(57)【要約】  ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に複数の脂質二重層を形成する方法が、開示される。セルの各々が、凹部を含む。塩類緩衝溶液がナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上を流され、セル内の凹部が塩類緩衝溶液で実質的に充填される。脂質および溶媒の混合物がセルアレイ上を流され、セル内の少なくとものいくつかの凹部上に脂質および溶媒の混合物が堆積される。セルの第１の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層を有することが検出される。セルの第２の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層でなく脂質膜を有することが検出される。電気的な脂質薄膜化刺激が、セルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ選択的に印加される。
2019516952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポア(nanopore)ベースの配列決定(sequencing)チップ内のセルアレイ上に複数の脂質二重層(lipid bilayers)を形成する方法であって、前記セルの各々は、凹部(well)を備え、
塩類緩衝溶液(salt buffer solution)を前記ナノポアベースの配列決定チップ内の前記セルアレイ上に流し、前記セル内の前記凹部を前記塩類緩衝溶液で実質的に充填するステップと、
脂質および溶媒の混合物を前記セルアレイ上に流し、前記セル内の少なくとものいくつかの前記凹部上に前記脂質および溶媒の混合物を堆積(deposit)させるステップと、
前記セルの第１の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層を有することを検出し、前記セルの第２の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層でなく脂質膜(lipid membrane)を有することを検出するステップと、
電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ、選択的に印加するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
セルがその凹部上に脂質二重層を有するか否かを検出するステップが、電気的な測定刺激を、前記セルへ印加するステップを含み、前記電気的な測定刺激は、前記電気的な脂質薄膜化刺激の絶対(absolute)振幅(magnitude)より小さい絶対振幅を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気的な脂質薄膜化刺激の前記絶対振幅を徐々に増大させるステップをさらに含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも部分的に、前記ナノポアベースの配列決定チップの目標収量(target yield)に基づいて、前記セルアレイへの前記電気的な脂質薄膜化刺激のさらなる印加を終了させるステップをさらに含み、目標収量は、前記セル内の前記凹部上に脂質二重層を有するセルの目標割合(target percentage)を含む、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ、選択的に印加するステップが、
前記セルの前記第１の部分の各々のスイッチを開路することによって、前記セルの前記第１の部分を前記電気的な脂質薄膜化刺激から切断するステップを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ、選択的に印加するステップが、第１の所定時間にわたり実行される方法であって、
前記第１の所定時間中、少なくとも１つの追加のセルが、その凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出するステップと、
前記少なくとも１つの追加のセルを、その凹部上に脂質二重層を各々有する前記セルの前記第１の部分に、前記第１の所定時間の終了を待たずに割り当てるステップであって、その結果、前記電気的な脂質薄膜化刺激が、前記少なくとも１つの追加のセルに印加されないステップと、
をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記所定時間の終了後、塩類緩衝溶液を、前記セル内の前記凹部上の脂質膜の厚さを低減するために、前記ナノポアベースの配列決定チップ内の前記セルアレイ上を流動させるステップを、さらに含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記塩類緩衝溶液を、前記セル内の前記凹部上の前記脂質膜の前記厚さを低減するために、前記ナノポアベースの配列決定チップ内の前記セルアレイ上を流動させるステップが、第２の所定時間にわたり実行される方法であって、
前記第２の所定時間中、少なくとも１つの追加のセルが、その凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出するステップと、
前記少なくとも１つの追加のセルを、その凹部上に脂質二重層を各々有する前記セルの前記第１の部分に、前記第２の所定時間の終了を待たずに割り当てるステップであって、その結果、電気的な刺激が、前記少なくとも１つの追加のセルに印加されないステップと、
をさらに含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ、選択的に印加するステップと、
塩類緩衝溶液を、前記セル内の前記凹部上の前記脂質膜の前記厚さを低減するために、前記ナノポアベースの配列決定チップ内の前記セルアレイ上を流動させるステップと、
を複数回繰り返す、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に複数の脂質二重層を形成する器具であって、システムは、
セルアレイを含むナノポアベースの配列決定チップであって、セルの各々が凹部を含む、ナノポアベースの配列決定チップと、
前記ナノポアベースの配列決定チップに連結された流動室(flow chamber)と、
プロセッサまたは回路であって、
塩類緩衝溶液を、前記流動室を介して前記ナノポアベースの配列決定チップ内の前記セルアレイ上に流し、前記セル内の前記凹部を前記塩類緩衝溶液で実質的に充填するように、
脂質および溶媒の混合物を、前記流動室を介して前記セルアレイ上に流し、前記セル内の少なくとものいくつかの前記凹部上に前記脂質および溶媒の混合物を堆積するように、
前記セルの第１の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層を有することを検出し、前記セルの第２の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層でなく脂質膜を有することを検出するように、かつ
電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ選択的に印加するように、
構成された、プロセッサまたは回路と、
を備える、
システムである、器具。
【請求項１１】
セルがその凹部上に脂質二重層を有するか否かを検出するステップが、電気的な測定刺激を、前記セルへ印加するステップを含み、前記電気的な測定刺激は、前記電気的な脂質薄膜化刺激の絶対振幅より小さい絶対振幅を有する、
請求項１０に記載の器具。
【請求項１２】
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記電気的な脂質薄膜化刺激の前記絶対振幅を徐々に増大させるようにさらに構成され、
セルの目標割合が、前記セル内の前記凹部上に脂質二重層を有する、
請求項１１に記載の器具。
【請求項１３】
前記電気的な測定刺激は、１００〜２５０ｍＶの絶対振幅であり、前記電気的な脂質薄膜化刺激は、２５０〜５００ｍＶの絶対振幅である、
請求項１０に記載の器具。
【請求項１４】
前記電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ、選択的に印加するステップが、
前記セルの前記第１の部分の各々のスイッチを開路することによって、前記セルの前記第１の部分を前記電気的な脂質薄膜化刺激から切断するステップを含む、
請求項１０に記載の器具。
【請求項１５】
前記電気的な脂質薄膜化刺激を、前記セルの前記第１の部分でなく前記セルの前記第２の部分へ、選択的に印加するステップが、第１の所定時間にわたり実行され、
前記プロセッサまたは前記回路が、
前記第１の所定時間中、少なくとも１つの追加のセルが、その凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出するように、
前記少なくとも１つの追加のセルを、その凹部上に脂質二重層を各々有する前記セルの前記第１の部分に、前記第１の所定時間の終了を待たずに割り当て、その結果、前記電気的な脂質薄膜化刺激が、前記少なくとも１つの追加のセルに印加されないように、
