(57)【要約】本発明は、核酸検出および同定のための方法およびシステムを提供する。2019512101.tif 000013
2019512101.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、標的核酸配列の増幅不要な検出方法：
(a)少なくとも1つの標的核酸配列を含むサンプルを提供する工程；
(b)前記サンプルを、核酸部分と正荷電タグとを含むプローブと接触させる工程であって、ここで、該核酸部分が前記標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ここで、該接触が、該核酸部分と相補標的核酸配列との間でプローブ−標的複合体が形成される条件下で行われる、工程；
(c)検出可能な正荷電タグを放出させるために、プローブ−標的複合体内のプローブを開裂する工程；および
(d)電気シグナルの変化に基づいて、ナノ細孔を通る放出された正荷電タグの移動を検出する工程であって、
電気シグナルの変化が、前記サンプル中の前記標的核酸配列の存在を示す、工程。
【請求項２】
前記プローブが、RNA配列、DNA配列、および脱塩基ヌクレオチド配列からなる群より選択される易切断性（scissile）連結をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
易切断性連結が、少なくとも1つのRNA残基を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
易切断性連結が、酸化プリンまたは酸化ピリミジンを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
易切断性連結が、脱プリン部位または脱ピリミジン部位を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
易切断性連結が、デオキシウリジン、5-ヒロキシウラシル（5-hyroxyuracil）、5-ヒドロキシメチルウラシル、または5-ホルミルウラシルを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
易切断性連結が、1型リボヌクレアーゼHまたは2型リボヌクレアーゼHによって開裂される、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
易切断性連結が、DNA N-グリコシラーゼおよびDNA AP-リアーゼ活性の組み合わせによって開裂される、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
易切断性連結が、DNA AP-リアーゼ活性またはエンドデオキシリボヌクレアーゼによって開裂される、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
易切断性連結が、DNA N-グリコシラーゼおよびエンドデオキシリボヌクレアーゼの組み合わせ、またはDNA N-グリコシラーゼおよびDNA AP-リアーゼ活性の組み合わせによって開裂される、請求項2に記載の方法。
【請求項１１】
以下をさらに含む、請求項1に記載の方法：
工程(b)において、前記サンプルをプライマーとさらに接触させることであって、ここで、プライマーが、前記標的核酸配列の、前記プローブと相補的な前記部分の上流にある、前記標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ここで、該接触が、プライマーと相補標的核酸配列との間でプライマー−標的複合体が形成される条件下で行われる、前記サンプルをプライマーとさらに接触させること；および
工程(c)において、プライマー伸長が生じる条件下で、プライマー−標的複合体を含む前記サンプルをDNAポリメラーゼと接触させること。
【請求項１２】
前記プローブが、DNAポリメラーゼによるプライマー伸長中に開裂される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記開裂が、DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって媒介される、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
DNAポリメラーゼによる伸長が、反応物中に存在するdNTPタイプの数によって制限される、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
反応物中に存在するdNTPの数が、4種類のdNTPのうちの1種類、または2種類、または3種類である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
以下をさらに含む、請求項1に記載の方法：
工程(b)において、前記サンプルを少なくとも2つのプライマーとさらに接触させることであって、ここで、少なくとも2つのプライマーが、前記標的核酸配列の、前記プローブと相補的な前記部分に隣接する、前記標的核酸配列中の部分に相補的であり、ここで、該接触が、少なくとも2つのプライマーと相補標的核酸配列との間でプライマー−標的複合体が形成される条件下で行われる、前記サンプルを少なくとも2つのプライマーとさらに接触させること；および
工程(c)において、DNAポリメラーゼを使用して少なくとも2つのプライマー間で前記標的核酸配列を増幅すること。
【請求項１７】
前記標的核酸配列を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または等温反応を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブが、増幅中にDNAポリメラーゼによって開裂される、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記開裂が、DNAポリメラーゼの5'フラップエンドヌクレアーゼ活性によって媒介される、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
前記開裂が、検出可能な正荷電タグの検出をもたらし、これは標的アンプリコンの複製を示す、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
前記プローブが正味の負電荷を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能な正荷電タグが、放出される前および後に正味の正電荷を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
検出可能な正荷電タグが、放出される前および後に正荷電核酸部分、非核酸部分、またはそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触工程が、前記サンプルを複数のプローブと接触させることを含み、該複数のプローブが、各々、少なくとも2つの異なる標的核酸配列に相補的であり、かつ各々、異なる正電荷（量またはタイプ）を有し、ここで、電気シグナル（タイプ／量）が、該少なくとも2つの異なる標的核酸配列を識別することができる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記開裂工程が、プローブを酵素によって開裂することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
検出可能な正荷電タグがナノ細孔を通過する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
検出可能な正荷電タグが、その電荷、形状、サイズ、またはそれらの任意の組み合わせによって検出可能である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出工程が、検出可能な正荷電タグを同定することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
同定されたタグを、前記対応する標的核酸配列の存在と相関させる工程をさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
電気シグナルの量／レベルを前記サンプル中の前記標的核酸配列の量と相関させる工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
コンピュータープロセッサを使用する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能な正荷電タグが、イオン感応性電界効果トランジスタを使用して検出される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程を含む、標的特異的プローブを使用してサンプル中の標的核酸を検出する方法：
(a)複数の一本鎖核酸断片を含むサンプルを提供する工程；
(b)一本鎖環を生成するために、一本鎖核酸を分子内で環状化する工程；
(c)一本鎖環と、少なくとも1つのプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該少なくとも1つのプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、一本鎖環中の相補配列へハイブリダイズし、かつ二本鎖のプライマー−環複合体を形成する、工程；
(d)二本鎖のプライマー−環複合体と酵素とを、ローリングサークル複製が生じる条件下で接触させる工程；
(e)ローリングサークル複製の産物と、標的特異的色素標識ディテクタープローブとを、該標的特異的色素標識ディテクタープローブが該ローリングサークル複製の産物中の相補配列へハイブリダイズする条件下で接触させる工程；ならびに
(f)標的特異的色素標識ディテクタープローブを検出する工程であって、ここで、標的特異的色素標識ディテクタープローブの存在が前記サンプル中の前記標的核酸の存在を示す、工程。
【請求項３４】
標的特異的プローブが固体支持体へ結合されている、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記環状化工程が、一本鎖DNAリガーゼによって媒介される、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
一本鎖環について濃縮するために非環状化線状核酸を酵素によって消化する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３７】
ローリングサークル複製の産物を固体支持体上に堆積させる工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出工程が、画像化を使用して行われる、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出工程が、ローリングサークル複製の産物を固体支持体の表面上に堆積させることを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項４０】
標的特異的色素標識ディテクタープローブを定量化し、かつ標的特異的色素標識ディテクタープローブの量を前記サンプル中の前記標的核酸の量と相関させる工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項４１】
胎児異数性の検出のための出生前検査に使用され、以下をさらに含む、請求項33に記載の方法：
前記サンプル中の複数の一本鎖核酸断片が、胎児および母親の無細胞ゲノムDNAを含む；
少なくとも1つの標的特異的プローブが、複数の染色体特異的プローブを含み、ここで、複数の染色体特異的プローブが、異数性について試験される第1の染色体に対応する少なくとも100個の異なる核酸配列を含むプローブの第1セットと、参照染色体に対応する少なくとも100個の異なる核酸配列を含むプローブの第2セットとを含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体と参照染色体とが異なる；
少なくとも1つの標的特異的プローブが、複数の染色体特異的プローブを含む；
少なくとも1つのプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、複数の染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで、複数の染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、異数性について試験される第1の染色体に由来する一本鎖環に特異的な少なくとも1つの染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーと、参照染色体に由来する一本鎖環に特異的な少なくとも1つの染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを含む；
線状一本鎖産物を生じさせるために、二本鎖のプライマー−環複合体を選択的に増幅すること、
標的特異的色素標識ディテクタープローブが、複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブであり、ここで、複数の染色体特異的ディテクタープローブが、異数性について試験される第1の染色体由来の染色体特異的プローブに相補的である少なくとも1つの染色体特異的ディテクタープローブと、参照染色体由来の染色体特異的プローブに相補的である少なくとも1つの染色体特異的ディテクタープローブとを含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体に特異的な複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブが、第1蛍光色素で標識されており、かつ参照染色体に特異的な複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブが、第2蛍光色素で標識されている、
第1蛍光色素を含む染色体特異的色素標識ディテクタープローブの存在が、胎児異数性の存在を示す。
【請求項４２】
複数の染色体特異的プローブが共通カスタム配列を共有する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
共通カスタム配列が、染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的である領域と、染色体特異的色素標識ディテクタープローブに相補的である領域とを含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
胎児異数性が、トリソミー21、トリソミー18、トリソミー13、モノソミーX、トリプルX症候群、XYY症候群、およびXXY症候群からなる群より選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも2つの異なるヒト染色体に相補的な染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つのセットを含む組成物であって、第1の染色体由来の複数の標的配列に相補的な染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第1セットと、第2の染色体由来の複数の標的配列に相補的な染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第2セットとを含む、前記組成物。
【請求項４６】
少なくとも2つのヒト染色体を検出するための染色体特異的色素標識ディテクタープローブの少なくとも1つのセットを含む組成物であって、第1の染色体に特異的な複数のプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的な染色体特異的色素標識ディテクタープローブの第1セットと、第2の染色体に特異的な複数のプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的な染色体特異的色素標識ディテクタープローブの第2セットとを含む、前記組成物。
【請求項４７】
請求項45に記載の組成物と請求項46に記載の組成物とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年2月20に出願された米国出願第62/297,826号および2016年2月26に出願された米国出願第62/300,623号に対する35 U.S.C. 119(e)下での優先権の恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、一般に、核酸を検出するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
少量の標的核酸の検出は、様々な定性的および／または定量的方法によって行うことができ、これらの大部分は2つの主な戦略 − シグナル増幅、または標的核酸増幅を使用する。後者の方法の中でも特に、特異性の増加のために蛍光標識プローブの様々な設計を用いるqPCR法が、様々な医療および非医療用途についての至適基準であると考えられる。しかし、嵩高い、高価な、かつ／または繊細な設備を必要とすることなく使用現場または臨床現場設定で核酸を検出するための方法および組成物についての必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
概要
一局面において、標的核酸配列の増幅不要な検出方法が提供される。そのような方法は典型的に以下を含む：(a)少なくとも1つの標的核酸配列を含むサンプルを提供する工程；(b)サンプルを、核酸部分と正荷電タグとを含むプローブと接触させる工程であって、ここで、核酸部分が標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ここで、接触が、核酸部分と相補標的核酸配列との間でプローブ−標的複合体が形成される条件下で行われる、工程；(c)検出可能な正荷電タグを放出させるために、プローブ−標的複合体内のプローブを開裂する工程；ならびに(d)電気シグナルの変化に基づいて、ナノ細孔を通る放出された正荷電タグの移動を検出する工程；ここで、電気シグナルの変化が、サンプル中の標的核酸配列の存在を示す。
【０００５】
いくつかの態様において、プローブは、RNA配列、DNA配列、および脱塩基ヌクレオチド配列からなる群より選択される易切断性（scissile）連結をさらに含む。易切断性連結は、少なくとも1つのRNA残基を含み得る。易切断性連結は、酸化プリンまたは酸化ピリミジンを含み得る。易切断性連結は脱プリン部位または脱ピリミジン部位を含み得る。易切断性連結は、デオキシウリジン、5-ヒロキシウラシル（5-hyroxyuracil）、5-ヒドロキシメチルウラシル、または5-ホルミルウラシルを含み得る。易切断性連結は、1型リボヌクレアーゼHまたは2型リボヌクレアーゼHによって開裂することができる。易切断性連結は、DNA N-グリコシラーゼおよびDNA AP-リアーゼ活性の組み合わせによって開裂することができる。易切断性連結は、DNA AP-リアーゼ活性またはエンドデオキシリボヌクレアーゼによって開裂することができる。易切断性連結は、DNA N-グリコシラーゼおよびエンドデオキシリボヌクレアーゼの組み合わせ、またはDNA N-グリコシラーゼおよびDNA AP-リアーゼ活性の組み合わせによって開裂することができる。
【０００６】
いくつかの態様において、方法は以下をさらに含み得る：工程(b)において、サンプルをプライマーとさらに接触させることであって、ここで、プライマーが、プローブと相補的な標的核酸配列の前記部分の上流にある標的核酸配列の少なくとも一部分に相補的であり、ここで、接触が、プライマーと相補標的核酸配列との間でプライマー−標的複合体が形成される条件下で行われる、サンプルをプライマーとさらに接触させること；および、工程(c)において、プライマー伸長が生じる条件下で、プライマー−標的複合体を含むサンプルをDNAポリメラーゼと接触させること。
【０００７】
いくつかの態様において、プローブは、DNAポリメラーゼによるプライマー伸長中に開裂される。いくつかの態様において、開裂は、DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって媒介される。
【０００８】
いくつかの態様において、DNAポリメラーゼによる伸長は、反応物中に存在するdNTPタイプの数によって制限される。いくつかの態様において、反応物中に存在するdNTPの数は、4種類のdNTPのうちの1種類、または2種類、または3種類である。
【０００９】
そのような方法は以下をさらに含み得る：工程(b)において、サンプルを少なくとも2つのプライマーとさらに接触させることであって、ここで、少なくとも2つのプライマーが、プローブと相補的な標的核酸配列の前記部分に隣接する標的核酸配列中の部分に相補的であり、ここで、接触が、少なくとも2つのプライマーと相補標的核酸配列との間でプライマー−標的複合体が形成される条件下で行われる、サンプルを少なくとも2つのプライマーとさらに接触させること；および、工程(c)において、DNAポリメラーゼを使用して少なくとも2つのプライマー間で標的核酸配列を増幅すること。
【００１０】
いくつかの態様において、標的核酸配列を増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または等温反応を含む。いくつかの態様において、プローブは、増幅中にDNAポリメラーゼによって開裂される。いくつかの態様において、開裂は、DNAポリメラーゼの5'フラップエンドヌクレアーゼ活性よって媒介される。いくつかの態様において、開裂は検出可能な正荷電タグの検出をもたらし、これは標的アンプリコンの複製を示す。
【００１１】
いくつかの態様において、プローブは正味の負電荷を含む。いくつかの態様において、検出可能な正荷電タグは、放出される前および後に正味の正電荷を含む。いくつかの態様において、検出可能な正荷電タグは、放出される前および後に正荷電核酸部分、非核酸部分、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、接触工程はサンプルを複数のプローブと接触させることを含み、該複数のプローブは、各々、少なくとも2つの異なる標的核酸配列に相補的であり、かつ各々、異なる正電荷（量またはタイプ）を有し、ここで、電気シグナル（タイプ／量）は、該少なくとも2つの異なる標的核酸配列を識別することができる。いくつかの態様において、開裂工程は、プローブを酵素によって開裂することを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、検出可能な正荷電タグはナノ細孔を通過する。いくつかの態様において、検出可能な正荷電タグは、その電荷、形状、サイズ、またはそれらの任意の組み合わせによって検出可能である。
【００１４】
いくつかの態様において、検出工程は、検出可能な正荷電タグを同定することをさらに含む。いくつかの態様において、方法は、同定されたタグを、対応する標的核酸配列の存在と相関させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、電気シグナルの量／レベルをサンプル中の標的核酸配列の量と相関させる工程をさらに含む。
【００１５】
いくつかの態様において、検出可能な正荷電タグは、イオン感応性電界効果トランジスタを使用して検出される。いくつかの態様において、方法はコンピュータープロセッサを使用する。
【００１６】
別の局面において、標的特異的プローブを使用してサンプル中の標的核酸を検出する方法が提供される。そのような方法は典型的に以下を含む：(a)複数の一本鎖核酸断片を含むサンプルを提供する工程；(b)一本鎖環を生成するために、一本鎖核酸を分子内で環状化する工程；(c)一本鎖環と、少なくとも1つのプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該少なくとも1つのプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、一本鎖環中の相補配列へハイブリダイズし、かつ二本鎖のプライマー−環複合体を形成する、工程；(d)二本鎖のプライマー−環複合体と酵素とを、ローリングサークル複製が生じる条件下で接触させる工程；(e)ローリングサークル複製の産物と、標的特異的色素標識ディテクタープローブとを、該標的特異的色素標識ディテクタープローブが該ローリングサークル複製の産物中の相補配列へハイブリダイズする条件下で接触させる工程；ならびに(f)標的特異的色素標識ディテクタープローブを検出する工程であって、ここで、標的特異的色素標識ディテクタープローブの存在がサンプル中の標的核酸の存在を示す、工程。
