使用して決定され得る。いくつかの場合には、抗ＣＬＤＮ抗体は、腫瘍形成性細胞の頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又はさらには３５％減少させ得る。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の頻度の減少は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％程度であり得る。ある特定の実施形態において、開示された化合物は、腫瘍形成性細胞の頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又はさらには９５％減少させ得る。腫瘍形成性細胞の頻度の何らかの減少は、腫瘍形成能、残留性、再発性及び新生物の攻撃性の対応する減少をもたらし得ることが理解される。
【００４５】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．抗体の構造
抗体並びにそのバリアント及び誘導体は、承認されている命名法及び番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；又はＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
【００４６】
「抗体」又は「無傷な抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合にＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む）定常領域とを含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、可変長のプロリン及びシステインリッチセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域（様々なＩｇＧサブクラスにおいて約１０から約６０のアミノ酸）によって分離されている。軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖は、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体（組換え産生ヒト抗体を含む）、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えば、これらのムテイン及びバリアント、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖ及びＳｃＦｖＦｃ）並びにＦｃ融合及び他の修飾を含むそれらの誘導体を含み、並びに、決定因子との優先的な会合又は結合を示す限りあらゆる他の免疫反応分子を含む。さらに、文脈上の制約によって他に指示されない限り、この用語は、さらに全ての抗体のクラス（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）並びに全てのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含む。様々な抗体のクラスに対応する重鎖定常領域は、通常、対応するギリシャ語の小文字α、δ、ε、γ及びμでそれぞれ示される。いずれかの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の１つに割り当てることができる。
【００４８】
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識及び結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である）。ＶＨ及びＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、又はより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる４つの可変性の少ない領域によって囲まれ分離されている。ＶＨ及びＶＬ領域間の非共有結合性の会合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。
【００４９】
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域及びＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；又はＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ又はＡｂＭ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供されるスキームの１つに従い得る。当該技術分野で周知のように、可変領域残基の番号付けは、典型的にはＣｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔに示されている通りである。Ａｂｙｓｉｓウエブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）及びＡｂＭによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基を下の表１に示す。ＭａｃＣａｌｌｕｍは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを用いていることに注意されたい。
【００５０】
【表１】
2019500335.tif 000004
【００５１】
抗体配列における可変領域及びＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）に従って、又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されている又はこれらを通じてアクセスされ得る。
【００５２】
好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  ｂｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。ここに添付されている図２Ｅ〜２Ｈは、ＳＣ２７．１、ＳＣ２７．２２及びＳＣ２７．１０８及びＳＣ２７．２０４マウス抗体の例示的な重鎖及び軽鎖可変領域の注釈における、こうした解析の結果を示している。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
【００５３】
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８〜８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１と報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」又は「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」又は「Ｅｕインデックス」又は「Ｅｕ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら（前掲）に示されている。本発明に適合する例示的なカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列は、配列番号４として示されており、本発明に適合する例示的なラムダ軽鎖定常領域アミノ酸配列は、配列番号７として示される。同様に、本発明に適合する例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列は、配列番号１として示される。
【００５４】
開示された定常領域配列又はそれらの変形若しくは誘導体は、開示された重及び軽鎖可変領域と、標準的な分子生物学技術を使用して操作可能に会合されて、本発明の抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣでそのまま使用され得る又はそれに組み込まれ得る全長抗体を提供し得る。
【００５５】
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋又は結合、つまり鎖間及び鎖内ジスルフィド結合がある。当該技術分野で周知のように、鎖間ジスルフィド結合の位置及び数は、免疫グロブリンのクラス及び種類によって変化する。本発明は、抗体の任意のクラス又は特定のサブクラスに限定されるものではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンが、例示のために、本開示を通して使用される。野生型ＩｇＧ１分子には、１２の鎖内ジスルフィド結合（それぞれ重鎖に４つとそれぞれ軽鎖に２つ）と、４つの鎖間ジスルフィド結合がある。鎖内ジスルフィド結合は、一般にやや保護されており、鎖間結合よりも相対的に還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能で、通常は比較的還元されやすい。２つの鎖間ジスルフィド結合は、重鎖間に存在し、さらにそれぞれの重鎖からそれぞれの軽鎖に存在するジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の会合に必須ではないことが実証された。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、重鎖に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含有しており、これらのシステインが、構造的な支えとともにＦａｂの動きを容易にする柔軟性をもたらす。重／重ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６及びＣ２２９（Ｅｕ番号付け）に位置し、一方でＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間（重／軽）のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパ又はラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上流ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
【００５６】
Ｂ．抗体生成及び産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
【００５７】
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；及びＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫適格性の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）を、抗原性タンパク質又は抗原性タンパク質を含む細胞若しくは調製物で免疫化する。一定時間後に、動物を出血させ、又は屠殺することにより、ポリクローナル抗体含有血清が取得される。血清は動物から取得した形態で使用されてもよく、又は抗体を部分的若しくは完全に精製して、免疫グロブリン分画若しくは単離された抗体調製物を得てもよい。
【００５８】
この点において、本発明の抗体は、免疫適格性の動物における、免疫応答を誘発するいかなるＣＬＤＮ決定因子からも生成され得る。本明細書において使用する場合、「決定因子」又は「標的」は、特定の細胞、細胞集団若しくは組織において又はこれらの上で、同定可能に会合するか又は特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー又は因子を意味する。決定因子又は標的は、形態的性質の場合もあり、機能的性質の場合もあり、又は生化学的性質の場合もあり、表現型であることが好ましい。好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞型又はある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の時点又は特定の微小環境（ｎｉｃｈｅ）にある細胞）によって異なって発現（過剰発現又は過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＣＬＤＮタンパク質、又はそのスプライスバリアント、アイソフォーム、ホモログ若しくはファミリーメンバー、又はこれらの特異的ドメイン、領域若しくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」又は「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入された場合に、免疫応答を刺激することができる、及び免疫応答により生じる抗体によって認識される、任意のＣＬＤＮタンパク質又は任意の断片、領域若しくはドメインを意味する。本明細書において検討されるＣＬＤＮ決定因子の存在又は不在は、細胞、細胞小集団又は組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞又はＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
【００５９】
任意の形態の抗原又は抗原を含有する細胞若しくは調製物を、ＣＬＤＮ決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。本明細書に記載されるように用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片又は選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一若しくは複数のドメイン又は全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はタンパク質を含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、表面上においてこの抗原の少なくとも一部を発現する細胞により免疫化する）又は可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分のみにより免疫化する）又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。抗原は、遺伝的に修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしていてもよい。任意のベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド及びカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
【００６０】
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。当該技術分野で公知であるように、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
【００６１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））又はこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第１版  ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ、第１版  ２０１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓ、第２版  １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマ及び生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体の産生後、特に有効な抗体を、様々なスクリーニングプロセスを通じて、例えば、決定因子に対するそれらの親和性又は内在化速度に基づいて、選択してもよい。本明細書に記載されるように産生される抗体は、「出所（ｓｏｕｒｃｅ）」抗体として使用され得、さらに、例えば、標的への親和性を改善するため、細胞培養における産生性を向上させるため、インビボでの免疫原性を減少させるため、多重特異的構築物を生成するために、修飾されてもよい。モノクローナル抗体の産生及びスクリーニングのより詳細な説明は、下記及び添付の実施例に示される。
【００６２】
３．ヒト抗体
「抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体及び／又は下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を指す。
【００６３】
ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技術を使用して産生され得る。技術の１つは、（好ましくはヒト）抗体のライブラリがファージ上に合成されている、ファージディスプレイであり、ライブラリは、目的の抗原又はその抗体結合部分を用いてスクリーニングされ、抗原に結合するファージが単離され、これらから免疫反応性断片を得ることができる。このようなライブラリを調製してスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用することができる他の方法及び試薬も、存在する（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ  ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ  ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照）。
【００６４】
一実施形態において、組換えヒト抗体は、上記の通り調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブリをスクリーニングすることにより単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリである。
【００６５】
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）により産生された抗体は、中程度の親和性（Ｋａは、約１０６〜１０７Ｍ−１）を有することができるが、親和性成熟は、当該技術分野において記載されている二次ライブラリから構築及び再選択することにより、インビトロにおいて模倣され得る。例えば、変異は、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、インビトロにおいてランダムに導入され得る（ＬｅｕｎｇらのＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）に報告されている）。さらに、親和性成熟は、選択された個々のＦｖクローンにおいて、例えば、目的のＣＤＲにかかるランダム配列を有するプライマーを用いるＰＣＲを使用して１つ以上のＣＤＲをランダムに変異させることにより、及びより高次の親和性クローンをスクリーニングすることによって行われ得る。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。別の有効な手法は、未免疫ドナーから得た天然Ｖドメインバリアントのレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及びＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されている、数回の鎖リシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術は、約約１０−９Ｍ以下の解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【００６６】
他の実施形態において、同様の手順は、これらの表面に結合ペアを発現する、真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリを使用して用いられ得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））。他の実施形態において、ヒト結合ペアは、酵母のような真核細胞において生成するコンビナトリアル抗体ライブラリから単離され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技術により、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを有利なことに可能にし、候補配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリングによる）。
【００６７】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することにより、作製することもできる。チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）すると、ヒト抗体産生が観察され、この産生は、遺伝子再配列、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６並びにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１及び６，１５０，５８４；並びにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得る又はインビトロで免疫化され得る）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７（Ｉ）８６−９５（１９９１）；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。
【００６８】
出所が何であっても、ヒト抗体配列は、当該技術分野において公知の分子操作技術を使用して作製され、本明細書に記載されている発現システム及び宿主細胞に導入され得ることが理解される。このような非天然に組換えにより産生したヒト抗体（及び、対象組成物）は、本開示の教示と完全に適合し、本発明の範囲内に明示的に保持されている。ある特定の選択態様において、本発明のＣＬＤＮＡＤＣは、細胞結合剤として作用する、組換えにより産生したヒト抗体を含む。
【００６９】
４．誘導された抗体
出所抗体は、上記のように生成され、選択され、単離された後、改善された医薬的特徴を有する抗ＣＬＤＮ抗体となるようにさらに改変されてもよい。好ましくは、出所抗体は、所望の治療学的特性を有する誘導抗体をもたらすように，既知の分子操作技術を使用して修飾又は改変されてもよい。
【００７０】
４．１．キメラ及びヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、免疫特異的にＣＬＤＮに結合するマウスモノクローナル抗体を含み、この抗体は、「出所」抗体であると考えることができる。選択された実施形態において、本発明の抗体は、このような「出所」抗体から、出所抗体の定常領域及び／又はエピトープ結合アミノ酸配列の任意選択の修飾を通じて誘導され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、出所抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合又は組合せを通じて変化する場合、出所抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、出所抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲ又はドメイン又は全重鎖及び軽鎖可変領域）がアクセプター抗体配列と組み合わされるか又はアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラ、ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導」抗体は、例えば、決定因子に対する親和性を改善するため、抗体安定性を改善するため、細胞培養物における産生及び収率を改善するため、インビボでの免疫原性を低減するため、毒性を低減するため、活性部分のコンジュゲーションを促進するため、又は多重特異的抗体を作製するなどのために、細胞を産生する抗体に由来する遺伝物質、及び下記に記載されている標準的な分子生物学的技術を使用して産生され得る。このような抗体は、出所抗体から、化学的手段又は翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターン又はペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
【００７１】
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種又はクラスに由来する共有結合的に連結されたタンパク質セグメントから誘導されたキメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにこのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である、構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７）。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域に操作可能に連結されている選択されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域の全て又はほとんどを含んでもよい。他の選択された実施形態において、抗ＣＬＤＮ抗体は、本明細書において開示されているマウス抗体から「誘導」され得、重鎖及び軽鎖可変領域の全体未満を含む。
【００７２】
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、「ＣＤＲグラフト化」抗体であり、この場合に、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）は、特定の種から誘導されるか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属しており、抗体の残りは、概ね、別の種から誘導されるか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属している。ヒトで使用するために、１つ以上の選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたマウスから取得される１つ以上のＣＤＲを含む。
【００７３】
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト化」抗体は、１つ以上の非ヒト抗体（ドナー又は出所抗体）から誘導された１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、「逆変異」が、ヒト化抗体に導入されていてもよい。この逆変異では、レシピエントのヒト抗体の可変領域の１つ以上のＦＲが、非ヒト種ドナー抗体の対応する残基によって置換されている。このような逆変異は、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性及び抗体安定性を改善し得る。様々なドナー種由来の抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類が挙げられる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに洗練するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。出所抗体由来のマウス成分及びアクセプター抗体由来のヒト成分を含む、本発明に適合するＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体は、下記実施例に示すように提示され得る。
【００７４】
当該技術分野で認識されている様々な技術を使用して、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するかを決定し、本発明に従ってヒト化構築物を提供することができる。適合するヒト生殖系列配列の編纂及びそれらのアクセプター配列としての適性を決定するための方法は、例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８〜４６３８）に開示されている。ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１〜６７４、２００５）を使用して適合するアクセプター配列を同定してもよい。さらに、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列も適合するアクセプター配列であり得、本教示に従って使用し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、マウス由来フレームワーク配列との相同性と、出所抗体及びアクセプター抗体のＣＤＲ古典的構造の解析とに基づいて選択される。次いで、誘導された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の誘導された配列が、当該技術分野で認識されている技術を使用して合成され得る。
【００７５】
例として、ＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体並びに関連する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０及び５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、（ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１及び７，０８７，４０９を参照。
【００７６】
ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体の可変領域のヒトアクセプター可変領域の配列同一性又はホモロジーは、本明細書で議論したように決定され、本明細書で議論したように測定されるとき、好ましくは少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似度を上方調節させて置換の保存的性質を正しくしてもよい。
【００７７】
添付の図２Ａ及び２Ｂに示される注釈の付されたＣＤＲ及びフレームワーク配列は、専売のＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに従って定義されていることが理解される。しかしながら、本明細書で説明され、図２Ｅ〜２Ｈに示されているように、当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭ又はＭａｃＣａｌｌｕｍらによって提供される定義に従って、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔらと同様に容易に同定し得る。このように、前述のシステムのいずれかに従って誘導された１つ以上のＣＤＲを含む抗ＣＬＤＮヒト化抗体は、本発明の範囲内に明確に保持される。
【００７８】
４．２．部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒又は他の抗がん剤へのコンジュゲーションを容易にするために（下記でより詳細に議論されるように）操作されてもよい。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製にとって、抗体上の細胞毒の位置及び薬物抗体比（ＤＡＲ）の観点から、均質なＡＤＣ分子集団を含むことが有利である。本発明に基づいて、当業者は本明細書に記載されるような部位特異的操作構築物を容易に作製することができる。本明細書で使用するとき、「部位特異的抗体」又は「部位特異的構築物」は、重鎖又は軽鎖のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、改変又は（好ましくは別のアミノ酸で）置換されて少なくとも１つの遊離システインを与えている抗体又はその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」は、部位特異的抗体と、不対又は遊離システインにコンジュゲートした少なくとも１つの細胞毒又は他の化合物（例えば、レポーター分子）とを含むＡＤＣを意味する。ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含む。他の実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。さらに他の実施形態において、遊離システインは、抗体のアミノ酸配列内（例えば、ＣＨ３ドメイン内）へと改変させてもよい。いずれにしても、部位特異的抗体は、様々なアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤであることができ；これらのクラス内で、抗体は、様々なサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であることができる。ＩｇＧ構築物に関して、抗体の軽鎖は、Ｃ２１４がそれぞれ組み込まれたカッパ又はラムダのいずれかのアイソタイプを含んでもよく、選択された実施形態において、Ｃ２１４は、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基がないことにより、不対であってもよい。
【００７９】
したがって、本明細書において使用する場合、用語「遊離システイン」又は「不対システイン」は、他に文脈により指示されていない限り、相互に交換可能に使用することができ、天然に存在しているか又は分子操作技術を使用して選択された残基位置に特別に組み込まれたかにかかわらず、生理学的条件下において天然に存在している（又は「未処理の（ｎａｔｉｖｅ）」）ジスルフィド結合の部分ではない、抗体の任意のシステイン（又はチオール含有）成分（例えば、システイン残基）を意味するものとする。ある特定の選択された実施形態において、遊離システインは、天然の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋パートナーが置換されるか、除去されるか又は他の方法で変化することにより、生理学的条件下で天然に存在しているジスルフィド架橋が破壊され、それによって部位特異的コンジュゲーションに適切な不対システインとなっている、天然のシステインを含み得る。他の好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは、抗体の重鎖又は軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置されているシステイン残基を含む。遊離又は不対システインは、コンジュゲーションの前に、チオール（還元されたシステイン）として、キャッピングされたシステイン（酸化されている）として、又は同一若しくは異なる分子上の別のシステイン若しくはチオール基（系の酸化状態に依存する）との非天然の分子内又は分子間ジスルフィド結合（酸化されている）として、存在してもよいことが認識される。下記でより詳細に説明するように、適切に操作された抗体構築物の穏やかな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。したがって、特に好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは（天然に存在するものか又は組み込まれたものかにかかわらず）、選択的還元、及びこの後のコンジュゲーションを受けて、均一なＤＡＲ組成物をもたらす。
【００８０】
開示された改変コンジュゲート調製物により示される好ましい特性は、コンジュゲーションの位置及び組成物の絶対的ＤＡＲ値の観点からコンジュゲーションを詳細に指定し、作製されたコンジュゲートを大きく限定する能力に基づき、少なくとも部分的に、予測されるものであることが理解される。従来の多くのＡＤＣ調製物と異なり、本発明は、ランダムコンジュゲーション部位及び比較的制御されていないＤＡＲ種を生成する抗体の部分的又は完全な還元に完全に依拠する必要はない。むしろ、特定の態様において、本発明は、好ましくは、標的化抗体を改変して天然に存在する（つまり「未処理の」）鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋の１つ以上を破壊することにより又は任意の位置にシステイン残基を導入することにより、１つ以上の所定の不対（又は遊離の）システイン部位を用意する。この目的のために、選択された実施形態において、システイン残基は、標準的分子操作技術を使用して、抗体（又はそれらの免疫反応性断片）の重鎖若しくは軽鎖のいずれの場所に組み込まれてもよく又は付加されてもよいことが理解される。他の好ましい実施形態において、天然ジスルフィド結合の破壊は、後にコンジュゲーション部位として使用され得る非天然システインの導入（後に遊離システインを含む）との組合せで行われ得る。
【００８１】
ある特定の実施形態において、操作された抗体は、鎖内又は鎖間システイン残基に少なくとも１つのアミノ酸欠失又は置換を含む。本明細書で使用するとき、「鎖間システイン残基」は、抗体の軽鎖と重鎖との間又は抗体の２つの重鎖間のいずれかの天然のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を意味し、一方で、「鎖内システイン残基」は、同じ重鎖又は軽鎖内の別のシステインと天然に対をなしているシステイン残基である。一実施形態において、鎖間システイン残基の欠失又は置換は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、システイン残基の置換又は欠失は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対形成しており、１つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインが相補的重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと対形成している抗体の相補的な構造により、いずれかの軽鎖又は重鎖の単一のシステインの変異又は欠失によって、操作された抗体における２つの不対システイン残基が生じる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、鎖間システイン残基は欠失している。他の実施形態において、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）で置換されている。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、スレオニン若しくはグリシン）又は親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン）残基での置き換えを生じ得る。選択された実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられている。
【００８３】
本発明で意図されるいくつかの実施形態において、欠失又は置換システイン残基は、軽鎖（カッパ又はラムダのいずれか）上にあり、したがって重鎖上に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失又は置換システイン残基は重鎖上にあり、軽鎖定常領域上に遊離のシステインを残す。アセンブリの際、無傷な（ｉｎｔａｃｔ）抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかの単一システインの欠失又は置換は、２つの不対システイン残基を有する部位特異的抗体をもたらすことが理解される。
【００８４】