構成される、
請求項１０に記載の器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明の一実施例は、例えば、二重層形成の電気的促進に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0001]近年の半導体産業における超小型化の進歩によって、生物工学者は、従来の大きな検出ツールをますます小さいフォームファクタに、いわゆるバイオチップ上にパッケージングすることを始められるようになった。バイオチップをより頑丈に、効率的にかつ費用効果的にするバイオチップの技術を開発することが、望ましいであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願発明の一実施例は、例えば、二重層形成の電気的促進に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0002]本発明は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に複数の脂質二重層を形成する方法であって、セルの各々は、凹部を備え、塩類緩衝溶液をナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に流しセル内の凹部を塩類緩衝溶液で実質的に充填するステップと、脂質および溶媒の混合物をセルアレイ上に流し、セル内の少なくとものいくつかの凹部上に脂質および溶媒の混合物を堆積させるステップと、セルの第１の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層を有することを検出するステップと、セルの第２の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層でなく脂質膜を有することを検出するステップと、電気的な脂質薄膜化刺激をセルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ選択的に印加するステップとを含む、方法を提供する。
【０００５】
[0003]セルがその凹部上に脂質二重層を有するか否かを検出するステップは、電気的な脂質薄膜化刺激の絶対振幅より小さい絶対振幅を有し得る電気的な測定刺激を、セルへ印加するステップを含み得る。電気的な脂質薄膜化刺激の絶対振幅は、徐々に増大され得る。刺激が、少なくとも部分的にナノポアベースの配列決定チップの目標収量に基づいて終了され、その結果、目標収量は、セル内の凹部上に脂質二重層を有するセルの目標割合を含み得る。電気的な脂質薄膜化刺激を、セルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ、選択的に印加するステップは、セルの第１の部分の各々のスイッチを開路することによって、セルの第１の部分を電気的な脂質薄膜化刺激から切断するステップを含み得る。ステップは、少なくとも１つの追加のセルが、第１の所定時間中にその凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出するステップと、少なくとも１つの追加のセルをその凹部上に脂質二重層を各々有するセルの第１の部分に第１の所定時間の終了を待たずに割り当て、その結果電気的な脂質薄膜化刺激が、少なくとも１つの追加のセルに印加されないようにするステップとを、さらに含み得る。
【０００６】
[0004]所定時間の終了後、塩類緩衝溶液は、セル内の凹部上の脂質膜の厚さを低減するために、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に流され得る。塩類緩衝溶液が、第２の所定時間にわたりセルアレイ上を流されるとき、方法は、少なくとも１つの追加のセルが、第２の所定時間中に、その凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出するステップと、少なくとも１つの追加のセルを、その凹部上に脂質二重層を各々有するセルの第１の部分に、第２の所定時間の終了を待たずに割り当て、その結果、電気的な刺激が、少なくとも１つの追加のセルに印加されないようにするステップとをさらに含み得る。この場合、電気的な脂質薄膜化刺激を、セルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ、選択的に印加するステップと、塩類緩衝溶液をセル内の凹部上の脂質膜の厚さを低減するために、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に流すステップとが、複数回繰り返され得る。
【０００７】
[0005]本発明は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に複数の脂質二重層を形成するシステムまたは器具であって、ナノポアベースの配列決定チップを含むシステムまたは器具は、セルアレイを含み、セルの各々は、凹部と、ナノポアベースの配列決定チップに連結された流動室と、塩類緩衝溶液を、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に流し、セル内の凹部を塩類緩衝溶液で実質的に充填し、脂質および溶媒の混合物を、流動室を介してセルアレイ上に流し、セル内の少なくとものいくつかの凹部上に脂質および溶媒の混合物を堆積させ、セルの第１の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層を有することを検出し、セルの第２の部分の各々が、その凹部上に脂質二重層でなく脂質膜を有することを検出し、電気的な脂質薄膜化刺激を、セルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ選択的に印加するように、構成されたプロセッサまたは回路とを備える、システムまたは器具をさらに提供する。セルがその凹部上に脂質二重層を有するか否かを検出するステップは、電気的な測定刺激を、セルへ印加するステップを含み得て、電気的な測定刺激は、電気的な脂質薄膜化刺激の絶対振幅より小さい絶対振幅を有し得る。
【０００８】
[0006]プロセッサまたは回路は、電気的な脂質薄膜化刺激の絶対振幅を徐々に増大させるようにさらに構成され得る。プロセッサまたは回路は、少なくとも部分的に、ナノポアベースの配列決定チップの目標収量に基づいて、セルアレイへの電気的な脂質薄膜化刺激のさらなる印加を終了させるようにさらに構成され、その結果、目標収量がセル内の凹部上に脂質二重層を有するセルの目標割合を含む。電気的な測定刺激は、１００〜２５０ｍＶの絶対振幅であり得て、電気的な脂質薄膜化刺激は、２５０〜５００ｍＶの絶対振幅であり得る。
【０００９】
[0007]電気的な脂質薄膜化刺激を、セルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ、選択的に印加するステップは、セルの第１の部分の各々のスイッチを開路することによって、セルの第１の部分を電気的な脂質薄膜化刺激から切断するステップを含み得る。このステップは、第１の所定時間にわたり実行され得て、プロセッサまたは回路は、少なくとも１つの追加のセルが、第１の所定時間中に、その凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出し、少なくとも１つの追加のセルを、その凹部上に脂質二重層を各々有するセルの第１の部分に、第１の所定時間の終了を待たずに割り当て、その結果、電気的な脂質薄膜化刺激が、少なくとも１つの追加のセルに印加されないように、さらに構成され得る。
【００１０】
[0008]プロセッサまたは回路は、第２の所定時間にわたり、塩類緩衝溶液を、セル内の凹部上の脂質膜の厚さを低減するために、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に流すようにさらに構成され得て、プロセッサまたは回路は、少なくとも１つの追加のセルが、第２の所定時間中に、その凹部上に脂質膜を有する状態から、その凹部上に脂質二重層を有する状態に遷移することを検出し、少なくとも１つの追加のセルを、その凹部上に脂質二重層を各々有するセルの第１の部分に、第２の所定時間の終了を待たずに割り当て、その結果、電気的な刺激が、少なくとも１つの追加のセルに印加されないようにさらに構成され得る。プロセッサは、電気的な脂質薄膜化刺激を、セルの第１の部分でなくセルの第２の部分へ、選択的に印加するステップと、塩類緩衝溶液を、セル内の凹部上の脂質膜の厚さを低減するために、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルアレイ上に流すステップとが、複数回繰り返されるように、さらに構成され得る。
【００１１】
[0009]本発明の各種実施形態は、以下の詳細な説明および添付の図面において開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】[0010]ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す図である。
