(57)【要約】  精製工程が介在しない、単一の反応器での線状ＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡ環の生成および増幅のための方法が本明細書において提供される。一本鎖ＤＮＡ環は、鋳型非依存性一本鎖ＤＮＡライゲーションによって生成される。ライゲーション支援ＤＮＡ増幅を用いる単一管での線状染色体ＤＮＡの全ゲノム増幅も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅のための方法であって、前記方法が、
（ａ）線状染色体ＤＮＡを準備する工程と；
（ｂ）一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの可能なリガーゼとともに前記線状染色体ＤＮＡをインキュベートして一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程と；
（ｃ）ランダムプライマー混合物を使用するローリングサークル増幅によって前記一本鎖ＤＮＡ環を増幅して増幅ＤＮＡ産物を形成する工程とを含み、
前記ランダムプライマー混合物が、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド配列を含み、かつ
前記方法の前記工程の全てが、介在する単離および精製工程を含まずに、単一の反応器で実施される、
方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、２−アミノ−デオキシアデノシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、２−チオ−デオキシチミジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ランダムプライマー混合物が、選択的結合相補オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択的結合相補オリゴヌクレオチドの各メンバーが、２−アミノ−デオキシアデノシンを含む少なくとも１つのヌクレオチドまたは２−チオ−デオキシチミジンを含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ランダムプライマー混合物が、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、２−アミノ−デオキシアデノシンを含むヌクレオチド、２−チオ−デオキシチミジンを含むヌクレオチド、またはその組合せを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ランダムプライマー混合物が、一般構造、＋Ｎ＋Ｎ（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）＊Ｎを有するオリゴヌクレオチド配列を含む六量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ランダムプライマー混合物中の個々のオリゴヌクレオチド配列が、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ランダムプライマー混合物の濃度が、多重ランダムプライムドローリングサークル増幅を促進するために、前記一本鎖ＤＮＡ環の濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記線状染色体ＤＮＡが、無細胞循環ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から単離したＤＮＡ、環境条件にさらされた法医学ＤＮＡ試料、非常に古いＤＮＡ試料、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記線状染色体ＤＮＡが、断片化されたＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記線状染色体ＤＮＡが二本鎖形態である場合に、工程（ｂ）の前に前記線状染色体ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リガーゼが、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リガーゼが、プレ−アデニル化リガーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プレ−アデニル化リガーゼが、プレ−アデニル化ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一本鎖ＤＮＡ環の前記生成が、アデノシン三リン酸またはデオキシアデノシン三リン酸の不在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）〜（ｃ）が、前記単一の反応器で順次に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法の前記工程の全てが、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記線状染色体ＤＮＡを前記リガーゼとともにインキュベートする前に、前記線状染色体ＤＮＡをリン酸供与体の存在下でポリヌクレオチドキナーゼで処理して、リン酸基を５’末端に有しヒドロキシル基を３’末端に有するライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記線状染色体ＤＮＡが、アデノシン三リン酸またはデオキシアデノシン三リン酸以外のリン酸供与体の存在下、前記ポリヌクレオチドキナーゼで処理される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅ＤＮＡ産物を配列決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅ＤＮＡ産物を断片化してゲノムＤＮＡライブラリーを作製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
標的ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションに基づく捕捉のために前記ゲノムＤＮＡライブラリーを用いることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記捕捉された標的ＤＮＡ配列を配列決定することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ＤＮＡ配列がエクソーム配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
損傷したヌクレオベースを修飾するために工程（ｃ）の前に前記一本鎖ＤＮＡ環を処理することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
前記処理が、工程（ｂ）の前記ライゲーション混合物をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ、またはその組合せとともにインキュベートすることによって実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅が全ゲノム増幅である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ローリングサークル増幅が、除染されたＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、単離および／または精製工程を介在させずに、単一の反応器でローリングサークル増幅によって線状核酸配列を増幅するための方法に関する。この方法は、鋳型非依存性一本鎖ＤＮＡライゲーションと、それに続く専門のプライマー配列を使用するローリングサークル増幅による、一本鎖もしくは二本鎖線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環の生成を伴う。この方法はさらに、ランダムプライマー混合物を使用するローリングサークル増幅による単一の反応器での線状染色体ＤＮＡの全ゲノム増幅とその後のその検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ増幅は、標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を複製してその複数のコピーを生成するプロセスである。ｄｓＤＮＡの個々の鎖は、逆平行で相補的であるので、各々の鎖は、その相補鎖を生成するための鋳型鎖として用いることができる。鋳型鎖は全体として、または末端切断部分として保存され、相補鎖はＤＮＡポリメラーゼによってデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）から構築される。相補鎖合成は、鋳型鎖とハイブリダイズするプライマー配列の３’末端から出発して５’→３’方向に進む。
【０００３】
全ゲノム増幅（ＷＧＡ）は、標的ＤＮＡの非特異的増幅を伴う。ＷＧＡは、多くの場合、鎖置換活性を有する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ）とともに標的ＤＮＡの複数の位置でＤＮＡ合成を開始させるためのランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いる多置換増幅（ＭＤＡ）技法によって達成される。たとえＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥヘルスケア、米国）およびＲｅｐｌｉＧ（キアゲン）キットなどの現在利用できる市販のＷＧＡ系が、高分子量の標的ＤＮＡで最適な結果を提供するとしても、標的ＤＮＡが短く、かつ／または高度に断片化されている場合には、これらの系の成績は悪い。標的ＤＮＡが断片化されていて、配列の長さが約１０００ヌクレオチド未満である場合、従来法を用いる標的ＤＮＡの増幅は、結果として増幅速度の低下、特に標的ＤＮＡの末端の近くの重要な配列の脱落、および非常に配列に偏った増幅をもたらす。鋳型ＤＮＡの長さが短くなるほど、ＭＤＡ反応において複数回プライミングされた鎖の尤度は低下する。このことは、これらのより短い断片の増幅可能性を低下させる。そのため、短い断片化されたＤＮＡを非特異的に増幅するための効率的な方法が非常に望ましい。
【０００４】
ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、断片化されたｄｓＤＮＡを増幅するために使用されている。しかし、断片化されたＤＮＡのごく一部だけしかこれらの反応において増幅されず、不適切なゲノムカバレッジを導く。断片化された標的ｄｓＤＮＡを効率的に増幅するためには、それらを最初に修復し、その後に平滑末端ライゲーションによって鎖状体化して、１０００塩基対（ｂｐ）よりも長い配列を生成すればよい。しかし、標的ＤＮＡの濃度が比較的高いと、しばしば鎖状体化およびその後の増幅を促進することが必要とされる。二本鎖標的ＤＮＡの環状化は、ＭＤＡ、ＷＧＡ、高分岐ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）および大規模並列ＤＮＡシークエンシングを含む、様々な核酸に基づくアッセイでも用いられている。断片化されたｄｓＤＮＡを効率的に環状化し増幅するためには、断片化されたＤＮＡの二本鎖末端を最初に修復し、その後に平滑末端ライゲーションして二本鎖ＤＮＡ環を形成する。しかし、長さが５００ｂｐ未満の二本鎖ＤＮＡ断片を環状化することは困難である。
【０００５】
二本鎖ＤＮＡは、変性させて一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を生成することができ、一本鎖ＤＮＡはリガーゼを用いる鋳型依存性分子内ライゲーション反応においてさらに環状化させることができる。しかし、標的ＤＮＡの事前の配列情報が、鋳型依存性環状化を実施するために必要とされる。ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションも文書化されている。例えば、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ＲＮＡリガーゼ  ＩＩまたはＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｋａｒｉａ、Ｍａｔｉｓ、アイスランド）あるいはＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国ウィスコンシン州の登録商標で市販されている））は、デジタルＤＮＡボールを作製するために、かつ／またはＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡなどの遺伝子座特異的切断および増幅のために使用されている。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）がＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼの実質的にアデニル化された形態を含む、低い程度（約３０％）のアデニル化を有する。ｍＲＮＡの５’末端断片から調製した線状一本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子も、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼを用いる環状化の後、ローリングサークル複製によって増幅された。センスＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列をｃＤＮＡに適切に組み込むことにより、環状化されたｃＤＮＡ鋳型は、転写基材として働き、したがって生体試料中のｍＲＮＡ分子の増幅に影響を及ぼすことが示されている。さらに、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼは、ｃＤＮＡ末端のランダム増幅（ＲＡＣＥ）のためにｃＤＮＡ末端を増幅するために使用されている。限られた量の断片化されたＤＮＡから、ローリングサークル増幅のためのＤＮＡ鋳型も、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼを用いることによって生成されている。この方法は、線状の断片化されたｄｓＤＮＡを変性させて線状ｓｓＤＮＡ断片を得、線状ｓｓＤＮＡとＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを連結して一本鎖ＤＮＡ環を得、その後ＲＣＡによってランダムプライマーおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖ＤＮＡ環を増幅することを伴った。しかし、反応条件を最適化した後でさえ、生成された一本鎖環状ＤＮＡの量は、変動が大きく、配列依存性であった。例えば、５’Ｇおよび３’Ｔヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、同一のライゲーション条件下で５’Ａおよび３’Ｃを含むその相補オリゴヌクレオチドよりも著しく良好に連結された。さらに、分子内ライゲーション効率は、同一かまたは非常に似たサイズを有するがヌクレオチド配列がわずかに異なる線状ｓｓＤＮＡ配列の間で変動した。この効率は異なるサイズ（例えば、サイズが１００塩基から数キロベースに及ぶ配列長）の線状ｓｓＤＮＡ配列間でも変動した。さらに、ライゲーション−増幅反応の全ての試みは中間の単離、精製および／またはクリーニング工程を必然的に含み、したがってライゲーション−増幅ワークフローを扱いにくいものにした。例えば、環状化とそれに続くローリングサークル増幅による、断片化されたＤＮＡからなる法医学試料の分析は、５’ＤＮＡリン酸化、アダプターライゲーション、ＤＮＡ環状化、および全ゲノム増幅を含む多数の工程で実行された。各々の工程反応は、次の工程を実施する前に反応クリーンアップに付した。さらに、多段階プロセスは多くの場合、鋳型ＤＮＡを失い、分析の失敗という結果をもたらした。ライゲーションおよび増幅を単一の反応器で実施した場合に、増幅の利点は観察されなかった；むしろ繰り越したライゲーション反応の成分はしばしばその後の増幅反応に対して抑制性であることが見出された。そのため、特に代表的で平均のとれた全ゲノム情報が望ましい場合に、介在するクリーニング工程がなく、単一の反応器で短いＤＮＡ配列を非特異的に増幅するための効率的な方法が非常に望ましい。さらに、ライゲーション−増幅の各々において反応物質に起因する抑制を克服する、単一の反応器でローリングサークル増幅によって線状の核酸配列を増幅するための方法は非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０２２３５９号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
一部の実施形態では、ローリングサークル増幅による線状染色体ＤＮＡの増幅のための方法が提供される。この方法は、線状染色体ＤＮＡを準備する工程、一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションの可能なリガーゼを用いて線状染色体ＤＮＡの分子内ライゲーションを実施して一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程、およびローリングサークル増幅によって一本鎖ＤＮＡ環を増幅する工程を含む。ローリングサークル増幅は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチド配列を含むランダムプライマー混合物を用いる。ライゲーション反応およびローリングサークル増幅反応を含む、この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介在させずに、単一の反応器で実施される。線状染色体ＤＮＡが二本鎖形態である場合、分子内ライゲーション反応の前にそれを変性させてて一本鎖ＤＮＡを生成する。一部の実施形態では、この方法は、標的ＤＮＡの全ゲノム増幅に使用される。
【０００８】
本発明のこれらおよびその他の特徴、態様および利点は、添付の図を参照して以下の詳細な説明を読むとより良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】断片化されたｄｓＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅の一実施形態の模式図を示す図である。
【図２】健康な個体の血漿から単離した循環ＤＮＡのサイズプロフィールを示す図である。