一実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパ又はラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が欠失又は置換されている。別の実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が欠失又は置換されている。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位又は２２９位のシステインが欠失又は置換されている。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンに置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、軽鎖に好ましい遊離システインをもたらす。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンに置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、重鎖に好ましい遊離システインをもたらす。このような部位特異的構築物は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されている。適合可能な部位特異的構築物のまとめが、直下の表２に示されており、ここで、番号付けは、一般的に、Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」又は天然の改変のない定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を指す（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステイン残基が欠失していることを示す）。
【００８５】
【表２】
2019500335.tif 000005
【００８６】
本発明の部位特異的構築物と適合可能な例示的な操作された軽鎖及び重鎖定常領域が直下に示されており、ここで、配列番号２及び３は、それぞれ、Ｃ２２０Ｓ  ＩｇＧ１及びＣ２２０ΔＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、配列番号５及び６は、それぞれ、Ｃ２１４Ｓ及びＣ２１４Δカッパ軽鎖定常領域を含み、配列番号８及び９は、それぞれ、例示的なＣ２１４Ｓ及びＣ２１４Δラムダ軽鎖定常領域を含む。各場合において、改変された又は欠失されたアミノ酸の部位は（隣接残基と共に）、下線付きである。
【００８７】
【化２】
2019500335.tif 000006
【００８８】
【化３】
2019500335.tif 000007
【００８９】
【化４】
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【００９０】
【化５】
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【００９１】
【化６】
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【００９２】
【化７】
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【００９３】
上で議論した通り、重鎖及び軽鎖バリアントはそれぞれ、開示された重鎖及び軽鎖可変領域（又は、ヒト化若しくはＣＤＲグラフト化構築物などのその誘導体）と操作可能に会合されて、本明細書において開示されている部位特異的抗ＣＬＤＮ抗体をもたらすことができる。このような操作された抗体は、開示されるＡＤＣにおける使用に、特に適合可能である。
【００９４】
システイン残基又は遊離システインを提供するための残基を（天然のジスルフィド結合の破壊とは対照的に）導入又は付加することに関して、抗体又は抗体断片上の適合する位置は、当業者によって容易に判別され得る。したがって、選択された実施形態において、システインは、所望のＤＡＲ、抗体構築物、選択されたペイロード及び抗体標的に応じて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメイン又はそれらの任意の組合せに導入され得る。他の好ましい実施形態において、システインは、カッパ又はラムダＣＬドメイン内に導入されてもよく、特に好ましい実施形態において、ＣＬドメインのｃ末端領域に導入されてもよい。それぞれの場合において、システインの挿入部位に近位の他のアミノ酸残基を変更、除去又は置換して、分子の安定性、コンジュゲーションの効率性を促進させてもよく、又は一度付加されたペイロードに保護的環境を与えてもよい。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の任意の接触可能部位にある。このような表面残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が容易に接触可能な部位に位置づけられ、本明細書でさらに記載されているように選択的に還元され得る。ある特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の接触可能部位にある。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が接触可能な部位に位置づけられ、抗体と選択的にコンジュゲートするために使用され得る。ある特定の実施形態において、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（Ｅｕ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（Ｅｕ番号付け）。さらなる置換位置及び適合する部位特異的抗体の作製方法は、その全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，５２１，５４１に記載されている。
【００９５】
本明細書に記載されるような、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するためのストラテジーと薬物負荷の化学量論とは、抗体の保存された定常領域の操作に主に関わるので、全ての抗ＣＬＤＮ抗体に広く適用可能である。抗体の各クラス及びサブクラスのアミノ酸配列及び天然のジスルフィド結合は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々な抗体の操作された構築物を、過度の実験を必要とせずに容易に作製することができ、したがってこのような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に意図されている。これは、本開示において示されている重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列の全て又は一部を含む部位特異的構築物に特に当てはまる。
【００９６】
４．３．定常領域の修飾又は改変された糖鎖結合
本発明の選択された実施形態は、定常領域（つまりＦｃ領域）の置換又は修飾、例えば、限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異及び／又は修飾を含んでもよく、この置換又は修飾により、化合物に好ましい特徴、例えば、限定されないが、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増強又は減少、糖鎖結合及び／又はジスルフィド結合の変化並びに結合特異性の変更がもたらされる。
【００９７】
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎ）に関与するアミノ酸残基の変化を通じて生成することができ、これにより、血清半減期の延長のような細胞毒性の増加及び／又は薬物動態の変化が導かれ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）を参照。
【００９８】
選択された実施形態において、インビボ半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失又は付加）することにより生成することができる（例えば、ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照）。このような実施形態に関して、Ｆｃバリアントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より長い、１０日より長い、１５日より長い、好ましくは２０日より長い、２５日より長い、３０日より長い、３５日より長い、４０日より長い、４５日より長い、２カ月より長い、３カ月より長い、４カ月より長い又は５カ月より長い、半減期を与え得る。延長された半減期により血清力価が高くなり、従って、抗体の投与頻度を減少させ、及び／又は投与される抗体の濃度を減少させる。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類で、アッセイされ得る。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が向上したか又は減少した抗体バリアントを記載している。さらに、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）を参照。
【００９９】
他の実施形態において、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増強又は低下が導かれ得る。当該技術分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、細胞毒性の１形態を指し、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージ）に存在するＦｃＲへ分泌Ｉｇが結合すると、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合可能となり、この後、細胞毒により標的細胞が殺傷される。本発明の文脈において、抗体バリアントは、「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有し、親抗体若しくは非修飾抗体又は天然のＦｃＲ配列を含む抗体と比較して、結合が増強又は低下している。低下した結合を示すこのようなバリアントは、明らかな結合をほとんど又は全く有さず、例えば、天然配列と比較してＦｃＲに対する結合は、例えば当該技術分野で周知の技術で決定するとき、０〜２０％であり得る。他の実施形態において、バリアントは、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して増強された結合を示す。これらの種類のＦｃバリアントは、開示された抗体の有効な抗新生物特性を増強するために有利に使用し得ることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、糖鎖結合及び／若しくはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位に対して）、結合特異性の変更、ファゴサイトーシスの増加及び／又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを導く。
【０１００】
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、例えば、タンパク質（例えばＦｃドメイン中の）に共有結合されている改変された糖鎖結合パターン又は改変された炭化水素組成を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０を参照。操作されたグリコフォームは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強又は減少、標的に対する抗体の親和性の増加又は抗体の産生促進のために有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域フレームワーク糖鎖結合部位の消去に至り得る置換、したがってこの部位での糖鎖結合を消去し得る置換は、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０及び６，３５０，８６１参照）。逆に、増強されたエフェクター機能又は改善された結合が、１つ以上のさらなる糖鎖結合部位の操作によって、Ｆｃ含有分子に付与されてもよい。
【０１０１】
他の実施形態としては、改変された糖鎖組成を有するＦｃバリアント、例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体又は二分化ＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体が、挙げられる。このような改変された糖鎖結合パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、操作されたか又はバリアントの発現系統を使用することにより、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））の共発現により、様々な生物又は様々な生物由来の細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後で炭水化物を修飾することにより（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）、生成され得る。
【０１０２】
４．４．断片
本発明の実施のためにどの形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択したかにかかわらず、免疫反応断片を、それ自体で又は抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従って使用し得ることが理解される。「抗体断片」は、無傷な抗体の少なくとも１部を含む。本明細書で使用するとき、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片を含んでおり、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原又はこの免疫原性断片に免疫特異的に結合又は反応し、この断片が由来する無傷抗体と特異的な抗原結合について競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。
【０１０３】
例示的な部位特異的断片としては、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられる。さらに、活性部位特異的断片は、抗原／基質又は受容体と相互作用する能力を維持し、無傷抗体と同様の（ただしおそらくはやや効率が劣る）様式でそれらを修飾する、抗体の部分を含む。このような抗体断片は、本明細書に記載されるような１つ以上の遊離システインを含むようにさらに操作されてもよい。
【０１０４】
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷抗体に存在しているときに通常伴われる少なくとも１つの生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を維持している断片である。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
【０１０５】
当業者であれば十分に認識されるように、断片は、分子操作技術により取得されてもよく、又は無傷の抗体若しくは完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的処理若しくは酵素的処理（例えばパパイン若しくはペプシン）を介して取得されてもよく、又は組換え手段により、取得されてもよい。抗体断片のより詳細な説明は、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照。
【０１０６】
４．５．多価構築物
他の実施形態において、本発明の抗体及びコンジュゲートは、一価又は多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書で使用するとき、用語「価数」は、抗体に関連した可能な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子又は特異的位置若しくは座位に特異的に結合する。抗体が一価であるとき、分子の各結合部位は、単一抗原位置又はエピトープで特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は同じ又は異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープ若しくは位置に結合してもよい）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照。
【０１０７】
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体であり、２つの鎖が、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９に記載されるように、異なる特異性を有している。他の実施形態には、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体が含まれる。他のより精巧な適合する多重特異的構築物及びそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５並びにＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０及びＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
【０１０８】
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合し得、又は異種性ポリペプチド若しくは固形支持材料のような標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合し得る。選択された実施形態は、２つの抗原にのみ結合する（つまり、二重特異的抗体である）ことができるが、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体も、本発明に包含される。二重特異的抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化させるために（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれかの都合のよい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は、当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共にＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
【０１０９】
さらに他の実施形態において、所望の結合特異性（抗体−抗原組合せ部位）を有する抗体可変ドメインは、当業者に周知の方法を使用して、ヒンジ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインのような免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。
【０１１０】
５．抗体の組換え産生
抗体及びそれらの断片は、抗体産生細胞及び組換え技術から得られた遺伝子材料を使用して作製又は修飾されてもよい（例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照）。
【０１１１】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分又は他の混入物、例えば、他の細胞核酸若しくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野で周知の他の技術を使用して分離されるとき、「単離される」か又は実質的に純粋にされる。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ及びその人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）であり得、一本鎖若しくは二本鎖又はＲＮＡ、ＲＮＡであってもよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。選択された実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１１２】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記実施例に記載された調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、抗体の軽鎖及び重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体については、抗体をコードしている核酸が、ライブラリから収集され得る。
【０１１３】
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードしているＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーをコードしている別のＤＮＡ断片に操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
【０１１４】
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを操作可能に連結する（又は、操作可能に会合している）ことによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。本発明に適合可能な例示的なカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列が、直下に示されている：
【０１１５】
【化８】
2019500335.tif 000012
【０１１６】
本発明に適合可能な例示的なラムダ軽鎖定常領域アミノ酸配列が、直下に示されている：
【０１１７】
【化９】
2019500335.tif 000013
【０１１８】
同様に、本発明に適合可能な例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列が、直下に示されている：
【０１１９】
【化１０】
2019500335.tif 000014
【０１２０】
Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
【０１２１】
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。
【０１２２】
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原又は抗体）が検討される。例えば、誘導されたヒト化抗体ＶＨ又はＶＬドメインは、出所（例えば、マウス）又はアクセプター（例えば、ヒト）ＶＨ又はＶＬドメインと配列類似性を示し得る。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。本明細書で使用するとき、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（つまり、％相同性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数と各ギャップの長さが考慮に入れられる。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１２３】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１〜１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ・レングス・ペナルティ、４のギャップペナルティを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ・ウェイト及び１、２、３、４、５又は６のレングス・ウェイトを使用して決定され得る。
【０１２４】
追加的に又は代替的に、本発明のタンパク質配列は、公的データベースに対して検索を行い、例えば関連する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用されてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップありアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているように利用されてもよい。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されてもよい。
【０１２５】
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換また非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を訂正するために、配列同一性パーセント又は類似度を上昇するように調整してもよい。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、実施形態において、配列同一性を示すポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能又は活性を保持する。
【０１２６】
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。
【０１２７】
本発明は、プロモーターに操作可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節及びプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞及び宿主発現系も提供する。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、又はポリペプチド及び抗体のいずれかを生成するように操作することができる任意の種類の細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））又は哺乳動物細胞若しくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターによって同時トランスフェクトされていてもよい。
【０１２９】
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１及び４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォーム又はＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
【０１３０】
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡによって形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれも使用することができ、例えば、選択された条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的又は部分的に、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７及びＥＰ０３３８８４１並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９及び５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の適合する発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１３１】
本発明の抗体が、組換え発現又は任意の他の開示された技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製又は単離してもよく、これにより抗体は、同定され、それらの天然環境から分離されるか及び／若しくは回収され、抗体又は関連ＡＤＣの診断的用途又は治療的用途に干渉する混入物から分離される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
【０１３２】
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション及び親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。下記の実施例において、適合する方法をより詳細に説明する。
【０１３３】
６．産生後選択
取得される方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は選択され、クローン化され、所望の特徴、例えば、堅固な成長、抗体高産生及び目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロで又は同系遺伝子免疫無防備状態動物においてインビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマ及び／又はコロニーを選択、クローニング及び拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学及び生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作及び発現させてもよい。
【０１３４】
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）及び抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージ又は酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
【０１３５】
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体又はｓｃＦｖ断片のライブラリがファージ又は酵母で合成されるファージディスプレイ又は酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原又はその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージ又は酵母を単離して、これらから抗体又は免疫反応性断片を取得し得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージディスプレイライブラリ又は酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは、市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用され得る他の方法及び試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利に可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
【０１３６】
ＩＶ．抗体の特徴
ある特定の実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローン化され、並びに好ましい特性、例えば、堅固な成長、抗体高産生及び下記に詳細に記載されるような望ましい部位特異的抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。他の場合において、抗体の特徴は、動物への接種のために、特定の抗原（例えば、特異的ＣＬＤＮアイソフォーム）又は標的抗原の免疫応答性断片を選択することによって付与されてもよい。さらに他の実施形態において、選択された抗体は、上記のように操作されて、免疫化学的特徴、例えば親和性又は薬物動態が増強されるか又は洗練されてもよい。
【０１３７】
Ａ．中和抗体
特定の実施形態において、抗体又は抗体コンジュゲートは、「中和」抗体又はそれらの誘導体若しくは断片を含む。すなわち、本発明は、特異的ドメイン又はエピトープに結合し、ＣＬＤＮ６の生物学的活性をブロックするか、低下させるか又は阻害することができる抗体分子を含み得る。より一般的には、「中和抗体」という用語は、標的分子又はリガンドに結合するか又はこれと相互作用し、受容体又は基質のような結合パートナーへの標的分子の結合又は会合を妨げ、これにより、そうしなければ分子の相互作用から生じるはずの生物学的反応を中断する抗体を意味する。
【０１３８】
当該技術分野で公知の競合結合アッセイを用いて、抗体又はこの免疫学的に機能的な断片若しくは誘導体の結合及び特異性を評価することができることが理解される。本発明に関して、過剰な抗体が、ＣＬＤＮに結合する結合パートナーの量を、例えば、標的分子活性により又はインビトロ競合結合アッセイにより測定するとき、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はより多く減少させる場合、抗体又は断片は、ＣＬＤＮが結合パートナー又は基質に結合することを阻害又は減少させために保持される。例えば、ＣＬＤＮに対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくは標的分子活性を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれ以上変化させる。この修飾された活性は、当該技術分野で認識されている技術を使用して直接的に測定され得る又は変化した活性が下流で有する影響（例えば、腫瘍形成又は細胞生存）により測定され得ることが理解される。
【０１３９】
Ｂ．内在化抗体
ある特定の実施形態において、抗体は、抗体が決定因子と結合し、腫瘍形成性細胞のような選択された標的細胞に内在化される（任意のコンジュゲートされた薬学的に活性な成分を伴う）ような、内在化抗体を含み得る。内在化する抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現腫瘍形成性細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体の効力、又は一部の場合には抗体薬物コンジュゲートの効力に応じて、単一抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分であり得る。本発明に関連して、発現されたＣＬＤＮタンパク質の実質的な部分が腫瘍形成性細胞表面に会合して残り、それにより開示された抗体又はＡＤＣの局在化及び内在化を可能にしているという証拠がある。選択された実施形態において、このような抗体は、内在化に際して細胞を殺傷する１つ以上の薬物と会合される又はコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、内在化部位特異的ＡＤＣを含む。
【０１４０】
本明細書で使用されるとき、「内在化する」抗体は、関連する決定因子に結合する際に、標的細胞によって（任意のコンジュゲートされた細胞毒と共に）取り込まれる抗体を指す。このような内在化するＡＤＣの数は、決定因子発現細胞、特に、決定因子発現がん幹細胞を殺傷するのに十分であることが好ましい。細胞毒又はＡＤＣの全体としての効力に応じて、一部の場合に、抗体の数分子の細胞内への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分である。例えば、ＰＢＤ又はカリチアマイシンのようなある特定の薬物は強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数分子の内在化が、腫瘍細胞を殺傷するために十分である。抗体が哺乳類細胞に結合して内在化するかどうかは、当該技術分野で認識されている様々なアッセイ（例えば、Ｍａｂ−Ｚａｐ及びＦａｂ−Ｚａｐのようなサポリンアッセイ；アドバンストターゲティングシステム）により決定され得る。抗体が細胞に内在化するかどうかを検出する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８にも記載されている。
【０１４１】
Ｃ．枯渇抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は枯渇抗体である。用語「枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）」抗体は、好ましくは細胞表面上又は細胞表面近傍で抗原に結合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ又は細胞毒性剤の導入により）細胞の死を誘導する、促進する又は生じさせる抗体を指す。実施形態において、選択された枯渇抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。
【０１４２】
好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団におけるＣＬＤＮ発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％を殺傷することができる。用語「見かけのＩＣ５０」とは、本明細書において使用する場合、毒素に連結している一次抗体が、この一次抗体によって認識された抗原を発現する細胞の５０パーセントを殺傷した濃度を指す。毒素は、一次抗体に直接コンジュゲートされ得、又は一次抗体を認識する二次抗体若しくは抗体断片を介して、一次抗体と会合し得、これらの二次抗体又は抗体断片は、毒素に直接コンジュゲートされている。枯渇抗体は、５μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＩＣ５０を有するのが好ましい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、濃縮されたか、区分されたか、精製されたか又は単離された腫瘍形成性細胞、例えば、がん幹細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料又はがん幹細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術が使用され、腫瘍形成性細胞の枯渇が、本明細書に記載の技術に従って監視及び定量されてもよい。
【０１４３】
Ｄ．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＣＬＤＮに対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満又は５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＣＬＤＮに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はｋｏｎ（又はｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１４５】
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＣＬＤＮに免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満又は１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数又はｋｏｆｆ（又はｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１４６】
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリを使用して決定され得る。
【０１４７】