【図２】[0011]ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す図である。
【図３】[0012]予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す図である。
【図４】[0013]予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す図である。
【図５】[0014]ナノポアベースの配列決定チップ内のセル５００の一実施形態を示す図である。
【図６Ａ】[0015]ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００の一実施形態を示す図であり、回路は、形成済みの脂質二重層が破壊しないように、脂質二重層がセル内に構成されるか否かを検出するように構成され得る。
【図６Ｂ】[0016]図６Ａに示した図と同様の、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００を示す図である。図６Ａと比較して、作用電極と対電極との間に、脂質膜／二重層を示す代わりに、作用電極および脂質膜／二重層の電気特性を表す電気モデルを示す。
【図７】[0017]システムの脂質二重層測定段階中の回路６００の一部の電気特性を表す電気モデル７００を示す図である。
【図８Ａ】[0018]脂質二重層がセル内で形成されなかったことを検出する±ΔＶｌｉｑに応答した小さな観測された±ΔＶＡＤＣを示す図である。
【図８Ｂ】[0019]脂質二重層がセル内で形成されたことを検出する±ΔＶｌｉｑに応答した大きな観測された±ΔＶＡＤＣを示す図である。
【図９Ａ】[0020]脂質二重層がセル内部で形成される前後の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロットを示す図である。
【図９Ｂ】[0021]脂質二重層が形成されなかったときの期間ｔ１の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図である。
【図９Ｃ】[0022]脂質二重層が形成されたときの期間ｔ２の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図である。
【図１０】[0023]ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質層を形成する改善された技術のプロセス１０００の一実施形態を示す図である。
【図１１】[0024]液体およびガスが、チップ表面上のセンサの上を通過し接触することを可能にする、シリコンチップを取り囲む改善された流動室を有する、ナノポアベースの配列決定システム１１００の上面図である。
【図１２Ａ】[0025]異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布である。
【図１２Ｂ】[0026]プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す図である。
【図１２Ｃ】[0027]プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階がさらに何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す図である。
【図１３】[0028]二重層測定段階、電気的な脂質薄膜化刺激段階、および塩類緩衝溶液流動段階のタイミング図の一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
[0029]本発明は、多数の方法で実装可能であり、多数の方法は、プロセス、装置、システム、組成物、コンピュータ可読記憶媒体上で具現化されるコンピュータプログラム製品、および／または、プロセッサ、例えばプロセッサに結合されたメモリに記憶されるおよび／またはメモリによって提供される命令を実行するように構成されたプロセッサを含む。この明細書では、これらの実施態様または本発明がとり得る他の任意の形は、技術と称されることがある。一般に、開示されたプロセスのステップの順序は、本発明の範囲内で変更されてもよい。別途記載されていない限り、タスクを実行するように構成されたものとして記載されるプロセッサまたはメモリのような構成要素は、そのタスクを所定の時間に実行するように一時的に構成される一般的な構成要素またはそのタスクを実行するために製造された特定の構成要素として実施されてもよい。本明細書において、「プロセッサ」という用語は、データ、例えばコンピュータプログラム命令を処理するように構成された１つまたは複数の装置、回路および／または処理コアを意味する。
【００１４】
[0030]以下、本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細な説明が、本発明の原理を示す添付の図面と共に提供される。本発明は、この種の実施形態に関連して記載されているが、本発明は、任意の実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定され、本発明は、多数の代替物、変更物および均等物を包含する。多数の具体的な詳細は、以下の説明に記載され、本発明の完全な理解を提供する。これらの詳細は、例のために提供され、本発明は、これらの具体的な詳細の一部または全部を用いずに特許請求の範囲に従って実施され得る。明確性のために、本発明に関連する技術分野において公知である技術的な材料は、本発明が不必要に不明瞭にならないように詳述されていない。
【００１５】
[0031]内径が１ナノメートル程度のポアサイズを有するナノポア膜装置は、迅速なヌクレオチド配列決定において見込みを示してきた。電位が導電性流体に浸漬されたナノポア全体に印加されたとき、ナノポア全体のイオンの伝導に起因するわずかなイオン電流が観察可能である。電流の量は、ポアサイズに影響される。
【００１６】
[0032]ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定のために用いられてもよい。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込む。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含み得る。
【００１７】
[0033]図１は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の一実施形態を示す。膜１０２は、セルの表面にわたって形成される。いくつかの実施形態では、膜１０２は、脂質二重層である。可溶性タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質１１４は、セルの表面上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ１０４は、電気穿孔法によって膜１０２内に挿入される。アレイ内の個々の膜は、化学的にも電気的にも互いに接続されていない。それゆえ、アレイ内の各セルは、独立した配列決定機械であり、ＰＮＴＭＣと結合した単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。ＰＮＴＭＣ１０４は、分析物に対して作用し、そうでなければ不透過性の二重層を介してイオン電流を調節する。
【００１８】
[0034]図１を続けて参照すると、アナログ測定回路１１２は、電解質の薄膜１０８によって覆われた金属電極１１０に接続されている。電解質の薄膜１０８は、イオン不浸透性膜１０２によって、バルク電解質１１４から分離される。ＰＮＴＭＣ１０４は、膜１０２を横切り、イオン電流がバルク液体から作用電極１１０へと流れるための唯一の経路を提供する。セルは、電気化学的電位センサである対電極（ＣＥ）１１６も含む。セルは、参照電極１１７も含む。
【００１９】
[0035]いくつかの実施形態では、ナノポアアレイは、合成による単分子ナノポアベースの配列決定（ナノ−ＳＢＳ）技術を用いる並行配列決定を可能にする。図２は、ナノ−ＳＢＳ技術を用いてヌクレオチド配列決定を実行するセル２００の一実施形態を示す。ナノ−ＳＢＳ技術では、配列決定されるべき鋳型２０２およびプライマーは、セル２００に導入される。この鋳型−プライマー複合体に対して、異なってタグ付けされた４つのヌクレオチド２０８は、バルク水相に添加される。正しくタグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼ２０４と複合体を形成すると、タグの尾部は、ナノポア２０６の筒内に位置決めされる。ナノポア２０６の筒内に保たれるタグは、固有のイオン遮断信号２１０を生成し、それにより、付加された塩基を、タグの異なる化学構造により電子的に同定する。
【００２０】