【００１７】
いくつかの態様において、標的特異的プローブは固体支持体へ結合されている。いくつかの態様において、環状化工程は、一本鎖DNAリガーゼよって媒介される。いくつかの態様において、方法は、一本鎖環について濃縮するために非環状化線状核酸を酵素によって消化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、ローリングサークル複製の産物を固体支持体上に堆積させる工程をさらに含む。
【００１８】
いくつかの態様において、検出工程は、画像化を使用して行われる。いくつかの態様において、検出工程は、ローリングサークル複製の産物を固体支持体の表面上に堆積させることを含む。
【００１９】
いくつかの態様において、方法は、標的特異的色素標識ディテクタープローブを定量化し、かつ標的特異的色素標識ディテクタープローブの量をサンプル中の標的核酸の量と相関させる工程をさらに含む。
【００２０】
いくつかの態様において、方法は、胎児異数性の検出のための出生前検査に使用され、かつ以下をさらに含む：サンプル中の複数の一本鎖核酸断片が、胎児および母親の無細胞ゲノムDNAを含む；少なくとも1つの標的特異的プローブが、複数の染色体特異的プローブを含み、ここで、複数の染色体特異的プローブが、異数性について試験される第1の染色体に対応する少なくとも100個の異なる核酸配列を含むプローブの第1セットと、参照染色体に対応する少なくとも100個の異なる核酸配列を含むプローブの第2セットとを含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体と参照染色体とが異なる；少なくとも1つの標的特異的プローブが、複数の染色体特異的プローブを含む；少なくとも1つのプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、複数の染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで、複数の染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、異数性について試験される第1の染色体に由来する一本鎖環に特異的な少なくとも1つの染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーと、参照染色体に由来する一本鎖環に特異的な少なくとも1つの染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを含む；線状一本鎖産物を生じさせるために、二本鎖のプライマー−環複合体を選択的に増幅すること；標的特異的色素標識ディテクタープローブが、複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブであり、ここで、複数の染色体特異的ディテクタープローブが、異数性について試験される第1の染色体由来の染色体特異的プローブに相補的である少なくとも1つの染色体特異的ディテクタープローブと、参照染色体由来の染色体特異的プローブに相補的である少なくとも1つの染色体特異的ディテクタープローブとを含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体に特異的な複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブが、第1蛍光色素で標識されており、かつ参照染色体に特異的な複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブが、第2蛍光色素で標識されている；第1蛍光色素を含む染色体特異的色素標識ディテクタープローブの存在が、胎児異数性の存在を示す。
【００２１】
いくつかの態様において、複数の染色体特異的プローブは共通カスタム配列を共有する。いくつかの態様において、共通カスタム配列は、染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的である領域と、染色体特異的色素標識ディテクタープローブに相補的である領域とを含む。
【００２２】
代表的な胎児異数性としては、非限定的に、トリソミー21、トリソミー18、トリソミー13、モノソミーX、トリプルX症候群、XYY症候群、およびXXY症候群が挙げられる。
【００２３】
別の局面において、少なくとも2つの異なるヒト染色体に相補的な染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つのセットを含む組成物であって、第1の染色体由来の複数の標的配列に相補的な染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第1セットと、第2の染色体由来の複数の標的配列に相補的な染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第2セットとを含む組成物が提供される。
【００２４】
別の局面において、少なくとも2つのヒト染色体を検出するための染色体特異的色素標識ディテクタープローブの少なくとも1つのセットを含む組成物であって、第1の染色体に特異的な複数のプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的な染色体特異的色素標識ディテクタープローブの第1セットと、第2の染色体に特異的な複数のプローブ特異的オリゴヌクレオチドプライマーに相補的な染色体特異的色素標識ディテクタープローブの第2セットとを含む組成物が提供される。
【００２５】
さらに別の局面において、本明細書に記載の組成物の両方を含むキットが提供される。
【００２６】
本明細書において以下が提供される：電子的に検出可能な正荷電タグを有するプローブを含む、核酸「増幅不要な」および「増幅を伴う」方法および検出組成物を含む、標的核酸の電子的検出の方法およびシステム；ならびに、温度コントロール、2つのチャンバ、増幅器を備える回路基板、少なくとも1つのナノ細孔を有する電気抵抗バリア、およびシグナル処理ソフトウェアを含む、集積ナノ細孔ディテクターを有するマイクロ流体デバイスを含む、正荷電タグの検出システム；標的増幅およびナノ細孔センサー検出を行うためのキット。
【００２７】
一局面において、標的核酸の検出方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、以下を含む、直接標的検出方法である：少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含むサンプルを提供する工程、標的配列に相補的な部分と検出可能な正荷電タグとを含むプローブを提供する工程、プローブ−標的複合体を形成するための標的ポリヌクレオチド配列へのプローブのハイブリダイゼーションのための条件、およびその後の検出可能タグのハイブリダイゼーション依存性酵素開裂（ここで、タグがプローブから放出される）のための条件を提供する工程、ナノ細孔を通っての該放出タグ流動のための条件を提供する工程、電極の助けを借りてタグを検出する工程であって、ここで、タグが、該プローブから放出された後の電気シグナルの発生によって検出され；そしてここで、該タグ検出が、該タグを同定することをさらに含み；そしてここで、特異的検出可能タグの検出が、今度は開裂事象、従って標的を検出する、工程、検出された電気シグナルをサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド配列の量と相関させる工程。
【００２８】
いくつかの態様において、工程(a)の標的ポリヌクレオチド配列は、二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチド断片に存在する。いくつかの態様において、工程(a)の標的ポリヌクレオチド断片は、デオキシリボヌクレオチド酸またはリボヌクレオチド酸である。いくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド断片は、ウイルス、細菌、真菌、およびより高等な真核生物のDNAおよびRNAの様々な種類を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、工程(b)のプローブは、標的に相補的な負荷電オリゴヌクレオチド配列および正荷電タグを含む。いくつかの態様において、正荷電タグは、負荷電相補部分の5'または3'末端へ結合される。いくつかの態様において、2つの異なるタグが、プローブの相補部分へ結合される：一方は5'末端へ、別のものは3'末端へ。いくつかの態様において、多重標的検出について、タグは、正電荷の数および／または化学構造が異なり、差次的タグ同定のための手段を提供する。いくつかの態様において、化学構造の差は、化合物の質量および形状の差をさらに含む。正荷電タグは、標的配列へのプローブハイブリダイゼーション後、開裂除去され得る。
【００３０】
いくつかの態様において、工程(c)のプローブ−標的複合体を形成するために、標的ポリヌクレオチド配列への工程(b)のプローブのハイブリダイゼーションについての化学的および熱的条件を提供する。いくつかの態様において、検出可能タグのハイブリダイゼーション依存性開裂のための条件を提供し、ここでタグがプローブから放出される。いくつかの態様において、タグの開裂は、標的ポリヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーション、およびプローブ中に存在する易切断性連結の酵素触媒分解の両方に依存する。いくつかの態様において、開裂は、標的に相補的なプローブの部分内にあり、この部分と検出可能タグとの間の接合点に隣接している。いくつかの態様において、放出されるタグは、プローブの標的相補部分に由来するいくつかのヌクレオチド（負荷電）を含有するが、放出される検出可能タグの全体的電荷はプラスである。
【００３１】
いくつかの態様において、工程(d)で、電位を、マイクロ流体チップの電解質溶液含有シス-およびトランス-チャンバにわたって印加し、ここで、チャンバは、少なくとも1つの埋め込まれたナノ細孔を有する電気抵抗バリアによって分離されている。これは、正味の負電荷を有する非開裂プローブ、負荷電プライマー、標的核酸、および増幅産物がシス-チャンバに残る一方、正味正荷電タグがナノ細孔を通っての流動によってシス-チャンバ(+)からトランス-チャンバ(-)へ移動するための条件を提供する。いくつかの態様において、電位を、開裂反応の全期間の間連続的に、または一定の時間間隔でのパルスで、印加する（リアルタイム検出モード）。いくつかの態様において、ナノ細孔を通っての放出タグ流動のための条件を、開裂反応の完了後に提供する（エンドポイント検出モード）。
【００３２】
いくつかの態様において、放出されたタグは、異なる程度および期間で、ナノ細孔を通るイオン電流をブロックし、従って、コンダクタンスの変化を生じさせる。いくつかの態様において、電子的変化は各タグについて異なり、それによって該タグを同定する。いくつかの態様において、タグの検出は、今度は開裂事象、従って標的核酸の存在を検出する。
【００３３】
いくつかの態様において、電子的変化の数は、ナノ細孔を通って流動するタグの数に対応し、それによって、検出された電気シグナルの数をサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド配列の量と相関させる。いくつかの態様において、タグ識別子である、コンダクタンス変化の程度は、サンプル中の特定の標的配列の量と相関し、それによって、サンプル中の各標的の定量化を可能にする。
【００３４】
別の局面において、同時に複数の標的を検出すること（多重化と呼ばれる）が提供される。いくつかの態様において、標的の検出は本明細書に記載されるように行われる。
【００３５】
別の局面において、標的核酸の追加の検出方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、核酸増幅を使用する標的検出方法であり、それは以下を含む：少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含むサンプルを提供する工程、少なくとも1対の核酸増幅プライマーを提供する工程、標的配列に相補的な部分と検出可能な正荷電タグとを含むプローブを提供する工程、ポリメラーゼ駆動核酸増幅を行う工程、プローブ−標的複合体を形成するための標的ポリヌクレオチド配列へのプローブのハイブリダイゼーションのための条件、およびその後の検出可能タグのハイブリダイゼーション依存性酵素開裂（ここで、タグがプローブから放出される）のための条件を提供する工程、ナノ細孔を通っての該放出タグ流動のための条件を提供する工程；電極の助けを借りてタグを検出する工程であって、ここで、タグが、該プローブから放出された後の電気シグナルの発生によって検出され；そしてここで、該タグ検出が、該タグを同定することをさらに含み；そしてここで、特異的検出可能タグの検出が、今度は開裂事象、従って標的アンプリコンの複製を検出する、工程、検出された電気シグナルをサンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド配列の量と相関させる工程。
【００３６】
いくつかの態様において、標的核酸は、指数関数的に増幅されるDNA領域、アンプリコンの位置およびサイズ／長さを選択するために、工程(b)の少なくとも1対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。いくつかの態様において、標的核酸を線状に増幅するために、1つのプライマーが使用され得る。
【００３７】
いくつかの態様において、工程(d)のポリメラーゼ駆動核酸増幅は、指数関数的であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。いくつかの態様において、工程(d)のポリメラーゼ駆動核酸増幅は線状であり、例えば、1つのプライマーを用いてのポリメラーゼサーモサイクリング反応である。いくつかの態様において、工程(d)のポリメラーゼ駆動核酸増幅はサーモサイクリングPCRである。いくつかの態様において、工程(d)のポリメラーゼ駆動核酸増幅は、等温増幅反応、例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）である。
【００３８】
いくつかの態様において、工程(e)のプローブ−標的複合体を形成するために、標的ポリヌクレオチド配列への工程(c)のプローブのハイブリダイゼーションについての化学的および熱的条件が提供される。いくつかの態様において、検出可能タグのハイブリダイゼーション依存性開裂のための条件が提供され、ここでタグがプローブから放出される。いくつかの態様において、タグの開裂は、プローブのハイブリダイゼーション、およびDNA合成中のプローブのポリメラーゼ触媒開裂の両方に依存し、ここで、開裂の位置は厳密に固定されない。いくつかの態様において、開裂は、DNAポリメラーゼ以外の酵素によって行われ、プローブの相補部分内のその位置は、プローブの易切断性連結の位置によって固定および決定される。いくつかの態様において、工程(e)の開裂は、標的に相補的なプローブの部分内にあり、この部分と検出可能タグとの間の接合点に隣接している。いくつかの態様において、放出されるタグは、プローブの標的相補部分に由来するいくつかのヌクレオチド（負荷電）を含有するが、放出される検出可能タグの全体的電荷はプラスである。
【００３９】
いくつかの態様において、放出されたタグは、異なる程度に、ナノ細孔を通るイオン電流をブロックし、従って、コンダクタンスの変化を生じさせる。いくつかの態様において、電子的変化は各タグについて異なり、それによって該タグを同定する。いくつかの態様において、タグの検出は、今度は開裂事象、従って標的アンプリコンの複製を検出する。
【００４０】
さらに別の局面において、入力ポートおよび集積ナノ細孔ディテクター（センサー）チップを有するマイクロ流体デバイスを含む、標的核酸検出のシステムが提供される。デバイスは、温度コントロール、導電性溶液と接触している対応する電極を有する2つの（シス-およびトランス-）チャンバ；2つの電解質溶液を分離するナノメートルスケールの直径を有する埋め込まれたナノ細孔を有する電気抵抗バリア、集積検知回路、およびシグナル処理ソフトウェアを含む。いくつかの態様において、ナノ細孔はソリッドステートナノ細孔であり得、他の態様においてそれは生物学的ナノ細孔であり得る。いくつかの態様において、複数のナノ細孔ディテクターがナノ細孔アレイを形成し得る。いくつかの態様において、ナノ細孔ディテクターは個々にアドレス可能である。
【００４１】
さらに別の局面において、以下を含む、コンダクタンス測定システムが提示される：(a)電解質溶液を有する2つのチャンバを分離する電気抵抗バリア；(b)該電気抵抗バリアは少なくとも1つのナノ細孔を含む；(c)シス-チャンバ中の電解質溶液中のタグを有する少なくとも1つのプローブ；(d)該少なくとも1つのナノ細孔は、イオン電流が、印加される電位によって電解質溶液にわたって駆動されることを可能にすることができる；(e)増幅不要な直接検出、またはDNA増幅連動検出を行い、プローブから検出可能タグを放出させるように構成された、少なくとも1つの標的核酸および生化学反応成分；(f)イオン電流を測定する手段；(g)時系列としてコンダクタンス時間経過を記録する手段。
【００４２】
さらに別の局面において、塞がれていない細孔および流動タグによって一時的に塞がれた細孔のコンダクタンスと統計的に一致する領域へコンダクタンス時系列のセグメントを線引きし、そして種類別にタグを定量化し、そしてこれらのデータをサンプル中に存在する標的核酸の量へ変換する方法が提供される。
【００４３】
さらに別の局面において、本明細書に記載されるような核酸の検出方法を行うためのキットが提供される。
【００４４】
核酸の断片を含むサンプル中の標的核酸の検出の方法および組成物がさらに本明細書において提供される。いくつかの方法は、標的特異的プローブの環状化、およびその後のプローブ増幅、標的の検出および計数を含む。他の方法は、サンプル中に存在する核酸の断片の環状化、標的核酸を含む環状化断片の選択的線状増幅、および増幅産物の検出を含む。さらに、一般的な染色体異数性を検出するための、母体血中を循環する無細胞DNAを使用する無侵襲的出生前検査（NIPT）の方法が提供される。組成物は、複数の標的特異的プローブセット、プローブセット特異的ディテクタープローブ、および標的特異的ディテクタープローブを含み得る。
【００４５】
一局面において、標的特異的プローブを使用するサンプル中の標的核酸の検出方法が提供され（図9A）、該方法は以下を含む：複数のポリヌクレオチド断片を含むサンプルを提供する工程；ポリヌクレオチド断片が一本鎖形態へ変換される変性条件を提供する工程；サンプルを少なくとも1つの標的特異的プローブと接触させる工程；アニーリング／ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのための条件を提供する工程であって、該条件下で、標的特異的プローブは核酸断片内のその標的配列へハイブリダイズし、ライゲーション産物を生じさせ、各ライゲーション産物は、少なくとも1つのライゲーション接合点を含む線状ポリヌクレオチドである、工程；線状ポリヌクレオチドの分子内環状化のための条件を提供する工程であって、一本鎖環を形成させるための、該線状ポリヌクレオチドの遊離末端のライゲーションのための条件を含む、工程；非環状化線状核酸を酵素によって消化することによって、一本鎖環を濃縮する工程；一本鎖環を+プローブ特異的または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、アニーリング条件を含み、この条件下で、プライマーが環の相補配列へハイブリダイズし、DNA合成の開始に適した二本鎖のプライマー−環複合体を形成する、工程；プライマー-環複合体のローリングサークル複製のための条件を提供する工程；ローリングサークル複製の産物を検出する工程であって、固相上に該産物を堆積させること、該産物を標的特異的色素標識ディテクタープローブとハイブリダイズさせること、および画像化することを含み、ここで、該産物の検出がサンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、工程；ならびに、検出された色素特異的シグナルを有する産物を計数し、そして検出されたローリングサークル複製の産物を、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド配列の量と相関させる工程。
【００４６】
いくつかの態様において、(a)のサンプルは、断片化デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含む。いくつかの態様において、核酸断片は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、より高等な真核生物、またはヒトのDNAおよびRNAの様々な種類を含む。
【００４７】
いくつかの態様において、リボ核酸の断片を、逆転写のプロセスによってデオキシリボ核酸へ変換し、ここで、リボ核酸鋳型鎖をリボヌクレアーゼによって消化する。
【００４８】
いくつかの態様において、ホスファターゼでの処理を含む、ポリヌクレオチド断片の末端の脱リン酸化のための条件が、工程(c)の前に提供される。
【００４９】
いくつかの態様において、工程(c)の標的特異的プローブは、標的配列に非相補的な5'末端部および標的配列に相補的な3'末端部を含有する左アームオリゴヌクレオチド、ならびに標的配列に相補的な5'末端部および標的配列に相補的でない3'末端部を含有する右アームオリゴヌクレオチドを含み、その結果、左アームおよび右アームと標的断片とのハイブリダイゼーションで、二本鎖複合体が形成し、ここで、左アームの3'末端は右アームの5'末端と並んで位置し、ここで、ライゲーションの条件下で、左アームの3'末端は右アーム5'末端へライゲートされ、ライゲーション接合点を形成し、従って、核酸の連続線状鎖を含むライゲーション産物を生じさせる。
【００５０】
いくつかの態様において、工程(c)の標的特異的プローブは、標的配列に非相補的な5'末端部および標的配列に相補的な3'末端部を含有する左アームオリゴヌクレオチド、ならびに標的配列に相補的な5'末端部および標的配列に相補的でない3'末端部を含有する右アームオリゴヌクレオチド、ならびに標的配列に相補的なブリッジオリゴヌクレオチドを含み、その結果、左アーム、右アーム、およびブリッジと標的断片とのハイブリダイゼーションで、二本鎖複合体が形成し、ここで、左アームの3'末端はブリッジオリゴヌクレオチドの5'末端と並んで位置し、右アームの5'末端はブリッジオリゴヌクレオチドの3'末端と並んで位置し、ここで、ライゲーションの条件下で、左アームの3'末端はブリッジの5'末端へライゲートされ、第1ライゲーション接合点を形成し、ブリッジの3'末端は右アームの5'末端へライゲートされ、第2ライゲーション接合点を形成し、従って、核酸の連続線状鎖を含む二重ライゲーション産物を生じさせる。
【００５１】
いくつかの態様において、標的に相補的でない、プローブの左アームおよび右アーム部分は、各々、ローリングサークル複製プライマーのアニーリングのために使用されるカスタム配列、または色素標識されたプローブ特異的ディテクタープローブのハイブリダイゼーションのために使用されるカスタム配列、または両方のいずれかを含む。いくつかの態様において、これらの2つの該カスタム配列は、同じアーム上、または異なるアーム上に配置される。いくつかの態様において、これらの2つの該配列のいずれかが左アームおよび右アームに分割され、その結果、その完全性および機能性は、工程(e)で形成される線状ポリヌクレオチドの環状化の際にのみ回復される。
【００５２】
いくつかの態様において、工程(e)のライゲーション産物は、各々、第1および第2ライゲーション接合点を含む、二重ライゲーション産物である。
【００５３】
いくつかの態様において、工程(d)で生成された線状ポリヌクレオチドの分子内環状化のための工程(e)の条件を提供する工程は、一本鎖DNAリガーゼの助けを借りての線状一本鎖ポリヌクレオチドの5'および3'末端のライゲーションを含み、ここで、ライゲーションの条件下で、線状ポリヌクレオチドの5'末端と線状ポリヌクレオチドの3'末端とがライゲートされ、従って、核酸の連続環状鎖を含むライゲーション産物を生じさせる。例示的な一本鎖DNAリガーゼは、CircLigase（商標）、CircLigase II（商標）（Epicentre）、およびThermophageリガーゼ（Prokaria）である。