用語「明白な結合親和性」とは、本明細書において使用する場合、抗原が細胞の表面に過剰発現されたときに、この標的抗原への抗体の見かけの結合があることを指す。抗原に対する抗体の見かけの結合親和性は、「見かけのＥＣ５０」として本明細書に記載されており、この「見かけのＥＣ５０」は、抗原を過剰発現した細胞への最大結合の５０％が起こる、抗体の濃度である。一実施形態において、２つの抗体が、互いに、４５％超まで、４０％超まで、３５％超まで、３０％超まで、２５％超まで、２０％超まで、１０％超まで又は５％超まで、違いのない見かけのＥＣ５０値を有する場合、＞９９％信頼性を伴って、これらの２つの抗体は、抗原に対して「実質的に同一の」見かけの結合親和性を有すると言われることができる。別の実施形態において、複数の標的抗原に結合する抗体、例えば、１つ以上のＣＬＤＮタンパク質に対して多重反応性である抗体は、これらの抗原のそれぞれに対する抗体の見かけのＥＣ５０が、互いに、４５％超まで、４０％超まで、３５％超まで、３０％超まで、２５％超まで、２０％超まで、１０％超まで又は５％超まで違いがない場合、＞９９％信頼性を伴って、複数の抗原に対して「実質的に同一の」見かけの結合親和性を有すると言われることができる。ある抗原に対する抗体の見かけの結合親和力を決定するために使用されるアッセイは、通常、この抗原を過剰発現し、かつ推定される平衡条件又は平衡に近い条件下において抗体に曝露される細胞を利用するので、見かけのＥＣ５０値は、アビディティーを反映したものであるか、又は複数の見かけの結合親和性の強度を一緒にしたもの若しくは蓄積したものを反映したものである。したがって、関連する実施形態において、２つの抗体の、見かけのＥＣ５０として表される細胞株に対する見かけの結合親和性が、互いに、４５％超まで、４０％超まで、３５％超まで、３０％超まで、２５％超まで、２０％超まで、１０％超まで又は５％超まで違いのない場合、＞９９％信頼性を伴って、これらの２つの抗体は、抗原を発現する標的細胞株に対して実質的に同一のアビディティーを共有する。同様に、複数の標的抗原に結合する抗体、例えば、１つ以上のＣＬＤＮタンパク質に対して多重反応性である抗体は、これらの抗原のそれぞれに対する見かけのＥＣ５０値が、互いに、４５％超まで、４０％超まで、３５％超まで、３０％超まで、２５％超まで、２０％超まで、１０％超まで又は５％超まで違いのない場合、＞９９％信頼性を伴って、これらの抗体は、複数の抗原に対して実質的に同一のアビディティーを有すると言われることができる。
【０１４８】
Ｅ．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）及びエピトープマッピング
本明細書において使用する場合、「ビニング」という用語は、これらの抗原結合特徴及びこれらが互いと競合するのかどうかに基づいて、抗体を「ビン」へと群分けするために使用される方法を指す。ビンの初期決定は、エピトープマッピング及び本明細書に記載されている他の技術により、さらに精緻化及び確認され得る。しかし、抗体の、個々のビンへの経験的な割当てにより、開示される抗体の治療的な潜在力を示し得る情報がもたらされることが十分に理解される。
【０１４９】
当該技術分野において公知であり、本明細書の実施例において示されている方法を使用することにより、選択された参照抗体（又はその断片）が、第２の試験抗体（すなわち、同じビン内にある）と結合について競合するかどうかを決定することができる。一実施形態において、参照抗体を、ＣＬＤＮ抗原と、飽和条件下において会合させ、次いで、二次抗体又は試験抗体がＣＬＤＮに結合する能力を、標準的な免疫化学的技術を使用して決定する。試験抗体が、ＣＬＤＮに、参照抗ＣＬＤＮ抗体と同時に、実質的に結合することが可能であれば、二次抗体又は試験抗体は、一次抗体又は参照抗体と異なるエピトープに結合する。しかし、試験抗体が、ＣＬＤＮに、同時に、実質的に結合することができない場合、試験抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ、又は一次抗体により結合されたエピトープと（少なくとも立体的に）近接するエピトープに結合する。すなわち、試験抗体は、抗原結合について競合し、参照抗体と同じビン内にある。
【０１５０】
「競合する」又は「競合抗体」という用語は、開示される抗体の文脈で使用される場合、試験される試験抗体又は免疫機能的断片が、参照抗体の共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにより決定される、抗体間の競合を意味する。そのようなアッセイは典型的には、固体表面又は細胞、非標識試験抗体及び標識参照抗体に結合した精製抗原（例えば、ＣＬＤＮ又はこのドメイン若しくは断片）の使用が含まれる。競合阻害は、試験抗体の存在下に固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、競合抗体は、参照抗体の共通抗原に対する特異的な結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。逆に、参照抗体が結合しているとき、参照抗体は、後で添加する試験抗体（つまり、抗ＣＬＤＮ抗体）の結合を、好ましくは、少なくとも、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１５１】
一般に、ビニング又は競合結合は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定され得る。このようなイムノアッセイは慣例であり、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；及びＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ参照）。
【０１５２】
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；又は、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリビーズアレイが挙げられる。
【０１５３】
Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模マルチプレックス抗体対合を可能にするビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、抗体の対の標的抗原への同時結合パターンを比較する。抗体の対の１つ（捕捉ｍＡｂ）がＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合し、一方でそれぞれの捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合する。他の抗体（検出因子ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（対合）を解析し、同様の対合プロファイルを有する抗体とともに群分けする。検出因子ｍＡｂ及び捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じ又は密接に関連したエピトープに結合することを示す。一実施形態において、対合プロファイルは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用して決定され、試験される一連の抗体の任意の特定の抗体に最も密接に相関する抗体を同定することができる。実施形態において、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出因子ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７又は０．８９である。さらなる実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２に記載されている。同時に１００種類（又はそれ以上）の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原及び／又は抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力及び解像度がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
【０１５４】
同様に、表面プラズモン共鳴を含むビニング技術は、本発明に適合する。本明細書で使用されるとき、「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、特異的相互作用のリアルタイム解析を可能にする光学的現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システムのような市販の機器を使用して、選択された抗体が、定義された抗原に対する結合に関して互いに競合するかを容易に決定することができる。
【０１５５】
他の実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」か否かを決定するために使用し得る技術は、「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中又は異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１及びＡｂ２は「競合する」抗体であると決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１及びＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。いくつかの実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１５６】
競合抗体の群を包含するビンが定義されたら、この抗体の群が結合する抗原上の特異的ドメイン又はエピトープを決定するために、さらなる特徴付けを実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコールを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。本明細書に開示された抗体は、これらの抗体が会合する個別のエピトープの観点で特徴付けることができる。「エピトープ」は、抗体又は免疫反応性断片が特異的に結合する決定因子の部分である。免疫特異的結合は、上記の結合親和性に基づいて、又はタンパク質及び／若しくは巨大分子の複雑な混合物における（例えば、競合アッセイにおける）この標的抗原の抗体による優先的な認識により、確認及び定義され得る。「線状エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする、抗原における連続的アミノ酸により形成される。線状エピトープに優先的に結合する能力は、抗原が変性されたときでさえも、通常、維持される。逆に、「立体エピトープ」は、通常、抗原のアミノ酸配列における非連続的アミノ酸を含むが、抗原の二次的、三次的又は四次的構造の文脈において、単一の抗体により同時に結合されるよう十分に近接している。立体エピトープを有する抗原が変性されると、抗体は、通常もはや抗原を認識しない。エピトープ（連続的又は非連続的）は、特有の空間的立体配置に、通常少なくとも３個、より一般的に少なくとも５個又は８〜１０個又は１２〜２０個のアミノ酸を含む。
【０１５７】
ある特定の実施形態において、ファインエピトープマッピングは、ファージ又は酵母ディスプレイを使用して実施することができる。他の適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）又はペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾のような方法（Ｔｏｍｅｒ、２０００、ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）もまた、タンパク分解酵素のような酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）、スクシンイミジルエステル及びそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン並びに遊離アミノ酸のような化学物質を使用して利用することができる。別の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を使用して、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類することができる（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。
【０１５８】
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対するさらなる抗体を、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、選択されたエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。
【０１５９】
Ｖ．抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、薬学的に活性な又は診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）又は「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、会合の方法にかかわらず、任意の薬学的に活性な又は診断的成分と本発明の抗体との共有結合的又は非共有結合的会合を意味する。ある特定の実施形態において、この会合は、抗体のリシン又はシステイン残基を通じて達成される。いくつかの実施形態において、薬学的に活性な又は診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲートされ得る。開示されるＡＤＣは、治療及び診断目的のために使用され得る。
【０１６０】
本発明のＡＤＣを使用して、細胞毒又は他のペイロードを、標的位置（例えば、ＣＬＤＮを発現している腫瘍形成性細胞）に送達し得る。本明細書で示される場合、用語「薬物」又は「弾頭」は相互に交換可能に使用でき、生物学的に活性な又は検出可能な分子若しくは薬物、例えば、下記に記載された抗がん剤又は細胞毒を意味する。「ペイロード」は、任意選択のリンカー化合物と組み合わせた「薬物」又は「弾頭」を含み得る。コンジュゲート上の弾頭は、ペプチド、タンパク質又はインビボで代謝されて活性薬剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位体を含み得る。好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロードを、弾頭の放出及び活性化の前に、比較的非反応性の非毒性状態で標的部位に向かわせる（例えば、本明細書において開示されているＰＢＤＳ１〜５）。弾頭のこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステインを介して）及び過剰にコンジュゲートされた毒性ＡＤＣ種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物を通じて達成される。弾頭を大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合されて腫瘍部位に送達されると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的な毒性を、実質的に低減し得る。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞及び組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）が組み込まれたペイロードを含むが、診断剤及び生体適合性修飾剤が組み込まれた他のペイロードも、開示されるコンジュゲートにより、提供される標的化放出から利益を得る場合があることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤又は生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的に又は非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。
【０１６２】
本発明のコンジュゲートは一般的に、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＣＬＤＮ抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約２０の整数である）
又はその薬学的に許容される塩によって表され得る。
【０１６３】
当業者は、前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカー及び薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々であることを理解する。このように、開示される抗体の反応性残基（例えば、システイン又はリシン）と会合する任意の薬物又は薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対するコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションを含む）を可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明のいくつかの好ましい実施形態は、薬物又は薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーション及び混入物がより少なく、対応して毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。
【０１６４】
Ａ．  弾頭
１．治療剤
本発明の抗体は、治療成分又は抗がん剤のような薬物である、薬学的に活性な成分、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤（又は細胞毒）、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、融合又は他の方法で会合されてもよい。
【０１６５】
例示的な抗がん剤又は細胞毒（それらのホモログ及び誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリチアマイシン（ｎ−アセチルカリチアマイシンを含む）、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１及びＤＭ−４（免疫原）、ベンゾジアゼピン誘導体（免疫原）のようなマイタンシノイド、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカイン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、酸、又は誘導体が挙げられる。
【０１６６】
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチン及びオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾若しくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体又は誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブ（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体及びチューブリシン、パクリタキセル及びＤＮＡ損傷剤、例えば、カリチアマイシン及びエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン及び５−フルオロウラシル  デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチン及びビンクリスチン及びアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を含む。
【０１６７】
選択された実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と会合され得る（ＢｉＴＥ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
【０１６８】
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含む細胞毒を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、７６Ｂｒ、２１１Ａｔ及び２２５Ａｃが挙げられる。他の放射性核種も診断剤及び治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
【０１６９】
他の選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体弾頭にコンジュゲートされる。開示された抗体にコンジュゲートされ得る適合ベンゾジアゼピン誘導体（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，４２６，４０２並びにＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８及びＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。ＰＢＤと同様に、適合ベンゾジアゼピン誘導体は、ＤＮＡの副溝に結合し、核酸合成を阻害すると考えられる。このような化合物は、強力な抗腫瘍特性を有することが報告され、したがって、本発明のＡＤＣに用いるのにとりわけ適している。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤ及びその薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を、弾頭として含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７及びＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３及びＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。本発明と適合するＰＢＤ化合物の例は、直後に一層詳細に議論されている。
【０１７１】
本発明に関すると、ＰＢＤは、最小の骨髄抑制を示しながらも、強力な抗腫瘍特性を有することが示されている。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカーのうちの少なくとも１つ（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用してＣＬＤＮ標的化剤に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。ＰＢＤは、以下の一般構造のものである。
【０１７２】
【化１１】
2019500335.tif 000015
【０１７３】
これらは、芳香族Ａ環及びピロロＣ環の両方における置換基の数、種類及び位置並びにＣ環の飽和の程度が異なる。Ｂ環において、ＤＮＡのアルキル化に関与する求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。全ての公知の天然産物は、Ｃ環からＡ環の方を見るときに右回りのねじれをもたらすキラルＣ１１ａ位における（Ｓ）−立体配置を有する。これは、Ｂ型ＤＮＡの副溝に対してイソらせん性となるための適切な三次元形状を天然産物に付与して、結合部位におけるぴったりとした結合をもたらす（Ｋｏｈｎ、Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３−１１頁（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ及びＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、１９巻、２３０−２３７頁（１９８６））。副溝における付加体（ａｄｄｕｃｔ）を形成する天然産物の能力は、ＤＮＡプロセシングを妨害すること及び細胞毒性剤として機能することを可能にする。上で言及したように、これらの効力を増大させるために、ＰＢＤは、本明細書で述べたように抗ＣＬＤＮ抗体にコンジュゲートされ得る二量体でしばしば用いられる。
【０１７４】
本発明のある特定の実施形態において、開示されたモジュレーターにコンジュゲートされ得る適合性ＰＢＤは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に記載されている。この開示は、ある特定の有利な特性を有することが示されている、ＰＢＤ二量体（すなわち、２つのＰＢＤ部分を含むもの）を提供している。この点において、本発明の選択されたＡＤＣは、式（ＡＢ）又は（ＡＣ）を有するＰＢＤ毒素を含む：
【０１７５】
【化１２】
2019500335.tif 000016
（式中、
点線は、Ｃ１とＣ２との間又はＣ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択され、ハロ又はジハロから任意選択的にさらに選択され、
ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから独立に選択され、
Ｒ６及びＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立に選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立に選択され、
Ｒ１０は、本明細書で述べたように、ＣＬＤＮ抗体又はこの断片若しくは誘導体に結合されたリンカーであり、
Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立に選択され、
Ｒ１１は、Ｈであり、若しくはＲであり、又はＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであってもよく、Ｍは、金属陽イオンであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択され、選択された実施形態において、Ｏを含み、
Ｒ”は、鎖が、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は環が置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジン）により中断されていてもよい、Ｃ３〜１２アルキル基であり、
Ｒ及びＲ’は、任意選択的に置換されたＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基から独立に選択され、そして任意選択的に、ＮＲＲ’基に関連して、Ｒ及びＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、任意選択的に置換された４、５、６又は７員ヘテロ環を形成しており、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”及びＲ１１”（存在する場合）は、それぞれＲ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ及びＲ１１に従って定義され、ＲＣは、キャッピング基である）。
【０１７６】
前述の構造を含む選択された実施形態を直下により詳細に記載する。
【０１７７】
二重結合
一実施形態において、Ｃ１とＣ２との間及びＣ２とＣ３との間に存在する二重結合は存在しない。
【０１７８】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ２とＣ３との間の二重結合の、任意選択的な存在を示す。
【０１７９】
【化１３】
2019500335.tif 000017
【０１８０】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルである場合に、Ｃ２とＣ３との間に存在する。好ましい実施形態において、Ｒ２は、メチル基を含む。
【０１８１】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ１とＣ２との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【０１８２】
【化１４】
2019500335.tif 000018
【０１８３】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルである場合に、Ｃ１とＣ２との間に存在する。好ましい実施形態において、Ｒ２は、メチル基を含む。
【０１８４】
Ｒ２
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択され、ハロ又はジハロから任意選択的にさらに選択される。
【０１８５】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択される。
【０１８６】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ及び＝Ｃ（ＲＤ）２から独立に選択される。
【０１８７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＨである。
【０１８８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲであり、Ｒは、ＣＨ３を含む。
【０１８９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｏである。
【０１９０】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝ＣＨ２である。
【０１９１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内において、＝ＣＨ−ＲＤ基は、下に示すいずれかの立体配置を有し得る。
【０１９２】
【化１５】
2019500335.tif 000019
【０１９３】
一実施形態において、立体配置は、立体配置（Ｉ）である。
【０１９４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０１９５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＦ２である。
【０１９６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲである。
【０１９７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０１９８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ１〜１２アリールである。
【０１９９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０２００】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜７アリールである。
【０２０１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ８〜１０アリールである。
【０２０２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいフェニルである。
【０２０３】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいナフチルである。
【０２０４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいピリジルである。
【０２０５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいキノリニル又はイソキノリニルである。
【０２０６】
一実施形態において、Ｒ２は、１つから３つの置換基を有し、１つ及び２つがより好ましく、一置換基が最も好ましい。置換基は、いずれの位置にあってもよい。
【０２０７】
Ｒ２がＣ５〜７アリール基である場合、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に隣接しない環原子上にある。すなわち、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に対してβ又はγである。したがって、Ｃ５〜７アリール基がフェニルである場合、置換基は、好ましくはメタ位又はパラ位にある、より好ましくはパラ位にある。
【０２０８】
一実施形態において、Ｒ２は、
【０２０９】
【化１６】
2019500335.tif 000020
（式中、アスタリスクは、結合点を示す）から選択される。
【０２１０】
Ｒ２がＣ８〜１０アリール基、例えば、キノリニル又はイソキノリニルである場合、Ｒ２は、キノリニル環又はイソキノリニル環のいかなる位置におけるいかなる数の置換基も有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、１つ、２つ又は３つの置換基を有し、これらは、近位及び遠位の環のいずれか又は両方（２つ以上の置換基の場合）に存在し得る。
【０２１１】
一実施形態において、Ｒ２が置換されていてもよい場合、置換基は、下の置換基の項に示す置換基から選択される。
【０２１２】
Ｒが置換されていてもよい場合、置換基は、好ましくは以下から選択される：
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ及びチオエーテル。
【０２１３】
一実施形態において、Ｒ又はＲ２が置換されていてもよい場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ及びＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０２１４】
Ｒ２がＣ１〜１２アルキルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０２１５】
Ｒ２がＣ３〜２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ１〜１２アルキル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０２１６】
Ｒ２がＣ５〜２０アリール基である場合、任意選択の置換基は、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ１〜１２アルキル基をさらに含み得る。
【０２１７】
「アルキル」という用語が、アルケニルサブクラス及びアルキニルサブクラス並びにシクロアルキルを含むことが、理解される。したがって、Ｒ２が置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルである場合、アルキル基が、共役系の一部をなし得る、１つ以上の炭素−炭素二重又は三重結合を任意選択的に含むことが理解される。一実施形態において、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重又は三重結合を含み、この結合は、Ｃ１とＣ２との間又はＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートしている。一実施形態において、Ｃ１〜１２アルキル基は、飽和Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、Ｃ２〜１２アルキニル及びＣ３〜１２シクロアルキルから選択される基である。
【０２１８】
Ｒ２上の置換基がハロである場合、置換基は、好ましくはＦ又はＣｌ、より好ましくはＣｌである。
【０２１９】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、アルコキシ基、例えば、Ｃ１〜７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）であり得る又は、いくつかの実施形態において、Ｃ５〜７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であり得る。
【０２２０】
Ｒ２上の置換基がＣ１〜７アルキルである場合、置換基は、好ましくはＣ１〜４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）であり得る。
【０２２１】
Ｒ２上の置換基がＣ３〜７ヘテロシクリルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルであり得る。これらの基は、窒素原子を介してＰＢＤ部分の残余部分に結合することができる。これらの基は、例えば、Ｃ１〜４アルキル基によりさらに置換することができる。
【０２２２】
Ｒ２上の置換基がビス−オキシ−Ｃ１〜３アルキレンである場合、これは、好ましくはビス−オキシ−メチレン又はビス−オキシ−エチレンである。
【０２２３】
Ｒ２の特に好ましい置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノ及びメチルチエニルを含む。
【０２２４】
特に好ましい置換Ｒ２基は、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシ−フェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル及びナフチルを含むが、これらに限定されない。
【０２２５】
一実施形態において、Ｒ２は、ハロ又はジハロである。一実施形態において、Ｒ２は、置換基がそれぞれ（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）として下に例示されている、−Ｆ又は−Ｆ２である。
【０２２６】
【化１７】
2019500335.tif 000021
【０２２７】
ＲＤ
一実施形態において、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから独立に選択される。
【０２２８】
一実施形態において、ＲＤは、独立にＲである。
【０２２９】
一実施形態において、ＲＤは、独立にハロである。
【０２３０】
Ｒ６
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立に選択される。
【０２３１】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２及びハロから独立に選択される。
【０２３２】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ及びハロから独立に選択される。
【０２３３】
一実施形態において、Ｒ６は、独立にＨである。
【０２３４】
一実施形態において、Ｒ６及びＲ７は、一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−基を形成しており、ｐは、１又は２である。
【０２３５】
Ｒ７
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、  Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立に選択される。
【０２３６】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲである。
【０２３７】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ１〜６アルキルである。
【０２３８】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよい飽和Ｃ１〜６アルキルである。
【０２３９】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ２〜４アルケニルである。
【０２４０】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＭｅである。
【０２４１】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＣＨ２Ｐｈである。
【０２４２】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にアリルである。
【０２４３】
一実施形態において、化合物は、二量体であって、各単量体のＲ７基が一緒になって、単量体を連結する式Ｘ−Ｒ’’−Ｘを有する二量体架橋を形成している。
【０２４４】
Ｒ９
一実施形態において、Ｒ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、  Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立に選択される。
