(57)【要約】表皮水疱症及び角膜糜爛の処置のために、コラーゲンＶＩＩを細胞ベース送達するための方法が提供される。本開示は、ケラチノサイトシートまたは角膜細胞シートを含むか、またはあるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになる組成物及び医薬組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の表皮水疱症（ＥＢ）を処置するための方法であって、
皮膚細胞の集団を前記対象から得ること、
全長野生型ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物のインテグレーションにより前記皮膚細胞をエクスビボで修正すること、
遺伝子修正細胞を培養して、ケラチノサイトシートを形成すること、及び
前記ケラチノサイトシートの移植片を皮膚創傷床に移植すること
を含み、
前記皮膚細胞が、前記遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入することにより修正され、形質導入された皮膚細胞のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）が、３以下であり、任意に２、１．５、１、または０．５未満である、方法。
【請求項２】
対象の表皮水疱症（ＥＢ）を処置する皮膚細胞の集団の使用であって、
皮膚細胞の集団が、プロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）を有する形質導入皮膚細胞の集団を得るために、全長野生型ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入することにより修正され、かつ前記形質導入皮膚細胞の集団のＰＧＣＮが、３以下であり、任意に２、１．５、１、または０．５未満である、使用。
【請求項３】
前記ウイルスは、レトロウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、またはレンチウイルスを含む、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである、請求項３に記載の方法または使用。
【請求項５】
前記レトロウイルスは、ＧａｌＶ偽型である、請求項３に記載の方法または使用。
【請求項６】
形質導入された皮膚細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）の放出前基準を満たす、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項７】
創傷は、非修正創傷床ケラチノサイトを含まない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
創傷が、非修正創傷床ケラチノサイトを切除するために処置される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対象は、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）に罹患している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１０】
前記対象は、ヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１１】
ケラチノサイトシートは、ＶＴＥ試験、ＰＧＣＮ試験、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、グラム染色無菌試験、ＬＥＡＥＳ生存率試験、放出後試験、ＲＣＲ試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂ特性決定、電子顕微鏡検査法、免疫電子顕微鏡検査法、免疫蛍光染色、Ｃ７発現、及びＡＦ分析からなる群から選択される１つ以上の試験を受ける、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫蛍光染色は、直接または間接免疫蛍光染色を含む、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
ケラチノサイトシートが、無細胞マトリックス、コラーゲンマトリックス、または生体適合性メッシュ上に配置される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１４】
前記生体適合性メッシュは、熱可塑性樹脂、ポリエチレン、超高分子量のポリエチレン、高分子量のポリオレフィン、非コーティング単繊維ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、シリコン、またはそれらの任意の組み合わせで作製される、請求項１３に記載の方法または使用。
【請求項１５】
前記皮膚細胞は、ケラチノサイトを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１６】
前記皮膚細胞は、幹細胞を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１７】
幹細胞をケラチノサイトに分化することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法または使用。
【請求項１８】
対象の角膜糜爛を処置するための方法であって、
角膜細胞の集団を前記対象から得ること、
全長野生型ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物のインテグレーションにより前記角膜細胞をエクスビボで修正すること、
遺伝子修正細胞を培養して、角膜細胞シートを形成すること、及び
前記角膜細胞シートの移植片を角膜表面に移植すること
を含む、方法。
【請求項１９】
前記角膜細胞は、角膜上皮細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記角膜細胞は、幹細胞を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
幹細胞を角膜上皮細胞に分化させることをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記角膜細胞が、前記遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入することにより修正され、前記ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レトロウイルスは、ＧａｌＶ偽型である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
形質導入された角膜細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下の、任意に２、１．５、１、または０．５未満のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）放出前基準を満たす、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）に罹患している、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象は、ヒトである、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記角膜細胞シートは、ＶＴＥ試験、ＰＧＣＮ試験、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、グラム染色無菌試験、ＬＥＡＥＳ生存率試験、放出後試験、ＲＣＲ試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂ特性決定、電子顕微鏡検査法、免疫電子顕微鏡検査法、免疫蛍光染色、Ｃ７発現、及びＡＦ分析からなる群から選択される１つ以上の試験を受ける、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫蛍光染色は、直接または間接免疫蛍光染色を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記角膜細胞シートが、無細胞マトリックス、コラーゲンマトリックス、または生体適合性メッシュ上に配置される、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記生体適合性メッシュは、熱可塑性樹脂、ポリエチレン、超高分子量のポリエチレン、高分子量のポリオレフィン、非コーティング単繊維ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、シリコン、またはそれらの任意の組み合わせで作製される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
組成物であって、ケラチノサイトシートを含み、前記ケラチノサイトシートが、
対象の皮膚細胞の集団を得る工程、
全長野生型ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物のインテグレーションにより、前記皮膚細胞をエクスビボで修正する工程、及び
遺伝子修細胞を培養して、前記ケラチノサイトシートを形成する工程
を含むプロセスにより調製され、
前記皮膚細胞が、前記遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入することにより修正され、形質導入された皮膚細胞のＰＧＣＮが、３以下である、組成物。
【請求項３３】
前記ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記レトロウイルスは、ＧａｌＶ偽型である、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
形質導入された前記皮膚細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）の放出前基準を満たす、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記対象は、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）に罹患している、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ケラチノサイトシートは、ＶＴＥ試験、ＰＧＣＮ試験、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、グラム染色無菌試験、ＬＥＡＥＳ生存率試験、放出後試験、ＲＣＲ試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂ特性決定、電子顕微鏡検査法、免疫電子顕微鏡検査法、免疫蛍光染色、Ｃ７発現、及びＡＦ分析からなる群から選択される１つ以上の試験を受ける、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記免疫蛍光染色は、直接または間接免疫蛍光染色を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記皮膚細胞は、ケラチノサイトを含む、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記皮膚細胞は、幹細胞を含む、請求項３２〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記幹細胞は、ケラチノサイトに分化する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
医薬組成物であって、ケラチノサイトシートを含み、該ケラチノサイトシートは、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた皮膚細胞を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
前記皮膚細胞は、前記機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする前記遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた幹細胞から分化する、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記皮膚細胞が、対象から得られる、請求項４３または４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
対象は、ＲＤＥＢに罹患している、請求項４３または４４に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
対象は、ヒトである、請求項４３〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質である、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質からの遺伝子改変を含む、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記遺伝子改変は、挿入、欠失、及び／または変異を含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記皮膚細胞または幹細胞が、前記遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入され、前記ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含む、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記レトロウイルスは、ＧａｌＶ偽型である、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
形質導入された皮膚細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たす、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記ケラチノサイトシートは、ＶＴＥ試験、ＰＧＣＮ試験、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、グラム染色無菌試験、ＬＥＡＥＳ生存率試験、放出後試験、ＲＣＲ試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂ特性決定、電子顕微鏡検査法、免疫電子顕微鏡検査法、免疫蛍光染色、Ｃ７発現、及びＡＦ分析からなる群から選択される１つ以上の試験を受ける、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記免疫蛍光染色は、直接または間接免疫蛍光染色を含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
医薬組成物であって、角膜細胞シートを含み、角膜細胞は、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた角膜細胞を含む、医薬組成物。
【請求項５８】
前記角膜細胞は、前記機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする前記遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた幹細胞から分化する、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記角膜細胞が、対象から得られる、請求項５７または５８に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記対象は、ＲＤＥＢに罹患している、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記対象は、ヒトである、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質である、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記角膜細胞または幹細胞が、前記遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入され、前記ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記レトロウイルスは、ＧａｌＶ偽型である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
