(57)【要約】  本発明は、あるＣＮＳ疾患を処置するための、微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲｓ）に対して（特に、ＴＡＡＲ１に対して）良好な親和性を有する式（Ｉ）で示される化合物に、及び薬学的に好適なその酸付加塩に関する。
2019512469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2019512469.tif 000039
で示されるモルホリン誘導体、及び薬学的に好適なその酸付加塩。
【請求項２】
５−エチル−４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）モルホリン−２−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミドである、式Ｉで示される化合物。
【請求項３】
請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物を製造するためのプロセスであって、
ａ）式：
【化２】
2019512469.tif 000040
で示される化合物からＮ保護基（ＰＧ）を開裂して、式：
【化３】
2019512469.tif 000041
［式中、ＰＧは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−tert−ブチル（ＢＯＣ）から選択されるＮ保護基である］
で示される化合物にすること、及び
所望により、得られた化合物を薬学的に許容し得る酸付加塩に変換すること
を含む、プロセス。
【請求項４】
治療活性物質として使用するための、請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物。
【請求項５】
鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害、統合失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、片頭痛、緊張亢進、薬物乱用、中毒、摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害の処置において使用するための、請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物。
【請求項６】
統合失調症、双極性障害又は鬱病の処置において使用するための、請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物。
【請求項７】
請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物と薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害、統合失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、片頭痛、緊張亢進、薬物乱用、中毒、摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害を処置するための医薬を調製するための、請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物の使用。
【請求項９】
鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害、統合失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、片頭痛、緊張亢進、薬物乱用、中毒、摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害を処置するための方法であって、有効量の請求項１及び２に記載の式Ｉで示される化合物を投与することを含む、方法。
【請求項１０】
本明細書中に上述される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式：
【０００２】
【化１】
2019512469.tif 000003
で示される化合物、及び薬学的に好適なその酸付加塩に関する。
【０００３】
本明細書中に開示され、上記の式Ｉによりカバーされる化合物は、互変異性を示し得る。本発明は、この化合物の任意の互変異性形態、又はそのような形態の混合物を包含し、上記の式に描かれるいずれか一方の互変異性形態に限定されるものではないことが意図される。
【０００４】
式Ｉで示される化合物（５−エチル−４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）モルホリン−２−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド）は、微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に対して（特に、ＴＡＡＲ１に対して）良好な親和性、及び先行技術の化合物と比較して低い副作用を有することを、ここに見出した。
【０００５】
マウスＴＡＡＲ１及びラットＴＡＡＲ１の類似のリガンドは、国際公開第２０１１／０７６６７８号及び国際公開第２０１２／０１６８２６号に開示されている。
【０００６】
式Ｉで示される化合物及びその薬学的に使用可能な付加塩は、価値ある薬理学的特性を有する。具体的には、本発明の化合物は、ヒト微量アミン関連受容体１（ｈＴＡＡＲ１）の部分アゴニストであることが見出された。
【０００７】
本発明の化合物は、先行技術の化合物に優る顕著な利点を有しており、その利点とは以下である：
−ヒトＴＡＡＲ１受容体における強力なアゴニスト活性、
−ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）に対する選択性、
−ｈＥＲＧイオンチャネルに対する選択性、
−低い両親媒性ベクトルであり、そのため、薬物誘導性リン脂質症（ＤＩＰＬ）を引き起こすリスクが低いこと（下記参照）。
【０００８】
したがって、式Ｉで示される化合物は、鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害、統合失調症のような精神障害、パーキンソン病のような神経疾患、アルツハイマー病のような神経変性障害、てんかん、片頭痛、緊張亢進（hypertension）、中毒、薬物乱用、並びに摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症のような代謝障害、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害を処置するための安全な薬物として使用され得る。
【背景技術】
【０００９】
古典的な生体アミン類（セロトニン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ドーパミン、ヒスタミン）は、中枢神経系及び末梢神経系において神経伝達物質として重要な役割を果たす［１］。それらの合成及び貯蔵、並びに放出後のそれらの分解及び再取り込みは厳密に調節されている。生体アミン類のレベルにおける不均衡は、多くの病的状態下での脳機能の変化の原因であることが知られている［２〜５］。内因性アミン化合物の第２の分類、いわゆる微量アミン（ＴＡ）は、構造、代謝及び細胞下局在性に関して古典的な生体アミンとかなり重複する。ＴＡには、ｐ−チラミン、β−フェニルエチルアミン、トリプタミン及びオクトパミンが含まれ、そして、これらは古典的な生体アミンよりも一般的に低いレベルで哺乳動物の神経系に存在する［６］。
【００１０】
ＴＡの調節異常は、統合失調症及び鬱病のような種々の精神疾患［７］や、注意欠陥多動性障害、片頭痛、パーキンソン病、薬物乱用及び摂食障害のような他の症状［８、９］に関連付けられている。
【００１１】
長い間、ＴＡ特異的受容体は、ヒト及び他の哺乳動物のＣＮＳにおける解剖学的に離散した高親和性ＴＡ結合部位に基づいて、仮説として取り上げられていただけであった［１０、１１］。したがって、ＴＡの薬理作用には、古典的な生体アミンの放出を誘発するか、それらの再取り込みを阻害するかによって、又はそれらの受容体系と「交差反応」するかのいずれかによって、古典的な生体アミンの周知の機構が介在すると考えられていた［９、１２、１３］。この見解は、ＧＰＣＲの新しいファミリーである微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）の幾つかのメンバーの同定により、大きく変化した［７、１４］。ヒトには９個のＴＡＡＲ遺伝子（３個の偽遺伝子を含む）があり、マウスには１６個の遺伝子（１個の偽遺伝子を含む）がある。ＴＡＡＲ遺伝子はイントロンを含まず（ＴＡＡＲ２は１個のイントロンを含むという１つの例外を除いて）、そして、同じ染色体セグメント上に互いに隣接して位置する。レセプター遺伝子の系統発生的関係は、ＧＰＣＲのファーマコフォア類似性の詳細な比較、及び薬理学的データに一致して、これらのレセプターが３つの異なるサブファミリーを形成することを示唆している［７、１４］。ＴＡＡＲ１は、ヒトと齧歯類との間で高度に保存された４つの遺伝子（ＴＡＡＲ１〜４）の最初のサブクラスにある。ＴＡは、Ｇαを介してＴＡＡＲ１を活性化する。ＴＡの調節異常は、鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害、統合失調症のような精神障害、パーキンソン病のような神経疾患、アルツハイマー病のような神経変性障害、てんかん、片頭痛、緊張亢進、中毒、薬物乱用、並びに摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症のような代謝障害、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害のような種々の疾患の病因に寄与することが明らかになった。
【００１２】
したがって、微量アミン関連受容体に関する知識を高めることには大きな関心が寄せられている。