【０２４５】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＨである。
【０２４６】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＲ又はＯＲである。
【０２４７】
Ｒ１０
好ましくは、本明細書に記載されるような適合リンカーは、Ｒ１０位（すなわち、Ｎ１０）における共有結合によりＣＬＤＮ抗体をＰＢＤ薬物部分に結合させる。
【０２４８】
Ｑ
特定の実施形態において、Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立に選択される。
【０２４９】
一実施形態において、Ｑは、独立にＯである。
【０２５０】
一実施形態において、Ｑは、独立にＳである。
【０２５１】
一実施形態において、Ｑは、独立にＮＨである。
【０２５２】
Ｒ１１
選択された実施形態において、Ｒ１１は、Ｈ若しくはＲであり、又はＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍであり得、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２５３】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｈである。
【０２５４】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｒである。
【０２５５】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２５６】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｈである。
【０２５７】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｒである。
【０２５８】
Ｘ
一実施形態において、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択される。
【０２５９】
好ましくは、Ｘは、Ｏである。
【０２６０】
Ｒ’’
Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／若しくは環が置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼン又はピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２６１】
一実施形態において、Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子及び／若しくは芳香環、例えば、ベンゼン又はピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２６２】
一実施形態において、該アルキレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＭｅから選択される１つ以上のヘテロ原子並びに／又は環が置換されていてもよい、芳香環によって任意選択的に中断されている。
【０２６３】
一実施形態において、芳香環は、Ｃ５〜２０アリレン基であり、アリレンは、芳香族化合物の２個の芳香環原子から２個の水素原子を除去することにより得られた二価部分に関し、この部分は、５から２０個の環原子を有する。
【０２６４】
一実施形態において、Ｒ’’は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は環がＮＨ２により置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２６５】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０２６６】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９及びＣ１１アルキレン基から選択される。
【０２６７】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３、Ｃ５及びＣ７アルキレン基から選択される。
【０２６８】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３及びＣ５アルキレン基から選択される。
【０２６９】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ３アルキレン基である。
【０２７０】
一実施形態において、Ｒ’’は、Ｃ５アルキレン基である。
【０２７１】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子及び／若しくは環が置換されていてもよい芳香環、例えば、ベンゼン又はピリジンによって、任意選択的に中断されていてよい。
【０２７２】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子及び／若しくは芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって任意選択的に中断されていてよい。
【０２７３】
上に示したアルキレン基は、非置換直鎖脂肪族アルキレン基であり得る。
【０２７４】
Ｒ及びＲ’
一実施形態において、Ｒは、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基から独立に選択される。
【０２７５】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルである。
【０２７６】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ３〜２０ヘテロシクリルである。
【０２７７】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０２７８】
好ましいアルキル基及びアリール基並びに任意選択の置換基の同一性及び数に関する様々な実施形態を、Ｒ２に関して上で述べた。Ｒ２について示した選択は、それがＲに適用されるとき、適切な場合、例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８又はＲ９がＲである場合、全ての他の基Ｒに適用できる。
【０２７９】
Ｒについての選択は、Ｒ’にも適用される。
【０２８０】
本発明のいくつかの実施形態において、−ＮＲＲ’置換基を有する化合物を提供する。いくつかの実施形態において、Ｒ及びＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４、５、６又は７員ヘテロ環を形成している。環は、さらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ又はＳを含み得る。
【０２８１】
一実施形態において、ヘテロ環は、それ自体Ｒ基で置換されている。さらなるＮヘテロ原子が存在する場合、置換基は、Ｎヘテロ原子上に存在し得る。
【０２８２】
前述のＰＢＤに加えて、特定の二量体ＰＢＤは、とりわけ活性であることが示され、本発明と共に用いることができる。この目的を達成するために、本発明の抗体薬物コンジュゲート（すなわち、本明細書で開示するＡＤＣ１〜６）は、ＰＢＤ１〜５として直下に示すＰＢＤ化合物を含み得る。以下のＰＢＤ１〜５は、本明細書においてより詳細に記載されているもののような、リンカーの分離後に放出される毒性弾頭を含む。薬物−リンカー化合物の成分としてのＰＢＤ１〜５のそれぞれの合成は、このような合成について参照により組み込むＷＯ２０１４／１３０８７９に極めて詳細に示されている。ＷＯ２０１４／１３０８７９を考慮すると、本発明のＡＤＣの選択された弾頭を含み得る細胞毒性化合物を、容易に作製し、本明細書で示すように用いることができる。したがって、リンカーからの分離の際に、開示されるＡＤＣから放出され得る選択されたＰＢＤ化合物は、直下に示される：
【０２８３】
【化１８】
2019500335.tif 000022
【０２８４】
前記二量体ＰＢＤ弾頭のそれぞれが、標的細胞による内在化及びリンカーの破壊に際して放出されることが好ましいことが理解される。下記においてさらに詳細に記載されているように、ある特定のリンカーは、リンカーのいかなる部分も保持することなく、活性なＰＢＤ弾頭の放出を可能にする自己崩壊部分を組み込むことができる切断可能リンカーを含む。放出に際し、ＰＢＤ弾頭は、標的細胞のＤＮＡに結合及び架橋する。このような結合は、標的がん細胞の分裂をそれらのＤＮＡヘリックスを歪ませることなく明らかに阻止すると報告されていることから、一般的な突発的な薬物耐性現象を潜在的に防ぐ。他の好ましい実施形態において、弾頭は、自己崩壊部分を含まない切断可能リンカーによってＣＬＤＮ標的部分に結合され得る。
【０２８５】
腫瘍部位におけるこのような化合物の送達及び放出は、本開示により増殖性障害を治療又は管理するのに臨床的に有効であることが証明され得る。該化合物に関して、開示されたＰＢＤのそれぞれが、各Ｃ環における１つのｓｐ２中心のみを有する化合物より、ＤＮＡの副溝における強い結合（したがってより大きい毒性）を可能にし得る、各Ｃ環における２つのｓｐ２中心を有することが理解される。したがって、本明細書に示すＣＬＤＮ  ＡＤＣに用いる場合、開示されたＰＢＤは、増殖性障害の治療にとりわけ有効であることが証明され得る。
【０２８６】
前述のことは、本発明に適合する例示的ＰＢＤ化合物をもたらし、このことは、本明細書における教示に従って抗ＣＬＤＮコンジュゲートに組み込まれることに成功し得る他のＰＢＤを限定することを決して意味しない。むしろ、本明細書で議論されるように及び下記実施例において示されるように、抗体にコンジュゲートされ得る任意のＰＢＤは、開示されたコンジュゲートと適合し、明確に本発明の範囲内にある。
【０２８７】
前述の作用剤に加えて、本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にコンジュゲートされてもよい。ある特定の実施形態において、生物学的応答修飾剤は、インターロイキン２、インターフェロン、又は様々なタイプのコロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）を含む。
【０２８８】
より一般的には、関連薬物成分は、所望の生物活性を有するポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；アポトーシス剤、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦα又はＴＮＦβ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）及びＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）が挙げられ得る。
【０２８９】
２．診断剤又は検出剤
他の実施形態において、本発明の抗体又はその断片若しくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチド又はヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア又は放射性同位体であり得る診断剤若しくは検出剤、マーカー又はレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生若しくは進行を監視するのに、又は開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するための若しくは治療の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として有用であり得る。このようなマーカー又はレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合又は抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離若しくは単離するために、又は前臨床的手法若しくは毒性研究においても、有用であり得る。
【０２９０】
このような診断、解析及び／又は検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、８９Ｚｒ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオン及び特定の放射性同位体に放射標識又はコンジュゲートした分子にカップリングすることによって、行われ得る。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
【０２９１】
他の実施形態において、抗体又はその断片は、マーカー配列又は化合物、例えば、ペプチド又はフルオロフォアに融合又はコンジュゲートされて、精製又は診断手法若しくは分析的手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣなどを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）及び「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
【０２９２】
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに特徴を調整、変化、改善又は緩和するために使用され得る生体適合性修飾因子とコンジュゲートしてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体又は融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成されてもよい。当業者は、ＰＥＧが、多くの様々な分子量及び分子構造で取得され得、これらを選択して抗体に特定の特性を付与することができる（例えば半減期を調節し得る）ことを理解する。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体若しくは抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのコンジュゲーションを通じて又はリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーあり又はなしで、抗体又は抗体断片又は誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする線状又は分岐ポリマー誘導体が、使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により密接に監視され得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、開示される抗体は、抗体若しくは抗体断片をインビボでより安定にするために又はインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００及びＷＯ０１／７７１３７；及びＥＰ０４１３，６２２を参照。他の生体適合性コンジュゲートは当業者にとって明らかであり、本明細書に記載の教示に従って容易に同定され得る。
【０２９３】
Ｂ．リンカー化合物
上で示されているように、本発明に適合するペイロードは、１つ以上の弾頭、及び任意選択的に、弾頭を抗体標的化剤と会合させるリンカーを含む。多数のリンカー化合物が、関連する弾頭に本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステイン又はリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することが必要とされるにすぎない。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的又はそれ以外のコンジュゲート）を提供するために使用され得る任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
【０２９４】
適合リンカーは、求核性である還元されたシステイン及びリシンに有利に結合し得る。還元されたシステイン及びリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィド及びチオールパラフルオロ反応が挙げられる。本明細書でさらに議論されるように、チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、この速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、及び抗体から血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンへの、マレイミド連結ペイロードの損失又は移行である。しかしながら、いくつかの実施形態において、コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、本明細書で下記実施例に示される選択的還元及び部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィド及びピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホン及びチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合し、明確に本発明の範囲内に含まれる。
【０２９５】
選択された実施形態において適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、水性媒体中で単量体状態において、ＡＤＣの自由な可溶性を保持する。細胞への移動又は送達の前には、ＡＤＣは、好ましくは安定であり、無傷のままであり、つまり、抗体は薬物部分に連結したままである。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断又は分解されるように設計され得る。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲート又は薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達又は輸送されるまで、安定及び無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；及び（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果又は細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣ並びに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体及び薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。ＭＭＡＥ及び抗体のような、２つ以上の機能的又は生物学的に活性な部分を結合するために有用な２価のリンカー試薬は公知であり、本明細書における教示と適合するそれらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されている。
【０２９６】
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカー及び非切断可能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー（例えば、オキシム及びヒドロゾン）、プロテアーゼ切断可能リンカー及びジスルフィドリンカーを含み得、標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーマル−リソソーマル経路において切断される。細胞毒の放出及び活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾン又はオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーム特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコール又はアルキルスペーサーを含有する適合性非切断可能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーマル分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、コンジュゲートで使用される特定の薬物、特定の指標及び抗体標的に依存する。
【０２９７】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソーマルプロテアーゼ又はエンドソーマルプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、薬剤がコンジュゲートされると通常減弱化され、コンジュゲートの血清安定性が比較的高いことである。
【０２９８】
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ほぼリソソームのｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満で不安定（例えば、切断可能）である。
【０２９９】
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）又は３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０３００】
本発明のある特定の態様において、選択されたリンカーは、式
【０３０１】
【化１９】
2019500335.tif 000023
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＣＬＤＮ抗体を含み、Ｌ１は、リンカー単位及び任意選択的に切断可能リンカー単位を含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、好ましくは共有結合であり、Ｕは、存在していてもしていなくてもよく、腫瘍部位における弾頭からのリンカーの完全な分離を促進する自己崩壊性単位の全て又は一部を含み得る）の化合物を含む。
【０３０２】
いくつかの実施形態（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される形態など）において、適合リンカーは、
【０３０３】
【化２０】
2019500335.tif 000024
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＣＬＤＮ抗体を含み、Ｌ１は、リンカー及び任意選択的に切断可能リンカーを含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、共有結合であるか又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊部分を形成する）を含み得る。
【０３０４】
Ｌ１及びＬ２の性質は、存在する場合、広く変動し得ることが理解される。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸若しくは塩基不安定性）、温度の変化又は放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元又は酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
【０３０５】
ある特定の実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含んでもよい。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
【０３０６】
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼ又はペプチダーゼである。
【０３０７】
別の実施形態において、Ｌ１は、カテプシン不安定性リンカーである。
【０３０８】
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１及びＸ２のＮ末端及びＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
【０３０９】
さらに、カルボキシル側鎖官能基又はアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕ及びＬｙｓに対して、ＣＯ及びＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
【０３１０】
一実施形態において、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−及び−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
【０３１１】
好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−及び−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
【０３１２】
最も好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−又は−Ｖａｌ−Ａｌａ−又はＶａｌ−Ｃｉｔである。特定の選択された実施形態において、ジペプチドは、−Ｖａｌ−Ａｌａ−を含む。
【０３１３】
一実施形態において、Ｌ２は、共有結合の形態で存在する。
【０３１４】
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。
【０３１５】
一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、これにより弾頭の放出を可能にする。
【０３１６】
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０３１７】
Ｌ１及びＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。
【０３１８】
Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基から誘導され得る。
【０３１９】
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基から誘導され得る。
【０３２０】
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基から誘導され得る。
【０３２１】
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチン及びシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体及び天然に存在するアミノ酸の誘導体；並びに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態及びそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
【０３２２】
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−及びＬ２は一緒になって基：
【０３２３】
【化２１】
2019500335.tif 000025
（式中、アスタリスクは、薬物又は細胞毒性剤の位置に対する結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である）を形成する。フェニレン環は、１、２又は３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、アルキル又はヒドロキシアルキルで置換されていてもよい。
【０３２４】
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
【０３２５】
一実施形態において、ｎは０又は１である。好ましくは、ｎは０である。
【０３２６】
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
【０３２７】
他の実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカー及びジペプチドを含み、一緒になって、基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成してもよい。他の選択された実施形態において、リンカーは、下記に示すＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ基を含んでもよい：
【０３２８】
【化２２】
2019500335.tif 000026
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは、遠位部位が活性化されるとき、以下に示す流れに沿って進み、保護された化合物（つまり、細胞毒）の明確な放出を可能にする：
【０３２９】
【化２３】
2019500335.tif 000027
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分への結合点を示し、Ｌ・は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である）。弾頭の明確な放出は、所望の毒性活性の維持を確実にする。
【０３３０】
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
【０３３１】
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
【０３３２】
ある特定の実施形態において、Ｌ１及びＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
【０３３３】
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的に関して、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ又は本明細書に記載の穏やかな還元剤での処理によってリンカー試薬とコンジュゲートするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
【０３３４】
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている、糖のヒドロキシル基又はアミノ基が挙げられる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；及び（ｖ）アルデヒド、ケトン、及びカルボキシル基が挙げられる。
【０３３５】
本発明と適合する例示的な官能基を、直下に示す：
【０３３６】
【化２４】
2019500335.tif 000028
【０３３７】
いくつかの実施形態において、システイン（部位特異的抗体の遊離システインを含む）と薬物−リンカー部分との間の結合は、リンカーに存在しているチオール残基及び末端マレイミド基を通じたものである。このような実施形態において、抗体と薬物−リンカーとの連結は、
【０３３８】
【化２５】
2019500335.tif 000029
（式中、アスタリスクは、薬物−リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す）であることができる。このような実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインから誘導され得る。
【０３３９】
他の適合可能なリンカーに関すると、結合部分は、抗体上の活性化残基と反応し得る末端ブロモアセトアミド又はヨードアセトアミドを含んで、所望のコンジュゲートをもたらすことができる。いずれにしても、当業者は、開示された薬物−リンカー化合物のそれぞれと、適合する抗ＣＬＤＮ抗体（例えば、部位特異的抗体）とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートすることができる。
【０３４０】
本開示によれば、本発明は、適合する抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、抗ＣＬＤＮ抗体を下記からなる群から選択される薬物−リンカー化合物にコンジュゲートすることを含む方法を提供する：
【０３４１】
【化２６】
2019500335.tif 000030
2019500335.tif 000031
2019500335.tif 000032
【０３４２】
本出願の目的に関し、ＤＬは、「薬物−リンカー」の略称として使用され、上記に示す薬物リンカー１〜６（つまり、ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、ＤＬ５及びＤＬ６）を含む。ＤＬ１及びＤＬ６は、同じ弾頭及び同じジペプチドサブユニットを含むが、連結基スペーサーが異なることに注意されたい。したがって、リンカーの切断によりＤＬ１及びＤＬ６の両方がＰＢＤ１を放出する。
【０３４３】
末端マレイミド部分（ＤＬ１〜ＤＬ４及びＤＬ６）又はヨードアセトアミド部分（ＤＬ５）が付されたリンカーは、当該技術分野で認識されている技術を使用して、選択されたＣＬＤＮ抗体の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートしてもよいことが理解される。前述の化合物に関する合成経路は、前述のＤＬ化合物の合成に関して明示的に参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１４／１３０８７９に示されているが、このようなＰＢＤのリンカーの組合せをコンジュゲートする具体的な方法は、以下の実施例に示されている。
【０３４４】
こうして、選択された態様において、本発明は、直下のＡＤＣ１〜６に実質的に示されているＣＬＤＮイムノコンジュゲートをもたらす、開示されたＤＬ部分にコンジュゲートされているＣＬＤＮ抗体に関する。したがって、ある特定の態様において、本発明は、
【０３４５】
【化２７】
2019500335.tif 000033
2019500335.tif 000034
2019500335.tif 000035
（式中、Ａｂは、抗ＣＬＤＮ抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む）からなる群から選択される抗体薬物コンジュゲートを対象とする。
【０３４６】
ある特定の態様において、本発明のＣＬＤＮ  ＰＢＤ  ＡＤＣは、添付されている実施例に示されている抗ＣＬＤＮ抗体又はこの免疫反応性断片を含む。特定の実施形態において、ＡＤＣ３は、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１（例えば、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ３）を含む。他の態様において、本発明のＣＬＤＮ  ＰＢＤ  ＡＤＣは、細胞結合剤ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１（例えば、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１  ＰＢＤ１）を組み込んだ、ＡＤＣ１又はＡＤＣ６を含む。
【０３４７】
Ｃ．コンジュゲーション
いくつかの周知の反応を使用して、薬物部分及び／又はリンカーが選択された抗体に結合してもよいことが理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。いくつかの実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニン及びセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて、開示されたペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るために想定どおりに仕立てられる。
【０３４８】
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミド及びヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよく又はリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件及び試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；及び（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性（又は二価）リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、及び化合物と共有又は非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
【０３４９】
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
【０３５０】
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオール又はリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬又は化合物−リンカー中間体又は薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基；並びに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物又はリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分又はリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジド基が挙げられる。
【０３５１】
コンジュゲーション試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル及びホスホラミダイトが、一般に挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類又はハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
【０３５２】
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８及び９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、イソシアネート及びイソチオシアネートを含むが、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできる。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、弾頭を抗体に共有結合させるために使用され得る。
【０３５３】
化合物をスレオニン又はセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリン又はスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的に及び迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
【０３５４】
いくつかの実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（又はその断片）に、１、２、３、４又はより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。少なくとも部分的には、本明細書に示す改変された遊離システイン部位及び／又は新規コンジュゲーション手法が提供されるため、このような部位特異的抗体又は改変抗体により、コンジュゲート調製物が、向上した安定性及び実質的な均一性を示すことが可能になる。鎖内又は鎖間の抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全又は部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元及びそれに対する薬物リンカーの結合をさらに提供する。
