(57)【要約】  本発明は、一般的に、アミロイドβタンパク質集合体のアストログリアによる取り込み及び分解を刺激する組成物及び方法に関連する。本発明の一態様は、臨床的に効果のある量のビタミンＡ又はその誘導体と増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）の組合せを、そのような治療を必要とするヒト又は獣医学的対象に投与することを含む、アルツハイマー病を予防又は治療する方法を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の脳内のアミロイドβタンパク質集合体を低減するための方法であって、そのような治療を必要とする対象に治療効果量のビタミンＡ又はその誘導体と増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストの組合せを含む組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
治療効果量がアストロサイトによるアミロイドβタンパク質の取り込みを刺激する量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療効果量が、アストロサイトによるアミロイドβタンパク質の分解を刺激する量である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アゴニストが、両親媒性カルボン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アゴニストが、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、クリノフィブラート及びフェノフィブラートから成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アゴニストが、ゲムフィブロジルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物がレチノイン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が少なくとも１つの薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内及び筋肉内経路から成る群より選択される経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、直接対象の中枢神経系に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、アルツハイマー病の症状を示す対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象がヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象の脳内のアミロイドβタンパク質集合体を低減するための方法であって、治療効果量の増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストを含む組成物を対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１５】
ＰＰＡＲαのアゴニストを投与することを含み、前記アゴニストが両親媒性カルボン酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アゴニストが、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、クリノフィブラート及びフェノフィブラートから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アゴニストが、ゲムフィブロジルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、ビタミンＡ又はその誘導体を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物がレチノイン酸を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が少なくとも１つの薬学的に許容される担体を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がヒト対象である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
ビタミンＡ又はその誘導体、増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニスト及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２３】
前記増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストがゲムフィブロジルであり、ビタミンＡ誘導体がレチノイン酸である、請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本特許出願は、２０１６年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３０８，３７４号の出願日の利益を請求するものであり、参照によりその内容を本明細書に援用する。
本発明は、一般的に、アミロイドβタンパク質集合体のアストログリアによる取り込み及び分解を刺激するための組成物及び方法に関連する。本発明の一態様は、臨床的に効果のある量のビタミンＡ又はその誘導体と増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストの組合せを、そのような治療を必要とするヒト又は獣医学的対象に投与することを含む、アルツハイマー病を予防又は治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、古典的な記憶障害と認知障害を伴う進行性の神経変性疾患である。アルツハイマー病の病理学的特徴は、アミロイドβオリゴマー（Ａβ４０／４２）で構成される老人斑（ＳＰ）の存在、及び神経原繊維濃縮体（ＮＦＴ）の形成であり、脳の大脳皮質及び海馬中でのタウの異常リン酸化に起源がある（１，２）。Ａβの異常蓄積及びＮＦＴの形成は、神経炎症及びそれに伴うニューロン損失を誘発し、アルツハイマー病の主要な原因となる（３）。
集合傾向のあるＡβ４０／４２断片は、アミロイド先駆タンパク質（ＡＰＰ）上のβ−及びγ−セクレターゼの連続的な活動により生成され、α−セクレターゼの活動は、集合傾向にはない溶解性ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）断片を産生する（４，５）。αセクレターゼは主として形質膜に結合するが、多くのβ−セクレターゼは、エンドソーム−リソソームコンパートメントに存在する（６，７）。加えて、いくつかのカテプシン（Ｄ及びＥ）は、β−／γ−セクレターゼ類似の活動を示すことができた（８）。ＡＰＰの処理は分泌経路又はエンドソーム−リソソーム経路のいずれかで起こり得る。新たに合成されたＡＰＰは、形質膜に運ばれ、そこで主にα−セクレターゼによって処理されるか（分泌経路）、時にはＡＰＰはエンドサイトーシスによってエンドソームにリサイクルされ、そこでβ−及びγ−セクレターゼによって処理され（エンドソーム−リソソーム経路）、Ａβ断片を生成するかのいずれかが可能である（９，１０）。
通常条件下では、リソソーム中の他のプロテアーゼ（主にカテプシンＢ）による更なる切断がＡβ断片をさらに小さな無害な断片に分解し、それはリサイクル又は細胞から抹消される（１１）。また、インビトロ、インビボの両方の条件で、細胞外Ａβはまたエンドサイトーシスされ、リソソーム中で分解されることができた（１２）。老化又はその他の病的状況によるリソソーム機能の低下は、リソソーム内でのＡβ断片の異常蓄積及びリソソーム負荷の増加をもたらし得る。これが、リソソーム膜の破裂につながる可能性があり、それにより毒性のＡβが細胞基質に放出されるのみならず、ネクローシス性又はアポトーシス性の細胞死を開始することができるリソソーム膜透過性（ＬＭＰ）を誘発する（１３）。したがって、リソソーム機能の向上が、アルツハイマー病におけるＡβ排出の可能性ある治療機構となり得る、ということが肝要である。
【発明の概要】
【０００３】
（好ましい実施形態の概要）