【００１３】
参照文献
【表１】
2019512469.tif 000004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、式Ｉで示される新規化合物及びその薬学的に許容し得る塩、微量アミン関連受容体の生物学的機能に関連する疾患を処置するためのそれらの使用、それらの製造、並びに、鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害、ストレス関連障害、統合失調症のような精神障害、パーキンソン病のような神経疾患、アルツハイマー病のような神経変性障害、てんかん、片頭痛、薬物乱用、中毒、並びに摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症のような代謝障害、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害のような病気の制御又は予防における本発明の化合物に基づく医薬である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
式Ｉで示される本化合物及びその薬学的に許容し得る塩は、当分野において公知の方法によって、例えば、後述のプロセスであって、
ａ）式：
【００１６】
【化２】
2019512469.tif 000005
で示される化合物からＮ保護基（ＰＧ）を開裂して、式：
【００１７】
【化３】
2019512469.tif 000006
［式中、ＰＧは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−tert−ブチル（ＢＯＣ）から選択されるＮ保護基である］
で示される化合物にすること、及び
所望により、得られた化合物を薬学的に許容し得る酸付加塩に変換すること
を含む、プロセスによって調製することができる。
【００１８】
【化４】
2019512469.tif 000007
【００１９】
出発物質１、１’及び２は、市販されているか、又は当分野で周知の方法によって調製してもよい。ラセミ２−（４−アミノフェニル）モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル（CAS RN: 1002726-96-6）は市販されている。（２Ｒ）−２−（４−アミノフェニル）モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル（CAS RN: 1260220-42-5）は市販されている。（２Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル（CAS RN: 1260220-43-6）は市販されているか、又は文献に記載されるとおり、例えば、Trussardi, R. & Iding, H, ＰＣＴ国際出願（国際公開第２０１５／０８６４９５号）に記載されるとおり調製することができる。
【００２０】
工程Ａ：アミド結合形成は、ＤＣＣ、ＥＤＣ、ＴＢＴＵ又はＨＡＴＵのようなカップリング試薬の存在下、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン又はＮ−メチルモルホリンのような有機塩基の存在下で、ジクロロメタン若しくは１，２−ジクロロエタンのようなハロゲン化溶媒中、又はジエチルエーテル、ジオキサン、ＴＨＦ、ＤＭＥ若しくはＴＢＭＥのようなエーテル系溶媒中で、アミン２とカルボン酸化合物１とのカップリング反応によって達成することができる。好ましい条件は、５０〜６０℃で１２〜４８時間、Ｎ−メチルモルホリンを伴ったＴＢＴＵ（ＴＨＦ中）である。或いは、アミド結合形成は、ジクロロメタン若しくは１，２−ジクロロエタンのようなハロゲン化溶媒中、又はジエチルエーテル、ジオキサン、ＴＨＦ、ＤＭＥ若しくはＴＢＭＥのようなエーテル系溶媒中、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンのような有機塩基の存在下で、アミン２と塩化アシル化合物１’とのカップリング反応によって達成することができる。好ましい条件は、室温で１８時間、ＴＨＦ中のトリエチルアミンである。必要に応じて、塩化アシル化合物１’は、対応するカルボン酸１から、ジクロロメタン若しくは１，２−ジクロロエタンのようなハロゲン化溶媒中、又はジエチルエーテル、ジオキサン、ＴＨＦ、ＤＭＥ若しくはＴＢＭＥのようなエーテル系溶媒中、ＤＭＦのような触媒の存在下で塩化オキサリルと処理することにより、インサイチュ（in situ）で調製してもよい。好ましい条件は、室温で１時間、ジクロロエタンである。或いは、塩化アシル化合物１’は、Ghosezと共同研究者の方法（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1979, 1180; Org. Synth. 1980, 59, 26-34）によって、対応するカルボン酸１から、ジクロロメタン中、１−クロロ−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルプロペニルアミン［CAS 26189-59-3］での処理と、続く減圧下の溶媒の除去により、インサイチュで調製してもよい。
【００２１】
工程Ｂ：ＢＯＣ Ｎ保護基の脱離は、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４若しくはＨ３ＰＯ４のような鉱酸、又はＣＦ３ＣＯＯＨ、ＣＨＣｌ２ＣＯＯＨ、ＨＯＡｃ若しくはｐ−トルエンスルホン酸のような有機酸と共に、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３、ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ又はＨ２Ｏのような溶媒中、０〜８０℃で達成することができる。好ましい条件は、８０℃で３時間、アセトニトリル水溶液中でのＣＦ３ＣＯＯＨ、又は室温で１６時間、ジオキサン中の４N ＨＣｌである。ラセミ出発物質２を使用した場合、得られるモルホリン化合物Ｉ’のラセミ混合物は、キラルＨＰＬＣを用いることにより、その構成エナンチオマーに分離してもよい。或いは、エナンチオマー的に純粋な化合物２から出発することによって、エナンチオマー的に純粋な形態で化合物Ｉを得てもよい。
【００２２】
化合物の単離及び精製
本明細書中に記載の化合物及び中間体の単離及び精製は、所望により、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、厚層クロマトグラフィー、分取の低圧若しくは高圧液体クロマトグラフィー、又はこれらの手順の組合せのような任意の好適な分離又は精製手順によって達成することができる。好適な分離及び単離手順の具体的な説明は、本明細書中で後述する調製例及び実施例を参照すれば分かる。しかしながら、他の等価の分離又は単離手順も当然使用することができよう。式Ｉで示されるキラル化合物のラセミ混合物は、キラルＨＰＬＣを用いて分離することができる。キラル合成中間体のラセミ混合物もまた、キラルＨＰＬＣを用いて分離されよう。
【００２３】
式Ｉで示される化合物の塩
式Ｉで示される化合物は塩基性であり、そして、対応する酸付加塩に変換してもよい。変換は、少なくとも化学量論量の適切な酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）及び有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）との処理によって達成される。典型的には、遊離塩基をジエチルエーテル、酢酸エチル、クロロホルム、エタノール又はメタノールなどのような不活性有機溶媒中に溶解し、そして、酸を同様の溶媒中で加える。温度は０℃〜５０℃の間に維持される。得られた塩は自然に沈殿するか、又はより極性の低い溶媒を用いて溶液から取り出してもよい。
【実施例】
【００２４】
実施例１
５−エチル−４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド
【００２５】
【化５】
2019512469.tif 000008
【００２６】
ａ）（２Ｓ）−２−［４−［（５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル）アミノ］フェニル］モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル
（２Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル（CAS RN: 1260220-43-6、３５０mg、１．２６mmol、１．００当量）及び５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（CAS RN: 957129-38-3、２４５mg、１．５１mmol、１．２０当量）のＴＨＦ（８ml）中の撹拌溶液に、ＴＢＴＵ（８０７mg、２．５１mmol、２．００当量）及びＮ−メチルモルホリン（５０９mg、５５３μl、５．０３mmol、４．００当量）を加えた。反応混合物を５０℃で１５時間撹拌した。ｔ＝１５ｈでのＴＬＣは、反応が完了したことを示した。反応混合物を減圧濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離剤：ヘプタン中 ０％〜１００％ ＥｔＯＡｃ）により精製して、（２Ｓ）−２−［４−［（５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル）アミノ］フェニル］モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル（５０１mg、９６％）をオフホワイト色の固体として得た。ＭＳ（ＩＳＰ）：４１３．７（［Ｍ−Ｈ］−）。
【００２７】
ｂ）５−エチル−４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド
トリフルオロ酢酸（１．３７ｇ、９１８μl、１２．０mmol、１０当量）の水（８ml）中の撹拌溶液に、（２Ｓ）−２−［４−［（５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニル）アミノ］フェニル］モルホリン−４−カルボン酸tert−ブチル（４９７mg、１．２mmol、１．００当量）のアセトニトリル（４ml）中懸濁液を加えた。反応混合物を８０℃で３時間撹拌した。ｔ＝３ｈでのＭＳは、反応が完了したことを示した。反応混合物を１M ＮａＯＨ水溶液に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧濃縮した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（SiliaSep（商標）アミンカートリッジ、溶離剤：ヘプタン中 ０％〜１００％ ＥｔＯＡｃ、次に、ＥｔＯＡｃ中 ０％〜１０％ ＭｅＯＨ）により精製して、５−エチル−４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド（３２７mg、８７％）をオフホワイト色の固体として得た。ＭＳ（ＩＳＰ）：３１５．７（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００２８】
実施例２
（比較例）
５−エチル−４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｒ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド
【００２９】
【化６】
2019512469.tif 000009
工程（ａ）において（２Ｓ）−２−（４−アミノフェニル）モルホリン−４−カルボン酸エステルの代わりに（２Ｒ）−２−（４−アミノフェニル）モルホリン−４−カルボン酸エステル（CASRN:1260220-42-5）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３１５．６（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００３０】
実施例３
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−６−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−３−カルボキサミド
【００３１】
【化７】
2019512469.tif 000010
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに６−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ニコチン酸（CAS RN: 159783-29-6）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３８２．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００３２】
実施例４
（比較例）
６−クロロ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−３−カルボキサミド
【００３３】
【化８】
2019512469.tif 000011
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに６−クロロ−ニコチン酸（CAS RN: 5326-23-8）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３２０．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３１８．２（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００３４】
実施例５
（比較例）
２−クロロ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−４−カルボキサミド
【００３５】
【化９】
2019512469.tif 000012
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−クロロ−イソニコチン酸（CAS RN: 6313-54-8）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３２０．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３１８．１（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００３６】
実施例６
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−２−フェニル−１，３−チアゾール−５−カルボキサミド
【００３７】
【化１０】
2019512469.tif 000013
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−フェニルチアゾール−５−カルボン酸（CAS RN: 10058-38-5）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３６６．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００３８】
実施例７
（比較例）
２，６−ジクロロ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−４−カルボキサミド
【００３９】
【化１１】
2019512469.tif 000014
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２，６−ジクロロ−イソニコチン酸（CAS RN: 5398-44-7）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３５６．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３５４．１（［｛３７Ｃｌ３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３５２．１（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４０】
実施例８
（比較例）
４−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド
【００４１】
【化１２】
2019512469.tif 000015
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに４−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（CAS RN: 879770-33-9）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３６３．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４２】
実施例９
（比較例）
５，６−ジクロロ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−３−カルボキサミド
【００４３】
【化１３】
2019512469.tif 000016
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに５，６−ジクロロ−ニコチン酸（CAS RN: 41667-95-2）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３５６．１（［｛３７Ｃｌ３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３５４．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３５２．１（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４４】
実施例１０
（比較例）
６−シアノ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−３−カルボキサミド
【００４５】
【化１４】
2019512469.tif 000017
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに６−シアノ−ニコチン酸（CAS RN: 70165-31-0）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３０９．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４６】
実施例１１
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン−３−カルボキサミド
【００４７】
【化１５】
2019512469.tif 000018
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに６−（トリフルオロメチル）ニコチン酸（CAS RN: 158063-66-2）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３５２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００４８】
実施例１２
（比較例）
５−クロロ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−２−カルボキサミド
【００４９】
【化１６】
2019512469.tif 000019