形質導入された細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たす、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記ＰＧＣＮは、２未満である、請求項６６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般に、表皮水疱症（ＥＢ）及び角膜糜爛を処置するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）は、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子（コラーゲンＶＩＩ、Ｃ７）の変異により引き起こされる、継承される遺伝性水疱形成皮膚疾患であり、Ｃ７機能の欠損をもたらす。この障害を有する患者は、中咽頭、結膜、食道、ならびに泌尿生殖器及び胃腸管の遠位側面を含む皮膚及び粘膜組織の広範囲にわたる水疱形成及び糜爛により特徴付けられる。痛みを伴う水疱形成及び糜爛は、主要な障害であるが、治癒した創傷からの瘢痕は、ミトン手指変形（偽合指症）、眼の瞼球癒着、食道の狭窄、小口症、舌癒着症、及び四肢の狭窄を含む重大な罹患も引き起こす。慢性創傷及び瘢痕化が、浸潤性扁平上皮癌浸潤の素因となり、これは、ＲＤＥＢの重大な問題であり、浸潤性扁平上皮癌は、１０代から始まるこの集団における主な死因である。それ故、この疾患の最適な治療法は、機能障害性瘢痕化の発生を防ぎ、かつ水疱形成を防止するために、早期に実施することができるものであろう。また、皮膚及び粘膜組織の双方を全身的に修正する能力は、ＲＤＥＢ治療アプローチにおいて非常に望ましいであろう。
【０００３】
ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）は、大きなホモ三量体三重らせんコラーゲン分子であり、これは、ＮＣ２末端で逆平行の二量体形成、続いて、アンカリングフィブリルと呼ばれる結合構造への超分子集合を受け、これは、基底膜ゾーン（ＢＭＺ）の緻密層を、真皮乳頭層に連結する。Ｃ７は、大きなＮＣ１ドメインを含有し、これは、緻密層及びコラーゲンドメイン中のラミニン−３３２を結合し、これは、真皮乳頭層内の間質性コラーゲン線維を包み込む。従って、ＲＤＥＢにおけるＣ７の欠如は、真皮乳頭層及び緻密層の間に水疱形成を生じる。
【０００４】
この疾患の分子診断の進歩にもかかわらず、現在の治療法は、緩和ケアに限定されている。Ｃ７に代わるいくつかのアプローチが提案されているが、全ては、限界がある。局所的に適用される場合、ｒＣ７は、無傷の皮膚を透過することができず、損傷領域に制限される。ＲＤＥＢ患者の皮内ｒＣ７タンパク質注射は、別の代替手段である。しかし、通常の針注射からの拡散の制限により、臨床使用にはまだ利用できないｒＣ７マイクロニードルアレイ送達が必要とされる。
【０００５】
治療目的では、Ｃ７の皮膚への局所送達が望ましい。本発明は、この問題を扱う。Ｃ７の全身療法は、全身毒性を引き起こし得る。（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １３５，３０６０−３０６７を参照のこと。）
【発明の概要】
【０００６】
ヒト対象における表皮水疱症（ＥＢ）の処置のための組成物及び方法が提供される。本発明の処置方法では、ヒトケラチノサイトの集団は、野生型ヒトＣ７をコードする遺伝子構築物をインテグレートすることにより、Ｃ７を発現するように操作される。一部の実施形態では、発現レベルは、正常なヒトケラチノサイト発現レベルよりも高い。一部の実施形態では、発現レベルは、正常なヒトケラチノサイト発現レベルよりも小さく、類似しており、または同じである。本発明には、野生型Ｃ７を発現するように、本発明の方法により操作されたケラチノサイトの単離集団が含まれ、これは、医薬単位用量組成物で提供され得る。一部の実施形態では、対象は、表皮水疱症（ＥＢ）を引き起こすＣ７の遺伝的欠陥を抱えるヒトである。実施形態では、遺伝的欠陥は、ＲＤＥＢである。
【０００７】
一部の実施形態では、処置に利用されるケラチノサイトは、自己ケラチノサイトである。エクスビボ操作方法は、限定されないが、レトロウイルス（例えば、ガンマレトロウイルス）、ＡＡＶウイルス、及びレンチウイルスを含む、限定されないが、ウイルスにより引き起こされるもの、または非ウイルスベクター、トランスポゾン、ミニサークルインテグレーション、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムなどを含むウイルスフリーインテグレート法から選択されてもよい。一部の実施形態では、ガンマレトロウイルスは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶもしくはＭｕＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、及び異種マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）を含み、それから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ゲノム編集機能の能力を有するエピソームベクターもしくは組み込みベクターを含み、それから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の実施形態では、ＭＬＶ  ＬＴＲの制御下で機能性ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡを含有するＧＭＰグレードのＧａｌＶ−偽型ＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１ウイルスは、Ｃ７遺伝子をケラチノサイトにインテグレートするために使用される。一部の実施形態では、機能性ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡは、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡである。一実施形態では、機能性ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡは、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡからの遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、ウイルス形質導入は、細胞培養上にウイルス上清を重層することにより実施される。一部の実施形態では、このように処理されたケラチノサイトは、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たす。一部の実施形態では、ＰＧＣＮは、３、１０、２０、４０、または６０を超える。一部の実施形態では、ＰＧＣＮは、２、１．５、１、または０．５未満である。
【０００８】
一部の実施形態では、内在性変異、機能不全、または短縮型Ｃ７遺伝子は、本明細書に記載されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（または該ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムをコードするベクター）及び標的とする切断後に、遺伝子に挿入される「ドナー」配列（例えば、機能性ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡまたはＣ７遺伝子）を使用して置換される。
【０００９】
本発明の一部の実施形態では、ＥＢの処置のための方法が提供され、方法は、ＥＢに罹患する対象由来のケラチノサイト集団を得ること、野生型ヒトＣ７を発現するように、レトロウイルス形質導入によりケラチノサイトを改質すること、及びケラチノサイトを個体に再導入することを含み、それから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、血清を含むか、または含まないケラチノサイト培地中、インビトロで培養される皮膚パンチ生検から得られる。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、細胞のフィーダー層を有するか、または有さない培地中で培養される。表皮は、真皮層から分離され、ケラチノサイトは、表皮層から得られる。少なくとも約１０6 個の細胞、少なくとも約２×１０6 個、及び／または少なくとも４×１０6 個の細胞は、遺伝子修正細胞の集団を提供するために形質導入に使用される。細胞は、移植のための約２５ｃｍ2 〜約１００2 ｃｍのシートを生成するように培養される。遺伝子修正ケラチノサイトシートは、扁平上皮癌（ＳＣＣ）の臨床所見がない感染してない、糜爛した、及び／または瘢痕化した創傷部位上に配置される。創傷部位は、約５０ｃｍ2 、約１００ｃｍ2 、及び／または約２００ｃｍ2 からであってよい。一部の実施形態では、移植片のための創傷が生成される。一部のこのような実施形態では、創傷は、残存する非修正創傷床ケラチノサイトを切除するために電気焼灼される。移植片は、創傷床の調製後に溶解可能な縫合糸により創傷床に固定される。
【００１０】
別の実施形態では、本開示は、ＥＢの症状を低減するために有効な用量で野生型ヒトＣ７を発現するように遺伝子修正ケラチノサイトの集団を含むか、それから本質的になるか、またはそれからさらになる組成物、及び薬学的に許容される担体を提供する。本開示の一態様では、組成物は、凍結される。一部の実施形態では、ケラチノサイトは、処置のために選択された個体に対して自己である。
【００１１】
別の実施形態では、本開示は、ケラチノサイトシートを含むか、それから本質的になるか、またはそれからさらになる医薬組成物を提供し、これは、機能性ＣＯＬ７  Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた皮膚細胞を含み、それから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の実施形態では、ケラチノサイトシートは、生物工学により製造された皮膚同等物上に配置される。一部の実施形態では、ケラチノサイトシートは、無細胞マトリックス、コラーゲンマトリックス、ＥＣＭタンパク質、もしくは化学層、または生体適合性メッシュ上に配置される。一実施形態では、無細胞マトリックスは、ヒト及び／または動物の真皮から作製される。一部の実施形態では、生体適合性メッシュは、熱可塑性樹脂、ポリエチレン、超高分子量のポリエチレン、高分子量のポリオレフィン、非コーティング単繊維ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、シリコン、またはそれらの任意の組み合わせで作製される。
【００１２】
本明細書では、自己ＲＤＥＢケラチノサイトを皮膚生検から単離し、機能性（例えば、全長）ヒトＣＯＬ７Ａ１を有するレトロウイルスで形質導入した。各対象では、自己表皮シート（約３５ｃｍ2 ）を製造し、調製した創傷床に移植した。エンドポイントは、ベースラインと比較した創傷治癒のパーセントとしての安全性、有効性、及び移植の３ヶ月後及び６ヶ月後でのＣ７発現の形跡を含んでいた。全ての移植片は、全ての対象により十分に忍容され、重大な有害事象（全身ウイルス感染、自己免疫、移植片内の皮膚癌の発生）は、報告されなかった。３〜６ヶ月で、移植片の大部分は、７５％の治癒を示した。移植部位の生検は、正常なアンカリングフィブリル存在下の、３ヶ月及び６ヶ月の真皮−表皮接合部に強力なＣ７発現を示した。ＣＯＬ７Ａ１エクスビボ遺伝子導入は、好ましい安全性プロファイルを有しており、継承ＲＤＥＢを有する対象における有望な有効性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ａは、ＲＤＥＢ遺伝子修正フローチャートを示し、ＫＣ−表皮ケラチノサイト、ＬＥＡＥＳ−ＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１で操作された自己表皮シート移植片を表す。Ｂは、ＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１ウイルスを形質導入したＲＤＥＢ  ＫＣの間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンポリクローナル抗体（オレンジ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）を表し、スケールバーは１００μｍである。Ｃは、４人のＲＤＥＢ対象の修正ＫＣにおけるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）の定量化を示す。Ｄは、４人のＲＤＥＢ対象の修正ＫＣにおける平均プロウイルスコピー数（ＰＧＣＮ）の定量化を示す。Ｅは、移植片の移植前及び移植後のＲＤＥＢ表現型の臨床表示を示し、ＬＥＡＥＳ移植の３ヶ月前及び６ヶ月前と比較した、修正皮膚移植前及び未処置の創傷における水疱に注意する。Ｆは、皮膚移植片におけるＶＩＩ型コラーゲン発現のＩＩＦ分析を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ２  Ｍａｂ  ＬＨ２４及びＮＣ１  Ｐａｂ  ＦＮＣ１（緑色）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）、修正組織移植片の真皮−表皮接合部におけるＶＩＩ型コラーゲンの線状緑色染色に注意し、スケールバーは１００μｍである。Ｇは、修正ＲＤＥＢ皮膚移植片の免疫ＥＭ分析を示し、組織切片を、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ２  Ｍａｂ  ＬＨ２４、続いて、抗マウスＩｇＭコンジュゲートイムノゴールド粒子（黒い点、矢印で示す）で一括して標識しており、スケールバーは２００ｎｍである。
【図２】第Ｉ相試験における対象の登録のＣＯＮＳＯＲＴ図である。
【図３】ＮＣ１ドメインに特異的な抗ＶＩＩ型コラーゲンポリクローナル抗体を使用した培養ＫＣ上清のウェスタンブロット分析を示し、試験に登録された全ての対象においてＮＣ１ドメインを含有する短縮型Ｃ７タンパク質発現に注目する。
【図４】収穫前の成熟ＬＥＡＥＳ、アセンブリされた最終のＬＥＡＥＳ移植片を示す。
【図５】Ａは、移植片の移植前及び移植後のＲＤＥＢ表現型の臨床表示を示す。Ｂは、皮膚移植片におけるＶＩＩ型コラーゲン発現のＩＩＦ分析を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ２  Ｍａｂ  ＬＨ２４（緑色）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）、ケラチン１４（抗Ｋ１４  Ｐａｂ、オレンジ）、ケラチン１（抗Ｋ１  Ｐａｂ、オレンジ）、及びロリクリン（抗ロリクリンＰａｂ、オレンジ）を表し、全時点での修正組織移植片の真皮−表皮接合部でのＶＩＩ型コラーゲンの線状緑色染色に注意し、スケールバーは１００μｍである。
【図６】Ａは、移植前及び移植後の対象２の創傷、移植片の移植前及び移植後のＲＤＥＢ表現型の臨床表示を示す。Ｂは、移植前及び移植後の対象２の創傷、皮膚移植片におけるＶＩＩ型コラーゲン発現のＩＩＦ分析を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ２  Ｍａｂ  ＬＨ２４（緑色）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）、ケラチン１４（抗Ｋ１４  Ｐａｂ、オレンジ）、ケラチン１（抗Ｋ１  Ｐａｂ、オレンジ）、及びロリクリン（抗ロリクリンＰａｂ、オレンジ）を表し、３ヶ月後の修正組織移植片の真皮−表皮接合部におけるＶＩＩ型コラーゲンの線状緑色染色に注意し、スケールバーは１００μｍである。
【図７】Ａは、移植前及び移植後の対象３の創傷、移植片の移植前及び移植後のＲＤＥＢ表現型の臨床表示を示す。Ｂは、移植前及び移植後の対象３の創傷、皮膚移植片におけるＶＩＩ型コラーゲン発現のＩＩＦ分析を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ２  Ｍａｂ  ＬＨ２４（緑色）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）、ケラチン１４（抗Ｋ１４  Ｐａｂ、オレンジ）、ケラチン１（抗Ｋ１  Ｐａｂ、オレンジ）、及びロリクリン（抗ロリクリンＰａｂ、オレンジ）を表し、全時点での修正組織移植片の真皮−表皮接合部でのＶＩＩ型コラーゲンの線状緑色染色に注意し、スケールバーは１００μｍである。
【図８】Ａは、移植前及び移植後の対象４の創傷、移植片の移植前及び移植後のＲＤＥＢ表現型の臨床表示を示す。Ｂは、移植前及び移植後の対象４の創傷、皮膚移植片におけるＶＩＩ型コラーゲン発現のＩＩＦ分析を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ２  Ｍａｂ  ＬＨ２４（緑色）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）、ケラチン１４（抗Ｋ１４  Ｐａｂ、オレンジ）、ケラチン１（抗Ｋ１  Ｐａｂ、オレンジ）、及びロリクリン（抗ロリクリンＰａｂ、オレンジ）を表し、ＬＨ２４  Ｍａｂを用いた３ヶ月での修正組織移植片及びＮＣ１  Ｐａｂを用いた６ヶ月での修正組織移植片の真皮−表皮接合部でのＶＩＩ型コラーゲンの線状緑色染色に注意し、スケールバーは１００μｍである。
【図９】抗Ｃ７  ＬＨ２４モノクローナル抗体の特性決定を示し、ＮＣ２ドメインを含有するカルボキシル末端ペプチドに対するＬＨ２４  Ｍａｂ交差反応性を示す酵素的に消化されたＣ７のウェスタンブロット分析を示し、ＮＣ２特異的ｐＡｂ（ＮＣ２−１０）５で確認されたペプシンで消化されたＣ７画分中のＮＣ２ドメインの存在を表し、ＦＮＣ１  ｐＡｂ  ６を使用して同定されたコラゲナーゼで消化されたＣ７画分中のＮＣ１ドメインを表す。
【図１０】対象４の非修正創傷の臨床表示、未処置創傷における特徴的な自発的な水疱発生を示す。
