(57)【要約】  本発明は、配列決定のために細胞外小胞体から単離された核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）を調製する一連のステップを提供する。これは、効率的に検出されるように、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの幅広い多様性を可能にする。次いで、これらは、例えば遺伝子発現、選択的スプライシング、ならびに単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）や構造変異体（挿入／欠失、融合、逆位）を含めた体細胞変異および生殖細胞変異の両方の検出などの様々な属性を認識するのに使用できる。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルからの核酸を配列決定する方法であって：
（ａ）生体サンプルを準備し；
（ｂ）固形物捕捉表面と該生体サンプルとを、その捕捉表面上または表面内にその生体サンプルからの無細胞ＤＮＡおよび細胞外小胞体を保持するのに十分な条件下で接触させ；
（ｃ）溶解試薬と該捕捉表面とを、該無細胞ＤＮＡおよび細胞外小胞体が該捕捉表面上または表面内に存在している間に接触させ、それにより、その捕捉表面からＤＮＡおよびＲＮＡを放出させ、ホモジネートを作り出し；
（ｄ）該ホモジネートからＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を抽出し；
（ｅ）該ホモジネートから、または抽出されたＤＮＡ、抽出されたＲＮＡもしくはその両方から選択的にリボソームＤＮＡまたはＲＮＡ配列を取り除き；
（ｆ）該ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；
（ｇ）該抽出されたＤＮＡ、逆転写されたｃＤＮＡ、または抽出されたＤＮＡと逆転写されたｃＤＮＡの両方から二本鎖ＤＮＡライブラリを構築し；
（ｈ）任意で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方をライブラリから増幅し；
ｃＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡライブラリから核酸配列を選択的に濃度を高め；そして、
（ｉ）該ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはｃＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの両方を含むライブラリを配列決定すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｅ）の前または後に、ホモジネート、抽出されたＲＮＡ、または抽出されたＤＮＡとＲＮＡを、例えばＤＮアーゼＩおよび／または修飾ＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼで前処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ライブラリ構築中のいずれかのステップにて、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡからリボソームＤＮＡまたはＲＮＡ配列を選択的に取り除くことを、ステップ（ｅ）にさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｄ）の前または後に、外因性ＲＮＡまたはＤＮＡのスパイクをホモジネートに、および／または抽出されたＤＮＡ、抽出されたＲＮＡ、または抽出されたＤＮＡとＲＮＡの両方に加えるステップをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｊ）が、生体サンプルからのＲＮＡとＤＮＡの両方を同時に配列決定することである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｄ）の前または後に、例えばＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼでホモジネートを前処理するステップと、それに続く、外因性ＲＮＡのスパイクをホモジネートに加えるステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｄ）の前または抽出した後に、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００の希釈にて外因性ＲＮＡまたはＤＮＡのスパイクをホモジネートに、および／または抽出されたＲＮＡ、抽出されたＤＮＡ、または抽出されたＤＮＡとＲＮＡの両方に加えるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
リボソームＲＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡを選択的に取り除くステップが、例えばＲＮアーゼＨなどの酵素試薬または制限酵素消化産物を使用すること；ハイブリダイゼーションベースのビオチン化プローブ濃縮およびストレプトアビジン結合常磁性ビーズを利用することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または二本鎖ＤＮＡライブラリからの核酸配列を選択的に高めるステップが、ＰＣＲベースのアプローチ相補的オリゴヌクレオチド、および／またはハイブリダイゼーションベースのビオチン化プローブ濃縮およびストレプトアビジン結合常磁性ビーズを利用することである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または二本鎖ＤＮＡ分子が、独特な分子指標（独特な分子タグ、独特な識別子、ランダムなバーコード）を用いてタグ付与され、そしてそれが、鋳型の識別、重複排除、エラー修復、およびコピー数の計測を可能にする方法であって、ここで、該独特な分子指標が、プライマーアニーリング、アダプター連結反応、および酵素的アプローチを介して付加される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸が、２００ヌクレオチド超、例えば３００ヌクレオチド超、あるいは５００ヌクレオチド超などを有する長鎖ＲＮＡを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルが、例えば約０．５ｍＬから約２０ｍＬ、約０．５ｍＬから約１０ｍＬ、約０．５ｍＬから約５ｍＬ、約０．５ｍＬから約４ｍＬ、あるいは約０．５ｍＬから約２ｍＬの体積などの、約０．５ｍＬほどのわずかな体積である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体サンプルが、血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、脳脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸管、腸管、および尿生殖路に含まれる体液、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、内臓系液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、およびこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体サンプルが、血液、血漿または血清である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記固形物捕捉表面が、例えばカラム膜などの膜であるか、またはビーズである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記固形物捕捉表面が、再生セルロースを含む膜である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記固形物捕捉表面が、２〜５μｍの範囲内、または少なくとも３μｍの孔径を有する膜である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記固形物捕捉表面が、少なくとも２種類の膜、あるいは少なくとも３種類の膜などの２種類以上の膜を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記固形物捕捉表面が、３種類の膜を含み、ここで、該３種類の膜が互いに直接隣接している、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記固形物捕捉表面が磁性体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記固形物捕捉表面が、イオン交換（ＩＥＸ）ビーズであるか、陽性荷電しているか、または陰性荷電しているビーズである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記固形物捕捉表面が、第四級アミン、スルファート、スルホナート、三級アミン、またはそれらの組み合わせで官能化されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記固形物捕捉表面が、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記固形物捕捉表面が、例えば強い強磁性、高容量ビーズ、あるいは強い強磁性、高容量、酸化鉄含有磁性高分子などの磁性、高容量ＩＥＸビーズであるＩＥＸビーズを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記固形物捕捉表面が、酸化傾向がある液体に晒される表面を有していないＩＥＸビーズを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記固形物捕捉表面が、暴露表面に対して高い確率でビーズ荷電を有するＩＥＸビーズを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｄ）が、ホモジネートからのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方を抽出する前に、タンパク質沈殿バッファーをホモジネートに加えることをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｄ）が、酵素分解をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｄ）が、プロテイナーゼ消化を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（ｄ）が、あらかじめ固体表面からの物質の溶出を伴っても、またはそれなしでも、実施される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（ｄ）が、プロテイナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、またはそれらの組み合わせを使用した消化を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ｄ）が、遷移金属イオン、緩衝剤、または遷移金属イオンと緩衝剤の両方を含むタンパク質沈殿バッファーをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ａ）が、例えば０．８μｍフィルターを使用して濾過することによるなどして、生体サンプルを濾過することによって生体サンプルを加工することをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ｂ）が、捕捉表面と生体サンプルを接触させた後に、遠心分離ステップをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ｂ）が、捕捉表面と生体サンプルを接触させた後に、捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ｄ）が、ホモジネートに核酸対照スパイクインを加えることをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、タンパク質が沈殿した溶出液をシリカカラムに結合させ；そして、該シリカカラムから抽出物を溶出するステップをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、生体サンプルからの核酸のハイスループット分離に使用される、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｄ）が、例えば至適濃度のイソプロパノール、酢酸ナトリウムおよびグリコーゲンなど、固体表面への低分子ＲＮＡの結合を高めるために１または複数の化学薬品を使用することを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ステップ（ｂ）が、陽イオンの濃度、陰イオン濃度、洗浄薬、ｐＨ、時間および温度、ならびにそのいずれかの組み合わせを含めたものから成る群から選択される結合条件の最適な組み合わせを利用する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１０月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／４１０，９７４号および２０１７年７月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／５３６，５４５号の利益を主張するものであり、その内容を全体として参照により本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学の技術分野にある。より特に、本発明は、分子診断の技術分野にある。分子生物学では、ＲＮＡやＤＮＡなどの核酸の形態にある分子が、組織や様々な生体液などのヒト由来サンプル材料から単離され、さまざまな方法論でさらに分析される。
【背景技術】
【０００３】
背景
生体液からのエキソソームや他の細胞外小胞体の、ＲＮＡ配列決定を含めた広範囲な核酸配列決定は、非常に感度の高い診断と、それによる疾患の検出、患者の階層化および治療応答の観察が期待できる。エキソソームという用語は、細胞によって放出されたあらゆる細胞外膜結合小胞を本明細書では示す。
【０００４】
インビトロまたはエクスビボ系のどちらから単離されたエキソソーム内の長鎖ＲＮＡカーゴ（cargo）に関しても基本的な理解不足がある。エキソソームのＲＮＡカーゴを調査する従来の試験は、低分子ＲＮＡ画分に主に焦点を合わせていた。注釈付けされた長鎖ＲＮＡの比較的小さな集団および低い転写産物カバー率が、これらの試験で報告され、多くが、エキソソームがタンパク質コードおよび非コードＲＮＡの短い断片のみを担持しているとの結論に至ったので、エキソソームを通じた遺伝子発現調節および細胞間伝達におけるそれらの潜在的な機能的能力に関して疑問が生じた。
【０００５】
細胞外小胞体からのＤＮＡおよび／またはＤＮＡと（少なくともＲＮＡを含めた）核酸を単離する現行の方法としては、超遠心分離、例えば１００ｋＤａの濾過器を使用した限外濾過、重合体沈殿技術、および／またはサイズに基づく濾過などが挙げられる。しかしながら、細胞外小胞体を単離し、そして任意に、その中に含まれた核酸、好ましくは細胞外小胞体ＲＮＡを抽出する、ならびに診断目的を含めたさまざまな適用における使用のためにその中に含まれた核酸を配列決定するための効率的かつ効果的な代替法の必要性が存在している。
【０００６】
従って、細胞外小胞体を用いた核酸の信頼性の高い配列決定および分析の必要性が存在する。本開示はこれら、およびその他の、重要な目的を対象とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本発明は、生体サンプルからの核酸を配列決定する方法であって、生体サンプルを準備し；固形物捕捉表面と該生体サンプルとを、その捕捉表面上または表面内にその生体サンプルからの無細胞ＤＮＡおよび細胞外小胞体を保持するのに十分な条件下で接触させ；溶解試薬と該捕捉表面とを、該無細胞ＤＮＡおよび細胞外小胞体が該捕捉表面上または表面内に存在している間に接触させ、それにより、その捕捉表面からＤＮＡおよびＲＮＡを放出させ、ホモジネートを作り出し；該ホモジネートからＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を抽出し；該ホモジネートから、または抽出されたＤＮＡ、抽出されたＲＮＡまたはその両方から選択的にリボソームＤＮＡまたはＲＮＡ配列を取り除き；該ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し；該抽出されたＤＮＡ、逆転写されたｃＤＮＡ、または抽出されたＤＮＡと逆転写されたｃＤＮＡの両方から二本鎖ＤＮＡライブラリを構築し；任意で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方をライブラリから増幅し；ｃＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡライブラリから核酸配列を選択的に濃縮し；そして、該ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはｃＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの両方を含むライブラリを配列決定することを含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記方法は、リボソームＤＮＡまたはＲＮＡ配列を選択的に取り除く前または取り除いた後に、ホモジネート、抽出されたＲＮＡ、または抽出されたＤＮＡとＲＮＡを、例えばＤＮアーゼＩおよび／または修飾ＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼで前処理するステップをさらに含む。他の実施形態において、前記方法は、ライブラリ構築中のいずれかのステップにおいて、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡからリボソームＤＮＡまたはＲＮＡ配列を選択的に取り除くことをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記方法は、生体サンプルからのＲＮＡとＤＮＡの両方を同時に配列決定することを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記方法は、ホモジネートからＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を抽出する前または抽出した後に、外因性ＲＮＡまたはＤＮＡのスパイクをホモジネートに、および／または抽出されたＤＮＡ、抽出されたＲＮＡ、または抽出されたＤＮＡとＲＮＡの両方に加えるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、ホモジネートからＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を抽出する前または抽出した後に、例えばＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼでホモジネートを前処理するステップと、それに続く、外因性ＲＮＡのスパイクをホモジネートに加えるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、ホモジネートからＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を抽出する前または抽出した後に、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００の希釈にて外因性ＲＮＡまたはＤＮＡのスパイクをホモジネートに、および／または抽出されたＲＮＡ、抽出されたＤＮＡ、または抽出されたＤＮＡとＲＮＡの両方に加えるステップをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、リボソームＲＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡを選択的に取り除くこととしては、例えばＲＮアーゼＨなどの酵素試薬または制限酵素消化産物を使用すること；ハイブリダイゼーションベースのビオチン化プローブ濃縮およびストレプトアビジン結合常磁性ビーズを利用することが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または二本鎖ＤＮＡライブラリからの核酸配列を選択的に高めることは、ＰＣＲベースのアプローチ相補的オリゴヌクレオチド、および／またはハイブリダイゼーションベースのビオチン化プローブ濃縮およびストレプトアビジン結合常磁性ビーズを利用することである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または二本鎖ＤＮＡ分子は、独特な分子指標（独特な分子タグ、独特な識別子、ランダムなバーコード）を用いてタグ付与され、そしてそれは、鋳型の識別、重複排除、エラー修復、およびコピー数の計測を可能にする。独特な分子指標は、プライマーアニーリング、アダプター連結反応、および酵素的アプローチを介して付加される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、核酸は、２００ヌクレオチド超、例えば３００ヌクレオチド超、あるいは５００ヌクレオチド超などを有する長鎖ＲＮＡを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、生体サンプルは、例えば約０．５ｍＬから約２０ｍＬ、約０．５ｍＬから約１０ｍＬ、約０．５ｍＬから約５ｍＬ、約０．５ｍＬから約４ｍＬ、あるいは約０．５ｍＬから約２ｍＬの体積などの、約０．５ｍＬほどのわずかな体積である。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、脳脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸管、腸管、および尿生殖路に含まれる体液、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、脳脊髄液、内臓系液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、およびこれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血液、血漿または血清である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、固形物捕捉表面は、例えばカラム膜などの膜であるか、またはビーズである。固形物捕捉表面は、再生セルロースを含む膜であってもよい。固形物捕捉表面は、２〜５μｍの範囲内、または少なくとも３μｍの孔径を有する膜であってもよい。固形物捕捉表面は、少なくとも２種類の膜、あるいは少なくとも３種類の膜などの２種類以上の膜を含んでもよい。固形物捕捉表面は、３種類の膜を含んでもよく、ここで、該３種類の膜は、互いに直接隣接している。