【図３Ａ】ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）を用いる、全血の非細胞画分から抽出される循環ＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅を示す図である。
【図３Ｂ】Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる、全血の非細胞画分から抽出された循環ＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅を示す図である。
【図３Ｃ】大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼを用いる、全血の非細胞画分から抽出される循環ＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅を示す図である。
【図４】４つの異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座の感受性がありバランスのとれたＤＮＡ増幅のためのリガーゼ支援全ゲノム増幅の有効性を示す図である。
【図５】１２の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座の感受性がありバランスのとれたＤＮＡ増幅のためのリガーゼ支援全ゲノム増幅の有効性を示す図である。
【図６】異なる反応および緩衝条件でのリガーゼ支援全ゲノム増幅の効率を示す図である。
【図７】リガーゼ支援全ゲノム増幅における高分子量ゲノムＤＮＡの増幅の抑制を示す図である。
【図８】ポリヌクレオチドキナーゼを用いる断片化されたＤＮＡのプロセシング（例えば、末端修復）とその後のプロセシングされた断片化されたＤＮＡのリガーゼ支援増幅を含むリガーゼ支援全ゲノム増幅の模式図を示す図である。
【図９】ＧＴＰの存在下、ＰＮＫおよびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）を用いる、断片化されたＤＮＡのリガーゼ支援増幅の単一管反応の模式図を示す図である。
【図１０】ＤＹＳ１４雄特異的マーカーがインプットＤＮＡから作成したライブラリーを用いて検出される、雄−雌血漿／血液を用いる単一管リガーゼ支援増幅反応を示す図である。
【図１１】断片化されたＤＮＡのリン酸化およびプレ−アデニル化とその後の実質的非アデニル化リガーゼを用いるライゲーションの模式図を示す図である。
【図１２】実質的非アデニル化リガーゼを用いるプレ−アデニル化ＤＮＡ配列の環状化の効率の向上を示す図である。
【図１３】標的ＤＮＡ配列がプレ−アデニル化された場合およびライゲーションが非アデニル化リガーゼを用いて実施された場合のリガーゼ支援全ゲノム増幅の効率の向上を示す図である。
【図１４】ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）を用いる、血漿ＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅を示す図である。
【図１５】カバレッジ深度および均一性レベルに関して、増幅されたＤＮＡの定性分析を示す図である。
【図１６】ＡＴ六量体を使用する、標的配列領域の全体にわたって観察された全体的なカバレッジおよび均一性を示す図である。
【図１７】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）を用いて一本鎖ＤＮＡ環の生成の前に一本鎖ＤＮＡから損傷を修復する／除去するか、または生成された一本鎖ＤＮＡ環から損傷を修復する／除去する場合の、あるいはＤＮＡ損傷の修復／除去が行われない場合の、カバレッジの深度を示す図である。
【図１８】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）を用いて一本鎖ＤＮＡ環の生成の前に一本鎖ＤＮＡからＤＮＡ損傷を修復する／除去するか、または生成された一本鎖ＤＮＡ環からＤＮＡ損傷を修復する／除去する場合の、あるいはＤＮＡ損傷の修復／除去が行われない場合の、カバレッジの深度および均一性を示す図である。
【図１９】ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）を用いてローリングサークル増幅の前に一本鎖ＤＮＡ環からＤＮＡ損傷を修復する／除去するか、または生成された一本鎖ＤＮＡ環からＤＮＡ損傷を修復する／除去する場合の、あるいはＤＮＡ損傷の修復／除去が行われない場合の、良好な陽性的中率（ＰＰＶ）および感受性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本発明または本発明の使用を制限することを目的としない。明細書全体を通して、特定の用語の例示は、限定されない例とみなされるべきである。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への言及が含まれる。本明細書において明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用される近似を表す語は、その関連する基本機能を変えることなく許容範囲内で変化し得る任意の量的表現を修飾するために適用されてよい。したがって、「約」などの用語によって修飾された値は、特定される正確な値に限定されない。別に指定されない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される構成成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表す全ての数は、全ての例において「約」という用語で修飾されていると理解される。したがって、他にそうでないことが示されていない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲で示される数値パラメータは本発明によって得ようとする望ましい性質によって変化する可能性のある近似値である。少なくとも、特許請求の範囲と同等物の学説の適用を制限する試みではなく、各々の数値パラメータは、少なくとも報告される有効数字の数を考慮し、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。必要な場合には、範囲が提供されており、それらの範囲はその間のあらゆる下位範囲を含む。特許請求される本発明の主題をより明白かつ簡潔に記載し示すために、以下の説明および添付される特許請求の範囲で使用される特定の用語に対して以下の定義が与えられる。
【００１１】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、核酸塩基（ヌクレオベース）が糖部分に結合しているグリコシルアミン化合物をさす。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドリン酸をさす。ヌクレオチドは、表１に記載されるようにそのヌクレオシドに対応するアルファベット文字（文字呼称）を用いて表すことができる。例えば、Ａはアデノシン（ヌクレオベースを含有するヌクレオシド、アデニン）を意味し、Ｃはシチジンを意味し、Ｇはグアノシンを意味し、Ｕはウリジンを意味し、Ｔはチミジン（５−メチルウリジン）を意味する。ＷはＡかまたはＴ／Ｕのいずれかを意味し、ＳはＧかまたはＣのいずれかを意味する。Ｎはランダムヌクレオシドを表し、ｄＮＴＰは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸をさす。Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ／Ｕのいずれであってもよい。
【００１２】
【表１】
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本明細書において、用語「ヌクレオチド類似体」とは、天然に存在するヌクレオチドに構造的に類似する化合物をさす。ヌクレオチド類似体は、変更されたリン酸主鎖、変更された糖部分、変更されたヌクレオベース、またはその組合せを有してよい。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または代替置換部分（例えば、イノシン）であってよい。一般に、変更されたヌクレオベースをもつヌクレオチド類似体は、とりわけ、異なる塩基対形成および塩基スタッキング特性を付与する。本明細書において、用語「ＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分がリボ核酸（ＲＮＡ）を模倣する糖コンホメーションにロックされた二環式フラノース単位を含有するヌクレオチド類似体をさす。デオキシリボヌクレオチド（またはリボヌクレオチド）からＬＮＡヌクレオチドへの構造変化は、化学的見地から限られている、つまり、２’位と４’位の炭素原子間のさらなる結合の導入である（例えば、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合；例えば、Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４，４５５−４５６，１９９８、またはＫｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７−３６３０，１９９８参照）。ＬＮＡヌクレオチドにおいてフラノース単位の２’位および４’位は、Ｏ−メチレン（例えば、オキシ−ＬＮＡ：２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド）、Ｓ−メチレン（チオ−ＬＮＡ）、またはＮＨ−メチレン部分（アミノ−ＬＮＡ）、および同類のものによって結合されてよい。そのような結合は、フラノース環のコンホメーションの自由度を制限する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的一本鎖ＲＮＡ、および相補的一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性の向上を示す。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａ型（ＲＮＡ様）の二重鎖コンホメーションを誘導することができる。改変されたリン酸塩−糖骨格（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ）を有するヌクレオチド類似体は、多くの場合、とりわけ、二次構造形成などの鎖の性質を修飾する。文字呼称の前の星（＊）記号は、その文字で指定されるヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを示す。例えば、＊Ｎは、ホスホロチオエート修飾ランダムヌクレオチドを表す。文字呼称の前のプラス（＋）記号は、その文字で指定されるヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであることを示す。例えば、＋Ａは、アデノシンＬＮＡヌクレオチドを表し、＋Ｎは、ロックドランダムヌクレオチド（すなわちランダムＬＮＡヌクレオチド）を表す。文字呼称「（ａｔ  Ｎ）」は、ヌクレオベース２−アミノ  ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、ＧまたはＣを含有するランダムヌクレオチドを表す。
【００１３】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのオリゴマーをさす。本明細書において用いられる用語「核酸」とは、ヌクレオチドのポリマーをさす。本明細書において用いられる用語「配列」とは、オリゴヌクレオチドまたは核酸のヌクレオチド配列をさす。本明細書全体を通して、オリゴヌクレオチドまたは核酸が一連の文字で表される場合はいつでも、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順序である。例えば、文字配列（Ｗ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｓ）ｚ（式中、ｘ＝２、ｙ＝３およびｚ＝１）で表されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列ＷＷＮＮＮＳを表し、この際、Ｗは５’末端ヌクレオチドであり、Ｓは３’末端ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体（例えば、ホスホロチオエート類似体）であってよい。オリゴヌクレオチドまたは核酸には、修飾された塩基および／または骨格（例えば、修飾されたリン酸結合または修飾された糖部分）を含むこともできる。安定性および／またはその他の利点を核酸に与える合成骨格の限定されない例としては、ホスホロチオエート結合、ペプチド核酸、ロックド核酸、キシロース核酸、またはそれらの類似体を挙げることができる。
【００１４】
本明細書において、用語「プライマー」とは、標的核酸配列（例えば、増幅させるＤＮＡ鋳型）とハイブリダイズして核酸合成反応を開始させる短い線状のオリゴヌクレオチドをさす。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列であってよい。プライマーは、天然、合成、または修飾ヌクレオチドを含んでよい。プライマーの長さの上限と下限は経験的に求められる。プライマー長の下限は、核酸増幅反応条件下での標的核酸とのハイブリダイゼーションによって安定した二重鎖を形成するために必要とされる最小の長さである。非常に短いプライマー（通常３ヌクレオチド長未満）は、そのようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と熱力学的に安定した二重鎖を形成しない。上限は、多くの場合、標的核酸の予め決められた核酸配列以外の領域で二重鎖形成ができる可能性によって決まる。一般に、適したプライマー長は、約３ヌクレオチド長から約４０ヌクレオチド長の範囲内である。
【００１５】
本明細書において、用語「ランダムプライマー」とは、オリゴヌクレオチド配列の任意の所与位置で、該所与位置が可能性のあるヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれからも構成され得るような方法（完全ランダム化）でヌクレオチドをランダム化することによって生成されたプライマー配列の混合物をさす。したがってランダムプライマーは、配列内のヌクレオチドのあらゆる可能性のある組合せからなる、オリゴヌクレオチド配列のランダムな混合物である。例えば、六量体のランダムプライマーは、配列ＮＮＮＮＮＮまたは（Ｎ）６で表すことができる。六量体ランダムＤＮＡプライマーは、４つのＤＮＡヌクレオチド、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのあらゆる可能性のある六量体の組合せからなり、結果として４６（４，０９６）の特有の六量体ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含むランダム混合物となる。ランダムプライマーは、標的核酸の配列が不明である場合か、または全ゲノム増幅反応のために、核酸合成反応を開始させるために効果的に使用することができる。
【００１６】
本明細書に記載されるように、用語「部分拘束プライマー」とは、オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチドの一部を完全にランダム化すること（すなわち、ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ、またはそれらの類似体のいずれかであってよい）一方で、一部のその他のヌクレオチドの完全なランダム化を制限する（すなわち、特定の位置でのヌクレオチドのランダム化は、可能性のある組合せＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ、またはそれらの類似体よりも程度が低い）ことによって生成されたプライマー配列の混合物をさす。例えば、ＷＮＮＮＮＮで表される部分拘束ＤＮＡ六量体プライマーは、混合物中の全ての配列の５’末端ヌクレオチドがＡまたはＴであるプライマー配列の混合物を表す。ここで、５’末端ヌクレオチドは、完全ランダムＤＮＡプライマー（ＮＮＮＮＮＮ）の最大４の可能性のある組合せ（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）とは対照的に、２つの可能性のある組合せ（ＡまたはＴ）に拘束される。部分拘束プライマーの適したプライマー長は、約３ヌクレオチド長から約１５ヌクレオチド長の範囲内であってよい。
【００１７】
本明細書に記載されるように、用語「末端ミスマッチプライマー−二量体構造を有する部分拘束プライマー」とは、部分拘束プライマー中の２つの個別のプライマー配列が、３以上のヌクレオチドの内部相同性で互いに分子間でハイブリダイズして、陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造、または単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造、または２つのヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成する場合、プライマー−二量体構造の両方の３’末端ヌクレオチドにヌクレオチドミスマッチ（すなわちヌクレオチドが塩基対形成しない）が存在する、部分拘束プライマー配列をさす。例えば、ＷＮＮＮＳで表される部分拘束五量体プライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。プライマー−二量体構造には、３ヌクレオチドの内部相同性が存在する（すなわち、分子間ハイブリダイゼーションによって陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造が形成される場合に、ＷＮＮＮＳの３つのランダムヌクレオチドは、互いに塩基対形成することがある）。しかし、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を含むプライマー−二量体構造を形成する場合に末端ミスマッチをもたらさない。同様に、ＷＷＮＮＮＳで表される部分拘束六量体プライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。さらに、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成する場合でさえ、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。ＷＷＷＮＮＮＳで表される部分拘束七量体プライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。さらに、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして、単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成するか、または２−ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。
