(57)【要約】  本発明は、患者に由来する細胞試料中における正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を、フローサイトメトリーによって検出する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に由来する細胞試料中の正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を、フローサイトメトリーによって、検出する方法であって、前記方法が以下の工程：
ａ）前記細胞試料を以下：
−  κ鎖マーカー、λ鎖マーカー、及び以下：CD38マーカーとCD138マーカーとから選択されるマーカーであり、3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発するマーカー、並びに
−  1つ以上の腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）であり、これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が前記先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発するマーカー、並びに
−  1つ以上の正常な形質細胞 CDマーカー（複数可）であり、これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発するマーカー
と接触させること、
ｂ）以下：
−  CD38マーカー又はCD138マーカーについての陽性シグナル、及び
−  κ鎖マーカー又はλ鎖マーカーについての陽性シグナル
によって特徴づけられる形質細胞を検出すること、
ｃ）  工程ｂ）において検出された形質細胞の中から、以下の基準：
−  腫瘍性形質細胞に特異的な少なくとも1つのマーカーについての陽性シグナル、及び／又は
−  正常な形質細胞の少なくとも1つのマーカーについて、陰性若しくは有意に低下したシグナル
の少なくとも1つを有する、腫瘍性形質細胞を検出すること、
ｄ）  工程ｂ）及びｃ）において取得した結果を分析し、正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を決定すること
を含む、方法。
【請求項２】
以下：
−  本発明による方法の正常な形質細胞に特異的なCDが、以下：CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81、より選択的には、CD19、CD27から選択され、並びに
−  本発明による方法の腫瘍性形質細胞についての特異的なCDが、以下：CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28、より選択的には、CD56、CD117、CD200から選択されること
において特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記CD38マーカー又はCD138マーカーがそれぞれ、PE-Cy5.5蛍光色素にコンジュゲートした抗CD38抗体又は抗CD138抗体であり、前記κ鎖マーカーがPE-CF594蛍光色素にコンジュゲートした抗κ鎖抗体であり、前記λ鎖マーカーがFITC蛍光色素にコンジュゲートした抗λ鎖抗体である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
CD19及びCD27マーカーがPE-Cy7蛍光色素にコンジュゲートした抗CD19抗体及び抗CD27抗体であり、CD56、CD117及びCD200マーカーがPE蛍光色素にコンジュゲートした抗CD56抗体、抗CD117抗体及び抗CD200抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
Ａ．前記細胞試料を、使用した他のマーカーとは異なるシグナルを発する、1つ以上の細胞増殖マーカー（複数可）、選択的には、２つの細胞増殖マーカーと接触させること；
Ｂ．前記マーカー（複数可）により発せられたシグナルの分析によって、増殖している腫瘍性形質細胞を検出すること；
Ｃ．Ｓ期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること；
Ｄ．任意選択で、前記細胞増殖マーカー（複数可）の少なくとも1つがDNAマーカーである場合、2倍性 (G0/G1又はG2/M)を決定すること
を含み、腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定することも含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞試料が、骨髄、血液、血清、血液抽出液、PBMC、脳脊髄液、胸膜液及びリンパ節、選択的には、患者の骨髄の細胞から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
患者に由来する細胞試料を使用して、in vitroで単クローン性ガンマグロブリン血症を診断する又はモニターする方法であって、以下の工程：
１）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を実行すること、並びに
２）以下：
ａ）本発明の請求項に記載の方法の工程ｄ）の分析の結果に従って、総白血球細胞中の腫瘍性形質細胞の割合が、健常な対照被験者において本発明の請求項に記載の方法によって取得した結果に基づく所定の閾値を超えている場合、及び／又は
ｂ）単位体積毎の腫瘍性形質細胞数が所定の閾値を超えている場合
の単クローン性ガンマグロブリン血症を発症するリスクを実証すること
を含む、方法。
【請求項９】
患者に由来する第一及び第二の細胞試料を使用して、in vitroで単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている患者の疾患の進行をモニターする方法であって、以下の工程：
ｉ）患者に由来する第一の細胞試料において、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出方法を実行すること、
ｉｉ）前記第一の試料を取得した後に、前記第二の試料を取得し、患者に由来する第二の細胞試料中において、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出方法を実行すること、並びに
ｉｉｉ）第一及び第二の試料を用いて取得した工程ｄ）の分析の結果を比較すること、並びに
ｉｖ）工程iii)の分析結果に従って、前記患者の前記単クローン性ガンマグロブリン血症の進行をモニターすること
を含む、方法。
【請求項１０】
少なくとも以下：
−  各々異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
−  以下：CD38マーカー又はCD138マーカーから選択されるマーカー（前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞について特異的な1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞について特異的な1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発する）
を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を実行するための組成物の使用であって、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
−  以下：CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー（前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞についての1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発する）
を含む、組成物の使用。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキットであって、少なくとも以下：
−  各々異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
−  先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する、CD38マーカー又はCD138マーカー；並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞についての1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナルを発する）
を含む、キット。
【請求項１３】
以下：
−  BrdUのタイプの塩基類似体、及びAPCにコンジュゲートした抗BrdU抗体、若しくは、EdU、及び蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor（登録商標）647に結合したアジド；並びに／又は