【００１５】
いくつかの実施形態において、固形物捕捉表面は磁性体である。いくつかの実施形態において、固形物捕捉表面は、イオン交換（ＩＥＸ）ビーズであるか、陽性荷電しているか、または陰性荷電しているビーズである。固形物捕捉表面は、第四級アミン、スルファート、スルホナート、三級アミン、またはそれらの組み合わせで官能化されていてもよい。固形物捕捉表面は、四級アンモニウムＲ−ＣＨ２−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化されていてもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態において、固形物捕捉表面は、例えば強い強磁性、高容量ビーズ、あるいは強い強磁性、高容量、酸化鉄含有磁性高分子などの磁性、高容量ＩＥＸビーズであるＩＥＸビーズを含む。固形物捕捉表面は、酸化傾向がある液体に晒される表面を有していないＩＥＸビーズを含んでいてもよい。固形物捕捉表面は、暴露表面に対して高い確率でビーズ荷電を有するＩＥＸビーズを含んでいてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、前記抽出ステップは、ホモジネートからのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方を抽出する前に、タンパク質沈殿バッファーをホモジネートに加えることをさらに含む。いくつかの実施形態において、抽出ステップは、酵素分解をさらに含む。抽出ステップは、プロテイナーゼ消化を含んでもよい。いくつかの実施形態において、抽出ステップは、あらかじめ固体表面からの物質の溶出を伴っても、またはそれなしでも、実施される。いくつかの実施形態において、抽出ステップは、プロテイナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、またはそれらの組み合わせを使用した消化を含む。いくつかの実施形態において、抽出ステップは、遷移金属イオン、緩衝剤、または遷移金属イオンと緩衝剤の両方を含むタンパク質沈殿バッファーをさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、前記方法は、例えば０．８μｍフィルターを使用して濾過することによるなどして、生体サンプルを濾過することによって生体サンプルを加工することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、捕捉表面と生体サンプルを接触させた後に、遠心分離ステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、捕捉表面と生体サンプルを接触させた後に、捕捉表面を洗浄することをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記方法は、ホモジネートに核酸対照スパイクインを加えることをさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、前記方法は、タンパク質が沈殿した溶出液をシリカカラムに結合させ；そして、該シリカカラムから抽出物を溶出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、生体サンプルからの核酸のハイスループット分離に使用される。いくつかの実施形態において、前記方法は、例えば至適濃度のイソプロパノール、酢酸ナトリウムおよびグリコーゲンなど、固体表面への低分子ＲＮＡの結合を高めるために１または複数の化学薬品を使用することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、陽イオンの濃度、陰イオン濃度、洗浄薬、ｐＨ、時間および温度、ならびにそのいずれかの組み合わせを含めたものから成る群から選択される結合条件の最適な組み合わせを利用する。
【００２１】
以下に、本発明の様々な態様および実施形態を詳細に記述する。自明であるが、本発明の範囲を逸脱することなく、これら詳細の修正を行うことが可能である。さらに、文脈により特に必要がなければ、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２２】
特定されたすべての特許、特許出願、および文献は、例えば、本発明に関連して用いられる可能性がある文献に記述された方法を記述および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの文献は、本願の出願日の前に開示されたもののみが提供される。この点については何ら、本発明者らが、従来の発明のため、あるいは何らかの他の理由でそのような開示に先行する資格がないことを認めるとものと解釈するべきで
はない。これら文献の内容の日付および表現についてのすべての記述は、出願人に入手可能な情報に基づくものであり、これら文献の日付または内容について何らかの承認を行うものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＲＮＡＳｅｑライブラリにおける長鎖ＲＮＡ転写物の増幅および取り込みからもたらされたＲＮＡプロファイルを示す一連のバイオアナライザープロットである。
【００２４】
【図２】図２は、様々な条件の転写産物相関を示すプロットである。合成スパイクインの使用は、０．９９９の重複間の相関を示し、ライブラリ重複間の優れた相関と再現性を実証している。
【００２５】
【図３】図３は（左から右に向かって）遺伝子間、イントロン、他のゲノム、トランスクリプトームおよび未マッピングの読み（read）として抜き出された読みの割合を例示し、そこで、Ｘ軸が読みのパーセントを提供する。
【００２６】
【図４】また、図４は（左から右に向かって）ＥＲＣＣ、Ｉｇ、ｍｉｓｃＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、タンパク質コード遺伝子、擬似遺伝子、ｒＲＮＡ、反復、低分子ＲＮＡおよびｔＲＮＡとして抜き出された読みの割合を例示し、そこでは、Ｘ軸が読みのパーセントを提供する。
【００２７】
【図５】図５は、リボソームＲＮＡを含まない、読みの割合による注釈分布をプロットしたグラフであり、そこで、Ｙ軸が読みのパーセントを示し、Ｘ軸がＲＮＡ型を示す。
【００２８】
【図６】図６は、リボデプレッションを用いていない（左側）およびそれを用いた（右側）両方の、読みのパーセントとしてリボソーム遺伝子２８Ｓ、１８Ｓ、１２Ｓおよび１６Ｓをプロットしたグラフである。
【００２９】
【図７】図７は、遺伝子、タンパク質をコードする転写産物のみ、およびすべての転写産物を比較するＧｅｎｃｏｄｅ ｖ２４注釈のパーセントを例示する。
【００３０】
【図８】図８は、すべての転写産物（左側）、ならびに拡大した非コードＲＮＡ（右側）に関する転写産物数による注釈分布をプロットした。
【００３１】
【図９】図９は、Ｘ軸上に被カバー転写産物（エクソンのみ）のパーセンテージおよびＹ軸上に被カバー転写産物の割合として、８６，７９９個の全被カバー転写産物をプロットしたグラフである。
【００３２】
【図１０】図１０は、Ｘ軸上のｌｏｇ２スケールの分子数に対して、同様にＹ軸上のｌｏｇ２スケールで１００万個あたりの転写産物をプロットしたグラフである。
【００３３】
【図１１】図１１は、血漿エキソソームの長鎖ＲＮＡで示されることが分かったｔｏｐ遺伝子オントロジーのカテゴリを表にしている。
【００３４】
【図１２】図１２は、本明細書中に提供した改良されたワークフローによる種々の実験条件に関するＥＲＣＣ相関を実証するプロットである。
【００３５】
【図１３】図１３は、転写産物における３’→５’カバー率の変動（左側）およびＥＲＣＣスパイクインにおける３’→５’カバー率の変動（右側）に関するプロットであり、そこでは、Ｘ軸が転写産物に沿った正規化距離であり、Ｙ軸が正規化カバー率である。
【００３６】
【図１４】図１４は、血漿エキソソームの最終的なライブラリサイズ分布を提供するバイオアナライザープロットである。
【００３７】
【図１５】図１５は、本明細書中に提供した改良されたワークフローに従って実装された代表的なアルゴリズムの図解である。
【００３８】
【図１６】図１６は、ＲＮＡＳｅｑパイプラインの概略を提供する。
【００３９】
【図１７】図１７は、マッピング指標（図１７Ａ）、塩基カバー率の％としてのＵＨＲ、ＲＮＡのみ、およびＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡの塩基カバー率（図１７Ｂ）、ならびに全癌あたりの読みに関するプロット（図１７Ｃ）を示す。
【００４０】
【図１８】図１８は、マッピング指標（図１８Ａ）、塩基カバー率の％としてのｃｆＤＮＡおよびｃｆＤＮＡ＋ＲＮＡの塩基カバー率（図１８Ｂ）、ならびに標的あたりのカバー率の深度に関するプロット（図１８Ｃ）を示す。
【００４１】
【図１９】図１９は、マッピング指標（図１９Ａ）、塩基カバー率の％としてのＵＨＲ、ＲＮＡのみ、およびＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡの塩基カバー率（図１９Ｂ）、ならびに遺伝子読みカバー率に関するプロット（図１９Ｃ）を示す。
【００４２】
【図２０】図２０は、液体生検検体のために最適化された３つの独立したＲＮＡｓｅｑライブラリ作成ワークフローをプロットした。
【００４３】
【図２１】図２１は、様々なリボソームＲＮＡ除去アプローチを実証する。
【００４４】
【図２２】図２２は、全ＲＮＡおよび全核酸（ｃｆＤＮＡ＋ＲＮＡ）に関するライブラリ作成方法を実証する。
【００４５】
【図２３】図２３は、血漿から構築された６つの独立したライブラリ重複に関するＥＲＣＣ外因性ＲＮＡスパイクインベースの全ＲＮＡＳｅｑアッセイの検出限界を実証するプロットである。
【００４６】
【図２４】図２４は、ＱＣ指標と分析結果を表示するＲＮＡＳｅｑブラウザである。
【００４７】
【図２５】図２５は、示差的発現解析の結果を表示し、および評価する示差的発現ブラウザである。
【００４８】
【図２６】図２６は、単一の方法（方法６）にこれらの別々の流れを組み合わせる改良されたプロセスを用いた、エキソソームサンプルの２つの画一的なプロセス（方法４および方法５）を比較する図解である。
【００４９】
【図２７】図２７は、１サンプルあたりのパーセント入力読み数の計測値として、未マッピング、その他のゲノム、遺伝子間、イントロン、およびトランスクリプトームのカバー率を注釈付けする。
【００５０】
【図２８】図２８は、１００万個あたりの読みとして、バイオタイプＥＲＣＣ、夾雑物、ｒＲＮＡ、タンパク質コード遺伝子、ｎｃＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、擬似遺伝子、ｍｉｓｃＲＮＡ、およびＩｇのそれぞれを注釈付けする。
【００５１】
【図２９】図２９は、密度に対する挿入物の長さ（ヌクレオチド数）を示すプロットである。
【００５２】
【図３０】図３０は、Ｙ軸の遺伝子数に基づいてＸ軸の遺伝子バイオタイプをプロットする。
【００５３】
【図３１】図３１は、全遺伝子（上段）、有用なトランスクリプトーム（中段）、およびｍＲＮＡ（下段）に関して閾値にてまたは閾値を超えて検出された１遺伝子数あたりの検出閾値ＲＰＭに関するプロットを提供する。
【００５４】
【図３２】図３２は、Ｙ軸の全転写産物の割合に対してＸ軸の被カバー転写産物（エクソンのみ）のパーセンテージをプロットする。
【００５５】
【図３３】図３３は、ＥＲＣＣ転写産物の検出限界を実証する。
【００５６】
【図３４】図３４は、正規化カバー率に対して転写産物に対する正規化位置（５’→３’）をプロットした。
【００５７】
【図３５】図３５は、１サンプルあたりのパーセント入力読み数の計測値として、未マッピング、その他のゲノム、遺伝子間、イントロン、およびトランスクリプトームのカバー率を注釈付けする。
【００５８】
【図３６】図３６は、１００万個あたりの読みとして、バイオタイプＥＲＣＣ、夾雑物、ｒＲＮＡ、タンパク質コード遺伝子、ｎｃＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、擬似遺伝子、ｍｉｓｃＲＮＡ、およびＩｇのそれぞれを注釈付けする。
【００５９】
【図３７】図３７は、密度に対する挿入物の長さ（ヌクレオチド数）を示すプロットである。
【００６０】
【図３８】図３８は、Ｙ軸の遺伝子数に基づいてＸ軸の遺伝子バイオタイプをプロットする。
【００６１】
【図３９】図３９は、全遺伝子（上段）、有用なトランスクリプトーム（中段）、およびｍＲＮＡ（下段）に関して閾値にてまたは閾値を超えて検出された１遺伝子数あたりの検出閾値ＲＰＭに関するプロットを提供する。
【００６２】
【図４０】図４０は、Ｙ軸の全転写産物の割合に対してＸ軸の被カバー転写産物（エクソンのみ）のパーセンテージをプロットする。
【００６３】
【図４１】図４１は、転写産物の割合に対する転写産物の長さのプロッティングに基づいて、＞８０％のカバー率を有する転写産物のサイズを強調する。
【００６４】
【図４２】図４２は、ＥＲＣＣ転写産物の検出限界を実証する。
【００６５】
【図４３】図４３は、正規化カバー率に対して転写産物に対する正規化位置（５’→３’）をプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明の詳細な説明
本発明は、配列決定のためにエキソソームから単離された核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）を調製する一連のステップを提供する。これは、効率的に検出されるように、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの幅広い多様性を可能にする。次いで、これらは、例えば遺伝子発現、選択的スプライシング、融合転写物、環状ＲＮＡ、ならびに単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）や構造変異体（挿入／欠失、融合、逆位）を含めた体細胞変異および生殖細胞変異の両方の検出などの様々な属性を認識するのに使用できる。
【００６７】
ある実施形態において、本発明は、単一のワークフローの中に、複数のワークフロー、例えばＲＮＡおよびＤＮＡ向けの別々の加工条件、を組み合わせて、より効果的な形でのエキソソームサンプルの分析を可能にする能力を提供する。
【００６８】
ある実施形態において、本発明は、着目の標的に関して特異的にサンプルの濃度を高める、そして、より深い配列カバー率を可能にするワークフローを提供する。そのワークフローは、例えば着目の遺伝子のサブセットについてサンプルの濃度を高める、および／または着目されていない他の遺伝子を除去することによって、特定のサンプル中の捕捉ｃＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを標的化する能力を提供する。
【００６９】
ある実施形態によると、本発明は、ＲＮＡ配列決定ワークフローの中に、エキソソームから短いＲＮＡ転写物と長鎖ＲＮＡ転写物の両方を含むように特別に設計されたプラットフォームを提供する。本明細書中に使用される場合、「長鎖ＲＮＡ」という用語は、２００ヌクレオチド超、例えば３００ヌクレオチド超、あるいは５００ヌクレオチド超など、を有するＲＮＡを指し、さらに長い非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および環状ＲＮＡを含んでもよい。
【００７０】
ある実施形態によると、本発明は、配列決定ワークフローの中に、単独またはエキソソームからのＲＮＡ（短いＲＮＡ転写物と長鎖ＲＮＡ転写物の両方）との混合物の状態のいずれかのＤＮＡを加工するためのプラットフォームを提供する。
【００７１】
配列決定ワークフローのための入力としての役割を果たす生体液の体積は、≧０．５ｍｌほどの少なさであってよく、上限はない（図１６）。
【００７２】
本明細書に記載した生体サンプル、例えば、ヒト血漿、血清、血液、尿、脳脊髄液などから開始することで、核酸が、エキソソームおよび他の無細胞起源から単離される。あるいは、核酸は、参照標準やＦＦＰＥ材料などの組織起源に由来してもよい。
【００７３】
エキソソーム由来の核酸は、これらの核酸組み合わせの配列決定を例示する図１７（ＲＮＡおよびＲＮＡ＋ＤＮＡ）および図１８（ＤＮＡおよびＲＮＡ＋ＤＮＡ）に示されているように、個別に、またはＲＮＡとＤＮＡの混合物として、ＲＮＡまたはＤＮＡを含んでもよい。エキソソーム由来の核酸は、エキソソーム内に含まれるか、またはエキソソームの外部表面に結合した、物質を含んでもよい。ＤＮＡ成分は、エキソソーム起源であっても、またはその他の無細胞起源（ｃｆＤＮＡ）であってもよい。
【００７４】
ある実施形態において、本明細書に記載の結合型核酸を有する細胞外小胞体の更なる精製のためのエキソソームの単離法としては、以下のものが挙げられる：１）比較的に低密度のエキソソームを浮かせるためのショ糖密度勾配またはショ糖クッションと組み合わせることが多い超遠心分離。ショ糖勾配超遠心と組み合わせた、連続分別遠心法によるエキソソームの単離は、エキソソームの高濃縮を提供できる。２）ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、酢酸デキストラン、ポリビニールアルコール、ポリ酢酸ビニル、またはポリビニル硫酸から成る群から選択される体積排除高分子の使用；そしてここで、該体積排除高分子の分子量は１０００〜３５０００ダルトンであり、０〜１Ｍの追加の塩化ナトリウムと併用することが好ましい。３）サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ２００カラムマトリックス。４）例えばこれだけに限定されるものではないが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３２６、ＫＳＡ、ＴＲＯＰ１を含めた表面抗原に対する抗体を使用することによって、（免疫沈降反応を含めた）常磁性ビーズを使用した選択的イムノアフィニティーまたは荷電ベースの捕捉。選択抗体は、常磁性マイクロビーズに結合されていてもよい。５）例えばグアニジニウムチオシアン酸塩などのカオトロピック試薬を用いた直接的な沈殿。
【００７５】
エキソソーム単離に続いて、サンプルは、記載の方法に供される。簡単に言えば、ある実施形態において、ワークフローは、エキソソームＲＮＡ単離から始まり、そして、ＤＮＡが分析に干渉する場合がある適用のためのＤＮアーゼ処理がそれに続く。
【００７６】
別の実施形態において、エキソソームＲＮＡ単離に続いて、サンプルは、ＤＮアーゼで処理されるか、または未処理のままにされる。いくつかの実施形態において、ＤＮアーゼ処理は、ＤＮＡが分析に干渉する場合がある適用に関して有用である。他の実施形態において、サンプルは、ＤＮＡの影響が分析において関心のあるものである場合に、未処理のままにされる。
【００７７】
本明細書中に企図されたＤＮアーゼ処理としては、野生型ＤＮアーゼＩ、ならびにそのタンパク質操作形態または別の方法で修飾された形態が挙げられる。市販の例としては、これだけに限定されるものではないが、ArcticZymes：Ｈｅａｔ＆Ｒｕｎ ｇＤＮＡ除去キット；New England Biolabs：ＤＮａｓｅＩ；Sigma Aldrich：ＤＮａｓｅＩ；ThermoFisher Scientific：Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ；ThermoFisher Scientific：Ａｍｂｉｏｎ ＤＮａｓｅＩが挙げられる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本明細書中で「合成スパイクイン」とも呼ばれる、合成ＲＮＡまたはＤＮＡ標準のスパイクインは、品質管理指標としてＤＮアーゼステップの前もしくは後、または配列決定ライブラリ作成前の任意のステップで実施される。例えば合成核酸などの外因性物質は、サンプル品質管理試薬である定量化試薬としての役割を果たすことができ、そして、検出限界、ダイナミックレンジおよび技術的な再現性試験を可能にすることができ、および／または特定の配列決定を検出する試験を可能にすることができる。