【００５４】
いくつかの態様において、工程(d)で生成された線状ポリヌクレオチドの分子内環状化のための工程(e)の条件を提供する工程は、二本鎖DNAリガーゼ、例えばT4 DNAリガーゼ、ならびに線状ポリヌクレオチドの5'末端および3'末端配列の両方に相補的なオリゴヌクレオチドを含むスプリントオリゴヌクレオチドの助けを借りての線状一本鎖ポリヌクレオチドの5'および3'末端のライゲーションを含み、その結果、両末端がスプリントオリゴヌクレオチドへハイブリダイズし、二本鎖複合体を生じさせ、ここで、線状ポリヌクレオチドの5'末端は、線状ポリヌクレオチドの3'末端と並んで位置し、ここで、ライゲーションの条件下で、線状ポリヌクレオチドの5'末端と線状ポリヌクレオチドの3'末端とがライゲートされ、従って、核酸の連続環状鎖を含むライゲーション産物を生じさせる。
【００５５】
いくつかの態様において、工程(f)の一本鎖環を濃縮する工程は、1つまたは複数のエキソヌクレアーゼの助けを借りて非環状化線状断片を消化することを含む。
【００５６】
いくつかの態様において、工程(g)のプライマーは、工程(h)でのローリングサークル複製の特異性を高めるために、ヘアピンプライマー、またはブロックされた開裂可能なrhPCR（RNase H依存性PCR、IDT）プライマー、またはブロックされた開裂可能な3'末端を有するヘアピンプライマーを含む。
【００５７】
いくつかの態様において、本開示の方法は、複数の標的の同時検出（多重検出、または多重化と呼ばれる）を含み、ここで、複数の標的特異的プローブが使用され、標的特異的またはプローブ特異的ディテクタープローブは、蛍光色素で差次的に標識されている。
【００５８】
いくつかの態様において、多重検出のために、標的特異的ディテクタープローブは、標識パラダイムである、“Multicolor Combinatorial Probe Coding”（MCPC）（Qiuying Huang, et al. (2011), PLoS ONE Volume 6, Issue 1, e16033）に従う蛍光色素で標識されたプローブを含み、この標識パラダイムは、各プローブを標識するために様々な組み合わせで限定数(n)の異なった色のフルオロフォアを使用し、2n -1個の標的の全てが1つの反応で検出されることを可能にする。
【００５９】
本明細書において、染色体特異的または遺伝子座特異的標的ポリヌクレオチドの検出および定量化を含む、胎児異数性の検出のための無侵襲的出生前検査へ適用されるような方法および組成物（図9B）がさらに提供され、ここで、複数のプローブセットおよびそれらの対応するディテクタープローブの各々は、単一の染色体または染色体遺伝子座に特異的であり、ここで、染色体は、異数性の影響を受けやすい染色体および参照染色体のリストより選択される。胎児異数性の検出のための出生前検査の方法、該方法は以下を含む：複数のポリヌクレオチド断片を含むサンプルを提供する工程であって、ここで、ポリヌクレオチド断片が胎児および母親の無細胞ゲノムDNAを含む、工程；ポリヌクレオチド断片が一本鎖形態へ変換される変性条件を提供する工程；サンプルを複数の染色体特異的プローブと接触させる工程であって、ここで、プローブは標的染色体の相補配列へ特異的にアニールし、二本鎖複合体を形成し、ここで、該複数の染色体特異的プローブは、異数性について試験される第1の染色体より選択される少なくとも100個の異なるポリヌクレオチド配列（第1の染色体についてのプローブセット）、および参照染色体より選択される少なくとも100個の異なるポリヌクレオチド配列（参照染色体についてのプローブセット）を含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体と参照染色体とが異なる、工程；ハイブリダイゼーションおよびライゲーションのための条件を提供する工程であって、該条件下で、複数の染色体特異的プローブは核酸断片内のその標的配列へハイブリダイズし、複数の染色体特異的ライゲーション産物を生じさせ、各ライゲーション産物は、少なくとも1つのライゲーション接合点を含む線状ポリヌクレオチドである、工程；複数の線状ポリヌクレオチドの分子内環状化のための条件を提供する工程であって、複数の染色体特異的一本鎖環を形成させるための、該線状ポリヌクレオチドの遊離末端のライゲーションのための条件を含む、工程；非環状化線状核酸を酵素によって消化することによって、一本鎖環を濃縮する工程；一本鎖環を複数の染色体特異的オリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、アニーリング条件を含み、この条件下で、プライマーが染色体特異的環の相補配列へハイブリダイズし、DNA合成の開始に適した二本鎖のプライマー−環複合体を形成し、ここで、該複数が、異数性について試験される第1の染色体に由来する環に特異的な少なくとも1つのプライマーと、参照染色体に由来する環に特異的な少なくとも1つのプライマーとを含む、工程；染色体特異的プライマー−環複合体のローリングサークル複製のための条件を提供する工程であって、ここで、異数性について試験される第1の染色体に由来する環および参照染色体に由来する環が、選択的に増幅され、長い線状一本鎖産物を生じさせる、工程；ローリングサークル複製の産物を検出する工程であって、固相上に該産物を堆積させること、該産物を複数の染色体特異的色素標識ディテクタープローブとハイブリダイズさせること、および画像化することを含み、ここで、該複数の染色体特異的ディテクタープローブは、異数性について試験される第1の染色体より選択される工程(c)の染色体特異的プ���ーブセットのカスタム配列に相補的な少なくとも1つのポリヌクレオチド配列と、参照染色体より選択される工程(c)の染色体特異的プローブセットのカスタム配列に相補的な少なくとも1つのポリヌクレオチド配列とを含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体と参照染色体とが異なり、ここで、異数性について試験される第1の染色体に特異的な複数のディテクタープローブは、参照染色体に特異的な複数のディテクタープローブの蛍光色素とは異なる、同一蛍光色素で標識されており、ここで、該産物の検出がサンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、工程；色素特異的シグナルを示す産物を計数する工程であって、異数性について試験される第1の染色体に特異的な胎児および母親ポリヌクレオチド断片に対応するローリングサークル複製産物、ならびに参照染色体に特異的な産物を計数することを含む、工程；無細胞DNAサンプルについて、胎児異数性の存在または非存在を決定する工程であって、(j)の、第1の染色体に対応する計数されたローリングサークル複製産物の数および参照染色体に対応する計数されたローリングサークル複製産物の数を使用することを含む、工程。
【００６０】
いくつかの態様において、異数性について試験される第1の染色体は、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体、およびY染色体からなる群より選択され；かつ、参照染色体は、1番染色体、2番染色体、および3番染色体からなる群より選択される。
【００６１】
いくつかの態様において、方法は、トリソミー21、トリソミー18、トリソミー13、およびモノソミーXを含む、ヒト集団において検出される主要な異数性を調べる。
【００６２】
別の局面において、サンプルの核酸断片の環状化を使用するサンプル中の標的核酸の検出方法（図9C）が提供され、該方法は以下を含む：複数のポリヌクレオチド断片を含むサンプルを提供する工程；5'リン酸基および3'ヒドロキシル基の回復を含むポリヌクレオチド断片の末端修復のための条件を提供する工程；ポリヌクレオチド断片が一本鎖形態へ変換される変性条件を提供する工程；ポリヌクレオチド断片の分子内環状化のための条件を提供する工程であって、リガーゼおよび補因子を含み、一本鎖環を形成させる、工程；非環状化線状断片を酵素によって消化することによって、一本鎖環を濃縮する工程；一本鎖環を、デオキシリボ核酸合成のプライマーを含む少なくとも1つの標的特異的オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、アニーリング条件を含み、この条件下で、プライマーが環状標的ポリヌクレオチドの相補配列へハイブリダイズし、二本鎖複合体を形成する、工程；標的特異的プライマー−環複合体のローリングサークル複製のための条件を提供する工程；ローリングサークル複製の産物を検出する工程であって、固相上に該産物を堆積させること、該産物を標的特異的色素標識ディテクタープローブとハイブリダイズさせること、および画像化することを含み、ここで、該産物の検出がサンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、工程；ならびに、検出された色素特異的シグナルを有する産物を計数し、そして検出されたローリングサークル複製の産物を、サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチド配列の量と相関させる工程。
【００６３】
いくつかの態様において、(a)のサンプルは、断片化デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含む。いくつかの態様において、核酸断片は、ウイルス、細菌、酵母、真菌、およびより高等な真核生物のDNAおよびRNAの様々な種類を含む。
【００６４】
いくつかの態様において、リボ核酸の断片を、逆転写のプロセスによってデオキシリボ核酸へ変換する。
【００６５】
いくつかの態様において、工程(b)のポリヌクレオチド断片の末端修復のための条件を提供する工程は、ポリヌクレオチドキナーゼでのサンプルの処理を含む。
【００６６】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチド断片の分子内環状化のための工程(d)の条件を提供する工程は、一本鎖DNAリガーゼの助けを借りての線状一本鎖ポリヌクレオチド断片の5'および3'末端のライゲーションを含み、ここで、ライゲーションの条件下で、線状ポリヌクレオチドの5'末端と線状ポリヌクレオチドの3'末端とがライゲートされ、従って、核酸の連続環状鎖を含むライゲーション産物を生じさせる。例示的なssDNAリガーゼは、CircLigase（商標）、CircLigase II（商標）（Epicentre）、およびThermophageリガーゼ（Prokaria）である。
【００６７】
いくつかの態様において、工程(f)のプライマーは、工程(g)でのローリングサークル複製の特異性を高めるために、ヘアピンプライマー、またはブロックされた開裂可能なrhPCR（RNase H依存性PCR）プライマー、またはブロックされた開裂可能な3'末端を有するヘアピンプライマーを含む。
【００６８】
いくつかの態様において、本開示の方法は、複数の標的の同時検出（多重検出、または多重化と呼ばれる）を含み、ここで、標的特異的ディテクタープローブは、識別可能な蛍光色素で標識されている。
【００６９】
いくつかの態様において、多重検出のために、標的特異的ディテクタープローブは、標識パラダイムである、“Multicolor Combinatorial Probe Coding”（MCPC）（Qiuying Huang, et al. (2011), PLoS ONE Volume 6, Issue 1, e16033）に従う蛍光色素で標識されたプローブを含み、この標識パラダイムは、各プローブを標識するために様々な組み合わせで限定数(n)の異なった色のフルオロフォアを使用し、2n -1個の標的の全てが1つの反応で検出されることを可能にする。
【００７０】
いくつかの態様において、工程(g)は、非標識dNTP、または蛍光標識dNTP、または特定の比率での両方の組み合わせの存在下でのローリングサークル複製を含む。いくつかの態様において、工程(h)の産物を検出する工程は、固相上に該産物を堆積させること、および蛍光を画像化することを含む。
【００７１】
いくつかの態様において、工程(g)は、パルス追跡反応を含み、ここで、非標識dNTPの存在下でのローリングサークル複製の時間経過中、蛍光標識dNTPを特定の時点で添加し、複製産物が蛍光標識されるまで反応を継続する。
【００７２】
いくつかの態様において、多重検出は、工程(a)から工程(e)までの、任意の方法工程後に、サンプルを2つ以上の部分に分割すること、およびサンプル中に存在する各標的核酸の検出を別々に行うことを含む。
【００７３】
いくつかの態様において、多重化は、サンプルを分割すること、および専用のコンパートメント中において各標的について別々にローリングサークル複製を行うことを含み、ここで、該ローリングサークル複製を、特定の比率で蛍光標識dNTPと混合された非標識dNTPの存在下で行い、ここで、異なる色のフルオロフォアが異なるdNTPへ結合されており、そしてここで、限られた数の異なる色のdNTPの様々な組み合わせならびに非標識および蛍光標識dNTP間の様々な比率を使用し、着色フルオロフォアの数よりも高いレベルの多重化を達成する。いくつかの態様において、ローリングサークル複製の産物を一緒にプールし、その後、検出および逆多重化のために固体基体上にそれらを堆積させる。
【００７４】
別の局面において、胎児および母親の無細胞ゲノムDNAを含むサンプル中の染色体異数性の検出方法（図9D）が提供され、該方法は以下を含む：複数のポリヌクレオチド断片を含むサンプルを提供する工程であって、ここで、ポリヌクレオチド断片が胎児および母親の無細胞ゲノムDNAを含む、工程；5'リン酸基および3'ヒドロキシル基の回復を含むポリヌクレオチド断片の末端修復のための条件を提供する工程；ポリヌクレオチド断片が一本鎖形態へ変換される変性条件を提供する工程；ポリヌクレオチド断片の分子内環状化のための条件を提供する工程であって、リガーゼおよび補因子を含み、一本鎖環を形成させる工程；非環状化線状断片を酵素によって消化することによって、一本鎖環を濃縮する工程；プライマーが環の相補配列へ特異的にハイブリダイズし二本鎖のプライマー−環複合体を形成する条件下で、一本鎖環を、DNA合成のプライマーを含む複数の染色体特異的オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここで、該複数の染色体特異的プライマーは、異数性について試験される第1の染色体より選択される少なくとも100個の異なるポリヌクレオチド配列、および参照染色体より選択される少なくとも100個の異なるポリヌクレオチド配列を含み、ここで、異数性について試験される第1の染色体と参照染色体とが異なる、工程；染色体特異的プライマー−環複合体のローリングサークル複製のための条件を提供する工程であって、ここで、異数性について試験される第1の染色体に由来する環および参照染色体に由来する環が、選択的に増幅され、長い線状一本鎖産物（各々、少なくとも200コピーの環状化標的染色体断片を含む）を生じさせる、工程；ローリングサークル複製の産物を検出する工程であって、固相上に該産物を堆積させること、該産物を複数の標的特異的色素標識ディテクタープローブとハイブリダイズさせること、および画像化することを含み、ここで、該複数の標的特異的ディテクタープローブは、異数性について試験される第1の染色体より選択される工程(f)のプライマーに完全にまたは部分的に相補的な少なくとも100個の異なるオリゴヌクレオチド配列、および参照染色体より選択される工程(f)のプライマーに相補的な少なくとも100個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み、ここで、ディテクタープローブの数が、工程(f)の染色体特異的プライマーの数に等しく、ここで、異数性について試験される第1の染色体に特異的な複数のディテクタープローブは、参照染色体に特異的な複数のディテクタープローブの標識のために使用される蛍光色素とは異なる、同一蛍光色素で標識されている、工程；色素特異的シグナルを示す産物を計数する工程であって、異数性について試験される第1の染色体に特異的な胎児および母親ポリヌクレオチド断片に対応するローリングサークル複製産物、ならびに参照染色体に特異的な産物を計数することを含む、工程；無細胞DNAサンプルについて、胎児異数性の存在または非存在を決定する工程であって、(i)の、第1の染色体に対応する計数されたローリングサークル複製産物の数および参照染色体に対応する計数されたローリングサークル複製産物の数を使用することを含む、工程。
【００７５】
いくつかの態様において、異数性について試験される第1の染色体は、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体、およびY染色体からなる群より選択され；かつ、参照染色体は、1番染色体、2番染色体、および3番染色体からなる群より選択される。
【００７６】
いくつかの態様において、方法は、トリソミー21、トリソミー18、トリソミー13、およびモノソミーXを含む、ヒト集団において検出される主要な異数性を調べる。
【００７７】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明の方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を本発明の方法および組成物の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を下記に記載する。さらに、材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定的であるようには意図されない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
パートA−正荷電タグを使用して標的核酸を検出する方法
【図１】様々なプローブ構成を示す略図である。プローブは、標的相補セグメントおよび検出可能タグ、またはフラップを含む。パネル(A)および(B)において、タグはプローブの5'末端にあり；パネル(C)および(D)において、タグはプローブの3'末端にある。パネル(B)および(D)において、プローブは、タグに隣接する易切断性連結を含有する。
【図２】多重化のために使用されるプローブの略図である。パネル(A)は、異なる数の正電荷を有する検出可能タグを含有するプローブの例を描写する。パネル(B)は、そのような多重化プローブによって発生される電気シグナルの例を示す。
【図３】多重化についての別のアプローチの略図である。パネル(A)および(B)は、正荷電部分301および追加の化合物（中性または正荷電）を含む検出可能タグを有するプローブの例を描写する。パネル(C)は、ナノ細孔を通って流動する間にこれらのプローブによって生成される電気シグナルの例を描写する。
【図４】二重タグを有するプローブの略図である。パネル(A)、(B)および(C)は、5'および3'検出可能タグ、またはフラップを有するプローブの例を描写する。パネル(A)、(B)および(C)に示される態様において、タグは、正荷電部分および追加の化合物（中性または正荷電）の様々な組み合わせを含む。
【図５】ナノ細孔ディテクターを使用しての標的核酸の直接（即ち、増幅不要な）電子的検出のための例示的な方法の図式的概説である。パネル(A)は、プローブが標的領域へアニールし、易切断性連結（修飾）に特異的である酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはリアーゼ）によって開裂され、正荷電タグ（またはフラップ）を放出することを示す。放出されたタグは電場力へ供され、ナノ細孔を通って移行し、電気シグナル、例えば、コンダクタンスの変化を生じさせる。他の核酸種は負荷電であり、シス-コンパートメント中に残る。パネル(B)は、プローブおよび上流のプライマーが、ニックまたは1 ntギャップ離れてタンデムで標的ポリヌクレオチドへアニールすることを示す。5'-エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼは、限定的なDNA合成を行い；検出可能な5'タグが、DNAポリメラーゼ／エキソヌクレアーゼによって開裂され、放出され、本明細書に記載されるように検出される。
【図６】ナノ細孔ディテクターを使用しての標的核酸の増幅ベースの電子的検出のための例示的な方法の図式的概説である。順方向および逆方向プライマーならびにプローブを使用して、標的DNAを増幅する。増幅中に、プローブが標的アンプリコン領域へアニールし、開裂され、検出可能な正荷電タグ（またはフラップ）を放出する。放出されたタグは電場力へ供され、ナノ細孔を通って移行し、電気シグナル、例えば、例えば、コンダクタンスの変化を生じさせる。他の核酸種は負荷電であり、シス-コンパートメント中に残る。パネル(A)は、5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く、鎖置換ポリメラーゼの使用を示す略図である。増幅の最中に、易切断性連結を有するプローブは、標的へハイブリダイズし、易切断性連結（修飾）に特異的である酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはリアーゼ）によって開裂され；正荷電検出可能タグが、負電荷を有するプローブの置換された標的相補部分と一緒に、放出される。パネル(B)は、5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの使用を示す略図である。増幅中に、プローブの5'末端に位置するタグ（またはフラップ）は、5'-3'エキソヌクレアーゼ（フラップエンドヌクレアーゼとも呼ばれる）の活性によって開裂除去され；プローブの残りは同じ活性によって分解される。パネル(C)は、パネル(B)と同様に、5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの使用を示す略図であるが、パネル(C)中の検出可能タグはプローブの3'末端に位置する。DNAポリメラーゼは、検出可能タグ（またはフラップ）が放出されるまで、プローブの標的相補部分をニックトランスレーションする。
【図７】集積ナノ細孔ディテクターを備えるデバイスの一例を示す略図である。本発明の場合においては、正荷電タグがナノ細孔を通っての移行によって検出されるため、デバイスは、従来のDNA配列決定ナノ細孔デバイスと比べて電極の逆極性を特徴とする。
【図８】電気泳動ゲルの写真である。ゲルは、正荷電タグを含むプローブの同時開裂を伴うPCRによる標的DNA増幅の例を示す。5'または3'末端でのプローブ保持タグは両方ともTaq DNAポリメラーゼによって開裂される。
【００７９】
パートB−ローリングサークル複製を使用して標的核酸を検出する方法
【図９】核酸標的分子のデジタル検出および定量化のための本明細書に記載の方法のフローチャートである。パネル(A)および(B)中の方法は、環状化プローブのローリングサークル複製を伴う。パネル(C)および(D)中の方法は、標的配列を有するDNAの環状化断片のローリングサークル複製を伴う。パネル(B)および(D)中の方法は、無細胞循環DNAを含有するサンプルを使用しての染色体異数性についての出生前検査を伴う。
【図１０】プローブおよびプローブ環状化法の略図である。パネル(A)は、一本鎖DNAリガーゼを使用する、プローブおよびプローブ環状化の例を描写する。パネル(B)はパネル(A)に類似しているが、パネル(B)中のプローブは「ブリッジ」オリゴヌクレオチドを含む。
【図１１】プローブおよびプローブ環状化法の略図である。パネル(A)は、二本鎖DNAリガーゼおよびライゲーション鋳型としての「スプリント」オリゴヌクレオチドを使用する、プローブおよびプローブ環状化の例を描写する。パネル(B)はパネル(A)に類似しているが、パネル(B)中のプローブは「ブリッジ」オリゴヌクレオチドを含む。
【図１２】サンプルの核酸断片の環状化を含む、標的核酸を検出するための方法の図式的概説である。例として、2つの標的を検出するための方法を描写し、ここで、ローリングサークル複製の産物は、標的特異的色素標識ディテクタープローブとのハイブリダイゼーションで視覚化される。
【図１３】サンプルの核酸断片の環状化を含む、標的核酸を検出するための方法の図式的概説である。例として、2つの標的を検出するための方法を描写し、ここで、ローリングサークル複製の産物は、後期に（パネル(A)）、または反応開始時に非標識dNTPとの混合物として（パネル(B)）、RCR反応へ添加される蛍光標識dNTPで識別可能に標識される。