【００１８】
本明細書において、用語「ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）」とは、ローリングサークル機構によって、環状の核酸鋳型（例えば、一本鎖ＤＮＡ環）を増幅する核酸増幅反応をさす。ローリングサークル増幅反応は、プライマーと、環状の、多くの場合一本鎖の、核酸鋳型とのハイブリダイゼーションによって開始される。次に、核酸ポリメラーゼが、環状の核酸鋳型の周囲を連続的に前進して、核酸鋳型の配列を何度も繰り返して複製すること（ローリングサークル機構）によって、環状の核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させる。ローリングサークル増幅は、一般に、環状の核酸鋳型配列の縦列反復単位を含むコンカテマーを生成する。ローリングサークル増幅は、線状の増幅速度を示す線状ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）（例えば、単一の特異的プライマーを用いるＲＣＡ）であってもよいし、指数関数的な増幅速度を示す指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）であってもよい。ローリングサークル増幅はまた、複数のプライマーを用いて実施して（多重プライムドローリングサークル増幅またはＭＰＲＣＡ）超分岐コンカテマーを導くこともできる。例えば、二重プライミングＲＣＡにおいて、一方のプライマーは、線状ＲＣＡでのように、環状の核酸鋳型に対して相補的であってよいが、もう一方はＲＣＡ産物の縦列反復単位核酸配列と相補的であってよい。その結果として、二重プライミングＲＣＡは、両方のプライマーの関与する多重ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、および鎖置換事象の分枝カスケードを特徴とする指数関数的（幾何学的）増幅速度をもつ連鎖反応として進行することができる。これは、多くの場合、別のコンカテマー二本鎖核酸増幅産物のセットを生成する。ローリングサークル増幅は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの適した核酸ポリメラーゼを用いて等温条件下、インビトロで実施されてよい。
【００１９】
本明細書において、多置換増幅（ＭＤＡ）とは、増幅がプライマーを変性核酸にアニーリングした後に鎖置換核酸合成する工程を含む核酸増幅法をさす。核酸が鎖置換によって合成されるにつれて、プライミング事象の数は次第に増加して、超分岐核酸構造のネットワークが形成される。ＭＤＡは、配列の偏りが制限された高分子量ＤＮＡを少量のゲノムＤＮＡ試料から生成するための全ゲノム増幅に非常に有用である。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大きい断片などの、その核酸合成活性の他に鎖置換活性を有する鎖置換核酸ポリメラーゼは、ＭＤＡで使用することができる。ＭＤＡは、配列の偏りが制限された増幅を実現するために、ランダムプライマーを用いて、等温反応条件下で実施される場合が多い。
【００２０】
本明細書において、用語「プレ−アデニル化リガーゼ」とは、そのアデニル化形態のリガーゼをさす。リガーゼのアデニル化形態は、ＡＴＰまたはｄＡＴＰの不在下で５’ホスホリル基および３’ヒドロキシル基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションをする能力がある。プレ−アデニル化リガーゼを用いるライゲーションとは、反応で使用されるリガーゼ分子が高い割合でアデニル化形態であるライゲーション反応をさす。概して、リガーゼ分子の６０％超がそのアデニル化形態であってよい。一部の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の７０％超がそのアデニル化形態であってよい。一部のその他の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の８０％、９０％、または９５％超がそのアデニル化形態であってよい。
【００２１】
本明細書において、用語「アデニル化酵素」とは、核酸配列をアデニル化して５’アデニル化核酸を生成する能力のある酵素をさす。本明細書において用いられる５’アデニル化核酸とは、ヒドロキシル基をその３’末端に有し、アデニル化末端ヌクレオチドをその５’末端に有する核酸配列をさす。例えば、５’アデニル化ＤＮＡ（ＡｐｐＤＮＡ）とは、その５’末端がアデニル化され、その３’末端にヒドロキシル基を有するＤＮＡ配列をさす。
【００２２】
本明細書において、用語「非アデニル化リガーゼ」とは、その非アデニル化形態のリガーゼをさす。リガーゼの非アデニル化形態は、ＡＴＰまたはｄＡＴＰの不在下で３’ヒドロキシル基を有する線状５’−アデニル化ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションをする能力がある。非アデニル化リガーゼを用いるライゲーションとは、反応で使用されるリガーゼ分子が高い割合で非アデニル化形態であるライゲーション反応をさす。概して、リガーゼ分子の６０％超がその非アデニル化形態であってよい。一部の実施形態では、非アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の７０％超がその非アデニル化形態であってよい。一部のその他の実施形態では、非アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の８０％、９０％または９５％超がその非アデニル化形態であってよい。
【００２３】
本明細書において、プライマー鋳型の核酸二重鎖の用語「融解温度」（Ｔｍ）は、二重鎖の二分の一が一本鎖の分子に分離する温度をさす。プライマー鋳型のＤＮＡ二重鎖の安定性は、そのＴｍで測定され得る。プライマーの長さおよび配列は、成功する増幅のパラメータを設計する際の重要な決定要因である。プライマー鋳型の核酸二重鎖の融解温度は、プライマー長とともに、かつＧＣ含量の増加とともに上昇する。一価および二価の塩濃度（例えば、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋）、温度ならびに化学変性剤の存在は、プライマー鋳型の核酸二重鎖のＴｍに影響を及ぼし得、プライマー鋳型の核酸二重鎖の安定性を変えるために使用することができる。例えば、ＤＮＡ二重鎖の安定性は、通常、より高い塩濃度とともに増加するが、上昇した温度の関数として、または変性剤の存在下で低下する。例えば、Ｎａ＋イオンはホスホジエステル骨格の負電荷を遮蔽することができ、それによりＤＮＡ鎖の静電反発力を減少させるので、高濃度の塩（例えばＮａＣｌなど）は、プライマー−標的ＤＮＡ二重鎖のＴｍを上昇させる。一方、より高い温度（使用する緩衝条件下のプライマー−標的ＤＮＡハイブリッドのＴｍに近いかまたはそれを上回る）は、二重鎖安定性およびＤＮＡハイブリダイゼーション効率を低下させる。任意の定義された配列のＴｍは、二重鎖長、ＧＣ含量、塩濃度、変性剤濃度、およびｐＨを含む緩衝液組成の複合作用に依存する。その上、ハイブリダイゼーションはＤＮＡ増幅反応中に必要とされるので、酵素活性とのバッファー適合性も主要な関心事である。最適な酵素活性のためには、プライマー鋳型ハイブリダイゼーションの条件は、達成されなければならないだけでなく、酵素安定性および酵素活性のための条件でもなければならない。一部の例では、最適な酵素活性は、プライマー−標的ハイブリダイゼーションが最適でない条件下で生じることがあり、Ｔｍをもたらすプライマー条件に修正を含めることによって、使用する条件下で二重鎖のＴｍを修正することによってプライマー−標的ハイブリダイゼーションを改善することができる。
【００２４】
一部の実施形態では、一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションの可能な適したリガーゼとともにインキュベートすることによる、線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法が提供される。線状ＤＮＡは、線状染色体ＤＮＡ、無細胞循環ＤＮＡ、非常に古いＤＮＡまたは環境露出によって劣化したＤＮＡ、あるいはホルマリン固定ＤＮＡであってよい。一部の実施形態では、線状ＤＮＡは、断片化された線状ＤＮＡであってよい。断片化された線状ＤＮＡの長さは、１５ヌクレオチドから２１０００ヌクレオチドに及んでよい。線状ＤＮＡは、ライゲーション可能な末端を既に有する配列を含んでもよく、またはそれはライゲーション不可能な末端を有する配列を含んでもよい。一実施形態では、線状ＤＮＡは、ライゲーション可能な末端を既に有する配列を含んでよい。例えば、線状ＤＮＡは、５’末端のリン酸基および３’末端のヒドロキシル基を既に有してよい。そのようなＤＮＡ配列は、適したリガーゼとのインキュベーションによって分子内ライゲーションに従う。一部の実施形態では、線状染色体ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法が提供され、該方法には、一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションの可能なリガーゼとともに線状染色体ＤＮＡをインキュベートして、一本鎖ＤＮＡ環を生成することが含まれる。一部の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼは、ライゲーション反応に使用される。鋳型に依存しない方法で一本鎖ＤＮＡ配列を連結することのできるどんなプレ−アデニル化リガーゼを用いてもよい。一部の実施形態では、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼの実質的にアデニル化された形態が鋳型非依存性分子内ライゲーション反応に使用される。線状染色体ＤＮＡは、二本鎖形態である場合、分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。ライゲーション反応は、ＡＴＰおよび／またはｄＡＴＰの不在下で実施されてよい。
【００２５】
一部の実施形態では、該線状ＤＮＡは、ライゲーションできない末端を有する配列を含んでよい。例えば、線状ＤＮＡは、５’ヒドロキシル基かまたは３’ホスホリル基のいずれか、あるいは両方を有してよい。一部の実施形態では、この方法は、線状ＤＮＡを準備する工程、リン酸供与体の存在下でポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）とともに線状ＤＮＡをインキュベートすることによってそれを末端修復して、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する工程、および、ライゲーション可能なＤＮＡ配列のリガーゼによる分子内ライゲーションを実施して、一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程を含む。末端修復には、ライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成するための、５’末端ヌクレオチドのリン酸化、３’末端ヌクレオチドの脱リン酸化または両方が含まれてよい。末端修復したライゲーション可能なＤＮＡは、二本鎖形態である場合、分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。一部の実施形態では、ＤＮＡをＰＮＫ反応の前に変性させる。一本鎖ＤＮＡのリン酸化または脱リン酸化は、通常、二本鎖平滑末端または５’陥凹末端のリン酸化または脱リン酸化よりも効率的である。リン酸供与体および反応混合物中のその濃度は、それがその後の分子内ライゲーション反応を阻害しないように選択される。例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）以外のいずれの適したリン酸供与体も、ＰＮＫを用いる末端修復反応に使用されてよい。適したリン酸供与体としては、限定されるものではないが、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）またはデオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）が挙げられる。一部の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼは、ライゲーション反応に使用される。鋳型非依存性一本鎖ＤＮＡ配列の可能ないずれのプレ−アデニル化リガーゼも用いることができる。一部の実施形態では、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼの実質的にアデニル化された形態が鋳型非依存性分子内ライゲーション反応に使用される。キナーゼ反応およびライゲーション反応は、ＡＴＰおよび／またはｄＡＴＰの不在下で実施される。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介在させずに、単一の反応器で実施される。この方法の個々の工程は、中間の精製もしくは単離工程を含まずに同時にまたは順次に実施することができる。例えば、ＰＮＫは、線状標的ＤＮＡの末端修復を促進するために、ＧＴＰとともに、線状標的ＤＮＡを含む核酸溶液を含有する反応器（例えば、エッペンドルフチューブ）に添加されてよい。５’リン酸化および３’ホスファターゼ活性を有するいずれのＰＮＫ（例えば、Ｔ４  ＰＮＫ）も、末端修復反応に使用することができる。その各々が５’リン酸化または３’ホスファターゼを有するＰＮＫの組合せを末端修復反応に使用してもよい。ひとたびキナーゼ反応が完了すれば、プレ−アデニル化リガーゼを同じ反応器に添加して、分子内ライゲーション反応を促進することができる。
【００２６】
線状ＤＮＡは、天然もしくは合成起源の二本鎖または一本鎖ＤＮＡであってよい。ＤＮＡは、生体試料から得てもよいし（例えば、生物学的被験体から得た試料）、あるいは、インビボまたはインビトロで未知の物体から見出してもよい（例えば、法医学調査中に得たＤＮＡ）。例えば、それは、限定されるものではないが、生物学的被験体の体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、乳、脳脊髄液、胸腔内液、リンパ液、涙、痰、唾液、便、肺吸引液、咽頭もしくは生殖器スワブ）、器官、組織、細胞培養、細胞分画、切片（例えば、器官または組織の断面部分）あるいは生物学的被験体から、または特定領域（例えば、疾患細胞、または血中循環腫瘍細胞を含有する領域）から単離した細胞から得ることができる。標的線状ＤＮＡ（すなわち目的の線状ＤＮＡ）を含有するか含有すると思われる生体試料は、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源またはバクテリオファージ起源の試料であってよい。例えば、標的線状ＤＮＡは、昆虫、原虫、鳥類、魚類、爬虫類、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、またはウサギ）、または霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）から得ることができる。線状ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（例えば、線状染色体ＤＮＡ）またはｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）であってよい。ｃＤＮＡは、逆転写酵素を用いてＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ）から生成することができる。線状ＤＮＡは、断片化されたＤＮＡであってよく、ライゲーション不可能な末端ヌクレオチドを有してよい。例えば、線状ＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼが分子内ライゲーション反応を実施することができないように、５’ヒドロキシル基および／または３’リン酸基を含むことがある。線状ＤＮＡは、溶液中に分散させてもよいし、固相支持体、例えばブロット、アッセイ、アレイ、スライドガラス、マイクロタイタープレートまたはＥＬＩＳＡプレートの上に固定化されていてもよい。例えば、線状ＤＮＡは、プライマーを通じて基板の上に固定化されていてよく、その後環状化され増幅されてよい。
【００２７】
線状ＤＮＡが二本鎖形態である場合、それは分子内ライゲーション反応の前に一本鎖形態に変性させる必要がある。これは、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡ配列に変換するための当該技術分野で承認されている方法のいずれかを使用することによって実現することができる。例えば、ｄｓＤＮＡは、加熱変性させてもよいし、化学変性させてもよいし、熱化学変性させてもよい。ｄｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡの融解温度を低下させる変性剤（例えば、グリセロール、エチレングリコール、ホルムアミド、尿素またはその組合せ）を用いて化学変性させることができる。変性剤は、反応混合物に加えられる変性剤１０％（容積／容積）ごとに融解温度を５℃〜６℃低下させることができる。変性剤または変性剤の組合せ（例えば、１０％グリセロールおよび６〜７％エチレングリコール）は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の反応混合物（容積／容積）を含んでよい。ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを低下させる塩を、低い濃度で反応緩衝液に含めて、ｄｓＤＮＡを低温で化学変性させてもよい。ｄｓＤＮＡは、例えば、９５℃でｄｓＤＮＡを加熱することによって、熱変性させることができる。
【００２８】