【００７９】
市販の合成スパイクインとしては、これだけに限定されるものではないが、Dharmacon：Ｓｏｌａｒｉｓ ＲＮＡスパイクイン対照キット；Exiqon：ＲＮＡスパイクインキット；Horizon Diagnostics：参照標準；Lexogen：スパイクインＲＮＡ変異体対照ミックス；Thermo Fisher Scientific：ＥＲＣＣ ＲＮＡスパイクイン対照ミックス；およびＱｂｅｔａ ＲＮＡスパイクイン、酵母またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＲＮＡが挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、合成スパイクインは、様々な希釈率にてサンプルに追加される。いくつかの実施形態において、サンプルに追加されるスパイクインの希釈率は、これだけに限定されるものではないが、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００、および１：１０，０００，０００の希釈率を含めた、１：１０００〜１：１０，０００，０００の範囲内にあってもよい。サンプルに追加されるスパイクインの特定の希釈率は、サンプル中に存在する核酸の量および／または質および／または起源に基づいて決定される。
【００８１】
次に、サンプルは、逆転写反応に供されても、または無処理であってもよい。いくつかの実施形態において、サンプル中のＲＮＡは、ＲＮＡからｃＤＮＡに変換することに関心があるときには、逆転写される。いくつかの実施形態において、一本鎖ｃＤＮＡのみが所望されるとき、第一鎖合成のみが実施される。いくつかの実施形態において、二本鎖ＤＮＡが所望されるとき、第一鎖合成と第二鎖合成の両方が実施される。いくつかの実施形態において、サンプル中にＤＮＡ割合の調査のみに関心があるときには、サンプルは処理されない。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ加工ステップとしては、例えば、これだけに限定されるものではないが、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼでの処理によるか、またはＮＧＳアダプター配列の方向付けによる鎖情報の保持、ＲＮＡの切断、ＲＮＡの断片化、非標準ヌクレオチドの取り込み、アダプター配列のアニーリングまたは連結、第二鎖の合成などが挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、サンプルは断片化に供されるか、または処理されない。断片化は、酵素的または非酵素的方法を使用するか、またはＲＮＡもしくはｄｓＤＮＡを伴った材料の物理的剪断によって達成される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡおよび／またはｄｓＤＮＡの断片化は、二価陽イオンの存在下での熱変性によって実施される。特定のサンプルの断片化継続時間は、サンプル中に存在する核酸の量および／または質、および／または起源に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、断片化継続時間は、０分から３０分に及ぶ。
【００８３】
いくつかの実施形態において、配列決定アダプターは、末端修復およびポリアデニル化に続いて、連結ベースのアプローチを使用して材料に加えられる。いくつかの実施形態において、配列決定アダプターは、ＰＣＲベースのアプローチを使用して材料に加えられる。先に記載した実施形態のいずれかを経て、そして、配列決定アダプターを有するサンプル中の核酸は、ここでは、サンプル中の核酸断片の全回収物を指すとき、「ライブラリ」と記載されるか、または配列アダプターの内容の中に組み込まれた核酸断片を指すとき、「ライブラリ断片」と記載される。アダプター配列内への独特な分子インデックス（ＵＭＩ）、独特な識別子、または分子タグの封入は、読みの重複排除およびサンプル中の核酸分子の入力数の高度な見積りに関して付加的な利益をもたらす。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ビーズベースの分離技法を使用することで、ライブラリは、それによりライブラリの組成物が：１）（これだけに限定されるものではないが、残留アダプター、プライマー、バッファー、酵素、アダプター二量体を含めた）好ましくない生成物を取り除くため；２）特定の粒径範囲にあるようにするため（ビーズまたはビーズバッファー試薬対サンプルの比を変更することによって、低分子量および／または高分子量の生成物が、サンプル中に含まれるか、または排除されるようにできる）；３）最少体積中への溶出によりサンプルを濃縮するために、さらに修飾されるプロセスに供されることができる。このプロセスは一般的に「クリーンアップ」ステップと呼ばれるか、またはサンプルは、「クリーンアップ」され、そして、本明細書ではそのように呼ばれる。ビーズベースの分離技法は、これだけに限定されるものではないが、常磁性ビーズを含んでもよい。ビーズベースのクリーンアップは、必要に応じて、一度実施されても、または複数回実施されてもよい。
【００８５】
本明細書における本方法により有用な市販の常磁性ビーズとしては、これだけに限定されるものではないが、Beckman Coulter：Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ；Beckman Coulter：Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡｃｌｅａｎ ＸＰ；Kapa Biosystems：Ｋａｐａ Ｐｕｒｅビーズ；Omega Biosystems：ＭａｇＢｉｎｄ ＴｏｔａｌＰｕｒｅ ＮＧＳビーズ；およびThermoFisher Scientific：Ｄｙｎａｂｅａｄｓが挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、ビーズは水和ステップに供され、ここで、乾燥ビーズは、再懸濁された水和液、例えば水、特にヌクレアーゼを含まない水などに覆われ、約２０℃〜約４０℃の範囲内、例えば約２０℃〜約２５℃などの温度にて、約１分〜約１０分、例えば約５分〜約１０分などの時間にわたるインキュベートが可能になる。好ましい実施形態において、ビーズは、再水和のために室温にて５分間インキュベートされことができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、ビーズベースのクリーンアップに続いて、ライブラリは、アダプター配列を標的とする汎用プライマーを使用して一斉に増幅される。増幅サイクル数は、下流の加工ステップに必要とされる十分な生成物を作り出すように加減できる。いくつかの実施形態において、可能性のある偏りの導入を最小にするために、より少ないサイクルが使用される。いくつかの実施形態において、より多くのサイクルが、より高濃度の分子を用いたライブラリを作り出すために使用される。いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲの任意のラウンドが実施されて、ライブラリのＰＣＲ増幅のために最適なサイクル数を決定する。ライブラリ増幅に続いて、先に記載したように、ビーズベースのクリーンアップが繰り返される。
【００８８】
次に、ライブラリの量および質が、これだけに限定されるものではないが、例えばＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイおよび／またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＨＳ ＤＮＡアッセイなどの蛍光定量的技術を使用して定量化される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、サンプルのアリコートが、ハイブリダイゼーションベースの濃縮プロセス（図１７〜１９を指す）に使用される。このプロセスは、サンプル中に含まれた着目のゲノム配列領域に相補的なヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを利用し、着目の配列向けに選択されたバッファーを使用した一連の洗浄が続き、その間に、不用な物質を洗い流した。プローブ−配列ハイブリッドは、これだけに限定されるものではないが、ストレプトアビジン−ビオチン化学反応を利用するために選択されてもよい。そのプロセスは、これだけに限定されるものではないが、エクソン領域、非翻訳領域（ＵＴＲ）、遺伝子間領域およびイントロン領域を含めたゲノム配列またはトランスクリプトーム配列の任意の部分またはその混合物を濃縮するのに使用でき、そしてそれは、遺伝子内または遺伝子外の全遺伝子コード領域または特定のホットスポットの位置をカバーできる。ハイブリダイゼーションプローブパネルは、これだけに限定されるものではないが、〜２０，０００個の遺伝子（図４を見る）を含む全タンパク質をコードするトランスクリプトーム、長い非コード、長い遺伝子間非コード反復、例えばＡｌｕ、ＨｅｒＶ、Ｌｉｎｅなど、アンチセンスおよび小さい非コードトランスクリプトームまたは上記の任意の組み合わせを含めた全非コードトランスクリプトーム、幅広い疾患または疾患関連経路を標的とした大きなパネル、＞１，０００個の遺伝子またはより少ない遺伝子による病的状態（図１７〜１８を参照）、ならびに５０〜５００個の遺伝子による注目の疾患（例えば、固形腫瘍）または疾患関連経路を標的とした中程度のパネル、を含めた、少数の標的（１または２０）〜多くの標的（＞１，０００）の任意の標的配列の濃度を高めるのに使用できる。いくつかの実施形態において、サンプルは濃縮されず、その場合、全サンプルが配列決定される（図２０〜２２）。代表的な市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばAgilentのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｅｘｏｍｅ Ｖ２；ArcherDxのＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ；AsuragenのＱｕａｎｔｉｄｅｘ ＮＧＳ Ｐａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｋｉｔ；ClonTechのＳＭＡＲＴｅｒ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｃａｐｔｕｒｅ；IDTのＰａｎ−Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ；IlluminaのＴｒｕｓｉｇｈｔ ＲＮＡ Ｐａｎ−Ｃａｎｃｅｒ Ｐａｎｅｌ；IlluminaのＴｒｕＳｉｇｈｔ Ｔｕｍｏｒ １７０；IlluminaのＲＮＡ Ａｃｃｅｓｓ；New England BioLabsのＮＥＢＮｅｘｔ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃａｎｃｅｒ ＨｏｔＳｐｏｔ Ｐａｎｅｌ；NuGENのＯｖａｔｉｏｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐａｎｅｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２；RocheのＳｅｑＣａｐ ＥＺ Ｅｘｏｍｅ ｖ３．０ Ｋｉｔ；およびRocheのＡｖｅｎｉｏ ｃｔＤＮＡ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｋｉｔが挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、全サンプルが分析されているとき、リボソーム配列（ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃｆＤＮＡ）は、少量の転写産物の検出に影響を及ぼす可能性があり得、その場合、リボソーム配列のサンプルを取り除くかまたは除去することが望ましく、それは、本明細書中で「リボデプレッション」とも呼ばれる（図２１を参照）。これだけに限定されるものではないが、リボソーム配列および／またはグロビン遺伝子配列を含めた、豊富ではあるが、望ましくない配列の選択的除去は、ＲＮＡ配列のレベル（ＲＮＡのみが単離され、分析されるときに適切である）で達成されても、あるいはｄｓＤＮＡ（ライブラリ）レベル（ｃＤＮＡおよび／またはｃｆＤＮＡが分析されるときに適切である）で達成されてもよい。リボソーム配列に特異的な除去は、これだけに限定されるものではないが、ＲＮアーゼＨまたは制限酵素消化に類似した酵素試薬を使用して達成されてもよい。除去はまた、ハイブリダイゼーションベースのビオチン化プローブ濃縮、およびリボソーム配列を特異的に捕捉し、取り除くためのストレプトアビジン結合常磁性ビーズを利用することで達成されてもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、リボソーム除去はまた、プライマーアニーリングに関する１もしくは複数の追加サイクル、例えば１つの追加サイクル、２つの追加サイクル、３つの追加サイクル、または５つ以上の追加サイクルなど、を含んでもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションベースの標的濃縮またはリボソーム除去プロセスに続いて、残留サンプル材料は、配列決定アダプターを認識する汎用プライマーを使用して増幅される。ＰＣＲベースの増幅は、該材料の中に偏りを潜在的に導入する過剰なサイクルを使用することなしに、その後のステップのために十分な量の生成物を作り出すのに必要とされるくらいに多いサイクルを使用する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションベースの標的濃縮および／またはリボソーム除去プロセスに続いて、残留サンプル材料は、先に記載したように、ビーズベースの常磁性アプローチを使用してクリーンアップされる。クリーニングは、先に記載した追加の増幅サイクルの前、後、またはその前後にあってもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態において、これには、これだけに限定されるものではないが、例えばＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイおよび／またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＨＳ ＤＮＡアッセイなどの蛍光定量的技術を使用したライブラリの量および質の定量化が続く。次に、ライブラリは、正規化され、多重化され、そして、任意の次世代配列決定プラットフォームによる配列決定に供される。
【００９５】
いくつかの実施形態において、次に、配列決定データは、必要であれば、多重分離され、そして、転写産物／遺伝子カウントが、既存のゲノムもしくはトランスクリプトーム参照配列に対する、またはデノボ合成したゲノムまたは転写産物に対するマッピングによって作り出される（図１６、図２４を参照）。次いで、各配列のＵＭＩタグが、ＰＣＲ複製によって生じる断片を同定するのに使用できる。カウントは、特にライブラリサイズ、ＧＣバイアス、配列バイアス、配列決定深度に関して正規化される。次いて、これらのカウントは、サンプルタイプ間で区別できる前述の適用に限らず、潜在的バイオマーカーのリストを作成するための様々な条件（例えば、腫瘍／健常）に関係する遺伝子発現解析である示差的発現解析を実施するのに使用できる（図２５）。アラインされた参照データは、例えば一塩基多型、挿入／欠失、融合、逆位および反復拡張などに限らず、配列変化のプロファイリングに使用できる。
サンプル分離
【００９６】
本発明は、表面に無細胞ＤＮＡおよび細胞外小胞体を捕捉し、次いで該細胞外小胞体を溶解して核酸、特に該細胞外小胞体に含まれるＲＮＡを放出させて、該捕捉表面からＤＮＡおよび／またはＤＮＡ、ならびに少なくともＲＮＡを含む核酸を溶解させることによって、少なくとも該細胞外小胞体からのＲＮＡを含む核酸を配列決定するおよび／または分析する方法を提供する。
【００９７】
微小小胞体は、細胞の外へ、真核細胞から放出される、あるいは細胞膜から出芽して放出される。これらの膜小胞は、サイズが不均質であり、直径が約１０ｎｍ〜約５０００ｎｍの範囲に渡る。本明細書では、直径が０．８μｍ未満の細胞から放出されるすべての膜小胞をまとめて「細胞外小胞体」または「微小小胞体」と呼ばれる。これら細胞外小胞体としては、微小小胞体、微小小胞状粒子、プロスタソーム、デキソソーム、テキソソーム、エクトソーム、オンコソーム、アポトーシス小体、レトロウイルス状粒子、およびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）粒子が挙げられる。当該分野では、細胞内多胞体のエキソサイトーシス（開口放出）によって放出される小さい微小小胞体（直径が約１０〜１０００ｎｍ、３０〜２００ｎｍであることが多い）を「微小小胞体」と呼ばれる。
【００９８】
エキソソームは、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）およびｍｉＲＮＡが（マイクロＲＮＡ）を含めたＲＮＡ型を含むことが知られている。しかしながら、インビトロまたはエクスビボ系のいずれかから単離されたエキソソーム中の長鎖ＲＮＡカーゴに関する理解の基本的な欠落が存在する。エキソソームのＲＮＡカーゴを調査する従来の試験は、低分子ＲＮＡ画分に主に焦点を合わせてきた。注釈付けされた長鎖ＲＮＡの比較的小さな集団および低い転写産物カバー率が、これらの試験で報告され、多くが、エキソソームがタンパク質コードおよび非コードＲＮＡの短い断片のみを担持しているとの結論に至ったので、エキソソームを通じた遺伝子発現調節および細胞間伝達におけるそれらの潜在的な機能的能力に関して疑問が生じた。
【００９９】
本明細書中に示したとおり、血漿エキソソーム中のＲＮＡには幅広い多様性が存在する。本明細書の方法により同定されたＲＮＡ型は、図５で同定されたＲＮＡ型を含む。いくつかの実施形態において、本明細書の方法によって同定されたＲＮＡ型としては、これだけに限定されるものではないが、リボソームＲＮＡ、ＳＩＮＥ ＲＮＡ、長散在ヌクレオチド配列ＲＮＡ、Ａｌｕ ＲＮＡ、ＨＥＲＶｓ、グロビンＲＮＡ、および他のタイプの長い非コードＲＮＡ、および／または、例えばgencodegenes.org/gencode_biotypes.htmlなどの他のところで記載された反復配列が挙げられる。
【０１００】
前記方法およびキットは、以下の一般手法を使用した、少なくともサンプルからのＲＮＡを含む核酸、例えばＤＮＡおよび／またはＤＮＡと核酸を単離および抽出する。最初に、サンプル中の核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡと細胞外小胞体画分）は、膜濾過器などの捕捉表面に結合し、そしてその捕捉表面は洗浄される。次いで、溶出試薬が使用されて、膜上での溶解と、核酸、例えばＤＮＡおよび／またはＤＮＡとＲＮＡの放出がおこなわれ、それにより、溶出液が形成される。次いで、その溶出液は、遷移性金属および緩衝剤を含むタンパク質沈殿バッファーと接触させられる。次に、ｃｆＤＮＡおよび／またはＤＮＡと少なくとも細胞外小胞体からのＲＮＡを含めた核酸は、例えば、シリカカラムへの結合とそれに続く洗浄および溶出などの技術分野で認識されたさまざまな技術のいずかを使用してタンパク質を沈殿させた溶出液から単離される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、規定した溶液ｐＨを維持するために、変性剤、界面活性剤、緩衝物質、および／またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、強い変性剤を含む。いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、強い変性剤と還元剤を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、小胞膜を破壊し、ヌクレアーゼを不活化し、および固相吸着のためにイオン強度を調整する変性剤であるグアニジンチオシアナート（ＧＴＣ）を含んでいる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、細胞外小胞体膜の破壊を補助し、および捕捉表面からのバイオマーカーの効果的な溶出を助けるために、例えばＴｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤を含んでいる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、分子内ジスルフィド結合Ｃｙｓ−Ｃｙｓを低減し、および溶出液中に存在するタンパク質、特にＲＮアーゼを変性する助けとなるように、例えばβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）などの還元剤を含んでいる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、溶出バッファーは、ＧＴＣ、界面活性剤、および還元剤を含んでいる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、タンパク質沈殿バッファーの遷移金属イオンは、亜鉛である。いくつかの実施形態において、亜鉛は、塩化亜鉛としてタンパク質沈殿バッファー中に存在している。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、タンパク質沈殿バッファー中の緩衝剤は、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ｐＨ≦６．０のＮａＡｃである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、タンパク質沈殿バッファーは、塩化亜鉛およびｐＨ≦６．０にてＮａＡｃ緩衝剤を含む。
