(57)【要約】  本発明は、支持層上に、真皮同等物および表皮同等物、ならびにそれぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物を含むインビトロ完全皮膚モデルに関する。さらに、本発明は、完全皮膚モデルの製造、ならびにスクリーニング法において、ならびに汗分泌および体臭の抑制に影響を及ぼす化粧品物質のインビトロ評価のための、このモデルのインビトロモデルとしての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ完全皮膚モデルであって、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層、
ｂ）少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物、
ｄ）前記真皮同等物と前記表皮同等物との間に位置する少なくとも１つの基底膜
を含み、
前記真皮同等物ｂ）および／または前記表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、前記三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデル。
【請求項２】
前記真皮同等物が、５×１０５〜６×１０６個、好ましくは６×１０５〜５×１０６個、特に７×１０５〜４×１０６個の総細胞数において、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を含有することを特徴とする、請求項１に記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【請求項３】
前記表皮同等物が、互いに異なる複数の細胞層、特に少なくとも２つの異なる分化した細胞層、および少なくとも１つの角質化した細胞層を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【請求項４】
前記真皮同等物ｂ）および／または前記表皮同等物ｃ）が、２〜１００個の三次元汗腺同等物、好ましくは５〜１００個の三次元汗腺同等物、より好ましくは２０〜１００個の三次元汗腺同等物、特に５０〜１００個の三次元汗腺同等物を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【請求項５】
インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、前記方法が、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程、
ｂ）工程ａ）で提供された前記コラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された前記支持層に適用し、７〜２８日の期間にわたって前記線維芽細胞を培養することによって真皮同等物を製造する工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された前記真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含み、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法。
【請求項６】
工程ｃ）における前記真皮同等物を製造するために、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が、培地１ｍＬあたり２×１０５〜２×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり３×１０５〜１×１０６個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり４×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４．５×１０５〜５．５×１０５個の細胞の総濃度で使用されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｄ）において、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトが、培地１ｍＬあたり１．５×１０５〜１×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり２．５×１０５〜９×１０５個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり３．５×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４×１０５〜５×１０５個の細胞の総濃度で使用されることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記三次元汗腺同等物が、工程ｃ）において導入され、前記初代線維芽細胞、特に前記ヒト初代線維芽細胞が前記三次元汗腺同等物と混合され、次いで、工程ｂ）で製造された前記支持層に適用されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
化粧品および個人衛生における、特に化粧品物質の試験、同定、および調査のための、好ましくは、体の汗および／または体臭の抑制および／または低減に関するそれらの有効性についての試験、同定、および調査のための請求項１〜４のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデルの使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデルを備えるシステム、特に試験システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真皮同等物および表皮同等物を有するインビトロ完全皮膚モデルであって、５００〜５０００００個の汗腺細胞を有し、１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、真皮同等物および／または表皮同等物に含有される、インビトロ完全皮膚モデルに関する。インビトロ完全皮膚モデルに汗腺同等物を組み込むことにより、ヒトの皮膚におけるインビボ状況を効果的にエミュレートすることができる。特に、三次元汗腺同等物はまた、完全皮膚モデルに組み入れられた後にその機能を保持するので、種々の細胞タイプ間に存在するインビボ細胞−細胞相互作用を効果的に表すことができる。
【０００２】
本発明はさらに、最初に真皮同等物が支持層上に調製されるインビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法に関する。次に、表皮同等物がこの真皮同等物に適用される。三次元汗腺同等物は、真皮同等物および／または表皮同等物の調製中にインビトロ完全皮膚モデルに導入される。
【０００３】
さらに、本発明は、化粧品および個人衛生において、特に化粧品物質の試験、同定、および調査のための、好ましくは汗の分泌および／または体臭の抑制に関するそれらの有効性についての試験、同定、および調査のための、ならびに汗分泌および／または体臭の抑制および／または低減に対する化粧品物質の影響のインビトロ評価のための本発明によるインビトロ完全皮膚モデルの使用に関する。
【０００４】
最後に、本発明は、本発明によるインビトロ完全皮膚モデルを備えるシステム、特に試験システムに関する。
【背景技術】
【０００５】
個人の体の洗浄、清掃、およびケアは、人間の基本的要求であり、近代産業は、様々な方法でこれらの人間の要求を満たす方法を絶えず探し求めている。日々の衛生のために特に重要なことは、体臭および脇の下の濡れの持続的な除去または少なくとも低減である。ヒトの脇の下におけるエクリンおよびアポクリン汗腺の分泌によって、脇の下の濡れおよび体臭が生じる。エクリン腺は、体内の熱の調節に関与し、脇の下の濡れの発生の原因であるが、アポクリン腺は、ストレスに反応して粘性の分泌物を滲出し、それが細菌の分解を受けると不快な体臭が生じる。
【０００６】
ネイティブなエクリンおよびアポクリン汗腺に関する初期の研究は、それらを外分泌腺群に属する皮膚付属器の群に分類するために、早ければ２０世紀初めに行われた。その後、汗腺は、アポクリンおよびエクリン汗腺、ならびにアポクリンおよびエクリン汗腺のハイブリッド（アポエクリン汗腺としても既知）に分けられた。上述の形態は、それらの形態学的および特徴的な特性によって区別することができる。
【０００７】
エクリン汗腺、特にヒトエクリン汗腺は、非分岐コイル状管状腺に属し、分泌基底（コイルとしても既知）、真皮排出管（ダクトとしても既知）、および表皮ダクト（表皮内汗管としても既知）に分けることができる。腺のこれらの部分に存在する細胞は、例えば、コイル内での分泌、ダクト内でのイオンの再吸収、および分泌物、特に汗を表皮内汗管を通して周囲の皮膚に滲出させるなどの異なる目的および機能を有する。エクリン汗腺は、神経伝達物質アセチルコリン（Ａｃｈ）によって刺激される。
【０００８】
したがって、脇の下の濡れおよび／または体臭を防止する観点から、エクリンおよび／またはアポクリン汗腺からの分泌を低減および／または回避することが望ましい。これは、例えば、プラグとして既知のものによってエクリン汗腺の排出管を目立たなくすることによって行ってもよい。これに関して、先行技術では、汗抑制アルミニウムおよび／またはアルミニウムジルコニウム塩が使用される；しかしながら、これらは、もはや消費者によって高く評価されていない。さらに、汗の細菌分解を防止する抗菌剤が先行技術において使用されている。しかしながら、そのような薬剤は、脇の下の皮膚の天然ミクロフローラに悪影響を及ぼすことがある。したがって、脇の下の濡れおよび／または体臭を確実に防止することができ、先行技術で使用されるアルミニウムおよび／またはアルミニウムジルコニウム塩も抗菌剤も含有しない化粧剤を提供することが良い着想である。そのような薬剤を調製するための１つの可能性は、汗腺の刺激を効果的に抑制することによって、汗の分泌を低減または防止する物質を使用することから生じる。そのような物質を同定できるようにするために、トライアル参加者によるインビボ試験を行うことができる。しかしながら、そのような試験は、高価であり、ハイスループットスクリーニング法に好適ではない。
【０００９】
さらに、汗腺の細胞モデルを使用して、汗腺の刺激に対する試験物質の影響を調査することができる。そのようなモデルは、インビボ状況を可能な限り厳密にシミュレートする必要があり、それらは、標準化することができ、廉価でなければならず、加えてハイスループットスクリーニング法での使用に好適でなければならない。先行技術から既知の三次元汗腺モデルの一例が、Ｌｉ（Ｌｉら；「Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｃｃｒｉｎｅ  ｓｗｅａｔ  ｇｌａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｓｗｅａｔ  ｇｌａｎｄ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ」；Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１５，  ３３２，  ６７〜７７頁）によって記載されている。その汗腺モデルを製造するために、最初に、初代汗腺細胞がゲル様物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））中の増殖因子とともに培養され、次いで、生存マウスの背中に移植される。移植後、汗腺特異的マーカータンパク質を発現する球状構造が形成される。マウスは、分化した構造を構築する必要があるため、このモデルは、研究動物の使用が禁止されている化粧品および医薬品の研究には使用することができない。