【０３５５】
これに関して、部位の改変及び選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなるのを可能にすることが理解される。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的操作及び選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物及び非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物及び開示された新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態及び／又は薬力学並びに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
【０３５６】
ある特定の実施形態において、部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、還元されると、上記で開示するようなリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる求核性チオール基を含む。上記のように、本発明の抗体は、還元可能な不対の鎖間若しくは鎖内システイン又は導入された非天然システイン、つまりこのような求核性基を提供するシステインを有してもよい。したがって、ある特定の実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物リンカーの末端マレイミド又はハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にされてもよい。各遊離システインは、したがって論理的に、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬は、本発明に特に適合するが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に一般に公知の様々な反応、条件及び試薬を使用して行われ得ることが理解される。
【０３５７】
さらに、操作された抗体の遊離システインは、選択的に還元されて、部位特異的コンジュゲーションの向上及び望ましくない潜在的な毒性混入物の減少をもたらし得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内又は分子間相互作用を調節することが見出され、選択された（好ましくは比較的穏やかな）還元剤と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」又は「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、この選択的な還元は、ある特定の還元剤又はある特定の還元剤濃度の使用により行われ得る。他の実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒の存在下で選択的に還元された、操作された抗体のコンジュゲーションを意味することが理解される。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤（例えば、アルギニン）の使用は、抗体重鎖及び軽鎖におけるコンジュゲーションの程度並びに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。適合する抗体構築物並びに選択的コンジュゲーション技術及び試薬は、本明細書に詳細に組み込むＷＯ２０１５／０３１６９８においてこのような方法及び構築物に関して詳細に開示されている。
【０３５８】
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節及び／又は立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）還元剤に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、（水素結合及び静電相互作用を介して）塩橋を形成することが知られており、好ましい構造変化を生じさせ得、及び／又は好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させる安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（及び分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合する、所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、このような技術は、本開示に従って作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーション及び対応する望ましくないＤＡＲ種のレベルを相当に減少させるために使用され得る。
【０３５９】
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、三級アミン又はグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリン及びシステインを含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、安定化剤は、アルギニンを含む。さらに適合安定化剤は、グアニジン及び塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
【０３６０】
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、関連するｐＫａが、標準的技術を使用して容易に計算又は決定され得、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用され得ることを理解する。
【０３６１】
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションについて部位特異的な還元された遊離のシステインを生じさせる、任意の化合物を含み得る。好ましくは、このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤又は還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」又は「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（任意選択的に安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質又は条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤又は条件（好ましくは安定化剤との組合せ）は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、遊離システインを効果的に還元する（チオールを提供する）ことができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、いくつかの実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明の選択的還元技術に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール及び２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
【０３６２】
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的であることが理解される。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（例えば、各軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上である。
【０３６３】
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生又は保存されるときに、阻止又はキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることがさらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオン及びスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防又は阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じ又は異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップをはずすことを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップされておらず、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊せず、再配列もしない、無キャップ反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元又は選択的還元）中に生じることが理解される。
【０３６４】
Ｄ．ＤＡＲ分布及び精製
選択された実施形態において、本発明に適合するコンジュゲーション及び精製方法は、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力を有利にもたらす。この点に関して、開示された構築物（例えば、部位特異的構築物）及び／又は選択的コンジュゲーションは、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点及び毒素の位置に関して、試料内のＡＤＣ種に均質性を提供する。上記で簡単に述べたように、用語「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」は、抗体に対する薬物のモル比を指す。ある特定の実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、ＡＤＣ調製物内で、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関しても均一である特定のＤＡＲ（例えば、２又は４のＤＡＲ）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であることを意味する。本発明の他のある特定の実施形態において、部位特異的抗体及び／又は選択的還元並びにコンジュゲーションの使用を通じて、所望の均質性を達成することができる。他の実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の実施形態において、適合する調製物は、所望の均質性を得るために分析的又は分取クロマトグラフィー技術を使用して精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）又はキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
【０３６５】
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るために、標準的医薬調製方法が使用され得ることが理解される。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）又は混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
【０３６６】
本開示のＡＤＣ及びその調製物は、抗体の構成及び少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分及び抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣあたりの薬物負荷は、１から２０の弾頭を含み得る（すなわち、ｎは１〜２０である）。他の選択された実施形態は、１から１５の弾頭の薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１から１２の弾頭、又はより好ましくは１から１０の弾頭を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、１から８の弾頭を含む。
【０３６７】
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性及び弾頭疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物及び他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い、例えば、＞８又は１０である薬物負荷は、ペイロードによって、凝集、不溶性、毒性又はある特定の抗体薬物コンジュゲートの細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７又は８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷性を有し得る）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４又は６であり、いくつかの実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
【０３６８】
本発明により提供される比較的高いレベルの均質性にかかわらず、開示された組成物は、ある範囲の（ＩｇＧ１の場合は１から８の範囲の）薬物化合物を有するコンジュゲートの混合物を実際に含む。このように、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成要素の抗体のほとんどは、１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（改変された構築物及び選択的還元によりもたらされる相対的なコンジュゲート特異性にもかかわらず、）薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合されていてもよい。つまり、以下の本発明のコンジュゲートＡＤＣ組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するコンジュゲートの混合物を含む（主に遊離システインの交差反応性によって引き起こされる、特定の反応混入物を含む）。しかしながら選択的還元及び作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体に対する薬物負荷（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と、商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値又は特異度、平均値、範囲又は分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５である）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
【０３６９】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の実施形態において、本発明は、２、４、６又は８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された実施形態において、本発明は、２＋／−０．５又は４＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲又は偏差は、いくつかの実施形態において、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６若しくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２若しくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、又はさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．４であり、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６又は８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、ＤＡＲが２又はＤＡＲが４）は、組成物中に存在する他の全てのＤＡＲ種に対して測定すると、５０％超の濃度、５５％超の濃度、６０％超の濃度、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度又はさらに９７％超の濃度で存在する。
【０３７０】
以下の実施例において詳述されているように、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ及び電気泳動法のような従来手段により特徴付けられ得る。抗体あたりの薬物の観点で、ＡＤＣの定量的分布も、決定され得る。ＥＬＩＳＡによって、ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値が決定され得る。しかし、抗体価あたりの薬物分布は、抗体−抗原結合、及びＥＬＩＳＡの検出限界によって認識されない。同様に、抗体−薬物コンジュゲートの検出向けのＥＬＩＳＡアッセイにより、重鎖若しくは軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基のような、薬物部分が抗体のどこに結合しているかどうかが決定されない。
【０３７１】
ＶＩ．医薬調製物及び治療的使用
Ａ．製剤及び投与経路
本発明の抗体又はＡＤＣは、当該技術分野で認識されている技術を使用して様々な方法で製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、そのまま又は最小量の付加的成分と共に投与することができ、他方で任意選択的に適切な薬学的に許容される担体を含有するように製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当該技術分野で周知であり、医薬調製物で使用するために商業的供給源から入手可能である、賦形剤、ビヒクル、アジュバント及び希釈剤を含む（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌら（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅら（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【０３７２】
適切な薬学的に許容される担体は、比較的不活性である物質を含み、抗体の投与を容易にしてもよく、又は活性化合を作用部位に送達するために薬学的に最適化された調製物に処理することを補助してもよい。
【０３７３】
このような薬学的に許容される担体は、製剤の形態、一貫性、粘度、ｐＨ、張度、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集又は溶解度を変えることができる薬剤を含み、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル剤及び皮膚浸透促進剤を含む。担体のある特定の非限定的例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、ショ糖、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びこれらの組合せを含む。全身投与のための抗体は、経腸的、非経口的又は局所的投与のために製剤化され得る。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的及び経口的薬物送達のための賦形剤及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに示されている。
【０３７４】
経腸投与のために適切な製剤は、硬又は軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ又は吸入剤及びこれらの制御放出形態を含む。
【０３７５】
非経口投与（例えば、注射による）に適切な製剤としては、活性成分が、溶解、懸濁化又は他の方法で（例えば、リポソーム又は他の微小粒子系で）提供される水性又は非水性、等張性かつ発熱物質不含有の滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられる。このような液体は、他の薬学的に許容される抗体、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定化剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤及び対象とするレシピエントの血液（又は他の関連する体液）と製剤を等張にする溶質をさらに含んでもよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。このような製剤に使用するための適切な等張の薬学的に許容される担体の例は、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル液又は乳酸リンゲル注射剤を含む。
【０３７６】
非経口投与（例えば、静脈内注射）用の適合する製剤は、約１０μｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ又は抗体濃度を含み得る。特定の選択された実施形態において、抗体又はＡＤＣ濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬを含む。他の実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬを含む。
【０３７７】
本発明の化合物及び組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮及びくも膜下内、又はそれ以外に移植若しくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルが挙げられる。適切な製剤及び投与経路は、意図する適用及び治療レジメンにより選択され得る。
【０３７８】
Ｂ．投与量及び投与レジメン
特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミング及び反復は、特定の個体並びに実験的検討事項、例えば、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）に依存する。投与の頻度の決定は、当業者、例えば、担当医により、状態及び治療される状態の重症度、治療される対象の年齢及び全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。投与の頻度は、選択した組成物の効能及び投与レジメンの評価に基づいて治療の過程を通じて調整され得る。このような評価は、特異的な疾患、障害若しくは状態のマーカーに基づいて行われ得る。個体ががんを有する実施形態において、評価は、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査、間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された抗原、増殖性又は腫瘍形成性細胞の数の減少、このような新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の減少又は転移の発生の遅延の測定を含む。
【０３７９】
本発明のＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣは、様々な範囲で投与され得る。これらの範囲としては、用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重及び用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３８０】
選択された実施形態において、ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの投与量で投与される（好ましくは静脈内）。ある特定の実施形態において、ＡＤＣは、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．００６ｍｇ／ｋｇ、０．００７ｍｇ／ｋｇ、０．００８ｍｇ／ｋｇ、０．００９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ又は１ｇ／ｋｇの濃度で投与され得る。本明細書の教示を用い、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察並びに標準的な医学及び生化学的技術及び測定に基づいて、様々なＣＬＤＮ  ＡＤＣのための適切な投与量を容易に決定することができる。
【０３８１】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．１４／５０９８０９に開示されているような体表面積（ＢＳＡ）計算に基づき、予測され得る。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算され、彼又は彼女の身体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。
【０３８２】
抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣは、特別なスケジュールで投与されてもよい。一般に、ＣＬＤＮコンジュゲートの有効量は、対象に１回以上投与される。より詳細には、ＡＤＣの有効量は、対象に、１カ月に１回、１カ月に１回より多く又は１カ月に１回未満投与される。ある特定の実施形態において、ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣの有効量は、複数回、例えば少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年又は数年間投与され得る。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６若しくは７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８週間）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８カ月間）またさらには１年間若しくは数年間が、開示された抗体又はＡＤＣの投与間に経過し得る。
【０３８３】
いくつかの実施形態において、コンジュゲート抗体を含む治療の過程は、数週間又は数カ月の期間にわたり、選択された薬物製品を複数回投与することを含む。より詳細には、本発明の抗体又はＡＤＣは、１日毎に１回、２日毎に１回、４日毎に１回、１週間毎に１回、１０日毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月毎に１回、６週間毎に１回、２カ月毎に１回、１０週間毎に１回又は３カ月毎に１回投与され得る。これに関して、患者の応答及び診療に基づき、投与量を変化させてもよく、投与間隔を調整してもよいことが理解される。本発明には、不連続投与又は数回の部分投与に分割された１日用量も包含される。本発明の組成物及び抗がん剤は、交互に、隔日又は隔週で投与されてもよく、又は一連の抗体治療を行って、この後に１つ以上の抗がん剤治療による治療を行ってもよい。いずれにしても、当業者であれば理解するように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、化学療法剤が単独で又は他の化学療法剤との併用で投与される臨床治療において既に採用されている用量程度である。
【０３８４】
特定の実施形態において、本発明は、がんの治療に用いる抗ＣＬＤＮ抗体薬物コンジュゲートを提供するものであって、治療は、抗ＣＬＤＮ抗体薬物コンジュゲート（ＣＬＤＮ  ＡＤＣ）の有効量を１週間毎（ＱＷ）に少なくとも１回、２週間毎（Ｑ２Ｗ）に少なくとも１回、３週間毎（Ｑ３Ｗ）に少なくとも１回、４週間毎（Ｑ４Ｗ）に少なくとも１回、５週間毎（Ｑ５Ｗ）に少なくとも１回、６週間毎（Ｑ６Ｗ）に少なくとも１回、７週間毎（Ｑ７Ｗ）に少なくとも１回、８週間毎（Ｑ８Ｗ）に少なくとも１回、９週間毎（Ｑ９Ｗ）に少なくとも１回又は１０週間毎（Ｑ１０Ｗ）に少なくとも１回投与することを含み得る。選択された実施形態において、ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、２週間毎（Ｑ２Ｗ）に少なくとも１回、３週間毎（Ｑ３Ｗ）に少なくとも１回、４週間毎（Ｑ４Ｗ）に少なくとも１回、５週間毎（Ｑ５Ｗ）に少なくとも１回又は６週間毎（Ｑ６Ｗ）に少なくとも１回投与される。他の選択された実施形態において、ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ又は０．８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。選択された実施形態は、ＣＬＤＮ  ＡＤＣの単回投与により患者を治療することを含む。特定の他の実施形態は、規定の間隔（すなわち、Ｑ２Ｗ、Ｑ３Ｗ、Ｑ４Ｗ、Ｑ５Ｗ、Ｑ６Ｗなど）で２サイクル（ｘ２）、３サイクル（ｘ３）、４サイクル（ｘ４）、５サイクル（ｘ５）又は６サイクル（ｘ６）患者を治療することを含む。他の実施形態において、初期ＣＬＤＮ  ＡＤＣ治療（ｘサイクルの）を完了させることができ、がんが進行の徴候を示すまでさらなるＣＬＤＮ  ＡＤＣ治療は、行われない（進行時治療）。さらに他の実施形態において、初期ＣＬＤＮ  ＡＤＣ治療（ｘサイクルの）を完了させることができ、次いで患者を維持療法（例えば、無期限に０．１ｍｇ／ｋｇ  ＣＬＤＮ  ＡＤＣ  Ｑ６Ｗ）のもとにおく。
【０３８５】
本発明のいくつかの態様において、ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、ＰＢＤを含む。さらに他の態様において、ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、静脈内投与される。特定の他の態様において、治療されるがんは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）又は大細胞神経内分泌がん（ＬＣＮＥＣ）を含む。他の選択された態様において、治療されるがん患者は、セカンドライン（ｓｅｃｏｎｄ  ｌｉｎｅ）患者（すなわち、以前に治療された患者）を含む。さらに他の実施形態において、治療されるがん患者は、サードライン（ｔｈｉｒｄ  ｌｉｎｅ）患者（すなわち、以前に２回治療された患者）を含む。
【０３８６】
本発明の特定の好ましい実施形態は、３サイクルにわたり３週間毎に０．２ｍｇ／ｋｇのＣＬＤＮ  ＡＤＣ（０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３）により患者を治療することを含む。選択された実施形態において、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３で治療される患者は、ＳＣＬＣに罹患している。他の実施形態において、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３で治療される患者は、ＬＣＮＥＣに罹患している。いくつかの態様において、患者は、がんについて治療されたことがない。特定の態様において、患者は、セカンドライン患者を含む。さらに他の実施形態において、患者は、サードライン患者を含む。他の態様において、患者は、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３治療サイクルの後、進行時に治療される。さらに他の態様において、患者は、０．２ｍｇ／ｋｇ  Ｑ３Ｗｘ３治療サイクルの後、ＣＬＤＮ  ＡＤＣ維持療法に移行する。
【０３８７】
本発明の特定の他の好ましい実施形態は、２サイクルにわたり６週間毎に０．３ｍｇ／ｋｇのＣＬＤＮ  ＡＤＣ（例えば、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２）により患者を治療することを含む。下記実施例において示されるように、このようなレジメンは、本発明のＣＬＤＮ  ＡＤＣの半減期が比較的長いため、とりわけ有効である（効果的な治療指数を示す）。選択された実施形態において、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２で治療される患者は、ＳＣＬＣに罹患している。他の実施形態において、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２で治療される患者は、ＬＣＮＥＣに罹患している。いくつかの態様において、患者は、がんについて治療されたことがない。特定の態様において、患者は、セカンドライン患者を含む。さらに他の実施形態において、患者は、サードライン患者を含む。他の態様において、患者は、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２治療サイクルの後、進行時に治療される。さらに他の態様において、患者は、０．３ｍｇ／ｋｇ  Ｑ６Ｗｘ２治療サイクルの後、ＣＬＤＮ  ＡＤＣ維持療法に移行する。
【０３８８】
さらなる実施形態において、本発明のＣＬＤＮ  ＡＤＣは、いずれか１つのサイクルにおいて異なる投与量で投与され得る。例えば、薬物を比較的高い用量（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ）で投与し（すなわち、負荷又は薬物負荷）、その後、同じサイクルの一部として４週後（Ｑ４Ｗ）により低い用量のＣＬＤＮ  ＡＤＣ（例えば、０．２ｍｇ／ｋｇ）を投与することができる。さらに、このようなサイクルを、反復する（２ｘ、３ｘなど）又は進行まで遅延させる（進行時に治療する）又はＣＬＤＮ  ＡＤＣ維持（例えば、無期限に０．１ｍｇ／ｋｇ  Ｑ４Ｗ）によりフォローアップすることができる。
【０３８９】
別の実施形態において、本発明のＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣは、疾患の初期症状後の腫瘍再発の確率を減少又は無くすための維持療法に使用されてもよい。最初の治療がＣＬＤＮ  ＡＤＣによるものか別の化学療法剤によるものかにかかわらず、このような維持療法を使用することができる。好ましくは、障害は、治療されたことがあり、最初の腫瘍塊は除去、減少又は他の方法で緩和されており、患者は無症状である又は寛解状態にある。このような場合、標準的診断手法を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くない場合でも、対象は、薬学的に有効な量の開示された抗体が１回以上投与されてもよい。
【０３９０】
別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、予防的に又は減量手法後の腫瘍転移の可能性を予防又は減少させるためのアジュバント療法として使用され得る。本開示で使用するとき、「減量手法」は、腫瘍若しくは腫瘍増殖を減少させるか又は緩和させる任意の手法、技術又は方法を意味する。例示的減量手法としては、限定されないが、外科手術、放射線治療（つまり、ビーム照射）、化学療法、免疫療法又はアブレーションが挙げられる。本開示に鑑みて当業者により容易に決定される適切な時間に、本開示のＡＤＣは、臨床的、診断的又は治療診断的手法により示唆されるように腫瘍転移を低減させるために投与されてもよい。
【０３９１】
本発明のさらに他の実施形態は、本開示のＡＤＣを、無症状であるががんを発症するリスクのある対象に投与することを含む。つまり、本発明のＡＤＣは、真に予防的な意味において使用することができ、検査若しくは試験を受けて１つ以上の認められた危険因子（例えば、ゲノム指標、家族歴、インビボ又はインビトロ試験結果など）を有するが新生物を発症していない患者に投与されてもよい。
【０３９２】
投与量及びレジメンも、本開示の組成物を個体に１回以上投与して、実験的に決定され得る。例えば、個体に、本明細書に記載されるように製造された治療組成物を、漸増する投与量で与えてもよい。選択された実施形態において、投与量は、実験的に決定されたか又は観察された副作用又は毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加又は減少又は減弱化してもよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害又は状態のマーカーを前述のように伴ってもよい。がんに関して、これらには、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された腫瘍形成性抗原、疼痛又は麻痺の減少、会話、視力、呼吸若しくは他の腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増加又は容認された試験若しくは生存の延長によって測定される生活の質の向上の測定が挙げられる。当業者は、投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の病期、新生物状態の個体の他の位置への転移並びに過去及び現在に使用している治療に依存して変わることを認識する。
【０３９３】
Ｃ．併用療法
ＣＬＤＮタンパク質は、これらのタンパク質が、上皮細胞間の細胞空間における分子の流れを制御する傍細胞バリアを確立すると考えられている上皮細胞の密着結合において発現する。抗ＣＬＤＮ抗体の使用は、上皮細胞の密着結合の破壊をもたらすことができ、こうして、そうでなければがん細胞に浸透することが可能ではないと思われる治療剤の接近を改善する。したがって、本発明の抗ＣＬＤＮ抗体及びＡＤＣと組み合わせて、様々な治療法を使用すると、がんの予防又は治療、及びがんの転移又は再発の予防に有用となり得る。「併用療法」は、本明細書において使用する場合、少なくとも１つの抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ、及び少なくとも１つの治療成分（例えば、抗がん剤）を含む組合せ物の投与を意味し、この場合、この組合せ物は、（ｉ）抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣの単独使用、又は（ｉｉ）治療成分の単独使用、又は（ｉｉｉ）抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣを添加せずに別の治療成分と組み合わせた治療成分の使用よりも、がんの治療において、治療的な相乗作用を有する又は測定可能な治療効果を改善することが好ましい。用語「治療的相乗作用」は、本明細書で使用される場合、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せの相加的効果よりも大きい治療効果を有する、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣと１つ以上の治療成分との組合せを意味する。
【０３９４】
開示された組合せの所望の転帰は、対照又はベースラインの測定に対する比較によって定量される。本明細書で使用される場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加する」又は「減少させる」は、対照、例えば、本明細書に記載の治療の開始前の同じ個体の測定値又は本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ抗体もＡＤＣも不在であるが、標準治療処置などの他の治療成分の存在下における対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定値に対する値を示す。代表的な対照個体は、治療されている個体と同じ形態のがんに罹患しており、治療されている個体とほぼ同じ年齢の個体である（治療される個体及び対照個体の疾患の病期が同等であることを確実にするため）。
【０３９５】