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに５−クロロ−ピコリン酸（CAS RN: 86873-60-1）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３２０．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３１８．２（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００５０】
実施例１３
（比較例）
５−クロロ−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−３−カルボキサミド
【００５１】
【化１７】
2019512469.tif 000020
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに５−クロロ−ニコチン酸（CAS RN: 22620-27-5）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３２０．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３１８．１（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００５２】
実施例１４
（比較例）
２−クロロ−６−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−４−カルボキサミド
【００５３】
【化１８】
2019512469.tif 000021
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−クロロ−６−メチルピリジン−４−カルボン酸（CAS RN: 25462-85-5）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３３４．１（［｛３７Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）、３３２．１（［｛３５Ｃｌ｝Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００５４】
実施例１５
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−２−フェニル−１，３−オキサゾール−４−カルボキサミド
【００５５】
【化１９】
2019512469.tif 000022
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−フェニルオキサゾール−４−カルボン酸（CAS RN: 23012-16-0）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３５０．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００５６】
実施例１６
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−２−フェニル−１，３−チアゾール−４−カルボキサミド
【００５７】
【化２０】
2019512469.tif 000023
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−フェニルチアゾール−４−カルボン酸（CAS RN: 7113-10-2）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３６６．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００５８】
実施例１７
（比較例）
２−メチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−４−カルボキサミド
【００５９】
【化２１】
2019512469.tif 000024
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−メチル−イソニコチン酸（CAS RN: 4021-11-8）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：２９８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００６０】
実施例１８
（比較例）
２，６−ジメチル−Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］ピリジン−４−カルボキサミド
【００６１】
【化２２】
2019512469.tif 000025
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２，６−ジメチル−イソニコチン酸（CAS RN: 54221-93-1）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３１２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００６２】
実施例１９
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−２−メチル−１，３−チアゾール−４−カルボキサミド
【００６３】
【化２３】
2019512469.tif 000026
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに２−メチルチアゾール−４−カルボン酸（CAS RN: 35272-15-2）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３０４．１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００６４】
実施例２０
（比較例）
Ｎ−［４−［（２Ｓ）−モルホリン−２−イル］フェニル］−１−フェニルピラゾール−３−カルボキサミド
【００６５】
【化２４】
2019512469.tif 000027
工程（ａ）において５−エチル−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸の代わりに１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（CAS RN: 4747-46-0）を用いて、実施例１と同様に標題化合物を得た。白色固体。ＭＳ（ＩＳＰ）：３４９．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
【００６６】
上記のとおり、本発明の化合物は、先行技術の化合物に優る顕著な利点を有しており、その利点とは、ヒトＴＡＡＲ１受容体における強力なアゴニスト活性、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）に対する選択性、ｈＥＲＧイオンチャネルに対する選択性、及び低い両親媒性ベクトルであり、それにより、薬物誘導性リン脂質症（ＤＩＰＬ）を引き起こすリスクが低いことである（下記参照）。
【００６７】
先行技術の既知化合物と比較して式Ｉで示される化合物の利点の優位性を示すために、以下の比較データ及びコメントを提供し得る。
【００６８】
１．ヒト微量アミン関連受容体１（ｈＴＡＡＲ１）の部分アゴニストの薬理作用及び治療潜在性
齧歯類ＴＡＡＲ１とヒトＴＡＡＲ１との間のリガンド−受容体相互作用において、顕著に種差があるとの証拠がある［１］。したがって、ＴＡＡＲ１関連疾患を処置するためのヒト治療薬として使用するための化合物を選択する場合、ヒト型ＴＡＡＲ１受容体（ｈＴＡＡＲ１）でのそれらの機能活性の効力に基づいた候補化合物の優先順位付けが重要である。ｈＴＡＡＲ１はＧタンパク質共役膜貫通受容体（ＧＰＣＲ）であり、そこでは、リガンドは、受容体のアンタゴニスト、アゴニスト、部分アゴニスト又はインバースアゴニストとして機能し得る。式Ｉで示される化合物及び比較例は、ｈＴＡＡＲ１での機能活性についてインビトロで試験され、そこでは、式Ｉで示される化合物は、ｈＴＡＡＲ１の部分アゴニストであることが見出された。式Ｉで示される化合物及び選択された比較例についての実験的に決定されたｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０値を表１に示す（下記参照）。これにより、実施例１の化合物は、特に、インビトロでｈＴＡＡＲ１の強力な部分アゴニストであることが見出された。
【００６９】
腹側被蓋領域及び背側縫線核におけるエクスビボの電気生理学実験によって、野生型マウスではＴＡＡＲ１部分アゴニストがＤＡ及び５−ＨＴニューロンの発火率を増強し［２、３］、一方、ｐ−チラミンのような完全アゴニストは発火率を低下させたことが示された［３、４］。しかしながら、完全アゴニスト及び部分アゴニストの両方とも、精神刺激薬コカインの報酬効果及び強化効果に対して保護的であることが示されている［５］。アンフェタミンのような完全アゴニストは、負のフィードバックを誘導し、ＤＡ及び５−ＨＴ系に及ぼすそれら自身の作用を鈍らせる［６、７］一方、部分アゴニストは、ＴＡＡＲ１を介して発火率を増加させることによって神経シグナル伝達に及ぼすその効果を増大さ得る。これらの知見や、ＴＡＡＲ１部分アゴニストが完全アゴニストよりも齧歯類においてより豊富なインビボの薬理を有するという報告［３、８］のために、ＴＡＡＲ１部分アゴニストが、限定されるものではないが、統合失調症、双極性障害、鬱病、パーキンソン病を含むＣＮＳ疾患を処置するための、並びにアルコールの及び薬物の中毒を処置するためのヒトの治療薬として使用するために、非常に有望な潜在性を示すことを示唆する強力な前臨床の証拠が出現している。
【００７０】