−  活発な細胞周期のタンパク質についてのマーカー、例えば、蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor（登録商標）647にコンジュゲートした抗Ki67抗体；並びに／又は
−  デオキシリボ核酸 (DNA)マーカー、例えば、DAPI、PI若しくはHoechst色素(33342若しくは33258)等
から選択される、少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含むことにおいて特徴づけられるキットであって、
前記細胞増殖マーカー（複数可）の各々が、前記キット中に存在する他のマーカーによって発せられるシグナルとは異なる、特に先の5つのシグナルとは異なる、シグナルを発する、
請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性血友病における微小残存疾患を、診断する分野又は診断を補助する分野、及びモニターする分野に関するものであり、その主題は、腫瘍性形質細胞を検出する方法、並びに単クローン性のガンマグロブリン血症を診断する方法又は診断を補助する方法、及びモニターする方法である。
【０００２】
多発性骨髄腫 (MM)又はケーラー病は、骨髄中における腫瘍性形質細胞 (Bリンパ球)の蓄積、及び単クローン性の免疫グロブリン全体の蓄積又は単クローン性の軽鎖の蓄積によって特徴づけられる悪性血友病である。この病的状態によって、フランスにおいては年間2000人の新規患者、欧州においては19000人、及び米国においては19000人が侵されている。65歳以下の患者の平均余命の中央値は6〜7年である。MMの診断としては、骨の徴候、沈降速度の増加、単クローン性の免疫グロブリンの存在、及び以下：
−  ジストロフィー（dystrophy）形質細胞（正常な細胞質であるが、細胞学的な核の異常 (多核細胞、複数の又は異形の有糸分裂)）の存在；及び
−  形質細胞増殖症、即ち、10%超か若しくはそれと同等である形質細胞増殖症の存在（深刻でない基準）、又はある症例においては、30%超の形質細胞増殖症の存在（深刻である基準、重度の病的状態）
を示す骨髄像の使用が挙げられる。
【０００３】
全症例において、MMは良性の単クローン性のガンマグロブリン血症（MGUS（Monoclonal Gammopathy of Undeterminated Significance）は意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症に由来する）が先行する。MGUSは、60歳の被験者の2〜4%、70歳の被験者の10%、80歳の被験者の20%において検出される。MGUSの診断日とは独立して、年間1%程度が形質転換し、MGUSはMMに進行する。
【０００４】
MMは、年間のがんの新規症例の1%、悪性血友病の10〜15%に相当し、非ホジキンリンパ腫の次（2番目）に良く見られる悪性血友病である。更に、その治療に関連する費用は、その中でも最も高い。
【０００５】
最近の文献のデータによって、MMを患っている患者における腫瘍性及び正常な形質細胞の同定及び特徴づけによって、治療への応答の信頼できるマーカーが提供されることが示されている。San Miguel教授のグループによって、高用量の化学療法に続けて造血幹細胞の自家移植を行った3ヶ月後に、10000の総白血球細胞につき、1未満の腫瘍性形質細胞が存在する場合（10-4の感受性）、患者は有意に長く生存することが示された（Paivaら、2014）。腫瘍性形質細胞／正常な形質細胞の比は、通常の診断マーカーとは独立した予後因子である（Mateoら、2008）。フローサイトメトリーによって計算した腫瘍性形質細胞の増殖指標はまた、強力な予後因子でもある。それは、患者が活発な再発にあるか否かを評価するために決定的であり得る。S期の細胞のレベル（中央値）は、病気の個体においては1%であり（Paivaら、2012）、再発している患者において増加している。
【０００６】
更に、多発性骨髄腫における微小残存疾患 (MRD)は、治療後に残存している腫瘍細胞の持続性を示す。形質細胞は、骨髄中の細胞の5%までに相当し、MRDの存在は、500000の総白血球細胞につき少なくとも50細胞（即ち、細胞の0.01%）の腫瘍性形質細胞の存在によって定義される（Rawstronら、2013）。
【０００７】
患者の生存期間中央値は、治療なしでは7ヶ月であり、従来の化学療法による治療を行って3〜4年であり、高用量の化学療法及び自家移植を行って6〜7年である。従って、治療後にMRDをモニターすることはまた、なるべく早期に再発を検出するため、及び治療的処置を改善するためにも非常に重要である。
【０００８】
現時点では、MRDを検出するための様々な方法、例えば、「ディープシーケンシング」、特異的プライマーを用いた定量PCR (ポリメラーゼ連鎖反応)及びマルチパラメーターフローサイトメトリー (MFC)がある（Martinez-Lopezら、2014；Paivaら、2008）。最初の2つの方法は高い感受性がある；しかしながら、それらは非常に高価なままであり、時間がかかり、自動化が難しい。従って、現時点では、多色フローサイトメトリーが、早期での再発を検出するための、及び治療による利益／コスト比を最大化するために治療的処置を改善するための、患者の応答を評価する最も好適な方法である。
【０００９】
骨髄中には、ごく少量の正常な形質細胞が存在する（即ち、健常なドナーにおいては単核細胞の中央値は0.44%）と仮定すると、このことは、統計的誤差を最小にするために、多数の細胞イベントを捕捉しなければならないことを意味する。
【００１０】
現在、STI研究室によって設定された方法（Carauxら、2010、2012）では、臨床医に結果を提供するために、2日（即ち、16勤務時間）掛かる。更に、そのような方法は、少なくとも7色、7個の検出器、2つのレーザー及び5本のチューブを使用し、それゆえ、多くの高価な装置及び試薬を使用する。更に、そのような方法の使用は、データの準備、取得、コンペンセーション及び分析のために、サイトメトリーの専門家のノウハウを必要とする。
【００１１】
それゆえ、本疾患の進行を診断及びモニターするための新規の方法及び組成物を開発するという本当のニーズ、特に、腫瘍性形質細胞を検出するためのテストの感度及び信頼性を改善するという本当のニーズがある一方で、同時に多様な実験工程の費用及び複雑さを低減するという本当のニーズがある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】連続的なウィンドウ処理（windowing）による腫瘍性形質細胞の識別。
【図２−１】STI法に従った、連続的なウィンドウ処理による腫瘍性形質細胞の識別の図。
【図２−２】STI法に従った、連続的なウィンドウ処理による腫瘍性形質細胞の識別の図。
【図３】正常レベルのS期の形質細胞を有する多発性骨髄腫を患っている患者に由来する試料を用いて、BrdU及びDAPI、又はKi67及びDAPIの使用による、正常及び腫瘍性形質細胞の増殖のモニタリング。
【図４】高レベルのS期の形質細胞を有する多発性骨髄腫を患っている患者に由来する試料を用いて、BrdU及びDAPI、又はKi67及びDAPIの使用による、正常及び腫瘍性形質細胞の増殖のモニタリング。
【図５】DAPI及びEdUの使用による、S期の腫瘍細胞のパーセンテージの決定。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明者等は、非常に高い感度、再現性及び信頼性を有する、腫瘍性形質細胞を検出する方法を開発した。
腫瘍性及び正常な形質細胞マーカーの特定の組合せの使用によって、本発明による方法は、先行技術において既に公知である検出方法を使用して取得したものと少なくとも同等である、正常な及び腫瘍性形質細胞の検出の結果を取得することを可能にする。
【００１４】
先行技術の方法と比較して、本発明による方法は、分析される試料及び様々なマーカーを含む、例えば、チューブ又はウェルを有するプレートのウェル等の単一の容器中で実行することができる利点を有する。特に、このことは、より安価である、多様な実験工程の時間及び複雑さを低減できる、並びに結果を取得する際の遅延を低減できる利点を有する。従って、本発明による方法は、能力のある人員の必要性とそれに伴うエラーのリスクを低減することができ、従って、同時に、方法の信頼性を向上させることができる。更に、本発明による方法の多様な実験工程についての複雑さを低減することで、再現性を改善し、生産性を高めることができる。
【００１５】
本発明の主題は、患者に由来する細胞試料中の正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を、フローサイトメトリーによって検出する方法であって、前記方法が以下の工程：
a) 前記細胞試料を以下：
−  κ鎖マーカー、λ鎖マーカー及び以下：CD38マーカーとCD138マーカーとから選択されるマーカー（3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発する、以下においては、「先の3つのシグナル」）、並びに
−  先の3つのシグナルとは異なる、1つ以上の腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する、以下においては、「第4の」シグナル）、並びに