【図１１】Ａは、対象４の、血清ＶＩＩ型コラーゲンに対する血清反応性、移植片の移植前及び移植後（３ヶ月）の対象４血清の全長Ｃ７に対する交差反応性を示すウェスタンブロット分析を示す。Ｂは、対象４の、血清ＶＩＩ型コラーゲンに対する血清反応性を示し、移植前及び移植の３ヶ月後に得られた対象４の血清は、ＮＣ２ドメインを含有する酵素的に（ペプシンで）消化されたＣ７タンパク質に特異的であり、対照（右レーン）は、ＮＣ２特異的Ｐａｂ（ＮＣ２−１０）５を使用して消化されたＣ７画分中のＮＣ２ドメインの存在を確認する。
【図１２】移植前及び移植の１２ヶ月後の対象１の創傷、ベースライン及び移植の１２ヶ月後における創傷の臨床表示、皮膚移植片におけるＶＩＩ型コラーゲン発現のＩＩＦ分析を示し、抗ＶＩＩ型コラーゲンＮＣ１  Ｐａｂ（緑色）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核（青色）、ケラチン１４（抗Ｋ１４  Ｐａｂ、オレンジ）、ケラチン１（抗Ｋ１  Ｐａｂ、オレンジ）、及びロリクリン（抗ロリクリンＰａｂ、オレンジ）を表し、修正組織移植片の真皮−表皮接合部におけるＶＩＩ型コラーゲンの線状緑色染色に注意し、スケールバーは１００μｍである。
【図１３】ｐＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１レトロウイルスプラスミドのマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、及び試薬に限定されず、そのようなものであるから、変動し得ることを理解すべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解すべきである。
【００１５】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示がない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞」についての言及は、複数のこのような細胞を含み、「培養物」についての言及は、当業者らに既知の１つ以上の培養物及びその同等物についての言及を含む。本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、別途明示がない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１６】
本方法、装置、及びシステムのいずれかの任意の実施形態は、記載の工程及び／または機能を−含む／含む／含有する／有するよりはむしろ−それからなり、またはそれから本質的になり得る。従って、請求項のいずれかでは、「からなる」または「から本質的になる」という用語は、制約がない連結動詞を別途使用しているものから、所与の請求項の範囲を変更させるために、上に引用された制約がない連結動詞のいずれかと置換され得る。
【００１７】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示されない限り、「及び／または」を意味するために使用され、または、代替物は、互いに排他的である。但し、本開示は、代替物及び「及び／または」のみを指す定義をサポートする。
【００１８】
本出願の全体にわたって、「約」という用語は、値を決定するために用いられている装置または方法の誤差の標準偏差を、値が含むことを示すために使用される。
【００１９】
本発明の操作されたケラチノサイトでの処置のための目的の状態は、後天性及び先天性形態を含む種々の形態の表皮水疱症を含むが、これらに限定されず、これらのうちの後者は、劣性または優性であってよい。
【００２０】
最近の分類システムに基づいて、栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）は、３つの亜型：劣性ＤＥＢ、重度の全身性（ＲＤＥＢ−ｓｅｖ  ｇｅｎ）（以前はＨａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ型（ＲＤＥＢ−ＨＳ）と呼ばれていた）、劣性ＤＥＢ、他の全身性（ＲＤＥＢ−Ｏ）（以前は非Ｈａｌｌｏｐｅａｕ−Ｓｉｅｍｅｎｓ型（非ＨＳ型ＲＤＥＢ）と呼ばれていた）、及び優性ＤＥＢ（ＤＤＥＢ）を含む。ＲＤＥＢ−ｓｅｖ  ｇｅｎでは、全身に影響を及ぼす水疱は、新生児期に存在し得る。口腔病変は、口の水疱形成、舌の口底部への融合、及び口腔のサイズの漸進的な縮小をもたらし得る。食道糜爛は、重度の嚥下障害を引き起こす可能性があるウェブ及び狭窄につながる可能性がある。従って、重度の栄養不足及び２次的な問題が一般的である。角膜糜爛は、瘢痕化及び視力喪失につながる可能性がある。手及び足の水疱形成、続く、瘢痕は、指趾を融合して、この疾患の特質である「ミトン」の手及び足になる。積極的な扁平上皮癌の生涯リスクは、９０％を超える。ＤＤＥＢでは、水疱形成は多くの場合、軽度であり、手、足、膝、及び肘に限定されるが、それにもかかわらず、瘢痕化を伴って治癒する。ジストロフィー爪、特に、足の爪は、一般的であり、ＤＤＥＢの唯一の症状であり得る。
【００２１】
創傷被覆材及び栄養補助を含む、症状の通常の処置は、主に有効である。作業療法は、手の拘縮を予防するために役立ち得る。指の外科的解放は多くの場合、繰り返される必要がある。
【００２２】
野生型Ｃ７を発現するように操作されたケラチノサイトは、栄養障害型表皮水疱症の治療での使用を見出すことができる。
【００２３】
遺伝性形態のＥＢに加えて、後天性形態の表皮水疱症（ＥＢＡ）は、ＶＩＩ型コラーゲンにおける病状を含み、本開示の操作されたケラチノサイトで処置され得る。ＥＢＡ患者において循環血中の自己抗体は、ＶＩＩ型コラーゲン分子中のエピトープを認識し、ＶＩＩ型コラーゲンｃＤＮＡの分子クローニングは、ＶＩＩ型コラーゲンのアミノ末端ＮＣ−１ドメイン内で優性な免疫エピトープを同定するツールを提供している。ＮＣ−１（ＶＩＩ）ドメインの抗原特性は、後天性形態のＥＢを有する患者の皮膚のＶＩＩ型コラーゲンをマッピングするために臨床的に使用されているＨ３Ａ及びＬ３Ｄなどのモノクローナル抗体がタンパク質のこの部分のエピトープも同定するという事実によりさらに強調される。ＥＢＡにおけるＶＩＩ型コラーゲンエピトープを認識する循環血中の自己抗体に加えて、全身性エリテマトーデスを有する一部の患者における水疱性病変は、抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体とも関連している。
【００２４】
コラーゲン
本明細書中で使用される場合、「コラーゲン」という用語は、存在するタンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上が、三重らせん立体配置のコラーゲンである組成物を指す。個々のα鎖の三重らせん立体配座へのフォールディングは、繰り返しのＧｌｙ−Ｘ−Ｙ三重項配列を含む特徴的な１次配列に基づく。コラーゲンは広く、脊椎動物種で見出され、多くの異なる種のために配列が決定されている。種間の、例えば、哺乳動物種間の、高度の配列類似性に起因して、異なる種由来のコラーゲンは、生物学的目的のために使用することができる。但し、ヒトタンパク質が好まれ得る。
【００２５】
ＦＡＣＩＴコラーゲン（中断された三重らせんを有する線維関連コラーゲン）は、ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＩＸ、ＸＸ、及びＸＸＩ型を含む。後者の型のコラーゲンのいくつかは、より大きなコラーゲン線維と関連し、会合し、分子ブリッジとして機能し、細胞外マトリックスの構成を安定化させる。コラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１、染色体３、ＮＣ＿０００００３．１０（４８５７６５１０．．４８６０７６８９、補体））は特に興味深い。ＶＩＩ型コラーゲンは、アンカリングフィブリルの主要構成成分である。
【００２６】
ＶＩＩ型コラーゲンは、隣接非コラーゲン配列を有する長い４２４ｎｍの三重らせんドメインである。ＶＩＩ型コラーゲン分子は、非コラーゲンＮＣ−１及びＮＣ−２ドメインが隣接する主要コラーゲン、トリプルヘリックスセグメントを含む。間質性コラーゲンとは異なり、繰り返しのＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ反復配列中のアミノ酸の挿入または欠失に起因する１９個の欠陥により中断される。最も顕著であるのは、三重らせんドメインの中央には、３９アミノ酸の非コラーゲン「ヒンジ」領域があり、これは、ペプシンを用いるタンパク質分解消化に感受性がある。サイズが約１４５ｋＤａのＶＩＩ型のアミノ末端ＮＣ−１ドメインは、軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）と相同性を有するセグメント、９つの連続したフィブロネクチンＩＩＩ型様（ＦＮ−ＩＩＩ）ドメイン、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子のＡドメインと相同性を有するセグメント、ならびに短いシステイン及びプロリンリッチ領域を含む既知の接着タンパク質と相同性を有するサブモジュールを含む。カルボキシ末端の非コラーゲンドメインであるＮＣ−２は、約３０ｋＤａと比較的小さく、それは、Ｋｕｎｉｔｚプロテアーゼインヒビター分子と相同性を有するセグメントを含有する。
【００２７】
ヒトＶＩＩ型コラーゲン遺伝子であるＣＯＬ７Ａ１は、合計１１８個の別々のエクソンを有する複雑な構造を有する。しかし、遺伝子は、比較的コンパクトであり、イントロンの大部分は、比較的小さい。従って、ヒトＣＯＬ７Ａ１遺伝子全体のサイズは、約８．９ｋｂのメッセンジャーＲＮＡをコードする、わずか約３２ｋｂである。ＣＯＬ７Ａ１は、ヒト３番染色体の短腕である領域３ｐ２１．１にマッピングされている。ＶＩＩ型コラーゲン遺伝子構造及びタンパク質のコードされた１次配列は、よく保存され、例えば、マウス遺伝子は、ヌクレオチドで８４．７％の相同性及びタンパク質レベルで９０．４％の同一性を示す。
【００２８】
ＶＩＩ型コラーゲンは、培養中の表皮ケラチノサイト及び皮膚線維芽細胞の双方により合成される。完全なプロα１（ＶＩＩ）ポリペプチドの合成時に、３つのポリペプチドは、コラーゲン部分がフォールドして三重らせんが形成される三量体分子にカルボキシ末端の端部を介して会合する。次いで、三重らせん分子は、細胞外環境に分泌され、２つの種類のＶＩＩ型コラーゲン分子はアラインメントして逆平行二量体になり、アミノ末端ドメインは、分子の両端に存在する。この二量体アセンブリは、ＶＩＩ型コラーゲン分子の双方のカルボキシ末端の一部をタンパク質分解的除去及び分子間ジスルフィド結合形成による安定化を伴う。続いて、多数のこれらの逆平行二量体は、横方向に凝集してアンカリングフィブリルを形成する。
【００２９】
優性栄養障害型表皮水疱症（ＤＤＥＢ）において、ＣＯＬ７Ａ１の三重らせんドメイン（特に、エクソン７３、７４、及び７５）のグリシン置換変異が優勢である。変異ｐ．Ｇｌｙ２０３４Ａｒｇ及びｐ．Ｇｌｙ２０４３Ａｒｇは、最も一般的なＤＤＥＢを引き起こす変異であり、最大の米国コホートで報告された優性変異の５０％を占める。グリシン置換ならびにこの領域外の他のアミノ酸置換及びスプライス接合変異は、優性ＤＥＢにも見出され得る。
【００３０】
全形態のＤＥＢについて、遺伝子全体にわたる４００を超える劣性ＤＥＢを引き起こす変異が記載されている。しかし、各変異は、変異の総数の１％〜２％以下を占める。グリシン置換及び他のアミノ酸置換が記載されているが、ＲＤＥＢでは、ヌル変異が優勢である。より軽度の形態のＲＤＥＢは多くの場合、スプライス接合部変異または他のミスセンス変異により引き起こされる。
【００３１】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、本明細書に記載の方法に従って組み換え手段により生成することができる。従って、天然配列ポリペプチドは、例えば、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または他の任意の哺乳動物種由来のポリペプチドなどのアミノ酸配列を有することができる。「天然配列コラーゲンＶＩＩタンパク質」という用語は、開始Ｎ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を有するか、または有しない天然のタンパク質を含む。
【００３２】
「多様体」ポリペプチドは、天然配列ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する、以下に定義されるような生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような多様体は、１つ以上のアミノ酸残基が、天然の配列のＮ末端もしくはＣ末端で、または天然の配列内で添加されるポリペプチドを含み、約１〜４０のアミノ酸残基が欠失され、かつ１つ以上のアミノ酸残基により任意に置換されるポリペプチド、及び得られる産物が天然に存在しないアミノ酸を有するように、アミノ酸残基が共有結合的に修飾されている上記ポリペプチドの誘導体を含む。通常、生物学的に活性なコラーゲンＶＩＩ多様体は、天然配列コラーゲンＶＩＩポリペプチドと少なくとも約９０％、好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。
【００３３】
天然配列コラーゲンであるＶＩＩポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列コラーゲンＶＩＩポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」は、天然配列のフラグメントならびに天然配列コラーゲンＶＩＩポリペプチドの誘導体及びそのフラグメントを含むが、これらに限定されない。但し、それらは、対応する天然配列コラーゲンＶＩＩポリペプチドと共通の生物学的活性を有する。「誘導体」という用語は、コラーゲンＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列多様体及びその共有結合修飾物の双方を包含する。
【００３４】
「創傷床」という用語は、創傷の生存可能な一番上の層を指す。一実施形態では、創傷床は、スラフまたはエスカーで覆われる。別の実施形態では、創傷床は、肉芽組織線維スラフ、エスカー、骨、腱、及び／または他の下にある構造体の存在について評価することができる。
【００３５】
「ウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）試験」という用語は、ウイルスを形質導入した細胞数の、形質導入を受けた全細胞数に対する比率を測定するための試験である。一実施形態では、ＶＴＥは、形質導入されたウイルス上で発現されるタンパク質を標的とする抗体を用いる蛍光抗体染色により測定される。別の実施形態では、ＶＴＥは、リアルタイムＰＣＲまたは定量ＰＣＲにより測定される。
【００３６】
「プロウイルスゲノムコピー数」または「ＰＧＣＮ」という用語は、ウイルス形質導入細胞におけるプロウイルスＤＮＡコピーの数を指す。従って、ＰＧＣＮ試験は、ウイルス形質導入または感染後の細胞におけるプロウイルスＤＮＡのコピーの数を測定する。一実施形態では、コピー数は、リアルタイムＰＣＲまたは定量ＰＣＲにより測定される。別の実施形態では、ＰＧＣＮは、サザンブロットまたはハイスループット法により測定される。一部の実施形態では、ＰＧＣＮは、３、２、１、０．５未満である。一部の実施形態では、ＰＧＣＮは、３、１０、１００、または１，０００を超える。
【００３７】
「無菌試験」という用語は、試料中の生存可能な汚染微生物の有無を明らかにするために試みられる試験を指し、多くの場合、偽陽性の結果を排除するために使用される。一実施形態では、偽陽性の結果は、環境からの汚染または誤差に起因して生じる。
【００３８】
「エンドトキシン」という用語は、限定されないが、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、及びＶｉｂｒｉｏ種を含む特定のグラム陰性細菌の外膜に関連する毒素を指す。一実施形態では、エンドトキシンは、分泌されないが、細胞が破壊されるときにのみ放出される。エンドトキシンは、ゲル−クロット法、発色法、比濁法、またはそれらの組み合わせにより測定または試験することができる。
【００３９】
「マイコプラズマ」という用語は、細菌が特定の種類の抗生物質により影響を受けにくいように、または影響を受けないように、細胞膜の周りの細胞壁を欠いている細菌の集団を指す。マイコプラズマ試験は、寒天及びブロッティング手順、ＤＮＡ検出、酵素、及びＥＬＩＳＡ法、ならびにＰＣＲを含むが、これに限定されない。
【００４０】
「グラム染色無菌試験」という用語は、試料中の細菌及び／または真菌を検出するための手順を指す。一実施形態では、グラム染色滅菌試験は、試料中の細菌または真菌の存在もしくは不存在、及び／またはそれらの一般的な種類を示すことができる。
【００４１】
「生存率試験」という用語は、器官、細胞、または組織が生存率を維持または回復する能力を決定する試験を指し、これは、器官、細胞、または組織の機械的活性、運動性、収縮性、有糸分裂活性を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１で操作された自己表皮シート（ＬＥＡＥＳ）生存率試験は、ＬＥＡＥＳ上の細胞または組織が生存率を維持または回復する能力を試験することである。
【００４２】