例えば、ＴＡＡＲ１部分アゴニストは、改善された認知及び気分、並びに副作用減少プロファイル（例えば、現在の抗精神病薬で見られるメタボリックシンドロームの誘導がない）という利点のある抗精神病上の有効性を示すことにより、既存の非定型抗精神病薬より優れていると提案されている［３、８］。他の文献は、双極性障害［８］、薬物中毒［５、９］及び糖尿病［１０］を含む、可能性ある適応症を示唆している。
【００７１】
参照文献
【表２】
2019512469.tif 000028
【００７２】
２．ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、並びに関連する薬物乱用に対する傾向及び／又は中毒の潜在性
ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）の薬理は、とりわけ、コカイン及びＭＤＰＶのような特定の精神刺激薬の精神刺激効果に、並びに乱用傾向及び中毒メカニズムに関係している［１〜３］。したがって、ヒトでの使用を意図した新しい治療薬については、乱用傾向又は中毒に対する潜在性のリスクを最小限に抑えるために、ドーパミントランスポーターＤＡＴの阻害又はこれとの相互作用を回避することが望ましい。
【００７３】
例えば、コカインの強化効果は、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）を迅速に遮断するその能力に依存することが証拠により示唆されている。動物試験では、コカイン以外のドーパミン再取り込み阻害剤も自己投与されており、一般的にＤＡＴの阻害におけるその効力と正の相関がある相対効力を伴うが、セロトニン又はノルエピネフリントランスポーター（ＳＥＲＴ、ＮＥＴ）ではそれがない［４〜８］。コカインを自己投与するように訓練された動物はまた、直接ドーパミンアゴニストを自己投与するであろう［９〜１１］。更に、ドーパミン神経終末の破壊は、コカインの自己投与挙動の消失を招くこともあり［１２、１３］、そして、これらの効果は、他の強化因子によって維持された応答が保たれた場合にさえ観察された［１４、１５］。ヒトにおいて、コカイン誘導性の「恍惚感（high）」は脳内のＤＡＴ占有率と相関する［１６］。
【００７４】
ＤＡＴがコカインの強化効果に必須であるという仮説を更に試験するために、機能的であるが「コカイン非感受性」ＤＡＴが作成され、マウスにおいて発現された［１７、１８］。この突然変異ＤＡＴは野生型ＤＡＴと比較してコカインに対する８９倍低い親和性を示し、この突然変異ＤＡＴを発現するノックイン（ＤＡＴｋｉ）マウスにおいて、コカインは側坐核で細胞外ドーパミンを増加させることができなかったか、又は運動活性、常同行動若しくは条件付け場所嗜好性における増加を誘導できなかった［１８〜２０］。更に、コカインは、これらのＤＡＴｋｉマウスにおける正の強化因子として機能できなかったが、食物、ｄ−アンフェタミン及び直接ドーパミンアゴニストは、野生型マウスに匹敵するレベルで、これらのマウスにおけるオペラント行動を確実に維持した［２１］。とりわけ、腹側被蓋領域（ＶＴＡ）を含む脳領域へのコカイン感受性野生型ＤＡＴの再導入は、ＤＡＴｋｉマウスにおけるコカイン報酬行動の回復をもたらした［２２］。結論として、ＤＡＴを遮断するコカインの能力は、マウスにおけるその強化効果を無効にするのに充分であり、このことは、ＤＡＴ遮断がコカインの強化効果にとって重要であるという強い証拠を提供している。
【００７５】
したがって、まとめると、これらの知見は、ヒトでの使用を意図した新しい治療薬については、乱用傾向又は中毒潜在性のリスクを最小限に抑えるために、ドーパミントランスポーターＤＡＴの阻害又はこれとの相互作用を回避することが非常に望ましいことを示唆している。
【００７６】
一連のＴＡＡＲ１化合物について測定されたインビトロＤＡＴ Ｋｉを表１に示す（下記参照）。驚くべきことに、実施例１は、他の化合物よりもＤＡＴでの有意に弱いリガンドであるが、同時にｈＴＡＡＲ１の強力な部分アゴニストであり、したがって、実施例１についてのｈＴＡＡＲ１／ＤＡＴ選択性の比は、他の化合物よりも有意に高いことが見出された。
【００７７】
参照文献
【表３】
2019512469.tif 000029
2019512469.tif 000030
【００７８】
３．ｈＥＲＧ遮断及び関連する心臓ＱＴ間隔延長についての傾向
薬物誘発性の心臓副作用を引き起こす見込みを最小化することは、ヒトでの安全な使用を意図した治療剤、特に長期処置レジメンに使用されることが意図された薬物には非常に望ましい。近年、規制当局は、心臓ＱＴ間隔を延長する治療剤の承認を遅延させるか又はその使用に制限を課すか、そして、その承認を拒絶するか又は市場から排除さえしている。ＱＴ間隔は、心電図（ＥＣＧ）のＱＲＳ群の開始からＴ波の終わりまでの時間であり、心室脱分極及び再分極の期間の尺度である。ＱＴ間隔を延長する薬物は、トルサード・ド・ポワント（Torsades de Pointes）（ＴｄＰ）と呼ばれる多形性心室頻拍と関連している。この不整脈は、重篤な心血管転帰を引き起こし得、不可逆的な心室細動及び死に進行し得る。ＩＣＨ Ｓ７Ｂ規制ガイドライン［１］は、インビトロのＩＫｒアッセイ［ヒト エーテルアゴーゴー（ether-a-go-go）関連遺伝子（ｈＥＲＧ）によって伝導されるカリウム電流］を含む新規分子実体（ＮＭＥ）の心血管リスクを評価するための全体的な非臨床の方策を推奨している。ｈＥＲＧの阻害は、ＱＴ延長についての主要な機序として同定された［２］。したがって、推奨される最小限の非臨床ＱＴ間隔のリスク回避方策は、インビトロｈＥＲＧアッセイにおいて所与の化学系列からの代表化合物を試験することである［３］。目標は、治療活性の有効なインビトロ（又は利用可能であればインビボ）濃度より少なくとも３０倍低い濃度で、２０％以下のｈＥＲＧ阻害を引き起こす化合物を選択することである。ＴＡＡＲ１アゴニストの場合には、ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０を、治療活性を予測する妥当なインビトロ濃度として考えることができる（上記参照）。したがって、ｈＥＲＧ ＩＣ２０／ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０比が少なくとも３０倍である、ＴＡＡＲ１アゴニストを選択することが望ましい。
【００７９】
一連のＴＡＡＲ１化合物について測定されたインビトロｈＥＲＧ ＩＣ２０及びＩＣ５０を表１に示す（下記参照）。
【００８０】
とりわけ、塩基性化合物は、ｈＥＲＧチャネルの強力な阻害を特に引き起こす傾向があることが知られている［４］。全てのＴＡＡＲ１化合物は同じモルホリノ頭部基を有するため、全ての化合物は同様に塩基性であることが見込まれる。塩基性部分は、ｈＴＡＡＲ１のアゴニスト活性に必要である。驚くべきことに、実施例１は比較化合物よりも有意に弱いｈＥＲＧチャネル阻害剤であり、したがって、実施例１のｈＥＲＧ ＩＣ２０／ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０比は、推奨される最小値である３０倍よりも有意に高いことが見出された。
【００８１】
参照文献
【表４】
2019512469.tif 000031
【００８２】
４．両親媒性及び関連する薬物誘導性リン脂質症（ＤＩＰＬ）についての傾向
リン脂質症（ＰＬＤ）は、組織におけるリン脂質の過剰蓄積を特徴とするリソソーム貯蔵障害である［１］［２］［３］。抗鬱剤、抗狭心症剤、抗マラリア剤及びコレステロール低下剤を含む多くのカチオン性両親媒性薬物は、動物及びヒトにおいて薬物誘導性リン脂質症（ＤＩＰＬ）を引き起こすことが報告されている。ＤＩＰＬの機序は、患部細胞のリソソーム及び酸性小胞内へのＤＩＰＬ薬物の捕捉又は選択的取り込みを伴う。薬物捕捉の後に、内部のリソソーム膜内に薬物−リン脂質複合体が徐々に蓄積される。未消化物質の増加は、組織中の多層体（ミエロイド小体）の異常な蓄積をもたらす。リン脂質症は主として貯蔵障害であると考えられているが、幾つかの化合物では、貯蔵障害は、炎症及び壊死と関連しており、患部組織の機能障害につながることが知られている。したがって、治療薬は、ＤＩＰＬを引き起こすリスクを生じないことが非常に望ましい。これは、長期使用を意図した医薬（例えば、統合失調症、双極性障害又は鬱病のような慢性精神障害の処置を意図した薬物）、又は糖尿病のような慢性代謝障害の処置を意図した薬物の場合に特に当てはまる。
【００８３】
ＤＩＰＬは、カチオン性両親媒性薬物（ＣＡＤ）に特に関連することが知られている有害作用である［４］。ＤＩＰＬを回避するためには、化合物の塩基性ｐＫａ（塩基性ｐＫａ＜６．３）又は両親媒性（ΔΔＧａｍ＞−６kJ mol−１）のいずれかを減少させる必要がある（即ち、ΔΔＧａｍを増加させる必要がある）［５］。化合物は、塩基性ｐＫａ値が６．３未満であるか、又は両親媒性がΔΔＧａｍ＝−６kJ mol−１よりも高いかのいずれかの場合、ＤＩＰＬ陰性として分類される。所与の化合物についての両親媒性は、分子構造式から直接インシリコ（in silico）で計算することができる［６］ため、その化合物についてＤＩＰＬに対して予測されるリスクもインシリコで計算することができ［５］、この予測アルゴリズムは、以下の基準により定義されるＤＩＰＬリスク分類を利用しており、これは、広範囲の化合物について実験的に決定されたリン脂質症の結果を含むコンピュータ訓練セットから抽出されたパラメーターに基づいている：
両親媒性ベクトル＞−５．０kJ/mol、及びＢＰＫＡ１≦５．６０  陰性ＤＩＰＬが予測される；
−７．０kJ/mol＜両親媒性ベクトル＜−５．０kJ/mol、及び／又は７．０＞ＢＰＫＡ１＞５．６０  境界ＤＩＰＬが予測される；
両親媒性ベクトル＜−７．０kJ/mol、及びＢＰＫＡ１≧７．００  陽性ＤＩＰＬが予測される。
【００８４】
一連のＴＡＡＲ１化合物について算出された両親媒性（ΔΔＧａｍ（kJ mol−１））及びはインシリコＤＩＰＬリスク予測（陰性／境界／陽性）を表１に示す（下記参照）。
【００８５】