[0036]図３は、予め装填されたタグを用いたヌクレオチド配列決定を実行しようとしているセルの一実施形態を示す。ナノポア３０１は、膜３０２内に形成される。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ）は、ナノポアと結合している。いくつかの場合では、ポリメラーゼ３０３は、ナノポア３０１に共有結合している。ポリメラーゼ３０３は、配列決定されるべき核酸分子３０４と結合している。いくつかの実施形態では、核酸分子３０４は環状である。いくつかの場合では、核酸分子３０４は線状である。いくつかの実施形態では、核酸プライマー３０５は、核酸分子３０４の一部にハイブリダイズしている。ポリメラーゼ３０３は、ヌクレオチド３０６のプライマー３０５上への、一本鎖核酸分子３０４を鋳型として用いる取り込みを触媒する。ヌクレオチド３０６は、タグ種（「タグ」）３０７を備える。
【００２１】
[0037]図４は、予め装填されたタグを用いた核酸配列決定のためのプロセス４００の一実施形態を示す。段階Ａは、図３において説明したような構成要素を示す。段階Ｃは、ナノポア内に装填されるタグを示す。「装填された」タグは、認識可能な長さの時間、例えば、０．１ミリ秒（ｍｓ）から１００００ｍｓの間、ナノポア内に位置決めされる、および／または、ナノポア内または近くに留まるタグでもよい。いくつかの場合では、予め装填されるタグは、ヌクレオチドから放出される前に、ナノポア内に装填される。いくつかの例では、タグが、ヌクレオチド組み込み事象の際に放出されたあとにナノポアを通過する（および／またはナノポアにより検出される）確率が適度に高い、例えば９０％から９９％である場合、タグは予め装填される。
【００２２】
[0038]段階Ａにおいて、タグ付けされたヌクレオチド（４つの異なるタイプ：Ａ、Ｔ、ＧまたはＣのうちの１つ）は、ポリメラーゼと結合していない。段階Ｂにおいて、タグ付けされたヌクレオチドは、ポリメラーゼと結合している。段階Ｃにおいて、ポリメラーゼは、ナノポアにドッキングする。タグは、ドッキングの間、電気的な力、例えば、膜および／またはナノポア全体に印加される電圧により生成される電界の存在下で生成される力によってナノポア内に引き込まれる。
【００２３】
[0039]結合したタグ付けされたヌクレオチドのいくつかは、核酸分子と塩基対合しない。これらの塩基対合しなかったヌクレオチドは、典型的には、正しく対合したヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままである時間スケールより短い時間スケール内で、ポリメラーゼによって拒絶される。対合しなかったヌクレオチドは、一時的にのみポリメラーゼと結合するので、図４に示すプロセス４００は、典型的には、段階Ｄを越えて進行しない。例えば、対合しなかったヌクレオチドは、段階Ｂにおいて、または、プロセスが段階Ｃに入った少しあとに、ポリメラーゼによって拒絶される。
【００２４】
[0040]ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前、ナノポアのコンダクタンスは、約３００ピコジーメンス（３００ｐＳ）である。段階Ｃにおいて、ナノポアのコンダクタンスは、約６０ｐＳ、８０ｐＳ、１００ｐＳまたは１２０ｐＳであり、それぞれは、タグ付けされたヌクレオチドの４つのタイプのうちの１つに対応する。ポリメラーゼは、異性化およびリン酸基転移反応を経て、ヌクレオチドを成長している核酸分子内に組み込み、タグ分子を放出する。特に、タグがナノポア内に保たれるとき、固有のコンダクタンス信号（例えば、図２の信号２１０を参照）は、タグの異なる化学構造により生成され、それにより、付加された塩基を電子的に同定する。サイクル（すなわち、段階ＡからＥまたは段階ＡからＦ）を繰り返すことにより、核酸分子の配列決定が可能になる。段階Ｄにおいて、放出されたタグは、ナノポアを通過する。
【００２５】
[0041]いくつかの場合では、図４の段階Ｆに見られるように、成長している核酸分子内に組み込まれていないタグ付けされたヌクレオチドも、ナノポアを通過することになる。組み込まれていないヌクレオチドは、いくつかの例では、ナノポアによって検出され得るが、その方法は、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれなかったヌクレオチドとを、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて区別するための手段を提供する。組み込まれなかったヌクレオチドに結合したタグは、ナノポアを迅速に通過し、短期間（例えば、１０ｍｓ未満）の間検出され、一方、組み込まれたヌクレオチドに結合したタグは、ナノポア内に装填され、長期間（例えば、少なくとも１０ｍｓ）の間検出される。
【００２６】
[0042]図５は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル５００の一実施形態を示す。セル５００は、誘電体層５０１を含む。誘電体層５０１を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、窒化物、その他を含む。セル５００は、誘電体層５０１の上層の誘電体層５０４を含む。誘電体層５０４は、作用電極５０２が底部に配置されている、凹部５０５を囲む側壁を形成する。誘電体層５０４を形成するために使用される誘電体材料は、ガラス、酸化物、シリコン一窒化物（ＳｉＮ）、その他を含む。誘電体層５０４の上面は、シラン処理され得る。シラン処理は、誘電体層５０４の上面の上に疎水性層５２０を形成する。いくつかの実施形態では、疎水性層５２０は、約１．５ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する。
【００２７】
[0043]誘電体層壁５０４によって形成される凹部５０５は、作用電極５０２の上層の塩類溶液５０６薄膜をさらに含む。塩類溶液５０６は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つを含み得る。いくつかの実施形態では、塩類溶液５０６の薄膜は、約３マイクロメートル（μｍ）の厚さを有する。
【００２８】
[0044]図５に示すように、膜は、誘電体層５０４の上面に形成され、凹部５０５全体に及ぶ。例えば、膜は、疎水性層５２０の上面に形成された脂質単一層５１８を含む。膜が凹部５０５の開口に達したとき、脂質単一層は、凹部の開口全体に及ぶ脂質二重層５１４に移行する。タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および対象の分析物を含むバルク電解質５０８は、凹部の上に直接配置される。単一のＰＮＴＭＣ／ナノポア５１６は、電気穿孔法によって、脂質二重層５１４内に挿入される。ナノポア５１６は、脂質二重層５１４を横切り、バルク電解質５０８から作用電極５０２へのイオン流のための唯一の経路を提供する。バルク電解質５０８は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つをさらに含み得る。
【００２９】
[0045]セル５００は、電気化学的電位センサである対電極（ＣＥ）５１０を含む。セル５００は、参照電極５１２も含む。いくつかの実施形態では、対電極５１０は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通の電位を、測定セル内のナノポアと接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルの全てに共通である。
【００３０】
[0046]いくつかの実施形態では、作用電極５０２は、金属電極である。非ファラデー性伝導のために、作用電極５０２は、腐食および酸化に耐性を示す、例えば、白金、金などの金属、チタン窒化物、およびグラファイトで形成され得る。例えば、作用電極５０２は、電気めっきを用いた白金電極であってもよい。例えば、作用電極５０２は、チタン窒化物（ＴｉＮ）作用電極であってもよい。
【００３１】
[0047]ナノポアを脂質二重層内に挿入するステップは、脂質二重層がナノポアベースの配列決定チップのセル内に適切に形成されたことが判定されたあとに、実行される。いくつかの技術では、脂質二重層がセル内で適切に形成されたか否かを判定するプロセスは、適切に形成済みの脂質二重層を破壊させ得る。例えば、刺激電圧が印加され、電流は電極を横断して流れることになり得る。測定される刺激電圧への応答が、適切に形成された脂質二重層を有する（すなわち、脂質分子厚の２層である脂質二重層）セルを、適切に形成された脂質二重層を有さないセル（例えば、セルの凹部全体に及ぶ、厚い脂質および溶媒の複合膜を有するセル）と区別するために使用され得るが、いくつかの例では、刺激電圧レベルは、十分に高く、適切に形成済みの脂質二重層を壊すことになる。すなわち、脂質二重層をテストする刺激電圧は、脂質二重層に対して破壊的であり得る。適切に形成済みの脂質二重層が刺激電圧によって破壊された場合では、非常に高い電流が、短絡状態の結果として、電極を横断して流れ始める。それに応じて、システムは、再び特定のセル内に新たな脂質二重層を再形成することを試行するが、このことは、時間を要し効率的でもない。加えて、脂質二重層は、連続する試行での特定のセル内で再形成しない可能性がある。結果として、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセル全体の割合（すなわち、ナノポアベースの配列決定チップの収量）は、低減される。