本開示では、「複製能力があるレトロウイルス（ＲＣＲ）」という用語は、レトロウイルスベクターが複製欠損であるように設計されている場合であっても、複製することが可能なレトロウイルスを指す。一実施形態では、ＲＣＲは、プロデューサー細胞内の導入ベクターのパッケージング構成要素及び内在性レトロウイルスエレメントの間の相同または非相同組み換えにより、製造中に生成される。ＲＣＲ試験は、試料中のＲＣＲを検出することである。
【００４３】
「細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ」という用語は、細胞媒介性免疫機能を評価するためのアッセイを指す。
【００４４】
本開示における「放出後試験」という用語は、限定されないが、無菌試験、ＲＣＲ試験、マイコプラズマ試験、生存率試験、及びグラム染色無菌試験を含む、表皮シートがプレートから放出された後の１つ以上の試験を指す。
【００４５】
「遺伝子改変」という用語は、生体の遺伝子を変更するか、または遺伝子を１つの生物から別の生物に挿入するプロセスを指す。一実施形態では、遺伝子改変は、挿入、欠失、及び／または変異を含み、それから本質的になり、またはそれからさらになる。「挿入」という用語は、１つ以上のヌクレオチド塩基対をヌクレオチド配列に付加することを意味する。「欠失」という用語は、除去されるか、または欠損している染色体またはヌクレオチド配列の一部を指す。「変異」という用語は、ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ配列）の変更である。変異は、限定されないが、染色体の単一塩基対（すなわち、点変異）、いくつかの塩基対、または多くとも大きなセグメントを含む種々のサイズで生じる可能性がある。
【００４６】
「保存的遺伝子改変」という用語は、遺伝子改変された遺伝子によりコードされるポリペプチドの、同じまたは類似の生化学的特性を維持する遺伝子改変を指す。例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸の双方は共に、負に荷電した小さな残基である。一部の実施形態では、それは、ポリペプチド中でアスパラギン酸をグルタミン酸に変異させることによる保存的遺伝子改変である。
【００４７】
プロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４ＨＡ；ＥＣ  １．１４．１１．２）は、コラーゲン合成において中心的な役割を果たす。それは、ペプチド連結におけるプロリン残基のヒドロキシル化により、コラーゲン中の４−ヒドロキシプロリンの形成を触媒する。４−ヒドロキシプロリン残基は、新たに合成されたプロコラーゲンポリペプチド鎖の三重らせん分子へのフォールディングに必須である。活性酵素は、約２４０，０００の分子量を有する２αサブユニット及び２βサブユニットの四量体である。βサブユニット（Ｐ４ＨＢ）は、酵素ジスルフィドイソメラーゼ（ＥＣ  ５．３．４．１）及び主要な細胞甲状腺結合タンパク質と同一である。αサブユニットは、酵素の触媒部位の大部分に関与する。ポリペプチドは、５１７アミノ酸残基及び１７アミノ酸のシグナルペプチドである。
【００４８】
Ｐ４ＨＡ遺伝子は、６９キロベースを超えて包含し、１６エクソンからなる。遺伝子のＲＮＡ転写物の相互に排他的な選択的スプライシングのための証拠が以前に提示されていた。本データは、ｍＲＮＡに見出される相互に排他的な配列が、２つの連続した相同の７１ｂｐエクソン９及び１０によりコードされることを示した。これらのエクソンは、最初の５塩基対で同一であり、それらの間の全体的な同一性は、ヌクレオチドレベルが６１％であり、コードされたアミノ酸のレベルが５８％である。双方の種類のｍＲＮＡは、研究された全ての組織において発現されることが見出されたが、一部の組織では、エクソン９またはエクソン１０配列をコードする種類は、他の種類よりも豊富であった。
【００４９】
「核酸構築物」とは、天然には一緒には見出されない１つ以上の機能性単位を含むように構築されている核酸配列を意味する。例としては、環状、線状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（λファージ由来のＣＯＳ配列を含有するプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが挙げられる。
【００５０】
本方法では、コラーゲンＶＩＩは、通常は、ウイルス発現構築物を、インテグレート時に、細胞集団に導入することにより生成される。コラーゲンＶＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡは、種々の供給源から調製された、コラーゲンＶＩＩポリペプチドｍＲＮＡを発現する組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得られ得る。コラーゲンＶＩＩポリペプチドコード遺伝子も、ゲノムライブラリーから、またはオリゴヌクレオチド合成により得られ得る。遺伝子コードを特定する別の手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである。
【００５１】
コラーゲンＶＩＩポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、発現のために必要な要素に作動可能に連結される発現のための構築物に挿入される。多くのこのような構築物が、利用可能である。構成要素は一般に、次のコード配列、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に導入することが可能である。例えば、ベクターは、標的細胞において発現されることが可能なコード配列を含み得る。本発明の目的では、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」は一般に、目的の遺伝子の発現を導くことが可能な任意の核酸構築物を指し、これは、目的の遺伝子を標的細胞に導入することに有用である。従って、この用語は、クローニング及び発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。
【００５３】
「発現カセット」は、目的の遺伝子／コード配列ならびに非翻訳ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを含む任意のＲＮＡ転写物の発現を導くことが可能な任意の核酸構築物を含む。このようなカセットは、発現カセットを標的細胞に導入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」に構築することができる。従って、用語は、クローニング及び発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００５４】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、「作動可能に連結される」。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつ読み取り段階にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、都合がよい制限部位での連結により達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、通常の実施に従って使用される。
【００５５】
発現ベクターは、自己白血球、またはｍＲＮＡの発現のための宿主細胞により認識され、かつコラーゲンＶＩＩコード配列に作動可能に連結されるプロモーターを含有するであろう。プロモーターは、作動可能に連結される特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する（一般に約１００ｂｐ〜１０００ｂｐ内の）構造遺伝子の開始コドンの上流（５′）に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは通常は、２つのクラスである誘導性及び構成性に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくつかの変化、例えば、栄養素の有無、または温度の変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。様々な潜在的宿主細胞により認識される多数のプロモーターは、周知である。異種プロモーターは、一般により大きな転写及びより高い収量を可能にするので、好ましい。
【００５６】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、または免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御され得る。但し、このようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性がある。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。
【００５７】
高等真核生物による転写は多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は約１０ｂｐ〜３００ｂｐであり、これは、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、相対的な配向性及び位置独立性であり、イントロン内及びコード配列自体内の転写ユニットの５′及び３′に見出されている。ここで、多くのエンハンサー配列は、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）から知られている。しかし、通常は、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例としては、複製起点の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の５′または３′の位置で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５′の部位に位置する。
【００５８】
真核宿主細胞で使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。このような配列は一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５′及び場合により３′非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。
【００５９】
発現カセットの細胞へのインテグレーションのためのベクター及びシステムは、当該技術分野で知られており、限定されないが、レトロウイルスベクターを含み得る。外来遺伝子を標的哺乳動物細胞に導入するために有用な多くのベクターは、利用可能である。レトロウイルス系ベクターは特に有用であることが示されている。レトロウイルス及び適切なパッケージング株の組み合わせが使用されてもよく、キャプシドタンパク質は、標的細胞を感染させるために機能するであろう。通常、細胞及びウイルスは、培地中で少なくとも約２４時間インキュベートされる。次いで、細胞は、一部の用途では、短い間隔で、例えば、２４〜７３時間、または少なくとも２週間、培地中で成長させ、分析前に、５週間以上成長させ得る。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥があり」、すなわち、生産的感染に必要なウイルスタンパク質を生成することができない。ベクターの複製は、パッケージング細胞株における成長を必要とする。
【００６０】
レトロウイルスの宿主細胞特異性は、エンベロープタンパク質、ｅｎｖ（ｐ１２０）により決定される。エンベロープタンパク質は、パッケージング細胞株により提供される。エンベロープタンパク質は、少なくとも３つの種類、エコトロピック、アンフォトロピック、及びゼノトロピックである。アンホトロピックエンベロープタンパク質、例えば、４０７０Ａ（Ｄａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ、上掲）を有するレトロウイルスは、ヒト、イヌ、及びマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型に感染することが可能である。アンフォトロピックパッケージング細胞株は、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１Ｂ４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５Ｂ２９０２）；ＧＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：６４６０Ｂ６４６４）を含む。ゼノトロピックエンベロープタンパク質、例えば、ＡＫＲ  ｅｎｖと共にパッケージされたレトロウイルスは、マウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型に感染することが可能である。レトロウイルスの５′及び３′末端の配列は、長い末端反復（ＬＴＲ）である。ＭＭＬＶ−ＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＡＫＲ−ＬＴＲ、ＦＩＶ−ＬＴＲ、ＡＬＶ−ＬＴＲなどを含むＬＴＲ配列の数は、当該技術分野で既知であり、使用され得る。５′ＬＴＲは、強力なプロモーターとして作用し、標的細胞ゲノムへのインテグレーション後に導入された遺伝子の転写を引き起こす。
【００６１】
ケラチノサイト
新たに収集した初代ケラチノサイトは、皮膚パンチ生検から収集され、単離され、培養期間後に形質導入されて、ケラチノサイトを真皮細胞から単離し得る。インビトロで増殖した上皮ケラチノサイトは、シートを形成することができる。一部の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞が形質導入された時点から約１〜１００日、１〜５０日、１〜２０日、１〜１０日、１〜５日、１〜３日、１〜２日、または１日以内に患者に投与される。
【００６２】
当業者に知られているように、様々な培地のいずれかは、本方法において使用され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，２０００−２００９  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。実例となる培地は、ケラチノサイト培地も含まれるが、これに限定されず、これは、無血清であることがあり、適切なケラチノサイトサプリメントを含有し得る。
【００６３】
本開示は、対象における表皮水疱症（ＥＢ）を処置する方法を提供し、方法は、対象の皮膚細胞の集団を得ること、機能性（例えば、全長野生型）ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物のインテグレーションにより皮膚細胞をエクスビボで修正すること、遺伝子修正細胞を培養して、ケラチノサイトシートを形成すること、及びケラチノサイトシートの移植片を皮膚創傷床に移植することを含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。本開示はまた、対象の表皮水疱症（ＥＢ）を処置する皮膚細胞の集団の使用にも関し、皮膚細胞の集団は、プロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）を有する形質導入皮膚細胞の集団を得るために、全長野生型ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入することにより修正され、皮膚細胞の形質導入された集団のＰＧＣＮは、３以下である。一部の実施形態では、遺伝子修正細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地及びＦ１２培地を含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになるＤＦＦ３１培地中で培養される。一実施形態では、皮膚細胞は、発現構築物を含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになるウイルスで形質導入することにより修正され、ウイルスは、レトロウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、またはレンチウイルスを含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。別の実施形態では、レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである。一実施形態では、レトロウイルスは、ＧａｌＶ−偽型である。さらなる実施形態では、このように形質導入されたケラチノサイトは、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たす。一部の実施形態では、ＰＧＣＮは、２．５、２、１．５、または１未満である。別の実施形態では、ＰＧＣＮは、３〜２０、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、または８０〜１００である。別の実施形態では、ＰＧＣＮは、１００を超える。一部の実施形態では、ケラチノサイトシートは、サイズが異なる。当業者は、ケラチノサイトシートのサイズを決定することができる。
【００６４】