治療法への応答の変化又は改善は、一般に、統計学的に有意である。本明細書において使用する場合、用語「有意性」又は「有意な」は、２つ以上の実体の間に非ランダムな関係が存在する確率の統計学的解析に関する。関係が「有意」であるか又は「有意性」を有するかどうかを決定するために「ｐ値」が計算され得る。ユーザー定義のカットオフ点を下回るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満又は０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。
【０３９６】
相乗的治療効果は、単一の治療成分若しくは抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣにより誘発される治療効果よりも又は所与の組合せの抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ若しくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計よりも、少なくとも約２倍又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍又は少なくとも約２０倍又は少なくとも約５０倍又は少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。また相乗的治療効果は、単一の治療成分若しくは抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣにより誘発される治療効果又は所与の組合せの抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ若しくは単一治療成分により誘発される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％又は少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は少なくとも１００％以上の治療効果の増加として観察され得る。相乗的効果は、組合せで使用したときに、治療剤の投与量の減少を可能にする効果でもある。
【０３９７】
併用療法の実施において、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び治療成分は、単一の組成物又は同じ若しくは異なる投与経路を使用する２つ以上の別個の組成物において、対象に同時に投与することができる。代替的に、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣでの治療は、例えば、数分から数週間の間隔で、治療成分による治療に先行又は追随してもよい。一実施形態において、治療成分と、抗体又はＡＤＣとの両方が互いに約５分から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６若しくは７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８）が、抗体と治療成分の投与の間に経過してもよい。
【０３９８】
併用療法は、状態が治療されるまで、緩和されるまで、又は治癒されるまで、様々なスケジュールで、例えば、１日に１回、２回若しくは３回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、６カ月毎に１回、投与されてもよく又は連続的に投与されてもよい。抗体及び治療成分は、１日おきに若しくは１週間おきに投与されてもよく、又は一連の抗ＣＬＤＮ抗体若しくはＡＤＣ治療を行い、後に追加の治療成分で１回以上治療してもよい。一実施形態において、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣは、１つ以上の治療成分と組み合わせて短期治療サイクルで投与される。他の実施形態において、組合せ治療は、長期治療サイクルで投与される。併用療法は、任意の経路によって投与され得る。
【０３９９】
選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、ＰＤ−１阻害剤又はＰＤ−Ｌ１阻害剤のようなチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用されてもよい。ＰＤ−１は、そのリガンドＰＤ−Ｌ１と共に、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の負の制御因子である。一実施形態において、併用療法は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分と共に抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣの投与を含んでもよい。別の実施形態において、併用療法は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分と共に抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣの投与を含んでもよい。さらに別の実施形態において、併用療法は、チェックポイント阻害剤及び／又は標的化ＢＲＡＦ併用療法（例えば、ベムラフェニブ又はダブラフェニブ）での治療後に進行が続く患者に投与される抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と共に抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣの投与を含んでもよい。
【０４００】
１．卵巣がん
卵巣がんを有するほとんどの患者は、診察時に疾患が広がっている。これらの女性の８０％超が、第１選択治療（これは、積極的な腫瘍減量術及び白金−タキサンレジメンによる併用療法からなる）から利益を受けるが、これらの患者のほとんど全てにおいて、診断から１５カ月のメジアンにおいて腫瘍再発が起こる（Ｈｅｎｎｅｓｓｙ、Ｃｏｌｅｍａｎ及びＭａｒｋｍａｎ、２００９年）。毎年の卵巣がんにおける死亡は、約６５％の発生率である。腫瘍減量手術が最適に至らなかったＩＩＩ期及びＩＶ期の患者は、タキサンを含めた、現行世代の試験前の白金系併用療法により、１０％未満の５年生存率しか示さなかった。静脈内のタキサンと腹腔内の白金及びタキサンとの組合せによる最適な腫瘍減量を達成したＩＩＩ期及びＩＶ期の患者は、６６カ月メジアン生存を達成した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００６年）。
【０４０１】
卵巣上皮、卵管及び原発性腹膜がんと診断された患者の約８０％は、第１選択白金系及びタキサン系化学療法の後に再発する。白金含有レジメンを完了して６カ月以内に起こる臨床的再発は、白金不応性又は白金抵抗性再発とみなされる。これらの再発に、アントラサイクリン、タキサン、トポテカン、エトポシド及びゲムシタビンが単剤として使用される。しかし、奏効率は中程度である（１９〜２７％）。第２相試験において、トポテカンは、単剤として、１３％〜１６．３％の範囲の全奏効率（「ＯＲＲ」）をもたらした。毎週のトポテカン及び二週毎に一回のベバシズマブを組み合わせると、白金抵抗性患者集団において、２５％のＯＲＲ率となることが示された。ベバシズマブ及びオラパリブなどの標的治療法は、以前にベバシズマブにより治療されなかった患者、及び患者の腫瘍が、それぞれ、有害なＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２変異に対してポジティブと試験された患者に利用可能である。第２相試験において、ベバシズマブ単剤は、再発性又は白金抵抗性疾患において、１６％〜２１％の範囲のＯＲＲをもたらした。ベバシズマブ及び化学療法は、化学療法単独と比べて、３０．９％のＯＲＲを伴って６．７カ月のメジアン無増悪生存期間（「ＰＦＳ」）を示した。このレジメン間に、ＯＳの統計的に有意な差異はなかった。第２相試験において、オラパリブ単剤は、白金抵抗性ＢＲＣＡ１及び２の生殖系卵巣がんの患者において、３４％の奏効率及び７．９カ月の反応持続期間を生じた。オラパリブは、３種以上のラインの化学療法を受けた進行性卵巣がんの患者、及び生殖系ＢＲＣＡ変異を有する患者に現在、推奨されている。
【０４０２】
したがって、いくつかの実施形態において、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣは、がんの様々な承認済みの第一選択治療との組合せで使用されてもよい。一実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにイホスファミド、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ、ビンデシン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン（ｉｒｏｎｉｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、メトトレキセート及びペメトレキセドのような細胞毒性剤並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４０３】
別の実施形態において、例えば、卵巣がんの治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ、及びベバシズマブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えばゲムシタビン及び／又は白金アナログ）の使用を含む。
【０４０４】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び白金系薬剤（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ビノレルビン；ゲムシタビン；例えばドセタキセル若しくはパクリタキセルのようなタキサン；イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｉｃａｎ）；又はペメトレキセド）の使用を含む。
【０４０５】
２．乳がん
本発明のＡＤＣは、乳がんを治療するために使用することができる。一態様において、本発明は、乳がん（例えば、ＴＮＢＣ）を治療する方法であって、本明細書において開示されている別の治療成分と組み合わせて、抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を含む。一実施形態において、例えば、ＢＲ−ＥＲＰＲ、ＢＲ−ＥＲ又はＢＲ−ＰＲがんの治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び「ホルモン療法」として記載されている１つ以上の他の治療成分の使用を含む。「ホルモン療法」は、本明細書で使用されるとき、例えば、タモキシフェン；性腺刺激ホルモン又は黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＧｎＲＨ又はＬＨＲＨ）；エベロリムス及びエキセメスタン；トレミフェン；又はアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン又はフルベストラント）を指す。
【０４０６】
別の実施形態において、例えばＢＲ−ＨＥＲ２の治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及びトラスツズマブ又はトラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ−ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ペルツズマブ及び／又はドセタキセル）の使用を含む。
【０４０７】
いくつかの実施形態において、例えば転移性乳がんの治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにタキサン（例えば、ドセタキセル又はパクリタキセル）並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン若しくはエピルビシン）及び／又はエリブリンの使用を含む。
【０４０８】
別の実施形態において、例えば転移性又は再発性乳がん又はＢＲＣＡ−変異乳がんの治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及びメゲストロール及び任意選択的に追加の治療成分の使用を含む。
【０４０９】
さらなる実施形態において、例えばＢＲ−ＴＮＢＣの治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、ＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ルカパリブ及びベリパリブ）並びに任意選択的に追加の治療成分の使用を含む。
【０４１０】
別の実施形態において、例えば乳がんの治療において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにシクロホスファミド並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、５−ＦＵ及び／又はメトトレキサート）の使用を含む。
【０４１１】
３．肺がん
本発明のＡＤＣは、乳がんを治療するために使用することができる。一態様において、本発明は、肺がん（例えば、肺扁平上皮癌又は肺腺癌）を治療する方法であって、本明細書において開示されている別の治療成分と組み合わせて、抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を含む。別の実施形態において、ＥＧＦＲ−ポジティブＮＳＣＬＣの治療の場合の併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ、及びアファチニブ及び任意選択の１つ以上の他の治療成分（例えば、エルロチニブ及び／又はベバシズマブ）の使用を含む。別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにアファチニブ並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、エルロチニブ及び／又はベバシズマブ）の使用を含む。
【０４１２】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及びエルロチニブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ベバシズマブ）の使用を含む。
【０４１３】
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及びセリチニブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４１４】
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及びクリゾチニブ及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４１５】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにベバシズマブ並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、ドセタキセル若しくはパクリタキセルのようタキサン；及び／又は白金アナログ）の使用を含む。
【０４１６】
一実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び白金系薬物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）アナログ、及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、例えばドセタキセル及びパクリタキセルタキサンのようなタキサン）の使用を含む。
【０４１７】
一実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び白金系薬物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）アナログ、及び任意選択的に１つ以上の他の治療成分（例えば、例えばドセタキセル及びパクリタキセル及び／又はゲムシタビン及び／又はドキソルビシンなどのタキサン）の使用を含む。
【０４１８】
特定の実施形態において、白金製剤耐性腫瘍の治療のための併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにドキソルビシン及び／又はエトポシド及び／又はゲムシタビン及び／又はビノレルビン及び／又はイホスファミド及び／又はロイコボリン変調（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｃｉｌ）及び／又はベバシズマブ及び／又はタモキシフェン並びに任意選択的に１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４１９】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ、及びＰＡＲＰ阻害剤及び任意選択の１つ以上の他の治療成分の使用を含む。
【０４２０】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及びベバシズマブ及び任意選択的にシクロホスファミドの使用を含む。
【０４２１】
併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び変異又は異常発現した遺伝子又はタンパク質（例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）を含む腫瘍（例えば、黒色腫）に有効な化学療法成分を含んでもよい。
【０４２２】
Ｔリンパ球（例えば、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ））は、悪性腫瘍に対する宿主防御に重要な役割を果たす。ＣＴＬは、抗原提示細胞上の腫瘍関連抗原の提示によって活性化される。活性特異的免疫療法は、既知のがん関連抗原に由来するペプチドを患者にワクチン接種することによって、がんに対するＴリンパ球応答を増強するために使用することができる方法である。一実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ並びにがん関連抗原（例えば、メラノサイト系譜特異的抗原チロシナーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１又はｇｐ７５）に対するワクチンを含んでもよい。他の実施形態において、併用療法は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣの投与と共に、自己ＣＴＬ又はナチュラルキラー細胞のインビトロ拡大増殖、活性化及び養子性再導入を含んでもよい。ＣＴＬ活性化は、抗原提示細胞による腫瘍抗原提示を増強する戦略によっても促進され得る。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、樹状細胞の動員及び樹状細胞交差プライミングの活性化を促進する。一実施形態において併用療法は、抗原提示細胞の単離、このような細胞の刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）による活性化、腫瘍関連抗原を用いたプライミング並びにこの後の抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣ及び任意選択的に１つ以上の異なる治療成分の使用を組み合わせた患者への抗原提示細胞の養子性再導入を含んでもよい。
【０４２３】
本発明は、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣと放射線療法との組合せも提供する。用語「放射線療法」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出などを意味する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、本明細書に開示の抗ＣＬＤＮ抗体と組み合わせて又は抗ＣＬＤＮ抗体のコンジュゲートとして使用され得る。典型的には、放射線療法は、約１から約２週間の期間にわたりパルスで投与される。任意選択的に、放射線療法は、単独用量として又は複数回の連続用量として投与されてもよい。
【０４２４】
他の実施形態において、抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣは、下記の抗がん剤の１つ以上と組み合わせて使用され得る。
【０４２５】
Ｄ．抗がん剤
用語「抗がん剤」又は「化学治療剤」は、本明細書において使用する場合、「治療成分」の１つのサブセット、つまり「医薬として活性な成分」として記載される薬剤のサブセットである。より詳細に、「抗がん剤」は、がんのような細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を意味し、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線治療及び放射線治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。選択された実施形態において、上記で議論されているように、このような抗がん剤は、コンジュゲートを含むことができ、投与前に抗体と会合させてもよい。ある特定の実施形態において、開示された抗がん剤は、本明細書において開示されているＡＤＣを与えるよう、抗体に連結される。
【０４２６】
用語「細胞毒性剤」は、やはり抗がん剤とすることができ、細胞に対して毒性である物質、細胞の機能を低下若しくは阻害する物質、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。通常、これらの物質は、生きている生物に由来する天然分子（又は、合成的に調製された自然産物）である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素又は酵素的に活性な細菌毒素（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体内毒素及び菌体外毒素、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モルデクシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン及びトリコテセン）又は動物の毒素（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片及び／又はバリアントを含む）が挙げられる。
【０４２７】
抗がん剤は、がん性細胞、又はがん性になる可能性がある若しくは腫瘍形成性後代（例えば、腫瘍形成性細胞）を発生する可能性がある細胞を阻害する、又は阻害するように設計されている、任意の化学剤を含み得る。このような化学剤は、細胞の成長又は分裂に必要な細胞内プロセスをしばしば対象とし、したがって、一般的に急速に成長して分裂するがん性細胞対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を解重合し、こうして、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。このような薬剤が投与されることが多く、組み合わせて、例えば、製剤ＣＨＯＰにおいて最も有効となることが多い。やはり、選択された実施形態において、このような抗がん剤は、開示される抗体にコンジュゲートされて、ＡＤＣをもたらす。
【０４２８】
本発明の抗体と組み合わせて（又はコンジュゲートして）使用し得る細胞毒性剤又は抗がん剤の例は、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミン及びメチルメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン  ダイネマイシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カンフォスファミド、カルビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、トルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン，ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファーニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリゴマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ラパマイン、ロドルビシン、ゾラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、クエン酸タモキシフェン、テモゾロミド、テパディナ（ｔｅｐｏｄｉｎａ）、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝物質、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎物質、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）のような葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキサート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖錯体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロエチルアミン；トリコテシン類（Ｔ−２毒素、ベラキュリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ及びアン��イジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、細胞増殖を減少させるＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤並びに上記のいずれかの医薬的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体を含む。腫瘍に対するホルモンの作用を調節するか又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤並びに抗アンドロゲン剤並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビン及びエスペラミシン並びに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体なども本定義に含まれる。
【０４２９】
抗がん剤は、商業的又は臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的又は臨床的に利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ  ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商��）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
【０４３０】
用語「薬学的に許容される塩」又は「塩」は、分子又は巨大分子の有機塩又は無機塩を意味する。酸付加塩は、アミノ基と共に形成され得る。例示的な塩としては、これらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩（すなわち、１，１’メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））が挙げられる。薬学的に許容される塩は、例えば、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子が包含されたものを含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、この塩は複数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有し得る。
【０４３１】
「薬学的に許容される溶媒和物」又は「溶媒和物」は、１つ以上の溶媒分子と分子又は巨大分子との会合物を指す。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、これらに限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられる。
【０４３２】
他の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、現在臨床試験にある又は市販のいくつかの抗体（又は免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。開示された抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、アテゾリズマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パーサツズマブ、パトリツマブ、ペンブロリズマブ、ペムツモマブ、パーツズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＤＸ−１１０５及びＭＥＤＩ４７３６及びこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
【０４３３】
他の実施形態は、がん治療のために承認された抗体、例えば、これらに限定されないが、リツキシマブ、ゲムツズマブ  オゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｔｉｔｕｍｕｍａｂ）、オファツムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブベドチンの使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
【０４３４】
Ｅ．放射線療法
本発明は、抗体又はＡＤＣと、放射線療法（つまり、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組合せも提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、開示された抗体又はＡＤＣは、標的抗がん剤又は他の標的化手段と結び付けて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部がんを有する対象に約６〜７週間投与されてもよい。任意選択的に、放射線療法は、単回用量として又は複数回の連続用量として投与されてもよい。
【０４３５】
ＶＩＩ．適応症
本発明は、本発明の抗体及びＡＤＣの、様々な障害、例えば、新生物、炎症性、血管新生及び免疫学的障害並びに毒素によって引き起こされる障害の診断、診断治療、治療及び／又は予防のための使用を提供する。特定の実施形態において、治療される疾患は、固形腫瘍を含む新生物状態を含む。他の実施形態において、治療される疾患は、血液悪性疾患を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体又はＡＤＣは、ＣＬＤＮ決定因子を発現する腫瘍又は腫瘍形成性細胞を治療するために使用される。好ましくは、治療される「対象」又は「患者」はヒトであるが、本明細書で使用するとき、それらの用語は、あらゆる哺乳動物種を含むものとして表される。
【０４３６】
本発明の化合物及び組成物は、疾患の様々な病期にあり、治療サイクルにおける種々の点にある対象を治療するために用いることができることが理解される。したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体及びＡＤＣは、フロントライン治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の抗体及びＡＤＣは、セカンドライン患者及びサードライン患者（すなわち、同じ状態について以前にそれぞれ１及び２回治療を受けた対象）を治療するために用いられる。さらに他の実施形態は、開示されたＣＬＤＮ  ＡＤＣにより又は異なる治療剤により３回以上同じ又は関連する状態について治療されたフォースライン患者又はこれより高次の患者（例えば、胃又は結腸直腸がん患者）の治療を含む。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体又はＡＤＣを用いて又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。
【０４３７】
ある特定の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、フロントライン治療又は導入治療として、単剤として若しくは組合せのどちらかとして使用されて、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、単剤として若しくは組合せとして、強化療法又は維持療法の間に使用される。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体若しくはＡＤＣを用いて、又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象、又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、幹細胞源として、骨髄、臍帯血又は動員末梢血液による自己造血幹細胞又は同種造血幹細胞の移植のどちらかを受ける準備に、コンディショニングレジメンの一部として使用される。
【０４３８】
より一般的には、本発明に従った新生物状態の治療対象は、良性又は悪性であり得、固形腫瘍及び血液悪性疾患であり得、限定されないが、以下の群から選択され得る；副腎腫瘍、ＡＩＤＳ−関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱がん（扁平上皮癌及び移行上皮癌）、胞胚腔障害、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨のう腫（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ  ｂｏｎｅ  ｃｙｓｔ）、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頚部がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、腎明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、深在性良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮障害、ユーイング腫瘍、骨格性粘液様軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管がん、胃がん、胃腸、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺障害、頭頚部がん、視床下部、腸がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞癌）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞癌）、リンパ腫、肺がん（小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌など）、マクロファージ障害（ｍａｃｒｏｐｈａｇａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭癌、副甲状腺腫瘍、小児科がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体膿瘍腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、希少血液障害（ｒａｒｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎性転移性がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、間質性障害、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移性がん及び子宮がん（子宮頸部癌、子宮内膜癌及び平滑筋腫）。
【０４３９】
ある特定の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、フロントライン治療として使用され、がん性状態に関して以前に治療されたことがない対象に投与される。他の実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、以前に（本発明の抗体若しくはＡＤＣを用いて、又は他の抗がん剤を用いて）治療され、再燃した対象、又は以前の治療に対して不応性と判断された対象を治療するために使用される。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍を有する対象を治療するために使用され得る。
【０４４０】
特定の実施形態において、増殖性障害は、固形腫瘍、例えば、限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮内膜、子宮頚部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞及び非小細胞の両方を含む）、甲状腺、癌腫、肉腫、神経膠芽腫及び様々な頭頚部の腫瘍を含む。他の実施形態において、及び下記実施例において示されるように、本開示のＡＤＣは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん及び扁平上皮小細胞肺がん）を治療するのにとりわけ有効である。一実施形態において、肺がんは、白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）及び／又はタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル若しくはカルバジタキセル）に対して不応性、再発性又は抵抗性である。さらに他の実施形態において、治療される対象は、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）に罹患している。選択された実施形態において、抗体及びＡＤＣは、限定された病期の疾患又は広範囲の病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の実施形態において、開示されたコンジュゲート抗体は、不応性患者（つまり、初期治療の全工程中又は直後に疾患を再発する患者）、感受性のある患者（つまり、再発が一次治療から２〜３カ月後より長い患者）；又は白金系薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）及び／若しくはタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル若しくはカバジタキセル）に耐性を示す患者に投与される。特定の好ましい実施形態において、本発明のＣＬＤＮ  ＡＤＣは、フロントライン患者に投与することができる。他の実施形態において、本発明のＣＬＤＮ  ＡＤＣは、セカンドライン患者に投与することができる。さらに他の実施形態において、本発明のＣＬＤＮ  ＡＤＣは、サードライン患者に投与することができる。
【０４４１】
Ａ．婦人科系のがん
ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＣは、婦人科系のがん、特に、卵巣がん又は子宮内膜がんを治療するために使用される。卵巣がんは、米国において診断された新しいがんの症例の１．３％に相当し、２０１５年に、２１，２９０名の新規症例及び１４，１８０名の死亡と推定される。卵巣の上皮癌は、最も一般的な婦人科系の悪性腫瘍の１つであり、女性におけるがん死亡の第５番目に頻度の高い原因であり、全ての症例の５０％が、６５歳より高齢の女性に起こっている。上皮卵巣がんを有する患者の４０％未満しか治癒しない。それほど一般的でないが、卵管がん及び原発性腹膜がんは、卵巣上皮がんに似ており、同じ方法で段階付けされて治療される。