ある態様において、本発明は、そのような治療を必要とする対象に、治療効果量の増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストとビタミンＡ又はその誘導体の組合せを含む組成物を投与することを含む対象の脳内におけるアミロイドβタンパク質集合体を低減させる方法を提供する。ある実施形態において、前記アゴニストは、両親媒性のカルボン酸である。別の実施形態では、アゴニストは、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、 ベザフィブラート、クリノフィブラート又はフェノフィブラートである。前記組成物はまた少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことができる。
別の実施形態では、治療効果量は脳内に存在するアストロサイトによるアミロイドβタンパク質の取り込みを刺激する量である。また別の実施形態において、治療効果量は、そのようなアストロサイトによるアミロイドβタンパク質の分解を刺激する量である。
【０００４】
対象はヒト、例えば、アルツハイマー病の症状を提示するヒト対象であってよい。前記組成物は経口投与されてよい。代替的に、前記組成物は、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内又は筋肉内経路で投与される。別の実施形態では、前記組成物は、直接中枢神経系に投与される。
本発明の別の態様は、治療効果量の増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストを含む組成物を対象に投与することを含む、対象の脳の脳内アミロイドβタンパク質集合体を低減するための方法を提供する。特定の実施形態では、前記アゴニストは、両親媒性カルボン酸である。前記アゴニストは、例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、 ベザフィブラート、クリノフィブラート又はフェノフィブラートであってよい。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ−Ｂ】図１（Ａ−Ｂ）は、ＧＦＢとＲＡ処置が、マウス初代アストロサイトにおけるＡβ取り込みを向上させることを示す。図１（Ａ）において、マウス初代アストロサイトを、２４時間、ＧＦＢとＲＡで処置し、続いて、５００ｎＭのＦＡＭ−タグ付加Ａβオリゴマー（１−４２）とともに、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、８時間インキュベートした。Ａβ取り込みアッセイは本明細書に記載の方法で実施した。データはＤＭＳＯ処置対照との比較によるパーセンテージ変化で示す。図１（Ｂ）は、マウス初代アストロサイトをＧＦＢ及びＲＡで処置し、５００ｎＭのＨＦ−Ａβ（１−４２）及び７５ｎＭのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄとともに観察前にインキュベートしたものの顕微鏡写真を示す。スケールバー＝２０μＭ。ｐ＊＜０．０５、ＤＭＳＯ処置対照に対して。全てのデータは３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図２Ａ−Ｄ】図２（Ａ−Ｃ）は、ＨＳＰＧ、ＴＦＥＢ及びＬＤＬＲの、マウス初代アストロサイトにおけるＧＦＢ及びＲＡ仲介Ａβ取り込みにおける効果を示す。図２（Ａ）：マウス初代アストロサイトをＤＭＳＯ又はＧＦＢ−ＲＡで処置し、続いてヘパリン希釈物（１００μｇ／ｍｌ）で処置し、更に５００ｎＭのＦＡＭ−Ａβ中で４時間インキュベートした。Ａβ取り込みアッセイを実施し、データを非処置対照に対するパーセンテージ変化で表す。図２（Ｂ）：マウス初代アストロサイトにスクランブルｓｉＲＮＡ、Ｔｆｅｂ  ｓｉＲＮＡ又はＬＤＬＲ  ｓｉＲＮＡを形質移入し、ＧＦＢ−ＲＡで処置し、続いて５００ｎＭのＦＡＭ−Ａβ中で４時間インキュベートした。Ａβ取り込みアッセイからのデータは、ＤＭＳＯ及びスクランブルｓｉＲＮＡ処置対照に対するパーセンテージ変化で表す。図２Ｃ：定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ｓｉＲＮＡによるＬＤＬＲサイレンシングの有効性及びＰＰＡＲα（−／−）細胞のＬＤＬＲレベルを測定した。図２（Ｄ）：定量ＲＴ−ＰＣＲを実施し、ｓｉＲＮＡによる、ＴＦＥＢサイレンシングの効果を測定した。ｐ*＜０．０５、対象に対して；ｎｓ−有意差なし。全てのデータは３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図３Ａ−Ｄ】図３（Ａ−Ｄ）は、ＧＦＢ及びＲＡ処置が、マウス初代アストロサイト中のＡβ分解を向上させることを示す。図３（Ａ）：マウス初代アストロサイトを２４時間ＧＦＢ及びＲＡ処置し、続いて５００ｎＭのＦＡＭ−タグ付加Ａβオリゴマー（１−４２）とともに４時間インキュベートし、Ａβを含まない培地で１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間及び８時間成長させた。Ａβ分解アッセイを方法セクションに記載のとおり実施した。データは、非洗浄対照との比較によるパーセンテージ変化で表した。図３（Ｂ）：ＧＦＢ及びＲＡ処置したマウス初代アストロサイトを、５００ｎＭのＨＦ−Ａβ（１−４２）とともにインキュベートし、４時間及び６時間洗浄して、更に７５ｎＭのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄとともにインキュベートし、顕微鏡下で観察した。スケールバー＝２０μＭ。ｐ*＜０．０５、非洗浄対照に対して。図３（Ｃ）：マウス初代アストロサイトをＧＦＢ及びＲＡで２４時間処置し、続いて１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１とともに４５分間処置して、５００ｎＭのＦＡＭ−Ａβとともにインキュベートし、Ａβを含まない培地で６時間洗浄し、分解アッセイを実施した。データは、非洗浄対照に対するパーセンテージ変化で表す。図３（Ｄ）：ＤＭＳＯ又はＧＦＢ−ＲＡとともに処置する前に、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＴｆｅｂ  ｓｉＲＮＡのいずれかを形質移入したマウス初代アストロサイトでＡβ分解アッセイを行った。データは、ＤＭＳＯ処置し、スクランブルｓｉＲＮＡを形質移入した対照と比較する。ｐ*＜０．０５、対照に対して：ｎｓ−有意差なし。全てのデータは３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。全てのデータは３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図４Ａ−Ｅ】図４（Ａ−Ｅ）は、マウス初代アストロサイト中のＡβ取り込み及び分解におけるＰＰＡＲα及びＰＰＡＲβの役割を示す。図４（Ａ）：ＰＰＡＲα（−／−）、ＰＰＡＲβ（−／−）及びＷＴ動物から単離したマウス初代アストロサイトを単離し、ＧＦＢ−ＲＡ又はＤＭＳＯで処置し、続いて５００ｎＭのＦＡＭ−Ａβとともにインキュベートし、Ａβ取り込みアッセイに供した。データをＤＭＳＯ処置したＷＴ対照と比較し、パーセンテージ変化で表した。ｐ*＜０．０５、対照に対して：ｎｓ−有意差なし。図４（Ｂ）：ＰＰＡＲα（−／−）、ＰＰＡＲβ（−／−）及びＷＴ動物から単離したマウス初代アストロサイトを単離し、ＧＦＢ−ＲＡで処置し、続いて５００ｎＭのＦＡＭ−Ａβで４時間インキュベートし、Ａβを含まない培地で６時間洗浄し、Ａβ分解アッセイに供した。データの分析は「議論」の箇所で詳細に記載する。ｐ*＜０．０５、対照に対して：ｎｓ−有意差なし。ＷＴ（図４（Ｃ））、ＰＰＡＲα（−／−）（図４（Ｄ））及びＰＰＡＲβ（−／−）（図４（Ｅ））動物から単離されたマウス初代アストロサイトを単離し、ＤＭＳＯで処置し、続いて５００ｎＭのＨＦ−６４７−Ａβとともに４時間、７５ｎＭのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで４５分間インキュベートし（第１パネル）、ＧＦＢ−ＲＡで処置し、続いて５００ｎＭのＨＦ−６４７−Ａβとともに４時間、７５ｎＭのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで４５分間インキュベートし（第２パネル）、ＧＦＢ−ＲＡで処置し、続いて５００ｎＭのＨＦ−６４７−Ａβとともに４時間インキュベートし、Ａβを含まない培地で６時間洗浄して、７５ｎＭのＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ中で４５分間インキュベートし（第３パネル）、顕微鏡下で観察した。