【００１０】
最後に、真皮同等物および表皮とともに汗腺も含有する完全皮膚モデルの使用もまた既知である。ネイティブな成人の皮膚から標本をパンチングすることにより、皮膚のこの領域において、汗腺を包含する皮膚付属器のすべてを含有するモデルが得られる。そのようなモデルは、エキソビボ完全皮膚モデルとしても既知である。これらのモデルの１つの欠点は、汗腺の正確な数を制御することが不可能であり、さらに、モデルの特性がドナーごとに異なるため、標準化の可能性が低いことである。
【００１１】
したがって、ヒトの皮膚と類似の、好ましくは同一の組織学的構造を有し、専らインビトロ法を使用して製造することができるインビトロ完全皮膚モデルが必要とされている。これらのインビトロ完全皮膚モデルが廉価な様式で標準化および製造することができ、ハイスループットスクリーニング法に好適であることもまた良い着想である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、天然の皮膚の細胞構造および細胞−細胞相互作用に非常に類似しており、専らインビトロ法によって製造することができる細胞構造および細胞−細胞相互作用を有するインビトロ完全皮膚モデル（以下、皮膚同等物とも称する）を提供することである。さらに、このモデルは、製造するのに安価であり、標準化が可能であり、ハイスループットスクリーニング法での使用に好適であるべきである。
【００１３】
驚くべきことに、三次元汗腺同等物を皮膚同等物の真皮同等物および／または表皮同等物に導入することにより、種々の細胞タイプ間の細胞−細胞相互作用が天然の皮膚におけるものとほぼ対応するモデルを得ることができるということが発見された。製造は、専らインビトロ法によるものであり、標準化の可能性が高く、加えて廉価に皮膚同等物を製造することが可能である。このように、これらの皮膚同等物は、化粧品および医薬品に使用するための汗抑制物質を試験するハイスループットスクリーニング法における使用に特に好適である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、第１の態様において、本発明は、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層、
ｂ）少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物、
ｄ）前記真皮同等物と前記表皮同等物との間に位置する少なくとも１つの基底膜
を含むインビトロ完全皮膚モデルであって、
前記真皮同等物ｂ）および／または前記表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、前記三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデルを提供する。
【００１５】
本発明による三次元汗腺同等物をインビトロ完全皮膚モデルに導入することにより、ヒトの皮膚に存在する細胞−細胞相互作用がエミュレートされる。したがって、これらのモデルは、インビボ状況を効果的に表すので、これらのモデルにより得られた結果は、汗腺同等物のない完全皮膚モデルから得られた結果よりも重要性をもつ。さらに、三次元汗腺同等物に含有されるエクリン汗腺細胞は、創傷治癒のための潜在的な幹細胞活性を有するので、皮膚で発生するさらなるプロセスを本発明による皮膚同等物で調査することができる。皮膚同等物の製造のために培養細胞を使用することにより、培養細胞から同じ特性を有する多数の皮膚同等物を製造することができるので、標準化のための高い可能性を得ることができる。さらに、正確に決定可能な数の三次元汗腺同等物を導入することにより、標準化の高い可能性を確実にすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「インビトロ完全皮膚モデル」（以下、皮膚同等物としても既知）という用語は、インビトロ法を使用して専ら製造することができ、層状の表皮および真皮の両方を有し、基底膜が真皮と表皮との間に配置される皮膚のモデルを意味すると理解すべきである。
【００１７】
さらに、本発明の文脈において使用される「支持層」という用語は、本発明による皮膚同等物の真皮同等物のための基部または骨格として機能する自立層を意味すると理解すべきである。好ましくは、この層は、皮膚同等物の製造に使用されるマイクロタイタープレートのウェルに配置される。本発明によれば、この層は、コラーゲンマトリックスを含み、「コラーゲンマトリックス」という用語は、好ましくは細孔を備える、コラーゲンから形成される空間ネットワークを意味すると理解すべきである。しかしながら、これは、真皮の線維芽細胞によって製造されるコラーゲンによって形成されるマトリックスを含まない。
【００１８】
さらに、本発明の文脈において使用される「真皮同等物」という用語は、天然の真皮に実質的に対応する線維芽細胞から形成される結合組織様層を意味する。
【００１９】
さらに、本発明の文脈において使用される「表皮同等物」という用語は、好ましくは、天然の表皮に実質的に対応する層状表皮の形態でケラチノサイトから形成される多層層を意味する。
【００２０】
さらに、「基底膜」という用語は、好ましくは、コラーゲン、特にコラーゲンＩＶから形成され、ラミニンから形成された二次元ネットワークと絡み合っている多層ウェブから形成された層を意味すると理解すべきである。コラーゲンウェブとラミニンネットワークとの間の粘着力は、好ましくは、パーレカン（ヘパリン硫酸から形成されるプロテオグリカン）およびエンタクチン（ニドゲンとしても既知）によって確保される。
【００２１】
最後に、本発明で使用される「三次元汗腺同等物」という用語は、空間において３方向すべてに延在し、細胞が、ネイティブな汗腺における細胞と類似の機能、特に同一の機能を有する汗腺細胞から形成される細胞モデルを意味すると理解すべきである。
【００２２】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルは、第１の必須成分ａ）としてコラーゲンマトリックスを含有する支持層を含む。
【００２３】
本発明の文脈において、皮膚同等物は、好ましくは、支持層として特定のコラーゲン化合物から形成されたマトリックスを含む。したがって、本発明によれば、コラーゲンマトリックスが、低溶解性コラーゲン、特に、ウマ、ブタ、またはウシの腱から形成される低溶解性コラーゲンを含むことが有利である。本発明で使用される「低溶解性コラーゲン」という用語は、少なくとも５時間にわたって水性媒体中で目に見えない、もしくは僅かな膨潤しか示さない、または僅かなゲル形成も示さない、もしくは僅かなゲル形成しか示さない粗繊維状コラーゲンを意味すると理解すべきである。このタイプのコラーゲンは、好ましくは動物、特に哺乳類、好ましくはウマ、ブタ、またはウシ由来の腱、より特に好ましくはアキレス腱またはウシ由来の皮膚、特にウシ由来のアキレス腱から得られる。
【００２４】
本発明によれば、支持層として使用されるマトリックスが凍結乾燥された低溶解性コラーゲンから形成されることが特に有利であることが示されている。したがって、本発明の好ましい実施形態は、コラーゲンマトリックスが、凍結乾燥された低溶解性コラーゲン、特にウマ、ブタ、またはウシ由来の腱から形成される凍結乾燥された低溶解性コラーゲンを含むことを特徴とする。本発明により使用される「凍結乾燥された低溶解性コラーゲン」という用語は、この低溶解性コラーゲンの均質な懸濁液を溶媒、好ましくは水中で凍結乾燥することによって得られる低溶解性コラーゲンを意味すると理解すべきである。凍結乾燥はまた、昇華乾燥としても既知であり、この場合は、好ましくは水の形態で溶媒を凍結させることによって高真空下で急速冷凍した材料を乾燥させ、次いで凍結状態で蒸発させることを意味する。特に好ましくは、凍結乾燥された低溶解性コラーゲンから形成されたこのコラーゲンマトリックスは、その表面に細孔を有する皮膚を有する。これらの細孔は、真皮同等物の構築中に線維芽細胞による支持体材料の特に良好なコロニー形成をもたらし、その結果、真皮同等物の形成に必要な線維芽細胞の分化中の妨害が回避される。
【００２５】
本発明の文脈において、支持層のコラーゲンマトリックスが特定の総量のコラーゲンを含有することが有利であることが示されている。したがって、本発明の好ましい実施形態は、コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．５重量％〜５．０重量％、好ましくは０．８重量％〜３．５重量％、より好ましくは０．８重量％〜２．５重量％、特に０．８重量％〜１．２重量％の総量のコラーゲン、特に凍結乾燥された低溶解性コラーゲンを含有することを特徴とする。上記の総量のコラーゲン、特に凍結乾燥された低溶解性コラーゲンを含有する支持層は、本発明による皮膚同等物の効果的な安定化をもたらし、このようにして、同等物を容易に取り扱うことができることを意味する。
【００２６】
架橋コラーゲンマトリックスの使用は、本発明による皮膚同等物が収縮するのを防止するために有利であることが示されている。収縮を避けることは、試験物質を常に同一の大きさの表面に適用することができるため、標準化の高い可能性を構成する。このようにして、試験物質の適用後の濃度の変動を回避することができる。したがって、本発明によれば、コラーゲンマトリックスが架橋コラーゲンマトリックスであることが好ましい。コラーゲンマトリックスの架橋は、例えば、化学的または物理的方法によって行われてもよい。化学的架橋の場合、特に化学的架橋剤が使用される；物理的架橋は、例えば、ＵＶ照射または脱水熱架橋（ＤＨＴとしても既知）を使用して行われてもよい。
【００２７】
これに関連して、コラーゲンマトリックスが化学的架橋剤によって架橋されることが特に有利であることが示されている。したがって、本発明の文脈において、コラーゲンマトリックスの架橋は、グルタルアルデヒド、ｐ−ベンゾキノン、ジメチルアジピミデート、ジメチルピメリニデート、ジメチルスベリミデート、１，４−フェニレンジイソチオシアネート、ポリオキシエチレン−ビス−（イミダゾリルカルボニル）、ビス［ポリオキシエチレン−ビス（イミダゾリルカルボニル）］およびスベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、酵素、ならびにそれらの混合物によって形成される群からの化学的架橋剤、特に、グルタルアルデヒドを用いて行われることが好ましい。本出願人は、驚くべきことに、化学的架橋剤であるグルタルアルデヒドを使用したコラーゲンマトリックスの架橋が、インビトロ完全皮膚モデルに悪影響を及ぼすグルタルアルデヒドの細胞有毒性およびアポトーシス性なしに皮膚同等物の優れた安定化をもたらすことを立証した。
【００２８】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルは、第２の必須成分として真皮同等物を含む。
【００２９】