変性工程の後、生成したｓｓＤＮＡは、鋳型の不在下でｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションをする能力のあるＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼで処理されて一本鎖ＤＮＡ環を形成することができる。ライゲーション反応に使用してよい適したリガーゼとしては、限定されるものではないが、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼが挙げられる。線状一本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖ＤＮＡ環への変換は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼなどのライゲーション酵素を用いて鋳型依存性分子内ライゲーション反応によって慣習的に実施される。しかし、特にｓｓＤＮＡ分子の環状化が未知の配列および／またはサイズのｓｓＤＮＡ分子の集団で実施される場合に、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡの鋳型依存性分子内ライゲーションは、制限された成功しかしなかった。たとえバクテリオファージＴ４  ＲＮＡリガーゼＩが鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を示すとしても、この活性は非常に低く、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成する際に実際に使用するには非効率的である。
【００２９】
一部の実施形態では、ｓｓＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ環への変換は、５’ホスホリルおよび３’ヒドロキシル基を有する線状ｓｓＤＮＡおよび／またはｓｓＲＮＡ基質に対して良好な鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を有する熱安定性ＲＮＡリガーゼで実施される。リガーゼは、実質的にプレ−アデニル化形態であってよい。例えば、好熱性細菌、サーマス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）に感染させるサーマスバクテリオファージＴＳ２１２６に由来するＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼを、断片化された線状ｓｓＤＮＡの環状ｓｓＤＮＡへの鋳型非依存性環状化に用いることができる。ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼなどの中温性のＲＮＡリガーゼの多くよりも熱安定性が高い（約７５℃まで安定）。ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ活性の温度範囲は、約４０℃よりも高く、例えば、約５０℃〜約７５℃であり得る。このため、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼは、より高い温度で使用されてよく、それはｓｓＤＮＡの望ましくない二次構造をさらに減らす。線状ｓｓＤＮＡの環状化は、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ以外のリガーゼによって、またはトポイソメラーゼなどのＤＮＡ結合活性を有する任意のその他の酵素を用いることによっても実現されることができる。一部の実施形態では、断片化された一本鎖ＤＮＡ分子の環状化は、線状の断片化されたｓｓＤＮＡ分子を環状化する際に高い鋳型非依存性リガーゼ活性を有する好熱性古細菌、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ）に由来するＲＮＡリガーゼ１によって実現される。
【００３０】
一部の実施形態では、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼによるｓｓＤＮＡの環状化の効率を向上させる方法が提供される。ｐＨ８．０のＨＥＰＥＳ緩衝液のライゲーション反応への使用は、ライゲーション効率を向上させた。鋳型非依存性ｓｓＤＮＡライゲーションは、反応をＴＲＩＳ緩衝液（例えば、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）について、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒにより提案される１０ｘ反応緩衝液は、０．３３Ｍ  ＴＲＩＳ酢酸（ｐＨ７．５）、０．６６Ｍ酢酸カリウム、および５ｍＭ  ＤＴＴを含む）で実施した場合に非効率的であった。さらに、ライゲーション反応の必須補因子であるマンガンは、アルカリ条件下で急速に酸化され、ＴＲＩＳの存在下で沈殿を生じる。Ｍｎ２＋のＭｎ３＋への空気酸化は、Ｍｎ３＋イオンを強く錯化することのできる陰イオンによって促進することができる。例えば、ＨＣｌでｐＨを適切に調節した等量の０．２モル／リットルＴＲＩＳおよび２ミリモル／リットルのＭｎＣｌ２を混合した場合、色の変化は、ｐＨ９．３（ＴＲＩＳ塩基だけのｐＨ）では即座であり；ｐＨ８．５では約３分の初期のタイムラグがあり；８．３よりも低いｐＨ値では１時間以内に検出できなかった。低いｐＨでは反応が起こらなかったが、高いｐＨで観察された変化は、酸を添加することによって逆転しなかった。ＴＲＩＳ緩衝液中のマンガンの急速な酸化のために、分子内ライゲーションをＴＲＩＳ緩衝液中で実施する場合には、より高い濃度のマンガンがライゲーション反応に必須である（例えば、２．５ｍＭの終濃度へのＭｎＣｌ２の添加）。さらに、マンガン濃度は時間とともに低下し続けるので、反応物中のマンガンの働く濃度を正確に予測することは困難となる。ライゲーションおよび増幅が単一の反応器で実施される場合に、マンガンの濃度が高いほど、増幅中のポリメラーゼのエラーレートは高くなり得る。ライゲーション反応でＴＲＩＳ緩衝液をＨＥＰＥＳ緩衝液で置き換えることにより、効果的な分子内ライゲーションを、０．５ｍＭ未満のマンガンイオン濃度によって実現することができる。ＨＥＰＥＳの他には、その他のＧｏｏｄの緩衝液のいずれか（例えば、Ｇｏｏｄ，Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５（２）：４６７−４７７，１９６６；およびＧｏｏｄ，Ｎｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４：５３−６８，１９７２参照）を分子内ライゲーション反応に用いることができる。一実施形態では、分子内ライゲーション反応は、約２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、約６６ｍＭ  ＫＯＡｃ、約０．５ｍＭ  ＤＴＴ、約０．００３％（ｗｔ／ｗｔ）Ｔｗｅｅｎ−２０および約０．５Ｍベタインを含有する３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝８．０）中で実施される。
【００３１】
ライゲーション反応混合物中のｓｓＤＮＡ環は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）方法によって等温条件下で増幅させることができる。ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびｄＮＴＰを含む増幅試薬を同じ反応器に添加して増幅反応混合物を生成し、ＲＣＡ反応を開始させてよい。増幅反応に使用される個々の試薬は、混入している核酸を除去するために前処理されてよい。増幅試薬の汚染除去は、当分野で公知の方法のいずれかを用いることによって実施されてよい。例えば、除染されたｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼなどの除染された検査用ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＣＡ反応に使用されてよい。プルーフリーディングＤＮＡの汚染除去は、混入している核酸を除去するためにｄＮＴＰの不在下で二価陽イオンとともにそれをインキュベートすることによって実施されてよい。Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどのプルーフリーディング能力のないＤＮＡポリメラーゼは、混入している核酸を除去するために二価陽イオンの存在下およびｄＮＴＰの不在下でプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼとともにそれをインキュベートした後に使用されてよい。汚染除去は、増幅試薬をＤＮＡアーゼなどのヌクレアーゼとともにインキュベートすることによって実施されてもよい。汚染除去がヌクレアーゼを用いることによって実施される場合、それは増幅反応の前に除去されるかまたは消化される必要がある。増幅反応混合物には、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの試薬および／または適した増幅反応緩衝液がさらに含まれてよい。ｓｓＤＮＡ環の増幅は、ライゲーションが実施されている同じ反応器で実施される。ｓｓＤＮＡ環の単離または精製および／またはリガーゼの除去は、増幅反応の前に必要ではない。増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡ検出のための現在公知の方法のいずれかによって検出されてよい。
【００３２】
ＲＣＡは、当技術分野で公知のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ）のいずれかを使用することによって実施されてよい。それは、ランダムプライマー混合物を用いて、または特異的プライマーを用いることにより実施されてよい。一部の実施形態では、ランダムプライマーがＲＣＡ反応に使用される。１または複数のヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、２−アミノ−ｄＡ、または２−チオ  ｄＴ修飾）を含むプライマー配列を使用してもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性プライマー（例えば、適切な位置にホスホロチオエート基を含むプライマー配列）を増幅反応に用いる（例えば、ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ）。一部の実施形態では、ＲＣＡは、ｓｓＤＮＡ環をランダムプライマー混合物を含むプライマー溶液と接触させて、核酸鋳型−プライマー複合体を形成すること；核酸鋳型−プライマー複合体をＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸と接触させること；ならびに、核酸鋳型を増幅することにより実施されてよい。一部の実施形態では、プライマー溶液は、ＷＷＮＮＳなどの部分拘束プライマーを含む。部分拘束プライマーは、末端にミスマッチのあるプライマー−二量体構造を有し得る。一部の実施形態では、ｘ、ｙおよびｚが互いに独立した整数値であり、ｘの値が２または３であり、ｙの値が２、３または４であり、ｚの値が１または２である、ヌクレオチド配列（Ｗ）ｘ（Ｎ）ｙ（Ｓ）ｚからなる部分拘束プライマーが、ＲＣＡ反応に使用される。部分拘束プライマーは、１または複数のヌクレオチド類似体を含んでよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドを含み、末端ミスマッチプライマー−二量体構造を有する、ヌクレアーゼ耐性、部分拘束プライマーがＲＣＡ反応に用いられる。適したプライマー配列としては、限定されるものではないが、＋Ｗ＋ＷＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＳ、＋Ｗ＋ＷＮＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮ＊Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮＮ＊Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＮ＊Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮＮＮ＊Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋Ｎ＊Ｎ＊Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮ＊Ｎ＊Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮ＊Ｎ＊Ｓ、または＋Ｗ＋ＷＮＮ＊Ｎ＊Ｓが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＣＡ反応は、ｓｓＤＮＡ環を末端ミスマッチプライマー−二量体構造を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液と接触させ、ｓｓＤＮＡ環を増幅することによって実施される。一部のその他の実施形態では、ＲＣＡ反応は、ｓｓＤＮＡ環を、ヌクレオチド類似体を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液と接触させ、ｓｓＤＮＡ環を増幅することによって実施される。ｓｓＤＮＡ環のＲＣＡは、配列の脱落が減少し、増幅の偏りが減少した大量のＤＮＡを生成する。ｓｓＤＮＡライゲーションおよび増幅の全プロセスは、中間の精製もしくは単離工程を含まずに、単一の管で実施されてよい。非標的増幅を避けるために、ライゲーションおよび／または核酸増幅で使用される試薬（例えば、プライマー溶液、ライゲーション緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ）は、混入している核酸を除去するために前処理されてよい。
【００３３】
一部の実施形態では、線状染色体ＤＮＡの増幅方法が提供される。この方法は、染色体ＤＮＡの全ゲノム増幅のために使用されてよい。線状染色体ＤＮＡは、無細胞循環ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から単離されたＤＮＡ、法医学ＤＮＡ試料、または非常に古いＤＮＡ試料であってよい。線状染色体ＤＮＡは、環境条件に露出されていてもよく、断片化されたＤＮＡであってもよい。この方法には、（ａ）線状染色体ＤＮＡを準備する工程、（ｂ）一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの可能なリガーゼとともに線状染色体ＤＮＡをインキュベートして一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程、および（ｃ）ランダムプライマー混合物を使用するローリングサークル増幅によって一本鎖ＤＮＡ環を増幅して増幅ＤＮＡ産物を形成する工程が含まれる。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介在させずに、単一の反応器で実施される。増幅反応に使用される個々の試薬は、混入している核酸を除去するために前処理されてよい。増幅試薬の汚染除去は、当分野で公知の方法のいずれかを用いることによって実施されてよい。例えば、除染されたｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼなどの除染された検査用ＤＮＡポリメラーゼが、ＲＣＡ反応に使用されてよい。プルーフリーディングＤＮＡの汚染除去は、混入している核酸を除去するためにｄＮＴＰの不在下で二価陽イオンとともにそれをインキュベートすることによって実施されてよい。リガーゼは、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼまたはこれらの組合せであってよい。プレ−アデニル化ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼは、例示的な実施形態の一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションに用いられる。過剰な塩、ライゲーション試薬および／またはその他の副生成物の存在は、標準的なランダムプライマー混合物がＲＣＡ反応に使用される場合に、生成された一本鎖ＤＮＡ環のローリングサークル増幅を阻害し得る。単一の反応器でのライゲーション支援全ゲノム増幅法で使用されるランダムプライマー混合物は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。ランダムプライマー混合物中のヌクレオチド類似体は、それがプライマーの融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、プライマー−二量体形成を防ぎ、かつ／またはプライマーをヌクレアーゼに耐性にするように選択される。例えば、一部の実施形態では、この方法は、修飾ヌクレオベース（例えば、２−アミノ−ｄＡ）および、単一の反応器内でのリガーゼ支援全ゲノム増幅に使用されるランダムプライマー混合物の融解温度を上昇させるＬＮＡを含むヌクレオチド類似体を組み込む。各々の２−アミノ−ｄＡ塩基をランダム六量体プライマー混合物に含めることにより、Ｔｍは約３℃まで上昇し、各々のＬＮＡヌクレオチドを含めることにより、Ｔｍは２〜８℃上昇する。修飾されたランダムプライマー混合物は、ヌクレオベース、２−チオ−デオキシチミジン（２−チオ−ｄＴ）を含むヌクレオチド類似体をさらに含んでよく、２−アミノ−ｄＡおよび２−チオ−ｄＴを含むヌクレオチド類似体の組み込みは、プライマー−二量体形成を防ぐ。さらに、２−アミノ−ｄＡおよび２−チオ−ｄＴを含むヌクレオチド類似体を含めると、２−アミノ−ｄＡは、未修飾のデオキシチミジン（ｄＴ）と３つの水素結合を形成し、２−チオ−ｄＴは、その未修飾のパートナー（すなわちデオキシアデノシン（ｄＡ））と通常の安定した対合を形成するので、プライマーの標的核酸とハイブリダイズする能力が改善される。修飾されたヌクレオチド類似体塩基およびＬＮＡヌクレオチドのランダムプライマー混合物中での使用は、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液の使用を可能にし、それにより不必要な核酸二重鎖の形成を大幅に減少させ、不必要な非標的核酸増幅の発生を低下させる。さらに、プライマーが修飾されたランダムプライマーである場合には、高い塩濃度も核酸増幅反応に用いられてよい。ランダムプライマー混合物は、標的線状染色体ＤＮＡと比較した場合、一般に過剰に使用される。ランダムプライマー混合物は、混入している核酸を除去するためにＤＮアーゼなどのヌクレアーゼで前処理されてよい。一部の実施形態では、線状染色体ＤＮＡは、ライゲーションおよび増幅反応の前にＤＮＡ修復酵素で処理される。一部の実施形態では、線状染色体ＤＮＡは、増幅反応の前にＤＮＡ修復酵素で処理される。一部の実施形態では、ＤＮＡ修復酵素による処理は、ライゲーション反応後であるが増幅反応の前に実施される。処理は、ライゲーション混合物をウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ、またはその混合物とともにインキュベートすることによって実施されてよい。ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼによるライゲーションに使用される条件などの高い温度でのインキュベーション時間の増加は、自発的なＤＮＡ塩基の変化（例えば、Ｃ−ＴおよびＧ−Ａ変異をもたらすＤＮＡ塩基転位）という、より大きなインシデントの危険にさらす。特に、一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡよりも１４０倍速い自発的脱アミノ反応速度を示す。例えば、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼに媒介されるサークル・シークエンシングにより、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および／またはホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）などのＤＮＡ修飾酵素による処理が、Ｃ−ＴおよびＧ−Ａ変異を効果的に抑制したことが示された。一部の実施形態では、この方法の個々の工程は、中間の精製または単離工程を含まずに順次に実施される。この方法の工程は、通常、ＨＥＰＥＳ緩衝液中、アデノシン三リン酸またはデオキシアデノシン三リン酸の不在下で実施される。一実施形態では、増幅反応は、約３８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、約１８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、約１ｍＭ  ＴＣＥＰ、約２．５ｍＭ  ＫＯＡｃ、約２．５％  ＰＥＧ−８０００、約０．００７％  Ｔｗｅｅｎ−２０および約４０ｕＭの、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチド配列を含むランダムプライマー混合物を含む緩衝液中で実施される。一部の実施形態では、この方法の全ての工程は、中間の精製または単離工程を含まずに同時に実施される。単一の反応器でライゲーション支援全ゲノム増幅を実施する間、過剰なライゲーション試薬、過剰なＤＮＡ、過剰な塩および／またはその他のライゲーション反応から��不純物（例えば、望まれないライゲーション産物）が、ライゲーション反応の後に反応器に存在することがあり、増幅反応は、これらの試薬、塩、ＤＮＡおよび／またはその他の不純物のいずれかを除去せずに同じ反応器で実施される。さらなる実施形態では、線状染色体ＤＮＡは断片化されていて、ライゲーション工程の前にライゲーション可能なＤＮＡを生成するためにポリヌクレオチドキナーゼで処理されてよい。ＰＮＫ反応は、アデノシン三リン酸またはデオキシアデノシン三リン酸以外のリン酸供与体の存在下で実施されるので、ＰＮＫ反応、分子内ライゲーションおよびＲＣＡ増幅をはじめとする全ての工程は、単離もしくは精製工程を介在させずに、単一の反応器で実施することができる。