【０１０９】
細胞外小胞体からＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくともＲＮＡを含む核酸単離する現在の方法としては、有害物質、超遠心分離、例えば、１００ｋＤの濾過器を用いた限外濾過、重合体沈殿技術、および／または粒径に基づく濾過などが挙げられる。しかしながら、診断目的を含む様々な用途で用いるための細胞外小胞体を単離し、必要に応じて細胞外小胞体に含まれる核酸、例えば、いくつかの実施形態において、細胞外小胞体ＲＮＡを抽出するのに効率的かつ有効な別の方法が求められている。
【０１１０】
本明細書で提供した単離および抽出方法および／またはキットは、無細胞ＤＮＡおよび／または細胞外小胞体に結合する親和性膜を用いたスピン式カラムによる精製過程を採用している。本開示の方法およびキットは、単一カラムで０．２〜４ｍＬの体積を用いて多数の臨床サンプルを並行して操作する能力がある。本明細書で提供した手順を用いて単離された無細胞ＤＮＡは非常に純度が高い。単離されたＲＮＡは非常に純度が高く、溶解までは小胞膜で保護されており、無傷の小胞を前記膜から溶出することができる。前記手順は、血漿入力から実質的にすべての無細胞ＤＮＡを使い尽くすことができ、市販の循環ＤＮＡ単離キットに比べてＤＮＡの収量は同じまたはそれ以上である。前記手順は、血漿入力から実質的にすべてのｍＲＮＡを使い尽くすことができ、超遠心分離または直接溶解に比べてｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ収量は同じまたはそれ以上である。市販のキットおよび／または従来の単離方法に比べて、前記方法および／またはキットは、ｍｉＲＮＡの細胞外小胞体結合画分が豊富であり、入力材料の量を容易に増やすことができる。この量を増やす能力により、目的の量の少ない転写物の研究が可能になる。市場にある他の市販品と比べて、本開示の方法およびキットは、本明細書で提供される実施例で示される固有の能力を提供する。
【０１１１】
前記方法およびキットは、以下の一般的な手順を用いて生体サンプルから核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよび少なくともＲＮＡを含む核酸）を単離および抽出する。まず、ｃｆＤＮＡおよび細胞外小胞体画分を含むサンプルをメンブレンフィルターに結合させて、このフィルターを洗浄する。次いで、ＧＴＣベースの試薬を用いて膜上の溶解を行い、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を放出させる。次いで、タンパク質沈殿を実施する。次いで、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）をシリカカラムに結合させて、洗浄し、溶出する。様々な下流のアッセイのいずれかにより、抽出した核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）をさらに分析してもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、核酸を次のステップに従って単離する。溶解試薬を添加した後、タンパク質沈殿バッファーをホモジネートに添加して、その溶液を短時間激しく混合する。次いで、その溶液を室温、１２，０００×ｇで３分間遠心分離する。次いで、核酸を単離および／または抽出するための当該技術で認められた様々な方法のいずれかによりこの溶液を処理してもよい。
【０１１３】
次いで、単離された核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を様々な下流のアッセイのいずれかを用いてさらに分析してもよい。いくつかの実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの同時検出を用いて、起こりうる変異に対する感度を高める。循環核酸には検出可能な変異の複数の考え得る供給源がある。例えば、生きている腫瘍細胞は、サンプルの細胞外小胞体画分から単離された考え得るＲＮＡおよびＤＮＡの供給源である。死んだ腫瘍細胞は、無細胞ＤＮＡ源（例えば、アポトーシス性小胞ＤＮＡおよび壊死腫瘍細胞の無細胞ＤＮＡなど）考え得る供給源である。変異した核酸の頻度は、循環血液中では比較的低いので、検出感度を最大にすることは非常に重要になる。ＤＮＡおよびＲＮＡの同時単離により、病気の進行および処置に対する患者の応答を評価するための包括的な臨床情報が得られる。しかしながら、本明細書で提供される方法およびキットに比べて、血液を循環する核酸を検出する市販のキットは、血漿由来の、すなわち死んだ細胞由来のｃｆＤＮＡのみを単離することができる。当業者には自明であるが、変異またはその他のバイオマーカーのコピーが多い程、変異およびその他のバイオマーカーの同定の感度と正確度が高まる。
【０１１４】
開示の方法は、血漿サンプルからすべてのＤＮＡを単離するのに使用できる。開示の方法は、同じサンプル体積に対して同じレベルでＲＮＡとＤＮＡを分離し、そして、そのＲＮＡとＤＮＡを互いに分離できる。これらの開示の方法は、市販の分離キットに比べて、同等以上の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、同等以上のｍＲＮＡおよびはるかに多くのｍｉＲＮＡを捕捉する。
【０１１５】
開示の方法はまた、ＲＮＡとＤＮＡの同時精製にも使用できる。開示の方法（本明細書では手順とも呼ばれる）は、０．２〜４ｍＬ、例えば０．５〜４ｍＬなどの血漿または血清を使用して、エキソソームおよび他の細胞外小胞体からＲＮＡおよびＤＮＡを単離するのに使用できる。相性のよい血漿チューブのリストとしては、添加剤のＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸−リン酸−デキストロースを含む血漿が挙げられる。ヘパリンを含む血漿は、ＲＴ−ｑＰＣＲを阻害する可能性がある。
【０１１６】
次いで、サンプルは、単独で、あるいは結合バッファーで希釈して、捕捉膜を有するスピンカラムに充填され、そして、５００×ｇで１分間回転させる。通過画分を捨て、次に、カラムを同じ回収チューブ内に戻す。次いで、洗浄バッファーを加え、５０００×ｇで５分間回転させてカラムから残留量を取り除く。注記：遠心分離後に、カラムが通過画分と接触しないようにスピンカラムから回収チューブを取り外す。次いで、スピンカラムを新しい回収チューブに移し、ＧＴＣベースの溶出バッファーを膜に添加する。次いで、スピンカラムを５０００×ｇで５分間回転させて、溶解したエキソソームを含むホモジネートを回収する。次いで、タンパク質沈殿を実施する。
【０１１７】
本明細書に提供した方法は、生体サンプルからのＤＮＡを単離および検出するのに有用である。小胞体ＲＮＡは、例えば疾患組織の、生細胞に由来すると考えられる。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、死滅細胞、例えば疾患組織の壊死細胞に由来すると考えられる。よって、ｃｆＤＮＡは、治療反応の指標として有用であり、それに対して、ＲＮＡは増加している耐性変異の指標である。
【０１１８】
前記方法は、血液中の希な変異の検出に有用である。というのは、本明細書に提供した方法は、十分な量の核酸に適用できる十分に高感度な方法を提供されるからである。生体液中の実際のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の量は非常に限られているので、前記方法は、有効な下流加工および／または分析に十分なわずかな体積での突然変異検出に適した、血液のすべての分子を抽出する単離法を提供する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、サンプル分離および分析技術は、例えばＷＯ２０１４／１０７５７１およびＷＯ２０１６／００７７５５（それぞれを全体として参照により本明細書に援用する）に記載のＥＸＯ５０および／またはＥＸＯ５２と呼ばれる方法を含む。また、商品名ＥＸＯＬＵＴＩＯＮ（商標）、ＥＸＯＬＵＴＩＯＮ ＰＬＵＳ（商標）、ＥＸＯＬＵＴＩＯＮ（商標）ＵＰＲＥＰ、ＥＸＯＬＵＴＩＯＮ ＨＴ（商標）、ＵＰＲＥＰ（商標）、ＥＸＯＥＡＳＹ（商標）、ＥＸＯＲＮＥＡＳＹ（商標）、それぞれExosome Diagnostics, Inc.から入手可能、ならびにＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｋｉｔ、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔｓ、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、およびＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、それぞれQiagenから入手可能、として販売されている市販の液体生検検体プラットフォームも企図される。
【０１２０】
本明細書で用いられる用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを指す。核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの例では、核酸はＤＮＡである。いくつかの例では、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびＨＥＲＶ元素が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「生体サンプル」は、生体材料（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質）を含むサンプルを指す。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルは対象由来の体液を好適に含んでいてもよい。前記体液は、対象の体のいずれかの場所、例えば周辺部位から単離された液体であってもよい。前記体液としては、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、髄液、脳脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸管、腸管、および尿生殖路に含まれる体液、涙液、唾液、母乳、リンパ系由来の液体、精液、内臓系液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、細胞培地の上澄み、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。生体サンプルはまた、糞便サンプルまたは盲腸サンプル、あるいはこれらから単離された上澄みを含む場合がある。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルは、細胞培地の上澄みを好適に含んでいてもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルは、対象由来の組織サンプルを好適に含んでいてもよい。前記組織サンプルは、対象の体のいずれかの場所から単離されてもよい。
【０１２５】
体液の好適なサンプル体積は、例えば、体液が約０．１ｍｌ〜約３０ｍｌの範囲である。体液の体積は、いくつかの因子、例えば、用いる体液の種類に依存していてもよい。例えば、血清サンプルの体積は約０．１ｍｌ〜約４ｍｌであってもよく、例えば、いくつかの実施形態において、約０．２ｍｌ〜４ｍｌであってもよい。血漿サンプルの体積は、約０．１ｍｌ〜約４ｍｌであってもよく、０．５ｍｌ〜４ｍｌが好ましい。尿サンプルの体積は、約１０ｍｌ〜約３０ｍｌであってもよく、例えば、いくつかの実施形態において、約２０ｍｌであってもよい。
【０１２６】
本明細書で提供される実施例では血漿サンプルを用いたが、当業者には自明であるが、これらの方法は様々な生体サンプルに適用可能である。
【０１２７】
本開示の方法およびキットは、ヒト対象に由来するサンプルに用いるのに好適である。また、本開示の方法およびキットは、非ヒト対象（例えば、齧歯動物、非ヒト霊長類、ペット動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、および／または家畜（例えば、ニワトリ））に由来するサンプルに用いるのに好適である。
【０１２８】
用語「対象」は、核酸を含む粒子を有することが示された、あるいは期待されるすべて
の動物を含むものとする。特定の実施形態において、前記対象は、哺乳類、ヒトまたは非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、他の家畜、または齧歯動物（例えばマウス、ラット、モルモットなど）である。ヒト対象は、観察可能な異常（例えば、病気）がない健常なヒトであってもよい。ヒト対象は、観察可能な異常（例えば、病気）を有するヒトであってもよい。前記観察可能な異常は、ヒト自身によって、あるいは医療専門家によって観察されてもよい。用語「対象」、「患者」、および「個体」は、本明細書ではお互いに言い換え可能である。
【０１２９】
本明細書で提供される実施例では膜を捕捉表面として用いているが、自明であるが、捕捉表面（例えば、ビーズまたはフィルター、本明細書では膜とも言う）の形態は、本明細書で提供される方法の、生体サンプルから細胞外小胞体を効率的に捕捉する能力に影響を及ぼさない。
【０１３０】
広範囲の捕捉表面が本明細書で提供される方法に従って細胞外小胞体を捕捉することができるが、すべての捕捉表面が細胞外小胞体を捕捉するわけではない（何も捕捉しない表面もある）。
【０１３１】
本開示ではまた、使い捨てのプラスチック部品および遠心分離器を用いて生体サンプルまたは臨床サンプルから細胞外小胞体を単離して濃縮する装置について記載される。例えば、前記装置は、捕捉表面（すなわち、メンブレンフィルター）を含むカラム、外部フリットと内管の間で捕捉表面を固定するホルダー、および回収管を含む。外部フリットは、液体が通過できる大きな網目構造を含み、カラムの一方の端にあることが好ましい。内管は捕捉表面を所定位置に保持し、わずかに円錐形であることが好ましい。回収管は、市販の、すなわち５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管であってもよい。カラムは回転に好適であることが好ましい。すなわち、そのサイズは、標準的な遠心分離器およびマイクロ遠心分離器と相性がよいことが好ましい。
【０１３２】
前記捕捉表面が膜である実施形態において、生体サンプルから前記細胞外小胞体画分を単離する装置は少なくとも１つの膜を含む。いくつかの実施形態において、前記装置は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの膜を含む。いくつかの実施形態において、前記装置は３つの膜を含む。前記装置が１つより多い膜を含む実施形態において、これらの膜はすべて、カラムの一方で互いに直接隣接している。前記装置が１つより多い膜を含む実施形態において、これらの膜はすべて、互いに同一、すなわち、同じ電荷を持つ、かつ／または同じ官能基を有する。
【０１３３】
なお、細胞外小胞体より小さい孔径で濾過しての捕捉は、本明細書で提供される方法での捕捉の一次反応機構ではない。しかしながら、それにもかかわらず、フィルターの孔径は重要である。というのも、例えばｍＲＮＡは２０ｎｍフィルターにひっかかって回収できないが、マイクロＲＮＡは容易に溶出させることができるためである。また、例えば、フィルターの孔径は利用可能な表面捕捉面積の重要なパラメーターであるためである。
【０１３４】
本明細書で提供される方法では様々な捕捉表面のいずれかが用いられる。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は膜（本明細書では、フィルターまたはメンブレンフィルターとも言う）である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は市販の膜である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は市販の帯電膜である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は中性である。実施形態によっては、前記捕捉表面は、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）イオン交換膜（PALL Corporation製）、Ｖｉｖａｐｕｒｅ（登録商標）Ｑ膜（Sartorius AG製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＱまたはＶｉｖａｐｕｒｅ（登録商標）Ｑ Ｍａｘｉ Ｈ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｄ（Sartorius AG製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（Ｓ）（Sartorius AG製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Sartorius AG製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）ＩＤＡ（Sartorius AG製）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ａｌｄｅｈｙｄｅ（Sartorius AG製）、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）ＤＥ８１（Sigma）、Ｆａｓｔ Ｔｒａｐ Ｖｉｒｕｓ精製カラム（EMD Millipore）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＊ Pierce Ｓｔｒｏｎｇ Ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓから選択される。
【０１３５】
前記捕捉表面が電荷を帯びている実施形態において、前記捕捉表面は、０．６５ｕｍの正に帯電したQ ＰＥＳ真空濾過（Millipore）、３〜５ｕｍの正に帯電したQ ＲＣスピンカラム濾過（Sartorius）、０．８ｕｍの正に帯電したQ ＰＥＳ自家製スピンカラム濾過（Pall）、０．８ｕｍの正に帯電したQ ＰＥＳシリンジ濾過（Pall）、０．８ｕｍの負に帯電したＳ ＰＥＳ自家製スピンカラム濾過（Pall）、０．８ｕｍの負に帯電したＳ ＰＥＳシリンジ濾過（Pall）、および５０ｎｍの負に帯電したナイロンシリンジ濾過（Sterlitech）からなる群より選択される帯電フィルターであってもよい。いくつかの実施形態において、帯電フィルターは、シリンジ濾過装置内に収められていない。というのも、これらの実施形態において核酸をフィルターから取り出すのがより困難である可能性があるからである。いくつかの実施形態において、帯電フィルターはカラムの一方の端に収められている。
【０１３６】
前記捕捉表面が膜である実施形態において、前記膜は様々な好適な材料から作製してもよい。いくつかの実施形態において、前記膜はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）（例えば、MilliporeまたはPall）である。いくつかの実施形態において、前記膜は再生セルロース（ＲＣ）（例えば、SartoriusまたはPierce）である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は正に帯電した膜である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は、正に帯電した膜であり、かつ第四級アミンを含む陰イオン交換体であるＱ膜である。例えば、前記Ｑ膜は四級アンモニウムＲ−ＣＨ３−Ｎ＋（ＣＨ３）３で官能化される。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は負に帯電した膜である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は、負に帯電したＳ膜であり、かつスルホン酸基を含む陽イオン交換体である。例えば、前記Ｓ膜は、スルホン酸Ｒ−ＣＨ３−ＳＯ３−で官能化される。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は、ジエチルアミン基Ｒ−ＣＨ３−ＮＨ＋（Ｃ２Ｈ５）２を含む弱塩基性陰イオン交換体であるＤ膜である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は金属キレート膜である。例えば、前記膜は、イミノ二酢酸−Ｎ（ＣＨ３ＣＯＯＨ−）２で官能化されたＩＤＡ膜である。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は、アルデヒド基−ＣＨＯで官能化された微多孔性膜である。他の実施形態において、前記膜は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースを含む弱塩基性陰イオン交換体である。すべての帯電膜が、本明細書で提供される方法に用いるのに好適なわけではない。例えば、Sartorius Vivapure Ｓ膜スピンカラムを用いて単離したＲＮＡは、ＲＴ−ｑＰＣＲの阻害を示し、したがって、ＰＣＲに関連した下流のアッセイには適さなかった。