この真皮同等物は、好ましくは、真皮線維芽細胞によって形成される。したがって、本発明の好ましい実施形態は、真皮同等物が初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞から形成されることを特徴とする。「初代線維芽細胞」という用語は、好ましくは、特にヒトの真皮、遺伝子組換え線維芽細胞、自発的突然変異由来の線維芽細胞、またはそれらの前駆体に天然に存在する線維芽細胞を意味すると理解すべきである。特に好ましくは、ヒト初代前培養線維芽細胞を使用して真皮同等物を形成する。前培養されたヒト初代線維芽細胞はまた、ヒト初代線維芽細胞を培養することによって得られてもよく、その培養は、好ましくは、細胞増殖によってインビトロで行われる。線維芽細胞を前培養するために、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変性イーグル培地）を用いるのが好ましい。
【００３０】
本発明による真皮同等物が、特定の総細胞数の初代線維芽細胞を含有することが有利であることが示されている。したがって、本発明の文脈において、真皮同等物は、好ましくは、５×１０５〜６×１０６個、好ましくは６×１０５〜５×１０６個、特に７×１０５〜４×１０６個の総細胞数において、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を含有する。前記総細胞数の初代線維芽細胞を含有する真皮同等物は、ヒトの皮膚の真皮における分化と非常に類似した分化を示す。これは、本発明によるインビトロ完全皮膚モデルが、インビボ状況を可能な限り厳密にエミュレートすることを確実にする。
【００３１】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルは、第３の必須成分ｃ）として少なくとも１つの表皮同等物を含有する。
【００３２】
この表皮同等物は、好ましくは初代ケラチノサイトから形成される。本発明で使用される「ケラチノサイト」という用語は、角質化した扁平上皮、遺伝子組換えケラチノサイト、および自発的突然変異から得られるケラチノサイト、ならびにそれらの前駆体を形成する表皮の細胞を意味すると理解すべきである。基礎幹細胞画分の完全な角化を伴う適切に分化した表皮同等物の形成は、表皮同等物の形成に使用されるケラチノサイトに依存するので、未処理の生検組織からの実質的に未分化のケラチノサイト幹細胞が好ましくは使用される。したがって、本発明の好ましい実施形態は、表皮同等物が初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトから形成されることを特徴とする。好ましくは、表皮同等物は、初代ケラチノサイトを培養することによって、好ましくはこれらの細胞の増殖によって得られる前培養ケラチノサイトから形成される。ケラチノサイトの前培養を行うためには、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変性イーグル培地）とハムのＦ１２培地との混合物を使用するのが好ましい。
【００３３】
特に好ましくは、表皮同等物は、互いに異なる複数の細胞層を有する。したがって、本発明によれば、好ましくは、表皮同等物は、互いに異なる複数の細胞層、特に少なくとも２つの異なる分化した細胞層、および少なくとも１つの角質化した細胞層を含む。本発明で使用される「複数の細胞層」という用語は、互いに異なる少なくとも２つの細胞層、特に互いに異なる２〜２０個の細胞層を意味すると理解すべきである。表皮中の異なる細胞層の存在は、例えば、光学顕微鏡を用いて決定されてもよい。特に好ましくは、表皮同等物には、互いに異なる２〜１０個の細胞層が提供され、前記細胞層のうちの少なくとも１つは、角質層、有棘層、および顆粒層から選択される。
【００３４】
本発明によれば、表皮同等物が特定の総細胞数の初代ケラチノサイトを含有することが有利であることが示されている。したがって、本発明の文脈において、好ましくは、表皮同等物は、４×１０５〜５×１０６個、好ましくは５．５×１０５〜４×１０６個、特に６．５×１０５〜３．５×１０６個の総細胞数において、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを含有する。上で定義した総細胞数の初代ケラチノサイトを含有する表皮同等物は、ヒトの皮膚の表皮における分化と非常に類似した分化を示す。これは、本発明によるインビトロ完全皮膚モデルが、インビボ状況を可能な限り厳密に模倣することを確実にする。
【００３５】
本発明による完全皮膚モデルは、第４の必須成分として真皮同等物と表皮同等物との間に位置する基底膜を含む。
【００３６】
好ましくは、本発明の文脈において、完全皮膚モデルの基底膜は、特異的タンパク質を含む。したがって、本発明の好ましい実施形態は、基底膜が、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびそれらの混合物によって形成される群からのタンパク質を含むことを特徴とする。上に列挙したタンパク質を含有する基底膜は、真皮同等物と表皮同等物との間の特に有効な結合をもたらし、このようにして、本発明による完全皮膚モデルの良好な安定性および取り扱いを確実にする。
【００３７】
好ましくは、本発明による完全皮膚モデルは、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含有する。三次元汗腺同等物の組み込みは、ヒトの皮膚におけるインビボ状況が、汗腺または汗腺同等物を含有しない完全皮膚モデルよりも良好に再現されることを意味する。同等数の別個の汗腺同等物を組み込むことはまた、パンチ生検において、それぞれが、変動する数の汗腺を有するこれらの生検の使用と比較したときよりも標準化された様式で完全皮膚モデルを製造することができることを意味する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、２〜１００個の三次元汗腺同等物、好ましくは５〜１００個の三次元汗腺同等物、より好ましくは２０〜１００個の三次元汗腺同等物、特に５０〜１００個の三次元汗腺同等物を含むことを特徴とする。
【００３８】
本発明による完全皮膚モデルに含有される別個の三次元汗腺同等物は、例えば、初代汗腺細胞を使用したハンギングドロップ法によって、および専らインビトロ法を使用して製造してもよい。この目的のために、最初に皮膚生検からの汗腺、特に皮膚生検からのネイティブなエクリンおよび／またはアポクリン汗腺が単離される。単離は、２〜３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩと０．１〜０．２ｍｇ／ｍＬのサーモリシンとの混合物を使用して、３〜６時間、３５℃〜４０℃、特に３７℃でヒトの皮膚を酵素消化することによって行われてもよい。初代汗腺細胞は、単離された汗腺を培養することによって得ることができる。初代汗腺細胞を解離させるために注意深くトリプシン処理した後、それらは、単層培養で７〜２８日間培養され、次いで、混合物の総重量に対して、１０重量％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）をさらに含有する、３：１の重量比のＤＭＥＭおよびハムのＦ１２によって形成された栄養培地に懸濁させる。培地１μＬあたり５０〜２５００００個、特に４００〜６００個の細胞の濃度を調整した後、この懸濁液の１０〜１００μＬ、特に４０〜６０μＬを３６℃〜３８℃の温度および培養のために使用される雰囲気の総重量に対して、５重量％のＣＯ２含有量で２〜７日間、懸滴マルチウェルプレートに懸滴培養すると三次元汗腺同等物が形成される。これらの同等物は、その収穫直後または１〜６日間のさらなる培養後に完全皮膚モデルに統合することができる。収穫は、上記の栄養培地の７０〜１００μＬを添加することによって行ってもよい。本発明による完全皮膚モデルに含有される三次元汗腺同等物の製造は、２０１５年１１月１２日に出願されたドイツ特許第ＤＥ  １０  ２０１５  ２２２  ２７９．９号に記載されている；その全体の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
本発明によれば、好ましくは、三次元汗腺同等物は、真皮同等物に含有される。これらの汗腺同等物を真皮同等物に組み込むことは、インビボ状況のより良い模倣を可能にする。したがって、本発明によれば、真皮同等物ｂ）が、三次元汗腺同等物を含むことが有利である。三次元汗腺同等物を真皮同等物に導入することにより、インビボでも起こり、例えば、創傷治癒プロセスに関与する細胞−細胞相互作用が可能になる。
【００４０】
好ましくは、特定の直径を有する三次元汗腺同等物が、本発明による完全皮膚モデルに含有される。したがって、有利には、本発明によれば、三次元汗腺同等物は、それぞれ１００〜４００００μｍ、好ましくは１００〜３０００μｍ、特に２００〜２５００μｍの直径を有する。この点に関する直径データは、個々の三次元汗腺同等物の直径を指す。本発明による球状汗腺同等物の直径は、例えば、「ＣｅｌｌＳｅｎｓ」ソフトウェアを用いる顕微鏡測定によって測定されてもよい。
【００４１】
本発明の文脈において、本発明による完全皮膚モデルに含有される汗腺同等物は、マトリックス化合物および／または支持体を含まない。「マトリックス化合物」という用語は、ここでは、空間ネットワークを形成することができる化合物を意味すると理解すべきである。しかしながら、これには、空間ネットワークを形成することができる細胞自体によって製造され排出される物質は含まれない。さらに、本発明において使用される「支持体」という用語は、汗腺細胞のための基部またはフレームとして機能することができる自立物質を意味する。本発明の好ましい実施形態によれば、三次元汗腺同等物は、それぞれマトリックス化合物および／または支持体を含まず、特にマトリックス化合物および支持体を含まない。
【００４２】
本発明において使用される「含まない」という用語は、三次元汗腺同等物が、三次元汗腺同等物の総重量に対して、１重量％未満のマトリックス化合物および／または支持体を含有することを意味すると理解すべきである。したがって、本発明の文脈において、有利には、三次元汗腺同等物は、三次元汗腺同等物の総重量に対して、０〜１重量％、好ましくは０〜０．５重量％、好ましくは０〜０．２重量％、特に０重量％のマトリックス化合物および支持体を含有する。
【００４３】
これに関連して、三次元汗腺同等物が特定のマトリックス化合物および支持体を含まないことが特に有利である。したがって、好ましくは、三次元汗腺同等物は、コラーゲン、特にＩ型コラーゲンおよび／またはＩＩＩ型および／またはＩＶ型、スクレロタンパク質、ゼラチン、キトサン、グルコサミン、グルコサミノグルカン（ＧＡＧ）、硫酸ヘパリンプロテオグリカン、硫酸化糖タンパク質、増殖因子、架橋多糖類、架橋ポリペプチド、ならびにそれらの混合物によって形成される群から選択されるいかなるマトリックス化合物および／または支持体も含有しない。
【００４４】
特に好ましくは、本発明による皮膚同等物に含有される三次元汗腺同等物は、エクリンおよび／またはアポクリンヒト汗腺の同等物である。したがって、本発明の好ましい実施形態は、三次元汗腺同等物が、それぞれエクリンおよび／またはアポクリンヒト汗腺の三次元汗腺同等物であることを特徴とする。そのような汗腺同等物を含有する完全皮膚モデルは、ヒトにおけるインビボ使用のための汗抑制物質の同定に特によく適している。
【００４５】
本発明による特に好ましい完全皮膚モデルを以下に記載する。
【００４６】
この発明の主題の特に好ましい実施形態は、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層であって、コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．８重量％〜１．２重量％の総量の凍結乾燥低溶解性コラーゲンを含有し、コラーゲンマトリックスが、架橋コラーゲンマトリックスである、支持層、