一部の実施形態では、内在性変異、機能不全、または短縮型Ｃ７遺伝子は、本明細書に記載されているようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（または該ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムをコードするベクター）及び標的とする切断後に、遺伝子に挿入される「ドナー」配列（例えば、機能性ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡもしくはＣ７遺伝子または全長野生型ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡもしくは遺伝子）を使用して置換される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細菌の４０％及び古細菌の９０％に見られ、それらのシステムの複雑さは異なる。例えば、全体として参照により組み込まれる米国特許第８，６９７，３５９号を参照のこと。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（規則的にクラスター化された間隔が短いパリンドロームリピート）は、外来ＤＮＡの短いセグメントが短いリピートパリンドローム配列の間にインテグレートされる生体のゲノム内の領域である。これらの遺伝子座は、転写され、ＲＮＡ転写物（「ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ」）は、短いＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。これらのＲＮＡ及び「Ｃａｓ」タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連）として知られているタンパク質を全て組み込む３種類のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムがある。Ｉ型及びＩＩＩ型は双方ともに、いずれも、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをプロセシングし、ｃｒＲＮＡに完全にプロセシングされたときに、ｃｒＲＮＡに相補的である核酸を切断することが可能であるマルチＣａｓタンパク質複合体をアセンブルするＣａｓエンドヌクレアーゼを有する。ゲノム内の内在性遺伝子（例えば、内在性もしくはセーフハーバー遺伝子、または制御遺伝子もしくはそのＤＮＡ標的）の目的の領域における標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的遺伝子及び機能ドメイン（例えば、転写制御ドメイン及び／またはヌクレアーゼドメイン）を認識する１つ以上の操作されたシングルガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、遺伝子内にもしくは遺伝子に隣接したコード領域もしくは非コード領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロンの、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかにある非転写領域内の、目的の領域（例えば、ＥＢ組織由来の内在性Ｃ７遺伝子）に結合及び／またはそれを切断し得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、遺伝子、例えば、変異、機能不全、または短縮型Ｃ７遺伝子に結合及び／または切断する。
【００６５】
一態様では、創傷は、非修正創傷床ケラチノサイトを含まない。一実施形態では、創傷は、非修正創傷床ケラチノサイトを切除するために処置される。別の態様では、対象は、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）に罹患している。異なる態様では、対象は、ヒトである。
【００６６】
別の実施形態では、ケラチノサイトシートは、ＶＴＥ試験、ＰＧＣＮ試験、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、グラム染色無菌試験、ＬＥＡＥＳ生存率試験、放出後試験、ＲＣＲ試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂ特性決定、電子顕微鏡検査法、免疫電子顕微鏡検査法、免疫蛍光染色、Ｃ７発現、及びＡＦ分析からなる群から選択される１つ以上の試験を受ける。一態様では、免疫蛍光染色は、直接または間接免疫蛍光染色を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。
【００６７】
一部の実施形態では、ケラチノサイトシートは、無細胞マトリックス、コラーゲンマトリックス、または生体適合性メッシュ上に配置される。一実施形態では、生体適合性メッシュは、熱可塑性樹脂、ポリエチレン、超高分子量のポリエチレン、高分子量のポリオレフィン、非コーティング単繊維ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、シリコン、またはそれらの任意の組み合わせで作製される。
【００６８】
一部の実施形態では、皮膚細胞は、ケラチノサイトを含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一実施形態では、皮膚細胞は、幹細胞を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。別の実施形態では、方法は、幹細胞をケラチノサイトに分化させることをさらに含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一態様では、幹細胞は、形質導入の前、後、または間に分化する。一部の実施形態では、幹細胞は、形質導入の前に（例えば、ケラチノサイトまたは角膜上皮細胞に）分化する。一部の実施形態では、幹細胞は、形質導入後に分化する。さらなる実施形態では、幹細胞は、形質導入中に分化する。
【００６９】
ＲＤＥＢ患者は、衰弱させる痛みを伴う角膜糜爛を頻繁に発症する可能性がある。従って、対象の角膜糜爛を処置する方法も本開示で提供され、方法は、角膜細胞の集団を対象から得ること、機能性（例えば、全長野生型）ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物のインテグレーションにより、エクスビボで角膜細胞を修正すること、遺伝子修正細胞を培養して、角膜細胞シートを形成すること、及び角膜細胞シートの移植片を、角膜表面に移植することを含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の態様では、角膜細胞は、角膜上皮細胞を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。別の態様では、角膜細胞は、幹細胞を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の実施形態では、方法は、幹細胞を角膜上皮細胞に分化させることをさらに含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。
【００７０】
一部の態様では、角膜細胞は、遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入することにより修正され、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一実施形態では、レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである。一部の実施形態では、レトロウイルスは、ＧａｌＶ−偽型である。一部の実施形態では、このように形質導入された角膜細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たす。一部の実施形態では、ＰＧＣＮは、２．５、２、１．５、または１未満である。別の実施形態では、ＰＧＣＮは、３〜２０、２０〜４０、４０〜６０、６０〜８０、または８０〜１００である。別の実施形態では、ＰＧＣＮは、１００を超える。一部の態様では、対象は、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）に罹患している。異なる態様では、対象は、ヒトである。
【００７１】
一態様では、角膜細胞シートは、ＶＴＥ試験、ＰＧＣＮ試験、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ試験、グラム染色無菌試験、ＬＥＡＥＳ生存率試験、放出後試験、ＲＣＲ試験、細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂ特性決定、電子顕微鏡検査法、免疫電子顕微鏡検査法、免疫蛍光染色、Ｃ７発現、及びＡＦ分析からなる群から選択される１つ以上の試験を受ける。一実施形態では、免疫蛍光染色は、直接または間接免疫蛍光染色を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一部の実施形態では、角膜細胞シートは、無細胞マトリックス、コラーゲンマトリックス、または生体適合性メッシュ上に配置される。
【００７２】
一態様では、生体適合性メッシュは、限定されないが、生体適合性金属、例えば、チタン合金、ステンレス鋼、コバルト−クロム合金、及びニッケル−チタン合金を含む非再吸収性材料から作製することができる。別の態様では、生体適合性メッシュの層は、限定されないが、熱可塑性樹脂、ポリエチレン、超高分子量のポリエチレン、高分子量のポリオレフィン、非コーティングモノフィラメントポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、１つ以上の二重結合を含有する任意のポリマーもしくは脂肪族炭化水素、他の任意の適切な多孔質材料、または曲げられるか、もしくは別途形状に形成される可能性がある他の任意の適切な多孔質材料を含む非再吸収性ポリマー材料から作製することができる。
【００７３】
別の態様では、生体適合性メッシュは、限定されないが、ポリグリコール酸、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリＤ、Ｌ−乳酸（ＰＤＬＡ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ−Ｐ−ジオキサノン、ラクチド及びグリコリドのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリヒドロキシ−３−ブチラート、コラーゲン、ヒアルロン酸、シルク、バイオセルロース、他のタンパク質系ポリマー、多糖類、ポリ（ＤＴＥカーボネート）、ポリアリラート、ＰＬＬＡ、ＰＬＤＡ、またはＰＬＧＡとＴＭＣとのブレンド、ならびにこれらのポリマーの他の組み合わせを含む合成または生物学的吸収性ポリマー材料から構成することができる。
【００７４】
一実施形態では、生体適合性メッシュは、熱可塑性樹脂、ポリエチレン、超高分子量のポリエチレン、高分子量のポリオレフィン、非コーティング単繊維ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタラート、ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、シリコン、またはそれらの任意の組み合わせで作製される。
【００７５】
ケラチノサイトシートを含むか、あるいはそれから本質的なるか、またはそれからさらになる組成物も本開示で提供され、ケラチノサイトシートは、対象の皮膚細胞の集団を得る工程、機能性（例えば、全長野生型）ヒトコラーゲンＶＩＩ（ＣＯＬ７Ａ１）タンパク質をコードする遺伝子構築物のインテグレーションにより、エクスビボで皮膚細胞を修正する工程、遺伝子修正細胞を培養してケラチノサイトシートを形成する工程を含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになるプロセスにより調製される。一部の実施形態では、皮膚細胞は、ケラチノサイトを含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一実施形態では、皮膚細胞は、幹細胞を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。別の実施形態では、幹細胞は、ケラチノサイトに分化する。一部の実施形態では、幹細胞は、形質導入の前、後、または間に分化する。
【００７６】
ケラチノサイトシートを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになる医薬組成物がさらに提供され、該ケラチノサイトシートは、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた皮膚細胞を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。一態様では、皮膚細胞は、対象から得られる。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、皮膚細胞は、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボで組み込まれた幹細胞から分化する。一実施形態では、対象は、ＲＤＥＢに罹患している。一部の実施形態では、皮膚細胞または幹細胞は、遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入され、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含む。
【００７７】
一実施形態では、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質である。一態様では、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質からの遺伝子改変を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。別の態様では、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質からの遺伝子改変を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになり、遺伝子改変は、保存的である。さらなる態様では、遺伝子改変は、挿入、欠失、及び／または変異を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。
【００７８】
角膜細胞シートを含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになる医薬組成物も本開示で提供され、該角膜細胞は、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた角膜細胞を含む。一部の実施形態では、角膜細胞は、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質をコードする遺伝子構築物がエクスビボでインテグレートされた幹細胞から分化する。別の実施形態では、角膜細胞は、対象から得られる。一実施形態では、対象は、ＲＤＥＢに罹患している。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、角膜細胞または幹細胞は、遺伝子構築物を含むウイルスで形質導入され、ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶを含む。一実施形態では、レトロウイルスは、ＬＺＲＳＥウイルスである。一部の実施形態では、レトロウイルスは、ＧａｌＶ−偽型である。さらなる実施形態では、形質導入された細胞は、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たす。
【００７９】
一態様では、機能性ＣＯＬ７Ａ１タンパク質は、全長野生型ヒトＣＯＬ７Ａ１タンパク質である。
【００８０】
特定の実施形態では、細胞は、１〜２１日間培養される。さらなる実施形態では、細胞は、７、１４、２１日またはそれ以上培養される。従って、細胞は、適切な条件下で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９日間以上培養され得る。細胞は、リプレーティングされ、培地及びサプリメントは、当該技術分野において既知の技術を使用して、必要に応じて、添加または変更され得る。
【００８１】
特定の実施形態では、遺伝的に変更されたケラチノサイトは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の細胞がＣ７導入遺伝子を発現するような条件下及び十分な期間で培養され得る。
【００８２】
一実施形態では、本開示の細胞組成物は、ＥＢの処置に有効な量の天然ヒトＣ７タンパク質を発現する、遺伝子変更された自己ケラチノサイト集団を含み、あるいはそれから本質的になり、またはそれからさらになる。標的細胞集団は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、対象への移植のためにシート中で成長する。このような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン、抗酸化剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含み得る。
【００８３】