−  先の4つのシグナルとは異なる、1つ以上の正常な形質細胞マーカー（複数可）（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する、以下においては、「第5のシグナル」）
と接触させること、
b) 以下：
−  CD38マーカー又はCD138マーカーについての陽性シグナル、特に強い陽性シグナル、及び
−  κ鎖マーカー又はλ鎖マーカーについての陽性シグナル、特に強い陽性シグナル
によって特徴づけられる形質細胞を検出すること、
c) 工程b)において検出された形質細胞から、以下の基準：
−  腫瘍性形質細胞に特異的な少なくとも1つのマーカーについての陽性シグナル、及び／又は
−  正常な形質細胞の少なくとも1つのマーカーについての陰性か若しくは有意に低下したシグナル
の少なくとも1つを有する、腫瘍性形質細胞を検出すること（他の形質細胞が正常とみなされる）、並びに
d) 工程b)及びc)の間に取得した結果を分析し、正常な形質細胞と腫瘍性形質細胞とを定量すること
を含む、方法である。
【００１６】
他の実施形態に従って、CD38及びCD138マーカーのそれぞれの代わりに、以下：CD229マーカー、CD54マーカー、CD319マーカー(Pojeroら、Utility of CD54、CD229、and CD319 for the identification of Plasma Cells in Patients with Clonal Plasma Cell Diseases)、CD319マーカー又はCD269マーカー (Frigyesiら、Blood. 2014 Feb 27；123(9)：1336-40. doi：10.1182/blood-2013-09-529800)からなる群から選択される、1つ以上のマーカーの使用がなされ得る。細胞質内の（intracytoplasmid）マーカーである、MUM1/IRF4マーカーについても言及され得る。
【００１７】
上述のマーカーを、個別に、CD38及びCD138マーカーのそれぞれの代わりとして、又はそれらとの組合せ及び／若しくは特にCD38との組合せで、使用し得る。
従って、例えば、κ鎖マーカー、λ鎖マーカー及びCD229マーカーを使用し得る。
【００１８】
そのことは、本発明によるCDマーカー（複数可）、共通する発現の差異（減少又は消失、それに対して、増加又は獲得）を有する1つの同じグループのマーカーが、1つの同じ蛍光色素又は発色団に結合（coupled）又はコンジュゲート（conjugated）していることが、以下に記載される発明を説明している詳細な説明及び実施例の残りの部分から理解される。
【００１９】
本発明に従って、まず、工程a)の腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）は、それが先の3つのシグナルとは異なる、1つの同じシグナル、換言すれば、先の3つのシグナルとは異なる、共通のシグナル又は「単一で検出可能なシグナル」であるという意味において、先の3つのシグナルとは異なる（第四の）シグナルを発する。
【００２０】
発明に従って、用語「1つの同じシグナル」又は「単一で検出可能なシグナル」は、それらが、検出器によって認識される、共通のシグナルを発するという点で、腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）が特徴づけられるということを意味するものとして意図される。
【００２１】
好ましい一実施形態に従って、先の3つのシグナルとは異なる、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発するように、前記腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）が同じ蛍光色素に結合又はコンジュゲートされる。
【００２２】
代替的な一形態に従って、前記腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）は、先の3つのシグナルとは異なる、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）に近いか、同等であるか、又は可能性のある周波帯で、好適な周波数の検出器によって、検出され得るシグナル（前記単一の検出可能なシグナル）を発する蛍光色素に結合又はコンジュゲートされる。
【００２３】
次に、本発明に従って、工程a)の正常な形質細胞マーカー（複数可）は、それが先の4つのシグナルとは異なる1つの同じシグナル、換言すれば、先の4つのシグナルとは異なる共通のシグナル又は「単一で検出可能なシグナル」であるという意味において、先の4つのシグナルとは異なる（第五の）シグナルを発する。
【００２４】
発明に従って、用語「1つの同じシグナル」又は「単一で検出可能なシグナル」は、それらが検出器によって認識される共通のシグナルを発するということにおいて、正常な形質細胞マーカー（複数可）が特徴づけられることを意味することを意図する。
【００２５】
好ましい一実施形態に従って、先の4つのシグナルとは異なる、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発するように、正常な形質細胞マーカー（複数可）が同じ蛍光色素に結合又はコンジュゲートされる。
【００２６】
代替的な一形態に従って、前記正常な形質細胞マーカー（複数可）は、先の4つのシグナルとは異なる、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）に近いか、同等であるか、又は可能性のある周波帯で、好適な周波数の検出器によって、検出され得るシグナル（先の4つのシグナルとは異なる前記単一の検出可能なシグナル）を発する蛍光色素に結合又はコンジュゲートされる。
【００２７】
共通する発現の差異（減少又は消失、それに対して、増加又は獲得）を有する1つの同じグループのマーカーについての1つの同じシグナルの検出は、有利に、蛍光色素及び／又は検出可能なシグナルの数を減らすことができ、それゆえ、迅速（より少ないデータファイルで）かつ簡便な分析のために、本発明による検出方法において、検出器及びソースの数を減らすことができる。
【００２８】
選択的には、本発明による形質細胞マーカーは、形質細胞の抗原マーカー、選択的には、形質細胞の分化抗原群 (CD)マーカーである。
【００２９】
用語「マーカー」は、標的の認識、及び検出可能なシグナルの発光によるそれらの検出を可能にする任意の分子（複数可）を意味することを意図する。有利には、ペプチド配列の標識のためには、本発明によるマーカーは、蛍光色素にコンジュゲートしたアプタマー又は抗体であり、選択的には、蛍光色素は、PE-Cy5.5、PE-CF594、PE-Cy7、PE、APC及びFITCから選択される。代替的には、DNAの標識のためには、本発明によるマーカーはまた、塩基の類似体であり得、それらがDNAに結合又はインターカレーションする場合、又はDNAに結合若しくはインターカレーションし得る蛍光色素にコンジュゲートした分子（例えば、抗体）に結合する場合、自家蛍光分子（例えば、DAPI；約456 nmで青色蛍光）であり得る。有利には、本発明に従って、腫瘍性形質細胞マーカー（複数可）は、他のシグナルとは異なる、1つの同じシグナルの発光のための1つの同じ蛍光色素 (発色団)にコンジュゲートされる。更に、正常な形質細胞マーカー（複数可）は、他のシグナルとは異なる、1つの同じシグナルの発光のための別の蛍光色素 (発色団)にコンジュゲートされる。
【００３０】
これによって、共通する発現の差異（減少又は消失、それに対して、増加又は獲得）を有するマーカーのグループ毎に、1つの同じシグナルを取得することが可能となり、それにより該方法が簡略になり、有利には、単一の容器中で行わせることが可能となる。
【００３１】
従って、発明によるマーカーによって発せられたシグナルの量は、マーカー／標的の複合体の量にリンクし、それゆえ、ペプチド配列の発現レベル及び／又は標的のDNAの量にリンクする。
【００３２】
用語「シグナル」は、透過（transmission）後に、このシグナルを回収することを可能にする特性を有する、任意の発せられたシグナルを意味することを意図している。これらの特性は、例えば、周波数（frequencies）、変調（modulations）、符号化（encodings）であり得る。選択的には、検出可能なシグナルは、それらが割り当てられた周波数帯で発せられ、より選択的には、光の透過における可視スペクトラムの色で発せられる。従って、近い周波数帯において異なる検出可能なシグナルを発する、様々なマーカーが1つの同じ検出器によって検出され得るか、又は1つの同じ単一の検出可能なシグナルを発する異なるマーカーが1つの同じ検出器によって検出され得る。
【００３３】
特定の好ましい一実施形態に従って、他のシグナルとは異なる、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する1つ以上のマーカーの、又は共通する発現の差異（減少又は消失、それに対して、増加又は獲得）を有する1つの同じグループのマーカーの、本発明による使用がなされる。従って、1つの同じ蛍光色素（one or the same）(発色団)は、単一のシグナルの発光を与えるように、共通する発現の差異（減少又は消失、それに対して、増加又は獲得）を有するマーカーの各グループに対応する。
【００３４】