ｂ）少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物、
ｄ）真皮同等物と表皮同等物との間に位置する少なくとも１つの基底膜
を含むインビトロ完全皮膚モデルであって、
真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデルによって構成される。
【００４７】
さらに、この発明の主題の特に好ましい実施形態は、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層であって、コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．８重量％〜１．２重量％の総量の凍結乾燥低溶解性コラーゲンを含有し、コラーゲンマトリックスが、架橋コラーゲンマトリックスである、支持層、
ｂ）ヒト初代線維芽細胞から形成される少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物、
ｄ）真皮同等物と表皮同等物との間に位置する少なくとも１つの基底膜
を含むインビトロ完全皮膚モデルであって、
真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデルによって構成される。
【００４８】
また、この発明の主題の特に好ましい実施形態は、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層であって、コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．８重量％〜１．２重量％の総量の凍結乾燥低溶解性コラーゲンを含有し、コラーゲンマトリックスが、架橋コラーゲンマトリックスである、支持層、
ｂ）ヒト初代線維芽細胞から形成される少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物であって、ヒト初代ケラチノサイトから形成され、少なくとも２つの異なる分化された細胞層および少なくとも１つの角質化した細胞層を含む、表皮同等物、
ｄ）真皮同等物と表皮同等物との間に位置する少なくとも１つの基底膜
を含むインビトロ完全皮膚モデルであって、
真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデルによって構成される。
【００４９】
加えて、この発明の主題の特に好ましい実施形態は、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層であって、コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．８重量％〜１．２重量％の総量の凍結乾燥低溶解性コラーゲンを含有し、コラーゲンマトリックスが、架橋コラーゲンマトリックスである、支持層、
ｂ）ヒト初代線維芽細胞から形成される少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物であって、ヒト初代ケラチノサイトから形成され、少なくとも２つの異なる分化された細胞層および少なくとも１つの角質化した細胞層を含む、表皮同等物、
ｄ）少なくとも１つの基底膜であって、真皮同等物と表皮同等物との間に位置し、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびそれらの混合物によって形成される群からのタンパク質を含む、基底膜
を含むインビトロ完全皮膚モデルであって、
真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデルによって構成される。
【００５０】
最後に、この発明の主題の特に好ましい実施形態は、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層であって、コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．８重量％〜１．２重量％の総量の凍結乾燥低溶解性コラーゲンを含有し、コラーゲンマトリックスが、架橋コラーゲンマトリックスである、支持層、
ｂ）ヒト初代線維芽細胞から形成される少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物であって、ヒト初代ケラチノサイトから形成され、少なくとも２つの異なる分化された細胞層および少なくとも１つの角質化した細胞層を含む、表皮同等物、
ｄ）少なくとも１つの基底膜であって、真皮同等物と表皮同等物との間に位置し、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびそれらの混合物によって形成される群からのタンパク質を含む、基底膜
を含むインビトロ完全皮膚モデルであって、
真皮同等物ｂ）が、５０〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ２００〜２５００μｍの直径を有し、三次元汗腺同等物が、それぞれエクリンおよび／またはアポクリンヒト汗腺の三次元汗腺同等物であることを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデルによって構成される。
【００５１】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルは、現在使用されているパンチ生検よりも標準化可能性および有用性の可能性が高く、いかなる汗腺および／または汗腺同等物も含有しない完全皮膚モデルよりもインビボ状況に近い。さらに、これらの皮膚同等物は、この完全皮膚モデルを使用することによって、例えば、特定の試験物質の存在下および非存在下でのアセチルコリン（Ａｃｈ）による刺激時の遺伝子発現またはタンパク質発現を比較することによって、試験物質の汗抑制作用を調査することができるので、ヒトにおけるインビボ研究の安価な代替物を構成する。本発明による完全皮膚モデルは、それらの構造およびさらにそれらの組織学的組成の両方に関して、ヒトの皮膚をインビボでシミュレートするので、これらのモデルで得られた情報は、ヒトに容易に適用可能であり、インビボで既に試験された化合物のデータと比較することもできる。
【００５２】
第２の態様では、本発明は、インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、該方法が、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、７〜２８日の期間にわたって前記線維芽細胞を培養することによって真皮同等物を製造する工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含み、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法を提供する。
【００５３】
本発明の文脈において使用される「低溶解性コラーゲンの懸濁液」という用語は、溶媒、好ましくは水中の固体コラーゲンの均質な混合物を意味すると理解すべきである。均質な懸濁液を製造するために、当業者に既知である静的ミキサーまたはＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘミキサーなどの装置を使用してもよい。
【００５４】
さらに、「培養する」という用語は、好ましくは、例えば、代謝産物および生成物の添加および除去による好適な環境において、細胞、特に線維芽細胞およびケラチノサイトの生命機能のインビトロ維持、特に細胞の増殖を意味する。
【００５５】
本発明による方法の文脈において、方法工程ａ）において提供される懸濁液が特定の総量のコラーゲンを含有することが有利であることが示されている。したがって、本発明による方法の好ましい実施形態は、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有することを特徴とする。前述の総量のコラーゲンを有する懸濁液を使用することは、特に安定な支持層が形成されることを意味し、その結果、本発明による方法から生じる完全皮膚モデルの高い安定性および良好な取り扱い性が保証される。
【００５６】
さらに、本発明による方法の文脈において、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有することが有利であると示されている。前述のｐＨ値を有する懸濁液を使用することは、特に安定な支持層が形成されることを意味する。
【００５７】
方法工程ｂ）における凍結乾燥の前に、コラーゲン懸濁液は、好ましくは、所望の支持層に対応する寸法を有する容器に入れられる。この方法の文脈において、好適な容器は、例えば、マイクロタイタープレートのウェルである。さらに、支持層の容器壁への接着を改善するために、コラーゲン懸濁液を添加する前に、これらの容器を好適な薬剤で被覆することが可能である。好適な薬剤の例は、ゼラチン、ポリリシン、フィブリンもしくはフィブリノゲン／トロンビン、またはフィブロネクチンである。この点に関して、まず、内部容器壁が上記の薬剤で濡らされ、次いで乾燥される、その結果、薬剤の層は、内部容器表面に接着したままである。次に、コラーゲン懸濁液が添加される。方法工程ｂ）において行われた凍結乾燥は、好ましくはこれらの容器中で行われる。さらに、本発明によれば、凍結乾燥は、好ましくは特定の冷却速度で行われる。したがって、本発明の文脈において、好ましくは、工程ｂ）におけるコラーゲン懸濁液の凍結乾燥は、５℃〜４０℃／時間、好ましくは１０℃〜３０℃／時間、より好ましくは１８℃〜２３℃／時間、特に２０℃〜２２℃／時間の冷却速度で行われる。遅い冷却速度は、凍結乾燥支持層の表面に薄い肌の形成をもたらし、薄い肌は、表面に細孔を有する。これらの細孔は、線維芽細胞の支持層へのゆっくりとした移動を促進するので、線維芽細胞によるその後のコロニー形成のための特に良好な条件を構成する。一方、上述の冷却速度よりも速い冷却速度は、所与の培養時間中に線維芽細胞が新たに合成された細胞外マトリックスを完全に満たすことができない大きな細孔を有する支持層をもたらす。次いで、播種された線維芽細胞は、これらの大きな細孔中で凝集し、分化することができ、その後層化することによって、真皮の分化を実質的に摂動することができる。したがって、上述の冷却速度は、線維芽細胞によって最適にコロニー形成することができる支持層が提供されることを確実にする。このようにして、ヒトの皮膚にも対応する非摂動な分化を達成することができる。
【００５８】
架橋コラーゲンマトリックスが支持物質として使用される場合、このマトリックスの架橋は、方法工程ｃ）に記載された凍結乾燥後に行われる。これに関して、本発明の第１の態様に関連して上記の架橋剤を使用してもよい。特に好ましくは、架橋のためにグルタルアルデヒドが使用される。架橋は、製造中の完全皮膚モデルにおける収縮プロセスが回避され、その結果、均一なサイズおよび能力のために高い再現性を保証することができることを意味する。
【００５９】
真皮同等物の製造に使用される線維芽細胞の取得および培養は、当業者に既知の方法を使用して行われる。好ましくは、好適なパス、特に第３または第４のパスからの線維芽細胞は、細胞培養フラスコ中で予備培養され、使用直前にトリプシン処理によって基部から解離させる。線維芽細胞を培養するための栄養培地は、例えば、１０重量％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭであってもよい。