【００３２】
[0048]ナノポアベースの配列決定チップのセル内に形成される脂質二重層を検出する非破壊技術が、開示される。脂質二重層を検出する非破壊技術は、ナノポアベースの配列決定チップの効率および収量を増加させることを含む、多くの利点を有する。
【００３３】
[0049]図６Ａは、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００の一実施形態を示し、回路は、形成済みの脂質二重層が破壊しないように、脂質二重層がセル内に形成されるか否かを検出するように構成され得る。
【００３４】
[0050]図６Ａは、セルの作用電極６１４と対電極６１６との間にあり、その結果、電圧が脂質膜／二重層６１２を横断して印加される脂質膜すなわち脂質二重層６１２を示す。脂質二重層は、脂質分子の２層からなる薄膜である。脂質膜は、脂質分子の（２より多い）数層からなる薄膜である。脂質膜／二重層６１２は、バルク液体／電解質６１８とも接触する。なお、作用電極６１４、脂質膜／二重層６１２、および対電極６１６が、図１の作用電極、脂質二重層、および対電極と比較して、上下反対に描かれていることに留意されたい。いくつかの実施形態では、対電極は、複数のセル間で共有され、それゆえ、共通電極とも称される。共通電極は、共通電極を電圧源Ｖｌｉｑ６２０に接続することによって、共通の電位を、測定セル内の脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加するように構成可能である。共通の電位および共通電極は、測定セルの全てに共通である。共通電極とは対照的に、作用セル電極は、各測定セル内に存在し、作用セル電極６１４は、他の測定セル内の作用セル電極から独立して、異なる電位を印加するように構成可能である。
【００３５】
[0051]図６Ｂは、図６Ａに示した図と同様の、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の回路６００を示す。図６Ａと比較して、作用電極と対電極との間に、脂質膜／二重層を示す代わりに、作用電極および脂質膜／二重層の電気特性を表す電気モデルを示す。
【００３６】
[0052]電気モデル６２２は、作用電極６１４の電気特性を表すコンデンサ６２４を含む。作用電極６１４に関連付けられたキャパシタンスは、２重層キャパシタンス（Ｃ２重層）とも称される。電気モデル６２２は、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスをモデル化するコンデンサ６２６（Ｃ二重層）と、脂質膜／二重層に関連付けられた抵抗をモデル化する抵抗器６２８（Ｒ二重層）とをさらに含む。脂質膜／二重層に関連付けられた抵抗は、非常に高く、それゆえＲ二重層は、開回路によって置換され得て、電気モデル６２２をＣ２重層とＣ二重層の直列に簡略化できる。
【００３７】
[0053]電圧源Ｖｌｉｑ６２０は、交流（ＡＣ）電圧源である。対電極６１６は、バルク液体６１８に浸漬され、ＡＣ非ファラデー性モードが利用され、方形波電圧Ｖｌｉｑを調節し、それを測定セル内の脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加する。いくつかの実施形態では、Ｖｌｉｑは、±２００〜２５０ｍＶの振幅および２５〜１００Ｈｚの周波数を有する方形波である。
【００３８】
[0054]パスデバイス６０６は、脂質膜／二重層および電極を測定回路６００と接続または切断するために使用され得るスイッチである。スイッチは、セル内の脂質膜／二重層を横断して印加され得る電圧刺激を有効化または無効化する。脂質が、脂質二重層を形成するためにセルに堆積される前では、２つの電極間のインピーダンスは、セルの凹部が封止されていないため、非常に低く、それゆえスイッチ６０６は、短絡状態を回避するために開路に維持される。スイッチ６０６は、脂質溶媒がセルに堆積されてセルの凹部を封止したあと、閉じられ得る。
【００３９】
[0055]回路６００は、チップ上に作り込まれた積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）をさらに含む。積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５に接続されることによって、予備充電される。いくつかの実施形態では、電圧源Ｖｐｒｅ６０５は、９００ｍＶの大きさの固定の正電圧を供給する。スイッチ６０１が閉じられているとき、積分コンデンサ６０８は、電圧源Ｖｐｒｅ６０５の正電圧レベルまで予備充電される。
【００４０】
[0056]積分コンデンサ６０８が予備充電されたあと、リセット信号６０３が使用されスイッチ６０１が開路され、その結果、積分コンデンサ６０８は、電圧源Ｖｐｒｅ６０５から切断される。この時点では、Ｖｌｉｑのレベルにより、対電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位より高いレベルにあるか、その反対でもあり得る。例えば、方形波Ｖｌｉｑの正位相の間（すなわち、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗期間）、対電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位より高いレベルにある。同様に、方形波Ｖｌｉｑの負位相の間（すなわち、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間）、対電極６１６の電位は、作用電極６１４の電位より低いレベルにある。この電位差により、積分コンデンサ６０８は、ＡＣ電圧源信号サイクルの暗期間中に充電され、ＡＣ電圧源信号サイクルの明期間中に放電され得る。
【００４１】
[0057]アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）６１０のサンプリング速度により、積分コンデンサ６０８は、一定の期間中、充電または放電し、次に、積分コンデンサ６０８内に蓄えられる電圧は、ＡＤＣ６１０によって読み出され得る。ＡＤＣ６１０によるサンプリングのあと、積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５に再接続されることによって、再び予備充電される。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ６１０のサンプリング速度は、１５００〜２０００Ｈｚである。いくつかの実施形態では、ＡＤＣ６１０のサンプリング速度は、最高で５ｋＨｚである。例えば、１ｋＨｚのサンプリング速度で、積分コンデンサ６０８は、約１ｍｓの期間中、充電または放電し、次に、積分コンデンサ６０８内に蓄えられる電圧は、ＡＤＣ６１０によって読み出される。ＡＤＣ６１０によるサンプリングのあと、積分コンデンサ６０８は、リセット信号６０３を使用しスイッチ６０１を閉じ、その結果、積分コンデンサ６０８が電圧源Ｖｐｒｅ６０５に再接続されることによって、再び予備充電される。積分コンデンサ６０８を予備充電するステップと、積分コンデンサ６０８が充電または放電する一定の期間を待機するステップと、積分コンデンサ内に蓄えられた電圧をＡＤＣ６１０によってサンプリングするステップとが、次に、システムの脂質二重層測定段階の間中サイクルで繰り返される。
【００４２】
[0058]回路６００は、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）におけるデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣを監視することによって、脂質二重層がセル内に形成されるか否かを検出するために、使用され得る。以下で詳述するように、脂質二重層測定段階中、回路６００は、直列に接続されたＣ二重層６２６、Ｃ２重層６２４、およびｎｃａｐ６０８を有する電圧分割器としてモデル化され得て、電圧分割器の中間点で取り出される電圧変化は、脂質二重層が形成されたか否かを判定するＡＤＣ６１０によって、読み出され得る。
【００４３】
[0059]図７は、システムの脂質二重層測定段階中の回路６００の一部分の電気特性を表す電気モデル７００を示す。図７に示すように、Ｃ２重層６２４は、Ｃ二重層６２６と直列に接続されているが、Ｒ二重層６２８（図６Ｂ参照のこと）は、電気モデル７００から除去されている。Ｒ二重層６２８は、脂質膜／二重層に関連付けられた抵抗が、非常に高く、それゆえＲ二重層が、開回路として近似され得るので、電気モデル７００から除去することができる。図７に示すように、Ｃ２重層６２４およびＣ二重層６２６は、ｎｃａｐ６０８と直列にさらに接続される。
【００４４】
[0060]ＡＣモードで動作するとき、ＡＤＣによって読み出される電圧（ＶＡＤＣ）は、以下の式で決定される。
【００４５】
【数１】
2019516952.tif 000003
【００４６】
ここで、Ｚ＝１／（ｊωＣ）であり、
Ｚ（ｎｃａｐ）は、ｎｃａｐに関連付けられた交流インピーダンスであり、