【０１３８】
前記捕捉表面が帯電している実施形態において、細胞外小胞体は正に帯電したフィルターで単離することができる。
【０１３９】
前記捕捉表面が帯電している実施形態において、細胞外小胞体の捕捉中のｐＨは７以下である。いくつかの実施形態において、ｐＨは４超および８以下である。
【０１４０】
前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである実施形態において、バッファー系は、２５０ｍＭのビストリスプロパン（ｐＨ：６．５〜７．０）を含む洗浄バッファーを含む。前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである実施形態において、前記溶解バッファーはＧＴＣベースの試薬である。前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである実施形態において、前記溶解バッファーは１体積で存在する。前記捕捉表面が正に帯電したＱフィルターである実施形態において、前記溶解バッファーは、１より大きい体積で存在する。
【０１４１】
膜材料に応じて、膜の孔径は３μｍ〜２０ｎｍの範囲である。例えば、捕捉表面が市販のＰＥＳ膜である実施形態において、膜は２０ｎｍ（Exomir）、０．６５μｍ（Millipore）または０．８μｍ（Pall）の孔径を有する。捕捉表面が市販のＲＣ膜である実施形態において、膜は、３〜５μｍ（Sartorius, Pierce）の範囲内の孔径を有する。
【０１４２】
捕捉表面の表面電荷は、正、負、または中性であってもよい。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は、正に帯電したビーズまたは数種のビーズである。
【０１４３】
本明細書で提供される方法は溶解試薬を含む。いくつかの実施形態において、膜上溶解に用いられる試薬は、ＧＴＣベースの試薬である。いくつかの実施形態において、前記溶解試薬は高塩濃度バッファーである。
【０１４４】
本明細書で提供される方法は、充填バッファーおよび洗浄バッファーを含む様々なバッファーを含む。充填バッファーおよび洗浄バッファーのイオン強度は高くても低くてもよい。塩濃度（例えば、ＮａＣｌ濃度）は０〜２．４Ｍであってもよい。前記バッファーは様々な成分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記バッファーは、以下の成分の１種以上を含んでいる：Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓ−プロパン、イミダゾール、クエン酸塩、メチルマロン酸、酢酸、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、およびリン酸ナトリウム。本明細書で提供される方法では、充填バッファーおよび洗浄バッファーのｐＨが重要である。充填前に血漿サンプルのｐＨが５．５以下に設定されているとフィルターが詰まる傾向にある（血漿はカラムで全く回転しない）。また、ｐＨが高くなると、細胞外小胞体が不安定になるため、細胞外小胞体ＲＮＡの回収率が低い。ｐＨが中性であると、細胞外小胞体からのＲＮＡの回収が最適になる。いくつかの実施形態において、用いられるバッファーの濃度は１倍、２倍、３倍、または４倍である。例えば、充填バッファーまたは結合バッファーは、濃度が２倍であり、洗浄バッファーは濃度が１倍である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、前記方法は、例えば、生体サンプルを捕捉表面と接触させた後に１つ以上の洗浄ステップを含む。いくつかの実施形態において、清浄剤を前記洗浄バッファーに添加して、非特異的結合（すなわち、汚染物質、細胞の残骸、および循環タンパク質複合体または核酸）の除去を容易にして、より高純度の細胞外小胞体画分を得る。用いるのに好適な清浄剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、Ｂｒｉｊ−３５、Ｂｒｉｊ−５８、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、またはＣＨＡＰＳＯが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、前記捕捉表面（例えば膜）は、遠心分離では例えばスピンカラム、真空系では例えば真空フィルターホルダー、または圧力を用いる濾過では例えばシリンジフィルターなど、用いられる装置内に収められている。いくつかの実施形態において、前記捕捉表面は、スピンカラムまたは真空システムに収められている。
【０１４７】
核酸の抽出前に生体サンプルから細胞外小胞体を単離することは、以下の理由により有益である。１）細胞外小胞体から核酸を抽出することで、体液サンプル内の他の細胞外小胞体から病気または腫瘍に特定の細胞外小胞体を単離して得た病気または腫瘍に特定の核酸を選択的に分析する機会が得られる。２）最初に細胞外小胞体を単離せずに体液サンプルから直接核酸を抽出して得られた核酸種の収率／完全性に比べて、核酸を含む細胞外小胞体は、より高い完全性を有する核酸種を非常に高い収率で産生する。３）本明細書で記載される方法により、例えば、低濃度で発現した核酸を検出するための容量拡大性や感度を、より多くの体積のサンプルから細胞外小胞体を濃縮することで高めることができる。４）核酸抽出ステップの前にタンパク質、脂質、細胞の残骸、細胞、およびその他の可能性がある汚染物質、および生体サンプル内に天然に見られるＰＣＲ阻害物が排除されるので、より高純度で高品質の核酸が抽出される。５）核酸の抽出方法でより多くの選択肢を用いることができる。というのは、単離された細胞外小胞体画分の体積はサンプルの開始体積よりも少ないので、小体積カラムフィルターを用いてこれらの画分またはペレットから核酸を抽出することができるからである。
【０１４８】
生体サンプルから細胞外小胞体を単離するいくつかの方法が当該分野で記載されている。例えば、分画遠心分離法はRaposo et al.の論文（Raposo et al, 1996）、Skog et. al.の論文（Skog et al, 2008）、およびNilsson et. al.の論文（Nilsson et al., 2009）に記載されている。イオン交換および／またはゲル浸透クロマトグラフィーの方法が米国特許第６，８９９，８６３号および６，８１２，０２３号に記載されている。ショ糖密度勾配法、すなわち細胞小器官電気泳動が米国特許第７，１９８，９２３号で記載されている。磁性活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）が、Taylor and Gercel Taylorの論文（Taylor and Gercel-Taylor, 2008） に記載されている。ナノ膜限外濾過濃縮法が、Cheruvanky et al.の論文（Cheruvanky et al, 2007）に記載されている。パーコール勾配単離法が、Miranda et al.の文献（Miranda et al., 2010）に記載されている。さらに、マイクロ流体デバイスにより、細胞外小胞体を同定して対象の体液から単離してもよい（Chen et al., 2010）。研究開発や核酸バイオマーカーの商業的な応用では、一貫した信頼性のある実践的な方法で生体サンプルから高品質の核酸を抽出することが望ましい。
【０１４９】
したがって、本発明の目的は、生体サンプル（例えば、体液など）から核酸を含む粒子を素早く容易に単離し、単離された粒子から高品質の核酸を抽出する方法を提供することである。本発明の方法は、実験室または臨床環境、あるいは現場で用いられる小型装置または半自動化もしくは全自動化された機器に採用および組み込むのに好適なものであってもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、前記サンプルは、生体サンプルから核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡ）を単離および抽出する前に前処理されていない。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞体の単離、精製、または濃縮を行って、前記生体サンプルに存在する望ましくない大きい粒子、細胞および／または細胞の残骸、および他の汚染物質を除去する前に、前記サンプルは前処理ステップを経ている。前記前処理ステップは、１つ以上の遠心分離ステップ（例えば、分画遠心分離）、１つ以上の濾過ステップ（例えば、限外濾過）、またはそれらの組み合わせを経て達成してもよい。２つ以上の遠心分離前処理ステップを行う場合、前記生体サンプルはまず低速で遠心分離して、その後高速で遠心分離してもよい。必要に応じて、さらに好適な遠心分離前処理ステップを行ってもよい。１つ以上の遠心分離前処理ステップに代えて、あるいは加えて、前記生体サンプルを濾過してもよい。例えば、生体サンプルをまず、２０，０００ｇで１時間遠心分離して、望ましくない大きい粒子を除去して、その後、前記サンプルを、例えば０．８μｍフィルターなどで濾過してもよい。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、前記サンプルを前濾過して、０．８μｍ超の粒子を除外する。いくつかの実施形態において、前記サンプルは、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、および／またはクエン酸塩−リン酸ブドウ糖などの添加物を含む。いくつかの実施形態において、前記サンプルはヘパリンを含まない。というのは、ヘパリンはＲＴ−ｑＰＣＲおよびその他の核酸分析に悪影響を及ぼす可能性があるからである。いくつかの実施形態において、精製および／または核酸単離および／または抽出の前に前記サンプルをバッファーと混合する。いくつかの実施形態において、前記バッファーは結合バッファーである。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルを前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の遠心分離ステップを行って、細胞外小胞体を分離し、生体サンプル画分から単離された細胞外小胞体を濃縮する。望ましくない大きい粒子、細胞および／または細胞の残骸を除去するために、前記サンプルを約１００〜５００ｇ、例えば、いくつかの実施形態において、約２５０〜３００ｇの低速で遠心分離してもよい。これに代えて、あるいは加えて、前記サンプルをより高速で遠心分離してもよい。遠心分離速度は約２００，０００ｇ以下、例えば、約２，０００ｇから約２００，０００ｇ未満である。遠心分離速度は、約１５，０００ｇ超および約２００，０００ｇ未満、約１５，０００ｇ超および約１００，０００ｇ未満、約１５，０００ｇ超および約５０，０００ｇ未満が、いくつかの実施形態において使用される。遠心分離速度は約１８，０００ｇ〜約４０，０００ｇまたは約３０，０００ｇ、約１８，０００ｇ〜約２５，０００ｇがより好ましい。いくつかの実施形態において、遠心分離速度は約２０，０００ｇである。一般に、遠心分離に好適な時間は約５分〜約２時間、例えば、約１０分〜約１．５時間、または約１５分〜約１時間である。約０．５時間が使用され得る。約２０，０００ｇで約０．５時間、生体サンプルを遠心分離するのが、いくつかの実施形態において有用である。しかしながら、上記の速度および時間を任意の組み合わせ（例えば、約１８，０００ｇ〜約２５，０００ｇまたは約３０，０００ｇ〜約４０，０００ｇで、約１０分〜約１．５時間または約１５分または約１時間、または約０．５時間など）で好適に用いることができる。前記１つ以上の遠心分離ステップを周囲温度未満、例えば約０〜１０℃、例えば、約１〜５℃、例えば、約３℃または約４℃にて行ってもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルを前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の濾過ステップを行う。孔径が約０．１〜約１．０μｍの範囲、例えば約０．８μｍまたは０．２２μｍのフィルターを用いてもよい。また、フィルターの孔隙率を下げながら連続濾過を行ってもよい。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーステップで処理するサンプルの体積を減らすために、前記生体サンプルを前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の濃縮ステップを行う。濃縮は、前記サンプルを高速、例えば１０，０００〜１００，０００ｇで遠心分離して、細胞外小胞体を沈殿させることで行ってもよい。これは一連の分画遠心分離からなっていてもよい。得られたペレット中の細胞外小胞体を、過程の次のステップのためにより少ない体積で好適なバッファー中に再構成してもよい。また、この濃縮ステップを限外濾過で行ってもよい。実際、この限外濾過は、前記生体サンプルを濃縮し、細胞外小胞体画分をさらに精製する。他の実施形態において、前記濾過は限外濾過、例えば接線限外濾過である。接線限外濾過は、所定のカットオフ閾値の膜で分離された２つの区画（濾液および保持液）の間で溶液を濃縮し、分画することからなる。保持液区画の流れおよびこの区画と濾液区画の間の膜間圧を加えることで分離を行う。例えば、らせん膜（Millipore、Amicon）、平膜または中空繊維（Amicon、Millipore、Sartorius、Pall、GF、Sepracor）など、様々なシステムを用いて限外濾過を行ってもよい。本発明の範囲内では、カットオフ閾値が１０００ｋＤａ未満、例えば、いくつかの実施形態において、１００ｋＤａ〜１０００ｋＤａ、例えば、いくつかの実施形態において、１００ｋＤａ〜６００ｋＤａの膜を用いることが有益である。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルを前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上のサイズ排除クロマトグラフィーステップまたはゲル浸透クロマトグラフィーステップが行われる。ゲル浸透クロマトグラフィーステップを行うために、シリカ、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、エチレングリコール−メタクリル酸共重合体、またはこれらの混合物）例えば、アガロース−デキストラン混合物）から選択される支持体を、いくつかの実施形態において使用する。このような支持体としては、例えば、SUPERDEX（登録商標）200HR（Pharmacia）、TSK G6000（TosoHaas）、またはSEPHACRYL（登録商標）S（Pharmacia）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、前記生体サンプルを前記捕捉表面と接触させる前後に１つ以上の親和性クロマトグラフィーステップが行われる。また、いくつかの細胞外小胞体を特定の表面分子で特徴づけることができる。微小小胞体は細胞膜の出芽から形成されるので、これら微小小胞体は、微小小胞体が由来する細胞で見られる同じ表面分子の多くを共有していることが多い。本明細書で用いられる「表面分子」は、微小小胞体の膜の表面、膜内、または膜上に見られる抗原、タンパク質、脂質、炭水化物、およびマーカーをまとめて指す。これらの表面分子としては、例えば、受容体、腫瘍に関連づけられた抗原、膜タンパク質修飾（例えば、グリコシル化構造）が挙げられる。例えば、腫瘍細胞から出芽する微小小胞体は、細胞表面に腫瘍に関連づけられた抗原を提示していることが多い。したがって、親和性クロマトグラフィーまたは親和性排除クロマトグラフィーを本明細書で提供される方法と組み合わせて用いて、特定の提供者の細胞種から微小小胞体の特定の集団を単離、同定、または濃縮してもよい（Al-Nedawi et al., 2008; Taylor and Gercel-Taylor, 2008）。例えば、（悪性または非悪性）腫瘍微小小胞体は、腫瘍に関連づけられた表面抗原を担持しており、これらの腫瘍微小小胞体をこれらに特異的な腫瘍に関連づけられた表面抗原を介して検出、単離、および／または濃縮してもよい。一例では、前記表面抗原は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。上皮細胞接着分子は、肺、結腸直腸、胸、前立腺、頭部および頸部、および肝臓由来であるが血液細胞由来ではない上皮性悪性腫瘍に由来する微小小胞体に特異的である（Balzar et al., 1999; Went et al., 2004）。また、腫瘍に特異的な微小小胞体は、特定の表面マーカー（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の欠如により特徴づけることができる。これらの場合では、これらのマーカーを有する微小小胞体は、腫瘍に特異的なマーカーのさらなる分析のために、例えば、親和性排除クロマトグラフィーにより排除してもよい。親和性クロマトグラフィーは、例えば、様々な支持体、樹脂、ビーズ、抗体、アプタマー、アプタマー類縁体、分子鋳型重合体、または微小小胞体の所望の表面分子を特異的に標的する当該分野で周知の他の分子を用いて達成することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、細胞外小胞体の単離または核酸の抽出の前に、１もしくは複数の対照粒子または１もしくは複数の核酸をサンプルに添加して、内部対照として作用させて細胞外小胞体精製および／または核酸抽出の効率あるいは品質を評価してもよい。本明細書で記載される方法は、効率的な単離、および細胞外小胞体画分と共に対照核酸を提供する。これらの対照核酸としては、Ｑβバクテリオファージからの１もしくは複数の核酸、ウイルス粒子からの１もしくは複数の核酸、または対照核酸（例えば、少なくとも１個の対照標的遺伝子であって、天然に出現するものでもよく、あるいは組み換えＤＮＡ技術で遺伝子操作されていてもよい）を含む任意の他の粒子などが挙げられる。いくつかの実施形態において、サンプルに添加する前に対照核酸の量が分かっている。リアルタイムＰＣＲ分析により前記対照標的遺伝子を定量化してもよい。対照標的遺伝子の定量化を用いて、細胞外小胞体精製ステップまたは核酸抽出ステップの効率または品質を決定してもよい。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、前記対照核酸はＱβバクテリオファージからの核酸（本明細書ではＱβ対照核酸と呼ばれる）である。本明細書で記載される方法に用いられるＱβ対照核酸は、天然に出現するウイルス対照核酸であっても、または組み換えまたは遺伝子操作されたウイルス対照核酸であってもよい。Ｑβは、レビウイルス科に属し、４種のウイルスタンパク質、すなわち、被覆タンパク質、成熟タンパク質、溶解タンパク質、およびＲＮＡ複製酵素をコードする３個の遺伝子からなる線状の一本鎖ＲＮＡゲノムにより特徴づけられる。Ｑβ粒子自体が対照として使用されるとき、平均的な細胞外小胞体とサイズが類似しているため、本明細書で記載する細胞外小胞体を単離するのと同じ精製方法により、生体サンプルからＱβを容易に精製することができる。また、Ｑβウイルスの一本鎖遺伝子構造があまり複雑でないため、増幅に基づく核酸アッセイに対照として用いるのに有用である。Ｑβ粒子は、サンプル中のＱβ粒子量を定量化するために検出または測定される対照標的遺伝子または対照標的配列を含む。例えば、前記対照標的遺伝子はＱβ被覆タンパク質遺伝子である。Ｑβ粒子自体が対照として使用されるとき、生体サンプルにＱβ粒子を添加した後、本明細書で記載される抽出方法により前記Ｑβ粒子に由来する核酸を前記生体サンプルに由来する核酸と共に抽出する。Ｑβからの核酸、例えばＱβからのＲＮＡが、対照として使用されるとき、Ｑβ核酸は、本明細書で記載される抽出方法により前記Ｑβ粒子に由来する核酸を前記生体サンプルに由来する核酸と共に抽出する。Ｑβ対照標的遺伝子の検出は、例えば、（１種以上の）目的のバイオマーカーと同時にＲＴ−ＰＣＲ分析により決定することができる。対照標的遺伝子の１０倍希釈液で少なくとも２、３、または４つの濃度の標準曲線を用いてコピー数を決定してもよい。検出されたコピー数および添加されたＱβ粒子量、または検出されたコピー数および添加されたＱβ核酸、例えばＱβＲＮＡの量を比較して、単離過程および／または抽出過程の品質を決定してもよい。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、体液サンプルに添加されたＱβ粒子またはＱβ核酸（例えば、ＱβＲＮＡ）のコピー数は、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、１，０００個、または５，０００個である。いくつかの実施形態において、体液サンプルに添加されたＱβ粒子またはＱβ核酸（例えば、ＱβＲＮＡ）のコピー数は１００個である。Ｑβ粒子自体が対照として使用されるとき、Ｑβ粒子のコピー数は、Ｑβバクテリオファージの標的細胞を感染させる能力に基づいて算出してもよい。したがって、Ｑβ粒子のコピー数は、Ｑβバクテリオファージのコロニー形成単位と相関関係がある。