【０４４２】
卵巣癌の主なサブタイプは、高次及び低次漿液性、類内膜、明細胞及び粘膜性のものを含む。明細胞、低次類内膜、粘液性及び低次漿液性癌腫は、異型内膜症、又は漿液性境界悪性腫瘍に起因し、Ｋ−Ｒａｓ、Ｂ−Ｒａｆ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＮＮＢ１、ＰＴＥＮ、ＡＲＩＤ１Ａ及びＨＮＦ１における特異的な変異により特徴付けられ、都合のよい予後への介在を有する。高度漿液性癌は、卵巣がん診断の全ての約７０％を占め、大部分の患者は、診断時に進行性疾患（ＩＩＩ期及びＩＶ期）及び予後不良を有する。これらの腫瘍は、卵管の端の采状上皮に起因していると考えられ、遺伝的に不安定であり、ほとんど全てが、ＴＰ５３変異及び／又はｐ５３タンパク質の蓄積若しくは完全喪失のどちらかに至る機能異常を伴う。ＢＲＣＡ１及び２生殖系及び体細胞変異は、高次漿液性腫瘍を伴い、それぞれ、卵巣がんの約１５％及び６％に起こる。
【０４４３】
子宮体部子宮内膜癌は、米国において、最も一般的な婦人科系悪性腫瘍であり、女性のがん全ての約６％を占め、２０１６年において、６０，０５０の新規症例及び１０，４７０名の死亡者と推定される。このタイプの婦人科系悪性腫瘍は、子宮の内部内張である、子宮内膜において始まる。これは、６０歳以上の女性において最も一般に起こる。子宮内膜がんのほとんど７０％が、早期において診断され、この場合、がんは、子宮の外部に広がっていない。子宮の外に広がった末期の腫瘍は、ホルモン療法により治療され得るが、ただし、これらの腫瘍は、適切な受容体を発現する条件とする。子宮体部子宮内膜癌のサブセットは、ＴＰ５３の発生頻度の高い変異、ほとんどないＤＮＡメチル化の変化、及び広範囲なコピー数の改変を含めた、漿液性卵巣がんと遺伝的特徴を共有している。
【０４４４】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、卵巣がん、例えば、高次及び低次漿液性、類内膜性、明細胞及び粘液性卵巣癌を治療する方法であって、本明細書において開示されている抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を含む。他の実施形態において、本発明は、子宮内膜がん、特に、末期（例えば、ＩＩＩ期及びＩＶ期）の子宮内膜がんを治療する方法を含む。
【０４４５】
Ｂ．肺がん
他の実施形態において、開示される抗体及びＡＤＣは、以下のサブタイプ：小細胞肺がん及び非小細胞肺がん（例えば、扁平上皮腺癌）を含めた、肺がんの治療にとりわけ有効である。
【０４４６】
いくつかの実施形態において、本開示のＡＤＣは、小細胞肺がんを治療するために用いることができる。このような実施形態に関して、コンジュゲート抗体は、限定された病期の疾患を示す患者に投与することができる。他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、広範囲の病期の疾患を示す患者に投与することができる。他の好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは、不応性患者（すなわち、最初の療法の過程中若しくはその完了の直後に再発した患者）又は再発小細胞肺がん患者に投与される。さらに他の実施形態は、感受性患者（すなわち、再発が一次療法の後２〜３カ月より長い患者）への本開示のＡＤＣの投与を含む。それぞれの場合において、適合ＡＤＣは、選択された投与レジメン及び臨床診断によって他の抗がん剤と組み合わせて用いることができることが理解される。本発明の抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣはまた、１回又は２回の治療の後に進行性疾患を有するＳＣＬＣ患者（すなわち、セカンドラインＳＣＬＣ患者又はサードラインＳＣＬＣ患者）を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、開示されるＡＤＣは、小細胞肺がんを治療するために使用されてもよい。このような実施形態に関して、コンジュゲート抗体は、限定された病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の実施形態において、本開示のＡＤＣは、広範囲の病期の疾患を示す患者に投与される。他の好ましい実施形態において、本開示のＡＤＣは、不応性患者（すなわち、最初の療法の過程中若しくはその完了の直後に再発した患者）又は再発小細胞肺がん患者に投与される。さらに他の実施形態は、本開示のＡＤＣの感受性患者（すなわち、再発が一次療法の後の２〜３カ月より長い患者）への投与を含む。各場合において、適合ＡＤＣは、選択された投与レジメン及び臨床診断に応じて、他の抗がん剤と組み合わせて使用され得ることが理解される。本発明の抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、１回又は２回の治療の後に進行性疾患を有するＳＣＬＣ患者（すなわち、セカンドラインＳＣＬＣ患者又はサードラインＳＣＬＣ患者）を治療するために用いることもできる。
【０４４７】
Ｃ．乳がん
他の実施形態において、開示される抗体及びＡＤＣは、乳がん、例えば、基底様、子宮内膜、エストロゲン受容体ポジティブ及び／又は黄体ホルモン受容体ポジティブ、トリプルネガティブ乳がんの治療にとりわけ有効である。ＡＤＣは、限定された病期の疾患又は広範囲の病期の疾患を示す患者に投与され得る。他の実施形態において、開示されるＡＤＣは、不応性患者又は再発乳がん患者に投与される。さらに他の実施形態は、乳がんを罹患している感受性の高い患者への開示されるＡＤＣの投与を含む。各場合において、適合抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、選択された投与レジメン及び臨床診断に応じて、他の抗がん剤と組み合わせて使用され得ることが理解される。
【０４４８】
ＶＩＩＩ．製品
本発明は、１つ以上の容器又はレセプタクルを含む医薬パック又はキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体又はＡＤＣを含み得る。このようなキット又はパックは、本質的に診断用又は治療用である。特定の実施形態において、パック又はキットは、１つ以上の追加の薬剤及び任意選択的に１つ以上の抗がん剤を含むか又は含まない、例えば、本発明の抗体又はＡＤＣを含む組成物の所定の量を意味する、単位用量を含む。特定の他の実施形態において、パック又はキットは、がん性細胞の検出、定量化及び／又は視覚化のための結合レポーター分子及び任意選択的に１つ以上の追加の薬剤を含むか又は含まない、検出可能な量の抗ＣＬＤＮ抗体又はＡＤＣを含む。
【０４４９】
いずれにしても本発明のキットは、一般的に、薬学的に許容される製剤を含む適切な容器又はレセプタクル内に、本発明の抗体又はＡＤＣを含み、任意選択に、同じか又は異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断又は併用療法用のいずれかのために、他の薬学的に許容される製剤又は装置を含んでもよい。診断装置又は機器の例としては、細胞又は増殖性障害に伴うマーカーの検出、監視、定量化又はプロファイルに使用し得るものを含む（このようなマーカーの完全な列挙について、上記参照）。いくつかの実施形態において、装置は、インビボ又はインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、監視、及び／又は定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体又はＡＤＣを抗がん剤又は診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９参照）。
【０４５０】
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は非水性であり得るが、典型的には水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、又は適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の薬学的に許容されるバッファー又は他の希釈剤、例えば、注射用静菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含み得る。キットが、本発明の抗体又はＡＤＣをさらなる治療薬又は薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、又は一方の成分を他方より過剰にして予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体又はＡＤＣ及びいずれかの任意選択の抗がん剤又は他の薬剤（例えば、ステロイド）は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
【０４５１】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の組成物を含む前述のキットは、キットの内容物ががんの治療、予防及び／又は診断のために使用され得ることを示すラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本を含む。他の好ましい実施形態において、キットは、キットの内容物が、がんを患う対象を治療するためのある種の投与量又は投与レジメンに従って投与され得ることを示す、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本を含むことができる。特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本は、キットの内容物が、血液悪性腫瘍（例えば、ＡＭＬ）の治療、予防及び／若しくは診断のために用いられ得ること、又はこの治療の投与量若しくは投与レジメンを提示することを表示する。他の特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は読本は、キットの内容物が、肺がん（例えば、腺癌）の治療、予防及び／若しくは診断、又はこの治療のための投与レジメンのために用いられ得ることを表示する。
【０４５２】
適切な容器又はレセプタクルとしては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、注入バッグ（ＩＶバッグ）などが含まれる。容器は、ガラス又は医薬として適合するプラスチックのような様々な材料から形成され得る。ある特定の実施形態において、レセプタクルは、滅菌アクセスポートを含むことができる。例えば、容器は、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい。
【０４５３】
いくつかの実施形態において、キットは、抗体及びいずれかの任意選択の成分を患者に投与するための手段、例えば、製剤を対象に注射若しくは導入する又は身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針又はシリンジ（充填済又は空）、点眼器、ピペット又は他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアル又はそれと同様のもの、及び市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアル及び他の装置を配置及び保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
【０４５４】
ＩＸ．その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両方の終点及び終点の間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０及び２．０と３．０との間の全ての点を含む。
【０４５５】
一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及び化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法及び技術は、一般的に、当該技術分野で周知の及び本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
【０４５６】
Ｘ．参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願及び出版物並びに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列提出物並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込む」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かにかかわらず、参照により組み込む。前述の詳細な説明及び以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は組織化を目的とするものにすぎず、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
【実施例】
【０４５７】
上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない、実施例は、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験であると表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
配列表のまとめ
表３は、本明細書に含まれているアミノ酸配列及び核酸配列のまとめを提示している。
【０４５８】
【表３】
2019500335.tif 000036
2019500335.tif 000037
【０４５９】
腫瘍細胞株のまとめ
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０〜ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前のマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプ及びサブタイプの略称が以下の通り表４に示される：
【０４６０】
【表４】
2019500335.tif 000038
2019500335.tif 000039
【０４６１】
［実施例１］
組換えＣＬＤＮタンパク質のクローニング及び発現、並びに細胞表面ＣＬＤＮタンパク質を過剰発現する細胞株の操作
ヒトクローディン（ＣＬＤＮ）遺伝子ファミリーは、２３の既知の遺伝子からなる。クローディンタンパク質配列間の関係を推定するために、ベクターＮＴＩソフトウェアパッケージのＡｌｉｇｎＸプログラムを使用して、２３のヒトＣＬＤＮ遺伝子から３０のクローディンタンパク質配列をアラインメントした。このアラインメントの結果は、図１Ａにおける樹状図として図示されている。この図を吟味すると、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９は、配列が極めて近縁であり、樹状図の同じ分枝上に互いに隣接して出現する一方、ＣＬＤＮ４が、次に最も近縁のＣＬＤＮタンパク質配列であることを示している。アミノ酸配列それ自体を検討すると、ヒトＣＬＤＮ６タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ９タンパク質配列と極めて近縁である（図１Ｂ）。ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９タンパク質は、この細胞外ドメイン（ＥＣＤ）において高度に保存されている（太字、図１Ｂ）一方、カルボキシ末端細胞質ドメインは、これらのタンパク質の最も異なる部分である（小文字、残基１８１〜２２０、図１Ｂ）。これらのタンパク質配列関係に基づくと、完全長ヒトＣＬＤＮ６抗原による免疫付与は、ヒトＣＬＤＮ９  ＥＣＤとやはり交差反応性である、ヒトＣＬＤＮ６  ＥＣＤを認識する多数の抗体がもたらすと仮説が立てられた。
【０４６２】
ヒトＣＬＤＮ６タンパク質、ヒトＣＬＤＮ４タンパク質及びヒトＣＬＤＮ９タンパク質をコードするＤＮＡ断片
ヒトＣＬＤＮ６（ｈＣＬＤＮ６）タンパク質に関して、本発明において必要な分子材料及び細胞材料を全て生成するために、ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＮＰ＿０６７０１８と同一のタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ断片を合成した（ＩＤＴ）。このＤＮＡクローンを、成熟ｈＣＬＤＮ６タンパク質又はその断片を発現する構築物の全ての後続の操作のために使用した。同様に、ヒトＣＬＤＮ４（ｈＣＬＤＮ４）に対する、ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＮＰ＿００１２９６、又はヒトＣＬＤＮ９（ｈＣＬＤＮ９）に対する、ＮＣＢＩタンパク質受託番号ＮＰ＿０６６１９２と同一のタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ断片を購入し、ｈＣＬＤＮ４タンパク質若しくはｈＣＬＤＮ９タンパク質又はこれらの断片を発現する構築物の全ての後続の操作のために使用した。
【０４６３】
細胞株の操作
当該技術分野において認識されている技術を使用して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株又は３Ｔ３細胞株を形質導入するようにレンチウイルスベクターを使用して、上記で列挙された様々なＣＬＤＮタンパク質を過剰発現する、操作された細胞株を構築した。まず、鋳型として上に記載した、市販品の合成ＤＮＡ断片を使用して目的のタンパク質（例えば、ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ９又はｈＣＬＤＮ４）をコードするＤＮＡ断片を増幅するために、ＰＣＲを使用した。次いで、個別のＰＣＲ生成物を、レンチウイルス発現ベクターであるｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の多重クローニング部位（ＭＣＳ）へとサブクローニングして、一連のレンチウイルスベクターを生成した。結果として得られたｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＣＬＤＮ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰベクター内のＴ２Ａ配列は、ペプチド結合の縮合部のリボソームスキッピングを促進し、以下の２つの独立したタンパク質を発現する：Ｔ２Ａペプチドの下流においてコードされるＧＦＰマーカータンパク質の共発現を伴う、Ｔ２Ａペプチドの上流においてコードされる、特異的なＣＬＤＮタンパク質の高レベル発現。この一連のレンチウイルスベクターを用い、当業者に周知の標準的なレンチウイルス形質導入技術を使用して、個別のＣＬＤＮタンパク質を過剰発現する、別個の安定なＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株又は３Ｔ３細胞株を作製した。ＣＬＤＮポジティブ細胞は、ＧＦＰに対してもやはり強力にポジティブな高発現ＨＥＫ−２９３Ｔサブクローンを使用して、ＦＡＣＳにより選択した。
【０４６４】
［実施例２］
抗ＣＬＤＮ抗体の生成
ＣＬＤＮタンパク質を認識する抗体を生成する目的のために、２つの免疫付与を行った。第１の免疫付与において、ＣＬＤＮ６を過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞又は３Ｔ３細胞（実施例１において記載されている通りに生成した）をマウスに接種した。第１の免疫付与において、６匹のマウス（以下の株：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢを各々２匹ずつ）に、等体積のアジュバントを用いて乳化させたｈＣＬＤＮ６−ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞１００万個を接種した。第２の免疫付与において、６匹のマウス（以下の株：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢを各々２匹ずつ）に、ＣＬＤＮ６を過剰発現する３Ｔ３細胞を接種した。初回の接種に続き、各場合において、マウスに、毎週２回ずつ７週間、個々の接種材料を注射した。
【０４６５】
マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径及び内側腸骨）を切開し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞（３０５ｘ１０６細胞）の単一細胞浮遊液を非分泌Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１５８０）と、１：１の比率で、エレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して融合した。細胞を、ハイブリドーマ選択培地：アザセリン（Ｓｉｇｍａ）、１５％の胎性クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール及び１００μＭのヒポキサンチンを補足したＤＭＥＭ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）に再浮遊させ、３つのＴ２２５フラスコ中、フラスコあたり９０ｍＬの選択培地において培養した。フラスコを、５％ＣＯ２及び９５％空気を含有する３７℃の加湿インキュベーターにおいて、６日間、置いた。ライブラリは、バイアルあたり約１５ｘ１０６個の生存細胞で、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０バッファー（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の６個のバイアル中で凍結し、液体窒素中で保管した。
【０４６６】
ライブラリからのバイアル１つを３７℃で解凍し、凍結したハイブリドーマ細胞を、上記の９０ｍＬのハイブリドーマ選択培地に添加し、Ｔ１５０フラスコに入れた。細胞は、５％のＣＯ２及び９５％の空気を含有する、３７℃の加湿インキュベーター内で、一晩にわたり培養した。翌日、ハイブリドーマ細胞をフラスコから採集し、（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞ソーターを使用して）２００μＬの補給したハイブリドーマ選択培地中の、ウェルあたり細胞１個を、４８のＦａｌｃｏｎ９６ウェルＵ底プレートに蒔いた。ハイブリドーマを、１０日間、培養し、フローサイトメトリを使用して、上清を、ｈＣＬＤＮ６タンパク質、ｈＣＬＤＮ４タンパク質又はｈＣＬＤＮ９タンパク質に特異的な抗体についてスクリーニングした。フローサイトメトリは、以下の通りに実施した：ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ４又はｈＣＬＤＮ９をコードするレンチウイルスベクターを安定的に形質導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の、ウェルあたり１×１０５個を、１００μＬのハイブリドーマ上清と共に、３０分間、インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより洗浄し、次いで、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中、１：２００に希釈された、試料あたり５０μＬのＤｙＬｉｇｈｔ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間のインキュベート後、細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより２回、洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰＢＳ／２％ＦＣＳに再浮遊させ（死滅細胞を検出するため）、アイソタイプ対照抗体により染色された細胞の蛍光を超える蛍光についてフローサイトメトリにより解析した。１つ以上のＣＬＤＮ抗原に対する抗体について試験するとポジティブとなった、選択されたハイブリドーマは、さらなる特徴付けを行うために確保した。未使用ハイブリドーマライブラリ細胞の残りは、今後のライブラリ試験及びスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
【０４６７】
［実施例３］
抗ＣＬＤＮ抗体の配列決定
抗ＣＬＤＮ抗体は、上記の実施例２において記載した通りに生成し、次いで、以下の通りに配列決定した。全ＲＮＡは、製造業者の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、選択されたハイブリドーマ細胞から精製した。試料あたり１０４〜１０５個の間の細胞を使用した。単離したＲＮＡ試料は、使用するまで−８０℃において保存した。各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した８６のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む２つの５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組合せて使用して増幅させた。同様に、ＶＫマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した６４の５’ＶＫリーダー配列を含む２つのプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ＶＨ及びＶＬ転写産物を、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で４つのＲＴ−ＰＣＲ反応を各ハイブリドーマについて実施し、２つはＶＫ軽鎖について、２つはＶＨ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、１．５μＬのＲＮＡ、０．４μＬの１００μＭの重鎖又はカッパ軽鎖いずれかのプライマー（ＩＤＴによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ並びに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する０．６μＬの酵素ミックスを含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、以下のステップ：５０℃で６０分間、９５℃で１５分間のＲＴステップ、続いて（９４．５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１分間）を３５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終インキュベートを含んだ。抽出されたＰＣＲ産物を、上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製及び配列決定サービスのため、外部配列決定提供業者（ＭＣＬＡＢ）に送付した。
【０４６８】
図２Ａ及び図２Ｂは、例示マウス及びヒト化（以下の実施例４に記載されている）抗ＣＬＤＮ抗体（配列番号２１〜７７、奇数）及びｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８及びｈＳＣ２７．２０４（以下の実施例５にさらに記載されている）のバリアントの軽鎖（図２Ａ）及び重鎖（図２Ｂ）可変領域アミノ酸配列を示している。マウス及びヒト化軽鎖及び重鎖可変領域核酸配列は、図２Ｃ中に提示されている（配列番号２０〜７６、偶数）。図２Ａ及び２Ｂは共に、ＳＣ２７．１、ＳＣ２７．２２、ＳＣ２７．１０３、ＳＣ２７．１０４、ＳＣ２７．１０５、ＳＣ２７．１０６、ＳＣ２７．１０８、ＳＣ２７．２０１、ＳＣ２７．２０３、ＳＣ２７．２０４、ｈＳＣ２７．１、ｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８、ｈＳＣ２７．２０４及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２と称される、マウス及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体の注釈の付いたＶＨ及びＶＬ配列を提示する。アミノ酸配列に注釈を付けて、Ｋａｂａｔに準拠して定義される、フレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び相補性決定領域（すなわち、図２Ａ中のＣＤＲＬ１〜ＣＤＲＬ３又は図２Ｂ中のＣＤＲＨ１〜ＣＤＲＨ３）を同定する。図２Ｅ〜２Ｈは、抗ＣＬＤＮ抗体であるＳＣ２７．１、ＳＣ２７．２２（図２Ｆ）、ＳＣ２７．１０８（図２Ｇ）及びＳＣ２７．２０４（図２Ｈ）の軽鎖及び重鎖可変領域の注釈の付されたアミノ酸配列（Ｋａｂａｔらの通りに番号付けした）を示しており、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ及びＣｏｎｔａｃｔの方法を使用して誘導される。可変領域配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースの専売のバージョンを使用して解析し、ＣＤＲ及びＦＲの表示を提示した。図２Ａ及び２ＢにおけるＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従い示されるが、当業者は、ＣＤＲ及びＦＲの表示はまた、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、又は他の任意の許容された命名法システムに従って定義され得ることを理解する。
【０４６９】
それぞれの特定の抗体の配列番号は、一連の奇数である。したがって、モノクローナル抗ＣＬＤＮ抗体ＳＣ２７．１は、それぞれＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列番号２１及び２３を含み、ＳＣ２７．２２は、配列番号２５及び２７を含み、他も同様である。各抗体のアミノ酸配列についての対応する核酸配列は、図２Ｃに含まれており、対応するアミノ酸の配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ２７．１抗体のＶＬ及びＶＨの核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０及び２２である。
【０４７０】
［実施例４］
キメラ及びヒト化抗ＣＬＤＮ抗体の生成
キメラ抗ＣＬＤＮ抗体を、当該技術分野で認識されている技術を用いて以下のように生成した。全ＲＮＡを抗ＣＬＤＮ抗体生成ハイブリドーマから抽出し、ＲＮＡをＰＣＲ増幅した。マウス抗体のＶＨ及びＶＬ鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントに関するデータは、本発明の抗ＣＬＤＮ抗体の核酸配列（核酸配列について、図２Ｃを参照されたい）から得た。抗体のＶＨ及びＶＬ鎖のフレームワーク配列に特異的なプライマーセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩを用いて消化した。ＶＨ及びＶＬ消化ＰＣＲ産物を精製し、それぞれＩｇＨ又はＩｇＫ発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化及び精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物並びに２５ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ中で実施した。コンピテントのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物を用いて形質転換し、濃度１００μｇ／ｍＬでアンピシリンプレートの上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製及び消化後、ＶＨ断片を、ＨｕＩｇＧ１（ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１）を含むｐＥＥ６．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、ヒトカッパ軽鎖定常領域（ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ）を含むｐＥＥ１２．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
【０４７１】
キメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターを用いてＨＥＫ−２９３Ｔ又はＣＨＯ−Ｓ細胞いずれかに同時トランスフェクションすることにより発現させた。トランスフェクションの前に、１５０ｍｍプレートにおいて１０％熱不活性化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧを補足したダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で標準的条件下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。一過性トランスフェクションのために細胞を８０％の集密度まで増殖させた。各２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中１０μＬのＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクション試薬に加えた。混合物を室温で３０分間インキュベートし、細胞に加えた。上清を、トランスフェクションから３〜６日後に採取した。ＣＨＯ−Ｓ細胞の場合、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡの各々を２．５μｇずつを、４００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の１５μｇのＰＥＩトランスフェクション試薬に加えた。混合物を室温で１０分間インキュベートし、細胞に加えた。上清を、トランスフェクションから３〜６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体を、タンパク質Ａビーズにより精製した。
【０４７２】
マウス抗ＣＬＤＮ抗体を、専売のコンピュータ支援ＣＤＲグラフト化方法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）と標準的な分子操作技術とを使用して、以下のようにヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列及びＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列及びＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔ番号付けに従って行った。可変領域が選択されたら、それらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。いくつかの場合、可変領域は、コドンが最適化されており、ＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって産生した。ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
【０４７３】
ヒト化抗体のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列は、対応するマウス抗体のＶＬ配列及びＶＨ配列から誘導した（例えば、ｈＳＣ２７．１は、マウスＳＣ２７．１から誘導される）。作製されたヒト化抗体ｈＳＣ２７．１、ｈＳＣ２７．２２又はｈＳＣ１７．１０８の軽鎖又は重鎖可変領域においてフレームワークの変化又は復帰変異はなかった。しかし、以下の表５に示されるように、ＳＣ２７．２０４（すなわち、ｈＳＣ２７．２０４及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２）から誘導されたヒト化構築物の重鎖フレームワーク内に２つの残基が変化した。
【０４７４】
フレームワーク変化に加えて、ｈＳＣ２７．２０４のバリアントを生成して、分子の安定性を向上させた。ｈＳＣ２７．２０４ｖ２と称するバリアント抗体は、ｈＳＣ２７．２０４（配列番号７３）と同じ軽鎖を共有するが、重鎖が異なる。より具体的に、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２（配列番号７７）の重鎖可変領域は、ｈＳＣ２７．２０４重鎖可変領域（配列番号７５）のＣＤＲＨ２（配列番号１１５）において、保存的変異Ｎ５８Ｑを含む。この残基の位置は、ｈＳＣ２７．２０４ＶＨ配列（配列番号７５）及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２ＶＨ配列（配列番号７７）の場合、図２Ｂに下線が付けられている。
【０４７５】
前述のヒト化構築物に加えて、本明細書における教示に従い、ｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２の部位特異的バリアント（ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１、ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１と称する）を構築した。これらの部位特異的バリアントは、以下の実施例５においてさらに詳細に記載されている。
【０４７６】
以下の表５は、Ｋａｂａｔらに従って番号付けしたヒト化抗ＣＬＤＮ抗体及びこれらのバリアントの要約を示している。各場合において、ヒト化抗体の結合親和性は、対応するマウス抗体に実質的に等価であることを確実となるよう、上記の親和性を確認した。図２Ａは、例示的なヒト化抗体及びこれらのバリアントのＶＬの連続するアミノ酸配列を図示している。図２Ｂは、例示的なヒト化抗体及びこれらのバリアントのＶＨの連続するアミノ酸配列を図示している。抗ＣＬＤＮヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の核酸配列が、図２Ｃに提示されている。
【０４７７】
【表５】
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【０４７８】
［実施例５］
部位特異的抗ＣＬＤＮ抗体の生成
天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域及び変異重鎖（ＨＣ）定常領域を含む操作されたヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＣＬＤＮ部位特異的抗体を構築した。この抗体において、ＬＣのシステイン２１４（Ｃ２１４）と鎖間ジスルフィド結合を形成するＨＣの上方ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）がセリンと置換されている（Ｃ２２０Ｓ）。構築されたとき、ＨＣ及びＬＣは、治療剤とのコンジュゲーションに適切である２つの遊離システインを含む抗体を形成する。他に記載しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらに示されるＥＵ番号付けスキームに従っている。
【０４７９】