【図１４】サンプルの核酸断片の環状化を含む、標的核酸を検出するための方法の図式的概説である。例として、2つの標的を検出するための方法を描写し、ここで、ローリングサークル複製の産物は、後期に（パネル(A)）、または反応開始時に非標識dNTPとの混合物として（パネル(B)）、RCR反応へ添加される蛍光標識dNTPで識別可能に標識される。一本鎖環中間体を含むサンプルを分割し、ローリングサークル複製および検出の両方を別個のコンパートメント中において行う。
【図１５】アミノシラン化スライドガラスの表面上のそれらのミックスの堆積後の、対応してヒト1番染色体および21番染色体に特異的なRCR産物の検出を示す、蛍光顕微鏡で撮影された同じ視野のCy3およびCy 5蛍光の合成画像である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
詳細な説明
最近の20年間で、多くの標的核酸検出法が開発され、いくつかは、医学、農業、バイオセイフティー、および食品安全性用途において現在広く使用されている。それらの中で、等温標的核酸検出法（例えば、NASBA、LAMP、およびRPA）ならびにPCRが最も一般的である。PCRベースの方法、特に、TaqManアッセイのような、プローブベースのPCRは、それらの頑健性、簡単さ、感度および特異性に起因して「至適基準」であると考えられる。しかし、それらの出力は、蛍光標識プローブまたはプライマー、およびインターカレーティング色素によって発生されるアナログ光シグナルである。
【００８１】
最近になって、次世代PCRと呼ばれることが多い、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）技術（Bio-Rad, Inc.、RainDance Technologies, Inc）が開発され、サンプル中の標的核酸の絶対的定量の能力を提供した。しかし、これらの技術は、PCRモジュールに加えて、エマルジョン滴を発生させて単一分子をコンパートメント化するために、流体デバイスを必要とする。さらに、PCRバイアスに関連する方法の一定の制限、非常に小さなリアクター中の限定的な量の試薬、ならびにドロップレットサイズおよび組成の不均一性が存在する。加えて、エマルジョン滴技術は、試薬を漸増的に添加する多段階化学を妨げ、その全体的な有用性を低減させる。
【００８２】
母体血中を循環する無細胞胎児（cff）DNAを使用する無侵襲的出生前検査（NIPT）は、遺伝性疾患および一般的な染色体異数性、例えば、トリソミー13、18、および21の早期発見を可能にする。これは、性と生殖に関する健康および妊娠管理に関して決定を行うのを助ける。商業化されたNIPTアッセイは、冒された染色体の領域の超並列PCR増幅、続いてのショットガン配列決定またはマイクロアレイ技術による胎児ゲノム中の染色体不均衡の検出に基づく。NIPTについての費用および所要時間を改善する必要性がある。本開示は、PCR不要かつ配列決定不要なNIPTのための方法および組成物を提供する。これらの方法は、核酸標的を検出するための新規のアプローチを表し、他の用途、例えば、病原体検出、遺伝子型決定などについて用いることができる。
【００８３】
パートA−正荷電タグを使用して標的核酸を検出する方法
1．概説
標的核酸を電子的に検出する方法を本明細書において提供する。標的核酸を増幅することができるが（例えば、非限定的に、PCRまたは等温増幅を使用する）、本明細書に記載の方法は増幅を必要としない（即ち、本明細書に記載の方法は増幅不要な方法を含む）。本明細書に記載の方法の特徴の一つは、相補的な標的核酸とのハイブリダイゼーション後に放出される、検出可能な正荷電タグの供給源として役立つ、プローブである。標的ポリヌクレオチドを特異的な増幅プライマーの助けを借りて増幅する場合、アンプリコンへのプローブのハイブリダイゼーションは、プローブの増幅依存性開裂を生じさせ、従って、標的核酸の検出の特異性および感度をさらに増加させる。
【００８４】
負荷電である、標的核酸に相補性の領域に加えて、プローブは検出可能な正荷電タグを含み、これは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションでフラップを形成する。酵素の開裂作用によるプローブからのタグの標的依存性放出は、ナノ細孔を使用して電子的に検出することができ（例えば、ナノ細孔を通ってのタグの移行の際に）、これは、光学的、電気化学的、光学機械的、および電気機械的方法を含む、プローブに基づく核酸検出方法の他の方法と異なる。本開示の例示的な方法の図式的フローチャートを図5および6に示す。
【００８５】
本明細書に記載の方法の一部として、正荷電タグを使用して標的核酸を検出するためのシステムも提供する。そのようなシステムは、典型的に、ナノ細孔センサーを有するマイクロ流体デバイスを含む。そのようなマイクロ流体デバイスは、典型的に、(+)電極および導電性緩衝溶液中のサンプルを含有する第1コンパートメント、(-)電極を含有する第2コンパートメント、ならびに2つのコンパートメントを分離するバリア中に埋め込まれたナノ細孔を含む。そのようなマイクロ流体デバイスはまた、温度制御エレメント、コンピュータープロセッサ（例えば、メモリを含む）へ接続された増幅器を備える回路基板、およびシグナル処理ソフトウェアを含むことができる。本明細書に記載の方法およびシステムは、標的核酸のリアルタイム検出を可能にすることができることが、認識されるだろう。重要なことには、開示されるマイクロ流体デバイスは、持ち運びでき、小型化されており（例えば、「メモリースティック」または「ジャンプドライブ」ほどのサイズ）、このため、それは臨床現場ならびに現場適用について理想的である。
【００８６】
さらに、本明細書に記載の方法およびシステムの一部として、標的核酸を検出するために使用することができるキットを提供する。本明細書に記載されるようなキットは、単一の標的または複数の標的（例えば、多重標的検出）に特異的な1つまたは複数のプローブを含むことができる。本明細書に記載されるようなキットはまた、1つまたは複数の増幅プライマー、緩衝液、および酵素を含むことができる。さらに、キットはまた、本明細書に記載されるようなマイクロ流体デバイスを含むことができる。
【００８７】
本明細書に記載されるような標的核酸を電子的に検出する方法は、医学、農業、生体防御、食品安全性、および環境モニタリングにおいて重要な様々な標的を検出するために使用することができる。これらとしては、非限定的に、様々な病原体（例えば、細菌もしくはウイルス）、一塩基変異多型（SNP）変異体、突然変異体、またはゲノム構造変形物が挙げられる。
【００８８】
本明細書に記載の方法およびシステムは、インビトロ診断のコストを著しく低減させることができる多数の特徴を有する。例えば、本明細書に記載の方法およびシステムは、他の現在使用されているデバイスのような、高価な光学素子を必要としない。従って、本明細書に記載されるようなマイクロ流体デバイスの低コストは、現在使用されている嵩高い光学検出デバイスとは対照的に、それを一回使用の使い捨てデバイスとして構築することを可能にする。
【００８９】
2．核酸検出のための方法およびシステム
核酸検出についての既存の戦略は、3つのカテゴリーにグループ化することができる：標的増幅、プローブ増幅、およびシグナル増幅。多数の方法が標的増幅について開発され、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が、現在、様々な診断用途についての至適基準である。読み出し蛍光プローブ、例えば、TaqMan二重標識プローブ、Scorpionプローブ、Molecular Beacon、LightCyclerプローブ、およびインターカレーティング色素（例えばSYBR Green）を使用する定量的PCR法は、核酸診断において最も一般的な方法であるが、温度サイクリングおよび光学読み出しを行うために精巧かつ高価な設備を必要とする。特に臨床現場設定において、PCRにおける制限を回避するために、鎖置換増幅（SDA）、ループ介在増幅（LAMP）、核酸シーケンス増幅（NASBA）、ヘリカーゼ依存増幅（HDA）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）などを含む、様々な等温増幅技術が開発された（例えば、Yan et al., 2014, Mol. BioSyst., 10:970-1003において概説される）。
【００９０】
あるいは、プローブ増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Invaderアッセイ、Padlockプローブ、ローリングサークル増幅（RCA）、および超分子構造体を与えるDNAプローブの自己集合による検出が挙げられる。シグナル増幅戦略は、プローブ増幅方法と同様に、標的核酸増幅を必要とせず、これらとしては、ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅（NESA）およびニッキングエンドヌクレアーゼ支援ナノ粒子活性化（NENNA）、JunctionもしくはY-プローブ、Split DNAZymeおよびデオキシリボザイム増幅戦略、増幅シグナルをもたらす鋳型指示化学反応、非共有結合DNA触媒反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応（HCR）、Tyramideシグナル増幅、およびBranched DNA（bDNA）が挙げられる（Andras et al., 2001, Mol. Biotech., 19(1):29-44；およびYan et al., 2014, Mol. BioSyst., 10:970-1003において概説される）。
【００９１】
ナノテクノロジーの進歩に伴って、シグナル検出システムは、バイオコンジュゲート化ナノ粒子（NP）の使用を直ちに取り入れ、様々な検出システムが開発された（例えば、Ju et al., 2011, Chapter 2 in NanoBiosensing, pp 39-84において概説される）。核酸検出方法の大部分は、光学的、視覚的および／または電気化学的シグナル検出システムを用いる。しかし、ナノ材料およびナノ加工技術の進歩につれて、集積電子チップ／センサーを備えるシンプルでコスト効率が良い使用現場デバイスのための、小型化、感度のさらなる増加、および読み出しデジタル化についての新たな機会が存在する。これらの新たな機会に適応するために、新しい方法および検出技術が開発される必要がある。本開示において、核酸を電子的に検出する新規の方法およびシステムを開示する。
【００９２】
本開示は、核酸を電子的に検出するための方法およびシステムを記載し、ここで、複雑性、コスト、および感度を含む、既存の核酸検出システムの制約の多くが緩和されている。本明細書に記載されるナノ構造体ベースの検出方法およびシステムは、高感度（例えば、単一分子検出）で非常に短時間に核酸標的を検出することができる。
【００９３】
ナノ細孔を使用して核酸を検出するための方法およびシステムを本明細書に記載する。方法は、個々の検出可能な正荷電タグを正確に検出することができ、これらの存在は、相補的な標的核酸へのプローブハイブリダイゼーション後のような、プローブの開裂事象と相関性がある。これらの正荷電タグは、次いで、ナノ細孔を通され、検出され得る。このようにして、標的核酸の存在を検出することができる。複数の標的が同時に調べられる場合、異なる正荷電タグ（即ち、各標的に特有）が使用され得、放出後、それらがナノ細孔を通過する時に同定され得、従って、各標的核酸の存在を同定することができる。プローブの開裂時の検出可能な正荷電タグの放出は、リアルタムで検出することができる。
【００９４】
本明細書に記載の方法は単一分子デジタル検出方法であり、何故ならば、ナノ細孔が、通過する単一タグ分子を検出することができるためである。従って、プローブ開裂事象の数、従って、形成される標的−プローブ複合体の数、従って、標的分子の数を、検出および定量化することができる。標的核酸が増幅される場合、シグナルがクローン分子の各々によって発生され、このため、本明細書に記載の方法は増幅のリアルタム定量化のために使用される。
【００９５】
図5Aは、標的増幅を伴わない標的核酸の直接検出のための方法を図式的に説明する。方法は、標的ポリヌクレオチドを含有するサンプルを提供する工程、および標的へプローブをハイブリダイズさせ、二重鎖を形成する工程を含む。ハイブリダイゼーションの方法および組成物は、当技術分野において周知であり、プローブの添加の前、またはプローブの添加と同時の、サンプル核酸の変性を含み得る。ハイブリダイズされたプローブは、標的ポリヌクレオチドと複合体を形成し、ここで、検出可能タグは「フラップ」を形成する。検出可能タグは5'フラップおよび／または3'フラップであり得る。
【００９６】
プローブの相補部分内に配置された易切断性連結は、二重鎖構造体の形成時に酵素的開裂を受け入れるようになる。いくつかの態様において、易切断性連結は、脱塩基部位（AP部位）、例えば、テトラヒドロフラン（THF）であり、これは、多数のエンドデオキシリボヌクレアーゼまたはDNA AP-リアーゼによって開裂され得る。例示的な市販の酵素としては、エンドヌクレアーゼIV、Fpg、hOOG1、エンドヌクレアーゼVIII、エキソヌクレアーゼIII、エンドヌクレアーゼIII（Nth）、およびAPE1が挙げられる。これらの酵素のいくつかの熱安定性ホモログ、例えば、TmaエンドヌクレアーゼIIIおよびTthエンドヌクレアーゼIVもまた利用可能である。いくつかの態様において、易切断性連結は、単一のリボヌクレオチド残基であり、これは、二重鎖ポリヌクレオチドの状況下で、RNaseH IIによって認識および開裂される。いくつかの態様において、易切断性連結は、4つのプリンリッチリボヌクレオチド残基であり、これは、RNaseH Iによって認識および開裂される。いくつかの態様において、易切断性連結は8-オキソグアニンであり、これは、APリアーゼと組み合わせてFpg N-グリコシラーゼによって開裂可能である。
【００９７】
いくつかの態様において（図5B参照）、易切断性連結は提供されず、検出可能な正荷電タグ（例えば、5'または3'フラップ）は、DNAポリメラーゼ、例えば、大腸菌（E. coli）ポリメラーゼI、Bstポリメラーゼ、またはTaqポリメラーゼの、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性またはフラップエンドヌクレアーゼ活性によってプローブから開裂除去される。これは、プライマーとプローブの相補部分との間にギャップがないかまたは1〜2 ntのギャップが存在するように、プローブの標的アニール部分の上流の標的核酸へアニールする単一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して達成することができる。プライマーおよびプローブの設計は、少なくとも1種類、または2種類、または3種類のタイプのデオキシリボヌクレオチド（dNTP）、例えば、dATP単独、またはdATPおよびdTTP、またはdATP、dTTPおよびdGTPの添加で、ポリメラーゼが標的核酸に沿って下流へ進み、プローブの標的相補部分の1つまたはいくつかの塩基を置換し、短い5'または3'フラップを生じさせるようなものであり、この短い5'または3'フラップは、DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ（またはフラップエンドヌクレアーゼ）活性によって開裂可能である。これらの条件は、反応ミックス中に4種類のヌクレオチドの全ては存在しないことに起因して、ポリメラーゼによる二本鎖DNAのバルク合成を妨げ、しかし、プローブの開裂を依然として生じさせ、検出可能タグを生成する。
【００９８】
エンドデオキシリボヌクレアーゼまたはDNA AP-リアーゼによる開裂の結果として（図5A参照）、ニックまたは1ヌクレオチドギャップがプローブ中に形成され、これは、温度の緩やかな上昇で、検出可能な正荷電タグを放出するが、アニールしたプローブの残りを必ずしも放出しなくてもよく、何故ならば、アニールしたプローブの残りは、標的核酸とより安定した二重鎖構造体を有するように設計され得るためである。図5Bに描写される方法において、検出可能な正荷電タグは、温度を上げることなく、標的ポリヌクレオチドから放出され得る。プローブの標的相補部分がDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって部分的に分解され、自然に放出されたとしても、放出された残部の全体的電荷はマイナスであり、従って、それは、電位がナノ細孔にわたって印加された場合にシス-チャンバ中に留まる。対照的に、適切に開裂された正荷電タグは、全体的正電荷を有し、これは、（例えば、シス-チャンバから負電極へ）ナノ細孔を通って流動し、コンダクタンスの変化を生じさせ、これは、一定の振幅および持続時間を有する電気シグナルとして記録される。従って、全ての放出された正荷電フラップは個々に検出され、シグナルの総数はサンプル中の核酸標的の数に対応する。
【００９９】
図6Aは、ナノ細孔ディテクターを使用する標的核酸の増幅ベースの電子的検出のための例示的な方法を図式的に説明する。方法は、標的核酸を含有するサンプル、オリゴヌクレオチドプライマー、および少なくとも1つのプローブを提供する工程を含む。標的核酸を、順方向および逆方向プライマーを使用して増幅し、プローブを使用して検出する。いくつかの態様において、増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用する。いくつかの態様において、増幅方法は、等温増幅方法、例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）を利用する。等温増幅方法の使用は、本明細書に記載されるようなマイクロ流体デバイスの構築を大幅に単純化し、しかしなお、標的核酸配列の迅速な指数関数的増幅を提供する。増幅中に、プローブが標的アンプリコン領域へアニールし、二本鎖複合体を形成し、易切断性連結で開裂され、検出可能な正荷電タグを放出する。本明細書に示されるように、検出可能な正荷電タグは5'および／または3'フラップの形態であり得る。プローブの相補部分内に配置された易切断性連結は、二重鎖構造体の形成時のみ酵素的開裂を受け入れるようになる。放出されたタグは電場力へ供され、ナノ細孔を通って移行し、電気シグナル、例えば、例えば、コンダクタンスの変化を生じさせる。他の核酸種（即ち、非標的核酸）は負荷電であり、シス-コンパートメント中に残る。いくつかの態様において、易切断性連結は、脱塩基部位（AP部位）、例えば、テトラヒドロフラン（THF）であり、これは、多数のエンドデオキシリボヌクレアーゼまたはDNA AP-リアーゼによって開裂され得る。これらの酵素の大部分は、生理的温度で活性であり、そのような温度で等温増幅技術が使用されなければならない。例示的な方法としては、例えば、25℃〜42℃の温度で行うことができる、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）が挙げられる。
【０１００】
エンドデオキシリボヌクレアーゼおよび／またはDNA AP-リアーゼは、開裂の部位で3'ヒドロキシル基を生成しない酵素のリストより選択され得、何故ならば、3'ヒドロキシル基はDNAポリメラーゼによって伸長され得、これは非生産的切断型二次的アンプリコンを生成するためである。そのような酵素の例としては、Endo IIIおよびhOOG1が挙げられ、これらは、作り出される末端の3'末端で、3'-ホスホ-α,β-不飽和アルデヒドを生成する。そのような酵素の追加の例としては、Endo VIII、Fpg、およびhNEIL1が挙げられ、これらの全てが非伸長性3'リン酸末端を作り出す。さらに、プローブ中に組み込まれ得そしてI型およびII型リボヌクレアーゼH（RNase HIおよびRNase HII）によって開裂される、RNA残基は、伸長可能な易切断性連結であり、何故ならば、3'-OH基が開裂部位の3'末端で生成されるためである。いくつかの、例えば、3つまたは4つの、RNA残基が易切断性連結として使用される場合、これはRNaseHIによって開裂され、3'-OH基は第2のRNA残基に優先的に存在する。単一のRNA残基が易切断性連結として使用されかつRNaseHIIによって開裂される場合、DNA上に3'-OH基が生成される。両方のシナリオにおいて、DNAまたはRNAのいずれかの上の3'-OH末端は、大腸菌DNAポリメラーゼIおよびBsu DNAポリメラーゼのような中温性DNAポリメラーゼによる、ポリメラーゼ駆動3'末端伸長のための鋳型として役立ち得る。
【０１０１】
酵素の熱安定性は、最も高いハイブリダイゼーションストリンジェンシーを可能にする温度でそれが使用されることを可能にし、非特異的ハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドを最小限にしながら、特定のDNA:RNAヘテロ二重鎖についての感度および選択性を最大限にする。増幅方法が、PCRにおけるように、高温サイクリングを伴う場合、プローブ中の好適な易切断性連結は、典型的に、少なくとも4つのRNA残基を含む。いくつかの態様において、易切断性連結は、4つのプリン含有RNA残基を含み、これは、リボヌクレアーゼHI（RNase HI）についての基質である。RNase HIは、相補DNAへアニールするRNAトラクトのホスホジエステル結合を特異的に加水分解するエンドリボヌクレアーゼである。結果として生ずるニックはRNAトラクト内に配置され、3'-OH基は主に第2のRNA残基に配置される。そのようなRNA含有3'末端は、Taqポリメラーゼについての基質として役立つことができない。熱安定性RNase HIはHybridase（Epicentre）として市販されており、DNAやハイブリダイズされていないRNAに影響を与えることなく、DNA:RNAハイブリッド中のRNAを特異的に分解する。55℃で急速に不活性化される大腸菌RNase Hとは対照的に、Hybridase RNase Hは高温で活性である（例えば、それは65℃超で最適な活性を有し、95℃までの温度で使用することができる）。熱安定性RNase H 2型酵素はパイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abysii）RNase H2（IDT）として市販されている。RNase HIIは、二本鎖DNA中の単一のRNA残基を認識し、リボヌクレオチドに対して5'を優先的にニックする、エンドリボヌクレアーゼである。これはDNA残基上に3'-OH基を生成し、これは、Taqポリメラーゼを含む任意のポリメラーゼによって伸長可能であり得、従って、本開示の方法に適していない。図6Aに示される標的増幅および検出方法が、等温でしかし生理的温度より高い温度で行われる場合、熱安定性APエンドヌクレアーゼおよびリアーゼ、例えば、ピロバキュラム・アエロフィラム（Pyrobaculum aerophilum）エンドヌクレアーゼIII、およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）エンドヌクレアーゼIVが、易切断性連結を開裂するために使用され得る。
【０１０２】
図6Bは、ナノ細孔を使用する標的核酸の増幅ベースの電子的検出のための別の例示的な方法を示す。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、標的ポリヌクレオチドを含有するサンプル、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する工程を含み、順方向および逆方向プライマーならびにプローブを使用して、標的DNAを増幅する。いくつかの態様において、増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用することができる。本方法について使用されるプローブは、典型的に、標的配列アンプリコンに相補的であり、かつ、使用される増幅プライマーと重複しない。プローブはまた、通常、易切断性連結を含有しない。標的核酸へのそのようなプローブのハイブリダイゼーションで、正荷電検出可能タグは、図6Bに描写されるように、5'-フラップである。5'-3'エキソヌクレアーゼ活性およびフラップ構造体特異的エンドヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼが、アニールしたプローブに達し、そしてプローブの標的相補部分の1つまたは複数のヌクレオチドを置換した後に形成される、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAの接合点でのホスホジエステル結合の加水分解的開裂を触媒する。プローブの開裂後、フラップ構造体（即ち、検出可能な正荷電タグ）および少数の負荷電DNA残基が標的核酸から放出される。5'-フラップ開裂後、DNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブのアニールした標的相補部分の残りを消化する。正味の正電荷を有する放出されたタグは、電場力へ供され、これによって、それはナノ細孔を通って流動し、電気シグナル、例えば、コンダクタンスの変化が生じる。増幅反応の他の核酸種（プライマー、プローブ、標的核酸、ならびに増幅および5'-3'エキソヌクレアーゼ分解産物）は負荷電であり、シス-コンパートメント中に残る。5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有する例示的なDNAポリメラーゼとしては、Taq DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、および大腸菌DNAポリメラーゼIが挙げられる。後者は熱安定性酵素ではなく、標準PCR反応において必要なサーモサイクリング条件において使用することができない。