本開示の細胞組成物は、ＥＢの処置に適切な手法で投与される。投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度のような因子により決定されるであろう。但し、適切な投薬量は、臨床試験により決定され得る。
【００８４】
細胞は、通常は皮膚移植片の形態で、当業者らに周知の方法により対象に投与され得る。開業医は、部分的に、疾患の種類及び場所に基づいて特定の対象に好適な投与経路を決定することができるであろう。トランスフェクトされた細胞は、創傷部位に局所的に投与され得る。
【００８５】
対象に投与するための操作された細胞の医薬製剤は、本発明により検討される。当業者は、細胞を対象に投与するための技術に精通しているであろう。さらに、当業者は、対象に投与する前に、これらの細胞シートを調製するために必要な技術及び医薬品に精通しているであろう。
【００８６】
本発明の特定の実施形態では、医薬製剤は、Ｃ７及び任意にプロリル−４−ヒドロキシラーゼを過剰発現するように改変されている、操作された細胞を含むか、あるいはそれから本質的になるか、またはそれからさらになる水性組成物である。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、対象から得られている細胞（すなわち、自己細胞）を使用して調製される。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中のトランスフェクトされた細胞の有効量の溶液を含む。本明細書で使用される場合、「医薬製剤」または「医薬組成物」は、任意の溶媒及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体または薬剤が細胞と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が検討される。補助的な活性成分は、組成物に組み込むこともできる。ヒト投与では、製剤は、ＦＤＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの要求に応じて、無菌性、発熱原性、一般安全性、及び純度基準を満たすべきである。
【００８８】
当業者は、他の任意の経路による適用のための滅菌溶液を生成するための技術に精通しているであろう。細胞移植片のサイズ及び移植片上の細胞数の決定は、当業者によりなされるであろう。特定の態様では、複数用量が、数日、数週間、数ヶ月、または数年間にわたって投与され得る。対象は、例えば、同じ領域または異なる領域の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の移植片を投与され得る。一実施形態では、対象は、同じ領域または異なる領域に再移植され得る。別の実施形態では、対象の生物学的試料（例えば、ケラチノサイトまたは角膜細胞）は、適切な条件で保存される。生物学的試料が保存されると、対象が新しい移植片を必要とする場合、パンチ生検は必要ではない。保存された生物学的試料は、対象により必要とされる移植片を決定するために十分な情報または補助的な情報を提供することができる。
【００８９】
「有効量」または「治療量」が示される場合、投与されるべき本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、及び状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。本明細書に記載の細胞を含む細胞組成物が、これらの範囲内の全ての整数値を含む、１〜１００、１〜１０3 、１〜１０4 、１〜１０5 、１〜１０6 、１〜１０7 、または１０7 個の細胞を超える量で投与され得ることを、一般に述べることができる。細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法で一般に知られている注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。特定の患者のための最適な投薬量及び処置レジメンは、患者を疾患の徴候について監視すること、及びそれに応じて、処置を調整することにより、医学分野の当業者により容易に決定することができる。
【００９０】
本開示の特定の実施形態では、本明細書に記載の方法または当該技術分野で既知の他の方法を使用して遺伝子操作されたケラチノサイトは、任意の数の関連治療モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。
【実施例】
【００９１】
次の実施例は、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者らに提供するために記載され、発明者らが発明とみなすものの範囲を制限するものではなく、または以下の実験が実施された全ての実験もしくは唯一の実験を表すものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保つための取り組みがなされているが、一部の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途指示がない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。
【００９２】
本明細書で引用される全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれることを具体的にかつ個別に示すように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むために、本発明者により見出され、または提案された特定の実施形態について記載されている。本開示に照らして、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態において多くの修正及び変更を行うことができることが、当業者らに理解されるであろう。例えば、コドン冗長性により、潜在的なＤＮＡ配列中の変更は、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく行うことができる。さらに、生物学的機能的均等性の考慮のために、種類または量における生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造に、変更をなすことができる。このような改変は全て、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【００９４】
実施例１
劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）の処置としての自己細胞の細胞リプログラミング
【００９５】
劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）は、ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）をコードする遺伝子であるＣＯＬ７Ａ１の機能変異の欠損により引き起こされる重度の水疱形成皮膚疾患である。Ｃ７は、表皮基底膜ゾーン（ＢＭＺ）を真皮に固定するアンカリングフィブリル（ＡＦ）の主要な構成成分である。Ｃ７は、ＢＭＺリガンドに結合するアミノ末端非コラーゲンＮＣ１ドメイン、三重らせんにアセンブリする中央コラーゲンドメイン、及びＡＦへのＣ７アセンブリを触媒するＮＣ２ドメインを含む、複数のドメインの使用によりこの機能を実行する。ＲＤＥＢにおけるこれらの機能性Ｃ７ドメインの欠損は、重度のＢＭＺ分離をもたらす。これは、広範のかつ痛みを伴う水疱形成、糜爛、及び瘢痕を生じさせ、これは、順次、２０代及び３０代に出現する悪性の、多くの場合、致命的な形態のＳＣＣにつながる可能性がある。この疾患の分子診断の進歩にもかかわらず、現在の治療法は、緩和ケアに限定されている。同種異系線維芽細胞の臨床試験（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３；６９（６）：８９８−９０８）、骨髄移植（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１０；３６３（７）：６２９−６３９）、骨髄由来の間葉系間質細胞の皮内及び静脈内送達（Ｃｏｎｇｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０；１２（３）：４２９−４３１；Ｐｅｔｒｏｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１５；１３５  （９）：２３１９−２３２１；Ｇｏｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１５；３２  （２）：２２０−２２５）、及び皮膚代替物（Ｆａｌａｂｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０００；１３６（１０）：１２２５−３４２）は、有効性及び安全性の可変の割合で行われている。前臨床試験は、静脈内及び局所Ｃ７を含む潜在的な治療モダリティ、誘導性多能性幹細胞、及びアミノグリコシドを調査している。
【００９６】
遺伝子療法は、ＲＤＥＢなどの一因性疾患の処置のための潜在的に強力なツールである。しかし、重度の複合免疫不全症及びＷｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群の患者における遺伝子導入後に、重大な安全性の懸念が提起された。挿入的変異導入が依然として潜在的な懸念事項として残っているが、皮膚遺伝子療法の利点は、移植された組織が表面に配置されるために、新生物をより容易に臨床評価できることである。さらに、遺伝子改変された皮膚移植片は、接合部型ＥＢを有し、長期間の修正を伴い、かつ有害な副作用を伴わない１人の患者を処置するために効率よく使用されている。再生ヒト表皮における長期Ｃ７発現のためのプラットフォームを確立して、免疫不全マウスに移植した（Ｓｉｐｒａｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２０１０，２１（１０）：１２９９−１３１０）。目下、本開示は、重度のＲＤＥＢを有する対象に移植されたＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１で操作された自己表皮シート（ＬＥＡＥＳ）のエクスビボでの遺伝子導入の第Ｉ相臨床試験の結果を提供する。
【００９７】
臨床結果
対象及び処置
スクリーニングされた３８人の対象のうち、８人が本研究に同意し、４人の対象が登録され、移植片を受けた（図２）。対象は、短縮型Ｃ７（ＮＣ１ドメイン）の発現をもたらす種々の化合物であるヘテロ接合型ＣＯＬ７Ａ１変異を有していた。これは、ウェスタンブロットによりケラチノサイト培地中で検出された（図３）が、ＩＩＦにより組織中では検出されなかった（図１Ｆ、図５Ｂ、図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ、図１２）。全ての対象は、２３（範囲：１８〜３２）の平均年齢で、かつ４％〜３０％の全身面の病変に罹患している男性であった。それぞれは、貧血、食道狭窄、及び偽合指症の病歴を含む皮膚症状を伴う重篤な疾患を有していた（表１）。
【００９８】
初代ＲＤＥＢケラチノサイトを、無傷の皮膚から単離し、細胞当たり７０％の効率及び０．８のプロウイルスゲノムコピーの平均値（図１Ｂ〜Ｄ）を有するＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１レトロウイルスベクターで形質導入した。各患者の５つの瘢痕化及び／または糜爛した創傷、ならびに１つの誘導創傷に移植した。移植された慢性創傷の大部分は、５年間を超えて存在していた（表３）。２４の移植片全てを、パーセント創傷治癒、感染、疼痛、及び痒みについて連続的に監視した。
【００９９】
有効性
全ての対象は、創傷治癒及び皮膚強度の改善、ならびに移植部位における痛み及び掻痒の減少を報告した。移植片はベースラインと比較して水疱形成の減少を示し、各対象からの代表的な写真が示される（図１Ｅ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ、図１２）。対照的に、未処置創傷は、継続的な水疱形成を示した（図１０）。
【０１００】
移植の１ヶ月後に、２０／２４の創傷（８３％）は、７５％以上の治癒を示した一方、４つの創傷のみが５０％〜７４％の治癒を示した（表３）。３ヶ月で、２１／２４（８７％）の創傷は、７５％以上が治癒した一方、３／２４（１３％）は、５０％〜７４％が治癒した（表３）。６ヶ月で、１６／２４（６７％）は、７５％以上が治癒し、５／２４（２１％）は、５０％〜７５％治癒し、３／２４（１３％）の移植部位のみは、水疱を示し、移植不全とみなされた（０％〜４９％が治癒した）。
【０１０１】
ＬＥＡＥＳ移植片の分子分析は、３ヶ月の９／１０（９０％）の試料及び６ヶ月の８／１２（６６％）の試料で、強力なＣ７発現を示した。ＬＥＡＥＳのＩＩＦ分析は、未修正皮膚対照とは対照的に、表皮−皮膚接合部でのＣ７の適切な局在を示した（図１Ｆ、図５Ｂ、図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ、図１２）。ＬＥＡＥＳ移植片は、棘状層及び顆粒層を有する完全に分化した表皮を示し、これは、正常皮膚に似ている表皮マーカーであるケラチン１４、ケラチン１、及びロリクリンに対して陽性であった（図１Ｆ、図５Ｂ、図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂ、図１２）。陰性試料の中で、Ｃ７は、６ヶ月の対象２から得られた分析生検で検出されなかった。しかし、アンカリングフィブリル（ＡＦ）は、対応する生検で存在していた。６ヶ月で、Ｃ７は、ＮＣ１ドメインに特異的な抗体を使用して、対象４において同定された（図１Ｆ）。
【０１０２】
修正試料中のＢＭＺの分子構造を評価するために、ＬＥＡＥＳ移植片から得られた生検も、透過型電子顕微鏡（法）で分析した。３ヶ月で、５／７の試料（７１％）は、形態学的に正常な外観及びＮＣ２反応性ＡＦの頻度を明らかにした（図１Ｇ）。６ヶ月で、４／１２（３３％）の生検で、ＡＦを検出し、対象４から得られた生検で、ＡＦを検出しなかった（図１Ｇ）。
【０１０３】
安全性
重大な有害事象は、報告されていなかった。移植部位の痒み（ｎ＝３）、続いて、移植部位の排液（ｎ＝２）の増加は、最も一般的な有害事象（グレード１または２）であり、悪性腫瘍の臨床徴候は認められなかった。ＲＣＲ及び細胞傷害性Ｔ細胞アッセイは、全時点で陰性であった（表２）。
【０１０４】
創傷の排液の増加は、２／２４の創傷で見られたが、紅斑、浮腫、疼痛、または圧痛がないことを含む感染症の徴候がないことが、部位で認められた。６ヶ月で、対象３の部位Ｚは、創傷コロニー形成（グレード２）を有し、移植不全と考えられた（表３）。痒みは、３／２４の移植部位及び２つの周辺区域（グレード１）で認められた。
【０１０５】
Ｃ７免疫応答を、この研究の間密接に監視した。対象は、全身性自己免疫症状または移植領域外での水疱形成の増加がなかった。対象１では、ＩＩＦまたはＤＩＦにより循環血中の抗体または組織に結合した抗体は観察されなかった（表２）。３ヶ月の対象２は、２つの創傷（Ａ及びＥ）のＤＩＦ分析により、補体なしで、１＋（軽度）線状ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡを示した。これらの免疫反応物質は、移植の６ヶ月後に観察されなかった。対象３は、ＤＩＦにより６ヶ月目にＩｇＭ及びＩｇＡの１＋線状組織染色のわずかな痕跡と共に、ＩＩＦにより３ヶ月目に線状血清ＩｇＡの一時的な上昇（１：３２０）を示した。対照的に、対象４は、ＤＩＦにより３ヶ月目に３つの移植片で検出された１〜２＋ＩｇＧ、ＩｇＡ、Ｃ３、及びＩｇＭ染色と共に、ＩＩＦにより１ヶ月目及び３ヶ月目の循環血中の線状ＩｇＧ抗体が１：１６０力価であることを明らかにした（表２）。しかし、全身性自己免疫症状または移植片の外側の水疱形成の増加は認められず、Ｃ７特異的細胞傷害性Ｔ細胞アッセイの結果は陰性であった。６ヶ月目に、血清抗体ＩｇＧ及びＣ３レベルは低減し（１：４０）、組織結合免疫複合体は、移植片で検出されなかった（表２）。対象４の表皮下線状免疫沈着の発見後に、本発明者らは、精製Ｃ７タンパク質のウェスタンブロット分析を使用して、対象４のベースライン血漿抗Ｃ７抗体レベルを再評価した。負のベースラインＩＩＦデータとは対照的に、ウェスタンブロット分析は、ベースライン（１：３００）及び血清移植の３ヶ月後（１：１０００）の双方が、精製されたＣ７に反応性であったことを示して、対象４が、移植片の配置前に外来Ｃ７に感受性があったことを示した（図１１Ａ）。対象４の血清抗体反応性を、移植片の配置前及び配置後の双方で、以前に特性決定されたカルボキシル末端Ｃ７ペプシンフラグメント内で確認した（図１１Ｂ）。
【０１０６】
考察
ＲＤＥＢの遺伝子修正は、９ｋｂを超えるＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡを包含する大きな導入遺伝子の効率的な送達を必要とするような実質的な課題を課す。ここで、本開示は、ＲＤＥＢを有する４人の対象において、有望な有効性及び許容される安全性を有する、遺伝子修正自己表皮ケラチノサイト移植のインヒューマン研究を提供する。遺伝子修正表皮細胞は、移植の６ヶ月後に試験された移植部位の６７％を超えて、機能性自己複製表皮を再生し、Ｃ７は、１対象に対し１年まで検出可能であった（図１２）。これは、慢性創傷の２／９（２２％）のみが１８週で治癒した同種異系ケラチノサイト移植片よりも顕著な改善であった。ＬＥＡＥＳ移植片は、同種異系線維芽細胞注射と比較して、より良好な創傷治癒結果も生じた。これは、ＢＭ−ＭＳＣのプラセボまたは皮内もしくは静脈内注射と比較して、創傷治癒において一部の初期改善を示したが、長期間の差異を示さなかった。類似した方法論を使用する、接合部型表皮水疱症のための遺伝子療法の症例報告は、長期間の治療効果に優先する長くとも６年間の修正を示した。本発明者らがＬＥＡＥＳ移植片に認める６ヶ月の継続したＣ７発現は、６つの表皮ターンオーバーサイクルの期間に及び、本発明者らは、遺伝子導入技術で幹細胞をうまく標的化していることを意味する。