スケールバー＝２０μｍ。全てのデータは３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図５Ａ−Ｆ】図５（Ａ−Ｆ）は、ＧＦＢ−ＲＡ処置がリソソーム活動をオートファジーフラックスと同様増加させたことを示す。図５（Ａ−Ｂ）マウス初代アストロサイトを、形質移入しないか、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＴｆｅｂ  ｓｉＲＮＡを形質移入して、ＤＭＳＯ又はＧＦＢ−ＲＡで処置した。全細胞抽出を調製し、ＣｔｓＢ（Ａ）及びＣｔｓＤ（Ｂ）のためカテプシンアッセイ（本明細書に詳細記載する）に供した。図５（Ｂ）ＤＭＳＯ又はＧＦＢ−ＲＡで処置した細胞からの全細胞抽出を用いてＣｔｓＢ及びＣｔｓＤのレベルについてイムノブロットを実施した。図５（Ｄ）イムノブロットの濃度測定分析、β−アクチンで正規化。図５（Ｅ）１００ｎＭバフィロマイシンＡ１又は５００ｎＭＡβオリゴマーの存在若しくは非存在下で、マウス初代アストロサイトをＤＭＳＯ又はＧＦＢ−ＲＡ処置した。全細胞抽出をＬＣ３及びｐ６２のレベルのためにイムノブロットに供した。図５（Ｆ）イムノブロットの濃度測定分析、β−アクチンで正規化。ｐ*＜０．０５、対照に対して；ｎｓ−有意差なし。全てのデータは３つの独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図６】図６は、異なるＩＦチャンネル中の漏れ込みシグナルについての試験を示す。マウス初代アストロサイトをＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養し、別々にＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（上部パネル）及びＨＦ６４７−Ａβ（下部パネル）で染色した。Ｄａｐｉを核の染色に用いた。ＩＦ顕微鏡下で、ＤＡＰＩ、Ｃｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５チャンネル中で細胞を観察した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（定義）
別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。争いが生じる場合は、本文書が、定義を含めて、支配権を有するであろう。好ましい方法及び物質は以下に記載されるが、本明細書に記載されたものと同様または同等の方法及び物質を、本発明の実施又は試験において、用いることができる。
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語の使用及び発明を記述する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における類似の引用は、別途本明細書に示される、あるいは明らかに文脈的に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、別途本明細書に示されない限り、単に当該範囲に入るそれぞれ別個の値を個別に参照することの略式の方法として用いることを意図したものであり、それぞれの別個の値は、あたかも個別に本明細書に列挙されたかのように明細書に編入される。本明細書に記述された全ての方法は、別途本明細書に示される、または明確に文脈的に矛盾しない限り、いずれか適切な順番で実施することができる。本明細書で提供される、任意の及び全ての例または例示的な言葉（例えば「などの」、「たとえば」）の使用は、単に本発明をよりよく解明することを意図したものであり、別途請求されていない限り、本発明の対象範囲に限界を付すものではない。本明細書の文言は、任意の請求されていない要素が本発明の実施にとって本質的であることを示していると解釈されるべきでない。
「治療効果」という用語は、本明細書で用いられる場合、病理症状、病勢進行、または、例えば、ヒトまたは動物の対象の脳内におけるアミロイドβタンパク質の集合のような不調に屈服することに関係した生理的状態又は抵抗することについて、好転、またはその他の点での改善を誘発する効果を意味する。「治療効果のある量」という用語は、薬について用いられる場合、ヒトまたは動物の患者に治療効果を与える薬の量を意味する。
【０００７】
（アミロイドβタンパク質の排出を刺激する方法）
アルツハイマー病は最も一般的なヒト神経変性疾患であり、進行性のニューロン死と記憶喪失をもたらす。神経病理学的にこの病気は、アミロイドβ（Ａβ）タンパク質の集合体、４０−４３アミノ酸タンパク質分解断片の構成する神経原繊維変化と老人斑の両方の存在によって特徴づけられる。アルツハイマー病の脳において、ニューロンが死ぬ一方で、アストロサイトやミクログリアのようなグリア細胞は死なない。アストロサイトは脳内の主要な細胞タイプであり、進行したアルツハイマー病においてさえ、アミロイド斑を破砕するために用いられている可能性がある。
治療効果量の増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストを含む組成物の投与はアストロサイト中のアミロイドβ（Ａβ）の取り込み及び分解を刺激する。前記組成物はまた、ビタミンＡ又はその誘導体を含んでよい。前記アゴニストは、両親媒性カルボン酸であることができる。ある特定の実施形態では、前記アゴニストは、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、クリノフィブラート又はフェノフィブラートである。ある好ましい実施形態において、前記組成物は、ゲムフィブロジルとレチノイン酸の組合せを含む。
【０００８】
ＦＤＡに承認された脂質低下剤であるゲムフィブロジル及びビタミンＡ誘導体レチノイン酸はアミロイドβ（Ａβ）のアストロサイト中での取り込み及び分解を刺激する。低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は、前記取り込みにおいて重要な役割を果たし、ＴＦＥＢが仲介するリソソーム活動の誘発が前記分解に決定的に重要である。ゲムフィブロジルとレチノイン酸処置はまた、アストロサイト中でオートファジーフラックス及びリソソーム活動を増加し、ＬＣ３−１１形成の増加及びカテプシン（Ｂ／Ｄ）活性の増加からそれぞれ観察された。
さらに、ゲムフィブロジルとレチノイン酸のＡβ取り込み／分解に与える効果は、ゲムフィブロジル−レチノイン酸が仲介するＴＦＥＢの誘導に重要な役割を果たすペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）の不存在にあっては停止する。これらの結果は、ＰＰＡＲαが、リソソームＡ（３排出の向上を通じて、アストログリアのＡβ取り込み及び分解の重要な制御因子であることを明らかにし、ビタミンＡ誘導体レチノイン酸及びゲムフィブロジル又はその他のＰＰＡＲαアゴニストの組合せがアルツハイマー病患者におけるＡβ斑負荷を低減し得ることを示唆する。
ゲムフィブロジル、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）のアゴニストはそれのみで、及び全てのトランスレチノイン酸（ＲＡ）と共に、脳細胞中のＴＦＥＢを向上させることができる。レチノイドＸ受容体（ＲＸＲα）及び、ＰＰＡＲβ及びＰＰＡＲγではなくＰＰＡＲαが、ＧＦＢ−仲介ＴＦＥＢの上方制御に関与している。レポーターアッセイ及びクロマチン免疫沈降調査により、Ｔｆｅｂ促進因子のＰＰＡＲ結合サイト上での、ＲＸＲα、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ共活性因子１α（ＰＧＣα）の補充を確認した。続いて、薬が仲介するＴＦＥＢの誘導は、細胞内での特定のリソソームタンパク質の増加及びリソソーム増殖を引き起こした（１４）。これらの発見はまた、ＴＦＥＢ促進因子上のＰＧＣ１αの補充によるＴＦＥＢの転写制御を示した別の研究と整合した（１５，１６）。
【０００９】
マウスアストロサイトによるＡβ取り込み及び分解におけるリソソーム活動の向上は、インビトロＡβ取り込み及び分解アッセイを用いて評価され、細胞内Ａβ負荷の顕微鏡観察によって支持された。ＧＦＢ−ＲＡで刺激した場合、Ａβの取り込み及び分解の両方の著しい増加が、ＷＴ及びＰＰＡＲβ（−／−）細胞で観察されたが、ＰＰＡＲα（−／−）細胞では観察されなかった。ＬＤＬＲｓｉＲＮＡによるＬＤＬＲのサイレンシングは、Ａβ取り込み率を低減したが、ＴＦＥＢの遺伝子サイレンシングは、分解率を低減した。さらに、ＧＦＢ−ＲＡ処置により仲介することができたオートファジーフラックス及びリソソーム活動において、著しい変化が、カテプシンＢ／Ｄ（ＣｔｓＢ／Ｄ）、ＬＣ３−Ｉ／ＩＩ及びｐ６２のレベルをモニターすることによって観察された。我々のデータは、ＰＰＡＲα：ＲＸＲα：ＰＧＣ１α活性によるＴＦＥＢ上方制御（及び生物発生リソソームの増加）が、Ａβ取り込みの増加、及びこれに続くマウス初代アストロサイト中のリソソーム中におけるエンドサイトースされたＡβの分解を導くことを示す。