【０１６１】
任意に、対照粒子は、細胞外小胞体精製および／または核酸抽出の効率または質を評価するための内部対照として役立つように、細胞外小胞体分離または核酸抽出前にサンプルに追加され得る。本明細書に記載した方法は、効率的単離と、細胞外小胞体画分に伴う対照粒子を提供する。これらの対照粒子としては、Ｑβバクテリオファージ、ウイルス粒子、または天然に生じ得るか、または組み換えＤＮＡ技術によって設計され得る対照核酸（例えば、少なくとも１つの対照標的遺伝子）を含むその他の粒子が挙げられる。いくつかの実施形態において、対照粒子の量は、サンプルへの添加前に知られている。対照標的遺伝子は、リアルタイムＰＣＲ分析を使用して定量化できる。対照標的遺伝子の定量化は、細胞外小胞体精製または核酸抽出ステップの効率または質を決定するのに使用できる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、Ｑβ粒子は、核抽出前に尿サンプルに添加される。例えば、Ｑβ粒子は、限外濾過前の尿サンプルの前処理濾過ステップ後に添加される。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載した方法およびキットは、１もしくは複数のインプロセス対照を含む。いくつかの実施形態において、インプロセス対照は、サンプルの質を示す参照遺伝子（すなわち、生体サンプル、例えば生体液サンプルの質の指標）の検出および分析である。いくつかの実施形態において、インプロセス対照は、血漿の質を示す参照遺伝子（すなわち、血漿サンプルの質の指標）の検出および分析である。いくつかの実施形態において、（単数もしくは複数の）参照遺伝子が、追加のｑＰＣＲによって分析される。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、インプロセス対照は、逆転写酵素および／またはＰＣＲ性能に関するインプロセス対照である。これらのインプロセス対照としては、限定されることのない例として、ＲＮＡ単離後かつ逆転写前にスパイクインされる参照ＲＮＡ（本明細書中ではｒｅｆ．ＲＮＡとも呼ばれる）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ｒｅｆ．ＲＮＡは、例えばＱｂｅｔａなどの対照である。いくつかの実施形態において、ｒｅｆ．ＲＮＡは、追加のＰＣＲによって分析される。
核酸の抽出
【０１６５】
本発明は、細胞外小胞体の単離、精製、または濃縮を向上させるための捕捉表面の使用に関する。本明細書に開示された方法は、前記細胞外小胞体から高品質の核酸を抽出するために高度に濃縮された細胞外小胞体画分を提供する。本明細書で記載される方法で得られた核酸抽出物は、病気または病状の診断、予後、または監視など、高品質核酸抽出物が求められる、あるいは好ましい様々な用途に有用である場合がある。
【０１６６】
最近の研究では、微小小胞体内の核酸がバイオマーカーとしての役割を有することが明らかになっている。例えば、ＷＯ２００９／１０００２９では、特に、医療診断、予後、および治療評価におけるＧＢＭ患者の血清の微小小胞体から抽出した核酸の使用が記載されている。ＷＯ２００９／１０００２９ではまた、同じ目的でのヒトの尿中の微小小胞体から抽出した核酸の使用が記載されている。微小小胞体から抽出した核酸の使用は、生検の必要性を回避する可能性があると見なされており、微小小胞体生物学の大きな診断可能性を強調するものである（Skog et al, 2008）。
【０１６７】
単離された細胞外小胞体の品質または純度は、抽出された細胞外小胞体核酸の品質に直接影響を及ぼす可能性があり、よって、病気の診断、予後、および／または監視のためのバイオマーカーアッセイの効率および感度に直接影響を及ぼす。臨床分野で正確で高感度の診断試験の重要性を前提として、生体サンプルから非常に濃縮された細胞外小胞体画分を単離する方法が必要とされている。この必要性に対処するために、生体サンプルから高品質の核酸を抽出するために生体サンプルから細胞外小胞体を単離する方法が本明細書に記載されている。本明細書で示すように、高度に濃縮された細胞外小胞体画分は、本明細書で記載される方法で生体サンプルから単離され、その後、この高度に濃縮された細胞外小胞体画分から高品質の核酸が抽出される。これら抽出された高品質の核酸は、病気または他の病状の診断、予後、および／または監視で補助となるバイオマーカーの有無を測定または評価するのに有用である。
【０１６８】
核酸抽出について述べる場合に本明細書で用いられる用語「高品質」は、18S ｒＲＮＡおよび28S ｒＲＮＡを、例えば、いくつかの実施形態において、約１：１〜約１：２の比；および／または、例えば、いくつかの実施形態において、約１：２の比で検出することができる抽出物を意味する。また、本明細書で記載される方法で得られた高品質な核酸抽出物は、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）が低タンパク質生体サンプル（例えば、尿）では５以上、タンパク質生体サンプル（例えば、血清）では３以上であり、２０ｍｌの低タンパク質生体サンプルまたは１ｍｌの高タンパク質生体サンプルからの核酸収量が５０ｐｇ／ｍｌ以上であることが理想的である。
【０１６９】
高品質のＲＮＡ抽出物が望ましい。というのは、ＲＮＡの分解は、例えば遺伝子発現およびｍＲＮＡ分析、非コードＲＮＡ（例えば、小ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ）の分析など、抽出されたＲＮＡの下流の評価に悪影響を及ぼす可能性があるからである。本明細書で記載される新規な方法によれば、細胞外小胞体内の核酸の正確な分析を行うことができるように生体サンプルから単離された細胞外小胞体から高品質の核酸を抽出することができる。
【０１７０】
生体サンプルから細胞外小胞体を単離した後、その単離または濃縮された細胞外小胞体画分から核酸を抽出してもよい。これを達成するために、いくつかの実施形態において、まず細胞外小胞体を溶解してもよい。細胞外小胞体の溶解および核酸の抽出は、当該分野で周知の様々な方法で達成することができる。いくつかの実施形態において、核酸の抽出は、当該分野で周知の標準的な手順および技術に従ってタンパク質沈殿を用いて達成することができる。また、そのような方法では、核酸結合カラムを用いて細胞外小胞体内に含まれる核酸を捕捉してもよい。核酸を一旦結合させて、バッファーまたは核酸と結合カラムとの相互作用を阻害するのに好適な溶液を用いて溶出させてもよい。これにより、核酸を溶出させることができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、前記核酸の抽出方法はまた、生体サンプルから高品質の核酸の抽出を防止する有害因子を除去または軽減するステップを含む。異なる生体サンプルは様々な有害因子の種を含んでいる可能性があるので、そのような有害因子は異種である。生体サンプルによっては、過剰ＤＮＡなどの因子が、生体サンプルからの核酸抽出物の品質に影響を及ぼし得る場合がある。他のサンプルでは、過剰な内因性ＲＮアーゼなどの因子が、生体サンプルからの核酸抽出物の品質に影響を及ぼし得る場合がある。多くの試薬および方法を用いてこれらの有害因子を除去することができる。これらの方法および試薬をまとめて、本明細書では「抽出向上操作」と呼ばれる。例によっては、抽出向上操作は、生体サンプルに核酸抽出向上試薬を添加することを含む場合がある。内因性ＲＮアーゼなどの有害因子を除去するため、本明細書で定義された抽出向上試薬としては、ＲＮアーゼ阻害剤（例えば、Ｓｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ社から市販されている）、ＲＮアーゼｌＮｐｌｕｓ（プロメガ社から市販されている）、または類似の機能を有する他の試薬など）、プロテアーゼ（ＲＮアーゼ阻害剤として機能してもよい）、ＤＮアーゼ、還元剤、おとり基質（例えば、合成ＲＮＡおよび／または担体ＲＮＡ）、ＲＮアーゼと結合することができる溶解性受容体、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ結合分子（例えば、抗ＲＮＡ抗体、塩基性タンパク質、またはシャペロンタンパク質）、ＲＮアーゼ変性物質（例えば、高浸透圧溶液、清浄剤）、またはこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
例えば、前記抽出向上操作は、核酸を抽出する前に、生体サンプルおよび／または単離された細胞外小胞体画分にＲＮアーゼ阻害剤を添加することを含んでいてもよい；例えば、いくつかの実施形態において、前記ＲＮアーゼ阻害剤の濃度は、体積で１μｌ以上のサンプルに対して０．０２７ＡＵ（１倍）超、あるいは体積で１μｌ以上のサンプルに対して０．１３５ＡＵ（５倍）以上、あるいは体積で１μｌ以上のサンプルに対して０．２７ＡＵ（１０倍）以上、あるいは体積で１μｌ以上のサンプルに対して０．６７５ＡＵ（２５倍）以上、あるいは体積で１μｌ以上のサンプルに対して１．３５ＡＵ（５０倍）以上である。ここで、１倍の濃度とは、０．０２７ＡＵ以上のＲＮアーゼ阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された細胞外小胞体を処理する酵素条件を指す。５倍の濃度とは、０．１３５ＡＵ以上のＲＮアーゼ阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された細胞外小胞体を処理する酵素条件を指す。１０倍のプロテアーゼ濃度とは、０．２７ＡＵ以上のＲＮアーゼ阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された粒子を処理する酵素条件を指す。２５倍の濃度とは、０．６７５ＡＵ以上のＲＮアーゼ阻害剤を用いて１μｌ以上の体液のから単離された細胞外小胞体を処理する酵素条件を指す。５０倍のプロテアーゼ濃度とは、１．３５ＡＵ以上のＲＮアーゼ阻害剤を用いて１μｌ以上の体液から単離された粒子を処理する酵素条件を指す。いくつかの実施形態において、前記ＲＮアーゼ阻害剤はプロテアーゼである。この場合、１ＡＵは、１分あたり１μｍｏｌのチロシンに対応するフォリン陽性アミノ酸およびペプチドを放出するプロテアーゼ活性である。
【０１７３】
これらの核酸抽出向上試薬は、例えば、ＲＮアーゼ活性の阻害（例えば、ＲＮＡ分
解酵素阻害剤）、タンパク質の普遍的分解（例えば、プロテアーゼ）、またはＲＮＡに結合して保護するシャペロンタンパク質（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）など、様々な方法でその機能を発揮してもよい。すべての場合で、このような抽出向上試薬は、生体サンプル中の有害因子、または単離された粒子からの高品質の核酸抽出を妨げる単離された粒子に関連づけられた有害因子のいくつかまたはすべてを除去、あるいは少なくとも軽減する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、18S ｒＲＮＡおよび28S ｒＲＮＡの定量化を用いて核酸抽出の品質を決定してもよい。
核酸バイオマーカーの検出
【０１７５】
いくつかの実施形態において、抽出された核酸は、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡおよびＲＮＡを含む。抽出された核酸がＤＮＡおよびＲＮＡを含む実施形態において、前記ＲＮＡは、さらなる増幅の前に相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写される。そのような逆転写は、単独で、または増幅ステップと組み合わせて行ってもよい。逆転写および増幅ステップを合わせた方法の一例として、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）がある。これは、例えば、米国特許第５，６３９，６０６号（その教示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲなど、さらに定量的に修正してもよい。前記方法の他の例としては、２つの個別のステップ、すなわち、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する第１の逆転写ステップ、およびｑＰＣＲによりｃＤＮＡの量を定量する第２のステップを含む。以下の実施例で示されるように、本明細書に開示された方法により核酸を含む粒子から抽出されたＲＮＡは、多くの転写物の種を含む。それらの例としては、リボソーム18S ｒＲＮＡおよび28S ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、病気または病状に関連づけられた転写物、および病状の診断、予後、および監視に重要なバイオマーカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、反応毎のＣｔ（サイクル閾値）値を決定する。ＲＴ−ＰＣＲでは、陽性反応は蛍光信号の蓄積により検出される。Ｃｔ値は、閾値を超える（すなわち、バックグラウンド値を超える）ために蛍光信号に必要なサイクル数と定義する。Ｃｔ値は、サンプル中の標的核酸または対照核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔ値が低い程、サンプル中の対照核酸の量が多くなる）。
【０１７７】
他の実施形態において、対照核酸のコピー数は、従来の技術で認められている様々な技術の何れかにより測定することができる。そのような技術としては、ＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。対照核酸のコピー数は、較正曲線すなわち標準曲線を作製して用いるなど、当該分野で周知の方法で決定することができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、１種以上のバイオマーカーは遺伝的異常の１つ、または集合であってもよい。本明細書で「バイオマーカー」とは、核酸の量、および核酸を含む粒子内の核酸多様体を指すのに用いられる。具体的には、遺伝的異常としては、遺伝子（例えば、がん遺伝子）または遺伝子パネルの過剰発現、遺伝子（例えば、ｐ５３またはＲＢなどの腫瘍抑制遺伝子）または遺伝子パネルの過小発現、遺伝子または遺伝子パネルのスプライス多様体の代替え生成物、遺伝子コピー数多様体（ＣＮＶ）（例えば、二重微小ＤＮＡ）（Ｈａｈｎ、１９９３）、核酸修飾（例えば、メチル化反応、アセチル化反応、およびリン酸化反応）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、染色体再編（例えば、逆位、欠失、および重複）、および多くの場合、最終的に変異が遺伝子産物の活性および機能に影響を及ぼして、別の転写性スプライス多様体および／または遺伝子発現量の変化となる遺伝子または遺伝子パネルの変異（挿入、欠失、重複、ミスセンス変異、ナンセンス変異、同義的変異、または任意のその他のヌクレオチドの変化）、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
単離された粒子に存在する核酸の分析は定量分析および／または定性分析である。定量分析の場合、単離された粒子内の特定の目的核酸の相対量あるいは絶対量（発現量）は（以下で記載の）当該分野で周知の方法で測定される。定性的分析の場合、単離された細胞外小胞体内の特定の目的核酸の種が野生型または多様体のいずれかであるかは、当該分野で周知の方法で同定される。
【０１８０】
本発明はまた、（ｉ）対象の診断を補助する、（ｉｉ）対象の病気または他の病状の進行または再発を監視する、あるいは（ｉｉｉ）病気または他の病状の処置を受けている、あるいは処置が予期される対象の処置の有効性の評価を補助する目的で、生体サンプルから細胞外小胞体を単離し、そして、核酸の配列決定をする方法の使用を含む。ここで、前記方法により得られた核酸抽出物中に１つ以上のバイオマーカーがあるか否かが決定され、前記１つ以上のバイオマーカーは、病気または他の病状の診断、進行または再発、あるいは処置の有効性とそれぞれ関連づけられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、それを分析する前に細胞外小胞体の核酸を増幅することは、有益であるか、またはそうでなければ、望ましいことであり得る。核酸増幅の方法は、一般的に使用され、かつ、当該技術分野で広く知られており、そしてその多くの例が、本明細書中に記載されている。所望であれば、増幅は、それが定量的になるように実施できる。定量的な増幅は、様々な核酸の相対量の定量測定を可能にして、遺伝的または発現プロファイルをもたらす。
【０１８２】
核酸増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第５，２１９，７２７号）およびインサイチューポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第５，５３８，８７１号）などのその変形、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第５，２１９，７２７号）、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第５，５５６，７７３号）、自家持続配列複製およびその変形（Guatelli et al., 1990）、転写増幅システムおよびその変形（Kwoh et al., 1989）、Qβレプリカーゼおよびその変形（Miele et al., 1983）、コールド−ＰＣＲ（Li et al., 2008）、Ｂｅａｍｉｎｇ（Li et al., 2006）または他の任意の核酸増幅法を含むがこれらに限定されるわけではなく、増幅された分子をその後当業者に周知の技術を用いて検出する。そのような分子が存在する量が非常に少ない場合、核酸分子を検出するために設計された検出スキームは特に有用である。前記の参照文献は、これらの方法に関するその教示により本明細書に組み入れられる。他の態様において、核酸増幅ステップは実施されない。その代わりに、抽出核酸を、（例えば次世代シークエンシングによって）直接分析する。
【０１８３】
そのような遺伝子異常の判定は、当業者に公知の多様な技術によって実施することができる。例えば、核酸の発現レベル、選択的スプライス変種、染色体再配列、および遺伝子コピー数は、マイクロアレイ分析（例えば、米国特許第６，９１３，８７９号、同第７，３６４，８４８号、同第７，３７８，２４５号、同第６，８９３，８３７号、および同第６，００４，７５５号を参照されたい）、および定量的ＰＣＲによって決定することができる。特に、コピー数変化は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＩＩ全ゲノム遺伝子タイピングアッセイ法またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＣＧＨマイクロアレイ（Steemers et al., 2006）によって検出されうる。核酸修飾は、例えば米国特許第７，１８６，５１２号および特許公報ＷＯ／２００３／０２３０６５に記載される方法によってアッセイすることができる。特に、メチル化プロファイルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡメチル化ＯＭＡ００３癌パネルによって決定されうる。ＳＮＰおよび変異は、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション、酵素的変異検出、ミスマッチヘテロ二本鎖の化学的切断（Cotton et al., 1988）、ミスマッチ塩基のリボヌクレアーゼ切断（Myers et al., 1985）、質量分析（米国特許第６，９９４，９６０号、同第７，０７４，５６３号、および同第７，１９８，８９３号）、核酸シークエンシング、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）（Orita et al., 1989）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）（Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）（Kan and Dozy, 1978a; Kan and Dozy, 1978b）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法（ＯＬＡ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）（米国特許第５，６３９，６１１号）、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）およびその変形（Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994）、フローサイトメトリーヘテロ二本鎖分析（ＷＯ／２００６／１１３５９０）およびその組み合わせ／改変版によって検出されうる。特に、遺伝子発現レベルは、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）技術（Velculescu et al., 1995）によって測定されうる。一般的に、遺伝子異常を分析するための方法は、多数の刊行物に報告されており、本明細書において引用した方法に限定されず、当業者に利用可能である。適切な分析法は、分析の特異的目標に、患者の状態／病歴に、および、検出されるか、モニターされるかまたは処置される特異的癌、疾患または他の医学的状態に依存すると考えられる。前記の参照文献は、これらの方法の教示により本明細書に組み入れられる。