ＶＨ核酸を、ＨＣの定常領域におけるＣ２２０Ｓ変異を含有する発現ベクター上にクローニングした。ｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８又はｈＳＣ２７．２０４ｖ２の変異体Ｃ２２０Ｓ  ＨＣをコードするベクターに、ＣＨＯ−Ｓ細胞中で、ｈＳＣ２７．２２、ｈＳＣ２７．１０８又はｈＳＣ２７．２０４の天然ＩｇＧ１カッパＬＣをコードするベクターと同時トランスフェクトし、哺乳類一過性発現システムを使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体を含有する操作された抗ＣＬＤＮ部位特異的抗体は、それぞれｈＳＣ２７．２２ｓｓ１、ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１又はｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１と称した。
【０４８０】
ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１、ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１部位特異的抗体の完全長重鎖のアミノ酸配列が図２Ｄに示されている（配列番号はそれぞれ、８２、８５及び８９）。ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１のＬＣのアミノ酸配列は、ｈＳＣ２７．２２（配列番号８０）のアミノ酸配列と同一であり、ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１のＬＣのアミノ酸配列は、ｈＳＣ２７．１０８（配列番号８３）のアミノ酸配列と同一であり、ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１のＬＣのアミノ酸配列は、ｈＳＣ２７．２０４及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２抗体（配列番号８６）のアミノ酸配列と同一である。こうして、部位特異的抗体は、それぞれ、配列番号８０及び配列番号８２（ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１）、配列番号８３及び配列番号８５（ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１）及び配列番号８６及び配列番号８９（ｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１）に示されている、軽鎖及び重鎖を含む。
【０４８１】
操作された抗ＣＬＤＮ部位特異的抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付け、正確な変異体が生成されたことを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）のような還元剤の存在下及び非存在下、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液により染色した（データ示さず）。還元条件下、遊離ＬＣ及び遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下、バンドパターンは、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示す天然ＩｇＧ分子とは異なる。ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドが観察された。さらに、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの顕著なバンドが観察された。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各ＬＣ上のｃ末端における遊離システインにより予測される。
【０４８２】
［実施例６］
抗ＣＬＤＮ６抗体−薬物コンジュゲートの調製
４つのマウス抗ＣＬＤＮ抗体（ＳＣ２７．２２、ＳＣ２７．１０３、ＳＣ２７．１０５及びＳＣ２７．１０８）及び３つのヒト化部位特異的抗ＣＬＤＮ抗体（ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１、ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１）を、遊離スルフヒドリル基を有する末端マレイミド部分を介してピロロベンゾジアゼピン（ＤＬ６の形態にあるＰＢＤ１）にコンジュゲートさせ、ＳＣ２７．２２ＰＢＤ１、ＳＣ２７．１０３ＰＢＤ１、ＳＣ２７．１０５ＰＢＤ１、ＳＣ２７．１０８ＰＢＤ１、ｈＳＣ２７．２２ｓｓ１ＰＢＤ１、ｈＳＣ２７．１０８ｓｓ１ＰＢＤ１及びｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１ＰＢＤ１と称する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製した。
【０４８３】
マウス抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを、以下のように調製した。抗ＣＬＤＮ抗体のシステイン結合を、抗体１ｍｏｌあたりトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）の所定のモル数の添加により、５ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、室温で９０分間、部分的に還元した。次いで、得られた部分還元調製物を、室温において最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ１にコンジュゲートした（ＰＢＤ１の構造は、本明細書の上記に提示されている）。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを６．０に調整した。ＡＤＣの調製は、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで、ダイアフィルトレーションした抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。得られた抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、タンパク質濃度（ＵＶ測定により）、凝集（ＳＥＣ）、薬物対抗体比（ＤＡＲ）（逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により）及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
【０４８４】
部位特異的ヒト化抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、改変された部分還元プロセスを使用してコンジュゲートした。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（Ｃ２１４）に最大限にコンジュゲートし、２より大きい（ＤＡＲ＞２）薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを最小化する一方で、ＤＡＲが２の（ＤＡＲ＝２）ＡＤＣを最大化する、ＡＤＣである。コンジュゲーションの特異性をさらに改善するため、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）及び穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して抗体を選択的に還元し、この後、リンカー薬物を用いてコンジュゲーションを行い、次いで、ダイアフィルトレーション及び製剤化工程を行った。
【０４８５】
各抗体の調製物を、所定濃度の還元済みグルタチオン（ＧＳＨ）を含む、ｐＨ８．０の１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファー中、室温で最低２時間、部分還元した。次いで、全ての調製物を、３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０のバッファーへとバッファー交換し、還元バッファーを除去した。次いで、得られた部分還元調製物を、室温において最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ１にコンジュゲートした（ＰＢＤ１の構造は、本明細書の上記に提示されている）。次いで水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮＡＣを添加することにより、反応をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸を添加してｐＨを６．０に調整した。ＡＤＣの調製物を、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いでダイアフィルトレーションした抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて製剤化し、目的の最終濃度にした。得られた抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣは、タンパク質濃度（ＵＶ測定により）、凝集（ＳＥＣ）、薬物対抗体比（ＤＡＲ）（逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により）及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
【０４８６】
［実施例７］
抗ＣＬＤＮ抗体及びＡＤＣの特徴付け
アイソタイプ、親和性、及び他のＣＬＤＮファミリーメンバーとの交差反応性に関して、様々な方法を使用して、実施例２及び４において生成した抗ＣＬＤＮ抗体を特徴付けた。
【０４８７】
実施例２に記載されている通りに生成したマウス抗体が、フローサイトメトリを使用して、ＣＬＤＮファミリーメンバーと交差反応したかどうかを判定するために、上記のマウス抗体を特徴付けし、以下の通りに、解析を行った：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、実施例１に記載されているｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ９又はｈＣＬＤＮ４をコードするレンチウイルスベクターを安定的に形質導入した。上述の発現構築物を安定的に形質導入した１ｘ１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌに希釈した抗ＣＬＤＮ抗体と共に、４℃で３０分間、インキュベートし、最終体積を５０μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳにした。インキュベート後、細胞を、２００μＬのＰＢＳ／２％ＦＣＳにより洗浄して遠心分離によりペレットにし、上清を廃棄して、細胞ペレットをＰＢＳ／２％ＦＣＳ中、１：２００に希釈した、試料あたり５０μＬのＤｙＬｉｇｈｔ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的二次抗体中に再浮遊させた。４℃において１５分間、インキュベートした後、既に記載した通りに細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳにより２回洗浄してペレットにし、２μｇ／ｍＬの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含む１００μＬのＰＢＳ／２％ＦＣＳに再浮遊させた。フローサイトメトリにより試料を解析し、生存細胞は、アイソタイプ対照抗体により染色した細胞の蛍光を超過する蛍光について、ＤｙｅＬｉｇｈｔ６４９を用いて評価した。
【０４８８】
上記のフローサイトメトリアッセイにより、多数の抗ＣＬＤＮ抗体を同定した。交差反応性は、蛍光から１を引いた（ＦＭＯ）アイソタイプ対照（灰色）を使用して決定されたシグナルに対して、表示されているＣＬＤＮファミリーメンバーを特異的に過剰発現する細胞株への抗体の結合に関する幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化に基づいて決定した（図３）。すなわち、２つのｈＣＬＤＮ６結合抗体ＳＣ２７．１及びＳＣ２７．２２は、このアッセイにおいて、ヒトＣＬＤＮファミリー：ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ４及びｈＣＬＤＮ９の３つのメンバーと交差反応するので、これらは、クローディン多重反応性抗体として記載することができる。ＳＣ２７．１及びＳＣ２７．２２抗体もまた、ＣＬＤＮ４及びＣＬＤＮ９のマウス及びラットのオルソログに結合した（データは図示せず）。
【０４８９】
様々な追加のマウス抗体がＣＬＤＮファミリーメンバーに結合する能力を試験するため、精製した一次抗ＣＬＤＮ抗体又はマウスＩｇＧ２ｂ対照抗体１０μｇ／ｍＬと共にインキュベートし、次いで、Ａｌｅｘａ６４７抗マウス二次抗体と共にインキュベートした、ヒトＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６又はＣＬＮＤ９を過剰発現する細胞株を用いてフローサイトメトリを行った。図３Ｂに示されているように、抗体は全て、ＣＬＤＮ６に結合した一方で、一部は、ＣＬＤＮ６特異的であり（例えば、ＳＣ２７．１０２、ＳＣ２７．１０５及びＳＣ２７．１０８）、その他は多重反応性であり、ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ９（例えば、ＳＣ２７．１０３及びＳＣ２７．２０４）、又はＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ４（例えば、ＳＣ２７．１０４）の両方に結合した。こうして、本発明の抗体に関する、幅広い多重反応性結合プロファイルを得た。
【０４９０】
ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９に対する多重反応性抗ＣＬＤＮ抗体の見かけの結合親和性を比較するため、ヒト化抗ＣＬＤＮ抗体ｈＳＣ２７．２２の段階希釈を用いるフローサイトメトリを行った。５０ｐｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度まで抗体を段階希釈し、ＣＬＤＮ６又はＣＬＤＮ９を過剰発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する９６ウェルプレートに加え、１時間、氷上で維持した。二次抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−６０５−０９８）を加えて、暗所中、１時間、インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で２回、洗浄し、この後に、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６３−１４）を１０分間、加えた。ＰＢＳによりさらに洗浄した後、細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により固定し、製造業者の指示に従って、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータで読み取りを行った。製造業者の指示に従って、蛍光マイクロスフィア（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して正規化した。ＣＬＤＮ６又はＣＬＤＮ９発現細胞のどちらか一方に抗体が結合したかについて、正規化済みの最大ＭＦＩ値を使用して、以下の式を用い、これらのデータを各過剰発現細胞に対する最大結合率に変換した：最大結合率＝（観察された正規化ＭＦＩ／正規化済み最大ＭＦＩ）。次に、各細胞株へのｈＳＣ２７．２２の結合に関する見かけのＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ソフトウェアパッケージ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）において提供されているｌｏｇ（阻害剤）対応答モデルに対する４パラメータ可変傾き曲線当てはめを使用して算出した。図３Ｃは、ヒト化多重反応性抗ＣＬＤＮ６抗体であるｈＳＣ２７．２２が、ＣＬＤＮ６に対して、ＣＬＤＮ９に対するものと実質的に同じＥＣ５０を有することを示している。（見かけのＥＣ５０は、ＣＬＤＮ６では３．４５μｇ／ｍＬ（適合度ｒ２＝０．９９８７、９９％信頼限界：２．５１〜４．７５μｇ／ｍＬ）であり；見かけのＥＣ５０は、ＣＬＤＮ９では４．６６μｇ／ｍＬ（適合度ｒ２＝０．９９９８、９９％信頼限界：４．０９〜５．３１μｇ／ｍＬ）である）。
【０４９１】
［実施例８］
抗ＣＬＤＮ抗体
インビトロでの細胞毒性剤の送達の促進
抗ＣＬＤＮ抗体が、内在化して、生存腫瘍細胞に細胞毒性剤の送達を媒介するかどうかを判定するため、選択された抗ＣＬＤＮ抗体、及び二次抗マウス抗体ＦＡＢ断片に連結したサポリンを使用して、インビトロでの、細胞殺傷アッセイを行った。サポリンは、リボソームを非活性化する植物毒であり、これによって、タンパク質合成が阻害され、細胞が死に至る。サポリンは、細胞内部でしか毒性ではなく、細胞において、リポソームに接近するが、それ自体、内在化することはできない。したがって、これらのアッセイにおけるサポリン媒介性の細胞毒性は、抗マウスＦＡＢ−サポリンコンジュゲートが、抗ＣＬＤＮ抗体の結合及び内在化したときしか、標的細胞に内在化することができないことを示す。
【０４９２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ４又はｈＣＬＤＮ９過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単一細胞浮遊液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ウェルあたり５００個の細胞で蒔いた。１日後、２５０ｐＭの精製済みＳＣ２７．１、ＳＣ２７．２２又はアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ１）抗体、及び固定濃度の２ｎＭの抗マウスＩｇＧ  ＦＡＢ−サポリンコンジュゲート（アドバンストターゲティングシステム）を培養物に加えた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗体処理後、７２時間、インキュベートした。インキュベート後、製造業者の指示により、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。二次ＦＡＢ−サポリンコンジュゲートとのみインキュベートした細胞を含有する培養物を使用して、生の発光カウントを１００％参照値として設定し、全ての他のカウントを適宜、算出した。２５０ｐＭの濃度の抗ＣＬＤＮ抗体であるＳＣ２７．１及びＳＣ２７．２２はどちらも、ｈＣＬＤＮ６及びｈＣＬＤＮ９過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を効果的に殺傷した一方（図４Ａ）、同じ濃度のマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ１）は、そうではなかった。ナイーブなＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、この処理によって効果的に殺傷されなかった一方、ｈＣＬＤＮ４過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＳＣ２７．１によって効果的に殺傷されたが、試験した用量では、ＳＣ２７．２２処理により殺傷されなかった。点線の横線は、細胞毒性が観察されなかったレベルを表す。
【０４９３】
ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６又はＣＬＤＮ９に対する追加の抗体の見かけのＩＣ５０を決定するために、０．１５ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度範囲にわたる、抗体の力価測定により上の段落に記載した実験を繰り返した（図４Ｂ）。各抗体濃度において観察された細胞殺傷率を、上記のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）により計算し、各細胞株に対する抗体の殺傷活性に関する見かけのＩＣ５０を算出するため、得られたデータに曲線を当てはめた。＞２０００ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する抗体は、ある特定の細胞株を殺傷しなかったとみなし、図４Ｂにおいて「ＮＫ」として表す。対照のマウスＩｇＧ１抗体も、やはり、試験した細胞株のいずれも殺傷しなかった。この細胞毒性アッセイは、抗体結合親和性の直接的な尺度をもたらすというよりもむしろ、様々な抗体の、結合抗原の内在化による細胞毒の送達を媒介する能力を測定するものであるが、図４Ｂ中に示されている抗体の見かけのＩＣ５０は、図３Ｂに示されている単点フローサイトメトリデータとよく連動している。例えば、両方の実験において、ＳＣ２７．１０８は、ＣＬＤＮ６特異的（見かけのＩＣ５０＝１００ｎＭ）であることを示している。同様に、フローサイトメトリによって、ＳＣ２７．１０３は、ＣＬＤＮ６に対して強力に結合していること、及びＣＬＤＮ９に中程度に結合していることを示し、このことは、見かけＩＣ５０値が、ＣＬＤＮ６に対して５８ｎＭ、ＣＬＤＮ９に対して４６６ｎＭであること連動している。しかし、バックグラウンドを超える検出可能な結合は、必ずしも、検出可能な殺傷をもたらさない（例えば、ＳＣ２７．１０４はＣＬＤＮ９に結合する（図３Ｂを参照）が、効果的に内在化してＣＬＤＮ９過剰発現細胞を殺傷することはできない（図４Ｂ参照）一方、ＳＣ２７．２０１は、ＣＬＤＮ９に結合（図３Ｂを参照）し、ＣＬＤＮ９発現細胞に内在化して、これらの細胞を殺傷することができる（図４Ｂ参照））ことがやはり明らかである。
【０４９４】
まとめると、上記の結果は、多重反応性抗ＣＬＤＮ抗体は、内在化を媒介する能力があること、及び毒性ペイロードを送達する能力があることを実証しており、抗ＣＬＤＮ抗体は、ＡＤＣの標的部分として、治療的利用性を有し得るという仮説を支持するものである。
【０４９５】
［実施例９］
ヒト化抗ＣＬＤＮ
抗体薬物コンジュゲートは腫瘍成長をインビボで抑制する。
【０４９６】
免疫不全マウスにおいて、上の実施例６に記載されているように生成した抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを試験し、ＯＶ及びＬＵ−Ａｄ腫瘍成長を抑制する能力を実証した。
【０４９７】
ＣＬＤＮを発現するＰＤＸ腫瘍株（例えば、ＯＶ９１、ＯＶ７８及びＬＵ１３４）を、当該技術分野で認識されている技術を使用して、雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹の皮下において成長させた。腫瘍体積及びマウス重量を１週あたり１回又は２回、監視した。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ３に到達すると、マウスを無作為に処理群に割り振った。ＯＶ９１腫瘍を有するマウスに、２ｍｇ／ｋｇのＳＣ２７．１．ＰＢＤ１若しくはＳＣ２７．２２．ＰＢＤ１、又は抗ハプテン対照マウスＩｇＧ１ＰＢＤ１を単回用量で注射した。ＯＶ７８腫瘍を有するマウスに、１．６ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ２７．２０４ｖ２ｓｓ１ＰＢＤ１又は抗ハプテン対照ＩｇＧ１ＰＢＤ１を単回用量で注射した。ＬＵ−Ａｄ腫瘍を有するマウスに、２ｍｇ／ｋｇのＳＣ２７．２２．ＰＢＤ１又は抗ハプテンマウスＩｇＧ１ＰＢＤ１対照を単回用量で注射した。
【０４９８】
処理後、腫瘍が８００ｍｍ３を超える、又はマウスが健康を害するまで、腫瘍体積及びマウス重量を監視した。抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣにより処理されたマウスは、免疫不全の腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて通常、観察されるものを超えた健康への悪影響を何ら示さなかった。抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣの投与により、ＯＶ９１腫瘍を有するマウスにおいて、１５０日間にわたり、有意な腫瘍抑制が続き（図５Ａ）、ＬＵ１３４腫瘍を有するマウスの場合、６０日間にわたり、有意な腫瘍抑制が続いた（図５Ｂ）一方、対照ＡＤＣ  ＩｇＧ１ＰＢＤ１の投与は、腫瘍体積の縮小をもたらさなかった。ＯＶ７８腫瘍を有するマウスにおける抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣの投与により、ビヒクルに対して約１２０日間、及びアイソタイプ対照に対して約９０日間となる腫瘍進行の有意な遅延が示された。
【０４９９】
抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣが、ＣＬＤＮ発現腫瘍細胞を特異的に殺傷する能力、及び長期間、腫瘍成長をインビボで劇的に抑制する能力は、がんの治療的処置、特に、ＯＶ及びＬＵがんにおける、抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣの使用をさらに確証するものである。
【０５００】
［実施例１０］
がん幹細胞集団におけるＣＬＤＮ発現の強化
腫瘍細胞は、２つのタイプの細胞小集団：非腫瘍形成性細胞（ＮＴＧ）及び腫瘍開始細胞又は腫瘍形成性細胞に広く分割することができる。腫瘍形成性細胞は、免疫無防備状態マウスに移植すると、腫瘍を形成する能力を有している一方、非腫瘍形成性細胞は腫瘍を形成しない。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍形成性細胞のサブセットあり、多系列分化の能力を維持しながら、不確定に自己複製することができる。
【０５０１】
本発明の抗ＣＬＤＮ抗体が、腫瘍形成性ＣＳＣ集団を検出することができるかどうかを判定するため、ＰＤＸ腫瘍を単一細胞浮遊液に切り離して入れ、選択的マーカーＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋を使用して、以下の通り、ＣＳＣ腫瘍細胞小集団（ＷＯ２０１２／０３１２８０を参照）を濃縮した。
【０５０２】
ＰＤＸ腫瘍の単一細胞浮遊液を、以下の抗体：抗ＣＬＤＮ  ＳＣ２７．１；抗ヒトＥＰＣＡＭ；抗ヒトＣＤ４６；抗ヒトＣＤ３２４；及び抗マウスＣＤ４５及びＨ−２ｋＤ抗体と共にインキュベートした。次に、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータを使用して、フローサイトメトリにより、染色について腫瘍細胞を評価した。ＯＶ−Ｓ（例えば、ＯＶ４４及びＯＶ５４ＭＥＴ）、ＯＶ−ＰＳ（例えば、ＯＶ９１ＭＥＴ）、ＰＡ、ＬＵ−Ａｄ（例えば、ＬＵ１３５）及びＬＵ−Ｓｑ（例えば、ＬＵ２２）ＰＤＸ腫瘍のヒトＥＰＣＡＭ＋ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＳＣ腫瘍細胞小集団は、抗ＣＬＤＮ  ＳＣ２７．１抗体により陽性染色されることを実証した一方、ＮＴＧ細胞（ＣＤ４６ｌｏ／−及び／又はＣＤ３２４−）は、抗ＣＬＤＮ抗体により有意なほどに染色されないことを実証した（図６Ａ）。アイソタイプ対照抗体及びＦＭＯ対照を、当該技術分野における標準作業の通りに、染色特異性を確認するために使用した。ＣＳＣ及びＮＴＧ細胞の表面上で観察された抗ＣＬＤＮ抗体の染色差をまとめている表が図６Ａに示されており、発現は、それぞれの腫瘍細胞小集団に対する、表示された抗ＣＬＤＮ抗体とアイソタイプ対照との間の幾何平均蛍光強度（ΔＭＦＩ）の変化として算出されている。これらのデータにより、ＣＳＣ上にｈＣＬＤＮタンパク質が発現したことが確認される。
【０５０３】
腫瘍中のＣＬＤＮ発現が、腫瘍形成性の向上と連動し得るかどうかを判定するため、以下の検討を行った。ヒトＯＶ  ＰＤＸ腫瘍試料（ＯＶ９１ＭＥＴ）を、免疫無防備状態マウスにおいて成長させて、腫瘍が８００〜２，０００ｍｍ３に到達した後、切除した。腫瘍を切り離して、当該技術分野で認識されている酵素消化技術を使用して単一細胞浮遊液に入れた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照）。ヒト腫瘍細胞とマウス細胞との間を区別するため、ヒトＯＶ  ＰＤＸ腫瘍細胞をマウス抗ＣＤ４５又は抗Ｈ２ｋＤ抗体、及び抗ＥＳＡ抗体により染色した。腫瘍はまた、抗ＣＬＤＮ抗体（ＳＣ２７．２２）により染色し、次に、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した。ヒトＯＶ  ＰＤＸ腫瘍細胞をＣＬＤＮ＋及びＣＬＤＮ−の小集団に分離した。５匹の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫無防備状態マウスに、２００個のＣＬＤＮ＋ＯＶ腫瘍細胞を皮下注射した。５匹のマウスに２００個のＣＬＤＮ−ＯＶ腫瘍細胞を注射した。腫瘍体積を４カ月間、週単位で測定した。
【０５０４】
図６Ｂは、ＣＬＤＮ＋（黒丸）腫瘍細胞が、腫瘍をインビボで機能的に再構成することができる一方、ＣＬＤＮ−腫瘍（白丸）はそうではないことを示している。したがって、ＣＬＤＮ発現腫瘍細胞は、ＣＬＤＮを発現しなかったそのような腫瘍細胞よりもかなり腫瘍形成性が高く、このことは、ＣＬＤＮタンパク質は、ヒト腫瘍内に腫瘍形成性小集団を機能的に定義することができることを示唆しており、選択された抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣを使用して、顕著な腫瘍退縮及び腫瘍再発の予防をもたらすことができる、腫瘍細胞の腫瘍形成性小集団を標的化することができることを支持している。
【０５０５】
［実施例１１］
抗ＣＬＤＮ抗体−薬物コンジュゲートによるがん幹細胞の頻度の減少
実施例１０に実証されているように、ＣＬＤＮ発現は、がん幹細胞に関連している。したがって、抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣによる治療が、薬物抵抗性があること並びに腫瘍再発及び転移を刺激することが知られているがん幹細胞（ＣＳＣ）の頻度を減少することを実証するため、インビボでの、限界希釈アッセイ（ＬＤＡ）を以下に記載されているように行った。
【０５０６】
ＬＵ１８７腫瘍を免疫不全マウスにおいて皮下で成長させた。腫瘍体積が、１５０ｍｍ３〜２５０ｍｍ３のサイズの平均になると、マウスを無作為に２つの群に分けた。群の１つには、ネガティブ対照として薬物にコンジュゲートしたヒトＩｇＧ１を腹腔内に注射した。もう一方の群には、２ｍｇ／ｋｇの抗ＣＬＤＮ  ＳＣ２７．２２ＰＢＤ１又は抗ハプテンマウスＩｇＧ１ＰＢＤ１対照を注射した。投与して１週間後、各群からの２匹の代表的なマウスを安楽死させて、これらの腫瘍を採取し、単一細胞浮遊液に分散させた。次に、各処理群からの腫瘍細胞を採取してプールしておき、細分類した。マウス細胞を検出するため、これらの細胞をＦＩＴＣコンジュゲートした抗マウスＨ２ｋＤ及び抗マウスＣＤ４５抗体により標識し、ヒト細胞を検出するためＥｐＣＡＭを、及び死滅細胞を検出するためＤＡＰＩを標識した。次に、得られた浮遊液をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメータを使用してＦＡＣＳにより選別し、生存ヒト腫瘍細胞を単離して回収した。
【０５０７】
マウスの４つのコホートに、抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣにより処理した腫瘍に由来する、１２５０個、３７５個、１１５個又は３５個の選別した生存ヒト細胞のいずれかを注射した。ネガティブ対照として、マウスの４つのコホートに、対照ＩｇＧ１  ＡＤＣにより処理した腫瘍に由来する、１０００個、３００個、１００個又は３０個の選別した生存ヒト細胞のいずれかを移植した。レシピエントマウス中の腫瘍を毎週、測定し、腫瘍が１５００ｍｍ３に到達する前に、個々のマウスを安楽死させた。レシピエントマウスはポジティブ又はネガティブ腫瘍成長を有するとして、点数を付けた。ポジティブ腫瘍成長は、１００ｍｍ３を超過する腫瘍の成長として定義した。ポアソン分布統計（Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、各集団におけるＣＳＣの頻度を算出した。図７において分かるように、ＣＬＤＮは腫瘍開始細胞に関連している。抗ＣＬＤＮ  ＡＤＣであるＳＣ２７．２２ＰＢＤ１により処理された腫瘍は、対照ＡＤＣにより処理された腫瘍に比べて、腫瘍開始細胞が約４倍、縮小したことを示した。
【０５０８】
［実施例１２］
Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓからの一次腫瘍におけるＣＬＤＮ発現プロファイル
ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９ファミリーメンバーのｍＲＮＡの過剰発現を、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ、米国がん研究所）として知られている腫瘍及び正常試料の、公に入手可能な多量のデータセットを使用して、様々な腫瘍において確認した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームからのエクソンレベル３の発現データは、ＴＣＧＡデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＤｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ）からダウンロードして解読し、各単一遺伝子の個々のエクソンからの読取値を統合し、各試料における各遺伝子に関する、マップされたリード数１００万あたりのエクソンのキロベースあたりのリード数（ｒｅａｄ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）（ＲＰＫＭ）の単一の値を生成した。次に、Ｔａｂｌｅａｕソフトウェアを使用して、集めたデータを表示した。ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９について解析したデータは、それぞれ、図８Ａ及び図８Ｂに示されており、この場合、各試料は、単一ドットとして表されており、黒色の横線は、所与の正常組織又は腫瘍サブタイプ内のセットオフデータポイントに対する四分位境界線を表す。図８Ａは、卵巣漿液性嚢胞腺癌としてサブタイプに分類されるＯＶ腫瘍において、他の全ての正常組織に比べて、ＣＬＤＮ６発現が向上していることを示している。さらに、ＣＬＤＮ６は、正常の肺試料、及びかなり多くの浸潤性乳房癌腫瘍（ＢＲＣＡ）と比べて、多数のＬＵ−Ａｄ試料において向上している。ＣＬＤＮ６の場合に観察されるものと同様の過剰発現パターンが、ＣＬＤＮ９に観察され得る（図８Ｂ）。やはり、これらのデータは、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ９の発現レベルは、様々な腫瘍において腫瘍形成を示すものであり、潜在的な治療標的として、その選択肢を高めていることを示している。
【０５０９】
ＣＬＤＮ６のｍＲＮＡの過剰発現はまた、ＴＣＧＡデータセット内に含まれる子宮体部子宮内膜癌（ＵＴＥＣ）のサブセットにおいて観察され得る（図８Ｃ）。ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ９のどちらも、正常な子宮組織と比べて、腫瘍試料において発現が高まっていることが示された一方、ＣＬＤＮ６は、末期のＵＴＥＣにおいて進行性の向上を明確に示した。さらに、ＣＬＤＮ６発現は、黄体ホルモン受容体発現を失った同じ末期の腫瘍において、向上しているように思われ、したがって、ホルモン療法に無反応性となる可能性がある（図８Ｄ）。まとめると、これらのデータは、卵巣癌、子宮体癌、非小細胞肺癌（腺癌と扁平上皮サブタイプの両方）及び乳癌は、ＣＬＤＮタンパク質を標的とする抗体薬物を施用する適切な指標となり得ることを示している。
【０５１０】
当業者はさらに、本発明が、本趣旨又は中心的な特性から逸脱することなく、他の特定の態様に具現化され得ることを理解している。本発明の上述の記載がこの例示的な実施形態しか開示していないという点において、他の変形が本発明の範囲内であることが企図されることが理解される。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、参照は、本発明の範囲及び内容の指標として添付の特許請求の範囲に対してなされるべきである。
【図１Ａ】
2019500335.tif 000050
【図１Ｂ】
2019500335.tif 000051
【図２Ａ−１】
2019500335.tif 000052
【図２Ａ−２】
2019500335.tif 000053
【図２Ｂ−１】
2019500335.tif 000054
【図２Ｂ−２】
2019500335.tif 000055
【図２Ｃ−１】
2019500335.tif 000056
【図２Ｃ−２】
2019500335.tif 000057
【図２Ｃ−３】
2019500335.tif 000058
【図２Ｃ−４】
2019500335.tif 000059
【図２Ｃ−５】
2019500335.tif 000060
【図２Ｄ−１】
2019500335.tif 000061
【図２Ｄ−２】
2019500335.tif 000062
【図２Ｅ】
2019500335.tif 000063
【図２Ｆ】
2019500335.tif 000064
【図２Ｇ】
2019500335.tif 000065
【図２Ｈ】
2019500335.tif 000066
【図３Ａ】
2019500335.tif 000067
【図３Ｂ】
2019500335.tif 000068
【図３Ｃ】
2019500335.tif 000069
【図４Ａ】
2019500335.tif 000070
【図４Ｂ】
2019500335.tif 000071
【図５Ａ】
2019500335.tif 000072
【図５Ｂ】
2019500335.tif 000073
【図６Ａ】
2019500335.tif 000074
【図６Ｂ】
2019500335.tif 000075
【図７】
2019500335.tif 000076
【図８Ａ】
2019500335.tif 000077
【図８Ｂ】
2019500335.tif 000078
【図８Ｃ】
2019500335.tif 000079
【図８Ｄ】
2019500335.tif 000080
【配列表】
2019500335000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月21日(2018.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｅ】
2019500335.tif 000081
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｆ】
2019500335.tif 000082
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｇ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｇ】
2019500335.tif 000083
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｈ】
2019500335.tif 000084
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ａ】
2019500335.tif 000085
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｂ】
2019500335.tif 000086
【国際調査報告】
2019500335.tif 000087
2019500335.tif 000088
2019500335.tif 000089
2019500335.tif 000090