【０１０３】
いくつかの態様において、検出可能タグは、プローブの標的相補部分の3'末端にある。図6Cは、ナノ細孔を使用する標的核酸の増幅ベースの電子的検出のための例示的な方法を示し、ここで、検出可能タグは3'フラップとして示される。いくつかの態様において、方法は、標的ポリヌクレオチドを含有するサンプル、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する工程を含む。プローブの存在下で、順方向および逆方向プライマーを使用して、標的DNAを増幅することができる。いくつかの態様において、増幅方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であり得る。本方法において使用されるプローブは、典型的に、標的配列アンプリコンに相補的であるが、使用される増幅プライマーと重複しない。プローブはまた、必ずしも易切断性連結を含有しない。標的核酸へのそのようなプローブのハイブリダイゼーションで、正荷電検出可能タグは3'-フラップである（図6C）。その5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼが、アニールしたプローブに達すると、それはニックトランスレーションによって鋳型をコピーし続け、ここで、残っている未分解相補部分のTmが、それが検出可能タグと一緒に標的配列から解離するポイントへ低下するまで、プローブは5'末端から分解／消化される。この態様において、放出された検出可能タグは、プローブの標的相補部分の3'末端ヌクレオチド（負荷電）および正荷電3'フラップを含む。
【０１０４】
そのような検出可能タグの正味の電荷は、負荷電ヌクレオチドの数および3'フラップの正電荷の数に依存する。放出されたタグ中の未消化ヌクレオチドの数が少ないほど、正味の正電荷は高くなる。プローブの正荷電3'-フラップは、鋳型鎖との静電相互作用によってプローブの相補部分の3'部分を安定させることができ、それによって、放出されるタグ中のヌクレオチドの数を減少させる。いくつかの態様において、フラップとの接合点に隣接するプローブの標的相補部分の部分は、負（例えば、LNA）、または中性（例えば、PNA、PMO、メチルホスホネート）または正（例えば、PMOplus）骨格を有する1つまたは複数の二重鎖安定化ヌクレオチド類似体を含むことができる。骨格中のそのような修飾の使用は、検出可能タグ中の負荷電ヌクレオチドの数を減少させるか、または中性もしくは正電荷を有する残基でそれらを置き換える。さらに、これらの修飾骨格はまた、ヌクレアーゼによる（例えば、DNAポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼによる）分解に対して増加した耐性を示す。いくつかの態様において、中性またはカチオン性骨格を有するヌクレオチド類似体は、PMO、PMOplus、PNA、メチルホスホネート、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。正味の正電荷を有する放出されたタグは、次いで、電場力へ供され得、その結果、それはナノ細孔を通って流動し、電気シグナル、例えば、コンダクタンスの変化を生じさせる。増幅反応の他の核酸種（例えば、プライマー、プローブ、標的核酸、ならびに増幅および5'-3'エキソヌクレアーゼ分解産物）は負荷電であり、シス-コンパートメント中に残る。
【０１０５】
本明細書に記載の方法において使用されるプライマーおよびプローブは、効率的な標的ハイブリダイゼーションおよび増幅に適しており、かつ、検出可能タグを生成するために適している、任意の様々な長さおよび構成を有し得る。典型的に、プライマーおよびプローブは、約15〜約30ヌクレオチド長（例えば、約20〜約25ヌクレオチド）であり得るが、これらの範囲外の長さを使用してもよい。プライマーが増強された塩基対形成親和性を有する1つまたは複数のヌクレオチド類似体、例えば、ロックド核酸（LNA）またはペプチド核酸（PNA）を含有する場合、より短い長さを使用することができる。第1および第2プライマーは、標的核酸へアニールし、任意の所望の長さの、通常、少なくとも30（例えば、少なくとも50）ヌクレオチド長かつ最長200（例えば、最長300、500、1000）またはそれ以上のヌクレオチド長の、増幅産物を生成するように設計され得る。プローブおよびプライマーは、任意の好適な濃度で提供され得る。
【０１０６】
3．核酸
本明細書に記載される電子的検出および同定方法およびシステムにおいて使用される標的核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖核酸の部分を含有してもよい。例えば、標的核酸は、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、cDNA、mRNA、リボゾームRNA、小型RNA、非コードRNA、核内低分子RNA、核小体低分子RNA、およびY RNAであり得る。いくつかの態様において、標的核酸は、サンプルより抽出および／または精製され得る。
【０１０７】
標的核酸（例えば、ゲノムDNA）は、関心対象の任意の生物から得ることができる。関心対象の生物としては、例えば、動物（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長動物を含む、哺乳動物）；植物、真菌、および病原体、例えば細菌およびウイルスが挙げられる。いくつかの態様において、標的核酸（例えば、ゲノムDNAまたはRNA）は細菌またはウイルス核酸である。
【０１０８】
標的核酸は、関心対象のサンプルから得ることができる。サンプルの非限定的な例としては、細胞；体液（血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗ならびに精液が挙げられるが、これらに限定されない）；環境サンプル（例えば、大気、農業、水および土壌サンプル）；生物兵器剤サンプル；研究サンプル（例えば、PCRもしくはMDA増幅反応のような、核酸増幅反応の産物）；精製サンプル、例えば精製ゲノムDNA；RNA調製物；および生サンプル（細菌、ウイルス、ゲノムDNAなど）が挙げられる。生物から標的核酸（例えば、ゲノムDNA）を得る方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1999); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)など参照。
【０１０９】
いくつかの態様において、標的核酸はゲノムDNAである。いくつかの態様において、標的核酸は、ゲノムのサブセット（例えば、特定の用途についての関心対象のサブセット、例えば、癌患者のような集団の特定のサブセット中において突然変異を有し得る選択された遺伝子）である。いくつかの態様において、標的核酸は、エクソームDNA、即ち、転写配列について濃縮された全ゲノムDNAのサブセットである。いくつかの態様において、標的核酸は、トランスクリプトーム、即ち、細胞または細胞集団中において産生される全てのmRNAまたは「転写産物」のセット、の全部または一部である。
【０１１０】
いくつかの態様において、標的核酸（例えば、ゲノムDNA）を使用前に断片化する。断片化の任意の方法を使用することができる。例えば、いくつかの態様において、標的核酸を、機械的手段（例えば、超音波せん断、音響せん断、もしくは注射針せん断）によって；化学的方法によって；または酵素的方法（例えば、エンドヌクレアーゼを使用する）によって、断片化する。断片化の方法は当技術分野において公知である（例えば、US 2012/0004126参照）。いくつかの態様において、断片化は、超音波を使用して達成することができる。
【０１１１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、サンプルから標的核酸を単離する工程、および標的核酸を電子的検出用に調製する工程を含む。様々な起源のサンプルから核酸を抽出するためのいくつかの例示的な技術としては、溶解酵素、超音波処理、高圧、またはそれらの任意の組み合わせを使用することが挙げられる。多くの場合において、細胞から放出されると、核酸は、例えば、プロテイナーゼ、有機溶媒、脱塩、スピンカラム、および磁気ナノ粒子を含む官能化マトリックスへの結合の使用を含む市販の方法によって、細胞壁破片、タンパク質および他の成分から精製され得る。いくつかの場合において、標的核酸は、無細胞核酸（例えば、リキッドバイオプシー）であり、細胞からの抽出を必要としない。
【０１１２】
4．プローブ
典型的に、本明細書に記載の方法において使用されるプローブは2つの部分を含む：標的相補オリゴヌクレオチド100および正荷電検出可能タグ101（例えば、図1参照）。標的相補オリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格を有し、その結果、中性pHの水溶液中において負電荷を有する。ホスホジエステル骨格は、一般に、ヌクレオチド塩基（一般に、プリンまたはピリミジン基）が各糖部分へ結合されている、交互の糖部分およびリン酸部分の糖−リン酸骨格を含む。任意の糖、例えば、特に、リボース（RNAについて）、デオキシリボース（DNAについて）、アラビノース、ヘキソース、2'-フルオロリボース、および／または糖の構造類似体が、骨格中に含まれ得る。いくつかの態様において、相補オリゴヌクレオチド中の1つまたは複数の残基は、代替の骨格のヌクレオチド類似体で置換され得る。例示的な代替の骨格としては以下が挙げられ得る：a）負荷電ホスホロアミデート（例えば、Beaucage et al., 1993, Tetrahedron, 49(10):1925参照）、ホスホロチオエート（PS）（例えば、Mag et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19:1437; および米国特許第5,644,048号参照）、ロックド核酸（LNA）（例えば、Koshkin et al., 1998, Tetrahedron, 54:3607-30; WO 98/39352; WO 99/14226; WO 00/56746; およびWO 99/60855参照）、アンロックド核酸（UNA）（例えば、Pasternak et al., 2011, Org. Biomol. Chem., 9:3591-97参照）、N3'-P5'ホスホロアミデート、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)RNA、2'-O-メチル(2'-OMe)RNA（例えば、Kole et al., 2012, Nat. Rev. Drug Discov., 11(2):125-40参照）、ヘキシトール核酸（HNA）；b）非荷電（中性）メチルホスホネート（例えば、Miller et al., 1981, Biochemistry, 20:1874-80参照）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMO）（例えば、米国特許第5,185,444号参照）、ペプチド核酸（PNA）（例えば、Egholm, 1992, J. Am. Chem. Soc., 114:1895; Braasch and Corey, 2001, Chem. Biol., 8(1):1-7; Nielsen, 1995, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 24:167-83; Nielsen et al., 1999, Curr. Issues Mol. Biol., 1(1-2):89-104; およびRay et al., 2000, FASEB J., 14(9):1041-60参照）、トリアゾール連結DNA（例えば、Varizhuk et al., 2013, J. Org. Chem., 78(12):5964-69参照）。人工骨格および／または部分を有する核酸は、総電荷を増加もしくは減少させるため、塩基対形成安定性を増加もしくは減少させるため、化学安定性を増加もしくは減少させるため、試薬によって作用される能力を変更するためなどに、使用され得る。
【０１１３】
いくつかの態様において、プローブの標的相補部分の全長は、約15〜約60塩基長（例えば、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、または約60塩基長）である。
【０１１４】
いくつかの態様において、プローブは、ポリメラーゼによる伸長および／またはヌクレアーゼによる分解についてブロックされた3'末端、または5'末端、または3'末端および5'末端の両方を含む。ポリメラーゼによる3'末端伸長をブロックするために、末端ヌクレオチドは、除去されるか、または3'-OH基をブロッキング基（例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカンジオール、ジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピン）で置換するように修飾され得る。市販の3'修飾またはブロッキング基の非限定的な例としては、例えば、3'アミノ修飾剤（3AmMO、Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IA）、3'スペーサー（例えば、C3スペーサー3SpC3、Integrated DNA Technologies (IDT)）、ジデオキシヌクレオチド（例えば、ddC、Integrated DNA Technologies (IDT)）、逆向きdT（invdT、Integrated DNA Technologies (IDT)）、または3-dT-Q/3-dA-Q/3-dC-Q/3-dG-Q（Operon/Eurofins, Huntsville, AL）が挙げられる。5'および／または3'末端は、修飾5'または3'連結（例えば、WO 93/13121参照）、修飾ヌクレオチド、および非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造体によって、エキソヌクレアーゼ分解からブロックされ得る。例示的な末端ブロッキング基としては、キャップ構造体（例えば、7-メチルグアノシンキャップ）、反転ヌクレオモノマー（例えば、3'-3'および／または5'-5'末端反転を伴う；例えば、Ortiagao et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2:129参照）、メチルホスホネート、ホスホルアミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、コンジュゲート）などが挙げられる。ヌクレアーゼ分解を減少させるために、少なくとも1つの最も5'および／または3'側の連結は、修飾連結、例えば、ホスホロチオエート連結であり得る。
【０１１５】
いくつかの態様において、プローブは、標的相補部分100内に易切断性連結102を含む（例えば、図1Bおよび図1D参照）。易切断性連結の非限定的な例としては、少なくとも1つのRNA残基；酸化プリン；酸化ピリミジン；脱プリン、もしくは脱ピリミジン（AP）部位；デオキシウリジン、5-ヒロキシウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、もしくは5-ホルミルウラシルのいずれか：または脱塩基ヌクレオチド類似体、テトラヒドロフラン（THF − 時には「dSpacer」と呼ばれる）が挙げられる。いくつかの態様において、易切断性連結は、プローブが相補性の領域内で一本鎖標的核酸と二本鎖核酸複合体を形成する場合にのみ、開裂される。
【０１１６】
例示的な酸化プリン、8-オキソグアニン（これは、合成中にオリゴヌクレオチド中へ組み込まれ得る）は、二本鎖DNA内でデオキシ-シトシンまたはデオキシ-グアノシンと対形成された場合に、Fpg（8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼとしても公知の、ホルムアミドピリミジン[fapy]-DNAグリコシラーゼ）によって開裂され得る。酵素は、N-グリコシラーゼおよびAP-リアーゼの両方として作用する。N-グリコシラーゼ活性は、二本鎖DNAから、損傷したプリンである8-オキソグアニンを放出し、脱プリン（AP部位）を生成する。AP-リアーゼ活性は、次いで、AP部位に対して3'および5'の両方を開裂し、それによってAP部位を除去し、1塩基ギャップを残す。同様の酵素、hOGG1（αアイソフォーム）は、N-グリコシラーゼおよびAP-リアーゼの両方として作用する8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼである。Fpgとは対照的に、hOOG1のAP-リアーゼ活性は、AP部位に対して3'のみを開裂し、5'ホスフェートおよび3'-ホスホ-α,β-不飽和アルデヒドを有するニックを残す。
【０１１７】
N-グリコシラーゼによって生成されたか、またはテトラヒドロフラン（THF、またはdSpacer）としてプローブ中へ組み込まれた、脱プリンまたは脱ピリミジン（AP）部位は、APヌクレアーゼ（例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ）およびDNA AP-リアーゼ（例えば、Endo IVエンドヌクレアーゼ、APリアーゼ、FPGグリコシラーゼ/APリアーゼ、Endo VIIIグリコシラーゼ/APリアーゼ、エキソヌクレアーゼIII(大腸菌)）によって開裂される。Endo IVは、傷に対して5'にある第1ホスホジエステル結合で開裂し、3'末端にヒドロキシル基および5'末端にデオキシリボース5'-ホスフェートを残す。TthエンドヌクレアーゼIVはEndo IVの熱安定性ホモログである。エンドヌクレアーゼVIII(大腸菌)はN-グリコシラーゼおよびAP-リアーゼの両方として作用する。AP-リアーゼ活性は、AP部位に対して3'および5'を開裂し、5'ホスフェートおよび3'ホスフェートを残す。エンドヌクレアーゼVIIIはエンドヌクレアーゼIIIと同様であるが、エンドヌクレアーゼVIIIはβおよびδリアーゼ活性を有し、一方、エンドヌクレアーゼIIIはβリアーゼ活性を有する。Endo VIIIはまた固有のN-グリコシラーゼ活性を有し、これは、損傷したピリミジン（例えば、尿素、5,6-ジヒドロキシチミン、チミングリコール、5-ヒドロキシ-5-メチルヒダントン（5-hydroxy-5-methylhydanton）、ウラシルグリコール、6-ヒドロキシ-5,6-ジヒドロチミンおよびメチルタルトロニル尿素（methyltartronylurea））を二本鎖DNAから放出し、脱プリン（AP部位）を生成する。大腸菌（Escherichia coli）由来のエンドヌクレアーゼIII（Nth）タンパク質もまた、N-グリコシラーゼおよびAP-リアーゼの両方として作用する。この酵素のAP-リアーゼ活性は、AP部位に対して3'を開裂し、5'ホスフェートおよび3'開環糖を残す。Endo IIIはまたN-グリコシラーゼ活性を有し、これは、損傷したピリミジン（例えば、尿素、5,6ジヒドロキシチミン、チミングリコール、5-ヒドロキシ-5-メチルヒダントン、ウラシルグリコール、6-ヒドロキシ-5,6-ジヒドロチミンおよびメチルタルトロニル尿素）を二本鎖DNAから放出し、脱塩基（a basic）（AP部位）を生成する。大腸菌エンドヌクレアーゼIII（Nth）の熱安定性ホモログは、TmaエンドヌクレアーゼIIIとして公知である。大腸菌エキソヌクレアーゼIII（APエンドヌクレアーゼVI）は、二本鎖および一本鎖DNAの両方において脱塩基部位に対して5'のホスホジエステル結合を加水分解するDNA修復酵素である（例えば、Shida et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24(22):4572-76参照）。ヒト脱プリン／脱ピリミジン（AP）エンドヌクレアーゼ、APE 1は、大腸菌エキソヌクレアーゼIIIタンパク質と相同性を共有する。APE 1は、加水分解機構によってAP部位に対して直接5'のホスホジエステル骨格を開裂し、一本鎖DNA切断を生じさせ、3'-ヒドロキシルおよび5'-デオキシリボースリン酸末端を残す。
【０１１８】
プローブ内のデオキシウリジンは、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）のN-グリコシラーゼ活性によって認識および放出され、AP部位を生成する。AP部位は、次いで、APヌクレアーゼ（エンドデオキシリボヌクレアーゼ）またはDNA AP-リアーゼ（例えば、Endo IVエンドヌクレアーゼ、APリアーゼ、FPGグリコシラーゼ/APリアーゼ、Endo VIIIグリコシラーゼ/APリアーゼ）によって開裂される。デオキシウリジンは、二本鎖のプローブ−標的複合体中のデオキシ-アデノシンと対形成した場合に開裂され得るが、一本鎖プローブ内でも開裂され得、これは、ウラシルDNAインヒビター（New England Biolabs, MA）によるUDGの不活性化、またはAP部位の開裂前のプローブの除去を必要とする。脱塩基部位はまた、デオキシウリジン以外のヌクレオチド類似体で生成され得、エンドヌクレアーゼでの処理によって類似の方法で開裂され得る。例えば、デオキシイノシンは、AlkAグリコシラーゼへの曝露によって脱塩基部位へ変換され得る。このように生成された脱塩基部位は、次いで、典型的に、好適なエンドヌクレアーゼ（例えば、Endo IV、APリアーゼ）での処理によって、開裂され得る（例えば、US 2011/0014657参照）。
【０１１９】
複数のポリヌクレオチド標的の同時検出（多重検出）のために、複数の異なるプローブを使用することができる。複数のプローブは、異なる検出可能タグ101を含むことができる（図1参照）。一例において、プローブは、図2Aに例示されるように、可変数の電荷を有するタグ201、202および203を有する。そのような多重化プローブによって発生された電気シグナルの例を図2Bに示す。タグのアイデンティティーは、発生される電気シグナルの独自性によって確立され得る。対応して、同定されたタグは、サンプル中に存在する個々の標的核酸と相関させることができる。別の例において、検出可能タグ305、306および307（図3A参照）は、標的相補部分300に隣接する正荷電部分301、ならびに部分301へ結合された追加の化合物（または化学基）302、303および304を含む。これらの化合物は、中性電荷を有し得るか、または部分301へ追加の正電荷を加え得るが、それらは、形状、サイズ、および電荷分布、またはそれらの任意の組み合わせによって、検出可能タグ305、306および307を見分けるように意図される。このタイプの多重化プローブの検出可能タグによって発生される電気シグナルの例を図3Cに示す。多重化プローブの使用の別の例において、易切断性連結102の開裂の効率に対する正荷電部分301の接近によって引き起こされる潜在的な負の干渉を防ぐために、検出可能タグ308、309および310の正荷電部分301（図3B参照）が、化学基（または化合物）302、303、および304によって、プローブの標的相補部分300部分から分離されている。追加の例において、プローブは、プローブの標的相補部分400の5'および3'末端へ結合された2つの検出可能タグ401および403（図4A参照）、403および406（図4B参照）、または406および407（図4C参照）を含むことができる。2つの検出可能タグを有するプローブは、2つの易切断性連結401および402を含むことができ、これらは酵素によって開裂され、両方のタグを放出し得る。2つの検出可能タグの全ての組み合わせが示されるとは限らないが、全ての組み合わせが本開示中に含まれる。検出可能タグ201、202および203（図2参照）、305、306および307（図3A参照）、ならびに308、309および310（図3B参照）は、例を提供する目的のためにのみ、5'フラップとして示されており − これらのプローブを、3'フラップとしてプローブの標的相補部分の3'末端へ結合することができる。