【０１８４】
多くのバイオマーカーは、対象における疾患または他の医学的状態の有無に関連する可能性がある。したがって、本明細書において開示される方法に従って、単離された粒子からの核酸抽出物中におけるそのようなバイオマーカーの有無を検出することは、対象における疾患または他の医学的状態の診断を助ける可能性がある。
【０１８５】
さらに、多くのバイオマーカーが対象における疾患または医学的状態のモニタリングを助ける可能性がある。したがって、本明細書において開示される方法に従って単離された粒子からの核酸抽出物中におけるそのようなバイオマーカーの有無を検出することは、対象における疾患または他の医学的状態の進行または再発のモニタリングを助ける可能性がある。
【０１８６】
多くのバイオマーカーが、特定の患者における処置の有効性に影響を及ぼすことが見いだされている。したがって、本明細書において開示される方法に従って単離された粒子からの核酸抽出物におけるそのようなバイオマーカーの有無を検出することは、所定の患者における所定の処置の効果の評価を助ける可能性がある。患者の生物試料から単離された粒子から抽出された核酸におけるこれらのバイオマーカーの同定は、患者のための処置の選択の手引きとなる可能性がある。
【０１８７】
本発明の上記態様の特定の実施形態において、疾患または他の医学的状態は、新生物疾患または状態（例えば、癌または細胞増殖性障害）である。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、抽出された核酸、例えばエキソソームＲＮＡ（本明細書中では「ｅｘｏＲＮＡ」とも呼ばれる）は、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの検出に基づいてさらに分析される。いくつかの実施形態において、更なる分析は、機械学習ベースのモデリング、データマイニング法、および／または統計解析を使用して実施される。いくつかの実施形態において、データを解析して、患者の疾患転帰を特定するか、または予測する。いくつかの実施形態において、データを解析して、患者集団内の患者を階層化する。いくつかの実施形態において、データを解析して、患者が処置に対して抵抗性であるかどうか特定するか、または予測する。いくつかの実施形態において、データを使用して、対象の無増悪生存率の推移を計測する。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、データを解析して、バイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせが検出されているときには、対象の処置オプションを選択する。いくつかの実施形態において、処置オプションとは、治療法の組み合わせ伴う処理である。
配列決定技術
【０１９０】
いくつかの実施形態において、「次世代」配列決定（ＮＧＳ）またはハイスループット配列決定実験が、本発明の方法に従って実施される。これらの配列決定技術は、サンプル中に少量もしくは大量に存在するか、またはその他の点では、より従来型のハイブリダイゼーションでは検出されない核酸の識別を可能にする。ＮＧＳは、ヌクレオチドの添加と、それに続く洗浄ステップを典型的には組み込む。
【０１９１】
鎖情報を保存し、哺乳類のＲＮＡおよび非常に少ない入力ＲＮＡ向けである、全ＲＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧのための市販キットは、この点において有用であり、そして、Clontech：ＳＭＡＲＴｅｒ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡＳｅｑキット；Clontech：ＳＭＡＲＴＳｅｑ ｖ４ ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ｉｎｐｕｔ ＲＮＡＳｅｑキット；Illumina：Ｔｒｕｓｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｏｔａｌ ＲＮＡライブラリ調製キット；Kapa Biosystems：Ｋａｐａ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡＳｅｑライブラリ調製キット；New England Biolabs：ＮＥＢＮｅｘｔ ｕｌｔｒａ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌライブラリ調製キット；Nugen：Ｏｖａｔｉｏｎ Ｓｏｌｏ ＲＮＡＳｅｑキット；およびNugen：Ｎｕｇｅｎ Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡＳｅｑシステムｖ２が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【実施例】
【０１９２】
本明細書で提供される実施例では、遠心分離および／または濾過の目的のために様々な膜および装置が用いられるが、自明であるが、これらの方法は、細胞外小胞体を効率的に捕捉し、核酸、特に細胞外小胞体に含まれるＲＮＡを放出することができる任意の捕捉表面および／または収納装置と共に用いることができる。
実施例１
【０１９３】
サンプルの分離
【０１９４】
サンプルは、一般的に商業的供給源から入手し、そして、例えば、ＷＯ２０１４／１０７５７１およびＷＯ２０１６／００７７５５に記載のＥＸＯ５０および／またはＥＸＯ５２法によって分離される。
【０１９５】
長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法１：
【０１９６】
サンプル分離後に、サンプルを、製造元のガイドラインに従って：一般的に、約１０分間〜約２時間、例えば約１０分間〜約６０分間など、および約３０℃〜約４０℃、例えば約３５℃〜約３７℃などの温度にてインキュベートすることによって、ＤＮアーゼＩ酵素および／または修飾ＤＮアーゼＩ酵素で処理する。
【０１９７】
ＤＮアーゼ処理に続いて、外因性合成ＲＮＡスパイクインを、サンプルに応じて調整した希釈率にてサンプルに追加する。合成スパイクインを、ＤＮアーゼ処理前またはＤＮアーゼ処理後のいずれであってもサンプルに追加し得る。それに続いて、サンプルを、市販試薬／プロトコールを使用したＲＮＡ断片化に供するか、またはサンプルを未断片化のままにしておいた。
【０１９８】
次いで、サンプルを最初に、製造元のガイドラインに従って、市販の試薬を使用した第一鎖ｃＤＮＡ合成（逆転写）に供する。
【０１９９】
次いで、ＩｌｌｕｍｉｎａベースのＮＧＳアダプターを、製造業者のガイドラインに従って、ＰＣＲベースの技術および市販の試薬を使用してｃＤＮＡに加える。
【０２００】
ＮＧＳアダプターのＰＣＲベースの付加に続いて、サンプルを、製造業者のガイドラインに従って、一般的な市販の試薬を使用した、１または２ラウンドの常磁性ビーズベースのライブラリのクリーンアップに供する。
【０２０１】
ＡＭＰｕｒｅクリーンアップに続いて、サンプルを、市販の試薬およびプロトコールを使用したリボデプレッションに供する。
【０２０２】
次いで、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、複数サイクルのＰＣＲ増幅に供する。ＰＣＲベースの増幅サイクルは１０〜３０サイクルの範囲であり得る。
【０２０３】
ＰＣＲ増幅に続いて、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、１または２ラウンドの常磁性ビーズベースのライブラリのクリーンアップに供する。
【０２０４】
この段階で、最終的なＮＧＳライブラリおよびサンプルを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（断片サイズ分析および濃度）およびＱｕｂｉｔ（濃度）を含めた標準的なＮＧＳ ＱＣ計測に供する。サンプルを、１〜４ｎＭの濃度に希釈し、次いで、配列決定のための調製前に貯留する。標準的な配列決定調製物は、配列決定器具によるクラスタリングに使用されるサンプル変性およびｐＭ濃度への希釈を含む。
【０２０５】
長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法３：
【０２０６】
分離後に、サンプルを、製造元のガイドラインに従って：一般的に、約１０分間〜約２時間、例えば約１０分間〜約６０分間、または約３０分間など、および約３０℃〜約４０℃、例えば約３５℃〜約３７℃などの温度にてインキュベートすることによって、一般的にＤＮアーゼＩ酵素で処理する。
【０２０７】
ＤＮアーゼ処理後に、外因性合成ＲＮＡスパイクインを、サンプルに応じて調整した希釈率にてサンプルに追加する。
【０２０８】
次に、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、別のラウンドのＤＮアーゼ処理およびプライマーアニーリングに供する。
【０２０９】
次いで、サンプルを最初に、製造元のガイドラインに従って、市販の試薬を使用した第一鎖ｃＤＮＡ合成（逆転写）に供する。
【０２１０】
次いで、サンプルを、市販のＮＧＳ試薬を使用した、一連のｃＤＮＡ加工ステップに供する。
【０２１１】
次いで、サンプルを、市販の試薬およびガイドラインを使用した、第二鎖ｃＤＮＡ合成（逆転写）、末端修復、およびアダプター連結反応に供する。アダプター連結反応に続いて、サンプルを、市販の試薬を使用した、１もしくは複数のラウンドの常磁性ビーズベースのライブラリのクリーンアップに供する。標準プロトコールを、実施例に規定するように、我々のワークフロー向けにビーズ水和時間および溶出体積を変更するように変更した。
【０２１２】
次に、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、市販の試薬を使用して、試験するサンプルのために最適な増幅サイクルを決定するために実施する。
【０２１３】
次いで、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、前ステップで決定されたサイクル数に基づくＰＣＲ増幅に供する。
【０２１４】
ＰＣＲ増幅に続いて、サンプルを、市販の試薬および、さらに、標準的なキットプロトコールを我々のワークフローにビーズ水和ステップを提供するように変更したプロトコールを使用した、１または２ラウンドの常磁性ビーズベースのライブラリクリーンアップに供する。
【０２１５】
次に、サンプルを、サンプル濃度を決定するために標準的なＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒまたはＱｕｂｉｔ分析に供する。最高１０ｎｇのライブラリを、ワークフローの次のステップに進める。
【０２１６】
次いで、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、リボデプレッションに供する。標準的なキットプロトコールを、我々のワークフロー向けにプライマーアニーリングの追加サイクルを加えることによって変更した。
【０２１７】
次いで、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、複数のサイクルのＰＣＲ増幅を終了するまで、ＰＣＲ増幅の第二のラウンドに供する。
【０２１８】
ＰＣＲ増幅に続いて、サンプルを、市販の試薬とプロトコールを使用した、１または２ラウンドの常磁性ビーズベースのライブラリのクリーンアップに供する。そのプロトコールは、実施例で詳しく述べられるように、我々のワークフロー向けに水和時間を変えるように変更された。
【０２１９】
この段階で、我々はこれまでに、最終的なＮＧＳライブラリを有し、そして、サンプルを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（断片サイズ分析および濃度）およびＱｕｂｉｔ（濃度）を含めた標準的なＮＧＳ ＱＣ計測に供する。サンプルを、１〜４ｎＭの濃度に希釈し、次いで、配列決定のための調製前に貯留する。標準的な配列決定調製物は、配列決定器具によるクラスタリングに使用されるサンプル変性およびｐＭ濃度への希釈を含む。
【０２２０】
濃縮ワークフロー
【０２２１】
ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの組み合わせを、以下のワークフローに供する。サンプルを、市販の試薬とガイドラインを使用して、ＤＮアーゼＩで処理するか、または未処理のままにしておいた。
【０２２２】
次いで、サンプルを、断片化に供するか、または未断片化のままにしておいた。第一鎖ｃＤＮＡ合成（逆転写）を、サンプルに対して実施し、必要な場合には、第二鎖ｃＤＮＡ合成（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ反応）を、第一鎖ｃＤＮＡ合成後にサンプルに対して実施する。
【０２２３】
サンプルを、市販の試薬およびガイドラインに従って、末端修復、およびアダプター連結反応に供する。アダプター連結反応に続いて、サンプルを、市販の試薬とガイドラインを使用した、１ラウンドの常磁性ビーズベースのライブラリのクリーンアップに供する。
【０２２４】
サンプルを、市販の試薬とガイドラインに従って、第一のＰＣＲ増幅に供する。ＰＣＲに続いて、サンプルを、ハイブリダイゼーションベースの標的濃縮に供する、および／または方法１または方法３（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡ）から作成した最終的なＮＧＳライブラリを、ハイブリダイゼーションベースの標的濃縮に供する。プローブを、６０ｂｐ、８０ｂｐ、または１２０ｂｐのサイズを有する特異的配列でビオチン化する。配列特異的部位でのプローブのタイリング密度またはオーバーラップは、１倍、２倍、３倍ｘ、４倍およびそれ以上であってもよい。
【０２２５】
プローブを、市販の試薬とガイドラインを使用して、サンプル中の着目の特異的配列にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションに続いて、サンプルを、ストレプトアビジン結合常磁性ビーズに晒して、特異的配列を補足し、好ましくない配列を取り除く。好ましくない配列、バッファー、および酵素のクリーニングは、それらを洗浄によって取り除き、それと同時に、サンプル中の着目の特異的配列を、ストレプトアビジン結合常磁性ビーズに結合させる。
【０２２６】
特異的配列のハイブリダイゼーションとストレプトアビジン結合常磁性ビーズによる捕捉を、約２〜約２４時間の範囲のハイブリダイゼーション時間を用いて、一度または複数回実施する。
【０２２７】
ハイブリダイゼーションに続いて、配列特異的に捕捉されたサンプルを、製造業者のガイドラインに従うが、収率を改善するために増やした増幅サイクルを用いた第二のＰＣＲ増幅に供する。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、サンプルを、常磁性ビーズベースのライブラリによって、またはフイルタースピンカラムを使用して、１ラウンドのクリーンアップに供する。サンプルを、終濃度（すなわち、ｎｇ／μｌ、ｎＭ）を高めるために、より少ない体積の溶出バッファーで溶出する。
【０２２９】
この段階で、我々はこれまでに、最終的な濃縮ＮＧＳライブラリを有し、そして、サンプルを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（断片サイズ分析および濃度）およびＱｕｂｉｔ（濃度）を含めた標準的なＮＧＳ ＱＣ計測に供する。サンプルを、１〜４ｎＭの濃度に希釈し、次いで、配列決定のための調製前に貯留する。標準的な配列決定調製物は、配列決定器具によるクラスタリングに使用されるサンプル変性およびｐＭ濃度への希釈を含む。
実施例２
【０２３０】
我々は、ＲＮＡ配列決定ワークフロー内にエキソソームからの短いＲＮＡ転写物および長鎖ＲＮＡ転写物の両方を含むように特別に設計された新規プラットフォームを開発した。Exosome Diagnosticsから入手可能なＥｘｏＬｕｔｉｏｎまたはＥｘｏＬｕｔｉｏｎ Ｐｌｕｓを使用し、かつ、ヒト血漿から開始して、我々は、高品質の全エキソソームＲＮＡを単離し、そして、得られたそれを長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法１に供した。
【０２３１】
簡単に言えば、そのワークフローを、エキソソームＲＮＡ単離物を用いて開始し、そして、次いで、ＤＮＡが分析に干渉する場合がある適用のために、ＤＮアーゼ処理を続けておこなった。合成ＲＮＡ標準のスパイクインを、品質管理指標としてＤＮアーゼステップの前または後に実施するときもある。
【０２３２】
ＲＮＡを、混合オリゴと、鋳型スイッチング活性を有する逆転写酵素とを使用して、転写する。このあとに続いて、ＰＣＲを使用して、バーコードがあるもしくはそれがないＤＮＡオリゴアダプターを付加した。ｃＤＮＡを、常磁性ビーズを使用して、より小さいオリゴからクリーンアップする。リボソーム配列は、少量の転写産物の検出に影響を及ぼすこともあり得るので、そのため、リボソーム除去ステップを使用して、選択的に取り除くこともある。リボソーム配列の切断または除去後に、未切断ライブラリ分子を、ＰＣＲによって濃度を高める。このあとに続いて、常磁性ビーズを使用して、別のクリーンアップをおこなう。次いで、ライブラリを定量化し、配列決定してもよい。
【０２３３】
実験の目的は、血漿エキソソームに最適な、完全な長鎖ＲＮＡＳｅｑプラットフォームを開発することである。
【０２３４】
サンプル：２ｍＬ、正常ヒト血漿、性別に偏りのない４８人の個人のプール。合成スパイクインを、感度、技術的な再現性、および鎖形成性（stranded-ness）の対照としてサンプルに追加する。
【０２３５】
エキソソームＲＮＡＳｅｑ：ＤＮアーゼ処理、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ断片化、増幅、リボソームＲＮＡ除去に好適な変数／変数の組み合わせの識別と最適化。
【０２３６】
図面は、本方法の驚くべき結果を実証している。特に、図１は、エキソソームＲＮＡサイズ分布やエキソソームの最終的なライブラリサイズ分布を含めた、ＲＮＡＳｅｑライブラリ中の長鎖ＲＮＡ転写物に関して得られた増幅および取り込みを示すバイオアナライザースキャンを提供する。増幅されたｃＤＮＡは、低分子ＲＮＡおよび長鎖ＲＮＡ断片の両方から見られる。
【０２３７】
図２は、本方法によるライブラリ複製間の優れた相関と再現性を示す。血漿エキソソームＲＮＡのための適切な条件を同定することによって、我々は、０．７〜０．９７のライブラリ複製間の再現性を改善した。外因性ＲＮＡスパイクインの相関によって決定される複製間の技術的な再現性は０．９９９である。転写産物の９７％から９９％が正しい鎖情報を保持した。図３は、変数の最適化がトランスクリプトームに位置する読みの割合を増大させたことを示す。特に、これらのパラメーターを変更することが、４０〜４５％の読みマップがトランスクリプトームに位置することを可能にする。同様に、図４は、変数の最適化が読みの反復を最少化し、かつ、タンパク質をコードする読みを増大することを示す。
【０２３８】
図５は、（リボソームＲＮＡを除いた）ＲＮＡ型に関する血漿エキソソームのＲＮＡの幅広い多様性を示す。
【０２３９】
図６は、２８Ｓ、１８Ｓ、１２Ｓ、および１６Ｓリボソーム遺伝子に関して、リボデプレッションなし（左）およびあり（右）のリボソームＲＮＡの高度に効率的な除去を示す。
【０２４０】
図７は、血漿エキソソームのトランスクリプトームカバー率を示す。
【０２４１】
図８は、血漿エキソソームＲＮＡカーゴの多様性を示す。
【０２４２】
図９は、エキソソームにおける完全な転写産物カバー率を伴った多数の長鎖ＲＮＡ、およびエキソソームの転写産物カバー率の２モード分布を示す。
【０２４３】
図１０は、本方法がエキソソーム中の分子の高感度検出を提供することを示す。
【０２４４】
本方法によって作成された追加データを、図１１〜１５に提供する。図１２は、ライブラリ複製間のスパイクインの優れた相関を示し、その一方で、図１３は、転写産物の５末端がより高いカバー率を有することを実証する。ＲＮＡＳｅｑライブラリにおける長鎖ＲＮＡ転写物の増幅および取り込みが、血漿エキソソームの最終的なライブラリのサイズ分布として図１４に提供されている。
【０２４５】
要約すれば、本方法は、エキソソームに対する長鎖ＲＮＡＳｅｑのための新規アプローチを提供する。それはＲＮＡ転写産物の検出に関して優れた再現性（Ｒ＞０．９７）、転写産物の高感度検出法（ＬＯＤ＠１５Ｍの読み＝１２分子）、およびリボソーム転写産物の高度に効率的な除去を実証している。加えて、タンパク質コードおよび非コードＲＮＡの幅広い多様性が、本方法によりエキソソームで検出されている。本方法は、エキソソームにおいて完全なカバー率を伴った多数の転写産物を同定する。
実施例３
【０２４６】