【００１０】
（医薬組成物）
本発明の別の態様は、増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）又はＰＰＡＲαのアゴニストである薬剤を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、前記アゴニストは、両親媒性カルボン酸である。例えば、前記アゴニストは、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、クリノフィブラート又はフェノフィブラートであってよい。また別の本発明の態様は、増殖因子活性化受容体α（「ＰＰＡＲα」）又はＰＰＡＲαのアゴニストとビタミンＡ又はその誘導体である薬剤の組合せを含む医薬組成物を提供する。ある好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、ゲムフィブロジルとレチノイン酸を含む。
前記医薬組成物は、例えば、錠剤、ピル、糖衣錠、硬及び軟ゲルカプセル、顆粒、ペレット、水性、脂質、油性またはその他の溶液、水中油型乳剤のような乳剤、リポソーム、水性あるいは油性懸濁液、シロップ、エリキシール（alixiers）、固体乳剤、固体分散剤、または分散性パウダーの形状を取ることができる。経口投与のための医薬組成物中では、該薬剤は、一般的に知られ、使用されているアジュバント及び賦形剤、例えば、アラビアゴム、滑石、デンプン、糖（例えば、マンニトース、メチルセルロース、ラクトース）、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、水溶性または非水溶性溶媒、パラフィン誘導体、架橋剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存料、香味料（例えば、精油）、溶解性向上剤（例えば、ベンジルベンゾエートまたはベンジルアルコール）または生物学的利用能向上剤（例えばＧＥＬＵＣＩＲＥ）と混合してもよい。医薬組成物中で、該薬剤はまた、微小粒子、例えばナノ粒子組成物中に分散されてもよい。
非経口投与のため、該薬剤または該薬剤の医薬組成物は、生理的に許容される希釈剤、例えば、水、バッファー、溶解剤と共に、あるいは抜きの油、界面活性剤、分散剤または乳化剤に溶解しまたは懸濁させることができる。油としては、例えば、オリーブオイル、ピーナッツオイル、綿実油、大豆油、ひまし油及びごま油が用いられ得るがこれらに限定するものではない。より一般的には、非経口投与のため、該薬剤または該薬剤の医薬組成物は、水性、脂質、油性またはその他の種類の溶液または懸濁液の形状であってもよく、あるいはリポソームまたはナノ懸濁液の形状で投与されてさえよい。
【００１１】
（投与方法）
前記医薬組成物は、治療効果量の該薬剤を対象に送達することを可能とするいかなる方法によって投与されてもよい。投与方法としては、経口、局所、経皮及び非経口経路が、組織への直接注入やカテーテルによる送達と同様に挙げられるが、これらに限られるわけではない。非経口経路としては、皮下、皮内、関節内、静脈内、腹腔内及び筋肉内の経路が挙げられるが、これに限られるわけではない。ある実施形態では、投与経路は局所または経皮投与であり、例えば、ローション、クリーム、パッチ、注射、体内埋め込み装置、移植装置またはその他の制御された放出担体による。投与経路には、いかなる非経口経路も含め、組成物を大循環に直接送達するいかなる経路（例えば、注射）も含まれる。あるいは、投与は、中枢神経系への直接の送達によってもよい。
本発明による方法の一つの実施形態は、前記組成物を、アルツハイマー病の発達を阻害若しくはその程度を小さくするために十分な用量、濃度及び時間、投与することを含む。別の実施形態は、本発明は、前記組成物を対象の脳内のアミロイドβタンパク質集合体を低減するために十分な用量、濃度及び時間、投与することを含む。また別の実施形態において、本発明は、前記組成物を、対象の脳内のアストロサイトによるアミロイドβタンパク質集合体の取り込みを刺激するために十分な用量、濃度及び時間、投与することを含む。別の実施形態では、本発明は前記組成物を、対象の脳内のアストロサイトによるアミロイドβタンパク質集合体の分解を刺激するために十分な用量、濃度及び時間、投与することを含む。
【００１２】
特定の実施形態は、前記組成物を、対象の体重１Ｋｇあたり約０．１μｇと約１００ｍｇの間の量、対象の体重１Ｋｇあたり約０．１μｇと約１０ｍｇの間の量、対象の体重１Ｋｇあたり約０．１μｇと約１ｍｇの間の量、全身的に投与することを含む。該方法を実施するにあたっては、前記組成物は、一日１回の用量または一日複数回の用量で投与することができる。この治療方法は、長期間にわたる投与を必要とする場合がある。投与された一回分の服用量または全体の投与量は、医師によって定められ、患者の体重、年齢、患者の一般的健康状態及び組成物に対する患者の耐久力といった要因に依存するであろう。
本発明の実施形態は、下記実施例によってさらに説明されるが、それは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００１３】
実施例１−初代マウスアストログリアの単離
アストログリアを記載のとおり（１７，１８）Ｇｉｕｌｉａｎ及びＢａｋｅｒ（１９）の手続きに従って混合グリア培養物から単離した。簡潔に述べると、第９日に、混合グリア培養物をダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ−１２で３回洗浄し、２４０ｒｐｍで２時間、３７℃でロータリーシェーカー上で振とうしてマイクログリアを除去した。２日後、オリゴデンドログリアを除去するため２４時間、振とうを繰り返し、全ての非アストログリア細胞の完全な除去を確実にした。付着した細胞を、更なる研究のため、新しいプレートに藩種した。
【００１４】
実施例２−半定量的な逆転写酵素結合ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡをマウス初代アストロサイト及びヒト初代アストロサイトから、RNA-Easy Qiagenキットを用いて、製造者のプロトコルに従って単離した。先に記載のとおり（２０）、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１２−１８、及びモロニ―マウス白血病逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ、イントロジェン）を２０μｌ反応混合物中で用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。結果として得られたｃＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘとマウス遺伝子のためのプライマーを用いて適切に増幅した。Ｔｆｅｂプライマー：フォワード：５’−ａａｃａａａｇｇｃａｃｃａｔｃｃｔｃａａ−３’  配列番号：１；リバース：５’−ｃａｇｃｔｃｇｇｃｃａｔａｔｔｃａｃａｃ−３’  配列番号：２。Ｌｄｌｒプライマーをサンタクルズバイオテクノロジー（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ−３５８０３−ＰＲ）から購入した。増幅生成物を２％アガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウムで染色して可視化した。グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Ｇａｐｄｈ）ｍＲＮＡを負荷コントロールとして、等量のｃＤＮＡが各サンプルから合成されることを確認するため用いた。
【００１５】
実施例３  定量的リアルタイムＰＣＲ
ｍＲＮＡの定量を、ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムでＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを用いて行った。標的遺伝子のｍＲＮＡ発現は、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡのレベルに正規化され、データはＡＢＩ配列検出システム１．６ソフトウェアで処理した。