【００３４】
一部の実施形態では、ランダムプライマー混合物は、少なくとも１つの修飾された塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、修飾された塩基は、２−アミノ−デオキシアデノシン（２−アミノ−ｄＡ）かまたは２−チオ−デオキシチミジン（２−チオ−ｄＴ）のいずれかである。一部のその他の実施形態では、ランダムプライマー混合物は、少なくとも１つの２−チオ−デオキシチミジンおよび少なくとも１つの２−チオ−デオキシチミジンを含むオリゴヌクレオチド配列を含む。一例である実施形態では、全ゲノム増幅に用いられるランダムプライマー混合物は、選択的結合相補的オリゴヌクレオチド（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＳＢＣオリゴヌクレオチド）を形成するオリゴヌクレオチドを含む。ＳＢＣオリゴヌクレオチドは、１以上の修飾された塩基対を含むオリゴヌクレオチドの相補対である（つまり、相補対を形成する各メンバーオリゴヌクレオチドは、修飾された塩基で修飾される）。個々の修飾された塩基は、その修飾されたパートナーと安定な塩基対を形成しないが、その天然の（未修飾の）対応物とは特に安定な塩基対を形成する。したがって、２つの相補的なＳＢＣオリゴヌクレオチドは、互いに安定な二重鎖を形成しないが、個々のＳＢＣオリゴヌクレオチドは、相補標的などの未修飾配列と非常に安定な二重鎖を形成する。この特性は、ＳＢＣ二重鎖が、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方またはＲＮＡ二重鎖標的と効果的に結合することを可能にする。
【００３５】
一つの特定の実施形態では、全ゲノム増幅で使用されるランダムプライマー混合物は、ＳＢＣオリゴヌクレオチドから本質的になる。例えば、選択的結合相補対から本質的になるプライマー混合物を生成するために、ランダムプライマー混合物中のオリゴヌクレオチド配列のデオキシアデノシンの１以上は、２−アミノ−デオキシアデノシンと交換されてよく、ランダムプライマー混合物中のオリゴヌクレオチド配列のデオキシチミジンの１以上は、２−チオ−デオキシチミジンと交換されてよい。２−アミノ−ｄＡの組み込みは、その標的とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を改善する。２−アミノ−ｄＡヌクレオチド塩基は、未修飾のＡとＴとの間の２つだけのＨ−結合と比較して、チミン（Ｔ）と３つの水素結合（Ｈ−結合）を形成する。２−アミノＡ：Ｔ塩基対は、このように、Ｇ：Ｃ塩基対が形成するのと同じ数のＨ−結合を有する。その結果、２−アミノ−ｄＡオリゴヌクレオチドがその未修飾標的と結合する場合、二重鎖の融解温度（Ｔｍ）は、未修飾例と比較して、添加される２−アミノ−ｄＡ残基につき約３℃まで上昇する。その上、おそらくＡ上の２−アミノとＧ上の２−アミノとの間の立体的衝突のために、２−アミノ−ｄＡはＡ−Ｇゆらぎミスマッチも不安定にする。したがって、２−アミノ−ｄＡ修飾オリゴヌクレオチドは、それらの未修飾対応物よりも良好な、標的に対する特異性を示す。ＳＢＣオリゴヌクレオチドの優れた対は、２−アミノ−ｄＡをＡの代わりに用い、２−チオ−ｄＴをＴの代わりに用いる（本明細書においてＡＴランダムプライマーと呼ばれる）ことによって作製することができる。２−アミノ−ｄＡは２−チオ−ｄＴとだ１つの水素結合を形成するので、これらの修飾された塩基対は非常に弱く、対応する二重鎖は不安定である。しかし、２−アミノ−ｄＡと２−チオ−ｄＴの両方は、Ｔ塩基およびＡ塩基とそれぞれ効果的に結合する。一般に、２０−ｍｅｒのＤＮＡ標的に対してアニールされた２０−ｍｅｒのＳＢＣは、対応するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも１０℃高いＴｍ値を示すが、ＳＢＣ−ＳＢＣハイブリッドは、３℃低いＴｍ値を示す。ＡＴランダムプライマー混合物中のオリゴヌクレオチドは、２−アミノ−ｄＡおよび２−チオ−ｄＴに加えて、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドまたはＬＮＡヌクレオチドも含んでよく、それはプライマー−標的二重鎖の融解温度（Ｔｍ）をさらに改善し、プライマー−二量体構造の形成を防ぎ、かつ／またはランダムプライマー混合物をエキソヌクレアーゼに耐性にすることができる。
【００３６】
介在する単離および精製工程を含まない、単一の反応器でのライゲーションとそれに続くＲＣＡによる線状染色体ＤＮＡの単一管増幅は、標準的なヌクレアーゼ耐性ランダム六量体を用いる場合には非効率的であった（図１４）。過剰な塩、ライゲーション試薬および／またはその他の副生成物が存在すると、生成されたＤＮＡ環のローリングサークル増幅は阻害された。しかし、２−アミノ−ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドおよびＬＮＡヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含有するＡＴランダムプライマー混合物を使用すると、驚くことに、介在する単離および精製工程を含まずに、ライゲーション−増幅反応を単一の反応器で進行させることが可能になる。このプライマーは、増幅反応をこれらの緩衝条件下で良好に行うことを可能にするが、標準的なヌクレアーゼ耐性ランダム六量体は、同じレベルで行うことができない。プライマー配列中のＬＮＡヌクレオチドの位置は、それがプライマー配列の３’末端を占有しないように選択される。一部の実施形態では、ランダムプライマー混合物中の個々のオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも１つの２−アミノ−ｄＡまたは２−チオ−ｄＴを含む。一つの例示的な実施形態では、単一の反応器でのＲＣＡによるリガーゼ支援全ゲノム増幅は、一般構造、＋Ｎ＋Ｎ（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）＊Ｎを有する六量体オリゴヌクレオチド配列を含むランダムプライマー混合物を用いて実施される。ランダムプライマー混合物の濃度は、一般に、多重ランダムプライムドローリングサークル増幅を促進するために、上記の全ゲノム増幅法の間の一本鎖ＤＮＡ環の濃度よりも高く保たれる。
【００３７】
ライゲーション支援全ゲノム増幅の増幅ＤＮＡ産物を用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製することができる。ゲノムライブラリーは、増幅ＤＮＡ産物を断片化することによって作製されてよい。一部の実施形態では、断片化された産物には、鎖状体の増幅ＤＮＡ産物の単一の単量体配列が含まれる。一部のその他の実施形態では、断片化された産物には、鎖状体の増幅ＤＮＡ産物の１以上の単量体配列が含まれる。増幅ＤＮＡ産物は、さらに配列決定されてよい。シークエンシングは、ＮｅｘｔＧｅｎシークエンシング技法をはじめとする、当分野で確立されたＤＮＡシークエンシングの技法のいずれかを用いることによって実施されてよい。増幅ＤＮＡ産物はＤＮＡ環の縦列反復配列であるので、増幅ＤＮＡ産物のシークエンシングを用いて、ＮｅｘｔＧｅｎシークエンシング技法に関連するシークエンシングエラーを除去することができる。ハイスループットＤＮＡシークエンシングの主な制限は、高率で生じる間違った塩基要求である。ライゲーション支援ＲＣＡ増幅による全ゲノム増幅によるゲノムＤＮＡライブラリーの作製は、作製されたゲノムＤＮＡライブラリーのシークエンシングエラーの頑強な下流の計算による補正を可能にする。線状染色体ＤＮＡ鋳型は環状化され、ローリングサークルポリメラーゼによって縦列に複数回コピーされ、その後、任意のハイスループットシークエンシング機で配列決定されるので、生じる各読み取りデータは、計算によって処理されて、最初の配列の全ての関連するコピーのコンセンサス配列を得ることができる。コピーを物理的に結び付けることは、各コピーが独立に最初の配列に由来し、そのようなサークル・シークエンシング・プロトコールでのコンセンサス配列の効率的な形成を可能にすることを確実にする。本明細書に記載される全ゲノム増幅の方法は、このように、全ゲノムの単一管増幅とそれに続く作製されたゲノムＤＮＡライブラリーの誤りのないシークエンシングのための簡便なプロトコールを許容する。ゲノムＤＮＡライブラリーは、標的ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションに基づく捕捉にも使用することができる。ハイブリダイゼーションに基づく捕捉は、溶液で、または表面で（例えば、マイクロアレイに基づく捕捉）実施されてよい。溶液に基づく標的捕捉は、一般に、特に多数の試料が含まれる場合に、よりスケーラブルであり、経済的である。さらに、標的ＤＮＡの溶液に基づく捕捉は、カバレッジの均一性の向上をもたらす。捕捉された標的ＤＮＡは、標的化再シークエンシングによってさらに配列決定されてよい。標的ＤＮＡ配列は、エクソーム解析を可能にするためにゲノムＤＮＡのエクソーム領域であるように選択されてよい。
【００３８】
一部の実施形態では、多置換増幅（ＭＤＡ）による制限量の線状の断片化されたＤＮＡの増幅のための方法が提供される。ＭＤＡの従来法は、線状の断片化されたＤＮＡで試みた場合、増幅速度の低下および非常に配列に偏った増幅をもたらした。さらに、重要な配列の脱落が特に断片化されたＤＮＡの末端の近くで多くの場合観察された。これらの制限を克服するために、断片化されたｄｓＤＮＡは最初にｓｓＤＮＡに変換される。次に、ｓｓＤＮＡは、鋳型非依存性分子内ライゲーション反応によって一本鎖環状ＤＮＡ（すなわちＤＮＡ環）に変換され、それにより問題の多いＤＮＡ末端を除去する。５００ｂｐよりも短いｓｓＤＮＡ配列でさえも、ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションを用いて環状化することができる。さらに、ｓｓＤＮＡのライゲーションが鋳型に依存しない方法で実施される場合には、標的配列の事前の知識はＤＮＡ環を作成するために必要でない。環状化の前に、断片化されたＤＮＡをＰＮＫで処理してライゲーションできない末端を修復することができる。断片化されたｓｓＤＮＡを環状化した後、環状化されたＤＮＡでＭＤＡが実施される。増幅反応は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）方法を用いることによって等温条件下で実施することができる。ＲＣＡは、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）ＲＣＡキット（ＧＥヘルスケア）などの市販のＲＣＡ増幅キットを用いて実施することができる。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）ローリングサークル増幅は、ロックド核酸を含有するランダムプライマーを用い、それはより高い感受性および増幅バランスを提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性プライマーがＲＣＡ反応に使用される。本明細書に開示される方法は、増幅感受性を向上させ、配列の脱落を減らし、よりバランスのとれた増幅を可能にする。一本鎖の断片化されたＤＮＡの鋳型非依存性環状化は、低い濃度でさえ、より短い配列で達成され得るので、リガーゼ支援全ゲノム増幅を高度に断片化されたＤＮＡ（例えば、血漿中の循環ＤＮＡ）の増幅に用いる場合、速度が速く配列包括度の向上した、よりバランスのとれたＤＮＡ増幅を達成することができる。例えば、ｓｓＤＮＡの持続長は、ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性環状化に関して１５ヌクレオチドと低いことがある。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）をライゲーション反応に用いる場合、標準条件下で、線状のコンカテマーまたは環状のコンカテマーはほとんど生成されない。さらに、環状化および増幅反応は、ともに中間の精製もしくは単離工程を含まずに単一の反応器で実施することができ、それにより汚染の機会を減らし、増幅ワークフローを単純化することができる。リガーゼ支援全ゲノム増幅法は、限定されるものではないが、循環血漿無細胞ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から単離され断片化されたＤＮＡ、環境条件経の曝露によって損傷した法医学ＤＮＡ試料または非常に古いＤＮＡ試料を分析するために用いることができる。増幅されたライブラリーは、ｑＰＣＲまたはシークエンシングによって、増幅された配列の標的検出にさらに使用されてよい。
【００３９】
ｓｓＤＮＡ断片のＤＮＡ環への事前のライゲーションとそれに続くローリングサークル増幅を含む、本明細書に記載される様々なライゲーション支援全ゲノム増幅法は、高分子量ゲノムＤＮＡよりも断片化されたＤＮＡの優先増幅をもたらす。例えば、循環ＤＮＡを含む血漿調製物は、精製プロセス中に血液細胞から放出されるゲノムＤＮＡでしばしば汚染されることがある。ＭＤＡによる全ゲノム増幅の従来法は、循環ＤＮＡとゲノムＤＮＡの両方を増幅する。対照的に、断片化された循環ＤＮＡ分子が最初にＴＳ２１２６  ＲＮＡによって環状化され、その後にＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＲＣＡによって環状化されたＤＮＡ分子が増幅される場合、循環ＤＮＡは高分子量ゲノムＤＮＡよりも優先的に増幅された。そのような、断片化されたＤＮＡのゲノムＤＮＡへの優先増幅は、診断上関連するＤＮＡを下流の分析のために優先的に増幅することができるので、診断用途に特に適している（実施例４参照）。さらに、リガーゼ支援全ゲノム増幅は、従来のＭＤＡに基づく全ゲノム増幅と比較した場合に、断片化されたＤＮＡのより強い増幅を許容する。
【００４０】
図１は、断片化されたｄｓＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅の一実施形態の模式図を示す。二本鎖ＤＮＡの持続長は非常に高く（約１５０ｂｐ）、その生得的な剛性は５００ｂｐ未満の断片の環状化を非常に非効率的にする。さらに、約２５０ｂｐの範囲の小型の二本鎖の断片化されたＤＮＡ分子で、末端が適切なアラインメントでない限り、環状化は非効率的である（約１０．５ｂｐ／回転）。対照的に、一本鎖の断片化されたＤＮＡの環状化の持続長は、二本鎖の断片化されたＤＮＡと比較すると非常に小さく約１５ヌクレオチドである。図１に示されるように、リガーゼ支援全ゲノム増幅において、断片化されたｄｓＤＮＡは、最初に一本鎖ＤＮＡ環に変換される。これは、断片化された二本鎖ＤＮＡを９５℃で十分な時間インキュベートしてｄｓＤＮＡを一本鎖に変性させることによって実現することができる。次に、断片化されたｓｓＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡ基質の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼで処理して、一本鎖ＤＮＡ環を生成する。分子内ライゲーションに使用され得るリガーゼの限定されない例としては、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ（ＭｔｈＲｎｌ１）、または大腸菌リガーゼが挙げられる。次に、ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムプライマー、およびｄＮＴＰを含む増幅試薬を添加して一本鎖ＤＮＡ環のＲＣＡ反応を開始させる。ＲＣＡを用いるこのリガーゼ支援全ゲノム増幅は、従来の全ゲノム増幅法とは対照的に配列の脱落および増幅の偏りの低下した大量のＤＮＡを生成する。そのため、それは非常に断片化されたＤＮＡでさえも増幅および検出するために使用され得る。一本鎖ＤＮＡ環の生成およびＲＣＡによるそのその後の増幅の全プロセスは、精製工程が介在することなく単一の管で行われる。
【００４１】