我々は、ＲＮＡ配列決定ワークフロー内にエキソソームからの短いＲＮＡ転写物および長鎖ＲＮＡ転写物の両方を含むように特別に設計された新規プラットフォームを開発した。我々は、単独での、またはＲＮＡとの混合物での、ＤＮＡを加工するようにも、これらのワークフローをさらに拡張した。我々は、より深い配列カバー率を可能にする着目の標的に関して特異的にサンプルの濃度を高めるために、これらのワークフローをさらに拡張した。Exosome Diagnosticsから入手可能なＥｘｏＬｕｔｉｏｎ（商標）、ＥｘｏＬｕｔｉｏｎ ＨＴ（商標）、ＵＰｒｅｐ（商標）、ＥｘｏＥａｓｙ（商標）、ＥｘｏＲＮｅａｓｙ（商標）、またはＥｘｏＬｕｔｉｏｎ Ｐｌｕｓ（商標）を使用し、、かつ、ヒト血漿から開始して、我々は、高品質の全エキソソーム核酸を単離し、そして、得られたそれを長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法１および／または方法３に供した。
【０２４７】
記載した配列決定ワークフローは、核酸を生体液から分離した後に始まる（図１６）。配列決定ワークフローのための入力としての役割を果たす生体液の体積は、≧０．５ｍｌほどの少なさであってよく、上限はない（図１６）。核酸は、エキソソームおよび／または他の無細胞起源に由来してもよい。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、サンプルのアリコートが、ハイブリダイゼーションベースの濃縮プロセス（図１７〜１９を指す）に使用される。このプロセスは、サンプル中に含まれた着目のゲノム配列領域に相補的なヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを利用し、着目の配列向けに選択されたバッファーを使用した一連の洗浄が続き、その間に、不用な物質を洗い流した。プローブ−配列ハイブリッドは、これだけに限定されるものではないが、ストレプトアビジン−ビオチン化学反応を利用するために選択されてもよい。そのプロセスは、これだけに限定されるものではないが、エクソン領域およびイントロン領域を含めたゲノム配列の任意の部分またはその混合物を濃縮するのに使用でき、そしてそれは、遺伝子内の全遺伝子コード領域または特定のホットスポットの位置をカバーできる。ハイブリダイゼーションプローブパネルは、これだけに限定されるものではないが、〜２０，０００個の遺伝子（図４を見る）を含む全タンパク質をコードするトランスクリプトーム、＞１，０００個の遺伝子による幅広い疾患または疾患関連経路を標的とした大きなパネル（図１７〜１８を参照）、ならびに５０〜５００個の遺伝子による注目した疾患（例えば、固形腫瘍）または疾患関連経路を標的とした中程度のパネル、を含めた、少数の標的（１〜２０）〜多くの標的（＞１，０００）の任意の標的配列の濃度を高めるのに使用できる。
【０２４９】
図１７は、汎癌パネルを使用したサンプル濃縮を実証する。サンプルを、ライブラリ作成に供し、それに続いて、癌に関係した１，３８７個の標的のパネルについて濃縮した。液体生検検体からのＲＮＡのみまたはＲＮＡとｃｆＤＮＡの混合物を含むサンプルを調査した。市販のＲＮＡ（ＵＨＲ）を対照サンプルとして含んだ。図１７Ａは、産生された標的読みに対して非常に高いパーセンテージの例証となるライブラリのマッピング指標を示す。図１７Ｂは、パネル中のヌクレオチドの大部分が３個のサンプルのすべてにわたって１×超カバーされていることを示す塩基カバー指標を示す。図１７Ｃは、標的あたりのマッピングされた読み数をプロットし、そして、ＲＮＡのみとＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡを含むサンプルを加工する能力、ならびにＲＮＡとｃｆＤＮＡの両方が同じサンプル中で分析されるときの読みカウントの増加を例示する。
【０２５０】
図１８は、汎癌パネルを使用した濃縮を実証する。サンプルを、ライブラリ作成に供し、それに続いて、癌に関係した１，３８７個の標的のパネルについて濃縮した。液体生検検体からのｃｆＤＮＡのみまたはＲＮＡとｃｆＤＮＡの混合物を含むサンプルを調査した。図１８Ａは、産生された標的読みに対して非常に高いパーセンテージの例証となるライブラリのマッピング指標を示す。図１８Ｂは、同量の開始血漿を使用したとき、ｃｆＤＮＡ＋ＲＮＡが、ｃｆＤＮＡ単独と比較して、優れた標的カバー率を提供することを示す塩基カバー指標を示す。図１８Ｃは、標的あたりのマッピングされた読み数をプロットし、そして、ｃｆＤＮＡのみとＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡを含むサンプルを加工する能力、ならびにＲＮＡの寄与がｃｆＤＮＡと共に含まれるときの読みカウントの増加を例示する。
【０２５１】
図１９は、Ｗｈｏｌｅ Ｅｘｏｍｅ捕捉パネルを使用したサンプル濃縮を実証する。サンプルを、ライブラリ作成に供し、それに続いて、トランスクリプトームをコードする全タンパク質を表す〜２０，０００個の標的のパネルについて濃縮した。液体生検検体からのｃｆＤＮＡのみまたはＲＮＡとｃｆＤＮＡの混合物を含むサンプルを調査した。市販のＲＮＡ（ＵＨＲ）を対照サンプルとして含んだ。図１９Ａは、産生された標的読みに対して非常に高いパーセンテージの例証となるライブラリのマッピング指標を示す。図１９Ｂは、示された塩基カバー指標を実証する。図１９Ｃは、標的あたりのマッピングされた読み数を示し、そして、ｃｆＤＮＡのみとＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡを含むサンプルを加工する能力を例示する。
実施例４
【０２５２】
サンプルが濃縮されていない場合では、全サンプルを配列決定する（図２０〜２２）。
【０２５３】
図２０は、エキソソーム液体生検検体に最適化した２つの独立したＲＮＡｓｅｑライブラリ作成ワークフローを実証する。変動を最小にするために、複製ＲＮＡ抽出を、対照血漿プールから単離した。次いで、複製（方法あたり６回）を、２つの最適化ワークフローのうちの一方を使用して実施した。サンプルを、リボソーム除去に供さなかった。すべてのサンプルを、ディープシークエンシングに供し、および分析のための読みカウントを正規化するためにダウンサンプリングした。図２０Ａは、ライブラリ複製間の転写産物の非常に再現性のよい検出を示す。図２０Ｂは、トランスクリプトームに位置する読みの割合が、標的指標で高いことを例証すること示す。図２０Ｃは、バイオタイプあたりの読みの割合を示す。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、全サンプルが分析されているとき、リボソーム配列（ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃｆＤＮＡ）は、少量の転写産物の検出に影響を及ぼす可能性があり得、その場合、リボソーム配列のサンプルを取り除くかまたは除去することが望ましい（図２１を参照）。リボソーム配列の選択的除去は、ＲＮＡ配列のレベル、ｃＤＮＡレベル、またはｄｓＤＮＡ（ライブラリ）レベルで達成されてもよい。リボソーム配列に特異的な除去は、これだけに限定されるものではないが、ＲＮアーゼＨまたは制限酵素消化に類似した酵素試薬を使用して達成されてもよい。除去はまた、ハイブリダイゼーションベースのビオチン化プローブ濃縮、およびリボソーム配列を特異的に捕捉し、取り除くためのストレプトアビジン結合常磁性ビーズを利用することで達成されてもよい。
【０２５５】
図２１は、様々なリボソームＲＮＡ除去アプローチを実証する。変動を最小にするために、複製ＲＮＡ抽出を、対照血漿プールから単離した。さらに変動を避けるために、すべてのサンプルを、同じＲＮＡｓｅｑライブラリ手順を利用して調製した。個々のサンプルを、３つの市販のリボソーム配列除去アプローチ（試薬１、試薬２、および試薬３とも呼ばれる）のうちのいずれか１つに供したが、それらに関して、除去は、ＲＮＡまたはｃＤＮＡのレベルで起こり得る。試薬１に関しては、条件Ａは市販のプロトコールを指し、それに対し、条件Ｂは特定された最適プロトコールを指す。リボソームＲＮＡを除去しなかったサンプルを、未処理対照として含んだ。すべてのサンプルを、ディープシークエンシングに供し、および分析のための読みカウントを正規化するためにダウンサンプリングした。図２１Ａは、最適条件の選択がどのように除去の有効性とその後の着目のＲＮＡ回収に多大な影響を与えるかを、トランスクリプトームの読みの割合が例証していることを示す。図２１Ｂは、未除去サンプルに対する除去サンプルの比較を提供し、そして、望ましくないリボソームＲＮＡの最も効果的な除去を有する一方で、初期のライブラリの多様性を維持し（紫色）、かつ、損失を最小にし（ピンク色）、ならびに処理と比較したときに追加ＲＮＡ（青色）の解明を可能にする最適条件を選択する重要さを例証している。本明細書では、試薬１を使用する条件Ｂが、タンパク質をコードする読みの１７倍の改善、９３．５％の未除去とのオーバーラップおよび９６．５％の新しい転写産物に通じる最も最適なリボデプレッションをもたらすことがわかった。
【０２５６】
図２２は、全ＲＮＡと全核酸（ｃｆＤＮＡ＋ＲＮＡ）の両方のライブラリ調製方法を実証する。核酸を、３つの方法：１つは高品質のＲＮＡのみを単離し、および２つはＲＮＡに加えてｃｆＤＮＡを単離する異なった方法、のうちの１つを使用して対照血漿から単離した。変動を最小にするために、これらのライブラリのそれぞれからのサンプルを、同じアプローチを使用して、配列決定のために調製した。図２２Ａは、非常に再現性の高いライブラリがこのライブラリ方法を使用して生成され、そして、両方の単離法が、高度に類似した出発材料を作り出すことを示す。図２２Ｂは、マッピング指標を提供し、それに対して、図２２Ｃは、ＲＮＡのみと比べてＲＮＡとｃｆＤＮＡとを組み合わせることによって検出される高い転写産物カバー率を実証する転写産物カバー率を提供する。図２２Ｄは、ＲＮＡのみ（上段）、ｃｆＤＮＡ＋ＲＮＡの方法１（中段）および方法２（下段）に関して同定された転写産物を提供する。サンプルからのＲＮＡとＤＮＡを組み合わせて、同じワークフローにそれらを供することによって、全転写産物（コードおよび非コード）の検出は、４７．４％（ＲＮＡのみ）から９９．６％（ＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡ）に増大し、タンパク質をコードする転写産物の検出は、６６．５％（ＲＮＡのみ）から９９．９％（ＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡ）に増大し、およびｌｉｎｃＲＮＡの検出は、１４．７％（ＲＮＡのみ）から＞９９％（ＲＮＡ＋ｃｆＤＮＡ）に増大した。
【０２５７】
図２３は、血漿から構築した６つの独立したライブラリ複製物において、全ＲＮＡＳｅｑアッセイベースの外因性ＲＮＡスパイクインの検出限界を実証する。その図面は、１０分子以下に下がったＲＮＡの一貫性のある検出を実証する。このアッセイのダイナミックレンジは、１０〜１８０万分子の５桁に及ぶ。
【０２５８】
ライブラリ定量化に続いて、ライブラリは、正規化され、多重化され、そして、次世代配列決定プラットフォームを使用した配列決定に供される。次に、配列決定データは、必要であれば、多重分離され、そして、転写産物／遺伝子カウントが、既存のゲノムもしくはトランスクリプトーム参照配列に対する、またはデノボ合成したゲノムまたは転写産物に対するマッピングによって作り出される（図１６、図２４を参照）。図２４は、ＱＣ指標および分析結果を表示するための代表的なＲＮＡＳｅｑブラウザを提供する。
【０２５９】
次いで、各配列のＵＭＩタグが、ＰＣＲ複製によって生じる断片を同定するのに使用できる。カウントは、特にライブラリサイズ、ＧＣバイアス、配列バイアス、配列決定深度に関して正規化される。次いて、これらのカウントは、図２５にあるとおり、サンプルタイプ間で区別できるバイオマーカーのリストを作成するための様々な条件（例えば、腫瘍／健常）に関係する遺伝子発現解析である示差的発現解析を実施するのに使用でき、そしてそれは、示差的発現解析の結果を表示および評価するための代表的な示差的発現ブラウザを提供する。
【０２６０】
アラインされた参照データは、例えば一塩基多型、挿入／欠失、融合、逆位および反復拡張などに限らず、配列変化のプロファイリングに使用できる。
実施例５
【０２６１】
ホルマリン固定化パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含めた組織分析のために作成された、ハイブリダイゼーションベースの標的濃縮のための容易に入手可能な市販キットを、細胞外小胞体サンプル（ｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡ）への適用性について試験するために使用した。そのキットは、融合、挿入／欠失、一塩基多型、およびコピー数の変動の検出のための標的を含んでいる。
【０２６２】
エキソソームサンプル向けの画一的なプロセスの適合に関して実現可能性を試験するために、我々は、図２６で示す方法４および方法５の２つのプロセスを調べた。表１に概説した標的とした濃縮パラメーターを調査し、我々は、ＥｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡが少量入力の対照ＲＮＡ（汎用ヒト参照ＲＮＡ）およびＤＮＡ（通常のゲノムＤＮＡ）に匹敵することを見出した。予想される標的濃縮（標的特異的配列に位置する読み）の範囲は、ｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡについて７０％〜９９％である。
表１
【表１】
2019535307.tif 000003
【０２６３】
ｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡに関して、トランスクリプトームに位置する読みのパーセントは３０％〜９５％であり、イントロン領域では５％〜６０％であり、および遺伝子間領域では０．２％〜１０％である。
【０２６４】
ｅｘｏＲＮＡおよびｃｆＤＮＡにおいて、標的の配列塩基は、１つの読みで＞９０％の間でカバーされる。
【０２６５】
我々は、低頻度の突然変異を検出するために、３０，０００×より多くのカバー深度が必要とされることを見つけた。
実施例６
【０２６６】
実験目標は、汎癌市販キットによってエキソソームサンプル（組み合わせたｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡ）の実現可能性を調査することである（図２６の方法６）。そのキットは、ＦＦＰＥサンプルおよび癌サンプルにおけるＲＮＡ転写産物および融合の検出のために作成された。
【０２６７】
我々は、ｅｘｏＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、および組み合わせたｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡの標的濃縮を調査した。エキソソームサンプルに関する標的濃縮の結果は、使用した汎用ヒト参照ＲＮＡ対照に匹敵している。
表２
【表２】
2019535307.tif 000004
【０２６８】
予想される標的濃縮（標的特異的配列に位置する読み）の範囲は、ｅｘｏＲＮＡ、ｃｆＤＮＡ、および組み合わせたｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡに関して７５％〜９９％である。
【０２６９】
組み合わせたｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡに関してトランスクリプトームに位置する読みのパーセントは３５％〜９５％であり、イントロン領域では８％〜４５％であり、および遺伝子間領域では０．４％〜５％である。
【０２７０】
組み合わせたｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡにおいて、標的の配列塩基は、１つの読みで＞８０％にて完全にカバーされる。
【０２７１】
ｅｘｏＲＮＡとｃｆＤＮＡの組み合わせは、図１７で見られるように、遺伝子あたりのより高い読みカバー率、およびより優れた標的濃縮を提供する。
実施例７
【０２７２】
この試験の目的は：（１）全ＲＮＡＳｅｑデータに対するいろいろな断片化時間の効果；（２）ＤＮアーゼ処理の効果；（３）リボデプレッションの効果；および（４）合成スパイクインの効果、を調査することである。その方法は、先に概説されている長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法１であり、続いて、ＥＸＯ−５０方法を使用して２ｍＬの正常ヒト血漿サンプルからＲＮＡ単離をおこなう。
【０２７３】
通常、サンプルを、ＤＮアーゼ処理に供し、続いて、合成スパイクイン、そして、単回のリボデプレッションステップに供する。サンプルは、表３のとおりである。
表３
【表３】
2019535307.tif 000005
【０２７４】
分析したサンプルのマッピング統計は、図２７〜２８のとおりであり、複製間の一貫性を示す。図２７に関して、すべてのサンプルにおいて、約４０〜５０％の読みがトランスクリプトームに位置することがわかった。
【０２７５】
図２８から明白なように、３０〜４０％の読みが、リボソームＲＮＡに位置し、および４０〜５０％の読みが、タンパク質をコードするＲＮＡに位置する。
【０２７６】
挿入物のサイズ分布は、図２９に示されているように、異なるライブラリの複製間で比較的一貫している。
【０２７７】
トランスクリプトームカバー率もまた、図３０および図３１に示されているように調査する。ライブラリは、１０，０００超のタンパク質コード遺伝子を検出する。タンパク質コード遺伝子は、エキソソームにおいて最も多く、続いて、偽遺伝子およびｌｉｎｃＲＮＡを加工する。
【０２７８】
転写産物カバー率もまた、図３２に示されているとおり、すべてのサンプルおよび複製にわたって比較的一貫している。
【０２７９】
図３３は、合成スパイクイン転写産物の検出限界を実証する。合成スパイクインのダイナミックレンジは５桁を超える。
【０２８０】
図３４は、すべてのライブラリにおいて示される５’から３’への転写産物カバー率を実証する。
実施例８
【０２８１】
この実施例の目的は、長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法３を使用して正常ヒト血漿エキソソームからのＲＮＡＳｅｑライブラリを構築し、そして、（１）増幅サイクルの数；（２）リボデプレッションの効果、を調査することである。その方法は、合成スパイクインを用いた、上述の長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法３であり、続いて、ＥＸＯ−５０方法を使用して２ｍＬの正常ヒト血漿サンプルからＲＮＡ単離をおこなう。
【０２８２】
通常、サンプルを、Ｄワークフロー方法３によるＮアーゼ処理、リボデプレッション、合成スパイクインの添加、逆転写、可変回数の増幅サイクル、そして、さらなる処理（クリーンアップステップを含む）に供する。サンプルを表４のように同定する。
表４
【表４】
2019535307.tif 000006
【０２８３】
分析したサンプルのマッピング統計は、図３５〜３６のとおりである。図３５に示されているように、すべてのサンプルにおいて、読みの大部分が、トランスクリプトームに位置する。
【０２８４】
図３６から明白なように、ライブラリ中のリボソームの読みの最も低い割合は、サンプル１および２で観察され、そして、タンパク質をコードする読みおよびｍｉｓｃ ＲＮＡの読みの最も高い割合もまた、サンプル１および２で観察される。
【０２８５】
挿入物のサイズ分布は、図３７に示されているように、複製の間およびすべてのサンプルの間で非常に一貫している。
【０２８６】
トランスクリプトームカバー率は、図３８に示したように調査する。全体的に見て、トランスクリプトームカバー率は、複製の間およびすべてのサンプルの間で一貫している。
【０２８７】
図３９は、全体的に見て、様々な検出閾値においてサンプル間の遺伝子検出に一貫性があることを示す。
【０２８８】
転写産物カバー率は、全体的に見て、図４０に示した様々な検出閾値においてサンプルの間で一貫している。
【０２８９】
図４１は、＞８０％のカバー率を有する転写産物のサイズを強調する。
【０２９０】
図４２は、サンプル１〜７で観察されたＥＲＣＣスパイクイン検出レベルが、サンプル８〜９のサンプルと異なっていることを実証している。
【０２９１】
図４３は、転写産物全長の比較的一定のカバー率が、長鎖ＲＮＡＳｅｑワークフロー方法３ライブラリを用いて観察され、そしてそれは、複製の間およびサンプルの間で一貫していることを示している。
その他の実施形態
【０２９２】
本発明をその詳細な説明と合わせて記載したが、上述の記載は、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を例示する意図であって、本発明の範囲を限定する意図ではない。その他の態様、利点、および修正は以下の範囲内に含まれる。
参照文献
【化１】
2019535307.tif 000007
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019535307.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019535307.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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