【００１６】
実施例４−イムノブロッティング
ウェスタンブロット法を先述（２１，２２）のとおり修正しつつ行った。簡潔に述べると、細胞を１ＸＲＩＰＡ緩衝液中で掻き取り、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を用いてタンパク質を測定し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）緩衝液を添加して、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４−１２％ビスートリスゲル（インビトロジェン）上で電気泳動させ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ高速セミドライ式ブロッターを用いて、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上にタンパク質を移した。前記メンブレンをＴＢＳプラスツイン２０（ＴＢＳＴ）で１５分間洗浄し、ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ中で１時間ブロックした。次にメンブレンを一晩４℃で振とう条件下で以下の１°抗原とともにインキュベートした；ＣｔｓＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００）、ＣｔｓＤ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：１０００）、ＬＣ３（Ｎｏｖｕｓ，１：５００）、ｐ６２（Ａｂｃａｍ，  １：５００）及びβ−ａｃｔｉｎ（Ａｂｃａｍ，  １：１０００）。翌日、メンブレンをＴＢＳＴ中で１時間洗浄し、２°抗原中で１°抗原ホストに対して（全て１：１０，０００；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）室温で１時間インキュベートし、更に１時間洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｌｉ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）の下で可視化した。
【００１７】
実施例５−アミロイドβ取り込みアッセイ
マウス初代アストロサイトを黒色９６ウェルプレートに載せた。適切な処置の後、前記ウェルを３７℃で５００ｎＭＦＡＭ−タグ付加Ａβオリゴマー（１−４２）で適当な時間インキュベートした。最終的に、Ａβ含有培地を除去し、ウェルを優しく通常の培地で洗浄し、続いて細胞外Ａβを１００μｌのＰＢＳ中０．２％トリパンブルーとともに２分間冷却した。吸引後、蛍光をＶｉｃｔｏｒ  Ｘ２マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中、Ｅｘ．／Ｅｍ．４８５／５３５で測定した。前記ウェルは更に１００μｌのＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌヘキスト  ３３３４２色素とともに３０分間インキュベートし、蛍光をＥｘ．／Ｅｍ．３６０／４６５ｎｍで測定した（２３）。Ａβ蛍光は、細胞数の変化性がもしあれば、それを説明するためヘキスト蛍光で正規化した。
【００１８】
実施例６−アミロイドβ分解アッセイ
マウス初代アストロサイトを載せて、処置して、次いでＦＡＭ−タグ付加Ａβ（１−４２）とともに、４時間インキュベートした。インキュベート後、Ａβ含有培地を除去し、優しく１回洗浄した後、プレートを通常の培地とともに、３７℃で異なる時間インキュベートした。Ａβの測定及びヘキスト蛍光は上述のとおり測定した。
【００１９】
実施例７−アミロイドβ取り込み／分解のための免疫細胞化学
マウス初代アストロサイトを６ウェルプレートに置かれた正方形のカバースリップ上で培養した。処置後、細胞を５００ｎＭのＨＦ−６４７タグ付加Ａβオリゴマー（１−４２）とともにインキュベートした。分解研究のため、細胞は、Ａβ含有培地を除去した後、通常の培地中で更に成長させた。インキュベート後、７５ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ９９を含有する培地中で細胞を更に３０分間インキュベートした。続いて細胞を洗浄し、ガラススライド上に固定し、ＢＸ４１蛍光顕微鏡下で観察した（２３）。
【００２０】
実施例８−カテプシンアッセイ
マウス初代アストロサイトを培養し、処置し、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び２．５ｍＭのＤＴＴを伴う１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で溶解した。
カテプシンBアッセイのため、上清を３０分間、ｐＨ６．０で、１００μＭのＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．７−アミノー４−メチルクマリンとともにインキュベートし、ＡＭＣを標準として用いた。蛍光をＶｉｃｔｏｒ  Ｘ２マイクロプレートリーダー中、Ｅｘ．／Ｅｍ．３５５／４６０ｎｍで測定した。
カテプシンＤアッセイのため、上清を１０μＭの基質７−メトキシクマリン−４−アセチル−（Ｍｃａ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−２，４  ニトロフェニル（Ｄｎｐ）−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ2  、ｐＨ４．０で３０分間インキュベートした。Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨを標準として用いた。蛍光は、Ｅｘ．／Ｅｍ．３２０／４２０ｎｍで測定した。
サンプルの蛍光読み取り値をそれぞれの標準と比較して、得られた生成物の量を測定した。カテプシン活性（単位）を細胞抽出物のｍｇあたりで計算し、３７℃で、１時間あたり、１単位の酵素活性が１ｎモルの生成物を放出するものと考えた（２４，２５）。
【００２１】
実施例９−濃度測定分析
タンパク質ブロットをＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を用いて解析し、バンドをそれぞれのβ−アクチン負荷対照で正規化した。免疫蛍光定量データは、１条件当たり少なくとも２５の異なるイメージについて３つの独立した一連の実験からの、それぞれの対照に対する平均倍変化で表したものである。
【００２２】
実施例１０−統計解析
値を、少なくとも３つの独立した実験の平均±標準誤差で表す。差についての統計解析をスチューデントのｔ検定を経て行った。この統計的有意差についての基準は、ｐ＜０．０５であった。
【００２３】
実施例１１−ＧＦＢ及びＲＡ処置によるマウス初代アストロサイトにおけるＡβ取り込みの向上
リソソーム活動は、アルツハイマー病脳内のＡβの排出に不可欠である。したがって、我々は、マウス初代アストロサイトによる細胞外Ａβの取り込みにおいてリソソーム生物発生を向上させるＧＦＢ−ＲＡの効果を探索した。我々は、細胞による取り込みのＡβレベルの変化を測定するため、定量的インビトロアッセイ及び定性的顕微鏡解析の両方を行った。
インビトロアッセイは、細胞内からのＦＡＭ−タグ付加Ａβ（１−４２）のシグナル強度を定量的に測定することができる堅調な技術である。細胞は、ＧＦＢ−ＲＡで処置し、ＦＡＭ−Ａβ（１−４２）とともに様々な時間（１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、及び８時間）更にインキュベートした。Ａβのシグナル強度を、各ウェルにおける細胞数の変化性がもしあれば、それを説明するため、最初そのヘキストに対して正規化した。次に、ＧＦＢ−ＲＡ処置サンプルの正規化したＡβシグナルを、その対応するＤＭＳＯ処置したものと比較し、各時間におけるＡβシグナルのパーセンテージ変化を計算した。
【００２４】
Ａβ含有培地中で２時間インキュベートした後に、ＧＦＢ−ＲＡ処置細胞内のＡβ量は、ＤＭＳＯ処置細胞に比較して〜６０％多かった。４時間で、処置細胞中のＡβシグナルは、対照よりも約〜８０％高かった（図１Ａ）。しかしながら、更に８時間までインキュベートしても、処置細胞中のＡβ含有量の更なる増加は得られず、４時間のインキュベーションがアッセイのために最適な時間であろうことを示した。したがって、更なる取り込みアッセイでは、この時間がＡβのインキュベーションに選択された。