一部の実施形態では、ライゲーションできないＤＮＡ末端を修復するための断片化されたＤＮＡのプロセシングを含む、断片化されたＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅に対して、単一管ワークフローが提供される。例えば、断片化された一本鎖ＤＮＡが５’ホスホリル基および３’ヒドロキシル基を含まない場合、それは分子内ライゲーション反応において連結されないことがある。そのようなライゲーションできないＤＮＡ配列の存在は、リガーゼ支援全ゲノム増幅において増幅の偏りを引き起こすことがある。例えば、図８に概略的に表されるように、細胞死の間のＤＮアーゼＩＩ消化により生成されるＤＮＡ断片は、５’ヒドロキシル基、３’ホスホリル基を含むことがある。そのような５’ヒドロキシル基、３’ホスホリル基を含む二本鎖ＤＮＡ断片から生じる一本鎖ＤＮＡ断片は、分子内ライゲーション反応において環状化されない。したがってＤＮアーゼＩＩ型の切れ目は、全ゲノム増幅において標本として不十分である。一部の実施形態では、断片化されたＤＮＡは、キナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＴＰＫ）で処理されて断片化されたＤＮＡの５’ヒドロキシル基をリン酸化し、かつ／または３’ホスホリル基を脱リン酸化する。キナーゼを反応に含めることにより、５’リン酸を含まないプールの断片の効率的な環状化が許容される。断片化されたＤＮＡの５’末端をキナーゼでリン酸化し、その後断片化されたＤＮＡを増幅することにより、より代表的なライブラリーが作成される。
【００４２】
一部の実施形態では、断片化されたｄｓＤＮＡのリン酸化修復は、Ｔ４  ＰＮＫキナーゼを用いて実施することができる。リン酸化修復は、断片化されたｄｓＤＮＡかまたは変性し断片化されたｓｓＤＮＡのいずれかで実施されてよい。リン酸化修復がｄｓＤＮＡで実施される場合、修復されたｄｓＤＮＡをその後変性させて線状ｓｓＤＮＡとしてよく、それはその後にＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）（ＣＬＩＩと略される）を用いて環状化させることができる。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）は、実質的にアデニル化形態のＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼを含む。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）によるｓｓＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションは、より高い濃度のＡＴＰまたはｄＡＴＰによって阻害される。しかし、キナーゼによるリン酸化修復は、多くの場合ＡＴＰの存在を必要とする。さらに、ＤＮＡに損傷を与えずに反応混合物からＡＴＰを除去することは容易でないことがある。例えば、ＡＴＰを除去するための反応混合物のホスファターゼ処理も、結果として（ＤＮＡが、例えば、プレ−アデニル化によって保護されていない限り）ＤＮＡの脱リン酸化をもたらし、したがってＤＮＡ鎖をライゲーション不可能にする。結果として、精製もしくは単離工程が介在することなく、単一管において、断片化されたＤＮＡのリン酸化修復およびｓｓＤＮＡ環の生成を実施することは、困難な場合が多い。本明細書において提供される方法は、キナーゼ反応中にＡＴＰの代わりにＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰまたはｄＴＴＰを用いる。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）はＧＴＰまたは代替リン酸供与体（例えば、ＣＴＰまたはＵＴＰ）に対する寛容性が高いので、キナーゼ修復工程およびライゲーション工程は、精製および／または単離工程を介在させずに、単一の反応器で実行することができる。キナーゼ反応混合物は、マンガン塩およびベタイン（両性イオントリメチルグリシン）などの追加の試薬をさらに含んでよい。連結させると、ｓｓＤＮＡ環を増幅させることができる。ライゲーションおよび増幅反応を比較的低濃度のＧＴＰで実行することにより、本明細書に記載される単一管ワークフローは、酵素処理間の間欠性のクリーンアップ工程を回避し、ＤＮＡ鋳型の喪失を最小限に抑える（キナーゼ修復、ライゲーションおよび増幅を伴う単一管ワークフローの模式図について図９を参照）。
【００４３】
一部の実施形態では、線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための代替法が提供される。該方法は分子内ライゲーション工程の前にＤＮＡプレ−アデニル化工程を用いる。最初に、線状ＤＮＡは、ＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートされて、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を含むライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成することができる。その後、ライゲーション可能なＤＮＡ配列をアデノシン三リン酸の存在下でアデニル化酵素とともにインキュベートして、５’アデニル化ＤＮＡ配列を生成する。５’アデニル化ＤＮＡ配列は、遊離３’ヒドロキシル基を有する。ライゲーション反応でのＡＴＰの濃度は、ライゲーション可能なＤＮＡ配列の３’末端でアデニル化が起こらないように選択される。その後、５’アデニル化ＤＮＡ配列を、５’アデニル化ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のある非アデニル化リガーゼとともにインキュベートして、一本鎖ＤＮＡ環を生成する。ＡＴＰ依存性非アデニル化リガーゼを分子内ライゲーション反応に用いる場合、ＡＴＰは、分子内ライゲーション反応の前に反応混合物をホスファターゼで処理することにより反応混合物から除去されているべきであり得る。ＤＮＡの末端ヌクレオチドの５’リン酸塩（通常、ホスファターゼによって除去される）は、プレ−アデニル化のためにホスファターゼ処理から保護される。ＤＮＡが二本鎖形態である場合、それは分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介在させずに、単一の反応器で実施される。
【００４４】
一部の実施形態では、好熱性古細菌、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ１）に由来するＲＮＡリガーゼＩなどのＲＮＡリガーゼをＡＴＰの存在下で使用して線状ＤＮＡのアデニル化形態を生成する。一本鎖ＤＮＡ環を生成するために、自己アデニル化、脱アデニル化および／またはアデニル酸転移のできない変異体または適切に操作されたＡＴＰ非依存性リガーゼを、アデニル化線状ＤＮＡの分子内ライゲーション反応に使用してよい。例えば、Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼのモチーフＶリジン変異体（Ｋ２４６Ａ）を用いることができる。この変異体はプレ−アデニル化基質で完全なライゲーション活性を有する。モチーフＩ（Ｋ９７Ａ）において触媒リジンに対するアラニン置換を有するＭｔｈ  ＲＮＡリガーゼ変異体を用いてもよい。Ｋ９７Ａ変異体の活性は、供与体基質としてプレ−アデニル化ＲＮＡかまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のいずれかと類似しているが、同一配列をもつｓｓＤＮＡと比較して受容体基質としてＲＮＡに対して２倍優先される。ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼなどのＡＴＰ依存性リガーゼが５’アデニル化ＤＮＡ配列の分子内ライゲーション反応に用いられる場合、反応中のＡＴＰは、ライゲーション反応の前に除去されているべきであり得る。
【００４５】
一部の実施形態では、代替ワークフローを用いるリガーゼ支援全ゲノム増幅が提供される。このワークフローの模式図は図１１に提供される。この方法は、ライゲーションおよび増幅の前に、断片化されたＤＮＡをキナーゼで修復することおよび断片化されたＤＮＡの５’末端をＡＴＰの存在下でＲＮＡリガーゼまたはＤＮＡリガーゼでプレ−アデニル化することを含む。ライゲーションできない末端を有する配列（例えば、５’ヒドロキシルおよび／または３’ホスホリル基を含む配列）を含む断片化されたＤＮＡは、キナーゼで処理することによって５’末端でリン酸化され、３’末端で脱リン酸化されて、ライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する。次に、ライゲーション可能なＤＮＡ配列をＡＴＰの存在下でＭｔｈ  ＲＮＡリガーゼ（ＭｔｈＲｎｌ  １）などのＲＮＡリガーゼを用いてアデニル化して、断片化されたＤＮＡのアデニル化形態を生成することができる。ＡＴＰはその後に反応混合物をホスファターゼ（例えば、シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ））で処理することによって反応混合物から除去される。ＤＮＡの５’アデニル化のための、当技術分野で利用可能ないずれの方法を用いてもよい（例えば、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼまたは合成法）。次に、プレ−アデニル化一本鎖線状ＤＮＡを、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）などの低い程度のアデニル化を有するＲＮＡリガーゼで処理して、分子内ライゲーションによってＤＮＡ環を生成する。次に、ＲＣＡを使用してＤＮＡ環を増幅させる。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）が分子内ライゲーションによってＤＮＡ環を生成する実施形態では、分子内ＤＮＡライゲーションおよびその後の増幅反応はＡＴＰの不在下で実施される。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）によるプレ−アデニル化ｓｓＤＮＡの環状化はＡＴＰによって阻害されるので、キナーゼ処理およびプレ−アデニル化反応の後の反応混合物からのＡＴＰの除去は必須である。一部の実施形態では、ＡＴＰは、ホスファターゼによる処理によってアデノシンおよびリン酸に変換される。たとえアデノシンが環状化反応に対して抑制性でないとしても、結果として得られるリン酸塩が分子内ライゲーション反応を阻害することがある。生成されたリン酸塩は、反応混合物をリン酸塩封鎖酵素で、またはリン酸塩を沈殿または除去する試薬（例えば、ＬａｙｎｅＲＴ樹脂などのリン酸塩結合樹脂）で処理することによって、溶液からさらに除去することができる。リン酸塩の除去は、マルトースのグルコースおよびグルコース−１−リン酸塩への変換を触媒するマルトースホスホリラーゼなどの酵素で反応混合物を処理し、それによりリン酸塩を溶液から除去することによっても実現することができる。キナーゼを反応に含めることにより、５’リン酸塩および／または３’ヒドロキシル基を含まないプールのＤＮＡ断片の環状化および増幅が許容され、それによって、リガーゼ支援増幅による、より代表的なライブラリーが作製される。標的ＤＮＡのプレ−アデニル化は、分子内ライゲーション反応に、低い程度のアデニル化を有するリガーゼ（例えば、約３０％アデニル化されているＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標））を使用することを容易にする。高い程度のアデニル化を有するリガーゼ（例えば、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標））は、非アデニル化ＤＮＡを１回だけしか連結しないので、これは興味深いものであり得る。したがって、化学量論量のリガーゼがしばしば分子内ライゲーション反応を完了させるために必要とされる。対照的に、低い程度のアデニル化を有するリガーゼ（例えばＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）など）は、高い回転率を有し、可逆的かつ触媒的にまたは繰り返して、複数のプレ−アデニル化されたＤＮＡ分子に作用することができる。これは、ライゲーション速度を高め、必要なリガーゼの量を減らし、潜在的により困難または複雑なＤＮＡ鋳型の環状化の増加を可能にする。
【００４６】
一部の実施形態では、リガーゼ支援全ゲノム増幅のための方法は、全血または尿などの生体試料中の循環核酸（例えば、生体試料の非細胞画分由来の循環ＤＮＡ）の増幅およびその後の検出に使用される。循環核酸は、アポトーシス細胞または壊死細胞に起源をもつものであってもよいし、細胞から活発に放出されたものであってもよい。細胞ヌクレアーゼは高分子量ゲノムＤＮＡを小型のヌクレオソームの大きさの断片に分解するので、循環核酸は天然に高度に断片化されている。高度に断片化された循環核酸は多くの場合、従来の核酸増幅法に従わない。さらに、循環核酸は血流中に非常に少量で存在する。二本鎖循環線状核酸の標準的なローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、非効率的であり、非常に偏っている。ローリングサークル増幅の前に循環核酸を一本鎖に分離し、リガーゼによって環状化することは、効率を高め、偏りを少なくする。そのような希薄なＤＮＡ鋳型によって良好なＲＣＡ速度および高い感受性を可能にするために、過剰なライゲーション試薬、塩およびその他のライゲーション反応の副生成物の存在下で、ヌクレオチド類似体および／またはＬＮＡを含むプライマーを用いるＲＣＡ法が用いられる。この改良されたＲＣＡは、微量ＤＮＡおよび単一細胞増幅のために最適化された。
【００４７】
一部の実施形態では、全血由来の循環ＤＮＡを増幅する方法が提供される。循環ＤＮＡは、全血の非細胞画分（例えば、血漿または血清）から増幅される。この方法は、全血の非細胞画分を収集する工程、非細胞画分から循環ＤＮＡ（主にその天然の二本鎖形態に存在）を収集する工程、二本鎖ＤＮＡを変性させて線状一本鎖ＤＮＡを生成する工程、循環一本鎖ＤＮＡ分子を環状化して一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程、およびローリングサークル増幅によって一本鎖ＤＮＡ環を増幅する工程を含む。持続長のために、１５０ｂｐよりも小さい配列長を有するｄｓＤＮＡを環状化することは通常可能ではなく、ＤＮＡが２００ｂｐよりも長くなるまでｄｓＤＮＡを環状化することは非常に困難である。対照的に、１５ヌクレオチド（ｎｔ）以上の配列長を有する線状ｓｓＤＮＡ分子は、５’末端がリン酸化され、３’末端がヒドロキシル化されている限り、適したリガーゼによって非常に効率的に環状化される。一本鎖ＤＮＡ環を生成するための一本鎖ＤＮＡの環状化は、一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるリガーゼを用いることによって実現される。一部の実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子の環状化は、一本鎖線状ＤＮＡを、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）などのＲＮＡリガーゼで処理することによって実施される。
【００４８】
一部の実施形態では、循環ＤＮＡ検出の感受性は、ｓｓＤＮＡライゲーション工程およびＲＣＡの前にポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で循環核酸をリン酸化することによってさらに高まる。ＰＮＫ工程をワークフローに組み込むと、本明細書に提示されるリガーゼ支援全ゲノム増幅法は、１％のレベルでスパイクした場合に（三重反復）、雌全血中の雄循環ＤＮＡを検出することができた。鋳型非依存性分子内ライゲーションは、ｓｓＤＮＡ鋳型が５’リン酸基および３’ヒドロキシル基を有さない限り、達成されることができない。多様な条件がＤＮＡにおいて５’ヒドロキシルを生じる（ＤＮアーゼＩＩ酵素切断、および血液中のホスファターゼ活性など）。ＰＮＫ処理はこの問題を除去し、ローリングサークル増幅ＣＮＡライブラリーの多様性を向上させる。
【００４９】
一部の実施形態では、線状ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡ環の生成のためのキットが提供される。一実施形態では、このキットは、一緒にパッケージングされた、ポリヌクレオチドキナーゼ、リン酸供与体、およびｓｓＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるプレ−アデニル化リガーゼを含む。ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４  ＰＮＫであってよい。リン酸供与体は、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰまたはｄＴＴＰから選択されてよい。一実施形態では、キットには、ＴＳ２１２６リガーゼが含まれてよい。ＴＳ２１２６リガーゼの６０％超がプレ−アデニル化されていてよい。キットは、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ＤＮＡ増幅試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ）、および、提供される方法による一本鎖ＤＮＡ環の生成に用いられるその他の試薬（例えば、ＭｎＣｌ２、ベタイン）をさらに含んでよい。一部の実施形態では、キットには、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼおよびランダム／部分拘束プライマーが含まれてよい。もう一つの実施形態では、キットは、一緒にパッケージングされた、アデニル化酵素、ホスファターゼおよび非アデニル化リガーゼを含む。キットは、ポリヌクレオチドキナーゼおよび／またはリン酸供与体をさらに含んでよい。アデニル化酵素は、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカムに由来するＲＮＡリガーゼＩ（Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ）であってよい。非アデニル化リガーゼは、リガーゼの６０％超がその非アデニル化形態である、ＴＳ２１２６リガーゼの組成物であってよい。キットには、線状ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡ環の生成の説明書がさらに含まれてよい。
【００５０】
発明の実践は、説明のためだけに本明細書に提示され、添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない、以下の実施例からさらにより十分に理解されるであろう。実施例の項で使用されるいくつかの略語は、略さずに書くと以下の通りである：「ｍｇ」：ミリグラム；「ｎｇ」：ナノグラム；「ｐｇ」：ピコグラム；「ｆｇ」：フェムトグラム；「ｍＬ」：ミリリットル；「ｍｇ／ｍＬ」：ミリリットル毎ミリグラム；「ｍＭ」：ミリモル；「ｍｍｏｌ」：ミリモル；「ｐＭ」：ピコモル濃度；「ｐｍｏｌ」：ピコモル；「μＬ」：マイクロリットル；「ｍｉｎ．」：分および「ｈ．」：時間。