【００６０】
本発明によれば、特定の総濃度の線維芽細胞を使用することは、真皮同等物の製造にとって有利であることが示されている。したがって、本発明の好ましい実施形態は、工程ｃ）における真皮同等物の製造のために、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞は、培地１ｍＬあたり２×１０５〜２×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり３×１０５〜１×１０６個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬ当たり４×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４．５×１０５〜５．５×１０５個の細胞の総濃度で使用されることを特徴とする。培地は、好ましくは、１０重量％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地である。さらなる安定化のために、追加のヒトフィブロネクチンおよび／またはラミニンを培養培地に添加してもよい。「フィブロネクチン」という用語は、インビボで他の巨大分子、例えば、コラーゲンと結合するように機能し、隣接細胞への細胞の接着に関与する線維芽細胞において製造される構造的または接着タンパク質を意味する。ラミニンは、細胞が接着することができる基底膜のタンパク質である。培養培地にフィブロネクチンおよび／またはラミニンを添加することにより、線維芽細胞の支持層への結合が相互補強される。上述の総濃度を用いることにより、支持層の線維芽細胞による十分なコロニー形成を確実にする。初代線維芽細胞の細胞数は、例えば、従来の計数チャンバおよびトリパンブルーを使用して決定されてもよい。この目的のために、トリパンブルー溶液は、培養初代線維芽細胞の希釈されていない懸濁液に添加され、適切な四角形における細胞の数が決定される。算術平均は、これらの値から作成される。計数チャンバの容積、希釈係数、および供給係数を考慮して、この平均値からｍＬまたはμＬあたりの細胞数が決定される。この点で方法工程ｃ）で使用される細胞数は、生存細胞の数（生存数）に関する。
【００６１】
方法工程ｃ）において支持層に適用される線維芽細胞の培養は、好ましくは浸漬培養で行われる。これは、栄養溶液で覆われた線維芽細胞の培養を意味すると理解すべきである。培養条件を変化させることによって、またはセラミドおよびビタミンなどの化学物質を培地に添加することによって、バリア機能をさらに作り出してもよい。好ましくは、本発明によれば、工程ｃ）における初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞の培養は、８〜２５日、好ましくは１０〜２２日、好ましくは１１〜２０日、特に１２〜１８日の期間にわたって、３０℃〜４０℃の温度で行われる。
【００６２】
表皮同等物を製造するために使用されるケラチノサイトの取得および培養は、当業者に既知の方法を使用して行われる。好ましくは、好適なパス、特に第３または第４のパスからのケラチノサイトは、細胞培養フラスコ中で予備培養され、使用直前にトリプシン処理によって基部から解離させる。線維芽細胞を培養するための栄養培地は、例えば、１重量％〜３０重量％のＦＣＳ、ならびに他の血清生成物および添加物を含有するＤＭＥＭおよびハムのＦ１２培地であってもよい。
【００６３】
方法工程ｄ）において、ケラチノサイトは、方法工程ｃ）において製造された真皮同等物に適用される。この場合も、ケラチノサイトが特定の総濃度で使用されるのが有利であることが示されている。したがって、本発明によれば、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトは、培地１ｍＬあたり１．５×１０５〜１×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり２．５×１０５〜９×１０５個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり３．５×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４×１０５〜５×１０５個の細胞の総濃度で、工程ｄ）において使用することが有利である。上述の総濃度を使用することにより、真皮同等物のケラチノサイトによる十分なコロニー形成が保証される。細胞数は、線維芽細胞の細胞数に関連して上記の様式で決定されてもよい。
【００６４】
方法工程ｄ）において適用されるケラチノサイトは、好ましくは、浸漬培養において特定の期間培養される。したがって、本発明の文脈では、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトが、１〜８日、好ましくは１〜６日、より好ましくは１〜４日、特に１〜２日の期間にわたって、３０℃〜４０℃の温度での浸漬培養下で工程ｄ）において培養されることが好ましい。特に好ましくは、ケラチノサイトは、培地の総重量に対して、およそ１重量％〜３０重量％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＮＣＳ、所定の血清または血清置換産物、ならびに細胞の増殖および分化を促進する種々の添加物を含有する細胞培養培地、特に好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において支持層上に播種される。次に、支持層は、特に、マウスＥＧＦまたは他の動物由来の匹敵する調製物、表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）（例えば、０．２μｇ／Ｌの培地濃度）、および例えば、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＤＭＥＭ培地で覆われ、その後、好ましくは１〜８日間浸漬培養される。
【００６５】
ケラチノサイト層の完全な分化は、培地−空気境界でのケラチノサイトの培養によって達成される。このタイプの培養は、ｈＥＧＦおよびＢＰＥ（ウシ下垂体抽出物）を含まないＤＭＥＭが培養培地として使用されるエアリフト培養としても既知である。「エアリフト培養」という用語は、栄養培地表面の高さが正確に真皮同等物の高さに設定される培養を意味すると理解すべきであるが、ケラチノサイトによって形成された細胞層は、栄養培地の表面の上にあり、栄養培地で覆われない、すなわち培養は、空気−栄養培地境界層で行われ、培養物は、下から供給される。続いて、モデルは、マイクロタイタープレートのウェルから持ち上げ、ペトリ皿の金属製スペーサ上に置かれた濾紙上に置かれる。培地は、濾紙を完全に覆わないのではなく、皮膚モデルの基部の周囲に液体のカラー（空気−液体界面としても既知）を形成するような深さまでペトリ皿に注がれる。空気−栄養培地境界での培養中に皮膚の典型的な表皮同等物が形成される。したがって、本発明による方法の特に好ましい実施形態は、工程ｄ）後に得られたモデルを空気−培地境界で培養することが、８〜３５日、好ましくは９〜３０日、より好ましくは１０〜２０日、特に１０〜１３日の期間にわたって、３０℃〜４０℃の温度で行われることを特徴とする。
【００６６】
本発明の方法における三次元汗腺同等物は、方法工程ｃ）および／またはｄ）に導入される。このようにして、インビボ状況を厳密にエミュレートすることができるので、真皮同等物の製造中の方法工程ｃ）における汗腺同等物の導入は、本発明によれば好ましい。したがって、本発明によれば、三次元汗腺同等物を工程ｃ）において導入することが好ましく、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が三次元汗腺同等物と混合され、次いで、工程ｂ）で製造された支持層に適用される。
【００６７】
しかしながら、本発明によれば、本発明による方法の工程ｄ）中に三次元汗腺同等物を導入することも可能である。したがって、本発明によれば、三次元汗腺同等物を工程ｄ）において導入することも好ましく、三次元汗腺同等物は、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを適用する１〜３時間前に播種される。「播種」という用語は、本明細書において、三次元汗腺同等物を真皮同等物の表面に適用することを意味すると理解すべきである。
【００６８】
本発明によれば、方法工程ｃ）および／またはｄ）において、５００〜５０００００個の細胞の細胞数および１００〜６０００μｍの直径をそれぞれ有する１〜１００個の別個の汗腺同等物が導入される。しかしながら、本発明の文脈では、より小さな直径を有するより多くの汗腺同等物が完全皮膚モデルに導入されることが有利であることが示されている。したがって、本発明の文脈では、好ましくは、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ５００〜２５００μｍの直径を有する５０〜１００個の三次元汗腺同等物は、工程ｃ）および／または工程ｄ）において、特に工程ｃ）において導入されてもよい。
【００６９】
本発明による特に好ましい方法を、インビトロ完全皮膚モデルの製造について以下に記載する。これらの方法は、好ましくは、方法工程のすべてが専らインビトロ法を使用して行われる方法に関する。
【００７０】
したがって、本発明のこの主題の特に好ましい実施形態は、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程であって、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有し、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有する、工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、７〜２８日の期間にわたって前記線維芽細胞を培養することによって真皮同等物を製造する工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含む、インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法によって構成される。
【００７１】
本発明のこの主題のさらに特に好ましい実施形態は、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程であって、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有し、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有する、工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程であって、工程ｂ）におけるコラーゲン懸濁液の凍結乾燥が、１時間あたり５℃〜４０℃、好ましくは１時間あたり１０℃〜３０℃、より好ましくは１時間あたり１８℃〜２３℃、特に１時間あたり２０℃〜２２℃の冷却速度で行われる、工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、７〜２８日の期間にわたって前記線維芽細胞を培養することによって真皮同等物を製造する工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含む、インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法によって、適宜、構成される。