細胞をＨＦ−６４７−タグ付加Ａβ（１−４２）とともに２時間インキュベートし、続いてＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄとともに４時間インキュベートして、蛍光顕微鏡検査を行った。我々は２時間、及び４時間インキュベートされたＧＦＢ−ＲＡ処置細胞中のＨＦ−６４７−Ａβの点状シグナルがＤＭＳＯ対照に対して増加したことを観察した。更に、Ａβシグナルは、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒシグナルと共存し、細胞により取り込まれたＡβは細胞内の酸性小胞（後期エンドソーム又はリソソーム）内に存在することを示した（図１Ｂ）。Ａβシグナルのパターン及びＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒシグナルのパターンは類似すると予想されることから、我々は細胞を別々にＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ及びＨＦ−６４７−Ａβとインキュベートし、任意の蛍光の漏れ込み（bleed through signal）を全てのチャンネルについて試験した。予想通り、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒのみがＣＹ２及びＣＹ３チャンネルの間でわずかなシグナルの重複を示したが、ＨＦ−６４７−Ａβについての他のいかなるチャンネルにおいても、その真のシグナルであるＣＹ５チャンネル以外からの有意な漏れ込みはなかった（図６）。
【００２５】
実施例１２−ＧＦＢ−ＲＡが媒介するＡβ取り込みにおけるＬＤＬＲ及びＴＦＥＢの効果
Ａβは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に補助される微飲作用を通じて取り込まれることができた（２６）。したがって、ＧＦＢ−ＲＡが仲介するＡβ取り込みの向上のメカニズムを明瞭にするため、我々はＡβ取り込みアッセイをヘパリン（ＨＳＰＧの阻害因子）の存在下でまず行った。ヘパリン存在下でＧＦＢ−ＲＡで処置した細胞は、Ａβ取り込みにおいて〜４０％の増加を示したのに対し、ヘパリン不存在の下でＧＦＢ−ＲＡ処置した細胞は〜８０％の増加を示した（図２Ａ）。しかしながら、この取り込みレベルの低減は統計的に優位であったが、まだ約４０％の取り込みがヘパリン存在下で行われており、このことは別の因子が取り込みプロセスの原因となっている可能性を示す。我々は細胞にＴｆｅｂ  ｓｉＲＮＡを形質移入し、Ｔｆｅｂ  ｓｉＲＮＡ形質移入細胞中のＡβ取り込みレベルに、スクランブルｓｉＲＮＡ形質移入細胞に比べてわずかな減少（統計的に優位ではなく、ｐ＝０．５９）を観察した（図２Ｂ）。ＴＦＥＢサイレンシングの有効性を図２Ｄに示す。これらのデータは、ＨＳＰＧもＴＦＥＢもそれだけがＡβの取り込み向上の原因であるわけではないという考えを更に強めることとなった。最近の報告は、ＬＤＬＲ及びＬＲＰ１のようなリポタンパク質受容体がまたグリア細胞におけるＡβのインターナリゼーションを促進していることを示唆している。興味深いことに、ＬＤＬＲの肝臓発現が、Ａｋｔリン酸化及びＳＲＥＢＰ２の転写活動が関与するＰＰＡＲαに依存したメカニズムによるフェノフィブラート（ＦＦ）によって誘発されるとの報告がある（２７，２８）。したがって、我々はさらに細胞にＬｄｌｒ  ｓｉＲＮＡを形質移入し、ＧＦＢ−ＲＡのＡβの取り込みへの効果がＬＤＬＲの不存在にあって減じることを観察した（図２Ｂ）。ＬＤＬＲサイレンシングの効率は、図２Ｃから明らかである。また、ＧＦＢで処置すると、フィブラートは、ＲＡとともにＷＴアストロサイト中でＬＤＬＲの発現を誘発したが、ＰＰＡＲα（−／−）細胞中ではしなかった（図２Ｃ）。これらを考え合わせると、この一連のデータは、ＧＦＢ−ＲＡが、ＬＤＬＲ仲介エンドサイトーシスを経由して、アストロサイト中のＡβの取り込みを促すことを示している。
【００２６】
実施例１３−ＧＦＢ及びＲＡ処置がマウス初代アストロサイト中のＡβの分解を向上させる
我々はＡβとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（リソソーム色素）の共存を観察した（図１Ｂ）。したがって、オルガネラが適切に機能すれば、リソソーム内部でＡβの分解があるであろうことは必然である。我々は、ＴＦＥＢの誘発（及びそれに続くリソソーム遺伝子及びリソソーム生物発生の誘発）がリソソーム中のＡβ分解プロセスを加速できたか否かを観察したかった。我々は同じインビトロアッセイを細胞内Ａβ含有量のために手配したが、今回は、Ａβとともに４時間インキュベートした後、該細胞をＡβを含まない培地中で異なる時間（１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、及び８時間）成長させた。ＤＭＳＯ処置細胞及びＧＦＢ−ＲＡ処置細胞の正規化されたＡβシグナル（ヘキストシグナルに対して正規化されたもの）を、Ａβを含まない培地で成長させなかったそれぞれの対応物（「０分洗浄」と呼ぶ）と比較した。予想通り、Ａβのリソソーム処理の基底レベルは、細胞内Ａβのシグナル強度を、６〜８時間の間で、０分洗浄細胞に比べて、〜２０％低減させた。一方で、ＧＦＢ−ＲＡで処置された細胞は、加速された排出速度を示し、６〜８時間の間で、〜４０％シグナルを低減させた（図３Ａ）。データは最適な分解が６時間であることを示し、その時間が更なる分解アッセイに用いられた（「６時間洗浄」と呼ぶ）。我々はまた、６時間洗浄後のＨＦ−６４７−Ａβの点の減少を顕微鏡下で可視化した（図３Ｂ）。Ａβシグナルの喪失がリソソーム処理のためであるか否かを決定するため、我々は、リソソームの酸性化を阻害しそれによってその活性を低減するバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）とともに細胞をインキュベートした。ＢａｆＡ１の存在は、ＧＦＢ−ＲＡで処置された細胞中で観察されたＡβの喪失の加速化を阻み、ＢａｆＡ１存在下では、Ａβ分解速度は、ＤＭＳＯ措置細胞とＧＦＢ−ＲＡ処置細胞の両方でほぼ同じとなった（図３Ｃ）。更に、Ｔｆｅｂ  ｓｉＲＮＡの細胞への形質移入はまた、ＧＦＢ−ＲＡが仲介する、Ａβの加速化したリソソーム分解を減じた（図３Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＧＦＢ−ＲＡ処置が仲介するリソソーム生物発生の誘発は、リソソームによるＡβ分解のプロセスを加速化することができたことを示す。
【００２７】
実施例１４−ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲβのＧＦＢ−ＲＡ仲介Ａβ取り込み及び分解における役割
ＰＰＡＲαはＴＦＥＢの転写活性化の仲介、及びそれに続く、リソソーム生物発生の向上において重要な役割を果たす。我々は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲβの不存在が、マウス初代アストロサイト中のＡβ取り込み及び分解の制御に影響を与えることを試験した。ＷＴ、ＰＰＡＲα（−／−）及びＰＰＡＲβ（−／−）動物から単離された細胞をＧＦＢ及びＲＡで処置し、更にＦＡＭ−Ａβ（１−４２）（インビトロアッセイのため）及びＨＦ−６４７−Ａβとともに、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＲｅｄ（顕微鏡のため）と併せてインキュベートした。以前同様、Ａβシグナルは、細胞数の任意の変化性を説明するため、ヘキストシグナルで正規化した。
Ａβ取り込みアッセイは、Ａβとともに４時間インキュベート後、細胞内のＡβ含有量の顕著な増加（ＦＡＭ−Ａβシグナル強度で測定）を、ＷＴ及びＰＰＡＲβ（−／−）細胞の両方で示したが、ＰＰＡＲα（−／−）細胞では示さなかった（図４Ａ）。全ての細胞のシグナル強度をＤＭＳＯ処置ＷＴ対照と比較した。ＧＦＢ−ＲＡ処置されたＰＰＡＲα（−／−）細胞中のＡβレべルにわずかな増加（〜２０％）があったが、ＧＦＢ−ＲＡ処置されたＷＴ及びＰＰＡＲβ（−／−）細胞中のそれぞれ〜８０％及び７０％の増加に比べれば著しくはなかった（図４Ａ）。ＰＰＡＲのＡβ分解における役割を評価するため、ＷＴ及びノックアウト動物からの細胞を処置し、Ａβでインキュベートし、更にＡβを含まない培地で６時間成長させた。ＧＦＢ−ＲＡ処置されたアストロサイトの各細胞タイプについて、６時間洗浄を行ったあるいは行わないものの正規化されたＡβシグナルを、最初にそれらの対応するＤＭＳＯ処置対照と比較した。そして、６時間洗浄ＧＦＢ−ＲＡ処置細胞の細胞内Ａβシグナルのパーセンテージ変化（先にそれらのＤＭＳＯ処置対照に対して正規化したもの）を０分洗浄ＧＦＢ−ＲＡ処置細胞（先にそれらのＤＭＳＯ処置対照に対して正規化したもの）と各細胞タイプについて計算した。我々は、ＷＴ及びＰＰＡＲβ（−／−）細胞の両方についてＡβレベルの〜６０％低減を観察したが、ＰＰＡＲα（−／−）の場合は３０〜３５％のシグナル喪失に過ぎなかった（図４Ｂ）。初期に観察された通り、Ａβはこれら３つの細胞タイプで差別的に取り込まれたが、Ａβ含有量についてのパーセンテージ変化を６時間洗浄前と後で比較すると（派生物については詳細に議論の場所で記述する）、Ａβ取り込みの変化性を説明し、Ａβ分解の絶対尺度を提供した。