【００５１】
実施例
実施例１：血漿由来の循環核酸の全ゲノム増幅：
Ｗａｋｏ  ＤＮＡ抽出器ＳＰキット（和光純薬株式会社）を用いて、明らかに健康な個体の、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース（ＣＰＤ）で安定化させた血漿から循環ＤＮＡを単離した。約１．３ｎｇを、ＴＢＥ緩衝液を用いる２％アガロースゲルによる電気泳動により分析し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎイメージャで可視化した。図２に示されるように、循環ＤＮＡの大部分は約１８０ｂｐの長さであった。さらなるそれよりも少ない量の配列は約３７０ｂｐの長さであり、さらにそれよりもかなり少ない量のそれよりも高分子量の配列があった。
【００５２】
３５０ｐｇの血漿由来の循環ＤＮＡを９５℃で加熱して鋳型を変性させた。次に、変性した一本鎖ＤＮＡ鋳型をＲＮＡまたはＤＮＡリガーゼで処理して一本鎖ＤＮＡ環を生成した。ＡＴＰ依存性Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、細胞にコードされたＮＡＤ依存性大腸菌ＤＮＡリガーゼまたは熱安定性ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標））をライゲーション反応に使用した。次に、１００ｐｇのＤＮＡを連結した一本鎖ＤＮＡ環を、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＧｅｎｏｍｉＰｈｉキット（ＧＥヘルスケア）を用いる全ゲノム増幅に供した。「（ａｔ  Ｎ）」が、２−アミノ  ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、正常なＧおよび正常なＣを含有するランダム混合物を表す、プライマー混合物＋Ｎ＋Ｎ（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）＊Ｎを用いて増幅を実施した。リアルタイム増幅は、少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＳＮｉＰｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で経時的に蛍光シグナル増加をモニターすることによって実施した。比較のために、当量濃度の未処理ゲノムＤＮＡ、未処理血漿ＤＮＡ、およびＤＮＡ鋳型を含まない（鋳型増幅のない）試料を含めた。
【００５３】
図３に示されるように、同等量の高分子量ゲノムＤＮＡと比較した場合に、未処理の断片化された血漿ＤＮＡの増幅速度は、はるかに低く、増幅の欠陥を示した。しかし、断片化された血漿ＤＮＡが前処理され、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）を用いて一本鎖ＤＮＡ環に変換された場合、急速な増幅速度が実現された（図３Ａ）。ＡＴＰ依存性Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（図３Ｂ）および細胞にコードされたＮＡＤ依存性大腸菌ＤＮＡリガーゼ（図３Ｃ）を含むリガーゼも効果的であったが、断片化された血漿ＤＮＡの増幅速度を回復させるには効率が低かった。これらの実施例では、増幅速度の相対的な増加は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーションを促進する際のリガーゼの各々の有効性を示す。
【００５４】
実施例２：リガーゼ支援全ゲノム増幅により増幅させた血漿由来の循環核酸の分析。
【００５５】
実施例１で生成した増幅ＤＮＡを、４つの異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座（ｖＷＡ、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１２９、およびＤ１３Ｓ３１７）を標的とするプライマーを用いる定量的ＰＣＲによってさらに分析して、感受性がありバランスのとれたＤＮＡ増幅を促進するためのリガーゼ支援全ゲノム増幅法の有効性を試した。これらのＤＮＡレベルを増幅させていないＤＮＡから得た値と比較して、増幅後の相対的な発現レベルを決定した。図４に示されるように、両方の例において、未処理血漿ＤＮＡの増幅は、配列の脱落を導くか、または試験した遺伝子座で標本として非常に不十分であるＤＮＡを生成した。対照的に、この方法にＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）かまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼのいずれかを含めると、４つの遺伝子座の配列の脱落を防ぎ、増幅させた高分子量ゲノムＤＮＡに表示の点でより類似するＤＮＡを生成した。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）を一本鎖ＤＮＡリガーゼとして使用する実施例では、１２の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座を標的とするプライマーを用いる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって試験した１２の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座のうち、１１を増幅後に回収したが、増幅させた未処理血漿ＤＮＡでは４しか存在しなかった（図５）。図５において、報告されるＣｔ値は、２つの複製の平均である。Ｃｔ値が未決定であったＰＣＲ反応は「Ｘ」で印がつけられている。
【００５６】
実施例３：リガーゼ支援全ゲノム増幅の反応条件の最適化。
【００５７】
リガーゼ支援ＤＮＡ増幅反応を、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼによる一本鎖ＤＮＡ分子のライゲーション反応の効率を最適化することによってさらに最適化した。標準的な製造業者の推奨する緩衝液からマンガンを除去することによって増幅率がバックグラウンドレベルまで低下したので、金属イオンの存在はライゲーション反応に必要不可欠であった。未処理ゲノムＤＮＡおよび未処理血漿ＤＮＡを、変更した緩衝条件を用いてＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）で処理した血漿ＤＮＡ試料と比較した（図６）。全ての緩衝条件は、３３ｍＭ  ＫＯＡｃ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および１Ｍベタインを含んだ。指示される場合、緩衝液は３３ｍＭ  ＴＲＩＳ−酢酸塩（ｐＨ７．５）または３３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）を含み、さらに２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２かまたは２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含んだ。少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで経時的に蛍光の増加をモニターすることによってリアルタイム増幅を実施した。増幅閾値は、蛍光がバックグラウンドレベル（２０００ＲＦＵ）より高くなる時点である。
【００５８】
リガーゼ支援全ゲノム増幅反応（試料１００ｐｇ）の増幅速度の比較を図６に示す。マグネシウムとマンガンの両方が、標準的なＴＲＩＳ緩衝液の存在下で同様の効果を促進したが、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．０の存在下でマンガンとマグネシウムの組合せが、高い増幅率を促進するのに最も効果的であったことが観察された。ＨＥＰＥＳ緩衝液がこの反応条件において血漿ＤＮＡの環状化効率を増加させたことは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のマンガン陽イオンの酸化の減少に起因し得る。
【００５９】
実施例４：リガーゼ支援全ゲノム増幅における高分子量ゲノムＤＮＡの増幅の抑制。
【００６０】
未処理のゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅反応の増幅速度を、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）およびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）で処理したゲノムＤＮＡ試料（試料１００ｐｇ）と比較した。結果を図７に示す。図７に示されるように、ゲノムＤＮＡのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）処理は、高分子量ゲノムＤＮＡの増幅率に抑制効果（血漿ＤＮＡへのプラスの効果とは異なる）を生じた。抑制は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）およびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）の両方について明白であった。
【００６１】
Ｐｈｉ２９に基づく増幅がリガーゼによって抑制されたかを調査するために、未処理のゲノムＤＮＡを活性のあるリガーゼの存在下で増幅させた。少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで経時的に蛍光の増加をモニターすることによってリアルタイム増幅を実施した。増幅閾値は、蛍光がバックグラウンドレベル（２０００ＲＦＵ）より高くなる時点である。ゲノムＤＮＡ増幅の抑制は、増幅中に存在する、活性のあるリガーゼの効果ではないことが観察された。
【００６２】
血液細胞由来のゲノムＤＮＡはしばしば循環核酸の調製物を汚染し、診断価値が少ないので、高分子量ゲノムＤＮＡよりも循環の増幅を優先することは、特定の用途に有利であり得る。
【００６３】
実施例５：リガーゼ支援全ゲノム増幅を用いる断片化されたＤＮＡの単一管増幅−分子内ライゲーションの前のキナーゼによる循環ＤＮＡ断片のリン酸化の効果。
【００６４】
循環ＤＮＡ断片のキナーゼによるリン酸化は、血漿中の循環ＤＮＡのより感受性の高い検出を許容した。雄−雌血漿／血液混合実験を実施して、キナーゼで処理したインプットＤＮＡから作成したライブラリーがより代表的であったことを確立し、ＤＹＳ１４雄特異的マーカーのより感受性の高い検出を可能にした（図１０、３／３複製物、それに反してリン酸化が行われなかった場合は１／３しか検出されなかった）。１００μＬの血液／血漿混合物を以下の通り調製した：１００Ａ：１００％雄血漿；５Ａ〜Ｃ：雌全血に５％ｖ／ｖでスパイクした雄血漿；１Ａ〜Ｃ：雌全血に１％ｖ／ｖでスパイクした雄血漿；および０Ａ：１００％雌血液。ＭＦ１膜（Ｗｈａｔｍａｎ）を通した横の流れによって血漿を血液細胞から分離し、それに続いて乾燥させ一晩貯蔵したセルロースパッドの上に収集した。次に、循環ＤＮＡを、標準的なヨウ化ナトリウム／洗浄剤に基づく方法であるＷａｋｏ抽出器ＳＰキット（和光純薬株式会社）の変更によって、セルロースパッドから単離した。次に、約１．８ｎｇのＤＮＡを、ＧＴＰ、マンガン、およびベタインの存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてまたは用いずに処理し、次にＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）で処理して一本鎖ＤＮＡ断片を環状化した。次に、ＤＮＡをＧｅｎｏｍｉＰｈｉ全ゲノム増幅（ＧＥヘルスケア）に供し、生成物を定量的ＰＣＲで分析して、２つのマーカー：Ｄｙｓ１４（Ｙ−染色体に位置するマルチコピー遺伝子であり、雄画分だけから検出可能であるべきである）、およびＤ１６Ｓ５３９（染色体１６に位置するＳＴＲ遺伝子座であり、雄と雌の両方の画分から検出可能であるべきである）の検出を評価した。反応は、ワークフロー中に中間の精製もしくは単離工程を含まずに、単一の反応器で実施された。これは、比較的低い濃度のＧＴＰでリン酸化反応を実施することによって実現された。
【００６５】
図１０は、キナーゼを反応に含めることにより、５’リン酸塩を含まないプールのＤＮＡ断片の環状化および増幅が許容され、それによって、より代表的なライブラリーが作成されることを示す。これには、細胞死の間にＤＮアーゼＩＩ消化によって特異的に生成される５’ヒドロキシルを含有するＤＮＡ断片が含まれる。雄−雌血漿／血液混合実験を用いて、キナーゼで処理したインプットＤＮＡから作成したライブラリーがより代表的であったことが証明され、ＤＹＳ１４雄特異的マーカーのより感受性の高い検出（３／３複製物、それに反してリン酸化が行われなかった場合は１／３しか検出されなかった）を可能にした。
【００６６】
実施例６：環状化反応の前の断片化ＤＮＡのプレ−アデニル化の効果。
【００６７】
４０分でリン酸化されたかまたはプレ−アデニル化された小型のＤＮＡ断片の環状化の効率は、異なる量のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素で評価される。５’位にリン酸基かまたはアデニル化を含む、２．５ｐｍｏｌの６４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、漸増量のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）またはＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）で４０分間６０℃で処理した。環状化率を、線状および環状の位置のバンドの強度を走査することによって求めた。図１２に示されるように、断片化されたＤＮＡのプレ−アデニル化は、ライゲーションおよび増幅速度を向上させた。図１２では、Ｐ−６４ｍｅｒは、５’−リン酸化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表し；ａｄ−６４は、プレ−アデニル化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表す。プレ−アデニル化ＤＮＡは、標準的なリン酸化されたＤＮＡよりも急速に環状化された。さらに、アデニル化の程度の低いライゲーション酵素は、モル過剰の基質のライゲーションを触媒し、リガーゼがプレ−アデニル化されたＤＮＡ分子と連結する複数の機会を有することを示した。そのことは、ライゲーション速度を増加させ、より困難な鋳型の環状化の増加を可能にする可能性がある。
【００６８】
実施例７：プレ−アデニル化ワークフローを用いる５’−リン酸塩および５’−ヒドロキシル含有オリゴヌクレオチドの環状化。
【００６９】
５ｐｍｏｌの６４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを含有する、５’位にリン酸基かまたはヒドロキシル基のいずれかとの反応物を、１．２５ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで指示される場所で３７℃で処理した。２５ｐｍｏｌ  Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼとの６５℃でのインキュベーションの後、反応物を０．２５単位のシュリンプアルカリホスファターゼで処理した。Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼはＡＴＰ濃度に対して非常に感受性が高いので、標準的な１００μＭのＡＴＰ濃度で、Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼは、ＤＮＡ末端をほとんどアデニル化する。このＡＴＰ濃度ではＭｔｈ  ＲＮＡリガーゼによる分子内ライゲーションは起こらない。酵素は各々のインキュベーションの後に熱失活させた。最後に、反応物を、指示される場所で５０単位のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）で処理し、６０℃で６０分間インキュベートした。環状化率を、線状および環状の位置のバンドの強度を走査することによって求めた（図１３）。Ｐ−６４ｍｅｒは、５’−リン酸化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表し；ａｄ−６４ｍｅｒは、プレ−アデニル化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表す。
【００７０】
図１１は、５’−リン酸塩または５’−ヒドロキシル基を含有する線状オリゴヌクレオチドが環状形態に変換される、「単一管」プレ−アデニル化ワークフローを示す。この「単一管」プロセスにおいて、基質は、中間の精製工程を含まずに、ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｍｔｈ  ＲＮＡリガーゼ、シュリンプアルカリホスファターゼ、およびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  Ｉ（商標）で連続的に処理される。
【００７１】
実施例８：血漿由来の断片化された核酸の全ゲノム増幅の速度：