Ｚ（２重層）は、作用電極に関連付けられた交流インピーダンスであり、
Ｚ（二重層）は、脂質膜／二重層に関連付けられた交流インピーダンスである。
【００４７】
[0061]２重層の交流インピーダンスであるＺ（２重層）は、Ｃ２重層がＣ二重層すなわちｎｃａｐのキャパシタンスよりもかなり大きいので、Ｚ（二重層）およびＺ（ｎｃａｐ）と比べて非常に低い値を有する。したがって、Ｚ（ｎｃａｐ）＝１／（ｊωＣｎｃａｐ）、Ｚ（二重層）＝１／ｊωＣ二重層、およびＺ（２重層）＝０を代入すると、式（１）は、以下のように簡易化される。
【００４８】
【数２】
2019516952.tif 000004
【００４９】
ここで、Ｃ（ｎｃａｐ）は、ｎｃａｐに関連付けられたキャパシタンスであり、
Ｃ（二重層）は、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスである。
[0062]脂質がまず脂質二重層を形成するためにセル内に堆積されるとき、セルのいくつかは、自然に形成される脂質二重層を有するが、そのセルのいくつかは単に、セルの凹部の各々の全体に広がる厚い脂質膜（脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を伴う）を有するにすぎない。脂質二重層に関連付けられたキャパシタンスは、脂質膜／二重層のキャパシタンスがその厚さに反比例するので、厚さが脂質分子の２層より多い、脂質膜に関連付けられたキャパシタンスよりも大きい。脂質膜が薄膜化され、脂質二重層になるように移行するにつれて、厚さは減少し、その付随するキャパシタンスは増加する。上記の式（２）では、脂質二重層がセル内で形成し始めるにつれて、Ｃ（二重層）は増加し、一方、Ｃ（ｎｃａｐ）は一定で、その結果、ＶＡＤＣ全体では増加する。ＶＡＤＣの増加は、それゆえ脂質二重層がセル内で形成されたことの指標として使用され得る。
【００５０】
[0063]いくつかの実施形態では、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加されるデルタ電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答する積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）でのデルタ電圧変化ΔＶＡＤＣは、脂質二重層がセル内で形成されたか否かを検出するために、監視される。例えば、式（２）は、以下のように書き直され得る。
【００５１】
【数３】
2019516952.tif 000005
【００５２】
ここで、ΔＶＡＤＣは、ＡＤＣによって読み出される積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）での電圧変化である。
ΔＶｌｉｑは、バルク液体に印加される電圧変化であり、
Ｃ（ｎｃａｐ）は、ｎｃａｐに関連付けられたキャパシタンスであり、
Ｃ（二重層）は、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスである。
【００５３】
[0064]上記の式（３）では、Ｃ（ｎｃａｐ）が一定に留まり、一方、Ｃ（二重層）は、脂質二重層がセル内で形成し始めるにつれて増加するので、ΔＶＡＤＣも同様に増加する。ΔＶＡＤＣは、脂質膜／二重層に関連付けられたキャパシタンスであるＣ（二重層）におおよそ比例する。ΔＶＡＤＣの増加は、それゆえ脂質二重層がセル内で形成されたことの指標として使用され得る。
【００５４】
[0065]いくつかの実施形態では、より確かに脂質二重層を検出する観測可能なΔＶＡＤＣを最大化するために、脂質膜／二重層（最大ΔＶｌｉｑ）と接触するバルク液体に印加される最大電圧変化に応答するΔＶＡＤＣは、脂質二重層がセル内で形成されたか否かを検出するために、監視される。
【００５５】
[0066]図８Ａは、正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した小さな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣによって、脂質二重層のセル内での形成が検出されないことを示す。図８Ｂは、正／負の電圧変化±ΔＶｌｉｑに応答した大きな観測された正／負の電圧変化±ΔＶＡＤＣによって、脂質二重層のセル内での形成が検出されることを示す。
【００５６】
[0067]図８Ａでは、方形波Ｖｌｉｑが負位相から正位相に変化するとき、正の最大電圧変化＋ΔＶｌｉｑが発生し、一方、方形波Ｖｌｉｑが正位相から負位相に変化するとき、負の最大電圧変化−ΔＶｌｉｑが発生する。図８Ａでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていない場合、小さな＋ΔＶＡＤＣのみが観測され得て、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていない場合、小さな−ΔＶＡＤＣのみが観測され得る。
【００５７】
[0068]図８Ｂでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されている場合、大きな正の電圧変化＋ΔＶＡＤＣが観測され得る。そして、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されている場合、大きな負の電圧変化−ΔＶＡＤＣが観測され得る。
【００５８】
[0069]いくつかの実施形態では、ΔＶｌｉｑの絶対値（｜ΔＶｌｉｑ｜）が最大であるとき観測されるΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）は、所定の閾値と比較される。｜ΔＶＡＤＣ｜＞所定の閾値の場合、そのとき脂質二重層が検出されたと判定される。逆に、｜ΔＶＡＤＣ｜＜所定の閾値の場合、そのとき脂質二重層が検出されないと判定される。
【００５９】
[0070]図９Ａは、脂質二重層がセル内部で形成される前後の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロットを示す。図９Ａのプロットは、実際の試験データに基づく。図９Ａに示すように、Ｙ軸のＶＡＤＣの単位は、ＡＤＣのカウントである。しかしながら、他の単位が同様に用いられてもよい。図９Ａに示すように、脂質二重層が形成されていない期間ｔ１の間に記録される｜ΔＶＡＤＣ｜の値は、脂質二重層がセル内で形成された期間ｔ２の間に記録される値よりも小さい。
【００６０】
[0071]図９Ｂは、脂質二重層が形成されなかったときの期間ｔ１の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図を示す。図９Ｂで示した結果は、図８Ａと一致する。図９Ｂでは、方形波Ｖｌｉｑが負位相から正位相に変化するとき、最大＋ΔＶｌｉｑが発生し、一方、方形波Ｖｌｉｑが正位相から負位相に変化するとき、最大−ΔＶｌｉｑが発生する。図９Ｂでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていないので、小さな＋ΔＶＡＤＣのみが観測され得て、ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層がセル内で形成されていないので、小さな−ΔＶＡＤＣのみが観測され得る。
【００６１】
[0072]図９Ｃは、脂質二重層が形成されたときの期間ｔ２の間の、時間に対するＶＡＤＣの例示的なプロット（図９Ａ参照のこと）の拡大図を示す。図９Ｃで示した結果は、図８Ｂと一致する。図９Ｃでは、ΔＶｌｉｑが正の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されているので、２つの連続したサンプル点の間に、大きな＋ΔＶＡＤＣが観測され得る。ΔＶｌｉｑが負の最大値にある段階において、脂質二重層が既にセル内で形成されているので、大きな−ΔＶＡＤＣが観測され得る。なお、方形波Ｖｌｉｑがある位相から別の位相に変化した少しあと、ΔＶｌｉｑは、ゼロに留まり、それに応じてＶＡＤＣは、ゼロに低下することに留意されたい。図９Ｃに示すように、脂質二重層がセル内で既に形成されているとき、ＶＡＤＣの正または負のスパイクが観測され得る。正または負のスパイクのあとには、より小さいＶＡＤＣの値が続く。
【００６２】