【００７２】
本発明のこの主題のさらに特に好ましい実施形態は、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程であって、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有し、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有する、工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程であって、工程ｂ）におけるコラーゲン懸濁液の凍結乾燥が、１時間あたり５℃〜４０℃、好ましくは１時間あたり１０℃〜３０℃、より好ましくは１時間あたり１８℃〜２３℃、特に１時間あたり２０℃〜２２℃の冷却速度で行われる、工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、前記線維芽細胞を７〜２８日の期間にわたって培養することによって真皮同等物を製造する工程であって、工程ｃ）において真皮同等物を製造するために、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が、培地１ｍＬあたり２×１０５〜２×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり３×１０５〜１×１０６個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり４×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４．５×１０５〜５．５×１０５個の細胞の総濃度で使用される、工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含む、インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法によって、適宜、構成される。
【００７３】
本発明のこの主題のなおさらに特に好ましい実施形態は、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程であって、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有し、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有する、工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程であって、工程ｂ）におけるコラーゲン懸濁液の凍結乾燥が、１時間あたり５℃〜４０℃、好ましくは１時間あたり１０℃〜３０℃、より好ましくは１時間あたり１８℃〜２３℃、特に１時間あたり２０℃〜２２℃の冷却速度で行われる、工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、前記線維芽細胞を７〜２８日の期間にわたって培養することによって真皮同等物を製造する工程であって、工程ｃ）において真皮同等物を製造するために、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が、培地１ｍＬあたり２×１０５〜２×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり３×１０５〜１×１０６個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり４×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４．５×１０５〜５．５×１０５個の細胞の総濃度で使用される、工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程であって、工程ｄ）において、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトが、培地１ｍＬあたり１．５×１０５〜１×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり２．５×１０５〜９×１０５個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり３．５×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４×１０５〜５×１０５個の細胞の総濃度で使用される、工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含む、インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法によって、適宜、構成される。
【００７４】
最後に、本発明のこの主題のなおさらに特に好ましい実施形態は、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程であって、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有し、工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有する、工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程であって、工程ｂ）におけるコラーゲン懸濁液の凍結乾燥が、１時間あたり５℃〜４０℃、好ましくは１時間あたり１０℃〜３０℃、より好ましくは１時間あたり１８℃〜２３℃、特に１時間あたり２０℃〜２２℃の冷却速度で行われる、工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、前記線維芽細胞を７〜２８日の期間にわたって培養することによって真皮同等物を製造する工程であって、工程ｃ）において真皮同等物を製造するために、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が、培地１ｍＬあたり２×１０５〜２×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり３×１０５〜１×１０６個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり４×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４．５×１０５〜５．５×１０５個の細胞の総濃度で使用される、工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程であって、工程ｄ）において、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトが、培地１ｍＬあたり１．５×１０５〜１×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり２．５×１０５〜９×１０５個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり３．５×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４×１０５〜５×１０５個の細胞の総濃度で使用される、工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含む、インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する５０〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）においてこれらの同等物を添加することによって導入される、方法によって、適宜、構成される。
【００７５】
エクリンおよび／またはアポクリンヒト汗腺の三次元汗腺同等物は、好ましくは、インビトロ完全皮膚モデルの製造のための上記方法において導入される。
【００７６】
本発明による方法は、インビトロ完全皮膚モデルを製造するために、任意のインビボ方法を使用する必要はないという利点を有する。結果として、これらのモデルは、化粧品用途のために想定される物質を試験するためにも使用され得る。さらに、本発明による方法は、ハイスループット率を有するスクリーニング法において使用することができる標準化モデルの廉価な製造を提供する。さらに、この製造方法は、これらのモデルで生成されたインビトロデータをインビボ状況に適用することができるように、異なる分化された細胞層を有し、汗腺特異的マーカーを発現する完全皮膚モデルをもたらす。
【００７７】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルに関する記述は、本発明による方法のさらに好ましい実施形態に準用する。
【００７８】
第３の態様において、本発明は、化粧品および個人衛生において、特に化粧品物質の試験、同定、および調査のための、好ましくは体の汗および／または体臭の抑制および／または低減に関するそれらの有効性についての試験、同定、および調査のための本発明によるインビトロ完全皮膚モデルの使用に関する。既に言及したように、この完全皮膚モデルは、化粧品の分野における汗腺に対する試験物質の影響、特に個人衛生のものを決定するためのインビトロモデルとして使用されてもよい。可能な標準化の可能性が高く、およびインビボ状況の良好なシミュレーションのために、本発明による完全皮膚モデルは、特に、新規の汗抑制物質を発見するために使用されてもよい。本発明による完全皮膚モデルは、例えば、有効性、望ましくない副作用、例えば、刺激、毒性、および炎症効果、アレルギー誘発効果、または物質耐性に関する製品試験に特に好適である。さらに、本発明による完全皮膚モデルはまた、物質の再吸収、輸送、および／または浸透、ならびに創傷治癒に関する研究に使用されてもよい。さらに、このモデルにより、例えば、照射、熱、放射能、電場などの外部の環境影響が皮膚に及ぼす影響を調査することができる。そのような影響の作用は、例えば、遺伝子発現、代謝、増殖、分化、および細胞再編成を評価することによって決定されてもよい。本発明によるインビトロ完全皮膚モデルは、感染プロセスおよび治癒を研究するために、微生物、特に真菌、細菌、およびウイルスなどの病原性微生物でコロニー形成されることも可能である。
【００７９】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルおよび方法に関する記述は、本発明による使用のさらに好ましい実施形態に準用する。
【００８０】
さらなる態様では、本発明は、好ましくは自動化されたスクリーニング法において、特に化粧品物質の試験、同定、および調査のための、好ましくは体の汗および／または体臭の抑制および／または低減に関するそれらの有効性についての試験、同定、および調査のための本発明によるインビトロ完全皮膚モデルの使用に関する。
【００８１】
本発明によるインビトロ完全皮膚モデルおよび方法に関する記述は、本発明による使用のさらに好ましい実施形態に準用する。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は、汗分泌および／または体臭の抑制および／または低減に対する化粧品物質の影響をインビトロ評価するための本発明によるインビトロ完全皮膚モデルの使用に関する。
【００８３】