全てのＴＡＡＲ１化合物は同じモルホリノ頭部基を有するため、全ての化合物の塩基性ｐＫａは非常によく似ており、明らかに６．３を上回っている。塩基性部分は、ｈＴＡＡＲ１でのアゴニスト活性に必要である。したがって、ＤＩＰＬを回避する唯一の方法は、分子の基本骨格の親油性を低下させることである。驚くべきことに、実施例１については、類似の化合物についての結果に基づいて期待されたよりも親油性が顕著に低下しているため、実施例１については両親媒性が明らかに低下し、そして、結果としてこの化合物はＤＩＰＬを引き起こすとは予測されないことが見出された。
【００８６】
参考文献
【表５】
2019512469.tif 000032
【００８７】
本化合物は、本明細書中に後述される試験により調査された。
【００８８】
材料と方法
ヒトＴＡＡＲ１
発現プラスミドの構築のために、ヒトＴＡＡＲ１のコード配列を、本質的にLindemann et al.により記載［１４］されたとおりゲノムＤＮＡから増幅した。１．５mM Ｍｇ２＋を含むＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Roche Diagnostics）を使用して、精製ＰＣＲ産物を、製造者の取扱説明書に従いｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングした。ＰＣＲ産物をｐＩＲＥＳｎｅｏ２ベクター（BD Clontech, Palo Alto, California）にサブクローニングし、細胞株に導入する前に発現ベクターの配列検証を行った。
【００８９】
ＨＥＫ２９３細胞（ATCC # CRL-1573）を、本質的にLindemann et al.（2005）により記載されたとおり培養した。安定にトランスフェクトされた細胞株を樹立するために、ＨＥＫ２９３細胞を、製造者の取扱説明書により、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）を用いてＴＡＡＲコード配列を含有するｐＩＲＥＳｎｅｏ２発現プラスミド（上記）でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に培地に１mg/ml Ｇ４１８（Sigma, Buchs, Switzerland）を補充した。約１０日間の培養期間後、クローンを単離し、増殖させて、製造者により提供された非アセチル化ＥＩＡ手順に従いｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ Ｅｎｚｙｍｅイムノアッセイ（ＥＩＡ）システム（Amersham）を用いて、微量アミン（全化合物をSigmaから購入）に対する応答性について試験した。１５継代の培養期間で安定したＥＣ５０を示したモノクローナル細胞株をその後の全ての試験に使用した。
【００９０】
ｃＡＭＰ測定は、以前に記載されたとおりに実施した（Revel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8485-8490）。要するに、ヒトＴＡＡＲ１を発現した細胞を９６ウェルプレート（BIOCOAT 6640; Becton Dickinson, Allschwil, Switzerland）上に播き、３７℃で２０時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１mM ３−イソブチル−１−メチルキサンチンを含有するＰＢＳと共に、３７℃及び５％ ＣＯ２で１０分間プレインキュベートした後に、３７℃で３０分間、広い濃度範囲のアゴニストで細胞を刺激した。０．２％ ＤＭＳＯによる刺激を基準レベルとして設定し、３０μM β−ＰＥＡの効果を最大応答として設定した。次に、細胞を溶解して、ｃＡＭＰアッセイを製造者の取扱説明書（ｃＡＭＰキット；Upstate/Millipore, Schaffhausen, Switzerland）により実施した。最後に、プレートをルミノメーター（１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター；PerkinElmer, Schwerzenbach, Switzerland）で読み取り、ｃＡＭＰの量を算出した。結果は、少なくとも３回の独立した実験から得られた。実験はデュプリケイト又はトリプリケイトで実施された。ＥＣ５０値は、平均値±標準偏差（μM）として提示される。ＴＡＡＲ１での機能活性データについてのＥｍａｘ値は、内因性リガンド及び完全アゴニストであるβ−ＰＥＡについての１００％と比較した機能活性の程度を表す。
【００９１】
ヒトＤＡＴ
インビトロでのドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）への結合。ヒトＤＡＴで安定にトランスフェクトされたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（Invitrogen, Zug, Switzerland）を培養した。細胞を収集し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。ペレットを−８０℃で凍結させた。次に、ペレットを４℃で１０mM ＥＤＴＡを含む２０mM ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）（４００ml）中に再懸濁した。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Kinematica, Lucerne, Switzerland）を用いて１００００回転／分（rpm）で１５秒間ホモジナイズした後、ホモジネートを４℃で３０分間、４８０００×ｇで遠心分離した。膜ストックのアリコートを−８０℃で凍結させた。全てのアッセイを少なくとも３回実施した。試験化合物を結合緩衝液（２５２mM ＮａＣｌ、５．４mM ＫＣｌ、２０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、３．５２mM ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）（２０ml）中に希釈して、１０点希釈曲線を作成し、９６ウェル白色ポリスチレンアッセイプレート（Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland）に移した。［３Ｈ］−ＷＩＮ３５，４２８（〜８６Ci/mmol；Perkin-Elmer）は、ＤＡＴアッセイ用の放射性リガンドであり、１２nMのＫｄを有した。［３Ｈ］−ＷＩＮ３５，４２８（〜４０nM濃度） ５０μlをｈＤＡＴアッセイプレートの各ウェルに加え、［３Ｈ］−ＷＩＮ３５，４２８の最終濃度１０nMを目標とした。アッセイプレート中の結合緩衝液（２０μl）単独で全結合が規定され、一方で、１０μM インダトラリンの存在下の結合では非特異的結合が規定された。凍結したＤＡＴ膜ストックを解凍し、ポリトロン組織ホモジナイザーを用いて約０．０４mgタンパク質/ml結合緩衝液（Ｈ２Ｏ中 １：１希釈）の濃度に再懸濁した。次に、膜ホモジネート（４０μg/ml）を、ポリビニルトルエン（ＰＣＴ）コムギ胚芽凝集素被覆シンチレーション近接アッセイ（ＷＧＡＳＰＡ；Amersham Biosciences）ビーズ（７．７mgビーズ/mlホモジネート）と共に、５〜３０分間軽く混合した。アッセイを開始するために、放射性リガンド及び試験化合物を含有するアッセイプレートの各ウェルに膜／ビーズ混合物 １３０μlを添加し（各ウェル中の最終容量 ２００μl）、これを撹拌しながら室温で約２時間インキュベートした。次に、アッセイプレートをＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐｃｏｕｎｔのＰＶＴ ＳＰＡ計数モードで計数した。［３Ｈ］−ＷＩＮ３５４２８ストック ５０μlを、Ｐａｃｋａｒｄ １９００ＣＡ液体シンチレーションカウンターでＲｅａｄｙＳａｆｅシンチレーションカクテル（Beckman Industries） ５ml中で計数して、それぞれのアッセイに加えた総カウントを決定した。非線形回帰を利用して、データをシグモイド曲線にフィッティングし、結合及び取り込みについてのＩＣ５０値を決定した。結合及び取り込みについてのＫｉ値は、以下のＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）を用いて算出された。
【００９２】
ヒトＥＲＧ（ｈＥＲＧ）
ホールセル・パッチクランプ技法を用いて、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞における、生理的温度（３６±１℃）付近のｈＥＲＧ（human-ether-a-go-go関連遺伝子）カリウムチャネルに及ぼす試験品目の効果を調べた。ｈＥＲＧチャネルを安定に発現する少なくとも３つのＣＨＯ細胞において、４濃度（０．３−３−３０−３００μM）でｈＥＲＧ Ｋ＋電流パラメーターに及ぼす化合物の効果を評価した。電気生理学的測定のために、ハイグロマイシンＢを含まない培地 ２mlを含む３５mmの滅菌培養皿に細胞を播種した。単一細胞（隣接細胞との、視認できる接続が無い）が測定できる密度で細胞を培養した。５％ ＣＯ２（相対湿度 約９５％）の加湿雰囲気中、３７℃で細胞をインキュベートした。１０％ウシ胎仔血清及び１０％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充した栄養混合物Ｆ−１２（Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２）を含む滅菌培養フラスコ中で細胞を継続的に維持し継代した。方法の正確さを確保するために、毎日、少なくとも３つの細胞を選択的ＩＫｒブロッカー（Ｅ−４０３１、参照物質）で処理した。単一細胞が記録できる密度で細胞を播種した３５mm培養皿を顕微鏡のディッシュホルダー上に載せ、生理的温度（３６±１℃）付近で浴液（塩化ナトリウム １５０mM、塩化カリウム ４mM、塩化カルシウム １．２mM、塩化マグネシウム １mM、ＨＥＰＥＳ １０mM、ｐＨ（ＮａＯＨ）７．４）を用いて継続的に灌流した（約１ml/分で）。パッチ電極と個々のｈＥＲＧを安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（ピペット抵抗範囲：２．０MΩ〜７．０MΩ；シール抵抗範囲：＞１GΩ）との間のギガシールの形成後、ピペット先端を横切る細胞膜が破れて、細胞内部への電気的アクセスが確保された（ホールセル・パッチ構成）。シールの質が不充分な場合には、異なる細胞及び新しいピペットを用いてシール形成プロセスを繰り返した。安定なシールが確立されるとすぐに、−８０mVの保持電位から−４０mVへの細胞膜の脱分極時に５０ms、次に、＋２０mV（チャネルの活性化）で５００ms、そして、続く−４０mVへの再分極時に５００ms、外向きのｈＥＲＧテール電流を測定した。この電圧プロトコルを、１０秒間隔で少なくとも１０回実行した。電流密度が測定には低すぎると判断された場合、別の細胞を記録した。対照の記録が達成されたら、試験品目を含む浴液を用いて細胞を継続的に灌流した。試験品目の洗い流し中に、定常状態レベルの遮断に達するまで、上記の電圧プロトコルを１０秒間隔で継続的に再度実行した。化合物の４つの試験品目濃度を累積的に３つの細胞に順次適用した。ｈＥＲＧテール電流が試験品目により阻害されると、濃度−応答曲線が作成され、ＩＣ５０値が算出された。ＩＣ５０値に基づいてＩＣ２０を推定した。試験品目の各濃度を３回の実験（ｎ＝３）で分析した。