用語「検出器」は、その他の中から検出可能なシグナルの1つを回収すること（それらの検出及び／又はそれらの定量）を可能にする任意のシステム／装置を意味することが意図される。選択的には、検出器は、それが検出するシグナルを単離するためのフィルターを使用する。より選択的には、このフィルターは、バンドパス型（band-pass type）である。選択的には、検出及び／又は定量は、光／電子変換器、例えば、フォトダイオード（photodiodes）、アバランシェフォトダイオード（avalanche photodiodes）、光電子増倍管（photomultipliers）（PMT）によって行われる。
【００３５】
用語「正常な形質細胞」は、CD19、CD27、CD38、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99、CD138、CD163から選択される(分化抗原群；CD) 抗原を有し、CD20、CD28、CD52、CD56、CD117及びCD200抗原を有しない、形質（plasma）細胞、形質（plasmatic）細胞又は形質細胞（plasmatocytes）を意味することが意図される。正常な形質細胞は、細胞質内にあるカッパ鎖又はラムダ鎖を、それぞれ2/3及び1/3の割合で示す。
【００３６】
用語「腫瘍性形質細胞」は、正常なプロファイルに対して、少なくとも1つの改変：
−  CD19、CD27、CD45、CD52及びCD81の中で少なくとも1つのCDの消失、
−  CD20、CD28、CD56、CD117、CD200及びCD229の中で少なくとも1つのCDの獲得、
−  腫瘍性形質細胞中で過少に発現するCD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99、CD138及びCD163、腫瘍性形質細胞中で過剰に発現するCD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD138、CD300a及びCD320の中で少なくとも1つのCDの発現レベルの変更、並びに／又は
−  カッパ／ラムダ比 (単クローン性)の改変
を有する、形質（plasma）細胞、形質（plasmatic）細胞又は形質細胞（plasmatocytes）を意味することが意図される。
【００３７】
本発明による表現「陽性シグナル」は、使用した形質細胞特異的マーカーがそれらの標的に結合し、検出可能なシグナルを有意に発する場合に、シグナルが陽性とされることを意味する。従って、「陽性シグナル」は、本発明による方法の工程b)において検出された形質細胞（複数可）では、使用したマーカー（複数可）によって認識された分子の発現のレベルが、検出された形質細胞（複数可）によって、有意に増加していることを示す。「CD」マーカーの陽性シグナルは、通常、検出された前記マーカーの発現レベルに依存して、「CD+」、又は「CDlow又はdim」、「CDmid又はintermediate」若しくは「CDhigh又はbright」という用語によって表現される。また、low若しくはdim、mid若しくはintermediate、又はhigh若しくはbright陽性シグナルとしても言及される。
【００３８】
マトリクス上で観察された蛍光強度、例えば、以下の実施例において記載されたもの等のx軸上の測定された蛍光強度は、通常、以下の記載方法に従って、以下の強度のオーダー（10倍単位）により分類される：
102未満：陰性シグナル、又は「−」；
102〜103：low若しくはdim陽性シグナル、又は「+/-」；
103〜104：mid若しくはintermediate陽性シグナル、又は「+」；
104超：high若しくはbright陽性シグナル、又は「++」。
【００３９】
発明に従って、以下の実施例及び図において記載されている通り、特に、本発明による検出方法の工程b)における腫瘍性形質細胞の検出のためのhigh陽性シグナルについての検出に焦点が当てられる。（総）形質細胞を検出する工程b)は、以下：CD38マーカー又はCD138マーカーについてのhigh陽性シグナル、κ鎖マーカー又はλ鎖マーカーについてのhigh陽性シグナルによって特徴づけられる。これはまた、CD38++／κ++若しくはCD138++／λ++、又は、例えば、CD38high／κhigh若しくはCD138high／λhighという用語によっても表現される場合がある。CD38又はCD138マーカー、及びκ鎖マーカー又はλ鎖マーカーを過剰発現している（総）形質細胞のhigh陽性シグナルを検出する、この工程b)は、例えばBリンパ球等の他の細胞型を排除することを目的とする、追加の工程を省くことができるという利点がある。従って、本発明による検出方法は、現行の検出方法と比較して、簡略化されている。
【００４０】
用語「陰性シグナル」は、使用した形質細胞特異的マーカーが、それらの標的に結合しないか、又は弱く結合し、それゆえ、検出可能なシグナルを有意に発しない場合、シグナルを陰性とすることを意味することが意図される。従って、これらの特異的マーカーの「陰性シグナル」は、本発明による方法の工程b)において検出された形質細胞（複数可）が、使用したマーカー（複数可）によって認識された分子が陰性であるか、又はその発現レベルが有意に低下していることを示す。「CD」マーカーについての陰性シグナルは、通常、「CD」と表される。
【００４１】
選択的には、本発明による方法に使用した細胞試料は、骨髄、血液、血清、血液抽出液、PBMC (末梢血単核細胞)、脳脊髄液、胸膜液及びリンパ節、選択的には、患者の骨髄から選択されるか、又は取得される。
【００４２】
特定の一実施形態に従って、本発明による方法の細胞試料は、単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている患者に由来するか、又は単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている可能性のある個人に由来する。
【００４３】
好ましい一実施形態に従って、本発明による方法の正常な形質細胞に特異的であるCDは、以下：CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81、より選択的には、CD19、CD27から選択される。
【００４４】
好ましい一実施形態に従って、発明による方法の腫瘍性（tumurol）形質細胞に特異的であるCDは、以下：CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28、より選択的には、CD56、CD117、CD200から選択される。
【００４５】
選択的には、本発明による方法はまた、FSC (前方散乱)及びSSC (側方散乱)のシグナルを分析することも含む。FSC及びSSCは、フローサイトメトリーによって行った同時の測定に対応しており、それにより単離された細胞の物理的及び生物学的特徴を決定することが可能となる。定義により、FSCは、軸（角度＜12°）において散乱された励起源からの光の強度に対応し、それは細胞の大きさに比例する一方で、SSCは、入射光源に対して直交して（いわゆる「広角」（90°に近い））散乱する光の強度に対応し、それは細胞内の複雑さを表している。
【００４６】
好ましい一実施形態に従って、本発明による方法の試料は、以下：
−  κ鎖マーカー、λ鎖マーカー、及びCD38又はCD138、選択的には、CD38マーカー（3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される、正常な形質細胞の1つ以上のマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）、並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される、腫瘍性形質細胞の1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
と接触させる。
【００４７】
発明の特定の一実施形態に従って、本発明による方法の試料は、以下：
(i)10個未満のマーカー、特に9つ以下のマーカー、又は更に8つ以下のマーカー、又は更に7つ以下のマーカー、又は更に6つ以下のマーカーのマーカー数で、以下：
・κ鎖マーカーと、λ鎖マーカーと、CD38又はCD138マーカーとを有する総形質細胞の少なくとも3つのマーカー、及び
・正常な形質細胞の少なくとも1つのマーカー、及び
・腫瘍性形質細胞の少なくとも1つのマーカー、及び
・任意選択で、少なくとも1つの細胞増殖マーカー、
を含み、並びに
(ii)8つ未満の蛍光色素、又は7つ以下の蛍光色素、又は更に6つ以下の蛍光色素、又は更に5つ以下の蛍光色素の数で、以下：
・総形質細胞のマーカーの3つの蛍光色素、及び
・正常な形質細胞のマーカー（複数可）の前記蛍光色素とは異なる蛍光色素、及び
・腫瘍性形質細胞のマーカー（複数可）の蛍光色素、及び
・任意選択で、細胞増殖マーカー（複数可）の蛍光色素
を含むマーカー、
と接触させる。
【００４８】
発明の特定の好ましい一実施形態に従って、本発明による方法は、分析される試料及び様々なマーカーを含む、例えば、チューブ又はウェルを有するプレートのウェル等の単一の容器内で行われる。好ましくは、本発明による方法はチューブ内で行われる。
【００４９】
選択的には、本発明による方法の試料は、以下：