Ｗａｋｏ  ＤＮＡ抽出器ＳＰキット（和光純薬株式会社）を用いて、明らかに健康な個体から血漿ＤＮＡを単離した。１ｎｇの精製された血漿ＤＮＡを９５℃で加熱して鋳型を変性させた。次に、変性した一本鎖ＤＮＡ鋳型をＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）で処理して一本鎖ＤＮＡ環を生成した。ライゲーション反応のために、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、６６ｍＭ  ＫＯＡｃ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１Ｍベタイン、および３０Ｕ  ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含有するライゲーション反応混合物（６μＬ）とともに血漿ＤＮＡを６０℃で２時間インキュベートした。その後に反応混合物を８０℃で１０分間インキュベートすることによってリガーゼを熱失活させた。次に、一本鎖ＤＮＡ環を、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いるランダムプライムドローリングサークル全ゲノム増幅を用いる全ゲノム増幅に供した。一本鎖ＤＮＡ環は、ＤＮＡの精製を介在させずに、ライゲーション反応混合物を以下の条件：２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５％  ＰＥＧ−８０００、４０μＭ  ＡＴランダム六量体プライマー混合物、２０ｎｇ／μＬ  Ｐｈｉ２９ポリメラーゼおよび５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に調節して最終容積を２０μＬとすることによって、同じ反応器で増幅された。増幅反応混合物を３０℃で１０時間インキュベートし、その後に６５℃で２０分間ポリメラーゼを熱失活させた。リアルタイム増幅は、少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＳＮｉＰｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で蛍光シグナル増加を経時的にモニターすることによって実施した。増幅は、「ａｔ  Ｎ」が２−アミノ  ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、正常なＧおよび正常なＣを含有するランダム混合物を表す、配列＋Ｎ＋Ｎ（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）＊Ｎ（ＡＴランダム六量体）を有するランダムプライマー混合物を用いて実施した。
【００７２】
比較のために、上記と同じプロトコールを用いて、当量濃度の血漿ＤＮＡを標準的なランダム六量体（ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ）およびＤＮＡ鋳型を含まない（鋳型コントロールのない）試料で増幅させた。図１４に示されるように、ＡＴランダム六量体プライマー混合物を用いて実施した増幅反応は、驚くことに、標準的なランダム六量体と比較して、より速い速度を示し、著しく高い増幅産物ＤＮＡ収率を生じた。標準的なランダム六量体を用いるＤＮＡ収率の０．８４μｇと比べると、ＡＴランダム六量体を用いる増幅のＤＮＡ収率は、２．２５μｇである。ＤＮＡ収率は、「鋳型コントロールなし」（ＮＴＣ）反応についてはゼロである。図１４に示されるように、ＡＴランダム六量体などの修飾されたヌクレオチドを含むランダムプライマーが使用される場合に、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）を用いて血漿ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ環に連結し、変換すると、急速な増幅速度が達成された。（図３）。単一管ライゲーションおよび増幅反応は、ベタイン、酢酸カリウム、およびマンガンをはじめとする、ＤＮＡライゲーション反応からのキャリーオーバー成分を含み、それらは増幅に対して阻害効果を有することが一般に公知である。しかし、反応が、修飾されたヌクレオチドを含むＡＴランダム六量体の存在下で実施された際、増幅に対するこの阻害効果は驚くほど最小限であった。図１４に例示されるような増幅速度の相対的増加は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含むランダムプライマー混合物の、介在する単離および精製工程を含まない、同じ反応器中の一本鎖ＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーションの後のローリングサークル増幅反応を促進する際の有効性を示す。
【００７３】
実施例９：リガーゼ支援全ゲノム増幅により増幅させた血漿由来の核酸の分析。
【００７４】
実施例８で生成した増幅ＤＮＡ産物を、エタノール沈殿法によって精製し、シークエンシング反応に供して、ＡＴランダム六量体プライマーを用いるリガーゼ支援全ゲノム増幅法の品質を決定した。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭを３１８個のチップおよび２００ｂｐの読み取り長さ使用するＩｏｎ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌシングルエンド標的化シークエンシングを用いてシークエンシングを実施した。図１５に例示されるように、ＡＴランダム六量体を用いて増幅ＤＮＡ産物は、標準的なランダム六量体を用いて増幅されたＤＮＡよりも高品質である。ＡＴ六量体を用いて増幅させたＤＮＡの回収された塩基の百分率は、バルク非増幅血漿ＤＮＡから得たものにより近い。表２に示されるように、ＡＴ六量体を用いて増幅されたＤＮＡのカバレッジ深度および均一性レベルは、バルク非増幅血漿ＤＮＡから得たものにより近い。
【００７５】
【表２】
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ＡＴランダム六量体を用いる標的配列領域の全体にわたって観察される、より高い全体的なカバレッジおよび均一性は、既知のＣｌｉｎＶａｒ変異部位で測定された臨床的に関連のある一塩基多型（ＳＮＰｓ）を含む領域でも、より高いカバレッジ深度をもたらした（図１６、図中、ラベリングはカバレッジの平均深度、１ｘ深度、１５ｘ深度などを示す）。この図は、全てのカットオフレベルで、ＡＴプライマーが、ランダムプライマーよりも多くの割合のＣｌｉｎＶａｒ変異領域をカバーすることを示す。対照的に、環状化工程を行わずに血漿ＤＮＡを直接に増幅させるワンステップ反応では、配列包括度は非常に不十分であり、これらの領域のカバレッジ深度は変わりやすく、ＣｌｉｎＶａｒ変異部位でのカバレッジは不十分であった。
【００７６】
実施例１０：標的化再シークエンシングのための単一管ＦＦＰＥ組織抽出、ＤＮＡ環状化、修復、およびゲノム増幅。
【００７７】
ＦＦＰＥ組織スライドの脱パラフィンは、ＦＦＰＥ組織スライドを６５℃のオーブンで１時間インキュベートすることによって実施した。脱パラフィン化されたスライドを、ＨＩＳＴＯＣＨＯＩＣＥ（商標）Ｃｌｅａｎ  Ａｇｅｎｔ（ＡＭＲＥＳＣＯ、カタログ番号Ｈ１０３）を５分間使用して、２回洗浄した。スライドを連続的に１００％エタノール（２回、各回５分）、７５％エタノール（１回、５分）および５０％エタノール（１回、５分）で洗浄した。次に、スライドをヌクレアーゼフリー水ですすぎ、風乾した。抗原は、クエン酸塩−ＴＲＩＳ抗原回収（ＡＲ）緩衝液を使用してスライドから回収した。クエン酸塩−ＡＲ（ｐＨ６．０）およびＴＲＩＳ−ＡＲ緩衝液（ｐＨ８．５）は、７０℃で２０分間予熱した。予熱したクエン酸塩−ＡＲを含有するジャーにスライドを入れ、ジャーを１１０℃の圧力鍋に４分間入れ、続いて７５℃の圧力鍋に２０分間入れた。次に、スライドを予熱したＴＲＩＳ−ＡＲ緩衝液に移し、２０分間保持した。ジャーを室温で１０分間冷却し、スライドを手短に水で洗浄し、その後風乾した。次に、ＦＦＴＥ組織を、プロテイナーゼＫを用いて消化させた。消化には、０．６μＬの２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ消化液を１ｍｍ２の面積の組織に使用した（例えば、４ｍｍ×６ｍｍの組織切片には、約１５μＬのプロテイナーゼＫ消化液を使用した）。プロテイナーゼＫ消化液は、５μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃  ＡＭ２５４８）と５μＬの組織消化緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を混合することによって調製した。最初に、０．５μＬのプロテイナーゼＫ消化液をスライドに添加して組織を濡らした。エタノールで拭いたカミソリの刃を使用し；組織をこすり取って０．２ｍＬ管に移した。次に、２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ消化液の残りを管に添加し、５０℃で２時間またはそれ以上、スラリーが透明になるまでインキュベートした。スラリーを室温まで冷却し、２μＬの粗抽出物をＤＮＡ濃度測定のために別にして取っておいた（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、高感受性（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃  Ｑ−３３１２０））。
【００７８】
消化混合物を失活させるために、５μＬの粗抽出物（４０ｎｇのＤＮＡを含有）をプロテイナーゼＫ阻害剤（０．６μＬの５ｍＭ  プロテイナーゼＫ阻害剤（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃  ５３９４７０）、３．３μＬの９．１％  α−シクロデキストリン、（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ４６８０））で処理する。次に、試料を３つの異なる組合せで処理する。
【００７９】
ＲＥＶ１０プロトコール−抽出物に、１．１μＬの５Ｍベタイン、１．１μＬの１０×環状化緩衝液（３５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６６０ｍＭ  ＫＯＡｃ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０）ならびに１０．５６μＬまでのヌクレアーゼフリー水を添加した（総容積１１μＬ）。混合物を室温で１０分間インキュベートした。その後、反応混合物を約９５℃に３分間加熱し、それに続いて氷上で急冷した。これに０．４４μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＃ＣＬ９０２５Ｋ）を添加して最終反応容積を１１μＬとした。反応混合物をサーモサイクラーで６０℃で８時間、それに続いて８０℃で１０分間インキュベートして酵素を失活させた。
【００８０】
ＲＥＶ１１プロトコール−抽出物に、１．１μＬの１０×修復緩衝液（０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｍＭ  ＤＴＴ）、０．７７μＬ修復／損傷除去ミックス（０．６μＬ  ＵＤＧ（５Ｕ／μＬ）、０．３μＬ  Ｆｐｇ（８Ｕ／μＬ）、０．１５μＬ  Ｅｎｄｏ  ＩＶ（１０Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））およびヌクレアーゼフリー水を添加することによって修復反応成分を添加して、最終容積を１１μＬとした。反応混合物をサーモサイクラーで３７℃で３０分間、それに続いて８５℃で１５分間インキュベートして酵素を失活させた。これに、１．５μＬの５Ｍベタイン、１．５μＬの１０×環状化緩衝液（３５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６６０ｍＭ  ＫＯＡｃ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０）ならびにヌクレアーゼフリー水を添加した（総容積１４．４μＬ）。反応混合物を約９５℃に３分間加熱し、それに続いて氷上で急冷した。これに０．６μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＃ＣＬ９０２５Ｋ）を添加して最終反応容積を１５μＬとした。反応混合物を６０℃のヒートブロックで８時間、その後８０℃で１０分間インキュベートして酵素を失活させた。
【００８１】
ＲＥＶ１２プロトコール−抽出物に、１．１μＬの５Ｍベタイン、１．１μＬの１０×環状化緩衝液（３５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６６０ｍＭ  ＫＯＡｃ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０）ならびにヌクレアーゼフリー水を添加した（総容積１０．５６μＬ）。混合物を室温で１０分間インキュベートした。その後、反応混合物を約９５℃に３分間加熱し、それに続いて氷上で急冷した。これに０．４４μＬのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ  ＩＩ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＃ＣＬ９０２５Ｋ）を添加して最終反応容積を１１μＬとした。反応混合物をサーモサイクラーで６０℃で８時間、それに続いて８０℃で１０分間インキュベートして酵素を失活させた。環状化ミックス全体（１１μＬ）を、１．５μＬの１０×修復緩衝液（０．０３％Ｔｗｅｅｎ−２０、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｍＭ  ＤＴＴ）、１．０５μＬ修復ミックス（０．６μＬ  ＵＤＧ（５Ｕ／μＬ）、０．３μＬ  Ｆｐｇ（８Ｕ／μＬ）、０．１５μＬ  Ｅｎｄｏ  ＩＶ（１０Ｕ／μＬ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））および１．４５μＬのヌクレアーゼフリー水を添加することによって修復／損傷除去反応に使用して、最終容積を１５μＬとした。反応混合物をサーモサイクラーで３７℃で３０分間、それに続いて８５℃で１５分間インキュベートして酵素を失活させた。
【００８２】
ＤＮＡ増幅用に、クリーニング反応マスターミックスを、２０μＬの３×Ｐｈｉ２９緩衝液（１１４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１２０μＭ  ＡＴプライマー混合物  ０．０２１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５４．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＴＣＥＰ、７．５ｍＭ  ＫＯＡｃおよび７．５％ＰＥＧ−８０００）、０．３μＬの１：１００  サイバーグリーンＩ＊（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ  Ｓ−７５６３）、１．２μＬのＰｈｉ２９ポリメラーゼ（１ｍｇ／ｍＬ、ＧＥヘルスケア）、２１．１μＬのヌクレアーゼフリー水を混合することによって構築し、最終容積を４２．６μＬとした。クリーニング反応マスターミックスを３０℃で１時間インキュベートし、使用するまで４℃で保持した。増幅反応は、２．４μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ溶液を該クリーニング反応に添加することによって開始させた。直ちに、全部のクリーニングされた反応ミックスを、６０μＬの最終反応容積を得るために１５μＬの修復されたミックスに添加した。これを３０℃で８〜１６時間インキュベートし、その後に６５℃で１５分間ポリメラーゼを熱失活させた。リアルタイムセットアップでは、データは１０分おきに収集された。
【００８３】
全ゲノム増幅産物は、精製用の製造業者の説明書によって精製された（ＳＵＲＥＣＬＥＡＮ  ＰＬＵＳ（商標）、Ｂｉｏｌｉｎｅ）。手短に言えば、６０μＬのＳＵＲＥＣＬＥＡＮ  ＰＬＵＳ（商標）を６０μＬのＷＧＡ産物に添加し、完全に混合した。これを３０分間室温でインキュベートし、ベンチトップ遠心機で３０分間最大速度で遠心した。上清を吸引によって除去した。１２０μＬの新しく作製した７０％エタノールを添加し、１０秒間ボルテックスし、１５分間最大速度で遠心した。上清を注意深く除去した。洗浄工程を１回繰り返した後、風乾して確かにエタノールを完全に除去した。乾燥したペレットを３０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に再懸濁した。２μＬの精製ＷＧＡ産物ＤＮＡ濃度測定に使用した（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ｄｓＤＮＡ  Ｂｒｏａｄ−Ｒａｎｇｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃  Ｑ−３３１３０）。予測収量は約３μｇであった。
【００８４】
ＤＮＡ試料を、ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での次世代シークエンシングを用いて分析した。体細胞変異を検出するための高度に多重化された標的化再シークエンシングアッセイである、ＴｒｕＳｅｑアンプリコン−癌パネル（ＴＳＡＣＰ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造業者の推奨に従って使用した。２５０ｎｇの最近に凍結させた組織由来のＤＮＡを陽性対照として使用し、ＲＥＶ１０、ＲＥＶ１１、およびＲＥＶ１２プロトコールから全て二度繰り返して得られる４０ｎｇのＦＦＰＥ  ＤＮＡ由来の１，０００ｎｇのローリングサークル増幅された全ゲノムＤＮＡを、シークエンシングワークフローで使用した。これらのシークエンシング反応から、カバレッジの深度、配列標的均一性、および突然変異の統計量を求めた。図１７、図１８、および図１９に示されるように、ＲＥＶ１０、１１、および１２プロトコールは、優れたカバレッジ深度およびカバレッジの均一性を提供する。しかし、ＤＮＡ修復／ＤＮＡ損傷除去工程が長いＤＮＡの環状化工程の後に実施されるＲＥＶ１２プロトコールは、ＲＥＶ１０およびＲＥＶ１１プロトコールと比較して、改善された陽性的中率および改善された感受性を有した（図１９）。
【００８５】
特許請求される本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなくその他の具体的な形態で具体化されてよい。前述の実施形態は、多様な全ての可能性のある実施形態または実施例から選択された実施形態または実施例である。そのため、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を制限するというよりもむしろあらゆる点で実例となると考えられるべきである。特許請求される本発明の特定の特徴だけが本明細書において例示され説明されたが、当業者が、本開示の利益を得て、これらおよびその他の種類の用途に適した本発明の原理に従って本方法を用いるための適した条件／パラメータを特定し、選択し、最適化するかまたは変更することができることは理解されるべきである。試薬の正確な使用、選択、変数、例えば濃度、容積、インキュベーション時間、インキュベーション温度、および同類のものなどの選択は、主にそれが意図される特定の用途に依存し得る。そのため、添付される特許請求の範囲は、本発明の真の精神の中に入る全ての変更および改変を網羅することを目的とすることが理解される。さらに、特許請求の範囲の等価物の意味および範囲内にある全ての改変は、その中に包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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