【００９３】
両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ）計算及びインシリコＤＩＰＬ予測
式Ｉで示される化合物及び比較化合物についての分子構造式から、公開アルゴリズム（Fischer, H.; Kansy, M.; Bur, D.;“CAFCA: a novel tool for the calculation of amphiphilic properties of charged drug molecules”. Chimia 2000, 54, 640-645; Fischer, H.; Atzpodien, E. A.; Csato, M; Doessegger, L.; Lenz, B.; Schmitt, G.; Singer, T.;“In silico assay for assessing phospholipidosis potential of small drug like molecules: training, validation and refinement using several datasets.”J. Med. Chem. 2012, 55, 126-139）により、両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ）及びインシリコＤＩＰＬ予測をコンピュータ上で決定した。
【００９４】
式Ｉで示される化合物は、表１に示されるとおり、ｈＴＡＡＲ１での部分アゴニスト活性（ＥＣ５０（μM））、ｈＤＡＴでの結合親和性（Ｋｉ（μM））、及びｈＥＲＧでのチャネル遮断活性（ＩＣ２０及びＩＣ５０（μM））を有する。表１はまた、上記手順を用いて計算された、式Ｉで示される化合物及び比較化合物についての算出された両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ（kJmol−１））及びインシリコのリン脂質症推定（インビトロＤＩＰＬ及びインビボＤＩＰＬについての陰性／陽性／境界予測）を示す。
【００９５】
【表６】
2019512469.tif 000033
2019512469.tif 000034
2019512469.tif 000035
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【００９６】
驚くべきことに、式Ｉで示される化合物（実施例１）は、ｈＴＡＡＲ１での強力なアゴニスト活性、ｈＤＡＴに対する高い選択性、ｈＥＲＧに対する高い選択性、低い両親媒性ベクトル及び結果として低いリン脂質症リスクという点に関して、先行技術の他のＴＡＡＲ１化合物に比較して全体的に優れた性質の組合せを示すことが見出された。表１を精査すると、実施例１は、ｈＴＡＡＲ１で強力な部分アゴニスト活性（ＥＣ５０＝０．０５９μM）を有し、ｈＤＡＴに対して高度に選択的（Ｋｉ＝２７．５μM；選択性の比＝４７１倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ｈＥＲＧに対して高度に選択的（ＩＣ２０＝３６．２μM；選択性の比＝６１９倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、そして、リン脂質症の懸念の閾値をはるかに下回る低い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−３．４７kJ mol−１）を有する（インシリコＤＩＰＬリスク予測＝陰性）ことが明らかになる。
【００９７】
表１を精査すると、実施例１に近い類似体が、１つ以上の点で実施例１と比較して劣る性質を有することが明らかになる。
【００９８】
例えば、実施例１のＲエナンチオマーである比較例２は、ｈＴＡＡＲ１での効力が弱く（ＥＣ５０＝０．２６３２μM）、このことは、実施例１のように、絶対立体化学のＳ立体配置がｈＴＡＡＲ１でのより強い効力を得るために好ましいことを教示している。
【００９９】
比較例３は、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝１．９７μM；選択性の比＝５２倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−６．３kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１００】
比較例４は、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝２．５μM；選択性の比＝４０倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、より高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−５．３kJ mol−１）を有するため、境界ＤＩＰＬが予測される。
【０１０１】
比較例５は、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝１．５μM；選択性の比＝２３倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、より高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−５．９kJ mol−１）を有するため、境界ＤＩＰＬが予測される。
【０１０２】
比較例６は、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝０．３８μM；選択性の比＝５倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ＤＡＴでより強力（Ｋｉ＝５．９μM；選択性の比＝７４倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−８．４６kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１０３】
比較例７は、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝３．５７μM；選択性の比＝４３倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝０．７９μM；選択性の比＝９倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−７．４１kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１０４】
比較例８は、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝３．０１μM；選択性の比＝２８倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））である。
【０１０５】
比較例９は、ｈＴＡＡＲ１で効力が弱く（ＥＣ５０＝０．１４４μM）、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝１．１４μM；選択性の比＝８倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝０．４８μM；選択性の比＝３倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−８．８３kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１０６】
比較例１０は、ｈＴＡＡＲ１で効力が弱く（ＥＣ５０＝０．１８４μM）、ｈＥＲＧでより強力（ＩＣ２０＝５．７８μM；選択性の比＝３１倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））である。
【０１０７】
比較例１１は、ｈＴＡＡＲ１で効力が弱く（ＥＣ５０＝０．２０３μM）、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝２．５９μM；選択性の比＝１３倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝２．３３μM；選択性の比＝１２倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−６．１８kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１０８】