−  κ鎖マーカー、λ鎖マーカー及びCD38マーカー（3つのマーカーの各々が異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD19マーカー及びCD27マーカー（前記先の3つのシグナルとは異なる、シグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）、並びに
−  CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカー（先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
と接触させる。
【００５０】
選択的には、CD38又はCD138マーカーはそれぞれ、PE-Cy5.5蛍光色素にコンジュゲートした抗CD38抗体又は抗CD138抗体であり、κ鎖マーカーはPE-CF594蛍光色素にコンジュゲートした抗κ抗体であり、λ鎖マーカーはFITC蛍光色素にコンジュゲートした抗λ鎖抗体であり；検出は、先行技術に従って、適切なフローサイトメトリー検出器上で行われる。
【００５１】
有利には、CD19及びCD27マーカーはPE-Cy7蛍光色素にコンジュゲートした抗CD19抗体及び抗CD27抗体であり、CD56、CD117及びCD200マーカーはPE蛍光色素にコンジュゲートした抗CD56抗体、抗CD117抗体及び抗CD200抗体であり；検出は、先行技術に従って、適切なフローサイトメトリーの検出器上で行われる。
【００５２】
更に、上記の通り、腫瘍性形質細胞の増殖指標は、フローサイトメトリーによって計算した、S期にある腫瘍細胞のパーセンテージに対応し、強力な予後因子であり、それにより腫瘍量の発達の速度を評価し、患者が活発な再発状態にあるのか否かを決定することができる。
【００５３】
従って、好ましい一実施形態に従って、本発明による方法はまた、以下の工程：
A．前記細胞試料を、使用した他のマーカーとは異なるシグナルを発する、1つ以上の細胞増殖マーカー（複数可）、選択的には、2つの細胞増殖マーカーと接触させること；
B．前記マーカー（複数可）により発せられたシグナルの分析によって、増殖している腫瘍性形質細胞を検出すること；
C．S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること；
D．任意選択で、前記細胞増殖マーカー（複数可）の少なくとも1つがDNAマーカーである場合、2倍性 (G0/G1又はG2/M)を決定すること
を含む、腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定することも含む。
【００５４】
用語「増殖マーカー」は、細胞がG0/G1、G2/M又はSの細胞周期にあるかを決定することを可能にする任意のマーカーを意味することが意図される。例えば、増殖マーカーは、以下：
−  S期の細胞を特定することを可能にする増殖マーカー、例えばBrdU又はEdUのタイプの塩基類似体等
−  G0期の細胞 (静止細胞)又はG1/S/G2/M期の細胞 (非静止細胞)を特定することを可能にする増殖マーカー、例、例えばKi67等のタンパク質のマーカー(Dako)
−  G0/G1期又はG2/M期の細胞を特定することを可能にする増殖マーカー、例、例えばアクリジンオレンジ、DAPI、ヨウ化プロピジウム (PI)、又はHoechst色素 (33342若しくは33258)等のデオキシリボ核酸 (DNA)マーカー
から選択される。
【００５５】
特定の好ましい一実施形態に従って、S期の細胞を特定することを可能にする少なくとも1つの増殖マーカー、例えばBrdU又はEdUのタイプの塩基類似体等、好ましくは、BrdUのタイプの使用がなされる。
【００５６】
特定の一実施形態に従って、本発明による方法の腫瘍性形質細胞の増殖のマーカーは以下：
−  アロフィコシアニン（APC）にコンジュゲートした抗BrdU抗体によって認識される、BrdUのタイプの塩基類似体、若しくは蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor（登録商標）647に結合したアジドによって認識されるエチニルデオキシウリジン（EdU）；及び／又は
−  活発な細胞周期において存在するタンパク質、例えば、蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor 647にコンジュゲートした抗Ki67抗体によって認識されるKi67；及び／又は
−  例えば、DAPI、PI、Hoechst色素 (33342若しくは33258)等のデオキシリボ核酸 (DNA)マーカー等
から選択される。
【００５７】
用語「BrdU」(BrdU FlowKit；BD Pharmingen)は、チミジンの構造類似体である合成ヌクレオシドとして定義され、DNAに取り込まれ得、それは細胞の細胞周期の時期、特に、前記細胞がDNA複製期 (S期)にあるかどうかを決定するための特異的抗体によって検出することができる。用語「EdU」(Click-iT（登録商標）EdU；Thermofisher)は、複製の間にDNAに取り込まれる合成ヌクレオシド (チミジンの構造類似体)として定義される。EdUのエチニルフラグメントのアルキンと、蛍光色素に結合したアジドとの間の結合は、クリックケミストリー（click-chemistry）で最も一般的なライゲーション反応の1つである、環化付加反応により行われる。次いで、目的の細胞がDNA複製期 (S期)にあるかどうかを決定するために、それがDNAに取り込まれる場合に、EdUは検出され得る。
【００５８】
有利には、本発明による、腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定する方法は、以下の工程：
A1．ブロモデオキシウリジン (BrdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って；BrdU FlowKit；BD Pharmingen；カタログ：557892)；
B1．デオキシリボヌクレアーゼ (DNase、BrdU FlowKit；BD Pharmingen；カタログ：557892)の作用によって、DNAを変性させること；
C1．使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素にコンジュゲートした抗BrdU抗体を用いて、DNAに取り込まれたBrdUを標識すること（選択的には、前記蛍光色素はAPCである）；
D1．フローサイトメトリーによって、前記BrdUを用いて標識した前記細胞を検出すること；
E1．S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること
を含む。
【００５９】
選択的には、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定する方法は、以下の工程：
A2．エチニルデオキシウリジン (EdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って；Click-it（登録商標）Plus EdU Alexa Fluor（登録商標）647フローサイトメトリーアッセイキット、Life Technologies、カタログ：C10635)；
B2．使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素を用いて、EdUを標識すること（選択的には、前記蛍光色素はAlexa Fluor（登録商標）647である）；
C2．フローサイトメトリーによって、前記EdUを用いて標識した前記細胞を検出すること；
D2．S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞のパーセンテージを決定すること
を含む。
【００６０】
選択的には、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定する方法はまた、工程C1とD1との間、又はB2とC2との間に、DAPIを添加することからなる、2倍性を評価する追加の工程も含む。
【００６１】
選択的には、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定する方法は、以下の工程：
A3．ブロモデオキシウリジン (BrdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って；BrdU FlowKit；BD Pharmingen；カタログ：557892)；
B3．デオキシリボヌクレアーゼ (DNase、BrdU FlowKit；BD Pharmingen；カタログ：557892)の作用によって、DNAを変性させること；
C3．使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素にコンジュゲートした抗BrdU抗体を結合させることによって、DNAに取り込まれたBrdUを標識すること（選択的には、前記蛍光色素はAPCである）；
D3．DAPIを細胞試料と接触させること；
E3．フローサイトメトリーによって、前記BrdU及びDAPIを用いて標識した前記細胞を検出すること；
F3．S期にある腫瘍細胞及び正常な形質細胞の2倍性及びパーセンテージを決定すること