【０１２０】
5．例示的なタグ
いくつかの態様において、正荷電検出可能タグ101（例えば、図1参照）は、ポリヌクレオチド、または正荷電骨格を有するポリヌクレオチド類似体であり得る。本方法において有用な例示的な好適な正荷電骨格としては、デオキシ核酸性グアニジン（DNG）（例えば、Dempcy et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097-101; Barawkar and Bruice, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:11047-52; Park and Bruice, 2008, Bioorg. Med. Chem. Lett., 18(12):3488-91参照）、ヌクレオシルアミノ酸（NAA）修飾（例えば、Schmidtgall et al., 2015, Beilstein J. Org. Chem., 11:50-60参照）、N, N-ジエチル-エチレンジアミンホスホロアミデート連結（例えば、Dagle and Weeks, 1996, Nucl. Acids Res., 24(11):2143-49参照）、トリアゾール連結Plus DNA（TL DNA+）（例えば、Fujino et al., 2013, Heterocycles, 87(5):1023-28参照）、またはホスホロジアミデートモルホリノPMOの骨格中の正荷電ピペラジン残基（PMOplus）が挙げられる。いくつかの態様において、正荷電タグ101は、ポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチド類似体）およびペプチドのキメラであり得る。例示的なキメラとしては、ペプチドコンジュゲート化ホスホロジアミデートモルホリノPMO（PPMO）中の正荷電アルギニンリッチペプチド、および正荷電リジン（Lys）尾部を有するペプチド核酸（PNA）オリゴマーが挙げられ得る。ペプチドと核酸とのコンジュゲートは、当技術分野において一般に知られている技術を使用して調製され得る。一つのそのような技術において、所望のアミノ酸およびヌクレオチド配列のペプチドおよび核酸コンポーネントは、例えば標準自動化学合成技術によって、別々に合成され、次いで、水性／有機溶液中においてコンジュゲートされ得る。例として、Glen Researchから市販されているOPeC（商標）システムは、5'-システイニルオリゴヌクレオチドへのN末端チオエステル官能化ペプチドの自然ライゲーションに基づく。
【０１２１】
いくつかの態様において、正荷電検出可能タグ101（例えば、図1参照）は、オリゴカチオンまたはオリゴヌクレオチド-オリゴカチオンコンジュゲートを含む。例示的な正荷電コンジュゲートとしては、Zip核酸（ZNA）が挙げられる（例えば、Moreau et al., 2009, Nucleic Acids Res., 37(19):e130; Paris et al., 2010, Nucleic Acids Res., 38(7):e95参照）。ZNAの全体的電荷は、オリゴヌクレオチドへ結合されたカチオン性スペルミン部分の数によって調節される。いくつかの態様において、プローブは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体によって表される、標的相補部分100、およびスペルミン単位のタグ101を含むように、ZNAとして合成され得る。いくつかの態様において、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によるタグの開裂後、または上述のような酵素活性による易切断性連結102でのタグの開裂後、放出された検出可能タグ101は、正荷電ポリスペルミンおよび少なくとも1つの負荷電ヌクレオチド残基を含み得る。本明細書に記載の方法によれば、カチオン性スペルミン単位の数は、放出される検出可能タグの全体的（または正味）電荷がプラスであり、一方、プローブの全体的（または正味）電荷がマイナスであるように、選択されるべきである。
【０１２２】
いくつかの態様において、正荷電検出可能タグ201、202および203を構成する正荷電ヌクレオチド、またはそれらの類似体、または非ポリヌクレオチドカチオンの数は、異なるプローブ中において異なり得る（例えば、図2Aに描写されるようなポリヌクレオチド標的の多重検出のために使用される異なるプローブ）。
【０１２３】
いくつかの態様において、多重化のために使用される検出可能タグの正荷電部分へ結合された追加の化学基または化合物（例えば、図3に示される検出可能タグ305、306、307、308、309、および310の302、303および304）は、ポリエチレングリコール（PEG）鎖を含む。このアプローチは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドへの12個のエチレングリコール単位の結合によって例示される（例えば、Shokrzadeh et al., 2014, Bioorg. Med. Chem. Lett., 24(24):5758-61参照）。
【０１２４】
いくつかの態様において、追加の化学基または化合物は正荷電グリコポリマーを含むことができる。メタクリレートまたはメタクリルアミドベースの糖モノマーを生成し、RAFTまたはATRPによってそれらを重合し、狭い多分散性を有する直鎖または分岐鎖グリコポリマーを得る方法は、周知である。また、オリゴ糖ベースのモノマーを重合し、十分に定義されたグリコポリマーを得ることができる。これらのグリコポリマーを、様々な方法を使用して、例えば、ジスルフィド結合交換（例えば、Engineered Carbohydrate-Based Materials for Biomedical Applications, Ed. Ravin Narain, 2001, Ch 4, Willey参照）によって、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドへコンジュゲートすることができる。α-マンノシドおよびβ-ガラクトシドを有するオリゴヌクレオチド-グリコポリマーコンジュゲートは、5'-チオール-修飾オリゴヌクレオチドと、テロメル化によって合成されたヨードアセトアミド化グリコポリマーとをカップリングすることによって、調製することができる（例えば、Akasaka et al., 2001, Bioconjugate Chem., 12(5):776-85参照）。これらのコンジュゲートは、DNA立体構造および二重鎖の融解挙動に最小限に影響を与える。
【０１２５】
いくつかの態様において、追加の非荷電または正荷電化学基または化合物は、ポリペプチドおよび／またはポリペプトイド（即ち、ポリ-N-置換グリシン）を含む。いくつかの態様において、化学的部分は、その誘導体、例えば、N-メトキシエチルグリシン（NMEG）オリゴマーである（例えば、米国特許第7,371,533号；Meagher et al., 2008, Anal. Chem., 80:2842-48参照）。
【０１２６】
いくつかの態様において、追加の非荷電または正荷電化学基または化合物は、様々な市販のオリゴヌクレオチドスペーサーまたはアームを含み得る。スペーサーおよびアームの非限定的な例としては、3'ヘキサンジオール（6炭素グリコールスペーサー）、スペーサー9（より長いスペーサーが必要とされる場合は常に、連続的に含む、オリゴの5'末端または3'末端で組み込まれ得るトリエチレングリコールスペーサー）、スペーサー18（5'末端または3'末端で組み込まれ得る、18-原子ヘキサ-エチレングリコールスペーサー）が挙げられる。さらに、スペーサーC12（オリゴヌクレオチド中へ長いスペーサーアームを組み込むために使用される12-炭素スペーサー）が、より長いスペーサーが必要とされる場合には連続付加で組み込まれ得る（Tri Link Inc.）。別の例において、スペーサーホスホルアミダイト（Fidelity Systems Inc.）は、異なる長さおよび可変の疎水性で入手可能であり、合成中にオリゴヌクレオチドの5'末端へ単独でまたは連続して付加され得る（例えば、Arm26-Achスペーサー、Arm26-Tスペーサー、15Aスペーサー、14Aスペーサー、Diol 22Aスペーサー）。異なる長さおよび可変の疎水性のこれらの非ヌクレオシドスペーサーは、5'末端へ単独でまたは連続して付加され得、共通の第2級アミノアルコール、トランス-4-アミノシクロヘキサノールより作製され、これは、その後、Fidelity Systems Inc.の専有のMOX化学を利用して誘導体化される。5'末端修飾を変えるための別の方法は、Branching Unit 11 Amiditeを使用することであり、これはオリゴヌクレオチドの5'末端に接続点を導入する。高度に分岐したオリゴヌクレオチドを作製するために、分岐単位を単独でまたは連続して付加することができる。
【０１２７】
6．正荷電タグの検出
標的核酸は、プローブの開裂の副産物である正荷電検出可能タグを検出することによって、サンプル中において電子的に検出することができる。いくつかの態様において、標的核酸分子を検出するための方法は、(a)プローブを、標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーション後に開裂する工程であって、ここで、開裂後に、正荷電タグが生成される、工程、および(b)ナノ細孔を使用して放出正荷電タグを検出する工程を含む。タグは、本明細書に記載されるようなナノ細孔を介しての電圧差によってナノ細孔を通って流動するように指示され得る。
【０１２８】
正荷電タグがナノ細孔を通過すると、それは電子的変化を生じさせる。いくつかの態様において、電子的変化は、電流振幅の変化、ナノ細孔のコンダクタンスの変化、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１２９】
図2、3、および4を連続して参照すると、異なるタグは、異なる標的特異的プローブの標的相補部分へ結合され得、その結果、タグが放出されそしてナノ細孔を通過する際に、それらは、ナノ細孔中において発生される特定のシグナルに基づいて互いに見分けることができる。図3Cを特に参照すると、3つの異なるシグナル強度（305、306および307）が検出され得る。例えば、ナノ細孔を通過するあるタグは振幅305を有するシグナルを発生させ得、別のタグ306はより低い振幅を有するシグナルを発生させ得、そして第3のタグ307はより高い振幅を有するシグナルを発生させ得る。いくつかの場合において、シグナルは、検出と検出の間にベースラインレベル311へ戻り得る。いくつかの態様において、ナノ細孔がタグによってブロックされる時間は、タグ間で異なり得、ここで、タグは、正荷電部分、および異なる質量の化合物（「ドラッグ」）、例えば、種々の数のモノマーの線状ポリマー、例えばPEG、を有する。ナノ細孔を通ってのそのようなタグの移行は、特有の平均滞留時間を有する異なる質量依存性コンダクタンス状態を引き起こす。例えば、Robertson et al. (2007, PNAS USA, 104(20):8207-11)は、コンダクタンスベースの質量スペクトルが、エチレングリコールの繰り返し単位を明確に分解し、滞留時間はPEGの質量と共に増加することを実証した。
【０１３０】
本開示は、追加の化合物（「ドラッグ」）を有する正荷電タグのアイデンティティーを決定するための方法を提供し（例えば、図3）、これは、化合物をシステムと接触させる工程であって、該システムが、化合物を有する検出可能タグがナノ細孔を通って移行する際に、コンダクタンスを測定しそして電場の変化を記録する、工程を含む。電場の変化は、タグおよび化合物、電解質、ならびに細孔の相互作用の結果であり、これは、化合物のサイズ、電荷および組成を示し、それによって、電場の変化と化合物のアイデンティティーとを相関させることを可能にする。いくつかの場合において、検出可能タグは、追加の「ドラッグ」を持たず（図2）、タグを構成するポリマーの正荷電単位の数のみ異なる。
【０１３１】
いくつかの態様において、タグのアイデンティティーを決定するための方法は、コンダクタンス測定システムを含む。コンダクタンス測定システムは、物理的バリアによって分離された第1および第2電解質溶液を有する第1および第2チャンバを含むことができる。そのようなシステムにおいて、バリアは、ナノメートルスケールの直径を有する少なくとも1つのナノ細孔；バリアにわたって電場を印加するための手段；および電場の変化を測定するための手段を有する。
【０１３２】
いくつかの態様において、標的核酸検出のための電子的方法は、正荷電タグを感知するための電界効果トランジスタ（FET）を含む。いくつかの態様において、FETは、イオン感応性FET（ISFET）またはカーボンナノチューブFET（CNFET）を含む。
【０１３３】
7．デバイス
本明細書に開示される方法および材料は、任意の様々な装置またはデバイスと併用して使用され得る。本明細書に開示される標的核酸の電子的検出は、マイクロ流体デバイスと併用して、小型化形式で、開示される方法を行うことについて有利であり得る。マイクロ流体デバイスは、サンプルを調製、輸送、および／または分析するために、様々なジオメトリで配置される、様々なマイクロチャネル、ウェル、および／またはバルブを利用することができる。流体は、特に、注入、ポンピング、印加吸引、毛細管作用、浸透作用、電気浸透、ならびに熱膨張および収縮を含む、様々な力を使用して、デバイスを通して輸送され得る。
【０１３４】
いくつかの態様において、マイクロ流体デバイスは、好適な基板中に製作された1つまたは複数のマイクロ流体チャンバまたはチャネル、少なくとも1つの標的ポリヌクレオチド配列を含有するサンプルを受け取るように構成された注入口；ならびに、マイクロ流体デバイス中へ埋め込まれた、チャネルおよびバルブを介して注入口と連絡しているナノ細孔ディテクターチップを含むことができる。
【０１３５】
いくつかの態様において、複数のチャンバまたはチャネルが、標的核酸を含有するサンプルを分割または分離し、シングルプレックス形式で本開示の方法を行うために使用され得、即ち、異なる標的が各反応チャンバ中において個々に調べられる。いくつかの態様において、マイクロ流体デバイスのそのような構造は、複数の注入口を用いてさらに構成される場合、1つの反応チャンバ中において単一の（シングルプレックス検出）または複数の（多重検出）標的について複数のサンプルを調べるために使用することができる。
【０１３６】
いくつかの態様において、ナノ細孔ディテクターチップは、第1電極を有し、かつ、温度コントロールへサンプルを供するために構成された、1つまたは複数のシス-チャンバを含む。典型的に、シス-チャンバは、プローブからの検出可能タグの開裂が生じる場所である。いくつかの態様において、ナノ細孔ディテクターチップは、埋め込まれたナノ細孔を含むバリアによってシス-チャンバから分離されている、第2電極を有する1つまたは複数のトランス-チャンバを含む。そのようなナノ細孔ディテクターチップは、電極へ電位を印加し、ナノ細孔を通って検出可能タグを移行させ、それによってコンダクタンスの変化を引き起こすことによって、タグを検出および同定するのに適している。
【０１３７】
図7は、ナノ細孔ディテクターチップ（またはマイクロ流体デバイス）の例を示す。ナノ細孔ディテクターは以下を含み得る：上部電極603および導電性溶液を含有する、シス-チャンバ（上部）600；半導体基板608中に埋め込まれかつ下部導電性電極604を含有する、トランス-チャンバ（下部）601；ならびに、2つのチャンバ600および601を分離し、かつ、埋め込まれたナノ細孔602を有する、電気抵抗バリアまたは膜。ナノ細孔ディテクターはまた、以下を含み得る：電気刺激（例えば、電圧バイアス）を制御し、かつ、基板（例えば、シリコン基板）内に埋め込まれた検出電気シグナルを処理するための、電気回路607；電気回路607の一部として含まれる可変電圧源609；ならびに温度制御エレメント606。電気回路はまた、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御ロジック、および様々な追加のコンポーネントを含み得る。温度制御エレメント606は、熱電加熱および／または冷却デバイス（例えば、ペルチェ素子）であり得る。シス-チャンバは、典型的に、緩衝電解質溶液中に、標的核酸、酵素ミックス、プローブ、およびプライマー（適用可能な場合）を含有する。
【０１３８】
いくつかの態様において、ナノ細孔ディテクターの電気回路は、メモリへ接続され得る、コンピュータープロセッサへ接続され得る。
【０１３９】
いくつかの態様において、複数のナノ細孔ディテクターがナノ細孔アレイを形成し得、ここで、ナノ細孔は個々にアドレス可能であり得る。
【０１４０】
いくつかの態様において、検出可能な正荷電タグの検出中、シス-チャンバ中に埋め込まれた上部電極が正電極であり、かつ、トランス-チャンバ中に埋め込まれた下部電極が負電極であるように、電圧バイアスが提供される。そのような電圧バイアスは、シス-チャンバからナノ細孔を通ってトランス-チャンバへ検出可能な正荷電タグを流動させる。これは、負荷電核酸が正電極の方向にナノ細孔を通って移行する、当技術分野において公知の従来の核酸検出および／または配列決定ナノ細孔デバイスとは反対である。
【０１４１】
本明細書に記載の方法およびシステムにおいて使用されるナノ細孔は、非導電性材料で製作されたソリッドステートナノ細孔、または、チャネルを形成する構造体へ自己集合することができるタンパク質で形成され、脂質二重層中に埋め込むことができる、生物学的ナノ細孔であり得る。
【０１４２】
いくつかの生物学的ナノ細孔が、単一分子レベルで核酸を検出するために使用することができる（例えば、Feng et al., 2015, Nanopore-based Fourth-generation DNA Sequencing Technology, Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 13(1):4-16参照）。それらのうちの1つはα-溶血素（α-HL）細孔である。α-HLチャネルの内径と、一本鎖DNA（ssDNA）分子とは、サイズが非常に近い（直径約1.3 nm）。α-HLナノ細孔は、ナノ細孔の内側のイオン電流を使用して単一のヌクレオチドを区別することができる。ナノ細孔の限定的な口径は、線状一本鎖核酸分子が通過することを可能にするが、二本鎖核酸分子（直径約2.0 nm）が通過することを可能にしない。別のナノ細孔はマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）ポーリンA（MspA）であり；MspA八量体のチャネルは最小点で直径約1 nmであり、これは、α-HLのそれと比べて比較的小さく狭い。従って、それは、ssDNA検出および配列決定の空間分解能を改善することができる。α-HLおよびMspAは両方とも非常にロバストであり、チャネルは、pH値を2から12へ変化させかつ温度を100℃で30分間維持するような、極端な実験条件下で活性のままである。バクテリオファージPhi29ナノ細孔は別の生物学的ナノ細孔である。phi29細孔中のチャネルは、末端のうちの1つで約10 nm2の断面積（直径3.6 nm）を有し、二本鎖DNA（dsDNA）が通過できることが実証された。α-HLおよびMspAと比較して、phi29 細孔はより大きな直径を有し、これは、dsDNA、嵩高い基へ連結されたdsDNA、例えば、DNAまたはタンパク質の複合体のような、より大きな分子の測定を可能にする。
【０１４３】
生物学的ナノ細孔はssDNA配列決定に有用であることが示されたが、そのようなタンパク質細孔は、一定の細孔サイズ、プロフィールを有し、安定性が欠如している。それらは伝統的な支持脂質膜の脆弱性に苦しむ。これらの欠陥を克服するために、様々な合成ソリッドステートナノ細孔が、異なる材料および方法を使用して製作され、核酸分析へ適用された。ソリッドステートナノ細孔は、化学的、熱的および機械的安定性、ならびにサイズ調整性のような、それらの生物学的相当物と比べて多くの利点を有する。様々な技術が、窒化ケイ素（Si3N4）、二酸化ケイ素（SiO2）、酸化アルミニウム（Al2O3）、窒化ホウ素（BN）、グラフェン、高分子膜、およびハイブリッド材料中にナノ細孔を製作するためにしばしば使用される。ナノ細孔を製作する方法としては、イオンミリングトラックエッチ法、電子線に基づく分解スパッタリング、集束イオンビーム（FIB）技術、レーザアブレーション法、電子線リソグラフィー、ヘリウムイオン顕微鏡法、および絶縁破壊法が挙げられる。ソリッドステートナノ細孔の電気的および幾何学的特性は、生物学的相当物とは異なる利点をそれらに提供する。
【０１４４】
ナノ細孔は、集積回路のような、検知回路の検知電極に隣接して配置された非導電性バリアまたは膜中に形成もしくは製作され得るかまたはそうでなければ埋め込まれ得る。集積回路は、特定用途向け集積回路（ASIC）であり得る。いくつかの態様において、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（CMOS）である。
【０１４５】
8．キット／製品
別の局面において、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。
【０１４６】
いくつかの態様において、キットは、核酸増幅のための順方向および逆方向プライマーとして使用される第1のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第2のオリゴヌクレオチドプライマー；ならびに本明細書に記載されるような標的核酸の検出のための検出可能タグを有するプローブを含む。
【０１４７】
いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載されるような2つ以上の標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ（例えば、第1標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ、ならびに第2標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ）を含む。
【０１４８】
いくつかの態様において、キットはまた、本明細書に記載されるような核酸検出に関する1つまたは複数の追加の成分を含むことができる。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される方法工程のうちの1つまたは複数を行うための1つまたは複数の酵素（例えば、DNA増幅における使用のための酵素、プローブの開裂における使用のための酵素、またはRNAの逆転写を行うための酵素）をさらに含むことができ、本明細書に記載されるような酵素反応および／またはタグの検出を行うための他の試薬（例えば、緩衝液、ヌクレオチド、添加剤など）を任意で含むことができる。
【０１４９】
いくつかの態様において、キットは、使い勝手の良いプレミックス配合物中に成分（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、酵素、および他の反応成分）を含む。
【０１５０】
パートB−ローリングサークル複製を使用して標的核酸を検出する方法
1．概説
核酸検出についての戦略は3つのカテゴリーにグループ化することができる：標的増幅、プローブ増幅、およびシグナル増幅。多数の方法が標的増幅について開発され、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が、現在、様々な診断用途における至適基準である。蛍光プローブ、例えば、TaqMan二重標識プローブ、Scorpionプローブ、Molecular Beacon、LightCyclerプローブ、およびインターカレーティング色素（例えばSYBR Green）を使用する定量的PCRは、核酸診断において最も一般的な方法である。定量的PCRは、温度サイクリングおよび光学読み出しを行うための精巧かつ高価な設備を必要とする。特に臨床現場設定において、PCR使用における制限を回避するために、鎖置換増幅（SDA）、ループ介在増幅（LAMP）、核酸シーケンス増幅（NASBA）、ヘリカーゼ依存増幅（HDA）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）などを含む、様々な等温増幅技術が開発された（例えば、Yan et al., 2014, Mol. BioSyst., 10:970-1003参照）。
【０１５１】