本発明による三次元汗腺同等物および方法に関する記述は、本発明による使用のさらに好ましい実施形態に準用する。
【００８４】
最後に、さらなる態様では、本発明は、本発明によるインビトロ完全皮膚モデルを備えるシステム、特に試験システムに関する。
【００８５】
本発明による三次元汗腺同等物および方法に関する記述は、本発明による使用のさらに好ましい実施形態に準用する。
【００８６】
要約すると、本発明は、特に以下の点を特徴とする：
【００８７】
１．インビトロ完全皮膚モデルであって、
ａ）少なくとも１つのコラーゲンマトリックスを含む少なくとも１つの支持層、
ｂ）少なくとも１つの真皮同等物、
ｃ）少なくとも１つの表皮同等物、
ｄ）真皮同等物と表皮同等物との間に位置する少なくとも１つの基底膜
を含み、
真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、１〜１００個の三次元汗腺同等物を含み、三次元汗腺同等物が、それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞を含み、それぞれ１００〜６０００μｍの直径を有することを特徴とする、インビトロ完全皮膚モデル。
【００８８】
２．コラーゲンマトリックスが、低溶解性コラーゲン、特にウマ、ブタ、またはウシ由来の腱から形成される低溶解性コラーゲンを含むことを特徴とする、ポイント１に記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００８９】
３．コラーゲンマトリックスが、凍結乾燥された低溶解性コラーゲン、特にウマ、ブタ、またはウシ由来の腱から形成される低溶解性コラーゲンを含むことを特徴とする、ポイント１または２に記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９０】
４．コラーゲンマトリックスが、コラーゲンマトリックスの総重量に対して、０．５重量％〜５．０重量％、好ましくは０．８重量％〜３．５重量％、より好ましくは０．８重量％〜２．５重量％、特に０．８重量％〜１．２重量％の総量のコラーゲン、特に凍結乾燥された低溶解性コラーゲンを含有することを特徴とする、ポイント１〜３のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９１】
５．コラーゲンマトリックスが架橋コラーゲンマトリックスであることを特徴とする、ポイント１〜４のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９２】
６．コラーゲンマトリックスの架橋が、グルタルアルデヒド、ｐ−ベンゾキノン、ジメチルアジピミデート、ジメチルピメリニデート、ジメチルスベリミデート、１，４−フェニレンジイソチオシアネート、ポリオキシエチレン−ビス−（イミダゾリルカルボニル）、ビス［ポリオキシエチレン−ビス（イミダゾリルカルボニル）］およびスベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、酵素、ならびにそれらの混合物、特に、グルタルアルデヒドによって形成される群からの化学的架橋剤を用いて行われることを特徴とする、ポイント５に記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９３】
７．真皮同等物が、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞から形成されることを特徴とする、ポイント１〜６のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９４】
８．真皮同等物が、５×１０５〜６×１０６個、好ましくは６×１０５〜５×１０６個、特に７×１０５〜４×１０６個の総細胞数において、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を含有することを特徴とする、ポイント１〜７のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９５】
９．表皮同等物が、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトから形成されることを特徴とする、ポイント１〜８のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９６】
１０．表皮同等物が、複数の相互に異なる細胞層、特に少なくとも２つの相互に異なる細胞層、および少なくとも１つの角質化した細胞層を含むことを特徴とする、ポイント１〜９のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９７】
１１．表皮同等物が、４×１０５〜５×１０６個、好ましくは５．５×１０５〜４×１０６個、特に６．５×１０５〜３．５×１０６個の総細胞数において、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを含有することを特徴とする、ポイント１〜１０のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９８】
１２．基底膜が、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、およびそれらの混合物によって形成される群からのタンパク質を含むことを特徴とする、ポイント１〜１１のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【００９９】
１３．真皮同等物ｂ）および／または表皮同等物ｃ）が、２〜１００個の三次元汗腺同等物、好ましくは５〜１００個の三次元汗腺同等物、より好ましくは２０〜１００個の三次元汗腺同等物、特に５０〜１００個の三次元汗腺同等物を含むことを特徴とする、ポイント１〜１２のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【０１００】
１４．前記真皮同等物ｂ）が、三次元汗腺同等物を含むことを特徴とする、ポイント１〜１３のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【０１０１】
１５．三次元汗腺同等物が、それぞれ１００〜４０００μｍ、好ましくは１００〜３０００μｍ、特に２００〜２５００μｍの直径を有することを特徴とする、ポイント１〜１４のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【０１０２】
１６．三次元汗腺同等物が、それぞれマトリックス化合物および／または支持体を含まず、特に、マトリックス化合物および支持体を含まないことを特徴とする、ポイント１〜１５のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【０１０３】
１７．マトリックス化合物および／または支持体が、コラーゲン、特にＩ型コラーゲンおよび／またはＩＩＩ型および／またはＩＶ型、スクレロタンパク質、ゼラチン、キトサン、グルコサミン、グルコサミノグルカン（ＧＡＧ）、硫酸ヘパリンプロテオグリカン、硫酸化糖タンパク質、増殖因子、架橋多糖類、架橋ポリペプチド、ならびにそれらの混合物によって形成される群から選択されることを特徴とする、ポイント１６に記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【０１０４】
１８．三次元汗腺同等物が、それぞれエクリンおよび／またはアポクリンヒト汗腺の三次元汗腺同等物であることを特徴とする、ポイント１〜１７のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデル。
【０１０５】
１９．インビトロ完全皮膚モデルを製造するための方法であって、該方法が、特定の順序で以下：
ａ）低溶解性コラーゲンの懸濁液を提供する工程、
ｂ）工程ａ）で提供されたコラーゲン懸濁液を凍結乾燥することによって支持層を製造する工程、
ｃ）初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞を工程ｂ）で製造された支持層に適用し、７〜２８日の期間にわたって前記線維芽細胞を培養することによって真皮同等物を製造する工程、
ｄ）初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを工程ｃ）で製造された真皮同等物に適用し、前記ケラチノサイトを１〜１０日の期間にわたって培養する工程、
ｅ）工程ｄ）後に得られたモデルを、空気−培地境界で７〜４２日の期間にわたって培養する工程
を含み、
それぞれ５００〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ１００〜６０００μｍの直径を有する１〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において前記同等物を添加することによって導入される、方法。
【０１０６】
２０．工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、懸濁液の総重量に対して、０．２重量％〜４．０重量％、好ましくは０．３重量％〜３．０重量％、より好ましくは０．４重量％〜２．０重量％、特に０．５重量％〜１．５重量％の総量のコラーゲンを含有することを特徴とする、ポイント１９に記載の方法。
【０１０７】
２１．工程ａ）における低溶解性コラーゲンの懸濁液が、ｐＨ０．１〜ｐＨ６．９、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０、より好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．５、特にｐＨ３．５〜ｐＨ４．０を有することを特徴とする、ポイント１９または２０に記載の方法。
【０１０８】
２２．工程ｂ）におけるコラーゲン懸濁液の凍結乾燥が、５℃〜４０℃／時間、好ましくは１０℃〜３０℃、より好ましくは１８℃〜２３℃／時間、特に２０℃〜２２℃／時間の冷却速度で行われることを特徴とする、ポイント１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【０１０９】
２３．工程ｃ）における真皮同等物の製造のために、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が、培地１ｍＬあたり２×１０５〜２×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり３×１０５〜１×１０６個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり４×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４．５×１０５〜５．５×１０５個の細胞の総濃度で使用されることを特徴とする、ポイント１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【０１１０】
２４．初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞の培養が、８〜２５日、好ましくは１０〜２２日、より好ましくは１１〜２０日、特に１２〜１８日の期間にわたって、３０℃〜４０℃の温度で工程ｃ）において行われることを特徴とする、ポイント１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【０１１１】