【０１０７】
本発明者らの研究では、創傷治癒の改善及び皮膚の耐久性の増加は、ＢＭＺにおける検出可能な全長Ｃ７生成及びＡＦ形成に直接関連していた。移植前に存在しなかったが、双方は、各研究時点で存在したが、可変の効率で、即ちＣ７発現の場合に６６〜９０％及びＡＦ形成の場合に３３〜７１％で、検出された。生検サンプリングの変動性は、修正表皮細胞の異種集団または部分的な移植片の取り込みのいずれかに起因する可能性がある。一部の実施形態では、移植片領域は、対象が生活の質に有益であると感じる領域とすることができる。しかし、移植片の配置の重要な最初の数日間に、領域の一部は、固定化することまたは機械的摩擦から保護することが困難であった（例えば、対象２の背下部Ｅ、左肩部Ｂ、表３、肩後部Ｄ、図６Ａ）。さらに、対象が他の試験参加者と比較して移植後の固定化が最短であったので、対象２の６ヶ月のサンプリングした生検において、ＩＦによる全体の創傷治癒の低減及び検出可能なＣ７の不存在により示されるように、観察されるような移植後の固定化時間が短いと、移植片の取り込みに悪影響を及ぼし得る（表１）。さらに、誘発創傷は、良好な治癒能力を示したが、最も少ないＣ７発現を示した。電気焼灼などの破壊的な方法がなければ、残存する非修正創傷床ケラチノサイトは、覆っているＬＥＡＥＳ移植片の定着を妨げている可能性があった。これらの知見は、創傷床ケラチノサイトをより効率的に切除する創傷床調製技術が、移植片の取り込みを改善する可能性があったことを示唆している。
【０１０８】
安全性に関しては、いくつかの有害事象が報告され、認められたものは、全て軽度であった。対象は、任意の時点で、血液中のＲＣＲの形跡、または移植片での扁平上皮癌を示さなかったが、潜在的な有害事象の長期監視は進行中である。遺伝子導入を含む全ての分子置換アプローチは、特に、ヌル変異を有する対象において、治療産物に対する望ましくない免疫応答のリスクをもたらす。この研究では、全ての対象が、ＮＣ１ドメインを含有する短縮型Ｃ７分子を発現し、これは、タンパク質の抗原性部分であると考えられており、それ故、潜在的な免疫反応のリスクを最小限にする。Ｃ７関連細胞傷害性Ｔ細胞活性の形跡は、研究中の全ての対象の任意の時点で認められなかった。しかし、対象４のＩＩＦ及びＤＩＦ研究は、１ヶ月及び３ヶ月のＢＭＺ反応性ＩｇＧ、３ヶ月の補体Ｃ３固定、移植の６ヶ月後のより低い血清ＩｇＧ力価を明らかにした（表２）。ＮＣ１ドメインは、Ｃ７の最も抗原性が高い部分として報告されているが、カルボキシル末端のＮＣ２ドメインは、小さな抗原性エピトープも含有し、ＲＤＥＢ患者における抗Ｃ７自己抗体の存在は、過去の著作物で多数回報告された。対象４が、ウェスタンブロット分析を使用した移植前に検出可能な抗Ｃ７抗体（ＣＬＩＡ認定ＩＩＦアッセイでスクリーニングプロセス中に同定されなかった）を有していたという知見は、より感度が良い標準化された方法が、今後の治療研究におけるベースライン免疫交差反応を評価するために開発されるべきであることを示唆する。
【０１０９】
結論として、遺伝子修正自己表皮皮膚移植片は、重篤なＲＤＥＢ患者においてＣ７沈着の増加及び水疱形成の低減を示し、患者集団は、他の具体的な処置の選択肢を有していた。より若いＲＤＥＢ対象に関する大きな研究は、このアプローチの長期間の有効性及び安全性を評価するために計画されている。
【０１１０】
【表１】
2019506925.tif 000002
【０１１１】
【表２】
2019506925.tif 000003
【０１１２】
【表３】
2019506925.tif 000004
【０１１３】
【表４】
2019506925.tif 000005
【０１１４】
方法
研究デザイン
これは、第Ｉ相非盲検臨床試験（ＮＣＴ０１２６３３７９）である。主な研究目的は、全長ＣＯＬ７Ａ１コード配列を含有するレトロウイルスベクターで形質導入した遺伝子操作された自己ケラチノサイトを移植したＲＤＥＢ対象における安全性及び有効性のデータを得ることであった（図１Ａ）。２０１３年１０月〜２０１５年２月の間に、４人の成人ＲＤＥＢ対象にＬＥＡＥＳを移植した。全対象のデータを、少なくとも６ヶ月の経過観察で収集する。この研究は、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＩＮＤ＃１３７０８）及びＳｔａｎｆｏｒｄ  ＩＲＢ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌ＃１４５６３）により承認された。
【０１１５】
対象
対象は、１８歳以上であり、ＲＤＥＢと臨床診断され、ＬＥＡＥＳ移植に適する１００ｃｍ2 〜２００ｃｍ2 の面積だけ開いた糜爛を有する。対象はまた、全身麻酔を受けることができ、スクリーニングプロトコールに基づいて選択された。これにおいて、ＲＤＥＢが、遺伝子検査（ＧｅｎｅＤｘ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）により確認された。Ｃ７のＮＣ１ドメインの存在を、培養ケラチノサイト（ＫＣ）上清のウェスタンブロット及び皮膚生検試料の間接免疫蛍光顕微鏡法（ＩＩＦ）により評価した。生検試料中の全長Ｃ７及び成熟ＡＦの不存在は、Ｃ７のカルボキシル末端ＮＣ２ドメインに特異的なＬＨ２４抗体を使用したＩＩＦ及び免疫電子顕微鏡法（ＩＥＭ）により確認された（図９）。霊長類食道の血清及び対象の生検部分の直接免疫蛍光法（ＤＩＦ）をそれぞれ使用したＩＩＦにより、循環血中の及び組織に結合したＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＣ３を分析した。ＨＩＶ、肝炎、全身感染、または心臓異常を含む重大な非ＲＤＥＢ合併症を有する対象は除外した。臨床的に重大な貧血を、移植前に処置した。
【０１１６】
試験処置
無傷の非瘢痕皮膚の領域からＬＥＡＥＳ製造のために２つの８ｍｍのパンチ生検材料を得た。ＣＢＣ、完全生化学検査（ＣＭＰ）、ならびに複製可能なトレトロウイルス（ＲＣＲ）及びＣ７感受性細胞傷害性Ｔ細胞アッセイに対するベースライン血液試料を得た。自己ケラチノサイト由来の皮膚生検は、ＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１で形質導入し、８つのＬＥＡＥＳ移植片を生成するために使用した（図４）。ＳＣＣの臨床所見を欠く感染していない、糜爛した、かつ／または瘢痕化した創傷部位に、６つの移植片を適用した。６つの移植創傷部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｚ、表３）のうち、機械的摩擦（「部位Ｚ」）により、手術時の各対象の１つの創傷を作成した。全身麻酔下で、保持された表皮幹細胞の可能性を最小限にするために、創傷床を焼灼した。ＬＥＡＥＳ移植片を、創傷床の調製後に溶解可能な縫合糸を介して創傷床に固定した。対象３及び４は、経過観察の移植片同定を補助するために、各移植片の角に小さなインド・インク・タトゥーを入れることに同意した。移植片を、標準的な創傷被覆材及び局所的なムピロシンで覆い、これを、移植の５〜７日後に除去した。
【０１１７】
エンドポイント及び評価
移植の１、３、６、及び１２ヶ月後に、対象を追跡した。各研究訪問で、ＩＩＦ、Ｃ７感受性細胞傷害性Ｔ細胞アッセイに、ＣＢＣ、及びＣＭＰにより、循環血中の自己抗体について血清試料を評価した。血清中のＲＣＲの存在を、３及び６ヶ月で評価した。各受診時に、代表的な移植片を生検して、ＤＩＦにより組織に結合した免疫グロブリン及び補体を、ＩＩＦによりＣ７発現を、ならびにＩＥＭによりアンカリングフィブリルの存在を、評価した。創傷を、臨床的に評価し、デジタル写真及び／またはＣａｎｆｉｅｌｄ  Ｖｅｃｔｒａカメラを使用して、ベースラインと比較して、１００％〜７５％が治癒し（重大な創傷治癒として定義される）、７４％〜５０％が治癒し、４９％〜２５％が治癒し、２５％未満が治癒したと査定した。
【０１１８】
材料及び試薬
ＬＥＡＥＳ製造中に使用された全ての材料及び試薬には、製造者により提供された分析の証明を基準にして、偶発性ウイルスを含めなかった。ウシ由来試薬を含む各ロット組織培地を、偶発性ウイルスを試験する市販の９ＣＦＲ吸光試験（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ワシントン州プルマン）により試験し、陰性であることが判明した。
【０１１９】
ＲＤＥＢケラチノサイトの単離及び増殖
皮膚試料を、２つの８ｍｍパンチ生検として得、３０μｇ／ｍＬのアミカシン（ＨＩｋｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、英国ロンドン）、２０μｇ／ｍＬのバンコマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、及び０．５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、マサチューセッツ州サレム）と共に、３５ｍＬの生検収集培地５０／５０Ａ（ヒトケラチノサイト成長サプリメントを含む５０％のケラチノサイト培地１５４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）、及びサプリメントを含む５０％の規定されたケラチノサイト血清不含培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド））に導入した。表皮を真皮から分離するために、２５カゼイン分解ユニット／ｍＬのディスパーゼを含有するディスパーゼ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）に、皮膚試料を５℃で１６〜２０時間置いた。翌日、表皮を、真皮から慎重に剥がし、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １０Ｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）溶液中に３７℃で２０〜３０分間置いた。この溶液を、１２００ｒｐｍにスピンダウンして、ケラチノサイトペレットを得た。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）で１回洗浄し、ケラチノサイトを、５０／５０Ａ培地で、ＰｕｒｅＣｏａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｃｕｌｔｕｒｅｗａｒｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州テュークスベリー）にプレーティングした。ケラチノサイトが、６０〜７０％コンフルエンスに達した後、細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  １０Ｘで処理し、ウイルス形質導入のためにプレーティングした。形質導入プロセスを開始するためには、少なくとも４×１０6 個の細胞を必要とした。
【０１２０】
ケラチノサイト修正
ＭＬＶＬＴＲの制御下の、全長ＣＯＬ７Ａ１  ｃＤＮＡを含有するｃＧＭＰグレードのＧａｌＶ−偽型ＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１ウイルスを、Ｓｉｐｒａｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０に記載されるように、現在のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓを使用して、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより作成した。ｐＬＺＲＳＥ−ＣＯＬ７Ａ１プラスミドのマップを、図１３に示し、完全な配列を配列番号１に示す。各プレートに対し１２ｍＬのウイルス上清を重層すること、ならびに１２５０ｒｐｍ及び３２℃で１時間の細胞の遠心分離により、ウイルス形質導入を実施した。遠心分離後、修正ケラチノサイトの増殖のために使用して、ＰＢＳ及び５０／５０Ｖ培地で洗浄することにより、ウイルス上清を除去した。修正ＫＣが、５０％を超えるウイルス形質導入効率（ＶＴＥ）及び３以下のプロウイルスゲノムコピー数（ＰＧＣＮ）の放出前基準を満たし続けている限り、必要に応じて、形質導入を繰り返した。
【０１２１】
放出前試験
ＶＴＥ試験。抗ＶＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体ＮＰ３２、ＮＰ１８５、または抗ＶＩＩ型コラーゲンポリクローナル抗体ＦＮＣ１を用いるＩＦ技術を使用して、ＶＴＥ試験を実施した。細胞を、メタノール／アセトン混合物の溶液中で固定し、洗剤で透過処理し、抗Ｃ７１次抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。多数回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５色素にコンジュゲートした２次抗体を加え、さらに１時間インキュベートした。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で１０分間標識し、洗浄し、金退色防止試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）でマウントした。青色核のＣ７陽性細胞との比率を計数することにより、ＶＴＥを決定した。放出前基準を満たすために、少なくとも５０％の細胞は、Ｃ７発現について陽性であった。
【０１２２】
ＰＧＣＮ試験
レトロウイルス形質導入後に、修正ＲＤＥＢ  ＫＣから単離されたゲノムＤＮＡのｑＰＣＲ分析を介して、ＰＧＣＮ試験を行った。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して、ゲノムＤＮＡを、３×１０6 個の修正細胞から精製した。標準分光測光技術を使用して、ＤＮＡを定量化し、ｑＰＣＲ分析に使用した。プラスミドＤＮＡ対照の量からの、鋳型の閾値サイクル（Ｃｔ）及びＣｔ依存度の標準曲線を使用して、プロウイルス用量を決定した。平均ＰＧＣＮを、ＰＧＣＮ＝（ＴＰＣＮ×６．１６ｐｇ）／（Ｃｔｅｍｐｌ．×１０３ｐｇ）（式中、ＴＰＣＮ＝総プロウイルスコピー数）から計算した。６．１６ｐｇ＝体細胞におけるゲノムＤＮＡの量。Ｃｔｅｍｐｌ．＝ナノグラム単位の、ＰＣＲで使用された鋳型量。放出前基準を満たすために、各ケラチノサイトゲノムに対し、３以下のプロウイルスゲノムコピー数が平均して存在した。
【０１２３】
無菌試験
潜在的な偽陰性を、培地に存在する抗生物質から排除するように設計されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｔｅｒｉｔｅｓｔシステムを使用した膜濾過（Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＬａｂｓ、カリフォルニア州ヘラクレス）により、培養上清の試料を、無菌状態について試験した。濾過及び洗浄後、試料を、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地及び液体チオグリコレート培地に入れ、１４日間インキュベートした。毎日の微生物汚染の形跡について、試料を観察した。
【０１２４】
エンドトキシン試験
培養上清の試料を、製造者の推奨に従って、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）ＱＣＬ−１０００アッセイ（Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）により評価した。この試験の結果は、産物の放出要件を満たすために、１．０ＥＵ／ｍＬ未満であった。
【０１２５】
マイコプラズマ試験
製造者の要求に従って、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）を使用して、細胞培養上清を、マイコプラズマについて試験した。この試験の結果は、産物の放出要件を満たすためには、０．９未満であった。
【０１２６】
ＬＥＡＥＳ開始及び処理
修正ケラチノサイトが、１００％コンフルエンスに達すると、ＬＥＡＥＳ開始プロセスを開始し、成長培地を、５０／５０Ｖから表皮シート生成培地ＤＦＦ３１に変更した。これは、１０％のウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）、３６ｎｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ニュージャージー州ニューブランズウィック）、２５μｇ／ｍＬのアデニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、５μｇ／ｍＬの組み換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、２ｎｇ／ｍＬのリオチロニン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ニュージャージー州ニューブランズウィック）、５μｇ／ｍＬのウシトランスフェリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビルリカ）、１０ｎｇ／ｍＬの組み換え上皮成長因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）及び３０μｇ／ｍＬのアミカシン（Ｈｉｋｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、英国ロンドン）、ならびに２０μｇ／ｍＬのバンコマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）及びＦ１２培地（Ｌｏｎｚａ、スイス、バーゼル）からなる。