【００２８】
更に、顕微鏡観察から、ＰＰＡＲα（−／−）細胞中で、ＰＰＡＲβ（−／−）及びＷＴ細胞に比べて、ＡβとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの両方のシグナル強度の低減が明らかになった（図４Ｃ、４Ｄ及び４Ｅ）。これは、ＰＰＡＲαの不存在はＧＦＢ−ＲＡ仲介リソソーム増殖の向上を、Ａβ取り込みの鍵となる成分であるＬＤＬＲの発現の減少と同様に停止するという我々の先の発見と合致した。
顕微鏡解析はまた、６時間洗浄後のＷＴ及びＰＰＡＲβ（−／−）中で、ＨＦ−６４７−Ａβの点は減少するが、ＰＰＡＲα（−／−）細胞中では著しい変化は認められないことを明らかにした（図４Ｃ、４Ｄ及び４Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ＰＰＡＲαは二重の役割を有することを示している。すなわち、ＬＤＬＲ発現を制御することによって、それはＡβの取り込みを促進することが可能であり、また、ＴＦＥＢを介してリソソーム生物発生を向上させることにより、それはリソソーム中でのＡβ分解の加速化を誘発する。
【００２９】
実施例１５−ＧＦＢ及びＲＡ処置がリソソーム活性及びオートファジーフラックスを向上させた
Ａβのリソソーム分解の向上のため、我々はリソソーム活性とオートファジーのためのマーカーを調査した。我々は、リソソーム中のＡβ断片の分解に関わる２つの重要なカテプシンである、カテプシンＢ（ＣｔｓＢ）及びカテプシンＤ（ＣｔｓＤ）におけるＧＦＢ−ＲＡ処置を評価した。カテプシン活性アッセイを、Ｔｆｅｂ  ｓｉＲＮＡの存在又は不存在の両方についてＧＦＢ−ＲＡ処置細胞において、物質及び方法に記載のとおり実施し、ＧＦＢ−ＲＡ処置による活性の任意の変化が、ＴＦＥＢを介して仲介されるか否かを決定した。我々のデータは、ＧＦＢ−ＲＡ処置により両方のカテプシンの活性の増加を示す。ｓｉＲＮＡによるＴＦＥＢのサイレンシングは、カテプシン活性への薬剤の効果を停止した（図５Ａ及び５Ｂ）。両カテプシンのタンパク質レベルは、ＧＦＢ−ＲＡ処置細胞で約２〜３倍増加することが認められた（図５Ｃ及び５Ｄ）。これは、ＣｔｓＢ及びＣｔｓＤがＴＦＥＢの直接のターゲットであること及びＴＦＥＢ活性の向上が、続いてカテプシンのレベル及び活性を同様に誘発するという発見と整合する。
【００３０】
オートファジー又はオートファジー経路のブロックの欠如は、細胞内のオートファジー液胞におけるＡβの異常な蓄積をもたらし、Ａβに誘発される神経細胞毒性の主な原因の一つであることが報告されている（９）。したがって、我々は、ＧＦＢ−ＲＡ処置細胞中のオートファジーフラックスの変化を、ＬＣ３（ＬＣ３−Ｉ／ＬＣ３−ＩＩ）及びｐ６２／ＳＱＳＴＭ１のレベルをモニタリングすることによって観察した。ＧＦＢ−ＲＡ処置は、ＬＣ３−Ｉのホスファチジルエタノールアミン接合形である、ＬＣ３−ＩＩのレベルを増加させた（図５Ｅ及び５Ｆ）。ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの変換は、オートファジー誘発の特徴である。我々は更にリソソーム活性をＢａｆＡ１を用いてブロックし、ＬＣ３−ＩＩの更なる蓄積を観察した（図５Ｅ及び５Ｆ）。以前の研究と整合的に、我々はまた、ＬＣ３−ＩＩの蓄積がある条件でのｐ６２のレベルの低減が、オートファジーフラックスの向上を更に強化することを観察した（図５Ｅ及び５Ｆ）。
これらを考えあわせると、これらのデータは、ＴＦＥＢを介し、ＧＦＢ−ＲＡに仲介され、ＰＰＡＲαに依存する形でのリソソーム生物発生の増加は、マウス初代アストロサイトによるリソソーム中でのＡβ取り込み及びそれに続く分解を誘発することができるという、我々の仮説を確認するものである。
【００３１】
実施例１６−実験プロトコルについての議論
Ａβ産生におけるリソソーム活動の役割である、取り込み及び排出については、過去数年の間によく確立されてきた（１，２，７，１１，２３）。ここで、我々は、ＧＦＢ−ＲＡによるリソソーム生物発生の向上をマウス初代アストロサイトによるＡβ取り込み及び分解において観察した。ＦＡＭ−タグ付加Ａβ（１−４２）を用いたインビトロアッセイを９６ウェルマイクロプレートで行い、同時に複数のサンプル／処置の評価を可能とした。細胞外シグナルと死細胞からのシグナルをトリパンブルーを用いて抑制することで、生存細胞からの細胞内Ａβシグナルのみが、４８５／５３５ｎｍ（Ｅｘ．／Ｅｍ．）で検出された。更に、同じウェルからのＡβシグナルをヘキスト３３３４２シグナルで３６０／４６５ｎｍで正規化することで、細胞数の変化性を説明する。
実験のタイプによって、データを適切な対照と比較し、Ａβ取り込み／分解の倍数変化又はパーセンテージ変化で表した。ＷＴ及びＰＰＡＲβ（−／−）細胞が、処置に伴い、Ａβ取り込みの著しい増加を示す一方、ＰＰＡＲα（−／−）細胞はそれほどの増加を示さなかった。ＨＦ−６４７−ＡβシグナルとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの共存が顕微鏡下で観察され、インターナライズされたＡβが実際にリソソームの中で最後を迎えたことを示した。ヘパリン及びＬＤＬＲ  ｓｉＲＮＡ存在下での細胞内Ａβシグナルの低減は、アストロサイトによる細胞外Ａβのエンドサイトーシス及び微飲作用におけるＨＳＰＧとＬＤＬＲの役割を示した。ＰＰＡＲα又はＴＦＥＢ活性と微飲作用との間の関連は十分わかっていないが、リソソーム生物発生の増加は、飲作用胞のターンオーバーを向上させ、それによりＨＳＰＧが仲介するＡβの取り込みを増加させるように思われる。
【００３２】
ＬＤＬＲのＡβの取り込み及び分解における役割は十分確立されている。先の研究はＬＤＬＲの過剰発現がＡβの沈着を防ぎ、細胞外Ａβの排出を向上させたことを示した（２９）。前記効果は、アルツハイマー病の最も強い遺伝子リスク因子の１つである、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の関与あり又はなしで仲介することができた（２７−２９）。更に、ＬＤＬＲ過剰発現はまた大脳Ａβの脳から血液への輸送率を促進することが示され、それにより、病理的なＡβの脳からの排出を向上させる（３０）。また、ＬＤＬＲがアルツハイマー病の５ＸＦＡＤマウスモデル（５ＸＦＡＤ／ＬＤＬＲ−／−）から除かれた場合、アミロイドβの蓄積の増加とグリア細胞の炎症反応の低減の証拠があり、このことは、神経膠症とＡβ排出におけるＡｐｏＥから独立したＬＤＬＲの役割を示す（３１）。興味深いことに、Ａβ取り込みの別の候補であるＬＤＬＲの発現は、またＰＰＡＲαの活性化によりＳＲＥＢＰ２を介して制御される。ゲムフィブロジルと同じクラスに属する別のフィブラートであるフェノフィブラート（ＦＦ）は、ＰＰＡＲα−ＳＲＥＢＰ２仲介経路における肝臓ＬＤＬＲを上方制御することが示されている（３２）。我々の研究においても、ＰＰＡＲαの活性因子としてよく知られているＧＦＢでの処置は、ＷＴ細胞においてＬＤＬＲ発現を増加させたが、ＰＰＡＲα（−／−）細胞中では増加させなかった。また、アストロサイト中のＬＤＬＲノックダウンは、Ａβ取り込みの向上を減じた。このデータに基づき、我々は、インビトロでマウス初代アストロサイト中でのＡβ取り込みをＬＤＬＲに依存するやり方で促進する場合のＰＰＡＲαの新しい役割（その活性化因子、ＧＦＢも同様に）を明らかにした。
【００３３】
分解アッセイもまた同様のやり方で行った。この場合、細胞を、Ａβを含まない培地で、シグナルを計測する前に、様々な時間、成長させた。ＢａｆＡ１によるリソソーム活動の阻害又はＴＦＥＢのサイレンシングは、Ａβ分解の低減を示し、Ａβ分解におけるリソソームの役割を強めた（１−４２）。しかしながら、我々がＡβ分解をＷＴ、ＰＰＡＲα（−／−）及びＰＰＡＲβ（−／−）細胞中でアッセイした場合、計算はより複雑であった。この場合、我々は３つの異なる細胞タイプ（ＷＴ、ＰＰＡＲα（−／−）及びＰＰＡＲβ（−／−））を有しており、それらはＧＦＢ−ＲＡ処置にＡβ取り込みにおいて差別的な反応を示すものである。したがって、適切な分解評価のため、６時間洗浄後のＡβのレベルを、洗浄前のＡβ（０分洗浄）との倍率変化で、個別に、それぞれのタイプのＧＦＢ−ＲＡ処置細胞について、比較しなければならなかった。