[0073]上述のように、脂質および溶媒の混合物がまず脂質二重層を形成するためにセル内に堆積されるとき、セルのいくつかは、自然に形成される脂質二重層を有するが、そのセルのいくつかは単に、セルの凹部の各々の全体に広がる、溶媒と組み合わされた脂質分子の複数の層を伴う厚い脂質膜を有するにすぎない。ナノポアベースの配列決定チップの収量（すなわち、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセルの割合）を増加させるために、ナノポアベースの配列決定チップは、追加のセル内の脂質二重層の形成を支援するためにさらなるステップを実行し得る。例えば、その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップは、厚い脂質膜上を液体が流れる効率を向上させ得て、それにより任意の過剰な脂質溶媒の除去を支援し、その結果、厚い脂質膜は、薄膜化され、より効果的に脂質二重層へと移行され得る。その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップはまた、過剰な脂質溶媒を絞り出し、厚い脂質膜を脂質二重層へと薄膜化する結果につながる静電力を発生させ得る。一方、電気的刺激により薄い脂質二重層のいくらかは破壊することになり得るので、その内部に既に脂質二重層を適切に形成させたセルは、同一の電気的な脂質薄膜化刺激にさらに露出させるべきではない。したがって、その内部に脂質二重層を形成させたナノポアベースの配列決定チップ内のセルの部分を、その内部にまだ脂質二重層を適切に形成させていないセルの部分から検出し、分離するために、本出願で説明した非破壊技術を使用することは、有益である。セルを異なるグループに分割することによって、異なるグループのセルは、別々に処理され得て、それにより、より大きな効率を実現し、ナノポアベースの配列決定チップの全体の収量を増大させる。
【００６３】
[0074]図１０は、ナノポアベースの配列決定チップのセル内の脂質層を形成する改善された技術のプロセス１０００の一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、図１０のナノポアベースの配列決定チップは、複数の図１のセル１００を含む。いくつかの実施形態では、図１０のナノポアベースの配列決定チップは、複数の図５のセル５００を含む。いくつかの実施形態では、図１０のナノポアベースの配列決定チップは、複数の図６Ａおよび６Ｂの回路６００を含む。
【００６４】
[0075]プロセス１０００は、ステップを含み、その中では異なるタイプの流体が流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通り流される。著しく異なる特性（例えば、圧縮性、疎水性、および粘性）を有する複数の流体が、ナノポアベースの配列決定チップ表面上のセンサアレイの上を流される。改善された効率のために、アレイ内のセンサの各々は、流体へ安定した方法で露出させられなければならない。例えば、異なるタイプの流体の各々は、流体が、セルの各々の表面を均一に覆い接触するようにチップへ送達され、次に、チップ外に送達され得るように、ナノポアベースの配列決定チップ上を流されなければならない。上述のように、ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成される多数のセンサセルを組み込む。ナノポアベースの配列決定チップは、ますます多くのセルを含むために拡大されるので、チップのセル全体を異なるタイプの流体の均一な流れを達成することは、さらに難しくなる。
【００６５】
[0076]いくつかの実施形態では、図１０のプロセス１０００を実行するナノポアベースの配列決定システムは、流体をチャネルの長さ方向に沿ったチップの異なるセンサ上を横切るように誘導するヘビ状流体流路を有する改善された流動室を含む。図１１は、液体およびガスが、チップ表面上のセンサの上を通過し接触することを可能にする、シリコンチップを取り囲む改善された流動室を有する、ナノポアベースの配列決定システム１１００の上面図を示す。流動室は、ヘビ状または曲がりくねった流路１１０８を備え、それにより、流体をセンサバンク１１０６（各バンクが数千のセンサセルを含む）の１つの列（または１つの行）の直上をチップの一方の端部から反対の端部まで流れるように誘導し、次に、流体を繰り返し折り返して、全てのセンサバンクが、少なくとも１回横切られるまで、センサバンクの他の隣接した列の直上を流れるように誘導する。図１１に示すように、システム１１００は、入口１１０２および出口１１０４を含む。
【００６６】
[0077]図１１を参照すると、流体は、入口１１０２を通りシステム１１００内へと誘導される。入口１１０２は、管または針であってもよい。例えば、管または針は、１ミリメートルの直径を有し得る。液体またはガスを直接、単一の連続した空間を有する広い流動室内へ給送する代わりに、入口１１０２は、液体またはガスをヘビ状流路１１０８内へと給送し、それにより、液体またはガスをセンサバンク１１０６の単一の列の直上を流れるように誘導する。ヘビ状流路１１０８は、上板と、流動室をヘビ状流路になるように仕切る仕切り１１１０とを互いに積層してフローセルを形成し、次に、フローセルをチップの上に取付けることによって、形成され得る。液体またはガス流れは、ヘビ状流路１１０８を通過し流れたあとに、液体またはガスは、出口１１０４に至るまで導かれ、システム１１００の外に導かれる。
【００６７】
[0078]システム１１００によって、流体が、チップ表面上の全てのセンサの上を、より均一に流れることが可能になる。流路幅は、十分狭く、毛細管現象が効果をもつように構成される。より詳細には、流体と取り囲む表面との間の表面張力（これは流体内の凝集によって生じる）および粘着力が、流体をまとめて保持する役割を果たし、それにより流体または気泡が崩壊しデッド領域が形成されることを防止する。例えば、流路は、１ミリメートルまたはそれより短い幅を有し得る。狭小な流路は、流体の制御された流動を可能にし、先行する流体またはガスの流動からの残余を最小化する。
【００６８】
[0079]図１０を参照すると、１００２では、塩類／電解質緩衝溶液が、セル内の凹部を塩類緩衝溶液で実質的に充填するために、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通し流される。塩類緩衝溶液は、以下の、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、のうちの１つを含み得る。いくつかの実施形態では、塩類緩衝溶液の濃度は、３００ｍＭ（ミリモル）である。
【００６９】
[0080]１００４では、脂質および溶媒の混合物が、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通し流される。いくつかの実施形態では、脂質および溶媒の混合物は、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）などの脂質分子を含む。いくつかの実施形態では、脂質および溶媒の混合物は、デカンまたはトリデカンを含む。脂質および溶媒の混合物がまず脂質二重層を形成するためにセル内に堆積されるとき、セルのいくつかは、自然に形成される脂質二重層を有するが、そのセルのいくつかは単に、セルの凹部の各々の全体に広がる厚い脂質膜（脂質分子の複数の層および共に組み合わされた溶媒を伴う）を有するにすぎない。ナノポアベースの配列決定チップの収量（すなわち、適切に形成された脂質二重層およびナノポアを有するナノポアベースの配列決定チップ内のセルの割合）を増加させるために、ナノポアベースの配列決定チップは、追加のセル内の脂質二重層の形成を支援するために、２つの段階すなわち電気的な脂質薄膜化刺激段階および緩衝液流動段階を繰り返し通過することになる。
【００７０】
[0081]プロセス１０００の電気的な脂質薄膜化刺激段階は、ステップ１００６、１００８、および１０１０を含む。いくつかの実施形態では、この段階中、ステップ１００６、１００８、および１０１０は、図１０に示すような順序で実行され得る。いくつかの実施形態では、ステップ１００６、１００８、および１０１０は、別の順序で実行されてもよい。いくつかの実施形態では、ステップは、同時に実行されてもよい。
【００７１】
[0082]１００６では、本出願で説明した非破壊技術が使用され、脂質二重層が図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を使用してセル内に形成されたか否かを検出する。検出は、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加される電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）における電圧変化ΔＶＡＤＣを監視することを含む。検出された脂質二重層を有するセルは、検出された脂質二重層を有さないセルと別のグループに分離される。検出された脂質二重層を有するセルの各々の内部で、パスデバイス６０６が、脂質二重層および電極を測定回路６００から切断するために開路され、その結果、電気的な脂質薄膜化刺激のセルへの印加は、無力化される。
【００７２】
[0083]１００８では、電気的な脂質薄膜化刺激は、ナノポアベースの配列決定チップのセルに印加される。その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップは、厚い脂質膜上を液体が流れる効率を向上させ得て、それにより任意の過剰な脂質溶媒の除去を支援し、その結果、厚い脂質膜は、薄膜化され、より効果的に脂質二重層へと移行され得る。その内部にまだ脂質二重層を形成させていないセルへ、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するステップはまた、過剰な脂質溶媒を絞り出し、厚い脂質膜を脂質二重層へと薄膜化する結果につながる静電力を発生させ得る。いくつかの実施形態では、図６Ａおよび図６Ｂの同一の回路６００が、電気的な脂質薄膜化刺激を印加するために使用され得る。脂質二重層検出と脂質薄膜化との間の、回路６００の設定での唯一の違いは、脂質二重層を検出するＶｌｉｑの絶対振幅がより低いことである。例えば、脂質二重層を検出する絶対振幅Ｖｌｉｑは、１００ｍＶ〜２５０ｍＶであり得て、一方、脂質を薄膜化する絶対振幅Ｖｌｉｑは、２５０ｍＶ〜５００ｍＶであり得る。