【０１２７】
ＬＥＡＥＳアセンブリ及び輸送
ＬＥＡＥＳアセンブリを、移植の日に開始した。ディスパーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）で酵素消化させることにより、表皮シートを、プレートの表面から３７℃で２０〜３０分間放出させた。培地及びディスパーゼの残留量を除去するために、表皮シートを、５０／５０ＶＣで少なくとも５回洗浄した。それを、手術用ヘモクリップでサイズのマッチした石油ガーゼに固定し、基底面に無菌黒縫合糸でマークした。アセンブリされたＬＥＡＥＳを、５０／５０ＶＣの輸送培地に浸漬し、ガス透過性滅菌膜で密閉した。次いで、ＬＥＡＥＳ表皮移植片を、移植のために手術室に輸送した。
【０１２８】
放出試験
グラム染色滅菌試験。ＬＥＡＥＳ放出の日に、培地の試料を、迅速なグラム染色試験のために、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの臨床検査室に送った。試験の陰性結果を、ＬＥＡＥＳロット放出基準として使用した。
【０１２９】
ＬＥＡＥＳ生存率試験
ＬＥＡＥＳ試料を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ染色を含有する核染料混合物と共に２０分間インキュベートした生存性試験を実施した。ＳＹＴＯＸ緑色染色のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色に対する比率を、７０％以上で計算して、産物を放出させた。
【０１３０】
放出後試験
培地及びＬＥＡＥＳ移植片の試料を、送出試験のために提出した。長い期間の試験プロセスに起因する移植片移植後に得られるべき試験結果を期待した。これらの「放出後」試験結果が、規格外であった場合に、安全性計画は実施されていた。放出後基準は、追加の無菌試験（放出前試験の無菌試験を参照のこと）、ＲＣＲ試験（Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）及びマイコプラズマ試験（Ｂｉｏｎｉｑｕｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州サラナクレイク）を含んでいた。
【０１３１】
ＲＣＲ試験
ＬＥＡＥＳ及びＬＥＡＥＳ培養した上清の試料を、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの拡張ＰＧ−４  Ｓ＋Ｌ−細胞プラークアッセイにかけ、放出基準として使用される試験結果「ＲＣＲの形跡なし」であった。ベースライン、３ヶ月、及び６ヶ月で、血液試料を、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで分析して、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を使用して、存在するＧＡＬＶエンベロープ（ＧＡＬＶ−Ｅ）配列のレベルを決定した。血液試料の量の妥当性を、ヒトアポリポタンパク質Ｂ遺伝子配列のための第２のプローブ及びプライマーセットにより評価した。ゲノムＤＮＡ０．１２μｇ当たり１０５、１０４、１０３、１０２、及び１０コピーのＧＡＬＶ−Ｅ配列を含有するゲノム１２／２２／１５  ８ＤＮＡを使用した標準曲線を、陽性対照として使用した。陰性対照は、形質導入されていないヒトゲノムＤＮＡ及び水を含んでいた。
【０１３２】
細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ
細胞傷害性Ｔ細胞アッセイについて、ベースライン、１ヶ月、３ヶ月、及び６ヶ月に、１５ｍＬの全血を採取した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞を、軟膜または全血から単離した。次いで、接着性単球を、ペトリ皿中で２時間インキュベートした後に回収した。ＭＡＣＳ磁気細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、非接着細胞を、常磁性マイクロビーズに結合した抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体とインキュベートすることにより、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球を一緒に精製した。９６ウェルＰＶＤＦフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ＩＦＮ−γ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはＩＬ−４（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するモノクローナル抗体でコーティングし、５％のヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ培地を使用してブロックし、無血清ＲＰＭＩで洗浄した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球（２×１０5 細胞／ウェル）及びγ照射単球（２．５×１０4 細胞／ウェル）を、空気インキュベーター中で加湿した、５％のＣＯ2 の中で、２０ＵＩ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、３７℃で、４０時間、プレート上で同時インキュベートした。培地は、リンパ球を刺激するために、１０μｇ／ｍｌの組み換え型ＶＩＩ型コラーゲンまたは３μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）のいずれかを含有していた。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩＦＮ−γまたは抗ＩＬ−４モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、続いて、ストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）の１：１０００希釈液で、各ウェルを連続的に反応させることにより、個々の細胞により分泌されたＩＦＮ−γまたは抗ＩＬ−４をその場で検出した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、検出を実施した。水で洗浄することにより、反応を停止させ、ＣＴＬ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用して、スポットを計数した。抗原なしのＴ細胞を使用して、陰性対照を並行して実施し、対応するスコアを、未知数のものから差し引いた。
【０１３３】
抗Ｃ７  ＬＨ２４  ｍＡｂの特性決定
ＬＨ２４  ｍＡｂを予め同定して、表皮基底膜２と反応させた。本発明者らの研究における、Ｃ７ヌルＲＤＥＢ患者の皮膚の特異的な不存在は、それがＣ７上のエピトープを認識したことを示した。Ｃ７分子上のＬＨ２４反応性をさらに局在化させるために、ＮＣ１及びＮＣ２ドメインを含有するＣ７の酵素消化物に対するＬＨ２４反応性を、ウェスタンブロットにより試験した。Ｃ７フラグメントを含有するＮＣ１ドメインを、上述したように、高度に精製された細菌コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を用いた精製Ｃ７の消化から生成された。Ｃ７フラグメントを含有する３つのＮＣ２  １２／２２／１５  ９を、上述したように、精製Ｃ７のペプシン消化後に生成した。
【０１３４】
電子顕微鏡検査法
０．０５％のタンニン酸を含有するダルベッコ無血清培地（ＳＦＭ）中の１．５％のグルタルアルデヒド／１．５％のパラホルムアルデヒドに最低１時間浸漬させ、続いて、ＳＦＭ中で多数回すすぎ、次いで、１％のＯｓＯ4 中で６０分間、後固定することにより、３ｍｍの皮膚パンチ生検を、電子顕微鏡検査法のために調製した。試料を、ＳＦＭ中で洗浄し、次いで、１００％までの段階的な一連のエタノールで脱水し、プロピレンオキシド中ですすぎ、Ｓｐｕｒｒエポキシに合計２時間にわたって浸透させ、マイクロ波エネルギーを介して加速させた。試料を、１８時間かけて７０℃で重合させた。
【０１３５】
免疫電子顕微鏡検査法
ＳＦＭ中で多数回すすぎ、次いで、４℃で一晩、ＳＦＭ中で１：５に希釈したコラーゲンＶＩＩのＮＣ２領域に特異的なマウスＩｇＭ  ＬＨ２４抗体に浸漬させ、ＳＦＭ中で多数回すすぎ、次いで、ＳＦＭ中で１：３に希釈したヤギ抗マウスＩｇＭ超小型コロイド金コンジュゲート（Ａｕｒｉｏｎ）中で、４℃で一晩インキュベートすることにより、免疫電子顕微鏡検査法のための３ｍｍの皮膚パンチ生検試料を調製した。ＳＦＭ中で多数回すすいだ後、試料を、金増感溶液（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）に１５分間氷上で曝露し、次いで、２５℃まで急速に温め、さらに５分インキュベートした。次いで、試料を、氷冷ＳＦＭですすぎ、次いで、上記のように固定及び包埋した。間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）：ヒト血清をサル食道上に置き、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＣ３に対する抗体で染色した。１：４０以上の抗体希釈で検出されたシグナルは、バックグラウンドを超えると考えられる。
【０１３６】
直接免疫蛍光法（ＤＩＦ）
１２／２２／１５  １０組織を、５マイクロメートルに切断し、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、Ｃ３、及びフィブリノゲンのフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色した。正常対照を、並行して実行した。Ｃ７発現及びＡＦ分析：３ｍｍの皮膚パンチ生検試料を、８マイクロメートルに切断し、（Ｃ７のＮＣ１ドメインに対する）抗ＶＩＩ型コラーゲンポリクローナル抗体ＦＮＣ１またはモノクローナル抗体ＬＨ２４（Ｃ７のＮＣ２ドメイン）を使用したＩＩＦにより分析した。要約すると、切片を、メタノール／アセトン混合物の溶液中で固定し、洗剤で透過処理し、室温（２５℃）で１時間、抗Ｃ７１次抗体とインキュベートした。多数回洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５または４８８色素にコンジュゲートされた２次抗体を加え、１時間インキュベートした。細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で１０分間標識し、洗浄し、金退色防止試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）でマウントした。表皮マーカーの場合、Ｃｏｖａｎｃｅ（カリフォルニア州エメリービル）から入手したケラチン１、ケラチン１４、及びロリクリン抗体である。生検材料は、真皮−表皮接合部でのＶＩＩ型コラーゲンの連続線状染色が検出された場合、Ｃ７発現について陽性とした。生検は、密度、厚み、湾曲、弓状部、及びループを含むＡＦの特性を有する超微細構造のＮＣ２ドメイン特異的ＬＨ２４抗体を表す金コンジュゲート粒子が検出された場合、アンカリングフィブリル（ＡＦ）について陽性とした。
【０１３７】
写真
対象２〜４では、Ｃａｎｆｉｅｌｄ  Ｖｅｃｔｒａ  ３Ｄカメラを使用して、複数の角度から各移植部位の約５枚の画像を撮影した。次いで、これらの画像をつぎ合わせて、包括的な３Ｄ画像を作成した。Ｍｉｒｒｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州フェアフィールド）を使用して、目印を選択し、各画像の対応する場所を識別するために番号を付け、次いで、単一の画像に融合した。移植片の縁を正確に追跡するために、経過観察受診の融合画像を、０日目の移植の輪郭の上に置いてベースライン画像と比較した。解剖学的目印（例えば、刺青の点）を再度確認して、輪郭を正しく配置した。デジタル写真（Ｃａｎｏｎ  Ｐｏｗｅｒｓｈｏｔ）を用いて、必要に応じて、対象２〜４に対する追加写真及び対象１の全ての画像を得た。
【０１３８】
均等物
本開示が、上記実施形態に関連して説明されているが、上述の説明及び実施例が、例示するものであって、本開示の範囲を限定するものではないと理解すべきである。本開示の範囲内の他の態様、利点、及び修正は、本開示が属する当業者らには明らかであろう。
【０１３９】
別途定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で提供される全てのヌクレオチド配列は、５′から３′の方向に提示される。
【０１４０】
本明細書に例示的に記載された実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（複数可）、制限（複数可）の不存在下で適切に実施され得る。従って、例えば、「を有する」、「を含む」、「を含有する」などの用語は、広範にかつ制限なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で用いられる用語及び表現は、説明のかつ非限定の用語として使用されており、示され、かつ説明された特徴の任意の均等物またはそれらの部分を除くこのような用語及び表現を使用する意図はないが、種々の修正が本開示の範囲内で可能であることが認識される。
【０１４１】
従って、本開示が、具体的な実施形態により具体的に開示されているが、開示された本明細書のその中の実施形態の任意の特徴、修正、改良、及び変形は、当業者らによって用いられることがあり、かつこのような修正、改良、及び変形が、本開示の範囲内であるとみなされると理解すべきである。本明細書で提供される材料、方法、及び実施例は、特定の実施形態の代表例であり、例示であり、本開示の範囲を限定するものではない。
【０１４２】
本開示の範囲は広く一般に本明細書に記載されている。一般的な開示にあてはまる、より狭い種及び亜属郡のそれぞれもまた、本開示の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に列挙されるか否かに関わらず、任意の主題を属から除外する条件または否定的な制限を伴う一般的な説明を含む。
【０１４３】
加えて、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群に関して記載される場合、本開示の実施形態も、それにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関して記載され得ることを、当業者らは認識するであろう。
【０１４４】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それぞれが個別に参照により組み込まれているような同じ程度で、全体として参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が支配するであろう。
【０１４５】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された契約ＡＲ０５５９１４に基づく政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０１４６】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１月４日に出願された米国特許出願第６２／２７４，７００号及び２０１６年１０月２８日に出願された米国特許出願第６２／４１４，５３３号に対する米国特許法１１９（ｅ）の優先権を主張し、それぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019506925.tif 000006
【図２】
2019506925.tif 000007
【図３】
2019506925.tif 000008
【図４】
2019506925.tif 000009
【図５】
2019506925.tif 000010
【図６】
2019506925.tif 000011
【図７】
2019506925.tif 000012
【図８】
2019506925.tif 000013
【図９】
2019506925.tif 000014
【図１０】
2019506925.tif 000015
【図１１】
2019506925.tif 000016
【図１２】
2019506925.tif 000017
【図１３】
2019506925.tif 000018
【配列表】
2019506925000001.app
【国際調査報告】
2019506925.tif 000019
2019506925.tif 000020
2019506925.tif 000021
2019506925.tif 000022
2019506925.tif 000023