２５．工程ｄ）において、初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトが、培地１ｍＬあたり１．５×１０５〜１×１０６個の細胞、好ましくは培地１ｍＬあたり２．５×１０５〜９×１０５個の細胞、より好ましくは培地１ｍＬあたり３．５×１０５〜７×１０５個の細胞、特に培地１ｍＬあたり４×１０５〜５×１０５個の細胞の総濃度で使用されることを特徴とする、ポイント１９〜２４のいずれかに記載の方法。
【０１１２】
２６．初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトの培養が、浸漬培養で、１〜８日、好ましくは１〜６日、より好ましくは１〜４日、特に１〜２日の期間にわたって、３０℃〜４０℃の温度で工程ｄ）において行われることを特徴とする、ポイント１９〜２５のいずれかに記載の方法。
【０１１３】
２７．工程ｄ）後に得られたモデルの培養が、空気−培地境界で、８〜３５日、好ましくは９〜３０日、より好ましくは１０〜２０日、特に１０〜１３日の期間にわたって、３０℃〜４０℃の温度で行われることを特徴とする、ポイント１９〜２６のいずれかに記載の方法。
【０１１４】
２８．三次元汗腺同等物が、工程ｃ）において導入され、初代線維芽細胞、特にヒト初代線維芽細胞が三次元汗腺同等物と混合され、次いで、工程ｂ）で製造された支持層に適用されることを特徴とする、ポイント１９〜２７のいずれかに記載の方法。
【０１１５】
２９．初代ケラチノサイト、特にヒト初代ケラチノサイトを適用する１〜３時間前に播種される三次元汗腺同等物が、工程ｄ）において導入されることを特徴とする、ポイント１９〜２７のいずれかに記載の方法。
【０１１６】
３０．それぞれ５０〜５０００００個の汗腺細胞の細胞数およびそれぞれ５００〜２５００μｍの直径を有する５０〜１００個の三次元汗腺同等物が、工程ｃ）および／または工程ｄ）において、特に工程ｃ）において導入されることを特徴とする、ポイント１９〜２９のいずれかに記載の方法。
【０１１７】
３１．化粧品および個人衛生における、特に化粧品物質の試験、同定、および調査のための、好ましくは、体の汗および／または体臭の抑制および／または低減に関するそれらの有効性についての試験、同定、および調査のためのポイント１〜１８のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデルの使用。
【０１１８】
３２．好ましくは自動化されたスクリーニング法、特に化粧品物質の試験、同定、および調査のための、好ましくは体の汗および／または体臭の抑制および／または低減に関するそれらの有効性についての試験、同定、および調査のためのポイント１〜１８のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデルの使用。
【０１１９】
３３．汗分泌および／または体臭の抑制および／または低減に対する化粧品物質の影響のインビトロ評価のためのポイント１〜１８のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデルの使用。
【０１２０】
３４．ポイント１〜１８のいずれかに記載のインビトロ完全皮膚モデルを備えるシステム、特に試験システム。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いかようにも限定しない。
【実施例】
【０１２２】
１．１  汗腺の単離
天然の汗腺は、整形外科手術を受けている患者から採取され、材料を研究目的に使用することができることに同意したヒト組織サンプル（生検として既知のもの）から得た。使用された組織は、上腕リフトおよびフェイスリフト中に取り出した。脇の下の領域からのエクリンおよびアポクリン汗腺をこれらから単離した。
【０１２３】
この目的のために、それぞれの生検を小片に分けた後、最大サイズおよそ１ｃｍ×１ｃｍの切片に切断した。次に、結合組織がほぼ完全に消化されるまで、およそ３．５〜５時間、インキュベーターにおいて３７℃で等量のコラゲナーゼＩＩ（５ｍｇ／ｍＬ）とサーモリシン（０．２５ｍｇ／ｍＬ）との混合物で皮膚を消化させた。次いで、この混合物を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を破棄して酵素溶液および余分な脂肪を除去した。残ったペレットをＤＭＥＭ溶液に取り、溶液をペトリ皿に移した。インタクトな汗腺を、マイクロキャピラリーを使用して双眼顕微鏡下で単離し、新鮮なＤＭＥＭ培地に移した。
【０１２４】
１．２  単離した天然汗腺の培養
工程１．１で単離した汗腺をコラーゲンＩで被覆した培養フラスコに入れ、次いで、２５ｍＬの栄養培地を添加した。３７℃および５％のＣＯ２下のインキュベーター内で７〜２１日間培養した後、成長した汗腺細胞を解離させ、コラーゲンＩで被覆した培養フラスコ内でコンフルエンス（初代汗腺細胞の単層培養）に再培養した。
【０１２５】
使用した栄養培地の組成は以下の通りであった：
【表１】
2019514370.tif 000002
【０１２６】
１．３  細胞調製物および三次元汗腺同等物の製造
初代汗腺細胞の上記単層培養の正確な細胞数を決定した後、それらを上記栄養培地を使用して１μＬあたり１０〜５０００個の細胞数に調整した後、この細胞懸濁液の５０μＬを「ＳｕｒｅＤｒｏｐ（登録商標）Ｉｎｌｅｔ」システムを使用して「ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ（登録商標）」プレートの各ウェルに移した（いずれもＩｎｓｐｈｅｒｏ  ＡＧ、スイス）。培養は、３６℃〜３８℃および培養に使用した雰囲気の総重量に対して、５重量％のＣＯ２含有量下で行った。１〜３日後、「ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ（登録商標）」プレートのウェル中の培地のそれぞれ４０重量％を新鮮な栄養培地と交換した。３〜５日間培養した後、３Ｄ汗腺同等物を５０〜２００μＬの栄養培地を添加することによって収穫し、「ＧｒａｖｉｔｙＴＲＡＰ（登録商標）」−Ｐｌａｔｔｅ（Ｉｎｓｐｈｅｒｏ  ＡＧ、スイス）に移した。収穫する前に、「ＧｒａｖｉｔｙＴＲＡＰ（登録商標）」−Ｐｌａｔｔｅをマルチチャンネルピペットを用いて６０〜１００μＬのケラチノサイト培地で湿らせ、気泡の形成を最小限にし、三次元汗腺同等物の損失を防止した。収穫後、プレートを１００〜３００×ｇで１〜５分間遠心分離して気泡を除去した。
【０１２７】
１．４  真皮同等物中に三次元汗腺同等物を有するインビトロ完全皮膚モデルの製造
架橋コラーゲンマトリックスを含んだ支持層の製造は、公開済みの特許文献ＷＯ２００６／０１９１４７Ａ１の２２頁および２３頁の実施例１および２に記載されているように行った。培地を吸引除去した後、マイクロタイタープレート中の支持層に、予め培養した線維芽細胞（培地１ｍＬあたり６×１０５個の繊維芽細胞；使用した培地は、１０重量％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンＧ、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および１ｍＭのアスコルビル−２−ホスフェートを有するＤＭＥＭであった）の混合物の１ｍＬを、ポイント１．３に記載されているように製造された６０〜１００個の三次元汗腺同等物（およそ２５０００個の汗腺細胞あたりの細胞数）と補充した。この目的のために、培養フラスコ中で前培養された第３または第４のパスの線維芽細胞を、トリプシン溶液を添加することによって培養フラスコの底部から解離させ、培地で洗浄し、遠心分離した。細胞数を決定した後、細胞懸濁液を上記の濃度に調整し、上記の数の別個の汗腺同等物を加えた。線維芽細胞と汗腺同等物との混合物を支持層に適用した後、プレートの蓋を閉め、プレートを３７℃および５％ｖ／ｖのＣＯ２下で１６日間浸漬インキュベートし、培地は３日ごとに交換した。１６日後、三次元汗腺同等物が組み込まれた真皮同等物が形成された。次に、ケラチノサイトをこの真皮同等物に播種した。この目的のために、第１または第２パスのケラチノサイトを、細胞培養フラスコ中で、ポイント１．２で記述した栄養培地で予備培養し、次いで、トリプシン溶液を添加することによって底部から解離させた。栄養培地で洗浄し、遠心分離した後、ケラチノサイト懸濁液の細胞数を培地１ｍＬあたり１〜６×１０５個のケラチノサイトに調整した。真皮同等物の表面がちょうど湿るまで、真皮同等物を含有したマイクロタイタープレートのウェルから培地を吸引した。次に、先に調製したケラチノサイト懸濁液の１ｍＬを添加し、プレートの蓋を閉めた。浸漬培養における培養は、３７℃および５％ｖ／ｖのＣＯ２下で２日間行った。２日目の最後に、皮膚モデルをウェルから取り出し、ペトリ皿中の金属スペーサ上に置いた濾紙上に置いた。次いで、培地が濾紙の上端に達し、皮膚モデルの基部の周りにそれ自体が分布するように、ペトリ皿にポイント１．２で記述した栄養培地をある程度まで充填した。一方、モデルの表面は、培地によって覆わなかった（エアリフト培養）。エアリフト培養でさらに１１日間培養した後、多層表皮および角質化した組織表面を有した本発明によるインビトロ完全皮膚モデルが得られた。
【０１２８】
１．５  表皮同等物中に三次元汗腺同等物を有するインビトロ完全皮膚モデルの製造
真皮同等物を支持する支持層は、線維芽細胞の培養を１６日間行った、公開済みの特許文献ＷＯ２００６／０１８１４７Ａ１の２２〜２４頁の実施例１〜３に記載されているように製造した。ポイント１．３に記載されているよう製造された三次元汗腺同等物は、ポイント１．２に記載された栄養培地にそれらを懸濁させ、次いで、この懸濁液を真皮同等物に適用することによって、この真皮同等物上に置いた。１〜２時間後、ケラチノサイトをポイント１．４で記載したように播種した。浸漬条件下で１日後、モデルを空気−液体界面培養フォーマットに移し、これらの条件下でさらに１１日間培養した。このようにして製造されたインビトロ完全皮膚モデルは、多層表皮および角質化した組織表面を含んでいた。
【０１２９】
１．６  インビトロ完全皮膚モデルの分析
汗腺特異的マーカータンパク質からのタンパク質発現をアッセイするために、組織学的部分について免疫蛍光染色を行った。この目的のために、ポイント１．４および１．５に記載されたように製造されたインビトロ完全皮膚モデルを１×０．５ｃｍの大きさの切片に切断し、パラフィンに包埋するか、または包埋媒体で凍結させた。次に、組織学的部分（例えば、製造会社であるＡｂｃａｍ（ケンブリッジ、ＵＫ）製）についての標準的な蛍光プロトコールに従って物体を区分し、次いで染色した。次いで、染色されたサンプルは、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡下で分析することができた。以下の汗腺特異的マーカータンパク質をアッセイした：癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ３（Ｍ−ＡＣｈ−Ｒ３）、ナトリウム−塩化カリウム共輸送体１（ＮＫＣＣ１）、ガラニン受容体２（ＧａｌＲ２）。本発明によるインビトロ完全皮膚モデルにおける汗腺特異的マーカータンパク質の発現は、このモデルにおける三次元汗腺同等物がその天然の機能を保持していたことを示す。したがって、これらのモデルは、汗抑制に対する物質の影響を調査するために使用することができる。
【国際調査報告】
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