あるいは、プローブ増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（LCR）、Invaderアッセイ、Padlockプローブ、ローリングサークル増幅（RCA）、および超分子構造体を与えるDNAプローブの自己集合による検出が挙げられる。シグナル増幅方法は、プローブ増幅方法と同様に、標的核酸増幅を必要とせず、これらとしては、ニッキングエンドヌクレアーゼシグナル増幅（NESA）およびニッキングエンドヌクレアーゼ支援ナノ粒子活性化（NENNA）、JunctionもしくはY-プローブ、Split DNAZymeおよびデオキシリボザイム増幅戦略、増幅シグナルをもたらす鋳型指示化学反応、非共有結合DNA触媒反応、ハイブリダイゼーション連鎖反応（HCR）、Tyramideシグナル増幅、Branched DNA（bDNA）が挙げられる（例えば、Andras et al., 2001, Mol. Biotech., 19(1):29-44；およびYan et al., 2014, Mol. BioSyst., 10:970-1003参照）。ナノテクノロジーの進歩に伴って、シグナル検出システムは、バイオコンジュゲート化ナノ粒子（NP）の使用を直ちに取り入れ、様々な検出システムが開発された（例えば、Ju et al., 2011, Signal Amplification for Nanobiosensing, Ch. 2 in NanoBiosensing, pp 39-84参照）。
【０１５２】
プローブ増幅方法の中でも、ローリングサークル複製（RCR）と呼ばれることが多い、ローリングサークル増幅（RCA）は、同じ分子内で複数のコピー（例えば、タンデムリピート）を生成し、このため、数百個の蛍光標識ディテクタープローブのハイブリダイゼーションで容易に検出可能な大きな（例えば、数百ナノメートル〜マイクロメートルサイズの）コイル状の単一分子構造体から、小さな単一のDNA環を検出することが困難となる。このような大きな構造体は、固体支持体上に堆積させ、カウントし、標的核酸の検出および正確な定量化のためのデジタル読み出しを提供することができる。概念的に、本明細書に記載の方法はドロップレットデジタルPCR（ddPCR）と類似しており、ここで、単一の線状DNA分子が小さなリアクター中へ閉じ込められ、標的特異的増幅プライマーを使用してPCRによって特異的に増幅される。ddPCRと比較してのRCAの利点は、増幅前に単一のDNA分子をコンパートメント化する必要性がないことであり、何故ならば、RCR機構は、同じ反応体積中で大きな別個の個々の構造体へ自発的に崩壊する長い一本鎖DNA分子を生成するためである。
【０１５３】
本開示において、新規の標的核酸検出方法は、デジタル検出のために、環状プローブを生成しそしてローリングサークル複製機構によってプローブを増幅するための、2つの連続するプローブライゲーション反応を含む。本明細書に記載の方法は、PadlockプローブおよびSelectorプローブ（これらもまたローリングサークルプローブ増幅を活用する）のような当技術分野において公知の他の方法と比較してよりコスト効率が良く、何故ならば、本明細書に記載の方法は、プローブの組成中において遥かにより短いオリゴヌクレオチドを利用することができ、これらは、より長いプローブと比べて遥かにより製造し易くかつコストが著しくより低いためである。具体的には、本明細書に記載の方法は、妊婦の血液から採取された無細胞DNAサンプル中の胎児異数性を検出するために非常に有用である。
【０１５４】
本明細書に記載される別の新規の方法はまた、ローリングサークル増幅に基づき、しかし、環状プローブを生成および増幅する代わりに、サンプル中の核酸の断片を環状化し、必要に応じて、検出および計数のために、標的核酸をローリングサークル複製によって選択的に増幅する。本方法は、無細胞胎児DNAを含有するサンプル中の胎児異数性を検出するのに特によく適しており、何故ならば、これらのサンプル中の無細胞DNA種の大部分のサイズは、約165〜約190ヌクレオチド以内であり、これは、サンプルDNAを断片化する必要性なく、直接の鋳型無し環状化／ライゲーションを受け入れるためである。
【０１５５】
本明細書に記載の方法は単一分子デジタル検出方法であり、何故ならば、単一のプローブ、または標的核酸分子からのシグナルが、プローブまたは標的のローリングサークル増幅を使用して検出可能となるためである。
【０１５６】
いくつかの態様において、核酸の断片を含むサンプル中の標的核酸を検出する方法および組成物を提供し、ここで、検出の特異性は、標的核酸へハイブリダイズしそして環状形態（例えば、標的特異的環）へさらに変換される標的特異的プローブを用いることによって達成される。単一分子である各標的特異的環は、ローリングサークル複製によって増幅され、複数のタンデムリピートを有する長い線状核酸を生成する。従って、複数のタンデムリピートを有するこの長い線状核酸は、プローブ特異的蛍光標識ディテクタープローブとのハイブリダイゼーションで検出可能かつ定量可能となる（図9A中の例示的な方法を参照のこと）。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、胎児染色体異数性について、無細胞循環DNAを含有するサンプルを試験するように調整される。染色体特異的断片の検出および定量化を含む、そのような方法をさらに開示する（例えば、図9B参照）。
【０１５７】
核酸の断片を含むサンプル中の標的核酸を検出するための方法および組成物が提供され、ここで、先ず、核酸の断片を環状化し、次いで、標的特異的環を、標的特異的プライマーを使用してバルク環からローリングサークル複製による増幅のために選択する。標的核酸の検出は、蛍光標識された標的特異的ディテクタープローブとローリングサークル複製の産物とのハイブリダイゼーションを含み、さらに、色素特異的産物の計数を含み得る（例えば、図9C参照）。これらの方法はまた、胎児染色体異数性について、無細胞循環DNAを有するサンプルを試験するように調整され得る。染色体特異的断片の検出および定量化を含む、そのような方法をさらに開示する（例えば、図9D参照）。
【０１５８】
2．プローブを使用する標的核酸検出および定量化
本明細書に記載される標的核酸検出方法は、鋳型として標的核酸を使用してのプローブのアームの第1ライゲーション、およびライゲートされたプローブを環状化するための第2ライゲーションを含む（例えば、図10A参照）。サンプル中の核酸とプローブとを接触させる前に、サンプル中の核酸を、例えば加熱およびスナップ冷却によって、変性させる。プローブは、左アームオリゴヌクレオチド200および右アームオリゴヌクレオチド201を含むことができる（図10参照）。プローブの左アームは、標的核酸断片208中の上流配列に相補的である15〜35ヌクレオチド長部分202、および、ディテクタープローブに相補的な部分206とローリングサークル複製のためのプライマーとして役立つオリゴヌクレオチド212の5'部分に部分的に相補的な部分207とを有するカスタム非相補部分204を含む。プローブの右アームは、標的核酸断片208中の下流配列に相補的である15〜35ヌクレオチド長部分203、および、ローリングサークル複製のためのプライマーとして役立つオリゴヌクレオチド212の3'末端部分に相補的な2〜5ヌクレオチドの短い配列を含むカスタム非相補部分205を含む。
【０１５９】
プローブの左および右アームが標的核酸208へアニールする条件下で、標的相補部分202および203は、3'末端202が5'リン酸化末端203と並ぶように、二本鎖複合体を形成し、そして2つの末端はDNAリガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼまたはTaqリガーゼ）の助けを借りてライゲートされる。これは、核酸の連続線状鎖である、ライゲーション産物を生じさせる。ライゲーション後、ライゲートされたプローブと標的核酸との二本鎖複合体を、加熱によって変性させ、一本鎖DNAリガーゼ（例えば、CircLigase II）の助けを借りて環状化し、共有結合的に閉じられた一本鎖環209を生成し、ここで、ローリングサークル複製のプライマー212に相補的な配列の完全性が回復される。サンプル中の核酸断片をホスファターゼで処理し、5'末端リン酸基を除去したため、それらは環状化することができない。プローブの未反応左および右アームはまた、それらが5'末端にリン酸基を有するために、環状化され得る（210および211）。
【０１６０】
エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼI）を使用してのライゲーションミックス中の線状ポリヌクレオチドの消化後、プローブ特異的プライマー212を環へアニールさせることができる。プライマー212を環状化プローブ209へアニールさせることは、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼ（例えば、ファージφ29 DNAポリメラーゼ）によるローリングサークル複製を開始することができる複合体を生成し、何故ならば、プライマーの3'末端が環へ完全にアニールされるためである。逆に、プライマー212をプローブの環状化左アーム210へアニールさせることは、DNA合成を開始することができない複合体を生成し、何故ならば、プライマー212の3'末端は環状鋳型と一致しないためである。
【０１６１】
環210の潜在的なプライミングおよび他の非特異的プライミングを生じさせ得る、ファージφ29 DNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性によるプライマー212の3'末端の消化を防ぐために、3'-5'エキソヌクレアーゼ作用に耐性のホスホロチオエート骨格を、プライマーオリゴヌクレオチド212の最後の1〜3個のヌクレオチド連結中へ導入することができる。環状化右アーム211は、そのとき、プライマー212と安定な複合体を形成することができず、従って、ローリングサークル複製をプライミングおよび開始することができない。従って、一つの環状化産物、完全長環状化プローブ209のみが、ローリングサークル複製の鋳型として役に立ち、プローブのタンデムリピートコピーを有する長い一本鎖分子を生成する。
【０１６２】
いくつかの態様において、プローブは、ゲノム中の小さな遺伝的変異、例えば、生殖細胞系中または癌細胞中の一塩基変異多型（SNP）または突然変異を区別および検出するように設計され得る。左アーム部分202中の3'末端での、または右アーム部分203中の最初の5'ヌクレオチド位置での、ヌクレオチドのタイプを設計によって変えることは、2つの対立遺伝子が区別されることを可能にし、何故ならば、DNAリガーゼ、例えば、T4 DNAリガーゼは、標準条件下で、ライゲーション接合点の両側面上の鋳型鎖へ完全に一致するDNA末端のみを主にライゲートすることができるためである。従って、ライゲーション点の隣のマッチまたはミスマッチの存在に依存して、部分202および203は、DNAリガーゼによって、一緒に連結され得るか、または一緒に連結され得ない。
【０１６３】
いくつかの態様において、標的核酸検出方法は、鋳型として標的核酸を使用してのプローブのアームおよび追加のオリゴヌクレオチドである「ブリッジ」の第1ライゲーション、ならびにライゲートされたプローブを環状化するための第2ライゲーションを含む（図10B）。図10Aに示される方法と比較して、図10B中のプローブはまた、左アームオリゴヌクレオチド200および右アームオリゴヌクレオチド201に加えてブリッジオリゴヌクレオチド213を含む。本明細書において使用される場合、ブリッジオリゴヌクレオチド213は、プローブの部分202および203に相補的である上流配列および下流配列の間の標的核酸の中央域に相補的である。プローブへのブリッジオリゴヌクレオチドの付加は、ライゲートされた線状プローブポリヌクレオチドを生成するためには2つのライゲーション事象が必要であるために、アッセイの特異性をさらに増加させるだけでなく、標的核酸中の小さな遺伝的変異（例えば、SNP − 一塩基変異多型）をよりよく調べる方法をも提供する。ブリッジオリゴヌクレオチド213は、5〜10ヌクレオチド長であり得、ヌクレオチド変異は、5'もしくは3'末端、および／またはプローブの左もしくは右アームとのライゲーション接合点の隣を含む、ブリッジオリゴヌクレオチドの長さに沿った様々な位置に配置され得る。ブリッジオリゴヌクレオチドがより短いほど、マッチとミスマッチとの区別がより良くなり、何故ならば、5〜6ヌクレオチド長のブリッジ内の1つのミスマッチでさえ、ブリッジおよびその相補的な標的核酸間に形成される二本鎖複合体の安定性に対して著しい影響を有するためである。
【０１６４】
別の局面において、第2ライゲーション（プローブの環状化）が鋳型依存性ライゲーションである（即ち、ここで、図10に示される態様と比較して、ライゲーション接合点が二本鎖性の領域内にある）方法を提供する（図11Aおよび図11B）。図11に示される態様において、図10の方法において必要とされるような、ローリングサークル複製のためのプライマー311に相補的である配列307を分割する必要がない。図10の方法においては、配列207の完全性の回復が、2つの連続的ライゲーションを受けた環のみをRCRを使用して増幅し、そしてプローブの環状化単一アームから区別するための選択機構として役立つ。一本鎖DNAリガーゼを使用して一本鎖5'および3'末端の鋳型非依存性ライゲーションが行われる図10に示される方法と比較して、鋳型依存性分子内ライゲーションは、標的特異的環を形成するための第2ライゲーション反応として使用され得る。
【０１６５】
図11Aおよび11Bに描写されるように、左アーム300および右アーム301（図11Aを参照して；または図11Bを参照して、左アーム300、右アーム301、および「ブリッジ」309）を有するライゲートされたプローブ314および315のみが、スプリントオリゴヌクレオチド310を使用して、環状化され得る。本明細書において使用されるようなスプリントオリゴヌクレオチド310は、左アームのカスタム5'末端配列および右アームの3'末端配列に相補的である。スプリントオリゴヌクレオチド310へのこれらの末端のアニーリングを促進する条件下で、二本鎖DNA複合体が形成され、ここで、左アーム300のカスタム部分303の5'リン酸化末端が、右アーム301のカスタム部分306の3'末端と並び、DNAリガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼ、またはTaqリガーゼ）を使用して、2つの末端をライゲートすることができる。これは、共有結合的に閉じられた環状一本鎖DNAを含む、ライゲーション産物312を生じさせる。図11Bに示される方法は、一局面においてのみ、図11Aに示される方法と異なり、この一局面において、図11B中の「ブリッジ」オリゴヌクレオチド309が、ライゲートされた線状プローブ315の形成の特異性をさらに増加させるために使用され、ここで、形成されるためには2つのライゲーション接合点が必要とされる。スプリント支援ライゲーション環状化は、共有結合的に閉じられた一本鎖DNA環313を形成させる。加えて、「ブリッジ」の使用は、本明細書において議論されるように、標的核酸中の小さな遺伝的変異を調べるための特異性および適応性をさらに増加させる。
【０１６６】
いくつかの態様において、複数の標的特異的プライマーの各々、および複数のディテクタープローブの各々は、10〜200ヌクレオチド長である。
【０１６７】
3．環状化サンプル核酸の標的特異的プライミングを使用する標的核酸検出および定量化
図12は、断片化核酸（例えば、DNA）の環状化を含む、サンプル中の標的核酸を検出するための本明細書に記載の方法の別の態様を示す。例えば、図12は、2つの核酸標的の同時検出を描写する。そのような方法は、一本鎖DNA（ssDNA）の断片を効率的に環状化するために一本鎖DNAリガーゼの特性を活用する。市販のssDNAリガーゼとしては、非限定的に、CircLigase（商標）、CircLigase II（商標）（Epicentre）、およびThermophageリガーゼ（Prokaria）が挙げられる。例えば、CircLigase（商標）II ssDNAリガーゼは熱安定性酵素であり、5'-リン酸基および3'-ヒドロキシル基を有するssDNA鋳型の分子内ライゲーション（即ち、環状化）を触媒することができる。線状ssDNA断片から環状ssDNA 分子を作るために、それを使用することができる。そのようなssDNA環は、ローリングサークル複製、またはローリングサークル転写のための鋳型として役立つ。相補DNA鋳型上で互いに隣接してアニールされているDNA末端をライゲートするT4 DNAリガーゼとは対照的に、CircLigase II ssDNAリガーゼは、相補配列の非存在下でssDNAの末端をライゲートする。cDNAを含む、15塩基を超える線状ssDNAが、CircLigase II酵素によって環状化される。標準反応条件下で、事実上、線状コンカテマーも環状コンカテマーも生成されない。環状化効率は、ssDNAの長さの増加と共に減少し、例えば、環状化は、500塩基長を超える鋳型について効率的ではない。そこで、本明細書に開示されるような方法は、典型的に、50〜500ヌクレオチド長の範囲の、断片化DNA、またはcDNAを使用する。
【０１６８】
いくつかの態様において、このサイズ範囲のssDNAは、物理的に（例えば、音波破砕）、または酵素的に（例えば、NEBNext（登録商標）dsDNA Fragmentase、New England Biolabs Inc.）サンプルdsDNAを断片化することによって生成することができる。いくつかの態様において、断片化RNAから生成されたcDNAを、環状化のための鋳型として使用することができる。いくつかの態様において、ヒト血液サンプル中に見られる無細胞循環DNA（ccfDNA）を使用する。このDNAは、ホストの正常細胞、胎児DNA、または腫瘍DNAに由来し得る。ccfDNAは、約170塩基対のdsDNA断片によって主に表される。そのような断片のサイズは、ヌクレオソームに巻き付けられたdsDNAサイズ（長さ）にほぼ対応する。変性後、約170ヌクレオチドのssDNA断片は、CircLigase IIによる効率的な環状化によく適している。
【０１６９】
本明細書に開示される方法において、サンプル中に存在するdsDNAの断片は、先ず、熱変性／氷上での急冷、またはアルカリ変性／中和法のいずれかによって一本鎖形態へ変換され、次いで、例えばCircLigase IIによって、環状化され、ssDNA環を生成する。DNAせん断法に依存して、dsDNA断片は、ライゲーションに必要な5'リン酸基および3'ヒドロキシル基を回復させるために修復される必要があり得る。これは、ポリヌクレオチドキナーゼでのdsDNAの処理によって達成することができる。例えばNEBNext（登録商標）dsDNA Fragmentaseによって、酵素により生成されたdsDNA断片は、末端修復を受ける必要がない。
【０１７０】
いくつかの態様において、ssDNA環状化後、非環状化線状断片を、エキソヌクレアーゼ（例えば、大腸菌由来のエキソヌクレアーゼI）で消化し、ssDNA環について濃縮することができる。これは、非環状化線状断片によるローリングサークル複製の潜在的な非特異的プライミングを防止し、標的特異的プライマーが環に対してのみDNA合成を開始することを確実にする。
【０１７１】
いくつかの態様において、少なくとも1つの標的特異的ローリングサークル複製プライマーを、ローリングサークル複製を開始するために提供する。いくつかの態様において、プライマーのセットと呼ばれ得る、複数のプライマーは、標的核酸に相補的である。例えば、病原体もしくはウイルスのゲノム、または染色体もしくは染色体遺伝子座が使用される場合、プライマーのセットは、別個の標的配列をそれぞれ特異的に認識する少なくとも10個の異なるプライマー（例えば、少なくとも異なる100個のプライマー、または少なくとも1000個の異なるプライマー）を含むことができる。
【０１７２】
いくつかの態様において、ローリングサークル複製は、前進的ローリングサークル複製機構の必須条件である強力な鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼによって、プライマー−環複合体から開始される。「鎖置換」は、合成中に酵素によってもたらされる下流DNAを置換する酵素の能力を記載する。例示的なDNAポリメラーゼとしては、ファージφ29 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼラージフラグメント、およびBsu DNAポリメラーゼラージフラグメントが挙げられる。ファージφ29 DNAポリメラーゼは最も強力な鎖置換活性を有し、中程度の温度（例えば、およそ20〜37℃）で活性である。Bsu DNAポリメラーゼラージフラグメントは中程度の鎖置換活性を有し、中程度の温度（例えば、20〜37℃）で活性である。他方で、Bst DNAポリメラーゼ、ラージフラグメントは、高温（例えば、およそ65℃）で活性である良好な鎖置換酵素である。ローリングサークル複製は、環状二重鎖の一方の鎖が複数回の複製のための鋳型として使用され、その鋳型の多くのコピーを生成する、複製構造体である、ローリングサークルを使用する。ローリングサークルは、DNA合成がプライマーの3'末端から開始される場合に形成され、ポリメラーゼ酵素が、アニールしたプライマーの5'末端に達するまで、dsDNAが生成される。DNAポリメラーゼは、次いで、上流の5'末端を置換し始める。新しく合成された鎖は、元のニックを入れられた鎖を置換し、これは新たな合成のための鋳型として役立たない。従って、ローリングサークル機構はDNAの一方の鎖のみをコピーする。伸長は、ローリングサークルに類似するパータンで、複製が鋳型を複数回周回することによって進行する。これは、末端間で連結または結合された、DNAの一本鎖の大量のコピーを産生する。ファージφ29 DNAポリメラーゼによって駆動されるローリングサークル複製は、僅か20〜30分で50キロ塩基長を超える線状コンカテマー産物を生じさせる。そのような長い線状分子は、マイクロメートルサイズのランダムコイルへ折り畳まれ、これは、表面上における堆積および蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションによる染色で、検出され得る。
【０１７３】
いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ssDNA環のミックス内に存在する複数の標的の同時ローリングサークル複製を行う工程を含む。そのような戦略は、「多重標的検出」、または「多重化」と呼ばれる。そのような多重標的検出は、複数のプライマーセットを使用して行うことができ、ここで、複数のプライマーセットの各々は、別個の標的配列を特異的に認識する複数のプライマーを含む。複数のプライマーセットは少なくとも2つのプライマーセットを含む。プライマーセットの数は、対応のディテクタープローブの光学分割可能なセットの数によってのみ制限される。図12は、核酸サンプル中の2つの別個の標的の同時調査を描写し、これは、2つの別個の標的特異的プライマーセットでのローリングサークル複製の開始を含み、ここで、単純化するために、各プライマーセットが1つの単一のプライマーによって表されている。
【０１７４】
いくつかの態様において、ローリングサークル複製のプライミングは、ssDNA環へのプライマーのハイブリダイゼーションを含む。これは、環およびプライマーのミックスを90℃超に加熱すること、続いて約30〜37℃の反応温度へ徐冷すること、ならびにPhi29 DNAポリメラーゼ、緩衝液、および補因子を続いて添加し、DNA合成を開始することによって達成することができる。
【０１７５】
いくつかの態様において、プライマーは、分子ビーコンプローブと類似しているが、フルオロフォア部分が結合されていない、ヘアピン（またはステムループ）構造を有するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、プライマーの3'末端の配列は標的に相補的であり得、3'末端に相補的な5〜8ヌクレオチドが、プライマーの5'末端へ付加され得る。ヘアピンプライマーはローリングサークル複製の特異性を増加させ、何故ならば、ローリングサークル複製の温度（例えば、30〜37℃）で、そのようなプライマーはステムループ形態であり、ここで、3'末端が二本鎖ステム内に隠されており、中程度の反応温度で生成されるローリングサークル複製の2つの主な偽産物であるプライマー二量体または非特異的RCR産物を形成するための誤ったDNA合成に参加することができないためである。
【０１７６】