比較例１２は、ｈＴＡＡＲ１で効力が弱く（ＥＣ５０＝０．２１２μM）、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝３．２１μM；選択性の比＝１５倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝１．７８μM；選択性の比＝８倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−６．５９kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１０９】
比較例１３は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝０．４０５μM）、ｈＥＲＧでより強力（ＩＣ２０＝９．１４μM；選択性の比＝２３倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝１．３１μM；選択性の比＝３倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−６．２３kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１１０】
比較例１４は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝０．４４７μM）、ＤＡＴで有意により強力（Ｋｉ＝７．３２μM；選択性の比＝１６倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−６．９６kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１１１】
比較例１５は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝０．６６３μM）、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝２．４０μM；選択性の比＝４倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−７．４kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１１２】
比較例１６は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝０．６６６μM）、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝３．３５μM；選択性の比＝５倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、有意により高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−８．４８kJ mol−１）を有するため、陽性ＤＩＰＬが予測される。
【０１１３】
比較例１７は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝０．６７３μM）、ＤＡＴでより強力（Ｋｉ＝１０．３２μM；選択性の比＝１５倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））である。
【０１１４】
比較例１８は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝０．８２７μM）、また、より高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−５．８２kJ mol−１）を有するため、境界ＤＩＰＬが予測される。
【０１１５】
比較例１９は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝１．０２５μM）、ｈＥＲＧでより強力（ＩＣ２０＝８．３２μM；選択性の比＝８倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））である。
【０１１６】
最後に、比較例２０は、ｈＴＡＡＲ１で有意に効力が弱く（ＥＣ５０＝２．４８μM）、ｈＥＲＧで有意により強力（ＩＣ２０＝２．４９μM；選択性の比＝１倍（対ｈＴＡＡＲ１ ＥＣ５０））であり、また、より高い両親媒性ベクトル（ΔΔＧａｍ＝−５．３７kJ mol−１）を有するため、境界ＤＩＰＬが予測される。
【０１１７】
したがって、表１のデータの全てを考慮して、式Ｉで示される化合物（実施例１）は、ヒトにおけるＴＡＡＲ１関連障害を処置するための、特に、鬱病、不安障害、双極性障害、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、ストレス関連障害のような慢性ＣＮＳ障害、統合失調症のような精神障害、パーキンソン病のような神経疾患、アルツハイマー病のような神経変性障害、てんかん、片頭痛、緊張亢進、薬物乱用、中毒、並びに摂食障害、糖尿病、糖尿病合併症、肥満、脂質異常症のような代謝障害、エネルギーの消費及び同化の障害、体温恒常性の障害及び機能不全、睡眠及び概日リズムの障害、並びに心血管障害を治療するための、安全かつ有効な治療剤としての意図された使用のための全体的に最も好ましい化合物である。最も好ましい障害は、統合失調症、双極性障害又は鬱病である。
【０１１８】
式Ｉで示される化合物及び式Ｉで示される化合物の薬学的に許容し得る塩は、医薬として、例えば、医薬製剤の形態で使用することができる。医薬製剤は、例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠、硬及び軟ゼラチンカプセル剤、液剤、乳剤又は懸濁剤の形態で経口投与することができる。しかしながら、投与はまた、直腸内に（例えば、坐剤の形態で）又は非経口的に（例えば、注射液の形態で）達成され得る。
【０１１９】
式Ｉで示される化合物は、医薬製剤の製造のために薬学的に不活性な無機又は有機の担体と共に加工することができる。乳糖、トウモロコシデンプン又はそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩などは、例えば、錠剤、コーティング錠、糖衣錠及び硬ゼラチンカプセル剤のためのそのような担体として使用することができる。軟ゼラチンカプセル剤に好適な担体は、例えば、植物油、ロウ、脂肪、半固体及び液体ポリオールなどである。しかし、活性物質の性質に応じて、軟ゼラチンカプセル剤の場合には担体は通常必要とされない。液剤及びシロップ剤の製造に好適な担体は、例えば、水、ポリオール、グリセロール、植物油などである。坐剤に好適な担体は、例えば、天然油又は硬化油、ロウ、脂肪、半液体又は液体ポリオールなどである。
【０１２０】
医薬製剤は更に、保存料、可溶化剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味料、浸透圧を変えるための塩、緩衝剤、マスキング剤又は酸化防止剤を含有することができる。これらはまた、更に他の治療上有用な物質を含有することができる。
【０１２１】
式Ｉで示される化合物又はその薬学的に許容し得る塩と治療上不活性な担体とを含有する医薬もまた、それらを製造するためのプロセスであって、式Ｉで示される化合物及び／又は薬学的に許容し得る酸付加塩と、所望により、１種以上の他の治療上有用な物質とを、１種以上の治療的に不活性な担体と共にガレヌス投与形態にすることを含む、プロセスと同様に、本発明の１つの目的である。
【０１２２】
本発明による最も好ましい適応症は、中枢神経系の障害を含むもの、例えば、鬱病、統合失調症及び双極性障害の処置又は予防である。
【０１２３】
投薬量は、幅広い範囲内で変化させることができ、当然ながら、各特定の症例における個々の要求に合わせて適合させなければならない。経口投与の場合には、成人に対する投薬量は、一般式Ｉで示される化合物の約０．０１mg〜約１０００mg／日、又は薬学的に許容し得るその塩の対応する量まで変化させることができる。１日投薬量は、単回用量として、又は分割用量にして投与してもよく、更に、上限は、望ましいと分かった場合にはこれを超えることもできる。
【０１２４】
錠剤処方（湿式造粒）
項目 成分 mg／錠
１．式Ｉで示される化合物          ５      ２５    １００    ５００
２．乳糖無水物ＤＴＧ          １２５    １０５      ３０    １５０
３．Ｓｔａ−Ｒｘ １５００         ６        ６        ６      ３０
４．微結晶性セルロース          ３０      ３０      ３０    １５０
５．ステアリン酸マグネシウム      １        １        １        １
合計                      １６７ １６７ １６７ ８３１
【０１２５】
製造手順
１．項目１、２、３及び４を混合し、精製水と共に造粒する。
２．顆粒を５０℃で乾燥させる。
３．顆粒を好適な粉砕機器を通過させる。
４．項目５を加えて３分間混合し；好適な打錠機（press）で圧縮する。
【０１２６】
カプセル剤処方
項目 成分 mg/カプセル
１．式Ｉで示される化合物          ５      ２５    １００    ５００
２．乳糖水和物                １５９    １２３    １４８    −−−
３．トウモロコシデンプン        ２５      ３５      ４０      ７０
４．タルク                      １０      １５      １０      ２５
５．ステアリン酸マグネシウム      １        ２        ２        ５
合計                      ２００ ２００ ３００ ６００
【０１２７】
製造手順
１．項目１、２及び３を好適なミキサーで３０分間混合する。
２．項目４及び５を加えて３分間混合する。
３．好適なカプセルに充填する。
【国際調査報告】
2019512469.tif 000042
2019512469.tif 000043