第１段階の導出
ヘキストシグナルで正規化したＡβシグナル＝Ａβnorm（全ての条件について）
第２段階の導出
Ａβnorm（ＤＭＳＯ，０分洗浄）に対して正規化したＡβnorm（Ｔｘ，０分洗浄）＝Ａβfold（Ｔｘ，０分洗浄）
Ａβnorm（ＤＭＳＯ，６時間洗浄）に対して正規化したＡβnorm（Ｔｘ，６時間洗浄）＝Ａβfold（Ｔｘ，６時間洗浄）
第３段階の導出
｛Ａβfold（Ｔｘ，６時間洗浄）／Ａβfold（Ｔｘ，０分洗浄）｝＊  １００  ＝  ％変化
このＡβシグナルの第３段階の導出により、同じ細胞による洗浄前のＡβの純取り込み量と比較した細胞内のＡβ含有量の純減の間で比較することが可能となった。
【００３４】
最終的に、リソソーム活動を、２つの加水分解酵素、カテプシンＢ及びＤの活性をモニタリングすることによって計測した。ＣｔｓＢ及びＣｔｓＤは、２つの公知のＴＦＥＢの直接のターゲットであり、予期される通り、我々はこれら酵素の活性及びレベルの増加を観察した。Ａβ産生のエンドソーム−リソソーム経路において、リソソーム加水分解酵素によって生成したβアミロイド断片は、続いてカテプシンによって分解される（ＣｔｓＢ及びＤ）（８）。カテプシンの阻害は、Ａβ断片の急速な蓄積を引き起こし、その一方で増加したカテプシン活性は、Ａβの効果的な分解及びＡβ斑の低減をもたらすことが示されている（３３）。また、オートファジー向上は、Ａβのリソソーム分解を結果としてもたらし、ニューロンをＡβに誘発される神経毒性から守ることが示されている（３４）。
オートファジープロセスによる異常な又は不適切なＡβの処理はまた、細胞外スペースへの有毒なＡβ断片の分泌を引き起こし、オートファジーの欠陥は、リソソーム中でのＡβの蓄積をもたらし、それによりＬＭＰを引き起こす（１３）。したがって、我々はまた、オートファジーフラックスの変化を、ＬＣ３−ＩからＬ３−ＩＩへの転換及びそれと結合したタンパク質ｐ６２をモニタリングすることによって確認した。微小管結合タンパク質１（ＭＡＰ１）軽鎖３（ＭＡＰ−ＬＣ３又は単にＬＣ３）は自由な溶解性形状（ＬＣ３−Ｉ）で存在し、それはＡｔｇ４の酵素反応によってホスファチジルエタノールアミンと共有結合する（ＬＣ３−ＩＩ）（３５，３６）。オートファジーの誘導を導くシグナルは、転換のきっかけとなる。ＬＣ３−ＩＩはオートファゴソーム膜に結合したままであり、このことは新たなオートファジー液胞の産生に不可欠である（３７，３８）。ＬＣ３−Ｉ／ＩＩのレベルの変化をモニタリングすることは、オートファジー誘導をモニターするためのシンプルかつ効果的な方法であると考えられている（１０）。しかしながら、ＬＣ３−ＩＩレベルの単なる増加は必ずしも完全なオートファジーを示すものではない。ＬＣ３−ＩＩ自身がオートファジー分解の後半段階で分解し、そのことがＬＣ３イムノブロット結果の解釈をより複雑なものとする。
【００３５】
したがって、ＬＣ３−Ｉ／ＩＩレベルをオートファジー活性化因子と阻害因子の両方の存在下でモニタリングすることが、データを解釈するためにより良い方法であると提案されている（３９，４０）。リソソーム阻害条件下でのＬＣ３−ＩＩの蓄積増加は、オートファジーフラックスの持続的な増加のためであるが、リソソーム分解によるＬＣ３−ＩＩの排出を低減した。一方、別のオートファジーマーカーであるｐ６２は、またセクエストソーム１（ＳＱＳＴＭ１）としても知られ、ＬＣ３−ＩＩをオートファゴソームに運び、大多数のｐ６２はオートファゴソーム形成の初期段階で分解される（３９−４２）。ｐ６２とＬＣ３の負の相関が予期され、他のグループ同様我々のデータに認められたように、ＧＦＢ−ＲＡ処置細胞中のオートファジーフラックスの増加を示した。
【００３６】
ＡＰＰ処理、Ａβ産生及び分解におけるオートファジーの役割は広範囲にわたって研究されている。ＡＰＰ処理のエンドソーム−リソソーム経路が、先に議論された通り、病理的Ａβ断片の生成を制御するうえで著しく貢献する（７，９）。ＡＰＰはリソソーム中で処理されるため、リソソーム機能の遮断は、Ａβ分解及び分泌の抑制と同様に、リソソーム内及び外におけるＡβの蓄積をもたらす（４３，４４）。神経芽細胞腫細胞系では、Ｎ２ａ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害は、リソソーム生物発生を促し、リソソーム中でのＡβ分解を促進する（４５）。また、ＬＤＬＲ−関連タンパク質１（ＬＰＲ１）は、ニューロン内でのＡβインターナリゼーション及び分解を仲介する（４６，４７）。多数の受容体、例えば、補体受容体１（ＣＲ１）、スカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ）、ＣＤ３６、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−ｂｅｔａ１）、ミエロイド細胞上に発現した誘発性受容体（ＴＲＥＭ２）等は、細胞外Ａβと相互作用し、Ａβ取り込み及び分解を導くシグナリングメカニズムを誘発するマイクログリアの表面上で確認されている（４８−５１）。Ａβ排出及び分解におけるアストロサイトの役割は、アストロサイトはＡｐｏＥ−Ａβ複合体を細胞外のスペースからインターナリゼーションし、引き続いてそれらを分解又は血管周囲腔に分泌するため、利益になるものと考えられている（５２−５４）。アストロサイトはまた、ＡβをＮＥＰ、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）又はインシュリン分解酵素（ＩＤＥ）の酵素反応によって分解することが可能である（５５−６０）。しかしながら、長時間病理的なＡβに曝されることは、アストロサイトがそのような大量のＡβカーゴを取扱うことを不可能とし、アストロサイト中でのＡβ蓄積をもたらす（６１，６２）。過去数年間、リソソーム生物発生の向上は、Ａβインターナリゼーション及び分解に決定的な役割を果たすことが示されてきた。グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター又はＣＭＶ−プロモーターに動かされた、ＴＦＥＢ遺伝子を有するアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）が、定位的注入により、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬に投与され、これは特にアストロサイト又はニューロンをそれぞれターゲットとしたものである。ＴＦＥＢ過剰発現はリソソーム生物発生の誘導を導き、最終的には、間質液からのアストロサイトによるＡβの取り込み及び排出の向上及びニューロンによるＡＰＰ処理の向上をもたらし、それはＡβ産生を低減する（２３，６３）。これらの研究は、アルツハイマー病におけるアストロサイトのＡβ排出の重要性を明確にするが、薬が仲介するリソソーム生物発生の誘発によるＡβ排出の向上はこれまで十分に研究されてこなかった。
要約すると、フィブラートによるＰＰＡＲαの活性化は、マウス初代アストロサイトによるＡβ取り込み及び排出の向上を導く。この研究の結果は、これまで知られていなかったＰＰＡＲαの性質に脚光を当て、リソソーム貯蔵疾患同様、アルツハイマー病に新しい治療オプションを提供し、ＴＦＥＢによるより動態的な制御を明らかにするものである。
【００３７】
（参考文献）
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【００３８】
本発明はその特定の例示的な実施形態を参照して説明及び例証されているが、該発明がそれら例示的な実施形態に限られることを意図するものではない。下記特許請求の範囲に規定されている本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、変形や修正を施すことは可能であることを当業者であれば認識するであろう。したがって、本発明のすべてのそのような変形及び修正は、添付された特許請求の範囲及びそれと均等な範囲内に含まれることを意図している。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図５Ａ−Ｆ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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