を含む。
【００６２】
選択的には、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖指標を決定する方法は、以下の工程：
A4．エチニルデオキシウリジン (EdU)を細胞試料と接触させること (供給者の推奨に従って；Click-it（登録商標）Plus EdU Alexa Fluor（登録商標）647フローサイトメトリーアッセイキット、Life Technologies、カタログ：C10635)；
B4．使用した他のマーカーのシグナルとは異なるシグナルを発する蛍光色素を用いて、EdUを標識すること（選択的には、前記蛍光色素はAlexa Fluor（登録商標）647である）；
C4．DAPIを細胞試料と接触させること；
D4．フローサイトメトリーによって、前記EdU及びDAPIを用いて標識した前記細胞を検出すること；
E4．腫瘍細胞及び正常な形質細胞の2倍性を決定すること
を含む。
【００６３】
他の白血球に対する腫瘍性形質細胞の割合は、細胞環境を描写するが、この割合は他の白血球集団の変動によって影響を受ける。
【００６４】
腫瘍細胞の定量によって、その一部として、腫瘍量が評価される。この定量は、既知の体積の試料に既知の量で導入された、例えば、蛍光ポリスチレンビーズ等 (例えば、Coulter、FlowCyto Standard Corporation、Polysciences、Sperotech、BD TrueCounts、DakoCytomation等によって販売されている)の計数用の粒子を使用して、フローサイトメトリーによって、既知の体積を分析することによってか、あるいは定量された集団（例えば、自動化された計数装置によって取得した試料の総白血球数）に対する腫瘍性形質細胞の割合によって間接的に、なされ得る。
【００６５】
従って、特定の一実施形態に従って、本発明による患者に由来する細胞試料中の正常な形質細胞及び腫瘍性形質細胞の存在を、フローサイトメトリーによって、検出する方法はまた、以下：
−  単位体積毎に、細胞集団の量又は細胞集団のグループを、決定又は受容する工程；
−  定量された集団又は集団のグループに対する、形質細胞集団の割合を決定すること；
−  単位体積毎に、形質細胞集団を定量すること
を含む。
【００６６】
表現「集団の量を受容すること」は、分析されるか、又は既に分析された試料中に存在する細胞の量(例えば：白血球の定量)に関する情報をシステムに提供することを可能にする動作を意味することが意図される。例えば、この動作は、コンピュータからの転送、又はオペレータによる入力からなる。
【００６７】
特定の一実施形態に従って、前記患者は、単位体積毎の腫瘍性形質細胞数が所定の閾値よりも大きい場合、単クローン性ガンマグロブリン血症を発症するリスクがあるとみなされる。この「所定の閾値」は、健常及び／又は体調不良の対照被験者から、本発明による方法によって取得した結果から決定される。本発明の特定の一実施形態に従って、本発明による所定の閾値はパラメーター設定可能である。
【００６８】
本発明の主題はまた、患者に由来する細胞試料を使用して、in vitroで単クローン性ガンマグロブリン血症を診断する方法若しくは診断を補助する方法、又はモニターする方法であって、以下の工程：
1）本発明による方法を実行すること、並びに
2）以下：
a）本発明による方法の工程d)の分析の結果に従って、総白血球細胞中の腫瘍性形質細胞の割合が、所定の閾値を超える場合；及び／又は
b）単位体積毎の腫瘍性形質細胞数が所定の閾値を超える場合
の単クローン性ガンマグロブリン血症を発症するリスクを実証すること
を含む、方法である。
【００６９】
本発明の主題はまた、患者の細胞試料を使用して、in vitroで単クローン性ガンマグロブリン血症を診断する方法、又は診断を補助する方法であって、本発明による工程1)及び2)が自動化されている、方法である。
【００７０】
本発明の主題はまた、患者に由来する第一及び第二の細胞試料を使用して、in vitroで、単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている患者の疾患の進行をモニターする方法であって、以下の工程：
i）患者に由来する第一の細胞試料において、本発明による検出方法を実行すること、
ii）患者に由来する第二の細胞試料において、本発明による検出方法を実行すること（前記第一の試料を取得した後に、前記第二の試料が取得されている）、並びに
iii）第一及び第二の試料を用いて取得した、工程d)の結果の分析を比較すること、並びに
iv）工程iii)の分析結果に従って、前記患者の前記単クローン性ガンマグロブリン血症の進行 (腫瘍量、増殖、単クローン性等)をモニターすること
を含む、方法である。
【００７１】
本発明の主題はまた、患者に由来する第一及び第二の細胞試料を使用して、in vitroで、単クローン性ガンマグロブリン血症を患っている患者の疾患の進行をモニターする方法であって、工程i)、ii)、iii)及びiv)が自動化されていることを特徴とする、方法である。
【００７２】
本発明はまた、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー、並びに
−  以下：CD38マーカー又はCD138マーカーから選択されるマーカー（前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する）、並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される、正常な形質細胞に特異的である、1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する））、並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される、腫瘍性形質細胞に特異的である、1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
を含む、組成物にも関する。
【００７３】
有利には、本発明による組成物は、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー；並びに
−  以下：CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー（前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する）；並びに
−  CD19マーカー及びCD27マーカー（前記マーカーが、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）；並びに
−  CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカー（前記マーカーが、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
を含む。
【００７４】
有利な一実施形態に従って、本発明による組成物はまた、前記組成物中に存在する他のマーカーのシグナルの各々とは異なるシグナルを発する、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖についての1つ以上のマーカー（複数可）も含む。
【００７５】
本発明の主題はまた、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー；並びに
−  以下：CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー（前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する）；並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される、正常な形質細胞についての1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）；並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカー（複数可）の各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
を含む、本発明による方法を実施するための組成物の使用である。
【００７６】
有利には、本発明の主題は、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー；並びに
−  以下：CD38マーカー及びCD138マーカーから選択されるマーカー（前記マーカーが、先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する）；並びに
−  CD19マーカー及びCD27マーカー（前記マーカーが、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）；並びに
−  CD56マーカー、CD117マーカー、CD200マーカー（前記マーカーが、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
を含む；本発明による方法を実施するための、組成物の使用である。
【００７７】