【００７３】
[0084]ステップ１０１０では、電気的な脂質薄膜化刺激段階が終了したか否かが判定される。いくつかの実施形態では、電気的な脂質薄膜化刺激は、２秒間でその内部に脂質二重層を有するとして検出されなかった任意のセルに印加される。しかしながら、他の所定の期間が同様に用いられてもよい。段階がまだ終了しない場合、プロセス１０００は、時限が終了するまでステップ１００６および１００８に再び戻り、そうでない場合、プロセス１０００は、次に塩類緩衝溶液流動段階に進む。
【００７４】
[0085]プロセス１０００の塩類緩衝溶液流動段階は、ステップ１０１２、１０１４、および１０１６を含む。いくつかの実施形態では、この段階中、ステップ１０１２、１０１４、および１０１６は、図１０に示すような順序で実行され得る。いくつかの実施形態では、ステップ１０１２、１０１４、および１０１６は、別の順序で実行されてもよい。いくつかの実施形態では、ステップは、同時に実行されてもよい。
【００７５】
[0086]１０１２では、ステップ１００６で使用された同様の非破壊技術が使用され、脂質二重層が図６Ａおよび図６Ｂの回路６００を使用してセル内に形成されたか否かを検出する。検出された脂質二重層を有するセルは、検出された脂質二重層を有さないセルと別のグループに分離される。検出された脂質二重層を有するセルの各々の内部で、パスデバイス６０６が、脂質二重層および電極を測定回路６００から切断するために開路される。
【００７６】
[0087]１０１４では、塩類／電解質緩衝溶液が、流動室を介してナノポアベースの配列決定チップのセルを通し流される。塩類緩衝溶液をセル上に流動させる目的は、各セル上の脂質二重層の形成を支援するためである。塩類緩衝溶液がセル上を流動するとき、セル上に堆積される脂質および溶媒の混合物の厚さは、減少し、脂質二重層の形成を支援する。
【００７７】
[0088]ステップ１０１６では、塩類緩衝溶液流動段階が終了したか否かが判定される。
いくつかの実施形態では、塩類緩衝溶液は、２秒間流動される。しかしながら、他の所定の期間が同様に用いられてもよい。段階がまだ終了しない場合、プロセス１０００は、時限が終了するまでステップ１０１２および１０１４に再び戻り、そうでない場合、プロセス１０００は、ステップ１０１８に進む。
【００７８】
[0089]ステップ１０１８では、プロセス１０００の電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が繰り返されるべきか否かが判定される。別の基準が、このステップで用いられてもよい。いくつかの実施形態では、電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階は、所定の回数だけ実行される。いくつかの実施形態では、２つの段階は、ナノポアベースの配列決定チップの目標収量に到達するまで繰り返される。いくつかの実施形態では、刺激および緩衝溶液流動による薄膜化の最終回中に形成された脂質二重層を有するとしてまさに検出されたばかりのセルの増加数または割合が、所定の閾値よりも低い場合、プロセス１０００は、終了する。いくつかの実施形態では、２つの段階は、最近印加された電気的な脂質薄膜化刺激レベルが、例えば５００ｍＶの所定の最大閾値に到達するまで繰り返される。
【００７９】
[0090]プロセス１０００は、プロセス１０００の電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が次に繰り返されることになる場合、ステップ１０２０へ進む。ステップ１０２０では、印加されることになる次の電気的な脂質薄膜化刺激が決定される。いくつかの実施形態では、電気的な脂質薄膜化刺激レベルは、例えば１００ｍＶ増加の一定の所定の量だけ増大される。いくつかの実施形態では、最終の繰り返し中に形成された脂質二重層を有するとしてまさに検出されたばかりのセルの増加数または割合が、所定の閾値よりも低い場合、電気的な脂質薄膜化刺激レベルは、一定の所定の量だけ増大され、そうでない場合は、先行の電気的な脂質薄膜化刺激は、有効であると見なされ、したがって、同一の電気的な脂質薄膜化刺激レベルが再び使用される。
【００８０】
[0091]図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、プロセス１０００の電気的な脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が、何回か繰り返されるにつれて、適切に形成された脂質二重層を有するナノポアベースの配列決定チップ内のセル全体の割合（すなわち、ナノポアベースの配列決定チップの収量）が、増大されることを示すヒストグラムである。
各々の図で、ｘ軸は、脂質膜／二重層と接触するバルク液体に印加される電圧変化（ΔＶｌｉｑ）に応答した積分コンデンサ６０８（ｎｃａｐ）における電圧変化ΔＶＡＤＣであり、一方、ｙ軸は、あるΔＶＡＤＣの値域内にそのΔＶＡＤＣ値を有するセル数である。図１２Ａは、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。図１２Ｂは、プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。図１２Ｃは、プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階がさらに何回か繰り返されたあとの、異なるΔＶＡＤＣ値を有するセルの初期分布を示す。この例では、５０以上のΔＶＡＤＣ値を有するセルは、その内部に形成された脂質二重層を有するとして決定される。図１２Ａに示すように、初期において、少数のセルのみが検出される脂質二重層を有する。図１２Ｂに示すように、プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階が何回か繰り返されたあと、検出される脂質二重層を有するセルの数は、増大する。最終的に、図１２Ｃに示すように、プロセス１０００の脂質薄膜化刺激段階および塩類緩衝溶液流動段階がさらに何回か繰り返されたあと、ナノポアベースの配列決定チップ内のセルの大部分は、検出される脂質二重層を有する。
【００８１】
[0092]図１３は、二重層測定段階、電気的な脂質薄膜化刺激段階、および塩類緩衝溶液流動段階のタイミング図の一実施形態を示す。この例では、脂質がセル内に堆積されたあと、二重層測定段階が開始される。二重層測定段階は、約２秒間継続する。この段階中、セルの全てが有効化される。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０ｍＶである。
【００８２】
[0093]二重層測定段階は、約２秒間継続する電気的な脂質薄膜化刺激段階へと続く。この段階中、ΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）がセル内で閾値１を超えるとき、次に、脂質二重層は、セル内で検出され、セルは、電圧源から切断される。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０〜５００ｍＶである。
【００８３】
[0094]電気的な脂質薄膜化刺激段階は、塩類緩衝溶液流動段階へと続き、後者は、約２〜１０秒間継続する。この段階中、ΔＶＡＤＣの絶対値（｜ΔＶＡＤＣ｜）がセル内で閾値２を超えるとき、次に、脂質二重層は、セル内で検出され、セルは、電圧源から切断される。Ｖｌｉｑの絶対値は、２５０ｍＶである。
【図１】
2019516952.tif 000006
【図２】
2019516952.tif 000007
【図３】
2019516952.tif 000008
【図４】
2019516952.tif 000009
【図５】
2019516952.tif 000010
【図６Ａ】
2019516952.tif 000011
【図６Ｂ】
2019516952.tif 000012
【図７】
2019516952.tif 000013
【図８Ａ】
2019516952.tif 000014
【図８Ｂ】
2019516952.tif 000015
【図９Ａ】
2019516952.tif 000016
【図９Ｂ】
2019516952.tif 000017
【図９Ｃ】
2019516952.tif 000018
【図１０】
2019516952.tif 000019
【図１１】
2019516952.tif 000020
【図１２Ａ】
2019516952.tif 000021
【図１２Ｂ】
2019516952.tif 000022
【図１２Ｃ】
2019516952.tif 000023
【図１３】
2019516952.tif 000024
【国際調査報告】
2019516952.tif 000025
2019516952.tif 000026