ローリングサークル複製の特異性を高めるために、プライマーは、IDTによって開発されたrhPCR（RNase H依存性PCR）プライマーと類似した、ブロックされた開裂可能な3'末端を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる（例えば、Dobosy et al., 2011, BMC Biotechnol., 11:80参照）。そのようなプライマーは、3'から5'への方向で、標的に対してミスマッチである第1のDNA塩基、第6位に配置された標的とマッチするRNA塩基、第2および第5位の2つのマッチングDNA塩基、ならびに第3および第4位のブロッキング基（C3スペーサー）を含む。そのようなプライマーは、RNase HIIによってアンブロックされる前は非機能性である。ssDNA環へのそのようなプライマーのアニーリング後、アンブロッキングが、プライマーの3'末端付近に配置された単一のRNA残基でのRNase HII媒介性開裂によって達成される。開裂はブロッキング基を除去し、DNA合成をプライミングすることができる3'-OH末端を残す。開裂は、RNA塩基位置でのおよびRNA塩基位置の周りでのマッチ／ミスマッチの影響を受けやすく、この領域における塩基配列についての非常に高い特異性を生じさせる。
【０１７７】
ローリングサークル複製は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の添加によって停止させることができる。ローリングサークル複製産物の長さは、ほぼ直線的に反応時間依存性である。従って、ランダムコイルへの複製産物の折り畳みは、一定の直径を有する構造体を形成させる。例えば、コンカテマーコイルは、少なくとも50ナノメートル（例えば、少なくとも100ナノメートル、少なくとも500ナノメートル、少なくとも800ナノメートル、少なくとも1マイクロメートル、少なくとも2マイクロメートル、またはそれ以上）の断面直径を有し得る。
【０１７８】
4．表面へのRCR産物の堆積、検出および計数
ローリングサークル複製の産物を表面（例えば、固体、半固体、またはゲル表面）上に堆積させることができる。固体支持体としては、ガラス、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、制御多孔性ガラス、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、カルボキシル修飾テフロン、重合Langmuir Blodgett膜、官能化ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、変性シリコン（modified silicon）、もしくは(ポリ)テトラフロオルエチレン、(ポリ)ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組み合わせのような材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。固体支持体としては、スライド、プレート、ビーズ、粒子、球体、ストランド、シート、容器（例えば、試験管、微量遠心管、トレーなど）、毛細管、フィルム、ポリマーチップなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。基体の表面は平面であり得る。基体上の領域は、例えば、トレンチ、溝、ウェルなどを使用して、互いから物理的に分離され得る。半固体支持体は、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド（ナイロン）および架橋アガロース、デキストランならびにポリエチレングリコールより選択され得る。
【０１７９】
いくつかの態様において、支持体は、コンカテマーが支持体へカップリングされることを可能にするための様々な異なる結合部分を含み得る。好適な結合部分としては、捕捉部分、例えば疎水性化合物、オリゴヌクレオチド、抗体もしくは抗体の断片、タンパク質、化学架橋剤、捕捉対の1つまたは複数のエレメント、例えば、ビオチン-ストレプトアビジン、NHS-エステルなど、チオエーテル結合、静電荷相互作用、ファン・デル・ワールス力などが挙げられるが、これらに限定されない。支持体は、当技術分野において公知の様々な官能基のいずれかで官能化することができる。一般的に使用される化学官能基としては、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、ヒドラジド、アミド、クロロメチル、エポキシ、アルデヒドなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１８０】
いくつかの態様において、ローリングサークル複製の産物を、アミノシランがコーティングされたスライドガラスの表面上に、または96-ウェルプレート中のウェル中に、堆積させる。
【０１８１】
いくつかの態様において、基体の表面上におけるローリング複製の産物の堆積後、それらを標的特異的ディテクタープローブと接触させることによって、それらを検出および視覚化することができる。図12（図9Cの方法）において例示されるような、ディテクタープローブ、またはディテクタープローブセットは、蛍光色素で差次的に標識されている。ハイブリダイゼーション後、2種の産物は識別可能に標識され、2つの標的に対応する産物の数をカウントすることができる。同じ検出戦略はまた、図9A、9B、および9Cに示される方法において使用することできる。図9Aおよび9Bに示される方法と図9Cおよび9Dの方法との主な差異は、最初の2つの方法のためのディテクタープローブは、ライゲーションプローブのカスタム部分（例えば、図10Aおよび10B中の206ならびに図11中の304）に相補的であり、一方、最後の2つの方法において、ディテクタープローブは、サンプル中に存在するそれらの線状形態でのおよび対応する環状形態での標的DNA分子に相補的であることである。
【０１８２】
複数の核酸種の相対量を定量化するために、異なるシグナルを各々の種について使用することができ、例えば、あるプローブセットの産物は、別のプローブセットの産物とは異なる蛍光の波長またはスペクトルを発することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、胎児染色体異数性について試験するために、無細胞循環DNAを含有するサンプルについて調整され得る（例えば、図9Bおよび図9D中の方法を参照のこと）。そのような方法は以下を含み得る：a）異数性について試験される染色体および対照染色体に対応する、第1および第2のRCR産物の混合物を、基体の表面へ堆積させる工程；b）第1および第2の複数のディテクタープローブとハイブリダイズさせる工程であって、ここで、第1および第2の複数のディテクタープローブが識別可能に標識されている、工程；ならびにc）第1の複数のディテクタープローブへ結合されたRCR産物の数をカウントし、独立して、第2の複数のディテクタープローブへ結合されたRCR産物の数をカウントする工程。各RCR産物は元の一本鎖DNA環の数百または数千のコピーを含むため、標識されたディテクタープローブは、これらの複数の繰り返される配列へハイブリダイズし、光学画像化システムによって容易に検出可能である強力な蛍光シグナルを発生させ、従って、各RCR産物の計算処理を可能にする。個々のRCR産物からのシグナルのそのようなデジタルカウントは、無細胞DNAのサンプル中に存在する特定の染色体（例えば、21番染色体対対照1番染色体）に対応するDNA断片の正確なカウントを可能にする。一部の配列が他のものよりも遥かに高い効率で増幅されるために、標的分子の増幅が著しいバイアスを生じさせ得るので、本明細書に記載の方法はPCRよりも正確である。
【０１８３】
いくつかの態様において、ディテクタープローブは蛍光標識され得る。本明細書に記載の方法において有用である好適な識別可能な蛍光標識対としては、Cy-3およびCy-5（Amersham Inc., Piscataway, NJ）、RadiantDY-547およびRadiantDY-647（BioVentures, Inc., Murfreesboro, TN）、Quasar 570およびQuasar 670（Biosearch Technology, Novato CA）、Alexafluor555およびAlexafluor647（Molecular Probes, Eugene, OR）、BODIPY V-1002およびBODIPY V1005（Molecular Probes, Eugene, OR）、POPO-3およびTOTO-3（Molecular Probes, Eugene, OR）が挙げられる。2つを超える蛍光標識が多重標的検出のために必要であることが理解される。好適な識別可能で検出可能な標識は、ウェブリソース“Database on Fluorescent Dye”（World Wide Web上のfluorophores.org）およびKricka et al. (2002., Ann. Clin. Biochem., 39:114-29)において見られ得る。
【０１８４】
同時に使用されるスペクトル的に別個のフルオロフォアの数が限られているため、多重化は、現在、5〜6つの色素に限定されている。しかし、コンビナトリアル標識法が、必要数の異なる発光スペクトルを生じさせるために使用することができる。いくつかの態様において、5-プレックスより高い多重検出について、標的特異的ディテクタープローブは、“Multicolor Combinatorial Probe Coding”（MCPC）（例えば、Huang et al., 2011, PLoS ONE, 6(1):e16033参照）に従う蛍光色素で標識されたプローブを含むことができ、これは、各プローブを標識するために様々な組み合わせで限定数(n)の異なった色のフルオロフォアを使用し、2n -1個の標的の全てが1つの反応で検出されることを可能にする、標識パラダイムを記載している。RCA産物は、それらが基体上に分配される前または後に、標識され得ることが、認識されるだろう。
【０１８５】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、例としての2-プレックス標的検出アッセイについての図13Aに描写されるように、RCRの開始前に、環状化DNA断片を含むサンプルをいくつかの反応へ分割する工程を典型的に含み、ここで、2つのRCR反応が、ポリメラーゼおよびdNTPを使用して別個のコンパートメント中において行われ、そしてここで、新生RCR産物が、色素標識dNTPでの追跡反応中に標識され、識別可能に標識された標的特異的RCR産物を生じさせる。あるいは、RCR反応は、図13Bに描写されるように、開始時に標識dNTPを含むことができる。この場合、非標識dNTPに対する色素標識dNTPの比率は、色素標識dNTPの組み込み密度とRCR産物の全長とのバランスを決定する主要な因子である。非常に高い比率は、嵩高い色素部分の組み込みによってDNAヘリックスが変形し、最終的にはDNAポリメラーゼがさらなるDNA合成を行うことができなくなることに起因して、ローリングサークル複製の進行を制限し、RCRを不成功に終わらし得る。ローリングサークル複製中の色素標識dNTP組み込みの実行可能性は実証されている（例えば、Smolina et al., 2005, Analyt. Biochem., 347:152-5参照）。蛍光標識dNTP、例えば、Cy3.5-dCTP（GE Healhcare Life Sciences）；5-FAM-dUTP、Andy Fluor 488-X-dUTP、Andy Fluor 555-X-dUTP、Andy Fluor 568-X-dUTP、Andy Fluor 594-X-dUTP、Andy Fluor 647-X-dUTP、Cy3-X-dUTP、Cy5-X-dUTP（Applied BioProbes）；ジエチルアミノクマリン-5-dUTP、ジエチルアミノクマリン-5-dCTP、Cy5-dGTP、Cy5-dUTP、Cy5-dATP、Cy5-dCTP、Texas Red-5-dUTP、Texas Red-5-dCTP、Texas Red-5-dATP、Cy3-dUTP、Cy3-dCTP、Cy3-dGTP、Cy3-dATP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dCTP、リサミン-5-dUTP、フルオレセイン-12-dUTP、フルオレセイン-12-dCTP、フルオレセイン-12-dGTP、フルオレセイン-12-dATP（Perkin Elmer）が市販されている。フルオロフォア標識ディテクタープローブのハイブリダイゼーション（例えば、図12参照）の代替法である、そのようなRCR産物標識法は、容易なシグナル検出のために、各RCR産物中に数百または数千のフルオロフォアを組み込むことができる。
【０１８６】
いくつかの態様において、識別可能に標識された分割されたRCR反応物を、定量化のための表面上における堆積前に一緒にプールし戻すか（図13Aおよび13B参照）、または支持体の表面上における分離した領域上に堆積させる（図14Aおよび14B）。後者の場合、分割された反応物は、同じフルオロフォアの組み込みによってRCR中に標識され得る。
【０１８７】
本発明に従って、当技術分野の技能内の従来の分子生物学、微生物学、生化学、および組換えDNA技術が用いられ得る。そのような技術は文献中に完全に説明されている。本発明を以下の実施例においてさらに説明し、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の方法および組成物の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１８８】
パートA−正荷電タグを使用して標的核酸を検出する方法
実施例1−オリゴスペルミン-オリゴヌクレオチドコンジュゲートプローブの開裂
Zip核酸（ZNA）オリゴヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド検出プローブを合成し、ここで、5'または3'検出可能タグは、それぞれ、(- + + + +) × 3 = 9+、または(- + + + +) × 4 = 12+の正味の電荷を有する3または4つのスペルミン単位を有するオリゴスペルミンポリカチオン性5'または3'尾部である。
【０１８９】
RNaseP qPCRアッセイについてのプローブ1：
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【０１９０】
RNaseP qPCRアッセイについてのプローブ2：
2019512101.tif 000004
【０１９１】
プローブのオリゴヌクレオチド部分は、ヒトRNaseP遺伝子に相補的な配列である。アニールしたプローブの3'末端からのDNAポリメラーゼによるDNA合成のプライミングを防ぐために、プローブ1の3'末端をC3スペーサーによってブロックする。PCR順方向および逆方向プライマーを、60 bpのRNasePアンプリコンを生成するように設計した。
【０１９２】
RNaseP qPCRアッセイについての順方向プライマー：
2019512101.tif 000005
【０１９３】
RNaseP qPCRアッセイについての逆方向プライマー：
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【０１９４】
プローブ1は、Taqポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ（フラップエンドヌクレアーゼ）活性によってPCR中に開裂され、5'ポリカチオン性オリゴスペルミンタグを放出すると予想される。プローブ2のオリゴヌクレオチド部分は、Taqポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性によってPCR中に消化され、3'ポリカチオン性オリゴスペルミンタグを放出すると予想される。
【０１９５】
ヒトRNaseP遺伝子の60 bpアンプリコンのPCR増幅を、下記に指定の反応条件下においてプローブ1またはプローブ2のいずれかの存在下で行った。1x Taq緩衝液（New England Biolabs Inc.）、200μMの各dNTP、0.8μM順方向プライマー、0.8μM逆方向プライマー、0.4μMプローブ、5 U/μl Hot Start Taq（New England Biolabs Inc.）、および100 ngヒトDNAを含有する反応ミックス中において、PCRを行った。6つのPCR反応を以下のように設定した：
反応1：プローブ1を使用するPCR；
反応2：「鋳型無し対照」（NTC） − 反応1と同じ、但し、鋳型DNAが含まれなかった；
反応3：プローブ2を使用するPCR；
反応4：「鋳型無し対照」（NTC） − 反応3と同じ、但し、鋳型DNAが含まれなかった；
反応5：「陰性対照」 − プローブ1を含む反応ミックス、但し、順方向プライマー、逆方向プライマー、Taqポリメラーゼ、および鋳型DNAが省かれた、
反応6：「陰性対照」 − プローブ2を含む反応ミックス、但し、順方向プライマー、逆方向プライマー、Taqポリメラーゼ、および鋳型DNAが省かれた。
【０１９６】
サーモサイクリングを以下の条件下で行った：95℃30秒間；95℃15秒間、55℃30秒間、68℃30秒間を30サイクル；ならびに68℃5分間。PCRの完了後、反応物を15% TBE-尿素ゲル上にロードし、180 Vで泳動させ、GelStarインターカレーティング色素（Lonza, Inc.）で染色した。図8は、NTC（レーン2）と比較されるように、プローブ1がPCR反応（レーン1）中に特異的に開裂されることを実証する。レーン5は、プローブ1の電気泳動移動度を示す。同様に、プローブ2は、産物の増幅が成功したサンプルにおいてのみ開裂され（レーン3）、対照NTCサンプル（レーン4）において開裂は観察されない。レーン6は、プローブ2の電気泳動移動度を示す。これらの結果は、5'または3'末端で正荷電タグを有するプローブが、Taqポリメラーゼによって効率的に開裂され得ることを実証する。
【０１９７】
パートB−ローリングサークル複製を使用して標的核酸を検出する方法
実施例1−トリソミー21（ダウン症）の検出
図11Aに描写されるような、例示的な方法は、ヒト染色体特異的領域を調べるための設計であった。192個のヒト1番染色体特異的プローブおよび192個のヒト21番染色体特異的プローブを合成した。それぞれのプローブは、2つの5'リン酸化オリゴヌクレオチド：左アームおよび右アームを含んだ。それぞれの左および右アームオリゴヌクレオチドは、標的とするヒト配列に対する20〜30 nt相同領域、および以下の配列を有するカスタム配列フラップを有した：
1番染色体プローブの左アームについて
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21番染色体の左アームについて
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ならびに
1番染色体特異的プローブおよび21番染色体特異的プローブの両方の右アームについて
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【０１９８】
Coriell Cell Repository（Camden, NJ）からのNA19238女性のヒトDNAを、Fragmentase（New England Biolabs）で断片化し、平均断片サイズ180 ntへサイズ選択した。20 ngの断片化DNAを、各々192個のプローブ（384個のプローブの各々は最終濃度5 nMである）からなる染色体特異的プローブの2つのプールのミックスと混ぜ合わせ、製造業者の条件に従ってHiFi Taqリガーゼによって62℃でアニールおよびライゲートした。平均サイズ約90 ntを有する一本鎖のライゲーション産物を、ゲル電気泳動によってプローブから分離し、Nucleospinキット（Machereu-Nagel）を使用して2%ゲルから切り離し、抽出した。60μlの10 mM Tris pH 8 / 0.1 mM EDTA中のライゲーション産物を、10μlの10μMスプリントオリゴヌクレオチド
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と混合し、95℃へ3分間加熱し、次いで、氷上でスナップ冷却した。1x TA緩衝液（33 mM Tris-アセテート(pH 7.5)、66 mM酢酸カリウム、10 mM酢酸マグネシウム、および0.5 mM DTT）、1 mM ATP、ならびに2.1単位／μlのT4 DNAリガーゼからなるライゲーションミックス50 ulを添加し、ライゲーション／環状化反応を37℃で1時間行った。エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼIII（両方ともEnzymatics Inc製）を、それぞれ、最終濃度0.62単位／μlおよび1.03単位／μlまで、ライゲーションミックスへ添加し、37℃で0.5時間サーマルサイクラー中においてインキュベートした。反応を停止するために、6μlの0.5 M EDTAをサンプルへ添加した。一本鎖DNA環を、Nucleospin Clean-Upキット（Macherey-Nagel）を使用して精製し、20μlの10 mM Tris pH 8中において溶出した。RCRプライマー（スプリントオリゴヌクレオチドと同じ）を、最終濃度0.5μMまで添加し、30μl反応ミックスを93℃へ3分間加熱し、30分間にわたって30℃へ徐冷した。アニールしたRCRプライマーを有する環を含有するミックスへ以下の反応成分を添加することによって、ローリングサークル複製を設定した：1x Phi29緩衝液、0.2 mM dNTP（それぞれ）、0.2μg/μl BSA、200 mU/μl Phi29 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）。反応を30℃で1時間行い、EDTAの添加によって停止させた。最終RCR産物を、カスタムフローセル中のアミノシランスライドガラスの表面上に30分間堆積させ、最終デコレーター（decorator）プローブ濃度5 nMで、ハイブリダイゼーション緩衝液（1 M NaCl / 20 mM EDTA / 20 mM Tris / 0.1% Tween-20；70℃で2分間および50℃で30分間）中、1番染色体に特異的な
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および21番染色体に特異的な
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のミックスとハイブリダイズさせた。フローセルをハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄し、同じ視野のCy3およびCy5蛍光画像を撮影し、1番染色体および21番染色体に特異的なRCR産物を視覚化した。図15。
【０１９９】
本発明の方法および組成物を多数の異なる局面と共に本明細書において記載したが、様々な局面の前述の記載は、説明するように意図され、本発明の方法および組成物の範囲を限定しないことが、理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０２００】
開示される方法および組成物のために使用され得るか、これらと共に使用され得るか、これらのための調製において使用され得るか、またはこれらのプロダクトである、方法および組成物が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されることが理解される。即ち、これらの組成物および方法のそれぞれの様々な個々のおよび集合的な組み合わせおよび順列への具体的な参照が明示的に開示されていない場合があるが、それぞれが本明細書において具体的に意図および記載される。例えば、本発明の特定の組成物または特定の方法が開示および議論され、そして多数の組成物または方法が議論される場合、そうではないように具体的に示されない限り、組成物および方法のあらゆる組み合わせおよび順列が具体的に意図される。同様に、これらのいかなるサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に意図および開示される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月18日(2018.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019512101000001.app
【国際調査報告】
2019512101.tif 000037
2019512101.tif 000038