特定の一実施形態に従って、本発明による組成物の使用はまた、前記組成物中に存在する他のマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖についての1つ以上のマーカーも含む。
【００７８】
本発明の主題はまた、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー；並びに
−  先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する、CD38マーカー又はCD138マーカー；並びに
−  CD19、CD27、CD45、CD81、CD5L、CD11a、CD16b、CD24、CD36、CD52、CD68、CD79a、CD80、CD82、CD84、CD99及びCD163マーカー、選択的には、CD19、CD27、CD45及びCD81マーカー、より選択的には、CD19マーカー及びCD27マーカーから選択される正常な形質細胞についての、1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカーの各々が、先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）；並びに
−  CD56、CD117、CD200、CD20、CD28、CD1D、CD2BP2、CD32c、CD47、CD59、CD109、CD229、CD300a及びCD320マーカー、選択的には、CD56、CD117、CD200、CD20及びCD28マーカー、より選択的には、CD56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカーから選択される腫瘍性形質細胞についての、1つ以上のCDマーカー（複数可）、選択的には、少なくとも2つのCDマーカー、より選択的には、少なくとも3つのCDマーカー（これらの1つ以上のマーカーの各々が、先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）；
を含む、本発明による方法を実行するためのキットである。
【００７９】
好ましい一実施形態に従って、本発明による方法を実施するためのキットは、少なくとも以下：
−  異なるシグナルを発する、κ鎖マーカー及びλ鎖マーカー；並びに
−  先の2つのシグナルとは異なるシグナルを発する、CD38マーカー又はCD138マーカー；並びに
−  CD19マーカー及びCD27マーカー（先の3つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）；並びに
−  D56マーカー、CD117マーカー及びCD200マーカー（先の4つのシグナルとは異なるシグナル、特に、1つの同じシグナル（別名「単一で検出可能なシグナル」として知られる）を発する）
を含む。
【００８０】
特定の一実施形態に従って、本発明によるキットはまた、前記キット中に存在する他のマーカーの各々とは異なるシグナルを発する、本発明による腫瘍性形質細胞の増殖についての1つ以上のマーカーも含む。
【００８１】
有利には、本発明によるキットはまた、以下：
−  BrdUのタイプの塩基類似体、及びAPCにコンジュゲートした抗BrdU抗体、若しくは、EdU、及び蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor（登録商標）647に結合したアジド；並びに／又は
−  活発な細胞周期中に存在するタンパク質、例えば、蛍光色素、選択的にはAlexa Fluor 647にコンジュゲートした抗Ki67抗体によって認識されるKi67についてのマーカー；並びに／又は
−  例えば、DAPI、PI、Hoechst色素 (33342若しくは33258)等のデオキシリボ核酸 (DNA)マーカー
から選択される、少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含み、
前記細胞増殖マーカー（複数可）の各々が、前記キット中に存在する他のマーカーによって発せられるシグナルとは異なる、特に先の5つのシグナルとは異なるシグナルを発する。
【００８２】
優先的な一実施形態に従って、本発明によるキットは、以下：
−  ブロモデオキシウリジン (BrdU)塩基類似体；
−  デオキシリボヌクレアーゼ (DNase、BrdU FlowKit；BD Pharmingen；カタログ：557892)；
−  蛍光色素にコンジュゲートした抗BrdU抗体を含むマーカー（前記キット中に存在するマーカーによって発せられる他のシグナルとは異なるシグナルを発する）；
−  任意選択で、DAPI（前記キット中に存在する他のマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する）
から選択される少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含むという点において特徴づけられる（前記細胞増殖マーカー（複数可）の各々が、前記キット中に存在するマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する）。
【００８３】
優先的な一実施形態に従って、本発明によるキットは、それが以下：
−  エチニルデオキシウリジン (EdU)塩基類似体；
−  蛍光色素に結合したアジド（前記キット中に存在するマーカーによって発せられる他のシグナルの各々とは異なるシグナルを発する）；
−  任意選択で、DAPI（前記キット中に存在するマーカーの各々のシグナルとは異なるシグナルを発する）
から選択される少なくとも1つの細胞増殖マーカーを含むという点において特徴づけられる。
【００８４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例及び図中において明らかにされる：
【実施例】
【００８５】
実施例1：MMを患っている患者における腫瘍性及び正常な形質細胞の検出
本ストラテジーの原理は、それらのサイズ、それらの構造の複雑性及び細胞マーカーの存在、又は蛍光色素に結合した抗体によって認識される抗原によって、目的の細胞を識別することである。形質細胞には特徴的な8つの抗原（CD38、κ、λ、CD19、CD27、CD56、CD117及びCD200）が存在し、それらに特異的な抗体は単一のチューブ中で5つの異なる蛍光色素に結合される (CD38/PeCy5.5、κ/PECF594、λ/FITC、(CD19、CD27)/PeCy7、(CD56、CD117、CD200)/PE)。本ストラテジーは、半日で実施することが出来る。
抗CD38抗体、抗カッパ抗体及び抗ラムダ抗体は、他の白血球から総形質細胞を識別するために使用され、抗体の2つのグループによって腫瘍細胞を特定することが可能となる。陰性群は抗CD19抗体及び抗CD27抗体を含み、陽性群は抗CD56抗体、抗CD117抗体及び抗CD200抗体を含む。図1は、形質細胞を特定するために行われた、様々なウィンドウ（windowing）操作を表す。第一の工程は、FSC及びSSCチャンネル上でのパルス形状の分析によって、多重項（multiplets）を除去することからなる。次いで、FSC/SSCマトリクス上のデブリ（debris）を除去する。次いで、CD38/κ又はCD38/λマトリクス上で、それぞれCD38及びκ、又はCD38及びλのいずれかを強く発現している細胞を選択する。κ/λマトリクス上の対角の事象を除去する。形質細胞集団を識別した後、陽性群及び陰性群によって腫瘍細胞を特定する。
【００８６】
試料の調製
骨髄試料の採取に続いて、前記骨髄は、あらゆる骨のデブリを除去するために、濾過しなければならない。次いで、赤血球細胞を、NH4Cl溶解液を用いて (1/4比)溶解し、これに由来するデブリは遠心分離によって大部分が除去される。それぞれの蛍光色素CD56-PE (Beckman Coulter；カタログ：A07788)、CD117-PE (Beckman Coulter；カタログ：IM2732)、CD200-PE (BD Pharmingen；カタログ：552475) (陽性群)、CD19-PeCy7 (Beckman Coulter；カタログ：IM3628)、CD27-PeCy7 (Beckman Coulter；カタログ：A54823) (陰性群)、CD38-PeCy5.5 (Beckman Coulter；カタログ：A70205)に結合した膜の抗体は、製造者の推奨に従って、細胞調製物中に直接、配置される。4℃で20分間インキュベーションした後に、PBSで洗浄し、細胞を固定する (Intraprep キット；Beckman Coulter；カタログ：A07803)。次いで、固定溶液を全て除去するために、PBSで前記細胞を洗浄する。最後に、製造者の推奨に従って、細胞を、透過させ (Intraprep キット；Beckman Coulter；カタログ：A07803)、κ-PE-CF594 (BD Pharmingen；カタログ：562620)及びλ-FITC (BD Pharmingen；カタログ：555796)の細胞質内抗体/蛍光色素からなるペアを用いて標識する。4℃で20分間インキュベーションした後に、PBSで洗浄し、フローサイトメトリー装置 (BD LSRFORTESSA X-20、BD Biosciences)を用いて試料を分析する。
【００８７】
分析
多重項の除去
最初に、同時に測定ウィンドウを通過した細胞を、細胞のサイズ及び構造の複雑性にそれぞれ対応するFSC及びSSCパラメーターを使用して、除去する。これらの2つのパラメーターについて、測定ピークの高さ及び面積のマトリクスを使用し、このマトリクスの対角から外れる事象を除去する。これは高さの値及び面積値が比例しており、この比例の欠如（対角線の外側の点）が二重項又は更に多重項の存在を反映するためである。
【００８８】
デブリの除去
次いで、溶解によって生じた細胞デブリ、主に赤血球細胞のデブリを除去する。白血球の全てを選択するため、及びサイズが小さく非常に複雑でない構造を有する細胞デブリを除去するために、FSC/SSCマトリクスを使用する。
【００８９】
総形質細胞の選択
3つのマーカーによって、総形質細胞の選択を実行し、それによって、CD38並びに2つの細胞質内タンパク質κ及びλを検出することが可能となる。形質細胞は、それらの膜表面上にCD38マーカーを強く発現している細胞である。これらの細胞は、(κ又はλ)軽鎖及び重鎖からなる抗体を産生することができる。各形質細胞は、1つのタイプの軽鎖のみを産生でき、「カッパ」又は「ラムダ」形質細胞と呼ばれる形質細胞の割合はそれぞれ2/3及び1/3である。多発性骨髄腫を患っている患者においては、κ又はλクローンの増殖によってκ／λ比の不均衡が誘発されるであろう。形質細胞は、CD38/κ及びCD38/λマトリクス上で独立して選択される。
【００９０】
κ／λ事象の除去
κ及びλの次元（dimension）の対角線上にある事象が除去される。実際、形質細胞は、それらの寿命の間ずっとκ軽鎖又はλ軽鎖で分泌し得るが、両方を分泌することはない。
【００９１】
腫瘍性/正常な形質細胞の識別
一度、総形質細胞が選択されると、腫瘍性形質細胞は、PEチャンネル上で測定された陽性群のマーカー(CD56/CD117/CD200)を発現している、及び／又はPE-Cy7チャンネル上で測定された陰性群のマーカー(CD19/CD27)の１つの発現を欠いている細胞を選択することによって、正常な形質細胞に関して、識別されなければならない。
【００９２】
実施例2：本発明によるストラテジーと公知の先行技術ストラテジーとの比較
「Suivi des therapie innovant」[「革新的治療モニタリング」]研究室によって開発され、実行され、先行技術 (Carauxら；2012)に記載されたストラテジーは、「STIストラテジー」として本明細書で言及され、4本の独立のチューブに分配された7個の異なる蛍光色素に結合した、形質細胞の特徴的な抗原(CD38、CD45、CD19、CD20、κ、λ、CD27、CD56、CD117及びCD200)に対する10個の抗体を必要とする。
図2は、STIストラテジーは連続的なウィンドウ操作を表す。第一の工程は、FSC及びSSCの次元によって、（幾つかの細胞が同時に検出ウィンドウを通過する）多重項を除去することからなる。次いで、非常に小さいサイズ（FSC）及び顆粒性（granulosities）（SSC）のデブリを、FSC/SSCマトリクス上で除去する。次いで、例えば形質細胞等の、CD38を強く発現している全ての細胞をCD38/CD45サイトグラム上で選択する。次いで、サイトグラムの対角にあるκ/λ事象を除去する。これは、形質細胞がκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかを分泌するためである。4本のチューブの各々における総形質細胞の集団を特定した後で、マーカーによって腫瘍細胞を正常な形質細胞から識別する。それによって、最初の1つの発現及び／又は後の物の発現の喪失によって、CD27、CD56、CD117及びCD200を保護することが可能となる。従って、この先行技術の方法は、７色、同数の検出器、2つのレーザー及び4〜5本のチューブを使用し、それゆえ多くの高額な装置及び試薬を使用する。更に、そのような方法の使用は、データの準備、取得、コンペンセーション及び分析のためのサイトメトリーの専門家のノウハウを必要とする。比べて、本発明による方法 (実施例1)は実行することがより簡易であり、より経済的である：それは、5個の検出器、単一のレーザー及び単一のチューブを用いて実行でき、結果の解釈のためにサイトメトリーの専門家の介在を必要としない。
【００９３】
実施例3．S期の腫瘍細胞のパーセンテージの決定
BrdU分析によって、S期 (合成期)の腫瘍細胞のパーセンテージを決定することが可能となる。DNA (2N/4N)を定量するために、DAPI (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール)、DNAのアデニン (A)塩基及びチミジン (T)塩基に強く結合することが出来る蛍光分子)が使用される。
【００９４】
材料及び方法
細胞の増殖をモニターするために、供給者の推奨に従って、APC BrdU Flow Kit (BD Pharmingen、カタログ：557892)を使用した。
実施例1に記載したプロトコールに続いて、細胞溶液に350μlのDAPI/PermWash混合液を、2μl/mlで添加し、次いで、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞溶液をPBSで洗浄し、次いで、PBS中に懸濁した（taken up）後、フローサイトメトリー (CyAnTM ADPサイトメーター−Beckman Coulter)によって分析した。
【００９５】
結果
S期の形質細胞が正常なレベル(0.60%)である、多発性骨髄腫を患っている患者 (図4)。
S期の形質細胞が高レベル(4.89%)である、多発性骨髄腫を患っている患者 (図5)。
【００９６】
実施例4.細胞周期にある細胞(静止していない細胞)のパーセンテージの決定
Ki67によって、細胞周期にある細胞(静止していない細胞)のパーセンテージを定量することが可能となる。DNA (2N/4N)を定量するために、DAPI (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール、DNAのアデニン (A)塩基及びチミジン (T)塩基に強く結合することが出来る蛍光分子)が使用される。
【００９７】
材料及び方法
2本のチューブ、表面を抗体で標識するときに細胞溶液に添加したAPCアイソタイプ（Beckman Coulter、Ref：IM2475U）を含む陰性対照、細胞質内を抗体で標識するときに細胞溶液に添加したAlexa Fluor 647に結合した抗Ki67 (BD Pharmingen、カタログ：558615)を含むKi67のチューブ（陽性）を使用する。
前記プロトコールに続いて、350μlのDAPI/PermWash混合液を、2μl/mlで細胞溶液に添加し、次いで、4℃で20分間インキュベートした。次いで、PBSで細胞溶液を洗浄し、次いで、PBS中に懸濁した（taken up）後、フローサイトメトリー (CyAnTM ADPサイトメーター−Beckman Coulter)によって分析する。
【００９８】
結果
細胞周期にある細胞（静止していない細胞）をあるレベル(21%)で有する、多発性骨髄腫を患っている患者 (図4)。
細胞周期にある細胞（静止していない細胞）をあるレベル(39.5%)で有する、多発性骨髄腫を患っている患者 (図5)。
【００９９】
実施例5.DAPI及びEdUを用いたS期の腫瘍細胞のパーセンテージの決定
材料及び方法
細胞の増殖をモニターするために、供給者の推奨に従って、Click it（登録商標）Plus EdU Alexa Fluor（登録商標）647フローサイトメトリーアッセイキット (Life Technologies、カタログ：C10635)を使用した。
前記プロトコールに続いて、350μlのDAPI/PermWash混合液を2μl/mlで、細胞溶液に添加し、次いで、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞溶液をPBSで洗浄し、次いで、PBS中に懸濁した（taken up）後、フローサイトメトリー (BD LSRFortessaTM X-20サイトメーター−BD Biosciences)によって分析する。
【０１００】
結果
形質細胞の増殖のモニタリングは、二次元 (DAPI対EdU)又は一次元(EdUヒストグラム)で実行することが出来る。
図5に表示された結果は、一次元又は二次元を使用して、多発性骨髄腫を有すると診断された患者において、EdUの存在下で、それぞれ2.89%及び2.80%のS期の形質細胞 (陽性チューブ)を特定することが出来ることを示している。
【０１０１】
参考文献
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【図１】
2019516997.tif 000002
【図２−１】
2019516997.tif 000003
【図２−２】
2019516997.tif 000004
【図３】
2019516997.tif 000005
【図４】
2019516997.tif 000006
【図５】
2019516997.tif 000007
【国際調査報告】
2019516997.tif 000008
2019516997.tif 000009
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